(57)【要約】本発明は、ＰＳＭＡに対する安定化した高親和性の核酸リガンドを提供する。２’−Ｏ−メチル置換核酸によるＳＥＬＥＸＴＭ法、および細胞表面ＳＥＬＥＸＴＭを使用した、ＰＳＭＡに対する新規の安定な高親和性リガンドの同定および調製のための方法が、本明細書中に記載される。ＰＳＭＡ発現によって特徴付けられる疾患の処置および診断のための方法および組成物もまた含まれ、この処置および診断は、記載される核酸リガンドを使用する。
2008536485.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＳＭＡに結合するアプタマーであって、配列番号１１〜１３、配列番号１５〜２６、配列番号３０〜９０、配列番号１２２〜１６５、および配列番号１６７からなる群より選択される核酸配列を含む、アプタマー。
【請求項２】
前記アプタマーは、インビトロでＰＳＭＡのＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を調節する、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
前記アプタマーは、さらに改変されて、少なくとも１つの化学的改変を含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項４】
前記改変は、前記核酸の糖の位置における化学的置換、該核酸のリン酸の位置における化学的置換、および該核酸の塩基の位置における化学的置換からなる群より選択される、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項５】
前記改変は、改変ヌクレオチドの組み込み、３’キャッピング、アミンリンカーへの結合体化、高分子量の非免疫原性化合物への結合体化、脂肪親和性化合物への結合体化、薬物への結合体化、細胞傷害性部分への結合体化および放射性同位体による標識化からなる群より選択される、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項６】
前記細胞傷害性部分は、前記アプタマーの５’末端に結合体化される、請求項５に記載のアプタマー。
【請求項７】
前記細胞傷害性部分は、前記アプタマーの３’末端に結合体化される、請求項５に記載のアプタマー。
【請求項８】
前記細胞傷害性部分は、ナノ粒子中に封入される、請求項５に記載のアプタマー。
【請求項９】
前記ナノ粒子は、リポソーム、デンドリマー、およびくし型ポリマーからなる群より選択される、請求項８に記載のアプタマー。
【請求項１０】
前記細胞傷害性部分は、低分子細胞傷害性薬剤である、請求項５に記載のアプタマー。
【請求項１１】
前記低分子細胞傷害性部分は、ビンブラスチンヒドラジド、カリケアマイシン、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン、チューブリシン、ドラスタチン−１０、ドラスタチン−１５、オーリスタチンＥ、リゾキシン、エポチロンＢ、エピチロンＤ、タキソイド、メイタンシノイド、ならびにそれらの任意の改変体および誘導体からなる群より選択される、請求項１０に記載のアプタマー。
【請求項１２】
前記放射性同位体は、イットリウム−９０、インジウム−１１１、ヨウ素−１３１、ルテチウム−１７７、銅−６７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、およびアクチニウム−２２５からなる群より選択される、請求項５に記載のアプタマー。
【請求項１３】
前記細胞傷害性部分は、タンパク質毒素である、請求項５に記載のアプタマー。
【請求項１４】
前記タンパク質毒素は、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニン、およびシュードモナス属体外毒素Ａからなる群より選択される、請求項１３に記載のアプタマー。
【請求項１５】
前記非免疫原性の高分子量化合物は、ポリアルキレングリコールである、請求項５に記載のアプタマー。
【請求項１６】
前記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである、請求項１５に記載のアプタマー。
【請求項１７】
治療的に有効な量の請求項１０に記載のアプタマーまたはその塩および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１８】
ＰＳＭＡの発現に関連する疾患を処置または改善する方法であって、請求項１７に記載の組成物を、ＰＳＭＡの発現に関連する疾患を処置または改善する必要のある患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
治療的に有効な量の請求項１３に記載のアプタマーまたはその塩、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
ＰＳＭＡのアップレギュレーションに関連する疾患を処置または改善する方法であって、請求項１９に記載の組成物を、ＰＳＭＡのアップレギュレーションに関連する疾患を処置または改善する必要のある患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
配列番号１７（ＡＲＣ１０９１）、配列番号１８（ＡＲＣ１１４２）、配列番号１９（ＡＲＣ１７８６）、配列番号２２（ＡＲＣ５９１）、配列番号２３（ＡＲＣ２０３８）、配列番号２４（ＡＲＣ２０３９）、配列番号８８（ＡＲＣ１１１３）、配列番号８９（ＡＲＣ２０３５）、配列番号９０（ＡＲＣ２０３６）、配列番号１２８（ＡＲＣ９４２）、配列番号１２９（ＡＲＣ２０３７）、配列番号１３０（ＡＲＣ１０２６）、配列番号１５６（ＡＲＣ１７２１）、配列番号１５７（ＡＲＣ２０３３）、配列番号１５８（ＡＲＣ２０３８）、配列番号１６２（ＡＲＣ１７２５）、配列番号１６３（ＡＲＣ２０３２）、配列番号１６７（ＡＲＣ９６４）、および配列番号１６８からなる群より選択される核酸配列を含むアプタマーであって、該核酸配列が、細胞傷害性部分に結合体化される、アプタマー。
【請求項２２】
前記細胞傷害性部分は、メイタンシノイド誘導体およびビンブラスチンヒドラジドからなる群より選択される、請求項２１に記載のアプタマー。
【請求項２３】
前記細胞傷害性部分は、前記アプタマーの５’末端に結合体化される、請求項２１に記載のアプタマー。
【請求項２４】
前記細胞傷害性部分は、前記アプタマーの３’末端に結合体化される、請求項２１に記載のアプタマー。
【請求項２５】
前記細胞傷害性部分は、ナノ粒子中に封入される、請求項２１に記載のアプタマー。
【請求項２６】
前記ナノ粒子は、リポソーム、デンドリマー、およびくし型ポリマーからなる群より選択される、請求項２５に記載のアプタマー。
【請求項２７】
以下の構造：
【化１】
2008536485.tif 000059
を含むアプタマーであって、
該アプタマーが、配列番号１７および配列番号９０のうちのいずれか１つからなる群より選択される、
アプタマー。
【請求項２８】
以下の構造：
【化２】
2008536485.tif 000060
を含むアプタマーであって、
該アプタマーが、配列番号１８、配列番号１３０および配列番号１６７のうちのいずれか１つからなる群より選択される、
アプタマー。
【請求項２９】
前記アプタマーは、γ線を放出する放射性同位体によって標識される、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３０】
請求項１に記載のアプタマーと組成物とを接触させる工程、および該組成物におけるＰＳＭＡまたはその改変体の存在または非存在を検出する工程を包含する、診断方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載のアプタマーを被験体に投与する工程、および該患者において局在した放射性金属を検出する工程を包含する、診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、核酸の分野、そしてより具体的には、ＰＳＭＡに結合し得るアプタマーの分野に関連し、このアプタマーは、前立腺癌および／またはＰＳＭＡが関係している他の疾患もしくは障害の治療薬および診断薬として有用である。本発明はさらに、ＰＳＭＡに結合し得るアプタマーの投与のための材料および方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アプタマーは、古典的なワトソン−クリック塩基対形成以外の相互作用によって、分子に対する特異的な結合親和性を有する核酸分子である。
【０００３】
ファージディスプレイによって産生されるペプチドまたはモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）のようなアプタマーは、選択された標的に対して特異的に結合し得、そして例えば、結合するアプタマーがそれらの標的の機能する能力をブロックし得ることによって標的の活性を調節し得る。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロ選択プロセスによって産生されたアプタマーが、１００種類を超えるタンパク質（増殖因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン、およびレセプターを含む）に対してもたらされている。代表的なアプタマーは、１０〜１５ｋＤａのサイズ（３０〜４５ヌクレオチド）であり、ナノモル未満の親和性でその標的に結合し、かつ近縁の標的を区別する（例えば、アプタマーは、代表的に、同じ遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質に結合しない）。一連の構造研究は、アプタマーが、抗体−抗原複合体における親和性および特異性を生じさせるのと同じ型の結合性相互作用（例えば、水素結合、静電的相補性、疎水的接触、立体排除）を使用し得ることを示している。
【０００４】
アプタマーは、治療薬および診断薬として使用するための多くの望ましい特徴を有し、その特徴としては、高い特異性および親和性、生物学的効力、ならびに優れた薬物動態特性が挙げられる。さらに、アプタマーは、抗体および他のタンパク質生物製剤を上回る特定の競合的利益を提供し、それは、例えば、以下のものである：
１）速度および制御。アプタマーは、全体的にインビトロでのプロセスによって産生され、治療的な優位を含む最初の優位の迅速な発生を可能にする。インビトロ選択は、上記アプタマーの特異性および親和性が厳密に制御されることを可能にし、そして毒性についての目的および非免疫原性についての目的の両方を含む優位の発生を可能にする。
【０００５】
２）毒性および免疫原性。部類としてのアプタマーは、ほとんどか、または全く毒性または免疫原性を示さなかった。高レベルのアプタマーを用いたラットまたはウッドチャックの慢性投薬（９０日間にわたって毎日１０ｍｇ／ｋｇ）において、毒性は、あらゆる臨床的か、細胞性か、または生化学的な測定で観察されない。多くのモノクローナル抗体の効力が、抗体自体に対する免疫応答によって厳しく制限され得るのに対して、アプタマーに対して抗体を惹起することは、非常に困難である。なぜならば、アプタマーはほぼ、ＭＨＣおよび免疫応答が、一般に、核酸フラグメントを認識しないように養成（ｔｒａｉｎ）されることによって、Ｔ細胞によって提示される可能性がないからである。
【０００６】
３）投与。最も最近承認された抗体治療薬が、静脈内注入（代表的に、２〜４時間にわたる）によって投与されるのに対して、アプタマーは、皮下注射によって投与され得る（皮下投与を介するアプタマーのバイオアベイラビリティーは、サルによる研究において＞８０％である（非特許文献１））。この違いは、主に、比較的低い溶解度に起因し、したがって大容量が、ほとんどの治療用ｍＡｂに対して必要とされる。良好な溶解度（＞１５０ｍｇ／ｍＬ）および比較的低い分子量（アプタマー：１０〜５０ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）に起因して、アプタマーの１週間の用量は、０．５ｍＬ未満の用量で注射によって送達され得る。さらに、小さいサイズのアプタマーは、それらを抗体または抗体フラグメントが透通できない立体配座の収縮を生じる領域へ透通させ、アプタマーベースの治療薬または予防薬のなお別の利点を提供する。
【０００７】
４）スケール拡大性（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）および費用。治療用アプタマーは、化学的に合成され、したがって生産需要を満たす必要に応じて容易に増減され得る。生産の増減における困難性が、現在、いくつかの生物学の利用可能性を制限しており、そして大規模なタンパク質生産プラントの資本コストが、莫大であることに対して、単一の大規模なオリゴヌクレオチド合成機は、１００ｋｇ／年以上を生産し得、そして比較的少量の初期投資を必要とする。キログラム規模でのアプタマー合成のための物品の時価は、＄５００／ｇと推定され、高度に最適化された抗体についてのものに匹敵する。プロセスの開発における継続的な改良は、５年で物品の費用を＄１００／ｇを上回って低下させることが期待される。
【０００８】
５）安定性。治療用アプタマーは、化学的に頑丈である。それらは、本質的に、熱および変性剤などの因子に対する曝露後に活性を回復するように適合され、そして凍結乾燥粉末として室温で長期間（＞１年）にわたって保管できる。
【０００９】
（前立腺癌および現在の処置）
前立腺癌は、依然として満たされていない主要な医学的懸案事項である。前立腺癌は、男性が一生のうちで６人に１人の発症数（生まれてから死ぬまで通算して）を有する癌の最も一般的な形態である。全体的に、前立腺癌は、男性の癌による死因の二番目（年間約３０，０００人）である。米国において、２２０，９００人の患者が、２００３年において前立腺癌と診断された。これらの患者のほとんどは、早期に診断され、そしてその治癒率は、外科手術および／または放射線治療によって非常に高いものである。しかし、限局性疾患を有する患者の１０〜５０％は、進行した転移性疾患へと進行する（第ＩＩＩ期）。
【００１０】
現在、進行した転移性前立腺癌に対して利用可能な限定的な処置の選択肢が、存在する。長期のアンドロゲン除去療法（アンドロゲン枯渇療法、ホルモン枯渇療法）は、転移性前立腺癌に対する治療の現在の基準である。Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標）およびＺｏｌａｄｅｘ（登録商標）などの性腺刺激ホルモン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）（黄体形成ホルモン放出ホルモンまたは「ＬＨＲＨ」とも称される）アンタゴニストが、下垂体のレベルでアンドロゲンの産生をブロックする一方で、フルタミドなどの薬物は、副腎のレベルでアンドロゲン産生をブロックし、そしてフィナステリドは、そのレセプターに対するアンドロゲンの結合をブロックする。しかし、治癒は、この後期において稀であり、そしてホルモン療法に対する応答の中央値の長さは、１８〜２４ヶ月であり、その後、全てとはいえないがほとんどの患者は、再発する。前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）の上昇またはこの段階における進行の他の徴候を示す患者についての予後は悪く、１年後に６０％しか生存しない。この後期において、生活の質（「ＱＯＬ」）は、一般に、アンドロゲン枯渇療法の副作用に起因して、少なくとも部分的に減少し、その副作用としては、疲労、筋肉量の減少、性機能障害、悪心および嘔吐、精神的苦痛ならびに女性化乳房が挙げられる。
【００１１】
再発の際にしばしば、アンドロゲン枯渇療法に一旦応答した前立腺癌は、不応性になるか、またはアンドロゲン非依存性になり、その後、有効な処置の選択肢が、劇的に減少する。化学療法は、現在、アンドロゲン非依存性前立腺癌（「ＡＩＰＣ」）としても公知であるアンドロゲン非依存性の転移性疾患（第ＩＶ期）を有する患者において利用される。現在、それは、ＡＩＰＣの唯一利用可能な治療的選択肢であり、そしてその化学療法は、しばしば、疼痛を減少させ、かつＱＯＬを増大させるためにコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン）と組み合わせて使用される。しかし、現在の化学療法レジメンは、生存の上昇に関してほとんど寄与せず、そして、主として疼痛管理における効果によるＱＯＬの改善に基づいて主に承認されている。
【００１２】
最近まで、プレドニゾンと組み合わせて投与されるＮｏｖａｎｔｒｏｎ（登録商標）（ミトザントロン）は、ＡＩＰＣに対する治療の基準であった。Ｎｏｖａｎｔｒｏｎ（登録商標）の開発を支援する臨床試験において、寛解応答は、主要なエンドポイントであった；生存、病変の大きさの変化、ＰＳＡレベルの減少、およびＱＯＬは、二次的なエンドポイントであった。記録を支持する中心的な研究は、寛解応答のエンドポイントおよび二次的なエンドポイントに関して中程度の効力を示したが、生存に対する効果を示さなかった。２００４年５月に、ＦＤＡは、アンドロゲン非依存性の転移性前立腺癌を有する患者の処置について、プレドニゾンと組み合わせたＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）（ドセタキセル）注射を承認した。Ｔａｘｏｔｅｒｅの安全性および有効性は、１，０００人を上回る患者による、無作為の多施設による世界的臨床試験において、転移性のアンドロゲン非依存性前立腺癌を有する男性においてＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）およびプレドニゾンによる化学療法をミトザントロンおよびプレドニゾンによる化学療法と比較することによって確立された。３週間毎に与えられるプレドニゾンと組み合わせたＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）は、その試験におけるコントロール群よりも約２．５ヶ月の生存における優位性を示した。これは、ホルモン不応性前立腺癌に対して承認された最初の薬物であり、それは、任意の生存における利点を示しているが、それは、僅かなものである。
【００１３】
（癌治療としてのアプタマー−毒素結合体）
広範な先の研究は、様々な適応に対する強力な治療として、抗体−毒素結合体（「免疫結合体」）の概念を開発しており、その適応は、ほぼ血液学的な腫瘍に主要な焦点を有する癌の処置に対する。標的性送達のための種々の異なるペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）は、タンパク質毒素、強力な低分子細胞傷害剤、放射性同位体、およびリポソーム封入型薬物を含む前臨床研究および臨床研究において試験されている。これらの努力が、血液学的な腫瘍に対するＦＤＡに承認された３つの治療（Ｍｙｏｔａｒｇ、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、およびＢｅｘｘａｒ（登録商標））を首尾よくもたらした一方で、分類としての免疫結合体（特に、固形腫瘍に対するもの）は、抗体の複数の異なる特性に起因して歴史的に不本意な結果をもたらしており、それとしては、非ヒト化抗体に対して中和抗体の応答を発症する傾向、固形腫瘍における制限された浸透、毒素結合体化の結果としての標的結合親和性の損失、および全体の治療指数を制限する抗体半減期と毒素結合体半減期との間の不均衡が挙げられる（非特許文献２によって概説される）。
【００１４】
先に言及された通り、アプタマーは、それらの吸収、分布、代謝、および排泄（「ＡＤＭＥ」）の特性が、本質的に異なり、そしてそれらが、一般に、抗体に関連する免疫エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害性、補体依存性細胞傷害性）の多くを欠くことを除いて、機能的に抗体と同様である。先に記載されたアプタマーおよび抗体の特性の比較において、いくつかの因子は、アプタマーによる毒素−送達が抗体を用いた送達を上回るいくつかの明確な利点を与え、最終的にアプタマーに治療薬としての十分な可能性を提供することを示唆する。抗体を上回るアプタマーによる毒素−送達の利点のいくつかの例は、以下の通りである：
１）アプタマー−毒素結合体は、完全に化学的に合成される。化学合成は、上記結合体の性質によってより良好な制御を提供する。例えば、結合の化学量論（１個のアプタマーあたりの毒素の割合）および部位は、正確に規定され得る。異なるリンカーの化学は、容易に試験され得る。アプタマーの折り畳みの可逆性は、結合体化の間の活性の損失は生じる見込みがないことを意味し、そしてその可逆性は、収量を最大化するための結合体化条件の調整においてより大きい柔軟性を提供する。
【００１５】
２）より小さいサイズは、腫瘍に対するより良好な透通を可能にする。固形腫瘍への抗体の乏しい透通は、しばしば、結合体化アプローチの効力を制限する因子として記載される（非特許文献３）。非ＰＥＧ化抗テネイシンＣアプタマーの特性と対応する抗体の特性を比較する研究は、腫瘍への効率的な取り込み（腫瘍：血液の比によって規定される場合）および腫瘍に局在したアプタマーが予想外に長い寿命（ｔ１／２＞１２時間）であるという証拠を示す（非特許文献４）。
【００１６】
３）調節可能なＰＫ。アプタマーの半減期／代謝は、ペイロードの特性を調和させ、全身の曝露を最小化しつつ、腫瘍に対して毒素を送達する性能を最適化するために容易に調節され得る。上記アプタマー骨格に対する適切な改変および高分子量ＰＥＧの付加は、上記アプタマーの半減期を結合体化された毒素／リンカーの固有の半減期に一致させ得るはずであり、非機能的な毒素含有代謝産物（ｔ１／２（アプタマー）＜＜ｔ１／２（毒素）であると予想される）に対する全身的な曝露を最小化し、そして持続性の結合体化していないアプタマー（ｔ１／２（アプタマー）＞＞ｔ１／２（毒素）であると予想される）が結合体化したアプタマーの取り込みを機能的にブロックする可能性を減少させる。
【００１７】
４）比較的低い材料要件。投薬レベルは毒性ペイロードに固有の毒性によって制限される可能性がある。そのようなものとして、処置の単一の過程は、比較的小さい量（＜１００ｍｇ）のアプタマーを必要とし、オリゴヌクレオチド合成の費用がアプタマーベースの治療に対する障害となる可能性を減少させる。
【００１８】
５）非経口投与は、この適応に関して好ましい。患者／医師の受諾を引き出すための代替的な処方物の開発に対する特別な必要性が、存在しない
（ＰＳＭＡ）
前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ酵素活性に関するホモダイマーのＩＩ型内在性膜タンパク質である。それは、前立腺上皮細胞上に高度に発現され、そしてＰＳＭＡは、前立腺癌の進行全体を通してアップレギュレートされることが公知である。ＰＳＭＡは、クラスリン被膜ピットを介して恒常的に内在化する。前立腺癌細胞上の高い発現と組み合わされたこの恒常的な内在化は、ＰＳＭＡを新規の前立腺癌治療薬についての魅力的な標的にする。興味深いことに、ＰＳＭＡ発現はまた、非前立腺固形腫瘍の新生脈管構造において見出されており、したがってそれを、同様に非前立腺固形腫瘍に対する抗脈管形成剤の開発についての魅力的な標的にする。
【００１９】
先に記載されるように、ＰＳＭＡ（その発現が前立腺細胞および他の非前立腺固形腫瘍の新生脈管構造に限定される膜タンパク質）は、前立腺癌の進行において高度にアップレギュレートされ、そしてＰＳＭＡは、恒常的に内在化される。したがって、ＰＳＭＡに特異的なアプタマーは、毒性ペイロードをＰＳＭＡ発現細胞のみに特異的に送達し、非ＰＳＭＡ発現細胞において毒性の副作用をほとんどかまたは全く引き起こさないために使用され得る。進行した転移性かつアンドロゲン非依存性の前立腺癌の処置において有効な治療薬に対する依然として満たされていない重要な医学的必要性に起因して、ＰＳＭＡ発現細胞に対する細胞毒性部分の送達のための毒素に結合化したＰＳＭＡ特異的アプタマーを有することは、有益である。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満たす材料および方法を提供する。
【非特許文献１】Ｔｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．、１９９９年、第７３２巻、ｐ．２０３−２１２
【非特許文献２】ＲｅｆｆおよびＨｅａｒｄ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２００１年、第４０巻、ｐ．２５−３５
【非特許文献３】Ｃｏｌｃｈｅｒ，Ｄ．、Ｇｏｅｌ，Ａ．、Ｐａｖｌｉｎｋｏｖａ，Ｇ．、Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ，Ｇ．、Ｂｏｏｔｈ，Ｂ．、Ｂａｔｒａ，Ｓ．Ｋ、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｑ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、１９９９年、第４３巻、ｐ．１３２−１３９
【非特許文献４】Ｈｉｃｋｅ，ＢＪ．、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ａ．Ｗ．、「Ｅｓｃｏｒｔ  ａｐｔａｍｅｒｓ：ａ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｅｒｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、２０００年、第１０６巻、ｐ．９２３−９２８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
本発明は、ＰＳＭＡ発現細胞に対する毒素ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）の標的性送達のための材料および方法、ならびにＰＳＭＡ発現と関係する疾患の処置のための材料および方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法および材料は、前立腺癌を処置するために使用されるが、一方で他の実施形態において、この方法および材料は、非前立腺固形腫瘍の処置のための抗脈管形成剤として使用される。なお他の実施形態において、本発明の方法および材料は、インビトロおよびインビボで診断薬として使用される。
【００２１】
本発明は、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）（特に、ＰＳＭＡの細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」））に特異的に結合するアプタマーを提供する。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーが特異的に結合するＰＳＭＡは、ヒトＰＳＭＡ（特にヒトＰＳＭＡのＥＣＤ）である。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーが結合するＰＳＭＡは、ヒトＰＳＭＡの機能と本質的に同じである生物学的機能を達成するヒトＰＳＭＡの改変体である。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーが結合するＰＳＭＡのＥＣＤは、ヒトＰＳＭＡのＥＣＤの機能と本質的に同じ機能である生物学的機能を達成するヒトＰＳＭＡの改変体ＥＣＤである。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーが結合するＰＳＭＡ、ＰＳＭＡのＥＣＤまたはその改変体の生物学的機能は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性である。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡのヒトＥＣＤの改変体は、本発明のアプタマーを結合する実質的に同じ構造および実質的に同じ能力を有し、その構造および能力は、ＰＳＭＡのヒトＥＣＤと同じである。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーは、ＰＳＭＡのＥＣＤ、またはその改変体を結合し、それらは、配列番号５と少なくとも８０％（特に、少なくとも９０％）で同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーが結合するＰＳＭＡのＥＣＤは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーは、少なくとも１μＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、５００ｐＭ未満またはそれ以下のＰＳＭＡのヒトＥＣＤまたはその改変体に対する解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、上記ＫＤ値は、結合反応を設定することによって決定され、この反応において微量の５’−３２Ｐ標識アプタマーは、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡをと一緒に１×ＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含む）中の精製された組換えＰＳＭＡの希釈列と、室温にて３０分間インキュベートされる。次いで、上記結合反応は、マニフォールドＩドットブロット（９６ウェル真空濾過マニフォールド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ））（ドットブロット結合アッセイ）を使用したニトロセルロース濾過によって分析される。（上から下に向かって）Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐナイロン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＧＢ００２ゲルブロット紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）からなる三層の濾過媒体が、使用される。核酸よりもタンパク質を選択的に結合する上記ニトロセルロース層は、好ましくはタンパク質リガンドとの複合体において抗ＰＳＭＡアプタマーを保持するが、複合体形成していない抗ＰＳＭＡアプタマーは、そのニトロセルロースを通過し、そして上記ナイロンに吸着される（上記ドットブロット紙は、他の濾過のための媒体を補助するために含まれる）。濾過の後、濾過層は、取り出され、乾燥され、そしてリン光スクリーニング（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に曝され、そしてＳｔｏｒｍ  ８６０  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（登録商標）ブロット画像化システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量され、そしてＫＤ値は、方程式ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙ切片に当てはめて算出される。他の実施形態において、上記ＫＤ値は、下の実施例１に記載される条件下におけるニトロセルロースフィルター結合アッセイによって決定される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーは、ＰＳＭＡのＥＣＤを結合する能力を実質的に有し、その能力は、配列番号１１〜１３、配列番号１５〜２６、配列番号３０〜９０、配列番号１２２〜１６５、配列番号１６７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーと同じである。他の実施形態において、本発明のアプタマーは、ＰＳＭＡのＥＣＤに結合する構造および能力を実質的に有し、その構造および能力は、配列番号１１〜１３、配列番号１５〜２６、配列番号３０〜９０、配列番号１２２〜１６５、および配列番号１６７からなる群より選択されるヌクレオチドを含むアプタマーと同じである。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号１１〜１３、配列番号１５〜２６、配列番号３０〜９０、配列番号１２２〜１６５、および配列番号１６７からなる群より選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。他の実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号１１〜１３、配列番号１５〜２６、配列番号３０〜９０、配列番号１２２〜１６５、および配列番号１６７からなる群より選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。なお別の実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号１１〜１３、配列番号１５〜２６、配列番号３０〜９０、配列番号１２２〜１６５、および配列番号１６７からなる群より選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。なお別の実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号１１〜１３、配列番号１５〜２６、配列番号３０〜９０、配列番号１２２〜１６５、および配列番号１６７からなる群より選択される核酸配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号１１〜１３および配列番号１５〜１９からなる群より選択される配列のうちの１つと少なくとも８０％同一であり、具体的に少なくとも９０％同一であり、より具体的に少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。
【００２６】
好ましい実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号１７（ＡＲＣ１０９１）、配列番号１８（ＡＲＣ１１４２）、配列番号１９（ＡＲＣ１７８６）、配列番号２２（ＡＲＣ５９１）、配列番号２３（ＡＲＣ２０３８）、配列番号２４（ＡＲＣ２０３９）、配列番号８８（ＡＲＣ１１１３）、配列番号８９（ＡＲＣ２０３５）、配列番号９０（ＡＲＣ２０３６）、配列番号１２８（ＡＲＣ９４２）、配列番号１２９（ＡＲＣ２０３７）、配列番号１３０（ＡＲＣ１０２６）、配列番号１５６（ＡＲＣ１７２１）、配列番号１５７（ＡＲＣ２０３３）、配列番号１５８（ＡＲＣ２０３８）、配列番号１６２（ＡＲＣ１７２５）、配列番号１６３（ＡＲＣ２０３２）からなる群より選択される核酸配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーは、本発明の方法によって選択され、その方法は、以下を包含する：核酸の候補混合物を調製する工程；核酸配列の候補混合物と細胞表面上にアプタマーの標的（例えば、ＰＳＭＡ）を発現する細胞の懸濁物とを接触させる工程；標的を発現する生細胞（例えば、ＰＳＭＡを発現する生細胞）のみに対して増大した親和性を有する核酸配列の集団を単離する工程；および標的を発現する（例えば、ＰＳＭＡを発現する）細胞に結合について比較的より高い親和性および特異性を有する核酸が濃縮された混合物を産生するために増大した親和性の核酸配列を増幅する工程。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程、単離する工程および増幅する工程は、反復して繰り返される。いくつかの実施形態において、上記濃縮された核酸混合物は、接触させる工程の前に転写され、特に、上記接触させる工程、同定する工程、増幅する工程および転写する工程は、反復して繰り返される。さらなる実施形態において、上記方法は、標的（例えば、ＰＳＭＡ）に結合する核酸リガンドを同定するさらなる工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、機能的アッセイ（例えば、インビトロの生化学的アッセイおよび／または機能的な細胞ベースのアッセイ）における核酸リガンド分析および／またはドットブロットアッセイにおける結合による核酸リガンド分析をさらに包含する。
【００２８】
上記方法の１つの実施形態において、候補の核酸混合物は、先にＳＥＬＥＸＴＭを受けているバイアスをかけたプール（ｂｉａｓｅｄ  ｐｏｏｌ）であり、上記標的は、細胞表面上に発現されるもの以外の単離されたタンパク質である。本発明のアプタマーを選択する方法の特定の実施形態において、上記候補の核酸混合物は、標的（例えば、ＰＳＭＡ、具体的に、ＰＳＭＡのＥＣＤ、より具体的には、ヒトＰＳＭＡのＥＣＤ）に特異的に結合するＳＥＬＥＸＴＭによって先に同定されたアプタマー核酸配列に基づく合成の縮重プール（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｏｏｌ）である。好ましい実施形態において、この方法は、ネガティブな選択工程において上記核酸混合物と、細胞表面上に標的（例えば、ＰＳＭＡ）を発現しない細胞の懸濁物とを接触させる工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記核酸混合物は、その混合物と、標的を発現する（例えば、ＰＳＭＡを発現する）細胞とを接触させる前に、アプタマーの標的を発現しない細胞（例えば、ＰＳＭＡを発現しない細胞）と接触させられる。特定の実施形態において、アプタマーの標的を発現しない細胞（例えば、ＰＳＭＡを発現しない細胞）は、標的（例えば、ＰＳＭＡ）を発現しない細胞型とは異なる。いくつかの実施形態において、上記核酸混合物と接触するＰＳＭＡを発現する細胞は、ＬＮＣａＰ細胞であり、そしてＰＳＭＡを発現しない細胞は、ＰＣ３細胞である。本発明のアプタマーを選択する方法のいくつかの実施形態において、生細胞と結合する増大した親和性の核酸の集団を単離するために使用される方法は、ＦＡＣＳ分析である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーは、ＰＳＭＡの機能を調節する。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーは、インビトロでＰＳＭＡの機能を調節する。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーは、インビボでＰＳＭＡの機能を調節する。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーは、ＰＳＭＡの機能を阻害する。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーによって調節されるＰＳＭＡの生物学的機能は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性である。
【００３０】
本発明は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸であるアプタマーを提供する。本発明のアプタマーは、一本鎖のリボ核酸、デオキシリボ核酸、またはリボ核酸とデオキシリボ核酸との組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマーは、少なくとも１つの化学的改変を含む。いくつかの実施形態において、上記改変は、上記核酸の糖の位置における化学的置換、上記核酸のリン酸の位置における化学的置換、および上記核酸の塩基の位置における化学的置換からなる群より選択される。他の実施形態において、上記改変は、改変ヌクレオチドの組み込み；３’キャッピング、５’キャッピング、高分子量の非免疫原性化合物への結合体化、アミンリンカーへの結合体化、脂肪親和性化合物への結合体化、およびリン酸骨格中へのホスホロチオエート組み込みからなる群より選択される。好ましい実施形態において、上記非免疫原性の高分子量化合物は、ポリアルキレングリコールであり、より好ましくはポリエチレングリコールである。別の好ましい実施形態において、上記改変ヌクレオチドは、２’−フルオロ改変ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、および２’−デオキシ改変ヌクレオチドを含む。
【００３１】
本発明は、薬物（例えば、細胞傷害性部分）に結合体化されるか、または放射性同位体による標識化されるアプタマーを提供する。いくつかの実施形態において、細胞傷害性部分などの薬物は、アプタマーの３’末端に結合体化されるが、他の実施形態において、細胞傷害性部分などの薬物は、アプタマー５’末端に結合体化される。いくつかの実施形態において、細胞傷害性部分などの薬物は、ナノ形態（リポソーム、デンドリマー、およびくし型ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない）中に封入されるである。１つの実施形態において、上記細胞傷害性部分は、低分子（ビンブラスチンヒドラジド、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、ドラスタチン−１０、ドラスタチン−１５、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）Ｅ、リゾキシン、エポチロンＢ、エピチロン（ｅｐｉｔｈｉｌｏｎｅ）Ｄ、タキソイド、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）ならびにその任意の改変体誘導体が挙げられるが、これらに限定されない）である。別の実施形態において、上記細胞傷害性部分は、放射性同位体であり、その放射性同位体としては、イットリウム−９０、インジウム−１１１、ヨウ素−１３１、ルテチウム−１７７、銅−６７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、およびアクチニウム−２２５が挙げられるが、これらに限定されない。なお別の実施形態において、上記細胞傷害性部分は、タンパク質毒素であり、そのタンパク質毒素としては、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニン、およびシュードモナス属体外毒素Ａが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
いくつかの実施形態において、細胞傷害性部分に結合体化されるアプタマーは、配列番号１１〜１３、配列番号１５〜２６、配列番号３０〜９０、配列番号１２２〜１６５、配列番号１６７および配列番号１６８からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、細胞傷害性部分に結合体化されるアプタマーは、配列番号１７（ＡＲＣ１０９１）、配列番号１８（ＡＲＣ１１４２）、配列番号１９（ＡＲＣ１７８６）、配列番号２２（ＡＲＣ５９１）、配列番号２３（ＡＲＣ２０３８）、配列番号２４（ＡＲＣ２０３９）、配列番号８８（ＡＲＣ１１１３）、配列番号８９（ＡＲＣ２０３５）、配列番号９０（ＡＲＣ２０３６）、配列番号１２８（ＡＲＣ９４２）、配列番号１２９（ＡＲＣ２０３７）、配列番号１３０（ＡＲＣ１０２６）、配列番号１５６（ＡＲＣ１７２１）、配列番号１５７（ＡＲＣ２０３３）、配列番号１５８（ＡＲＣ２０３８）、配列番号１６２（ＡＲＣ１７２５）、配列番号１６３（ＡＲＣ２０３２）、配列番号１６７（ＡＲＣ９６４）および配列番号１６８（Ａ９）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、細胞傷害性部分に結合体化されるアプタマーは、配列番号１８、配列番号８８、および配列番号１３０からなる群より選択される。特定の実施形態において、上記細胞傷害性部分に結合体化されるアプタマーは、配列番号１８、配列番号８８、配列番号１３０および配列番号１６７からなる群より選択され、そしてその細胞傷害性部分は、ビンブラスチンおよびＤＭ１からなる群より選択される。
【００３３】
特定の実施形態において、本発明のアプタマー−毒素結合体は、以下の構造：
【００３４】
【化３】
2008536485.tif 000003
を含み、
そのアプタマーは、配列番号１７および配列番号９０のうちのいずれか１つからなる群より選択される。
【００３５】
別の特定の実施形態において、本発明のアプタマー−毒素結合体は、以下の構造：
【００３６】
【化４】
2008536485.tif 000004
を含み、
そのアプタマーは、配列番号１８、配列番号１３０および配列番号１６７のうちのいずれか１つからなる群より選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、細胞傷害性部分に結合体化される本発明のアプタマーはまた、高分子量の非免疫原性化合物に結合体化される。好ましい実施形態において、上記高分子量の非免疫原性化合物は、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）である。本発明のＰＥＧ−アプタマー−細胞毒のいくつかの実施形態において、そのＰＥＧ部分は、そのアプタマーの５’末端に結合体化され、そしてその細胞傷害性部分は、そのアプタマーの３’末端に結合体化され、一方で他の実施形態において、上記ＰＥＧ部分は、上記アプタマーの３’末端に結合体化され、そして上記細胞傷害性部分は、５’末端に結合体化される。一方で、いくつかの実施形態において、上記アプタマーは、上記ＰＥＧ部分によって上記細胞毒に連結される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本発明は、前立腺癌の処置、予防および／または改善において使用するためのアプタマー−毒素結合体を提供する。別の実施形態において、本発明は、ＰＳＭＡが発現される固形腫瘍の処置、予防および／または改善のために抗脈管形成として使用するためのアプタマー−毒素結合体を提供し、例えば、そのＰＳＭＡは、腫瘍の新生脈管構造において発現される。別の実施形態において、治療的に有効な量のアプタマー−薬物結合体（特に、本発明のアプタマー−細胞毒素結合体）またはその塩、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物が、提供される。いくつかの実施形態において、本発明は、インビトロおよび／またはインビボにおいて診断薬と使用するためのアプタマー−細胞毒素結合体を提供する。
【００３９】
本発明は、ＰＳＭＡに特異的なアプタマーを選択するための方法を提供し、その方法は、以下の工程を包含する：核酸の候補混合物を調製する工程；核酸配列の候補混合物と細胞表面上にＰＳＭＡを発現する細胞の懸濁物とを接触させる工程；ＰＳＭＡを発現する生細胞のみに対して増大した親和性を有する核酸配列の集団を単離する工程；およびＰＳＭＡを発現する細胞に対する結合について比較的より高い親和性および特異性を有する核酸が濃縮された混合物を産生するために増大した親和性の核酸配列を増幅する工程。さらなる実施形態において、その方法は、ＰＳＭＡに結合する核酸リガンドを同定するさらなる工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記同定工程は、機能的アッセイ（例えば、インビトロの生化学的アッセイおよび／または機能的な細胞ベースのアッセイ）における分析および／またはドットブロットアッセイにおける結合による分析をさらに包含する。
【００４０】
本発明のアプタマーを選択する上記方法の１つの実施形態において、上記候補の核酸混合物は、標的（例えば、ＰＳＭＡ、具体的に、ＰＳＭＡのＥＣＤ、より具体的には、ヒトＰＳＭＡのＥＣＤ）に特異的に結合するＳＥＬＥＸＴＭによって先に同定されたアプタマー核酸配列に基づく合成の縮重プールである。好ましい実施形態において、この方法は、ネガティブ選択工程において上記核酸混合物と、細胞表面上にＰＳＭＡを発現しない細胞の懸濁物とを接触させる工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記ネガティブ選択工程は、上記混合物とＰＳＭＡを発現する細胞とを接触させる工程の前に行なわれる。特定の実施形態において、ＰＳＭＡを発現しない細胞は、ＰＳＭＡを発現する細胞とは異なる型の細胞である。いくつかの実施形態において、上記核酸混合物と接触させられるＰＳＭＡを発現する細胞は、ＬＮＣａＰ細胞であり、そして上記ＰＳＭＡを発現しない細胞は、ＰＣ３細胞である。本発明のアプタマーを選択する方法のいくつかの実施形態において、生細胞と結合する増大した親和性の核酸の集団を単離するために使用される方法は、ＦＡＣＳ分析である。
【００４１】
本発明はまた、ＰＳＭＡ発現に関連する疾患を処置、予防および／または改善する方法を提供し、この方法は、本発明の薬学的組成物を、脊椎動物（好ましくは、哺乳動物（より好ましくは、ヒト））に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、処置、予防または改善される上記疾患は、アンドロゲン依存性の前立腺癌またはアンドロゲン非依存性の前立腺癌を含む前立腺癌およびその転移からなる群より選択される。別の実施形態において、処置、予防または改善される上記疾患は、非前立腺固形腫瘍を含み、この固形腫瘍において、ＰＳＭＡが、その腫瘍の新生脈管構造において発現される。
【００４２】
本発明はまた、インビトロおよびインビボでの診断薬としてＰＳＭＡに結合するアプタマーを提供する。いくつかの実施形態において、インビボまたはインビトロでの診断薬のために使用される本発明のアプタマーは、γ線を放出する放射性同位体（例えば、９９Ｔｃおよび１１１Ｉｎｄ）によって標識化され得る金属錯化剤に結合体化される。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のアプタマーと組成物とを接触させる工程、およびＰＳＭＡまたはその改変体の存在または非存在を検出する工程を包含する診断方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、前立腺癌の検出、病期分類、処置のための診断方法を提供し、その診断方法は、γ線を放出する放射性同位体よってＰＳＭＡに特異的なアプタマーを標識化する工程、γ線を放出する放射性同位体によって標識されたアプタマーを被験体に投与する工程、およびその被験体において局在した放射性金属を検出する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記診断方法は、インビトロで使用するための方法であるが、他の実施形態において、上記診断方法は、インビボで使用するための方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
（発明の詳細な説明）
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、付随する以下の説明において示される。本明細書中に記載されるものと類似するまたは等価である任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用され得、好ましい方法および材料は、本明細書中に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、上記説明から明らかとなる。この明細書において、単数形は、その文脈が特に明示しない限り複数形をも含む。特に明記しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合において、本明細書が、支配する。
【００４４】
（ＳＥＬＥＸＴＭ法）
アプタマーを産生するのに適切な方法は、一般に図１に示される「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」（「ＳＥＬＥＸＴＭ」）と名付けられたプロセスを用いる。上記ＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、標的分子に対する高度な特異的結合を有する核酸分子のインビトロ進化のための方法であり、そして、例えば、現在放棄されている米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年１月１１日出願）、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」の米国特許第５，４７５，０９６号、および表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」の米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ  ９１／１９８１３もまた参照のこと）に記載される。各ＳＥＬＥＸＴＭで同定された核酸リガンド（すなわち、各アプタマー）は、所与の標的化合物または標的分子の特定のリガンドである。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、核酸が、種々の二次元構造および三次元構造を形成する十分な性能を有し、ならびに実質的に任意の化合物（モノマーであってもポリマーであってもよい）とリガンドとして作用する（すなわち、特定の結合対を形成する）場合にそれらのモノマー内で利用可能である十分な化学的万能性（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ）を有するという、独特な識見に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が、標的として作用し得る。
【００４５】
ＳＥＬＥＸＴＭは、出発点としてランダム化された配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーまたはプールに依存する。上記オリゴヌクレオチドは、改変または未改変のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。いくつかの例において、上記プールは、１００％ランダムか、または部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例において、上記プールは、ランダムかまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含み、それらのオリゴヌクレオチドは、ランダム化された配列内に組み込まれた少なくとも１つの固定された配列および／または保存された配列を含む。他の例において、上記プールは、ランダムかまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含み、それらのオリゴヌクレオチドは、上記オリゴヌクレオチドプールの全ての分子によって共有される配列を含み得る少なくとも１つの固定された配列および／または保存された配列をその５’末端および／または３’末端に含む。固定された配列は、ＰＣＲプライマーに対するハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７、およびＳＰ６）、制限酵素部位、またはホモポリマー配列（例えば、ポリＡ区画（ｔｒａｃｔ）またはポリＴ区画）、触媒コア（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｃｏｒｅ）、アフィニティーカラムに対する選択的結合のための部位、ならびに目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にするための他の配列などの配列である。保存された配列は、先に記載される固定された配列以外の配列であり、同じ標的に結合する多くのアプタマーによって共有される。
【００４６】
上記プールのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ランダム化された配列部分、および効率的増幅のために必要な固定された配列を含む。代表的に、開始プールのオリゴヌクレオチドは、３０〜５０個のランダムヌクレオチドの内部領域に隣接（ｆｌａｎｋ）する、固定された５’末端配列および３’末端配列を含む。ランダム化されたヌクレオチドは、化学合成およびランダムに切断した細胞核酸からのサイズ選択を含む多くの方法において産生され得る。試験核酸における配列バリエーションはまた、選択／増幅の反復の前または間に、変異誘発によって導入または増大され得る。
【００４７】
上記オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、任意の長さであり得、そしてそのランダム配列部分は、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得、そしてそのランダム配列部分は、改変されたかもしくは天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号；米国特許第５，６６０，９８５号；米国特許第５，９５８，６９１号；米国特許第５，６９８，６８７号；米国特許第５，８１７，６３５号；米国特許第５，６７２，６９５号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ９２／０７０６５号を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドは、当該分野において周知である固相オリゴヌクレオチド合成技術を使用してホスホジエステル連結したヌクレオチドから合成され得る。例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドはまた、トリエステル合成法などの溶液相方法を使用して合成され得る。例えば、Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）およびＨｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．、２８：２４４９（１９７８）を参照のこと。自動化ＤＮＡ合成装置において行なわれる代表的な合成は、１０１４〜１０１６個の個別の分子（ほとんどのＳＥＬＥＸＴＭ実験に十分な数）をもたらす。配列設計におけるランダム配列の十分に大きい領域は、それぞれの合成された分子が固有の配列を示すようである可能性を増大させる。
【００４８】
オリゴヌクレオチドの開始ライブラリーは、ＤＮＡ合成機における自動化された化学合成によって産生され得る。ランダム化された配列を合成するために、４種全てのヌクレオチドの混合物が、ヌクレオチドのランダムな組み込みを可能にする、その合成プロセスの間の各ヌクレオチド付加工程において添加される。上に記載される通り、１つの実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、全体的にランダムな配列を含む；しかし、他の実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、ランダムでないかまたは部分的にランダムな配列の範囲（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含み得る。部分的にランダムな配列は、それぞれの付加工程において異なるモル比で４種のヌクレオチドを添加することによって作製され得る。
【００４９】
オリゴヌクレオチドの開始ライブラリーは、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであり得る。ＲＮＡライブラリーが開始ライブラリーとして使用されるべき場合において、それは、代表的に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは改変Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロでＤＮＡライブラリーを転写することによって産生され、そして精製される。次いでそのライブラリーは、結合に好ましい条件下で標的と混合され、そして結合の親和性および選択性の実際に所望される任意の判定基準を達成するために、同じ一般的な選択スキームを使用して、結合、分離および増幅の段階的な反復に供される。より具体的には、核酸の開始プールを含む混合物によって開始する場合、上記ＳＥＬＥＸＴＭ法は、以下の工程を包含する：（ａ）上記混合物と標的とを、結合に好ましい条件下で接触させる工程；（ｂ）結合していない核酸を標的分子に特異的に結合した核酸から分離する工程；（ｃ）核酸−標的複合体を解離させる工程；（ｄ）核酸のリガンドが豊富な混合物を産生するために上記核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅する工程；および（ｅ）標的分子に対する高度に特異的な高親和性核酸リガンドを産生するために、結合させる工程、分離する工程、解離させる工程および増幅する工程を、所望の回数のサイクルで繰り返す工程。ＲＮＡアプタマーが選択されている場合において、上記ＳＥＬＥＸＴＭ法は、以下の工程をさらに含む：（ｉ）工程（ｄ）における増幅の前に上記核酸−標的複合体から解離した核酸を逆転写する工程；および（ｉｉ）工程（ｄ）由来の増幅した核酸を、上記プロセスを再度開始する前に転写する工程。
【００５０】
多数の可能な配列および構造を含む核酸混合物内に、所与の標的に対する広範な結合親和性が存在する。例えば、２０ヌクレオチドのランダム化されたセグメントを含む核酸混合物は、４２０通りの候補可能性を有し得る。標的に対してより高い親和性定数を有するものは、ほぼその標的に結合するようである。分離、解離および増幅の後、より高い結合親和性の候補について濃縮された第２の核酸混合物が、産生される。選択のさらなるラウンドは、得られる核酸混合物が１種のみかまたは数種の配列から主として構成されるまで、最良のリガンドを次第に支持する。次いでこれらは、クローニングされ、配列決定され、そして純粋なリガンドまたはアプタマーとして結合親和性について個別に試験され得る。
【００５１】
選択および増幅のサイクルは、所望の目標が達成されるまで繰り返される。最も一般的な場合において、選択／増幅は、結合強度における顕著ではない改善が上記サイクルの反復において達成されるまで続けられる。その方法は、代表的に、約１０１４種の異なる核酸種を抽出（ｓａｍｐｌｅ）するために使用されるが、約１０１８種程度に多い異なる核酸種を抽出するために使用され得る。一般に、核酸アプタマー分子は、５〜２０サイクルの手順において選択される。１つの実施形態において、異質性が、最初の選択段階においてのみ導入され、そしてその異質性は、複製プロセス全体を通して生じない。
【００５２】
ＳＥＬＥＸＴＭの１つの実施形態において、上記選択プロセスは、１サイクルのみの選択および増幅を必要とするので、選択された標的に最も強力に結合する核酸リガンドを単離することにおいて効率的である。このような効率的な選択は、例えば、クロマトグラフィー型のプロセスにおいて生じ得、カラム上に結合された標的と結合する核酸の能力は、そのカラムが最も高い親和性の核酸リガンドの分離および単離を十分に可能にし得るような様式で作用する。
【００５３】
多くの場合において、単一の核酸リガンドが同定されるまでＳＥＬＥＸＴＭの反復工程を行なうことは、必ずしも望ましくない。標的特異的核酸リガンド溶液は、多くの保存された配列を有する核酸の構造またはモチーフのファミリー、および標的に対する核酸リガンドの親和性に著しく影響せずに置換または付加され得る多くの配列を含み得る。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスを完了前に終了させることによって、核酸リガンド溶液ファミリーの多くのメンバーの配列を決定することが、可能である。
【００５４】
核酸の種々の一次構造、二次構造および三次構造が存在することは、公知である。非ワトソン−クリック型相互作用に関与することが最も一般的に示されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称バルジおよび非対称バルジ、シュードノットならびにそれらの種々の組み合わせと称される。このようなモチーフのほとんど全ての公知である例は、それが３０ヌクレオチドを超えない核酸配列において形成され得ることを示唆する。この理由に起因して、しばしば、隣接したランダム化されたセグメントによるＳＥＬＥＸＴＭ手順は、約２０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドの間、そしていくつかの実施形態において、約３０ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドの間のランダム化されたセグメントを含む核酸配列によって開始されることが、好ましい。１つの例において、５’固定：ランダム：３’固定配列は、約３０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドのランダム配列を構成する。
【００５５】
コアＳＥＬＥＸＴＭ法は、多くの特定の目的を達成するために改変されている。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号は、特定の構造的特徴を有する核酸分子（例えば、ベントＤＮＡ）を選択するために、ゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸＴＭの使用を記載する。米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子を結合し得るか、そして／または標的分子に光架橋し得るか、そして／または標的分子を光不活化し得る光反応基を含む核酸リガンドを選択するための方法に基づくＳＥＬＥＸＴＭを記載する。米国特許第５，５６７，５８８号および米国特許第５，８６１，２５４号は、標的分子に対して高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと、標的分子に対して低い親和性を有するオリゴヌクレオチドとの間の非常に効率的な分離を達成する方法に基づくＳＥＬＥＸＴＭを記載する。米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸＴＭ工程が行なわれた後に、改良された核酸リガンドを得るための方法を記載する。米国特許第５，７０５，３３７号は、リガンドをその標的に共有結合させるための方法を記載する。
【００５６】
ＳＥＬＥＸＴＭはまた、標的分子の１つより多い部位に結合する核酸リガンドを得るため、および標的の特定の部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために使用され得る。ＳＥＬＥＸＴＭは、任意の想到可能な標的に結合する核酸リガンドを単離する手段、および任意の想到可能な標的に結合する核酸リガンドを同定する手段を提供し、その標的としては、大きい生体分子および小さい生体分子（例えば、核酸結合タンパク質、およびそれらの生物学的機能の一部として核酸に結合することが公知ではないタンパク質、ならびに補因子および他の低分子）が挙げられる。例えば、米国特許第５，５８０，７３７号は、カフェインおよび近縁のアナログであるテオフィリンに高親和性で結合し得る、ＳＥＬＥＸＴＭによって同定された核酸配列を開示する。
【００５７】
カウンター（ｃｏｕｎｔｅｒ）−ＳＥＬＥＸＴＭは、１種以上の非標的分子に対して交差反応性を有する核酸リガンド配列を排除することによって、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改良する方法である。カウンター−ＳＥＬＥＸＴＭは、以下の工程から構成される：（ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；（ｂ）候補混合物を標的と接触させる工程（ここで、候補混合物と比較して標的に対して増大した親和性を有する核酸は、候補混合物の残部から分離され得る）；（ｃ）候補混合物の残部から増大した親和性の核酸を分離する工程；（ｄ）増大した親和性の核酸を標的から解離させる工程；（ｅ）増大した親和性の核酸と１種以上の非標的分子とを、非標的分子に対して特異的な親和性を有する核酸リガンドが除去されるように接触させる工程；および（ｆ）標的分子に対する結合に関して比較的より高い親和性および特異性を有する核酸配列について濃縮された核酸の混合物を産生するために、標的分子のみに対して特異的な親和性を有する核酸を増幅する工程。ＳＥＬＥＸＴＭに関して上に記載されるように、選択および増幅のサイクルは、所望の目標が達成されるまで、必要に応じて繰り返される。
【００５８】
治療薬およびワクチンとしての核酸の使用において直面する１つの潜在的な問題は、ホスホジエステル形態にあるオリゴヌクレオチドが、所望の効果が発現される前に、細胞内酵素および細胞外酵素（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）によって体液中で迅速に分解され得ることである。したがって、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、リガンドに改良された特性（例えば、改良されたインビボ安定性または改良された送達特性）を与える改変ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような改変の例としては、リボースの位置における化学的置換および／またはリン酸の位置における化学的置換および／または塩基の位置における化学的置換が挙げられる。ＳＥＬＥＸＴＭで同定された核酸リガンド（改変ヌクレオチドを含む）は、例えば、リボースの２’位、ピリミジンの５位、およびプリンの８位において化学的に改変されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，６６０，９８５号、種々の２’改変ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，７５６，７０３号、ならびに２’−アミノ（２’−ＮＨ２）置換基、２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換基、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基によって改変された１つ以上のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リガンドを記載する米国特許第５，５８０，７３７号に記載される。
【００５９】
本発明において企図される核酸リガンドの改変としては、核酸リガンドの塩基または核酸リガンド全体に付加的な電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用、および流動性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を組み込む他の基を供給するものが含まれることが企図されるが、これらに限定されない。ヌクレアーゼに対して抵抗性であるオリゴヌクレオチド集団を産生するための改変はまた、１つ以上のヌクレオチド間結合の置換、変化した糖、変化した塩基、またはそれらの組み合わせを含み得る。このような改変としては、２’位の糖改変、５位のピリミジン改変、８位のプリン改変、環外アミンにおける改変、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ−ウラシルまたは５−ヨード−ウラシルの置換；骨格改変（ホスホロチオエート改変またはアルキルホスフェート改変）、メチル化、およびイソ塩基（ｉｓｏｂａｓｅ）（イソシチジンおよびイソグアノシン）などの異質（ｕｎｕｓｕａｌ）な塩基対形成の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。改変としてはまた、３’改変および５’改変（例えば、キャッピング）が挙げられ得る。
【００６０】
１つの実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）あるは３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）によって置換されるオリゴヌクレオチドが、提供され、ＲまたはＲ’の各々は、独立して、Ｈあるいは置換または非置換のアルキルである。結合基は、−Ｏ−結合、−Ｎ−結合、または−Ｓ−結合を介して隣接するヌクレオチドに連結され得る。オリゴヌクレオチド中の全ての結合が、必ずしも同一である必要はない。本明細書中で使用される場合、用語「ホスホロチオエート」は、１個以上の硫黄原子によって置換された、ホスホジエステル結合中の１個以上の非架橋酸素原子を含む。
【００６１】
さらなる実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、改変された糖基を含み、例えば、そのヒドロキシル基の１個以上は、ハロゲン、脂肪族基によって置換されるか、またはエステルもしくはアミンのように官能化される。１つの実施形態において、フラノース残基の２’位は、任意のＯ−メチル基、Ｏ−アルキル基、Ｏ−アリル基、Ｓ−アルキル基、Ｓ−アリル基、またはハロ基によって置換される。２’改変糖の合成の方法は、例えば、Ｓｐｒｏａｔ、ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｇｏｔｔｅｎ、ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載される。他の改変は、当業者に公知である。このような改変は、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前の改変またはＳＥＬＥＸＴＭプロセス後の改変（先に同定された改変されていないリガンドの改変）であっても、ＳＥＬＥＸＴＭプロセスへの組み込みによって行われてもよい。
【００６２】
ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前の改変またはＳＥＬＥＸＴＭプロセスへの組み込みによって行なわれる改変は、核酸リガンドのＳＥＬＥＸＴＭ標的に対する特異性および改良された安定性（例えば、インビボ安定性）の両方を有する核酸リガンドを産生する。核酸リガンドに対して行なわれるＳＥＬＥＸＴＭプロセス後の改変は、核酸リガンドの結合能に悪影響を及ぼすことなく改良された安定性（例えば、インビボ安定性）をもたらす。
【００６３】
ＳＥＬＥＸＴＭ法は、選択されたオリゴヌクレオチドと、他の選択されたオリゴヌクレオチドならびに米国特許第５，６３７，４５９号および米国特許第５，６８３，８６７号に記載されるような非オリゴヌクレオチド官能性ユニットとを組み合わせることを包含する。ＳＥＬＥＸＴＭ法は、例えば、米国特許第６，０１１，０２０号、米国特許第６，０５１，６９８号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ９８／１８４８０号に記載されるように、選択された核酸リガンドと、脂肪親和性かまたは非免疫原性の高分子量化合物とを、診断用かまたは治療用の複合体において組み合わせることをさらに包含する。これらの特許および出願は、形状および他の特性と、オリゴヌクレオチドの効率的な増幅特性および複製特性との広範な組み合わせ、ならびに形状および他の特性と他の分子の所望の特性との広範な組み合わせを教示する。
【００６４】
ＳＥＬＥＸＴＭ法による小さい柔軟なペプチドに対する核酸リガンドの同定はまた、探索されている。小さいペプチドは、柔軟な構造を有し、そしてそのペプチドは、通常、溶液中で複数の型の平衡状態であり、したがってそれは、最初に、結合親和性が柔軟なペプチドを結合する際に立体配座のエントロピーの損失によって制限され得ると考えられた。しかし、溶液中の小さいペプチドに対する核酸リガンドを同定することの実行可能性は、米国特許第５，６４８，２１４号に示された。この特許において、サブスタンスＰ（１１アミノ酸のペプチド）に対する高親和性ＲＮＡ核酸リガンドが、同定された。
【００６５】
本発明の標的に対して特異性および結合親和性を有するアプタマーは、代表的に、本明細書中に記載されるようなＳＥＬＥＸＴＭプロセスによって選択される。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスの一部として、標的に結合する選択された配列は、次いで、所望の結合親和性を有する最小の配列を決定するために、必要に応じて最小化される。選択された配列および／または最小化された配列は、必要に応じて、結合親和性を増大するためか、あるいは結合活性に必須であるその配列中の位置を決定するために、その配列のランダムかまたは指定された変異誘発を行なうことによって最適化される。さらに、選択は、インビボでの分解に対してアプタマー分子を安定化するために、改変ヌクレオチドを組み込む配列を用いて行われ得る。
【００６６】
（２’改変ＳＥＬＥＸＴＭ）
アプタマーが治療薬として使用するのに適切であるために、アプタマーは、好ましくは、合成について高価ではなく、安全であり、そしてインビボで安定である。野生型ＲＮＡアプタマーおよびＤＮＡアプタマーは、代表的に、ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの感受性に起因して、インビボで安定ではない。ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性は、２’位に改変する基を組み込むことによって大きく増大させ得る。
【００６７】
フルオロ基およびアミノ基は、オリゴヌクレオチドプールに首尾よく組み込まれ、次いでそのプールから、アプタマーが、選択されている。しかし、これらの改変は、得られたアプタマーの合成の費用を大きく増大させ、そしていくつかの場合において、改変ヌクレオチドが改変オリゴヌクレオチドの分解およびＤＮＡ合成のための基質としてのそのヌクレオチドの次なる使用によって宿主ＤＮＡ中に再循環され得る可能性に起因して、安全性の問題を誘導し得る。
【００６８】
２’−Ｏ−メチル（「２’−ＯＭｅ」）ヌクレオチドを含むアプタマーは、本明細書中で提供されるように、これらの欠点の多くを克服する。２’−ＯＭｅヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性であり、そして合成について高価ではない。２’−ＯＭｅヌクレオチドは、生物学的な系において広範に分布するが、天然のポリメラーゼは、生理学的条件下において基質として２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを受容せず、したがって宿主ＤＮＡへの２’−ＯＭｅヌクレオチドの再循環に対する安全性の問題は、存在しない。２’改変アプタマーを産生するために使用されるＳＥＬＥＸＴＭ法は、例えば、米国仮特許出願第６０／４３０，７６１号（２００２年１２月３日出願）、米国仮特許出願第６０／４８７，４７４号（２００３年７月１５日出願）、米国仮特許出願第６０／５１７，０３９号（２００３年１１月４日出願）、米国特許出願第１０／７２９，５８１号（２００３年１２月３日出願）、および表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」の米国特許出願第１０／８７３，８５６号（２００４年６月２１日出願）（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００６９】
本発明は、酵素分解および化学的分解ならびに熱分解および物理的分解に対して、改変されていないオリゴヌクレオチドよりも安定であるオリゴヌクレオチドを作製するために、ＰＳＭＡに結合するアプタマー（改変ヌクレオチド（例えば、２’位に改変を有するヌクレオチド）を含む）を含む。文献（例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２、６８３−６９５、１９９５）において２’−ＯＭｅ含有アプタマーのいくつかの例が存在するが、これらは、Ｃ残基およびＵ残基が２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換され、かつＡ残基およびＧ残基は、２’−ＯＨであった改変された転写物のライブラリーのインビトロ選択によって産生された。一旦機能的配列が単離されると、次いでＡ残基およびＧ残基の各々は、２’−ＯＭｅ置換に対する許容性について試験され、そして上記アプタマーは、再合成され、その全てのＡ残基およびＧ残基は、２’−ＯＭｅ残基として２’−ＯＭｅ置換を許容した。この２工程の様式において産生されるアプタマーのＡ残基およびＧ残基の大部分は、２’−ＯＭｅ残基による置換を許容するが、平均して、約２０％は、その置換を許容しない。したがって、この方法を使用して産生されたアプタマーは、２個〜４個の２’−ＯＨ残基を含む傾向にあり、そして安定性および合成の費用は、結果として損なわれる。アプタマーがＳＥＬＥＸＴＭ（および／または本明細書中に記載されるものを含むその任意のバリエーションおよび改良）によって選択および濃縮されるオリゴヌクレオチドプールにおいて使用される転写反応（安定化したオリゴヌクレオチドを産生する）に改変ヌクレオチドを組み込むことによって、本発明の方法は、選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドを（例えば、改変ヌクレオチドを用いてそのアプタマーオリゴヌクレオチドを再合成することによって）安定化する必要性を取り除く。
【００７０】
１つの実施形態において、本発明は、ＡＴＰヌクレオチド、ＧＴＰヌクレオチド、ＣＴＰヌクレオチド、ＴＴＰヌクレオチド、およびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ改変と、２’−Ｆ改変と、２’−デオキシ改変と、２’−ＯＭｅ改変との組み合わせを含むアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＰヌクレオチド、ＧＴＰヌクレオチド、ＣＴＰヌクレオチド、ＴＴＰヌクレオチド、およびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ改変と、２’−Ｆ改変と、２’−デオキシ改変と、２’−ＯＭｅ改変と、２’−ＮＨ２改変と、２’−メトキシエチル改変との組み合わせを含むアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＰヌクレオチド、ＧＴＰヌクレオチド、ＣＴＰヌクレオチド、ＴＴＰヌクレオチド、およびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ改変と、２’−Ｆ改変と、２’−デオキシ改変と、２’−ＯＭｅ改変と、２’−ＮＨ２改変と、２’−メトキシエチル改変との５６通りの組み合わせを含むアプタマーを提供する。
【００７１】
本発明の２’改変アプタマーは、改変ポリメラーゼ（例えば、改変Ｔ７ポリメラーゼ）を使用して作製され、その改変ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼよりも高い、フラノースの２’位にかさ高い置換基を有する改変ヌクレオチドの組み込み速度を有する。例えば、６３９位のチロシン残基がフェニルアラニンに変化した変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）は、２’デオキシヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、２’アミノ−ヌクレオチド三リン酸、および２’フルオロ−ヌクレオチド三リン酸を基質として容易に利用し、そして種々の用途のための改変ＲＮＡを合成するために使用されている。しかし、この変異体Ｔ７ポリメラーゼは、報告によると、かさ高い２’−置換基（例えば、２’−ＯＭｅ置換基または２’−アジド（２’−Ｎ３）置換基）を有するＮＴＰを容易に用いる（すなわち、組み込む）ことができない。かさ高い２’置換基の組み込みのために、Ｙ６３９Ｆ変異に加えて７８４位のヒスチジンがアラニン残基に変化した二重Ｔ７ポリメラーゼ変異体（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）が、記載され、そしてそれは、改変ピリミジンＮＴＰを組み込むために制限された状況において使用されている。Ｐａｄｉｌｌａ，Ｒ．およびＳｏｕｓａ，Ｒ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００２、３０（２４）：１３８を参照のこと。７８４のヒスチジンがアラニン残基に変化した変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｈ７８４Ａ）もまた、記載されている（Ｐａｄｉｌｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２、３０：１３８）Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体およびＨ７８４Ａ変異体Ｔ７ポリメラーゼの両方において、より小さいアミノ酸残基（例えば、アラニン）への変化は、よりかさ高いヌクレオチド基質（例えば、２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチド）の組み込みを可能にする。
【００７２】
一般に、本明細書中に開示される条件下において、Ｙ６９３Ｆ変異体が全ての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰ（ＧＴＰを除く）の組み込みのために使用され得、そしてＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体が全ての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰ（ＧＴＰを含む）の組み込みのために使用され得ることが、見出されている。Ｈ７８４Ａ変異体は、本明細書中に開示される条件下で使用される場合に、Ｙ６３９Ｆ変異体およびＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異体と同様の特性を有することが、予想される。
【００７３】
２’−改変オリゴヌクレオチドは、完全に改変ヌクレオチドから合成され得るか、または改変ヌクレオチドのサブセットを用いて合成され得る。上記改変は、同一であっても異なっていてもよい。全てのヌクレオチドは、改変され得、そしてその全ては、同じ改変を含み得る。全てのヌクレオチドは、改変され得るが、異なる改変を含み得る（例えば、同じ塩基を含む全てのヌクレオチドが、１つの型の改変を有し得るが、他の塩基を含むヌクレオチドは、異なる型の改変を有し得る）。全てのプリンヌクレオチドは、１つの型の改変を有し得る（または、改変されていない）が、全てのピリミジンヌクレオチドは、別の異なる型の改変を有する（または、改変されていない）。この様式において、転写物または転写物のプールは、例えば、リボヌクレオチド（２’−ＯＨ）、デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−Ｆ、および２’−ＯＭｅヌクレオチドを含む改変の任意の組み合わせを使用して産生される。２’−ＯＭｅ  Ｃおよび２’−ＯＭｅ  Ｕならびに２’−ＯＨ  Ａおよび２’−ＯＨ  Ｇを含む転写混合物は、「ｒＲｍＹ」混合物と称され、そしてそこから選択されたアプタマーは、「ｒＲｍＹ」アプタマーと称される。デオキシＡおよびデオキシＧならびに２’−ＯＭｅ  Ｕおよび２’−ＯＭｅ  Ｃを含む転写混合物は、「ｄＲｍＹ」混合物と称され、そしてそこから選択されたアプタマーは、「ｄＲｍＹ」アプタマーと称される。２’−ＯＭｅ  Ａ、２’−ＯＭｅ  Ｃ、および２’−ＯＭｅ  Ｕ、ならびに２’−ＯＨ  Ｇを含む転写混合物は、「ｒＧｍＨ」混合物と称され、そこから選択されたアプタマーは、「ｒＧｍＨ」アプタマーと称される。２’−ＯＭｅ  Ａ、２’−ＯＭｅ  Ｃ、２’−ＯＭｅ  Ｕおよび２’−ＯＭｅ  Ｇならびに２’−ＯＭｅ  Ａ、２’−ＯＭｅ  Ｕおよび２’−ＯＭｅ  Ｃおよび２’−Ｆ  Ｇを交代性に含む転写混合物は、「交代性」混合物と称され、そしてそこから選択されたアプタマーは、「交代性混合物」アプタマーと称される。２’−ＯＭｅ  Ａ、２’−ＯＭｅ  Ｕ、２’−ＯＭｅ  Ｃ、および２’−ＯＭｅ  Ｇ（Ｇの１０％までがリボヌクレオチドである）を含む転写混合物は、「ｒ／ｍＧｍＨ」混合物と称され、そしてそこから選択されたアプタマーは、「ｒ／ｍＧｍＨ」アプタマーと称される。２’−ＯＭｅ  Ａ、２’−ＯＭｅ  Ｕ、および２’−ＯＭｅ  Ｃ、ならびに２’−Ｆ  Ｇを含む転写混合物は、「ｆＧｍＨ」混合物と称され、そしてそこから選択されたアプタマーは、「ｆＧｍＨ」アプタマーと称される。２’−ＯＭｅ  Ａ、２’−ＯＭｅ  Ｕ、および２’−ＯＭｅ  Ｃ、ならびにデオキシＧを含む転写混合物は、「ｄＧｍＨ」混合物と称され、そしてそこから選択されたアプタマーは、「ｄＧｍＨ」アプタマーと称される。デオキシＡ、ならびに２’−ＯＭｅ  Ｃ、２’−ＯＭｅ  Ｇおよび２’−ＯＭｅ  Ｕを含む転写混合物は、「ｄＡｍＢ」混合物と称され、そしてそこから選択されたアプタマーは、「ｄＡｍＢ」アプタマーと称され、そして全てが２’−ＯＨのヌクレオチドを含む転写混合物は、「ｒＮ」混合物と称され、そしてそこから選択されたアプタマーは、「ｒＮ」アプタマーまたは「ｒＲｒＹ」アプタマーと称される。「ｍＲｍＹ」アプタマーは、全て��２’−０−メチルのヌクレオチドを含むものであり、そして通常、可能な場合、２’−ＯＭｅ  Ｇによる任意の２’−ＯＨ  ＧのＳＥＬＥＸＴＭ後の置換によってｒ／ｍＧｍＨオリゴヌクレオチドから誘導される。
【００７４】
好ましい実施形態は、２’−ＯＨヌクレオチドと、２’−デオキシヌクレオチドと、２’−ＯＭｅヌクレオチドとの任意の組み合わせを含む。より好ましい実施形態は、２’−デオキシヌクレオチドと２’−ＯＭｅヌクレオチドとの任意の組み合わせを含む。よりさらに好ましい実施形態は、２’−デオキシヌクレオチドと２’−ＯＭｅヌクレオチドとの任意の組み合わせを用い、ここでピリミジンは、２’−ＯＭｅである（例えば、ｄＲｍＹ、ｍＲｍＹまたはｄＧｍＨ）。
【００７５】
本発明のアプタマーへの改変ヌクレオチドの組み込みは、（前）選択プロセス（例えば、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前の改変）の前に達成される。必要に応じて、改変ヌクレオチドがＳＥＬＥＸＴＭプロセス前の改変によって組み込まれた本発明のアプタマーは、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス後の改変（すなわち、ＳＥＬＥＸＴＭ前の改変後のＳＥＬＥＸＴＭプロセス後の改変）によってされに改変され得る。ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前の改変は、ＳＥＬＥＸＴＭ標的に対して特異性を有する改変核酸リガンド、および改良されたインビボ安定性をももたらす。ＳＥＬＥＸＴＭプロセス後の改変（すなわち、改変（例えば、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前の改変によって組み込まれたヌクレオチドを有する先に同定されたリガンドの切断ヌクレオチド改変、欠失ヌクレオチド改変、置換ヌクレオチド改変または付加ヌクレオチド改変））は、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前の改変によって組み込まれたヌクレオチドを有する核酸リガンドの結合能に悪影響を及ぼすことなくインビボ安定性のさらなる改良を生じ得る。
【００７６】
ポリメラーゼが２’−改変ＮＴＰを受容する条件下で２’−改変（例えば、２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ転写物のプールを産生するために、好ましいポリメラーゼは、Ｙ６９３Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体またはＹ６９３Ｆ変異体である。他のポリメラーゼ（特に、かさ高い２’−置換基に対して高い許容性を示すポリメラーゼ）もまた、本発明において使用され得る。このようなポリメラーゼは、本明細書中に開示される転写条件下において改変ヌクレオチドを組み込むそれらの能力をアッセイすることによってこの性能についてスクリーニングされ得る。
【００７７】
多くの因子が、本明細書中に開示される方法において有用な転写条件に重要であることを示している。例えば、リーダー配列が、得られる転者物の少なくとも最初の約６残基がプリンであるようにＤＮＡ転写テンプレートの５’末端にて固定された配列の５’末端に組み込まれる場合に、改変転写物の収量の増加が、観察される。
【００７８】
改変ヌクレオチドを組み込む転写物を得ることにおける別の重要な因子は、２’−ＯＨ  ＧＴＰの存在または濃度である。転写は、２つの相に分けられ得る：第１相は、反応開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）であり、その間に、ＮＴＰが、ＧＴＰ（または別の置換グアノシン）の３’−ヒドロキシ末端に付加されて、ジヌクレオチドを生じ、次いでそのジヌクレオチドが、約１０〜１２ヌクレオチドに伸長される；第２相は、延長であり、その間に、転写が、最初の約１０〜１２ヌクレオチドの付加を超えて進行する。過剰な２’−ＯＭｅ  ＧＴＰを含む転写混合物に添加された少量の２’−ＯＨ  ＧＴＰはポリメラーゼに２’−ＯＨ  ＧＴＰを使用して転写を開始させるのに十分であるが、一旦転写が延長相に入ると、２’−ＯＭｅ  ＧＴＰと２’−ＯＨ  ＧＴＰとの間の識別の低下、および２’−ＯＨ  ＧＴＰを上回る過剰な２’−ＯＭｅ  ＧＴＰが、主に２’−ＯＭｅ  ＧＴＰの組み込みを可能にすることが、見出されている。
【００７９】
転写物への２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドの組み込みにおける別の重要な因子は、転写混合物における二価のマグネシウムおよび二価のマンガンの両方の使用である。塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの濃度の異なる組み合わせは、２’−Ｏ−メチル化転写物の収量に影響を及ぼし、塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの至適濃度は、転写反応混合物のＮＴＰ（二価金属イオンと錯体形成する）の濃度に依存することが見出されている。最も多い収量の最大限に２’置換されたＯ−メチル化転写物（すなわち、全てのＡヌクレオチド、Ｃヌクレオチド、およびＵヌクレオチドならびに約９０％のＧヌクレオチド）を得るために、ＮＴＰが０．５ｍＭの濃度で存在する場合、約５ｍＭ塩化マグネシウムおよび１．５ｍＭ塩化マンガンの濃度が、好ましい。各ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合、約６．５ｍＭ塩化マグネシウムおよび２．０ｍＭ塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、約９．６ｍＭ塩化マグネシウムおよび２．９ｍＭ塩化マンガンの濃度が好ましい。あらゆる場合において、これの濃度からその２倍までの逸脱は、依然として顕著な量の改変転写物を与える。
【００８０】
ＧＭＰまたはグアノシンを用いた転写の刺激もまた、重要である。この効果は、開始ヌクレオチドに対するポリメラーゼの特異性によって生じる。結果として、この様式において産生された任意の転写物の５’末端ヌクレオチドは、２’−ＯＨ  Ｇであるようである。ＧＭＰ（またはグアノシン）の好ましい濃度は、０．５ｍＭであり、そしてよりさらに好ましくは、１ｍＭである。転写反応中にＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ−８０００）を含むことは改変ヌクレオチドの組み込みを最大化するのに有用であることがまた、見出されている。
【００８１】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、ＵＴＰ（１００％）、ＣＴＰ（１００％）およびＧＴＰ（約９０％）（「ｒ／ｍＧｍＨ」）の最大の組み込みのために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合は６．５ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合は２．０ｍＭ）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）５００μＭ（より好ましくは、１．０ｍＭ）、２’−ＯＨ  ＧＴＰ  ３０μＭ、２’−ＯＨ  ＧＭＰ  ５００μＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５ユニット／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ  ５ユニット／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全てがプリンであるリーダー配列。本明細書中で使用される場合、１ユニットのＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（または本明細書中で指定される任意の他の変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）は、ｒ／ｍＧｍＨ条件下で１ナノモルの２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを転写物に組み込むために必要とされる酵素の量として規定される。本明細書中で使用される場合、１ユニットの無機ピロホスファターゼは、ｐＨ７．２および２５℃にて１分間あたり１．０モルの無機正リン酸を放出させる酵素の量として規定される。
【００８２】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよび２’−ＯＭｅ  ＣＴＰ（「ｒＧｍＨ」）の最大の組み込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は２．９ｍＭ）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５ユニット／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ  ５ユニット／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全てがプリンであるリーダー配列。
【００８３】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよび２’−ＯＭｅ  ＣＴＰ（「ｒＲｍＹ」）の最大の組み込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は２．９ｍＭ）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５ユニット／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ  ５ユニット／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全てがプリンであるリーダー配列。
【００８４】
転写物へのデオキシＡＴＰおよびデオキシＧＴＰならびに２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよび２’−ＯＭｅ  ＣＴＰ（「ｄＲｍＹ」）の最大の組み込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミン２ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）２．０ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５ユニット／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ  ５ユニット／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全てがプリンであるリーダー配列。
【００８５】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよび２’−ＯＭｅ  ＣＴＰならびに２’−Ｆ  ＧＴＰ（「ｆＧｍＨ」）の最大の組み込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）２．０ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５ユニット／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ  ５ユニット／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全てがプリンであるリーダー配列。
【００８６】
転写物へのデオキシＡＴＰならびに２’−ＯＭｅ  ＵＴＰ、２’−ＯＭｅ  ＧＴＰおよび２’−ＯＭｅ  ＣＴＰ（「ｄＡｍＢ」）の最大の組み込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）２．０ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５ユニット／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ  ５ユニット／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全てがプリンであるリーダー配列。
【００８７】
上記の各々に関して、（ａ）転写が、好ましくは、少なくとも２時間にわたって約２０℃〜約５０℃、好ましくは約３０℃〜４５℃、そしてより好ましくは約３７℃にて行なわれ、そして（ｂ）５０〜３００ｎＭの二本鎖ＤＮＡ転写テンプレートが、使用される（２００ｎＭのテンプレートが、多様性を増大させるためにラウンド１において使用され（３００ｎＭのテンプレートが、ｄＲｍＹ転写において使用される）、そしてその後のラウンドに対して、本明細書中に記載される条件を使用して約５０ｎＭ（最適化されたＰＣＲ反応の１／１０希釈）のテンプレート、が使用される）。好ましいＤＮＡ転写テンプレートが、下に記載される（ＡＲＣ２５４およびＡＲＣ２５６を、全てが２’−ＯＭｅの条件下において転写し、そしてＡＲＣ２５５を、ｒＲｍＹ条件下において転写する）。
【００８８】
【化５】
2008536485.tif 000005
本発明のｒＮ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−ＯＨシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−ＯＨウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。本発明のｒＮ転写混合物を使用して産生された改変オリゴヌクレオチドは、２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＨシチジン、および２’−ＯＨウリジンを実質的に全て含む。ｒＮ転写の好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、ｏｆ全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨシチジンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写のより好ましい実施形態において、得られた本発明の改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨシチジンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写の最も好ましい実施形態において、本発明の改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−ＯＨシチジンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。
【００８９】
本発明のｒＲｍＹ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｒＲｍＹ転写混合物を使用して産生される改変オリゴヌクレオチドは、２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンを実質的に全て含む。好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチド少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチド少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチド少なくとも１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【００９０】
本発明のｄＲｍＹ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸、２’−デオキシグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｄＲｍＹ転写条件を使用して産生される改変オリゴヌクレオチドは、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、および２’−Ｏ−メチルウリジンを実質的に全て含む。好ましい実施形態において、得られる本発明の改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−デオキシグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる本発明の改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−デオキシグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる本発明の改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−デオキシアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−デオキシグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【００９１】
本発明のｒＧｍＨ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸を含む。本発明のｒＧｍＨ転写混合物を使用して産生される改変オリゴヌクレオチドは、２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、および２’−Ｏ−メチルアデノシンを実質的に全て含む。好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。
【００９２】
本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸および２’−ＯＨグアノシン三リン酸を含む。本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写混合物を使用して産生される得られる改変オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンを実質的に全て含み、グアノシンヌクレオチドの集団は、最大で約１０％の２’−ＯＨグアノシンを有する。好ましい実施形態において、得られる本発明のｒ／ｍＧｍＨ改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドのうちの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドのうちの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドのうちの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。
【００９３】
本発明のｆＧｍＨ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、および２’−Ｆグアノシン三リン酸を含む。本発明のｆＧｍＨ転写条件を使用して産生される改変オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、および２’−Ｆグアノシンを実質的に全て含む。好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。
【００９４】
本発明のｄＡｍＢ転写条件下において、転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｄＡｍＢ転写混合物を使用して産生される改変オリゴヌクレオチドは、２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンを実質的に全て含む。好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる本発明の改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−デオキシアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【００９５】
それぞれの場合において、転写産物は、次いで、アプタマーを同定するためおよび／または所与の標的に対する結合特異性を有する配列の保存されたモチーフを決定するために、ＳＥＬＥＸＴＭプロセスにおいてライブラリーとして使用され得る。得られる配列は、既に、部分的に安定化され、最適化されたアプタマー配列に到達するためにプロセスからこの工程を排除し、そして結果として高度に安定化したアプタマーを与える。２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭプロセスの別の利点は、得られる配列が、その配列において必要とされる、より少ない２’−ＯＨヌクレオチドを有するようである（恐らく、有さない）ことである。ある程度（ｅｘｔｅｎｔ）の２’ＯＨヌクレオチドが残存した結果、それらは、ＳＥＬＥＸＴＭ後の改変を行なうことによって除去され得る。
【００９６】
下に記載されるように、より低いが依然として有用な収量の２’置換ヌクレオチドを十分に組み込む転写物が、上に記載される最適化された条件以外の条件下において得られ得る。例えば、上記の転写条件に対するバリエーションとしては、以下が挙げられる：
ＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度は、０〜１Ｍの範囲であり得る。本発明はまた、５と１０との間のｐＫａを有する他の緩衝剤の使用を企図し、その緩衝剤としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ヒドロキシメチル−アミノメタンが挙げられる。
【００９７】
ＤＴＴの濃度は、０〜４００ｍＭの範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の還元剤の使用を提供し、その還元剤としては、例えば、メルカプトエタノールが挙げられる。
【００９８】
スペルミジンおよび／またはスペルミンの濃度は、０〜２０ｍＭの範囲であり得る。
【００９９】
ＰＥＧ−８０００の濃度は、０〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の親水性ポリマーの使用を提供し、その親水性ポリマーとしては、例えば、他の分子量のＰＥＧまたは他のポリアルキレングリコールが挙げられる。
【０１００】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は、０〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の非イオン性洗浄剤の使用を提供し、その洗浄剤としては、例えば、他のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ洗浄剤を含む他の洗浄剤が挙げられる。
【０１０１】
ＭｇＣｌ２の濃度は、０．５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり得る。ＭｎＣｌ２の濃度は、０．１５ｍＭ〜１５ｍＭの範囲であり得る。ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２の両方は、記載された範囲内で存在しなければならず、そして好ましい実施形態において、約１０〜約３のＭｇＣｌ２：ＭｎＣｌ２の比で存在し、好ましくは、その比は、約３〜５：１であり、より好ましくは、その比は、約３〜４：１である。
【０１０２】
２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度（各ＮＴＰ）は、５μＭ〜５ｍＭの範囲であり得る。
【０１０３】
２’−ＯＨ  ＧＴＰの濃度は、０μＭ〜３００μＭの範囲であり得る。
【０１０４】
２’−ＯＨ  ＧＭＰの濃度は、０〜５ｍＭの範囲であり得る。
【０１０５】
ｐＨは、ｐＨ６〜ｐＨ９の範囲であり得る。本発明の方法は、改変ヌクレオチドを組み込むポリメラーゼの大部分の活性ｐＨ範囲内で実施され得る。さらに、本発明の方法は、上記転写反応条件における錯化剤の選択的使用を提供し、その錯化剤としては、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびＤＴＴが挙げられる。
【０１０６】
（医薬品化学による最適化）
アプタマー医薬品化学は、改変体アプタマーのセットが化学的合成されるアプタマー改良技術である。改変体のこれらのセットは、代表的に、単一置換基の導入によって親アプタマーとは異なり、そしてこの置換基の位置によって互いと異なる。これらの改変体は、次いで、互いおよび親と比較される。特徴における改良は、十分意味深いものであり得るので、特定の治療的判定基準を達成するのには、単一置換基を含むことで足り得る。
【０１０７】
あるいは、単一の改変体のセットから収集された情報は、１個より多い置換基が同時に導入される改変体のさらなるセット設計するために使用され得る。１つの設計ストラテジーにおいて、単一置換基改変体の全ては、順位付けされ、上位４種が、選択され、そしてこれら４種の単一置換基改変体のうちの全ての可能な２種の組み合わせ（６）、３種の組み合わせ（４）および４種の組み合わせ（１）が、合成およびアッセイされる。第２の設計ストラテジーにおいて、最良の単一置換基改変体は、新規の親と見なされ、そしてこの最も高い順位の単一置換基改変体を含む全ての可能な二置換基改変体が、合成およびアッセイされる。他のストラテジーが、使用され得、そしてこれらのストラテジーは、さらに改良された改変体を同定し続けながら置換基の数が段階的に増加するように繰り返し適用され得る。
【０１０８】
アプタマー医薬品化学は、置換基の全体的な導入よりもむしろ、局所的な導入を探索するための方法として最も価値がある。アプタマーは転写によって産生されるライブラリー内で見出されるので、ＳＥＬＥＸＴＭプロセスの間に導入される任意の置換基は、全体的に導入されるはずである。例えば、ヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を導入することが望まれる場合、ホスホロチオエート結合は、各Ａ（または各Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）においてのみ導入され得る（全体的に置換される）。いくつかのＡ（またはいくつかのＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）においてホスホロチオエートを必要とするが他のＡにおいてそれを許容できない（局所的に置換される）アプタマーを、このプロセスによって容易に見出すことはできない。
【０１０９】
アプタマー医薬品化学プロセスによって利用され得る置換基の種類は、それらを固相合成試薬として産生し、かつそれらをオリゴマー合成スキームに導入する能力によってのみ制限される。このプロセスは、決してヌクレオチドのみに限定されない。アプタマー医薬品化学スキームは、立体容積、疎水性、親水性、脂肪親和性、疎脂性（ｌｉｐｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）、正電荷、負電荷、中性電荷、両性イオン、分極率、ヌクレアーゼ抵抗性、立体配座の硬性、立体配座の柔軟性、タンパク質結合特性、質量などを導入する置換基を含み得る。アプタマー医薬品化学スキームは、塩基の改変、糖の改変またはホスホジエステル結合の改変を含み得る。
【０１１０】
置換基の種類を考慮することが、治療用アプタマーの状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）内で有益であるらしい場合、以下の分類の１つ以上に含まれる置換基を導入することが、望まれ得る：
（１）身体に既に存在する置換基（例えば、２’−デオキシプリン、２’−リボプリン、２’−Ｏ−メチルプリンまたは２’−デオキシピリミジン、２’−リボピリミジン、２’−Ｏ−メチルピリミジンまたは５−メチルシトシン）。
【０１１１】
（２）既に承認された治療薬の一部である置換基（たとえば、ホスホロチオエート連結したオリゴヌクレオチド）。
【０１１２】
（３）上記２つの分類へと加水分解または分解する置換基（例えば、メチルホスホネート連結したオリゴヌクレオチド）。
【０１１３】
本発明のＰＳＭＡアプタマーは、本明細書中に記載されるようなアプタマー医薬品化学によって開発されたアプタマーを含む。
【０１１４】
（治療用アプタマー−薬物結合体）
いくつかの実施形態において、本発明の治療用アプタマー−薬物結合体は、以下の一般式：（アプタマー）ｎ−−リンカー−−（薬物）ｍを有し、ｎが、１と１０との間であり、かつｍが、０と２０との間である（特に、ｎが、１と１０との間であり、かつｍが、１と２０との間である）。特定の実施形態において、上記アプタマーは、配列番号１１〜１３、配列番号１５〜２６、配列番号３０〜９０、配列番号１２２〜１６５、配列番号１６７および配列番号１６８からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、ポリアルキレングリコール（特に、ポリエチレングリコール）である。いくつかの実施形態において、上記薬物は、例えば、ナノ粒子中に封入される。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、リポソーム、デンドリマーまたはくし型ポリマーである。いくつかの実施形態において、上記薬物は、細胞毒である。複数のアプタマー種および複数の薬物種は、治療用組成物を産出するために組み合され得る。
【０１１５】
１つの実施形態において、本発明の治療用アプタマー−薬物結合体は、細胞毒のアプタマー媒介性送達による腫瘍細胞の標的化された殺傷において使用される。標的腫瘍マーカーが、容易に腫瘍細胞中に内在化または再循環するマーカーである場合、細胞の殺傷効率は、改善される。アプタマー−毒素分子は、米国特許出願第１０／８２６，０７７号（２００４年４月１５日出願）、米国特許出願第１０／６００，００７号（２００３年６月１８日出願）、米国仮特許出願第６０／３９００４２号（２００２年６月１８日出願）（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）において一般的に記載されている。
【０１１６】
腫瘍細胞を標的化するアプタマー：本発明のこの特定の実施形態において、アプタマー−薬物結合体において使用されるアプタマーは、腫瘍細胞の表面上に優勢に発現されるが、全ての正常組織から比較的欠乏しているマーカーを特異的に認識する能力について選択される。適切な標的腫瘍マーカーとしては、下の表Ａに列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
（表Ａ：腫瘍細胞への細胞毒送達のためのアプタマー標的）
【表Ａ】
2008536485.tif 000006
【０１１８】
所与の腫瘍細胞マーカー（例えば、表Ａに列挙されるもの）に特異的であるアプタマーは、上に記載されるようなＳＥＬＥＸＴＭプロセスを使用して産生される。ＳＥＬＥＸＴＭは、単離され、精製された腫瘍細胞表面のタンパク質（例えば、テネイシンＣ、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ）およびインビトロで培養された腫瘍細胞（例えば、Ｕ２５１（神経膠芽腫細胞株）、ＹＰＥＮ−１（形質転換した前立腺内皮細胞株））の両方に対するアプタマーを産生するために首尾よく使用されている。ほとんどの場合において、同定された腫瘍マーカータンパク質の細胞外部分は、組換え的に発現され、精製され、そしてＳＥＬＥＸＴＭプロセスによって可溶性タンパク質として処理される。可溶性タンパク質ドメインを容易に産生することができない場合において、形質転換細胞に対する結合についての直接選択（必要に応じて、正常細胞の結合に対してネガティブに選択すること）は、腫瘍特異的マーカーに結合するアプタマーをもたらす。
【０１１９】
ＳＥＬＥＸＴＭプロセスの適用によって最初に同定されたアプタマー配列は、改変の進歩的なセットによって、大規模な合成用途およびインビボ用途の両方のために最適化される。これらの改変としては、例えば、（１）アプタマーのサイズを減少させるための５’末端および３’末端ならびに内部の欠失、（２）標的に対する結合の親和性または効率を増大させる配列改変についてのドープ型再選択、（３）アプタマー中のらせん状エレメントの安定性を増大させる安定化する塩基対形成の変化の導入、（４）熱力学的安定性の増大およびインビボでのヌクレアーゼの攻撃のブロックの両方のための２’−リボースの位置（例えば、２’−ヒドキシル→２’−Ｏ−メチルの置換）およびリン酸の位置（例えば、ホスホジエステル→ホスホロチオエートの置換）の位置指定改変、ならびに（５）エキソヌクレアーゼによる攻撃をブロックするための５’キャップおよび／または３’キャップの付加（例えば、逆位３’−デオキシチミジン）が挙げられる。このプロセスによって産生されるアプタマーは、代表的に、１５〜４０ヌクレオチド長であり、そして１０時間より大きい血清半減期を示す。
【０１２０】
上記アプタマー結合体の合成を容易にするために、反応性である求核性の結合点または求電子性の結合点が、例えば、指向型の固相合成または合成後の改変によって導入される。遊離アミンは、それぞれ、固相合成の終わりまたは初めに、適切なアミノ改変因子ホスホアミデート（例えば、それぞれ、５’−アミノ改変因子Ｃ６、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＶＡ；または３’−ＰＴ−アミノ−改変因子Ｃ６  ＣＰＧ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＶＡ）を組み込むことによって上記アプタマーの５’末端または３’末端のいずれかに導入される。このアミンは、求核性の結合点として直接作用するか、あるいはこのアミンは、求電子性の結合点へとさらに変換される。例えば、ビス（スルホスクシニミジル）基質（ＢＳ３）との反応または関連する試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ）は、アミン含有分子による結合体化に適したＮＨＳエステルを生じる。あるいは、カルボン酸基は、アプタマー固相合成の終わりにおいて５’−カルボキシ改変因子Ｃ１０（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＶＡ）を使用することによって導入される。次いで、このようなカルボキシレートは、例えば、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いてインサイチュで活性化されて、求核試薬とさらに反応する。
【０１２１】
複数のアミンが、５’対称性ダブラー（ｄｏｕｂｌｅｒ）が１回以上組み込まれ、その後上に記載されるような５’−アミノ改変因子を用いた末端反応が行われる固相合成によって上記アプタマーの５’末端に組み込まれ得る。対称性ダブラーホスホラミダイトは、市販されている（例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＶＡ）。図４に示される通り、対称性ダブラーを用いた２ラウンドのカップリング後にアミンキャッピングを行うことによって、４個の遊離反応性アミンを有するアプタマーが生じる。
【０１２２】
細胞毒：薬物は、それらの薬理学的活性が結合体において保たれるか、または結合体のインビボでの代謝が薬理学的に活性な薬物フラグメントの放出をもたらすように、リンカーに結合される。表２は、結合体化に適した潜在的な細胞毒を列挙する。抗体結合体を合成するためか、またはこれらの細胞毒の薬理学的に活性な改変体を産生するためのこれまでの努力は、いくつかの場合において、官能基が改変に順応するという有用な識見を提供した。以下の改変細胞毒は、アプタマー−リンカー−薬物結合体を構築するために使用され得る。
【０１２３】
カリケアマイシン：Ｎ−アセチルγカリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＮＡｃ−γ−ＤＭＨ）は、アルデヒドと容易に反応して対応するヒドラゾンを形成する反応性ヒドラジド基を与える。ＮＡｃ−γ−ＤＭＨは、リンカーを有するアルデヒドに結合体化するために直接使用され得るか、あるいはＨａｍａｎｎら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１３：４７−５８（２００２））に記載されるようなＮ−ヒドロキシスクシニミドを有するアミン反応性形態（ＮＡｃ−γ−ＮＨＳ）に変換されてアミン含有アプタマーに結合体化され得る。
【０１２４】
メイタンシノイド：メイタンシノイドの結合体化可能形態は、メイタンシノールの再エステル化によって利用可能になり、それ自体は、メイタンシノールが、数種の還元試薬（水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウムトリメトキシアルミニウム、水素化リチウムトリエトキシアルミニウム、水素化リチウムトリプロポキシアルミニウム、および対応するナトリウム塩が挙げられる）のうちの１つを使用するメイタンシンまたはアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）Ｐ−３の還元によって米国特許第４，３６０，４６２号および同第６，３３３，４１０号に記載される通りに産生され得る。次いで、メイタンシノールは、（１）カルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド）および触媒量の塩化亜鉛（米国特許第４，１３１，２３０号に記載されるような）の存在下におけるジスルフィド含有カルボン酸（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号において考慮される種々のリンカー）との反応、（２）チオール含有メイタンシノイドを産生するための、チオール特異的試薬（例えば、ジチオスレイトール）を使用したジスルフィドの還元後のＨＰＬＣ精製、および（３）二官能性であるチオール反応性かつアミン反応性の架橋剤（例えば、Ｎ−スクシニミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート）との反応によって、米国特許第５，２０８，０２０号に記載されるようなアミン反応性形態に変換され得る。結合体処方物に適したアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシニミドを含む代表的な活性化メイタンシノイドは、表２に示される（Ｍａｙ−ＮＨＳ）。
【０１２５】
ビンカアルカロイド：ビンブラスチンなどのビンカアルカロイドは、アルデヒド含有リンカーに直接結合体化され、次いでＢｒａｄｙら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４５：４７０６−４７１５、２００２）によって記載されるようなヒドラジド形態に変換され得る。簡単にいうと、硫酸ビンブラスチンは、１：１のヒドラジン／エタノールに溶解され、そして６０℃〜６５℃まで２２時間にわたって加熱されて、デスアセチルビンブラスチン３−カルボキシヒドラジド（表２、ＤＡＶＣＨ）を産生する。あるいは、ビンブラスチンのアミン反応性形態は、（１）最初に硫酸ビンブラスチンをデスアセチル形態に変換すること（例えば、Ｂｒａｄｙらによって記載される、１：３のヒドラジン／メタノールと２０℃にて２０時間にわたって反応する）、（２）得られた遊離塩基を約２倍過剰の無水コハク酸と反応させてヘミスクシネート（表２、ＤＡＶＳ）を産生すること、および（３）クロロ蟻酸イソブチルと反応させて反応性の混合酸無水物を形成することによって、Ｔｒｏｕｅｔら（米国特許第４，８７０，１６２号）に記載されるようにインサイチュで産生され得る。
【０１２６】
クリプトフィシン：クリプトフィシンは、天然に存在する非常に強力なチューブリンインヒビターである。効力および製造可能性を改善するための大規模な医薬品化学の努力は、クリプトフィシン−５２（ＬＹ３５５７０３）をもたらした。環状デプシペプチド上のほとんどの部位を、生物学的活性を減少させずに改変することはできない。Ｃ３’−フェニル環の改変は、容易に共用されるが、しかし、それは、この部位が機能的結合体の形成のための手掛かりであることを示す。クリプトフィシン−５２のアミン含有誘導体の合成は、先に記載されている（ＥｇｇｅｎおよびＧｅｏｒｇ、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２２（２）：８５−１０１、２００２）。この誘導体（表２、Ｃｒｙｐ−ＮＨ２）は、直接的に、結合体化に適している。
【０１２７】
チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）：チューブリシンは、最近見出された非常に強力なチューブリンインヒビターの分類である。改変アミノ酸の直線状ペプチドとして、それらは、比較的標準的なペプチド化学（例えば、カルボジイミドによるインサイチュのカルボキシレート活性化）を使用した化学合成および結合体化に順応する。代表的なチューブリシン構造は、下の表Ｂに示される。
【０１２８】
その他；多くの他の高度に強力な細胞毒性薬剤が、同定され、そして特徴付けられており、それらの多くは、さらに、アプタマー−リンカー−薬物結合体の形成のために適切であり得る。これらとしては、ドラスタチン−１０、ドラスタチン−１５、オーリスタチンＥ、リゾキシン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、タキソイドの改変された改変体が挙げられる。
【０１２９】
（表Ｂ：アプタマーとの結合体化に使用するための細胞毒）
【表Ｂ−１】
2008536485.tif 000007
【０１３０】
【表Ｂ−２】
2008536485.tif 000008
【０１３１】
【表Ｂ−３】
2008536485.tif 000009
【０１３２】
【表Ｂ−４】
2008536485.tif 000010
【０１３３】
リンカー：上記結合体のリンカー部分は、アプタマーおよび薬物に対する反応性の結合点として機能する複数（すなわち、２以上）の求核部分および／または求電子部分を与える。求核部分としては、例えば、遊離アミン、ヒドラジド、またはチオールが挙げられる。求電子部分としては、例えば、活性化カルボキシレート（例えば、活性化エステルまたは混合酸無水物）、活性化チオール（例えば、チオピリジン）、マレイミド、またはアルデヒドが挙げられる。
【０１３４】
上記結合体の段階的な合成を容易にするために、上記反応性の結合点は、インサイチュで作製されるか、またはインサイチュでブロックされない。例えば、カルボキシレート含有リンカーは、クロロ蟻酸イソブチルの添加によって一過性に活性化されて混合酸無水物を生成し、次いでアミン含有アプタマーおよび／または薬物による攻撃に供される。ヘテロ二官能性リンカー上のＢｏｃ保護アミン（例えば、Ｂｏｃ−アミノ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）は、その求電子部分をクエンチする最初のカップリング反応後に脱保護される。ＮＨＳ含有リンカーは、アミンおよびジオールを有する混合型リンカー（例えば、アミノグリコシド）と反応させ、次いで過ヨウ素酸酸化を行うことによってヒドラジド反応性アルデヒドに変換される。そのようなものとして、ＮＨＳ含有デンドリマーとアミン含有アプタマーとの部分的反応、その後のアミノグリコシドによる誘導体化は、結合体化のための多価アルデヒドを生成する。
【０１３５】
高分子量リンカーを使用することによって、上記結合体の腎クリアランスは、その結合体に連結されたアプタマーが（例えば、インビボでのヌクレアーゼ分解の結果として）除去されたとしても、最小化され得る。腎排泄の予防は、上記薬物結合体のインビボ半減期を増大させ、そしてまた、毒性濃度の薬物が腎臓に蓄積すること（強力な細胞毒結合体に対する特定の懸念）を妨げる。好ましい実施形態において、リンカーのかさ（ｂｕｌｋ）は、ポリエチレングリコールの１つ以上の鎖から構成される。上記結合体の全体の分子量は、腎クリアランスを有効にブロックするために２０，０００〜４０，０００Ｄａよりも大きくなければならない。比較的均散の高分子量（２０，０００〜３０，０００Ｄａ）ＰＥＧ鎖の合成は、実現可能であるが、複数の中鎖（２，０００〜１０，０００Ｄａ）分子量ＰＥＧを中心のコア実体に対して連結することは、等しく実現可能である（特に、リンカーに結合したアプタマーが結合体全体のサイズに実質的に寄与することが与えられる）。アプタマーおよび薬物に対する反応性の結合点は、ＰＥＧ鎖を係留するために使用されるコアに導入されるか、またはＰＥＧ鎖の自由（ｆｒｅｅ）な末端において導入される（すなわち、そのコアから十分に除去される）かのいずれかであり得る。
【０１３６】
数種の異なる型のコア分子が、ＰＥＧ鎖連結を係留するために使用される。例としては、複数の求核物質または求電子物質を有する単なる低分子（例えば、エリスリトール、ソルビトール、リジン）、直鎖状のオリゴマーまたはポリマー（例えば、オリゴリジン、デキストラン）、あるいは高次構造へと自己構築する能力を有する単一反応性（ｓｉｎｇｌｙ−ｒｅａｃｔｉｖｅ）分子（例えば、ミセルまたはリポソームを形成する性能を有するリン脂質）が挙げられる。代表的なリンカーは、下の表Ｃに列挙される。
【０１３７】
（表Ｃ：結合体形成において使用するためのリンカー）
【表Ｃ−１】
2008536485.tif 000011
【０１３８】
【表Ｃ−２】
2008536485.tif 000012
【０１３９】
【表Ｃ−３】
2008536485.tif 000013
【０１４０】
結合体合成：下に示される表は、治療用アプタマー−薬物結合体を産生するために組み合わせられるアプタマーと、リンカーと、薬物との特定の組み合わせの例を列挙する。１つの実施形態において、結合体合成は、アプタマー、リンカー、および薬物が適切なレベルで組み合わせられて最終的な結合体をもたらすワンポット反応である。他の実施形態において、表Ｄに記載される通り、アプタマーおよび薬物の段階的な付加が、必要とされる。
【０１４１】
下の表Ｄにおいて、用語「ＮＨ２−アプタマー」は、上に記載されるように産生される単一または複数の第一級アミンを有するアプタマーを含む。用語「ＣＯＯＨ−アプタマー」は、上に記載されるように、５’末端にカルボキシレートを有するアプタマーに対応する。リンカーおよび薬物に対する略語は、表Ｂおよび表Ｃに与えられた慣用名に対応する。
【表Ｄ−１】
2008536485.tif 000014
【０１４２】
【表Ｄ−２】
2008536485.tif 000015
【０１４３】
【表Ｄ−３】
2008536485.tif 000016
【０１４４】
【表Ｄ−４】
2008536485.tif 000017
【０１４５】
【表Ｄ−５】
2008536485.tif 000018
【０１４６】
【表Ｄ−６】
2008536485.tif 000019
【０１４７】
【表Ｄ−７】
2008536485.tif 000020
【０１４８】
【表Ｄ−８】
2008536485.tif 000021
【０１４９】
【表Ｄ−９】
2008536485.tif 000022
【０１５０】
【表Ｄ−１０】
2008536485.tif 000023
【０１５１】
【表Ｄ−１１】
2008536485.tif 000024
【０１５２】
【表Ｄ−１２】
2008536485.tif 000025
【０１５３】
（ＰＳＭＡ特異的アプタマー）
本発明の物質は、４８〜７４ヌクレオチド長の一連の新規核酸アプタマーを含み、そしてその核酸アプタマーは、ＰＳＭＡに特異的に結合し、そしていくつかの実施形態において、機能的に調節（例えば、インビボおよび／または細胞ベースのアッセイにおいてＰＳＭＡの活性をブロック）するが、他の実施形態において、その核酸アプタマーは、ＰＳＭＡ発現細胞に対する毒性ペイロードの送達のために細胞傷害性部分（特に、細胞毒）に結合体化され、いくつかの実施形態において、その細胞毒は、インビトロで送達される。いくつかの実施形態において、上記細胞毒は、インビボで送達される。
【０１５４】
ＰＳＭＡに特異的に結合得、そしてそれを調節し得るアプタマーが、本明細書中に示される。これらのアプタマーはまた、低毒性、安全性、およびＰＳＭＡ発現のアップレギュレーションに関連することが公知である疾患または障害（例えば、前立腺癌、および他の非前立腺固形腫瘍）に対する毒性部分の送達についての有効な治療様式（ｍｏｄａｌｉｔｙ）を提供する。
【０１５５】
アプタマー−毒素結合体の治療薬および／または診断薬として使用するためのＰＳＭＡ特異的結合アプタマーの例としては、下に列挙される配列が挙げられる。列挙される以下の核酸配列は、５’から３’の方向であり、そして全てのヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵの前に、それぞれ、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、２’−フルオロ改変ヌクレオチド、および２’デオキシ改変ヌクレオチドを指す小文字「ｍ」および「ｆ」および「ｄ」がある場合を除いて、２’−ＯＨである。「３Ｔ」は、逆位３’デオキシチミジンを示し、「ｓ」は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を示し、そしてＮＨ２は、化学的カップリングを容易にするアミン改変（ヘキシルアミン末端基）を示す。
【０１５６】
【化６−１】
2008536485.tif 000026
【０１５７】
【化６−２】
2008536485.tif 000027
ＰＳＭＡを結合する他のアプタマーは、実施例１〜４において下に記される。一方で、他のＰＳＭＡ結合アプタマーは、ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｉｎ  米国特許出願第０９／９７８，９６９号（２００１年１０月１６日出願）、米国仮特許出願第６０／６６０，５１４号（２００５年３月７日出願）、および米国仮特許出願第６０／６７０，５１８号（２００５年４月１１日出願）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０１５８】
これらのアプタマーは、本明細書中に記載されるような改変を含み得、その改変としては、例えば、脂肪親和性化合物または高分子量化合物（例えば、ＰＥＧ）への結合体化、ＣｐＧモチーフの組み込み、キャッピング部分の組み込み、改変ヌクレオチドの組み込み、およびリン酸骨格におけるホスホロチオエート結合の組み込みが挙げられる。
【０１５９】
本発明の１つの実施形態において、ＰＳＭＡに結合する単離された天然に存在しないアプタマーが、提供される。いくつかの実施形態において、上記単離された天然に存在しないアプタマーは、ＰＳＭＡに対する１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または５００ｐＭ未満のＫＤを有する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ＰＳＭＡの機能を調節する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ＰＳＭＡの機能を阻害するが、別の実施形態において、そのアプタマーは、標的の機能を刺激する。本発明の別の実施形態において、上記アプタマーは、ＰＳＭＡ改変体に結合し、そして／またはＰＳＭＡ改変体の機能を調節する。本明細書中で使用される場合、ＰＳＭＡ改変体は、本質的にＰＳＭＡ機能と同じ機能を実行する改変体、好ましくは、実質的に同じ構造を含む改変体、そしていくつかの実施形態において、ＰＳＭＡのＥＣＤのアミノ酸配列に対する少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、そしてより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含む改変体を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、標的改変体の配列同一性は、下に記載されるように、ＢＬＡＳＴを使用して決定される。
【０１６０】
２つ以上の核酸配列またはタンパク質配列の文脈において、用語「配列同一性」とは、最大限の対応について比較および整列された場合に、同じであるか、またはアミノ酸残基またはヌクレオチドの同じである特定された％を有する２つ以上の配列または下位配列をいい、それは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してか、または視診によって測定される。配列比較に関して、代表的に、１つの配列は、試験配列と比較するための参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピューターに入力され、下位配列座標が、必要な場合に指定され、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメータが、指定される。次いで上記配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の％配列同一性を算出する。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似法に対する検索、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または視診（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）によって行われ得る。
【０１６１】
％配列同一性を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例は、ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ（本明細書中で以下、「ＢＬＡＳＴ」）において使用されるアルゴリズムである（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（本明細書中で以下、「ＮＣＢＩ」）を介して公に利用可能である。ＮＣＢＩから利用可能なソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列に対するもの）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列に対するもの））を使用した配列同一性の決定において使用される初期設定パラメータは、ＭｃＧｉｎｎｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３２：Ｗ２０−Ｗ２５（２００４）に記載される。
【０１６２】
本発明の別の実施形態において、上記アプタマーは、実質的に、配列番号１１〜１３、配列番号１５〜２６、配列番号３０〜９０、配列番号１２２〜１６５、配列番号１６７のうちのいずれか１つを含むアプタマーと同じＰＳＭＡを結合する能力を有する。本発明の別の実施形態において、上記アプタマーは、実質的に、配列番号１１〜１３、配列番号１５〜２６、配列番号３０〜９０、配列番号１２２〜１６５、配列番号１６７のうちのいずれか１つを含むアプタマーと同じ構造およびそのＰＳＭＡを結合する能力と同じ能力を有する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、１１〜１３、１５〜２６、３０〜９０、１２２〜１６５、１６７のうちのいずれか１つに従う配列を有する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、薬学的組成物において活性成分として使用される。別の実施形態において、上記アプタマーまたは本発明のアプタマーを含む組成物は、前立腺癌、および非前立腺固形腫瘍を処置するために使用される。
【０１６３】
１つの実施形態において、本発明のアプタマーは、ＰＳＭＡ発現に関連する前立腺癌および非固形前立腺腫瘍の処置のために、細胞傷害性部分に結合体化される。いくつかの実施形態において、上記細胞傷害性部分は、上記アプタマーの３’末端に結合体化され、一方で、他の実施形態において、その細胞傷害性部分は、５’末端に結合体化される。いくつかの実施形態において、上記細胞傷害性部分は、リポソーム、デンドリマー、またはくし型ポリマーなどのナノ粒子形態中に封入される。１つの実施形態において、上記アプタマーが結合体化される細胞傷害性部分は、ビンブラスチンヒドラジド、カリケアマイシン、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン、チューブリシン、ドラスタチン−１０、ドラスタチン−１５、オーリスタチンＥ、リゾキシン、エポチロンＢ、エピチロンＤ、タキソイド、メイタンシノイドならびにそれらの任意の改変体および誘導体からなる群より選択される低分子である。別の実施形態において、上記アプタマーが結合体化される細胞傷害性部分は、イットリウム−９０、インジウム−１１１、ヨウ素−１３１、ルテチウム−１７７、銅−６７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、およびアクチニウム−２２５からなる群より選択される放射性同位体である。なお別の実施形態において、上記アプタマーが結合体化される細胞傷害性部分は、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニン、およびシュードモナス属体外毒素Ａからなる群より選択されるタンパク質毒素である。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、本発明のアプタマー治療薬は、アプタマー治療薬が患者または被験体の身体において分解する場合に、天然に存在しないヌクレオチド置換よる有害な副作用を減少させつつ、それらの標的に対する大きな親和性および特異性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のアプタマー治療薬を含む治療用組成物は、フッ素化されたヌクレオチドを含まないか、または減少した量のフッ素化されたヌクレオチドを含む。
【０１６５】
本発明のアプタマーは、当該分野において公知である任意のオリゴヌクレオチド合成技術を使用して合成され得、そのオリゴヌクレオチド合成技術としては、当該分野において周知である固相オリゴヌクレオチド合成技術（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと）およびトリエステル合成法などの溶液相方法（例えば、Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）およびＨｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ、２８：２４４９（１９７８）を参照のこと）が挙げられる。
【０１６６】
（免疫刺激性モチーフを有するアプタマー）
本発明は、ＰＳＭＡに特異的に結合し、そして標的性ペイロード（例えば、細胞傷害性部分）をＰＳＭＡを発現する細胞（例えば、前立腺癌細胞）に送達するために有用であるアプタマーを提供する。ＰＳＭＡ特異的アプタマーの標的性ペイロードの機能は、ＰＳＭＡに結合し、そして免疫刺激性モチーフを含むアプタマーについて選択することによってか、またはＰＳＭＡに結合するアプタマーを免疫刺激性配列を結合することが公知である標的に対するアプタマーと組み合わせて処置することによって、さらに増強され得る。
【０１６７】
脊椎動物の免疫系による細菌ＤＮＡの認識は、特定の配列状況におけるメチル化されていないＣＧジヌクレオチド（「ＣｐＧモチーフ」）の認識に基づく。そのようなモチーフを認識する１つのレセプターは、異なる微生物成分を認識することによって先天免疫応答に関与するＴｏｌｌ様レセプター９（「ＴＬＲ  ９」）（Ｔｏｌｌ様レセプターのファミリーのメンバー（約１０メンバー））である。ＴＬＲ  ９は、配列特異的様式でメチル化されていないオリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」）ＣｐＧ配列を結合する。ＣｐＧモチーフの認識は、先天免疫応答をもたらし、そして最終的に獲得免疫応答をもたらす防御機構を誘発する。例えば、マウスにおけるＴＬＲ  ９の活性化は、抗原提示細胞の活性化、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子のアップレギュレーションならびに重要な共刺激性分子ならびにサイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＬ−２３を含む）の発現を誘導する。この活性化は、直接的および間接的の両方で、ＴＨ１サイトカインであるＩＦＮ−γの頑健なアップレギュレーションを含む、Ｂ細胞応答およびＴ細胞応答を増強する。まとめると、ＣｐＧ配列に対する応答は、感染症に対する防御、ワクチンに対する改善された免疫応答、喘息に対する有効な応答、および改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害をもたらす。したがって、ＣｐＧ  ＯＤＮは、感染症に対する防御を提供し得、免疫アジュバントまたは癌治療薬（単剤療法あるいはｍＡｂまたは他の治療との組み合わせ）として機能し得、そして喘息およびアレルギー応答を減少させ得る。
【０１６８】
１つ以上のＣｐＧまたは他の免疫刺激性配列を含む本発明のアプタマーは、例えば、本明細書中に記載されるＳＥＬＥＸＴＭプロセスを使用する種々のストラテジーによって同定または産生され得る。組み込まれる免疫刺激性配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ／ＲＮＡの組み合わせであり得る。一般に、上記ストラテジーは、２つの群に分けられ得る。群１において、上記ストラテジーは、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激性配列、および標的に対する結合部位の両方を含むアプタマーを同定または産生することに関し、その標的（本明細書中で以下、「非ＣｐＧ標的」）は、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激性配列を認識することが公知であり、かつＣｐＧモチーフに対する結合の際に免疫応答を刺激することが公知であるもの以外の標的である。本発明のいくつかの実施形態において、非ＣｐＧ標的は、ＰＳＭＡである。この群の第１のストラテジーは、オリゴヌクレオチドプールを使用するＳＥＬＥＸＴＭを行なって特定の非ＣｐＧ標的（好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症に関する標的（例えば、ＰＳＭＡ））に対するアプタマーを得ること（ここで、ＣｐＧモチーフは、固定された領域またはその一部としてそのプールの各メンバーに組み込まれており、例えば、いくつかの実施形態において、そのプールメンバーのランダム化された領域は、そのなかに組み込まれたＣｐＧモチーフを有する固定された領域を含む）、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。この群の第２のストラテジーは、ＳＥＬＥＸＴＭを行なって特定の非ＣｐＧ標的（好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症に関する標的（例えば、ＰＳＭＡ））に対するアプタマーを得ること、および選択後に、５’末端および／または３’末端にＣｐＧモチーフを付加すること、またはアプタマーの領域（好ましくは、非必須領域）にＣｐＧモチーフを設計することを含む。この群の第３のストラテジーは、ＳＥＬＥＸＴＭを行なって特定の非ＣｐＧ標的（好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症に関する標的（例えば、ＰＳＭＡ））に対するアプタマーを得ること（ここで、上記プールの合成の間に、種々のヌクレオチドのモル比は、１以上のヌクレオチド付加工程においてバイアスをかけられ、その結果、そのプールの各メンバーのランダム化された領域は、ＣｐＧモチーフが豊富になる）、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。この群の第４のストラテジーは、ＳＥＬＥＸＴＭを行なって特定の非ＣｐＧ標的（好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症に関する標的（例えば、ＰＳＭＡ））に対するアプタマーを得ること、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。この群の第５のストラテジーは、ＳＥＬＥＸＴＭを行なって特定の非ＣｐＧ標的（好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症に関する標的（例えば、ＰＳＭＡ））に対するアプタマーを得ること、および結合の際に免疫応答を刺激するがＣｐＧモチーフを含まないアプタマーを同定することを含む。
【０１６９】
群２において、上記ストラテジーは、ＣｐＧモチーフに対するレセプター（例えば、ＴＬＲ９または他のｔｏｌｌ様レセプター）によって結合され、かつ結合の際に免疫応答を刺激するＣｐＧモチーフおよび／または他の配列を含むアプタマーを同定または産生することに関する。この群の第１のストラテジーは、オリゴヌクレオチドプールを使用するＳＥＬＥＸＴＭを行なってＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激性配列に結合することが公知である標的に対するアプタマーであってかつ結合の際に免疫応答を刺激するアプタマーを得ること（ここで、ＣｐＧモチーフは、固定された領域またはその一部としてそのプールの各メンバーに組み込まれており、例えば、いくつかの実施形態において、そのプールメンバーのランダム化された領域は、そのなかに組み込まれたＣｐＧモチーフを有する固定された領域を含む）、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。この群の第２のストラテジーは、ＳＥＬＥＸＴＭを行なってＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激性配列に結合することが公知である標的に対するアプタマーであってかつ結合の際に免疫応答を刺激するアプタマーを得ること、およびその後に、５’末端および／または３’末端にＣｐＧモチーフを付加すること、またはアプタマーの領域（好ましくは、非必須領域）にＣｐＧモチーフを設計することを含む。この群の第３のストラテジーは、オリゴヌクレオチドプールを使用するＳＥＬＥＸＴＭを行なってＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激性配列に結合することが公知である標的に対するアプタマーであってかつ結合の際に免疫応答を刺激するアプタマーを得ること（ここで、上記プールの合成の間に、種々のヌクレオチドのモル比は、１以上のヌクレオチド付加工程においてバイアスをかけられ、その結果、そのプールの各メンバーのランダム化された領域は、ＣｐＧモチーフが豊富になる）、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。この群の第４のストラテジーは、オリゴヌクレオチドプールを使用するＳＥＬＥＸＴＭを行なってＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激性配列に結合することが公知である標的に対するアプタマーであってかつ結合の際に免疫応答を刺激するアプタマーを得ること、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定することを含む。この群の第５のストラテジーは、オリゴヌクレオチドプールを使用するＳＥＬＥＸＴＭを行なってＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激性配列に結合することが公知である標的に対するアプタマーを得ること、および結合の際に免疫応答を刺激するがＣｐＧモチーフを含まないアプタマーを同定することを含む。
【０１７０】
ＣｐＧモチーフの種々の異なるクラスが、同定されており、その各々は、事象の異なるカスケードにおける認識、サイトカインおよび他の分子の放出、ならびに特定の細胞型の活性化を生じる。例えば、ＣｐＧ  Ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２、２０：７０９−７６０（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。さらなる免疫刺激性モチーフは、以下の米国特許（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）に開示される：米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号；米国特許第６，４２９，１９９号；米国特許第６，２１４，８０６号；米国特許第６，６５３，２９２号；米国特許第６，４２６，４３４号；米国特許第６，５１４，９４８号および米国特許第６，４９８，１４８号。任意のこれらのＣｐＧまたは他の免疫刺激性モチーフが、アプタマーに組み込まれ得る。アプタマーの選択は、処置される疾患または障害に依存する。好ましい免疫刺激性モチーフは、以下の通り（左から右に５’から３’を示す）であり、「ｒ」表示は、プリンであり、「ｙ」表示は、ピリミジンであり、そして「Ｘ」表示は、任意のヌクレオチドである：ＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧ（配列番号４；ＡＡＣＧＴＴ；ＡＣＧＴ、ｒＣＧｙ；ｒｒＣＧｙｙ、ＸＣＧＸ、ＸＸＣＧＸＸ、およびＸ１Ｘ２ＣＧＹ１Ｙ２（Ｘ１は、ＧまたはＡであり、Ｘ２は、Ｃではなく、Ｙ１は、Ｇではなく、そしてＹ２は、好ましくはＴである）。
【０１７１】
ＣｐＧモチーフが、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合の際に免疫応答を刺激することが公知である標的以外の特定の標的（「非ＣｐＧ標的」）に結合するアプタマーに組み込まれる場合において、そのＣｐＧは、好ましくは、そのアプタマーの非必須領域に配置される。アプタマーの非必須領域は、位置指定変異誘発、欠失の分析および／または置換の分析によって同定され得る。しかし、アプタマーの非ＣｐＧ標的に結合する能力を著しく妨害しない任意の位置が、使用され得る。アプタマー配列内に埋め込まれることに加えて、上記ＣｐＧモチーフは、５’末端および３’末端のいずれかまたは両方に付加（ａｐｐｅｎｄ）され得るか、そうでなければそのアプタマーに連結（ａｔｔａｃｈ）され得る。連結のあらゆる位置または手段が、アプタマーの非ＣｐＧ標的に結合する能力が著しく妨害されない限り、使用され得る。
【０１７２】
本明細書中で使用される場合、「免疫応答の刺激」は、（１）特定の応答の誘導（例えば、Ｔｈ１応答の誘導）または特定の分子の産生の誘導、あるいは（２）特定の応答の阻害もしくは抑制（例えば、Ｔｈ２応答の阻害もしくは抑制）または特定の分子の阻害もしくは抑制のいずれかを意味し得る。
【０１７３】
（薬学的組成物）
本発明はまた、ＰＳＭＡに結合するアプタマー分子および／または細胞傷害性部分に結合体化され、ＰＳＭＡに結合するアプタマー分子を含む薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態において、上記組成物は、内服に適しており、そして単独かまたは１種以上の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせた有効量の本発明の薬理学的に活性な化合物を含む。上記化合物は、特に、それらが非常に低い毒性（毒性がある場合）を有する点で有用である。
【０１７４】
本発明の組成物は、病理（例えば、疾患または障害）を処置または予防するため、あるいは患者におけるこのような疾患または障害の症状を緩和するために使用され得る。例えば、本発明の組成物は、前立腺癌、および固形腫瘍の新生脈管構造においてＰＳＭＡを発現する他の型の癌に関連する病理を処置または予防するために使用され得る。
【０１７５】
本発明の組成物は、本発明のアプタマーが特異的に結合する標的に関連するか、またはその標的に由来する疾患または障害を罹患する被験体、あるいはその疾患または障害の素因を有する被験体に対する投与に関して有用である。本発明の組成物は、病理を有する患者または被験体を処置するための方法において使用され得る。その方法は、患者または被験体にアプタマーおよび／またはアプタマー−毒素結合体を含む組成物を投与する工程を包含し、そのアプタマーおよびアプタマー−毒素結合体は、上記病理に関連する特定の細胞表面成分（例えば、内在性膜タンパク質）に結合し、その結果、細胞表面成分に対するアプタマーまたはアプタマー−毒素結合体の結合の際に（そしてその成分が発現される細胞に対する毒性ペイロードの送達が、生じる）、その病理の処置が、達成される。いくつかの実施形態において、アプタマーまたはアプタマー−毒素結合体の結合は、インビボでＰＳＭＡ発現腫瘍のサイズの安定化または減少をもたらす。
【０１７６】
病理を有する患者または被験体（すなわち、本発明の方法によって処置される患者または被験体）は、脊椎動物、より具体的には哺乳動物、またはより具体的にはヒトであり得る。
【０１７７】
実施において、上記アプタマーおよび／もしくは上記アプタマー−毒素結合体またはそれらの薬学的に受容可能な塩は、それらの所望の生物学的活性（例えば、ＰＳＭＡに対するそのアプタマーの結合特定の細胞型に対する毒性ペイロードの送達）を発揮するのに十分である量で投与される。
【０１７８】
１つの局面において、本発明は、癌関連障害に対する他の処置と組み合わせた本発明のアプタマー組成物を含む。本発明のアプタマー組成物は、例えば、１種より多いアプタマーを含み得る。いくつかの例において、本発明の１種以上の化合物を含む本発明のアプタマー組成物は、細胞傷害性薬剤、増殖抑制性薬剤、または化学療法剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、有糸分裂インヒビターまたは細胞傷害性抗生物質）などの別の有用な組成物と組み合わせて投与される。一般に、このような組成物に使用する公知の治療剤の現在利用可能な投薬形態が、適切である。
【０１７９】
「併用療法」（または「同時治療（ｃｏ−ｔｈｅｒａｐｙ）」）は、本発明のアプタマー組成物および少なくとも第２の薬剤の投与を含み、それは、これらの治療剤の共同作用による有益な効果を提供することが意図される特定の処置レジメンの一部である。その組み合わせの有益な効果としては、治療剤の組み合わせによって生じる薬物動態学的かまたは薬力学的な共同作用が挙げられるが、これに限定されない。組み合わせにおけるこれらの治療剤の投与は、代表的に、規定された期間（通常は、選択された組み合わせに依存して分、時間、日または週）にわたって実施される。
【０１８０】
「併用療法」は、本発明の組み合わせを付随的に、そして自由裁量で生じる別個の単剤療法レジメンの一部としてこれらの治療剤の１種以上の投与を含むことが意図され得るが、一般的にそれは意図されない。「併用療法」は、連続的な様式におけるこれらの治療剤の投与（すなわち、各治療剤は、異なる時間に投与される）、および実質的に同時の様式におけるこれらの治療剤または少なくとも２種の治療剤の投与を包含することが意図される。実質的に同時の投与は、例えば、固定された比の各治療剤を有する単一のカプセルを被験体に投与するか、または各々の治療剤についての単一のカプセルを複数で被験体に投与することによって達成され得る。
【０１８１】
各治療剤の連続的な投与または実質的に同時の投与は、任意の適切な経路によって達成され得、その経路としては、局所経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を通した直接吸収が挙げられるが、これらに限定されない。上記治療剤は、同じ経路または異なる経路によって投与され得る。例えば、選択された組み合わせの第１の治療剤は、注射によって投与され得るが、その組み合わせの他の治療剤は、局所的に投与され得る。
【０１８２】
あるいは、例えば、全ての治療剤は、局所的に投与されても、注射によって投与されてもよい。上記治療剤が投与される順序は、特に明記されない限り、あまり重要ではない。「併用療法」はまた、他の生物学的に活性な成分とさらに組み合わせた上に記載されるような治療剤の投与を包含し得る。上記併用療法が、非薬物処置をさらに含む場合、その非薬物処置は、治療剤と非薬物処置との組み合わせの共同作用による有益な効果あが達成される限り、任意の適切な時間にて行われ得る。例えば、適切な場合において、上記有益な効果は、上記非薬物処置が、おそらく、数日または数週間でさえ、上記治療剤の投与から一時的に取り除かれる場合に、依然として達成される。
【０１８３】
本発明の治療用組成物または薬理学的組成物は、一般に、薬学的に受容可能な媒体に溶解または分散された、治療の有効量の活性成分を含む。薬学的に受容可能な媒体またはキャリアとしては、任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。補助的な活性成分もまた、本発明の治療用組成物に組み込まれ得る。
【０１８４】
薬学的組成物または薬理学的組成物の調製は、本開示に鑑みて当業者に公知である。代表的に、このような組成物は、注射剤（溶液または懸濁物のいずれかとして）；注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固体形態；経口投与のための錠剤または他の固形物；徐放カプセル；または現在使用される任意の他の形態として調製され得、その形態としては、点眼剤、クリーム、ローション、軟膏、吸入剤などが挙げられる。外科医、医師または医療従事者による手術する場所における特定の領域を処理するための滅菌処方物（例えば、食塩水ベースの洗浄剤）の使用もまた、特に有用であり得る。組成物はまた、微小デバイス、微粒子またはスポンジ（ｓｐｏｎｇｅ）をによって送達され得る。
【０１８５】
処方物において、治療薬は、投薬処方物に適合可能な様式、かつ薬理学的に有効であるような量で投与され得る。種々の投薬形態（例えば、上に記載される注射可能な溶液）で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた、使用され得る。
【０１８６】
この文脈において、活性成分の量および投与される組成物の容量は、処置される宿主動物に依存する。投与に必要とされる活性化合物の正確な量は、実施者の判断に依存し、そして各個体に対して固有である。
【０１８７】
活性化合物を分散するために必要とされる組成物の最小容量が、代表的に、利用される。投与についての適切なレジメンはまた、変更可能であるが、最初に化合物を投与し、そしてその結果をモニタリングし、次いでさらなる間隔においてさらに制御された用量を与えることによって代表される。
【０１８８】
例えば、錠剤またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態における経口投与のために、活性薬物成分は、経口用であり非毒性の薬学的に受容可能な不活性キャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水など）と組み合され得る。さらに、所望されるかまたは必要な場合、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤もまた、その混合物に組み込まれ得る。適切な結合剤としては、デンプン、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン、天然の糖類（例えば、グルコースまたはβ−ラクトース、コーンシロップ、天然ゴムおよび合成ゴム（例えば、アカシアゴム、トラガントゴムまたはアルギン酸ナトリウム）、ポリエチレングリコール、蝋などが挙げられる。これらの投薬形態において使用される滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、滑石、ステアリン酸、ステアリン酸のマグネシウム塩もしくはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊薬としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムデンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡性混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシンが挙げられる。
【０１８９】
本発明の化合物はまた、持続放出型（ｔｉｍｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）の錠剤もしくはカプセルおよび持続放出型（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）の錠剤もしくはカプセル、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル、チンキ、懸濁物、シロップならびにエマルションのような経口投薬形態で投与され得る。坐剤は、脂肪性エマルションまたは脂肪性懸濁物から有利に調製される。
【０１９０】
上記薬学的組成物は、滅菌され得、そして／または補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶解促進剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤）を含み得る。さらに、それらはまた、他の治療的に有益な物質を含み得る。上記組成物は、従来の混合方法、顆粒化方法、またはコーティング方法によって調製され、そして代表的に、約０．１％〜７５％（好ましくは約１％〜５０％）の活性成分を含む。
【０１９１】
液体（特に、注射可能な組成物）は、例えば、溶解、分散などによって調製され得る。上記活性化合物は、薬学的に純粋な溶媒（例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなど）に溶解されるか、または薬学的に純粋な溶媒と混合され、それによって注射可能な溶液または懸濁物を形成する。さらに、注射前に液体に溶解するのに適した固体形態が、処方され得る。
【０１９２】
本発明の化合物は、静脈内形態（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内形態、皮下形態または筋肉内形態で投与され得、全ての使用する形態は、薬学分野の当業者に周知である。注射剤は、液体溶液または液体懸濁物のいずれかとして従来の形態で調製され得る。
【０１９３】
注射可能な非経口投与は、一般に、皮下、筋肉内または静脈内の注射および注入のために使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、米国特許第３，７１０，７９５号（本明細書中に参考として援用される）による徐放システムまたは持続放出システムの移植物を使用し、それらのシステムは、一定レベルの投薬量が維持されると仮定する。
【０１９４】
さらに、本発明のための好ましい化合物は、適切な鼻腔内ビヒクル、鼻腔内吸入剤の局所使用によって鼻腔内形態で投与され得るか、または当業者に周知である経皮パッチの形態を使用して経皮経路を介して投与され得る。経皮送達システムの形態で投与されるために、その投薬量の投与、当然ながら、投薬レジメン全体を通して、間欠的ではなくむしろ持続的である。他の好ましい局所調製物としては、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレーおよびゲルが挙げられ、その活性成分の濃度は、代表的に、０．０１％〜１５％（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）の範囲である。
【０１９５】
固体組成物に関して、賦形剤としては、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。上で規定される活性化合物はまた、例えば、キャリアとしてポリアルキレングリコール（例えば、プロピレングリコール）を使用して、坐剤として処方され得る。いくつかの実施形態において、坐剤は、脂肪性エマルションまたは脂肪性懸濁物から有利に調製される。
【０１９６】
本発明の化合物はまた、リポソーム送達システム（例えば、小さい単層小胞、大きい単層小胞および多層小胞）の形態で投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含む種々のリン脂質から形成され得る。いくつかの実施形態において、脂質成分のフィルムは、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されるように、薬物の水溶液によって水和されてその薬物を封入する脂質層を形成する。例えば、本明細書中に記載されるアプタマー分子は、当該分野において公知である方法を使用して構築された、脂肪親和性化合物または非免疫原性の高分子量化合物との複合体として提供され得る。さらに、リポソームは、細胞毒性薬剤を標的性にするためおよび細胞毒性薬剤を内部に保有するためにそのリポソームの表面上にアプタマーを有して、細胞の殺傷を媒介し得る。核酸関連複合体の例は、米国特許第６，０１１，０２０号に提供される。
【０１９７】
本発明の化合物はまた、標的可能な薬物キャリアとしての可溶性ポリマーとカップリングされ得る。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール、またはパルミトイル残基によって置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが挙げられ得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成するのに有用なあるクラスの生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋型ブロックポリマーまたは両新媒性ブロックポリマー）にカップリングされ得る。
【０１９８】
所望される場合、投与される薬学的組成物はまた、小さい量の非毒性の補助的な物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および他の物質（例えば、酢酸ナトリウム、およびオレイン酸トリエタノールアミン））を含み得る。
【０１９９】
上記アプタマーを利用する投薬レジメンは、種々の因子に従って選択され、その因子としては、患者の型、種、年齢、体重、性別および医学的状態；処置される状態の重篤度；投与の経路；患者の腎機能および肝機能；ならびに使用されるアプタマーまたはその塩が挙げられる。当業者である医師または獣医は、上記状態の進行を予防するか、その進行に対抗するか、またはその進行を阻むために必要とされる薬物の有効量を、容易に決定および処方し得る。
【０２００】
本発明の経口投薬量は、示された効果のために使用される場合、経口で約０．０５ｍｇ／日〜７５００ｍｇ／日の間の範囲である。上記組成物は、好ましくは、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、１００．０ｍｇ、２５０．０ｍｇ、５００．０ｍｇおよび１０００．０ｍｇの活性成分を含む第２の錠剤の形態で提供される。注入される投薬量、鼻腔内投薬量および経皮投薬量は、０．０５ｍｇ／日〜７５００ｍｇ／日の間の範囲である。皮下投薬量、静脈内投薬量および腹腔内投薬量は、０．０５ｍｇ／日〜３８００ｍｇ／日の間の範囲である。
【０２０１】
本発明の化合物の有効血漿レベルは、０．００２ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲である。示された投薬量および／または有効血漿濃度におけるアプタマーの量に関する質量の指標は、オリゴの重量のみを指し、そして結合体（例えば、毒素またはＰＥＧ部分）の重量を含まない。
【０２０２】
本発明の化合物は、単一の１日用量で投与され得るか、または１日の総用量は、１日に２回、３回もしくは４回の分割用量で投与され得る。
【０２０３】
（アプタマー治療薬の薬物動態および生体分布の調節）
アプタマーを含む全てのオリゴヌクレオチドベースの治療薬についての薬物動態特性が所望の薬学的用途に調和するように調整されることが、重要である。細胞外標的に対するアプタマーは、細胞内送達に関する困難性を被らず（アンチセンスベースの治療薬およびＲＮＡｉベースの治療薬と同様）、一方でこのようなアプタマーは、標的器官および標的組織に依然として分布し、そして所望の投与レジメンと一致した時間にわたって（改変されずに）身体に残存しなければならない。
【０２０４】
したがって、本発明は、アプタマー組成物の薬物動態、そして特に、アプタマーの薬物動態を調整する能力に影響する材料および方法を提供する。アプタマーの薬物動態の調整能（ｔｕｎａｂｉｌｉｔｙ）（すなわち、調節する能力）は、核酸の化学組成を変化させるための、そのアプタマーへの改変する部分（例えば、ＰＥＧポリマー）の結合体化および／または改変ヌクレオチド（例えば、２’−フルオロまたは２’−Ｏ−メチル）の組み込みによって達成される。アプタマーの薬物動態を調整する能力は、存在する治療適用の改良あるいは新規の治療適用の開発に使用される。例えば、いくつかの治療適用（例えば、迅速な薬物クリアランスまたは薬物の遮断（ｔｕｒｎ−ｏｆｆ）が望まれ得る抗新生物性の医療環境または急性の医療環境）において、循環におけるアプタマーの滞留時間を減少させることが、望ましい。あるいは、他の治療適用（例えば、治療薬の体循環が望まれる維持療法）において、循環におけるアプタマーの滞留時間を増大させることが、望まれ得る。
【０２０５】
さらに、アプタマーの薬物動態の調整能は、被験体中のアプタマー治療薬の生体分布を改変するために使用される。例えば、いくつかの治療適用において、特定の型の組織または特定の器官（または器官のセット）を標的する試みにおいてアプタマー治療薬の生体分布を変化させることが、望まれ得る。いくつかの適用において、上記アプタマー治療薬は、特定の組織または器官において優勢に蓄積する。他の治療適用において、所与の疾患、細胞の損傷または他の異常な病理に関連する細胞マーカーまたは症状を提示する組織を、そのアプタマー治療薬が影響を受けた組織において優勢に蓄積するように標的することが、望まれ得る。例えば、表題「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」の米国仮特許出願第６０／５５０７９０号（２００４年３月５日出願）および表題「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」の米国非仮特許出願第１０／−−−，−−−（２００５年３月７日出願）において記載されるように、アプタマー治療薬のＰＥＧ化（例えば、２０ｋＤａのＰＥＧポリマーによるＰＥＧ化）が、ＰＥＧ化アプタマー治療薬が炎症組織において優勢に蓄積するように炎症組織を標的するために使用される。
【０２０６】
アプタマー治療薬（例えば、アプタマー結合体または改変ヌクレオチドなどの変化した化学的性質を有するアプタマー）の薬物動態プロフィールおよび生体分布プロフィールを決定するために、種々のパラメータが、モニタリングされる。このようなパラメータとしては、例えば、アプタマー組成物の半減期（ｔ１／２）、血漿クリアランス（Ｃｌ）、分布容積（Ｖｓｓ）、濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）、観察された最大の血清濃度または血漿濃度（Ｃｍａｘ）、または平均滞留時間（ＭＲＴ）が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「ＡＵＣ」とは、アプタマー治療薬の血漿濃度  対  アプタマー投与後の時間のプロットの下の面積をいう。ＡＵＣ値は、所与のアプタマー治療薬のバイオアベイラビリティー（すなわち、アプタマー投与後の循環中の投与されたアプタマー治療薬の割合）および／または総クリアランス（Ｃｌ）（すなわち、アプタマー治療薬が循環から除去される速度）を推定するために使用される。分布容積は、身体に存在するアプタマーの量に対するアプタマー治療薬の血漿濃度に関連する。Ｖｓｓがより大きいほど、より多くのアプタマーが、血漿の外部に見出される（すなわち、より多い血管外遊出）。
【０２０７】
本発明は、制御された様式において、インビボで安定化したアプタマー組成物の薬物動態および生体分布を、調節する部分（例えば、低分子、ペプチド、またはポリマーの末端基）に対するアプタマーを結合体化すること、またはアプタマーに改変ヌクレオチドを組み込むことによって調節するための材料および方法を提供する。本明細書中に記載される通り、調節する部分および／または変化するヌクレオチドの化学組成物の結合体化は、循環におけるアプタマー滞留時間および組織に対する分布の基礎的局面を変化させる。
【０２０８】
ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、オリゴヌクレオチド治療薬は、腎濾過を介した排泄に供される。そのようなものとして、静脈内に投与されたヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドは、代表的に、濾過をブロックできない限り１０分未満のインビボ半減期を示す。これは、血清から組織への迅速な分布を容易にすること、または糸球体有効なサイズカットオフを超えてオリゴヌクレオチドの見かけの分子量を増加させることのいずれかによって達成され得る。下に記載されるＰＥＧポリマーに対する小さい治療薬の結合体化（ＰＥＧ化）は、循環中のアプタマーの滞留時間を劇的に延長させ得、それによって投与頻度を減少させ、そして脈管標的に対する有効性を増強する
アプタマーは、高分子量ポリマー（例えば、ＰＥＧ；ペプチド（例えば、Ｔａｔ（ＨＴＶ  Ｔａｔタンパク質の１３アミノ酸のフラグメント（Ｖｉｖｅｓら（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０−７））、Ａｎｔ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオタンパク質の第３へリックスに由来する１６アミノ酸の配列（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ、ら（２００１）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（１１−１２）：１３９７−４０５））およびＡｒｇ７（ポリアルギニン（Ａｒｇ７）から構成される短い正に荷電した細胞透過性ペプチド（Ｒｏｔｈｂａｒｄら（２０００）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（１１）：１２５３−７；Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊら（２００２）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（１７）：３６１２−８））；および低分子（例えば、コレステロールなどの脂肪親和性化合物）などの種々の改変する部分に結合体化され得る。本明細書中に記載される種々の結合体の間で、アプタマーのインビボ特性は、ＰＥＧ基との複合体形成によって最も著しく変化する。例えば、２’Ｆと２’−ＯＭｅとの混合型改変アプタマー治療薬と、２０ｋＤａのＰＥＧポリマーとの複合体形成は、腎濾過を妨げ、そして健康な組織および炎症組織の両方に対するアプタマーを促進する。さらに、２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマー−アプタマー結合体が、アプタマーの腎濾過の予防において４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーとほぼ同程度に有効であることが分かる。ＰＥＧ化の１つの効果は、アプタマーのクリアランスであるが、２０ｋＤａ部分の存在によって与えられる延長された全身曝露はまた、組織に対するアプタマーの分布（特に、高度に灌流された器官のものおよび炎症部位におけるもの）を容易にする。上記アプタマー−２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマー結合体は、ＰＥＧ化アプタマーが炎症組織において優勢に蓄積するように、アプタマー分布を炎症の部位に指向させる。いくつかの例において、上記２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマー結合体は、細胞（例えば、腎細胞）の内部に到達し得る。
【０２０９】
改変ヌクレオチドはまた、アプタマーの血漿クリアランスを調節するために使用され得る。例えば、化学的性質を安定化する２’−Ｆおよび２’−ＯＭｅの両方を組み込む結合体化されていないアプタマーは、それがインビトロおよびインビボで高度のヌクレアーゼ安定性を示すような現世代のアプタマーの代表であり、そのアプタマーは、改変さていないアプタマーと比較した場合に、血漿からの迅速な喪失（すなわち、迅速な血漿クリアランス）および組織（主に腎臓）への迅速な分布を示す。
【０２１０】
（ＰＥＧ誘導体化核酸）
上に記載されるように、高分子量の非免疫原性ポリマーによる核酸誘導体化は、核酸の薬物動態および薬力学的特性を変化させてそれらをより有効な治療剤にする可能性を有する。活性の好ましい変化としては、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性の増大、腎臓による濾過の減少、免疫系に対する曝露の減少、および身体にわたる治療薬の分布の変化が挙げられ得る。
【０２１１】
本発明のアプタマー組成物は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分によって誘導体化され得る。ＰＡＧ誘導体化核酸の例は、米国特許出願第１０／７１８，８３３号（２００３年１１月２１日出願）（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に見出される。本発明において使用される代表的なポリマーとしては、ポリエチレンオキシド（「ＰＥＯ」）としても公知であるポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、およびポリプロピレングリコール（ポリイソプロピレングリコールを含む）が挙げられる。さらに、１９種のアルキレンオキシド（例えば、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド）のランダムコポリマーまたはブロックコポリマーが、多くの用途において使用され得る。その最も一般的な形態において、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）は、ヒドロキシル基によって各末端が終結する直鎖状ポリマー：ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨである。このポリマー（α−ジヒドロキシルポリエチレングリコール、ω−ジヒドロキシルポリエチレングリコール）はまた、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして表され得、−ＰＥＧ−記号は以下の構造単位：−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−（ここで、ｎは、代表的に、約４〜約１０，０００の範囲である）を表すことが、理解される。
【０２１２】
示される通り、上記ＰＥＧ分子は、二官能性であり、そしてそのＰＥＧ分子は、時として、「ＰＥＧジオール」と称される。上記ＰＥＧ分子の末端部分は、比較的に非反応性であるヒドロキシル部分（ＯＨ基）であり、そのヒドロキシル部分は、化合物上の反応性部位における他の化合物に対するＰＥＧの結合のために、活性化され得るか、または官能性部分に変換され得る。このような活性化ＰＥＧジオールは、本明細書中で二重に活性化（ｂｉ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）されたＰＥＧと称される。例えば、ＰＥＧジオールの末端部分は、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド由来のスクシニミジル活性エステル部分を用いた比較的に非反応性であるヒドロキシル部分（−ＯＨ）の置換によって、アミノ部分との選択的反応のために活性なカルボネートエステルとして官能化されている。
【０２１３】
多くの適用において、本質的に非反応性である部分によって一方の末端に対してＰＥＧ分子をキャッピングし、結果としてそのＰＥＧ分子が単官能性である（または，一箇所が活性化（ｍｏｎｏ−ａｃｔｉｖａｔｅ）される）ことが望ましい。活性化ＰＥＧに対して複数の反応部位を一般的に提示するタンパク質治療薬の場合において、二官能性の活性化ＰＥＧは、乏しい官能性の集合体を生じる広範な架橋形成をもたらす。一箇所が活性化されたＰＥＧを生成するために、ＰＥＧジオール分子の末端における一方のヒドロキシル部分は、代表的に、非反応性のメトキシ末端部分（−ＯＣＨ３）によって置換される。他方（そのＰＥＧ分子の非キャッピング末端）は、代表的に、表面または分子（例えば、タンパク質）上の反応性部位における結合のために活性化され得る反応性末端に変換される。
【０２１４】
ＰＡＧは、代表的に、水において溶解特性を有し、そして多くの有機溶媒において毒性を欠き、かつ免疫原性を欠くポリマーである。ＰＡＧの１つの用途は、そのポリマーを不溶性分子に共有結合させて、得られるＰＡＧ−分子「結合体」を可溶性にすることである。例えば、不水溶性薬物パクリタキセルはＰＥＧにカップリングした場合に水溶性になることが、示されている（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６０：３３１−３３６（１９９５））。ＰＡＧ結合体は、しばしば、溶解度および安定性を増強するためだけではなく分子の血液循環半減期を延長させるために使用される。
【０２１５】
本発明のポリアルキル化化合物は、代表的に、５ｋＤａと８０ｋＤａとの間のサイズであるが、任意のサイズが、使用され得、その選択は、アプタマーおよび適用に依存する。本発明の他のＰＡＧ化合物は、１０ｋＤａと８０ｋＤａとの間のサイズである。本発明のなお他のＰＡＧ化合物は、１０ｋＤａと６０ｋＤａとの間のサイズである。例えば、ＰＡＧポリマーは、少なくとも１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、または８０ｋＤａのサイズである。このようなポリマーは、直鎖状または分枝状であり得る。いくつかの実施形態において、上記ポリマーは、ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、上記ポリマーは、分枝状ＰＥＧである。なお他の実施形態において、上記ポリマーは、図２に示されるよな４０ｋＤａの分枝状ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、上記４０ｋＤａの分枝状ＰＥＧは、図３に示されるよに、上記アプタマーの５’末端に結合される。
【０２１６】
生物学的に発現されたタンパク質治療薬とは対照的に、核酸治療薬は、代表的に、活性化されたモノマーヌクレオチドから化学的に合成される。ＰＥＧ−核酸結合体は、同一の反復的なモノマー合成を使用してＰＥＧを組み込むことによって調製され得る。例えば、ホスホラミダイト形態への変換によって活性化されたＰＥＧは、固相オリゴヌクレオチド合成に組み込まれ得る。あるいは、オリゴヌクレオチド合成は、反応性のＰＥＧ結合部位の部位特異的組み込みによって達成され得る。最も一般的に、これは、５’末端における自由（ｆｒｅｅ）な第一級アミンの付加（固相合成の最後のカップリング工程において改変因子ホスホラミダイトを使用して組み込まれる）によって達成されている。このアプローチを使用して、反応性ＰＥＧ（例えば、アミンと反応し、そしてそのアミンとの結合を形成するように活性化されるもの）は、精製されたオリゴヌクレオチドと合わせられ、そしてカップリング反応が、溶液中で実施される。
【０２１７】
ＰＥＧ結合体化の治療薬の生体分布を変化させる能力は、多くの因子に関連し、その因子としては、（例えば、流体力学半径に関して測定されるような）上記結合体の見かけのサイズが挙げられる。より大きい結合体（＞１０ｋＤａ）は、腎臓による濾過をより有効にブロックし、次いで小さい高分子（例えば、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の血清半減期を増大させることが公知である。濾過をブロックするＰＥＧ結合体の能力は、約５０ｋＤａまでのサイズのＰＥＧに関して増大することが示されている（さらなる増大は、半減期が腎臓を介した排泄よりもむしろマクロファージ媒介性の代謝によって規定されることとなるような最小限の有益な効果を有する）。
【０２１８】
高分子量ＰＥＧ（＞１０ｋＤａ）の生成は、困難であり得、非効率的であり得、そして高価であり得る。高分子量のＰＥＧ−核酸結合体の合成を目的とした経路のように、先の研究は、より高分子量の活性化ＰＥＧの生成に集中している。このような分子を生成するための１つの方法は、２個以上のＰＥＧが活性化された基を保有する中心のコアに結合される分枝状活性化ＰＥＧの形成を包含する。これらのより高分子量のＰＥＧ分子の末端部分、すなわち、比較的に非反応性であるヒドロキシル（−ＯＨ）部分は、１個以上のＰＥＧを他の化合物にその化合物上の反応性部位において結合させるために、官能性部分へと活性化または変換され得る。分枝状の活性化ＰＥＧは、２個より多い末端を有し、そして２個以上の末端が活性化されている場合において、このような活性化されたより高分子量のＰＥＧ分子は、本明細書中で多重活性化ＰＥＧと称される。いくつかの場合において、分枝ＰＥＧ分子の末端は、必ずしも活性化されるわけではない。分枝ＰＥＧ分子の任意の２つの末端が活性化される場合において、このようなＰＥＧ分子は、二重に活性化されたＰＥＧと称される。分枝ＰＥＧ分子のただ１つの末端が活性化されるいくつかの場合において、このようなＰＥＧ分子は、一箇所が活性化されたと称される。このアプローチの例として、リジンコアに２個のモノメトキシＰＥＧを結合させ、次いでそのリジンコアを活性化することによって調製される活性化ＰＥＧが、記載されている（Ｈａｒｒｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、第２巻：２１４−２２１、２００３）。
【０２１９】
本発明は、高分子量のＰＥＧ−核酸（好ましくは、アプタマー）結合体（多重にＰＥＧ化された核酸が挙げられる）の合成に関して、さらに対費用効果が高いを提供する。本発明はまた、ＰＥＧに連結した多量体オリゴヌクレオチド（例えば、二量体化アプタマー）を包含する。本発明はまた、高分子量組成物に関し、ここで、ＰＥＧ安定性部分は、アプタマーの異なる部分を隔てるリンカーであり、例えば、そのＰＥＧは、高分子量アプタマー組成物の直線配列が、例えば、核酸−ＰＥＧ−核酸（−ＰＥＧ−核酸）ｎ（ｎは、１より大きいかまたは１に等しい）であるように単一のアプタマー配列内に結合体化される。
【０２２０】
本発明の高分子量組成物は、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有するものである。組成物は、代表的に、サイズが１０ｋＤａと８０ｋＤａとの間である分子量を有する。本発明の高分子量組成物は、サイズが少なくとも１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、または８０ｋＤａである。
【０２２１】
安定性部分は、本発明の高分子量アプタマー組成物の薬物動態特性および薬力学特性を改良する分子、または分子の部分である。いくつかの場合において、安定性部分は、２つ以上のアプタマーまたはアプタマードメインを接近させるか、あるいは本発明の高分子量アプタマー組成物の全体的な回転自由度の減少を提供する分子または分子の部分である。安定性部分は、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）であり得、それは、直鎖状または分枝状の、ホモポリマーまたはヘテロポリマーであり得る。他の安定性部分としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのポリマーが挙げられる。オリゴヌクレオチドはまた、安定性部分であり得る；このようなオリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、および／または改変された結合（例えば、ホスホロチオエート）を含み得る。安定性部分は、アプタマー組成物の不可欠な部分であり得る（すなわち、それは、そのアプタマーに共有結合される）。
【０２２２】
本発明の組成物としては、２個以上の核酸が少なくとも１個のポリアルキレングリコール部分に共有結合的に結合体化される高分子量アプタマー組成物が挙げられる。上記ポリアルキレングリコール部分は、安定性部分として機能する。ポリアルキレングリコール部分がアプタマーのいずれかの末端において共有結合し、その結果としてそのポリアルキレングリコールが核酸を１分子中で一緒に連結する組成物において、そのポリアルキレングリコールは、結鎖部分と称される。このような組成物において、その共有結合分子の一次構造は、核酸−ＰＡＧ−核酸である直線配列を含む。１つの例は、核酸−ＰＥＧ−核酸の一次構造を有する組成物である。別の例は、核酸−ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧ−核酸の直線配列である。
【０２２３】
核酸−ＰＥＧ−核酸結合体を産生するために、その核酸は、それが単一の反応性部位を有する（例えば、それは一箇所が活性化される）ように最初から合成される。好ましい実施形態において、この反応性部位は、上記オリゴヌクレオチドの固相合成の最後の工程として改変因子ホスホラミダイトの付加によって５’末端に導入されるアミノ基である。上記改変オリゴヌクレオチドの脱保護および精製の後、その改変オリゴヌクレオチドは、活性化ＰＥＧの自発的加水分解を最小化する溶液において高濃度で再構成される。好ましい実施形態において、そのオリゴヌクレオチドの濃度は、１ｍＭであり、そしてその再構成された溶液は、２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）を含む。上記結合体の合成は、高度に精製された二官能性ＰＥＧの緩徐で段階的な添加によって開始される。好ましい実施形態において、上記ＰＥＧジオールは、スクシニミジルプロピオネートを用いた誘導体化によって、両末端において活性化される（二重に活性化される）。反応後、そのＰＥＧ−核酸結合体は、完全に結合体化された化学種と、部分的に結合体化された化学種と、結合体化されていない結合体化された化学種とを分離するために、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製される。連結された複数のＰＡＧ分子（例えば、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマー）またはより小さいＰＡＧ鎖は、種々の長さ（または分子量）を得るために連結され得る。非ＰＡＧリンカーは、種々の長さのＰＡＧ鎖の間に使用され得る。
【０２２４】
２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、２’−フルオロ改変ヌクレオチドおよび他の改変ヌクレオチドによる改変は、ヌクレアーゼに対してアプタマーを安定化させ、そしてインビボでのその半減期を増大させる。３’−３’−ｄＴキャップもまた、エキソヌクレアーゼ抵抗性を増大させる。例えば、米国特許第５，６７４，６８５号；同第５，６６８，２６４号；同第６，２０７，８１６号および同第６，２２９，００２号（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０２２５】
（反応性核酸のＰＡＧ誘導体化）
高分子量のＰＡＧ−核酸−ＰＡＧ結合体は、単官能性の活性化ＰＥＧと１つ以上の反応性部位を含む核酸との反応によって調製され得る。１つの実施形態において、上記核酸は、二重反応性であるか、または二重に活性化され、そして２種の反応性部位を含む：従来のホスホラミダイト合成（例えば、図４に示されるような３’−５’−ジ−ＰＥＧ化）によってオリゴヌクレオチドに導入された５’−アミノ基および３’−アミノ基。代替的な実施形態において、反応性部位は、第１級アミンの結合のための部位として、例えば、ピリミジンの５位、プリンの８位、またはリボースの２’位を使用して内部に導入され得る。このような実施形態において、上記核酸は、いくつかの活性化部位または反応性部位を有し得、そしてその核酸は、多重に活性化されていると称される。合成および精製の後、上記改変オリゴヌクレオチドは、自発的加水分解を最小化しつつオリゴヌクレオチド反応性部位との選択的反応を促進する条件下において一箇所が活性化されたＰＥＧと合わせられる。好ましい実施形態において、モノエトキシ−ＰＥＧは、スクシニミジルプロピオネートによって活性化され、そしてその共役反応は、ｐＨ８．３において行われる。二置換ＰＥＧの合成を行うために、化学量論的に過剰なＰＥＧが、上記オリゴヌクレオチドに対して与えられる。反応後、そのＰＥＧ−核酸結合体は、完全に結合体化された化学種と、部分的に結合体化された化学種と、結合体化されていない結合体化された化学種とを分離するために、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製される。
【０２２６】
結鎖ドメインはまた、それに結合された１個以上のポリアルキレングリコール部分を有する。このようなＰＡＧは、種々の長さであり、そしてそのＰＡＧは、上記組成物の所望の分子量を得るために適切な組み合わせで使用され得る。
【０２２７】
特定のリンカーの効果は、その化学的組成および長さの両方に影響され得る。長すぎるか、短すぎるか、またはＰＳＭＡとの好ましくない立体的相互作用および／またはイオン相互作用を形成するリンカーは、アプタマーとＰＳＭＡとの間の複合体の形成を妨害する。核酸間の距離を補うのに必要とされるものより長いリンカーは、そのリガンドの有効濃度を減少させることによって結合安定性を低下させ得る。したがって、標的に対するアプタマーの親和性を最大化するためにリンカーの組成および長さを最適化することが、しばしば必要とされる。
【０２２８】
本明細書中に引用される全ての刊行物および特許文書は、それぞれのこのような刊行物または文書があたかも具体的かつ個別に本明細書中に参考として援用されることがしめされるかのように本明細書中に参考として援用される。刊行物および特許文書の引用は、いずれも先行技術であるとを認めることでも、それと同じ内容またはデータであるとの承認を構成するものでもない。ここで、本発明を、文書によって記載することで、当業者は、本発明が種々の実施形態において実施され得ること、ならびに上述の説明および以下の実施例が例示を目的としており、かつ添付の特許請求の範囲を限定することを目的としないを認識する
【実施例】
【０２２９】
（実施例１：アプタマーの選択および配列）
（実施例１Ａ：ｒＧｍＨ組成の抗ＰＳＭＡアプタマーについてのデノボ選択）
デノボ選択を、ヒトＰＳＭＡの細胞ガイドメインのＮ末端６−Ｈｉｓタグ化バージョンに対して、下に記載したＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズプルダウン選択法を使用して開始した。ｒＧｍＨプール組成（２’−ＯＨ  Ｇ、２’Ｏ−Ｍｅ  Ａ、２’Ｏ−Ｍｅ  Ｃ、および２’Ｏ−Ｍｅ  Ｕ）を使用する選択を、開始した。中程度〜高親和性の２種のアプタマー（ＡＲＣ９５５（Ｇ２）およびＡＲＣ９５６（Ｇ８））を得た。これらの２種のクローンについての配列および結合データを、下に示す。
【０２３０】
ＰＳＭＡのＥＣＤのタンパク質精製：完全長組換えヒトＰＳＭＡをコードするＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．クローン（５２０２７１５）を、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｌｏｎｅ  ＥＨＳｌＯＯｌ−１８５３３、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から購入した。ＰＣＲを使用して、完全長クローンの細胞外部分を増幅した。Ｎ末端ヒスチジンタグを有するオリゴを、膜貫通ドメイン残基１〜４４を欠く構築物を操作するために設計した。そのヒスタグ化細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にサブクローニングした。ＰＳＭＡのＥＣＤを、トランスフェクト２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から自前で精製した。ＤＡＡＱＰＡＲＲＡＲＲＴＫＬの後に８個のヒスチジンを含むＮ末端リンカー配列を含む発現したタンパク質のアミノ酸配列を、下に記載する：
【０２３１】
【化７】
2008536485.tif 000028
プールの調製。配列５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣ（Ｎ３０）ＧＧＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧ−３’（ＡＲＣ３５６）（配列番号６）を含むＤＮＡテンプレートを、ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥＴＭ  ＤＮＡ合成機を使用して合成し、そして標準的な方法によって脱保護した。そのテンプレートを、プライマー５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号７）および５’−ＣＡＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＣ−３’（配列番号８）を用いて増幅し、次いでＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）を用いたインビトロ転写のためにテンプレートとして使用した。転写を、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  スペルミジン、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％  ＰＥＧ−８０００、９．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ  ２’−ＯＭｅ−ＣＴＰ、２ｍＭ  ２’−ＯＭｅ−ＵＴＰ、２ｍＭ  ２’−ＯＨ  ＧＴＰ、３ｍＭ  ２’−ＯＭｅ−ＡＴＰ、０．０１ユニット／μＬ無機ピロホスファターゼ、およびＴ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）、ならびに約１μＭテンプレートＤＮＡを使用して行った。
【０２３２】
ＳＥＬＥＸＴＭ。選択を、２’−ＯＨ  Ｇ、２’−ＯＭｅ  Ａ、２’−ＯＭｅ  Ｃ、２’−ＯＭｅ  Ｕ改変ＡＲＣ３５６プール（ｒＧｍＨ組成）の２×１０１４個の分子と２０ピコモルのＥＣＤ  ＰＳＭＡタンパク質とを、微量のα−３２Ｐ  ｒＧＴＰ標識されたＲＮＡを含む１００μｌの最終容量の選択緩衝液（１×ＳＨＭＣＫ緩衝液：２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中で室温にて１時間インキュベートすることによって開始した。ＲＮＡ−タンパク質複合体および結合していないＲＮＡ分子を、３×３００μｌのＳＨＭＣＫ緩衝液を用いて前洗浄および平衡化した１００μｌのＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）ビーズスラリーを用いて分離した。次いでＲＮＡ／タンパク質溶液を、そのビーズに添加し、室温にて１時間結合させた。次いでそのビーズを、２×５００μｌの１×ＳＣＨＭＫ緩衝液で２回洗浄し、ビーズ／洗浄溶液を０．２μＭフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を通して濾過することによって取り出した。そのＲＮＡを、２×２５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４）をさらに含む１００μＬの１×ＳＣＨＭＫ緩衝液を２回添加することによってそのビーズから溶出させた。
【０２３３】
溶出されたタンパク質を、フェノール：クロロホルムによってそのＲＮＡ混合物から抽出し、そしてそのプールＲＮＡを、沈殿させた（１μＬグリコーゲン、１．５容量のイソプロパノール）。そのＲＮＡを、製造業者の指示書に従ってＴｈｅｍｉｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲＴＭシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用い、配列番号８に従う３’プライマーを使用して逆転写した。そのｃＤＮＡを、ＰＣＲ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣ１２、０．５μＭ  ５’プライマー（配列番号７）、０．５μＭ  ３’プライマー（配列番号８）、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．０５ユニット／μＬ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））によって増幅した。テンプレートを、３２Ｐ  ＧＴＰ体標識化を用いて３７℃で一晩転写した。その反応を、製造業者の指示書に従ってＣｅｎｔｒｉｓｅｐ  Ｓｐｉｎカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）を使用して脱塩し、そして変性ポリアクリルアミドゲル上で精製した。
【０２３４】
次のラウンドを、ラウンド１と同じであるが、ネガティブ選択工程の追加を有する方法を使用して繰り返した。タンパク質標的とのインキュベーションの前に、そのプールＲＮＡを、非特異的結合に対して選択するために１００μｌのＮｉ−ＮＴＡビーズおよび１×ＳＣＨＭＫと一緒に１５分間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、そのＲＮＡを、そのビーズから取り出し、そしてポジティブ選択工程に進ませた。
【０２３５】
上記プールＲＮＡを、ラウンド毎にゲル精製した。転写反応を、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いてクエンチし、そしてエタノール沈殿し、次いで１．５ｍｍ変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ尿素、１０％アクリルアミド；１９：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミド）上で精製した。プールＲＮＡを、受動的にゲルフラグメントを３００ｍＭ  ＮａＡｃおよび２０ｍＭ  ＥＤＴＡにおいて一晩溶出させることによってそのゲルから取り出した。その溶出した材料を、２．５容量のエタノールおよび１μｌのグリコーゲンを添加することによって沈殿させた。
【０２３６】
タンパク質濃度を、上記選択を通して２００ｎＭに維持した。そのプール濃度は、各ラウンドで定量されなかったが、前ラウンドの収量の半分を、次のラウンドに進め、そのＲＮＡプールが２００ｎＭ  ＥＣＤ  ＰＳＭＡより過剰にあることを確保した。競合因子ｔＲＮＡを、ラウンド２において初めに０．１ｍｇ／ｍＬで結合反応に添加した。９ラウンドの選択が終了した後、そのプールを、配列決定し、そしてクローンについてスクリーニングした。以下の表１に概説した選択の進行を、ポジティブ選択工程の間にＮｉ−ＮＴＡビーズから溶出した投入プールＲＮＡの％を測定することによってモニタリングした。以下の表１において、ＰＣＲ限界を、４％アガロースＥ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上のＰＣＲバンドの強度が１００ｂｐマーカーレーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と等しいことを得るＰＣＲ増幅サイクルの数として定義した。
【０２３７】
（表１：ｒＧｍＨ選択の概要）
【０２３８】
【表１】
2008536485.tif 000029
ドットブロット結合分析。ドットブロット結合アッセイを、上記プールのタンパク質結合親和性をモニタリングするために上記選択を通して行った。最初のプールスクリーニングに関して、微量のＰ標識したプールＲＮＡを、ＰＳＭＡと合わせ、そして０．１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡを加えた３０μｌの最終容量の１×ＳＨＭＣＫ緩衝液（ｐＨ７．４）（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）において室温で３０分間インキュベートした。その混合物を、ニトロセルロース、ナイロン、およびゲルブロットメンブレン（上から下に向かって）を取り付けたドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｍｉｎｉｆｏｌｄ−１  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ、Ａｃｒｙｌｉｃ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）に適用した。タンパク質に結合したＲＮＡは、ニトロセルロースフィルター上に捕捉される；それに対してタンパク質に結合していないＲＮＡは、ナイロンフィルター上に捕捉される。上記選択プールを、バックグラウンドを上回るごくわずかな結合を示したラウンド９においてアッセイした。ラウンド９のプールを、クローニングし、そして１００ｎＭ  ＰＳＭＡを使用した一点ドットブロットアッセイにおいてスクリーニングした（０ｎＭ  ＰＳＭＡをネガティブコントロールとして使用した）。クローン転写物を、３２−Ｐ  ＡＴＰによって５’末端標識した。次いで、考えられる結合因子を、一定のＲＮＡ濃度を用いた８点のＰＳＭＡ滴定を使用して、すぐ上に記載したドットアッセイ条件（しかしｔＲＮＡを含まない）によってＫＤのためにアッセイした。試験した合計２５種のクローンからの２種の最良のクローン（ＡＲＣ９５５（Ｇ２）およびＡＲＣ９５６（Ｇ８））についてのアッセイ結果を、表２に示す（報告したＫＤ値は、ｔＲＮＡを用いずにもたらされた）。ｔＲＮＡを含むことは、ｔＲＮＡが結合に関して競合する場合にＫＤ測定値を上昇させ得る。スクリーニングしたクローンの両方は、ラウンド９の選択プールにおいてユニーク配列であった。
【０２３９】
ｒＧｍＨアプタマーの核酸配列を、下の表３に列挙する。各アプタマーのユニーク配列は、５’の固定された配列５’−ＵＡＡＵＡＣＧＡＣＵＣＡＣＵＡＵＡＧ−３’（配列番号９）の直後のヌクレオチド１９にて始まり、そして３’の固定された核酸配列５’−ＧＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＡＵＣＧＡＵＧ−３’（配列番号１０）に到達するまで続く。特に記載しない限り、表３において下に列挙した個々の配列は、５’から３’の方向で示され、そしてｒＧｍＨ  ＳＥＬＥＸＴＭ条件下で選択され、アデノシン三リン酸、シチジン三リン酸およびウリジン三リン酸は、２’−ＯＭｅであり、そしてグアノシン三リン酸は、２’−ＯＨである。いくつかの実施形態において、本発明は、下の表２に記載したような核酸配列を有するアプタマーを含む。他の実施形態において、下の表２に記載したアプタマーの核酸配列は、さらに、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）に対する化学的カップリング、および／または結合体化を容易にするために３’キャップ（例えば、逆位ｄＴキャップ（３Ｔ））および／または５’アミン（ＮＨ２）改変を含む。
【０２４０】
（表２：ラウンド９  ＰＳＭＡ  ｒＧｍＨクローンについての結合データ）
【０２４１】
【表２】
2008536485.tif 000030
（表３：ラウンド９  ＰＳＭＡ  ｒＧｍＨ選択由来の配列）
【０２４２】
【表３】
2008536485.tif 000031
（実施例２：組成および配列の最適化）
実施例２Ａにおいて、実施例１に記載したｒＧｍＨ選択から得たＡＲＣ９５５（Ｇ２）と指定したＰＳＭＡ特異的アプタマーを、合成的短縮によってさらに最適化した。実施例２Ｂ〜実施例２Ｅにおける研究は、
【０２４３】
【化８】
2008536485.tif 000032
からなる配列を有する本明細書中でＡ９クローンと記載されるクローンＡ９（ｒＲｆＹ組成（２’−ＯＨプリン（ＡおよびＧ）および２’−フルオロピリミジン（ＣおよびＵ））の存在するＰＳＭＡ特異的アプタマー）をＳＥＬＥＸＴＭ後の最適化によって改良する試みの結果を記載する。Ａ９クローンは、ＵＳＳＮ  ０９／９７８，９６９を有する特許出願（２００１年１０月１６日出願）（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載された。Ａ９クローン（配列番号１６８）を、合成的短縮（実施例２Ｂ）、細胞表面ドープ型（ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｏｐｅｄ）ＳＥＬＥＸＴＭ（実施例２Ｃ）、操作した変異（実施例２Ｄ）、および操作した骨格改変（実施例２Ｅ）によって広範に最適化した。
【０２４４】
（実施例２Ａ：ＡＲＣ９５５（Ｇ２）アプタマーの最小化および最適化）
ＰＳＭＡに対するＡＲＣ９５５の結合に必要なコア構造エレメントを同定するために、そのクローンの３’境界をアルカリ加水分解によって決定した。親ＲＮＡ転写物を、γ−３２Ｐ  ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’末端を標識した。放射標識したリガンドを、部分的なアルカリ加水分解に供し、次いで溶液中でＥＣＤ  ＰＳＭＡ（自前で精製した）に対して１００ｎＭにて選択的に結合させ、ニトロセルロースフィルター（Ｃｅｎｔｒｅｘ  ＭＦ  １．５ｍＬ、０．４５μｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ  ＮＨ）に通した。残ったオリゴヌクレオチドを、８％変性ポリアクリルアミドゲル上で分解した。ＰＳＭＡに結合した最も小さいオリゴヌクレオチドは、３’境界を規定した。予想される折り畳みの境界実験および視診に基づいて、短縮構築物を、合成した。次いでクローンを、それらのＫＤを決定するために、先に記載したようなドットブロットによってアッセイした。ＡＲＣ１０９１は、アプタマーの完全な結合能を維持する試験した最も小さいミニマーを表す。ドットブロットアッセイにおけるＡＲＣ１０９１についての結合曲線を、図５Ａに示し、そしてＡＲＣ１０９１の予想される二次構造を、図５Ｂに示す。ドットブロット結合アッセイによって決定した場合の総合的に最も高いＰＳＭＡ親和性を有する３種の最小化構築物についてのＫＤおよび結合した最大％を、表４に列挙する。下で表５において記載した最小化ｒＧｍＨアプタマーに関して、グアノシン三リン酸は、２’−ＯＨであり、そしてアデノシン三リン酸、シチジン三リン酸およびウリジン三リン酸は、２’−ＯＭｅである。特に記載しない限り、個々の配列は、５’から３’の方向で示される。いくつかの実施形態において、本発明は、下で表４に記載した核酸配列を有するアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、下で表４に記載したアプタマーの核酸配列は、さらに、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）に対する化学的カップリング、および／または結合体化を容易にするために３’キャップ（例えば、逆位ｄＴキャップ）および／または５’アミン（ＮＨ２）改変を含む。他の実施形態において、表４に記載した核酸配列は、化学的カップリングを容易にするために、示した３’キャップ（例えば、逆位ｄＴキャップ（３Ｔ））および／または５’アミン（ＮＨ２）改変を欠く。
【０２４５】
（表４：ｒＧｍＨミニマーの結合データ）
【０２４６】
【表４】
2008536485.tif 000033
結合した最大％は、ドットブロットによってアッセイした場合の、標的タンパク質に結合したミニマーの最も高い％を指す。
【０２４７】
（表５：ｒＧｍＨミニマーの配列）
【０２４８】
【表５】
2008536485.tif 000034
（実施例２Ｂ：Ａ９アプタマーの短縮）
親Ａ９アプタマー配列（配列番号１６８）を、ほぼ分子全体を含む部分的にミスマッチしたヘアピンに折り畳むために、ＲＮＡＳｔｒｕｃｔｕｒｅプログラムｖ．４．１１において実行されるＭＦＯＬＤアルゴリズムによって予想する。自己対形成するヌクレオチドを５’末端および３’末端から同時に除去した一連の短縮構築物を、設計し、従来の固相ホスホラミダイトベースの合成を使用して化学的に合成し、そして試験した。短縮Ａ９アプタマー（例えば、ＡＲＣ５９１を参照のこと）のいくつかの設計において、さらなる塩基を、その短縮物の３’末端および５’末端に付加し、５’末端に付加された塩基は、３’末端に付加された塩基とワトソン−クリック塩基対形成を形成し得、それによってステム構造の長さを増大させる。短縮アプタマーを、フルオレセインによって５’標識し、そして下に記載したＦＡＣＳアッセイにおいてＬＮＣａＰ細胞（ＰＳＭＡ＋）に対する結合について試験した。ＰＣ−３細胞（ＰＳＭＡ−）を、コントロール細胞株として使用した。設計した短縮Ａ９アプタマーの配列を、下で表６に列挙した。
【０２４９】
５’−フルオレセイン標識化を達成するために、アプタマーを、５’−アミンを用いて合成した、次いで固相合成後に改変した。必要とされるアプタマーを、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に約１０〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解した。その低分子（フルオレセインのＮＨＳエステル）を、ＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解した。１．５モル濃度等価物を、そのアプタマーに添加し、そしてその溶液を、約１５秒間ボルテックスした。その反応を、暗所で室温にて１時間進行させ、次いで５μＬアリコートを、引き出し、水によって希釈し、そしてＨＰＬＣによって分析した。その低分子のさらなる等価物を、その反応が終了する（ＨＰＬＣによる）まで添加した。過剰の低分子を、ゲル濾過によって除去した。
【０２５０】
ＦＡＣＳアッセイのためのアプタマーを調製するために、ＰＳＭＡアプタマーを、Ｖ底９６ウェルプレートにおいて、試験される濃度にてＦＡＣＳ緩衝液（１０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡおよび０．２％アジ化Ｎａを補充した１×ＤＰＢＳ  ｗ／Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））に連続的に希釈した（０〜１ｕＭ）。ＬＮＣａＰ細胞およびＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、トリプシンを用いて収集し、そして１ウェルあたり２００，０００個の細胞を、計測し、１×ＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含む）によって１回洗浄し、そして２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＦＡＣＳ緩衝液中の２００μｌの細胞を、新しい９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、遠心分離（１３００ｒｐｍで５分間）によってペレットにし、そして１００μｌの適切な濃度の希釈したアプタマーに再懸濁した。ＦＡＣＳ緩衝液、α−ＰＳＭＡ抗体（３Ｃ６）（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ、カタログ番号６０−５００２）および無関係（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）なフルオレセインイソチオシアネート（「ＦＩＴＣ」）マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号５５４６７９）を、コントロールとして使用した。アプタマー／細胞混合物のウェルを、室温にて２０〜３０分間インキュベートした。
【０２５１】
インキュベーション後、１８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（１０ｍｇ／ｍＬ  ｓｓＤＮＡおよび０．２％アジ化Ｎａを加えた）を、各ウェルに添加してその反応をクエンチし、そして細胞を、遠心分離によってペレットにした。抗フルオレセイン／Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標），ウサギＩｇＧ分画，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８結合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、カタログ番号Ａ１１０９０）を、アプタマー−ＦＩＴＣ結合体およびＦＩＴＣ−マウスＩｇＧアイソタイプコントロールのための二次抗体として、ＦＡＣＳ緩衝液（１００μｌ／ウェル）において１：１００に希釈した。ＦＩＴＣ  Ｒａｔ抗マウスＩｇＧ１（Ａ８５−１）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号５５３４４３）を、α−ＰＳＭＡ抗体のための二次抗体として、ＦＡＣＳ緩衝液において１：１００に希釈した。遠心分離後、その細胞ペレットを、１００μｌの上記適切に希釈した二次抗体に再懸濁し、そして室温にて１０分間インキュベートした。インキュベーション後、１８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を、各ウェルに添加してその反応をクエンチし、そして細胞を、遠心分離によってペレットにした。
【０２５２】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧを認識する三次抗体を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシグナルのさらなる増幅のために調製した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、カタログ番号Ａ１１０３４）をＦＡＣＳ緩衝液において１：１００に希釈し、そしてそのペレットにした細胞を、１００μｌの三次抗体に再懸濁し、そして室温にて１０分間インキュベートした。インキュベーション後、１８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を、各ウェルに添加してその反応をクエンチし、そして細胞を、遠心分離によってペレットにし、そして１μｌ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（「ＰＩ」）を含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液再懸濁して生細胞／死細胞染色を可能にした。
【０２５３】
細胞サンプルを、以下のパラメータの下でＦＡＣＳスキャン機（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）において分析した：ＦＳＣ／ＳＳＣ、ＦＬ−１／ＦＳＣ、ＦＬ−３／ＦＳＣ。染色されていないコントロールおよび／またはアイソタイプコントロールを、ゲートをかけるパラメータを確立するために使用し、そしてそのデータを、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアバージョン５．１．１（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して分析した。図６は、スクランブルＡ９アプタマーをネガティブコントロールとして使用したＬＮＣａＰ  ＦＡＣＳアッセイにおけるＰＳＭＡ特異的アプタマーについての代表的な結果の例であり、図６は、Ａ９アプタマー（配列番号１６８）が、ＬＮＣａＰ（ＰＳＭＡ＋）細胞に結合するが、ＰＣ−３（ＰＳＭＡ−）細胞に結合しないことをヒストグラムプロットによって示す。さらに、図８は、αＰＳＭＡ抗体によるＡ９蛍光シグナルの競合が、クローンがあらゆる他の細胞表面成分よりもむしろＰＳＭＡと特異的相互作用によって結合することを実証すること示す。
【０２５４】
これらの研究から、上に記載したＬＮＣａＰ  ＦＡＣＳアッセイおよびＮＡＡＬＡＤａｓｅ阻害アッセイ（実施例２Ｄにおいて下に記載した）において完全な機能的活性を維持する４８ヌクレオチド「ミニマー」ＡＲＣ５９１を、同定し、そしてそれは、図７に示すように、先に記載したドットブロットアッセイによってＰＳＭＡに３．４ｎＭのＫＤで結合することが示された。
【０２５５】
特に記載しない限り、表６において下で列挙した個々の配列は、５’から３’の方向で示され、そしてそれらは、アプタマーに由来し、全てのアデノシン三リン酸およびグアノシン三リン酸は、２’−ＯＨであり、そして全てのシチジン三リン酸およびウリジン三リン酸は、２’−フルオロである。いくつかの実施形態において、本発明は、下で表６に記載したような核酸配列を有するアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、下で表６に記載したアプタマーの核酸配列は、さらに、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）に対する化学的カップリング、および／または結合体化を容易にするために３’キャップ（例えば、逆位ｄＴキャップ（３Ｔ））および／または５’アミン（ＮＨ２）改変を含む。他の実施形態において、表６に記載した核酸配列は、化学的カップリングを容易にするために、示した３’キャップ（例えば、逆位ｄＴキャップ）および／または５’アミン（ＮＨ２）改変を欠く。
【０２５６】
ＡＲＣ７１１（配列番号２６）においてＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵに先行する小文字「ｆ」および「ｍ」は、それぞれ、２’−フルオロ置換および２−Ｏ−メチル置換を示し、Ｃ６−ＦＡＭは、５’−フルオレセインを示す。
【０２５７】
（表６：短縮Ａ９アプタマーの配列）
【０２５８】
【表６】
2008536485.tif 000035
（実施例２Ｃ：細胞表面ドープ型ＳＥＬＥＸＴＭ）
この実施例において、ドープ型再選択を使用して、活性クローンまたは活性ミニマー内の配列必要条件を探索した。ドープ型選択は、単一の配列（ここで、ＡＲＣ５９１）に基づいて設計した合成の縮重プールを用いて実行した。縮重のレベルは、通常、７０％〜８５％の野生型ヌクレオチドを変える。一般に、天然の変異が、観察されるが、いくつかの場合において、配列の変化は、親和性の改善をもたらす。次いで、複合性の配列情報が、最小の結合モチーフを同定し、そして最適化の試みを支援するために使用され得る。
【０２５９】
ＡＲＣ５９１の配列に基づくドープ型選択ストラテジーを使用して、（１）ＰＳＭＡのタンパク質を発現する細胞に対するＰＳＭＡ指向性の結合を改良した配列改変体、（２）非特異的細胞結合を最小化した配列改変体、および（３）さらなる最適化を導くためのアプタマーの二次構造および三次構造の必要条件に関する情報を提供する配列改変体を、同定した。
【０２６０】
プールの調製。ＡＲＣ５９１の配列からなり、ＰＳＭＡ結合を妨害しないことが別個に示される任意の一定のプライマー配列によって隣接されるＤＮＡテンプレートを、ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥＴＭ  ＤＮＡ合成機を使用して合成し、そして標準的な方法によって脱保護した。
【０２６１】
【化１０】
2008536485.tif 000036
太字のヌクレオチドは、８５％の示した残基である確率および５％の他の３種のヌクレオチドのうちの１つである確率を有した（図６Ｂもまた参照のこと）。上記ＤＮＡテンプレートを、プライマー５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＡＧＧＡＣＧＡＡＧＧＧＡＧＧ３’（配列番号２８）およびプライマー５’−ＴＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＣＧ−３’（配列番号２９）を使用して増幅し、次いでＹ６３９Ｆ変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写のためのテンプレートとして使用した。転写を、α３２Ｐ  ＡＴＰ体標識化を使用して３７℃にて一晩行った（４％  ＰＥＧ−８０００、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  スペルミジン、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３ｍＭ  ２’ＯＨプリン、３ｍＭ  ２’Ｆピリミジン、２５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１ユニット／μｌ無機ピロホスファターゼ、Ｔ７  Ｙ６３９Ｆ変異体ＲＮＡポリメラーゼ、５μＣｉ  α３２Ｐ  ＡＴＰ）。その反応を、製造業者の指示書に従ってＢｉｏ  Ｓｐｉｎカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して脱塩した。
【０２６２】
このドープ型プールを、ＬＮＣａＰ細胞に対する優勢な結合およびＰＣ−３細胞に対する最小限の結合について下で詳細に記載したような細胞表面ＳＥＬＥＸＴＭを使用して反復的に濃縮した。ドープ型再選択プロセスの概要を、図８Ａに示す。腫瘍細胞において内因性に発現されるＰＳＭＡに結合し得るアプタマー改変体の濃縮を特異的に駆動するために、ＳＥＬＥＸＴＭプールを、ＰＳＭＡ（＋）ＬＮＣａＰ細胞（ポジティブ選択）およびＰＳＭＡ（−）ＰＣ−３細胞（ネガティブ選択）を使用して分離した。各ラウンドにおいて、細胞を、以下の通りに分離するために収集した。組織培養フラスコ中で増殖させた細胞を、ＰＢＳによって洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡと合わせ、そして３７℃にて、代表的には細胞がそれらのペレットから解離し始めるまで１分間未満インキュベートした。その細胞を、次いでほぼ等しい容量の培地（ＲＰＭＩ１６４０＋ウシ胎仔血清）によって希釈し、そして１，５００ｒｐｍにて１．５分間の遠心分離によって収集した。その上清を除去した後、細胞を、培地によって１回洗浄し、そして１×ＰＢＳ（Ｍｇ＋＋  Ｃａ＋＋を加えた）（Ｇｉｂｃｏ  ＃１４０４０−１３３）によって２回洗浄した。細胞を回収した後、細胞を、調製し、その後、上記ＳＥＬＥＸＴＭプールに曝露した。細胞ＳＥＬＥＸＴＭの各ラウンドは、代表的に、ポジティブ選択については２．３×１０７個のＬＮＣａＰ細胞を使用し、そしてネガティブ選択については１．１×１０７個のＰＣ−３細胞を使用した。回収した細胞を、遠心分離によって濃縮し、１ｍＬあたり１〜２×１０６個の細胞の濃度にて細胞結合緩衝液（細胞結合緩衝液＝０．９×ＰＢＳ中の０．１％  ＢＳＡ、０．２ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、０．２ｍｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ）に穏やかに再懸濁し、４℃にて２０分間にわたってゆっくりと回転した。このインキュベーションの後、１Ｕ／μｌ  ＳＵＰＥＲａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、＃２６９６）および０．０１％  ＮａＮ３を、細胞に添加し、そしてさらに１０分間、４℃にて回転し続けた。
【０２６３】
ネガティブＳＥＬＥＸＴＭ。ネガティブな選択圧が適用される細胞表面ＳＥＬＥＸＴＭラウンド（ラウンド２〜６）において、上記ＳＥＬＥＸＴＭプールを、上に記載したように調製したＰＣ−３細胞に前除去（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｉｎｇ）工程において最初に曝した。そのＰＣ−３細胞を、２つの等しい分画に分け、ＣＢＢＡ（ＣＢＢＡ＝細胞結合緩衝液＋添加剤＝１０ｍｌ細胞結合緩衝液、１００μｌ  １％  ＮａＮ３、および２５０μｌ  ２０Ｕ／μｌ  ＳＵＰＥＲａｓｅ）によって６００μｌに希釈し、最小限の容量で上記ＳＥＬＥＸＴＭプールと合わせ、そして４℃にて３０分間インキュベートした。細胞を、遠沈（１，５００ｒｐｍ、２分間）し、そしてその上清を、ポジティブ選択工程のために収集した。
【０２６４】
ポジティブＳＥＬＥＸＴＭ。ネガティブＳＥＬＥＸＴＭ工程由来の上清（約５５０μｌ）を、上に記載したように調製した、予めブロックし、ペレットにしたＬＮＣａＰ細胞と合わせた。細胞を、ＣＢＢＡによって２回洗浄してそのＳＥＬＥＸＴＭプールの結合していない分画を除去し、次いで４℃にて３０分間インキュベートした。後期のラウンド（ラウンド５およびラウンド６）において、選択のストリンジェンシーを、（本質的に遅い解離速度を有する分子の選択を駆動する）細胞から一過性に解離した分子を競合的に置換し得るさらなる増幅不可能な競合因子（ＡＲＣ５９１）を含むことによって増大させた。実現可能性の研究は、ＳＥＬＥＸＴＭプールの顕著な分画がこの結合後のＬＮＣａＰ細胞と会合したこと、そして洗浄処理が調製段階の間に殺された細胞による非特異的取り込みに起因し得ることを示した。ＰＳＭＡに会合した分子を特異的に濃縮するために、ＦＡＣＳを、ヨウ化プロピジウム染色（１０μｇ／ｍｌ）に基づいて生細胞および死細胞を分別するために使用し、死細胞について確立された閾値を下回る平均蛍光強度を有する１．５〜２×１０６個の細胞を特異的に収集した。収集した細胞を、遠心分離によってペレットにし、そして会合したＳＥＬＥＸＴＭプール分子を、下に記載した通りに増幅した。
【０２６５】
抽出および増幅。ＦＡＣＳによって単離した細胞ペレットを、５００μｌ溶出緩衝液（５Ｍ尿素、３００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を用いて再懸濁し、次いでＲＮＡを、５００μｌ酸性フェノール（ｐＨ約５）によって抽出し、４００μｌ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液および８００μｌクロロホルムによって逆抽出した。その上清を、新しいチューブに移し、そして３Ｍ酢酸Ｎａ、２．５容量のエタノール、および１μｌグリコーゲンを用いて沈殿させた。その単離したペレットを、１００μｌの水を用いて再懸濁し、Ｇ２５スピンカラム（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して２回脱塩し、そして以下を含む逆転写反応のカクテルのための次なる投入として使用した：１２０μｌの抽出したＲＮＡ、２．５μｌの１００μＭ逆方向プライマー５’−ＴＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＣＧ−３’（配列番号２９）、５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ。その反応混合物を、６５℃にて３分間インキュベートし、以下のものを添加した：５０μｌの５×逆転写緩衝液、２５μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１２．５μｌのＲＮＡｓｅＯＵＴ、１０μｌのＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ  ＃１１１４６−０２４）、２５μｌのＨ２Ｏ。完全な反応ミックスを、６５℃にて６０分間インキュベートした、そして８５℃にて１０分間のインキュベーションによって熱で殺した。
【０２６６】
上記ｃＤＮＡを、次いで、２５μｌのＰＣＲミックス（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＭのプライマー確認プライマー配列５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＡＧＧＡＣＧＡＡＧＧＧＡＧＧ３’（配列番号２８）、０．５μＭのプライマー５’ＴＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＣＧ−３’（配列番号２９）、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．０５ユニット／μＬ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））において１μｌを使用したＰＣＲによって増幅した。５２℃のアニーリング温度を伴う標準的なＰＣＲ条件を、使用した。このサイクルを、十分量のＰＣＲ産物（４％  Ｅ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上でＰＣＲ産物のアリコートを電気泳動することによって測定した）がもたらされるまで繰り返した。バンドの強度が１００ｂｐマーカーレーンと等しかった場合、そのテンプレートを使用して転写の次のラウンドを刺激（ｐｒｉｍｅ）した。その反応を、製造業者の指示書に従ってＣｅｎｔｒｉｃｅｐスピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）を使用して脱塩し、そして表７に示したように、いくつかのラウンドにおいて変性ポリアクリルアミドゲル上で精製した。
【０２６７】
表７は、ＳＥＬＥＸＴＭの各ラウンドについての条件に対する特定の情報を要約する。図８Ｂに示した通り、初めのドープ型ライブラリー（Ａ９変異誘発型プール、図１０Ｂ）は、先に記載したＬＮＣａＰ  ＦＡＣＳアッセイにおいて蛍光標識した転写物を使用して評価したところ有意なＬＮＣａＰ結合を示さなかった。ＬＮＣａＰ結合についての４ラウンドの再選択後（ｐＲｄ４、図１０Ｂ）、結合のレベルは、元のＡ９クローンによって観察されたレベルに戻った（ｘＰＳＭ−Ａ９、図１０Ｂ）。抗ＰＳＭＡ抗体（αＰＳＭＡ  ｐＲｄプール、図１０Ｂ）による蛍光シグナルの競合は、クローンがあらゆる他の細胞表面成分よりもむしろＰＳＭＡと特異的相互作用によって結合することを実証すること示す。ＳＥＬＥＸＴＭの２回のさらなるラウンドを、ＰＳＭＡに対する強力により高い親和性結合を有するアプタマーをもたらすために、増大したストリンジェンシー条件下で実施した。増大したストリンジェンシー条件は、結合後の細胞を５００ｎＭの増幅不可能なＡ９アプタマーと一緒に３０分間インキュベートして、その時間の間にＰＳＭＡから解離したアプタマー改変体による再結合をブロックすることを必要とする標準的な洗浄工程に続いた。合計で６ラウンドのＳＥＬＥＸＴＭの後、アプタマーを、サブクローニングし、そして配列決定した。４７種の独立したクローン配列を、獲得し、そしてそれらの配列を、表８に列挙した。ヌクレオチドの対の間の配列保存およびワトソン−クリック共変動は、高度に保存された１６ヌクレオチドのヘアピンループ、あまり良好に保存されていない非対称性ループ、および高度に保存されたＣ：Ｔミスマッチを有する特定のヘアピン構造を規定した（図９）。
【０２６８】
（表７：ドープ型細胞ＳＥＬＥＸＴＭの概要）
【０２６９】
【表７】
2008536485.tif 000037
特に記載しない限り、表８において下で列挙した個々の配列は、５’から３’の方向で示され、そしてアプタマーから得られ、全てのアデノシン三リン酸およびグアノシン三リン酸は、２’−ＯＨであり、そして全てのシチジン三リン酸およびウリジン三リン酸は、２’−フルオロである。いくつかの実施形態において、本発明は、下で表８に記載した核酸配列を有するアプタマーを含む。他の実施形態において、下で表８に記載したアプタマーの核酸配列は、さらに、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）に対する化学的カップリング、および／または結合体化を容易にするために３’キャップ（例えば、逆位ｄＴキャップ（３Ｔ））および／または５’アミン（ＮＨ２）改変を含む。
【０２７０】
（表８：ラウンド６のドープ型細胞ＳＥＬＥＸＴＭ由来の配列）
【０２７１】
【表８−１】
2008536485.tif 000038
【０２７２】
【表８−２】
2008536485.tif 000039
【０２７３】
【表８−３】
2008536485.tif 000040
【０２７４】
【表８−４】
2008536485.tif 000041
（実施例２Ｄ：最小化したＡ９アプタマーＡＲＣ５９１における操作した変異）
元のＡＲＣ５９１配列に対する変異が、再選択したクローン中のいくつかの部位において、ドープ型プールの合成に使用したヌクレオチド比率に基づいて予想されるより高い頻度で観察された。数種の点変異体を、構築し、そしてこれらの変異に基づいて試験して、再選択したクローンにおけるそれらの発生が選択的結合の利点を与えるそれらの能力に起因するか否かを調べた。
【０２７５】
下に記載した点変異体構築物に関して、そのプリンは、２’−ＯＨを含み、そしてそのピリミジンは、２’−フルオロ改変を含むが、そのテンプレートおよびプライマーは、改変されていないデオキシリボヌクレオチドを含む。
【０２７６】
点変異体アプタマー（配列番号７７）５’−ＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＵＧＡＣＵＵＣＵＡＵＡＣＵＡＡＧＵＣＵＡＣＧＵＵＣＣＵＣＣ−３’のために、５’ＰＣＲプライマー  配列番号９１）５’−ＣＣＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡ−３’および３’ＰＣＲプライマー（配列番号９２）５’−ＧＧＡＧＧＡＡＣＧＴＡＧＡＣＴＴＡＧ−３’を使用して、テンプレート：
【０２７７】
【化１１】
2008536485.tif 000042
を増幅した。
【０２７８】
点変異体アプタマー（配列番号７８）５’−ＧＧＡＧＧＡＣＣＧＧＡＡＡＡＧＡＣＣＵＧＡＣＵＵＣＵＡＵＡＣＵＡＡＧＵＣＵＡＣＧＵＵＣＣＵＣＣ−３’のために、５’ＰＣＲプライマー（配列番号９４）５’−ＣＣＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡ−３’および３’ＰＣＲプライマー（配列番号９５）５’−ＧＧＡＧＧＡＡＣＧＴＡＧＡＣＴＴＡＧ−３’を使用して、テンプレート：
【０２７９】
【化１２】
2008536485.tif 000043
を増幅した。
【０２８０】
点変異体アプタマー（配列番号７９）５’−ＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＣＡＡＧＡＣＣＵＧＡＣＵＵＣＵＡＵＡＣＵＡＡＧＵＣＵＡＣＧＵＵＣＣＵＣＣ−３’のために、５’ＰＣＲプライマー（配列番号９７）５’−ＣＣＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡ−３’および３’ＰＣＲプライマー（配列番号９８）５’−ＧＧＡＧＧＡＡＣＧＴＡＧＡＣＴＴＡＧ−３’を使用して、テンプレート：
【０２８１】
【化１３】
2008536485.tif 000044
を増幅した。
【０２８２】
点変異体アプタマー（配列番号８０）５’−ＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＡＡＧＧＡＣＣＵＧＡＣＵＵＣＵＡＵＡＣＵＡＡＧＵＣＣＡＣＧＵＵＣＣＵＣＣ−３’のために、５’ＰＣＲプライマー（配列番号１００）５’−ＣＣＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡ−３’および３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０１）５’−ＧＧＡＧＧＡＡＣＧＴＧＧＡＣＴＴＡＧ−３’を使用して、テンプレート：
【０２８３】
【化１４】
2008536485.tif 000045
を増幅した。
【０２８４】
点変異体アプタマー（配列番号８１）５’−ＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＵＧＡＣＵＵＣＵＡＵＡＣＵＡＡＧＵＧＵＡＣＧＵＵＣＣＵＣＣ−３’のために、５’ＰＣＲプライマー（配列番号１０３）５’−ＣＣＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡ−３’、および３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０４）５’−ＧＧＡＧＧＡＡＣＧＴＡＧＣＣＴＴＡＧ−３’を使用して、テンプレート：
【０２８５】
【化１５】
2008536485.tif 000046
を増幅した。
【０２８６】
点変異体アプタマー（配列番号８２）５’−ＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＵＧＡＣＵＵＣＵＡＵＡＣＵＡＡＧＧＣＵＡＣＧＵＵＣＣＵＣＣ−３’のために、５’ＰＣＲプライマー（配列番号１０６）５’−ＣＣＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡ−３’、および３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０７）５’−ＧＧＡＧＧＡＡＣＧＴＡＧＣＣＴＴＡＧ−３’を使用して、テンプレート：
【０２８７】
【化１６】
2008536485.tif 000047
を増幅した。
【０２８８】
点変異体アプタマー（配列番号８３）５’−ＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＧＣＣＵＧＡＣＵＵＣＵＡＵＡＣＵＡＡＧＣＣＵＡＣＧＵＵＣＣＵＣＣ−３’のために、５’ＰＣＲプライマー（配列番号１０９）５’−ＣＣＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡ−３’、および３’ＰＣＲプライマー（配列番号１１０）５’−ＧＧＡＧＧＡＡＣＧＴＡＧＧＣＴＴＡＧ−３’を使用して、テンプレート：
【０２８９】
【化１７】
2008536485.tif 000048
を増幅した。
【０２９０】
点変異体アプタマー（配列番号８４）５’−ＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＵＧＡＣＵＵＣＵＧＵＡＣＵＡＡＧＵＣＵＡＣＧＵＵＣＣＵＣＣ−３’のために、５’ＰＣＲプライマー（配列番号１１２）５’−ＣＣＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡ−３’および３’ＰＣＲプライマー（配列番号１１３）５’−ＧＧＡＧＧＡＡＣＧＴＡＧＡＣＴＴＡＧ−３’を使用して、テンプレート：
【０２９１】
【化１８】
2008536485.tif 000049
を増幅した。
【０２９２】
点変異体アプタマー（配列番号８５）５’−ＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＵＧＡＣＵＵＣＵＡＵＡＣＵＡＡＧＵＣＵＡＣＧＵＡＣＣＵＣＣ−３’のために、５’ＰＣＲプライマー（配列番号１１５）５’−ＣＣＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡ−３’および３’ＰＣＲプライマー（配列番号１１６）５’−ＧＧＡＧＧＴＡＣＧＴＡＧＡＣＴＴＡＧ−３’を使用して、テンプレート：
【０２９３】
【化１９】
2008536485.tif 000050
を増幅した。
【０２９４】
点変異体アプタマー（配列番号８６）５’−ＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＵＧＡＣＵＵＣＵＡＵＡＣＵＡＡＧＵＣＵＡＣＧＵＵＡＣＵＣＣ−３’のために、５’ＰＣＲプライマー（配列番号１１８）５’−ＣＣＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡ−３’および３’ＰＣＲプライマー（配列番号１１９）５’−ＧＧＡＧＴＡＡＣＧＴＡＧＡＣＴＴＡＧ−３’を使用して、テンプレート：
【０２９５】
【化２０】
2008536485.tif 000051
を増幅した。
【０２９６】
これらの点変異体構築物を、ＰＳＭＡ  ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性の阻害に関する活性について評価した。上記ＮＡＡＬＡＤａｓｅアッセイを、９６ウェル形式で行った。ＰＳＭＡアプタマーを、試験される標準的な９６ウェルプレートにおいて、３０ｐＭ〜１μＭの範囲の最終濃度にて１×反応緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭ  ＺｎＳＯ４、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）に連続的に希釈した。酵素を、３０μＬの１００ｎＭ  ＰＳＭＡを８ｍＬの反応緩衝液中に希釈することによって調製し、そして氷上で冷却し続けた。基質を、１９μｌのＮＡＡＧ［グルタメート−３，４−３Ｈ］（５０．８Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１９．７μＭ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ、ＮＥＴ１０８２）を２．２ｍＬの反応緩衝液に添加することによって調製した。
【０２９７】
全ての試薬の調製後、４μｌの連続的に希釈した各アプタマーを、別個の９６ウェルプレート（反応プレート）に添加した。７６μｌの希釈した酵素を、アプタマーを含む対応するウェルに添加した。８０μｌの反応緩衝液を、バックグラウンドコントロールとして機能するようにウェルのうちの１つのカラムに添加した。次いで希釈した基質および反応プレートを、３７℃の部屋に移し、そして１０分間にわたって平衡化させた。温度を平衡にした後、２０μｌの調製した基質を、１ウェルあたり１００μｌの最終容量、ならびに１ウェルあたり０．３ｎＭの酵素最終濃度および３０ｎＭの基質最終濃度になるように、１２チャンネルピペットを使用して各ウェルに添加した。酵素および基質のみを含むウェルのカラムを、高いコントロール（ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用した。そのアプタマー／酵素／基質反応を、３７℃にて１５分間インキュベートし、そして１００μｌのクエンチ緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）の添加によって停止させた。
【０２９８】
切断産物、ＮＡＡＧおよびグルタメートを上記基質から分離するために、ＡＧ  １−Ｘ８（２００〜４００メッシュ）ホルメート樹脂（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、＃１４０−１４５４）を、使用した。その樹脂を、Ｈ２Ｏ中で１：１スラリーを形成することにって調製し、そしてＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ、１．２μｍフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、＃  ＭＡＢＶＮ１２５０））を使用して９６ウェルあたり１４０μｌで添加した。そのフィルタープレートを、その樹脂を固める（ｐａｃｋ）（７０μｌの樹脂床を形成する）ためおよびその後の溶出のために２０００ｒｐｍにて２分間遠心分離した。１００μｌの反応を、その樹脂カラムに添加し、遠心分離し、そしてそのフロースルーを、収集し、そして遠心分離用整列フレーム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃  ＭＡＣＦ０９６０４）を使用してフィルタープレートと組み立てた標準的な９６ウェルプレートを捕獲プレートとして使用して廃棄した。そのカラムを、５０μｌのＨ２Ｏによって２回洗浄し、そしてフロースルーを、捕獲プレートに収集し、そして廃棄した。次いでそのカラムを、５０μｌの１Ｍホルメート（ｐＨ１．８）によって３回洗浄した。ホルメートによる各洗浄に関して、溶出液を、収集し、そして捕獲プレートに保存した。次いで、５０μｌの上記収集した溶出液を、Ｄｅｅｐｗｅｌｌ  Ｌｕｍａプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）に移し、そして中程度の加熱（ｍｅｄｉｕｍ  ｈｅａｔ）において１時間の高速真空遠心分離を使用して徹底的に乾燥した。そのプレートを、密封し、そしてＰａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して読み取った。作製したそれぞれの点変異体構築物の位置の変異、およびＮＡＡＬＡＤａｓｅアッセイにおけるそれぞれについての各ＩＣ５０を比較する表を、図１０に示す。
【０２９９】
これらの実験を通して、ＰＳＭＡに対するアプタマーの見かけの親和性をわずかに改善する元の配列に対する３種の塩基の変化を、同定した。ＣによるＡリッチバルジ中の位置Ａ１２の置換（再選択したクローンのうちの１３％において観察された）は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ  ＩＣ５０を約２０％改善した。同様の改善が、共変動するＡ１６：Ｕ３５塩基対をＧ：Ｃ対形成によって置換した場合に観察された。これらの変異の３種全てを有する複合性の分子を、産生し、それは、ＡＲＣ１１１３（配列番号８８）として公知である。
【０３００】
驚くべきことに、多くの統計的に好ましい変異は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ阻害活性に対して効果を有さないか、またはネガティブな効果を有するかのいずれかであった。その変異が、ドープ型プールの状況（すなわち、そのアプタマーが、機能性ドメインの適切な折り畳みに影響し得る長いプライマー配列によって隣接される場合）において独特に好まれる可能性がある。あるいは、その変異は、（例えば、会合／解離の動態を遅くすることによって）ＰＳＭＡに対するその固有の親和性を変えることなく、好ましい濃縮選択に対する結合特性に影響し得る。
【０３０１】
表９は、全ての生成した点変異体構築物についての配列を列挙する。全ての配列は、５’〜３’方向で列挙され、そして特に示さない限り、全てのプリンは、２’−ＯＨであり、そして全てのピリミジンは、２’−フルオロ改変を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、下で表９に記載したような核酸配列を有するアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、下で表９に記載したアプタマーの核酸配列は、さらに、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）に対する化学的カップリング、および／または結合体化を容易にするために３’キャップ（例えば、逆位ｄＴキャップ）および／または５’アミン（ＮＨ２）改変を含む。他の実施形態において、表９に記載した核酸配列は、化学的カップリングを容易にするために、示した３’キャップ（例えば、逆位ｄＴキャップ（３Ｔ））および／または５’アミン（ＮＨ２）改変を欠く。
【０３０２】
ＡＲＣ８３４（配列番号８７）、ＡＲＣ１１１３（配列番号８８）、ＡＲＣ２０３５（配列番号８９）およびＡＲＣ２０３６（配列番号９０）においてＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵに先行する小文字「ｍ」および「ｆ」は、それぞれ、２’−Ｏ−メチル置換および２’−フルオロ置換を示す。
【０３０３】
（表９：点変異体構築物の配列）
【０３０４】
【表９】
2008536485.tif 000052
（実施例２Ｅ：Ａ９アプタマーにおける操作した骨格改変）
安定性および製造可能性を改善するために、個別に２’−Ｏ−メチル改変を含む構築物およびＡＲＣ５９１の位置のブロック（塊）を含む構築物を、化学的に合成し、そしてＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性のアプタマー阻害に対するそれらの影響について、先に記載したアッセイにおいて評価した。生成した種々の構築物（ＡＲＣ８３４〜ＡＲＣ８３９、およびＡＲＣ９４１〜ＡＲＣ９４４）についての位置的なブロックの置換を比較する表を、ＮＡＡＬＡＤａｓｅアッセイにおけるそれぞれについて各ＩＣ５０と一緒に、図１１に示す。これらの構築物についての配列を、下で表１０に列挙する。まとめると、らせん状ステム中のリボヌクレオチドおよび２’−フルオロヌクレオチドの両方の大多数は、先に記載したＮＡＡＬＡＤａｓｅ阻害アッセイを使用して測定される機能的活性を損なうことなく２’−Ｏ−メチルヌクレオチドによって置換され得た。
【０３０５】
さらに、ＡＲＣ１１１３の最適化（上に記載されるような３種の塩基改変を有するＡＲＣ５９１）の３つの段階を通して、保存されたヘアピンループおよびＡリッチバルジ中のヌクレオチドの顕著な分画が２’−Ｏ−メチル改変、２’−デオキシ改変、または２’−デオキシホスホロチオエート改変によって置換され得ることが、さらに見出された。ＡＲＣ１１１３の第１段階の最適化において、ＡＲＣ５９１の最適化からの良好な許容性が見出されたブロック２’−Ｏ−メチル改変をＡＲＣ１１１３に対するさらなる単一の２’−Ｏ−メチル改変と組み合わせて、ＡＲＣ１５０８〜ＡＲＣ１５１７を産生した。第２段階において、第１段階から良好に許容されたさらなる２’−Ｏ−メチル改変を２’−デオキシ改変と組み合わせて、ＡＲＣ１５７４〜ＡＲＣ１５８６を産生した。
【０３０６】
第３段階の最適化において、最初の２つの段階からの２’−Ｏ−メチル改変、２’−デオキシ改変を２’−デオキシホスホロチオエート改変と組み合わせて、ＡＲＣ１７２１〜ＡＲＣ１７２２を産生した。最適化のこの第３段階から、アプタマーを同定した（ＡＲＣ１７２５）。ＡＲＣ１７２５は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ阻害アッセイにおいて評価したところ、改変されていないＡＲＣ５９１と比較して完全な活性を維持した。最適化の全３種の段階の間に産生された各構築物についての位置的な骨格改変、およびＮＡＡＬＡＤａｓｅアッセイにおけるそれぞれについての対応するＩＣ５０を比較する表を、図１１に要約した。これらの構築物についての配列を、下で表１０に列挙する。
【０３０７】
各構築物の血漿安定性を、０時間、１時間、３時間、１０時間、３０時間、および１００時間にわたる血漿安定性の時間経過アッセイを使用して測定した。反応を、１×ＰＢＳを用いて総容量にした、９５％ヒト血漿（１時点あたり２０μｌ）、適切な濃度のアプタマー（最も高い予想投与レベル（ＣＭａｘ）によって決定した）、およびその反応の１：１０希釈が１０００ｃｐｍを上回るような十分量のスパイクした５’末端標識アプタマーを使用して、エッペンドルフチューブ中の試験した各アプタマーに対して設定した。反応を構築するときに、その血漿を、最後に添加し、そしてその反応を、直ぐに３７℃のヒートブロックに添加した。血漿の代わりに１×ＰＢＳを含む試験した各アプタマーを、０時間の時点として使用した。それぞれの指定した時点において、２０μｌを、各反応から引き出し、そして２００μｌのホルムアミド添加（ｌｏａｄｉｎｇ）色素を含む適切に標識したエッペンドルフチューブに添加し、そしてそれを、直ちに液体窒素中で急速冷凍し、そして約−２０℃に保存した。全てのサンプルを収集した後、２０μｌの各血漿サンプル／添加色素を、別個のチューブに等分し、そして２μｌの１％  ＳＤＳを、各チューブに添加した（０．１％の最終ＳＤＳ濃度）。０．１％  ＳＤＳを含むサンプルを、９０℃にて１０〜１５分間加熱した。次いで、それぞれの加熱したサンプルの１５μｌを、１５％  ＰＡＧＥゲルにロードし、各アプタマーの時間経過の間に空のレーンをおいた。そのＰＡＧＥゲルを、そのゲル上の標識した物質の全てを保つように１２Ｗにて３５分間電気泳動した。そのゲルを電気泳動し終わったとき、そのゲルを、ホスホイメージングスクリーニングに曝し、そしてＳｔｏｒｍ８６０ホスホイメージング機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）上でスキャンした。
【０３０８】
各時点について残存する親アプタマーの％を、親アプタマーのバンドを定量し、そしてそのレーンにおける総カウント数で除算することによって決定した。この値を、各時点について、０時間の時点の親アプタマーの％に対して正規化した。その正規化した％値を、時間の測定としてグラフにし、そしてそのデータを、以下の方程式に当てはめた：ｍ１＊ｅ＾（−ｍ２＊ｍ０）；ｍ１は、親アプタマーの最大％（ｍ１＝１００）であり；そしてｍ２は、分解の速度である。そのアプタマーの半減期（Ｔ１／２）は、（ｌｎ２）／ｍ２に等しい。
【０３０９】
第１段階〜第３段階の改変を組み合わせて、ＡＲＣ１７２５を産生した。ＡＲＣ１１１３は、完全に安定化したらせん状ステムおよび３’キャップ（３’−ｉｄＴ）を有するＡＲＣ５９１に基づくリボ含有アプタマーである。ＡＲＣ１７２５は、ＡＲＣ５９１に基づくリボを含まないバージョンであり、ここでリボは、ＤＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅ、およびホスホロチオエートによって合成的に置換されている。驚くべきことに、完全にリボを含まない分子は、このアッセイにおいて親ＡＲＣ１１１３と比較して有意に改善した安定性を有さない（１１時間対２０時間）。
【０３１０】
表１０は、産生された最適化した構築物の全てについての配列を列挙する。特に示さない限り、表１０に列挙した核酸配列は、５’から３’の方向であり、そして全てのヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵに先行する小文字「ｍ」および「ｆ」が、それぞれ、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドおよび２’−フルオロ改変ヌクレオチドを指す場合を除いて、２’−ＯＨである。いくつかの実施形態において、本発明は、下で表１０に記載したような核酸配列を有するアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、下で表１０に記載したアプタマーの核酸配列は、さらに、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）に対する化学的カップリング、および／または結合体化を容易にするために３’キャップ（例えば、逆位ｄＴキャップ（３Ｔ））および／または５’アミン（ＮＨ２）改変を含む。他の実施形態において、表１０に記載した核酸配列は、化学的カップリングを容易にするために、示した３’キャップ（例えば、逆位ｄＴキャップ）および／または５’アミン（ＮＨ２）改変を欠く。
【０３１１】
（表１０：ＡＲＣ５９１およびＡＲＣ１１１３に対する骨格改変由来の最適化した配列）
【０３１２】
【表１０−１】
2008536485.tif 000053
【０３１３】
【表１０−２】
2008536485.tif 000054
【０３１４】
【表１０−３】
2008536485.tif 000055
（実施例３：アプタマー−毒素結合体）
（実施例３Ａ：アプタマーが結合体化可能な低分子毒素の合成）
ＰＳＭＡに対するアプタマーを、ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞を標的とした殺傷（実施例４に記載した）を可能にするために活性化した強力な細胞毒素によって改変した。初期の研究は、リボヌクレオチドで終結したアプタマーの３’末端に対するビンブラスチンヒドラジドの結合体化に集中した。その後の実験は、アプタマーに対するＤＭ１（活性化メイタンシノイド）の、固相合成の間に導入した５’−アミンを介する結合に集中した。
【０３１５】
材料および方法。アプタマー−細胞毒結合体の試験を容易にするために、ビンブラスチン（ビンブラスチンヒドラジド）の結合体化可能形態およびメイタンシン（ＤＭ１−ＳＰＰ）の結合体化可能形態を、市販の前駆物質から調製した。化学物質を、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ  Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｍｏｒｒｉｓｔｏｗｎ、ＮＪ）から購入し、そしてさらなる精製を伴わずに供給業者から使用した。低分子を、適切な重水素化溶媒中で４００ＭＨｚの１Ｈ  ＮＭＲによって分析した。低分子を、順相シリカ用いてＢｉｏｔａｇｅ  Ｈｏｒｉｚｏｎシステム（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ）に適した精製を行った。反応を、ＴＬＣあるいはＲＰ−ＨＰＬＣ（１００ｍＭ  ＴＥＡＡ緩衝液Ａ、アセトニトリル緩衝液Ｂ）またはＳＡＸ−ＨＰＬＣ（２５ｍＭホスフェート、２５％アセトニトリル緩衝液ＡおよびＢ、１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液Ｂ）のいずれかによってモニタリングした。全てについて、ＲＰ−ＨＰＬＣ  ＴＳＫゲルＯｌｉｇｏＤＮＡ−ＲＰカラムを使用した（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）。合成したアプタマーを、ＳＡＸ−ＨＰＬＣカラム：ＤＮＡ−ＰＡＣ１００（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して分析し、そしてＲｅｓｏｕｒｃｅカラム（ＡＢＩ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）上で精製した。
【０３１６】
ビンブラスチンヒドラジドの調製。ブンブラスチンヒドラジドを、生成物を１：１の酢酸エチル：メタノールにおいて短いクロマトグラフィーカラムで精製したことを除いて、図１２に概略的に示したようなＢｒａｄｙら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２、４５、４７０６−４７１５の方法に従って調製した。
【０３１７】
簡単にいうと、硫酸ビンブラスチン（１００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪ）を、１：１のヒドラジン：エタノール（４ｍＬ）に懸濁し、そして密封したフラスコにおいて２２時間にわたって加熱した６５℃に加熱した。薄層クロマトグラフィー（「ＴＬＣ」）は、出発物質が完全に消費されたことを示した。次いでその反応混合物を、氷で冷却し、そしてジクロロメタン（「ＤＣＭ」）によって希釈した。次いでその溶液を、水によって希釈し、そしてその層を、分離した。その有機層を、水、飽和炭酸ナトリウム、およびブラインによって洗浄した。その有機層を、エバポレートし、次いで２：１のトルエン：エタノールと共沸した。粗生成物を、短いシリカカラム上でフラッシュし、１：１の酢酸エチル：メタノールを用いて溶出させて、化合物１を得た（図１８）（０．０７３グラム（８７％））。
【０３１８】
ＤＭ１の調製．ＤＭ１を、図１３において概略的に示した通りに調製した。簡単にいうと、メイタンシノールを、Ｋｕｐｃｈａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９７８、２１、３１−３７の方法によって調製した。次いでメイタンシノールを、カルボン酸３にカップリングした。次いでジスルフィドの還元および４−（２ピリジルジチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）を用いた再酸化を行って、ＤＭ１を得た。
【０３１９】
図１３に示した合成の工程「ａ」に関して、６個の５ｍｇ重量部のアンサミトシンＰ３（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、合わせ、そしてトルエンと３回共沸した。次いでアンサミトシンＰ３を、ＴＨＦに溶解し、そして氷で０℃に冷却した。水素化アルミニウムリチウム（「ＬＡＨ」）を、を少しずつ添加しながら、その反応を、ＴＬＣによってモニタリングした。合計で２〜３ｍｇのＬＡＨを、３時間かけて添加し、その時点において、その反応を１％硫酸を用いてクエンチした。その反応混合物を、酢酸エチルによって希釈し、分液漏斗に移し、そしてその層を、分離した。その有機層を、水およびブラインによって洗浄し、そして白色固形物になるまで濃縮し、その白色固形物を、カラムクロマトグラフィーによってＤＣＭにおいて精製して別の白色固形物（メイタンシノール、２０ｍｇ（６５％））を得た。
【０３２０】
図１３に示した合成の工程「ｂ」に関して、メイタンシノール（２０ｍｇ）を、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）によって希釈し、そして酸３（下および図２１に記載した通りに調製した）を、０．５ｍＬのＤＣＭに添加した。均一な混合物に、エーテル中のジシクロヘキシル−カルボ−ジイミド（「ＤＣＣ」）および２５μＬの１Ｍ  ＺｎＣｌ２を添加した。その反応混合物（ここで、不均一である）を、アルゴン下で一晩撹拌した。その反応混合物を、ＤＣＭおよび水（各１ｍＬ）によって希釈し、そして分液漏斗に移した。その層を、分離し、そしてその有機層を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして濃縮して黄色薄膜を生成し、その薄膜を、さらに操作することなく使用して化合物４を得た。
【０３２１】
図１３に示した合成の工程「ｃ」に関して、化合物４を、１：１の酢酸エチル：メタノールに溶解し、そして１０倍過剰のジチオスレイトール（「ＤＴＴ」）によって処理した。１時間後、その反応混合物を、水によってクエンチし、そして酢酸エチルをも用いて抽出した。エバポレーションによって、黄色固形物を得た。再びその黄色固形物を、さらに精製することなく使用して、３工程を通して０．０２７ｇ（６０％）の化合物５を得た。
【０３２２】
図１３に示した合成の工程「ｄ」に関して、化合物５を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびメタノール（各０．５ｍＬ）においてＳＰＰ（下および図１４に記載した通りに調製した）（３当量）によって室温にて３時間にわたって処理した。濃縮および小さいシリカパッドにおける精製は、０．０３５ｇ（７７％）収量のＤＭ１を与えた。
【０３２３】
ＳＰＰの調製。上および図１３に記載したＤＭ１合成において使用したＳＰＰを、図１４に示したように、Ｃａｉｉｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７８、１７３、７２３−７３７によって合成した。簡単にいうと、１，３−ジブロモブタン（１５ｇ、０．０６９ｍｏｌ）を、ＤＭＳＯに溶解した。ＮａＣＮ（３．７５ｇ、０．０７６ｍｏｌ）を、８ｍＬの水に溶解し、そして１ｍＬを、直ちに添加した。シアニド溶液の残部を、０．５時間にわたって添加した。次いでその反応混合物を、一晩わたって撹拌した。その反応混合物を、７０ｍＬの水によって希釈し、そしてその水性混合物を、１２５ｍＬの１：１のヘプタン：酢酸エチルによって２回抽出した。次いで合わせた有機層を、７０ｍＬの水および７０ｍＬのブラインによって洗浄した。その有機層を、濃縮し、そして２１ｍＬのエタノールに溶解した。チオ尿素（６．６４ｇ、０．０８７ｍｏｌ）を、２１ｍＬの水と一緒に加え、そしてその均一な反応混合物を加熱して、４時間にわたって還流した。この時点において、５０ｍＬの１０Ｍ  ＮａＯＨ溶液を、添加し、そしてその反応混合物を加熱して、一晩還流した。その反応混合物を、室温に冷却し、そして５０ｍＬ  ＥｔＯＡｃによって希釈した。そのＥｔＯＡｃを、分離し、そしてその有機層を、ＥｔＯＡｃの別の重量部によって洗浄した。合わせた有機層を、合わせ、そして濃縮してわずかに黄色の液体を得た（６．４８ｇ、７０％）。２，２’−ジチオピリジン（２５ｇ）を、エタノール（１００ｍＬ）および酢酸（４．２ｍＬ）に溶解した。そのチオール−酸を、１５分間にわたって添加し、そしてその反応を、室温にて２時間撹拌した。その反応を濃縮して溶液を得た。その溶液を、３：１のトルエン：ＥｔＯＡｃ〜１：３のトルエン：ＥｔＯＡｃを用いて溶出させるＢｉｏｔａｇｅ  ４０Ｍカートリッジで精製して、白色固形物（ＳＰＰ、１３ｇ（７９％））を得た。
【０３２４】
カルボン酸３の調製。上および図１３に記載したＤＭ１合成において使用したカルボン酸３を、図１５に示すように合成した。簡単にいうと、３−メルカプトプロパン酸（Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏａｐｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（５ｇ、０．０４７ｍｏｌ）を、水（１５０ｍＬ）に溶解し、そしてメチルメタンチオスルホネート（６．５４ｇ、０．０５２ｍｏｌ）を、エタノール（７５ｍＬ）において添加した。その均一な反応混合物を、一晩撹拌した。次いでその反応混合物を、４００ｍＬのブラインによって希釈し、そして２００ｍＬのＥｔＯＡｃによって２回抽出した。合わせた有機層を、１５０ｍＬのブラインによって洗浄し、次いで濃縮して、さらなる操作を行うことなくその酸を得た。
【０３２５】
上記酸（２ｇ、０．０１３ｍｏｌ）を、ＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解した。ＴＥＡ（１．８ｍＬ）を添加し、そしてその溶液を、アルゴン下で−１５℃に冷却した。クロロ蟻酸イソブチル（１．６５ｍＬ、０．０１３ｍｏｌ）を、２重量部で添加し、そしてその反応混合物を、−１５℃にて１５分間撹拌した。Ｎ−メチル−ＤＬ−アラニン（ａｎａｌｉｎｅ）（１．３４ｇ、０．０１３ｇ）を３．６ｍＬのＴＥＡおよび２０ｍＬの水において添加した。不均一なその反応混合物を、１時間にわたって室温に温め、そして一晩撹拌した。その反応を、５０ｍＬの水によって希釈し、そして１Ｍ  ＨＣｌを用いてｐＨ６に酸性化した。その溶液を、１２５ｍＬのＥｔＯＡｃによって抽出し、そして濃縮して酸３（図１５、０．６１ｇ（２０％））を得た。
【０３２６】
アプタマーの調製。全てのアプタマーを、市販のホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ  ｏｒ  ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）および逆位デオキシチミジンＣＰＧ支持体またはリボグアノシンＣＰＧ支持体を使用した標準的なプロトコル（Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．編、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  １９９３）に従ってＡＫＴＡ  ＤＮＡ合成機（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）における固相化学によって合成した。示される場合、末端アミン官能基（「ＮＨ２」と示される）を、５’アミノ改変因子である６−（トリフルオロアセチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト（Ｃ６−ＴＦＡ）（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ  ｏｒ  ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）と結合させた。脱保護の後、全てのアプタマーを、使用前にＨＰＬＣ精製し、そしてエタノール沈殿した。アプタマー毒素結合体を、以下のアプタマー（全て５’から３’の方向で示した）を使用して首尾よく作製し、小文字「ｍ」、「ｆ」、および「ｄ」は、それぞれ、２’−Ｏ−メチル置換、２’−フルオロ置換、および２’−デオキシ置換を示し、そして全ての他のヌクレオチドは、２’−ＯＨであり；３Ｔは、逆位３’デオキシチミジンを示し；そして５’−アミン（ＮＨ２）は、毒素に対する化学的カップリングを容易にする。
【０３２７】
【化２１】
2008536485.tif 000056
ビンブラスチン結合体の調製。３’末端リボース残基を含むアプタマー（例えば、ＡＲＣ１０２６、８５ナノモル）を、水（２５０μＬ）中で５０当量のＮａＩＯ４を用いて１．５時間にわたって暗所にて酸化して、化合物２を得た（図１２）。熟成期間の後、その反応混合物を、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）またはＧ２５カラム（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に通し、そして１．５当量のビンブラスチンヒドラジドを、添加した。その反応を、４時間インキュベートし、次いでＣｅｎｔｒｉｃｏｌｕｍｎ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）に通して５２モルのＡＲＣ１０２６ビンブラスチンヒドラジド結合体（化合物３  図１２）を得た。結合体を、さらに操作することなく細胞殺傷アッセイにおいて使用した。．
得られたビンブラスチンアプタマー結合体は、以下の構造を含む。
【０３２８】
【化２２】
2008536485.tif 000057
ＤＭ１結合体の調製。５’アミンで終結したアプタマーとＤＭ１との細胞傷害性結合体を、以下の方法に従って合成した：ＡＲＣ１１１３を、例えば、リン酸緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２１）およびアセトニトリルにおいてＤＭ１と混合し、その反応を、ＨＰＬＣによってモニタリングし、そして代表的に、過剰のＤＭ１を、添加した（２〜４当量）。その反応を、アプタマー濃度が開始濃度の１０％未満になるまで進行させ、そして残りの結合体化していない毒素を、ＣｅｎｔｒｉｃｏｌｕｍｎまたはＧ２５カラムによって除去した。収率は、そのアプタマーに基づいて７０％〜９０％で変動した。
【０３２９】
得られたＤＭ１結合体は、以下の構造を含む：
【０３３０】
【化２３】
2008536485.tif 000058
（実施例３Ｂ：代替的なアプタマー−毒素結合体）
低分子細胞傷害性薬剤の腫瘍細胞を標的とした送達を媒介することに加えて、代替的な結合体化方法は、腫瘍細胞の殺傷を同様に誘導し得る種々の他の毒性ペイロードの結合を可能にする。有望な代替物としては、放射性同位体、タンパク質毒素、および封入された細胞毒素が挙げられる。
【０３３１】
数種の異なる放射性同位体（イットリウム−９０、インジウム−１１１、ヨウ素−１３１、ルテチウム−１７７、銅−６７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、およびアクチニウム−２２５が挙げられる）が、腫瘍細胞を標的とする殺傷をもたらすために使用され得る。これらの同位体は、特定の放射性金属の化学的特性に依存して、種々の異なる方法でアプタマーに結合体化され得る。例えば、ヨウ素−１３１は、キャリア分子に共有結合で組み込まれ得、そのキャリア分子が、その後の活性化によって、アプタマー上の５’−アミンに結合され得る。ヨウ素化のための適切なキャリア分子としては、（ｐ−ヨードフェニル）エチルアミンおよびＮ−スクシニミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ  ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｋｕｒｔｌｉら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．３６：１２５５）が挙げられる。
【０３３２】
あるいは、多くの他の放射性金属（９０Ｙおよび１１１Ｉｎが挙げられる）は、上記アプタマーに共有結合するキレート剤に結合され得る。適切なキレート剤としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、メルカプトアセチルグリシン（ＭＡＧ３）、およびヒドラジノニコチンアミノ（ＨＹＭＣ）の結合体化可能な形態が挙げられる。結合は、これらのキレート剤のアミン反応性形態（例えば、ＤＴＰＡ−ＩＴＣ、ＤＴＰＡのイソチオシアネート形態）を調製し、それらを５’−アミン改変アプタマーと、適切な反応条件化で合わせることによって与えられ得る。
【０３３３】
タンパク質毒素は、代表的に、著しく高い効力を示し、いくつかの場合において、標的細胞を殺傷するのに、単一分子で足りる程少ない分子を必要とする。多くのこれらの毒素は、標的性／細胞の取り込みおよび細胞の殺傷を担う分割可能なドメインを有する二部構成の分子として構成される。細胞の殺傷を担う実体を同定し、そして標的性／取り込みの機能性をアプタマーによって有効に置換することによって、強力な腫瘍特異的細胞毒性薬剤が、もたらされ得る。腫瘍細胞特異的アプタマーに対する結合体化に適した毒素としては、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニン、およびシュードモナス属体外毒Ａが挙げられる。タンパク質毒素は、ホモ二官能性アミン反応性の架橋剤（例えば、ＤＳＳ（ジスクシニミジル基質）、ＤＳＧ（ジスクシニミジルグルタメート）、またはＢＳ３（ビス［スルホスクシニミジル］基質））を使用し、自由なリジンを介して５’−アミン改変アプタマーに結合体化され得る。あるいは、システイン含有毒素は、ヘテロ二官能性架橋剤（例えば、ＳＭＰＴ（４−スクシニミジルオキシカルボニル−メチル−ａ−［２−ピリジルジチオ］トルエン）またはＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）を使用して、アミン含有アプタマーに結合体化され得る。
【０３３４】
従来の細胞毒性薬剤は、それらの生体分布特性および薬物動態特性、都合のよい低下した細胞傷害性ならびに腫瘍細胞における滞留の増大を好ましく変化させるために、ナノ粒子形態（例えば、リポソーム、デンドリマー、またはくし型ポリマー）中に有効に封入され得る。標的する因子（例えば、腫瘍抗原に対して高度に特異的なアプタマー）の付加は、これらの細胞傷害性ナノ粒子の送達をさらに最適化することを可能にする。リポソームの表面をアプタマーによってコートするための方法は、先に記載されており、そしてその方法は、アプタマーの５’末端に対する脂肪親和性部分（例えば、ジアシルグリセロール）の共有結合を含む。同様に、ＰＥＧおよびＰＬＧＡから構成されるポリマー性ナノ粒子は、先に記載されるような３’末端改変（Ｆａｈｒｏｋｚａｈｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４）６４：７６６８−７６７２）を介したアプタマーの結合を可能にするために改変され得る。
【０３３５】
（実施例３Ｃ：診断剤としての放射標識された抗ＰＳＭＡアプタマー）
その治療適用に加えて、適切に改変された抗ＰＳＭＡアプタマーは、前立腺癌の検出、病期分類、および処置の管理のための診断剤として使用され得る。先に記載したような金属錯化剤に対するアプタマーの結合体化は、γ線を放出する放射性同位体（例えば、９９Ｔｃおよび１１１Ｉｎ）による標識化を可能にする。患者に投与された標識されたアプタマーは、ＰＳＭＡ発現の部位（原発腫瘍および転移腫瘍を含む）に標的特異的様式で局在する。ＰＥＧ化されていないアプタマーは、それらが特定の標的結合によって隔離されない限り、腎排泄によって迅速に排除される。そのようなものとして、腫瘍：血液の大きい比は、患者への造影剤の投与後に数時間以内で画像化することを可能にすることを迅速に発生する。局在した放射性金属は、腫瘍への取り込みを定量するためにγ線カメラを使用して直接的に画像化され得る。長期間にわたる首尾よい画像化は、疾患の進行をモニタリングすること、および処置の選択肢を導くことを可能にする。
【０３３６】
（実施例４：機能的細胞アッセイ）
上で実施例３に記載したように調製したＰＳＭＡアプタマー−ビンブラスチン結合体を、ＬＮＣａＰ細胞のＰＳＭＡ標的性の殺傷についてインビトロで試験した。ＬＮＣａＰ細胞生存率に対する効果を、下に記載したＢｒｄＵ（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の化学発光検出に基づいた細胞増殖アッセイにおいて評価したＰＣ−３細胞を、コントロール細胞株として使用した。
【０３３７】
方法。ＬＮＣａＰ細胞およびＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１０％  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）において培養した。ＬＮＣａＰ（ＰＳＭＡ＋）細胞またはＰＣ３（ＰＳＭＡ−）細胞が増殖する１５ｃｍプレートから培地を、吸引し、次いで細胞を、１０ｍＬの１×ＰＢＳによって洗浄した。細胞を、３７℃にて３０秒間トリプシン処理した。トリプシン処理の後、８ｍＬの１０％  ＦＢＳ培地を使用して、トリプシンをクエンチした。細胞を、１０００ｒｐｍで３．３０分遠沈した。遠沈後、その培地を、吸引し、そしてその細胞ペレットを、１０ｍＬ完全培地によって再懸濁した。その細胞密度を、１ｍＬあたり２００，０００個の細胞に調整した。１ウェルあたり５０μｌの細胞を、コラーゲンでコートした黒色の９６ウェルプレートに添加した（１ウェルあたり１０，０００個の細胞）。細胞を、５％  ＣＯ２中で３７℃にて２４時間インキュベートして、適切に付着させた。２５μｌの培地を一晩インキュベートした後、アプタマーまたは抗体を、ウェルにおける最終容量が１００μｌであるように各ウェルに添加し、そして５％  ＣＯ２中で３７℃にて指定した時間の長さにわたってインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、完全培地によって３回洗浄し、そして５％  ＣＯ２中で３７℃にて４８時間さらにインキュベートした。２日後、２０μｌのＢｒｄＵ標的化試薬（１００Ｘ）を、２ｍＬの完全培地と混合する。１０μｌのＢｒｄＵ標的化試薬混合物を、各ウェルに添加し、そしてその細胞を、ＢｒｄＵと一緒に３７℃にて５％  ＣＯ２中で２．５時間インキュベートした。インキュベーション後、その培地を除去し、そしてそのアッセイを、製造業者のプロトコルに従って完了した：２００μｌ／ウェルのＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を、各ウェルに添加し、そしてＲＴにて３０分間インキュベートした。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を除去した後、１００μｌの抗ＢｒｄＵ  ＰＯＤ  Ｆａｂフラグメント溶液（ルミノール／４−ヨードフェノール）を、各ウェルに添加し、そしてＲＴにて９０分間インキュベートした。インキュベーション後、抗ＢｒｄＵ  ＰＯＤ溶液を、除去し、そしてプレートを、ＲＴで５分間インキュベートしながら２００μｌ／ウェルの洗浄溶液で３回洗浄した。１００μｌの基質溶液を、各ウェルに添加し、そして細胞を、３分間にわたりＲＴにて暗所でインキュベートした。そのプレートを、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ上で１秒カウント（ｓｅｃ  ｃｏｕｎｔ）を用いた発光プログラムを使用して読み取った。
【０３３８】
ゲニステイン（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）を、細胞傷害性アッセイのためのポジティブコントロールとして使用し、そしてゲニステインは、２５μＭ用量における部分的な阻害および１５０μＭにおける完全な細胞の殺傷を一貫して示した。
【０３３９】
図１６は、ＡＲＣ１１４２のビンブラスチン結合体（図においてＧ２−ｖｉｎと称される）、ＡＲＣ１０２６のビンブラスチン結合体（図においてＡ９−ｖｉｎと称される）、ＡＲＣ７２５のネガティブコントロールビンブラスチン結合体（図においてコントロールアプタマー−ｖｉｎと称される）、ＡＲＣ９５５（図においてＧ２と称される）またはＡＲＣ９４２（図においてＡ９と称される）によって処理したＬＮＣａＰ細胞の％細胞生存率を示す。ＰＳＭＡに特異的な機能性の非毒素結合体化アプタマー（ＡＲＣ９５５およびＡＲＣ９４２）は、あらゆる濃度にて細胞生存率に対して固有の効果を有さないことが、このアッセイにおいて示された。ＡＲＣ１１４２と同様のヌクレオチド組成を有するが、固有のＰＳＭＡ結合を有さない任意のオリゴヌクレオチド配列（ＡＲＣ７２５）のビンブラスチン結合体は、同様に、全濃度範囲にわたって細胞の殺傷を示すことができなかった。機能性ＰＳＭＡアプタマーであるＡＲＣ１１４２およびＡＲＣ１０２６のビンブラスチン結合体の両方は、一方で、中程度〜低い濃度（１０〜５００ｎＭ）にて完全な細胞の殺傷を誘導でき、ＡＲＣ９５５（Ｇ２）誘導体は、ＡＲＣ９４２（Ａ９）誘導体よりも３０倍良好な効力を示した。機能性ＰＳＭＡアプタマーであるＡＲＣ１１４２およびＡＲＣ１０２６のビンブラスチン結合体の両方は、非ＰＳＭＡ発現ＰＣ−３細胞の細胞生存に対して細胞傷害効果をほとんどかまたは全く示さなかった（データ示さず）。
【０３４０】
ここで、本発明は、書面による説明および例によって記載され、当業者は、本発明が種々の実施形態において実施され得ること、および上記の説明および例が例示を目的とし、かつ添付の特許請求の範囲を限定するものでないはことを認識する。
【図面の簡単な説明】
【０３４１】
【図１】図１は、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロアプタマー選択（ＳＥＬＥＸＴＭ）プロセスの概略図である。
【図２】図２は、４０ｋＤａの分枝状ＰＥＧの例示である。
【図３】図３は、アプタマーの５’末端に結合した４０ｋＤａの分枝状ＰＥＧの図である。
【図４】図４は、標準的な単一のＰＥＧ化、多重のＰＥＧ化、およびＰＥＧ化を介したオリゴマー化を表す種々のＰＥＧ化ストラテジーを示す図である。
【図５】図５Ａは、ドットブロット結合アッセイにおけるＡＲＣ１０９１に対するＰＳＭＡ結合曲線である。ＰＳＭＡ濃度は、Ｘ軸  対  Ｙ軸における結合したアプタマーの％で示される；図５Ｂは、ＡＲＣ１０９１の予想される最小エネルギー構造の図である。
【図６】図６は、ＬＮＣａＰ（ＰＳＭＡ＋）細胞に結合する蛍光標識したＰＳＭＡアプタマーおよびＰＣ−３（ＰＳＭＡ−）細胞に結合しない蛍光標識したＰＳＭＡアプタマーのＦＡＣＳ分析によるヒストグラムプロットを示す（スクランブルＰＳＭＡアプタマーはネガティブコントロールである）。αＰＳＭＡ抗体によるＰＳＭＡアプタマー蛍光シグナルの競合は、クローンがＰＳＭＡとの特異的相互作用を介して結合することを示す。
【図７Ａ】図７は、化学的に合成されたＡ９ミニマー（ＡＲＣ５９１）が、機能的であり、そしてＰＳＭＡに対して特異的であることを示す：図７Ａは、ドットブロット結合アッセイ（＋／−ｔＲＮＡ）におけるＡＲＣ５９１についてのＰＳＭＡ結合曲線であり、これは、ＡＲＣ５９１が３．４ｎＭのＫＤ（ｔＲＮＡ無し）を有することを示す；図７Ｂは、ＡＲＣ５９１が抗ＰＳＭＡ抗体（３Ｃ６）よりもＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を阻害することを示すグラフであり、それは、６．７ｎＭの見かけのＩＣ５０を有する；図７Ｃは、ＦＡＣＳ分析によって評価したところ、蛍光標識したＡ９ミニマー（ＡＲＣ７１０およびＡＲＣ７１１）がＬＮＣａＰ細胞の表面に対する結合について、蛍光標識した抗ＰＳＭＡ抗体と有効に競合することを示すグラフである（スクランブルＰＳＭＡアプタマーはネガティブコントロールである）。
【図７Ｂ】図７は、化学的に合成されたＡ９ミニマー（ＡＲＣ５９１）が、機能的であり、そしてＰＳＭＡに対して特異的であることを示す：図７Ａは、ドットブロット結合アッセイ（＋／−ｔＲＮＡ）におけるＡＲＣ５９１についてのＰＳＭＡ結合曲線であり、これは、ＡＲＣ５９１が３．４ｎＭのＫＤ（ｔＲＮＡ無し）を有することを示す；図７Ｂは、ＡＲＣ５９１が抗ＰＳＭＡ抗体（３Ｃ６）よりもＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を阻害することを示すグラフであり、それは、６．７ｎＭの見かけのＩＣ５０を有する；図７Ｃは、ＦＡＣＳ分析によって評価したところ、蛍光標識したＡ９ミニマー（ＡＲＣ７１０およびＡＲＣ７１１）がＬＮＣａＰ細胞の表面に対する結合について、蛍光標識した抗ＰＳＭＡ抗体と有効に競合することを示すグラフである（スクランブルＰＳＭＡアプタマーはネガティブコントロールである）。
【図７Ｃ】図７は、化学的に合成されたＡ９ミニマー（ＡＲＣ５９１）が、機能的であり、そしてＰＳＭＡに対して特異的であることを示す：図７Ａは、ドットブロット結合アッセイ（＋／−ｔＲＮＡ）におけるＡＲＣ５９１についてのＰＳＭＡ結合曲線であり、これは、ＡＲＣ５９１が３．４ｎＭのＫＤ（ｔＲＮＡ無し）を有することを示す；図７Ｂは、ＡＲＣ５９１が抗ＰＳＭＡ抗体（３Ｃ６）よりもＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を阻害することを示すグラフであり、それは、６．７ｎＭの見かけのＩＣ５０を有する；図７Ｃは、ＦＡＣＳ分析によって評価したところ、蛍光標識したＡ９ミニマー（ＡＲＣ７１０およびＡＲＣ７１１）がＬＮＣａＰ細胞の表面に対する結合について、蛍光標識した抗ＰＳＭＡ抗体と有効に競合することを示すグラフである（スクランブルＰＳＭＡアプタマーはネガティブコントロールである）。
【図８】図８Ａは、細胞表面ＳＥＬＥＸＴＭのフローチャートである；図８Ｂは、蛍光標識したＡ９アプタマー（ｘＰＳＭ−Ａ９）のＦＡＣＳ分析のヒストグラムプロット、ＬＮＣａＰ細胞ＳＥＬＥＸＴＭ（ライブラリーを変異誘発させたＡ９変異型ライブラリー）を開始するために使用されたドープ型プールのＦＡＣＳ分析のヒストグラムプロット、４ラウンドの細胞ＳＥＬＥＸＴＭ（ｐＲｄ４）後のドープ型プールのＦＡＣＳ分析のヒストグラムプロット、および抗ＰＳＭＡ抗体との競合の効果のＦＡＣＳ分析のヒストグラムプロットを（上から下に向かって）示す。４ラウンドの細胞ＳＥＬＥＸ後、そのプールは、ＰＳＭＡ特異的結合について豊富（ｅｎｒｉｃｈ）であり、そしてＰＳＭＡ特異的結合について特異的である。
【図９】図９は、６ラウンドのドープ細胞型ＳＥＬＥＸＴＭから同定されたアプタマー配列を結合するＬＮＣａＰの分析を示す；示されたコーディング（イタリック体の文字、下線付きの文字、小文字、円で囲んだ文字、または下線付きの文字）は、それぞれの配列されたクローンにわたる各位置でのヌクレオチド保存に対応する。ワトソン−クリック塩基対形成と一致する位置の対におけるヌクレオチド保存は、囲み部分によって示される。好ましい変異および配列決定されたクローンのセット内のそれらの頻度を、各位置に対してアルファベットと数字で示され、それらは、著しい配列の偏りが観察された（例えば、「９Ａ」は、配列決定されたクローンの９が、複合性の二次構造中に、示されるヌクレオチドの代わりにＡを含んだことを示す）。
【図１０】図１０は、ＡＲＣ５９１を最適化するように設計および合成された点変異体構築物の整列された配列を示す表であり、それは、各構築物についての位置の変異およびＮＡＡＬＡＤａｓｅ阻害アッセイにおいて親ＡＲＣ５９１アプタマーと比較した見かけのＩＣ５０（その表の最後の欄）に対する各点変異の効果を示す。
【図１１】図１１は、ＡＲＣ５９１についての配列最適化の異なる段階の間に産生された全ての構築物の整列された配列を示す表であり、それは、変異または２’−置換が各構築物についてなされた位置、およびＮＡＡＬＡＤａｓｅ阻害アッセイにおいて親ＡＲＣ５９１配列と比較した各々についての見かけのＩＣ５０（その表の最後の欄）に対するこれらの効果を示す。
【図１２】図１２は、ビンブラスチン−アプタマー結合体の化学合成の図である。
【図１３】図１３は、アプタマー結合体化に適した活性化メイタンシノイドの化学合成の図である。
【図１４】図１４は、ＳＰＰ（活性化メイタンシノイドリンカーアーム中の成分）の合成の図である。
【図１５】図１５は、カルボン酸３（活性化メイタンシノイドアーム中の成分）の合成の図である。
【図１６】図１６は、ビンブラスチンに結合体化したＰＳＭＡアプタマーの細胞傷害効果  対  毒素と結合体化していないＰＳＭＡアプタマーの細胞傷害効果を示すグラフである。Ｇ２−ｖｉｎ（塗りつぶした円）は、ＡＲＣ１１４２（ＡＲＣ１０９１（最小化したＡＲＣ９５５（Ｇ２）アプタマー）の５’−アミン標識化形態）のビンブラスチン結合体を指す。Ａ９−ｖｉｎ（塗りつぶした三角）は、ＡＲＣ１０２６（ＡＲＣ９４２（最小化したＡ９アプタマー）の改変形態）のビンブラスチン結合体を指す。Ｇ２（ＡＲＣ９５５）（白抜きの円）およびＡ９（ＡＲＣ９４２）（白抜きの四角）は、結合体化していないアプタマーを指す。コントロールアプタマー−ｖｉｎ（塗りつぶした四角）は、ビンブラスチンとＡＲＣ７２５（ＰＳＭＡ結合を示さないことが示されたＡＲＣ１１４２と類似する組成を有する非機能性ミニマー）との結合体である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月9日(2008.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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