(57)【要約】天然のインターフェロンβに従って番号付けをして２５位のアスパラギンが脱アミドされている、インターフェロンβタンパク質類似体は、上昇したレベルの天然のヒトインターフェロンβの生物学的活性を表し、タンパク質の安定化のためにＨＡを必要としない。脱アミド産物は、多発性硬化症を含む疾患の処置のための、ＨＡを含む治療薬またはＨＡを含まない治療薬に組み込むための、大規模な製造に適している。酵素消化、続いてＲＰ−ＨＰＬＣを用いてタンパク質のフィンガープリントのプロフィールを生じる、エンドプロテイナーゼ−Ｃのペプチドマップ技術も、脱アミド産物の同定および／または定量の試験としての品質管理にとって、有用である。
2008519769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製され単離された合成ヒトインターフェロンβタンパク質類似体であって、ここで、天然のインターフェロンβに従って番号づけをして２５位のアスパラギンは脱アミドされており、該タンパク質類似体は天然のヒトインターフェロンβの生物学的活性を表す、合成タンパク質類似体。
【請求項２】
請求項１に記載の合成タンパク質類似体であって、ここで、天然のインターフェロンβに従って番号づけをして１７位のシステインは欠失しているかまたは中性アミノ酸によって置換されている、合成タンパク質類似体。
【請求項３】
請求項２に記載の合成タンパク質類似体であって、ここで、前記システイン残基がセリン残基により置換された、合成タンパク質類似体。
【請求項４】
請求項３に記載の合成タンパク質類似体であって、ここで、前記アスパラギン残基が、アスパルテート、イソ−アスパルテートおよび環状イミドからなる群から選択される残基で置換された、合成タンパク質類似体。
【請求項５】
請求項４に記載の合成タンパク質類似体であって、ここで、該タンパク質類似体はグリコシル化されていない、合成タンパク質類似体。
【請求項６】
請求項５に記載の合成タンパク質類似体であって、ここで、該タンパク質類似体はＮ末端のメチオニンが欠失している、合成タンパク質類似体。
【請求項７】
請求項４に記載の合成タンパク質類似体であって、ここで、該タンパク質類似体はＩＦＮ−βｓｅｒ１７より高い生物学的活性を有する、合成タンパク質類似体。
【請求項８】
薬学的に受容可能なキャリア媒体と混合された、治療上有効な量の請求項４に記載のタンパク質類似体を含む、ＩＦＮ−βの活性を有する、治療用組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、ここで、前記合成タンパク質類似体の少なくとも５０％が、天然のインターフェロンβに従って番号づけをして２５位において脱アミドされている、組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の組成物であって、ここで、前記合成タンパク質類似体の実質的に全てが、天然のインターフェロンβに従って番号づけをして２５位において脱アミドされている、組成物。
【請求項１１】
請求項８に記載の組成物であって、ここで、該組成物がＨＡを含まない、組成物。
【請求項１２】
脱アミドされたＩＦＮ−β類似体を作製する方法であって：
ＩＦＮ−βタンパク質を適切な条件下、約２５〜６０℃という中程度から高い温度でインキュベートする工程；
該脱アミドされたタンパク質類似体を精製および単離する工程
を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって：
約４０℃という温度で約１４日間のインキュベーション
を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、さらに、ここで、前記インキュベーションが少なくとも４というｐＨで行われることを包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって：
７〜１４というｐＨでのインキュベーション
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記インキュベーションがｐＨ８〜９で約１４日間である、方法。
【請求項１７】
患者を処置する方法であって、該患者に、請求項８に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記処置は前記患者の細胞増殖を調節するためのものであり、前記有効量は、細胞増殖を調節する前記組成物量である、方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記処置は前記患者のウイルス疾患のためのものであり、前記有効量は、ウイルス疾患を阻害する前記組成物量である、方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記処置は前記患者におけるナチュラルキラー細胞の活性を刺激するためのものであり、前記有効量は、ナチュラルキラー細胞を刺激する前記組成物量である、方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記処置は前記患者における多発性硬化症のためのものであり、前記有効量は、治療上有効な前記組成物量である、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、ここで、前記処置は多発性硬化症の再発の頻度を減少させることを包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記多発性硬化症は再発寛解型である、方法。
【請求項２４】
ペプチドマッピング方法であって：
還元剤を含む、ｐＨ８未満の緩衝された溶液中にて、タンパク質試料をインキュベートする工程；
該インキュベートされた試料を、エンドプロテイナーゼＣで消化する工程；および
消化物のペプチド断片を、液体クロマトグラフィーにより分離する工程
を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ここで、前記還元剤はトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記インキュベーションは約４のｐＨで行われる、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、ここで、前記液体クロマトグラフィーはＲＰ−ＨＰＬＣである、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質試料は脱アミドされたＩＦＮ−βである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
（１．技術分野）
本発明は生物学的に活性なタンパク質の化学の一般的な領域にある。さらに詳細には、本発明は、システイン、アスパラギンなどの残基の置換、欠失または改変によって、変異または化学的に改変された、天然のタンパク質と異なるインターフェロンβ類似体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（２．背景技術）
インターフェロンβは、ヒトの疾患、特に多発性硬化症の処置に有用であることがわかっている。多発性硬化症（ＭＳ）は、神経線維を取り囲む保護鞘が切断された場合に起こる中枢神経系の慢性疾患であり、しばしば身体障害にする疾患である。ＭＳ患者の約３０％が、再発（ｆｌａｒｅ−ｕｐ）の後、症状が完全にまたは部分的に消失し、引き続き、何ヶ月または何年もの間続き得る安定性期間がある、再発−寛解型のこの疾患にかかる。βインターフェロン（インターフェロンβまたはＩＦＮ−β）の投与は、ＭＳの再発の頻度を減少させることが明らかにされた。その結果として、インターフェロンβに基づいた薬は、ＭＳの管理および処置における、価値のある手段となった。
【０００３】
組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術が発達して、インターフェロンβに基づいた薬の大規模な製造が容易になった。これらの技術により取り組まれることが所望される一つの問題は、特に、ヒトのβインターフェロン（図１（配列番号１）にそのアミノ酸配列が提供されている）が、１７位、３１位および１４１位にシステイン残基を含むことであった（非特許文献１および非特許文献２）。これらのシステイン残基のうちの少なくともいくつかは、活性に必須でないが、望ましくない分子間または分子内の結合を自由に形成する。ｒＤＮＡ技術によるＩＦＮ−βの微生物的調製の過程において、高濃度のＩＦＮ−βを含む抽出物内では、この分子間結合に起因してＩＦＮ−βの二量体およびオリゴマーが形成されることが観察されている。この多量体の形成はＩＦＮ−βの精製および単離を、大変骨の折れる、かつ、時間のかかるものにし、並びに、精製手順および単離手順において、精製中にタンパク質を還元し、そしてタンパク質を本来の高次構造へ戻すために再度酸化し、これによって、不正確なジスルフィド結合の形成の可能性を高めることのような、いくつかのさらなる工程を必要とする。これに加えて、この多量体の形成は、低い生物学的比活性と関連していた。
【０００４】
これらの問題と取り組むため、微生物により産生された生物学的に活性なＩＦＮ−βタンパク質類似体を、これらの活性に悪影響を与えないように、しかし、このタンパク質に望ましくない四次構造（例えば、タンパク質の活性を減少させる高次構造）を採らせる、分子間の架橋または分子内結合を形成する能力を減少させるかまたは除去するように改変するための洗練されたｒＤＮＡ技術が開発されてきた。指定型の変異誘発技術が成功裏に用いられ、その結果、親のタンパク質の望ましい活性を保持するが、分子間連結または望ましくない分子内ジスルフィド結合を形成する能力を欠く、変異により改変された生物学的に活性なタンパク質類似体（「タンパク質類似体」とは、本明細書中では、その一つまたはそれより多くのアミノ酸が遺伝的および／または化学的に改変されており、かつ、親のタンパク質の生物学的活性を保持する、合成タンパク質をいう）が形成された。１７位のシステイン残基が欠失しているかまたは別のアミノ酸により置換された、生物学的に活性なＩＦＮ−βタンパク質の合成タンパク質類似体が、望ましい活性および特徴を有することが見出されている。
【０００５】
特に、１７位のシステイン残基がセリン残基により置換された生物学的に活性なタンパク質である、ＩＦＮ−βの合成の組換えタンパク質類似体である、インターフェロン−β  １ｂ（ＩＦＮ−β  １ｂ）が作製された。微生物により産生されるタンパク質であるので、ＩＦＮ−β  １ｂはグリコシル化されていない。また、これはＮ末端メチオニンが欠失している。ＩＦＮ−β  １ｂは、ＭＳの治療および管理に効果があることが示されたＢｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）として市販されている、成功裏の薬に処方されている。このタンパク質類似体、その製造のための材料および技術、治療薬としてのその処方およびＭＳを処置するためのその使用が、以下を含む多くの米国特許および出願に、記載および請求されている：１９８２年１０月１９日に出願された、出願第４３５１５４号；１９８６年５月１３日に発行された、特許文献１；１９８８年４月１２日に発行された、特許文献２；１９９０年９月２５日に発行された、特許文献３；これらの各々は、これらの特徴の開示について本明細書中に参考として援用される。
【０００６】
薬用のＩＦＮ−βの大規模製造が、哺乳類供給源、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からも、行われる。このＩＦＮ−β類似体は、ＩＦＮ−β  １ａと呼ばれるが、ＩＦＮ−β  １ｂのＳｅｒ１７変異を欠き、そしてグリコシル化されている。ＩＦＮ−β  １ａは、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）およびＲｅｂｉｔｈ（登録商標）として市販される治療薬製品に処方されている。
【特許文献１】米国特許第４５８８５８５号明細書
【特許文献２】米国特許第４７３７４６２号明細書
【特許文献３】米国特許第４９５９３１４号明細書
【非特許文献１】Ｇｅｎｅ、１９８０年、第１０巻、ｐ．１１−１５
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ、１９８０年、第２８５巻、ｐ．５４２−５４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
大部分の治療薬について、より強力な生物学的活性を有する薬剤を同定および製造したいという持続的な所望がある。ＩＦＮ−βに基づいた薬の場合、上昇した生物学的活性を有するＩＦＮ−β類似体が望ましい。
【０００８】
これに加えて、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）を含む、いくつかのＩＦＮ−β処方薬は、一般的なタンパク質安定化剤であるヒトアルブミン（ＨＡまたはＨＳＡ）を含む。ＨＡはヒトの血液産物であり、ますます供給量が減っている。従って、より最近は、ＨＡを含まない薬の処方に対する所望があり、そしてＨＡを含まない、安定で有効なＩＦＮ−β処方物が所望される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、脱アミドされたインターフェロンβを提供することにより、これらの必要性と取り組む。この脱アミドされたインターフェロンβは、天然のインターフェロンβに従って番号付けをして２５位のアスパラギンが脱アミドされているヒトインターフェロン−βタンパク質類似体である。この脱アミド産物は、上昇したレベルの天然のヒトインターフェロンβの生物学的活性を表し、タンパク質の安定化のためにＨＡを必要としない。
【００１０】
特定の実施形態では、脱アミドされたＩＦＮ−βは、合成のヒトインターフェロン−β  １ｂタンパク質類似体であり、この類似体において、天然のインターフェロンβに従って番号付けをして１７位のシステインは、欠失しているかまたは中性アミノ酸、特にセリンにより置換されており、そして、２５位のアスパラギンは、それが環状イミド、アスパルテートまたはイソアスパルテート残基になるように脱アミドされている。この脱アミド産物は、ＩＦＮ−βの親タンパク質と比較して上昇したレベルの天然のヒトインターフェロンβの所望の生物学的活性（例えば、多発性硬化症の再発の頻度を減じることと相関することが示されたような、細胞の細胞変性効果または抗増殖活性）を表す。これに加えて、上昇した生物学的活性は、このタンパク質類似体のＨＡを含まない処方物においても、観察される。
【００１１】
治療用組成物におけるこの活性なタンパク質類似体化合物の処方、並びに製造方法および使用方法もまた提供される。
【００１２】
これに加えて、相対的に低いｐＨでの還元されたタンパク質の酵素消化、続いてペプチド断片のクロマトグラフィーによる分離を用いるタンパク質フィンガープリントプロフィールを生じ、脱アミド産物のＩＤ試験としての品質管理にとって有用である、エンドプロテイナーゼ−Ｃのペプチドマップ技術が提供される。
【００１３】
本発明についての、これらおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明が添付の図面と共に読まれれば、より十分に明白になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の特定の実施形態の説明）
本発明の化合物、組成物、材料、並びに、関連した技術および使用法が、いくつかの実施形態を参照して、ここで記載され得る。記載された実施形態の重要な性質および特徴は、本文中の構造に例示される。本発明はこれらの実施形態に関して記載されるが、本発明はこれらの実施形態に限定されることを意図しないことが理解されるべきである。それどころか、添付の特許請求の範囲により規定される通りの本発明の精神および範囲の内に含まれ得るような、代替物、改変物および均等物を含むことを意図している。以下の説明では、数多くの特定の詳細が、本発明の完全な理解を提供するために示される。本発明は、これら特定の詳細のうちのいくつかまたは全てがない状態で実行され得る。他の例において、周知のプロセスの操作は、本発明を不必要に曖昧にしないために、詳しくは記載されていない。
【００１５】
（序論）
本発明は脱アミドされたインターフェロンβを提供する。脱アミドされたＩＦＮ−βは、天然のインターフェロンβに従って番号付けをして２５位のアスパラギンが脱アミドされている、ヒトインターフェロンβタンパク質類似体である。Ａｓｎは、環状イミド中間体を介して脱アミドされて、Ａｓｐまたはイソ−Ａｓｐとなる。脱アミド産物は、上昇したレベルの、天然のヒトインターフェロンβの生物学的活性を表し、タンパク質安定化のためにＨＡを必要としない。治療用組成物における活性なタンパク質類似体化合物の処方、並びに製造方法および使用方法もまた、提供される。
【００１６】
「タンパク質類似体」とは、本明細書中で、一つまたはそれより多くのアミノ酸が遺伝的および／または化学的に改変されており、かつ、細胞の細胞変性効果または抗増殖活性のような、親タンパク質の生物学的活性を保持する、合成タンパク質をいう。このような生物学的活性は、多発性硬化症の再発の頻度を減じることのような、他の特定の生物学的活性と相関することが示されている。
【００１７】
特定の実施形態では、脱アミドされたＩＦＮ−βは、精製および単離された合成のヒトインターフェロン−β  １ｂタンパク質類似体であって、この類似体において、天然のインターフェロンβに従って番号付けをして１７位のシステインは、欠失しているかまたは中性アミノ酸、特にセリンにより置換されており、そして、２５位のアスパラギンは脱アミドされている。特定の実施形態では、Ａｓｎ２５は脱アミドされ、アスパルテート、イソ−アスパルテートまたは環状イミド残基（例えば、それぞれ、ＩＦＮ−βｓｅｒ１７，ａｓｐ２５、ＩＦＮ−βｓｅｒ１７，ｉｏｓ−ａｓｐ２５またはＩＦＮ−βｓｅｒ１７，ｃｙｃｌｉｃ−ｉｍｉｄｅ２５）となる。この脱アミド産物は、ＩＦＮ−β  １ｂと比較して上昇したレベルの天然のヒトインターフェロンβの生物学的活性を表す。これに加えて、上昇した生物学的活性は、このタンパク質類似体のＨＡを含まない処方物においても観察され、ＨＡを含まないＩＦＮ−β  １ｂ治療薬を可能とする。
【００１８】
本発明の合成タンパク質類似体では、１７位のシステイン残基は、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはメチオニンにより置換され得る。特定の実施形態では、この置換物は、セリン１７である。２５位のアスパラギン残基はアスパルテート、イソ−アスパルテートまたは環状イミド残基により置換された。図２を参照すると、本発明に従った、ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体の一次構造（アミノ酸配列（配列番号：２））および二次構造（フォールディング、架橋）が図示されている。２５位では、天然のＡｓｎ残基が脱アミドされる。アスパラギンの脱アミドは環状イミド中間体を介して起こる。この経路は図３に図示されている。下記でさらに詳細に記載されているように、Ｇｌｕ−Ｃペプチドマップの結果は、脱アミドの主な型はイソ−Ａｓｐ（ＩＦＮ−βｓｅｒ１７，ｉｓｏ−ａｓｐ２５）および環状イミド（ＩＦＮ−βｓｅｒ１７，ｃｙｃｌｉｃ−ｉｍｉｄｅ２５）であることを示す。
【００１９】
このタンパク質類似体は、組換え合成技術および化学的な改変技術の組合せにより、作製され得る。初めに、ＩＦＮ−β  １ｂ合成タンパク質類似体は、本出願の背景の項の中で上記に参照された特許に記載されているように、典型的に、組換えＤＮＡ指定型の変異誘発技術により作製される。指定型変異誘発技術は周知であり、Ｌａｔｈｅｒ，Ｒ．Ｆ．およびＬｅｃｏｑ，Ｊ．Ｐ．著、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８３年、ｐ．３１−５０により、概説されている。オリゴヌクレオチド指定型の変異誘発は特に、Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．およびＧｉｌｌａｍ，Ｓ．著、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９８１年、３、ｐ．１−３２により、概説されている。
【００２０】
ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体はその後、２５位のアルパラギン残基を脱アミドする化学的処理を受ける。大規模な薬の製造に採用するのに効果的で、かつ適切であり得る、多数の可能な脱アミド技術がある。そして、天然の生物学的活性、好ましくは上昇した生物学的活性を保持しながら脱アミドを達成する任意の技術が用いられ得る。概して言えば、ＩＦＮ−βタンパク質の脱アミドは、条件に依存して、中程度の温度から高い温度（例えば、約２５〜６０℃）で、そして低いｐＨ（例えば、約０〜４）から、中程度のｐＨ（例えば、約４〜１０）、高いｐＨ（例えば、約１０〜１４）までの多様なｐＨで、約１分間から約９０日間またはそれより長い反応時間でのインキュベーションにより、達成され得る。例えば、脱アミドは、６０℃まで；または約２５と４０℃との間、例えば約４０℃で、ｐＨ約４にて、少なくとも２４時間、例えば４０日間までにわたってＩＦＮ−β（例えば、ＩＦＮ−β  １ａまたはＩＦＮ−β  １ｂ）をインキュベーションすることにより達成され得る。反応時間および／または反応温度は、ｐＨを、例えば約７から約１４まで、中性ｐＨから塩基性ｐＨへと、例えば約８〜約１２、例えば約８．５に上昇させることにより、減少され得る。一つの例では、ＩＦＮ−β  １ｂ試料の生物学的活性（ＣＰＥ）は、ｐＨ８．４にて２〜８℃で１４日間処理した後、ほぼ２倍増加して約４．５ＩＵ／ｍｇとなる。実質的な活性の増加は、中程度の温度（例えば、室温）〜高い温度（例えば、３７〜４０℃）で、１４〜４０日間の処理についても、観察された。
【００２１】
脱アミドされたＩＦＮ−βタンパク質類似体を調製するための技術は、部分的にまたは実質的に純粋な産物を生じ得る。例えば、この産物中の合成タンパク質類似体うちの少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または実質的に全てが、天然のインターフェロンβに従って番号付けをして２５位において脱アミドされ得る。産物の実質的に全てより少ない産物が脱アミドされる場合、この産物はそれにも関わらず、上昇した生物学的活性およびＨＡを含まない安定性を示し得る。ある場合は、この産物中の脱アミドされたタンパク質類似体を精製および単離することが所望され得る。この精製および単離は、陽イオン交換ＨＰＬＣにより、例えば、以下の条件を用いて、達成され得る：
クロマトグラフィーの固定相：Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｍｏｎｏ  Ｓ  ＨＲ  ５／５、または均等物；
溶離緩衝液：０．５％Ｅｍｐｉｇｅｎを含む、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）；
勾配：溶離緩衝液中にて、２００ｍＭまたはそれより高濃度までのＮａＣｌの線形勾配。
製造のために、この技術は大規模に行われ得る。
【００２２】
好ましい実施形態では、合成タンパク質類似体が微生物により産生される場合、合成タンパク質類似体はグリコシル化されない。また、このタンパク質類似体はＮ末端メチオニンが欠失している。他の実施形態では、このタンパク質類似体は哺乳類細胞中にて産生され得、従ってグリコシル化され得る。
【００２３】
下記においてさらに詳細に記載されるように、様々な活性アッセイは、脱アミドされたＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体が親ＩＦＮ−βタンパク質と比較して上昇した生物学的活性を有することを実証する。そして、安定性の結果がＨＡを含まない試料で得られ、このことは、本発明の脱アミドされたＩＦＮ−βタンパク質類似体が治療薬として、ＨＡを含まない処方に適していることを示している。治療用組成物を形成するため、上記の通りの部分的または実質的に純粋なタンパク質類似体は、この種の治療用製品について周知であるような、薬学的に受容可能なキャリア媒体と混合され得る。
【００２４】
本発明の組成物がＨＡを含まない安定性を表すことは本発明の組成物の有利な性質である一方、脱アミドはＨＡを含む処方物についても行われ得、これらは本発明の範囲から除外されない。これに加えて、本発明はＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体を参照してここで主に記載されるが、一方で、本発明はＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体を含めた他のＩＦＮ−β類似体にも適用される。
【００２５】
本発明の、ＩＦＮ−βタンパク質類似体および組成物は生物学的活性を表し、このことは、患者での細胞増殖の制御、ウイルス疾患についての患者の処置および患者でのナチュラルキラー細胞の活性の刺激を含む、多数の適用における治療薬における有用性を示唆している。一つの特定の用途は、患者での多発性硬化症、特に再発−寛解ＭＳを処置することである。これに関して、本発明に従った治療薬は、多発性硬化症の再発を減じるための処置に有用である。脱アミドされたＩＦＮ−βタンパク質類似体の上昇したレベルの生物学的活性は、治療薬としての、例えば、ＭＳの処置および管理における増加した効果を示す。
【００２６】
本発明のもう一つの局面に従って、エンドプロテイナーゼ−Ｃ（Ｇｌｕ−Ｃ）のペプチドマップ技術が提供される。このペプチドマップは、相対的に低いｐＨで還元されたタンパク質試料の酵素消化、続いて消化物断片の液体クロマトグラフィー（例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣ）による分離を用いて、タンパク質についてのフィンガープリントのプロフィールを生じる。ペプチドマッピングは、本発明に従った、脱アミドされたＩＦＮ−βタンパク質類似体産物のＩＤ試験として品質管理において用いられ得る。これは、酸化または脱アミドによる削除、変異および分解のような事象に起因したタンパク質の一次構造の改変をモニターするための強力な手段である。
【００２７】
脱アミドされたＩＦＮ−βの一つの改変体は脱アミドの中間体形態である環状イミドを含むことが公知である。この環状イミド形態は安定性試料において上昇した量で見出される。ＩＦＮ−βについての従来のペプチドマップに用いられる、Ｌｙｓ−Ｃを含む大部分の酵素は、中性のｐＨから高いｐＨで、タンパク質を最適に消化する。中性のｐＨから高いｐＨで、環状イミドは不安定であり、さらなる脱アミドが人工的に誘導される。従って、還元中および消化中は低いｐＨ環境下で試料を維持することが、試料中の環状イミドおよび他の脱アミド形態（Ａｓｐ、イソ−Ａｓｐ）の両方の天然のレベルをモニターするのに必要である。
【００２８】
エンドプロテイナーゼ−Ｃ（Ｇｌｕ−Ｃ）のペプチドマップは、８未満のｐＨ、例えば、約３〜８の範囲のｐＨ、例えば、約３、４、５、６、７もしくは８またはそれらの間のｐＨにおいて機能的な還元剤と結びつけられる。適した還元剤は、トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタチオン、２−メルカプトエチルアミンおよびチオグリコール酸のような、約３〜８のｐＨで機能的な他の還元剤が用いられ得る。Ｇｌｕ−Ｃペプチドマップは、その酵素活性について、二つの最適ｐＨ（ｐＨ７．８およびｐＨ４．０）を有する。上記のように、ＴＣＥＰは８．０未満のｐＨで機能的であることが知られている。一つの実施形態では、新しいＧｌｕ−Ｃペプチドマップは、ＴＣＥＰによる還元、および、天然のレベルの脱アミドされた形態、例えば、試料中の環状イミドを保存するための最適ｐＨ範囲にある、低いｐＨ４．０での消化の両方を含む、試料調製を用いる。この新しいマップ技術は、ＩＦＮ−β試料中の環状イミドを含めた脱アミドされた形態を含んだ消化物断片を特徴づけるために用いられ得る。
【００２９】
ＩＦＮ−β試料は、脱アミド位置およびその形態（例えば、Ａｓｐ、イソ−Ａｓｐ、環状イミド）を同定するために、Ｇｌｕ−Ｃペプチドマップにより試験され得る。緩衝化された処方物におけるタンパク質試料（例えば、２〜５００ｍＭの緩衝剤の処方緩衝液中、または、ある場合、５０〜１００ｍＭの、以下のような塩中の０．１〜１０、例えば、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度の、０．５ｍｌのタンパク質試料：アスパラギン酸塩、重炭酸塩（例えば、炭酸水素アンモニウム）、炭酸塩（例えば、炭酸アンモニウム）、酢酸塩（例えば、酢酸アンモニウム）、リン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム）、クエン酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパン、ＡＤＡ、ＢＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＴＥＡなど；これらの適切な選択および使用は、所望のｐＨ（例えば、２ｍＭアスパラギン酸、ｐＨ４）について当業者に公知である）は、ＴＣＥＰを用いて、例えば、１：２〜１：３０、例えば、１：１０のように、１：３、１：４、１：５、１：１０または１：２０のモル比率のタンパク質対ＴＣＥＰを用いて、還元され得る。この試料は、例えば、約３０〜４０℃（例えば、３７℃）で、試料物質が還元されるまで、インキュベートされる。適したインキュベート時間は、試料の不安定性に依存して、約５分から２４時間まで、例えば、３時間であり得る。還元された物質は引き続いて、１：１〜２０：１（または２：１、３：１、４：１、１０：１などを含め、任意の適した中間の比率）、例えば、５：１のタンパク質対Ｇｌｕ−Ｃの質量比率で例えば１〜１０、例えば４ｍｇ／ｍｌのＧｌｕ−Ｃを用いて消化され、そして例えば、約３０〜４０℃（例えば、３７℃）で、試料物質が消化されるまで、インキュベートされる。適した消化時間は、試料の不安定性に依存して、約５分から２４時間まで、例えば、４時間であり得る。ペプチド断片は、液体クロマトグラフィー、例えばＲＰ−ＨＰＬＣにより分離され得る。
【００３０】
特定のペプチドマップの実験およびその結果が下記の実施例の項に記載されている。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例は、本発明の局面を例示するが、本発明を制限するとは決して意図していない。これらの様々な実施形態では、環状イミドとおよび他の脱アミドされた形態（Ａｓｐおよびイソ−Ａｓｐ）という、効力の増加を示した二つの主な区別できる種の間の識別をする。いずれも脱アミドされた形態であるが、環状イミドと他の脱アミドされた形態（Ａｓｐおよびイソ−Ａｓｐ）との間の相違点を指摘する。特に図のラベル中において、前者を時々「環状イミド」と呼び、一方、後者を時々「脱アミドされた」または「脱アミド」と呼ぶ。
【００３２】
（実施例１：ＨＡを含まないＩＦＮ−β  １ｂ安定性試料における効力の増加）
（要約）
ＨＡを含まないＩＦＮ−β  １ｂ安定性試料における効力の増加が観察された。細胞変性効果（ＣＰＥ）のバイオアッセイにより、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの２５℃の安定性試料において、（Ｔ＝０〜６ヶ月）の時間経過において、効力の増加が示された。最終的な脱アミド産物およびその中間体である環状アミドもまた、２５℃の安定性試料において、増加されることが観察された。
【００３３】
Ｇｌｕ−Ｃペプチドマッピングにより、Ａｓｎ２５の脱アミド位置が同定され、そして、ＨＡを含まないＩＦＮ−β  １ｂ安定性試料における主な脱アミド形態がイソ−Ａｓｐおよび環状イミド類似体である一方で、Ａｓｐ形態がわずかに増加することが示された。
【００３４】
ＲＰ−ＨＰＬＣ法から得た結果により、脱アミドされた形態（環状イミド、Ａｓｐおよびイソ−Ａｓｐ）が、ＨＡを含まないＩＦＮ−β安定性試料において、著しく増加することが示された。
【００３５】
ＨＡを含まないＩＦＮ−β安定性試料における脱アミド形態は、ＣＰＥおよび効増殖アッセイにより、元の（アミド化された）ＩＦＮ−βより高い生物学的活性が示された。
【００３６】
これらの知見に基づいて、脱アミド（Ａｓｐ、イソ−Ａｓｐおよび環状イミド類似体を形成する）は、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの生物学的活性を促進すると考えられる。従って、ＨＡを含まないかまたはＨＡを含むかのいずれの場合も、ＩＦＮ−βに基づいた治療薬の生物学的活性を促進するために、脱アミドされた形態のＩＦＮ−βを調製することが可能である。中程度から高い温度で、および／または低い、中程度または高いｐＨで、ＩＦＮ−β溶液（ＨＡを含まないかまたはＨＡを含むかのいずれか）をインキュベートすることにより、脱アミドされた類似体を調製することが可能である。本発明の脱アミドされた産物は、要求された臨床的な用量を減少させ、そして、室温での液体のＩＦＮ−β処方物の安定性を増加させる。臨床的な用量を減じると、有害な免疫反応（例えば、中和抗体）を受ける患者の割合が減少する。
【００３７】
ＩＦＮ−β  １ｂ調製物の様々な安定性の研究および解析から得た、本発明を実証するデータを下に提供する：
１．ＨＡを含まないＩＦＮ−β安定性のデータ
以下の表１（薬剤物質：２ｍＭアスパラギン酸、ｐＨ４．０において）および表２（薬剤産物：２ｍＭアスパラギン酸、ｐＨ４．０、９％トレハロースにおいて）に示すように、細胞変性効果（ＣＰＥ）のバイオアッセイは、ＨＡを含まないＩＦＮ−β  １ｂの２５℃の安定性試料において、（Ｔ＝０〜６ヶ月）の時間経過で、効力の増加を示した：
【００３８】
【表１】
2008519769.tif 000003
【００３９】
【表２】
2008519769.tif 000004
以下の表３および表４に示すように、陽イオン交換（ＣＥＸ）−ＨＰＬＣは、それぞれ、薬剤物質および薬剤産物の２５℃試料の安定性のデータもまた脱アミド（Ｄ−ＩＦＮ−β）の増加を示したことを実証している：
【００４０】
【表３】
2008519769.tif 000005
【００４１】
【表４】
2008519769.tif 000006
以下の表５および表６は、脱アミドの環状イミド中間体形態を表す、ピークＤの増加もまた、それぞれ、薬剤物質および薬剤産物の２５℃試料における、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ技術により、時間が経つにつれて観察されたことを示す：
【００４２】
【表５】
2008519769.tif 000007
【００４３】
【表６】
2008519769.tif 000008
図４〜図１１は、本発明の一局面に従った、様々なＨＡを含まないＩＦＮ−βの安定性薬剤物質および製品ロット中の脱アミドされたＩＦＮ−β  １ｂの量（「％Ｄ−ＩＦＮ」または「％ピークＤ」）に対する効力のプロットを示す。これらのデータは、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの効力の増加とＨＡを含まないＩＦＮ−βの脱アミドのレベルとの間に相関があることを実証している。
【００４４】
２．ＨＡを含まないＩＦＮ−β安定性試料の特徴づけ
ＩＦＮ−β  １ｂの一次配列を図３に示す。脱アミドがＡｓｎ２５で起こることが見出された。脱アミドの性質、および脱アミドされた産物の性質を、下記のアッセイにおいて調べた：
２．１．Ｇｌｕ−Ｃペプチドマップ
ペプチドマップは、酵素消化、続いてＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、タンパク質のフィンガープリンドのプロフィールを生じる。ペプチドマッピングは通常、ＩＤ試験としての品質管理に利用される。これはまた、酸化または脱アミドに起因した削除、変異および分解のような事象によるタンパク質の一次構造のマイナーな改変をモニターするための強力な手段である。ＨＡを含まないＩＦＮ−βは環状イミドという、脱アミドの中間形態を含むことが公知である。この環状イミドは、ＨＡを含まないＩＦＮ−β中の、重要な分解された改変体であって、安定性試料において、上昇した量で見出される。ＨＡを含まないＩＦＮ−βについての現在のペプチドマップに用いられる大部分の酵素は、Ｌｙｓ−Ｃを含め、中性から高いｐＨにおいてタンパク質を最適に消化する。中性から高いｐＨでは、環状イミドは不安定であって、脱アミドが人工的に誘導される。従って、還元中および消化中は低いｐＨ環境下で試料を維持することが、試料中の環状イミドの天然のレベルおよび脱アミドをモニターするのに重要である。
【００４５】
ＨＡを含まないＩＦＮ−β中の、環状イミドを含め、脱アミドされた形態を含んだ断片を特徴づけるため、還元剤としてのトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）と結びつけられた、新しいエンドプロテイナーゼＣ（Ｇｌｕ−Ｃ）ペプチドマップが開発された。Ｇｌｕ−Ｃペプチドマップは、その酵素活性についてｐＨ７．８およびｐＨ４．０という二つの最適ｐＨを有することが公知である。ＴＣＥＰは８．０未満のｐＨで機能的であることが公知である。試料中の天然レベルの脱アミドされた形態（例えば、環状イミド）を保存するのに最適なｐＨ範囲にある、４．０という低いｐＨでの還元および消化の両方を含む試料調製を用いて、新しいＧｌｕ−Ｃペプチドマップを開発した。ここで開発したペプチドマップは低いｐＨの試料調製を採るため、ＨＡを含まないＩＦＮ−β中の、天然レベルの脱アミドされた形態の正確なモニタリングが成功裏に達成される。
【００４６】
ＨＡを含まないＩＦＮ−β  １ｂ薬剤産物のロットＴＡ２４５１（２５℃で、３、６および９ヶ月）の安定性試料を、脱アミド部位およびその形態（例えば、Ａｓｐ、イソ−Ａｓｐ、環状イミド）を同定するため、Ｇｌｕ−Ｃペプチドマップにより試験した。２ｍＭのアスパラギン酸、ｐＨ４．０の処方緩衝剤中で０．５ｍｇ／ｍｌという濃度の、各０．５ｍｌのタンパク質試料を、ＴＣＥＰを用いて還元した。１：１０のモル比率のタンパク質対ＴＣＥＰを用いて、試料を３７℃で３時間インキュベートした。還元された物質を、その後、５：１の質量比率のタンパク質対Ｇｌｕ−Ｃで、４ｍｇ／ｍｌのＧｌｕ−Ｃを用いて消化し、そして３７℃で４時間インキュベートした。ペプチド断片を、溶出緩衝液として０．１％のトリフロオロ酢酸中アセトニトリルの勾配を用いる、流速１．０ｍｌ／分およびカラム温度３８℃でのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー（ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ  ＢｉｏＢａｓｉｃ  Ｃ１８、１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）により、分離した。
【００４７】
図１２Ａは、本発明の一局面に従った、ＨＡを含まないＩＦＮ−β安定性試料のＧｌｕ−Ｃペプチドマップを示す。図１２Ｂは、図１２Ａのマップの２２〜２６分のＲＴ部分の拡大図を示す。
【００４８】
図に示すように、断片Ｅ１のピークは時間経過に従って減少したが、一方で、イソ−Ａｓｐ、環状イミドおよびＡｓｐを表すピークは増加した。これらのピークは、断片Ｅ１における、２５位のＡｓｎの脱アミドされた形態である。このピークの特徴づけを、Ｅ１関連断片のリシルエンドペプチダーゼ消化により得たＥ１サブ断片の質量分析およびエドマン配列決定により行った。Ａｓｎ２５残基は、グリシンが後に続くアミノ酸配列を有する。このＡｓｎ−Ｇｌｙ配列は、速い速度の脱アミドを有することが公知である。
【００４９】
このＧｌｕ−Ｃペプチドマップの結果に基づき、ＨＡを含まないＩＦＮ−β安定性試料における脱アミドの主な形態がイソ−Ａｓｐおよび環状イミドであることが確認された。Ａｓｐ形態のレベルのわずかな上昇もあった。
【００５０】
２．２．ＲＰ−ＨＰＬＣ
ＲＰ−ＨＰＬＣは、疎水性に基づいて化合物を分離する。ＨＡを含まないＩＦＮ−β  １ｂ試料を、ＩＦＮ−β  １ｂ改変体（例えば、Ａｓｐ、イソ−Ａｓｐ、環状イミド）を特徴づけるために、ＲＰ−ＨＰＬＣ法により試験した。試験試料をＺｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−ＣＮ、１５０×４．６ｍｍ、３．５μｍの粒子サイズのクロマトグラフィーカラムに注入し、そして、ＩＦＮ−β  １ｂ改変体を、０．１％トリフルオロ酢酸溶出緩衝液中にてアセトニトリルの勾配を用いて、分離した。対照の試料の結果を図１３に示す。
【００５１】
図に示したピークの同定を、オンラインのＬＣ／質量分析（ＲＰ−ＨＰＬＣ／Ｑ−ＴＯＦ／ＥＳＩ−ＭＳ）により行った。ＨＰＬＣの流れをおよそ１：２０に分け、そして質量分析器のイオン供給源に約５０μｌ／分を向けた。質量分析器は、エレクトロスプレーイオン供給源を有する、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ２機器であった。データを、飛行時間型（ＴＯＦ）分析器を用いて３００ｍ／ｚと２５００ｍ／ｚとの間で収集した。イオン電圧を３２００に、円錐体電圧を５０に設定した。オンラインのＬＣ／質量のデータは、ＲＰ−ＨＰＬＣのピークのうちのいくつかの下で共に溶出する一つより多くのタンパク質改変体が存在することを示す。
【００５２】
図１４は、ＨＡを含まないＩＦＮ−β  １ｂ薬剤製品のロット（２５℃で約１０ヶ月）の安定性試料のＲＰ−ＨＰＬＣのプロフィールを示す。図に示すように、このプロフィールは対照の試料のプロフィール（図１３）と異なり、環状イミド（ピークＤ）および脱アミド（Ａｓｐおよび／またはイソ−Ａｓｐ）（中央のピーク）は、ＨＡを含まないＩＦＮ−β  １ｂ中で有意に増加した。複数のマイナーな、他の脱アミドされた、および環状のイミド改変体が観察される。これらは、さらなる構造の、および化学的な改変を伴っており、異なる疎水的な性質に起因して分離される、脱アミドされた、および環状のイミド改変体である。
【００５３】
２．３．ＣＰＥバイオアッセイ
ＩＦＮ−βは哺乳類細胞内で抗ウイルス状態を誘導し、この状態では、いくつかのウイルス種は複製することおよび細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）を引き起こすことを阻害される。Ａ５４９ヒト肺癌細胞およびマウス脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルスを用いて、ＨＡを含まないＩＦＮ−β  １ｂ薬剤製品のロット（２５℃で約１０ヶ月）の安定性試料から得たＲＰ−ＨＰＬＣ画分の生物学的活性を評価した。
【００５４】
細胞を９６穴プレート内にて増殖させ、ウイルス添加前に一晩、ＩＦＮ−β  １ｂの系列希釈物で処理した。培養物を、その後、ウイルスの複製を許容するに適切な期間にわたってインキュベートした。充分なＩＦＮ−β  １ｂで処理した細胞は、ウイルス負荷から保護された。そして生存し続ける。保護されない細胞は細胞変性性の負荷を受け、死亡した。インターフェロンの用量に依存したＣＰＥを、染色技術、およびＩＦＮ−βの濃度に対する細胞生存率のプロット（最適密度測定）から作成した用量応答曲線を用いて定量した。ＩＦＮ−βの活性を、最大の細胞の保護の半分に必要な濃度（ＥＤ５０濃度）として算出した。
【００５５】
図１５に示すように、脱アミドされた画分（中央のピーク、画分１６）におけるＣＰＥ活性は、親のＩＦＮ−β  １ｂ画分（ピークＢ、画分１８）におけるより有意に著高い。環状イミドの画分（ピークＤ、画分１５）も親のＩＦＮ−β  １ｂ画分よりも高いＣＰＥ活性を示す。
【００５６】
２．４．抗増殖アッセイ
ＩＦＮ−βはヒトの腫瘍から確立された多数の細胞株に対する抗増殖活性を示す。二つの細胞株（Ｈｓ２９４Ｔ（ヒト黒色腫細胞株）およびＤａｕｄｉ（バーキットリンパ腫由来のヒトＢリンパ芽球株））を、ＨＡを含まないＩＦＮ−β  １ｂ薬剤製品のロット（２５℃で、約１０ヶ月）の安定性試料から得たＲＰ−ＨＰＬＣ画分の生物学的活性を評価するために用いた。
【００５７】
ＩＦＮ−β試験試料の系列希釈を、９６穴プレート内にて行った。応答細胞を組織培養培地中にて調製し、そしてアッセイプレートに添加した。３日間のインキュベーションの後、増殖応答を測定するために、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅによる細胞の染色またはＣｏｕｌｔｅｒカウンターによる計数を用いた。細胞増殖は用量依存的にＩＦＮ−βに応答して阻害された。用量応答曲線を、ＩＦＮ−βの濃度に対する細胞数（最適密度の測定値）のプロットから作成した。ＩＦＮ−βの活性を、最大の細胞増殖の半分に必要な濃度（ＥＤ５０濃度）として算出した。
【００５８】
図１６Ａ（Ｈｓ２９４Ｔ）および図１６Ｂ（Ｄａｕｄｉ）に示すように、脱アミドされた画分（中央のピーク、画分１６）および環状イミドの画分（ピークＤ、画分１５）の抗増殖活性は、親のＩＦＮ−βの画分（ピークＢ、画分１８）の抗増殖活性より著しく高い。
【００５９】
３．結論
上記の研究から得た安定性のデータおよび結果に基づいて、脱アミド（２５位のＡｓｎを置換している、Ａｓｐ、イソ−Ａｓｐおよび環状イミド）はＩＦＮ−βの生物学的活性を増強する。従って、化合物の生物学的活性を高めるために、ＩＦＮ−β、例えば、ＩＦＮ−β  １ｂの脱アミドされた形態を意図的に調製し得る。脱アミドされた形態を、中程度から高い温度で、または低い、中程度もしくは高いｐＨ環境でＩＦＮ−βをインキュベートすることにより、調製し得る。本発明の脱アミドされた製品は、必要な臨床的用量を減少させ、そして、ＨＡを含まないＩＦＮ−β処方物およびＨＡを含むＩＦＮ−β処方物を含めた、液体のＩＦＮ−β処方物の、室温における安定性を増加させる。臨床的な用量を減少させると、有害な免疫反応（例えば、中和抗体）を経験する患者の割合が減少する。
【００６０】
（実施例２：製造可能性のデータ）
上記の通り、様々な脱アミド技術を実証するために、実験を行った。ＣＰＥバイオアッセイから得たデータは、脱アミドされたＩＦＮ−βを大規模な薬の産生に適切なプロセスにより容易に調製されることを明示する。特に、有意な生物活性の増加が、中程度の温度（例えば、室温）から高い温度（例えば、３７〜４０℃）で１４〜４０日間インキュベートされた、医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の下で製造した様々な試料において観察された。そして、ＧＭＰ試料を、室温でｐＨ８．８にて約１時間インキュベートすることにより、および２〜８℃でｐＨ８．４にて約１４日間インキュベートすることにより、ほぼ２倍の生物活性の増加が得られた。
【００６１】
ＣＰＥバイオアッセイの結果
【００６２】
【表７】
2008519769.tif 000009
【００６３】
【表８】
2008519769.tif 000010
（結論）
前記の発明を、理解を明確にする目的で、ある程度詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲の範囲内において、特定の変化および改変を実行し得ることは明白である。本発明のプロセスおよび組成物の両方を実行する多くの代替法が存在することは注意されるべきである。従って、本発明の実施形態が例示であって限定ではないと考えられるべきであり、そして、本発明は本明細書で与えた詳細に限定されるべきではないが、本発明を添付の特許請求の範囲の範囲および均等物内で改変され得る。
【００６４】
本明細書で引用した全ての文書は、それらの全体が、そして全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、ＩＦＮ−βのアミノ酸配列の図である。
【図２】図２は、本発明に従った脱アミドの位置および性質を示している、ＩＦＮ−β  １ｂのアミノ酸配列の図である。
【図３】図３は、本発明に従ったＩＦＮ−βのＡｓｎ２５脱アミドを参照してＡｓｎの脱アミドの経路を説明する図である。
【図４】図４は、本発明の一局面に従って、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの安定薬剤物質および製品ロット中での、脱アミドされたＩＦＮ−β  １ｂの量に対する効力のプロットを示す。
【図５】図５は、本発明の一局面に従って、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの安定薬剤物質および製品ロット中での、脱アミドされたＩＦＮ−β  １ｂの量に対する効力のプロットを示す。
【図６】図６は、本発明の一局面に従って、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの安定薬剤物質および製品ロット中での、脱アミドされたＩＦＮ−β  １ｂの量に対する効力のプロットを示す。
【図７】図７は、本発明の一局面に従って、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの安定薬剤物質および製品ロット中での、脱アミドされたＩＦＮ−β  １ｂの量に対する効力のプロットを示す。
【図８】図８は、本発明の一局面に従って、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの安定薬剤物質および製品ロット中での、脱アミドされたＩＦＮ−β  １ｂの量に対する効力のプロットを示す。
【図９】図９は、本発明の一局面に従って、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの安定薬剤物質および製品ロット中での、脱アミドされたＩＦＮ−β  １ｂの量に対する効力のプロットを示す。
【図１０】図１０は、本発明の一局面に従って、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの安定薬剤物質および製品ロット中での、脱アミドされたＩＦＮ−β  １ｂの量に対する効力のプロットを示す。
【図１１】図１１は、本発明の一局面に従って、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの安定薬剤物質および製品ロット中での、脱アミドされたＩＦＮ−β  １ｂの量に対する効力のプロットを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、本発明の一局面に従った、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの安定性試料におけるＧｌｕ−Ｃペプチドのマップを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１２Ａのマップの一部分の拡大図を示す。
【図１３】図１３は、ＨＡを含まないＩＦＮ−βの対照試料における、ＲＰ−ＨＰＬＣのプロフィール（時間（分）対応答（ｍＶ））を示す。
【図１４】図１４は、本発明の一局面に従った、ＨＡを含まないＩＦＮ−β  １ｂの薬品ロットの安定性試料における、ＲＰ−ＨＰＬＣのプロフィールを示す。
【図１５】図１５は、本発明の一局面に従った、ＨＡを含まないＩＦＮ−β安定性試料のＲＰ−ＨＰＬＣ画分のＣＰＥ活性のプロットを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、本発明の一局面に従った、ＨＡを含まないＩＦＮ−β安定性試料のＲＰ−ＨＰＬＣ画分についての、Ｈｓ２９４Ｔに対する抗増殖活性の結果のプロットを示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、本発明の一局面に従った、ＨＡを含まないＩＦＮ−β安定性試料のＲＰ−ＨＰＬＣ画分についての、Ｄａｕｄｉに対する抗増殖活性の結果のプロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【国際調査報告】
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2008519769.tif 000030
2008519769.tif 000031