(57)【要約】  本発明は、標的薬物送達のための脂質化グリコサミノグルカン粒子に封入された水不溶性又は水難溶性薬物の処方を提供する。
2008519076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのグリコサミノグリカンと、第１級アミノ基を有する少なくとも１つの脂質との反応生成物を含むことを特徴とし、そして水不溶性又は水難溶性活性成分を封入している、脂質化グリコサミノグリカン粒子。
【請求項２】
水不溶性又は難溶性活性成分が、癌を治療するための化学療法剤である、請求項１記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子。
【請求項３】
該化学療法剤が、パクリタキセルである、請求項２記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子。
【請求項４】
該少なくとも１つの脂質が、ジラウリル・ホスファチジル・エタノールアミンである、請求項３記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子。
【請求項５】
該少なくとも１つのグリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、ケラチン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマチン（dermatin）硫酸、並びにこれらの断片、塩、及び混合物よりなる群から選択される、請求項１記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子。
【請求項６】
該少なくとも１つのグリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸である、請求項１記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子。
【請求項７】
脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである、請求項１記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子。
【請求項８】
該ホスファチジルエタノールアミンが、ジパルミトイル・ホスファチジルエタノールアミンである、請求項７記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子。
【請求項９】
該ホスファチジルエタノールアミンが、ジラウリル・ホスファチジルエタノールアミンである、請求項７記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子。
【請求項１０】
粒度が、約２〜５ミクロンの範囲にある、請求項１記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子。
【請求項１１】
粒度が、約５０〜２００ナノメートルの範囲にある、請求項１記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子。
【請求項１２】
請求項１記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子及び薬剤学的に許容しうる担体、希釈剤、賦形剤又は助剤を含むことを特徴とする、薬剤組成物。
【請求項１３】
ある病態に苦しむ対象の治療方法であって、該対象に、その病態を治療するために、有効量の請求項１記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子に封入された水不溶性又は水難溶性活性成分を投与することを特徴とする方法。
【請求項１４】
病態が、癌である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
水不溶性又は難溶性活性成分が、パクリタキセルである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ある適応症を治療するのに有効な水不溶性又は水難溶性薬物で、該適応症を治療する方法において、該薬物が、脂質化グリコサミノグリカン粒子に封入されて投与されるという改良法。
【請求項１７】
請求項１記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子の製造方法であって、
脂質及び水不溶性又は水難溶性活性成分を別々に有機溶媒に溶解すること；
溶解した脂質及び溶解した水不溶性又は水難溶性活性成分を一緒にして合わせた溶液にすること；
合わせた溶液を蒸発乾固して、塩基性ホウ酸緩衝液に懸濁液として分散させること；
この分散懸濁液を、カップリング剤とのプレインキュベーションにより活性化したグリコサミノグリカンの溶液と混合及びインキュベートして、水不溶性又は水難溶性活性成分を封入している脂質化グリコサミノグリカン粒子を形成すること；そして
脂質化グリコサミノグリカン粒子を濃縮するために、連続遠心分離により分画すること
を特徴とする方法。
【請求項１８】
更に、分画及び濃縮した脂質化グリコサミノグリカン粒子を凍結乾燥することを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
該ホスファチジルエタノールアミンが、ジパルミトイル・ホスファチジルエタノールアミン及びジラウリル・ホスファチジルエタノールアミンよりなる群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該有機溶媒が、エタノールである、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
該グリコサミノグリカンが、ヒアルロナンである、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
該混合分散懸濁液及び活性化グリコサミノグリカン溶液が、約１：１のグリコサミノグリカン対脂質の重量比を有する、請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
該混合分散懸濁液及び活性化グリコサミノグリカン溶液が、約１：１０〜１：２の範囲の活性成分対脂質のモル比を有する、請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
ある病態の治療用の医薬の処方における請求項１記載の脂質化グリコサミノグリカン粒子の使用であって、該脂質化グリコサミノグリカン粒子に、該病態を治療するのに有効な水不溶性又は水難溶性活性成分を封入することによる使用。
【請求項２６】
病態が、癌である、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
水不溶性又は水難溶性活性成分が、パクリタキセルである、請求項２６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法１１９（ｅ）条の下で、２００４年１１月２日出願の米国仮出願第60/623,862号からの優先権の利益を主張するが、これの全内容は、引用例として本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、薬物送達及び処方、そして具体的には水不溶性又は水難溶性薬物を封入している脂質化グリコサミノグリカンの粒子、並びに病態の診断及び治療におけるこれらの使用に関する。
【０００３】
関連技術の説明
グリコサミノグリカン、即ちムコ多糖類は、コラーゲンと共に、全ての結合組織の主要な構造要素である。グリコサミノグリカン、即ちｇａｇは、少量のタンパク質を伴う多糖鎖の大きな複合体である。これらの化合物は、大量の水を結合する能力を持ち、その結果生体の結合組織を形成するゲル様マトリックスを作り出す。ｇａｇは、繰り返し二糖単位（アミノ糖−酸性糖繰り返し単位）からなる長鎖である。アミノ糖は、典型的にはグルコサミン又はガラクトサミンである。アミノ糖はまた、硫酸化することができる。酸性糖は、Ｄ−グルクロン酸又はＬ−イズロン酸であってよい。インビボで、ヒアルロン酸以外のｇａｇは、タンパク質に共有結合して、プロテオグリカンモノマーを形成する。この多糖鎖は、酸性糖及びアミノ糖の逐次付加により伸長する。
【０００４】
最もありふれたｇａｇには、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、及びデルマチン硫酸がある。ｇａｇは、化学修飾することにより、その最初に抽出された形よりも多くの硫黄基を含むことができる。更に、ｇａｇは、部分又は完全合成することができ、そして植物又は動物由来のいずれかであってよい。
【０００５】
ヒアルロン酸は、関節の軟骨及び滑液に、更には硝子体液に、血管壁、並びに臍帯及び他の結合組織に特に高濃度で存在する、天然のグリコサミノグリカンファミリーの一員である。ヒアルロン酸は、滑液中のように遊離型であっても、そして細胞外マトリックス成分のように結合型であってもよい。この多糖類は、交互のβ−１，３−グルクロニジン及びβ−１，４−グルコサミニジン結合により結合している、交互のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びＤ−グルクロン酸残基からなる。水中で、ヒアルロン酸は、溶解して高粘性流体を形成する。自然源から単離したヒアルロン酸の分子量は、一般に５×１０4〜１０7ダルトンの範囲に入る。ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスに対する、並びに乳房、脳、肺、皮膚、及び他の臓器と組織の腫瘍を含む種々の腫瘍への、高親和性を有する。
【０００６】
薬物送達システムは、体内への薬物の投与によって長時間にわたる薬物の一定の血中レベルを維持するために、又は全身性若しくは局所投与によって、そして長時間にわたって特定の標的臓器での薬物の最適濃度を維持するために使用される。例えば、化学修飾したヒアルロン酸は、放出制御型薬物送達のために使用することができる。Balazsらは、米国特許4,582,865において、ヒアルロン酸の架橋ゲルが、そこに分散した（しかしゲル高分子マトリックスに共有結合していない）低分子量物質の放出を減速させることができることを報告した。薬物の担体として、ポリマーの薄膜の使用又はリポソームの使用を含む、他の形の製剤／処方が、薬物送達システムとして使用されている。
【０００７】
薬物担体には２つの基本的分類が存在する：細胞、ミクロスフェア、ウイルスエンベロープ、及びリポソームのような、微粒子系；並びにタンパク質又は合成ポリマーのような高分子からなる、通常は可溶性系である、非微粒子系。
【０００８】
しかし臨床的に利用できる薬物投与剤形の大多数（９９％以上）は、遊離薬物の処方である。それでもなお、薬物送達システムとして機能する、顕微鏡的及び超顕微鏡的微粒子担体は、遊離薬物での治療に比較した臨床転帰を改善するために使用されている。担体中への閉じ込めは、薬物を生物学的環境から保護し、分解及び不活化のリスクを減少させる。封入はまた、遊離薬物の無差別な分布から生物学的環境を保護して、毒性及び有害な副作用のリスクを減少させる。担体の仲介によって、早過ぎる薬物クリアランスが減少し、全身性又は局所投与により長時間にわたって薬物の一定の血中レベル及び／又は標的臓器における薬物の最適濃度が確保される。微粒子担体は、徐放性又は放出制御性の薬物貯蔵庫として機能し、それによって薬効の改善に寄与し、投与頻度を減少させられる。
【０００９】
提案された利点にもかかわらず、薬物を封入するバイオポリマーの使用に関して幾つかの問題点がある。例えば、マイクロ粒子又はナノ粒子として構成されたバイオポリマーは、標的化能力が限定されており、循環中の保持及び安定性が限定されており、長期投与による潜在毒性を持ち、そして浸出させることができない。抗体、糖タンパク質、及びレクチンを含む、様々な認識物質を、リポソーム、ミクロスフェアなどのような微粒子系に（これらをある程度標的化できるようにするために）結合させる多くの試みが行われた。微粒子系へのこれらの認識物質の結合は成功しているが、得られる修飾微粒子系は、特にインビボでは望みどおりには機能しなかった。
【００１０】
他の問題点もまた、このような認識物質を使用するときに生じる。例えば、抗体は、患者特異的であり、よって薬物療法の費用を増大させる。更には、認識物質と担体の間の結合が全て共有結合とは限らない。非共有結合の場合には、認識物質を求めての微粒子系と標的部位に対する認識の相手方との間の競合によって、投与の部位で微粒子系から認識物質が解離してしまうかもしれないため、共有結合は必須である。このような解離により、投与した修飾微粒子系は、正規の微粒子系に立ち戻ってしまい、そのため、修飾微粒子系の投与の目的は挫折するかもしれない。
【００１１】
乏しい水溶解度を有する薬物（以降、水難溶性及び水不溶性薬物と呼ばれる）に関して言えば、遊離薬物での治療には更に別の欠陥がある。とにかく治療が可能な投与剤形を作成するために、薬物を可溶化するには充分に疎水性であるが、水性媒体中への投与に適応させるには充分に親水性であるビヒクル中に、水不溶性又は水難溶性薬物を配合することが必要である。これらのビヒクルは通常、パクリタキセルに使用されるクレモフォール（Cremophor）ＥＬ（ポリエトキシル化ひまし油）とエタノールとの１：１ブレンドのような、洗剤様物質である。欠点は、これらのビヒクル及び他の同様の洗剤に基づくビヒクルは毒性が高く、そして患者に過敏性反応及びヒスタミンの放出を引き起こすことである。
【００１２】
サクライ（Sakurai）らの米国特許5,733,892は、水性溶液に可溶性の脂質化グリコサミノグリカン分子を開示している。WO 03/015755は、水相中の粒子の懸濁液を形成する、脂質化グリコサミノグリカン粒子の同様の系を開示している。現在利用可能な送達技術のいずれもが、水不溶性及び水難溶性薬物の標的化送達に関連する問題に対する満足な解決策を与えないため、本発明は、WO 03/015755の脂質化グリコサミノグリカン粒子を改良した。
【００１３】
本明細書のどの文献の引用も、このような文献が関連先行技術であることの承認を意図するものでなく、また本出願の任意の請求の範囲の特許性に問題となるものとは考えられない。任意の文献の内容又は日付に関する記述のいずれもが、出願時に出願人が入手できる情報に基づいており、このような記述の正確性に関する承認を構成するものではない。
【００１４】
発明の要約
本発明の目的は、先行技術における欠陥を克服することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、水不溶性又は水難溶性薬物を封入するための脂質化グリコサミノグリカン粒子を形成することである。
【００１６】
本発明の更に別の目的は、このような脂質化グリコサミノグリカン粒子に封入された水不溶性又は水難溶性薬物を送達することである。
【００１７】
本発明は、「ガゴマー（gagomers）」とも呼ばれる、脂質化グリコサミノグリカン粒子に封入された水不溶性又は水難溶性薬物の処方を提供する。このようなガゴマーは、第１級アミノ基を有する脂質をカルボン酸含有グリコサミノグリカンに架橋することにより製造される生体接着性バイオポリマーである。マイクロ粒子又はナノ粒子（マイクロ粒子では大体が約２〜５ミクロンの粒径範囲であり、そしてナノ粒子では５０〜２００ナノメートルの範囲である）が、制御されたやり方で形成される。水不溶性又は水難溶性である、小さいか又は大きな活性成分／薬物は、これらのガゴマー粒子に、５０％を超える、そして通常は８０％を超える高効率で、封入／捕捉させることができる。
【００１８】
本発明はまた、脂質化グリコサミノグリカン粒子に封入された水不溶性又は水難溶性薬物／活性成分を含む、薬剤組成物を提供する。
【００１９】
本発明の他の態様は、脂質化グリコサミノグリカン粒子に封入された薬物／活性成分の製造方法、及び脂質化グリコサミノグリカン粒子に封入された有効量の水不溶性又は水難溶性活性成分／薬物を投与することによる、ある病態に苦しむ対象の治療方法を含む。
【００２０】
本発明の更に別の態様は、ある適応症を治療するのに有効な水不溶性又は水難溶性薬物で、この適応症を治療するための改良法に関するが、ここでこの改良とは、水不溶性又は水難溶性薬物が、脂質化グリコサミノグリカン粒子に封入されて投与されることである。
【００２１】
図面の簡単な説明
図１は、ＤＭＳＯ経由法における、ガゴマー濃度（単位：mgＰＥ/ml）の関数としてのガゴマー中のパクリタキセル封入の効率を示すグラフである。点は、リストされる様々な初期薬物濃度で得られた実験データである。実線及びエラーバーは、全データ点の平均封入効率及びｓｄである。
【００２２】
図２は、エタノール経由法における、ガゴマー濃度（単位：mgＰＥ/ml）の関数としてのガゴマー中のパクリタキセル封入の効率を示すグラフである。点は、リストされる様々な初期薬物濃度で得られた実験データである。実線は、非理論的であり、データの傾向を強調するために描かれている。
【００２３】
図３は、ＰＥ経由法における、ガゴマー濃度（単位：mgＰＥ/ml）の関数としてのガゴマー中のパクリタキセル封入、担体調製法及び薬物封入の効率を示すグラフである。点は、リストされる様々な初期薬物濃度で得られた実験データである。実線及びエラーバーは、全データ点の平均封入効率及びｓｄである。
【００２４】
図４は、３つのタイプの処方（即ち、ＤＭＳＯ経由法、エタノール経由法及びＰＥ経由法）における、薬物／ガゴマー比の関数としてのパクリタキセル封入の効率の比較を示すグラフである。使用した略語：ＴＸ−パクリタキセル；ＧＡＧ−ガゴマー；ＨＡ−ヒアルロナン；ＰＥ−ホスファチジルエタノールアミン。点は、実験値であり、記号は以下のとおりである：白抜き四角：ＤＭＳＯ経由法；白抜き円：エタノール経由法；塗りつぶし円：ＰＥ経由法。実線の曲線は、非理論的であり、データの傾向を強調するために描かれている。
【００２５】
図５は、５０％ヒト血清中で３７℃で、時間の関数としての薬物を含まないガゴマー及びパクリタキセル封入ガゴマー（エタノール法により調製）の安定性を示すグラフである。ガゴマー中のＨＡ濃度、ガゴマー中のＰＥ濃度、薬物封入のレベルを別々にモニターする。薬物を含まないガゴマー及びパクリタキセル封入性ガゴマー（ＴＸ−ＧＡＧ）は、エタノール経由法により調製した。点は、実験値であり、各試験した変数に関する特定の記号がリストされている。実線の曲線は、非理論的であり、データの傾向を強調するために描かれている。
【００２６】
図６は、別々に、ＰＢＳ中、及び５０％血清中で、一定方向の流れ（吸い込み）条件下での、エタノール経由法で調製したガゴマーからのパクリタキセル流出の動態を示すグラフである。従属変数のｆtは、時間＝ｔでの処方から放出された総薬物の割合である。点は、実験データである。実線の曲線は、等式（１）及び表３の脚注に列挙された速度論パラメーターにより描かれた理論的予想である。
【００２７】
図７は、ガゴマー内に装填された不溶性薬物の製造工程のスキームを示す。
【００２８】
図８は、リン酸緩衝生理食塩水単独（淡色のバー）、又は同じ緩衝液であるが０．２％ウシ血清アルブミンを含むもの（濃色のバー）で洗浄した、遠心分離ペレット中のパクリタキセル（ＴＸ）の保持率を示すグラフである。
【００２９】
図９は、薬物を装填したガゴマー及び薬物を含まないガゴマー、更には遊離薬物の示差走査熱量測定を示す。上半分：遊離パクリタキセル−結晶型（点線）及び水和型（断続線）並びに薬物を含まないガゴマー（黒色実線）。下半分：遊離結晶型（黒色実線）又は水和型（断続線）パクリタキセルと、薬物を含まないガゴマーとの混合物（１：２の薬物：脂質モル比）。パクリタキセル装填ガゴマー（点線）（これも１：２の薬物：脂質モル比）。
【００３０】
図１０は、Ｂ１６Ｆ１０．９細胞の培養液中の、滅菌前後の遊離パクリタキセル及びパクリタキセル装填ガゴマーの細胞毒性を示すグラフである。
【００３１】
発明の詳細な説明
「ガゴマー」とも呼ばれる、脂質化グリコサミノグリカン粒子は、先行技術の限界及び欠陥を克服する、水不溶性及び水難溶性薬物／活性成分のための新規な薬物送達技術である。この技術は、製造法及び臨床転帰の両方に関して顕著に性能が改善された多用途で多品種の薬物送達システムを提供する。これらのガゴマーは、全身性、局所性、及び限局性投与のための、部位接着性で部位保持性の徐放性薬物貯蔵庫として機能する能力を有する。水不溶性又は水難溶性薬物での使用のためのこの技術の導入は、標的化薬物送達方式における最先端技術を著しく前進させることが期待される。
【００３２】
ガゴマー粒子は、グリコサミノグリカンを少なくとも１つの脂質と、好ましくはホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のようなリン脂質と、更に好ましくはジラウリル・ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）又はジパルミトイル・ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）（鎖長が異なる）と反応させて、グリコサミノグリカン中のカルボン酸基を脂質中の第１級アミンと架橋させることにより調製される、生体接着性バイオポリマーである。好ましくは、グリコサミノグリカンのカルボキシル残基と脂質の第１級アミンとの間に共有結合を形成する、カルボジイミド型のカップリング剤が、架橋に使用される。
【００３３】
本発明者らにより発見されたガゴマー技術の独自の特色は、これらの担体粒子が、その内部脂質領域のおかげで、いかなる毒性で有害な副作用を引き起こす洗剤様ビヒクルをも含める必要なく、水不溶性及び水難溶性薬物の可溶化及び封入のための環境を提供することである。よってガゴマー粒子は、水不溶性及び水難溶性薬物のための標的化送達システムとして機能する有利な能力を有する。水不溶性及び水難溶性薬物は、高効率でガゴマー粒子に封入されて、本発明の薬物封入性ガゴマー粒子を形成する。よって生じる処方は、血清中で安定であり、そして等量の遊離薬物と同様か、又はより良好なレベルで薬物活性を保持する、徐放性薬物貯蔵庫として機能する。
【００３４】
本発明は、ガゴマー粒子中の水不溶性又は水難溶性薬物の処方、この薬物封入性ガゴマーを含む薬剤組成物、並びにその製造方法及び使用に関する。
【００３５】
本発明のガゴマー粒子に封入される水難溶性薬物の好ましい実施態様は、イチイ科植物（pacific yew plant）の樹皮から最初に単離された細胞毒性薬物である、パクリタキセル（タキソール；ＴＸ）である。パクリタキセルは、非常に安定かつ機能不全の細胞内マイクロチューブリンの作成を促進するので、正常な小管の動態が混乱し、それによって細胞分裂を妨げるため、細胞死をもたらす。この活性に基づいて、パクリタキセルは、卵巣癌、乳癌、結腸癌、頭部癌、非小細胞肺癌、及びＡＩＤＳ関連カポジ肉腫を含む、多種多様な癌に対する化学療法剤として使用される。パクリタキセルによる治療は、一般的に上で考察されるように、２つの主要な問題を抱えている：（１）どんな化学療法薬物もそうであるように腫瘍標的化担体を極度に必要とすること；及び（２）水性溶液に極めて難溶性であること。臨床的に使用される現在承認されているパクリタキセルの処方では、パクリタキセルは、非常に毒性のあるクレモフォールＥＬ（ポリエトキシル化ひまし油）とエタノールとの１：１ブレンドに溶解されている。
【００３６】
この分野で進められている努力は、ほとんどがクレモフォールＥＬ／エタノールのブレンドを、ＰＥＧ化リポソームのような担体を含む、もっと好ましいビヒクルに置き換えることに焦点を合わせている。しかし今までのところ、どれも充分に満足できるものであることが証明されていない。より良いビヒクルが溶解度の問題を克服するのに有用であるかもしれないが、その努力のどれもが、腫瘍標的化の問題に対処していない。それに反して、本発明のガゴマー粒子に封入されたパクリタキセルの好ましい実施態様は、単一の担体／送達技術において、標的化と溶解度の問題の両方に対処する。これは、患者における毒性及び有害作用を軽減し、同時に治療効果を増強することにより、臨床転帰における著しい改善が得られるはずである。
【００３７】
脂質化グリコサミノグリカン粒子に封入された水溶性薬物が、特に薬物耐性になった癌細胞に対して、遊離薬物よりもはるかに有効であることは以前に見い出されている。ガゴマーが、癌細胞に付着し、そのため、排出されるよりも速く細胞中に入ることができる薬物の貯蔵庫になると考えられる。よってこれらの水溶性薬物は、癌細胞中で発生した薬物耐性機序にもかかわらず、細胞に及ぼす毒性作用を有する。本発明の脂質化グリコサミノグリカン粒子に封入された水不溶性又は水難溶性薬物もまた、遊離薬物に比較して細胞に及ぼす作用が増強されていることが期待される。
【００３８】
パクリタキセルに加えて、ガゴマー粒子への封入用の水難溶性の薬物／薬物モデルの他の非限定例は、表１にその治療適応と共に提示されている。≦３０μg/mlの水溶解度を持つ薬物は、水難溶性又は水不溶性と考えられる。本発明の目的には、「薬物」という用語は、生体に治療的に作用しうる任意の物質を意味するものである。治療薬物の例は、癌治療用の化学療法剤、感染症治療用の抗生物質、真菌感染症治療用の抗真菌剤、炎症治療用の抗炎症剤などを含む。以下の実施例に示されるように、脂質のジラウリル・ホスファチジルエタノールアミンは、調製法、封入効率及び細胞毒性に基づいて、パクリタキセルを封入するのに好ましい。しかし幾つかの他の薬物には、ジパルミトイル・ホスファチジルエタノールアミンが、より良く好ましいことが判るであろう。
【００３９】
【表１】
2008519076.tif 000003
【００４０】
本発明において使用されるガゴマーは、薬物捕捉性接着性バイオポリマーを利用する、それぞれ、ＭＤＤＳ及びＮＤＤＳとも呼ばれる、非毒性のマイクロ粒子及びナノ粒子薬物送達システムである。水不溶性又は水難溶性薬物を装填されると、これらの担体は、遊離型で投与された同じ薬物に比較して臨床転帰を改善する。更には、これらのガゴマー粒子は、以下のような他の粒子担体を上まわる幾つかの他の利点を有する；（１）良好かつ充分な循環血中の保持−グリコサミノグリカン成分は既に、オプソニン作用及びＲＥＳによる取り込みを遅延させることが見い出された親水性外殻を持つ、及び（２）グリコサミノグリカン成分の生体接着性が、インビボ認識部位に高親和性で接着する能力をガゴマー粒子に与え、そして活発な標的化の手段を与える。
【００４１】
本発明の薬物封入性ガゴマーは、それを必要としている対象の病態を治療するための薬剤組成物において使用することができる。本明細書において使用されるとき「対象」という用語は、ヒト及び他の哺乳動物（ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスなど）、更には両生類、鳥類、爬虫類及び魚類を含む動物を含むものと解釈される。
【００４２】
本発明の薬物封入ガゴマーでの治療に適した病態は、水不溶性又は水難溶性薬物が治療に使用される、任意の適応症を含む。特に限定されないが、例として、癌、細菌及び真菌感染症（火傷のような外傷に続発するものを含む）、寄生虫又はウイルスにより引き起こされる感染症、創傷治癒、炎症などを含む。よって本発明はまた、ある病態に苦しむ対象の治療方法であって、この対象に、その病態を治療するために有効量の本発明のガゴマーに封入された水不溶性又は水難溶性成分を投与することを含む方法を提供する。パクリタキセルの好ましい薬物実施態様の場合には、その病態は癌である。
【００４３】
本発明は更に、特定の適応症の治療を必要とする対象に、その適応症を治療するのに有効な水不溶性又は水難溶性薬物を送達するための現行法の改良であって、対象に投与される薬物が、ガゴマー粒子に封入されていることである改良である。
【００４４】
天然のグリコサミノグリカンは、免疫原性及び細胞毒性に関する問題を回避するために、本発明に使用されるガゴマーにおいて好ましいが、合成グリコサミノグリカンも使用することができ、更には、特に限定されないが、コンドロイチン、ヒアルロン酸、グルクロン酸、イズロン酸、ケラタン硫酸、ケラチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマチン硫酸、並びにこれらの断片、塩、及び混合物を含む、天然、合成、又は半合成分子も使用することができる。本明細書において使用されるとき「グリコサミノグリカン」という用語は更に、グリコサミノグリカンの塩及び遊離酸、並びに化学変性されている（しかし部分加水分解されていない）がその機能を保持しているグリコサミノグリカン類を包含する。これらの修飾は、特に限定されないが、エステル化、硫酸化、多硫酸化、及びメチル化を含む。一例としてヒアルロン酸（ＨＡ）を用いると、そのヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、及びヒアルロン酸カルシウムを含む。
【００４５】
グリコサミノグリカンの自然源は、植物源と動物源の両方、即ち、ブナの木及び動物軟骨の形（サメ軟骨を含む）、ウシ気管、クジラ隔膜、ブタの鼻、並びにモエギイガイ（Perna canaliculus）及びナマコのような軟体動物を含む。
【００４６】
グリコサミノグリカンは、これらが、その生物原料から精製されるときに得られ、そして化学的及び／又は生物学的分解に付されていないサイズで使用される。例えば、ヒアルロン酸では、これは、約１×１０5〜約１×１０7ダルトンの範囲に相当する。
【００４７】
本発明の薬物封入性ガゴマーを含む薬剤組成物は、非経口、例えば、皮下、静脈内、局所、筋肉内、腹腔内、経皮、直腸内、膣内、鼻内又は眼内を含む、任意の都合のよい経路により投与することができる。あるいは又は同時に、投与は、経口経路によってもよい。
【００４８】
非経口投与は、ボーラス注射によるか、又は時間をかけての緩やかな注入によって行うことができる。非経口投与は、一般には注射、最も典型的には皮下、筋肉内又は静脈内注射を特徴とする。
【００４９】
本発明の薬物封入性ガゴマー粒子、浸透促進剤、及び他の生物学的活性薬物又は医薬からなる局所処方は、多くの方法で適用することができる。液体処方は、適切な送達装置から、適切な皮膚の領域又は病変皮膚又は粘膜に滴下により適用し、手で擦り込むか、又は単に空気乾燥させることができる。適切なゲル化剤を液体処方に加えることができ、そしてこの調剤は、適切な領域に適用して、擦り込むことができる。創傷又は火傷への投与には、ガゴマーは、油剤、乳剤などのような投与剤形に組み込むことができる。このような調剤は、ローション剤、クリーム剤、泥膏、軟膏剤などの剤形にして、患部に直接適用することができる。
【００５０】
あるいは、局所液体処方は、スプレー装置に入れて、スプレーとして送達することができる。この型の薬物送達装置は、皮膚病に罹患した広い面積の皮膚への、ひどい敏感肌への、又は鼻腔若しくは口腔への適用には特に適している。場合により、ガゴマーは、軟膏剤又は経皮パッチの剤形にして投与することができる。
【００５１】
投与の経口経路は、投与の口腔内及び舌下経路を含むものと理解される。
【００５２】
本発明のガゴマーはまた、粘膜による取り込みを最適化する、他の経路により投与することができる。例えば、膣内（特に膣内病態を治療する場合に）、直腸内及び鼻内経路は、投与の好ましい経路である。更にはガゴマーは、粘膜組織又は表皮を通しての送達に特に適している。鼻内投与されるならば、ガゴマーは、典型的にはエーロゾルの剤形で、又は点鼻剤の剤形で投与されよう。これは、肺病変の治療には特に有用である。適切な処方は、「レミントンの製剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」（第16及び18版、Mack Publishing、イーストン、ペンシルバニア州（1980及び1990））及び「製剤の投与剤形序説（Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms）」（第4版、Lea & Febiger、フィラデルフィア（1985））に見い出すことができるが、これらはそれぞれ引用例として本明細書に取り込まれる。
【００５３】
所望の投与の様式に応じて、使用される組成物は、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、液剤、懸濁剤などのような、固体、半固体又は液体投与剤形にしてよく、好ましくは、正確な用量の単回投与に適した単位投与剤形にしてよい。本薬剤組成物は、本発明の薬物封入性ガゴマー粒子及び薬剤学的に許容しうる希釈剤、担体、賦形剤、補助剤、又は助剤を含む。薬剤学的に許容しうる担体は、活性化合物に対して化学的に不活性であり、かつ使用条件下で有害な副作用又は毒性を持たないものであることが好ましい。担体の選択は、ある程度は特定の活性成分によって、更には組成物を投与するのに使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の薬剤組成物には多種多様な適切な処方が存在する。
【００５４】
適切な賦形剤は、詳細には、糖類（例えば、乳糖又はショ糖、マンニトール、ソルビトールなど）、セルロース調剤及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、リン酸水素カルシウムなど）のような充填剤、更には、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプンを用いるデンプン糊、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドンのような結合剤である。
【００５５】
非経口投与用の注射処方は、液体懸濁液として、注射前に液体に入れて溶液若しくは懸濁液にするのに適した固体剤形、又は乳濁液として調製することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。更に、所望であれば、投与すべきこの薬剤組成物はまた、例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどのような、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などのような少量の非毒性助剤を含んでいてもよい。
【００５６】
水性注射懸濁液はまた、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランを含む、懸濁液の粘度を増大させる物質を含んでいてもよい。場合により、この懸濁液はまた、安定化剤を含んでいてもよい。
【００５７】
非経口処方は、単位用量として、又はアンプル及びバイアルのような多回投与密封容器に入って存在することができ、そして使用の直前に注射用の滅菌液体担体（例えば、水）の添加だけを要する凍結乾燥条件で貯蔵することができる。即時調製の注射懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。
【００５８】
経口投与には、薬剤学的に許容しうる非毒性の組成物が、例えば、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、クロスカルメロースナトリウム、ブドウ糖、ゼラチン、ショ糖、炭酸マグネシウムなどのような、任意の通常使用される賦形剤の組み込みによって形成される。このような組成物は、懸濁剤、錠剤、分散性錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、徐放性処方などを含む。経口投与に適した処方は、水、食塩水、又はオレンジジュースのような希釈液に懸濁された有効量の薬物封入性ガゴマー粒子のような液体懸濁剤；サシェ剤、舐剤、及びトローチ剤（それぞれ所定量の活性成分を固体又は顆粒として含む）；粉剤、適切な液体中の懸濁剤；並びに適切な乳剤よりなっていてよい。液体処方は、薬剤学的に許容しうる界面活性剤、懸濁剤、又は乳化剤を添加するか、又は添加しない、水及びアルコール類（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、及びポリエチレンアルコール類）のような希釈剤を含んでもよい。
【００５９】
組成物が、丸剤又は錠剤であるとき、これは、活性成分と一緒に、乳糖、ショ糖、リン酸二カルシウムなどのような希釈剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；並びにデンプン、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース及びその誘導体などのような結合剤を含む。
【００６０】
錠剤の剤形は、１種以上の乳糖、ショ糖、マンニトール、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸、微結晶性セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ガーゴム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、保存料、着香剤、薬剤学的に許容しうる崩壊剤、保湿剤、及び薬理学的に適合性の担体を含んでもよい。
【００６１】
カプセル剤の剤形は、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、及びトウモロコシデンプンのような、例えば、界面活性剤、滑沢剤、及び不活性充填剤を含む、普通の殻の硬い、又は軟らかいゼラチン型のものであってよい。
【００６２】
舐剤の剤形は、担体（通常はショ糖とアラビアゴム又はトラガカントゴム）中に薬物封入性ガゴマー粒子を、更には、不活性基剤（ゼラチン又はグリセリン、あるいはショ糖とアラビアゴム）中に活性成分を含む香錠を含んでいてもよい。
【００６３】
投与すべきガゴマー粒子の用量を決定する際に、投与の用量と頻度は、特定の活性成分の薬理学的特性に関連して選択される。通常は、少なくとも３つの用量レベルを使用すべきである。毒性試験では一般に、最大用量が、毒性レベルに達するが、群内の多くの動物には致死量未満であろう。可能ならば、最小用量は、生物学的に実証できる作用を誘導すべきである。これらの試験は、各選択化合物について並行して実施すべきである。
【００６４】
更に、問題の活性成分（薬物封入性ガゴマー粒子）のＥＤ50（試験集団の５０％に対する有効用量）レベルは、選択される用量レベルの１つであるべきであり、そして他の２つは、毒性レベルに達するように選択されるべきである。最小用量は、生物学的に実証できる作用を示さない用量である。毒性試験は、得られた結果に基づいて算出した適切な新しい用量を用いて反復すべきである。
【００６５】
明確な系統に属する幼若で健常なマウス又はラットを、種の第１選択とし、第１の試験は、一般に投与の好ましい経路を利用する。プラセボ投与又は処置なしの対照群を試験に含める。一般毒性に関する試験は、上に略述されるように、通常は、別の非齧歯類動物、例えば、ウサギ又はイヌで反復すべきである。試験はまた、投与の代替経路を利用して反復してもよい。
【００６６】
単回投与毒性試験は、急性毒性の兆候が露呈し、死に方が決定されるようなやり方で行うべきである。投与すべき用量は、上述の毒性試験において得られた結果に基づいて算出される。最初に選択された化合物全てに試験の継続はしないことが望ましい。
【００６７】
単回投与毒性、例えば、実験動物の５０％が死ぬ用量である、ＬＤ50に関するデータは、体重１kg当たりの重量又は容量の単位として表され、一般には異なる投与の様式で少なくとも２種について供給すべきである。齧歯類におけるＬＤ50値に加えて、他の種、即ち、イヌ及びウサギについて最大耐量及び／又は最小致死量を求めることが望まれる。
【００６８】
上に略述されたように適切かつ推定上安全な用量レベルが確立したら、薬物封入性ガゴマー粒子の慢性中毒、その生殖に及ぼす作用、及び潜在的突然変異誘発性に関する試験もまた、算出された妥当な用量範囲が、これらの危険に関しても安全であることを裏付けるために必要とされる。
【００６９】
例えば、活性成分及び代謝物の吸収、分布、生体内変化、及び排出を明らかにする、薬物動態に関する薬理学的動物試験が次に実施される。得られた結果を用いて、次にヒトの薬理学に関する試験が計画される。
【００７０】
ヒトにおける化合物の薬力学及び薬物動態の試験は、健常な対象において、臨床使用向きの投与の経路を用いて実施すべきであり、そして患者において反復することができる。異なる用量が投与されるときの、又は幾つかのタイプの結合体若しくは結合体の組合せ及び遊離化合物が投与されるときの用量作用関係は、用量作用関係（用量：血漿濃度：作用）、治療域、及び最適投与間隔を解明するために試験すべきである。また、時間効果関係に関する試験、例えば、効果の経時変化に関する試験、並びに薬物の望まれる薬理学的作用及び望まれない同作用を解明するために種々の臓器での、特に他の重要臓器系での試験を実施すべきである。
【００７１】
次に本発明の化合物は、化合物の効力を既存療法と比較するための臨床試験の準備ができている。治療効果及び副作用との用量作用関係は、この時点でより精細に確立することができる。
【００７２】
任意の所定の患者に投与される本発明の薬物封入性ガゴマー粒子の量は、経験的に決定しなければならず、そして患者の症状に応じて相違する。比較的少量の薬物封入性ガゴマー粒子を最初に投与することができ、有害作用を認めなければ、徐々に用量を増加させられる。当然、所定の動物毒性試験において決定される最大安全毒性用量は、決して超えるべきでない。
【００７３】
本発明の範囲内の組成物は、水不溶性又は水難溶性薬物を封入しているガゴマーが、その本来の目的を達成するのに有効な量で含まれる、全ての組成物を含む。個々のニーズは変化するが、各化合物の有効量の最適範囲の決定は、当該分野の技術範囲内である。投与される用量は、個々のそのレシピエントの年齢、健康、及び体重に、更には任意の併用療法の性質及び望まれる作用に依存する。典型的な用量は、０．０１〜１００mg/kg体重を含む。好ましい用量は、約０．１〜１００mg/kg体重の範囲内にある。最も好ましい用量は、約１〜５０mg/kg体重の範囲内にある。
【００７４】
薬物を捕捉したガゴマーの調製法は、単純で費用効率が高い。これらの薬物封入性ガゴマー粒子は、徐放性薬物貯蔵庫として作用し、抗生物質及び化学療法剤の流出に１９〜３５時間の範囲の半減期を持つ。ガゴマー粒子のこれらの性質は、これらの生体接着性と一緒になって、全身性（経口を含む）、局所性、及び限局性（鼻内を含む）投与のための、部位接着性で部位保持性の徐放性薬物貯蔵庫として機能する能力をこれらの薬物担体に提供している。
【００７５】
ガゴマー調製の原則は、脂質を有機溶媒に溶解して、脂質薄膜が生成するようにこれを蒸発乾固し、次に塩基性緩衝液、通常はｐＨ９のホウ酸緩衝液中で水和させることである。あるいは、脂質を、適切な塩基性緩衝液中で脂質のＴｍを超える温度で直接水和させることができる。グリコサミノグリカンは、酸性水相に独立に溶解して、カルボジイミドのような水溶性カップリング剤により活性化させる。水和脂質膜と活性化グリコサミノグリカンの水溶液を一緒にして、この系を、共有結合が生じる間、塩基性ｐＨ緩衝液中で維持する。
【００７６】
２つの基本型のガゴマーを合成することができる：ＬＬＧと表示される、低い脂質対グリコサミノグリカン比（１：１、w/w）、及びＨＬＧと表示される、高い脂質対グリコサミノグリカン比（５：１〜２０：１、w/w）。調製法において特定の工程を変化させることにより、その成果を、マイクロ粒子又はナノ粒子を形成するように導くことができる。
【００７７】
本発明の手順により生成するガゴマーは、薬物と共に、又は薬物なしに、凍結乾燥することができ、そして水単独で再水和するか、又は興味ある薬物の水溶液で再水和することができる。
【００７８】
リポソームのような他の粒子担体とは異なり、調剤の長期貯蔵性及び安定性を増強するために、ガゴマーには凍結乾燥の前に保護剤（糖類のような凍害防御物質）を加える必要はない。ガゴマーは、ヒアルロナン（ヒアルロン酸）により提供される固有の凍害防御性を有する。
【００７９】
再水和に続いて、調剤は加熱することができる。一旦ガゴマーを凍結乾燥したら、使用されるまで長期間にわたり貯蔵することができる。貯蔵のための適温は、ガゴマーの脂質処方及び封入される物質の温度感受性に依存するだろう。
【００８０】
凍結乾燥ガゴマーを使用するとき、再水和は、単に蒸留水又は適切な緩衝液のような水溶液をガゴマーに加え、再水和するのを待つことにより達成される。この再水和は、室温で、又はガゴマーの組成及びその内部の含量に適切な他の温度で実施することができる。
【００８１】
脂質化グリコサミノグリカンである本発明のガゴマーは、好ましくは、以下の方法：
（１）脂質及び水不溶性又は水難溶性活性成分を別々に有機溶媒に溶解すること；
（２）溶解した脂質及び溶解した水不溶性又は水難溶性活性成分を一緒にして合わせた溶液にすること；
（３）合わせた溶液を蒸発乾固して、塩基性ホウ酸緩衝液に懸濁液として分散させること；
（４）この分散懸濁液を、カップリング剤とのプレインキュベーションにより活性化したグリコサミノグリカンの溶液と混合及びインキュベートして、水不溶性又は水難溶性活性成分を封入している脂質化グリコサミノグリカン粒子を形成すること；そして
（５）脂質化グリコサミノグリカン粒子を濃縮するために、連続遠心分離により分画すること
によって、少なくとも１個の第１級アミノ基を有する脂質、好ましくはリン脂質、更に好ましくはホスファチジルエタノールアミン、そして最も好ましくはジラウリル又はジパルミトイル・ホスファチジルエタノールアミンを、カルボン酸含有グリコサミノグリカン、好ましくはヒアルロン酸（ＨＡ）に共有結合させることにより調製される。分画して濃縮した脂質化グリコサミノグリカン粒子は、更に場合により凍結乾燥することができる。
【００８２】
あるいは、脂質化ガゴマーは、薬物／活性成分を封入する前に、以下の方法によって調製することができる：
（ａ）脂質が薄層として容器の底と壁に広げられた、反応容器を用意する。これは、脂質を有機溶媒に溶解して、ロータリーエバポレーター中で低圧下で脂質を蒸発乾固することにより達成することができる。
（ｂ）架橋剤との酸性ｐＨ中でのプレインキュベーションにより、グリコサミノグリカンを活性化する。
（ｃ）活性化グリコサミノグリカンを反応容器に加える。
（ｄ）脂質と活性化グリコサミノグリカンとの反応混合物を、８．６〜９．０の範囲の塩基性ｐＨまで緩衝化する。
（ｅ）絶え間なく振盪しながら、脂質化グリコサミノグリカンが生成するのに充分な時間（一晩というような）３７℃で緩衝化反応混合物をインキュベートする。脂質化ｇａｇはインビボで使用するように設計されるため、約３７℃で安定でなければならない。脂質化にはもっと高温を利用することができるが、脂質は温度上昇により、一般には約６２℃で物理変化を受ける。よって、脂質化は、好ましくは約３０〜４０℃の温度で行われる。
（ｆ）脂質化グリコサミノグリカンは、中性ｐＨまで緩衝化して、体液中に存在するイオン又は塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｃａ2+及びＭｇ2+など）による生理的レベルまでイオン強度を上昇させるために、必要に応じて他のイオン及び水溶性添加剤を加える。
（ｇ）各ランが１．６×１０5のｇ力で４℃で４０分間の連続遠心分離により、以下のとおり粒子を分画する：３回のラン後のペレットはマイクロ粒子濃縮画分であり、更に３回のランに付した、このマイクロ粒子濃縮画分の上清は、ナノ粒子濃縮画分である。
（ｈ）生じた脂質化グリコサミノグリカンを凍結乾燥する。
（ｉ）水不溶性又は水難溶性活性成分の原液は、ＤＭＳＯ又はエタノールのような有機溶媒中で調製される。次に希釈標準溶液は、有機溶媒の濃度が≦１％になるように、原液を水に希釈することにより調製される。次いでこの希釈標準溶液を使用して、凍結乾燥ガゴマー粉末を再水和する。
【００８３】
分光光度計での光散乱による濁度試験は、等濃度の可溶性ヒアルロン酸、及びヒアルロン酸とホスファチジルエタノールアミンから調製されたガゴマーについて、合成によって実際に粒子状物質が生成するかどうかに関する識見を獲得するために実施することができる。予想されるように、試験した濃度範囲にわたって遊離ヒアルロン酸は可溶性であり、そしてその溶液は光を散乱させない。これとは対照的に、ガゴマー含有試料は、混濁しており、ガゴマー濃度と共に光散乱が増大し、このため、このバイオポリマーが不溶性物質であることが明らかになった。
【００８４】
脂質化グリコサミノグリカン粒子は、好ましくは何ら封入物質を伴わずに製造され、次に凍結乾燥により粉末を生成する。粉末化グリコサミノグリカン粒子は、次に封入される物質の粉末と混合する。あるいは、粉末化グリコサミノグリカン粒子は、有機溶媒（この有機溶媒は、好ましくはエタノールである）中の封入すべき物質の溶液と混合することにより再構成される。一旦混合物が再構成されると、粒子は、混合された物質を捕捉したことになる。よって、抗生物質及び化学療法剤のような小さな水不溶性又は水難溶性分子は、更には大きな分子も、この方法で封入することができる。
【００８５】
本発明の粒子は、少なくとも１つのグリコサミノグリカンを長い形で反応させることにより調製される（即ち、ｇａｇは、小さいサイズに切られていない）。ヒアルロン酸を除く全てのグリコサミノグリカンは、本来、タンパク質残基が多糖残基に共有結合した形である。化学的及び酵素的にタンパク質−糖結合を加水分解する方法は両方とも、当業者には周知である。更に、タンパク質残基が既に除去されている、幾つかの市販の製品が利用可能である。
【００８６】
グリコサミノグリカンポリマーは、少なくとも１個の第１級アミノ基を有する脂質と反応させることにより、グリコサミノグリカンのカルボン酸残基を脂質中の第１級アミンに架橋させる。一旦この反応が起こると、熱力学的安定性によって、脂質が相互に作用することにより、生成物が引きあって、グリコサミノグリカンを外側に持ち、脂質を内側に持つ球形になる。脂質分子の自己集合は、ガゴマー粒子を得る上で決定的に重要な力である。これらの粒子は、水不溶性又は水難溶性薬物／活性成分を粒子の内部に封入するために使用される。
【００８７】
本発明の１つの実施態様では、グリコサミノグリカンのタンパク質部分は除去して、糖基本骨格のみを脂質と反応させる。
【００８８】
標的化のため、又はリポソームの生体接着性を増大させるために、ヒアルロン酸をリポソームの外側に結合させることは、当該分野において知られている。本発明では、リポソームは存在しない；正しくは、脂質分子がヒアルロン酸に共有結合している。
【００８９】
本発明の別の実施態様では、他の分子を最初にグリコサミノグリカンに結合させてもよく、次にこれを脂質と反応させる。生成する粒子は、粒子の外側に現れるこれらの他の分子を有する。これらの他の分子は、例えば、抗体、葉酸、ポルフィリン、又はレクチンであってよく、そして標的化のために使用することができる。
【００９０】
ここまで一般的に本発明を説明してきたが、本発明は、例示のために提供され、そして本発明を限定するものではない、以下の実施例に即してより容易に理解されるだろう。
【００９１】
実施例１
パクリタキセル装填ガゴマーの調製：最初に薬物をＤＭＳＯに溶解し、続いて水に大量希釈する（ＤＭＳＯ経由法と呼ばれる）
凍結乾燥した薬物を含まないガゴマー粉末を以下のとおり調製した：
以下の工程（１）及び（２）は並行して行った：
【００９２】
（１）ヒアルロナン（ＨＡ）を２mg/mlの濃度になるまで水に溶解した。ＥＤＣをこの溶液に２０mg/mgＨＡの比で加え、ＨＣｌ（１Ｍ）での滴定によりｐＨを４．０に調整し、この系を３７℃で振盪器中で２時間インキュベートした。
【００９３】
（２）ジパルミトイル・ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）６０mgを１．５mg/mlの濃度になるまでクロロホルム：メタノール（３：１、v/v）に溶解して、乾燥した均一なフィルムが得られるまで、この溶液をロータリーエバポレーター中で低圧下で完全に蒸発乾固した。次に、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１０mlをこの乾燥脂質に加え、この懸濁液を数分間激しく撹拌し、次に振盪器中で３７℃で２時間インキュベートすることにより、均一な脂質分散液を生成した。
【００９４】
（３）活性化ＨＡの溶液とＰＥの塩基性懸濁液を１：１のＨＡ：脂質重量比で混合して、振盪器中で３７℃で一晩インキュベートした。
【００９５】
（４）（３）からの反応混合物を超遠心分離機中で１６０，０００のｇ力及び４℃で４０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを以下のとおり４サイクルの洗浄に付した：ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、上に列挙した条件下で再遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをＰＢＳに再懸濁した等々。最後のペレットをＰＢＳに懸濁して所望の容量にした（通常は系（３）の容量）。
【００９６】
（５）ガゴマー懸濁液を１mlの凍結乾燥用小瓶に分配し、以下のとおり凍結乾燥した：−８０℃で２時間凍結し、一晩凍結乾燥した（周囲温度、凝縮器温度ＬＴ−５０℃、圧力０．０５５hPa）。使用するまで、このガゴマー粉末を凍結貯蔵した（−１８℃）。
【００９７】
本実施例及び続く全ての実施例において、ガゴマー濃度は、そのホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）含量により定義する。
【００９８】
ＤＭＳＯ中のパクリタキセルの原液は、４０mMの薬物濃度範囲で調製した。希釈標準パクリタキセル溶液は、１７０〜６２５μg/mlの濃度範囲まで、これらの原液を水に希釈することにより調製し、そして最終ＤＭＳＯ濃度は、＜１％とした。所定の希釈標準溶液は、直ちに選択量のガゴマー粉末と混合することにより、０．１６〜５mgＰＥ/mlの範囲の最終ガゴマー濃度にした。この混合物を振盪浴中で３７℃で２時間インキュベートした。パクリタキセルは、処方中に微量の3Ｈ−パクリタキセルを含めることにより定量した。
【００９９】
薬物封入の効率は、担体粒子内に封入されている系中の総薬物の割合として定義される。パクリタキセル封入効率は、以下のとおり「熱力学法」により決定した。パクリタキセル−ガゴマー処方は、超高速遠心分離（４０分間、４℃、１７５０００のｇ力）に付した。上清（未封入薬物を含む）をペレット（薬物封入性ガゴマーを含む）から分離した。ペレットは、薬物を含まない緩衝液に再懸濁して、元の容量にした。パクリタキセル濃度は、分離前の元の処方中、上清中、及び再懸濁ペレット中で測定して、これらのデータを使用することにより、封入の効率を決定した。図１に示されるように、これらの調製物中のパクリタキセル封入効率は、９６（±２）％と非常に高く、ガゴマー濃度に敏感ではなかった。
【０１００】
実施例２
パクリタキセル装填ガゴマーの調製：最初に薬物をエタノールに溶解し、続いて水に大量希釈する（エタノール経由法と呼ばれる）
パクリタキセル−ガゴマー処方は、実施例１に記載されるものと同様に調製したが、以下の違いがある：原液用の溶媒としてＤＭＳＯの代わりにエタノールを使用した。希釈標準パクリタキセル濃度は、４３〜１７０μg/mlの範囲であり、そして最終エタノール濃度は、＜１％とした。図２に示されるように、それぞれ高及び低タキソール濃度について８０（±６）％及び９５（±１）％と高い封入効率がこのアプローチによっても得られ、試験範囲内ではガゴマー濃度への依存性はほとんど又は全くなかった。
【０１０１】
実施例３
パクリタキセル装填ガゴマーの調製：最初に薬物をエタノールに溶解し、続いて有機ＰＥ溶液に添加する（ＰＥ経由法と呼ばれる）
このアプローチでは、パクリタキセルは、ガゴマー調製の過程で、ＰＥを有機溶媒系に溶解する段階で導入した。パクリタキセルは、エタノールに溶解して、クロロホルム：メタノール（３：１、v/v）中のＰＥ溶液に室温で加えた（即ち、上記実施例１の工程２）。この時点から、ガゴマー調製は、工程５（凍結乾燥）を割愛したことを除いて実施例１に記載されるように進行した。
【０１０２】
処方中のパクリタキセル最終濃度は、０．２〜１．２mMとした。図３に示されるように、この方法でも８２（±５）％という高い封入効率が得られるが、このアプローチでは実施例１及び２のアプローチよりも高い薬物用量を封入できるという利点がある。この最後の点は、パクリタキセルがエタノールに溶解された系について、表２に示される比較により強調される。「ＰＥ経由」法では、封入効率は比較的低いが、大きく上まわる薬物用量の使用が可能である。その結果、好ましい方法（即ち、ＰＥ経由法）における封入薬物用量は５倍高い。
【０１０３】
【表２】
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【０１０４】
実施例４
封入効率とパクリタキセル装填の関係
上記の実施例１〜３に記載された３つ全ての方法の封入効率は、装填レベル（パクリタキセル／ＰＥ、w/w）に対して比較した。図４に示されるように、パクリタキセル装填の広い範囲にわたり３つの封入法の間には良好な一致が存在する。
【０１０５】
実施例５
血清中の安定性
血清中のパクリタキセル−ガゴマー処方の包括的な安定性プロフィールは以下を必要とする：（１）独立に２成分（ヒアルロナンとＰＥ）の運命を追うことによりモニターできる、粒子の完全性の保持、及び（２）粒子内の装填薬物の保持。
【０１０６】
パクリタキセル−ガゴマー処方の血清安定性を評価するために、試料を２４時間まで５０％ヒト血清中で３７℃でインキュベートした。粒子の完全性及びそのパクリタキセルの存在に対する感受性に及ぼす血清の作用に関して、より多くの識見を獲得するために、同様の試験を薬物を含まないガゴマーでも実施した。アリコートは、実験の全期間内の選択された時点で反応混合物から取り出して、遠心分離による分離に付した。遠心分離条件及び詳細は、封入効率を求めるための熱力学法に関して実施例１に開示されたものと同様とした。
【０１０７】
無傷のガゴマー及びその封入薬物を含むペレットは、ＰＢＳに再懸濁した。ヒアルロナン（ＨＡ）、ＰＥ及びパクリタキセルは、遠心分離前に取り出したアリコートで、上清で、及び再懸濁ペレットで、以下の追跡ラベルを利用して定量した：ＦＩＴＣ標識ＨＡ（Ｆ−ＨＡ）、14Ｃ−ＰＥ、及び適宜、3Ｈ−パクリタキセル。結果は、図５に要約されている。
【０１０８】
データは、薬物を含まない試験系と薬物装填試験系の両方について、ヒアルロナンの大部分が、ＰＥとは独立に、ペレット中に保持されていることを極めて明らかに示している。この保持は更に、時間範囲の大部分にわたり両方の成分について同じレベルである。これらの知見によって、血清中で良好な粒子安定性が存在するという結論が得られる。封入薬物の同様の保持は、この結論を更に裏付けている。
【０１０９】
全てのデータをまとめると、ガゴマーが血清中で安定なだけでなく、封入薬物が無傷の粒子から消失しないこと、そしてその存在が血清中の粒子安定性を害さないことが明らかになった。
【０１１０】
実施例６
無傷のガゴマーからのパクリタキセルの流出
ガゴマーからのパクリタキセルの流出は、ＰＢＳ中及び５０％ヒト血清中の両方で一定方向の流れ（吸い込み）条件下で、本質的にWO 03/015755及びMargalitら（1991）に記載されているような透析アプローチを利用して試験した。各時点での透析袋から放出されたパクリタキセルを定量するため、更には時間＝０及び実験の最後のガゴマー中のパクリタキセルを定量するため、微量の3Ｈ−パクリタキセルを調製物に含めた。データ加工及び分析は、本発明者らの実験室で以前に開発された手順（WO 03/015755；Margalitら, 1991）により実施したが、時間＝０での２つの独立な薬物プール（一方の封入薬物、もう一方の未封入薬物）の場合に適合することが見い出された。結果は、図６及び表３に示される。このタイプのデータ分析は、時間＝０でのガゴマーと外部媒体の間の薬物の分布を再構成し、これによって実施例１に開示された熱力学的アプローチとは独立の、封入効率を求めるための別のアプローチを構成する。
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
図６に示した各データは、透析液中の封入薬物と未封入薬物の両方を合わせた累積を示しており、血清の存在下での流出は、ＰＢＳ中よりも遅いことが明確に見て取れる。上記実施例４のデータ及び結論と同時に、表３で分かるように、高い血清安定性が保持されている−ｆ2（封入レベル）値は、血清中とＰＢＳ中では全く同様である。両方の媒体中で、パクリタキセル−ガゴマー処方は、薬物担体における非常に望まれる特性である、徐放性薬物貯蔵庫として機能している。
【０１１３】
興味深いことに、両方の速度定数は、透析袋の中に血清が存在すると低下する。この場合−親油性薬物の流出−に最重要の血清成分は、アルブミン及びリポタンパク質であり、これらは両方とも実験をとおして袋の中に留まる（この膜のカットオフは、１２０００〜１４０００Daである）。Margalitら（1991）に詳細に考察されたように、透析袋から透析液への未封入薬物及び封入薬物の流出は、単一の律速段階を持つ、それぞれ独立の多段階プロセスであり、そこで薬物は、元のプールから一連の中間プールを経て透析液に終わる拡散をする。この同じパターン−それぞれ元の薬物プールからの拡散のための単一の律速段階−はまた、パクリタキセルのこの場合にも当てはまり、速度定数の血清対ＰＢＳの差は、律速となる薬物プールの環境におけるわずかな違いを暗示している。
【０１１４】
実施例７
インビトロ細胞毒性
パクリタキセル及びガゴマー封入パクリタキセルの細胞毒性は、薬物−ガゴマー処方（実施例１、２及び３を参照のこと）、細胞株及び処理プロトコールのマトリックスにわたり、１nM〜１００μMに及ぶ薬物濃度範囲について評価した。
【０１１５】
実験の２４時間前に、所望の株の細胞を９６ウェルのマルチウェル培養プレートに５×１０3細胞／ウェルの範囲の密度で接種した。実験は、サブコンフルエントな単層で開始した。実験の開始時に、表４に列挙されるような、処理培地を加えた。２つのプロトコールを用いた：
【０１１６】
（Ｉ）短期プロトコール。細胞は、処理培地と共に４時間インキュベートして、最後に処理培地を吸引し、細胞を洗浄して、薬物を含まない血清を補足した細胞増殖培地中で４４時間インキュベートした。終了は、開始から４８時間後とした。
【０１１７】
（II）長期プロトコール：細胞は、処理培地中で４８時間インキュベートした。終了時に、いずれのプロトコールでも、ＭＴＴ又はＳＲＢアッセイ法のいずれかを用いて、各ウェルの細胞生存率を測定した。
【０１１８】
【表４】
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【０１１９】
この２つのプロトコール、長期及び短期の根拠は、以下のとおりである：長期プロトコールは、様々な薬物処方の間の細胞毒性のインビトロ比較に使用される、従来法である。細胞は、処理処方と共に通常２４〜７２時間の時間範囲内の期間インキュベートし、そして全ての処方は同じ時間インキュベートする。比較が、遊離薬物と担体配合薬物との間で行われるとき、特に標的細胞との特異的な陽性の相互作用を有する担体では、この同じインキュベーション期間は、遊離薬物に有利に結果を歪曲する。インビボでは、遊離薬物は、標的ゾーンに長くは留まらないが、一方標的化担体は、長時間留まることができる。短期プロトコールは、この遊離薬物対担体−薬物の不均衡をインビボ状態に向けて調節するために設計されている。４時間後の処理培地の除去は、全ての細胞外の遊離薬物を系から一掃し、一方薬物装填担体は、細胞と結びつくことができる（膜への結合及び／又はエンドサイトーシス）。このような結合が起こるならば、４時間後の処理培地の除去により担体が介在する薬物全てが一掃されるわけではなく、残存する薬物−担体処方は、実験の残りの期間中、薬物を細胞に供給し続けることができる。
【０１２０】
各細胞株について、使用したガゴマー濃度（１．５mgＰＥ/mlのガゴマー濃度範囲を超える必要はない）は細胞に対して毒性でないことを検証した。パクリタキセル濃度の関数としての細胞生存率のデータは、ＩＣ50（細胞増殖の５０％阻害を引き起こす薬物濃度）を導き出すために使用した。このパラメーターは、この分野の標準的パラメーターの効力として広く用いられている−ＩＣ50が低いほど、所定の処方の効力は高い。
【０１２１】
遊離及びガゴマー装填薬物についてのパクリタキセルのＩＣ50値は、表５に列挙されている。全ての場合に、そして３つの異なるパクリタキセル−ガゴマー型の処方について、データは、封入パクリタキセルが活性なままであることを極めて明らかに示している。ＤＭＳＯ経由及びエタノール経由処方の両者では、遊離及び担体配合薬物の間に有意な差はない。
【０１２２】
【表５】
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【０１２３】
ＰＥ経由処方での結果もまた、表５に列挙されている。これらの結果は、このロットを最も後押ししている。これらは、短期プロトコール（遊離薬物対担体配合薬物を比較するとき、より適切なプロトコールである）において、ＩＣ50値の低下があることを極めて明らかに示している。よって、遊離薬物からガゴマー配合薬物への効力の増大は、４倍以上である。細胞への薬物供給の上述の機序を考慮すると、ガゴマー中に配合されるとき効力の増大は更に高いかもしれない。更に、腫瘍細胞株での増加は、対照の非腫瘍株よりも有意に高い。
【０１２４】
実施例８
パクリタキセル装填ガゴマーの調製及び性状解析：最初に薬物をエタノールに溶解し、続いてエタノール性ＤＰＰＥ溶液に添加にする（エタノール性ＤＰＰＥ経由法と呼ばれる）
このアプローチは、実施例３のものと同様であるが、以下の違いがある：
【０１２５】
（１）脂質であるジパルミトイル・ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）をエタノールに５５℃で溶解して、１２mgＰＥ/mlの濃度にした。
【０１２６】
（２）原液濃度のパクリタキセルは、エタノールに溶解して、エタノール性ＤＰＰＥ溶液に加え、そして合わせたＤＰＰＥ／タキソールのエタノール性溶液を５５℃で更に１５分間保持した。
【０１２７】
（３）ＤＰＰＥ／タキソールのエタノール性溶液を蒸発乾固して、実施例１の工程２に記載されるように、塩基性ホウ酸緩衝液に分散させた（ただし、この分散液のインキュベーションは６５℃としたことを除く）。この時点から、このプロセスは、実施例３のように続けた。パクリタキセルの効率は完全であった（即ち、１００％）。Ｂ１６Ｄ１０．９細胞における細胞毒性は、実施例７に記載されるように測定した。表６の１列目に示される結果は、ガゴマー封入パクリタキセルが活性を保持しており、遊離パクリタキセルよりも強力（即ち、低いＩＣ50）であることを示している。パクリタキセルのエタノール性溶液は、この実施例の方法でパクリタキセル封入性ガゴマーを製造するのに使用したのと同じ条件下で、４０〜７０℃の範囲内の幾つかの温度で加熱し、そして同じ細胞毒性アッセイを用いて、この条件下で、加熱が薬物の細胞毒性活性を害さなかったことを検証した。
【０１２８】
【表６】
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【０１２９】
実施例９
パクリタキセル装填ガゴマーの調製及び性状解析：最初に薬物をエタノールに溶解し、続いてエタノール性ＤＬＰＥ溶液に添加する（エタノール性ＤＬＰＥ経由法と呼ばれる）
ガゴマー調製及びパクリタキセル封入は、以下の点を除いて、全て実施例８に記載されるものと同様とした：
【０１３０】
（１）２つのパルミトイル鎖を有する（即ち、Ｃ１６）ＤＰＰＥは、別のＰＥである、２つの鎖がジラウリルである（即ち、Ｃ１２）ＤＬＰＥにより置換した。
【０１３１】
（２）脂質をエタノールに溶解するための温度、エタノール性脂質溶液をエタノール性パクリタキセル溶液と混合するための温度、及び塩基性ホウ酸緩衝液へのＤＬＰＥとパクリタキセルの分散のための２時間のインキュベーションのための温度は、全て４４℃まで低下させた。他の全ての工程は、実施例８のものと同様とした。
【０１３２】
パクリタキセルの効率は完全であった（即ち、１００％）。Ｂ１６Ｄ１０．９細胞における細胞毒性は、実施例７に記載されたように測定した。表６の２列目に示される結果は、ガゴマー封入パクリタキセルパクリタキセルが活性を保持しており、遊離パクリタキセルよりもより強力（即ち、低いＩＣ50）であることを示している。これまで製造された全てのパクリタキセル−ガゴマー処方の中で、この処方（表５及び６を参照のこと）が、調製、封入効率及び細胞毒性に関して最良であった。
【０１３３】
実施例１０
ＴＸ−ＧＡＧ粒子の薬物装填能力
ＴＸ−ＧＡＧ粒子は、脂質としてＤＬＰＥを用いて、図７に略述されるスキームにより調製した。初期の薬物／脂質モル比は、１：１０（即ち、０．１）〜１：２（即ち、０．５）のＴＸ：脂質の範囲とし、封入効率は、実施例１に記載されたように、遠心分離及び洗浄により、これらの調製物の各々について求めた。
【０１３４】
遠心分離ペレット中のパクリタキセルが、完全にガゴマー粒子の中にあるか、それとも（特に薬物装填が増大するにつれて）遊離の不溶性薬物として粒子の外側に残存するかを評価するために、高速遠心分離により行われる、過剰の試薬からのＴＸ−ＧＡＧ粒子の洗浄（図７の工程５）は、以下のとおり行った：各調製物を２つの部分に分けた。１つの部分を遠心分離して、前実施例と同様に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）単独により洗浄した。もう１つの部分を遠心分離して、同様の条件下で洗浄したが、洗浄媒体は、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳとした。ＢＳＡを用いる根拠は、一般的な「混入物吸収タンパク質」としてのこのタンパク質の従来からの使用に起因するだけでなく、具体的にパクリタキセルが、このタンパク質に対する高親和性を有しており、そして血清アルブミンが、現在使用されている市販の処方中の、患者に投与される遊離パクリタキセルの内在性担体として作用するためでもある。遠心分離ペレットがガゴマー粒子に入らなかった薬物を含んでいたならば、そしてその不溶性のために、ＴＸ−ＧＡＧ粒子と一緒にペレット中に沈殿していたならば、ＢＳＡは、沈殿した遊離薬物の少なくとも幾らかを溶解させるはずである。このペレットから上清への沈殿した遊離パクリタキセルの除去は、ＰＢＳ単独で洗浄した同等の系に比較して、遠心分離ペレット中の薬物を減少させているだろう。
【０１３５】
図８に示される結果により、ＢＳＡ洗浄が、ペレット中の薬物を減少させなかったことは極めて明白となり、よって全ての装填について、ガゴマーに結びついた全てのパクリタキセルが実際にガゴマーの中に装填されていることを示している。高いＢＳＡ濃度（３％）でも、ＴＸ−ＧＡＧ粒子からパクリタキセルを「洗い落とす」ことはなかった。
【０１３６】
実施例１１
ＴＸ−ＧＡＧ粒子の熱量分析
１：１０〜１：２の範囲の薬物／脂質モル比を持つＴＸ−ＧＡＧ粒子は、実施例１０に記載されたように調製した。薬物を含まないガゴマーは、薬物を割愛して同様に調製した。両方のタイプの系を、図７の工程６に記載されたように凍結乾燥した。
【０１３７】
２３０〜２５０℃の温度範囲内で、結晶性パクリタキセル、並びに水性懸濁液から凍結乾燥したパクリタキセル（水和パクリタキセルと表示される）は、最初に融解を、次に分解を受けることが知られている。更には、融解は吸熱過程であり、そして分解は発熱過程であることが知られている。両方の過程、及び最初の吸熱ピークに続いて発熱ピークが来るその連続パターンは、その物質を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）にかけることにより測定及び観察することができる。これは、２回の走査（１回は結晶のため、そしてもう１回は水和パクリタキセルのため）により、図９の上半分に実証されている。
【０１３８】
また図９の上半分に示されるように、ＤＳＣにかけた薬物を含まないガゴマーは、脂質による１００℃の領域に小さな吸熱ピークを持つことが見い出されたが、上に示され考察されるように、遊離パクリタキセルが大規模な変化を受ける２３０〜２７０℃範囲での熱変化を受けないことが判った。薬物を含まないガゴマーと結晶性又は水和パクリタキセルとの１：２の薬物：脂質モル比での混合物もまた、ＤＳＣにかけた。図９の下半分に実証されているように、混合物中の独立した成分が、その個々の熱挙動を保持しており、１００℃の領域の脂質の吸熱ピーク、及び２３０〜２５０℃範囲の２つの連続した吸熱及び発熱ピークを示している。
【０１３９】
上記の全てとは対照的に、ＴＸ−ＧＡＧ処方をＤＳＣにかけると、封入薬物の（遊離薬物に比較して）異なる熱挙動が明らかになった。また図９の下半分に示されるように、１：２のＴＸ：ＰＥの薬物装填について、パクリタキセルの融解ピークが消失したが、一方分解ピークは残っていた。同様の結果は、もっと低い薬物：脂質装填物でも得られた。
【０１４０】
全ての試料について、分解ピークの同定はまた、熱重量分析（ＴＧＡ）によっても行った。
【０１４１】
一緒にした全ての上記結果は、実施例１０の知見と調和しており、これは、並はずれて高い薬物装填量のＴＸ−ＧＡＧ粒子が得られることを強く示している。
【０１４２】
実施例１２
滅菌ＴＸ−ＧＡＧ粒子中のパクリタキセルの安定性
ＴＸ−ＧＡＧ粒子の水性懸濁液は、図７のスキームにより工程５まで調製した。パクリタキセル単独（即ち、遊離パクリタキセル）の水性懸濁液も調製した。試料をＴＸ−ＧＡＧと遊離パクリタキセルの両方からとっておき、各系の残りを以下の滅菌プロセスに付した：１２０℃で１２分のオートクレーブ。この滅菌プロセスがＴＸ−ＧＡＧ処方に対して実行可能であるかどうかという重大な問題は、薬物活性の保持である。したがって、滅菌プロセスの前にとっておいた元の試料、並びにこのプロセスを受けた試料を、実施例７に記載されたように、Ｂ１６Ｆ１０．９培養物で、これらの細胞毒性について試験した。図１０に図解された結果により示されるように、そして予想されたように、滅菌プロセスは、遊離パクリタキセルの細胞毒性を何ら有意に低下させなかった。更には、このプロセスはまた、ガゴマー装填パクリタキセルの細胞毒性でも何ら有意な低下を引き起こさなかった。実際、４つ全ての系は、０．３０μMパクリタキセルの範囲では、細胞毒性、ＩＣ50値において同様であった。
【０１４３】
これらの結果は、ＴＸ−ＧＡＧ処方が、適用された滅菌条件下で良好な安定性を有することを示しており、そして更にこれが、製品の滅菌に対して実行可能なアプローチであることを示している。
【０１４４】
今や本発明を充分に記述したので、当然ながら、当業者であれば、広範な均等なパラメーター、濃度、及び条件の中で、本発明の本質及び範囲を逸することなく、かつ過度の実験を行うことなく、本発明を実行することができよう。
【０１４５】
本発明は、その具体的な実施態様に関連して記述されているが、当然ながら更なる改変を加えることが可能である。本出願は、一般に本発明の原理にしたがい、そして本発明が関係する当該分野内の既知の又は通常の慣例に入るような、及び添付の請求の範囲に以下のとおり示された本明細書に前述の本質的な特色に適用されるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変形態様、使用、又は適応に及ぶことが意図される。
【０１４６】
雑誌記事又は要約、公開されたか、又は対応する米国又は外国特許出願、特許された米国又は外国特許、あるいは任意の他の文献を含む、本明細書に引用されている全ての参照文献は、引用文献に提示された全てのデータ、表、図、及びテキストを含めて、全体が引用例として本明細書に取り込まれる。更には、本明細書に引用された文献内に引用された文献の全内容もまた、全体が引用例として取り込まれる。
【０１４７】
既知法の工程、従来法の工程、既知法又は従来法に対する参照は、本発明の任意の態様、説明又は実施態様が、関連技術において開示、教示又は示唆されていることを承認するものでは全くない。
【０１４８】
具体的な実施態様の前記の説明は、本発明の一般的性質を充分に明らかにするため、同業者は、当該分野の技術内の知識（本明細書に引用された文献の内容を含む）を適用することにより、過度の実験を行うことなく、本発明の一般概念を逸することなく、このような具体的な実施態様を、容易に改変及び／又は種々の応用に適応させることができる。したがって、このような適応及び改変は、本明細書に提示された教示及び案内に基づいて、開示された実施態様の均等物の意味及び範囲内にあるものとされる。当然ながら、本明細書の言葉遣い又は専門用語は、説明を目的とするものであり、限定のためではないため、本明細書の専門用語又は言葉遣いは、本明細書に提示された教示及び案内に照らして、当業者の知識と組合せて、当業者が解釈すべきものである。
【０１４９】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、ＤＭＳＯ経由法における、ガゴマー濃度（単位：mgＰＥ/ml）の関数としてのガゴマー中のパクリタキセル封入の効率を示すグラフである。
【図２】図２は、エタノール経由法における、ガゴマー濃度（単位：mgＰＥ/ml）の関数としてのガゴマー中のパクリタキセル封入の効率を示すグラフである。
【図３】図３は、ＰＥ経由法における、ガゴマー濃度（単位：mgＰＥ/ml）の関数としてのガゴマー中のパクリタキセル封入、担体調製法及び薬物封入の効率を示すグラフである。
【図４】図４は、３つのタイプの処方（即ち、ＤＭＳＯ経由法、エタノール経由法及びＰＥ経由法）における、薬物／ガゴマー比の関数としてのパクリタキセル封入の効率の比較を示すグラフである。
【図５】図５は、５０％ヒト血清中で３７℃で、時間の関数としての薬物を含まないガゴマー及びパクリタキセル封入ガゴマー（エタノール法により調製）の安定性を示すグラフである。
【図６】図６は、別々に、ＰＢＳ中、及び５０％血清中で、一定方向の流れ（吸い込み）条件下での、エタノール経由法で調製したガゴマーからのパクリタキセル流出の動態を示すグラフである。
【図７】図７は、ガゴマー内に装填された不溶性薬物の製造工程のスキームを示す。
【図８】図８は、リン酸緩衝生理食塩水単独（淡色のバー）、又は同じ緩衝液であるが０．２％ウシ血清アルブミンを含むもの（濃色のバー）で洗浄した、遠心分離ペレット中のパクリタキセル（ＴＸ）の保持率を示すグラフである。
【図９】図９は、薬物を装填したガゴマー及び薬物を含まないガゴマー、更には遊離薬物の示差走査熱量測定を示す。
【図１０】図１０は、Ｂ１６Ｆ１０．９細胞の培養液中の、滅菌前後の遊離パクリタキセル及びパクリタキセル装填ガゴマーの細胞毒性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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