(57)【要約】  単一ヌクレオチド多型およびハプロタイプを有する２型糖尿病の関連性が開示される。また開示されるのは、２型糖尿病を有するかまたは２型糖尿病を発達させる危険にある者を同定する上での診断適用、ならびに治療薬および治療の方法の発見である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＮＰが配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置する、２型糖尿病と関連したＳＮＰの危険にあるアレルを検出することを含む、個体における２型糖尿病に対する罹病性を決定する方法。
【請求項２】
前記ＳＮＰが配列番号１または配列番号１の相補体内に位置する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＳＮＰが配列番号２または配列番号２の相補体内に位置する、請求項１の方法。
【請求項４】
前記ＳＮＰが配列番号３または配列番号３の相補体内に位置する、請求項１の方法。
【請求項５】
前記ＳＮＰが配列番号４または配列番号４の相補体内に位置する、請求項１の方法。
【請求項６】
前記ＳＮＰが配列番号５または配列番号５の相補体内に位置する、請求項１の方法。
【請求項７】
前記ＳＮＰが配列番号６または配列番号６の相補体内に位置する、請求項１の方法。
【請求項８】
前記ＳＮＰが配列番号７または配列番号７の相補体内に位置する、請求項１の方法。
【請求項９】
配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ＳＮＰが配列番号１または配列番号１の相補体内に位置する、請求項９の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ＳＮＰが配列番号２または配列番号２の相補体内に位置する、請求項９の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ＳＮＰが配列番号３または配列番号３の相補体内に位置する、請求項９の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ＳＮＰが配列番号４または配列番号４の相補体内に位置する、請求項９の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ＳＮＰが配列番号５または配列番号５の相補体内に位置する、請求項９の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ＳＮＰが配列番号６または配列番号６の相補体内に位置する、請求項９の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ＳＮＰが配列番号７または配列番号７の相補体内に位置する、請求項９の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
試料を、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、厳密な条件下で第一ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションする第二ポリヌクレオチドと接触させることを含む、前記試料における２型糖尿病と関連したＳＮＰを有する該第一ポリヌクレオチドの存在または２型糖尿病を発達させる素因についてアッセイするための方法。
【請求項１８】
配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含有し、調節配列へ動作可能に連結された単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１９】
請求項１８のベクターを含む、リコンビナントホスト細胞。
【請求項２０】
請求項１９のリコンビナントホスト細胞を、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを有する単離されたポリヌクレオチドの発現に適した条件下で培養することを含む、該ポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドを産生するための方法。
【請求項２１】
試料を、前記試料中の配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを有する単離されたポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させることを含む、該ポリペプチドの存在についてアッセイする方法。
【請求項２２】
配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを有するポリヌクレオチドを含む遺伝子導入動物。
【請求項２３】
（ａ）（１）配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰと、（２）リポーター遺伝子へ動作可能に連結されたプロモーター領域とを含むポリヌクレオチドを、発現のための条件下でテストされる薬剤と接触させること、
（ｂ）前記薬剤の存在下で前記リポーター遺伝子の発現のレベルを評価すること、
（ｃ）前記薬剤の不在下で前記リポーター遺伝子の発現のレベルを評価すること、および
（ｄ）発現が前記薬剤によって変化したことを示す差異について、工程（ｂ）における発現のレベルを、工程（ｃ）における発現のレベルと比較すること
を含む、２型糖尿病と関連したＳＮＰを含有するポリヌクレオチドの発現を変化させる薬剤を同定する方法。
【請求項２４】
ａ）ハイブリダイゼーションに適切な条件下で試料を、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列を含む第二ポリヌクレオチドと接触させること、および
ｂ）該第二ポリヌクレオチドの一部と少なくとも部分的に相補的な第一ポリヌクレオチドと該第二ポリヌクレオチドとの間でハイブリダイゼーションが生じたかどうかを評価すること
を含み、ハイブリダイゼーションが生じた場合、該第一ポリヌクレオチドが該試料中に位置する、該第一ポリヌクレオチドの存在について該試料をアッセイするための方法。
【請求項２５】
該第一ポリヌクレオチドの存在が２型糖尿病または２型糖尿病を発達させる素因を示す、請求項２４の方法。
【請求項２６】
該第二ポリヌクレオチドが該第一ポリヌクレオチドの配列の一部と完全に相補的である、請求項２４または２５の方法。
【請求項２７】
該第一ポリヌクレオチドの少なくとも一部の増幅をさらに含む、請求項２４〜２６のうちのいずれか一つの方法。
【請求項２８】
該第二ポリヌクレオチドが長さにおいて９９以下のヌクレオチドであり、および（ａ）該第一ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの連続的な配列と少なくとも８０％同一であるかまたは（ｂ）該第一ポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイゼーションすることができるかのいずれかである、請求項２４〜２７のうちのいずれか一つの方法。
【請求項２９】
配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含む第一ポリヌクレオチドの一部と少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含む第二ポリヌクレオチドを含む、該第一ポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための試薬。
【請求項３０】
該第二ポリヌクレオチドが該第一ポリヌクレオチドの一部と完全に相補的である、請求項２９の試薬。
【請求項３１】
個別の容器に、
ａ）配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列を含む１つ以上のラベルされた第二ポリヌクレオチド、および
ｂ）該ラベルの検出のための試薬
を含む、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含む第一ポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための試薬キット。
【請求項３２】
図２に示されるハプロタイプからなる群から選択される２型糖尿病と関連したハプロタイプを検出することを含む、個体における２型糖尿病に対する罹病性を診断する方法。
【請求項３３】
前記ハプロタイプの存在を検出することが前記個体由来の核酸の酵素による増幅を含む、請求項３２の方法。
【請求項３４】
前記ハプロタイプの存在を検出することが電気泳動分析をさらに含む、請求項３２の方法。
【請求項３５】
前記ハプロタイプの存在を検出することが制限フラグメント長の多型分析をさらに含む、請求項３２の方法。
【請求項３６】
前記ハプロタイプの存在を検出することが配列分析をさらに含む、請求項３２の方法。
【請求項３７】
ａ）個体からポリヌクレオチド試料を得ること、および
ｂ）図２に示されるハプロタイプを含む、ハプロタイプの存在または不在について前記ポリヌクレオチド試料を分析すること
を含み、前記ハプロタイプの存在が２型糖尿病に対する罹病性について診断する、該個体において２型糖尿病に対する罹病性を診断する方法。
【請求項３８】
（ａ）配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含有する遺伝子を同定すること、および（ｂ）前記遺伝子が２型糖尿病と関連していることを示す差異について、危険にあるアレルを有する個体における該遺伝子の発現を、危険にあるアレルを有さない個体における該遺伝子の発現と比較することを含む、２型糖尿病と関連した遺伝子を同定する方法。
【請求項３９】
（ａ）配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含有するポリヌクレオチドを、テストされる薬剤と接触させること、および（ｂ）２型糖尿病を処置するのに有用であろう方法で該薬剤が前記ポリヌクレオチドに結合し、変化させ、または影響を及ぼすかどうかを決定することを含む、２型糖尿病を処置するのに適した薬剤を同定する方法。
【請求項４０】
（ａ）配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含有するポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドを、テストされる薬剤と接触させること、および（ｂ）２型糖尿病を処置するのに有用であろう方法で該薬剤が前記ポリペプチドに結合し、変化させ、または影響を及ぼすかどうかを決定することを含む、２型糖尿病を処置するのに適した薬剤を同定する方法。
【請求項４１】
請求項３９または４０の方法によって同定される薬剤。
【請求項４２】
請求項３９または４０の方法によって同定される薬剤を含有する薬学的組成物。
【請求項４３】
治療上有効量で前記薬剤を含有する、請求項４２の薬学的組成物。
【請求項４４】
後述の、特に実施例に関する、方法、ポリヌクレオチド、ベクター、リコンビナントホスト細胞、遺伝子導入動物、試薬、薬剤、および薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
炭水化物の利用が低下し、脂質およびタンパク質の利用が亢進する代謝疾患である真性糖尿病は、インスリンの絶対的または相対的欠乏に起因する。より重度の場合、糖尿病は、慢性的な高血糖、糖尿、水および電解質の損失、ケトアシドーシスおよび昏睡を特徴とする。長期の合併症には、ニューロパチー、網膜症、腎症、大小の血管における汎発性変性変化および感染に対する罹病性の増大の進行が包含される。糖尿病の最も一般的な形態は２型であり、標的組織におけるインスリン分泌障害およびインスリン抵抗性による高血糖を特徴とするインスリン非依存性糖尿病である。遺伝子上の要因および環境上の要因の両者が前記疾病に関与する。例えば、肥満は前記疾病の発達においてメジャー役割を担う。２型糖尿病はしばしば、徐々に惹起する糖尿病の穏やかな形態である。
【０００２】
２型糖尿病の健康上への影響は非常に大きい。１９９５年には、糖尿病の成人が世界中で１億３５００万人であった。２０２５年には３億人に近い人が糖尿病を有するであろうと概算される（King H., et al, Diabetes Care, 21(9): 1414-1431 (1998)）。
【０００３】
２型糖尿病は、強い家族性伝達を有することが示されてきており、２型糖尿病を有する一卵性双生児の４０％は、前記疾病に冒された一人または何人もの一親等の親類も有する。Barnett et al. 20 Diabetologia 87-93 (1981)。ピマ族のインディアンにおいて、糖尿病になる相対的な危険性は、糖尿病である片親に対して生まれた子供については２倍、両親が冒されているときは６倍増大する。Knowler, W. C, et al. Genetic Susceptibility to Environmental Factors. A Challenge for Public Intervention 67-74 (Almquist & Wiksele International: Stockholm, 1988)。２型糖尿病についての一卵性双生児の一致率は、１型糖尿病に冒された一卵性双生児についての約５０％と比較して９０％を超えることが観察されてきた。Barnett, A. H., et al. 20(2) Diabetologia 87-93 (1981)。２型糖尿病の両親の非糖尿病の双生児は、一回の経口糖負荷試験後にインスリン分泌の低下および糖耐性の低下を有することが示された。Barnett, A. H., et al. 282 Brit. Med. J. 1656-1658 (1981)。
【０００４】
前記疾病の高い罹患率および影響を受けた人口の増大は、２型糖尿病に関与する他の遺伝的因子を定義し、関連した危険因子をより精確に定義するまだ対処されていない医学的需要を示す。また必要とされているのは、２型糖尿病を進行させる素因を同定する診断アッセイならびに前記疾病の予防および治療のための治療剤である。
【０００５】
２つ以上の配列が集団（自然集団または合成集団のいずれか、例えば、合成分子のライブラリー）において可能である核酸配列は、本明細書において「多型部位」と呼ばれる。多型部位は、置換、挿入、または欠失に基づいた配列における差異が可能である。このような置換、挿入、または欠失は結果として、フレームシフト、成熟前終止コドンの発生、ポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のアミノ酸の欠失または付加を生じ得、スプライス部位を変化でき、ｍＲＮＡの安定性または輸送に影響を及ぼし得る。多型部位が長さにおいて一つのヌクレオチドである場合、前記部位は単一ヌクレオチド多型（「ＳＮＰ」）と呼ばれる。
【０００６】
ＳＮＰは、疾病罹病性および薬物反応における差異を生じる遺伝的変動の最も一般的な形態である。ＳＮＰは、両親間の疾病の危険性の差異または薬物反応の差異等の多くの表現型の評価項目に直接関与し得、またはより一般的にはそのためのマーカーとして機能し得る。
【０００７】
これらの遺伝的要因の同定は、特定の疾病を発達させる素因を有する個体の同定のための診断方法、試薬および試薬キットをもたらし得る。
【０００８】
〔技術分野〕
本発明は、候補遺伝子ならびに特に診断上および治療上の処置に影響を受けやすい単一ヌクレオチド多型（「ＳＮＰ」）を有する遺伝子の核酸フラグメントについて焦点を当てた、個体を糖尿病にかかりやすくする遺伝的因子の同定に関するものである。
【０００９】
〔発明の開示〕
ある態様において、本発明は、配列同定番号（「配列番号」）１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含有する単離されたポリヌクレオチドに加え、このようなポリヌクレオチドを含有するベクター、リコンビナントホスト細胞、遺伝子導入動物、および組成物を提供する。本発明は、２型糖尿病と関連した１つ以上のハプロタイプを検出することによって個体における２型糖尿病に対する罹病性を診断する方法も提供する。
【００１０】
また本発明によって意図されるのは、前記疾病の経過を改変し得る薬剤を同定する方法に加え、前記薬剤自体およびこれらの薬剤を含む薬学的組成物である。
【００１１】
ヒトゲノムにおける最も頻繁なＤＮＡ配列変異である単一ヌクレオチド多型は、幅広い範囲の生物学的および生物医学的適用についてますます重要になっている。ＳＮＰは、ヒト集団の進化の歴史を探り、法医学的試料を分析するために使用される。ＳＮＰは、遺伝学的分析においても重要な役割を担う。さらに、薬理遺伝学はこれらのＤＮＡ変異を利用して、異なる薬物有効性または副作用の根底にある遺伝学的要因を解明する。最後に、ＳＮＰは、複雑な疾病に関与する遺伝子を同定するのを助けると考えられる。
【００１２】
本発明は、２型糖尿病と表現型上関連していると具体的に同定される特定のローカスまたは単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の同定に関するものである。結果として、例えば食事の変化、運動および／または薬物療法等の処置が、位置する疾病の症状の前に２型糖尿病に罹患する個体へ処方され得る。２型糖尿病のローカスに関係する遺伝子の同定は、前記疾病の過程をよりよく理解することを可能にし、次いで、改善された診断および療法をもたらし得る。
【００１３】
２型糖尿病に関与すると考えられる遺伝子を分析してＳＮＰを同定した。次に、ＳＮＰを含有する核酸配列を糖尿病の場合およびマッチしたコントロールにおける遺伝子型を同定した。次に、統計分析を実施し、コントロール集団および糖尿病集団の分析において２型糖尿病との関係を見出した。１８６個の遺伝子において１，７６９個のＳＮＰを分析した後、特定のＳＮＰが２型糖尿病と統計的に関係する（ｐ≦０．０５）ことがわかった。
【００１４】
「ＳＮＰ」という語は、個体の集団間で変異するヒトゲノムにおける特定の位置での単一ヌクレオチド多型を指す。本明細書で使用されるように、ＳＮＰは、その名称または特定の配列内での位置によって同定され得る。図１の配列番号において同定されるＳＮＰは、カッコによって示される。例えば、図１の配列番号１におけるＳＮＰ「［Ｇ／Ａ］」は、配列におけるその位置でのヌクレオチド塩基（またはアレル）がグアニンまたはアデニンのいずれかであり得ることを示す。図１における２型糖尿病と関連したアレル（例えば、配列番号１におけるグアニン）は、個別のカラムにおいて示される。図１における各配列番号についてＳＮＰと隣接するヌクレオチドは、ゲノムにおけるＳＮＰの位置を同定するのため使用される隣接する配列である。
【００１５】
本明細書で使用されるように、本発明の配列番号によって開示されるヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列の相補体を包含する。さらに、本明細書で使用されるように、「ＳＮＰ」という語は、一セットのアレル間のいずれかのアレルをも包含する。
【００１６】
「アレル」という語は、ＳＮＰを定義するヌクレオチドの選択対象間の特定のヌクレオチドを指す。
【００１７】
「マイナーアレル」という語は、個体の集団内でメジャーアレルよりもあまり頻繁には生じないＳＮＰのアレルを指す。
【００１８】
「メジャーアレル」という語は、個体の集団内でマイナーアレルよりも頻繁に生じるＳＮＰのアレルを指す。
【００１９】
「危険にあるアレル」という語は、２型糖尿病と関連したアレルを指す。図１および図３〜５は、本発明の危険にある多くのアレルを示す。
【００２０】
「ハプロタイプ」という語は、二つ以上のＳＮＰからの特定のアレルの組み合わせを指す。
【００２１】
「危険にあるハプロタイプ」という語は、２型糖尿病と関連したハプロタイプを指す。図２は、本発明の多くの危険にあるハプロタイプを示す。
【００２２】
「ポリヌクレオチド」という語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらのアナログを含有し得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖および三重のへリックス分子構造を有し得、公知または未知のいずれかの機能を実施し得る。以下は、ポリヌクレオチドの制限のない態様であり、すなわち、遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、短い干渉性核酸分子（ｓｉＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、リコンビナントポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたＤＮＡ、いずれかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーである。ポリヌクレオチドは、メチル化された核酸分子および核酸分子アナログ等の、修飾された核酸分子も含み得る。
【００２３】
「実質的に単離された」または「単離された」ポリヌクレオチドは、本来関係する配列が実質的にないものである。実質的にないことによって意味されるのは、本来関係する材料が少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％ないことである。「単離されたポリヌクレオチド」には、リコンビナントポリヌクレオチドも含まれ、由来または操作によって、（１）本来関係するポリヌクレオチドのすべてまたは一部と関係していない、（２）本来連結されるもの以外のポリヌクレオチドへ連結される、または（３）本来生じない。
【００２４】
「厳密な条件下でハイブリダイゼーションする」という語は、互いに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるヌクレオチド配列が、互いに対して典型的にハイブリダイゼーションされたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての条件を記述するよう企図される。このような厳密な条件は、当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y (1989), 6.3.1- 6.3.6に見出され得る。厳密なハイブリダイゼーション条件の制限のない実施例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション後の、５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。
【００２５】
「ベクター」という語は、挿入されたＤＮＡを運搬し得、ホスト細胞において作用し得るＤＮＡ分子を指す。ベクターは、クローニングベクター、クローニング媒体または媒体としても公知である。「ベクター」という語には、核酸分子の細胞への挿入のために主として機能するベクター、核酸の複製のために主として機能する複製ベクター、およびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターが含まれる。また含まれるのは、上述の機能のうちの２つ以上を提供するベクターである。
【００２６】
「ホスト細胞」には、ベクターのためのまたは核酸分子および／またはタンパク質の組み入れのためのレシピエントであり得るかまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物が含まれる。ホスト細胞には単一ホスト細胞の子孫が含まれ、子孫は、自然突然変異、偶発的突然変異、または計画的突然変異により、もとの親と（形態学上または総ＤＮＡ相補体において）完全に同一である必要はないかもしれない。ホスト細胞には、本発明のポリヌクレオチドで形質移入された細胞が含まれる。「単離されたホスト細胞」は、由来した生物体から物理的に解離したものである。
【００２７】
「個々の」、「ホスト」、および「対象」という語は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指すために本明細書で相互変換可能に使用される。
【００２８】
「形質転換」、「形質移入」、および「遺伝的形質転換」という語は、挿入に使用される方法とは無関係の、ホスト細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入または導入を指すために本明細書で相互変化可能に使用され、例えば、リポフェクション、形質導入、感染、電気穿孔法、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、粒子照射等がある。外因性ポリヌクレオチドは、統合されていないベクター、例えばプラスミドとして維持され得るか、またはホスト細胞ゲノムへと統合され得る。遺伝子形質転換は、一過性であるかまたは安定であり得る。
【００２９】
本発明は、別段の記載がなければ、（リコンビナント技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を採用し、それらは当技術分野の技術内である。
【００３０】
本明細書で使用されるように、いずれかの語の単数形は複数形を代替的に包含し得、逆もまた同じである。
【００３１】
本明細書で引用されるすべての刊行物および参考文献は、いずれの目的についてもそれらの全体において参照により組み入れられる。
【００３２】
本発明は、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、ＳＮＰの特定のアレル（特定のヌクレオチド塩基）の存在は、２型糖尿病を発達させる素因を示すかまたはさもなくば２型糖尿病を同定するのに使用され得る。ある態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される。別の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列の少なくとも一部を含む。
【００３３】
本発明は、テスト試料に位置するヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションするか、相補的であるか、または部分的に相補的である、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含む単離されたポリヌクレオチドにも関するものである。さらなる態様において、単離されたポリヌクレオチドは、検査試料に位置するヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションするか、相補的であるか、または部分的に相補的である、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列の少なくとも一部を含む。特定の態様において、ＳＮＰは、配列番号２または配列番号２の相補体内に位置する。特定の態様において、ＳＮＰは、配列番号４または配列番号４の相補体内に位置する。特定の態様において、ＳＮＰは、配列番号５または配列番号５の相補体内に位置する。特定の態様において、ＳＮＰは、配列番号６または配列番号６の相補体内に位置する。特定の態様において、ＳＮＰは、配列番号７または配列番号７の相補体内に位置する。
【００３４】
本発明は、２型糖尿病を発達させる素因を示す図２において同定されるハプロタイプからなる群から選択される１つ以上のハプロタイプを含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【００３５】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に提供される標準的な分子生物学の技術および配列情報を使用して単離され得る。配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列のすべてまたは一部を使用することで、ポリヌクレオチドは、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を使用して単離され得る（例えば、Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y, 1989に記載されるとおり）。
【００３６】
ポリヌクレオチドは、標準的なＰＣＲ増幅技術にしたがって、テンプレートとしてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅され得る。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、適切なベクターへとクローン化され得、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けられ得る。さらに、ポリヌクレオチドのすべてまたは一部に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって、例えば自動ＤＮＡ合成装置を使用することによって調製され得る。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドの配列に基づいたプローブは、転写産物またはゲノムの配列を検出するのに使用され得る。プローブは、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素共因子へ結合されるラベル群を含み得る。このようなプローブは、対象由来の細胞の試料中のタンパク質をコード化する核酸分子のレベルを測定すること等によって、例えばｍＲＮＡレベルを検出するかまたはタンパク質をコード化する遺伝子が突然変異されたかまたは欠失されたかどうかを決定することによって、タンパク質を誤発現する細胞または組織を同定するための診断用テストキットの一部として使用され得る。
【００３８】
特定の態様において、本発明は、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含むポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドも提供する。ある態様において、ポリペプチドは、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコード化される。別の態様において、ポリペプチドは、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドによってコード化される。また意図されるのは、このようなポリペプチドを結合する抗体である。
【００３９】
本発明は、ポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドも提供し、ポリヌクレオチドは、図２において同定されるハプロタイプからなる群から選択されるハプロタイプを含む。
【００４０】
特定の態様において、本発明は、図２において同定されるハプロタイプを含むかまたは配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含み、調節配列へ操作できるよう連結されるベクターも提供する。ある態様において、ベクターは、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列を含み、調節配列へ操作できるよう連結される。別の態様において、ベクターは、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列の少なくとも一部を含み、調節配列へ操作可能に連結される。
【００４１】
特定の態様において、本発明は、このようなベクターを含むリコンビナントホスト細胞も提供する。特定の態様において、本発明は、図２において同定されるハプロタイプまたは配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含ポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドを産生するための方法も提供し、発現に適した条件下でこのようなポリヌクレオチドを含有するリコンビナントホスト細胞を培養することを含む。ある態様において、ポリペプチドは、発現のための条件下でポリヌクレオチドを含有するリコンビナントホスト細胞を培養することによって産生され、ポリヌクレオチドは配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列を含む。別の態様において、ポリペプチドは、発現のための条件下でポリヌクレオチドを含有するリコンビナントホスト細胞を培養することによって産生され、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列の一部を含む。
【００４２】
本発明によってさらに意図されるのは、図２において同定されるハプロタイプまたは配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含むポリヌクレオチドを含有する遺伝子導入動物である。ある態様において、遺伝子導入動物は、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチドを含有する。別の態様において、遺伝子導入動物は、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドを含有する。
【００４３】
他の態様において、本発明のポリヌクレオチド、タンパク質、抗体、ベクター、および／またはホスト細胞を含有する組成物およびキットが意図される。
【００４４】
最新の発明のある出願は、２型糖尿病を発達させるより高い危険性にある者の予測を包含する。２型糖尿病に関与する遺伝的要因を定義する診断テストは、一般的な集団に対して個体の危険性を定義する公知の臨床的危険要因とともに、またはそれとは無関係に使用され得る。２型糖尿病についての危険にある個体を同定するための手段は、最新の臨床的危険要因のより積極的な管理を含むよりよい予防法および治療法にいたるべきである。特定の態様において、本発明には、特定の遺伝子または遺伝子断片の核酸における多型を検出することを含む、個体において２型糖尿病に対する罹病性を診断する方法が含まれ、核酸における多型の存在は、２型糖尿病に対する罹病性を示す。
【００４５】
ある態様において、本発明には、配列番号１〜７に含まれ図１に示されるＳＮＰの特定のアレルの有無を決定することを含む、個体において２型糖尿病を診断するかまたは２型糖尿病に対する罹病性を診断する方法が含まれる。本発明のある局面において、方法は、図１に示される２型糖尿病と関連した危険にあるアレルのうちの一つについてのスクリーニングを含む。特定の態様において、ＳＮＰは配列番号１または配列番号１の相補体内に位置する。特定の態様において、ＳＮＰは配列番号２または配列番号２の相補体内に位置する。特定の態様において、ＳＮＰは配列番号３または配列番号３の相補体内に位置する。特定の態様において、ＳＮＰは配列番号４または配列番号４の相補体内に位置する。特定の態様において、ＳＮＰは配列番号５または配列番号５の相補体内に位置する。特定の態様において、ＳＮＰは配列番号６または配列番号６の相補体内に位置する。特定の態様において、ＳＮＰは配列番号７または配列番号７の相補体内に位置する。
【００４６】
ある態様において、本発明は、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含有する試料中のポリヌクレオチドの存在を検出する方法を提供し、方法は試料を、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチドと、ハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させること、およびハイブリダイゼーションが試料中のポリヌクレオチドと単離されたポリヌクレオチドとの間に生じたかどうかを評価することを含み、ハイブリダイゼーションが生じた場合、２型糖尿病と関連したＳＮＰの特定のアレルを含有する特定のポリヌクレオチドが試料中に位置する。上述の方法の特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、試料中に位置するポリヌクレオチドと完全に相補的である。上述の方法の他の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、試料中に位置するポリヌクレオチドと部分的に相補的である。他の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、試料中に位置するポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一であり、該ポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイゼーションできる。望まれれば、試料中に位置するポリヌクレオチドの増幅が、当技術分野で公知の方法を使用して実施され得る。
【００４７】
本発明はさらに、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列を含む第二ポリヌクレオチドの一部に少なくとも部分的に相補的である第一ポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための方法を提供し、ａ）該試料をハイブリダイゼーションに適切な条件下で該第二ポリヌクレオチドと接触させること、およびｂ）ハイブリダイゼーションが該第一ポリヌクレオチドと該第二ポリヌクレオチドとの間で生じたかどうかを評価することを含み、ハイブリダイゼーションが生じた場合、該第一ポリヌクレオチドは該試料中に位置する。前述に記載の方法のある態様において、該第一ポリヌクレオチドの存在は、２型糖尿病または２型糖尿病を発達させる素因を示す。該方法のさらなる態様において、該第二ポリヌクレオチドは、該第一ポリヌクレオチドの配列の一部と完全に相補的である。別の態様において、該方法はさらに、該第一ポリヌクレオチドの少なくとも一部の増幅を含む。さらなる態様において、該第二ポリヌクレオチドは、長さにおいて９９以下のヌクレオチドであり、（ａ）該第一ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの連続した配列と少なくとも８０％同一であるか、または（ｂ）該第一ポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイゼーションできるかのいずれかである。
【００４８】
また本発明によって意図されるのは、ポリヌクレオチドによってコード化される２型糖尿病と関連したポリペプチドの存在について試料をアッセイする方法であり、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置する２型糖尿病と関連したＳＮＰのアレルを含み、方法は、試料を該ポリペプチドへ特異的に結合する抗体と接触させることを含む。ある態様において、（配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列を含む）ポリヌクレオチドによってコード化される試料中の２型糖尿病と関連したポリペプチドの存在は、試料を該ポリペプチドへ特異的に結合する抗体と接触させることによってアッセイされる。別の態様において、（配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列の少なくとも一部を含む）ポリヌクレオチドによってコード化される試料中の２型糖尿病と関連したポリペプチドの存在は、試料を該ポリペプチドへ特異的に結合する抗体と接触させることによってアッセイされる。
【００４９】
本発明には、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含む第一ポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための試薬も含まれ、該試薬は、第一ポリヌクレオチドの一部と少なくとも部分的に相補的な連続したヌクレオチド配列を含む第二ポリヌクレオチドを含む。該試薬のある態様において、該第二ポリヌクレオチドは、第一ポリヌクレオチドの一部と完全に相補的である。
【００５０】
本発明は、個別の容器に、ａ）配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列を含む１つ以上のラベルされた第二ポリヌクレオチド、およびｂ）該ラベルを検出するための試薬を含む、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含む第一ポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための試薬キットも包含する。
【００５１】
他の態様において、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置する２型糖尿病と関連した（または関連していない）ＳＮＰのアレルを含有するポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするのに使用され得るポリヌクレオチドを含有するキットが意図される。２型糖尿病と関連した（または関連していない）ＳＮＰのアレルを含有するポリヌクレオチドによってコード化される２型糖尿病と関連した（または関連していない）タンパク質の存在について試料をアッセイするのに使用され得る抗体を含有するキットも意図される。
【００５２】
個体において２型糖尿病に対する罹病性を診断する他の方法は、２型糖尿病と関係していないＳＮＰのアレルを含有するポリヌクレオチドによってコードされるコントロール試料中でポリペプチドの発現または組成を決定すること、およびそれを、２型糖尿病と関連したＳＮＰのアレルを含有する以外の同一のポリヌクレオチドによってコード化されるテスト試料中のポリペプチドの発現または組成と比較することを含み、コントロール試料と比較したテスト試料中のポリペプチドの発現または組成における変化の存在は、２型糖尿病に対する罹病性を示す。
【００５３】
特定の態様において、本発明は、個体における２型糖尿病または２型糖尿病に対する罹病性を診断する方法にも関するものであり、個体における特定のハプロタイプの有無を決定することを含む。本発明のある局面において、方法は、図２に示される危険にあるハプロタイプのうちの一つについてスクリーニングすることを含む。したがって、本発明は、個体において２型糖尿病に対する罹病性を診断するための方法、または２型糖尿病に対する罹病性を有する個体についてスクリーニングする方法を包含し、図２に示されるハプロタイプからなる群から選択される２型糖尿病と関連したハプロタイプを検出することを含む。
【００５４】
ハプロタイプの有無はさまざまな方法によって決定され得、例えば、個体由来の核酸の酵素増幅、電気泳動分析、制限フラグメント長さ多型分析および／または配列分析を使用することが含まれる。
【００５５】
個体において２型糖尿病に対する罹病性を診断する方法、または２型糖尿病に対する罹病性について個体をスクリーニングするための方法も含まれ、ａ）該個体からポリヌクレオチド試料を得ること、およびｂ）図２に示されるハプロタイプを含むハプロタイプの有無についてポリヌクレオチド試料を分析することを含み、ハプロタイプの存在は２型糖尿病に対する罹病性に対応する。
【００５６】
特定の態様において、図１または２において同定される複数のＳＮＰを検出することを含む、個体において２型糖尿病に対する罹病性を決定する方法が提供される。特定の態様において、個体において２型糖尿病に対する罹病性を決定する方法は、配列番号１、２、３および／または４において同定される複数のＳＮＰを検出することを含む。他の態様において、個体において２型糖尿病に対する罹病性を決定する方法は、配列番号４、５、６、および／または７において同定される複数のＳＮＰを検出することを含む。他の態様において、個体において２型糖尿病に対する罹病性を決定する方法は、配列番号１、２、６、および／または７において同定される複数のＳＮＰを検出することを含む。他の態様において、個体において２型糖尿病に対する罹病性を決定する方法は、配列番号３、４、５、および／または６において同定される複数のＳＮＰを検出することを含む。特定の態様において、図１において１つ以上の危険にあるアレルを含有する試料中における第一ポリヌクレオチドの存在は、試料を該第一ポリヌクレオチドと相補的なプローブポリヌクレオチドと接触させることによってアッセイされる。特定の態様において、少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１または配列番号１の相補体内に位置する。特定の態様において、少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号２または配列番号２の相補体内に位置する。特定の態様において、少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号３または配列番号３の相補体内に位置する。特定の態様において、少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４または配列番号４の相補体内に位置する。特定の態様において、少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号５または配列番号５の相補体内に位置する。特定の態様において、少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号６または配列番号６の相補体内に位置する。特定の態様において、少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号７または配列番号７の相補体内に位置する。
【００５７】
本発明の特定の方法において、２型糖尿病治療薬が意図される。２型糖尿病治療薬は、図２において同定されるハプロタイプまたは配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含むポリヌクレオチドのポリペプチド活性および／または発現を変化させる（例えば、亢進させるかまたは阻害する）薬剤であり得る。このような薬剤には、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、レセプター、結合剤、ペプチド模倣薬、融合タンパク質、プロドラッグ、抗体、ポリヌクレオチド発現を変化させる薬剤、本発明の遺伝子またはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの活性を変化させる薬剤、本発明の遺伝子またはポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドの転写後過程を変化させる薬剤、ポリペプチドの結合剤またはレセプターとの相互作用を変化させる薬剤、遺伝子またはポリヌクレオチドによってコード化されるスプライシング変異体の転写を変化させる薬剤、およびリボソームが含まれる。特定の態様において、本発明は、本明細書に記載される２型糖尿病治療薬の少なくとも１つを含む薬学的組成物にも関するものである。
【００５８】
２型糖尿病治療薬は、さまざまな手段によって、例えばポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの転写または翻訳をアップレギュレーションすることによって、ポリペプチドの翻訳後過程を変化させることによって、スプライシング変異体の転写を変化させることによって、またはポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの発現、転写または翻訳をダウンレギュレーションすることによってポリペプチド活性に介入することによって（例えば、ポリペプチドへの結合によって、または興味の対象のポリペプチドと相互作用する別のポリペプチドへの結合によって）、または興味の対象のポリペプチドとポリペプチド結合剤との相互作用を変化させることによって、ポリペプチドの活性またはポリヌクレオチドの発現を変化させ得る。
【００５９】
特定の態様において、本発明は、２型糖尿病治療薬を個体へ治療上有効量で投与することによって、２型糖尿病を罹病する個体を治療する方法にも関するものである。特定の態様において、２型糖尿病治療薬はアゴニストであり、他の態様において、２型糖尿用治療薬はアンタゴニストである。特定の態様において、本発明はさらに、２型糖尿病の治療において使用するための薬物の製造のための２型糖尿病治療薬の使用にも関するものである。
【００６０】
本明細書に記載される治療薬は、組成物中でまたは単独で送達され得る。それらは全身投与され得るか、または特定の組織へターゲティングされ得る。治療薬は、化学合成、すなわちリコンビナント生成およびｉｎ  ｖｉｖｏ産生（例えば、遺伝子導入動物、その全体において参照により本明細書に組み入れられるMeade et alに対する米国特許第４，８７３，３１６号参照）を含むさまざまな手段によって製造され得、当技術分野で公知の標準的な方法を使用して単離され得る。さらに、治療の上述の方法のいずれかの組み合わせ（例えば、ｍＲＮＡをターゲティングするアンチセンス療法と組み合わせたポリペプチドの投与、第二スプライシング変異体をターゲティングするアンチセンス療法と組み合わせた第一スプライシング変異体の投与）も使用され得る。
【００６１】
特定の態様において、最新の発明は、当技術分野で公知の方法を使用して、２型糖尿病の治療に及ぼす本発明の治療薬の有効性を観察する方法も包含する。最新の発明の別の適用は、特定の治療薬に対する個体の反応を予測するためのその使用である。例えば、ＳＮＰまたはハプロタイプは、薬物反応を予測し、与えられた個体において治療薬の選択を誘導するための薬理ゲノミクス診断剤として使用され得る。
【００６２】
他の態様において、本発明は、２型糖尿病と関連したＳＮＰのアレルを含有するポリヌクレオチドの発現を変化させる薬剤を同定する方法にも関するものであり、（ａ）発現のための条件下で、（１）配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置する２型糖尿病と関連したＳＮＰのアレルと、（２）リポーター遺伝子へ操作できるよう連結されるプロモーター領域とを含むポリヌクレオチドをテストされる薬剤と接触させること、（ｂ）薬剤の存在下でリポーター遺伝子の発現のレベルを評価すること、（ｃ）薬剤の不在下でリポーター遺伝子の発現のレベルを評価すること、および（ｄ）薬剤によって発現が変化したことを示す差異について、段階（ｂ）における発現のレベルを段階（ｃ）における発現のレベルと比較することを含む。
【００６３】
他の態様において、本発明は、２型糖尿病を治療するのに適した薬剤を同定する方法に関するものであり、（ａ）図２において同定されるハプロタイプまたは配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含有するポリヌクレオチドを、テストされる薬剤と接触させること、および（ｂ）該薬剤が２型糖尿病を治療するのに有用であろう方法でポリヌクレオチドへ結合し、変化させ、または影響を及ぼすかどうかを決定することを含む。
【００６４】
特定の態様において、薬剤の存在下でのポリヌクレオチドの発現は、種類または量において薬剤の不在下での１つ以上のスプライシング変異体の発現とは異なる１つ以上のスプライシング変異体の発現を含む。
【００６５】
他の態様において、本発明は、２型糖尿病を治療するのに適した薬剤を同定する方法に関するものであり、（ａ）図２に同定されるハプロタイプまたは配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含有するポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドを、テストされる薬剤と接触させること、および（ｂ）該薬剤が２型糖尿病を治療するのに有用であろう方法でポリペプチドへ結合し、変化させ、または影響を及ぼすかどうかを決定することを含む。前述の方法によって同定される薬剤も、このような薬剤を含有する薬学的組成物と同様に意図される。
【００６６】
ある態様において、図２において同定されるハプロタイプまたは配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがｉｎ  ｓｉｔｕで投与されるかまたは発生し、ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡへ特異的にハイブリダイゼーションする「アンチセンス」療法において使用される。ｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡへ特異的にハイブリダイゼーションするアンチセンスポリヌクレオチドは、そのｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡによって、例えば翻訳および／または転写を阻害することによってコード化されるポリペプチドの発現を阻害する。アンチセンスポリヌクレオチドの結合は、従来の塩基対相補性によって、または例えばＤＮＡ二本鎖への結合の場合において二重へリックスの主要溝における特異的な相互作用を通じてなされ得る。
【００６７】
アンチセンスコンストラクトは、例えば発現プラスミドとして送達され得る。プラスミドが細胞内で転写されるとき、それはポリペプチドをコード化するｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡの一部と相補的なＲＮＡを生成する。あるいは、アンチセンスコンストラクトは、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成し、細胞内へと導入されるポリヌクレオチドプローブであり得、その後アンチセンスコンストラクトは、ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションすることによって発現を阻害する。ある態様において、ポリヌクレオチドプローブは、内因性ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに対して耐性のある改変されたオリゴヌクレオチドであり、それによりそれらをｉｎ  ｖｉｖｏで安定にする。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための典型的な核酸分子は、フォスフォールアミデート（phosphoramidate）、フォスフォチオエート（phosphothioate）およびＤＮＡのメチルホスホン酸である（それらのすべてがそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，１７６，９９６号、第５，２６４，５６４号、および第５，２５６，７７５号参照）。さらに、アンチセンス療法において有用なオリゴマーを構築するための一般的なアプローチも、例えばVan der Krol et al. (BioTechniques 6:958-976 (1988))、およびStein et al. (Cancer Res. 48:2659-2668 (1988)によって記載され、それらの両者はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる。アンチセンスＤＮＡに関して、翻訳開始部位由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが使用され得る。
【００６８】
アンチセンス療法を実施するため、ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドがデザインされる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ転写産物へ結合し、翻訳を防止する。絶対的な相補性は、オリゴヌクレオチドがＲＮＡとハイブリダイゼーションして安定した二本鎖を形成できるのに十分な相補性を有する限り必要ではない。ハイブリダイゼーションする能力は、相補性の程度およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さの両者に依存するであろう。一般に、ハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドが長ければ長いほど、塩基が含有し得なおも安定した二本鎖（または場合がそうであり得るとき、三本鎖）を形成し得るＲＮＡとより多くミスマッチする。当業者は、標準的な手段の使用によってミスマッチの許容可能な程度を確認し得る。
【００６９】
アンチセンス療法において使用されるオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはそれらの一本鎖または二本鎖のキメラ混合物または誘導体または改変されたバージョンであり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば分子、ハイブリダイゼーション等の安定性を高めるために、塩基部分、糖部分、またはリン酸塩主鎖において改変され得る。オリゴヌクレオチドは、（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでホスト細胞レセプターをターゲティングするための）ペプチドなどの他の付記される基、または細胞膜を通過する輸送を促進させる薬剤（例えば、Letsinger et al, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 86:6553-6556 (1989)、Lemaitre et al, Proc. Natl. Acad. Sd USA 84:648-652 (1987)、ＰＣＴ国際刊行番号WO 88/09810参照）または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ国際刊行番号WO 89/10134参照）、またはハイブリダイゼーションによりトリガーされる開裂剤（例えば、Krol etal, BioTechniques 6:958-976 (1988)参照）または挿入剤（例えば、Zon, Pharm.Res. 5:539-549 (1988)参照）を含み得る。この目的のため、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによりトリガーされる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションによりトリガーされる開裂剤）へ結合され得る。
【００７０】
特定の態様において、アンチセンス分子は２型糖尿病に関与するポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで発現する細胞へ送達される。多くの方法がアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞へ送達するのに使用され得、例えば、アンチセンス分子は組織部位へ直接注入され得るか、または望ましい細胞へターゲティングするようデザインされた改変されたアンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上に発現したレセプターまたは抗原と特異的に結合するペプチドまたは抗体へ連結されるアンチセンス）は全身投与され得る。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なプロモーター（例えば、ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩ）の調節下にあるリコンビナントＤＮＡコンストラクトが利用される。親の標的細胞を形質移入するためのこのようなコンストラクトの使用は結果として、内因性転写産物と相補的な塩基対を形成するであろう一本鎖ＲＮＡの十分な量の転写を生じ、それによりｍＲＮＡの翻訳を妨げる。例えば、ベクターがｉｎ  ｖｉｖｏで導入され得、それによりベクターが細胞によって取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写に向かう。このようなベクターは、それが望ましいアンチセンスＲＮＡを生成するよう転写され得る限り、エピソームのままであり得るかまたは染色体に統合され得る。このようなベクターは、当技術分野において標準的なリコンビナントＤＮＡ技術および方法によって構築され得る。例えば、プラスミド、コスミドまたはウィルスベクターは、組織部位へ直接導入され得るリコンビナントＤＮＡコンストラクトを調製するのに使用され得る。あるいは、望ましい組織を選択的に感染させるウィルスベクターが使用され得、この場合、投与は別の経路（例えば、全身性）によって達成され得る。本発明の別の態様において、小分子の二本鎖干渉ＲＮＡ（ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ））が使用され得る。ＲＮＡｉは転写後の過程であり、その中で二本鎖ＲＮＡが導入され、配列特異的遺伝子のサイレンシングが、ターゲティングされたｍＲＮＡの触媒作用分解を通じて生じる。例えば、Elbashir, S.M. et al, Nature 411:494-498 (2001)、Lee, N.S., Nature Biotech. 19:500- 505 (2002)、Lee, S-K. etal, Nature Medicine 8(7):681-686 (2002)を参照してほしく、それらの全体的な教示はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる。
【００７１】
ある態様において、本発明は、図２において同定されるハプロタイプまたは配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列において同定されるＳＮＰを含有するポリヌクレオチドの発現をダウンレギュレーションする二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを含む短い干渉性核酸（「ｓｉＮＡ」）分子を含む。他の態様において、本発明は、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列において同定されるＳＮＰを含有する遺伝子の発現を変化させるために、（米国特許公報第ＵＳ２００４／０１９２６２６Ａ１号、第ＵＳ２００４／０２０３１４５Ａ１号、および第ＵＳ２００４／０１９８６８２Ａ１号［それらのすべてはそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる］に記載されるように）ＲＮＡ干渉に使用されるポリヌクレオチド、組成物、および方法を含む。
【００７２】
遺伝子産物の内因性発現も、ターゲティングされた相同性リコンビナントを使用して遺伝子またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することによって低下され得る。例えば、内因性遺伝子（遺伝子のコード化領域または調節領域のいずれか）と相同的なＤＮＡによって隣接される変化した非機能性遺伝子（または完全に無関連のＤＮＡ配列）が、選択可能なマーカーおよび／または負の選択可能なマーカーを使用してまたは使用しないで、遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させる細胞を形質移入するために使用され得る。ターゲティングされた相同性リコンビナントを介したＤＮＡコンストラクトの挿入は結果として、遺伝子の不活性化を生じる。リコンビナントＤＮＡコンストラクトは上述のように、適切なベクターを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで必要とされる部位へ直接投与され得るかまたはターゲティングされ得る。あるいは、変化しない遺伝子の発現は、同様の方法を使用して増大し得る。ターゲティングされた相同性リコンビナントは、変化しない機能性遺伝子、またはその相補体、またはその一部を含むＤＮＡコンストラクトを、上述のように、細胞中の遺伝子のしかるべきところに挿入するために使用され得る。別の態様において、ターゲティングされた相同性リコンビナントは、細胞中に位置するものとは異なるポリペプチド変異体をコード化するポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトを挿入するのに使用され得る。
【００７３】
あるいは、遺伝子産物の内因性発現は、身体中の標的細胞内の遺伝子の転写を防止する三重へリックス構造を形成するため、調節領域（すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲティングすることによって低下し得る（一般に、Helene, C, et al., Anticancer Drug Des., 6(6):569-84 (1991)、Helene, C, et al, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36 (1992)、およびMaher, L. J., Bioassays 14(12):807-15 (1992)を参照し、それらのすべてはそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる）。同様に、本明細書に記載のアンチセンスコンストラクトは、遺伝子産物の通常の生物活性に拮抗することによって、例えば、組織分化、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでの両者の組織などの培養組織の操作において使用され得る。さらに、アンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子の微量注入、または転写産物がＲＮＡまたは核酸配列に関してアンチセンスであるプラスミドによる形質移入）は、２型糖尿病および関連疾患の発達に関与する経路に関与する１つ以上の遺伝子の役割を研究するのに使用され得る。このような技術は、細胞培養において利用され得るが、遺伝子導入動物の作出にも使用され得る。
【００７４】
本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチド、タンパク質、および／または治療薬は、投与に適した薬学的組成物へと組み入れられ得る。このような組成物は典型的に、ポリヌクレオチド、タンパク質、および／または治療薬および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される担体」という語は、薬学的投与と互換性のある、いずれかのおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張液および吸着遅延剤、およびそれらの類似物を含むよう企図される。薬学的活性物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。いずれかの従来技術の媒体または薬剤が活性化合物と互換性がない限りを除き、組成物におけるそれらの使用は意図される。補助的な活性化合物も組成物へと組み入れられ得る。
【００７５】
本発明の薬学的組成物は、その企図される投与経路と互換性があるよう処方される。投与経路の例には、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（局所的）、経粘膜投与、および直腸投与が含まれる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液には、以下の構成要素が含まれ得る。すなわち、注入のための水などの滅菌希釈剤、塩類溶液、固定された油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性の調整のための薬剤である。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの産または塩基で調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジあるいはガラス製またはプラスチック製の複数用量バイアルに封入され得る。
【００７６】
注入可能な使用に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および注入可能な滅菌溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、適切な担体には、生理塩類溶液、静菌水、クレモフォア（Cremophor）ＥＬＴＭ（BASF、Parsippany、N.J.）またはリン酸塩緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）が含まれる。いくつかの場合において、組成物は滅菌されており、注射可能性が簡便である程度まで流体であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の夾雑作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、およびそれらの類似物）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサル、およびそれらの類似物によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトールなどの多価アルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことは望ましいであろう。注入可能な組成物の長期吸着は、吸着を遅延させる薬剤、例えば一ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【００７７】
注入可能な滅菌溶液は、活性化合物（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体）を必要な量で、必要とされるように上述に列挙される成分のうちの一つまたは組み合わせとともに適切な溶媒中に組み入れた後、ろ過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体および上述に列挙されるもの以外の必要とされる成分を含有する滅菌担体へと組み入れることによって調製される。注入可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製のいくつかの方法は、活性成分の粉末に加え、そのすでにろ過滅菌した溶液由来のさらなる望ましいいずれかの成分を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【００７８】
経口組成物には一般に、不活性の希釈剤または可食性担体が含まれる。それらはゼラチンカプセルに封入され得るかまたは錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与の目的のため、活性化合物は賦形剤とともに組み入れられ得、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、口内洗浄剤としての使用のために流体担体を使用しても調製され得、流体担体中の化合物は経口適用され、さらさらと音を立て、喀出されまたは嚥下される。薬学的に互換性のある結合剤、および／またはアジュバント材料は組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチおよびそれらの類似物は、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含有し得る。すなわち、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤、でんぷんまたは乳糖などの賦形剤、アルギン酸またはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、コロイド状二酸化シリコンなどのｇｌｉｄａｎｔ、ショ糖またはサッカリンなどの甘味料、またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味などの香料である。
【００７９】
吸入による投与のため、化合物は、適切な駆出剤、例えば二酸化炭素などの気体を含有する加圧された容器または噴霧器、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００８０】
全身性投与は、経粘膜手段または経皮手段によってなされ得る。経粘膜投与または経皮投与のため、浸透されるバリアーへの適切な浸透剤が製剤において使用される。このような浸透剤は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、経粘膜投与については、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻スプレーまたは坐薬の使用を通じて達成され得る。経皮投与については、活性化合物は、当技術分野で一般に公知の軟膏、膏薬、ジェル、またはクリームへと製剤される。
【００８１】
化合物は、直腸送達のために、（例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬ベースを使用した）坐薬または留置浣腸剤の形態でも調製され得る。
【００８２】
ある態様において、活性化合物は、徐放性製剤などの、身体からの迅速な排泄から化合物を保護するであろう担体とともに調製され、それにはインプラントおよび微量被包性送達システムが含まれる。酢酸エチレンビニル、多価無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤の調製のための方法は、当業者にとって明白であろう。材料はまた、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals, Incから商業的にも入手され得る。（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染した細胞へターゲティングされるリポソームを含む）リポソーム懸濁液も、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の方法に従って調製され得、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載される。
【００８３】
用量の投与および均一性の簡便さのために、用量単位形態で経口組成物または非経口組成物を製剤することは特に有利である。本明細書で使用される用量単位形態は、治療される対象についてまとまった用量として適した物理的に離散した単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体とともに望ましい治療効果を生じるよう計算された活性化合物のあらかじめ決めておいた量を含有する。本発明の用量単位形態についての仕様は、活性化合物の独特の特徴および達成される特定の治療効果、および個体の治療のためのこのような活性化合物を化合する当技術分野において固有の制限によって規定され、それらに直接依存する。
【００８４】
本発明の核酸分子は、ベクターへと挿入され得、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号参照）または定位注入（例えば、Chen et al. (1994) Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:3054- 3057参照）によって対象へ送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製には、許容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが含まれ得るか、または遺伝子送達媒体が包埋される徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターがリコンビナント細胞からインタクトに作製され得る場合、例えばレトロウィルスベクターの場合、薬学的調製は、遺伝子送達システムを産生する１つ以上の細胞を含み得る。
【００８５】
薬学的組成物は、容器、パック、または噴霧器に、投与のための説明書とともに含まれ得る。本発明の治療剤を含むキットが意図される。
【００８６】
本発明の別の態様は、２型糖尿病を治療する特定の薬物に対する個体の反応を予測するためのその使用である。一般に、患者が同一薬物に対して等しく反応しないことは周知の減少である。与えられた薬物に対する薬物反応における差異のほとんどは、特定の遺伝子およびそれらの対応する経路における個体間の遺伝子およびタンパク質の差異に基づいていると考えられている。本発明は、２型糖尿病と関連する特定のＳＮＰ、ハプロタイプ、および遺伝子を定義する。いくつかの最新のまたは将来の治療薬は、このようなＳＮＰ、ハプロタイプ、および／または遺伝子と直接的にまたは間接的に関連する経路に影響を及ぼすことができ、それゆえ２型糖尿病の危険性がこのようなＳＮＰ、ハプロタイプ、および／または遺伝子によって一部決定される患者において効果的であり得る。一方で、それらの同一薬物は、該ＳＮＰおよび／またはハプロタイプの特定のアレルを有さない患者においてほとんど効果的ではないかまたはまったく効果がないかもしれない。それゆえ、本発明のＳＮＰおよび／またはハプロタイプは、与えられた個体において薬物反応および治療剤の誘導選択を予測する薬理ゲノム診断剤として使用され得る。
【００８７】
ある態様において、２型糖尿病の治療に及ぼす薬物の有効性を観察するための方法は、薬物で治療する前に、図１において同定されるＳＮＰからなるＳＮＰの群から選択される１つ以上のＳＮＰを含有する２型糖尿病と関連した遺伝子の発現のレベルを観察すること、該薬物による治療後に該遺伝子の発現を観察すること、および該遺伝子の発現のレベルを該治療の前と該治療の後とで比較することを含む。
【００８８】
別の態様において、２型糖尿病の治療において与えられた治療薬の有効性を予測するための方法は、配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置する１つ以上のＳＮＰの有無についてのスクリーニングを含む。
【００８９】
別の態様において、２型糖尿病の治療における与えられた治療薬の有効性を予測するための方法は、図２において同定される１つ以上のハプロタイプの有無についてのスクリーニングを含む。
【００９０】
最新の発明の別の適用は、２型糖尿病に関与する律速経路の具体的な同定である。コントロールと比較して糖尿病患者において明らかにより一般的な遺伝子変異を有する疾病遺伝子は、２型糖尿病の病因における具体的に確認された原因となる工程を示す。つまり、遺伝子が原因となるかまたは疾病過程に単純に反応性があるかどうかについての不確かさは排除される。疾病遺伝子によってコード化されるタンパク質は、２型糖尿病の素因の生物学的過程に関与する律速分子経路を定義する。このような２型遺伝子によってコード化されるタンパク質またはその分子経路におけるその相互作用タンパク質は、小分子治療、タンパク質治療、抗体治療、または核酸治療によって選択的に仲介され得る薬物標的を表し得る。このような特異的情報は、２型糖尿病に影響される人口が増大しているため、大いに必要とされる。
【００９１】
ＳＮＰベースの関係によって２型糖尿病とすでに関係することが公知ではないが、本発明においてＳＮＰベースの関係によって２型糖尿病と関係することが発見された遺伝子には以下のものが含まれる。
【００９２】
【表１】
2008522634.tif 000002
【００９３】
ある態様において、本発明は、２型糖尿病と関連する遺伝子を同定する方法に関するものであり、（a）配列番号１〜７によって同定される配列と配列番号１〜７によって同定される配列の相補体とからなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含有する遺伝子を同定すること、および（ｂ）遺伝子が２型糖尿病と関連することを示す差異について、危険にあるアレルを有する個体における該遺伝子の発現を、危険のないアレルを有する個体における該遺伝子の発現と比較することを含む。
【００９４】
別の態様において、本発明は、２型糖尿病と関連した遺伝子を同定する方法に関するものであり、（ａ）図２において同定される危険にあるハプロタイプを含有する遺伝子を同定すること、および（ｂ）遺伝子が２型糖尿病と関連することを示す差異について、危険にあるハプロタイプを有する個体における該遺伝子の発現を、危険にあるハプロタイプを有さない個体における該遺伝子の発現と比較することを含む。
【実施例】
【００９５】
実施例１．研究集団
コントロール集団と２型糖尿病集団との間のＳＮＰおよびＳＮＰハプロタイプの存在における変動を研究するため、全６００名の患者を本研究に含んだ。スウェーデン人の糖尿病患者の１コホートをＳＮＰ発見に使用し、ポーランド人の糖尿病患者の個別のコホートを関連研究に使用した（表２参照）。さらなる３００名のマッチしたコントロール由来の試料を関連研究に使用するために分析した。
【００９６】
【表２】
2008522634.tif 000003
【００９７】
ケース−コントロール研究から、表現型は単純に「糖尿病」であった。他の副表現型は、ＢＭＩ、ヘモグロビンＡＩＣ、心疾患（ＭＩ等）、ネフロパチー等を含む分析に含まれ得た。その全体において参照により本明細書に組み入れられるArdlie et al., Testing for population subdivision and association in four case-control populations, Am J Hum Genet. 71:304-311, 2002に詳述されるプロトコールにしたがって、試料をGenomics Collaborative Inc. (CGI)により回収した。
【００９８】
最後に、集団は、ほぼ等しい数の男性と女性を含んだ（２７４名の男性および３２６名の女性）。試料も、糖尿病群および影響を受けていない群において男性（１６３名のケースおよび１６３名のコントロール）および女性（１３７名のケースおよび１３７名のコントロール）の同一数と十分にマッチした。
【００９９】
いずれかの集団に基づいた研究において、未知の混乱させる要因に基づいた見せかけの結果を回避するため、ケースとコントロールとをマッチさせることは重要である。遺伝学的研究において、このことは、ケース集団およびコントロール集団がゲノムに渡って遺伝的に同一であるべきであることを意味するが、表現型の素因をつくりやすくする遺伝子を含有する領域が研究されることは例外である。つまり、マーカーの無作為なセットは、ケース集団およびコントロール集団において幅広く同様のアレル頻度を示すべきである。集団の層形成は、患者およびコントロールが性別および民族性についてマッチしただけでなく、同一国家（ポーランド）から選択されたため、本研究において存在しそうになかった。しかしながら、集団の層形成についてテストするため、Falush et al. (March 2002)によるソフトウェアプログラムＳＴＲＵＣＴＵＲＥ２．０を使用してデータを分析し、Pritchard et al, Inference of population structure: Extensions to linked loci and correlated allele frequencies; GENETICS印刷中、(2003); Pritchard et al, Inference of Population Structure Using Multilocus Genotype Data; GENETICS 155: 945-959 (2000a)も参照のこと、それらはすべてそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる。ＳＴＲＵＣＴＵＲＥは、それらの全体において参照により本明細書に組み入れられるPritchard et al., Association mapping in structured population,. AM. J. HUM. GENET. 671:170-81 (2000)に記載されるモデルベースのクラスター化方法を実行する。プログラムによって、いずれの介入もなくクラスターのあらかじめ指定された数へとデータを類別できた。データセットは、３つの基準に基づいて選択される１５０個のマーカーからなった。第一に、マイナーアレルは、集団全体において５％超の頻度を有しなければならなかった。第二に、個体の少なくとも８０％が遺伝子型を有する必要があり、および第三に、マーカーはセットにおけるその他のマーカーと１００ｋｂ以上離れ得た。
【０１００】
データの層別化分析は、明白なクラスター化を示さなかった。さまざまな因子が以下を含む構造の欠如を示した。すなわち、各クラスターからの個体のゲノムの割合は、ケースおよびコントロールについて同一であり、すべての個体を混合した。つまり、それらはすべてのクラスター由来の遺伝子を有すると考えられ、より多くの因子を付加すること（すなわち、より多くのクラスターを適合させること）によって見込みは改善されなかった。
【０１０１】
要約すると、ケースとコントロールとの間に一貫した遺伝的偏向はない。ＳＴＲＵＣＴＵＲＥによって生じた最善に適合したクラスターは、個体の試料の表現型と関連していないようである。
【０１０２】
実施例２．糖尿病集団候補遺伝子における試料回収およびＳＮＰ発見
糖尿病患者からの３００個の試料をＳＮＰ発見過程について分析した。（糖尿病遺伝子に関係すると同定された）全１８６の遺伝子をＳＮＰ発見のために利用した。これらの遺伝子のうち６２を、ParAllele's Mismatch Repair Detection System (MRD)を利用して３４１のＳＮＰを検出するために分析した。他の１６５９のＳＮＰをｄｅ  ｎｏｖｏ配列決定により同定し、公共のデータベース（National Center for Biotechnology Information）から同定した。
【０１０３】
ＳＮＰ発見のために分析した１８６の遺伝子のうち６２の遺伝子を、ミスマッチ修復検出プラットフォーム（ＭＲＤ）を介して３４１のＳＮＰを検出するために分析した。分析の目的は、糖尿病集団およびコントロール集団を含む研究集団において２％以上の頻度にあるＳＮＰをこれらの標的において発見することであった。すべての遺伝子のエキソンに関する情報を、３３に構築されたEnsembl (The Sanger Centre, Cambridge, UK)データベースから収集した。転写産物のすぐ上流の配列が調節配列を多く含むため、最初の３５０ｂｐの上流をエキソン０として符号化した。エキソン、ヒトマウス相同性、およびエキソン０の各々が領域である全９９０の領域を同定した。これらの領域のうち１７５がヒトマウス相同性であり、８１５が（エキソン０を含む）エキソンであった。遺伝子あたりのエキソン数は、ＰＰＰＩＲ３Ｃについてのケースにおける２から５８（ＮＯＳ２Ａ）までに及んだ。大きなエキソンのうちのいくつかを二つ以上の標的へ分割し、小さな密に離れたエキソンのいくつかの対を、一つの標的を形成するよう合流させた。全部で、１０１１の標的を生じ、９９９のアンプリコン（amplicon）を増幅するようプライマーをデザインした。
【０１０４】
実施例３．ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）
ＭＲＤは、変異体または、Escherichia coliのミスマッチ修復システム（その全体において参照により本明細書に組み入れられるModrich, P., Mechanisms and biological effects of mismatch repair, ANN REV. GENET, 25: 2259-53 (1991)）を利用するＳＮＰを検出する。形質転換されたフラグメントの一つのプールを二つのプール、すなわち変異を有するものと有しないものとへ類別するために、特定の系を遺伝子工学的に改変した。ＭＲＤは、複数変異走査のための方法（その全体において参照により本明細書に組み入れられるFaham. M., et al., Mismatch repair detection (MDKD): high- throughput scanning for DNA variations, HUMMOL. GENET, 10(16);p 1657-64 (2001)）としてすでに記載されている。ＭＲＤは、二つの異なる集団における共通の変異体アレルを発見するために、標準的なジデオキシ終結因子配列決定と組み合わせて使用される。一つの集団からプールされたゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用する個々のＰＣＲ反応物を、単一のハプロイド個体由来のＰＣＲフラグメントと混合する。Ｓａｎｇｅｒ配列決定は、プールされた集団が直接配列決定されるゲノムプール由来の希少なアレルを検出するのに十分な感度を有しない。代わりに、多くのＰＣＲ反応物をプールし、一つのＭＲＤ反応を実施して、ハプロイド標準物質と比較して変異体アレルを多く含むコロニーのプールを生じる。変異体の多いプールからの一回の増幅反応を各アンプリコンについて実施した後、検討した集団における共通で希少な変異を同定するために配列決定反応を実施する。その全体において参照により本明細書に組み入れられるFakhrai-Rad et al., SNP Discovery in Pooled Samples With Mismatch Repair Detection, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, 14: 1404-1412 (2004)を参照のこと。
【０１０５】
本過程の最終的な結果は、多くの個体を増幅させ配列決定する必要性を、多様な様式において何千個ものアンプリコンについて実施されるプールされた濃縮過程と置換することである。配列決定過程はしたがって、ハプロイド標準物質を配列決定する課題およびＭＲＤにより濃縮されたプールの結果まで低減した。間違った正のＳＮＰ発見速度を低下させるために、フォワードおよびリバースの両者においてアンプリコンを典型的に配列決定する。
【０１０６】
ＭＲＤベースのＳＮＰの発見の感度は、非ゲノムＤＮＡミスマッチのＭＲＤ濃縮により生じるバックグラウンドにより制限される。これらは二つの方法で生じ得る。すなわちオリゴヌクレオチド突然変異およびＰＣＲエラーである。ＰＣＲプライマーにおけるオリゴエラーおよびＰＣＲエラーの両者は、いずれかの実際のＤＮＡ変異のない場合の突然変異を含有する一セットのフラグメントを生ずる。これらのフラグメントは、バックグラウンドレベルよりも低い頻度で生じる突然変異を高めることができないことを意味する実際の変異にしたがって濃縮されるであろう。これらの問題を最小化するため、突然変異の割合の低いオリゴおよび忠実度の高いポリメラーゼを使用するＰＣＲを使用する。ＢＲＣＡ１遺伝子における変異を有する患者を使用して、コントロール実験を実施した。これらの患者を配列決定して、ＢＲＣＡ１エキソンにおける突然変異を同定した。これらのＤＡＮを次に、個々のＳＮＰが頻度のある範囲で見出された試料を作製するような方法でプールした。これらのプールを次に、濃縮し配列決定した。ＭＲＤは、１％頻度と同じくらい低い変異に対する非常に高い感度を表し、アンプリコンが１０％超の頻度でＳＮＰを表す場合、完全に再発見する。
【０１０７】
ヒトの集団において、ＭＲＤベースのＳＮＰ発見の感度に関する他の制限を与える他の実際上の問題がある。これらのうちの第一は、複数のＳＮＰが特定の配列決定フラグメントで生じることである。このことが非常に異なる頻度を有する二つのＳＮＰで生じる場合、より高い頻度を有するＳＮＰは濃縮されたプールを支配する傾向にあるであろうし、より希少なＳＮＰの信号を抑制するであろう。この効果は、いくつもの方法において緩和され得る。第一は、複数のＳＮＰが単一フラグメント内で生じる機会を最小化するために、かなり小さなＰＣＲフラグメントを使用することである（典型的には〜３００ｂｐのフラグメントを使用する）。第二に、共通のＳＮＰが生じることがわかっている場合、これらのＳＮＰを排除するようＰＣＲプライマーをデザインし得る。これらの制限は、典型的な方法における多くの個体の配列決定および分析の非常に高い経費を圧縮すべきである。伝統的な方法で配列決定される個体数の減少は、小さな集団の選択におけるポワソンノイズを導入することによって適用範囲を低下させる。
【０１０８】
実施例４．分子反転プローブを使用するＳＮＰ遺伝子型分類
糖尿病の親由来の試料を利用してＳＮＰ発見相を完全にした後、糖尿病患者の第二コホート由来の３００試料のセットおよび非糖尿病コントロール由来の３００試料のセットを含む試料の別のセットを、プロジェクトの遺伝子型分類相に利用した。
【０１０９】
分子反転プローブ（ＭＩＰ）をＳＮＰ遺伝子型分類に利用した。１７３９個のＳＮＰについての配列を分析した。総数１５９１のこれらのＳＮＰはＮＣＢＩデータベース（ビルド３３）において特有であった。３２７のＳＮＰに隣接する４０ｂｐの配列は独特であった。ＳＮＰ発見において検出されなかった公共のデータベース由来の８２／１０２の確認されたＳＮＰは、ゲノムにおいて特有であった。このことは、ＭＩＰプローブがデザインされた２，０００のＳＮＰを実際に与えた。これらの２，０００のプローブのうち、１，７６９（８８．４％）は有効なアッセイを生じた。これらを次に、３００名の糖尿病ケースおよび３００名の民族的および性別上マッチしたコントロールにおいて遺伝子型分類をした。
【０１１０】
糖尿病に対する罹病性における役割を担い得る１８６の遺伝子に関する情報を提供するため、これらのＳＮＰを選択した。これらの遺伝子は、２１番目の染色体およびＹ染色体を除き、どの染色体からも少なくとも１つの遺伝子を有するゲノムにわたって位置する。遺伝の長さが各遺伝子における最も広く開いたＳＮＰ間の領域のサイズによって測定され、それゆえたった一つのＳＮＰを有する遺伝子が０ｋｂのサイズを有すると記録されたことに留意すること。
【０１１１】
本過程におけるオリゴヌクレオチドプローブは、増幅され得ない分子から増幅され得る分子への単一分子再配置を経験する。この再配置は、ゲノムＤＮＡおよびアレル特異的方法において生じる酵素による「ギャップフィル」過程によって仲介される。ギャップフィル過程は結果として、プローブが環化される重要な中間状態を生じる。この状態によって、すべて交差反応したおよび反応していないプローブを分解するであろうエキソヌクレアーゼ処理を通じての単一分子相互作用について選択できる。干渉後、蛍光ラベルをつけた包括的なＰＣＲプライマーを使用して、プローブを増幅させる。その全体において参照により本明細書に組み入れられるHardenbol et al., Multiplexed genotyping with sequence tagged molecular inversion probes, 21 NAT. BlOTECHNOL. (6):673-78 (June, 2003)を参照してほしい。
【０１１２】
アレルを同定するため、４つの同一の反応をＳＮＰについて使用する。４つの多重化反応の各々は、単一のヌクレオチド種（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）を使用することによって異なるＳＮＰアレルを評価する。反転後、反転を経験したすべてのプローブが各反応において増幅されるであろうように、ＰＣＲを共通のプライマー対で実施する。これらの４つの反応の各々において異なる蛍光ラベルを使用することによって、４つの個別の反応から生じるＭＩＰプローブアンプリコンにラベルが位置することを同定することによってＳＮＰアレルを推量し得る。
【０１１３】
増幅後、４つの反応物を普遍的なオリゴヌクレオチドアレイへハイブリダイゼーションする。相対的な塩基の組み込みを、ＤＮＡアレイ上の対応する相補的なタグ部位における蛍光信号によって測定する。各プローブについての４つの強度の値を生じる。期待されたアレル塩基についての２つの値を比較して、ＳＮＰが与えられた個体についてホモ接合性であるかまたはヘテロ接合性であるかどうかを決定し、２つの非アレル塩基をアレル塩基と比較して、品質管理のチェックとしてのプローブについてのノイズに対する信号を測定する。
【０１１４】
実施例５．アレル関連結果の要約
マーカー−形質関係を、分割表分析および経験的なｐ値についてのＦｉｓｈｅｒの正確検定を使用して検討した。一つの特定の研究のアレルのカイ二乗関連検定（２×２、１ｄ．ｆ．）からの結果の要約を図３に示し、ＳＮＰの多くがｐ≦０．０５で有意であることがわかった。
【０１１５】
実施例６．遺伝子型関連結果の要約
一つの特定の研究の遺伝子型のカイ二乗関連検定（２×３、２ｄ．ｆ．）からの結果の要約を図４に示し、ＳＮＰの多くがｐ≦０．０５で有意であることがわかった。
【０１１６】
実施例７．劣性効果についてのカイ二乗検定
疾病への潜在的な遺伝的かかりやすさが付加的な遺伝モデルと一致するときに、アレルおよび遺伝子型の両テストが最も適切である一方で、遺伝子型テストには優性についてのテストも含まれる。しかしながら、遺伝子型テストおよびアレルテストの両者は、劣性のアレル効果に向けられず、もし存在したとしても、それらは見逃されるであろう。この問題に向かうため、カイ二乗検定の別のシリーズを実行し、そこで各ＳＮＰのマイナーアレルを劣性効果としてモデル化した（２×２、１ｄ．ｆ．）。いくつものＳＮＰは、劣性テストによって有意であり（図５参照）、それらのうちのいくつかをアレルテストによってすでに関係付けた。図６は、劣性効果についてのアレルの関連、遺伝子型の関連およびカイ二乗検定を使用して、２型糖尿病と関連することがわかったＳＮＰの要約を提供する。
【０１１７】
実施例８．危険にあるハプロタイプについての評価
本明細書に記載のハプロタイプは、２型糖尿病を有さない個体よりも２型糖尿病を有する個体においてより頻繁に見られる。したがって、これらのハプロタイプは、個体において２型糖尿病または２型糖尿病に対する罹病性を検出するための予測値を有する。本明細書に記載の特定の方法において、２型糖尿病についての危険にある個体は、危険にあるハプロタイプの同定された個体である。
【０１１８】
ある態様において、危険にあるハプロタイプは、２型糖尿病の有意な危険を与えるものである。ある態様において、ハプロタイプと関連した有意性をオッズ比によって測定する。さらなる態様において、有意性を百分率によって測定する。ある態様において、有意な危険を少なくとも約１．２のオッズ比として測定し、それには１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８および１．９を含むがそれらには限定されない。さらなる態様において、少なくとも１．２のオッズ比が有意である。さらなる態様において、少なくとも１．５のオッズ比が有意である。さらなる態様において、少なくとも約１．７の危険における有意な増大が有意である。さらなる態様において、危険における有意な増大が少なくとも約２０％であり、それには約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％および９８％が含まれるが、それらには限定されない。さらなる態様において、危険における有意な増大は少なくとも約５０％である。しかしながら、危険が医学的に有意であるかどうかを同定することは、特定の疾病、そのハプロタイプ、およびしばしば、環境上の要因を含むさまざまな要因にも依存し得ることは理解される。
【０１１９】
蛍光ベースの技術（Chen, et at, Genome Res. 9, 492 (1999)）、ＰＣＲ、ＬＣＲ、入れ子状態のＰＣＲおよび核酸増幅についての他の技術などのＳＮＰの存在についての遺伝子型分類のための標準的な技術を使用し得る。ある態様において、方法は、ＳＮＰの存在または頻度を個体において評価することを含み、健常なコントロール個体と比較してＳＮＰの過剰またはより高い頻度は、個体が２型糖尿病を有するか２型糖尿病に対して罹病性があることを示す。２つ以上のＳＮＰの存在は、個体をスクリーニングするのに使用され得る、危険にあるハプロタイプの存在を示し得る。例えば、危険にあるハプロタイプは、図２において同定されるハプロタイプ、図１において同定されるＳＮＰの組み合わせ、あるいは図１または２において同定されるＳＮＰの組み合わせを含み得る。危険にあるハプロタイプの存在は２型糖尿病に対する罹病性を示し、それゆえ、本明細書に記載の治療方法について標的集団内にある個体を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、各配列内のカッコによってＳＮＰの示された配列番号１〜７を示す。２型糖尿病と関連した各ＳＮＰのアレルは個別のカラムに示される。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃ（本明細書では「図２」と集約的に呼ばれる）は、２型糖尿病と関連したハプロタイプを示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃ（本明細書では「図２」と集約的に呼ばれる）は、２型糖尿病と関連したハプロタイプを示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃ（本明細書では「図２」と集約的に呼ばれる）は、２型糖尿病と関連したハプロタイプを示す。
【図３】図３は、図１における各ＳＮＰについて同定された危険性のある各アレルが、前記アレルのカイ二乗関連検定に基づいて２型糖尿病とどれだけ関連するか（ｐ≦０．０５での有意性）を示す。
【図４】図４は、図１における各ＳＮＰについて同定された危険性のある各アレルが、遺伝子型のカイ二乗関連検定に基づいて２型糖尿病とどれだけ関連するか（ｐ≦０．０５での有意性）を示す。
【図５】図５は、図１における各ＳＮＰについて同定された危険性のある各アレルが、劣性効果についてのカイ二乗検定に基づいて２型糖尿病とどれだけ関連するか（ｐ≦０．０５での有意性）を示す。
【図６】図６は、アレルの関連、遺伝子型の関連および／または劣性効果についてのカイ二乗検定を使用して２型糖尿病と関連があるとわかったＳＮＰの要約を提供する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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