(57)【要約】本発明は、安全かつ効率的なワクチン組成物を提供する。この組成物は、効率的に免疫化する量の不活性化Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓバクテリンと、薬学的に受容可能なキャリアと、免疫原性を刺激する量のアジュバント系とを含み、該アジュバント系は、本質的に抗体応答誘導因子および細胞媒介性免疫応答誘導因子からなる。本発明はまた、イヌにおけるイヌエールリヒア症の予防または軽減のための方法を提供する。本発明はさらに、試験動物において臨床的なＥ．ｃａｎｉｓ感染を誘導するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン組成物であって、該組成物は、効率的に免疫化する量の不活性化Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓバクテリンと、薬学的に受容可能なキャリアと、免疫原性を刺激する量のアジュバント系とを含み、該アジュバント系は、本質的に抗体応答誘導因子および細胞媒介性免疫応答誘導因子からなる、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記不活性化バクテリンは、Ｅｂｏｎｙ，Ｂｒｏａｄｆｏｏｔ、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｉｓｒａｅｌ  ６１１、Ｋｏｇａｓｈｉｍａ  １、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ、Ｏｋｌａｈｏｍａ、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮＣＳＵ）株Ｊａｋｅ、ＮＣＳＵ単離体Ｄｅｍｏｎ、ＤＪおよびＦｕｚｚｙと命名された１つ以上のＥ．ｃａｎｉｓ株、該命名された株のいずれかによるＥ．ｃａｎｉｓ感染細胞株、ならびに該命名された株のいずれかによるＥ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞株からなる群より選択される、組成物。
【請求項３】
前記不活性化バクテリンが、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  Ｅｂｏｎｙ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  Ｂｒｏａｄｆｏｏｔおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体応答誘導因子が、エチレン無水マレイン酸コポリマー、スチレン化アクリルコポリマー、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞媒介性免疫応答誘導因子が、水中油形エマルジョン、弱毒化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記不活性化バクテリンが、単位用量あたり１×１０４ＴＣＩＤ５０を与えるのに十分な量で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗体応答誘導因子が、１％  ｖｏｌ／ｖｏｌのエチレン無水マレイン酸コポリマーと３％  ｖｏｌ／ｖｏｌのスチレン化アクリルコポリマーとの量で存在する、エチレン無水マレイン酸コポリマーとスチレン化アクリルコポリマーとの混合物である、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記水中油形エマルジョンが、パラフィン水中油形エマルジョン、スクアランとエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロックコポリマーとを含むエマルジョン、Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ−１のエマルジョンならびにそれらの混合物からなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉバクテリンをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞媒介性免疫応答因子が、水中油形エマルジョンであり、かつ約３％  ｖｏｌ／ｖｏｌ〜７％  ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲で存在する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞媒介性免疫応答因子が、水中油形エマルジョンであり、かつ約５％  ｖｏｌ／ｖｏｌの量で存在する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
イヌにおけるイヌエールリヒア症を予防または改善するための方法であって、該方法は、該イヌにワクチン組成物を投与する工程を包含し、該ワクチン組成物は、効率的に免疫化する量の不活性化Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓバクテリンと、薬学的に受容可能なキャリアと、免疫原性を刺激する量のアジュバント系とを含み、該アジュバント系は、本質的に抗体応答誘導因子および細胞媒介性免疫応答誘導因子からなる、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記ワクチン組成物において、前記不活性化バクテリンが、Ｅｂｏｎｙ、Ｂｒｏａｄｆｏｏｔ、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｉｓｒａｅｌ  ６１１、Ｋｏｇａｓｈｉｍａ  １、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ、Ｏｋｌａｈｏｍａ、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮＣＳＵ）株Ｊａｋｅ、ＮＣＳＵ単離体Ｄｅｍｏｎ、ＤＪおよびＦｕｚｚｙと命名された１つ以上のＥ．ｃａｎｉｓ株、該命名された株のいずれかによるＥ．ｃａｎｉｓ感染細胞株、ならびに該命名された株のいずれかによるＥ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞株からなる群より選択される、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、前記ワクチン組成物において、前記不活性化バクテリンが、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  Ｅｂｏｎｙ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  Ｂｒｏａｄｆｏｏｔまたはそれらの混合物である、方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、前記ワクチン組成物において、前記抗体応答誘導因子が、エチレン無水マレイン酸コポリマーとスチレン化アクリルコポリマーとの混合物である、方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法であって、前記ワクチン組成物において、前記細胞媒介性免疫応答誘導因子は、パラフィン水中油形エマルジョン、スクアランとエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロックコポリマーとを含む水中油形エマルジョン、Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ−１の水中油形エマルジョン、弱毒化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓならびにそれらの混合物からなる群より選択される、方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の方法であって、前記ワクチン組成物において、前記不活性化バクテリンが、単位用量あたり少なくとも１×１０４ＴＣＩＤ５０を与えるのに十分な量で存在する、方法。
【請求項１８】
試験動物における臨床的なイヌエールリヒア症の誘導のための方法であって、該方法は、該試験動物に有効量のチャレンジストックを投与する工程を包含し、該チャレンジストックは、本質的に毒性のＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ微生物で感染された末梢血単核細胞からなる、方法。
【請求項１９】
前記ストック溶液が皮下投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記毒性の微生物が、試験動物において該微生物を繰り返し継代することによって生成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記微生物がＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  Ｅｂｏｎｙである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
毒性のＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ微生物で感染された末梢血単核細胞を含む、チャレンジストック組成物。
【請求項２３】
前記毒性の微生物が、試験動物において繰り返し継代されているＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  Ｅｂｏｎｙである、請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
イヌエールリヒア症は、血液由来の細胞内病原体であるＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ（Ｅ．ｃａｎｉｓ）によって引き起こされる致死性の疾患であり、いかなる成長期においてもイヌのすべての品種（ｂｒｅｅｄ）に感染する。イヌエールリヒア症は、クリイロコイタマダニであるＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｏｕｓによって主に伝染され、このイヌダニは、この疾患の主な貯蔵庫であると考えられている。イヌエールリヒア症は、米国の風土病であり、世界中で生じる潜在的に致死性の疾患である。症状は、一般に、生物体の菌株および宿主の免疫状態に依存して、急性の病状から慢性の病状に進行する。急性の症例では、症状としては、粘液膿性の眼漏および粘液膿性の鼻汁、脱水症、細網内皮過形成、発熱、全身性リンパ節症、巨脾腫ならびに血小板減少が挙げられる。慢性の症例では、食欲不振の可変サイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｉｇｎ）、抑うつ、体力の喪失、歩行のぎこちなさ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）および歩行に対する消極性（ｒｅｌｕｃｔａｎｃｅ）、四肢または陰嚢の水腫、ならびに咳嗽または呼吸困難が生じ得る。
【０００２】
現在、イヌエールリヒア症の有効な処置または予防に利用可能なワクチンは存在しない。エールリヒア症のすべての形態に対する共通の処置は、テトラサイクリンのような抗生物質を、急性の症例には最低限２週間、または慢性の症例では１〜２ヶ月間投与することである。慢性の症例では、血液学的異常が３〜６ヶ月間、あるいは一生涯持続し得る。支持療法は、るいそう（ｗａｓｔｉｎｇ）および特定の臓器機能不全に対抗する必要があり得る。明らかに、この疾患の有効な予防が、感染後抗生物質養生法よりも好ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、イヌにおけるイヌエールリヒア症に対する防御免疫の誘導のために有用な、安全かつ有効なワクチン組成物を提供することが本発明の１つの目的である。
【０００４】
イヌにおけるイヌエールリヒア症の予防または改善のための方法を提供することが、本発明の別の目的である。
【０００５】
試験動物における臨床的なイヌエールリヒア症の誘導のための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。この方法は、宿主防御機構および発病機構の評価および研究、ならびにエールリヒア症に対するワクチンの改善された開発に有用である。
【０００６】
ワクチン組成物が、種々の地理的領域に由来するＥ．ｃａｎｉｓの複数の株に対してイヌを保護し得るということが、本発明の特徴である。
【０００７】
イヌエールリヒア症に対する有効な防御免疫が、いかなる年齢のイヌにも与えられ得るということが、本発明の別の特徴である。
【０００８】
本発明のさらなる目的および特徴は、本明細書中以下に示される詳細な説明から明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、安全かつ有効なワクチン組成物を提供し、この組成物は、以下を含む：有効な免疫化量の不活性化Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓバクテリン、薬理学的に受容可能なキャリア、ならびに抗体応答誘導因子および細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答誘導因子を含むかもしくは本質的にこれらからなる免疫原性を刺激する量のアジュバント系。
【００１０】
本発明はまた、イヌにおけるイヌエールリヒア症を予防または改善するための方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、試験動物において臨床的なＥ．ｃａｎｉｓ感染を誘導するための方法を提供し、この方法は、宿主防御機構および発病のメカニズムの研究および評価、ならびにイヌエールリヒア症の処置および予防の先進的開発に有用である。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
イヌエールリヒア症の原因因子は、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ目のグラム陰性細菌のＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ（Ｅ．ｃａｎｉｓ）であり、これは、循環する哺乳動物白血球において個々にもしくは小型の封入のいずれかを生じ、マダニにより運ばれる。イヌエールリヒア症は、米国の多くの地域の風土病であり、世界中で生じることが知られている。急性の自然発生的なイヌエールリヒア症は、ロッキー山熱と似た症状を呈する。ほとんどの急性の症例は、より暖かい月に生じ、これはマダニベクターの最も高い活性と一致する。イヌエールリヒア症は、致死性の疾患である。イヌエールリヒア症は、頻繁に慢性の疾患であり、どの年齢のイヌにも影響を与え、多様な症状（例えば、食欲不振、抑うつ、体力の喪失、歩行のぎこちなさ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）および歩行に対する消極性（ｒｅｌｕｃｔａｎｃｅ）、四肢または陰嚢の水腫、咳嗽または呼吸困難）を生じ得る。これまで、イヌエールリヒア症に対して利用可能な有効なワクチン接種または免疫処置は知られていない。
【００１３】
ここで驚くべきことに、有効な免疫化量の不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓバクテリン、薬理学的に受容可能なキャリア、ならびに本質的に抗体応答誘導因子および細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答誘導因子からなる免疫原性を刺激する量のアジュバント系を含み、イヌエールリヒア症を予防または改善するためにどの成長段階のイヌにも（好ましくは、１６週齢以上）投与し得るワクチン組成物が見出された。
【００１４】
本発明のワクチン組成物で使用するのに適切なＥ．ｃａｎｉｓバクテリンは、１以上の株のバクテリンであり得る。本発明のワクチン組成物で使用するのに適切なＥ．ｃａｎｉｓバクテリンは、１以上の株（例えば、Ｅｂｏｎｙ、Ｂｒｏａｄｆｏｏｔ、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｉｓｒａｅｌ  ６１１、Ｋｏｇａｓｈｉｍａ  １、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ、Ｏｋｌａｈｏｍａ、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮＣＳＵ）株Ｊａｋｅ、ＮＣＳＵ単離体Ｄｅｍｏｎ、ＤＪおよびＦｕｚｚｙ、それらの命名された株のいずれかによるＥ．ｃａｎｉｓ感染細胞株、それらの命名された株のいずれかによるＥ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞株またはアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に寄託されたＥ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞株と称されるバクテリン、および米国特許第５，１９２，６７９号などに開示されるように受託番号ＣＲＬ  １０３９０を与えられたバクテリン）であり得る。本発明のワクチン組成物で使用するのに適切なＥ．ｃａｎｉｓバクテリンは、好ましくは、Ｅ．ｃａｎｉｓの２つの株（例えば、ＥｂｏｎｙおよびＢｒｏａｄｆｏｏｔ）であり得る。
【００１５】
例えば、Ｅｂｏｎｙ株は、１６Ｓ組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配列に基づき、Ｏｋｌａｈｏｍａ株と９９．９パーセント相同であり（すなわち、１つのヌクレオチドが異なる）［Ｍａｔｈｅｗ  ＪＳら、Ａｔｔｅｍｐｔｅｄ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  ｂｙ  Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ  ａｆｔｅｒ  ｐａｓｓａｇｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ  １９９６  Ｎｏｖ；５７（１１）：１５９４−８］、若虫のダニおよび成虫のクリイロコイタマダニ（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）（Ｍａｔｈｅｗ  １９９６）によってイヌに対して伝染性であることが示されてきた。
【００１６】
Ｆｌｏｒｉｄａ株は、保存された主要な免疫反応性の２８ｋＤａタンパク質遺伝子を含むこと（米国特許第６，４５８，９４２号）およびｏｍｐ−１同義遺伝子ファミリーに属するｐ  ３０遺伝子を含むこと（米国特許第６，４３２，６４９号）が開示されている。さらに、米国特許第６，０４３，０８５号は、Ｆｌｏｒｉｄａ株が各々３６個のアミノ酸を有する１４の繰り返し（これらは、表面に曝露されていると推定される）を含む１２０ｋＤａの免疫優性の抗原タンパク質を有することを開示する。繰り返し単位は親水性であり、そのタンパク質の表面に曝露された領域のコアを形成し、セリンおよびグルタミン酸が豊富である。セリンおよびグルタミン酸は各々、繰り返し単位のアミノ酸の１９％を占める。Ｆｌｏｒｉｄａ株は、Ｅ．ｃａｎｉｓ株ＮＣＳＵ  Ｊａｋｅよりも毒性が低いと考えられる［Ｂｒｅｉｔｓｃｈｗｅｒｄｔら、Ｄｏｘｙｙｃｌｉｎｅ  ｈｙｃｌａｔｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃａｎｉｎｅ  Ｅｈｒｌｉｃｈｉｏｓｉｓ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｃｈａｌｌｎｅｇｅ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｗｏ  Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  ｓｔｒａｉｎｓ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、１９９８  Ｆｅｂ；４２（２）：３６２−６８］が、Ｏｋｌａｈｏｍａ株との血清学的比較により、１００％の特異性および８７．５％の感受性が明らかになっている［Ｄａｗｓｏｎ  ＪＥら、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｈｒｌｉｃｈｉｏｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９９１  Ｍａｒ；１６３（３）：５６４−７］。
【００１７】
連続継代イヌ細胞株（例えば、ＤＨ８２）において増殖されること（Ｋｅｙｓａｒｙ  Ａら、Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  ｉｎ  Ｉｓｒａｅｌ，Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１９９６  Ａｐｒ；６２（３−４）：３３１−４０）に加えて、Ｉｓｒａｅｌ  ６１１株は、連続継代マウスマクロファージ細胞株（例えば、Ｊ７７４．Ａ１）で増殖されている（Ｋｅｙｓａｒｙ  Ａら、Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ＢＡＬＢ／Ｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｌｉｎｅ，Ｊ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１  Ｎｏｖ；１３（６）：５２１−３）。Ｉｓｒａｅｌ  ６１１は、２つの形態（（１）しっかりと充填された形態、および（２）ゆったりと充填された形態）の桑実胚を有し、その１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、Ｏｋｌａｈｏｍａ株と３つのヌクレオチドが異なり、Ｆｌｏｒｉｄａ株とは４個のヌクレオチドが異なり１つのヌクレオチドのギャップが各々に存在する（Ｋｅｙｓａｒｙ  １９９６）。Ｏｋｌａｈｏｍａ株との相同性の相違の程度は、０．５４パーセントであり、一方でＦｌｏｒｉｄａ株との相違は、０．６１パーセントである（Ｋｅｙｓａｒｙ、１９９６）。
【００１８】
Ｆｌｏｒｉｄａ株と同様に、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ株は、保存された主要な免疫反応性の２８ｋＤａのタンパク質遺伝子（米国特許第６，４５８，９４２号）、ｏｍｐ−１同義遺伝子ファミリーに属するｐ  ３０遺伝子（米国特許第６，４３２，６４９号）、および米国特許第６，０４３，０８５号に開示されるように、各々３６個のアミノ酸を有する１４の繰り返しを含む１２０ｋＤａの免疫優性の抗原タンパク質を有し、これらは、表面に曝露されていると予測される。この繰り返し単位は親水性で、そのタンパク質の表面に曝露されている領域のコアを形成し、そしてセリンおよびグルタミン酸に富む。セリンおよびグルタミン酸は各々、繰り返し単位のアミノ酸の１９％を占める。
【００１９】
また同様に、Ｏｋｌａｈｏｍａ株は、保存された主要な免疫反応性の２８ｋＤａのタンパク質遺伝子（米国特許第６，４５８，９４２号）、ｏｍｐ−１同義遺伝子ファミリーに属するｐ  ３０遺伝子（米国特許第６，４３２，６４９号）、米国特許第６，０４３，０８５号に開示されるように、各々３６個のアミノ酸を有する１４の繰り返しを含む１２０ｋＤａの免疫優性の抗原タンパク質を有し、これらは、表面に曝露されていると予測される。この繰り返し単位は親水性で、そのタンパク質の表面に曝露されている領域のコアを形成し、そしてセリンおよびグルタミン酸に富む。セリンおよびグルタミン酸は各々、繰り返し単位のアミノ酸の１９％を占める。さらに、ＭｃＢｒｉｄｅ  ＪＷらは、Ｏｋｌａｈｏｍａが、５４８〜６８８個のアミノ酸のタンパク質をコードする糖タンパク質遺伝子（２，０６４ｂｐ）（わずか６１ｋＤａおよび７３ｋＤａの予測分子量であるが、それぞれ１４０ｋＤａ（Ｐ１４０）の電気泳動移動度である）を有することを見出した。１４０ｋＤａのタンパク質遺伝子は、ほぼ同一で直列に配置された１０８ｂｐの繰り返し単位を１４個有する。Ｐ１４０遺伝子（１，６２０ｂｐ）の１４個の繰り返し領域（７８％）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで発現された。その組換えタンパク質は、そのアミノ酸配列によって予測される分子量よりも１．６倍〜２倍大きい範囲の分子量を示した。その組換えタンパク質に対する抗体は、Ｅ．ｃａｎｉｓ  Ｐ１４０と反応する。炭水化物がＥ．ｃａｎｉｓ組換えタンパク質で検出された。炭水化物組成分析により、組み換えタンパク質においてグルコース、ガラクトースおよびキシロースが同定された。１つの部位にのみＮ結合（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）グリコシル化が存在すること、Ｎ−グリコシダーゼ  Ｆの効果の喪失、Ｐ１２０およびＰ１４０の繰り返し単位においてそれぞれ７０および１２６のＳｅｒ／Ｔｈｒグリコシル化部位が存在すること、ならびにタンパク質に対する炭水化物の高いモル比は、グリカンがＯ結合型であり得ることを示唆する（ＭｃＢｒｉｄｅ  ＪＷら、Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０００年１月、６８（１）：１３−１８）。Ｏｋｌａｈｏｍａは、１２．５％ウシ胎仔血清と２００ｍＭのＬ−グルタミンとを含む最小必須培地中のイヌマクロファージ細胞株ＤＨ８２で増殖し得る（Ｂｏｗｉｅ，Ｍ．Ｖ．ら、Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｆｏｒ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅａｒｔｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９９年３月；６（２）：２０９−１５）。ＦＬ株との血清学的な比較により、１００％の特異性および８７．５％の感受性が明らかになった（Ｄａｗｓｏｎ  １９９１、前出）。１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づき、９９．９パーセントの類似性が、株Ｅｂｏｎｙ（Ｍａｔｈｅｗ  １９９６）、Ｋａｇｏｓｈｉｍａ  １（Ｕｎｖｅｒ  Ａら、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ，Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｌａｔｙｓ，ａｎｄ  Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃａｎｉｎｅ  ｂｌｏｏｄ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００３年６月；９９０：６９２−８）、およびＶｅｎｅｚｕｅｌａ（Ｕｎｖｅｒ  Ａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｏｇｓ，ｔｉｃｋｓ，ａｎｄ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｉｎ  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１年８月；３９（８）：２７８８−９３）によって見出されている。
【００２０】
ＮＣＳＵ単離体であるＤｅｍｏｎ、ＤＪおよびＦｕｚｚｙ、ならびに株Ｊａｋｅについて、これらすべてが保存された主要な免疫反応性の２８ｋＤａのタンパク質遺伝子（米国特許第６，４５８，９４２号）を有する。ＤＪ、ＦｕｚｚｙおよびＪａｋｅはまた、ｏｍｐ−１同義遺伝子ファミリーに属するｐ  ３０遺伝子（米国特許第６，４３２，６４９号）を有することが開示されている。Ｊａｋｅは、Ｆｌｏｒｉｄａ株よりも毒性であると考えられる（Ｂｒｅｉｔｓｃｈｗｅｒｄｔ  １９９８、前出）。
【００２１】
Ｋａｇｏｓｈｉｍａ  １の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列のほぼ全体が、９９．９パーセントの配列同一性で、Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｅ．ｃａｎｉｓ株およびＶｅｎｅｚｕｅｌａ  Ｅ．ｃａｎｉｓ株由来の配列とほとんど同じである（１，３８７塩基対のうち１塩基対の相違）ことが見出された（Ｕｎｖｅｒ  ２００３、前出）。Ｋａｇｏｓｈｉｍａ  １株に対するその高い配列同一性に加えて、そしてそのことと同様に、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａ株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づき、Ｏｋｌａｈｏｍａ株と９９．９パーセント同じである（Ｕｎｖｅｒ  ２００１）。
【００２２】
好ましい実施において、Ｅ．ｃａｎｉｓバクテリンは、ウシ胎仔血清と、グルコースとグルタミンとを補充したＲＰＭＩ１６４０を含む培地に補助されたイヌ単球マクロファージ細胞株（時々、連続イヌマクロファージ細胞またはイヌマクロファージ細胞株と称される）中で増殖される。好ましくは、これらの細胞は、補助培地（１０％までのウシ胎仔血清、０．５％ラクトアルブミン加水分解物、３０μｇ／ｍＬ  Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｂ、１１０μｇ／ｍＬ  ピルビン酸ナトリウム、２．５ｍｇ／ｍＬ  炭酸水素ナトリウム、４ｍｇ／ｍＬ  グルコース、６ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−グルタミン、０．５５ｍｇ／ｍＬ  硫酸マグネシウムを補充したＲＰＭＩ１６４０、ＯｐｔｉＭＥＭまたはＡＩＭ  Ｖであり得、好ましくはＲＰＭＩ１６４０であり得る）で培養され、そして１×１０４ＴＣＩＤ５０以上の力価（組織培養感染用量）を達成するように、９５日目まで、好ましくは３５日目まで、最も好ましくは約５〜１０日間培養され、次いで、この培養物は収集され、不活性化のために処理される。
【００２３】
次いで、このようにして得られたＥ．ｃａｎｉｓバクテリンは、従来の不活性化手段によって不活性化され得る。例えば、化学的な不活性化剤（例えば、バイナリーエチレンイミン（ｂｉｎａｒｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、β−プロピオラクトン、ホルマリン、マーシオレート、グルタルアルデヒド、ドデシル硫酸ナトリウムなど、またはそれらの混合物）用いる化学的不活性化であり、ホルマリンが好ましい不活性化剤である。バクテリンはまた、加熱または紫外線の存在下でのソラレンによって不活性化され得る。
【００２４】
不活性化されたＥ．ｃａｎｉｓバクテリンの有効な免疫化量は、選択される株に依存して変化し得、防御免疫反応を惹起するために十分な任意の量であり得る。投薬単位が少なくとも約１×１０４ＴＣＩＤ５０の不活性化されたＥ．ｃａｎｉｓバクテリンを含む量が適切である。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体応答誘導因子」は、体液性免疫応答を増強し得る任意の化合物または化合物の組み合わせを指す。代表的な例は、エチレン無水マレイン酸（ＥＭＡ）コポリマー、スチレンと、アクリル酸およびメタクリル酸の混合物とのコポリマー（例えば、ＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）Ａ−６４０（Ａｖｅｃｉａ  Ｎｅｏ  Ｒｅｓｉｕｓ，Ｆｒａｎｋｆｏｒｔ，ＩＮ））、水酸化アルミニウムなど、あるいはそれらの混合物である。本発明の抗体応答誘導因子は、好ましくは、ＥＭＡとＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）との混合物である。ＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）は、水系のアクリルポリマーおよびコポリマーに対するＡｖｅｃｉａ  ＢＶ（Ｓｌｕｉｓｗｅｇ  １２  Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １２３  ＮＬ−５１４０  ＡＣ  Ｗａａｌｗｉｌｋ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の登録商標である。数字のＡ６４０は、そのグレードを示す。ＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）Ａ６４０は、非結合性の水性スチレン化アクリルコポリマーであり、約７．５のｐＨ、約１００ｃｐｓの粘度（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ２５℃）、重量で４０パーセントの固体を含んで供給された場合に１ガロンあたり８．６ポンドの重量、１．３０ｍｇ／Ｌの比重、４４℃のガラス転移温度（Ｔｇ）、４０℃の最低フィルム形成温度（ＭＦＦＴ）、および５０の酸価（不揮発性）を有する。具体的には、ＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）Ａ６４０は、スチレンとの非結合性の水性アクリルコポリマーである。より具体的には、ＮＥＯＣＲＹＬ（登録商標）Ａ６４０は、スチレンと、アクリル酸およびメタクリル酸の混合物とのコポリマーのラテックスエマルジョンである。
【００２６】
本発明において有用なＥＭＡコポリマーの適切なグレードは、ＥＭＡ−３１（Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（これは、酸官能コポリマーである）のような直鎖状のエチレン−無水マレイン酸コポリマーである。これらのコポリマーは水溶性であり、以下の代表的な特性を有する微細で白色の自由に流れる粉末である：約１７０℃の軟化点、約２４７℃の分解温度、２．３のｐＨ（１％溶液）、および０．９ｇ／１００ｍＬ〜１．２ｇ／１００ｍＬの比粘度（ジメチルホルムアミド中の１％溶液）。
【００２７】
用語「細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答誘導因子」は、本明細書中で使用される場合、細胞免疫応答を増強し得る任意の薬剤または薬剤の組み合わせを表す。代表的な例は、生物製剤（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）などの弱毒化株）、およびＴｈ１関連サイトカイン（例えば、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、γインターフェロンなどであり、好ましくはＩＬ−１２）；あるいは水中油エマルジョン物質（例えば、パラフィン水中油エマルジョン様のＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）ＳＡ（ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｓｔｏｎ，ＮＥ））、ＳＰ油状物（スクアレンの組成物であるＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ１２１およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（スクアレンはＶＷＲ／Ｋｏｄａｋ．Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ製であり、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ１２１はＢＡＳＦ，Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪから入手可能）、ＳＡＦ−１（Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ−１、ムラミルジペプチド（ｄｉｐｅｔｉｄｅ）のスレオニルアナログの組成物、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ１２１およびスクアレン（これは、Ｂｙａｒｓ，Ｎ．Ｅ．およびＡｌｌｉｓｏｎ，Ａ．Ｃ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，５（３）：２２３−２８に記載される）））などであり、好ましくは、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）ＳＡであり、より好ましくは、水中油エマルジョンである。ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）は、乳化された水中油の性質の獣医学的抗原アジュバントに対するＭｏｄｅｒｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，５４０４  Ｍｉｌｌｅｒ  Ａｖｅ．Ｏｍａｈａ，Ｎｅｂｒａｓｋａ  ６８１２７，Ｕ．Ｓ．Ａ．の登録商標である。ＳＡの文字は、そのグレードを示す。パラフィンで乳化された油状アジュバントベースであるＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）ＳＡは、Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）（２０％  最終濃度）と混合された場合、乳白色であり、２５〜５０ｃｐｓの粘度であり（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＬＶ粘度計、スピンドル＃１８、３０ｒｐｍ）、そして８ミクロン以下の油相の液滴の少なくとも８０％を占める。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）は、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロックコポリマーに対するＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録商標であり、Ｌ１２１の数字はそのグレードを示す。
【００２８】
アジュバント系の免疫原性を刺激する量は、抗体応答誘導因子、ＣＭＩ誘導因子、Ｅ．ｃａｎｉｓバクテリン成分、潜在的な感染曝露の程度、ワクチン組成物の投与方法、イヌの成長段階およびサイズなどに依存して変化し得る。さらに、アジュバント系の免疫原性を刺激する量は、免疫剤のＥ．ｃａｎｉｓバクテリンに対する免疫応答を増強するのに十分である量である。一般的に、約１％〜６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、好ましくは約４％ｖｏｌ／ｖｏｌの抗体応答誘導因子、および約３％〜７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、好ましくは約５％ｖｏｌ／ｖｏｌのＣＭＩ誘導因子が適切である。
【００２９】
本発明のワクチン組成物において使用するのに適切な薬理学的に受容可能なキャリアは、獣医学的薬学的組成物に適切な任意の従来の液体キャリアであり得、好ましくは、組織培養培地において使用するのに適切であるような平衡塩溶液である。
【００３０】
活性成分として不活性化されたＥ．ｃａｎｉｓバクテリンに加えて、本発明のワクチン組成物が他の活性成分（例えば、狂犬病ウイルス、ライム病（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、イヌジステンパーウイルス、イヌパルボウイルス、イヌアデノウイルス、イヌコロナウイルス、ジアルジア属；ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（例えば、ｓｅｒｏｖａｒｓ  ｃａｎｉｃｏｌａ、ｉｎｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、ｐｏｍｏｎａ、ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａまたはｂｒａｔｉｓｌａｖａなど）、あるいはそれらの組み合わせに指向性の抗病原性成分）もまた含み得ることが企図される。
【００３１】
本発明の１つの実施形態において、本発明の不活性化されたＥ．ｃａｎｉｓバクテリン成分は、公知の技術（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９７４，２５２，２５２−２５４またはＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９７８，１２０，１１０９−１３に記載される技術）を使用して、リポソームに組み込まれ得る。本発明の別の実施形態において、本発明の不活性化されたＥ．ｃａｎｉｓバクテリン成分は、適切な生物学的化合物（例えば、多糖類、ペプチド、タンパク質などまたはそれらの組み合わせ）に結合され得る。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物は、投与を容易にし、投薬の均一性を確実にするように、単位投薬形態中に処方され得る。ここで、投薬単位は、ワクチン組成物に関連する場合、動物に対する単回投薬量として適切な物理学的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされるアジュバント系およびキャリアもしくはビヒクルに関して、所望の免疫原性効果をもたらすように計算された所定量のＥ．ｃａｎｉｓバクテリンを含む。
【００３３】
本発明のワクチン組成物は、非経口投与（例えば、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、皮内投与など）され得、好ましくは、皮下投与または皮内投与され、より好ましくは、皮下投与される；あるいは上記組成物は、経口投与または鼻腔内投与され得る。
【００３４】
したがって、本発明はまた、イヌにおいてイヌエールリヒア症を予防または改善するための方法を提供し、この方法は、上記イヌに上記のような安全かつ有効なワクチン組成物を投与する工程を包含する。
【００３５】
好ましい実施において、本発明のワクチン組成物は、Ｅ．ｃａｎｉｓバクテリンのキャリアに対する潜在的曝露の時間によって決定されたスケジュールに従って有効量で、非経口投与、経口投与、または鼻腔内投与され、好ましくは、非経口投与され、より好ましくは、皮下投与される。この方法において、処置された動物は、天然の曝露の前に、免疫を構築するための時間を有する。例えば、代表的な処置スケジュールとしては、潜在的曝露の少なくとも５週間前の非経口投与、好ましくは皮下注射が挙げられ得る。少なくとも２回の投与が好ましく、例えば、第一の投与は処置動物の潜在的曝露の少なくとも５週間前であり、第二の投与は処置動物の潜在的曝露の少なくとも２週間前である。
【００３６】
Ｅ．ｃａｎｉｓバクテリンの病原機構および宿主であるイヌの防御機構を効果的に研究および評価するために、そして、それによって、ワクチン技術を進歩させ、ワクチン製品を改善するために、効果的なチャレンジモデルが創られなければならない。イヌエールリヒア症についての異なるチャレンジモデルが知られてはいるが、高パーセンテージの試験動物に、持続する重篤なイヌエールリヒア症に一般的に関連する臨床的症状（例えば、粘液膿性の眼漏、脱水症など）を示させるのに有効なものはない。したがって、より良い、より一貫して有効なチャレンジモデルが、ワクチンおよび薬剤の評価、ならびにＥ．ｃａｎｉｓバクテリンおよびそれによって引き起こされる疾患の研究のために必要とされている。
【００３７】
驚くべきことに、特に効果的なＥ．ｃａｎｉｓチャレンジが、生きたＥ．ｃａｎｉｓ菌の毒性培養物を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のチャレンジストックを試験動物に対して投与することでその試験動物において得ることができることがここで見出された。この毒性Ｅ．ｃａｎｉｓ培養物は、Ｅ．ｃａｎｉｓ  Ｅｂｏｎｙ、Ｅ．ｃａｎｉｓ  ＢｒｏａｄｆｏｏｔなどのようなＥ．ｃａｎｉｓ微生物（好ましくは、Ｅ．ｃａｎｉｓ  Ｅｂｏｎｙ）を宿主中で繰り返し継代し；その宿主の血液サンプルからＰＢＭＣを分離して；そしてその分離したＰＢＭＣを２０％ウシ胎仔血清および１０％ジメチルスルホキシドと混合することで調製される。したがって、本願発明はまた、試験動物における臨床上のイヌエールリヒア症の誘導のための方法もまた提供する。この方法は、有効量のＥ．ｃａｎｉｓチャレンジストックをその動物に投与する工程を包含し、このチャレンジストックは、本質的には、末梢血単核細胞中の毒性のＥ．ｃａｎｉｓ微生物からなる。Ｅ．ｃａｎｉｓ  Ｂｒｏａｄｆｏｏｔ（時折、Ｅ．ｃａｎｉｓ  ＢＦまたはＢｒｏａｄｆｏｏｔと呼ばれていた）、およびＥ．ｃａｎｉｓ  Ｅｂｏｎｙ（時折、Ｅｂｏｎｙと呼ばれる）の各々の生存培養物が、特許手続のための微生物寄託に関するブタベスト条約の条項および要件のもとＡＴＣＣに寄託されており（２００４年２月１１日）、上述の生存培養物は、ＡＴＣＣ寄託番号が与えられており、それぞれ、Ｂｒｏａｄｆｏｏｔ株についてはＰＴＡ−５８１１、Ｅｂｏｎｙ株についてＰＴＡ−５８１２である。
【００３８】
現実的な実施において、Ｅ．ｃａｎｉｓ微生物の毒性は、宿主動物内で継代が繰り返されることにより増大する。その宿主動物由来の全血サンプルを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）１０７７のような勾配媒体（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）中に置き、遠心分離し、そしてＰＢＭＣ層を分離した。このようにして得られたＰＢＭＣを、２０％ウシ胎仔血清および１０％ジメチルスルホキシドとともに混合して、チャレンジストックの一貫した継続的な供給を提供するために、貯蔵用に液体窒素中で凍結させた。このチャレンジストックを、試験動物に対して投与する前に緩衝生理食塩水溶液で希釈できる。
【００３９】
本願発明をより明瞭に理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、単に、例示的なものであり、決して、本願発明の範囲およびその根底に存在する原理を限定するものとして理解すべきではない。実際、本願発明における種々の改変は、本願明細書において示され、記載されたものに加えて、これ以降に示した実施例ならびにこれまでの記載から当業者にとって明確なものとなる。このような改変物も、添付の特許請求の範囲にうちに包含されることが企図される。
【００４０】
別段示されない限り、全ての部は、重量部である。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
（毒性のＥ．ｃａｎｉｓチャレンジモデルの評価）
（Ａ．チャレンジストックの調製）
生きているＥ．ｃａｎｉｓ  Ｅｂｏｎｙ株細菌を、イヌにおいて繰り返し継代する。感染したイヌ由来の全血サンプルを、２５００×ｇで１５分間遠心分離する。バフィコートを回収し、リン酸緩衝化溶液（ＰＢＳ）で希釈し、次いでＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）１０７７上で重層（ｌａｙｅｒ）し、その重層した物質を４００×ｇで４５分間遠心分離する。ＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳで洗浄する。その洗浄したＰＢＭＣを２０％ウシ胎仔血清および１０％ジメチルスルホキシドと混合し、液体窒素中で凍結させる。使用前に、チャレンジストックを、１：３または１：４のチャレンジストック：緩衝化生理食塩水溶液の最終希釈に、緩衝化生理食塩水溶液で希釈する。
【００４２】
（Ｂ．チャレンジ方法）
この評価では、８ヶ月齢〜１２ヶ月齢の年齢にわたる２０匹のイヌを、２群に無作為化する。このイヌに、１ｍＬの希釈チャレンジストックを、皮下経路によりチャレンジする。一方の群には、１：３希釈のチャレンジストックをチャレンジし、残りの群には１：４希釈のチャレンジストックをチャレンジする。チャレンジ後、計５６日間疾患の臨床的徴候（血小板減少症を含む）をモニターするために、そのイヌを観察し、血液サンプルを１週間あたり３回採取する。
（Ｃ．観察）
観察された臨床的徴候としては、粘液膿性の鼻汁および粘液膿性の眼漏、うつ病、脱水症、リンパ節症ならびに角膜浮腫が挙げられる。粘液膿性の眼漏および脱水症が、最も頻繁に観察される徴候である。粘液膿性の眼漏および脱水症は、疾患の進行に特異的であり、その疾患の重篤度を間接的に反映する。各臨床的徴候について観察時点ごとの１回の発生を記録し、群の間の総発生率を比較する。観察時点で、粘液膿性の眼漏は５３％（１：３希釈）および３５％（１：４希釈）であり、脱水症は４４％（１：３希釈）および３０％（１：４希釈）であった。
【００４３】
この評価において、有意に高い死亡率もまた観察した。死亡の誘導が、そのチャレンジストックで使用されたＥ．ｃａｎｉｓバクテリンの強力な病原の最も著しい指標である。１：３希釈処置については、１００％のイヌが、エールリヒア症の症例定義を満たし、１：４希釈処置については、８０％のイヌがエールリヒア症の症例定義を満たした。このデータを、表Ｉに示す。
【００４４】
直腸温度を、エールリヒア属感染の指標として記録した。感染したイヌのほとんどが、直腸温度上昇のいくらかの発生を有した。このデータを、表ＩＩに示す。
【００４５】
血小板減少症（２００，０００／μｌ未満の血小板数）を、チャレンジ後（ＤＰＣ）約１２日から開始して観察期間の残りの間にわたって観察した。このデータを、表ＩＩＩに示す。
【００４６】
（Ｄ．結論）
上に記載されるチャレンジモデルは、イヌにおけるイヌエールリヒア症の重篤な臨床的徴候をもたらし、イヌエールリヒア症に対する処置のさらなる研究および評価における使用のためのエールリヒア症疾患の症例定義を提供する。イヌエールリヒア症の臨床的症例定義は、死亡、粘液膿性の眼漏の少なくとも３日間連続での観察、および／または脱水症の少なくとも３日間連続での観察によって定義される。
【００４７】
【表１】
2008500962.tif 000002
【００４８】
【表２】
2008500962.tif 000003
【００４９】
【表３】
2008500962.tif 000004
（実施例２）
（ＢＣＧをアジュバントとした（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）Ｅ．ｃａｎｉｓバクテリンによって誘導される有効性の評価）
ＢＣＧ（弱毒化ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓのオートクレーブ調製物）は、細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）の強力な誘導因子として認識されている。相乗的なＣＭＩ効果を決定するために、Ｅ．ｃａｎｉｓバクテリンを、異なる濃度レベルのＢＣＧをアジュバントとした。以前の研究により、従来の（抗体応答誘導性）イヌアジュバント（例えば、ＥＭＡおよびＮｅｏｃｒｙｌ（登録商標））のみをアジュバントとしたＥ．ｃａｎｉｓバクテリンは、やや強力な保護性免疫を誘導することができるだけであることが実証された。
【００５０】
（Ａ．材料および方法）
それぞれ７匹のイヌの３つのワクチン接種群および６匹のイヌのコントロール群を使用した。このワクチンは、以下のアジュバントの組み合わせをアジュバントとした５ｌｏｇＴＣＩＤ５０（不活性化前の力価）のＥ．ｃａｎｉｓ  Ｅｂｏｎｙ株バクテリンを含む。ワクチンＡは、ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉバクテリン（ＢＢＢ）およびＥＭＡ／Ｎｅｏｃｒｙｌ（登録商標）を含んだ。ワクチンＢは、ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉバクテリン（ＢＢＢ）、ＥＭＡ／Ｎｅｏｃｒｙｌ（登録商標）および１００μｇ／用量のＢＣＧを含んだ。ワクチンＣは、ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉバクテリン（ＢＢＢ）、ＥＭＡ／Ｎｅｏｃｒｙｌ（登録商標）および１．０ｍｇ／用量のＢＣＧを含んだ。この３つのワクチンの他の構成成分は同一であった。イヌのコントロール群にはワクチン接種しなかった。
【００５１】
２７匹のイヌを４群に無作為化した。それぞれ７匹のイヌの最初の３群に、ワクチンＡ、ワクチンＢまたはワクチンＣで２回、皮下経路を通して２１日間隔でワクチン接種した。６匹のイヌの第四の群は、コントロールとして機能し、ワクチン接種しなかった。２回目のワクチン接種から１６日後、全てのイヌに毒性のＥ．ｃａｎｉｓをチャレンジし、臨床的徴候、直腸温度および血小板数の変化について、計５６日間観察した。
【００５２】
（Ｂ．結果および考察）
結果を表ＩＶにまとめる。毒性のＥ．ｃａｎｉｓのチャレンジから５６日後、ワクチンＡ接種群では、７匹中４匹（５７％）のイヌが血小板減少症であり、高い直腸温度を有した。同じ結果を、ワクチンＢ接種群において観察した。ワクチンＣ群におけるイヌの中では、ワクチン接種された７匹中２匹（２８．５％）しか、研究の間、血小板減少症および高い直腸温度を有さなかった。コントロールのイヌ６匹中５匹（８３％)が、血小板減少症および高い直腸温度を有した。各群の臨床的徴候は混ざっており、群の間で違いを有さなかった。体温および血小板数の変化が、Ｅ．ｃａｎｉｓｉ感染およびエールリヒア症の代表的な徴候であった。
【００５３】
【表４】
2008500962.tif 000005
１ＢＢＢ＝Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ製品系列から供給されるｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉバクテリン。
２Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯにより製造された。
３ＡＶＥＣＩＡ  Ｎｅｏ  Ｒｅｓｉｕｓ，Ｆｒａｎｋｆｏｒｔ，ＩＮにより製造された。
４ＢＣＧ＝Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ，これは、弱毒化ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓである。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから供給される。
【００５４】
この研究からの結果は、従来の（抗体応答誘導性）アジュバント（ＥＭＡ＋Ｎｅｏｃｒｙｌ（登録商標））単独をアジュバントとしたワクチンは、保護性ではなかったことを明確に示した。ワクチンが低用量のＢＣＧ（例えば、１００μｇ／用量）をアジュバントとした場合も、同じことが当てはまる。しかし、１ｍｇ／用量のＢＣＧをアジュバントとした場合、そのワクチンは保護性になる。従って、免疫応答を強めるのに十分な濃度のＣＭＩ誘導因子（ＢＣＧ）によって誘導される保護性免疫は、Ｅ．ｃａｎｉｓバクテリンワクチン効力をもたらす。
【００５５】
（Ｃ．結論）
ＣＭＩは、Ｅ．ｃａｎｉｓ感染からイヌを保護するのに必要である。従来のイヌアジュバントのみをアジュバントとしたＥ．ｃａｎｉｓバクテリンは、インビボで保護性免疫を誘導するのに効果的ではない。
【００５６】
（実施例３）
（不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓワクチン組成物の調製）
Ｅ．ｃａｎｉｓバクテリンの２つの株（ＥｂｏｎｙおよびＢｒｏａｄｆｏｏｔ）を、５％〜７％ウシ胎仔血清、２％グルコースおよび２ｍｍｏｌグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０含有培地によって補助されるＤＨ８２細胞中で、５〜１４日間それぞれ培養する。得られた培養物を、１×１０４ＴＣＩＤ５０以上の力価で収集する。収集物を滴定し、溶解し、次いで０．１％ホルマリン溶液を加え、３６±２℃で２４〜４８時間の間インキュベートし、別の分の０．１％ホルマリンを加え、そして３６±℃で２４〜４８時間二回目のインキュベートをすることによって、不活性化する。Ｅ．ｃａｎｉｓの２つの不活性化株を、１×１０４．５ＴＣＩＤ５０の等しい投与量で、以下に記載されるアジュバント系と一緒に混合して、ワクチン組成物Ａを得る。
【００５７】
【表４Ａ】
2008500962.tif 000006
１Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯにより製造された。
２ＡＶＥＣＩＡ  Ｎｅｏ  Ｒｅｓｉｕｓ，Ｆｒａｎｋｆｏｒｔ，ＩＮにより製造された。
３ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｌｓｔｏｎ，ＮＥにより製造された。
４ＬＴＩ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹにより製造された最小必須培地（ＭＥＭ）。
【００５８】
（実施例４）
（Ｅ．ｃａｎｉｓワクチン組成物Ａにより誘導された免疫の１２ヶ月間の評価）
この評価において、１５〜１６週齢のビーグル犬を、１５匹のイヌのコントロール（ワクチン接種しない）群および２７匹のイヌのワクチン接種群の２群に分ける。ワクチン接種群に、１ｍＬ用量の実施例３において記載されたワクチン組成物Ａを、２１日間隔で２回与える。ワクチン接種から１２ヵ月後、全ての試験動物を、実施例１に記載されるようなＥ．ｃａｎｉｓ感染末梢血単核細胞（ｐｍｂｃ）の確立した凍結チャレンジプールの１：３希釈で、皮下経路によりチャレンジする。その試験動物をチャレンジ後の日数（ＤＰＣ）で１２日目から、一週間当たり３回観察する。動物福祉および所内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従って、瀕死かまたは身体状態の悪いいずれの試験動物も、国家資格を有する獣医師によって綿密に試験する。
【００５９】
血清サンプルを、Ｋ−ＥＬＩＳＡを使用してＥ．ｃａｎｉｓ抗体について評価し、ワクチン接種後の免疫応答を定量化する。その血清サンプルは、二連で、Ｅ．ｃａｎｉｓ細胞全体の抽出タンパク質でコーティングされたウェルに加える。次いで、ペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗イヌ免疫グロブリン（ＩｇＧ）を各ウェルに加え、プレートを３６±２℃で３０分間インキュベートする。結合していない結合体を除去後、そのプレートをＡＴＢＳ置換システム（ＡＴＢＳ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して現像する。そのプレートを、運動モードを使用して、４０５〜４９０μｍで２０分間、３５秒間隔で読み取る。血清学的な結果を表Ｖに示す。この表でＤＰＶ１は、ワクチンの最初の投薬後の日数を示し；ＤＰＶ２はワクチンの２回目の投薬後の日数を示し；ＭＰＶ２はワクチンの２回目の投薬後の月数を示し；そしてＤＰＣはチャレンジ後の日数を示す。
【００６０】
（観察）
表Ｖにおける血清学的データから理解し得るように、ワクチン接種群は、コントロール（非ワクチン接種）群に対して、抗体の有意な増加を示した。そのワクチン接種群とコントロール群との間の抗体における有意な差異は、チャレンジ後にもまた観察される。血清学的データに加えて、ヘマトクリット値、血小板数、直腸温度および毎週の体重を記録する。ヘマトクリットパーセンテージは、コントロール群と比較してワクチン接種群において有意に極めて低下した。血小板数は、チャレンジ後４４日にコントロール群と比較してワクチン接種群において有意に極めて低下した。体重減少は、コントロールと比較した場合、ワクチン接種群において有意に減少した。コントロール群において、８７％がイヌエールリヒア症に対する症例定義（死亡を含む）を満たした。ワクチン接種群では、４４％が、５６日の臨床的観察期間の間、イヌエールリヒア症に対する症例定義を満たした。
【００６１】
（結論）
実施例３のＥ．ｃａｎｉｓワクチン組成物は、イヌにおいて臨床的なイヌエールリヒア症を有意に減少させた。このワクチンの１ｍＬ用量の２回の投与は、少なくとも１２ヶ月間の期間にわたって免疫を誘導する。イヌにおけるＥ．ｃａｎｉｓに対する抗体の顕著な増加が、実施例３のワクチン組成物の投与によって得られる。
【００６２】
【表５Ａ】
2008500962.tif 000007
【００６３】
【表５Ｂ】
2008500962.tif 000008
（実施例５）
（不活性化Ｅ．ｃａｎｉｓワクチンへの応答における細胞媒介性免疫の評価）
イヌＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを使用して、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ（Ｅ．ｃａｎｉｓ）バクテリンでワクチン接種したイヌにおけるＩＬ−１２およびＩＦＮ−γのレベルを評価する。コントロールのイヌとの比較に際して、ワクチン接種されたイヌから単離された末梢血単核細胞によって産生される、より多数のＩＬ１２およびＩＦＮ−γスポットは、ＣＭＩ応答がＥ．ｃａｎｉｓ感染に対して保護性の役割を果たし得ることを示す。
【００６４】
（Ａ．材料および方法）
イヌの２つの群をこの研究において使用する：Ｅ．ｃａｎｉｓバクテリンを与えたワクチン接種群およびＥ．ｃａｎｉｓバクテリンを与えなかったコントロール群。全血を、Ｅ．ｃａｎｉｓバクテリンでの最初のワクチン接種後に、ワクチン接種されたイヌおよびコントロールのイヌから抜く。コントロールのイヌおよびワクチン接種されたイヌ由来の全血サンプルを、無菌の静脈穿刺により１０ｍＬのＥＤＴＡチューブ内に収集する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配での遠心分離により単離する。単離後、ＰＢＭＣを計数し、細胞濃度を各サンプルについて決定する。次いで、単離したＰＢＭＣを、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにすぐに使用する。
【００６５】
イヌＰＢＭＣを培養するために使用される完全培養培地は、等量のＡｉｍ  Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；カタログ番号１２０５５−０８３）およびＥｘ−Ｃｅｌｌ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ；カタログ番号１４１６１０−５００Ｍ）、１０％熱不活性化ウマ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ；カタログ番号ＳＨ３００７４．０３）および１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンからなる。
【００６６】
（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）
（Ｅｌｉｓｐｏｔプレートの調製）
（ＩＬ−１２プレート）
Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を７０％エタノールで予め濡らし、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ−Ｖｏｇｔリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄し、１００μＬ／ウェルのマウス抗ヒトＩＬ−１２抗体（１０μｇ／ｍＬ；Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）でコーティングし、カーボネート緩衝液（ｐＨ９．６）に希釈し、３７℃、５±２％ＣＯ２で２時間インキュベートする。次いで、プレートをＤＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、完全Ａｉｍ  Ｖ／ＥｘＣｅｌｌ培地で、３６℃、５±２％ＣＯ２にて最低２時間ブロックする。
【００６７】
（ＩＦＮ−γプレート）
イヌＩＦＮ−γ検出のためのＥｌｉｓｐｏｔプレートは、イヌＩＦＮ−γに対して特異的な抗体を使用して、イヌＩＬ−１２プレートと同様の様式で調製する。この研究で使用するプレートは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号ＥＬ７８１）から購入し、製造者の指示に従って調製する。これらのプレートを、抗イヌＩＦＮ−γポリクローナル抗体で予めコーティングする。
【００６８】
（抗原の調製）
６つの異なる細胞調製物を初めに抗原として使用して、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ産生を刺激する。細胞調製物としては：
１．生きているＥ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞
２．Ｅ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞溶解物（細胞をホモジナイズにより溶解した）
３．ホルマリン処理によって不活性化されたＥ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞溶解物
４．生きている未感染ＤＨ８２細胞単独
５．未感染ＤＨ８２細胞溶解物
６．ホルマリン処理によって不活性化された未感染ＤＨ８２細胞溶解物、
が挙げられる。
【００６９】
最初の３つの調製物を使用して、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ産生を刺激する。残りの３つの調製物は、試験においてネガティブコントロールとして使用する。アッセイの日に、生きているＥ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞および未感染ＤＨ８２細胞を収集し、計数し、そして細胞濃度を決定する。所望の数の生きている細胞および等価な細胞数の（ホルマリン処理されているかまたはホルマリン処理されていない）細胞溶解物を、完全Ａｉｍ  Ｖ／Ｅｘｃｅｌｌ培地に再懸濁し、アッセイに適用する。マイトジェンであるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｃ０４１２）およびＰｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＰＨＡ）由来のレクチン（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｌ−４１４４）を、完全培地中で調製し、アッセイのためのポジティブコントロールとして使用する。
【００７０】
（Ｅ．ｃａｎｉｓおよびＰＢＭＣのインキュベート）
２時間の培地のブロッキング後に、抗体でコーティングされたプレートを、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。生きているＥ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞および未感染ＤＨ８２細胞、細胞溶解物、培地および適切な希釈度のポジティブコントロールを、１ウェル当たり１５０μＬの容量で、抗体でコーティングされたウェルに加える。完全培地中で所望の細胞濃度に希釈されている希釈ＰＢＭＣおよび５０μＬ／ウェルの細胞培養物を、適切なウェルに加える。次いで、このプレートを、実施されるアッセイに依存して、３６℃±２℃、５±２％ＣＯ２にて２０〜５０時間インキュベートする。
【００７１】
（プレートの現像）
（ＩＬ−１２プレート）
インキュベート後、上記細胞を、ＤＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄することにより除去する。ビオチン化検出抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ；カタログ番号３４５０−６）を、ＤＰＢＳ＋０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、１．０μｇ／ｍＬで希釈し、使用前に０．２μｍのシリンジフィルターを通して濾過する。１００μＬの検出抗体を、適切なウェルに加える。このプレートを、３６℃±２℃、５±２％ＣＯ２にて３時間インキュベートする。検出抗体を除去し、プレートをＤＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄する。プレートを、ＤＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中に１：１０００で希釈された１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；カタログ番号１４−３０−００）と一緒に、３６℃、５±２％ＣＯ２にて１時間インキュベートする。
【００７２】
インキュベートの間、基質溶液を調製する。ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチル（Ｅｔｈｙ）−カルバゾール，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号Ｄ４２５４）の２０ｍｇ錠１つを、ガラスエルレンマイヤー（Ｅｒｙｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコ中で、２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＮＦ）に溶解する。一旦溶解したら、５８ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）および３０μＬの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を基質溶液に加え、次いで、これを使用前に０．４５μｍフィルターを通して濾過する。
【００７３】
上記プレートをＤＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いでＤＰＢＳのみで洗浄して、残った界面活性剤を除去する。１００μＬの基質溶液を各ウェルに加え、室温にて最大２０分間インキュベートする。基質溶液を除去することによりこの反応を停止させ、蒸留水でリンスする。そのプレートを室温で乾燥させ、スポット産生単位（ｓｐｏｔ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｕｎｉｔ）（ＳＰＣ）を、ＫＳ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ４．４ソフトウェアと一緒にＺｅｉｓｓ  Ｅｌｉｓｐｏｔ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｖｉｓｉｏｎ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、量、面積および強度について評価する。
【００７４】
（ＩＦＮ−γプレート）
インキュベート後、洗浄緩衝液（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で洗浄することにより細胞を除去する。ビオチン化検出抗体を、製造者の指示に従って希釈緩衝液１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に希釈し、使用前に０．２μｍシリンジフィルターを通して濾過する。１００μＬの検出抗体を適切なウェルに加える。次いで、プレートを、３６℃±２℃、５±２％ＣＯ２にて３時間インキュベートする。検出抗体を除去し、プレートを洗浄緩衝液で洗浄する。そのプレートを製造者の指示（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に従って希釈された１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ＡＰと一緒に、３６℃±２℃、５±２％にて１時間インキュベートする。
【００７５】
ストレプトアビジン−ＡＰとのインキュベート後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、１ウェル当たり１００μＬのＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）と一緒に、室温で２０分間インキュベートする。基質溶液を除去し、プレートを蒸留水でリンスして、反応を停止させる。そのプレートを室温で乾燥させ、スポット産生単位（ＳＰＣ）を、ＫＳ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ４．４ソフトウェアと一緒にＺｅｉｓｓ  Ｅｌｉｓｐｏｔ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｖｉｓｉｏｎ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、量、面積および強度について評価する。
【００７６】
（データ分析）
結果をスポット形成細胞（ｓｐｏｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ）（ＳＰＣ）として読み取り、実験の性質に依存して別々に表現する。データを提示するための３つの可能な方法：各ウェルにおける本来のスポット数、各サンプルについての各処理に対するスポットの平均数、および刺激指数（Ｓｔｉｍｕｌｕｓ  Ｉｎｄｅｘ）、が存在する。刺激指数は、刺激されていないウェル（細胞＋培地のみ）におけるスポットの平均数を、刺激されたウェルにおけるスポットの平均数で割ることによって計算する。
【００７７】
（Ｂ．結果および解釈）
この評価を実施し、Ｅ．ｃａｎｉｓワクチン接種したイヌから単離したＰＢＭＣ中のＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ分泌細胞の数を評価する。
【００７８】
この実験において、１匹のコントロールおよび３匹のワクチン接種したイヌを使用する。この実験の結果を、表ＶＩおよび表ＶＩＩに提示する。表ＶＩから、データは、コントロールのイヌ由来のＰＢＭＣによってＩＬ−１２が産生されなかったことと比較して、生きているＥ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞のみが、３匹のワクチン接種したイヌにおけるＰＢＭＣ中でＩＬ−１２産生を刺激したことを示す。この刺激はまた、Ｅ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞において用量に依存し、１：１０００希釈よりも１：１０希釈のＥ．ｃａｎｉｓストック（１×１０４細胞／ウェルに相当）にてスポット数が最大となる。ホルマリン処理されたかまたはされていないＥ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞溶解物、生きている未感染ＤＨ８２細胞、未感染ＤＨ８２細胞溶解物、およびホルマリン処理したＤＨ８２細胞溶解物は、検出可能なＩＬ−１２応答を何も生じなかった。ワクチン接種したイヌのうち２匹は、３匹目のワクチン接種したイヌよりも高い度合いで反応した。コントロールのイヌは、ポジティブなマイトジェン（ＰＨＡ）への低い応答を除いては、刺激に対する応答を示さなかった。
【００７９】
表ＶＩＩは、同じ４匹のイヌについてのＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔの結果を示す。ＩＬ−１２と同様、生きているＥ．ｃａｎｉｓＤＨ８２細胞が、ワクチン接種したイヌ三匹全ての中でＩＦＮ−γの最大の誘導を示した。この誘導もまた、Ｅ．ｃａｎｉｓ細胞数依存性であり、１：１０希釈に最大レベルがあり、１：１０００希釈に最小のレベルがある。Ｅ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞溶解物は、ワクチン接種したイヌに対してより低いスポット数をもたらした。ホルマリン処理した溶解物は、１：１０００希釈ではバックグラウンドを生じたが、１：１０希釈または１：１００希釈ではスポットを生じなかった。これは、残ったホルマリンの単核細胞活性に対する阻害効果に起因し得る。３つの調製物全てに対する未感染ＤＨ８２細胞は、生きているＥ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞と比較して、バックグラウンドのスポットのみをもたらした。個々のイヌの応答は、ＩＬ−１２  Ｅｌｉｓｐｏｔにおいて見られたものと同様だった。同じ２匹のワクチン接種したイヌは、３匹目のイヌよりも高い応答を示し、コントロールのイヌは、マイトジェン（ＣｏｎＡ）刺激のみに低い応答を示した。
【００８０】
この実験の結果は、生きているＥ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞のみが、ＰＢＭＣによるＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ両方の産生を誘導し得ることを示す。Ｅ．ｃａｎｉｓ感染ＤＨ８２細胞溶解物またはホルマリン処理した溶解物は、細胞活性についてのＴ細胞または単球に対する刺激効果が低いので、使用することができない。
【００８１】
（Ｃ．まとめ）
以下の表ＶＩおよび表ＶＩＩに示されるデータは、ＣＭＩがＥ．ｃａｎｉｓバクテリンでワクチン接種されたイヌの保護において役割を果たし得ることを実証する。ワクチン接種したイヌに対するＩＬ−１２およびＩＦＮ−γスポット数の増加は、Ｔ細胞および単球の活性化を示す。
【００８２】
【表６】
2008500962.tif 000009
【００８３】
【表７】
2008500962.tif 000010
【国際調査報告】
2008500962.tif 000011
2008500962.tif 000012
2008500962.tif 000013
2008500962.tif 000014
2008500962.tif 000015