(57)【要約】  本開示は、病原体および／またはマーカー分子を検出するための方法、組成物および装置に関する。特定の実施形態では、検出される病原体は、マイコバクテリウム・ボビスまたは哺乳動物において結核を惹起する任意の他のマイコバクテリウム属の種であってよい。しかし、本明細書に開示した方法は限定されず、実質的に任意のタイプの病原体および／またはマーカー分子をスクリーニングおよび検出することができる。好ましい実施形態は、およそ１００％の感受性および可能性のある最高相対感受性−１つの実施例では７０％−で同一アッセイを用いるリフレックス・サプリメンタルテストを含む。反復して使用されるそのようなアッセイ条件は、各検査ラウンドについて未感染被験者の７０％の排除を生じさせる。４ラウンド以上の検査の使用が生じさせる誤差は１％未満である。陽性サンプルだけが再検査されるので、本方法は、感染被験者を検出するための迅速、安価かつ高度に正確な方法を提供する。
2008522198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１群のサンプル中で病原体を検出する方法であって、
ａ）前記病原体の存在について約１００％の感受性で前記サンプルをアッセイするステップと、
ｂ）同一のアッセイを用いて、陽性検査結果を示すサンプルだけを繰り返して再検査するステップと、
ｃ）選択レベルの正確度が入手されるまで、各検査ラウンド後に陽性検査結果を示すサンプルについてだけ前記反復再検査を繰り返すステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記反復再検査は、３、４、５または６サイクル繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アッセイは、１００％の感受性および７０％の選択性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アッセイは、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％または１００％の感受性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記病原体はマイコバクテリウム属の種である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記病原体はマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アッセイは、被験者由来の血液、血清又は血漿のサンプルにＣＰ１０＿ＥＳＡＴ融合タンパク質を曝露させるステップと、前記融合タンパク質に結合している抗体を検出するステップとを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記被験者は、ウシ、アナグマ、バイソン、シカ又はヒトである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
偽陰性検査結果の数はゼロである、請求項１に記載のリフレックス・サプリメンタルテスト法。
【請求項１０】
化学発光を発生させるためにビオチン化ヤギＩｇＧ抗ウシＩｇＭ抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート化ストレプトアビジンおよび過酸化ルミナール溶液を用いて、サンプル中の抗融合タンパク質抗体の存在を検出するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
化学発光は、全光学アッセイ装置（Ｔｏｔａｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化学発光は、リフレクティブ・ハニカムセルを備えたカセットを用いて測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
各サンプル由来の測定された化学発光シグナルについてデータ分析を実施するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記データ分析は、自動閾値補正を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記データ分析は、ピクセル群についてのバックグラウンド決定を含み、ピクセル群についての前記バックグラウンドは前記群内の任意ピクセルについての最高バックグラウンド発光と等しくなるように設定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記データ分析は、量子効率補正係数を適用することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
陽性検査結果についての閾値は、多数の陰性サンプルについての平均検査値を約１．６標準偏差超えるように設定されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記融合タンパク質は、磁気ビーズにコンジュゲートされる、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
溶液から磁気ビーズを収集するために球状磁石を使用することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
サンプル中で分子マーカーを検出する方法であって、
ａ）前記分子マーカーの存在について約１００％の感受性で前記サンプルをアッセイするステップと、
ｂ）同一のアッセイを用いて、陽性検査結果を示すサンプルだけを繰り返して再検査するステップと、
ｃ）選択レベルの正確度が入手されるまで、各検査ラウンド後に陽性検査結果を示すサンプルについてだけ前記反復再検査を繰り返すステップと
を含む方法。
【請求項２１】
前記分子マーカーは、疾患状態についてのマーカーである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願＞
本出願は、米国特許法第１１９条ｅ項の下で、２００４年１２月３日に提出された「Ｒｅｆｌｅｘ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂｏｖｉｓ−Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｉｓｏｌａｔｅ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ａｎｉｍａｌｓ」と題する米国仮特許出願第６０／６３３，２１７号、および２００５年１月２０日に提出された「Ｒａｐｉｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」と題する米国仮特許出願第６０／６４５，４２８号の利益を主張する。本出願は、２００５年３月１日に提出された米国特許出願第１１／０６９，３５１号に対する優先権もまた主張する。各出願の全内容は、参照して本明細書に組み込まれる。
【０００２】
＜発明の分野＞
本発明は、生物学的サンプル中の病原体および／またはマーカー分子の存在を検出するための方法に関する。特定の実施形態では、本方法は、病原体および／またはマーカー分子の存在についての高度に感受性かつ選択性の試験の使用を含む。感受性は１００％もしくは１００％近くとなるように選択できるので、陰性の検査結果は病原体もしくはマーカーの不存在の指標であると見なされる。より特定の実施形態では、陽性の検査結果を示すサンプルは、同一アッセイを用いる、１００％もしくは１００％近くに設定された感受性を備えるリフレックス・サプリメンタルテストにかけられる。２回目の陽性検査結果は、第３ラウンドの検査の指標として使用できる。リフレックステストの各ラウンドに伴って、偽陽性検査結果の数が減少する。偽陽性の存在は、試験される被験者の数、使用するアッセイの感受性および特異性に依存して、反復リフレックステストの適切な回数を選択することによって、任意の所望レベルへ排除もしくは減少させることができる。陽性サンプルのリフレックステストの選択されたラウンド回数の使用は、結果として偽陽性の実質的排除を生じることができる。
【背景技術】
【０００３】
ウシ結核症は、マイコバクテリウム・ボビスによる感染によって惹起される、畜牛における感染性かつ高度に伝染性の疾患である。この疾患は、マイコバクテリウムへのエアロゾル曝露または汚染した物質の摂取によって蔓延することがある。この疾患は、初期段階には比較的無症候性の慢性炎症として進行する傾向がある。進行した症例は、衰弱、食欲不振、リンパ節腫脹、持続性の咳および呼吸窮迫などの非特異的症状を特徴とし、他のタイプの呼吸器疾患と間違えられることがある。この細菌は優先的に畜牛に感染するが、ヒトや他の哺乳動物への伝播も報告されている。
【０００４】
現在標準的な検出方法には、ツベルクリン皮膚テストが含まれる。しかし、標準的皮膚テストの偽陰性もしくは偽陽性検査結果は珍しくない。陽性検査結果は、その動物に直接的に曝されていた他の群内動物と一緒に推定感染動物の駆除を生じさせる可能性が高いので、結核検査のためのより感受性が高くかつ正確な方法に対する必要が存在する。そのような方法があれば、ヒト被験者を結核や他の疾患について検査するためにも有益である。
【０００５】
偽陽性検査結果の発生を減少させるためのリフレックステストは、ウイルス性Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全性ウイルス（ＨＩＶ）感染およびＢ型肝炎感染などの感染症についても推奨されている（例えば、Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  Ｗｅｅｋｌｙ  Ｒｅｐｏｒｔ，Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ７，２００３，５２（ＲＲ−３）：１−１３を参照）。しかし、そのようなリフレックステストは、初期陽性検査結果を生成するために使用されたアッセイとは相違するタイプのアッセイを用いて実施されている。例えば、米国疾病管理予防センター（ＣＤＣ）は、抗Ｃ型肝炎抗体の存在についての初期陽性検査結果については、組換え免疫ブロットアッセイまたは核酸スクリーニング検査などのより特異的な血清学検査を用いるリフレックステストを用いてフォローアップすることを推奨している（同上）。そのような試験はより費用が高くなり、時間を要し、より高度の専門技術を必要とするので、相違する、より高感受性のアッセイを用いるリフレックステストは、確定的な検査結果を入手する費用、遅延、または困難を相当大きく増加させる可能性がある。以前のリフレックステストの例は、精度は低いが速度、経済性もしくは便宜性の高い初期試験を使用し、その後に通常は速度が遅く、費用が高く、さらにより複雑な試験方法を備えるより高精度のリフレックステストを行うことに重点を置いていた。特に、そのような試験プロトコルは、偽陰性の存在に悩まされ、結果としてその疾患を蔓延させる可能性がある感染被験者の集まりが残留する結果を生じていた。そこで、偽陽性および偽陰性検査結果を減少または排除するために、同一タイプのアッセイを繰り返し利用できるリフレックステスト法に対する必要が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当業者は、本明細書に開示かつ請求の範囲に記載したリフレックステスト方法がウシまたはヒトにおける結核症に限定されず、むしろ広範囲の病原体および／またはマーカー分子の存在についての試験に適用できることを理解する。様々な病原体および／またはマーカー分子に対する多数の相違する試験が当分野において知られ、市販で入手できる。例えば、温度、ｐＨ、洗浄ステップの回数および／またはストリンジェンシー、洗剤、カオトロピック剤（例えば、ホルムアミド、ウレア、グアニジニウム、イソチオシアネート）、キレート剤（ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ）、抗体もしくは他の検出部分の非特異的結合を減少させるための化合物（例えば、ウシ血清アルブミン）、などの剤の存在、不存在もしくは濃度、塩の濃度、二価カチオンの濃度のパラメータを変化させるステップおよび当分野において知られている他の技術によって、高レベルもしくは低レベルのストリンジェンシーを提供するためにそのような試験を実施するために使用される条件を変化させることは当業者の技術に範囲内に含まれる。そのような技術を用いて、所与の試験の相対感受性および／または特異性を調整できる。多くの場合に、感受性および特異性は逆に変化する。すなわち、アッセイの感受性が増加すると、特異性は相互の、類似の病原体または分子との非特異的結合または交差反応性のために減少する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に開示かつ請求した好ましい実施形態では、対応して減少した特異性とともに、１００％もしくは１００％近くの感受性を提供できるようにアッセイ条件を選択できる。そのような条件は、陰性検査結果を示すサンプルをその後の検査から排除できるように、偽陰性検査結果の存在を排除するように選択できる。偽陽性は、以前の検査サイクルにおいて陽性検査結果を示したサンプルについてのみ反復検査を行うことによって減少または排除できる。本明細書に開示かつ請求した検査方法は、検査の経済性、速度、効率、単純性ならびに偽陽性および偽陰性の減少もしくは排除に関して先行技術の検査方法よりすぐれた実質的長所を提供する。
【０００８】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の所定の実施形態を詳細に例証するために含まれている。これらの実施形態は、本明細書に明示した特定の実施形態についての詳細な説明と組み合わせて１つまたは複数のこれらの図面を参照することにより明確に理解できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の典型的な実施形態を例示している追加の詳細は、それらの各々の本文が参照して本明細書に組み込まれる２００３年４月２９日に提出された米国特許出願第１０／４２５，２２２号；２００３年２月２４日に提出された第１０／３７３，５４６号；２００３年２月２４日に提出された第１０／３７３，４０８号；２００３年２月２４日に提出された第１０／３７３，４０８号および２００４年２月１７日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４６７５に開示されている。
【００１０】
定義
本明細書に他に特に規定されていない用語は、それらの平易かつ通常の意味にしたがって使用される。
【００１１】
本明細書で使用する「１つの」は、１つまたは２つ以上の品目を意味することがある。
【００１２】
本明細書で使用する「捕捉分子」もしくは「プローブ」は、１つまたは複数の病原体、病原体関連分子、および／またはマーカー分子に対する結合親和性を有する分子もしくは凝集体を指す。本発明の範囲内では、当該の一部の病原体および／またはマーカー分子に対する結合親和性を有する実質的に任意の分子もしくは凝集体は「プローブ」であり得る。「プローブ」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、ＦＡｂフラグメント、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、アフィボディ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、アプタマー、結合タンパク質、受容体タンパク質、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、ならびに少なくとも１つの病原体および／または病原体関連分子に結合できる任意の他の知られているリガンドが含まれるが、それらに限定されない。
【００１３】
本明細書で使用する「マーカー」分子は、サンプル中のそれらの存在、不存在および／または濃度が疾患、病原性微生物もしくは他の状態の存在または不存在の指標である、分子もしくは分子の凝集体を指す。例えば、被験者における特定形状の癌の存在は前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１２５、ｒａｓもしくはＨｅｒ２−ｎｅｕタンパク質の突然変異体形、ＣＥＡ（胎児性癌抗原）および他の分子などの様々なマーカー分子の存在もしくは上昇濃度によって指示することができる。同様に、アルツハイマー病は、アミロイドβペプチド、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）または他の知られているマーカーの存在または上昇したレベルによって指示されることがある。多くのそのようなマーカー分子もしくは分子複合体は、様々な疾患状況もしくは状態について当分野において知られ、任意のそのような公知のマーカーは請求の範囲に記載された方法を用いてアッセイできる。
【００１４】
本明細書で使用する「病原体」は、感染性疾患と関連していることが当分野において知られている任意のウイルス、細菌、微生物、分子もしくは分子凝集体である。病原体の非限定的例は、表６に列挙されている。
【００１５】
本明細書で使用する「量子効率」は、イメージング装置のために利用される、またはイメージング装置の電流もしくはシグナル出力に寄与する光線もしくは光子束の比率を意味する。
【００１６】
本明細書で使用する「イメージセンサ」、「イメージング装置」、または「イメージャ」は、画像を捕捉するための装置を指す。この用語には、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）イメージセンサおよびＣＣＤ（電荷結合素子）イメージャが含まれるが、それらに限定されない。
【００１７】
本明細書で使用する「光子束」は、イメージセンサの表面を含む、表面に衝突する光子のエネルギーを意味する。表面に衝突するエネルギーは、Ｗ（ワット）／ｃｍ2で測定することができ、所与時間にわたり単位面積に衝突する光子数と相関している。
【００１８】
＜ウシ結核症について検査＞
典型的な実施形態では、本明細書に開示したリフレックステスト法は、ウシまたはヒト被験者において結核症を誘発する細菌の存在について検査するために使用できる。結核症は、世界的に重大なヒトおよび動物の健康問題であり、ヒト疾患は年間約３００万人の死亡を引き起こしている（世界保険機構、「１９９０年代についての結核の管理および研究戦略。ＷＨＯ会議の覚書」、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｗ．Ｈ．Ｏ．７０：１７−２１，１９９２）。ウシ結核症は、経済的損失の主要な原因および人畜共通感染症の重大な原因を提示する（Ｄａｂｏｒｎ，Ｃ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇｒａｎｇｅ，Ｊ．Ｍ．，ＨＩＶ／ＡＩＤＳ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．１９９３．Ｂｒ．Ｖｅｔ．Ｊ．１４９：４０５−４１７）。
【００１９】
畜牛では、結核（ＴＢ）は、ヒト病原体である結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の近縁菌である細菌、マイコバクテリウム・ボビスによる感染によって惹起される。それらがどちらも「結核菌複合体」として規定されている細菌に含まれるこれらの菌株によって発現した抗原においては極めて限定された相違しか見出されていないが、抗原発現の明白な相違が疾患誘発物質を非病原性菌株から識別する（Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，「Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＳＡＴ−６  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ，」  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，１９９７，６５：２５８７−９２；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ａ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ４０，０００  ＭＷ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，」  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９２．６０：２３１７−２３２３；Ｈａｒｂｏｅ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＳＡＴ−６  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ，」  １９９６，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：１６−２２）。ウシ結核症は、ヒト、他の家畜および一部の野生動物（ヘラジカおよびオジロジカを含む）にも感染することがある。
【００２０】
ウシ結核症根絶プログラムは、現在、米国および多数の他の国々において実施されている。有病率の追跡は１９１７年に開始され、根絶プログラムに関連する有病率における減少は、経時的に増加する各年に実感された利益を生じさせている。２００４年の見積利益は、年間１億９，０００万ドルであった。（２００４年結核委員会の報告書、ｕｓａｈａ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ／ｒｅｐｏｒｔｓ／ｒｅｐｏｒｔ−ｔｂ−２００４）。それでも、ウシ結核症による感染は、頻回に発見されている。２００３事業年度においては１０の罹患畜牛群が検出され、２００４年には６群以上が検出された。感染酪農用未出産雌牛／去勢牛の起源は、感染した畜牛またはＴＢ感染領域からの違法移動と混合された、米国酪農業における未検出ＴＢと関連付けられている。不適切な動物の同定は、さらにまた感染起源を同定する検証努力を妨害することがある。２００３事業年度における３９症例の発見と比較して、２００４事業年度には畜殺サーベイランスによって、３５の結核症例が明らかにされた。メキシコでは、感染率は、２００３事業年度における０．３４／１０，０００頭（畜牛）に比較して２００４年に輸入された０．２２／１０，０００頭（畜牛）であった。１９９６年から２００４年１月までに畜牛における確認された新規感染発生を生じさせた英国における拘束されていない群についての試験のパーセンテージを図９に示したが、これはより良好な試験および根絶法に対する必要を協調している。２００４年１０月からは、試験した動物３７２，２８４頭中１３１１頭の感染動物が確認された（有病率０．４％）。現在のおおよその有病率は、米国では０．２％、メキシコでは０．４％および英国では０．４％である。
【００２１】
ヒトは、１）感染した動物もしくは感染したヒトが近くで咳やくしゃみをした後で細菌に汚染した空気を吸入すること；２）感染したウシ由来の未殺菌乳汁を飲んだり、感染した動物由来の生肉もしくは加熱が不十分な肉を食べたりすること；または３）屠殺動物の下ごしらえおよび処理において感染した肉を取り扱うことによって、特に食事をする前に注意深く手を洗わなかった場合に、ウシ結核症に罹患する。
【００２２】
しかし、任意の他の疾患より多数のヒトが結核で死亡することは認識されている。世界保険機構（ＷＨＯ）によると、２００３年には結核のために２００万人を超える人が死亡した。世界中で３人中１人が潜伏性結核を有し、ほぼ３億人の感染者がいることになるというのが現在の推定である。結核は、風邪に似て高度に伝染性で、迅速に蔓延するので、世界的に制御されなければ米国内で根絶することはできない。
【００２３】
ヒトにおけるウシ結核症の症状は、一般に伝播方法に関連し、結核（Ｍｔｂ）感染症において観察される症状に類似する。これらの症状には、咳、熱、寝汗、疲労および体重減少が含まれる。ＭｂｏｖもしくはＭｔｂに感染した患者は、典型的にはツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）皮膚テストを用いて同定され、いずれの症例でも同一処方薬を用いて治療される。ＴＢを治療するために使用される薬物は、決して無害ではなく、適正な療法のためには患者は長期間にわたる治療に耐えることが要求されるので、罹病および死亡の原因となる。これは、適切には容易に治療できないために、世界的な主要な感染性死因である。薬物耐性ＴＢの有病率は、高速で上昇し、現在は３％を超えている。現在利用できる最高の試験を用いて個人が感染していることを確認するためには数週間から数カ月間を要する。
【００２４】
生物は単離するのが困難であり、緩徐に増殖し、そして予測不能に播種性であるために、感染していて疾患を広めている個人を容易に同定する高速診断試験はない。皮膚テストは、実施するために高度の専門技術を必要とし、この微生物に感染している、もしくは保有するＢＣＧワクチン接種済み患者を確実に同定するためには使用で傷、真に感染している個人の３０〜４０％を同定することができない。感染している個人を見つける際に、そしてＴＢを根絶およびまたは制御するために彼らを治療する際には、迅速（１〜４時間）かつ単純な血液検査が極めて価値がある。
【００２５】
＜結核の根絶＞
結核の制御および根絶は、感染した被験者を同定する困難さのために深刻な挑戦課題を提示する。ほとんどの疾患において、ヒトおよび動物は異種タンパク質に反応して検出可能なレベルの抗体を容易に発生し、これは特定病原体による感染の確実な指標を与える。実際に、現代の疾患診断およびサーベイランスは、一般に疾患因子自体よりむしろ、感染性因子に対する抗体の検出に基づいてきた。
【００２６】
しかし、ＴＢ病原体は、病原体が明確に確定されて疾患の臨床徴候が既に明白である感染後期になるまでは、伝統的方法によっては検出可能な抗体がほとんど観察されないより潜行性の疾患因子群の１つである。Ｍ．ボビスに感染した大多数の畜牛は、有効な細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答を増加させ、低抗体反応を有し、さらに長期間にわたり局所病巣内に感染を含有することは証明されている（Ｔｈｅｏｎ，Ｃ．Ｏ．ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ａ．，Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｏｍｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．１９８３，Ｖｅｔ．Ｂｕｌｌ，Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ，５３：５４３−５５０）。その理由から、ＴＢ感染に応答して発生した特異的抗体を測定する診断試験は、ＴＢの多数の偽陰性または見逃し症例を生じさせるので、ツベルクリンＰＰＤ皮膚テストより（ヒトおよび畜牛のどちらにおいても）低感受性であることが証明されている。これらの血清学試験は、典型的には、それらが他の比較的に無害のマイコバクテリアに応答して身体によって生成された抗体を頻回に検出し、偽陽性を生じさせる点で、低特異性を有することも証明されている。
【００２７】
＜畜牛における診断方法＞
畜牛においてＴＢを診断するために現在好ましい方法は、Ｍ．ボビス感染への細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答を測定するフィールド試験である単回ツベルクリン皮内テスト（ＳＩＤＴ）である。詳細には、このテストはウシツベルクリンＰＰＤの皮内接種後のＣＭＩ応答の構成要素である遅延型高感受性反応を測定する。結果は、７２時間後に評価される（Ｗｏｏｄ，Ｐ．Ｒ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｌ．Ｂｏｖｉｇａｍ（商標）ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｃｒｅｄｉｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＵＳＡＨＡ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，１９９８，１−９）。このテストは、広範囲に感染が広がっている群では９６〜９９％という高い特異性を有すると報告されている（Ｍｏｎａｇｈａｎ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｈｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ  ｔｅｓｔ．１９９４，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏ．４０：１１１−１２４）。
【００２８】
しかし、感染した動物の２８％は未感染であると不正確に同定されるために、ＴＢ根絶プログラムにおいてはこのテストの中等度の感受性（７２％）は問題が多い。未感染と同定された畜牛は、明白に疾病ではない限り群に戻され、他の未感染畜牛に感染を蔓延させる。同様に、一部の地理的領域では、特異性は、非定型マイクバクテリアとの重大な交差反応性のためにさらにいっそう減少する。オジロジカ、ヘラジカ、アナグマなどを含む根絶プログラムに含まれていない他の感染した動物もまた、以前に直っていた畜牛を再感染させ、それによって根絶に関連する問題の一因となり、問題を悪化させる。
【００２９】
感受性および特異性はどちらも、疾患を根絶させる際に重大な影響を及ぼす。有病率の減少に伴って、真の陽性動物に比較して検出される偽陽性動物の数は、特異性が１００％未満であるために増加する。陽性予測値は有病率と正比例して減少し、結果として大多数の動物は低有病率で感染すると不正確に同定される。感染していると不正確に同定されたそれらの動物を根絶することは、経済的に容認できない。さらに、これらの短所にもかかわらず、皮膚テストは過去１００年以上にわたって大規模集団（ヒトもしくは動物）をスクリーニングするために利用できる唯一の実際的テストであった。
【００３０】
結核を有する大多数の畜牛は、臨床徴候を示さない。しかしそれらは、他の家畜およびヒトにとって深刻な脅威を提示する。結核の有病率は、現在根絶プログラムが進行中である米国および多数の他の国々内では低いと考えられているが、このプログラムにおける弱点は持続している。多数の国々では、２つの完全ではない試験様式を組み合わせる標準的な「連続式」テストが使用されている（Ｍ．Ｔｈｒｕｓｆｉｅｌｄ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ，ＵＳＡ．１９９５）。第１テストは、容疑（反応者）または陽性のどちらかを同定するために設計されているＣａｕｄａｌ  Ｆｏｌｄテスト（ＣＦＴ）と呼ばれるＰＰＤ皮膚テストである。次に、陽性もしくは反応者のどちらかであるという結果の出た全動物は、ときには比較頸部テストとも呼ばれる短間隔比較ツベルクリンテスト（ＳＩＣＴＴ）を用いて再検査される。ＣＦＴについての感度範囲は６８〜９５％であり、特異性範囲は９６〜９８．８％である。ＳＩＣＴＴは７７〜９５％の感受性範囲を有し、特異性は９９％より高い（Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ  ｔｅｓｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｏｖｉｎｅ  ＰＰＤ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎｓ，」  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｃｏｒｄ，１９７８  １０３：４２０−４２５；Ｍｏｎａｇｈａｎ，ＭＬ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ  ｔｅｓｔ，」  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，４０：１１１−１２４）。このテスト結果が陽性である場合、動物は屠殺され、培養および組織学検査のために組織が採取される。完全ではないテストを２つ組み合わせることによって、総合感度はほぼ７０％へ減少するが、特異性は１００％近くあるので、不正確に同定された動物が屠殺されずにすむ。しかし、感度の低下は一部の偽陰性検査結果を生じさせ、対応する感染したかどうかがあいまいな動物の存在は持続的に低レベルの感染率を生じさせる。連続式で行なわれる診断試験のための連続式試験の統計的転帰についての良好な例については、ｐｒｅｖｍｅｄ．ｖｅｔ．ｏｈｉｏ−ｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｅｘｔ＿６２ｂ．ｈｔｍで考察されている。
【００３１】
＜ＣＦＰ１０−ＥＳＡＴ６融合タンパク質＞
伝染力の強いＭ．ボビスと弱毒化ワクチン菌株によるＭ．ボビスＢＣＧとの遺伝学的相違についての分子分析が実施された。サブトラクティブゲノムハイブリダイゼーションを用いて、ＲＤ−１〜ＲＤ−３と指名された３つの相違領域が同定された。ＲＤ−１は結核菌およびＭ．ボビスの全菌株で検出されたが、全ＢＣＧ亜株では不存在である（Ｍａｈｅｉｒａｓ，Ｇ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｔ  Ｍ．ｂｏｖｉｓ，」  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７８：１２７４−１２８２）。早期分泌抗原標的（Ｅａｒｌｙ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｔａｒｇｅｔ）６ｋＤタンパク質をコードするＥＳＡＴ−６遺伝子は、ＲＤ−１内で見出されている。ＥＳＡＴ−６は、結核菌短期培養濾液から精製されている主要Ｔ細胞抗原である（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，」  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：１７１０−１７１７；Ｈａｒｂｏｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，１９９６，「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＳＡＴ−６  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ，」  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：１６−２２）。ＥＳＡＴ−６に帰せられている機能はまだないが、ＥＡＳＴ−６は本質的に強度に抗原性であり、マウス記憶免疫Ｔリンパ球由来のγインターフェロンの産生を刺激し、抗結核免疫の発生に寄与できる可能性がある（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，「Ｒｅｃａｌｌ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，」  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３３５９−３３７２）。
【００３２】
ＥＡＳＴ−６と共転写される、ｌｈｐと指名された新規遺伝子が同定されている。ｌｈｐ／ｅｓａｔ−６オペロン内では、新規遺伝子ファミリーを規定する、計１３の潜在的遺伝子（もしくはオープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）もまた同定されている。結核菌ｌｈｐ遺伝子産物は、同様に短期培養濾液中でも見出されている低分子量１０ｋＤ培養濾液タンパク質であるＣＦＰ−１０として同定されている（Ｂｅｒｔｈｅｔ，Ｆ−Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，「Ａ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｏｐｅｒｏｎ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＥＳＡＴ−６  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｍａｓｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｉｌｔｒａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＣＦＰ−１０），」  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：３１９５−３２０３）。そこで、ＣＦＰ−１０およびＥＳＡＴ−６はどちらも結核菌もしくはＭ．ボビスにおいて早期に一緒に転写され、どちらも小輸出タンパク質をコードする。２つの遺伝子はいずれのゲノム内でも相互に隣接して発生するので、両方の全長タンパク質から構成される融合タンパク質組換え抗原は、本発明者らのアッセイのための捕捉プローブとして設計した。
【００３３】
＜Ｂｏｖｉｇａｍテスト＞
現在は、結核菌もしくはＭ．ボビスへの曝露後に免疫系によって活性化されたキラーＴ細胞が、これらの生物由来の特異的細菌エピトープを用いて刺激された場合にγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）産生についてアッセイされる新規パネルの試験が評価されている。この試験のウシ適用は、Ｂｏｖｉｇａｍ（商標）と呼ばれ、霊長類適用はＰｒｉｍａｇａｍ（商標）およびヒト適用はＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ（商標）である。これらのアッセイでは、全血が患者から採取されてツベルクリン（結核菌もしくはＭ．ボビスから抽出したタンパク質）とともに一晩インキュベートされる。患者（ヒトもしくは動物）が以前にＴＢに曝露させられている場合は、血液中のＴ細胞は、単純な研究室アッセイで検出可能なＩＦＮ−γを産生する。そのような試験の長所は、試験血液サンプルの抽出は被験者の免疫状態を妨害しないので、必要であれば反復検査が可能であり（皮膚テストは、再検査前に少なくとも６０日間の間隔を必要とする）、感染の早期症例を検出するために使用できる。
【００３４】
これらのテストは、皮膚テストを使用できないＨＩＶ感染者および他の免疫不全者においても容易に使用できる。世界中での３００，０００頭をはるかに超える畜牛を対象とする試験は、Ｂｏｖｉｇａｍ（商標）が皮膚テストについての６５．６〜８４．４％に比較して７７〜９３．６％の範囲内の感受性を有することを証明している。Ｂｏｖｉｇａｍ（商標）および皮膚テストを一緒に使用することができ、その場合にはより高度の感受性を達成できる。
【００３５】
＜Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ試験＞
Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ（商標）は、現在までに３，０００を超える個体を含む臨床試験において試験されている。Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ（商標）の改良バージョンでは、結核菌抗原であるＥＳＡＴ−６もしくはＣＦＰ−１０（ＭｔｂもしくはＭｂｏｖの活性感染症において早期に発現する遺伝子産物）であるＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ  ＧＯＬＤテストがツベルクリンＰＰＤの代わりに使用される。ＥＳＡＴ−６配列は、結核性非ヒト霊長類（Ｋａｎａｕｊｉａ，Ｇ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＳＡＴ−６  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｒａ  ｏｆ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  Ｎｏｎｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ，」  Ｃｌｉｎ．ａｎｄ  Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４，１１（１）：２２２−２２６）および畜牛（Ｂｕｄｄｌｅ，Ｂ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ＥＳＡＴ−６  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｋｉｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００１．８０：３７−４６；Ｂｕｄｄｌｅ，Ｂ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｔｅｓｔ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃａｔｔｌｅ．Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｃｏｒｄ，２００３．６１５−６２０；Ｖｏｒｄｅｒｍｅｉｅｒ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｅｓａｔ−６  ａｎｄ  ｃｆｐ−１０  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ．Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１．８：５７１−８）ならびにヒト（Ａｒｅｎｄ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＤ１−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ＥＳＡＴ−６  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｉｌｔｒａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０  ａｎｄ  ｔｏ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，２０００．６８：３３１４−２１；Ａｒｅｎｄ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｅａｒｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ６−ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｉｌｔｒａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２０００．１８１：１８５０−４；Ｂｅｒｔｈｅｔ，Ｆ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｏｐｅｒｏｎ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＥＳＡＴ−６  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｍａｓｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｉｌｔｒａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＣＦＰ−１０）．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８．１４４：３１９５−２０３；Ｂｒｏｃｋ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＰＰＤ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ＥＳＡＴ−６  ａｎｄ  ＣＦＰ−１０．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｔｕｂｅｒｃ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓ，２００１．５：４６２−７．）の血清中の抗体によって認識されることが証明されている。
【００３６】
多数の公表された臨床試験は、ＴＢ感染を検出するためのＥＳＡＴ−６および／またはＣＦＰ−１０（Ｂｏｖｉｇａｍ（商標）またはＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ（商標）以外の方法を用いる）に対するＩＦＮ−γ応答を測定するステップの有用性を証明している（Ｄｉｌｌｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＣＦＰ−１０，ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｉｓｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００．３８：３２８５−９０；Ｐａｔｈａｎ  Ａ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩＦＮ−γ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１．１６７：５２１７−２５；Ｓｈａｍｓ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，２００１．６９：３４９７−５０１；Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ＣＤ８（＋）Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｈｅａｌｔｈｙ  ＢＣＧ−ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｇａｍｂｉａ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，２０００．６８：７１４４−８；Ｖｅｋｅｍａｎｓ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｎｔａｃｔｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｈａｖｅ  ｈｉｇｈｅｒ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＥＳＡＴ−６  ｔｈａｎ  ｄｏ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｇａｍｂｉａ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，２０００．６９：６５５４−７）。しかし、これらの試験は一般に、実行するのが面倒な試験システムを使用し、日常的な診断用途（例えば、精製リンパ球培養、ＥＬＩＳＰＯＴ）のためには適合しない。オーストラリアで実施された試験は、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ（商標）試験の感受性および特異性が各々ほぼ９０％および９８％であることを見いだした。これに比較すると、皮膚テストは、ヒトＴＢ感染を検出するために約７０％の感受性を有する。
【００３７】
＜血液検査対皮膚テスト＞
Ｂｏｖｉｇａｍ（商標）、Ｐｒｉｍａｇａｍ（商標）およびＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ（商標）は、１回の血液採取しか必要とせず、現在までに皮膚テストおよびＴＢ抗体検出試験よりはるかに正確であり、それらは相当に実行するのに費用がより高額であり、自動化されておらず、活性化Ｔ細胞リンパ球とＭ．ボビスもしくは結核菌特異的抗原とのインキュベーション２４時間後まで結果を入手できないので実施するのが冗長である。さらに、各テストのために新鮮血液サンプルが必要とされ、採血後２４時間以内にアッセイされなければならない。そこで、これらの検査を広範なスクリーニングのために使用することは非実際的であり、より単純な初期スクリーニング方法によって陽性とされた試験サンプルの確認アッセイとして使用するのが最もよい。
【００３８】
英国では、皮内比較頸部ツベルクリンテスト（ＳＩＣＣＴ／皮膚テスト）は、畜牛においてＴＢを診断するために使用される唯一の試験である。ＢｏｖｉｇａｍテストはＳＩＣＣＴテストより高感受性であるが低特異性であると思われるので、感染した群を根絶するためにＢｏｖｉｇａｍを使用する確率が調査された。従来型ＰＰＤ抗原およびより新規な合成抗原の両方が、ＩＦＮテストが有用であるかどうかを決定するための費用効果性試験において使用された（ｄｅｆｒａ．ｇｏｖ．ｕｋ／ａｎｉｍａｌｈ／ｔｂ／ｆｏｒｕｍ／ｐａｐｅｒｓ／ｔｂｆ７１．ｐｄｆ）。血液検査は皮膚テストが陽性になる前に検出できることが観察されたが、複雑性および動物１頭当たりの総費用のために、この試験の経済的な全体的利益は正当化できない。
【００３９】
皮膚テストに比較して血液検査に関連する長所には、以下が含まれる。
・群が移動制限下に置かれる時間の長さが減少する。
・皮膚テストのために必要とされるような家畜を２回訪問検査する必要が取り除かれる。
・検査に消費される時間を減少させることによって獣医学および検査の費用が減少する。
・検査の増加した感受性のために感染を解決するために必要とされる検査のラウンド数を減少させる。
・感染の早期段階に畜牛の感染を検出する。
・皮膚テストにおける問題のような干渉（少なくとも６０日間の間隔）なしで極めて短い間隔で再検査する能力。
・感染が迅速に蔓延しているときにより多くの疾患を取り上げるために理想的に適合する高感受性。
・ＢＣＧでワクチン接種した畜牛とＭ．ボビスに感染した畜牛とを識別する。
・結果の分析は、訓練を積んだ獣医による皮膚反応の主観的評価よりはるかに正確である。
【００４０】
皮膚テスト（ＳＩＣＣＴもしくはＣＦＴ）は、検査を実施して２〜３日後に結果を再び読み取るために動物を集合させる必要がある。このテストの感受性が経験を積んでいない技術者が行った場合には２０％と低い可能性があるので、経験を積んだ獣医が実施することが高度に推奨されている。検査を実施して読み取るために経験および訓練を積んだ獣医を使用することは、血清に基づく試験に比較してはるかに多くの時間および費用を必要とする。
【００４１】
Ｍ．ボビスに対する循環中抗体を検出できる血清学的アッセイについては長年にわたり絶えざる研究が行われてきたが、現在までにルーチン使用するための診断テストとして適合するものにする適正な感受性もしくは特異性を証明できたアッセイはない（Ｗｏｏｄ，Ｐ．Ｒ．ａｎｄ  Ｒｏｔｈｅｌ，Ｊ．Ｓ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｂｏｖｉｎｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．１９９４，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏ，４０：１２５−１３５）。
【００４２】
＜リフレックス・サプリメンタルテスト−ＴＢ感染被験者を同定するための迅速で効率的かつ高度に正確な方法＞
マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｂｖ）感染についてのＰｒｉＴｅｓｔ迅速診断テストは、畜牛におけるＴＢ感染の広範なスクリーニングについての理想的な血清学的方法を提供する。本方法は、皮膚テストに比較して多数の点で優れ、少量の血清サンプルを必要とする（単回血液採取からの０．１ｍＬという少量の血清が、多数回のラウンドの検査について十分以上の物質を提供する）。本検査は、初回スクリーニングについて１．５時間未満で高度に正確な結果を生じさせるので、高レベルの技術的専門性を必要としない。単一の血液サンプルが必要とされるすべてであり、結果は次に研究室で処理され、そこで結果は機器およびソフトウエアによって自動的に解釈できる。
【００４３】
本試験は、特に試験デザインに備わっている高度の正確性が再検査しなければならない動物の数を最小限に抑えるので、極めて多数の畜牛をスクリーニングする際に使用するために経済的である。リフレックス・サプリメンタルテスト（ＲＳＴ）を用いると、最終結果は、Ｂｏｖｉｇａｍを特徴とするより効果で面倒な試験に頼る必要なく入手される。そして血液サンプルはいつでも再検査することができ、正確なＢｏｖｉｇａｍ試験のために必要とされる時間依存性要件（１５時間）を有していない。
【００４４】
ＰｒｉＴｅｓｔ迅速診断テストでは、ツベルクリン注射が行われず、結果が１日以内（初期スクリーニングおよび陽性サンプルを対象とする２回の確認リフレックス・サプリメンタルテストを含む）に検査室内で入手されるために、免疫応答性は影響を受けない。ＰｒｉＴｅｓｔ迅速診断テストは、Ｂｏｖｉｇａｍ（商標）を用いた場合と同様にＭ．ボビスに対して特異的であり、Ｍ．ボビスとパラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などの他のマイコバクテリア感染との鑑別診断を提供する。どちらの検査もＢＣＧワクチン接種動物には陽性反応しない。Ｂｏｖｉｇａｍ（商標）は、１５時間以内に試験されなければならない特殊な取り扱い要件とともに新鮮血液サンプルを必要とする。ＰｒｉＴｅｓｔ迅速診断テストは血清を試験しさえすればよく、特殊な取り扱いを必要としないので、サンプルを採取して、後になって試験するために冷凍保存することさえできる。
【００４５】
典型的な試験は、カルボキシルアクリルポリマーでコーティングされたフェライト粒子にコンジュゲートしているＭｔｂ  ＣＦＰ−１０／ＥＳＡＴ−６の組換え融合タンパク質捕捉プローブを用いるステップを含む。規定量のビーズは、１０ｍＭのＰＢＳ、０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のＰｒｏＣｌｉｎからなる希釈バッファ中に１：５０で希釈されている試験血清サンプル中に分散させる。希釈した血清およびビーズは、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートする。次にビーズはネオジウム磁石を用いてサンプルチャンバの壁に付着させ、洗浄バッファ中に再分散させ、２回以上収集する。好ましい実施形態では、１対の球状磁石を１つはサンプルチャンバホルダ（微小遠心管ホルダなど）の片側に置いてプラスチックブロック内に配置することができる。球状磁石は、溶液からフェライトビーズをより効率的に収集するためのより強度の局所磁場を提供することが見出されている。
【００４６】
二次ビオニチル化抗ウシ抗体は、フェライトビーズ上の組換え抗原によって捕捉されているウシＴＢ抗体を標識するために使用する。１０分間の室温でのインキュベーション後に、ビーズは、磁石を用いて１．５ｍＬのエッペンドルフ微小遠心管などのチャンバの側壁へ再び付着させ、洗浄バッファ内にさらに２回分散させ、再収集する。次にウシ抗体へ付着したビオチン化抗体を含むビーズは、ホースラディッシュペルオキシダーゼストレプトアビジン（ＨＲＰ−ＳＡ）とともに５分間インキュベートし、次に２回分散させ、ビーズを洗浄する。
【００４７】
次にビーズは１：１のルミノール−過酸化物溶液中で懸濁させ、化学発光は、例えば、ＰｒｉＴｅｓｔ  ＴＯＡＤ（商標）（例えば、参照して本明細書に組み込まれる２００４年１月２９日に提出された米国仮特許出願第６０／５４０，７２０号を参照されたい）のようなホトイメージャ内で検出する。例えば、画像は、ビーズに結合した抗体レベルに対応する光子画像を正確に測定するために１０分間にわたって完全暗色チャンバ内で入手できる。ソフトウエアパッケージ（例えば、Ｓｌｉｄｅｒバージョン３．６、２００３年２月２４日に提出された米国特許出願第１０／３７３，４０８号を参照）を使用すると、ワンパスで１２サンプルまでを処理することができる。指定された陽性または陰性の数値は、陰性コントロール参照血清に基づいて計算される。
【００４８】
各ｃｒｉｂセットは現在、陰性コントロールに加えて１１という多数の試験サンプルを有する。数値として与えられる観察されたシグナルは、観察されたサンプル値からｃｒｉｂのバックグラウンドを減じることによって各サンプルの比視感度（ＲＬ）を計算する自動プログラムに入力される。次に各サンプルについてのデータ比視感度（ΔＲＬ）は、サンプルを陽性と読み取らなければならない閾値基準を設定するために統計的調整を行って各サンプルのＲＬから陰性コントロール（ＴＢについて試験して陰性であった約１０例のウシ血清のプール血清からなる）のＲＬを減じるステップによって計算される。
【００４９】
サンプルをＭ．ボビス抗体について陰性または陽性であると指定するための閾値、もしくはカットオフ値は、プログラム内に含有される事前設定アルゴリズムによって決定される。スクリーニングの第１ラウンドにおいて検査結果が陽性であるサンプルは、第２ラウンドで再検査される（リフレックステスト＃１）。第２ラウンドにおいて検査結果が陽性であるサンプルは、確認ラウンドで再検査される（リフレックステスト＃２）。リフレックステストにおける任意の時点で検査結果が陰性であった任意のサンプルは、陰性であると確認される。リフレックステスト＃２後に検査結果が陽性であるサンプルは、指定において陽性であると確認される。
【００５０】
１回の検査では、１００％の確実性で感染した動物を効果的に単離するために必要とされる感受性（感度）および特異性のレベルを一貫して生じさせない。リフレックス・サプリメンタルテストは、陽性を検出するための閾値が１００％の陽性感染動物を捕捉するために十分に低く設定されているので、偽陽性（すなわち、１００％もしくは１００％近くで）が予想される閾値で慎重に検査するステップを含む。
【００５１】
次に第２バッチにおいて同一アッセイを用いて感染について試験した結果が再び陽性になった動物の全部を検査することによって、未感染動物の第２バッチは安全に放出される。リフレックス・サプリメンタルテストプロセスは、検査結果が陽性の動物だけを各間隔で再検査して、真陽性単離体だけが確認されるまで段階的に継続される。迅速に検査する本方法は、感染した動物に重点が置かれるが、他方では偽陽性検査結果の動物は実際にそれらが感染していない場合は陰性であると再検査できる。感染している動物を正確に確認することについては、単回スクリーニングテストよりはるかに効率的である。
【００５２】
＜ＲＳＴ数を計算する＞
自信を持って再検査を停止するためには、何回のリフレックス・サプリメンタルテストが必要であるか？過剰に多数回の検査は、時間、資金および資源が浪費されるので価値がない。この数は、容易に計算することができる。血清反応陽性および血清反応陰性動物はどちらも、１回のアッセイで容易に決定できる試験値を有する。感染（陽性）および未感染（陰性）動物両方についての数値の正規分布曲線を決定できる（図１０を参照）。
【００５３】
分布曲線は、対称的である必要はなく（図示したように）、図１０に示したように実際には重複する。陽性および陰性についての２本の曲線が重複しない場合は、曲線間の閾値は、１００％の特異性および感受性で感染および未感染畜牛の２つの集団間を容易に識別する。しかし、畜牛におけるＴＢの場合のように曲線が重複する場合でさえ、試験された全感染（陽性）動物の左（低い数値）に閾値を選択できる。閾値指定を用いると、全部の真に陽性の動物の１００％は正確に検出される（すなわち、偽陰性はゼロになる）が、未感染畜牛の一部は、図１０を調査することによって明らかなように誤って陽性であると同定される（すなわち、「陰性血清」曲線の一部分は閾値の右の方にある）。しかし、図から明らかなように、リフレックステストの各繰り返しに伴って、偽陽性検査結果の数が迅速に減少する。
【００５４】
各試験、および各リフレックス・サプリメンタルテストを用いた各動物（感染または未感染いずれか）についてのアッセイ値は、図１０に示した２本の曲線の１つ内に入り、アッセイで使用した閾値に基づいて、陽性または陰性検査結果であると指定できる。数値は、適切な曲線下のいずれか（感染または未感染）に含まれると予想され、測定された以前の数値を必ずしも高度の精度で再現しない場合がある。分布曲線の形状によって規定されるように、分散が予想される。
【００５５】
最高ＲＳＴ数（Ｎ、繰り返し試験のサイクル数に等しい）は、３つの因子に左右される−プロセッシングについてのサンプルの総数（Ｘ）、試験されたサンプル数における真に感染した畜牛の数（有病率）、および真に感染した畜牛全部に「陽性」値を正確に指定するために十分に低い閾値に対する特異性。各テストを用いて、実際的に未感染であるサンプルのパーセンテージは、試験のために一致してサンプルのプールから除去される。リフレックス・サプリメンタルテストは、その後のテストを受ける準備が整っている陰性に比較した陽性のパーセンテージを高める各サイクルを生じさせる。この方法は有病率を増加させ、検査の陽性予測値を、プロセスにおける各再検査により良好にし、リフレックステスト＃１からリフレックステスト＃２などへの相対分布における変化において図１０に示されている。プール内の陽性の比率は、各サイクルの試験を用いてプール内の陰性に比較して増加する。最適化されたＲＳＴは、試験された陽性総数に比較して偽陰性検査結果を最小限に抑える。最適化のための試験の総数は、合計として計算できる。
試験の総数
（スクリーニング＋ＲＳＴ）＝Ｘ｛１＋Ｆ＋Ｆ2＋Ｆ3＋．．．ＦN｝
Ｆは特異性に依存する偽陽性因子であり、
Ｆ＝１−特異性
偽陽性の数＝Ｆ｛（Ｘ−真陽性数）｝
Ｘ＝総サンプルプロセス数
Ｎ＝最適化されたＲＳＴ数
【００５６】
本発明者らは、試験されるサンプルの総数において１頭の感染動物の有病率があることを推定して１頭の偽陽性動物を排除するための最小基準を設定することによって合理的特異性を用いて最適化できる（本明細書に開示した典型的プロトコルを用いた場合と同様に、特異性が５０％より実質的に大きいことを推定して）。これは、合計において最終シリーズを１の数値へ設定すること、そしてサンプルの総数（Ｘ）および特異性に基づいてＮの計算を可能にすることに相当する。
ＸＦN＝１
Ｎ＝｛Ｌｏｇ  １−Ｌｏｇ  Ｘ｝／Ｌｏｇ  Ｆ
【００５７】
スクリーニングにおける特異性、有病率、および初期テストの数が、１００％の感度で所与のアッセイについて自信を持って感染もしくは感染の除去と畜牛を指定するために必要とされるリフレックス・サプリメンタルテストの総数を決定する。ＲＳＴ数は、図１１に示したように１００〜５００，０００例の畜牛のサンプル中で１頭の真陽性動物について、表７において０．７０、０．７４（典型的試験）、０．９０および０．９９の特異性について計算される。特異性が高いほど必要とされる総試験数は少なくなることは明白であるが、さらにＲＳＴ法は、１００頭の動物群において真に感染した動物を３〜４サイクル以内に高速で同定する。
【００５８】
ＲＳＴ数を最適化すると、血清学的陰性（未感染）畜牛についての平均値を約１．６標準偏差超える閾値は、１００％感受性で現行ＰｒｉＴｅｓｔ迅速Ｍｂｖ畜牛アッセイにおける７４％の特異性を生じることが明らかになる。単回スクリーニングおよび３回のリフレックス・サプリメンタルテストでは、陽性感染動物は１０００頭の畜牛の群中で４頭中１頭以内へ同定されるはずであり、追加の４回の試験によって陽性であると同定できる。これらの条件下で、１，０００頭の動物群において１頭の感染動物を陽性であると同定するために実施される試験の総回数は１３４８回である。そこで、リフレックステストの複数の繰り返しサイクルを用いた場合でさえ、必要とされる試験の総数は群のサイズに比較して相当に低い。
【００５９】
＜病原体またはマーカー検出のための装置＞
本発明の所定の実施形態は、病原体および／またはマーカー分子検出アッセイのための使用の装置に関する。本発明の典型的な実施形態を例示している追加の詳細は、それらの各々の本文が全体に参照して本明細書に組み込まれる２００１年１０月１０日に提出された米国特許出願第０９／９７４，０８９号；２００２年１０月９日に提出された第１０／０３５，３６７号；２００３年４月２９日に提出された第１０／４２５，２２２号；２００３年２月２４日に提出された第１０／３７３，５４６号；２００３年２月２４日に提出された第１０／３７３，４０８号および２００４年１月２９日提出された仮特許出願第６０／５４０，７２０号に開示されている。
【００６０】
＜全光学アッセイ装置（ＴＯＡＤ）＞
図１２は、全光学アッセイ装置（Ｔｏｔａｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｉｃｅ：ＴＯＡＤ（商標））の非限定的な典型的実施形態を示している。この実施例では、ＴＯＡＤ（商標）は、ヒンジ付きリッド１２２０を備える遮光性ケーシング１２１０を含む。リッド１２２０が閉鎖されると、ケーシング１２１０は、ＴＯＡＤ（商標）の内部からの外部光線を遮断し、生物発光または分析対象のサンプルから発光された他の光線の高感受性検出を可能にする。リッド１２２０は、ステージ１２３０を示すために開かれている。ＧＲＡＢＢＥＲ（商標）スライド（下記参照）もしくはマイクロタイターウエル装置を含むがそれらに限定されないイメージングできる装置は、ステージ１２３０の上部に配置できる。ステージの下方には、ＣＣＤ（電荷結合素子）チップまたは他の光センサ（図示していない）の上部に載っている単一集束レンズがある（図示していない）。スライドもしくはマイクロタイターウエルは、ステージ１２３０の上部の対応する形状の凹所とアライメントさせるステップによってステージ１２３０の上に配置できる。ケーシング１２１０は、ＴＯＡＤ（商標）の移動を容易にするための凹所、ハンドルもしくは他の機能を含むことができる。
【００６１】
図１３は、ＴＯＡＤ（商標）の典型的実施形態の略図を示し、ケーシング１３１０の本体は内部構成要素を示すために移動させられている。リッド１３２０は、イメージング装置１３５０の上部に配置されたＣＣＤチップの上方にスライド、マイクロタイターウエルまたは他の装置を配置するために使用されるステージ１３３０の上に重なる。非限定的実施例では、イメージング装置１３５０は、ＱＩＣＡＭ  １０ビットのモノクロ冷却ＣＣＤカメラ（Ｑｉｍａｇｉｎｇ（商標）、Ｂｕｒｎａｂｙ，Ｂ．Ｃ．、カナダ国、製品番号ＱＩＣ−Ｍ−１０−Ｃ）である。しかし、ＴＯＡＤ（商標）は典型的実施形態には限定されず、他の知られているタイプのイメージング装置１３５０を利用できることが企図されている。単集束レンズ（図示していない）はＣＣＤチップとステージ１３３０との間に挿入され、例えば、Ｃ−マウントアダプタを用いて、イメージング装置１３５０の上部に取り付けることができる。
【００６２】
典型的な実施形態では、イメージング装置１３５０は、ＣＣＤチップに加えて、ＣＣＤチップを取り囲んでいるペルチエ（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ）型熱交換素子を含有する。イメージング装置１３５０の残りは、６ピンファイアワイヤコネクタなどの電源装置への連結部、ソフトウエアインターフェースおよび外部データポートと一緒に、ＣＣＤチップによって検出されるシグナルを処理するための電子部品を含有する。ペルチエ型熱交換器は、ＣＣＤカメラ１３５０から熱を取り除き、それをケーシング１３１０の内側へ放出する。ＴＯＡＤ（商標）が過熱するのを防止するために、単独ファン駆動式冷却装置１３４０は、イメージング装置１３５０の上部に隣接して配置される。冷却装置１３４０は、高温空気をケーシングからケーシング１３１０の背部（図示していない）で遮光性ベントを通して排出し、ケーシング１３１０の内部に通して冷却空気を循環させる。標準作動中、冷却装置１３４０は、ＣＣＤカメラ１３５０を過熱させずに持続的に作動させるために十分効率的に機能する。ＣＣＤカメラ１３５０の過熱は、バックグラウンド雑音の実質的増加を生じさせ、ＣＣＤチップの光学視野を通しての見かけの光検出のランダムバーストを生じさせる。
【００６３】
イメージング装置１３５０は、ステージ１３３０に比較してイメージング装置１３５０を正位置に保持するベース１３６０の上部にのっている。ベース１３６０の底部は、イメージング装置１３５０の底部のオンオフスイッチ、および電源装置（例えば、１１０ボルトのＡＣ電気コード）、ファイアワイヤおよび任意の他の外部連結部にアクセスできるように開いている。
【００６４】
図１４は、ＴＯＡＤ（商標）の典型的実施形態の上面図を示している略図であり、ステージ１４２０の上面を示すためにケーシング１４１０は取り外されている。ステージ１４２０の上部には、スライド、マイクロタイターウエルまたはＣＣＤチップの上方の他の装置のポジショニングを可能にするように配列されたくぼみ１４３０、１４４０が示されている。ステージ１４２０の中心にある穴１４６０は、スライド、マイクロタイターウエルまたは他の装置を通る光線透過および下にあるＣＣＤチップ１４５０による検出を許容する。当業者には、以下でより詳細に考察するように、透明性もしくは透過性装置の使用は、光学的に読み取る装置の下方に配置された光学検出器を備えるＴＯＡＤ（商標）装置の使用を促進することは明白である。
【００６５】
上記で考察した典型的実施形態は、以下に開示するルミノール系などの例えば任意の知られている化学発光もしくは生物発光検出系を用いて、自然に発光するサンプルを用いて光学検出するために設計されている。この場合には、結合した分析物を検出するためには励起光の外部光源は必要とされない。当業者は、標的分析物に結合する蛍光標識検出分子などの代替系を利用できることを明確に理解する。そのような系は、当分野において周知である。蛍光検出系の使用は、励起光源（例えば、レーザー、光ダイオードアレイなど）、励起光線から光検出器をスクリーニングするためのカットオフフィルタ、および蛍光検出系のための他のそのような公知の構成要素などの追加の構成要素を必要とする。上記で考察した具体的実施形態は、最小のバックグラウンド雑音で構造および使用の単純性、低コスト、および標的分析物の高感受性検出という長所を有する。
【００６６】
＜スライド＞
所定の実施形態では、光学検出は、チップ、マトリックスアレイおよび／または、病原体および／またはマーカー分子を検出するための結合表面としての顕微鏡スライドなどのスライドと組み合わせて使用できる。様々なスライド基質は、以下で考察するように知られている。
【００６７】
＜伝統的な透過性スライド＞
ガラスもしくはプラスチック製顕微鏡スライドは、一般にマイクロアレイ分析のための固体マトリックス支持体として使用されてきた。プローブ分子は、架橋化合物を用いてガラスもしくはプラスチック表面に付着させられている（例えば、Ｓｃｈｅｎａ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，６４８  ｐｐ．，２００２を参照）。プローブは、スポットの２Ｄアレイとして印刷できる。多数の相違する種類の架橋剤は、プローブ機能性に影響を及ぼさずに表面へ架橋結合（例えば、標的分子結合）させることのできるプローブ分子上で利用できる反応性部分（例えば、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシル、フェニル、ヒドロキシル、アルデヒドなど）のタイプに依存して知られている。
【００６８】
プローブ付着のための以前の方法についての問題は、付着能力が限定されることである。孔径が増加するにつれて、予想される標的分子のために可能性のある結合部位の数は一般に減少する。プローブのための結合部位が検出閾値より下方のレベルで飽和している場合は、たとえプローブと標的分子との間で結合が発生している場合でさえシグナルは観察されない。
【００６９】
アビジンコーティングスライドおよびビオチンコンジュゲート化プローブ分子を用いてガラス表面にプローブを付着させることが試みられてきた。または、アミノシランもしくは３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランなどのシラン類がグラス表面上にコーティングされ、シラン部分はガラスに付着し、反応部分はプローブ分子に架橋している。その他のアプローチは、ガラス表面へそれを永続的に付着させるために、プローブ分子との共有結合を形成できる官能性アルデヒド、カルボキシル、エポキシ、またはアミン基との反応性基質でコーティングされたスライドを利用してきた。
【００７０】
これらの方法は小さなプローブ分子のためには中等度に良好に機能するが、官能性（結合）がプローブの方向付け、柔軟性および架橋度に左右されるより大きなプローブ分子（例えば、抗体）のためには不良にしか機能しない傾向がある。共有結合方法は、さらにまたマトリックス表面へ極めて少しの物質しか結合させない傾向もある。結果として、プローブ濃度は低く、シグナル検出は困難である。２Ｄアレイの表面上では相当に少量のプローブしか利用できないので、そのような系はプローブと標的との間の陽性結合反応について低い信号対雑音比を示す。
【００７１】
タンパク質もしくはペプチド標的分子は、捕捉分子として抗体を用いることによって検出されることが多い。臨床診断またはプロテオミクスにおいて使用される二次元アレイは、タンパク質またはペプチド標的分子のためのプローブとして頻回に抗体を利用する。抗体はそれらの標的抗原に対して高度に特異的である傾向を示すが、それらは架橋剤および標準方法を用いてはガラスまたはプラスチック表面に容易に付着させられない。これは、標的結合すると弱いシグナルを生じさせる、知られている化学を用いてマトリックスへ付着させることのできる限定された量の物質であるからである。また別の問題は、抗体特異的結合は、適正な水化およびマトリックス内の支持体を用いずには維持できないことである。そこで、抗体結合固体マトリックスアレイの長期安定性は、アレイの年齢に依存して入手される矛盾しない結果とともに、限定される傾向を示す。
【００７２】
この問題は、タンパク質を安定化させてその機能的プローブ特徴を保持する環境を作り出すことによって解決することが試みられてきた。例えば、Ｐｒｏｌｉｎｘ社（ワシントン州ボセル）は、それらの表面に付着させられたポリマーブラシフォーマットを備える標準ガラススライドを用いる化学親和性システムを開発した。このシステムは、安定性の複合体を形成する２つの合成小分子であるフェニルジボロン酸（ＰＤＢＡ）およびサリチルヒドロキサム酸（ＳＨＡ）間の相互作用に基づいている（例えば、Ｓｔｏｌｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１２：２２９−２３９，２００１を参照）。ＰＤＢＡは、最初にタンパク質プローブとコンジュゲートされる。コンジュゲートプローブは、次に３Ｄ機能的アレイを形成するためにポリマーブラシへ付着したＳＨＡに連結する。この方法は、表面に結合できる抗体の量によって限定される。より重要にも、標的抗原は、マトリックスに付着した抗体と反応するためにブラシ境界を通して拡散するために十分に小さくなければならない。そのような方法は、全細胞または細菌などの大きな標的を同定および／または定量するためには適合しない。
【００７３】
＜不透明スライド＞
マトリックスアレイに付着したプローブの量を安定化かつ増加させる方法は、高度に望ましい。そのような方法は、一般に不透明スライドを生じさせるが、これはプローブ結合を増加させて安定性を維持するために使用されるマトリックス物質が、典型的には非透過性ゲル、ヒドロゲル、寒天、およびその他のガラス表面上にコーティングされた物質を含むからである。そのような不透明マトリックス材料に取り付けられたタンパク質は、三次元アレイ内での疎水性および静電性相互反応によって安定化させられる。
【００７４】
ゲノムおよびプロテオミクスマイクロアレイにおいて現在使用されている大多数のスキャナは、不透明マトリックスアレイを用いて、結合プローブおよび標的分子と同側からスライドを読み取る。マイクロアレイを生成するために使用される不透明マトリックスコーティング物質には、ナイロン、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）およびニトロセルロースが含まれる。５０年以上にわたって使用されている伝統的なポリマー基質であるニトロセルロースは、マイクロアレイ適用のために極めて魅力的な特性を備える基質である（例えば、Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｌｌｍａｎ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７：ｃ１−１２，２００２）。
【００７５】
不透明ニトロセルロースは、生体分子分析のためにタンパク質および核酸を固定化するために広範囲に使用されてきた。ニトロセルロースはほぼ定量的方法で当該の分子を固定化し、短期および長期貯蔵を可能にする。ニトロセルロースは、さらにまた液相標的種が固定化された捕捉分子へ効率的に結合することを可能にする。ＥＬＩＳＡ法を用いる診断装置は、捕捉試薬を膜へ結合させるためにラテラルフロー・プロセスとともにニトロセルロース膜を使用してきた（Ｊｏｎｅｓ，ＩＶＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５（２）：３２，１９９９）。
【００７６】
伝統的な不透明膜物質は、多数の魅力的な特徴を有する。それらは構築するのが安価であり、リンカーコーティングガラススライドによって結合できる１００倍以上の量のタンパク質に結合し、一般に容易に機能する。これは、特に長い使用歴を有する不透明のニトロセルロース膜について当てはまる。
【００７７】
ニトロセルロースは、通常は、不透明な表面を形成するためにガラススライドの表面に適用できるマイクロポーラス形で生成される。次に、プローブは標準ニトロセルロース結合法を用いて、マイクロアレイ内の不透明ニトロセルロース膜に付着させることができる。そのようなスライドは、放射、蛍光および化学発光検出系とともに使用されてきた（例えば、Ｂｒｕｓｈ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １４［９］：２１，２０００）。
【００７８】
伝統的なニトロセルロース膜はさらにまた支持構造もしくは基礎の不存在下では極めて脆性であり、頻回なクラッキングまたは断片化を引き起こす。この理由から、不透明ニトロセルロースは、プラスチックシートに結合したマイクロポーラス形で使用されてきた。そのようなシートは、マイクロポーラス形のために常に不透明であり、取り扱い中の損傷を回避するために支持構造（例えば、酢酸塩またはセルロース）を必要とする。
【００７９】
＜透過性ニトロセルローススライド＞
本明細書に開示した方法および組成物は、スライドの底部（非結合）側に配列された検出器の使用を可能にしながら、不透明のニトロセルロース膜の有益な結合特性を保持するコロイド状ニトロセルロースの透過性表面コーティングを生成するために使用できる。プローブと標的分子との相互作用は、透過性ニトロセルロース固体マトリックス上で直接的に観察できる。
【００８０】
一部の実施形態では、透過性ニトロセルロースマトリックスアレイを使用できる。そのような実施形態では、透過性ニトロセルロースマトリックスは、ガラスまたはプラスチックスライド（例えば、ナイロン）の片側に付着させることができる。プローブはニトロセルロースに付着させることができ、プローブと標的分子との相互作用はセンサまたはカメラを用いてスライドを通して観察できる。
【００８１】
ニトロセルロース物質は、本明細書に開示した方法によって形成した場合は、完全に透過性（すなわち、透明性）である。そこで光シグナルは、不透明物質からの散乱または干渉を伴わずに観察することができる。これは、不透明のマイクロポーラス形ニトロセルロースマトリックスアレイと比較して、より大きな信号対雑音比および標的分子の容易な検出を可能にする。そのような不透明のマトリックスアレイは、標的分子が結合すると生成される光線もしくは反応インジケータ種（例えば、生物発光化合物）の部分を覆い隠すことができる。
【００８２】
酢酸アミル溶媒中のコロイドの形状にあるニトロセルロースは、標本のための鋳造物を形成するために電子顕微鏡技師によって使用されてきた。コロイド状ニトロセルロースは、水面上に極薄フィルムとして鋳造するステップによって形成される。次に、フィルムは透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）グリッド上に取り上げられ、ＴＥＭ標本のための支持体フィルムとして使用できる。フィルムは極めて清潔かつ一様でなければならないので、その製造においては大きな注意が払われなければならない。コロイド状ニトロセルロースは、酢酸アミル中に容易に溶解性である。酢酸アミルは、水溶性であり、均一に蒸発して均質なフィルムを形成する。これは、極めて純粋なニトロセルロースの１％溶液として供給される。
【００８３】
ＥＭグレードの酢酸アミル（コロジオン）中の高純度ニトロセルロースは、市販の入手起源から購入できる。酢酸アミルは、全水分を除去するために酸化カルシウムの上方で還流させるステップによって精製される。可溶性および懸濁化物質は、緩徐な蒸留によって除去される。溶媒からの微量の全水分の除去は、実質的に穴を備えていない極めて強力なコロイド状ニトロセルロースフィルムの形成を許容する。
【００８４】
典型的な実施形態では、コロジオンはＥｒｎｅｓｔ  Ｆ  Ｆｕｌｌａｍ社（ニューヨーク州ラザム）からバルクで入手され、高品質透過性ニトロセルロースマトリックスアレイを製造するために使用された。１％のコロジオン溶液の２００μＬアリコートを新しく洗浄した標準２５×７５ｍｍのガラススライドの表面上にピペットで移した。コロジオンは粉塵を含まない領域内のガラススライド表面の辺縁まで均一に広げた。室温で２時間乾燥させた後、スライドを約６０℃でさらに１時間以上加熱した。乾燥させたスライドに標識し、マイクロアレイを製造するために貯蔵した。
【００８５】
ガラスアレイ表面を使用する場合は、各スライドの辺縁は、水溶液へ曝露させると極薄ニトロセルロース基質がガラスから離れるのを防止するためにラッカー（例えば、マニキュア液）または他の接着剤を用いてシールした。コロイド状ニトロセルロースがナイロンスライド、酢酸塩フィルムまたは他のプラスチック表面に適用される場合は、接着剤を必要とせず、しっかりと結合する。スライドは、酢酸アミルが表面と反応してそれを変色させたり、またはその特性を変化させたりしない限り、ほぼ任意の透過性物質から構成されてよい。所定のタイプのプラスチックは、酢酸アミルに曝露させられると不透明になるので、その溶媒系とともに使用するためには適合しない。また別の実施形態では、コロイド状ニトロセルロースは、ナイロン、ガラスまたは他の透過性スライドに適用する前に酢酸アミル以外の他の揮発性有機溶媒中に懸濁させることができる。
【００８６】
透過性ニトロセルロース表面の長所は、プローブ結合反応の進行をスライドの透過性の下面を通して確認することによって試験できることである。これは、より効果的なプローブ結合が発生することを可能にする。プローブ−標的結合反応の進行は、さらにスライドの下面を通してリアルタイムで監視することもできる。
【００８７】
＜ＧＲＡＢＢＥＲ（商標）スライド＞
所定の実施形態は、透明性コーティングスライド、例えば上記に開示したように調製したＧＲＡＢＢＥＲ（商標）の装置および使用方法に関する。ＧＲＡＢＢＥＲ（商標）は、スライドの表面上でアッセイされた溶液中の１つまたは複数の当該標的を検出および同定するための容易な使用方法を提供する。即時に試験する準備が整っている、付着した捕捉プローブ（例えば、抗体）が事前にスポットされたスライドを提供できる。または、それらの独自の２Ｄスポットしたアレイを調製したいと望む使用者は、１時間で試験のための手動アレイを調製できる。
【００８８】
所定の好ましい実施形態では、検出方法は、一次抗体を利用して、ビオチン化もしくはさもなければ標識されている二次抗体との免疫複合体を形成するために抗原標的を捕捉する。一次抗体プローブは、透明性ニトロセルロースコーティングスライド（ＧＲＡＢＢＥＲ（商標））へ付着させられ、全手順中はスライドの表面に付着されたままである。
【００８９】
形成される場合は、免疫複合体は、周知の酵素活性化生物発光プロセスを用いて検出できる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、過酸化物の崩壊を触媒し、崩壊プロセス中にルミノールが溶液に加えられると強度の光線を生成する。ルミノールは、４３０ｎｍで光子の放出を生じさせる不安定性フリーラジカル中間体を形成する。ストレプトアビジン（ＳＡ）へＨＲＰをコンジュゲートさせることによって、免疫複合体は、適切かつ感受性光子検出器を用いて検出することができる。ビオチンおよびストレプトアビジンは、迅速に結合してこの光線生成複合体を形成する。
【００９０】
典型的なタンパク質（例えば、抗体）プローブは、０．０５〜０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で１スポット当たり１〜５ｎＬの液体でスポットできる。一次抗体がスライド、マトリックスアレイまたは他の表面に付着させられる場合は、ビオニチル化抗体などの二次タグ付け抗体は、事前にスポットしたスライドによる標的検出のための最適化濃度で事前に混合された希釈バッファ中で提供することができる。最適化濃度は、使用者が経験によって決定できる。二次抗体は、希釈バッファ中で典型的には５〜３０μｇ／ｍＬの範囲内の濃度へ希釈できる。
【００９１】
ＴＯＡＤ（商標）（全光学アッセイ装置）には、使用者がスライドの表面のシグナルを読み取り、解釈し、そして記録することを可能にするソフトウエアを用意することができる。イメージファイルおよびレポートは、その後の分析および比較のために保存またはプリントすることができる。
【００９２】
ＧＲＡＢＢＥＲ（商標）は、結合した分子の機能性および３Ｄ構造を保持しながらコーティングされた表面にそれらを強力に付着させる、しっかりとかつ即時にタンパク質、炭水化物および／またはオリゴヌクレオチドに結合する透明性ニトロセルロース基質（例えば、２００３年２月２４日に提出された米国特許出願第１０／３７３，５４６号を参照）でコーティングできる。プローブをスライド表面へ付着させるためには他の化学プロセスは必要としないので、２Ｄアレイ法を単純かつ高速にする。優れた接触角を備える疎水性表面は、緻密なロボット印刷アレイのために特に適合する。
【００９３】
生物発光反応は長期持続性であり、シグナルは長期間にわたって獲得できるので、検出において特別な感受性を可能にする。単一サンプル中で多数の標的を同時に同定できる。適正な一次プローブ抗体およびビオチン化二次抗体は、適正に検出するために標的と強度に相互作用するはずである。事前に印刷されたスライドおよび提供された試薬は、高品質検出を生じさせるために最適化される。当業者は、透明性でコーティングされたスライドが標的結合を検出するための単に１つの好ましい代替物であること、そして以下で考察する磁気ビーズなどの他の代替物を光学検出系とともに使用できることを明確に理解する。
【００９４】
＜再構成可能なマイクロアレイ＞
所定の実施形態では、固体マトリックスの表面に結合したアプタマーもしくはアフィボディなどの小さなリンカー分子を用いることによって再構成可能なマイクロアレイを製造できる。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（例えば、Ｂｒｏｄｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７４：５−１３，２０００）と呼ばれるインビトロ進化的プロセスによって引き出されるオリゴヌクレオチドである。アプタマーは、知られている方法（例えば、米国特許第５，２７０，１６３号；第５，５６７，５８８号；第５，６７０，６３７号；第５，６９６，２４９号；第５，８４３，６５３号）によって製造できる、または市販入手源（例えば、Ｓｏｍａｌｏｇｉｃ、コロラド州ボールダー）から入手できる。アプタマーは、約７〜５０ｋＤａの相当に小さな分子である。それらは小さく、安定性であり、タンパク質ほど容易に損傷しないので、それらは固体マトリックスの表面へ多数が結合できる。これはアレイの表面上のプローブ反応部位の数を効果的に増幅させる。
【００９５】
Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）リガンド（米国特許出願第５，８３１，０１２号）は、アプタマーと同様に設計および使用できる高度に特異的な親和性タンパク質である。アフィボディは、製造できる、または市販起源（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢ、スウェーデン国ブローマ）から購入できる。アプタマーおよびアフィボディは、プローブ分子結合のための透明性もしくは非透明性固体マトリックスの機能的アビディティを増加させるために抗体と組み合わせて使用できる。増加した結合は、順にシグナル強度の増加、より大きな信号対雑音比、より再現性の標的分子検出およびより大きな検出感受性を生じさせる。
【００９６】
再構成可能なマイクロアレイは、２つの抗体と捕捉プローブと組み合わせて使用できる。捕捉プローブは、アフィボディ、アプタマー、または複数の抗体のうちの１つに結合できる任意の他のプローブであってよい。両方の抗体は、標的細胞、分子、または抗原に選択的に結合するはずである。
【００９７】
結合の有効性は、捕捉プローブがＩｇＧクラスに特徴的な抗体の一部分に結合する場合は増加する。そのようなプローブは、抗体−標的複合体と反応して結合するために抗体構造の小さな部分が存在することしか必要としない。微生物もしくは細胞などのより大きな標的は、抗体と極めて大きな複合体を形成できる多数の抗原で被覆される。しかし、短縮ＩｇＧ抗体フラグメントはそのような大きな標的と相互作用し、それでもスライド表面上でアプタマーもしくはアフィボディプローブに結合できる。
【００９８】
所定の実施形態では、２つの抗体が溶液中の標的に結合させられる。標的−抗体複合体が形成されると、その複合体は、再構成可能なマトリックスアレイ上でアプタマーまたはアフィボディプローブ分子に曝露させることができる。プローブは一次抗体に結合することができるが、二次抗体は生物発光タグまたは他のマーカーにコンジュゲートすることができる。次にタグ付き複合体は、光学検出または任意の他の知られている検出方法を用いて、マトリックスの表面上で検出できる。
【００９９】
例えば、アプタマーはマウスＩｇＧのＦｃ部分へ高親和性で特異的に結合するように特別仕立てすることができる。当該の標的分子を含有するサンプルは、当該の抗原に対して特異的なマウス抗体と溶液中で相互作用させることができる。このサンプルは、同一抗原上の相違するエピトープへ結合する、相違するビオチン化、さもなければタグ付け二次（非マウス）抗体と混合される。一次および二次抗体へ結合した標的抗原は、アプタマーマイクロアレイに曝露させられる。抗マウスアプタマーは、複合体を固体マトリックスへ付着させる。未結合タグ付き抗体を除去するための広範囲の洗浄後、マトリックスアレイ表面に取り付けられているタグ付き抗体を含有する複合体が検出される。
【０１００】
当業者は、このスキームの多数の変形を使用できることを明確に理解する。例えば、また別の実施形態では、一次抗体を多数のタグ付き二次抗体と結び付けて使用できるが、それらは各々標的分子の相違するエピトープに結合する。これは、例えば、利用できる二次抗体がポリクローナル抗体である場合に発生することがある。または、同一抗原に対する親和性を備える２つ以上の二次抗体は、検出の感受性を改良できる。さらにまた別の実施形態では、１つの二次抗体は１クラスの標的（例えば、全大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））に結合することができ、他方では二次抗体は特異的サブクラス（例えば、大腸菌株Ｏ１５７：Ｈ７）に結合する。
【０１０１】
非限定的な実施例では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を検出するために、ＩｇＧマウス抗リステリアｍ．抗体を適切な濃度（典型的には１〜５０μｇ／ｍＬ）で当該の食品サンプルと一緒にインキュベートしてよい。ウサギ（または他の非マウス）ビオチン化二次抗リステリアｍ．抗体（１〜５０μｇ／ｍＬ）を加え、５〜３０分間インキュベートしてよい。次に両方の抗体を備えるサンプルは、抗マウスＩｇＧアプタマーを含有するアレイに適用してよい。短時間の間隔（約１５分間）後、アレイを洗浄すると、リステリアｍ．と複合化したマウスＩｇＧおよびウサギビオチン化抗体だけがアレイ上に維持される。次に表面上に適用されたＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンもしくは他のインジケータの溶液は、表面上に付着した抗リステリアｍ．抗体複合体の存在または不存在を解明することができる。
【０１０２】
＜磁気ビーズ＞
所定の実施形態では、当該のプローブ、抗原または他のリガンドは、標的結合を分離および／または検出するために磁気ビーズに付着させることができる。磁気ビーズとともに使用するためのプロトコルの追加の詳細は、以下の実施例のセクションにおいて開示する。好ましい実施形態では、ビーズに付着したプローブ、抗原または他のリガンドは、例えば抗体、抗体フラグメント、抗体結合タンパク質（例えば、プロテインＡ）または標的抗原などのタンパク質またはペプチドであってよい。分子を磁気ビーズもしくはマグネタイト基質へ結合させるためのプロセスは、当分野において、すなわち米国特許出願第４，６９５，３９３号、第３，９７０，５１８号、第４，２３０，６８５号、および第４，６７７，０５５号において周知である。結合は、共有または非共有のいずれであってもよい。ＥＤＣ、ジニトロベンゼン、ビスイミデート、スベリン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチル−３，３’−ジチオ−ビスプロピオンイミデート、４−（ブロモアミノエチル）−２−ニトロフェニルアジド、酒石酸ジスクシンイミジルおよびアジドグリオキサルを含む多数の潜在的化学架橋剤は、当分野において周知である。
【０１０３】
使用される磁気粒子は様々なサイズがあることは想定されている。大きな磁気粒子（溶液中の平均径が１０μｍ超）は弱い磁場および傾斜磁場に反応できるが、それらはすぐに沈殿する傾向を示すので、均質な状態を必要とする反応のためには有用性を限定する。大きな粒子はさらに、重量当たり表面積が小さな粒子よりも限定されるので、それらに結合できる物質が少なくなる。好ましい実施形態では、磁気ビーズは径が１０μｍ未満である。
【０１０４】
強磁性物質は、一般に磁場に反応して永久的に磁化される。「超常磁性」と呼ばれる物質は、傾斜磁場において力を受けるが、永久的には磁化されない。酸化鉄磁性体の結晶は、結晶のサイズに依存して、強磁性または超常磁性のどちらかの可能性がある。鉄の酸化鉄超常磁性体は、一般に、結晶の直径が約３００オングストローム（Å）未満である場合に生じる；大きな結晶は、一般に強磁性の特性を有する。
【０１０５】
分散性の酸化鉄磁性体粒子は、報告によれば３００Åの径を有し、表面アミン基は、米国特許出願第４，２６７，２３４号にしたがってポリエチレンイミンの存在下で塩化第一鉄および塩化第二鉄（Ｆｅ2+／Ｆｅ3+＝１）の塩基沈降によって調製される。これらの粒子は調製中に磁場へ３回曝露させられ、再分散性であると記載されている。磁気粒子は、０．１μｍと報告された径を備える磁気ポリグルタルアルデヒドミクロスフェアを形成するためにグルタルアルデヒド懸濁重合系と混合される。ポリグルタルアルデヒドミクロスフェアは、タンパク質などのアミノ含有分子への結合を形成できる表面上のコンジュゲート化アルデヒド基を有する。
【０１０６】
本明細書に開示した方法には様々な粒径を適用できることは想定されているが、好ましい実施形態では、粒子の径は約０．１〜約１．５μｍである。この範囲内にある平均径を備える粒子は、生物親和性吸着結合のための高い能力を提供する、約１００〜１５０ｍ2／ｇｍという大きさの表面積を備えて製造できる。このサイズ範囲の磁気粒子は、大きな粒子の高速沈殿問題を克服するが、小さな粒子を分離するために必要とされる磁場および傾斜磁場を生成するための大きな磁石の必要を回避する。磁気粒子を分離するために使用される磁石は、約１００〜約１，０００エルステッドの磁場を生成できればよい。そのような磁場は、好ましくは磁気粒子の分散を保持する容器より小さい永久磁石を用いて入手できるので、ベンチトップ使用のために適合する可能性がある。強磁性粒子は本発明の所定の適用において有用な可能性があるが、超常磁性粒子は強磁性粒子に関連する磁気凝集を示さず、再分散および再使用を許容するので、超常磁性挙動を備える粒子が通常は好ましい。好ましい実施形態では、１対の球状磁石を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブなどの容器に並列させることができ、チューブの側面上に磁気ビーズを収集するために使用できる。球状磁石の使用は、溶液からの磁気ビーズの分離を促進する、より強度の限局性磁場を提供する。
【０１０７】
磁気粒子を調製する方法は、微細な磁気金属酸化物結晶を形成するために塩基中に金属塩を沈降させるステップと、再分散させるステップと、水中および電解液中で結晶を洗浄するステップとを含むことができる。磁気分離は、結晶が超常磁性である場合は洗浄間で結晶を収集するために使用できる。次に結晶は、金属酸化物に吸着的もしくは共有的に結合できる、およびタンパク質もしくは他のリガンドと結合するための官能基を有する物質でコーティングすることができる。例えばＤｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（米国ウィスコンシン州ブラウンディア）のような磁気ビーズの市販入手源も当分野において知られ、使用できる。
【０１０８】
＜イメージングカセットのハニカムアルミニウムコア＞
典型的な実施形態では、イメージングハニカム・センターセルカセットは、上記で考察したＴＯＡＤ（商標）などの光学イメージャ上でイメージングして視感度を測定するためのディスポーザブル器具である。これは、ＣＣＤカメラへのカセットの適正な方向付けを提供するためにステージ上の２本のロッキングピンによって適所に配置かつ保持される。カセットの下面（底部）は、ハニカムアルミニウムコアへ取り付けられた光学的に透明な窓である。カセットの不透明上面（トップ）は、ハニカム内に個別セルを充填するためのテンプレートを形成するためにマーキングされる。ハニカムの上面に取り付けられたその内面は高度に反射性であり、さもなければ検出を免れた光子をセンサへ送り返す。センターセル５５型カセットは、ワンパスで計５５までのサンプルを処理できる。しかし、本明細書で請求した主題の範囲内で相違する立体配置およびセル数を利用できることは明白である。
【０１０９】
カセットを構築するステップは、スキンを適正なサイズに切断するステップとおよそ２．７５×２．７５インチ平方のサイズの正方形にアルミニウムハニカムをパターンカットするステップを含む。底部透明層は、それがアルミニウムハニカムに付着させられる前に穿孔されたロッキングホールを用いてダイカットされる（図１９を参照）。セルを充填するためにオペレータにガイダンスを提供する上方スキンテンプレートは、最終ステップにおいて付着させられる。
【０１１０】
下方スキンをハニカムへ付着させるステップは、接着剤（例えば、活性化ガラスファイバー樹脂）を最初にハニカムの下面に提供するステップと、および次に光学窓を汚すことを回避するための注意を払いながら、結合するために下方スキン上にハニカムを配置させるステップとによって実施すべきである。酢酸塩へのアルミニウムの確実な結合は、浅い樹脂製トレイ内に浸漬したハニカムの下縁を軽度にコーティングするステップと、酢酸塩上に重みづけを伴わずに平穏に静止させるステップによって、ガラスファイバー樹脂および触媒を用いて容易に実行した。
【０１１１】
アルミニウムハニカムは、水平カットはセルだけを二等分し、垂直カットは直線でセルおよびノードを二等分することを認識して、以下に示すように必要とされるパターンに注意を払って生成物を照明するための視覚的グレードのセル５．２密度の非穿孔コアであり０．２５０’’×４８’’×９６’’１／４インチのストックから切り取ることができる。カット公差要件は、各カットの全長に対して開始して１／４セル行または垂直列内にとどまることである。
【０１１２】
＜上方および下方スキン＞
好ましい実施形態では、下方スキンは、標準Ａｖｅｒｙラベル５１９６と正確に同一サイズの２．６４×２．６４インチの正方形の型抜きポリエステル製透明７ミルシート材である。上方スキンは、同様に標準Ａｖｅｒｙラベル５１９６のサイズに型抜きされたサイズが同様に２．６４×２．６４インチの正方形であるアルミニウムハニカムへ付着させられたホイル張り裏面を備えるタグストックである。上面は、テンプレートパターンが印刷されている、またはＡｖｅｒｙ  ５１９６印刷ラベルが付着させられている。テンプレートホールは、ピペットチップを上方スキンに通して容易に通過させて内容物をセルへ分注できるように、ホイルへＫＩＳＳ穿孔される。
【０１１３】
＜接着性結合剤＞
使用できる可能性のある数種の接着剤がある。ポリエステルまたはエポキシ樹脂はどちらも良好に機能するはずである。結合要件は最小であるので、エポキシ樹脂により与えられるより高度の強度は不要と思われる。ポリエステル樹脂は、良好に使用されてきた。この樹脂は、硬化するにつれてポリエステルシート上に流れ込む樹脂が少なくなるように、硬化時間中の樹脂の濃度を高くするために粉末充填剤と混合すべきである。アルミニウム粉末は、さらに接着剤を完全に不透明にさせ、１つのセルから次のセルへの光線交差汚染（ドア下漏出）を最小限に抑えるので、推奨されている。
【０１１４】
＜材料のリスト＞
１カセット当たりの材料および寸法の典型的なリストは、ハニカムについてのおおよその寸法とともに表１に示されている。ハニカムパターンカットは、最終組立体がセル窓をカメラの上方で中心に配置するために、正確な寸法よりも重要である。当業者は、また別の寸法を使用できることを明確に理解する。
【０１１５】
【表１】
2008522198.tif 000003
【０１１６】
スキンのレイアウトおよびカット、アルミニウムハニカム、ならびにロッキングホールを用いたハニカムのポジショニングに関する追加の詳細は、以下で考察する典型的図面に提供されている。典型的な実施形態では、ロッキングホールは、図２２に示したアライメントを用いて透明スキンがハニカムに付着させられる前に事前に穿孔されていることに留意されたい。キーセルは、光学アパーチャの上方で中心となるようにアライメントされる。好ましい実施形態では、全ハニカムセル構造は、キー（中央）セルを光学アパーチャの上方の中心において、同時に光学的に検出できる。
【０１１７】
＜セルの番号付けおよび立体配置：＞
カセットに付着させた不透明の上方テンプレートは、オペレータへウエル内にサンプルを装填するための視覚ガイドを提供する。カセット内の各セルはアドレスを有する。アドレスは、行および行内の番号（図２０を参照）によるが、また別の番号付けスキームも使用できる。
【０１１８】
例示した典型的な実施形態では、９つの行がＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＩと指定され、行内の各セルの位置の番号は、図２０に示されている。例えば、中心に置かれたセルのアドレスはＥ４である。オペレータへセルにサンプルを装填することを指示する装填テンプレートは、カセットの上面に印刷することができ、イメージングの前に取り除かれる（図２３を参照）。
【０１１９】
＜装填テンプレートの寸法：＞
典型的な実施形態では、装填のための上方テンプレートは標準Ａｖｅｒｙラベル５１９６と同一サイズであり、２．６４インチ平方でり、８．５×１１インチのプレカットタグストックのシート内に９つのテンプレートが印刷されている。テンプレート上には５５のセルアクセスポートが存在する。アクセスポートは、行およびサンプルのための番号によって番号付けされ、同定される。
【０１２０】
ポート位置は、表２に５５セルの実施形態について示されている。測定は、テンプレートの左縁（上左隅にあるインジケータ）からポートの中心へ水平に、そしてテンプレート縁（０インチ）から始めて上部から底部へ垂直に行なわれる。センターセルの水平位置（Ｅｈ４）に対する座標は１．３２インチであり、垂直位置（Ｅｖ４）は１．３２インチである。
【０１２１】
【表２】
2008522198.tif 000004
【０１２２】
＜アルミニウムコア上のカットパターン＞
アルミニウムコア材料の大きなシートについての典型的なカッティングパターンは、図２１に示したとおりである。シートからカットされた約２．７５×２．７５インチの寸法の各正方形は、図２３に示したセル構造を完全に有していなければならない。これらのセルを越える辺縁は、トリミングしたり研磨したりする必要はない。それらはきれいにカットしなければならず、微粒子物質や研磨剤が付着していてはならない（きれいに洗浄する）。
【０１２３】
目的を達成するためのカットパターンの詳細な拡大図は図２２に、シート全体については図２１に示されている。コアアルミニウムからカットされた正方形は、輸送中損傷することがないように注意深く包装された箱の中にプラスチックバッグに入れて清潔に、チリや粒子状物質が付着していない状態で供給されなければならない。
【０１２４】
＜イメージセンシングおよびデータ分析＞
様々な実施形態では、例えば、実施例１に例示したように、化学発光標的−リガンド複合体によって放出された光シグナルの分析によって陽性アッセイ結果を検出することができる。光シグナルを検出および分析するための様々な方法および装置は、当分野において知られ、本明細書で請求する方法で使用できる。例えば、相補的金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサはデジタルカメラ内で使用され、様々な分析機器においてますます多く見出されるようになっている。ＣＭＯＳイメージセンサは品質が改良され、低レベルスペクトル画像を検出するために電荷結合素子（ＣＣＤ）に挑戦して取って代わりつつある。
【０１２５】
現在の大多数の光検出器は、標的に向けて二次元アレイの感受性光ダイオードを提示することによってスペクトルシグナルを捕捉するように設計されている。光ダイオードは、光線に曝露させられると電流を発生するように設計され、結果として生じる電流は様々な方法で分析できる。現代のセンサは、アナログの光ダイオードシグナルをデジタルのシグナルフォーマットへ変換するので、これは後の分析のために保存かつ処理することができる。適切な抗原、光学系、イメージセンサ、およびコンピュータを用いると、高分解能デジタル画像を１ピクセル毎に生成できる。そのようなシステムを用いると、モノクロまたはカラーフォーマットのどちらでも写真画像を入手できる。
【０１２６】
しかし、光ダイオードは、標的が特定波長での単色光線によって照明された場合などの特別な状況においてのみ、光ダイオードアレイに衝突するエネルギーと相関するアナログ出力シグナルを生成する。例えば光ダイオードの出力シグナルが光ダイオードに適用された照明に対して本質的に直線状であっても、ピクセルに対するシグナル値は一般に光子束と正確には相関しない。これは、光子束を光ダイオード電気エネルギーへ変換させるための量子効率（ＱＥ）が所定の因子に伴って変動するためである。さらに、ほとんどの場合、単一波長以外の光線が光ダイオードに衝突する。
【０１２７】
どの光ダイオードも、波長および温度などの因子に伴って変動する所定のＱＥ値を有する。光子束は、二次元アレイの表面に衝突する電磁エネルギーを表し、ＱＥは、そのエネルギーを電気エネルギーに変換する光ダイオードの能力を表している。ＱＥは、通常は１００％未満の何らかのパーセンテージに等しい、エネルギー束のパーセンテージとして表示される。ＱＥは光ダイオードを照明する光線の波長に伴って大きく変動するので、１つの波長でのシグナルとまた別の波長でのシグナルとの比較は、適用される全波長についてのＱＥ係数が知られていない限り、解釈するのは困難である。さらに、大多数のイメージセンサは、製造業者によってフィルム上またはヒトの目によって見える画像とほぼ同等である画像を生成するように設計されている。製造業者は、「真に迫った」画像および色を再生することに関心を抱いている。製造業者は、各ピクセルについて生のデジタル情報へのアクセスを提供できるが、イメージセンサは一般に、ヒトの視覚的予想を表すより「真に迫った」色および強度にするために、分析に入手できる前にその情報を処理する。これらの理由から、イメージセンサによって生成されるデータは、センサの光ダイオードアレイに衝突する光子束には直接的には関連していない。この要素は、分析目的でのイメージセンサの有用性を制限する。
【０１２８】
＜イメージセンサの操作＞
光ダイオード検出器を使用する研究者は、検出器から獲得したデジタルデータが検出器に衝突する光子束と相関すると不正確に想定することがあるが、それはシグナル出力の強度の増加が一般に特定波長または帯域幅におけるシグナル入力の増加と直接的に相関するためである。光ダイオードは出力において極めて直線性であるので、光ダイオード表面上方での相違する波長での光子束の増加は光ダイオードのダイナミックレンジ全体で、直線状出力シグナルを生成する。しかし、出力データは、光ダイオードに衝突する波長範囲全体にわたってＱＥが変動性の場合には、光子束と相関しない。ある期間にわたり光ダイオードに衝突する特定数の光子については、光ダイオードについてのＱＥが第２波長より第１波長についての方が高い場合には、より大きな電流が第２波長より第１波長で光ダイオードによって生成される。
【０１２９】
フィルタリングまたはレーザー光源を使用することによって分析用の光源を狭い帯域に制限しても、正確度の問題は解決しない。イメージセンサを用いて評価される発光スペクトルは、たとえ励起光源が狭い波長範囲を有する場合でさえ極めて広い可能性がある。このために、光ダイオードのためのＱＥ曲線の形状は、イメージセンサからの出力データを評価する際に注意深く考察すべきである。
【０１３０】
イメージセンサの選択に関しては、ＣＭＯＳイメージセンサは電荷結合素子とは基本的に相違し、顕微鏡および診断機器においてますます多く使用されるようになっているが、それは安価で構築することができ、作動させるために必要な電力が相当に少なく済むからである。ＣＣＤカメラは、以前は実際にそうであった低強度光線状況においてもはや明らかに優れていない。ＣＭＯＳ画像は、現在はフィルム上の伝統的なカラーイメージング法に匹敵し、容易に操作される。
【０１３１】
画像は、整列させたデータピクセルアドレスを保存する様々なフォーマットで１つのプロセッサから別のプロセッサへデジタルファイルとして転送することができる。製造業者は、色をヒトの目の経験に極めて近付けることでデジタル画像を強化するために様々なカラーフィルタおよび内挿法を用いて多数のエネルギー再生性「真に迫った」カラーイメージセンサに専念してきた。しかし、カラーＣＭＯＳイメージセンサを用いて入手された魅力的な「真に迫った」カラー画像は、分析方法のためには有用ではない。画像が滅多に真実ではない単一波長の光線によって生成されない限り、モノクロ画像についても類似の問題が存在する。
【０１３２】
図１は、利用できるカラーＣＭＯＳイメージセンサの実施例の略図である。ＣＭＯＳイメージャの全部の構成要素および機能が例示されているわけではない。図１および本セクションの残りの図面は例示することを目的とし、必ずしも縮尺で描かれてはいない図１では、イメージセンサ１００は、イメージングアレイ１１０を含む。イメージングアレイは、二次元アレイで配列された極めて多数のピクセルから構成される。アレイ１１０の特定領域の拡大したピクセルアレイ１２０に示したように、イメージングアレイ１１０内のピクセル各々と関連付けられたフィルタが存在する。イメージセンサ１００は、一般にイメージングアレイ１１０によって生成されるシグナルの処理および伝送に関連する、アナログシグナルプロセッサ１４０、アナログ−デジタル変換器１５０、およびデジタルロジック１６０を含む電子機器をさらに含有する。
【０１３３】
ＣＭＯＳカラーイメージセンサ内の光ダイオードアレイは、従来型Ｂａｙｅｒ  ＲＧＢ（レッド・グリーン・ブルー）二次元アレイにおけるような規則正しく並んだポリマーフィルタの薄層によって覆われている。各フィルタは、入射照明光線の広い帯域幅からカラー情報を捕捉するために連続（Ｂａｙｅｒ）パターンで個別光ダイオードの上方に適合するようなサイズにされている。ＲＧＢアレイでは、５５０ｎｍにヒトの視覚的最高反応を指定するためにグリーンフィルタに大きな強調が置かれている。レッドフィルタ１つ毎およびブルーフィルタ１つ毎に２つのグリーンフィルタが存在する。しかし、ヒトの目がグリーン５５０ｎｍ領域により適合させられる場合でさえ、ＱＥ因子に関しては一般的にはイエローが優れた選択である。
【０１３４】
ＣＭＯＳイメージセンサおよびアクティブピクセルアレイを規定する集積回路は、元来は、光線の色にではなく光ダイオードに衝突する電子の総数にのみ反応するモノクロ（黒および白）機器である。カラーは、光線を連続シリーズのフィルタ（レッド、グリーン、およびブルーフィルタなど）に通過させること、またはピクセルアレイの上方に配置される小型透明ポリマー製薄層フィルタを用いてのいずれかで検出される。
【０１３５】
アクティブピクセルセンサ（ＡＰＳ）テクノロジーは、ＣＭＯＳイメージ検出器のための最もポピュラーなデザインである。光ダイオードに加えて、各ピクセル（もしくはイメージング素子）は、その表面上に蓄積した電荷を測定可能な電圧に変換し、光ダイオードをリセットし、電圧を垂直コラムバスへ移送する三つ組のトランジスタを含む。そこで光ダイオードは、ピクセル領域の１分画しか占めていない。光ダイオードの領域は、大多数のＣＭＯＳセンサについて全ピクセル領域の３０〜８０％に等しい領域を包含する。光ダイオードに占められたこの領域は、光子を吸収する領域であるが、ピクセルの他の部分は相当に不透明であり、光線を遮断する、反射する、または吸収する。光ダイオード領域もしくは窓は、ピクセルもしくはイメージセンサの「アパーチャ」もしくは「フィルファクタ」と呼ばれている。小さなアパーチャもしくはフィルファクタは、重大な感受性の消失および対応する信号対雑音比の減少を生じさせ、センサのダイナミックレンジの減少を引き起こす。
【０１３６】
ＣＭＯＳイメージセンサは、アクティブピクセルセンサアレイ内の各ピクセルと関連している光ダイオード表面に光子が衝突したときに生成するシグナルに基づいて画像を生成するために利用できる。ピクセルシグナルは、モノクロ（黒および白）またはカラーのどちらかで全画像を形成するために処理される。モノクロＣＭＯＳイメージセンサは、ピクセルの光ダイオード部分の上方ではカラーフィルタを有していない。しかし、カラーＣＭＯＳイメージャは、標準Ｂａｙｅｒパターンフィルタを用いた場合でさえ、一般にモノクロＣＭＯＳイメージャよりはるかに感受性が高い。フィルタを備えていないモノクロＣＭＯＳ光ダイオードは、フィルタを通過する一部の光線は吸収されて決してカラーフィルタ付き光ダイオード内の光ダイオードへ到達しないので元来より感受性であると思われる可能性があるが、これは一般に真実ではない。この仮定は所定のシグナルを増強する可能性があるフィルタが光ダイオードのためにＱＥ上で及ぼす作用を十分には考慮に入れておらず、以下で説明するカラー光ダイオード構造内のマイクロレンズによって提供される長所を無視している。モノクロＣＭＯＳイメージセンサはカラーフィルタを有しておらず、通常は各ピクセルの上方にマイクロレンズも有していない。これらは、イメージャの感受性に関してモノクロイメージャがカラーＣＭＯＳイメージセンサよりも魅力的でなくなる重要な要素である。
【０１３７】
図２は、利用できるカラーイメージセンサのイメージングアレイの小さな区域を例示している。例示した区域は、イメージングアレイ全体で繰り返される。区域２００は、各々が１つのフィルタを有する４つのピクセルから構成される。フィルタ２２０〜２５０は、アレイのために行なわれた選択に基づくカラーを有する。フィルタの下方では、２１０は個別ピクセルの構造を例示している。ピクセル２６０などの各ピクセルについて、光ダイオード２７０を含む一部分が存在し、光ダイオードのその領域は全領域の１分画に過ぎない。イメージセンサは、光ダイオード領域上に落ちる光線の部分しか検出しない。
【０１３８】
分析において使用されるカラーイメージャでは、１つの可能性のあるアプローチは、ほぼ一定である所与の帯域幅についてのＱＥ係数を生成するためにフィルタおよび光ダイオードを注意深く選択することによってイメージャを構築することである。アレイ内の適切な数の光ダイオードと選択したフィルタとを結び付けることによって、光線エネルギーの測定はより正確になる。選択されたフィルタは、ＱＥ係数のレベリングおよび改良に役立つ。しかし、実際には、フィルタおよび光ダイオードは、視覚的に最も魅力的な画像を生成することを目標に、他の目的のために選択される。量子効率およびスペクトル反応を改良するために、数社のＣＭＯＳ製造業者は、標準加法混色の原色であるレッド、グリーン、およびブルー（ＲＧＢ）の代わりに、減法的原色であるシアン、マゼンタ、およびイエロー（ＣＭＹ）に基づくカラーフィルタアレイを使用している。ＣＭＯＳ画像製造業者は、一般に、Ｂａｙｅｒ  ＲＧＢもしくは写真画像のために選択されているＢａｙｅｒ  ＣＭＹパターンのどちらかを使用する。
【０１３９】
図３は、ＲＧＢおよびＣＭＹフィルタの例示である。これらのフィルタのために、イメージングアレイはフィルタの小さなアレイに分割されるが、そのようなフィルタのアレイは各々が同一フィルタパターンを有する。ＲＢＧフィルタアレイ３００は、２×２アレイのフィルタを含有し、各アレイは２つの対角ピクセルに対して１つのレッドフィルタおよび１つのブルーフィルタならびに残りの２つの対角ピクセルに対して２つのグリーンフィルタを含有する。ＣＭＹフィルタアレイ３１０は、２×２アレイのフィルタを含有し、各アレイは２つの対角ピクセルに対して１つのシアンフィルタおよび１つのマゼンタフィルタならびに残りの２つの対角ピクセルに対して２つのイエローフィルタを含有する。例示したフィルタは最も一般的なフィルタ配列であるが、多数の他のフィルタのカラーおよびパターンが可能であり、任意のフィルタパターンを使用できる。所定の波長範囲において利益を提供する所定の他の代替フィルタパターンは、表８に示されている。
【０１４０】
モノクロイメージセンサとは対照的に、カラーＣＭＯＳイメージセンサは光ダイオードアパーチャへ光子を効果的に差し向けるマイクロレンズをさらに含有する。一般に抗反射性コーティングを含むバブルレンズは、所定の適用ではおよそ６０％という有意な量で光ダイオードの表面積を効果的に増加させることができる。マイクロレンズは、実質的に有効フィルファクタを増加させ、光ダイオードに到達できる全光線を削減するフィルタを補償する以上のことができる。
【０１４１】
図４は、イメージセンサ内のマイクロレンズの略図である。イメージセンサ内には、複数のピクセル４０５が存在する。各ピクセルはアクティブ部分４１０を有し、アクティブ部分はピクセル領域のほんの一部分しか含んでいない。通常はアクティブ部分４１０に衝突しない光エネルギーを部分的に補償するために、ピクセル４０５の各々は結び付いたマイクロレンズ４２０を有する。各マイクロレンズ４２０の機能は、より多くの光エネルギーをアクティブ部分４１０に集束させ、そこで入射光子束のより大きなパーセンテージの測定を可能にすることである。例えば、光線４３０はマイクロレンズ４２０に衝突し、ピクセル４１０のアクティブ部分４０５上に集束する。
【０１４２】
＜イメージセンサの最適化＞
イメージセンサの光感受性領域による光子収集を減少または妨害する３つの主要メカニズムは、吸収、反射、および透過である。これらの要素は、本質的に波長依存性であり、一部にはイメージセンサの量子効率（ＱＥ）を規定する。例えば、入射光線の反射および透過は、波長の関数として発生し、高いパーセンテージの４００ｎｍ未満の短波長は反射される。短波長は光感受性領域の最初の数ミクロン内に吸収されるが、６５０ｎｍを越える最長波長は光感受性領域を通過することが多い。
【０１４３】
図５は、イメージセンサに対する典型的な量子効率およびスペクトル反応を例示している。図５については、Ｂａｙｅｒ  ＣＭＹフィルタが評価されている。スペクトル反応５００は、イメージセンサ上の様々な波長の入射光線についてのイメージセンサの量子効率を例示している。マゼンタフィルタ５１０を備える１つのピクセル、シアンフィルタ５２０を備える１つのピクセル、およびイエローフィルタ５３０を備える１つのピクセルについて個別反応曲線が存在する。各曲線は、相違する入射光線の波長で山および谷を有する。
【０１４４】
イメージセンサにおいて使用される各フィルタタイプについてＱＥ波長依存性曲線を調査することによって、モノクロイメージセンサについてのピクセルを含む任意の波長または当該の間隔について光子束に比例する出力シグナルを決定できる。多くの場合に、アレイ内の各ピクセルは、フィルタの種類（ＣＭＹ、ＲＧＢ、他のパターン、またはフィルタなし）を除いてその隣のピクセルと本質的に同一である。フィルタの作用は、所与の光子束についての光ダイオードエネルギー出力を増加させる、または減少させるかのいずれかである。シグナルへの作用は、波長依存性である。ＱＥは、出力シグナル内で変動性であり、ありとあらゆるピクセルについてイメージングアレイ全体で公平な比較を行わなければならない場合は、方程式から解釈すべきである。
【０１４５】
ＣＭＯＳイメージャでは、ピクセルシグナルは、設定時間間隔に対してアナログ−デジタル変換器が数値を変換した後に生データとして各ピクセルに対して入手される。ＱＥが分画として表示される場合は、ピクセルシグナルはＱＥと光子束の積に正比例している。
ピクセルシグナル＝定数×ＱＥ×光子束
【０１４６】
生データを適切なＱＥにしたがって標準化できる場合は、より正確なその後の分析に使用できるデジタル値を作製できる。カラーＣＭＯＳイメージセンサについてのピクセル値は、オンチップ変換が始まる前に入手でき、その数値は特定カラーフィルタに対する各シグナル値に逆ＱＥを掛けることによって標準化できる。比較的狭い帯域幅については、ＱＥは使用される波長およびフィルタタイプに依存して定数として扱うことができる。１つの実施例では、Ｋｏｄａｋ  １３１０カラーＣＭＯＳイメージセンサのために５５０〜６５０ｎｍの範囲内に渡るＢａｙｅｒ  ＣＭＹパターンは、およそ４６％のＱＥを提供し、その後６５０ｎｍから９９０ｎｍでの５％へ、５ｎｍ毎におよそ０．６％ずつ低下する。さらに、マゼンタおよびイエローフィルタは、６３０ｎｍ〜９９０ｎｍの範囲にわたって極めて類似である。
【０１４７】
６７０ｎｍでＣＭＹパターンのＫｏｄａｋ  １３１０カラーイメージセンサを用いる特定の実施例について、ＱＥ値は表９に示したとおりである。イエローフィルタを備えるピクセルはデジタル生データ×２．３８、マゼンタフィルタを備えるピクセルは×２．２７、およびシアンフィルタを備えるピクセルは×７．６９を有する。本実施形態では、各ピクセルについてのシグナルは、実際の光子束に正比例する数値へ有効に変換される。表９は、特定波長（６７０ｎｍ）の光線がイメージセンサに衝突した場合のイメージセンサについてのＱＥしか含有していないことに留意されたい。任意の他の光線波長についてのＱＥは、図５に示したように変動する。
【０１４８】
＜ＱＥ係数の相関＞
ＱＥにおける相違を補償する補正は、特定のフィルタタイプおよび波長に対して知られているＱＥ係数に基づいて行うことができる。（例えば、表８および表９に含まれているデータを参照されたい）。しかし、イメージセンサは、ピクセルＱＥにおける相違を自動的に補正するためにも利用できる。各フィルタの四分円などのセンサアレイの各領域は、四分円内の各ピクセルをリアルタイムで光子束に対して最適に調整できるように標準化できる。ピクセルおよびフィルタが、例えば、表８に示したようにＹＹＹＹ、ＭＭＭＭ、およびＣＣＣＣフィルタパターンのように全部同一タイプである場合は、補正は行なわれない。アレイ内に２つ以上のフィルタタイプが存在する（例えば、ＹＹＹＣ、ＲＧＢ  Ｂａｙｅｒ、または修正ＣＭＹ  Ｂａｙｅｒなどのフィルタパターン）場合は補正を行うことができる。２つ以上のフィルタおよび光ダイオードタイプの任意の組み合わせに対してはＱＥについて自動補正する方法を使用することができ、そのような方法は、各ピクセルが等価の出力シグナルを生成するように四分円内の４つのピクセルを標準化するように補正する。
【０１４９】
ピクセルがアレイの所与領域全体に光子束内の変化に対して四分円内で密に充填されている場合は、任意の所与の瞬間に四分円内で同一数の光子が各ピクセルに衝突すると仮定できる。現在利用可能な高分解能センサ、および分解能において予想される将来の改良を考えると、任意の所与四分円内の隣接ピクセルは同一光子束を経験するという仮定が適切である。この仮定を用いると、四分円内のピクセル各々は同一出力を生成するはずである。したがって、各フィルタ四分円内の隣接ピクセルと同一にするために自動補正を使用できる。四分円内の最高感受性ピクセルタイプを使用すると、ＱＥおよび波長の差を解釈することができ、これは波長および帯域幅依存性について補正する問題を単純化する。１つの実施例では、四分円内の最高感受性ピクセルについてバックグラウンドの補正ファクタが決定されると、同一四分円内の他のピクセル各々について同一バックグラウンド補正ファクタを推定できる。自動補正は、相違するフィルタおよび光ダイオードタイプについて温度変化に関連する問題をさらに減少または排除する。以下のセクションでは、閾値および標準化視感度指定のための自動方法について考察する。
【０１５０】
また別の実施例では、イメージセンサのアレイは複数のフィルタ四分円を含む。４つのピクセルからなる各四分円内で２つ以上のフィルタが使用される。４つのピクセルからなる各四分円内では、各フィルタおよび光ダイオードタイプについての平均アナログ−デジタル変換されたシグナル出力が決定される。例えば、四分円内に３つのイエローフィルタを備えるピクセルと１つのシアンフィルタを備えるピクセルが存在する場合は、３つのイエローピクセルが最初に決定される。イエローピクセルについての出力値は次にシアンピクセルについての数値と比較され、どちらの出力が数値として大きいかが決定される。この実施形態では、全４つのピクセルが同等の光子束を受け入れることを前提としている。最高出力値が四分円内の全４つのピクセルに指定される。アレイ内の次の四分円は、その後同一方法で補正することができ、このプロセスはアレイ全体に光子束と相関するように補正出力値が指定されるまで継続される。
【０１５１】
自動補正のプロセスは、イメージセンサが画像を記録するために使用されるにつれて経時的に繰り返される。さらにまた別の実施例では、イメージセンサによって受け入れられた光線の波長は第１波長から第２波長へ変化することがある。第１タイプのフィルタは第１波長に対して最高ＱＥを提供できるが、他方第２タイプのフィルタは第２波長に対して最高ＱＥを提供する。波長における変化は計算プロセスに含むことができ、このために変化する光線についての自動補正をリアルタイムで行うことができる。
【０１５２】
ＱＥの相違を自動補正するために各フィルタタイプについて前もってＱＥが知られている必要はない。画像が入手される時点の光子束に基づいてセンサを自動補正するステップは、光子束と相関させるために写真画像を最適化する。このシグナルを補正する方法は、相違するフィルタタイプについての温度および波長依存性を除去し、ソフトウエアを用いて実行できる。そこでそのような方法は、イメージセンサに衝突する広範囲の帯域シグナルについて自動的に補正する。さらにまた別の実施例では、光子束について自動補正されたイメージセンサによって生成されたデジタルシグナルは、その後にモノクロ描写で視認するためにグレースケール画像にすることができる。
【０１５３】
＜イメージセンサのキャリブレーション＞
イメージセンサの最適化は、キャリブレーションステップを含むことができる。キャリブレーションは、カラーフィルタおよび光ダイオードを知られている波長および強度の光線で照明するステップによって遂行できる。カラーＣＭＯＳイメージャについては、各フィルタのための生データが入手されて予想値と比較される。結果として生じた比較から、アレイ内のありとあらゆるピクセルのために使用される各カラーフィルタのための等価の出力シグナルを入手するために必要とされるＱＥおよび乗数（標準化係数）を入手できる。
【０１５４】
ＱＥ係数変換を用いて入手された最適化されたシグナルは、シグナルを光子束へより正確に関連付けることができ、このために化学反応における励起−発光スペクトルまたは吸収現象に関連する光学事象などの事象をより正確に特徴付けることができる。感受性および正確度は、どちらもＱＥ係数を明らかにするためにシグナルを適切に変換するステップによって強化される。標準ＣＭＯＳイメージャ（Ｋｏｄａｋ  １３１０カラーＣＭＯＳイメージセンサなど）を使用すると、生成された生データはシグナル最適化のために処理できる。シグナルは、イメージャ上に入射した光子束と相関する数値に変換される。このプロセスは、シグナルを光子束と比例させるためにカラーまたはモノクロＣＭＯＳイメージセンサのどちらにも適用できる。
【０１５５】
処理されたデータは、実際光子束と相関する白黒画像を生成するためにグレースケール標準（０〜２５５の単色）などによって可視化することができる。データの視像はグレースケールモノクロイメージセンサと表面的には等価であるが、同等輝度に対しては、カラーＣＭＯＳチップは一般にモノクロチップより高感受性であるので、モノクロの非変換ＣＭＯＳ対応物によって生成される画像より高強度である。カラーイメージセンサは、一般により良好なシグナルを生成し、モノクロイメージャより高感受性であるが、それはピクセル光ダイオードフィルタが光ダイオードのためのＱＥを向上させるからである。カラーイメージセンサによる光線のフィルタリングは、光子束と正比例している数へシグナルを変換させるためにＱＥ係数を用いて補正することができる。さらに、また別の長所は、光ダイオードのためのアパーチャを効果的に増幅させるカラーフィルタのマイクロレンズによってもたらされる。
【０１５６】
＜プロセスの例示＞
図６は、イメージセンサを最適化するためのキャリブレーションについてのプロセスの非限定的実施例を例示している。キャリブレーションプロセス（６００）では、波長および強度が知られている光線が生成される（６０５）。強度が知られているので各ピクセル上の光子束が知られているが、これはピクセルのＱＥが１００％である場合は出力となる。知られている光線は、イメージセンサ上に方向付けられる（６１０）。イメージセンサの各ピクセルの出力が入手される（６１５）。イメージセンサの出力は、次に実際光子束と比較できる（６２０）。比較を用いるとピクセルの量子効率を計算することができ（６２５）、次に量子効率に基づいて標準化係数が計算される（６３０）。カラーＣＭＯＳイメージセンサについては、比較および計算は各フィルタカラーについて実施でき、結果として各フィルタカラーについての標準化係数を生じる。他の実施形態では、比較および計算はイメージセンサの各ピクセルについて、またはイメージセンサのピクセルの区域について行うことができ、その場合はイメージセンサの所定の部分に適合する標準化係数が得られる。標準化係数はイメージセンサに衝突する光線の各波長について変動するので、知られている光線の波長が変動させられ（６３５）、必要とされる各波長についてこのプロセスが繰り返される。
【０１５７】
所定の実施形態では、イメージセンサは、各ピクセルが１つのフィルタを備えるピクセルのアレイを含有するカラーセンサであってよい。フィルタは、四分円で配列されてよく、各四分円は特定のフィルタパターンを有する。アレイの第１四分円内のピクセル各々の出力を入手できる。四分円内の各フィルタタイプの平均出力が次に決定される。１つの実施例では、フィルタ四分円が１つのシアンフィルタ、１つのマゼンタフィルタ、および２つのイエローフィルタを含有するＣＭＹパターンである場合は、シアン出力、マゼンタ出力、および２つのイエロー出力の平均値が決定される。これらの出力は、次に比較されて、最高出力が決定される。最高出力は、次に四分円内の各ピクセルに指定される。例えば、平均イエロー出力がＣＭＹ四分円について最高出力である場合は、特定条件下では、イエローフィルタが最高ＱＥ係数を有することを指示しているので、次にイエローの平均出力が四分円内のピクセルの各々に指定される。アレイ内により多くの四分円が存在する場合は、次の四分円の出力が入手され、プロセスが継続される。最終四分円が補正されると、このプロセスは完了し、そのアレイについての補正出力を入手できる。このプロセスは、イメージセンサについてのリアルタイムＱＥ係数補正を許容するために経時的に繰り返すことができる。
【０１５８】
図８は、イメージセンサを最適化するための典型的プロセスを例示しているフローチャートである。最適化プロセス（７００）では、事象の画像がイメージセンサを用いて捕捉される（７０５）。本発明の１つの実施形態の下では、イメージセンサは、Ｂａｙｅｒ  ＲＧＢまたはＣＭＹパターンなどのフィルタパターンを利用するカラーＣＭＯＳイメージセンサである。事象の画像についての生データはイメージセンサから入手される（７１０）。この生データは、イメージセンサの性質のために、一般にはイメージセンサに衝突した実際光子束から大きく変動する非最適化データである。標準化係数は光線の波長に依存するので、波長が決定される（７１５）。適切な標準化係数は、光線の波長に基づいて各ピクセルに対して決定される（７２０）。カラーＣＭＯＳイメージセンサを利用する１つの実施形態については、標準化において各レンズカラーに対する標準化係数が使用される。他の実施形態の下では、標準化係数は他の要素に基づいて変動することがある。生データは、次にイメージセンサのピクセルに対して適切な標準化係数を用いて変換され（７２５）、次に捕捉された事象の画像についての実際光子束に近似する最適化データセットを生成する。本発明の１つの実施形態の下では、変換されたデータを用いて画像を生成できる（７３０）。
【０１５９】
＜蛍光検出＞
ガラス表面上の結合反応の存在または不存在を検出するためには、蛍光体が使用されることが多い。蛍光検出器は、蛍光体がレーザーまたは他の光源を用いて励起されたときに生成されるエバネッセント波の強度を測定する。典型的には、レーザーを使用して蛍光体がその吸収ピークで励起され、検出器はその特定蛍光体に特徴的である長い発光波長で発光シグナルを読み取るために調整される。吸収と発光の間の波長の変化は、ストークス・シフトと呼ばれている。大多数の蛍光検出方法は大きなストークス・シフトを備える蛍光体を使用するので、発光および吸収曲線は明確に分離する。小さなストークス・シフトを有する蛍光体を使用する場合は、発光および吸収曲線が重複するために最適ピーク吸収極大値より短い波長で励起することが必要になる。シグナル放出強度が減少し、標的分子を検出するための感度が低下する。大きなストークス・シフトに対する必要もまた、使用できる蛍光体の選択を限定する。
【０１６０】
吸収および発光についての曲線は相互に極めて近いことが非常に多いために、発光シグナルの正確な読み取りは複雑になる可能性がある。発光および吸収曲線の間隔が小さい場合は、発光スペクトルからの光線を吸収シグナルの光線から分離するのは困難である。発光スペクトル曲線のすぐ下の所定の臨界点まで全光線を除外するためのフィルタとともに、吸収ピークで狭い帯域を備えるレーザーが使用されることが多い。適切なロングパスフィルタ、帯域通過フィルタ、またはロングパスフィルタと帯域通過フィルタの組み合わせを選択することによって、励起光源からの干渉の多くを排除して、発光シグナルを狭いウィンドウ内で観察することができる。励起光源からの干渉は、さらにまた検出器および装置をアライメントすることによって回避されるので、発光シグナルは励起ビームに対して大きな入射角で読み取ることができる。フィルタはほとんどのシグナルを励起光源から排除するが、それらはエバネッセント（発光された）シグナルの重要な部分も除外する。大多数の帯域通過フィルタは、発光シグナルの４０〜５０％という多くを除外する。ロングパスフィルタは、発光シグナルのさらに１０％を除外する可能性がある。
【０１６１】
蛍光検出は、多数の一般的試験方法において使用されている。ＤＮＡハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズしてスライドに付着したオリゴヌクレオチドを捕捉する１セットの知られているオリゴヌクレオチドに結合した適切な蛍光体を用いて、一般にこの方法で分析されている。サンドイッチイムノアッセイもまた、一次抗体に結合するタグ付け二次抗体を用いる、または二次ビオチン化抗体およびタグとしてのアビジン蛍光体を用いるどちらかで、この分析方法を使用する。この方法の多くの変形は周知である。
【０１６２】
蛍光検出においては、様々な他のタイプの光干渉が発生することがある。励起ビームの反射によって光散乱が発生し、他方励起ビームの反射および屈曲によって光分散が発生する。散乱および分散は、検出器に衝突する光線の大部分を表すことがある。一般に、物質（タンパク質、核酸または他の生体分子など）がスライドガラスの表面に付着させられると、それは様々な方向へ光線を反射および散乱させる鏡として作用する。被覆された表面の量および付着した物質の質量もしくは密度は散乱光の量に大きな影響を及ぼすことがある。ガラス表面に付着したタンパク質、オリゴヌクレオチドまたはポリマーの化学組成もまた、以下の図８から明らかなように、散乱光に影響を及ぼすことがある。さらに、ガラス表面物質に付着した物質自体が蛍光を発することがある。使用されるガラスは、検出器によって受信されるシグナルに影響を及ぼし得る表面不規則性を有することもある。ガラス全体にわたって吸収されるエネルギーは、１つのスポットから別のスポットにかけて変動することがあるので、シグナル分析には極めて大きな問題が生じる。そのような問題は、蛍光検出および／またはデータ分析の新規な方法の使用を必要とする。
【０１６３】
＜エバネッセント発光および散乱光＞
エバネッセントシグナルは、一般に極めて弱く、光散乱は強度であるので、正確な分析の定量的検出には問題が生じる。光散乱は、しばしばフィルタによって排除されると想定されている。しかし、散乱光はほとんど常に存在し、検出器に到達する全シグナルの重大な部分である可能性がある。光散乱を除去するために使用されるフィルタは、標的発光シグナルの大部分も除去してしまうので、これにより検出器の感受性が低下する。フィルタは、また少量の散乱光も透過させる。散乱光がエバネッセント発光に比較して相対的に大きい場合は、検出されるシグナルは数種の起源の組み合わせとなり、標的分子結合を表しているのはその内の１つだけである。
【０１６４】
光散乱の構成要素は、図８に例示されている。２つのスポット（例えば、相違する抗体）がガラス表面に配置されている。標的を検出する方法の間、これらのスポットの一方は、完全に非反応性のままである。他方のスポットは、細菌病原体および／または他の試薬などの標的と反応する。反応性抗体への標的結合はスポットに付着した質量を増加させ、そのスポットでのより大きな表面積および分子構造の変化を生じさせる。質量効果が発生している。反応性スポットからの光散乱は、標的分子結合前の光散乱とは相違する。感受性光子計数検出器であれば、散乱におけるこの相違を検出できる。所定のフローサイトメーターおよび濁度計などの様々な機器は、溶液中の物質の量を定量するために散乱を利用している。それらの機器は、標的物質上に衝突する光線についての散乱角度を測定する。シグナルにおける変化は、参照シグナル（Ｓref）とシグナル２（Ｓ2）との相違である。図８では、Ｓ2シグナルは、２つの構成要素である、結合病原体の修正散乱シグナル＋質量効果シグナルを有するように示されている。反応性スポットからのシグナルは変化するが、他方非反応性スポットシグナルからのシグナルは一定である。
ΔＳ（非反応性スポット）＝０
ΔＳ（反応性スポット）＝修正（Ｓp）＋Ｍ1−Ｓref
【０１６５】
大きな散乱効果を誘発するために質量効果が十分であれば、標的検出のために使用される蛍光体を排除できる。例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーション実験では、標準オリゴヌクレオチドプローブ（約２４ヌクレオチド長）を用いて表面に付着させられた質量は、標的核酸に結合すると係数２以上増大することがある。そのような質量における大きな変化は、エバネッセント波の代わりに光散乱を監視することによって検出可能である。ビオチン化二次抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイの場合には、ビオチン化抗体が病原体に結合した時点に別の質量効果が発生する。アビジンコンジュゲート化蛍光体がビオチンに結合すると、第３の質量効果が発生する。
【０１６６】
最高感受性シグナルは、蛍光体が付着させられて励起された後に入手される、最後に捕捉されたシグナルから最初の参照シグナルを減じることによって入手できる。そのシグナルは、反応スポットについての修正蓄積質量効果および発光シグナルを表す。
ΔＳ（反応性スポット）＝修正蓄積質量効果＋発光−Ｓref
【０１６７】
この分析方法は、ＣＭＯＳイメージャまたはその後の処理のためにピクセル画像の保存を可能にする任意の知られているデジタルイメージング法とともに使用できる。各スポットから入手したシグナルはより有用な情報を含有し、適正なサブトラクション法が使用されれば標的結合後のより強度の変化を示す。散乱効果は、標的結合を検出する際に長所へ転換することができる。さらに、疑似シグナルは画像から取り去られるので、蛍光体の発光および吸収曲線を明確に分離させる必要がない。発光シグナルの全強度は、フィルタを用いて発光光線を減少させずに測定できる。
【０１６８】
サブトラクション法は、例えばスライドガラス表面における非均質性（小片、傷）に由来するアーチファクトおよび欠陥もまた排除する。非反応性スポットは、完全に無効にされ、シグナルとしては出現しない。ＣＭＯＳイメージャおよびピクセル捕捉装置は、一般に、無作為の、極めて低レベルの雑音を示すので、どの種類のシグナルを検出できるかに関して制限がある。任意の所与時点に、ベースライン時参照は、無作為の数のスパイクを示すことがある。２つのスパイク間に含まれる弱いシグナルは、通常はこのバックグラウンド雑音に対して検出されない。
【０１６９】
信号対雑音の問題は、多数の画像が捕捉され、１枚ずつ他の画像に追加されると、改善することができる。ＣＭＯＳイメージャなどの検出器に固有の無作為スパイクは常に移動するので、フレーム画像の蓄積は無作為雑音を平均化する傾向を示す。しかし、励起蛍光体の発光からの弱いシグナルはそのピクセル位置を変化させない。このため、標的結合によって誘発された蓄積シグナルは経時的に増加する。この方法は、対象が空のかなたへ移動するにつれて追跡することによる、遠くの星または星雲の写真画像を撮影する方法に類似している。シグナルが検出器上の同一スポットで蓄積されるが、バックグランド光線は平均化されるので、該の対象は、経時的にバックグラウンドに比してより明るく見えるようになる。
【０１７０】
＜分析方法＞
典型的な実施形態では、ガラスもしくはナイロンスライドまたは他のマトリックスアレイがステージ上に固定される。標的分子結合の前に、励起用レーザーは、約３０〜４０度の入射角度でスライドの一方の端に集束させられる。スライドは、表面上に、結合した一次抗体を含有するスポットへ励起光を案内する導波管として機能する。光シグナルを捕捉するためには、ＣＭＯＳ、ＣＣＤまたは他の光学イメージャが使用される。イメージャは、スライドの下方に位置して、スライド上のスポットがイメージャのすぐ上に来て、光学レンズおよびアパーチャを備えるイメージャ表面上に明確に焦点が合うようにアライメントすることができる。
【０１７１】
多数の画像が撮影される。各画像は、単一フレームを表す。例えば、５０ミリ秒間の露光を用いて１０フレームが撮影される。露光は、単一フレーム内に捕捉される光線の量がカメラの感受性範囲内に入るように選択される。１０枚のデジタルフレームは、次に望ましくない（バックグラウンド）シグナルの減算のために使用される参照セットを提供するために加えられる。蓄積画像は、キャリブレーションスライドと呼ばれる。
【０１７２】
参照スライド画像を入手するために使用された同一数のフレームが、同一露光を用いて、一次および／または二次抗体、酵素および試薬などの結合後に同一スライドから撮影される。蓄積フレームセットは、サンプルスライド画像と呼ばれる。各スポットについての発光シグナルは、サンプルスライド画像から参照スライド画像を減じることによって決定される。このプロセスは、本質的にバックグラウンド雑音およびマトリックスアレイのアーチファクトを排除し、標的分子の極めて高感受性検出を生じさせる。
【０１７３】
また別の実施形態では、スチルフレームまたはビデオモードのどちらかで画像を入手できる。典型的なビデオフレームは、参照およびサンプル分析の各々のために２０００ｍｓで行い、１００フレームを捕捉する。本方法は、アーチファクトおよび非反応性スポットを除去し、アレイへの標的分子結合を表すシグナルだけを残す。
【０１７４】
＜自動閾値補正＞
サンプル分析における一般的問題は、測定を行って、絶対的標準値が存在しない場合に数値の意味を解釈しなければならない。例えば、視感度を測定する際には、反応が開始した時点には測定値を通常は正確に入手できないために、そして基質の濃度は典型的には知られていないので、一般には相対視感度測定値だけが入手されて、分析プロセスにおいて使用される。それに対してシグナルを測定できる絶対的な標準は存在しない。
【０１７５】
視感度は、ソフトウエアを備えるＣＣＤカメラを用いて測定されることが多い。各機器は、回路、光学素子、ＣＣＤチップおよびハウジングなどにおける変化のために、絶対数値に関して様々に測定する。同一機器さえ瞬間毎およびスキャン毎に、さらに相違する日には温度および回路反応におけるかすかな変化、溶液、スキャン時間における変動などに起因して測定結果が相違するので、所与測定値セットにおいて入手される絶対値を解釈することを困難にさせる。
【０１７６】
特定の機器については、シグナルにおけるこれらの相違が入手された数値に比較して相対的に小さい場合は、１セット内の１つのサンプルをそのセット内の他のサンプルに比較して容易に識別し、例えば特定のマーカーについて陰性または陽性血清サンプルとしてそれを相違する分布プロファイルを備える集団に指定することが可能な場合がある。しかし、実際には、１つの実験から次の実験までの測定値における相違は、同一もしくは類似サンプルについては絶対数値に比較して大きいことがある。これは、特に比視感度の数値が極めて低く、低レベル測定が行なわれる場合に当てはまる。
【０１７７】
それに他の全測定値が比較される１セットの測定値内の参照値を使用することによって、シグナルがその参照数値より大きい、等しい、または小さいかのいずれであるかを正確に陳述することが可能になる。そして、観察されることの多い比視感度単位で１，０００超〜１，０００，０００の広いダイナミックレンジを用いると、比視感度を明確に数／１，０００単位にまで測定することが可能になる。
【０１７８】
しかし各新規セットの測定値を用いると、絶対値における変化のために、バックグラウンド測定値、または特異的サンプル測定値を別の測定値から減じることによって入手される１セットの測定値の比視感度は、必ずしも試験サンプルについての同等比視感度を提供しない。別の（陽性または固有にマーキングおよび識別されたサンプルセット）の分布曲線とは相違する分布曲線を備える一連の１つのサンプルセット（血清の陰性または正常セット）を識別する方法が必要とされる。さらに、同一方法でそれらがシグナルを識別する能力において全機器を同等にさせる方法もまた必要とされる。これは、任意のサンプル試験のために、陰性または陽性参照セットどちらかを提供するサンプルについて測定された視感度だけを用いて実施することができ、バックグラウンド参照シグナルもまたスキャニング方法で入手される。
【０１７９】
一般に、サンプルのプールを調製して、同時に試験かつ平均化された数種のサンプルについて平均予想値に密接に近似する参照として使用できるので、参照として陰性または正常セットを使用した方がよい。陽性または固有にマーキングされた血清は、マーカーに依存して相当大きく変動することがある。例えば、当該のマーカーとしての循環中抗体を備えるＭ．ボビスに感染した畜牛は、感染の早期にはほとんど抗体を有していない可能性がある。相違する動物または感染の後期には、抗体濃度は極めてはるかに高くなる、または濃度が低くなることがある。陽性感染動物は、参照作製のためには使用すべきではない。陰性（正常）血清は、Ｍ．ボビスに対して特異的な抗体マーカーに欠けているので、参照として使用できる。
【０１８０】
＜比視感度の測定値＞
上記で説明した、ソフトウエア、光学素子、および分析用のサンプルセットが装填されている機器ハウジングとともに使用される全光学アッセイ装置（ＴＯＡＤ）はｃｒｉｂセット内の各サンプルについての数値を研究者に提供する。ｃｒｉｂセットは、通常は、各々が設定時間（例えば、１０分間）内に１枚の画像を捕捉するためにスキャンされるサンプルまたはコントロール溶液のどちらかを含有するウエルを１２以上含有する。
【０１８１】
通常は、数種のサンプルが同時にスキャンされる。サンプルの不存在下で観察されたシグナル（バックグラウンド）を表すバックグラウンド数値は、サンプル間のＣＣＤカメラ標的領域内の領域を試験することによってサンプルがスキャンされるのと同時に入手される。サンプル数値とバックグラウンド数値との相違は、特定試験サンプルについての比視感度を表す。１２サンプルからなる１セットについての代表的な画像は、参照（陰性コントロール）として使用された同一基質濃度での約１０例の陰性動物のプール血清とともに、図１５に示されている。
【０１８２】
単一ｃｒｉｂセットアッセイでは１１例のサンプルと１例の陰性コントロールしか処理できないので、多数のサンプルを分析するためには多数のセットが必要とされる。各セットに対して、１１例の追加のサンプルが入手され、それらの数値はそのｃｒｉｂセットについての陰性コントロール参照と比較して測定できる。表１０は、未感染および感染畜牛血清を用いた盲検試験での９９例の相違するサンプルについての比視感度とともに９つの連続アッセイセットについての結果を示している。
【０１８３】
ｃｒｉｂセット内の各サンプルについての比視感度は、陰性コントロールの参照プールを用いて陰性動物からの陽性感染動物の識別を可能にする有用な情報を提供する。これは、サンプルが陽性であるより上方および陰性であるより下方の閾値を指定することによって遂行される。この閾値は、所与セットの実験条件に対して経験的に入手される。
【０１８４】
＜閾値の指定：＞
サンプルが陽性感染であるか陰性であるかを決定するために使用される閾値カットオフは、経験的に決定される。陰性コントロール参照値は９つのｃｒｉｂセットの各々について入手され、バックグラウンド、ＮＣ、およびＮＣ比視感度値（ＮＣからＢＧを減じることによる）は表１１に示されている。
【０１８５】
プール陰性コントロール血清についての比視感度は獲得されている（表１１のＮＣ＿ＲＬを参照）。ＮＣ＿ＲＬについての数値は、相当大きく変動している。プール陰性参照に比較した個別に測定された数種の血清の平均値＋平均値からの多重標準偏差の比率は一定である。この比率は、ＣＣＤ画像出力はその表面に衝突する光子に正比例し、このためプール血清参照および検査中の陰性サンプル血清はどちらも１セット実験条件について同程度に影響を受けるために、一定である。
【０１８６】
閾値は、平均予想比視感度値に任意の陰性血清サンプルを含むはずである平均値を超える標準偏差の乗数を加えることによって、プール陰性サンプルの参照に比較して陰性である血清についての平均予想比視感度値と、真陰性もしくは真陰性ではない可能性があるサンプルについて観察された数値との関係を活用することによって自動的に決定される。これは、次の方程式によって表すことができる。
閾値＝ＯｂｓNC＋Ｘ（ＳＤ）−ＮＣ＿ＲＬフ゜ール参照
ＯｂｓNC＝観察された陰性コントロールサンプルの血清値
Ｘ＝乗数
ＳＤ＝いくつかの陰性サンプル血清値の標準偏差
ＮＣ＿ＲＬ＝陰性コントロールプール血清参照値
【０１８７】
サンプルについて観察された数値がＮＣプール参照に等しい場合は、その閾値は、所与セットの実験条件についてプール参照を超える標準偏差の乗数である。
閾値＝Ｘ（ＳＤ）
【０１８８】
数種の検査結果が陰性のサンプルの平均値＋プール参照試験サンプルに比較して試験したそれらのサンプルについての標準偏差の乗数が一定であるので、閾値は、以下に示すように単純な式によって自動的に計算できる。
｛ＯｂＳNC平均値＋Ｘ（ＳＤ）｝／ＮＣ＿ＲＬフ゜ール参照＝定数
このため、
閾値＝｛定数−１｝ＮＣ＿ＲＬ
閾値係数＝｛定数−１｝
【０１８９】
１つのｃｒｉｂセット内の特定サンプルは、その数値は閾値より上方または下方のいずれかであるので、陽性または陰性のどちらかであると決定される。
陽性の指定
Ｏｂｓ比視感度≧閾値
陰性の指定
Ｏｂｓ比視感度＜閾値
【０１９０】
実際には、｛定数−１｝についての数値は試験後に変動させられるので、特異性および感受性測定値への影響を決定できる。次に標準ＲＯＣ曲線が構築される（例えば、図１６を参照）。数値の表から、所望の特異性および感受性カットオフ値に対する閾値係数が選択される（表１２）。例えば、０．９の閾値係数は、各々９１および７６％の特異性および感受性値を表す。
【０１９１】
＜閾値および比視感度の標準化＞
計算された閾値は、陽性感染および正常血清群のいずれかにその比視感度に基づいてサンプルを指定するために使用される。使用した閾値係数が１００％感受性を生じさせる場合は、陽性サンプルの全部を同定しなければならないが（すなわち、偽陰性はゼロになるはずである）、閾値はそれらの包含を排除するには低すぎるので、多数の偽陽性（正常血清群）が存在することがある。偽陽性は、リフレックス・サプリメンタルテストを用いたその後の実験において除外できる。
【０１９２】
選択した閾値に対して比視感度を標準化することによって、サンプルは、その数値は各々１．０より大きい、または小さいので、陽性または陰性のいずれかであると同定できる。これは、そのサンプルについての数値に基づいてどのセットに指定を割り付けるべきかを直ちに判断するために、サンプルのリストを試験することを容易にするために、数値を表示するより有用な方法である。
【０１９３】
閾値は、サンプルについて観察された比視感度をそのｃｒｉｂセットについての閾値で割ることによって比視感度から整数へ変換（標準化）される。それは、１つのサンプルを他のサンプルと比較するときにΔ／閾値が１．０より上か下かを見るだけで理解できる。これだけで、陽性または陰性サンプルについての指定を決定する。比視感度の検査だけではそのような容易な指定の解釈は許容しない。
陽性の指定
｛Ｏｂｓ比視感度｝／閾値≧１．０
陰性の指定
｛Ｏｂｓ比視感度｝／閾値＜１．０
【０１９４】
９９頭の試験された動物について、初回検査ラウンドについてのみ、自動および標準価値が表１３に列挙されている。スクリーニングおよびリフレックス・サプリメンタルテストについてのグラフ表示は、図１７に示されている。
【０１９５】
閾値を自動計算することによって、所与セットの実験条件に対する感受性および特異性についての基準が設定される。各機器は、同一基準によって同等方法で結果を解釈する。そして、計算比視感度を閾値で割ることにより観察された比視感度を標準化することによって、一連または機器毎の全サンプルは、それらが１．０より上か下のどちらかであるとして選択された閾値に対して陽性または陰性のいずれかであると容易に評価される。
【０１９６】
＜タンパク質およびペプチドに対する一般的方法＞
病原体および／またはマーカー分子を検出するために、本明細書で請求した方法および組成物の範囲内で様々なポリペプチドまたはタンパク質を使用できる。所定の実施形態では、タンパク質は、抗体または抗原結合部位を含有する抗体のフラグメントを備えていてよい。個別分析物に対する結合特異性を備える多数の抗体は、当分野において知られている。
【０１９７】
本明細書で使用するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、一般に、約２００アミノ酸より大きく、遺伝子から翻訳される全長配列までのタンパク質；約１００アミノ酸より大きいポリペプチド；および／または約３〜約１００アミノ酸のペプチドを意味するが、それらに限定されない。便宜性のために、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチドは、本明細書では互換的に使用される。したがって、用語「タンパク質もしくはペプチド」は、天然型タンパク質で見出される２０種の一般アミノ酸のうちの少なくとも１つ、または表１４に示されているアミノ酸を含むがそれらに限定されない少なくとも１つの修飾もしくは異常アミノ酸を含むアミノ酸配列を包含する。
【０１９８】
タンパク質もしくはペプチドは、標準分子生物学技術によるタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、天然起源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に知られている任意の技術によって作製できる。ヌクレオチドおよび様々な遺伝子に対応するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列は以前に開示され、当業者に知られているコンピュータ・データベースに見出すことができる。そのようなデータベースの１つは、全米バイオテクノロジー情報センターのＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベースである（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。知られている遺伝子についてのコーディング領域は、本明細書で開示する技術、または当業者には既知の技術を用いて増幅および／または発現させることができる。または、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの様々な商業的調製物は、当業者に知られている。
【０１９９】
＜融合タンパク質＞
その他の実施形態は、以下で考察するＣＰ１０＿ＥＳＡＴ融合タンパク質などの融合タンパク質に関係することがある。これらの分子は、一般に、第２ポリペプチドもしくはタンパク質の全部もしくは一部分へＮもしくはＣ末端で連結したペプチドの全部もしくは実質的部分を有する。例えば、融合は、異種宿主内のタンパク質の組換え発現を許容するために他の種由来のリーダー配列を使用できる。別の有用な融合は、抗体エピトープなどの免疫学的に活性などメインの付加を含む。所定タイプの融合タンパク質は、広域スペクトルの抗体スクリーニングを提供するために、２種以上の様々なタンパク質由来の抗原性エピトープを使用できる。複数の病原体タンパク質由来の融合エピトープの使用は、感染宿主における抗病原体抗体を検出するために増加した感受性を提供すると期待できる。融合タンパク質を生成する方法は、当業者には周知である。そのようなタンパク質は、例えば二官能架橋試薬を用いる化学結合によって、完全融合タンパク質の新規合成によって、または第１タンパク質もしくはペプチドをコードするＤＮＡ配列を、第２ペプチドもしくはタンパク質をコードするＤＮＡ配列へ結合させ、その後に無傷融合タンパク質を発現させることによって生成できる。
【０２００】
＜タンパク質の精製＞
所定の実施形態では、タンパク質もしくはペプチドは単離または精製できる。タンパク質精製技術は、当業者には周知である。これらの技術は、１つのレベルでは、細胞、組織もしくは器官の均質化およびポリペプチドおよび非ポリペプチド分画への粗分画化を含む。当該のタンパク質もしくはポリペプチドは、部分もしくは完全精製（または、均質性への精製）を達成するためにクロマトグラフィおよび電気泳動法技術を用いてさらに精製することができる。純粋ペプチドを調製するために特に適合する分析方法は、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル排除クロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、親和性クロマトグラフィ、免疫親和性クロマトグラフィおよび等電点電気泳動法である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）または均一ＨＰＬＣである。
【０２０１】
タンパク質精製において使用するために適合する様々な技術は、当業者には周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いた沈降法、またはその後に遠心分離；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイトおよび親和性クロマトグラフィなどのクロマトグラフィステップ；等電点電気泳動法；ゲル電気泳動法を行う熱変性法、ならびにこれらおよびその他の技術の組み合わせが含まれる。当分野において一般に知られているように、様々な精製ステップを実施する順序は変化させることができる、または所定のステップを削除でき、それでも実質的に精製されたタンパク質もしくはペプチドを調製するための適切な方法を生じさせると考えられている。
【０２０２】
タンパク質もしくはペプチドをそれらの最も精製された状態で常に提供する一般的要件は存在しない。実際に、実質的にあまり精製されていない生成物が所定の実施形態では有用性を有することが想定されている。部分精製は、小数の精製ステップを組み合わせて使用することによって、または同一の一般的精製スキームの様々な形態を利用することによって遂行できる。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実行されるカチオン交換カラムクロマトグラフィは、一般に、低圧クロマトグラフィシステムを利用する同一技術より何倍も大きな精製を生じさせると理解されている。低度の相対精製を示す方法は、タンパク質生成物の全回収において、または発現したタンパク質の活性を維持することにおいて長所を有することがある。
【０２０３】
親和性クロマトグラフィは、単離すべき物質とそれに特異的に結合できる分子との間の特異的親和性に基づくクロマトグラフィ方法である。これは、受容体−リガンドタイプの相互作用である。カラム物質は、結合パートナーの一方を不溶性マトリックスへ共有結合させることによって合成される。カラム物質は、次に溶液からその物質を特異的に吸着することができる。溶離は、条件を結合が発生しない条件（例えば、変化したｐＨ、イオン強度、温度など）に変化させることによって発生する。マトリックスは、それ自体は分子を任意の有意な程度まで吸着しない、そして広範囲の化学的、物理的および熱的安定性を有する物質でなければならない。リガンドは、その結合特性に影響を及ぼさないような方法で結合しなければならない。リガンドは、さらに比較的密な結合を提供しなければならない。さらに、サンプルまたはリガンドを破壊せずに物質を溶離させることが可能でなければならない。
【０２０４】
＜合成ペプチド＞
タンパク質もしくはペプチドは、従来型技術にしたがって、溶液中または固体支持体上で、全体として、もしくは部分的に合成できる。様々な自動合成装置は市販で入手することができ、知られているプロトコルにしたがって使用できる。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，（１９８４）；Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９８６）；ａｎｄ  Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９７９）を参照されたい。通常は約６から約３５〜５０アミノ酸までの短いペプチド配列は、そのような方法によって容易に合成できる。または、当該のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクター内に挿入され、適切な宿主細胞に変換もしくは形質導入され、発現のために適切な条件下で培養される組換えＤＮＡ技術を使用できる。
【０２０５】
＜抗体＞
用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を意味するために使用され、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）などの抗体フラグメントを含む。様々な抗体をベースとする構築物およびフラグメントを調製して使用する技術は、当分野において周知である。抗体を調製して特性付けるための手段もまた、当分野において周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照）。様々な当該の病原体を検出するために使用される抗体もまた、広範囲の知られている入手起源から市販で入手できる。例えば、様々な抗体分泌ハイブリドーマ系は、アメリカンタイプ・カルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、メリーランド州ロックビル）から入手できる。
【０２０６】
ポリクローナル抗体は、動物を免疫源により免疫し、その免疫動物から抗血清を採取することによって調製できる。抗血清を製造するためには、広範囲の動物種を使用できる。典型的には、抗血清を製造するために使用する動物は、非ヒト動物、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ブタもしくはウマである。ウサギは相当に大量の血液量を有するために、ウサギはポリクローナル抗体を製造するために好ましい選択である。
【０２０７】
ポリクローナルおよびモノクローナル両方の抗体は、当業者には一般に知られているように、従来型免疫技術を用いて調製できる。抗原性エピトープを含有する組成物は、ウサギもしくはマウスなどの１種もしくは複数の実験動物を免疫するために使用でき、それらは次に特異的抗体を生成するように進行する。ポリクローナル抗血清は、抗体生成の時間を置いた後に、単純に動物に出血させ、全血から血清サンプルを調製することによって入手できる。
【０２０８】
当分野において周知のように、所与の組成物はその免疫原性において相違する可能性がある。このため、免疫源をキャリアへ結合させることによって達成できるように、宿主免疫系を増強することがしばしば必要である。典型的かつ好ましいキャリアは、アオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オバルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンもまた、キャリアとして使用できる。抗原をキャリアタンパク質へコンジュゲートさせるための手段は当分野において周知であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビス−ビアゾ化ベンジジンが含まれる。
【０２０９】
同様に当分野において周知のように、特定免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激因子の使用によって強化できる。典型的かつ好ましいアジュバントには、フロイント完全アジュバント（殺滅された結核菌を含有する免疫応答の非特異的刺激因子）、フロイント不完全アジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。
【０２１０】
ポリクローナル抗体の製造において使用される免疫原組成物の量は、免疫源の性質ならびに免疫に使用される動物に依存して変動する。免疫源を投与するためには様々な経路を使用できる（皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹腔内）。ポリクローナル抗体の製造は、免疫後の様々な時点に免疫動物から血液をサンプリングすることによって監視できる。第２回のブースト注射もまた行うことができる。ブースト注射および力価測定のプロセスは、適切な力価が達成されるまで繰り返される。所望レベルの免疫原性が入手されると、免疫動物を出血させて血清を単離および貯蔵することができる、および／または動物を使用してモノクローナル抗体を生成できる。
【０２１１】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，１９６，２６５号に例示されている技術などの、周知の技術の使用を通して容易に調製できる。典型的には、この技術は適切な動物を選択された免疫原組成物で免疫するステップを含む。免疫組成物は、抗体産生細胞を刺激するために有効な方法で投与される。マウスおよびラットなどの齧歯類由来の細胞が好ましいが、ウサギ、ヒツジ、カエル細胞の使用もまた可能である。マウスは好ましく、中でもＢＡＬＢ／ｃマウスは最も日常的に使用され、一般に高パーセンテージの安定性融合を生じるので最も好ましい。
【０２１２】
免疫後に、抗体、詳細にはＢリンパ球（Ｂ細胞）を産生する可能性がある体細胞が、ｍＡｂ生成プロトコルに使用するために選択される。これらの細胞は、生検切除した脾臓、扁桃もしくはリンパ節から、または末梢血サンプルから入手できる。脾臓細胞および末梢血細胞は、前者はそれらが分裂中形質芽球期にある抗体産生細胞の豊富な起源であり、後者は末梢血を入手可能であるために好ましい。しばしば、１パネルの動物が免疫されて最高抗体力価を備える動物の脾臓が除去され、シリンジを用いてその脾臓を均質化することによって脾臓リンパ球が入手される。典型的には、免疫したマウス由来の脾臓は、およそ５×１０7〜２×１０8個のリンパ球を含有する。
【０２１３】
免疫動物由来の抗体産生Ｂリンパ球は、次に一般には免疫された動物と同一種の細胞である不死骨髄腫細胞の細胞と融合させられる。ハイブリドーマ産生融合方法において使用するために適合する骨髄腫細胞系は、好ましくは非抗体産生性であり、高融合効率、ならびに所望の融合細胞（ハイブリドーマ）だけの増殖を指示する所定の選択培地中では増殖不能にさせる酵素欠乏を有する。
【０２１４】
当業者には知られているように、多数の骨髄腫細胞のうちの任意の１つを使用できる。例えば、免疫動物がマウスである場合は、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌを使用できる；ラットについては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０を使用できる；ならびにＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６は、全部が細胞融合と結び付けて有用である。
【０２１５】
抗体産生脾臓もしくはリンパ節細胞および骨髄腫細胞のハイブリッドを生成するための方法は、通常は、体細胞を骨髄腫細胞と２：１の比率で混合するステップを含むが、この比率は細胞膜の融合を促進する（化学的または電気的）物質の存在下では、約２０：１〜約１：１までそれぞれ変動することがある。センダイウイルスを用いる融合方法、および３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用する方法が記載されている。電気誘導融合方法の使用もまた適切である。
【０２１６】
融合方法は、通常は、約１×１０-6〜１×１０-8の低頻度で生育可能なハイブリッドを生成する。しかし、これは生育性の融合ハイブリッドが選択培地中で培養するステップによって母体の非融合細胞（特に、通常は無期限に分化し続ける未融合骨髄腫細胞）から識別されるので、問題を有していない。選択的培地は、一般に、組織培養培地中でヌクレオチドの新規合成を遮断する物質を含有する培地である。典型的かつ好ましい物質は、アミノプテリン、メトトレキセート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートは、プリンおよびピリミジン両方の新規合成を遮断するが、アザセリンはプリン合成だけを遮断する。アミノプテリンもしくはメトトレキセートが使用される場合は、培地にはヌクレオチドの起源としてヒポキサンチンおよびチミジンが補給される（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合は、培地にはヒポキサンチンが補給される。
【０２１７】
好ましい選択培地は、ＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路を作動させることのできる細胞だけが、ＨＡＴ培地中で生残することができる。骨髄腫細胞は、例えばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）などのサルベージ経路の重要な酵素が欠けているので、生残できない。Ｂ細胞はこの経路を作動させることができるが、それらは培養中では限定された寿命しか有しておらず、一般には約２週間以内に死滅する。このため、選択培地中で生残できる細胞だけが、骨髄腫およびＢ細胞から形成されたハイブリッドである。
【０２１８】
この培養するステップは、それから特異的ハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート内での単一クローン希釈によって細胞を培養するステップ、およびその後に所望の反応性について個別クローナル上清を試験するステップ（約２〜３週間後）によって実施される。このアッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなどのように感受性、単純かつ迅速でなければならない。
【０２１９】
次に選択されたハイブリドーマは、連続的に希釈されて、個別抗体産生細胞系中にクローン化されるが、それらのクローンは次にｍＡｂを提供するために無期限に増殖させることができる。これらの細胞系は、２つの基本方法においてｍＡｂ産生のために活用できる。ハイブリドーマのサンプルは、最初の融合のための体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用されたタイプの組織適合性動物内へ（しばしば腹腔内へ）注射できる。注射された動物は、融合した細胞ハイブリッドによって産生した特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生する。血清もしくは腹水などの動物の体液を採取すると、高濃度でｍＡｂを提供することができる。個別細胞系は、さらにまた、ｍＡｂが自然にそれから容易に高濃度で入手できる培養培地内へ分泌されるインビトロで培養することができる。いずれかの手段によって生成したｍＡｂは、所望であれば、濾過、遠心分離、ならびにＨＰＬＣもしくは親和性クロマトグラフィなどの様々なクロマトグラフィ法を用いてさらに精製できる。
【０２２０】
［実施例］
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するために含まれている。当業者であれば、以下の実施例において開示した技術は本発明者らが本発明の実践において良好に機能することを発見した技術を示していること、したがってその実践のために好ましい様式を構成すると見なせることを理解できるはずである。しかし、当業者であれば、本開示を参考にすると、本明細書に開示した特定の実施形態において多数の変更を加えられること、そしてそれでも本発明の精神および範囲から逸脱せずに同様もしくは類似の結果を得られることを理解できるはずである。
【実施例１】
【０２２１】
＜ウシ結核症を試験するための典型的プロトコル＞
上記で考察したように、当該の標的病原体内で発現した１つまたは複数のペプチド配列または他の抗原を含む捕捉プローブは、被験者から入手した血液、血清もしくは他のサンプル中の抗病原体抗体に結合させてその存在を検出するために使用できる。当業者は、検出対象の標的は限定されないこと、およびそれに対する循環中宿主抗体が存在する任意の標的は類似プロトコルを用いて検出できることを明確に理解する。これとは逆に、当該の標的に対する抗体は、捕捉プローブとして使用でき、そして標的抗原の存在は、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡまたは当分野において周知の他の技術によって検出できる。
【０２２２】
＜材料および方法＞
＜組換え抗原（ＲｅｃＡｇ）プローブの生成＞
ウシ結核症検出についてのこの典型的実施形態では、使用される捕捉プローブは、ＣＦＰ−１０およびＥＳＡＴ−６をコードする結核菌Ｈ３７Ｒｖ株ゲノム内の２つの隣接オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から発現した組換え融合タンパク質であった。それらの２つの遺伝子産物は、ＣＦＰ−１０のＴＧＡ終止コドンがＧｌｙ（ＧＧＡ）へ変化させられ、追加のＧ残基が正しいリーディングフレームを保持するためにＣＦＰ−１０およびＥＳＡＴ−６の間の３２ヌクレオチド介在領域内で下流に挿入されたＰＣＲ−指定突然変異誘発のプロセスによってフレーム内で融合させられた。これはＯＲＦ間領域から介在１２「ナンセンス」アミノ酸を備える完全ＥＳＡＴ−６遺伝子産物（９５アミノ酸）へ融合した完全ＣＦＰ−１０遺伝子産物（１００アミノ酸）からなる融合タンパク質を生じさせた。組換え抗原（ＲｅｃＡｇ）は次に、感染した動物においてウシ抗体に対するプローブとしてフェライトビーズへ付着させた。
ＣＦＰ−１０アミノ酸配列
ＭＡＥＭＫＴＤＡＡＴＬＡＱＥＡＧＮＦＥＲＩＳＧＤＬＫＴＱＩＤＱＶＥＳＴＡＧＳＬＱＧＱＷＲＧＡＡＧＴＡＡＱＡＡＶＶＲＦＱＥＡＡＮＫＱＫＱＥＬＤＥＩＳＴＮＩＲＱＡＧＶＱＹＳＲＡＤＥＥＱＱＱＡＬＳＳＱＭＧＦ（配列番号１）
ＣＦＰ−１０ヌクレオチド配列
ａｔｇｇｃａｇａｇａｔｇａａｇａｃｃｇａｔｇｃｃｇｃｔａｃｃｃｔｃｇｃｇｃａｇｇａｇｇｃａｇｇｔａａｔｔｔｃｇａｇｃｇｇａｔｃｔｃｃｇｇｃｇａｃｃｔｇａａａａｃｃｃａｇａｔｃｇａｃｃａｇｇｔｇｇａｇｔｃｇａｃｇｇｃａｇｇｔｔｃｇｔｔｇｃａｇｇｇｃｃａｇｔｇｇｃｇｃｇｇｃｇｃｇｇｃｇｇｇｇａｃｇｇｃｃｇｃｃｃａｇｇｃｃｇｃｇｇｔｇｇｔｇｃｇｃｔｔｃｃａａｇａａｇｃａｇｃｃａａｔａａｇｃａｇａａｇｃａｇｇａａｃｔｃｇａｃｇａｇａｔｃｔｃｇａｃｇａａｔａｔｔｃｇｔｃａｇｇｃｃｇｇｃｇｔｃｃａａｔａｃｔｃｇａｇｇｇｃｃｇａｃｇａｇｇａｇｃａｇｃａｇｃａｇｇｃｇｃｔｇｔｃｃｔｃｇｃａａａｔｇｇｇｃｔｔｃＴＧＡ（配列番号２）
ＯＲＦ間領域
ｃｃｃｇｃｔａａｔａｃｇａａａａｇａａａｃｇｇａｇｃａａａａａｃ（配列番号３）
ＥＳＡＴ−６アミノ酸配列
ＭＴＥＱＱＷＮＦＡＧＩＥＡＡＡＳＡＩＱＧＮＶＴＳＩＨＳＬＬＤＥＧＫＱＳＬＴＫＬＡＡＡＷＧＧＳＧＳＥＡＹＱＧＶＱＱＫＷＤＡＴＡＴＥＬＮＮＡＬＱＮＬＡＲＴＩＳＥＡＧＱＡＭＡＳＴＥＧＮＶＴＧＭＦＡ（配列番号４）
ＥＳＡＴ−６ヌクレオチド配列
ａｔｇａｃａｇａｇｃａｇｃａｇｔｇｇａａｔｔｔｃｇｃｇｇｇｔａｔｃｇａｇｇｃｃｇｃｇｇｃａａｇｃｇｃａａｔｃｃａｇｇｇａａａｔｇｔｃａｃｇｔｃｃａｔｔｃａｔｔｃｃｃｔｃｃｔｔｇａｃｇａｇｇｇｇａａｇｃａｇｔｃｃｃｔｇａｃｃａａｇｃｔｃｇｃａｇｃｇｇｃｃｔｇｇｇｇｃｇｇｔａｇｃｇｇｔｔｃｇｇａｇｇｃｇｔａｃｃａｇｇｇｔｇｔｃｃａｇｃａａａａａｔｇｇｇａｃｇｃｃａｃｇｇｃｔａｃｃｇａｇｃｔｇａａｃａａｃｇｃｇｃｔｇｃａｇａａｃｃｔｇｇｃｇｃｇｇａｃｇａｔｃａｇｃｇａａｇｃｃｇｇｔｃａｇｇｃａａｔｇｇｃｔｔｃｇａｃｃｇａａｇｇｃａａｃｇｔｃａｃｔｇｇｇａｔｇｔｔｃｇｃａｔａｇ（配列番号５）
完全ヌクレオチド配列
ａｔｇｇｃａｇａｇａｔｇａａｇａｃｃｇａｔｇｃｃｇｃｔａｃｃｃｔｃｇｃｇｃａｇｇａｇｇｃａｇｇｔａａｔｔｔｃｇａｇｃｇｇａｔｃｔｃｃｇｇｃｇａｃｃｔｇａａａａｃｃｃａｇａｔｃｇａｃｃａｇｇｔｇｇａｇｔｃｇａｃｇｇｃａｇｇｔｔｃｇｔｔｇｃａｇｇｇｃｃａｇｔｇｇｃｇｃｇｇｃｇｃｇｇｃｇｇｇｇａｃｇｇｃｃｇｃｃｃａｇｇｃｃｇｃｇｇｔｇｇｔｇｃｇｃｔｔｃｃａａｇａａｇｃａｇｃｃａａｔａａｇｃａｇａａｇｃａｇｇａａｃｔｃｇａｃｇａｇａｔｃｔｃｇａｃｇａａｔａｔｔｃｇｔｃａｇｇｃｃｇｇｃｇｔｃｃａａｔａｃｔｃｇａｇｇｇｃｃｇａｃｇａｇｇａｇｃａｇｃａｇｃａｇｇｃｇｃｔｇｔｃｃｔｃｇｃａａａｔｇｇｇｃｔｔｃＧＧＡｃｃｃｇｃｔＧａａｔａｃｇａａａａｇａａａｃｇｇａｇｃａａａａａｃａｔｇａｃａｇａｇｃａｇｃａｇｔｇｇａａｔｔｔｃｇｃｇｇｇｔａｔｃｇａｇｇｃｃｇｃｇｇｃａａｇｃｇｃａａｔｃｃａｇｇｇａａａｔｇｔｃａｃｇｔｃｃａｔｔｃａｔｔｃｃｃｔｃｃｔｔｇａｃｇａｇｇｇｇａａｇｃａｇｔｃｃｃｔｇａｃｃａａｇｃｔｃｇｃａｇｃｇｇｃｃｔｇｇｇｇｃｇｇｔａｇｃｇｇｔｔｃｇｇａｇｇｃｇｔａｃｃａｇｇｇｔｇｔｃｃａｇｃａａａａａｔｇｇｇａｃｇｃｃａｃｇｇｃｔａｃｃｇａｇｃｔｇａａｃａａｃｇｃｇｃｔｇｃａｇａａｃｃｔｇｇｃｇｃｇｇａｃｇａｔｃａｇｃｇａａｇｃｃｇｇｔｃａｇｇｃａａｔｇｇｃｔｔｃｇａｃｃｇａａｇｇｃａａｃｇｔｃａｃｔｇｇｇａｔｇｔｔｃｇｃａｔａｇ（配列番号６）
【０２２３】
上述したように、ＣＦＰ−１０コーディング配列の３’末端にあるＴＧＡ終止コドンは、ＧＧＡグリシンコドンをコードするグリシンへ突然変異させた。さらに、Ｇ残基は、ＣＦＰ−１０配列とフレーム単位で融合したＥＳＡＴ−６コーディング配列を作製するために突然変異ＧＧＡコドンから６塩基下流に挿入した。組換えＣＦＰ−ＥＳＡＴ抗原は、ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（カリフォルニア州サンディエゴ）によって調製された。
【０２２４】
＜磁気ビーズの融合タンパク質へのコンジュゲート＞
ＣＦＰ−１０：ＥＳＡＴ−６組換え融合タンパク質抗原（ＣＦＰ−ＥＳＡＴ）は、結合プロセスにおいてわずかな修飾を加えて、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（インディアナ州フィッシャーズ）からのＣＯＯＨミクロスフェア用のＰｏｌｙＬｉｎｋタンパク質結合キットを用いてフェライトビーズへコンジュゲートさせた。プロテインＡおよび他の干渉物質を含んでいない融合タンパク質は、アクリルカルボキシル（ＣＯＯＨ）がコーティングされたフェライトビーズへ共有結合した。手短には、カルボキシル基は、活性エステルを作製するためにこれらの基と反応するＮＨＳ修飾を備える水溶性カルボジイミドを用いて活性化した。このエステルは、ビーズにコンジュゲートされるタンパク質上の第一級アミンに対して反応性である。代表的プロトコルは、データシート＃６４４（ＰｏｌｙＬｉｎｋタンパク質結合キットに添付されている）に開示されている。
【０２２５】
ストックのフェライトビーズ−ＣＦＰ−ＥＳＡＴコンジュゲートは、グリシンアミドバッファ中で遮断かつ洗浄した後、微生物阻害剤を備える標準希釈バッファ中に２ｍｇ／ｍＬのフェライトビーズ濃度へ懸濁させた。使用前に、ビーズは、ウシＴＢアッセイに使用するために標準希釈バッファ（１０ｍＭのＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＰｒｏＣｌｉｎ）中の濃度０．０４ｍｇ／ｍＬへ希釈した。希釈したビーズ調製物のアリコートを使用して、分析される各サンプルのための希釈血清サンプルをスパイクした。
【０２２６】
＜材料＞
カルボキシル（ＣＯＯＨ）コーティングしたフェライトミクロスフェアおよびＰｏｌｙＬｉｎｋタンパク質結合キットは、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（インディアナ州フィッシャーズ）から入手した。ビオチン化ヤギ抗ウシＩｇＭ（μ鎖特異的）は、ＫＰＬ社（メリーランド州ゲーサーズバーグ）から入手した。ＨＲＰ−ＳＡ溶液、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏルミノール／エンハンサー溶液およびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ安定性過酸化物溶液は、Ｐｉｅｒｃｅ社（イリノイ州ロックフォード）から入手した。
【０２２７】
＜プロトコル＞
Ｍｂｖ感染についての迅速診断テストのための典型的な段階的プロトコルを以下に提供する。より一般的には、典型的テストでは、血清サンプルの１：５０希釈液は、１．５ｍＬのエッペンドルフＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ内の９８０μＬの標準希釈バッファ（１０ｍＭのＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＰｒｏＣｌｉｎ）へ２０μＬの全ウシ血清（好ましくはアジ化物無含有）を加えることによって作製した。次にこのサンプル２８０μＬを２本目のエッペンドルフＬｏＢｉｎｄチューブへ分注し、０．０５ｍｇ／ｍＬのＥＳＡＴ−６／ＣＦＰ−１０  Ｂａｎｇｓ  Ｂｉｏｍａｇビーズコンジュゲートが良好に分散した溶液７０μＬをウシ血清サンプル中にピペットで移し、非磁気ラック位置で１５分間、室温でインキュベートした。
【０２２８】
このチューブを磁気ラック内へぴったりと挿入し、７２０μＬの洗浄バッファ（１０ｍＭのＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）をサンプルに加え、これをさらに２分間にわたり磁場内でインキュベートした。サンプルチューブは磁気ラック内に残したまま、全サンプル液はＬ−１０００ピペットチップをチューブの底部へ降下させ、バッファおよびサンプル全部を吸引するステップによって注意深く取り除いた（磁場内には容器の壁にしっかりと付着したフェライトビーズの２つの分離したドット「スネークアイ（ｓｎａｋｅ−ｅｙｅｓ）」が残される）。次にチューブをラックから取り外し、９００μＬのＰＢＳ−０．０５％のＴｗｅｅｎ洗浄バッファを用いてビーズを洗浄した。さらにサンプルは、ビーズに付着させるために２分間、磁場内に置いた。３回の洗浄（最初は７２０μＬのスパイクおよびその後２回の洗浄）が達成されるように再び、洗浄ステップを繰り返した。２５０μＬの透析したＫＰＬ（μ鎖特異的）ビオチン化抗ウシＩｇＭ（標準希釈バッファ中で０．３μｇ／ｍＬ）を使用してサンプル壁から溶液中に戻すためにビーズを洗浄した。ビーズは、ビオチン化抗体とともに室温で１０分間インキュベートした。
【０２２９】
サンプルを再び７２０μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ洗浄バッファを用いてスパイクし、磁石上でインキュベートし、最初のサンプルインキュベーションステップについて上述したとおりに洗浄した。フェライトビーズしか含有していないチューブを再び磁場から取り外し、２００μＬのＨＲＰＳＡ（標準希釈バッファ中で０．２μｇ／ｍＬ）を使用してビーズを溶液中へ分散させ、それらを室温で５分間インキュベートした。最後に、同一プロセスを使用して、サンプルに７２０μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ洗浄バッファでスパイクし、分散および２分間間隔でビーズを付着させることによって２回洗浄した。次に各チューブへ２００μＬのルミナール−過酸化物の１：１混合液（Ｐｉｅｒｃｅ社）を加え、ビーズをこの溶液中に一様に分散させた。
【０２３０】
全２００μＬのルミノール−過酸化物−ビーズ複合体を透明分離型ウエル内に移し、イメージングのために１２サンプルのｃｒｉｂ内へ挿入した（１サンプルは常にＴＢについての検査結果が陰性であるプールウシ血清からなる陰性コントロールサンプルであった）。放出された光子は、上述したＴＯＡＤ（商標）装置上で１０分間にわたり捕捉される。陰性コントロールならびにバックグラウンド（４つのバックグラウンドフィールド上の平均シグナルとして決定される）を含む、各サンプルについて観察された数値は、次に自動閾値指定を用いるソフトウエア上で処理した。結果は、プログラムによってＭｂｖ陰性または陽性と決定された。陽性は、上述したように２回のリフレックスラウンドで再検査した。この一般的方法は、当分野において周知の技術による日常的実験がその後に実施されても、または日常的実験によって修飾されてもよい。以下では本明細書に請求した方法において使用するより詳細な典型的な段階的プロトコルについて説明する。
【０２３１】
＜詳細なプロトコル＞
当業者は、以下に列挙する詳細なプロトコルステップが本明細書に請求した方法の好ましい実施形態を表すこと、様々なステップ、濃度、量、時間などは日常的実験によって本明細書に請求した方法の範囲内で変更できることを明確に理解する。全血清希釈液は、好ましくは作製するべきで、全検査は１．５ｍＬのエッペンドルフＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ内で実施すべきである。各ｃｒｉｂセット（１２サンプル）内には、１例の陰性コントロールサンプルを含めた。ＴＢについての検査結果が陰性であったプールウシ血清（１：５０希釈液）の２８０μＬアリコートを個別血清サンプルの代わりに使用し、試験されるウシサンプルと正確に同様に処理した。
【０２３２】
陽性コントロールを含めるかどうかは任意であるが、陽性コントロールを用いて定期的に行うことはアッセイ試薬の品質管理試験のためには良い考えである。標準ＰｒｉＴｅｓｔ希釈バッファ（１０ｍＭのＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＰｒｏＣｌｉｎ）中で作製した０．０４ｍｇ／ｍＬのＢＢＳＡコンジュゲート化Ｂａｎｇｓ  Ｂｉｏｍａｇビーズの溶液５０μＬは、１．５ｍＬのエッペンドルフＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ内へ分注した。ビーズを磁石に付着できる量にするためにさらに２８０μＬの希釈バッファを加えた。陽性コントロールは、以下のステップ６（洗浄ステップ）で始まる他のサンプルと正確に同様に処理した。
１）２０μＬの全ウシ血清（アジ化ナトリウム無含有）を９８０μＬの希釈バッファ（１０ｍＭのＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＰｒｏＣｌｉｎ）へ、そしてアリコート２８０μＬを１．５ｍＬのエッペンドルフＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブへ加えることによって検査対象の各血清サンプルの１：５０希釈液を作製する。
２）０．０５ｍｇ／ｍＬのＥＳＡＴ−６／ＣＦＰ−１０  Ｂａｎｇｓ  Ｂｉｏｍａｇビーズコンジュゲートのしっかりと分散した溶液７０μＬを２８０μＬのウシ血清サンプル中にピペットで移し、室温で１５分間インキュベートする。各チューブを磁気ウエル内にぴったりと挿入し、サンプルに７２０μＬの洗浄バッファ（１０ｍＭのＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）を用いてスパイクする。磁石に曝露させたチューブの側面上でフェライトビーズの凝縮斑である「ピンぞろ」を形成させるためにさらに２分間、磁石上でインキュベートする。
３）Ｌ−１０００ピペットをチューブ内に挿入して、先端で気泡が観察されるまで平滑で安定した流れの中で底部から液体を吸引することによって、側面に結合したビーズを乱さないようにチューブから液体を注意深く吸引する（全プロトコルを通して、１つのサンプルに１つのピペットの先端を専用で使用した）。
４）磁気ウエルからチューブを取り外した後、９００μＬの洗浄バッファを加え、チューブの壁に接触させたチップからピペット溶液を緩徐に出したり入れたりすることによってビーズを再び溶液内に静かに混合する（発泡を最小限に抑えるように注意を払う）。チューブを磁気ウエル内に戻し、２分間インキュベートする。上述したように結合したビーズを妨害しないように液体をピペットで除去する。全３回の洗浄を行うためにこのステップをもう１回繰り返す（初回スパイクおよびその後２回の洗浄）。
５）チューブを磁気ウエルから取り外した後、希釈バッファ中で０．３μｇ／ｍＬで調製した、２５０μＬの透析したＫＰＬビオチンコンジュゲート化親和性精製ヤギ抗ウシＩｇＭ（μ鎖特異的）抗体を各サンプルに加え、静かに手作業で溶液内に攪拌することによってビーズを分散させる。室温で１０分間インキュベートし、磁気ウエル内にぴったりと挿入し、７２０μＬの洗浄バッファでスパイクし、さらに２分間インキュベートする。
６）上記のステップ４に記載したように、追加の２回の洗浄ステップを用いて、ステップ３と同様に注意深く液体をピペットで除去する。サンプルチューブを磁気ウエルから取り外す。
７）各チューブに２００μＬのＰｉｅｒｃｅ  ＨＲＰ−ＳＡ（希釈バッファ中で０．２μｇ／ｍＬで調製した）を加え、ビーズを溶液中に分散させ、室温で５分間インキュベートする。磁気ウエル内にぴったりと挿入し、サンプルに７２０μＬ洗浄バッファをスパイクし、室温で２分間インキュベートする。
８）液体をピペットで注意深く除去し、ステップ４で上述したようにさらに２回洗浄する。サンプルチューブを磁気ウエルから取り外す。
９）１：１の比率でＰｉｅｒｃｅ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏルミノール／エンハンサーとＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ安定性過酸化物の溶液を調製し、２００μＬを各サンプルチューブに加える。各チューブの内容物を静かに手作業で攪拌し、ビーズを溶液中に分散させるためにＬ−２００ピペットを用いてチューブの側面へ液体を注ぎ込む。全２００μＬ量を各サンプルチューブから透明なプラスチック製分離型ウエルへ移し、１２サンプルのｃｒｉｂ内へ挿入する（そのサンプルの１つはプールＭｂｏｖ陰性血清からなる陰性コントロール（１：５０希釈液）である）。
１０）放出された光子は上述したＴＯＡＤ（商標）装置上で１０分間にわたり捕捉し、冷却ＣＣＤ高分解能カメラを用いて最適化条件下でソフトウエアを用いて分析する。各サンプルおよび陰性コントロールならびにバックグラウンド（４つのバックグラウンドフィールドの平均値として決定）について観察された数値を、リフレックステスト−自動閾値調整Ｅｘｃｅｌシートテンプレート内に挿入する。各サンプルについての結果は、エクセルテンプレートにおいてアルゴリズムによって分析され、Ｍｂｏｖ陰性または陽性の指定が与えられる。この初回ラウンドのスクリーニングにおける陽性は、上述したように正確に再検査される（リフレックステスト＃１）。この第２回検査ラウンドの陽性は、陽性状態（Ｍ．ボビス感染）を確認するために最後の１回（リフレックステスト＃２）で試験される。
【０２３３】
＜結果＞
ＰｒｉＴｅｓｔ高速診断テストおよびリフレックス・サプリメンタルテストを用いて入手された３回の感受性および特異性盲検試験からの結果は、１つの９９サンプル試験にプールされた。初回スクリーニングの結果は表１０に示されている。アッセイは、７０ｕＬのフェライトコンジュゲートＧＷ  ＥＳＡＴ、０．０４ｍｇ／ｍＬのプローブ、１０ｍＭのＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０洗浄バッファ、０．３ｕｇ／ｍＬのＩｇＭ、１０ｍＭのＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＰＣ抗体溶液、０．２ｕｇ／ｍＬのＨＲＰＳＡ、１０ｍＭのＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＰＣ、および１５、１０、５分間のインキュベーションサイクルを用いて上述したように実施した。３回の検査は、８８の平均感受性、８４の特異性、０．９４のＲＯＣ、５２のＰＰＶおよび９６のＮＰＶを示した。１１例の血清および１例の陰性コントロールの単一ｃｒｉｂセットについての代表的な画像は、図１５に示されている。
【０２３４】
リフレックス・サプリメンタルテストの長所は、表１３に示されている。リフレックス・サプリメンタルテスト方法が、入手される偽陽性検査結果の数を減少させることは明白である。血清を対象とする５００回を超える試験が完了している。およそ２０例の陽性サンプルおよびより多くの陰性血清サンプルが、アッセイの有効性に影響を及ぼす因子を同定するために１：５０の希釈率で使用されてきた。以下では所定のこれらの因子について考察する。
【０２３５】
＜Ｍｂｖ検出に温度が及ぼす作用＞
温度がアッセイに及ぼす作用は、結果を有意に変化させることがある。低温（約４℃）および高温（約３７℃）はどちらも、陽性および陰性血清サンプルを相互から識別することをはるかに困難にする。高温では、陰性血清を含む全サンプルは極めて強力に反応すると思われるので、極めて多くの光線が生成され、シグナルは本質的に識別不能になる。低温は、陰性および陽性血清どちらについてもシグナル消失を伴う全く正反対の作用を及ぼす。好ましい温度は、極めて室温に近い温度（約２５℃）であると思われる。
【０２３６】
＜Ｍｂｖ検出にｐＨが及ぼす作用＞
限定された分析に基づくと、最適のシグナルは約ｐＨ７．４で検出された。ｐＨを４．０へ低下させると、陽性血清についてのシグナルの顕著な減少が生じた。
【０２３７】
＜ビオチン化二次抗体＞
本アッセイでは、ビオチン化ＩｇＹ抗ウシＩｇＧ、ビオチン化ヤギＩｇＧ抗ウシＩｇＧおよびビオチン化ヤギＩｇＧ抗ウシＩｇＭを含む多数のビオチン化二次抗体が試験されてきた。組み合わせについてもまた試験されている。個別および組み合わせ試験は全部が陽性および陰性血清を様々な程度に識別することに成功したが、使用するのが最も単純で現在最適化されている抗体は、ビオチン化ヤギＩｇＧ抗ウシＩｇＭであった。０．２ｕｇ／ｍＬのＨＲＰ＿ＳＡを含む最適濃度は、標準希釈バッファ中で０．３ｕｇ／ｍＬのＩｇＭであった。
【０２３８】
＜プロテインＡの干渉＞
プロテインＡを含んでいないフェライトビーズコンジュゲートを調製するために大きな努力が費やされてきた。プロテインＡは、偽陽性検査結果および／または高度のバックグラウンドを生成してアッセイ発生を実質的に干渉することが見出された。ＲｅｃＡｇコンジュゲーション中に溶媒もしくは基質中に存在するプロテインＡは微量でさえ、ビオチン化抗体およびウシ血清抗体と強度に反応するビーズを生じさせた。微量汚染により、陰性コントロールについてのバックグラウンドシグナルは、陽性血清検査結果と同等以上に明るくなる。
【０２３９】
プロテインＡは、抗体精製スキームのために一般に使用され、抗体と共溶離させられることが多いので排除すべきであり、さもなければ偽陽性シグナルが観察される。これは、プロテインＡはＦｃおよびＦａｂ（少ない程度に）の両方に結合して他の抗体への架橋を可能にするために、抗体の使用方法とは無関係に言えることである。
【０２４０】
抗体をフェライトビーズへコンジュゲートしなければならず、混合液中にプロテインＡを有する場合は、プロテインＡの一部は最後に抗体と一緒にフェライトビーズ上に残る。本発明者らはフェライト上の抗体反応を典型的には一次抗体が認識したものと同一もしくは連結した標的に対するビオチン化抗体との抗体−抗原相互作用として検出するので、（ルミノールとのＨＲＰＳＡ反応によって）獲得された任意のビオチンは、一次抗体がエピトープを獲得していた確証であると推定される。フェライトビーズ上のプロテインＡおよび感受性検出器を用いると、プロテインＡはビオチン化二次抗体の一部を捕捉し、一次抗体に何が発生したのかとは無関係にアッセイ終了時に光検出を生じさせる。エピトープの不存在下では偽陽性が検出される。
【０２４１】
抗体がビオチン化され（二次抗体検出器であると意図されている）、プロテインＡが存在する場合は、プロテインＡの一部はビオチン化され、それがビオチン化抗体のＦｃおよびＦａｂと結合するので、透析後にさえ試薬中に残留する。プロテインＡは、エピトープが存在しない場合でさえ、それらを連結している２つの抗体間で架橋できるので、ビオチン化抗体はフェライト上で抗体に結合（またはニトロセルロース上でスポット化）して、同様に偽陽性検出を生じさせる。
【０２４２】
＜プロテインＡを除去するための抗体透析＞
低ｐＨでは、プロテインＡの抗体に対する親和性は劇的に低下する。本発明者らは、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ２．８）透析液を使用し、１００ｋＤ膜カットオフを備える透析チューブ内へ抗体を配置することによって解離を駆動し、透析液中でタンパク質に膜を通過させて捕捉するためにグリシンへカチオン樹脂を加える。典型的には、膜チューブ（ｆｌｏａｔａｌｙｚｅｒ）内の５ｍＬの抗体に対して１リットルの交換を行う、１ｇの強力カチオン交換樹脂をｐＨ２．８のグリシンに加え１６〜２４時間にわたり透析を実施して２〜３リットルの交換を実施する。透析液をｐＨ７．４の１０ｍＭのＰＢＳリットルに切り替え、さらに１６〜２４時間透析を継続して２〜３リットルの交換を実施する。そこで、グリシンバッファ（ｐＨ２．８）中の比率は２００：１×３、さらにＰＢＳ媒質中でも同一である（１００万倍の初回および１００万倍の第２回の交換比）。ビオチン化抗体を用いて作業をする場合は、１０ｍＭのＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＰｒｏｃｌｉｎ（抗微生物阻害因子）溶液を第２セットの交換のために使用する。これは、フェライトビーズのコンジュゲートもしくはビオチン化のための準備が整っているＰＢＳ中の第１実施例およびアッセイ作業のための適切なレベルへ希釈するための準備が整っている第２実施例において、極めて純粋な抗体を生じさせる。
【０２４３】
＜サイズが１０ｋＤ〜１００ｋＤのタンパク質からのプロテインＡの除去＞
このカテゴリーに含まれるタンパク質は、通常はエピトープである。プロテインＡが存在する場合は、プロテインＡが抗体へ非特異的に結合するので、そしてエピトープがプロテインＡによって汚染されていると推定されるので、イムノアッセイは正しく機能しない。プロテインＡへ結合させるために、結合が強力であるｐＨで抗体を使用する。第１ステップは、タンパク質溶液に、好ましくはビオチンを含んでいない適切なＩｇＧ抗体をスパイクするステップである。これはさらに、アッセイにおいて一般に使用される抗体とは異なるファミリー由来の抗体でなければならない。抗体は、典型的にはｐＨ７．４のＰＢＳ溶液中でタンパク質溶液と３０分間インキュベートする。次に濾過し、１００ｋＤの膜フィルタ（例Ａｍｉｃｏｎ  １００ｋＤフィルタ）を用いて濾液が収集する。４７ｋＤのプロテインＡは、通常はフィルタを通過するが、それに抗体が結合している場合は通過しない。当該のタンパク質はこのフィルタを通過するので、プロテインＡを含まずに収集される。収集したタンパク質は、ｐＨ７．４のＰＢＳに対して透析する。
【０２４４】
典型的な例は、約２７ｋＤであるＣＦＰ１０ＥＳＡＴ６である。用量１ｍＬの融合タンパク質の５００μｇ／ｍＬの溶液を５０μＬのヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（０．７μｇ／ｍＬ）でスパイクし、３０分間インキュベートする。この溶液をＡｍｉｃｏｎ  １００ｋＤフィルタへ移し、遠心分離機上に配置し、濾液を収集する。回収濾液量は約１ｍＬである。濾液は１０ｋＤの膜を備える１ｍＬの透析チューブへ移し、１Ｌの１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液中へ入れ、２４時間にわたり透析して３回交換する。次に新しく単離した融合タンパク質を修正プロトコルでフェライトビーズへコンジュゲートさせる。
【０２４５】
＜バッファおよび他の試薬からのプロテインＡの除去＞
多くの市販試薬がプロテインＡで汚染されている。全試薬は、プロテインＡが不注意にこれらの時点に混合液中に戻ってこないことを確実にするために、コンジュゲートステップを作動させる前に、３０ｋＤ  Ａｍｉｃｏｎフィルタに通して濾過する。例えば、コンジュゲート前のフェライトビーズのＭＥＳ洗浄ステップでは、およびビーズ活性化のためにＥＤＣおよびＮＨＳ試薬を調製する際には、ＭＥＳを事前に濾過する。クエンチングおよびその後のビーズの安定化のためにも、濾過した溶液もしくは清潔な溶液を使用する。
【０２４６】
＜血清サンプルにおける変動性＞
Ｍｂｖアッセイを開発する際の１つの困難は、サンプル分析における顕著な変動性に関連していた。同一サンプルを繰り返し試験した場合でさえ、陰性コントロールのプールに比較して比視感度における相当に大きな変動が頻回に観察された。変動問題を最小限に抑えるために多数の技術的修飾および方法の改良が開始されたが、それでもまだ任意の所与サンプルについては絶対ＲＬ値に関して再現性が不良であった。しかし最終的には、陰性血清および陽性血清は、陽性血清が陰性コントロールとして使用された陰性プール血清を永続的に大きく越えている限り相違する挙動を示すが、他方検査結果の高い陰性血清が一貫して高い検査結果を示すわけではないので、リフレックス・サプリメンタルテストによって排除できることが理解された。
【０２４７】
一般に、陽性血清についての閾値が、試験される複数の陰性血清についての平均値よりおよそ１．６標準偏差高く設定された場合には、極めて再現性の結果が達成されることが見出された。この閾値では、単純な非フレックススクリーニング（例えば、表１０）では、感受性は８８％および特異性は８４％であった。分析における何らかの考えられる偏りを回避するために、９９サンプル全部について無作為割り付けおよび盲験プロトコルを用いて試験した。陽性血清の一部は極めて弱い陽性であるように見えたが、それでも初回スクリーニングおよびサプリメンタル・リフレックステストの両方で検出された。初回スクリーニングとサプリメンタル・リフレックステストとの比較は表１０に示されている。極めて低い流行状態では、１００％未満の特異性を備える任意の試験は多数の偽陽性を生じさせ、陽性予測値をほぼ無用のものにすることを理解することが重要である。リフレックス・サプリメンタルテスト戦略を採用することによって、各回毎に試験される動物のプールが豊富になって集結したので、提供される感受性が高くなった。これは、偽陽性を排除して、確信を持って真に感染した動物を同定することを可能にする。
【０２４８】
本アッセイを最適化した決定因子の一部は、洗浄溶液中での０．０５％のＴｗｅｅｎの使用およびエッペンドルフＬｏＢｉｎｄチューブの使用に関連している。プラスチック製容器の表面上への極めて少量ではあるが予測不能な量の吸着は変動性の原因となっていたが、これをＬｏＢｉｎｄフォーマットでは低下させることができた。可能性のあるビーズ消失についての証拠を見出すために相当に大きな努力が費やされたが、これは観察された変動における重大な要素ではなかったと思われる。
【０２４９】
＜ＲＯＣ曲線＞
データは、任意の試験閾値位置が変動するにつれた感受性および特異性における変動を考慮に入れているＲＯＣ（受信者動作特性）曲線と呼ばれるまた別の統計学アプリケーションによって分析することもできる。試験がいかに有用であるのかは、真陰性と真陽性の２つの集団間を識別するときに、ＲＯＣ曲線下面積を試験することによって特徴付けられる。面積が０．５に近いほど検査結果は不良であり、１．０に近いほど検査結果は良好である。本明細書に開示した高速診断テストを用いた１回の初回スクリーニング後のＲＯＣ曲線下面積は、０．９４である（図１６）。
【０２５０】
＜陽性予測値および有病率＞
Ｃａｕｄａｌ  Ｆｏｌｄ法、Ｂｏｖｉｇａｍ法について報告された感受性および特異性値、ならびに本明細書に開示したリフレックス・サプリメンタルテストを用いて試験した９９例の無作為化畜牛血清におけるアッセイ結果を用いた、使用した方法に基づく陽性予測値（ＰＰＶ）の直接比較は以下に示されている（図１８）。所与の有病率に対して高いＰＰＶを示す試験は、どの動物が感染しているのかをより正確に予測する。陽性予測値は、式：
（群中の全真陽性血清数−非検出真陽性数）／検査において検出された全陽性数
によって計算される。
【０２５１】
本明細書に請求した方法が、陽性予測値において現行のアッセイ法であるＢｏｖｉｇａｍ法およびＣａｕｄａｌ  ｆｏｌｄ法より優れている点は、図１８から明らかである。リフレックス・サプリメンタルテストを用いると、高特異性（９９％）のために、低有病率試験環境において予測される偽陽性の大部分は、本明細書に開示したリフレックス・サプリメンタルテスト方法による偽陽性検査結果の数の減少によって明示されるように、間違って屠殺されることなく解放される。
【０２５２】
＜結論＞
本明細書には、マイコバクテリウム・ボビスに陽性感染した畜牛と未感染畜牛とを組換え体を用いて識別する高速（４時間未満）法が開示されている。９９サンプルのスクリーニングは、８８％の感受性および８４％の特異性を生じた。閾値を調整することによって、本試験は約７４％の特異性で陽性感染動物の１００％を捕捉するように設定できる。
【０２５３】
リフレックス・サプリメンタルテストは、偽陽性検査結果を減少または排除することによって改良された結果を生じさせる。本方法は、感受性（８８％）における何らの変化も伴わずに特異性を９９％へ増加させるためにほんの少数回の追加の試験しか必要としない。ＰＰＶに基づくと、本明細書に開示したリフレックス・サプリメンタルテスト方法は、現在当分野において知られている最も正確な試験であるＢｏｖｉｇａｍ法またはＣａｕｄａｌ  ｆｏｌｄテストのいずれよりも優れている。本方法は、より高速ではるかにより安価であり、実施するための技術的要件を必要としないので、畜牛におけるＭ．ボビスを根絶するための有用なツールである。
【０２５４】
必要とする唯一のサンプルは血清であるので、１回の訪問およびサンプルが、動物が感染しているかどうかを決定するために必要な情報を提供できる。血清は、試験を開始する準備が整うまでの不明確な期間中は冷凍保存することができる。適切と思われる場合は、血液のサンプリングにおける動物の免疫反応を変化させる懸念なしに反復検査を実施できる。
【実施例２】
【０２５５】
＜病原体の検出方法＞
本方法、組成物および装置は、ＣＰ１０＿ＥＳＡＴ融合タンパク質アッセイを用いて、結核感染動物の効果的かつ高速の同定および単離を可能にする。そのようなアッセイでは、マイコバクテリウム・ボビスの１つまたは複数の抗原性エピトープを提示する合成タンパク質もしくはペプチドが、Ｍ．ボビスに感染していることが疑われる動物由来の血液、血清または血漿と反応させられる。抗体の標的抗原への結合は、その動物がＭ．ボビスに感染していることを指示する。使用したＣＰ１０＿ＥＳＡＴ融合タンパク質はヒトなどの他の種に感染することが知られているマイクバクテリア種と免疫交差反応性を提示するので、当業者は、ヒト、野牛、シカ、またはマイクバクテリア種に対する潜在的キャリアであることが知られている他の動物などの他の種における結核を検出するために同一組成物、装置および方法を使用できることを明確に理解する。ＣＰ１０およびＥＳＡＴと同種であるタンパク質は、様々なマイコバクテリア種に対して周知の抗原である（例えば、ｖａｎ  Ｐｉｔｔｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２（１０），２００１）。タンパク質チップ、Ｇｒａｂｂｅｒ（商標）スライドまたは磁気ビーズなどの基質に付着させたＣＰ１０＿ＥＳＡＴ融合タンパク質を用いると、感染宿主血液中に存在する抗マイコバクテリア抗体もまた基質へ結合する。適切な洗浄ステップ後に、サンプル中の抗マイコバクテリア抗体の存在は、例えば、市販で入手できるビオチン化抗ウシ抗体の添加によって、そして次に上記で考察したようにコンジュゲート化ＨＲＰ−ＳＡ、過酸化物およびルミノールを用いる化学発光アッセイによって検出できる。
【０２５６】
ウシ血清の３３サンプルの予備セットは、上記で開示したプロトコルを用いて、盲験法で試験した。アッセイ条件下では、偽陰性検査結果はゼロであった。３３例の盲験サンプル中、第１ラウンドのアッセイでは４例の偽陽性検査結果が入手された。初回ラウンドで検査結果陽性であった各サンプルには、より高感受性で同一アッセイを用いて、リフレックス再検査にかけた。リフレックス再検査後、偽陽性の数はゼロに減少した。感受性対特異性を分析するＲＯＣ曲線は、本アッセイが約７０％の特異性で本質的に１００％の感受性を入手でき、他方１００％特異性は約７０％の感受性で入手されることを示している（例えば、表１２および図１６を参照）。リフレックスサンプル試験を１００％感受性および７０％特異性で実施することによって、実質的に全部の偽陽性検査結果を排除することが可能になる。
【０２５７】
当業者は、本明細書に開示したリフレックス・サプリメンタルテスト法が結核の検出に限定されず、適切なリガンドおよび／またはプローブを入手できる限り、実質的に任意のタイプの病原体、汚染因子、バイオハザード、生物兵器、疾患細胞もしくは他の状態を検出するために使用できることを明確に理解する。この特定の典型的実施形態では、本方法は、約１００％の感受性および約７０％の特異性の条件で同一アッセイを用いて、全陽性サンプルを対象にサプリメンタル・リフレックステストを実施するステップを開示している。これらの条件下では、実質的に偽陰性検査結果は生じない。このため、繰り返しリフレックステストの各ラウンドは、陽性検査結果プールから真陰性被験者の約７０％を排除する。以前のラウンドで検査結果が陽性であったサンプルだけに適用する反復リフレックステストの４ラウンドの使用は、感染した動物を検出する際に１００％に近い正確度を生じさせるはずである。例えば、７０％特異性での４サイクルの繰り返し検査は、０．３×０．３×０．３×０．３、または１％未満の偽陽性率を生じさせる。５サイクルの使用は、約０．２５％の偽陽性率を生じさせる。６サイクルの使用は、０．１％未満の偽陽性率を生じさせる。さらに、リフレックステストは陽性サンプルについてのみ実施されるので、実施されるアッセイ数は各サイクル毎に急速に減少し、１００％に近い試験正確度を達成するための高速、効率的および安価な方法を生じさせる。リフレックス・サプリメンタルテスト戦略は、数時間以内に感染した動物への明確な経路を提供するので、感染動物が群に再び入って他の動物を感染させることは決してない。
【０２５８】
米国およびヨーロッパなどの先進諸国では、群内での感染動物のパーセンテージは相当に低い。１，０００頭中１頭の感染率が推定されている。
【表３】
2008522198.tif 000005
【０２５９】
実験室設定において一貫して９８％の感受性および９８％の特異性を生成するアッセイを使用したと想定されたい。これはほとんどの標準によって極めて良好であると考察される。しかし１頭の感染動物（１，０００頭中１頭の動物が感染）を見つけるために多数の陰性動物がスクリーニングされる上記の実施例では、非感染動物中２０頭が偽陽性の検査結果を生じると予測される。本発明者らは、高い感受性および特異性だけが効果を出すのではないことを見ている。本発明者らは、感染した動物が偽陰性として検出されずに群へ静かに戻ってしまわないことを前提にして、その群内の２１頭の動物が陽性と測定されることを予想する。陽性動物５０頭毎に１頭が洩れ出てしまい、９８％の感受性でその群を再感染させる。本発明者らは、２１頭中のどの１頭が真に感染しているのかを同定する方法が分からない。そこで次は、この問題を処理するためにこれらの２１頭の動物にはるかに高価な確認試験を実施しなければならない。
【０２６０】
群のサイズが１０，０００頭で感染動物が１頭である場合は、初回通過は２０１頭の陽性を提供するはずである。そして群内の感染動物の数が増加するにつれて、多数の偽陰性検査結果が発生する。検出されなかった動物は、群に再び戻って群内の他の動物を感染させる。
【０２６１】
１回の検査では、１００％の確実性で感染した動物を効果的に分離するために必要なレベルの感受性および特異性を一貫して生じさせることは決してできない。リフレックス・サプリメンタルテストは、陽性を検出するための閾値は陽性感染動物の１００％を捕捉するために十分に低く設定されているので、故意に偽陽性が予測される閾値で検査を実施するステップを含む。次に同一アッセイにおける初回ランで陰性通過しなかった動物全部を第２バッチにおいて試験することによって、第２バッチの真非感染動物を安全に解放できる。このプロセスは、真陽性単離体だけが確認されて迅速に感染動物に集中するまで連続ステップで継続できる。本方法は、原理的には、単回ステップアッセイよりはるかに効果的である。
【０２６２】
特異性が、１００％感受性を予想できる閾値より中等度に高い場合は、極めて多数の動物が各ランにおいて解放される。１本の血清チューブで十分であり、「陽性」検査結果動物にのみ検査が繰り返される。感受性は１００％であるので、初回ランで陽性検査結果が出たが第２もしくは第３回ランで陰性検査結果であった動物は、真に非感染動物として安全に解放できる。本明細書に開示した典型的なアッセイは、１００％感受性についての閾値として７０％特異性を提供する。本発明者らは、計算によって群内の１，０００頭中での陽性感染動物数を得ることができる。例示によって、計算は１０，０００頭の動物数について示されている。
【０２６３】
【表４】
2008522198.tif 000006
【０２６４】
各動物についての血清は保持され、それが検査結果陽性である場合にのみリフレックステストされる。１，０００の群サイズから２頭の動物を分離するための検査総数は１１２８回であり、全試験を完了するために各動物について１ｍＬ未満の血清で十分過ぎるほどである。各パス毎に多数の動物が解放されるので、２分の１の確率へ感染動物を分離するために必要な追加検査は１２８回に過ぎない。１０，０００頭の群サイズで２頭の動物をスクリーニングおよび選択するために必要であるのは、６種のリフレックステスト方法および１１，２８５回の検査だけである。本発明者らは、初回スクリーニングにおいて７，０００頭の動物を解放できると予測する。
【実施例３】
【０２６５】
＜ＴＢの検出についてのその後の検査＞
診断学の分野における多数の技術的進歩にもかかわらず、現在までに、最小能動性マイコバクテリア感染さえ診断するための高速で安価かつ正確な手段は存在しない。他の検査より優れた単独試験は存在せず、それらは全部が、感受性または特性が欠けていて、一般に不良である。Ｚａｈｒａｎｉ  ｅｔ．ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅ  １６２，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，２０００，１３２３−１３２９）は、６０例の能動性ＴＢを診断するための典型的所見を報告している。以下の検査の感受性および特異性は、各々、マイコバクテリア培養法７３％および１００％；ＰＣＲ法４２％および１００％；胸部Ｘ線検査法６７〜７７％および６６〜７６％；ツベルクリンテスト法９４％および２０％；ならびに血清学検査法３３％および８７％である。ツベルクリンテストは現在、潜伏性疾患を検出できる唯一のテストであるが、本方法によって多数の偽陽性検査結果が生じる。
【０２６６】
マイコバクテリア感染に対する循環中抗体を検出できる血清学的アッセイについては長年に渡り永続性の研究が行なわれてきたが、ラテラルフローまたはＥＬＩＳＡ法を用いた結果は一般に不良である。血清学的検査は、一般に他の方法に比較して高速であり、試験するための材料をほんの少量しか必要とせず、能動性疾患を有する患者からさもなければ感染組織（例えば、唾液サンプル）を取り扱うヒトに感染する感染する機会を最小限に抑えるために、魅力的である。血清検査は、さらに、潜伏性非能動性疾患の検出可能性もまた提供するので、早期に治療することができ、将来の合併症および１つの個体から他の個体への広がりを最小限に抑える。これは、急激にＴＢで死亡してしまう、そして感染を他の接触者へ広げる可能性があるＨＩＶ  ＴＢ感染患者において特に興味深い。
【０２６７】
循環中マイコバクテリア抗体がそのようにとらえどころなく検出を免れる理由は、正確には不明である。多くの仮説がある。本開示に示した典型的な方法、組成物、イメージングソフトウエアおよび機器は、ヒトＴＢに密接に類似する疾患（畜牛やアナグマに感染するＭ．ボビス）において使用した場合に、すでに抗体は豊富に存在すること、そして能動形および潜伏形の疾患を容易に検出できることを高い感受性および特異性で証明した。Ｍ．ボビス（Ｍｂｖ）血清学的検査は、ヒトにおけるＴＢ血清学的検査と同様に、歴史的に感染動物を正確に検出して非感染動物から識別することに失敗してきた（Ｗｏｏｄ，Ｐ．Ｒ．ａｎｄ  Ｒｏｔｈｅｌ，Ｊ．Ｓ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｂｏｖｉｎｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．１９９４，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏ，４０：１２５−１３５）。同一の方法、組成物および装置を用いて、ヒトＴＢのための高速、正確および費用効果性の試験を達成できる。
【０２６８】
マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｂｖ）感染のために本明細書に開示した典型的な実施形態は、畜牛におけるＴＢ感染の広汎なスクリーニングのための理想的な血清学方法を提供する。これは、アナグマの試験においても良好に機能することもまた証明されている。本試験は、初回スクリーニングのためには２時間未満で高度に正確な結果を生じさせると思われ、高レベルの技術的専門性を必要としない。血清のリフレックス・サプリメンタルテストを用いて、最小の偽陽性を生じるために感受性および特異性の両方を最適化することが実施される。同一方法を使用して、たった１滴の血液を用いてヒトにおけるＴＢを高い特異性および感受性で検出できる。
【０２６９】
ＴＢについてアナグマ血清を試験するためにＭａｒｋ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ（ＶＬＡ）との共同研究を実施した。本試験は、Ｍｂｖについての培養によって確認されたアナグマをＭｂｖ抗体について陽性または陰性のどちらかであると識別することが可能であることを証明した。Ｍｂｖ培養陽性アナグマは、ＭＰＢ８３およびＣＦＰ１０＿ＥＳＡＴ６（融合タンパク質）を含む様々なエピトープに対する抗体を生成する。
【０２７０】
抗体をベースとするアッセイを使用して、非感染および陽性感染アナグマが同定された。Ｈ＆Ｅおよび培養で確認されたＭｂｖ陽性および非感染（陰性）アナグマからのサンプルアナグマ血清に基づいて最適化の結果が入手され、報告された。陰性コントロール試験および参照値は、捕らえられた、決して感染していないことが既知であるアナグマを試験することによって入手した。マイコバクテリア抗原に対する抗体を検出するための一般的スキームは、図２５に示されている。
【０２７１】
フェライトエピトープコンジュゲートを使用して、Ｍｂｖが血清中に存在する場合は、Ｍｂｖに対する抗体が同定および単離される。ヒトにおけるＴＢを検出するためにも同一試験を使用できる。コンジュゲートは、希釈血清と一緒に３０分間インキュベートされる。次に磁気ポートでフェライトが収集される。使用された希釈血清は廃棄される。
【０２７２】
フェライトコンジュゲートは、残留する微量のアナグマ血清を除去するために洗浄される。それらは再び収集され、アナグマ（または畜牛）抗体に対する抗体を備える溶液中に懸濁させられる。コンジュゲートに付着した抗体は、溶液にビオチン化ウサギ抗マウスまたは抗ニワトリ抗体を加えることによって検出される。
【０２７３】
２０分後に、フェライトコンジュゲートは再び収集され、洗浄され、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ中に１０分間懸濁させられる。フェライトは収集され、２回洗浄され、ルミノール過酸化物中に懸濁させられる。次にルミノール過酸化物フェライトコンジュゲートは、イメージングのためにハニカムカセットへ移される。
【０２７４】
２つのエピトープが試験された。ＭＰＢ８３を使用して、英国内の研究者によって提供された極めて多数のアナグマおよび畜牛における全血清中で試験した。本発明者らは、さらにＭＰＢ８３についての検査結果陽性であったワクチン接種および非ワクチン接種アナグマ血清中でＣＦＰ１０＿ＥＳＡＴ６について試験した。アッセイは、最初に培養、Ｈ＆Ｅおよび剖検に基づく極めて正確な指定を用いて最適化され、その後の盲験において血清分析単独による結果が疾患指定について陽性および陰性と正確に相関していることが証明された（表５参照）。
【０２７５】
各サンプルの視感度は、バックグラウンドおよびカセット内の他のサンプル各々と比較して測定した。エピトープに対する抗体を同定するために、Ｍｂｖについての培養陰性である処理されたアナグマ（または畜牛）サンプルについてのシグナル強度をＭｂｖについて培養陽性であるアナグマについてのシグナルに対して測定した。
【０２７６】
ＭＰＢ８３フェライトコンジュゲートは、人工的に感染した、ワクチン接種した捕らえられたアナグマを正確に同定すると思われる。これは、適切な抗体組み合わせを用いて畜牛においても証明された。ＢＣＧがアッセイにおいて干渉を引き起こす確率を詳細に決定するために、本発明者らは、それまでに一度も人工的に感染したことがなかった、ワクチン接種した捕らえられたアナグマからの血清サンプルを要請した。フィールドアナグマ試験における陰性コントロール血清サンプルとして、ＢＣＧワクチン接種したが一度も感染したことのない捕らえられたアナグマ血清を含めたが、これは群中１例を除いて、他の陰性血清から識別可能であった。これは、フェライトプローブ上のＭＰＢ８３抗原が依然として感染動物とＢＣＧワクチン接種非感染動物とを識別することを強く証明している。
【０２７７】
３種の機器上で、３人の相違するオペレータによって、盲検試験におけるほぼ半分で１，５００例超のアナグマサンプルを試験した。感受性および特異性はどちらも、一貫して０．９５〜１．０の間のＲＯＣ面積を備える単純スクリーニングにおいてほぼ９０％であった。
【０２７８】
英国で試験された畜牛血清の冷凍アンプルは、Ｍａｒｔｉｎ  Ｖｏｒｄｅｒｍｅｉｅｒ社（英国）によって、皮膚テストおよび培養結果に基づく指定を備えて提供された。畜牛血清は、ＭＰＢ８３もしくはＣＦＰ１０＿ＥＳＡＴ６どちらかのフェライトコンジュゲートに基づいて感染について陽性または陰性のどちらかであると迅速に同定された。畜牛の試験で入手された特異性および感受性の種類は、最適化プロトコルに基づいて図２６に示されている。
【０２７９】
【表５】
2008522198.tif 000007
【０２８０】
＜リフレックス・サプリメンタルテスト：＞
１回の試験で、優れたアッセイ方法においてさえ発生することが予測される偽陽性の数を最小限に抑えるために必要とされるレベルの感受性および特異性を一貫性で生成することはできない。リフレックス・サプリメンタルテストは、陽性を検出するための閾値が陽性感染動物の１００％を捕捉するために十分に低く設定されているので、アッセイのスクリーニング部分中に偽陽性が予測されて容認される閾値で試験を慎重に実施するステップを含む。これは、統計学に基づいて、正確に反応陽性者を同定することを改良するために実施される。スクリーニングにおける全陽性サンプルのリフレックス・サプリメンタルテスト（ＲＳＴｅｓｔ）は、スクリーニング特異性を特徴とする比率で偽陽性を反復して排除する。この方法で、真陽性血清が維持されて同定され、その間に偽陽性サンプルはその後の試験において疾患について真陰性であることが証明される。本発明者らは、不正確に指定される陽性数を最小限に抑えながら、本試験方法が真陽性を同定する際に最も効率的であることを見いだした。現在開示されたアッセイにおける高い特異性および感受性を用いると、理想的な試験結果のために必要な繰り返し数は相当に少なくなる。ヒトにおけるＴＢを検出するための試験において、同一方法を使用できる。
【０２８１】
１，５００頭を超える畜牛の試験が実施され、アッセイ最適化プロトコルにおいて多くの改良が加えられた。フェライトコンジュゲートのための抗体および抗原の適正な選択が重要である。本発明者らは、所定のタンパク質が血清の試験においてどの程度強度に干渉し得るかについて理解できるようになった。例えば、プロテインＡは、フェライトプローブに付着したときに抗原に極めて低レベルで付随する場合でさえ、試験がほぼ無益となるほど大きな干渉を引き起こす。これらの種類の汚染因子を排除するための適切なステップを使用しなければ、多数の偽陽性検査結果が見られる。大多数の抗体は、プロテインＡカラム上で、多くの研究者が問題が多いと認識できなかった重大な干渉構成成分の１つを導入することで、親和性精製される。これは、ラテラレルフロー法およびＥＬＩＳＡ法がむしろ非感受性検出法である理由を一部には説明できる。
【実施例４】
【０２８２】
＜ヒトＴＢ試験＞
本明細書に開示したソフトウエアを備えるＣＣＤイメージングテクノロジーは、アトグラム（１０-18）／ｍＬレベルまで標的タンパク質を一貫して検出できる。フェライトコンジュゲートに付着した適切に選択された抗原を用いると、高度に正確、安価および高速であるヒトＴＢについての血清学試験もまた提供できる。ＭＰＢ８３およびＣＦＰ１０＿ＥＳＡＴ６フェライトコンジュゲートは、疾患ヒト血清について明確に特徴付けられた陽性および陰性サンプルについて試験される。その他の抗原または抗原の組み合わせについてもまた試験できる。畜牛およびアナグマの試験に基づいて、潜伏性および能動性の両方の疾患が、ヒト血清ＴＢ試験において２時間の試験時間内で高度の感受性および特異性で同定される。
【０２８３】
本明細書に開示かつ請求した組成物、方法および装置の全部は、本開示を参照すると無用な実験を行わずに作製かつ実行できる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者には、組成物、方法および装置ならびに本明細書に記載した方法のステップまたはステップの順序において本発明の概念、精神および範囲から逸脱せずに変更を加えられることが明白である。より詳細には、化学的および生理学的両方に関連する所定の物質は、本明細書に記載した物質に置換することができ、それでも同一もしくは類似の結果が達成されることは明白である。当業者に明白なそのような類似の代替形および修飾はすべてが、添付の特許請求項によって規定された本発明の精神、範囲および概念の中に含まれると見なされる。
【０２８４】
【表６Ａ】
2008522198.tif 000008
【表６Ｂ】
2008522198.tif 000009
【表６Ｃ】
2008522198.tif 000010
【表６Ｄ】
2008522198.tif 000011
【０２８５】
【表７】
2008522198.tif 000012
【０２８６】
【表８】
2008522198.tif 000013
【０２８７】
【表９】
2008522198.tif 000014
【０２８８】
【表１０Ａ】
2008522198.tif 000015
【表１０Ｂ】
2008522198.tif 000016
【表１０Ｃ】
2008522198.tif 000017
【０２８９】
【表１１】
2008522198.tif 000018
【０２９０】
【表１２】
2008522198.tif 000019
【０２９１】
【表１３Ａ】
2008522198.tif 000020
【表１３Ｂ】
2008522198.tif 000021
【表１３Ｃ】
2008522198.tif 000022
【０２９２】
【表１４】
2008522198.tif 000023
【０２９３】
【表１５】
2008522198.tif 000024
【図面の簡単な説明】
【０２９４】
【図１】ＣＭＯＳイメージセンサの図である。
【図２】Ｂａｙｅｒカラーフィルタのモザイクアレイの図である。
【図３】イメージセンサについて見込まれるフィルタ配列の図である。
【図４】イメージセンサにおけるマイクロレンズ作動の図である。
【図５】典型的なイメージセンサの量子効率のグラフである。
【図６】イメージセンサを最適化するためのキャリブレーションの実施形態を示したフローチャートである。
【図７】イメージセンサ最適化の実施形態を示したフローチャートである。
【図８】光散乱検出の図である。
【図９】英国において１９９６〜２００４年に確認されたウシＴＢによる新規畜牛感染を示す。英国環境食糧農林省統計局から入手したデータ（２００５年２月２３日、ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ｄｅｆｒａ．ｇｏｖ．ｕｋ／ｅｓｇ／ｓｔａｔｎｏｔ／ｔｂｐｎ．ｐｄｆ）。
【図１０】感染および非感染畜牛についての正規分布を推定している、典型的なリフレックス・サプリメンタルテストのスキームの図である。
【図１１】畜牛をＴＢについて検査する際のＲＳＴ数に特異性および有病率が及ぼす作用を示す。
【図１２】全光学アッセイ装置（ＴＯＡＤ（商標））の具体的例の図である。
【図１３】典型的なＴＯＡＤ（商標）装置の構成要素を例示している略図である。
【図１４】ステージ１４２０を示すために、ケーシング１４１０が取り外されているＴＯＡＤ（商標）の上面の略図を示す。
【図１５】陽性および陰性の畜牛血清サンプルとのフェライトＣＰ１０−ＥＳＡＴ６融合タンパク質コンジュゲートを用いた、１１例のサンプルと１例の陰性コントロール参照を含む典型的なｃｒｉｂセットを示す。サンプルは、実施例１に開示したように分析された。
【図１６】典型的なＲＯＣ曲線を示す。
【図１７】Ｍ．ボビス陽性感染を有する畜牛についての自動閾値調節標準化比視感度スクリーニングおよびＲＳＴ試験についての典型的なアッセイ結果を示す。
【図１８】Ｃａｕｄａｌ  Ｆｏｌｄ法、Ｂｏｖｉｇａｍ法および本明細書に開示したリフレックス・サプリメンタルテスト法についてのＰＰＶ（陽性予測値）の典型的な比較を示す。
【図１９】リフレクティブ・ハニカムカセットについての典型的なポリカーボネート底部（透明）スキンを示した図である。底部スキンは、丸みを帯びたコーナーを備えるカセットハニカム２．６４‘‘×２．６４’’に貼付された７ミルの透明ポリエステルである（標準Ａｖｅｒｙ  ５０９６ラベルサイズ）。ロッキングホール３／１６’’および１／１６’’は、ハニカムへ貼付する前に穿孔される。
【図２０】ハニカムの１つの実施形態ではセルについての、この実施例ではハニカム内の５５セルについての典型的なナンバリングを示す。隅のインデックスマーカーは、３／１６’’ホールロッキングピンと同側に位置している。
【図２１】水平列および垂直列のカットを示す、典型的なアルミニウム製ハニカムカットパターンを示す。
【図２２】アルミニウム製ハニカムカットパターンのための典型的なカットの詳細を示す。
【図２３】光学検出器のためのアパーチャの上方に集中したセルとともにカセットの詳細を示す。
【図２４】カセットのための典型的な装填テンプレートを示す。
【図２５】抗マイコバクテリア抗体を濃縮および単離するためにフェライト抗原コンジュゲートを用いる、ＴＢ検出のための典型的プロトコルを例示する。
【図２６】ＭＰＢ８３コンジュゲートについてのＲＯＣグラフのための典型的な畜牛検査結果の要約を提供する。
【図１】
2008522198.tif 000025
【図２】
2008522198.tif 000026
【図３】
2008522198.tif 000027
【図４】
2008522198.tif 000028
【図５】
2008522198.tif 000029
【図６】
2008522198.tif 000030
【図７】
2008522198.tif 000031
【図８】
2008522198.tif 000032
【図９】
2008522198.tif 000033
【図１１】
2008522198.tif 000034
【図１２】
2008522198.tif 000035
【図１３】
2008522198.tif 000036
【図１４】
2008522198.tif 000037
【図１５】
2008522198.tif 000038
【図１６】
2008522198.tif 000039
【図１７】
2008522198.tif 000040
【図１８】
2008522198.tif 000041
【図１９】
2008522198.tif 000042
【図２０】
2008522198.tif 000043
【図２１】
2008522198.tif 000044
【図２２】
2008522198.tif 000045
【図２３】
2008522198.tif 000046
【図２４】
2008522198.tif 000047
【図２５】
2008522198.tif 000048
【図２６】
2008522198.tif 000049
【図１０】
2008522198.tif 000050
【配列表】
2008522198000001.xml
【国際調査報告】
2008522198.tif 000054
2008522198.tif 000055