(57)【要約】  本発明は、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び関連網膜症疾患を治療するための方法を提供する。本方法は、網膜の損傷領域の有益な生理的血行再建を促進し、疾患によって引き起こされた網膜への損傷を改善するために有効な、血管栄養系統陰性の造血幹細胞集団からの細胞の一定量を、未熟児網膜症又は関連網膜症疾患に罹患している又は前記疾患を発症する危険性がある哺乳動物の網膜に投与することを含む。好ましくは、哺乳動物はヒト患者である。１つの好ましい実施形態では、系統陰性造血幹細胞集団は、造血幹細胞及び内皮前駆細胞を含む系統陰性造血幹細胞集団（すなわちＬｉｎ−ＨＳＣ）である。もう１つの好ましい実施形態では、系統陰性造血幹細胞集団は、細胞の大部分が系統陰性であり、ＣＤ４４抗原及びＣＤ１１ｂ抗原を発現する単離骨髄球様骨髄（ＭＬＢＭ）細胞集団である。選択的に、新生児の治療のために、系統陰性造血幹細胞集団を臍帯静脈血から単離することができる。
2008536804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜の損傷領域の有益な生理的血行再建を促進し、疾患によって引き起こされた網膜への損傷を改善するために有効な血管栄養系統陰性の造血幹細胞集団からの細胞の一定量を哺乳動物の網膜に投与することを含む、未熟児網膜症又は関連網膜症疾患に罹患している又は前記疾患を発症する危険性がある哺乳動物を治療する方法。
【請求項２】
系統陰性造血幹細胞集団が、骨髄に由来する造血幹細胞及び内皮前駆細胞を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
系統陰性造血幹細胞集団が、哺乳動物から骨髄を単離すること、骨髄から系統陽性細胞を除去すること、及び骨髄から系統陰性造血幹細胞集団を回収することを含む方法によって生産される、請求項２の方法。
【請求項４】
系統陽性細胞が、骨髄からの単球を少なくとも１個の系統パネル抗体で処理すること及び少なくとも１個の系統パネル抗体と免疫反応する細胞を単球から分離することによって除去される、請求項３の方法。
【請求項５】
系統陰性造血幹細胞集団が、細胞の大部分が系統陰性であり、及びＣＤ４４抗原及びＣＤ１１ｂ抗原を発現する、単離骨髄球様骨髄細胞集団である、請求項１の方法。
【請求項６】
単離骨髄球様骨髄細胞集団が、哺乳動物から骨髄を単離すること及び抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１１ｂ及びこれらの組合せからなる群より選択される抗体と免疫反応する骨髄からの細胞を陽性選択することによって生産される、請求項５の方法。
【請求項７】
系統陰性造血幹細胞集団が臍帯静脈血から単離される、請求項１の方法。
【請求項８】
哺乳動物がヒトである、請求項１の方法。
【請求項９】
哺乳動物が新生児哺乳動物である、請求項１の方法。
【請求項１０】
新生児哺乳動物が、高酸素状態に暴露されたことがある、請求項１の方法。
【請求項１１】
細胞が眼内注射によって投与される、請求項１の方法。
【請求項１２】
細胞が、治療される哺乳動物にとって自己由来である、請求項１の方法。
【請求項１３】
細胞が、疾患症状の発現前に投与される、請求項１の方法。
【請求項１４】
細胞が、哺乳動物が高酸素状態に暴露される前に投与される、請求項１の方法。
【請求項１５】
細胞が、細胞を投与する前に治療的に有用な遺伝子で形質移入される、請求項１の方法。
【請求項１６】
治療的に有効な遺伝子が、Ｔｒｐ−ＲＳの血管新生抑制フラグメントをコードする、請求項１５の方法。
【請求項１７】
Ｔｒｐ−ＲＳの血管新生抑制フラグメントが、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ（配列番号３）又はＴ２−ＴｒｐＲＳ−ＧＤ（配列番号４）である、請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜症疾患を治療するための方法に関する。より詳細には、本発明は、未熟児網膜症及び関連網膜症疾患を、前記疾患に罹患している又は前記疾患を発症する危険性がある哺乳動物の眼に系統陰性造血幹細胞を投与することによって治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病性網膜症、滲出性加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び血管閉塞を含む網膜の血管疾患は、視覚障害及び失明の主要原因である。この疾患群は、病的眼新生血管形成を予防又は調節するのを助ける新規治療方法を特定することを目的とした集中的研究の焦点である。例えばＡＲＭＤは、６５歳超の１２００万〜１５００万のアメリカ人に影響を及ぼし、脈絡膜（網膜下）血管新生の直接作用として彼らの１０〜１５％において視力欠損を生じさせる。６５歳以下のアメリカ人の視力欠損の主要原因は糖尿病である；米国では１６００万人が糖尿病患者であり、年間４０，０００人が、しばしば網膜血管新生の結果である、この疾患の眼合併症に罹患する。レーザー光凝固術は、高危険度糖尿病患者の小群において重症視力欠損を予防する上で有効であったが、網膜症の１０年間の全体的発生率は実質的に変わらないままである。ＡＲＭＤ又は眼ヒストプラスマ症などの炎症性眼疾患に起因する脈絡膜血管新生を有する患者に関しては、光凝固術は、ほとんど例外なく、視力欠損を予防する上で効果がない。最近開発された非破壊的光線力学的療法は、これまで治療不能の脈絡膜血管新生を有する患者において個々の障害を一次的に軽減するためには有望であるが、３〜４ヶ月ごとに治療された患者の６１．４％だけが、プラセボ処置群の４５．９％と比較して改善された又は安定化された視力を有していた。
【０００３】
加齢性黄斑変性及び糖尿病性網膜症は先進工業国における視力欠損の主要原因であり、異常網膜血管新生の結果として起こる。網膜は、神経、グリア及び血管要素の明瞭な層からなるので、血管増殖又は水腫で見られるような比較的小さな障害が視覚機能の重大な喪失へと導き得る。色素性網膜炎（ＲＰ）などの遺伝性網膜変性も、細動脈狭窄及び血管萎縮のような血管異常に結びつく。血管新生を促進する及び阻害する因子を特定する上で大きな進歩が為されてきたが、現在のところ、眼血管疾患を特異的に治療するために使用できる治療法はない。
【０００４】
網膜の遺伝性変性は、３５００人に１人が罹患し、しばしば完全な失明へと進行する、進行性夜盲症、視野欠損、視神経萎縮、細動脈減弱、血管透過性の変化及び中央部の視力喪失を特徴とする（Ｈｅｃｋｅｎｌｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｒ．編集、１９８８；Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＪＢ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．）。これらの疾患の分子遺伝学的分析は、公知の罹患個体の比較的小さなパーセンテージだけを説明する、１１０以上の異なる遺伝子における突然変異を特定した（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０４−８０８；Ｆａｒｒａｒら、２００２，ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：８５７−８６４）。これらの突然変異の多くは、ロドプシン、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ、ｒｄｓペリフェリン及びＲＰＥ６５を含む光情報伝達機構の酵素及び構造成分に関連する。これらの所見にもかかわらず、これらの網膜変性疾患の進行を遅らせる又は逆転させる有効な治療法はまだない。遺伝子治療における最近の進歩は、特定突然変異を有する動物において野生型導入遺伝子を光受容器又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）に送達したとき、マウスにおけるｒｄｓ（Ａｌｉら、２０００，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２５：３０６−３１０）及びｒｄ（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７８１２−７８１６）表現型及びイヌにおけるＲＰＥ６５表現型（Ａｃｌａｎｄら、２００１，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：９２−９５）を逆転させることに成功した。
【０００５】
血管新生は新しい血管が形成する過程である。特定化学シグナルに応答して、毛細血管が既存の脈管から発芽し、最終的に生物によって必要とされる大きさに成長する。最初に、血管の内層を覆う内皮細胞が既存脈管と直角の方向に分かれ、堅い新芽を形成する。次に、隣接内皮細胞が、大きな空胞を形成し、空胞が端と端を接するように自らを位置づけ、最終的に結合して新しい毛細血管の管腔を形成するように細胞が再配列する（管形成）。
【０００６】
血管新生は、創傷に対する応答のような多くの条件によって刺激され、哺乳動物などの脊椎動物では実質的に全ての組織成長に伴って起こる。血管新生はまた、糖尿病性網膜症及びある種の癌などのある種の疾患状態において役割を果たす。例えば腫瘍の増殖は、増殖する腫瘍組織に酸素と養分を与えるために血管増殖を必要とする。
【０００７】
血管新生は、血管新生過程を刺激する化学シグナルに干渉することによって停止又は阻害し得る。例えば血管新生内皮細胞は、血管を取り囲む基底膜を消化するためにプロテアーゼを生産し、これによって新しい毛細血管のための通路を切り開く。これらのプロテアーゼ又はこれらの形成の阻害は新しい血管の形成を防ぐことができる。同様に、内皮細胞は化学的シグナルに応答して増殖する。特に重要な増殖シグナルは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びタンパク質の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーを含む。ＶＥＧＦはある種の腫瘍の血管新生に関与することが示された。これらの増殖シグナル伝達過程に干渉することも、血管新生を阻害することができる。
【０００８】
いくつかの因子が血管新生に関与する。酸性及び塩基性の両方の線維芽細胞増殖因子分子が、内皮細胞及び他の細胞型のための分裂促進因子である。血管内皮細胞のための高度選択的分裂促進因子は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。
【０００９】
健常成人では、血管新生は厳格に調節されており、創傷治癒、妊娠及び子宮周期に限定される。血管新生は、塩基性及び酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＶＥＧＦ、アンギオゲニン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）などの特定血管新生分子によって作動される。血管新生は、インターフェロン−α、トロンボスポンジン−１、アンギオスタチン及びエンドスタチンなどの阻害分子によって抑制され得る。正常な静止毛細血管系を制御するのは、これらの天然に生じる刺激因子と阻害因子の平衡である。ある種の疾患状態におけるように、この平衡が崩れたとき、毛細血管内皮細胞は、増殖し、移動し、最終的に分化するように誘導される。
【００１０】
血管新生は、癌及び眼血管新生を含む様々な疾患において中心的役割を果たす。様々な腫瘍の持続的増殖と転移もまた、腫瘍由来血管新生因子に応答した、腫瘍内への新しい宿主血管の増殖に依存することが示された。様々な刺激に応答した新しい血管の増殖は、増殖性糖尿病性網膜症、ＡＲＭＤ、血管新生緑内障、角膜実質炎及び未熟児網膜症を含む眼疾患及び盲の大部分における主要所見として起こる。これらの疾患では、組織損傷が、毛細血管増殖を生じさせる血管新生因子の放出を刺激し得る。ＶＥＧＦは、虹彩血管新生及び血管新生網膜症において支配的役割を果たす。報告は眼内ＶＥＧＦレベルと虚血性網膜症眼血管新生との間の相関を明らかに示すが、おそらくＦＧＦが役割を果たしている。検出可能なレベルが一貫して血管新生と相関するわけではないが、塩基性及び酸性ＦＧＦは健常成人網膜に存在することが知られている。これは主として、ＦＧＦが細胞外マトリックスの荷電成分と非常に固く結合しており、眼内液の標準アッセイによって検出される自由拡散形態では容易に入手可能でない場合があるという事実によると考えられる。
【００１１】
血管新生応答における最終共通経路は、増殖性血管内皮細胞と細胞外マトリックスとの間のインテグリンを介した情報交換を含む。インテグリンと呼ばれる、接着受容体のこのクラスは、全ての細胞上でα及びβサブユニットを有するヘテロ二量体として発現される。１つのこのようなインテグリン、αｖβ３はこのファミリーの最も無差別な成員であり、内皮細胞が多種多様な細胞外マトリックス成分と相互作用することを許容する。このインテグリンのペプチド及び抗体拮抗物質は、増殖性血管内皮細胞のアポトーシスを選択的に誘導することによって血管新生を阻害する。血管新生の２つのサイトカイン依存性経路が存在し、異なる血管細胞インテグリン、αｖβ３及びαｖβ５へのこれらの依存性によって定義され得る。詳細には、各々のインテグリンの抗体拮抗物質は、ウサギ角膜及びヒナ絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデルにおいてこれらの血管新生経路の１つを選択的にブロックするので、塩基性ＦＧＦ及びＶＥＧＦ誘導の血管新生はそれぞれインテグリンαｖβ３及びαｖβ５に依存する。全てのαｖインテグリンをブロックするペプチド拮抗物質は、ＦＧＦ及びＶＥＧＦ刺激性血管新生を阻害する。健常ヒト眼血管はどちらのインテグリンも提示しないが、αｖβ３及びαｖβ５インテグリンは、活性血管新生眼疾患を有する患者からの組織において血管上に選択的に提示される。αｖβ３だけがＡＲＭＤを有する患者からの組織において一貫して認められたが、増殖性糖尿病性網膜症を有する患者からの組織中にはαｖβ３及びαｖβ５の両方が存在した。全身投与したインテグリンのペプチド拮抗物質は、網膜脈管形成のマウスモデルにおいて新しい血管形成をブロックした。
【００１２】
網膜血管新生疾患のための潜在的治療を試験することは、子ネコ、幼弱ビーグル犬、ラット及びマウスを含むいくつかの動物種における酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）のモデルの開発によって大きく促進された。これらのモデルの各々において、新生児動物を高酸素状態（又は交互に起こる高酸素状態と低酸素状態）に暴露すると、網膜血管発生の後退又は遅延が促され、続いて、正常酸素レベルへの回復後に異常血管新生が起こる。これらのモデルは、未熟児に影響を及ぼし得る病的血管新生を含む状態である、未熟児網膜症（ＲＯＰ）の間に起こる事象を反映する。
【００１３】
この１０年間にわたって、ＯＩＲのマウスモデルは酸素誘導網膜症に関連する異常血管新生を検討するための最も一般的なモデルとなってきた。このモデルにおける血管異常のパターンは、ＲＯＰで認められるものとはわずかに異なる；マウスでは中心後部網膜が高酸素状態への暴露後に無血管となるが、ヒト乳児では末梢が無血管である。これにもかかわらず、これは、高酸素症誘導性網膜症の疾患機構と潜在的治療を検討するための広く受け入れられているモデルであり、血管の変化は非常に一致し、再現性があり、定量化可能である。近年、このモデルの使用は、虚血性血管症及び関連する抗血管新生介入処置の全般的検討へと拡大され、現在、基本と応用の両方の研究環境において広汎に使用されている。
【００１４】
マウスＯＩＲモデルにおける増殖性血管新生応答を定量化するための歴史的に共通する方法は、網膜から硝子体内（「前内境界膜（ｐｒｅ−ｉｎｎｅｒ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＩＬＭ）核」）に伸びる新生血管に関連する細胞数を数えることに基づく。これは、通常は視神経円板に近い（但し視神経円板を含まない）領域で、矢状断切片において行われる。本方法は非常な労力と時間を要し、硝子体内のヒアリン血管の細胞から異常血管の細胞を識別する必要を含む、困難さを内包する。一般に、３０番目ごとの連続切片だけを評価するので、組織の大きな部分が定量化されず、潜在的に大きな標本誤差を導入する。加えて、眼全体を即時に切片化するので、このモデルのもう１つの重要なパラメータ、すなわち血管閉塞の程度及び異常血管新生のふさ状分岐形成と同時に起こる網膜の脈管再生を同じ眼で評価することを妨げる。このパラメータは、網膜全載標本において最も良好に評価される。
【００１５】
長年にわたり、幹細胞集団が健常成人の循環及び骨髄中に存在することが知られてきた。これらの細胞の種々の小集団は、造血系統陽性（Ｌｉｎ＋）又は系統陰性（Ｌｉｎ−）系統に沿って区別することができる。さらに、系統陰性造血幹細胞（ＨＳＣ）集団は、最近になって、インビトロ及びインビボで血管を形成することができる内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含むことが示された（Ａｓａｈａｒａら、１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：９６４−７参照）。これらの細胞は、正常及び病的生後血管新生に関与することができ（Ｌｙｄｅｎら、２００１  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，１１９４−２０１；Ｋａｌｋａら、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：３４２２−７；及びＫｏｃｈｅｒら、２００１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：４３０−６参照）、並びに肝細胞（Ｌａｇａｓｓｅら、２０００，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：１２２９−３４参照）、小グリア細胞（Ｐｒｉｌｌｅｒら、２００２  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：１３５６−６１参照）、心筋細胞（Ｏｒｌｉｃら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１０３４４−９参照）及び上皮（Ｌｙｄｅｎら、２００１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：１１９４−１２０１参照）を含む様々な非内皮細胞型に分化することができる。これらの細胞は血管新生のいくつかの実験モデルにおいて使用されてきたが、新生血管系を標的するＥＰＣの機構は不明であり、特定血管系に寄与する細胞の数を有効に増加させる戦略も特定されていない。
【００１６】
骨髄からの造血幹細胞は、現在、治療適用のために一般的に使用される幹細胞の唯一の型である。骨髄ＨＳＣは４０年以上にわたって移植において使用されてきた。現在、精製幹細胞を採取する先端的方法が、白血病、リンパ腫及び遺伝性血液疾患の治療のための療法を開発すべく検討されている。ヒトにおける幹細胞の臨床適用は、限られた数のヒト患者において糖尿病及び進行腎癌の治療のために検討されてきた。
【発明の開示】
【００１７】
本発明は、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び関連網膜症疾患を治療するための方法を提供する。本方法は、網膜の損傷領域の有益な生理的血行再建を促進し、疾患によって引き起こされた網膜への損傷を改善するために有効な、血管栄養系統陰性の造血幹細胞集団からの細胞の一定量を、未熟児網膜症又は関連網膜症疾患に罹患している又は前記疾患を発症する危険性がある哺乳動物の網膜に投与することを含む。好ましくは、哺乳動物はヒト患者である。１つの好ましい実施形態では、系統陰性造血幹細胞集団は、造血幹細胞及び内皮前駆細胞を含む系統陰性造血幹細胞集団（すなわちＬｉｎ−ＨＳＣ）である。もう１つの好ましい実施形態では、系統陰性造血幹細胞集団は、細胞の大部分が系統陰性であり、ＣＤ４４抗原及びＣＤ１１ｂ抗原を発現する単離骨髄球様骨髄（ＭＬＢＭ）細胞集団である。選択的に、新生児の治療のために、適切な系統陰性造血幹細胞集団を臍帯静脈血から単離することができる。
【００１８】
好ましくは、哺乳動物に投与する細胞は、治療される個々の哺乳動物にとって自己由来である。細胞は、好ましくは眼内注射によって投与される。好ましい実施形態では、細胞は、疾患の初期段階の間に、ヒト乳児などの未熟児網膜症（ＲＯＰ）に罹患している哺乳動物に投与される。もう１つの好ましい実施形態では、細胞は、ＲＯＰ又は関連網膜症疾患を発症する危険性がある哺乳動物に、予防薬として、疾患症状の発現前又は乳児の高酸素状態への暴露前に投与される。
【００１９】
ＲＯＰの酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）モデルからの結果は、本発明の治療方法が、網膜症疾患に罹患している哺乳動物の網膜において治癒と血管の回復を促進することを指し示す。加えて、本方法は、細胞の神経栄養作用による視覚ニューロンの回復を促進する。有益なことに、本発明の系統陰性造血幹細胞集団からの細胞は、網膜の血管構造に組み込まれ、同時に神経回路網に組み込まれて、網膜錐体細胞などの神経細胞の変性を改善しつつ、内皮細胞へと分化する。単離系統陰性造血幹細胞集団は、硝子体内経路で眼に注入されたとき活性化網膜星状膠細胞を選択的に標的し、眼の新生血管系及び神経回路網に安定に組み込まれたままである細胞を含む。
【００２０】
さらにもう１つの好ましい実施形態では、系統陰性造血幹細胞集団からの細胞を治療的に有用な遺伝子で形質移入する。例えば細胞は、細胞に基づく遺伝子治療の形態を通して新生血管系を選択的に標的し、有益な血管再生及び神経発生をさらに促進する神経栄養因子等を作動可能にコードするポリヌクレオチドで形質移入することができる。
【００２１】
本方法による眼治療の特別の利点は、系統陰性造血幹細胞集団からの細胞で硝子体内処置した眼において認められる血管栄養及び神経栄養救済作用である。本発明の細胞集団からの細胞で治療した眼では、網膜ニューロン及び光受容器、特に錐体が保存され、ある程度の視覚機能が維持され得る。
【００２２】
好ましくは、本方法によって治療される罹患網膜は、活性化星状膠細胞を含む。これは、関連グリオーシスが存在するときは系統陰性造血幹細胞集団での眼の早期処置によって、又は活性化星状膠細胞の局所増殖を刺激するためにレーザーを使用することによって達成され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
骨髄は、様々な血液細胞型、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、顆粒球、血小板及び赤血球へと発達することができる造血幹細胞を含む。系統表面抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ：ＣＤ１８）、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、マウスＬｙ−６Ｇ、マウスＴＥＲ−１１９、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ６６ｂ、ヒト白血球抗原ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）を含む、成熟血液細胞系統のマーカーである細胞表面タンパク質の群である。この細胞表面に「系統表面抗原」（Ｌｉｎ）を有意のレベルで発現しない単離造血幹細胞を、本明細書においては「系統陰性」又は「Ｌｉｎ−」造血幹細胞、すなわちＬｉｎ−ＨＳＣと称する。ヒト造血幹細胞は一般に、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）及び／又はＣＤ１３３などの他の表面抗原を発現する。マウス造血幹細胞は一般に、ＣＤ３４、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、Ｔｈｙ−１及び／又はＳｃａ−１などの他の表面抗原を発現する。
【００２４】
骨髄細胞は、ＣＤ４４抗原（すなわちヒアルロン酸受容体）及びＣＤ１１ｂ（インテグリンαＭ）を発現する細胞の小集団を含む。ＣＤ４４及びＣＤ１１ｂ発現細胞に富む骨髄細胞の骨髄球様集団は、ＣＤ４４抗原に対する抗体（抗ＣＤ４４）及び／又はＣＤ１１ｂ抗原に対する抗体（抗ＣＤ１１ｂ）で骨髄細胞を処理し、次に、抗体と免疫反応する細胞を選択することによって骨髄から単離することができる。抗体は、その後、当分野で周知の方法によって細胞から除去することができる。細胞は、例えばフローサイトメトリーを使用して、ビーズに結合した又はビーズに被覆された抗体とこれに続くろ過を用いて、又は当分野で周知の他の分離方法によって選択することができる。選択細胞の大部分は系統陰性であり、単離においてどちらの抗体を利用するかに関わりなく、ＣＤ４４抗原とＣＤ１１ｂ抗原の両方を発現する。
【００２５】
幹細胞は、典型的には細胞の表面上の抗原の分布によって特定される（詳細な検討については、関連する範囲で参照により本明細書に組み込まれる、国立衛生研究所科学政策局によって作成された報告書、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，Ｊｕｎｅ  ２００１，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｅ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ参照）。骨髄から単離される系統陰性造血幹細胞集団の約７５％は、同時にＣＤ４４陽性である。好ましい実施形態では、ＭＬＢＭ細胞集団からの細胞の大部分は系統陰性造血幹細胞（すなわちＣＤ４４＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ）である。
【００２６】
本明細書において及び付属請求項において使用するとき、骨髄及び骨髄細胞に関する「成体」という語句は、胚の対語として、生後単離された、すなわち幼若及び成体個体から単離された骨髄を含む。従って、「成体哺乳動物」という語は、胚又は出生前個体の対語として、幼若（生後）及び完全な成熟哺乳動物の両方を指す。
【００２７】
内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含むＬｉｎ−ＨＳＣ集団は本方法において特に有用である。単離Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団は、好ましくは、細胞の少なくとも約２０％が内皮細胞上に一般的に存在する表面抗原ＣＤ３１を発現する、哺乳動物細胞を含む。他の実施形態では、細胞の少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６５％、最も好ましくは少なくとも約７５％がＣＤ３１を発現する。好ましくは、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ集団の細胞の少なくとも約５０％がインテグリンα６抗原を発現する。
【００２８】
１つの好ましいマウスＬｉｎ−ＨＳＣ集団では、細胞の少なくとも約５０％がＣＤ３１抗原を発現し、及び細胞の少なくとも約５０％がＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）抗原を発現する。好ましくは、Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞の少なくとも約７５％が表面抗原ＣＤ３１を発現し、より好ましくは細胞の約８１％がＣＤ３１を発現する。もう１つの好ましいマウス実施形態では、細胞の少なくとも約６５％が表面抗原ＣＤ１１７を発現し、より好ましくは細胞の約７０％がＣＤ１１７を発現する。本発明の特に好ましい実施形態は、細胞の少なくとも約５０％〜約８５％が表面抗原ＣＤ３１を発現し、及び細胞の約７０％〜約７５％が表面抗原ＣＤ１７を発現する、Ｌｉｎ−ＨＳＣの集団である。
【００２９】
好ましいヒトＬｉｎ−ＨＳＣ集団では、細胞はＣＤ１３３陰性であり、細胞の少なくとも約５０％はＣＤ３１表面抗原を発現し、及び細胞の少なくとも約５０％はインテグリンα６抗原を発現する。さらにもう１つの好ましい実施形態は、細胞がＣＤ１３３陽性であり、細胞の約３０％未満がＣＤ３１表面抗原を発現し、及び細胞の約３０％未満がインテグリンα６抗原を発現する、ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ集団である。
【００３０】
本発明の単離Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団は、そこから細胞が単離されたマウス又はヒトなどの哺乳動物種の眼に硝子体内注射されたとき、星状膠細胞を選択的に標的し、網膜新生血管系に取り込まれる。
【００３１】
単離ＭＬＢＭ細胞集団も、そこから細胞が単離されたマウス又はヒトなどの哺乳動物種の眼に硝子体内注射されたとき、星状膠細胞を選択的に標的し、網膜新生血管系に取り込まれる。
【００３２】
単離ＭＬＢＭ細胞集団は、内皮細胞に分化し、網膜内の血管構造を生成する細胞を含む。特に、ＭＬＢＭ細胞集団は、網膜血管新生及び網膜血管変性疾患の治療のため、及び網膜血管損傷の修復のために有用である。ＭＬＢＭ細胞集団はまた、網膜における神経細胞救済を促進し、抗アポトーシス遺伝子の上方調節を促進する。本発明のＭＬＢＭ細胞集団は、酸素誘導網膜症又は未熟児網膜症に罹患している哺乳動物などの、新生児哺乳動物の眼における網膜欠損を治療するために特に有用である。
【００３３】
選択的に、新生児の治療のために、臍帯静脈血から単離した血管栄養系統陰性造血幹細胞集団を骨髄由来幹細胞集団の代わりに使用することができる。
【００３４】
本発明は、哺乳動物における酸素誘導網膜症などの未熟児網膜症及び関連疾患を治療する方法を提供する。本方法は、網膜の損傷部分の有益な生理的血管再生を促進するために有効な、血管栄養系統陰性の造血幹細胞集団からの細胞の一定数を、未熟児網膜症又は関連網膜症疾患に罹患している又は前記疾患を発症する危険性がある哺乳動物の網膜に投与することを含む。好ましくは、哺乳動物はヒト患者である。
【００３５】
１つの好ましい実施形態では、系統陰性造血幹細胞集団は、本明細書で述べるような、内皮前駆細胞を含むＬｉｎ−ＨＳＣ集団、例えば骨髄由来集団である。もう１つの好ましい実施形態では、系統陰性造血幹細胞集団は、細胞の大部分が系統陰性であり、ＣＤ４４抗原並びにＣＤ１１ｂ抗原を発現する、単離骨髄球様骨髄（ＭＬＢＭ）由来細胞集団である。好ましくは、哺乳動物に投与する細胞は、治療される個々の哺乳動物にとって自己由来である。細胞は、好ましくは眼内注射によって投与される。好ましい実施形態では、細胞は、疾患の初期段階の間に、ヒト乳児などの未熟児網膜症（ＲＯＰ）に罹患している哺乳動物に投与される。もう１つの好ましい実施形態では、細胞は、ＲＯＰ又は関連網膜症疾患を発症する危険性がある哺乳動物に、予防薬として、高酸素状態への暴露前又は疾患症状の発現前に投与される。
【００３６】
眼に注入する系統陰性造血幹細胞集団からの細胞の数は、眼の疾患状態を停止させるために十分な数である。例えば注入細胞の量は、眼の網膜損傷を修復する、網膜新生血管系を安定化する、網膜新生血管系を成熟させる、及び血管漏出及び血管出血を予防する又は修復するために有効であり得る。
【００３７】
本発明の系統陰性造血幹細胞集団からの細胞は、眼の細胞に基づく遺伝子治療における使用のための抗血管新生タンパク質をコードする遺伝子及び神経細胞救済作用を増強するための神経栄養物質をコードする遺伝子などの、治療的に有用な遺伝子で形質移入することができる。
【００３８】
形質移入細胞は、網膜疾患の治療のために治療上有用ないかなる遺伝子も含み得る。１つの好ましい実施形態では、形質移入細胞は、タンパク質、又はＴｒｐＲＳの抗血管新生（すなわち血管新生抑制性）フラグメント、例えばこの開示が参照により本明細書に組み込まれる、共同所有及び同時係属中の米国特許出願第１０／０８０，８３９号に詳細に述べられている、ＴｒｐＲＳのＴ１及びＴ２フラグメントなどのタンパク質フラグメントを含む、抗血管新生ペプチドを作動可能にコードする遺伝子を含み得る。本発明の抗血管新生ペプチドをコードする形質移入細胞は、糖尿病性網膜症などの異常血管発生を含む網膜疾患及び同様の疾患の治療のために有用である。好ましくは、細胞集団はヒト細胞の集団である。
【００３９】
もう１つの好ましい実施形態では、形質移入細胞は、神経成長因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、毛様体神経栄養因子、網膜色素上皮由来神経栄養因子、インスリン様増殖因子、グリア細胞系由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子等のような神経栄養剤を作動可能にコードする遺伝子を含む。このような神経栄養細胞は、緑内障及び色素性網膜炎などの網膜神経変性疾患における神経細胞救済を促進するため、網膜神経への損傷の治療において等のために有用である。毛様体神経栄養因子の移植は色素性網膜炎の治療のために有用であると報告された（Ｋｉｒｂｙら、２００１，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．３（２）：２４１−８；Ｆａｒｒａｒら、２００２，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１：８５７−８６４参照）。脳由来神経栄養因子は、報告によれば、損傷した網膜神経節における増殖関連遺伝子を調節する（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、１９９７，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４７：５６１−５７２参照）。グリア細胞系由来神経栄養因子は、報告では色素性網膜炎における光受容器変性を遅延させる（ＭｃＧｅｅら、２００１，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．４（６）：６２２−９参照）。
【００４０】
好ましくは、系統陰性造血幹細胞集団からの少なくとも約１×１０５細胞を、網膜変性疾患に罹患している哺乳動物の眼に硝子体内注射によって投与する。注射する細胞の量は、網膜変性の重症度、哺乳動物の年齢及び網膜疾患を治療する当業者には容易に明らかな他の因子に依存し得る。系統陰性造血幹細胞集団からの細胞は、治療を担当する医師によって決定されるように、単回投与で又は一定期間にわたる多回投与によって投与され得る。
【００４１】
ＲＯＰのＯＩＲモデルからの結果は、本方法による治療の特別の利点が、系統陰性造血幹細胞集団からの細胞で硝子体内処置した眼において認められる血管栄養及び神経栄養救済作用であることを指し示す。本発明の系統陰性造血幹細胞集団からの細胞で治療した眼では、網膜ニューロン及び光受容器、特に錐体が保存され、ある程度の視覚機能が維持され得る。血管新生阻害剤による処置は、系統陰性造血幹細胞集団の治療作用をブロックしなかった。マクロファージ様細胞が救済血管と共に認められ、系統陰性細胞の血管栄養作用における免疫細胞と系統陰性骨髄細胞との間の結びつきの可能性を示唆した。血管からのマクロファージ管外遊出を低減するための、Ｐ７とＰ１７の間のＣＤ１８に対する抗体の注入は、しかしながら、系統陰性造血幹細胞集団の救済作用をブロックしなかった。
【００４２】
さらにもう１つの好ましい実施形態では、眼を治療せずに放置した場合に起こる損傷から網膜を保護するため、疾患の発症前又は疾患の初期段階で細胞を注入する。このような予防的処置は、治療する哺乳動物が未熟児網膜症、酸素誘導網膜症又は他の網膜症疾患を発症する危険度が高いことが知られている場合に特に望ましい。眼における系統陰性幹細胞集団の存在は、単に損傷からの回復を促進するのではなく、実際に網膜への血管損傷の重症度を軽減し、損傷が生じる前に疾患を停止させ得るので、予防的処置は本方法において特に有効である。例えばＯＩＲモデルでは、Ｐ３〜Ｐ７の間に、高酸素状態への暴露前にＬｉｎ−ＨＳＣを注入されたマウスは、網膜損傷の程度が低く、高酸素状態への暴露後に注入されたマウスよりも迅速に回復する。さらに、高酸素状態への暴露の間に処置されたマウスも回復の加速を示した。
【００４３】
マウス網膜血管発生
眼血管新生についてのモデル。マウス眼は、ヒト網膜血管発生などの哺乳動物網膜血管発生の検討のための広く認められたモデルを提供する。マウス網膜血管構造の発生の間、虚血駆動性網膜血管が星状膠細胞と密接に結びついて発生する。これらのグリア要素は、視神経円板から神経節細胞層に沿って第三トリメスターのヒト胚又は新生児げっ歯動物の網膜へと移動し、放射状に広がる。マウス網膜血管構造が発生するとき、内皮細胞は、網膜血管パターンを決定するためにこの既に確立された星状膠細胞鋳型を利用する（図１（ａ及びｂ）参照）。図１（ａ及びｂ）は、発生中のマウス網膜の概要図を示す。パネル（ａ）は、星状膠細胞鋳型（明るい線）に重なる一次脈管叢（図の左上の暗い線）の発生を示し、一方（ｂ）は、網膜血管形成の第二期を示す。図１において、ＧＣＬは神経節細胞層を表わし；ＩＰＬは内網状層を表わし；ＩＮＬは内核層を現し；ＯＰＬは外網状層を表わし；ＯＮＬは外核層を現し；ＲＰＥは網膜色素上皮を表わし；ＯＮは視神経を表わし；及びＰは末梢を表わす。
【００４４】
出生時には、網膜血管構造は実質的に存在しない。生後１４日目（Ｐ１４）までに網膜は、視覚の発生と一致して網膜脈管の複雑な一次（表在）及び二次（深）層を発生する。最初に、輪止め様の乳頭周囲脈管が既存の星状膠細胞網の上に末梢に向かって放射状に増殖し、毛細血管叢の形成によって次第に相互に連結される。これらの脈管はＰ１０の間に神経線維内で単層として増殖する（図１（ａ））。Ｐ７〜Ｐ８の間にこの一次叢から側副枝が発芽し、網膜に入って外網状層へと進み、そこで二次又は深網膜血管叢を形成する。Ｐ２１までに、血管網全体が広汎なリモデリングを受け、内核層の内側表面に三次又は中間叢が形成される（図１（ｂ））。
【００４５】
新生児マウス網膜血管新生モデルは、いくつかの理由から眼血管新生の間のＨＳＣの役割を検討するために有用である。この生理的に関連するモデルでは、大きな星状膠細胞鋳型が内因性血管の出現前に存在し、新生血管形成過程の間の細胞−細胞標的に関する役割の評価を可能にする。加えて、この一貫した再現可能な新生児期網膜血管形成過程は低酸素状態駆動性であることが公知であり、この点で虚血が役割を果たすことが知られる多くの網膜疾患と類似性を有する。
【００４６】
骨髄からの内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の富化
細胞表面マーカー発現は、ＨＳＣの標本において認められるＥＰＣ集団に関して広汎に評価されてきたが、ＥＰＣを独自に特定するマーカーはまだほとんど定義されていない。ＥＰＣを富化するため、造血系統マーカー陽性細胞（Ｌｉｎ＋）、すなわちＢリンパ球（ＣＤ４５）、Ｔリンパ球（ＣＤ３）、顆粒球（Ｌｙ−６Ｇ）、単球（ＣＤ１１）及び赤血球（ＴＥＲ−１１９）をマウスの骨髄単核細胞から除去した。ＥＰＣをさらに富化するためにＳｃａ−１抗原を使用した。Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋細胞又はＬｉｎ−細胞の同数の硝子体内注射後に得られた結果の比較は、２つの群の間で相違を検出しなかった。実際に、Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１−細胞だけを注射したとき、発生中の血管へのはるかに大きな組込みが認められた。
【００４７】
機能的アッセイに基づき、Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団はＥＰＣに富む。さらに、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ集団はＬｉｎ−ＨＳＣ集団とは機能的に全く異なって行動する。各々の画分についてＥＰＣを特定するために一般的に使用されるエピトープ（先に報告したインビトロ特性決定試験に基づき）も評価した。これらのマーカーのいずれも、Ｌｉｎ−画分と独占的に結合することはなかったが、全てが、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ画分と比較してＬｉｎ−ＨＳＣでは約７０〜約１８００％高かった（図１（ｃ））。図１、パネル（ｃ）は、骨髄由来のＬｉｎ＋ＨＳＣ及びＬｉｎ−ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリー特性決定を示す。パネル（ｃ）の上の列は、非抗体標識細胞の造血幹細胞ドットプロット分布を示す。Ｒ１は、ＰＥ染色陽性の定量可能なゲート領域を定義し、Ｒ２はＧＦＰ陽性を示す。Ｌｉｎ−ＨＳＣのドットプロットを中央の列に示し、Ｌｉｎ＋ＨＳＣのドットプロットを下の列に示す。Ｃ５７Ｂ／６細胞を、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１についてのＰＥ複合抗体で標識した。Ｔｉｅ−２データはＴｉｅ−２−ＧＦＰマウスから得た。ドットプロットの隅のパーセンテージは、Ｌｉｎ−ＨＳＣ又はＬｉｎ＋ＨＳＣ集団全体からの陽性標識細胞のパーセントを示す。興味深いことに、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｔｉｅ−２及びＳｃａ−１のような一般に認められているＥＰＣマーカーはほとんど発現されず、このため、さらなる分画のためには使用しなかった。
【００４８】
Ｌｉｎ−ＨＳＣは、（ａ）成体哺乳動物から骨髄を抽出すること；（ｂ）骨髄から複数の単球を分離すること；（ｃ）単球を、１又はそれ以上の系統表面抗原、好ましくはＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ（マウス）、ＴＥＲ−１１９（マウス）、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ６６ｂ、ヒト白血球抗原ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）からなる群より選択される系統表面抗原に対するビオチン複合系統パネル抗体で標識すること；（ｄ）複数の単球から、前記１又はそれ以上の系統表面抗原に関して陽性の単球を除去すること；及び（ｅ）そこから系統陰性造血幹細胞の集団を回収すること、によって単離することができる。
【００４９】
Ｌｉｎ−ＨＳＣを成人骨髄から単離するときは、好ましくは単球を、系統表面抗原ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６（Ｂ７．２）及びＣＤ２３５ａに対するビオチン複合系統パネル抗体で標識する。Ｌｉｎ−ＨＳＣを成体マウス骨髄から単離するときは、好ましくは単球を、系統表面抗原ＣＤ３、ＣＤ１１、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ及びＴＥＲ−１１９に対するビオチン複合系統パネル抗体で標識する。
【００５０】
硝子体内注入したＨＳＣ  Ｌｉｎ−細胞は、星状膠細胞を標的するＥＰＣを含み、発生中の網膜血管系に取り込まれる。
【００５１】
硝子体内注入したＬｉｎ−ＨＳＣが網膜の特定細胞型を標的し、星状膠細胞を鋳型として利用して、網膜血管新生に関与することができるかどうかを調べるため、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物からの約１０５細胞又は成体（ＧＦＰ又はＬａｃＺトランスジェニック）マウスの骨髄から単離したＬｉｎ＋ＨＳＣ細胞（対照、約１０５細胞）を、生後２日目（Ｐ２）のマウス眼に注入した。注射後４日目（Ｐ６）に、ＧＦＰ又はＬａｃＺトランスジェニックマウスに由来する、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物からの多くの細胞が網膜に付着しており、内皮細胞の特徴的な細長い外観を有していた（図２（ａ））。図２は、発生中のマウス網膜へのＬｉｎ−細胞の移植を示す。図２、パネル（ａ）に示すように、注射後４日目（Ｐ６）に硝子体内注射したｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は網膜に付着し、分化する。
【００５２】
網膜の多くの領域において、ＧＦＰ発現細胞はこの下にある星状膠細胞に従ったパターンで配置され、血管に類似していた。これらの蛍光細胞は、発生中の内因性血管網に先んじて認められた（図２（ｂ））。逆に、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ（図２（ｃ））又は成体マウス腸間膜内皮細胞（図２（ｄ））の少数だけが網膜表面に付着した。注入したＬｉｎ−ＨＳＣ集団からの細胞が、既に確立された脈管を有する網膜にも付着することができるかどうかを調べるため、Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物を成体眼に注入した。興味深いことに、いずれの細胞も網膜に付着せず、確立された正常網膜血管に取り込まれないことが認められた（図２（ｅ））。これは、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物が正常に発生した血管系を分断せず、正常に発生した網膜において異常血管新生を開始させないことを指し示す。
【００５３】
注入したＬｉｎ−ＨＳＣ組成物と網膜星状膠細胞の関係を調べるため、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、星状膠細胞のマーカー）及びプロモーター駆動性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するトランスジェニックマウスを使用した。ｅＧＦＰトランスジェニックマウスからのＬｉｎ−ＨＳＣを注入したＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの網膜の検査は、注入したｅＧＦＰ  ＥＰＣと既存の星状膠細胞の共局在を明らかにした（図２（ｆ〜ｈ）、矢印）。ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣの過程は、下にある星状膠細胞網に従うことが認められた（矢印、図２（ｇ））。これらの眼の検査は、注入した標識細胞だけが星状膠細胞に付着することを明らかにした；網膜末梢がまだ内因性脈管を有さないＰ６マウス網膜では、注入細胞は、これらのまだ血管化されていない領域で星状膠細胞に付着することが認められた。驚くべきことに、注入した標識細胞は、正常網膜血管がその後発生する正確な位置で網膜のより深い層において認められた（図２（ｉ）、矢印）。
【００５４】
注入したＬｉｎ−ＨＳＣが発生中の網膜血管系に安定して取り込まれるかどうかを調べるため、いくつかのより遅い時点での網膜脈管を検査した。Ｐ９（注射後７日目）という早い時点で、Ｌｉｎ−ＨＳＣはＣＤ３１＋構造に取り込まれた（図２（ｊ））。Ｐ１６（注射後１４日目）までに、細胞は既に網膜血管様構造に広汎に取り込まれた（図２（ｋ））。動物を犠死させる前にローダミン−デキストランを血管内注射したとき（機能的網膜血管を特定するため）、Ｌｉｎ−ＨＳＣの大部分が親脈管と一列に並んだ（図２（ｌ））。標識細胞分布の２つのパターンが認められた：（１）１つのパターンでは、細胞は非標識内皮細胞の間に血管に沿って散在し；及び（２）他方のパターンは、脈管が完全に標識細胞から構成されることを示した。注入細胞はまた、深血管叢の脈管にも取り込まれた（図２（ｍ））。Ｌｉｎ−ＨＳＣ由来ＥＰＣの新生血管系への散発的な取り込みが以前に報告されているが、これは、全面的にこれらの細胞から構成される血管網の最初の報告である。これは、硝子体内注入した骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣの集団からの細胞が、形成中の網膜血管叢のいずれの層にも効率的に取り込まれ得ることを明らかにする。
【００５５】
非網膜組織（例えば脳、肝臓、心臓、肺、骨髄）の組織学的検査は、硝子体内注射後５又は１０日目まで検査したとき、ＧＦＰ陽性細胞の存在を示さなかった。これは、Ｌｉｎ−ＨＳＣ画分内の細胞の小集団が網膜星状膠細胞を選択的に標的し、発生中の網膜血管系に安定に取り込まれることを指し示す。これらの細胞は内皮細胞の多くの特徴（網膜星状膠細胞との結合、細長い形態、親脈管への安定な組込み及び細胞外の位置に存在しないこと）を有するので、これらの細胞はＬｉｎ−ＨＳＣ集団内に存在するＥＰＣである。標的星状膠細胞は、低酸素性網膜症の多くで認められるのと同じ型である。グリア細胞が、ＤＲ及び網膜損傷の他の形態で認められるふさ状分岐の新生血管葉（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒｏｎｄｓ）の顕著な成分であることは周知である。反応性グリオーシス及び虚血誘導血管新生の条件下で、ヒトを含む多くの哺乳動物種において新生児期網膜血管鋳型形成の間に認められるのと同様に、活性化星状膠細胞は増殖し、サイトカインを産生して、ＧＦＡＰを上方調節する。
【００５６】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団は、新生児眼におけるように成体マウス眼において活性化星状膠細胞を標的する。Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞を、光凝固（図３（ａ））又は針の先端（図３（ｂ））によって損傷された網膜を有する成体眼に注入した。両方のモデルにおいて、顕著なＧＦＡＰ染色を有する細胞の集団は損傷部位の周囲にだけ認められた（図３（ａ及びｂ））。注入したＬｉｎ−ＨＳＣ組成物からの細胞は損傷部位に局在し、ＧＦＡＰ陽性星状膠細胞に特異的に結合したままであった（図３（ａ及びｂ））。これらの部位で、Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞はまた、深網膜血管系の新生児期形成の間に認められるのと同様のレベルで網膜のより深い層へと移動することが認められた。網膜の非損傷部分は、Ｌｉｎ−ＨＳＣを正常な非損傷成体網膜に注入したときに認められるのと同じように、Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞を含まなかった（図２（ｅ））。これらのデータは、Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物が、グリオーシスを有する損傷成体網膜並びに血管新生を受ける新生児網膜において標的活性化グリア細胞を選択的に標的できることを示唆する。
【００５７】
硝子体内注入したＬｉｎ−ＨＳＣは変性血管系を救済し、安定化することができる。
【００５８】
硝子体内注入したＬｉｎ−ＨＳＣ組成物は星状膠細胞を標的し、正常網膜血管系へと取り込まれるので、これらの細胞は同時に、グリオーシス及び血管変性に関連する虚血又は変性網膜疾患において変性血管系を安定化する。ｒｄ／ｒｄマウスは、生後１ヶ月までに光受容器と網膜血管層の深刻な変性を示す網膜変性についてのモデルである。これらのマウスにおける網膜血管系はＰ１６まで正常に発生し、この時点でより深い血管叢が後退する；大部分のマウスでは、Ｐ３０までに深及び中間叢がほぼ完全に変性した。
【００５９】
ＨＳＣが後退脈管を救済することができるかどうかを調べるため、Ｌｉｎ＋又はＬｉｎ−ＨＳＣ（Ｂａｌｂ／ｃマウスより）をＰ６にｒｄ／ｒｄマウスに硝子体内注射した。Ｐ３３まで、Ｌｉｎ＋細胞の注射後、最深網膜層の血管はほぼ完全に存在しなかった（図４（ａ及びｂ））。これに対し、Ｐ３３までに大部分のＬｉｎ−ＨＳＣ注入網膜は、３つの平行する良好に形成された血管層を備えるほぼ正常な網膜血管系を有していた（図４（ａ及びｂ））。この作用の定量化は、Ｌｉｎ−注入ｒｄ／ｒｄ眼の深血管叢における脈管の平均長が未処置又はＬｉｎ＋細胞処置眼よりもほぼ３倍大きいことを明らかにした（図４（ｅ））。驚くべきことに、ｒｄ／ｒｄ成体マウス（ＦＶＢ／Ｎ）骨髄に由来するＬｉｎ−ＨＳＣ組成物の注入はまた、変性ｒｄ／ｒｄ新生児マウス網膜血管系も救済した（図４（ｆ））。ｒｄ／ｒｄマウス眼における血管系の変性は、生後２〜３週間という早期に認められた。Ｐ１５という遅い時期のＬｉｎ−ＨＳＣの注入も、少なくとも１ヶ月間ｒｄ／ｒｄマウスにおいて変性血管系の部分的安定化を生じさせた（図４（ｇ及びｈ））。
【００６０】
より幼若な（例えばＰ２）ｒｄ／ｒｄマウスに注入したＬｉｎ−ＨＳＣ組成物も、発生中の表在血管系に取り込まれた。Ｐ１１までに、これらの細胞は深血管叢のレベルに移動し、野生型外網膜血管層で認められるのと同じパターンを形成することが認められた（図５（ａ））。注入Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物からの細胞がｒｄ／ｒｄマウスにおいて変性網膜血管系に取り込まれ、これを安定化する方法をより明瞭に説明するため、Ｂａｌｂ／ｃマウスに由来するＬｉｎ−ＨＳＣ組成物をＴｉｅ−２−ＧＦＰ  ＦＶＢマウス眼に注入した。ＦＶＢマウスはｒｄ／ｒｄ遺伝子型を有し、融合タンパク質Ｔｉｅ−２−ＧＦＰを発現するので、全ての内因性血管は蛍光性である。
【００６１】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物からの非標識細胞が新生児Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ  ＦＶＢ眼に注入され、その後発生中の血管系に取り込まれるとき、取り込まれた、注入非標識Ｌｉｎ−ＨＳＣに対応する内因性Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ標識血管には非標識間隙が存在するはずである。もう１つ別の血管マーカー（例えばＣＤ−３１）でのその後の染色は血管全体を描画し、非内因性内皮細胞が血管系の部分であるかどうかに関する判定を可能にする。注入の２ヵ月後、ＣＤ３１陽性、Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ陰性血管が、Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物を注入した眼の網膜において認められた（図５（ｂ））。興味深いことに、救済された血管の大半がＴｉｅ−２−ＧＦＰ陽性細胞を含んだ（図５（ｃ））。平滑筋アクチンに関する染色によって測定したとき、血管周囲細胞の分布は、血管救済が存在するか否かにかかわらず、Ｌｉｎ−ＨＳＣ注入によって変化しなかった（図５（ｄ））。これらのデータは、硝子体内注入したＬｉｎ−ＨＳＣ細胞が網膜内に移動し、正常網膜血管の形成に関与して、遺伝的欠損マウスにおける内因性変性血管系を安定化することを明らかに示す。
【００６２】
Ｌｉｎ−ＨＳＣからの形質移入細胞による網膜血管新生の阻害。
【００６３】
網膜血管疾患の大半は、変性ではなく異常血管増殖を含む。星状膠細胞を標的するトランスジェニック細胞は、抗血管新生タンパク質を送達し、血管新生を阻害するために使用できる。Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物からの細胞をＴ２−トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｔ２−ＴｒｐＲＳ）で形質移入した。Ｔ２−ＴｒｐＲＳは、網膜血管新生を強力に阻害するＴｒｐＲＳの４３ｋＤフラグメントである（図６（ａ）及び図３４）。Ｐ１２に、Ｐ２に対照プラスミドで形質移入したＬｉｎ−ＨＳＣ組成物（Ｔ２−ＴｒｐＲＳ遺伝子なし）は正常一次（図６（ｃ））及び二次（図６（ｄ））網膜血管叢を有していた。Ｔ２−ＴｒｐＲＳで形質移入した本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物をＰ２眼に注入し、１０日後に評価したとき、一次血管網は有意の異常を有し（図６（ｅ））、深網膜血管系の形成はほぼ完全に阻害された（図６（ｆ））。これらの眼で認められた数少ない脈管は、脈管の間の大きな間隙で顕著に減弱していた。Ｔ２−ＴｒｐＲＳを分泌するＬｉｎ−ＨＳＣによる阻害の程度を表１に詳細に示す。
【００６４】
Ｔ２−ＴｒｐＲＳは、インビトロでＬｉｎ−ＨＳＣ組成物中の細胞によって産生及び分泌され、これらの形質移入細胞の硝子体内への注入後、網膜においてＴ２−ＴｒｐＲＳの３０ｋＤフラグメント（図６（ｂ））が認められた。この３０ｋＤフラグメントは、形質移入したＬｉｎ−ＨＳＣを注入した網膜においてのみ特異的に認められ、組換え又はインビトロ合成タンパク質と比較して見かけ分子量のこの減少は、インビボでのＴ２−ＴｒｐＲＳのプロセシング又は分解によると考えられる。これらのデータは、Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物が、血管新生抑制分子を発現する遺伝子などの機能的に活性な遺伝子を、活性化星状膠細胞を標的することによって網膜血管系に送達するために使用できることを指し示す。認められた血管新生抑制作用は細胞を介した活性に起因する可能性もあるが、同一であるが非Ｔ２形質移入Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物で処置した眼は正常な網膜血管系を有していたので、これは極めて可能性が低い。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
硝子体内注入したＬｉｎ−ＨＳＣ集団は、網膜星状膠細胞に局在し、脈管内に取り込まれ、多くの網膜疾患を治療する上で有用であり得る。注入したＨＳＣ組成物からの大部分の細胞は星状膠細胞鋳型に付着するが、少数は網膜内に深く移動し、深血管網がその後発生する領域に帰還する（ｈｏｍｉｎｇ）。生後４２日目以前にこの領域でＧＦＡＰ陽性星状膠細胞が認められなくても、これは、ＧＦＡＰ陰性グリア細胞がＬｉｎ−ＨＳＣ局在化についてのシグナルを与えるために既に存在する可能性を排除しない。これまでの試験は、多くの疾患が反応性グリオーシスに関連することを示した。ＤＲでは、特に、グリア細胞及びこれらの細胞外マトリックスが病的血管新生に結びつく。
【００６７】
注入Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物からの細胞は、損傷の種類に関わりなく、ＧＦＡＰ発現グリア細胞に特異的に結合するので、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物は網膜における前血管新生病変を標的するために使用できる。例えば糖尿病のような虚血性網膜症では、新生血管形成は低酸素状態に対する応答である。Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物を病的血管新生の部位に標的することにより、発生中の新生血管系を安定化して、出血又は水腫（ＤＲに関連する視覚喪失の原因）などの新生血管系の異常を予防することができ、最初に新生血管形成を刺激した低酸素状態を潜在的に軽減することができる。異常血管は正常状態へと修復され得る。さらに、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ（図３４の配列番号３）、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ−ＧＤ（図３４の配列番号４）、ミニＴｒｐＲＳ（図３５の配列番号５）及びＴ１−ＴｒｐＲＳ（図３６の配列番号６）などの血管新生抑制タンパク質は、形質移入したＬｉｎ−ＨＳＣ組成物及び星状膠細胞のレーザー誘導活性化を使用することによって病的血管新生の部位に送達することができる。ＴｒｐＲＳの好ましい血管新生抑制フラグメントは、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ及びＴ２−ＴｒｐＲＳ−ＧＤを含む。レーザー光凝固術は臨床眼科学において一般的に使用されるので、このアプローチは多くの網膜疾患に対する適用を有する。このような細胞に基づくアプローチは癌治療において研究されてきたが、眼疾患のためのこれらの使用は、眼内注射が多数の細胞を疾患部位に直接送達することを可能にするので、より好都合である。
【００６８】
Ｌｉｎ−ＨＳＣによる神経栄養及び血管栄養救済。
【００６９】
上述したように増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、Ｃ３Ｈ（ｒｄ／ｒｄ）、ＦＶＢ（ｒｄ・ｒｄ）マウスの骨髄からＬｉｎ−ＨＳＣを分離するためにＭＡＣＳを使用した。これらのマウスからのＥＰＣを含むＬｉｎ−ＨＳＣをＰ６  Ｃ３Ｈ又はＦＶＢマウス眼に硝子体内注射した。注射後様々な時点で（１ヶ月目、２ヶ月目及び６ヶ月目）網膜を収集した。ＣＤ３１に対する抗体での染色後に走査型レーザー共焦点顕微鏡によって及びＤＡＰＩでの核染色後に網膜組織学検査によって血管系を分析した。様々な時点での網膜からのｍＲＮＡのマイクロアレイ遺伝子発現分析も、作用に潜在的に関与する遺伝子を特定するために使用した。
【００７０】
ｒｄ／ｒｄマウスの眼は、Ｐ２１までに感覚神経網膜及び網膜血管系の両方の深刻な変性を有していた。Ｐ６にＬｉｎ−ＨＳＣで処置したｒｄ／ｒｄマウスの眼は、６ヶ月の長期にわたって正常な網膜血管系を維持した；全ての時点で（１Ｍ、２Ｍ及び６Ｍ）、対照と比較したとき、深及び中間層の両方が有意に改善された（図１２参照）。加えて、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置した網膜はまた、対照としてＬｉｎ＋ＨＳＣで処置した眼に比べてより厚く（１Ｍ；１．２倍、２Ｍ；１．３倍、６Ｍ；１．４倍）、外核層内により多くの細胞数を有することを認めた。対照（未処置又は非Ｌｉｎ−処置）ｒｄ／ｒｄ網膜と比較して「救済された」（例えばＬｉｎ−ＨＳＣ）ｒｄ／ｒｄ網膜の大規模ゲノム分析は、図２０、パネルＡ及びＢに列挙するタンパク質をコードする遺伝子を含む、ｓＨＳＰ（低分子熱ショックタンパク質）及び特定増殖因子をコードする遺伝子の、血管及び神経救済と相関する有意の上方調節を明らかにした。
【００７１】
骨髄由来のＬｉｎ−ＨＳＣ集団は、ｒｄ／ｒｄマウスにおいて有意に及び再現可能に正常血管系の維持を誘導し、光受容器及び他の神経細胞層を劇的に増加させた。この神経栄養救済作用は、低分子熱ショックタンパク質及び増殖因子の有意の上方調節と相関し、現在治療不可能な網膜変性疾患に対する治療アプローチへの洞察を提供する。
【００７２】
ｒｄ１／ｒｄ１マウス網膜は深刻な血管及び神経変性を示す。
【００７３】
マウスにおける正常な生後網膜血管及び神経発生は広く記述されており、第三トリメスターのヒト胎児で認められる変化に類似する（Ｄｏｒｒｅｌｌら、２００２，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４３：３５００−３５１０）。ｒｄ１遺伝子に関してホモ接合のマウスは、ヒト網膜変性の多くの特徴を共有し（Ｆｒａｓｓｏｎら、１９９９，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１１８３−１１８７）、ＰＲ  ｃＧＭＰホスホジエステラーゼをコードする遺伝子の突然変異の結果として重症血管萎縮を伴う急速な光受容器（ＰＲ）喪失を示す（Ｂｏｗｅｓら、１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４７：６７７−６８０）。網膜発生とその後の変性の間の血管構造を調べるため、成熟血管系の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質であるコラーゲンＩＶ（ＣＩＶ）、及び内皮細胞についてのマーカーであるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）に対する抗体を使用した（図１５）。ｒｄ１／ｒｄ１（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）の網膜は、光受容器を含む外核層（ＯＮＬ）の変性が始まる、およそ生後（Ｐ）８日目まで正常に発生した。ＯＮＬは急速に変性し、細胞はアポトーシスによって死滅して、核の単一層だけがＰ２０まで残った。ＣＩＶ及びＣＤ３１の両方に対する抗体での全載網膜の二重染色は、他の研究者によって述べられているのと同様の（Ｂｌａｎｋｓら、１９８６，Ｊ  Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５４：５４３−５５３）ｒｄ１／ｒｄ１マウスにおける血管変性の詳細を明らかにした。一次及び深網膜血管層はＰ１２まで正常に発生すると思われ、その後、ＣＤ３１染色の不在によって証明されるように内皮細胞の急速な喪失が起こる。ＣＤ３１陽性内皮細胞は、Ｐ１２まで正常な分布で存在したが、その後急速に消失した。興味深いことに、ＣＩＶ陽性染色は検討した時点を通じて存在し続け、脈管及び関連ＥＣＭは正常に形成されるが、マトリックスだけが、ＣＤ３１陽性細胞が認められなくなる時点であるＰ１３以後も残存することを示唆した（図１５、中央のパネル）。中間血管叢もＰ２１後は変性するが、この進行は深部叢で認められるよりも緩やかである（図１５、上のパネル）。正常マウスの網膜血管及び神経細胞層をｒｄ１／ｒｄ１マウスとの比較のために示す（図１５、右のパネル）。
【００７４】
ｒｄ１／ｒｄ１マウスにおける骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣの神経保護作用。
【００７５】
硝子体内注入したＬｉｎ−ＨＳＣは、３つの血管叢全てで内皮網膜血管系に取り込まれ、血管が変性するのを予防する。興味深いことに、注入した細胞は外核層では実質的に全く認められない。これらの細胞は、形成中の網膜脈管に取り込まれるか又はこれらの脈管にごく近接して認められる。マウスＬｉｎ−ＨＳＣ（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪより）を、変性の開始の直前であるＰ６にＣ３Ｈ／ＨｅＪ（ｒｄ１／ｒｄ１）マウス眼に硝子体内注入した。Ｐ３０までに、対照細胞（ＣＤ３１−）注入眼は典型的なｒｄ１／ｒｄ１表現型、すなわち深血管叢のほぼ完全な変性を示し、ＯＮＬは検査した全ての網膜で認められた。Ｌｉｎ−ＨＳＣを注入した網膜は正常な外観の中間及び深血管叢を維持した。驚くべきことに、Ｌｉｎ−ＨＳＣ注入眼の核間層（ＩＮＬ）及びＯＮＬでは対照細胞注入眼よりも有意に多い細胞が認められた（図１６（Ａ））。Ｌｉｎ−ＨＳＣのこの救済作用は注射後２ヶ月目（図１６（Ｂ））に観察され、６ヶ月の長期にわたって認めることができた（図１６（Ｃ））。Ｌｉｎ−ＨＳＣ注入眼の中間及び深部叢、並びに神経細胞含有ＩＮＬ及びＯＮＬの血管構造の差は、救済眼と非救済眼を比較した全ての測定時点で有意であった（図１６（Ｂ及びＣ））。この作用を、血管系の全長を測定すること（図１６（Ｄ））及びＯＮＬで認められるＤＡＰＩ陽性細胞核の数を計数することによって（図１６（Ｅ））数量化した。単純線形回帰分析を全ての時点のデータに適用した。
【００７６】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ注入眼では、Ｐ３０（ｐ＜０．０２４）及びＰ６０（ｐ＜０．０３４）の血管救済と神経（例えばＯＮＬの厚さ）救済の間で統計的に有意の相関が認められた（図１６（Ｆ））。Ｌｉｎ−ＨＳＣ注入網膜を対照細胞注入網膜と比較したＰ１８０では、相関は、統計的に有意ではないが（ｐ＜０．１４）、高いままであった（図１６（Ｆ））。これに対し、対照細胞注入網膜は、いずれの時点でも血管構造の保存とＯＮＬの間に有意の相関を示さなかった（図１６（Ｆ））。これらのデータは、Ｌｉｎ−ＨＳＣの硝子体内注入がｒｄ１／ｒｄ１マウスの網膜において網膜血管と神経の同時救済を生じさせることを明らかにする。注入細胞は、ＯＮＬ又は網膜血管内又はこのすぐ近く以外のいかなる場所においても認められなかった。
【００７７】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ注入したｒｄ／ｒｄ網膜の機能的救済。
【００７８】
網膜電位図検査（ＥＲＧ）を、対照細胞又はマウスＬｉｎ−ＨＳＣの注入の２ヵ月後にマウスで実施した（図１７）。血管及び神経救済が起こったかどうかを確認するためにＥＲＧ記録後に各々の眼に関して免疫組織化学及び顕微鏡分析を行った。処置した救済眼及び対照非救済眼からの代表的ＥＲＧ記録は、救済眼において、デジタル減算したシグナル（処置マイナス未処置眼）が８−１０μボルトの振幅で明らかに検出可能なシグナルを生じたことを示す（図１７）。明らかに、両方の眼からのシグナルは著しく異常である。しかし、Ｌｉｎ−ＨＳＣ処置眼からは一貫した検出可能なＥＲＧが記録可能であった。全ての場合に、対照眼からのＥＲＧは検出不能であった。救済眼におけるシグナルの振幅は正常よりもかなり低かったが、シグナルは組織学的救済が存在する場合に一貫して認められ、他の遺伝子ベースの救済試験によって報告された大きさと類似していた。全体としてこれらの結果は、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置した眼におけるある程度の機能的救済を明らかにする。
【００７９】
救済されるｒｄ／ｒｄ網膜細胞型は主として錐体である。
【００８０】
救済された網膜と非救済網膜を、桿体又は錐体オプシンに特異的な抗体で免疫組織化学的に分析した。図１７に示すＥＲＧ記録のために使用した同じ眼を桿体又は錐体オプシンに関して分析した。野生型マウス網膜では、存在する光受容器の約５％未満が錐体であり（Ｓｏｕｃｙら、１９９８，Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：４８１−４９３）、図２５（Ａ）に示す赤色／緑色錐体オプシン又は図２５（Ｂ）に示す桿体ロドプシンに関して認められた免疫組織化学染色パターンは、錐体細胞のこのパーセンテージと一致した。野生型網膜を免疫前ＩｇＧで染色したとき、血管の自己蛍光以外に感覚神経網膜内のいかなる場所でも染色を認めなかった（図２５（Ｃ））。生後２ヶ月目に、非注入ｒｄ／ｒｄマウスの網膜は、赤色／緑色錐体オプシン（図２５（Ｄ））又はロドプシン（図２５（Ｇ））に対する抗体に関していかなる染色も示さない、基本的に萎縮性の外核層を有していた。対照ＣＤ３１−ＨＳＣを注入した眼も、錐体（図２５（Ｅ））又は桿体（図２５（Ｈ））オプシンのいずれの存在に関しても陽性染色されなかった。これに対し、Ｌｉｎ−ＨＳＣを注入した反対側の眼は、保存された外核層に約３−約８列の核を有していた；これらの細胞の大部分は錐体オプシンに関して陽性であり（図２５（Ｆ））、桿体オプシンに関しては約１−３％陽性であった（図２５（Ｉ））。注目すべきことに、これは、桿体が支配的である正常マウス網膜で通常認められるのとほぼ逆である。これらのデータは、Ｌｉｎ−ＨＳＣの注入が、通常はこの間に錐体が変性する、長期間にわたって錐体を保存することを明らかにする。
【００８１】
ヒト骨髄（ｈＢＭ）由来のＬｉｎ−ＨＳＣも変性網膜を救済する。
【００８２】
ヒト骨髄から単離したＬｉｎ−ＨＳＣはマウスＬｉｎ−ＨＳＣと同様に行動する。骨髄をヒト提供者から収集し、Ｌｉｎ＋ＨＳＣを除去して、ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ（ｈＬｉｎ−ＨＳＣ）の集団を生産した。これらの細胞を蛍光染料によってエクスビボで標識し、Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ  ＳＣＩＤマウス眼に注入した。注入したｈＬｉｎ−ＨＳＣは、マウスＬｉｎ−ＨＳＣを注入したときに認められるのと同じように網膜血管新生の部位に移動し、この部位を標的した（図１８（Ａ））。血管標的に加えて、ヒトＬｉｎ−ＨＳＣはまた、ｒｄ１／ｒｄ１マウスの血管及び神経細胞層の両方に堅固な救済作用を提供した（図１８（Ｂ及びＣ））。この所見は、網膜血管系を標的し、網膜変性を予防することができるヒト骨髄中の細胞の存在を確認する。
【００８３】
Ｌｉｎ−ＨＳＣはｒｄ１０／ｒｄ１０マウスにおいて血管栄養及び神経栄養作用を有する。
【００８４】
ｒｄ１／ｒｄ１マウスは網膜変性についての最も広く使用され、最もよく特性決定されたモデルであるが（Ｃｈａｎｇら、２００２，Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．４２：５１７−５２５）、変性は非常に急速であり、この点でヒト疾患において認められる通常のより緩やかな時間経過と異なる。この系統では、光受容器細胞変性は、網膜血管系がまだ急速に拡大しつつあるＰ８頃に始まる（図１５）。深網膜血管系のその後の変性は、この疾患を有する大部分のヒトで認められるのと異なって、中間叢がまだ形成しつつあり、このためｒｄ１／ｒｄ１マウスの網膜がまだ完全に発生していない間でも起こる。変性のより緩やかな時間経過を有し、ヒト網膜変性状態により密接に類似するｒｄ１０マウスモデルを、Ｌｉｎ−ＨＳＣを介した血管救済を検討するために使用した。ｒｄ１０マウスでは、光受容器細胞変性はＰ２１頃に始まり、血管変性はこのすぐ後に始まる。
【００８５】
正常な感覚神経網膜発生は主としてＰ２１までに完了するので、変性は網膜が分化を完了した後に始まることが認められ、このようにｒｄ１／ｒｄ１マウスモデルよりもヒト網膜変性により類似する。ｒｄ１０マウスからのＬｉｎ−ＨＳＣ又は対照細胞をＰ６の眼に注入し、網膜を様々な時点で評価した。Ｐ２１にＬｉｎ−ＨＳＣ及び対照細胞注入眼からの網膜はどちらも、全ての血管層の発生完了とＩＮＬ及びＯＮＬの正常な発生を伴って、正常であると思われた（図１８（Ｄ及びＨ））。およそＰ２１に網膜変性が始まり、年齢と共に進行した。Ｐ３０までに、対照細胞注入網膜は重篤な血管及び神経変性を示したが（図１８（Ｉ））、Ｌｉｎ−ＨＳＣ注入網膜はほぼ正常な血管層と光受容器細胞を維持した（図１８（Ｅ））。救済眼と非救済眼の差は遅い時点でより顕著であった（図１８（Ｆ及びＧ）と図１８（Ｊ及びＫ）を比較する）。対照処置眼では、血管変性の進行がＣＤ３１及びコラーゲンＶＩに関する免疫組織化学染色によって非常に明瞭に認められた（図１８（Ｉ−Ｋ））。対照処置眼はＣＤ３１に関してほぼ完全に陰性であったが、コラーゲンＩＶ陽性血管の「航跡（ｔｒａｃｋｓ）」が明白なままであり、不完全な血管形成ではなく血管の後退が起こったことを示唆した。これに対しＬｉｎ−ＨＳＣ処置眼は、正常な野生型眼に非常に類似すると思われる、ＣＤ３１及びコラーゲンＩＶ陽性血管を有していた（図１８（ＦとＩ）を比較する）。
【００８６】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ処置後のｒｄ／ｒｄマウス網膜の遺伝子発現分析。
【００８７】
神経栄養救済の推定上のメディエイタを特定するべく救済及び非救済網膜を分析するために大規模ゲノム学（マイクロアレイ分析）を使用した。Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置したｒｄ１／ｒｄ１マウス網膜における遺伝子発現を、非注入網膜並びに対照細胞（ＣＤ３１−）を注入した網膜と比較した。これらの比較を各々３回実施した。存在するとみなすためには、遺伝子は、３回の比較全てにおいてバックグラウンドレベルより少なくとも２倍高い発現レベルを有する必要があった。対照細胞注入及び非注入ｒｄ／ｒｄマウス網膜に比べてＬｉｎ−ＨＳＣ保護網膜において３倍上方調節された遺伝子を図２０、パネルＡ及びＢに示す。変動係数（ＣＯＶ）レベルを、発現された遺伝子に関して、標準偏差を各々のｃＲＮＡ複製の平均発現レベルで除することによって算定した。加えて、発現レベルとノイズ変動の間の相関を、平均と標準偏差（ＳＤ）を関係付けることによって算定した。遺伝子発現レベルと各々の遺伝子についての標準偏差の間で相関が得られ、バックグラウンドレベルと信頼発現レベル閾値を決定することができた。全体として、データは十分に許容限界範囲内であった（Ｔｕら、２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１４０３１−１４０３６）。以下で個々に論じる遺伝子は、これらの臨界発現レベルを上回る発現レベルを示した。論じる遺伝子についての対応ある「ｔ検定」値も決定した。各々の場合に、複製の間に類似性及び種々の試験群の間に推定有意差が存在することを示す、ｐ値は妥当である（０．０５付近又はそれ以下）。ＭＡＤ及びＹｉｎｇ  Ｙａｎｇ−１（ＹＹ−Ｉ）（Ａｕｓｔｅｎら、１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２４：１２３−１３０）を含む、有意に上方調節される遺伝子の多くは、アポトーシスからの細胞の保護に関わる機能を有するタンパク質をコードする。ストレスからの細胞の保護に関わる公知の熱ショックタンパク質と配列相同性及び類似機能を有する多くのクリスタリン遺伝子も、Ｌｉｎ−ＨＳＣ処置によって上方調節された。α−クリスタリンの発現は、免疫組織化学分析によりＯＮＬに局在化された（図１９）。図１９は、クリスタリンαＡが、Ｌｉｎ−ＨＳＣ処置後の救済外核層細胞において上方調節されるが、対照細胞で処置した反対側の眼では上方調節されないことを示す。左のパネルは、救済された網膜におけるＩｇＧ染色（対照）を示す。中央のパネルは、救済網膜におけるクリスタリンαＡを示す。右のパネルは、非救済網膜におけるクリスタリンαＡを示す。
【００８８】
ヒトＬｉｎ−ＨＳＣで救済されるｒｄ１／ｒｄ１マウス網膜からのメッセンジャーＲＮＡを、ヒト特異的Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイチップにハイブリダイズした。ストリンジェント分析後、このｍＲＮＡ発現が、バックグラウンドを上回って、ヒト特異的であり、マウスＬｉｎ−ＨＳＣ救済網膜及びヒト対照細胞注入非救済網膜と比較してヒトＬｉｎ−ＨＳＣ救済網膜において有意に高い、多くの遺伝子が認められた（図２０、パネルＣ）。原始及び新たに分化したＣＤ３４＋造血幹細胞の表面で発現される細胞接着分子、ＣＤ６及び造血幹細胞によって発現されるもう１つの遺伝子、インターフェロンα１３が、どちらもマイクロアレイバイオインフォマティクス手法によって認められ、評価プロトコールの有効性を確認した。加えて、いくつかの増殖因子及び神経栄養因子が、ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ救済マウス網膜試料によってバックグラウンドを上回って発現された（図２０、パネルＤ）。
【００８９】
ＥＰＣを含む骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣの集団を陰性選択するために系統拘束造血細胞についてのマーカーを使用した。ＥＰＣとして働くことができる骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣの小集団は、一般的に使用される細胞表面マーカーによって特性決定されないが、発生中又は損傷網膜血管系におけるこれらの細胞の行動は、Ｌｉｎ＋又は成体内皮細胞集団について認められるものとは全く異なる。これらの細胞は網膜血管新生の部位を選択的に標的し、親血管の形成に参加する。
【００９０】
遺伝性網膜変性疾患はしばしば網膜血管系の喪失を伴う。このような疾患の有効な治療は、機能の修復並びに複雑な組織構造の維持を必要とする。いくつかの最近の研究は、栄養因子又は幹細胞自体の細胞ベースの送達の使用を検討しているが、両者のある種の組合せが必要であると考えられる。例えば網膜変性疾患を治療するための増殖因子治療の使用は、正常網膜組織構造の重篤な破壊をもたらす、血管の調節不能の過剰増殖を生じさせた。網膜変性疾患を治療するための神経又は網膜幹細胞の使用は神経機能を再構成し得るが、機能的血管系も、網膜機能の完全性を維持するために必要である。ｒｄ／ｒｄマウスの網膜血管へのＬｉｎ−ＨＳＣ集団からの細胞の組込みは、網膜構造を破壊することなく変性血管系を安定化した。この救済作用は、細胞をＰ１５  ｒｄ／ｒｄマウスに注入したときにも認められた。ｒｄ／ｒｄマウスでは血管変性はＰ１６に始まるので、この所見は有効なＬｉｎ−ＨＳＣ治療のための治療ウインドウを拡大する。Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞を注入した細胞では、網膜神経細胞及び光受容器が保存され、視覚機能が維持される。
【００９１】
成体骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣは、網膜変性疾患を有するマウスに硝子体内注入したとき、著しい血管及び神経栄養作用を及ぼす。この救済作用は処置後６ヶ月間まで続き、Ｌｉｎ−ＨＳＣを完全な網膜変性に先立って（通常生後３０日目までに完全な網膜変性を示すマウスでは生後１６日目までに）注入するとき最も有効である。この救済は、網膜変性の２つのマウスモデルで認められ、注目すべきことに、受容者が網膜変性を有する免疫欠損げっ歯動物（例えばＳＣＩＤマウス）であるとき又は提供者が網膜変性を有するマウスであるときに、成人骨髄由来ＨＳＣで達成され得る。いくつかの最近の報告は、野生型遺伝子によるウイルスに基づく遺伝子救済後の網膜変性を有するマウス又はイヌでの部分的表現型救済を述べているが（Ａｌｉら、２０００，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２５：３０６−３１０；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７８１２−７８１６；Ａｃｌａｎｄら、２００１，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：９２−９５．）、本発明は、血管救済によって達成される初めての一般的な細胞ベースの治療作用である。このため、１００以上の公知の関連突然変異を有する疾患群（例えば色素性網膜炎）を治療する上でのこのようなアプローチの潜在的有用性は、各々の公知の突然変異を治療するために個別の遺伝子治療を創造することよりも実際的である。
【００９２】
神経栄養救済作用の正確な分子基礎は不明のままであるが、血管安定化／救済が同時に存在するときにのみ認められる。注入した幹細胞の存在は、それ自体では、神経栄養救済を生じさせるのに十分ではなく、外核層における幹細胞由来神経細胞の明らかな不在は、注入細胞が光受容器に変換する可能性を排除する。マイクロアレイ遺伝子発現分析によって得られたデータは、抗アポトーシス作用を有することが知られる遺伝子の有意の上方調節を明らかにした。網膜変性において認められる大部分の神経細胞死はアポトーシスによるので、このような保護は、光受容器及びこれらの疾患における視覚機能にとって決定的に重要な他の神経細胞の寿命を延長させる上で大きな治療的利益であり得る。ｃ−ｍｙｃは、様々な下流のアポトーシス誘導因子の上方調節によってアポトーシスに関与する転写因子である。ｒｄ／ｒｄマウスでは野生型に比べてｃ−ｍｙｃ発現が４．５倍に上昇しており、ｒｄ１／ｒｄ１マウスで認められる光受容器変性への潜在的関与を示唆した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ保護網膜において劇的に上方調節される２個の遺伝子、Ｍａｄ１とＹＹ−１は（図２０、パネルＡ）、ｃ−ｍｙｃの活性を抑制することが知られており、このためｃ−ｍｙｃ誘導のアポトーシスを阻害する。Ｍａｄ１の過剰発現も、アポトーシス経路のもう１つの重要な成分である、Ｆａｓ誘導のカスパーゼ８の活性化を抑制することが示された。これら２つの分子の上方調節は、通常はｒｄ／ｒｄマウスにおいて変性を導くアポトーシスの開始を妨げることによって血管及び神経変性からの網膜の保護に役割を果たすと考えられる。
【００９３】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ保護網膜において大きく上方調節されるもう一組の遺伝子は、クリスタリンファミリーの成員を含む（図２０、パネルＢ）。熱ショック及び他のストレス誘導性タンパク質と同様に、クリスタリンは網膜ストレスによって活性化され、アポトーシスに対する保護作用を与え得る。クリスタリンαＡの異常に低い発現は、網膜ジストロフィーのラットモデルでは光受容器喪失と相関し、最近のｒｄ／ｒｄマウスにおける網膜のプロテオーム解析は、網膜変性に応答したクリスタリン上方調節の誘導を明らかにした。ＥＰＣ救済ｒｄ／ｒｄマウス網膜についての我々のマクロアレイデータに基づき、クリスタリンの上方調節は、ＥＰＣを介した網膜神経保護において鍵となる役割を果たすと思われる。
【００９４】
ｃ−ｍｙｃ、Ｍａｄ１、Ｙｘ−１及びクリスタリンなどの遺伝子は、おそらく神経救済の下流メディエイタであると考えられる。神経栄養物質は抗アポトーシス遺伝子発現を調節することができるが、我々のマウス幹細胞で救済された網膜のマイクロアレイ分析は、公知の神経栄養因子のレベル上昇の誘導を示さなかった。ヒト骨髄由来幹細胞を介した救済のヒト特異的チップによる分析は、他方で、多数の増殖因子遺伝子の発現の、低いが有意の上昇を明らかにした。
【００９５】
上方調節される遺伝子は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのいくつかの成員及びオトファーリン（ｏｔｏｆｅｒｌｉｎ）を含む。オトファーリン遺伝子の突然変異は、聴覚神経障害による難聴を導く遺伝疾患に結びつく。注入Ｌｉｎ−ＨＳＣによるオトファーリン産生は網膜神経障害の予防にも寄与する可能性がある。歴史的に、網膜変性を有する患者及び動物で認められる血管変化は、光受容器が死滅すると共に代謝要求が低下することに続発すると長い間考えられてきた。本発明のデータは、少なくとも遺伝性網膜変性を有するマウスに関しては、正常血管系を保存することが外核層の成分を維持するのにも役立ち得ることを指し示す。文献における最近の報告は、組織特異的血管系が、単に血管「栄養」を与えることから期待されるものを超えた栄養作用を有するという概念を裏付ける。例えば肝臓内皮細胞は、ＶＥＧＦＲ１活性化後、肝損傷に直面したときの肝細胞の再生と維持にとって決定的に重要な増殖因子を生産するように誘導され得る（ＬｅＣｏｕｔｅｒら、２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：８９０−８９３）。
【００９６】
血管内皮細胞と隣接肝実質細胞の間の同様の示唆的相互作用は、報告によれば、機能的血管の形成のかなり前に、肝臓器官形成に関与する。網膜変性を有する個体における内因性網膜血管系はそれほど劇的な救済を促進し得るわけではないが、この血管系が骨髄造血幹細胞集団に由来する内皮前駆細胞で強化された場合は、血管構造を変性に対してより抵抗性にし、同時に網膜神経細胞並びに血管の生存を促進し得る。網膜変性を有するヒトにおいて、完全な網膜変性の発症を遅延させることは何年間かの付加的な視力を提供し得る。Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置された動物は、視覚を維持するのに十分であると考えられる、ＥＲＧの有意の保存を有していた。
【００９７】
臨床的に、まだ機能的視力を保持している間に光受容器及び他の神経細胞の実質的な喪失が存在し得ることは広く認識されている。ある時点で、臨界閾値を超え、視力が失われる。ヒト遺伝性網膜変性のほとんど全てが、早期はであるが緩やかに発症するので、網膜変性を有する個体を特定し、網膜変性と付随する視力喪失を遅延させるために本発明の自己由来骨髄幹細胞の移植片で硝子体内治療することができる。本発明の幹細胞のターゲティングと取り込みを促進するために、活性化星状膠細胞の存在が望ましい（Ｏｔａｎｉら、２００２，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：１００４−１０１０）；これは、関連グリオーシスが存在するときは早期治療によって、又は活性化星状膠細胞の局所増殖を刺激するためにレーザーを使用することによって達成できる。場合により、救済作用を増強するために、眼内注射の前に１又はそれ以上の神経栄養物質による幹細胞のエクスビボトランスフェクションを使用することができる。このアプローチは、網膜神経節細胞変性が存在する、緑内障のような他の視覚神経変性疾患の治療に適用することができる。
【００９８】
成体骨髄からのＬｉｎ−ＨＳＣ集団は、反応性星状膠細胞を標的することによって血管新生を促進し、網膜構造を破壊することなく確立された鋳型に組み込まれることができるＥＰＣの集団を含む。Ｌｉｎ−ＨＳＣはまた、網膜変性に罹患している眼において長期的な神経栄養救済作用を提供する。加えて、ＥＰＣを含む遺伝的に修飾された自己由来Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物は、虚血又は異常血管新生眼に移植することができ、新しい血管及び神経細胞層に安定に取り込まれて、長期間にわたって持続的に治療分子を局所送達することができる。薬理的物質を生理的に意味のある用量で発現する遺伝子のこのような局所送達は、現在治療不可能な眼疾患を治療するための新しい枠組みである。
【００９９】
正常マウス網膜における光受容器は、例えば、主として桿体であるが、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣによる救済後に認められる外核層は主として錐体を含む。大部分の遺伝性ヒト網膜変性は、一次性の桿体特異的欠損の結果として起こり、錐体の喪失は、おそらく桿体によって発現される何らかの栄養因子の喪失に関係する、桿体機能不全に続発すると考えられる。
【０１００】
（実施例）
【実施例１】
【０１０１】
細胞の単離と富化；マウスＬｉｎ−ＨＳＣ集団Ａ及びＢの作製。
【０１０２】
一般手順。全てのインビボ評価はＮＩＨの「実験動物の管理と使用に関する指針」に従って実施し、全ての評価手順はＴｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＴＳＲＩ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の実験動物の管理及び使用委員会によって承認された。骨髄細胞は、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａ２６、Ｔｉｅ−２ＧＦＰ、ＡＣＴｂＥＧＦＰ、ＦＶＢ／ＮＪ（ｒｄ／ｒｄマウス）又はＢａｌｂ／ｃＢＹＪ成体マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭＥ）から抽出した。
【０１０３】
次に、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）ポリスクロース勾配（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた密度勾配分離によって単球を分離し、マウスにおけるＬｉｎ−選択のためにビオチン複合系統パネル抗体（ＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１、ＴＥＲ−１１９、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識した。系統陽性（Ｌｉｎ＋）細胞を分離し、磁気分離装置（ＡＵＴＯＭＡＣＳ（商標）選別機、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いてＬｉｎ−ＨＳＣから除去した。生じた内皮前駆細胞を含むＬｉｎ−ＨＳＣ集団を、以下の抗体：ＰＥ複合Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、ＫＤＲ及びＣＤ３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ＦＡＣＳ（商標）Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いてさらに特性決定した。Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ骨髄細胞をＴｉｅ−２の特性決定のために使用した。
【０１０４】
成体マウス内皮細胞を採取するため、腸間膜組織をＡＣＴｂＥＧＦＰマウスから外科的に切除し、組織を消化するためにコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）中に入れて、その後４５μｍフィルターを用いてろ過した。フロースルーを収集し、内皮増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共にインキュベートした。形態学的な敷石像を観察すること、ＣＤ３１  ｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色すること、及びＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）マトリックス（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）における管様構造の形成に関して培養物を検査することによって内皮特徴を確認した。
【０１０５】
マウスＬｉｎ−ＨＳＣ集団Ａ。骨髄細胞を上述した一般手順によってＡＣＴｂＥＧＦＰマウスから抽出した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞をＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、Ｆｌｋ−１及びＴｉｅ−２細胞表面抗原マーカーに関するＦＡＣＳフローサイトメトリーによって特性決定した。結果を図１（ｃ）に示す。Ｌｉｎ−ＨＳＣの約８１％がＣＤ３１マーカーを示し、Ｌｉｎ−ＨＳＣの約７０．５％がｃ−ｋｉｔマーカーを示し、Ｌｉｎ−ＨＳＣの約４％がＳｃａ−１マーカーを示し、Ｌｉｎ−ＨＳＣの約２．２％がＦｌｋ−１マーカーを示し、Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞の約０．９１％がＴｉｅ−２マーカーを示した。これに対し、これらの骨髄細胞から単離したＬｉｎ＋ＨＳＣは有意に異なる細胞マーカープロフィールを有していた（すなわちＣＤ３１：３７．４％；ｃ−ｋｉｔ：２０％；Ｓｃａ−１：２．８％；Ｆｌｋ−１：０．０５％）。
【０１０６】
マウスＬｉｎ−ＨＳＣ集団Ｂ。骨髄細胞を上述した一般手順によってＢａｌｂ／Ｃ、ＡＣＴｂＥＧＦＰ及びＣ３Ｈマウスから抽出した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞を、細胞表面マーカー（Ｓｃａ−１、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＤ３４、ＣＤ３１及び様々なインテグリン：α１、α２、α３、α４、α５、α６、αＬ、αＭ、αＶ、αＸ、αＩＩｂ、β１、β２、β３、β４、β５及びβ７）の存在に関して分析した。結果を表２に示す。
【０１０７】
【表２】
2008536804.tif 000004
【実施例２】
【０１０８】
マウスモデルにおける細胞の硝子体内投与。
【０１０９】
Ｐ２−Ｐ６眼球を露出させるために鋭い刃でマウス眼瞼において眼瞼裂溝を創造した。その後、３３ゲージ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）針付き注射器を用いて本発明の系統陰性ＨＳＣ集団Ａ（細胞培養培地約０．５μｌ−約１μｌ中約１０５細胞）を硝子体内注射した。
【実施例３】
【０１１０】
ＥＰＣトランスフェクション。
【０１１１】
マウスＬｉｎ−ＨＳＣ（集団Ａ）を、ＦｕＧＥＮＥ（商標）６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を製造者のプロトコールに従って使用して、Ｈｉｓ６標識を同時に含む、ＴｒｐＲＳのＴ２フラグメント（配列番号３）をコードするＤＮＡ（配列番号１、図７）で形質移入した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞（約１０６細胞／ｍｌ）を、幹細胞因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を含むｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に懸濁した。次にＤＮＡ（約１μｇ）及びＦｕＧＥＮＥ試薬（約３μｇ）混合物を添加し、混合物を約３７℃で約１８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、収集した。この系のトランスフェクション速度は、ＦＡＣＳ分析によって確認したとき約１７％であった。Ｔ２−ＴｒｐＲＳ産生をウエスタンブロット法によって確認した。Ｈｉｓ６標識Ｔ２−ＴｒｐＲＳのアミノ酸配列を配列番号２、図８に示す。
【実施例４】
【０１１２】
免疫組織化学及び共焦点分析。
【０１１３】
マウス網膜を様々な時点で採取し、全載又は凍結切片化のために調製した。全載のために、網膜を４％パラホルムアルデヒドで固定し、５０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び２０％正常ヤギ血清中、外界温度で１時間ブロックした。網膜を一次抗体に関して処理し、二次抗体で検出した。使用した一次抗体は、抗コラーゲンＩＶ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、抗β−ｇａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、抗−ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）、抗α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）であった。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ  ４８８又は５９４蛍光マーカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）のいずれかに複合した。画像は、ＭＲＣ１０２４共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて撮影した。全載網膜における血管発生の３つの異なる層を検査するために、ＬＡＳＥＲＳＨＡＲＰ（登録商標）ソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて三次元画像を作製した。共焦点顕微鏡検査によって識別された、増強ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マウスとＧＦＡＰ／ｗｔＧＦＰマウスの間のＧＦＰピクセル強度の差を、三次元画像を作製するために利用した。
【実施例５】
【０１１４】
マウスにおけるインビボ網膜血管新生の定量化。
【０１１５】
Ｔ２−ＴｒｐＲＳ分析のために、一次及び深部叢をマウス網膜の三次元画像から再構築した。一次叢を２つのカテゴリー：正常発生又は停止血管進行に分けた。深血管発生の阻害のカテゴリーは、以下の判定基準を含む血管阻害のパーセンテージに基づいて解釈した：深部叢形成の完全な阻害は「完全」と分類し、正常血管発生（２５％未満の阻害を含む）は「正常」と分類し、残りを「部分的」と分類した。ｒｄ／ｒｄマウス救済データのために、各々の全載網膜のより深い叢の４つの別々の領域を、１０×レンズを用いて捕らえた。血管系の全長を各々の画像について算定し、要約して、群の間で比較した。正確な情報を得るため、Ｌｉｎ−ＨＳＣを一方の眼に注入し、同じマウスのもう一方の眼にＬｉｎ＋ＨＳＣを注入した。非注入対照網膜を同腹仔から得た。
【実施例６】
【０１１６】
成体網膜損傷マウスモデル。
【０１１７】
レーザー及び瘢痕モデルを、ダイオードレーザー（１５０ｍＷ、１秒、５０ｍｍ）を用いて又は２７ゲージ針でマウス網膜を穿刺することによって機械的に作製した。損傷の５日後、硝子体内法を用いて細胞を注入した。５日後にマウスから眼を採取した。
【実施例７】
【０１１８】
網膜再生の神経栄養救済。
【０１１９】
成体マウス骨髄由来の系統陰性造血幹細胞集団（Ｌｉｎ−ＨＳＣ）は、網膜変性のマウスモデルにおいて血管栄養及び神経栄養救済作用を有する。１０日齢のマウスの右眼に、本発明の約１０５Ｌｉｎ−ＨＳＣを含む約０．５μｌを硝子体内注入し、２ヵ月後に網膜血管系及び神経細胞層の存在及び核の数に関して評価した。同じマウスの左眼に対照としてＬｉｎ＋ＨＳＣのほぼ同じ数を注入し、同様に評価した。図９に示すように、Ｌｉｎ−ＨＳＣ処置眼では、網膜血管系はほぼ正常と思われ、内核層はほぼ正常であり、外核層（ＯＮＬ）は約３−約４層の核を有していた。これに対し、反対側のＬｉｎ＋ＨＳＣ処置眼は、顕著な萎縮中間網膜血管層、完全な萎縮外網膜血管層を有していた；内核層は顕著に萎縮し、外核層は完全に消失していた。これは、マウス３及びマウス５において劇的に例証された。マウス１では、救済作用は存在せず、これは注入マウスの約１５％についても当てはまった。
【０１２０】
視覚機能を網膜電位図（ＥＲＧ）で評価したとき、血管と神経救済の両方が観察されたときに陽性ＥＲＧの修復が認められた（マウス３及び５）。陽性ＥＲＧは、血管又は神経救済が存在しないときには認められなかった（マウス１）。本発明のＬｉｎ−ＨＳＣによるｒｄ／ｒｄマウス眼の血管と神経栄養救済の間の相関は、図１０に示す回帰分析プロットによって説明される。神経（ｙ軸）と血管（ｘ軸）回復の間の相関は、中間血管系型（ｒ＝０．４５）及び深血管系（ｒ＝０．６７）に関して認められた。
【０１２１】
図１１は、Ｌｉｎ＋ＨＳＣによる血管救済と神経救済の間に統計的に有意の相関が存在しないことを示す。血管救済を数量化し、データを図１２に示す。図１２に示す注射後１ヶ月目（１Ｍ）、２ヶ月目（２Ｍ）及び６ヶ月目（６Ｍ）のマウスについてのデータは、血管長が、特に１ヶ月目及び２ヶ月目の同じマウスからの未処置眼（明るい色の棒）における血管長と比較して本発明のＬｉｎ−ＨＳＣで処置した眼（暗い棒）では有意に増加したことを明らかにする。神経栄養救済作用は、Ｌｉｎ−ＨＳＣ又はＬｉｎ＋ＨＳＣの注射後約２ヶ月目に内及び外核層における核を計数することによって数量化した。結果を図１３及び１４に示す。
【実施例８】
【０１２２】
ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ集団。
【０１２３】
骨髄細胞を、上述した一般手順によって健常成人志願者から抽出した。次に、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）ポリスクロース勾配（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた密度勾配分離によって単球を分離した。ヒト骨髄単核細胞からＬｉｎ−ＨＳＣ集団を単離するために以下のビオチン複合系統パネル抗体を磁気分離システム（ＡＵＴＯＭＡＣＳ（商標）選別機、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）と共に使用した：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６、ＣＤ２３５ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。
【０１２４】
ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ集団を、ＣＤ１３３発現に基づき２つの小集団にさらに分類した。細胞をビオチン複合ＣＤ１３３抗体で標識し、ＣＤ１３３陽性とＣＤ１３３陰性の小集団に分けた。
【実施例９】
【０１２５】
網膜変性についてのマウスモデルにおけるヒト及びマウス細胞の硝子体内投与。
【０１２６】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ  ＳＣＩＤ及びｒｄ１０マウス系統を網膜変性モデルとして使用した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ及びＣ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ  ＳＣＩＤマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｉｎｅ）は、早期発症の重症網膜変性を引き起こす突然変異である、網膜変性１（ｒｄ１）突然変異に関してホモ接合であった。突然変異は、桿体視細胞ｃＧＭＰホスホジエステラーゼβサブユニットをコードするＰｄｅ６ｂ遺伝子のエクソン７に位置する。この遺伝子の突然変異は、常染色体劣性色素性網膜炎（ＲＰ）を有するヒト患者において認められた。Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ  ＳＣＩＤマウスはまた、重症合併型免疫欠損偶発突然変異（Ｐｒｋｄｃ  ＳＣＩＤ）についてもホモ接合であり、ヒト細胞導入実験のために使用した。ｒｄ１０マウスにおける網膜変性はＰｄｅ６ｂ遺伝子のエクソン１３の突然変異によって引き起こされる。これはまた、ｒｄ１／ｒｄ１よりも後期発症で軽度の網膜変性を有する臨床的に適切なＲＰモデルである。全ての評価はＮＩＨの「実験動物の管理と使用に関する指針」に従って実施し、全ての手順はＴｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの実験動物の管理及び使用委員会によって承認された。
【０１２７】
Ｐ２−Ｐ６眼球を露出させるために鋭い刃でマウス眼瞼において眼瞼裂溝を創造した。その後、マウス集団Ａ又はヒト集団Ｃについての系統陰性ＨＳＣ細胞（細胞培養培地約０．５μｌ−約１μｌ中約１０５細胞）を、３３ゲージ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）針付き注射器を用いてマウス眼に硝子体内注射した。注入したヒト細胞を視覚化するため、注射の前に細胞を染料（Ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒグリーンＣＭＦＤＡ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。
【０１２８】
網膜を様々な時点で採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）及びメタノールで固定し、次いで５０％ＦＢＳ／２０％ＮＧＳ中、室温で１時間ブロックした。網膜血管系を染色するため、網膜を抗３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び抗コラーゲンＩＶ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）抗体、次いでＡｌｅｘａ  ４８８又は５９４複合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）と共にインキュベートした。全載標本を得るために、網膜を４つの放射状減張切開で平らにした。中間又は深網膜血管叢の血管系の画像（Ｄｏｒｒｅｌｌら、２００２  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４３：３５００−３５１０参照）を、Ｒａｄｉａｎｃｅ  ＭＰ２１００共焦点顕微鏡及びＬＡＳＥＲＳＨＡＲＰ（登録商標）ソフトウエア（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて得た。血管系の数量化のために、４つの独立した領域（９００μｍ×９００μｍ）を中間又は深血管層の中央部分から無作為に選択し、ＬＡＳＥＲＰＩＸ（登録商標）解析ソフトウエア（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて血管系の全長を測定した。同じ叢内のこれら４つの領域の全長をさらなる分析のために使用した。
【０１２９】
扁平封入網膜をクリオスタット切片用に再包埋した。網膜を４％ＰＦＡ中に一晩入れ、その後２０％スクロースと共にインキュベートした。網膜を最適切断温度（ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ：Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ；Ｓａｋｕｒａ  ＦｉｎｅＴｅｃｈ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）コンパウンドに包埋した。クリオスタット切片（１０μｍ）を、核染料ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含むＰＢＳ中で再水和した。視神経乳頭及び周辺網膜全体を含む単一切片内の３つの異なる領域（幅２８０μｍ、不偏サンプリング）のＤＡＰＩ標識核画像を共焦点顕微鏡によって撮影した。１つの切片内の３つの独立した領域のＯＮＬに位置する核の数を計数し、分析のために合計した。深部叢における血管系の長さとＯＮＬ内の細胞核の数の間の関係を調べるために単線形回帰分析を実施した。
【０１３０】
一晩暗所に適応させた後、マウスをケタミン１５μｇ／ｇｍ及びキシラジン７μｇ／ｇｍの腹腔内注射によって麻酔した。網膜電位図（ＥＲＧ）を、口標準及び尾部接地電極と共に金ループ角膜電極を使用して瞳孔拡張後に（１％硫酸アトロピン）各々の眼の角膜表面から記録した。反射率の高いＧａｎｚｆｅｌｄドームの外側に取り付けたＧｒａｓｓ  Ｐｈｏｔｉｃ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＰＳ３３  Ｐｌｕｓ，Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｑｕｉｎｃｙ，ＭＡ）で刺激を生成した。閃光刺激装置によって許容される最大値（０．６６８ｃｄ−ｓ／ｍ２）までの強度範囲にわたる短波長（Ｗｒａｔｔｅｎ  ４７Ａ；λｍａｘ＝４７０ｎｍ）閃光に対しての桿体応答を記録した。応答シグナルを増幅し（ＣＰ５１１  ＡＣ増幅器、Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、デジタル化して（ＰＣＩ−１２００，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、コンピュータ解析した。各マウスは、処置眼及び未処置眼の両方から記録されたＥＲＧに対する自身の内部対照として機能した。１００掃引までを最弱シグナルに関して平均した。未処置眼からの平均応答を、処置眼からの応答からデジタル減算し、このシグナルの差を、機能的救済を指数化するために使用した。
【０１３１】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ標的網膜遺伝子発現の評価のためにマイクロアレイ分析を使用した。Ｐ６  ｒｄ／ｒｄマウスにＬｉｎ−又はＣＤ３１−ＨＳＣのいずれかを注射した。これらのマウスの網膜を注射後４０日目にＲＮアーゼ不含培地中で切開した（注射後この時点で網膜血管系及び光受容器層の救済は明白である）。各々の網膜からの１つの四分円を、正常なＨＳＣターゲティング並びに血管系及び神経保護が達成されていたことを確実にするために全載によって分析した。成功裏に注射した網膜からのＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、フェノール／クロロホルムＲＮＡ単離プロトコールを用いて精製した。ＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｕ７４Ａｖ２チップにハイブリダイズし、ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（登録商標）ソフトウエア（ＳｉｌｉｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて分析した。精製ヒト又はマウスＨＳＣをＰ６マウスに硝子体内注射した。Ｐ４５に網膜を切開し、ＲＮＡの精製及びヒト特異的Ｕ１３３Ａ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップへのハイブリダイゼーションのために、１）ヒトＨＳＣ注入した救済マウス網膜、２）ヒトＨＳＣ注入した非救済マウス網膜、及び３）マウスＨＳＣ注入した救済マウス網膜の画分にプールした。バックグラウンドを上回って発現され及びヒトＨＳＣ救済網膜においてより高い発現率を有する遺伝子を特定するためにＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（登録商標）ソフトウエアを使用した。次に、これらの遺伝子の各々についてのプローブ対発現プロフィールを個別に分析し、ヒト種特異的ハイブリダイゼーションを判定するため及び種間ハイブリダイゼーションによる偽陽性を除外するためにｄＣｈｉｐを用いて正常ヒトＵ１３３Ａマイクロアレイ実験のモデルと比較した。
【０１３２】
図２１は、本発明のＣＤ１３３陽性（ＣＤ１３３＋）及びＣＤ１３３陰性（ＣＤ１３３−）ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ集団でのＣＤ３１及びインテグリンα６表面抗原の発現を比較するフローサイトメトリーデータを示す。左のパネルはフローサイトメトリー散乱図を示す。中央及び右のパネルは、細胞集団での特異抗体発現のレベルを示すヒストグラムである。Ｙ軸は事象の数を表わし、Ｘ軸はシグナルの強さを示す。輪郭ヒストグラムは、非特異的バックグラウンド染色のレベルを示すアイソタイプＩｇＧ対照抗体である。充実ヒストグラムは細胞集団上の特異抗体発現のレベルを示す。輪郭（対照）ヒストグラムの右側に移動した充実ヒストグラムは、蛍光シグナルの上昇及びバックグラウンドレベルを上回る抗体の発現を表わす。２つの細胞集団の間の充実ヒストグラムのピークの位置の比較は、細胞上のタンパク質発現の差を表わす。例えばＣＤ３１は、本発明のＣＤ１３３＋及びＣＤ１３３−細胞の両方でバックグラウンドを上回って発現される；しかしＣＤ１３３＋細胞集団では、ＣＤ１３３−集団におけるよりもＣＤ３１のより低いレベルを発現する細胞が多く存在する。このデータから、ＣＤ３１発現が２つの集団の間で異なること及びα６インテグリン発現が主としてＬｉｎ−集団の細胞に限定され、このため血管及び神経救済機能を有する細胞のマーカーとして使用し得ることは明らかである。
【０１３３】
ＣＤ１３３陽性及びＣＤ１３３陰性Ｌｉｎ−ＨＳＣ小集団を新生児ＳＣＩＤマウスの眼に硝子体内注射したとき、発生中の血管系への最大の取り込みは、ＣＤ３１とインテグリンα６表面抗原の両方を発現する、ＣＤ１３３陰性小集団に関して認められた（図２１、下の図参照）。ＣＤ３１又はインテグリンα６を発現しないＣＤ１３３陽性小集団（図２１、上の図）は、末梢虚血駆動性新生血管形成の部位を標的するが、血管新生を受けている眼に注入したときには標的しないと思われる。
【０１３４】
救済及び非救済網膜を、桿体又は錐体オプシンに特異的な抗体で免疫組織化学的に分析した。図１７に示すＥＲＧ記録のために使用したのと同じ眼を桿体又は錐体オプシンに関して分析した。野生型マウス網膜では、存在する光受容器の５％未満が錐体であり（Ｓｏｕｃｙら、１９９８，Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：４８１−４９３）、図２５（Ａ）に示す赤色／緑色錐体オプシン又は図２５（Ｂ）に示す桿体ロドプシンに関して認められる免疫組織化学染色パターンは、錐体細胞のこのパーセンテージと一致した。桿体ロドプシン（ｒｈｏ４Ｄ２）に特異的な抗体は、ブリティッシュ・コロンビア大学のＲｏｂｅｒｔ  Ｍｏｌｄａｙ博士より提供され、先に述べられているように使用した（Ｈｉｃｋｓら、１９８６，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．４２：５５−７１）。錐体赤色／緑色オプシンに特異的なウサギ抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（ＡＢ５４０５）より購入し、製造者の指示に従って使用した。
【実施例１０】
【０１３５】
酸素誘導網膜変性についてのマウスモデルにおけるマウス細胞の硝子体内投与。
【０１３６】
新生児野生型Ｃ５７Ｂ６マウスを、酸素誘導網膜変性（ＯＩＲ）モデルにおいて生後Ｐ７−Ｐ１２日の間に高酸素状態（７５％酸素）に暴露した。図２２は、Ｐ０−Ｐ３０のＣ５７Ｂ６マウスにおける正常な生後血管発生を示す。Ｐ０には出芽表在血管だけが視神経円板の周囲に認められる。その後数日間にわたって、一次表在網が末梢へと伸びて、Ｐ１０までに遠くの末梢に達する。Ｐ７とＰ１２の間に、二次（深）血管叢が発生する。Ｐ１７までに、広汎な表在及び深血管網が存在する（図２２、挿入図）。その後数日で、およそＰ２１に成体構造が達成されるまで三次（中間）血管層の発生と共にリモデリングが起こる。
【０１３７】
これに対し、ここで述べるＯＩＲモデルでは、Ｐ７−Ｐ２１の７５％酸素への暴露後に、正常な事象の連続が著しく分断される（図２３）。成体マウスＬｉｎ−ＨＳＣ集団を、その後ＯＩＲに供するマウスの眼に、Ｐ３に硝子体内注射し、他方の眼には対照としてＰＢＳ又はＣＤ３１陰性細胞を注射した。図２４は、Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団が発生中のマウス網膜において高酸素レベルの変性作用を逆転させ得ることを示す。処置眼ではＰ１７に完全に発生した表在及び深網膜血管系が認められるが、対照眼は、実質的に深血管がない大きな無血管領域を示した（図２４）。ＯＩＲモデルのマウスの約１００個の眼を観察した。正常血管形成は、ＣＤ３１−細胞で処置した対照眼の１２％及びＰＢＳで処置した対照眼の３％に比べて、Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団で処置した眼の５８％において認められた。
【実施例１１】
【０１３８】
ＣＤ４４選択によるマウス骨髄からの骨髄球様骨髄細胞の単離。
【０１３９】
骨髄細胞を成体マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭＥ）から抽出した。全骨髄をマウスＣＤ４４抗体で処置し、骨髄からＣＤ４４発現細胞を単離するためにフローサイトメトリーを使用した。細胞を抗体から分離し、その後の使用のために緩衝液中で保存した。ＣＤ４４を有意に発現しない細胞の集団も単離した（ＣＤ４４ｌｏＢＭ）。
【実施例１２】
【０１４０】
ＣＤ４４選択によるマウス骨髄からの骨髄球様骨髄細胞の単離。
【０１４１】
骨髄細胞をまた、実施例１１で述べたＣＤ４４の代わりにＣＤ１１ｂに対する抗体を用いて陽性選択した。ＣＤ４４を用いて実施例１１で単離したＣＤ４４ｈｉ集団に類似の活性特徴を有する、ＣＤ４４ｈｉ及びＣＤ１１ｂ＋である骨髄球様骨髄細胞集団を単離した。ＣＤ４４ｌｏ及びＣＤ１１ｂ−集団も単離し、これは不活性であることが認められた。
【実施例１３】
【０１４２】
ＭＬＢＭ細胞集団の特性決定。
【０１４３】
これに関連するＣＤ４４の役割は明らかではないが、この受容体は、眼への細胞の注入後、ヒアルロン酸に富む硝子体において細胞の生存、細胞移動及び／又は細胞分化を媒介すると考えられる。ＣＤ４４ｈｉ（すなわちＭＬＢＭ）及びＣＤ４４ｌｏ細胞の異なる集団が非分画マウス骨髄中に存在した。ＭＬＢＭ細胞集団は、先の実施例で使用したＬｉｎ−集団の７６％を占め、一方骨髄からのＬｉｎ＋及びＣＤ３１−／ＣＤ３４−／ＣＤ１１ｂ−細胞集団のそれぞれ約３７％及び４％だけがＣＤ４４を発現した（図２６）。従って、これら３つの集団において認められるＣＤ４４発現と血管栄養及び神経栄養活性の間には卓越した相関が存在し、すなわちＬｉｎ−細胞は最も有効であり、一方ＣＤ３１−／ＣＤ３４−／ＣＤ１１ｂ−細胞は一貫して最も有効性が低かった。系統特異的抗体のパネルを使用して、ＣＤ４４ｈｉ細胞の大部分が強い骨髄球様特性を有すると判定された（図２７）。同様に、ＣＤ４４ｈｉ骨髄細胞のほぼ全部が同時にＣＤ１１ｂ＋である（図２７）。
【０１４４】
実施例１２でＣＤ１１ｂ抗体を用いて陽性選択したＭＬＢＭ（ＣＤ４４ｈｉＣＤ１１ｂ＋）は、血管ターゲティング実験においてＣＤ４４抗体選択を用いて単離したＭＬＢＭで得られたのと同様の活性結果を生じた。
【０１４５】
実施例１２のＭＬＢＭ細胞集団及び実施例１２で単離したＣＤ４４ｌｏＣＤ１１ｂ＋細胞の細胞表面抗原特徴を以下の表３に示す。表３では、プラス記号（＋）のより多くの数は抗原の相対的により高い発現を指示する。マイナス記号（−）は検出された発現がないことを指示する。
【０１４６】
【表３】
2008536804.tif 000005
【実施例１４】
【０１４７】
ＭＬＢＭ細胞集団の血管栄養及び神経栄養作用。
【０１４８】
実施例１１のＭＬＢＭ細胞集団は、血管ターゲティング及び血管栄養及び神経栄養作用に関してＬｉｎ−細胞の性質を保持していたが、ＣＤ４４ｌｏＢＭ細胞はほとんど又は全く活性を示さなかった。血管ターゲティング活性は、生後７日目（Ｐ７）マウスにＧＦＰ＋  ＭＬＢＭ細胞集団からの細胞を硝子体内注入し、Ｐ１４に網膜を分析することによって明らかにされた。血管をＧＳイソレクチンで標識した後、ＧＦＰ＋細胞は、取り込みの証拠を伴わずに、網膜血管系を標的し、血管周囲局在化を担うことを認められた。これらの事象はＭＬＢＭを使用したときは一般的であったが、ＣＤ４４ｌｏＢＭで処置した眼ではほとんど起こらないか又は存在しなかった（図２８）。
【０１４９】
実施例１１のＭＬＢＭ細胞集団の血管及び神経栄養活性を、Ｌｉｎ−ＨＳＣに関して上述したように網膜変性のマウスモデルを用いて評価した。ｒｄ１／ｒｄ１マウスは、光受容器の死滅及び深網膜血管構造の萎縮を含む網膜変性疾患の特徴的な性質を示す。上述したように、Ｌｉｎ−ＨＳＣ骨髄細胞は、深網膜血管構造及び部分的に救済された光受容器を保持した。ＭＬＢＭ細胞集団は同じ機能を果たす（図２９）。
【０１５０】
酸素誘導網膜症モデルは未熟児網膜症と特徴を共有する。このモデルに結びつく病変は、ＭＬＢＭ細胞集団からの細胞で眼を処置したとき有意に低下する。このモデルにおけるＭＬＢＭ細胞集団からの細胞の作用は、上述したＬｉｎ−ＨＳＣを使用して認められたものと同様であった。ＭＬＢＭ細胞集団からの細胞で処置した眼は、このモデルにおいて病変の程度を定量するために使用される２つのパラメータ：血管閉塞面積及び新生血管のふさ状分岐面積、の有意の低下を示した。これに対し、ＣＤ４４ｌｏＢＭで処置した眼は賦形剤対照で処置した眼に比べて改善を示さなかった（図３０）。
【０１５１】
網膜血管系を標的するのに加えて、ＭＬＢＭ細胞集団からの細胞はマクロファージ様（Ｆ４／８０＋）細胞へと分化し、網膜に浸透して、網膜色素上皮（ＲＰＥ）と厳密に反対の位置を取る。この局在化は、ＭＬＢＭ細胞集団からの細胞の観察された血管及び光受容器救済作用を促進する。さらに、ひとたびＲＰＥの近くに位置すると、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子が活性化すると緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が発現される、ＶＥＧＦ−ＧＦＰマウスに由来するＭＬＢＭ細胞集団からの細胞の注入によって明らかにされたように、ＭＬＢＭ細胞集団からの細胞はＶＥＧＦを生産する（図３１）。このため、ＭＬＢＭ細胞集団からの細胞はＶＥＧＦ「活性化」状態であると思われる。ＭＬＢＭ細胞集団からの導入細胞は、ＧＦＰ＋（導入）及びＧＦＰ−（内因性）細胞の両方がＲＰＥ領域で認められたので、同じ型の内因性細胞を動員すると思われる。この局在化は、正常網膜血管発生の間の野生型マウス、ｒｄ１／ｒｄ１マウスの救済網膜及び酸素誘導網膜症モデルにおいて認められた。
【０１５２】
同様の血管ターゲティング結果が実施例１２のＭＬＢＭ細胞集団に関して認められた。図３２は、Ｐ２に注入したとき実施例１２のＣＤ４４ｈｉＣＤ１１ｂ＋細胞（緑色）が、実施例１１の高ＣＤ４４集団と同様に、Ｐ２０まで、血管系（赤色）を特異的に標的したことを示す。図３３は、実施例１２のＣＤ４４ｌｏＣＤ１１ｂ−細胞が血管系を特異的に標的しなかったことを示す。
【０１５３】
本発明のＭＬＢＭ細胞集団は、虚血性網膜症疾患及び同様の眼疾患のための有効で多用途の治療を提供する。細胞は自己由来骨髄から容易に単離され、このため細胞に基づく治療でしばしば認められる潜在的免疫原性を最小限に抑える。長期的な（６ヶ月までの）追跡は、系統陰性細胞を注入した眼において時折にだけ生じるロゼットと神経網膜の組織学的保存を明らかにした。加えて、本発明のＭＬＢＭ細胞集団は、機能的遺伝子を網膜に送達するために有用な遺伝子で形質移入することができる。
【０１５４】
上述した実施形態の数多くの変法及び修正が、本発明の新規特徴の精神及び範囲から逸脱することなく実施し得る。ここで示す特定実施形態に関していかなる限定も意図されておらず又は推測されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１−Ａ】発生中のマウス網膜の概要図を示す。（ａ）一次脈管叢の発生。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＰＬ、内網状層；ＩＮＬ、内核層；ＯＰＬ、外網状層；ＯＮＬ、外核層；ＲＰＥ、網膜色素上皮；ＯＮ、視神経；Ｐ、末梢。
【図１−Ｂ】発生中のマウス網膜の概要図を示す。（ｂ）網膜血管形成の第二期。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＰＬ、内網状層；ＩＮＬ、内核層；ＯＰＬ、外網状層；ＯＮＬ、外核層；ＲＰＥ、網膜色素上皮；ＯＮ、視神経；Ｐ、末梢。
【図１−Ｃ】発生中のマウス網膜の概要図を示す。パネル（ｃ）は、骨髄由来のＬｉｎ＋ＨＳＣ及びＬｉｎ−ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリー特性決定を示す。上の列：Ｒ１がＰＥ染色陽性の定量可能なゲート領域を定義し、Ｒ２がＧＦＰ陽性を示す、非抗体標識細胞のドットプロット分布；中央の列：Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）及び下の列：Ｌｉｎ＋ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）細胞、各々の細胞系は、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１についてのＰＥ複合抗体で標識されている。Ｔｉｅ−２データをＴｉｅ−２−ＧＦＰマウスから得た。パーセンテージは、Ｌｉｎ−ＨＳＣ又はＬｉｎ＋ＨＳＣ集団全体からの陽性標識細胞のパーセントを示す。
【図２−Ａ】発生中のマウス網膜へのＬｉｎ−ＨＳＣの移植を示す。（ａ）注射後４日目（Ｐ６）に、硝子体内注射したｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は網膜に付着し、分化する。（ｂ）Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａ２６マウス、β−ｇａｌ抗体で染色）は、コラーゲンＩＶ抗体で染色した血管系に先んじて確立される（星印は血管系の先端を示す）。（ｃ）注射後４日目（Ｐ６）のＬｉｎ＋ＨＳＣ細胞（ｅＧＦＰ＋）の大部分は分化することができなかった。（ｄ）注射後４日目（Ｐ６）の腸間膜ｅＧＦＰ＋マウスＥＣ。（ｅ）成体マウス眼に注入したＬｉｎ−ＨＳＣ（ｅＧＦＰ＋）。（ｆ）ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスにおける、既存の星状膠細胞鋳型へと誘導され、これに沿って分化するｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ（矢印）の低倍率像。（ｇ）Ｌｉｎ−細胞（ｅＧＦＰ）とこの下にある星状膠細胞の結合（矢印）のより高い倍率像。
【図２−Ｂ】発生中のマウス網膜へのＬｉｎ−ＨＳＣの移植を示す。（ｈ）非注入ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック対照。（ｉ）注射後４日目（Ｐ６）に、ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣは将来の深脈管叢の領域へと移動し、この領域内で分化を受ける。左の図は、全載網膜におけるＬｉｎ−ＨＳＣ活性を捕らえている；右側の図は、網膜におけるＬｉｎ−細胞の位置（矢印）を示す（上は硝子体側であり、下は強膜側である）。（ｊ）α−ＣＤ３１−ＰＥ及びα−ＧＦＰ−ａｌｅｘａ４８８抗体による二重標識。注射後７日目に、注入したＬｉｎ−ＨＳＣ（ｅＧＦＰ、赤色）は血管構造に取り込まれた（ＣＤ３１）。矢じりは、取り込まれた領域を示す。（ｋ）ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は注射後１４日目（Ｐ１７）に血管を形成する。（ｌ及びｍ）ローダミン−デキストランの心臓内注射は、血管が一次（ｌ）及び深脈管叢（ｍ）の両方において無傷であり、機能性であることを示す。
【図３】ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞が、成体網膜においてレーザーで（ａ）及び機械的に（ｂ）誘発した損傷（星印は損傷部位を示す）によって誘導されるグリオーシスに集まる（ＧＦＡＰを発現する星状膠細胞によって示される、一番左の画像）ことを示す。一番右の画像はより高倍率であり、Ｌｉｎ−ＨＳＣと星状膠細胞の密接な結びつきを明らかにする。較正スケール＝２０μＭ。
【図４】Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞が網膜変性マウスの血管構造を救済することを示す。（ａ〜ｄ）コラーゲンＩＶ染色した注射後２７日目（Ｐ３３）の網膜；（ａ）及び（ｂ）、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ細胞を注射した網膜（Ｂａｌｂ／ｃ）は、正常ＦＶＢマウスと血管構造の相違を示さなかった；（ｃ）及び（ｄ）、Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｂａｌｂ／ｃ）を注射した網膜は、野生型マウスに類似する豊富な血管網を示した；（ａ）及び（ｃ）、ＤＡＰＩ染色した全網膜の凍結切片（上は硝子体側であり、下は強膜側である）；（ｂ）及び（ｄ）、全載網膜の深脈管叢；（ｅ）Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞を注入した網膜において形成される深血管叢の血管分布の増加を示す棒グラフ（ｎ＝６）。深網膜血管新生の程度は、各々の画像内の脈管の全長を計算することによって数量化した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ又は対照網膜についての脈管の平均全長／強拡大視野（ミクロン）を比較した。（ｆ）ｒｄ／ｒｄマウスからのＬｉｎ−ＨＳＣ（Ｒ、右眼）又はＬｉｎ＋ＨＳＣ（Ｌ、左眼）細胞の注射後の深血管叢の長さの比較。６匹の独立したマウスの結果を示す（各々の色は別々のマウスを表わす）。（ｇ）及び（ｈ）Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞（Ｂａｌｂ／ｃ）はまた、Ｐ１５の眼に注射したときｒｄ／ｒｄ血管構造を救済した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｇ）又はＬｉｎ＋ＨＳＣ（Ｈ）細胞を注射した網膜（注射後１ヵ月目）の中間及び深血管叢を示す。
【図５】マウス網膜組織の顕微鏡写真を示す：（ａ）全載網膜の深部層（ｒｄ／ｒｄマウス）、可視ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ（灰色）による注射後５日目（Ｐ１１）。（ｂ）及び（ｃ）Ｐ６にＢａｌｂ／ｃ  Ｌｉｎ−細胞（ｂ）又はＬｉｎ＋ＨＳＣ細胞（ｃ）の注射を受けたＴｉｅ−２−ＧＦＰ（ｒｄ／ｒｄ）マウスのＰ６０網膜血管系。内因性内皮細胞（ＧＦＰ染色）だけが（ｂ）と（ｃ）の左のパネルにおいて可視である。（ｂ）と（ｃ）の中央のパネルはＣＤ３１抗体で染色している；矢印は、ＣＤ３１で染色したがＧＦＰでは染色していない脈管を示す；（ｂ）と（ｃ）の右のパネルはＧＦＰとＣＤ３１の両方による染色を示す。（ｄ）Ｌｉｎ−ＨＳＣ注射した網膜（左のパネル）及び対照網膜（右のパネル）のα−ＳＭＡ染色。
【図６】Ｔ２−ＴｒｐＲＳで形質移入したＬｉｎ−ＨＳＣがマウス網膜血管系の発生を阻害することを示す。（ａ）ヒトＴｒｐＲＳ、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ及びアミノ末端にＩｇｋシグナル配列を有するＴ２−ＴｒｐＲＳの図式的表示。（ｂ）Ｔ２−ＴｒｐＲＳで形質移入したＬｉｎ−ＨＳＣを注入した網膜はインビボでＴ２−ＴｒｐＲＳタンパク質を発現する。（１）大腸菌で生産された組換えＴ２−ＴｒｐＲＳ；（２）大腸菌で生産された組換えＴ２−ＴｒｐＲＳ；（３）大腸菌で生産された組換えＴ２−ＴｒｐＲＳ；（４）対照網膜；（５）Ｌｉｎ−ＨＳＣ＋ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（ベクターのみ）を注入した網膜；（６）Ｌｉｎ−ＨＳＣ＋ｐＫＬｅ１３５（ｐＳｅｃＴａｇ内のＩｇｋ−Ｔ２−ＴｒｐＲＳ）を注入した網膜。（ａ）内因性ＴｒｐＲＳ。（ｂ）組換えＴ２−ＴｒｐＲＳ。（ｃ）Ｌｉｎ−ＨＳＣのＴ２−ＴｒｐＲＳを注入した網膜。（ｃ〜ｆ）注入網膜の代表的一次（表在）及び二次（深）脈管叢、注射後７日目；（ｃ）及び（ｄ）空のプラスミドで形質移入したＬｉｎ−ＨＳＣを注射した眼は正常に発生した；（ｅ）及び（ｆ）Ｔ２−ＴｒｐＲＳで形質移入したＬｉｎ−ＨＳＣを注入した眼の大部分は深脈管叢の阻害を示した；（ｃ）及び（ｅ）一次（表在）脈管叢；（ｄ）及び（ｆ）二次（深）脈管叢。（ｆ）で認められる脈管のかすかな輪郭は、（ｅ）に示される一次網脈管の「ブリードスルー（滲み出し）現象」画像である。
【図７−Ａ】Ｈｉｓ６標識Ｔ２−ＴｒｐＲＳをコードするＤＮＡ配列、配列番号１を示す。
【図７−Ｂ】Ｈｉｓ６標識Ｔ２−ＴｒｐＲＳをコードするＤＮＡ配列、配列番号１を示す。
【図８】Ｈｉｓ６標識Ｔ２−ＴｒｐＲＳのアミノ酸配列、配列番号２を示す。
【図９】この眼にＬｉｎ−ＨＳＣ及びＬｉｎ＋ＨＳＣ（対照）を注入したマウスからの網膜の顕微鏡写真及び網膜電位図（ＥＲＧ）を示す。
【図１０】Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置したｒｄ／ｒｄマウス眼の中間（Ｉｎｔ．）及び深血管層の両方についての神経救済（ｙ軸）と血管救済（ｘ軸）との間の相関を示す統計的図表である。
【図１１】Ｌｉｎ＋ＨＳＣで処置したｒｄ／ｒｄマウス眼に関して神経救済（ｙ軸）と血管救済（ｘ軸）との間に相関がないことを示す統計的図表である。
【図１２】Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置した（暗い棒）ｒｄ／ｒｄマウス眼及び未処置（明るい棒）ｒｄ／ｒｄマウス眼に関する、注射後１ヶ月目（１Ｍ）、２ヶ月目（２Ｍ）及び６ヶ月目（６Ｍ）の時点での任意の相対単位の血管長（ｙ軸）の棒グラフである。
【図１３】注射後１ヶ月目（１Ｍ）、２ヶ月目（２Ｍ）及び６ヶ月目（６Ｍ）の時点でのｒｄ／ｒｄマウスの外核層（ＯＮＲ）における核の数の３つの棒グラフを含み、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ（明るい棒）で処置した対照眼に比べてＬｉｎ−ＨＳＣ（暗い棒）で処置した眼についての核の数の有意の上昇を明らかにする。
【図１４】１ヶ月目（１Ｍ）、２ヶ月目（２Ｍ）及び６ヶ月目（６Ｍ）の時点（注射後）で、左眼（Ｌ、Ｌｉｎ＋ＨＳＣで処置した対照眼）に対して右眼（Ｒ、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置）を比較した、個々のｒｄ／ｒｄマウスの外核層における核の数の図表を示す；所与の図表内の各々の線は個々のマウスの眼を比較している。
【図１５】ｒｄ１／ｒｄ１（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、左のパネル）又は野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、右のパネル）における網膜血管系及び神経細胞の変化を示す。同じ網膜の全載網膜（赤色：コラーゲンＩＶ、緑色：ＣＤ３１）及び切片（赤色：ＤＡＰＩ、緑色：ＣＤ３１、下のパネル）における中間（上のパネル）又は深（中央のパネル）血管叢の網膜血管系を示す（Ｐ：生後日数）。（ＧＣＬ：神経節細胞層、ＩＮＬ：内核層、ＯＮＬ：外核層）。
【図１６】Ｌｉｎ−ＨＳＣ注入がｒｄ１／ｒｄ１マウスにおける神経細胞の変性を救済することを示す。（Ａ、Ｂ及びＣ）、Ｐ３０（Ａ）、Ｐ６０（Ｂ）及びＰ１８０（Ｃ）の、Ｌｉｎ−ＨＳＣ注入眼（右のパネル）及び反対側の対照細胞（ＣＤ３１−）注入眼（左のパネル）の中間（Ｉｎｔ．）又は深血管叢及び切片の網膜血管系。（Ｄ）、Ｐ３０（左、ｎ＝１０）、Ｐ６０（中央、ｎ＝１０）及びＰ１８０（右、ｎ＝６）のＬｉｎ−ＨＳＣ注入又は対照細胞（ＣＤ３１−）注入網膜における血管系の平均全長（±平均の標準誤差）。中間（Ｉｎｔ．）及び深血管叢のデータを別々に示している（Ｙ軸：血管系の相対長）。（Ｅ）、対照細胞（ＣＤ３１−）又はＬｉｎ−ＨＳＣ注入網膜のＰ３０（左、ｎ＝１０）、Ｐ６０（中央、ｎ＝１０）及びＰ１８０（右、ｎ＝６）のＯＮＬにおける細胞核の平均数（Ｙ軸：ＯＮＬにおける細胞核の相対数）。（Ｆ）、Ｌｉｎ−ＨＳＣ又は対照細胞注入網膜のＰ３０（左）、Ｐ６０（中央）及びＰ１８０（右）の、血管系の長さ（Ｘ軸）とＯＮＬにおける細胞核の数（Ｙ軸）との間の線形相関。
【図１７】網膜機能がＬｉｎ−ＨＳＣ注入によって救済されることを明らかにする。Ｌｉｎ−ＨＳＣ又は対照細胞（ＣＤ３１−）注入網膜の機能を測定するために網膜電位図（ＥＲＧ）記録を使用した。注射後２ヶ月目の救済された網膜と非救済網膜の代表的な症例。同じ動物のＬｉｎ−ＨＳＣ注入した右眼（Ａ）と対照細胞注入した左眼（Ｂ）の網膜切片を示す（緑色：ＣＤ３１染色した血管系、赤色：ＤＡＰＩ染色した核）。（Ｃ）、（Ａ）及び（Ｂ）に示した同じ動物からのＥＲＧ結果。
【図１８】ヒト骨髄細胞の集団がｒｄ１マウスにおいて変性網膜を救済できることを示す（Ａ〜Ｃ）。救済はまた、網膜変性のもう１つのモデル、ｒｄ１０においても認められる（Ｄ〜Ｋ）。Ａ、緑色染料で標識したヒトＬｉｎ−ＨＳＣ（ｈＬｉｎ−ＨＳＣ）は、Ｃ３ＳｎＳｍｎへの硝子体内注射後に網膜血管細胞へと分化することができる。ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ  ＳＣＩＤマウス。（Ｂ及びＣ）、ｈＬｉｎ−ＨＳＣ注入眼（Ｂ）又は反対側の対照眼（Ｃ）における網膜血管系（左のパネル；上：中間血管叢、下：深血管叢）及び神経細胞（右のパネル）注射後１．５ヶ月目。（Ｄ〜Ｋ）、Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｐ６に注射）によるｒｄ１０マウスの救済。Ｐ２１（Ｄ：Ｌｉｎ−ＨＳＣ、Ｈ：対照細胞）、Ｐ３０（Ｅ；Ｌｉｎ−ＨＳＣ、Ｉ：対照細胞）、Ｐ６０（Ｆ；Ｌｉｎ−ＨＳＣ、Ｊ：対照細胞）、及びＰ１０５（Ｇ；Ｌｉｎ−ＨＳＣ、Ｋ：対照細胞）の代表的網膜を示す（処置及び対照眼は各々の時点の同じ動物からである）。網膜血管系（各々のパネルの上の画像は中間血管叢であり、各々のパネルの中央の画像は深血管叢である）は、ＣＤ３１（緑色）及びコラーゲンＩＶ（赤色）で染色した。各々のパネルの下の画像は、同じ網膜から作製した切片を示す（赤色：ＤＡＰＩ、緑色：ＣＤ３１）。
【図１９】クリスタリンαＡが、Ｌｉｎ−ＨＳＣによる処置後に救済された外核層細胞において上方調節されるが、対照細胞で処置した反対側の眼では上方調節されないことを明らかにする。左のパネル：救済網膜におけるＩｇＧ対照、中央のパネル；救済網膜におけるクリスタリンαＡ、右のパネル；非救済網膜におけるクリスタリンαＡ。
【図２０−Ａ】本発明のＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において上方調節される遺伝子の表を含む。（Ａ）マウスＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜においてこの発現が３倍上昇する遺伝子。
【図２０−Ｂ】本発明のＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において上方調節される遺伝子の表を含む。（Ｂ）マウスＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において上方調節されるクリスタリン遺伝子。
【図２０−Ｃ】本発明のＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において上方調節される遺伝子の表を含む。（Ｃ）ヒトＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜においてこの発現が２倍上昇する遺伝子。
【図２０−Ｄ】本発明のＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において上方調節される遺伝子の表を含む。（Ｄ）ヒトＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜においてこの発現が上方調節される神経栄養因子又は増殖因子についての遺伝子。
【図２１】ＣＤ１３３陽性（ＤＣ１３３＋）及びＣＤ１３３陰性（ＤＣ１３３−）ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ集団上のＣＤ３１及びインテグリンα６表面抗原の分布を示す。左のパネルはフローサイトメトリー散乱図を示す。中央及び右のパネルは、細胞集団上の特異抗体発現のレベルを示すヒストグラムである。Ｙ軸は事象の数を表わし、Ｘ軸はシグナルの強さを示す。輪郭（対照）ヒストグラムの右側に移動した充実ヒストグラムは、蛍光シグナルの上昇及びバックグラウンドレベルを上回る抗体の発現を表わす。
【図２２】生後Ｐ０からＰ３０までの、正常酸素レベル（酸素正常状態）で飼育した野生型Ｃ５７／Ｂ１６マウスにおける生後網膜発生を示す。
【図２３】Ｐ７からＰ１２までは高酸素レベルで（高酸素状態；７５％酸素）、その後Ｐ１２−Ｐ１７は酸素正常状態で飼育したＣ５７／Ｂ１６マウスにおける酸素誘導網膜症モデルを示す。
【図２４】酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）モデルにおけるＬｉｎ−ＨＳＣ集団での処置による血管救済を明らかにする。
【図２５】Ｌｉｎ−ＨＳＣの硝子体内注入後にｒｄ１マウス外核層（ＯＮＬ）において救済された光受容器が主として錐体であることを示す。野生型マウス網膜（上のパネル）における光受容器の小さなパーセンテージが、赤色／緑色錐体オプシンの発現によって実証されるように錐体であり（Ａ）、一方ＯＮＬの大部分の細胞は、桿体特異的ロドプシンに関して陽性であった（Ｂ）。網膜血管系は前免疫血清で自己蛍光を発するが（Ｃ）、核層は、桿体又は錐体特異的オプシンでの染色に関して完全に陰性であった。ｒｄ／ｒｄマウス網膜（下のパネル）は、内核層の減少及びほぼ完全な萎縮ＯＮＬを有し、どちらも錐体（Ｄ）又は桿体（パネルＧ）オプシンに関して陰性であった。対照であるＣＤ３１−ＨＳＣ処置眼は、錐体（Ｅ）又は桿体（Ｈ）オプシンに関して染色を示さず、非注入ｒｄ／ｒｄ網膜と同じである。Ｌｉｎ−ＨＳＣ処置した反対側の眼は、錐体赤色／緑色オプシンに関する陽性免疫反応によって実証されるように、主として錐体から構成される、顕著に低いが明らかに存在するＯＮＬを示した（Ｆ）。少数の桿体も認められた（Ｉ）。
【図２６】ＣＤ４４抗原を発現する細胞のパーセンテージ（赤色の点のデータ）を示す、系統陰性及び系統陽性幹細胞集団（それぞれ左上と左下の図）のフローサイトメトリー特性決定からの散乱図；並びにＣＤ４４抗原を発現する細胞のパーセンテージ（赤色の点のデータ）を示す、ＣＤ３１陰性及びＣＤ３１陽性細胞集団（それぞれ右上と右下の図）の図を示す。
【図２７】様々な他の細胞表面抗原を発現する細胞の相対的パーセンテージを例示する、ＣＤ４４抗原の有意のレベルを発現する系統陰性細胞集団（図の左側のセット）及びＣＤ４４抗原の有意のレベルを発現しない骨髄細胞からの小集団（図の右側のセット）のフローサイトメトリー特性決定からの散乱図を示す。
【図２８】ＣＤ４４ｌｏ細胞を硝子体内注入したマウスからの網膜と比較した、好ましい単離ＭＬＢＭ細胞集団からの細胞を硝子体内注入したマウスからの網膜（左のパネル）の顕微鏡写真画像を示す。
【図２９】ＭＬＢＭ細胞集団からの細胞（ＣＤ４４ｈｉ）及びＣＤ４４ｌｏ細胞を注入した眼からの網膜の顕微鏡写真画像を示す。
【図３０】未熟児網膜症の酸素誘導網膜症モデルにおける、マウス網膜の病的血管新生を改善するため及び有益な生理的血管再生を促進するためのＭＬＢＭ細胞集団の有益な作用を明らかにする棒グラフを示す。上のグラフは、対照網膜（最初の棒）、ＣＤ４４ｌｏ細胞で処置した網膜（中央の棒）及びＭＬＢＭ細胞集団からの細胞で処置した網膜（右の棒）についての網膜前方新生血管ふさ状分岐面積を比較する。下のグラフは、対照網膜（最初の棒）、ＣＤ４４ｌｏ細胞で処置した網膜（中央の棒）及びＭＬＢＭ細胞集団からの細胞で処置した網膜（右の棒）についての血管閉塞面積を比較する。
【図３１】ひとたびＭＬＢＭ細胞集団からの細胞が網膜の血管系に取り込まれると、画像の下の部分における細胞の緑色染色によって示されるように、細胞が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現することを明らかにする顕微鏡写真画像である。
【図３２】本発明のＣＤ１１ｂ＋ＭＬＢＭ細胞集団からの細胞が網膜の血管系を選択的に標的することを明らかにする顕微鏡写真画像を示す。
【図３３】ＣＤ４４−ＣＤ１１ｂ−骨髄細胞が網膜の血管系を選択的に標的しないことを明らかにする顕微鏡写真画像を示す。
【図３４】ＴｒｐＲＳのＴ２フラグメント（配列番号３）及びこのＴ２−ＴｒｐＲＳ−ＧＤ変異型（配列番号４）のアミノ酸残基配列を示す。
【図３５】ミニＴｒｐＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号５）を示す。
【図３６】Ｔ１−ＴｒｐＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号６）を示す。
【図１−Ａ】
2008536804.tif 000006
【図１−Ｂ】
2008536804.tif 000007
【図１−Ｃ】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2008536804.tif 000014
【図７−Ａ】
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【図７−Ｂ】
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【図８】
2008536804.tif 000017
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−Ａ】
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【図２０−Ｂ】
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【図２０−Ｃ】
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【図２０−Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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