(57)【要約】  本明細書でロイシンリッチリピート（LRR）モチーフ含有タンパク質と同定されたタンパク質（INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169と称される）、並びに疾患の診断、予防及び治療におけるこれらタンパク質及びコード遺伝子に由来する核酸配列の使用が提供される。
2008519593.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）配列番号:2（成熟INSP168）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ii）生物学的に活性なポリペプチドとして機能するか、及び/又は（i）記載のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、（i）記載のポリペプチドのフラグメントであるポリペプチド；又は
（iii）（i）又は（ii）記載のポリペプチドの機能的等価物であるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号:4（成熟INSP149）、配列番号:6（INP149の細胞外領域）、配列番号:8（成熟INSP168-SV1）、配列番号:10（成熟INSP169）、配列番号:12（INSP169の細胞外領域）及び/又は配列番号:67（INSP169のクローニングされた細胞外領域）に示すアミノ酸配列から成る、請求項１の（i）に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、及び/又は配列番号:67に示すアミノ酸配列と相同であることを特徴とする、請求項1の（iii）に記載の機能的等価物であるポリペプチド。
【請求項４】
配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号14、及び/又は配列番号:67に示すアミノ酸配列、又はその活性なフラグメントと50%を超える配列同一性、好ましくは60%、70%、80%、90%、95%、98%又は99%を超える配列同一性を有する、請求項１の（ii）に記載のフラグメント又は機能的等価物。
【請求項５】
配列番号:14（LRRモチーフ）に示すアミノ酸配列から成る、請求項4に記載のフラグメント。
【請求項６】
配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号14、及び/又は配列番号:67に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと有意な構造的相同性を示す、請求項1から5のいずれかに記載の機能的等価物。
【請求項７】
配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、及び/又は配列番号:67の配列の7つ以上（例えば8、10、12、14、16、18、20又はそれ以上）のアミノ酸残基から成る、請求項１の（i）に記載のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、請求項１から６のいずれかに記載のフラグメント。
【請求項８】
請求項１から7のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項９】
前記ポリペプチドがヒスチジンタグを含む、請求項8に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
その配列が、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、及び/又は配列番号:28に示される、請求項9に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがシグナルペプチドを含む、請求項１から11のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
その配列が配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44及び/又は配列番号:67に示される、請求項11に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチドをコードする精製核酸分子。
【請求項１４】
配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43及び/又は配列番号:66に示される核酸配列を含むか、又はそれら核酸配列から成る、請求項13に記載の精製核酸分子。
【請求項１５】
配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43及び/又は配列番号:66に示される核酸配列から成るか、又はその重複等価物若しくはフラグメントである、請求項13又は14に記載の精製核酸分子。
【請求項１６】
高ストリンジェンシー条件下で請求項13から15のいずれかに記載の核酸分子とハイブリダイズする精製核酸分子。
【請求項１７】
請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１８】
請求項17に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチドと特異的に結合し、さらに好ましくは前記ポリペプチドの細胞表面認識分子活性を阻害するリガンド。
【請求項２０】
抗体である、請求項19に記載のリガンド。
【請求項２１】
請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチドの発現又は活性レベルを増減させる化合物。
【請求項２２】
前記ポリペプチドの生物学的作用のいずれも誘発することなく、請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチドと結合する、請求項21に記載の化合物。
【請求項２３】
天然若しくは改変基質、リガンド、酵素、レセプター又は構造的若しくは機能的模倣物である、請求項21又は22に記載の化合物。
【請求項２４】
疾患の治療又は診断に使用される、請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチド、請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子、請求項17に記載のベクター、請求項18に記載の宿主細胞、請求項19又は20に記載のリガンド、又は請求項21から23のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５】
患者で疾患を診断する方法であって、前記方法が、前記患者由来の組織で請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現レベルを判定するか、又は請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチドの活性を判定し、さらに、前記発現のレベル又は活性をコントロールレベルと比較することを含み、前記コントロールレベルと相違するレベルが疾患の指標となる、前記疾患の診断方法。
【請求項２６】
in vitroで実施される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
（a）請求項19又は20に記載のリガンドを生物学的サンプルと、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で接触させる工程；及び（b）前記複合体を検出する工程を含む、請求項25又は26に記載の方法。
【請求項２８】
以下の工程を含む、請求項25又は26に記載の方法：
（a）患者由来の組織サンプルを核酸プローブと、請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子と前記プローブとの間でハイブリッド複合体の生成を許容するストリンジェントな条件下で接触させる工程；
（b）コントロールサンプルを前記プローブと、工程（a）で用いられた同じ条件下で接触させる工程；及び
（c）前記サンプルでハイブリッド複合体の存在を検出する工程；
ここで、コントロールサンプルのハイブリッド複合体レベルと相違する、患者サンプルのハイブリッド複合体レベルの検出が疾患の指標となる。
【請求項２９】
以下の工程を含む、請求項25又は26に記載の方法：
（a）患者組織由来の核酸サンプルを核酸プライマーと、請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子と前記プライマーとの間でハイブリッド複合体の生成を許容するストリンジェントな条件下で接触させる工程；
（b）コントロールサンプルを前記プライマーと、工程（a）で用いられた同じ条件下で接触させる工程； 
（c）前記サンプル核酸を増幅する工程；及び
（d）患者及びコントロールの両サンプルの増幅核酸レベルを検出する工程；
ここで、コントロールサンプル中の増幅核酸レベルと有意に相違する、患者サンプルの増幅核酸レベルの検出が疾患の指標となる。
【請求項３０】
以下の工程を含む、請求項25又は26に記載の方法：
（a）疾患について検査される患者から組織サンプルを入手する工程；
（b）請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子を前記組織サンプルから単離する工程；及び
（c）疾患に付随する変異の存在を疾患の指標として前記核酸分子で検出することによって、前記患者を疾患について診断する工程。
【請求項３１】
前記核酸分子を増幅して増幅生成物を形成する工程及び前記増幅生成物で変異の有無を検出する工程をさらに含む、請求項30の方法。
【請求項３２】
前記患者における変異の有無が、前記核酸分子を前記核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブとストリンジェントな条件下で接触させて、疾患に付随する変異に対応する任意の部分で前記核酸プローブ鎖とハイブリダイズしない部分を有するハイブリッド二本鎖分子を形成する工程、及び疾患に付随する変異の有無の指標として前記プローブ鎖のハイブリダイズしない部分の有無を検出する工程によって検出される、請求項30又は31の方法。
【請求項３３】
前記疾患が以下から選択される、請求項25から32のいずれかに記載の方法：網膜、網膜色素上皮（RPE）及び脈絡膜の疾患；眼球の新生血管形成、眼球の炎症及び網膜の変性；糖尿病性網膜症、慢性緑内障、網膜はく離、鎌状赤血球網膜症、老人性黄斑変性、網膜新生血管形成、網膜下新生血管形成；ルベオーシス虹彩炎炎症疾患、慢性後部ブドウ膜炎及び汎ブドウ膜炎、新形成、網膜芽細胞腫、偽神経膠腫、血管新生緑内障；硝子体水晶体同時切除後に生じる新生血管形成、以下の血管性障害（網膜虚血、脈絡膜血管不全、脈絡膜血栓症、視神経の新生血管形成、糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑水腫、色素性網膜炎、網膜静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症、色素線条、網膜動脈閉塞）、眼又は眼球損傷の穿通による新生血管形成、ニューロパシー；リーバー氏、特発性、薬剤誘発性、視神経性、及び虚血性ニューロパシー；脊髄損傷、対麻痺、神経変性疾患、中枢神経系の異常、末梢神経系の異常、脳損傷、脳血管系疾患、パーキンソン病、皮質基底変性、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症、外傷性脳損傷、発作、発作後脳損傷、外傷後脳損傷、脳小血管疾患、痴呆、アルツハイマー病、血管性痴呆、レーヴィー小体を伴う痴呆、前側頭痴呆、パーキンソン症候群、前側頭痴呆、ピック病、進行性核麻痺、皮質基底変性、ハンチントン病、視床変性、クロイツフェルト-ヤコブ痴呆、HIV痴呆、痴呆を伴う精神分裂病、コルサコフ精神病、発作及び外傷。
【請求項３４】
細胞表面認識分子として、又は細胞表面認識分子のアンタゴニストとしての、請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項３５】
請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチド、請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子、請求項17に記載のベクター、請求項18に記載の宿主細胞、請求項19又は20に記載のリガンド、又は請求項21から23のいずれかに記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項３６】
請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子を含む、ワクチン組成物。
【請求項３７】
以下から選択される疾患の治療を目的とする医薬の製造で使用される、請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチド、請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子、請求項17に記載のベクター、請求項18に記載の宿主細胞、請求項19又は20に記載のリガンド、請求項21から23のいずれかに記載の化合物、又は請求項35に記載の医薬組成物：網膜、網膜色素上皮（RPE）及び脈絡膜の疾患；眼球の新生血管形成、眼球の炎症及び網膜の変性；糖尿病性網膜症、慢性緑内障、網膜はく離、鎌状赤血球網膜症、老人性黄斑変性、網膜新生血管形成、網膜下新生血管形成；ルベオーシス虹彩炎炎症疾患、慢性後部ブドウ膜炎及び汎ブドウ膜炎、新形成、網膜芽細胞腫、偽神経膠腫、血管新生緑内障；硝子体水晶体同時切除後に生じる新生血管形成、以下の血管性障害（網膜虚血、脈絡膜血管不全、脈絡膜血栓症、視神経の新生血管形成、糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑水腫、色素性網膜炎、網膜静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症、色素線条、網膜動脈閉塞）、眼又は眼球損傷の穿通による新生血管形成、ニューロパシー；リーバー氏、特発性、薬剤誘発性、視神経性、及び虚血性ニューロパシー；脊髄損傷、対麻痺、神経変性疾患、中枢神経系の異常、末梢神経系の異常、脳損傷、脳血管系疾患、パーキンソン病、皮質基底変性、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症、外傷性脳損傷、発作、発作後脳損傷、外傷後脳損傷、脳小血管疾患、痴呆、アルツハイマー病、血管性痴呆、レーヴィー小体を伴う痴呆、前側頭痴呆、パーキンソン症候群、前側頭痴呆、ピック病、進行性核麻痺、皮質基底変性、ハンチントン病、視床変性、クロイツフェルト-ヤコブ病痴呆、HIV痴呆、痴呆を伴う精神分裂病、コルサコフ精神病、発作及び外傷。
【請求項３８】
請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチド、請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子、請求項17に記載のベクター、請求項18に記載の宿主細胞、請求項19又は20に記載のリガンド、請求項21から23のいずれかに記載の化合物、又は請求項35に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、患者で疾患を治療する方法。
【請求項３９】
健常者の発現レベル又は活性と比較したとき、前記天然の遺伝子の発現又は前記ポリペプチドの活性が罹患患者で低い疾患に対して、投与されるポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物又は組成物がアゴニストである、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
健常者の発現レベル又は活性と比較したとき、前記天然の遺伝子の発現又は前記ポリペプチドの活性が罹患患者で高い疾患に対して、投与されるポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物又は組成物がアンタゴニストである、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
患者で疾患の治療をモニターする方法であって、前記方法が、請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチドの発現レベル若しくは活性、又は、請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子の発現レベルをある期間にわたって前記患者由来の組織でモニターすることを含み、ここで、前記期間にわたってコントロールレベルに対し前記発現レベル又は活性が変化すれば、前記疾患の緩解を示す、前記疾患の治療をモニターする方法。
【請求項４２】
疾患の治療及び/又は診断で有効な化合物を同定する方法であって、前記方法が、請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチド、又は請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子を、前記ポリペプチド又は核酸分子に対して結合親和性を有すると推定される1つ以上の化合物と接触させ、さらに前記核酸分子又はポリペプチドと特異的に結合する化合物を選別することを含む、前記化合物の同定方法。
【請求項４３】
請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸プローブを収納する第一の容器；前記核酸分子を増幅させるために有用なプライマーを収納する第二の容器；及び疾患の診断を容易にするために前記プローブ及びプライマーを使用するための指示を含む、疾患の診断に有用なキット。
【請求項４４】
ハイブリダイズしないRNAを消化する薬剤を保持する第三の容器をさらに含む請求項43のキット。
【請求項４５】
少なくともその1つが請求項13から16のいずれかに記載の核酸分子である、核酸分子のアレイを含むキット。
【請求項４６】
請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチドと結合する1つ以上の抗体；及び前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応を検出するために有用な試薬を含むキット。
【請求項４７】
請求項1から12のいずれかに記載のポリペプチドを高レベルで又は低レベルで発現するように、又は前記を発現しないように形質転換したトランスジェニック、又はノックアウト非ヒト動物。
【請求項４８】
請求項47に記載の非ヒトトランスジェニック動物を候補化合物と接触させ、前記動物の疾患に対する前記化合物の影響を決定することによって、疾患の治療に有効な化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４９】
前記疾患が請求項33に示す疾患の1つである、請求項38から44又は請求項48のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
ロイシンリッチリピート（LRR）モチーフ含有タンパク質が関係する疾患の治療用、又は予防用候補薬剤のスクリーニングのための標的としてのINSP168、INSP168-SV1、INSP149又はINSP169ポリペプチドの使用。
【請求項５１】
以下の工程を含む生物学的に活性な化合物を選別する方法：
（i）候補化合物をINSP168、INSP168-SV1、INSP149又はINSP169ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞と接触させる工程；
（ii）前記細胞の表面で前記INSP168、INSP168-SV1、INSP149又はINSP169ポリペプチドと結合する化合物、及び/又はINSP168、INSP168-SV1、INSP149又はINSP169ポリペプチドの活性を調整する化合物を選別する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本明細書でロイシンリッチリピート（LRR）モチーフ含有タンパク質と同定されたタンパク質（INSP168、INSP168-SV1、INSP14９及びINSP169と称される）、並びに疾患の診断、予防及び治療におけるこれらタンパク質及びコード遺伝子に由来する核酸配列の使用に関する。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は参照により完全に本明細書に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
薬剤発見プロセスは、機能ゲノミクスの時代が到来したために目下のところ根幹的な改革を受けている。“機能ゲノミクス”という用語は、対象となっているタンパク質配列に機能を帰するためにバイオ関連情報学（bioinformatics）ツールを利用するアプローチに適用される。そのようなツールは、配列データの生産速度が、機能をこれらタンパク質配列に割り当てる研究室の能力を急速に凌駕しつつあるためにますます必要性が増している。
バイオ関連情報学ツールの有効性及び正確さが増しているので、生化学的に性状を決定する通常技術は、これらのツールによって急速に置き換えられつつある。実際に、本発明の同定に用いられた高度なバイオ関連情報学ツールは、今や高度な信頼を置き得る結果を産出することができる。
配列データが利用可能になるにつれ、種々の機関及び商業的機構がそれらを調査し、重大な発見が継続的に達成されている。しかしながら、研究及び薬剤発見のための標的として、更なる遺伝子及びそれらがコードするポリペプチドの同定及び性状決定を求める持続的な要求がなお存在する。
【０００３】
分泌タンパク質序論
細胞が細胞外タンパク質を生成しこれを分泌する能力は多くの生物学的プロセスにとって主要なものである。酵素、増殖因子、細胞外マトリックスタンパク質及びシグナリング分子はいずれも細胞によって分泌される。これは分泌小胞と形質膜との融合を介する。ほとんどの事例では（全てというわけではないが）、タンパク質は小胞体へ、さらに分泌小胞へシグナルペプチドによって誘導される。シグナルペプチドはcis-作動性配列であり、前記配列はポリペプチド鎖の細胞質から膜結合小区画（例えば分泌小胞）への輸送に影響を与える。分泌小胞を標的とするポリペプチドは細胞外マトリックスに分泌されるか、又は形質膜に保持される。形質膜に保持されるポリペプチドは、1つ以上のトランスメンブレンドメインを有するであろう。細胞の機能で中心的な役割を果たすシグナルペプチド含有タンパク質の例はサイトカイン、ホルモン、細胞外マトリックスタンパク質、粘着分子、レセプター、プロテアーゼ、並びに増殖及び分化因子である。
【０００４】
PAL序論
フォトレセプター関連ロイシンリッチリピート（LRR）タンパク質（PALと略称される）は膜糖タンパク質であり、網膜のフォトレセプター細胞で特異的に発現される（Gomi et al. J Neuroscience, 2000, 20(9):3206-3213）。
PAL遺伝子の配列決定によって、PALタンパク質はLRRモチーフ、Ig C2-様ドメイン及びフィブロネクチンIII型-様ドメイン（いずれもPALタンパク質の細胞外ドメイン内に存在する）を含むことが明らかになった。上記に記載したこの3タイプのドメインの組み合わせは、新規なクラスのトランスメンブレンタンパク質と同定されたが、以前に知られたいくつかのタンパク質はこれら3つのドメインの2つ（例えばTrk及びNCAM）を含んでいる（Gomi et al. J Neuroscience, 2000, 20(9):3206-3213）。
大量のPAL mRNAがラットの網膜の発生経過で増加するのが観察された。ノザンブロット実験によって、PAL mRNAは網膜内のフォトレセプター細胞に特異的であることが明らかになった。PAL-特異的ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット及び免疫沈澱実験は、PALはSDS及び高温に耐性を有する強力なホモダイマー構造を形成することを示した（Gomi et al. J Neuroscience, 2000, 20(9):3206-3213）。
PALのヒトホモローグもまた同定され、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）によって染色体10q23.2-23.3にマッピングされた。ラットの網膜細胞で実施された実験から、PALは、ある種の栄養因子のためのレセプター又は形態発生に参画する粘着分子のためのレセプターとして機能し得ると説明された。ヒトPALタンパク質は、したがって遺伝性網膜異常のための潜在的疾患遺伝子候補であると考えられた（Gomi et al. J Neuroscience, 2000, 20(9):3206-3213）。
他の公知の網膜特異的遺伝子にはロドプシン、トランスデュシン、cGMP-ゲート操作イオンチャネル、ペリフェリン/rds及びrom-1が含まれる。これらの中から、遺伝性網膜疾患の多数の原因遺伝子が同定された。例えば、ロドプシン又はペリフェリン/rdsは、優性常染色体による色素性網膜炎の一因となる。
【０００５】
フィブロネクチン3型ドメイン序論
フィブロネクチンIII型（FnIII）タンパク質ドメインは、いくつかのマルチモジュールタンパク質に含まれる80−100アミノ酸によって構成され、大半は、細胞外マトリックス、（例えばテナシン（A. Joester & A Faissner, Matrix Biol, 2001, 20:13-22）又はチチン（G.O. Skeie, Cell Mol Life Sci, 2000, 57:1570-6））、又はレセプタータンパク質（例えばインスリンレセプタータンパク質ファミリー（C. Marino-Buslje et al. FEBS Lett. 1998, 441:331-6）と結合する。
極めて類似した三次構造にもかかわらず、FnIIIモジュールは低い配列相同性しか共有しない。逆に、多数の種の間で同じFnIIIモジュールの配列相同性は顕著に高く、配列の多様性は機能的に意義を有することが示唆される。保存された残基の間で、プロリンはこのドメインを含むマルチモジュールタンパク質の凝集を防止するので特に重要である（D. Craig et al. Structure, 2004, 12:21-30；D. Craig et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(10):5590-5；E. Cota et al. J Mol Biol, 2001, 305:1185-94；E. Cota et al. J Mol Biol, 2000, 302:713-25；A Steward et al. J Mol Biol, 2002, 318:935-40）。
このタンパク質モジュールの実例はヒトフィブロネクチンであり、前記はいくつかのタンパク質モジュールを含む、2386アミノ酸の糖タンパク質細胞外マトリックスで、通常は3つの型、FnI、FnII及びFnIII（又はF1、F2若しくはF3；J.R. Potts & I.D. Campbell, Matrix Biol. 1996, 15:313-20）に分類される。フィブロネクチンは血漿中で可溶形として循環し、さらにまた適切な部位の細胞外マトリックス内では不溶性のマルチマー形として見出される。これら不溶性の原線維の形成及び分解は、アクチン細胞骨格及びインテグリンレセプターが中心的に関与する一連の事象によって仲介される動的で細胞依存性プロセスである。フィブロネクチン原線維は、哺乳動物細胞及び細菌細胞の表面並びに種々の分子（コラーゲン、フィブリン、ヘパリン、DNA及びアクチンを含む）と結合することができる。フィブロネクチンは、細胞粘着/収縮性/運動性、オプソニン作用、創傷治癒、線維症性凝集物の形成に必要である。例えば、ある種の慢性炎症性疾患（喘息を含む）では、この調節の低下は、組織の線維症発達と平行するフィブロネクチンの過剰又は不適切な沈着をもたらす（D.C. Hocking, Chest. 2002, 122(6 Suppl):275S-278S）。
最後に、細胞外マトリックスタンパク質の単離フィブロネクチンドメイン（フィブロネクチン線維の限定的タンパク質分解又は機械的ストレスによって生理学的に生成することができる）は、多様な生物学的及び生理学的応答を調整することができる。前記応答は、例えばニューロン再生、海馬の学習及びシナプス形成性（S. Meiners & M.L. Mercado, Mol Neurobiol, 2003, 27:177-96；T. Strekalova et al. Mol Cell Neurosci. 2002, 21:173-87）、骨芽細胞の粘着、増殖及び分化（T.I. Kim et al. Biotechnol Lett, 2003, 25:2007-11）、組織の分解、炎症及び腫瘍の進行（J. Labat-Robert, Ageing Res Rev, 2004, 3:233-47）である。FnIII-含有タンパク質のフラグメント又はスプライシング変種は、例えば癌（C. Ebbinghaus et al. Curr Pharm Des, 2004, 10:1537-49）、炎症性関節炎（M.L. Barilla & S.E. Carsons, Semin Arthritis Rheum, 2000, 29:252-65）又は器官移植（A.J. Coito et al. Dev Immunol, 2000, 7:239-48）のような重要な治療的又は診断的用途を有する抗体及び前記タンパク質を遮断する他のタンパク質のための標的となり得る。
【０００６】
ロイシンリッチリピート（LRR）モチーフ序論
LRRはおよそ22−28残基の比較的短いモチーフであり、多様な細胞質、膜及び細胞外タンパク質で見出される。LRRを含むタンパク質は、非常に広範囲の生物学的機能に付随するが、ただしいずれもタンパク質-タンパク質相互作用又は細胞粘着に中心的に関与すると考えられる。LRRモチーフは、配列LxxLxxLxLxxNxLxxLxxxxFxxの数コピーで構成される反復モチーフである。LRRはしばしばしステインリッチ領域、N-末端LRRモチーフ又はロイシンリッチリピートC-末端ドメイン（LRRCT）とフランキングする。
免疫グロブリンドメイン序論
免疫グロブリン（Ig）ドメインは、種々の機能を有する数百のタンパク質に存在するよく性状が知られたドメインである。基本的なIgドメイン構造は、ジスルフィド結合によって連結された2つの軽鎖及び2つの重鎖を有するテトラマーである。免疫ドメインを含む細胞表面認識分子は、多様な生理学的機能において役割を演じることが示された（その多くは病的プロセスで役割を果たすことができる）。それらの活性を変化させることは疾患の表現型を変化させる手段であり、したがって、新規な免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子を同定することは、それらが多くの疾患（特に炎症性疾患、腫瘍学的疾患及び心脈管系疾患）で役割を果たし得るので極めて適切なことである。免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子は、一連の生物学的プロセス（胚発生、組織の完全性の維持、白血球の血管外遊出/炎症、腫瘍形成、血管形成、骨吸収、神経学的機能不全、血栓形成及び細菌性病原体の宿主細胞への侵襲/粘着を含む）において必要である。
いくつかの免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子ファミリーの構造及び機能に関する詳細な性状決定によって、多くの製薬企業による、炎症を伴う疾患の治療、腫瘍学、神経学、免疫学及び心脈管機能で使用される調整物質開発の活発なプログラムがもたらされた。免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子は、胚発生からアポトーシスに至る実質的に全ての生物学的局面で必要とされる。それらは、ほぼ全ての組織の構造的完全性及び恒常性機能に必須である。したがって、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子における欠陥が疾患を惹起するということ、及び多くの疾患が免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子の機能の調整を必要とするということは驚くにあたらない。
免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子は、したがって多様な生理学的機能において役割を演じることが知られており、それらの多くは疾患のプロセスで役割を果たすことができる。それらの活性を変化させることは疾患の表現型を変化させる手段であり、したがって、新規な免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子を同定することは、それらが多くの疾患（特に免疫学的疾患、炎症性疾患、腫瘍学的疾患、心脈管系疾患、中枢神経系疾患及び感染）で役割を果たし得るので極めて適切なことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
要約すれば、細胞表面認識分子（LRR、Igドメイン又はフィブロネクチン3型ドメインを含有するものを含む）は、多様な生理学的機能において役割を果たすことが示されたが、それらの多くは、疾患のプロセスにおいて役割を果たすことができる。それらの活性を変化させることは疾患の表現型を変化させる手段であり、したがって、新規な粘着分子を同定することは、それらが多くの疾患（特に炎症性疾患、腫瘍学的疾患、心脈管系疾患及び細菌感染）で役割を果たし得るので極めて適切なことである。さらに別の網膜特異的細胞表面認識分子（ヒトPALタンパク質（前記はLRR、Igドメイン及びフィブロネクチン3型ドメインを含むであろう）のパラローグを含む）の同定は、網膜の発生及び網膜の病変の解明の前進に極めて重要である。それらの同定は、網膜の疾患及び異常の治療並びに診断のための新規な方法の開発を可能にするであろう。したがって、人間の疾患の治療及び予防のための新規な薬剤の開発を可能にするようなタンパク質の同定がなお希求されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169タンパク質は、PAL（SwissProt Acc. Code PALP_HUMAN）及びnogoレセプターホモローグ（SwissProt Acc. Code Q6X814）と類似性を有する配列を含むロイシンリッチリピート（LRR）モチーフのスプライス変種であるという発見に基づく。
特に、本発明は、本発明のポリペプチドはPAL-様及び/又はnogo-レセプター様分子であるという発見に基づく。
本発明の第一の特徴では、以下のポリペプチドが提供される：
（i）配列番号:2（成熟INSP168）に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ii）生物学的に活性なポリペプチドとして機能するか、及び/又は（i）記載のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、（i）記載のポリペプチドのフラグメント；又は
（iii）（i）又は（ii）記載のポリペプチドの機能的等価物であるポリペプチド。
本発明の第一の特徴の（i）に記載のポリペプチドは、配列番号:4（成熟INSP149）、配列番号:8（成熟INSP168-SV1）、又は配列番号:10（成熟INSP169）に示すアミノ酸配列を含むことができる。
出願人らはこの理論に拘束されることを望まないが、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169タンパク質の最初の19アミノ酸は、下記の模式図に示すように、シグナルペプチドを形成すると仮定される：
MHLFACLCIVLSFLEGVGCLCPSQCTCDYHGRNDGSGSR…
したがって、本発明の第一の特徴の（i）に記載のポリペプチドは、配列番号:30（完全長INSP168）、配列番号:32（完全長INSP149）、配列番号:34（完全長INSP168-SV1）、配列番号:36（完全長INSP169）、及び配列番号:67（INSP169のクローニングされた細胞外領域）に示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【０００９】
本発明の第一の特徴の（i）に記載のポリペプチドは、配列番号:4（成熟INSP149）又は配列番号:10（成熟INSP169）に示すアミノ酸配列の細胞外部分を含むことができる。したがって、本発明の第一の特徴の（i）に記載のポリペプチドは、配列番号:6（INSP149細胞外領域）又は配列番号:12（INSP169の細胞外領域）に示すアミノ酸配列を含むことができる。本発明の第一の特徴の（i）に記載のポリペプチドは、配列番号:67（INSP169のクローニングされた細胞外領域）に示すアミノ酸配列の細胞外部分を含むことができる。INSP169のクローニングされた細胞外領域（配列番号:67）は、INSP169の予想した細胞外領域とはアミノ酸524で異なっている（実施例7及び図8参照）。
INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169タンパク質は、各々ロイシンリッチリピートモチーフを含む。INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169タンパク質に存在するロイシンリッチリピートモチーフのアミノ酸配列は配列番号:14に示されている。したがって、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169タンパク質の好ましいフラグメントは、配列番号:14（LRRモチーフ）に示すアミノ酸配列を含むか、又は前記から成るフラグメントである。
【００１０】
本発明の第一の特徴の（i）に記載のポリペプチドは、配列番号:2（成熟INSP168）、配列番号:4（成熟INSP149）、配列番号:6（INSP149細胞外領域）、配列番号:8（成熟INSP168-SV1）、配列番号:10（成熟INSP169）、配列番号:12（INSP169の細胞外領域）、配列番号:14（LRRモチーフ）、配列番号:30（完全長INSP168）、配列番号:32（完全長INSP149）、配列番号:34（完全長INSP168-SV1）、配列番号:36（完全長INSP169）、又は配列番号:67（INSP169のクローニングされた細胞外領域）に示すアミノ酸配列及びヒスチジンタグを含むことができる。好ましくは、前記ヒスチジンタグは前記ポリペプチドのC-末端に位置する。好ましくは、前記ヒスチジンタグは、1から10の間のヒスチジン残基（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10残基）を含む。より好ましくは、前記ヒスチジンタグは6残基を含む。したがって、本発明の第一の特徴の（i）に記載のポリペプチドは、配列番号:16（hisタグ成熟INSP168）、配列番号:18（hisタグ成熟INSP149）、配列番号:20（hisタグINSP149細胞外領域）、配列番号:22（hisタグ成熟INSP168-SV1）、配列番号:24（hisタグ成熟INSP169）、配列番号:26（hisタグINSP169の細胞外領域）、配列番号:28（hisタグLRRモチーフ）、配列番号:38（hisタグ完全長INSP168）、配列番号:40（hisタグ完全長INSP149）、配列番号:42（hisタグ完全長INSP168-SV1）、又は配列番号:44（hisタグ完全長INSP169）に示すアミノ酸配列を含むことができる。
【００１１】
したがって、本発明の第一の特徴は、配列番号:2（成熟INSP168）、配列番号:4（成熟INSP149）、配列番号:6（INSP149細胞外領域）、配列番号:8（成熟INSP168-SV1）、配列番号:10（成熟INSP169）、配列番号:12（INSP169の細胞外領域）、配列番号:14（LRRモチーフ）、配列番号:16（hisタグ成熟INSP168）、配列番号:18（hisタグ成熟INSP149）、配列番号:20（hisタグINSP149細胞外領域）、配列番号:22（hisタグ成熟INSP168-SV1）、配列番号:24（hisタグ成熟INSP169）、配列番号:26（hisタグINSP169の細胞外領域）、配列番号:28（hisタグLRRモチーフ）、配列番号:30（完全長INSP168）、配列番号:32（完全長INSP149）、配列番号:34（完全長INSP168-SV1）、配列番号:36（完全長INSP169）、配列番号:38（hisタグ完全長INSP168）、配列番号:40（hisタグ完全長INSP149）、配列番号:42（hisタグ完全長INSP168-SV1）、又は配列番号:44（hisタグ完全長INSP169）、又は配列番号:67（INSP169のクローニングされた細胞外領域）に示すアミノ酸配列を含むか、又は前記から成るポリペプチドを提供する。本発明の第一の特徴はまた、そのようなポリペプチドのフラグメントであり、さらに生物学的に活性なポリペプチドとして機能し及び/又はそのようなポリペプチドと共通の抗原決定基を有するポリペプチド、又はそのようなポリペプチドの機能的等価物であるポリペプチドを提供する。
本明細書で用いられる、“INSP168ポリペプチド”という用語は、配列番号:2（成熟INSP168）に示すアミノ酸配列を含むか又は前記から成るポリペプチド、例えば配列番号:4（成熟INSP149）、配列番号:6（INSP149細胞外領域）、配列番号:8（成熟INSP168-SV1）、配列番号:10（成熟INSP169）、配列番号:12（INSP169の細胞外領域）、配列番号:16（hisタグ成熟INSP168）、配列番号:18（hisタグ成熟INSP149）、配列番号:20（hisタグINSP149細胞外領域）、配列番号:22（hisタグ成熟INSP168-SV1）、配列番号:24（hisタグ成熟INSP169）、配列番号:26（hisタグINSP169の細胞外領域）、配列番号:30（完全長INSP168）、配列番号:32（完全長INSP149）、配列番号:34（完全長INSP168-SV1）、配列番号:36（完全長INSP169）、配列番号:38（hisタグ完全長INSP168）、配列番号:40（hisタグ完全長INSP149）、配列番号:42（hisタグ完全長INSP168-SV1）、又は配列番号:44（hisタグ完全長INSP169）、又は配列番号:67（INSP169のクローニングされた細胞外領域）に示すアミノ酸配列を含むか、又は前記から成るポリペプチドを含む。
【００１２】
INSP149、INSP168及びINSP169は、網膜特異的タンパク質PALと類似性を有するロイシンリッチリピート含有配列のスプライス変種を表す一組の予想配列であった。
INSP149は、5つのエキソンにおいてコードされる595アミノ酸（1785bp）のORFのための予想配列であった。INSP168は、3つのエキソンにおいてコードされる197アミノ酸（591bp）のORFのための予想配列であった。INSP169は、4つのエキソンにおいてコードされる679アミノ酸（2037bp）のORFのための予想配列であった。INSP149及びINSP169は、ロイシンリッチリピートモチーフ、免疫グロブリンドメイン及びフィブロネクチン3型ドメインを含むI型トランスメンブレンタンパク質であると予想された。INSP169は、INSP149ポリペプチドのスプライス変種であり、最後のエキソン（INSP149の最後の2つのエキソンを抱合する）がより長いという点を除いてINSP149と同一である。INSP169によってコードされるより長い配列は、INSP149と同じドメイン編成を有するが、IgとFN IIIドメインとの間に複雑度の小さい挿入物を有する。INSP168は、本質的にはINSP149及びINSP169の切端スプライス変種であり、分泌タンパク質を表すと予想された。INSP168ポリペプチドはINSP149ポリペプチドのスプライス変種であり、前記はその第三のエキソンの開始点で停止コドンを含む。第三のエキソンにおけるこの切端の結果として、INSP168ポリペプチドは、INSP149のエキソン5で見出されるトランスメンブレン領域を欠く。前記3つの予想配列のいずれもN-末端部分に4つのロイシンリッチリピート領域を含んでいた（配列番号:14）。INSP149及びINSP169はまた、予想される細胞外領域に免疫グロブリンドメイン及びフィブロネクチンIII型ドメインを含んでいた。前記3つの予想アミノ酸配列のアラインメントは図1に示されている。上記に記したように、シグナルペプチドは残基1から19に広がると予想された。
【００１３】
INSP168予想配列のオープンリーディングフレーム（ORF）を、PCRプライマー対を用いてクローニングした（図2及び3参照）。前記プライマー対は、脳及び網膜由来の選別cDNAライブラリー並びに脳及び眼のcDNA鋳型で、プラチナム（Platinum(商標)）Taq DNAポリメラーゼハイフェデリティ（HiFi）を用いて調べた。PCR生成物をクローニングして配列を決定し、脳cDNA由来のクローンを同定し増幅した。前記は期待したINSP168のORFを含んでいた。第二のクローンもまた脳cDNAから同定し増幅した。前記はINSP168 ORFのスプライス変種を含んでいた。このクローンはINSP168 ORFの3'末端近くに32アミノ酸挿入物を含み、前記は新規なエキソン3を表していた。前記挿入物はまた、本来のINSP168エキソン3に対応する余分な6アミノ酸を新規なエキソン4が含むフレームシフトをもたらした。このクローンをINSP168-SV1と称し、これもまた図1のアラインメントに示されている。
INSP168ポリペプチドは、構造的には網膜特異的タンパク質PAL（SwissProt Acc. Code PALP_HUMAN）及びnogoレセプターホモローグ（SwissProt Acc. Code Q6X814）と関係がある。INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169ポリペプチド並びにPAL間のアミノ酸アラインメントは図5に示され、ドメインの模式図は図6に示されている。
上述のように、INSP169のクローニングした細胞外領域（配列番号:67）は、INSP169の予想した細胞外領域とはアミノ酸524で異なっている（実施例7及び図8参照）。
【００１４】
PALは、網膜、網膜色素上皮（RPE）及び脈絡膜の疾患に関与している可能性がある（例えばJP2001128686参照）。前記疾患には眼球の新生血管形成、眼球の炎症及び網膜の変性が含まれる。これら症状の具体的な例には以下が含まれる：糖尿病性網膜症、慢性緑内障、網膜はく離、鎌状赤血球網膜症、老人性黄斑変性、網膜新生血管形成、網膜下新生血管形成；ルベオーシス虹彩炎炎症疾患、慢性後部ブドウ膜炎及び汎ブドウ膜炎、新形成、網膜芽細胞腫、偽神経膠腫、血管新生緑内障；硝子体水晶体同時切除後に生じる新生血管形成、以下の血管性障害（網膜虚血、脈絡膜血管不全、脈絡膜血栓症、視神経の新生血管形成、糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑水腫、色素性網膜炎、網膜静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症、色素線条、網膜動脈閉塞）、眼又は眼球損傷の穿通による新生血管形成。さらにまた別の関連する疾患には、ニューロパシー、例えばリーバー氏、特発性、薬剤誘発性、視神経性、及び虚血性ニューロパシーが含まれる。
Nogoレセプター様タンパク質は、CNSのニューロン再生の主要な阻害物質であり得る（M.E. Schwab, Curr Opin Neurobiol., 2004 Feb, 14(1):118-24；Teng et al. J Neurochem., 2004 May, 89(4):801-6）。Nogo-Aを標的とする抗体（例えばIN-1 Fab'フラグメント又はNogo-Aに対する新規な精製IgG）による動物の処置は、種々の行動試験において常に高度な回復を示した。さらにまた、Nogo-66アンタゴニストペプチド（NEP1-40）は、皮質脊髄路の軸索の顕著な成長をもたらし、胸郭中部脊髄の半側切断を実施したラットの機能回復を改善した。脊髄損傷動物のNEP1-40皮下投与は、皮質脊髄軸索の強い増殖、セロトニン作動性線維の出芽、シナプス形成及び運動回復強化をもたらす。NogoレセプターサブユニットNgR（Nogoをブロッキングする）の可溶性Fc融合タンパク質は、ミエリンの阻害活性を顕著に低下させる。同様な結果が、動物モデルにおけるNogo遺伝子欠失及び下流メッセンジャーRho-A及びROCKのブロッキング後に得られた。
【００１５】
SLITタンパク質のロイシンリッチリピートドメインは、in vitroにおける軸索発射及びニューロン遊走の両者の誘導に十分である（SLITのLRR領域は構造的にINSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169のLRR領域と関係を有する）。したがって、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169、又はLRR領域を含むフラグメントは、本明細書に列挙した疾患の治療で有用であり得よう。SLIT-様タンパク質は、細胞の遊走で分子性誘導指標として機能すると考えられ、その機能は、ラウンダバウトホモローグレセプター（高い親和性でROBO1及びROBO2と結合する）との相互作用によって仲介されるようである。神経の発生時に、SLITは、神経管の腹側正中線の軸索移動及び種々の領域への軸索発射で必要とされる。脊髄索の発生では、SLITは、交連軸索がいったん底面に達したら、ネトリンへの応答を調整することによって直ちにそれら交連軸索を誘導する際に役割を果たすことができる。SLITは、脊髄索正中線交差後軸索反発に関与するかもしれない。視覚系の発生では、SLITは、これら軸索を視覚交差前又は前記通過後のそれら軸索の適切な通路にしたがって誘導する反発物質を提供することによって、網膜神経節軸索のための反発力として機能するようである。in vitroでは、SLITは網膜神経節細胞の増殖コーンを破壊しこれらを忌避する。SLITは、CNS感覚軸索の分岐及び樹枝状化、並びにニューロン細胞遊走に役割を果たすようである。in vitroでは、Slitホモローグ2タンパク質N-生成物（Slitホモローグ2タンパク質C-生成物は異なるが）は、嗅球（OB）を忌避するが、後根神経節（DRG）軸索は忌避せず、OB増殖コーンの破壊を誘発し、さらにDRG軸索の分岐を誘発する。SLITは白血球の遊走の調節に中心的に関与するように思われる。
【００１６】
INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169並びに他のINSP168ポリペプチド及び/又は前記のフラグメント及び機能的等価物（例えばLRR領域含有フラグメント）は、他の構造的に関連するタンパク質（例えば上記に記載のPAL-及びNogoレセプター様タンパク質）が治療活性を発揮する疾患の診断及び/又は治療に有用であり得る。
特に、INSP168、INSP168-SV1、及び/又はINSP149及び/又はINSP169の成熟可溶形、及び/又は前記のアゴニストから成るか、及び/又は前記を含む本発明のポリペプチドは、前記疾患の診断及び/又は治療に有用である。好ましくは、INSP149及び/又はINSP169の可溶形は、INSP149及び/又はINSP169の成熟細胞外部分及び/又は切断フラグメントから成る。膜結合INSP149及び/又はINSP169のアンタゴニスト（例えば抗体）は、前記疾患の診断及び/又は治療に有用である。
INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169ポリペプチドは、網膜の疾患、脊髄損傷（例えば対麻痺）及び神経変性疾患に関与し得る。これら疾患には、中枢神経系の異常とともに末梢神経系の異常が含まれる。神経変性異常には、脳損傷、脳血管系疾患及び前記の後遺症、パーキンソン病、皮質基底変性、運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症（ALS）を含む）、多発性硬化症、外傷性脳損傷、発作、発作後脳損傷、外傷後脳損傷及び脳小血管疾患が含まれるが、ただしこれらに限定されない。痴呆は、例えばアルツハイマー病、血管性痴呆、レーヴィー小体を伴う痴呆、前側頭痴呆、パーキンソン症候群、前側頭痴呆（ピック病を含む）、進行性核麻痺、皮質基底変性、ハンチントン病、視床変性、クロイツフェルト-ヤコブ痴呆、HIV痴呆、痴呆を伴う精神分裂病及びコルサコフ精神病とともに発作及び外傷である。
【００１７】
特に、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169ポリペプチドは以下の疾患に関与し得る：網膜、網膜色素上皮（RPE）及び脈絡膜の疾患；眼球の新生血管形成、眼球の炎症及び網膜の変性；糖尿病性網膜症、慢性緑内障、網膜はく離、鎌状赤血球網膜症、老人性黄斑変性、網膜新生血管形成、網膜下新生血管形成；ルベオーシス虹彩炎炎症疾患、慢性後部ブドウ膜炎及び汎ブドウ膜炎、新形成、網膜芽細胞腫、偽神経膠腫、血管新生緑内障；硝子体水晶体同時切除後に生じる新生血管形成、以下の血管性障害（網膜虚血、脈絡膜血管不全、脈絡膜血栓症、視神経の新生血管形成、糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑水腫、色素性網膜炎、網膜静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症、色素線条、網膜動脈閉塞）、眼又は眼球損傷の穿通による新生血管形成、ニューロパシー；リーバー氏、特発性、薬剤誘発性、視神経性、及び虚血性ニューロパシー；脊髄損傷、対麻痺、神経変性疾患、中枢神経系の異常、末梢神経系の異常、脳損傷、脳血管系疾患、パーキンソン病、皮質基底変性、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症、外傷性脳損傷、発作、発作後脳損傷、外傷後脳損傷、脳小血管疾患、痴呆、アルツハイマー病、血管性痴呆、レーヴィー小体を伴う痴呆、前側頭痴呆、パーキンソン症候群、前側頭痴呆、ピック病、進行性核麻痺、皮質基底変性、ハンチントン病、視床変性、クロイツフェルト-ヤコブ病痴呆、HIV痴呆、痴呆を伴う精神分裂病、コルサコフ精神病、発作及び外傷。
【００１８】
神経炎症は、いくつかの神経学的疾患、（中枢レベル又は末梢レベルでの）外傷症状、（脳、心臓、腎臓の）発作、又は（ウイルス因子（例えばHIV）又は細菌因子（例えば髄膜炎によって仲介される）感染性疾患の共通の特色であり、中枢神経系における過剰な炎症性応答をもたらす。（これらの種々の症状によりニューロン又は稀突起神経膠細胞から発する）多くの刺激は神経炎症の引き金となり得る。特に、星状細胞は多様なケモカイン及びサイトカインを分泌してさらに新たな白血球の補充を誘発し、前記白血球は順次、星状細胞を刺激して応答の悪循環をさらに生じる。慢性神経変性疾患（例えば多発性硬化症（MS）、脊髄筋萎縮（SMA）、アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、ハンチントン病（HD）、又は筋萎縮性側索硬化症（ALS））では、持続的な神経炎症の存在が、前記疾患の進行に、及び二次的事象（例えば微細出血事象）におけるADの場合に中心的に関与すると考えられる（M. Cacquevel et al. Curr Drug Targets, 2004, 5:529-534；A. Chavarria et al. Autoimmun Rev. 2004, 3:251-260；E. Ambrosini & F. Aloisi, Neurochem Res., 2004, 29:1017-1038）。
軸索の再生及び可塑性が限定的であることは、一連の神経学的異常（発作、頭部外傷、多発性硬化症及び神経変性疾患を含む）の病理生理学の主要部分である。
視力低下又は失明におけると同様に神経学的異常の病理生理学におけるその役割に加えて、nogo-様分子は癌にも関与している。前記理論に拘束されないが、本発明のポリペプチドは、EGFR阻害を介して癌に関与する。好ましくは、前記癌は肺癌である。
【００１９】
神経保護、軸索の完全性の維持、髄鞘形成、ミエリン産生細胞の再生/発生に関係するINSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169ポリペプチドの生物学的特性を、細胞株を必要とする種々のアッセイで検査することができる。例えば、化合物の神経免疫調整作用はU373（ヒトの星状膠細胞株）で判定することができる。U373では、サイトカイン/ケモカイン発現に必要とされる特定の調節タンパク質の核への移転を定量することができる（E. Le Roy et al. J Virol., 1999, 73:6582-9；Y. Jin et al. J Infec Dis., 1998, 177:1629-1638；M. Acevedo-Duncan et al. Cell Growth Differ. 1995, 6:1353-1365）。
一連のアッセイが実施され、INSP168を含有する培養液の添加はU373細胞でStat-2の核への移転を刺激することが示された。この最初の実験シリーズでは、INSP168は、U373細胞でStat-2の核への移転を誘発することによって細胞内シグナリングを刺激する能力を有することが明らかにされた。Statタンパク質シグナリングの活性化は、免疫調整を、最終的には細胞分裂を伴うことが知られている（E. Pfitzner et al. Curr Pharm Des, 2004, 10:2839-2850）。
本発明の第一の特徴のポリペプチドは、したがって細胞分裂のアクチベーターとして、神経調整物質（神経免疫調整物質）として、CNSの炎症応答の調節物質として、星状細胞分裂のレギュレーターとして、又は軸索発射、ニューロン遊走又は白血球の補充若しくは遊走のレギュレーターとして機能することができる。
【００２０】
好ましくは、本発明のポリペプチドの活性は以下のアッセイの少なくとも1つで確認することができる：
（a）ニューロン細胞生存の維持で、例えば損傷成人ニューロンの再生で、又は
（b）脊髄損傷の動物モデルにおける軸索成長の調整で（Fouad et al. Brain Res Rev., 2001, 36:204-212；Bareyre et al., J Neurosci., 2002, 22:7097-7110；GrandPre et al. Nature 2002, 417:547-551；Li & Strittmatter, J Neurosci. 2003, 23:4219-4227；Liebscher et al. Ann Neurol., 2005, 58:706-719）、例えば軸索成長、及び他のCNS病巣（例えば中脳動脈閉塞によって誘発された皮質病巣又は脳虚血）のミエリン阻害の調整で（Yu Hsuan Teng & Luen Tang, J Neurochemistry 2005, 94:865-874；Papadopoulos et al. Ann Neurol 2002, 51:433-441；Emerick et al. J Neurosci 2003, 123:4826-4830）、又は
（c）多くのタイプのニューロンの軸索（例えば皮質脊髄路（CST）軸索、皮質遠心性、網膜、上頸神経節、脊髄又は海馬ニューロン、後柱軸索）の成長の調整で、例えば非病巣皮質ニューロンの軸索可塑性の調整で（行動の回復の強化を示す）、又は
（d）実施例6に記載のStat2の移転で、又は
（e）増殖因子又は増殖関連タンパク質（例えば脳由来神経栄養因子（BDNF）、血管内皮増殖因子（VEGF）及び/又は増殖関連タンパク質43（GAP-43））のアップレギュレーションで、又は
（f）神経線維、例えば縫線脊髄、赤核脊髄又は皮質脊髄線維の再生で、又は損傷視神経線維の再生（例えば視神経破壊モデル）で、又は
（g）運動機能の改善で、又は
（h）セクレターゼ、例えばβ-セクレターゼの調節で、又は
（i）例えばBcl-2ファミリーの前アポトーシスタンパク質及び/又はミトコンドリアタンパク質を調整することによるアポトーシスの調整で、又は
（j）Rho又はRho-関連キナーゼ（ROCK）の調整で、又は
（k）β-セクレターゼ（例えばBACE1活性）の調整で、及び/又はアミロイドβペプチドの生成、及び/又はアミロイド斑の生成で、又は
（l）眼の優位（OD）可塑性（ocular dominance plasticity）の調節で、又は
（m）上皮増殖因子レセプター（EGFR）のリン酸化の調整で、又は
（n）神経回路の安定化で、又は
（o）樹状突起の可塑性の調整で。
Nogoレセプター（NgR）に関しては、ミエリン阻害性タンパク質Nogo、ミエリン関連糖タンパク質（MAG）及び稀突起細胞ミエリン糖タンパク質（Omgp）はいずれもNgRの細胞外ロイシンリッチリピート（LRR）ドメインと結合する。したがって、LRRドメインを含むか及び/又は前記から成る本発明のポリペプチドは少なくとも、上記アッセイの1つで活性を示すことができる。
【００２１】
INSP168、INSP168-SV1の成熟形（シグナルペプチドを欠く）及び/又は切断形、及び/又はINSP149及び/又はINSP169の成熟可溶形、及び/又は前記のアゴニストが好ましくは上述のアッセイで用いられる。好ましくは、INSP149及び/又はINSP169の可溶形は、INSP149及び/又はINSP169の成熟細胞外部分及び/又は切断フラグメントから成る。また別には、膜結合INSP149及び/又はINSP169のアンタゴニスト（例えば抗体）を上述のアッセイで用いることができる。本発明のポリペプチドの好ましいエピトープは、文献に記載されているように、“アフィニティーフィンガープリント” によって検出することができる（Schimmele & Pluckthun, J Mol Biol., 352(1):229-241）。
本発明のポリペプチドは、メタロエンドペプチダーゼ及び/又は前タンパク質コンバターゼ（例えば亜鉛メタロプロテイナーゼ、N-アルギニンジベーシック（NDR）コンバターゼ又はスブチリシン様前タンパク質コンバターゼ）によって切断することができる。NDR切断部位及びPCSK切断部位は、本発明のポリペプチドで検出されている。そのようにして生成された本発明のポリペプチドの切断フラグメントを疾患の診断及び/又は治療に用いることができることは、当業者には理解されよう。膜結合INSP149及び/又はINSP169の切断によって、そのもの自体として、又は融合タンパク質（例えばFc融合物）の成分として有用な可溶性N-及びC-末端フラグメントを得ることができる。
【００２２】
NDR切断部位は、本発明の完全長ポリペプチドにおいて最初のLRRモチーフの後ろに位置する70−72位（RRI）で検出された。驚くべきことに、PCSK切断部位は、完全長INSP168-SV1の207−209位で、及び完全長膜結合INSP169の439−441位（KRS）及び449−451位（KRN）で検出された。興味深いことには、INSP168-SV1のPCSK切断部位はLRRモチーフの直後に存在し、INSP169についてはLRRモチーフとフィブロネクチンドメインとの間に存在する。本発明のポリペプチドはまた、前記生成された切断N-フラグメント及び/又はC-フラグメント又は前記の成熟形も含む。好ましくは、前記生成切断フラグメントは可溶性フラグメントである。好ましくは、前記生成フラグメントは以下から成る：
（i）INSP168-SV1の最初の208アミノ酸又はその成熟形、又は
（ii）INSP169の最初の440アミノ酸又はその成熟形、又は
（iii）INSP169の最初の450アミノ酸又はその成熟形。
本発明のこの特徴はまた、本発明の第一の特徴のポリペプチドを取り込んだ融合タンパク質を含む。
本発明の“抗原決定基”は、本発明のポリペプチドの部分であり得る。前記部分は抗体結合部位又はT-細胞レセプター（TCR）と結合する。また別には、“抗原決定基”は、単一抗体分子が結合する、本発明のポリペプチドの表面上の部位であり得る。一般的には、抗原はいくつかの又は多くの別個の抗原決定基を有し、異なる多くの特異性を有する複数の抗体と反応する。好ましくは、前記抗体は本発明のポリペプチドと免疫特異的である。好ましくは、前記抗体は、融合たんぱく質の部分ではない本発明のポリペプチドと免疫特異的である。好ましくは、前記抗体は、INSP168、INSP168-SV1、INSP149若しくは INSP169、又は前記のフラグメントと免疫特異的である。抗原決定基は、通常は、科学的に活性な表面の分子群、例えばアミノ酸又は糖側鎖から成り、固有の三次元構造特徴とともに固有の荷電特徴を有することができる。好ましくは、“抗原決定基”は、抗原性を有する（すなわち固有の免疫応答を誘引する）本発明のポリペプチド上の特定の化学基を指す。
ポリペプチドAAI04038（配列番号:68）、XP_853150（配列番号:69）及びENSCAFP00000016927（配列番号:70）、並びの前記のコード核酸配列は、本発明の範囲から特に除外される。
【００２３】
第二の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする精製核酸分子を提供する。
“精製核酸分子”という用語は、好ましくは、（1）全核酸が供給源細胞から単離されたときに天然の状態で見出されるタンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質の少なくとも約50%から分離されてある本発明の核酸分子；（2）“精製核酸分子”が天然の状態では結合しているポリヌクレオチドの全部又は一部分と結合していない本発明の核酸分子；（3）天然の状態では結合していないポリヌクレオチドと機能的に連結されている本発明の核酸分子；又は（4）天然の状態ではより大きなポリヌクレオチド配列の部分として存在しない本発明の核酸分子を指す。好ましくは、本発明の単離核酸分子は、ポリペプチド生成におけるその使用、又はその治療的、診断的、予防的若しくは研究的使用の妨げとなり得る、他のいずれの夾雑核酸分子も、又はその天然の環境で見出される他の夾雑物質も実質的に含まない。好ましい実施態様では、ゲノムDNAは本発明の範囲から特に除外される。好ましくは、10kbp（キロ塩基対）、50kbp、100kbp、150kbp、200kbp、250kbp又は300kbpより大きいゲノムDNAは、特に本発明の範囲から除外される。好ましくは、“精製核酸分子”はcDNAのみから成る。
好ましくは、前記精製核酸分子は、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43及び/又は配列番号:66に示される核酸配列を含むか若しくは前記核酸配列から成るか、又は前記配列の重複等価物若しくはフラグメントである。
好ましくは、前記精製核酸分子は、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43及び/又は配列番号:66に示される核酸配列から成るか、又は前記配列の重複等価物若しくはフラグメントである。
【００２４】
第三の特徴では、本発明は、本発明の第二の特徴の核酸分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする精製核酸分子を提供する。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は以下のように規定される：50%ホルムアミド、5ｘのSSC（150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5ｘデンハルト溶液、10%硫酸デキストラン及び20μg/mLの変性せん断サケ精子DNAを含む溶液で42℃での一晩のインキュベーション、続いて0.1ｘのSSCで約65℃でフィルターを洗浄。
第四の特徴では、本発明は、ベクター（例えば発現ベクター）を提供し、前記ベクターは本発明の第二又は第三の特徴の核酸分子を含む。
第五の特徴では、本発明は、本発明の第四の特徴のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
第六の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のロイシンリッチリピートモチーフと特異的に結合し、好ましくは前記モチーフの活性を阻害するリガンドを提供する。
第七の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現を変化させるために有効であるか、又は本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性を調節するために有効な化合物を提供する。
そのような化合物は、本明細書に開示するアッセイ及びスクリーニング方法を用いて同定することができる。
本発明の第七の特徴の化合物は、前記遺伝子の発現レベル又は前記ポリペプチドの活性を増加させるか（アゴニスト）又は低下させる（アンタゴニスト）ことができる。
【００２５】
重要なことには、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169ポリペプチドのドメイン編成及び機能を同定することによって、疾患の治療及び/又は診断に有効な化合物を同定することができるスクリーニング方法の設計が可能になる。本発明の第六及び第七の特徴のリガンド及び化合物はそのような方法を用いて同定することができる。これらの方法は本発明の特徴として含まれる。これらの方法を用いて、臨床的に応用してin vivoでINSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169活性を調整する場合に有用であり得る、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169の阻害物質又はアンタゴニスト、例えばモノクローナル抗体の同定が可能であろう。そのような化合物は、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169ポリペプチドに対抗する場合におそらく有用である。
本発明のまた別の特徴は、候補薬調整物質、特にロイシンリッチリピート（LRR）モチーフ含有タンパク質関連疾患に対して活性を有する候補薬のスクリーニングの標的としてINSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169遺伝子又はポリペプチドを使用することにある。
本発明のさらに別の特徴は、ロイシンリッチリピート（LRR）モチーフ含有タンパク質関連疾患の治療用化合物をスクリーニングする方法にある。前記方法は、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169遺伝子若しくはポリペプチド又は前記のフラグメントと結合する化合物の能力を決定することを含む。
本発明のさらに別の特徴は、ロイシンリッチリピート（LRR）モチーフ含有タンパク質関連疾患の治療用化合物をスクリーニングする方法にある。前記方法は、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169遺伝子若しくはポリペプチド又は前記のフラグメントの活性の調整をテストすることを含む。
【００２６】
第八の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチド、又は本発明の第二若しくは第三の特徴の核酸分子、又は本発明の第四の特徴のベクター、又は本発明の第五の特徴の宿主細胞、又は本発明の第六の特徴のリガンド、又は本発明の第七の特徴の化合物を、ロイシンリッチリピートモチーフ含有タンパク質が関与する疾患の治療又は診断で使用するために提供する。そのような疾患には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：網膜、網膜色素上皮（RPE）及び脈絡膜の疾患；眼球の新生血管形成、眼球の炎症及び網膜の変性；糖尿病性網膜症、慢性緑内障、網膜はく離、鎌状赤血球網膜症、老人性黄斑変性、網膜新生血管形成、網膜下新生血管形成；ルベオーシス虹彩炎炎症疾患、慢性後部ブドウ膜炎及び汎ブドウ膜炎、新形成、網膜芽細胞腫、偽神経膠腫、血管新生緑内障；硝子体水晶体同時切除後に生じる新生血管形成、以下の血管性障害（網膜虚血、脈絡膜血管不全、脈絡膜血栓症、視神経の新生血管形成、糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑水腫、色素性網膜炎、網膜静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症、色素線条、網膜動脈閉塞）、眼又は眼球損傷の穿通による新生血管形成、ニューロパシー；リーバー氏、特発性、薬剤誘発性、視神経性、及び虚血性ニューロパシー；脊髄損傷、対麻痺、神経変性疾患、中枢神経系の異常、末梢神経系の異常、脳損傷、脳血管系疾患、パーキンソン病、皮質基底変性、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症、外傷性脳損傷、発作、発作後脳損傷、外傷後脳損傷、脳小血管疾患、痴呆、アルツハイマー病、血管性痴呆、レーヴィー小体を伴う痴呆、前側頭痴呆、パーキンソン症候群、前側頭痴呆、ピック病、進行性核麻痺、皮質基底変性、ハンチントン病、視床変性、クロイツフェルト-ヤコブ痴呆、HIV痴呆、痴呆を伴う精神分裂病、コルサコフ精神病、発作及び外傷。
本発明の第一、第二、第三、第四、第五、第六又は第七の特徴の部分もまた、そのような疾患を治療する医薬の製造で用いることができる。
【００２７】
第九の特徴では、本発明は患者で疾患を治療する方法を提供する。前記方法は、本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現レベル、又は本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性を前記患者由来の組織で判定し、前記発現又は活性のレベルをコントロールレベルと比較することを含み、前記コントロールレベルと異なるレベルは疾患の指標である。そのような方法は、好ましくはin vitroで実施されるであろう。同様な方法を疾患の治療を患者でモニターするために用いることができ、ポリペプチド又は核酸分子の発現又は活性のレベルがある期間にわたってコントロールレベルに対して変化すれば疾患の緩解の指標となる。
本発明の第一の特徴のポリペプチドを検出する好ましい方法は以下の工程を含む：（a）本発明の第六の特徴のリガンド（例えば抗体）を生物学的サンプルとリガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で接触させる工程；及び（b）前記複合体を検出する工程。
当業者には明らかなように、本発明の第九の特徴に一致する多数の異なる方法が存在する。前記は、例えば短いプローブによる核酸のハイブリダイゼーション、点変異解析、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、及び異常なタンパク質レベルを検出するために抗体を用いる方法である。同様な方法を短期又は長期にわたって用いて、疾患の治療を患者でモニターすることができる。本発明はまた疾患を診断するこれらの方法で有用なキットを提供する。
好ましくは、本発明の第九の特徴の方法によって診断される疾患は、ロイシンリッチリピートモチーフ含有ポリペプチドが関与する、上記に記載したような疾患である。
【００２８】
十番目の特徴では、本発明は、細胞分裂のアクチベーターとして、神経調整物質（神経免疫調整物質）として、CNSの炎症性応答の調整物質として、星状細胞分裂の調節物質として、又は軸索発射、ニューロン遊走又は白血球補充若しくは遊走の調節物質として本発明の第一の特徴のポリペプチドの使用を提供する。INSP168、INSP168-SV1、又はINSP149及びINSP169の切端形（例えばトランスメンブレン領域を欠く）を、INSP149及びINSP169の内因性活性の組換え可溶性アンタゴニストとして用いることができよう。INSP168ポリペプチドのまた別の適切な使用は、INSP168ポリペプチドが関与する疾患及び症状に対して有効な薬剤化合物のスクリーニングにおける使用である。
十一番目の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチド、又は本発明の第二若しくは第三の特徴の核酸分子、又は本発明の第四の特徴のベクター、又は本発明の第五の特徴の宿主細胞、又は本発明の第六の特徴のリガンド、又は本発明の第七の特徴の化合物を、医薬的に許容できる担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
十二番目の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチド、又は本発明の第二若しくは第三の特徴の核酸分子、又は本発明の第四の特徴のベクター、又は本発明の第五の特徴の宿主細胞、又は本発明の第六の特徴のリガンド、又は本発明の第七の特徴の化合物を、ロイシンリッチリピートモチーフ含有ポリペプチドが関与する疾患の診断又は治療のための医薬の製造で使用するために提供する。そのような疾患には、本発明の第八の特徴と合わせて上記に記載した疾患が含まれる。
【００２９】
十三番目の特徴では、本発明は患者で疾患を治療する方法を提供する。前記方法は、本発明の第一の特徴のポリペプチド、又は本発明の第二若しくは第三の核酸分子、又は本発明の第四の特徴のベクター、又は本発明の第五の特徴の宿主細胞、又は本発明の第六の特徴のリガンド、又は本発明の第七の特徴の化合物を患者に投与することを含む。
症状を有する患者において本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現、又は本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性が、健常な者での前記発現又は活性レベルと比較して低い疾患の場合、患者に投与されるポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物はアゴニストであるべきである。逆に、症状を有する患者において前記ポリペプチドの天然の遺伝子の発現又は活性が、健常な者での前記発現又は活性レベルと比較して高い疾患の場合、患者に投与されるポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物はアンタゴニストであるべきである。そのようなアンタゴニストの例にはアンチセンス核酸分子、リボザイム及びリガンド（例えば抗体）が含まれる。
十四番目の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチドを高レベルで又は低レベルで発現するか、又は前記が発現されないように形質転換されたトランスジェニック、又はノックアウト非ヒト動物を提供する。そのようなトランスジェニック動物は、疾患の研究のための非常に有用なモデルであり、さらにまた、そのような疾患の治療又は診断に有効な化合物の同定のためのスクリーニング計画でも用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本明細書で用いられる、“機能的等価物”は、本発明のポリペプチド又は核酸分子と実質的に類似する機能的又は構造的特徴を有するタンパク質又は核酸分子を指す。タンパク質の機能的等価物は、特定の機能の実施のために必要とされる改変に応じてそのような改変を含むことができる。“機能的等価物”という用語は、分子のフラグメント、変異体、ハイブリッド、変種、類似体又は化学的誘導体を含むことを意図する。
好ましくは、“機能的等価物”は、本発明のポリペプチドの任意の1つ以上の機能的活性を示すタンパク質又は核酸分子であり得る。
好ましくは、“機能的等価物”は、生物学的活性又は機能の測定のための適切なアッセイでINSP168、INSP168-SV1、INSP149若しくはINSP169又はそのフラグメントと比較して、実質的に類似の活性を示すタンパク質又は核酸であり得る。好ましくは、“機能的等価物”は、生物学的活性又は機能の測定のための適切なアッセイでINSP168、INSP168-SV1、INSP149若しくはINSP169又はそのフラグメントと比較して、同一又はより高い活性を示すタンパク質又は核酸分子であり得る。好ましくは、“機能的等価物”は、生物学的活性又は機能の測定のための適切なアッセイでINSP168、INSP168-SV1、INSP149若しくはINSP169又はそのフラグメントと比較して、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%又はそれより高い活性を示すタンパク質又は核酸分子であり得る。
好ましくは、“機能的等価物”は、本発明のポリペプチドと実質的に類似するin vivo又はin vitro活性を示すことができるタンパク質又はポリペプチドであり得る。好ましくは、“機能的等価物”は、本発明のポリペプチドの対応する部分が他の細胞内又は細胞外分子と相互作用する態様と実質的に類似の態様でそれら分子と相互作用することができるタンパク質又はポリペプチドであり得る。例えば、 “機能的等価物”は、免疫アッセイにおいて、本発明のポリペプチドの対応するペプチド（すなわち“機能的等価物”を達成するためにそのアミノ酸配列が改変されたペプチド）又は本発明のペプチドそのものと抗体との結合を低下させることができよう（ここで前記抗体は本発明のポリペプチドの対応するペプチドに対して生成されたものであった）。等モル濃度の機能的等価物は、前述の対応するペプチドの結合を少なくとも約5%、好ましくは約5%から10%、より好ましくは約10%から25%、さらに好ましくは約25%から50%、もっとも好ましくは約40%から50%低下させるであろう。
例えば、機能的等価物は完全な機能を有することができるが、また1つ以上の活性を欠くこともできる。したがって、本発明では、変異は、例えばロイシンリッチリピート（LRR）モチーフを所有していることを反映する前記ポリペプチドの機能に影響を与えることができる。
【００３１】
本発明を利用するために用いることができる標準的な技術及び方法の要旨は下記に提供される。本発明は、記載した特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクター及び試薬に限定されないことは理解されよう。本明細書で用いられる用語は単に具体的な実施態様を記載する目的のためであり、さらに、この用語が本発明の範囲を限定することを意図しないこともまた理解されよう。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲の語句によってのみ制限される。
ヌクレオチド及びアミノ酸の標準的な略語が本明細書では用いられる。
別に指定がなければ、本発明の実施には、通常の分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び免疫学の技術が用いられ、前記技術は当業者の技量の範囲内である。
そのような技術は文献で完全に説明されている。参考のための特に適切な成書には以下が含まれる：Sambrook Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989)；DNA Clonig, Vokumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)；Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)；Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986)；Immoblized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.)、特に154及び155巻；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, Lomdon)；Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.)；及びHandbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV（D.M. Weir and C.C. Blackwell eds. 1986）。
【００３２】
本明細書で用いられる、“ポリペプチド”という用語には、2つ以上のアミノ酸が互いにペプチド結合又は改変ペプチド結合（すなわちペプチドイソステア）によって結合されたものを含む、任意のペプチド又はタンパク質が含まれる。この用語は、短い鎖（ペプチド及びオリゴペプチド）及び長い鎖（タンパク質）の両者を指す。
本発明のポリペプチドは成熟タンパク質型であっても、プレ-、プロ-又はプレプロ-タンパク質であってもよい。後者は、プレ-、プロ-又はプレプロ-部分の切断によって活性化され、活性を有する成熟ポリペプチドを生成することができる。そのようなポリペプチドでは、前記プレ-、プロ-又はプレプロ-配列はリーダー配列でも又は分泌配列でもよく、又は成熟ポリペプチド配列の精製のために用いられる配列でもよい。
上述のように、本発明の第一の特徴のポリペプチドは融合タンパク質の部分を形成することができる。例えば、1つ以上の付加されたアミノ酸配列を含むことはしばしば有利である。前記付加される配列は、分泌配列若しくはリーダー配列、プロ-配列、生成を促進する配列、又はより高い安定性を例えば組換え体の生成中に付与する配列を含むことができる。また別には、又は前記に加えて、成熟ポリペプチドは別の化合物、例えば前記ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合させることができる。
本発明のポリペプチドは、そのもの自身で、融合タンパク質（例えばFc融合物）の成分として、及び/又は別の物質と組み合わされて有用である。好ましくは、Fc融合物は、INSP168の成熟形、INSP168-SV1の成熟形、又はINSP149若しくは INSP169の細胞外部分の成熟形を含む。
好ましくは、前記物質は、インターフェロン-β、可溶性NgR（例えばNogo-66）、NgRに対する抗体、ミエリン阻害物質（例えばNogo、MAG又はOmgp）を標的とする抗体、CXCL10、セロトニンレセプターのアゴニスト（例えば5-HT1A/2A/7）、LIE、EGFRブロッカー（例えばエルロチニブ）、及び/又はメチルプレドニソロンから選択される。
さらに好ましい実施態様では、本発明のポリペプチド（INSP168、INSP168-SV1、INSP149又は INSP169と少なくとも85%の相同性を有する配列を含むことができる）は融合タンパク質である。
これらの融合タンパク質は、INSP168、INSP168-SV1、INSP149又はINSP169と少なくとも85%の相同性を有する配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、異種タンパク質配列のコード配列に対してイン-フレームでクローニングすることによって入手することができる。
【００３３】
本明細書で用いるとき、“異種”という用語は、ヒトINSP168、INSP168-SV1、INSP149又はINSP169ポリペプチド以外の任意のポリペプチドを指している。融合タンパク質のN-又はC-末端に含まれ得る異種配列の例には、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常領域（Fc領域）、マルチマー化ドメイン、細胞外タンパク質のドメイン、シグナル配列、エキスポート配列及びアフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にする配列が含まれる。
これら異種配列の多くは、発現プラスミドとして市場で入手できる。なぜならば、これら配列は、それらと融合されるタンパク質の特有の生物学的活性を顕著に損なうことなく付加的特性を提供するために融合タンパク質に一般的に含まれるためである（K. Terpe, 2003, Appl Microbiol Biotechnol, 60:523-33）。そのような付加的特性の例は、体液中でのより長い半減期、細胞外局在、又はいわゆる“ヒスチジンタグ” （Gentz et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:821-4）を形成する一連のヒスチジン若しくは“HA”タグによって可能になる容易な精製手段、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープ（Wilson et al. Cell, 1994, 37:767-78）である。必要な場合には、異種配列は、タンパク質切断によって、例えばタンパク質と異種配列との間にタンパク質切断部位を挿入し、精製融合タンパク質を適切なプロテアーゼに暴露することによって除去することができる。これらの特質は、融合タンパク質の製造及び医薬組成物の調製でのそれらの使用を促進するので融合タンパク質にとって特に重要である。例えば、INSP168、INSP168-SV1、INSP149又はINSP169ポリペプチドは、INSP168、INSP168-SV1、INSP149又はINSP169のC-末端に融合させた6-ヒスチジンの手段によって精製することができる。融合タンパク質が免疫グロブリン領域を含むとき、前記融合は直接的であっても、短いリンカーペプチドを介していてもよい。前記短いリンカーペプチドは、長さが1−3アミノ酸残基の短いものであっても、長いもの、例えば13アミノ酸残基であってもよい。前記リンカーは、例えば配列E-F-M（Glu-Phe-Met）のトリペプチドであっても、またはGlu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met（配列番号:71）を含む13-アミノ酸リンカー配列でもよい（前記は本発明の物質の配列と免疫グロブリン配列との間に導入される）。生成される融合タンパク質は、改善された特性、例えば体液中での滞留時間の延長（すなわち半減期の延長）、比活性の増加、発現レベルの増加を有し、又は融合タンパク質の精製が促進される。
【００３４】
好ましい実施態様では、タンパク質はIg分子の定常領域と融合される。好ましくは、前記は、例えばヒトのIgG1のCH2及びCH3ドメインのような重鎖領域と融合される。Ig分子の他のアイソフォームもまた、本発明の融合タンパク質の生成に適している。前記は、例えばアイソフォームIgG2若しくはIgG4、又は他のIgクラス、例えばIgM又はIgAである。融合タンパク質は、モノマーでもマルチマーでも、又はヘテロ-マルチマーでもホモ-マルチマーでもよい。
さらに好ましい実施態様では、機能的な誘導体は、1つ以上の官能基（アミノ酸残基の1つ以上の側鎖として生じる）に結合した少なくとも1つの部分を含む。好ましくは、前記部分はポリエチレン（PEG）部分である。PEGyl化は、公知の方法（例えばWO99/55377に記載されている方法）によって実施することができる。
ポリペプチドは、20個の遺伝暗号のアミノ酸以外の、天然のプロセス（例えば翻訳後プロセッシング）又は化学的改変技術（当分野で公知である）によって改変されたアミノ酸を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドに一般的に存在することができる公知の改変にはグリコシル化、脂質付加、硫酸化、例えばグルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、ヒドロキシル化、及びADPリボシル化がある。他の潜在的な改変には、アセチル化、アシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、GPIアンカー形成、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、タンパク質へのトランスファー-RNA仲介アミノ酸添加（例えばアルギニル化）、及びユビキチン化が含まれる。
【００３５】
改変は、ポリペプチドのいずれの場所（ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシ末端）に生じていてもよい。実際、ポリペプチドのアミノ又はカルボキシ末端又はその両端の共有結合的改変によるブロッキングは、天然に存在するポリペプチド及び合成ポリペプチドで一般的であり、そのような改変は本発明のポリペプチドで存在し得る。ポリペプチドで生じる改変は、しばしばどのように前記ポリペプチドが生成されるかの相関的要素であろう。組換えによって生成されるポリペプチドの場合、改変の性質及び程度は、大きな比率で、個々の宿主細胞の翻訳後修飾能力及び問題のポリペプチドのアミノ酸配列に存在する改変シグナルによって決定されるであろう。例えば、グリコシル化パターンは宿主細胞の種々のタイプ間で変動する。
本発明のポリペプチドは任意の適切な態様で調製することができる。そのようなポリペプチドには単離された天然に存在するポリペプチド（例えば細胞培養由来の精製形）、組換え生成ポリペプチド（融合タンパク質を含む）、合成により生成されたポリペプチド、又は前記方法の組合せにより生成されたポリペプチドが含まれる。
本発明の第一の特徴の機能的に等価のポリペプチドは、INSP168と相同なポリペプチドであり得る。ポリペプチドの一方の配列が他方のポリペプチドの配列と十分に高度な同一性又は類似性を有する場合、これらの2つのポリペプチドは、本明細書で当該用語が用いられるように“相同”である。“同一性”とは、アラインメントを実施した複数の配列の個々の任意の位置においてアミノ酸残基が前記配列間で同一であることを示す。“類似性”とは、アラインメントを実施した配列の個々の任意の位置においてアミノ酸残基が前記配列間で類似のタイプであることを示す。同一性及び類似性の程度は容易に計算することができる（Computational Molecular Biology, A.M .Lesk,ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing. Infomatics and Genome Projects, D.W. Smith ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, A.M. Griffin and H.G. Griffin eds., Humana Press, New Jersy, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heinje Academic Press, 1987；及びSequence Analysis Primer, M. Gribskov and J. Devereux eds., M. Stockton Press, New York, 1991）。好ましくは、本明細書で言及するパーセント同一性は、BLASTヴァージョン2.1.3でNCBI（National Center for Biotechnology Information；http:www.ncbi.nlm.nih.gov）が規定する以下のような規定値パラメータを用いて決定されるようなものである[ブロッサム62マトリックス；ギャップオープンペナルティー＝11及びギャップ伸長ペナルティー＝1]。
【００３６】
したがって相同なポリペプチドには、INSP168ポリペプチドの天然の生物学的変種（例えば前記ポリペプチドが由来する種の中での対立遺伝子座変種、又は地理的変種）及び変異体（例えばアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む変異体）が含まれる。そのような変異体には、1つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されているポリペプチドが含まれ得る。そのような置換アミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされるものであってもなくてもよい。典型的な前記置換は、Ala、Val、Leu及びIle間で；Ser及びThr間で；酸性残基Asp及びGlu間で；Asn及びGln間で；塩基性残基Lys及びArg間で；又は芳香族残基Phe及びTyr間で生じる。特に好ましいものは、いくつかアミノ酸、すなわち5から10、1から5、1から3、1から2、又は1つだけのアミノ酸が、任意の組合せで置換、欠失又は添加されてある。特に好ましいものは、前記タンパク質の特性及び活性を変化させないサイレント置換、付加及び欠失である。これに関してまた特に好ましいものは保存的置換である。そのような変異体には、1つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチドが含まれる。
【００３７】
本発明にしたがえば、いずれの置換も好ましくは“保存的”又は“安全な”置換であるべきで、前記は、一般的には、十分に類似する化学的特性（例えば塩基性、陽性荷電アミノ酸がまた別の塩基性、陽性荷電アミノ酸で置き換えられるべきである）を有するアミノ酸を導入し、分子の構造及び生物学的機能を保存する置換と定義される。
文献には、タンパク質の配列及び/又は構造における統計的及び物理化学的研究をもとにして保存的アミノ酸置換の選択を実施することができる多くのモデルが提供されている（S.I. Rogov and A.N. Nekrasov, 2001）。タンパク質設計実験によって、アミノ酸の特定のサブセットの使用が折りたたみ可能で活性を有するタンパク質を生成することができることが示され、タンパク質構造で容易に収容することができ、機能的及び構造的ホモローグ並びにパラローグの検出に用いることができるアミノ酸の“同義”置換物の分類に役立った（L.R. Murphy et al. 2000）。同義アミノ酸のグループ及びより好ましい同義アミノ酸のグループは表1に示されている。
特定の非保存的変異もまた、種々の目的をもつ本発明のポリペプチドに導入することができる。前記タンパク質のアフィニティーが低下させる変異は、再使用されリサイクルされるその能力を高め、潜在的にその治療能力を高めることができる（C.R. Robinson, 2002）。本発明のポリペプチドに最終的に存在する免疫原性エピトープはワクチンの開発に利用することができ（S. Stevanovic, 2002）、または、タンパク質の安定性を高めるための変異を選択する公知の方法に従って改変し、さらにそれらを修正することによって除去することができる（B. van den Burg and V. Eijsink, 2002；WO02/05146, WO00/34317, WO98/52976）。
【００３８】
ペプチド模倣物に含まれるアミノ酸誘導体の好ましいまた別の同義グループは表2に定義されているものである。アミノ酸誘導体の非包括的リストにはまた以下が含まれる：アミノイソ酪酸（Aib）、ヒドロキシプロリン（Hyp）、1,2,3,4-テトラヒドロ-イソキノリン-3-COOH、インドリン-2カルボン酸、4-ジフルオロ-プロリン、L-チアゾリジン-4-カルボン酸、L-ホモプロリン、3,4-ジヒドロ-プロリン、3,4-ジヒドロキシ-フェニルアラニン、シクロヘキシル-グリシン及びフェニルグリシン。
“アミノ酸誘導体”とは、20の遺伝的にコードされる天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸又はアミノ酸様化学物質を指す。特に、アミノ酸誘導体は、置換又は非置換、直鎖、分枝若しくは環式アルキル部分を含むことができ、さらに1つ以上のへテロ原子を含むことができる。アミノ酸誘導体はde novoに生成するか、又は市販の供給源（Calbiochem-Novabiochem AG, Switzerland; Bachem, USA）から入手することができる。
タンパク質の構造及び機能を調べ、及び/又はこれを改善するために、in vitro及びin vivo翻訳系を用いる、非天然アミノ酸誘導体をタンパク質に取り込むための種々の方法が文献に開示されている（D.A. Dougherty, 2000）。非ペプチド模倣物と同様にペプチド模倣物の合成及び開発もまた当分野では周知である（A. Golebiowski et al. 2001；V.J. Hruby and P.M. Balse 2000；T.K. Sawyer, in "Structure Based Drug Design", edited by P. Veerapandia, Marcel Dekker Inc., pg.557-663, 1997）。
そのような変異体にはまた、1つ以上のアミノ酸が置換基を含むポリペプチドが含まれる。
典型的には、2つのポリペプチド間の80%を超える同一性は機能的等価性を示していると考えられる。好ましくは、本発明の第一の特徴の機能的に等価なポリペプチドは、INSP168ポリペプチド又はその活性なフラグメントと80%を超える配列同一性の程度を有する。より好ましいポリペプチドは、それぞれ90%、95%、98%又は99%を超える同一性の程度を有する。
【００３９】
本発明の第一の特徴の機能的に等価のポリペプチドはまた、構造的アラインメントの1つ以上の技術を用いて同定されたポリペプチドであろう。例えば、バイオペンジウム（Biopendium(商標)）検索データベースを作成するために用いられた検索ツールの1つの特徴を構成するインファーマティカ・ゲノムスレッダー（Inpharmatica Genome Threader）技術を用いて（WO01/69507として公開されたPCT出願を参照されたい）、INSP168ポリペプチドと比較して低い配列同一性を有するが、INSP168ポリペプチド配列と有意な構造相同性を共有するために細胞表面認識分子あると予想される、現時点では未知の機能をもつポリペプチドを同定することができる。 “有意な構造相同性”とは、インファーマティカ・ゲノムスレッダーが、2つのタンパク質は10%以上の確実性で構造的相同性を共有すると予想することを意味する。
本発明の第一の特徴のポリペプチドはまた、INSP168ポリペプチドのフラグメント、及びこれらのポリペプチドの機能的等価物のフラグメントを含むが、ただし、これらフラグメントがINSP168ポリペプチドの生物学的活性を保持するか、又はこれらポリペプチドと共通の抗原決定基を有することを条件とする。
本明細書で用いられる、“フラグメント”という用語は、INSP168ポリペプチド、又はその機能的等価物のアミノ酸配列の部分（全体ではない）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。前記フラグメントは、前記配列から少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含むべきであり、さらに、個々の配列に応じてｎは好ましくは7以上（例えば8、10、12、14、16、18、20またはそれより多い）である。小さなフラグメントは抗原決定基を形成することができる。
【００４０】
好ましくは、本発明の核酸は長さが10−2000ヌクレオチド、好ましくは100−1750ヌクレオチド、好ましくは500−1500、好ましくは600−1200、好ましくは長さが750−1000ヌクレオチドである。本発明のポリペプチドは、好ましくは長さが10−700アミノ酸、好ましくは50−600、好ましくは100−500、好ましくは200−400、好ましくは長さが300−375アミノ酸である。
完全長のINSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169エキソンポリペプチド、並びにINSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169ポリペプチドのフラグメントは、それぞれINSP168、INSP168-SV1、INSP149又はINSP169ポリペプチド内の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17の隣接エキソン配列の組合せから成ることができる。
そのようなフラグメントは“独立して”あってもよく（すなわちそれらは他のアミノ酸又はポリペプチドの部分ではない）、又は、それらが部分又は領域を形成するより大きなポリペプチド内に含まれていてもよい。より大きなポリペプチド内に含まれているとき、本発明のフラグメントはもっとも好ましくはただ1つの連続する領域を形成する。例えば、ある種の好ましい実施態様は、フラグメントのアミノ末端に融合されたプレ-及び/又はプロ-ポリペプチド領域を有するフラグメント、及び/又はフラグメントのカルボキシ末端に融合された付加領域を有するフラグメントに関する。しかしながら、いくつかのフラグメントがただ1つのより大きなポリペプチド内に含まれていてもよい。
【００４１】
本発明のポリペプチド又はそれらの免疫原性フラグメント（少なくとも1つの抗原決定基を含む）を用いて、リガンド（例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体、それらは前記ポリペプチドに対して免疫特異的である）を作成することができる。そのような抗体を利用して、本発明のポリペプチドを発現するクローンを単離又は同定するか、又は本発明のポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。前記抗体はまた、当業者には明白なように、他の適用の中でとりわけ診断的又は治療的補助物質として利用することができる。
“免疫特異的”という用語は、本発明のポリペプチドに対して、従来技術の他の関連するポリペプチドに対するアフィニティーよりも実質的により強いアフィニティーを有する抗体を意味する。本明細書で用いられる、“抗体”という用語は、完全な分子と同様にそのフラグメント、例えばFab、F(ab')2、及びFvを指し、前記フラグメントは問題の抗原決定基と結合することができる。そのような抗体は、したがって本発明の第一の特徴のポリペプチドと結合する。
“実質的により強いアフィニティー”とは、公知の細胞表面レセプターに対するアフィニティーと比較した時、本発明のポリペプチドに対するアフィニティーで測定可能な増加が存在することを意味する。
好ましくは、前記アフィニティーは、公知の細胞表面認識分子に対するよりも、本発明のポリペプチドに対して少なくとも1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍又はそれより強い。
好ましくは、公知のロイシンリッチリピート（LRR）モチーフ含有タンパク質と比較した時、本発明のポリペプチドに対するアフィニティーで測定可能な増加が存在する。
ポリクローナル抗体が望ましい場合は、選択した哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ヤギ又はウマを本発明の第一の特徴のポリペプチドで免疫することができる。前記動物の免疫に用いられるポリペプチドは、組換えDNA技術によって誘導しても、又は化学的に合成してもよい。所望の場合は、前記ポリペプチドは担体タンパク質と結合させることができる。ポリペプチドを化学的に結合させることができる一般的に用いられる担体には、ウシ血清アルブミン、タイログロブリン及びキーホールリンペットヘモシアニンが含まれる。
続いて前記結合させたポリペプチドを用いて、動物を免疫することができる。前記免疫動物の血清を採集し、公知の方法にしたがって、例えば免疫アフィニティークロマトグラフィーによって処理する。
【００４２】
本発明の第一の特徴のポリペプチドに対するモノクローナル抗体もまた当業者は容易に作成することができる。ハイブリドーマ技術を用いるモノクローナル抗体を作成する一般的な方法は周知である（例えば以下を参照されたい：G. Koehler and C. Milstein, 1975,Nature 256:495-497；Kozbor et al. 1983, Immunology Today 4:72；Cole et al. 1985, 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.）。
本発明の第一の特徴のポリペプチドに対して生成されたモノクローナル抗体のパネルを種々の特性、すなわちアイソタイプ、エピトープ、アフィニティーなどについてスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体は、それらを誘導した個々のポリペプチドの精製で特に有用である。また別には、問題のモノクローナル抗体をコードする遺伝子を、例えば当分野で公知のPCR技術によってハイブリドーマから単離し、適切なベクターでクローニングし発現させることができる。
キメラ抗体（前記では非ヒト可変領域がヒトの定常領域に結合又は融合されている）（例えば以下を参照されたい：Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84:3439）もまた有用であり得る。
前記抗体を改変し（例えばヒト化によって）、個体での免疫原性を低下させることができる（例えば以下を参照されたい：Jones et al. Nature 1986, 321:522；Verhoeyen et al. Science 1988, 239, 1534；Kabat et al. J. Immunol. 1991, 147:1709；Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:10029；Gorman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88:34181；及びHodgson et al. Bio/Technology 1991, 9:421）。本明細書で用いられる、“ヒト化抗体”という用語は、非ヒトドナー抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメイン中のCDRアミノ酸及び選択した他のアミノ酸が、ヒト抗体中の同等のアミノ酸の代わりに代用された抗体分子を指す。したがってヒト化抗体はヒト抗体に極めて類似するが、ドナー抗体の結合能力を有する。
さらに別の態様では、前記抗体は“二重特異的”抗体であってもよい。すなわち抗体は2つの異なる抗原結合ドメインを有し、各ドメインは異なるエピトープに向けられている。
ファージディスプレー技術を用いて、関連抗体の保持についてスクリーニングしたヒトのリンパ球のPCR増幅V-遺伝子レパートリーから、又はナイーブライブラリーから、本発明のポリペプチドに対して結合活性を有する抗体をコードする遺伝子を選別することができる（J. McCafferty et al. 1990, Nature 348:552-554；J. Marks et al. 1992, Biotechnology 10:779-783）。これら抗体のアフィニティーは、チェーンシャッフリングによっても改善することができる（T. Clackson et al. 1991, Nature 352:624-628）。
上記技術によって生成された抗体は、ポリクローナルであれ、モノクローナルであれ、免疫アッセイ、放射性免疫アッセイ（RIA）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）における試薬として用いることができるという点で更なる有用性を有する。これらの用途では、抗体は、解析レベルで検出可能な試薬（例えば放射性同位体、蛍光分子又は酵素）により標識することができる。
【００４３】
本発明の第二及び第三の特徴の好ましい核酸分子は、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44及び/又は配列番号:67に示すポリペプチド配列及び機能的に等価なポリペプチドをコードする核酸分子である。これら核酸分子は、本明細書に記載する方法及び応用で用いることができる。本発明の核酸分子は好ましくは、本明細書に開示する配列に由来する少なくともｎの連続するヌクレオチドを含み、ここでｎは個々の配列に応じて10又はそれより大きい（例えば12、14、15、18、20、25、30、35、40又はそれより大きい）。
本発明の核酸分子はまた、上記に記載した核酸分子に対して相補的である配列を含む（例えばアンチセンス又はプローブの目的のため）。
本発明の核酸分子はRNAの形態（例えばmRNA）であってもよく、又はDNAの形態（例えばcDNA、合成DNA又はゲノムDNAを含む）であってもよい。そのような核酸分子は、クローニングによって、化学的合成技術によって、又は前記の組合せによって入手することができる。前記核酸分子は、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成を用いて化学的な合成によって、ゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーから、又は生物から分離することによって調製することができる。RNA分子は一般的にはDNA配列のin vitro又はin vivo転写によって生成することができる。
核酸分子は二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖DNAはコード鎖（センス鎖としても知られている）でもよいが、また前記は非コード鎖（アンチセンス鎖とも称される）であってもよい。
“核酸分子”という用語にはまたDNA及びRNAの類似体、例えば改変骨格を含むもの及びペプチド核酸（PNA）が含まれる。本明細書で用いられる、“PNA”という用語は、アンチセンス分子又はアンチ遺伝子因子を指し、前記は、複数のアミノ酸残基のペプチド骨格（好ましくはリジンで終わる）に連結された長さが少なくとも5ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む。末端のリジンは組成物に可溶性を付与する。PNAはPEGyl化させて細胞内でのその寿命を延長することができる。細胞内で、PNAは相補的な一本鎖DNA及びRNAと優先的に結合し、転写物の伸長を停止させる（P. E. Nielsen 1993, Anticancer Drug Des. 8:53-63）。
【００４４】
配列番号:2のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:１に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:4のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:3に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:6のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:5に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:8のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:9に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:10のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号9:に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:12のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:11に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:14のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:13に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:16のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:15に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:18のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:17に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:20のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:19に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:22のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:21に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:24のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:23に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:26のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:25に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:28のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:27に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:30のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:29に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:32のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:31に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:34のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:33に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:36のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:35に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:38のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:37に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:40のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:39に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:42のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:41に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:44のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:43に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。配列番号:67のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:66に示される核酸分子のコード配列と同一であり得る。
【００４５】
これらの分子はまた、遺伝暗号の縮退の結果として、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44又は配列番号:67のポリペプチドをコードする種々の配列を有することができる。そのような核酸分子には以下が含まれ得る（ただしこれらに限定されない）：成熟ポリペプチドのみのためのコード配列；成熟ポリペプチド及び付加コード配列（例えばリーダー配列又は分泌配列をコードする配列、例えばプロ-、プレ-、又はプレプロ-ポリペプチド配列）のためのコード配列、；前述の付加コード配列を含むか、又は含まない成熟ポリペプチドのコード配列であって、更なる付加的な非コード配列を一緒に有する前記コード配列（前記更なる付加的非コード配列は非コード5'及び3'配列を含み、前記は例えば転写されるが、翻訳されない配列であり、転写（終了シグナルを含む）、リボソーム結合及びmRNAの安定性で役割を果たす）。前記核酸分子はまた、付加的なアミノ酸（例えば付加的な機能を提供するもの）をコードする付加的な配列を含むことができる。
本発明の第二及び第三の特徴の核酸分子はまた、本発明の第一の特徴のポリペプチド及びフラグメントのフラグメント又は機能的等価物及びをコードすることができる。そのような核酸分子は、天然に存在する変種、例えば天然に存在する対立遺伝子変種でもよいが、又は前記分子は天然に存在することが知られていない変種であってもよい。前記核酸分子の天然に存在しないそのような変種は変異導入技術（核酸分子、細胞又は生物に応用できる変異導入技術を含む）によって作成することができる。
この点に関する変種では、ヌクレオチド置換、欠失又は挿入によって前述の核酸分子とは異なる変種が存在する。前記置換、欠失又は挿入は1つ以上のヌクレオチドを含むことができる。前記変種は、コード領域又は非コード領域又はその両方で変異を有することができる。コード領域における変異は、保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失又は挿入を生じることができる。
本発明の核酸分子はまた、多様な理由のために、当分野で一般的に知られている方法（クローニング、プロセッシング及び/又は遺伝子生成物（ポリペプチド）の発現の改変を含む）を用いて操作することができる。ランダムな断片化並びに遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのPCRによる再アッセンブリーによるDNAシャッフリングは、前記ヌクレオチド配列の操作に用いることができる技術として含まれる。位置特異的変異導入を用いて、新規な制限部位の挿入、グリコシル化パターンの改変、コドン優先性の変更、スプライス変種の生成、突然変異の導入、云々を実施することができる。
【００４６】
本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする核酸分子を異種配列に連結し、その結果、一体となった核酸分子は融合タンパク質をコードすることができる。そのような結合核酸分子は本発明の第二又は第三の特徴に含まれる。例えば、前記ポリペプチドの活性の阻害物質についてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、そのような結合核酸分子を用いて、市販の抗体によって認識することができる融合タンパク質を発現させることは有用であろう。融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチド配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作することができ、それによって、前記ポリペプチドを異種タンパク質から切断して別個に精製することができる。
本発明の核酸分子はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子と部分的に相補的であり、したがって前記コード核酸分子とハイブリダイズする（ハイブリダイゼーション）アンチセンス分子を含む。当業者には公知のように、そのようなアンチセンス分子（例えばオリゴヌクレオチド）を設計して、本発明のポリペプチドをコードする標的核酸を認識させ、これと特異的に結合させて転写を妨げることができる（例えば以下を参照されたい：J.S. Cohen 1989, Trends in Pharm. Sci. 10:435；Okano 1991, J. Neurochem. 56:560；O'Connor J. Neurochem. 56:560(1991)；Lee et al. Nucleic Acids Res. 6:3073(1979)；Cooney et al. 1998, Science 241:456；Dervan et al. 1991, Science 251:1360）。
本明細書で用いられる、“ハイブリダイゼーション”という用語は、互いに水素結合することによる2つの核酸分子の会合を指す。典型的には、１つの分子が固相に固定され、他方は溶液中で遊離しているであろう。続いて、この2つの分子は、水素結合に適した条件下で互いに接触できるように配置される。この結合に影響を与える因子には以下が含まれる：溶媒のタイプ及び体積；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；攪拌；液相分子の固相との非特異的結合を阻止する薬剤（デンハルト試薬又はBLOTTO）；前記分子の濃度；分子の結合速度を高める化合物の使用（硫酸デキストラン又はポリエチレングリコール）；及びハイブリダイゼーションの後の洗浄条件のストリンジェンシー（上掲書（Sambrook et al.）を参照されたい）。
【００４７】
標的分子と完全に相補的な分子のハイブリダイゼーションの阻害は、当分野で公知のように（例えば上掲書（Sambrook et al.）を参照されたい）ハイブリダイゼーションアッセイを用いて調べることができる。実質的に相同な分子は、文献に教示されているように、種々のストリンジェンシー条件下で完全に相同な分子の標的分子との結合に競合し、これを阻害するであろう（G.M. Wahl and S.L. Berger, 1987, Methods Enzymol. 152:399-407；A.R. Kimmel, 1987, Methods Enzymol. 152:507-511）。
“ストリンジェンシー”とは、異なる分子の結合よりも非常に類似する分子の結合に有利なハイブリダイゼーション反応の条件を指す。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、50%のホルムアミド、5ｘのSSC（150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5ｘのデンハルト溶液、10%硫酸デキストラン及び20μg/mLの変性せん断サケ精子DNAを含む溶液中において42℃で一晩のインキュベーション、続いて0.1ｘのSSC、約65℃でのフィルターの洗浄と規定される。低ストリンジェンシー条件は、35℃でのハイブリダイゼーション反応の実施を含む（上掲書（Sambrook et al.）を参照されたい）。好ましくは、ハイブリダイゼーションに使用される条件は高ストリンジェンシー条件である。
本発明のこの特徴の好ましい実施態様は、INSP168ポリペプチド（例えば配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44又は配列番号:67）をコードする核酸分子とそれらの全長にわたって少なくとも70%同一である核酸分子、及びそのような核酸分子と実質的に相補的な核酸分子である。好ましくは、本発明のこの特徴の核酸分子は、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43又は配列番号:66に示される配列を有する核酸分子、又は前記と相補的な核酸分子とその全長にわたって少なくとも80%同一である領域を含む。これに関しては、前記とその全長にわたって、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%又は99%同一である核酸分子が特に好ましい。この特徴で好ましい実施態様は、INSP168ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドをコードする核酸分子である。
【００４８】
本発明はまた、以下の工程を含む、本発明の核酸分子を検出す方法を提供する：（a）ハイブリダイズする条件下で本発明の核酸プローブを生物学的サンプルと接触させて二重鎖複合体を形成する工程；及び（ｂ）形成されたそのような二重鎖複合体の一切を検出する工程。
本発明にしたがって利用することができるアッセイとの関係でさらに下記で考察するように、上述の核酸分子をRNA、cDNA又はゲノムDNAのためのハイブリダイゼーションプローブとして用いて、INSP168ポリペプチドをコードする完全長cDNA及びゲノムクローンを単離し、さらにこのポリペプチドをコードする遺伝子と高い配列類似性を有する相同遺伝子又はオルソロガス遺伝子のcDNA及びゲノムクローンを単離することができる。
これに関しては、当分野で公知の他の技術の中でとりわけ下記の技術を利用することができ、これらは例示を目的として下記で考察される。DNAの配列決定および解析のための方法は周知であり、当分野で一般的に利用可能である。実際、それらは本明細書で考察する本発明の実施態様の多くを実施するために用いることができる。そのような方法では、DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメント、シークェナーゼ（US Biochemical Corp. Cleveland, OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Chicago, IL）、又はポリメラーゼ及びプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ（例えばGibco/BRL（Gaithersburg, MD）が市販するELONGASE増幅系で見出されるもの）の組合せのような酵素を用いることができる。好ましくは、配列決定プロセスは以下のような機械を用いて自動化することができる：Hamilton Micro Lab2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Thermal Cycler（PTC200; MJ Research, Watertown, MA）並びにABI Catalyst 及び373及び377DNA Sequencers（Perkin Elmer）。
【００４９】
INSP168ポリペプチドの機能と等価な機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子を単離するある方法は、当分野で公知の標準的方法を用いて、天然のプローブ又は人工的に設計したプローブによりゲノムDNA又はcDNAを探索することである（例えば以下を参照されたい：“Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel et al.(eds). Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992）。適切なコード遺伝子（配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43又は配列番号:66）由来の核酸配列に一致するか、又は前記と相補的な、少なくとも15、好ましくは少なくとも30、より好ましくは少なくとも50の連続する塩基を含むプローブが特に有用なプローブである。そのようなプローブは、解析で検出することができる試薬で標識して、前記の同定を促進することができる。有用な試薬には、放射性同位元素、蛍光色素及び検出可能な生成物の形成を触媒することができる酵素が含まれるが、ただしこれらに限定されない。これらのプローブを用いて、当業者は、ゲノムDNAの相補的なコピー、cDNA又はRNAポリヌクレオチド（前記はヒト、哺乳動物又は他の動物由来の問題のタンパク質をコードする）を単離し、関連する配列（例えば前記ファミリー、タイプ及び/又はサブタイプのさらに別のメンバー）について、前記のような供給源をスクリーニングすることができる。
【００５０】
多くの事例で、単離されたcDNAは、ポリペプチドをコードする領域が短く切断されている（通常は5'末端で）という点で不完全であろう。完全長のcDNAを得るために、又は短いcDNAを伸長させるためにいくつかの方法が利用可能である。そのような配列は、部分的なヌクレオチド配列を利用したり、上流の配列（例えばプロモーター及び調節エレメント）を検出するために当分野で知られている種々の方法を用いたりして伸長させることができる。例えば、利用することができるある方法は、cDNA末端迅速増幅法（Rapid Amplification of cDNA: RACE）を基にしている（例えば以下を参照されたい：Frohman et al. 1988,PNAS USA 85:8998-9002）。マラソン（Marathon(商標)）テクノロジー（Clontech Laboratories Inc.）によって実施されるこの技術の最近の改変により、例えばより長いcDNAについての検索が顕著に単純化された。わずかに異なる技術（“制限部位”PCRと称される）はユニバーサルプライマーを用い、既知の遺伝子座に隣接する未知の核酸配列を回収する（G. Sarkar, 1993, PCR Methods Applic. 2:318-322）。逆PCRもまた、公知領域を土台にした分岐プライマーを用いて配列を増幅又は伸長させるために用いることができる（T. Triglia et al. 1988, Nucleic Acids Res. 16:8186）。利用できるまた別の方法は捕捉PCRであり、前記はヒト及び酵母人工染色体DNA中の公知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅を含む（M. Lagerstrom et al. 1991, PCR Methods Applic., 1:111-119）。未知の配列を回収するために利用できるまた別の方法は、Parkerらの方法である（J.D. Parker et al. 1991, Nucleic Acids Res. 19:3055-3060）。さらにまた、PCR、ネステッドプライマー及びプロモーターファインダー（PromoterFinder(商標)）ライブラリーをゲノムDNAウォーキングのために用いてもよい（Clontech, Palo Alto, CA）。この工程ではライブラリーをスクリーニングする必要がなく、イントロン/エキソン接合部の発見に有用である。
完全長cDNAをスクリーニングするときは、より大きなcDNAを含むためにサイズ選別したライブラリーを使用することが好ましい。さらにまた、ランダムプライミングされたライブラリーが、それらは遺伝子の5'領域を含む配列をより多く含むという点で好ましい。ランダムにプライミングされたライブラリーの使用が、オリごd(T)ライブラリーは完全長cDNAをもたらさないという状況のために特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、5'非転写調節領域への配列の伸張のために有用であろう。
【００５１】
本発明のある実施態様では、本発明の核酸分子を染色体上の位置決定のために用いることができる。この技術では、核酸分子は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的とし、これとハイブリダイズすることができる。本発明にしたがって、染色体に対して関連する配列をマッピングすることは、それら配列と遺伝子関連疾患との相関性確認で重要な工程である。いったん配列が染色体上の正確な位置に対してマッピングされたら、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝子地図データと相関させることができる。そのようなデータは、例えば以下で見出される（V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man、ジョーンズホプキンス大学ウェルヒメディカルライブラリーからオンラインで入手できる）。
同じ染色体の領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係は、続いてリンケージ解析により識別される（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）。前記は、ポジショナルクローニング又は他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子について探索を行っている研究者に貴重な情報を提供する。いったん遺伝的リンケージによって特定のゲノム領域に疾患又は症状が大雑把に位置決めされたら、前記領域にマッピングされる任意の配列が更なる調査のための関連遺伝子又は調節遺伝子となる。前記核酸分子はまた、転座、倒置などによる染色体上の位置の相違を正常個体、キャリア個体又は罹患個体間で検出するために用いることができる。
本発明の核酸分子はまた組織内分布を知るために貴重である。そのような技術は、それらをコードするmRNAを検出することによって組織内での前記ポリペプチドの発現パターンの決定を可能にする。これらの技術には、in situハイブリダイゼーション技術及びヌクレオチド増幅技術（例えばPCR）が含まれる。これらの研究から得られる結果は、生物体内での前記ポリペプチドの正常機能の指標を提供する。さらにまた、mRNAの正常な発現パターンと変異遺伝子によってコードされるmRNAの発現パターンとの比較研究は、疾患における変異遺伝子の役割についての貴重な洞察を提供する。そのような不適切な発現は時間的、空間的又は定量的性質を有し得る。
【００５２】
遺伝子サイレンシングアプローチもまた、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の内因性発現をダウンレギュレートするために行うことができる。RNA干渉（RNAi）（S.M. Elbashir et al. 2001, Nature 411:494-498）は、用いることができる配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの一方法である。短いdsRNAオリゴヌクレオチドが、in vitroで合成され、細胞内に導入される。これらdsRNAオリゴヌクレオチドの配列特異的結合は、標的mRNAの分解、標的タンパク質発現の低下又は除去の引き金となる。
上記で評価した遺伝子サイレンシングアプローチの有効性はポリペプチド発現の測定により（例えばウェスタンブロッティングによる）判定することができ、さらにRNAレベルではタックマン（TaqMan）による方法を用いることができる。
本発明のベクターは本発明の核酸分子を含み、前記はクローニングベクター又は発現ベクターであり得る。本発明の宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい（前記は本発明のベクターで形質転換、トランスフェクト又は形質導入されている）。
本発明のポリペプチドは、宿主細胞内に含まれるベクター中で前記ポリペプチドのコード核酸分子の発現によって組換え形態で調製され得る。そのような発現方法は、当業者に周知であり、例えば以下に詳細に記載されている：Sambrook et al.（上掲書）及びFernandez & Hoeffler（1998, eds. “Gene expression systems. Using nature for the art of expression”. Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto）。
一般的には、必要とされる宿主でポリペプチドを調製するために核酸分子の維持、増殖又は発現に適した任意の系を用いることができる。種々の日常的な周知の技術、例えば上掲書（Sambrook et al.）に記載されたようなもののいずれかによって、適切なヌクレオチド配列を発現系に挿入することができる。一般的には、コード遺伝子は、コントロールエレメント（例えばプロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現の場合）及び場合によってオペレーター）の制御下に置かれ、それによって所望のポリペプチドをコードするDNA配列が形質転換宿主細胞内でRNAに転写される。
【００５３】
適切な発現系の例は、例えば染色体系、エピソーム系及びウイルス由来系を含み、例えば以下に由来するベクターが含まれる：細菌性プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス（例えばSV40）、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、擬似狂犬病ウイルス及びレトロウイルス）又は前記の組合せ、例えばプラスミドとバクテリオファージ遺伝エレメント（コスミド及びファージミドを含む）に由来するもの。ヒト人工染色体（HAC）もまた、プラスミド中に含まれ発現され得るDNAよりも大型のDNA断片のデリバリーに用いることができる。
pCR4-TOPO-INSP168、pCR4-TOPO-INSP168-SV1、pEAK12_dINSP168-6HIS、pENTR_INSP168-6HIS 及びpDEST12.2_INSP168-6HISベクターが、本発明にしたがって使用される適切なベクターの好ましい例である。
特に適切な発現系には微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、タバコモザイクウイルス（TMV））又は細菌発現ベクター（例えばTi又はpBR322プラスミド）で形質転換感染させた植物細胞系；又は動物細胞系が含まれる。無細胞翻訳系もまた本発明のポリペプチドの生成に用いることができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸分子の宿主細胞への導入は、多くの標準的な実験室用マニュアル（例えばDavis et al. 1986, Basic Methods in Molecular Biology；及びSambrook et al. 上掲書）に記載されている方法によって実施することができる。特に適切な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、弾道導入又は感染が含まれる（以下を参照されたい：Sambrook et al. 1989（上掲書）；Ausubel et al. 1991（上掲書）；Spector, Goldman & Leinwald, 1998）。真核細胞では、発現系は系の要求に応じて一過性でも（例えばエピソーム系）又は永久性（染色体組込み）であってもよい。
【００５４】
コード核酸分子は、例えば翻訳されたポリペプチドの小胞体腔への又は細胞周囲間隙への又は細胞外環境への分泌のために、制御配列をコードする配列、例えばシグナルペプチド又はリーダー配列を含んでいても、又は含んでなくてもよい。これらのシグナルはポリペプチドにとって内在性であってもよいが、またそれらは異種シグナル配列であってもよい。リーダー配列は細菌宿主によって翻訳後プロセッシングで除去され得る。
制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に対応してポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することが所望され得る。調節配列の例は、化学的又は物理的刺激（調節性化合物の存在を含む）、種々の温度又は代謝条件に応答して遺伝子の発現を増減させる配列である。調節配列は、ベクターの非翻訳領域、例えばエンハンサー、プロモーター並びに5'及び3'非翻訳領域である。これらは宿主細胞タンパク質と相互作用し、転写及び翻訳を遂行することができる。そのような調節配列はそれらの強度及び特異性において変動し得る。利用されるベクター系及び宿主に応じて、多数の適切な転写及び翻訳エレメント（構成性、誘導性プロモーターを含む）を用いることができる。例えば、細菌系でクローニングするときは、誘導性プロモーター（例えばブルースクリプトファージミド（Stratagene, LaJolla, CA）又はpSport(商標)プラスミド（Gibco BRL）の）ハイブリッドlacZプロモーターなどを用いることができる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターを昆虫細胞で用いることができる。植物細胞（例えば熱ショック、RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）又は植物ウイルス（例えばウイルスプロモーター又はリーダー配列）に由来するプロモーター又はエンハンサーをベクターでクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来のプロモーター又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。多数の配列コピーを含む細胞株を作成する必要がある場合は、SV40又はEBVを土台にしたベクターを適切な選別可能マーカーとともに用いることができる。
発現ベクターは、個々の核酸コード配列が適切な調節配列とともにベクター内に配置されるように構築され、調節配列に対するコード配列の配置及び方位は、コード配列が前記調節配列の“制御”下で転写されることができるように、すなわち、前記制御配列でDNA分子と結合するRNAポリメラーゼが前記コード配列を転写することができるように構築される。いくつかの事例では、適切な向きで制御配列に前記配列を結合させることができるように（すなわちリーディングフレームを維持するために）、前記配列を改変する必要があるかもしれない。
【００５５】
上記制御配列及び他の調節配列は、ベクターに挿入する前に核酸コード配列と連結することができる。また別には、前記コード配列は、既に制御配列及び適切な制限部位を含む発現ベクターで直接クローニングすることができる。
組換えポリペプチドの長期的な高収量産生のためには安定な発現が好ましい。例えば、問題のポリペプチドを安定的に発現する細胞株を、ウイルス起源の複製及び/又は内因性発現エレメント及び選別可能マーカー遺伝子を同じ又は別個のベクターに含み得る発現ベクターを用いて形質転換することができる。前記ベクターの導入に続いて、前記細胞を選択培養液に切り替える前に、細胞を1−2日間リッチ培養液で増殖させることができる。選別可能マーカーの目的は選択に対する耐性を付与するためであり、前記マーカーの存在は、導入された配列を発現させることができる細胞の増殖及び回収を可能にする。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンを前記細胞タイプに適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
発現のために宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当分野では公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から入手可能な、以下を含む（ただしこれらに限定されない）多くの哺乳動物細胞株が含まれる：チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa、ベビーハムスター腎（BHK）細胞、サル腎（COS）細胞、C127、3T3、BHK、HEK293、ボウズメラノーマ細胞及びヒト肝細胞癌（例えばHep G2）細胞並びに多数の他の細胞株。
バキュロウイルス系では、バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のための材料がキットの形（“MaxBac”キット）でとりわけインビトロジェン（Invitrogen, San Diego, CA）から市販されている。これらの技術は一般的に当業者には公知であり、以下に完全に記載されている：Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)。この系で使用される特に適切な宿主細胞には、例えばショウジョウバエS2及びスポドプテラSf9細胞のような昆虫細胞が含まれる。
【００５６】
当分野で公知の多くの植物細胞培養および完全な植物遺伝子発現系が存在する。適切な植物細胞遺伝子発現系の例にはUS5,693,506；US5,659,122及びUS5,608,143に記載されたものが含まれる。植物細胞培養での遺伝子発現の更なる例は以下に記載されている：Zenk, 1991, Phytochemistry 30:3861-3863。
特に、プロトプラストを単離し、これを培養して完全な再生植物を得て、それによって移入された遺伝子を含む完全な植物が得られる全ての植物を利用することができる。実際には、サトウキビ、サトウダイコン、綿花、果実及び他の樹木、豆類及び野菜の全ての主要な種を含む（ただしこれらに限定されない）培養細胞又は組織から全ての植物を再生することができる。
特に好ましい細菌宿主細胞の例には連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトミセス属及び枯草菌（Bacillus subtilis）細胞が含まれる。
真菌類での発現のために特に適切な宿主細胞の例には酵母細胞（例えばS.セレビシエ）及びアスペルギルス細胞が含まれる。
形質転換細胞を回収するために用いることができる多数の選別系が当分野で公知である。前記の例には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（M. Wigler et al. 1977, Cell 11:223-32）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（L. Lowy et al. 1980, Cell 22:817-23）遺伝子が含まれ、前記はそれぞれtk-又はaprt+/-細胞を利用することができる。
さらにまた、選別のための基準として例えば以下のように抗代謝薬、抗生物質又は除草剤耐性を用いることができる：メトトレキセート耐性を付与するジヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR）（M. Wigler et al. 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70）；npt、アミノグリコシド系のネオマイシン及びG-418に対する耐性を付与する（F. Colbere-Garapin et al. 1981, J. Mol. Biol. 150:1-14）；及びals又はpat、それぞれクロロスルフロン及びホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する。さらに別の選別可能な遺伝子が文献に記載されてあり、前記の例は当業者には明白であろう。
マーカー遺伝子発現の有無は問題の遺伝子もまた存在することを示唆するが、その存在及び発現は確認する必要がある。例えば、問題とされる配列がマーカー遺伝子配列内に挿入されるならば、前記適切な配列を含む形質転換細胞はマーカー遺伝子機能が存在しないことによって識別することができる。また別には、マーカー遺伝子をただ1つのプロモーターの存在下で本発明のポリペプチドとタンデムに配置することができる。誘導又は選別に応答するマーカー遺伝子の発現は通常、前記タンデム遺伝子の発現も同様に示す。
【００５７】
また別には、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、前記ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に公知の多様な方法によって同定することができる。これらの方法には、DNA-DNA又はDNA-RNAハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ、例えば蛍光活性化細胞分類（FACS）又は免疫アッセイ技術（例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）及び放射性免疫アッセイ（RIA））が含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記方法は、核酸又はタンパク質の検出及び/又は定量のために膜系、溶液系、チップ系技術を含む（以下を参照されたい：R. Hampton et al. 1990, Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN；及びD.E. Maddox et al. 1983, J. Exp. Med. 158:1211-1216）。
多様な標識及び結合技術が当業者には公知であり、種々の核酸アッセイ及びアミノ酸アッセイで用いることができる。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関連する配列の検出のために標識されたハイブリダイゼーションプローブ又はPCRプローブを生成する手段には、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識又は標識ポリヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。また別には、本発明のポリペプチドをコードする配列はmRNAプローブの産生のためにベクターでクローニングしてもよい。そのようなベクターは当分野で公知であり、市販されている。前記は、適切なRNAポリメラーゼ（例えばT7、T3又はSP6）及び標識ヌクレオチドを添加することによって、in vitroでのRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、多様な市販キット（Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI；Prommega, Madison, WI；及びU.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH）を用いて実施することができる。
【００５８】
検出を容易にするために用いることができる適切なレポーター分子又は標識には、放射性核種、酵素並びに蛍光性、化学発光性薬剤又は発色剤が、基質、補助因子、阻害剤、磁性粒子などと同様に含まれる。
本発明の核酸分子もまた、トランスジェニック動物、特にげっ歯類動物の作成に用いることができる。そのようなトランスジェニック動物は本発明の更なる特徴を構成する。前記は、体細胞の改変によって局所的に実施するか、又は生殖系列療法によって実施し遺伝可能な改変を取り込ませることができる。そのようなトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドの調整物質として有効な薬剤分子のための動物モデルの作成で特に有用であり得る。
前記ポリペプチドは、組換え細胞培養から以下を含む周知の方法によって回収及び精製することができる：硫安又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレシチンクロマトグラフィー。高速液体クロマトグラフィーは精製に特に有用である。ポリペプチドが単離及び精製の間に変性したときは、タンパク質をリフォールディングさせるための周知の技術を用いて、活性な構造を再生することができる。
所望にしたがってタンパク質の精製を促進するために特殊化したベクター構築物を用いることもできる。前記は、本発明のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させることによって実施される。そのような精製促進ドメインの例には、金属キレートペプチド（例えば固定金属上での精製を可能にするヒスチジン-トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Aドメイン、及びFLAGS伸長/アフィニティー精製系で利用されるドメイン（Immunex Corp., Seattle, WA）が含まれる。切断可能なリンカー配列（例えばXA因子又はエンテロキナーゼに対して特異的なもの）（Invitrogen, San Diego, CA）を精製ドメインと本発明のポリペプチドとの間に含有させることによって精製を促進してもよい。そのような発現ベクターは、チオレドキシン又はエンテロキナーゼ切断部位に先行するいくつかのヒスチジン残基と融合した本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。前記ヒスチジン残基はIMAC（Porathら（J. Porath et al. 1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281）が記載した固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）による精製を促進し、一方、チオレドキシン又はエンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質から本発明のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターに関する考察は以下に提供されている：D.J. Kroll et al. 1993, DNA Cell Biol. 12:441-453。
【００５９】
前記ポリペプチドをスクリーニングアッセイで使用するために発現させる場合は、一般的には、前記ポリペプチドが発現される宿主細胞の培養液中に前記ポリペプチドが分泌されることが好ましい。この事例では、本発明のポリペプチドは、スクリーニングアッセイで使用する前に採集した培養液から、例えば標準的タンパク質精製技術（例えばゲル排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィー）を用いて精製することができる。タンパク質精製の適切な方法の例は本明細書の実施例で提供される。ポリペプチドが細胞内で産生される場合は、細胞は、ポリペプチドを回収する前に先ず溶解されねばならない。
また別には、本発明のポリペプチドは細胞表面融合タンパク質として発現されることが好ましい。この事例では、宿主細胞をスクリーニングアッセイで使用する前に、例えば蛍光活性化細胞分類（FACS）又はイムノアフィニティー技術を用いて採集することができる。
上記で示したように、本発明はまた、薬剤候補物又は先導物質のスクリーニングのための新規な標的及び方法を提供する。これらのスクリーニング方法には、結合アッセイ及び/又は機能アッセイが含まれ、前記は、in vitroで、細胞系で又は動物で実施することができる。
これに関しては、本発明の具体的な目的は、ロイシンリッチリピーと（LRR）モチーフ含有タンパク質が関与する疾患を治療又は予防する候補薬剤をスクリーニングするための標的としてINSP168ポリペプチドを使用することにある。
本発明のまた別の目的は、生物学的に活性な化合物を選別する方法にあり、前記方法は、候補化合物をINSP168遺伝子又はポリペプチドと接触させ、前記遺伝子又はポリペプチドと結合する化合物を選別することを含む。
本発明のさらに別の目的は、生物学的に活性な化合物を選別する方法にあり、前記方法は、INSP168ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞と候補化合物を接触させ、前記細胞の表面で前記INSP168ポリペプチドと結合する化合物、及び/又はINSP168ポリペプチドの活性を調整する化合物を選別することを含む。
【００６０】
“生物学的に活性な”化合物は、対象者で生物学的な活性、好ましくは治療的活性を有する任意の化合物、より好ましくは、ロイシンリッチリピート（LRR）モチーフ含有タンパク質が関与する疾患を治療するために用いることができる化合物、又はロイシンリッチリピート（LRR）モチーフ含有タンパク質が関与する疾患を治療する薬剤を開発するための先導物質として用いることができる化合物を指す。“生物学的に活性な”化合物は、好ましくはINSP168ポリペプチドの活性を調整する化合物である。
上記の方法は、種々の装置及び条件を用いて（固定した試薬の使用を含む）in vitroで実施することができ、さらにロイシンリッチリピート（LRR）モチーフ含有タンパク質が関与する疾患のモデル（例えば動物モデル）で前記選別した化合物の活性をアッセイする追加工程を含むことができる。
標的遺伝子又はポリペプチドとの結合は、前記化合物が前記標的の活性を調節する能力、したがって対象者で疾患に至る経路に影響を及ぼす能力に関する指標を提供する。結合の決定は、種々の技術、例えば候補化合物の標識、標識した参考リガンドとの競合などによって実施することができる。in vitro結合アッセイのためには、前記ポリペプチドを本質的に純粋な形態で、懸濁状態で、支持体に固定して、又は膜（完全な細胞、膜調製物、リポソームなど）で発現させて用いることができる。
活性の調整には、レセプターの表面発現の刺激及び前記レセプターのマルチマー化の調整（例えば他のサブユニットとのマルチマー複合体の形成）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。アッセイに用いられる細胞は、任意の組換え細胞（すなわちINSP168ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む任意の細胞）でも、内在性INSP168ポリペプチドを発現する任意の細胞でもよい。そのような細胞の例には、原核細胞（例えば細菌）及び真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。具体的な例には、大腸菌、ピキア・パストリス（Pichia pastpris）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula Polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）又はサッカロミセス属の酵母菌、哺乳動物細胞株（例えばVero細胞、CHO細胞、3T3細胞、COS細胞など）が、初代又は樹立哺乳動物細胞培養（例えば線維芽細胞、胚性細胞、上皮細胞、神経系細胞、脂肪細胞など）と同様に含まれる。
【００６１】
好ましい選別化合物は、INSP168のアゴニスト、すなわちINSP168と結合し、その内在性リガンドの活性を模倣することができる化合物である。
本発明のさらに別の目的は、生物学的に活性な化合物を選別する方法にある。前記方法は、本発明のINSP168ポリペプチドとテスト化合物をin vitroで接触させ、前記INSP168ポリペプチドの活性を調整する前記テスト化合物の能力を決定することを含む。
本発明のさらに別の目的は、生物学的に活性な化合物を選別する方法にある。前記方法は、本発明のINSP168遺伝子とテスト化合物をin vitroで接触させ、前記INSP168遺伝子の発現を調整する前記テスト化合物の能力を決定することを含む。
また別の実施態様では、本発明は、活性な化合物をスクリーニングし、選別し、又は同定する方法に関する。前記方法は、INSP168遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むレポーター構築物を含む組換え宿主細胞とテスト化合物を接触させ、前記レポーター遺伝子の発現を調整する（例えば刺激又は低下させる、好ましくは刺激する）テスト化合物を選別することを含む。
本発明のポリペプチドは、多様な薬剤スクリーニング技術のいずれかで化合物ライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。そのような化合物は、本発明の遺伝子の発現レベル、又は本発明のポリペプチドの活性を活性化（作動）し、又は阻害（拮抗）して、更なる本発明の特徴を構成することができる。好ましい化合物は、本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現を変化させるか、本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性を調節するために有効である。
アゴニスト又はアンタゴニスト化合物は、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー又は天然生成物の混合物から単離することができる。これらのアゴニスト又はアンタゴニストは、天然又は改変された基質、リガンド、酵素、レセプター又は構造的若しくは機能的模倣物であり得る。そのようなスクリーニング技術の適切な概覧のためには以下の文献を参照されたい：Coligan et al. Current Protocols in Immunology (1991) 1(2):Chapter 5）。
【００６２】
良好なアンタゴニストである可能性が極めて高い化合物は、その結合に際して本発明のポリペプチドの生物学的作用を誘発することなく、前記ポリペプチドと結合する分子である。潜在的なアンタゴニストには、本発明のポリペプチドと結合し、それによってその活性を阻害又は消滅させる小有機分子、ペプチド、ポリペプチド及び抗体が含まれる。この態様では、正常な細胞結合分子と前記ポリペプチドとの結合が阻害され、その結果前記ポリペプチドの正常な生物学的活性が妨げられる。
そのようなスクリーニング技術で用いられる本発明のポリペプチドは、溶液中で遊離していても、固相に固定されていても、細胞表面に保持されていても、又は細胞内に存在していてもよい。一般的には、そのようなスクリーニング方法は、前記ポリペプチドを発現し、結合又は機能的応答の刺激若しくは阻害を観察するためにテスト化合物と接触させる適切な細胞又は細胞膜の使用を含むことができる。続いてテスト化合物と接触させた細胞の機能的応答を、テスト化合物と接触させなかったコントロール細胞と比較する。そのようなアッセイによって、前記ポリペプチドの活性化によって生じるシグナルを前記テスト化合物がもたらすか否かを適切な検出系を用いて判定することができる。活性化の阻害因子は一般的には公知のアゴニストの存在下でアッセイし、さらにテスト化合物の存在下における前記アゴニストによる活性化に対する影響を観察する。
【００６３】
本明細書に記載するアッセイタイプで検出可能なシグナルを発生させる方法は当業者には公知であろう。具体的な例は、本発明のポリペプチド又はフラグメント（例えばLBD）をGAL4 DNA結合ドメインと融合された状態で発現する構築物を、レポータープラスミド（前記の例はpFR-Luc（Stratagene Europe, Amsterdam, The Netherlands）である）とともに同時トランスフェクトすることである。このプラスミドはGAL4結合部位の5つのタンデムリピートをもつ合成プロモーターを含む（ルシフェラーゼ遺伝子の発現を制御する）。潜在的なリガンドが細胞に添加されると、前記リガンドはGAL4-ポリペプチド融合物と結合し、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘導する。ルミネッセンスリーダーを用いて、ルシフェラーゼ発現レベルをその活性によってモニターすることができる（例えば以下を参照されたい：Lehman et al. 1995, JBC 270:12953；Pawar et al. 2002, JBC 277:39243）。
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト化合物を同定する好ましい方法は以下の工程を含む：
（a）その表面で本発明の第一の特徴のポリペプチドを発現している細胞を、前記ポリペプチドとの結合を可能にする条件下でスクリーニングされるべき化合物と接触させる工程、ここで前記ポリペプチドは、化合物と前記ポリペプチドとの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる第二の成分と結合されてあり；さらに
（b）化合物とポリペプチドとの相互作用から生じたシグナルのレベルを測定することによって、前記化合物が前記ポリペプチドと結合して、これを活性化又は阻害したか否かを決定する工程。
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するさらに好ましい方法は以下の工程を含む：
（a）その表面で前記ポリペプチドを発現している細胞を、前記ポリペプチドとの結合を可能にする条件下でスクリーニングされるべき化合物と接触させる工程、ここで前記ポリペプチドは、化合物と前記ポリペプチドとの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる第二の成分と結合されてあり；さらに
（b）化合物とポリペプチドとの相互作用から生じたシグナルのレベルを、化合物の非存在下でのシグナルレベルと比較することによって、前記化合物が前記ポリペプチドと結合し、これを活性化又は阻害したか否かを決定する工程。
例えば、ペプチドコアクチベーターの存在下で前記ポリペプチドと結合したリガンドのFRET検出のような方法を用いることができる（Norris et al. Science, 1999, 285:744）。
さらに好ましい実施態様では、上記記載の一般的な方法は、さらに前記ポリペプチドのための標識又は未標識リガンドの存在下でアゴニスト又はアンタゴニストの同定を実施する工程をさらに含むことができる。
【００６４】
また別の実施態様では、本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法は以下の工程を含む：候補化合物と前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下で、本発明のポリペプチドをその表面に有する細胞又はそのようなポリペプチドを含む細胞膜とリガンドの結合の阻害を前記候補化合物の存在下で決定する工程、及び前記ポリペプチドと結合したリガンドの量を決定する工程。リガンドの結合を低下させることができる化合物はアゴニスト又はアンタゴニストであると考えられる。好ましくは、リガンドは標識される。
より具体的には、ポリペプチドのアンタゴニスト又はアゴニスト化合物についてスクリーニングする方法は以下の工程を含む：
（a）細胞表面で本発明のポリペプチドを発現している全細胞、又は本発明のポリペプチドを含む細胞膜と標識リガンドをインキュベートする工程；
（b）前記全細胞又は細胞膜と結合した標識リガンドの量を測定する工程；
（c）標識リガンド及び工程（a）の全細胞又は細胞膜の混合物に候補化合物を添加し、前記混合物を平衡化させる工程；
（d）工程（c）の後で、全細胞又は細胞膜と結合した標識リガンドの量を測定する工程；及び
（e）工程（b）及び（d）で結合した標識リガンドの相違を比較する工程、ここで、工程（d）で結合を減少させる化合物をアゴニスト又はアンタゴニストであると考える。
【００６５】
前記ポリペプチドはまた、多様な生理学的及び病理学的プロセスを用量依存態様で調節することが上記に記載したアッセイで見出すことができる。したがって、本発明のポリペプチドの“機能的等価物”には、同じ調整活性のいずれかを上記記載のアッセイにおいて用量依存態様で示すポリペプチドが含まれる。用量依存活性の程度は本発明のポリペプチドのそれと同一である必要はないが、好ましくは、与えられた活性アッセイにおいて、前記“機能的等価物”は本発明のポリペプチドと比較して実質的に類似する用量依存性を示すであろう。
上記に記載したある種の実施態様では、単純な結合アッセイを用いることができる。前記アッセイでは、ポリペプチドを保持している表面へのテスト化合物の付着は、テスト化合物に直接的又は間接的に結合させた標識の手段によって、又は標識競合物との競合を必要とするアッセイで検出される。また別の実施態様では、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。前記アッセイでは、ポリペプチドと結合することができる中和抗体がテスト化合物と結合について特異的に競合する。この態様では、前記ポリペプチドに対して特異的な結合アフィニティーを有するいずれのテスト化合物の存在の検出にも前記抗体を用いることができる。
当業者は、本発明のポリペプチドの調整物質を同定するアッセイを考案することができよう。これに関してLokkerらの論文は興味深い（N.A. Lokker et al. J. Biol. Chem. 1997, Dec, 26, 272(52):33037-44）。前記は、アンタゴニストを同定するアッセイの例（この場合は中和抗体）を報告している。
前記ポリペプチドをコードするmRNAの細胞内での産生に対する添加テスト化合物の影響を検出するためのアッセイもまた設計することができる。例えば、モノクローナル又はポリクローナル抗体を用い当分野で公知の標準的な方法によって、分泌又は細胞結合ポリペプチドレベルを測定するELISAを構築することができ、適切に操作した細胞又は組織の前記ポリペプチド産生を阻害又は強化することができる化合物についての探索のために用いることができる。続いてポリペプチドと被検化合物間での結合複合体の形成を測定することができる。
用いることができる薬剤スクリーニングのためのまた別の技術は、問題のポリペプチドに対して適切な結合アフィニティーを有する化合物の高処理スクリーニングを提供することができる（国際特許出願WO84/03564を参照されたい）。この方法では、大量の小さな種々のテスト化合物を固体の基質上で合成し、続いて前記を本発明のポリペプチドと反応させ洗浄する。ペプチドを固定するある方法は、非中和抗体を用いることである。続いて結合を当分野で周知の方法を用いて検出することができる。上述の薬剤スクリーニング技術で使用するために、精製ポリペプチドはまたプレート上に直接被覆することができる。
【００６６】
本発明の範囲内にまた含まれるアッセイ方法は、過剰発現アッセイ又は除去アッセイで本発明の遺伝子及びポリペプチドの使用を必要とするものである。そのようなアッセイは、細胞内のこれら遺伝子/ポリペプチドレベルの操作及び前記操作された細胞の生理学に対する前記操作の影響の判定を伴う。例えばそのような実験は、個々の遺伝子/ポリペプチドが関与するシグナリング経路及び代謝経路を明らかにし、調査対象ポリペプチドが相互作用するポリペプチドの実態に関する情報をもたらし、さらに関連する遺伝子及びタンパク質を調節する方法に関する手がかりを提供する。
用いることができるまた別の薬剤スクリーニング技術は、問題のポリペプチドに対する適切な結合アフィニティーを有する化合物の高処理スクリーニングを提供する（（国際特許出願WO84/03564を参照されたい）。この方法では、大量の小さな種々のテスト化合物を固体の基質上で合成し、続いて前記を本発明のポリペプチドと反応させ洗浄する。ペプチドを固定する方法は、非中和抗体を用いることである。続いて結合を当分野で周知の方法を用いて検出することができる。上述の薬剤スクリーニング技術で使用するために、精製ポリペプチドはまたプレート上に直接被覆することができる。
本発明のポリペプチドを用い、当分野で公知の標準的なレセプター結合技術、例えばリガンド結合アッセイ及び架橋アッセイを介して膜結合又は可溶性レセプターを同定することができる。前記アッセイでは、ポリペプチドは放射能同位体で標識されるか、化学的に改変されるか、又はその検出若しくは精製を促進するペプチド配列と融合され、さらに仮想的レセプターの供給源（例えば細胞組成物、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、又は体液）とインキュベートされる。結合効率は、生物物理学的技術、例えば表面プラズモン共鳴（A.B. Biacore, Uppsala, Swedenが供給）及び分光解析を用いて測定することができる。結合アッセイはレセプターの精製又はクローニングのために用いることができるが、また、前記ポリペプチドとそのレセプターとの結合と競合するアゴニスト及びアンタゴニストを同定することもできる。スクリーニングアッセイを実施する標準的な方法は当分野では周知である。
【００６７】
また別の実施態様では、本発明は、疾患の治療を目的とするINSP168、INSP168-SV1、INSP149又はINSP169ポリペプチドのアゴニスト又は刺激物質を単離又は生成するために、INSP168、INSP168-SV1、INSP149又はINSP169ポリペプチド又はそのフラグメント（したがって前記フラグメントは好ましくはINSP168、INSP168-SV1、INSP149又はINSP169遺伝子特異的フラグメントである）を使用することに関する。
ここで前記アゴニスト又は刺激物質は以下から成る群から選択される：
１．特異的抗体又はそのフラグメント［a）キメラ抗体、b）ヒト化抗体、又はｃ）完全にヒトの抗体を同様に含む］、
２．二重特異性又は多重特異性抗体、
３．単鎖（例えばscFv）抗体、又は
４．単一ドメイン抗体、又は
５．前記抗体に由来するペプチド-又は非ペプチド-模倣物、又は
６．抗体模倣物、例えばa）アンチカリン又はb）フィブロネクチン系結合分子（例えばトリネクチン又はアドネクチン）。
抗体からペプチド-又は非ペプチド-模倣物を作成することが当分野で公知である（Sarabovi et al. 1991；及びSaragovi et al. 1992）。
アンチカリンもまた当分野で公知である（Vogt et al. 2004）。フィブロネクチン系結合分子はUS6818418及びWO2004029224に記載されている。
さらにまた、テスト化合物は、多様な起源、性質及び組成物であり得る。前記は例えば任意の小分子、核酸、脂質、ペプチド、ポリペプチドであり、前記ポリペプチドには抗体（例えばキメラ抗体、ヒト化抗体又は完全にヒトの抗体又は抗体フラグメントを含む）、それらに由来するペプチド-又は非ペプチド-模倣物と同様に二重特異性若しくは多重特異性抗体、単鎖（例えばscFv）若しくは単一ドメイン抗体又は抗体模倣物（例えばアンチカリン又はフィブロネクチン系結合分子（例えばトリネクチン又はアドネクチン））などが含まれ、前記は単離形又は混合物又はその組合せである。
【００６８】
本発明はまた、上記に記載したアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、レセプター、基質、酵素を同定する方法で有用なスクリーニングキットを含む。
本発明は、上記に記載する方法によって発見された本発明のポリペプチドの活性又は抗原性を調節する、アゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、レセプター、基質及び酵素、並びに他の化合物を含む。
上記で述べたように、本発明の多様な構成部分（すなわち、本発明の第一の特徴のポリペプチド、本発明の第二若しくは第三の特徴の核酸分子、本発明の第四の特徴のベクター、又は本発明の第五の特徴の宿主細胞、又は本発明の第六の特徴のリガンド、又は本発明の第七の特徴の化合物）が、疾患の治療又は診断で有用であり得ることが意図される。疾患の治療又は診断についての本発明の成分の有用性を判定するために、1つ以上の以下のアッセイを実施することができる。以下のアッセイのいくつかはテスト化合物がタンパク質/ペプチドであるとしているが、当業者は、本発明の他の成分もまた“テスト化合物”として用いることができるように以下のアッセイを容易に改変できることに留意されたい。
本発明はまた、本発明のポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物を適切な医薬担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。これらの組成物は、下記で詳しく述べるように、治療薬若しくは診断薬として、ワクチンとして、又は他の免疫原性組成物として適切であり得る。
本明細書で用いられる用語にしたがえば、ポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物［X］を含む組成物は、組成物中のX＋Y（Ｙは不純物）の合計の少なくとも85重量％がXであるときに、不純物［Y］が“実質的に除かれている”。好ましくは、Xは、組成物中のX＋Yの合計の少なくとも約90重量％を構成し、より好ましくは、少なくとも約95重量％、98重量%又は99重量%ですらある。
【００６９】
前記医薬組成物は、好ましくは治療的に有効な量の本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンド又は化合物を含む。本明細書で用いられる、“治療的に有効な量”という用語は、標的の疾患又は症状を治療、軽減若しくは予防するために、又は検出可能な治療的若しくは予防的効果を示すために必要な治療薬剤の量を指す。いずれの化合物についても、先ず初めに治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイ（例えば新形成細胞の細胞培養アッセイ）で、又は動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌ又はブタ）で評価することができる。前記動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与ルートを決定するために用いることができる。続いて、そのような情報を用いて、ヒトでの投与のために有用な用量及びルートを決定する。
ヒト対象者のための厳密な有効用量は、症状の重篤度、対象者の一般的な健康状態、年齢、体重及び性別、食事、投与の時期及び頻度、薬剤の組合せ、反応の鋭敏性、並びに治療に対する耐性/応答に左右される。前記用量は日常的な検査によって決定することができ、臨床医の裁量の範囲内である。一般的には、有効用量は、0.01mg/kgから50mg/kg、好ましくは0.05mg/kgから10mg/kgであろう。組成物は患者に個々に投与してもよいが、また他の物質、薬剤又はホルモンと組み合わせて投与してもよい。
医薬組成物はまた、治療用物質の投与のために医薬的に許容できる担体を含むことができる。そのような担体には抗体及び他のポリペプチド、遺伝子および他の治療用物質（例えばリポソーム）が含まれるが、ただし前記担体はそれ自体、前記組成物を受容する固体に有害な抗体の産生を誘発せず、さらに不適切な毒性を生じることなく投与され得ることを条件とする。適切な担体は大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー及び不活性なウイルス粒子であり得る。
【００７０】
医薬的に許容できる塩、例えば鉱酸塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）；有機酸の塩（例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）をここでは用いることができる。医薬的に許容できる担体についての完全な考察は以下の成書で入手できる：Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co., N.J. 1991）。
治療用組成物中の医薬的に許容できる担体にはさらに液体（例えば水、食塩水、グリセロール及びエタノール）が含まれ得る。さらにまた、補助物質（例えば湿潤剤、乳化剤、pH緩衝物質など）もそのような組成物中に存在することができる。そのような担体は、患者による摂取のために、前記医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー懸濁剤などに処方することを可能にする。
いったん処方されたら、本発明の組成物は患者に直接投与することができる。治療されるべき対象者は動物であり、特に人間が治療され得る。
本発明で利用される医薬組成物は多数の経路によって投与することができる。前記経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、腱鞘内、脳室内、経皮又は皮膚貫通適用（例えばWO98/20734を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸投与が含まれるが、ただしこれらに限定されない。遺伝子銃又はヒポスプレーもまた本発明の医薬組成物の投与に用いることができる。典型的には、治療用組成物は、注射可能剤として（液体溶液又は懸濁物として）；注射前に液体ベヒクル中の溶液又は懸濁液として調製するために適切な固体形として調製され得る。
前記組成物の直接的デリバリーは、一般的には、皮下、腹腔内、静脈内、又は筋肉内に注射することによって達成されるか、又は組織間隙腔にデリバーすることができる。前記組成物はまた病巣に投与することもできる。投薬処置は1回投薬スケジュールでも複数回投薬スケジュールでもよい。
【００７１】
個々の症状において、本発明のポリペプチドの活性が過剰な場合は、いくつかのアプローチが利用可能である。あるアプローチは、対象者に上記に記載した阻害化合物（アンタゴニスト）を、本発明のポリペプチドの機能を抑制するために有効な量で医薬的に許容できる担体と一緒に投与することを含む（前記ポリペプチドの機能の抑制は、例えばリガンド、基質、酵素、レセプターの結合を阻止し、又は第二のシグナルを阻害しそれによって異常な症状を軽減することによって達成される）。好ましくは、そのようなアンタゴニストは抗体である。もっとも好ましくは、そのような抗体は、それらの免疫原性を最小限にするために、上記で考察したようにキメラ化及び/又はヒト化されている。
また別のアプローチでは、問題のリガンド、基質、酵素、レセプターに対する結合アフィニティーを保持するポリペプチドの可溶形を投与することができる。典型的には、前記ポリペプチドは問題の部分を保有するフラグメントの形態で投与することができる。
さらに別のアプローチでは、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、発現ブロッキング技術を用いて（例えば上記に記載したようなアンチセンス核酸分子の使用（内部で生成させるか、又は別個に投与される））抑制することができる。遺伝子発現の改変は、ポリペプチドをコードする遺伝子の制御5'領域、調節領域（シグナル配列、プロモーター、エンハンサー及びイントロン）の相補性配列又はアンチセンス分子（DNA、RNA又はPNA）を設計することによって達成することができる。同様に、抑制は“トリプルヘリックス”ベースペアリング法を用いて達成することができる。トリプルヘリックスペアリングは、ポリメラーゼ、転写因子又は調節分子の結合のために十分に開き得るというダブルヘリックスの能力の阻害を惹起するので有用である。トリプレックスDNAを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（J.E. Gee et al. 1994, In: B.E. Huber and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY）。相補性配列又はアンチセンス分子はまた、転写物のリボソームへの結合を妨げることによってmRNAの翻訳を阻止するように設計することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは投与するか、又はin vivo発現によりin situで生成させてもよい。
【００７２】
さらにまた、本発明のポリペプチドの発現は、そのコードmRNA配列に特異的なリボザイムを用いることによって妨げることができる。リボザイムは触媒活性を有するRNAであり、天然又は合成であり得る（例えば以下を参照されたい：N. Usman et al. Curr. Opin. Struc. Biol. 1996, 6(4):527-33）。合成リボザイムは、mRNAを選択した位置で特異的切断し、それによってmRNAの機能的ポリペプチドへの翻訳を防げることができるように設計することができる。リボザイムは、通常RNA分子で見出されるように、天然のリン酸リボース骨格及び天然の塩基を用いて合成することができる。また別には、リボザイムは、非天然骨格（例えば2'-O-メチルRNA）を用いて合成しリボヌクレアーゼによる分解から保護することができ、さらに改変塩基を含むことができる。
RNA分子を改変して、細胞内安定性及び半減期を高めることができる。可能な改変には、前記分子の5'及び/又は3'末端におけるフランキング配列の付加、又は前記分子の骨格内でのホスホジエステル結合以外のホスホロチオエート又は2'-O-メチルの使用が含まれるが、ただしこれらに限定されない。この概念はPNAの作成で固有であり、非慣用的塩基（例えばイノシン、ケオシン及びブトシン）と同様に、アセチル-、メチル-、チオ-並びにアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様な改変型（内在性エンドヌクレアーゼはこれらを容易に認識しない）を含有させることによって、これらの分子の全てに広く適用することができる。
本発明のポリペプチド及びその活性の過小発現に関連する異常状態を治療するために、いくつかのアプローチがまた利用可能である。あるアプローチは、対象者に前記ポリペプチドを活性化する化合物（すなわち上記に記載したアゴニスト）の治療的に有効な量を投与し、前記異常な症状を軽減することを含む。また別には、前記ポリペプチドの治療量を適切な医薬担体と一緒に投与して、ポリペプチドの問題の生理学的バランスを回復させることができる。
【００７３】
遺伝子療法を用い、対象者で対応する細胞による前記ポリペプチドの内在性産生を達成することができる。遺伝子療法は、修正した治療用遺伝子で欠損遺伝子を置換することによって前記ポリペプチドの不適切な産生を永久的に治療するために用いられる。
本発明の遺伝子療法はin vivo又はex vivoで実施することができる。ex vivo遺伝子療法は、患者細胞の単離及び精製、治療遺伝子の導入、及び遺伝的に変化させた細胞を前記患者に戻すことを必要とする。対照的に、in vivo遺伝子療法は患者の細胞の単離及び精製を必要としない。
前記治療用遺伝子は患者への投与のために典型的には“パッケージングされている”。
遺伝子デリバリーベヒクルは、非ウイルス性（例えばリポソーム）、又は複製欠損ウイルス（例えばK.L. Berkner（Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1992, 158:30-66）記載のアデノウイルス、又はN. Muzyczka（Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1992, 158:97-129；及び米国特許5,252,479号）記載のアデノ関連ウイルス（AAV））であり得る。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、複製欠損レトロウイルスベクターで発現について操作することができる。続いてこの発現構築物を単離し、さらに、前記ポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージング細胞に導入することができる。その結果、前記パッケージング細胞は問題の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生することができる。in vivoで細胞を操作し、さらにin vivoで前記ポリペプチドを、発現するために、これらのプロデューサー細胞を対象者に投与することができる（以下の成書の20章を参照されたい：Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches in Human Molecular Genetics (1996), T. Strachan and A.P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd.（及びその中に引用された参考文献））。
また別のアプローチは“裸のDNA”の投与であり、前記アプローチでは治療用遺伝子は血流又は筋肉組織に直接注射される。
【００７４】
本発明のポリペプチド又は核酸が疾患惹起因子である状況では、本発明は、前記ポリペプチド又は核酸をワクチンとして用いて前記疾患惹起因子に対する抗体の生成を提供する。
本発明のワクチンは、予防的（すなわち感染を防ぐ）又は治療的（すなわち感染後の疾患を治療する）であり得る。そのようなワクチンは免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質又は核酸を含み、前記は通常は上記に記載したように医薬的に許容できる担体と組み合わされている。前記担体には、前記組成物を受容する個体において有害な抗体をそれ自体誘発しない任意の担体が含まれる。さらにまた、これらの担体は免疫刺激物質（“アジュバント”）として機能することができる。さらにまた、前記抗原又は免疫原は、細菌の類毒素（例えばジフテリア、破傷風、コレラ、H.ピロリ及び他の病原体由来の類毒素）と結合させることができる。
ポリペプチドは胃で分解され得るので、ポリペプチドを含むワクチンは好ましくは非経口的に（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、又は皮内注射）投与される。非経口投与に適した処方物には、水性及び非水性無菌的注射溶液（抗酸化剤、緩衝物質、制菌剤、及び処方物をレシピエントの血液と等張にさせる溶質を含むことができる）、及び水性及び非水性無菌的懸濁物（懸濁剤又は膨張剤を含むことができる）が含まれる。
本発明のワクチン処方物はユニットドース又はマルチドース容器で提供することができる。例えば、封入アンプル及びバイアルは、使用直前に無菌的液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。投与量は、ワクチンの具体的な活性に左右され、日常的な実験によって容易に決定することができる。
本発明のポリペプチドと結合する抗体の遺伝的デリバリーはまた、例えば国際特許出願WO98/55607に記載されているように実施することができる。
ジェットインジェクション（例えば以下を参照されたい：www.powderject.com）と称される技術もまたワクチン組成物の処方で有用である。
ワクチン接種及びワクチンデリバリー系のために多数の適切な方法が国際特許出願WO00/29428に記載されている。
【００７５】
本発明はまた、診断試薬としての本発明の核酸分子の使用に関する。本発明の核酸分子の特徴を有する遺伝子の変異型（前記は機能不全を伴う）の検出は、疾患の診断又は疾患に対する感受性（前記遺伝子の過少発現、過剰発現又は空間的若しくは時間的発現の変異により生じる）の診断に付け加えることができるか、又は前記を限定することができる診断的ツールを提供する。前記遺伝子に変異を有する個体は、多様な技術によってDNAレベルで検出することができる。
診断用核酸分子は、対象者の細胞（例えば血液、尿、唾液、組織生検又は剖検材料）から入手できる。ゲノムDNAは直接検出に用いてもよいが、又は、解析の前にPCR、リガーゼ連鎖反応（LCR）、鎖の置換増幅（SDA）又は他の増幅技術によって酵素的に増幅してもよい（以下を参照されたい：Saiki et al. Nature 1986, 324:163-166；Bej et al. Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 1991, 26:301-334；Birkenmeyer et al. J. Virol. Meth. 1991, 35:117-126；J. Van Brunt Bio/Technology 1990, 8:291-294）。
ある実施態様では、本発明のこの特徴は患者で疾患を診断する方法を提供し、前記方法は、本発明のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現レベルを判定し、さらに前記発現レベルをコントロールレベルと比較することを含み、前記コントロールレベルと相違するレベルが疾患の指標となる。前記方法は、
（a）患者の組織サンプルと核酸プローブとを、本発明の核酸分子と前記プローブとの間でのハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で接触させる工程；
（b）コントロールサンプルを前記プローブと工程（a）で用いた条件と同じ条件下で接触させる工程；及び
（c）前記サンプルにおいてハイブリッド複合体の存在を検出する工程、
を含み、コントロールサンプル中のハイブリッド複合体レベルと異なる患者サンプル中のハイブリッド複合体レベルの検出が疾患の指標となる。
本発明の更なる特徴は以下の工程を含む診断方法を含む：
（a）疾患について検査される患者から組織サンプルを入手する工程；
（b）前記組織サンプルから本発明の核酸分子を単離する工程；
（c）疾患と関連した核酸分子の変異の存在を検出することにより、疾患について患者を診断する工程。
【００７６】
上記の方法で核酸分子の検出を促進するために、例えばPCRを用いる増幅工程を含むことができる。
本発明の更なる特徴は以下の工程を含む診断方法を含む：
（a）疾患について検査される患者から組織サンプルを入手する工程；
（b）前記組織サンプルから本発明の核酸分子を単離する工程； 
（c）疾患と関連した核酸分子の変異の存在を検出することにより、疾患について患者を診断する工程。
上記の方法で核酸分子の検出を促進するために、例えばPCRを用いる増幅工程を含むことができる。
欠失及び挿入は、正常な遺伝子型と比較して増幅生成物のサイズの変化によって検出することができる。点変異は、本発明の標識RNA或いは本発明の標識アンチセンスDNA配列に対して増幅DNAをハイブリダイズさせることによって識別することができる。完全にマッチした配列は、RNase消化によるか又は融解温度における相違を判定することによってミスマッチ二重鎖と区別することができる。患者における変異の有無は、ストリンジェントな条件下でDNAとハイブリダイズしてハイブリッド二本鎖分子を形成する核酸プローブとDNAを接触させることによって検出することができる。前記ハイブリッド二本鎖分子は、疾患に関連する変異に対応する任意の部分において核酸プローブがハイブリダイズしない部分を有しており、前記プローブがハイブリダイズしない部分の有無が、DNA鎖の対応する部分における疾患関連変異の有無の指標として検出される。
このような診断は出生前および出生後検査として特に有用である。
リファレンス遺伝子と“変異体”遺伝子との間の点変異及び他の配列の相違は他の周知の技術、例えば直接的DNA配列決定又は一本鎖コンフォメーション多形性によって特定することができる（以下を参照されたい：Orita et al. Genomics 1989, 5:874-879）。例えば、改変PCRによって生成された二本鎖PCR生成物又は一本鎖鋳型分子とともに配列決定プライマーを用いることができる。前記配列決定は、放射能標識ヌクレオチドを用いる通常の工程によって、又は蛍光タグを用いる自動配列決定工程によって実施される。クローン化DNAセグメントもまたプローブとして用いて、特定のDNAセグメントを検出することができる。この方法の感度は、PCRと併用されたときに極めて強化される。さらに、点変異及び他の配列変種（例えば多形性）は、上記のように、例えばただ1つのヌクレオチドが異なる配列のPCR増幅のために対立遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを用いることにより検出することができる。
【００７７】
DNAの配列相違はまた、変性剤含有又は非含有ゲルにおけるDNAフラグメントの電気泳動移動度の変化によって、又は直接DNA配列決定によって検出することができる（例えば、Meyers et al. Science 1985, 230:1242）。特定の位置における配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えばRNase）及びS1保護又は化学的切断方法によって示すことができる（Cotton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 85:4397-4401）。
通常のゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、ミクロ欠失、異数体、転座、倒置のような変異はまたin situ解析によっても検出することができる（例えば以下を参照されたい：Keller et al. DNA Probes, 2nd Ed. (1993) Stockton Press, New York, N.Y. USA）。すなわち、細胞内のDNA又はRNA配列は、それらを単離及び/又は膜上に固定する必要なしに変異について解析することができる。フルオレッセンスin situハイブリダイゼーション（FISH）は現在のところもっとも一般的に用いられる方法であり、FISHに関しては多数の概説が存在する（例えば以下を参照されたい：Trachuck et al. Science 1990, 250:559-562：Trask et al. Trends. Genet. 1991, 7:149-154）。
本発明の別の実施態様では、本発明の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築し、遺伝的変種、変異及び多形性の効率的なスクリーニングを実施することができる。アレイテクノロジーの方法は周知であり、普遍的な応用性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖及び遺伝的変動性を含む分子遺伝学における多様な疑問に答えるために用いることができる（例えば以下を参照されたい：M. Chee et al. Science 1966, 274:610-613）。
【００７８】
ある実施態様では、前記アレイは、文献（PCT出願WO95/11995（Chee et al.）；D.J. Lockhart et al. 1996, Nat. Biotech. 14:1675-1680；M. Schena 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619）に記載された方法にしたがって調製され、使用された。オリゴヌクレオチド対は2つから100万を超える範囲であり得る。オリゴマーは、光誘導化学反応を用いて基質上の指定の領域で合成される。前記基質は紙、ナイロン若しくは他のタイプのメンブレン、フィルター、チップ、ガラススライド又は任意の他の適切な固相であろう。別の特徴では、オリゴヌクレオチドは、化学的結合方法及びインクジェット適用装置をPCT出願WO95/25116（Baldeschweiler et al）に記載されたように用いて、基質の表面で合成することができる。別の特徴では、真空系、熱、UV、機械的又は化学的結合方法によって、ドット（又はスロット）ブロットに類似する“グリッド形成（gridded）”アレイを用い、基質の表面にcDNA断片又はオリゴヌクレオチドを配列し、結合させることができる。アレイ（例えば上記に記載のもの）は手動で作成するか、又は利用可能な装置（スロットブロット又はドットブロット装置）、材料（任意の適切な固相）及び機械（自動装置を含む）を用いて製作することができ、8、24、96、384、1536又は6144のオリゴヌクレオチド、又は2から100万を超える他の任意の数（前記100万を超える数は市販の装置の効率的な使用に役立つ）のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
上記に考察した方法に加えて、対象者に由来するサンプルから異常に低下又は増加したレベルのポリペプチド又はmRNAを測定することを含む方法によって疾患を診断することができる。発現の低下又は増加は、ポリヌクレオチドの定量について当分野で周知の方法のいずれか（例えば核酸増幅、例えばPCR、RT-PCR、RNase保護、ノザンブロッティング及び他のハイブリダイゼーション方法）を用いて、RNAレベルで測定することができる。
【００７９】
宿主由来のサンプルで本発明のポリペプチドレベルを決定するために用いることができるアッセイ技術は当業者には周知であり、ある程度詳細に上記で考察されている（放射能免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット解析及びELISAアッセイを含む）。本発明のこの特徴は以下の工程を含む診断方法を提供する：（a）上記に記載のリガンドを生物学的サンプルと、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で接触させる工程；及び（b）前記複合体を検出する工程。
ポリペプチドレベルを測定するためのプロトコル、例えばELISA、RIA及びFACSはさらにまた、変化した又は異常なポリペプチド発現レベルの診断の根拠を提供する。ポリペプチド発現の正常又は標準値は、正常な哺乳動物対象、好ましくはヒトから採取した体液又は細胞抽出物を、前記ポリペプチドに対する抗体と複合体形成に適した条件下で一緒にすることによって確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法（例えば光測定手段）によって定量することができる。
本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を、前記ポリペプチドの発現を特徴とする症状又は疾患の診断に用いるか、又は本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンド及び他の化合物で処置される患者をモニターするアッセイで用いることができる。治療薬について上記で述べた態様と同じ態様で診断のために有用な抗体を調製することができる。前記ポリペプチドのための診断アッセイには、前記抗体及びヒトの体液又は細胞若しくは組織の抽出物中で前記ポリペプチドを検出するための標識を利用する方法が含まれる。前記抗体は改変して又は改変せずに用いることができる。さらに前記抗体は、共有結合又は非共有結合によりそれらをレポーター分子と結合させることによって標識することができる。当分野で公知の極めて多様なレポーター分子を使用することができ、それらのいくつかは上記に記載されている。
【００８０】
対象者、生検組織由来のコントロールサンプル及び疾患サンプルで発現されるポリペプチドの量を標準値と比較する。標準値及び対象の値との間の偏差によって疾患を診断するためのパラメータが確立される。診断アッセイは、ポリペプチド発現の有る、無し、及び過剰を識別し、さらに、治療的介入時のポリペプチドレベルの調節をモニターするために用いることができる。そのようなアッセイはまた、具体的な治療計画の有効性を判定するために動物実験、臨床試験又は個々の患者の治療のモニターで用いることができる。
本発明の診断キットは以下を含むことができる：
（a）本発明の核酸分子；
（b）本発明のポリペプチド；
（c）本発明のリガンド。
本発明のある特徴では、診断キットは以下を含むことができる：ストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含む第一の容器；前記核酸分子を増幅させるために有用なプライマーを含む第二の容器；及び疾患の診断を容易にするために前記プローブ及びプライマーを使用するための指示書。前記キットはさらにハイブリダイズしないRNAを消化するための試薬を保持する第三の容器を含むことができる。
本発明のまた別の特徴では、診断キットは核酸分子のアレイを含むことができ、前記分子の少なくとも1つは本発明の核酸分子である。
本発明のポリペプチドを検出するために、診断キットは、本発明のポリペプチドと結合する1つ以上の抗体；及び前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬を含むことができる。
【００８１】
そのようなキットは、疾患、特にロイシンリッチリピートモチーフ含有タンパク質が関与する疾患又は前記疾患に対する感受性の診断で有用であろう。そのような疾患には以下が含まれ（ただしこれらに限定されない）：網膜、網膜色素上皮（RPE）及び脈絡膜の疾患；眼球の新生血管形成、眼球の炎症及び網膜の変性；糖尿病性網膜症、慢性緑内障、網膜はく離、鎌状赤血球網膜症、老人性黄斑変性、網膜新生血管形成、網膜下新生血管形成；ルベオーシス虹彩炎炎症疾患、慢性後部ブドウ膜炎及び汎ブドウ膜炎、新形成、網膜芽細胞腫、偽神経膠腫、血管新生緑内障；硝子体水晶体同時切除後に生じる新生血管形成、以下の血管性障害（網膜虚血、脈絡膜血管不全、脈絡膜血栓症、視神経の新生血管形成、糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑水腫、色素性網膜炎、網膜静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症、色素線条、網膜動脈閉塞）、眼又は眼球損傷の穿通による新生血管形成、ニューロパシー；リーバー氏、特発性、薬剤誘発性、視神経性、及び虚血性ニューロパシー；脊髄損傷、対麻痺、神経変性疾患、中枢神経系の異常、末梢神経系の異常、脳損傷、脳血管系疾患、パーキンソン病、皮質基底変性、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症、外傷性脳損傷、発作、発作後脳損傷、外傷後脳損傷、脳小血管疾患、痴呆、アルツハイマー病、血管性痴呆、レーヴィー小体を伴う痴呆、前側頭痴呆、パーキンソン症候群、前側頭痴呆、ピック病、進行性核麻痺、皮質基底変性、ハンチントン病、視床変性、クロイツフェルト-ヤコブ痴呆、HIV痴呆、痴呆を伴う精神分裂病、コルサコフ精神病、発作及び外傷。
本発明の種々の特徴及び実施態様を、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及び INSP169に具体的に言及しながらこれから実施例によってより詳細に述べる。
細部の改変は本発明の範囲から逸脱することなく実施され得ることは理解されよう。
【００８２】
表１
2008519593.tif 000003
【００８３】
表２
2008519593.tif 000004
【実施例】
【００８４】
実施例１：INSP168及びINSP168-SV1のクローニング
ヒトcDNA鋳型の調製：種々の健常人組織の全RNAサンプル（Clontech, Stratagene, Ambion, Biochain Institute及び本研究所内の調製物）から、スーパースクリプト（Superscript）II RNaseH逆転写酵素（Invitrogen）を用い第一鎖のcDNAを業者のプロトコルにしたがって調製した。オリゴ(dT)15プライマー（500μg/mLで1μL）（Promega）；2μgのヒト全RNA；1μLの10mMのdNTPミックス（各々10mMのdATP、dGTP、dCTP及びdTTP；中性pH）；及び滅菌蒸留水で最終体積12μLとしたものを、1.5mLのエッペンドルフ管で混合し、65℃で5分加熱し、続いて氷上で冷却した。簡単に遠心して内容物を集め、4μLの5ｘ第一鎖緩衝液、2μLの0.1MのDTT、及び1μLのRNaseOUTリコンビナントリボヌクレアーゼ阻害剤（40ユニット/μL、Invitrogen）を添加した。前記管の内容物を穏やかに混合し、42℃で2分間インキュベートし；続いて1μL（200ユニット）のスーパースクリプトII酵素を添加し、ピペット操作により穏やかに混合した。前記混合物を42℃で50分インキュベートし、続いて70℃で15分加熱して不活化した。cDNAと相補的なRNAを除去するために、1μL（2ユニット）の大腸菌RNaseH（Invitrogen）を添加し、反応混合物を37℃で20分インキュベートした。最終的な21μLの反応混合物に179μLの無菌的蒸留水を添加して希釈し、総体積200μLを得た。INSP168の増幅のために用いるcDNA鋳型は脳及び眼のRNAから得られた。
cDNAライブラリー：ヒトcDNAライブラリー（バクテリオファージラムダ（λ）ベクター中のライブラリー）を業者（Stratagene又はClontech）から購入するか、又はλZAP又はλGT10ベクター中で業者（Stratagene）のプロトコルにしたがって研究所内（Serono Pharmaceutical Research Insitute）で調製した。バクテリオファージλDNAは、感染させた大腸菌宿主株の小規模培養から、ウィザードラムダプレップ（Wizard Lambda Preps）DNA精製システムを用い業者（Promega, Corporation, Madison WI.）の指示にしたがって調製した。INSP168の増幅に用いられるcDNAライブラリー鋳型は、脳、胎児脳、網膜、及び脳-肺-精巣混合ライブラリーから得られた。
PCRのための遺伝子特異的クローニングプライマー：18から25塩基の長さを有するPCRプライマー対を、プライマーデザイナーソフトウェア（Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA）を用いて、バーチャルcDNAの予想されるコード配列を増幅させるために設計した。PCRプライマーは、55+10℃に近いTm及び40-60%のGC含量を持つように最適化させた。標的配列（INSP168）に対して高い選択性を有し固有のプライミングはほとんど又は全くもたないプライマーを選別した。
【００８５】
ヒトcDNA鋳型からINSP168のPCR増幅
予想されるINSP168cdsの全体をカバーする614bpのcDNAフラグメントを増幅するために、遺伝子特異的クローニングプライマー（INSP168-CP1及びINSP168-CP2、図2、図3及び表3）を設計した。前記プライマーをヒトcDNAサンプル及びPCR鋳型として上記に挙げたcDNAライブラリーとともに用いた。PCRは以下を含む50μLの最終体積で実施した：1ｘのプラチナム（Platinum(商標)）Taqハイフィデリティー（High Fidelity, HiFi）緩衝液；2mMのMgSO4；200μMのdNTP；0.2μMの各クローニングプライマー；1ユニットのプラチナムTaq DNAポリメラーゼハイフィデリティー（HiFi）（Invitrogen）；及び約20ngの鋳型cDNA。サイクリングは、以下のようにプログラムしたMJリサーチDNAエンジンを用いて実施した：94℃、2分；94℃で30秒、57℃で30秒、及び68℃で1分の40サイクル；続いて68℃で7分の1サイクル；及び4℃の維持サイクル。
各増幅生成物の30μLを1ｘのTAE緩衝液（Invitrogen）中の0.8%アガロースゲルで可視化した。ほぼ予想された分子量の生成物が、脳及び眼のcDNA鋳型から増幅したPCR生成物で観察された。これらの生成物を、プロメガ・ウィザード（Promega Wizard(商標)）PCR Preps DNA精製システムを用いてゲルから精製し、50μLの水に溶出させ直接サブクローニングを実施した。
PCR生成物のサブクローニング：前記PCR生成物を、インビトロゲン（Invitrogen）社から購入したTAクローニングキットを用い前記業者が特定する条件下で、トポイソメラーゼI改変クローニングベクター（pCR4-TOPO）でサブクローニングした。簡単に記せば、4μLのゲル精製PCR生成物を1μLのTOPOベクター及び1μLの塩溶液と室温で15分インキュベートした。続いて、前記反応混合物で大腸菌TOP10（Invitrogen）を以下のように形質転換しタ：50μLアリコットのワンショットTOP10細胞を氷上で融解し、2μLのTOPO反応物を添加した。前記混合物を15分氷上でインキュベートし、続いて42℃で正確に30秒インキュベートして熱ショックを与えた。サンプルを氷に戻し、250μLの温SOC培養液（室温）を添加した。サンプルを37℃で1時間、振盪（220rpm）しながらインキュベートした。続いて、アンピシリン（100μg/mL）を含むL-ブロス（LB）平板に前記形質転換混合物を加え、37℃で一晩インキュベートした。
コロニーPCR：滅菌楊枝を用いて50μLの滅菌水にコロニーを接種した。続いて、MJリサーチDNAエンジンを用い、以下を含む20μLの総反応体積で接種物の10μLアリコットをPCRに付した：1ｘのAmpliTaq TM緩衝液；200μMのdNTP；20pmoleのT7プライマー；20pmoleのT3プライマー；1ユニットのAmpliTqa TM（Applied Biosystems）。サイクリング条件は以下のとおりであった：94℃、2分；94℃で30秒、48℃で30秒、及び72℃で1分の30サイクル。サンプルは、更なる解析の前に４℃で維持した（維持サイクル）。
【００８６】
PCR反応生成物は、1ｘのTAE緩衝液中の1%アガロースゲルで解析した。ほぼ予想された分子量（マルチクローニング部位（MCS）のために614bp又は267bp＋105bp）のPCR生成物を生じたコロニーを、アンピシリン（100μg/mL）を含む5mLのL-ブロス（LB）中で、220rpmで振盪しながら37℃で一晩増殖させた。
プラスミドDNA調製及び配列決定：前記5mL培養からバイオロボット8000自動システム（Qiagen）又はウィザードプラスSVミニプレップキット（Promega cat. No. 1460）を用い、業者の指示にしたがってミニプレッププラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAを80μLの滅菌水に溶出した。スペクトラマックス190分光光度計（Molecular Devices）を用いて前記DNA濃度を測定した。ビッグダイ（BigDye）ターミネーターシステム（Applied Biosystems Cat. No. 4390246）を用い業者の指示にしたがって、プラスミドDNA（200−500ng）をT7及びT3プライマーによるDNA配列決定に付した。前記プライマー配列は表3に示されている。配列決定反応物は、ダイ-エキス（Dye-Ex）カラム（Qiagen）又はモンタージュ（Montage）SEQ96クリーンアッププレート（Millipore cat. No. LSKS09624）を用いて精製し、続いてアプライドバイオシステム3700シーケンサーで解析した。
配列解析によって、想定INSP168配列とマッチするクローンが同定された（前記は脳cDNAから増幅された）。クローニングされたPCR生成物のプラスミドマップはpCR4-TOPO-INSP168である。PCR生成物INSP168の翻訳を含むヌクレオチド配列は図2に示されている。
配列の3'末端に面して77bpの挿入物を含むINSP168cdsを含む第二のクローンが同定された（前記もまた脳から増幅された）。これは、32アミノ酸の挿入物及びフレームシフトをもたらし、前記フレームシフトによって229アミノ酸のORFが生じた。前記挿入物は新たなエキソンを表し、前記は4つのエキソンにおいてコードされるORFを生じる。停止コドンは同定されなかったが、ゲノムDNA中の新規な配列の3'末端から2bp下流に存在するものが機能を有すると思われた。PCR生成物INSP168-SV1の翻訳を含むヌクレオチド配列は図3に示されている。INSP168-SV1cdsのゲノム編成は図4に示されている。クローニングされたPCR生成物のプラスミドマップはpCR4-TOPO-INSP168-SV1である。INSP168-CP1増幅プライマーの位置は、cdsの最後の塩基が失われていることを意味し、この塩基はゲートウェーエントリーベクターpDONR221に移されている間に付加された（下記参照）。
【００８７】
【表３】
2008519593.tif 000005
【００８８】
実施例２：INSP168のための哺乳動物細胞発現ベクターの構築
pCR4-TOPO-INSP168をPCR鋳型として用いて、6HISタグをコードする3'配列を有するINSP168 ORF配列を含むpEAK12dおよびpDEST12.2発現クローンを、ゲートウェー（Gateway(商標)）クローニング法（Invitrogen）を用いて作製した。
インフレームで6HISタグ配列に融合させたGateway適合INSP168 ORFの作成：Gatewayクローニング方法の第一段階は、5'末端側がattB1組換え部位およびコザック配列によりフランキングされ、3'末端側がインフレーム6ヒスチジン（6HIS）タグをコードする配列、停止コドン及びattB2組換え部位にフランキングされたINSP168のORFを作成する二工程PCR反応を必要とする（Gateway適合cDNA）。最初のPCR反応（50μLの最終体積）はそれぞれ以下を含む：１μL（40ng）のプラスミドpCR4-TOPO-INSP168、1.5μL dNTPs(10mM)、10μLの10x Pfxポリメラーゼ緩衝液、１μL MgSO4(50mM)、各々0. 5μLの遺伝子特異的プライマー（100μM）(INSP168-EX1およびINSP168-EX2)、及び0.5μL Platinum Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）。PCR反応は以下のように実施した：95℃で２分の初期変性工程、続いて、94℃で15秒、55℃で30秒、68℃で2分の12サイクル、及び4℃の保持サイクル。増幅生成物を業者の指示に従ってWizard PCR Preps DNA Purification System（Promega）を用いて直接精製し、50μLの滅菌水に回収した。
第2のPCR反応（最終体積50μL）には、10μLの精製PCR1生成物、1.5μL dNTPs（10mM）、５μLの10x Pfxポリメラーゼ緩衝液、１μL MgSO4(50mM)、各々0.5μLのGateway変換プライマー（100μM）（GCPフォワードおよびGCPリバース）及び0.5μLのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼを含んでいた。この第2のPCR反応の条件は以下の通りであった：95℃で１分；94℃で15秒、50℃で30秒、68℃で２分の４サイクル；94℃で15秒、55℃で30秒、68℃で２分の25サイクル；続いて４℃の保持サイクル。PCR生成物を１x TAE緩衝液（Invitrogen）中の0.8％アガロースゲルで可視化し、予想した分子量（661bp）で泳動したバンドをWizard PCR Preps DNA精製システム（Promega）を用い業者の指示にしたがってゲルから精製し、50μLの滅菌水に回収した。
【００８９】
Gateway適合INSP168 ORFのGatewayエントリーベクターpDONR221並びに発現ベクターpEAK12d及びpDEST12.2でのサブクローニング：Gatewayクローニング方法の第２段階は、以下のようなGateway改変PCR生成物のGatewayエントリーベクターpDONR221（Invitrogen）でのサブクローニングを必要とする：のPCR2で得られた精製物の５μLを1.5μL pDONR221ベクター（0.1μg/μL）、２μLのBP緩衝液及び1.5μLのBPクロナーゼ酵素ミックス（Invitrogen）と共に最終体積10μLで室温にて１時間インキュベートした。プロテイナーゼKの１μL（２μg/μL）の添加により反応を停止さて、37℃でさらに10分間インキュベートした。この反応物の一部（１μL）を用いて大腸菌DH10B細胞を以下のようにエレクトロポレーションにより形質転換した：DH10Bエレクトロコンピテント細胞（Invitrogen）25μLを氷上で解氷し、１μLのBP反応ミックスを添加した。この混合物を冷却した0.1cmエレクトロポレーションキュベットに移し、BioRad Gene-Pulser（商標）を用い業者の推奨プロトコルに従って細胞にエレクトロポレーションを実施した。室温に加温しておいたSOC培地（0.5mL）をエレクトロポレーション後直ちに添加した。この混合物を15ml スナップキャップチューブに移し、振盪しながら(220rpm)37℃で１時間インキュベートした。続いて、この形質転換混合物の一部（10μL及び50μL）をカナマイシン（40μg/mL）を含むL-ブロス（LB）平板に撒き、37℃で一晩インキュベートした。
得られたコロニーの6個に由来する５mL培養物からQiaprep BioRobot 8000システム（Qiagen）を用いてプラスミドミニプレップDNAを調製した。プラスミドDNA（150-200ng）を21M13およびM13Revプライマーを用いて、BigDyeTerminatorシステム（Applied Biosystemsカタログ番号4336919）を用いて業者の指定に従ってDNA配列決定を実施した。プライマーは表３に示されている。配列決定反応物はMontage SEQ 96クリーンアッププレート（Millipore、カタログ番号LSKS09624）を用いて精製し、Applied Biosystems 3700シーケンサーで解析した。
【００９０】
続いて、正確な配列（pENTR_INSP168-6HIS）を含んでいたクローンの1つからのプラスミド溶出物（２μL又はほぼ150ng）を、1.5μLのpEAK12dベクター又はpDEST12.2ベクター（0.1μg/μL）、２μLのLR緩衝液及び1.5μLのLRクロナーゼ（Invitrogen）を最終体積10μLに含む組換え反応物で用いた。この混合物を室温で1時間インキュベートし、プロテイナーゼK（２μg）の添加により停止させ、37℃でさらに10分間インキュベートした。この反応物の一部（１μL）を用いて大腸菌DH10B細胞を以下のようにエレクトロポレーションにより形質転換した：DH10Bエレクトロコンピテント細胞（Invitrogen）25μLを氷上で解氷し、１μLのLR反応ミックスを添加した。この混合物を冷却した0.1cmエレクトロポレーションキュベットに移し、BioRad Gene-Pulser（商標）を用いて業者の推奨プロトコルに従って細胞にエレクトロポレーションを実施した。室温に加温しておいたSOC培地（0.5ml）をエレクトロポレーション後直ちに添加した。この混合物を15ml スナップキャップチューブに移し、振盪しながら(220rpm)37℃で１時間インキュベートした。この形質転換混合物の一部（10μLおよび50μL）を、アンピシリン（100μg/mL）を含むL-ブロス（LB）プレート上に撒き、37℃で一晩インキュベートした。
得られたコロニーの6個について5mlの培養物からQiaprep BioRobot 8000（Qiagen）を用いてプラスミドミニプレップDNAを調製した。pEAK12dベクター中のプラスミドDNA(200-500ng)を、pEAK12FおよびpEAK12Rプライマーを用いて上述したようにDNA配列決定に付した。pDEST12.2ベクター中のプラスミドDNA(200-500ng)は、21M13及びM13Revプライマーを用いて上述のようにDNA配列決定に付した。プライマー配列は表３に示されている。
配列を確認したクローン（pEAK12d_INSP168-6HIS）の500ml培養物から、J. Sambrookらが記載した方法（Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989））を用いてCsCl勾配精製マキシプレップDNAを調製した。プラスミドDNAを滅菌水（または10mM Tris-HCl pH8.5）中で１μg/μLの濃度に再懸濁し、-20℃に保存した。
配列を確認したクローン（pDEST12.2_INSP168-6HIS）の500ml培養物から、EndoFree Plasmid Megaキット（Qiagen）を用い、業者の指定に従って内毒素を含まないマキシプレップDNAを調製した。内毒素を含まないTE緩衝液に精製DNAを少なくとも３μg/μLの最終濃度で再懸濁して-20℃で保存した。
【００９１】
実施例3：INSP168の組織分布及び発現レベル
INSP168の組織分布及びin vivo発現レベルを本明細書に開示したヌクレオチド及びアミノ酸配列を基準にして決定するために、更なる実験を実施することができる。
INSP168の転写物の存在は、種々のヒト組織に由来するcDNAのPCRによって調べることができる。INSP168転写物は被検サンプルに非常に低レベルで存在し得る。したがって、RNA調製物中の少量のゲノム夾雑物が擬似陽性結果をもたらすので、種々のヒト組織中の転写物の存在を確認する実験の設計には特別な注意が要求される。したがって、全てのRNAは、逆転写に使用する前にDNAseで処理されねばならない。加えて、各組織について、逆転写を行わないコントロール反応（-ve RTコントロール）を設定することができる。
例えば、各組織からの１μgの全RNAを用い、Multiscript逆転写酵素（ABI）及びランダムヘキサマープライマーを用いてcDNAを生成することができる。各組織について、逆転写酵素以外の全ての成分を加えたコントロール(-ve RTコントロール)を設定する。各組織について逆転写RNAサンプル及びマイナスRTコントロールに対してPCR反応を行う。INSP168特異的プライマーは本明細書で提供する配列情報に基づいて容易に設計することができる。逆転写サンプル中に正しい分子量の生成物が存在し、それと一緒にマイナスRTコントロール中に生成物が存在しないことはその組織中に転写物が存在することの証拠とすることができる。上述のように生成されるものに限らず、適切なcDNAライブラリーはいずれも、INSP168転写物のスクリーニングに使用することができる。
INSP168ポリペプチドの組織分布パターンはこれらのポリペプチドの機能に関するさらに有用な情報を提供するであろう。
【００９２】
実施例4：INSP168の発現及び精製
発現ベクターを用いて更なる実験を実施することができる。これらのベクターによる哺乳動物細胞株のトランスフェクションによって、INSP168ポリペプチドの高レベル発現が可能になり、したがってINSP168ポリペプチドの機能的特徴の持続的な解明が可能である。
細胞培養：エプスタイン-バーウイルス核抗原を発現するヒト胎児腎293細胞（HEK293-EBNA、Invitrogen）をEx-cell VPRO無血清培養液中で浮遊させて維持した（種ストック、維持培養液、JRH）。トランスフェクションの16から20時間前に（Day-1）、細胞を2本のT22フラスコに播種する（2％FBSシーディング培養液（JRH）を含むDMEM/F12（1：1）中に2ｘ105細胞/mlの濃度でフラスコ当たり50mL）。次の日（トランスフェクションDay 0）、JetPEITM試薬（2μL/μgのプラスミドDNA、PolyPlas-トランスフェクション）を用いてトランスフェクションを実施する。各フラスコについて、プラスミドDNAをGFP（蛍光レポーター遺伝子）DNAと同時トランスフェクトする。続いて、トランスフェクションミックスを2本のT225フラスコに添加し、6日間37℃（5%CO2）でインキュベートする。陽性トランスフェクションの確認はDay 1及びDay 6に定性的蛍光試験（Axiovert 10 Zeiss）によって実施することができる。
Day 6（採集日）に、2本のフラスコの上清をプールし、遠心して固有の識別票を有するポットに入れる。アリコット（500μL）を6His-タグ付加タンパク質のQCのために保持する（内部バイオプロセッシングQC）。
“浮遊細胞のPEIトランスフェクション”と称されるプロトコル（BP/PEI/HH/02/04参照）にしたがい、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（Polysciences）を用いてスケールアップバッチを作成することができる。
【００９３】
精製プロセス：C-末端6Hisタグを有する組換えタンパク質を含む培養液サンプルを冷緩衝液A（50mMのNaH2PO4；600mMのNaCl；8.7%（w/v）グリセロール、pH7.5）で希釈する。前記サンプルを滅菌ろ紙（Millipore）でろ過し、無菌的な角型培養ビン（Nalgene）で保存する。
精製は、自動サンプルローダー（Labomatic）に連結したVISIONワークショップ（Applied Biosystems）にて4℃で実施する。精製方法は、以下の2つの連続工程で構成される：NiイオンをチャージしたPoros 20 MCカラム（Applied Biosystems）（4.6ｘ50mm、0.83mL）での金属アフィニティークロマトグラフィー、前記に続くセファデックスG-25媒体（Amersham Pharmacia）カラム（1.0ｘ10cm）でのゲルろ過。
最初のクロマトグラフィー工程については、金属アフィニティーカラムは、30カラム体積のEDTA溶液（100mMのEDTA；1MのNaCl；pH8.0）で再生し、15カラム体積の100mMのNiSO4溶液による洗浄でNiイオンを再チャージし、10カラム体積の緩衝液Aで洗浄してから7カラム体積の緩衝液B（50mMのNaH2PO4；600mMのNaCl；8.7%（w/v）グリセロール；400mMイミダゾール；pH7.5）で洗浄し、最後に15カラム体積の緩衝液A（15mMイミダゾールを含む）で平衡させる。サンプルをラボマチック（Labomatic）サンプルローダーで200mLのサンプルループに移し、続いてNi金属アフィニティーカラムに10mL/分の流速で充填する。12カラム体積の緩衝液Aで、続いて28カラム体積の緩衝液A（20mMイミダゾール含有）でカラムを洗浄する。20mMイミダゾール洗浄時にゆるやかに結合している夾雑タンパク質はカラムから溶出される。組換えHis-タグ付加タンパク質は、2mL/分の流速の10カラム体積の緩衝液Bで最終的に溶出し、溶出タンパク質を収集する。
【００９４】
第二のクロマトグラフィー工程については、セファデックスG-25ゲルろ過カラムは2mLの緩衝液D（1.137MのNaCl；2.7mMのKCl；1.5mMのKH2PO4；8mMのNaH2PO4；pH7.2）で再生し、続いて4カラム体積の緩衝液C（137mMのNaCl；2.7mMのKCl；1.5mMのKH2PO4；8mMのNaH2PO4；20%（w/v）グリセロール；pH7.4）で平衡させる。VISIONに一体化されているサンプルローダーによりNi-カラムから溶出したピーク分画を自動的にセファデックスG-25カラムにロードし、タンパク質を2mL/分の流速で緩衝液Cにより溶出させる。分画を無菌的な遠心フィルター（Millipore）でろ過し、-80℃で保存した。あるアリコットのサンプルをSDS-PAGE（4−12％NuPAGEゲル；Novex）ウェスタンブロット（抗His抗体使用）で解析する。NuPAGEゲルは、0.1%クーマシーブルーR250染色溶液（30%メタノール；10%酢酸）で室温にて1時間染色し、続いてバックグラウンドが透明になりタンパク質が明瞭に見えるようになるまで20%メタノール、7.5%酢酸で脱色する。
電気泳動の後、タンパク質をゲルからニトロセルロース膜に電気的に移す。前記膜を緩衝液E（137mMのNaCl；2.7mMのKCl；1.5mMのKH2PO4；8mMのNaH2PO4；0.1%トゥイーン20；pH7.4）中の5%粉乳で1時間、室温でブロッキングし、その後、緩衝液E中の2.5%粉乳中の2つのウサギポリクローナル抗His抗体（G-18及びH-15、各々0.2μg/mL；Santa Cruz）の混合物とともに4℃で一晩インキュベートし、膜を緩衝液Eで洗浄し（3ｘ10分）、続いて2.5%粉乳含有緩衝液Eで1/3000に希釈したHRP結合抗ウサギ二次抗体（DAKO, HRP 0399）とともに室温で2時間インキュベートする。緩衝液Eで洗浄後（3ｘ10分）、膜をECLキット（Amersham Pharmacia）で1分デベロップする。続いて、膜をハイパーフィルム（Hyperfilm, Amersham Pharmacia）に暴露し、フィルムを現像してウェスタンブロット像を視覚的に解析する。
クーマシー染色で検出可能なタンパク質バンドを示したサンプルについて、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いBCAタンパク質アッセイキット（Pierce）でタンパク質濃度を決定することができる。
さらにまた、細胞株におけるこのポリペプチドの過剰発現またはノックダウンを用いて宿主細胞ゲノムの転写活性化に対する影響を決定することができる。INSP168ポリペプチドの二量体化パートナー、共活性化因子、共リプレッサーはウェスタンブロッティングと組み合わせた免疫沈殿および質量分析と組み合わせた免疫沈殿によって同定することができる。
【００９５】
実施例5：INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169の生物学的意義
上記で説明したように、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169は、網膜特異的タンパク質PAL（SwissProt Acc. Code PALP_HUMAN）及びnogoレセプターホモローグ（SwissProt Acc. Code Q6X814）と構造的に関連する。INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169並びにPALとの間のアミノ酸アラインメントは図5に示され、ドメインの模式図は図6に示されている。
PALは、網膜、網膜色素上皮（RPE）及び脈絡膜の疾患に関係している可能性がある（例えばJP2001128686を参照されたい）。これらには眼球の新生血管形成、眼球の炎症及び網膜の変性が含まれる。これら症状の具体的な例には、糖尿病性網膜症、慢性緑内障、網膜はく離、鎌状赤血球網膜症、老人性黄斑変性、網膜新生血管形成、網膜下新生血管形成；ルベオーシス虹彩炎炎症疾患、慢性後部ブドウ膜炎及び汎ブドウ膜炎、新形成、網膜芽細胞腫、偽神経膠腫、血管新生緑内障；硝子体水晶体同時切除後に生じる新生血管形成、以下の血管性障害（網膜虚血、脈絡膜血管不全、脈絡膜血栓症、視神経の新生血管形成、糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑水腫、色素性網膜炎、網膜静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症、色素線条、及び網膜動脈閉塞）、並びに眼又は眼球損傷の穿通による新生血管形成。さらに関連する疾患にはニューロパシー、例えばリーバー氏、特発性、薬剤誘発性、視神経性、及び虚血性ニューロパシーが含まれる。
Nogoレセプター様タンパク質は、CNSニューロン再生の主要な阻害物質であり得る（M.E. Schwab, Curr Opin Neurobiol., 2004 Feb, 14(1):118-24；Teng et al. J. Neurochm 2004 May, 89(4):801-6）。Nogo-Aを標的とする抗体で処置された動物は、常に種々の行動検査で高度な回復を示した（例えばIN-1 Fab'フラグメント又はNogo-Aに対する新規な精製IgG）。加えて、Nogo-66アンタゴニストペプチド（NEP1-40）は、皮質脊髄路の顕著な軸索成長をもたらし、さらに胸郭中部脊髄の半側切断を実施したラットの機能回復を改善した。脊髄に病変を有する動物でNEP1-40の皮下投与は、皮質脊髄軸索の強い増殖、セロトニン作動性線維の出芽、シナプス形成及び運動回復強化をもたらす。NogoレセプターサブユニットNgR（Nogoをブロッキングする）の可溶性Fc融合タンパク質は、ミエリンの阻害活性を顕著に低下させる。同様な結果が、動物モデルにおけるNogo遺伝子欠失及び下流メッセンジャーRho-A及びROCKのブロッキング後に得られた。
【００９６】
SLITタンパク質のロイシンリッチリピートドメインは、in vitroにおける軸索発射及びニューロン遊走の両者の誘導に十分である（SLITのLRR領域は構造的にINSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169のLRR領域と関係を有する）。SLIT-様タンパク質は、細胞の遊走で分子性誘導指標として機能すると考えられ、機能は、ラウンダバウトホモローグレセプター（高い親和性でROBO1及びROBO2と結合する）との相互作用によって仲介されるようである。神経の発生時に、SLITは、神経管の腹側正中線の軸索移動及び種々の領域への軸索発射で必要とされる。脊髄索の発生では、SLITは、交連軸索がいったん底面に達したら、ネトリンへの応答を調整することによって直ちにそれら交連軸索を誘導する際に役割を果たすことができる。SLITは、脊髄索正中線交差後軸索反発に関与するかもしれない。視覚系の発生では、SLITは、これら軸索を視覚交差前又は前記通過後のそれら軸索の適切な通路にしたがって誘導する反発物質を提供することによって、網膜神経節軸索のための反発力として機能するようである。in vitroでは、SLITは網膜神経節細胞の増殖コーンを破壊しこれらを忌避する。SLITは、CNS感覚軸索の分岐及び樹枝状化、並びにニューロン細胞遊走に役割を果たすようである。in vitroでは、Slitホモローグ2タンパク質N-生成物（Slitホモローグ2タンパク質C-生成物はそうではないが）は、嗅球（OB）を忌避するが、後根神経節（DRG）軸索は忌避せず、OB増殖コーンの破壊を誘発し、さらにDRG軸索の分岐を誘発する。SLITは白血球の遊走の調節に中心的に関与するように思われる。
INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169及び/又はそのフラグメントは、他の構造的に関連するタンパク質（例えば上記に記載のPAL-及びNogoレセプター様タンパク質）が治療活性を発揮する疾患の診断及び/又は治療に有用であり得る。
【００９７】
したがって、INSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169は、網膜の疾患、脊髄損傷（例えば対麻痺）及び神経変性疾患に関係している可能性がある。神経変性疾患には脳損傷、脳血管系疾患及びそれらの後遺症、パーキンソン病、皮質基底変性、運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症（ALS）を含む）、多発性硬化症、外傷性脳損傷、発作、発作後脳損傷、外傷後脳損傷及び脳小血管疾患が含まれるが、ただしこれらに限定されない。痴呆、例えばアルツハイマー病、血管性痴呆、レーヴィー小体を伴う痴呆、前側頭痴呆、パーキンソン症候群、前側頭痴呆（ピック病を含む）、進行性核麻痺、皮質基底変性、ハンチントン病、視床変性、クロイツフェルト-ヤコブ痴呆、HIV痴呆、痴呆を伴う精神分裂病、コルサコフ精神病が、発作及び外傷と同様に含まれる。
したがって、NSP168、INSP168-SV1、INSP149及びINSP169は以下の疾患に関与している可能性がある：網膜、網膜色素上皮（RPE）及び脈絡膜の疾患；眼球の新生血管形成、眼球の炎症及び網膜の変性；糖尿病性網膜症、慢性緑内障、網膜はく離、鎌状赤血球網膜症、老人性黄斑変性、網膜新生血管形成、網膜下新生血管形成；ルベオーシス虹彩炎炎症疾患、慢性後部ブドウ膜炎及び汎ブドウ膜炎、新形成、網膜芽細胞腫、偽神経膠腫、血管新生緑内障；硝子体水晶体同時切除後に生じる新生血管形成、以下の血管性障害（網膜虚血、脈絡膜血管不全、脈絡膜血栓症、視神経の新生血管形成、糖尿病性黄斑浮腫、類嚢胞黄斑水腫、色素性網膜炎、網膜静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症、色素線条、網膜動脈閉塞）、眼又は眼球損傷の穿通による新生血管形成、ニューロパシー；リーバー氏、特発性、薬剤誘発性、視神経性、及び虚血性ニューロパシー；脊髄損傷、対麻痺、神経変性疾患、中枢神経系の異常、末梢神経系の異常、脳損傷、脳血管系疾患、パーキンソン病、皮質基底変性、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症、外傷性脳損傷、発作、発作後脳損傷、外傷後脳損傷、脳小血管疾患、痴呆、アルツハイマー病、血管性痴呆、レーヴィー小体を伴う痴呆、前側頭痴呆、パーキンソン症候群、前側頭痴呆、ピック病、進行性核麻痺、皮質基底変性、ハンチントン病、視床変性、クロイツフェルト-ヤコブ病痴呆、HIV痴呆、痴呆を伴う精神分裂病、コルサコフ精神病、発作及び外傷。
【００９８】
実施例6：INSP168の神経保護活性
神経炎症は、いくつかの神経学的疾患、外傷症状（中枢レベル又は末梢レベルでの）、発作（脳、心臓、腎臓の発作）、又は感染性疾患（ウイルス因子（例えばHIV）又は細菌因子（例えば髄膜炎）によって仲介される）の共通の特色であり、中枢神経系における過剰な炎症性応答をもたらす。（これらの種々の症状により影響を受けているニューロン又は稀突起神経膠細胞から発する）多くの刺激は神経炎症の引き金となり得る。特に、星状細胞は多様なケモカイン及びサイトカインを分泌してさらに新たな白血球の補充を誘発し、前記白血球は順次、星状細胞を刺激して応答の更なる悪循環を生じる。慢性神経変性疾患（例えば多発性硬化症（MS）、脊髄筋萎縮（SMA）、アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、ハンチントン病（HD）、又は筋萎縮性側索硬化症（ALS））では、持続的な神経炎症の存在が、前記疾患の進行に、及び二次的事象（例えば微細出血事象）におけるADの場合に中心的に関与すると考えられる（M. Cacquevel et al. Curr Drug Targets, 2004, 5:529-534；A. Chavarria et al. Autoimmun Rev. 2004, 3:251-260；E. Ambrosini & F. Aloisi, Neurochem Res., 2004, 29:1017-1038）。
神経保護、軸索の完全性の維持、髄鞘形成、ミエリン産生細胞の再生/発生に関係するINSP168の生物学的特性を、細胞株を必要とする種々のアッセイで検査することができる。例えば、化合物の神経免疫調整作用はU373（ヒトの星状膠細胞株）で判定することができる。U373では、サイトカイン/ケモカイン発現に必要とされる特定の調節タンパク質の核への移転を定量することができる（E. Le Roy et al. J Virol., 1999, 73:6582-9；Y. Jin et al. J Infec Dis., 1998, 177:1629-1638；M. Acevedo-Duncan et al. Cell Growth Differ. 1995, 6:1353-1365）。
一連のアッセイがヒトの星状膠細胞株U373で実施され、INSP168が、転写因子、例えばStat-2（Signal transducer and activator of transcription-2、サイトカインによって誘発され、IFN-ベータ応答を調整する：G. Banninger and N.C. Reich, J Biol Chem 2004, 279:39199-39206；W.J. Leonard, Int J Hematol, 2001, 73:271-277）の細胞質から核への移転を刺激するか否かが調べられた。
【００９９】
U373細胞（ECACC ref no: 8908403）を、80μLの10%FCS（Fetak Calf Serum）含有DMEMに4000細胞/ウェルの濃度で96ウェルプレート（Packard ViewPlate-96, black; Cat. No. 6005225）に播種し、5%CO2湿潤インキュベーターに37℃で一晩置いた。次の日、20μLの単独培養液又は被検タンパク質含有培養液（1000 IU/mLの組換えIFNベータを添加した培養液、又はHisタグ付加INSP168発現細胞から得た培養液）を細胞に添加した。30分後に、培養液を取り出し、細胞を3.7%のホルムアルデヒド（Sigma; Cat. No. 25,254-9）で固定し、市販のキットを用い（c-Jun免疫染色にはCellomics c-Jun活性化HitKit（Cat. No. K01-0003-1）；Stat-2免疫染色にはCellomics Stat-2活性化HitKit（Cat. No. K01-0005-1））、業者の指示にしたがい免疫染色のために処理した。染色後、プレートを画像解析システム（ArrayScan II HCS System; Cellomics）で判読した。
結果は、“核移転ユニット”として表した。核移転ユニットは、各領域内の標的の蛍光濃度マイナス細胞質領域の標的蛍光濃度の測定であり、ウェル内の全解析細胞（ほぼ100細胞/ウェル）の平均として報告されている。いくつかの実験を比較するために、結果はまた、陽性コントロール（IFNベータ）を用いて計算した最大刺激の百分率として表した。統計解析は、スチューデントT検定、又は変量解析（ANOVA）及びワンウェーANOVAを用い、続いて実験あたりの群の数に応じてDunnett検定を実施した。有意レベルはｐ＜0.05に設定した。結果は平均±平均の標準誤差（s.e.m.）として表した。
INSP168含有培養液の添加は、核内の蛍光濃度の統計的に有意な増加によって示されるとおり、U373細胞におけるStat-2の核への移転を刺激することが判明した。この応答は、陽性コントロールのIFNベータで達成される最大レベルの20−30％に相当する（図7で、**はｐ＜0.005、***はｐ＜0.0005を意味する）。
この最初の実験シリーズによって、INSP168は、U373細胞でStat-2核移転を誘発することによって細胞内シグナリングを刺激する能力を有することが明らかにされた。Statタンパク質シグナリングの活性化は、免疫調整を、最終的には細胞分裂を伴うことが知られている（E. Pfitzner et al. Curr Pharm Des, 2004, 10:2839-2850）。
【０１００】
実施例7：INSP169細胞外ドメイン（INSP169ec）のクローニング
INSP169は、4コードエキソンに広がる679アミノ酸のタンパク質をコードするINSP149の再予想配列である。トランスメンブレン（TM）ドメインはC-末端近くに想定される。N-末端の細胞外ドメインは580アミノ酸を超えて伸長し、4つのロイシンリッチリピート（LRR）クラスターを含み、前記はCys-リッチドメイン、IgC-2ドメイン及びフィブロネクチン3型ドメインによってフランキングされている。この予想配列の細胞外ドメインをクローニングした。
用いたクローニング方法は、多様なヒト組織（下記参照）から最初のRNAプールを調製する工程及び前記プールから逆転写用鋳型として多組織ポリA+ mRNAの単一調製物を作成する工程であった。遺伝子特異的cDNAプライマーを前記予想配列の小セット（典型的には5−10配列）のために設計し、得られたcDNAミックスのアリコットを、対応するコード領域を得るために設計したプライマーを用いる別々のPCR反応のための鋳型に提供した。続いて、増幅フラグメントをゲル電気泳動によって精製し、PCRプライマーの末端に付加した固有の制限部位により、Bluescriptクローニングベクターでクローニングした。
INSP169ecの場合には、この配列の中央部分の固有のBamHI制限部位を利用する二工程手法を用いた。第一のRT-PCRを実施して、TMドメインからBamHI部位までの1063ヌクレオチドを入手し、第二のRT-PCRを実施してBamHI部位の上流からメチオニン開始コドンまでの残りの683ヌクレオチドを入手した。続いて、これら2つのフラグメントをBamHI消化及び連結に続いてアッセンブリングした。
使用した前記遺伝子特異的プライマーは下記及び下記の表4に記載されている。1740ヌクレオチドのcDNAを入手し、この挿入物の配列分析によって、INSP169の完全な細胞外ドメインのための予想cDNA配列が提示された。INSP169ecのクローニングで使用したオリゴヌクレオチドプライマーのコード領域及び位置は図8に示されている。
【０１０１】
7.1 ヒト多組織cDNA鋳型の調製：
以下の供給源の各々に由来するほぼ10μgの全RNAを混合することによって、ヒトRNAの調製物を調製した：脳（Clontech）、心臓（Clontech）腎臓（Clontech）、肝臓（Clontech）、肺臓（Clontech）、胎盤（Clontech）、骨格筋（Clontech）、小腸（Clontech）、脾臓（Clontech）、胸腺（Clontech）、子宮（Clontech）、骨髄（Clontech）、甲状腺（Clontech）、卵巣（Ambion）、精巣（Ambion）、前立腺（Ambion）、皮膚（Resgen）、膵臓（Clontech）、唾液腺（BD Bioscences）、副腎（BD Biosciences）、乳房（Ambion）、下垂体（BioChain Institut）、胃（Ambion）、乳腺（Clontech）、リンパ節（BioChain Institut）、脂肪組織（BioChain Institut）、膀胱（BioChain Institut）、虫垂（BioChain Institut）、動脈（BioChain Institut）、咽喉（BioChain Institut）、ヒトユニバーサルリファレンス（Stratagene）胎児腎臓（Stratagene）胎児脳（BioChain Institut）、胎児脾臓（BioChain Institut）、胎児肝臓（BioChain Institut）、胎児心臓（BioChain Institut）、胎児肺臓（BioChain Institut）、末梢血単球（ばっフィーコートから院内で調製）。
予め充填しておいたオリゴ-dTカラム（Stratagene）で、得られた全RNAのプールを業者供給のプロトコルにしたがってクロマトグラフィーによって分画した。ほぼ400μgの全RNAから16μgのポリA+mRNAが得られ、これを小分けして-80℃で凍結した。
7.2  INSP169ecのRT-PCRクローニング：
7.2.1  ステージ１：ヌクレオチド678−1740のクローニング：
7.2.1.1  cDNA合成：クローニングの第一ステージでは、INSP169のための遺伝子特異的cDNAプライマー（TMドメインに存在する）（AS502）を、他の9予想配列のための遺伝子特異的cDNAと一緒に、各々1pMの最終濃度でプールした。前記cDNAプライマープールセットを10倍希釈して以下を含む50μLの混合物にした：1ｘ RT緩衝液、各々500μMのdNTP、10U/μLのRNAguard（Pharmacia）及び上述のように調製した1μgの変性ポリA+ RNA。cDNA合成は、10UのOmniscript逆転写酵素（Qiagen）の添加により開始し、37℃で1時間進行させた。反応の最後に、5μLのcDNAミックスを下記に記載するようにPCR増幅に用いた。
7.2.1.2  INSP169ヌクレオチド678−1740のためのPCR増幅：一番上の鎖（AS503）及び一番下の鎖（AS504）のPCRプライマー（表4参照）は、内部BamHI部位とTMドメインとの間の予想コード配列に広がるように設計された。EcoRI制限部位を各プライマーの5'末端に付加した。反応混合物は、1ｘのPCR緩衝液、各々0.2mMのdNTP、各々0.5μMのPCRプライマー、上記の5μL cDNAを含むように設定し、PCR反応は5UのPfu Turbo（Stratagene）の添加によって開始した。“タッチダウン”PCRのサイクリング条件は以下のとおりであった：94℃で2分（１サイクル）；94℃で30秒、64℃（各サイクルで1℃ずつ低下させる）で30秒、72℃で90秒（14サイクル；94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で90秒（25サイクル）；72℃で7分（1サイクル）。PCR反応のアリコットを0.8%アガロースゲルでの電気泳動で解析し、PCR生成物のサブクローニングの前に、残余を業者の推奨にしたがってWizard PCRクリーンアップシステム（Promega）を用いて精製した。
【０１０２】
7.2.1.3  PCR生成物のサブクローニング：前記精製PCR反応物のアリコットを、EcoRI（New England Biolabs）で37℃にて2時間、業者提供の酵素緩衝液を用いて消化した。
平行して、適切な量のBluescript BSK-クローニングベクターをEcoRIで消化し、ウシ腸内アルカリホスファターゼ（Roche Diagnosis）を用い供給者の推奨にしたがい脱リン酸化した。完全長の直鎖化して脱リン酸化したクローニングベクターを0.8%アガロースゲルで分離して切り出し、業者提供のプロトコルにしたがいWizardクリーンアップシステム（Promega）を用いて精製した。前記精製ベクターDNA及びPCR生成物を1：3のモル比で混合し、2.5容積のエタノールの存在下で-20℃で一晩沈殿させた。沈殿したDNAを遠心により回収し、70%エタノールで洗浄し、真空下で乾燥させ、Rapid Ligation Kit（Roche Diagnostics）を業者の供給したプロトコルにしたがって用いて10μLの最終体積で連結させた。
続いて、前記連結混合物を用いて大腸菌株JM101を以下のように形質転換した：コンピテントJM101細胞の50μLアリコットを氷上で解凍し、1μL又は5μLの連結混合物を添加した。前記細胞を氷上で40分インキュベートし、続いて42℃で2分間インキュベートして熱ショックに付した。1mLの温かい（室温）L-ブロス（LB）を添加し、サンプルをさらに1時間37℃でインキュベートした。続いて、アンピシリン（100μg/mL）、IPTG（0.1μM）及びX-gal（50μg/mL）を含むLBプレートに前記形質転換混合物を撒き、37℃で一晩インキュベートした。単一の白色コロニーをプラスミドの単離のために選別した。
7.2.1.4  プラスミドDNAの調製、制限消化及び配列の解析：5mLの培養からBiorobot 8000自動システム（Qiagen）を用い、業者の指示にしたがってミニプレッププラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAを80μLの滅菌水に溶出した。エッペンドルフBO分光光度計又はSpectramax 190分光光度計（Molecular Devices）を用いて前記DNA濃度を測定した。
ミニプレッププラスミドDNAのアリコット（100−200ng）をEcoRIで37℃にて2時間消化し、0.8%アガロースゲルでの電気泳動によって解析した。約1.1kbの予想サイズの挿入物を有するプラスミドをDNA配列解析のために選別した。200−500ngのプラスミドDNAをT7及びT3配列決定プライマー（表4参照）と混合することによって、いずれかの末端から挿入物の配列を決定した。配列決定反応物は、BigDyeターミネーターシステム（Applied Biosystems Cat. No. 4390246）を用い業者の指示にしたがって処理した。生成物は、Dye-Exカラム（Qiagen）又はMontage SEQ96クリーンアッププレート（Millipore cat. No. LSKS09624）を用いて精製し、Applied Biosystems 3700シーケンサーで解析した。
7.2.1.5  ヌクレオチド678−1740のクローニングと配列解析の結果：内部BamHI部位からTMドメインに広がる領域のための予想されるmRNAコード配列が確認された。DNAミニプレップ#14を代表的なクローンとして更なる実験のために採用した。
【０１０３】
7.2.2  ステージ2：ヌクレオチド1−683のクローニング
7.2.2.1  cDNA合成：クローニングの第二のステージでは、内部BamHI部位の直ぐ下流に位置するINSP169のための遺伝子特異的cDNAプライマー（AS515）を、他の6予想配列のための遺伝子特異的cDNAと一緒に、各々1pMの最終濃度でプールした。前記cDNAプライマープールセットを10倍希釈して以下を含む40μLの混合物にした：1ｘ RT緩衝液、各々500μMのdNTP、10U/μLのRNAguard（Pharmacia）及び上述のように調製した1μgの変性ポリA+ RNA。cDNA合成は、10UのOmniscript逆転写酵素（Qiagen）の添加により開始し、37℃で1時間進行させた。反応の最後に、5μLのcDNAミックスを下記に記載するようにPCR増幅に用いた。
7.2.2.2  INSP169ヌクレオチド1−683のためのPCR増幅：一番上の鎖（AS516）及び一番下の鎖（AS517）のPCRプライマー（表4参照）は、イニシエーターメチオニンと内部BamHI部位との間の予想コード配列に広がるように設計された。BamHI制限部位をAS516の5'末端に付加した。反応混合物は、1ｘのPCR緩衝液、各々0.2mMのdNTP、各々0.5μMのPCRプライマー、上記の5μL cDNAを含むように設定し、PCR反応は5UのPfu Turbo（Stratagene）の添加によって開始した。“タッチダウン”PCRのサイクリング条件は以下のとおりであった：94℃で2分（１サイクル）；94℃で30秒、64℃（各サイクルで1℃ずつ低下させる）で30秒、72℃で80秒（14サイクル；94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で80秒（25サイクル）；72℃で7分（1サイクル）。PCR反応のアリコットを0.8%アガロースゲルでの電気泳動で解析し、PCR生成物のサブクローニングの前に残余を、Wizard PCRクリーンアップシステム（Promega）を業者の推奨にしたがって用いて精製した。
7.2.2.3  PCR生成物のサブクローニング：前記精製PCR反応物のアリコットを、BamHI（New England Biolabs）で37℃にて2時間、業者提供の酵素緩衝液を用いて消化した。
平行して、適切な量のBluescript BSK-クローニングベクターをBamHIで消化し、ウシ腸内アルカリホスファターゼ（Roche Diagnosis）を用い供給者の推奨にしたがい脱リン酸化した。完全長の直鎖化し脱リン酸化したクローニングベクターを0.8%アガロースゲルで分離して切り出し、業者提供のプロトコルにしたがい、Wizardクリーンアップシステム（Promega）を用いて精製した。前記精製ベクターDNA及びPCR生成物を1：3のモル比で混合し、2.5容積のエタノールの存在下で-20℃で一晩沈殿させた。沈殿したDNAを遠心により回収し、70%エタノールで洗浄し、真空下で乾燥させ、Rapid Ligation Kit（Roche Diagnostics）を業者の供給したプロトコルにしたがって用いて10μLの最終体積で連結させた。
続いて、前記連結混合物を用いて大腸菌株JM101を以下のように形質転換した：コンピテントJM101細胞の50μLアリコットを氷上で解凍し、1μL又は5μLの連結混合物を添加した。前記細胞を氷上で40分インキュベートし、続いて42℃で2分間インキュベートして熱ショックに付した。1mLの温かい（室温）L-ブロス（LB）を添加し、サンプルをさらに1時間37℃でインキュベートした。続いて、アンピシリン（100μg/mL）、IPTG（0.1μM）及びX-gal（50μg/mL）を含むLBプレートに前記形質転換混合物を撒き、37℃で一晩インキュベートした。単一の白色コロニーをプラスミドの単離のために選別した。
7.2.2.4  プラスミドDNAの調製、制限消化及び配列の解析：5mLの培養からBiorobot 8000自動システム（Qiagen）を業者の指示にしたがって用い、ミニプレッププラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAを80μLの滅菌水に溶出した。エッペンドルフBO分光光度計又はSpectramax 190分光光度計（Molecular Devices）を用いて前記DNA濃度を測定した。
ミニプレッププラスミドDNAのアリコット（100−200ng）をBamHIで37℃にて2時間消化し、0.8%アガロースゲルでの電気泳動によって解析した。約0.7kbの予想サイズの挿入物を有するプラスミドをDNA配列解析のために選別した。200−500ngのプラスミドDNAをT7及びT3配列決定プライマー（表4参照）と混合することによって、いずれかの末端から挿入物の配列を決定した。配列決定反応物は、BigDyeターミネーターシステム（Applied Biosystems Cat. No. 4390246）を業者の指示にしたがって用いて処理した。生成物は、Dye-Exカラム（Qiagen）又はMontage SEQ96クリーンアッププレート（Millipore cat. No. LSKS09624）を用いて精製し、Applied Biosystems 3700シーケンサーで解析した。
7.2.2.5  ヌクレオチド1−683のクローニングと配列解析の結果：イニシエーターメチオニンから内部BamHI部位までの領域のための予想されるmRNAコード配列が確認された。DNAミニプレップ#15を代表的なクローンとして更なる実験のために採用した。
【０１０４】
7.3  完全なINSP169細胞外ドメインのアッセンブリー：
ステージ1のDNAミニプレップ#14及びステージ2のDNAミニプレップ#15のアリコットをBamHI（New England Biolabs）で37℃にて2時間、業者供給の酵素緩衝液を用いて消化した。ミニプレップ#14の完全長直鎖化プラスミド及びミニプレップ#15から切り出した0.7kbのフラグメントを0.8%のアガロースゲルで分離して切り出し、業者提供のプロトコルにしたがい、Wizardクリーンアップシステム（Promega）を用いて精製した。前記2つの精製DNAを1：3のモル比で混合し、2.5容積のエタノールの存在下で-20℃で一晩沈殿させた。沈殿したDNAを遠心により回収し、70%エタノールで洗浄し、真空下で乾燥させ、Rapid Ligation Kit（Roche Diagnostics）を業者供給のプロトコルにしたがって用いて10μLの最終体積で連結させた。
コンピテントJM101の前記連結ミックスによる形質転換、プラスミドの単離、及び配列解析は、上記の7.2.1.3及び7.2.1.4に記載したように実施した。
7.4 完全長INSP169ecの配列解析の結果：
12のミニプレップDNAの配列解析によって、ヌクレオチド1−683に対応するフラグメントが、ヌクレオチド678−1740に対応する配列の上流に正しい向きで挿入されてあって、さらに2つのフラグメントの接合点が正確に再連結されたBamHI部位（678−683位）であるクローンが同定された。
DNAミニプレップ#11を選別し、完全な配列が、配列決定プライマーT3、T7、AS515及びAS599（表4参照）を用いて確認された。予想配列と比較して、ただ1つのSNP、SerからAsnへのコドン変化を生じたG524Aが見出された。
【０１０５】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】INSP168、INSP168-SV1、INSP149及び INSP169のORFのアミノ酸アラインメント。予想されるトランスメンブレン領域は太字で示されている。予想される内部LRRは枠で囲まれている。
【図２】プライマーINSP168-CP1及びINSP168-CP2を用いてクローニングしたPCR生成物INSP168のヌクレオチド配列とその翻訳物。予想されるシグナルペプチドは太字で示されている。予想される内部LRRは枠で囲まれている。前記プライマーの位置及びセンスは矢印で示されている。
【図３】プライマーINSP168-CP1及びINSP168-CP2を用いてクローニングしたPCR生成物INSP168-SV1のヌクレオチド配列とその翻訳物。予想されるシグナルペプチドは太字で示されている。予想される内部LRRは枠で囲まれている。前記プライマーの位置及びセンスは矢印で示されている。
【図４】PCR生成物INSP168-SV1のゲノム編成。
【図５】INSP168、INSP168-SV1、INSP149及び INSP169並びに網膜特異的タンパク質PAL（SwissProt Acc. Code PALP_HUMAN）間のアミノ酸アラインメント。
【図６】INSP168、INSP168-SV1、INSP149、INSP169、網膜特異的タンパク質PAL（SwissProt Acc. Code PALP_HUMAN）及びnogoレセプターホモローグ（SwissProt Acc. Code Q6X814）のドメイン模式図。
【図７】2つの別個の実験による、U373におけるStat-2の核への移転に対するINSP168の影響。左手の2つの列は培養液のみ添加の影響、中央の2つの行は陽性コントロールIFN-ベータの添加の影響、右手の2つの行はINSP168の培養液への添加の影響を示す。
【図８】クローニングしたINSP169の細胞外ドメインのcDNAコード配列及び推定されるペプチド配列。クローニング及び配列決定に用いたプライマーの位置及び向きは矢印で示されている。太字の配列は、完全長のクローンのアッセンブリーで用いられた中心に位置するBamHI部位に一致する。
【図９】クローニングしたINSP169細胞外ドメインのヌクレオチド配列。
【図１０】クローニングしたcDNAのN-末端からTMドメインまでのペプチド配列。シグナル配列は斜字体で、ロイシンリッチリピート領域は太字で示されている。免疫グロブリンC-2ドメインには下線が付され、フィブロネクチン3型ドメインは太い斜字体で示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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