(57)【要約】  本発明は、動脈硬化症の診断のための、個体からの試料における一つ以上のペプチドマーカーの存在又は不在の使用、及びペプチドマーカーの存在又は不在が動脈硬化症の存在を表す、動脈硬化症の診断のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈硬化症の診断のための、被験者からの試料における少なくとも１個のペプチドマーカーの存在又は不在の使用であって、動脈硬化症の診断のために前記ポリペプチドマーカーが分子量に関する以下の数値：
【表１】
2008516191.tif 000007
によって特徴付けられる、ポリペプチドマーカーＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９から選択される、前記使用。
【請求項２】
前記ポリペプチドマーカーが、分子量及び泳動時間に関する以下の数値：
【表２】
2008516191.tif 000008
によって特徴付けられる、ポリペプチドマーカーＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
少なくとも２個のポリペプチドマーカー、特にポリペプチドマーカー：
−Ｎｏ．１とＮｏ．２、Ｎｏ．１とＮｏ．３、Ｎｏ．１とＮｏ．４、Ｎｏ．１とＮｏ．５、Ｎｏ．１とＮｏ．６、Ｎｏ．１とＮｏ．７、Ｎｏ．１とＮｏ．８、Ｎｏ．１とＮｏ．９、
−Ｎｏ．２とＮｏ．３、Ｎｏ．２とＮｏ．４、Ｎｏ．２とＮｏ．５、Ｎｏ．２とＮｏ．６、Ｎｏ．２とＮｏ．７、Ｎｏ．２とＮｏ．８、Ｎｏ．２とＮｏ．９、
−Ｎｏ．３とＮｏ．４、Ｎｏ．３とＮｏ．５、Ｎｏ．３とＮｏ．６、Ｎｏ．３とＮｏ．７、Ｎｏ．３とＮｏ．８、Ｎｏ．３とＮｏ．９、
−Ｎｏ．４とＮｏ．５、Ｎｏ．４とＮｏ．６、Ｎｏ．４とＮｏ．７、Ｎｏ．４とＮｏ．８、Ｎｏ．４とＮｏ．９、
−Ｎｏ．５とＮｏ．６、Ｎｏ．５とＮｏ．７、Ｎｏ．５とＮｏ．８、Ｎｏ．５とＮｏ．９、
−Ｎｏ．６とＮｏ．７、Ｎｏ．６とＮｏ．８、Ｎｏ．６とＮｏ．９、
−Ｎｏ．７とＮｏ．８、Ｎｏ．７とＮｏ．９又は
−Ｎｏ．８とＮｏ．９
を使用し、前記ポリペプチドマーカーが請求項１又は２で定義されるとおりである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
請求項１又は２で定義される少なくとも３個のポリペプチドマーカーを使用する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
請求項１又は２で定義される少なくとも４個のポリペプチドマーカーを使用する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項６】
請求項１又は２で定義される少なくとも５個のポリペプチドマーカーを使用する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項７】
請求項１又は２で定義される少なくとも６個のポリペプチドマーカーを使用する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項８】
請求項１又は２で定義される少なくとも７個のポリペプチドマーカーを使用する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項９】
請求項１又は２で定義される少なくとも８個のポリペプチドマーカーを使用する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１又は２で定義される９個のポリペプチドマーカーを使用する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項１１】
少なくとも１個のさらなるポリペプチドをマーカーとして使用する、請求項１から１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記泳動時間が、長さ９０ｃｍのキャピラリーで、水中３０容量％のメタノール、０．５容量％のギ酸の移動相において３０ｋＶでのキャピラリー電気泳動によって測定される、請求項２から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
被験者からの前記試料が、尿試料又は血液試料、特に血清又は血漿試料である、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
動脈硬化症の診断のための方法であって、
ａ）被験者からの試料において請求項１又は２で定義される少なくとも１個のポリペプチドマーカーの存在又は不在を測定する；及び
ｂ）前記被験者における動脈硬化症の存在の確率を判定する、但し、
ｉ）疾患被験者におけるポリペプチドマーカーの存在の確率が対照被験者における同じポリペプチドマーカーの存在の確率よりも高い場合、このポリペプチドマーカーの存在は動脈硬化症の存在のより高い可能性を表す；
ｉｉ）疾患被験者におけるポリペプチドマーカーの存在の確率が対照被験者における同じポリペプチドマーカーの存在の確率よりも低い場合、このポリペプチドマーカーの不在は動脈硬化症の存在のより高い可能性を表す；
ｉｉｉ）疾患被験者におけるポリペプチドマーカーの存在の確率が対照被験者における同じポリペプチドマーカーの存在の確率よりも高い場合、このポリペプチドマーカーの不在は動脈硬化症が存在しないことのより高い可能性を表す；あるいは
ｉｖ）疾患被験者におけるポリペプチドマーカーの存在の確率が対照被験者における同じポリペプチドマーカーの存在の確率よりも低い場合、このポリペプチドマーカーの存在は動脈硬化症が存在しないことのより高い可能性を表す
工程を含む、方法。
【請求項１５】
工程ｂ）における個々の確率が以下のとおり：
【表３】
2008516191.tif 000009
である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも２、３、４、５、６、７、８又は９個のポリペプチドマーカーを使用する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項３で定義するポリペプチドマーカーの組合せを使用する、請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ポリペプチドマーカーＮｏ．１、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８及び／又はＮｏ．９の存在が動脈硬化症の存在を表す、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ポリペプチドマーカーＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及び／又はＮｏ．６の不在が動脈硬化症の存在を表す、請求項１４から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチドマーカー（一つ又は複数）の存在又は不在を検出するためにキャピラリー電気泳動、気相イオン分光法及び／又は質量分析法を使用する、請求項１４から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
キャピラリー電気泳動を、前記ポリペプチドマーカーの分子量を測定する前に実施する、請求項１４から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドマーカー（一つ又は複数）の存在又は不在を検出するために質量分析法を使用する、請求項１４から２１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化症の診断のための、被験者からの試料における一つ以上のペプチドマーカーの存在又は不在の使用、及び一つ以上のペプチドマーカーの存在又は不在が動脈硬化症の存在を表す、動脈硬化症の診断のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化症もしくは血管又は動脈の石灰化であるアテローム性動脈硬化症は、最も多い病的血管変性である。動脈硬化症は、長年の間に形成され、最初は認識されないままである血管の変性である。血中脂質及び白血球が血管壁で富化し（プラーク形成）、血管が石灰化して、弾性を失い、血管直径が次第に狭くなる。動脈硬化症の形成についての危険因子は、高コレステロール血症、高血圧、喫煙、糖尿病、肥満、身体的不活発及び低い社会的状態を含むと考えられているが、他の因子にも密接に関連する。高トリグリセリド血症、リポタンパク質、ホモシステイン及びｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）又はフィブリノーゲンなどの特定炎症パラメータの高い血中レベル、並びに慢性クラミジア又はヘリコバクターピロリ感染のようなさらなる危険因子が論じられている。
【０００３】
動脈硬化症は長期間にわたって全く症状を引き起こさない。血管直径がプラークによって明らかに低下したとき又はプラークの領域で血餅（血栓）が形成されるときにのみ、症状が起こる。最も多い動脈硬化性心臓及び血管疾患は、冠状動脈心臓病、脳血管疾患及び末梢動脈閉塞性疾患である；これらの重篤な合併症、すなわち心筋梗塞、卒中又は下肢の喪失は、発展途上国に比べてドイツでは異例の頻度で起こり、公衆衛生に対して極めて高いコストを生じさせる。
【０００４】
動脈硬化症が引き起こす心臓血管疾患は、死亡原因についてのドイツ統計のトップを占める。このため、１９９９年には、ドイツのＳｔａｔｉｓｔｉｓｃｈｅｓ  Ｂｕｎｄｅｓａｍｔによれば、心臓血管疾患は４８％を占める最も頻度の高い死亡原因であり、虚血性（冠状動脈）心臓病が２１％、脳血管系の疾患が１０％を占めた。これと比較して、致死的な結果に至る癌の割合は２６％であり、呼吸器及び消化管の疾患の割合はそれぞれ６％と５％であった。
【０００５】
動脈硬化変性はしばしば若年で既に起こるが、患者はほとんどが中高年になって初めて臨床徴候を発現する。
【０００６】
動脈硬化症は薬剤によって治療することはできないが、予防によってのみ回避することができる。既に起こってしまった石灰化は破壊することができず、弾性を硬い血管壁に戻すことはできない。しかし、ニコチン離脱などにより、生活様式を変えることで危険因子に影響を及ぼすことによって、又は薬剤（例えばアセチルサリチル酸）によって、動脈硬化症の進行を明らかに遅らせることができる。加えて、重症の動脈石灰化のためには、バルーン血管形成術（ＰＴＡ、経皮経管動脈形成術）、バイパス手術及びステントの挿入などの外科的方法が使用可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記で説明したように、動脈硬化変性は治療によって処置することができないが、回避する又は遅延させることだけが可能であるので、動脈硬化変性の早期検出は特に重要である。
【０００８】
通常の状況下では、二次疾患の診断だけが、罹患者が動脈硬化症を有しているとの結論を可能にする。現在、このために、例えば造影剤又はＸ線又は超音波によって、血管の狭窄を検出する。加えて、通常は、高いコレステロールレベル又は糖尿病などの危険因子を検査する。しかし、これらの方法全てが動脈硬化症の早期及び信頼し得る診断のためには十分でない。特に、できる限り侵襲性の少ない、動脈硬化症の迅速で安価な早期検出の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
意外にも、今や、被験者からの試料中の特定ペプチドマーカーが動脈硬化症の診断のために使用できることが見出された。
【００１０】
このため本発明は、動脈硬化症の診断のための、被験者からの試料における少なくとも１個のペプチドマーカーの存在又は不在の使用に関し、前記ポリペプチドマーカーは、表１に示す分子量についての数値によって特徴付けられる、ポリペプチドマーカーＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９から選択される。
【００１１】
【表４】
2008516191.tif 000002
【００１２】
本発明により、非常に早期の段階で動脈硬化症を診断することが可能である。このため、初期段階で又はこの症状発現の前に公知の治療アプローチによって疾患を治療することができ、これにより、この後の経過を緩和することができる。本発明はさらに、ある程度非侵襲性の又は最小限の侵襲性の処置で、動脈硬化症の安価で迅速及び信頼し得る診断を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の特定の実施形態では、ポリペプチドマーカーは、この分子量によってのみならず、この泳動時間によっても特徴付けられる（表２参照）：
【００１４】
【表５】
2008516191.tif 000003
【００１５】
泳動時間は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって、例えば実施例の項目２で述べるように測定される。すなわち、長さ９０ｃｍ、内径（ＩＤ）７５μｍ、外径（ＯＤ）３６０μｍのガラス細管を３０ｋＶの電圧で操作する。試料のための溶媒として、水中３０％メタノール、０．５％ギ酸を使用する。
【００１６】
ＣＥ泳動時間が変動し得ることが公知である。これにもかかわらず、ポリペプチドマーカーが溶出する順序は、典型的には使用するいずれのＣＥシステムに関しても同じである。泳動時間の差を相殺するために、泳動時間が公知である標準物質を用いてシステムを基準化し得る。これらの標準物質は、例えば実施例で述べるポリペプチドであり得る（実施例、項目３、「ＣＥ測定のための標準」参照）。
【００１７】
表１から３に示すポリペプチドマーカーの特性決定を、例えばＮｅｕｈｏｆｆら（Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、  Ｖｏｌ．２０：１４９−１５６、２００４）によって詳細に説明されている方法、キャピラリー電気泳動−質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）によって実施した。個々の測定間又は異なる質量分析計の間での分子量の変動は比較的小さく、典型的には±０．１％の範囲内、好ましくは±０．０５％の範囲内である。
【００１８】
本発明に従ったポリペプチドマーカーは、タンパク質又はペプチドもしくはタンパク質又はペプチドの分解産物である。これらは、分解の範囲内で、例えばグリコシル化、リン酸化、アルキル化又はジスルフィド架橋などの翻訳後修飾によって又は他の反応によって、化学修飾されていてもよい。加えて、ポリペプチドマーカーはまた、試料の精製の範囲内で、化学変性されていてもよく、例えば酸化されていてもよい。
【００１９】
ポリペプチドマーカーを決定するパラメータ（分子量及び泳動時間）から進んで、先行技術において公知の方法によって対応するポリペプチドの配列を特定することが可能である。
【００２０】
本発明に従ったポリペプチド（表１又は２参照）は、動脈硬化症を診断するために使用される。「診断」は、症状又は現象を疾患又は障害に割り当てることによって知識を獲得する工程を意味する。この場合は、特定ポリペプチドマーカーの存在又は不在から動脈硬化症の存在が結論される。このため、本発明に従ったポリペプチドマーカーは被験者からの試料において測定され、この存在又は不在が動脈硬化症の存在を結論付けることを可能にする。ポリペプチドマーカーの存在又は不在は、先行技術において公知の何らかの方法によって測定できる。公知と考えられる方法を以下に例示する。
【００２１】
ポリペプチドマーカーは、この測定値が少なくともこの閾値と同程度の高さである場合、存在するとみなされる。測定値がより低い場合は、ポリペプチドマーカーは存在しないとみなされる。閾値は、測定方法の感受性（検出限界）によって又は経験的に決定され得る。
【００２２】
本発明に関して、好ましくはある分子量についての試料の測定値がブランク試料（例えば緩衝液又は溶媒のみ）の測定値の少なくとも２倍の高さである場合、より好ましくは測定値がブランク試料の数値の少なくとも３倍、さらに一層好ましくは少なくとも４倍、最も好ましくは少なくとも５倍の高さである場合、閾値を超えているとみなされる。
【００２３】
一つ以上のポリペプチドマーカーは、この存在又は不在が測定され、この存在又は不在が動脈硬化症の指標であるように使用される。このため、ポリペプチドマーカーＮｏ．１、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８Ｎｏ．９のような、動脈硬化症（疾患）を有する患者において典型的に存在するが、動脈硬化症がない（対照）被験者では存在しないポリペプチドマーカーがある。加えて、動脈硬化症のない（対照）被験者では存在するが、動脈硬化症を有する被験者ではより頻度が低い又は全く存在しないポリペプチドマーカーがある。これらは、例えばポリペプチドマーカーＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．６である。
【００２４】
【表６】
2008516191.tif 000004
疾患    ポリペプチドマーカーが試料中に存在した動脈硬化症を有する被験者の割合
対照    ポリペプチドマーカーが試料中に存在した動脈硬化症に罹患していない被験者の割合
Δ      （疾患―対照）の絶対値
【００２５】
一つ以上のポリペプチドマーカーの存在又は不在を測定する試料が由来する被験者は、動脈硬化症に罹患する可能性があるいかなる被験者でもよく、例えば動物又はヒトであり得る。好ましくは、被験者は、イヌ、ウマ、ネコなどの哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、動脈硬化症を診断するために、１個のポリペプチドマーカーだけでなく、ポリペプチドマーカーの組合せを使用し、これらの存在又は不在から動脈硬化症の存在を結論することができる。複数のポリペプチドマーカーを比較することにより、疾患又は対照個体における典型的存在確率からの少数の個別逸脱による全体的結果のバイアスを低減する又は回避することができる。
【００２７】
このため、本発明の好ましい実施形態では、表１又は２の２個のポリペプチドマーカーを動脈硬化症の診断のために使用する。特に、これらは以下のポリペプチドマーカーの組合せである：
−Ｎｏ．１とＮｏ．２、Ｎｏ．１とＮｏ．３、Ｎｏ．１とＮｏ．４、Ｎｏ．１とＮｏ．５、Ｎｏ．１とＮｏ．６、Ｎｏ．１とＮｏ．７、Ｎｏ．１とＮｏ．８、Ｎｏ．１とＮｏ．９、
−Ｎｏ．２とＮｏ．３、Ｎｏ．２とＮｏ．４、Ｎｏ．２とＮｏ．５、Ｎｏ．２とＮｏ．６、Ｎｏ．２とＮｏ．７、Ｎｏ．２とＮｏ．８、Ｎｏ．２とＮｏ．９、
−Ｎｏ．３とＮｏ．４、Ｎｏ．３とＮｏ．５、Ｎｏ．３とＮｏ．６、Ｎｏ．３とＮｏ．７、Ｎｏ．３とＮｏ．８、Ｎｏ．３とＮｏ．９、
−Ｎｏ．４とＮｏ．５、Ｎｏ．４とＮｏ．６、Ｎｏ．４とＮｏ．７、Ｎｏ．４とＮｏ．８、Ｎｏ．４とＮｏ．９、
−Ｎｏ．５とＮｏ．６、Ｎｏ．５とＮｏ．７、Ｎｏ．５とＮｏ．８、Ｎｏ．５とＮｏ．９、
−Ｎｏ．６とＮｏ．７、Ｎｏ．６とＮｏ．８、Ｎｏ．６とＮｏ．９、
−Ｎｏ．７とＮｏ．８、Ｎｏ．７とＮｏ．９又は
−Ｎｏ．８とＮｏ．９。
【００２８】
本発明のもう１つのさらに一層好ましい実施形態では、表１又は２の３個のポリペプチドマーカーを動脈硬化症の診断のために使用する。特に、これらは以下のポリペプチドマーカーの組合せである：
−ペプチドマーカーＮｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１及びＮｏ．２、
−ペプチドマーカーＮｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１及びＮｏ．３、
−ペプチドマーカーＮｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１及びＮｏ．４、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１及びＮｏ．７、
−ペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２及びＮｏ．３、
−ペプチドマーカーＮｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２及びＮｏ．４、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．２及びＮｏｖ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３及びＮｏ．４、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．３及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．４及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．４及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．４及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．４及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．５及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．５及びＮｏ．８、
−Ｎｏ．８又はＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．６及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．６及びＮｏ．８、又は
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．７及びＮｏ．８。
【００２９】
本発明のもう１つのさらに一層好ましい実施形態では、表１又は２の４個のポリペプチドマーカーを動脈硬化症の診断のために使用する。特に、これらは以下のポリペプチドマーカーの組合せである：
−ペプチドマーカーＮｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２及びＮｏ．３、
−ペプチドマーカーＮｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２及びＮｏ．４、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３及びＮｏ．４、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３及びＮｏ．４、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．４、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、又は
−Ｎｏ．９と組み合わせたＮｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８。
【００３０】
本発明のもう１つのさらに一層好ましい実施形態では、表１又は２の５個のポリペプチドマーカーを動脈硬化症の診断のために使用する。特に、これらは以下のポリペプチドマーカーの組合せである：
−ペプチドマーカーＮｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３及びＮｏ．４、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、又は
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８。
【００３１】
本発明のもう１つのさらに一層好ましい実施形態では、表１又は２の６個のポリペプチドマーカーを動脈硬化症の診断のために使用する。特に、これらは以下のポリペプチドマーカーの組合せである：
−ペプチドマーカーＮｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．５、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、又は
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８。
【００３２】
本発明のもう１つのさらに一層好ましい実施形態では、表１又は２の７個のポリペプチドマーカーを動脈硬化症の診断のために使用する。特に、これらは以下のポリペプチドマーカーの組合せである：
−ペプチドマーカーＮｏ．７、Ｎｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．６、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ペプチドマーカーＮｏ．８又はＮｏ．９の１個と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．７、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、又は
−ポリペプチドマーカーＮｏ．９と組み合わせたＮｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８。
【００３３】
本発明のもう１つのさらに一層好ましい実施形態では、表１又は２の８個のポリペプチドマーカーを動脈硬化症の診断のために使用する。特に、これらは以下のポリペプチドマーカーの組合せである：
−Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．８、
−Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７及びＮｏ．９、
−Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．８及びＮｏ．９、
−Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８及びＮｏ．９、
−Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８及びＮｏ．９、
−Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８及びＮｏ．９、
−Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８及びＮｏ．９、
−Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８及びＮｏ．９、
−Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８及びＮｏ．９。
【００３４】
本発明のもう１つのさらに一層好ましい実施形態では、表１又は２の９個のポリペプチドマーカーを動脈硬化症の診断のために使用する。特に、これらは以下のポリペプチドマーカーの組合せである：
−Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８及びＮｏ．９。
【００３５】
上記に挙げたポリペプチドマーカーに加えて、少なくとも１個のさらなるポリペプチドが動脈硬化症を表す又は動脈硬化症の不在（対照、例えば健常状態）を表す場合、このような少なくとも１個のさらなるポリペプチドの存在又は不在を動脈硬化症の診断のためのマーカーとして使用することができる。例えば上記ポリペプチドは、ペプチド結合を通して連結された少なくとも１０個のアミノ酸から成る。好ましくは、ポリペプチドは最大限１００個のアミノ酸から成る。より好ましくは、ポリペプチドは約５００〜１５，０００Ｄａ、さらに一層好ましくは約７５０〜約１０，０００Ｄａ、特に約１０００〜約７，５００Ｄａの分子量を有する。前記マーカーは、分解の範囲内で、例えばグリコシル化、リン酸化、アルキル化又はジスルフィド架橋などの翻訳後修飾によって又は他の反応によって、化学修飾されていてもよい。加えて、ポリペプチドマーカーはまた、試料の精製の範囲内で、化学変性されていてもよく、例えば酸化されていてもよい。
【００３６】
本発明に従った一つ以上のペプチドマーカーの存在又は不在を測定する試料は、被験者の身体から得られるいかなる試料であってもよい。試料は、被験者の状態（動脈硬化症又は健常、すなわち動脈硬化症を有さない被験者）についての情報を提供するのに適するポリペプチド組成物を有する試料である。例えば血液、尿、滑液、組織液、体分泌物、汗、脳脊髄液、リンパ、腸液、胃液又は膵液、胆汁、涙液、組織試料、精液、膣液又は便試料であり得る。好ましくは液体試料である。
【００３７】
好ましい実施形態では、試料は尿試料又は血液試料であり、最も好ましくは、血清又は血漿試料である。
【００３８】
尿試料は、先行技術において好ましいとされているように採取することができる。好ましくは、本発明に関しては中間尿試料を前記尿試料として使用する。例えば尿試料はまた、ＷＯ０１／７４２７５に述べられている排尿装置によっても採取し得る。
【００３９】
血液試料は、先行技術において公知の方法によって、例えば静脈、動脈又は毛細血管から採取することができる。通常、血液試料は、例えば被験者の腕から注射器を用いて静脈血を採取することによって得られる。「血液試料」という用語は、血漿又は血清などの、さらなる精製及び分離方法によって血液から得られる試料を包含する。
【００４０】
血漿は、例えば遠心分離によって、血液から全ての細胞成分を除去することによって得られる。遠心分離は、凝固因子がまだ血漿中に存在するので、例えばクエン酸ナトリウムなどの凝固阻害剤の存在下で実施し得る。血清は、基本的には、例えば血液凝固によって、凝固活性タンパク質、主としてフィブリノーゲンを除去した血清に相当する。
【００４１】
血清及び血清を作製するための方法は先行技術において一般的に公知である。加えて、ＷＯ０４／６５９５８は、血漿からフィブリノーゲンを除去するための方法を開示する。血清又は血漿の分離のための組成物は、例えばＷＯ０３／４８６７４に開示されている（ＵＳ２００４／１２９６３１も参照）。血液から血漿又は血清試料を収集するための装置及び方法は、例えばＵＳ２００４／３１７４６に述べられている。
【００４２】
試料中のポリペプチドマーカーの存在又は不在は、ポリペプチドマーカーを測定するのに適した先行技術で公知の何らかの方法によって判定し得る。このような方法は当業者に公知である。原則として、ポリペプチドマーカーの存在又は不在は、質量分析法などの直接法によって、又は例えばリガンドによる、間接法によって判定することができる。
【００４３】
必要に応じて又は所望する場合は、被験者からの試料、例えば尿又は血液試料を、何らかの適切な手段によって前処理してもよく、例えば一つ以上のポリペプチドマーカーの存在又は不在を測定する前に精製又は分離し得る。処理は、例えば精製、分離、希釈又は濃縮を含み得る。方法は、例えば遠心分離、ろ過、限外ろ過、透析、沈殿、又は、アフィニティー分離又はイオン交換クロマトグラフィーによる分離、電気泳動分離、すなわち電場を適用した時の溶液中での荷電粒子の異なる泳動による分離などの、クロマトグラフィー法であり得る。この特定例は、ゲル電気泳動、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、金属アフィニティークロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、レクチン系アフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、順相及び逆相ＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィー及び表面への選択結合である。これらの方法は全て当業者に周知であり、当業者は、使用する試料及び一つ以上のポリペプチドマーカーの存在又は不在を判定するための方法に応じて方法を選択することができる。
【００４４】
本発明の１つの実施形態では、キャピラリー電気泳動によって分離する前に、試料を超遠心分離法によって精製する及び／又は限外ろ過によって特定分子サイズのポリペプチドマーカーを含む分画に分割する。
【００４５】
好ましくは、ポリペプチドマーカーの存在又は不在を判定するために質量分析法を使用し、試料の精製又は分離はこのような方法の上流で実施し得る。現在使用されている方法と比較して、質量分析法は、試料の多くの（＞１００）ポリペプチドの濃度を１つの分析によって測定できるという利点を有する。いかなる種類の質量分析計も使用し得る。質量分析法によって、複雑な混合物において約±０．０１％の測定精度で慣例的に、１０ｆｍｏｌのポリペプチドマーカー、すなわち１０ｋＤタンパク質０．１ｎｇを測定することが可能である。質量分析計では、イオン形成ユニットが適切な分析装置に連結されている。例えば液体試料中のイオンを測定するためには主にエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースが用いられ、個別に調製された試料からイオンを作製するためにはＭＡＬＤＩ法が最も頻繁に使用される。様々な種類の分析装置、例えばイオントラップ型分析装置又はＴＯＦ型分析装置が使用可能である。ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩのどちらも、基本的に全ての種類の質量分析計と組み合わせ得るが、ＥＳＩは通常イオントラップ型と、及びＭＡＬＤＩはＴＯＦ型と組み合わせる。
【００４６】
エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）では、溶液中に存在する分子を、特に高電圧（例えば１から８ｋＶ）の影響下で、噴霧し、これが最初は荷電した小滴を形成して、溶媒の蒸発によってより小さくなる。最終的に気相中での遊離イオンの形成が起こる。
【００４７】
飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計による質量分析法では、イオンに等しい量の運動エネルギーを与える特定加速電圧を適用する。この後、等しい量の運動エネルギーでは、イオンの速度はこれらの質量に依存するので、それぞれのイオンが飛行管を通って特定のドリフト距離を移動するのに要する時間が非常に正確に測定される。ＴＯＦ質量分析計はとても早い走査速度を有し、このため優れた分離度が得られる。
【００４８】
ポリペプチドマーカーの存在及び不在の判定のための好ましい方法は、レーザー脱離／イオン化質量分析法、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ（表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法）、２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＳ及びキャピラリー電気泳動質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）などの気相イオン分光測定法を含む。
【００４９】
２Ｄ−ＰＡＧＥは通常ポリペプチドを分離するために用いられ、質量分析法と共に個々のポリペプチドの特定のために使用できる（２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＳ）。１０００以上のタンパク質スポットを２Ｄ−ＰＡＧＥによって識別することができる。しかし、それぞれの単一ポリペプチドスポットは質量分析法によって別々に特定しなければならない。
【００５０】
ＳＥＬＤＩシステムでは、プロテインチップが最も重要な成分である。分析する試料をアレイ上に存在するスポットに直接適用する。種々のアレイが存在し、例えば疎水性、親水性、陽イオン交換、陰イオン交換及び固定化金属イオン親和性表面であるクロマトグラフィーアレイ、及び共有結合を可能にする化学基を有する前活性化アレイがある。陽イオン交換表面が好ましい。ＳＥＬＤＩ法では、実際にチップの表面に結合しているポリペプチドだけを測定する。試料ポリペプチドの結合後に、エネルギー吸収マトリックスを各々のスポットに適用する。マトリックスを結晶化させた後、プロテインチップアレイを、通常は分析のためのプロテインチップリーダーにおいて評価する。
【００５１】
前記リーダーは、レーザーによってタンパク質を脱着し、イオン化するＴＯＦ（飛行時間型）質量分析計である。結晶化したタンパク質がスポット表面に等しく分布するので、イオン化レーザー光は常に分析物中の代表的平均の分子にヒットし、定量的測定を可能にする。イオン化後、ポリペプチドは電場において加速され、検出器に衝突する。アレイ表面のレーザー照射から検出器への分子の衝突までの飛行時間は、試料中のポリペプチドの分子量の正確な測定を可能にする（例えば以下の総説論文参照：Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ｍ．とＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｒ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、Ｖｏｌ．２１２：１１６４−１１７７、２０００）。
【００５２】
特に好ましい方法は、キャピラリー電気泳動を質量分析法と組み合わせるＣＥ−ＭＳである。この方法は、例えばドイツ特許出願ＤＥ１００２１７３７、Ｋａｉｓｅｒら（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ、Ｖｏｌ．１０１３：１５７−１７１、２００３及びＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２５：２０４４−２０５５、２００４）及びＷｉｔｔｋｅら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、１０１３：１７３−１８１、２００３）に少し詳しく述べられている。ＣＥ−ＭＳテクノロジーは、短い時間内に小容量で、数百のポリペプチドマーカーの存在を同時に高い感受性で測定することを可能にする。ポリペプチドを含む試料を測定した後、測定したポリペプチドマーカーのパターンを作成し、このパターンを疾患又は健常ヒトのパターンと比較することができる。ほとんどの場合、動脈硬化症の診断のためには１個又は限られた数のポリペプチドマーカーを使用すれば十分である。特に、表１又は２からの１、２、３、４、５、６、７、８又は９個のポリペプチドマーカーを、好ましくは上記に示したポリペプチドマーカーの組合せで、測定することができる。例えばオンラインで、ＥＳＩ−ＴＯＦ分析装置に接続したキャピラリー電気泳動を含むＣＥ−ＭＳ法はさらに好ましい。この場合は、試料を電気泳動細管に適用し、電圧、例えば５０ｋＶまで、特に３０ｋＶまでの電圧をかける。
【００５３】
ＣＥ−ＭＳのためには、揮発性溶媒に使用が好ましく、基本的に塩分を含まない条件下で作業することが最も適切である。このような溶媒の例は、アセトニトリル、イソプロパノール、メタノール等を含む。溶媒は、分析物をプロトン化するために水又は弱酸（例えば０．１％ギ酸）と混合することができる。試料中のポリペプチドマーカーは、細管内の飛行時間を決定する、これらの大きさと電荷によって分離される。
【００５４】
キャピラリー電気泳動により、分子をこれらの電荷と大きさによって分離することが可能である。中性粒子は電流の適用時に電気浸透流の速度で泳動し、一方陽イオンは陰極に向かって加速され、陰イオンは遅延する。電気泳動における細管の利点は、電流フローの間に生じるジュール熱の良好な散逸を可能にする、表面対容積の良好な比率にある。これが次に、高電圧（通常は３０ｋＶ）の適用を可能にし、このため高い分離性能と短い分析時間を可能にする。
【００５５】
キャピラリー電気泳動では、通常シリカガラス細管を使用する。小さな内径の細管を使用することにより、放射状拡散と対流の両方が回避される。電圧適用時に細管内で電流によって生じる熱を環境へと十分に散逸させることができるように、細管の内径は小さく保持されねばならない。５０から７５μｍの内径を有する細管が通常使用される。使用される長さは、例えば３０から１００ｃｍである。このような寸法の細管を用いると、通常、放出されるイオン熱による細管内での温度上昇は細管内で気泡の形成を生じさせないことが確実になる。加えて、分離細管は通常、プラスチック被覆したシリカガラスで作られる。細管は、未処理、すなわちこれらの疎水性基が内側表面に露出されていてもよく、又は内表面で被覆されていてもよい。分離度を改善するために疎水性被覆を使用し得る。電圧に加えて、圧を適用してもよく、典型的には０から１ｐｓｉの範囲内である。圧はまた、測定の間だけ適用してもよく又はこの間に変化させてもよい。
【００５６】
分離度を改善するために、負荷の間、積層プロトコールを使用し得る：試料を負荷する前に、塩基を負荷し、次に試料を負荷し、この後酸を負荷する。分析物のイオンはこれによって酸と塩基の間に含まれる。電圧を適用したとき、正に荷電した分析物イオンは塩基の方へ移動する。塩基に到達すると、これらは負に荷電して、反対の方向へと移動し、ここで正電荷となる。酸と塩基が中和するまでこれが反復される。このため、濃縮された試料が得られる。負荷する前に、試料を適切な緩衝液で希釈してもよい。
【００５７】
キャピラリー電気泳動によって分離されたポリペプチドマーカーの検出のために、好ましくはキャピラリー電気泳動装置を質量分析計に接続する。質量分析計は、高真空中での自由イオンの分子量の測定を可能にする。質量分析計は、イオンをこれらの質量−電荷比（ｍ／ｚ）によって分離する質量分析器と検出器を備える。
【００５８】
試料中のポリペプチドマーカーを測定するためのさらに一層好ましい方法では、試料のポリペプチドマーカーをキャピラリー電気泳動によって分離し、次に直接イオン化して、検出のために接続された質量分析計へとインターフェースを通してオンラインで移動させる。
【００５９】
本発明はさらに、
ａ）被験者からの試料において請求項１又は２で定義される少なくとも１個のポリペプチドマーカーの存在又は不在を測定すること；及び
ｂ）前記被験者における動脈硬化症の存在の確率を判定すること、但し、
ｉ）疾患被験者におけるポリペプチドマーカーの存在の確率が対照被験者における同じポリペプチドマーカーの存在の確率よりも高い場合、このポリペプチドマーカーの存在は動脈硬化症の存在のより高い可能性を表す；
ｉｉ）疾患被験者におけるポリペプチドマーカーの存在の確率が対照被験者における同じポリペプチドマーカーの存在の確率よりも低い場合、このポリペプチドマーカーの不在は動脈硬化症の存在のより高い可能性を表す；
ｉｉｉ）疾患被験者におけるポリペプチドマーカーの存在の確率が対照被験者における同じポリペプチドマーカーの存在の確率よりも高い場合、このポリペプチドマーカーの不在は動脈硬化症が存在しないことのより高い可能性を表す；
ｉｖ）疾患被験者におけるポリペプチドマーカーの存在の確率が対照被験者における同じポリペプチドマーカーの存在の確率よりも低い場合、このポリペプチドマーカーの存在は動脈硬化症が存在しないことのより高い可能性を表す、
による動脈硬化症の診断のための方法に関する。
【００６０】
本発明に従った方法の１つの実施形態では、工程ｂ）での動脈硬化症に罹患している被験者（疾患被験者）又は対照被験者におけるポリペプチドマーカーの存在の確率は以下の通りである：
【００６１】
【表７】
2008516191.tif 000005
【００６２】
好ましい実施形態では、対照被験者は動脈硬化症に罹患していない被験者である。さらなる好ましい実施形態では、対照被験者は動脈硬化症に罹患していないヒトである。
【００６３】
本発明に従った方法では、診断のためにいくつかのポリペプチドマーカーを使用することが好都合である。特に、表１又は表２の少なくとも２、３、４、５、６、７、８又は９個のポリペプチドマーカーを使用し得る。さらに一層好ましくは、ポリペプチドマーカーの組合せは上記で述べた組合せである。
【００６４】
いくつかのマーカーを使用するときの動脈硬化症の存在の確率を決定するために、当業者に公知の統計方法を使用し得る。例えばＳ−Ｐｌｕｓなどのコンピュータプログラムを利用することによってＷｅｉｓｓｉｎｇｅｒら（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２００４  Ｊｉｍ；６５（６）：２４２６−２４；Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓ  ｍｅｔｈｏｄ）が述べた方法を使用し得る。
【００６５】
本発明に従った方法では、試料中のポリペプチドマーカーＮｏ．１、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８及び／又はＮｏ．９の存在及び／又は試料中のポリペプチドマーカーＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５及び／又はＮｏ．６の不在は動脈硬化症の存在を表す。
【００６６】
存在又は不在を判定するために、本発明に従った方法では上述した精製、分離及び検出方法を使用し得る。好ましくは、キャピラリー電気泳動、気相イオン分光測定法及び／又は質量分析法を一つ以上のポリペプチドの存在又は不在を検出するために使用する。
【００６７】
特に好ましい実施形態では、ポリペプチドマーカーの分子量を測定する前に、一つ以上のポリペプチドの存在又は不在を検出するためにキャピラリー電気泳動を実施する及び／又は質量分析法を使用する。
【実施例】
【００６８】
１．試料の作製
動脈硬化症のポリペプチドマーカーを検出するために、血漿を用いた。血漿を健常ドナー（対照）から並びに動脈硬化症に罹患している透析依存患者から採取した。健常ドナーから血漿を採取するためには、ヘパリンと共にＳ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅｓ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、一方透析患者からの血漿は、既にヘパリンを投与されていたので、直接採取した。ヘパリンは血液凝固とタンパク質分解作用を回避する働きをし、このためまた、血漿中に含まれるタンパク質とペプチドを酵素による分解から保護するのに役立つ。
【００６９】
この後のＣＥ−ＭＳ測定のために、アルブミン及び免疫グロブリンなどの非常に高濃度で血漿中に含まれるタンパク質を限外ろ過によって分離除去しなければならなかった。ここで、血漿５００μｌを取り、ろ過緩衝液（４ｍｏｌ／ｌ尿素、０．１ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、０．０１％アンモニア）２ｍｌと混合した。この２．５ｍｌの試料容量を限外ろ過した（Ｃｅｎｔｒｉｓａｒｔ  ２０  ＭＷＣＯ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。限外ろ過は、限外ろ液２ｍｌが得られるまで遠心分離機において３４００ｒｐｍで実施した。
【００７０】
得られたろ液２ｍｌを、次に、尿素、塩及び他の邪魔になる成分を除去するためにＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｃ−２カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に適用した。結合ポリペプチドを、この後、水中５０％アセトニトリル、０．５％ギ酸でＣ−２カラムから溶出し、凍結乾燥した。ＣＥ−ＭＳ測定のために、ポリペプチドを水２０μｌ（ＨＰＬＣグレード、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁した。
【００７１】
２．ＣＥ−ＭＳ測定
ＣＥ−ＭＳ測定を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）からのキャピラリー電気泳動システム及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍａｒｉｎｅｒ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）からのＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計で実施した。
【００７２】
ＣＥ細管はＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（前出）より供給され、内径／外径７５／３６０μｍ、長さ９０ｃｍであった。ＣＥ分離のための移動相は、水中３０％メタノール及び０．５％ギ酸から成り、同じ混合物を２μｌ／分の流量でＭＳでの「シースフロー」のために使用した。ＣＥとＭＳの連結は、ＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳ  Ｓｐｒａｙｅｒ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって実現した。
【００７３】
試料を注入するために１ｐｓｉ（約６９００Ｐａ）の圧を適用し、注入期間は２０秒間であった。これらのパラメータで、細管容積の約０．２５％に相当する、約１００ｎｌの試料を差異管に注入した。細管内で試料を濃縮するために積層手法を用いた。このため、試料を注入する前に１ｍｏｌ／ｌ  ＮＨ３溶液を７秒間注入し（１ｐｓｉで）、試料を注入した後、２ｍｏｌ／ｌギ酸溶液を５秒間注入した。分離電圧（３０ｋＶ）を適用したとき、分析物はこれらの溶液の間で自動的に濃縮された。
【００７４】
この後のＣＥ分離は圧法で実施した：０ｐｓｉで４０分間、次に０．１ｐｓｉを２分、０．２ｐｓｉを２分、０．３ｐｓｉを２分、０．４ｐｓｉを２分、及び最後に０．５ｐｓｉを３２分間。分離操作の合計期間は、このため、８０分間であった。
【００７５】
ＭＳの側でできる限り良好なシグナル強度を得るために、ネブライザガスを止めた。エレクトロスプレーを生成するためにスプレー針に適用した電圧は３２００Ｖであり、これは、細管全体に約２７ｋＶの有効分離電圧を生じさせた。Ｍａｒｉｎｅｒ質量分析計の他の設定条件は、製造者のプロトコールに従ってペプチド検出のために最適化した。ｍ／ｚ４００からｍ／ｚ２５００までの質量範囲にわたってスペクトルを記録し、３秒ごとに累積した。
【００７６】
３．ＣＥ測定のための標準
ＣＥ測定を確認し、標準化するために、示されているＣＥ泳動時間によって特徴付けられる以下のタンパク質及びポリペプチドを使用した：
これらは、ペプチドマーカー１〜９並びに測定試料のＣＥ時間を基準化するために使用し得る。
【００７７】
タンパク質／ポリペプチド                                                泳動時間
アプロチニン（ＳＩＧＭＡ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ＤＥ、
カタログ番号ＡＩ  １５３）                                ９．２分
リボヌクレアーゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ＤＥ、
カタログ番号Ｒ４８７５）                            １０．９分
リゾチーム（ＳＩＧＭＡ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ＤＥ、カタログ番号Ｌ７６５１）
８．９分
「ＲＥＶ」、配列：ＲＥＶＱＳＫＩＧＹＧＲＱＩＩＳ                      １５．６分
「ＥＬＭ」、配列：ＥＬＭＴＧＥＬＰＹＳＨＩＮＮＲＤＱＩＩＦＭＶＧＲ    ２３．４分
「ＫＩＮＣＯＮ」、配列：ＴＧＳＬＰＹＳＨＩＧＳＲＤＱＩＩＦＭＶＧＲ    ２０．０分
「ＧＩＶＬＹ」、配列：ＧＩＶＬＹＥＬＭＴＧＥＬＰＹＳＨＩＮ            ３６．８分
【００７８】
タンパク質／ポリペプチドは、各々、水中１０ｐｍｏｌ／μｌの濃度で使用した。
「ＲＥＶ」、「ＥＬＭ」、「ＫＩＮＣＯＮ」及び「ＧＩＶＬＹ」は合成ペプチドである。
【００７９】
ペプチドの分子量及びＭＳで目に見える個々の電荷状態の質量は以下の通りである：
【００８０】
【表８】
2008516191.tif 000006
【配列表】
2008516191000001.app
【国際調査報告】
2008516191.tif 000010
2008516191.tif 000011
2008516191.tif 000012
2008516191.tif 000013
2008516191.tif 000014
2008516191.tif 000015