(57)【要約】  ＳＯＳＴ遺伝子産物スクレロスチンの減少は、高骨質量（ＨＢＭ）を特徴とする硬化狭窄をもたらす。本報告書において、我々は、スクレロスチンが、ヒト胎性腎Ａ２９３細胞およびマウス骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３細胞におけるカノニカルＷｎｔシグナル伝達をアンタゴナイズし得ることを見出した。このスクレロスチン媒介アンタゴニズムは、Ｗｎｔ補助受容体ＬＲＰ５の過剰発現により反転し得る。さらに、我々は、スクレロスチンが、ＬＲＰ５ならびにＬＲＰ６に結合することを見出し、ＬＲＰ５の最初の２つのＹＷＴＤ−ＥＧＦ反復ドメインが結合の原因であることを確認した。これら２つの反復ドメインは、カノニカルＷｎｔシグナルを変換するために必要であるが、カノニカルＷｎｔは、ＬＲＰ５への結合に関してスクレロスチンと競合していないように思われた。頭頂骨の初期骨芽細胞分化時のスクレロスチンおよびＷｎｔ７ｂの発現、自己分泌カノニカルＷｎｔの調査により、スクレロスチンが骨芽細胞分化の後期に発現し、骨形成マーカーのオステオカルシンの発現と同時に起こり、Ｗｎｔ７ｂの発現に遅れることが判明した。カノニカルＷｎｔシグナル伝達が、骨形成を刺激することを示す多くの証拠が得られたことにより、スクレロスチンの減少と関連するＨＢＭ表現型が少なくともある程度、スクレロスチン媒介Ｗｎｔアンタゴニズムの減少から生じるカノニカルＷｎｔシグナル伝達の増加に起因し得ると我々は考えている。
2008536816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成または骨リモデリングに関与する受容体または補助受容体へのスクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）の結合を防止する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む骨形成または骨リモデリングを促進させる方法。
【請求項２】
ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体へのスクレロスチンの結合を防止する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む骨形成または骨リモデリングを促進させる方法。
【請求項３】
ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体のホモログへのスクレロスチンの結合を防止する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む骨形成または骨リモデリングを促進させる方法。
【請求項４】
ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体の少なくとも１つのドメインへのスクレロスチンの結合を防止する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む骨形成または骨リモデリングを促進させる方法。
【請求項５】
ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体の第一または第二ドメインへのスクレロスチンの結合を防止する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む骨形成または骨リモデリングを促進させる方法。
【請求項６】
前記化合物または前記化合物の断片が、ＩＩＩＣ３またはＩＩＣ８を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物または前記化合物の断片が、ＩＩＩＣ３、ＩＩＣ８、またはそれらの任意の誘導体もしくはアナログを含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
２種以上の前記化合物、または前記化合物の断片が、架橋と共に直接連結されているか、またはリンカーアームと共に間接的に連結されている請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物、前記化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせが、同じ結合部位、受容体またはタンパク質上の第一の位置および第二の位置に結合する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物、前記化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせが、異なる結合部位、受容体またはタンパク質上の第一の位置および第二の位置に結合する請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物または前記化合物の断片が、リンカーアームまたは架橋と共に連結されている請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物または前記化合物の断片が、小分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、もしくは化学物質を含む化合物の断片を含む請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸、もしくは皮下投与、またはそれらの任意の組み合わせを含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物または前記化合物の断片が、少なくとも１種のアゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、またはそれらの任意の組み合わせを含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が、
ａ．ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを用いて受容体上のキャビティにはまり込む化合物をスクリーニングする工程；
ｂ．Ｆｌｅｘｘ（商標）プログラムを用いて前記化合物を前記キャビティに結合させる工程；および
ｃ．Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを用いて最高結合親和性を有する化合物を得る工程、
を含む方法を用いて同定される請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
骨形成または骨リモデリングに関与する受容体または補助受容体へのスクレロスチンの結合を防止する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む、哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常の治療方法。
【請求項１７】
ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体へのスクレロスチンの結合を防止する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常の治療方法。
【請求項１８】
ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体のホモログへのスクレロスチンの結合を防止する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常の治療方法。
【請求項１９】
前記化合物が、ＩＩＩＣ３またはＩＩＣ８を含む請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物または前記化合物の断片が、ＩＩＩＣ３またはＩＩＣ８を含む請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記２種以上の化合物、または前記化合物の断片が、架橋と共に直接連結されているか、またはリンカーアームと共に間接的に連結されている請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物、前記化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせが、同じ結合部位、受容体またはタンパク質上の第一の位置および第二の位置に結合する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物、前記化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせが、異なる結合部位、受容体またはタンパク質上の第一の位置および第二の位置に結合する請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物または前記化合物の断片が、リンカーアームまたは架橋と共に連結されている請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物または前記化合物の断片が、小分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、もしくは化学物質を含む化合物の断片を含む請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸、もしくは皮下投与、またはそれらの任意の組み合わせを含む請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物または前記化合物の断片が、少なくとも１種のアゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、またはそれらの任意の組み合わせを含む請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物が、
ａ．ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを用いて、受容体上のキャビティにはまり込む化合物をスクリーニングする工程；
ｂ．Ｆｌｅｘｘ（商標）プログラムを用いて、前記化合物を前記キャビティに結合させる工程；および
ｃ．Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを用いて、最高結合親和性を有する化合物を得る工程、
を含む方法を用いて同定される請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
骨形成または骨リモデリングにおける受容体または補助受容体へのスクレロスチンの結合を防止する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常を治療するための治療用組成物。
【請求項３０】
ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体へのスクレロスチンの結合を防止する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常を治療するための治療用組成物。
【請求項３１】
スクレロスチンの、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体のホモログへの結合を防止する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常を治療するための治療用組成物。
【請求項３２】
前記化合物または前記化合物の断片が、ＩＩＩＣ３またはＩＩＣ８を含む請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記化合物または前記化合物の断片が、ＩＩＩＣ３、ＩＩＣ８、またはそれらの任意の誘導体もしくはアナログを含む請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記２種以上の化合物、または前記化合物の断片が、架橋と共に直接連結されているか、またはリンカーアームと共に間接的に連結されている請求項３２または３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記化合物、前記化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせが、同じ結合部位、受容体またはタンパク質上の第一の位置および第二の位置に結合する請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記化合物、前記化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせが、異なる結合部位、受容体またはタンパク質上の第一の位置および第二の位置に結合する請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記化合物または前記化合物の断片が、リンカーアームまたは架橋と共に連結されている請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記化合物または前記化合物の断片が、小分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、もしくは化学物質を含む化合物の断片を含む請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記投与工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸、もしくは皮下投与、またはそれらの任意の組み合わせを含む請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記化合物または前記化合物の断片が、少なくとも１種のアゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、またはそれらの任意の組み合わせを含む請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記非天然化合物が、
ａ．ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを用いて受容体上のキャビティにはまり込む化合物をスクリーニングする工程；
ｂ．Ｆｌｅｘｘ（商標）プログラムを用いて前記化合物を前記キャビティに結合させる工程；および
ｃ．Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを用いて最高結合親和性を有する化合物を得る工程、
を含む方法を用いて同定される請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物が、製薬的に許容できる担体をさらに含む請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記組成物が、錠剤、丸剤、糖衣剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、シロップ剤、スラリー剤または懸濁剤として配合される請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
スクレロスチンと、骨形成または骨リモデリングに関与する受容体または補助受容体との相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む骨形成または骨リモデリングの調節方法。
【請求項４５】
スクレロスチンと、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体との相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む骨形成または骨リモデリングの調節方法。
【請求項４６】
スクレロスチンと、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体のホモログとの相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む骨形成または骨リモデリングの調節方法。
【請求項４７】
スクレロスチンと、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体の少なくとも１つのドメインとの相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む骨形成または骨リモデリングの調節方法。
【請求項４８】
スクレロスチンと、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体の第一または第二のドメインとの相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む骨形成または骨リモデリングの調節方法。
【請求項４９】
前記化合物または前記化合物の断片が、ＩＩＩＣ３またはＩＩＣ８を含む請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記化合物または前記化合物の断片が、ＩＩＩＣ３、ＩＩＣ８、またはそれらの任意の誘導体もしくはアナログを含む請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記２種以上の化合物、または前記化合物の断片が、架橋と共に直接連結されているか、またはリンカーアームと共に間接的に連結されている請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記化合物、前記化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせが、同じ結合部位、受容体またはタンパク質上の第一の位置および第二の位置に結合する請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記化合物、前記化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせが、異なる結合部位、受容体またはタンパク質上の第一の位置および第二の位置に結合する請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記化合物または前記化合物の断片が、リンカーアームまたは架橋と共に連結されている請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記化合物または前記化合物の断片が、小分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、もしくは化学物質を含む化合物の断片を含む請求項４４〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記投与工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸、もしくは皮下投与、またはそれらの任意の組み合わせによる投与を含む請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記化合物または前記化合物の断片が、少なくとも１種のアゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、またはそれらの任意の組み合わせを含む請求項４４〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記非天然化合物が、
ａ．ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを用いて受容体上のキャビティにはまり込む化合物をスクリーニングする工程；
ｂ．Ｆｌｅｘｘ（商標）プログラムを用いて前記化合物を前記キャビティに結合させる工程；および
ｃ．Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを用いて最高結合親和性を有する化合物を得る工程、
を含む方法を用いて同定される請求項４４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
スクレロスチンと、骨形成または骨リモデリングに関与する受容体または補助受容体との相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む、哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常の治療方法。
【請求項６０】
スクレロスチンと、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体との相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常の治療方法。
【請求項６１】
スクレロスチンと、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体のホモログとの相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常の治療方法。
【請求項６２】
スクレロスチンと、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体の少なくとも１つのドメインとの相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常の治療方法。
【請求項６３】
スクレロスチンと、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体の第一または第二のドメインとの相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常の治療方法。
【請求項６４】
前記化合物または前記化合物の断片が、ＩＩＩＣ３またはＩＩＣ８を含む請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記化合物または前記化合物の断片が、ＩＩＩＣ３、ＩＩＣ８、またはそれらの任意の誘導体もしくはアナログを含む請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記２種以上の化合物、または前記化合物の断片が、架橋と共に直接連結されているか、またはリンカーアームと共に間接的に連結されている請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記化合物、前記化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせが、同じ結合部位、受容体またはタンパク質上の第一の位置および第二の位置に結合する請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記化合物、前記化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせが、異なる結合部位、受容体またはタンパク質上の第一の位置および第二の位置に結合する請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記化合物または前記化合物の断片が、リンカーアームまたは架橋と共に連結されている請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記化合物または前記化合物の断片が、小分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、もしくは化学物質を含む化合物の断片を含む請求項５９〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記投与工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸、もしくは皮下投与、またはそれらの任意の組み合わせによる投与を含む請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記化合物または前記化合物の断片が、少なくとも１種のアゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、またはそれらの任意の組み合わせを含む請求項５９〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記非天然化合物が、
ａ．ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを用いて受容体上のキャビティにはまり込む化合物をスクリーニングする工程；
ｂ．Ｆｌｅｘｘ（商標）プログラムを用いて前記化合物を前記キャビティに結合させる工程；および
ｃ．Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを用いて最高結合親和性を有する化合物を得る工程、
を含む方法を用いて同定される請求項５９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
スクレロスチンと、骨形成または骨リモデリングに関与する受容体または補助受容体との相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、化合物の少なくとも１種の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常を治療するための治療用組成物。
【請求項７５】
スクレロスチンと、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体との相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、化合物の少なくとも１種の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常を治療するための治療用組成物。
【請求項７６】
スクレロスチンと、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体のホモログとの相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、化合物の少なくとも１種の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常を治療するための治療用組成物。
【請求項７７】
スクレロスチンと、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体の少なくとも１つのドメインとの相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常を治療するための治療用組成物。
【請求項７８】
スクレロスチンと、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体の第一または第二のドメインとの相互作用を破壊する、少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む哺乳動物対象における骨折、骨疾患、骨傷害、または骨異常を治療するための治療用組成物。
【請求項７９】
前記化合物が、ＩＩＩＣ３またはＩＩＣ８を含む請求項７４〜７８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８０】
前記化合物が、ＩＩＩＣ３、ＩＩＣ８、またはそれらの任意の誘導体もしくはアナログを含む請求項７４〜７８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８１】
前記２種以上の化合物、または前記化合物の断片が、架橋と共に直接連結されているか、またはリンカーアームと共に間接的に連結されている請求項７９または８０に記載の組成物。
【請求項８２】
前記化合物、前記化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせが、同じ結合部位、受容体またはタンパク質上の第一の位置および第二の位置に結合する請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記化合物、前記化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせが、異なる結合部位、受容体またはタンパク質上の第一の位置および第二の位置に結合する請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
請前記化合物または前記化合物の断片が、リンカーアームまたは架橋と共に連結されている請求項７４〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記化合物または前記化合物の断片が、小分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、もしくは化学物質を含む化合物の断片を含む請求項７４〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８６】
前記投与工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸、もしくは皮下投与、またはそれらの任意の組み合わせを含む請求項７４〜７８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８７】
前記非天然化合物が、
ａ．ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを用いて、受容体上のキャビティにはまり込む化合物をスクリーニングする工程；
ｂ．Ｆｌｅｘｘ（商標）プログラムを用いて、前記化合物を前記キャビティに結合させる工程；および
ｃ．Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを用いて、最高結合親和性を有する化合物を得る工程、
を含む方法を用いて同定される請求項７４〜８６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８８】
製薬的に許容できる担体をさらに含む請求項７４〜８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８９】
前記組成物が、錠剤、丸剤、糖衣剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、シロップ剤、スラリー剤または懸濁剤として配合される請求項７４〜８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９０】
スクレロスチンを投与することによって哺乳動物対象における骨形成を防止または阻止する方法。
【請求項９１】
スクレロスチンに対する抗体、またはスクレロスチンを減少させるか、または除去する任意の他の非天然化合物または化合物の断片を投与する工程を含む、哺乳動物対象における骨異常増殖の治療方法。
【請求項９２】
前記化合物または前記化合物の断片が、小分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、または化学物質を含む化合物の断片を含む請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記投与工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸、もしくは皮下投与、またはそれらの任意の組み合わせを含む請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記スクレロスチンが、スクレロスチンの関連タンパク質、スクレロスチンに類似の機能を有する無関連タンパク質、またはスクレロスチンの任意のホモログまたは誘導体を含む請求項９０〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
哺乳動物対象において骨形成を防止または阻止するためのスクレロスチンを含む治療用組成物。
【請求項９６】
哺乳動物対象における骨形成を防止または阻止するための、スクレロスチンに対する抗体、またはスクレロスチンを減少させるか、または除去する任意の他の非天然化合物または化合物の断片を含む治療用組成物。
【請求項９７】
前記非天然化合物が、
ａ．ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを用いて、受容体上のキャビティにはまり込む化合物をスクリーニングする工程；
ｂ．Ｆｌｅｘｘ（商標）プログラムを用いて、前記化合物を前記キャビティに結合させる工程；および
ｃ．Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを用いて、最高結合親和性を有する化合物を得る工程、
を含む方法を用いて同定される請求項９１〜９６のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項９８】
タンパク質−タンパク質相互作用を促進させるか、または阻害する薬物候補または化合物を同定する方法であって、
ａ．受容体タンパク質の仮想構造を決定する工程；
ｂ．前記受容体タンパク質上の特定の結合キャビティを確認する工程；
ｃ．前記結合キャビティ内の特定部位を確認する工程；および
ｄ．前記特定部位内にはまり込む化合物をスクリーニングする工程、
を含む方法。
【請求項９９】
Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを用いて最高結合親和性を有する化合物を同定する工程をさらに含む請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
特定の結合キャビティを確認する前記工程が、前記化合物の生物学的機能に基づく実験を実施する工程を含む請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記実験が、変異分析を含む請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記受容体タンパク質が、非溶解性または膜に結合している請求項９８に記載の方法。
【請求項１０３】
タンパク質−タンパク質相互作用を促進または阻止する薬物候補または化合物を同定する方法であって、
ａ．受容体タンパク質の仮想構造を決定する工程；
ｂ．前記受容体タンパク質上の特定の結合キャビティを確認する工程；
ｃ．前記結合キャビティ内の特定部位を確認する工程；
ｄ．ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを用いて前記特定部位にはまり込む化合物をスクリーニングする工程；
ｅ．Ｆｌｅｘｘ（商標）プログラムを用いて、前記化合物を前記キャビティに結合させる工程；および
ｆ．Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを用いて、最高結合親和性を有する化合物を得る工程、
を含む方法。
【請求項１０４】
前記特定の結合キャビティを確認する工程が、前記化合物の生物学的機能に基づく実験を実施する工程を含む請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記実験が、変異分析を含む請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記受容体タンパク質が、非溶解性または膜に結合している請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
骨形成または骨リモデリングに関与する受容体タンパク質に結合する薬物候補化合物を同定する方法であって、
ａ．アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、前記受容体タンパク質のアナログまたは誘導体、またはそれらの組み合わせの使用を含む、非溶解性受容体タンパク質の仮想構造または計算構造を決定する工程；
ｂ．変異分析、アミノ酸の化学修飾、共Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、またはそれらの任意の組み合わせを含む生物学的機能に基づく実験の使用により、前記受容体タンパク質上の特定の結合キャビティを確認する工程；
ｃ．変異または化学修飾に基づく前記結合キャビティ内で特定の結合部位を確認する工程；
ｄ．ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを用いて、前記特定部位にはまり込む化合物をスクリーニングする工程；および
ｅ．Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを用いて最高結合親和性または最低エネルギーを有する化合物を同定し、最良の適合性を有する化合物を見出すこと、
を含む方法。
【請求項１０８】
骨形成または骨リモデリングに関与する受容体タンパク質に結合する薬物候補化合物を同定する方法であって、
ａ．アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、前記シグナルペプチドのアナログまたは誘導体、またはそれらの組み合わせの使用を含む、シグナルペプチドの仮想構造または計算構造を決定する工程；
ｂ．変異分析、化学修飾、共Ｘ線結晶学、ＮＭＲまたはそれらの任意の組み合わせを含む生物学的機能に基づく実験の使用により前記受容体タンパク質上の特定の結合キャビティを確認する工程；
ｃ．前記実験から得られた結果に基づく前記結合キャビティ内で特定の結合部位を確認する工程；
ｄ．ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを用いて前記結合キャビティ内または前記結合キャビティ内の前記特定部位にはまり込む化合物をスクリーニングする工程；
ｅ．Ｆｌｅｘｘ（商標）プログラムを用いて前記化合物が、前記結合キャビティ内または前記結合キャビティ内の前記特定部位に結合させる工程；および
ｆ．Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを用いて最高結合親和性または最低エネルギーを有する化合物を同定する工程、
を含む方法。
【請求項１０９】
シグナル伝達系に関与するタンパク質に結合する薬物候補または化合物を同定する方法であって、
ａ．アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、前記受容体タンパク質のアナログまたは誘導体、またはそれらの組み合わせの使用を含む、前記タンパク質の仮想構造または計算構造を提供するか、または決定する工程；
ｂ．変異分析、アミノ酸の化学修飾、共Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、またはそれらの任意の組み合わせを含む種々の実験を用いて、前記タンパク質上の特定の結合キャビティ、部位またはドメインを確認する工程；
ｃ．前記実験結果に基づき前記結合キャビティ、部位またはドメイン内の特定の結合部位を確認する工程；および
ｄ．前記特定の結合部位または前記結合キャビティ、部位またはドメインとの最良の適合を有する薬物候補または化合物を同定するために薬物候補化合物のライブラリーをスクリーニングする工程、
を含む方法。
【請求項１１０】
シグナル伝達系に関与する非可溶性または膜に結合したタンパク質に結合する薬物候補または化合物を同定する方法であって、
ａ．アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、前記受容体タンパク質のアナログまたは誘導体、またはそれらの組み合わせの使用を含む前記タンパク質の仮想構造または計算構造を提供するか、または決定する工程；
ｂ．変異分析、アミノ酸の化学修飾、共Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、またはそれらの任意の組み合わせを含む種々の実験を用いて、特定の結合キャビティ、部位またはドメインもしくは前記タンパク質を確認する工程；
ｃ．前記実験結果に基づき前記結合キャビティ、部位またはドメイン内の特定の結合部位を確認する工程；および
ｄ．前記特定の結合部位または前記結合キャビティ、部位またはドメインとの最良の適合を有する薬物候補または化合物を同定するために薬物候補化合物のライブラリーをスクリーニングする工程、
を含む方法。
【請求項１１１】
Ｗｎｔシグナル伝達経路に関与するタンパク質に結合する薬物候補または化合物を同定する方法であって、
ａ．アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、前記受容体タンパク質のアナログまたは誘導体、またはそれらの組み合わせの使用を含む前記タンパク質の仮想構造または計算構造を提供するか、または決定する工程；
ｂ．変異分析、アミノ酸の化学修飾、共Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、またはそれらの任意の組み合わせを含む種々の実験を用いて、特定の結合キャビティ、部位またはドメインもしくは前記タンパク質を確認する工程；
ｃ．前記実験結果に基づき前記結合キャビティ、部位またはドメイン内の特定の結合部位を確認する工程；および
ｄ．前記特定の結合部位または前記結合キャビティ、部位またはドメインとの最良の適合を有する薬物候補または化合物を同定するために薬物候補化合物のライブラリーをスクリーニングする工程、
を含む方法。
【請求項１１２】
骨増殖を促進させるか、または阻止するためのシグナル伝達系に関与するタンパク質に結合する薬物候補または化合物を同定する方法であって、
ａ．アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、前記受容体タンパク質のアナログまたは誘導体、またはそれらの組み合わせの使用を含む前記タンパク質の仮想構造または計算構造を提供するか、または決定する工程；
ｂ．変異分析、アミノ酸の化学修飾、共Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、またはそれらの任意の組み合わせを含む種々の実験を用いて、特定の結合キャビティ、部位またはドメインもしくは前記タンパク質を確認する工程；
ｃ．前記実験結果に基づき前記結合キャビティ、部位またはドメイン内の特定の結合部位を確認する工程；および
ｄ．前記特定の結合部位または前記結合キャビティ、部位またはドメインとの最良の適合を有する薬物候補または化合物を同定するために薬物候補化合物のライブラリーをスクリーニングする工程、
を含む方法。
【請求項１１３】
骨形成または骨リモデリングに関与する受容体または補助受容体へのスクレロスチンの親和性を低下させるか、または除去する少なくとも１種の非天然化合物、少なくとも１種の非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む骨形成または骨リモデリングの調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願に関する参照
本出願は、２００４年５月１９日に出願された、標題が「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ」の米国特許出願第１０／８４９，０６７号明細書の一部継続特許出願である。本出願はまた、２００４年５月１９日に出願された、標題が「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｅｌｆ−Ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ」の米国特許出願第１０／８４９，６４３号明細書の特許出願に関連し、その内容は参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
技術分野
本発明は、タンパク質スクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）、Ｗｎｔタンパク質のアンタゴニストおよび／または阻害剤に関する。スクレロスチンは、ＬＲＰ５受容体またはＬＲＰ６受容体（ＬＲＰ５／６）に結合する際にＷｎｔシグナル伝達を阻害し、したがって骨形成を阻害する。本発明は、骨折、骨疾患、骨傷害、骨異常、腫瘍、または増殖の治療における治療方法、組成物およびその使用に関する。さらに具体的には、当該組成物および方法は、スクレロスチンを阻害することにより骨形成を生じさせる化合物に関する。当該化合物は、種々のスクリーニング法およびアッセイにより国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＮＣＩ）データベースから同定された。これらの化合物はまた、ＮＣＩデータベース、または天然に見られない、やはり有効に機能する誘導体またはアナログを作製するために修飾し得る。
【０００３】
本出願に引用された、または確認された全ての特許、特許出願、特許公開、科学論文などは、本発明に関連する当業界の動向をより十分に説明するために、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００４】
背景技術
分泌性糖タンパク質のＷｎｔファミリーは、胚誘導、細胞極性の生成、および細胞運命の特定化に重要な役割を果たしている発生上重要なシグナル伝達分子のうちの主要なファミリーの１つである。遺伝子研究および生化学的研究の双方により、フリーズルド（Ｆｚ）およびＬＲＰ５／６は、リンパ球増強因子−１（ＬＥＦ−１）およびＴ細胞因子（ＴＣＦ）などの転写調節因子により最終的にβ−カテニンの安定化および遺伝子転写の調節をもたらすカノニカルＷｎｔシグナル伝達変換のための補助受容体である。Ｗｎｔシグナル伝達は、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）分子を含む多くの天然のアンタゴニストによっても調節される。最初のＤｋｋ（アフリカツメガエルのＤｋｋ−１）は、頭部形成において重要な役割を果たすＷｎｔアンタゴニストとして最初に発見された。今日まで、哺乳動物においてＤｋｋの４種のメンバーが確認されている。しかしながら、カノニカルＷｎｔシグナル伝達のアンタゴニストとして機能することが十分に文書化されているのは、最初の２つのメンバー（Ｄｋｋ１およびＤｋｋ２）だけである。Ｄｋｋ１およびＤｋｋ２は双方とも、ＬＲＰ５／６およびＫｒｅｍｅｎと呼ばれる単一の膜内外タンパク質に同時に結合することによってカノニカルＷｎｔシグナル伝達をアンタゴナイズする。Ｄｋｋ１およびＤｋｋ２の最初のドメインではなくて第二のＣｙｓに富むドメインが、カノニカルＷｎｔシグナル伝達を阻害することがさらに立証されている。
【０００５】
無数の証拠により、ＬＲＰ５／６媒介カノニカルＷｎｔシグナル伝達が、骨質量の増加をもたらすことが立証されている。ＬＲＰ５の機能欠損変異は、常染色体性障害の１つであるヒト骨粗しょう症偽膠腫症候群（ＯＰＰＧ）の原因となるが、一方、Ｇｌｙ１７１のＶａｌへの置換など機能変異の推定上の獲得は、ヒト高骨質量（ＨＢＭ）表現型と関連している。さらに、ＬＲＰ５遺伝子が、遺伝子標的化により不活化されたマウスは、ＯＰＰＧ患者と同様の表現型を示し、マウスにおいてＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖの遺伝子導入発現により、ＨＢＭが生じた。さらにマウス一次的骨芽細胞は、ＬＲＰ５の不在下、Ｗｎｔに対する応答減少、および増殖指標の低下を示し、カノニカルＷｎｔまたは活性化β−カテニンは、カノニカルＷｎｔシグナル伝達活性を刺激し、骨芽細胞様細胞において骨芽細胞マーカーのアリカリホスファターゼ（ＡＰ）の産生を誘導した。ＷｎｔアンタゴニストｓＦＲＰ１の不活化が、小柱状骨発生を増強する知見により、カノニカルＷｎｔシグナル伝達が骨形成を増強するという考えがさらに支持されている。Ｄｋｋ１は、分化された骨芽細胞に発現され、骨細胞およびＬＲＰ５におけるＧ１７１Ｖの変異は、カノニカルＷｎｔシグナル伝達に対するＤｋｋ１のアンタゴニスト作用を減衰させることによりＨＢＭ表現型の原因となり得る。
【０００６】
イタサキ（Ｉｔａｓａｋｉ）らは、ＷＩＳＥと呼ばれる新規のＷｎｔアンタゴニストを記載した。ＷＩＳＥは、Ｗｎｔシグナル伝達の状況依存性の調節因子であると思われ：アフリカツメガエルにおける種々のアッセイにおいてＷｎｔシグナル伝達を阻害するか、または刺激し得る。ＷＩＳＥはまた、ＬＲＰ６に結合し、ＬＲＰ６への結合に関してＷｎｔ８と競合することが示されている。ＷＩＳＥは、ＳＯＳＴの遺伝子産物であるスクレロスチンと３８％のアミノ酸同一性を共有する。ＳＯＳＴの機能欠損変異は、常染色体劣性スクレロスチン骨格障害の原因となる。以前の研究により、スクレロスチンは、骨細胞に高度に発現し、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニストとして作用し得ることが示されているが、別の研究では、スクレロスチンは、機能性ＢＭＰアンタゴニストではないかもしれないことが示唆され、Ｗｎｔシグナル伝達を調節している可能性が推測された。この報告書において、スクレロスチンがＬＲＰ５とＬＲＰ６の双方に結合でき、Ｗｎｔアンタゴニストとして作用できることを、我々はここに明確に立証する。スクレロスチン発現は、骨形成分化の際、Ｗｎｔ７ｂ発現のピーク後に生じることから、Ｗｎｔシグナル伝達のスクレロスチン媒介アンタゴニズムの減少は、ＳＯＳＴと関連する骨質量の増加に寄与している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の要約
本発明は、骨粗しょう症および他の骨疾患などの骨リモデリングに関連する幾つかの問題を扱う方法および組成物に関する。本発明はまた、骨の骨折または他の傷害または異常の治癒に役立つ組成物の使用を提供する。特に、本発明は、スクレロスチンの結合を防止する化合物の有効量を対象に投与する工程を含む哺乳動物対象における骨形成を促進させる方法を提供する。
【０００８】
本発明は、スクレロスチンの結合を防止する化合物の有効量を投与する工程を含む、不十分な骨形成を特徴とし、またはスクレロスチンの発現の減少を引き起こすことを特徴とする臨床病態に対する遺伝子治療の方法論をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の他の態様において、スクレロスチンまたは関連タンパク質の遺伝子発現、検出および定量化は、種々の骨疾患に関する強力な診断法として役立つ。
【００１０】
本発明はまた、腫瘍または他の骨増殖を処置する方法および組成物に関する。
【００１１】
本発明は、細胞に提供される場合、骨形成または骨リモデリングの刺激、増強、阻止阻害または調節に関与する補助受容体のドメイン上に見られる部位またはキャビティに結合するか、それと相互作用するか、またはそれにはまり込む化合物を同定した。これらの受容体としては、ＬＲＰ５受容体、ＬＲＰ６受容体、フリーズルド受容体、またはＬＲＰ５またはＬＲＰ６（ＬＲＰ５／６）受容体系に関与する任意の他の受容体が挙げられる。
【００１２】
該化合物は、米国特許出願第１０／８４９，０６７号明細書に記載されたスクリーニング法を用いて同定された。これらの化合物は、スクレロスチンとＬＲＰ５／６との相互作用を破壊することが判明した。他の化合物は、ＬＲＰ５／６へのＷｎｔの結合を阻害することによってＷｎｔシグナル伝達を阻害した。本発明の化合物は、細胞に存在するのではなくて、外部の供給源に由来する非天然、または外因性化合物である。具体的には、ＩＩＩＣ３（ＮＣＩ８６４２）およびＩＩＣ８（ＮＣＩ３６６２１８）として同定された化合物が、スクレロスチンとＬＲＰ５／６との相互作用を破壊することが判明した。図５に示されるように、ＬＲＰ５へのスクレロスチン−ＡＰ（スクレロスチンとアルカリホスファターゼの融合タンパク質）の結合は、ＩＩＩＣ３またはＩＩＣ８が添加された場合に減少した。該化合物は、ＬＲＰ５／６に結合し、したがってスクレロスチンの結合を防止し、Ｗｎｔを阻止し、恐らく骨形成を抑制すると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
ＷＩＳＥとスクレロスチンとの間で相同性が共有されるため、スクレロスチンが、カノニカルＷｎｔシグナル伝達に対して影響を及ぼすかどうかを判定するために実験を実施した。カノニカルＷｎｔシグナル伝達のＷｎｔ３ａ誘導活性に対して、マウススクレロスチンを含有する馴化培地（ＣＭ）の影響を、ヒト胎性腎（ＨＥＫ）細胞におけるＬＥＦ−１ベースのレポーター遺伝子アッセイを用いて判定した。スクレロスチン含有ＣＭは、用量依存様式でＷｎｔ３ａ活性の著しい阻害を示した（図１Ａ）。対照ＣＭは、５０マイクロリットルでかなりの阻害を示し始めたので、それより高い用量は試験しなかった。スクレロスチンのこの影響をさらに確認するために、スクレロスチンおよび別のカノニカルＷｎｔであるＷｎｔ１を、ＨＥＫ細胞において共発現させると、スクレロスチンは、共発現Ｗｎｔ−１活性の６０％までの阻害を示した（図１Ｂ、バー２および４）。興味深いことに、ＬＲＰ５の共発現は、Ｗｎｔシグナル伝達に対するスクレロスチンのアンタゴニスト作用を無効にし、スクレロスチンによるＷｎｔシグナル伝達の些少の刺激も、共発現したＬＲＰ５の存在下で見られた（図１Ｂ、バー６および８）。骨芽細胞系ＭＣ３Ｔ３におけるＷｎｔシグナル伝達に対するスクレロスチンの影響も調べた。スクレロスチンの発現はまた、ＭＣ３Ｔ３細胞においてＷｎｔ−１活性化レポーター遺伝子活性の７０％までの阻害を示した（図１Ｃ、バー２および４）。もう一度、ＬＲＰ５の発現が阻害を反転させた（図１Ｃ、バー６および８）。しかしながら、スクレロスチンおよびＬＲＰ５がＷｎｔと共に発現した場合、ＭＣ３Ｔ３細胞においてＷｎｔ１活性の増加はなかった（図１Ｃ）。それにもかかわらず、全てこれらの結果は、ＬＲＰ５が内因性レベルで発現する場合、スクレロスチンは、カノニカルＷｎｔ類により活性化されたカノニカルＷｎｔ活性をアンタゴナイズすることを明確に立証している。
【００１４】
スクレロスチンがカノニカルシグナル伝達をどのようにアンタゴナイズするかを理解するために、スクレロスチンがＬＲＰ５／６に直接結合するかどうかを判定するための実験を実施した。外因性ＬＲＰ５またはＬＲＰ６を発現する細胞へのスクレロスチン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）融合タンパク質の結合を、Ｄｋｋ１−ＡＰに使用された同じ方法を用いて測定した。図２Ａに示されるように、スクレロスチン−ＡＰは、Ｄｋｋ１−ＡＰと同様のＬＲＰ６−結合曲線を示し、スクレロスチン−ＡＰは、以前にサブナノモラー（Ｓｕｂ−ｎａｎｏｍｏｌａｒ）と測定されたＬＲＰ６に対するＤｋｋ１−ＡＰの親和性と同等の親和性を有することが示唆された。ＬＲＰ５発現細胞へのスクレロスチン−ＡＰおよびＤｋｋ１−ＡＰの結合により、スクレロスチン−ＡＰおよびＤｋｋ１−ＡＰもまた、ＬＲＰ５に対して同様の親和性を有することが判明した（図２Ｂ）。ＬＲＰ５のどの領域がスクレロスチン−ＡＰの結合の原因であるかを説明するために、我々は、最初または最後の２つのＹＷＴＤ−ＥＧＦ反復ドメインのいずれかを欠く、２種のＬＲＰ５変異体へのスクレロスチン−ＡＰの結合を測定した。これらの変異体は、それぞれＬＲＰ５Ｒ１２またはＬＲＰ５Ｒ３４と称される（図２Ｅ）。Ｄｋｋ１−ＡＰは、双方のＬＲＰ５変異体に結合できるが（図２Ｄ）、スクレロスチン−ＡＰは、ＬＲＰ５Ｒ３４ではなくてＬＲＰ５Ｒ１２だけに結合し得る（図２Ｃ）。
【００１５】
ＬＲＰ５Ｒ１２は、依然としてＷｎｔシグナル伝達を変換できることを我々は以前に示しているが、このＬＲＰ５変異体は、Ｗｎｔ結合配列を保持し得ることを示唆した。スクレロスチンおよびＷｎｔがＬＲＰ５Ｒ１２への結合に関して互いに競合するかどうかを判定するために、Ｗｎｔ３ａＣＭの存在または不在下でＬＲＰ５Ｒ１２を発現する細胞へのスクレロスチン−ＡＰの結合を測定した。Ｗｎｔ３ａの存在は、スクレロスチン−ＡＰのＬＲＰ５Ｒ１２への結合に全く影響を及ぼさなかった（図３Ａ）。対照的にＤｋｋ１の存在は、スクレロスチン−ＡＰのＬＲＰ５Ｒ１２への結合を完全に遮断した（図３Ｂ）。ＬＲＰ５上のスクレロスチン結合配列をさらに説明する試みにおいて、第２〜第４のＹＷＴＤ−ＥＧＦ反復ドメインおよび第１、第３、および第４のＹＷＴＤ−ＥＧＦ反復ドメインをそれぞれ欠いている２つのさらなるＬＲＰ５変異体が構築された。しかしながら、これら２つのＬＲＰ５変異体は、スクレロスチン−ＡＰまたはＤｋｋ１−ＡＰのいずれにも結合せず、それらはＷｎｔシグナル伝達を変換しなかった。これらの結果により、第１および第２のＹＷＴＤ−ＥＧＦ反復ドメインが、スクレロスチンのＬＲＰ５への結合に必要であるか、またはこれらのＬＲＰ５変異体が、不正確に折りたたまれていることを示唆している。
【００１６】
第１のＹＷＴＤ−ＥＧＦ反復ドメイン内の幾つかのＬＲＰ５変異体は、ＨＢＭと関連することが判明している。我々は以前に、変異の１つであるＧ１７１Ｖを特性化しており、この変異は、ＬＲＰ５とそのシャペロンＭｅｓｄとの相互作用を妨害し、その結果、ＬＲＰ５の細胞表面への輸送が不十分になることが判明している。このＬＲＰ５変異体は、自己分泌Ｗｎｔ類に関して依然として細胞内にシグナルを変換できるため、この変異は、Ｄｋｋ１が骨細胞において高度に発現されることからＤｋｋ１などの細胞外アンタゴニストから細胞内にＬＲＰ５受容体を保持することによってＷｎｔシグナル伝達を増加し得ると想定された。骨および骨細胞に発現することが知られている新規なＷｎｔアンタゴニストとしてのスクレロスチンの発見により、第１のＹＷＴＤ−ＥＧＦ反復ドメインに配置され、スクレロスチン結合領域内にあるＧ１７１Ｖ変異の作用に関して代わりの説明を提供し得る。このような説明の１つとして、Ｇ１７１Ｖ変異が、ＬＲＰ５のスクレロスチンへの結合を直接妨害することであり得る。この可能性を試験するために、我々は、スクレロスチン−ＡＰのＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖへの結合と、Ｄｋｋ１−ＡＰの結合とを測定し、比較した。我々が以前に示したように、ＬＲＰ５ＧＶを発現する細胞は、変異によるシャペロン機能の妨害のため、野生型ＬＲＰ５を発現する細胞よりもＤｋｋ１−ＡＢへの見かけの結合が５倍低い（図３Ｃ）。同様に、ＬＲＰ５ＧＶを発現する細胞はまた、スクレロスチン−ＡＰの結合が同じ程度の減少を示した（図３Ｂ）。Ｇ１７１Ｖ変異は、ＬＲＰ５とＤｋｋ１との間の相互作用を直接妨害しないので、その変異は、ＬＲＰ５とスクレロスチンとの間の相互作用を妨害する可能性は低い。ＬＲＰ５ＧＶは、野生型ＬＲＰ５として同じ用量範囲でＷｎｔ活性のスクレロスチン媒介阻害を依然として反転し得るという観察により（図１Ｂ、Ｃ）、Ｇ１７１Ｖ変異は、ＬＲＰ５と、またはＬＰＲ６とＤｋｋ１との間の相互作用を妨害しないという考えをさらに支持される。
【００１７】
スクレロスチンは、主として骨細胞に発現することが以前に示されている。一次的登頂骨骨芽細胞の分化の際にＷｎｔ７Ｂの発現に関連するスクレロスチンの発現を調べた。我々は、一次的骨髄骨芽細胞の分化の際に、発現レベルが激烈な変化を示した唯一のＷｎｔとして、β−カテニンを安定化できるカノニカルＷｎｔ、Ｗｎｔ７ｂを、以前に同定した。同様に、Ｗｎｔ７Ｂの発現レベルが、登頂骨骨芽細胞の分化の際に激烈な変化を示した；Ｗｎｔ７ｂの発現レベルが８日目にピークとなり、次いで骨芽細胞マーカーのオステオカルシンおよび別のＷｎｔアンタゴニストのＤｋｋ１の発現に先立って低レベルに低下した（図４Ａ）。インサイチュハイブリダイゼーションにより、Ｗｎｔ７ｂ  ｍＲＮＡが、主としてマウスの長期骨における早期未分化骨芽細胞において検出されたというＷｎｔ７ｂ発現に対する結論がさらに確認される（図４Ｂ）。スクレロスチンの発現は、オステオカルシンの発現と経時的に同様に示され、骨細胞が、石灰化マトリックスに恐らく形成される際に分化の後期段階で生じるだけであった（図４Ａ）。このスクレロスチンの発現パターンは、スクレロスチンが骨マトリックスに埋め込まれた骨細胞に発現され、機械的負荷において役割を演じ得るという先のｉｎ  ｖｉｖｏ観察と一致する。スクレロスチンおよびＷｎｔ７ｂの発現パターンに基づいて、スクレロスチンが、Ｗｎｔ結合を直接妨害しなくても、または変異がＬＲＰ５へのスクレロスチンの結合に影響を及ぼさなくても、スクレロスチンはＧ１７１Ｖ関連ＨＢＭ表現型に寄与すると我々は仮定している。Ｇ１７１Ｖ変異が、自己分泌Ｗｎｔに関する変異受容体のシグナル伝達能力を減らすことなくパラ分泌アンタゴニストからの受容体を隠し得るという我々の仮説により示唆されるように、十分に分化された骨芽細胞または骨細胞によってのみ産生されるスクレロスチンは、野生型ＬＲＰ５よりもＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖへのアクセスが恐らく低くなるようなパラ分泌アンタゴニストのうちの１つと考えられる。したがって、Ｇ１７１変異は、Ｄｋｋ１のみならず、スクレロスチンおよび可能性としては骨内に存在する他のパラ分泌ＷｎｔアンタゴニストによりカノニカルＷｎｔシグナル伝達のアンタゴニズムを弱めることによってＷｎｔ活性を増加できる。
【００１８】
先の研究において、スクレロスチンはＢＭＰアンタゴニストとして作用することが示された。スクレロスチンは、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７に対して適度に高親和性を有することが確信されている。しかしながら、ＢＭＰに対するスクレロスチンの生物学的作用は、骨芽細胞へのリガンド付加の３〜６日後にＢＭＰ誘導アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性を測定することによって単に判定された。このＡＰ活性の読取りは、ＢＭＰ活性に特異的ではない。実際、カノニカルＷｎｔ類はまた、これらのタイプの細胞においてＡＰ活性を刺激できる。対照的に、我々のＷｎｔレポーター遺伝子アッセイは、カノニカルＷｎｔに特異的であり、ＨＥＫ細胞内のＢＭＰにより活性化できない（データは示していない）。さらにＣＭを用いるアッセイにおいて、我々は、６時間におけるスクレロスチンの作用を測定した（図１Ａ）。スクレロスチンは、ＢＭＰにより引き出された早期応答を阻害できなかったという最近の観察が得られたので、スクレロスチンは、恐らく生物学的にカノニカルＷｎｔアンタゴニストであり、骨質量に対するその作用は、主として恐らくカノニカルＷｎｔシグナル伝達に対するアンタゴニスト作用に帰すると我々は考えている。
【００１９】
図２に示されるように、スクレロスチンは、Ｗｎｔシグナルを変換するためにも必要であるＬＲＰ５の最初の２つのＹＷＴＤ−ＥＧＦ反復ドメインに結合する。しかしながら、我々の証拠により、１）Ｗｎｔ３ａは、ＬＲＰ５へのスクレロスチン−ＡＰの結合を阻害できなかった；および２）ＬＲＰ５は、カノニカルＷｎｔシグナル伝達に対してスクレロスチンの阻害作用を反転できたことから、スクレロスチンのアンタゴニスト作用が、ＬＲＰ結合に関して恐らくＷｎｔとの直接的競合によるのではないことが示唆されている。後者の観察により、Ｗｎｔシグナル伝達のＤｋｋ１抑制はまた、ＬＲＰ５／６の外因性発現により反転できるのでＷｎｔシグナル伝達に対するＤｋｋ１の作用を暗示する。ＬＲＰ５／６分子がＤｋｋの作用を反転させる能力の理由は、Ｄｋｋ媒介アンタゴニズムが別のタンパク質Ｋｒｅｍｅｎを必要とするからである。Ｋｒｅｍｅｎが、ＬＲＰ５／６と共発現される場合、Ｄｋｋ媒介阻害を復元できた。Ｋｒｅｍｅｎは、スクレロスチン媒介アンタゴニズムに対して何ら作用はなかったが、同様の機序が、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するスクレロスチンに使用できることを我々は疑う。言い換えれば、スクレロスチンがアンタゴニストとして効率的に機能するのに必要と思われるＫｒｅｍｅｎのようなアクセサリータンパク質であり得る。最近、ノギンがスクレロスチンと直接的に相互作用することが示されており、ＢＭＰシグナル伝達を阻害するためにノギンの能力を阻害する。したがって、ノギンがスクレロスチンに結合したら、Ｗｎｔシグナル伝達を調節するスクレロスチンの能力を阻害し得るであろう。さらに、外因性ＬＲＰ５またはＬＲＰ５ＧＶの存在下、スクレロスチンが、ＬＥＦ−１レポーター遺伝子活性について僅かな刺激を示したという観察により、スクレロスチンは哺乳動物系でも一定の環境下、部分的アゴニストである可能性を示唆している。
【００２０】
本発明は、少なくとも１種の非天然化合物、非天然化合物の断片、またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程を含む、骨形成または骨リモデリングを促進させるか、または調節する方法を提供する。非天然化合物は、哺乳動物対象、特に人体の天然に見られない化合物として定義される。非天然化合物はまた、人体に天然に見られる化合物と同一の人工製造化合物を含むことができる。非天然化合物が、骨形成または骨リモデリングに関与する受容体または補助受容体に結合する場合、スクレロスチンの結合を防止されることによって骨形成を可能にする。
【００２１】
２種以上の化合物が、例えば、架橋により直接一緒に結合し得るか、またはリンカーアームにより間接的に結合し得る。これらの結合化合物の各々はまた、同一の結合部位、タンパク質または受容体上の異なる位置に結合できる。これら結合化合物の各々はまた、異なる結合部位、タンパク質または受容体上の異なる位置に結合できる。
【００２２】
該化合物または化合物の断片が、小分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質または化学物質であり得る。該化合物または断片は、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、または前述の任意の組み合わせでもあり得る。
【００２３】
該化合物は、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸、または皮下により投与できる。
【００２４】
本発明はまた、引き続く事象の発生を阻止阻害するか、または促進させるために、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するシグナルペプチドまたはタンパク質に結合する化合物または薬物候補を同定する方法を提供する。具体的には、該化合物または薬物候補は、骨形成または骨リモデリングを阻止阻害するか、または促進させるために受容体タンパク質に結合する。最初の工程は、アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、受容体タンパク質のアナログまたは誘導体、または前記方法の任意の組み合わせなどの種々の方法の使用により受容体タンパク質の仮想構造または計算構造を決定することを含む。好ましい実施形態において、該タンパク質は、非溶解性または膜結合性である。
【００２５】
次の工程は、変異分析、化学修飾（例えば、アミノ酸の）、共Ｘ線結晶学、ＮＭＲまたは前記方法の任意の組み合わせを含む生物学的機能に基づく実験の使用により、受容体タンパク質上の特定の結合キャビティ部位またはドメインを同定することを含む。変異および化学修飾など、これらの実験から得られた結果を用いて、特定結合部位またはドメインは、化合物または薬物候補が結合する結合キャビティ内に同定される。全結合キャビティまたはキャビティ内の特定結合部位は、はまり込みおよび結合する化合物をスクリーンするために使用できる。スクリーニングは、ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを用いて実施する。該キャビティへの該化合物の結合は、Ｆｌｅｘｘ（商標）プログラムを用いて実施する。次いで最高結合親和性または最低結合エネルギーを有する化合物が、Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを用いて選択される。究極の目標は、最良の適合を有する化合物または薬物候補を選択することである。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態は、スクレロスチンを投与することにより哺乳動物対象における骨形成を防止するか、または阻止する方法である。
【００２７】
本発明の別の好ましい実施形態は、スクレロスチンを低下させるか、または除去するか、あるいは骨形成または骨リモデリングに関与する受容体または補助受容体へのスクレロスチンの親和性を低下させるか、または除去するスクレロスチンに対する抗体、または任意の他の化合物もしくは化合物の断片を投与する工程を含む骨異常増殖の治療用の方法である。
【００２８】
材料および方法
細胞培養、トランスフェクション、ＣＭの調製、およびルシフェラーゼアッセイ
ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ）系Ａ２９３Ｔおよびマウス骨芽細胞系ＭＣ３Ｔ３を前記のとおり維持し、トランスフェクトした。ルシフェラーゼアッセイのために、２４ウェルプレート中、細胞を５×１０４細胞／ウェルで播種し、製造元により提案されたとおり、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州）を用いて、０．５μｇＤＮＡ／ウェルをトランスフェクトした。各トランスフェクションでのＤＮＡ濃度を等しくするために、ＬａｃＺプラスミドが通常用いられた。トランスフェクションの２４時間後、細胞抽出物を採取した。前記のとおりルシフェラーゼアッセイを実施した。ルミネセンス強度をＧＦＰの蛍光強度に対して正規化した。ＣＭを含有するＤＫＫ１−ＡＰおよびスクレロスチン−ＡＰの調製のため、ＨＥＫ細胞を４×１０５細胞／ウェルで播種し、１μｇＤＮＡ／ウェルをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＣＭを採取した。
【００２９】
発現プラスミドの構築および変異誘発
ヒトＬＲＰ５、ＬＲＰ６、マウスＷｎｔ１、ＤＫＫ１、スクレロスチン、およびＤＫＫ−２の野生型および変異体を、高忠実度耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州）を用いてＰＣＲにより産生した。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ塩基配列決定により確かめられた。ＨＡまたはフラッグエピトープのタグを、完全長分子および変異体分子のＣ末端に導入した。これら分子の発現は、ＣＭＶプロモーターにより駆動された。ＬＥＦ−１レポーター遺伝子コンストラクトは、グロッシェドル（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ）博士により恵与された。
【００３０】
ＤＫＫ１−ＡＰおよびスクレロスチン−ＡＰ結合アッセイ
２４ウェルプレートにＨＥＫ細胞に、ＬＲＰ５およびその変異体を形質移入させた。１日後、細胞を冷洗浄用緩衝液（ＢＳＡおよびＮａＮ３を含有するＨＢＢＳ）で洗浄し、マウスＤＫＫ−１ＡＰまたはスクレロスチン−ＡＰ  ＣＭと共に氷上で２時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄用緩衝液で３回洗浄し、溶解した。溶解液を６５℃で１０分間加熱し、そのＡＰ活性を、ＴｒｏｐｉｘルミネセンスＡＰアッセイキットを用いて測定した。免疫沈澱アッセイは、本質的に以前に記載されたとおりに実施した。
【００３１】
第一次頭頂部骨芽細胞培養
５日齢のマウスのマウス頭頂部骨芽細胞培養物を、前記のとおり作製し、８ｍＭのβ−グリセロリン酸、および５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸の存在下、骨形成分化を受けるように誘導した。培地は２日おきに交換した。
【００３２】
定量的ＰＣＲ分析
製造元の指示に従い、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて、総ＲＮＡを単離した。ＱＰＣＲ分析のために、ＲＴ−ＰＣＲ用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））により、ＲＮＡを逆転写した。ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＯＰＴＩＣＯＮ（商標）（ＭＪリサーチ社（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）機器上、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））を用いて、ＱＰＣＲを実施した。各サンプルで、内部参照としてＢアクチンを用いた。前記の式を用いて、ｍＲＮＡ濃度の相対的変化を、β−アクチンのｍＲＮＡ濃度に対して正規化した。
【００３３】
インサイチュハイブリダイゼーション
アンチセンスおよびセンスプローブを合成するためにＷｎｔ７ｂのコード領域全長を用いた。該プローブは、ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、米国、インディアナ州、インディアナポリス、）を用い、ジゴキシゲニンにより標識した。３週齢マウスの脛骨の切片を脱蝋し、再水和し、４％のパラホルムアルデヒドによって再び固定した。次いで、該切片を、２％のグリシンおよびプロテイナーゼ−Ｋによって処理し、無水酢酸／ＴＥＡ溶液を用いてアセチル化した後、ジゴキシゲニン標識プローブによってハイブリダイゼーションした。５０％のホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、５％のＳＤＳにより、７０℃で３０分間、２回、および５０％のホルムアルデヒド、２×ＳＳＣにより、６５℃で３０分間洗浄した後、該切片を、抗ジゴキシゲニン−アルカリホスファターゼ抗体と共に、続いて、ニトロブルーエトラゾリウム／４−ブロモ−５−クロロインドリルホスフェートと共にインキュベートすると、紫青色となる。該切片はまた、メチルグリーン（核）およびオレンジＧ（細胞質）により対比染色した。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】スクレロスチンがカノニカルＷｎｔシグナル伝達をアンタゴナイズすることを示す図であり、Ｗｎｔ３ａ  ＣＭに及ぼすスクレロスチンＣＭの効果を示す図である。Ｗｎｔ３ａ  ＣＭ（２５μｌ）を種々の量のスクレロスチンＣＭ（ＳＣＭ）または対照ＣＭ（ＣＣＭ）と混合し、ＬＥＦ−１レポーター遺伝子をトランスフェクトしたＨＥＫ細胞に加えた。６時間後、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性を判定した。ＳＣＭ不在下での活性を１００％とする。Ｗｎｔ３ａ  ＣＭは、レポーター遺伝子活性を５倍増加させた。Ｆｌａｇタグ化スクレロスチンの発現は抗Ｆｌａｇ抗体（挿入体）により検出した。
【図１Ｂ】スクレロスチンがカノニカルＷｎｔシグナル伝達をアンタゴナイズする図であり、ＨＥＫ細胞におけるＷｎｔ１シグナル伝達に及ぼす共発現スクレロスチンの効果を示す図である。図に示されるように、細胞に、Ｗｎｔ１、スクレロスチン（Ｓｃｌ）、野生型ＬＲＰ５（Ｗｔ）、またはＧ１７１Ｖ  ＬＲＰ５（ＧＶ）をコードするｃＤＮＡ、およびＬＥＦ−１−レポーター遺伝子およびＧＦＰ発現プラスミドをトランスフェクトした。１日後、細胞を溶解させ、ＧＦＰ濃度およびルシフェラーゼ活性を判定し、ＧＦＰ濃度に対して正規化した。
【図１Ｃ】スクレロスチンがカノニカルＷｎｔシグナル伝達をアンタゴナイズする図であり、ＭＣ３Ｔ３細胞におけるＷｎｔ１シグナル伝達に及ぼす共発現スクレロスチンの効果を示す図である。図に示されるように、細胞に、Ｗｎｔ１、スクレロスチン（Ｓｃｌ）、野生型ＬＲＰ５（Ｗｔ）、またはＧ１７１Ｖ  ＬＲＰ５（ＧＶ）をコードするｃＤＮＡ、およびＬＥＦ−１−レポーター遺伝子およびＧＦＰ発現プラスミドをトランスフェクトした。１日後、細胞を溶解させ、ＧＦＰ濃度およびルシフェラーゼ活性を判定し、ＧＦＰ濃度に対して正規化した。
【図２Ａ】ＬＲＰ５に対するスクレロスチン−ＡＰの結合を示す図であり、完全長のＬＲＰ６、ＬＲＰ５またはＬａｃＺに対するＤＫＫ１−ＡＰおよびスクレロスチン−ＡＰの結合を示す図である。ＨＥＫ細胞に、完全長ＬＲＰ６をトランスフェクトした。前記方法において記載されたとおり、ＤＫＫ１−ＡＰまたはスクレロスチン−ＡＰ（Ｓｃｌ）の結合を判定した。対照プラスミドＬａｃＺをトランスフェクトした細胞の結合を、非特異的結合として差し引いた。特異的結合はチャートに示してある。
【図２Ｂ】ＬＲＰ５に対するスクレロスチン−ＡＰの結合を示す図であり、完全長のＬＲＰ６、ＬＲＰ５またはＬａｃＺに対するＤＫＫ１−ＡＰおよびスクレロスチン−ＡＰの結合を示す図である。ＨＥＫ細胞に、ＬＲＰ５をトランスフェクトした。前記方法において記載されたとおり、ＤＫＫ１−ＡＰまたはスクレロスチン−ＡＰ（Ｓｃｌ）の結合を判定した。対照プラスミドＬａｃＺをトランスフェクトした細胞の結合を、非特異的結合として差し引いた。特異的結合はチャートで示してある。
【図２Ｃ】ＬＲＰ５変異体に対するスクレロスチン−ＡＰの結合を示す図であり、ＤＫＫ１−ＡＰおよびスクレロスチン−ＡＰのＬＲＰ５変異体への結合を示す図である。示されるように、ＨＥＫ細胞にＬａｃＺまたはＬＲＰ５の変異体をトランスフェクトした。スクレロスチン−ＡＰの結合を判定した。
【図２Ｄ】ＬＲＰ５変異体に対するスクレロスチン−ＡＰの結合を示す図であり、ＤＫＫ１−ＡＰおよびスクレロスチン−ＡＰのＬＲＰ５変異体への結合を示す図である。示されるように、ＨＥＫ細胞にＬａｃＺまたはＬＲＰ５の変異体をトランスフェクトした。Ｄｋｋ１−ＡＰの結合を判定した。
【図２Ｅ】ＬＲＰ５変異体に対するスクレロスチン−ＡＰの結合を示す図であり、ＬＲＰ５変異体の略図を表したものである。
【図３Ａ】スクレロスチン結合に及ぼすＷｎｔ３ａ、Ｄｋｋ１、およびＬＲＰ５変異体の効果を示す図である。ＨＥＫ細胞にＬＲＰ５をトランスフェクトした。対照ＣＭ（ＣＣＭ）またはＷｎｔ３ａ  ＣＭ（ＷＣＭ、１００μｌ）の存在下、スクレロスチン−ＡＰ（５μｌ）の結合を判定した。この結合アッセイにおいて、対照プラスミドＬａｃＺをトランスフェクトした細胞に対する結合は、非特異的結合として差し引いた。特異的結合はチャートに示してある。
【図３Ｂ】スクレロスチン結合に及ぼすＷｎｔ３ａ、Ｄｋｋ１、およびＬＲＰ５変異体の効果を示す図である。ＨＥＫ細胞にＬＲＰ５Ｒ１２をトランスフェクトした。緩衝液または組換えＤｋｋ１（１０ｎＭ）の存在下、スクレロスチン−ＡＰ（５０μｌ）の結合を判定した。この結合アッセイにおいて、対照プラスミドＬａｃＺをトランスフェクトした細胞に対する結合は、非特異的結合として差し引いた。特異的結合はチャートに示してある。
【図３Ｃ】スクレロスチン結合に及ぼすＷｎｔ３ａ、Ｄｋｋ１、およびＬＲＰ５変異体の効果を示す図である。ＨＥＫ細胞にＬＲＰ５（黒バー）またはＬＲＰ５Ｇ１７１Ｖ（白バー）をトランスフェクトした。Ｄｋｋ１−ＡＰ（Ｄｋｋ）またはスクレロスチン−ＡＰ（Ｓｃｌ）の結合を判定した。この結合アッセイにおいて、対照プラスミドＬａｃＺをトランスフェクトした細胞に対する結合は、非特異的結合として差し引いた。特異的結合はチャートに示してある。
【図４Ａ】Ｗｎｔ７ｂ、スクレロスチン、Ｄｋｋ１、およびオステオカルシンの発現を示す図である。５日齢マウスから第一次頭頂部骨芽細胞培養物を確立した。５日目に分化誘導剤を加えた。Ｗｎｔ７ｂ、スクレロスチン（ｓｃｌ）、オステオカルシン（ＯＣ）、およびＤｋｋ１の相対的発現レベルを、前記方法において記載されたとおり、ＱＲＴ−ＰＣＲによって判定した。
【図４Ｂ】Ｗｎｔ７ｂ、スクレロスチン、Ｄｋｋ１、およびオステオカルシンの発現を示す図である。マウスにおけるＷｎｔ７ｂの長期発現を、インサイチュハイブリダイゼーションを用いて調べた。Ｗｎｔ７ｂ（暗色染色）は、骨芽細胞内に早期検出される。核は緑色に対比染色される。
【図５Ａ】ＬＲＰ５に対するスクレロスチン−ＡＰの結合に及ぼすＩＩＩＣ３の効果を示す図である。骨形成の抑制は、存在しているＩＩＩＣ３の量に逆相関した。加えるＩＩＩＣ３の量が多いほど、骨形成抑制のパーセンテージが低くなる。
【図５Ｂ】ＬＲＰ５に対するスクレロスチン−ＡＰの結合に及ぼすＩＩＣ８の効果を示す図である。加えるＩＩＣ８の量が多いほど、骨形成抑制のパーセンテージが低くなる。
【図１Ａ】
2008536816.tif 000003
【図１Ｂ】
2008536816.tif 000004
【図１Ｃ】
2008536816.tif 000005
【図２Ａ】
2008536816.tif 000006
【図２Ｂ】
2008536816.tif 000007
【図２Ｃ】
2008536816.tif 000008
【図２Ｄ】
2008536816.tif 000009
【図２Ｅ】
2008536816.tif 000010
【図３Ａ】
2008536816.tif 000011
【図３Ｂ】
2008536816.tif 000012
【図３Ｃ】
2008536816.tif 000013
【図４Ａ】
2008536816.tif 000014
【図４Ｂ】
2008536816.tif 000015
【図５Ａ】
2008536816.tif 000016
【図５Ｂ】
2008536816.tif 000017