(57)【要約】【課題】サンプルを励起し、蛍光を検出する装置及び方法の提供。【解決手段】一実施態様では、複数のサンプルを保持する試料ホルダが、複数のサンプル各々に対する励起ソース、受光部又はそれらの両方を有する光学マニホールドと共に設けられている。他の実施形態では、光学マニホールドは励起ソースのみ又は受光部のみを含み、その他が試料ホルダと接続している。このシステムは、動作部品を用いずに、またいかなる光学機械的又は電子的な妨害なしに、蛍光の急速な励起及び測定を可能にする。特殊なシグナル対ノイズ比を示し、それによって非常に低いレベルでの蛍光の差異を区別できる。【選択図】図１２
2008536092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一部が蛍光物質を含んでよい複数のサンプルを保持するための試料ホルダ、前記複数のサンプル各々に対し１つずつ存在し、前記蛍光物質を励起できる、複数の励起ソース、前記複数のサンプル各々に対し１つずつ存在し、励起状態での前記蛍光物質からの蛍光放出を検出できる、複数の受光部、前記試料ホルダと関連して各励起ソース及び各受光部を保持するための光学マニホールド、を含んでなる蛍光検出システムであって、各励起ソースの操作により対応するサンプル中のあらゆる蛍光物質を励起し、対応する受光部によって検出するシステム。
【請求項２】
各励起ソース及び対応する受光部がオフセットで軸外にずれた位置関係にあり、互いに近接して設置され、一方で励起ソースから前記サンプルへ至り、更に対応する受光部へ戻る光路を規定する、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
各励起ソース及び対応する受光部が７度のオフセット角の軸外にずれた位置関係にある、請求項１記載のシステム。
【請求項４】
前記受光部の各々と接続されたアンプを更に含んでなる、請求項１記載のシステム。
【請求項５】
前記アンプの各々に調節可能な利得制御部が設置されている、請求項４記載のシステム。
【請求項６】
前記励起ソースの前記照射が印加される前記電圧に比例し、更に前記複数の励起ソースの各々に対する可変的な電圧制御を含んでなる、請求項１記載のシステム。
【請求項７】
前記受光部の各々がアバランシレシーバを含んでなる、請求項１記載のシステム。
【請求項８】
前記複数の受光部から記録装置まで順次データを提供するコントローラを更に含んでなる、請求項１記載のシステム。
【請求項９】
前記試料ホルダが複数のサンプルバイアルを受ける構成をとる、請求項１記載のシステム。
【請求項１０】
前記試料ホルダがサンプル保持のための複数のディンプルを含んでなる、請求項１記載のシステム。
【請求項１１】
前記受光部が高インピーダンスの硫化カドミウムのフォトレジスタを含み、更に電気シグナルの発生のための高インピーダンスを低下させるレジスタを含んでなる、請求項１記載のシステム。
【請求項１２】
電波干渉を減衰させるためのフィルタキャパシタを更に含んでなる、請求項１１記載のシステム。
【請求項１３】
複数のサンプルを保持する試料ホルダ、複数のサンプル各々に対して１つ存在する複数の励起ソース、複数のサンプル各々に対して１つ存在する複数の受光部、光学マニホールド、を含んでなる蛍光検出システムであって、前記光学マニホールドが前記試料ホルダに関連して前記複数の励起ソース又は前記複数の受光部を保持する構成をとり、前記試料ホルダが前記複数の励起ソースまたは複数の受光部以外のものを保持する構成をとり、各励起ソースの操作により対応するサンプル中のあらゆる蛍光物質を励起し、対応する受光部によって検出するシステム。
【請求項１４】
前記光学マニホールドが前記複数の励起ソースを保持し、前記試料ホルダが複数の受光部を保持する、請求項１３記載のシステム。
【請求項１５】
前記光学マニホールドが前記複数の受光部を保持し、前記試料ホルダが前記複数の励起ソースを保持する、請求項１３記載のシステム。
【請求項１６】
前記受光部の各々と接続したアンプを更に含んでなる、請求項１３記載のシステム。
【請求項１７】
前記アンプの各々に調節可能な利得制御部が設置されている、請求項１４記載のシステム。
【請求項１８】
前記励起ソースの前記照射が印加される前記電圧に比例し、更に前記複数の励起ソースの各々に対する可変的な電圧制御を含んでなる、請求項１３記載のシステム。
【請求項１９】
前記受光部の各々がアバランシレシーバを含んでなる、請求項１３記載のシステム。
【請求項２０】
前記複数の受光部から記録装置まで順次データを提供するコントローラを更に含んでなる、請求項１記載のシステム。
【請求項２１】
前記試料ホルダが複数のサンプルバイアルを受ける構成をとる、請求項１３記載のシステム。
【請求項２２】
前記試料ホルダがサンプル保持のための複数のディンプルを含んでなる、請求項１３記載のシステム。
【請求項２３】
前記受光部が高インピーダンスの硫化カドミウムのフォトレジスタを含み、更に電気シグナルの発生のための高インピーダンスを低下させるレジスタを含んでなる、請求項１３記載のシステム。
【請求項２４】
電波干渉を減衰させるためのフィルタキャパシタを更に含んでなる、請求項１３記載のシステム。
【請求項２５】
複数のサンプルを保持する試料ホルダ、複数のサンプル各々に対して１つ存在する複数の励起ソース、複数のサンプル各々に対して１つ存在する複数の受光部、前記試料ホルダが前記複数の励起ソースまたは複数の受光部を保持する構成をとり、各励起ソースの操作により対応するサンプル中のあらゆる蛍光物質を励起し、対応する受光部によって検出するシステム。
【請求項２６】
前記受光部が高インピーダンスの硫化カドミウムのフォトレジスタを含み、更に電気シグナルの発生のための高インピーダンスを低下させるレジスタを含んでなる、請求項２５記載のシステム。
【請求項２７】
電波干渉を減衰させるためのフィルタキャパシタを更に含んでなる、請求項２５記載のシステム。
【請求項２８】
複数のサンプルを準備し、前記複数のサンプルの各々に励起ソースを準備し、前記複数のサンプルの各々に受光部を準備し、各励起ソースを活性化させ、各受光部の前記出力を測定することを含んでなる、複数のサンプルの蛍光検出方法。
【請求項２９】
前記ポリメラーゼ連鎖反応を使用した増幅の蛍光モニタリング方法であって、黒い不透明な低蛍光サンプルバイアルを準備する工程、前記ポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程、及び蛍光検出システムを使用して前記サンプルバイアル中の前記ポリメラーゼ連鎖反応中の蛍光放射をモニターする工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光物質を励起し、サンプルの蛍光を検出する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な光学検出システムが定性的及び定量的な測定の用途で開発されている。一つの公知のシステムとして、標的（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅による反応生成物）と結合する蛍光化合物をラベルとして使用することが挙げられる。
【０００３】
適切な周波数の励起光で照射されると蛍光を発する多数の化合物が公知である。例えば、約４９０ｎｍの波長の光によって励起し、約５２０ｎｍの波長の光を発する蛍光が挙げられる。励起波長及び放出波長間のギャップは、その放出波長を参照することで、定性的又は定量的な蛍光の観察及び測定を可能にする。
【０００４】
従来の蛍光読取システムの一例では、光をバンドパスフィルタに通し、励起波長でサンプルを通して光を供給し、第２のバンドパスフィルタを通して放出波長で光を検出器に供給する。この古典的なシステムにおいて、複数のサンプルは、例えばカルーセルを用いて連続的に読取部に出し入れされる。その工程をスピードアップするため、他のステッピングシステムが開発され（例えば米国特許第６０１５６７４号を参照）、又は多重発光ダイオードを光ファイバーネットワークと共に設置し、同時に幾つかの試験を実行するシステム（米国特許第６５９７４５０号参照）が提供されている。この種のシステムは有用ではあるが、それらは光学システムの感度を低下させるノイズを発生させ、あるいはその光学システムのヘッドのサンプルへの移動、又はヘッドに対するサンプル移動に時間がかかるため、全サンプルの測定するにはかなりの時間が必要となる。光ファイバシステムはまた光ファイバーの使用に伴いシグナルを減衰させ、感度の低下をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はサンプルの蛍光を励起し検出する装置及び方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、複数のサンプルを保持する試料ホルダが、別々の励起ソース及び各々の複数サンプルに対する別々の受光部を備える光学マニホールドと共に設置されている。
【０００７】
他の実施形態では、光学マニホールドが励起ソースのみを含み、受光部が試料ホルダと接続している。
【０００８】
他の実施形態では、光学マニホールドが受光部のみを含み、励起ソースが試料ホルダと接続している。
【０００９】
他の実施形態では、光学マニホールドは設けられておらず、励起ソース及び受光部が試料ホルダに位置している。
【００１０】
本発明は、動作部品を用いず、機器に対していかなる光学的又は電子的な妨害なしで、迅速な励起及び蛍光の測定を可能にする。それは特殊なシグナル対ノイズの比を示し、それにより非常に微小な蛍光レベルの差異を区別することを可能にする。
【００１１】
本発明の上記の、また他の特徴は、以下の説明及び添付の特許請求の範囲からより明確となり、又は以下に示すような本発明の実施によっても理解できる。
【００１２】
本発明の上記の及び他の効果及び特徴を更に明瞭にするため、添付の図面に例示される本発明の具体的な実施例を参照することで、本発明がより具体的に説明される。これらの図面は本発明の典型的な実施態様のみを表し、したがって、その範囲のみに限定されるものと解釈すべきでない。本発明は、添付の図面を用いることにより、その付加的な特性及び詳細が表現され、説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、一つのサンプル又は例えば従来の９６穴プレート等のサンプルアレイでの少量の蛍光測定に有用な光学システムを提供する。本発明の特徴は、励起／放出の間に機械的動作を含まないこと又は光学部品を共有することであり、それにより非常に迅速な読取が可能となり、光学機械の動作による感度の低下が回避される。
【００１４】
本発明の実施態様を図１に表し、本発明を実施する一つの構成を例示する。図１は、サンプルバイアル２２に近接して光学マニホールド２０がサンプルウェル支持体３８Ａによって保持されている位置関係を例示する。サンプルバイアル２２にはサンプル２４が含まれ、そこには蛍光を使用して定性的又は定量的に検出される物質が含まれうる。
【００１５】
光学マニホールド２０は励起周波数で光を発生させる励起ソース２６を備えている。励起バンドパスフィルタ２８は、その励起周波数で光を通過させる。
【００１６】
その励起周波数の光がサンプル２４に当たるように、励起ソース２６及び励起バンドパスフィルタ２８は配置される。放射バンドパスフィルタ３０はサンプル２４の上部に位置し、サンプル中の蛍光物質からの放出蛍光を受ける。適切な受光部３２は、放射バンドパスフィルタ３０を通過する光を受信する。
【００１７】
他の構成をとることも可能であるが、励起ソース及び受光部が軸外にずれた位置関係にあり、主にＰＣＲウェル中の目標とされた液体に一致する光路を形成することが本発明では好ましい。７度のオフセット角が適切であることを見出した。もちろん、当業者であれば本願明細書の教示から、他の構成が可能であることを認識するであろう。
【００１８】
図２は、サンプルを保持する別の方法を例示する。サンプルバイアルの使用を示す図１とは異なり、図２はサンプルの適切な量を保持できるディンプル３４の使用を示す。他の構造がディンプルの代わりに使用できることは、これらの教示より当業者にとって明らかである。
【００１９】
図３は、図１の構成要素の他の幾何学的配置を例示する。図３において、マニホールド３６Ａはサンプルウェル２２の上から受光部３２及びバンドパスフィルタ３２を支持し、サンプルウェル支持体３８Ｂには励起ソース２６および励起バンドパスフィルタ２８が取り付けられている。
【００２０】
図４は図３と同様であるが、励起ソース及び励起バンドパスフィルタはマニホールド３６Ｂに位置し、放射バンドパスフィルタ３０及び受光部３２はサンプルウェル支持体３８Ｃに位置する。
【００２１】
図５は、本発明の別の実施態様では別の光学マニホールドの使用が省略されることを表す。図５は、励起ソース２６及び受光部３２をサンプルウェル支持体３８Ｄに組み込む一つの方法を示す。他の実施態様と同様に、図５の実施態様では、励起バンドパスフィルタ２６及び放射バンドパスフィルタ３０を含んでもよい。これらの構成要素を試料ホルダに組み込むコストのため、その試料ホルダの集合体が再使用可能であることが好ましく、サンプルを簡便に使い捨てるために、その試料ホルダが、ディンプル又は他の使い捨てでないサンプル容器よりむしろ、サンプルバイアル２２を受け入れる構成をとることが好ましい。図５において、励起ソース及び受光部は互いに直列に位置する。当業者であれば、本願明細書における教示から、他の構成においても本発明の利点を提供できることを理解するであろう。
【００２２】
好適な励起ソースとしては、ＬＥＤ及びレーザダイオードが挙げられる。励起ソースは好ましくは約７０００〜２５，０００ミリカンデラの高い光度を提供するのが目下のところ好ましい。励起ソースが光を凝縮する必要なく効果的な放出を提供するためには、約２０度未満の分散ビームであるのが好ましい。
【００２３】
好適な受光部としては、励起周波数で光を検出できる硫化カドミウムフォトレジスタ、ＰＩＮダイオード、フォトトランジスタ又は他の装置が挙げられる。
【００２４】
当業者であれば、おそらくバンドパスフィルタが必要でないか、又は不必要な光を取り除くため、又は照射光源が所望の波長でモノクロである場合、バンドパスフィルタの代わりに他の構造をとってもよいことを理解するであろう。
【００２５】
例えば集束光学素子等の更なる要素を追加することは可能であるが、典型的には上記の構成においては別の光学が必要でないことがわかっている。
【００２６】
図１から５は、単一のサンプルに関連する様々な光学部品の構成を示す。本発明の利点の一つは、同時に多数のサンプルを処理する能力である。図６は、図１のその基本的な構成を、従来の９６穴プレート４０のサンプルウェルごとに使用した例を示す。これは図６において、励起ソース２６、励起バンドパスフィルタ２８、放射バンドパスフィルタ３０及び受光部３２の９６の別の組合せを取り付けられたマニホールド４２を提供することによって構成され、それは９６のサンプルウェルと接続している。図６の構成は、ＰＣＲ若しくはＥＬＩＳＡリーダー、又は他の複数サンプルに必要なものと接続して使用するのに適している。図６の構成では、いかなる光学機械的又は電子的な妨害もなく、わずか２、３ミリ秒で従来の９６穴プレートの９６個のウェル各々の読み取りが可能である。マニホールドは非常に頑丈であり、それにより非常に信頼性が高く、携帯用の実験室用機器に適するものとなる。
【００２７】
図７は、コントローラシステムの実施態様を図式的に表す。ＤＣ電力供給４４は、複数の励起ソース２６に電力を供給するために設けられている。一つ以上のリレー４６は、複数の励起ソース２６の各々を作動させるために設けられている。コンピュータ又はプログラミング可能な論理コントローラ（図示せず）又は他のコントローラは、励起ソースを自在にオン／オフする。若干の構成において単一のリレー４６を用いて同時に励起ソースの全てを起動させてもよく、又は別のリレーを励起ソース各々に用いてもよい。
光学励起要素の概略図を図７にも示し、各種要素に関して上に同一参照番号を割り当てている。励起ソース２６が励起バンドパスフィルタ２８と連動して示され、サンプルバイアル２２に励起光を供給している。放射バンドパスフィルタ３０及び受光部３２は、そのサンプルから蛍光放出を受ける。受光部からのデータは好ましくはそれぞれのアンプ４８に供給され、対応する受光部からのシグナルを増幅する。典型的な受光部はアナログシグナルを生じると考えられ、このような場合、各受光部／アンプの組合せが対応するデータを次の分析に提供することを保証するために較正を実行して、各アンプが調節可能な利得を得ることが好ましく、このことにより、較正条件下でシステム構成要素間に存在しうる差異の存在を許容する。
【００２８】
アンプ４８からのそのシグナルは、マルチプレクサ装置５０に送られ、それは計測装置５２と協同して作動し、さまざまなアンプからの複数の入力間での切り替わりを抑制し、シグナルをコンピュータのアナログ入力装置５４に送信する。用語「コンピュータ」は広義に、この機能を実行することができるプログラミング可能な論理コントローラ又は他の構造の使用を含む意味で用いられる。
【００２９】
図８はコントローラシステムの他の実施態様を表し、様々なコントローラシステムが上記の光学部品と連動して有効に使用できることを示す。図８は、励起ソース２６の駆動に用いるアンプ５８に接続しているコンピュータからのアナログ出力５６を示す。励起ソースとして使用するＬＥＤは、その印加電圧と比例した輝度の光を発する。これによって、コンピュータ又はコントローラによる、必要とされる感度に応答する励起ソースとして使用するＬＥＤの輝度の制御、あるいは較正の必要を満たすことが可能にする。較正の一つの方法は、既知濃度の標準化された蛍光物質を使用し、各チャネルが同じ測定出力を生じるまで各チャネルを調整することである。様々な方法がこの較正を実行するために使用でき、例えばアンプの利得又は励起ソースの強度を別に調整することができるし、又はコンピュータで調整を行ってもよい。
【００３０】
図８の実施態様において、受光部が“アバランシ”受信器と典型的に呼ばれるタイプであることが好ましく、それは蛍光物質から発された光度が特定のレベルに達する時に完全に“ｏｆｆ”状態から完全に“ｏｎ”状態に変化するレシーバを指す。受光部を“ｏｎ”状態に変化させるのに必要となる印加電圧を、蛍光量を測る基準として用いることもできる。例えば、比較的大きい電圧（高輝度励起ソース）がその受光部をその“ｏｎ”状態に移行させるのに必要となる場合、少量の蛍光のみが検体中で生じている。その逆も真であり、すなわち比較的小さい電圧で受光部の移行が行われれば、多くの蛍光が発生している徴候を示す。受光部を“ｏｎ”状態に変化させるのに必要な電圧の測定により、サンプルの蛍光物質量の定量的測定が可能となる。
【００３１】
非線形アンプ５８を用い、受光部３２からのシグナルを増幅するのも好ましい。アンプ５８は、様々な状況下で使用可能なように、利得を可変的に調整する能力を有することが好ましい。シフトレジスタ６０は、コンピュータ又はコントローラによる複数の入力６２への入力シグナルのうちの一つをモニターするのに有用である。チャネルの全てがコンピュータによって読み込まれるように、デジタル“クロック”シグナル６４を、シフトレジスタ６０に様々な受光部からの複数の入力の切り替えのために、この構成に用いてもよい。
【００３２】
図９は、高利得、低ノイズ電気光学システムの実施態様を図式的に表す。付随する光学部品と共に、２サンプルのバイアル２２を用いたこのシステムを示すが、この有用なシステムには単一サンプルのみの場合、又は多くのサンプルの場合も含まれることを理解すべきである。
【００３３】
励起ソース２６及び励起バンドパスフィルタ２８は、サンプルに励起放出光を供給するためにサンプルバイアル２２中に配置される。放射バンドパスフィルタ３０を、高感度の蛍光光子排出供給源からの高い電子利得を実現できる高感度フォトレジスタであるフォトレジスタ７０と組み合わせて示す。蛍光物質としてフルオレセインを使用するとき、フォトレジスタは好ましくはフルオレセイン放出波長に対する良好な光応答を示す高いインピーダンスの硫化カドミウムのタイプである。
【００３４】
フォトレジスタ７０に接続しているのは高いインピーダンスを低下させるレジスタ７２であり、その組合せによって、低い光量の場合でも比較的大きい電気シグナルを発生させることが可能となる。
フィルタキャパシタ７４を含めることにより、短絡経路が提供されて無線周波数（ＲＦ）での干渉が弱まり、ＲＦ電気的ノイズの増幅が排除される。リニアアンプ７６は、複数の電気光学回路との相互バランスをとるため、利得制御部を備えている。
【００３５】
図９の電気光学システムでは、コンピュータによって制御されるＤＣ電源４４及びゲーティングリレー７８が設置されている。リニアアンプ７６の出力は好ましくはアナログゲーティングマルチプレクサ８０に至り、それは次々にコンピュータとデジタルゲートシグナル８２及びアナログ入力８４とを接続する。リニアアンプはまた、インピーダンス整合をアナログゲーティングマルチプレクサ８０にもたらす。アナログマルチプレクサは、複数の線形アンプ出力端からの出力の全てがサンプリングされ、管理コンピュータによって数ミリ秒毎に読み取られることを可能にする手段を提供し、それは好ましくは図９の実施態様に用いられるプログミング可能な論理コントローラである。
【００３６】
黒い不透明な超低蛍光サンプルバイアルの使用が、従来の透明なサンプルバイアルより低レベルの蛍光放射の検出を可能にするということを見出した。理論に束縛されるわけではないが、従来の透明なバイアルの壁においては、熱的に誘発された微妙な変化により、バックグラウンドの蛍光に変化を生じさせたと考えられる。通常研究室で用いられる、識別のために軽く色素を添加されたバイアルは、非常に蛍光性であることが多く、それはノイズを増加させ、感度を低下させることを見出した。
【００３７】
図９の実施態様では、同程度の光感度が光電管（ＰＭＴ）に提供される。それは、光量の非常に低いレベルにおける微妙な変化を検出でき、蛍光物質を含む９６サンプルバイアルを一秒以内に読み取る機械的なステップ機構が必要ない。この実施態様の他の効果は、各フォトレジスタが９ｍｍずつの空間しか占有しないことであり、ＰＭＴに必要な空間の本の一部分にすぎない。この実施態様のさらにもう一つの効果は、低電圧を使用するということであるが、ＰＭＴは通常１０００ボルト以上の電圧を必要とする。
【００３８】
図９の実施態様の他の効果としては、それを使用すればポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した増幅のモニタリングが可能になるという特徴であり、それはＰＣＲプロセスの開始直後に蛍光の違いをモニターすることによってなされる。従来のシステムにおいては、ＤＮＡの増幅がこれらのサイクルの間良好に検出できないため、通常ＰＣＲの最初の５サイクルは“ゼロ”ベースラインであると考えられていた。従来のシステムにおいては、２０サイクル目まではノイズによりＤＮＡ増幅が確実に観察できなかった。図９の実施態様では、５サイクル目から７サイクル目の間で明確にＤＮＡ増幅を検出できることを見出した。用途によっては、ＤＮＡ増幅の早期検出により、ごく少数の熱サイクルの使用で済むようになる。
【００３９】
図１０は、蛍光プローブの発光が、ＤＮＡが二本鎖のときに最高レベルにあり、ＤＮＡが一本鎖のときに最低レベルにあることを示す。二本鎖ＤＮＡの安定した増幅は、アニーリング段階の終了後の、照射ピークの増加によって示される。変性段階の間、二本鎖ＤＮＡの全てが一本鎖ＤＮＡへ変化すると、光度は一時的に減少する。連続したアニーリング段階に至ると光度は回復し、更により高いレベルに達し、ＤＮＡが増幅される。このシステムは、ＰＣＲ工程における生化学的反応速度の信頼性の高い解析を可能にする。ＰＣＲ工程における反応速度についての知識は、その工程の予測及び最適化において非常に有用である。
【００４０】
より複雑な観察も可能である。例えば、ＰＣＲサイクルにおける変性段階の間、発光減少を示す対数曲線を作成できる。逆に、アニーリングが起こると、蛍光の対数的な増加が検出される。
【００４１】
本発明の感度は、ＰＣＲの実行において使用する従来のサーモサイクラーを伴った場合には完全に有用ではないが、本発明は特に出願中の米国特許出願第１０／９９１７４６号において開示される新規なサーモサイクラーと組み合わせることにより有用となる。該出願は発明の名称「Ｒａｐｉｄ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ」として２００４年１１月１８日に出願され、本出願と同じ譲受人であり、本明細書において全内容が援用される。これは、従来のサーモサイクラーにおける次の段階までの間の移行時間が通常約４５秒であり、これらの長い移行時間により観察される曲線を抹消するか又は歪める傾向があることが理由である。良好な結果を得るため、段階間の移行時間は好ましくはほんの２、３秒まで減少させるべきである。従来のサーモサイクラーも顕著に熱ノイズを受けるが、それは上記「Ｒａｐｉｄ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ」の特許出願におけるサーモサイクラーで減少される。
【００４２】
図１１は、増幅が起こらないＰＣＲ読み取りを例示する。ピークの傾斜は一定の照射を受けると蛍光プローブの固有の減衰によりさらに下降する。プローブに接着していない化学的に純粋なフルオレセインを露出したときも、この同じ減衰が観察される。減衰速度は、強い励起光の供給源に連続的に露出したときは１秒あたり約０．０２％であることが観察されている。本発明において観察される蛍光光度の減衰は、ＤＮＡの増加により、光度の増加とは反対に働く。この現象はＤＮＡの増幅及び非増幅との間の発光の差動を広げるのに役立つ。サイクル１からサイクル３の間、サンプルの光度の減少がＤＮＡの増加に関連する光度の増加を凌駕し、蛍光が減衰することもありうる。しかしながらサイクル４及び上記で、ＤＮＡの増加と関連する光度の増加が全体的に光度を増加させる。その後、ＤＮＡ増幅が二倍ずつ行われ、蛍光の減衰を凌駕する。
【００４３】
図１２では、透明な熱可塑性バイアル及び黒い不透明なバイアルの使用を比較している。従来の透明なサンプルバイアルのバックグラウンドのシグナルは、黒い不透明なバイアルを用いてほぼ完全に除去できる。バックグラウンド蛍光が最低限に保持されると、シグナル対ノイズの比が改善されるため、電気光学シグナルをより高く増幅できる。超低蛍光バイアルは、低レベルでの蛍光変化の検出を必要とする用途においてノイズの減少に非常に有効である。
【００４４】
潜在的に有害な生物学的物質の定性的なＰＣＲ検出が時間によって微妙に左右されるとき、低レベルでの蛍光検出が有用である。統計学的な特定物質の検出に必要な時間は、従来の蛍光ＰＣＲ検出システムを使用した場合は、ほとんど１時間以上であるが、本発明を前述の同時係属の出願内容中に記載されているラピッドサーモサイクラーと組み合わせて使用すると１５分以下にまで減少できる。
【００４５】
本発明は、非常に有用かつ迅速な蛍光光度読取システムを提供するものであり、それはほんの２、３ミリ秒で９６穴プレートの全ウェルを読み取ることができ、いかなる動作部品も含まず、またいかなる光学機械的又は電子的な妨害も生じない。そのシステムは顕著なシグナル対ノイズの比を与えるものであり、それによって非常に低い蛍光レベルの差異を区別するのに使用できる。本発明のシステムは非常にコンパクトでかつ十分に頑丈であるため、研究室用途のみならず、環境中での用途に供される携帯用の機材としても実用的である。
【００４６】
本発明を、その技術思想又は主要な特徴から逸脱することなく、他の様々な形態で実施してもよい。記載されている実施態様は、あらゆる意味において単なる例示に過ぎず、また限定的でないと考慮すべきである。したがって、本発明の範囲は上記の説明ではなく、むしろ添付の特許請求の範囲によって示される。請求項における均等の語義及び範囲内に入るすべての変更は、それらの範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】光学マニホールド、試料ホルダ及び受光部を含む実施態様の概略図である。
【図２】光学マニホールド、試料ホルダ及び受光部を含む他の実施態様の概略図である。
【図３】光学マニホールド、試料ホルダ及び受光部を含む他の実施態様の概略図である。
【図４】光学マニホールド、試料ホルダ及び受光部を含む他の実施態様の概略図である。
【図５】励起ソース及び受光部を設置された試料ホルダを表す。
【図６】従来の９６穴プレートの構成を有する試料ホルダ、及びその９６の試料ホルダの各々と接続した励起ソース及び受光部を有する光学マニホールドを表す。
【図７】光学マニホールド、試料ホルダ及び受光部と接続したコントローラの実施態様を表す概略図である。
【図８】光学マニホールド、試料ホルダ及び受光部と接続したコントローラの他の実施態様を表す概略図である。
【図９】本発明の検出システムの別の実施態様の概略図である。
【図１０】ＰＣＲの最初の７サイクルの間の蛍光を表す。
【図１１】ＤＮＡ増幅がない場合のＰＣＲサーモサイクラーにおける最初の７サイクルの間の蛍光を表す。
【図１２】黒い不透明のＰＣＲバイアルと比較して、従来のサンプルバイアルを使用した、ＰＣＲの最初の７サイクルの間のノイズの蛍光を示す。
【符号の説明】
【００４８】
２２ サンプルバイアル
２４ サンプル
２６ 励起ソース
２８ 励起バンドパスフィルタ
３０ 放射バンドパスフィルタ
３２ バンドパスフィルタ
３４ ディンプル
３６Ａ マニホールド
３６Ｂ マニホールド
３８Ａ サンプルウェル支持体
３８Ｂ サンプルウェル支持体
３８Ｃ サンプルウェル支持体
３８Ｄ サンプルウェル支持体
４０ ９６穴プレート
４２ マニホールド
４４ 電源
４６ リレー
４８ アンプ
５０ マルチプレクサ装置
５２ 計測装置
５４ アナログ入力装置
５６ アナログ出力
５８ アンプ
６０ シフトレジスタ
６２ 入力
６４ シグナル
７０ フォトレジスタ
７２ レジスタ
７４ フィルタキャパシタ
７６ リニアアンプ
７８ ゲーティングリレー
８０ アナログゲーティングマルチプレクサ
８２ デジタルゲートシグナル
８４ アナログ入力
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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