【事件の表示】
　特許第２７６４４１５号「Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡおよびその用途」の請求項１ないし１０に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２７６４４１５号の請求項１ないし９に係る特許を維持する。
【理由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第２７６４４１５号に係る出願は、昭和６３年１２月１３日（優先権主張昭和６２年１２月１５日）の出願であって、平成１０年４月３日に設定登録がなされたところ、石井睦子より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内に訂正請求がなされたものである。
ＩＩ．訂正請求について
１．訂正の内容
　特許権者は、請求項７を削除する訂正を請求している。
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正は、特許請求の範囲の減縮に該当し、新規事項の追加に該当せず、実質的に特許請求の範囲を拡張又は変更するものではない。
３．独立特許要件
　後述の「ＩＩＩ．３．判断」の項に記載のように、訂正後の特許請求の範囲に記載された発明は出願の際独立して特許を受けることができるものである。
４．むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法１２０条の４，２項及び同条３項で準用する１２６条２から４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
ＩＩＩ．特許異議申立について
１．特許異議申立の理由の概要
　訂正前の本件請求項７に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であるから特許法２９条１項３号の規定により、及び請求項１乃至１０に係る発明は、甲第１乃至４号証に記載の発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができない。また、請求項１，３，７及び８は、特許法３６条の規定を満たしていない。
　　　　　　　　　記
　甲第１号証：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ　１９６９，１０６３〜１０６８　頁
　甲第２号証：特開昭５５−５８０９５号公報
　甲第３号証：特開昭５５−５０８９３号公報
　甲第４号証：特開昭５４−６７０８４号公報
２．甲各号証の記載内容
　甲第１号証には、ストレプトコッカス・フェイチウムＦ２４株が産生するα−グリセロホスフェートオキシダーゼ（以下、ＧＰＯという。）が、好気的条件でＬ−α−グリセロホスフェート及びＯ２をジヒドロアセトンホスフェート及びＨ２Ｏえｄに変換する反応に関与するフラボプロテインであり、ＧＰＯのＫｍが３．５〜６ｍＭであり、至適ｐＨが７であり、ｐＨ４．０〜４．６で沈殿するという記載がある。
　甲第２号証には、グルコースイソメラーゼをコードするＤＮＡをプラスミドｐＵＣ１００２に組み込み、これを大腸菌に含有させて形質転換体であるＪＣ１５５３菌株を得、これを培養し、グルコースイソメラーゼを発現させる方法が、甲第３号証には、異種蛋白質をコードするＤＮＡを含むベクターを開始点が特定構造である機能的組み換えＤＮＡに構成し、このベクターを単細胞宿主内に導入して、これを形質転換して得た形質転換体を培養することにより該異種蛋白質を生産する方法が、並びに甲第４号証には、微生物の突然変異体にグルタメートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドを上記微生物に導入して、形質転換し特定条件で成育するクローンを選択し、このクローンをメタノールとアンモニアおよび／またはアンモニウムイオンを含む水性培地で培養して単細胞蛋白質含有組成物を水性培地から回収する方法がそれぞれ記載されている。
３．判断
　請求項７に係る発明は、訂正により削除され、特許異議申立の対象外となったので、請求項１乃至６及び８乃至１０に係る発明について検討する。
（なお、請求項７に係る発明は、削除されたので、訂正前の請求項１乃至６及び８乃至１０に係る発明を訂正後の発明として、以下、各々本件発明１乃至６及び７乃至９という。）
Ａ．特許法２９条２項違反について
　本件発明１乃至２は、ＧＰＯを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡであるところ、甲第１号証には、ＧＰＯの酵素としての特性の記載はあるが、この酵素のアミノ酸配列或いはその塩基配列の記載はなく、ましてやその塩基配列を含むＤＮＡを単離・採取したという記載はない。
　また、甲第２乃至４号証には、酵素等の異種蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入した形質転換体を培養することにより酵素等の異種蛋白質を生産する方法が記載されているものの、ＧＰＯに言及するところはない。
　そうすると、甲第１号証に甲第２乃至４号証に記載された発明を組み合わせても、本件発明１乃至２が当業者にとって容易に想到し得たものであるとはいえない。
　本件発明３は、「宿主にとって外来性である請求項１記載のＤＮＡを保持することを特徴とする形質転換体」であるところ、「請求項１記載のＤＮＡ」自体が甲第１号証に記載されていないので、甲第２乃至４号証に記載された発明を加味しても、当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　本件発明４乃至５は、本件発明３を更に限定したものであるから、本件発明３についての判断と同様の理由により、甲第１乃至４号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　また、本件発明７は、本件発明３に係る形質転換体を培養してポリペプチドを製造する「ポリペプチドの製造法」であるから、甲第１乃至４号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　本件発明８乃至９は、本件発明７を更に限定したものであるから、本件発明７についての判断と同様の理由により、甲第１乃至４号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
Ｂ．特許法３６条違反について
▲１▼特許異議申立人は、本件ＧＰＯは、従来のＧＰＯとの比較がなく具体的にどの点が良好なのか記載がないから実質的に効果の記載がなされていない旨主張している。（異議申立書９頁１３〜１４行）
　しかし、本件明細書「発明の効果」の項によると、本件発明の効果は、本発明のＤＮＡ及び形質転換体を用いることによって、グリセロール、アスコルビン酸、α−ケト酸等の添加をすることなしに、より効率よくＧＰＯを製造することが可能になったところにあるから、たとえ本件ＧＰＯと従来のＧＰＯとの比較がないとしても、本件明細書に効果の記載がないとはいえない。
▲２▼特許異議申立人は、本特許公報においては、ＧＰＯは単独で酵素活性を発揮するのか、ＦＤＡ等の補欠分子属が必要なのか等、ＧＰＯの酵素活性がどのような機構で発揮されるのか具体的に説明がされてなく、ＧＰＯの効果の記載が不明瞭である旨主張している。（同９頁２０〜２２行）
　しかし、本件発明１乃至２は「ＤＮＡ」、３乃至６は「形質転換体」、７乃至９は「ポリペプチドの製造法」に係るものであって、「酵素」自体を直接の対象とするものではないので、上記特許異議申立人の▲２▼の主張のように、本件発明の効果の記載が不明瞭となるわけではない。
　なお、本件明細書には、「酵素」としての理化学的性状が具体的に記載されており、この記載で十分特定されているというべきである。
▲３▼特許異議申立人は、変異ＧＰＯがどのような構造を有している場合に、その活性が発揮し得るのか全く不明であり、効果との整合性がない旨主張している。（同９頁２４〜２５行）
　しかし、本件明細書には、酵素としての理化学的性状が具体的に開示されているから、この理化学的性状をふまえ、アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列の場合の活性を確認することは何ら困難なことではない。
　したがって、特許異議申立人の▲１▼乃至▲３▼の主張はいずれも失当である。
ＩＶ．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１乃至９についての特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件１乃至９に係る特許を取り消す理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年６月１８日（１９９９．６．１８）
【訂正の要旨】
　この訂正は、請求項７を削除するものであり、「特許請求の範囲の減縮」に該当する。
（５４）【発明の名称】
Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡおよびその用途
（５７）【特許請求の範囲】
　１．Ｎ末端側より第１図（１）〜（６）〔図中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基またはＯＨを示す〕に示したアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列で表される、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
　２．Ｎ末端側より第１図（１）〜（６）〔図中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基またはＯＨを示す〕に示したアミノ酸配列で表される、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、５’末端側より第２図（１）〜（５）〔図中、ＸはＴＡＡ，ＴＡＧ及びＴＧＡ以外のコドンまたは５’末端基を示し、Ｙはコドンまたは３’末端基を示す〕で表されるものである請求項１記載のＤＮＡ。
　３．宿主にとって外来性である請求項１記載のＤＮＡを保持することを特徴とする形質転換体。
　４．Ｎ末端側より第１図（１）〜（６）［図中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基またはＯＨを示す〕に示したアミノ酸配列で表される、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、５’末端側より第２図（１）〜（５）〔図中、ＸはＴＡＡ，ＴＡＧ及びＴＧＡ以外のコドンまたは５’末端基を示し、Ｙはコドンまたは３’末端基を示す〕で表されるものである請求項３記載の形質転換体。
　５．形質転換体が、エシェリヒア・コリに属する微生物である請求項３または４記載の形質転換体。
　６．形質転換体が、エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＧＯＰＳ１株〔微工研条寄第２１３３号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２１３３）〕である請求項３または４記載の形質転換体。
　７．宿主にとって外来性である請求項１記載のＤＮＡを保持する形質転換体を培養して該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培養物からＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを構成するポリペプチドを採取することを特徴とする、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを構成するポリペプチドの製造法。
　８．請求項１記載のＤＮＡが、ストレプトコッカス属に属するＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ生産菌に由来するＤＮＡである請求項７記載の製造法。
　９．宿主がエシェリヒア・コリに属する微生物である請求項７または８記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
　本発明はＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡ、該ＤＮＡを保持してなる形質転換体、該形質転換体により該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめて得られるポリペプチドの製造法に関する。
〔従来の技術〕
　Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、次の反応式
　Ｌ−α−グリセロホスフェート＋Ｏ２
　→ジヒドロキシアセトンホスフェート＋Ｈ２Ｏ２
で示される反応、すなわちＬ−α−グリセロホスフェートと１分子の酸素からジヒドロキシアセトンホスフェートと１分子の過酸化水素を生ずる反応を触媒する酵素である。このようにＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ（以下ＧＰＯと略す）は、Ｌ−α−グリセロホスフェートを基質とする酸化酵素であることから、Ｌ−α−グリセロホスフェートの定量に使用される。またこの酵素はリパーゼ、グリセロールキナーゼ等の他の酵素やＡＴＰの試薬と組み合せて使用することにより反応に関与する成分、例えばリパーゼ活性測定やトリグリセリド、グリセリン、ＡＴＰ等を簡便且つ特異的に定量することが可能であるため、従来の非特異的な化学的定量法に代わる生化学的定量法における主要酵素となるもので、臨床診断分野、研究分野において極めて有用である。
　一方、ＧＰＯは自然界に存在することが古くから知られており、例えばストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌に存在することが報告されている〔アーカイブス　オブ　バイオケミストリー　アンド　バイオフィジクス，８８巻、２５０頁（１９６０年）；特開昭５３−７２８９２号公報；同５５−１５７４６号公報〕。
〔発明が解決しようとする課題〕
　しかしながら、これら従来のＧＰＯ生産菌によるＧＰＯの生産にはいくつかの問題点があった。すなわち、これらのＧＰＯ生産菌はＧＰＯの生産性が低いこと；ストレプトコッカス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、乳酸桿菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｅｃｅａｅ）のＧＰＯ生産菌を用いる場合には製造時にグリセロール、アスコルビン酸、α−ケト酸等のＧＰＯ生産を誘導する物質の添加が必要であること；共存する他種酵素等の除去が非常に困難であった等の問題があった。従って、純度の高い良質なＧＰＯを得るためにはコストが極めて高いものとなり、研究用試薬、臨床診断用試薬として汎用するための障害となっていた。
　またＧＰＯの詳細な遺伝子の一次構造及び構成するタンパク質のアミノ酸配列の一次構造は未だ報告されていない。
〔課題を解決するための手段〕
　そこで本発明者らはＧＰＯの生産性向上、共存する他種酵素（夾雑酵素）の含量低減並びに製造コストの低減を図るべく鋭意検討を試みたところ、該ＧＰＯ遺伝子の採取ならびに一次構造解析に成功すると共に遺伝子工学的手法を応用することによって、生産性が良好であり、且つ生産時培地中に誘導物質の添加を必要としないＧＰＯの製造法を確立し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、Ｎ末端側より第１図（１）〜（６）〔図中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基またはＯＨを示す〕に示したアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の一部が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列で表される、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ（ＧＰＯ）を構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、該ＤＮＡを保持する形質転換体、及び該形質転換体を培養し、該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめて採取することを特徴とする該ＧＰＯを構成するポリペプチドの製造法を提供するものである。
　本発明のＤＮＡは、例えば遺伝子組換え技術を利用し次の如くして製造される。すなわち、ＧＰＯ生産能を有するＧＰＯ遺伝子の供与体である微生物より該微生物のＤＮＡを分離精製した後、超音波、制限酵素などを用いて切断した該ＤＮＡと切断してリニヤーにした発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接着末端部においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、斯くして得られた組換えＤＮＡベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーとＧＰＯの活性とを指標としてスクリーニングして取得した該組換えＤＮＡベクターを保持する微生物を培養し、該培養菌体から該組換えＤＮＡベクターを分離精製し、次いで該組換えベクターからＧＰＯ遺伝情報を有する本発明ＤＮＡを採取することにより製造される。
　ＧＰＯ遺伝子の供与体である微生物としては、ＧＰＯ産生能を有する微生物であれば特に制限されないが、例えば特開昭５３−７２８９２号、同５５−１５７４６号、同５８−１６５７８９号、などに示されているストレプトコッカス・フェイチウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）Ｆ２４株、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）１０ＣＩ株、ストレプトコッカス・フェカリスＡＴＣＣ　１２７５５株、ストレプトコッカス・フェカリスＡＴＣＣ　８０４３株、ストレプトコッカス・フェカリスＡＴＣＣ　１９４８８株、ストレプトコッカス・クリモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＮＲＲＬＢ６８４株等のストレプトコッカス属ＧＰＯ生産菌；ペディオコッカス・セレビシイエ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＴＣ　８０４２株、ペディオコッカス・セレビシイエＡＴＣＣ　８０８１株、ペディオコッカス・セレビシイエＩＦＯ　１２２３０株、，ペディオコッカス・アシディラクティ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｅｉ）ＩＦＯ　３８８５株、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＩＦＯ　１２３１８株、ペディオコッカス・パルヴァラス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒｖｕｌｕｓ）ＩＦＯ　１２２３５株、ペディオコッカス・ホマリ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｍａｒｉ）ＩＦＯ　１２２１７株、ペディオコッカス・ウリナエ−エクイ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｕｒｉｎａｅ−ｅｑｕｉ）ＡＴＣＣ　２９７２２株等のペディオコッカス属ＧＰＯ生産菌；ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ）ＡＴＣＣ　７４６９株、ラクトバチルス・デルブルツキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ）ＮＲＲＬ　Ｂ４４５株、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＮＲＲＬ　９３３８株、ラクトバチルス・レイクマニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ　４７９７株等のラクトバチルス属ＧＰＯ生産菌；ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）などのロイコノストック属ＧＰＯ生産菌；アエロコッカス・ビリダンス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｉｒｉｄａｎｓ）ＩＦＯ　１２２１９株、同ＩＦＯ　１２３１７株等のアエロコッカス属ＧＰＯ生産菌が挙げられるが、就中ストレプトコッカス属に属するＧＰＯ生産菌が好ましい。
　また、遺伝子組換え技術によりＧＰＯ産生能を付与せしめた形質転換微生物を、ＧＰＯ遺伝子の供与体として利用してもよい。
　なお特に好ましいＧＰＯ遺伝子の供与微生物としては、本発明者らが静岡県裾野市山口の牧場の土壌より分離したストレプトコッカス属に属する新規な菌株、ＧＰＯＳ−５３株が挙げられる。該ＧＰＯＳ−５３株は従来公知のＧＰＯに比べ良好な理化学的性質を有するＧＰＯを産生する。
　上述の新規なＧＰＯＳ−５３株の分類学的性状は以下の通りである。
Ｉ．各種培養における生育状態（培養温度２８〜３０℃）
　▲１▼斜面培養（普通寒天培地＋酵母エキス０．２％）
　　　線状に生育するが、生育はやや弱く、クリーム色〜乳白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
　▲２▼平面培養（普通寒天培地＋酵母エキス０．２％）
　　　円形で丘状の集落を形成し、クリーム色〜乳白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
　▲３▼液体培養（トリプトソイブロス（Ｄｉｆｃｏ社製））
　　　生育良好で一様に混濁するが、沈降する（上部は澄んでくる）。
　▲４▼ＢＣＰミルク培養
　　　産生になる。
ＩＩ．形態的特徴
　球形又は卵形状の細菌で、単独，二連，短連鎖又は長連鎖する。運動性はなく、芽胞は形成しない。大きさは０．８〜１．０×１．０μｍである。
ＩＩＩ．生理学的生化学的性質
　〔＋：陽性、−：陰性、（＋）：弱陽性〕
　グラム染色　　　　　　　　　　　　　　　　＋
　ＫＯＨ反応　　　　　　　　　　　　　　　　−
　抗酸性染色　　　　　　　　　　　　　　　　−
　カプセル形成　　　　　　　　　　　　　　　−
　ＯＦテスト（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ）　　Ｆ
　嫌気での生育　　　　　　　　　　　　　　　＋
　生育温度　４５℃　　　　　　　　　　　　　＋
　　　　　　３０℃　　　　　　　　　　　　　＋
　　　　　　１０℃　　　　　　　　　　　　　＋
　耐塩性　ＮａＣｌ濃度％
　　　　　　　　　０％　　　　　　　　　　　＋
　　　　　　　５．０％　　　　　　　　　　　＋
　　　　　　　６．０％　　　　　　　　　　　−
　生育ｐＨｐＨ９．５　　　　　　　　　　　　＋
　　　　　ｐＨ８．０　　　　　　　　　　　　＋
　　　　　ｐＨ４．０　　　　　　　　　　　　＋
　０．１％メチレン青ミルク培地での生育　　　＋
　カタラーゼ産生　　　　　　　　　　　　　　−
　オキシダーゼ産生　　　　　　　　　　　　　−
　ウレアーゼ産生（ＳＳＲ，Ｃｈｒｉｓとも）　−
　ゼラチン分解　　　　　　　　　　　　　　　−
　デンプン分解　　　　　　　　　　　　　　　−
　カゼイン分解　　　　　　　　　　　　　　　＋
　エスクリン分解　　　　　　　　　　　　　　＋
　ヒプレイト分解（ＡＰＩ・２０　ＳＴＲＥＰ）＋
　セルロース分解　　　　　　　　　　　　　　−
　アルギニン分解　　　　　　　　　　　　　　＋
　インドール産生　　　　　　　　　　　　　　−
　硫化水素産生　　　　　　　　　　　　　　　−
　アセトイン産生（ＮａＣｌ）　　　　　　　　＋
　ＭＲテスト　　　　　　　　　　　　　　　　＋
　硫酸塩還元　　　　　　　　　　　　　　　　−
　脱窒反応　　　　　　　　　　　　　　　　　−
（利用性テスト）
　クエン酸塩（Ｓｉｍｏｎｓ，Ｃｈｒｉｓとも）−
　リンゴ酸塩（Ｓｉｍｏｎｓ）　　　　　　　　−
　　　　　　（Ｃｈｒｉｓ）　　　　　　　　　＋
　プロピオン酸塩（Ｓｉｍｏｎｓ）　　　　　　−
　マロン酸塩（Ｃｈｒｉｓ）　　　　　　　　　＋
　グルコースよりガスの産生　　　　　　　　　−
（糖より酸の産生）
　アドニトール　　　　　　　　　　　　　　　−
　Ｌ（＋）アラビノース　　　　　　　　　　　＋
　セロビオース　　　　　　　　　　　　　　　＋
　ヅルシトール　　　　　　　　　　　　　　　−
　メソ−エリスリトール　　　　　　　　　　　−
　フラクトース　　　　　　　　　　　　　　　＋
　Ｄ−ガラクトース　　　　　　　　　　　　　＋
　Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　　　　＋
　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　（＋）
　イノシトール　　　　　　　　　　　　　　　−
　イヌリン　　　　　　　　　　　　　　　　　−
　ラクトース　　　　　　　　　　　　　　　　＋
　マルトース　　　　　　　　　　　　　　　　＋
　マンニトール　　　　　　　　　　　　　　　＋
　マンノース　　　　　　　　　　　　　　　　＋
　メリビオース　　　　　　　　　　　　　　　＋
　メレジトース　　　　　　　　　　　　　　　−
　ラフィノース　　　　　　　　　　　　　　　＋
　Ｌ（＋）ラムノース　　　　　　　　　　　　−
　Ｄ−リボース　　　　　　　　　　　　　　　＋
　サリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
　Ｌ−ソルボース　　　　　　　　　　　　　　−
　ソルビトール　　　　　　　　　　　　　　　−
　デンプン　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
　サッカロース　　　　　　　　　　　　　　　＋
　キシロース　　　　　　　　　　　　　　　　−
　トレハ口ース　　　　　　　　　　　　　　　＋
　溶血性（ＡＰＩ　２０　ＳＴＲＥＰ）　　　　−
　上記の菌学的性質から、本発明の新菌株の菌学的特徴は、グラム陽性の球菌〜卵形菌で単独，二連，短連鎖又は長連鎖し、カタラーゼ及びオキシダーゼ産生陰性、糖を発酵的に分解し酸を産生し、非運動性，芽胞非形成，大きさ０，８〜１．０×１．０μｍの菌であるといえる。
　本菌株の主性状をバージーズ　マニュアル　オブ　デタミネーティブ　バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版を参照した結果、本菌株はストレプトコッカス属に属する菌株であると判定される。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ：以下単にＳ．と示すことがある）属は１０℃及び４５℃での生育能、０．１％メチレン青ミルク培地での生育能、ゼラチン等の分解能、耐塩性等の性状で大別される。ストレプトコッカス属の主な菌種と本菌株を対比し以下に示す。
　表中、菌種（１）〜（９）は次の通りである。
（１）ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）
（２）ストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）
（３）ストレプトコッカス・エクイ（Ｓ．ｅｑｕｉ）
（４）ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
（５）ストレプトコッカス・サリバリス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｓ）
（６）ストレプトコッカス・ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）
（７）ストレプトコッカス・フェーカリス（Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓ）
（８）ストレプトコッカス・フェーシウム（Ｓ．ｆａｅｃｉｕｍ）
（９）ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓ．ｌａｃｔｉｓ）
　上述の対比の結果、本菌株はストレプトコッカス・フェーカリス、ストレプトコッカス・フェーシウム、ストレプトコッカス・ラクチスに類似する菌株であると判定される。かかる３菌種と本菌株の諸性状を詳細に対比し、次表に示す。
　以上の比較から、本菌株の諸性状は、Ｓ．ｆａｅｃｉｕｍとよく一致している。しかしストレプトコッカス属の分類のキーポイントとなるヒプレイン分解，耐塩性（６．５％）の点で異なっている。よって本菌株をストレプトコッカス属に属する新菌株と同定し、ストレプトコッカス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ）ＧＰＯＳ−５３と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に「微工研条寄第２１２０号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２１２０）」として寄託した。
　遺伝子の供与体である微生物から由来するＤＮＡは次の如くして採取される。即ち、供与微生物である上述した細菌のいずれかを、例えば、液体培地で約１〜３日間通気攪拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させることによってＧＰＯ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法との組み合せで行ってもよい。
　このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離、精製するには、常法に従って、例えば、フェノール抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせることにより行われる。
　分離精製された微生物ＤＮＡを切断するには、例えば、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができるが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易ならしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＢａｍＨＩなどのＩＩ型制限酵素を用いる方法が適している。
　ベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。
　ファージとしては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合には・λｇｔ・λＣ，λｇｔ・λＢなどが使用できる。
　また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９などが、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を宿主微生物とする場合にはｐＵＢ１１０，ｐＣ１９４などが使用でき、さらに、エシェリヒア・コリおよびサッカロマイセス・セレビシアなどのグラム陰・陽両性にまたがる二種以上の宿主微生物体内で自律的に増殖可能なシャトルベクターを利用することもできる。このようなベクターを、先に述べたＧＰＯ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断して、ベクター断片を得ることが好ましい。
　微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片との組換えＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えＤＮＡを作成することもできる。
　宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発現のできるものであればよく、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合、エシェリヒア・コリＤＨ１，エシェリヒア・コリＨＢ１０１，エシェリヒア・コリＷ３１１０，エシェリヒア・コリＣ６００等が利用出来る。
　宿主微生物に組換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシュウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行い、またバチルス属に属する微生物の場合には、コンピテントセル法またはリポソーム組換えＤＮＡのプロトプラスト宿主細胞内への電気的な融合移入法などを採用することができ、さらにマイクロインジェクション法を用いてもよい。
　宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有無についての選択は、目的ＤＮＡ断片を保持する組換えＤＮＡであるベクターの薬剤耐性マーカーとＧＰＯとを同時に発現し得る微生物を検索すればよく、例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、且つＧＰＯを生成する微生物を選択すればよい。
　このようにして一度選択されたＧＰＯ遺伝子を保有する組換えＤＮＡは、形質転換微生物から取り出され、他の宿主微生物に移入することもできる。また、ＧＰＯ遺伝子を保持する組換えＤＮＡから制限酵素などにより切断してＧＰＯ遺伝子であるＤＮＡを切り出し、これと同様な方法により切断して得られる他の開環ベクター末端とを結合させて新規な特徴を有する組換えＤＮＡを作製して、他の宿主微生物に移入することもできる。
　また本質的にＧＰＯ活性のあるＧＰＯムテインをコードするＤＮＡは、本発明のＧＰＯ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人口変異遺伝子を意味し、この人口変異遺伝子は部位特異的塩基変換法および目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人口変位ＤＮＡ断片で置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られ、斯くして取得された人口変異遺伝子のうち特に優れた性質を有するＧＰＯムテインＤＮＡについては、最終的には、このムテインＤＮＡをベクターに挿入せしめて組換えＤＮＡを作成し、これを宿主微生物に移入させることによって、ＧＰＯムテインの製造が可能である。
　かくして得られる本発明ＤＮＡの塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１４，１２０５〜１２１０（１９８１年）に示されているジデオキシ法で解読し、決定することができる。例えばＧＰＯ遺伝子供与体としてストレプトコッカス・エスピーＧＰＯＳ−５３株を用い、宿主微生物としてエシェリヒア・コリを用いて得られたプラスミド中のＧＰＯ遺伝子の塩基配列は第２図（１）〜（５）の通りである。
　第２図（１）〜（５）において、Ｘで示されるコドンは、アミノ酸をコードするコドンであればいずれでもよく、更に、その５′末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有していてもよいが、好ましくはＡＴＧまたはシグナルペプチドに対応するポリデオキシリボ核酸を挙げることができる。Ｙで示されるコドンは、翻訳終止コドンまたはアミノ酸をコードするコドンであればいずれでもよく、更に、その３′末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有していてもよいが、その場合には、この複数個のコドンの３′末端にさらに翻訳終止コドンを有することが好ましい。
　また、本発明ＤＮＡを発現させることにより生産されるポリペプチドのアミノ酸配列は、ＤＮＡの塩基配列から予測決定できる。なお、該ペプチドのＮ−末端部を構成する部分アミノ酸配列は、以下の如くして決定できる。すなわち、ＧＰＯ産生能を有するＧＰＯ遺伝子供与微生物を栄養培地で培養して菌体内にＧＰＯを産生蓄積せしめ、培養終了後、得られた培養物を▲濾▼過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡおよび／または適当な界面活性剤等を添加すれば、ＧＰＯが可溶化され、水溶液として分離採取される。この様にして得られたＧＰＯの水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安分画、ゲル▲濾▼過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、高純度ＧＰＯが得られ、高純度ＧＰＯを用いて液相プロテイン　シーケンサー（べックマン社製：ＢＥＣＫＭＡＮ　Ｓｙｓｔｅｍ　８９０ＭＥ）によりＧＰＯであるペプチドのＮ末端部を構成する部分アミノ酸配列が決定される。また、少なくとも、該部分アミノ酸配列は、遺伝子操作によって得られたＧＰＯのＮ末端部分アミノ酸配列と一致するものであることを確認した。第２図（１）〜（５）で示す塩基配列から、上記の如くして決定されたアミノ酸配列は第１図（１）〜（６）の通りである。第１図（１）〜（６）のアミノ酸配列のうち、Ａで示されるアミノ酸残基としては、１個または複数個のアミノ酸残基よりなり、Ａとしては、好ましくは、水素原子若しくはＭｅｔまたはシグナルペプチドが挙げられる。Ｂで示されるものとしては、酸アミドであってもよく、また１個以上のアミノ酸残基であってもよい。
　かくして得られる形質転換体は、栄養培地にて培養することにより多量のＧＰＯ活性を有するペプチドを安定に産生する。
　形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うか、工業的には深部通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース，シュクロース，ラクトース，マルトース，フラクトース，糖蜜などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン，肉エキス，酵母エキス，カゼイン加水分解物などが使用される。その他、リン酸塩，炭酸塩，硫酸塩，マグネシウム，カルシウム，カリウム，鉄，マンガン，亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸，特定のビタミンなどが必要に応じて使用されるが、従来のＧＰＯ製造において必要とされるグリセロール、アスコルビン酸またはα−ケト酸等のＧＰＯ誘導物質の添加は本発明方法には必要としない。
　培養温度は菌が発育し、ＧＰＯを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は、条件によって多少異なるが、ＧＰＯが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は１２〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ＧＰＯを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６〜８程度である。
　培養物中のＧＰＯが培養液中に存在する場合には、菌体を含む培養液そのままを採取し、利用することもできるが、一般には常法に従って、▲濾▼過、遠心分離などにより培養液中のＧＰＯと微生物菌体とを分離した後のＧＰＯ溶液が使用される。ＧＰＯが菌体内に存在する場合には、得られた培養物を▲濾▼過または遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤および／または界面活性剤を添加してＧＰＯを可溶化し水溶液として分離採取する。
　この様にして得られたＧＰＯ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール，エタノール，アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去することができる。また吸着剤あるいはゲル▲濾▼過剤などによるゲル▲濾▼過，吸着クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、これらの手段を用いた得られるＧＰＯ含有溶液は、減圧濃縮凍結乾燥等の処理にてより精製されたＧＰＯを得ることができる。
　斯くして得られるＧＰＯの活性測定法は次の通りである。
２００ｍＭ　ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
３００ｍＭ　Ｌ−α−グリセロリン酸
５ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ
１．５ｍＭ　４−アミノアンチピリン
０．０５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００
１．０ｍＭ　ＤＡＯＳ＊１
　＊１　３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−アニリン・ナトリウム塩
　上記の組成の反応液１．０ｍｌを試験管に分取し、３７℃５分間予備加温した後、酵素液２０μｌを加えて３７℃、５分間反応を行い、反応後２．０ｍｌの０．０５％ＳＤＳを加えて反応を停止した後に６００ｎｍの波長にて比色定量する。１分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生じる活性を１単位（Ｕ）とした。
　計算式
　　１６．８：キノン色素の分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌｅ）
　　Ｘ　　　：酵素濃度（ｍｇ／ｍｌ）
　本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核酸、核酸関連物質、その他に関する略号は、それらの当該分野における慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記する。またすべてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。
　　ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
　　ＲＮＡ：リボ核酸
　　　Ａ　：アデニン
　　　Ｔ　：チミン
　　　Ｇ　：グアニン
　　　Ｃ　：シトシン
　　Ａｌａ：アラニン
　　Ａｒｇ：アルギニン
　　Ａｓｎ：アスパラギン
　　Ａｓｐ：アスパラギン酸
　　Ｃｙｓ：システイン
　　Ｇｌｎ：グルタミン
　　Ｇｌｕ：グルタミン酸
　　Ｇｌｙ：グリシン
　　Ｈｉｓ：ヒスチジン
　　Ｉｌｅ：イソロイシン
　　Ｌｅｕ：ロイシン
　　Ｌｙｓ：リジン
　　Ｍｅｔ：メチオニン
　　Ｐｈｅ：フェニルアラニン
　　Ｐｒｏ：プロリン
　　Ｓｅｒ：セリン
　　Ｔｈｒ：スレオニン
　　Ｔｒｐ：トリプトファン
　　Ｔｙｒ：チロシン
　　Ｖａｌ：バリン
〔実施例〕
　以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらによって限定されるものではない。
実施例１　〔染色体ＤＮＡの分離〕
　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＧＰＯＳ−５３の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株を１５０ｍｌのブレインハートインフュージョン培地（Ｄｉｆｃｏ社製、以下ＢＨＩ培地と略す）で３７℃一晩振盪培養後遠心（３，０００回転１０分）により集菌した。１０％サッカロース、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ８．０）５０ｍＭ　ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍｌに懸濁させ、１ｍｌのリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃、１５分間保温し、次いで１ｍｌの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を加えた。この懸濁液に等量のクロロホルム−フェノール混液（１：１）を加え、攪拌混合し、１０，０００ｒｐｍ３分の遠心で水層と溶媒層に分け、水層を分取した。この水層に２倍量のエタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり攪拌しながらＤＮＡをガラス棒にまきつかせて分離した。これを１０ｍｌの１０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含んだ溶液（以下ＴＥと略す）で溶解した。これを等量のクロロホルム−フェノール混液で処理後、遠心により水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて上記の方法でもう一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。
実施例２　〔ｐＡＣＹＣ　１８４プラスミドＤＮＡの分離〕
　ｐＡＣＹＣ　１８４を保有するエシェリヒア・コリｐＭ１９１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　
１３４
実施例３　〔Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＧＰＯＳｌの作製〕
（ｉ）実施例１で調製したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．の染色体ＤＮＡ２μｌ（約０．５μｇ）と１０倍濃度のＭ緩衝液（前記Ｍａｎｉｏｒｔｉｓら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｐ１０４）１μｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造製１．０ｕｎｉｔ／μｌ）１μｌ，水６μｌを混合し、３７℃２時間切断した。別に調製したプラスミドｐＡＣＹＣ　１８４ＤＮＡ約０．３μｇを同様の方法を用いてＨｉｎｄＩＩＩで切断し、さらにアルカリ性フォスファターゼ（以下ＢＡＰと略すことがある。宝酒造製）０．６ｕｎｉｔを加え、６５℃１時間処理した。これらのＨｉｎｄＩＩＩで切断した２種のＤＮＡ溶液を混合し、その１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、さらに全体量と等量のクロロホルムーフェノール混液で処理し、遠心分離により水層を分取した。この水層に２倍容のエタノールを加え、遠心でＤＮＡを沈澱させたのち減圧乾燥した。水８９μｌで溶解後、１０倍濃度のライゲーションバッファ（０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．６），０．１Ｍ　ＭｇＣｌ２，０．１Ｍジチオスレイトール，１０ｍＭスペルミジン，１０ｍＭ　ＡＴＰ）１０μｌとＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ（宝酒造製３５０ｕｎｉｔ）を加え混合し４℃で一晩放置した。このＤＮＡ溶液をク口口ホルム−フェノール処理し、エタノール沈澱を集め減圧乾燥した後、１０μｌのＴＥで溶解した。
（ｉｉ）１００ｍｌのＢＨＩ培地（Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ，Ｄｉｆｃｏ社製）で培養した対数増殖期のエシェリヒア・コリＤＨＩ株〔ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５５７（１９８３）；ジェネテック　ストックセン夕ー，エール大学医学部より分与を受けた〕を遠心分離により集菌し（１０，０００ｒｐｍ．２分間）４０ｍｌの氷冷した３０ｍＭ　酢酸カリウム、１００ｍＭ　ＲｂＣｌ、１０ｍＭ　ＣａＣｌ２、５０ｍＭ　ＭｎＣｌ２および１５％グリセリンを含んだ溶液（ｐＨ５．８）で懸濁した。０℃で５分間放置後、遠心し上清をすて、さらに４ｍｌの１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ドー夕イト社製）、７５ｍＭ　ＣａＣｌ２、１０ｍＭ　ＲｂＣｌおよび１５％グリセリンを含んだ溶液（ｐＨ６．５）で懸濁し、０℃で１５分間放置してコンピテント細胞とした。
（ｉｉｉ）この大腸菌懸濁液２００μｌに（ｉ）で調製したＤＮＡ溶液１０μｌを加え、３０分間０℃で放置した。ＢＨＩ培地１ｍｌを加え、３７℃で９０分間保温後、この１００μｌをクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含んだＢＨＩ寒天プレートにまき、３７℃で一晩培養し形質転換体を得た。この形質転換体をＧＰＯＳ培地（組成はペプトン５ｇ、肉エキス２ｇ、イーストエキス５ｇ、ＮａＣｌ１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ、ＭｇＳＯ４０．５ｇ、パーオキシダーゼ５００ＩＵ、ジアニシジン０．１ｇ、グリセロリン酸カリウム１５ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１ｌ、ｐＨ７．０）のプレートにレプリカし、３７℃でさらに一晩培養した。
　約５０００コロニーの形質転換体を調べたところ、コロニーの周辺が茶褐色に変色したもの４株を得、このうち１株をエシェリヒア・コリＤＨｌｐＧＰＯＳ　１株と命名した〔微工研条寄第２１３３号、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２１３３〕。この菌を純粋分離後ＢＨＩ培地で３７℃一晩培養し、ＧＰＯ生産性をＧＰＯ活性測定法により調べたところ、約０．５ｕ／ｍｌのＧＰＯ活性を有していた。
　この菌株の保有していたプラスミドＤＮＡを実施例２と同様にして分離し、ＧＰＯ遺伝子を含みｐＡＣＹＣ　１８４遺伝子を含むプラスミドをｐＧＰＯＳ　１と命名した。
実施例４　〔ｐＧＰＯＳ　１のマッピングおよびＧＰＯ遺伝子の塩基配列の決定〕
　エシェリヒア・コリＤＨｌ　ｐＧＰＯＳ　１株からｐＡＣＹＣ　１８４と同様の方法でｐＧＰＯＳ　１プラスミドＤＮＡを調製した。ｐＧＰＯＳ　１ＤＮＡについて制限酵素ＢａｍＨ　Ｉ、Ｂｇｌ　ＩＩ、Ｃｔａ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉ、Ｐｓｔ　Ｉ、Ｓａｌ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ（いずれも宝酒造製）による切断地図を作成した。その結果を第３図に示した。ＧＰＯ遺伝子を含んだＤＮＡの塩基配列をＭ１３ファージを用いたジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２１４
実施例５　〔エシェリヒア・コリＤＨｌ　ｐＧＰＯＳ　１株によるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの製造〕
　エシェリヒア・コリＤＨｌ　ｐＧＰＯＳ　１株を２０ｌのＢＨＩ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３７℃１８時間ジャーファメンターにより培養し、５，０００ｒｐｍ１０分間の遠心で集菌した。生理食塩水２ｌで洗浄後２ｌの１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁した。リゾチームを１ｍｇ／ｍｌ，ＥＤＴＡ−２Ｎａを２ｍＭ、トリトンＸ−１００を０．１％となるように加えて３７℃で３０分間保温し、５，０００ｒｐｍ　１０分間の遠心により上清液を分離した。
　この上清液１．９ｌについて硫安塩析（４０％〜６６％）を行い沈澱物を遠心（５，０００ｒｐｍ　３０分）により集めた。この沈澱物を２００ｍｌの１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０，１０μＭのＦＡＤを含む）で溶解し、セファデックスＧ−２５で脱塩処理をした。この後、ＤＥＡＥ−セファロース　ＣＬ−６Ｂを用いてイオン交換クロマトを行い活性画分を分取後脱塩し、凍結乾燥により粉末として、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ０．３９５ｇ（４９ｕ／ｍｇ、収率２７％）を得た。
　斯くして得られたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの理化学的性状は以下の通りであった。
（１）作用；以下の反応を触媒する。
　　　Ｌ−α−グリセロホスフェート　＋　Ｏ２　→　ジヒドロキシアセトンホスフェート　＋　Ｈ２Ｏ２
（２）基質特異性；Ｌ−α−グリセロホスフェートに基質特異性を有する。
（３）至適ｐＨ；本酵素液（５．０ｕ／ｍｌ）を、１００ｍＭのグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ２．０〜５．０），酢酸バッファー（ｐＨ４．０〜６．０），３，３−ジメチルグルタミン酸（ＤＭＧ）−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ５．０〜７．０），リン酸バッファー（ｐＨ６．０〜８．０），トリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０〜９．０）の各バッファーで調整し、基質と酵素を反応せしめた後、前述の酵素活性測定法に準じて５００ｎｍの吸光度を測定した結果、至適ｐＨは５．５〜７．５であった。
（４）ｐＨ安定性；本酵素液（５ｕ／ｍｌ）を、１００ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ４．０〜６．０），３，３−ジメチルグルタミン酸−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ５．０〜７．０），リン酸バッファー（ｐＨ６．０〜８．０），トリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０〜９．０）の各バッファーで調整し、それぞれ、５０℃，５分間処理した酵素の残存活性の測定値から求めた。結果、ｐＨ安定性は、６．０〜８．０であった。
（５）Ｋｍ値；５．５±０．５ｍＭ（Ｌ−α−グリセロリン酸の測定の場合）
（６）等電点；ｐＨ４．０±０．５（キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法により測定した）
（７）熱安定性；本酵素溶液（５ｕ／ｍｌ）を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）で調整し、各温度において５分間処理した時の残存活性の測定値から、４０℃まで１００％の残存活性を示した。
（８）経時的酵素安定性；本酵素溶液（５ｕ／ｍｌ）を０．１Ｍ　ＭＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）で調整し、３７℃で各経過時間処理した時の残存活性の測定値から２４時間経過後で９０％以上の残存活性を示した。
　尚本特徴は、実際の臨床診断の場において要求される溶液中の経時的酵素安定性を示し、本酵素は極めて有用なものであった。
〔発明の効果〕
　本発明のＤＮＡおよび形質転換体を用いることによって、グリセロール、アスコルビン酸、α−ケト酸等の添加をすることなしに、より効率よくＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを製造することが可能となった。また本発明によってＧＰＯ遺伝子が明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
　第１図（１）〜（６）は全体として本発明のＧＰＯ遺伝子によって発現されるＧＰＯのアミノ酸配列を示す図面であり、第２図（１）〜（５）は全体として本発明のＧＰＯ遺伝子の塩基配列を示す図面である。
　第３図はプラスミドｐＧＰＯＳ　１の構成を示す模式図である。
　第１図（１）〜（６）又は第２図（１）〜（５）中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基またはヒドロキシ基を示し、ＸはＴＡＡ，ＴＡＧおよびＴＧＡ以外のコドンまたは５′末端基を示し、Ｙはコドンまたは３′末端基を示す。