(57)【要約】  本発明は動物飼料の分野に関し、特に魚飼料の分野に関する。驚くべきことに、ここで、魚の季節的な可動期間が魚の食餌を妨害することによって延長され得ることが見出された。我々は、魚の季節的な可動期間を2℃程度に低い温度でも活動的であるような程度まで増加させることができることを見出した。これは、天然物質を魚の飼料に加えることによって達成され得る。これらの天然物質の例は、ベータ-グルカンのような免疫賦活成分及び/又はオーキシン又はジベレリン酸のような少量の植物ホルモンである。また、これらの物質の組み合わせ、特にベータ-グルカン及び植物ホルモンの組み合わせは、それらが各成分単独よりも魚の季節的可動期間を延ばすという相乗効果を有することが示された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
飼料1kg当たり0.015〜150gのベータ-グルカン及び/又は0.3〜3000mgの植物ホルモンを含む魚飼料の、魚の季節的可動期間を延ばすための使用。
【請求項２】
魚飼料が、該飼料1kg当たり0.015〜15g、好ましくは0.1〜1gのベータ-グルカンを含む、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ベータ-グルカンが、1,3及び/又は1,6ベータ-グルカンを含む、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
植物ホルモンが、インドール-3-酢酸、サイトカイニン、ジベレリン、ジベレリン酸、エチレン、アブシジン酸、ブラシノステロイド、ジャスモン酸及びサリチル酸からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
魚飼料が、該飼料1kg当たり3〜300mg、好ましくは5〜100mgの植物ホルモンを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
植物ホルモンが遊離IAAである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
植物ホルモンがジベレリン酸である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
飼料1kg当たり0.015〜150gのベータ-グルカン及び0.5〜6000mgの遊離IAAを含む、魚飼料。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、動物飼料の分野、特に魚飼料の分野に関する。
【０００２】
魚飼料は多くの種類の材料からなる。そのような飼料は、動物のための全ての必須栄養素を含有し、該動物をよく成長させ且つ病気から保護することが必要である。
多くの魚類が、水温又は日中の長さが一定値以下に下がると休息期間を取ることはよく知られている現象である。移動度が減っている期間中は魚の代謝は劇的に減少する。その結果、魚は温度及び/又は日中条件が臨界レベル以下に保持されている限りは食物を消費せず、静止状態で留まる。水温及び/又は日中の長さが、例えば季節の変化によって再び増加すると魚は移動するようになり、再び食べ始める。
【０００３】
このメカニズムは例えば鯉で広く研究されている。鯉は、水温が約8℃以下に下がると動かなくなる。該魚の移動度は大きく減少して深い水深まで下降し、この条件が保持されている限りそこに留まる。春になって水温が8℃以上に上昇すると該魚は再び動くようになり、時折水面へ泳ぎ始める。
鯉の所有者らは、明白な理由のために彼らの鯉の活動又は可動期間を増加させようと試みた。春になると、気温は水温よりも素早く上昇することが良く知られている。従って鯉の所有者らは、彼ら自身が外で休養したいのとほぼ同時に彼らの魚が水面に現れるのを望んでいる。
【０００４】
この問題のために提供された明白な解決法の一つは、人工的な加熱装置を用いて水を加熱し、水温を臨界値以下に下げないことである。また、人工的に日中を延ばして鯉を長期間可動のままにしておくことも提案されている。言うまでもなく、これは特に冷たい気候における大きな屋外プールでは高価且つエネルギーを消費する解決法となり得る。
驚くべきことに、ここで魚の季節的な可動期間が魚の食事に干渉することによって延長され得ることが見出された。我々は、魚の季節的な可動期間を、2℃程度に低い温度でも活動的であるような程度まで増加させることができることを見出した。これは、天然物質を魚の飼料に加えることによって達成され得る。
【０００５】
ここで用いられている“魚の季節的な可動期間を延ばす”とは、魚が可動である期間が延長され得ることを意味し、この延長期間は、例えば季節的な変化によって決定される期間である。さらに詳細には、“魚の季節的な可動期間を延ばす”とは、魚が可動である2つの寒い季節の間の時間間隔が延長されることを意味することが意図される。従って、この現象はまた、魚が寒い期間後に可動となる最小温度を下げることとして記載されてもよい。この現象のグラフ表示としては図1も参照されたい。
【０００６】
本発明の効果をもたらす天然物質の例は、ベータ-グルカンのような免疫賦活成分及び/又はオーキシン又はジベレリン酸のような少量の植物ホルモンである。また、これらの物質の組み合わせ、特にベータ-グルカン及び植物ホルモン、より詳細には遊離インドール-3-酢酸(IAA、オーキシン)の組み合わせは、それらが各成分単独よりも魚の季節的可動期間を延ばすという相乗効果を有することが示された。
植物ホルモンは、ここでは植物成長及び発育を調整する役割を果たす分子として定義される。植物ホルモンと考えられる化合物は、例えば:インドール-3-酢酸(IAA、オーキシン)、サイトカイニン、ジベレリン、ジベレリン酸、エチレン、アブシジン酸である。さらに、ブラシノステロイド、ジャスモン酸及びサリチル酸が重要な成長調節活性を有することが示され、植物ホルモンとして機能すると考えられている。
【０００７】
特に良好な結果は、該魚飼料に共役IAAの代わりに遊離IAAが加えられたときに得られた。“遊離IAA”という用語はここでは遊離IAAが遊離又は酸形態であることを意味するために用いられ、“共役IAA”という用語はエステル結合又はアミド結合を介して共役されているIAAを指す。
遊離IAA及び共役IAAは公知の化合物である。遊離IAAは、広く研究されている天然植物成長植物ホルモンである。植物ではIAAの大部分が共役形態で生じ(Slovin et al. 1999, Biochemistry and molecular biology of plant hormones, Elsevier, Amsterdam. P115-140)、エステル結合を介して糖に共役されているか、又はアミド結合を介してアミノ酸及びペプチドに共役されている。
【０００８】
遊離IAAは、市販の製品として容易に入手可能である。化学的に合成されても生物学的方法で調製されてもよい。IAA製造微生物は天然に広く存在する。酵母菌、真菌及び多くの細菌並びに植物は、IAAの前駆体を遊離IAAに転化することが知られている。細菌によるL-トリプトファン転化に加え、遊離IAAへのL-トリプトファン独立生化学的ルートも広く記載されている(J. Plant Growth Regul (2001) 20: 198-216)。
遊離IAAを製造することのできるよく知られている細菌は、Azospirillum Brasilense(AB)である。通常の発酵方法における成長期の終わりに、ABはL-トリプトファンを遊離IAAに転化することができる。この転化率を増加させるために、少量の合成遊離IAAを該培地に加えてよい。フィードバック機構により、ABは遊離IAAへのL-トリプトファンの転化を増加させる。
【０００９】
1gの遊離IAA/リットルの培養液の最終濃度を製造するのは容易であるが、用いた微生物に依存してさらに高い濃度も可能である。
発酵終了後、微生物を溶解してよく、遊離IAAが豊富な粉末は噴霧乾燥又は培養液を乾燥させる任意の他の従来技術によって得られ得る。他の技術を用いて液体を部分的又は完全に除去してもよい。
【００１０】
1956年というかなり前から人体における遊離IAAの効果が研究されており、0.1g/kgの単回投与は無毒性であることが示された(Mirsky A and Diengott D, Hypoglycemic action of indole-3-acetic acid by mouth in patients with diabetes mellitus, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 93: 109-110.1956)。1964年には、遊離IAAの光-酸化生成が微生物の成長阻害剤として作用することが見出された(Still C, Fukuyama T and Moyed H, Inhibitory Oxidation Products of indole-3-acetic acid, J. Biological Chemistry, 240.6,2612-2618,1964)。
【００１１】
また、遊離IAA及びその誘導体の一部の医療用途は以前から記載されている。欧州特許第1.296.676号明細書は、特に人の腫瘍性疾患を治療するための医薬品としての遊離IAAの使用を記載している。WO 02/080906は、女性の子宮内膜症を治療するための遊離IAAの使用を記載している。Nachsonら(Food and Chemical Toxocology 41, 745-752)は、ヒト前立腺癌細胞系におけるアポトーシスの増殖及び誘導における一部の遊離IAA誘導体(インドール-3-カルビノール及び3,3'-ジインドリルメタン)の効果を報告し、Rossiterら(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 12, 2523-2526)並びにFolkesら(Biochemical Pharmacology 63, 265-272)は、酵素-プロドラッグ指定癌治療における遊離IAA及び一部の誘導体の使用を記載した。
【００１２】
IAAを含む動物飼料は当技術分野で記載されており、例えば、米国特許出願第2925341号明細書は飼料1kg当たり10-50mgのインドール酢酸を含む飼料添加剤を開示している。
ここで、植物ホルモン及びベータ-グルカンが、魚の季節的可動期間を延ばすのに広い範囲の濃度で作用することが見出された。最適な濃度は異なる種類の魚の間でいくらか変化するが、当業者は所定種に最適な濃度を得る方法を知っており、例えば、該魚飼料への所望の化合物の滴定及びこれが最適な効果を有するときの試験による。以下を本方法の手引きとして用いてよい。
【００１３】
当業者は、飼料に用いるための遊離IAAを調整して、動物に有効量の遊離IAAを与える必要があることを理解する。飼料における遊離IAA濃度を調節し、遊離IAAの一定の一日摂取量を達成させるためには、動物又は動物群の飼料摂取量から見積もる必要がある。当業者は、特別な(種類又は群の)動物の飼料摂取量を知っている。典型的には、1日当たりの飼料摂取量は動物の体重の0.05〜10%であり、時折例外的に20%程度である。しかし、休息期間から覚醒したばかりの鯉は、それらの体重の0.01〜0.1%のオーダーよりもかなり低く消費する。
鯉は、遊離IAAが1日に生体重(life weight)1kg当たり0.02〜240μg(ug/kglw/日)で与えられたときに移動度を増加させて応答した。コスト及び利益の間の最適値は0.2〜24ug/kglw/日の濃度で達成され、特に1〜5ug/kglw/日、例えば2,4ug/kglw/日の遊離IAAを含有する飼料が非常に有効であった。
【００１４】
従って、一つの特徴では、本発明は、魚の季節的可動期間を延ばすための方法であって、魚に1日に生体重1kg当たり0.02〜240μg(ug/kglw/日)の範囲の遊離IAAを与える方法に関する。
このために特に好適なのは、魚飼料1kg当たり0.3〜3000mgの遊離IAAを含む魚飼料である。従って、別の特徴では、本発明は、魚の季節的可動期間を延ばすための飼料1kg当たり0.3〜3000mgの植物ホルモンを含む魚飼料の使用に関する。
【００１５】
また、ベータ-グルカン群の中では、特に1,3及び1,6ベータ-グルカンが魚の季節的可動期間を延ばすのに非常に有用であることが見出された。そのような1,3及び1,6ベータ-グルカンの特に良好な供給源は、Agaricus blazei murill(ABM)の調製物又は酵母菌壁で見出され得る。乾燥していないABM又は乾燥したABMを本発明に用いてよく、乾燥ABMは通常は乾燥していないABMの質量の10%である。乾燥ABMは、2〜50%のオーダー、典型的には10〜20%のオーダーで1,3及び/又は1,6ベータ-グルカンを含有してよい。
魚に1〜10.000ug/kglw/日の乾燥Agaricus blazei murill(1kglw/日当たり10〜100.000ugの乾燥させていないAgaricus blazei murillに相当)を与えると、魚の季節的可動期間を延ばす所望の効果を生み出すことが見出された。これは、約0.1〜2000ug/kglw/日の1,3及び1,6ベータ-グルカンに相当する。優れた結果は、魚に10〜200ug/kglw/日の1,3及び1,6ベータ-グルカンを与えたときに得られ、コスト利益の最適値は、約60ug/kglw/日の1,3及び1,6ベータ-グルカン又は600ug/kglw/日の乾燥Agaricus blazei murillであることが見出された。
【００１６】
従って、一つの特徴では、本発明は、魚の季節的可動期間を延ばすための方法であって、魚に0.1〜2000ug/kglw/日の1,3及び1,6ベータ-グルカンを与える方法に関する。
このために特に好適なものは、魚飼料1kg当たり0.015〜150gを含む魚飼料である。従って、別の特徴では、本発明は、魚の季節的可動期間を延ばすための飼料1kg当たり0.015〜150gのベータ-グルカンを含む魚飼料の使用に関する。
【００１７】
ベータ-グルカンを含む動物飼料は、容易に入手可能である。例えば、WO 02/091850 Aは、飼料1kg当たり100-1000mgのベータ-グルカンを含む動物飼料を開示している。また、日本国特許出願第07 051000号明細書、米国特許第6306453号明細書、WO 2004/105775、WO 02/37988、WO 2004/066863、WO 2004/014320及び米国特許出願第2005/020490号明細書は、ベータ-グルカンを含み、且つ本発明の動物飼料として使用するのに好適となり得る組成物を開示している。そのような動物飼料はまた、Hiss and Sauerwein, Journal of animal physiology and animal nutrition, 87, 2003, pp2-11, Deblackwell, Berlinに記載されている。
【００１８】
鯉はまた、それらの餌にジベレリン又はジベレリン酸が補充されたときに所望の効果を示した。ここでの最適な濃度は、0.002〜20ug/kglw/日の範囲にあることが見出された。0.02〜2ug/kglw/日の範囲では、魚の季節的可動期間を延ばす効果が特に表れた。最適な結果は、0.1〜2ug/kglw/日、例えば0.24ug/kglw/日で達成された。
本発明で用いられ得るジベレリン酸を含む好適な飼料物質が記載されている。米国特許出願第2943938号明細書及びSvihusら(Journal of Animal Science, 64, 1997, p257-272)は、組成物1kg当たりの好適な量のジベレリン酸を含む動物飼料を記載している。
【００１９】
実施例
実施例1:遊離IAAを含有する調製物の微生物学的生産
Azospirillum brasilence Sp7(ATCC)を、培養チューブにおいて寒天培養として得た。LB培地を用い、終夜28℃の175rpmで菌株を成長させた。グリセロールを10%まで該培養物に加え、混合し、及びNalgene creovials上で分割し、-80℃で凍結させた。系統は-80℃でcreovialsに保存した。
A. brasilenceの種培養物を調製するために、1つの系統(1.2〜1.8mL)を解凍して1リットルのLB培地に加え、約20時間28℃の175rpmで約2.5の光学密度(OD620nm)まで成長させた。
10リットルの発酵槽を水ですすぎ、pH電極を較正した。9リットルのLB培地を調製し、1g/LのL-トリプトファン及び0.1g/Lの遊離IAAを加えた。該培地を2mLの消泡剤と共に発酵槽に入れた。該発酵槽を30分間121℃で滅菌した。28℃に冷却後、O2プローブをN2及びO2で較正し、それぞれ0及び100%の空気飽和状態とした。
種培養物を、オートクレーブで別々に滅菌したフラスコ及びパイプで発酵槽に移した。添加が完了したら該パイプ及びフラスコを取り除き、発酵を以下のパラメーターで開始した:
攪拌器速度      400rpm
温度            28℃
通気            0.75Nl/分
PH              7
【００２０】
15分後、サンプルを取り出してOD620nmを測定し、pHを確認した。サンプルを一定間隔で取り出し、A. brasilenceの成長を定量化した。成長速度を落とした追加の培地を加え、十分なバイオマスが遊離IAAの製造のために形成されることを保証した。遊離IAAの製造は、活性な成長段階が終わり、延長期間が続いたときに開始することが見出された。遊離IAA濃縮工程に続いてLC-MSを行う。遊離IAAの濃度が約1g/Lとなったとき、発酵が終了して細胞が収穫され、約1400barの非ジェット式ホモジナイザーを用いて溶解した。残りの上澄み液及び溶解した細胞を滅菌し、噴霧乾燥して所望の生成調合物を得た。
【００２１】
実施例2:ベータ-グルカンを含有する飼料の調製
3,0gの量のAgaricus Blazei Murill(Agaricus Farm)、自然源のベータ-グルカンを100mLのオリーブオイルに懸濁した。本発明の魚飼料は、1kgの市場で入手可能な(Coppens) Cyprico White 3mmのフローター(floater)飼料を100mLのオイル懸濁液で真空含浸することによって調製した。対照飼料は、同量の飼料をオリーブオイルのみで真空含浸することによって調製した。
【００２２】
実施例3:植物成長ホルモンを含有する飼料の調製
12mgの遊離IAAに相当する実施例1に記載の噴霧乾燥調合物の一定量を、100mLのオリーブオイルに懸濁した。本発明の魚飼料は、1kgの市場で入手可能な(Coppens) Cyprico White 3mmのフローター飼料を100mLのオイル懸濁液で真空含浸することによって調製した。対照飼料は、同量の飼料をオリーブオイルのみで真空含浸することによって調製した。
【００２３】
実施例4:ベータ-グルカン及び植物成長ホルモンを共に含有する飼料の調製
3,0グラムの量のAgaricus Blazei Murill(ABM、Agaricus Farm)、自然源のベータ-グルカン及び12mgの遊離IAAに相当する実施例1に記載の一定量の噴霧乾燥調合物を、100mLのオリーブオイルに懸濁した。本発明の魚飼料は、1kgの市場で入手可能な(Coppens) Cyprico White 3mmのフローター飼料を100mLのオイル懸濁液で真空含浸することによって調製した。対照飼料は、同量の飼料をオリーブオイルのみで真空含浸することによって調製した。
【００２４】
実施例5:ベータ-グルカン及び植物成長ホルモンを含む魚飼料の、魚の季節的可動期間を延ばすための使用
全体重が約50kgの鯉50匹が全てに入っているそれぞれ40立方メートルの4つの池を用いて、本発明の魚飼料の有効性を示した。対照として用いた1つの池では魚に対照飼料を与え、他の池の魚には上記実施例2〜4で調製された本発明の飼料を与えた。実験は水温が約2℃となったときに始めた。
対照池の魚に、1日当たり10gのCyprico White 3 mmフローター飼料を与え、他の池の魚には、実施例2、3及び4に記載の10gの飼料を与えた(表1)。
試験グループの魚は水面で泳いで飼料を食べ始め、対照グループは活動の兆候を示さないことが観察された。この効果は毎日徐々に増加して5日後には魚は完全に可動となったが、水温は依然として2〜3℃であった。魚の移動度を1〜5の相対的指標で評点し、表2)で1は完全に静止し、5は完全に可動である。対照池の水は他の池の水と正確に同じ温度であるが、対照池の魚は完全に静止していた。4週間後、水温が徐々に6℃まで上昇したときに有害な副作用は試験グループで観察されなかった。魚は健康的で十分に可動であり、対照グループはほぼ完全に静止していた。
【００２５】
【表１】
2008536507.tif 000002
【００２６】
【表２】
2008536507.tif 000003
【００２７】
表2は、1〜5のスケールで表現される魚の移動度(1は完全に静止し、5は完全に可動である)及び池の水温の間の関係を示している。池1、2及び3の魚には本発明の魚飼料を与え、池4の魚には対照飼料を与えた。さらなる詳細は実施例に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】オランダの月当たりの平均温度を表すグラフ(Source KNMI、de Bilt、オランダ、www.knmi.nl)。グラフにおける8及び3℃の水平ラインは、魚が動き始める温度が8〜3℃まで下がると、魚の季節的な可動期間は約2〜3ヶ月延びることを説明している。
【図１】
2008536507.tif 000004
【国際調査報告】
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