(57)【要約】本発明は、Ａβペプチドを有さないか若しくは許容可能な低いレベルで有する抗Ａβ抗体、非ヒトＡβペプチドを有さないか若しくは許容可能な低いレベルで有する抗Ａβ抗体、又は検出不能な濃度のＡβペプチドを有する抗Ａβ抗体を含有する、ヒト患者に投与するのに適した組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβペプチドを有さないか、又は許容可能な低いレベルにて有する抗Ａβ抗体を含有する、ヒトである対象に投与するのに適した組成物。
【請求項２】
前記Ａβペプチドは非ヒトＡβペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＡβペプチドはヒトＡβペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
検出不能な濃度のＡβペプチドを有する抗Ａβ抗体を含有する、ヒトである対象に投与するのに適した組成物。
【請求項５】
抗Ａβ抗体はヒト化抗Ａβ抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体、及び薬剤的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗Ａβ抗体を製造する方法であって、
ＮＳ０、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、及びＰＥＲ．Ｃ６のいずれかの細胞株内で抗Ａβ抗体を発現させ、該抗Ａβ抗体を精製することを含む方法。
【請求項８】
細胞株がＮＳ０である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞株がＣＨＯである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗Ａβ抗体を製造する方法であって、
β−セクレターゼ阻害剤を含有する細胞培地内で、抗Ａβ抗体を発現する細胞株を培養し、該抗Ａβ抗体を精製することを含む方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗Ａβ抗体を製造する方法であって、
γ−セクレターゼ阻害剤を含有する細胞培養内で、抗Ａβ抗体を発現する細胞株を培養し、該抗Ａβ抗体を精製することを含む方法。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗Ａβ抗体を製造する方法であって、
アミロイド前駆体タンパク質、β−セクレターゼ、及びγ−セクレターゼのいずれかを欠いた細胞株内で抗Ａβ抗体を発現させ、該抗Ａβ抗体を精製することを含む方法。
【請求項１３】
前記細胞株はアミロイド前駆体タンパク質を欠いている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞株はβ−セクレターゼを欠いている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞株はγ−セクレターゼを欠いている、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に属する。より詳細には、本発明はＡβペプチドを有さないか、又はＡβペプチドを許容可能な低いレベルで有する抗Ａβ抗体を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドプラークの主な構成要素は、３９〜４３個のアミノ酸からなるＡβペプチドである。このペプチドは、タイプＩ内在性膜タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から、タンパク質分解によって誘導される。細胞培地内で分泌される優位な種類はＡβペプチド（１〜３９／４０又はＸ〜３９／４０）であるが、より長い形態のＡβペプチド（１〜４２／４３又はＸ〜４２／４３）はより溶解性が低く、より凝集し易く、アミロイド沈着の核となる種を構成する。Ａβペプチド（１〜４２／４３）を含むアミロイド沈着物は、例えばアルツハイマー病、ダウン症候群、脳アミロイドアンギオパチー、血管性痴呆、軽度認知機能障害、及び同様物のような状態及び疾患と関連している。
【０００３】
Ａβペプチドを含む異常な沈着物と関連した状態及び疾患のための様々な治療的処置は、Ａβペプチドの産生及び／又はＡβペプチドのプラークへの凝集の防止、並びにアミロイドプラークの縮小又は排除に焦点を当ててきた。別の治療的アプローチの一つは、例えば能動免疫法（ＷＯ９９／２７９４４）等による、ペプチド投与を介したＡβペプチドに対する免疫原性反応の誘導である。しかしながら、合成ヒトＡβ１〜４２ペプチドを用いた能動免疫的アプローチを利用する最近のフェーズ２Ａ試験は、４人の患者が中枢神経系（ＣＮＳ）内の炎症に一致した臨床的徴候を示し、間もなく中止された。中止以降、更に１１人の患者がＣＮＳ炎症と関連した症状を発症した（Ｏｒｇｏｇｏｚｏ等、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６１：４６−５４（２００３）、Ｓｃｈｅｎｋ等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｎ．Ｉｍｍｕｎ．、１６：５９９−６０６（２００４））。このように、アルツハイマー病を治療するためのＡβペプチドの投与は有害な結果を招き、患者に対する安全上の問題を提起した。
【０００４】
Ａβペプチドを標的にする代替的な免疫学的手段では、例えば受動免疫法を用いてペプチドに特異的な抗体を投与する。受動免疫法は、能動免疫法のようにＴ細胞及びＢ細胞内で記憶を確立しないが、受動的アプローチは、能動免疫法を取り巻く安全上の問題を提起していない。
【０００５】
以前に、例えばＫ５６２、Ｍ１７、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、及びＨＵＶＥＣのような種々の細胞株が、Ａβペプチドを産生することが示された（Ｓｈｏｊｉ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：１２６−１２９（１９９２）、Ｈａａｓｓ等、Ｎａｔｕｒｅ、３５９：３２２−３２５（１９９２））。従って、臨床的使用のためのヒト又はヒト化抗体の発現に使用できる多数の細胞株、例えばＣＨＯ及びＨＥＫ２９３は、ＡＰＰホロタンパク質と、該ＡＰＰを切断して自然にＡβペプチドを発現するのに必要なγ−及びβ−セクレターゼとを内生的に含有する。
【０００６】
驚くべき事に、一般に組み換えによる抗体発現に使用される殆どの哺乳動物の細胞株内で内生的に産生されたＡβペプチドは、発現した抗Ａβ抗体に対して低いレベルで結合し、細胞培養及び精製工程を通して残り続けることが、抗Ａβ抗体の製造中に発見された。組み換え的に産生された抗Ａβ抗体材料のＡβペプチド汚染に伴い、患者の免疫原性反応が増大し、重要性の鍵を握るＡβペプチドが抑制、除去又は低減される可能性がある。更に、内生的に産生されたＡβペプチドが、ＣＨＯ細胞株により産生されたペプチドのようにヒトのものでない場合、発現した抗Ａβ抗体に結合している非ヒトＡβペプチドの免疫原性の関与は、更に重大な患者の安全上の問題を引き起こすと考えられ、従ってＡβペプチドの抑制、除去又は低減は極めて重要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒトである対象に投与するのに適した、Ａβペプチドを有さないか、又はＡβペプチドを許容可能な低いレベルで有する抗Ａβ抗体を含有する組成物を提供する。
【０００８】
また本発明は、ヒトである対象に投与するのに適した、非ヒトＡβペプチドを有さないか、又は非ヒトＡβペプチドを許容可能な低いレベルで有する抗Ａβ抗体を含有する組成物を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、ヒトである対象に投与するのに適した、検出不能な濃度のＡβペプチドを有する抗Ａβ抗体を含有する組成物を提供する。
【００１０】
本発明はまた、Ａβペプチドを有さないか、又は許容可能な低いレベルで有する抗Ａβ抗体を製造するための方法を提供する。
【００１１】
本発明の一実施態様では、抗体はＮＳ０細胞内で発現される。別の一実施態様では、抗体は、例えばＡＰＰ、β−セクレターゼ、若しくはγ−セクレターゼ遺伝子の一つ等をコードする特定の遺伝子の欠失によって、又はα−セクレターゼ発現の増大によってＡβ産生が失われた細胞内で発現される。更なる実施態様では、抗体はβ−又はγ−セクレターゼ阻害剤を含有する細胞培地内で産生される。更に別の一実施態様では、抗体は酸性化及びサイズ排除クロマトグラフィーによってＡβペプチドが除かれる。
【００１２】
加えて本発明は、本発明の組成物を使用した、アルツハイマー病、ダウン症候群、脳アミロイドアンギオパチー、血管性痴呆、軽度認知機能障害及び同様物のような状態及び疾患に罹患したヒト患者の治療方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本願に開示され特許請求されている本発明のために、以下の用語を次のように定義する。
【００１４】
「抗体」は、キメラ、ヒト化、ヒト、組み換え、トランスジェニック、移植及び単鎖抗体、並びに同様物、又はＡβペプチドに選択的に結合する一つ又は二つ以上のドメインを含む任意の融合タンパク質、複合体、断片、又はその誘導体を含むがこれらに限定されない全ての抗体を意味する。従って、抗体には全ての免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、又はこれらいずれかの免疫学的に有効な断片が含まれる。抗体断片は、当該技術分野にて公知のＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２断片を意味する。「抗Ａβ抗体」という表現は、Ａβペプチドを認識する、即ちＡβペプチドに結合する抗体を意味する。
【００１５】
用語「ヒト化抗体」は、その一部又は全部が、ヒト抗体の生殖細胞系又再編成配列に由来するアミノ酸配列からなる抗体を意味し、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体の配列を変更することによって形成される。可変領域のフレームワーク領域が、非ヒトＣＤＲを実質的に損なわずに、対応するヒトフレームワーク領域と置き換わる。ヒトフレームワーク領域は、ゲノムフレームワーク領域を含み、また一つ又は二つ以上のアミノ酸代替物を含むものも包含する。より詳細には、このような代替物には、ヒトフレームワーク内の特定の位置のアミノ酸が、非ヒトＣＤＲのための天然フレームワークの対応位置からのアミノ酸に代替されている突然変異を含む。ヒト化抗体という用語の抗体とは、完全長抗体に限定されるものではなく、断片及び単鎖の形態も含む。
【００１６】
本願の文脈において用語「Ａβペプチド」又は「Ａβ」は、インビボでアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）タンパク質から、タンパク質分解により誘導された３９、４０、４１、４２、及び４３個のアミノ酸からなるペプチド、並びにそれらペプチドの任意の断片、例えばそれらのペプチドから誘導されたＮ−末端短縮ペプチド（例、例えば、ｘ〜４２で表され、ここでｘ＝１、２、３等である。）、１〜３９、４０、４１、及び４２ペプチドから誘導されたＣ−末端短縮ペプチド、及び両方の末端にて短縮されたペプチドを含む。各完全長アミノ酸ペプチド配列の詳細は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ヒトＡβペプチド及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、齧歯動物Ａβペプチド（即ち、マウス、ハムスター）を参照されたい。
【００１７】
本願で使用されているように、用語「β−セクレターゼ」は、ＡＰＰを切断してＡβペプチドのアミノ末端を生成するＡＰＰ加工に関与する酵素を意味する。用語「γ−セクレターゼ」は、β−セクレターゼに続いてＡＰＰを切断して、Ａβのカルボキシル末端を生成するＡＰＰ加工に関与する酵素複合体を意味する。用語「α−セクレターゼ」は、可溶ＡＰＰのための経路内においてＡＰＰをＡβ配列内（Ａβペプチド残基１６と１７の間）で切断し、従ってＡβペプチドが生成されないＡＰＰ加工に関与する酵素を意味する。「β−又はγ−セクレターゼ阻害剤」は、β−又はγ−セクレターゼ酵素活性を阻害（遮断又は低減）する分子を意味する。
【００１８】
「許容可能な低いレベルのＡβペプチド」は、安全であり、従って特に医薬組成物中でヒト対象に投与されるに許容可能な、又は投与に適すると考えられる抗Ａβ抗体標本中の汚染Ａβペプチドのレベルを意味する。詳細には、許容可能な低いレベルのＡβペプチドは、抗Ａβ抗体を投与された患者の免疫原性反応を惹起しない、及び／又は免疫原性反応を増大させないと想定されるＡβペプチドを意味する。許容可能な低いレベルは、医薬組成物及び製剤の開発にて通常使用及び許容されている安全性の慣習に従って、当業者により決定されるであろう。
【００１９】
Ａβペプチドの「検出不能な濃度」とは、抗Ａβ抗体の標本中のＡβペプチドの濃度の測定に通常使用される方法の検出限界未満にあるＡβペプチドの濃度を意味する。このような方法には、ＥＬＩＳＡ法、酸−尿素ゲル／ウエスタンブロット分析法（実施例１〜３に記載するような）、質量分光法、分析クロマトグラフ法、又は他の高感度な分析法が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、実施例１〜３に記載する酸ゲル／ウエスタンブロット分析は、Ａβの１ｐｇ／μｇＩｇＧまでの最大感度を有する一方で、実施例３で使用されるＥＬＩＳＡ法は、０．０２ｎｇ／ｍＬの検出限界を有する。これら各方法の検出限界を下回るＡβの濃度は、検出不能であると思われる。
【００２０】
本発明の組成物は、当該技術分野にて公知の数種の方法によって製造することができる。以下の方法は例証であり、本発明を限定するものではない。
【００２１】
一般に、組み換え抗体産生は、細胞株の生成、細胞培養、及び精製という３つの主な段階にまとめることができる工程により実現される。従って、細胞株を生成した後、細胞株内で抗体を発現させ、該抗体を精製することを含む工程によって、一般に本発明の抗Ａβ抗体が製造される。これら任意の段階になされる変更は、生成する抗体の発現又は特徴に影響を与え得る。細胞株生成段階における多数の変更が抗体発現に影響を及ぼす可能性があり、その中には抗体の発現を可能にするよう細胞株の形質転換に使用されるベクター構造、及び該ベクター構造内に含まれるリーダー配列、細胞型の選択、トランスフェクト細胞の選択、遺伝子の増幅、並びに細胞株のスクリーニングが含まれる。選択された細胞株からの抗体発現は、細胞培養のための培地の使用に依存する。培地の改変、例えば温度、栄養分、及び溶解酸素における変化が、発現や生成物の品質に影響を与え得る。細胞培地内での抗体発現後、多様なクロマトグラフィー技術、濾過、及びバッファ交換等の精製技術により、所望の生成物の性質や、純度及び汚染物質の性質を変更し得る。これら一般の組み換え抗体産生段階を考慮して、本発明は特定の技術を使用するか、又はそれら段階の各々に特定の変更を施して実現することができる。
【００２２】
本発明の組成物の製造方法は、特定の細胞株源と、該細胞株に対する改変とに関係する。前述したように、細胞株は抗体発現に影響を与える。本発明の組成物の製造方法は、哺乳動物の細胞株を使用して抗Ａβ抗体を発現させることを含む。哺乳動物細胞株はハムスター、ヒト、又はマウスの細胞株であることが好ましい。哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、又はＮＳ０であることがより好ましい。哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ又はＮＳ０であることが最も好ましい。ＮＳ０細胞を使用した組み換えによる抗Ａβ抗体の産生により、検出不能な濃度のＡβペプチドを有する抗Ａβ抗体が生成されることが好ましい（実施例３参照）。
【００２３】
組み換え抗体の発現には、ＡＰＰ又はセクレターゼ（β−若しくはγ−セクレターゼ）の一つを欠いた哺乳動物細胞株を使用することができる。ＡＰＰ、β−若しくはγ−セクレターゼを欠いているか、又は低いレベルで有する細胞株は、様々な細胞株の操作又は改変を介して得られる。ＡＰＰ、β−又はγ−セクレターゼをコードする遺伝子（一つ又は複数）がノックアウトされた細胞株は、当該技術分野にて公知の方法で生成し得る。これに代わり、細胞株に対する改変が、この遺伝子欠損効果を生じることができる。有用な細胞株改変の一例では、ＲＮＡ干渉として周知のプロセスを介して、望ましくないタンパク質（例、ＡＰＰ又はβ−若しくはγ−セクレターゼ）のＲＮＡ転写物を分解することによって、発現するＡβペプチドの量を有意に低下させる。ＲＮＡ干渉を可能にするために、公知の方法に従って、細胞にＤＮＡ配列を安定的又は一時的にトランスフェクト又は感染させ、プラスミド又はウイルス仲介によりショートヘアピンＲＮＡ構造を発現させる。このショートヘアピンＲＮＡ構造は特定の転写物に特異的に結合して、その転写物の切断及び分解を開始させる（Ｂａｎａｎ及びＰｕｒｉ、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５：４４１−５０（２００４）、Ｎｅｓｔｅｒｏｖａ及びＣｈｏ−Ｃｈｕｎｇ、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、５：６８３−９（２００４）、Ｍｅｄｅｍａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、３８０：５９３−６０３、（２００４））。哺乳動物細の細胞培地の代替として、タンパク質の発現のために形質転換植物又は植物細胞培地が使用されており（Ｈｅｌｌｗｉｇ等、２００４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２：１４１５（２００４））、これらはＡβを欠いた抗体を産生するための別の一源であり得る。同様に、哺乳動物細胞培地の代替として様々な種のイーストが一般に使用されており、Ａβを欠いた抗体の発現に適用することができ得る。これらの方法の使用により、Ａβペプチドの産生が低下又は抑制される。
【００２４】
本発明の組成物の製造方法には、細胞培地に対する改変も含まれる。その方法は、好ましくはβ−又はγ−セクレターゼ阻害剤を細胞培地に組み込み、存在するＡβペプチドが許容可能な低いレベルにある抗Ａβ抗体を産生させる。様々なβ−及びγ−セクレターゼ阻害剤が公知であり（例、米国特許第６、４８６、３５０号、米国特許第６、６２７、７３９号、Ｄｏｖｅｙ等、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７６：１７３−１８１（２００１）、Ｙｕｅ−Ｍｉｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ、４０５：６８９−６９４（２０００））、これらの方法に使用することができる。
【００２５】
本発明の組成物を製造する更なる方法では、細胞培地内で可溶なＡＰＰの産生を増加させることによって、産生されるＡβペプチドの量を低下させる。可溶なＡＰＰの産生は、細胞株内でα−セクレターゼ活性を増大させることにより増加し得る。増大されたα−セクレターゼ活性を伴う細胞株は、当該技術分野で公知の方法により生成することができる。これに代わり、可溶なＡＰＰの産生はＣＨＯ細胞に銅を添加することにより増加する（Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、３４４：４３１−４６７（１９９９））。銅の添加もまた親ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及び銅耐性ＣＨＯ−ＣＵＲ３細胞内でのＡβペプチドのレベルを相当低下させた。
【００２６】
本発明の組成物の製造方法は、多様な精製技術も含む。その技術には、抗体による細胞培地からのプロテインＡ（ＰｒｏｔｅｉｎＡ）捕捉が含まれる。続く精製工程では、薬剤を使用してＡβペプチドから抗Ａβ抗体を分離し、次いでこれら二つの物質（ｅｎｔｉｔｙ）間のクロマトグラフィーによる差異に基づいて、抗原から抗体を分離する。好ましい分離薬剤には、酸、尿素、チオシアナート、及び洗浄剤がある。抗体と抗原とを分離した後、Ａβペプチドから抗Ａβ抗体を分離することが可能なクロマトグラフィー技術を使用して、抗体又は抗体抗原複合体から抗原を除去する。このクロマトグラフィー技術は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及び疎水クロマトグラフィーが好ましい。更に、抗体から抗原を分離する別の一技術として、タンジェンシャルフロー濾過が使用される。好ましい精製方法において、本発明の組成物は、抗体のプロテインＡ捕獲、中和、希釈、酸性化、サイズ排除クロマトグラフィー、及び中和を含むステップにより精製される（実施例２参照）。
【００２７】
別のクロマトグラフィー方法の一つでは、Ａβペプチドの別の一エピトープに対する固定化抗体を使用して、又はＡβペプチドに対する親和性がより高い抗体を使用して、抗体抗原複合体若しくは抗原を単離及び除去する。
【００２８】
本発明の組成物は、例えばアルツハイマー病、ダウン症候群、脳アミロイドアンギオパチー、血管性痴呆、軽度認知機能障害、及び同様物等の状態及び疾患を有するヒトの患者の治療に使用され得る。Ａβペプチドは、該Ａβペプチドがヒト以外である場合、患者において潜在的な免疫原性の危険性、及び更にはより大きな潜在的な健康上の問題を生じ得る。従って、Ａβペプチドの抑制、除去又は低減が重要なポイントとなる。
【００２９】
本発明の組成物は、抗Ａβ抗体、及び薬剤的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物として、ヒトである患者に投与されるのに適している。許容される賦形剤の例には、選択された投与モードに適切であるように構成された緩衝剤、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定剤及び同様物が含まれる。参照により本願に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ、最新版は、従事者に通常知られた調剤技術の大要を提供する。
【００３０】
以下の実施例は例証を意図し、本発明を限定するものではない。
【００３１】
＜実施例１＞
（γ−セクレターゼ阻害剤を含む細胞培地内における抗Ａβペプチドの発現）
γ−セクレターゼ阻害剤、
【化１】
2008500279.tif 000002
（ＷＯ９８／２８２６８）を抗Ａβ抗体が発現しているＨＥＫ２９３細胞培地に加えて、細胞によって自然に発現されるＡβペプチドの量を低下させた。この実施例の細胞培地サンプルには、阻害剤を添加していないコントロール培地、時間＝０と、その後５日間２４時間毎に１ｎＭ阻害剤を添加した培地（５日間のトランスフェクション用）、及び時間＝０に１ｎＭ阻害剤を添加した培地が含まれていた。これらのサンプルをプロテインＡカラム、及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。サンプルのＡβペプチド含有量を、以下に詳細に説明するように、酸−尿素ゲルセパレーション、及びその後のウエスタンブロット分析法により分析した。産生した、及びこの方法で分析した抗Ａβの結果を、後記の第１表に示す。
【００３２】
以下のプロトコールに、サンプルのギ酸変成、及びその後の酸−尿素ポリアクリルアミドマトリクスを介した電気泳動法の技術を説明する。
【００３３】
１日目
［装置の設定）
１）キャスティングのためにアクリルアミドゲルプレートを洗浄及び組立てた。例えば、キャスティングスタンド内にＨｏｅｆｆｅｒプレートを配置した（１６ｃｍ×１４ｃｍプレート及び１．５ｍｍスペーサー）。プレートを洗剤で徹底的に洗浄し、蒸留水（ｄＨ２Ｏ）、アセトンでリンスし、最後に１００％ＥｔＯＨでリンスした。
２）１０ｃｍ（２２％分離ゲル）及び１１．７５ｃｍ（１０％ステップゲル）の箇所にてプレートに印を付けた。
【００３４】
［ゲルの作成及びゲル濃度］
１）アクリルアミド（４０％溶液、例えば予め作成されたＢｉｏ−Ｒａｄ／ｃａｔ＃１６１−０１４８等）
２）ゲル成分
【表１】
2008500279.tif 000003
【００３５】
尿素、アクリルアミド、氷酢酸（ＧＡＡ）、及びｄＨ２Ｏを５０ｍＬコニカルチューブ内に加えた。短時間ボルテックスし、５５℃の水浴内でインキュベートした。尿素が溶液中に完全に溶解するまで、２、３分毎にボルテックスした。２２％及び１０％溶液を脱気し、溶液を氷上に配置し、４％スタッカーを水浴内に残した。
【００３６】
［ゲルの注ぎ込み（室温で）］
１）Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を２２％溶液に加え、数回穏やかに反転して混合した。次いで、１０％ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）を加え、数回反転した。２５ｍＬピペットを使用して、１０ｃｍの印に到達するまで、溶液をプレート間にゆっくり注いだ。
２）７５０μＬの５％ＧＡＡのオーバーレイを注意深く加えた。Ｐ１０００ピペットを使用して、５％ＧＡＡをガラスプレートの片面を伝わらせ非常にゆっくりと２２％分解ゲル上に下降させた。
３）室温にて少なくとも１時間、重合させた。
４）ＴＥＭＥＤ及び１０％ＡＰＳを、２２％の場合と同様に１０％アクリルアミド溶液に加えた。オーバーレイを除去し、溶液を１１．７５ｃｍにおける第二の印に到達するまで加えた。再び、上記のように５％ＧＡＡのオーバーレイ７５０μＬを注意深く注いだ。ゲルを３０分間重合させた。
５）４％スタッカー溶液を加える前に、ゲルスタンドを３７℃のインキュベーター内に１５分間配置して、ゲルを暖めた。このことはウェル内での正確な重合を助ける。４％スタッカー溶液を脱気し、５５℃に保持した。オーバーレイを除去した。ＴＥＭＥＤを加え、数回反転した後、１０％ＡＰＳを加えた。この溶液を急速に注ぎ、清浄な乾燥１２ウェルコーム（ｃｏｍｂ）（又は１５ウェルコーム）を挿入した。スタッカーを注いだ後、スタンドをインキュベーター内に戻し１５分間配置した後、除去した。ベンチトップ上で重合させた。スタッカーの完全な重合には少なくとも１．５時間を要するであろう。
【００３７】
＊注記：重合ステップ中、分解ゲル中に空洞部分が出現し得る。これらの部分は、重合前及び後のゲルの温度変化を原因として形成する。これらのスペースは、この技術の性能を損なうものではない。
【００３８】
［サンプルの調製］
単一レーン内の３ｍｇのタンパク質の上方への分析によって、妥当なバンド結果が得られるであろう。タンパク質分析の条件は、以下のようなものである。
【００３９】
（サンプル）
１００ｍｇ／ｍＬタンパク質（最大濃度のタンパク質）３０μＬ
８０μＬギ酸（９８％）（ＩＣＮ  ｃａｔ＃１５１６２−９０）
２０μＬ酸性ローディングバッファ（８０％ギ酸、６０％ショ糖及び０．０２％メチルグリーン、６ｇショ糖を約８ｍＬの約９９％ギ酸に溶解してバッファを作成した。混合物を加熱しかきまぜた。ショ糖が溶解した後、溶液の容積を約９９％ギ酸で１０ｍＬに調節した。２μＬの１％メチルグリーン溶液を加えた。
１μｌ  β−メルカプトエタノール
【００４０】
＊注記：必要に応じて容積を調節する。しかしながら、最終的なギ酸濃度が常に７０％〜９０％にあることを確認する。
【００４１】
（ラダー）
Ｐｈａｒｍａｃｉａ分子量マーカー、Ｍ．Ｗ．Ｒａｎｇｅ  ２、５１２−１６、９４９（ｃａｔ＃８０−１１２９−８３）。タンパク質を１ｍＬ  ＰＢＳ中で再構成した。１０μＬアリコートを−２０℃で冷凍した。１アリコートを必要とする各ラダー用に解凍し、ギ酸（９８％）９０μＬ、酸性ローディングバッファ２０μＬ、及びβ−メルカプトエタノール１μＬを加えた。
【００４２】
＊注記：これらラダーを製造業者の指示に従って再構成しないこと（ＳＤＳがラダーのスメアの原因となるため）。
【００４３】
（ＢＳＡサンプル）
各ゲル泳動の２レーンの外側に、歪みが生じる。この歪みによる負の効果を最小にするため、ＢＳＡサンプルをゲルの両側の外側レーン内にロードした。ＢＳＡサンプル＝５％ＢＳＡ１μＬ、ギ酸（９８％）９０μＬ、酸性ローディングバッファ２０μＬ、及びβ−メルカプトエタノール１μＬ。
【００４４】
［ゲルの泳動］
予備泳動：冷室内で装置を組み立てた。底部チャンバ（容積の３／４）を予め冷却した酸性ゲルランニングバッファで満たした。頂部リザーバに適量のバッファを加えた。ゲルをアノードからカソードへ、２５０ボルトにて３０分間予備泳動した。
【００４５】
＊ゲル底部の気泡を全て除去し、頂部リザーバからバッファが漏れていないか確認した。
＊＊酸性ゲルランニングバッファ＝氷酢酸２５０ｍＬ＋ｄＨ２Ｏ３７５０ｍＬ
【００４６】
サンプルのロード：サンプルをロードする前に、ウェルをバッファでリンスして過剰の尿素を除去した。サンプル、ラダー、及び外側のＢＳＡサンプルをロードした。２つのラダーを泳動して、転写前に、ペプチドラダーを含む１つのレーンを切断し、クマシーブルーで染色した。
【００４７】
段階電圧：以下のように、ゲルをアノードからカソードへ泳動した。
２５ボルトで１５分間
５０ボルトで１５分間
１００ボルトで１５分間
２００ボルトで１５分間
２７５ボルトで〜１５時間
【００４８】
＊＊染料の先頭が底部から約２〜２．５ｃｍになるまで、ゲルを一夜泳動した。これは通常、ゲルを夕方前にスタートさせた場合、翌朝になる。
【００４９】
２日目
［酸尿素ゲルの転写条件（４℃の冷室内で泳動）］
転写前の夜、以下のバッファを作成し、冷室にて貯蔵した。
転写バッファ
トリス塩基  １２．３６ｇ
グリシン      ５７．６ｇ
メタノール    ８００ｍＬ
ｄＨ２Ｏ      ４リットルまで
【００５０】
転写前に酸尿素ゲルを中和した。ゲルを注意深く除去し、洗浄したガラストレー内に配置した。２００ｍＬの転写バッファを加え、１５分間緩やかに揺すった。この洗浄ステップを合計４回繰り返した。転写を通常通り行った（１００ボルトで２．５時間）。
【００５１】
［ポンソーＳ染色及び脱染］
転写後、ラダー中のタンパク質をポンソーＳ染色により視覚化した。ニトロセルロースを５％酢酸中の０．１％ポンソーＳ溶液中で５分間染色した。膜をｄＨ２０で脱染後（３回の非常に短時間の洗浄）、膜をデジタルスキャンし、ラダーに先の丸い鉛筆で印をつけた。ファイルをセーブした。
【００５２】
＊注記：このラダーは単に整合を目的として使用される。この技術によってペプチドはその分子量（サイズ）及び電荷に従って分離される。例えば、同一の分子量を有するが異なる電荷を有する２種のペプチドは、同一の正味の可動性を有さないであろう。この問題のため、少なくとも一ウェル中のＡβペプチドの基準を常に泳動させる。これにより正確なＡβペプチドの同定が可能となる。
＊＊重要事項：ペプチド基準ラダーのバンド全てが転写されるわけではない。クマシーブルーラダーがポンソーＳ染色ニトロセルロースと整合した場合、１０．７ｋＤａ及び６．２ｋＤａバンドが転写されないことは明らかである。
【００５３】
［ウエスタンブロット条件］
ニトロセルロース膜をＰＢＳ中で５分間ボイルした。通常のウエスタン条件にて進行させた。
【００５４】
［ブロッキング工程］
１Ｘトリス緩衝生理食塩水／０．１２５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）（ＴＢＳ／Ｔ）中の５％ミルクで、５０ｍＬ容量にて４５分間、膜をブロックした。
【００５５】
［一次抗体］
選択された抗体の結合エピトープがＡβペプチドの異なる領域に結合するように、選択された数の抗Ａβ抗体（例、３個）を使用した。選択された抗体はまた少なくとも７９ｐｇの基準の視覚化を可能にすることを確認した。一次抗体溶液は０．５％ミルクＴＢＳ／Ｔ中にあり、選択された抗体は総容量２０ｍＬにて例えば１：１０００に希釈された。一次抗体を一夜ロッカー上にて放置した。
【００５６】
３日目
［膜の洗浄］
膜を３回、各々につき１０〜１５分間、ＴＢＳ／Ｔ中１％ＢＳＡで洗浄した。
【００５７】
［二次抗体］
二次抗体溶液は１％ミルクＴＢＳ／Ｔ中にあり、抗マウスＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇからカタログ番号７０７６）は総容量５０ｍＬにて１：６０００に希釈された。二次抗体中で膜を３時間放置した。
【００５８】
二次抗体処理後、膜を３回、各々につき１５分間、ＴＢＳ／Ｔで洗浄した。
【００５９】
［現像］
現像前に、膜を高感度ケミルミネッセンス（ＥＣＬ）溶液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃａｔａｌｏｇ＃３４０８０）中に５分間配置した。
【００６０】
この手法の最大感度は、ウエスタンブロット工程中に使用する試薬に依存する。上記した実施例については、このアッセイの最大感度は、約１ｐｇ／μｇＩｇＧである。サンプルのＩｇＧ濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、２８０ｎｍにおける吸収を測定し、その値を消散係数１．４で除算して決定した。
【００６１】
この実施例に従って生成したサンプルの分析により、以下の結果を得た。
【００６２】
第１表  γ−セクレターゼ阻害剤を含むか、又は含まない細胞由来の精製抗体の酸尿素ゲル分析
【表２】
2008500279.tif 000004
【００６３】
＜実施例２＞
［抗体及びＡβペプチドの酸解離による抗Ａβ抗体の精製］
抗Ａβ抗体を、細胞培地内で増殖したＨＥＫ２９３細胞で発現させた。培地をプロテインＡ−アガロースカラムにかけ、１００ｍＭグリシンバッファ、ｐＨ３．１で溶出することによって抗体を精製した。プロテインＡから溶出した分画の集合（ｐｏｏｌ）を、１Ｍトリスバッファ、ｐＨ８．０の小量を加えることによって約ｐＨ７．４に調整した。次に、この溶出した画分の集合を１Ｍグリシン、ｐＨ２中で１：１に希釈することによって約ｐＨ２に調整した。室温で約１０分間のインキュベーション後、酸性化した集合を、５０ｍＭグリシン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２の移動相を使用した流速３０ｃｍ／時間の２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上のサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。サイズ排除カラムから溶出した抗体を、トリスバッファを加えて中和し、ｐＨ７．４のＰＢＳに対して透析した。
【００６４】
変成酸／尿素傾斜ポリアクリルアミドゲル分析（本技術の更なる解説は、実施例１を参照）は、この酸解離法による精製で生成したサンプルのｐｇ／μｇＩｇＧ単位でのＡβペプチドの質量の推定値を提供する。この酸解離精製法を用いた抗−Ａβ抗体の精製の後、以下の結果を得た。
【００６５】
第２表  ＨＥＫ２９３細胞由来の精製抗体の酸尿素ゲル分析：サイズ排除クロマトグラフィーのみ（酸性化せず）、又は酸性化及びサイズ排除クロマトグラフィー
【表３】
2008500279.tif 000005
【００６６】
＜実施例３＞
［ＮＳ０細胞内での抗Ａβ抗体の発現］
抗Ａβ抗体を細胞培養内で増殖したＮＳ０細胞から発現させた。培地をプロテインＡ−アガロースカラムにかけ、１００ｍＭグリシンバッファ、ｐＨ３．１で溶出することによって抗体を精製した。プロテインＡから溶出した画分の集合を、１Ｍトリスバッファ、ｐＨ８．０を加えることにより約ｐＨ７．４に調整した。この溶出画分の集合を次にＰＢＳで１：１に希釈し、ＰＢＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４の移動相を使用した流速３０ｃｍ／時間の２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上のサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。サイズ排除カラムから溶出した抗体を、ｐＨ７．４のＰＢＳに対して透析した。変成酸／尿素傾斜ポリアクリルアミドゲル分析によれば、この方法で生成した抗Ａβ抗体内で、Ａβペプチドは検出されなかった。
【００６７】
ＥＬＩＳＡ分析を用いてＡβペプチドの濃度を測定した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）Ｆ９６又はＣ９６）のウェルに、中央Ａβペプチド（例、１７〜２５）結合領域の外側のエピトープを認識する抗Ａβ抗体（例、２又はそれ以上）を、各抗体につき例えば、被覆バッファ中で７．５μｇ／ｍＬの濃度で、冷却条件下で一夜被覆した。プレートから被覆溶液を吸引した後、ウェルを３００μＬ／ウェルのＨＢＳＴ／Ｂｌｏｔｔｏ（０．２５％ｗ／ｖ無脂肪ドライミルクを含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（各々、１５０ｍＭ及び１０ｍＭ）と、ＥＤＴＡ（３ｍＭ）及びＴｗｅｅｎ２０（登録商標）（０．５％ｗ／ｖ））で１〜２時間、室温でブロッキングし、その後洗浄バッファ（１ＸＰＢＳ及び０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））で１回洗浄して、吸引した。抗体を含むサンプルをＨＢＳＴ／Ｂｌｏｔｔｏ中で適切に希釈して、ＥＬＩＳＡプレートに添加した（ウェル毎１００μＬ）。等量の希釈物に更なる０．４ｎｇ／ｍＬ合成齧歯動物Ａβペプチド１〜４０を加えて、希釈サンプルマトリックスにおける正確な定量を確実にした。基準として、合成齧歯動物Ａβペプチド１〜４０を、精製抗Ａβ抗体と共に使用した（＜１ｐｐｍ総齧歯動物Ａβペプチド）。抗体（総Ａβペプチドのコントロールのための）及び抗体内に加えた合成齧歯動物Ａβペプチド１〜４２（Ａβペプチド１〜４２のコントロールのための）を含むコントロールサンプルも試験した。ＥＬＩＳＡプレートを１〜２時間、室温でインキュベートした。ウェルを洗浄バッファで４回洗浄し、吸引した。次いで、１００μＬ／ウェルのＨＢＳＴ／Ｂｌｏｔｔｏ中の希釈した（１：１０、０００）ロバ抗−ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼ複合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、＃７０９−０５６−１４９）を、各ウェルに添加した。室温で１〜２時間インキュベートした後、洗浄バッファで４回洗浄し、ウェルを吸引し、各ウェルに１００μｌの１ＸＤＥＡバッファ溶液中の１．０ｍｇ／ｍＬｐＮＰＰ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、＃５０−８０−００）溶液を加えた。ＥＬＩＳＡプレートを室温で周期的に振盪しながらインキュベートした。基準に関して色が十分に発現したとき（通常２．０〜２．５吸収単位）、マイクロプレートリーダーを使用して４０５ｎｍにおける吸収を読み取った。検出限界は０．０２ｎｇ／ｍＬであった。定量限界は０．１ｎｇ／ｍＬであった。基準のための濃度決定はＡＡＡ分析を使用した。サンプルのＩｇＧ濃度（ｍｇ／ｍＬ）は２８０ｎｍにおける吸収を測定し、その値を消散係数１．４で除算して決定した。このＥＬＩＳＡ分析を、上述したようにＮＳ０細胞内で発現した抗Ａβ抗体の分析に使用したが、Ａβペプチドは検出されなかった。
【００６８】
＜実施例４＞
［ヒト化抗Ａβ抗体標本中のＡβペプチドの陽イオン交換による低減］
ヒト化抗Ａβ抗体の標本を、ＣＨＯ細胞内で発現させた。プロテインＡ−アガロースカラムにかけ、１００ｍＭグリシンバッファ、ｐＨ３．１で溶出することによって抗体を生成した。プロテインＡから溶出した画分の集合を、１Ｍトリスバッファ、ｐＨ８．０を加えることによって約ｐＨ７．４に調整した。ＥＬＩＳＡ法による測定によれば、抗体標本は１５〜２０ｐｐｍのハムスターＡβペプチドを含有していた。
【００６９】
以下のように、抗体を陽イオン交換クロマトグラフィーで更に精製した。出発抗体材料をｐＨ５．２の５０ｍＭ酢酸ナトリウムに対して透析（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）して（５容量、３０ｋカットオフＰＥＳタンジェンシャルフロー超フィルターを使用）、陽イオン交換カラムにロードするために標本の導電率を低下させた。次いで透析したタンパク質溶液を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム中でｐＨ５．２に平衡させたＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム（０．６６×１５ｃｍ、１５ｍｇタンパク質／ｍＬカラム容積にてロード）に添加した。全操作は室温で行われ、線流速は１１５ｃｍ／時間であった。ロード後、カラムを５カラム容積のｐＨ５．２の５０ｍＭ酢酸ナトリウムで洗浄し、抗体を段階的に（５カラム容積の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．２）、又は１５カラム容積のｐＨ５．２の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中０〜１５０ｍＭの傾斜ＮａＣｌにより連続的に溶出した。主ピークからの画分をまとめた（約９０％の収率を達成するため）。この方法によって精製された集合した抗Ａβ抗体は、出発物質と比較して低いＡβペプチド含有量を有していた（段階的な溶出物質では１０ｐｐｍ、及び傾斜溶出物質では９ｐｐｍ）。
【００７０】
＜実施例５＞
［抗Ａβ抗体中のＡβの免疫精製による低減］
アミノ酸１３〜２８間のヒトＡβの中央ドメインに対して結合する抗Ａβ抗体を、細胞培地内で増殖したＨＥＫ２９３細胞により発現させた。この抗体から汚染ヒトＡβペプチドを、アガロースビーズに連結した、Ａβ４０のカルボキシル末端に向けられたモノクローナル抗体２Ｇ３を使用した免疫精製によって分離した。抗体標本を１０：１容量比にて、２Ｇ３に連結したビーズと共に一夜回転させた。一夜インキュベートした後、アガロースビーズをペレット化して２Ｇ３−Ａβ複合体を除去した。次いでＥＬＩＳＡ法により、免疫精製前及び後の抗Ａβ抗体内に存在するＡβペプチドの量を測定した。
【００７１】
この方法で免疫精製し、ＥＬＩＳＡ法により分析した抗Ａβ抗体標本は、精製前１０〜２５ｐｇ／μｇＩｇＧのＡβを有し、精製後は検出可能なＡβが存在しないことが見出された。汚染Ａβの低下を、実施例１に記載したように、酸ゲル／ウエスタンブロット分析により確認した。
【配列表】
2008500279000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月28日(2006.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008500279000001.app
【国際調査報告】
2008500279.tif 000007
2008500279.tif 000008
2008500279.tif 000009
2008500279.tif 000010