(57)【要約】  本発明は、対象における免疫応答を刺激するための、及びインターロイキン１２（ＩＬ−１２）治療の代替として使用するための、原発性腫瘍疾患、転移性腫瘍疾患及び感染症の予防及び治療のための組成物及び方法を提供する。詳細には本発明は、免疫刺激活性を有することから、癌及び感染症の治療及び予防並びに免疫変調に用途を有するアピコンプレックス関連タンパク質（ＡＲＰ）を提供する。ＡＲＰを含む組成物が提供される。インターロイキン１２（ＩＬ−１２）治療の代替として使用するための、及び対象における免疫応答を誘発するための、癌及び／又は感染症を予防及び／又は治療するためのＡＲＰの使用方法も提供される。
2008500005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における疾患を治療又は予防する方法であって、前記動物にタンパク質を供給する薬学的有効量の医薬組成物を前記動物に投与することを含み、前記タンパク質が、デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０からなる群から選択されるタンパク質のいずれか１つと少なくとも２５％の同一性を有し、前記タンパク質が免疫刺激活性を有する方法。
【請求項２】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、タンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、又は前記タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトされている細胞として供給する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
疾患を治療する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
疾患を予防する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、
（ａ）配列番号１を含む単離されたタンパク質、
（ｂ）配列番号２を含む単離されたタンパク質、
（ｃ）配列番号２８を含む単離されたタンパク質、
（ｄ）配列番号３０を含む単離されたタンパク質、
（ｅ）配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質、
（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は
（ｇ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）
として供給する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
医薬組成物が、配列番号１を含む単離されたタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
医薬組成物が、配列番号２を含む単離されたタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
医薬組成物が、配列番号２８を含む単離されたタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
医薬組成物が、配列番号３０を含む単離されたタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
医薬組成物が、配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
医薬組成物が、動物に前記タンパク質を、
（ａ）（１）アイメリアに感染している組織又は細胞の細胞抽出物を作製する段階、
（２）上清を作製するために前記細胞抽出物を遠心分離する段階、
（３）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによって前記上清を分画し、且つ前記ペレットを溶液に再懸濁する段階、
（４）ＨＩＣカラムに前記溶液を適用する段階、
（５）溶出した物質を作製するために前記ＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させる段階、
（６）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するために、前記溶出した物質を透析する段階、
（７）ＤＥＡＥカラムに前記試料を適用する段階、
（８）溶出した画分を作製するために緩衝液で前記ＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させ、且つ前記溶出した画分を濃縮する段階、
（９）サイズ排除カラムに前記濃縮され溶出した画分を適用する段階、
（１０）前記サイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールする段階、
（１１）カルシウム結合タンパクを除去するためにＨＩＣカラムに前記プールされた画分を適用する段階、
（１２）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムに前記ＨＩＣカラムから溶出した画分を適用し、且つ活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、
（１３）前記活性画分を透析する段階、並びに
（１４）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムに前記透析された活性画分を適用し、且つ１つ若しくは複数の活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、
（ｂ）組換え発現されたタンパク質、
（ｃ）前記（ａ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は
（ｄ）前記（ａ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）
として供給する、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
単離されたタンパク質が、
（１５）逆相ＨＰＬＣカラムに段階（１４）において収集された活性画分を適用する段階、及び
（１６）溶出したタンパク質を作製するために前記逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞は前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
をさらに含む工程の生成物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
単離されたタンパク質が、段階（１６）の溶出したタンパク質を再生する段階をさらに含む工程の生成物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞抽出物が、アイメリアに感染している組織から作製され、前記組織がウシ小腸組織である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
医薬組成物が、
（ａ）精製されたアピコンプレックス門生物の、又はアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製する段階、
（ｂ）ペレットを得るために前記ホモジネートを遠心分離する段階、
（ｃ）ホスホリパーゼを含む溶液で前記ペレットを処理する段階、
（ｄ）上清を得るために前記溶液を遠心分離する段階、
（ｅ）逆相ＨＰＬＣカラムに前記上清を適用する段階、及び
（ｆ）溶出したタンパク質を作製するために前記逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞は前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む工程の生成物である単離されたタンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
医薬組成物が、段階（ｆ）の溶出したタンパク質を再生する段階をさらに含む工程の生成物である単離されたタンパク質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
医薬組成物が、組換え発現された単離されたタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸として供給する、請求項５又は１１に記載の方法。
【請求項１９】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸として供給し、前記ヌクレオチド配列が前記動物において作動可能なプロモーターに連結している、請求項５又は１１に記載の方法。
【請求項２０】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸として供給し、前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結している請求項５又は１１に記載の方法。
【請求項２１】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、
（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０のいずれか１つの変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、
（ｃ）配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、
（ｄ）ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質、
（ｅ）低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、免疫刺激活性を有する単離されたタンパク質、
（ｆ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、免疫刺激活性を有する単離されたタンパク質、
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、
（ｈ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）
として供給し、前記医薬組成物が樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質として供給する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされる分子量１８〜２５ｋＤ及び４．０と４．７との間の等電点（ｐＩ）を含む単離されたタンパク質として供給する請求項１０から１５又は２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０のいずれか１つの変異体を含む単離されたタンパク質として供給し、前記変異体がそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質として供給し、前記変異体がそれぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質として供給する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされる単離されたタンパク質として供給し、前記タンパク質が免疫刺激活性を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされる単離されたタンパク質として供給し、前記タンパク質が免疫刺激活性を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
アイメリアの核酸が、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列として供給し、前記ヌクレオチド配列が前記動物において作動可能なプロモーターに連結している、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
形質転換細胞が、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞を含み、前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結している、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、
（ａ）配列番号１を含む単離されたタンパク質、
（ｂ）配列番号２を含む単離されたタンパク質、
（ｃ）配列番号２８を含む単離されたタンパク質、
（ｄ）配列番号３０を含む単離されたタンパク質、
（ｅ）配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質、
（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は
（ｇ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）
として供給する、請求項４に記載の方法。
【請求項３３】
医薬組成物が、配列番号１を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
医薬組成物が、配列番号２を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
医薬組成物が、配列番号２８を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
医薬組成物が、配列番号３０を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
医薬組成物が、配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、
（ａ）（１）アイメリアに感染している組織又は細胞の細胞抽出物を作製する段階、
（２）上清を作製するために前記細胞抽出物を遠心分離する段階、
（３）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによって前記上清を分画し、且つ前記ペレットを溶液に再懸濁する段階、
（４）前記溶液をＨＩＣカラムに適用する段階、
（５）溶出した物質を作製するために前記ＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させる段階  、
（６）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するために前記溶出した物質を透析する段階、
（７）ＤＥＡＥカラムに前記試料を適用する段階、
（８）溶出した画分を作製するために緩衝液で前記ＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させ、且つ前記溶出した画分を濃縮する段階、
（９）サイズ排除カラムに前記濃縮され溶出した画分を適用する段階、
（１０）前記サイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールする段階、
（１１）カルシウム結合タンパクを除去するためにＨＩＣカラムに前記プールされた画分を適用する段階、
（１２）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムに前記ＨＩＣカラムから溶出した画分を適用し、且つ活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、
（１３）前記活性画分を透析する段階、並びに
（１４）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムに前記透析された活性画分を適用し、且つ１つ若しくは複数の活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、
（ｂ）組換え発現されたタンパク質、
（ｃ）前記（ａ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は
（ｄ）前記（ａ）をコードし、プロモーターに作動可能に連結しているヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞
として供給する、請求項４に記載の方法。
【請求項３９】
単離されたタンパク質が、
（１５）前記段階（１４）において収集された活性画分を逆相ＨＰＬＣカラムに適用する段階、及び
（１６）溶出したタンパク質を作製するために前記逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階
をさらに含む工程の生成物であり、前記タンパク質が樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞が前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
単離されたタンパク質が、前記段階（１６）の溶出したタンパク質を再生する段階をさらに含む工程の生成物である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞抽出物が、アイメリアに感染している組織から作製され、前記組織がウシ小腸組織である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
医薬組成物が、
（ａ）精製されたアピコンプレックス門生物の、又はアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製する段階、
（ｂ）ペレットを得るために前記ホモジネートを遠心分離する段階、
（ｃ）ホスホリパーゼを含む溶液で前記ペレットを処理する段階、
（ｄ）上清を得るために前記溶液を遠心分離する段階、
（ｅ）逆相ＨＰＬＣカラムに前記上清を適用する段階、及び
（ｆ）溶出したタンパク質を作製するために前記逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞は前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む工程の生成物である単離されたタンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項４３】
医薬組成物が、段階（ｆ）の溶出したタンパク質を再生する段階をさらに含む工程の生成物である単離されたタンパク質である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
医薬組成物が、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸として動物に前記タンパク質を供給する、請求項３２又は３８に記載の方法。
【請求項４５】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸として供給し、前記ヌクレオチド配列が前記動物において作動可能なプロモーターに連結している、請求項３２又は３８に記載の方法。
【請求項４６】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸として供給し、前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結している、請求項３２又は３８に記載の方法。
【請求項４７】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、
（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０のいずれか１つの変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、
（ｃ）配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、
（ｄ）ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質、
（ｅ）低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、免疫刺激活性を有する単離されたタンパク質、
（ｆ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、免疫刺激活性を有する単離されたタンパク質、
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、
（ｈ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）
として提供し、前記医薬組成物が樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞が前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項４８】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質として供給する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされる分子量１８〜２５ｋＤ及び４．０と４．７との間の等電点（ｐＩ）を含む単離されたタンパク質として供給する、請求項３７から４２又は４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０のいずれか１つの変異体を含む単離されたタンパク質として供給し、前記変異体がそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質として供給し、前記変異体がそれぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
医薬組成物が、ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質として動物に前記タンパク質を供給する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされる、免疫刺激活性を有する単離されたタンパク質として供給する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされる、免疫刺激活性を有する単離されたタンパク質として供給する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列として供給する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列として供給し、前記ヌクレオチド配列が前記動物において作動可能なプロモーターに連結している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
形質転換細胞が、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞を含み、前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
動物における疾患を治療又は予防する方法であって、そのような治療又は予防が望ましい前記動物に治療又は予防有効量の精製されたアピコンプレックス門生物又は精製されたアピコンプレックス門生物のタンパク質含有膜画分を投与することを含む方法。
【請求項５９】
精製及び不活性化されたアピコンプレックス門生物を投与することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
アピコンプレックス門生物の胞子形成オーシストを投与することを含み、対象が、前記アピコンプレックス門生物の自然宿主ではない、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
アピコンプレックス門生物がアイメリア種である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
アピコンプレックス門生物又はタンパク質含有膜画分が経口投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
医薬組成物が、金属キレート剤と共に投与される、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
疾患が癌である、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
対象に癌に対する二次療法を施すことをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
二次療法が、手術、放射線療法、化学療法、又はその組合せである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
二次療法が、対象にＣＤ４０リガンド、インターフェロンγ、インターロイキン４、インターロイキン１８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、別のサイトカイン、抗ＣＤ４０抗体、又はその組合せを投与することを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
癌が卵巣癌である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
疾患が感染症であり、前記感染症がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はアイメリア属生物への感染によって引き起こされるものではない、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８に記載の方法。
【請求項７０】
感染症が細菌によって引き起こされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
感染症がウイルスによって引き起こされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
感染症がヒトにおけるものであり、医薬組成物が単離されたタンパク質を含み、前記単離されたタンパク質の用量が約２．８ｍｇから約２８０ｍｇである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
用量が約５ｍｇから約１００ｍｇである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
用量が約１０ｍｇから約５０ｍｇである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
感染症が原生動物によって引き起こされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７７】
感染症が寄生虫によって引き起こされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７８】
動物が鳥類種ではなく、且つヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しておらず、医薬組成物の投与が免疫応答を刺激する、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８に記載の方法。
【請求項７９】
動物がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しておらず、医薬組成物の投与が前記動物におけるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の全身レベルの上昇を刺激する、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８に記載の方法。
【請求項８０】
動物がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染していない、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８に記載の方法。
【請求項８１】
医薬組成物が生物のゲノムによってコードされるタンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項８２】
生物がアピコンプレックス門生物である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
アピコンプレックス門生物がアイメリア種である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
医薬組成物が精製された分子を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項８５】
医薬組成物が単離されたタンパク質を含み、前記単離されたタンパク質がジスルフィド結合を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項８６】
ジスルフィド結合が還元型である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
ジスルフィド結合が酸化型である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
医薬組成物がグリコシル化タンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項８９】
医薬組成物が非グリコシル化タンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項９０】
医薬組成物がグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結タンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項９１】
医薬組成物がグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結ではないタンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項９２】
医薬組成物が天然タンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項９３】
医薬組成物が組換え発現されたタンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項９４】
治療又は予防することがアイメリア属タンパク質を含む前記医薬組成物を用いるものである、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項９５】
動物がヒトである、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８に記載の方法。
【請求項９６】
動物がヒトではない、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８に記載の方法。
【請求項９７】
（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む精製されたポリペプチド、
（ｂ）配列番号３、４、５、６及び７を含む精製されたポリペプチド、
（ｃ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号２９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、並びに
（ｄ）配列番号３、４、５、６及び７を含むアミノ酸配列の変異体を含む精製されたポリペプチド（前記変異体は、それぞれ配列番号３、４、５、６及び７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）
からなる群から選択される精製されたポリペプチド。
【請求項９８】
ポリペプチドが配列番号３、４、６又は７を含み、前記ポリペプチドがドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされる分子量１８〜２５ｋＤ及び４．０と４．７との間の等電点（ｐＩ）を有する、請求項９７に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項９９】
ポリペプチドが配列番号３、４、５、６及び７を含み、前記ポリペプチドがドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされる分子量１８〜２５ｋＤ及び４．０と４．７との間の等電点（ｐＩ）を有する、請求項９７に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項１００】
（ａ）アイメリアに感染している組織又は細胞の細胞抽出物を作製すること、
（ｂ）上清を作製するために前記細胞抽出物を遠心分離すること、
（ｃ）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによって前記上清を分画すること、及び前記ペレットを溶液に再懸濁すること、
（ｄ）前記溶液をＨＩＣカラムに適用すること、
（ｅ）溶出した物質を作製するために前記ＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させること、
（ｆ）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するために、前記溶出した物質を透析すること、
（ｇ）ＤＥＡＥカラムに前記試料を適用すること、
（ｈ）溶出した画分を作製するために緩衝液で前記ＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させること、及び前記溶出した画分を濃縮すること、
（ｉ）サイズ排除カラムに前記濃縮され溶出した画分を適用すること、
（ｊ）前記サイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールすること、
（ｋ）カルシウム結合タンパクを除去するためにＨＩＣカラムに前記プールされた画分を適用すること、
（ｌ）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムに前記ＨＩＣカラムから溶出した画分を適用すること、及び活性画分を収集すること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、
（ｍ）前記活性画分を透析すること、
（ｎ）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムに前記透析された活性画分を適用すること、及び１つ又は複数の活性画分を収集すること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０１】
（ｏ）逆相ＨＰＬＣカラムに段階（ｎ）で収集された活性画分を適用する段階、及び
（ｐ）溶出したタンパク質を作製するために前記逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞は前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
をさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
段階（ｐ）の溶出したタンパク質を再生する段階をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
細胞抽出物が、アイメリアに感染しているウシ小腸組織から作製される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項１００に記載の工程の生成物である、精製されたポリペプチド。
【請求項１０５】
（ａ）精製されたアピコンプレックス門生物の、又はアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製すること、
（ｂ）ペレットを得るために前記ホモジネートを遠心分離すること、
（ｃ）ホスホリパーゼを含む溶液で前記ペレットを処理すること、
（ｄ）上清を得るために前記溶液を遠心分離すること、
（ｅ）逆相ＨＰＬＣカラムに前記上清を適用すること、及び
（ｆ）溶出したタンパク質を作製するために前記逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させること（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞は前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０６】
作製された抽出物がウシに自然に感染する精製されたアピコンプレックス門生物のものである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
請求項１０５に記載の工程の生成物である、精製されたポリペプチド。
【請求項１０８】
請求項９７、１０４又は１０７に記載の治療有効量のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１０９】
第１タンパク質に結合する抗体であって、前記第１タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２６からなり、前記抗体が第２タンパク質に結合せず、前記第２タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０からなる抗体。
【請求項１１０】
モノクローナル抗体である請求項１０９に記載の抗体。
【請求項１１１】
請求項１１０に記載の抗体のフラグメントを含む分子であって、前記フラグメントが前記第１タンパク質と結合できる分子。
【請求項１１２】
（ａ）配列番号３、４、６又は７を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、
（ｂ）配列番号３、４、５、６及び７を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、並びに
（ｃ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号２９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子
からなる群から選択される単離された核酸。
【請求項１１３】
精製されている、請求項１１２に記載の核酸。
【請求項１１４】
ベクターである、請求項１１２に記載の核酸。
【請求項１１５】
ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結しているプロモーターをさらに含む、請求項１１４に記載のベクター。
【請求項１１６】
発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記発現ベクターがヌクレオチド配列に作動可能に連結しているプロモーターを含み、前記プロモーターが前記ヌクレオチド配列に関して非天然であり、前記ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号３、４、６若しくは７を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号３、４、５、６及び７を含むポリペプチド、又は
（ｃ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号２９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
をコードする宿主細胞。
【請求項１１７】
哺乳動物宿主細胞である、請求項１１６に記載の宿主細胞。
【請求項１１８】
酵母細胞である、請求項１１６に記載の宿主細胞。
【請求項１１９】
昆虫細胞である、請求項１１６に記載の宿主細胞。
【請求項１２０】
細菌細胞である、請求項１１６に記載の宿主細胞。
【請求項１２１】
大腸菌である、請求項１２０に記載の宿主細胞。
【請求項１２２】
コードされているポリペプチドが請求項１１６に記載の細胞によって発現されるように前記細胞を増殖させること、及び発現した前記ポリペプチドを回収することを含むポリペプチドの製造方法。
【請求項１２３】
発現したポリペプチドを回収することが、
（ａ）宿主細胞の抽出物を作製すること、
（ｂ）上清を作製するために前記宿主細胞の抽出物を遠心分離すること、
（ｃ）タンパク質を沈殿させるために硫酸アンモニウムによって前記上清を分画すること、
（ｄ）ペレットを得るために前記沈殿を遠心分離すること、
（ｅ）前記ペレットを溶液に再懸濁すること、
（ｆ）低圧疎水性相互作用カラムに前記溶液を適用すること、
（ｇ）前記低圧疎水性相互作用カラムから溶出した活性画分を収集すること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、
（ｈ）前記低圧疎水性相互作用カラムから前記溶出した活性画分を透析すること、
（ｉ）低圧ＤＥＡＥカラムに前記透析された活性画分を適用すること、
（ｊ）前記低圧ＤＥＡＥカラムから溶出した１つ又は複数の活性画分を収集すること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、
（ｋ）サイズ排除カラムに前記低圧ＤＥＡＥカラムから溶出した前記活性画分を適用すること、及び
（ｌ）前記サイズ排除カラムから前記活性画分を溶出させること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
医薬組成物が血清アルブミンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２５】
血清アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
ヒト血清アルブミンが前記組成物の重量に対して約１重量％から約１０重量％の濃度で存在する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
ヒト血清アルブミンが前記組成物の重量に対して約２重量％から約４重量％の濃度で存在する、請求項１２６に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年７月１５日に出願された米国特許出願第６０／４８７３３６号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、免疫応答を刺激するための組成物及び方法、並びに原発性腫瘍疾患、転移性腫瘍疾患及び感染症の予防及び治療に関する。さらに詳細には本発明は、アピコンプレックス関連タンパク質（ＡＰＳ）、フラグメント、その誘導体、ホモログ又は類似体を含む組成物、並びに免疫刺激、癌及び感染症の予防及び治療へのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２０００年における国立癌研究所のサーベイランス、疫学、及び最終結果（ＳＥＥＲ）のデータベース並びに統計局からの集団データに基づくと、米国では１．２２百万の新症例（男性６１９７００人、女性６００４００人）が浸潤癌と診断を受け、５５２２００人が癌で死亡した。Braunwald et al., HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE, l5thed., McGraw-Hill (2001), at pp 491を参照のこと。癌は、米国において依然として心疾患に次ぐ第２位の死因である。同文献。多くの資源及び尽力が、癌を予防及び治療する有効な方法を探求するのに投資されている。
【０００４】
小腸腫瘍
癌と同様に普及していることに、小腸の腫瘍は希少事象である（例えばJuckett & Rosenberg, (1988) Mech, Ageing Dev. 43:239-257参照）。数年にわたり、予備実験が腫瘍のないこの自然の環境の原因を判定する試みを報告した。しかし、結果は結論に達さず、研究は精力的には遂行されなかった。
【０００５】
他の消化管癌に比べて小腸癌による死亡が低い数字であることから、癌に対する小腸の顕著な抵抗性を実証できる。他の全ての癌と比べた小腸癌の比率はわずか０．００７１である。Parkin et al. eds (1997) Cancer Incidence in Five Continents, Vol. V (IARC Scientific Publications No. 143) Lyon, IARC。これは、調査した全ての年及び種々のコホート全てについてほぼ同じである（同文献）。小腸腫瘍の発生率は、死亡率と同じ傾向にも従う（Parkin et al., eds., (1997), Cancer Incidence in Five Continents, Vol. VII (IARC Scientific Publications No. 143) Lyon, IARC）。低い発生率は、人類について、全ての遺伝子プールについて、及び長期間にわたりほぼ普遍的にあてはまる。これは、ほぼ全ての他の哺乳動物種についてもあてはまると思われる（ヒツジの２品種は例外である可能性）。Lingeman et al., (1972), J. of the National Cancer Institute 48:325-346参照。
【０００６】
小腸の異常な性質に関する追加観察は、（主に長崎及び広島の）放射線が誘発する病気及び腸の遺伝病に関する研究に由来する。大線量の高エネルギー放射線は、骨髄細胞及び小腸の内側を覆っている上皮細胞の破壊によって死亡を引き起こす。これらの細胞は両方とも放射線によって容易に損傷又は破壊される。非致死線量の放射線を受けた被爆者では、その後になって骨髄の癌の発生率が正常な発生率よりもずっと高いが、小腸癌の発生率の増加はない。Shimizu et al. (1991), J. Radiat. Res. Supplement, 212-230を参照のこと。
【０００７】
遺伝病である家族性大腸ポリポージスにおいて、患者は大腸癌の疾病素因を有することが公知である。しかし、小腸癌の潜在性は、胃腸管全体にポリポーシスが出現している個体でさえも非常に低い。Lightdale et al., (1982), Small Intestine, in: Cancer epidemiology and Prevention (eds, Schottenfield et al.) W.B Saunders Co.を参照のこと。
【０００８】
最終的にかつ注目に値すべきことに、他の部位に生じた癌から小腸への転移の拡散は非常にまれである。これは、局所の癌から小腸を防御する何らかのメカニズムが、同様に他の大部分の癌の発生も遮断するよう作動していることを示唆している。
【０００９】
小腸中の、又は小腸の癌の発生率が非常に低いのは、自然の強固な事実であり、説明を是非とも必要とする。以上に記載した事実は、長い間公知であった。これらの事実は、多くの科学者を驚かせ、その原因を推測するよう彼らを刺激した。小腸腫瘍の低い発生率は、消化管器官の相対的サイズを原因とはできない。それは、ヒトにおいて小腸は、消化管の長さの９０％及び吸収表面積の９８％を構成しているからである（Gabos et al., (1993) International J. of Epidemiology 22:198-206）。これは、他の動物についても同様にあてはまる。低い発生率は、神経細胞及び筋細胞でそうであるような低い細胞ターンオーバ速度を原因とはできない。それは、小腸陰窩の上皮が身体の全ての器官の中で最も高いターンオーバ速度を有するからである。Potten及びLoeffler (1990, Development 110: 1001-1020)は、「マウスの回腸には約７．５×１０５個の陰窩が存在することから、回腸には３×１０６個と１．２×１０７個との間の幹細胞が存在するに違いない。よって、３年の寿命の間にマウス小腸では１０９回と１０１０回との間の幹細胞分裂が起こる。１０６回中約１回の自然突然変異率では、約１０３又は約１０４回、すなわち１日当たり約１〜１０回の自然突然変異が予想されよう。したがって、小腸に癌がまれにしか発生しないことは驚異的である。小腸が適切に理解されていないメカニズムによって防御されているにちがいないことは確実である。」と述べている。
【００１０】
Ashley及びWells (1988, Seminars in Oncology 15:116-128)は、小腸の防御状況に関する種々の推測を挙げた。それらには、ａ）内容物の流動性及び迅速な通過によって有害物質の曝露から防御されていること、ｂ）小腸内腔のアルカリ度、ｃ）高濃度の分泌性免疫グロブリン、ｄ）低い細菌濃度、並びにｅ）潜在的発癌物質を失活させうるヒドロキシラーゼの存在がある。Cairns (1975, Nature 255: 197-200)によって別のメカニズムが提案された。これは、陰窩下部の幹細胞として始まり、陰窩、次に絨毛の表面に沿って移動し、最終的に剥がれて管腔に入る上皮細胞の物理的移動を伴う。これは、いずれはさらに突然変異して形質転換細胞（癌）になりうる変異（異常）型幹細胞の蓄積を予防しうるであろう。これらの推測のいずれも証明されていない。
【００１１】
Bennettら(1951, Proceedings of Society for Experimental Biology 78: 790-791、以後「Bennett」と呼ぶ)による報告において、小腸は、腫瘍増殖を抑制する化学物質を含むことが示唆された。マウスの小腸細胞を抽出し、３画分、すなわち原料の低速遠心分離から生じるペレット（画分４）、高速遠心分離から生じるペレット（画分９０）、及びその上清（supernatant）に分離した。各画分と共にリンパ肉腫細胞を規定時間インキュベートし、両者をマウスに接種した。画分９０を用いたとき少数の動物しか腫瘍を発生しなかったが、上清及び画分４と共にインキュベートした細胞を用いたとき多数の動物が腫瘍を発生して死亡する結果となった。肝臓、脾臓及び筋肉からの類似の抽出物は、全く腫瘍の阻止を示さなかった。Bennettは、この試験により彼らの仮説は確認されたと結論した。Bennettは、さらなる試験において上清の活性が（ミクロソームを含有する）画分９０の成分の混入が原因であり、より注意深い調製により除去できることも示した。このように、上清自体は活性ではなかった。Bennettは、彼らが推定される活性の原因としてのタンパク質分解酵素を除去したことも述べた。
【００１２】
１９７０年代半ばに別のグループも小腸抽出物を試験し（Chan et al., 1975, J. of the British Society of Gastroenterology 16:50-52、以後「Chan」と呼ぶ）、Bennettの結果と異なる説明に至った。Chanは、小腸抽出物と共に腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした結果、動物に接種する前に細胞の死滅がもたらされたこと、その抽出物が腫瘍細胞と同様に正常細胞を死滅させること、及び活性が上清中ではなく主にミクロソーム画分に存在したと結論した。彼らは、上皮の酵素活性がこれらの観察結果の原因であったと示唆した。
【００１３】
Calman (1974, Gut 15: 552-554)による報告では、小腸における抗腫瘍効果は、無傷の免疫系の存在を必要とすることが示された。胸腺切除及び放射線は、腫瘍を小腸に移植できるようにすることが示された。同じ処置を受けたが、胸腺移植片で免疫系が再構成された動物では、腫瘍は小腸でもはや再び増殖しないであろう。両群において、腫瘍をうまく胃に移植することができた。このように、小腸の防御効果は、局所免疫系の強化に関係していると思われた。しかし、局所免疫系を制御する因子の探索は実施されなかった。
【００１４】
原生動物とそれらの宿主の免疫応答
寄生虫は、多種のくぐりぬけ戦略を進化させ、その戦略によって一次宿主中で生存し、環境中の、しばしば二次宿主中の通過を通常は必要とする一連の発育期を経て生活環を完了することが可能となっている。これらの戦略には、抗原の脱落、抗原の移動、細胞内での長期間生存、宿主細胞の生化学的性質の操作、多器官への感染、及び被嚢形成がある（例えばBeverley, (1996), Cell 87: 787-789; Zambrano-Villa et al., (2002), Trends in Parasitol. 18: 272-278を参照のこと）。そのようなメカニズムは、進化圧により微調整され、原生動物が宿主免疫応答を回避するのを助ける。原生動物は、これらの回避メカニズムに非常に専門化しているため、１つの宿主の種又は属の中でのみ生活環を完了できる場合が多い。
【００１５】
アピコンプレックスは、動物の胞子形成性単細胞寄生虫であり、マラリア、コクシジウム症、赤尿症、コリドー病、東海岸熱、及び胆汁熱のような種々の疾患を引き起こす種がある。アピコンプレックス門の４つの主なクラスは、コクシジウム綱（Coccidia）（属には例えばベスノイチア（Besnoitia）、カリオスポラ（Caryospora）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、アイメリア（Eimeria）、フレンケリア（Frenkelia）、ハモンディア（Hammondia）、ヘパトゾーン（Hepatozoon）、イソスポラ（Isospora）、ランケステレラ（Lankesterella）、ネオスポラ（Neospora）、サルコシスティス（Sarcocystis）、及びトキソプラズマ（Toxoplasma）がある）、グレガリナ亜綱（Gregarinia）（属には、例えばグレガリナ、モノシスティス（Monocystis）、オフリオシスティス（Ophriocystis）、及びシュードモノシスティス（Pseudomonocystis）がある）、ヘモスポリダ目（Haemosporida）又は住血胞子虫類（haemosporidian）（属には例えばヘモプロテウス（Haemoproteus）、ヘパトシスチス（Hepatocystis）、及びプラスモディウム（Plasmodium）がある）、及びピロプラスマ目（Piroplasmida）又はピロプラスミド（Piroplasmids）（属には例えばバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）、シトークスゾーン（Cytauxzoon）、及びタイレリア（Theileria）がある）である。ヒトに感染する７種が同定された（プラスモジウム、バベシア、クリプトスポリジウム、イソスポラ、シクロスポラ（Cyclospora）、サルコシスティス、及びトキソプラズマ）。
【００１６】
アピコンプレックスをよく表している特徴は、生物の頂端と呼ばれる一端にみられる一群のオルガネラである。この「頂端複合構造」には、ミクロネーム及びロプトリーとして知られている分泌オルガネラ、微小管からなる極輪、並びに一部の種では極輪内に存在するコノイドがある。生活環のいくつかの時点で、アピコンプレックスのメンバーは、宿主細胞に侵入又は付着する。頂端オルガネラは、これらの宿主寄生体相互作用に役割を果たす。
【００１７】
２、３のアイメリア種は、ある動物において重度の罹患と時に死亡を引き起こすことが公知である。特に、Ｅ．テネラ（E. tenella）、Ｅ．アセルブリナ（E. acervulina）及びＥ．マキシマ（E. maxima）は、養鶏産業における問題である。ストレス及び密集状態は、アイメリア感染症を増悪し、重い下痢及び死亡を引き起こす。同様の問題が、ウシ畜産業で起こり場合があり、子ウシ同士の密集が重症の疾患をもたらしうる。成動物は、通常はアイメリアに対する免疫をもっているが、大部分の脊椎動物では無症状低感染が地域流行する。最初の曝露の際に動物における短期の体液性免疫応答が報告された（Faber et al., (2002), Vet. Parasitol. 104: 1-17; Allen & Fetterer, (2002), Clin. Microbiol. Rev. 15: 58-65; Rose, (1987), Eimeria, Isopora, and Cryptosporidium, in: Immune Responses in Parasitic ＩＦＮections: Immunology, Immunopathology, and Immuneoprophylaxis (ed. E.J.L. Soulsby) pp275-230）が、これは、宿主の生涯にわたり持続する防御を供すると思われる局所細胞性免疫応答に置き換わる。この防御の正確なメカニズムは完全には知られておらず、生活環の爆発的増殖を受けずに低レベルの生物がなぜ生存するかは、謎のままである。
【００１８】
Aliberti et al. (2003, Nature Immunology 4(5): 485-490)は、トキソプラズマゴンディー（Toxoplasma gondii）のシクロフィリンの（プロフィリンドメインを含まない）アイソフォームである精製タンパク質Ｃ−１８は、樹状細胞（ＤＣ）からのインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の生成を刺激できることを示した。しかし、組換えＴ．ゴンディーＣ−１８は、Ｔ．ゴンディーのタキゾイト粗抽出物（ＳＴＡｇ）に比べて低下したＩＬ−１２刺激活性を示した。
【００１９】
スポロゾイト１９ｋＤ抗原
アイメリアに対するワクチン接種は、家禽及びより少ない程度にウシの畜産における実質的な研究主題である。化学的予防は、養鶏業における標準的な治療であるが、アイメリアの耐性株は問題となり始めている。ワクチンの開発は、代替法とみなされ、小腸上皮層に侵入する時期であるスポロゾイト期からの表面抗原の使用に焦点を当てている（例えばAllen & Fetterer, (2002), Clin. Microbiol. Rev. 15: 58-65; Blackman & Bannister, (2001), Mol. Biochem. Parasitol. 117: 11-25; Min et al., (2001), Vaccine 20:267-274参照）。メロゾイト表面抗原も関心対象であり、それはこの時期の原生動物が、第１ラウンドの倍加後に放出され、隣接細胞に感染するからである。このプロセスの間に有効な免疫応答が感染拡大を制限しうるであろう。
【００２０】
ワクチンとしての使用について最終的に調査された表面分子の１つが、Ｅ．アセルブリナのｃＤＮＡ発現ライブラリーから数回単離された。それは、もともとJenkinsら（1988, Exp. Parasitol. 66: 96-107）によってアセルブリナの膜に対して作製されたウサギ抗体によって検出される少量の表面タンパク質（クローンｃＳＺ−１）として同定された。しかし、感染しているニワトリからの血清はそれと反応しなかった。彼らはウエスタンブロットで２４０及び１６０ｋＤに２本のバンドを確認し、大腸菌で作られたβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質がＴ細胞の分割を活性化できたことを示した。続いて、別のグループ（Laurent et al., (1994), Mol. Bioch. Parasitol. 63: 79-86）は、１Ｐと呼ばれる１９ｋＤ表面タンパク質が３つの家禽アイメリア種の間で保存されており、JenkinsらのｃＳＺ−１クローンと同じｃＤＮＡ配列を共有することを報告し、ヨウ素化は以前の研究で変則的に高分子量を与えた可能性があることを示唆した。彼らのクローンのヌクレオチド配列は、「１９ｋＤスポロゾイト抗原」（アクセッション番号Ｚ２６５８４）の名前でGenbankに寄託された。ごく最近、Lillehojら（2000, Avian Diseases 44: 379-389）は、ｃＤＮＡクローン（３−１Ｅ）からＥ．アセルリナのメロゾイト（アクセッション番号Ｚ２６５８４）に対するウサギ抗血清と反応するわずかに長いタンパク質リーディングフレームを単離した。翻訳物は、Ｎ末端での追加のアミノ酸１７個を含むが、分子の残りは、事実上同一であった。彼らは、Ｅ．アセルブリナを２回攻撃感染させたニワトリから単離され、その後そのタンパク質に曝露された脾臓細胞からのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＦＮγ生成を示すことによって、３−１Ｅタンパク質が細胞性免疫を活性化したことを実証した。彼らは、アイメリアからのコクシジウム症を予防するための適度に有効なワクチンとしてそのタンパク質を使用できることも示した。このグループは、ＤＮＡワクチンとしてそのヌクレオチド配列を使用するこの潜在性を探求し続けている（Song, et al., (2001), Vaccine 19: 234-252; Min, et al., (2001), Vaccine 20: 267-274）。唯一の薬剤としてＤＮＡワクチンは、攻撃感染からの部分防衛のみを発生した。種々のニワトリサイトカイン遺伝子を有するプラスミドの添加は、いくらか改善を供したが、依然として２分の１未満にはオーシスト産生を低下させなかった。
【００２１】
本明細書における参照の引用又は論考を、それらが本発明の従来技術であるとの容認として解釈してはならない。
【非特許文献１】Braunwald et al., HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE, l5th ed., McGraw-Hill (2001), pp 491
【非特許文献２】Juckett & Rosenberg, (1988) Mech, Ageing Dev. 43:239-257
【非特許文献３】Parkin et al. eds (1997) Cancer Incidence in Five Continents, Vol. V (IARC Scientific Publications No. 143) Lyon, IARC
【非特許文献４】Parkin et al., eds., (1997), Cancer Incidence in Five Continents, Vol. VII (IARC Scientific Publications No. 143) Lyon, IARC
【非特許文献５】Lingeman et al., (1972), J. of the National Cancer Institute 48:325-346
【非特許文献６】Shimizu et al. (1991), J. Radiat. Res. Supplement, 212-230
【非特許文献７】Lightdale et al., (1982), Small Intestine, in: Cancer epidemiology and Prevention (eds, Schottenfield et al.) W.B Saunders Co.
【非特許文献８】Gabos et al., (1993) International J. of Epidemiology 22:198-206
【非特許文献９】Potten and Loeffler (1990, Development 110: 1001-1020)
【非特許文献１０】Ashley and Wells (1988, Seminars in Oncology 15: 116-128)
【非特許文献１１】Cairns (1975, Nature 255: 197-200)
【非特許文献１２】Bennett et al.(1951, Proceedings of Society for Experimental Biology 78: 790-791)
【非特許文献１３】Chan et al., 1975, J. of the British Society of Gastroenterology 16: 50-52
【非特許文献１４】Calman (1974, Gut 15: 552-554)
【非特許文献１５】Beverley, (1996), Cell 87: 787-789
【非特許文献１６】Zambrano-Villa et al., (2002), Trends in Parasitol. 18: 272-278
【非特許文献１７】Faber et al., (2002), Vet. Parasitol. 104: 1-17
【非特許文献１８】Allen & Fetterer, (2002), Clin. Microbiol. Rev. 15: 58-65
【非特許文献１９】Rose, (1987), Eimeria, Isopora, and Cryptosporidium, in:  Immune Responses in Parasitic ＩＦＮections: Immunology, Immunopathology, and Immuneoprophylaxis (ed. E.J.L. Soulsby) pp275-230
【非特許文献２０】Aliberti et al. (2003, Nature Immunology 4(5): 485-490)
【非特許文献２１】Blackman & Bannister, (2001), Mol. Biochem. Parasitol. 117: 11-25
【非特許文献２２】Min et al., (2001), Vaccine 20: 267-274
【非特許文献２３】Jenkins et al. (1988, Exp. Parasitol. 66: 96-107)
【非特許文献２４】Laurent et al., (1994), Mol. Bioch. Parasitol. 63: 79-86
【非特許文献２５】Lillehojら(2000, Avian Diseases 44: 379-389)
【非特許文献２６】Song, et al., (2001), Vaccine 19: 234-252
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本明細書に使用する「単離された」という用語は、参照された物質がその天然環境、例えば細胞から取り出されたことを意味する。このように単離された生物学的物質は、細胞成分、すなわちその天然物質が自然に存在する細胞の成分（例えば細胞質成分又は膜成分）の一部又は全てを含まない場合がある。核酸分子の場合、単離された核酸にはＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又は制限フラグメントがある。別の実施形態において、単離された核酸は好ましくはその核酸が見出されうる染色体から切り出され、さらに好ましくは非コード領域ともはや結合しておらず隣接もしない（が、その天然調節領域又はその部分とは結合しうる）。さらに、染色体で見られたとき単離された核酸分子に含まれる遺伝子の上流又は下流に位置する他の遺伝子と結合しておらず隣接もしない。なお別の実施形態において、単離された核酸は１つ又は複数のイントロンを欠如している。単離された核酸分子には、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列、すなわちその核酸分子がキメラ組換え核酸コンストラクトの一部を形成するときの配列がある。このように具体的な実施形態において、組換え核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質は、他のタンパク質若しくは核酸、又はその両方と会合できる。単離されたタンパク質は、それらと細胞中で会合するか、又は単離されたタンパク質が膜関連タンパク質ならば、細胞膜と会合する。単離されたオルガネラ、細胞、又は組織は、生物においてそれが見出される解剖学的部位から取り出される。単離された物質を精製してもよいが、精製する必要はない。
【００２３】
タンパク質又は核酸に関して「精製された」という用語は、熟練者が所望の目的のために精製された物質を使用するのに足る程度に混入物から所望の物質を分離することを指す。好ましくはこれは、少なくとも１オーダ高い精製が達成されたこと、さらに好ましくは２又は３オーダ高い、最も好ましくは４又は５オーダ高い出発物質又は天然物質の精製が達成されたことを意味する。具体的な実施形態において精製されたＡＲＰは、総タンパク質又は核酸に対して、場合によってはその重量に対して少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％である。具体的な実施形態において、精製されたＡＲＰは、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動又はアガロースゲル電気泳動によってアッセイするとき均質となるまで精製されている。
【００２４】
本発明は、動物における疾患を治療又は予防する方法を提供し、その方法は、その動物に薬学的有効量の医薬組成物を投与することを含み、その医薬組成物は、その動物にタンパク質を供給し、そのタンパク質は、デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０の配列と少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有し、且つそのタンパク質は免疫刺激活性を有する。本発明は、タンパク質、そのタンパク質をコードする核酸、又はそのタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトされた細胞として動物にそのタンパク質を供給する医薬組成物もさらに提供する。
【００２５】
本発明は、（ａ）配列番号１を含む単離されたタンパク質、（ｂ）配列番号２を含む単離されたタンパク質、（ｃ）配列番号２８を含む単離されたタンパク質、（ｄ）配列番号３０を含む単離されたタンパク質、（ｅ）配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質、（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結する）として動物にタンパク質を供給する医薬組成物をその動物に投与することを含む、動物における癌を治療又は予防する方法を提供する。
【００２６】
本発明は、医薬組成物が、（ａ）（１）アイメリアに感染している組織若しくは細胞の細胞抽出物を作製する段階、（２）上清を作製するためにその細胞抽出物を遠心分離する段階、（３）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによってその上清を分画し、且つそのペレットを溶液に再懸濁する段階、（４）ＨＩＣカラムにその溶液を適用する段階、（５）溶出した物質を作製するために、ＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させる段階、（６）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するためにその溶出した物質を透析する段階、（７）ＤＥＡＥカラムにその試料を適用する段階、（８）溶出した画分を作製するためにＤＥＡＥカラムに結合した物質を緩衝液で溶出させ、且つその溶出した画分を濃縮する段階、（９）サイズ排除カラムにその濃縮され溶出した画分を適用する段階、（１０）そのサイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールする段階、（１１）カルシウム結合タンパク質を除去するためにＨＩＣカラムにそのプールされた画分を適用する段階、（１２）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムにＨＩＣカラムから溶出した画分を適用し、且つ活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（１３）その活性画分を透析する段階、並びに（１４）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムにその透析された活性画分を適用し、且つ１つ若しくは複数の活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、（ｂ）組換え発現されたタンパク質、（ｃ）上記（ａ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は（ｄ）上記（ａ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）として動物にタンパク質を供給する、癌を治療又は予防する方法を提供する。
【００２７】
本発明は、（ａ）精製されたアピコンプレックス門生物若しくはアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製する段階、（ｂ）ペレットを得るためにそのホモジネートを遠心分離する段階、（ｃ）ホスホリパーゼを含む溶液でそのペレットを処理する段階、（ｄ）上清を得るためにその溶液を遠心分離する段階、（ｅ）逆相ＨＰＬＣカラムにその上清を適用する段階、及び（ｆ）溶出したタンパク質を作製するために、その逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階を含む工程の生成物である単離されたタンパク質である医薬組成物を含む、癌を治療又は予防する方法を提供し、前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞は前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである。
【００２８】
本発明は、（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質、（ｂ）それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対する保存的アミノ酸置換のみを有する、配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０のいずれか１つの変異体を含む単離されたタンパク質、（ｃ）それぞれ配列番号３、４、６又は７に対する保存的アミノ酸置換のみを有する、配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質、（ｄ）ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質、（ｅ）低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたアピコンプレックス門タンパク質、（ｆ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたアピコンプレックス門タンパク質、（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、（ｈ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）として動物にタンパク質を供給する医薬組成物をその動物に投与することを含む、動物における癌を治療又は予防する方法を提供し、前記医薬組成物は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである。
【００２９】
本発明は、（ａ）配列番号１を含む単離されたタンパク質、（ｂ）配列番号２を含む単離されたタンパク質、（ｃ）配列番号２８を含む単離されたタンパク質、（ｄ）配列番号３０を含む単離されたタンパク質、（ｅ）配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質、（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）として動物にタンパク質を供給する医薬組成物をその動物に投与することを含む、動物における感染症を治療又は予防する方法を提供する。
【００３０】
本発明は、（ａ）（１）アイメリアに感染している組織若しくは細胞の細胞抽出物を作製する段階、（２）上清を作製するためにその細胞抽出物を遠心分離する段階、（３）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによってその上清を分画し、且つそのペレットを溶液に再懸濁する段階、（４）ＨＩＣカラムにその溶液を適用する段階、（５）溶出した物質を作製するために、そのＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させる段階、（６）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するためにその溶出した物質を透析する段階、（７）ＤＥＡＥカラムにその試料を適用する段階、（８）溶出した画分を作製するためにそのＤＥＡＥカラムに結合した物質を緩衝液で溶出させ、且つその溶出した画分を濃縮する段階、（９）サイズ排除カラムにその濃縮され溶出した画分を適用する段階、（１０）そのサイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールする段階、（１１）カルシウム結合タンパク質を除去するためにＨＩＣカラムにそのプールされた画分を適用する段階、（１２）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムにそのＨＩＣカラムから溶出した画分を適用して活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（１３）その活性画分を透析する段階、並びに（１４）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムにその透析された活性画分を適用し、且つ１つ若しくは複数の活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、（ｂ）組換え発現されたタンパク質、（ｃ）上記（ａ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は（ｄ）上記（ａ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）として医薬組成物が動物にタンパク質を供給する、感染症を治療又は予防する方法を提供する。
【００３１】
本発明は、（ａ）精製されたアピコンプレックス門生物若しくはアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製する段階、（ｂ）ペレットを得るためにそのホモジネートを遠心分離する段階、（ｃ）ホスホリパーゼを含む溶液でそのペレットを処理する段階、（ｄ）上清を得るためにその溶液を遠心分離する段階、（ｅ）逆相ＨＰＬＣカラムにその上清を適用する段階、及び（ｆ）溶出したタンパク質を作製するためにその逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階を含む工程の生成物である単離されたタンパク質である医薬組成物を含む、感染症を治療又は予防する方法を提供し、前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞は前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである。
【００３２】
本発明は、（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質、（ｂ）それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対する保存的アミノ酸置換のみを有する、配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０のいずれか１つの変異体を含む単離されたタンパク質、（ｃ）それぞれ配列番号３、４、６又は７に対する保存的アミノ酸置換のみを有する、配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質、（ｄ）ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質、（ｅ）低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたアピコンプレックス門タンパク質、（ｆ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたアピコンプレックス門タンパク質、（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、（ｈ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）として動物にタンパク質を供給する医薬組成物をその動物に投与することを含む、動物における感染症を治療又は予防する方法を提供し、前記医薬組成物は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである。
【００３３】
本発明は、癌を治療又は予防する方法を提供し、その方法は、そのような治療又は予防が望ましい対象に、（ａ）配列番号１を含む単離されたタンパク質（Ｅ．テネラのＡＲＰ）、（ｂ）配列番号２を含む単離されたタンパク質（Ｅ．アセルブリナのＡＲＰ）、（ｃ）配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質（ウシアイメリア種ＡＲＰの部分アミノ酸配列）、（ｄ）配列番号２８を含む単離されたタンパク質（クローンＥ１のＡＲＰ）、（ｅ）配列番号３０を含む単離されたタンパク質（クローンＥ１薬物生成物のＡＲＰ）からなる群から選択される治療又は予防的に有効量の物質を投与することを含む。配列番号３〜７は、必ずしも隣接せず、各フラグメントに介入配列又は隣接配列が存在しうる。好ましくはタンパク質は、配列番号３から配列番号７の順にＮ末端からＣ末端に配列番号３、４、５、６及び７を含む、（ｆ）（１）アイメリアに感染している組織又は細胞の細胞抽出物を作製する段階、（２）上清を作製するためにその細胞抽出物を遠心分離する段階、（３）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによってその上清を分画し、且つそのペレットを溶液に再懸濁する段階、（４）疎水性相互作用（以下「ＨＩＣ」と記載）カラムにその溶液を適用する段階、（５）溶出した物質を作製するためにそのＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させる段階  、（６）ジエチルアミノエチル（以下「ＤＥＡＥ」と記載）カラムに負荷するための試料を作製するために、その溶出した物質を透析する段階、（７）ＤＥＡＥカラムにその試料を適用する段階、（８）溶出した画分を作製するために緩衝液でそのＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させ、且つその溶出した画分を濃縮する段階、（９）サイズ排除カラムにその濃縮され溶出した画分を適用する段階、（１０）そのサイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールする段階、（１１）カルシウム結合タンパクを除去するためにＨＩＣカラムにそのプールされた画分を適用する段階、（１２）高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」と記載）ＨＩＣカラムにそのＨＩＣカラムから溶出した画分を適用し、且つ活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞はその能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（１３）その活性画分を透析する段階、並びに（１４）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムにその透析された活性画分を適用し、且つ１つ若しくは複数の活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、（ｇ）（１）精製されたアピコンプレックス門生物又はアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製する��階、（２）ペレットを得るためにそのホモジネートを遠心分離する段階、（３）ホスホリパーゼを含む溶液でそのペレットを処理する段階、（４）上清を得るためにその溶液を遠心分離する段階、（５）逆相ＨＰＬＣカラムにその上清を適用する段階、及び（６）溶出したタンパク質を作製するためにその逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力（免疫刺激能）を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、（ｆ）上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、並びに（ｈ）上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）からなる群から選択される、治療又は予防有効量の物質を投与することを含む。
【００３４】
本発明は、癌を治療又は予防する方法も提供し、その方法は、そのような治療又は予防が望ましい対象に、（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質、（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０の変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、（ｃ）配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、（ｄ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０の配列と少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％の同一性を含む単離されたタンパク質、（ｅ）ＰＲＯＦ（プロフィリング）ドメインを含む単離されたタンパク質、（ｆ）低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたアピコンプレックス門タンパク質、（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、（ｈ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）からなる群から選択される、治療又は予防有効量の物質を投与することを含み、前記物質は、免疫刺激能、例えば樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は、前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである。
【００３５】
本発明は、感染症を治療又は予防する方法も提供し、前記感染症はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はアイメリア属生物の感染によって引き起こされず、その方法は、そのような治療又は予防が望ましい対象に、（ａ）配列番号１を含む単離されたタンパク質（Ｅ．テネラのＡＲＰ）、（ｂ）配列番号２を含む単離されたタンパク質（Ｅ．アセルブリナのＡＲＰ）、（ｃ）配列番号２８を含む単離されたタンパク質（クローンＥ１のＡＲＰ）、（ｄ）配列番号３０を含む単離されたタンパク質（クローンＥ１薬物生成物のＡＲＰ）、（ｅ）配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質（ウシアイメリア種ＡＲＰの部分アミノ酸配列）、（ｆ）（１）アイメリアに感染している組織又は細胞の細胞抽出物を作製する段階、（２）上清を作製するためにその細胞抽出物を遠心分離する段階、（３）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによってその上清を分画し、且つそのペレットを溶液に再懸濁する段階、（４）その溶液をＨＩＣカラムに適用する段階、（５）溶出した物質を作製するためにそのＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させる段階  、（６）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するためにその溶出した物質を透析する段階、（７）ＤＥＡＥカラムにその試料を適用する段階、（８）溶出した画分を作製するために緩衝液でそのＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させ、且つその溶出した画分を濃縮する段階、（９）サイズ排除カラムにその濃縮され溶出した画分を適用する段階、（１０）そのサイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールする段階、（１１）カルシウム結合タンパクを除去するためにＨＩＣカラムにそのプールされた画分を適用する段階、（１２）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムにそのＨＩＣカラムから溶出した画分を適用し、且つ活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞はその能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（１３）その活性画分を透析する段階、及び（１４）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムにその透析された活性画分を適用し、且つ１つ又は複数の活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、（ｇ）（１）精製されたアピコンプレックス門生物の、又はアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製する段階、（２）ペレットを得るためにそのホモジネートを遠心分離する段階、（３）ホスホリパーゼを含む溶液でそのペレットを処理する段階、（４）上清を得るためにその溶液を遠心分離する段階、（５）逆相ＨＰＬＣカラムにその上清を適用する段階、及び（６）溶出したタンパク質を作製するためにその逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力（免疫刺激能）を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、（ｉ）上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかをコードする単離された核酸、並びに（ｉ）上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）からなる群から選択される、治療又は予防有効量の物質を投与することを含む。
【００３６】
本発明は、感染症を治療又は予防する方法を提供し、前記感染症はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はアピコンプレックス門生物の感染によって引き起こされず、その方法は、そのような治療又は予防が望ましい対象に、（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質、（ｂ）配列番号１又は配列番号２の変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、（ｃ）配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、（ｄ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号１、又は配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０の配列と少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％の同一性を含む単離されたタンパク質、（ｅ）ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質、（ｆ）低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたアピコンプレックス門タンパク質、（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、（ｈ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）からなる群から選択される、治療又は予防有効量の物質を投与することを含み、前記物質は免疫刺激能、例えば樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである。
【００３７】
本発明は、免疫応答を刺激する方法も提供し、その方法は、対象が鳥類種ではなく、且つヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）にも感染していないことを条件として、その対象に、（ａ）配列番号１を含む単離されたタンパク質（Ｅ．テネラのＡＲＰ）、（ｂ）配列番号２を含む単離されたタンパク質（Ｅ．アセルブリナのＡＲＰ）、（ｃ）配列番号２８を含む単離されたタンパク質（クローンＥ１のＡＲＰ）、（ｄ）配列番号３０を含む単離されたタンパク質（クローンＥ１薬物生成物のＡＲＰ）、（ｅ）配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質（ウシアイメリア種ＡＲＰの部分アミノ酸配列）、（ｆ）（１）アイメリアに感染している組織又は細胞の細胞抽出物を作製する段階、（２）上清を作製するためにその細胞抽出物を遠心分離する段階、（３）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによってその上清を分画し、且つそのペレットを溶液に再懸濁する段階、（４）その溶液をＨＩＣカラムに適用する段階、（５）溶出した物質を作製するためにそのＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させる段階、（６）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するためにその溶出した物質を透析する段階、（７）ＤＥＡＥカラムにその試料を適用する段階、（８）溶出した画分を作製するために緩衝液でそのＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させ、且つその溶出した画分を濃縮する段階、（９）サイズ排除カラムにその濃縮され溶出した画分を適用する段階、（１０）そのサイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールする段階、（１１）カルシウム結合タンパクを除去するためにＨＩＣカラムにそのプールされた画分を適用する段階、（１２）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムにそのＨＩＣカラムから溶出した画分を適用し、且つ活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞はその能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（１３）その活性画分を透析する段階、及び（１４）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムにその透析された活性（免疫刺激性）画分を適用し、且つ１つ又は複数の活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、（ｇ）（１）精製されたアピコンプレックス門生物の、又はアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製する段階、（２）ペレットを得るためにそのホモジネートを遠心分離する段階、（３）ホスホリパーゼを含む溶液でそのペレットを処理する段階、（４）上清を得るためにその溶液を遠心分離する段階、（５）逆相ＨＰＬＣカラムにその上清を適用する段階、及び（６）溶出したタンパク質を作製するためにその逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出��せる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力（免疫刺激能）を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、（ｈ）上記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、並びに（ｉ）上記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）からなる群から選択される有効量の物質を投与することを含む。
【００３８】
本発明は、免疫応答を刺激する方法も提供し、その方法は、対象がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染していないことを条件として、その対象に、（ａ）配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質、（ｂ）（１）鳥類種に自然感染しないアイメリアに感染している組織又は細胞の細胞抽出物を作製する段階、（２）上清を作製するためにその細胞抽出物を遠心分離する段階、（３）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによってその上清を分画し、且つそのペレットを溶液に再懸濁する段階、（４）その溶液をＨＩＣカラムに適用する段階、（５）溶出した物質を作製するためにそのＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させる段階  、（６）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するためにその溶出した物質を透析する段階、（７）ＤＥＡＥカラムにその試料を適用する段階、（８）溶出した画分を作製するために緩衝液でそのＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させ、且つその溶出した画分を濃縮する段階、（９）サイズ排除カラムにその濃縮され溶出した画分を適用する段階、（１０）そのサイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールする段階、（１１）カルシウム結合タンパクを除去するためにＨＩＣカラムにそのプールされた画分を適用する段階、（１２）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムにそのＨＩＣカラムから溶出した画分を適用し、且つ活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞はその能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（１３）その活性画分を透析する段階、及び（１４）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムにその透析された活性画分を適用し、且つ１つ又は複数の活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、（ｃ）（１）精製されたアピコンプレックス門生物の、又はアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製する段階、（２）ペレットを得るためにそのホモジネートを遠心分離する段階、（３）ホスホリパーゼを含む溶液でそのペレットを処理する段階、（４）上清を得るためにその溶液を遠心分離する段階、（５）逆相ＨＰＬＣカラムにその上清を適用する段階、及び（６）溶出したタンパク質を作製するためにその逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力（免疫刺激能）を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、並びに（ｅ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）からなる群から選択される有効量の物質を投与することを含む。
【００３９】
本発明は、免疫応答を刺激する方法も提供し、その方法は、対象が鳥類種ではなく、且つヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染していないことを条件として、その対象に、（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質、（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０の変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、（ｃ）配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、（ｄ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０の配列と少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％の同一性を含む単離されたタンパク質、（ｅ）ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質、（ｆ）低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたアピコンプレックス門タンパク質、（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、（ｈ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）からなる群から選択される有効量の物質を投与することを含み、前記物質は免疫刺激能、例えば樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである。
【００４０】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染していていない対象におけるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の全身レベルを上昇させる方法を提供し、その方法は、ＩＬ−１２レベルのそのような上昇が望ましい前記対象に、（ａ）配列番号１を含む単離されたタンパク質、（ｂ）配列番号２を含む単離されたタンパク質、（ｃ）配列番号２８を含む単離されたタンパク質、（ｄ）配列番号３０を含む単離されたタンパク質、（ｅ）配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質、（ｆ）（１）アイメリアに感染している組織又は細胞の細胞抽出物を作製する段階、（２）上清を作製するためにその細胞抽出物を遠心分離する段階、（３）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによってその上清を分画し、且つそのペレットを溶液に再懸濁する段階、（４）その溶液をＨＩＣカラムに適用する段階、（５）溶出した物質を作製するためにそのＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させる段階  、（６）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するためにその溶出した物質を透析する段階、（７）ＤＥＡＥカラムにその試料を適用する段階、（８）溶出した画分を作製するために緩衝液でそのＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させ、且つその溶出した画分を濃縮する段階、（９）サイズ排除カラムにその濃縮され溶出した画分を適用する段階、（１０）そのサイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールする段階、（１１）カルシウム結合タンパクを除去するためにＨＩＣカラムにそのプールされた画分を適用する段階、（１２）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムにそのＨＩＣカラムから溶出した画分を適用し、且つ活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（１３）その活性画分を透析する段階、及び（１４）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムにその透析された活性画分を適用し、且つ１つ又は複数の活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、（ｇ）（１）精製されたアピコンプレックス門生物の、又はアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製する段階、（２）ペレットを得るためにそのホモジネートを遠心分離する段階、（３）ホスホリパーゼを含む溶液でそのペレットを処理する段階、（４）上清を得るためにその溶液を遠心分離する段階、（５）逆相ＨＰＬＣカラムにその上清を適用する段階、及び（６）溶出したタンパク質を作製するためにその逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力（免疫刺激能）を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、（ｈ）上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、並びに（ｉ）上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）からなる群から選択される有効量の物質を投与することを含む。
【００４１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染していない対象におけるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の全身レベルを上昇させる方法も提供し、その方法は、そのようなＩＬ−１２レベルの上昇が望ましい対象に、（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質、（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０の変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、（ｃ）配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、（ｄ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０の配列と少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％の同一性を含む単離されたタンパク質、（ｅ）ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質、（ｆ）低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたアピコンプレックス門タンパク質、（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、（ｈ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）からなる群から選択される有効量の物質を投与することを含み、前記物質は免疫刺激能、例えば樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである。
【００４２】
本発明は、組換え細胞に発現されたＡＲＰタンパク質を抽出する方法も提供し、その方法は、（ａ）前記宿主細胞の抽出物を作製すること、（ｂ）上清を作製するためにその宿主細胞の抽出物を遠心分離すること、（ｃ）タンパク質を沈殿させるために硫酸アンモニウムによってその上清を分画すること、（ｄ）ペレットを得るためにその沈殿を遠心分離すること、（ｅ）そのペレットを溶液に再懸濁すること、（ｆ）低圧疎水性相互作用カラムにその溶液を適用すること、（ｇ）その低圧疎水性相互作用カラムから溶出した活性画分を収集すること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（ｈ）その低圧疎水性相互作用カラムから溶出した活性画分を透析すること、（ｉ）低圧ＤＥＡＥカラムにその透析された活性画分を適用すること、（ｊ）その低圧ＤＥＡＥカラムから溶出した１つ又は複数の活性画分を収集すること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（ｋ）サイズ排除カラムにその低圧ＤＥＡＥカラムから溶出した活性画分を適用すること、及び（ｌ）そのサイズ排除カラムから活性画分を溶出させること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む。
【００４３】
本発明は、癌を治療又は予防する方法も提供し、その方法は、そのような治療又は予防が望ましい対象に、治療又は予防有効量の精製されたアピコンプレックス門生物又は精製されたアピコンプレックス門生物のタンパク質含有膜画分を投与することを含む。
【００４４】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はアイメリア属生物の感染によって引き起こされない感染症を治療又は予防する方法も提供し、その方法は、そのような治療又は予防が望ましい対象に、治療又は予防有効量の精製されたアピコンプレックス門生物又は精製されたアピコンプレックス門生物のタンパク質含有膜画分を投与することを含む。
【００４５】
本発明は、免疫応答を刺激する方法をさらに提供し、その方法は、対象がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しておらず、且つ鳥類種ではないことを条件として、その対象に治療又は予防有効量の精製されたアピコンプレックス門生物又は精製されたアピコンプレックス門生物のタンパク質含有膜画分を投与することを含む。
【００４６】
本発明は、（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む精製されたポリペプチド、（ｂ）配列番号３、４、５、６及び７を含む精製されたポリペプチド、（ｃ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号２９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、又は少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、並びに（ｄ）配列番号３、４、５、６及び７を含むアミノ酸配列の変異体を含む精製されたポリペプチドからなる群から選択される精製されたポリペプチドを提供し、前記変異体はそれぞれ配列番号３、４、５、６及び７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する。本発明は、治療有効量のそのポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【００４７】
本発明は、（ａ）アイメリアに感染している組織又は細胞の細胞抽出物を作製する段階、（ｂ）上清を作製するためにその細胞抽出物を遠心分離する段階、（ｃ）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによってその上清を分画し、且つそのペレットを溶液に再懸濁する段階、（ｄ）その溶液をＨＩＣカラムに適用する段階、（ｅ）溶出した物質を作製するためにそのＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させる段階、（ｆ）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するために、前記溶出した物質を透析する段階、（ｇ）ＤＥＡＥカラムにその試料を適用する段階、（ｈ）溶出した画分を作製するために緩衝液でそのＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させ、且つ前記溶出した画分を濃縮する段階、（ｉ）サイズ排除カラムにその濃縮され溶出した画分を適用する段階、（ｊ）そのサイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールする段階、（ｋ）カルシウム結合タンパクを除去するためにＨＩＣカラムにそのプールされた画分を適用する段階、（ｌ）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムにそのＨＩＣカラムから溶出した画分を適用し、且つ活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（ｍ）その活性画分を透析する段階、（ｎ）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムにその透析された活性画分を適用し、且つ１つ又は複数の活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む、ポリペプチドを単離する方法も提供する。ある実施形態において、ポリペプチドを製造する方法は、（ｏ）逆相ＨＰＬＣカラムに段階（ｎ）の活性画分を適用すること、及び（ｐ）溶出したタンパク質を作製するためにその逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させること（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力（免疫刺激能）を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）をさらに含む。本発明は、この工程の生成物である精製されたポリペプチドも提供する。本発明は、治療有効量のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
【００４８】
本発明は、（１）精製されたアピコンプレックス門生物の、又はアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製する段階、（２）ペレットを得るためにそのホモジネートを遠心分離する段階、（３）ホスホリパーゼを含む溶液でそのペレットを処理する段階、（４）上清を得るためにその溶液を遠心分離する段階、（５）逆相ＨＰＬＣカラムにその上清を適用する段階、及び（６）溶出したタンパク質を作製するためにその逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力（免疫刺激能）を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む、ポリペプチドを単離する方法をさらに提供する。本発明は、この工程の生成物である精製されたポリペプチドも提供する。本発明は、治療有効量のそのポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
【００４９】
本発明は、第１タンパク質に結合する抗体を提供し、その第１タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２６からなり、その抗体は第２タンパク質に結合せず、その第２タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号２からなる。具体的な実施形態において、その抗体は、モノクローナル抗体である。別の具体的な実施形態において、本発明は、前記抗体のフラグメントを有する分子を提供し、そのフラグメントは前記第１タンパク質と結合できる。
【００５０】
本発明は、（ａ）配列番号３、４、６又は７を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、（ｂ）配列番号３、４、５、６及び７を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、並びに（ｃ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号２９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、又は少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子からなる群から選択される単離された核酸を提供する。一実施形態において、その核酸は、精製されている。別の実施形態において、その核酸は、ベクターである。なお別の実施形態において、そのベクターは、前記ポリペプチドをコードする前記核酸配列に作動可能に連結しているプロモーターをさらに有する。
【００５１】
本発明は、発現ベクターを含む宿主細胞も提供し、前記発現ベクターは、ヌクレオチド配列に作動可能に連結しているプロモーターを有し、前記プロモーターは前記ヌクレオチド配列に関して非天然であり、前記ヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号３、４、６若しくは７を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号３、４、５、６及び７を含むポリペプチド、又は（ｃ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号２９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
【００５２】
一実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞である。なお別の実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞である。具体的な実施形態において、細菌細胞は大腸菌である。本発明は、ポリペプチドの製造方法をさらに提供し、その方法は、コードされるそのポリペプチドが細胞によって発現されるように前記細胞を増殖させること及びその発現されたポリペプチドを回収することを含む。具体的な実施形態において、発現されたポリペプチドは、（１）前記細胞の抽出物を作製する段階、（２）上清を作製するためにその細胞抽出物を遠心分離する段階、（３）タンパク質を沈殿させるために硫酸アンモニウムによってその上清を分画する段階、（４）ペレットを得るためにその沈殿を遠心分離する段階、（５）そのペレットを溶液に再懸濁する段階、（６）低圧カラムに前記溶液を適用する段階、（７）その低圧カラムから溶出した活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（８）その活性画分を透析する段階、（９）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムにその透析された活性画分を適用する段階、（１０）そのＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムから溶出した１つ又は複数の活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（１１）サイズ排除カラムにその活性画分を適用する段階、及び（１２）そのサイズ排除カラムからその活性（免疫刺激性）画分を溶出させる段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む方法によって回収される。
慣例と略語
ＡＲＰ              アピコンプレックス関連タンパク質（本発明の活性分子）
ＳＩＥ              小腸抽出物
ＢＥＸ              ウシ小腸抽出物
ＧＭ−ＣＳＦ        顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＩＬ２              インターロイキン２
ＩＬ１２            インターロイキン１２
ＩＦＮγ            インターフェロンガンマ
ＤＣ                樹状細胞
ＬＧＬ              大型顆粒リンパ球
ＮＫ又はＮＫ細胞    ナチュラルキラー細胞
ｎ＿ＮＫ            標的細胞に対するＮＫの比、ｎは接種比を表す
ＣＭＣ              細胞性細胞傷害性
ｓｐｐ．            所定の属の多様な種
ｃＤＮＡ            相補ＤＮＡ
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明は、原発性腫瘍疾患、転移性腫瘍疾患及び感染症の予防及び治療、対象における免疫応答の刺激、並びにインターロイキン１２（ＩＬ−１２）治療の代替としての使用のための組成物及び方法を提供する。詳細には本発明は、免疫刺激活性を有し、よって癌及び感染症の治療及び予防への、並びに免疫変調における用途を有するアピコンプレックス関連タンパク質（ＡＲＰ）を提供する。ＡＲＰを含む組成物を提供する。癌及び感染症の予防及び／又は治療のための、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）治療の代替として使用するための、並びに対象における免疫応答を誘発させるためのＡＲＰの使用方法も提供する。任意の理論に縛られずに、本発明は、アイメリアに感染したウシの小腸抽出物から精製された分子がアピコンプレックス門原生動物であるアイメリアアセルブリナの表面抗原（3-1E、Lellehoj et al., 2000, Avian Diseases 44: 379-389）と高度に相同であり、ピコモル濃度及びフェムトモル濃度レベルで樹状細胞の強健な活性化物質であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で種相互免疫刺激効果を有するという出願者らの発見に一部基づいている。
【００５４】
開示を明確にするためであるが、限定する目的ではなく、本発明の詳細な説明を以下の小節に分ける。
（ｉ）      ＡＲＰ
（ｉｉ）    精製されたアピコンプレックスのＡＲＰ
（ｉｉｉ）  ＡＲＰの誘導体及び類似体
（ｉｖ）    ＡＲＰ、誘導体及び類似体に対する抗体
（ｖ）      ＡＲＰの構造予測及び機能性分析
（ｖｉ）    ＡＲＰ活性のキャラクタリゼーション及び実証
（ｖｉｉ）  本発明の組成物の使用
（ｖｉｉｉ）他の抗癌療法
（ｉｘ）    他の抗感染剤
（ｘ）      投与計画
（ｘｉ）    投与、製剤及びキット
（ｘｉｉ）  製品
（ｘｉｉｉ）治療中の効果の監視
【００５５】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＲＰは、免疫刺激活性を有する、アピコンプレックス門生物のタンパク質だけでなく、そのフラグメント、誘導体、変異体、ホモログ又は類似体である。アピコンプレックス門生物は、アピコンプレックス門の生物の１つである。アピコンプレックス門生物の非限定的な例には、下記の表１に挙げられているものがある。具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰには、配列番号１（Ｅ．テネラのＡＲＰ）、配列番号２（Ｅ．アセルブリナのＡＲＰ）、及び配列番号３〜７を有するタンパク質（ウシアイメリア種ＡＲＰの部分アミノ酸配列。配列番号３〜７は、必ずしも隣接せず、各フラグメントに介入配列又は隣接配列が存在しうる。好ましくはタンパク質は、配列番号３から配列番号７の順にＮ末端からＣ末端への配列番号３、４、５、６及び７を含む）があるが、それに限定されない。
【００５６】
具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは、BLAST 2.0スイートプログラム（Altschul et al., Nucleic Acids Res, 2: 3389-3402, 1997）を使用してデフォルトパラメータを用いたBLASTアルゴリズムによって測定されるように、配列番号１又は配列番号２の配列と少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％の同一性を有する（アピコンプレックス門生物のゲノムにコードされる）アピコンプレックス門タンパク質であり、そのアピコンプレックス門タンパク質は、免疫刺激活性及び／又は抗癌活性を有する。例えば下記の第５．６節及び第１２．３節に記載されているようなアッセイによって、そのような（免疫刺激）活性を測定できる。具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは、天然アピコンプレックス門タンパク質である。いくつかの実施形態において、本発明のＡＲＰは、可溶型で存在する。いくつかの実施形態において、本発明のＡＲＰは、膜連結型として存在する。データベースの類似性検索のために使用できるBLASTファミリーのプログラムには、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリ配列のためのBLASTN、タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリ配列のためのBLASTX、タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリ配列のためのBLASTP、ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリ配列のためのTBLASTN、及びヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリ配列のためのTBLASTXがある。Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995を参照のこと。上記プログラムの新バージョン又は新しいプログラムが概して将来確実に入手できるようになるであろうが、それらを本発明に使用できる。デフォルトへのパラメータの調整を将来的に必要に応じ容易に変更できるものである。
【００５７】
具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは、保存されたＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含むタンパク質であり、そのタンパク質は免疫刺激活性及び／又は抗癌活性を有する。例えば下記の第５．６節及び第１２．３節に記載されているアッセイによって、そのような活性を測定できる。反復する配列パターン又はモチーフに基づいて、保存されたドメインは規定される。公知の保存されたドメインの検索を、例えばウェブサイトncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgiで行うことができる。一実施形態において、保存されたＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインは、Conserved Domain Database(CDD v.1.60)及びデフォルトパラメータに調整したRPS-BLAST（Reverse Position-Specific BLAST）アルゴリズムによって決定される。現行のＣＤＤデータベースは、２つの人気の高いコレクションであるSmart及びPfamn、並びにＮＣＢＩからの寄与から得られるドメインを含んでいる。Conserved Domain Databaseにおいて、ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインは、smart00392若しくはcd00148ドメイン、又はpfam00235ドメインとしても同定されている（ＰＳＳＭのＩｄ１４９８３、１４８２４及び８０１に相当）。タンパク質配列における保存されたドメインを同定するために、RPS-TBLASTアルゴリズムを使用できる。クエリ配列を、基本となる保存されたドメインのアラインメントから準備された位置特異的スコアマトリックスと比べる。クエリ配列と代表的なドメイン配列とのペア状のアラインメント、又は多重アラインメントとしてヒットを表示できる。Marchler-Bauer et al., (2003) Nucleic Acids Research 31:383-387 (2003); Marchler-Bauer et al., (2002) Nucleic Acids Research 30:281-283を参照のこと。これら全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。「ＰＲＯＦ」ドメインは、アメーバから哺乳動物までの生物に存在する、自然界に遍在するプロフィリンに代表される。プロフィリンは、アクチンの重合の調節に関与し、ホスファチジルイノシトールサイクル及びRas経路の構成要素と相互作用することによって、細胞骨格を主なシグナル伝達経路と連結させうる。例えば、Korenbaum et al., Biochemistry (1998) 37(26): 9274-83; Schluter et al., Biochim Biophys Acta. (1997) 1359(2): 97-109を参照のこと。これら全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは植物プロフィリン、例えば配列番号１１、１２、１３又は１４である。
【００５８】
具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは、アピコンプレックス門タンパク質であり、そのタンパク質がコードする核酸（アピコンプレックス門ｃＤＮＡ又はゲノム核酸）は、ストリンジェントな条件（高、中又は低ストリンジェント条件）で（例えば配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、又は配列番号２０に示される配列若しくはその逆相補体、又はＡＲＰ誘導体をコードする核酸若しくはその逆相補体を有する）ＡＲＰの核酸とハイブリダイズし、そのアピコンプレックス門タンパク質は、免疫刺激活性及び／又は抗癌活性を有する。例えば下記の第５．６節及び第１２．３節に記載されているようなアッセイによって、そのような活性を測定できる。ストリンジェントな条件は、例えば配列依存性及び環境依存性であり、例えば長い配列の方が高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの完璧なガイドは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)にみられる。Martin et al (EMBO J 4: 1625-1630 (1985))及びDavies et al (Methods in Molecular Biology Vol 28: Protocols for nucleic acid analysis by non-radioactive probes, Isaac, P.G. (ed) pp 9-15, Humana Press Inc., Totowa NJ, USA)も参照のこと。これら全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００５９】
具体的な実施形態において、低ストリンジェンシー条件下でＡＲＰの核酸又はその逆相補体にハイブリダイズ可能な核酸が提供される。非限定的な例として、そのような低ストリンジェンシー条件を用いる方法は以下のとおりである（Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6789-6792も参照）。３５％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％フィコール、１％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中でＤＮＡを含むフィルターを４０℃で６時間前処理する。以下のように修正した同溶液中でハイブリダイゼーションを行う：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストラン。５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを使用する。４０℃で１８〜２０時間ハイブリダイゼーション混液中でフィルターをインキュベートし、次に２×ＳＳＣ、２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．１％ＳＤＳを含む５５℃の溶液中で１．５時間洗う。洗液を新鮮溶液と交換し、６０℃でさらに１．５時間インキュベートする。フィルターを乾燥状態で転写させ、オートラジオグラフィーのために露出させる。必要ならば、３回目として６５〜６８℃でフィルターを洗い、フィルムに再露出させる。別の実施例では、ホルムアミドなしで６２℃で低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを行う。使用されうる低ストリンジェンシーの他の条件は、（例えば種相互ハイブリダイゼーションに採用されるように）当技術分野で周知である。
【００６０】
別の具体的な実施形態において、高ストリンジェンシー条件下でＡＲＰの核酸又はその逆相補体にハイブリダイズ可能な核酸が提供される。例としてであるが、限定としてではなく、そのような高ストリンジェンシー条件を使用する方法は以下のとおりである。６×ＳＳＣ、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから構成される緩衝液中でＤＮＡを含むフィルターの予備ハイブリダイゼーションを６５℃で８時間から一晩行う。１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含む予備ハイブリダイゼーション混液中でフィルターを６５℃で４８ｈハイブリダイズさせる。２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％フィコール、及び０．０１％ＢＳＡを含む溶液中で３７℃で１時間フィルターの洗浄を実施する。この後に、０．１×ＳＳＣ中で５０℃で４５分間洗ってからオートラジオグラフィーを行う。別の例において、５０％ホルムアミドで６２℃で高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを行う。使用されうる高ストリンジェンシーの他の条件は、当技術分野で周知である。
【００６１】
別の具体的な実施形態において、中ストリンジェンシー条件下でＡＲＰの核酸又はその逆相補体にハイブリダイズ可能な核酸が提供される。そのようなストリンジェンシーに適当な条件の選択は、当技術分野において周知である（例えばSambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照のこと。Ausubel et al., eds., in the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals,（著作権）1987-1997, Current Protocols,（著作権）1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.も参照のこと）。非限定的な一例において、中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを２０％ホルムアミドで６２℃で実施できる。
【００６２】
（配列番号３〜７を有する）ウシＡＲＰ又はその誘導体が治療的又は予防的に使用される実施形態において、ＡＲＰはジスルフィド結合を有する。一実施形態において、ウシＡＲＰはジスルフィド結合を破壊するであろう還元条件に供されていない。還元されたＡＲＰタンパク質は、酸化型よりも２〜５倍大きな活性を有する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＲＰは、翻訳後修飾されている。いくつかの実施形態において、本発明のＡＲＰは、翻訳後修飾されていない。具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは、グリコシル化されている。具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは、グリコシル化されていない。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＲＰは、膜連結型である。いくつかの実施形態において、本発明のＡＲＰは、膜連結型ではない。具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結型である。具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは、ＧＰＩ連結型ではない。一実施形態において、本発明のＡＲＰは、リポタンパク質である。別の実施形態において、本発明のＡＲＰは、リポタンパク質ではない。
【００６５】
具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは天然タンパク質である。具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは、組換えにより製造されたタンパク質である。具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは、１８ｋＤ〜２５ｋＤの範囲の分子量及び４．０と４．７との間の等電点（ｐＩ）を有する。
【００６６】
当技術分野で公知の任意の１つ若しくは複数のアッセイ又は第５．６節に記載されるようなアッセイによって、所望の活性について本発明の治療用ＡＲＰをｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験できる。
【００６７】
本発明のＡＲＰは、非常に低濃度（例えばピコモル又はフェムトモル濃度レベル）でも強力な免疫刺激活性を概して有する。具体的な実施形態において、免疫応答を誘発するための、並びに癌及び感染症の予防及び治療のための本発明の治療又は予防用組成物は、濃厚にされたＡＲＰを含む。本明細書に使用する、タンパク質（例えばペプチド、ポリペプチド又は融合タンパク質）に関して「濃厚にされた」という用語は、そのタンパク質が得られる自然状態又は本来の状態に比べて、そのタンパク質が、目的の組成物に存在するタンパク質の総量に対してより高い割合を構成していることを意味している。存在する他のタンパク質の量が選択的に低減することによって、又は目的の特異的タンパク質の量が選択的に増加することによって、又はこれら２つの組合せによって濃厚にすることを達成できる。「濃厚にされた」は、他のタンパク質が存在しないことを意味するわけではないことに注意すべきである。この用語は、他の供給源からのタンパク質が存在しないことも意味しない。他の供給源からのタンパク質は、例えば別の種のゲノム又はクローニングベクターによってコードされるタンパク質を含みうる。この用語は、所望のタンパク質の比率を増加させるために人的に介入した状況のみに及ぶことを意味している。具体的な実施形態において、ＡＲＰは、総タンパク質の重量に対して０．００１ｗｔ％、０．００３ｗｔ％、０．０１ｗｔ％、０．０５ｗｔ％、０．１ｗｔ％、０．５ｗｔ％、１ｗｔ％、１０ｗｔ％、２０ｗｔ％、３０ｗｔ％を超える。
【００６８】
核酸に関して「濃厚にされた」という用語は、その核酸が得られた自然状態又は本来の状態に比べて、その核酸が目的の組成物に存在する核酸の総量に対してより高い割合を構成することを意味する。存在する他の核酸の量が選択的に低減することによって、又は目的の特異的核酸の量が選択的に増加することによって、又はこれら２つの組合せによって濃厚にすることを達成できる。「濃厚にされた」は、他の核酸が存在しないことを意味するわけではないことに注意すべきである。この用語は、他の供給源からの核酸が存在しないことも意味しない。他の供給源からの核酸は、例えば別の種のゲノム又はクローニングベクターによってコードされる核酸を含みうる。この用語は、所望の核酸の比率を増加させるために人的に介入した状況のみに及ぶことを意味している。
【００６９】
好ましい実施形態において、本発明のＡＲＰは、精製されている。タンパク質又は核酸に関して「精製されている」という用語は、出発物質又は天然物質の少なくとも１オーダ高い精製、好ましくは２又は３オーダ高い、最も好ましくは４又は５オーダ高い精製が達成されることを意味する。このように、本明細書に使用する「精製された」という用語は、その物質が１００％精製されたことを意味せず、よって精製されたタンパク質又は核酸が他の任意の物質を排除していることを意味しない。具体的な実施形態において、精製されたＡＲＰは、総タンパク質又は核酸の、場合によっては重量に対して少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％である。具体的な実施形態において、精製されたＡＲＰは、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動又はアガロースゲル電気泳動によってアッセイするとき均質になるまで精製されている。
【００７０】
具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは、任意の発達期の精製された生存可能な、若しくは不活性化されたアピコンプレックス門生物、又はそのタンパク質画分（例えばそのタンパク質含有膜調製物又はその貯蔵顆粒調製物）の形で存在する。具体的な実施形態において、アピコンプレックス門生物は、アイメリアであり、そのアイメリアは種特異的であり、自然宿主と異なる種の宿主には通常は症候性感染を引き起こせない。別の具体的な実施形態において、不活性化されたアピコンプレックス門生物は、生活環を欠損したアピコンプレックス門生物である。
【００７１】
ＡＲＰの調製及び精製
いくつかの実施形態において、癌及び／又は感染症の治療又は予防に使用される本発明の組成物は、濃厚にされたＡＲＰ、単離されたＡＲＰ、又は精製されたＡＲＰを含む。本明細書に記載される方法によると、本発明の組成物に採用されるＡＲＰは、総タンパク質のｍｇに対して０．００１〜１００パーセントの範囲、又は総タンパク質のｍｇに対して少なくとも０．００１％、少なくとも０．００３％、少なくとも０．０１％、少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも６０％、若しくは少なくとも９０％でありうる。一実施形態において、本発明の組成物に採用されるＡＲＰは、総タンパク質に対して少なくとも４％である。別の実施形態において、ＡＲＰは、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイするとき、みかけの均質になるまで精製されている。本発明のＡＲＰは、例えば可溶性画分（上清）若しくは不溶性画分（ペレット）のいずれかの使用によって、感染している組織の、又は精製されたアピコンプレックス門生物のホモジネートから、或いは細胞表面に作用する酵素の使用によって無傷細胞（例えば組換えタンパク質又はアピコンプレックス門細胞を発現している哺乳動物細胞）から精製されうる。沈殿による分離、吸着による分離（例えばカラムクロマトグラフィー、膜吸着剤、半径流カラム、バッチ吸着、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、無機吸着剤、疎水性吸着剤、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）、又は溶液状態の分離（例えばゲルろ過、電気泳動、液相分配、界面活性剤分配、有機溶媒抽出、及び限外ろ過）を含むがそれに限定されない、当技術分野において公知の任意の技術をＡＲＰの精製に使用できる。Scopes, PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES, AND PRACTICE, 3rded., Springer (1994)を参照のこと。その本文全体は参照により本明細書に組み込まれている。精製の間は、第５．６節及び第１２節に記載されているように１つ又は複数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによってＡＲＰの免疫刺激活性及び／又は抗腫瘍活性を監視すべきである。本発明は、二価陽イオンの結合の調節によってＡＲＰの活性及び／又は凝集状態に影響するＡＲＰの単離方法に対する任意の修正も包含する。ゲル電気泳動を例とするがそれに限定されない、当技術分野において公知の任意の方法によってＡＲＰの純度をアッセイできる。上記Scopesを参照のこと。
【００７２】
組織及び細胞抽出物からの可溶性ＡＲＰの精製
一実施形態において、ＡＲＰは、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類、鳥類、霊長類（例えばサル）、哺乳類、及びヒトを含むがそれに限定されない脊椎動物（その動物は症候性感染又は非症候性感染を有しうる）のアピコンプレックスに感染している組織から精製される。別の実施形態において、ＡＲＰは、アピコンプレックス門生物に感染している細胞培養から精製される。なお別の実施形態において、ＡＲＰは、アピコンプレックス門生物の調製物から精製される。感染している組織、細胞培養、又はアピコンプレックス門生物の調製物からＡＲＰを精製するために使用できる方法が、非限定的な例として下記の第６節に示される。
【００７３】
簡潔には、非限定的な例として感染している組織又は細胞の調製物（例えばホモジナイズされた小腸組織又は腸粘膜細胞の調製物）を遠心分離する。結果として生じた液状上清を固体硫酸アンモニウムで４５％飽和にし、遠心分離し、ペレットを捨てる。固体硫酸アンモニウムで上清を８０％飽和にし、再度遠心分離し、上清を捨てる。瓶又は試験管内で完全に再懸濁してから１．５Ｍ硫酸アンモニウム／５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）にペレットを溶かす。溶解していない物質を遠心分離で除去する。
【００７４】
好ましい実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィー前の高分子の負荷を減らすために２つの原体加工段階を使用する。第１段階は、疎水性相互作用カラム（以下「ＨＩＣ」カラムと記載。下記６．２．２節参照）を使用する。大量の不活性化物質、特にポリ核酸が通過液及び洗液中に除去される。硫酸アンモニウムを含まない緩衝液への交換の後に活性な（免疫刺激性）物質が溶出する（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）。緩衝液を交換しながら４℃で０．２ＭのＮａＣｌ／１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）４Ｌに対して透析することによってＤＥＡＥクロマトグラフィー用の溶出した物質を調製する。ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを用いて同様にその溶出液を処理し（下記第６．２．２節参照）、通過液及び洗液を捨てる。高ＮａＣｌ濃度での溶出液を保存し、膜圧力セルで濃縮し、サイズ排除カラム（例えばSuperdex（商標）カラム）に入れる。（第５．６節及び第１２節に記載されている１つ又は複数のアッセイによってアッセイされるタンパク質含量に関する）比活性は、精製の各段階からの保存された画分について決定される。サイズ排除クロマトグラフィー段階の終わりに約７０００倍の精製に達する。具体的な実施形態において（例えば小腸抽出物を使用する場合、細菌エンドトキシンは常に混入物である）、精製の各段階でＬＡＬアッセイ（下記第５．３節参照）でエンドトキシンレベルを監視する。エンドトキシンレベルは約１０００分の１に減少し、その結果としてＤＣアッセイを妨害しうるレベルを十分下回る最終レベルとなる（最小ＤＣ活性について１０００Ｕ／ｍＬの閾値。ＤＣアッセイの詳細な記載については第５．６節及び第１２節を参照のこと）。
【００７５】
いくつかの実施形態において、最終的な精製に十分な物質を得るために、多数の試料（例えば動物の腸）からの抽出物を含むプールを作る。好ましくは、これらは粗上清中に高活性が存在するかについて予備選択される（そのような活性の予備検査の例については第６．２．１節を参照のこと）。腸又は細胞の調製物のいくつかのバッチを合わせ、濃縮し、（ＨＩＣカラムによって、下記第６．２．２節参照）カルシウム結合タンパク質を除去し、プールと名付ける。
【００７６】
精製産物を得るために、高速液体クロマトグラフィー（以後「ＨＰＬＣ」と記載）ＨＩＣカラムでプールを最初に分離する。硫酸アンモニウムを除去するためにその活性画分（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を透析し、０．１５ＭのＮａＣｌを用いたＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムに適用する（下記第６．２．２節参照）。ＮａＣｌ勾配を適用し、活性（下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ又は複数のアッセイによりアッセイされる免疫刺激活性）は、イオン強度０．３Ｍ近くの主ピークと共に溶出する。好ましくはＨＩＣからの活性物質を処理するためにＤＥＡＥの運転を使用する。具体的な実施形態において、プールされた活性領域を逆相ＨＰＬＣカラム（例えばＣ８逆相ＨＰＬＣカラム、下記第６．２．２節参照）に適用し、水−アセトニトリル勾配を加えて溶出させる。活性（下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ又は複数のアッセイによりアッセイされる免疫刺激活性）は、流速の小さい、勾配のゆるい溶出プロトコルで４０％アセトニトリル近くに溶出する。これらの活性画分の純度の問題は、細かくサンプリングした分離物に沿って吸光度に対して活性をプロットすることによって取り組まれる。適度に頑健な一次回帰直線及びゼロ近くの切片は、混入分子の欠如を示す。
【００７７】
逆相ＨＰＬＣカラムによる精製段階は、大部分のタンパク質を変性させる。好ましい実施形態において、逆相ＨＰＬＣカラムから溶出するタンパク質は、当技術分野で公知の方法によって、好ましくは１３節に記載される方法によって再生（renaturing）される。別の実施形態において、逆相ＨＰＬＣカラムは本発明のＡＲＰを精製するために使用されない。
【００７８】
いくつかの実施形態において、可溶性ＡＲＰは、（１）濃厚にされたＡＲＰ、例えば組換えＡＲＰタンパク質を発現する細胞の抽出物を有する溶液を作製する段階、（２）上清を得るためにその溶液を遠心分離する段階、（３）タンパク質を沈殿させるために硫酸アンモニウムによってその上清を分画し、ペレットを得るためにその沈殿を遠心分離し、且つそのペレットを溶液に再懸濁する段階、（４）低圧ＨＩＣカラムにその溶液を適用し、且つ活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（５）その活性画分を透析する段階、（６）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムにその透析された活性画分を適用し、且つ１つ又は複数の活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、並びに（７）サイズ排除カラムにその活性画分を適用し、且つ溶出した活性（免疫刺激性）画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする（又は下記の第５．６節及び第１２節に記載されている１つ若しくは複数のアッセイによりその能力をアッセイする）１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）を含む工程によって単離されうる（下記第１０．２節参照）。
【００７９】
具体的な実施形態において、可溶性ＡＲＰは、（１）組換えＡＲＰを発現する細菌によって消費される無機培地を作製する段階、（２）ＤＥＡＥカラムにその培地を適用する段階、（３）溶出した画分を作製するために緩衝液でＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させる段階、（４）サイズ排除カラムに溶出した画分を適用する段階、及び（５）そのサイズ排除カラムから溶出した画分を収集する段階を含む工程によって単離される。
【００８０】
別の実施形態において、ＡＲＰは、表１に挙げるものを含むがそれに限定されないアピコンプレックス門原生動物から精製される。図１も一部のアピコンプレックス門原生動物に関する系統発生の情報を提供する。精製方法の非限定的な例を第８節に示す。
【００８１】
【表１】
2008500005.tif 000003
2008500005.tif 000004
2008500005.tif 000005
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2008500005.tif 000007
2008500005.tif 000008
【００８２】
精製されたアピコンプレックス門生物を当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。例えばTomley, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 13: 171-176 (1997)；Ryley et al., Parasitology, 73: 311-362(1976)；米国特許第６，００１，３６３号、第６，１００，２４１号、第５，７９２，６４４号、第６，４５１，９８４号及び６，００８，３４２号を参照のこと。詳細な例については第８節も参照のこと。
【００８３】
一実施形態において、ＡＲＰは、コクシジウム綱から精製される。別の実施形態において、ＡＲＰは、アイメリア科から精製される。なお別の実施形態において、ＡＲＰは、アイメリア属から精製される。
【００８４】
簡潔には、非限定的な例として以下のようにＥ．テネラからＡＲＰを精製できる（第８節参照）。胞子形成オーシストをＰＢＳに懸濁し遠心分離する。上清を取り出し、残しておく。ペレットを３０ｍＭヘペスに懸濁し氷冷しながらホモジナイズする。この処理の結果として、大部分のオーシストが破壊され、ほぼ無傷のままのスポロシストが放出される。微量遠沈管にそのホモジネートを移し、遠心分離する。
【００８５】
第２の調製では、超音波処理中にホモジネートを冷却しておくように注意しながらホモジネートを超音波処理する。放出されたスポロシストの約８０％が破壊される。懸濁液をプールし微量遠心分離する。ペレットを残しておき、以後の処理のために４℃で保存する。
【００８６】
胞子形成オーシストを３回目に抽出するための出発物質は、第２の抽出調製物の残渣ペレットである。このペレット物質をヘペスに懸濁し、ガラスビーズの入ったベッドビーターチューブに移す。次に、このチューブにヘペスを完全に満たし、加熱を防ぐように注意しながらミニベッドビーター（Mini-Beadbeater）で加工する。この懸濁液を短時間微量遠心分離し、上清をガラスビーズと分離する。この上清を微量遠心分離し、フィルター滅菌し、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによるＡＲＰの精製に使用する（例えばＣ８逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー）。ペレットは膜連結型のＡＲＰの精製に使用できる。
【００８７】
膜連結ＡＲＰの精製
具体的な実施形態において、本発明の治療又は予防用組成物は、アピコンプレックス門原生動物のタンパク質含有膜調製物を含む（第９節参照）。任意の理論に縛られることなく、ＡＲＰは、可溶型と膜連結型の２つの形で存在すると考えられている。具体的な実施形態において、本発明のＡＲＰは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞膜と連結している（原生動物由来ＧＰＩ及びその受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）の説明については、例えばAlmeida et al., J. of Leukocyte Biology, 2001, 70:467-477;Campos et al., the J. of Immunology, 2001, 167:416-423;Ropert et al., Current Opinion in Microbiology, 2000, 3:395-403を参照のこと）。アピコンプレックス門生物がウシのような宿主に感染すると、宿主の血液中に存在する内因性ホスホリパーゼＣ又はＤによる切断が原因で、可溶性ＡＲＰもアピコンプレックス門生物の膜から生じうる。非酵素法又は酵素法によってＡＲＰを膜から抽出できる。具体的な実施形態において、ＡＲＰは、界面活性剤によって膜から抽出される。別の具体的な実施形態において、ＡＲＰは、例えば内部若しくは外部ホスホリパーゼ又はプロテアーゼを用いた酵素法によって膜から放出される。インキュベーション緩衝液に二価陽イオンが存在しないならば、共沈する大きなＡＲＰの凝集体は（たとえあったとしても）同時に溶解する。
【００８８】
ある実施形態において、膜結合ＡＲＰは、（１）精製されたアピコンプレックス門生物の、アピコンプレックス門生物に感染している細胞の、又は組換えＡＲＰを発現している細胞のホモジネートを作製する段階、（２）ペレットを得るためにそのホモジネートを遠心分離する段階、（３）溶液にそのペレットを懸濁し、且つ（例えばホスホリパーゼを用いた）酵素法によってＡＲＰを放出させるためにその溶液を処理する段階、（４）ＡＲＰが非常に濃厚である上清を得るためにその溶液を遠心分離する段階、（５）逆相ＨＰＬＣカラムにその上清を適用する段階、及び（６）その逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階を含む工程によって単離される。具体的な実施形態において、段階（６）で溶出した結合タンパク質を当技術分野で公知の任意の手法によって再生させる。単離工程の間に、第５．６節及び第１２節に記載されている１つ又は複数のアッセイによってＡＲＰの免疫刺激活性を監視する。具体的な実施形態において、膜結合ＡＲＰは、以下の方法によって調製される。
【００８９】
簡潔には、非限定的な例としてＥ．テネラのスポロゾイトから膜の粗調製物を以下のように調製できる。ホモジナイゼーション緩衝液（以後「ＨＢ」と呼ぶ）（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＰＭＳＦ、５０μｌ／ｍｌプロテアーゼ阻害剤カクテル）中のオーシストの懸濁液を氷冷しながら超音波処理した後、凍結融解サイクル（液体窒素／室温）を行う。この方法の結果、オーシスト、スポロシスト及びスポロゾイトがほとんど完全に破壊される。内部ホスホリパーゼによる膜からのＡＲＰの放出を阻害し、且つ／又はＡＲＰの凝集を促進して収量を増やすために１０ｍＭのＺｎＣｌ２を添加できる。
【００９０】
次に膜をペレットにするために細胞ホモジネートを遠心分離する。この遠心分離方式は、核、他のオルガネラ、ペレット可能なＡＲＰ凝集体、及び存在するなら貯蔵顆粒もペレットにする。ＺｎＣｌ２を有さないＨＢに入れるさらなる精製サイクルでオルガネラを破壊できる。
【００９１】
ＨＢ１ｍｌにペレットを懸濁し、再度遠心分離する。遠心分離／再懸濁を、懸濁緩衝液中でＺｎＣｌ２存在下でもう１度、非存在下でさらに２〜３回繰り返す。ＺｎＣｌ２非存在下で行った遠心分離サイクルからの上清は、かなりの量のＡＲＰを含有する。
【００９２】
プロテアーゼ阻害剤存在下又は非存在下でＨＢ１００μｌに最終ペレットを懸濁し、追加の量のＡＲＰを放出させるために３７℃で１〜４時間インキュベートする。ホスホリパーゼＣは１６Ｕ／ｍｌでＡＲＰの放出を促進する。溶液中に放出されたＡＲＰを、遠心分離後に２回の洗浄サイクルを行うことによって不溶性物質と分離できる。３つの上清全てを合わせる。それらの上清は少量の混入物を有するＡＲＰを含み、逆相クロマトグラフィー（例えばＣ８逆相クロマトグラフィー）による１回分離によってその混入物を除去できる。
【００９３】
ＡＲＰの抗体−アフィニティ精製
別の実施形態において、ＡＲＰ又はそのフラグメントを精製するために抗体を使用する。任意のＡＲＰ調製物、例えばアピコンプレックスに感染している組織抽出物、細胞培養物、又はタンパク質含有膜調製物をＡＲＰの抗体アフィニティ精製に使用できる。組換えＡＲＰ産物又は合成ＡＲＰを精製する場合にも抗体を使用できる。抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよく、抗体は、ＡＲＰ又は（例えば親水性部分を有する）ＡＲＰのフラグメントに対して作製されうる。具体的な実施形態において、配列番号２６（ウシＡＲＰフラグメント５（配列番号７）に融合したウシＡＲＰフラグメント４（配列番号６）に融合したウシＡＲＰフラグメント３（配列番号５）に融合したウシＡＲＰフラグメント２（配列番号４）に融合したウシＡＲＰフラグメント１（配列番号３））に結合する抗体を、ＡＲＰ又はそのフラグメントを精製するために使用する。ＡＲＰが融合タンパク質として発現するように操作された場合は、ＡＲＰを精製するために、ＡＲＰではない融合タンパク質の部分に対して作製された抗体を使用できる。当技術分野で公知であるか、又は下記の第５．４節に記載されたような任意の方法によって抗体を作製できる。
【００９４】
タンパク質を精製するために抗体を使用する方法は、標準的であり、当技術分野で周知であり、本明細書では詳細には記載されない。例えばScopes, PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE, 3rded., Springer (1994), at pp 187-236を参照のこと。その本文全体は参照により本明細書に組み込まれている。
【００９５】
ＡＲＰの組換え発現
ＡＲＰを組換えにより製造するために当技術分野で公知の方法を利用できる。宿主細胞において繁殖及び発現させるためにＡＲＰをコードする核酸配列を発現ベクターに挿入できる。
【００９６】
本明細書に使用する発現コンストラクトは、適当な宿主細胞におけるＡＲＰの発現を可能にする１つ又は複数の調節領域に作動可能に関連している、ＡＲＰ又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を指す。「作動可能に関連している」は、調節領域及び発現されるＡＲＰ配列が繋がれ、転写及び最終的に翻訳が可能になるように配置されている関連を指す。
【００９７】
ＡＲＰの転写に必要な調節領域は、発現ベクターによって提供されうる。コグネート開始コドンを欠くＡＲＰ遺伝子配列を発現させるのならば、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）も提供されうる。適合性の宿主−コンストラクト系において、ＲＮＡポリメラーゼのような細胞転写因子は、発現コンストラクトの調節領域に結合し、宿主生物における修飾ＡＲＰ配列の転写に影響するであろう。遺伝子発現に必要な調節領域の厳密な性質は、宿主細胞によって多様でありうる。一般に、ＲＮＡポリメラーゼと結合でき、作動可能に関連している核酸配列の転写を助長できるプロモーターが必要とされる。そのような調節領域には、ＴＡＴＡボックス、キャップ形成配列、ＣＡＡＴ配列などのような転写及び翻訳の開始に関与している５’非コード配列がありうる。コード配列の３’に位置する非コード領域は、ターミネーター及びポリアデニル化部位のような転写終止調節配列を含みうる。
【００９８】
プロモーターのような調節機能を有するＤＮＡ配列をＡＲＰ遺伝子配列に結合させるために、又はベクターのクローニング部位にＡＲＰ遺伝子配列を挿入するために、当技術分野で周知の手法によってｃＤＮＡの末端に適当な適合性の制限部位を提供するリンカー又はアダプターをライゲートできる（Wu et al., 1987, Methods in Enzymol, 152:343-349）。制限酵素を用いた切断の後に、一本鎖ＤＮＡ末端を消化して短くするか、補足することによって平滑末端を作成する修飾を行ってからライゲーションを行うことができる。あるいは、ＰＣＲを使用することによって所望の制限酵素部位を含むＤＮＡの増幅によってＤＮＡのフラグメントにその所望の制限酵素部位を導入できる。
【００９９】
さらなるクローニングを行わずに、ＡＲＰを発現及び産生させるための適当な宿主細胞に、調節領域に作動可能に関連しているＡＲＰ配列を有する発現コンストラクトを直接導入できる。例えば米国特許第５，５８０，８５９号を参照のこと。発現コンストラクトは、例えば相同組換えを介して宿主細胞のゲノムにＡＲＰ配列の組み込みを促進するＤＮＡ配列も含みうる。この場合、宿主細胞で繁殖させＡＲＰを発現させるためにその適当な宿主細胞に適した複製起点を有する発現ベクターを採用する必要はない。
【０１００】
プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド又は修飾されたウイルスを含むがそれに限定されない多様な発現ベクターを使用できる。そのような宿主発現系は、目的コード配列を産生できその後精製できる媒介体を表すが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換されるか、又はそれをトランスフェクトされた場合にｉｎ  ｓｉｔｕでＡＲＰを発現しうる細胞も表す。これらには、ＡＲＰコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば大腸菌及び枯草菌）のような微生物；ＡＲＰコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサッカロミセス（Saccharomyces）、ピチア（Pichia））；ＡＲＰコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染している昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染しているか、若しくはＡＲＰコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換された植物細胞系；又は哺乳動物細胞のゲノムから得られるプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）若しくは哺乳動物ウイルスから得られるプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現コンストラクトを有する哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、３Ｔ３細胞）があるが、それらに限定されない。好ましくは、特に組換えＡＲＰ分子全体の発現のために大腸菌のような細菌細胞及び真核細胞が、組換えＡＲＰ分子の発現のために使用される。例えば、ＡＲＰの効果的な発現のためにサイトメガロウイルスの主要中間初期遺伝子（major intermediate early gene）からのプロモーターエレメントを有するベクターと共にチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞を使用できる（Foecking et al., 1986, Gene 45: 101及びCockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2）。
【０１０１】
細菌系において、発現させるＡＲＰ分子のために意図される使用に応じて多数の発現ベクターを好都合に選択できる。例えば、ＡＲＰ分子の医薬組成物を発生させるためにそのようなＡＲＰを大量に製造しようとする場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが理想的でありうる。そのようなベクターには、ＡＲＰコード配列がＰＣＲ反応から直接ライゲートされうるものであり、融合タンパク質が産生されるようにｌａｃＺコード領域のフレーム内に配置されうる大腸菌発現ベクターpCR2.1 TOPO（Invitrogen社製）；pINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109;Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509）などがあるが、それに限定されない。ＦＬＡＧペプチド、ｍａｌＥタンパク質、又はＣＢＤタンパク質との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために、pFLAG（Sigma社製）、pMAL（NEB社製）及びpET（Novagen社製）のような一連のベクターも使用できる。正しくフォールディング且つ成熟させるために、これらの組換えタンパク質をペリプラスム間隙に方向付けることもできる。発現されたタンパク質のアフィニティ精製のために、融合された部分を使用できる。エンテロキナーゼのような特異的プロテアーゼに対する切断部位が存在することによってＡＰＲを切断することが可能になる。グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるためにpGEXベクターも使用できる。一般にそのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズマトリックスへの吸着及び結合後に遊離グルタチオンの存在下で溶出させることによって、溶解した細胞からその融合タンパク質を容易に精製できる。pGEXベクターは、トロンビン又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されていることから、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出できる。
【０１０２】
昆虫系において、外来遺伝子を発現させるために多数のベクターを使用でき、例えば外来遺伝子を発現させるベクターとしてオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を使用できる。スポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の細胞のような細胞でウイルスは増殖する。ウイルスの可欠領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にＡＲＰのコード配列を個別にクローニングし、ＡｃＮＰＶのプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０１０３】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルス系発現系を利用できる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び三連のリーダー配列に、目的のＡＲＰのコード配列をライゲートできる。次に、このキメラ遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入できる。ウイルスゲノムの可欠領域（領域Ｅ１又はＥ３）への挿入の結果として、生存可能であり、感染した宿主中にＡＲＰを発現できる組換えウイルスがもたらされるであろう（例えばLogan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359を参照のこと）。挿入されたＡＲＰコード配列が効率的に翻訳されるには特異的開始シグナルも必要でありうる。これらのシグナルにはＡＴＰ開始コドン及び隣接配列がある。さらに、開始コドンは挿入部全体の翻訳を確実にするために所望のコード配列のリーディングフレームと同調しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方の多様な起源でありうる。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含によって増大しうる（例えばBittner et al., 1987, Methods in Enzymol.153: 51-544を参照のこと）。
【０１０４】
さらに、所望の特異的な方式で挿入された配列の発現を変調するか、又は遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞株を選択できる。そのようなタンパク質産物の修飾（例えばグリコシル化）及びプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能に重要でありうる。種々の宿主細胞が、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾に特徴的且つ特異的なメカニズムを有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために適当な細胞系又は宿主系を選択できる。この目的のために、一次転写体の適切なプロセシングのための、及び遺伝子産物の翻訳後修飾、例えば遺伝子産物のリン酸化及びホスホリル化のための細胞機械を有する真核生物宿主細胞を使用できる。そのような哺乳動物宿主細胞には、ＰＣ１２、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（免疫グロブリン鎖を全く内因性産生しないマウス骨髄腫細胞系）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞があるが、それに限定されない。細菌又は酵母系における発現は、翻訳後修飾がＡＲＰ活性に必須でないことが判明すれば使用できる。
【０１０５】
適切にプロセシングされたＡＲＰを長期間高収量で製造するために、細胞での安定発現が望ましい。選択マーカーを含むベクターを使用することによってＡＲＰを安定発現する細胞系を操作できる。非限定的な例として、発現コンストラクトを導入した後に操作された細胞を強化培地中で１〜２日間増殖させてから選択培地に切り換えてもよい。発現コンストラクト中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体に発現コンストラクトを安定組み込みすること、及び培養で増殖すること、及び細胞系に拡大することを最適に可能にする。ＡＲＰが連続的に発現する長い期間、そのような細胞を培養できる。
【０１０６】
使用されうる多数の選択系には、抗生物質耐性（ゲネチシン又はＧ−４１８に対する耐性を付与するNeo（Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596；Mulligan, 1993, Science 260: 926-932；及びMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217；May, 1993, TIB TECH 11(5): 155-215）；ゼオシン耐性のためのZeo；ブラスチシジン耐性のためのBsdなどのようなマーカー）、抗代謝耐性（メトトレキサート耐性を付与するDhfr（Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 357；O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527））、ミコフェノール酸耐性を付与するgpt（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072）；及びヒグロマイシン耐性を付与するhygro（Santerre et al., 1984, Gene 30: 147）があるが、それに限定されない。さらに、tk-、hgprt-、又はaprt-細胞を含めるがそれに限定されない突然変異細胞系を、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチン、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ又はアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの対応する遺伝子を有するベクターと組み合わせて使用できる。組換えＤＮＡ法の分野で一般に公知である方法を所望の組換えクローンを選択するために日常的に適用でき、そのような方法は、例えばAusubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；及びDracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)の第１２及び１３章；Colberre-Garapin et al.,1981, J. Mol. Biol. 150: 1に記載されている。
【０１０７】
標準条件の温度、インキュベーション時間、吸光度及び培地組成で組換え細胞を培養できる。しかし、組換え細胞の増殖のための条件は、ＡＲＰの発現のための条件と異なりうる。ＡＲＰの産生を増大させるために修正された培養条件及び培地も使用できる。ＡＲＰを産生させるための最適な条件を確立するために、当技術分野で公知の任意の手法を適用できる。
【０１０８】
ＡＲＰ遺伝子の単離
当技術分野で公知の任意の手法によってＡＲＰをコードする遺伝子を単離できる。ＡＲＰ遺伝子の単離のための具体的な実施形態を以下に述べる。例えば、アピコンプレックス属の原生動物を使用してその総ＲＮＡを単離できる。アピコンプレックス門原生動物の総ＲＮＡを一旦入手できたならば、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ＡＲＰのｍＲＮＡのアフィニティ精製、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むがそれに限定されない当技術分野で公知の方法によってＡＲＰ遺伝子を単離できる。
【０１０９】
具体的な実施形態において、単離されたＡＲＰ遺伝子は、配列番号１（Ｅ．テネラのＡＲＰ）、配列番号２（Ｅ．アセルブリナのＡＲＰ）又は配列番号３〜７（ウシアイメリア種ＡＲＰの部分配列。配列番号３〜７は、必ずしも隣接せず、各フラグメントに介入配列又は隣接配列が存在しうる。好ましくはその核酸分子は、配列番号３から配列番号７の順にＮ末端からＣ末端への配列番号３、４、５、６及び７を含むタンパク質をコードする）をコードする核酸分子を含む。具体的な実施形態において、単離されたＡＲＰ遺伝子は、配列番号１、配列番号２、又は配列番号２６（配列番号７に融合した配列番号６に融合した配列番号５に融合した配列番号４に融合した配列番号３）をコードする核酸分子からなる。
【０１１０】
一実施形態において、当技術分野で公知の任意の方法（例えばOrientExpress cDNA Library Construction System（Novagen社製））を使用することによってｃＤＮＡライブラリーを発生させる。第１鎖、第２鎖を合成するために総ｍＲＮＡを使用し、ラムダ（λ）バクテリオファージのアームにライゲートする。例えばPhageMaker Kit（Novagen社製）によって、構築したファージＤＮＡをバクテリオファージにパッケージできる。細菌宿主に感染させてラムダバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーを発生させるために種々のＤＮＡ挿入部を含むバクテリオファージを使用する。通常はそのライブラリーは１０５〜１０６個の一次クローンを含む。このファージライブラリーを増幅させて、例えば平板１枚当たり約１０４個のクローンとなるように平板に蒔く。次に、ＡＲＰ遺伝子プローブ（例えばＥ．テネラのＡＲＰ）を用いた膜リフティング法によって、ライブラリーをスクリーニングできる。あるいは、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）によってタンパク質の発現を誘導することによってｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングできる。発現したタンパク質を含む、平板から持ち上げられた膜を、ＡＲＰ（例えば配列番号１又は２）に対して発生させた抗体を使用することによってスクリーニングする。ＤＮＡ配列決定により、確認されたクローンを分析する。正しいＤＮＡ挿入部をタンパク質発現用のタンパク質発現ベクターにサブクローニングする。ＤＣ活性化性について組換えタンパク質を試験できる。
【０１１１】
別の実施形態において、ＡＲＰ遺伝子（例えば配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２７）をベクター（例えばpET-Blue２ベクター（Novagen社製））に逆方向にクローニングする。このプラスミドを形質転換により細菌宿主に導入する。pET-Blue2プラスミドを有する細菌株は、ヘルパーファージＲ４０８の感染後に一本鎖（ｓｓ）ファージＤＮＡを発生させる能力を有する。挿入体の正の鎖はファージが形成する間に作られる。逆方向を有する正の鎖は、ベクターにクローニングされた本来のＡＲＰ遺伝子の負の鎖に対応する。このｓｓＤＮＡは、ＡＲＰの標的ｍＲＮＡに相補的である。このｓｓＤＮＡをビオチン化してアピコンプレックス門原生動物の総ｍＲＮＡ調製物に加えて２本の相補鎖をハイブリダイズさせることができる。ストレプトアビジン磁気ビーズに結合させることによって複合体を単離できる。未結合のｍＲＮＡを洗浄後に、結合したアピコンプレックスＡＲＰの標的ｍＲＮＡは低塩条件下で溶出するが、ビオチン化ｓｓＤＮＡは強力なビオチン−ストレプトアビジンの結合によって磁気ビーズに結合したままである。結果としてもたらされたｍＲＮＡは、標的アピコンプレックスＡＲＰ遺伝子に特異的であり、第１鎖ＤＮＡ、第２鎖ＤＮＡを合成するために使用され、ＤＮＡ配列決定及びタンパク質発現のためにタンパク質発現ベクターにクローニングされる。ＤＮＡ配列は、ＡＲＰ遺伝子との相同性によって確認される。ＤＣ活性化機能を試験するために組換えタンパク質を発現させる。具体的な実施形態において、抗腫瘍活性はマウス試験によって確認される。
【０１１２】
別の実施形態において、アピコンプレックス原生動物から単離された総ｍＲＮＡを用いて、プライマーとしてオリゴｄＴを使用したＭＭＬＶ逆転写酵素によって第１鎖を合成できる。Taqポリメラーゼと、ＡＲＰ遺伝子配列（例えば配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２７）又はGenBankからのＥＳＴのコンセンサスによって決定される特異的プライマーとを使用することによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するために、結果としてもたらされた試料を使用する。分子量標準及びＡＲＰ遺伝子からの予想される値と比較して分子量を決定するためにＤＮＡアガロースゲルによってＰＣＲ産物を分析できる。クローニングベクター（例えばInvitrogen社製PCR2.1 TOPO）にＰＣＲ産物を導入でき、それらのサイズの分析及びＡＲＰ遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ増幅パターンに基づき正しい挿入部を有するプラスミドを選択できる。最後にその遺伝子を発現ベクターに再クローニングできる。ＡＲＰ配列を最終確認し、ＡＲＰ遺伝子を厳密に決定するために、クローニングされた遺伝子をＤＮＡ配列分析に供することができる。
【０１１３】
別の実施形態において、選択前にゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリー中の所望の配列を増幅させるためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。ＡＲＰの配列に相当するオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲにおけるプライマーとして使用できる。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、異なる種のＡＲＰ遺伝子間で相同性の高い保存されたセグメントの少なくとも一部に相当する。潜在的に関心がもたれる供給源（ＲＮＡ又はＤＮＡ）、好ましくはｃＤＮＡライブラリーからの配列を増幅するためのプライマーとして合成オリゴヌクレオチドを利用できる。例えばPerkin-Elmer社製Cetusサーマルサイクラー及びTaqポリメラーゼ（例えばGene Amp（商標））の使用によってＰＣＲを実施できる。増幅される核酸には、任意の種からのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡがありうる。ＰＣＲ反応において他の種からのホモログを増幅させるための縮重プライマーを合成できる。
【０１１４】
ＰＣＲ反応のプライミングに使用するハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変更し、ＡＲＰヌクレオチド配列と単離される核酸ホモログとの間のヌクレオチド配列の類似性の度合を高めたり、又は低くできるようにすることも可能である。種相互ハイブリダイゼーションには低ストリンジェンシー条件が好ましい。同種ハイブリダイゼーションには、中度にストリンジェントな条件が好ましい。ＡＲＰホモログのセグメントをうまく増幅させた後で、そのセグメントをクローニングして標準法によって配列決定し、完全ｃＤＮＡ又はゲノムクローンを単離するためのプローブとして利用できる。これは逆に、以下に記載するように遺伝子の完全ヌクレオチド配列の決定、その発現の分析、及び機能性分析のためのタンパク質産物の生成を可能にする。このように、ＡＲＰ及びＡＲＰ類似体をコードする追加の遺伝子を同定できる。
【０１１５】
ペプチド合成
組換え法によってＡＲＰ又はそのフラグメントを製造する代替法は、ペプチド合成である。例えば、ペプチド合成装置の使用によってＡＲＰ全体、又はＡＲＰの部分に対応するペプチドを合成できる。通常のペプチド合成又は当技術分野で周知の他の合成プロトコルを使用できる。
【０１１６】
Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149によって記載された方法と類似の方法を用いた固相ペプチド合成によって、ＡＲＰ又はその部分のアミノ酸配列を含むペプチドを合成できる。合成中に、Ｃ末端が連結した延長中のポリペプチド鎖及び不溶性ポリマー支持体、すなわちポリスチレンビーズに保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸を段階的に付加する。ジシクロヘキシルカルボジイミドのような試薬と反応させることによって活性化したＮ−α−保護アミノ酸のα−カルボキシル基にＮ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を連結することによってペプチドを合成する。活性化カルボキシル基への遊離アミノ基の結合は、ペプチド結合の形成を誘導する。最も一般に使用されるＮ−α−保護基には、酸に不安定なＢｏｃ及び塩基に不安定なＦｍｏｃがある。適当な化学物質、樹脂、保護基、保護アミノ酸及び試薬の詳細は当技術分野で周知であるため、本明細書において詳細に説明しない（Atherton et al., 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press及びBodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed., Springer-Verlagを参照のこと）。
【０１１７】
ゲル浸透クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを用いた分取用ＨＰＬＣのような通常の方法を用いて、結果としてもたらされたＡＲＰ又はそのフラグメントの精製を果たす。適当なマトリックス及び緩衝液の選択は、当技術分野で周知であるため、本明細書において詳細に説明しない。
【０１１８】
精製されたアピコンプレックスのＡＲＰ
具体的な実施形態において、本発明は、癌及び感染症の治療のための、及び免疫応答を誘発するためのＡＲＰを含む精製されたアピコンプレックス門生物を提供する。好ましい実施形態において、精製されたアピコンプレックス門生物は、不活性化されたアピコンプレックス門生物又は目的とされる宿主において疾患を引き起こせないアピコンプレックス門生物でもある。癌の治療又は予防のために、ＡＲＰを含む精製又は不活性化されたアピコンプレックス門生物を、対象に直接、好ましくは経口的に投与できる。
【０１１９】
アイメリア属のようなアピコンプレックスの一部の属は、高度に種特異的である。例えば鳥類種に感染するアイメリアは、通常は非鳥類種には症候性感染を引き起こさない。本発明の一実施形態において、ＡＲＰを含むアピコンプレックス門生物を、その生物の自然宿主ではない対象に癌の治療及び予防のために投与する。
【０１２０】
好ましい実施形態において、ＡＲＰを含むアイメリアの胞子形成オーシストを、その生物の自然宿主ではない対象に癌の治療及び予防のために投与する。
【０１２１】
本発明の別の実施形態において、欠損した生活環を有するようにＡＲＰを含むアピコンプレックス門生物を操作してその生物が宿主において症候性感染を引き起こせないようにして、癌の治療又は予防のためにその操作されたアピコンプレックス門生物を対象に投与する。アピコンプレックス門生物が欠損した生活環を有するようにできる、当技術分野で公知の任意の手法を使用できる。そのような手法には、遺伝子操作、化学毒素の使用、又は放射線照射があるが、それに限定されない。アピコンプレックス門生物が欠損した生活環を有するかどうかは、動物に感染させた後にその生物が細胞に進入したことを実証するための生検を行うことによって試験できる。適当な待機期間をおくことで、その生物が生活環を完了して便中にオーシストを作成できないかどうかが示されるであろう。
【０１２２】
アピコンプレックスは、複雑な生活環を有し、種々のアピコンプレックスの群の間で大きな多様性が存在する。無性生殖及び有性生殖が関与するが、一部のアピコンプレックスは１つ又はもう１つの成長期をスキップする。基本生活環は感染期又はスポロゾイトが宿主細胞に進入し、次に繰り返し分裂して多数のメロゾイトを形成するときに開始すると言われている場合もある。一部のメロゾイトは有性生殖細胞又はガモントに変換する。ガモントは対になって繋がり、ガモントシスト（gamontocyst）を形成する。ガモントシスト内ではガモントは分裂して無数のガメートを形成する。次にガメートの対は、融合して融合体を形成し、それは新しいスポロゾイトへの減数分裂によって起こり、生活環が再び開始する。アピコンプレックスは様々な方法で新しい宿主に伝播し、マラリア原虫のように感染している蚊によって伝播するものもあれば、感染した宿主の便に入るか又は捕食者が感染している獲物を食べたときに伝播しうる。
【０１２３】
コクシジウム綱は、腸管のような粘膜表面を介して脊椎動物に感染する傾向がある。コクシジウム綱アイメリア目アイメリア科は、１つの宿主のみを必要とする生活環及びオーススト期での環境中の迅速な通過を特徴とする。アイメリア属は、各アイメリア種に特異的な腸の領域に限定しているスポロゾイトの侵入、メロゾイト形成、ガメトサイト形成、及びオーシストの形成が特徴的である。オーシストは環境中で胞子形成して摂取され、オーシストの壁は十二指腸内で胆汁酸塩及びトリプシンによって壊れる。スポロゾイトは上皮細胞壁を透過し、そこでスポロゾイトは専用の膜で自分を防御する。この安全な楽園の中でスポロゾイトはシゾントとして１２００００個のメロゾイトを生成する。成熟した場合、これらは破裂し他の細胞に侵入する。この過程が２、３回繰り返され、その後有性生殖が起こりオーシストが形成されるガモント期が続く。これらは便と共に排泄され、生活環を完了する。
【０１２４】
本発明によると任意の発達期、例えばメロゾイト、ガモント、ガモントシスト、ガメート、スポロゾイト、又はオーシストのアピコンプレックス門生物を、癌若しくは感染症の治療若しくは予防に、又は免疫応答を誘発させるために使用できる。好ましい実施形態において、アピコンプレックス生物のスポロゾイト、メロゾイト又はオーシストは、癌若しくは感染症の治療若しくは予防に、又は免疫応答を誘発させるために使用される。さらに好ましくは、アイメリア種のスポロゾイト、メロゾイト又はオーシストは、癌若しくは感染症の治療若しくは予防に、又は免疫応答を誘発させるために使用される。
【０１２５】
本発明の別の実施形態において、癌を治療又は予防するために、ＡＲＰを含む死滅したアピコンプレックス門生物を対象に投与する。化学毒素及び放射線照射を含むがそれに限定されない当技術分野で公知の任意の方法によってアピコンプレックス門生物を殺滅できる。
【０１２６】
なお別の実施形態において、癌を治療又は予防するために、ＡＲＰを含むアピコンプレックス門生物のタンパク質画分、好ましくは膜調製物又は貯蔵顆粒調製物を対象に投与する。
【０１２７】
ＡＲＰの誘導体及び類似体
本発明は、さらにＡＲＰの誘導体（限定するものではないが、断片が挙げられる）、及び類似体を提供するものである。ＡＲＰに関連する誘導体及び類似体の製造及び使用は、本発明の範囲内である。
【０１２８】
具体的な実施形態では、誘導体又は類似体は機能的に活性、すなわち、完全長の野生型ＡＲＰに関連する1以上の機能活性を示すことができる。好ましくは、誘導体又は類似体は、ＤＣアッセイにより分析されるように樹状細胞の活性化因子である（５．６節及び１２．３節参照）。ＡＲＰの誘導体又は類似体は、当業界に既知の手順により所望の活性を試験することができ、限定するものではないが下記５．５節及び１２節に記載のアッセイが挙げられる。
【０１２９】
特に、ＡＲＰ誘導体は、機能的に等価な分子を与える置換、挿入又は欠失によってＡＲＰ配列を変更することにより作成し得る。好ましくは、ＡＲＰ配列のこのような変更は、可変部でなされ（すなわち、異なるＡＲＰ分子間で高度に保存されていない領域、例えば、図１９参照）、例えば、変更はＡＲＰの最初の１５個のアミノ酸でなされる。本発明の実施に際して、ヌクレオチドコード配列の縮退のため、ＡＲＰ遺伝子と同じアミノ酸配列を実質的にコードする他のＤＮＡ配列を用いてもよい。これらとしては、限定するものではないが、機能的に等価なアミノ酸残基をコードする様々なコドンの配列内での置換によって変更され、それによりサイレント変化を生じるＡＲＰ遺伝子の全部又は一部を含むヌクレオチド配列が挙げられる。同様に、本発明のＡＲＰ誘導体は、限定するものではないが、配列内の残基と機能的に等価なアミノ酸残基が置換されて、サイレント変化（すなわち、保存型置換）を生じる変更配列を含むＡＲＰのアミノ酸配列の全部又は一部を、アミノ酸一次配列として含むものが挙げられる。例えば、配列内の1個以上のアミノ酸残基を、機能的等価物として作用する同じ極性の別のアミノ酸により置換して、サイレント変化をもたらすことができる。配列内のアミノ酸の代替物は、そのアミノ酸が属する分類のその他のメンバーから選択されてもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。本発明のＡＲＰ誘導体は、限定するものではないが、アミノ酸一次配列として、アミノ酸残基が同じ化学特性(すなわち、保存型置換)を有する残基で置換されている変更配列を含むＡＲＰのアミノ酸配列の全部又は一部を含むものも挙げられる。具体的な実施形態では、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸が置換される。具体的な実施形態では、配列番号：１のアミノ酸残基１８１のＨｉｓをＴｙｒに変えることができ、新たなタンパク質は、やはり配列番号：１と同じ活性を有する。具体的な実施形態では、配列番号：１のアミノ酸残基１８３のＳｅｒをＡｌａに変えることができ、新たなタンパク質は、やはり配列番号：１と同じ活性を有する。他の具体的な実施形態では、配列番号：１のアミノ酸残基１８１のＨｉｓをＴｙｒに変えることができ、アミノ酸残基１８３のＳｅｒをＡｌａに変えることができ、新しいタンパク質は、やはり配列番号：１と同じ活性を有する。
【０１３０】
ＡＲＰの誘導体又は類似体は、限定するものではないが、ＡＲＰ若しくはそれらの断片と実質的に相同であるか、又はそれらをコードする核酸がＡＲＰ核酸配列とハイブリッド形成し得るこれらのペプチドが挙げられる。
【０１３１】
本発明のＡＲＰ誘導体及び類似体は、当業界で知られた様々な方法で製造し得る。製造をもたらす操作は、遺伝子又はタンパク質レベルで行うことができる。例えば、クローン化ＡＲＰ遺伝子配列は、当業者に知られた任意の多くの方法により修飾し得る（Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.）。配列は、制限酵素で適当な部位を切断し、次いで、さらに酵素修飾し、所望により単離及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合させることができる。ＡＲＰの誘導体又は類似体をコードする遺伝子の製造において、修飾された遺伝子が確実に所望のＡＲＰ活性をコードする遺伝子領域で翻訳停止信号により中断されないでＡＲＰと同じ翻訳の読み枠内に残るようにすることに注意すべきである。
【０１３２】
さらに、ＡＲＰをコードする核酸配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで突然変異させて、翻訳、開始、及び／又は終止配列を形成し且つ／又は破壊するか、或いは、コード領域で変異体を形成し且つ／又は新しい制限酵素部位を形成し若しくは既存の制限酵素部位を破壊し、更なるｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾を容易とすることが可能である。当該技術分野で知られた任意の突然変異技術を用いることが可能であり、限定するものではないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Hutchinson, C. et al., 1978, J. Biol. Chem 253:6551）、ＴＡＢ．ＲＴＭ．リンカー（Pharmacia社製）などが挙げられる。
【０１３３】
ＡＲＰ配列の操作は、タンパク質レベルでされてもよい。例えば、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化、アミド化、既知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子若しくは他の細胞性リガンドへの結合などにより、翻訳の間又は後に様々に修飾されるＡＲＰ断片又は他の誘導体若しくは類似体は、本発明の範囲内に含まれる。任意の多くの化学修飾が、既知の技術により行われてもよく、限定するものではないが、遊離ＮＨ２−基、遊離ＣＯＯＨ−基、ＯＨ−基、Ｔｒｐ−、Ｔｙｒ−、Ｐｈｅ−、Ｈｉｓ−、Ａｒｇ−、又はＬｙｓ−などの側鎖の保護又は修飾に有用な試薬；臭化シアン、水酸化アミン、ＢＮＰＳ-スカトール、酸又はアルカリ加水分解による特異的化学切断；トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による酵素的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；などが挙げられる。
【０１３４】
さらに、ＡＲＰ類似体及び誘導体を化学合成することが可能である。例えば、所望の領域を含み、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの所望の凝集活性を媒介し、受容体に結合するＡＲＰ部分に相当するペプチドを、ペプチド合成機の使用により合成することができる。さらに、所望により、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体を、ＡＲＰ配列への置換又は付加として導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定するものではないが、共通のアミノ酸のＤ異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、及びＮα−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸が挙げられる。
【０１３５】
具体的な実施形態では、ＡＲＰ誘導体は、そのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端で非ＡＲＰアミノ酸配列とペプチド結合を介して融合したＡＲＰ又はそれらの断片を含む、キメラタンパク質又は融合タンパク質である。好ましい実施形態では、非ＡＲＰアミノ酸配列をＡＲＰ又はそれらの断片のアミノ末端で融合させる。他の好ましい実施形態では、非ＡＲＰアミノ酸配列を、ＡＲＰ又はそれらの断片の可変部、例えばＡＲＰ遺伝子の最初の１５個のアミノ酸で融合させる。一実施形態では、このようなキメラタンパク質を、タンパク質をコードする核酸の組換え発現により製造する（インフレームを非ＡＲＰコード配列に結合させたＡＲＰコード配列を含む）。このようなキメラ生成物は、様々な会社（例、Retrogen社、Operon社など）にオーダーメードするか、又は適当なコードフレームで所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列と当該技術分野で知られた方法で互いにライゲートさせ、当該技術分野で共通に知られた方法によりキメラ生成物を発現させることにより製造することができる。或いは、このようなキメラ生成物をタンパク質合成技術、例えば、ペプチド合成機により製造することができる。具体的な実施形態では、異種信号配列により成熟ＡＲＰをコードするキメラ核酸を発現させて、キメラタンパク質を発現し、細胞でプロセシングして成熟ＡＲＰタンパク質にする。コンピュータシミュレーションを利用して、ＡＰＲ及び非ＡＰＲ遺伝子の一次配列を三次元構造を予想するのに用いてもよいであろう(Hopp and Woods,1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78:3824-3828)。キメラ組換え遺伝子は、三次構造及び生物学的機能の間の相関関係の点に照らして設計されるであろう。同様に、異種（非ＡＲＰ）タンパク質をコードする配列と融合したＡＲＰ分子の重要な部分を含むキメラ遺伝子を作成してもよい。具体的な実施形態では、このようなキメラ構造体を用いて、限定するものではないが、ＡＲＰの安定性、溶解性、又はプロテアーゼ耐性などといった、ＡＰＲの所望の特性を高めるのに用いることができる。他の実施形態では、キメラ構造体をＡＲＰを特異的部位に向かわせるのに用いることができ、例えば、癌の特異型に対する抗体と融合したＡＲＰを含むキメラ構造体は、ＡＲＰを癌部位に送達することを可能にする。更なる実施形態では、Ｈｉｓ標識、ＦＬＡＧ標識、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）、セルロース結合タンパク質（ＣｅｎＡ）又はマンノースタンパク質などのキメラ構造体を、本発明のＡＲＰを同定又は精製するために用いることができる。
【０１３６】
他の具体的な実施形態では、ＡＲＰ誘導体は、アピコンプレクサの他の種のＡＲＰと相同な領域を含む１つの種のアピコンプレクサのＡＲＰ断片である。本明細書で用いられるように、当該領域に含まれる数と同数のアミノ酸を有する第２のタンパク質中の任意の配列と比較した場合に、この領域のアミノ酸配列が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４５％、少なくとも５５％、少なくとも６５％、少なくとも７５％の同一性であるか、又は保存型変化を伴う場合には、最初のタンパク質の領域は、第２のタンパク質と「相同である」とみなせる。
【０１３７】
具体的な実施形態では、本発明は、ＡＲＰ誘導体及び類似体、特にＡＲＰ断片及びＡＲＰの1つ以上の領域を含むこのような断片の誘導体を提供するものである。
【０１３８】
具体的な実施形態では、アイメリア属以外の種、好ましくはアピコンプレクサ門の他の種のＡＲＰに関連する際には、ＡＲＰの特異的部位を含む断片は、アイメリアのＡＲＰの特異的断片とほぼ相同なそれぞれのＡＲＰ内の部位を含むものである。
【０１３９】
ＡＲＰ、誘導体及び類似体に対する抗体
様々な実施形態では、ＡＲＰ又はＡＲＰの領域に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体は、免疫測定法においてＡＲＰの量を測定するのに用いることができるか、又はＡＲＰの免疫親和的精製に用いることができる。Hopp&Woodsの親水性分析（Hopp & Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 :3824-3828 (1981)参照）を、タンパク質の親水性領域を同定し、且つ、ＡＲＰの潜在型エピトープを同定するのに用いることができる。具体的な実施形態では、配列番号：２６（断片２（配列番号：４）と融合し、断片３（配列番号：５）と融合し、断片４（配列番号：６）と融合し、また断片５（配列番号：７）と融合したウシのＡＲＰ断片１（配列番号：３）)に結合する抗体が、ＡＲＰの量を測定する免疫測定法又はＡＲＰの免疫親和的精製法に用いられる。
【０１４０】
ＡＲＰに免疫特異的に結合する抗体又はそれらの抗原断片は、抗体の合成に関する技術分野、特に、化学合成で知られた任意の方法によるか、又は、好ましくは組換え発現技術により製造することができる。
【０１４１】
ＡＲＰ又はそれらの抗原断片に免疫特異的なポリクローナル抗体は、当該分野で広く知られた様々な手順により製造することができる。例えば、ＡＲＰは、限定するものではないが、ウサギ、マウス、及びラットなどの様々な宿主動物に投与することができ、ＡＲＰに特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する。宿主の種によっては、様々なアジュバントを用いて免疫応答を増大させてもよく、限定するものではないが、フロイント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機化合物のゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール（pluronic polyol）、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）及びコリネバクテリウムパルバムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。このようなアジュバントは、当業界に周知であってもよい。
【０１４２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組合せの使用を含む、当該分野で知られた広く様々な技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体としては、当該分野で知られ、また、例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N. Y., 1981)に示されたものが挙げられる。本明細書に用いられる用語「モノクローナル抗体」は、限定するものではないが、ハイブリドーマ技術を介して産生される抗体である。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物の、原核生物の、又はファージのクローンを含む、単一クローンから派生する抗体をいい、それが産生される方法ではない。
【０１４３】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生し、スクリーニングする方法は、日常的（routine）であり、当該分野で広く知られている。簡潔には、非マウス抗体を用いてマウスを免疫化し、免疫応答が検出される時点、例えばその抗原に特異的な抗体がマウス血清に検出される時点で、マウスの脾臓を回収し、碑細胞を単離する。次いで、碑細胞を周知技術により、任意の最適なミエローマ細胞、例えば、ＡＴＣＣから入手可能なＳＰ２０細胞系由来の細胞と融合させる。ハイブリドーマを選定し、限界希釈法によりクローン化する。次いで、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドを結合させることが可能な抗体を分泌する細胞で、当業界に既知の方法で評価する。一般的に、高レベルの抗体を含む腹水は、陽性ハイブリドーマクローンを有するマウスを免疫化することにより生じさせることができる。
【０１４４】
本発明は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養する工程であって、好ましくは、ハイブリドーマが、非マウス抗原で免疫化したマウスから単離した碑細胞をミエローマ細胞と融合させることにより生じさせ、次いで、抗原に結合可能な抗体を分泌するハイブリドーマクローンを得るために、融合から得られるハイブリドーマをスクリーニングする工程を含む方法により産生される、抗体並びにモノクローナル抗体を生成する方法を提供するものである。
【０１４５】
特異的に特定のエピトープを認識する抗体断片は、当業者に知られた任意の技術により作成してもよい。例えば、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ'）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ'）２断片を作製するため）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子をタンパク質分解的に切断することによって作成してもよい。Ｆ（ａｂ'）２断片は可変部、軽鎖定常部及び重鎖のＣＨ１領域を含む。さらに、本発明の抗体は、当業界に知られた様々なファージディスプレイ方法を用いて作成することもできる。
【０１４６】
ファージディスプレイ方法では、機能的抗体領域が、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面に提示される。特に、ＶＨ及びＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列は、動物のｃＤＮＡライブラリー（例えば、罹患組織のヒト又はマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅される。ＶＨ及びＶＬ領域をコードするＤＮＡを、ＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーと一緒に再結合させ、ファージミドベクターに入れてクローン化する。ベクターは大腸菌にエレクトロポレーションにより導入され、この大腸菌はヘルパーファージに感染する。これらの方法に用いられるファージは、典型的にはｆｄ及びＭ１３などの繊維状ファージであり、ＶＨ及びＶＬ領域は、通常、ファージ遺伝子III又は遺伝子VIIIのいずれかと組換え技術により融合される。特定抗原に結合する抗原結合領域を発現するファージを選定し、抗原、例えば、標識抗原又は固相表面若しくはビーズに結合若しくは捕獲した抗原を用いて、同定することができる。本発明の抗体を作成するのに用いることができるファージディスプレイ方法の例としては、例えば、以下に開示されたものが挙げられる。Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182 : 41-50；Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184: 177-186；Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 952-958；Persic et al., 1997, Gene 187: 9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57: 191-280；国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／Ｏ１ １３４号；国際公開ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１、及びＷＯ９７／１３８４４；及び米国特許第５，６９８,４２６号、第５,２２３，４０９号、第５，４０３,４８４号、第５，５８０,７１７号、第５,４２７,９０８号、第５，７５０,７５３号、第５，８２１,０４７号、第５,５７１，６９８号、第５，４２７,９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０,２２５号、第５,６５８,７２７号、第５，７３３，７４３号及び第５，９６９,１０８号。
【０１４７】
上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコードする領域を単離し、使用して全抗体又は任意の他の所望の結合断片を生成し、例えば、以下に記載のように、任意の所望の宿主、例えば哺乳類の細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌、及び細菌で発現する。ＰＣＴ公報ＷＯ９２／２２３２４；Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12 (6): 864-869；Sawai et al., 1995, AJRI 34: 26-34；及びBetter et al., 1988, Science 240: 1041-1043に開示された分野で知られた方法を用いて、組換え技術によりＦａｂ、Ｆａｂ'及びＦ（ａｂ'）２断片を産生する技術を用いることもできる。
【０１４８】
全抗体を作成するために、ＶＨ又はＶＬヌクレオチド配列、制限部位、及び制限部位を保護するフランキング配列を含むＰＣＲプライマーを、ｓｃＦｖクローン中のＶＨ又はＶＬ配列を増幅させるのに用いることができる。当業者に知られたクローニング技術を利用して、ＰＣＲで増幅したＶＨ領域を、例えばヒトγ４定常部などのＶＨ定常部を発現するベクターに入れてクローン化することができ、また、ＰＣＲで増幅したＶＬ領域を、例えばヒトκ又はλ定常部などのＶＬ定常部を発現するベクターに入れてクローン化することができる。好ましくは、ＶＨ又はＶＬ領域を発現するベクターは、ＥＦ−１αプロモーター、分泌シグナル、可変部、定常部、及びネオマイシンなどの選択マーカー用のクローニング部位を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、必要な定常部を発現する１つのベクターに入れてクローン化してもよい。その後、重鎖転換ベクター及び軽鎖転換ベクターを細胞系に同時にトランスフェクトして、当業者に知られた技術を用いて、全長の抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定又は一過性の細胞系を作る。
【０１４９】
ヒトの抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出アッセイなどの用途によっては、ヒト化抗体又はキメラ抗体を使用することが好ましいであろう。ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いて、上述したファージディスプレイ法を含む当該技術分野で知られた様々な方法により、ヒト抗体を作成し得る。米国特許第４，４４４，８８７号及び第４，７１６，１１１号；及び国際公報ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、及びＷＯ９１／１０７４１も参照のこと。
【０１５０】
キメラ抗体は、抗体の異なる部位が異なる免疫グロブリン分子由来のものである分子である。キメラ抗体を作製する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Morrison, 1985, Science 229: 1202；Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214；Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202；及び米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、第４，８１６３９７号、及び第６，３１１，４１５号を参照のこと。
【０１５１】
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合することが可能であり、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域及び非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを含む、抗体又はその変異体又はそれらの断片である。ヒト化抗体は、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のものに相当し、全て又は実質的に全てのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、実質的に全ての、少なくとも１つ、典型的には２つの可変部（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）を含む。好ましくは、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。通常、抗体は軽鎖、並びに、少なくとも重鎖の可変部の両方を含むであろう。抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４領域を含んでもよい。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥなどの任意のクラスの免疫グロブリン、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などの任意のアイソタイプから選択することができる。通常、定常部は、ヒト化抗体が細胞毒性を示すことが望まれる相補的固定定常部であり、クラスは典型的にはＩｇＧ１である。このような細胞毒性が望まれない場合には、定常部はＩｇＧ２クラスのものであろう。ヒト化抗体は、１以上のクラス又はアイソタイプ由来の配列を含んでもよく、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常部を選択することは、当業者の範囲内である。ヒト化抗体のフレームワーク及びＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応している必要はなく、例えば、ドナーＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークは、少なくとも1つの残基の置換、挿入、又は欠失によって突然変異していてもよいので、その部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基はコンセンサス又は移入抗体のいずれにも対応しない。しかし、このような突然変異は、広範にはわたらないであろう。通常、少なくとも７５％、より頻繁には９０％、最も好ましくは９５％以上のヒト化抗体残基が、親のフレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ配列のものに対応するであろう。ヒト化抗体は、当該分野で知られた様々な技術を用いて産生することができ、限定するものではないが、ＣＤＲ移植（欧州特許ＥＰ２３９,４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７；及び米国特許第５，２２５,５３９号、第５,５３０，１０１号、及び第５，５８５,０８９号）、化粧張り（veneering）又は表面再処理（欧州特許ＥＰ５９２，１０６号及びＥＰ５１９，５９６号；Padlan,1991, Molecular Immunology 28 (4/5):489-498；Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7 (6): 805-814；及びRoguska et al., 1994, PNAS 91: 969-973）、チェインシャッフリング（chain shuffling）（米国特許第５，５６５,３３２号）、及び、例えば、米国特許第６，４０７,２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、ＷＯ９３１７１０５、Tan et al., J. Immunol. 169: 1119-25 (2002)、Caldas et al., Protein Eng. 13 (5):353-60 (2000)、Morea et al., Methods 20 (3): 267-79 (2000)、Baca et al., J. Biol. Chem. 272 (16):10678-84 (1997)、Roguska et al., Protein Eng. 9(10) : 895-904 (1996)、Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s (1995)、Couto et al., Cancer Res. 55(8) : 1717-22 (1995)、Sandhu JS, Gene 150(2) : 409-10(1994)、及びPedersen et al., J. Mol. Biol. 235 (3): 959-73 (1994)に開示の技術が挙げられる。しばしば、抗原結合を変更、好ましくは改良するために、フレームワーク領域内のフレームワーク残基がＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基と置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野で広く知られた方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用、並びに特定位置の異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較をモデリングすることにより確認する（例えば、Queen他、米国特許第５，５８５,０８９号;及びRiechmann et al., 1988, Nature 332: 323参照のこと）。
【０１５２】
さらに、ＡＲＰに免疫特異的に結合する抗体又はそれらの抗原断片は、同様に、ＡＲＰ又はそれらの抗原ペプチドを、当業者に広く知られた技術を用いて「模倣（mimic）」する抗イディオタイプ抗体を生じさせるのに利用することができる。（例えば、Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7 (5):437-444；及びNissinoff,1991, J. Immunol. 147 (8):2429-2438参照）。
【０１５３】
抗体をコードするポリヌクレオチド配列
本発明は、ＡＲＰ又はそれらの抗原断片に免疫特異的に結合する抗体又はそれらの断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供するものである。本発明は、高緊縮、中間、又は低緊縮ハイブリダイゼーション条件下で本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも含む。
【０１５４】
ポリヌクレオチドを入手して、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を当業界で知られた方法で決定してもよい。所望の抗原に対して免疫特異的な抗体のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋなどの文献又はデータベースから入手することができる。ＡＰＲのアミノ酸配列又はそれらの抗原断片が分かれば、この抗体又はそれらの断片（例えば、ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列は、当該技術分野で広く知られた方法を用いて決定することができる、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られたヌクレオチドコドンを、抗体をコードする核酸を生じさせるように構築する。このような抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成したオリゴヌクレオチドから構築されてもよく（例えば、Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17: 242に記載のように)、簡潔には、抗体をコードする配列の一部を含む重複するオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、次いで、連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を含む。
【０１５５】
或いは、抗体をコードするポリヌクレオチドを、好適な源から得た核酸から生じさせてもよい。もし、特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは利用可能ではないが、抗体分子の配列が知られている場合には、免疫グロブリンをコードする核酸を化学的に合成してもよく、或いは、配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅により、又は、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを同定するために、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングすることにより、好適な源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、又は本発明の抗体を発現するために選択されたハイブリドーマ細胞などの、抗体を発現する任意の組織又は細胞から作成したｃＤＮＡライブラリー、又はそれらから単離した核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から得てもよい。さらに、ＰＣＲにより作成した増幅した核酸を、当該分野で広く知られた任意の方法を用いて複製可能なクローニングベクターに入れてクローン化してもよい。
【０１５６】
抗体のヌクレオチド配列が一旦決定されれば、抗体のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列操作、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲなどとして当該技術分野で広く知られた方法を用いて操作して（例えば、Sambrook et al.,1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY、及び、Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照のこと。なお、これらの文献は両方共、その全体が本明細書に参照により援用される。）、様々なアミノ酸配列を含む抗体を作成し、例えば、アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を生じさせてもよい。
【０１５７】
具体的な実施形態では、１つ以上のＣＤＲを、ルーチンの組換えＤＮＡ技術を用いてフレームワーク領域内に挿入する。フレームワーク領域は、自然発生的又はコンセンサスフレームワーク領域であってもよく、好ましくはヒトフレームワーク領域であってもよい（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストとしてChothia et al., 1998, J. Mol. Biol.278 : 457-479参照）。好ましくは、フレームワーク領域の組合せにより形成したポリヌクレオチド及びＣＤＲは、特定の抗原に特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上述したように、１個以上のアミノ酸の置換がフレームワーク領域内でなされてもよく、好ましくは、アミノ酸置換により抗体とその抗原との結合を改良する。さらに、このような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生じさせる、１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換又は欠失を行ってもよい。他のポリヌクレオチドの変化も本発明に包含され、当該技術分野の技術の範囲内である。
【０１５８】
抗体の組換え発現
本発明の抗体、誘導体、類似体又はそれらの断片（例えば、本発明の抗体の重鎖若しくは軽鎖、又はそれらの部分、又は本発明の一本鎖抗体）の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。本発明の抗体分子又は抗体の重鎖若しくは軽鎖、又はそれらの部分（好ましくは、必ずしも必要ではないが、重鎖又は軽鎖可変領域を含む）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、抗体分子産生用のベクターを、当該分野で広く知られた技術を用いて組換えＤＮＡ技術により作成してもよい。例えば、米国特許第６，３３１，４１５号参照のこと。このように、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法について、本明細書に記載する。当業者に広く知られている方法を、抗体コード配列及び適当な転写及び翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築するのに用いることができる。これらの方法としては、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組み換えが挙げられる。したがって、本発明は、プロモーターに実施可能に結合した、本発明の抗体分子、抗体の重鎖又は軽鎖、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変領域又はそれらの部分、或いは重鎖又は軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供するものである。このようなベクターとしては、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列が含まれてもよく（例えば、国際公報ＷＯ８６／０５８０７及びＷＯ８９／０１０３６；及び米国特許第５，１２２,４６４号）、抗体の可変領域を重鎖全体、軽鎖全体、又は重鎖及び軽鎖全体の両方の発現ベクターのようなものでクローン化してもよい。
【０１５９】
発現ベクターを、通常の方法で宿主細胞にトランスフェクトし、その後、トランスフェクション細胞を通常の技術で培養して本発明の抗体を産生する。このように、本発明は、異種プロモーターに実行可能に結合された、本発明の抗体若しくはそれらの断片、又はそれらの重鎖若しくは軽鎖、又はそれらの一部、又は本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を包含する。二本鎖抗体の発現における好ましい実施形態では、以下に詳述するように、全免疫グロブリン分子の発現において、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞に同時発現させてもよい。
【０１６０】
様々な宿主発現ベクター系を利用して、本発明の抗体分子を発現させてもよい（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号、及び上記５．１．２節に記載のもの）。抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により増大させることができる（概説として、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)参照）。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能な場合には、宿主細胞の培養で存在するインヒビターレベルの増加により、マーカー遺伝子のコピー数を増加させるであろう。増幅された領域は抗体遺伝子に関連しているので、抗体の産生もまた増大するであろう（Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257）。
【０１６１】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、すなわち、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクター及び軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターを同時にトランスフェクトされてもよい。この２つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含有していてもよい。或いは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現することが可能な一個のベクターを用いてもよい。このような状況では、過剰の毒性の遊離の重鎖を避けるために、軽鎖を重鎖の前に配置すべきである（Proudfoot, 1986, Nature 322: 52；及びKohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2 197）。重鎖及び軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでもよい。
【０１６２】
本発明の抗体分子は組換え発現により一旦産生されたら、免疫グロブリン分子の精製における分野で知られた任意の方法により精製してもよく、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、特に、ＰｒｏｔｅｉｎＡに因んだ特異抗原に対する親和性による、及び、サイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又は、タンパク質の精製に関する任意の他の標準技術が挙げられる。さらに、本発明の抗体又はそれらの断片は、本明細書に記載された又は当該技術分野で知られた異種ポリペプチド配列と融合させて、精製を容易にしてもよい。
【０１６３】
ＡＲＰの構造予測及び機能解析
本発明は、アピコンプレクサの様々な種から得られるＡＲＰを提供するものである。したがって、ＡＲＰ又はそれらの断片の構造がアミノ酸配列に基づいて予想され得るか否かは重要であろう。構造予測、結晶学的データの解析、配列アラインメント、並びに、ホモロジーモデリング法は、ＢＬＡＳＴ、ＣｏｎｖｅｘのＣＨＡＲＭｍ  ｒｅｌｅａｓｅ  ２１．２、及びＱＵＡＮＴＡ  ｖ.３．３、（Molecular Simulations, Inc., York, United Kingdom）などの当該技術分野で利用可能なコンピュータソフトウェアプログラムを用いて達成し得る。例えば、ＡＲＰには、パラメータをデフォルトするＲＰＳ−ＢＬＡＳＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＢＬＡＳＴ）アルゴリズム設定により決定されるＣｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ  ｖ.１．６０）内の保存されたＰＲＯＦ（ｓｍａｒｔ  ００３９２又はｃｄ  ００１４８）領域を含むものがある。
【０１６４】
一旦ＡＲＰが同定されれば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差を含む標準的方法、又はタンパク質精製などの任意の標準技術により単離、精製してもよい。前述のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性及びｉｎ  ｖｉｖｏの生物学的機能を、任意の好適なアッセイを用いて評価してもよい（後述された免疫測定を含む）。
【０１６５】
或いは、一旦組換え宿主細胞により産生されるＡＲＰが同定されれば、ＡＲＰのアミノ酸配列は、例えば、自動アミノ酸シーケンサを用いたタンパク質の配列決定のための標準技術により決定することができる。
【０１６６】
ＡＲＰ配列は、親水性分析により特徴付けることができる（Hopp, T. and Woods, K., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78: 3824）。親水性プロファイルを用いて、ＡＲＰの疎水性及び親水性領域、並びにこのような領域をコードする遺伝子配列の対応領域を同定することができる。
【０１６７】
特定の二次構造を担うＡＲＰの領域を同定するために、二次構造解析（Chou, P. and Fasman, G., 1974, Biochemistry 13: 222）を行うこともできる。
【０１６８】
構造解析の他の方法も採用することができる。これらとしては、限定するものではないが、例えば、Ｘ線結晶学（Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13）及びコンピュータモデリング(Fletterick, R. and Zoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)が挙げられる。
【０１６９】
ＡＲＰ又はそれらの断片の機能的活性を、当該分野で知られた様々な方法により分析することができる。
【０１７０】
例えば、抗体への結合に関して、他の属由来のＡＲＰとある属由来のＡＲＰが結合又は競合する能力を評価する場合に、当該技術分野で既知の様々な免疫測定法を用いることができ、限定するものではないが、放射免疫測定などの技術を用いた競合及び非競合アッセイ系、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫放射定量測定法、ゲル内沈降反応、免疫拡散測定法、ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫測定法（金コロイド、酵素又は放射性同位体標識を例えば用いる）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集法（例えば、ゲル凝集法、赤血球凝集試験）、補体結合法、蛍光抗体法、タンパク質Ａアッセイ、及び免疫電気泳動法などが挙げられる。抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することにより検出することができる。或いは、一次抗体は、特に二次抗体が標識されている場合には、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合を検出することにより検出される。多くの方法が、免疫測定法の結合検出に関する技術分野で知られており、本発明の範囲内に含まれる。
【０１７１】
タンパク質の半減期は、タンパク質の安定性の測定法であり、タンパク質の活性が１／２低下するのに必要な時間を示す。ＡＲＰの半減期は、限定するものではないが、ＤＣアッセイ及びＮＫアッセイ（５．６節及び１２節参照）などの、ある期間に亘って被検体から得られるサンプル中のＡＲＰ活性を測定する任意の方法により決定することができる。サンプル中のＡＲＰ濃度に対する標準化は、ＡＲＰ投与後のある期間に亘って得られたサンプル中のＡＲＰ分子のレベルを測定するための抗ＡＲＰ抗体（又はＡＲＰを他の部分に融合する遺伝子の融合部分に対する抗体）を用いた免疫測定法、又は放射標識されたＡＲＰ分子の投与後被検体から得たサンプル中の放射標識されたＡＲＰ分子の検出により行うことができる。具体的な実施形態では、当該技術分野で知られた技術を、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＲＰの半減期を延長するのに用いることができる。例えば、アルブミン又は高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような不活性ポリマー分子を用いることができる。例えば、国際公報ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００、及びＷＯ０１／７７１３７；及び米国特許第６，５２８，４８５号参照。
【０１７２】
その他の方法が当業者に知られているであろうが、それは本発明の範囲内である。
【０１７３】
ＡＲＰ活性の特徴付け及び実証
本発明に従って用いられるＡＲＰの免疫刺激活性及び／又は抗癌活性は、当該技術分野で知られた方法により決定することができる。ある実施形態では、ＡＲＰの免疫刺激活性及び／又は抗癌活性を、限定するものではないが、当該技術分野で知られ、また、本明細書に参照により援用されるYamanaka, 2001, Microbiol Immunol 2001; 45 (7): 507-14に記載されたヒト腫瘍移植片を有する重症複合免疫不全マウスモデル又はヌードマウスなどの癌動物モデルなどの様々な実験動物モデルを用いることにより決定される。
【０１７４】
ＡＲＰの免疫刺激活性及び／又は抗癌活性を試験する様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが、ＡＲＰの精製工程に用いられる。本発明の手順及び組成は、ヒトに使用する前に、所望の治療又は予防活性に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏ、さらにｉｎ  ｖｉｖｏで試験されることも好ましい。
【０１７５】
一実施形態では、ＮＫ細胞アッセイを用いて、ＮＫ様細胞（１２．２節参照）のＡＲＰで誘導される細胞毒性を評価する。簡潔には、一例として、限定するものではないが、ＮＫ細胞アッセイを次のように実施することができる。大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）を、腫瘍細胞と様々な割合で（標的割合に対するエフェクター）４日間、３７℃、５％ＣＯ２で同時培養する。培地は、低濃度のＩＬ２に加えて、試験されるＡＲＰも含む。培養を４日目の終わりに終了し、ＭＴＴ細胞生死判別定量試験を用いて生体染色する（Mossman, T. J. Immunol. Methods 65: 55(1983)；及びSigma Chemical MTT (M5655) product application note参照）。培地を吸引し、残った細胞を洗浄し、ＭＴＴを含み、ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２で置換する。細胞をさらに４〜５時間、３７℃でインキュベートする。光吸収を、プレートリーダーを活用して測定する。光吸収の減少は、１ウェル当りの生存細胞数の減少（すなわち、細胞毒性）を示していた。ＨＣｌを含む２−プロパノールで培地の置換をすることにより、ＭＴＴを可溶化した後、光吸収を再び測定すると、ウェル全体に亘って均一な色を与える。ＮＫ誘導活性を、負（ＰＢＳ／ＢＳＡ）及び正（内部標準）対照群と比較して計算する。
【０１７６】
他の実施形態では、ＡＲＰ活性をＩＦＮγアッセイ（１２．４節参照）により測定する。一例として、限定するものではないが、培地へのＬＧＬによるＩＦＮγの産生及び放出は、次のように決定される。ＮＫ細胞で増強されたＬＧＬを単離し、１０％ウシ胎児血清、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、及びＩＬ２（１２５Ｕ／ｍＬ）を追加した２００μＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に、２．５又は５．０×１０５細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに蒔く。試験されるべきＡＲＰを加え、細胞を一晩培養し、その後、馴化培地（ＣＭ）を除去し、次いで、遠心して吸引された細胞を除く。次いで、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキットを用いて、所定量のＣＭのＩＦＮγを測定する。
【０１７７】
好ましい実施形態では、樹状細胞（ＤＣ）アッセイを用いて、ＤＣ活性化の指標として、単離したばかりの樹状細胞からのインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の放出を追跡調査する（１２．３節参照）。この活性は、ＡＲＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏのＮＫ−ＣＭＣ及びｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍活性の両方と高い相関関係がある。簡潔には、一例として、限定するものではないが、ＤＣアッセイは以下のように行うことができる。単離したばかりの樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋碑細胞、例えば、活性評価の１０時間以内にＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から単離）を、サイトカインを追加した培地に０．５×１０６細胞／ｍＬの密度で懸濁させる（ＧＭ−ＣＳＦ、１.０ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−４、１.０ｎｇ／ｍｌ；ＩＦＮｇ、３．０ｎｇ／ｍｌ；抗マウスＣＤ４０、０．５ｍｇ／ｍｌ）。次いで、樹状細胞（１００μＬ／ウェル）を、１００μＬ培地／ウェルに希釈したＡＲＰを含む９６ウェル組織培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気で一晩培養する。次いで、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋碑細胞）からのマウスＩＬ−１２の放出をＥＬＩＳＡを用いて測定する。
【０１７８】
ヒトで試験する前に、治療に使用する化合物を、限定するものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、雌ウシ、サル、ウサギなどの好適な動物モデル系で試験することができる。当該技術分野で知られ、広く用いられている主な動物モデルとしては、限定するものではないが、Hann et al., 2001, Curr Opin Cell Biol 2001 Dec; 13 (6):778-84に記載されたマウスが挙げられる。
【０１７９】
好ましい実施形態では、Ｓ−１８０細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８、バッチＦ４８０５）が、この系が動物及び培養液（血清含有及び無血清条件の両方で）の両方で増殖可能であるので、腫瘍モデルとして選ばれる。腫瘍は、組織培養から得られる細胞懸濁液の注射によりマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に定着させる。マウス１匹当り約１×１０６から３×１０６個の細胞を、腹腔内に注射する。腫瘍は、腹腔内の複数の部位で複数の充実性結節として現れたが、これは大半の動物で１０日〜１５日以内に死を引き起こす。動物の生存の観察に加えて、それらの状態を腫瘍の成長の進行として定性的に評価し、以下の段落に記載したような腫瘍指数を作成するのに用いる。
【０１８０】
腫瘍モデル実験の薬物活性の評価を確立するために、腫瘍モデル実験では、動物の観測調査と共にそれらの生存状況を組み合わせた指標を開発し得る。例えば、週に１回又は２回、マウスの腹腔内のＳ１８０腫瘍の存在、定着、末期的進行を触診する。以下の基準に従って、腫瘍の発生及び進行をこれらのマウスで評価する：「０」−触診された腫瘍なし；「１」−初発腫瘍が存在するように見える；小さいサイズ（〜１ｍｍ）；腹部膨張なし;「２」−腫瘍が定着したように見える；多少の腹部膨満；明らかな悪液質なし；「３」−腫瘍がよく定着し、顕著な腹部膨満、動物が悪液質を示す；及び、「４」−動物が死んだ。処置群の指数の値は、群中の個々のマウスの指数の平均である。
【０１８１】
さらに、当業者に知られた任意のアッセイを、癌及び／又は感染症の治療又は予防に関する本明細書に開示された組み合わせた治療法の予防及び／又は治療上の有用性を評価するために用いることができる。
【０１８２】
本発明の組成物の使用
本発明の組成物は、それらの必要のある被検体に投与して、免疫応答を刺激し、癌又は感染症（それらの一以上の症状を含む）を予防又は治療し、又はインターロイキン１２（ＩＬ−１２）処置に代わるものとして使用する。本発明の組成物は、免疫応答を誘導させるために、それらの必要な被検体に、単独又は免疫刺激に有用な１つ以上の他の治療法と組み合わせて投与してもよい。本発明の組成物は、被検体のＩＬ−１２の全身レベルを上昇させるために、それらの必要な被検体に、単独又は１つ以上の他の治療法と組み合わせて投与してもよい。本発明の組成物は、癌又は感染症を予防又は治療するために、それらの必要な被検体に、単独で、或いは、癌（限定するものではないが、下記５．８節に記載した予防又は治療薬が挙げられる）又は感染症（限定するものではないが、下記５．９節に記載した予防又は治療薬が挙げられる）の予防又は治療に有用な１つ以上の他の治療法と組み合わせて投与してもよい。
【０１８３】
一実施形態では、本発明は、癌又は感染症（１つ以上のそれらの症状を含む）を予防又は治療する方法であって、前記感染症はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染することによっては引き起こされず、このような治療又は予防が望まれる被検体に治療上又は予防上有効な量のＡＲＰを投与する過程を含む方法を提供するものである。他の実施形態では、本発明は、癌又は感染症（１つ以上のそれらの症状を含む）を治療又は予防する方法であって、前記感染症はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染することによっては引き起こされず、このような治療又は予防が望まれる被検体に１つ以上のＡＲＰをコードするヌクレオチド配列を含む治療上又は予防上有効な量の核酸を投与する過程を含む方法を提供するものである。他の実施形態では、本発明は癌又は感染症（１つ以上のそれらの症状を含む）を治療又は予防する方法であって、前記感染症はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染することによっては引き起こされず、このような治療又は予防が望まれる被検体にＡＲＰをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された治療上又は予防上有効な量の細胞を投与する過程を含み、前記ヌクレオチド配列が実行可能にプロモーターに結合されている方法を提供するものである。さらに別の実施形態では、本発明は、癌又は感染症（１つ以上のそれらの症状を含む）を治療又は予防する方法であって、前記感染症はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染することによっては引き起こされず、このような治療又は予防が望まれる被検体に治療上又は予防上有効な量のＡＲＰ及びＡＲＰ以外の治療上又は予防上有効な量の１つ以上の試薬を投与する過程を含む方法を提供するものである。具体的な実施形態では、治療される癌は卵巣癌である。具体的な実施形態では、感染症はアピコンプレクサ門の生物に感染することにより引き起こされる。他の具体的な実施形態では、感染症はアピコンプレクサ門の生物に感染することによっては引き起こされない。
【０１８４】
他の実施形態では、本発明は、前記被検体がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しない条件下で、有効量のＡＲＰを被検体に投与する過程を含む、免疫応答を刺激する方法を提供するものである。他の実施形態では、本発明は、被検体がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しない条件下で、１つ以上のＡＲＰをコードするヌクレオチド配列を含む有効量の核酸を被検体に投与する過程を含む、免疫応答を刺激する方法を提供するものである。他の実施形態では、本発明は、被検体がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しない条件下で、ＡＲＰをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質変換した有効量の細胞を被検体に投与する過程を含み、前記ヌクレオチド配列が実行可能にプロモーターに結合されている免疫応答を刺激する方法を提供するものである。さらに別の実施形態では、本発明は、被検体がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しない条件下で、有効量のＡＲＰ及びＡＲＰ以外の有効量の１つ以上の免疫刺激剤を被検体に投与する過程を含む、免疫応答を刺激する方法を提供するものである。具体的な実施形態では、被検体は鳥類である。他の具体的な実施形態では、被検体は鳥類ではない。
【０１８５】
さらに別の実施形態では、本発明は、被検体のインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の全身レベルを上昇させる方法であって、前記被検体はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染せず、このようなインターロイキン−１２レベルの上昇が望まれる被検体に有効量のＡＲＰを投与する過程を含む方法を提供するものである。他の実施形態では、本発明は、被検体のインターロイキン−１２の全身レベルを上昇させる方法であって、前記被検体はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染せず、１つ以上のＡＲＰをコードするヌクレオチド配列を含む有効量の核酸をインターロイキン−１２レベルのこのような上昇が望まれる被検体に投与する過程を含む方法を提供するものである。他の実施形態では、本発明は、被検体のインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の全身レベルを上昇させる方法であって、前記被検体はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染せず、インターロイキン-１２レベルのこのような上昇が望まれる被検体にＡＲＰをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質変換した有効量の細胞を投与する過程を含み、前記ヌクレオチド配列が実行可能にプロモーターに結合されている方法を提供するものである。さらに別の実施形態では、本発明は、被検体のインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の全身レベルを上昇させる方法であって、前記被検体はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染せず、インターロイキン−１２レベルのこのような上昇が望まれる被検体に有効量のＡＲＰ及びＡＲＰ以外の有効量の１つ以上の免疫刺激剤を投与する過程を含む方法を提供するものである。
【０１８６】
いくつかのアジュバントが、投与した抗原に対する免疫応答を高めるために実験的に用いられる。しかし、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）しか、ヒトに使用するアジュバントとしてＦＤＡに認可されていない。この不活性な無機分子は安全であることが示されているが、中程度に良好なアジュバントでしかない。他のアジュバント（例えば、カルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）、フロインドアジュバント、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ジニトロフェノール、ＱＳ−２１、ＣＡＰが動物研究に用いられ、又は現在ヒトで研究中である。残念ながら、これらは非特異的であるか（ＣＡＰ、ＱＳ−２１、ジニトロフェノール）又は毒性（ＢＣＧ、ＫＬＨ、フロインドアジュバント）がある。
【０１８７】
本発明のさらなる実施形態では、ＡＲＰの非常に強力な樹状細胞活性化特性により、ＡＲＰがワクチンの産生に関する優れたアジュバントを提供するための理想的候補となる。無機アジュバントは、免疫系の非特異的活性化因子とみなされる。これに対して、ＡＲＰは自然免疫の特異的活性化因子となるように思われる。したがって、ＡＲＰは樹状細胞の抗原提示活性を上方制御する遺伝的に事前にプログラムされた事象のカスケードを活性化させると同時に、即時型細胞応答（例えば、ＮＫ細胞）の活性化、さらに重要なことに、適応免疫の活性化（細胞性及び体液性の両方）に関連するサイトカインの放出を同時に生じる。この後者の機能は、記憶Ｔ細胞（細胞応答）及び循環抗体（体液性応答）の生成を可能にするであろう。
【０１８８】
本明細書に用いられる被検体は、動物、好ましくは哺乳動物をいう。ある実施形態では、被検体は家畜であり、限定するものではないが、ニワトリ、ブタ、ウシ、ウマ、及びヤギが挙げられる。ある実施形態では、被検体はペットであり、限定するものではないが、ネコ、イヌ、及びトリが挙げられる。好ましい実施形態では、被検体はヒトである。
【０１８９】
標的感染症
本発明の方法により治療又は予防することができる感染症は、これらに限定するものではないが、ウイルス、細菌、菌類、原生動物及び寄生虫などの感染体により引き起こされる。
【０１９０】
本発明の方法により治療又は予防することができるウイルス性疾患は、限定するものではないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純疱疹Ｉ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純疱疹II型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（echinovirus）、アルボウイルス、ハンタウイルス（huntavirus）、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、及びポリオウイルスにより引き起こされるものが挙げられる。本発明によれば、本発明の方法により治療又は予防される疾患は、ヒト免疫不全ウイルスによっては引き起こされない（ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−1）、又はヒト免疫不全ウイルスII型（ＨＩＶ−II）。例えば、疾患はＡＩＤＳではない。）。
【０１９１】
本発明の方法により治療又は予防することができる細菌性疾患は、限定するものではないが、放線菌、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、及びレジオネラなどの細菌により引き起こされる。
【０１９２】
本発明の方法により治療又は予防することができる真菌性疾患は、限定するものではないが、アスペルギルス症（aspergilliosis）、クリプトコッカス症（crytococcosis）、スポロトリクム症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、接合菌症、及びカンジダ症が挙げられる。
【０１９３】
本発明の方法により治療又は予防することができる原虫症は、限定するものではないが、レーシュマニア、コクジジオア（kokzidioa）、及びトリパノソーマ属などの原虫により引き起こされる。具体的な実施形態では、本発明の方法により治療又は予防することができる原虫疾患は、アピコンプレクサ原虫によっては引き起こされない。
【０１９４】
本発明の方法により治療又は予防することができる寄生虫病は、限定するものではないが、クラミジア及びアメーバ症などの寄生虫によって引き起こされる。
【０１９５】
標的とする癌
治療上の使用
ある実施形態では、本発明は、このような治療が望まれる被検体に、ＡＲＰを含む治療上有効な量の組成物を投与する過程を含む癌を治療する方法（それらの症状の改善を含む）を提供するものである。本発明の組成物は、例えば、一次、二次、三次又は四次の癌治療に用いられてもよい。ある実施形態では、本発明は、このような癌の１つ以上の通常の治療法に対して抵抗性のある患者の癌を治療する方法（それらの症状の改善を含む）であって、ＡＲＰを含む治療上有効な量の組成物を前記被検体に投与する過程を含む方法を提供するものである。治療に対応して、がん細胞の少なくともかなりの部分が死滅せず、或いは、それらの細胞分裂が停止しない場合には、癌は治療に抵抗性であると判断されるであろう。このような判断は、このような状況で当該技術分野に受け入れられている「抵抗性」の意味を用い、癌細胞に対する治療の効果を評価するための当該技術分野で知られた任意の方法によって、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかでなすことができる。具体的な実施形態では、癌細胞の数が有意に減少しないか、或いは増加した場合には、癌は抵抗性である。
【０１９６】
本発明は、既存のこのような癌の単独療法に抵抗性のある被検体の癌を治療する方法（１つ以上のそれらの症状の改善を含む）であって、前記被検体に治療上有効な量のＡＲＰを含む組成物及びＡＲＰ以外の治療上有効な量の１つ以上の治療薬を投与する過程を含む方法を提供するものである。本発明は、また、任意の他の抗癌治療（例えば、放射線療法、化学療法又は外科手術）と組み合わせて、他の治療に対する抵抗性が証明された患者に、ＡＲＰを含む組成物を投与することで癌を治療する方法を提供するものである。本発明は、また、癌患者又は１つ以上の他の癌治療を以前に行ったために免疫抑制された患者の治療方法を提供するものである。本発明は、また、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、及び／又は生物療法／免疫療法が毒性が強すぎることが判明したか、又は判明するかもしれない、すなわち、治療した被検体に容認できない又は耐え難い副作用を生じる場合に、代わりとなる癌の治療方法を提供するものである。
【０１９７】
具体的な実施形態では、癌治療のために、本発明のＡＲＰを含む組成物を、アピコンプレクサ門の生物に感染していない被検体に投与する。
【０１９８】
本発明により包含される方法によって治療することができる癌は、限定するものではないが、腫瘍、悪性腫瘍、転移、又は、癌とみなされるであろう制御されていない細胞増殖により特徴付けられる任意の疾患若しくは障害が挙げられる。癌は、原発性癌又は転移性癌であってもよい。本発明により治療することができる特異的癌は、限定するものではないが、表２に記載のものが挙げられる（このような障害の概説としては、Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphiaを参照のこと）。
【０１９９】
【表２】
2008500005.tif 000009
2008500005.tif 000010
2008500005.tif 000011
【０２００】
予防的使用
本発明の組成物は、限定するものではないが、表２に記載のそれらの障害などの腫瘍性又は悪性の状態への進行を阻止するために投与することができる。このような予防的使用は、異常増殖又は癌への進行を促進することが知られているか又は疑われている状態、特に、過形成、化生、又はさらにとりわけ、異形成からなる非腫瘍性の細胞増殖が生じた場合（このような異常増殖条件のレビューとしては、Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp.68-79参照のこと）に、必要とされる。過形成は、構造又は機能の有意な変化が無い、組織又は器官における細胞数の増加を伴う制御された細胞増殖形態である。ほんの一例として、子宮内膜の過形成は、しばしば子宮体癌の前に起こる。化生は、ある種類の成熟細胞又は完全に分化した細胞が別の種類の成熟細胞と置き換わる制御された細胞増殖形態である。化生は、上皮又は結合組織細胞で生じることができる。典型的な化生は、いくらか無秩序な上皮化生を伴う。異形成は、しばしば癌の前兆であり、上皮で主に見出される。それは、個別細胞の均一性及び細胞の構築の方向性の喪失を伴う、非腫瘍性の細胞増殖の最も無秩序な形態である。異形成細胞は、しばしば異常に大きい、濃く染まった核を有し、多形成を示す。異形成は、慢性的な刺激又は炎症が存在するところで特徴的に発生し、しばしば頚部、気道、口腔、及び胆嚢で見出される。
【０２０１】
過形成、化生又は異形成として特徴付けられる異常な細胞増殖の存在の代わりに又はそれに加えて、患者から入手した細胞のサンプルによりｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで示される、1つ以上の転換形質又は悪性の表現型の存在によって、本発明の組成物の予防上／治療上の投与の望ましさを示すことも可能である。このような転換形質の特徴としては、形態変化、より緩い基質接着、接触阻止の消失、足場依存性の消失、プロテアーゼ放出、糖輸送の増加、血清要求性の減少、胎児性抗原の発現、２５０，０００ダルトンの細胞表面タンパク質の消失などが挙げられる（転換形質又は悪性の表現型に関連する特徴としては、同上の８４〜９０頁も参照のこと）。
【０２０２】
具体的な実施形態では、白斑症、上皮の良性様過形成若しくは異形成病変、又はボーエン病、ｉｎ  ｓｉｔｕの癌腫が、予防処置の望ましさを示す前癌病変部である。
【０２０３】
他の実施形態では、繊維嚢胞性疾患（嚢胞性過形成、乳腺異形成、特に腺症（良性上皮過形成））が、予防処置の望ましさを示している。
【０２０４】
本発明の組成物の予防的使用は、癌を引き起こすであろう一部のウイルス性感染でも必要とされる。例えば、ヒトパピローマウイルスは子宮頸癌を引き起こす可能性があり（例えば、Hernandez-Avila et al., Archives of Medical Research (1997) 28 : 265-271参照）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）はリンパ腫を引き起こす可能性があり（例えば、Herrmann et al., J Pathol (2003) 199 (2): 140-5参照）、Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルスは肝臓癌を引き起こす可能性があり（例えば、El- Serag, J Clin Gastroenterol (2002) 35 (5 Suppl 2): S72-8参照）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）−ＩはＴ細胞白血病を引き起こす可能性があり（例えば、Mortreux et al., Leukemia(2003) 17 (1) : 26- 38参照）、及びヒトヘルペスウイルス−８感染はカポジ肉腫を引き起こす可能性がある（例えば、Kadow et al., Curr Opin Investig Drugs (2002) 3 (11): 1574-9参照）。
【０２０５】
他の実施形態では、１つ以上の以下の悪性の素因を示す患者が、有効量の本発明の組成物を投与することにより治療される。悪性（例えば、慢性骨髄性白血病に関するフィラデルフィア染色体、濾胞性リンパ腫に関するt (14 ; 18)、家族性ポリープ症又はガードナー症候群（大腸癌の危険性の前兆）、良性モノクローナル免疫グロブリン血症（多発性骨髄腫の危険性の前兆）、メンデル（遺伝的）遺伝形質を示す癌又は前癌性疾患の患者の一親等の親族（例えば、大腸の家族性ポリープ症、ガードナー症候群、遺伝性外骨症、多内分泌腺腫症、アミロイド産生の甲状腺髄様癌及びクロム親和細胞腫、ポイツ−イェーガー症候群、フォンレックリングハウゼンの神経線維腫症、網膜芽細胞腫、頚動脈小体腫瘍、皮膚黒色癌（cutaneous melanocarcinoma）、眼内黒色腫、色素性乾皮症、血管拡張性失調症、Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、白皮症、ファンコニ再生不良性貧血、及びブルーム症候群（Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 112-113参照）など）に関連する染色体転座、並びに発癌物質への暴露（例えば、喫煙、及び特定の化学物質の吸入又は接触）。
【０２０６】
他の具体的な実施形態では、本発明の組成物は、乳癌、大腸癌、卵巣癌、又は子宮頸癌への進行を阻止するためにヒトに投与される。
【０２０７】
遺伝子治療
一実施形態では、１つ以上のＡＲＰをコードする配列を含む１つ以上の核酸分子を、遺伝子治療の手段として、免疫応答を刺激するため及び／又は癌又は感染症を予防若しくは治療するために、被検体に投与する。遺伝子治療とは、発現された又は発現し得る核酸の被検体への投与によって行われる治療をいう。
【０２０８】
本発明に従って、当該分野で利用可能な遺伝子治療の任意の方法を用いることができる。典型的方法を以下に示す。
【０２０９】
遺伝子治療方法の一般的な概説としては、Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505；Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596；Mulligan, 1993, Science 260: 926-932；及びMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 11 (5): 155-215)を参照のこと。利用できる組換えＤＮＡ技術の分野で一般に知られた方法が、Ausubel et al. (eds. ), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY；及びKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。
【０２１０】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、１つ以上のＡＲＰをコードするヌクレオチド配列を含み、当該核酸配列は、好適な宿主中でＡＲＰを発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸は、ＡＲＰコード領域に実行可能に結合されたプロモーター、好ましくは異種（外来の）プロモーターを有し、当該プロモーターは誘導性又は恒常的であり、任意に組織特異的である。他の特定の実施形態では、ＡＲＰコード配列及び任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位で相同的組換えを促進する領域に隣接されており、それ故ＡＲＰ核酸の染色体内発現をもたらす核酸分子が用いられる（Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :8932-8935 ; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438）。
【０２１１】
核酸の患者への送達は、患者が直接核酸又は核酸担持ベクターに曝される場合には直接、或いは、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで最初に形質転換し、次いで患者に移植する場合には間接的のいずれかであってもよい。これらの２つのアプローチは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法としてそれぞれ知られている。
【０２１２】
具体的な実施形態では、核酸配列は、直接ｉｎ  ｖｉｖｏで投与され、そこで発現してコードされた生成物を生成する。これは、当該技術分野で知られた以下のような任意の多くの方法により達成し得る。例を挙げると、例えば欠陥若しくは弱毒レトロウイルス又はその他のウイルス性ベクターを用いて感染させることによる（米国特許第４，９８０，２８６号参照）といった、適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、それを投与して細胞内に含まれるようにすることによるもの、又は裸のＤＮＡの間接注射によるもの、又は微粒子照射（例えば、遺伝子銃、Biolistic、Dupont社製）若しくは脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクション試薬（transfecting agent）によるコーティング、リポソーム、微粒子若しくはマイクロカプセルへの封入の利用によるもの、又は核に入ることが知られているペプチドに結合させてそれらを投与することによるもの、受容体により媒介されるエンドサイトーシスにさらされるリガンドに結合させてそれを投与することによるもの（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432参照）（これは受容体を特異的に発現する標的細胞型に用いることができる）などがある。他の実施形態では、リガンドはエンドソームを破壊する融合性のウイルスペプチドを含み、核酸がリソソーム分解されるのを妨げることを可能にする、核酸−リガンド複合体を形成することができる。さらに他の実施形態では、特異的受容体を標的にすることにより、核酸をｉｎ  ｖｉｖｏで細胞特異的な取り込み及び発現の標的にすることができる（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０６１８０号、１９９２年４月１６日付（Wu他）；ＷＯ９２／２２６３５、１９９２年１２月２３日付け（Wilson他）；ＷＯ９２／２０３１６、１９９２年１１月２６日（Findeis他）；ＷＯ９３／１４１８８、１９９３年７月２２日付（Clarke他）、ＷＯ９３／２０２２１、１９９３年１０月１４日付（Young）参照）。或いは、核酸を細胞内に導入し、さらに、発現させるために、相同的組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み入れることができる（Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438）。
【０２１３】
一実施形態では、１つ以上のＡＲＰをコードする核酸を含むウイルスベクターが、本発明に従って用いられる（Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599参照）。レトロウイルスベクターは、例えば、遺伝子治療に用いることができ、ＡＲＰを被検体に送達することができる。これらのレトロウイルスは、ウイルスゲノムのパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの組込みに必要とされないレトロウイルスの配列を除去するように修飾されている。レトロウイルスベクターについての更なる詳細は、Boesen et al., 1994, Biotherapy 6: 291-302；Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651；Kiem et al., 1994, Blood 83 : 1467-1473；Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141；及びGrossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114に見出すことができる。
【０２１４】
遺伝子治療に用いることができる他のウイルスとしては、アデノウイルスベクターがある。アデノウイルスは、呼吸上皮に遺伝子を送達させるために特に魅力的な媒体である。アデノウイルスは、軽い疾患を引き起こす呼吸上皮に自然感染する。アデノウイルス型送達システムの他の標的は肝臓、中枢神経系、内皮細胞、及び筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。Kozarsky及びWilson（1993, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503）は、アデノウイルス型遺伝子療法の概説を公開している。Bout他（1994, Human Gene Therapy 5 : 3-10）は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクター.の使用について示している。遺伝子療法におけるアデノウイルスの他の使用例は、Rosenfeld et al., 1991, Science 252: 431-434；Rosenfeld et al., 1992, Cell 68 : 143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91: 225-234；ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１２６４９号；及びWang et al., 1995, Gene Therapy 2: 775-783に見出すことができる。好ましい実施形態では、癌を予防又は治療するためにＡＲＰを被検体に送達するために、アデノウイルスベクターは遺伝子治療に用いられる。
【０２１５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も、遺伝子療法に使用することが提案されてきた（Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０２１６】
遺伝子療法への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムに媒介されるトランスフェクション、又はウイルス感染などの方法により組織培養中の細胞に遺伝子を導入する過程を伴う。通常、導入方法としては、選択可能なマーカーの細胞への導入が挙げられる。次いで、細胞は選別下に置かれ、取り込んだこれらの細胞を単離して、導入された遺伝子を発現する。その後、これらの細胞は患者に送達される。
【０２１７】
この実施形態では、核酸は、得られる組換え細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与前に、細胞に導入する。このような導入は、当該分野で知られた任意の方法により実行することができ、限定するものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルス又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体により媒介される遺伝子導入、微小核体により媒介される遺伝子導入、スフェロプラスト融合などが挙げられる。外来遺伝子を細胞に導入する技術分野において、多くの技術が知られており（例えば、Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618；Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644; Cline, 1985,Pharmac. Ther. 29: 69-92参照）、受容細胞の必要な発生的及び生理的機能が破壊されないならば、本発明に従って用いてもよい。当該技術は、核酸は、細胞により発現可能であり、好ましくは遺伝的であり、且つその細胞の子孫により発現可能となるように、核酸の安定な細胞導入をもたらすべきである。
【０２１８】
得られる組換え細胞は、当該分野で知られている様々な方法により患者に送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹又は前駆細胞）は、好ましくは静脈内投与される。使用に想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者によって決定し得る。
【０２１９】
遺伝子療法を目的として核酸を導入可能な細胞には、任意の所望の利用可能な細胞型が含まれ、限定するものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球、自己癌細胞などの血液細胞；様々な幹細胞又は前駆細胞、特に、造血性の幹細胞又は前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られるようなものが挙げられる。
【０２２０】
好ましい実施形態では、遺伝子療法に用いられる細胞は、患者自身のものである。
【０２２１】
組換え細胞が遺伝子療法に用いられる一実施形態では、ヌクレオチド配列が細胞又はそれらの子孫により発現可能であるように、１つ以上のＡＲＰをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を細胞に導入し、次いで、組換え細胞を治療効果を得るためにｉｎ  ｖｉｖｏで投与する。具体的な実施形態では、幹細胞又は前駆細胞が用いられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単離し、維持することができる任意の幹細胞及び／又は前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って、潜在的に用いることができる（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／０８５９８、１９９４年４月２８日付；Stemple and Anderson, 1992, Cell 71: 973-985；Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229；及びPittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61: 771参照）。他の具体的な実施形態では、癌細胞が用いられる。
【０２２２】
具体的な実施形態では、遺伝子療法の目的で導入される核酸は、コード領域に実行可能に結合された恒常的、組織特異的、又は誘導性のプロモーターを含む。好ましい実施形態では、遺伝子療法を目的として導入される核酸は、転写の適当なインデューサーの存在又は不存在を制御することによって核酸の発現が制御可能となるように、コード領域に実行可能に結合された誘導性プロモーターを含む。
【０２２３】
その他の抗癌療法
本発明は、ＡＲＰを単独又はＡＲＰ以外の１つ以上の予防又は治療薬と組み合わせて含む組成物をそれらを必要とする被検体に投与する過程を含む癌を予防又は治療する方法を提供するものである。その他の治療又は予防薬としては、限定するものではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣薬、合成薬、無機分子、及び有機分子が挙げられる。有用であると知られているか、又は癌の予防若しくは治療に用いられていたか若しくは現在用いられている任意の薬剤又は治療法（例えば、化学療法、放射線療法、外科手術、ホルモン療法、及び／又は生物療法／免疫療法）を、本明細書に記載の発明に従って、本発明の組成物と組み合わせて使用することができる。
【０２２４】
このような薬剤の例（すなわち、抗癌剤）としては、限定するものではないが、ＤＮＡに相互作用する薬剤として、これらに限定するものではないがアルキル化剤（例えば、クロランブシル、シクロホスファミド、イソファミド（Isofamide）、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；チオテパなどのアジリジン；ブスルファンなどのメタンスルホン酸エステル；カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシンなどのニトロソ尿素；シスプラチン、カルボプラチンなどの白金錯体；マイトマイシンなどの生体内還元性アルキル化剤、及びプロカルバジン、ダカルバジン、及びアルトレタミン）；ブレオマイシンなどのＤＮＡ切断試薬；インターカレートするトポイソメラーゼII阻害剤、例えば、アムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンなどのインターカレーター、及びエトポシド及びテニポシドなどの非インターカレーター；インターカレートしないトポイソメラーゼII阻害剤、例えばエトポシド及びテニポシド（Teniposde）；及びＤＮＡマイナーグルーブバインダー、例えば、プリカマイシン（Plicamydin）が挙げられ；代謝アンタゴニストとしては、限定するものではないが、メトトレキセート及びトリメトレキセートなどの葉酸拮抗薬；フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ＣＢ３７１７、アザシチジン、及びフロクスウリジンなどのピリミジンアンタゴニスト；メルカプトプリン、６−チオグアニン、ペントスタチンなどのプリンアンタゴニスト；シタラビン及びフルダラビンなどの糖が修飾された類似体；及びヒドロキシ尿素などのリボヌクレオチド還元酵素阻害剤が挙げられ；チューブリンに相互作用する薬剤としては、限定するものではないが、コルヒチン、ビンクリスチン及びビンブラスチン、両方のアルカロイド及びパクリタキセル及びサイトキサンが挙げられ；ホルモン剤としては、限定するものではないが、エストロゲン、結合型エストロゲン及びエチニルエストラジオール及びジエチルスチルベステロール、クロロトリアニセン（Chlortrianisen）及びイデンストロール（Idenestrol）；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、及びメゲストロールなどのプロゲスチン；及びテストステロン、プロピオン酸テストステロンなどのアンドロゲン；フルオキシメステロン、メチルテストステロン；副腎皮質ホルモン剤、例えば、プレドニゾン、デキサメサゾン、メチルプレドニゾロン、及びプレドニゾロン；黄体形成ホルモンを放出するホルモン剤又はゴナドトロピン放出ホルモン拮抗薬、例えば酢酸ロイプロリド及び酢酸ゴセレリン；抗ホルモン抗体としては、限定するものではないが、タモキシフェンなどの抗エストロゲン薬、フルタミドなどの抗アンドロゲン薬；及びミトタン及びアミノグルテチミドなどの抗アドレナリン薬；サイトカインとしては、限定するものではないが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、及びウテログロビン（米国特許第５，６９６,０９２号）が挙げられ；抗血管新生剤としては、限定するものではないが、ＶＥＧＦ（例えば、その他の中和抗体（Kim他、１９９２年；Presta他、１９９７年；Sioussat他、１９９３年；Kondo他、１９９３年；Asano他、１９９５年、米国特許第５，５２０，９１４号）、可溶性受容体構築物（Kendall及びThomas、１９９３年；Aiello他、１９９５年；Lin他、１９９８年；Millauer他、１９９６年）、チロシンキナーゼ阻害剤（Siemeister他、１９９８年、米国特許第５，６３９，７５７号、及び第５，７９２，７７１号）、アンチセンス戦略、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に対するＲＮＡアプタマー及びリボザイム（Saleh他、１９９６年；Cheng他、１９９６年；Ke他、１９９８年；Parry他、１９９９年）；ＷＯ９８／１６５５１に記載されたような拮抗作用を有するＶＥＧＦの変異体；その他の化学的分類の化合物、例えば、米国特許第５，９７２，９２２号に記載されているようなアンジオスタチン様４，９（１１）ステロイド及びＣ２１酸化ステロイドなどのステロイド；米国特許第５，７１２，２９１号及び第５，５９３，９９０号に記載のようなサリドマイド及び関連化合物、前駆物質、類似体、代謝物及び加水分解生成物；トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）及び血小板因子４（ＰＦ４）；インターフェロン及びメタロプロテイナーゼ（metalloproteinsase）阻害剤；メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）；抗侵入因子、レチノイン酸及びパクリタキセル（米国特許第５，７１６，９８１号）；ＡＧＭ−１４７０（Ingber他、１９９０年）；サメ軟骨抽出物（米国特許第５，６１８，９２５号）；アニオン性ポリアミド又はポリウレアオリゴマー（米国特許第５，５９３，６６４号）；オキシインドール誘導体（米国特許第５，５７６，３３０号）；エストラジオール誘導体（米国特許第５，５０４，０７４号）；チアゾロピリミジン誘導体（米国特許第５，５９９，８１３号）；及びＬＭ６０９（米国特許第５，７５３，２３０号）；アポトーシス誘導薬としては、限定するものではないが、ｂｃｒ−ａｂ１、ｂｃｌ−２（ｂｃｌ−１、サイクリンＤ１と異なる；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１４７４５、Ｘ０６４８７；米国特許第５，６５０，４９１号；及び第５，５３９，０９４号）及びＢｃｌ−ｘｌ、Ｍｃｌ−１、Ｂａｋ、Ａ１、Ａ２０などのファミリーメンバー、及びアンチセンスヌクレオチド配列（米国特許第５，６５０，４９１号；第５，５３９，０９４号；及び第５，５８３，０３４号）が挙げられ；免疫毒素及びcoaguligand、腫瘍ワクチン、及び抗体が挙げられる。
【０２２５】
本発明の方法に従って用いることが可能な抗癌剤の具体例としては、限定するものではないが、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン（ambomycin）；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド、アムサクリン；アナストロゾール；アンスラマイシン；アスパラギナーゼ；アスパーリン（asperlin）；アザシチジン；アザテパ（azetepa）；アゾトマイシン（azotomycin）；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；Ｃアクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー（carbetimer）；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン（carubicin hydrochloride）；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロランブシル；シロルマイシン（cirolemycin）；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジクォン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン;クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン（duazomycin）；エダトレキサート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン（elsamitrucin）；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール（erbulozole）；塩酸エソルビシン（esorubicin hydrochloride）；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプライン（etoprine）；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルオロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターロイキンＩＩ（組み換えインターロイキンＩＩ又はｒＩＬ２を含む）、インターフェロン  アルファ−２ａ；インターフェロン  アルファ−２ｂ；インターフェロン  アルファ−ｎ１；インターフェロン  アルファ−ｎ３；インターフェロン  ベータ−Ｉａ；インターフェロン  ガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプライン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン（mitocarcin）；ミトクロミン；ミトジリン（mitogillin）；マイトマルシン（mitomalcin）；マイトマイシン；ミトスパー（mitosper）；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン（peliomycin）；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシ���；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパーフォセート（sparfosate）ナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフル；塩酸テトキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン（trestolone acetate）；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン（vinepidine sulfate）；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンロイロシン（vinleurosine sulfate）；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン（vinrosidine sulfate）；硫酸ビンゾリジン（vinzolidine sulfate）；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンが挙げられる。その他の抗癌剤としては、限定するものではないが、２０−エピ−１,２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール（adecypenol）；アドゼレシン；アルデスロイキン；全ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス（amidox）；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管形成阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリクス；抗背側化形態形成タンパク質−１；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン剤；抗新生物薬；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グリシン酸アフィジコリン；アポトーシス遺伝子修飾因子；アポトーシス制御因子；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アシュラクリン（asulacrine）；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン（axinastatin）１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール（balanol）；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベータクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスパーミン（bisaziridinylspermine）；ビスナフィド；ビストラテン（bistratene）Ａ；ビゼレシン；ブレフレート（breflate）；ブロピリミン；ブトチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトセシン誘導体；カナリア痘ＩＬ-２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキサミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来の阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスパーミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン類（chlorlns）；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス−プロフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシン（collismycin）Ａ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン（cryptophycin）８；クリプトフィシンＡ誘導体；キュラシンＡ；シクロペンタントラキノン；シクロプラタム（cychoplatam）；サイペマイシン（cypemycin）；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ（decliximab）；デシタビン；デヒドロダイデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジキノン；ダイデムニンＢ；ｄｉｄｏｘ；ジエチルノルスパーミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステロイド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン（fluorodaunorunicin hydrochloride）；ホルフェニメクス；ホルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセタミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン類；イミキモド；免疫賦活ペプチド；インスリン様成長因子１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン類；インターロイキン類；イオベングアニン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール（ipomeanol），４−；アイロプラクト（iroplact）；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラライドＦ；ラメラリン−Ｎ  トリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸；レプトルスタチン（leptolstatin）；レトロゾール；白血病阻害因子；白血病アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン；レバミゾール；リアロゾール；線形ポリアミン類似体；脂肪親和性二糖ペプチド；脂溶性白金化合物；リソクリンアミド（lissoclinamide）７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソサントロン（losoxantrone）；ロバスタチン；ロキソリビン；ラートテカン（lurtotecan）；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；細胞溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン（merbarone）；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；不適正二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド（mitonafide）；マイトトキシン繊維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質Ａ＋ミコバクテリウム（myobacterium）細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫瘍サプレッサー１型療法；マスタード抗癌剤；ミカペルオキシド（mycaperoxide）Ｂ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン（myriaporone）；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド類；ナファレリン；ナグレスチプ（nagrestip）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ｎａｐａｖｉｎ；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレータ；窒素酸化物酸化防止剤；ニトルリン（nitrullyn）；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド類；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン（oracin）；口腔のサイトカイン誘導因子；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキザウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；多硫酸ペントサンナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（pentrozole）；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラ
セチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金−トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡベースの免疫変調成分；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン類；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン結合体；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン（rohitukine）；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノン（rubiginone）Ｂ１；ルボキシル；サフィンゴール；セイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣剤；セムスチン；老化誘導阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；情報伝達阻害剤；情報伝達調整因子；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプタートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（solverol）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクワラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スティピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン（sulfinosine）；超活性血管活性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ（suradista）；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；５−フルオロウラシル；ロイコボリン；タモキシフェンメチオダイド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフル；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロマイド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン（tetrazomine）；タリブラスチン（thaliblastine）；チオコラリン；トロンボポイエチン；トロンボポイエチン模倣剤；チマルファシン；チモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；錫エチルエチオプルプリン；チラパザミン；チタノセン２塩化物；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チロホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞誘導成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子治療；サリドマイド；ベラレソール；ベラミン；バーディン（verdins）；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンクサルチン（vinxaltine）；バイタクシン；ボロゾール；ザノテロン（zanoterone）；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及びジノスタチンスチマラマーが挙げられる。
【０２２６】
本発明は、癌細胞を破壊するためのｘ線、ガンマ線及びその他の放射線源の使用を含む放射線療法と組み合わせたＡＲＰを含む組成物の投与も包含する。好ましい実施形態では、放射線治療は、放射がリモートソースから向けられる外照射療法又は遠隔療法として施される。その他の好ましい実施形態では、放射線治療は放射線源が癌細胞又は腫瘤に近い身体内部に配置される内科治療又は近接照射療法として施される。
【０２２７】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、免疫応答を刺激する際、及び／又は癌の予防又は治療の際に、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、ＣＤ４０リガンド、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、その他のサイトカイン、抗ＣＤ４０抗体及び共刺激アゴニストと組み合わせて用いられる。具体的な実施形態では、本発明のＡＲＰは、これらの薬剤と共に相乗的な免疫刺激効果を示すであろう。
【０２２８】
具体的な実施形態では、限定するものではないが、P３２療法などの腹腔内放射線療法、全腹部及び骨盤放射線療法、シスプラチン、パクリタキセル（タキソール）又はドセタキセル（タキソテール）及びシスプラチン又はカルボプラチンの組合せ、シクロホスファミド及びシスプラチンの組合せ、シクロホスファミド及びカルボプラチンの組合せ、５−ＦＵ及びロイコボリンの組合せ、エトポシド、リポソームのドキソルビシン、ゲムシタビン或いはトポテカンなどの卵巣癌の治療に有用な１つ以上の予防上又は治療上有効な量のその他の薬剤と組み合わせて、ＡＲＰを含む予防上又は治療上有効な量の組成物を卵巣癌患者に投与する。特に好ましい実施形態では、本発明の予防上又は治療上有効な量の組成物は、白金に抵抗性の疾患が認められる患者に対し、一般にタキソールの投与と組み合わせて投与される。更なる実施形態は、白金に抵抗性の疾患が認められる患者にイホスファミド、シスプラチン製剤をベースにした併用投薬計画の失敗後の救急療法としてヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、及びそれらの腫瘍における細胞質内のエストロゲン受容体の検出レベルにある患者にタモキシフェンの投与を含む、難治性の卵巣癌患者の治療である。
【０２２９】
癌治療法並びにそれらの投薬量、投薬経路及び推奨される使用法は、当該技術分野で知られており、Physician's Desk Reference（第５６版、２００２年）のような文献に記載されている。
【０２３０】
その他の抗感染剤
本発明は、感染症を予防又は治療する方法であって、それらの必要な被検体に、ＡＲＰを単独で又はＡＲＰ以外の１つ以上の予防又は治療薬と組み合わせて含む組成物を投与する過程を含む方法を提供するものである。有用であると知られている、又は感染症の予防若しくは治療に使用されてきたか若しくは現在使用されている任意の薬剤又は治療法を、本明細書に記載の本発明に従って、本発明の組成物と組み合わせて用いることができる。
【０２３１】
このような細菌感染を治療するための薬剤の例としては、限定するものではないが、葉酸拮抗薬（例えば、マフェニド、スルファジアジン銀、琥珀酸スルファチアゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、ピリメタミン（pyrimethoamine）、トリメトプリム、コトリモクサゾール）、細胞壁合成の阻害剤（例えば、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、モノバクタム、バンコマイシン（vacomycin）、バシトラシン、クラブラン酸、スルバクタム、タゾバクタム）、タンパク質合成阻害剤（例えば、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、クロラムフェニコール、クリンダマイシン）、フルオロキノロン（例えば、シプロフロキサシン（ciproloxacin）、エノキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン）、ナリジクス酸、メセナミン、ニトロフラントイン、アミノサリチル酸、サイクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、ピラチナミド、リファンピン、クロファジミン、及びダプソンが挙げられる。
【０２３２】
ＡＲＰと組み合わせて用いることができる真菌感染を治療するための薬剤の例としては、限定するものではないが、アンホテリシンＢ、フルコナゾール、フルシトシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、グリセオフルビン、ミコナゾール、及びニスタチンが挙げられる。
【０２３３】
ＡＲＰと組み合わせて用いることができる原虫感染を治療するための薬剤の例としては、限定するものではないが、クロロキン、デヒドロエメチン、ジロキサニドフロエート、エメチン、メトロニダゾール、パラモマイシン、クロロキン、メフロキン、プリマキン、ピリメタミン、キニーネ、キニジン、メラルソプロール、ニフルティモックス、ペンタミジン、スラミン、スチボグルコン酸ナトリウム、ピリメタミン、及びキナクリンが挙げられる。
【０２３４】
ＡＲＰと組み合わせて用いることができる蠕虫（寄生虫）感染を治療するための抗蠕虫薬剤の例としては、限定するものではないが、イベルメクチン、メベンダゾール、ピランテルパモエート、チアベンダゾール、プラジカンテル、及びニクロサミドが挙げられる。
【０２３５】
ＡＲＰと組み合わせて用いることができるウイルス感染を治療するための抗ウイルス薬の例としては、限定するものではないが、アマンタジン、リバビリン、リマンタジン、アシクロビル、ファムシクロビル、フォスカーネット、ガンシクロビル、トリフルリジン、ビダラビン、ジダノシン（ｄｄＩ）、スタブジン（ｄ4Ｔ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＡＺＴ）、ラミブジン、アバカビル、デラビルジン、ネビラピン、エファビレンツ、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル及びインターフェロンが挙げられる。
【０２３６】
投与計画
本発明の予防及び／又は治療プロトコルの毒性及び有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死に至る量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある量）を決定するための細胞培養又は動物実験の標準的な製剤手順により決定できる。毒性と治療効果間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す予防及び／又は治療薬が好ましい。毒性の副作用を示す予防及び／又は治療薬を用いても良いが、非感染細胞に対する潜在的損害を最小化し、それにより副作用を低減するために、このような薬剤を感染組織部位に向ける送達システムは注意して設計すべきである。
【０２３７】
細胞培養試験及び動物試験から得られるデータは、ヒト使用のための予防及び／又は治療薬の用量範囲を決定するのに用いることができる。このような薬剤の用量は、毒性がわずか又は毒性の無いＥＤ５０を包含する血中濃度範囲内にあることが好ましい。用量は、採用した用量及び利用した投与経路によって、このような範囲内で変更してもよい。本発明に用いられる任意の薬剤では、治療に有効な量は、最初に細胞培養試験から見積もることができる（５．６節及び１２節参照）。用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を包含する循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルで決定されてもよい。このような情報は、ヒトで有用な用量をより正確に決定するのに用いることができる。例えば、血漿レベルは、高速液体クロマトグラフィーにより測定してもよい。
【０２３８】
特定の障害又は病状の治療に効果的な本発明の組成物量は、障害又は病状の性質に依存し、標準的臨床技術によって決定することができる。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路及び疾患又は障害の重症度にも依存し、施術者の判断及び各患者の状況によって決定する必要がある。
【０２３９】
本発明により提供されるヒト患者に静脈内投与するＡＲＰの用量は、好ましくは１００μｇ／ｋｇ体重未満、５０μｇ／ｋｇ体重未満、１０μｇ／ｋｇ体重未満、５μｇ／ｋｇ体重未満、１μｇ／ｋｇ体重未満、０．５μｇ／ｋｇ体重未満、０．１μｇ／ｋｇ体重未満、０．０５μｇ／ｋｇ体重未満、０．０１μｇ／ｋｇ体重未満、又は０．００１μｇ／ｋｇ体重未満である。好ましい実施形態では、ＡＲＰは一人当り一日に付き０．１μｇの用量で与えられる（又は約０．１４ｎｇ／ｋｇ体重）。
【０２４０】
インフルエンザウイルスの感染を治療する場合には、ヒトを治療するための用量は、マウス１匹当り約１０，０００ｎｇであると見出されているマウスの好適な用量から導くことができる。体重が異なることを考えると、ヒトで匹敵する用量は２８ｍｇであろう。本発明を用いたヒト患者におけるインフルエンザウイルス感染の治療では、用量は好ましくは約２．８ｍｇから約２８０ｍｇ、より好ましくは約５ｍｇから約１００ｍｇ、最も好ましくは約１０ｍｇから約５０ｍｇである。
【０２４１】
最初の総量を投与する前に、各患者は少量（例えば、処方された量の１／１００から１／１０）の本発明の組成物の皮下注射を受けて、任意の急性の過敏症を検出することが好ましい。注射部位を、試験後１〜２時間検査する。もし何の反応も検出されなければ、その後総量を投与する。
【０２４２】
本発明の組成物は、経口投与することも可能である。一実施形態では、アピコンプレクサ属（例えば、アイメリアテネラ）の無処置の胞子形成オーシストを飲料水と共に経口で与える。投与量は、原虫の異種間の感染力によるが、一例としては、単回投与で１００から１０，０００オーシストであってもよい。
【０２４３】
本発明の組成物は、様々な形態で投与することができる。一実施形態では、本発明の組成物は膜結合型のＡＲＰを含む。他の実施形態では、本発明の組成物は、組換えＡＲＰを発現している生きている又は死んでいる細菌を含む。他の実施形態では、本発明の組成物は、組換えＡＲＰを発現している特定の臓器に特異的な生細菌を含む（例えば、乳酸桿菌属は、腸組織で生存するであろうが、ある種の空気感染性非病原性細菌は、肺又は鼻腔などに特異的であろう）。
【０２４４】
投与法、処方及びキット
本発明は、有効量のＡＲＰを含む組成物を被検体に投与することによる治療及び／又は予防方法を提供するものである。好ましい態様では、ＡＲＰを精製する。被検体は、好ましくは動物であり、限定するものではないが、ウシ、ブタ、ニワトリなどの動物が挙げられ、また、好ましくは哺乳動物である。好ましい実施形態では、被検体は家畜であり、限定するものではないが、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ及びウマが挙げられる。他の実施形態では、被検体はペットであり、限定するものではないが、ネコ、イヌ、及びトリが挙げられる。他の好ましい実施形態では、被検体はヒトである。
【０２４５】
例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、組換え細胞による発現、受容体により媒介されるエンドサイトーシス（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432参照）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としてのＡＲＰ核酸の構築などの様々な送達システムが知られており、本発明の組成物を投与するのに用いることができる。導入方法としては、限定するものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内及び経口ルートが挙げられる。本化合物は、例えば、注入又は大量瞬時投与によるもの、上皮又は粘膜皮膚の上皮（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜など）を介した吸収によるものなどの任意の好都合な経路により投与してもよく、また、他の生理活性物質と共に投与してもよい。投与は、全身又は局所的であってもよい。
【０２４６】
具体的な実施形態では、治療の必要な領域に本発明の医薬組成物を局所的に投与することが望まれるであろう。これは、例えば、外科手術の間の局所注入により、例えば外科手術後の創傷包帯と併せた局所適用により、注射により、カテーテル手段により、座薬手段により、又はインプラント手段により達成するであろう。前記インプラントは、多孔性、非多孔性、又はゲル状物質のものであってもよく、シアラスティック膜（sialastic membrane）などの膜、又は繊維が挙げられる。一実施形態では、投与は悪性腫瘍又は腫瘍性若しくは前癌性組織の部位（又は前部位）に直接注射することによってもよい。
【０２４７】
他の実施形態では、特定の領域を標的にするためにＡＲＰのキメラ構造物が用いられる、すなわち、組成物の全身投与でさえ、選ばれた臓器が組成物の標的にされるであろう（例えば、ＡＲＰと融合した特定の種類の癌に対する抗体が、このキメラ構造物を腫瘍表面に送達させるであろう。）。
【０２４８】
具体的な実施形態では、例えばレトロウイルスベクターの使用による（米国特許第４，９８０，２８６号参照）といった、適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内に含まれるように投与することにより、或いは直接注射により、或いは微粒子照射（例えば、遺伝子銃；Biolistic、Dupont社製）、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクション試薬によるコーティングの利用により、或いは核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに結合させて投与することによる（例えば、Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 1864-1868参照）などにより、ＡＲＰ核酸をｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、そのコードされたタンパク質の発現を促進することができる。或いは、ＡＲＰ核酸を細胞内に導入し、相同組換えによって発現させるために宿主細胞ＤＮＡ内に組み入れることができる。
【０２４９】
本発明は、また、医薬組成物を提供するものである。このような組成物は、本発明の治療上有効な量の組成物、及び医薬上許容される担体又は賦形剤を含む。このような担体としては、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組合せが挙げられる。担体及び組成物は、無菌であってもよい。処方は、投与型に適応させる必要がある。
【０２５０】
本組成物は、所望により、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含むこともできる。本組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、又は粉末であってもよい。本組成物は、従来の結合剤及びトリグリセリドなどの担体を有する座薬として処方されることができる。経口製剤としては、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。
【０２５１】
好ましい実施形態では、本組成物は、ヒトへの静脈内投与に用いられる医薬組成物として通常の手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝液に入れた溶液である。必要な場合には、組成物は注射部位の痛みを和らげるために可溶化剤及びリグノカインなどの局所的麻酔薬も含んでもよい。一般的には、成分は別々又は単回投与形態で一緒に混合して、例えば、凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、活性物質の量が示してあるアンプル又はサシェなどの密閉した密封容器中で供給される。注入により組成物が投与される場合には、医薬品グレードの滅菌水又は生理食塩水を含む注入容器に分注し得る。組成物を注射により投与する場合には、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルを、投与前に成分を混合することができるように提供することができる。
【０２５２】
本発明の組成物は、中性又は塩型として処方し得る。医薬上許容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどの遊離アミノ基を用いて形成されるもの、及び、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものなどの遊離のカルボキシ基を用いて形成されるものが挙げられる。
【０２５３】
一実施形態では、精製したアピコンプレクサ門の生物を経口で与える。具体的な実施形態では、無処置のアピコンプレクサ属（例えば、アイメリアテネラなどのアイメリア種）の胞子形成オーシストを飲料水と共に経口で与える。
【０２５４】
従前に記載の処方に加えて、本発明の組成物はデポー製剤として処方されてもよい。このような長時間作用性の製剤は、埋め込み（例えば、皮下又は筋肉内に）又は筋肉内注射により投与されてもよい。したがって、例えば、本組成物は、好適なポリマー又は疎水性物質（例えば、許容可能な油のエマルジョン）又はイオン交換樹脂を用いて、或いは難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として処方してもよい。リポソーム及びエマルジョンは、親水性薬剤のためのよく知られた送達媒体又は担体の例である。
【０２５５】
本発明の組成物は、所望により、活性成分を含む１回以上の投与形態を含むことができる包装又はディスペンサ装置に入れて提供してもよい。包装としては、例えば金属又はブリスターパックなどのプラスチックフォイルを含む。包装又はディスペンサ装置には、投与の指示書が添えられていてもよい。
【０２５６】
本発明は、本発明の治療内容を実行するためのキットも提供する。このようなキットは、１つ以上の容器に、治療上又は予防上有効な量の本発明の組成物を医薬上許容可能な形態で含む。本発明のキットのバイアルに含まれる組成物は、例えば、滅菌生理食塩水、デキストロース溶液、又は緩衝溶液、又はその他の医薬上許容可能な滅菌流体と組み合わせた、医薬上許容可能な溶液の形態であってもよい。或いは、本組成物は、凍結乾燥又は乾燥させていてもよい。この例では、キットは、注射用に溶液を形成するために組成物を戻すために、任意にさらに容器中に医薬上許容可能な溶液（例えば、生理食塩水、デキストロース溶液など）、好ましくは滅菌されたものを含む。
【０２５７】
他の実施形態では、本発明のキットは、さらに製剤を注射するための針又はシリンジ、好ましくは滅菌形態で包装されたもの、及び／又は包装したアルコールパッドを含む。臨床家による又は患者による本発明の製剤の投与のために任意に指示書が含まれる。
【０２５８】
ある実施形態では、本発明は、１回の投与に十分な量の本発明の組成物を含む医薬製剤又は医薬組成物をそれぞれ含む複数の容器を含むキットを提供するものである。
【０２５９】
具体的な実施形態では、キットはＡＲＰを含む組成物を含む第１の容器；及び第１の容器のＡＲＰの投与前、同時、又は後に投与する場合に、各成分の単独投与の効果以上に全体の治療効果を改善するために有効な量、又は、各成分を単独で使用する場合に治療の副作用を減少させるために有効な量の異なる治療法を含む第2の容器を含む。好ましい具体的な実施形態では、本発明は、第１の容器に本発明の組成物を含み、第2の容器に精製したサイトカインを含む組成物を含むキットを提供するものである。
【０２６０】
化学療法薬、放射線療法、及びサイトカインなどの生物製剤／免疫治療薬などの治療法のための適当かつ推奨される投与量、処方、及び投与経路が当該分野で知られており、Physician's Desk Reference（第５６版、２００２年）のような文献に記載されている。
【０２６１】
製品
本発明は、最終梱包し、ラベルした医薬品も包含する。この製品は、ガラス製バイアル又はその他の密閉容器などの適当な器又は容器内に適当な回数分の投与形態を含む。非経口投与に好適な投薬形態の場合には、活性成分は滅菌してあり、粒子状物質を含まない溶液として投与するのに好適である。すなわち、本発明は非経口溶液及び凍結乾燥粉末の両方を含み、各々滅菌されており、後者は注射前に再組成するのに適している。或いは、単回投与形態は、経口、経皮、局所又は粘膜送達に適した固体であってもよい。
【０２６２】
好ましい実施形態では、単回投与形態は静脈内、筋肉内、又は皮下送達に好適である。したがって、本発明は、溶液、好ましくは滅菌され、各送達経路に適したものを含む。
【０２６３】
他の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、限定するものではないが、レシチン、タウロコール酸、及びコレステロールなどの生体適合性界面活性剤；又は、限定するものではないが、γグロブリン及び血清アルブミンなどのその他のタンパク質と共に容器に貯蔵されている。さらに好ましくは、本発明の組成物は、ヒト用途ではヒト血清アルブミンと共に貯蔵されており、また、獣医学用途ではウシ血清アルブミンと共に貯蔵されている。任意の理論に捉われないが、低濃度のＡＲＰは、プラスチック製又はガラス製容器の表面で変性される傾向にある。本明細書に記載の取扱い法及び貯蔵法によれば、容器表面のＡＲＰの損失を最小限に抑え、ＡＲＰを活性状態で保つであろう。当該技術分野で知られたその他の方法も使用することができる。Wang, International J. of Pharmaceutics, 185 : 129-188 (1999)参照。
【０２６４】
任意の医薬品と同様に、包装材料及び容器は、貯蔵及び輸送の間生成物の安定性を保護するために設計される。さらに、本発明の製品は、使用説明書又は医者、技術者、又は患者に、問題の疾患又は障害の適切な予防又は治療の仕方を助言するその他の情報提供材料を含む。すなわち、製品には、限定するものではないが、実際の投与量、観察方法（平均絶対リンパ球数、腫瘍細胞数、及び腫瘍サイズを観察するための方法など）及びその他の観察情報などの投与方法を示し、又は提案する説明手段が含まれる。
【０２６５】
さらに具体的には、本発明は、箱、ビン、チューブ、バイアル、コンテナ、噴霧器、吸入器、静注用（ｉ．ｖ．）バッグ、膜（envelope）などの包装材料；及び少なくとも前記包装材料内に含まれる単回投与形態の医薬品を１つ含む製品を提供するものである。本発明は、箱、ビン、チューブ、バイアル、コンテナ、噴霧器、吸入器、静注用（ｉ．ｖ．）バッグ、膜（envelope）などの包装材料；及び少なくとも前記包装材料内に含まれる単回投与形態の医薬品を各々含む製品を提供するものでもある。本発明はさらに、箱、ビン、チューブ、バイアル、コンテナ、噴霧器、吸入器、静注用（ｉ．ｖ．）バッグ、膜（envelope）などの包装材料；及び少なくとも前記包装材料内に含まれる単回投与形態の医薬品を各々含む製品を提供するものでもある。本発明は、さらに製剤を注射するための針又はシリンジ、好ましくは滅菌形態で包装されたもの、及び／又は包装したアルコールパッドを含む。
【０２６６】
具体的実施形態では、製品は包装材料並びに前記包装材料内に含まれる医薬品及び指示書を含み、前記医薬品はＡＲＰ、又はそれらの誘導体、断片、ホモログ、類似体及び医薬上許容される担体であり、前記指示書は癌を有する被検体を予防、治療又は管理する投与方法を示す。他の実施形態では、製品は、包装材料並びに前記包装材料内に含まれる医薬品及び指示書を含み、前記医薬品はＡＲＰ又はそれらの誘導体、断片、ホモログ、類似体、ＡＲＰ又はそれらの誘導体、断片、ホモログ、類似体以外の予防又は治療薬、及び医薬上許容される担体であり、前記指示書は癌を有する被検体を予防、治療又は管理する投与方法を示す。他の実施形態では、製品は、包装材料並びに前記包装材料内に含まれる２つの医薬品及び指示書を含み、第１の医薬品がＡＲＰ、又はそれらの誘導体、断片、ホモログ、類似体及び医薬上許容される担体であり、第２の医薬品がＡＲＰ又はそれらの誘導体、断片、ホモログ、類似体以外の予防又は治療薬であり、前記指示書は癌を有する被検体を予防、治療又は管理する投与方法を示す。
【０２６７】
治療の間の効果の観察
本発明のＡＲＰ組成物を用いた免疫療法が腫瘍性疾患の発生及び進行に与える影響は、当業者に既知の任意の方法により観察することができ、限定するものではないが、以下のものを測定する方法が挙げられる。ａ）細胞性免疫の評価として遅延型過敏症；ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞溶解性のＴリンパ球の活性；ｃ）腫瘍特異性抗原、例えば、癌胎児（ＣＥＡ）抗原値；ｄ）コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンなどの技術を用いた腫瘍の形態変化；ｅ）危険性の高い被検体の特定の癌に対する危険性の推定バイオマーカーのレベルの変化、及びｆ）超音波診断器を用いた腫瘍の形態の変化。
【０２６８】
遅延型過敏性皮膚試験
遅延型過敏性皮膚試験は、抗原に対する全体的な免疫適格性及び細胞性免疫が重要である。一連の共通の皮膚抗原に対し反応できないことをアネルギーという（Sato, T., et al, 1995, Clin.Immunol. Pathol., 74: 35-43）。
【０２６９】
皮膚試験の適切な技術としては、使用前に抗原を４℃で滅菌して貯蔵し、光から保護し、且つ使用前に短時間で再構成させることが必要である。２５ゲージ針又は２７ゲージ針により、抗原の皮下よりむしろ皮内投与を確実にする。抗原の皮内投与後２４時間から４８時間に、最大規模の紅斑及び硬結の両方を物差しで測る。任意の投与された抗原又は抗原群に対する機能低下が、より高い濃度の抗原を用いて試験するか、又は、不明瞭な状況下では、介在する試験を用いた試験の繰り返しにより確認される。
【０２７０】
細胞傷害性Ｔ細胞のＩｎ  Ｖｉｔｒｏでの活性化
Ficoll-Hypaqueの勾配遠心技術により単離されたＴリンパ球由来の末梢血８×１０６個を、１０%ウシ胎児血清を含む３ｍｌ  ＲＰＭＩ培地中で、４×１０６個のマイトマイシンＣで処置した腫瘍細胞を用いて再刺激する。ある実施形態では、３３％の二次的に混合したリンパ球細胞上清又はＩＬ−２が、Ｔ細胞増殖因子源として培地に含まれる。
【０２７１】
免疫化後の細胞傷害性Ｔ細胞の一次応答を測定するために、Ｔ細胞を、刺激物質である腫瘍細胞無しに培養する。他の実施形態では、Ｔ細胞を抗原性の異なる細胞で再刺激する。６日後、培地の細胞障害性について４時間の５ｌＣｒ放出アッセイで試験する。自然発生的な５１Ｃｒ放出は、２０％未満の値に到達するはずである。抗ＭＨＣクラスＩ遮断作用では、Ｗ６／３２ハイブリドーマの１０倍に濃縮された上清を最終濃度１２．５%となるように試験物に加える（Heike M., et al., J. Immunotherapy, 15: 165-174）。
【０２７２】
腫瘍特異的抗原のレベル
全ての腫瘍上の独自の腫瘍抗原を検出するのは不可能であるかもしれないが、多くの腫瘍は、腫瘍と正常細胞を区別する抗原を提示する。モノクローナル抗体試薬は、抗原の単離及び生化学的特徴付けを可能とし、非形質転換細胞と形質転換細胞とを区別し、形質転換細胞の細胞系譜を定義するための診断上有益であった。最も良く特徴付けられているヒト腫瘍関連抗原は、腫瘍胎児抗原である。これらの抗原は胚形成の間に発現されるが、正常な成人組織では検出されないか、又は検出するのが非常に困難である。典型的抗原は、正常な成人大腸細胞では見出されないが、胎児の腸及びヒト大腸癌細胞で見出される糖タンパク質である、癌胎児抗原（ＣＥＡ）である。ＣＥＡは、大腸癌細胞から脱落して、血清で見出されるので、血清中の抗原の存在を利用して大腸癌の患者を選別できると最初は考えられていた。しかし、膵臓癌及び乳癌などの他の腫瘍を有する患者もＣＥＡの血清値を上昇させた。したがって、治療を受けている癌患者のＣＥＡレベルの下降及び上昇を観測することが腫瘍の進行及び治療に対する応答を予想するのに有用であることが証明された。
【０２７３】
いくつかの他の腫瘍胎児抗原は、ヒトの腫瘍を診断し、観察するのに有用であり、例えば、ウシの肝臓及び卵黄嚢の細胞で正常に分泌された、α−フェトプロテイン、α−グロブリンは、肝臓及び胚芽細胞腫瘍の患者の血清で見出され、疾病状態のマーカーとして利用できる。
【０２７４】
コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン
ＣＴは、依然として癌の精密な診断技術の選択肢である。ＣＴは、転移の検出では、任意の他の画像技術よりも感度が高く、特異的であることが証明されている。
【０２７５】
推定バイオマーカーの測定
特定の癌の危険性に対する推定バイオマーカー値を、本発明の複合分子の効果を観測するために測定する。例えば、前立腺癌の危険性の高い被検体では、血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を、Brawer, M. K., et. al., 1992,J.Urol., 147: 841-845、及びCatalona, W. J., et al.,1993, JAMA, 270: 948-958に記載の手順により測定する。又は、結腸直腸癌の危険性のある被検体では、ＣＥＡを５．１０．３節に上記したように測定する。また、乳癌の危険性の高い被検体では、エストラジオールの１６位の水酸化を、Schneider, J.et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:3047-3051に記載の手順により測定する。
【０２７６】
超音波診断器
超音波診断器は、依然として癌の精密な診断技術の代替的選択肢である。
【０２７７】
治療の間の副作用の観察
ＡＲＰの単独又は他の治療法（他の治療薬又は予防薬を含む）と組み合わせた使用の間の任意の副作用を観察することも好ましい。癌治療又は感染症の治療の間の化学療法の副作用の例としては、限定するものではないが、胃腸毒性、例えば限定するものではないが早期発生型及び遅発型の下痢及び膨満；嘔気；嘔吐；摂食障害；白血球減少症；貧血；好中球減少；無力症；腹部痙攣；熱；痛み；体重の減少；脱水症；脱毛症；呼吸困難；不眠症；眩暈、粘膜炎、口腔乾燥症及び腎不全、また同様に、便秘、神経及び筋肉作用、腎臓及び膀胱への一時的又は持続的損傷、インフルエンザ型の症状、体液鬱滞、及び一時的又は持続的不妊症が挙げられる。放射線療法の副作用としては、限定するものではないが、疲労、口内乾燥、及び食欲減退が挙げられる。その他の副作用としては、胃腸毒性、例えば限定するものではないが早期発生型及び遅発型の下痢及び膨満；嘔気；嘔吐；摂食障害；白血球減少症；貧血；好中球減少；無力症；腹部痙攣；熱；痛み；体重の減少；脱水症；脱毛症；呼吸困難；不眠症；眩暈、粘膜炎、口腔乾燥症及び腎不全が挙げられる。生物療法／免疫療法からくる副作用としては、限定するものではないが、投与部位での発疹又は隆起、例えば熱、寒気及び疲労などのインフルエンザ型の症状、消化管異常及びアレルギー反応が挙げられる。ホルモン療法からくる副作用としては、限定するものではないが、嘔気、不妊問題、鬱病、食欲減退、眼疾患、頭痛、及び体重変動が挙げられる。さらに、患者が典型的に経験する望まれない作用は多くあり、当該技術分野で知られている。Physician's Desk Reference（第５６版、２００２年）に多くのものが記載されている。
【実施例１】
【０２７８】
ウシの小腸抽出物からのＡＲＰの精製
材料
実施例で用いられる腸の供給源：大型動物の腸を、新鮮な食肉処理をされたウシから得た。これらは、通常、Michigan州AshleyのBellingar Packing社から入手した。ラット及びマウスの腸は、Indiana州IndianapolisのHarlan Industries社から購入した、Sprague Dawleyラット又はBALB-cマウスから入手した。ブタの腸は、Bellingar Packing社から入手した。ブタ及びウシの腸には、Michigan州HowellのBain's Packing & Refrigeration社から入手したものもあった。
【０２７９】
方法
ＡＲＰの濃縮又は単離
抽出及び遠心分離
盲腸に近いウシの小腸回腸切片（２５フィート又は４０フィート）を屠殺直後の動物から切除した。各切片を、その長さ方向に細長く切り、内容物を十分に洗浄した。洗浄は、食肉処理場で、シプロフロキサシン（１０ｍｇ／Ｌ）を加えたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で開始し、研究室で終了した。組織は氷上で研究室に輸送し、そこで１フィートの細長い片に切断し、外側の脂肪性沈着物を除去した。各切片をシプロフロキサシンを含むＰＢＳ溶液中で洗浄した。次いで、これをシプロフロキサシンを含まないＰＢＳを含む６つのビーカー（氷上）を介して連続洗浄した。各切片を十分に拭いて過剰の流体を除き、次いで、軟部組織を漿膜の外皮から擦り取り、漿膜を廃棄した。軟部組織を家庭用電動式小型フードプロセッサで、プロセッサの開始と停止を１０回繰り返して５０ｍＬの分量に細かく刻んだ。等量の冷３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを加え、テフロン製の乳棒で５５ｍＬのガラス製ホモジナイザー用チューブ中で混合物をホモジナイズした。ホモジナイザーで５回上下動後、材料を冷蔵したＳＳ−３４ Sorvol rotor中で１８，０００ｒｐｍ（２５，０００Ｇ）で遠心分離にかけた。得られた上清液を、滅菌ステンレス製９０ｍｍフィルターホルダーに装着した２層のMillipore社製のプレフィルター（＃ＡＰＩ５０７５００）を通して、前ろ過し、懸濁液中の脂質微粒子を除いた。ろ液は、液体窒素中で瞬間凍結させ、−８０℃で凍らせて貯蔵した。
【０２８０】
前ろ過したＢＥＸの予備試験
調製：
（ａ）１０×ＰＢＳから２．０Ｌの１×ＰＢＳ緩衝液を調製し、４℃に順応させる。
（ｂ）柔らかくなるまで逆浸透脱イオン水中で、適当な数（予備試験する腸の数よりも１つ多い）の長さ１００ｍｍ、幅１０ｍｍの再生セルロース透析膜、ＭＷＣＯ  ６−８０００を浸漬する。
（ｃ）前ろ過したＢＢＸ及び腸の混合物の一定量の腸に付き１．２ｍｌを解凍する。
【０２８１】
活性試験：
（ａ）１．０mの各腸抽出物及び腸の混合物を、１LのＰＢＳで４℃で３時間透析する。
（ｂ）緩衝液を変えて、一晩透析する。
（ｃ）透析液を滅菌１．２ｍｌのクリオチューブに移す。
（ｄ）透析したストック液のＢＢＸ１：１０に希釈することにより（１部のＢＢＸに９部の滅菌０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを加える）、樹状細胞活性試験用に各試料を準備する。各ストック液からのものを連続的に１：２の希釈を４回する（５０μｌストック液に５０μｌの０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳを加える）４×。
（ｅ）図により予備試験試料を所定の活性を有する適当な予備試験対照と比較する。
（ｆ）瞬間凍結し、−８０℃のフリーザーで予備試験の残余分を貯蔵する。
【０２８２】
プロセス管理：
予備試験対照の２０％未満しか樹状細胞活性を生じない腸からの抽出物は廃棄する。
【０２８３】
Procipitate（商標）及びCleanascite（商標）
Ligochem, Inc.社製の２つの市販の大量処理生成物（Cleanascite（商標）及びProcipitate（商標））を用いて、非活性高分子の最初の減少を可能にした。抽出物３部を、脂質、浮遊細胞、細胞残屑及び粘液性不純物を選択的に除く非イオン性吸着剤である、Cleanascite（商標）１部で処理した。遠心分離後、得られた上清を、合成の非水溶性アニオン性高分子電解質であるProcipitate（商標）を用いて、上清４部対Procipitate（商標）１部の割合で処理して、選択的にタンパク質を除いた。これを製造元の提言に従って低速で回転させ、上清を更に精製に付した。
【０２８４】
限外ろ過
各週毎のバッチの少量の試料を、試験用にAmicon攪拌セル（８００シリーズ）を用い、最初に３００ｋＤの円盤膜を適用して３００ｋＤより大きいサイズの不純物を除き、次いで、１０ｋＤの円盤膜を適用して１０ｋＤ未満の不純物を除くと同時に試料を濃縮して、精製した。この手順の間、リン酸緩衝生理食塩水を用いて＞３００ｋＤの保持物質（retentate）を洗浄した。得られた１０から３００ｋＤの試料を、ＮＫアッセイ及び／又はマウスで試験した。
【０２８５】
試料が活性であった場合は、バッチ全体を大規模手順で処理した。溶液をMillipore社製のPelicon（商標）限外ろ過システムの３００ｋＤのろ板を通してろ過し、その３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ洗浄液と共に＜３００ｋＤの流入（flow-through）物質を、１０ｋＤ円盤膜を備えたAmicon（商標）攪拌セルで濃縮した。ステージ１  ＢＥＸ（ウシの抽出物）と示される得られた物質を、Serum Acrodisc（商標）０．２２μｍ（Gelman社製カタログ＃４５２５）フィルターを用いて滅菌ろ過し、瞬間凍結し、−８０℃で保存して、ステージ２  ＢＥＸ精製を待った。
【０２８６】
Superdex（商標）サイズ排除
ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、ステージ１からステージ２にさらに精製した。１２００ｍｌのカラム（Amicon  カタログ＃９６４４１００）に、Superdex-75調製グレード（Pharmacia社製  カタログ＃１７−１０４４−０１）を充填し、１５ｍＭリン酸ナトリウム、１２０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０（ＰＢＳ）で平衡化する。ＰＢＳ緩衝液を、フラクションの定組成溶離に用いた。搭載に先立ち、ステージ１のＢＥＸをCentriPrep-10（商標）（Amicon  カタログ＃４３０４）で３５〜４０ｍｇ/ｍｌに濃縮し、Serum Acrodisc（商標）０．２２μｍ（Gelman社製  カタログ＃４５２５）を用いてろ過した。グリセロールを最終濃度が５％になるように加えて、カラム体積の０．１〜１％（１．２〜１２ｍｌ）で試料をカラムに搭載した。次のクロマトグラフィーのパラメータを用いた。２８０ｎｍ、吸収最大測定限界１．０、流速４．０ｍｌ／分（１８〜２６ｐｓｉ）、チャートスピード５ｃｍ／ｈｒ及びフラクションサイズ２．０分／８．０ｍＬ。
【０２８７】
活性フラクションを貯め、ＹＭ１０円盤膜（Amicon  カタログ＃１３６３２）を備えたAmicon Stir Cell（商標）型番号８２００（Amicon  カタログ＃５１２３）を用いて〜４０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ステージ２を滅菌ろ過し、−８０℃で次の精製工程に備えて貯蔵した。
【０２８８】
ＤＥＡＥ
ＤＥＡＥ−Sepharoseカラム（１．５×６ｃｍ、DEAE-Sepharose Fast Flow、Pharmacia Biotech Inc.社製、Piscataway、ＮＪ）を、３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化した。ＰＢＳのSuperdex75（商標）（ステージ２）から得た試料を、 カラムに適用した。次いで、カラムを１００ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、その後２００ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液で洗浄した。カラムを 約１２０ｍｌの０．３Ｍ  ＮａＣｌを含むＨｅｐｅｓ緩衝液を用いて定組成溶離した。フラクションを２．５ｍｌ／フラクションで４分ごとに回収した。カラムをさらに０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓで溶離した。フラクションをＮＫ媒介細胞毒性試験及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【０２８９】
ＡＲＰの精製：改良法
抽出及び遠心分離
６．２．１節の同工程を参照。
【０２９０】
前ろ過したＢＥＸの予備試験
６．２．１節の同工程を参照。
【０２９１】
硫酸アンモニウム分画
抽出上清を、固体化学を利用して４℃で４５％硫酸アンモニウムに注ぎ、１時間攪拌した。これを２５０ｍＬの遠心瓶で１３，０００ＲＰＭ（１７，３００Ｇ）で３０分間、また、４０ｍＬの遠心チューブで１５，０００ＲＰＭ（１７，５００Ｇ）で２０分間遠心分離にかけた。上清をデカントして４Ｌのガラスビーカーに移し、ペレットを廃棄した。上清を固体硫酸アンモニウムを用いて飽和率８０％にし、上記のように遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを、瓶又はチューブ内で完全に懸濁した後、１．５Ｍ硫酸アンモニウム／５０ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ６．８）に溶解した。溶解しない物質を、２５０ｍＬ遠心瓶で１０，０００ＲＰＭ（１０，２００Ｇ）で３０分間遠心分離して除いた。上清を滅菌ステンレス製９０ｍｍフィルターホルダーに装着した２層のMillipore社製のプレフィルター（ＡＰＩ５０７５００）を通して、前ろ過した。各工程後、試料を品質管理検査した。
【０２９２】
疎水性相互作用カラム（以下「ＨＩＣ」）段階溶離クロマトグラフィー
３００ｍＬのphenyl sepharose 6 fast flow（high substitution）−Amersham Pharmacia Biotech社製１７−０９７３−０５を充填した５ｃｍ×２０ｃｍのクロマトグラフィーカラムをｐＨ６．８の１．５Ｍ硫酸アンモニウム／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した。室温で、前ろ過した硫酸アンモニウムで処理したＢＢＸを流速〜１８ｍＬ／分でカラムでポンピングした。濁らなくなるまでカラムから流出液を回収した（〜１２００ｍＬ）。カラムを９００ｍＬの１．５Ｍ硫酸アンモニウム／５０ｍＭリン酸ナトリウムで洗浄した。活性物質を７００ｍｌの０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で溶離した。
【０２９３】
溶離した物質を、４℃で４Ｌの０．２Ｍ  ＮａＣｌ／１０ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７．４）で透析し、３〜６時間後に緩衝液を取り替え、次いで一晩最終的な透析をして、ＤＥＡＥクロマトグラフィー用に準備した。
【０２９４】
ＤＥＡＥ工程−溶離クロマトグラフィー
試料を０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４で透析後、試料を０．４５μｍのメンブランを通してろ過して微粒子を除き、次いで、DEAE-Sepharoseカラム（０．５×８ｃｍ）にかけた。カラムを約８００ｍＬの同じ緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で洗浄した。２８０ｎｍの吸収がベースラインに至った場合に、結合した物質を約４００ｍＬの溶離緩衝液（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．４）で溶離した。溶離したフラクションを、ＹＭ  １０メンブランを備えたAmicon stir cellにより濃縮して約２０ｍＬにした。試料を二等分に分割し、液体窒素中で瞬間凍結して、次いで−８０℃で貯蔵した。
【０２９５】
Superdex（商標）サイズ排除
ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、ＤＥＡＥ段階溶離で物質をさらに精製した。１２００ｍＬのカラム（Amicon  カタログ＃９６４４１００）に、Superdex- 75調製グレード（Pharmacia社製  カタログ＃１７−１０４４−０１）を充填し、１５ｍＭリン酸ナトリウム、１２０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０（ＰＢＳ）で平衡化する。ＰＢＳ緩衝液を、フラクションの定組成溶離に用いた。搭載に先立ち、試料をSerum Acrodisc（商標）０．２２μｍ（Gelman社製  カタログ＃４５２５）を用いてろ過し、カラム体積の０．１〜１％（１．２〜１２ｍｌ）でカラムに搭載した。次のクロマトグラフィーのパラメータを用いた。２８０ｎｍ、吸収最大測定限界１．０、流速４．０ｍｌ／分（１８〜２６ｐｓｉ）、チャートスピード５ｃｍ／ｈｒ及びフラクションサイズ２．０分／８．０ｍＬ。試料を、液体窒素中で瞬間凍結して−８０℃で貯蔵した。
【０２９６】
Superdex（商標）試料の濃縮及びカルモジュリン除去
７つのバッチからの活性領域を解凍し、貯蔵したところ、典型的には約１，２００ｍＬを生じた。試料をGSA rotorで１０，０００ｒｐｍ（１０，２００Ｇ）で３０分間遠心分離して全ての沈殿を除いた。次いで、試料を０．４５μｍシリンジフィルターでろ過し、DEAE-Sepharoseカラム（０．３×５．５ｃｍ）にかけた。カラムを０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸Ｎａ、ｐＨ７．４（約２００ｍＬ）で洗浄した。結合した物質を、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で溶離した。タンパク質ピークを約５０〜６０ｍＬで回収し、１リットルの１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で一晩透析した。
【０２９７】
カルモジュリン及びその他のカルシウム結合タンパク質を除くために、ＨＩＣカラム（１．５×６ｃｍ）を１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で平衡化し、その後試料をカラムに搭載した。試料をかけた後、カラムを同じ緩衝液を用いて洗浄した。流入フラクションを回収したところ、約７５から８０ｍｌを構成した。カラムを同じ緩衝液（約１００ｍＬ）で洗浄し、次いで結合した物質を１ｍＭ  ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で溶離した。流入フラクションは、全てＤＣ活性を有しており、次の工程に用いた。
【０２９８】
ＨＩＣ勾配クロマトグラフィー
全高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」）をWaters Associates（Milford, MA）社製626 LC system及びLinear Instruments（Reno, Nevada）社製 200 Uvis absorbance detectorを用いて２８０ｎｍ（ＨＩＣ）又は２１５ｎｍ（ＤＥＡＥ及びＣ−８separations)のいずれかで行った。全化学物質は、特に断りのない限り、J. T. Baker（Phillipsburg, NJ）社から入手した超高純度バイオ試薬グレードである。
【０２９９】
試料の体積を測定し、同体積の３．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＣＳグレード、Mallinckrodt社製、Paris KY）溶液とｐＨ７．２の５０ｍＭリン酸緩衝液中で混合した。試料をＨＰＬＣの溶媒注入管を介してロードした。溶媒は、緩衝液ＡがｐＨ７．２の１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液であり、緩衝液ＢがｐＨ７．２の５０ｍＭリン酸緩衝液である。試料を、緩衝液Ａで平衡化した、粒子サイズ１３μｍ、２１．５×１５０ｍｍのPhenyl-5PWカラム（TosoHaas社製、Montgomeryville、PA）に、室温で、流速４ｍＬ／分でかけた。このとき、線形勾配は、０〜１００％緩衝液Ｂで９０分間かけて、４ｍＬ／分で行った。フラクションは、フラクションコレクター（ＬＫＢ−Ｆｒａｃ−１００、Pharmacia社製、Piscataway NJ）を用いて２．５分ごとに回収した。フラクションをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、ＤＣアッセイで評価した。活性フラクションを貯蔵し、Spectra/Por 1メンブラン透析用チューブ、６〜８０００ＭＷＣＯ（Fisher社製、Pittsburgh PA）でＰＢＳを２回取り替えて透析した。
【０３００】
ＤＥＡＥ勾配クロマトグラフィー
試料は、ＨＰＬＣの溶媒注入管を介してロードした。溶媒は、緩衝液ＣがｐＨ７．２のＰＢＳであり、緩衝液ＤがｐＨ７．２の０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む１５ｍＭリン酸緩衝液である。試料を、緩衝液Ｃで平衡化した、１０μｍのビーズ、８×７５ｍｍ（TosoHaas社製）のＤＥＡＥ−５ＰＷカラムに、室温で、１ｍＬ／分でかけた。安定なベースラインが確立されるまで、カラムに緩衝液Ｃを流した。このとき、線形勾配は、０〜１００％の緩衝液Ｄで９０分かけて、１ｍＬ／分で行った。フラクションは、手動で個々のピークを集めるか、又は５分間隔でフラクションコレクターを用いて回収した。フラクションは、ＰＢＳで希釈して、ＤＣアッセイで評価した。
【０３０１】
Ｃ８逆相クロマトグラフィー
試料は、大容量（＞５ｍＬ）では溶媒注入管を介するか、又はより少ない試料ではインジェクターループを介してロードした。溶媒は、緩衝液Ｅが５％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード、Burdick and Jackson社製、Muskegon MI）／９５％水（ＨＰＬＣグレード、Burdick and Jackson社製）／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、緩衝液Ｆが９０％ＨＰＬＣ用アセトニトリル／１０％ＨＰＬＣ用の水／０．０８％ＴＦＡである。試料を、緩衝液Ｅで平衡化した、Ｃ８、５μｍのビーズ、３００Å、４．６×１５０ｍｍカラム（Ｖｙｄａｃ  ２０８ＴＰ５４１５、The Separations Group社、Hesperia CA）に、５５℃、１ｍＬ／分でかけた。安定なベースラインが確立されるまで、カラムに緩衝液Ｅを流した。このとき、線形勾配は、３０〜５５％の緩衝液Ｆで１５０分かけて、１ｍＬ／分、５５℃で行った。フラクションは、５分間隔又は個々のピークを回収した。フラクションは、ＰＢＳで希釈し、ＤＣアッセイで活性を評価した。大量のフラクションを液体窒素で瞬間凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【０３０２】
結果
濃縮した又は単離したＡＲＰ
小腸組織は、典型的には屠殺したばかりの６頭のウシから週に約１回入手した。抽出＆遠心分離、Procipitate（商標）＆Cleanascite（商標）、及び限外ろ過工程によって、サイズ範囲が約１０〜３００ｋＤの高分子可溶性混合物を得た。この物質は、無毒であり、マウスのＳ−１８０腫瘍を治療し、ＮＫ細胞傷害をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導し、ＮＫ細胞中のＩＦＮγをｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導し、さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで樹状細胞からのＩＬ−１２放出を誘導し得るであろう。溶液をマイコプラズマ及び細菌試験（MSU Animal Health Diagnostic Laboratory）用に採取し、ＬＡＬの反応性を測定した。それを、限外ろ過膜で濃縮することにより、サイズ排除（ステージ２）精製用に準備した。Superdex（商標）分子篩カラムによる分離により、約２０〜３０ｋＤに集中した１つの領域に限定された活性が生じた。
【０３０３】
ステージ２（サイズ排除精製）物質の純度を高めて、任意のエンドトキシンの負荷を低減するために、濃縮した１回目のSuperdex（商標）分離の活性フラクションを再びカラムにかけた。再実施のピークの中央部分を保持して、ＢＢＸ−０１と表示し、ＦＤＡにより認可された第１相臨床試験の最初の工程で用いた。この物質を滅菌ろ過し、限外ろ過膜で濃縮し、Iowa大学のＧＭＰ製剤施設で、投与形態に無菌充填した。
【０３０４】
ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを用いて、ステージ２の物質をステージ３の物質に精製した。Superdex（商標）分離から得た再実施物質の活性部分を洗浄したばかりのＤＥＡＥ Sepharose（商標）カラムにかけた。ステージ２の物質の高いイオン強度（０．１５Ｍ）のために、大半のタンパク質はカラムに結合しないで通過した。これをフラクションＡと表示する。結合した物質をイオン強度を２段階上昇（０．２Ｍ及び０.５Ｍ）させて溶離した。最初の溶離をフラクションＢと表示し、２番目の溶離をフラクションＣと表示する。２つのタイプの活性をフラクションＡ及びＣでそれぞれ検出したが、フラクションＢは大抵弱い活性を示した。フラクションＡの活性は、高ＩＦＮγ値の誘導に関連しており、これはＩＬ１８であることが証明された。フラクションＣは、大部分のＮＫ誘導活性及び抗腫瘍活性を有しており、樹状細胞を活性化する唯一のフラクションである。フラクションＣは、５％のタンパク質しか含まず、ＢＢＸ−０１ｃと表示する。この物質は、ヒトの第１相臨床試験の第２工程で用いた。
【０３０５】
ＡＲＰの精製：改良法
改良した精製手順を開発して、回収及び比活性を高めた。改良した手順により、最終工程でのＡＲＰの収率が、場合により１０２〜１０３倍と同じ程度だけ増加した。採用した手順の最初の部分では、硫酸アンモニウムによる分別を利用して粗物質を処理する長時間に亘る方法の実施を用いた。それは２段階で行った。最初の工程により約５０％のタンパク質の夾雑物をいくらかのその他の物質と一緒に除き、内在するプロテアーゼによるＡＲＰのタンパク質分解を阻害したが、第２工程ではＡＲＰを沈殿させて体積を減少させ、更なる精製工程を促進させ、更にタンパク質分解を最小限に留めた。タンパク質分解の阻止は、非常に高い確率で、収率の増加及び配列されたＡＲＰペプチドの平均長の増加に関与しており、これによりデータベース検索によるアイメリア表面抗原の同定が可能となった。最適条件を見出す実験により、最初の沈殿で飽和度４５％の硫酸アンモニウムを生じ、次いで２回目の沈殿で８０％の飽和度を生じた。最終的な沈殿ペレット中の活性物質は回収可能であり、更に精製するためにこれを再懸濁させた。
【０３０６】
Superdex（商標）サイズ排除クロマトグラフィーの前に、高分子搭載物（load）を減らすために、２つの大量処理工程を取り入れた。最初の工程では、硫酸アンモニウム分別処理の再溶解ペレットと適合するＨＩＣカラムを用いた。大量の不活性物質、特に核酸を流入法及び洗浄で除いた。硫酸アンモニウムを含まない緩衝液に変更後、活性物質を溶離した。溶離は、流入法及び洗浄は省いたが、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーにより同様の方法で処理した。高ＮａＣｌ濃度での溶離が保持され、メンブラン圧力セル（membrane pressure cell）で濃縮し、Superdex（商標）カラムに加え、低吸収領域で活性物質を溶離した（図２（Ａ））。典型的バッチ（１週間）の活性物質の全回収量を図２（Ｂ）に示す。比活性（タンパク質容量に対する）を、各精製工程から得た保持したフラクションで決定した（表３）。Superdex工程が終了したときには、約７０００倍の精製が達成された。
【０３０７】
【表３】
2008500005.tif 000012
【０３０８】
細菌のエンドトキシンは大抵小腸抽出物から得られる夾雑物であったので、エンドトキシン量を、各精製工程でＬＡＬアッセイ（１３節参照）により測定した。図２（Ａ）に示した工程については、これを図２（Ｂ）に示す。エンドトキシン量を約１０００分の１に減少させると、ＤＣアッセイを妨げる可能性のあるものよりも非常に低い最終量となる（１２．３節参照、最小ＤＣ活性に対する閾値１０００Ｕ／ｍＬ）。
【０３０９】
最終精製に十分な物質を得るために、２１頭のウシの腸から得られた抽出物を含むプールを作製した。これらを粗ホモジネート上清中で高活性のものを事前に選別し、３つ同時に処理した。３つの腸調製物の７つのバッチを併せて、濃縮し、カルシウム結合タンパク質を除去し、プールと命名した。このようなプールを４つ作製した。第１のプールは、方法の開発に用いて、第２のプールは第１の配列決定可能な生成物を得るために用いた。
【０３１０】
精製した生成物を得るために、一度にプールの半分をＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムで最初に分離した。活性物質は、クロマトグラムの端付近に位置しており（図３（Ａ）参照）、これは適度に疎水性の分子を示す。より早期に活性成分が検出されたこともあるが、弱く、散発的であった。活性フラクションを透析して、硫酸アンモニウムを除き、０．１５Ｍ  ＮａＣｌのＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムにかけた。ＮａＣｌ勾配をかけ、０．３Ｍのイオン強度付近の主要なピークを有する活性成分を溶離した。クロマトグラム及び活性を図３（Ｂ）に示す。ＨＩＣから得た活性物質を処理するために、ＤＥＡＥを３回実施する必要があった。プールした活性領域をＣ８逆相ＨＰＬＣカラムにかけて、アセトニトリル水溶液勾配を用いて溶離した（図３（Ｃ））。緩やかな浅い勾配溶離プロトコルで、活性物質は約４０％アセトニトリル付近で溶離した。１４回の分離を行って、ＤＥＡＥ分離から得た物質を処理した。活性物質は、２つの主要な近隣ピーク及び２若しくは３つの軽微なピーク又は肩部に付随していた。このことは分子の微小な変化を示しているように思われるが、これらの差異は定量されなかった。これらの活性フラクションの純度の問題について、精密に採取した分離に従って活性対吸収をプロットすることにより対処した。これを図３（Ｄ）に示す。線形回帰線は合理的に確固としており、ゼロ付近の交点は汚染分子が欠如していることを示している。
【０３１１】
最初の主要なピークは、αと表示するが、約半分のＣ８分離から得られ、ロータリーエバポレータにより濃縮し、トリプシンで消化し、ＭＳＵのMacromolecular Structure Facilityでのペプチド分離及びEdman配列決定法に供した。相当な量のタンパク質が濃縮工程で明らかに失われた。４つのピークは配列情報をもたらしたが、そのうちの１つは、ウシＡＲＰの異なる領域から得た２つの配列を含んでいた。この情報は、ＰａｔｔｉｎＰｒｏｔプログラム（ＰａｔｔｉｎＰｒｏｔ検索は、例えば、ウェブサイトphil. ibcp. fr （ＮＰＳ＠、次いでＰａｔｔｉｎＰｒｏｔを選択する）で行うことができる）を用いてデータベース検索を開始するのにすでに十分であり、混合物中のタンパク質の１つとしてＡＲＰが同定された。濃縮工程には、回収したフラクションを多数回、１つのチューブに移す工程が含まれていたので、我々は物質の損失はプラスチック製の円錐管にタンパク質が付着したことが原因に相違ないと考えた。実験により、チューブ間で分子を移動するにはアセトニトリルの添加が必要であることを実証した。αピークの後半分及び第２の主要なピーク（β）の前半分で処理の変更を別々に取り込むことにより、はるかに高いトリプシンペプチド量を生じた。これらのペプチドは、配列一致のための利用可能な公共データベースの検索（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＰａｔｔｉｎＰｒｏｔ）の範囲を拡大するのに十分な配列を与える。
【実施例２】
【０３１２】
スポロゾイト抗原タンパク質の同定
タンパク質配列決定サービスは、ＭＳＵのMacromolecular Structure Facility（Edman法）及びM-Scan Inc社、ペンシルベニア州West Chester（MS-MS法）により提供された。
【０３１３】
Edman配列決定法用のトリプシンペプチドは、以下の手順を用いて調製した。いくつかのＣ８分離から得た活性フラクション、典型的には、１ｍＬを微小遠心管に入れ、３５℃、真空下でほぼ乾燥するまで蒸発させた（Centrivap Concentrator、Labconco社製、Kansas City MO)。全サンプルチューブを２００μＬの６０％ＨＰＬＣ用アセトニトリル／４０％ＨＰＬＣ用の水／０.１％ＴＦＡで３回洗浄し、各回体積をほぼ乾燥状態になるまで減少させた。３回の洗浄後、全てのフラクションを合わせて一つの微小遠心管に入れ、５００μＬのＨＰＬＣ用の水で再び２回洗浄し、各洗浄後に減少させてほぼ乾燥状態とした。約１５μＬに減少させた合わせた試料を、消化用緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（試薬グレード、Sigma-Aldrich社、St. Louis MO）、ｐＨ８．４、２ｍＭ  ＣａＣｌ２）で１２５μＬに希釈した。トリプシン（シークエンスグレード、Sigma-Aldrich社）を２％（ｗ／ｗ）となるように加え、試料を３７℃で４時間インキュベートした。試料のｐＨを確認して、さらに５０μＬの消化用緩衝液を加えた。消化は、１８〜２０時間の消化後に、試料を液体窒素で瞬間凍結することにより停止した。
【０３１４】
トリプシンペプチドの精製は、ＭＳＵのMacromolecular Structure Facilityで、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム、５μｍ、３００Å、ＩＤ８００μｍを用いた微小口径の逆相ＨＰＬＣにより、１６０分で５％Ｈから７０％Ｈの線形勾配を用いて行った。緩衝液Ｇは、０.１％ＴＦＡの水溶液から構成されている。緩衝液Ｈは、９０％ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、１０％ＨＰＬＣグレードの水、及び０．９８５％ＴＦＡから構成されている。吸収をKratos Analytical社製Spectroflow 783検出器で、２１４ｎｍで観察した。選択したペプチド断片のＮ末端配列解析を、Edman分解化学反応に利用されるPerkin Elmer/Applied Biosystems社製494 cLC Procise Protein Sequencerにより行った。
【０３１５】
ＭＳ−ＭＳ分析のサンプルは、上述のように単離して、消化した。２つの試料をM-Scan Inc.社(West Chester, PA)に送った。トリプシンの自己消化及び試料の消化。各試料をＣ１８  ＺｉｐＴｉｐにかけて、０．１％ギ酸水溶液で洗浄して脱塩した。ペプチドを、０．１％ギ酸を含む、６０％アセトニトリル及び４０％水からなる溶液を用いて溶離した。各試料から得られたペプチド混合物を、Sciex Q-Star/Pulsar mass spectrometerを用いた陽イオンＥＳＩ−ＭＳにより最初に分析した。試料をナノスプレー用ニードルを用いて導入し、データをＭＣＡモードで回収した。同じ機器及び試料導入方法を、ＭＳ／ＭＳ配列決定に用いた。
【０３１６】
Edman及びＭＳ／ＭＳ法により得られたトリプシンペプチド由来のアミノ酸配列を表４に示す。２つ以上の別の配列が重畳していた解読結果があったり、また、大半は汚染されておりどのペプチドのほとんどどの位置にも複数の解読結果がもたらされたが、いくつかの確固たる解読結果がEdman法を用いて様々なピークから得られた。BLASTなどの最も普通に使用されるプログラムでは、このような複雑なデータを用いて検索を行うことはできなかった。したがって、配列は、PATTINPROTプログラム（Network Protein Sequence Analysis （NPS＠）；TIBS 2000, 25: 147-150）の利用により割り当てられた。各位置での複数のアミノ酸配列解読結果を、所望の類似性レベル（通常７０％より高い）でプログラムを検索し、タンパク質がこれらのパラメータと一致したリストを作成した。リストには通常数十の異なるエントリーが含まれていたので、第２のペプチド配列を用いて再び検索した。通常、このような手順によって、スポロゾイト抗原に関連するエントリーしか含まないリストを作成した。任意の同定可能な夾雑物が最初のリスト上にある場合には（トリプシン、ケラチン、アルブミン）、それらの配列をアミノ酸の解読結果から除き、残った解読結果を用いて検索を繰り返した。アイメリアスポロゾイト抗原が適当な候補とみなされると、複数の解読結果をある有力な配列との一致を見つけることによりデコンヴォルーションし、その後残った配列がタンパク質の異なる部分とも一致するかを決定した。この戦略は、多くのケースで成功し、ウシＡＲＰの最も可能性の高いいくつかのペプチド配列をもたらした。
【０３１７】
【表４】
2008500005.tif 000013
2008500005.tif 000014
【０３１８】
しかし、いくつかのデータの質のために、アミノ酸の割り当てで起こり得る誤りを除くことはできない。表５に、起こり得る誤り（ここで、標準文字は、高い信頼性のあるデータ、すなわち、複数の解読結果及び複数の試料を示し、下線は、信頼性のより低いものを示し、また、太文字は、信頼性の最も低いものを示す）を記載する。
【０３１９】
【表５】
2008500005.tif 000015
【０３２０】
βピークの後半分をM-Scan Inc.社にＭＳ／ＭＳ配列決定解析のために送った。いくつかのペプチドが同定され、アイメリア抗原との一致は様々であった。かなり長い可変領域も検出され、既知のＡＲＰ配列とやはり低い類似性で一致したので、分子の一部に割り当てられた。
【０３２１】
全ペプチド配列を評価したときには、スポロゾイト抗原との相同性の証拠は圧倒的であった。アイメリア１９ｋＤ抗原３−１Ｅに対する配列比較を図４に示す。大半の他の配列は、分かりやすい夾雑物、ケラチン、トリプシン、及びウシアルブミンに割り当てることができるであろう。少数の生じた配列は、割り当てられないままであった。
【実施例３】
【０３２２】
ｅ．テネラオーシストからの活性物質の抽出
オーシストは、意図的に感染させた動物から、庭の土壌から、又は感染した動物の排出物から得ることができる。オーシストを単離する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Tomley, Methods: A companion to Methods in Enzymology 13: 171-176 (1997)参照、当該文献は本明細書にその全体が参照により援用される。例えば、胞子形成オーシストを得るのに使用することが可能な手順の一つに以下のものがある。６から８週齢のLight Sussex chickenに、１０３から６×１０３個の胞子形成オーシストを経口投与することにより感染させ、７日後に酵素処理又は化学処理を用いて盲腸からオーシストを回収し（例えば、盲腸を取り出して、切断し、ｐＨ８．０のリン酸緩衝蒸留水を加え、市販のブレンダーを用いて微細な半流動状物（pulp）にホモジナイズする。次に、トリプシン（Difcon １：２５０粉末）を最終濃度が１．５％ｗ／ｖになるように加える。次に、４１℃で３０分間インキュベートし、２種の厚みのモスリンを通してろ過し、１０００ｇで１０分間遠心分離する。次に、上清を捨てて、同体積の飽和塩化ナトリウム溶液と取替え、よく混合し、再び遠心分離する。次に、カニューレ又は長針を装着したシリンジを用いて塩の上からオーシストを回収する。そして、遠心分離と緩衝水中での再懸濁とを繰り返して洗浄する。次いで、オーシストを胞子にする（例えば、オーシストを２％（ｗ／ｖ）重クロム酸カリウムに懸濁させ、強制通気しながら２８〜３０℃で４８時間インキュベートする。次いで、遠心分離と水による希釈を繰り返して重クロム酸カリウムを除く。次いで、次亜塩素酸ナトリウムを最終濃度が１０％（ｖ／ｖ）になるように加え、氷浴で５〜１０分間インキュベートする。次いで、遠心分離し、ペレットを飽和塩化ナトリウム溶液と混合する。次いで、チューブの内容物を蒸留水で覆い、５分間遠心分離する。次いで、混じりけの無い無菌のオーシストを塩と水との界面から滅菌蒸留水中に回収し、水中で遠心分離を繰り返すことにより洗浄する）。
【０３２３】
約３×１０８個の胞子形成オーシスト（Dr. Ray Fettererより贈与、USDA）を９．０ｍＬのＰＢＳに懸濁させ、２００×Ｇで１０分間遠心分離した。上清（「洗浄液」）を除き、保持した。ペレット（〜０．５ｍＬ凝集体積）を、０．５ｍＬの３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓに懸濁させ、合計で約１５分間、ガラスホモジナイザーで氷上でホモジナイズした（準備１）。ほとんどのオーシストを粉砕し、大部分が無傷のままのスポロシストを放出した。微量のあまり硬くない、小さめの構造体（恐らくスポロゾイト）が観察可能であった。連続的ホモジナイゼーションによって、これらの構造体がかなり増えるとは思えなかった。ホモジネートを微小遠心管に移して、６０００×Ｇで２０分間遠心分離した。上清（〜２００μｇ／ｍＬタンパク質）を滅菌ろ過し（０．２２μｍ）、Ｅ．テネラ胞子形成オーシストの可溶性タンパク質抽出物（ＥｔＨ−１）を消化した。
【０３２４】
第２の調製法では、それぞれ全量約５００μＬで、ホモジネートを３つの微小遠心管に分配した。超音波処理の間ホモジネートを冷却した状態に保つように注意しながら、各懸濁液を、Fisher Scientific Ultrasonic Dismembrator（商標）（モデル１００）を用いて、１秒のバーストを３０回加えて超音波処理した。約８０％の放出されたスポロシストを破砕させて非耐光性の「破砕（disrupted）」スポロゾイトにした。上清を貯蔵し、６０００×Ｇで２０分間微小遠心機にかけた。得られた上清を保持し、滅菌ろ過し、ＥｔＨ−２を消化した。ぺレットを保持し、さらなる処理（第３の抽出参照）に備えて４℃で保管した。
【０３２５】
アイメリアテネラ胞子形成オーシストの第３の抽出のための出発物質は、第２の抽出調製物の残余のペレットであった。このペレットを＋４℃で１８日間保存した。ペレット状物質を５００μＬの３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓに懸濁し、０．５ｍｍのガラスビーズ（BioSpec Products社製  ＃１１０７９１０５）約１．３ｍＬを含む２ｍＬのビードビーター（Bead Beater）管に移した。次いで、この管を３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓで完全に満たし、Mini-Beadbeater（BioSpec Products社製  型番３１１０ＢＸ）で、各々４８００ｃｐｍで３分間の２サイクルで処理した。３分間のサイクル間に、過剰な加温を阻止するため、この管を１５分間氷上に置いた。懸濁液を短時間微小遠心機にかけ、上清をガラスビーズから分離した。この上清を８０００×Ｇで２０分間、微小遠心分離にかけ、滅菌ろ過し、活性をＤＣ／ｍＩＬ１２放出アッセイで試験した。
【０３２６】
破砕したオーシスト、スポロシスト、破砕したスポロシスト、及びスポロゾイトを部分的にホモジナイズし、洗浄した混合物から得た上清には、少量のタンパク質中に大量のＤＣ活性が含まれていた。図５（Ａ）に示すように、最初の抽出上清は、低ピコグラムレベルの合計タンパク質量に対して活性がある希釈曲線を与えた。２０ｋＤのタンパク質では、これは約５０ｆＭである。これは抽出物中の全タンパク質が活性であることが前提だが、それは非現実的である。したがって、活性分子はおそらくこのレベルより低い活性である。異常な第２の活性領域が２日の異なる試験日で全５回の繰り返し実験で現れたが、それは、活性な分子がそれ自身又は他の分子と不活性な複合体（二量体、三量体、多量体）を形成するので、その活性部位が隔離されるためであろう。十分に希釈すれば、この複合体は解離し、活性が再び現れる。
【０３２７】
第２の抽出では超音波処理を利用して、オーシスト及びスポロシストの破砕を促進させた。これにより活性物質の収率を実質的に変化させ、高希釈で活性の再発生を繰り返した。第３の抽出では、Bead Beater（商標）を利用してマイクロビーズで嚢胞を破砕したので、最初のＤＣアッセイで変則的に高レベルの活性を生じたが、後のアッセイでは、図６に非常に類似していた。活性ゼロに達するのに必要とされる希釈量は、真に注目に値する。この広範な量／応答は、上述した低希釈の「隆起（hump）」に相関するであろう。もし異なる解離定数を有する異なるサイズの複合体が活性を出すのであれば、このような長い横ばいの応答を生ずるであろう。
【０３２８】
抽出物の試料を、ウシ抽出物のものと同様の手順を用いて、Ｃ８  ＨＰＬＣで分離した。クロマトグラム及び活性を図５（Ｂ）に示す。活性の位置が高純度のウシの分子と比較して、高い保持時間にシフトしている。このことは、原虫から直接抽出した場合には、アイメリア分子に対して高い疎水性を示しているように思われる。
【実施例４】
【０３２９】
粗膜調製及びＥ．テネラのスポロゾイトから得られるＡＲＰの膜結合形態の精製
手順
（１）オーシストの破砕
ホモジナイゼーション緩衝液（ＨＢ）：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５０μｌ／ｍｌプロテアーゼ阻害剤混合物及び１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２（一部の実験では）中に３×ｌ０７／ｍｌのオーシストを含む１ｍｌの懸濁液を、ガラスホモジナイザーで２０分間ホモジナイズし、次いで、１５回の凍結−解凍サイクル（液体窒素／３７℃）、又は、３回の凍結−解凍サイクルによる氷上での１０秒×３６〜４５バーストの超音波処理（Fisher Scientific Ultrasonic Dismembrator、モデル１００）を行った。ホモジナイゼーションによりほぼ完全にオーシストを破砕してスポロシストを得た。超音波処理によりスポロシスト壁を除く存在する全構造体をほぼ完全に破砕した。
【０３３０】
（２）膜沈降及び洗浄
細胞のホモジネートを４℃、１５０００ｇで１５分、スピンにかけ、膜をペレット化した。この遠心分離法により、核、その他の細胞小器官、ペレット化が可能なＡＲＰ凝集体及びもしあれば貯蔵顆粒も十分ペレット化できる。細胞小器官は、ＺｎＣｌ２を含まないＨＢ中のさらなる精製サイクルで破砕すべきである。ペレットを１ｍｌのＨＢに懸濁させ、再び遠心分離した。遠心分離／再懸濁を、懸濁緩衝液中で、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２有りでもう１回、また、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２無しでさらに２〜３回繰り返した。１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２の存在下での２回の洗浄サイクルを含むこの手順により得られたペレットを、１２．５．１節に記載した免疫刺激活性試験で、粗膜調製物として用いた。
【０３３１】
（３）膜からのＡＲＰの放出
膜結合ＡＲＰの精製のために、最終的ペレットをＺｎＣｌ２を含まない１００μｌのＨＢに懸濁させ、プロテアーゼ阻害剤及びセレウス菌由来のホスホリパーゼＣ、１６Ｕ／ｍｌの存在下又は非存在下で３７℃で１〜４時間インキュベートした。
【０３３２】
（４）膜遠心及び洗浄
溶液に放出されたＡＲＰを、工程２に記載の遠心分離により不溶性物質を分離し、次いで、洗浄サイクルを２回行った。合計３つの上清を併せた。
【０３３３】
（５）Ｃ８逆相クロマトグラフィー
Ｃ８クロマトグラフィーを、９０分で１００％緩衝液Ｅから１００％緩衝液Ｆの線形勾配を用いて、６節に記載のように行った。各フラクションからの一定分量について、再生後のＤＣ活性を検査した（図１８）。
【０３３４】
結論
対照試料（ＰＬＣなし）では、有意な量のＤＣ因子が自然発生的に溶液中に放出されることが確認された。外部のＰＬＣを添加すると、放出される活性物質量は、４回の実験全てで増加し、増加範囲は１０倍から２５％にわたり、このデータはＤＣ因子が実際に外側の細胞膜に結合したＧＰＩであることを示唆していた。
【０３３５】
自然発生的並びにＰＬＣ消化後に溶液中に放出された物質は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーで分析するのに十分な純度であった。ＤＣ活性物質が溶出した領域（４１〜５５％緩衝液Ｆ）は、完全にクリーンで、２１５ｎｍで０．０１未満のＵＶ吸収を有する２〜３つのピークを含んでいた。勾配でのＤＣ活性物質の位置は、全分析試料、すなわち、ＰＬＣの存在又は非存在下、３７℃で４時間インキュベートした後の、工程２の膜洗浄により得られた上清及び工程４の膜洗浄により得られた上清で同じであった。
【０３３６】
工程２の超音波処理及び膜洗浄の間のオーシスト懸濁液中の１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２の存在により、最初の２つの洗浄工程で有意にＡＲＰの損失が阻止されることが示されたが、この効果は、おそらく内在するホスホリパーゼを阻止し、ＡＲＰがより小さい範囲に凝集するためであろう。ＺｎＣｌ２の非存在下で約５０％の損失であったのに対し、ＺｎＣｌ２の存在下では１％未満にＡＲＰの損失が抑えられた。これにより、細胞破砕により生じた細胞内の物質を洗い流すことが可能になり、ＤＣ因子（ＡＲＰ）のいかなる損失もなくきれいな膜調製物が得られる（この調製物中のＡＲＰ凝集物の存在が可能となる）。ＺｎＣｌ２を含まない緩衝液中で膜ペレットを再懸濁させることによりＺｎＣｌ２を除去することで、自然発生的な活性物質の放出を回復する。ＺｎＣｌ２を含まない緩衝液中でペレットを洗浄し、３７℃で１時間インキュベーションすることにより、約３５〜５０％のＤＣ活性のペレットを溶液中に取り出すことができ、不純物のないＤＣ因子（ＡＲＰ）の調製物を得ることができる。全処理に１日かかる。
【実施例５】
【０３３７】
アイメリアテネラｃＤＮＡの遺伝子クローニング及び発現
Ｅ．テネラＡＲＰのクローニング及び発現
全ＲＮＡは、Ｅ．テネラから、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  チオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ社製）、及び０．５％のＮ−ラウロイルザルコシン（Ｓｉｇｍａ社製）を含む緩衝液２００μＬ中で、最終濃度１ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（商標）（Ｓｉｇｍａ社製）で〜１０７個のオーシストを消化処理することにより得た。混合物を、３７℃で１６時間、密封したEppendorf（商標）チューブ中に入れて振とうさせ、次いで、チオシアン酸グアニジン１２０ｍｇ、及びＴＲＩ（商標）試薬（ＭＲＣ,Ｉｎｃ.社製）１ｍｌを加えた。全ＲＮＡの単離を、Chomczynsky及びSachi（１９８７年）に基づく製造元の提案に従って行った。全ＲＮＡの最終ペレットを７５％エタノールで２回洗浄し、空気乾燥し、０．４％ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰ）で前処理してＲＮａｓｅを阻害した２０μＬの滅菌蒸留脱イオン水（ＤＤＷ）に溶解した。
【０３３８】
第１鎖ｃＤＮＡを、製造元の提案に従ってSuperScript RT（商標）（Life Technologies社製）を用いて得た。全ＲＮＡ約１μｇ（６μＬ）、及びオリゴ（ｄＴ２０）（Genemed社製）１μｇを、全量１１μＬとなるように共に混合し（ＤＥＰ処理した滅菌ＤＤＷにより調整）、９０℃で２分間加熱し、氷上に置いた。混合物に、４μＬの５×第１鎖緩衝液、２μＬの０.１Ｍ  ＤＴＴ、１μＬの全４個のｄＮＴＰの混合物（各２５ｍＭ、Life Technologies社製）及び３０Ｕの抗ＲＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を加えた。これを３７℃で２分間インキュベートし、次いで２００ＵのSuperScript RT（商標）を加え、短時間低速遠心分離にかけた。反応を３７℃で１００分間、次いで、７０℃で１５分間進行させ、酵素を不活性化した。ＲＮａｓｅＨ（４Ｕ、Life Technologies社製）を３７℃で３０分間加え、前工程で形成されたＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖からＲＮＡを消化した。
【０３３９】
二本鎖ｃＤＮＡの調製を、上記で得られた第１鎖ｃＤＮＡ、及び、次のプライマー（Retrogen Inc社製）を用い、ＰＣＲを利用して行った。Ｅ．テネラＥＳＴ由来のＡＲＰ遺伝子配列に特異的な順方向プライマー、CCAGTTTTTGCTTTCTTTTCC、及び、アイメリアに関連するいくつかの属由来の遺伝子に相補的となるよう設計された逆方向プライマー、TARAASCCRSMCTGGTRMAGGTACTC、ここで、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｓ＝Ｃ又はＧ、及びＭ＝Ａ又はＣである。その時点ではＥ．テネラ由来のＣ末端領域のＡＲＰの配列情報が欠けていたので、縮重している第２のプライマーを選択した。Ｔａｑ−ポリメラーゼ（Life Technologies社製）を、２ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．２％ＢＳＡと共に用いた。PCR Express（商標）（Hybaid社製）で実行されたプログラムは、以下のとおりであった。ａ）９４℃で２分、５０℃で４５秒、７２℃で１分からなる１サイクル。ｂ）９２℃で３０秒、５３℃で３０秒（１℃／秒の勾配で）、７２℃で６０秒（５秒／サイクルの時間増加率で）からなる２０サイクル；ｃ）９２℃で３０秒、５５℃で４５秒、７２℃で１００秒（５秒／サイクルの時間増加率で）からなる１５サイクル；及び、ｄ）７２℃で１０分、次いで４℃の保持工程からなる１サイクル。第１鎖ｃＤＮＡ（０．２μＬ）を含む１９．８μＬのポリメラーゼ混合物を、０．２ｍｌのMμlTI Ultra（商標）チューブ（Sorenson BioScience, Inc.社製）で反応させた。プログラムの終了後、全体積を、RunOne（商標）cell and power supply unit（EmbiTec社製）を用いて、０．５×ＴＡＥ（Tris-acetate：酢酸、ｐＨ８.５）緩衝液上で作成した０.８％アガロースゲルで、５０Ｖで分離した。ゲルを調製したばかりの０．０５％臭化エチジウム中で１０分間染色することにより視覚化し、短時間蒸留水で洗浄し、Transilluminator Model M-20E（ＶＷＲ社製）で観察した。１つの主要なバンドを見極め、ゲルから切断し、Wizard PCR（商標）キット（Promega社製）で製造元の手順を用いて洗浄した。断片をレジンから５０μＬの滅菌ＤＤＷに溶出させた。
【０３４０】
ｃＤＮＡを、製造元の提案に従って、pCR2.1 TOPOクローニングベクター（Invitrogen社製）に挿入した。個々の断片（水中４μＬ）を１μＬのベクターと混合し、室温で５分間インキュベートし、氷上に置いた。形質転換手順として、のNovaBlue（商標）コンピテント細胞（Novagen社製）、又はTransforMax EC100 Electrocompetent（商標）細胞（Epicentre社製）のいずれかの大腸菌４０μＬを、１〜２μｌの上記混合物と混合し、ＥＣＭ３９９型エレクトロポレーター（ＢＴＸ社製）（ＥＣ１００細胞用）の０．１ｃｍキュベット（ＢＴＸ社製）中での１５００Ｖ、５ｍ秒のエレクトロポレーション又はヒートショック法（３０秒、４３℃、NovaBlue細胞用）による形質転換のいずれかを行った。形質転換された混合物を５００μＬのＳＯＣ培地で希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細菌懸濁液を、１００μＬ／プレートで、ＬＢ培地アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む予熱した（３７℃）プレートに蒔いた。蒔く直前にＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌをプレートに拡散させた。白色コロニー（インサート含有）を選択し、４０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレートに再び蒔き、１つのコロニーを得た。各クローンから得た単独のコロニーを、ベクターに特異的なプライマー（Ｍ１３順方向（−４０）、及びＭ１３逆方向）を用いたＰＣＲによるインサートサイズの分析に用いた。マグネシウム濃度が３ｍＭで、最終体積が１０μＬ／チューブであった以外は、ＰＣＲの条件は上記と同様であった。断片を臭化エチジウムで上記のように視覚化した。インサートサイズが０．５〜０．６ｋＢのクローンを、利用可能なＥＳＴ：順方向プライマーAAATGGGAGAAGCAGACACC、及び逆方向プライマーTCCGCGAAGTTAAGAGCTGTTGの比較分析に基づいてＥ.テネラＡＲＰに特異的であるように設計されたプライマー（Retrogen Inc.社により合成されたもの）を用いたＰＣＲにより分析した。ＰＣＲプログラムは、アニーリング温度が第２段階で５６℃であり、第３段階で５８℃であった以外は上記と同じであった。アガロースゲルでシングルバンドを示したクローンを、更なる調査のために選択した。
【０３４１】
ＤＣ／ＩＬ−１２アッセイ用の試料を、選択したクローンを、滅菌１５ｍＬポリプロピレン製遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ社製）内で４０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加された３ｍＬの液体ＬＢ培地中で、好気条件下で育成することにより調製した（３７℃で２０時間振盪）。細菌細胞を、微小遠心ＨＳＣ１０Ｋ（商標）（Savant社製）で＋４℃で５分間、１０,０００×ｇで遠心分離することにより、１．７mLのSafeSeal MμlTI（商標）微小遠心管（Sorenson BioScience, Inc.社製）に回収した。上清を除去し、０．２２μｍの酢酸セルロースフィルター（Costar社製）（３，０００×ｇで５分）を備えたSpin-X遠心管で滅菌ろ過した。細菌細胞を０．５ｍＬの滅菌ろ過したＰＢＳで洗浄し、上記と同じ条件下で再ペレット化し、０．２ｍＬの滅菌ＰＢＳに再懸濁させた。細菌細胞を、Sonic Dismembrator（商標）１００型（Ｆｉｓｈｅｒ社製）で、３０秒間隔で１０秒のパルスを３回、超音波により破砕させたが、全ての処理は氷上で行った。試料を、ＨＳＣ１０Ｋで遠心分離（１０,０００×ｇ、１０分、＋４℃）することにより透澄化し、上清を上述のようにSpin-Xチューブで滅菌ろ過した。ＤＣアッセイでは、アッセイの各ウェルに付き、各使用済みの培地及び破砕した細菌の上清から１０μＬを用いた。
【０３４２】
Ｅ．テネラｃＤＮＡ由来の大腸菌から得られたＡＲＰの組換え型は、精製したウシの分子及びＥ．テネラの卵母細胞から抽出されたＡＲＰとほぼ同じ特異的活性を有している。図５参照。約５０フェムトモルの活性タンパク質濃度で５０％の活性が生じている。組換え物質をクローニングベクター、pCR2.1 TOPOから得た。ベクターにより、LacZ遺伝子に対するフレームに配置されたｃＤＮＡからの発現が可能となる。β−ガラクトシダーゼに融合したＡＲＰタンパク質として全構造体を、１Ｌの最少増殖培地の上清から得た。上清を、６節に記載の方法によりＤＥＡＥクロマトグラフィーを用いて精製し、６節に記載の方法を用いてＣ８ＨＰＬＣにより分離した。約２００ｎｇのタンパク質を含む、２つの活性なピークのうちの１つをＤＣアッセイで評価したところ、図６の応答が得られた。
【０３４３】
Ｅ．テネラＡＲＰのｃＤＮＡを、pCR2.1 TOPOクローニングベクター（Invitrogen社製）に挿入した。適当なクローンをインサートサイズ、配列、及び配向により選択した。最適化した発現ベクターではなかったが、融合タンパク質形態のインサートから作製されたタンパク質もあり、ＤＣ活性を示した。ＥｔＵ３で示されるインサートのＤＮＡ配列を、図７（Ａ）に示す。これらのインサートは、大腸菌及び真核細胞の発現ベクターにトランスフェクトされるであろう。発現したタンパク質は、同定及び精製を可能にするための除去可能な標識配列を含むであろう。ＬａｃＺプロモーターに対し直接又は逆配向のいずれかで導入されたインサートを有するクローニングベクターを含む２つの大腸菌の培養液から得られる生成物の活性物質を、図７（Ｂ）に示す。正しく配向されたＡＲＰ遺伝子しかＤＣ活性を示さなかった。このことは、２つの培養液間でその他の全てが同じであるので、活性はこの分子に関係しているという証拠が明らかに示されている。
【０３４４】
最小無機培地で育成した大腸菌中のクローニングベクターにより得られたタンパク質のＣ８クロマトグラフィー精製結果を、図７（Ｃ）に示し、ＤＣ活性を挿入図に示す。活性は弱いが、スポロゾイトから抽出された活性物質と同様の保持時間に位置づけられる。大腸菌の培地を最初にＤＥＡＥクロマトグラフィー、次いでSuperdex（商標）クロマトグラフィー（手順の詳細記述については６節参照）により精製したところ、高純度の生成物を得た。純度は、分析用Ｃ８クロマトグラフィーカラムの２つの活性ピークとして示される（図７（Ｃ））。このデータは、Ｎ末端領域が、ＤＣ活性のいかなる損失もなく有意に伸長できることを示唆している。Ｎ末端でβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）、ＦＬＡＧペプチド、又はセルロース結合タンパク質（ＣｅｎＡ）の一部のいずれかと融合されたＡＲＰ分子は、有意な活性を保持していた。その上、Ｃ末端（ＹからＨ、及びＧからＡ又はＳのいずれか）付近の２つの位置での点変異は、明らかに突然変異のＤＣ活性を変化させなかった。ＡＲＰ分子の活性におけるＣ末端の重要性を明らかにするために、短縮されたＡＲＰ分子をＰＣＲ（プライマー：CTATGTGAGAGCATCAGCTTTG）によりＣ末端の前に終止コドンの１４個のアミノ酸を導入することにより作成した。完全長の対照と比較して、ＤＣ活性は有意（桁違い）に低いことを示した。ＰＣＲ（プライマー：GAAGGAGTTTGCAAAATGGGAA）によりＡＴＧ開始コドンの前にShine-Dalgarnoリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が導入されたＴ７プロモーターから、両方とも発現した。したがって、欠落した配列（TALNFAEYLHQSGF）は、ＡＲＰの構造又は活性のいずれかに重要である。
【０３４５】
ｃＤＮＡを発現ベクター（pMAL-pZE、New England Biolabs社製）のトランスフェクションにより、ＤＣ活性を有するクローンを成功裏に作成した。このベクターは、エンテロキナーゼ切断部位に隣接したｍａｌＥ遺伝子（Ｎ末端でのマルトース結合タンパク質との融合用）を含んでおり、発現タンパク質の迅速な分離及び精製を可能にしている。融合ＡＲＰタンパク質をＩＰＴＧ誘導により発現させ、ＤＣアッセイによりチェックした場合に活性であると思われた。エンテロキナーゼを用いた切断によるＡＲＰタンパク質の融合構造体からの放出によりＤＣ活性は向上しなかったので、組換え分子の外来部位は活性に影響しないであろうことが示された。
【０３４６】
哺乳類細胞でのＡＲＰの安定な発現では、Ｅ.テネラＡＲＰ遺伝子を２つのベクター、pTracer-CMV2（Invitrogen社製）又はp3XFLAG-CMV9（Sigma社製）に入れて再クローン化した。ベクターpTracer-CMV2への一方向性クローニングを、KpnI及びXbaI部位に入れて行った。クローニングの断片は、新たに作成した部位Kpn I（開始コドンの前）及びXba I（終止コドンの後ろ）を有するプライマーを用いた遺伝子のＰＣＲ増幅により作成した。開始コドンを欠損した、Hind III部位に隣接するpMal-p2eベクター中の構築物から切り出されたＡＲＰ遺伝子を、ベクターp3xFLAG-CMV9のHind III部位に入れてクローニングに用いた。分泌シグナルペプチド並びに3xFLAGペプチドに関連する遺伝子の配向及びインフレーム位置を、インサートの完全配列決定により確認した。両方のプラスミドを用いて、製造元の提案に従ってLipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いてＣＨＯ−Ｋ１及びＳ−１８０細胞系を形質転換した。抗生物質（pTracer-CMV2ではZeocine、p3xFLAG-CMV9ではG-418）を含む増殖培地中で選別後に、形質転換した細胞の個別のクローンを得た後、９６ウェルプレートに低細胞密度で再び蒔いた。両方のケースで、使用済みの培地は、ＤＣアッセイ（１０３希釈まで）で高活性を示し、このことはＡＲＰが細胞から分泌していることを意味した。Ｃ８  ＲＰ−クロマトグラフィーによる培地の分析により、細菌で発現されたＡＲＰのものに近い位置で溶出するＤＣ活性物質の１つのピークの存在が示された。試算により、哺乳類細胞で発現されたＡＲＰの特異的活性は、細菌で発現されたタンパク質のものに相当するか、又はそれより高いことが示された。
【０３４７】
癌の生存及び成長に影響する多くのサイトカイン、ケモカイン及び増殖因子の遺伝子が、近年癌の遺伝子治療に導入されている。特に、インターロイキン１２（ＩＬ１２）の遺伝子を、様々な実験用癌細胞に導入したところ、細胞の腫瘍形成及び／又は腫瘍成長の顕著な減少が得られた。恐らく、癌細胞により放出されたＩＬ１２が、局所的な生得の免疫応答を刺激し、腫瘍の成長を遅らせるか、或いは腫瘍を一斉に排除するのであろう。
【０３４８】
ＡＲＰ遺伝子の単離及び発現の成功により、現在癌免疫療法における類似の使用を提案することが可能となっている。ＡＲＰは、恐らくＩＬ１２の放出に加えてＤＣの成熟及び活性化を包含する多くの経路を誘導するので、ＡＲＰ遺伝子の使用は、恐らく特異的因子（例えばＩＬ−１２）の遺伝子の使用よりも一層効果的であろう。したがって、より「完全な」免疫応答が引き起こされる。
【０３４９】
癌の免疫治療におけるＡＲＰ遺伝子の使用例を、以下に概説する。腫瘍をがん患者から切除し、短期培養する。培養した癌細胞に、搬出可能な発現ベクター中のＡＲＰ遺伝子をトランスフェクトし、サイトカイン及びケモカインなどのその他の潜在的に有用な遺伝子も同様にトランスフェクトしてもよい。致死的な放射線を照射したトランスフェクション癌細胞を、患者に再導入する。トランスフェクション癌細胞は、ｉｎ  ｓｉｔｕでＡＲＰを局所的に放出し、それにより隣接するＤＣを活性化し、ＩＬ１２及び可能性のあるその他の免疫変調成分を放出させるであろう。この応答により、トランスフェクション癌細胞に対する局所的免疫応答を刺激することができるであろう。癌細胞が殺傷され、腫瘍に関連する抗原を放出し、それを回収し、処理し、ＤＣを提示させ、身体に存在する他の腫瘍細胞（原発腫瘍、転移、再発）に対する特異的な適応的（記憶）免疫応答を生じる。
【０３５０】
Ｅ１クローンからのＥ.テネラＡＲＰの単離
ＡＲＰをコードするＥ．テネラ遺伝子を、順方向プライマー（ATGGGTGAAGAGGCTGATACTCAGG）及び逆方向プライマー（TTAGAAGCCGCCCTGGTACAGGTACTCAGCGA）を用いてＰＣＲによりクローン化した。ＰＣＲ断片を、clonableRT（Novagen社製）を用いて一晩１６℃でpET-Blue-1 acceptor vector（Novagen社製）に連結させた。得られたプラスミドを、カルベニシリン／テトラサイクリン及び白／青クローン選択を用いて、大腸菌宿主Nova Blueに入れて形質転換した。陽性クローンを、同じ順方向プライマー及びpET Blue Down primer＃７０６０３−３（Novagen社製）を用いて、コロニーＰＣＲにより同定し、正しい配向のＤＮＡインサートであること確認した。インサートのＤＮＡ配列を、配列決定法により確認した。陽性クローンのプラスミドを単離し、タンパク質を発現させるために宿主株TurnerTM (DE3) pLacI（Novagen社製）に入れて形質転換した。１つの安定なクローンをＥ１と称した。（図２０参照）。クローンＥ１を、２００４年７月１５日に、American Type Culture Collectionに寄託し、特許寄託番号＿が割り当てられた。
【０３５１】
寒天培地からのＥ１の単一クローンを、５０μｇ／ｍｌカルベニシリン及び３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールの存在下で、１％グルコースを添加した１０ｍｌのＬＢ培地に播種した。培養液を、２５０ｒｐｍで振盪しながら一晩３７℃に維持した。次いで、培養液を１リットルの同じ培地に加え、２．５時間成長させたところ、６００ｎｍでの吸収は０．６〜０．８であった。タンパク質発現を、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．５ｍＭの最終濃度となるように加えることにより誘導した。４時間後、細菌を８，０００ｒｐｍ(６，５００×ｇ)で２０分間遠心分離することにより、回収した。上清を除いて保存し、ペレットを使用するまで凍結させた。
【０３５２】
細菌ペレットを、３０ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、１，６００ｐｓｉで３回フレンチプレスに通し、細胞を破砕した。押圧した細胞（press cell）をＰＢＳですすぎ、残りの細胞試料を回収した。試料を、SS34 rotorを用いて、３０分間、１５，０００ｒｐｍ(１７，５００×ｇ)で遠心分離にかけて細胞片を除いた。上清及びペレットを別々に保存した。上清の全量は、合計で約３８ｍｌとなった。次いで、硫酸アンモニウムを３０％の飽和度になるように上清に加えた。４℃で１時間の攪拌後、沈殿を遠心分離により除いた。硫酸アンモニウムをさらに加えて、４５％の飽和度とした。１時間後、沈殿を除いた。硫酸アンモニウムを８０％の飽和度になるように加えた。試料を４℃で一晩攪拌した。沈殿を遠心分離により回収した。ペレットを、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中で再懸濁させた。次いで、試料を遠心分離して、溶解しなかった物質を除いた。
【０３５３】
Phenyl-Sepharose（商標）カラムの疎水性クロマトグラフィー：
溶解性フラクションを、phenyl-Sepharoseカラム（Fast Flow、(low sub)、Pharmacia社製、３×３．３cm）の疎水性クロマトグラフィーにかけた。試料をカラムにかけた後、それをベースラインが得られるまで同じ緩衝液で洗浄した。１．５Ｍから０Ｍの逆の線形勾配（reverse linear gradient）の硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０（各緩衝液槽ごとに２００ｍｌ）を、室温で流速２ｍｌ／分で適用した。５ｍｌのフラクションを回収した。選択したフラクションをＤＣアッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。活性フラクションを貯蔵し、４℃で一晩、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸Ｎａ、ｐＨ７．０で透析し、DEAE-Sepharose（商標）クロマトグラフィーに備えた。
【０３５４】
DEAE-Sepharose（商標）クロマトグラフィー：
DEAE-Sepharose（商標）カラム（Fast Flow、Pharmacia社製、１．５×５．５ｃｍ）を最初の緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０）で平衡化した。試料をかけた後、カラムを同じ緩衝液で洗浄し、Ａｂｓ２８０で観察しながら結合していない物質を除いた。吸収がベースラインにきた時に、線形勾配（０．２Ｍ〜０．６Ｍ  ＮａＣｌの１０ｍＭリン酸Ｎａ溶液、ｐＨ７．０、各緩衝液ごとに２００ｍｌ）をかけた。５ｍｌのフラクションを回収した。溶出したフラクションをＤＣアッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。
【０３５５】
Superdex（商標）サイズ排除クロマトグラフィー
最終的な精製及びエンドトキシンの除去は、６節に記載の方法を用いて、Superdex（商標）75クロマトグラフィーにより達成した。活性試料を凍結する代わりに４℃で貯蔵した。
【０３５６】
品質管理のためのＣ８クロマトグラフィー
Superdexクロマトグラフィーから得た貯蔵した活性物質試料で、逆相ＨＰＬＣ（９節に記載したように）を行った。
【実施例６】
【０３５７】
ＡＲＰの物理特性
長年のＡＲＰの不純物を含む調製物を取り扱っていた間、分子の物理的特性の情報を得ることが困難であった。当初は、例えば、それがタンパク質か又は他の種類の高分子であるのかがはっきりしていなかった。後から考えると、タンパク質の非常に強い特性というのは、それが大抵任意のほぼ純粋な調製物中で非常に微量な成分であったということを指していたことは明らかである。ＡＲＰ分子の性質に関連するいくつかの発見が以下の小節に含まれている。
【０３５８】
分子量
いくつかの実験により、ＡＲＰの分子量範囲は２０ｋＤ近くに中心があることが示されている。この分子量に関する多くの間接証拠が、既知の活性フラクションでのＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルバンドから得られている。同様に、通常、分子篩（sieving）クロマトグラフィーカラムによりこの範囲で活性物質が溶出されている。直接的証拠は、大規模なＳＤＳ−ＰＡＧＥスラブゲルから得られている。活性物質は、ＳＤＳでの煮沸を避けるために試料調製物に僅かな変更を加えてこの系に適用し、電気泳動後にゲルをスライスし、タンパク質を溶出させ、再生し、試験した。唯一回収可能な活性物質は、２０ｋＤ（１８±３ｋＤ）の範囲に位置していた。
【０３５９】
このことは、最終的な精製及び配列決定で確認された。トリのアイメリア由来の相同タンパク質が１８．５ｋＤの予想量を有することが報告されており、ペプチド断片に対する抗体は、Ｅ．テネラ及びＥ．アセルブリナ（Lillihoj他、２０００年）由来の２０ｋＤのバンドと反応する。
【０３６０】
ｐＩの決定
等電点電気泳動法後のアクリルアミドゲルから得られるタンパク質の抽出及び再折り畳みについてのいくつかの実験により、ＮＫアッセイのタンパク質活性では、４．０〜４．７の範囲にあることを明らかにしたが、Ｅ．アセルブリナ及びＥ．テネラのＡＲＰタンパク質に対する予想されるｐＩは４．３〜４．５である。これらの結果は、有意な数のカルボキシ基を含む酸性タンパク質に一致している。
【０３６１】
等電点電気泳動法を、会社の指示に従って、プレキャストｐＨ３〜７ IEF gel（Novex社製）を用いて行った。Broad pI calibration kit（Pharmacia社製）をｐＩ計算の標準として用いた。
【０３６２】
ＡＲＰ活性のｐＨ依存性
いくつかの実験により、ＡＲＰ活性のｐＨ依存性が明らかにされた。粗原料では、ＮＫ活性は、高いｐＨ＞１０、及び低いｐＨ＜４の両方で有意に減少することが見出された。実験によっては、ｐＨ４．０未満で最小活性が観察されたが、ある実験は、３．４＜ｐＨ＜３．７の範囲に最小活性があることを示した。高いｐＨでの活性の損失は、少なくとも一部は再生処理により回復することができるが、低いｐＨの影響は、多くの場合（特に、ｐＨ＜２．０では）、不可逆的であった。
【０３６３】
温度安定性
製剤ＢＢＸ−０１の安定性を、いくつかの温度で評価して、保存寿命及び保存条件の決定に役立てた。結果を表６に示す。
【０３６４】
【表６】
2008500005.tif 000016
【０３６５】
長期間の冷凍及び冷蔵条件下で活性は減少しなかったが、温度の増加に連れて減少した。しかし、３７℃でさえ半減期はほぼ１週間だったので、このことは薬物としての有用性が体温での自己分解により制限されないであろうことを示唆している。
【０３６６】
ヒト血清アルブミン中でのＥ１の安定性
１、５、又は１０％ｗ／ｖのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）の存在下における組換えＡＲＰであるＥｌ（１μｇ／ｍＬ）の安定性についての予備調査は、４℃で保存したときに、４、１１、２５、３９及び５４日では活性の損失がないことを示す。より高い温度の試験でも顕著な安定性が示される。ＨＳＡの存在下で、３７℃で４１日、５５℃で６時間又は７０℃で２時間のいずれかの後でも活性の損失は検出されなかった。ＢＢＸ−０１を超える安定性の増加は、恐らくＥ１調製物の純度がより高く、予想されるプロテアーゼ夾雑物を回避しているためであろう。ヒト臨床試験での使用として、ＡＲＰ  Ｅ１を、３％ＨＳＡと共に１μｇ／ｍｌで処方し、４℃で少なくとも５５週間、ＤＣアッセイで測定したときに活性の損失もなく保存した。
【０３６７】
ＡＲＰの酵素感受性
部分的に精製した物質は、タンパク質を含んでいたが、核酸、糖脂質、リポ多糖、又はペプチド成分とこれらのいくつかの複合体は含んでいなかったという有力な証拠があった。部分的に精製したフラクションを、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８、サブチリシン、及びパパインなどのプロテアーゼを用いて処理することにより、活性物質の除去に全て成功した。慎重な滴定実験により、概して、全活性を除去するのにプロテアーゼのサブチリシン由来の１つのカットで十分であったことが示されたが、キモトリプシンは活性を１０分の１減少させるのに３つのカットを必要とした。これらの結果は、活性分子の主要成分がタンパク質であったという有力な証拠をもたらした。改良したタンパク質又は複合体が活性に重要であった可能性を検証するために、さらに分解酵素を試験した。
【０３６８】
ヌクレアーゼ、例えばＲＮａｓｅ  Ａ及びＤＮａｓｅＩを用いたいくつかの実験では、ＡＲＰの活性はＮＫ及びＩＮＦγアッセイで追跡した。両酵素において、酵素なしで同じ条件下でインキュベートしたＡＲＰと比較して、３７℃でのインキュベーションの９時間及び２４時間後に活性の損失はなかった。どちらのケースでも、４％アガロースゲルでのＮＫ−活性成分の移動が酵素を用いた処理により影響を受けず、さらに可視の核酸バンドは消失しない。このことは、核タンパク質複合体が活性に重要で無かったことを示していた。
【０３６９】
粗ウシタンパク質調製物のＮ結合炭水化物部分に特異的なフラボバクテリウムメニンゴセプチカム由来のペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦを用いた脱グリコシル化に関し、脱グリコシル化酵素（deglycosylase）を用いて、いくつかの実験も行われた。これらは、消化後に、活性分子の位置がポリアクリルアミドゲル上で移動しなかったことを示した。しかし、活性は酵素を用いたインキュベーション後に、約４０％だけ減少した。このことは短い炭水化物鎖が分子に安定性を与えるであろうことの証拠を与える、又は、余分な負電荷（Ａｓｎ＞Ａｓｐ）の導入のためにその除去により活性を減少させる。ウシＡＲＰ配列には、２つの有望なＮ−グリコシル化部位（Asn-Gly-Thr）が存在している（表４参照）。
【０３７０】
ＡＲＰのＤＣ活性及び凝集状態に対する二価陽イオンの影響
アルカリ土類金属の塩（ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２）及び遷移金属の塩（ＺｎＣｌ２及びＣｕＣｌ２）について、準精製したウシ腸由来のＡＲＰ調製物及び組換えＡＲＰにより誘導されるＤＣ活性の阻害に関し、試験をした。粗ＡＲＰ調製物を用いて、ＺｎＣｌ２及びＣｕＣｌ２は、ｍＭ〜μＭの濃度範囲（生理学的範囲内である）で一貫して活性阻害を示したが、ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２では示さなかった。銅及び亜鉛とＡＲＰとの相互作用にいくらかの相違があり、さらに探求する必要がある。両方の遷移金属が、精製した組換えＡＲＰのＤＣ活性も阻害した。しかし、１０ｍＭアルカリ土類金属の塩との組換えＡＲＰのプレインキュベーションを伴う予備実験では、無機培地（２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含み、金属の痕跡のないＭ９）又はリッチな（ＬＢ）培地のいずれかで増殖させた細菌由来のＡＲＰ調製物中で異なる効果を示した。前者はカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの両方により阻害されたが、後者はマグネシウムイオンによってのみ阻害された。この違いは、合成の間の二価金属又はその他の補助因子の局所濃度及びＡＲＰの配座異性体の折り畳まれ、生じた異なる組のせいである可能性がある。
【０３７１】
Ｚｎ２＋による活性阻害のメカニズムに関する実験により、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２の存在下でＡＲＰの凝集が生じ、１５０００ｇで３０分間の遠心分離によりペレット化可能な高分子量の構造体を生じることが明らかにされた。このデータは、二価カチオンの結合が、ＡＲＰの三次構造で電荷を誘導し、内側の疎水性領域を晒し、凝集及び／又はその他のタンパク質との相互作用をもたらし、このことが活性の損失に導くことを示唆している。
【０３７２】
両金属グループの代表による阻害は、ＡＲＰ処理及び精製手順の設計に影響を及ぼす可能性がある。アルカリ土類金属は、全組織及び臓器に豊富にある。Ｚｎ２＋の生理的濃度は、血清中の１０μＭから精液中の３ｍＭまで様々である。Ｚｎ２＋及びＣｕ２＋の濃度は、悪性の物を含むいくつかの疾患の間で変化することが示された。組織及び／又は病態によっては、これらの金属濃度は、ＡＲＰの抗腫瘍活性を妨げるのに十分高いと思われる。これらのケースでは、金属キレート剤の局所投与がＡＲＰ処理手順に含まれるべきであろう。
【実施例７】
【０３７３】
ＡＲＰ活性の測定
動物腫瘍モデルを用いた腫瘍保護測定
BALB/c雄マウスを通常用い、Harlan Industries社から約７週齢のものを入手した。それらは、２日間環境に順応させた後、任意の処置を施した。マウスは、ワイヤー製のふたを有し、水の容器及びフードペレット（マウスの餌）が備えられた、１６ｃｍ×２６ｃｍのプラスチック製ケージ内に、１つのケージ当り５匹以下で飼育した。動物は、自由に水及び餌に接触可能にした。残物は週に一度取り替え、水及び餌は毎日点検した。室内照明は一日２４時間点灯した。
【０３７４】
Ｓ−１８０細胞系（ATCC CCL 8, batch F4805）を、この同じ系を動物及び培地（血清含有及び血清なしの条件の両方で）の両方で増殖させることができたので、腫瘍モデルとして選択した。腫瘍を組織培養液から得られる細胞懸濁液の注射によりマウスに定着させた。約１×１０６から３×１０６個の細胞を、マウス一匹に付き腹腔内に注射した。腫瘍が、腹腔の多数の部位で多数の充実性結節として発生し、１０から１５日内に大半の動物で死を引き起こした。動物の生存の観察に加えて、それらの状態を腫瘍成長の進行として質的に評価し、腫瘍指数を作成するのに用いた。
【０３７５】
治療手順
各実験の治療群は、５匹の動物から構成され、各実験に用いられる合計数から無作為に選んだ。治療は、５日間の毎日の腹腔内注射（ほぼ正午に）から構成されていて、Ｓ−１８０腫瘍細胞の注射後１日目に開始した。注射量は、全治療で０．５ｍｌで一定に保たれた。負対照群は、治療溶液に用いた緩衝液のみの偽注射を受けた。動物は、腫瘍成長による死まで、又はもし退行が生じたなら１００日目まで追跡した。治療に対する任意の遅延型反応を観察するために、自然の寿命まで生き延びさせた動物もあった。
【０３７６】
腫瘍指数
不完全な腫瘍モデル実験での薬物活性の推定値を確立するために、動物の観察による調査並びに生存状況を組み合わせた指標を開発した。マウスの腹腔内のＳ１８０腫瘍の存在、定着及び末期的進行を、週に１度又は２度触診した。腫瘍の発生及び進行は、以下の基準に従ってこれらのマウスで評価した。「０」−触診された腫瘍なし；「１」−初発腫瘍が存在するように思われる；小さいサイズ（〜１ｍｍ）；腹部膨張なし;「２」−腫瘍が定着したように見える；多少の腹部膨満；明らかな悪液質なし；「３」−腫瘍がよく定着し、顕著な腹部膨満、動物が悪液質を示す；及び、「４」−動物が死んだ。処置群の指標値は、群中の個々のマウスの指標の平均である。
【０３７７】
ＮＫアッセイ
材料
DMEM/F12培地、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、及びヒト組換えインターロイキン２（ｈｒ−ＩＬ２）（R & D Systems, Inc社製）は、Gibco/BRLから入手した。Percoll（商標）（Pharmacia, Inc社製）、ゲンタマイシン及びＭＴＴは、Sigma Chemical Co.社から入手した。マウス上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ウシインシュリン及びヒトトランスフェリンは、Collaborative Research Corpから購入した。腫瘍研究、小腸抽出物（ＭＥＸ−ＳＩ）の単離及び脾臓由来のＮＫ細胞の単離に用いた雄Balb/Cマウスは、Harlan Bioproducts for Science (Indianapolis, IN)から購入した。
【０３７８】
ＮＫ（ＬＧＬ）細胞の単離
脾臓（１回の実験当り１０〜１５個）を、６〜１０週齢の雄Balb/Cマウスから無菌的に取り出した。碑細胞を、２枚の滅菌ガラス製顕微鏡用スライドを用いて脾臓から「圧搾（squeezed）」した。細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む約１０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２中で回収した。回収した細胞を７０μｍのナイロンメッシュスクリーンに通すことにより、単一細胞懸濁液を得た。細胞ペレットをＰＢＳで一回洗浄後（６７５×ｇで５分間遠心分離した）、赤血球細胞を短時間の低浸透圧ショック（すなわち、滅菌蒸留脱イオン化水に曝し、直ぐに適当な容量の１０Ｘ  ＰＢＳで処理して等張性に戻した）により溶解した。残った細胞を遠心分離にかけ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳに再懸濁させ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ（フラスコ１個当り５個の脾臓から得た細胞）を各々２５ｍｌ含む７５ｃｍ２のフラスコに移した。細胞を３７℃で６０分間インキュベートし、選択的に付着細胞を容易に取り除いた（主に繊維芽細胞及びマクロファージ）。インキュベーション後、フラスコをゆっくり振盪させ、非付着細胞を除き、遠心分離でペレット化し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（添加物なし）（１．０ｍＬ／１０８細胞）に再懸濁させた。１５ｍｌの遠心管中の７０％／６０％／４０％（２ｍＬ／４ｍＬ／４ｍＬ）Percoll（商標）勾配上に１．０ｍＬの容量のこれらの細胞懸濁液を注意深く積層させ、３０分間６７５×Ｇで遠心分離にかけた。４０／６０界面の沈殿物が主に大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）に相当する細胞をＮＫ細胞で強化した。これらの細胞を注意深くパスツールピペットで除き、遠心分離にかけ、ＰＢＳで１回洗浄し、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及び１０％ウシ胎児血清を追加した約５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁させた。細胞の計数及びＬＧＬ細胞の適当な希釈をこれらの細胞を用いて以下のように行った。便宜上、このＬＧＬ細胞調製物を、同義的にＮＫ細胞という。
【０３７９】
ＮＫ細胞媒介性細胞毒性（ＮＫ−ＣＭＣ）アッセイ
マウスsarcoma 180細胞を、１０％ＦＣＳ及びゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を追加した１００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２中、５×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに蒔いた。数時間適切な付着を確実にさせた後、試験試料（例えば、ＡＲＰタンパク質、正又は負の対照群などの試料）を１０〜２５μＬの体積で各ウェルに加えた。ＮＫ細胞を１００μｌの添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２に次の指定した密度で加えた。０ＮＫ細胞／ウェル、５×１０４ＮＫ細胞／ウェル（１：１０  標的／エフェクター比）、１．２５×１０５ＮＫ細胞／ウェル（１：２５  標的／エフェクター比）、２．５×１０５ＮＫ細胞／ウェル（１：５０  標的／エフェクター比）、及び５×１０５ＮＫ細胞／ウェル（１：１００  標的／エフェクター比）。（注意：通常、１：５０及び１：１００の比のみスクリーニング目的に用いた。ＩＬ２を最終濃度１２５Ｕ／ｍＬで培地添加物として加えた）。共培養液を４日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、終結し、ＭＴＴ細胞生存率定量試験（Mossman, T. J. Immunol. Methods 65:55 (1983)；及びSigma Chemical MTT (M5655) product application note参照）を用いて生体染色した。各ウェルから培地を注意深く吸引し、残った細胞を２回洗浄し、ＭＴＴ（５０μｇ／ｍＬ）を含む１００μＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳと取り替えた。プレートをさらに、３７℃で４〜５時間インキュベートした。プレートリーダー（６００ｎｍフィルター）を活用して吸収を測定した。吸収の減少は、ウェル当りの精細胞の数の減少（すなわち、細胞毒性）を示していた。０．０４Ｍ  ＨＣｌを含む２−プロパノール２００μＬを含む培地で置き換えることにより、ＭＴＴを可溶化した後、吸収を再度測定した。これによりウェル全体に統一色を与え、不均等な細胞分布による吸収測定値の矛盾を最小化した。負（ＰＢＳ／ＢＳＡ）及び正（内部標準）の対照群と比較して、ＮＫ誘導活性を計算した。
【０３８０】
樹状細胞（ＤＣ）アッセイ
ＢＥＸの準精製調製物の活性を調査するために、単離したばかりの樹状細胞（ＤＣ）からのＩＬ１２の放出をＤＣ活性の指標として追跡するアッセイを開発した。この活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＫ−ＣＭＣ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性の両方と高い相関関係にある。
【０３８１】
特殊試薬
マウス組換えＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ４及びＩＦＮγ及び抗マウスＣＤ４０は、R & D Systems社（Minneapolis, MN）から入手した。コラゲナーゼＤは、Boehringer Mannheim社（Indianapolis, IN）から入手した。ＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気細胞分離システムは、Miltenyi Biotech社(Auburn, CA)から入手した。
【０３８２】
ＤＣの単離及び培養
ＤＣは、Miltenyi Biotech社から購入した磁気支援型細胞分離（magnetic assisted cell separation）（ＭＡＣＳ）システムを用いて、８〜１２週齢の雄BALB/cマウス（Harlan Bioproducts for Science社製、Indianapolis、IN）の脾臓から単離した。概説すると、脾臓を無菌的にマウスから取り出し、５ｍＬの維持培地（１０％ＦＣＳ及び抗生物質が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２）を含むペトリ皿に入れた。次いで、各脾臓に〜０．５ｍｌずつコラゲナーゼＤ溶液（１ｍｇ／ｍＬを含む１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２）を注射し、５〜１０ｍＬのコラゲナーゼＤに入れ、５〜６片に切断し、３７℃で４５〜６０分間インキュベートした。次いで、コラゲナーゼ消化した脾臓をスライドガラスを用いて処理し、７０μｍのナイロンメッシュセルストレイナー（cell strainer）に通した。ストレーナーに４０ｍＬの培地を流した後、細胞を遠心分離にかけ（８分＠２００×Ｇ）、１ｍＬのＰＢＳに懸濁させ、細胞懸濁液を室温で５分間、１０ｍＬのlysis緩衝液（１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０.１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でインキュベートすることにより赤血球細胞を溶解させ、次いでＰＢＳ中で５０ｍＬに希釈し、遠心分離した（８分＠２００×ｇ）。次いで、碑細胞をＭＡＣＳ緩衝液（２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５％  ＢＳＡを添加したＰＢＳ  ｐＨ７．２）１０ｍＬに懸濁させ、４０μｍのナイロンメッシュセルストレイナーに通し、ＭＡＣＳ緩衝液４０ｍＬを流した。この時点で細胞の予備的計数を行い、遠心分離にかけた（８分＠２００×Ｇ）。碑細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液４００μＬ当り、１０８個の細胞密度で懸濁させた。抗ＣＤ１１ｃ抗体で被覆したParamagnetic MicroBeadsを碑細胞懸濁液（１００μＬ／１０８細胞）と混合し、＋４℃で１５分間インキュベートし、洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液１．０ｍＬに懸濁させ、強磁場内に置かれたＭＳ＋分離カラムに通した。ＣＤ１１ｃ＋細胞をカラムに保持したが、ＣＤ１１ｃ−細胞は、流入細胞フラクションとしてカラムから洗い流した。次いで、ＣＤ１１ｃ＋細胞を、磁場からカラムを除くことにより回収し、１ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で２回カラムを洗い流した。ＣＤ１１ｃ＋細胞を培地で１回洗浄し、０．５×１０６細胞／ｍＬの密度でサイトカインを添加した培地｛マウスＧＭ−ＣＳＦ（１ｎｇ／ｍＬ）、マウスＩＬ−４（１ｎｇ／ｍＬ）、マウスＩＮＦγ（３ｎｇ／ｍＬ）及び抗マウスＣＤ４０（０.５ｍｇ／ｍＬ）を含む、１０％ＦＣＳ及びゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２｝に懸濁させた。次いで、ＣＤ１１ｃ＋細胞を、１ウェル当り培地１００μＬに希釈した試験試料（例えば、ＡＲＰタンパク質、正又は負の対照群を含む試料）を含む９６ウェル組織培養プレートに加え（１００μＬ／ウェル）、５％ＣＯ２、９５％空気中、３７℃で一晩培養した。
【０３８３】
ＤＣからのマウスＩＬ１２（ｐ７０）放出の測定
ＣＤ１１ｃ＋碑細胞からのマウスＩＬ１２放出を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。簡潔には、ＣＤ１１ｃ＋細胞培養上清を、一晩インキュベーション（通常１５〜１８時間）後サンプリングした。培地のサンプル（１００μＬ）を、抗マウスＩＬ１２（ｐ７０）捕捉用抗体（Ｒ＆Ｄ社製、＃ＭＡＢ４１９、１ウェル当り１００μＬ中に２５０ｎｇ）で被覆したＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃又は室温で２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で十分に洗浄した後、１ウェル当り１００μＬの検出用抗体／検出用試薬（ビオチン標識抗マウスＩＬ１２、Ｒ＆Ｄ社製、＃ＢＡＦ４１９、５０ｎｇ／ｍＬで、ストレプトアビジン−ＨＲＰ）を加えた。ＥＬＩＳＡプレートを再び２時間インキュベートし、洗浄し、ＴＭＰ基質溶液（Pierce社製、＃３４０２１）に２０分間曝した。基質反応を１００μＬ／ウェルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることにより止めた。ＥＬＩＳＡプレートを、４５０ｎｍ（５４０ｎｍで修正した）で読み取り、ＥＬＩＳＡでの（intra-ELISA）標準曲線（範囲：２０００〜３１．２５ｐｇ／ｍＬ）を用いてｍＩＬ１２（ｐ７０）レベルを計測した。
【０３８４】
ＩＮＦ-γアッセイ
ＬＧＬによる培地へのＩＦＮγの産生及び放出を以下のように評価した。ＮＫ細胞で強化したＬＧＬを１２．２節で上述したように単離し、１０％ウシ胎児血清、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、及びＩＬ２（１２５Ｕ／ｍＬ）を添加した２００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２中に、２．５又は５．０×１０５細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに蒔いた。試験サンプル（例えば、ＡＲＰタンパク質を含む試料、正又は負の対照群）を加え、細胞を一晩培養し、その後、馴化培地（ＣＭ）を除き、遠心分離にかけて吸引された細胞を除いた。次いで、定量のＣＭを、様々な供給源（BD PharMingen Inc.社、Genzyme Corp.社、及びＲ＆Ｄ Systems Inc.社）から購入したＥＬＩＳＡキットを用いてＩＦＮγについて測定した。簡潔には、ＥＬＩＳＡアッセイでは、ＣＭ又は血清サンプル（及びＩＦＮγ標準物質）を、予め捕捉用抗体（ハムスターモノクローナル抗マウスＩＦＮγ)で被覆したＥＬＩＳＡプレートウェルで、３７℃で１時間、インキュベートする。十分に洗浄後、ウェルをビオチン標識二次抗体（ポリクローナル抗マウスＩＦＮγ）に、３７℃で１時間曝す。次いで、洗浄後、ウェルを検出用試薬（西洋わさびペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジン）に、３７℃で１５〜２０分間曝す。再び、十分に洗浄後、１００μＬ  ＴＭＢ基質をウェルに加え、室温で５〜７分間インキュベートした。反応を１００μＬの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて停止する。４５０ｎｍでの吸収をプレートリーダーを用いて読み取り、ＩＦＮγ濃度を標準曲線から計算した。
【０３８５】
ＡＲＰの抗腫瘍活性
マウスＳ−１８０モデルにおける活性
濃縮又は単離したＡＲＰ
ＢＢＸ−０１ｃの質を決定するために用いられた、一連の通常のスクリーニング実験を一つの生存プロットに編集した。これを図８に示す。治療群の約半数の動物が治療されたとみなされた−１００日より多く生存した。死んだもの中でも、対照群より平均して寿命が増加しており、約２．５倍であった。
【０３８６】
ある実験では、５日の投与計画を、Ｓ１８０腫瘍の注射に関して異なる時間に開始した。−５日目から−１日目、−２日目から＋２日目、１日目から５日目、及び４日目から８日目。抗腫瘍活性は、腫瘍の注射の２日前に開始した注射が最適であった（治療群５匹のうち４匹）。結果は、１日目に開始した注射でも非常に良好であった（治療群５匹のうち３匹）。−５日目から−１日目、又は４日目から８日目に注射がされた場合には、抗腫瘍活性は乏しかった。これらのケースでは、寿命の増加は、非治療群のわずか〜１５０％であった。
【０３８７】
Ｅ．テネラ由来の粗膜調製物の抗腫瘍活性
粗膜調製物を、５０μｌのオーシスト懸濁液から９節に記載したように調製した。予備段階の結果を図１７に示す。腫瘍指数は、この調製物が抗腫瘍活性を示し、精製した可溶性ＡＲＰと同様に用いることができることを示す。
【０３８８】
純度が増大した場合の抗腫瘍活性
精製手順の検証によって、大抵マウスモデルでの腫瘍の治療の成功がもたらされた。異なる精製工程から得られる試料を回収し、ＮＫアッセイで活性を検証し、その後、標準的な５日間の手順に従って、腫瘍耐性マウスに注射した。５０％を超える純度であった、プール１由来のＣ８クロマトグラフィーの試料を含め、各工程で高い活性を観察した。
【０３８９】
Ｅ.テネラ抽出物の抗腫瘍活性
Ｅ.テネラのオーシストからの抽出物は、８節に記載の第２の手順を用いて調製した。Ｓ−１８０腫瘍耐性のマウスの５つの群に、異なる投与量のＡＲＰ含有抽出物を５日間注射した。これらの投与量を図９に示す（右側）。実験に入って４０日目の予備段階での結果は、最適な投与量がこの抽出物で存在するであろうことを示している（０．３６ｎｇ／マウス／日）。３桁の投与範囲にわたって、０．０４８ｎｇ／マウス／日に至るまで、良好な応答が観察される。
【０３９０】
組換えＥ．テネラＡＲＰ、ＥｔＵ３及びＥ１の抗腫瘍活性
ＥｔＵ３又はＥ１クローン（図２０参照）由来又はＥ.テネラ胞子形成オーシストの抽出物由来の精製した組換えＡＲＰ分子を、３つ又は５つの異なる投与量でＳ−１８０腫瘍耐性マウスに注射した。これらの投与量を、図９に示す（右側）。観察される腫瘍がないマウスが「治療された」とみなされた時点でマウスを１００日間追跡調査した。全種類のＡＲＰ分子に対する最適な治療投与範囲は、０．１から１０ｎｇ／マウス／日の間であった。応答体とは、対応する対照群の平均以上の２つの標準偏差より多く生存したマウスである。マウス抗腫瘍モデルにおいて５０％の応答を得るのに有効な量の推定値が、Hillの式を応答体数対投与量に当てはめることにより得られ、０．０１１ｎｇ／マウス／日の値が得られた（回帰計数＝０．８６、ＣＶ＝７．５％）。
【０３９１】
抗腫瘍活性とｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイとの相関
部分的に精製したＡＲＰ物質に関する初期の抗腫瘍試験では、ＮＫアッセイも同時に試験された。２つの試験の相関を図１０（Ａ）に示す。マウス腫瘍モデルで試験した試料を、ＮＫアッセイ及びＤＣアッセイでも試験して、開始用量の確立に役立てた。ＤＣアッセイの動物の生存に対する相関を図１０（Ｂ）に示す。この相関により、腫瘍試験に関して動物の使用に頼ることなく、また、抗腫瘍実験に固有の長期の遅滞なく、精製の間、定期的に活性を追跡することが可能となった。
【０３９２】
ヒト患者での応答
ＡＲＰの抗癌活性を第１相臨床試験でも試験した。試験は毒性を評価するために設計されていたが、陽性腫瘍状態の可能性のある患者に対しては常に注意を払う。試験の第２過程では、濃縮したＡＲＰ組成物（ＢＢＸ−０１ｃ）を用いた際に、胚細胞性卵巣癌の一人の患者が、血清ＩＬ−１２レベルが上昇し（図１１）、部分的に精製したＡＲＰ（ＢＢＸ−０１ｃ）の１回の５日間治療過程後に８ｃｍの骨盤の腫瘤が劇的に減少し（表７）、さらに２回目の５日間治療過程後に腫瘍及び腹膜の腹水を全て完全に除去されたことを示した。患者の肝臓及び脾臓のその他の瘤は難治性であったが、ほぼ２年間静的なままであった。患者は深刻な痛み及び寝たきりの状態から解放され、仕事に復帰可能な痛みのない状態となった。この患者の成功に続いて、他の末期の上皮性卵巣癌患者を補充した。主な癌専門医の評価は、これらの疾患が予想よりも長い間安定状態のままであったことを示している。
【０３９３】
【表７】
2008500005.tif 000017
【０３９４】
ＡＲＰの免疫刺激活性
ＮＫ活性
早期にこの計画で、マウス脾臓から単離された細胞傷害性リンパ球が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳ１８０細胞に対するマウス及びウシ小腸抽出物の細胞傷害効果の重要なメディエータであり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらの抽出物の抗腫瘍作用にも恐らく中心的に関与することが発見された。したがって、ＮＫ様細胞の細胞毒性活性の誘導を評価するための新しいｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを考案し、不連続なPercoll（商標）勾配を用い、マウス脾臓から単離された大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）を用いて実行した。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＩＥの細胞溶解効果の重要なメディエータとして通常言及される。しかし、キラー細胞により活性化されるリンパ球（ＬＡＫ）などの、碑細胞のＬＧＬ集団に含まれる他のリンパ球もまた含まれるであろうことに留意すべきである。
【０３９５】
ＬＧＬを、様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比で４日間、Ｓ１８０腫瘍細胞と共培養した。この手順は、ＮＫ活性に関する他の報告された実験では典型的には用いられない。これは、ＮＫの活性化が生じている間に腫瘍細胞が分裂しているので独特である。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件をもっと近く模倣するであろうより複雑な環境を作る。培地は、低濃度のＩＬ２（１２５Ｕ／ｍｌ）に加えて、試験される腸の抽出物の任意の実験的（精製）調製物を含んでいた。最も高いＮＫ：Ｓ１８０の比（１００＿ＮＫ）で、ＩＬ２単独で誘導される「定常」活性は、通常低く（１０〜１５％）、このことはＳ１８０細胞が、ＩＬ２により誘導されるＬＧＬ細胞の細胞溶解作用に対して相対的に耐性を有していることを示唆している。しかし、部分的に精製したウシ小腸抽出物の存在下では、これらのＬＧＬの細胞溶解活性は劇的且つ相乗的に増加し、しばしば、５０：１という低いエフェクター：標的比でほぼ１００％の細胞毒性をもたらした（エフェクター：標的比は細胞を蒔いた時点−０日目に決定することに留意すべきである。Ｓ１８０細胞は、続く培養期間の間に３〜４回の集団倍加を受け、ＬＧＬはこれらの条件下では増殖しないので、ＮＫ細胞の活性化の時点での実際のＥ：Ｔ比は、恐らくここで言われているものよりもかなり低いものであろう。）
【０３９６】
ナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害（ＮＫ−ＣＭＣ）の誘導は、Ｓ１８０細胞の抽出物の任意の直接的細胞毒性又は増殖阻害作用に関連しない。ＳＩＥ誘導ＮＫ−ＣＭＣは、ＮＫ細胞の非存在下で（０＿ＮＫ効果）、Ｓ１８０細胞の増殖又は生存度に与える観察可能な効果がないことを、膨大な投与範囲にわたって証明することができる。ＳＩＥで処理したＮＫ／Ｓ１８０共培養液の顕微鏡観察により、「活性化された」培養液中のＮＫ細胞のクラスター形成及び凝集が言及された。ＮＫ細胞のクラスター形成は、特にＳ１８０細胞の周囲に集中しているように思われる。経時変化実験は、２〜３日のＮＫ細胞のＳＩＥへの暴露が、細胞溶解活性を誘導するのに必要とされることを示す。ＳＩＥ誘導ＮＫ−ＣＭＣの誘導は、抗アシアロ−ＧＭ１抗体でＬＧＬ／Ｓ１８０の共培養液を処理することにより阻止され、ＮＫ細胞の細胞溶解効果を特異的に阻止する。これらの結果は、ＮＫ細胞が、Ｓ１８０腫瘍細胞に対するＳＩＥのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞障害反応の媒介に主に関与することを示している。
【０３９７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＩＥによるＮＫ−ＣＭＣの誘導は、これらの培養の培地のＩＦＮγレベルの増加に非常に関連している。ＩＦＮγ（[ＩＦＮγ]）の濃度を、ＳＩＥに曝したＬＧＬ培養液の馴化培地で測定するときに、[ＩＦＮγ]は、処理の１８時間以内に劇的に増加する。容量反応の関係は、[ＩＦＮγ]の増加とＮＫ−ＣＭＣの誘導との間に緊密に結びついた関係があることを示す（図１１）。マウスＩＦＮγ（抗マウスＩＦＮγ 抗体）に対する中和抗体を用いたＮＫ／Ｓ１８０細胞共培養液の処理は、ＳＩＥにより誘導されたＮＫ−ＣＭＣを著しく減少させ、且つ／又は阻止する。しかし、マウス組換えＩＦＮγを直接的にＮＫ／Ｓ１８０共培養液に加えることでは、ＳＩＥにより誘導される最大ＮＫ−ＣＭＣを遥かに下回る、ＮＫ−ＣＭＣの僅かな増加しかもたらさない。これらの結果は、ＳＩＥにより誘導される［ＩＦＮγ]の増加が、ＳＩＥ誘導ＮＫ−ＣＭＣを媒介する際に早期に必要とされる事象であるが、それ自身ではＮＫ−ＣＭＣを誘導するのに十分ではないことを示唆している。
【０３９８】
ＳＩＥによるＬＧＬ培養液中でのＩＦＮγの急速な誘導は、様々な精製工程の活性を試験するためのより迅速な方法をもたらす。ＩＮＦアッセイ考案して（１２．４節参照）、数年間、活性の１日のみの試験を提供するのに使用した。
【０３９９】
ＮＫ−ＣＭＣに影響を及ぼすための多数の生物反応修飾物質が報告されている。我々は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＩＥ誘導活性を再現しようとして、多くのこれらの因子をＮＫ−ＣＭＣアッセイでスクリーニングしてきた。
【０４００】
【表８】
2008500005.tif 000018
2008500005.tif 000019
【０４０１】
ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、及びＩＦＮγだけが、ＢＥＸ（濃縮したＡＲＰ）と同様の条件下で試験した場合にＮＫ−ＣＭＣを増加させる任意の能力を示した。しかし、ＴＮＦα及びＩＦＮγは、ＢＥＸに比べて比較的弱いエンハンサーであった。さらに、以下に記載するように、ＩＬ−１２のＮＫ−ＣＭＣを増加する能力は、ＬＧＬ混合物中の樹状細胞によるその産生に関連している。最終的に、Ａフラクション（ＤＥＡＥ流入フラクション）の主要成分であるＩＬ１８は、フラクションＣ（ＤＥＡＥ溶出フラクション）には存在していない。したがって、我々のＬＧＬ／Ｓ１８０アッセイ系のｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で試験したＮＫ−ＣＭＣの既知のエンハンサーは、小腸由来の抽出物に類似の様式では、ＮＫ細胞媒介細胞傷害を刺激しない。
【０４０２】
樹状細胞の活性化
我々は、近年、樹状細胞（ＤＣ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＲＰにより誘導される活性において重要な役割を果たすことを証明した。これは、標準的ＮＫアッセイからＤＣを除くことにより、全体的なＮＫ−ＣＭＣ活性を除くことをベースにしている。さらに、ＢＢＸ−０１ｃは、磁気支援型細胞分離（ＭＡＣＳ）により得られる濃縮したＤＣ懸濁液からのｍＩＬ−１２（マウスＩＬ−１２）放出を誘導する。抗ｍＩＬ−１２（中和抗体）もまた、顕著にＢＢＸで誘導されるＮＫ細胞媒介細胞傷害（ＮＫ−ＣＭＣ）を減少させる。
【０４０３】
他の活性化因子の非存在下ではＢＢＸ−０１ｃは脾臓ＤＣ由来の中程度の量のｍＩＬ−１２しか誘導しなかったので、これらの観察をＢＢＸ−０１ｃ物質の有用なアッセイに活用する試みが大幅に制限された。他の樹状細胞アゴニスト及び補助刺激分子の活用は、ＢＢＸのＣ成分との強力な相乗効果を示した（図１３（Ａ）−下のパネル）。４つの添加物は、ＢＢＸ−０１ｃの存在下で最大の応答を与えるが、その非存在下では活性を有しない。４つの添加物のうちの１つを取り除くことにより、ＩＬ−１２放出に様々な減少をもたらす。ＣＤ４０リガンドと置き換わる抗ＣＤ４０抗体は、最も重要な相乗作用を示す薬剤であり、次いでＧＭ−ＣＳＦ、さらにＩＬ−４が続く。後者の２つのサイトカインは、樹状細胞を成熟に導くが、ＣＤ４０リガンドはＣＤ４Ｔ細胞の存在を模倣して、結果的に樹状細胞にそれらの活性化サイトカインを放出させる。Ｅ.テネラ抽出物は、ＢＢＸ試料に対してほぼ理想的な様式で振る舞い（図１３（Ａ）−上のパネル）、２つの活性分子の類似性を強化するが、さらに重要なことに、小腸組織のその他の分子は活性に不可欠ではないことを示している。
【０４０４】
４つの添加物の最適化により、ＢＢＸ−０１ｃ及びアイメリアの活性の非常に確固としたアッセイが開発された。ＤＣ／ｍＩＬ−１２放出活性は、Superdex、ＨＩＣ、様々なＨＰＬＣクロマトグラフィー分離、並びにその他の分別から得られる試料のＮＫ−ＣＭＣ活性と非常によく相関している。さらに、用量／応答関係は、低レベルのＢＢＸ−０１ｃの活性Ｃ成分を検出する場合に、ＤＣ／ｍＩＬ−１２放出アッセイがＮＫ−ＣＭＣアッセイよりも有意に感受性が高いことを示している。それは完全にＡ成分に対しては非感受性で、抗腫瘍活性と最も高い相関性を有するＢＢＸの以下の成分の理想的なアッセイとなる。樹状細胞で活性であることが報告されたその他のサイトカインもまたＣとの相乗作用が試験され、これらは上記表８に報告されている。
【０４０５】
ＢＢＸの活性に関する他の重要な観察は、樹状細胞を精製するために単離したばかりの碑細胞を使用することの必要性である。もしＤＣ様細胞を、末梢血単球から培養液中でＩＬ４及びＧＭ−ＣＳＦとインキュベーションすることにより調製したら、それらはＢＢＸに対し応答しない。さらに、単離したばかりの碑細胞を培養条件に順応させることができれば、それらは反応性を失う。これを図１３（Ｂ）に示す。樹状細胞の成熟の特定の段階が活性に必要とされると思われる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで樹状細胞を腫瘍抗原に曝す現在の免疫治療手順は、アイメリア抗原刺激によって利益を得ないであろう。これに対し、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われるこれらの手順は非常に高められるであろう。
【０４０６】
マウス腫瘍モデルでのＧＭ−ＣＳＦとの相乗作用
樹状細胞からのＩＬ−１２放出アッセイの開発の間に、いくつかのサイトカインがＢＢＸ−０１ｃとの相乗作用を示した。これと臨床条件との関連性を探求する必要があり、将来人体試験で重要となるであろう。ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子）との相乗作用のｉｎ  ｖｉｖｏでの試験を、マウス腫瘍モデルで２つの実験を行った。その実質的な歴史及びヒト治療の相対的な安全性のために、ＧＭ−ＣＳＦが選択された。さらに、その作用形態は主に細胞集団の数を拡大し、ＢＢＸ−０１ｃに対する最も相補的な機能をもたらすであろう。
【０４０７】
２つの投薬の組合せの結果を図１４に示す。偽注射又はＧＭ−ＣＳＦ単独を受けた動物は、類似の生存曲線を辿った。次善のＢＢＸ−０１ｃ投与を行ったものは、いくらかの治癒及び残存の動物の生存率中央値の延長を示した。併用治療は、腫瘍成長の痕跡がなく、１００％の治癒効果があった。
【０４０８】
ＧＭ−ＣＳＦの投与量は、２０ｎｇ／マウス／日であったが、これは０．１μｇ／ｋｇ／日のヒト投与量とほぼ等価である。このようなヒト投与量は、化学療法の前後に白血球数を上昇させるために癌の治療に用いられるｒｈＧＭ−ＣＳＦ（組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ）に関する投薬範囲２〜３２μｇ／ｋｇ／日よりもかなり低い。この投与量は、ＧＭ−ＣＳＦに対するヒトの許容度がＢＢＸ−０１ｃとの可能な組合せでは問題とならないであろうことを示唆している。
【０４０９】
インターロイキン−１２の誘導
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方でのＡＲＰの主な効果の１つに、樹状細胞からのインターロイキン−１２（ＩＬ１２）の放出の誘導がある。ＩＬ１２は、例えば免疫調節などの、様々な用途が提案されてきた。しかし、このような用途は、ＩＬ１２の投与に関連する深刻な毒性により制限されてきた。本発明のＡＲＰはＩＬ−１２の全身投与の代替法を提供し、関連の毒性なしにＩＬ１２の投与の恩恵を与える。
【０４１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＲＰ分子の薬動力学の予備評価を、ＤＣ／ｍＩＬ１２生物検定の非常に高い感受性を利用して、マウスで試験して、非常に低濃度でＡＲＰを検出した。マウスに腹腔内又は皮下注射により、０．１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液０．５ｍｌに希釈したＡＲＰ  ＥｔＵ３（活性タンパク質３５２．５ｎｇ）を１回投与、又はＥ.テネラ抽出物（３６ｎｇの活性ＡＲＰ含有）を１回投与した。マウスは、以下の間隔で軽いエーテル麻酔を用い、眼窩洞穿刺技術を介して出血させた：ｌ時間、３．５時間、7.５時間、１２時間、２４時間、及び４２時間。血液をヘパリン化ミクロヘマトクリットの毛管に回収し、〜７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血漿を単離して、血液回収が終了するまで＋４℃で保管した。
【０４１１】
動物でＡＲＰがＩＬ１２を誘導し得る度合を評価するために、一定量の血漿試料を培地に入れて希釈し、ＩＬ１２  ＥＬＩＳＡに直接適用した。腹腔内注射した３匹のマウス及び皮下注射した１匹のマウスからの結果を、治療ごとに図２５に示す。血漿ＩＬ１２は、注射後約５時間でピークに達し、速度定数０．９２／時間の濃度の指数関数的増加及び速度定数〜０．１５／時間の濃度の指数関数的減衰を示した。
【０４１２】
これらの実験により、Ｅ.テネラ由来のＡＲＰ薬物療法によるＩＬ１２の誘導に関する原理の裏付けを示した。この実験で注射されたＡＲＰレベルは、マウスでの有効投与量より著しく高く（〜０．０５から５ｎｇ／マウス／日）、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ１２の誘導に関する上昇速度及び下降速度は、仮定的とみなす必要がある。
【０４１３】
さらに、ＢＢＸ−０１は、第１相臨床試験の選択的患者での血清ＩＬ１２の濃化を誘導した（図１１参照）。
【実施例８】
【０４１４】
ＡＲＰの精製に用いられるその他のアッセイ
エンドトキシンに関するＬＡＬ
エンドトキシンは通常ＬＡＬゲルクロット法（the Associates of Cape Cod Incorporated社から入手、704 Main St., Falmouth MA）により検査する。試料は、精製工程の様々な時点で採取し（１及び２段階の処理）及び製造元により記載された標準的方法を用いてエンドトキシンレベルを試験した。小腸処理の初期段階では、ヒト使用に対し上記許容可能なレベルのエンドトキシンが含まれていたが、これらは更なる精製により安全なレベルに減少させる。Superdex（商標）75カラムによる処理により、施行ごとにエンドトキシンレベルは１０分の１未満の減少をもたらした。したがって、カラムを通して物質を再処理することにより、エンドトキシンを任意の所望レベル、ＵＳＰ水の本来の背景濃度にまで減少させることが可能となった。標的エンドトキシンレベルは、非経口薬剤のためのＦＤＡガイドライン（＜５ＥＵ／ｋｇ）に合致する最終濃度の物質が得られるように設定した。ＢＢＸ−０１（１００ｍｇ／ヒト）の最も高い提案投与量では、これは約７０ｋｇ／ヒト×５ＥＵ／ｋｇ÷１００ｍｇ／ヒト、又は７０ｋｇの患者に対し３．５ＥＵ／ｍｇの最大標的エンドトキシンレベルを与える。ＢＢＸ−０１のパイロジェンの安全性の検証は、STS, Rush, NYで独立に試験することによってもたらされた。エンドトキシンレベルが０．４（±０．２）ＥＵ／ｍｇであるSuperdex（商標）再処理物質についてのウサギパイロジェン試験は、発熱効果をもたらさなかった。
【０４１５】
再生
ＡＲＰを含む回収したフラクションの再生には、逆相クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ゲル電気泳動（例えば、分子量の決定）、等電点電気泳動（ｐＩの決定）、及びいくつかの化学修飾の後に、いくつかの改良と共に、Cabilly et al. Proc Natl Acad Sci USA. 81 (11): 3273-7 (1984)により、異なる用途（不溶性組換えタンパク質の再折り畳み）に関して記載された方法を利用した。Ｃ−４、Ｃ−８、又はＣ１８ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーより回収したか、又はアクリルアミドゲルのスライスから抽出したフラクションを、６〜８，０００ｋＤ（Spectra/Por、Houston、ＴＸ）のＭＷ分画の多孔性分子透析チューブ（molecular porous dialysis tubing）に入れた。ＢＳＡを、最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように各バッグに加えた。次いで、バッグを、５０倍の量の８Ｍウレア／５０ｍＭアミノ酢酸ナトリウム、ｐＨ１０．８、１ｍＭシステイン、及び０．１ｍＭシスチンで、４℃で１６時間透析し、その後、これを１００倍の量の１Ｍウレアを含む同じ緩衝液で２４時間透析し、最終的に２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭシステイン、及び０．１ｍＭシスチンを含む１００倍の量のＰＢＳを２回交換した（８時間、及び１６時間）。フラクションを、Spin-X（商標）チューブ（Costar社製、Cambridge、MA）を用いることにより滅菌ろ過し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ用に希釈した。
【０４１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動：
Modular-Mini PROTEAN II（商標）電気泳動システム（BioRad社製  カタログ番号１６５−２９４０）を、１５％Ｔ、０．８％C Tris／グリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲルと共に用いた。ＳＤＳゲル電気泳動は、Laemmli, U. K. (1970) Nature 227,680-685に従って行った。ゲルは、銀染色し、写真を撮影し、貯蔵のために乾燥させるか（Promega 社製のGel Drying Kit、Fisher  カタログ番号ＰＲ−Ｖ７１２０）、又は密封バッグに湿ったまま保管した。ＡＲＰの分子量の概算のために、ゲルをスライスに切断し、チューブに入れ、０．１〜０．５％ＳＤＳを含む緩衝液で抽出し、その後、再生させた。抽出物をＮＫ活性及びＤＣ活性について試験した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を、分子量の計算に用いた。
【０４１７】
化学修飾手順
純粋でない活性なウシ試料の化学修飾を利用してＡＲＰ中の様々なアミノ酸の重要性を決定した。反応は、純粋なタンパク質用に設計された「The Protein Protocols CD-ROM」（Walker、1998、Protein Protocols on CD、Humana Press社、Totowa、NJ）に従って行った。修飾を付加することにより粗タンパク質混合物の利用が可能となった。遊離のＣＯＯＨ残基の修飾（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、及びＣ末端中）では、試薬ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を用いた。Ｈｉｓ修飾（エトキシホルミル化）では、試薬ＤＥＰ（ピロ炭酸ジエチル）を用いた。Ｔｒｐ修飾では、Koshland試薬（２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロマイド）を用いた。グアニジン基（Ａｒｇ中）の修飾では、ＣＨＤ（１，２−シクロヘキサンジオール）試薬を用いた。遊離ＳＨ基（Ｃｙｓ中）の修飾では、２つの方法が利用された。ａ）Ellman試薬、ＤＴＮＢ（５−５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））及びｂ）ＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）。遊離ＮＨ２基（アミジン化）（Ｌｙｓ、及び可能なＮ末端中）の修飾では、アミジン化試薬ＭＡＨ（メチルアセチミデート（methyl acetimidate）塩酸塩）を用いた。一般的な酸化／ニトロ化反応では、ＴＮＭ（テトラニトロメタン）を用いた。還元反応を行うために、ＮａＢＨ4、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４、又はＮａ２ＳＯ３のいずれかによる処理を用いた（これらの試薬の酸化還元電位は、１．２４、２．９６、及び０.９２Ｖである)。Ａｓｎ−Ｇｌｙ部位の分子の切断には、塩基性ｐＨでヒドロキシルアミンを用いた。
【実施例９】
【０４１８】
動物及びヒトでの毒物学
初期の毒物試験
小腸抽出物又は任意のその精製フラクションを用いた標準的(腹腔内)治療の間、毒性は観察されなかった。動物の健康状態、それらの活性レベル、体重増加に、明白な変化は認められなかった。
【０４１９】
１．０ｍｌまで単回投与で与えられた３匹のマウスで、ブタ小腸抽出物の急性毒性を試験した。過敏性又はアナフィラキシーの誘導について試験するために、０．５及び０．９ｍｌのブタ抽出物の反復投与を、それぞれ７日後及び８日後に行った。これらは、いかなる観察可能な変化も誘導しなかった。
【０４２０】
高い皮下投与量のＢＢＸ−０１ｃでは、マウスで非常に穏やかな表現型の変化が認められたが、５日間の注射の間だけしか認められなかった。様々な臓器由来の組織試料で何の病理学的効果も観察されなかった。
【０４２１】
治療動物は、通常碑腫大を示した。これは、通常ＩＬ−１２などの他の免疫促進剤で観察された。脾臓には病理学的変化はなかったので、腫大は、腸抽出物で処置した利点及び所望の結果とみなされる。
【０４２２】
イヌでのＢＢＸ−０１の安全移行
ＦＤＡの勧告の下、最初のＢＢＸ−０１製剤について２匹の雄及び２匹の雌のビーグルで初期安全移行試験を行った。これは、MPI Research社、ミシガン州Mattawanに外注した。試験の目的は、ヒトで使用されるであろう初期投与量を動物に注射したところ、イヌの体重は減少変化しなかった。これは、ヒトで初期投与量が安全に投与することができ、用量の漸増を進め得る基準レベルを与え得るとＦＤＡによりみなされていた。報告の概要は、薬物に対する副作用はなかったことを示していた。
【０４２３】
患者での毒性、ＢＢＸ−０１（試験の第１工程）
第１相臨床試験のこの工程で観察される唯一の毒性は、注射部位での穏やかな、可逆的紅斑であった。これは隆起せず、かゆみはなかった。全ての患者で大小の程度はあれ生じたが、危険とはみなされなかった。他の副作用は、血液化学、細胞数、又は注意深い身体診療では観察されなかった。
【０４２４】
患者での毒性、ＢＢＸ−０１ｃ（試験の第２工程）
より高い純度の製剤であるＢＢＸ−０１ｃは、患者の半数により高い同等の投与量を与えた時でさえ、前の製剤の紅斑を示さなかった。非常に高い投与量は、薬物がなかったため、追求しなかったが、胚細胞性卵巣癌患者でのある強い反応がこの物質の治療指数が恐らく高かったことを示していた。
【０４２５】
Ｅ.テネラ抽出物のマウスでの予備的毒性
８節に記載の方法を用いて、Ｅ．テネラのオーシスト由来の調製物を２匹のマウスに１回高用量で注射した。投与は、１２．１節に記載の抗腫瘍試験で与えられた４０回高用量であった。マウスは、何の観察可能な行動変化もなく注射を許容して、何らかの急性反応の兆候も生じなかった。
【０４２６】
Ｅ.テネラ組換えＡＲＰ、ＥｔＵ３の予備的毒性
組換えＡＲＰ（ＥｔＵ３）について、予備的毒性試験を行った。３匹の雄BALB/cマウスに、４．３μｇのＥｔＵ３を含む１ｍｌの０．１％ＢＳＡ含有緩衝液を、４日間連続で毎日各々（腹腔内）注射した。１匹の注射しないマウスを対照として確保した。体重を注射の間及び注射後に測定した。４回目の注射の２４日後、マウスに５回目の注射がなされた。５回目の注射の約１時間後に、血清ＩＬ１２レベルの測定及び予備的な薬物動態解析の測定のために血液を各マウスからサンプリングした。さらに、以下の臓器を除き、更なる組織病理学的な解析のために１０％緩衝ホルマリンで固定した。脾臓、肝臓、肺、腎臓、副腎、心臓及び脳。ＥｔＵ３での治療の間又は後で、毒性の明白な示唆は、観察されなかった。これらには、体重の有意な変化、「だらしなさ」、嗜眠及び下痢がなかったことも含まれる。
【０４２７】
マウスでのｒＢＢＸ−０１の毒性
ｒＢＢＸ−０１（３％ＨＳＡで製剤したＥ１)の急性毒性を、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与経路を用いてマウスで評価した。３匹の雄マウスに、４日間連続で毎日４．２７μｇ／ｋｇ／日のｒＢＢＸ−０１をｉ．ｐ．注射した。２７日目に各マウスは、５回目の投与を受けた。５回目の投与の１時間後、全動物を屠殺し、剖検した。選択した臓器及び組織を組織病理用に処理した。
【０４２８】
治療したマウスのいずれにも毒性のひどい兆候はなかった。治療した３匹のマウスの体重は、治療期間の間予期した僅かな増加を示した。臓器（肝臓、脾臓、腎臓、副腎、腺、心臓、肺及び脳）をサンプリングし、固定し、組織病理学的に検査した。サンプリングした組織のいずれにも、何の毒性作用も観察されなかった。
【０４２９】
より広範な試験では、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与経路下で、ｒＢＢＸ−０１の急性及び慢性毒性をマウスで評価した。２５匹の雄マウスに以下のようにｒＢＢＸ−０１の１回量をｉ．ｐ．注射した。５匹のマウスに対照溶媒（３％ＨＳＡのＰＢＳ溶液）を注射し、１０匹のマウスに４００ｎｇのＡＲＰ  Ｅ１を注射し、５匹のマウスに２０ｎｇのｒＢＢＸ−０１を注射し、５匹のマウスに１ｍｇのｒＢＢＸ−０１を注射した。注射後４日目に、４００ｎｇの治療群の中から３匹のマウスを屠殺し、剖検した。残りのマウスは、１７日目又は１９日目のいずれかに剖検した。選択した臓器及び組織は、組織病理用に処理した。体重は、試験の４、８、１０及び１３日目に記録した。脾臓の湿重量を、１７日目又は１９日目に剖検で測定した。
【０４３０】
治療したマウスのいずれにも毒性のひどい兆候はなかった。体重は、任意の治療群で有意な差異はなかった。４００ｎｇのｒＢＢＸ−０１で治療したマウスで、対照溶媒で処置した動物と比較した場合に、脾臓の湿重量に僅かな増加があった。臓器及び組織をサンプリングし、固定し、組織病理学的に検査した。有意な毒性作用は、いずれのサンプリングした組織においても観察されなかった。
【０４３１】
ラットでのｒＢＢＸ−０１の毒性
ラットでの一日に一度の皮下投与の５日後に、ｒＢＢＸ−０１の潜在的毒性を評価するために試験を行った。試験は、雄及び雌のＣＤ（登録商標）［対照：ＣＤ（登録商標）（ＳＤ）ＩＧＳ  ＢＲ］ラット（１０／性別／群）からなる３つの群から構成されていた。２つの群は、被験物質としてｒＢＢＸ−０１を７．５及び３００ｎｇ／動物の投与量で受け、１つの群は対照として用いられ、溶媒として３％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を受けた。全群の投与容量は、０．３ｍＬ／動物であった。最初の５匹の動物／性別／群を６日目に剖検したが、最後の５匹の動物／性別／群は、１５日目に剖検した。
【０４３２】
死亡及び臨床的兆候の観察及び体重の測定を試験を通して記録した。血液試料を、臨床病理学のパラメータの評価として２、６、及び１５日目に回収した。それぞれの暫定の及び末期の剖検（６日目及び１５日目）で、完全な剖検検査を行い、臓器重量を測定し、選択した組織を回収し、予定される将来の処理及び評価に備えて保存した。
【０４３３】
生存、臨床的兆候、体重、血液化学的評価／臨床化学的評価、及び巨視的評価に与える非治療に関連する影響を、試験の間記録した。非治療関連臓器の重量変化は、暫定の剖検でいずれかの性別で又は末期の剖検で雌で生じた。しかし、末期の剖検の雄は、投与に関連する前立腺の重量の増加を、７．５及び３００ｎｇ／動物で示した（それぞれ３４％及び９０％対照群より重い）。後の研究で、同じ治療を受けているラットは、前立腺の重量、及びこの臓器には治療に関連した効果がなかったと決定した１５日目に剖検された全動物（１、３、及び４群。各投与量０、７．５、及び３００ｎｇ／動物）の前立腺の顕微鏡の評価で有意な増加を示さなかった。
【０４３４】
この試験の条件及び発見に基づいて、ラットへの５日間連続のｒＢＢＸ−０１の毎日１回の皮下投与は、３００ｎｇ／動物の投与レベルまでよく許容された。
【実施例１０】
【０４３５】
ＡＲＰの天然存在度及び分布
動物の分布
様々な種
長年の経過の間、抽出物をマウス、ラット、ブタ及びウシから採取した。この早期の研究から得られた活性を表９に示す。これらの種の様々な組織を検査したが、小腸からの抽出物は、マウス抗腫瘍モデルで一貫して活性であり、このことは活性因子が積極的に種特異的ではないことを示していた。我々は、Ａ成分（ＩＬ１８含有）及びＣ成分（ＡＲＰ含有）の存在を明らかにしたとき、ＡフラクションのＩＬ−１８がある程度種の壁を横断することができるのでこれらの抽出物中で主要な寄与因子であると推測した。ＤＣアッセイは、実験マウス及びラットがＡＲＰ（Ｃフラクション）活性を有していなかったことを示した。ＭＳＵからのブタ試料もまた活性を欠いていたが、屠殺場のブタ由来の１０年齢の凍結試料は、高い活性を保持していた。このことは、環境要素を含む薬剤がＡＲＰ活性に関連していたことを示唆しており、全ての動物がこの薬剤に暴露されていたとは限らないことを示唆していた。我々は、ＭＳＵの畜産農家から野生のマウスを、また、農場で飼育されたウシに類似しているであろう非実験動物を試験することが許可された、ＢＲＩ所有地からトガリネズミを捕らえた。
【０４３６】
【表９】
2008500005.tif 000020
【０４３７】
ウシでのアイメリアのタンパク質の同定により、環境要因が活性に不可欠であったという観念を確認した。しかし、野生のマウスでの活性の欠如は、ＤＣアッセイは、マウス脾臓の樹状細胞を基にしているために、マウス由来のアイメリアが我々のアッセイで働かない可能性があることを示唆していた。さらに、腸ではない脾臓の樹状細胞を用いた場合には、異種間のアイメリアタンパク質の提示でしか有効ではないことを示唆している。これを解明するための更なる研究を計画している。
【０４３８】
ウシの飼育
我々は、ウシから数百の腸断片を得て、通常、動物と動物抽出物のプールとの間の広範囲の活性を観察した。図１５に示すように、この変動のいくつかは、異なる品種に起因していたが、品種内の変動もまた非常に高かった。より高レベルの活性を通常含む肉牛の場合には、これらは食肉処理場からより頻繁に選定された。より高い収率によって、均一に精製するのに十分な量に一層速く到達することが可能となった（６節参照）。
【０４３９】
組織分布
様々な臓器
観察された活性が腸管に限定されるという仮説を検証するために、限られた組の臓器及び組織を、長年かけて検査してきた。検査した齧歯類由来の脳及び脾臓は、抗腫瘍活性を示さなかった。ウシの脾臓、肝臓、及び肺由来の近年の組織試料は、ＤＣアッセイ及びＮＫアッセイで何らの活性を示さなかった。しかし、試料の大きさの限定及び試験の感度のために、他の臓器におけるＡＲＰの不存在は決定的なものではない。
【０４４０】
腸に沿った活性の分布
ウシの腸管に沿った活性の初期の試験により、マウスにおいて、小腸の回腸が最も高い抗腫瘍性を含んでいたことが明らかにされた（上記表９）。ＡＲＰに特異的な活性をＤＣアッセイにより同定し得るであろう場合には、これが再び検査された。３つの実験の平均を図１６（Ａ）に示す。腸管に沿ったプールした試料の予備的なマウス抗腫瘍結果を図１６（Ｂ）に示す。これらの結果は、従前の発見を確認し、腸管に沿った活性の分布に対するより細かな詳細をもたらした。この分布は、ウシでのアイメリアの生活期の位置と一致している。さらに重要なことに、この分布はウシにおける癌の罹患率に合致している（Lingeman and Garner, J. Natl. Cancer Inst. 48 (2): 325-46 (1972)）。ヒトと異なり、多くの動物では大腸癌の発生率が低く、さらに回腸でも発生率が低い。ウシでは、腸管癌は空腸及び直腸でのみ観察される。これは、図１６（Ａ）に示されたＤＣ活性化能の分布に非常に近似的に一致する。
【０４４１】
腸壁を横断する活性分布
７０〜９０％のＮＫ活性、８０〜１００％のＩＦＮγ誘導活性及び８０〜１００％のＤＣ活性が、３０ｍＭ  ＥＤＴＡの使用により腸組織から抽出し得るであろう。
【０４４２】
小腸回腸切片を調製し、６節に記載のように洗浄した。全長約３フィートの洗浄した切片を２〜３ｃｍの切片に切断し、ＰＢＳに０．５〜１ｍＭ  ＤＴＴと共に５〜１０分間インキュベートして粘液を除いた。溶液をデカントし、組織片を、６０ｍｌのＰＢＳ、３０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ中で３〜４回交換しながら、４０℃で３０〜６０分間攪拌した。この手順により細胞を、残った組織中での活性量の解析により検証されるように、ＮＫ−、ＤＣ−及びＩＦＮγ−誘導活性物質の大半が含まれる粘膜層から取り除いた。粘膜細胞フラクションへの全活性型の定量的抽出は、腸管粘膜へのアイメリア感染の既知の制限と一致している。
【実施例１１】
【０４４３】
ドメイン研究
ジスルフィド架橋の重要性が、ウシ及びＥ．テネラＡＲＰの両方の半純粋な試料で検証されてきた。Ａｓｎ−Ｇｌｙ部位でのウシＡＲＰの切断は、ＮＫ−、及びＤＣ−活性の両方を大幅に減少させた。ウシＡＲＰは、分子の真中に少なくとも１つのこのような部位を有しているので（図４）、得られたＡＲＰ分子の断片は、ＮＫ−、又はＤＣ−活性のいずれかに対して応答可能なドメインを含まないことが示されている。
【０４４４】
合成ペプチド（５０−ｍｅｒ）をウシ分子の可変領域と３−１Ｅタンパク質のフランキング領域との組合せから構築した（図４）。このペプチドは、Alpha Diagnostic International, Inc.社により合成され、乾燥粉末として受けた。新たに再構成した状態と再生した形態の両方で試験した。約０．１ｍｇ／ｍＬから始まって７桁に亘る範囲の濃度で試験した場合に、どちらの形態も何らの活性も示さなかった。この合成ペプチドは、ジスルフィド結合間のドメインを包含しており、その活性の欠損により様々なドメインが樹状細胞の結合に重要であるか、又はより多くの分子がこのドメインの正しい折り畳みに必要とされるということが示されている。
【０４４５】
Ｅ．テネラ由来の組換えＡＲＰに関する実験により、この分子のＮ末端がＤＣ活性に大きな変化を与えることなく大きな非関連タンパク質とペプチドとの融合を許容可能であることを示した（１０節）。６位にＡＴＧ開始コドンを有する短縮分子（GEADTを欠如している）は少なくとも完全なタンパク質と同じ活性であったが、開始コドンが２１位に移動した場合（GEADTQAWDTSVREWLVDTを欠く短縮分子を形成）には活性は失われた。このことは、Ｎ末端の遠位部分は恐らく少なくともＤＣ活性の発現に重要な任意のドメインの形成に関連していないことを示唆している。Ｅ.テネラＡＲＰの２つのＣ末端変異体（一方はＴｙｒからＨｉｓ及びＧｌｙからＳｅｒへの二重の変換を有し、他方はＧｌｙからＡｌａへの変換を有する。１０節）が得られ、ＤＣアッセイで等しく活性であると思われている。Ｃ末端から３つのアミノ酸（SGF）を欠如している別の変異体は、有意な活性を保持していたが、７、１０又は１４個のアミノ酸をＣ末端から欠如している変異体は、有意により低い（もしあれば）ＤＣ活性を示し（１０節）、それは分子のＣ末端部分がＤＣ活性を決定する何らかのドメインの一部であることを示唆している。分子のこの部分は、既知のアピコンプレクサＡＲＰに高度に保存された領域を含まない。この領域の共通のモチーフはT/S-A/I-L-A/N-F-A-E-(Y)-Lであり、これはＥＳＴの比較により判断されるようにアイメリア、アカパンカビ内に保存されており、トキソプラズマ由来のＡＲＰ配列に最も頻繁に見られる。
【実施例１２】
【０４４６】
可変及び定常領域に対する抗体
２つの20-merのエピトープに対するポリクローナル抗体は、Alpha Diagnostics International, Inc.社から入手されるウサギで産生させている。一方のエピトープはウシ配列の非保存領域由来のものであり、CRMFGASTDSGGDPYAELVQにわたる。他方は、Ｅ．アセルブリナ配列由来のものであり、CALYDEEKEQNKADALTTALにわたる。最初のケースでは、システインは分子の一部であるが、第２のケースでは、システインを先頭に加えて抗原性の改良に用いられるキーホールリンペットヘモシアニンへの結合を可能にした。
【実施例１３】
【０４４７】
疎水性膜アンカーの証拠
実施形態によっては、ＡＲＰはアイメリア寄生虫の外側の表面抗原である。我々は、ＧＰＩ結合タンパク質に特異的な酵素であるホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）によるＡＲＰ放出の可能性を研究することにより、細胞膜へのその結合（ＧＰＩ結合  対  膜内在性タンパク質）のメカニズムを調査した。実施例４で提示された結果は、ＡＲＰが、Ｅ.テネラスポロゾイトの外膜に結合されたＧＰＩであることを示唆している。
【０４４８】
ＡＲＰの膜からの自然発生的な放出がこれらの実験で観察されたが、それは表面タンパク質の「脱落」として他の寄生生物に関する文献に記載されている（Zambrano-Villa et al., Trends Parasitol. 18 (6): 272-8 (2002)）。このプロセスは、温度上昇、１０ｍＭ  ＥＧＴＡにより刺激され、トリパノソーマ由来の内在性原生動物ＰＬＣの阻害剤である、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２の存在下で阻害された。これらの観察は、恐らく内在性ＰＬＣが原因である、ＡＲＰ放出の酵素的特性の可能性と一致している。しかし、非酵素的メカニズムは排除しない。
【０４４９】
多くの原虫の表面タンパク質がＧＰＩ部分（Ropert and Gazzinelli, Curr Opin Microbiol. 3 (4): 395-403 (2000); Almeida and Gazzinelli, J Leukoc Biol. 70 (4): 467-77 (2001)）により固定され、この部分単独で従前にマクロファージ活性化能を示しており（Magez et al., J Immunol. 15; 160 (4): 1949-56 (1998)）、恐らくその脂質部分を介してトール様受容体−２に結合することが知られている（Campos, 2001, J. of Immunology 167: 416-423）。我々の実験は、ＡＲＰの放出がＧＰＩ結合の制御を介して原虫の代謝により制御されていること、また、ＰＬＣにより破壊される膜結合は、ＤＣ細胞の活性化には必要とされないことを示唆している。更なる証拠が、ホスホリパーゼ治療の存在下及び非存在下での高活性Ｅ．テネラ抽出物のＣ８ＲＰ−ＨＰＬＣ分離における活性物質の位置を比較することにより得られた。両方のケースで、活性は変化しないままであり、同じフラクションに現れた。このことは、ＡＲＰとＧＰＩ自身、ＬＰＳ、及び細菌のリポタンパク質などの脂質成分に依存するＤＣ活性化因子とを区別する（Brightbill et al., Science 285 (5428): 732-6 (1999); Aliprantis et al., Science 285(5428) : 736-9 (1999) ）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性に対するＥ．テネラのスポロゾイト由来の膜調製物を試験した際の予備データは、可能な解釈の１つとして、ＡＲＰの膜結合形態は、安定性及び／又は徐放性特性を向上させる効果的治療薬となり得ることを暗示している。
【実施例１４】
【０４５０】
Ｅ．テネラのオーシストの経口投与
マウス腫瘍モデルを用いて、異種のアイメリアの経口投与が、Ｅ．テネラ抽出物の投与により見られる抗腫瘍反応を生じ得るか否かを決定する。オーシストを与えた腫瘍耐性マウスの寿命の増加について調べる。オーシストを与えられた腫瘍のないマウスについて、オーシスト摂取後約２〜３週間で脾臓及び小腸でのＤＣ活性を検査する。これにより、ＳＩ組織でＡＲＰを上昇させることができるか否か、及びこれが他の組織に広がり得るか否かが示されるであろう。一晩の水の制限の後、オーシストは飲料水中に入れてマウスに与えられる。各マウスは、約１００，０００個のオーシストを含む約０．５ｍＬを飲む。
【実施例１５】
【０４５１】
ヒトでのＡＲＰの抗ウイルス活性の証拠
ＢＢＸ−０１の第１相臨床試験の間、末期の肺癌患者が、２箇所の体内の領域から、パピローマウイルス由来と思われる長期間のいぼが完全に消失したことを報告した。第１のものは背中の左及び中央領域に沿っており（脊柱の線に沿って）、また、第２のものは左腕の上側領域に沿っている。報告は、いぼが突然乾燥し、消失したと記載していた。患者は、約２週間の間隔を空けた、３回の徐々に量を増やした単回投与でＢＢＸ−０１を受けた後、しかし、繰り返し投与治療過程を受ける前に、これは生じた。患者は、この期間他の治療を受けなかった。
【実施例１６】
【０４５２】
アイメリア１９ｋＤスポロゾイト抗原に対し相同なタンパク質の同定
本発明の単離したペプチドで見出されたものと類似の配列及び／又は構造を有する他のタンパク質を同定するために、配列相同性検索を、本発明のＥ．アセルブリナＡＲＰ（配列番号：２）及びウシアイメリアタンパク質配列の可変領域を用いて行った。National Library or Medicineにより運営されているウェブサイト(www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)を介して利用可能な、The Basic Local Alignment Research Tool（ＢＬＡＳＴ）（登録商標）を使用して、ウシアイメリアタンパク質の相同性を同定した（表１０）。或いは、Plasmodium falciparumゲノム配列を含むデータベースを、次のウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用した、アイメリア１９ｋＤスポロゾイト抗原と熱帯熱マラリア原虫ゲノムの配列との間の比較に用いた：plasmodb. org/plasmodb/servlet/sv ? page=blast（表１０）。
【０４５３】
簡潔には、アイメリア１９ｋＤスポロゾイト抗原ペプチドを、次のＢＬＡＳＴ検索に用いた。１）合計３９，１９６配列を有するヒト（Homo sapiens）タンパク質配列のデータベース、２）合計１，６８７，９３０を有するＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ（但し、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、又はフェーズ０、１又は２  ＨＴＧＳを除く）配列のデータベース、及び３）合計１５，７２４，６９３配列を有する、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＥＳＴ区分からのＤＤＢＪ配列のデータベース。これらのデータベースの全てがNational Library of Medicine（ＮＬＭ）のNational Center for Biotechnology ＩＦＮormation（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを介して公共の検索に利用可能であり、上述のウェブサイトで見出し得たであろう。
【０４５４】
ヒトタンパク質配列のデータベース内でPairwise ＢＬＡＳＴ比較を、タンパク質−タンパク質の比較に好適である、「blastp」プログラムオプションを用いて行った。アイメリア１９ｋＤスポロゾイト抗原とヒトタンパク質データベースに保管してある配列との間に有意な相同性がないことを見出した。
【０４５５】
ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ（但し、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、又はフェーズ０、１又は２のＨＴＧＳを除く）配列のデータベース内でのPairwise ＢＬＡＳＴ比較を、全６つの読み枠内で翻訳されたヌクレオチド「配列２」に対してタンパク質「配列１」を比較する「tblastn」プログラムオプションを用いて行った。有意な配列及び構造上の相同性が、アイメリア１９ｋＤスポロゾイト抗原とこのデータベースに保管されている既知のタンパク質配列との間で見出された。
【０４５６】
ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＥＳＴ区分からのＤＤＢＪ配列のデータベースの範囲内でのPairwise ＢＬＡＳＴ比較を、全６つの読み枠内で翻訳されたヌクレオチド「配列２」に対してタンパク質「配列１」を比較する「tblastn」プログラムオプションを用いて行った。有意な相同性が、アイメリア１９ｋＤスポロゾイト抗原とデータベースに保管されている既知のＥＳＴ配列の間に見出された。興味深いことに、アピコンプレクサのメンバーのみがこの検索から得られた。
【０４５７】
本発明のウシアイメリアタンパク質の可変領域の配列を、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ（但し、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、又はフェーズ０、１又は２のＨＴＧＳ配列を除く）配列のデータベースのＢＬＡＳＴ検索に用いた。
【０４５８】
ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ（但し、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、又はフェーズ０、１又は２のＨＴＧＳ配列を除く）配列のデータベースの範囲内でのPairwise ＢＬＡＳＴ比較を、全６つの読み枠内で翻訳されたヌクレオチド「配列２」に対してタンパク質「配列１」を比較する「tblastn」プログラムオプションを用いて行った。本発明のウシアイメリアタンパク質の可変領域とウシのデータベースに保管されている任意の既知のタンパク質との間に、妥当な相同性は見出せなかった。
【０４５９】
同定したＡＲＰを、ウェブサイトncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi.で利用可能である、Conserved Domain Database (ＣＤＤ  ｖ．１．６０)及びデフォルトパラメータ（default parameter）に対するReverse Position-Specific BLAST（登録商標）アルゴリズム設定を用いて、保存された領域についても分析した。この分析は、同定したＡＲＰは、プロフィリンにより表される、保存されたＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを有していることを示した。データは、カバノキ花粉（例えば、配列番号：１３）を含む調製物がＤＣアッセイで活性であったことを示した。タンパク質レベルでのアラインメントに基づいて、カバノキの花粉がＥ．テネラＡＲＰに対する２８％の同一性及び５４％の類似性、Ｅ．アセルブリナＡＲＰに対する３１％同一性及び５７％類似性を有している。
【０４６０】
【表１０】
2008500005.tif 000021
【実施例１７】
【０４６１】
マウスでのＡＲＰの抗ウイルス活性の証拠
特定病原体未感染の雌BALB/cマウスを、用量ＬＤ９０のインフルエンザウイルスＡ／ＮＷＳ／３３(Ｈ１Ｎ１)により鼻腔内に感染させた。次いで、マウスを２つの治療手順のうちの１つによりＡＲＰ  Ｅ１を用いて治療した。最初の手順では、マウスは、１００ｎｇのＡＲＰ  Ｅ１を、ウイルスに暴露する４８時間前、ウイルスに暴露（０日目）した４時間後、及びウイルス暴露後３日目及び６日目に、腹腔内に与えることにより受けた。第２の手順では、マウスは、１００、１，０００、又は１０，０００ｎｇのＡＲＰ  Ｅ１を腹腔内に、ウイルス暴露（０日目）の４時間後、及びウイルス暴露の３日後及び６日後に受けた。プラセボ処置されるマウスは、ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を受けた。マウスは、死ぬまで毎日観察した。マウスの生存状況を表１１に示す。
【０４６２】
【表１１】
2008500005.tif 000022
【０４６３】
生存数及び死亡するまでの時間の有意な増加が、１０，０００ｎｇのＡＲＰ  Ｅ１で治療したマウスであった。３〜１１日目のこれらのマウスで、動脈血酸素飽和度も測定した。１，０００ｎｇ及び１０，０００ｎｇのＡＲＰ  Ｅ１で治療したマウスの酸素飽和度の減少の統計的に有意な減少があった。
【実施例１８】
【０４６４】
樹状細胞麻痺の惹起による免疫抑制薬としてのＡＲＰの使用
ＡＲＰの一次活性は樹状細胞中でのＩＬ−１２の産生を誘導するが、高用量（〜１０００回の刺激用量）でＡＲＰがＩＬ−１２産生を抑制できることに気づいた。この観察に基づいて、過敏性又は不適当な免疫応答により引き起こされる疾患の治療にＡＲＰを免疫抑制剤として使用することが可能であろう。この仮定を、ＳＪＬマウスにおいて実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルで試験した。ＥＡＥを、ヒトの多発性硬化症（ＭＳ）に非常に類似しているマウスの疾患を誘導する脊髄由来のミエリン塩基性タンパク質で免疫化することによりマウスに誘導する。
【０４６５】
ＳＪＬマウスは、０日目及び１０日目にミエリン塩基性タンパク質により免疫化され、０．１μｇ、１．０μｇ又は１０μｇのＡＲＰ  Ｅ１の治療をｉ．ｐ．で毎日与えられたか、或いは５ｍｇのLinomideがｓ．ｃ．で与えられたか、或いは溶媒単独が与えられた。治療は５日間毎日行われた。LinomideはＥＡＥを阻止することが知られている薬剤であり、正対照として用いている。ＥＡＥは、マウスで、尾ではじまり、死ぬまで進行する進行性の麻痺として現れる。ＥＡＥの重症度は、ＥＡＥスコアによって測定され、正常な０で始まり、死ぬ場合の５まで増加する。倫理的理由のため、マウスはスコア４に達すると屠殺される。実験は１５日目に終了した。平均ＥＡＥスコアを表１２に示す。
【０４６６】
【表１２】
2008500005.tif 000023
【０４６７】
ＡＲＰ処置群のＥＡＥスコアは溶媒対照と有意には区別がないが、スコアの傾向は、提案されているＡＲＰの作用メカニズムと一致している。ＡＲＰが免疫賦活薬として作用することが期待される最も低い用量では、疾患を僅かに悪化させるように思われた。しかし、ＡＲＰの免疫抑制活性薬としての活性が予期され得る高用量では、疾患は抑制されるように思われ、溶媒で処置した対照とLinomide正対照との間の中間のスコアを与える。
【実施例１９】
【０４６８】
マウスでのカンジダアルビカンス感染を治療するためのＡＲＰの使用
この試験の目的は、カンジダアルビカンスによる感染の誘発後に、ＡＲＰ投与がマウスの生存率を上昇させるか否かを決定することであった。雌ＣＤ１マウスの群を、０日目に静脈内(ｉ.ｖ.)に接種し、カンジダアルビカンスの感染量を測定したところ、対照群で６０〜１００％の死亡率をもたらした。マウスの群に、０日目の感染誘発の約１．５時間後に、供試物質（０．１、１．０又は１０．０ｎｇ／マウス／日）を３つの濃度のうちの１つで、又は溶媒をｉ.ｐ.注射により投与し、１日目から４日目に再び投与し、合計で５回投与した。更なるアッセイの対照群のマウスは、感染誘発の約１、２４、４８及び７２時間後に、体重１ｋｇに付き、約８０ｍｇのフルコナゾールを強制経口投与した。マウスを、感染性の接種後の死亡率について、１４日目まで観察した。
【０４６９】
【表１３】
2008500005.tif 000024
【０４７０】
試験群及び溶媒処置群との間で、死亡率、平均生存時間又は死ぬまでの平均時間には統計的有意差は観察されなかった。０．１ｎｇの用量のＡＲＰで効果があったかもしれないが、高用量では明らかではなかった。
【実施例２０】
【０４７１】
マウスでのマラリア治療のためのＡＲＰの使用
この試験の目的は、ネズミマラリア原虫（Plasmodium yoelii）による感染誘発後のＡＲＰ投与がマウスの生存率を増加させるか否かを判定することであった。雄C57BL/6マウスの群に、０日目に感染量のネズミマラリア原虫をｉ．ｖ．接種した。マウスの群に、試験物質（０．１、１．０又は１０．０ｎｇ／マウス／日）を３つの濃度のうちの１つで、又は溶媒を、１日目、再び２日目から５日目に、合計５回、ｉ．ｐ．注射により投与した。更なるアッセイの対照群のマウスに、体重１ｋｇに付き約４０ｍｇのクロロキンをｉ．ｐ．注射により１日目から５日目に同様に投与した。
【０４７２】
【表１４】
2008500005.tif 000025
【０４７３】
活性の別のマーカーとして、マウスの体温及び心拍数も観測された。ＡＲＰの３つの投与量の全てで、体温上昇及び心拍数の遅れ及び減少がマラリアに感染したマウスで典型的に見られた。さらに、生存率の僅かな上昇及び寄生された赤血球数の減少により明らかなように、このモデルでＡＲＰ活性の徴候があったが、これらの差異は統計的には有意ではなかった。
【実施例２１】
【０４７４】
マーモットでの慢性肝炎の治療のためのＡＲＰの使用
肝炎に慢性的に感染したマーモットの肝炎ＤＮＡのレベル及び抗肝炎抗体力価の両方を観察した。３匹のマーモットを、２週間、２５ｎｇ／ｋｇのＡＲＰで毎日治療した、別の３匹のマーモットを未処置の対照群として用いた。血液試料を、肝炎ＤＮＡレベル及び抗体力価の分析のために、処置開始の３、７、１５、２１、２８及び４２日後に回収した。使用したＡＲＰの用量では、ＡＲＰ治療の効果は肝炎ＤＮＡレベル又は抗肝炎抗体力価のいずれにも見られなかった。
【実施例２２】
【０４７５】
マウスでの結核の治療のためのＡＲＰの使用
０日目に、マウスの群を結核菌Erdman株（Ｍ．ｔｂ）に吸入により暴露した。１、２、３、４及び５日目に、マウスに０．１ｎｇ、１．０ｎｇ又は１０．０ｎｇのＡＲＰ  Ｅ１を含む３％  ＢＳＡ及びリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内注射により与えた。マウスの対照群は、溶媒のみを与えた。０、２１及び４２日目に、肺のＭ．ｔｂのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定した。対照群及びどの治療群との間にもｃｆｕに有意な統計的差異はなかった。この特定の治療計画はＭ．ｔｂ感染に有意な効果を示さなかったが、異なる投与量、投与経路又は治療時間によっては有利な効果を与えるであろう。
【実施例２３】
【０４７６】
Ｅ１でのｃｙｓ残基の数の決定
Ｅ１（ＡＲＰ  Ｅ１）のアミノ酸配列は、プラスミド生成物に挿入された核酸配列により予想されるように、２つのシステインを含むはずである。硫黄の反応性及びタンパク質の安定性におけるジスルフィド結合形成の潜在的役割のため、組換えタンパク質のスルフヒドリル含量、並びに還元状態を評価する必要がある。各バッチで得られる質量分析データから、１８，４１４Ｄａの一貫した質量が得られた。これは、両方のスルフヒドリル基が還元されていると仮定したときに、Ｅ１配列（図２０）として与えられているアミノ酸配列で予想される的確な質量である。ジスルフィド結合が存在していたかどうかを、１８，４１２Ｄａの質量から予期されるであろう。質量分析は非常に正確であるが、１８，４１４Ｄａの質量が還元状態を示すと結論付けることは、裏付けとなるデータがない状態では難しい。このようなデータを得るために、タンパク質のスルフヒドリル基をEllman試薬により修飾し、質量を再決定した。
【０４７７】
Ellman試薬は、ジスルフィド架橋を介して結合した２つのチオ−ニトロ−安息香酸残基の二量体である。これは、タンパク質中のシステインのチオールと反応してジスルフィド混合物を形成し、明確な質量の付加体を与えるであろう。タンパク質及びチオール付近の局所的な還元環境によって、これらのジスルフィド混合物を変換することができ、タンパク質上にジスルフィドを生成し、Ellman試薬の再生をもたらす。この反応はまた、各タンパク質のシステインを酸化させるために、還元されたEllman単量体を与える。
【０４７８】
Ｅ１タンパク質が２つのスルフヒドリル基を含む場合には、Ellman反応から得られる２つの生成物のうち第１のものは、以下の質量を有する二重の付加体となるはずである。
【０４７９】
１８，４１４.２４＋３９６．３（Ellman）−２（水素の損失）＝１８，８０８．５４Ｄａ
【０４８０】
第２の生成物は、質量１８，４１２．２４Ｄａのタンパク質のジスルフィド型になるはずである。
【０４８１】
この反応の手順、続いてＥ１原薬の質量分析データを以下に示す。質量分析により検出された主成分のみが予想された２つの生成物である。
【０４８２】
結果
deconvoluted Electrospray ＭＳスペクトル（図２６）は、Ellman試薬とＥ１タンパク質との反応で予想される２つの質量を有している。いかなる有意な他の質量も存在しない。
【０４８３】
この分析の第２の結果は、各バッチ（１８，４１４Ｄａの分子量）より製造される原薬は、還元型で存在する可能性が高い。
【０４８４】
手順
試薬：
１．ＤＴＮＢ（５，５'−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）＝Ellman試薬）、Pierce社製、カタログ番号＃２２５８２
２．Ｃｙｓ（システイン）、Sigma社製、カタログ番号Ｃ６８５２
３.ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、Sigma社製、カタログ番号Ｄ８４１８
４．Ｇｕ−ＨＣｌ（塩化グアニジン）、Fisher社製、カタログ番号ＢＰ１７８−５００
５．Ｔｒｉｓ（Trizma base）、Sigma社製、カタログ番号Ｔ１５０３
６．ＨＣｌ（塩酸）、EMScience社製、カタログ番号ＨＸ０６０３−７５
７．ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（酢酸アンモニウム）、Baker社製、カタログ番号０５９６−０１
８．Ｈ２Ｏ、Baker社製、ＨＰＬＣ試薬、カタログ番号４２１８−０３
【０４８５】
ストック溶液：
１．Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：１Ｍ、ｐＨ７．８８
２．酢酸アンモニウム：１Ｍ、ｐＨ６．９６
３．ＤＴＮＢ：ＤＭＳＯ中１００ｍＭ
４．１０×ＰＢＳ（ステージIIで使用）
５．Ｃｙｓ：ＰＢＳ中１００ｍＭ
【０４８６】
作用液：
１．反応用緩衝液：０.１Ｍ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９２〜８.０
２．透析用緩衝液：１０ｍＭ酢酸アンモニウム  ｐＨ６．７
３．ＤＴＮＢ：０．１Ｍ  ｔｒｉｓ中４４０μＭ
４．Ｇｕ−ＨＣｌ：０．１Ｍ  ｔｒｉｓ中８Ｍ
５．Ｃｙｓ：ＰＢＳ中１９５．５μＭ
６．ＰＢＳ
７．タンパク質：Ｅ１−９、Ｃｙｓ中１．８ｍｇ／ｍｌ＝１９５．５μＭ
【０４８７】
作用液の調製：
Ｇｕ−ＨＣｌ及びタンパク質を除く全作用液は、ストック溶液（＃１、２、３，６）から調製するか、或いは実験の直前に固体試薬を（＃５）を希釈することにより調製した。Ｇｕ−ＨＣｌは、実験の１週間前に調製し、室温に保持した。タンパク質は、−８０℃に保持し、実験の直前に解凍した。
【０４８８】
実験の直前に、全ての溶液を氷上のデシケーター内で３０分間脱気し、窒素下で開放し、２２℃の水浴で１５分間時々振盪させながら１５分のインキュベーションにより２２℃（その日の室温）に昇温させた。
【０４８９】
試料の処理：
１．ＤＴＮＢ修飾  ４５μｌの試験溶液（ＰＢＳ、Ｃｙｓ、タンパク質）を２２５μｌのＧｕ−ＨＣｌと混合し、室温で１５分間インキュベートしてタンパク質を変性させた。２０μｌのＤＴＮＢ溶液をプレートリーダー上で加え、ＯＤ４１４を１時間、３０秒ごとに読み取りながら観測した。１時間内に得られた最も高いＯＤ４１４を、ε４１４＝１４，０４７を使用して放出されたＴＮＢ２−イオンの濃度を計算するのに用いた（Methods in Enzymology, 1983, 91,49-60）。ＰＢＳ  ＯＤ４１４読み取り値を、Ｃｙｓ及びタンパク質の読み取り値から引いた。対照タンパク質試料ＤＴＮＢを、０．１Ｍ  ｔｒｉｓで置換した。
【０４９０】
結果：Ｃｙｓ試料：７３％ＤＴＮＢ修飾
タンパク質試料：３４％ＤＴＮＢ修飾
【０４９１】
２．透析  反応後、ＤＴＮＢ修飾試料及び対照タンパク質試料を透析して、Ｇｕ−ＨＣｌを別々のビーカーに移し、それぞれ３〜１０時間３×３００ｍｌの１０ｍＭ酢酸アンモニウム内に置いた。
【０４９２】
３．試料分析  修飾されたタンパク質の存在を決定するために、標準的手順に従って、両方の試料をＣ８ＲＰ−クロマトグラフィーで分析した。修飾したＣｙｓ残基の数を、ＤＴＮＢ修飾（Ｍ−Ｓｃａｎ、標準的手順）後に分子量の増加を測定することにより見積もった。副成分（恐らく、Ｃ８クロマトグラムにおける副成分と同じ（ピーク高さで全量の〜１６％））は、２つの修飾された残基を示した（分子量増加＝３９７Ｄａ）。主成分は、１８４１２Ｄａに酸化されていた。
【実施例２４】
【０４９３】
ジスルフィド結合及びＡＲＰ活性
特異的プライマー及びＰＣＲを用いて、Ｃｙｓ残基からＳｅｒ残基へ変える指定点変異を行った。突然変異（１の突然変異ではＣｙｓ３５→Ｓｅｒ及び他の突然変異ではＣｙｓ７３→Ｓｅｒ＋Ａｒｇ８０→Ｔｒｐ）を配列決定で確認した。馴化培地及び細菌抽出物をＤＣアッセイにより分析した。両方の修飾体は、非修飾ＡＲＰと比較して、約１／１０の活性の減少をもたらした。Ａｒｇ８０は通常疎水性アミノ酸により占められる非保存領域内にあるので、疎水性のＴｒｐへの変更は、重要性が低いと思われる。このことは、恐らくジスルフィド結合の形成のために、ＡＲＰ分子中の両方のＣｙｓ残基がＤＣ活性に重要であることを暗示している。
【０４９４】
アッセイ系に加えた場合に、ＡＲＰの酸化型及び還元型の両方が活性である。図２７に示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、還元型が酸化型よりも２〜５×活性であった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では、過剰な酸化型又は還元型のいずれかのグルタチオンをアッセイ系に加えた場合、還元型グルタチオンは、ＤＣアッセイで応答を低下させた。しかし、これらの両方の実験では、セルの当面の環境では酸化還元電位を決定することはできなかったので、どちらの型がＤＣセルに直接相関しているかは言うことはできない。
【０４９５】
引用参考文献及び同等物
本明細書に引用される全ての参考文献は、各別々の公報又は特許又は特許出願が具体的且つ独立に、その全体が本明細書において参照により援用されることを意図するかのようなものと同じ範囲で、その全体が本明細書において参照により援用される。
【０４９６】
本発明の多くの改変及び変更は、その趣旨及び範囲を逸脱することなくなすことができ、当業者に明らかであろう。本明細書に記載された具体的な実施形態は、単なる具体例として提供されており、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語、並びに、このような特許請求の範囲に与えられる等価物の全容のみによって限定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０４９７】
【図１】シクロスポラ及びアイメリア種の小サブユニットのリボソームRNA配列の系統樹を示す。トキソプラズマ・ゴンディイ（Toxoplasma gondii）をアウトグループとして用いたカルテットパズリング最尤法の結果を示す。解析後、アウトグループブランチを、明確にするために移動させた。節点の左の数は、各内部ブランチごとのカルテットパズリングサポート値を示す。スケールバーは、進化距離０．０１ヌクレオチド／配列内の位置を示す。垂直距離は、明確にするだけのためである（この図は、Eberhard et al., 1999, Emerging Infectious Diseases, 5 (5): 651-658.から採用した）。
【図２（Ａ）】Superdex（商標）75を用いた分子篩クロマトグラフィー工程の例及びＮＫアッセイ及びＤＣアッセイにおける活性を示す。図２（Ｂ）は、Superdex（商標）サイズ排除工程の最後における、６節に概説した精製スキームからの典型的な全回収量を示す。粗原料内の活性（全容量に対して補正）を左端に示す。Superdex（商標）クロマトグラフィー後に回収した全量を右端に示す。
【図３（Ａ）】カルシウム結合タンパク質除去工程後のＢＢＸのＨＩＣ勾配クロマトグラフィーを示す。図３（Ｂ）は、ＨＩＣ勾配からの活性フラクションのＤＥＡＥ勾配クロマトグラフィーを示す。図３（Ｃ）は、ＤＥＡＥ勾配からの活性フラクションのＣ８逆相勾配を示す。図３（Ｄ）は、Ｃ８活性フラクションの吸収及び活性の相関を示す。
【図４】３つのアイメリア種由来のタンパク質配列の比較を示す。Ｅ．テネラ（ＥｔＵ３）及びＥ．アセルブリナ（３−１Ｅ：アクセッション番号ＡＦ１１３６１３）の配列をｃＤＮＡの翻訳から得た。ＥｔＵ３のｃＤＮＡは、１０節に記載のＥ．テネラｍＲＮＡから得た。未知の種の推定ウシアイメリア由来の断片をトリプシンペプチドのEdman及びＭＳ／ＭＳアミノ酸配列決定により得た。
【図５（Ａ）】ＤＣアッセイでの未精製Ｅ．テネラ抽出物の希釈プロファイルを示す。８節の最初の抽出物に準じて試料を調製した。２つの別々のＤＣアッセイに及ぶ５つの反復希釈曲線を平均化した。エラーバーは、５つの反復の標準偏差を示す。図５（Ｂ）は、第２のＥ．テネラ抽出物のＣ８ＨＰＬＣ分離及び対応するフラクションのＤＣアッセイ活性を示す。
【図６】ＡＲＰの様々な源の用量／応答曲線を示す。純粋ではないＥ．テネラ抽出物及びＤＥＡＥ精製組換え試料は、全タンパク質重量の約４％のＡＲＰを含む。純粋なウシ抽出物及び組換えＥ．テネラタンパク質は純粋であるが、約９５％が逆相クロマトグラフィー条件により変性された。これらの推定値を用いてアッセイのタンパク質濃度を計算した。高度に純粋なｒＡＲＰ試料をＤＥＡＥ活性フラクションからサイズ排除クロマトグラフィーにより得た。その純度及びタンパク質含量をＣ８逆相クロマトグラフィーにより少量の試料で評価し、その活性を補正することなく濃度に対してプロットした。応答曲線は、類似の最大レベルに標準化した。
【図７（Ａ）】１０節に記載のプライマーを用いてＥ．テネラｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列を示す。図７（Ｂ）は、図（Ａ）に示された順方向又は逆方向のいずれかのｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉの２つの培地由来の活性を示す。図７（Ｃ）は、Ｅ．テネラのクローン化ＡＲＰを有するクローニングプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉにより調整された精製した最小培地のＣ８ＨＰＬＣ分離及び対応するフラクションのＤＣアッセイ活性を示す。
【図８】対照及び部分的に精製したＡＲＰ（ステージ１  ＢＥＸ）処置群由来の腫瘍耐性Balb/cマウスの生存データの編集を示す。これらの生存時間は、増強されたＡＲＰ（ステージ１抽出物）生成物の有効性をチェックするために設計されたスクリーニング実験から得られた。対照の数は、いくつかのバッチをしばしば同じ対照に対して同時にスクリーニングしたので、処置群の数に等しくない。
【図９】マウス腫瘍モデルにおけるE．テネラ抽出物及び組換えE．テネラＡＲＰの抗腫瘍活性を示す。各処置ごとに３つ又は５つの投与群を示す。投与手順は、腫瘍注射後１日目に開始して５日間毎日連続でｎｇ／マウス／日の指示用量から構成されていた。抽出物中のＡＲＰの量をＣ８ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより決定した。対照群は、緩衝液の偽注射を受けた。Ａ）ＥｔＵ３クローン由来の組換えＥ．テネラＡＲＰ、Ｂ）Ｅ１クローン由来の組換えＥ．テネラＡＲＰ、Ｃ）胞子形成オーシスト由来のＥ．テネラＡＲＰ抽出物
【図１０】マウスでの抗腫瘍応答とのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＫ及びＤＣアッセイの相関を示す。（Ａ）ＢＥＸの各バッチをマウス及びＮＫアッセイで定期的に試験した。この図では、約１年の抽出物にわたる一連のバッチを用いた。ｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍活性を、寿命の増加及び生存から計算される腫瘍指数により示され、０は１００%の治療を表し、４は負の対照群を超える生存の優位性を表す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＮＫアッセイ活性を、５０%の細胞殺傷に到達するのに必要な希釈の対数により示した。実線は、点を通る最良の直線回帰を示す。（Ｂ）実験的用量はＤＣアッセイで予め試験し、触診可能な腫瘍、悪液質の存在、及び生存状態の程度に基づいて、この用量に対する活性の対数を腫瘍指数に対してプロットした。この指数は、上記と同じエンドポイントを有する。回帰に適したパラメータを各プロットに表示した。
【図１１】２回の５日間の低用量のＢＢＸ−０１ｃの治療過程の間の患者＃５−ＲＷの血清ＩＬ−１２レベルを示す。血清レベルを測定し、１日目から５日目を通してＢＢＸ−０１ｃの注射をした。最終的試料は９日目又は１０日目のいずれかに取り出された。
【図１２】処置したＬＧＬ培地中のＩＦＮγのレベルの上昇と誘導されたＮＫ−ＣＭＣの相関を示す。ＬＧＬ／Ｓ１８０同時培養液を、様々な濃度のＢＥＸで処理し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＮＫアッセイで標準的な４日間でＮＫ−ＣＭＣを分析した。ＬＧＬ培養液を同じ濃度のＢＥＸで処理し、調整済みの培地のＩＦＮγ濃度を一晩培養後に分析した。
【図１３（Ａ）】相乗的添加剤の関数としてＥ．テネラ及びウシＢＢＸ−０１ｃに対するＤＣアッセイの応答を示す。各パネルにおいて、活性を、抗原単独、添加剤単独、全ての添加剤（ＡＬＬ）と抗原、１つの添加剤を追加した抗原（＋と表示）、及び１つの添加剤のみが欠損した抗原（−と表示）として測定する。２つのパネルは、２つの別々のアッセイを示し、２つの間の絶対値は比較できない。図１３（Ｂ）は、組織培養条件における時間の関数としてのＢＢＸ−０１ｃに対する、単離したばかりのＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の感受性の欠損を示す。
【図１４】マウス腫瘍モデルにおけるＢＢＸ−０１ｃ（増強したＡＲＰ）及びＧＭ−ＣＳＦの相乗作用を示す。２つの治療量以下のＢＢＸ−０１ｃを、ＧＭ−ＣＳＦと共に又はなしで腫瘍後１日目に注射した。ＧＭ−ＣＳＦ単独では、溶媒の偽注射と有意には違わなかった。
【図１５】基準と比較した様々なウシの品種のＤＣアッセイの活性を示す。ボックスは、第２５パーセンタイル（底）から第７５パーセンタイル（上端）までを示す。ボックスの上及び下の線は、それぞれ第９５及び第５パーセンタイル指標を示す。中央値はボックスの内側の線として表示する。
【図１６（Ａ）】自然の腫瘍発生率に比較した、ウシの腸系の切片由来の抽出物のＤＣ活性を示す。図１６（Ｂ）は、マウス腫瘍モデルにおけるウシの腸の抽出物の抗腫瘍活性を示す。１２．１．２節に記載したように、腫瘍指数は、進行中の実験を評価するために用いた。小腸及び大腸に沿った３つの隣接フラクションのストックが、盲腸サンプルと共に含まれていた。各群は、１２．１．１節の手順後の５匹のマウスの群から構成されていた。
【図１７】アイメリアテネラ粗膜調製物のＤＣ活性及びマウス腫瘍指数データを示す。樹状細胞ＩＬ１２生成物を、Ｅ．テネラ粗膜フラグメント懸濁液のさまざまな希釈物として示す。ここで１．０は、懸濁液の希釈がされていないことを示し、ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイでマウスに投与される濃度である。膜懸濁液活性の進行中の試験の腫瘍指数もまた示す。試験治療のより低い値は、陽性の抗腫瘍活性を示す。
【図１８】ｐＨ７．４の５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ中で、３７℃、４時間でインキュベーション後にＥ．テネラオーシストからの粗膜調製物から放出されたＡＲＰのＣ８逆相クロマトグラフィーを示す（９節）。
【図１９】様々なアピコンプレクサ発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）翻訳物のアラインメントを示す。アラインメントは、目視による観察により行った。ある位置での「類似性」の閾値は、その位置に存在した他のアミノ酸に比較した非保存的変化とみなすであろうたった２つのそのアミノ酸であった。もしこの条件が満たされれば、記録したアミノ酸はカラム中で最も一般的に生じるものである。開始のメチオニンからの平均長は１９１である。アミノ酸の特性に基づいて、比較されるＥＳＴのうち、４１位（４１／１９１＝２１%）は１００%の同一性を有し、１０６位（１０６／１９１＝５５%）は少なくとも８０%の類似性を有する。
【図２０】Ｅ．テネラＡＲＰ  Ｅ１クローン及びＥｔＵ３（図中Ｕ３ともいう）クローンのＤＮＡ配列のアラインメントを示す。
【図２１】Ｅ１クローン抽出物から得られた８０%硫酸アンモニウムフラクションのＨＩＣ勾配クロマトグラフィー分離のクロマトグラム及び対応するＤＣアッセイ活性プロファイルを示す。
【図２２】Ｅ１クローン抽出物のＨＩＣクロマトグラフィーから得られる活性フラクションのＤＥＡＥ勾配クロマトグラフィー分離のクロマトグラム及び対応するＤＣアッセイ活性プロファイルを示す。
【図２３】Ｅ１クローン抽出物のＤＥＡＥクロマトグラフィーから得られる活性フラクションのSuperdexアイソクラチッククロマトグラフィー分離のクロマトグラム及び対応するＤＣアッセイ活性プロファイルを示す。
【図２４】Ｅ１クローン抽出物のSuperdexクロマトグラフィーから得られる少量のストックした活性フラクションのＣ８  ＨＰＬＣ分離のクロマトグラムを示す。これは、Superdex 生成物が高い純度であることを示す。
【図２５】マウス内のＩＬ−１２のＥＬＩＳＡ試験は、Ｅ．テネラＡＲＰ（ＥｔＵ３）で処理した。
【図２６】ＡＲＰ  Ｅ１とのEllman試薬の反応に対して、予測される質量が１８，４１４及び１８，８０９を示す、Deconvoluted electrospray ＭＳスペクトルを示す。
【図２７】ＡＲＰの酸化型及び還元型の両方の用量／応答曲線を示す。曲線は、一定のタンパク質濃度に調整されている。
【図１】
2008500005.tif 000026
【図２（Ａ）】
2008500005.tif 000027
【図２（Ｂ）】
2008500005.tif 000028
【図３（Ａ）】
2008500005.tif 000029
【図３（Ｂ）】
2008500005.tif 000030
【図３（Ｃ）】
2008500005.tif 000031
【図３（Ｄ）】
2008500005.tif 000032
【図４】
2008500005.tif 000033
【図５（Ａ）】
2008500005.tif 000034
【図５（Ｂ）】
2008500005.tif 000035
【図６】
2008500005.tif 000036
【図７（Ａ）】
2008500005.tif 000037
【図７（Ｂ）】
2008500005.tif 000038
【図７（Ｃ）】
2008500005.tif 000039
【図８】
2008500005.tif 000040
【図９】
2008500005.tif 000041
【図１０】
2008500005.tif 000042
【図１１】
2008500005.tif 000043
【図１２】
2008500005.tif 000044
【図１３（Ａ）】
2008500005.tif 000045
【図１３（Ｂ）】
2008500005.tif 000046
【図１４】
2008500005.tif 000047
【図１５】
2008500005.tif 000048
【図１６（Ａ）】
2008500005.tif 000049
【図１６（Ｂ）】
2008500005.tif 000050
【図１７】
2008500005.tif 000051
【図１８】
2008500005.tif 000052
【図１９】
2008500005.tif 000053
【図１９−１】
2008500005.tif 000054
【図２０】
2008500005.tif 000055
【図２０−１】
2008500005.tif 000056
【図２１】
2008500005.tif 000057
【図２２】
2008500005.tif 000058
【図２３】
2008500005.tif 000059
【図２４】
2008500005.tif 000060
【図２５】
2008500005.tif 000061
【図２６】
2008500005.tif 000062
【図２７】
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【配列表】
2008500005000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月14日(2006.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における疾患を治療又は予防する方法であって、前記動物にタンパク質を供給する薬学的有効量の医薬組成物を前記動物に投与することを含み、前記タンパク質が、デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０からなる群から選択されるタンパク質のいずれか１つと少なくとも２５％の同一性を有し、前記タンパク質が免疫刺激活性を有する方法。
【請求項２】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、タンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、又は前記タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトされている細胞として供給する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
疾患を治療する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
疾患を予防する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、
（ａ）配列番号１を含む単離されたタンパク質、
（ｂ）配列番号２を含む単離されたタンパク質、
（ｃ）配列番号２８を含む単離されたタンパク質、
（ｄ）配列番号３０を含む単離されたタンパク質、
（ｅ）配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質、
（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は
（ｇ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）
として供給する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
医薬組成物が、配列番号１を含む単離されたタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
医薬組成物が、配列番号２を含む単離されたタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
医薬組成物が、配列番号２８を含む単離されたタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
医薬組成物が、配列番号３０を含む単離されたタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
医薬組成物が、配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
医薬組成物が、動物に前記タンパク質を、
（ａ）（１）アイメリアに感染している組織又は細胞の細胞抽出物を作製する段階、
（２）上清を作製するために前記細胞抽出物を遠心分離する段階、
（３）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによって前記上清を分画し、且つ前記ペレットを溶液に再懸濁する段階、
（４）ＨＩＣカラムに前記溶液を適用する段階、
（５）溶出した物質を作製するために前記ＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させる段階、
（６）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するために、前記溶出した物質を透析する段階、
（７）ＤＥＡＥカラムに前記試料を適用する段階、
（８）溶出した画分を作製するために緩衝液で前記ＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させ、且つ前記溶出した画分を濃縮する段階、
（９）サイズ排除カラムに前記濃縮され溶出した画分を適用する段階、
（１０）前記サイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールする段階、
（１１）カルシウム結合タンパクを除去するためにＨＩＣカラムに前記プールされた画分を適用する段階、
（１２）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムに前記ＨＩＣカラムから溶出した画分を適用し、且つ活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、
（１３）前記活性画分を透析する段階、並びに
（１４）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムに前記透析された活性画分を適用し、且つ１つ若しくは複数の活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、
（ｂ）組換え発現されたタンパク質、
（ｃ）前記（ａ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は
（ｄ）前記（ａ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）
として供給する、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
単離されたタンパク質が、
（１５）逆相ＨＰＬＣカラムに段階（１４）において収集された活性画分を適用する段階、及び
（１６）溶出したタンパク質を作製するために前記逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞は前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
をさらに含む工程の生成物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
単離されたタンパク質が、段階（１６）の溶出したタンパク質を再生する段階をさらに含む工程の生成物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞抽出物が、アイメリアに感染している組織から作製され、前記組織がウシ小腸組織である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
医薬組成物が、
（ａ）精製されたアピコンプレックス門生物の、又はアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製する段階、
（ｂ）ペレットを得るために前記ホモジネートを遠心分離する段階、
（ｃ）ホスホリパーゼを含む溶液で前記ペレットを処理する段階、
（ｄ）上清を得るために前記溶液を遠心分離する段階、
（ｅ）逆相ＨＰＬＣカラムに前記上清を適用する段階、及び
（ｆ）溶出したタンパク質を作製するために前記逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞は前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む工程の生成物である単離されたタンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
医薬組成物が、段階（ｆ）の溶出したタンパク質を再生する段階をさらに含む工程の生成物である単離されたタンパク質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
医薬組成物が、組換え発現された単離されたタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸として供給する、請求項５又は１１に記載の方法。
【請求項１９】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸として供給し、前記ヌクレオチド配列が前記動物において作動可能なプロモーターに連結している、請求項５又は１１に記載の方法。
【請求項２０】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸として供給し、前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結している請求項５又は１１に記載の方法。
【請求項２１】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、
（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０のいずれか１つの変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、
（ｃ）配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、
（ｄ）ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質、
（ｅ）低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、免疫刺激活性を有する単離されたタンパク質、
（ｆ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、免疫刺激活性を有する単離されたタンパク質、
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、
（ｈ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）
として供給し、前記医薬組成物が樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質として供給する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされる分子量１８〜２５ｋＤ及び４．０と４．７との間の等電点（ｐＩ）を含む単離されたタンパク質として供給する請求項１０から１５又は２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０のいずれか１つの変異体を含む単離されたタンパク質として供給し、前記変異体がそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質として供給し、前記変異体がそれぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質として供給する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされる単離されたタンパク質として供給し、前記タンパク質が免疫刺激活性を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされる単離されたタンパク質として供給し、前記タンパク質が免疫刺激活性を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
アイメリアの核酸が、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列として供給し、前記ヌクレオチド配列が前記動物において作動可能なプロモーターに連結している、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
形質転換細胞が、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞を含み、前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結している、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、
（ａ）配列番号１を含む単離されたタンパク質、
（ｂ）配列番号２を含む単離されたタンパク質、
（ｃ）配列番号２８を含む単離されたタンパク質、
（ｄ）配列番号３０を含む単離されたタンパク質、
（ｅ）配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質、
（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は
（ｇ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）
として供給する、請求項４に記載の方法。
【請求項３３】
医薬組成物が、配列番号１を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
医薬組成物が、配列番号２を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
医薬組成物が、配列番号２８を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
医薬組成物が、配列番号３０を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
医薬組成物が、配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、
（ａ）（１）アイメリアに感染している組織又は細胞の細胞抽出物を作製する段階、
（２）上清を作製するために前記細胞抽出物を遠心分離する段階、
（３）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによって前記上清を分画し、且つ前記ペレットを溶液に再懸濁する段階、
（４）前記溶液をＨＩＣカラムに適用する段階、
（５）溶出した物質を作製するために前記ＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させる段階  、
（６）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するために前記溶出した物質を透析する段階、
（７）ＤＥＡＥカラムに前記試料を適用する段階、
（８）溶出した画分を作製するために緩衝液で前記ＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させ、且つ前記溶出した画分を濃縮する段階、
（９）サイズ排除カラムに前記濃縮され溶出した画分を適用する段階、
（１０）前記サイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールする段階、
（１１）カルシウム結合タンパクを除去するためにＨＩＣカラムに前記プールされた画分を適用する段階、
（１２）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムに前記ＨＩＣカラムから溶出した画分を適用し、且つ活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、
（１３）前記活性画分を透析する段階、並びに
（１４）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムに前記透析された活性画分を適用し、且つ１つ若しくは複数の活性画分を収集する段階（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む工程の生成物である単離されたタンパク質、
（ｂ）組換え発現されたタンパク質、
（ｃ）前記（ａ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は
（ｄ）前記（ａ）をコードし、プロモーターに作動可能に連結しているヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞
として供給する、請求項４に記載の方法。
【請求項３９】
単離されたタンパク質が、
（１５）前記段階（１４）において収集された活性画分を逆相ＨＰＬＣカラムに適用する段階、及び
（１６）溶出したタンパク質を作製するために前記逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階
をさらに含む工程の生成物であり、前記タンパク質が樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞が前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
単離されたタンパク質が、前記段階（１６）の溶出したタンパク質を再生する段階をさらに含む工程の生成物である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞抽出物が、アイメリアに感染している組織から作製され、前記組織がウシ小腸組織である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
医薬組成物が、
（ａ）精製されたアピコンプレックス門生物の、又はアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製する段階、
（ｂ）ペレットを得るために前記ホモジネートを遠心分離する段階、
（ｃ）ホスホリパーゼを含む溶液で前記ペレットを処理する段階、
（ｄ）上清を得るために前記溶液を遠心分離する段階、
（ｅ）逆相ＨＰＬＣカラムに前記上清を適用する段階、及び
（ｆ）溶出したタンパク質を作製するために前記逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞は前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む工程の生成物である単離されたタンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項４３】
医薬組成物が、段階（ｆ）の溶出したタンパク質を再生する段階をさらに含む工程の生成物である単離されたタンパク質である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
医薬組成物が、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸として動物に前記タンパク質を供給する、請求項３２又は３８に記載の方法。
【請求項４５】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸として供給し、前記ヌクレオチド配列が前記動物において作動可能なプロモーターに連結している、請求項３２又は３８に記載の方法。
【請求項４６】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸として供給し、前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結している、請求項３２又は３８に記載の方法。
【請求項４７】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、
（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０のいずれか１つの変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、
（ｃ）配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質（前記変異体は、それぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）、
（ｄ）ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質、
（ｅ）低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、免疫刺激活性を有する単離されたタンパク質、
（ｆ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、免疫刺激活性を有する単離されたタンパク質、
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、
（ｈ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）
として提供し、前記医薬組成物が樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞が前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項４８】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号３、４、６又は７を含む単離されたタンパク質として供給する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされる分子量１８〜２５ｋＤ及び４．０と４．７との間の等電点（ｐＩ）を含む単離されたタンパク質として供給する、請求項３７から４２又は４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０のいずれか１つの変異体を含む単離されたタンパク質として供給し、前記変異体がそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質として供給し、前記変異体がそれぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
医薬組成物が、ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質として動物に前記タンパク質を供給する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされる、免疫刺激活性を有する単離されたタンパク質として供給する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされる、免疫刺激活性を有する単離されたタンパク質として供給する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列として供給する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列として供給し、前記ヌクレオチド配列が前記動物において作動可能なプロモーターに連結している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
形質転換細胞が、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞を含み、前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
動物における疾患を治療又は予防する方法であって、そのような治療又は予防が望ましい前記動物に治療又は予防有効量の精製されたアピコンプレックス門生物又は精製されたアピコンプレックス門生物のタンパク質含有膜画分を投与することを含む方法。
【請求項５９】
精製及び不活性化されたアピコンプレックス門生物を投与することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
アピコンプレックス門生物の胞子形成オーシストを投与することを含み、対象が、前記アピコンプレックス門生物の自然宿主ではない、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
アピコンプレックス門生物がアイメリア種である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
アピコンプレックス門生物又はタンパク質含有膜画分が経口投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
医薬組成物が、金属キレート剤と共に投与される、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
疾患が癌である、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
対象に癌に対する二次療法を施すことをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
二次療法が、手術、放射線療法、化学療法、又はその組合せである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
二次療法が、対象にＣＤ４０リガンド、インターフェロンγ、インターロイキン４、インターロイキン１８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、別のサイトカイン、抗ＣＤ４０抗体、又はその組合せを投与することを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
癌が卵巣癌である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
疾患が感染症であり、前記感染症がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はアイメリア属生物への感染によって引き起こされるものではない、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８に記載の方法。
【請求項７０】
感染症が細菌によって引き起こされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
感染症がウイルスによって引き起こされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
感染症がヒトにおけるものであり、医薬組成物が単離されたタンパク質を含み、前記単離されたタンパク質の用量が約２．８ｍｇから約２８０ｍｇである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
用量が約５ｍｇから約１００ｍｇである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
用量が約１０ｍｇから約５０ｍｇである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
感染症が原生動物によって引き起こされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７７】
感染症が寄生虫によって引き起こされる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７８】
動物が鳥類種ではなく、且つヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しておらず、医薬組成物の投与が免疫応答を刺激する、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８に記載の方法。
【請求項７９】
動物がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しておらず、医薬組成物の投与が前記動物におけるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の全身レベルの上昇を刺激する、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８に記載の方法。
【請求項８０】
動物がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染していない、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８に記載の方法。
【請求項８１】
医薬組成物が生物のゲノムによってコードされるタンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項８２】
生物がアピコンプレックス門生物である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
アピコンプレックス門生物がアイメリア種である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
医薬組成物が精製された分子を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項８５】
医薬組成物が単離されたタンパク質を含み、前記単離されたタンパク質がジスルフィド結合を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項８６】
ジスルフィド結合が還元型である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
ジスルフィド結合が酸化型である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
医薬組成物がグリコシル化タンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項８９】
医薬組成物が非グリコシル化タンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項９０】
医薬組成物がグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結タンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項９１】
医薬組成物がグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結ではないタンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項９２】
医薬組成物が天然タンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項９３】
医薬組成物が組換え発現されたタンパク質を含む、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項９４】
治療又は予防することがアイメリア属タンパク質を含む前記医薬組成物を用いるものである、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２又は４７に記載の方法。
【請求項９５】
動物がヒトである、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８に記載の方法。
【請求項９６】
動物がヒトではない、請求項５、１１、１５、２１、３２、３８、４２、４７又は５８に記載の方法。
【請求項９７】
（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む精製されたポリペプチド、
（ｂ）配列番号３、４、５、６及び７を含む精製されたポリペプチド、
（ｃ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号２９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、並びに
（ｄ）配列番号３、４、５、６及び７を含むアミノ酸配列の変異体を含む精製されたポリペプチド（前記変異体は、それぞれ配列番号３、４、５、６及び７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）
からなる群から選択される精製されたポリペプチド。
【請求項９８】
ポリペプチドが配列番号３、４、６又は７を含み、前記ポリペプチドがドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされる分子量１８〜２５ｋＤ及び４．０と４．７との間の等電点（ｐＩ）を有する、請求項９７に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項９９】
ポリペプチドが配列番号３、４、５、６及び７を含み、前記ポリペプチドがドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされる分子量１８〜２５ｋＤ及び４．０と４．７との間の等電点（ｐＩ）を有する、請求項９７に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項１００】
（ａ）アイメリアに感染している組織又は細胞の細胞抽出物を作製すること、
（ｂ）上清を作製するために前記細胞抽出物を遠心分離すること、
（ｃ）タンパク質を沈殿させてペレットにするために硫酸アンモニウムによって前記上清を分画すること、及び前記ペレットを溶液に再懸濁すること、
（ｄ）前記溶液をＨＩＣカラムに適用すること、
（ｅ）溶出した物質を作製するために前記ＨＩＣカラムに結合した物質を溶出させること、
（ｆ）ＤＥＡＥカラムに負荷するための試料を作製するために、前記溶出した物質を透析すること、
（ｇ）ＤＥＡＥカラムに前記試料を適用すること、
（ｈ）溶出した画分を作製するために緩衝液で前記ＤＥＡＥカラムに結合した物質を溶出させること、及び前記溶出した画分を濃縮すること、
（ｉ）サイズ排除カラムに前記濃縮され溶出した画分を適用すること、
（ｊ）前記サイズ排除カラムから溶出した画分を収集及びプールすること、
（ｋ）カルシウム結合タンパクを除去するためにＨＩＣカラムに前記プールされた画分を適用すること、
（ｌ）ＨＰＬＣ  ＨＩＣカラムに前記ＨＩＣカラムから溶出した画分を適用すること、及び活性画分を収集すること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、
（ｍ）前記活性画分を透析すること、
（ｎ）ＨＰＬＣ  ＤＥＡＥカラムに前記透析された活性画分を適用すること、及び１つ又は複数の活性画分を収集すること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０１】
（ｏ）逆相ＨＰＬＣカラムに段階（ｎ）で収集された活性画分を適用する段階、及び
（ｐ）溶出したタンパク質を作製するために前記逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させる段階（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞は前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
をさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
段階（ｐ）の溶出したタンパク質を再生する段階をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
細胞抽出物が、アイメリアに感染しているウシ小腸組織から作製される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項１００に記載の工程の生成物である、精製されたポリペプチド。
【請求項１０５】
（ａ）精製されたアピコンプレックス門生物の、又はアピコンプレックス門生物に感染している細胞のホモジネートを作製すること、
（ｂ）ペレットを得るために前記ホモジネートを遠心分離すること、
（ｃ）ホスホリパーゼを含む溶液で前記ペレットを処理すること、
（ｄ）上清を得るために前記溶液を遠心分離すること、
（ｅ）逆相ＨＰＬＣカラムに前記上清を適用すること、及び
（ｆ）溶出したタンパク質を作製するために前記逆相ＨＰＬＣカラムから結合したタンパク質を溶出させること（前記タンパク質は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する活性を有し、前記樹状細胞は前記活性をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０６】
作製された抽出物がウシに自然に感染する精製されたアピコンプレックス門生物のものである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
請求項１０５に記載の工程の生成物である、精製されたポリペプチド。
【請求項１０８】
治療有効量の請求項９７、１０４又は１０７に記載のポリペプチド又はデフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０からなる群から選択されるタンパク質のいずれか１つと少なくとも２５％の同一性を有するタンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記タンパク質が免疫刺激活性を保有する医薬組成物。
【請求項１０９】
第１タンパク質に結合する抗体であって、前記第１タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２６からなり、前記抗体が第２タンパク質に結合せず、前記第２タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０からなる抗体。
【請求項１１０】
モノクローナル抗体である請求項１０９に記載の抗体。
【請求項１１１】
請求項１１０に記載の抗体のフラグメントを含む分子であって、前記フラグメントが前記第１タンパク質と結合できる分子。
【請求項１１２】
（ａ）配列番号３、４、６又は７を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、
（ｂ）配列番号３、４、５、６及び７を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、並びに
（ｃ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号２９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子
からなる群から選択される単離された核酸。
【請求項１１３】
精製されている、請求項１１２に記載の核酸。
【請求項１１４】
ベクターである、請求項１１２に記載の核酸。
【請求項１１５】
ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結しているプロモーターをさらに含む、請求項１１４に記載のベクター。
【請求項１１６】
発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記発現ベクターがヌクレオチド配列に作動可能に連結しているプロモーターを含み、前記プロモーターが前記ヌクレオチド配列に関して非天然であり、前記ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号３、４、６若しくは７を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号３、４、５、６及び７を含むポリペプチド、又は
（ｃ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号２９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
をコードする宿主細胞。
【請求項１１７】
哺乳動物宿主細胞である、請求項１１６に記載の宿主細胞。
【請求項１１８】
酵母細胞である、請求項１１６に記載の宿主細胞。
【請求項１１９】
昆虫細胞である、請求項１１６に記載の宿主細胞。
【請求項１２０】
細菌細胞である、請求項１１６に記載の宿主細胞。
【請求項１２１】
大腸菌である、請求項１２０に記載の宿主細胞。
【請求項１２２】
コードされているポリペプチドが請求項１１６に記載の細胞によって発現されるように前記細胞を増殖させること、及び発現した前記ポリペプチドを回収することを含むポリペプチドの製造方法。
【請求項１２３】
発現したポリペプチドを回収することが、
（ａ）宿主細胞の抽出物を作製すること、
（ｂ）上清を作製するために前記宿主細胞の抽出物を遠心分離すること、
（ｃ）タンパク質を沈殿させるために硫酸アンモニウムによって前記上清を分画すること、
（ｄ）ペレットを得るために前記沈殿を遠心分離すること、
（ｅ）前記ペレットを溶液に再懸濁すること、
（ｆ）低圧疎水性相互作用カラムに前記溶液を適用すること、
（ｇ）前記低圧疎水性相互作用カラムから溶出した活性画分を収集すること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、
（ｈ）前記低圧疎水性相互作用カラムから前記溶出した活性画分を透析すること、
（ｉ）低圧ＤＥＡＥカラムに前記透析された活性画分を適用すること、
（ｊ）前記低圧ＤＥＡＥカラムから溶出した１つ又は複数の活性画分を収集すること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、
（ｋ）サイズ排除カラムに前記低圧ＤＥＡＥカラムから溶出した前記活性画分を適用すること、及び
（ｌ）前記サイズ排除カラムから前記活性画分を溶出させること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
医薬組成物が血清アルブミンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２５】
血清アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
ヒト血清アルブミンが前記組成物の重量に対して約１重量％から約１０重量％の濃度で存在する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
ヒト血清アルブミンが前記組成物の重量に対して約２重量％から約４重量％の濃度で存在する、請求項１２６に記載の方法。 
【請求項１２８】
治療有効量の請求項９７、１０４又は１０７に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008500005000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月13日(2007.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における疾患を治療又は予防する医薬組成物であって、デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号１、２、２８、及び３０からなる群から選択されるいずれか１つのタンパクと少なくとも２５％の同一性を有するタンパクを含む免疫刺激活性を有する医薬組成物。
【請求項２】
医薬組成物が、タンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、又は前記タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトされている細胞として供給される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
医薬組成物が、
（ａ）配列番号１を含む単離されたタンパク質、
（ｂ）配列番号２を含む単離されたタンパク質、
（ｃ）配列番号２８を含む単離されたタンパク質、
（ｄ）配列番号３０を含む単離されたタンパク質、
（ｅ）配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質、
（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、又は
（ｇ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された細胞（前記ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結している）
として供給される、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
医薬組成物が、配列番号１を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
医薬組成物が、配列番号２を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項６】
医薬組成物が、配列番号２８を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項７】
医薬組成物が、配列番号３０を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項８】
医薬組成物が、配列番号３、４、５、６及び７を含む単離されたタンパク質を含む、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項９】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされる分子量１８〜２５ｋＤ及び４．０と４．７との間の等電点（ｐＩ）を含む単離されたタンパク質として供給する請求項１〜８のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項１０】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０のいずれか１つの変異体を含む単離されたタンパク質として供給し、前記変異体がそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０に対して保存的アミノ酸置換のみを有する、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、配列番号３、４、６又は７の変異体を含む単離されたタンパク質として供給し、前記変異体がそれぞれ配列番号３、４、６又は７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１２】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、ＰＲＯＦ（プロフィリン）ドメインを含む単離されたタンパク質として供給する、請求項９〜１１のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項１３】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、低ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされる単離されたタンパク質として供給し、前記タンパク質が免疫刺激活性を有する、請求項９〜１２のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項１４】
医薬組成物が、動物にタンパク質を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２７、又は前記配列番号のいずれかの相補体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされる単離されたタンパク質として供給し、前記タンパク質が免疫刺激活性を有する、請求項９〜１２のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項１５】
動物における疾患を治療又は予防する医薬組成物であって、そのような治療又は予防が望ましい前記動物に治療又は予防有効量の精製されたアピコンプレックス門生物又は精製されたアピコンプレックス門生物のタンパク質含有膜画分を含む医薬組成物。
【請求項１６】
精製及び不活性化されたアピコンプレックス門生物を含む、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
アピコンプレックス門生物の胞子形成オーシストを含み、対象が、前記アピコンプレックス門生物の自然宿主ではない、請求項１５又は１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
アピコンプレックス門生物がアイメリア種である、請求項１５〜１７のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項１９】
アピコンプレックス門生物又はタンパク質含有膜画分が経口投与される、請求項１５〜１８のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項２０】
医薬組成物が、金属キレート剤と共に投与される、請求項１〜１９のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項２１】
疾患が癌である、請求項１〜２０のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項２２】
対象に癌に対する二次療法を施すことをさらに含む、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
二次療法が、手術、放射線療法、化学療法、又はその組合せである、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
二次療法が、対象にＣＤ４０リガンド、インターフェロンγ、インターロイキン４、インターロイキン１８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、別のサイトカイン、抗ＣＤ４０抗体、又はその組合せを投与することを含む、請求項２２又は２４記載の医薬組成物。
【請求項２５】
癌が卵巣癌である、請求項２１〜２４のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項２６】
疾患が感染症であり、前記感染症がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はアイメリア属生物への感染によって引き起こされるものではない、請求項１〜２０のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項２７】
感染症が細菌によって引き起こされる、請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
感染症がウイルスによって引き起こされる、請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
感染症がヒトにおけるものであり、医薬組成物が単離されたタンパク質を含み、前記単離されたタンパク質の用量が約２．８ｍｇから約２８０ｍｇである、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３１】
用量が約５ｍｇから約１００ｍｇである、請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】
用量が約１０ｍｇから約５０ｍｇである、請求項３１記載の医薬組成物。
【請求項３３】
感染症が原生動物によって引き起こされる、請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項３４】
感染症が寄生虫によって引き起こされる、請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項３５】
動物が鳥類種ではなく、且つヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しておらず、医薬組成物の投与が免疫応答を刺激する、請求項１〜３４のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項３６】
医薬組成物が、アピコンプレックス門生物のゲノムによってコードされるタンパク質を含む、請求項１〜３５のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項３７】
アピコンプレックス門生物がアイメリア種である、請求項３６記載の医薬組成物。
【請求項３８】
医薬組成物が精製された分子を含む、請求項１〜３７のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項３９】
医薬組成物が単離されたタンパク質を含み、前記単離されたタンパク質がジスルフィド結合を含む、請求項１〜３８のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項４０】
ジスルフィド結合が還元型である、請求項３９記載の医薬組成物。
【請求項４１】
ジスルフィド結合が酸化型である、請求項３９記載の医薬組成物。
【請求項４２】
医薬組成物がグリコシル化タンパク質を含む、請求項１〜４１のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項４３】
医薬組成物が非グリコシル化タンパク質を含む、請求項１〜４１のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項４４】
医薬組成物がグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結タンパク質を含む、請求項１〜４３のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項４５】
医薬組成物がグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結ではないタンパク質を含む、請求項１〜４３のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項４６】
医薬組成物が天然タンパク質を含む、請求項１〜４５のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項４７】
医薬組成物が組換え発現されたタンパク質を含む、請求項１〜４６のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項４８】
動物がヒトである、請求項１〜４７のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項４９】
動物がヒトではない、請求項１〜４７のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項５０】
（ａ）配列番号３、４、６又は７を含む精製されたポリペプチド、
（ｂ）配列番号３、４、５、６及び７を含む精製されたポリペプチド、
（ｃ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号２９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、並びに
（ｄ）配列番号３、４、５、６及び７を含むアミノ酸配列の変異体を含む精製されたポリペプチド（前記変異体は、それぞれ配列番号３、４、５、６及び７に対して保存的アミノ酸置換のみを有する）
からなる群から選択される精製されたポリペプチド。
【請求項５１】
ポリペプチドが配列番号３、４、６又は７を含み、前記ポリペプチドがドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされる分子量１８〜２５ｋＤ及び４．０と４．７との間の等電点（ｐＩ）を有する、請求項５０記載の精製されたポリペプチド。
【請求項５２】
ポリペプチドが配列番号３、４、５、６及び７を含み、前記ポリペプチドがドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイされる分子量１８〜２５ｋＤ及び４．０と４．７との間の等電点（ｐＩ）を有する、請求項５０記載の精製されたポリペプチド。
【請求項５３】
治療有効量の請求項５０〜５２のいずれか記載のポリペプチド、又はデフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０からなる群から選択されるタンパク質のいずれか１つと少なくとも２５％の同一性を有するタンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記タンパク質が免疫刺激活性を保有する医薬組成物。
【請求項５４】
第１タンパク質に結合する抗体であって、前記第１タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２６からなり、前記抗体が第２タンパク質に結合せず、前記第２タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１、配列番号２、配列番号２８又は配列番号３０からなる抗体。
【請求項５５】
モノクローナル抗体である請求項５４記載の抗体。
【請求項５６】
請求項５５記載の抗体のフラグメントを含む分子であって、前記フラグメントが前記第１タンパク質と結合できる分子。
【請求項５７】
（ａ）配列番号３、４、６又は７を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、
（ｂ）配列番号３、４、５、６及び７を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、並びに
（ｃ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号２９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子
からなる群から選択される単離された核酸。
【請求項５８】
発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記発現ベクターがヌクレオチド配列に作動可能に連結しているプロモーターを含み、前記プロモーターが前記ヌクレオチド配列に関して非天然であり、前記ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号３、４、６若しくは７を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号３、４、５、６及び７を含むポリペプチド、又は
（ｃ）デフォルトパラメータに調整したBLAST 2.0アルゴリズムによって決定される配列番号２９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする宿主細胞。
【請求項５９】
コードされているポリペプチドが請求項５８記載の細胞によって発現されるように前記細胞を増殖させること、及び発現した前記ポリペプチドを回収することを含むポリペプチドの製造方法。
【請求項６０】
発現したポリペプチドを回収することが、
（ａ）宿主細胞の抽出物を作製すること、
（ｂ）上清を作製するために前記宿主細胞の抽出物を遠心分離すること、
（ｃ）タンパク質を沈殿させるために硫酸アンモニウムによって前記上清を分画すること、
（ｄ）ペレットを得るために前記沈殿を遠心分離すること、
（ｅ）前記ペレットを溶液に再懸濁すること、
（ｆ）低圧疎水性相互作用カラムに前記溶液を適用すること、
（ｇ）前記低圧疎水性相互作用カラムから溶出した活性画分を収集すること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、
（ｈ）前記低圧疎水性相互作用カラムから前記溶出した活性画分を透析すること、
（ｉ）低圧ＤＥＡＥカラムに前記透析された活性画分を適用すること、
（ｊ）前記低圧ＤＥＡＥカラムから溶出した１つ又は複数の活性画分を収集すること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）、（ｋ）サイズ排除カラムに前記低圧ＤＥＡＥカラムから溶出した前記活性画分を適用すること、及び
（ｌ）前記サイズ排除カラムから前記活性画分を溶出させること（前記活性画分は樹状細胞からのインターロイキン１２の放出を刺激する能力を有し、前記樹状細胞は前記能力をアッセイする１０時間以内に哺乳動物から単離されたものである）
を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
医薬組成物が血清アルブミンをさらに含む、請求項１〜４９のいずれか、又は請求項５３記載の医薬組成物。
【請求項６２】
血清アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項６１記載の医薬組成物。
【請求項６３】
ヒト血清アルブミンが前記組成物の重量に対して約１重量％から約１０重量％の濃度で存在する、請求項６１又は６２記載の医薬組成物。
【請求項６４】
ヒト血清アルブミンが前記組成物の重量に対して約２重量％から約４重量％の濃度で存在する、請求項６１又は６２記載の医薬組成物。 
【請求項６５】
治療有効量の請求項５０〜５２のいずれか記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【国際調査報告】
2008500005.tif 000081
2008500005.tif 000082
2008500005.tif 000083