(57)【要約】  本発明は、粗ＦＳＨから出発する組換えヒトＦＳＨ又はＦＳＨ変異体を精製するための方法であって、以下の工程：１．色素アフィニティークロマトグラフィー；２．疎水性相互作用クロマトグラフィー；及び３．逆相クロマトグラフィー、を含んで成る方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＦＳＨ又はＦＳＨ変異体を精製するための方法であって、ＦＳＨを含有する液体を：
（１）色素アフィニティークロマトグラフィー；
（２）疎水性相互作用クロマトグラフィー；そして
（３）逆相クロマトグラフィー；
にかける工程（いずれの順番で行ってもよい）を含んで成る方法。
【請求項２】
工程（１）の色素アフィニティークロマトグラフィーが、固定化Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｆ３Ｇ−Ａを有する樹脂で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（１）の色素アフィニティークロマトグラフィーに使用される樹脂が、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（１）の色素アフィニティークロマトグラフィーが、溶出剤として、約６．５〜１１．５のｐＨにおけるリン酸ナトリウム緩衝液を使用して行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（２）の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）が、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ、又はこれと同様の特性を有する樹脂を使用して行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（２）の疎水性相互作用クロマトグラフィーが、溶出剤として、リン酸ナトリウム／硫酸アンモニウムを使用して行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（３）の逆相クロマトグラフィーの工程が、樹脂として、ＳＯＵＲＣＥ  ３０  ＲＰＣを使用して行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（３）の逆相クロマトグラフィーの工程が、溶出剤として、２−プロパノールを伴う酢酸アンモニウムを使用して行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程が、以下の順番：
（１）色素アフィニティークロマトグラフィー；
（２）疎水性相互作用クロマトグラフィー；その後
（３）逆相クロマトグラフィー；
で行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
更に、陰イオン交換クロマトグラフィー工程（０）の工程を含んで成る、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
陰イオン交換クロマトグラフィーの工程が、工程（１）、（２）及び（３）の前に行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程が、以下の順番：
（０）陰イオン交換クロマトグラフィー；
（１）色素アフィニティークロマトグラフィー；
（２）疎水性相互作用クロマトグラフィー；そして
（３）逆相クロマトグラフィー；
で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（０）の陰イオン交換クロマトグラフィーが、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ樹脂、又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ樹脂で行われる、請求項１０、１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（０）のイオン交換クロマトグラフィーが、溶出剤として、ホウ酸緩衝液を使用して行われる、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ホウ酸緩衝液が、約８．５のｐＨである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
更に、陰イオン交換クロマトグラフィー工程（４）の第二工程を含んで成る、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（４）の陰イオン交換クロマトグラフィーの第二工程が、工程（１）、（２）及び（３）の後に行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程が、以下の順番：
（０）陰イオン交換クロマトグラフィー；
（１）色素アフィニティークロマトグラフィー；
（２）疎水性相互作用クロマトグラフィー； 
（３）逆相クロマトグラフィー；そして
（４）陰イオン交換クロマトグラフィー；
で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（４）の陰イオン交換クロマトグラフィーの第二工程が、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ樹脂、又はＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ樹脂を使用して行われる、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（４）の陰イオン交換クロマトグラフィーの第二工程が、ホウ酸緩衝液及び増加性ＮａＣｌ濃度の勾配を使用して行われる、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ナノ濾過工程（４’）の工程を含んで成り、陰イオン交換クロマトグラフィー工程（４）の第二工程が行われる、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ナノ濾過（４’）の工程後に、限外濾過（５）の工程を含んで成る、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
いずれかの溶出剤及び／又は緩衝液が、抗酸化剤、特にＬ−メチオニンを含んでよい、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ヒト組換えＦＳＨを精製するための方法であって、ＦＳＨを以下の工程：
（−１）  限外濾過；
（０）  溶出剤として約８．５のｐＨにおけるホウ酸塩／ＮａＣｌ、Ｌ−メチオニンでのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦにおける陰イオン交換クロマトグラフィー；
（１）  工程（０）の溶出物を、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、及び溶出剤として約７のｐＨにおけるリン酸塩、ＮａＣｌ、Ｌ−メチオニンにおける色素アフィニティークロマトグラフィーにかける工程；
（２）  工程（１）の溶出物を、溶出剤として約７のｐＨにおけるリン酸塩、硫酸アンモニウム、Ｌ−メチオニンによるＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍにおける相互作用クロマトグラフィーにかける工程；
（３）  工程（２）の溶出物を、溶出剤として約７．６のｐＨにおける２−プロパノールを伴う、酢酸アンモニウム、Ｌ−メチオニンによるＳｏｕｒｃｅ  ３０  ＲＰＣにおける逆相クロマトグラフィーの工程にかける工程；
（４）  工程（３）の溶出物を、約８．５のｐＨにおけるホウ酸塩、Ｌ−メチオニン、及びＮａＣｌによる、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ｈｉｃａｐ樹脂における陰イオン交換クロマトグラフィーの工程にかける工程；
（４’）  工程（４）の溶出物を、ナノ濾過の工程にかける工程；そして
（５）  工程（４’）の透過液を、限外濾過の工程にかける工程、
を含んで成る方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、組換えヒトＦＳＨ又はＦＳＨ変異体。
【請求項２６】
請求項２５に記載のヒトＦＳＨ又はＦＳＨ変異体、並びに医薬的に許容される賦形剤を含んで成る、医薬組成物。
【請求項２７】
請求項２５に記載のＦＳＨ、プルロニックＦ６８、ショ糖、メチオニン、ｍ−クレゾール、及びｐＨ約７．０における水性リン酸緩衝液を含んで成る、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
妊娠障害の治療のための医薬の調製のための請求項２５に記載の組換えヒトＦＳＨ又はＦＳＨ変異体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の精製の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、ゴナドトロフィンのクラスに分類される注射可能なタンパク質である。ＦＳＨは女性及び男性の両方の患者における不妊症及び生殖障害の治療において使用される。
【０００３】
本来、ＦＳＨは下垂体により産生される。医薬的用途のために、ＦＳＨは、組換えにより産生することができ（ｒＦＳＨ）、あるいは閉経後の女性の尿から単離することができる（ｕＦＳＨ）。
【０００４】
ＦＳＨは、補助生殖医療（ＡＲＴ）のための排卵誘発（ＯＩ）及び過排卵誘発（ＣＯＨ）における女性患者において使用される。排卵誘発のための典型的な治療法において、患者には、約６〜１２日の期間においてＦＳＨ又は変異体（約７５〜３００ＩＵ  ＦＳＨ／日）の注射が毎日投与される。過排卵誘発のための典型的な治療法において、患者は、約６〜１２日の期間間においてＦＳＨ又は変異体（約１５０〜６００ＩＵ  ＦＳＨ／日の注射が毎日投与される）。
【０００５】
ＦＳＨはまた、精子減少症を罹患している男性において精子形成を誘発するために使用される。週に二回の２５００ＩＵのｈＣＧと併用する週に三回の１５０ＩＵのＦＳＨを用いる治療法が、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症に罹患している男性における精子数の改善を達成することに成功的である[Burgues et al.; Subcutaneous self- administration of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism; Hum. Reprod.; 1997, 12, 980-6]。
【０００６】
妊娠障害の治療におけるＦＳＨの重要性のために、高純度且つ高比活性のＦＳＨの供給が所望される。ＦＳＨ治療は反復的な注射を必要とする。高度に精製されたＦＳＨ調製物は皮下に投与することができ、患者による自己投与を許容し、従って患者の利便性及び服薬率を向上する。
【０００７】
Ｌｙｎｃｈら[The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinising hormone ; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12-19]は、ヒト下垂体ＦＳＨを精製するための方法を記載する。該方法は、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、イムノアフィニティー抽出、及びサイズ排除クロマトグラフィーを含む。該方法は、１６ＩＵ／ｍｇのＬＨを伴い、４９９０ＩＵ（イムノアッセイ）／ｍｇの比活性を有する下垂体ＦＳＨをもたらす。タンパク質含有量は、乾燥重量により、又は２８０ｎｍにおける吸収における溶液のいずれかにおいて測定された（１ｇ／ｌのＡ2801cmは１であると仮定する）。
【０００８】
ＷＯ９８／２００３９(IBSA lnstitut Biochimique SA)は、ヒト閉経期ゴナドトロピン（ｈＭＧ）と称される尿抽出物で出発するヒト尿ＦＳＨの精製方法を記載する。該方法は、ＤＥＡＥ型の弱塩基性陰イオン交換樹脂におけるイオン交換クロマトグラフィー、続いてリガンドとしてアントラキノン誘導体を有する樹脂におけるアフィニティークロマトグラフィーを使用する。該方法は、ＬＡが存在せず、そして６，８７０ＩＵ（イムノアッセイ）／ｍｇの比活性を有する尿ＦＳＨを産生するということである。タンパク質含有量は、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質の水溶液が、１ｃｍの長さを有する石英キュベット中で２７７ｎｍにおいて０．６２の吸光度を有することを仮定することにより測定された。
【０００９】
ＷＯ００／６３２４８(Instituto Massone SA)は、ヒト尿からの、ＦＳＨを含むゴナドトロピンの精製方法を記載する。該方法は以下の工程を含む：スルホプロピル型の強陽イオン樹脂でのイオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。報告によれば、８，４００ＩＵ／ｍｇの比活性を有するＦＳＨ調製物 (Steel man-Pohley method: Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604-616)、及び７５ＩＵのＦＳＨあたり１ＩＵ以下のＬＨ (rat seminal vesicle weight gain method: Van Hell H, Matthijsen R & GA Overbeek; Acta Endocrinol, 1964, 47, 409)の生物活性が得られる。タンパク質含有量はローリー法により行われた[O. H. Lowry et al., J. Biol. Chem., 1951, 193, 265]。
【００１０】
米国特許第５，９９０，２８８号(Musick et al.)は、生物試料、例えば、ヒト下垂体又はヒト閉経後尿からのＦＳＨの精製方法を記載する。該方法は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ3−６５０Ｍにおける陽イオン交換クロマトグラフィー、続いてＭｉｍｅｔｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ  １樹脂における色素アフィニティークロマトグラフィー、続いてＢａｋｅｒｂｏｎｄ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ  ＨＩ−プロピル樹脂における疎水性相互作用クロマトグラフィーの工程を使用する。該方法は、７，０６６ＩＵ（イムノアッセイ）／ｍｇの比活性を有するヒト下垂体ＦＳＨ、及び１ＩＵ（イムノアッセイ）／ｍｇ以下のＬＨ、及び６，２９８ＩＵ（イムノアッセイ）／ｍｇの比活性を有するヒト尿ＦＳＨ、及び３ＩＵ（イムノアッセイ）／ｍｇ以下のＬＨをもたらすということである。タンパク質含有量は２８０ｎｍにおける吸収により測定された（１ｇ／ｌのＡ2801cmは１であると仮定する）。
【００１１】
Ｃｈｉｂａら[Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland ; Endocrinol. J., 1997, 44, 205-218] は、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ（Ｃｏｎ）Ａアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、及びＣｕ++での固定化金属イオンクロマトグラフィーを使用する、イヌ下垂体ゴナドトロピン、例えば、ＦＳＨを精製するための技術を記載する。生じるＦＳＨは、生物活性を測定するためのＦＳＨについてのラジオレセプターアッセイ及びタンパク質含有量を測定するためのＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイキット(BioRad Laboratories CA USA) を使用して、２．１７ＩＵ／ｇタンパク質の比活性を有することが報告されている。
【００１２】
ＷＯ８８／１０２７０(Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA) は、尿からのヒトＦＳＨの精製方法を記載する。該方法は、ジビニルスルホンによりＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂと結合するＦＳＨ特異性固定化抗体でのイムノクロマトグラフィー、続く逆相ＨＰＬＣを含む。生じるＦＳＨはＬＨ及び他の尿タンパク質が存在せず、そして６，２００ＩＵ／ｍｇの比活性の凍結乾燥粉末を有する（Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ法）。該調製物は、その純度のために、皮下投与に適当な最初のＦＳＨ調製物である。
【００１３】
ＦＳＨ及びＦＳＨ変異体の調製のための新規な方法は未だ必要である。特に、コストの大きなイムノアフィニティークロマトグラフィー工程の使用を避ける精製法の必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
本発明の対象は、組換えＦＳＨ又は組換えＦＳＨ変異体を精製するための新規な方法を供することである。
【００１５】
最初の観点において、本発明は、粗ＦＳＨを含有する液体から出発する、組換えヒトＦＳＨ又はＦＳＨ変異体を精製するための方法であって、以下の工程（いずれの順番で行ってもよい）：
（１）色素アフィニティークロマトグラフィー；
（２）疎水性相互作用クロマトグラフィー；及び
（３）逆相クロマトグラフィー；
を含んで成る方法を供する。
【００１６】
略語
以下の略語が発明の記載において使用される。
ＤＦ：ダイアフィルトレーション；
ＦＳＨ：卵胞刺激ホルモン；
ｒ−ＦＳＨ：組換えＦＳＨ；
ｈＦＳＨ：ヒトＦＳＨ；
ｒ−ｈＦＳＨ：組換えヒトＦＳＨ
ＢＶ：総容積
ＤＥＡＥ：ジエチルアミノエチル
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫測定法
ＤＡＣ：色素アフィニティークロマトグラフィー
ＩＭＡＣ：  固定化金属イオンアフィニティー
ＯＤ：吸光度
ＨＩＣ：疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＩＲＭＡ：免疫放射線測定法
ＫＤ又はｋＤ：キロダルトン
ＨＣＰ：宿主細胞タンパク質、ＦＳＨの発現のために使用される宿主細胞由来のタンパク質
ＩＰＣ：工程管理
ＩＥＦ：等電点電気泳動
ＰＥＳ：ポリエーテルスルホン
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
Ｑ  ＦＦ：Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦにおける陰イオン交換
ＲＴ  ：室温
ＵＦ：限外濾過
ＷＦＩ：注射用水
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、粗ＦＳＨを含有する液体から出発する組換えヒトＦＳＨ又は組換えＦＳＨ変異体の精製方法であって、以下の工程（いずれの順番で行ってもよい）：
（１）色素アフィニティークロマトグラフィー；
（２）疎水性相互作用クロマトグラフィー；及び
（３）逆相クロマトグラフィー；
を含んで成る方法を供する。
【００１８】
本発明の精製方法は、最終医薬、例えば、ゴナールＦ（Serono)に処方できる、高純度の組換えＦＳＨバルクを産出する。これはイムノアフィニティークロマトグラフィーの使用を伴わない高い純度を産出する利点を有する。本発明に従う精製のための出発物質を形成する粗ＦＳＨは、組換えＦＳＨを含有する細胞培養回収物中に存在する。
【００１９】
好ましい態様において、抗酸化剤、又は抗酸化効果及び捕捉（スカベンジャー）効果を有する遊離アミノ酸若しくはジペプチドは、本発明に従う精製方法の一定の又は全ての工程において含まれる。より正確には、該抗酸化剤は、ｒ−ｈＦＳＨを精製及び／又は濃縮及び／又は濾過するために使用されるいずれかの緩衝液中に存在する。該酸化剤は、処理中のＦＳＨの酸化を防ぐ。好ましい抗酸化剤はＬ−メチオニンである。好ましくはＬ−メチオニンは、約１０〜１００ｍＭの濃度において使用される。抗酸化剤の更なる例は、ｔ−ブチル−４−メトキシ−フェノール、２，６−ビス（１，１−ジメチルエチル）−４−メチルフェノール；バイメタル亜硫酸水素カリウム又はナトリウム、亜硫酸水素ナトリウムを含む。抗酸化及び捕捉効果を有する有利アミノ酸及びジペプチドの例は、ヒスチジン、タウリン、グリシン、アラニン、カルノシン、アンセリン、１−メチルヒスチジン、又はこれらの組み合わせである。
【００２０】
典型的には、出発物質は最初に特定され、そしてその後且つ任意的に濃縮され（例えば、限外濾過を使用することにより）、そして／又は最初のクロマトグラフィー工程において捕捉される前に緩衝液を交換する（例えば、ダイアフィルトレーション工程）。
【００２１】
クロマトグラフィーの工程において、ポリマー型及びアガロース型樹脂を使用することができる。また、樹脂が機能性膜で置き換えられた膜クロマトグラフィーを使用することができる。
【００２２】
本発明の３つの精製工程（すなわち、色素アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー）は、以下においてより詳細に概要される。
【００２３】
色素アフィニティークロマトグラフィー工程（１）
本発明の方法は、色素アフィニティークロマトグラフィー（１）の工程を含む。好ましい態様において、色素アフィニティークロマトグラフィーの工程は、固定化リガンドとして、当業者に周知な染色化合物、すなわちＣｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｆ３Ｇ−Ａを有する樹脂を使用して行うことができる。「固定化」の語は、当業者にはよく理解され、そして樹脂に化学的に結合するという意味においてリガンドが誘導化されることを意味する。特に好ましい樹脂は、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦである(Amersham Biosciences Inc.から得られる)。Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの技術的特長は以下のとおりである：
【表１】
2008519010.tif 000002
【００２４】
該方法は、類似する特性を有するほかの樹脂で行うことができるものと理解される。他の樹脂の例は：Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−ｂｌｕｅ−ＨＣ−６５０Ｍ(Tosoh Bioscience)、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＢｕｔｙｌ  ５５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０、Ｂｌｕｅ  Ｃｅｌｌｔｈｒｕ  ＢｉｇＢｅａｄ(Sterogene)、ＳｗｅｌｌＧｅｌ  Ｂｌｕｅ(Pierce)、Ｃｉｂａｃｈｒｏｍｅ  ｂｌｕｅ  ３ＧＡ−アガロース１００(Sigma)、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ(BioRad)、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  ｂｌｕｅ  カートリッジ(Bio-Rad)、Ｂｌｕｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ(Amersham)、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  ３ＧＡ(Sigma)を含む。
【００２５】
固定化色素アフィニティーの工程における溶出は、好ましくはリン酸塩の緩衝液、特に好ましくはリン酸ナトリウムの緩衝液を使用して行うべきである。溶出剤のｐＨは、好ましくは約６．０〜約１１．５、より好ましくは約６．５〜約８、特に好ましくは約７．０である。７．０のｐＨを維持するために適当な他の緩衝液は以下を含む：ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ。色素アフィニティークロマトグラフィーの工程のための溶出緩衝液は、好ましくは伝導率を増加するために塩、好ましくはＮａＣｌを含有するべきである。
【００２６】
特に好ましい態様において、色素アフィニティークロマトグラフィーの工程のための生成物含有緩衝液（平衡化、洗浄及び溶出）は、抗酸化剤、例えば、Ｌ−メチオニンを含む。更なる抗酸化剤の例は、ｔ−ブチル−４−メトキシフェノール、２，６−ビス（１，１−ジメチルエチル）−４−メチルフェノール；ビメタ亜硫酸水素カリウム又はナトリウム、亜硫酸水素ナトリウムを含む。
【００２７】
疎水性相互作用クロマトグラフィー工程（２）
該方法はまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー（２）の工程を含む。好ましい態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ(Tosoh Biosep Inc.から得ることができる)等の樹脂で行われる。
【００２８】
工程（２）は、類似する特性を有する他の樹脂を使用して行うことができるものと理解される。使用することができる他の樹脂は以下のとおりである：Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ(high sub)；  Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ；Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ；  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；ＳＯＵＲＣＥ  １５ＥＴＨ；ＳＯＵＲＣＥ  １５ＩＳＯ；ＳＯＵＲＣＥ  １５ＰＨＥ。これらは全てAmersham Biosciences (800) 526-3593に由来する；(www.amershambiosciences.comを参照のこと)。更なる樹脂は、BioChrom Labs Inc. (812) 234-2558からの：Ｈｙｄｒｏｃｅｌｌ  Ｃ３又はＣ４；Ｈｙｄｒｏｃｅｌｌ  Ｐｈｅｎｙｌ；である (www.biochrom.comを参照のこと)。
【００２９】
ＨＩＣ樹脂における結合性は、塩（例えば、ＮａＣｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4又はＮａ2ＳＯ4）の添加を介して得られる高伝導率を伴う緩衝液において達成される。疎水性相互作用クロマトグラフィーの工程における溶出は、好ましくは、約６〜約８、より好ましくは約６．５〜約７．５、最も好ましくは約７のｐＨを有する緩衝液を使用して、移動相の伝導率を低下させることにより行われる。特に好ましい系は、約７のｐＨにおいて緩衝作用するリン酸ナトリウム、及び硫酸アンモニウムを含有する。他の緩衝液は上述されている。
【００３０】
特に好ましい態様において、ＨＩＣの工程（２）（平衡化、洗浄、溶出）のための生成物含有緩衝液は、抗酸化剤、例えば、Ｌ−メチオニンを含有する。他の抗酸化剤は上述されている。
【００３１】
逆相クロマトグラフィー工程（３）
本発明の方法はまた、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）（３）の工程を含んで成る。該ＲＰＣは、好ましくは、例えば、ＳＯＵＲＣＥ  ３０ＲＰＣ(Amersham Biosciencesから得ることができる) 等の樹脂を使用して行われる。工程（３）は、類似する特性を有する当業者に周知な他の樹脂を使用して行うことができるものと理解される。
【００３２】
該クロマトグラフィーは、好ましくは弱アルカリ性ｐＨにおいて、例えば、約７〜８．５、より好ましくは約７．５又は７．６において緩衝作用する移動相を使用して行われる。
【００３３】
好ましい態様において、緩衝作用種は、酢酸アンモニウムである。約７．６のｐＨに適当な他の緩衝液は：ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、リン酸塩、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳを含む。当該工程に使用される緩衝溶液はまた、有機修飾因子（organic modifier)、クロマトグラフィー工程の異なる段階（添加、洗浄、溶出、及び再生）のために調節される濃度を含んでよい。好ましい態様において、有機修飾因子は、水混和性有機溶媒、好ましくはアルコール（例えば、メタノール、エタノール等）、最も好ましくは２−プロパノール（イソプロパノール）である。
【００３４】
特に好ましい態様において、ＲＰＣの工程（平衡化、洗浄、溶出）のための生成物含有緩衝液は、抗酸化剤、例えば、Ｌ−メチオニンを含有する。他の抗酸化剤は上述されている。
【００３５】
任意的な更なる精製工程０−イオン交換クロマトグラフィー
上に概要した３つの主要な精製工程に加えて、本発明は追加的な精製工程を含んでよい。
【００３６】
ある態様において、本発明の精製方法は、以下の特性を有する、好ましくは強陰イオン交換樹脂、特に好ましくは第四級アンモニウム樹脂、例えば、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ(Amersham Biosciencesから得ることができる)によるイオン交換クロマトグラフィー（０）の予備工程を含む：
イオン交換体のタイプ：                  強陰イオン
総容量（ｍｍｏｌ／ｍｌ）：              ０．１８〜０．２５
排除限界（球状タンパク質）：            ４×１０6
ビーズ形態：                            球状、直径４５〜１６５μｍ
ビーズ構造：                            架橋型アガロース、６％
操作上のｐＨ安定性：                    ２〜１２
洗浄ｐＨ安定性：                        １〜１４
２５℃、１ｂａｒ、１５ｃｍベッド高、ＸＫ  ５０／３０カラムにおける線流速：
４００〜７００ｃｍ／ｈ
【００３７】
あるいは、該イオン交換クロマトグラフィー工程（０）は、例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ＨＩＣＡＰ(Merck KGaA, Darmstadt Germanyから得ることができる) 等の樹脂、又は類似する特性を有する樹脂を使用して行うことができる。以下を参照のこと：
【表２】
2008519010.tif 000003
【００３８】
イオン交換クロマトグラフィーの工程は、好ましくは、弱アルカリ性ｐＨ（例えば、約７．２〜約９．０、又は約８．０〜約９．０、最も好ましくは約８．５）を有する緩衝液を使用して行われる。適当な緩衝液は、例えば、ホウ酸緩衝液、トリエタノールアミン／イミノ二酢酸トリス、酢酸アンモニウム、トリシン、ビシン、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳを含む。最も好ましくは約８．５のｐＨにおけるホウ酸緩衝液である。イオン交換樹脂からの溶出は、塩、好ましくはＮａＣｌの添加を介して移動相の伝導率を上昇させることにより達成される。特に好ましい態様において、イオン交換クロマトグラフィー（平衡化、洗浄、溶出）のための生成物含有緩衝液は、抗酸化剤、好ましくはＬ−メチオニンを含む。他の抗酸化剤は上述されている。
【００３９】
このように、好ましい態様において、本発明の方法は以下の工程：
（０）好ましくは強陰イオン交換樹脂［好ましくは第四級アンモニウム樹脂、例えば、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ］における陰イオン交換クロマトグラフィー；
（１）色素アフィニティークロマトグラフィー［好ましくはＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦにおける］；
（２）疎水性相互作用クロマトグラフィー[好ましくはＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍにおける］；及び
（３）逆相クロマトグラフィー[好ましくはＳｏｕｒｃｅ  ３０  ＲＰＣにおける]、
を含んで成る。
【００４０】
任意的な更なる精製工程（−１）−限外濾過／ダイアフィルトレーション
イオン交換クロマトグラフィー（０）の工程の前に、粗ＦＳＨを濃縮するために限外濾過の工程を行うことが望ましい。限外濾過（又はダイアフィルトレーション）は、好ましくは約３〜１０ｋＤ、最も好ましくは約８ｋＤのカットオフを有する膜を使用して行われる。
【００４１】
任意的な更なる精製工程（４）−陰イオン交換クロマトグラフィー
更に好ましい態様において、本発明の方法はまた、陰イオン交換クロマトグラフィー（４）の第二工程を含んで成る。好ましい樹脂は、上述のとおり、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ＨＩＣＡＰ(Merck KGaA, Darmstadt Germanyから得ることができる)、又は類似する特性を有する樹脂である。あるいは、陰イオン交換クロマトグラフィーの第二工程は、上述のとおり、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、又は類似する特性を有する他の樹脂において行うことができる。
【００４２】
陰イオン交換クロマトグラフィー、色素アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、逆相クロマトグラフィーの工程、及び陰イオン交換クロマトグラフィーの第二工程は、いずれの順番において行ってもよいが、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を最初に行うことが好ましい。色素アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＲＰＣの工程、及び任意的な陰イオン交換クロマトグラフィーの第二工程の残りの工程は、いずれの順番においても行うことができるが、以下に示す順番に従うことが好ましい：
（０）陰イオン交換クロマトグラフィー、（１）色素アフィニティークロマトグラフィー、（２）相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、（３）逆相クロマトグラフィーＲＰＣ；そして（４）第二陰イオン交換クロマトグラフィー。
【００４３】
任意的な更なる精製工程（５）−限外濾過／ダイアフィルトレーション
更に好ましい態様において、いずれかのクロマトグラフィーの工程後（特に、逆相クロマトグラフィーの工程後）、ＦＳＨ試料を濃縮工程にかける。好ましくは、該工程は所望の組成を有するバルクを得るために、ダイアフィルトレーションと併用した限外濾過を使用して行われる。該限外濾過（ダイアフィルトレーション）は、好ましくは約３〜１０ｋＤ、最も好ましくは約５ｋＤのカットオフを有する膜を使用して行われる。
【００４４】
特に好ましい態様において、以下の工程は以下に示す順番で行われる；
（−１）  限外濾過（好ましくは約８ｋＤのカットオフを有する膜を伴う）、
（０）  陰イオン交換クロマトグラフィー（好ましくは、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを使用する）；
（１）  色素アフィニティークロマトグラフィー（好ましくは、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを使用する）；
（２）  相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（好ましくは、Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムを使用する）；
（３）  逆相クロマトグラフィー（好ましくは、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０  ＲＰＣカラムを使用する）；
（４）  強塩基性陰イオン交換樹脂における陰イオン交換クロマトグラフィー（好ましくはＴＭＡＥ  ｈｉｃｕｐ  樹脂を使用する）；及び
（５）  限外濾過（好ましくは５ｋＤのカットオフを有する膜を伴う）。
【００４５】
ＦＳＨ試料を、特にウイルスのクリアランス工程として、すなわち、細胞培養液由来のウイルス又はウイルス様粒子によるＦＳＨの汚染のリスクを低下するために、ナノ濾過の工程にかけることが望ましい。ナノ濾過は、精製処理のいずれの段階においても行うことができるが、しかしながらイオン交換クロマトグラフィーの第二工程後、又は逆相クロマトグラフィー後、又は相互作用クロマトグラフィー後に行うことが特に好ましい。ナノ濾過は、１回以上、例えば、２回行うことができる。
【００４６】
特に好ましい態様において、本発明の方法は以下の工程を含んで成る：
（−１）  限外濾過（好ましくは約８ｋＤのカットオフを有する膜を伴う）、
（０）  陰イオン交換クロマトグラフィー（好ましくは、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムによる）；
（１）  色素アフィニティークロマトグラフィー（好ましくは、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムによる）；
（２）  相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（好ましくは、Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムによる）；
（３）  逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）（好ましくは、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０ＲＰＣカラムによる）；
（４）  強塩基性陰イオン交換樹脂における陰イオン交換クロマトグラフィー（好ましくはＴＭＡＥハイカップ樹脂による）；
（４’）  ナノ濾過
（５）  限外濾過（好ましくは５ｋＤのカットオフを有する膜を伴う）。
【００４７】
本発明の利点は、該精製方法が、コストが大きなイムノアフィニティークロマトグラフィー工程を避け、そして高度なＦＳＨ純度及び特異的な生物活性を供することである。また、本発明の精製されたＦＳＨは、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより添加される所望されない不純物（例えば、樹脂から溶脱した免疫グロブリン）を含有しない。
【００４８】
保存／凍結乾燥
上述のとおり精製処理からもたらされ、そして精製されたＦＳＨを含有する液体組成物は、そのまま、又は精製後凍結させることができ、溶媒を除去するために溶出物を凍結乾燥（フリーズドライ）にかけてもよい。生じる液体又は凍結乾燥生成物は、「ＦＳＨバルク」と名づけられる。
【００４９】
ＦＳＨ製剤
本発明のＦＳＨ又はＦＳＨ変異体、あるいは本発明の方法に従う精製物は、筋肉内又は皮下における、好ましくは皮下における注射用に処方することができる。ＦＳＨ製剤はフリーズドライすることがき、この場合、注射の直前にこれを注射用水に溶解させる。ＦＳＨ製剤はまた、液体製剤でもよく、この場合、これをあらかじめ溶解することなく、直接注射することができる。
【００５０】
ＦＳＨ製剤は、単回投与又は複数回投与であってよい。複数回投与である場合、好ましくは静菌剤、例えば、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、チモール、又はフェノール、好ましくはベンジルアルコール又はメタ−クレゾールを含有するべきである。単回投与製剤もまた、静菌剤を含有してよい。
【００５１】
本発明のＦＳＨは、既知の賦形剤及び安定化剤、例えば、ショ糖及びマンニトールとともに処方することができる。これはまた酸化剤、例えば、メチオニンを含んで成ってよい。これは更に界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（好ましくはＴＷＥＥＮ２０）、又はプルロニック（Pluronic)（好ましくはプルロニックＦ６８）を含んで成ってよい。
【００５２】
特に好ましい複数回投与製剤において、本発明の方法により産生されたＦＳＨは、これを、ショ糖、リン酸緩衝液（ｐＨ７）、プルロニックＦ６８、メチオニン、及びメタ−クレゾール又はベンジルアルコールと共に注射用水に溶解することにより、処方することができる。
【００５３】
特に好ましい、皮下又は筋肉内注射用の組換えＦＳＨの液体複数回投与製剤は、以下のとおりである：
【表３】
2008519010.tif 000004
【００５４】
指摘
本発明のＦＳＨは、ＦＳＨが示される場合の全ての処理における用途に適当である。これは補助生殖医療のための排卵誘発、過排卵誘発、及び精子減少症の治療における皮下投与に特に適当である。これは他のゴナドトロピン、例えば、ＬＨ、及びｈＣＧと組み合わせて使用することができる。これはまた、ＦＳＨに対する応答を増大する更なる化合物、例えば、クエン酸クロミフェン、アロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ファドロゾール、及びＹＭ−５１１と共に使用することができる。
【００５５】
本明細書において使用される、卵胞刺激ホルモン、又はＦＳＨは、完全長成熟タンパク質として産生されるヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）を意味する。ＦＳＨはヒト糖タンパク質α−サブユニット及びヒトＦＳＨβ−サブユニットから構成される二量体である。ヒト糖タンパク質αサブユニットのタンパク質配列は配列番号１により供され、そしてヒトＦＳＨβサブユニットのタンパク質配列は配列番号２において与えられる。
【００５６】
「組換え」の語の用途は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ＷＯ８５／０１９５８を参照のこと）の使用を介して産生されるＦＳＨの調製物を意味する。
【００５７】
組換え技術を使用するＦＳＨの発現方法の１つの例は、ＥＰ０２１１８９４及びＥＰ０４８７５１２に記載されるとおり、別々のプロモーターを有する各サブユニットを伴う１つのベクター又は２つのベクターにおいて供される、ＦＳＨのα−及びβ−サブユニットをコードするＤＮＡ配列による真核細胞のトランスフェクションによるものである。ＦＳＨをコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡであってよく、あるいはこれはイントロンを含んでよい。
【００５８】
ＦＳＨを産生するための組換え技術の使用の他の例は、ＥＰ０５０５５００(Applied Research Systems ARS Holding NV)において記載されるとおり、異種制御セグメントを、ＦＳＨの１つ又は両方のサブユニットをコードする内在性配列に作用可能的な連結において導入するための相同組換えの使用によるものである。また、例えば、ＷＯ９９／５７２６３  (Transkaryotic Therapies)に記載される方法であって、ここで１つのサブユニットが細胞内に異種的に挿入され、そして他方のサブユニットが、相同組換えによる異種制御セグメントの挿入によるゲノム配列の活性化により発現される方法も考慮される。本発明の方法は、これらの方法及び他の方法のいずれかを使用して発現されるＦＳＨを精製するために使用することができる。
【００５９】
「組換え細胞」の表現は、上述したいずれかの遺伝子操作の方法を含む、異種ＤＮＡの挿入により産生された細胞を意味する。
【００６０】
好ましくは、ＦＳＨはＤＮＡを含んで成る、ヒト糖タンパク質α−サブユニット及びＦＳＨのβ−サブユニットをコードするＤＮＡを含んで成る、１又は複数のベクターでトランスフェクトされた中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において組換え的に産生される。α及びβサブユニットをコードするＤＮＡは、同じ又は異なるベクターにおいて存在してもよい。
【００６１】
「ＦＳＨ変異体」の表現は、アミノ酸配列、糖鎖付加パターン、又はヒトＦＳＨ由来のサブユニット間の結合において異なる分子であって、ＦＳＨ活性を示すものを包含することを意味する。例は、LaPoIt et al.; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; 又は Klein et al.; Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56に記載されるように、ＣＴＰ−ＦＳＨ、野生型αサブユニットとｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドがＦＳＨのβサブユニットのＣ末端に融合しているハイブリッドβサブユニットから成る、長時間作用性改変組換えＦＳＨを含む。また、単鎖ＣＴＰ−ＦＳＨ、以下の配列（Ｎ−末端からＣ末端まで）から成る単鎖分子を含む：
【表４】
2008519010.tif 000005
ここで、βＦＳＨは、Klein ら[Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey, Fertility & Sterility; 2002, 77, 1248-1255]により記載されるとおり、ＦＳＨのβ−サブユニットを示し、βｈＣＧ  ＣＴＰ（１１３−１４５）はｈＣＧのカルボニル末端ペプチドを示し、そしてαＦＳＨはＦＳＨのα−サブユニットを示す。ＦＳＨ変異体のほかの例は、ＷＯ０１／５８４９３(Maxygen)において開示される、α−及び／又はβ−サブユニット中に組み込まれる更なる糖鎖付加部位を有するＦＳＨ分子、及びＷＯ９８／５８９５７に開示される、サブユニット間Ｓ−Ｓ結合を伴うＦＳＨ分子を含む。ＦＳＨ変異体の更なる例は、例えば、ＷＯ９１／１６９２２及びＷＯ９２／２２５６８に開示される、ＦＳＨ由来の配列及びｈＣＧ又はＬＨ由来の配列を含んで成るキメラ分子を含む。
【００６２】
本明細書中に言及されるＦＳＨ変異体はまた、配列番号２の完全長成熟タンパク質よりも短いβサブユニットのカルボキシ末端欠失を含む。ヒトβサブユニットのカルボキシ末端欠失は、配列番号３、４及び５において供される。β鎖のカルボキシ末端変異体は、ＦＳＨ変異体ヘテロ二量体を形成するために既知のαサブユニットと複合体を形成するものと理解される。
【００６３】
好ましい態様において、ＦＳＨは、血清又は無血清培地におけるＣＨＯ細胞中で組換え的に産生される。
【００６４】
好ましい態様において、本発明の方法に従い産生された精製ＦＳＨは、患者による自己投与を許容する、皮下投与に適当である。
【００６５】
「粗組換えＦＳＨ」の表現は、いずれかのクロマトグラフィー工程を経る前のＦＳＨを発現する組換え細胞由来の細胞培養液上清を意味する。該表現は、上清の原体（細胞から単離されるもの）、並びに濃縮された、そして／又は濾過された、そして／又は限外濾過された上清を包含する。
【００６６】
ＦＳＨ活性に関係する「生物活性」の語は、ＦＳＨに関係する生物学的応答、例えば、Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイにおける卵巣重量増加 [Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604- 616]、又は上清患者における濾胞成長を誘発するためのＦＳＨ製剤の能力を意味する。女性患者における濾胞成長は、例えば、刺激の８日目における約１６ｍｍの平均直径を有する濾胞の数に関して、超音波により評価することができる。生物活性は、ＦＳＨについて受け入れられている標準に関して評価される。
【００６７】
ＦＳＨ調製物中のＬＨ含有量は、例えば、ＬＨ特異的イムノアッセイ、例えば、Ｄｅｌｆｉａ  ｈＬＨ  Ｓｐｅｃ(Wallac Oy, Turku, Finland)を使用して測定することができる。
【００６８】
ＦＳＨに関する「比活性」の語は、ＦＳＨについて認識された生物アッセイ、例えば、Ｓｔｅｅｌｍａｎ  Ｐｏｈｌｅｙバイオアッセイ[全タンパク質含有量についてのアッセイにより測定されたタンパク質の量で割る］、例えば、Ｌｏｗｒｙアッセイ[O. H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr and R.J. Randall (1951) J. Biol. Chem. 193: 265; Hartree E. E. (1972). Anal. Biochem. 48: 422; J. R. Dulley and P.A. Grieve (1975) Anal. Biochem. 64: 136]、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ[Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248]における、又は２８０ｎｍにおける吸光度による、調製物のＩＵにおける生物活性を意味する。
【００６９】
好ましくは、本発明により得られたＦＳＨは、約８０００ＩＵ／ｍｇ以上、より好ましくは約９０００ＩＵ／ｍｇ以上、より更に好ましくは約１００００ＩＵ／ｍｇ以上、より更に好ましくは約１４０００ＩＵ／ｍｇ以上の比活性を有する。ここで生物活性は、Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙバイオアッセイにより測定され、そしてタンパク質含有量はＳＥ−ＨＰＬＣにより測定される。
【００７０】
ＦＳＨ試料は、例えば、以下に示すような技術を使用して、手順の多様な段階においてこれらの純度に関して分析することができる。
【００７１】
ｒ−ｈＦＳＨ定量化／遊離αサブユニット／純度／酸化形態：ＲＰ−ＨＰＬＣ
上述のとおり、ＦＳＨは、α−及びβ−サブユニットから構成されるヘテロ二量体糖タンパク質である。いくらかのサブユニットの解離が起こり、これは試料中に存在する遊離αサブユニットの量に着目することによりモニターできる。更にＦＳＨサブユニットは酸化し得る。酸化混入物はＲＰ−ＨＰＬＣを使用して定量化することができ、一方遊離サブユニットはＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して評価することができる。
【００７２】
ｒ−ｈＦＳＨ定量化／イムノアッセイ
試料中のＦＳＨ含有量は、ＦＳＨに特異的なイムノアッセイ、例えば、ＤＥＬＦＩＡ  ＦＳＨイムノアッセイを使用して測定することができる。
【００７３】
総タンパク質：Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイ、２８０ｎｍにおける吸光度
いずれかのタンパク質調製と同様に、総タンパク質含有量は、例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイといった技術を使用して、あるいは２８０ｎｍにおける吸光度により測定することができる。
【００７４】
アイソフォームパターン：ＩＥＦ
上述のとおり、ＦＳＨは、両サブユニットにおける多様な場所において付着する複数のオリゴ糖残基を有する糖タンパク質である。該オリゴ糖残基は、異なる程度の分岐を有し、そしてシアル酸残基でキャップされてよい。シアル酸は負に帯電している（中性ｐＨにおいて）。キャッピングにおける違いは、異なる等電点（ｐＩ）を有する種類の混合物を伴う不均一性に導く。これは例えば、等電点電気泳動（ＩＥＦ）のような電荷に基づき分離する技術を使用して評価することができる。
【００７５】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）
宿主細胞タンパク質は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して分析することができる。例えば、抗体は、ＦＳＨ遺伝子を有さない宿主細胞の培養液である「偽の培養液」に上げることができる。
【実施例】
【００７６】
ここで、本発明を２つの例により説明する。
【００７７】
上記２つの例を説明する対応するフローチャートは、図１及び２に示される。生じた精製ｒ−ｈＦＳＨは「ｒ−ｈＦＳＨバルク」と称される。
【００７８】
例１（図１を参照のこと）
工程（１）：Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにおける色素アフィニティークロマトグラフィー
精製のためのＦＳＨ出発物質は、組換えＦＳＨ、すなわち血清培地中又は無血清培地中のいずれかにおけるＣＨＯ細胞中で組換え的に産生されたＦＳＨを含有する細胞培養液回収物から調製される。色素アフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ樹脂）を、Ｌ−メチオニンを含有するｐＨ８．５における低伝導率緩衝液で平衡化させる。添加後、平衡緩衝液を使用して結合されていない物質を洗い流す。最後にカラムを、ＮａＣｌ及びＬ−メチオニンを含有するｐＨ７．０におけるリン酸ナトリウムで流すことによりＦＳＨを溶出させる。該溶出プールを次の工程に直接処理する。該工程は２〜８℃において行う。
【００７９】
工程（２）：Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍにおける疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
工程（１）由来のＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ溶出物を、硫酸アンモニウム及びＬ−メチオニンを含有するｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液に対して平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムに添加する。平衡緩衝液で結合されていない物質を洗い流す。より低濃度の硫酸アンモニウムであるが、同じ緩衝液でＦＳＨを溶出させる。溶出物を次の工程において処理する。該工程は室温で行われる。
【００８０】
工程（３）：Ｓｏｕｒｃｅ  ３０  ＲＰＣにおける逆相クロマトグラフィー
まず、ＩＰＡ（イソプロパノール）の添加により、ＨＩＣ溶出物（工程（２）由来）を調整する。Ｓｏｕｒｃｅ  ３０  ＲＰＣカラムを、調整した添加物質と同じ濃度におけるＬ−メチオニン及び２−プロパノールを含有するｐＨ７．６の酢酸アンモニウム緩衝液に対して平衡化する。平衡緩衝液で結合していない物質を流した後、該樹脂を、Ｌ−メチオニン及び上昇させた濃度の２−プロパノールを含有するｐＨ７．６の酢酸アンモニウム緩衝液で洗浄する。更に２プロパノールの濃度を上昇させることにより、ＦＳＨを最終的に溶出させる。最後に、該溶出プールを、撹拌しながらＬ−メチオニンを含有する水で希釈する。該希釈したプールを次の工程において処理する。該工程は室温で行われる。
【００８１】
上述の手順に従い、精製の要因−すなわち、精製した試料中のＦＳＨ純度と出発材料中のＦＳＨ純度（粗ＦＳＨ）の割合は、約４０．０００である。
【００８２】
例２（図２を参照のこと）
工程（−１）：濃縮ｒ−ｈＦＳＨの限外濾過／ダイアフィルトレーション
全ての操作は冷却遠心条件（２〜８℃）において行った。精製のための出発材料を形成する粗ＦＳＨは、組換えＦＳＨを含有する細胞培養液回収物に由来する。
【００８３】
清澄化
粗ｒ−ｈＦＳＨを、０．５μｍのデプスフィルター（例えば、Ｐａｌｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ＩＩフィルター又はこれと同等のもの）を通して濾過した。
【００８４】
限外濾過
まず、１０ＫＤポリエーテルスルホン膜を使用して、限外濾過により清澄化した未精製物を濃縮した。それから、濃縮した保持液（retentate）を、抗酸化剤としてＬ−メチオニンを含有するｐＨ８．５の少なくとも５回量（diavolume）のホウ酸緩衝液でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションの進行をモニターするために保持液の伝導率及びｐＨを測定した。それから該系を排出する更に前に、保持液を濃縮した。限外濾過ユニットは最後にダイアフィルトレーション緩衝液で流し、そしてリンス液を回収した保持液と混合した。該プールを次の工程に用いた。
【００８５】
濾過
濃縮した生成物を、０．２μｍのポリエーテルスルホンフィルター（又はこれと同等のもの）を通して濾過した。
【００８６】
工程（０）：Ｑ  セファロース  ＦＦにおける陰イオン交換
それから、濾過した物質を、Ｌ−メチオニンを含有するｐＨ８．５のホウ酸ナトリム緩衝液に対して平衡化した強陰イオン交換（Ｑ  セファロース  ＦＦ）樹脂に適用した。添加後、結合していない全ての物質を流すために、該カラムを平衡緩衝液でリンスした。それから該カラムを、ＮａＣｌ（伝導性を増すため）及びＬ−メチオニン（抗酸化剤として）を含有するｐＨ８．５のホウ酸ナトリウム緩衝液で溶出させた。回収した溶出プールは、色素アフィニティークロマトグラフィーにおいて処理した。
【００８７】
工程（１）：Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにおける色素アフィニティークロマトグラフィー
まず、色素アフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｂｌｕｅ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ樹脂）を、Ｑ−セファロースＦＦ工程由来の溶出緩衝液で平衡化した。それから捕獲溶出物を樹脂に直接適用した。添加後、平衡緩衝液を使用して結合されていない物質を洗い流した。最後に、該カラムを、ＮａＣｌ及びＬ−メチオニンを含有するｐＨ７．０におけるリン酸ナトリウムで流すことによりＦＳＨを溶出させた。該溶出プールを次の工程において直接処理した。該工程は２〜８℃において行った。
【００８８】
工程（２）：Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍにおける疎水性相互作用クロマトグラフィー
Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ溶出物を、硫酸アンモニウム及びＬ−メチオニンを含有するｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液に対して平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムに添加した。平衡緩衝液で結合されていない物質を洗い流した。低濃度の硫酸アンモニウムであるが、同じ緩衝液でＦＳＨを溶出させた。溶出物を次の工程において処理した。該工程は室温で行った。
【００８９】
工程（３）：Ｓｏｕｒｃｅ  ３０ＲＰＣにおける逆相
まず、ＩＰＡ（イソプロパノール）の添加により、ＨＩＣ溶出物（工程（２）由来）を調整した。Ｓｏｕｒｃｅ  ３０ＲＰＣカラムを、調整した添加物質と同じ濃度における、Ｌ−メチオニン及び２−プロパノールを含有するｐＨ７．６の酢酸アンモニウム緩衝液に対して平衡化した。平衡緩衝液で結合していない物質を流した後、該樹脂を、Ｌ−メチオニン及び上昇濃度の２−プロパノールを含有するｐＨ７．６の酢酸アンモニウム緩衝液で洗浄する。更に２プロパノールの濃度を上昇させることにより、ＦＳＨを最終的に溶出させる。最後に、該溶出プールを、撹拌しながらＬ−メチオニンを含有する水で希釈する。該希釈したプールを次の工程において処理する。該工程は室温で行った。
【００９０】
工程（４）：Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ｈｉｃａｐ樹脂における陰イオン交換クロマトグラフィー
まず、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ｈｉｃａｐカラムをＬ−メチオニンを含有するｐＨ８．５のホウ酸ナトリウム緩衝液で平衡化した。希釈したポスト−ＲＰＣ物質（工程（３）由来））を該カラムに添加した。平衡緩衝液を使用して結合していない物質を流した。ＦＳＨを、直線的に塩濃度が増加するカラムから溶出する。該工程は２〜８℃において行った。
【００９１】
工程（４’）：ナノ濾過
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ−ＴＭＡＥ工程（４）由来の溶出物を、窒素雰囲気下における３ｂａｒの気圧において２０ｎｍのナノ濾過装置に直接適用した。該濾液を次の工程において処理する。該操作は２〜８において行った。
【００９２】
工程（５）：バルク限外濾過
ナノ濾過したＦＳＨ物質を、５ＫＤポリエーテルスルホン膜において接線流濾過により濃縮した。保持液が初期容量のおよそ半分に達してから、該物質をＷＦＩに対するダイアフィルトレーションにより緩衝液交換した。
【００９３】
試料の純度
精製工程後のＦＳＨ試料の純度を測定した。
【表５】
2008519010.tif 000006
【００９４】
試料の生物活性
精製したｒ−ｈＦＳＨの生物活性を、Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ卵巣重量増加法を使用して測定した。比活性は、以下のとおりＳＥ−ＨＰＬＣ法により測定したＦＳＨ含有量で割った生物活性を使用して計算した。
【００９５】
得られた最終バルクの比活性は、典型的には１００００〜１７０００ＩＵ／ｍｇであった。例２の方法に従い得られた最終バルクＦＳＨの２つの試料についての代表的な値を表１に示す。
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、本発明、すなわち以下の工程：  ・  色素アフィニティークロマトグラフィー、  ・  疎水性相互作用クロマトグラフィー、  ・  逆相クロマトグラフィー、を含んで成る精製方法を説明する。
【図２】図１は、本発明の具体的な態様、すなわち以下の工程：  ・  限外濾過／ダイアフィルトレーション  ・  陰イオン交換クロマトグラフィー、  ・  色素アフィニティークロマトグラフィー、  ・  疎水性相互作用クロマトグラフィー、  ・  逆相クロマトグラフィー、  ・  陰イオン交換クロマトグラフィー、  ・  ナノ濾過  ・  限外濾過／ダイアフィルトレーション；を含んで成る精製方法、のフローチャートを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９７】
配列
配列番号１：ヒト糖タンパク質α−サブユニット；
配列番号２：ｈＦＳＨβ−サブユニット
配列番号３：ｈＦＳＨβ−サブユニット変異体１
配列番号４：ｈＦＳＨβ−サブユニット変異体２
配列番号５：ｈＦＳＨβ−サブユニット変異体３
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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