【事件の表示】
　特許第２６１９８６６号「競合的均質検定法」の特許請求の範囲第１項、第１２項、第１７項及び第２１項に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２６１９８６６号の特許請求の範囲第１項、第８項及び第９項に記載された発明についての特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯　
　本件特許第２６１９８６６号の発明についての出願は、昭和６２年１月１０日に出願（パリ条約による優先権主張１９８６年１月１０日、米国）され、平成９年３月１１日にその発明について特許権の設定登録がなされ、その後、アボット・ラボラトリーズより特許異議の申立がなされ、平成１０年４月２３日付けで取消の理由の通知がなされ、その指定期間内である平成１０年１１月１６日に訂正請求がなされ、平成１１年７月２２日及び平成１２年６月３０日に訂正請求書の補正がされた後、平成１３年４月２７日付けで再度取消の理由の通知がなされ、その指定期間内である平成１３年５月１１日に再度訂正請求がなされるとともに、先の訂正請求が取り下げられたものである。　
２．訂正の適否　
（１）訂正の内容　
特許権者が求めている訂正の内容は、以下のとおりである。　
ア．特許請求の範囲第１項の「標的ポリヌクレオチドについて試料を検定する方法であって、…上記第１プローブおよび第２プローブはこれらのプローブの一方と会合した第１標識成分を含みおよび他方のプローブと会合した第２標識成分を含み、…の各工程を含む方法。」を、「標的ポリヌクレオチドについて試料を検定する方法であって、…上記第１プローブおよび第２プローブはこれらのプローブの一方と会合した第１標識成分を含みおよび他方のプローブと会合した第２標識成分を含み、
各プローブは複数の標識成分を有し、第１標識成分は上記プローブの一方の３’末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５’末端に存在し、
上記方法は４ピコモルの濃度で存在する標的ポリヌクレオチドを検出しうることを特徴とする
イ．特許請求の範囲第２項ないし第５項を削除し、同第６項ないし第１１項を、第２項ないし第７項とする。　
ウ．特許請求の範囲第１２項の「標的ポリヌクレオチドについて試料を検定するための試薬を含むキットであって、…上記第１プローブおよび第２プローブはこれらのプローブの一方と会合した第１標識成分を含みおよび他方のプローブと会合した第２標識成分を含み、…信号を発することができることを特徴とするキット。」を、「標的ポリヌクレオチドについて試料を検定するための試薬を含むキットであって、…上記第１プローブおよび第２プローブはこれらのプローブの一方と会合した第１標識成分を含みおよび他方のプローブと会合した第２標識成分を含み、
各プローブは複数の標識成分を有し、第１標識成分は上記プローブの一方の３’末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５’末端に存在し、
上記キットは４ピコモルの濃度で存在する標的ポリヌクレオチドを検出しうること
エ．特許請求の範囲第１３項ないし第１６項を削除する。　
オ．特許請求の範囲第１７項の「試料中のポリヌクレオチド標的について競合的均質検定を行うための装置であって、…上記プローブは一方のプローブと会合した少なくとも１つの標識成分および他方のプローブと会合した第２標識成分を有し、…上記信号を検出する手段；を含む装置。」を「試料中のポリヌクレオチド標的について競合的均質検定を行うための装置であって、…上記プローブは一方のプローブと会合した少なくとも１つの標識成分および他方のプローブと会合した第２標識成分を有し、
各プローブは複数の標識成分を有し、第１標識成分は上記プローブの一方の３’末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５’末端に存在し、
上記検定は４ピコモルの濃度で存在する標的ポリヌクレオチドを検出しうることを特徴とする
カ．特許請求の範囲第１８項ないし第２０項を、第１０項ないし第１２項とする。　
キ．特許請求の範囲第２１項ないし第２３項を削除する。　
ク．特許公報第２２欄第４８行の「マフィニティー」を、「アフィニティー」と訂正する。　
ケ．特許公報第２７欄第４７−４８行の「触解温度」を、「融解温度」と訂正する。　
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否　
　上記アの訂正事項に関連する記載として、願書に添付した明細書（以下、「特許明細書」という。）の発明の詳細な説明には「各プローブに対して複数の標識成分を使用することができ、好ましくは２つの標識成分（各末端に１つずつ）を使用する。例えば、第１標識成分は３’位置で第１プローブと結合し、第２標識成分は５’位置で結合する。類似の標識成分の構成（すなわち３’位置に第１標識成分および５’位置に第２標識成分）をもつ第２プローブは、相対するプローブの第１および第２標識成分がきわめて接近して相互作用をすることができるように、第１プローブとハイブリダイズするであろう。」（特許公報第９欄４−１３行）と記載され、また、本件の検定方法についての記載（同第３１欄３２行−第３３欄４４行）中に「検出可能な最も低い標的濃度は４ｐＭであることがわかった。」（第３３欄３６−３７行）と記載されていることから、本件のプローブとそれに会合する標識成分について、「各プローブは複数の標識成分を有すること」、「第１標識成分は上記プローブの一方の３’末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５’末端に存在すること」、及び、本件の検定方法により、「４ピコモルの濃度で存在する標的ポリヌクレオチドを検出しうること」は特許明細書に記載されているものと認める。　
　そうすると、上記アの訂正は、特許明細書に記載された事項の範囲内において、特許請求の範囲第１項の構成要件である「プローブ」とそれに会合する「標識成分」についてその数及び会合位置を限定し、「標的ポリヌクレオチドについての試料の検定」についてその感度を限定したものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであって、新規事項の追加に該当しない。　
　同様にして、上記ウ及びオの訂正は、特許明細書に記載された事項の範囲内において、特許請求の範囲第１２項及び第１７項の構成要件である「プローブ」に会合する「標識成分」の数と会合位置、及び「標的ポリヌクレオチドについての試料の検定」の感度について、それぞれ限定したものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであり、新規事項の追加に該当しない。　
　また、上記イ、エ、カ、キの訂正は、特許請求の範囲の請求項を削除するものであり、あるいはそれに伴い、請求項の番号を訂正するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであり、新規事項の追加に該当しない。　
　更に、上記ク及びケの訂正は、訂正前の記載が訂正後の記載の誤りであることが明らかであるから、誤記の訂正に該当するものであって、新規事項の追加にも該当しない。　
　そして、上記いずれの訂正も実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。　
　また、下記の特許異議申立についての判断の項で詳述するとおり、訂正後の特許請求の範囲に記載されている事項により特定される発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。　
（３）むすび　
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する第１２６条第２、３及び４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。　
３．特許異議申立についての判断　
（１）申立の理由の概要　
　申立人　アボット・ラボラトリーズは、甲第１号証（特開昭６０−２４４３００号公報）、甲第２号証（特開昭５８−２３７９５号公報）および甲第３号証（特開昭６０−１６６６９５号公報）を提出し、特許請求の範囲第１項、第１２項、第２１項に係る各特許発明は甲第１号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反して特許されたものであり、同第１７項に係る特許発明は甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであるため、特許請求の範囲第１項、第１２項、第１７項及び第２１項に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。　
（２）本件発明　
　訂正明細書の特許請求の範囲第１項、第８項及び第９項に係る発明（それぞれ、訂正前の特許請求の範囲第１項、第１２項、第１７項を訂正したものにあたる。）は、それぞれ、平成１３年５月１１日付けの訂正明細書の特許請求の範囲第１項、第８項及び第９項に記載された事項により特定されるとおりのものである。　
　なお、訂正前の特許請求の範囲第２１項およびその従属項である第２２項、第２３項は訂正により削除されている。
（３）刊行物に記載された発明　
　特許異議申立人が証拠として提示した刊行物には、それぞれ以下のような発明が記載されている。　
刊行物１：特開昭６０−２４４３００号公報（甲第１号証）　
　その特許請求の範囲第１項に「（ａ）（１）標的ヌクレオチド配列に対し、プリン／ピリミジン塩基の水素結合を通して塩基対結合ができるプローブポリヌクレオチドと、（２）プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列に結合できる領域と少なくとも部分的に同じ長さのプローブポリヌクレオチドの領域でプローブポリヌクレオチドに対しプリン／ピリミジン塩基の水素結合を通した塩基対結合により結合された標識ポリヌクレオチドとの試薬複合体を提供し；（ｂ）（１）有効量のハイブリダイゼーション促進活性を有する組み換えタンパク質と、（２）その活性に必要なコファクターの存在下で、標的ヌクレオチド配列がもし存在するならプローブポリヌクレオチドに結合し、複合体から標識ヌクレオチドを置換する条件で試薬複合体を試料と接触せしめ；（ｃ）試薬複合体から置換された標識ポリヌクレオチドの存在を決定する工程から成る生物試料の核酸中の前もって決定されている標的ヌクレオチド配列の存在を決定する方法。」と記載され、同第９項に「試薬複合体が接触工程（ｂ）の間溶液中で遊離している」ことが記載され、第１２頁左上欄４行〜右上欄４行には、「一つまたはそれ以上の検出可能な標識は一般的に標識ポリヌクレオチドに沿って一つまたはそれ以上のいくつかの点に…位置している。…試薬複合体中に少なくとも一つの標識ポリヌクレオチドが対になっていない領域があり、標識はそのような不対領域上または内に良好に存在または濃縮されている。…使用される直接検出可能な標識には、…蛍光化合物（標識ポリヌクレオチドの遊離末端または標識ポリヌクレオチドの一つまたはそれ以上の不対塩基に結合したフルオレスカインまたはローダミン誘導体）…が挙げられる。」と記載され、第１６頁左下欄下３行〜右下欄５行には、「本発明のいくつかの実施態様では…決定工程は置換により標識から検出できるシグナルにおける変化を含み、そのシグナルは標識ポリヌクレオチド上またはプローブポリヌクレオチド上の他の場所のシグナル影響部分への接近により影響される（下記の第３Ａ図〜第３Ｄ図の記述参照）。」と記載され、第２１頁右下欄４行〜２２頁右上欄２行には、「第３Ａ図は試薬複合体がすっかり溶液中にある…実施態様を示している。…標識ポリヌクレオチド（Ｌ）はプローブ（Ｐ）に付着した消光部分（Ｑ）にきわめて接近して複合体に保持された蛍光標識（Ｆ）を含む。これらの部分ＦおよびＱは消光部分（Ｑ）によって吸収された照射による蛍光標識（Ｆ）の刺激によって生じるシグナルに対して、図３Ａの複合体では充分に接近している。…置換の完了で…標識ポリヌクレオチドＬは全体的に置換される。この状態では、第３Ｃ図に示すように、標識（Ｆ）は消光されない刺激による検出可能のシグナルを生じる消光部分（Ｑ）から充分離れている。…従って、蛍光標識（Ｆ）の刺激と非消光シグナルの測定は分離工程を実施せずに置換ポリヌクレオチド用の定量的検出方法として役立ちうる。標識ポリヌクレオチドＬとプローブポリヌクレオチドＰ…が同一分子の部分を占めているという第３Ａ〜３Ｃ図の実施態様での変更が第３Ｄ図に示されてる。」と記載されている。
刊行物２：特開昭５８−２３７９５号公報（甲第２号証）　
　その特許請求の範囲第１項に、「ａ）一本鎖ポリヌクレオチド試料をハイブリッド形成条件下で標的の一本鎖ポリヌクレオチドの実質上相互に排他的な部分に相補性である第一及び第二の一本鎖ポリヌクレオチド反応剤セグメントと接触させ、第一反応剤セグメントがそれに付着した化学発光触媒をもちかつ第二セグメントがそれに付着した吸光体／発光体部分をもち、標的の一本鎖ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成時に化学発光触媒と吸光体／発光体部分とが非放射性エネルギー伝達を可能とするのに十分相互に近接しているようにし；ｂ）一本鎖ポリヌクレオチド試料を、化学発光触媒の存在下で光放出をおこさせるのに効果的な化学発光反応剤とさらに接触させ；そして；ｃ）吸光体／発光体部分から放出される光の量を測定する；ことから成る、独特のポリヌクレオチド配列または遺伝子セグメントを検定する方法。」が記載され、第８頁左下欄下３行〜右下欄７行には「…セグメントの３’−端をＲＮＡリガーゼを用いてアミノヘキサン−３’−５’−アデノシンジホスフェートで以てラベルすることができ、あるいは特定条件下でポリヌクレオチド　ホスホリラーゼを用いて、アミノヘキサン−５’−アデノシンジホスフェートで以てラベルすることができる。このストランドは３’−端に於いてアミノヘキシル官能基を含み、これを通じて各種の吸光体／発光体部分が容易に結合し得る。」と記載され、第９頁左上欄下８行〜右上欄下４行には、図２を説明して、「…すべての反応剤を一つの容器内に入れることが好ましく、…第一及び第二のｓｓ−ポリヌクレオチド反応剤セグメントの両者がともに吸光体／発光体標識をつけられている場合には、第一の吸光体／発光体は適切な波長の光で以て照射され、そして第二の吸光体／発光体の放出波長がハイブリッド形成度を決定するために追跡される。」と記載されている。
刊行物３：特開昭６０−１６６６９５号公報（甲第３号証）　
　第２頁左上欄下４〜１行に、「本発明は、ヌクレオチドの３’−末端リン酸基延長上に適度な長さのスペーサーを介して一級アミノ基を導入してなるオリゴヌクレオチド誘導体に関する。」と記載され、第３頁右上欄４〜６行に、この化合物は「５’−アミノアルキル−オリゴヌクレオチドと対をなす化合物として、研究上および応用上重要である。」と記載され、第３頁右上欄１２行〜１７行に「たとえば標識物質…をそれぞれのアミノ酸誘導体に付加後、リンカーとして天然のＤＮＡに結合させ、それぞれの標識物質の性質を利用して特定のＤＮＡを分離または検出する。」と記載されている。
（４）対比・判断　
　本件特許請求の範囲第１項、第８項及び第９項に係る発明と上記刊行物１に記載された発明とを対比すると、刊行物１には、標識ポリヌクレオチド（本件発明の第１プローブまたは第２プローブのいずれか一方にあたる。）には二つ以上の標識が結合していてもよい旨の記載はあるものの、プローブポリヌクレオチド（本件発明の第１プローブまたは第２プローブのいずれか他方にあたる。）についてはそのような記載は見あたらない。また、蛍光標識（Ｆ）と消光部分（Ｑ）の相互作用の有無により標的ヌクレオチドの検出を行う方法に用いるものとして、第３Ａ図〜第３Ｄ図に示されているのは、長いプローブポリヌクレオチドの一端側に短い標識ポリヌクレオチドが相補的に結合し、プローブポリヌクレオチドの標識ポリヌクレオチドが結合する側の末端に消光部分（Ｑ）が結合し、これに対応する標識ポリヌクレオチドの末端に蛍光標識（Ｆ）が結合するものだけであり、刊行物１の記載から、プローブポリヌクレオチドと標識ポリヌクレオチドのそれぞれの両末端に蛍光標識（Ｆ）と消光部分（Ｑ）を結合したものは想定できないから、刊行物１に記載された発明は、本件発明を特定する事項である、「各プローブは複数の標識成分を有し、第１標識成分は上記プローブの一方の３’末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５’末端に存在する」という事項を備えておらず、刊行物１にはこれを示唆する記載もないものと認められる。また、上記刊行物２，３にも上記事項は記載も示唆もされていない。　
　従って、本件特許請求の範囲第１項及び第８項に係る発明は上記刊行物１に記載された発明とはいえないし、上記刊行物１〜３に記載された発明に基づいて容易に発明をすることができたものともいえない。　
　また、同様の理由により、本件特許請求の範囲第９項に係る発明は、上記刊行物１〜３に記載された発明に基づいて容易に発明をすることができたものとはいえない。　
（５）むすび　
　以上のとおりであるから、特許異議申立ての理由及び証拠によっては特許請求の範囲第１項、第８項及び第９項に係る発明についての特許を取り消すことはできない。　
　また、他に本件特許請求の範囲第１項、第８項及び第９項に係る発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。　
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年５月１４日（２００１．５．１４）
【訂正の要旨】
（１）特許請求の範囲の減縮
（１．１）特許請求の範囲第１項を、特許請求の範囲の減縮を目的として次のとおり訂正する。
　『１．標的ポリヌクレオチドについて試料を検定する方法であって、
　（ａ）　試料と試薬を結合条件下で接触させ、
ここで上記試薬は第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌクレオチドプローブを含み、上記第１および第２ポリヌクレオチドプローブはそれらが互いに結合する第１の位置をとることができ且つ上記プローブの少なくとも１つは上記プローブ鎖が上記標的ポリヌクレオチドと結合する第２の位置をとることができ、上記第１プローブおよび第２プローブはこれらのプローブの一方と会合した第１標識成分を含みおよび他方のプローブと会合した第２標識成分を含み、各プローブは複数の標識成分を有し、第１標識成分は上記プローブの一方の３’末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５’末端に存在し、上記第１および第２標識成分は上記第１および第２プローブが互いに結合するとき相互作用して上記２つの位置の一方にあるプローブに特徴的な検出しうる信号を発することができる；および
　（ｂ）　上記試料中の標的の存在と関連がある信号の存在について上記試料を監視する；
の各工程を含み、
上記方法は４ピコモルの濃度で存在する標的ポリヌクレオチドを検出しうることを特徴とする方法。』
（１．２）特許請求の範囲第２−５項を削除するとともに、第６−１１項をそれぞれ第２−７項と訂正する。
（１．３）特許請求の範囲第１２項を、特許請求の範囲の減縮を目的として、次のとおり訂正するとともに、請求項の番号を第８項と訂正する。
　『８．標的ポリヌクレオチドもこついて試料を検定するための試薬を含むキットであって、
上記試薬は第１ボリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌクレオチドプローブを含み、上記第１および第２プローブはそれらが互いに結合する第１の位置をとることができ且つ上記プローブの少なくとも１つは上記プローブ鎖が上記標的と結合する第２の位置をとることができ、上記第１プローブおよび第２プローブはこれらのプローブの一方と会合した第１標識成分および他方のプローブと会合した第２標識成分を含み、各プローブは複数の標識成分を有し、第１標識成分は上　記プローブの一方の３’末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５’末端に存在し、上記第１および第２標識成分は上記第１および第２プローブが互いに結合するとき相互作用して、上記２つの位置の一方にあるプローブに特徴的な検出しうる信号を発することができ、上記キットは４ピコモルの濃度で存在する標的ポリヌクレオチドを検出しうることを特徴とするキット。』
（１．４）特許請求の範囲第１３−１６項を削除する。
（１．５）特許請求の範囲第１７項を、特許請求の範囲の減縮を目的として、次のとおり訂正するとともに、請求項の番号を第９項と訂正する。
　『９．試料中のボリヌクレオチド標的について競合的均質検定を行うための装置であって、
試薬および試料を収容するのに適した容器手段、ここで上記試薬は第１プローブおよび第２プローブを含み、上記第１および第２プローブは第１プローブが第２プローブと結合する第１の位置およびこれらのプローブの少なくとも１つが上記標的と結合する第２の位置をとることができ、上記プローブは一方のプローブと会合した少なくとも１つの標識成分および他方のプローブと会合した第２標識成分を有し、各プローブは複数の標識成分を有し、第１標識成分は上記プローブの一方の３’末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５’末端に存在し、上記第１および第２標識成分は上記プローブが上記第１の位置にあるとき相互作用して、上記標識成分の一方の励起の際に上記位置の一方に特徴的な検出しうる信号を発することができる；
上記標識成分の一方を励起する手段；
および上記信号を検出する手段；
を含み、上記検定は４ピコモルの濃度で存在する標的ポリヌクレオチドを検出しうることを特徴とする装置。』
（１．６）特許請求の範囲第１８−２０項をそれぞれ第１０−１２項と訂正する。
（１．７）特許請求の範囲第２１項を削除する。
（１．８）特許請求の範囲第２２−２３項を削除する。
（２）誤記の訂正
（２．１）本件特許公報第２２欄第４８行の「マフイニテイー」を、誤記の訂正を目的として、『アフイニティー』と訂正する。
（２．２）本件特許公報第２７欄第４７−４８行の「触解温度」を、誤記の訂正を目的として、『融解温度』と訂正する。
（５４）【発明の名称】
競合的均質検定法
（５７）【特許請求の範囲】
　１．標的ポリヌクレオチドについて試料を検定する方法であって、
（ａ）　試料と試薬を結合条件下で接触させ、
ここで上記試薬は第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌクレオチドプローブを含み、上記第１および第２ポリヌクレオチドプローブはそれらが互いに結合する第１の位置をとることができ且つ上記プローブの少なくとも１つは上記プローブ鎖が上記標的ポリヌクレオチドと結合する第２の位置をとることができ、上記第１プローブおよび第２プローブはこれらのプローブの一方と会合した第１標識成分を含みおよび他方のプローブと会合した第２標識成分を含み、各プローブは複数の標識成分を有し、第１標識成分は上記プローブの一方の３’末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５’末端に存在し、上記第１および第２標識成分は上記第１および第２プローブが互いに結合するとき相互作用して上記２つの位置の一方にあるプローブに特徴的な検出しうる信号を発することができる；および
（ｂ）　上記試料中の標的の存在と関連がある信号の存在について上記試料を監視する；
の各工程を含み、
上記方法は４ピコモルの濃度で存在する標的ポリヌクレオチドを検出しうることを特徴とする方法。
２．第１標識成分は核酸のアミノアルキル誘導体により上記プローブと会合している、特許請求の範囲第１項記載の方法。
３．上記誘導体はアデニンのアミノアルキル誘導体を含む、特許請求の範囲第２項記載の方法。
４．上記誘導体はアデニンのアミノヘキシル誘導体を含む、特許請求の範囲第２項記載の方法。
５．上記誘導体は８−（６−アミノヘキシル）−アミノアデノシン−５’−モノホスフェートを含む、特許請求の範囲第２項記載の方法。
６．３’末端にある上記標識成分は核酸の蛍光性誘導体である、特許請求の範囲第１項記載の方法。
７．標識成分は１−Ｎ６−エテノアデノシン−５’−モノホスフェートの誘導体を含む、特許請求の範囲第６項記載の方法。
８．標的ポリヌクレオチドについて試料を検定するための試薬を含むキットであって、
上記試薬は第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌクレオチドプローブを含み、上記第１および第２プローブはそれらが互いに結合する第１の位置をとることができ且つ上記プローブの少なくとも１つは上記プローブ鎖が上記標的と結合する第２の位置をとることができ、上記第１プローブおよび第２プローブはこれらのプローブの一方と会合した第１標識成分および他方のプローブと会合した第２標識成分を含み、各プローブは複数の標識成分を有し、第１標識成分は上記プローブの一方の３’末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５’末端に存在し、上記第１および第２標識成分は上記第１および第２プローブが互いに結合するとき相互作用して、上記２つの位置の一方にあるプローブに特徴的な検出しうる信号を発することができ、上記キットは４ピコモルの濃度で存在する標的ポリヌクレオチドを検出しうることを特徴とするキット。
９．試料中のポリヌクレオチド標的について競合的均質検定を行うための装置であって、
試薬および試料を収容するのに適した容器手段、ここで上記試薬は第１プローブおよび第２プローブを含み、上記第１および第２プローブは第１プローブが第２プローブと結合する第１の位置およびこれらのプローブの少なくとも１つが上記標的と結合する第２の位置をとることができ、上記プローブは一方のプローブと会合した少なくとも１つの標識成分および他方のプローブと会合した第２標識成分を有し、各プローブは複数の標識成分を有し、第１標識成分は上記プローブの一方の３’末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５’末端に存在し、上記第１および第２標識成分は上記プローブが上記第１の位置にあるとき相互作用して、上記標識成分の一方の励起の際に上記位置の一方に特徴的な検出しうる信号を発することができる；
上記標識成分の一方を励起する手段；および
上記信号を検出する手段；
を含み、上記検定は４ピコモルの濃度で存在する標的ポリヌクレオチドを検出しうることを特徴とする装置。
１０．標識成分は蛍光団であり、標識成分の一方を励起する手段が光源を含む、特許請求の範囲第９項記載の装置。
１１．少なくとも１つの標識成分が化学発光剤であり、標識成分の一方を励起する手段が上記容器に化学発光補助因子を導入する手段を含む、特許請求の範囲第９項記載の装置。
１２．検出手段が光検出器を含む、特許請求の範囲第９項記載の装置。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
　本発明は標的分子の検出および定量分析において有用な方法、試薬、組成物、キットおよび器具に関する。特に本発明はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のハイブリダイゼーション検定を行うための方法、試薬、組成物およびキットに関する。
従来技術
　本発明は係属中の米国特許出願第７３８５６０号（１９８５年５月２８日付）および同第２８４４６９号（１９８１年７月２１日付）の一部継続出願であり、これらはここに参照により引用される。
　次の定義は本発明の理解を促すために与えられる。本明細書で用いる“生物学的結合対”という用語は、相互親和性または結合能を示す分子対を意味する。“リガンド”という用語は、本明細書において、生物学的結合対の一方の分子を意味し、そして“抗リガンド”または“受容体”は生物学的結合対の他方の分子を意味するだろう。例えば、限定するものでないが、本発明の実施態様は生物学的結合対が２つの相補的なポリ核酸鎖を含む核酸ハイブリダイゼーション検定に応用される。これらの核酸鎖の一方がリガンドと呼ばれ、他方が抗リガンドと呼ばれる。しかしながら、生物学的結合対は２，３の名を挙げるならば、抗原および抗体、薬物および薬物受容部位、ならび酵素および酵素基質を含む。
　“プローブ”という用語は標的リガンドと選択的に結合できる既知性状のリガンドを意味する。核酸に適用するとき、“プローブ”は標的核酸鎖に相補的な塩基配列を有する核酸鎖を意味する。
　“標識”という用語は例えば放射性同位体；酵素；発光剤または沈殿剤；および色素を含む検出可能な分子成分を意味する。“剤”という用語は検出可能な応答へ導く反応に関与する全ての分子成分を含めた広い意味で使用される。“補助因子”という用語はその剤との反応に関与する全ての分子成分を含めた広い意味で使用される。
　遺伝情報は生細胞中に存在する糸状のＤＮＡ分子に蓄えられている。ｉｖ　ｖｉｖｏにおいてＤＮＡ分子は二重らせんであり、二重らせんの各鎖はヌクレオチド鎖である。各ヌクレオチドは４種類の塩基：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）の一つによって特徴づけられる。塩基は官能基の向きにより一定の塩基対が互いに引きつけ合って水素結合により結合するという意味で相補的である。一方のＤＮＡ鎖のアデニンは他方の相補鎖のチミンと対合する。一方のＤＮＡ鎖のグアニンは他方の相補鎖のシトシンと対合する。ＲＮＡでは、チミン塩基がウラシル（Ｕ）で置き換えられ、ウラシルは相補鎖中のアデニンと対合する。
　生物の遺伝暗号は塩基対配列のＤＮＡ鎖により伝達される。ＤＮＡは共有結合されたデオキシリボヌクレオチド鎖から成り、ＲＮＡは共有結合されたリボヌクレオチド鎖から成る。それぞれの核酸は１つのヌクレオチドの糖の５’−ヒドロキシル基と隣接ヌクレオチドの糖の３’−ヒドロキシル基との間のホスホジエステル結合によって結合される。自然界に存在するＤＮＡまたはＲＮＡの各線状鎖は、遊離５’−ヒドロキシル基をもつ末端と遊離３’−ヒドロキシル基をもつ末端とを有する。ポリヌクレオチドの各末端はそれぞれの遊離ヒドロキシル基に関連づけてしばしば５’末端または３’末端と呼ばれている。自然界に存在するポリヌクレオチドはその５’末端にホスフェート基をもち得る。ＤＮＡおよびＲＮＡの相補鎖は、一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端と結合する逆平行複合体を形成する。
　核酸ハイブリダイゼーション検定は２本の核酸鎖がそれらの相補領域で対合する傾向に基づいている。現在、核酸ハイブリダイゼーション検定は主に完全なＤＮＡ分子中の、または核酸混合物中の、または核酸フラグメント混合物中の、特異なＤＮＡもしくはＲＮＡ塩基配列あるいは特定遺伝子を検出して同定するために使用されている。
　組織または培養物試料から抽出された全ＤＮＡまたはＲＮＡ中の特異なＤＮＡまたはＲＮＡ配列もしくは特定遺伝子の同定は、生理学的または病理学的症状の存在を示すかも知れない。特に、ヒトまたは動物組織から抽出された全ＤＮＡまたはＲＮＡ中の特異なＤＮＡまたはＲＮＡ配列もしくは特定遺伝子の同定は鎌状赤血球貧血、組織適合性、癌および前癌状態、または細菌やウイルス感染などの症状もしくは遺伝病の存在を示唆する。細菌培養物から抽出された全ＤＮＡまたはＲＮＡ中の特異なＤＮＡまたはＲＮＡ配列もしくは特定遺伝子の同定は抗生物質耐性、毒物、ウイルスまたはプラスミドに関連した状態の存在を示し、また細菌型の同定を可能にする。
　従って、核酸ハイブリダイゼーション検定は病気の診断および検出において大きな可能性を有している。さらに、その可能性は植物の病因や毒物産生菌を検出するために核酸ハイブリダイゼーション検定を使用する農業や食品加工の分野にも存在する。
　最も広く使用されているポリヌクレオチドハイブリダイゼーション検定法の１つは、サザンブロットフィルターハイブリダイゼーション法または単にサザン法として知られているものである（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３，１９７５を参照）。サザン法は標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を同定するために用いられる。この方法は一般に対象となる標的配列を保有する可能性がある生物から単離したＲＮＡまたはＤＮＡ試料を制限エンドヌクレアーゼで消化して、ＤＮＡフラグメントを形成することによって実施される。その後、ＤＮＡフラグメント試料はアガロースやポリアクリルアミドのようなゲルで電気泳動を行い、フラグメント試料を鎖長により分類する。各フラグメント群は標的配列の存在について試験される。ＤＮＡをニトロセルロースシートへ移行させるためにゲル内部で変性する。ＤＮＡフラグメント試料を含むゲルはニトロセルロースフィルターシートまたはジアゾ化紙（これにＤＮＡフラグメントが移行して結合または固定される）と接触させる。次いで、ＤＮＡフラグメント試料を含むニトロセルロースシートを約８５℃に加熱してＤＮＡを固定する。その後ニトロセルロースシートを変性した（一本鎖の）放射性標識ＤＮＡプローブを含む溶液で処理する。放射性標識プローブは標的配列に相補的な塩基配列と検出可能な放射性成分を有するＤＮＡ鎖を含む。
　プローブとＤＮＡフラグメントとのハイブリダイゼーションを行わせる。ハイブリダイゼーション工程の間に固定化ＤＮＡ試料と標識ＤＮＡプローブとを結合させて、再び二本鎖構造を形成させる。
　ハイブリダイゼーション法はきわめて特異的である。標識プローブはもしも２つのＤＮＡ種が実質的に相補的な塩基対機構を共有しないならばＤＮＡ試料と結合しないであろう。ハイブリダイゼーションは所定の条件に応じて３〜４８時間を要する。
　続いてハイブリダイズしなかったプローブを洗い落とす。次に、ニトロセルロースシートをＸ線フイルムのシート上にのせて感光させる。Ｘ線フイルムは感光面を現像して、ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたＤＮＡフラグメント（従って対象とする塩基対配列を含む）を同定する。
　核酸ハイブリダイゼーション検定の使用は、Ｘ線フィルム上にバンドを視覚化するための長い感光時間によって幾分か妨げられている。一般的なサザン法は感光のために１〜７日間を要する。さらに、この技法の多くは標識剤として放射性同位体を必要とする。放射性標識剤を使用するには特別の実験手段とライセンスが必要である。
　放射線標識を使用する検定法に関係した上記の諸問題は、発光分子のような非放射性標識を使用する免疫検定法の開発へと導いた。一般的にはスミス（Ｓｍｉｔｈ）らの
Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８
　非放射性エネルギー源によって励起される標識を使用する発光検定法は、放射性標識を使用する検定法に伴う健康上の危険性やライセンスの問題を回避するこができる。さらに、発光標識の使用は、標識プローブが検定試薬と結合したときに結合しなかったときとは異なる発光特性を示し、その結果結合した標識プローブと結合しなかった標識プローブとを分離する必要がないという点で“均質な”検定法の開発を可能にする。沈殿、酵素、発光標識成分を使用する非放射性核酸型検定は信頼できるとみなすに足る感度または特異性を与えていない。
　発光検定法では、生物学的試料中のタンパク質や他の分子の存在が励起光線の散乱（“レイリー散乱”）を引き起こし、その結果励起光線の波長の約５０ｍｍ以内の波長で光を発する発光標識との干渉が生じる。内因性の化合物はまた散乱分子に特徴的な比較的長い波長で励起光線を散乱させ（“ラマン散乱”）、また発光標識の発光スペクトル中の光線を吸収し、その結果発光プローブの消光をもたらす。
　不均質な発光検定法の感度を改善する試みはいわゆる“時間分解（ｔｉｍｅ　ｒｅｓｏｌｖｅｄ）”検定法の開発へと導いた。ソニ（Ｓｏｎｉ）らの
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２９／１
　プローブまたは試料ＤＮＡの分離や固定化を必要とするこの技法は非放射性検定の操作を煩雑にしている。発光標識成分の発光は固体支持体によって低下される。支持物質はバックグラウンド蛍光源であり得、また発生光線を反射もしくは散乱させて検定を妨害する。ハイブリダイゼーション工程に要する時間は、相補的ＤＮＡ鎖が相補的対合関係にあるＤＮＡ鎖対の一方の固定化により完全に遊離状態でない場合に増大する。標識プローブの固体支持体への非特異的結合も検定の精度を低下させる。
発明の要約
　本発明の目的は、対象とする標的ポリヌクレオチド鎖の検定を行うための方法、試薬、組成物、キットおよび器具を提供することである。その他の目的は以後に示すであろう。
　要約すると、本発明の実施態様は生物学的結合対の構成員である標的分子について試料を検定する方法を包含する。本方法は試料とプローブ（プローブリガンドおよびプローブ抗リガンドを含む）含有試薬とを結合条件下で接触させることを含む。プローブリガンドおよびプローブ抗リガンドは互いに対して第１の結合位置をとることができ、プローブ構成員の少なくとも一方は標的分子に対して第２の結合位置をとることができる。プローブ構成員はプローブリガンド上に位置する第１標識成分およびプローブ抗リガンド上に位置する第２標識成分を含む。第１および第２標識成分はプローブリガンドおよび抗リガンドが第１結合位置で存在するとき相互作用して、２つの位置の一方にある試薬リガンドおよび抗リガンドに特徴的な検出しうる信号を発することができる。試料は標的分子の存在と関連した信号の存在について監視される。
　本発明の実施態様はさらに標的ポリヌクレオチド鎖について試料を検定する方法を包含する。本方法は試料と試薬（第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌクレオチドプローブを含む）とを結合条件下で接触させることを含む。第１および第２プローブはプローブ同士が互いに結合する位置をとることができ、プローブの少なくとも一方はそのプローブが標的ポリヌクレオチド鎖と結合する第２位置をとることができる。第１および第２プローブは一方のプローブに位置する第１標識成分及び他方のプローブに位置する第２標識成分を含む。第１および第２標識成分は第１および第２プローブが互いに結合したとき相互作用して、２つの位置の一方にある試薬鎖に特徴的な検出しうる信号を発することができる。試薬と接触させた試料は、試料中に標的ポリヌクレオチド鎖が存在することと関連する信号の存在について監視する。本方法は固定化工程を必要とせずに、また放射性標識技術を使用せずにポリヌクレオチド試料を検定することができる。
　好ましくは、少なくとも１つの標識成分は一方のプローブの３’末端に存在し、そして第２標識成分は他方のプローブの５’末端に存在する。各プローブに対して複数の標識成分を使用することができ、好ましくは２つの標識成分（各末端に１つずつ）を使用する。例えば、第１標識成分は３’位置で第１プローブと結合し、第２標識成分は５’位置で結合する。類似の標識成分の構成（すなわち３’位置に第１標識成分および５’位置に第２標識成分）をもう第２プローブは、相対するプローブの第１および第２標識成分がきわめて接近して相互作用することができるように、第１プローブとハイブリダイズするであろう。
　本発明方法の実施態様は、増幅手段中に標的配列と実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドセグメントをスプライシングして、試薬ポリヌクレオチドセグメントの多数のコピーを形成させることによる追加のプローブ作製工程を含む。好適には、増幅手段は細菌中に組み込んだときに増殖する高いコピー数のプラスミドまたはファージである。標的配列と実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドセグメントは細胞成分、および望ましくない細菌、プラスミドまたはファージＤＮＡから単離し、制限消化してセグメントとなす。その後、セグメントは標識成分を付加してプローブを作製するために利用される。
　さらに、各プラスミドまたはファージ誘導セクションは制限酵素で消化して、標識成分を一まとめにして結合できる多数のサブセクションとする。各サブセクションは標的鎖の代表的部分とハイブリダイズすることができるであろう。プラスミドまたはファージ源由来の多数の試薬プローブはより優れた信号発生能をもたらし、効率よくかつ比較的安価にプローブを提供するであろう。
　本発明の実施態様はさらに、ＤＮＡ鎖の３’末端を非放射性標識するための方法およびその結果得られる組成物を包含する。その組成物は核酸のアミノアルキル誘導体を有するＤＮＡ鎖を含む。核酸のアミノ基はアミン反応性標識成分と反応することができる。好ましくは、そのアミノアルキル誘導体は脂肪族の第１アミノ基を含む。より詳細には、好適なアミノアルキル誘導体は酵素ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によって試薬鎖に結合し得るアミノヘキシルアミノアデノシン三リン酸のようなリボ核酸誘導体を含む。
　ターミナルトランスフェラーゼは一本鎖ＤＮＡの末端に１つまたは２つのリボ核酸誘導体を付加して、それにより信号強度を標準化するために大きさによって分類しなければならず且つ立体効果に寄与しうるデオキシ誘導体の尾部に本来備わっている諸問題を取り除くであろう。尾部上の標識はエネルギー転移のための適当な立体関係または衝突の相互作用をもはやもたない。しかしながら、尾部は尾部上の標識成分が“サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）”である場合に良好であり、例えば多くの消光剤は消光剤のより大きな局部濃度ゆえにより大きな消光活性をもたらし、しかも消光剤が非蛍光性である場合には増大したバックグラウンドを示さない。
　本発明の実施態様はさらに、生物学的結合対の一部である標的分子の検定を行うためのキットを包含する。標的分子が特定の塩基配列を有する核酸のセグメントである場合に、キットは第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌクレオチドプローブを含む試薬を包含する。第１および第２プローブはそれらが結合条件下で互いに結合する第１の位置をとることができ、これらのプローブの少なくとも一方はそのプローブが標的と結合する第２の位置をとることができる。第１および第２プローブは一方のプローブと結合した少なくとも１つの標識成分および他方のプローブと結合した第２標識成分を有する。第１および第２標識成分は第１および第２プローブが第１位置にあるとき相互作用して、２つの位置の一方にあるプローブに特徴的な検出しうる信号を発することができる。
　本発明の実施態様はさらに、本方法に従って検定を行うための器具を包含する。標的がポリヌクレオチドセグメントである場合、その器具は試薬と標的を実質的に混合した均質状態で収容するのに適した反応室を含む。試薬は第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌクレオチドプローブを含有する。第１および第２プローブはそれらが結合条件下で互いに結合する第１の位置をとることができ、これらのプローブの少なくとも一方はそのプローブが標的と結合する第２の位置をとることができる。第１および第２プローブはこれらのプローブの一方と結合した少なくとも１つの標識成分および他方のプローブと結合した第２標識成分を有する。第１および第２標識成分は第１および第２プローブが第１位置にあるとき相互作用して、２つの位置の一方に特徴的な検出しうる信号を発することができる。器具はさらに信号を検出するための適当な検出手段（例えば発光剤の場合には光電増倍管）を含む。
　蛍光検定において使用するのに適した本器具の態様は適当な標識励起手段（適切な波長を定めるフイルターを備えたレーザーまたは光−放射装置、または化学発光剤や酵素剤の場合には補助因子を注入するための注入装置など）を含む。
　好適な器具は光を反応室ヘパルス化し、エネルギー転移により生じた蛍光の放出を選択的に読み取ってバックグラウンド蛍光を減らすための時間分解制御（ｔｉｍｅ　ｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ）を含むであろう。
好適な実施態様の説明
　今や本発明の好適な態様を模式図によって示す図面を参照すると、特に第１図では、必要な試薬組成物と共に、標的ポリヌクレオチド鎖の検定方法が模式的に示されている。慣用の検定法において、１つ以上の標的鎖および１つ以上のプローブ鎖を用いて検定が行われる。しかしながら、単純化して本発明をより理解しやすくするために、図面では単一の試薬セグメントと単一の標的セグメントのみを示す。
　第１図はハイブリダイズした又は相互に結合した第１位置にある第１および第２ポリヌクレオチド鎖プローブ（それぞれＰ１およびＰ２）を示す。また、対象とする２つの相補的な標的鎖から成る二本鎖ＤＮＡ（それぞれＴ１およびＴ２）を示す。第１プローブ（Ｐ１）は各末端に２つの標識成分（Ａ１およびＤ１）を含む。第１標識成分（Ａ１）は第１プローブ（Ｐ１）の５’末端に共有結合されており、そして第２標識成分（Ｄ１）は第１プローブの３’末端に共有結合されている。同様に、別の第１標識成分（Ａ２）が第２プローブ（Ｐ２）の５’末端に共有結合されており、そして別の第２標識成分（Ｄ２）が第２プローブの３’末端に共有結合されている。相対するプローブの第１および第２標識成分（Ａ１とＤ２）および（Ａ２とＤ１）は第１および第２プローブが相互に結合した第１の位置にあるとき相互作用することができる。
　当分野で通常の知識を有する者は、標識成分が共有結合以外の方法、例えば限定するものではないが挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）、キレート化、およびイオン的、親水的または疎水的親和性によりＤＮＡプローブと結合または会合しうることを認めるであろう。本明細書で使用する“会合”という用語は標識成分をプローブに結合させる全ての手段を包含する。
　本発明の標識成分はそれらを相互作用させる方法で対合または集合される。例えば、限定するものではないが、標識群は第１および第２蛍光団を含む標識成分の組合せ、蛍光団および化学発光成分の組合せ、化学発光成分および補助因子の組合せ、沈殿剤および可溶化剤の組合せ、酵素および基質の組合せ、ならびに比色定量成分および補助因子の組合せであり得る。
　第１図において、第１標識成分は特定波長（ｈｖ１）のエネルギーまたは光を受信し且つ第２波長（ｈｖ２）でエネルギーまたは光を発信し得る蛍光団（Ａ１およびＡ２）である。同様に、第２標識成分は特定波長（ｈｖ３）のエネルギーまたは光を受信し且つ第２波長（ｈｖ１）でエネルギーを発信もしくは転移し得る蛍光団（Ｄ１およびＤ２）である。相対するプローブの第１および第２蛍光団（Ａ１とＤ２）および（Ａ２とＤ１）は、第１および第２プローブが相互に結合した第１の位置にあるとき相互作用することができ、こうして第２蛍光団から放射される光は消去される。さらに、通常第１蛍光団（Ａ１およびＡ２）が受信できない波長ｈｖ３の光は相互作用により波長ｈｖ２の発光をもたらす。
　第１図に示すように、プローブ（Ｐ１およびＰ２）は標的鎖（Ｔ１およびＴ２）に加えるかまたは組み合わされる。プローブおよび標的鎖は変性して分離される。次に、プローブと標的をハイブリダイズさせ、さらにプロ」ブが標的と結合してプローブ−標的ハイブリッド（ＰＴ１およびＰＴ２）を形成する第２位置へ結合させる。各プローブ鎖の標識成分は相対するプローブ鎖の標識成分から分離されて相互作用することができない。
　プローブ鎖（Ｐ１およびＰ２）が相互に結合した第１の位置では、第２蛍光団（Ｄ１およびＤ２）を励起するのに適した波長（ｈｖ３）の光エネルギーの放射が、初期励起波長（ｈｖ３）または第２蛍光団（Ｄ１およびＤ２）の通常の放出波長（ｈｖ１）とは異なる波長（ｈｖ２）の光エネルギーを第１蛍光団（Ａ１およびＡ２）から放出させる。プローブ（Ｐ１およびＰ２）と標的（Ｔ１およびＴ２）との第２位置へのハイブリダイゼーションは、相対するプローブ鎖（Ａ１とＤ２；およびＡ２とＤ１）の標識成分同士の相互作用の分裂をもたらし、そして第１蛍光団（Ａ１およびＡ２）の放出波長（ｈｖ２）での光の放出を減少させる。第１標識成分、すなわち蛍光団（Ａ１およびＡ２）、の放出波長（ｈｖ２）の光の放出減少は存在する標的の濃度と逆の関係にある。
　第２蛍光団（Ｄ１およびＤ２）の発光は通常第１蛍光団（Ａ１およびＡ２）の存在下で消滅され、その結果放出波長（ｈｖ１）の光エネルギーはほとんど放出されないか又は全く検出されない。しかしながら、プローブ鎖（Ｐ１およびＰ２）と標的鎖（Ｔ１およびＴ２）がハイブリダイズしてプローブ標的ハイブリッド（ＰＴ１およびＰＴ２）を形成すると、相対するプローブ鎖（Ａ１とＤ２；およびＡ２とＤ１）の標識成分同士の相互作用がこわされて、第２蛍光団（Ｄ１およびＤ２）から波長（ｈｖ１）の検出可能な光エネルギーが放出され、これは標的（Ｔ１およびＴ２）と結合した第２位置をとるプローブ（Ｐ１およびＰ２）に特徴的である。第２標識成分、すなわち蛍光団（Ｄ１およびＤ２）、の放出波長（ｈｖ１）の光の放出増加は標的鎖の濃度と関係がある。
　２つの波長（ｈｖ１）および（ｈｖ２）での第１および第２標識成分、すなわち蛍光団（Ａ１とＡ２；およびＤ１とＤ２）、の発光値は分析的に組み合わされていずれか一方の値のみよりも優れた感度および精度の標的鎖の濃度に関する合計値を与えることができる。どちらの信号も標的鎖（Ｔ１およびＴ２）の存在について監視される。
　第１および第２蛍光団の選択、光散乱、二次蛍光、および光を蛍光団に放射する励起装置または発光装置の制限により、多重信号特にプローブ（Ｐ１およびＰ２）が互いに結合した位置にあるときの第１蛍光団（Ａ１およびＡ２）の信号を検出することは難しいかも知れない。さらに、光放出波長（ｈｖ２）は第２蛍光団（Ｄ１およびＤ２）の相互作用により必ずしも第１蛍光団（Ａ１およびＡ２）の通常の放出波長ではない。光放出（ｈｖ２）は第１蛍光団（Ａ１およびＡ２）または第２蛍光団（Ｄ１およびＤ２）単独とは全く異なる組合せもしくは群としての標識成分に特徴的であり、あるいは消光されるかも知れない。
　変性および再アニーリング後に、相対するプローブの標識成分、すなわち第１および第２蛍光団（ＡおよびＤ）は分離され、そして標的−プローブハイブリッド（ＰＴ１およびＰＴ２）の形成により離れた状態にある。標的−プローブハイブリッド（ＰＴ１およびＰＴ２）の形成は、第１標識成分の蛍光団（Ａ１およびＡ２）が第２蛍光団（Ｄ１およびＤ２）からのエネルギーを受け入れる又は消す能力を破壊する。エネルギーを受け入れる第１蛍光団ヘエネルギーを送る第２蛍光団（Ｄ１およびＤ２）の信号発生能は、一般に検出するのが比較的簡単である。第２蛍光団（Ｄ１およびＤ２）の信号強度の増加は試料中の標的の濃度および存在を示す尺度である。特定試料中の標的の量が多くなればなるほど、第２蛍光団の放出波長（ｈｖ１）の信号強度は大きくなる。
　本方法は第２図に示す装置を用いて実施される。この装置は次の主な手段：すなわち励起手段または光源、収納容器およびフオトンカウンター（ＰＣ）の形の信号検出器を含む。
　収納容器は標的ポリヌクレオチドを含む可能性がある試料と試薬を収容するのに適している。必要ならば、試料は当分野で知られた標的捕獲／放出技法により標的ポリヌクレオチド以外の全ての細胞成分を除くために処理される。試料中のタンパク質系物質を溶解するためにはカオトロピック塩が使用される。
　試料は第１プローブおよび第２プローブを含む試薬と混合される。第１および第２プローブはこれらのプローブが互いに結合する第１の位置、およびこれらのプローブの少なくとも一方が標的と結合しうる第２の位置をとることができる。各プローブはそれと会合した第１および第２標識成分（例えば蛍光団）を含み、第１および第２標識成分はプローブが互いに結合した第１位置にあるとき相互作用する。試薬はハイブリダイゼーションを促進する当分野で知られた促進剤を含んでいてもよい。
　自動分析用に設計された器具において、第２図に示す装置は好ましくは複数の収納容器を収めるための手段を含むであろう。試料を含む収納器は順次分析される。試料の精製、加熱、混合および再アニーリングは標識信号が測定されるステーションから離れたステーションで行うのが好ましい。従って、収納容器は試料の精製、加熱および混合を行う第１ステーションまたは一連のステーションから、プローブおよび標的（存在するならば）を再アニーリングさせる第２ステーションへ運ばれる。その後、収納容器は標識信号を監視する第３ステーションへ送られる。
　運搬手段は回転可能なターンテーブル、コンベヤーベルトまたは他の手段を含む。病院の臨床設定においては、運搬手段は手動による移動を含む。従って、病院の医員は患者から組織試料を採取し、その試料を収納容器の中に入れることができる。試料の精製、加熱および試薬の混合はベッドサイドで開始され、そして収納容器を信号監視用の第３ステーションに移しながら継続されるだろう。
　今や第１ステーションを参照すると、試料とプローブを融解温度に加熱するための加熱手段が収納容器にきわめて接近して配置されている。標的およびプローブはプローブ同士が互いに結合する第１の位置、または標的が存在する場合に少なくとも１つのプローブがその後の冷却の際に標的と結合する第２の位置のいずれかをとることができる。加熱手段は化学熱源、電気熱源または当分野で知られた他の熱源を含めた多くの形をとることができる。収納容器は試料とプローブの混合を促すために撹拌手段を含む。
　第１ステーションから、プローブと標的（もし存在するならば）を再アニーリングさせる第２ステーションへ収納容器を運ぶ。融解または変性温度からの収納容器の冷却を促進するために、第２ステーションは冷却手段を含む。冷却手段はもしも十分な時間が許されるならば必要でなく、プローブと標的を再アニーリングさせるためには周囲温度でも十分に低い。
　第２ステーションを去って、収納容器は信号（２つの位置の一方をとるプローブに特徴的である）を監視する第３ステーションへ送られる。
　第３ステーションは標識成分の１つを励起する手段を含む。第１および第２標識成分が蛍光団であるこの例では、励起手段は第２蛍光団の実質的励起を生じさせないように適当なフィルターを備えた光源を含む。また、適当に狭い発光スペクトルをもつレーザーも使用し得る。
　標識成分の１つが化学発光剤を含む場合、その励起手段は発光反応を生じさせるための適当な補助因子を収納容器の中に注入する手段を含むであろう。
　第３の作業ステーションは収納容器からの蛍光を受けるべく配置された信号検出器、フオトンカウンター（ＰＣ）を含む。好ましくは２つのフオトンカウンター（ＰＣ）を使用する。１つのフオトンカウンターは第１標識成分から発せられる信号を受信し、そして第２のフオトンカウンターはフィルターまたは時間分解法の使用により第２標識成分から発せられる信号を受信する。
　フオトンカウンターはアナライザーによって受信され、増幅され、処理されるフオトン信号を発する。アナライザーはその結果をオペレーターに送る他の装置に表示させるように、フオトン信号を処理して図式的に示すことができる値に変える。
　本装置はパルス化光源またはシヌソイド変調光源と共にアナログデフェクターを使用することにより、寿命分解法に適合させることができる。寿命分解法は本発明者の係属中の米国特許出願第７３８５６０号（１９８５年５月２８日付）に説明されており、これは参照によりここに引用される。
　本発明は合成オリゴヌクレオチドと共に使用するのに都合がよい。しかしながら、本発明は経済的な方法でプローブ（Ｐ１およびＰ２）を作製する生物学的クローニング法に容易に適合させることができる。
　今や第３図を参照すると、標的配列に相補的であることが知られている塩基配列を含むＤＮＡの二本鎖セグメント（以後プローブセグメントと呼ぶ）が慣用組換えＤＮＡ法によりプラスミドの中に導入される。例えば、プラスミドはプラスミド環を開裂して一本鎖の突出部または接着末端を生じさせる制限エンドヌクレアーゼで消化する。その接着末端はプローブセグメントの接着末端に相補的であって、それと結合する。プローブセグメントはその後のクローンの同定のための選択マーカーと共に挿入される。
　プラスミドはその後プラスミドが複製または増幅される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）のような細菌の中に挿入される。細菌はプローブセグメントと選択マーカーを首尾よく組み込んだ細菌以外の細菌に対して有毒である培地上でコロニーへと増殖させる。
　細菌コロニーを増殖させてプラスミドを高コピー数へと複製させた後、細菌ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡは他の細菌成分から分離し、そのＤＮＡを制限酵素で消化してプラスミドＤＮＡからプローブセグメントを切断する。次いで、プローブセグメントは電気泳動を含めた適当な手段で単離する。そのプローブセグメントは末端標識化してプローブを作製するのに適しているか、あるいはプローブとして価値があるサブセクションから成っている。従って、大きいプローブセグメントは制限酵素による消化を数回行って、大きいプローブセグメントを小さいプローブサブセグメント（その３’−および５’−末端を標識化するのに適している）に切断しうる。
　プローブセグメントまたはサブセグメントの３’末端の標識化は、活性化蛍光団との反応に利用し得る官能基をもつヌクレオチドの使用により達成される。官能基をもつヌクレオチドはターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の使用によりプローブセグメントに付加される。酵素ＴｄＴはリボヌクレオチドの１個または２個の塩基をプローブセグメントに付加させるだけであり、従ってプローブセグメントヘのヌクレオチドの尾部または伸長鎖の付加が回避されるだろう。ヌクレオチドの大きい尾部または伸長鎖は、標識成分間のエネルギー転移を変え、またプローブ鎖の標的鎖へのハイブリダイゼーションを変更もしくは損なう恐れのある立体効果を有するだろう。プローブセグメントの５’末端の標識化は、二官能性脂肪族基を使用してプローブセグメントに標識成分を結合させることにより達成される。好ましくは標識成分は脂肪族ジアミンによってプローブセグメントに結合される。
　初めに一本鎖ＤＮＡの３’末端の標識化について見ると、酵素ＴｄＴの使用によりヌクレオチドをＤＮＡ鎖に付加させる反応は次のように表わされる。
上記反応式において、ｐ（ｄｘ）ｍは長さがｍ個の塩基のオリゴデオキシヌクレオチドであり、Ｎはアデニン、グアニン、シチジン、ウリジン、チミンまたはその修飾体のうちの１つである。ｎはＤＮＡ鎖に付加される単量体の数を表わす。
　好ましくは単量体は核酸のアミノアルキル誘導体を含むだろう。アミノ基は多数の蛍光剤と反応することができる。より好ましくは、アミノアルキル誘導体は第一脂肪族アミノ基を含む。酵素ＴｄＴおよびポリヌクレオチド単量体の使用は、ＤＮＡ鎖への単量体塩基の付加を１個または２個の塩基に制限する。Ｍ２＋は金属イオン補助因子を表わす。好適なポリヌクレオチド誘導体の例は８−（６−アミノヘキシル）−アミノアデノシン−５’−三リン酸（ＡＨＡ−ＡＴＰ）であり、その構造を以下に示す。
　化合物ＡＨＡ−ＡＴＰは多種多様の蛍光標識の付加を可能にする種々の化学反応を受けることができる第一脂肪族アミノ基を含有する。
　従って、ＤＮＡ鎖の３’末端はＡＨＡ−ＡＴＰおよびターミナルトランスフェラーゼとｐＨ７において反応し、その反応は次のように表わされる。
　得られる生成物鎖は沈殿剤または可溶化剤、比色定量剤、発光剤、酵素または補助因子のような標識成分と反応し得るアミン官能基を含み、それにより標識成分をもつプローブを製造することができる。例えば、蛍光団イソチオシアネートはｐＨ９．３でＡＨＡ−ＡＴＰのアミン官能基と反応してプローブ鎖を形成する。その他のアミン反応性蛍光団には例えばフルオレセインイソチオシアネート、スルホローダミン１０１スルホン酸クロリド（テキサスレッド）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルピレンブタノエート、エオシンイソチオシアネートおよびエリトロシンイソチオシアネートが含まれるが、これらに限定されない。適当な化学発光剤および補助因子にはアミン反応性ルミノール誘導体、ミクロペルオキシダーゼ、アクリジニウムエステル、ペルオキシダーゼおよびそれらの誘導体が含まれる。当分野で通常の知識を有する者は、アミン反応性でない蛍光剤および化学発光剤をアミン反応性へと修飾して、本発明の標識成分として適するものにすることができることを認めるであろう。
　ＤＮＡ鎖はまたそれらの３’末端に１−Ｎ６−エテノアデノシン−５’−三リン酸（ＥＡＴＰ）のような蛍光ヌクレオチド誘導体をターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の媒介により付加して標識化することができる。しかしながらＤＮＡへのデオキシヌクレオチドの付加は標準化するのが困難であり且つ立体効果を生じやすい多くの付加を含む尾部または伸長鎖をもたらすかも知れない。他の蛍光ヌクレオチド誘導には例えば３’−（ジメチルアミノナフトイル）−ＡＴＰまたは−ＣＴＰおよび／または蛍光性複素環を含むヌクレオチド三リン酸が含まれる。
　一本鎖ＤＮＡの５’末端はそのＤＮＡ鎖の５’−リン酸を活性化蛍光団に結合させるエチレンジアミンを使用することによる２段階反応で標識化され、この反応は次のように表わされる。
　合成ポリヌクレオチドは５’−ヒドロキシル基をリン酸化するための追加工程を必要とするだろう。リン酸化は工程（Ｉ）に先立って酵素Ｔ４キナーゼを用いて行われる。
　好ましくは、カルボジイミドは水溶性であり、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミドメト−ｐ−トルエン−サルフェートおよびそれらの誘導体を含む。
　エチレンジアミンポリヌクレオチド誘導体は標識成分と反応することができる（工程ＩＩ）反応性アミン官能基を有する。反応性アミン官能基はｐＨ９．３でイソチオシアネートと反応してプローブ鎖を形成するだろう。一方の末端標識（例えば５’末端標識）のための適当な標識成分は、他方の末端標識（３’末端標識）成分を補足するように選択される。適当な蛍光団には例えばフルオレセインイソチオシアネート、スルホローダミン１０１スルホン酸クロリド（テキサスレッド）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルピレンブタノエート、エオシンイソチオシアネート、エリトロシンイソチオシアネートおよびそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。適当な化学発光剤および補助因子にはルミノール、ミクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アクリジニウムエステル、ルシゲニンおよびそれらの誘導体が含まれる。
　今や第４図を参照すると、一本鎖ＤＮＡに関して説明された標識化法は、生物学的源から単離された二本鎖ＤＮＡセグメントにも応用できる。こうして、図示するように、細菌プラスミドから単離された代表的ＤＮＡセグメントは２本の相補的なＤＮＡ鎖（各ＤＮＡ鎖は３’ヒドロキシル基と５’−リン酸基を有する）から成る。二本鎖ＤＮＡセグメントはエチレンジアミンおよび活性化蛍光団と反応させて、両方のＤＮＡ鎖の５’−リン酸位置に第１蛍光団（Ａ）を同時に共有結合させることができる。
　次に、二本鎖ＤＮＡセグメントはＴｄＴの媒介によりＡＨＡ−ＡＴＰと反応させ、そして各ＤＮＡ鎖の３’−位置に第２蛍光団（Ｄ）を共有結合させる。従って、一方のプローブ鎖の第１蛍光団（Ａ）はＤＮＡセグメントの両末端で他方のプローブ鎖の第２蛍光団（Ｄ）と相互作用するように位置づけられる。標識成分の第１蛍光団（Ａ）および第２蛍光団（Ｄ）は相互作用して、プローブが標的とのハイブリダイゼーションの際にとりうる２つの位置の一方に特徴的な信号を発することができる。
　本発明は好適な実施態様の特徴を示す次の実施例によりさらに説明される。
実施例
Ａ．物質および方法
　次の実施例において、１−Ｎ６−エテノアデノシンー５’−三リン酸（ナトリウム塩）、２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸（チトリウム塩）、ＤＮＡオリゴマー、およびセルロースに固定されたオリゴマーはニュージャージー州ピスカタウエーのファーマシア・バイオケミカルズ社から購入した。制限酵素はメリーランド州ガイサースバーグのベセスダリサーチ研究所から購入した。低分子量形のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ＴｄＴ）はフロリダ州セントピータースバーグのライフサイエンス社から購入した。８−（６−アミノヘキシル）−アミノアデノシン−５’−三リン酸（ＡＨＡ−ＡＴＰ）はミズーリ州セントルイスのシグマケミカルズ社から購入した。プラスミドｐＳＰ６５はウイスコンシン州マジソンのプロメガ・バイオテクから購入した。アミン反応性蛍光団はオレゴン州ジャンクションシティーのモレキュラープローブズ社から購入した。他の全ての試薬は分析級またはそれ以上のものであった。合成ＤＮＡオリゴマーはいくつかの市販源（カリフォルニア州エメリービルのアメリカン・バイオヌクレアーを含む）からの試薬類および標準ホスホルアマダイト法を用いてバイオサーチ・サム・ワン自動ＤＮＡ合成機（カリフォルニア州サンラフアエル）で製造した。
　本実施例において、ＴｄＴ反応緩衝液（２Ｘ）はｐＨ７．１で０．４Ｍカコジル酸、０．００２Ｍジチオトレイトール、０．０１６Ｍ塩化マグネシウムを含む。結合緩衝液はｐＨ７．５で１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸カリウム、一塩基性（ＫＨ２ＰＯ４）を含む。ホウ酸緩衝液は０．０５Ｍホウ酸を含むか、あるいは塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ９．３に調整した０．０５Ｍホウ酸ナトリウム溶液を含む。吸光度測定はＤＮＡプローブの組成、ＤＮＡおよびＤＮＡプローブの濃度、ならびにＤＮＡ融解実験（融解曲線）における塩基対合度を測定するために行われた。吸光スペクトルはキャリー１７Ｄ吸光度分光光度計（カリフォルニア州パロアルタのバリアンアソシエーツ社）を使って記録した。温度の関数としてＤＮＡの吸光度の変化を測定するために、サーモスタット付きのキュベットホルダーの温度をハークモデルＡ８１冷却水浴（ニュージャージー州、サドル・ブロック）を用いて制御した。ホモポリマー濃度の測定において使用した吸光係数は、ファーマシア・モレキュラー・バイオロジカルズのカタログの付録に載っている吸光係数編集物から得た。同じ付録に載っているホモポリマーおよび交互ホモポリマーＤＮＡの吸光係数の平均は混合塩基配列の吸光係数を概算するために使用され、一本鎖ＤＮＡについては８．７×１０３ｌ／ｍｏｌ／塩基および二本鎖ＤＮＡについては６．８×１０３／ｍｏｌ／塩基であった。非結合蛍光団の吸光係数は複合ＤＮＡプローブ中に存在する蛍光団の量を測定するために使用した。
　蛍光スペクトルはＳＬＭモデル４８００アナログ分光蛍光計（イリノイ州アーバナ、ＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯインスツルメンツ社）を使って測定および記録した。より優れた感度を得るために、アナログ分光蛍光計は蛍光のフオトン計数検出を行うように改良した。この改良は通常の検出器の代わりに、周囲温度ハウジング内にハママツモデルＲ９２８光電増倍管を、そして−３０℃付近に保たれた熱電冷却ハウジング（リサーチモデルＴＥ−１７７ＲＦ用の製品）内に同じ型の光電増倍管を含んでいた。管のアノードの電流パルスが増幅され、調整され、そしてＥＧ＆Ｇ　ＯＲＴＥＣヌクレアー・インスツルメンテーション・モジュールを使って計測された。このモジュールはモデル９３０１ファースト前置増幅器、モデル９３０２増幅器−弁別器、およびモデル８７４クワドカウンター／タイマーを含んでいた。光電増幅管のダイノード・チェイン（Ｄｙｎｏｄｅ　ｃｈａｉｎ）のための高電圧はＥＧ＆Ｇ　ＯＲＴＥＣモデル４７８電力供給器によって供給した。
　カウンターモジュールはヒューレット・パッカード９８２５コンピュータにＩＥＥＥ−４８８インタフェースを介して接続した。コンピュータおよびインタフェースは蛍光光度計の非改良部分の基準検出器測定およびモノクロメーター走査と同調させてフオトン計測スペクトルを得られるようにした。
　温度制御はハークモデルＡ８１水浴と接続したＳＬＭサーモスタット付きキュベットホルダーを用いて維持した。
　走査しない場合、試料の発光は一般にモノクロメーターの代わりにフィルターを使用した蛍光光度計の第２開口部を通して測定された。フルオレセイン標識ＤＮＡを含む試料からの発光は、５２０ｎｍ（ＦＷＨＭ＝８．２ｎｍ）に集中したピーク透過率をもつデイトリック・オプチックス３キャビティ干渉フィルターを通して濾光した。フルオレセイン試料は２ｎｍに設定されたモノクロメーター帯域幅で４９０ｎｍにおいて励起させた。時間の関数としてのフルオレセイン発光は、データ蓄積および運動学的情報の処理が可能なヒューレット・パッカードモデル９８３６コンピュータにインタフェースで接続されたカウンターモジュールを使って記録した。
　いろいろな公知のハイブリダイゼーション条件が本方法において使用された。ハイブリダイゼーション条件のための一般基準はメインコス（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ）およびワール（Ｗａｈｌ），Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１３８，Ｐ．２６７‐２８４（１９８４）に開示されている。
　当分野で通常の知識を有する者は必要に応じて次の条件を使用するであろう。ハイブリダイゼーションの最適速度は一般に融解転移温度より約２０°〜２５℃低い温度で得られる。より高いストリンジェンシー（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）のためには、ハイブリダイゼーションは融解温度の５°または１０℃以内の温度で行われる。ラムダＤＮＡの形のキャリアーＤＮＡの添加は、低濃度でプローブの安定性を高めることが判明した。いくつかの場合には、ＤＮＡの安定性を改善するためにＥＤＴＡも加えられた。濃縮剤や促進剤のような他の添加剤は、これらがプローブの作製に使用されるサイズオリゴマー（ｓｉｚｅ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ）に効果的であり且つこれらの添加によって蛍光バックグラウンドが非常に増加しない限り、ハイブリダイゼーション溶液中で使用することができる。
　実験で使用する一般方法は、まず初めに標的とプローブＤＮＡを一本鎖の形にする第１工程を含む。これは標的および試料ＤＮＡを含む試料を水浴中で加熱することにより達成された。長いＤＮＡ標的の場合は、一般に試料は沸騰水浴中で低塩緩衝液（または蒸留水）中約１０分間加熱される。プローブは高温度への長期暴露を避けるために、しばしばデハイブリダイゼーション法の終り付近で標的ＤＮＡ含有試料に加えられた。デハイブリダイゼーションの最後に、ハイブリダイゼーションのための塩および緩衝剤の所望濃度を達成すべく、濃厚塩緩衝液を加えた。比較的小さいオリゴマー標的およびプローブは、より低い温度においてより高い塩緩衝液中で融解（変性）される。通常のハイブリダイゼーションでは１ＭのＮａＣｌが使用されるが、ＤＮＡの融解温度を下げたい場合は１００ｍＭのＮａＣｌも使用できる。その後、標的およびプローブの両方を含む一本鎖試料はハイブリダイゼーション温度まで冷却させ、そして蛍光団標識の相互作用の程度を確かめるために蛍光測定を行った。ハイブリダイゼーション時間の長さは数分（高プローブ濃度の試料の場合）から数時間（低濃度のプローブＤＮＡを含む試料の場合）まで変化した。
　次の実施例は代表的な実験方法を説明するものであり、初めにプローブセグメントの３’末端標識化を示し、次にプローブセグメントの５’末端標識化を示し、そして最後に末端標識生成物の競合的均質検定法への応用について示す。
Ｂ．３’−末端標識化
　一本鎖ＤＮＡの３’末端は２工程反応で標識化した。第１工程では、反応性官能基をもつ１個のヌクレオチドを各ＤＮＡ鎖の３’ヒドロキシル基に結合させるために、酵素ＴｄＴを使用した。第２工程は反応性官能基との反応によって標識成分を各ＤＮＡ鎖に結合させることを包含していた。
　次の方法は１２塩基長のデオキシチミジン（ｄＴ１２）の一本鎖ホモポリマー、それぞれ２０塩基長のポリデオキシアデノシンおよびポリデオキシチミジンの二本鎖ホモポリマー（ｄＡ２０−ｄＴ２０）、混合塩基合成オリゴマー、および酵素Ａｌｕ　ＩおよびＨａｅ　ＩＩＩで消されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子フラグメントを含むｐＳＰ６５のプラスミドフラグメントを使用して行った。
　今や第１工程をさらに詳しく見てみると、標準円錐形プラスチック管の中で約１０ｎ　ｍｏｌのＤＮＡを３．３ｍＭ　ＡＨＡ−ＡＴＰ水溶液２５．５μｌと混合し、その試料を遠心真空装置（Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ，サバント）で乾燥させた。ＤＮＡ／ＡＨＡ−ＡＴＰ溶液中のＡＨＡ−ＡＴＰ分子：ＤＮＡの３’末端ヒドロキシル基の比は約１０：１であった。ＤＮＡ／ＡＨＡ−ＡＴＰ溶液に、ＴｄＴ反応緩衝液３０μｌ、ウシ血清アルブミン２０μｌ（水１ｍｌ当たりウシ血清アルブミン５００μｇ）、ＴｄＴ５００単位、および水を加えて７０μｌの反応混合物を得た。この反応混合物を３７℃の水浴中で１８〜２４時間インキュベートさせた。
　セルロース粒子に固定した相補的ホモポリマーに上記ホモポリマーを１０℃で結合させ、続いて結合緩衝液を用いてそのセルロースを２０℃で洗浄することにより、個々のホモポリマー鎖を未反応のＡＨＡ−ＡＴＰから分離した。次に、生成物を溶離して、ｐＨ９．３の０．０５Ｍホウ酸緩衝液中にセルロース粒子から分離した。
　ホモポリマー二本鎖、混合塩基オリゴマー、およびｐＳＰ６５二本鎖プラスミド制限フラグメントはセファデックスＧ−２５クロマトグラフィー媒質および水またはホウ酸緩衝液での溶離を使用するゲル透過クロマトグラフィー、あるいはバイオ−ラッド研究所で製造したＮＡＣＳイオン交換カラムのようなイオン交換カラムにより未反応のＡＨＡ−ＡＴＰから分離した。
　第２工程では、一本鎖ホモポリマー、混合塩基オリゴマー、二本鎖ホモポリマー、または二本鎖プラスミドフラグメントを一まとめにして考えると、ＡＨＡ−ＡＴＰと各ＤＮＡ鎖の３’末端との反応により形成された末端アミノヘキシル−アデノシンの第一脂肪族アミノ基に、アミン反応性蛍光団が共有結合された。アミン反応性蛍光団にはスルホローダミン１０１（テキサスレッド）、ピレンブタノエート、フルオレセイン、エオシンおよびエリトロシン、イソチオシアネート誘導体、スルホン酸クロリド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが含まれる。アミン反応性蛍光団は適当な非反応性可溶化溶剤に溶解され、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルピレンブタノエートはアセトンに、スルホローダミン１０１スルホン酸クロリドはジメチルホルムアミドに、そしてフルオレセインイソチオシアネートはジメチルスルホキシドにそれぞれ溶解した。０．０１モルの蛍光団溶液を、ＡＨＡ−ＡＭＰ結合ＤＮＡ鎖を含む０．０５モルのホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）に絶えず撹拌しながら滴下した。ＡＨＡ−ＡＭＰ結合ＤＮＡ鎖に対して２０倍〜２００倍モル過剰の反応性蛍光団を使用して、この反応を目的生成物へと至らしめた。反応は１６〜２４時間続けた。反応時間の終りに、蛍光団標識化一本鎖ホモポリマーを
アフィニティ
　上記の２工程３’末端標識法の別法として、ポリヌクレオチドは酵素ＴｄＴを用いて蛍光ヌクレオチドにより直接標識化することができる。例えば、一本鎖ホモポリマーはＡＨＡ−ＡＴＰを一本鎖ＤＮＡの３’末端に付加する方法と同じ方法を用いて、その３’末端が蛍光団、１，Ｎ６−エテノアデノシン三リン酸（ＥＡＴＰ）、修飾ヌクレオチドで標識化された。
　上記方法は表１に示すように一本鎖および二本鎖オリゴマーの３’末端に位置づけられた蛍光標識成分をもたらした。
Ｃ．５’末端標識化
　ＤＮＡの一本鎖ホモポリマー、ＤＮＡの二本鎖ホモポリマー、およびプラスミドＤＮＡの制限フラグメントの５’末端は２工程反応で標識化した第１工程では、ＤＮＡ鎖の末端５’リン酸基と反応性の二官能性有機分子（５’リン酸基を標識成分に結合しうる）とをチュー（Ｂ．Ｃ．Ｆ．Ｃｈｕ）、ワール（Ｇ．Ｍ．Ｗａｈｌ）およびオーゲル（Ｌ．Ｏｒｇｅｌ），Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１（１８），６５１３‐６５２９（１９８３）に記載の方法に従って縮合させた。第２工程はＤＮＡ鎖／反応性有機分子を標識成分と反応させてプローブ鎖を形成させることを包含する。
　当分野で習熟した者は、多くの形の天然に存在するＤＮＡがその５’末端でリン酸化されることを認めるであろう。非リン酸化ＤＮＡは酵素Ｔ４キナーゼを用いる初期リン酸化工程を必要とし、この方法は当分野でよく知られている。５’−ＤＮＡ末端標識システムについてのべセスダ・リサーチ研究所の製品カタログを参照されたい（ここに参照により引用される）。
　例えば、第１工程を詳細に説明すると、水溶性カルボジイミドの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを用いて、エチレンジアミンと、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ホモポリマーおよびｐＳＰ６５プラスミドの二本鎖制限フラグメントの末端５’リン酸基とを縮合させた。反応混合物は５０ｎ　ｍｏｌのＤＮＡを５００μｌの水に溶解し、０．５Ｍエチレンジアミン、０．２Ｍカルボジイミドおよび０．２Ｍ２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸を含有する５００μｌの反応溶液（ｐＨ６．０に調整）と混合することにより調整した。この反応混合物を室温で１６〜２４時間撹拌した。
　エチレンジアミンと反応したＤＮＡの一本鎖ホモポリマーは、反応混合物に塩化ナトリウムを１モル濃度になるまで加え、次にその混合物をセルロースに固定した相補的ホモポリマーを含むカラムに１０℃で通すことにより精製した。その後カラムは結合緩衝液を用いて１０℃で、次に２０℃で洗浄した。エチレンジアミンと反応したＤＮＡホモポリマーは５０〜６５℃の温度でそのカラムに０．０５Ｍホウ酸緩衝液を通すことにより回収した。
　二本鎖ホモポリマー、混合塩基オリゴマーおよびプラスミドＤＮＡの制限フラグメントは、エチレンジアミンと反応したＤＮＡをセファデックスＧ−２５カラムに通し、ホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液で溶離することにより精製した。別の精製法は低塩緩衝液中でエチレンジアミン反応ＤＮＡをバイオ−ラッドＮＡＣＳカラムに結合させ、高塩緩衝液または２．０Ｍ酢酸アンモニウムで溶離することを包含する。２．０Ｍ酢酸アンモニウムで溶離した試料は、遠心真空装置または凍結乾燥器を用いて塩緩衝液を除去すべく乾燥させた。
　第２工程では、反応性有機成分のエチレンジアミンと結合したＤＮＡ鎖を反応性蛍光団とさらに反応させてプローブ鎖を製造した。より詳細には、アミン反応性蛍光団（イソチオシアネート誘導体またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を適当な非反応性可溶化溶剤に溶解した。エチレンジアミン反応ＤＮＡを含む０．０５Ｍホウ酸緩衝液にｐＨ９．３で絶えず撹拌しながら０．０１Ｍ蛍光団溶液を滴下した。反応性蛍光団はこの反応を目的生成物へと至らせるために２０倍〜２００倍モル過剰に加えた。反応は撹拌下に１６〜２４時間継続した。
　反応時間の終りに、５’−蛍光団標識化ＤＮＡを濾過した。５’−蛍光団標識化ホモポリマー一本鎖ＤＮＡはアフィニティクロマトグラフィーにより単離した。５’−蛍光団標識化された二本鎖鎖ＤＮＡ、混合塩基オリゴマー、または標識プラスミド制限フラグメントはＮＡＣＳカラムもしくはゲル透過クロマトグラフィーにより単離した。５’−蛍光団標識化二本鎖ホモポリマーまたはプラスミド制限フラグメントはその後水もしくは結合緩衝液中に単離した。５’−蛍光団標識化一本鎖ＤＮＡは下記の表２に示される。
　５’末端標識化ホモポリマープローブ鎖は相補的な３’末端ホモポリマー鎖と結合して、二本鎖（一方の鎖の３’−標識成分が他方の鎖の５’−標識成分と相互作用する位置にある）を形成することができる。５’−および３’−ホモポリマー二本鎖およびプラスミド制限フラグメントは、２本の末端標識化相補的ポリヌクレオチドプローブ鎖を含む。
　多数の二本鎖プローブはまた大腸菌エンテロトキシン遺伝子の合成ＤＮＡから作ることができる。オリゴマーの相補対を合成して、その後標識した。大腸菌エンテロトキシン／遺伝子のゲノム上の５つの異なる領域に対応する塩基配列をもつ５対のオリゴマーを製造した。４対は２１塩基長のオリゴマーを含み、１対は２２塩基長のオリゴマーを含んでいた。１０の一本鎖オリゴマーは標識するために２群に分けた。１群はそれぞれの相補対の一員を含み、他群は他の対員を含んでいた。ターミナルトランスフェラーゼ反応混合物中にハイブリダイズしたＤＮＡを避けるために、非相補鎖同士を１つの群に集めた。末端ヌクレオチドの酵素付加は、平滑末端の二本鎖ＤＮＡプライマーを使用する場合にあまり効率がよくない。この方法の標識効率は先の二本鎖プローブ製造のときに得られたものほど高くなかったが、ハイブリダイゼーションに関連する蛍光の変化は相当に低いプローブ濃度でそれを検出するのに十分なほど大きかった。
　二本鎖ホモポリマー、プラスミド制限フラグメントおよびトキシン遺伝子プローブは下記の表３に示される。
　今や表３を参照すると、ホモポリマー二本鎖、混合塩基オリゴマー、およびプラスミド制限フラグメントはそれぞれの各鎖の３’末端および５’末端の両方に標識を含む。表１、表２および表３は二本鎖当たりの標識または一本鎖当たりの標識を、標識化反応の効率の表示として含む。プローブ当たりの標識の数は吸光分光分析法により測定した。
　相補的プローブ鎖の標識成分は、それらのプローブが互いに結合した位置にあるとき、第５図にグラフで示すように相互作用することができる。第５図は温度がハイブリダイズしたプローブの融解温度に関して変化するときの温度に対する蛍光放出の関係を示している。プローブはそれぞれ１２塩基長のデオキシアデノシンとデオキシチミジンのホモポリマー二本鎖であり、５’−フルオレセインと３’−スルホローダミンの標識群を含む。図示するように、中実の円および三角形はプローブ含有試料の温度が降下しつつあるときに得られた値を表わす。中空の円および三角形はプローブ含有試料の温度が上昇しつつあるときに得られた値を示す。三角形によって示された点は蛍光放出の温度消光についての補正値を表わす。円によって示された点は実際値を表わす。
　より詳細には、第５図の融解曲線データは、１Ｎ　ＮａＣｌおよび０．０２Ｎリン酸カリウムからなる緩衝液（ｐＨ７．５）中のＤＮＡ試料について記録したものである。第５図にプロットしたデータは等モル量（０．１μＭ）の５’−フルオレセイン−ｄＡ１２およびｄＴ１２−スルホローダミン−３’を混合し、多くの試料温度での試料の平衡化の後に蛍光放出を測定することにより得た。また蛍光放出に対する温度の影響を調べるために、５’−フルオレセイン−ｄＡ１２単独の蛍光を同一温度で測定した。５’−フルオレセイン−ｄＡ１２単独測定からのデータは２種のプローブ試料について記録された融解曲線を補正するために使用した。補正データおよび未補正データの両方をプロットした。
　プローブを冷却して再アニーリングするとき、蛍光放出が抑制されて蛍光信号強度の減少が生じる。プローブを融解温度または変性温度に加熱するとき、プローブは分離して標識成分同士の相互作用がなくなる。蛍光放出はもはや抑制されず、蛍光放出が増大する。
　第５図に示す標識成分の相互作用は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを溶液中で測定するための慣用方法で測定した“非標識”プローブの融解温度データと一致する。第６図は温度が非標識プローブの融解温度により変化するときの温度と、２６０ｎＭでの光エネルギーの吸光度と、の関係をグラフによって示している。第６図に示すプローブは１２塩基長のデオキシアデノシンおよびデオキシチミジンのホモポリマーを含む。中実の円で示したグラフの点は試料の温度が降下しつつあるときに読み取ったものである。中空の円は試料の温度が上昇しつつあるときに読み取ったものである。プローブの温度がプローブの融解温度により変化するにつれて、２６０ｎＭでの吸光度は塩基対合の減少が原因で約０．１３５から約０．１８２まで増加した。吸光度測定によって得られた非標識ＤＮＡの融解温度は、蛍光団の相互作用により測定した標識ＤＮＡの
融解温度
　標識成分の相互作用はまた表３および表４に示される。表３は非ハイブリッド形に対するハイブリッド形の標識ホモポリマー複合体およびプラスミド制限フラグメントの蛍光強度の比較を含む。ハイブリダイズしたプローブの信号に対するハイブリダイズしなかったプローブの信号の比は４．１程度に高いこともあり得る。
　表４はハイブリダイズした標識プローブに対するハイブリダイズしなかった標識プローブの蛍光強度の比較を示す。
　表３および表４において、蛍光の変化はハイブリダイゼーション条件下で観察された蛍光に対する非ハイブリッド状態の一方または両方の標識の蛍光の比として表わされる。データはハイブリダイゼーション状態を選択するために温度を使用した実験；相補的プローブを一緒に、その後単独で試験した実験；またはプローブのハイブリダイゼーションを大過剰（通常１０倍またはそれ以上）の非修飾相補ＤＮＡの存在または不在下で行った実験；のいずれかから得られた。後者の実験において、大過剰の標的ＤＮＡは相補的ＤＮＡプローブ同士が互いにハイブリダイズすることを妨げる競合的ハイブリダイゼーション反応をもたらす。同じ標識オリゴマーの異なる製法を試験したプローブ対については、蛍光変化の複数の値が記入されている。表４はオリゴマーの単一標識化によって作られたプローブを使って得られたデータを含む。これらのプローブの組成は表１および表２に載っている。表３のデータは第１蛍光団が各オリゴマーの５’末端にあり且つ第２蛍光団が３’末端にあるように標識されたプローブから誘導される。ハイブリダイゼーション条件において、一方の鎖の５’第１蛍光団が相補鎖の３’第２蛍光団ときわめて接近する。
　表３および表４は２つの標識の少なくとも１つの蛍光に有意な変化が生じる数種の標識の組合せを示す。フオルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）型エネルギー転移機構では、比較的長い波長の光を吸収および放射する標識は、その標識の励起の際に他の標識（エネルギー供与体）からのエネルギーを受けとることが予期される。その標識が蛍光である場合、これはエネルギー受容標識からの発光の増加に伴って起こるエネルギー供与標識からの発光の減少をもたらす。この機構に適合しうる挙動を示す標識の組合せはフルオレセイン／スルホローダミン１０１、アクリジン／スルホローダミン１０１、フルオレセイン／エテノアデノシン、フルオレセイン／エオシンおよびフルオレセイン／エリトロシンである。
　しかしながら、表３および表４はフオルスター型機構に従って行動しないいくつかの相互作用を示す。フオルスター型エネルギー転移機構と一致しない挙動を示す標識の組合せはフルオレセイン／ピレンブタノエートおよびフルオレセイン／アクリジンである。
　たとえいくつかの標識組合せがフオルスター型エネルギー転移の典型的な行動を示すとしても、相互作用のメカニズムは２つの標識の一方だけから収集されたデータからは確認することができない。試験した標識組合せにおいて、標識対の他方の一員はＤＮＡに結合したとき本質的に非蛍光性であるか、あるいはハイブリダイゼーションの状態にほとんど影響を受けない蛍光を示した。標識の相互作用の仕方の不確かさは、２つの標識分子を互いの衝突距離内にもたらす能力の結果である。衝突による相互作用が可能である場合、動的消光のいろいろな機構が競合して、観察される相互作用を支配しうる。接近した範囲の動的相互作用はまた静的相互作用よりも実際上顕著であると思われる。
　表３および表４に示したいくつかの蛍光変化は、タンパク質分子（すなわち抗体および／またはタンパク質抗原）のランダム標識化を当てにして両方または一方の標識物質を作らねばならない消光／エネルギー転位に基づくイムノアッセイにおいて観察されたものよりも大きい。従って、抗原：抗体複合体では標識のほんの少しの画分のみが互いとの静的または動的相互作用にとって適した位置にあるかも知れない。一方、ＤＮＡ末端の選択的標識化は相対する標識の正確な位置づけを可能にし、それ故にハイブリダイズしたプローブ鎖の全ての標識によって衝突の相互作用が可能となり、また静的な相互作用が強められる。
　表３および表４のデータはまた標識をＤＮＡに結合させる方法を適切に選択することの必要性を指摘している。フルオレセインが３’末端にあり且つピレンブタノエートが５’末端にある実施例の場合は、標識の相互作用がたとえあったとしてもほとんど観察されず、一方フルオレセインが５’末端にあり且つピレンが３’末端にある場合は相当な相互作用が検出される。これは制限酵素で消化したプラスミドＤＮＡばかりでなくホモポリマーオリゴマーにも観察された。標識の配置の相違は２つの別々の末端に標識を結合させる際に使用した異なる化学に関係しており、３’−標識はアミノヘキシルアミノアデノシンリンカーを介して結合されるが、５’−標識はエチレンジアミンリンカーを介して結合された。
Ｄ．競合的検定
　本発明の試薬プローブは競合的ＤＮＡ検定に応用した。このハイブリダイゼーション法は５’−フルオレセインｄＡ１２およびｄＴ１２−スルホローダミン−３’ホモポリマーを含むプローブに特徴的である。
　第７図を参照されたい。ここではプローブと標的ＤＮＡの溶液が混合された。プローブの濃度は０，１μＭに定め、標的濃度はゼロから０．５μＭの間で変えた。プローブは標的ＤＮＡ、十分量の水および緩衝液（ｐＨ７．５で１．０Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１〜０．０２Ｍ−塩基性リン酸カリウムの最終濃度を与える）と混合してハイブリダイゼーション溶液を調製した。この溶液を水浴中６５℃で１５分間加熱して、標的とプローブＤＮＡの完全なデハイブリダイゼーションを行った。次に試料を２時間かけて１０℃へと冷却させ、競合的ハイブリダイゼーションを起こさせた。
　第７図はフルオレセインイソチオシアネート（フルオレセイン）で標識化したデオキシアデノシンホモポリマーおよびスルホローダミンスルホン酸クロリド（スルホローダミン）で標識化したデオキシチミジンホモポリマー（各々１２塩基長）からなる一定濃度の１０−７モル二本鎖プローブを含むいろいろな濃度の標的鎖についての、蛍光強度（相対単位）対波長の関係をグラフにより示している。全ての試料は３００ｎｍの光エネルギーを照射した。
　約５２０ｎｍの波長でのピーク蛍光強度は、１２塩基長のデオキシアデノシンおよびデオキシチミジンの標的ホモポリマーの濃度変化により変化する。
　第８図は標的濃度に対する蛍光放出の関係を示す。第８図のグラフの点は一定濃度のプローブを使用した第７図のグラフのピーク値である。標的濃度が増すにつれて、スルホローダミンによる蛍光消滅度が低下して蛍光放出が増大する。
　５’−フルオレセイン−ｄＡ１２／ｄＴ１２−ピレンブタノエート−３’系について先に示したハイブリダイゼーションデータは、相互作用する標識に基づいた競合的ＤＮＡハイブリダイゼーション検定の概念を説明する上で役に立った。しかしながら、有用な検定系であるためには、この方法が特異的であり且つ感度が優れていることを示さねばならない。
　第９〜１２図のデータは標識の相互作用に基づく検定法のこれらの面を立証するのに役立つ。標識の特異性は表３に示した最初のｄＡ２０：ｄＴ２０誘導二本鎖プローブを使って第９図に示される。
　この実験では、５０ｎＭプローブ溶液といろいろな濃度の３つの異なる標的ＤＮＡとを水中で混合した。１つの標的は等モル量のｄＡ２０およびｄＴ２０から成っており、これはプローブとのハイブリダイゼーションにふさわしい標的であった。２つの非相補標的はウシ胸腺ＤＮＡとラムダファージＤＮＡであった。試料は沸騰水浴中で６分間加熱し、その後室温まで冷却させた。次いで試料を２Ｘ濃縮結合緩衝液で半分に希釈して、ｐＨ７．５においてそれぞれ１００ｍＭと１０ｍＭの最終ＮａＣｌおよびリン酸カリウム濃度を得た。その直後に室温での蛍光スペクトルを各試料について記録した。
　第９図にプロットした蛍光強度データは、正しい標的ＤＮＡ（ｄＡ２０：ｄＴ２０）を使用した場合に、予測された濃度依存性の競合的ハイブリダイゼーション挙動を示す。標的ＤＮＡ濃度は異なる分子量の標的を使用したので塩基対に換算してプロットした。各試料中に含まれる標識二本鎖プローブの対応する塩基対濃度は１μＭ（５０ｎＭ二本鎖プローブ）であった。約１．２μＭのｄＡ２０：ｄＴ２０（１μＭの値に近い）のところで生じた蛍光変化の中間点は、相補的鎖が相補プローブ鎖に対してもつのと同じ親和性を互いに対して有する競合的ハイブリダイゼーションを予期させた。非相補的標的ＤＮＡ（ウシ胸腺ＤＮＡとラムダＤＮＡ）を使って集めたデータは、過剰の非相補的ＤＮＡが相補的プローブ鎖同志のハイブリダイゼーションを妨げなかったので、プローブがｄＡ２０：ｄＴ２０標的ＤＮＡに対して特異的であることを示した。
　ハイブリダイゼーションの検定の感度は、比較的低いプローブ濃度で競合的ハイブリダイゼーションを行うことにより証明した。５００ｐＭ、５０ｐＭおよび５ｐＭ濃度の標識ｄＡ２０：ｄＴ２０プローブを用いた競合的八イブリダイゼーションから得られたデータを第１０図に示す。これらの実施では、プローブと標的ＤＮＡとを
ｐＨ７．５の１００ｍＭ　ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸カリウムを含む緩衝液中で混合した。次いで試料を８０℃で１０分間加熱し、その後５度／時間の割合で２０℃まで低下させた。これはコンピュータ制御水浴を使って行った。蛍光放出は２０℃で各試料について測定した。標的濃度の関数としての蛍光放出強度の特徴的なＳ字状依存がそれぞれのプローブ濃度で観察され、そして蛍光強度変化の中間点はより低いプローブ濃度を使用する検定に対してより低い標的濃度で生じた。最も低いプローブ濃度（５ｐＭプローブ）を使用する検定の場合は、蛍光変化の中間点が約２０ｐＭ標的だった。これらの実験で使用した試料は、標準セミミクロ蛍光キュベットを使用したので１ｍｌの容量であった。これは２０ｆｍｏｌｅの標的ＤＮＡに相当した。他の技法によるＤＮＡハイブリダイゼーションはしばしば１０μｌ程度の容量を使用して行われる。同様の容量の使用を可能にする蛍光計のために試料用セルを工夫することができ、その結果蛍光変化の中間点については２００ａｍｏｌｅへと約１００倍の感度の増加をもたらすであろう。この実験では５ｐＭプローブを使用する最大蛍光変化が緩衝液の蛍光とほぼ同じ大きさであるので、感度の大きい増加はプローブ濃度をこれ以上低下させても期待されない。換言すれば、信号対ノイズの比は１に等しかった。緩衝液のバックグラウンドは第１０図に示すデータから差し引かれる。
　検定感度の増加を可能にする１つの方法は、対象とするゲノムの異なる領域とハイブリダイズする複数のプローブを使用することである。これに関する２つの手法が試験された第１の手法では、制限酵素の使用により天然ＤＮＡから複数の二本鎖プローブを作製した。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子をｐＳＰ６５プラスミド（ウイスコンシン州マジソン，プロメガ・バイオテク社）に挿入して、このプラスミドを大腸菌で増殖させた。次いで、数ミリグラムのプラスミドＤＮＡを大腸菌培養物から単離し、このプラスミドＤＮＡを２種類の制限酵素ＡｌｕＩおよびＨａｅＩＩＩで処理した。これは大きさが約６塩基対から６００塩基対（ＤＮＡ配列分析による）までの範囲の約３７の平滑末端二本鎖をプラスミド１つにつきもたらした。その後二本鎖の集団はｄＡ２０：ｄＴ２０プローブを標識するときに使用した通常の５’−および３’−標識化法により標識付けした。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子はこの初期実験を単純化するために、一般には望まれることだが、プラスミドｐＳＰ６５から遊離の状態で単離しなかった。この制限酵素切断プラスミドの数種の標識化調製物は表３に載っている。
　第１１図はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む種々の濃度の未切断ｐＳＰ６５プラスミドを検索するために、表３に記載の第１のプラスミド調製物を用いて行った競合的ハイブリダイゼーションからのデータを示す。プラスミドプローブは２．７ｐＭの完全プラスミドに対応する濃度で存在していた（標識化二本鎖の合計１００ｐＭ）。水中のプローブおよび標的ＤＮＡは沸騰水浴中に１２分間置き、次にＮａＣｌとリン酸カリウムの最終濃度をそれぞれ１Ｍおよび１０ｍＭとするために２Ｘ濃縮結合緩衝液を添加しながら室温まで冷却させた。
　フルオレセイン放出は各試料について異なった時間で記録した。第１１図にプロットしたデータは１．５時間および５時間で測定されたフルオレセインに相当する。両方のフルオレセイン値は予測されたように標的濃度が増加するにつれて減少することが示されている。
　試験した標的濃度範囲は温度に関する蛍光変化の全範囲を示すには十分大きくないが、検定は使用したプローブの対応濃度に相当する少なくとも数ピコモルの感度を示す。仮説的な１０μｌ試料では、数ピコモル標的が約３０ａｍｏｌｅに相当する。この実験において、フルオレセイン放出強度はバックグラウンドフルオレセインの大きさの程度よりも大きかった。
　ハイブリダイゼーションはプラスミドのランダム制限消化から生ずるプローブの長さおよび広範囲の融解温度に関するプローブの不均一集団のために困難であることが予測される。それゆえに、出来るだけ均一な大きさのプローブ集団を作るべく制限酵素を注意深く選択することが有利であるだろう。クローン化ＤＮＡからこのような均一集団を作るために、ゲノム内に新しい制限部位を遺伝子操作により加えてもよい。
　大腸菌エンテロトキシン遺伝子の検定を示す第１２図を今や参照すると、約１００塩基対のエンテロトキシン遺伝子フラグメントから成る標的ＤＮＡがｐＨ７．５の１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１０ｍＭトリスを含む緩衝液７００μｌ中でラムダＤＮＡ（キャリアーＤＮＡ）１４μｇと混合された。この溶液を沸騰水浴中に１２分間おき、その後表３に“トキシン”として示した二本鎖プローブＤＮＡを加え、この溶液を沸騰水浴に戻してさらに２分間加熱した。次いで蛍光計のサーモスタット付きキュベットホルダー内に収容された蛍光キュベット中の２×ＮａＣｌ／リン酸緩衝液７００μｌにこの溶液を加え、４２℃（プローブの融解温度より２５℃低い温度）に維持した。ラムダＤＮＡ、塩化ナトリウムおよびリン酸カリウムの最終試料濃度はそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、１Ｍおよび０．０１Ｍであった。
　蛍光強度は前の実験とは異なる方法で測定した。蛍光値は検出用エレクトロニクスにインターフェースで接続したコンピュータの使用（物質および方法の部参照）により時間と共に連続して記録した。この方法で集めたデータは異なる濃度のエンテロトキシン標的を含む試料について第１２図にプロットした。初期および最終蛍光値を記録することによって、試料間で変動するバックグラウンド蛍光レベルから独立した蛍光変化が得られた。第１２図のデータ記録は各組のデータが同じ初期蛍光値を含むように相殺した。この効果は試料間で変動するバックグラウンドを取り去ることである。各試料の蛍光変化は存在する標的ＤＮＡの量に関係する。検出可能な最も低い標的濃度は４ｐＭであることがわかった。従って、仮説的な１０μｌ試料はこの濃度で４０ａｍｏｌｅの標的を含むだろう。蛍光強度を時間と共に連続して記録することの２番目の利点は、蛍光変化の時間依存が平衡値へのデータの外挿を可能にする運動学的方程式にあてはめることができるので、より短いハイブリダイゼーション時間を使用し得るということである。蛍光変化の相対度は第１２図に示す実験について２時間にわたって時々微分すればよい。
　前記実施例は特定の蛍光団を記録したものであるが、本発明は他のアミン反応性蛍光団および化学発光剤にも応用できる。アミン反応性蛍光団には例えば前述のフルオレセイン、ピレン、アクリジン、スルホローダミン、エオシン、エリトロシンおよびそれらの誘導体が含まれる。アミン反応性化学発光剤には例えばミクロペルオキシダーゼ、ルミノール、イソルミノール、グルコースオキシダーゼ、アクリジニウムエステルおよびそれらの誘導体が含まれる。
　化学発光剤はプローブの化学発光標識成分が第２相補的プローブの蛍光団と相互作用するように、蛍光団と関連して本検定に用いられる。蛍光団は標識成分が離れるまで化学発光剤の発光を抑えるだろう。発光反応を開始させるために、試料媒体に適当な化学発光補助因子も加えられるだろう。標的がプローブと結合部位について競合したとき、標識成分は分離して化学発光剤または化学発光成分を発光させ、そして検出可能な信号を発生することができる。
　化学発光剤はまた化学発光補助因子との組合せで本発明に用いられる。こうして、第１プローブの化学発光標識成分は第２相補プローブ上に化学発光補助因子標識成分と相互作用するであろう。この系は特定強度の光を発する。標的が存在する場合、標的はプローブと競合し、それにより第１および第２プローブおよび標識成分を分離し且つこの系の発光を抑制するだろう。
　蛍光団標識化プローブはバックグラウンド蛍光を制限するために時間分解検定法において利用される。従って、光パルスは第１蛍光団を励起するのに十分な波長で導入される。第１蛍光団はそのエネルギーを第２蛍光団に転移する。第１蛍光団から第２蛍光団へのエネルギーの転移および第２蛍光団によるエネルギーの放出は、直接蛍光に比べてゆっくりした過程である。第１蛍光団はエネルギー転位過程を引き延ばすために、長い発光寿命を有するように選ばれる。試料はパルス後、そのパルスによって開始された直接蛍光活性が終了した後に、および転移したエネルギーが第２蛍光団から発せられる合間に、第２蛍光団からの光エネルギーについて監視することができる。エネルギーを転移する位置にある蛍光群のみが監視される発光を生ずるだろう。相互作用する位置にある相補的プローブの標識成分のみが検出可能な信号をもち、それによりバックグラウンド発光が抑えられるだろう。
　時間分解検定法の詳しい説明は本発明者の係属中の米国特許出願第７３８５６０号に開示されており、これは参照によりここに引用される。
　こうして、本発明は均質な非放射性検定を特徴とする。本検定の均質性により、比較的短時間で検定を行うことができる。非放射性標識を使用すると、特別の許可がなくても本検定を行うことができ、また検定技術および製造技術が単純化される。
　本発明はその好適な実施態様について説明してきたが、本発明は変更および修飾が可能であり、それゆえに先に記載の細部に限定さ紅るべきでなく、特許請求の範囲に含まれる種々の変更および修正を加え得ることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
　第１図は本発明の競合的ＤＮＡ検定を示す模式図であり；
　第２図は本検定を行うための自動分析装置の略図であり；
　第３図はクローン化ＤＮＡ由来の二本鎖プローブの作製を示す模式図であり；
　第４図は二本鎖プローブの末端標識化を示す模式図であり；
　第５図は相補プローブ鎖の標識成分が相互作用するときの蛍光放出と温度の関係を示すグラフ（融解曲線）であり；
　第６図は非標識プローブの融解曲線を示すグラフであり；
　第７図は一定濃度の二本鎖プローブを含む異なる濃度の標的鎖についての蛍光強度と波長の関係を示すグラフであり；
　第８図は競合的エネルギー転移ＤＮＡハイブリダイゼーションにおける標的濃度と蛍光放出の関係を示すグラフであり；
　第９図はフルオレセイン−ｄＡ２０：ｄＴ２０−ピレンプローブを用いた競合的検定における各種標的ＤＮＡの濃度とフルオレセイン発光強度の関係を示すグラフであり；
　第１０図は異なる濃度のフルオレセイン−ｄＡ２０：ｄＴ２０−ピレンプローブを用いた競合的溶液ハイブリダイゼーションにおける標的ＤＮＡ濃度と蛍光強度の関係を示すグラフであり；
　第１１図はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＳＰ６５プラスミドを検索するために、フルオレセイン−プラスミド−ピレンプローブを用いて行った競合的ハイブリダイゼーションからのデータを示し；そして
　第１２図は大腸菌エンテロトキシン遺伝子の競合的検定を示す。