(57)【要約】【課題】本発明は、融合タンパク質、そのコード遺伝子、発現方法、及び応用を提供し、目的は、融合タンパク質、そのコード遺伝子、及び発現方法を提供し、更に該融合タンパク質を有効成分とした抗アレルギー薬を提供することである。【解決手段】本発明により提供される融合タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、前記配列番号２で表されるアミノ酸配列に由来し、前記配列番号２で表されるアミノ酸配列と同じ活性を有し、前記配列番号２で表されるアミノ酸配列に対する一つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加によって生成されるタンパク質のいずれかである。本発明の融合タンパク質は、ＩｇＥレセプターをブロックするＩｇＥモノクローナル抗体の機能を有するだけでなく、更に重要なことに、細胞内シグナル伝達システム内でアレルギー反応抑制システムを開始させ、細胞のアレルギー反応抑制を強める。これは、アレルギー性疾患治療において重要な役割を果たす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質及び、
前記配列番号２で表されるアミノ酸配列に由来し、前記配列番号２で表されるアミノ酸配列と同じ活性を有し、前記配列番号２で表されるアミノ酸配列に対する一つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加によって生成されるタンパク質
のいずれかであることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
配列番号２で表される配列を有する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
融合タンパク質コード遺伝子であって、
１）配列番号１で表されるＤＮＡ配列、
２）配列番号２で表されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
３）配列番号１で表されるＤＮＡ配列と９５％を超える相同性を有し、且つ、同じ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列
のヌクレオチド配列のいずれか１つを有することを特徴とする融合タンパク質コード遺伝子。
【請求項４】
前記融合タンパク質コード遺伝子が、配列番号１であることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質コード遺伝子。
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子を含有する、発現ベクター、キャリア、及び細胞株。
【請求項６】
請求項３に記載の遺伝子の任意の断片を増幅するための一対のプライマー。
【請求項７】
請求項１に記載の融合タンパク質を発現させる方法であって、
融合タンパク質コード遺伝子を含む発現ベクターをＳＰ２／０細胞にトランスフォーメーションして陽性クローンを得る工程と、
該陽性クローンを培養して融合タンパク質ＦＰ４を発現させる工程と
を含み、
該融合タンパク質コード遺伝子は
１）配列番号１で表されるＤＮＡ配列、
２）配列番号２で表されるタンパク質のＤＮＡ配列、及び
３）配列番号１で表されるＤＮＡ配列と９５％を超える相同性を有し、且つ、同じ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列
のヌクレオチド配列のいずれか１つを有することを特徴とする融合タンパク質を発現させる方法。
【請求項８】
前記融合タンパク質コード遺伝子を含む発現ベクターが、発現ベクターｐＳｅｃＴａｇへの前記融合タンパク質コード遺伝子のライゲーションによって得られる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の融合タンパク質を有効成分とした抗アレルギー薬。
【請求項１０】
抗アレルギー治療用薬剤の調製への請求項１に記載の融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質（ＦＰ）及びその遺伝コードの発現方法と遺伝子工学及び免疫学分野における用途に関し、特に、この融合タンパク質が抗アレルギー薬の有効成分として作用する場合の、その遺伝コードの発現方法と遺伝子工学及び免疫学分野における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性疾患は、急性及び慢性疾患の６番目の主な原因である。この疾患は、３０％〜６０％で遺伝する可能性がある。アレルギー性鼻炎、喘息、アレルギー性皮膚炎、アレルギー関節炎、じんましん、アレルギー性ショック等は、一般的なアレルギー性疾患である。中国人人口の約１０％〜１５％、アメリカ人人口の約２０％がアレルギー性疾患を患っている。
【０００３】
今日、アレルギー性疾患の治療薬の大部分は、臨床症状のコントロールに主に使用され、ステロイドホルモン、抗ヒスタミン薬、充血軽減薬、ジソジウム・クロモグリケイト、及び気管支拡張薬が使用される。近年、米国食品医薬品局は、臨床実験での抗ＩｇＥモノクローナル抗体の使用を認可した。これらの薬は、様々な副作用がある。研究所、大学及び製薬会社が新しい抗アレルギー薬を追求している。
【０００４】
目下、アレルギー性疾患の治療薬は、臨床症状を調節するために主に使用され、ステロイドホルモン、抗ヒスタミン薬、充血軽減薬、及び気管支拡張薬が挙げられる。近年、米国食品医薬品局は、臨床実験での抗ＩｇＥモノクローナル抗体の使用を認可した。これらの薬は、様々な副作用がある。研究所、大学及び製薬会社は新しい抗アレルギー薬を追求している。
【０００５】
アレルギー反応のメカニズムは以下の通りである。すなわち、抗原（アレルゲン）が体内に侵入すると、肥満細胞及び好塩基球上に付着したＩｇＧ分子（細胞親和性抗体）と結合して細胞の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を活性化し、細胞の生物活性物質の放出が促進されて、平滑筋の収縮、血管透過性の上昇、漿液の分泌等の臨床病理学的変化が起こる。ヒト肥満細胞及び好塩基球上の親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）は、この病理学的プロセスにおいて、アレルギー性疾患の主要な役割を果たす。一方、ＦｃｒＲＩＩ阻害レセプターは、ヒト肥満細胞及び好塩基球上に発現している。ＩｇＧ２分子がレセプターに同時に結合すると、重合が起こり免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化が誘発され、ＦｃεＲＩの活性化シグナルが抑制される。最近の研究により、ＦｃｒＲＩＩレセプターとＦｃεＲＩレセプターとが相互リンクすると、ヒト肥満細胞及び好塩基球中の阻害シグナルが誘導されて細胞中の活性経路がブロックされるため、活性化メディエーターの放出が抑制され、更に、アレルギー反応が抑制されることが示された。従って、アレルギー反応内の阻害シグナルをこのメカニズムによって活性化可能な融合タンパク質の開発は、抗アレルギー薬開発の新しいアプローチである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、遺伝子及びその遺伝子がコードする、抗アレルギー活性を有する融合タンパク質を提供することである。
本発明で使用される融合タンパク質は、ＦＰ４と称され、配列番号２のアミノ酸配列を有する機能タンパク質若しくは配列番号２から由来のタンパク質、又は配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸を一つ以上増減することによって得られるすべての置換物である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
配列番号２のアミノ酸配列のＦＰ４融合タンパク質は、５５４アミノ酸を含む（図１）。ＦＰ４構造は、３つの部分からなる：Ａ領域（Ｆｃε）（Ｎ末端から１〜３００番目のアミノ酸）、Ｂ領域（Ｆｃγ）（Ｎ末端から３１８〜５５４番目のアミノ酸、及びＣ領域（ヒンジ）（Ｎ末端における３０１〜３１７番目のアミノ酸）。これらの中で、Ａ領域は、ヒト免疫グロブリンＩｇＥに由来し、ＩｇＥレセプターのリガンドである（ＦＣεＲＩ）。Ｂ領域は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧに由来し、ＩｇＧレセプターのリガンドである（ＦｃγＲＩＩ）。Ｃ領域は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧに由来し、ねじれ構造である。
【０００８】
融合タンパク質ＦＰ４は、次の配列を有する。
１）配列番号１：ＤＮＡ配列
２）配列番号２：アミノ酸配列
３）配列番号１で表されるＤＮＡ配列と９５％を超える相同性を有し、且つ、同じ機能タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列。
配列１のＤＮＡ配列は、１６６５塩基対からなる。読み枠は、５末端で始まる１番目の塩基対から１６６５番目の塩基対までである。
【０００９】
本発明の遺伝子を含有する、発現ベクター、キャリア、及び細胞株も本発明の特許権保護下にある。
ＦＰ４の一対のプライマーでの増幅もまた、本発明の保護の拡張で保護される。
【００１０】
本発明の第２の目的は、融合タンパク質ＦＰ４の発現方法を提供することである。
本発明で導入されるＦＰ４の発現方法は、融合タンパク質ＦＰ４を発現する陽性クローンを得るためにＦＰ４遺伝子をＳＰ２／０細胞にトランスフォーメーションすることである。
発現ベクターは、通常の方法を使用して構築され、ＦＰ４遺伝子がｐＳｅｃＴａｇベクターにクローニングされる。
【００１１】
本発明の第３の目的は、有効成分が融合タンパク質ＦＰ４である抗アレルギー薬を提示することである。
必要に応じて、上記の薬に１つ又は複数のキャリアを加えることができる。これらのキャリアは、薬学的な仕様の希釈剤、賦形剤、助剤、結合剤、湿潤剤、粉末化医薬製剤、吸収促進剤、界面活性剤、吸収キャリア、及び潤滑剤等が挙げられる。必要であれば、また、香料添加剤、及び甘味剤も添加可能である。
【００１２】
本発明の薬は、いくつか方法があるが、特に、静脈内注射、皮下注射、又は皮膚に直接塗布して使用可能である。鼻内噴霧として、及び喉、口、皮膚、又は膜吸入器も使用可能である。更に、この薬は、鼻用水性懸濁液、点眼液、又は点耳液として適用可能である。更に、直腸ゲル、錠剤、粉末、丸薬、カプセル、液剤、オイルクリーム、クリーム、及び様々な他の形態で使用可能である。上記の方法は、正確な用量を決定するために従来の方法で薬学的に調製可能である。
上記の全ての薬は、概して、用量が０．０１〜１ｕｇ／ｋｇ／日、及び治療期間が１０〜２０日間である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
実施例１：融合タンパク質ＦＰ４の発現
図２に示すように、融合タンパク質ＦＰ４の発現方法は、以下の工程を含む。ヒト末梢血からのＢリンパ球を精製する工程；及び、ゲノムＤＮＡを特異的に直接分離して以下の通りに通常の処理を行う工程。
Ｐ１（Ｆｃε）:5’-GTGGCCCAGCCGGCCTTCACCCCGCCCACCGTGAAG-3’;
Ｐ２（Ｆｃε）:5’-GTGGATCCTTTACCGGGATTTACAGACAC-3’;
Ｐ３（Ｆｃγ）:5’-GGGGATCCGAGCCCAAATCTTGTGAC-3’;
Ｐ４（Ｆｃγ）:5’-GTGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’。
【００１４】
ポリメラーゼ連鎖反応によりＦｃε及びＦｃγ遺伝子を増幅し、Ｆｃε及びＦｃγのＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した。図３に結果を示す。Ｆｃε  ＤＮＡ  ＰＣＲ産物は、１１５５ｂｐであり、Ｆｃγ  ＤＮＡ  ＰＣＲ産物は、９２８ｂｐである。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン  カリフォルニア州）に直接クローニングした。ライゲーション後、ＦＰＥＦｃ−ε及びＦＰＧＦｃ−γを得て、ヌクレオチド配列分析を行った。
ヌクレオチド配列が正しいことを確認した後、Ｆｃε遺伝子をＳｆｉＩ−ＢａｍＨＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ）で切断した。Ｆｃγ遺伝子はＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩで切断した。その間にｐＳｅｃＴａｇ発現ベクター（インビトロジェン  カリフォルニア州）をＳｆｉＩ−ＮｏｔＩで切断し、Ｆｃε及びＦｃγをｐＳｅｃＴａｇＦＰ４にライゲーションした。挿入配列は図１と同じであることを確認した。ｐＳｅｃＴａｇＦＰ４ベクターを、マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞にエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。ゼオシン（Ｒ）で選別後、陽性クローンを酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングした（マウス抗ヒトＩｇＥでプレートをコーティングし、クローンの上清を添加し、そしてヤギ抗ヒトＩｇＥ−ＡＰコンジュゲートを添加する）。ＦＰ４タンパク質を高度に発現する陽性クローンを得た。
【００１５】
ＦＢＳ  ＲＰＭＩ  １６４０培地（インビトロジェン  カリフォルニア州）１０％を使用して陽性クローンを３７℃、ＣＯ２５％で１５日間培養した。上清を２０００ｒｐｍで遠心分離して回収し、抗ヒトＩｇＥアフィニティーカラムを使用してＦＰ４タンパク質を精製した（マウス抗ヒトＩｇＥをＣＮＢｒ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ファルマシア）に結合）。
【００１６】
実施例２：ＦＰ４及びＦｃεＲＩレセプター結合実験
１×１０６個のＣＨＯ３Ｄ１０細胞を、精製したＦＰ４５μgと４℃で１時間インキュベートし、ＦＩＴＣラベル抗ヒトＩｇＥ（カルタグ  カリフォルニア）５μｌを加え、フローサイトメトリーで分析した。図４に結果を示した。ＦＰ４タンパク質はＦｃεＲＩレセプターに結合し、ＣＨＯ３Ｄ１０のＦＩＴＣ陽性を示す。図４において、ＳＳＣ−Ｈは、細胞質の粒状度、ＦＳＣ−Ｈは細胞の大きさ、ＦＬ２−ＨはＰＥ、及びＦＬ１−ＨはＦＩＴＣである。
【００１７】
実施例３：ＦＰ４及びＦｃγＲＩＩレセプター結合実験
１×１０６個のＨＭＣ‐１細胞を、精製したＦＰ４タンパク質５μgと４℃で１時間インキュベートし、ＦＩＴＣラベル抗ヒトＩｇＧ（カルタグ  カリフォルニア州）５μｌを加え、フローサイトメトリーで分析した。結果はＦＰ４タンパク質がＦｃγＲＩＩレセプターに結合した。ＨＭＣ‐１細胞はＦＩＴＣ陽性を示し（図５）、ＳＳＣ−Ｈは、細胞質の粒状度、ＦＳＣ−Ｈは細胞の大きさ、ＦＬ２−ＨはＰＥ、及びＦＬ１−ＨはＦＩＴＣである。
【００１８】
実施例４：ｉｎ  ｖｉｔｒｏＦＰ４タンパク質機能実験
ヒト末梢血からのヒト好塩基球を分離精製した。精製した好塩基球（１×１０６）を、特異的ヒト抗ＮＰ−ＩｇＥ（セロテック）１〜１０μｇと３７℃で２時間インキュベートし、ＮＰ−ＢＳＡを２μｇ加えた。ヒスタミン放出をＥＬＩＳＡで測定した。結果は、ＦＰ４タンパク質が用量依存的にヒト好塩基球でのヒスタミン放出を有意に阻害した（図６）。Ｈｕ  ＩｇＥは、ヒトＩｇＥ、ＮＳ  ＩｇＥは非特異的ヒトＩｇＥ、ＮＰ−ＢＳＡはアレルゲン、＋は付加、−は付加なしを表す。
【００１９】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｖｏＦＰ４タンパク質機能実験
ヒトＦｃεＲＩα鎖トランスジェニックマウス（カリフォルニア大学サンディエゴ校）に、ヒト抗ＮＰ−ＩｇＥ（セロテック）を皮内注射し、４時間後にＮＰ−ＢＳＡ  １００μg＋Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅ（シグマ）染料１％を静脈注射した。アレルギー反応が起これば、血管から染料が漏れるため皮膚が局所的に青く変色する。同量の融合タンパク質（ＦＰ４）を加えた場合、アレルギー反応は完全に阻止され、皮膚が局所的に青く変色しなかった（図６）。この実験結果により、ＦＰ４タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏでアレルギー反応が阻止することが更にわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明において、融合タンパク質ＦＰ４の構成成分は、ヒト免疫グロブリンに由来する。従って、該タンパク質は人体に薬として入り、抗原を有さない（異種タンパク質免疫源）。融合タンパク質ＦＰ４  Ｃ領域（ヒンジ）は融通が利き、容易に回転し、及びＦｃεＲＩとＦｃγＲＩＩとを結合可能である等の特徴を得るため、細胞を刺激してシグナル送信を阻止し、細胞の様々な活発な生物学的粒子の放出を阻害して、アレルギー反応の発生を防止する。上記実験の全ての結果は、アレルギー反応を防止するために、融合タンパク質ＦＰ４が、好塩基球顆粒細胞表面の脂肪細胞又はＦｃ＿ＲＩとＦｃ＿ＲＩＩとを効果的に結合可能である。本発明の融合タンパク質ＦＰ４は、ＩｇＥアクセプターの機能を阻止するためにＩｇＥモノクローナル抗体を得るだけでなく、より重要なことはシグナル抑制により細胞のシグナル変換経路内のアレルギー反応が始まることである（細胞シグナル伝導系抑制系内でのアレルギー反応の開始はより重要である）。更に、細胞のアレルギー反応の抑制を強化し、アレルギー性疾患治療に不可欠な役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ＦＰ４の分子構造である。
【図２】図２は、ＦＰ４のクローニングのフローチャートである。
【図３Ａ】図３Ａは、ＦｃεＰＣＲ産物の電気泳動分析結果である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＦｃγＰＣＲ産物の電気泳動分析結果である。
【図４】図４は、ＦＰ４のＦｃεＲＩレセプターへの結合能力のフロー分析である。
【図５】図５は、ＦＰ４のＦｃγＲＩＩレセプターへの結合能力のフロー分析である。
【図６】図６は、ヒト好塩基球でヒスタミン放出を阻害したＦＰ４タンパク質を示す。
【図７】図７は、遺伝子導入マウスでアレルギー反応を阻止したＦＰ４融合タンパク質を示す。
【図２】
2008500807.tif 000002
【図４】
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【図５】
2008500807.tif 000004
【図６】
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【図１】
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【図３Ａ】
2008500807.tif 000007
【図３Ｂ】
2008500807.tif 000008
【図７】
2008500807.tif 000009
【配列表】
2008500807000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月9日(2007.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子を含有する、発現ベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質（ＦＰ）及びその遺伝コードの発現方法と遺伝子工学及び免疫学分野における用途に関し、特に、この融合タンパク質が抗アレルギー薬の有効成分として作用する場合の、その遺伝コードの発現方法と遺伝子工学及び免疫学分野における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性疾患は、急性及び慢性疾患の６番目の主な原因である。この疾患は、３０％〜６０％で遺伝する可能性がある。アレルギー性鼻炎、喘息、アレルギー性皮膚炎、アレルギー関節炎、じんましん、アレルギー性ショック等は、一般的なアレルギー性疾患である。アレルギー性鼻炎は、目、鼻、副鼻腔に影響する。鼻詰り、鼻水、耳及び咽喉、後鼻腔、涙目、目のかゆみ、気管支炎を生じ、花粉症としても知られている。アレルギー性皮膚炎は、皮膚に影響し、かゆみを伴う発疹を生じる。接触皮膚炎としても知られている。喘息は、肺に影響し、息切れ又は喘鳴を生じる。食物アレルギーは、胃、及び他の内臓に影響し、また、全身に症状を生じる可能性がある。じんましんは、皮膚にじんましんを生じる症状である。特別な注意が必要なアレルギー反応は、過敏症であり、急激な、重度の、死に至る可能性のある体の様々な部位に作用する可能性がある症状を伴う。通常、症状は、アレルゲンへの暴露後非常に早く現れ、全身中の激しいかゆみ、全身の腫れ、呼吸困難を含み、生死に係わるショックに至る可能性さえある。中国人人口の約１０％〜１５％、アメリカ人人口の約２０％がアレルギー性疾患を患っている。
【０００３】
今日、アレルギー性疾患の治療薬の大部分は、臨床症状のコントロールに主に使用され、ステロイドホルモン、抗ヒスタミン薬、充血軽減薬、ジソジウム・クロモグリケイト、及び気管支拡張薬が使用される。近年、米国食品医薬品局は、臨床実験での抗ＩｇＥモノクローナル抗体の使用を認可した。これらの薬は、様々な副作用がある。研究所、大学及び製薬会社が新しい抗アレルギー薬を追求している。
【０００４】
目下、アレルギー性疾患の治療薬は、臨床症状を調節するために主に使用され、ステロイドホルモン、抗ヒスタミン薬、充血軽減薬、及び気管支拡張薬が挙げられる。近年、米国食品医薬品局は、臨床実験での抗ＩｇＥモノクローナル抗体の使用を認可した。これらの薬は、様々な副作用がある。研究所、大学及び製薬会社は新しい抗アレルギー薬を追求している。
【０００５】
アレルギー反応のメカニズムは以下の通りである。すなわち、抗原（アレルゲン）が体内に侵入すると、肥満細胞及び好塩基球上に付着したＩｇＧ分子（細胞親和性抗体）と結合して細胞の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を活性化し、細胞の生物活性物質の放出が促進されて、平滑筋の収縮、血管透過性の上昇、漿液の分泌等の臨床病理学的変化が起こる。ヒト肥満細胞及び好塩基球上の親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）は、この病理学的プロセスにおいて、アレルギー性疾患の主要な役割を果たす。一方、ＦｃｒＲＩＩ阻害レセプターは、ヒト肥満細胞及び好塩基球上に発現している。ＩｇＧ２分子がレセプターに同時に結合すると、重合が起こり免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化が誘発され、ＦｃεＲＩの活性化シグナルが抑制される。最近の研究により、ＦｃｒＲＩＩレセプターとＦｃεＲＩレセプターとが相互リンクすると、ヒト肥満細胞及び好塩基球中の阻害シグナルが誘導されて細胞中の活性経路がブロックされるため、活性化メディエーターの放出が抑制され、更に、アレルギー反応が抑制されることが示された。従って、アレルギー反応内の阻害シグナルをこのメカニズムによって活性化可能な融合タンパク質の開発は、抗アレルギー薬開発の新しいアプローチである。
【０００６】
アレルギー体質の特徴は、抗原（アレルゲン）提示後、持続的なＩｇＥ反応を維持する傾向である。抗原への初期暴露は、特定のＩｇＥ分子の産生を刺激し、この分子は肥満細胞表面の高親和性Ｆｃレセプターに結合する。抗原へ再び暴露されると、抗原と膜結合ＩｇＥ分子との相互結合により血管作用物質が放出し、くしゃみ、かゆみ、及び気管支痙攣の臨床症状を誘発する。免疫グロブリンレセプター（Ｆｃレセプターともいう）は、肥満細胞の細胞表面レセプターであり、免疫グロブリンの定常部に結合し、抗原結合以外に様々な免疫グロブリン機能を仲介する。
【０００７】
ＩｇＥ分子と結合するＦｃレセプター（免疫グロブリンの一種）は、免疫系の多種類の細胞に見出される。現在ＩｇＥとして知られているＦｃレセプターは、多数鎖高親和性レセプター（ＦｃεＲＩ）、及び低親和性レセプター（ＦｃεＲＩＩ）の二種類がある。ＩｇＥ分子は、これらのＦｃレセプターを介して抗体として生物学的反応を仲介する。肥満細胞、好塩基球、ランゲルハンス細胞の表面に発現した高親和性ＦｃεＲＩレセプターは、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーに属し、レセプター発現及び情報伝達に必要とされるα‐鎖、β‐鎖及び２つのジスルフィド結合γ‐鎖からなる四量体構造を有する。レセプターのα‐鎖は、ＩｇＥのＨ鎖の第３の定常領域の遠位部と相互作用する。ヒトＦｃεＲＩレセプターの結合に関わるヒトＩｇＥ分子の特異的な領域は、６つのアミノ酸Ａｒｇ‐４０８、Ｓｅｒ‐４１１、Ｌｙｓ‐４１５、Ｇｌｕ‐４５２、Ａｒｇ‐４６５及びＭｅｔ‐４６９を含むものとして同定されている。相互作用は、結合定数約１０１０Ｍ−１と極めて特異的である。
【０００８】
好酸球、白血球、Ｂリンパ球、及び血小板等の炎症細胞表面に発現する低親和性ＦｃεＲＩＩレセプターは、免疫グロブリンスーパーファミリーから進化したものではないが、２、３の動物群と実質的に相同であり、細胞質内ＮＨ２末端の膜貫通型鎖からなる。低親和性レセプター（ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３））は、現在のところ２つの形態ＦｃεＲＩＩａ及びＦｃεＲＩＩｂを有し、どちらもクローン化及び塩基配列決定されている。２つの形態は、Ｎ‐末端細胞質領域だけが異なり、細胞外ドメインは同一である。サイトカインＩＬ‐４による誘導でＦｃεＲＩＩａは通常Ｂ細胞に発現し、ＦｃεＲＩＩｂはＴ細胞、Ｂ細胞、単球、及び好酸球に発現する。
【０００９】
高親和性ＦｃεＲＩレセプターを介して、ＩｇＥは、アナフィラキシーショックの深刻な生理条件に加えて、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、重度の食物アレルギー、慢性じんましん、血管性浮腫を含む数々の急性及び慢性アレルギー反応に重要な役割をする。抗原特異的ＩｇＥ分子に対する多価抗原結合は、特に、肥満細胞、又は好塩基球の表面のＦｃεＲＩレセプターに結合し、複雑に連続したシグナル伝達事象を活性化して、急性及び後期アレルギー反応に寄与する多数の血管作用及び前炎症性メディエーターが放出される。
【００１０】
Ｂリンパ球の表面に見られる低親和性ＦｃεＲＩＩレセプター（ＣＤ２３）の機能は、ＦｃεＲＩレセプターの機能よりも確立されていない。重合状態のＦｃεＲＩＩレセプターは、ＩｇＥ分子に結合し、この結合は、Ｂ細胞から産生される抗体の型（類）を調整する役割を果たし得る。
【００１１】
ヒトＩｇＧ分子の定常領域に結合するＦｃγレセプターは、３つのグループがこれまで細胞表面で同定されている。これらは、ＦＣγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦＣγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦＣγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）であり、これらはすべて、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーに属する。３つのＦＣγレセプターは、多数の様々なアイソフォームを有する。
【００１２】
刺激ＦｃεＲＩレセプターに加えて、肥満細胞、及び好塩基球もまた、抗体機能を負に調節するよう作用するＦｃγＲＩＩｂレセプターと言われる、免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有する抑制性低親和性レセプターを共発現する。ＦｃγＲＩＩｂレセプターは、抑制性免疫レセプタースーパーファミリー（ＩＲＳ）に属し、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有する免疫レセプター、及び他の様々な細胞応答を負に調節する構造及び機能が類似する抑制性レセプターの増殖因子ファミリーである。ＩＲＳメンバー（例えば、ＦｃγＲＩＩレセプター）と活性化レセプター（例えば、ＦｃεＲＩレセプター）との共凝集は、特徴的なＩＴＩＭチロシンのリン酸化反応に続いて、ＳＨ２領域含有タンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ‐１及びＳＨＰ‐２、及びＳＨ２領域含有ホスファターゼＳＨＩＰ及びＳＨＩＰ‐２が漸増する。共凝集の結果として、ＦＣγＲＩＩｂと細胞レセプターとの共凝集、及びＴ細胞レセプターと活性化レセプター（ＦＣεＲＩ及びサイトカイン等）との共凝集により立証されるような細胞活性化を阻害可能であることが挙げられる。喘息、アレルギー性鼻炎、及び重度の食物アレルギー反応の主な要因は、肥満細胞及び好塩基球から放出された誘発されたＩｇＥを促進するメディエーターである。肥満細胞又は好塩基球ＦｃεＲＩレセプターと多価抗原との相互反応は、β−及びγ−ＦｃεＲＩサブユニットの細胞質尾部における免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）のチロシンリン酸化作用により、Ｓｙｋを介して下流シグナル伝達を始める。肥満細胞、及び好塩基球もまた、ＦｃγＲＩＩｂレセプターを発現し、細胞質尾部内に単独保存された免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。研究により、ＦｃεＲＩへのＦｃγＲＩＩｂの凝集が、ＦｃεＲＩに会合するＬｙｎ及びＦｃεＲＩシグナル伝達阻害によるＦｃγＲＩＩｂ  ＩＴＩＭチロシンの迅速なチロシンリン酸化に繋がることが示されている。この仮説は、ヒト好塩基球にＦｃεＲＩ及びＦｃγＲＩＩｂレセプターを直接架橋するヒトＩｇ  ＦＣγ−Ｆｃε融合タンパク質を使用する実験にサポートされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、遺伝子及びその遺伝子がコードする、抗アレルギー活性を有する融合タンパク質を提供することである。
本発明で使用される融合タンパク質は、ＦＰ４と称され、配列番号２のアミノ酸配列を有する機能タンパク質若しくは配列番号２から由来のタンパク質、又は配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸を一つ以上増減することによって得られるすべての置換物である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
配列番号２のアミノ酸配列のＦＰ４融合タンパク質は、５５４アミノ酸を含む（図１）。ＦＰ４構造は、３つの部分からなる：Ａ領域（Ｆｃε）（Ｎ末端から１〜３００番目のアミノ酸）、Ｂ領域（Ｆｃγ）（Ｎ末端から３１８〜５５４番目のアミノ酸、及びＣ領域（ヒンジ）（Ｎ末端における３０１〜３１７番目のアミノ酸）。これらの中で、Ａ領域は、ヒト免疫グロブリンＩｇＥに由来し、ＩｇＥレセプターのリガンドである（ＦＣεＲＩ）。Ｂ領域は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧに由来し、ＩｇＧレセプターのリガンドである（ＦｃγＲＩＩ）。Ｃ領域は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧに由来し、ねじれ構造である。
【００１５】
融合タンパク質ＦＰ４は、次の配列を有する。
１）配列番号１：ＤＮＡ配列
２）配列番号２：アミノ酸配列
３）配列番号１で表されるＤＮＡ配列と９５％を超える相同性を有し、且つ、同じ機能タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列。
配列１のＤＮＡ配列は、１６６５塩基対からなる。読み枠は、５末端で始まる１番目の塩基対から１６６５番目の塩基対までである。
【００１６】
本発明の遺伝子を含有する、発現ベクター、キャリア、及び細胞株も本発明の特許権保護下にある。
ＦＰ４の一対のプライマーでの増幅もまた、本発明の保護の拡張で保護される。
【００１７】
本発明の第２の目的は、融合タンパク質ＦＰ４の発現方法を提供することである。
本発明で導入されるＦＰ４の発現方法は、融合タンパク質ＦＰ４を発現する陽性クローンを得るためにＦＰ４遺伝子をＳＰ２／０細胞にトランスフォーメーションすることである。
発現ベクターは、通常の方法を使用して構築され、ＦＰ４遺伝子がｐＳｅｃＴａｇベクターにクローニングされる。
【００１８】
本発明の第３の目的は、有効成分が融合タンパク質ＦＰ４である抗アレルギー薬を提示することである。
必要に応じて、上記の薬に１つ又は複数のキャリアを加えることができる。これらのキャリアは、薬学的な仕様の希釈剤、賦形剤、助剤、結合剤、湿潤剤、粉末化医薬製剤、吸収促進剤、界面活性剤、吸収キャリア、及び潤滑剤等が挙げられる。必要であれば、また、香料添加剤、及び甘味剤も添加可能である。
【００１９】
本発明の薬は、いくつか方法があるが、特に、静脈内注射、皮下注射、又は皮膚に直接塗布して使用可能である。鼻内噴霧として、及び喉、口、皮膚、又は膜吸入器も使用可能である。更に、この薬は、鼻用水性懸濁液、点眼液、又は点耳液として適用可能である。更に、直腸ゲル、錠剤、粉末、丸薬、カプセル、液剤、オイルクリーム、クリーム、及び様々な他の形態で使用可能である。上記の方法は、正確な用量を決定するために従来の方法で薬学的に調製可能である。
上記の全ての薬は、概して、用量が０．０１〜１ｕｇ／ｋｇ／日、及び治療期間が１０〜２０日間である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
実施例１：融合タンパク質ＦＰ４の発現
図２に示すように、融合タンパク質ＦＰ４の発現方法は、以下の工程を含む。ヒト末梢血からのＢリンパ球を精製する工程；及び、ゲノムＤＮＡを特異的に直接分離して以下の通りに通常の処理を行う工程。
Ｐ１（Ｆｃε）:5’-GTGGCCCAGCCGGCCTTCACCCCGCCCACCGTGAAG-3’;
Ｐ２（Ｆｃε）:5’-GTGGATCCTTTACCGGGATTTACAGACAC-3’;
Ｐ３（Ｆｃγ）:5’-GGGGATCCGAGCCCAAATCTTGTGAC-3’;
Ｐ４（Ｆｃγ）:5’-GTGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’。
【００２１】
ポリメラーゼ連鎖反応によりＦｃε及びＦｃγ遺伝子を増幅し、Ｆｃε及びＦｃγのＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した。図３に結果を示す。Ｆｃε  ＤＮＡ  ＰＣＲ産物は、１１５５ｂｐであり、Ｆｃγ  ＤＮＡ  ＰＣＲ産物は、９２８ｂｐである。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン  カリフォルニア州）に直接クローニングした。ライゲーション後、ＦＰＥＦｃ−ε及びＦＰＧＦｃ−γを得て、ヌクレオチド配列分析を行った。
ヌクレオチド配列が正しいことを確認した後、Ｆｃε遺伝子をＳｆｉＩ−ＢａｍＨＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ）で切断した。Ｆｃγ遺伝子はＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩで切断した。その間にｐＳｅｃＴａｇ発現ベクター（インビトロジェン  カリフォルニア州）をＳｆｉＩ−ＮｏｔＩで切断し、Ｆｃε及びＦｃγをｐＳｅｃＴａｇＦＰ４にライゲーションした。挿入配列は図１と同じであることを確認した。ｐＳｅｃＴａｇＦＰ４ベクターを、マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞にエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。ゼオシン（Ｒ）で選別後、陽性クローンを酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングした（マウス抗ヒトＩｇＥでプレートをコーティングし、クローンの上清を添加し、そしてヤギ抗ヒトＩｇＥ−ＡＰコンジュゲートを添加する）。ＦＰ４タンパク質を高度に発現する陽性クローンを得た。
【００２２】
ＦＢＳ  ＲＰＭＩ  １６４０培地（インビトロジェン  カリフォルニア州）１０％を使用して陽性クローンを３７℃、ＣＯ２５％で１５日間培養した。上清を２０００ｒｐｍで遠心分離して回収し、抗ヒトＩｇＥアフィニティーカラムを使用してＦＰ４タンパク質を精製した（マウス抗ヒトＩｇＥをＣＮＢｒ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ファルマシア）に結合）。
【００２３】
実施例２：ＦＰ４及びＦｃεＲＩレセプター結合実験
１×１０６個のＣＨＯ３Ｄ１０細胞を、精製したＦＰ４５μgと４℃で１時間インキュベートし、ＦＩＴＣラベル抗ヒトＩｇＥ（カルタグ  カリフォルニア）５μｌを加え、フローサイトメトリーで分析した。図４に結果を示した。ＦＰ４タンパク質はＦｃεＲＩレセプターに結合し、ＣＨＯ３Ｄ１０のＦＩＴＣ陽性を示す。図４において、ＳＳＣ−Ｈは、細胞質の粒状度、ＦＳＣ−Ｈは細胞の大きさ、ＦＬ２−ＨはＰＥ、及びＦＬ１−ＨはＦＩＴＣである。
【００２４】
実施例３：ＦＰ４及びＦｃγＲＩＩレセプター結合実験
１×１０６個のＨＭＣ‐１細胞を、精製したＦＰ４タンパク質５μgと４℃で１時間インキュベートし、ＦＩＴＣラベル抗ヒトＩｇＧ（カルタグ  カリフォルニア州）５μｌを加え、フローサイトメトリーで分析した。結果はＦＰ４タンパク質がＦｃγＲＩＩレセプターに結合した。ＨＭＣ‐１細胞はＦＩＴＣ陽性を示し（図５）、ＳＳＣ−Ｈは、細胞質の粒状度、ＦＳＣ−Ｈは細胞の大きさ、ＦＬ２−ＨはＰＥ、及びＦＬ１−ＨはＦＩＴＣである。
【００２５】
実施例４：ｉｎ  ｖｉｔｒｏＦＰ４タンパク質機能実験
ヒト末梢血からのヒト好塩基球を分離精製した。精製した好塩基球（１×１０６）を、特異的ヒト抗ＮＰ−ＩｇＥ（セロテック）１〜１０μｇと３７℃で２時間インキュベートし、ＮＰ−ＢＳＡを２μｇ加えた。ヒスタミン放出をＥＬＩＳＡで測定した。結果は、ＦＰ４タンパク質が用量依存的にヒト好塩基球でのヒスタミン放出を有意に阻害した（図６）。Ｈｕ  ＩｇＥは、ヒトＩｇＥ、ＮＳ  ＩｇＥは非特異的ヒトＩｇＥ、ＮＰ−ＢＳＡはアレルゲン、＋は付加、−は付加なしを表す。
【００２６】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｖｏＦＰ４タンパク質機能実験
ヒトＦｃεＲＩα鎖トランスジェニックマウス（カリフォルニア大学サンディエゴ校）に、ヒト抗ＮＰ−ＩｇＥ（セロテック）を皮内注射し、４時間後にＮＰ−ＢＳＡ  １００μg＋Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅ（シグマ）染料１％を静脈注射した。アレルギー反応が起これば、血管から染料が漏れるため皮膚が局所的に青く変色する。同量の融合タンパク質（ＦＰ４）を加えた場合、アレルギー反応は完全に阻止され、皮膚が局所的に青く変色しなかった（図６）。この実験結果により、ＦＰ４タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏでアレルギー反応が阻止することが更にわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明において、融合タンパク質ＦＰ４の構成成分は、ヒト免疫グロブリンに由来する。従って、該タンパク質は人体に薬として入り、抗原を有さない（異種タンパク質免疫源）。融合タンパク質ＦＰ４  Ｃ領域（ヒンジ）は融通が利き、容易に回転し、及びＦｃεＲＩとＦｃγＲＩＩとを結合可能である等の特徴を得るため、細胞を刺激してシグナル送信を阻止し、細胞の様々な活発な生物学的粒子の放出を阻害して、アレルギー反応の発生を防止する。上記実験の全ての結果は、アレルギー反応を防止するために、融合タンパク質ＦＰ４が、好塩基球顆粒細胞表面の脂肪細胞又はＦｃ＿ＲＩとＦｃ＿ＲＩＩとを効果的に結合可能である。本発明の融合タンパク質ＦＰ４は、ＩｇＥアクセプターの機能を阻止するためにＩｇＥモノクローナル抗体を得るだけでなく、より重要なことはシグナル抑制により細胞のシグナル変換経路内のアレルギー反応が始まることである（細胞シグナル伝導系抑制系内でのアレルギー反応の開始はより重要である）。更に、細胞のアレルギー反応の抑制を強化し、アレルギー性疾患治療に不可欠な役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ＦＰ４の分子構造である。
【図２】図２は、ＦＰ４のクローニングのフローチャートである。
【図３Ａ】図３Ａは、ＦｃεＰＣＲ産物の電気泳動分析結果である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＦｃγＰＣＲ産物の電気泳動分析結果である。
【図４】図４は、ＦＰ４のＦｃεＲＩレセプターへの結合能力のフロー分析である。
【図５】図５は、ＦＰ４のＦｃγＲＩＩレセプターへの結合能力のフロー分析である。
【図６】図６は、ヒト好塩基球でヒスタミン放出を阻害したＦＰ４タンパク質を示す。
【図７】図７は、遺伝子導入マウスでアレルギー反応を阻止したＦＰ４融合タンパク質を示す。
【国際調査報告】
2008500807.tif 000010
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2008500807.tif 000012
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