(57)【要約】本発明は、ヒト癌の検出、特徴付け、予防、および治療のための組成物、キット、および方法に関する。1またはそれ以上のMCRのコピー数の変化、および/または1またはそれ以上のマーカーの量、構造、および/または活性の変化が癌の存在と関連する、種々の染色体領域(MCR)およびそれに対応するマーカーを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が癌に罹患しているか癌を生じるリスクがあるか否かを評価する方法であって、対象試料の最小共通領域(MCR)(ここで、MCRは表3および/または7に記載のMCRからなる群から選ばれる)のコピー数をMCRの正常コピー数と比較することを含む、該試料のMCRのコピー数の変化が対象が癌に罹患しているか癌を生じるリスクがあることを示唆する方法。
【請求項２】
コピー数が蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)により評価される請求項1記載の方法。
【請求項３】
コピー数が定量的PCR(qPCR)により評価される請求項1記載の方法。
【請求項４】
該正常コピー数が対照試料から得られる請求項1記載の方法。
【請求項５】
対象が癌に罹患しているか癌を生じるリスクがあるか否かを評価する方法であって、
a)対象の、表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーの量、構造および/または活性；および
b)該マーカーの正常量、構造および/または活性(ここで、対象の該マーカーの量、構造、および/または活性と該正常量、構造および/または活性の有意差が対象が癌に罹患しているか癌を生じるリスクがあることを示す)
を比較することを含む方法。
【請求項６】
マーカーが表1、2、8、または9に記載のマーカーからなる群から選ばれる請求項5記載の方法。
【請求項７】
マーカーの量を比較する請求項5記載の方法。
【請求項８】
マーカーの構造を比較する請求項5記載の方法。
【請求項９】
マーカーの活性を比較する請求項5記載の方法。
【請求項１０】
マーカーの量を、マーカーの発現レベルを測定することにより測定する請求項7記載の方法。
【請求項１１】
マーカーの量を、マーカーのコピー数を測定することにより測定する請求項5記載の方法。
【請求項１２】
該正常量、構造および/または活性が対照試料から得られる請求項5記載の方法。
【請求項１３】
試料が、組織、全血、血清、血漿、口腔掻き取り物、唾液、脳脊髄液、尿、大便、気管支肺胞洗浄物、および肺組織からなる群から選ばれる請求項1または5記載の方法。
【請求項１４】
該コピー数が比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)により評価される請求項1または11に記載の方法。
【請求項１５】
該CGHがアレイ上で行われる請求項14記載の方法。
【請求項１６】
試料中の該マーカーの発現レベルが該マーカーに対応するタンパク質の試料中の存在を検出することにより評価される、請求項10記載の方法。
【請求項１７】
該タンパク質の存在が該タンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出される請求項16記載の方法。
【請求項１８】
該試薬が抗体、抗体誘導体、および抗体断片からなる群から選ばれる請求項17記載の方法。
【請求項１９】
試料中のマーカーの発現レベルが試料中の転写ポリヌクレオチド(転写ポリヌクレオチドは該マーカーを含む)またはその部分の存在を検出することにより評価される、請求項10記載の方法。
【請求項２０】
転写ポリヌクレオチドがmRNAである請求項19記載の方法。
【請求項２１】
転写ポリヌクレオチドがcDNAである請求項19記載の方法。
【請求項２２】
検出工程がさらに転写ポリヌクレオチドの増幅を含む請求項19記載の方法。
【請求項２３】
試料中のマーカーの発現レベルが、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、マーカーとアニールするか、またはマーカーを含むポリヌクレオチド、の部分とアニールする転写ポリヌクレオチドの試料中の存在を検出することにより評価される請求項10記載の方法。
【請求項２４】
対象における癌の進行をモニターする方法であって、
a)最初の時点の対象試料中の表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーの量および/または活性を検出し;
b)次の時点で工程a)を反復し、
c)工程a)およびb)で検出した該量および/または活性を比較し、対象における癌の進行をモニターする
ことを含む方法。
【請求項２５】
該マーカーが表1、2、8、または9に記載のマーカーからなる群から選ばれる請求項24記載の方法。
【請求項２６】
組織、全血、血清、血漿、口腔掻き取り物、唾液、脳脊髄液、尿、大便、気管支肺胞洗浄物、および肺組織からなる群から選ばれる請求項24記載の方法。
【請求項２７】
マーカーの活性を測定する請求項24記載の方法。
【請求項２８】
マーカーの量を測定する請求項24記載の方法。
【請求項２９】
該マーカーの量を該マーカーの発現レベルを測定することにより決定する請求項28記載の方法。
【請求項３０】
試料中のマーカーの発現レベルを、試料中の該マーカーに対応するタンパク質の存在を検出することにより評価する請求項28記載の方法。
【請求項３１】
該タンパク質の存在をタンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出する請求項30記載の方法。
【請求項３２】
該試薬が抗体、抗体誘導体、および抗体断片からなる群から選ばれる請求項31記載の方法。
【請求項３３】
試料中のマーカーの発現レベルが、試料中の転写ポリヌクレオチド(転写ポリヌクレオチドは該マーカーを含む)またはその部分の存在を検出することにより評価される請求項29記載の方法。
【請求項３４】
転写ポリヌクレオチドがmRNAである請求項33記載の方法。
【請求項３５】
転写ポリヌクレオチドがcDNAである請求項33記載の方法。
【請求項３６】
該検出工程がさらに転写ポリヌクレオチドの増幅を含む請求項33記載の方法。
【請求項３７】
試料中のマーカーの発現レベルが、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、マーカーとアニールするか、またはポリヌクレオチド(ポリヌクレオチドは該マーカーを含む)の部分とアニールする転写ポリヌクレオチドの存在を検出することにより評価される請求項29記載の方法。
【請求項３８】
試料が対象から得られる細胞を含む請求項24記載の方法。
【請求項３９】
最初の時点と次の時点の間に、対象が癌治療を受け、癌治療を完了し、および/または寛解期にある、請求項24記載の方法。
【請求項４０】
対象の癌を阻害するための被検化合物の有効性を評価する方法であって、
a)被検化合物存在下で維持される、対象から得られる第1試料中のマーカーの量および/または活性(ここで、マーカーは、表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)；および
b)被検化合物非存在下で維持される、対象から得られる第2試料中のマーカーの量および/または活性
を比較することを含む、
第2試料と比較して、癌中の欠失しているMCRに存在する第1試料中のマーカーの有意に高い量および/または活性が、被検化合物が癌の阻害に有効である指標であり、
第2試料と比較して、癌中の増幅されているMCRに存在する第1試料中のマーカーの有意に低い量および/または活性が、被検化合物が対象の癌の阻害に有効であることの指標である方法。
【請求項４１】
マーカーが、表1、2、8、または9に記載のマーカーからなる群から選ばれる請求項40記載の方法。
【請求項４２】
第1および第2試料が対象から得られる単一試料の部分である請求項40記載の方法。
【請求項４３】
第1および第2試料が対象から得られるプール試料の部分である請求項40記載の方法。
【請求項４４】
対象の癌を阻害するための被検化合物の有効性を評価する方法であって、
a)対象に療法の少なくとも部分を提供する前の対象から得られる第1試料中のマーカーの量および/または活性(ここで、マーカーは、表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)と、
b)該療法の部分を提供した後の対象から得られる第2試料中のマーカーの量および/または活性
を比較することを含む、
第2試料と比較して、癌中の欠失しているMCRに存在する第1試料中のマーカーの有意に高い量および/または活性が、被検化合物が癌の阻害に有効である指標であり、
第2試料と比較して、癌中の増幅されているMCRに存在する第1試料中のマーカーの有意に低い量および/または活性が、該療法が対象の癌の阻害に有効であることの指標である方法。
【請求項４５】
マーカーが、表1、2、8、または9に記載のマーカーからなる群から選ばれる請求項44記載の方法。
【請求項４６】
癌を調節することができる組成物を選択する方法であって、
a)癌細胞を含む試料を得、
b)該細胞と被検化合物を接触させ、
c)マーカーの量および/または活性を調節する被検化合物の能力を測定し(ここで、該マーカーは表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)、
癌の調節因子(モジュレーター)を同定する方法。
【請求項４７】
マーカーが、表1、2、8、または9に記載のマーカーからなる群から選ばれる請求項46記載の方法。
【請求項４８】
該細胞が癌の動物モデルから単離される請求項46記載の方法。
【請求項４９】
該細胞が癌細胞株由来である請求項46記載の方法。
【請求項５０】
該細胞が癌に罹患した対象由来である請求項46記載の方法。
【請求項５１】
該細胞が肺癌起源の肺癌細胞株由来である請求項49記載の方法。
【請求項５２】
癌を調節することができる組成物を選択する方法であって、
a)表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーと被検化合物を接触させ、
b)表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーの量および/または活性を調節する被検化合物の能力を測定し、
癌を調節することができる組成物を同定する
ことを含む方法。
【請求項５３】
マーカーが、表1、2、8、または9に記載のマーカーからなる群から選ばれる請求項52記載の方法。
【請求項５４】
さらに被検化合物を癌の動物モデルに投与することを含む請求項46または52記載の方法。
【請求項５５】
該調節因子が、表2に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応する遺伝子またはタンパク質の量および/または活性を阻害する請求項46または52記載の方法。
【請求項５６】
該調節因子が、表1に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応する遺伝子またはタンパク質の量および/または活性を増加させる請求項46または52記載の方法。
【請求項５７】
表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーの量、構造、および/または活性を評価するための試薬を含む、癌を阻害するための化合物の能力を評価するためのキット。
【請求項５８】
表3および/または7に記載のMCRからなる群から選ばれるMCRのコピー数を評価するための試薬を含む、対象が癌に罹患しているか否かを評価するためのキット。
【請求項５９】
表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーの量、構造、および/または活性を評価するための試薬を含む、対象が癌に罹患しているか否かを評価するためのキット。
【請求項６０】
表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーに対応するタンパク質と特異的に結合する抗体またはその断片、を含むヒト癌細胞の存在を評価するためのキット。
【請求項６１】
表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーに対応する転写ポリヌクレオチドを特異的に結合する核酸プローブを含む、癌細胞の存在を評価するためのキット。
【請求項６２】
該核酸プローブが分子ビーコンプローブである請求項61記載のキット。
【請求項６３】
該マーカーが、表1、2、8、または9に記載のマーカーからなる群から選ばれる請求項57、59、60、または61のいずれかに記載のキット。
【請求項６４】
表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーに対応する遺伝子またはタンパク質の量および/または活性の調節因子を対象に投与することにより、癌に罹患した対象を治療することを含む、癌に罹患した対象の治療方法。
【請求項６５】
該マーカーが、表1、2、8、または9に記載のマーカーからなる群から選ばれる請求項64記載の方法。
【請求項６６】
癌中で増幅している表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーに対応する遺伝子またはタンパク質の量および/または活性を阻害する化合物を対象に投与することにより、癌に罹患した対象を治療することを含む、癌に罹患した対象の治療方法。
【請求項６７】
該化合物が医薬的に許容される製剤で投与される請求項66記載の方法。
【請求項６８】
該化合物が、該マーカーに対応するタンパク質と特異的に結合する抗体または抗原と結合するその断片である請求項66記載の方法。
【請求項６９】
該抗体が毒素と結合している請求項68記載の方法。
【請求項７０】
該抗体が化学療法剤と結合している請求項68記載の方法。
【請求項７１】
該化合物が、該マーカーと対応する遺伝子の発現を阻害するRNA干渉剤である請求項66記載の方法。
【請求項７２】
該RNA干渉剤がsiRNA分子またはshRNA分子である請求項71記載の方法。
【請求項７３】
該化合物が、該マーカーに対応する遺伝子と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項66記載の方法。
【請求項７４】
該化合物がペプチドまたはペプチド模倣物である請求項66記載の方法。
【請求項７５】
該化合物が該マーカーの発現または活性を阻害するアプタマーである請求項66記載の方法。
【請求項７６】
該マーカーが表2に記載のマーカーからなる群から選ばれる請求項66記載の方法。
【請求項７７】
癌中の欠失している表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーに対応する遺伝子またはタンパク質の発現または活性を増加する化合物を対象に投与することにより癌に罹患した対象を治療することを含む、癌に罹患した対象の治療方法。
【請求項７８】
癌中の欠失している表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーに対応するタンパク質を対象に投与することにより、癌に罹患した対象を治療することを含む、癌に罹患した対象の治療方法。
【請求項７９】
該マーカーが表1に記載のマーカーからなる群から選ばれる請求項77または78に記載の方法。
【請求項８０】
該タンパク質が、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより対象の細胞に提供される請求項78記載の方法。
【請求項８１】
-該化合物が医薬的に許容される製剤で投与される請求項77記載の方法。
【請求項８２】
表1、2、8、または9に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応する単離されたタンパク質またはその断片。
【請求項８３】
表1、2、8、または9に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応する単離された核酸分子またはその断片。
【請求項８４】
表1、2、8、または9に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応するタンパク質と特異的に結合する単離された抗体またはその断片。
【請求項８５】
表3および/または7に記載のMCRから選ばれるMCR内に含まれる、単離された核酸分子またはその断片(ここで、該核酸分子は、癌の量、構造、および/または活性の変化を有する)。
【請求項８６】
請求項85の核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願)
本願は、米国仮出願no. 60/654,227(2005年2月17日出願)、および米国仮出願no. 60/690,064(2005年6月13日)の利益を主張し、この内容は本明細書の一部を構成する。
(政府による資金供与)
【０００２】
本明細書に記載の研究は、少なくとも一部はNational Institutes of Health(NIH)(助成K08AG 2400401、RO1CA099041、R01CA84628、P01CA95616、およびU01CA84313)により支援された。したがって、米国政府は本発明に対し一定の権利を有しうる。
(配列表)
【０００３】
本出願は、書面の代わりにCD-Rで提出した「長い」配列表を含み、その内容は本明細書の一部を構成する。2006年2月17日に記録した該CD-Rは、それぞれ「CRF」、「コピー1」、「コピー2」、および「コピー3」とラベルしており、それぞれ同じ2.03MBファイル(DFS06425.txt)を1つだけ含む。
【背景技術】
【０００４】
癌は、発癌に必要なあらゆる種類の生物学的特性を細胞に与える多遺伝子病変の表現型的終末点を示す。実際に、例えば、肺癌、乳癌、卵巣癌、および結腸癌を含む多くの癌の顕著なゲノムの特徴は、非可逆性転座、増幅、および欠失を含む多くの複雑な染色体の構造的異常の存在である。
【０００５】
核型分析(Johansson、B. et al.(1992)Cancer 69、1674-81；Bardi、G. et al.(1993)Br J Cancer 67、1106-12；Griffin、C. A. et al.(1994)Genes Chromosomes Cancer 9、93-100；Griffin、C. A. et al.(1995)Cancer Res 55、2394-9；Gorunova、L. et al.(1995)Genes Chromosomes Cancer 14、259-66；Gorunova、L. et al.(1998)Genes Chromosomes Cancer 23、81-99)、染色体CGHおよびアレイCGH(Wolf M et al.(2004)Neoplasia 6(3)240；Kimura Y、et al.(2004)Mod. Pathol. 21 May(epub)；Pinkel、et al.(1998)Nature Genetics 20:211；Solinas-Toldo、S. et al.(1996)Cancer Res 56、3803-7；Mahlamaki、E. H. et al.(1997)Genes Chromosomes Cancer 20、383-91；Mahlamaki、E. H. et al.(2002)Genes Chromosomes Cancer 35、353-8；Fukushige、S. et al.(1997)Genes Chromosomes Cancer 19:161-9；Curtis、L. J. et al.(1998)Genomics 53、42-55；Ghadimi、B. M. et al. (1999)Am J Pathol 154、525-36；Armengol、G. et al.(2000)Cancer Genet Cytogenet 116、133-41)、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析(Nilsson M et al.(2004)Int J Cancer 109(3):363-9；Kawasaki K et al.(2003)Int J Mol Med. 12(5):727-31)、およびヘテロ接合性の消失(LOH)マッピング(Wang ZC et al.(2004)Cancer Res 64(1):64-71；Seymour、A. B. et al.(1994)Cancer Res 54、2761-4；Hahn、S. A. et al.(1995)Cancer Res 55、4670-5；Kimura、M. et al.(1996)Genes Chromosomes Cancer 17、88-93)は、種々の癌のコピー数変化またはアレル欠失の反復(再発)領域を同定した。例えば、肺癌では、頻繁な獲得(gain)が1q31、3q25-27、5p13-14、および8q23-24に、また3p21、8p22、9p21-22、13q22、および17p12-13に欠失(loss)がマップされている(Bjorkqvist、A.M. et al.(1998)Br J Cancer 77、260-9；Luk、C. et al.(2001)Cancer Genet Cytogenet 125、87-99；Pei、J. et al.(2001)Genes Chromosomes Cancer 31、282-7；Petersen、I. et al.(1997)Cancer Res 57、2331-5；Balsara、B. R. & Testa、J. R.(2002)Oncogene 21、6877-83 )。ある場合には、これら遺伝子座内に存在する有効な発癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子が同定され、これには、MYC(8q24)、p16INK4A(9p21)、RB1(13q14)、RASSF1(3p21)、TUSC2(3p21)、SEMA3B(3p21)、FHIT(3p14)、およびKRAS2(12p12)が含まれる。しかしながら、大多数の増幅および欠失遺伝子座および常在遺伝子については、推定癌関連標的はまだ発見されていない。
(発明の要約)
【０００６】
本発明は、少なくとも一部、ある種の染色体領域(遺伝子座)内に含まれる、癌に関連する、コピー数変化が反復(再発)するゲノムの特異領域(本明細書では最小共通領域(MCR)という)の同定に基づく。これらMCRは、新規cDNAまたはオリゴマーベースのプラットフォーム、および肺癌ゲノムのコピー数変化の高精度の特徴付けを可能にするバイオインフォーマティック手段を用いて同定された(実施例1参照)。本発明は、一部、癌にも関連する、本発明のMCR内に存在するマーカーの同定に基づく。
【０００７】
したがって、ある局面において、本発明は、対象試料中のMCRのコピー数をMCRの正常コピー数と比較することを含む、対象が癌に罹患しているかまたは癌を生じるリスクがあるか否かを評価する方法を提供する(ここで、MCRは、表3および/または7に記載のMCRからなる群から選ばれ、試料中のMCRのコピー数の変化は、対象が癌に罹患しているかまたは癌を生じるリスクがあることを示す)。ある態様において、該コピー数は蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)により評価される。別の態様において、該コピー数は定量的PCR(qPCR)により評価される。さらに別の態様において、該コピー数はFISHプラススペクトルカロタイプ(SKY)により評価される。さらに別の態様において、該正常コピー数は対照試料から得られる。さらに別の態様において、該試料は、組織、全血、血清、血漿、口腔掻き取り物、唾液、脳脊髄液、尿、大便、気管支肺胞洗浄物、および肺組織からなる群から選ばれる。
【０００８】
別の局面において本発明は、対象試料中のマーカーの量、構造、および/または活性を(ここで、マーカーは表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)、該マーカーの正常量、構造、および/または活性と比較することを含む、対象が癌に罹患しているかまたは癌を生じるリスクがあるか否かを評価する方法を提供する(ここで、試料中の該マーカーの量、構造、および/または活性と該正常量、構造、および/または活性の間の有意差が対象が癌に罹患しているかまたは癌を生じるリスクがあることの指標である)。ある態様において、該マーカーは、表1または2に記載のマーカーからなる群から選ばれる。別の態様において、該マーカーの量は、該マーカーの発現レベルを測定することにより決定される。さらに別の態様において、対象中の該マーカーの発現レベルは、試料中の、該マーカーに対応するタンパク質の存在を検出することにより評価する。該タンパク質の存在は、該タンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出してよい。ある態様において、該試薬は、抗体、抗体誘導体、および抗体断片からなる群から選ばれる。別の態様において、試料中のマーカーの発現レベルは、試料中の転写ポリヌクレオチド(転写ポリヌクレオチドは該マーカーを含む)またはその部分の存在を検出することにより評価される。ある態様において、該転写ポリヌクレオチドはmRNAまたはcDNAである。試料中の該マーカーの発現レベルは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、マーカーとアニールするかまたはポリヌクレオチド(該ポリヌクレオチドは該マーカーを含む)の部分とアニールする転写ポリヌクレオチドの存在を試料中に検出することにより評価してもよい。
別の態様において、該マーカーの量は、該マーカーのコピー数を測定することにより決定される。MCRまたはマーカーのコピー数は、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、例えば、アレイCGHにより評価してよい。さらに別の態様において、該正常量、構造、および/または活性は対照試料から得られる。さらに別の態様において、該試料は、組織、全血、血清、血漿、口腔掻き取り物、唾液、脳脊髄液、尿、大便、気管支肺胞洗浄物、および肺組織からなる群から選ばれる。
【０００９】
別の局面において本発明は、対象の癌の進行をモニターする方法であって、
a)対象試料中の、第1時点のマーカーの量および/または活性を検出し(ここで、該マーカーは表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)；
b)次の時点で工程a)を反復し、
c)工程a)およびb)で検出された量および/または活性を比較し、それから対象の癌の進行をモニターすることを含む方法を提供する。ある態様において、該マーカーは、表1または2に記載のマーカーからなる群から選ばれる。別の態様において、該試料は、組織、全血、血清、血漿、口腔掻き取り物、唾液、脳脊髄液、尿、大便、気管支肺胞洗浄物、および肺組織からなる群から選ばれる。さらに別の態様において、該試料は、対象から得られる細胞を含む。さらに別の態様において、最初の時点と次の時点の間で、対象は、癌治療を受けており、癌治療が完了し、および/または寛解期にある。
【００１０】
さらに別の局面において、本発明は、被検化合物存在下で維持される、対象から得た第1試料中のマーカー(ここで、該マーカーは表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)の量および/または活性を、被検化合物非存在下で維持される、対象から得られる第2試料中の該マーカーの量および/または活性と比較することを含む、対象の癌を阻害するための被検化合物の有効性の評価方法を提供する(ここで、第2試料と比較して、癌中に欠失している第1試料中のマーカーの有意に高い量および/または活性が被検化合物が癌の阻害に有効であることの指標であり、また、第2試料と比較して、癌中に増幅される第1試料中の該マーカーの有意に低い量および/または活性が被検化合物が癌の阻害に有効であることの指標である。)。ある態様において、第1および第2試料は、対象から得られる単一試料の部分である。別の態様において、第1および第2試料は、対象から得られるプール試料の部分である。ある態様において、該マーカーは、表1または2に記載のマーカーからなる群から選ばれる。
【００１１】
さらに別の局面において、対象に該療法の少なくとも部分を提供する前に対象から得られる第1試料中のマーカー(ここで、該マーカーは、表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)の量および/または活性を、該治療の部分を提供後に対象から得られる第2試料中の該マーカーの量および/または活性と比較することを含む、対象の癌を阻害するための療法の有効性の評価方法を提供する(ここで、第2試料と比較して、癌中に欠失している第1試料中のマーカーの有意に高い量および/または活性が被検化合物が癌の阻害に有効であることの指標であり、第2試料と比較して、癌中に増幅される第1試料中の該マーカーの有意に低い量および/または活性が被検化合物が癌の阻害に有効であることの指標である)。ある態様において、該マーカーは、表1または2に記載のマーカーからなる群から選ばれる。
【００１２】
本発明の別の局面は、癌を調節することができる組成物を選択する方法であって、癌細胞を含む試料を得、該細胞と被検化合物を接触させ、被検化合物の、マーカー(ここで、該マーカーは表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)の量および/または活性を調節する能力を測定することにより癌の調節因子を同定することを含む方法。ある態様において、該マーカーは表1または2に記載のマーカーからなる群から選ばれる。該細胞は、例えば、癌の動物モデル、癌細胞株、例えば、肺癌起源の肺癌細胞株、または癌に罹患した対象から単離してよい。
【００１３】
本発明のさらに別の局面は、癌を調節することができる組成物の選択方法であって、マーカーを被検化合物と接触させ、マーカー(ここで、該マーカーは表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)の量および/または活性を調節する被検化合物の能力を測定することにより癌を調節することができる組成物を同定することを含む方法を提供する。ある態様において、該マーカーは、表1または2に記載のマーカーからなる群から選ばれる。別の態様において、該方法は、さらに癌の動物モデルに被検化合物を投与することを含む。さらに別の態様において、該阻害因子は、増幅している表2に記載のマーカー、例えば、表2に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応する遺伝子またはタンパク質の量および/または活性を阻害する。さらに別の態様において、該阻害因子は、欠失(欠損)している表1に記載のマーカー、例えば、表1に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応する遺伝子またはタンパク質の量および/または活性を増加させる。
【００１４】
別の局面において、本発明は、マーカー(ここで、該マーカーは表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)の量、構造、および/または活性を評価するための試薬を含む、化合物の癌を阻害する能力を評価するためのキットを提供する。ある態様において、該マーカーは表1または2に記載のマーカーからなる群から選ばれる。
【００１５】
本発明は、表3および/または7に記載のMCRからなる群から選ばれるMCRのコピー数を評価するための試薬を含む、対象が癌に罹患しているか否かを評価するためのキット、ならびにマーカーの量、構造、および/または活性を評価するための試薬を含む、対象が癌に罹患しているか否かを評価するためのキットも提供する。ある態様において、該マーカーは表1または2に記載のマーカーからなる群から選ばれる。
【００１６】
別の局面において、本発明は、マーカー(ここで、該マーカーは表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)に対応するタンパク質と特異的に結合する抗体またはその断片を含む、ヒト癌細胞の存在を評価するためのキットを提供する。ある態様において、該マーカーは表1または2に記載のマーカーからなる群から選ばれる。
【００１７】
さらに別の局面において、本発明は、マーカー(ここで、該マーカーは表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)に対応する転写ポリヌクレオチドと特異的に結合する核酸プローブを含む、癌細胞の存在を評価するためのキットを提供する。ある態様において、該マーカーは表1または2に記載のマーカーからなる群から選ばれる。
【００１８】
さらに別の局面において、本発明は、マーカー(ここで、該マーカーは表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカーである)に対応する遺伝子またはタンパク質の量および/または活性の調節因子を対象に投与することを含む、癌に罹患した対象を治療する方法を提供する。ある態様において、該マーカーは表1または2に記載のマーカーからなる群から選ばれる。
【００１９】
本発明は、癌に罹患した対象の治療方法であって、癌中に増幅している、表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカー、例えば、表2に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応する遺伝子またはタンパク質の量および/または活性を阻害する化合物を対象に投与することにより癌に罹患した対象を治療することを含む方法も提供する。ある態様において、該化合物は医薬的に許容される製剤で投与される。別の態様において、該化合物は、該マーカーに対応するタンパク質と特異的に結合する抗体、または抗原と結合するその断片である。例えば、該抗体は、毒素または化学療法剤と結合してよい。さらに別の態様において、該化合物は、該マーカーに対応する遺伝子の発現を阻害する、RNA干渉剤、例えば、siRNA分子またはshRNA分子である。さらに別の態様において、該化合物は、該マーカーに対応する遺伝子と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに別の態様において、該化合物は、ペプチドまたはペプチド模倣物、該マーカーの活性を阻害する低分子、例えば、マーカーと標的タンパク質の間のタンパク質-タンパク質相互作用を阻害する低分子、または該マーカーの発現または活性を阻害するアプタマーである。
【００２０】
別の局面において、本発明は、癌に罹患した対象の治療方法であって、癌中の欠失している表3および/または7に記載のMCRに存在するマーカー、例えば、表1に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応する遺伝子またはタンパク質の発現または活性を増加させる化合物を対象に投与することにより癌に罹患した対象を治療することを含む方法を提供する。ある態様において、該化合物は低分子である。本発明は、癌に罹患した対象の治療方法であって、マーカー、例えば、表1に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応するタンパク質を対象に投与することにより、癌に罹患した対象を治療することを含む方法を提供する。ある態様において、該タンパク質は、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより対象の細胞に提供される。さらに別の態様において、該化合物は、医薬的に許容される製剤で投与される。
【００２１】
本発明は、表1または2に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応する、単離されたタンパク質またはその断片も提供する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、表1または2に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応する、単離された核酸分子またはその断片を提供する。
【００２３】
さらに別の局面において、本発明は、表1または2に記載のマーカーから選ばれるマーカーに対応するタンパク質と特異的に結合する、単離された抗体またはその断片を提供する。
【００２４】
さらに別の局面において、本発明は、表3および/または7に記載のMCRから選ばれるMCR内に含まれる、単離された核酸分子(ここで、該核酸分子は癌中で量、構造、および/または活性の変化を有する)またはその断片を提供する。本発明は、該核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチドも提供する。
(図面の簡単な説明)
【００２５】
図1は、原発肺腺および扁平上皮癌、および肺癌細胞株の遺伝子プロフィールを示す。上のパネルは、染色体変化の反復を示す。断片化データ(Y軸)のCNAの整数-値反復(リカレンス)を染色体順にX軸に沿って等しくアラインした各プローブについてプロットする。暗色バーは、染色体物質の獲得または欠失(loss)を示し、淡色バーは増幅または欠失(deletion)領域内のプローブを示す。アスタリスクは文献に記載の増幅または欠失が最も頻繁な領域を特定する(Balsara、B. R.、およびTesta、J. R.(2002)Oncogene 21、6877-6883)。下のパネルは、全ての試料内の分離したCNAを示すヒートマッププロットを示し、X軸はゲノムマップ位置順に並べたプローブを示し、Y軸は個々の試料を示す。ライトグレーは染色体のゲイン/増幅を示し、ダークグレーは染色体の欠失/欠失を示す。
【００２６】
図2は、染色体断片長分布を示す。ゲノムの複雑性の全体的レベルは、各セットの狭い、大きな振幅のコピー数変化の数を定量することにより腺癌および扁平(扁平上皮)細胞癌aCGHプロフィールについて推定した。2つの試料クラス内の各プロフィールを、ゲノムの高度に変化した領域について検討した(断片は絶対log2コピー数>0.4を示す。材料と方法の項参照)。これらを該領域の長さ(メガ塩基対)にしたがってヒストグラムにプロットした。曲線下面積は、腺癌および扁平上皮癌データセットにおいて、試料あたりの高レベル変化の全発生率に対して正規化する。
【００２７】
図3は、染色体3qの180MB〜199MBが両aCGHおよび発現プロファイリングによりACとSCC間の有意差を示す、唯一のゲノム領域であることを示す。両プロット上で、x座標は、染色体1〜染色体Xのゲノムマップ位置順に並べられたプローブを表す。(A)アレイ-CGH上のSCCとAC原発腫瘍を比較して有意にゲイン/増幅したプローブ。Y軸は、置換試験のlog10 P値を示す。P<0.05を示すプローブを、赤色でプロットし、P>0.05のプローブを灰色で示した。SCCsとACs原発腫瘍の比較後にプローブは有意に欠失/欠失しなかった。(B)ゲノム領域は、SCCとAC原発腫瘍を比較して異なって発現されたプローブについて有意に豊富化された。Y軸は、豊富化についてのフィッシャーの直接確率検定のlog10調整p値を表す。赤線は、複数の試験について調整した調整P<0.05の領域を強調し、調整P>0.05のプローブを灰色で示す。
【００２８】
図4A-4Fは、8p12-p11.2単位複製配列の検証および限界の設定を示す。(A)8p12-p11.2単位複製配列のリアルタイムPCR検定とその境界を示す。2つの原発腫瘍を用いて境界を限定した：PT3(ダークグレーバー)およびPT1(ライトグレーバー)。BAC #1：BAC RP11-265K5；BAC #2：RP11-100B16。点線の四角は、単位複製配列に関与する遺伝子を含む。点入り縦線は、コピー数が増加したと考えられた(2倍)上記遺伝子量閾値を特定する。(B)(上のパネル)ある誘導体染色体上の多ライトグレーシグナルを示す細胞株NCI-H1703の分裂中期FISH分析(ライトグレーの矢印および左差し込み図。ライトグレーシグナル、BAC#2)。染色体8の正常コピーも明らかであり(ダークグレー矢印および右差し込み図)、BAC#2に対する2シグナル(ライトグレー)および対照BACに対する2シグナルを示す(RP11-138J2、染色体8上の27MBの単位複製配列にテロメリック、ダークグレーシグナル)。(下のパネル)隣り合った正常および腫瘍組織を比較する原発腫瘍PT3からの切片に対する間期FISH分析。注：腫瘍部分にBAC#1(ライトグレー)に多高強度シグナル、および該切片の正常部分にBAC#1の単一および二重シグナル。対照BAC(RP11-138J2は、染色体8上の27MBの単位複製配列にテロメリックである。ダークグレーシグナル)。(C)原発腫瘍PT3からの組織切片の間期FISH分析：BAC#1を用いると多高強度シグナルを示す(ライトグレー)。ダークグレー矢印、対照BAC(RP11-138J2、染色体8上の27MBの単位複製配列にテロメリック。赤色シグナル)。(D)原発腫瘍PT3からの組織切片の間期FISH分析：BAC#2(ダークグレーシグナル、白矢印)および対照BAC(RP11-138J2、染色体8上の27MBの単位複製配列にテロメリック。ライトグレーシグナル、ライトグレー矢印)の両方について2つのシグナル/細胞を示す。(E)原発腫瘍PT5からの組織切片の間期FISH分析：BAC#2を用いると多高強度シグナルを示す(ライトグレーシグナル)。白色矢印、対照BAC(RP11-138J2、染色体8上の27MBの単位複製配列にテロメリック。ライトグレーシグナル)。(F)原発腫瘍PT5からの組織切片の間期FISH分析：BAC#3(ダークグレーシグナル、ダークグレー矢印)および対照BAC(RP11-138J2、染色体8上の27MBの単位複製配列にテロメリック。ライトグレーシグナル、白色矢印)の両方に対する2シグナル/細胞を示す。
【００２９】
図5は、染色体8p12-p11.2単位複製配列に存在する遺伝子の発現分析を示す。Affymetrix(アフィメトリックス)分析からの該単位複製配列中の各遺伝子の発現レベルのヒートマップ表示。遺伝に対する複数のAffymetrixプローブが存在するときは、該プローブ間の中央値を用いた。各カラムは個々の試料を示し、各列は遺伝子を表す。ヒートマップ上の色の強さは発現強度と関連する。MCR陽性試料は、8p12-p11.2単位複製配列を示す5つの扁平原発腫瘍のうち4つ、ならびに8p12-p11.2単位複製配列を有する2つの肺癌細胞株NCI-H1703およびNCI-H520を含む。正常は、隣り合った組織学的正常肺組織から単離した3つの独立した正常RNA参照物を示し、MCR陰性腫瘍は8p12-p11.2の増幅を示さない2原発腫瘍である。
【００３０】
図6は、染色体20q11単位複製配列に存在する遺伝子の発現分析を示す。Affymetrix分析からの該単位複製配列中の5つの遺伝子、ID1、COX4I2、BCL2L1、TPX2、およびMYLK2それぞれの発現レベルのヒートマップ表示。遺伝子に対する複数のAffymetrixプローブが存在するときは、該プローブ間の中央値を用いた。各カラムは個々の試料を示し、各列は遺伝子を示す。ヒートマップ上の色の強さは発現強度と関連する。矢印は増幅を示す試料を示す。
【００３１】
図7は、cDNA-およびオリゴ-aCGHプロフィールの間の高レベルの一致を示す。典型例は、腺癌細胞株NCI-H1623についてのcDNA-およびオリゴ-aCGHプロフィールの対比を示す。該プロフィールは、ライトグレー(cDNA-aCGH)およびダークグレー(オリゴ-aCGH)で示す。cDNAアレイに対するより高解像度のオリゴヌクレオチドアレイプラットホームは、いくつかのさらなるきわめて限局性のCNA(アスタリスク)をみいだした。
【００３２】
図8は、染色体3変化の反復を示す。断片化データのCNAの整数-値反復(Y軸)は、染色体順でX軸に沿ってアラインした各プローブについてプロットする。ダークグレーバーは、染色体物質の損失を示し、ライトグレーバーは、欠失領域内のプローブを示す(材料と方法の項参照)。白色のスペースはプローブ間のギャップを示す。
【００３３】
図9は、細胞株NCI-H520中の8p12-p11.2単位複製配列のFISH分析を示す。染色体8の2つの正常コピー(それぞれBAC#2(ライトグレー)および対照BAC(暗赤色)に対する単一プローブ標識を示す)に加え、3つのさらなるマーカー染色体は、BAC#2に対するシグナルを示した(ライトグレー；矢印)。
【００３４】
図10A-10Cは、隣接する腫瘍と正常組織を比較する、原発腫瘍PT1から得た組織切片中の8p12-p11.2単位複製配列のFISH分析を示す。A：正常および隣接腫瘍を示すH&E染色スライド(倍率20x)。B：倍率40x。C：正常組織(挿入図、点線)および腫瘍組織を含むB中の強調領域のFISH。正常組織(点線中の挿入図)でなく腫瘍中に、高レベルの増幅がBAC#2(ライトグレー；矢印)を用いて明らかである。
【００３５】
図11は、原発腫瘍PT2(左)およびPT4(右)から得た切片中の8p12-p11.2単位複製配列のFISH分析を示す。BAC#2(ダークグレー；矢印)を用いると、対照BAC(ライトグレー；矢じり)と比べて複数の高強度シグナルが明らかである。
(表の簡単な説明)
【００３６】
表1は、欠失のMCRに存在する本発明のマーカーを含み、発現の減少を示す。表1は、配列番号1-67を含む。
【００３７】
表2は、増幅のMCRに存在する本発明のマーカーを含み、発現の増加を示す。表2は、配列番号68-272を含む。
【００３８】
表3は、高信頼(high-confidence)限局性MCRを含む。表3は、配列番号273-340を含む。
【００３９】
表4は、本明細書記載の細胞株の説明を含む。
【００４０】
表5は、本明細書に記載の腫瘍試料の説明を含む。
【００４１】
表6は、本明細書記載のオリゴヌクレオチド配列を含む。表6は配列番号341-712を含む。
【００４２】
表7は、肺腺癌(AC)および扁平上皮細胞癌(SCC)原発腫瘍および細胞株中の高信頼MCRのリストを含む。表7は、配列番号713-770を含む。
【００４３】
表8は、扁平上皮細胞癌(SCCs)と腺癌(ACs)に過剰発現するSCC中の3q上の遺伝子コピー数増幅の非存在下で過剰増幅したマーカーを含む。表8は、配列番号771-778を含む。
【００４４】
表9は、肺癌原発腫瘍中の発現増加を表現する本発明のマーカーを含む。表9は配列番号779-848を示す。
(発明の詳細な説明)
【００４５】
本発明は、少なくとも一部は、ある種の染色体領域(遺伝子座)内に含まれる、癌と関連する反復コピー数変化の、ゲノムの特異領域(本明細書では最小共通領域(MCR)という)の同定に基づく。これらMCRは、肺癌ゲノム、例えば、非小細胞肺癌(NSCLC)ゲノムにおけるコピー数変化の高解像度の特徴付けを可能にする新規cDNAまたはオリゴマーベースのプラットホームおよびバイオインフォーマティスク手段を用いて同定された(実施例1参照)。
【００４６】
同定した遺伝子座およびMCRに達するために、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(アレイ-CGH)を、肺癌細胞株および腫瘍試料中のコピー数異常(CNAs)(染色体領域の獲得および欠失)を定義するのに利用した。
【００４７】
データセットからのノイズをフィルターするための生プロフィールの分割分析(Olshen and Venkatraman、Olshen、A. B.、およびVenkatraman、E. S.(2002)ASA Proceedings of the Joint Statistical Meetings 2530-2535；Ginzinger、D. G.(2002)Exp Hematol 30、503-12；Golub、T. R. et al.(1999)Science 286、531-7；Hyman、E. et al.(2002)Cancer Res 62、6240-5；Lucito、R. et al.(2003)Genome Res 13、2291-305に記載)を実施し、これを用いてデータの統計的に有意な変化点を確認した。
【００４８】
遺伝子座の同定は、以下のいくつかの基本的基準を用いる自動化コンピューターアルゴリズムに基づいた：1)0.4以上または0.4以下の部分(cDNAについて0.5および0.55)を変化として同定する；2)2またはそれ以上の変化した部分は、単一プロフィール中で隣接しているか、または500KB以下で分離しており、該部分が及ぶ全領域は変化スパンと考えられる：3)大きく変化した部分または20MBより短いスパンは分離した遺伝子座の境界を定義するための「情報的スパン」として保持される。より長い領域は切り捨てられないが、遺伝子座の境界の定義には含まれない；4)情報的スパンを全試料で比較し、正の値または負の値の部分の重複グループを同定する(各グループは「重複グループ」と呼ばれる；5)重複グループは、反復率(再発率)が全グループについてピーク反復の25%以下であれば分離したグループに分けられる；反復は、高閾値の変化を有する試料数をカウントすることにより計算する(0.4、-0.4)；および6)最小共通領域(MCRs)はピーク反復の少なくとも75%を有する連続スパンとして定義する。2つのMCRsは、それらが結合する唯一のプローブ位置のギャップにより分離される。遺伝子座中に3つ以上のMCRがある場合は、全領域は単一の複合体MCRとして報告される。
【００４９】
遺伝子座同定アルゴリズムを用い、変化の振幅のサイズおよび有意な高閾値の達成に基づいて情報的CNAを定義する。次に、多プロフィールからの重複CNAを、領域的コピー数変化の分離した「遺伝子座」を定義するために自動的に結合し、その境界(bounds)はこれら重複CNAに及ぶ組み合わせフィジカル(physical)を表す。各遺伝子座は、ピークプロフィールにより特徴付けられ、その幅と振幅は、その遺伝子座に対する最も顕著な増幅または欠失の輪郭(contour)を反映する。さらに、各遺伝子座内で、1またはそれ以上の最小共通領域(MCRs)が、複数の腫瘍試料にわたって同定され、各MCRは、試料セットにわたってコピー数変化について標的とする異なる癌関連遺伝子を潜在的に保持する。
【００５０】
遺伝子座同定アルゴリズムは、細胞株および原発腫瘍の両方における反復、変化の振幅、および発現量について注釈を付けたデータセット内で分離したMCRを定義した。この分離したMCRは、原発腫瘍および細胞株の両方における反復高閾値変化を強調する4基準に基づいて優先順位を付けた(実施例1参照)。この優先順位付けスキームの実施は、肺腺癌および扁平上皮細胞癌原発腫瘍ならびに細胞株における4基準の少なくとも3つを満たす本発明の126MCRをもたらした(表3および7参照；表7は、高信頼MCRを示し、表3は高信頼限局性MCRを示す)。獲得または欠失、および増幅または欠失を有する原発腫瘍(T)または細胞株(C)の数をそれぞれ記載する。MCR反復は、全データセットのパーセンテージで表す。太字は、RT-PCRおよびFISHにより確認されたMCRである。染色体3の短腕は、数種の原発腫瘍および細胞株にわたって一定して欠失した(図1および図8)。試料のサブセットにおける欠失の存在および反復に基づいて、染色体3の短腕内の3つの小領域が自動化遺伝子座定義プログラムにより同定された(図8、明緑色バー)。
【００５１】
これら優先順位を付けた遺伝子座に帰す信頼水準は、さらにリアルタイム定量的PCR(QPCR)により確認され、アレイ-CGHにより定義した17選択MCRで100%の一致が示された。
【００５２】
本明細書において同定されたMCRは、1.42Mbのメジアン形を有し、29(23%)MCRsは0.5Mbまたはそれ以下にわたり、また平均4つの注釈付き遺伝子を有する。
【００５３】
また、表3および7において、該遺伝子座およびMCRは、「獲得(gain)および増幅」または「欠失(loss)および欠失(deletion)」のいずれかを有することが示され、各遺伝子座およびMCRは、(1)コピー数および/または発現の増加、または(2)コピー数および/または発現の減少、または欠失のいずれかを示唆した。
【００５４】
本発明のMCR内に存在する該遺伝子の有意な分画の相補的発現プロフィール分析は、遺伝子量とmRNA発現の間の統計的に有意な関連を有するマーカーのサブセットをもたらした。表1は欠失のMCRに存在し、次いで肺癌細胞株にわたる比較により発現の減少を表現する本発明のマーカーを記載する。表2は、肺癌細胞株にわたる比較により過剰発現する増幅のMCRに存在する本発明のマーカーを記載する。まだ注釈付けされていないMCR内のさらなるマーカーを、本明細書に記載の癌のマーカーとして使用してもよく、これは本発明に含まれる。
【００５５】
本明細書に記載のコピー数が変化した染色体領域を同定するための新規方法は、限定されるものではないが癌を含む種々の疾患に対する種々のデータセットに適用してよい。限定されるものではないがオリゴヌクレオチドベースのミクロアレイ(Brennan、et al.(2004)In Press；Lucito、et al.(2003)Genome Res. 13:2291-2305；Bignell et al.(2004)Genome Res. 14:287-295；Zhao、et al(2004)Cancer Research、64(9):3060-71)を含む当該分野で知られた他の方法、および例えば、ハイブリダイゼーション法(例えば、FISHおよびFISHプラススペクトル核型(SKY))を含む本明細書に記載の他の方法を用いてコピー数異常を測定してよい。
【００５６】
本明細書で同定されたMCRの増幅または欠失は、癌、例えば、肺癌および他の上皮性癌の存在と相関する。さらに、各MCR内に存在する該遺伝子のコピー数および/または発現レベルの分析は、本明細書に記載の個々のマーカーおよびマーカーの組み合わせ、および対象における、癌、例えば、肺癌、例えば、NSCLCの存在と相関する、発現の増加および減少、および/またはコピー数の増加および減少の同定をもたらした。
【００５７】
したがって、本明細書において、試料中の癌の存在、試料中の癌の非存在、およびマーカーの量、構造、および/または活性の変化を評価することにより対象における予防、診断、特徴付け、および治療法と関連する癌の他の特徴を検出する方法を提供する。例えば、本明細書において同定されたMCRの存在、非存在、またはコピー数の評価、またはコピー数の評価による、該マーカーの活性に影響を及ぼす突然変異(例えば、置換、欠失、または付加突然変異)の存在、発現レベル、タンパク質レベル、タンパク質活性、またはMCRs内のいずれか1つまたはそれ以上のマーカー(例えば、表1および2に記載のマーカーセット)のメチル化状態の評価も本発明の範囲内である。
【００５８】
本明細書において、対象における癌を抑制することができる化合物を同定するための方法、および本発明の遺伝子またはタンパク質マーカーの調節因子、例えばアゴニストまたはアンタゴニストを用いて癌を治療、予防、および/または抑制するための方法も提供する。
【００５９】
本明細書に記載のMCRおよびマーカーは肺癌試料中に同定されたが、本発明の方法は、肺癌の予防、診断、特徴付け、治療および予防のための使用に何ら限定されず、例えば本発明の方法は、本明細書に記載のあらゆる癌に適用することができよう。
【００６０】
本発明の種々の側面を以下の項でさらに詳細に説明する。
I. 定義
【００６１】
本明細書で用いている以下の各用語は、本項中の意味と関連する意味を有する。
【００６２】
本明細書に記載の冠詞「a」および「an」は、該冠詞の文法的目的語が1つ、または1以上(すなわち、少なくとも1)を表す。例として、「an element(要素)」は1要素または1以上の要素を表す。
【００６３】
用語「腫瘍」または「癌」は、癌を生じる細胞の典型的特徴、例えば無制御な増幅、不死性、転移潜在性、急速な成長および増殖速度、およびある種の特徴的形態学的特徴、を有する細胞の存在を表す。癌細胞は腫瘍の形であることが多いが、そのような細胞は、動物内のみに存在するか、または非腫瘍化癌細胞、例えば白血病細胞であってよい。本明細書で用いている用語「癌」には、悪性癌および前癌状態の癌が含まれる。癌には、限定されるものではないが、肺癌、例えば、非小細胞肺癌(NSCLC)、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織の癌などが含まれる。
【００６４】
本明細書で用いている用語「肺癌」または「新生物」には、非小細胞肺癌(NSCLC)および小細胞癌が含まれる。肺癌は、別の発生源(例えば、結腸)由来の「転移性」であるか、または「原発性」(肺細胞起源の腫瘍)であってよい。
【００６５】
本明細書で用いている用語「非小細胞肺癌」、「非小細胞肺癌」、または「NSCLC」は、小細胞癌以外のすべての肺癌を含む肺癌であり、該の腺癌(AC)、大細胞癌、肺胞細胞癌、および扁平上皮細胞癌(SCC)を含むことを意図する。
【００６６】
本明細書で用いている「最小共通領域(MCR)」は、癌のゲノムの、獲得および増幅(コピー数の増加)または欠失および欠失(コピー数の減少)を表現する連続染色体領域を表す。MCRは、コピー数が増加または減少している、癌と関連する少なくとも1の核酸配列を含む。本発明のMCRには、限定されるものではないが、表3および7に記載のものが含まれる。
【００６７】
「マーカー」は、変化(ここで、該変化は癌と関連する)していることがある遺伝子またはタンパク質である。該変化は、癌組織または癌細胞の、正常または健康組織または細胞(例えば、対照)におけるその量、構造、および/または活性と比較した量、構造、および/または活性であることがあり、癌のような病状と関連する。例えば、癌と関連する本発明のマーカーは、癌組織または癌細胞中のコピー数、発現レベル、タンパク質レベル、タンパク質活性、またはメチル化状態が正常、健康組織または細胞に比べて変化していてよい。さらに、「マーカー」は、その構造が変化した、例えば突然変異した分子(対立遺伝子変異体を含む)を含み、例えば、癌のような病状と関連する組織または細胞中に存在すると、例えば、置換、欠失、または付加によりヌクレオチドまたはアミノ酸レベルが野生型配列と異なる。
【００６８】
マーカーの用語「量の変化(altered)」またはマーカーの「レベルの変化」は、マーカーまたは染色体領域、例えば、対照試料中のマーカーの発現レベルまたはコピー数と比較した、MCRのコピー数の増加または減少および/または癌試料中の特定のマーカー遺伝子または遺伝子の発現レベルの増加または減少を表す。マーカーの用語「量の変化」は、正常対照試料中のマーカーのタンパク質レベルと比較した、試料、例えば癌試料中のマーカーのタンパク質レベルの増加または減少を含む。さらに、マーカーの量の変化は、マーカーの発現または活性に影響しうる、本明細書に記載のマーカーのメチル化状態を検出することにより測定してよい。
【００６９】
対象中の、マーカーの量、例えばマーカーまたはMCRの発現またはコピー数、またはマーカーのタンパク質レベルは、マーカーの量が量を評価するのに用いるアッセイの標準誤差より大きい量、その量の好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは3、4、5、10倍、またはそれ以上、正常レベルよりそれぞれ大きいかまたは小さければ、マーカーまたはMCRの正常量より「有意に」高いかまたは低い。あるいは、対象中のマーカーまたはMCRの量は、その量が該マーカーまたはMCRの正常量よりそれぞれ少なくとも約2倍、好ましくは少なくとも約3、4、または5倍高いかまたは低ければ正常量より「有意に」高いかまたは低いと考えることができる。
【００７０】
「遺伝子のコピー数」または「マーカーのコピー数」は、特定の遺伝子産物をコードする細胞中のDNA配列の数を表す。一般的に、特定の遺伝子について、哺乳類は各遺伝子2コピーを有する。しかしながら、該コピー数は、遺伝子増幅または複製により増加し、または欠失により減少しうる。
【００７１】
マーカーまたはMCRの「正常」コピー数、またはマーカーの「正常」発現レベルは、生物試料、例えば、癌に罹患していない対象、例えばヒト由来の組織、全血、血清、血漿、口腔掻き取り物、唾液、脳脊髄液、尿、大便、気管支肺胞洗浄物、および肺組織を含む試料中のマーカーの発現レベル、コピー数、またはMCRのコピー数である。
【００７２】
マーカーまたはMCRの用語「発現レベルの変化」は、発現またはコピー数を評価するのに用いるアッセイの標準誤差より大きいかまたは小さい、被検試料、例えば癌に罹患した患者由来の試料におけるマーカーの発現レベルまたはコピー数を表し、対照試料(例えば、関連疾患のない健康対象由来の試料)中のマーカーまたはMCRの発現レベルまたはコピー数、好ましくは種々の対照試料中のマーカーまたはMCRの平均発現レベルまたはコピー数の、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは3、4、5、または10倍またはそれ以上である。発現レベルの変化は、発現またはコピー数を評価するのに用いるアッセイの標準誤差より大きいかまたは小さく、好ましくは、対象試料(例えば関連疾患のない健康対象由来の試料)のマーカーまたはMCRの発現レベルまたはコピー数、好ましくは種々の対照試料中のマーカーまたはMCRの平均発現レベルまたはコピー数の、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは3、4、5、または10倍またはそれ以上である。
【００７３】
マーカーまたはMCRの、「過剰発現」または「有意に高レベルの発現またはコピー数」は、発現またはコピー数を評価するのに用いるアッセイの標準誤差より大きい、被検試料中の発現レベルまたはコピー数を表し、好ましくは、対象試料(例えば関連疾患のない健康対象由来の試料)のマーカーまたはMCRの発現レベルまたはコピー数、好ましくは種々の対照試料中のマーカーまたはMCRの平均発現レベルまたはコピー数の、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは3、4、5、または10倍またはそれ以上である。
【００７４】
マーカーまたはMCRの、「過小発現」または「有意に低レベルの発現またはコピー数」は、発現またはコピー数を評価するのに用いるアッセイの標準誤差より大きい、被検試料中の発現レベルまたはコピー数を表すが、好ましくは、対象試料(例えば関連疾患のない健康対象由来の試料)のマーカーまたはMCRの発現レベルまたはコピー数、好ましくは種々の対照試料中のマーカーまたはMCRの平均発現レベルまたはコピー数より、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは3、4、5、または10倍またはそれ以上少ない。マーカーの「メチル化状態」は、メチル化パターン、例えば該マーカーのプロモーターのメチル化、および/または該マーカーのメチル化レベルを表す。DNAメチル化は、遺伝的、可逆的、および遺伝子外変化である。さらに、DNAメチル化は、発生的および遺伝的結果を有する遺伝子発現を変化させる潜在性を有する。DNAメチル化は、例えば、Laird、et al.(1994)Human Molecular Genetics 3:1487-1495 and Laird、P.(2003)Nature 3:253-266(この内容は本明細書の一部を構成する。)に記載のごとく癌と関連している。例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子のプロモーター中のCpG オリゴヌクレオチドのメチル化は、その不活化をもたらしうる。さらに、正常メチル化プロセスの変化は、ゲノムの不安定性と関連する(Lengauer. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2545-2550、1997)。そのような異常な後成的変化は、多くの種類の癌にみられるので、発癌性形質転換の潜在的マーカーとして役割を果たし得る。
【００７５】
メチル化測定法には、制限ランドマークゲノムスキャンニング(Kawai、et al.、Mol. Cell. Biol. 14:7421-7427、1994)、メチル化感受性任意プライムドPCR(Gonzalgo、et al.、Cancer Res. 57:594-599、1997)；ゲノムDNAをメチル化感受性制限酵素で消化し、次いで目的とする領域をSouthern分析(消化-Southern法)；PCR増幅前に、ゲノムDNAのメチル化感受性制限酵素による消化を含むPCRベースのプロセス(Singer-Sam、et al.、Nucl. Acids Res. 18: 687, 1990)；重亜硫酸処理を用いるゲノムシーケンシング(Frommer、et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831、1992)；メチル化特異的PCR(MSP)(Herman、et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826、1992)；および重亜硫酸変換DNAから増幅したPCR産物の制限酵素消化(Sadri and Hornsby、Nucl. Acids Res. 24:5058-5059、1996；and Xiong and Laird、Nucl. Acids. Res. 25:2532-2534、1997)；遺伝子突然変異を検出するためのPCR技術(Kuppuswamy、et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1143-1147、1991)、および対立遺伝子特異的発現の定量(Szabo and Mann、Genes Dev. 9:3097-3108、1995；およびSinger-Sam、et al.、PCR 方法Appl. 1:160-163、1992)；および米国特許No.6,251,594に記載の方法(これらの内容は本明細書の一部を構成する。)が含まれる。Zardo、et al.(2000)Nature Genetics 32:453-458に記載の統合ゲノムおよびエピゲノム分析を用いてもよい。
【００７６】
マーカーの用語「活性変化」は、正常対照試料中のマーカーの活性と比較した、例えば癌試料中の疾患状態を増加または減少させるマーカーの活性を表す。マーカーの活性変化は、例えばマーカーの発現変化、マーカーのタンパク質レベルの変化、マーカーの構造変化、または例えば該マーカーと同じまたは異なる経路に関与する他のタンパク質との相互作用の変化、または転写活性化因子または阻害因子との相互作用の変化、またはメチル化状態の変化の結果でありうる。
【００７７】
マーカーの用語「構造変化」は、正常または野生型遺伝子またはタンパク質と比較して、マーカー遺伝子またはマーカータンパク質内の突然変異または対立遺伝子変異体、例えば、マーカーの発現または活性に影響を与える突然変異の存在を表す。例えば、突然変異は、限定されるものではないが、置換、欠失、または付加突然変異を含む。突然変異は、マーカーのコーディングまたは非コーディング領域に存在していてよい。
【００７８】
「マーカー核酸」は、本発明のマーカーに対応するかまたはそれによりコードされる核酸(例えば、DNA、mRNA、cDNA)を表す。例えば、そのようなマーカー核酸分子は、表1または2に記載のあらゆる核酸配列の完全または部分配列、またはそのような配列と相補的もしくはハイブリダイズする断片を含むDNA(例えば、cDNA)を含む。該マーカー核酸分子は、表1または2に記載のあらゆる核酸配列の完全または部分配列を含むRNA、またはそのような配列の相補物も含む(ここで、すべてのチミジン残基はウリジン残基で置換される)。「マーカータンパク質」は、本発明のマーカーによりコードされるかまたはそれに対応するタンパク質である。マーカータンパク質は、表1または2に記載のあらゆる配列によりコードされるタンパク質またはその断片の完全または部分配列を含む。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は本明細書において互換性に使用する。
【００７９】
本明細書で用いている「マーカー」は、表3および/または7に記載のMCRに存在するあらゆる核酸配列、またはそのような配列によりコードされるタンパク質を含む。
【００８０】
本明細書において同定されたマーカーは、診断的および治療的マーカーを含む。単一マーカーが診断的マーカー、治療的マーカー、または診断的および治療的マーカー両方であってよい。
【００８１】
本明細書で用いている用語「治療的マーカー」は、癌の成長(維持、進行、血管新生、および/または転移を含む)に関与すると考えられるマーカー、例えば、表1および2に記載のマーカーを含む。治療的マーカーの癌関連機能は、例えば以下により確認することができる：(1)例えば、ヒト癌の約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%以上、またはそれ以上の、コピー数の増加または減少(例えば、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、およびFISHプラススペクトルカリオタイプ(SKY)、または定量的PCR(qPCR))または突然変異(例えば、シーケンシングにより)、過剰発現または過少発現(例えば、in situハイブリダイゼーション(ISH)、Northernブロット、またはqPCRによる)、タンパク質レベルの増加または減少(例えば、免疫組織化学(IHC)による)、またはタンパク質活性の増加または減少(マーカーが関与する経路の調節により測定)、(2)例えばマーカーのRNA干渉(「RNAi」)による、例えば軟寒天中の癌細胞増殖および成長の阻害、(3)癌遺伝子、例えばMycおよびRASによるかまたはRAS単独によるマウス胚繊維芽細胞(MEF)の形質転換を増強するマーカーの能力、(4)例えば、軟寒天中の腫瘍細胞株の成長を増強または低下させるマーカーの能力、(5)SCID外植片における一次マウス細胞を形質転換するマーカーの能力、および/または(6)腫瘍、例えばマーカーの阻害または活性化によりde novoで生じた動物の腫瘍またはヒト癌細胞株由来腫瘍、の維持または形成の抑制。ある態様において、治療的マーカーは、診断的マーカーとして用いることができる。
【００８２】
本明細書で用いている用語「診断的マーカー」は、以下の癌の診断に有用なマーカー、表1および2に記載のマーカーを含む：治療中またはその前後の腫瘍の、過剰または過小活性発現、発現、成長、寛解、再発、または耐性。該マーカーの予測機能は、例えば以下により確認することができる：(1)例えば、ヒト癌の約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%以上、またはそれ以上の、コピー数の増加または減少(例えば、FISH、FISHプラスSKY、またはqPCRによる)、過剰発現または過小発現(例えば、ISH、Northern Blot、またはqPCRによる)、タンパク質レベルの増加または減少(例えばIHCによる)、または活性の増加または減少(例えば、マーカーが関与する経路の調節により測定される)、(2)生物試料、例えば、癌に罹患した対象、例えばヒト由来の組織、全血、血清、血漿、口腔掻き取り物、唾液、脳脊髄液、尿、大便、気管支肺胞洗浄物、および/または肺組織を含む試料中のその存在の有無、(3)癌患者の臨床サブセット(例えば、特定の療法に反応する者、または耐性が発現する者)中のその存在の有無。
【００８３】
診断的マーカーは、「代用マーカー」、例えば、癌進行の間接的マーカーであるマーカーも含む。
【００８４】
用語「プローブ」は、特に意図した標的分子、例えば本発明のマーカーと選択的に結合することができるあらゆる分子を表す。プローブは、当業者が合成するか、または適切な生物学的調製物由来でありうる。標的分子を検出するために、プローブを本明細書に記載のごとく標識するよう特に設計してよい。プローブとして利用することができる分子の例には、限定されるものではないが、RNA、DNA、タンパク質、抗体、および有機モノマーが含まれる。
【００８５】
本明細書で用いている用語「プロモーター/制御配列」は、プロモーター/制御配列と操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。ある場合には、この配列は、コアプロモーター配列であってよく、他の場合には、この配列は遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列と他の制御エレメントを含んでいてもよい。プロモーター/制御配列は、例えば、空間的または時間的に制限される方法で遺伝子産物を発現するものであり得る。
【００８６】
本明細書で用いている「RNA干渉剤」は、RNA干渉(RNAi)により、標的遺伝子、例えば本発明のマーカーの発現を阻害しまたは干渉するあらゆる物質と定義される。そのようなRNA干渉剤には、限定されるものではないが、標的遺伝子とホモローガスなRNA分子を含む核酸分子、例えば、本発明のマーカー、またはその断片、短干渉RNA(siRNA)、およびRNA干渉(RNAi)により標的遺伝子の発現を阻害し、または干渉する小分子が含まれる。「RNA干渉(RNAi)」は、進化的に保存されたプロセスであり、それにより標的遺伝子と同じかまたはきわめて類似の配列のRNAの発現または導入がその標的遺伝子から転写したメッセンジャーRNA(mRNA)の配列特異的分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)をもたらし(Coburn、G. and Cullen、B.(2002)J. of Virology 76(18):9225参照)、それにより標的遺伝子の発現が阻害される。ある態様において、該RNAは二本鎖RNA(dsRNA)である。このプロセスは、植物、無脊椎動物、および哺乳動物細胞について記載されている。天然のRNAiは、長いdsRNAの、siRNAと呼ばれる二本鎖断片への前進的開裂を促す、dsRNA特異的エンドヌクレアーゼDicerにより開始される。siRNAは、標的mRNAを認識し、開裂するタンパク質複合体内に組み込まれる。RNAiは、核酸分子、例えば、合成siRNAまたはRNA干渉剤を導入することにより開始し、標的遺伝子の発現を阻害しまたは封じる(silence)こともできる。本明細書で用いている「標的遺伝子発現の阻害」または「マーカー遺伝子発現の阻害」には、標的遺伝子(例えば、本発明のマーカー遺伝子)、または標的遺伝子によりコードされるタンパク質、例えば、本発明のマーカータンパク質の発現またはタンパク質活性またはレベルのあらゆる低下が含まれる。低下は、標的遺伝子の発現、またはRNA干渉剤の標的とならない標的遺伝子によりコードされるタンパク質の活性またはレベルと比較して、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%またはそれ以上でありうる。
【００８７】
本明細書では「小干渉RNA」ともいう「短干渉RNA」(siRNA)は、例えばRNAiにより標的遺伝子の発現を阻害するように機能する物質と定義される。siRNAは、化学的に合成され、in vitro転写により生成され、または宿主細胞内で生成されうる。ある態様において、siRNAは、長さ約15〜約40ヌクレオチド、好ましくは長さ約15〜約28ヌクレオチド、より好ましくは約19〜約25ヌクレオチド、より好ましくは長さ約19、20、21、または22ヌクレオチドの二本鎖RNA(dsRNA)分子であり、各鎖に長さ約0、1、2、3、4、または5ヌクレオチドの3'および/または5'オーバーハングを含んでよい。該オーバーハングの長さは、2本の鎖間で独立しており、1本の鎖上のオーバーハングの長さは、第2の鎖上のオーバーハングの長さに依存しない。好ましくは、siRNAは、標的メッセンジャーRNA(mRNA)の分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング(サイレンシング)(PTGS)を介してRNA干渉を促進することができる。別の態様において、siRNAは、小ヘアピン(ステムループともいう)RNA(shRNA)である。ある態様において、これらshRNAは、短(例えば、19-25ヌクレオチド)アンチセンス鎖、次いで5-9ヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖からなる。あるいはまた、該センス鎖は、ヌクレオチドループ構造の前に置かれてよく、アンチセンス鎖が次に来てよい。これらshRNAは、プラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルス中に含まれてよく、例えば、pol III U6プロモーター、または別のプロモーター(例えば、Stewart、et al.(2003)RNA Apr;9(4):493-501(この内容は本明細書の一部を構成する)参照)から発現してよい。RNA干渉剤、例えば、siRNA分子を、癌があるか、癌のリスクがある患者に、本発明のマーカー遺伝子、例えば、癌に過剰発現するマーカー遺伝子(例えば、表2に記載のマーカー)の発現を阻害するために投与し、対象の癌を治療、予防、または阻害することができる。
【００８８】
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に結合すると、該細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で生ヒト細胞中で遺伝子産物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
【００８９】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に結合すると、実質的に該プロモーターに対応するインデューサーが細胞中に存在する場合にのみ、生ヒト細胞中に遺伝子産物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
【００９０】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に結合すると、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ、生ヒト細胞中に遺伝子産物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
【００９１】
「転写ポリヌクレオチド」は、本発明のマーカーの転写、およびもしあれば転写物の正常転写後プロセシング(例えばスプライシング)、および転写物の逆転写により生成される成熟RNAのすべてまたは部分と相補的またはホモローガスであるポリヌクレオチド(例えば、RNA、cDNA、またはRNAまたはcDNAの1つの類似体)である。
【００９２】
「相補的」は、2本の核酸鎖間、または同じ核酸鎖の2領域間の配列相補性の広い概念を表す。第1核酸領域のアデニン残基は、第1領域と逆平行である第2核酸領域の残基がチミンまたはウラシルであるとき該残基と特定の水素結合を形成(「塩基対形成」)することができることが知られている。同様に、第1核酸領域のシトシン残基は、第1領域と逆平行である第2核酸領域の残基がグアニンであるとき該残基と特定の水素結合を形成(「塩基対形成」)することができることが知られている。2つの領域が逆平行に配置されたときに、第1領域の少なくとも1のヌクレオチド残基が第2領域の残基と塩基対形成することができれば、核酸の第1領域は、同じまたは異なる核酸の第2領域と相補性である。好ましくは、該第1領域は第1部分を含み、第2領域は第2部分を含むので、該第1および第2部分が逆平行に配置されたときに、第1部分のヌクレオチド残基の少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%が第2部分のヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。より好ましくは、第1部分のすべてのヌクレオチド残基が第2部分のヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。
【００９３】
本明細書で互換性に用いている用語「相同性」または「同一性」は、より厳密に比較した、2ポリヌクレオチド配列間または2ポリペプチド配列間の配列同一性を表す。用語「同一性または相同性パーセント」および「同一性または相同性%」は、2またはそれ以上のポリヌクレオチド配列または2またはそれ以上のポリペプチド配列の比較においてみいだされる配列類似性率を表す。「配列類似性」は、2またはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の塩基対配列の類似性パーセント(あらゆる適切な方法により測定される)を表す。2またはそれ以上の配列はどれでも0〜100%類似であり得るか、その間にあらゆる整数値でありうる。同一性または類似性は、各配列(比較のために整列(align)させてよい)中の1を比較することにより決定することができる。比較した配列中の位置が同じヌクレオチド塩基またはアミノ酸が占める場合は、該分子はその位置が同一である。ポリヌクレオチド配列間の類似性または同一性の程度は、該ポリヌクレオチド配列が共有する位置で同一またはマッチングするヌクレオチドの数に応じる。ポリペプチド配列の同一性の程度は、該ポリペプチド配列が共有する位置における同一アミノ酸の数に応じる。ポリペプチド配列の相同性または類似性の程度は、該ポリペプチド配列が共有する位置における同一アミノ酸の数に応じる。本明細書で用いている用語「実質的類似性」は、少なくとも50%、より好ましくは60%、70%、80%、90%、95% またはそれ以上の相同性を表す。
【００９４】
マーカーは、それが基質と共有または非共有結合しているとき、基質と「結合」しており、該基質は、マーカーの実質的分画が基質から解離することなく、液(例えば標準的クエン酸生理食塩水、pH7.4)でリンスすることができる。
【００９５】
本明細書で用いている「天然(の)」核酸分子は、天然に生じるヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子(例えば天然タンパク質をコードする)を表す。
【００９６】
癌は、癌の少なくとも1症状が軽減し、終結し、遅れ、または抑制された場合、「阻害(抑制)」される。本明細書で用いている癌は、癌の再発または転移が減少し、遅れ、遅延し、または抑制される場合にも「阻害(抑制)」される。
【００９７】
キットは、本発明のマーカーを特異的に検出する少なくとも1の試薬、例えばプローブを含むあらゆる製品であり、該製品は本発明の方法を実施するために単位として宣伝、配給、または販売される。
II. 本発明の使用
【００９８】
本発明は、一部、正常(すなわち非癌性)細胞と比較して癌細胞中に異なるコピー数をもたらす、構造的に変化した染色体領域(MCR)の同定に基づく。さらに、本発明は、一部、マーカー、例えば、正常(すなわち非癌性)細胞と比較して癌細胞中の量、構造、および/または活性が変化している本発明のMCRに存在するマーカー、の同定に基づく。本発明のマーカーは、正常および癌細胞の1つまたは両方を検出することができるDNA、cDNA、RNA、およびポリペプチド分子に対応する。
【００９９】
試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、口腔掻き取り物、唾液、脳脊髄液、尿、大便、気管支肺胞洗浄物、および肺組織を含む試料中のマーカーの1またはそれ以上の、量、構造、および/または活性、例えば、存在、非存在、コピー数、発現レベル、タンパク質レベル、タンパク質活性；突然変異、例えば、マーカーの活性に影響する突然変異(例えば、置換、欠失、または付加突然変異)、および/またはメチル化状態の存在は、本明細書では組織の癌状態と関連する。さらに、試料中の、本発明のMCRの1またはそれ以上の存在、非存在、および/またはコピー数も組織の癌状態と関連する。すなわち、本発明は、細胞(例えば、非ヒト、培養非ヒト細胞、およびin vivo 細胞から得られる細胞)の癌状態を評価するための組成物、キット、および方法、ならびに本発明のマーカーの調節因子、例えばアゴニストまたはアンタゴニストを用いる癌の治療、予防、および/または阻害方法を提供する。
【０１００】
本発明の組成物、キット、および方法は、特に以下の用途を有する：
1)対象が癌に罹患しているか否かを評価；
2)ヒト対象の癌の状態を評価;
3)対象中の癌のグレードを評価；
4)対象中の癌の良性または悪性度を評価;
5)対象中の癌の転移可能性を評価;
6)対象中の癌に関連する新生物の組織型を評価；
7)癌を治療するのに有用な抗体、抗体断片、または抗体誘導体の作成、および/または対象が癌に罹患しているか否かを評価；
8)癌細胞の存在を評価；
9)対象中の癌を阻害するための1またはそれ以上の被検化合物の有効性を評価；
10)対象中の癌を阻害するための療法の有効性を評価；
11)対象中の癌の進行を評価；
12)例えば対象中の癌を阻害するための組成物または療法を選択；
13)癌に罹患している対象を治療；
14)対象中の癌を阻害；
15)被検化合物の発癌可能性を評価；および
16)癌が生じるリスクのある患者における癌の発生を予防。
【０１０１】
すなわち、本発明は、対象が癌に罹患しているか、または癌を生じるリスクがあるか否かを評価する方法を含む。この方法は、対象試料中のマーカーの、量、構造、および/または活性、例えば、存在、非存在、コピー数、発現レベル、タンパク質レベル、タンパク質活性；突然変異、例えば、マーカーの活性に影響する突然変異(例えば、置換、欠失、または付加突然変異)の存在；および/またはメチル化状態を正常レベルと比較する。対象試料中のマーカーの量、構造、または活性と正常レベルの有意差は、対象が癌に罹患していることを示唆する。本発明は、癌試料中のMCR内のマーカーの発現レベルまたはMCRのコピー数を、正常対照試料中のMCR内のマーカーの発現レベルまたはMCRのコピー数と比較することにより、対象が癌に罹患しているか、または癌を生じるリスクがあるか否かを評価する方法も提供する。対象試料中MCR内のマーカーの発現レベル、またはMCRのコピー数と正常レベルの有意差は対象が癌に罹患していることを示唆する。MCRは、表3および/または7に記載のMCRからなる群から選ばれる。
【０１０２】
マーカーは、表1および2に記載のマーカーからなる群から選ばれる。表1には、遺伝子発現と遺伝子量の間にきわめて有意な相関(p、0.05)を有するマーカーを記載する。該マーカーの発現レベルまたはコピー数は、肺癌、例えばNSCLCと組織学的に同定された試料において減少した。表1には、各マーカーの、染色体、物理的位置(Mbで)、および遺伝子座番号も記載する。表1に記載のマーカーに対応する1またはそれ以上の分子は他の者によって記載されているかもしれないが、細胞の癌状態に関するこれらマーカーの重要性は以前には確認されていない。
【０１０３】
表2には、遺伝子発現と遺伝子量の間にきわめて有意な相関がある(p、0.05)マーカーも記載する。これらマーカーの発現レベルまたはコピー数は、肺癌、例えばNSCLCと組織学的に同定された試料において増加する。表2には、各マーカーの、染色体、物理的位置(Mbで)、および遺伝子座番号も記載する。表2に記載のマーカーに対応する1またはそれ以上の分子は他の者によって記載されているかもしれないが、細胞の癌状態に関するこれらマーカーの重要性は以前には確認されていない。
【０１０４】
表1または2に記載のあらゆるマーカーまたはマーカーの組み合わせ、または表3および/または7に記載のあらゆるMCRまたはMCRの組み合わせを、本発明の組成物、キット、および方法に用いてよい。一般に、癌細胞のマーカーまたはMCRの量、例えば発現レベルまたはコピー数および/または活性と、正常細胞中の同じマーカー量、例えば発現レベルまたはコピー数および/または活性の差ができるだけ大きいマーカーを用いるのが好ましい。この差は、マーカーの量および/または活性を評価するための方法の検出限界を可能な限り小さくすることができるが、その差は、評価方法の標準誤差より少なくとも大きい、好ましくは正常組織の同じ生物マーカーの量、例えば発現レベルまたはコピー数,および/または活性より少なくとも2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、15-、20-、25-、100-、500-、1000-倍、またはそれ以上の差であることが好ましい。
【０１０５】
本発明のマーカーの1またはそれ以上を用いるさらなる対象試料の常套的スクリーニングにより、ある種のマーカーは、特定の肺癌、例えばNSCLC、および限定されるものではないが以下のものを含む他の癌、を含む種々のタイプの癌中の量、構造、および/または活性が変化していることが明確になるものと理解される：メラノーマ、乳癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織の癌など。
【０１０６】
例えば、本発明のマーカーのいくつかは、癌、例えば肺癌のいくらか、すなわち、10%、20%、30%、または40%、またはほとんど(すなわち、50%またはそれ以上)または実質的にすべて(すなわち、80%またはそれ以上)で量、構造、および/または活性が変化していることを確認することができる。さらに、本発明のマーカーのあるものは種々の組織学的サブタイプの癌と関連があることを確認することができる。
【０１０７】
さらに、多数の対象試料について、本発明のマーカーの量、構造、および/または活性の変化、または本発明のMCRの発現またはコピー数の変化を評価し、試料を得た個々の対象の結果は相互に関連するので、ある種のマーカーの、量、構造、および/または活性が変化し、または本発明のMCRの発現またはコピー数が変化しているマーカーは、悪性癌と強い相関があり、本発明の他のマーカーの発現の変化は良性腫瘍または前癌状態と強い相関があることが確認されるであろう。すなわち、本発明の組成物、キット、および方法は、対象における癌の病期、グレード、組織型、および良性/前癌状態/悪性度の1またはそれ以上を特徴付けるのに有用である。
【０１０８】
本発明の組成物、キット、および方法が、対象における癌の病期、グレード、組織型、および良性/前癌状態/悪性度の1またはそれ以上を特徴付けるのに有用であるであるときは、本発明のマーカーまたはMCR、またはマーカーまたはMCRのパネルは、対応する病期、グレード、組織型、または良性/前癌状態/悪性度の癌に罹患した対象の、少なくとも約20%、好ましくは少なくとも約40%、60%、または80%、より好ましくは実質的にすべてにおいて、肯定的な結果が得られるように選択すべきである。好ましくは、本発明のマーカーまたはマーカーのパネルは、全人口について約10%以上のPPV(陽性的中率)が得られるように選択する(より好ましくは特異性が99.5%以上のアッセイと組み合わせて)。
【０１０９】
本発明の複数のマーカーまたはMCRを本発明の組成物、キット、および方法に用いる場合は、各マーカーの量、構造、および/または活性、または発現レベルまたはコピー数を、単一反応混合物(すなわち、各マーカーについて異なる蛍光プローブのような試薬を用いる)または1またはそれ以上のマーカーまたはMCRに対応する個々の反応混合物において、同じタイプの非癌性試料中の複数の各マーカーの正常な量、構造、および/または活性または発現レベルまたはコピー数と比較することができる。
【０１１０】
ある態様において、対応する正常レベルと比較した、試料中の、2以上の複数の混合物の量、構造、および/または活性の有意な変化、または1またはそれ以上のMCRのコピー数の有意な変化は、対象が癌に罹患していることを示唆する。対応する正常レベルまたはコピー数と比較して、例えば、複数の各マーカーまたはMCRの試料中の有意に低いコピー数は、対象が癌に罹患していることを示唆する。さらに別の態様において、対応する正常レベルと比較して、試料中の、1またはそれ以上のマーカーまたはMCRの有意に高いコピー数は、対象が癌に罹患していることを示唆する。また、対応する正常レベルと比較して、試料中の、複数の各マーカーまたはMCRの有意に高いコピー数は、対象が癌に罹患していることを示唆する。さらに別の態様において、対応する正常レベルと比較して、試料中の、1またはそれ以上のマーカーまたはMCRの有意に高いコピー数および1またはそれ以上のマーカーまたはMCRの有意に低いコピー数は、対象が癌に罹患していることを示唆する。
【０１１１】
複数のマーカーまたはMCRを用いるときは、2、3、4、5、8、10、12、15、20、30、または50、またはそれ以上の個々のマーカーまたはMCRを使用または同定することが好ましいが、より少ないマーカーまたはMCRが好ましい。
【０１１２】
少数のマーカーのみが、例えば肺癌(例えば、MYC、p16INK4A、RB1、RASSF1、TUSC2、SEMA3B、FHIT、およびKRAS2)と関連することが知られている。これらマーカー、または他のタイプの癌と関連することが知られている他のマーカーは、本発明の1またはそれ以上のマーカー、例えばマーカーのパネルと共に用いてよい。さらに、肺癌において、頻繁な獲得が1q31、3q25-27、5p13-14、および8q23-24に、また欠失が3p21、8p22、9p21-22、13q22、および17p12-13にマップされた(Bjorkqvist、A.M. et al.(1998)Br J Cancer 77、260-9；Luk、C. et al.(2001)Cancer Genet Cytogenet 125、87-99；Pei、J. et al.(2001)Genes Chromosomes Cancer 31、282-7；Petersen、I. et al.(1997)Cancer Res 57、2331-5；Balsara、B. R. & Testa、J. R.(2002)Oncogene 21、6877-83)。ある例では、以下のものを含むこれら遺伝子座内に存在する有効な発癌遺伝子および腫瘍差プレッサー遺伝子が同定されている：MYC(8q24)、p16INK4A(9p21)、RB1(13q14)、RASSF1(3p21)、TUSC2(3p21)、SEMA3B(3p21)、FHIT(3p14)、およびKRAS2(12p12)。あるタイプの遺伝子、例えば発癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、成長因子様遺伝子、およびタンパク質キナーゼ様遺伝子がしばしば種々のタイプの癌の発生に関与することがよく知られている。すなわち、本発明のマーカーのうち、既知の発癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子によりコードされる既知のタンパク質に似たタンパク質に対応するもの、および成長因子、プロテアーゼ、およびタンパク質キナーゼに似たタンパク質に対応するものを使用するのが好ましい。
【０１１３】
本発明の組成物、キット、および方法は、癌を生じるリスクが高い対象とその医師に特に有用であると認識される。癌を生じるリスクが増大していると認識される対象には、例えば、癌の家族歴を持つ対象、突然変異発癌遺伝子(すなわち、少なくとも1アレル)を有すると確認された対象、および高齢の対象が含まれる。
【０１１４】
正常(すなわち、非癌性)ヒト組織におけるマーカーの例えばコピー数、量、構造、および/または活性の変化は、種々の方法で評価することができる。ある態様において、正常発現レベルまたはコピー数は、非癌性と思われる細胞の部分におけるマーカーまたはMCRの発現レベルまたはコピー数を評価し、この正常発現レベルまたはコピー数と癌性であると疑われる細胞の部分における発現レベルまたはコピー数を比較することにより評価される。例えば、腹腔鏡検査または他の医学的方法によりある器官の一部で腫瘍の存在が示されると、マーカーまたはMCRの正常発現レベルまたはコピー数を該器官の非罹患部分を用いて評価し、この正常発現レベルまたはコピー数を該臓器の罹患部分(すなわち腫瘍)中の同じマーカーの発現レベルまたはコピー数と比較してよい。あるいはまた、特に本明細書に記載の方法の常套的作業の結果としてさらなる情報が利用可能になるので、本発明のマーカーまたはMCRの「正常」コピー数、量、構造、および/または活性についてのポピュレーション-平均値を用いてよい。他の態様において、マーカーまたはMCRの「正常」コピー数、量、構造、および/または活性は、非癌罹患対象から得られた対象試料、対象に癌の発生が疑われる前の対象から得られた対象試料、保存対象試料など中のマーカーまたはMCRのコピー数、量、構造、および/または活性を評価することにより決定してよい。
【０１１５】
本発明は、試料(例えば保存組織試料または対象から得た試料)中の癌細胞の存在を評価するための組成物、キット、および方法を含む。これら組成物、キット、および方法は、上記のものと実質的に同じであるが、ただし、必要であれば、該組成物、キット、および方法をあるタイプの試料とともに用いるために適合させる。例えば、試料がパラフィン化保存ヒト組織試料である場合は、本発明の組成物、本発明のキット中の化合物の比、または用いる方法を調節する必要がありうる。そのような方法は、当該分野でよく知られており、当業者の技術内である。
【０１１６】
すなわち、本発明は、癌細胞(例えば、対象試料のような試料中)の存在を評価するためのキットを含む。該キットは、例えば、本発明のマーカーまたはMCRに対応する核酸またはポリペプチドと特異的に結合する本発明のマーカーまたはMCRを同定することができる1またはそれ以上の試薬を含んでよい。本発明のマーカーに対応するポリペプチドと結合するための適切な試薬には、抗体、抗体誘導体、抗体断片などが含まれる。核酸(例えば、ゲノムDNA、mRNA、スプライスされたmRNA、cDNAなど)と結合するのに適した試薬には相補的核酸が含まれる。例えば、該核酸試薬には、基質と結合したオリゴヌクレオチド(標識または非標識)、基質と結合していない標識オリゴヌクレオチド、PCRプライマー対、分子ビーコンプローブなどが含まれる。
【０１１７】
本発明のキットは、所望により、本発明の方法を実施するのに有用なさらなる成分を含んでよい。例として、該キットは、相補的核酸とアニールするか、または抗体とそれと特異的に結合するタンパク質を結合させるのに適した液体(例えばSSC緩衝液)、1またはそれ以上の試料コンパートメント、本発明の方法の実施法を記載する指示資料、正常細胞試料、癌細胞試料などを含んでよい。本発明のキットは、マーカーのタンパク質レベルまたはタンパク質活性を測定するのに有用な試薬を含んでよい。別の態様において、本発明のキットは、マーカーのメチル化状態を測定する試薬を含むか、またはマーカーの構造変化、例えば突然変異の存在を測定する試薬を含んでよい。
【０１１８】
本発明は、本発明の方法およびキットに有用な抗体を生成する単離されたハイブリドーマの製造方法も含む。本発明のマーカーに対応するタンパク質は、単離されていてよく(例えば、それを発現する細胞から精製することによるか、または既知の方法を用いin vivo またはin vitroでタンパク質をコードする核酸を転写および翻訳することによる)、また脊椎動物、好ましくは哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、またはヒツジを該単離タンパク質を用いて免疫する。脊椎動物が該タンパク質に強い免疫応答を示すように、脊椎動物を、所望により(そして好ましくは)該単離タンパク質で少なくともさらに1回免疫してよい。脾細胞を免疫脊椎動物から単離し、当該分野でよく知られたあらゆる種々の方法を用いて不死化細胞株と融合させ、ハイブリドーマを形成させる。次に、このようにして形成されるハイブリドーマは、該タンパク質と特異的に結合する抗体を生成する1またはそれ以上のハイブリドーマを同定するための標準的方法を用いてスクリーニングする。本発明は、この方法により製造されたハイブリドーマおよび該ハイブリドーマを用いて製造した抗体も含む。
【０１１９】
本発明は、癌細胞を阻害する被検化合物の有効性を評価する方法も含む。上記のごとく、本発明のマーカーの量、構造、および/または活性、または本発明のMCRの発現レベルまたはコピー数の違いは、細胞の癌性状態と関連する。該マーカーのあるものの量、例えば、発現またはコピー数、構造、および/または活性、または本発明のMCRの発現またはコピー数の変化は、細胞の癌性状態から生じるらしいと認識されるが、同様に、該量の変化は該癌性状態を誘導し、維持し、進展させると認識される。すなわち、対象における癌を阻害する化合物は、変化、例えば、1またはそれ以上の本発明のマーカーの発現および/または活性の、該マーカーの正常レベルに近いレベルへの変化(例えば、非癌性細胞におけるマーカーの量、例えば、発現、および/または活性)を生じうる。
【０１２０】
すなわち、この方法は、被検化合物の存在下で維持される第1細胞試料中のマーカーの量、例えば、発現および/または活性を、被検化合物の非存在下で維持される第2細胞試料中のマーカーの量、例えば、発現および/または活性と比較することを含む。表1に記載のマーカー(例えば、癌中で減少することが示されたマーカー)の量、例えば、発現および/または活性の有意な増加、表2に記載のマーカー(例えば、癌中で増加することが示されたマーカー)の量、例えば、発現および/または活性の有意な低下は、被検化合物が癌を阻害したことを示唆する。細胞試料は、例えば、対象から得られる単一正常細胞試料の部分標本、対象から得られる正常細胞のプール試料、正常細胞株の細胞、対象から得られる細胞癌の単一試料の部分標本、対象から得られる細胞癌のプール試料、癌細胞株の細胞、癌の動物モデルから得られる細胞などであってよい。ある態様において、試料は対象から得られる癌細胞であり、種々の癌を阻害するのに有効であることが知られている複数の化合物を、対象中の癌を最もよく阻害すると思われる化合物を同定するために試験する。
【０１２１】
同様に、この方法は、化学療法、放射線療法、外科手術、または対象中の癌を阻害するのに有用なあらゆる他の治療方法のような療法の有効性を評価するのに用いてよい。ペアの試料(1つは治療受けたもの、もう1つは治療を受けなかったもの)中の、1またはそれ以上の本発明のマーカーの量、例えば、発現および/または活性を評価する。被検化合物の有効性を評価する方法と同様に、該療法が表2に記載のマーカー(例えば、癌で増加することが解ったマーカー)の量、例えば、発現および/または活性の有意な減少を誘導するか、表2に記載のマーカー(例えば、癌で増加することが解ったマーカー)の誘導をブロックするか、または、該療法が表1に記載のマーカー(例えば、癌で減少することが解ったマーカー)の量、例えば、発現および/または活性の有意な増強を誘導すれば、該療法は癌を阻害するのに有効である。上記のごとく、選択した対象から得た試料を本方法に用いると、対象中の癌を阻害するのに最も有効と思われる療法を選択するためにin vitroで代替療法を評価することができる。
【０１２２】
同様に、本方法は、対象中の癌の進行をモニターするのに用いることができる。ここで、癌の進行中、例えば、第1時点と次の時点で、対象の試料中の、表2に記載のマーカー(例えば、癌で増加することが解ったマーカー)の量、例えば、発現および/または活性が有意に減少しているか、表2に記載のマーカー(例えば、癌で増加することが解ったマーカー)の誘導がブロックされる、または、表1に記載のマーカー(例えば、癌で減少することが解ったマーカー)の量、例えば、発現および/または活性に有意に増強されていると、癌は改善している。さらに別の態様において、第1時点と次の時点の間に、対象は治療、例えば化学療法、放射線療法、外科手術、または癌を阻害するのに有用なあらゆる他の治療法を受けているか、治療が完結しているか、または寛解状態にある。
【０１２３】
本明細書に記載のごとく、対象中の癌は、表2に記載のマーカー(例えば、癌で増加することが解ったマーカー)の量、例えば、発現および/または活性の増加、および/または表1に記載のマーカー(例えば、癌で減少することが解ったマーカー)の量、例えば、発現および/または活性の低下と関連がある。上記のごとく、量、例えば、発現および/または活性数のこれら変化のいくつかは癌の発生から生じ、これら変化の他のものは癌細胞の癌状態を誘導し、維持し、促進する。すなわち、表2に記載の1またはそれ以上のマーカー(例えば癌で増加することが解ったマーカー)の量、例えば、発現および/または活性の増加を特徴とする癌は、それらマーカーの量、例えば、発現および/または活性を阻害することにより阻害することができる。同様に、表1に記載の1またはそれ以上のマーカー(例えば、癌で減少することが解ったマーカー)の量、例えば、発現および/または活性の減少を特徴とする癌は、それらマーカーの量、例えば、発現および/または活性を増強することにより阻害することができる。
【０１２４】
表2に記載のマーカー(例えば癌で増加することが解ったマーカー)の量および/または活性は、当該分野で一般に知られた多くの方法で阻害することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを癌細胞に与え、該マーカーの転写、翻訳、またはその両方を阻害することができる。RNA干渉剤、例えば、表2に記載のマーカーを標的とするsiRNA分子を癌細胞に与え、例えば、標的マーカーのメッセンジャーRNA(mRNA)の分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)により標的マーカーの発現を阻害することができる。あるいはまた、抗体、抗体誘導体、または抗体断片、例えば抗原と結合することができる断片をコードする、適切なプロモーターまたは制御領域と操作可能に結合したポリヌクレオチドを細胞に与え、マーカーに対応するタンパク質の機能、量、および/または活性を阻害する細胞内抗体を生成することができる。本発明のマーカーを標的とする、結合(conjugated)抗体またはその断片、例えば、化学標識抗体、放射性標識抗体、またはイムノトキシンも癌を治療、予防、または阻害するために投与することができる。小分子を用いて、表2に記載のマーカーの発現および/または活性を調節する、例えば阻害することができる。ある態様において、小分子は、本発明のマーカーと標的分子またはリガンドのタンパク質-タンパク質相互作用を崩壊させることにより、該マーカーの活性を調節する、例えば増加または減少させる様に作用する。
【０１２５】
本明細書に記載の方法を用い、特に細胞膜を横切ることができるように十分小さい分子を含む種々の分子をスクリーニングし、該マーカーの量および/または活性を阻害する分子を同定することができる。そうして同定された化合物を対象に与え、対象の癌細胞中の該マーカーの量および/または活性を阻害することができる。
【０１２６】
表1に記載のマーカー(例えば、癌において減少することが解ったマーカー)の量および/または活性は、当該分野で一般に知られた多くの方法を用いて増強することができる。例えば、該マーカーをコードする、適切なプロモーター/レギュレーター領域と操作可能に結合したポリヌクレオチドを対象の細胞に与え、その中のマーカーに対応するタンパク質(およびmRNA)の発現および/または活性の増強を誘導することができる。あるいはまた、タンパク質が細胞膜を通過しまたはそれ自身を細胞膜中に挿入することができるか、または正常に分泌されたタンパク質である場合は、対象中の癌細胞に該タンパク質を(例えば、直接または血流を介して)与えることにより該タンパク質の量および/または活性を増強することができる。小分子を用いて、表1に記載のマーカーの発現または活性を調節、例えば増加させることもできよう。別の態様において、本発明のマーカーの調節因子、例えば小分子を用いて、例えば腫瘍サプレッサーのようなサイレンス遺伝子を再発現させ、癌を治療または予防してよい。例えば、そのような調節因子は、DNA結合エレメントまたはメチルトランスフェラーゼと干渉しうる。
【０１２７】
上記のごとく、ヒト細胞の癌性状態は、本発明のマーカーの量および/または活性の変化と関連する。すなわち、表2に記載の1またはそれ以上のマーカー(例えば、癌で増加することが解ったマーカー)の発現または活性の増加、表1に記載の1またはそれ以上のマーカー(例えば、癌において減少することが解ったマーカー)の量および/または活性の減少を誘導する化合物は、細胞の発癌を誘導することができる。本発明は、被検化合物のヒト細胞の発癌潜在力を評価する方法も含む。本方法は、被検化合物の存在下および非存在下でヒト細胞の別個の部分標本を維持することを含む。各部分標本中の本発明のマーカーの発現または活性を比較する。被検化合物の存在下で維持された部分標本中の(被検化合物の非存在下で維持された部分標本と比べた)、表2に記載のマーカー(例えば、癌で増加することが解ったマーカー)の量および/または活性の有意な増加、または表1に記載のマーカー(例えば、癌において減少することが解ったマーカー)の量および/または活性の有意な減少は、被検化合物がヒト細胞の発癌潜在力を有することを示唆する。関連マーカーの量および/または活性を増強または阻害する程度を比較するか、該量および/または活性を増強または阻害するマーカーの数を比較するか、またはその両方を比較することにより、種々の被検化合物の相対的発癌潜在力を評価することができる。
III. 単離核酸分子
【０１２８】
本発明のある局面は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたはそのようなポリペプチドの部分をコードする核酸を含む、本発明のマーカーに対応する単離された核酸分子に関する。本発明の核酸分子には、本明細書で同定したMCRに存在する核酸分子が含まれる。本発明の単離された核酸分子には、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸分子およびそのような核酸分子の断片、例えば、核酸分子の増幅または突然変異のためにPCRプライマーとして用いるのに適したもの、を含む本発明のマーカーに対応する核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分な核酸分子も含まれる。本明細書で用いている用語「核酸分子」は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)およびRNA分子(例えば、mRNA)、およびヌクレオチド類似体を用いて生成したDNAまたはRNAの類似体を含むことを意図する。該核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖DNAである。
【０１２９】
「単離された」核酸分子は、核酸分子の天然供給源中に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸分子は、該核酸が由来する有機体のゲノムDNA中の核酸(すなわち、該核酸の5'および3'末端に位置する配列)と天然に側面に位置する配列(好ましくはタンパク質をコードする配列)を有さない。例えば、種々の態様において、単離された核酸分子は、該核酸が由来する細胞のゲノムDNA中の核酸分子と天然に側面に位置する、約5 kB、4 kB、3 kB、2 kB、1 kB、0.5 kB または0.1 kB以下のヌクレオチド配列を含むことができる。さらに、「単離された」核酸分子、例えばcDNA分子は、組換え技術により生成したとき他の細胞物質や培養液を実質的に含まないか、または化学的に合成したとき化学的前駆体や他の化学物質を実質的に含まないことが可能である。本発明の核酸分子、例えば表1または2に記載のマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸分子は、標準的分子生物学的技術と本明細書に記載のデータベースレコード中の配列情報を用いて単離することができる。そのような核酸配列のすべてまたは部分を用い、標準的ハイブリダイゼーションおよびクローニング技術(例えば、Sambrook et al.、ed.、Molecular Cloning： Laboratory Manual、2nd ed.、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989に記載の)を用いて本発明の核酸配列を単離することができる。本発明の核酸配列は、標準的PCR増幅技術に従い、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAを鋳型に用い、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。そのように増幅した核酸配列を適切なベクター中にクローンし、DNA配列分析により特徴付けることができる。さらに、本発明の核酸配列のすべてまたは部分に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば自動化DNA合成装置を用い、標準的合成技術により製造することができる。
【０１３０】
別の好ましい態様において、本発明の単離された核酸配列は、本発明のマーカーに対応する核酸のヌクレオチド配列または本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸配列を含む。特定のヌクレオチド配列と相補的な核酸配列は、特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズして安定な二本鎖を形成する、特定のヌクレオチド配列と十分相補的な核酸配列である。
【０１３１】
さらに、本発明の核酸分子は、核酸配列の部分のみを含み得るが、ここで、完全長核酸配列は、本発明のマーカーを含むかまたは本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする。そのような核酸配列を例えばプローブまたはプライマーとして用いることができる。該プローブ/プライマーは、典型的には1またはそれ以上の実質的に精製されたオリゴヌクレオチドとして用いられる。該オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェント条件下で、本発明の核酸の少なくとも約7、好ましくは約15、より好ましくは約25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、または400、またはそれ以上の連続したヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０１３２】
本発明の核酸配列の配列に基づくプローブを用い、本発明の1またはそれ以上のマーカーに対応する転写物またはゲノム配列を検出することができる。該プローブは、それと結合する標識群、例えば、放射性同位元素、蛍光核酸配列、酵素、または酵素補助因子を含む。そのようなプローブは、例えば、対象由来の試料中のタンパク質をコードする核酸配列のレベルを測定するか、例えばmRNAレベルを検出するか、またはタンパク質をコードする遺伝子が突然変異または欠失しているか否かを決定することにより、該タンパク質を誤発現(mis-express)する細胞または組織を同定するための診断試験キットの部分として用いることができる。
【０１３３】
本発明は、さらに、遺伝子コードの縮合により、本発明の、マーカーに対応するタンパク質をコードする、すなわち該タンパク質をコードする核酸配列のヌクレオチド配列と異なる核酸配列を含む。
【０１３４】
表1または2に記載のヌクレオチド配列に加え、アミノ酸配列の変化をもたらすDNA配列の多形性がポピュレーション(例えばヒトポピュレーション)内に存在しうることを当業者は認識するであろう。そのような遺伝子の多形性は、天然の対立遺伝子変化によりポピュレーション内の個体間に存在しうる。対立遺伝子は、特定の遺伝子座に代替的に生じる一群の遺伝子の1つである。さらに、該遺伝子の発現レベル全体に影響を与えることがある(例えば、調節または分解に影響することによる)、RNA発現レベルに影響するDNA多形性も存在しうることが理解されるであろう。
【０１３５】
本明細書で「対立遺伝子変異体」と互換性に用いている用語「対立遺伝子(アレル)」は、代替型(alternative form)の遺伝子またはその部分である。対立遺伝子は、同じ遺伝子座またはホモローガスな染色体上の位置を占める。対象が遺伝子の2つの同じ対立遺伝子を有するとき、対象は該遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合であるという。対象が遺伝子の2つの異なる対立遺伝子を有するとき、対象は該遺伝子または対立遺伝子についてヘテロ接合であるという。限定されるものではないが表1、2、または3に記載の遺伝子を含む特定遺伝子の対立遺伝子は、互いに1個のヌクレオチドまたは数個のヌクレオチドが相違することがあり、ヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含み得る。遺伝子の対立遺伝子は、1またはそれ以上の突然変異を含む遺伝子の一形態でもあり得る。
【０１３６】
本明細書で互換性に用いている用語「遺伝子の多形領域の対立遺伝子変異体」または「対立遺伝子変異体」は、ポピュレーションの遺伝子のその領域内に見られる種々の考えられるヌクレオチド配列の1つを有する、遺伝子の代替型を表す。本明細書で用いている対立遺伝子変異体は、機能的対立遺伝子変異体、非機能的対立遺伝子変異体、SNP、突然変異、および多形性を含むことを意味する。
【０１３７】
用語「1ヌクレオチド多形性」(SNP)は、対立遺伝子配列間の変化部位である、1個のヌクレオチドが占める多形部位を表す。該部位は、通常、対立遺伝子の高度に保存された配列(例えば、1/100または1/1000ポピュレーションメンバー以下で異なる配列)の後および前にある。SNPは、通常、多形部位で1個のヌクレオチドが別のものに置換することにより生じる。SNPは、基準対立遺伝子に対するヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入からも生じ得る。典型的には、該多形部位は基準塩基以外の塩基が占める。例えば、基準対立遺伝子は、多形部位に塩基「T」(チミジン)を含み、変化した対立遺伝子は多形部位に「C」(シチジン)、「G」(グアニン)、または「A」(アデニン)を含みうる。SNPは、タンパク質をコードする核酸配列に生じることがあり、その場合には、それらは欠陥または変異体タンパク質、または遺伝病を生じ得る。そのようなSNPは、遺伝子のコーディング配列を変化させるので、別のアミノ酸を特定しうるか(「ミスセンス」SNP)、またはSNPは終止コドンを導入しうる(「ノンセンス」SNP)。SNPがタンパク質のアミノ酸を変化させない場合は、該SNPは「サイレント」と呼ばれる。SNPは、ヌクレオチド配列の非コーディング領域にも生じうる。これは、例えば、代替(alternative)スプライシング(spicing)の結果として欠陥タンパク質発現を生じるか、またはタンパク質の機能に対する効果がない。
【０１３８】
本明細書で用いている用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を表す。そのような天然の対立遺伝子変化は、典型的には特定遺伝子のヌクレオチド配列に1〜5%の不一致を生じうる。代替対立遺伝子は、多くの異なる個体の目的遺伝子をシーケンシングすることにより同定することができる。これは、種々の個体の同じ遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを用いて容易におこなうことができる。天然の対立遺伝子変異の結果であり、その機能的活性を変化させない、あらゆるすべてのそのようなヌクレオチド変化および生じるアミノ酸多形性または変化は、本発明の範囲内にあるものとする。
【０１３９】
別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも7、15、20、25、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、4500、またはそれ以上の長さのヌクレオチドであり、ストリンジェント条件下で、本発明のマーカーに対応する核酸分子、または本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズする。本明細書で用いている用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションの条件を説明することを意図し、その条件下で互いに少なくとも60%(65%、70%、75%、80%、好ましくは85%)同じヌクレオチド配列は、典型的には互いにハイブリダイズしたままである。そのようなストリンジェント条件は当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、N.Y.(1989)の6.3.1-6.3.6項に記載されている。好ましい、非限定的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例には、約45℃の6X塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)でハイブリダイゼーションし、次いで50〜65℃の0.2X SSC、0.1% SDSで1回またはそれ以上洗浄することが挙げられる。
【０１４０】
該ポピュレーション中に存在しうる、本発明の核酸分子の天然の対立遺伝子変異体に加え、当業者は、さらに突然変異により配列変化を導入し、コードされたタンパク質の生物活性を変化させることなく、コードされたタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらすことができることを認識するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基にアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を変化させずに野生型配列から変化させることができる残基であるが、「必須」アミノ酸残基は生物活性に必要である。例えば、種々の種の相同体間で保存されていないかまたは半ばだけ保存されたアミノ酸残基は、活性にとって非必須であり得、変化の標的と思われる。あるいはまた、種々の種(例えばネズミおよびヒト)の相同体間で保存されているアミノ酸残基は、活性に必須であり、変化の標的ではないと思われる。
【０１４１】
したがって、本発明の別の局面は、活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含む、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。そのようなポリペプチドは、本発明のマーカーに対応する天然のタンパク質とアミノ酸配列が異なるが、依然として生物活性を保持している。ある態様において、そのようなタンパク質は、本発明のマーカーに対応するタンパク質の1つのアミノ酸配列と少なくとも約40%同一、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または98%同一なアミノ酸配列を有する。
【０１４２】
変異タンパク質をコードする単離された核酸分子は、1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失はコードされたタンパク質内に導入されるように、本発明の核酸のヌクレオチド配列に1またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することにより作製することができる。突然変異は、標準的技術、例えば部位指向性突然変異誘発およびPCR介在突然変異誘発により導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、1またはそれ以上の推定非必須アミノ酸残基になされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されている。これらファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。あるいはまた、突然変異は、例えば、飽和突然変異誘発によりコーディング配列のすべてまたは部分に沿って無作為に導入することができ、得られた突然変異体の生物活性をスクリーニングし、活性を有する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードされたタンパク質を組換え発現させ、該タンパク質の活性を測定することができる。
【０１４３】
本発明は、アンチセンス核酸分子、すなわち、本発明のセンス核酸と相補的な、例えば、本発明のマーカーに対応する二本鎖cDNA分子のコーディング鎖と相補的な、または本発明のマーカーに対応するmRNA配列と相補的な分子を含む。したがって、本発明のアンチセンス核酸分子は、本発明のセンス核酸と結合(すなわち、アニール)した水素であり得る。該アンチセンス核酸は、完全なコーディング鎖またはその部分のみ、例えば、タンパク質をコードする領域(すなわちオープンリーディングフレーム)のすべてまたは部分と相補的であり得る。アンチセンス核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の非コーディング領域のすべてまたは部分とアンチセンスでもあり得る。非コーディング領域(「5'および3'非翻訳領域」)は、コーディング領域の側面に位置する、アミノ酸に翻訳されない5'および3'配列である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50 またはそれ以上の長さのヌクレオチドでありうる。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で知られた方法を用いる化学合成および酵素結合反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然ヌクレオチド、または該分子の生物学的安定性を増大するか、またはアンチセンスとセンス核酸、例えばホスホロチオエート誘導体の間に形成された二本鎖の物理的安定性を増大するよう設計された種々の修飾されたヌクレオチドを用いて化学合成することができ、アクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を生成するのに用いることができる修飾ヌクレオチドの例は、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-イオドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2- メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルクエオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-あみの-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンを含む。あるいはまた、該アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローンされた発現ベクターを用いて生物学的に作製することができる(すなわち、挿入された核酸から転写されたRNAは、目的とする標的核酸に対してアンチセンス方向であろう。以下の項にさらに記載する)。
【０１４４】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、対象に投与されるか、または本発明の選択したマーカーに対応するポリペプチドをコードする細胞mRNAおよび/またはゲノムDNAをハイブリダイズまたは結合することにより、例えば、転写および/または翻訳を阻害することにより該マーカーの発現を阻害するようにin situで生成される。該ハイブリダイゼーションは、常套的ヌクレオチド相補性により、適切な二本鎖を形成するか、またはDNA二本鎖と結合するアンチセンス核酸分子の場合は、二重らせんのメジャーグルーブ(major groove)中の特異的に相互作用を介する。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位への直接注射、またはアンチセンス核酸の肺関連体液への注入が含まれる。あるいはまた、アンチセンス核酸分子は、選択細胞を標的とするよう修飾し、次いで全身投与することができる。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子を、例えば、細胞表面レセプターまたは抗原と結合する抗体またはペプチドとアンチセンス核酸分子を結合することにより、選択した細胞表面上に発現した抗原またはレセプターと特異的に結合するように修飾することができる。該アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載のベクターを用いる細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するため、アンチセンス核酸分子が強力なpol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下で置かれるベクター構築物が好ましい。本発明のアンチセンス核酸分子はα-アノマー核酸分子でありうる。α-アノマー核酸分子は、通常のαユニットとは異なり、鎖が互いに平行に走る、相補性RNAとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する(Gaultier et al.、1987、Nucleic Acids Res. 15:6625-6641)。該アンチセンス核酸分子は、2'-o-メチルリボヌクレオチド(Inoue et al.、1987、Nucleic Acids Res. 15:6131-6148)またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue et al.、1987、FEBS Lett. 215:327-330)も含みうる。
【０１４５】
本発明は、リボザイムも含む。リボザイムは、それと相補的領域を有する、一本鎖核酸、例えばmRNAを開裂することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒的RNA分子である。すなわち、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach、1988、Nature 334:585-591に記載のハンマーヘッドリボザイム)を用いてmRNA転写物を触媒的に開裂させ、mRNAによりコードされる該タンパク質の翻訳を阻害することができる。本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸分子に対する特異性を有するリボザイムは、該マーカーに対応するcDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が開裂するヌクレオチド配列と相補的である、Tetrahymena L-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる(Cech et al. 米国特許No.4,987,071；およびCech et al. 米国特許No.5,116,742参照)。あるいはまた、本発明のポリペプチドをコードするmRNAを用いて、RNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的RNAを選択することができる(例えば、Bartel and Szostak、1993、Science 261:1411-1418参照)。
【０１４６】
本発明は、三重らせん構造を形成する核酸分子も含む。例えば、本発明のポリペプチドの発現は、標的細胞中の遺伝子の転写を阻害する三重らせん構造を形成するポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域(例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー)と相補的なヌクレオチド配列を標的化することにより阻害することができる。一般的には、Helene(1991)Anti Cancer Drug Des. 6(6):569-84；Helene(1992)Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36；およびMaher(1992)Bioassays 14(12):807-15参照。
【０１４７】
種々の態様において、本発明の核酸分子は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を修飾し、例えば、該分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改善することができる。例えば、該核酸分子のデオキシリボースリン酸を修飾し、ペプチド核酸分子を生成することができる(Hyrup et al.、1996、Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1)：5-23参照)。本明細書で用いている用語「ペプチド核酸」または「PNA」は、デオキシリボースリン酸骨格を偽ペプチド骨格により置換し、4個の天然核塩基のみが保持される、核酸模倣物、例えば、DNA模倣物を表す。PNAの天然骨格は、低イオン強度の条件下でDNAおよびRNAに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。PNAオリゴマーの合成は、Hyrup et al.(1996)、上記；Perry-O'Keefe et al.(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675に記載の標準的固相ペプチド合成プロトコールを用いて行うことができる。
【０１４８】
PNAは、治療的および診断的適用に用いることができる。例えば、PNAは、例えば、転写または翻訳の停止を誘導し、または複製を阻害することにより遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子物質として用いることができる。PNAは、例えば、PNA指向性PCRクランピングによる遺伝子中の1塩基対突然変異の分析に；他の酵素、例えば、S1ヌクレアーゼと組み合わせて用いるときは合成制限酵素として(Hyrup(1996)、上記)；またはDNA配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして(Hyrup、1996、上記；Perry-O'Keefe et al.、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675)用いることもできる。
【０１４９】
別の態様において、PNAは、PNAに脂溶性または他のヘルパー基を結合させることによるか、PNA-DNAキメラの形成により、またはリポソームまたは当該分野で知られた他のドラッグデリバリー技術により、その安定性または細胞取り込みを増大させることができる。例えば、PNA-DNAキメラを作製し、PNAとDNAの有利な特性を組み合わせることができる。そのようなキメラは、DNA認識酵素、例えば、RNASE HおよびDNAポリメラーゼがDNA部分と相互作用するのを可能にし、PNA部分は高結合親和性および特異性をもたらすであろう。PNA-DNAキメラは、塩基スタッキング(積み重ね)、核酸塩基間の結合数、および方向について選択した適切な長さのリンカーを用いて結合させることができる(Hyrup、1996、上記)。PNA-DNAキメラの合成は、Hyrup(1996)、上記、およびFinn et al.(1996)Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63に記載のごとく行うことができる。DNA鎖は、例えば、標準的ホスホラミダイトカップリング化学および修飾ヌクレオシド類似体を用い、固体支持体上で合成することができる。5'-(4-メトキシトリチル)あみの-5'-デオキシ-チミジンホスホラミダイトのような核酸配列を、PNAおよびDNAの5'末端の間の結合として用いることができる(Mag et al.、1989、Nucleic Acids Res. 17:5973-88)。次に、PNAモノマーを段階的に結合させ、5'PNA断片と3'DNA断片を含むキメラ分子を作製する(Finn et al.、1996、Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63)。あるいはまた、5'DNA断片と3'PNA断片を含むキメラ分子を合成することができる(Peterser et al.、1975、Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124)。
【０１５０】
他の態様において、該オリゴヌクレオチドは、他の付加群、例えばペプチド(例えば、in vivoで宿主細胞レセプターを標的化するための)、または細胞膜を横切る輸送を促す物質(例えば、Letsinger et al.、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556；Lemaitre et al.、1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652；PCT公開公報WO 88/09810参照)または血液脳関門(例えば、PCT公開公報WO 89/10134参照)を含むことができる。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤(例えば、Krol et al.、1988、Bio/Techniques 6:958-976参照)または挿入剤(例えば、Zon、1988、Pharm. Res. 5:539-549参照)を用いて修飾することができる。このために、該オリゴヌクレオチドを別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送物質、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤などと結合させることができる。
【０１５１】
本発明は、該分子ビーコンが、試料中の、本発明の核酸分子の存在を定量するのに有用であるように、本発明の核酸分子と相補的な少なくとも1の領域を有する分子ビーコン核酸分子も含む。「分子ビーコン」核酸は、相補的領域のペアを含み、それと結合するフルオロフォアおよび蛍光消光剤を有する核酸分子である。該フルオロフォアおよび消光剤は、相補的領域が互いにアニールするときに、フルオロフォアの蛍光が消光剤により消光されるような方向に該核酸の異なる部分と結合している。該核酸分子の相補的領域が互いにアニールしないときは、フルオロフォアの蛍光は、より低い程度に消光される。分子ビーコン核酸分子は、例えば米国特許5,876,930に記載されている。
IV. 単離されたタンパク質および抗体
【０１５２】
本発明のある局面は、本発明の個々のマーカーに対応する単離されたタンパク質およびその生物学的に活性な部分、および本発明のマーカーに対応するポリペプチドに対する抗体を生じる免疫源として用いるのに適したポリペプチド断片に関する。ある態様において、マーカーに対応する天然ポリペプチドは、標準的タンパク質精製技術を用いる適切な生成スキームにより細胞または組織から単離することができる。別の態様において、本発明のマーカーに対応するポリペプチドは、組換えDNA技術により作製される。組換え発現の代わりに、本発明のマーカーに対応するポリペプチドは、標準的ペプチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。
【０１５３】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、細胞物質、またはタンパク質が誘導される細胞または組織源由来の他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成したときに化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞物質を実質的に含まない」は、タンパク質がそれが単離される細胞の細胞成分から単離されるかまたは組換え的に作製されるタンパク質の調製物を含む。すなわち、細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、約30%、20%、10%、または5%(乾燥重量)以下のヘテロローガスなタンパク質(本明細書では「夾雑タンパク質」ともいう)を有するタンパク質の調節物を含む。該タンパク質またはその生物学的に活性な部分を組換え的に作製するときは、培養液を実質的に含まない、すなわち、培養液はタンパク質調節物の容量の約20%、10%、または5%以下で存在することが好ましい。該タンパク質が化学合成により製造されるときは、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、化学的前駆体または該タンパク質の合成に関与する他の化学物質から単離されていることが好ましい。さらに、該タンパク質のそのような調製物は、約30%、20%、10%、5%(乾燥重量による)以下の化学的前駆体または目的ポリペプチド以外の化合物を含む。
【０１５４】
本発明のマーカーに対応するポリペプチドの生物学的に活性な部分は、該マーカーに対応するタンパク質のアミノ酸配列由来かまたはそれと十分に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド(例えば、表1または2に記載の核酸分子によりコードされるタンパク質)を含み、完全長タンパク質より少ないアミノ酸を含み、対応する完全長タンパク質の少なくとも1の活性を有する。典型的には、生物学的に活性な部分は、対応するタンパク質の少なくとも1の活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、10、25、50、100またはそれ以上の長さのアミノ酸であるポリペプチドでありうる。さらに、該タンパク質の他の部分が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術により製造することができ、本発明のポリペプチドの天然型の1またはそれ以上の機能的活性を評価することができる。
【０１５５】
好ましいポリペプチドは、表1または2に記載の核酸分子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を有する。他の有用なタンパク質は、これら配列の1つと実質的に同一(例えば、少なくとも約40%、好ましくは50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%)であり、対応する天然タンパク質のタンパク質の機能的活性を保持し、さらに天然の対立遺伝子変化または突然変異誘発によりアミノ酸配列が異なる。
【０１５６】
2つのアミノ酸配列または1つの核酸の同一パーセントを決定するため、該配列を最適な比較のために整列させる(例えば、第2アミノまたは核酸配列との最適なアライメントのために第1アミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入することができる)。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1配列中の位置を第2配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが占めるときは、該分子はその位置が同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、該配列が共有する同じ位置の数に応じる(すなわち、同一性% = 同一位置#/総位置#(例えば、重複位置)x100)。ある態様において、2つの配列は同じ長さである。
【０１５７】
2つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。2つの配列を比較するために利用する数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的例は、Karlin and Altschul(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268(Karlin and Altschul(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877において一部変更)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul、et al.(1990)J. Mol. Biol. 215:403-410のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれる。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム(スコア = 100、語長 = 12)を用いて実施し、本発明の核酸分子とホモローガスなヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索をXBLASTプログラム(スコア = 50、語長 = 3)を用いて実施し、本発明のタンパク質分子とホモローガスなアミノ酸配列を得ることができる。比較のためにギャップのあるアラインメントを得るために、Gapped BLASTをAltschul et al.(1997)Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のごとく利用することができる。あるいはまた、PSI-Blastを用いて、分子間の距離関係を検出する繰り返し(iterated)検索を実施することができる。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合は、各プログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターを用いることができる。ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照。配列を比較するのに利用する数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的例には、Myers and Miller、(1988)Comput Appl Biosci、4:11-7のアルゴリズムがある。そのようなアルゴリズムをGCG配列アラインメントソフトウエアパッケージの部分であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためのALIGNプログラムを利用するときは、PAM120重量残基表、12ギャップ長ペナルティ、4ギャップペナルティを用いることができる。局所配列類似性領域およびアラインメントを同定するためのさらに別の有用なアルゴリズムには、Pearson and Lipman(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448に記載のFASTAアルゴリズムがある。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するためのFASTAアルゴリズムを用いるときは、PAM120重量残基表を、例えばk-組値2で用いる。
【０１５８】
2つの配列間の同一パーセントは、上記と同様の技術を用い、ギャップを割り当てるか割り当てずに決定することができる。同一パーセントの計算では正確な一致のみをカウントする。
【０１５９】
本発明は、本発明のマーカーに対応するキメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細書で用いている「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、ヘテロローガスなポリペプチドと操作可能に結合した本発明のマーカーに対応するポリペプチド(すなわち、該マーカーに対応するポリペプチド以外のポリペプチド)のすべてまたは部分(好ましくは生物学的に活性な部分)を含む。融合タンパク質内の用語「操作可能に連結した(operably linked)」は、本発明のポリペプチドとヘテロローガスなポリペプチドが互いにインフレーム(in-frame)に融合していることを示すことを意図する。該ヘテロローガスなポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端と融合することができる。
【０１６０】
ある有用な融合タンパク質は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドがGST配列のカルボキシ末端と融合する、CST融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、本発明の組換えポリペプチドの精製を促進することができる。
【０１６１】
別の態様において、該融合タンパク質は、そのアミノ末端にヘテロローガスなシグナル配列を有する。例えば、本発明のマーカーに対応するポリペプチドの天然のシグナル配列を除去し、別のタンパク質由来のシグナル配列と置換することができる。例えば、バクロウイルスエンベロープタンパク質のgp67分泌配列をヘテロローガスなシグナル配列として用いることができる(Ausubel et al.、ed.、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY、1992)。真核ヘテロローガスなシグナル配列の他の例には、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列を含む(Stratagene；La Jolla、California)。さらに別の例において、有用な原核ヘテロローガスなシグナル配列は、phoA分泌シグナル(Sambrook et al.、上記)およびプロテインＡ分泌シグナル(Pharmacia Biotech；Piscataway、New Jersey)を含む。
【０１６２】
さらに別の態様において、該融合タンパク質は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドのすべてまたは部分が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明の免疫グロブリン融合タンパク質を、医薬組成物に組み込み、細胞表面(レセプター)上のタンパク質とリガンド(可溶性または膜結合)の間の相互作用を阻害するために対象に投与することにより、in vivoのシグナル変換を抑制することができる。免疫グロブリン融合タンパク質を用いて、本発明のポリペプチドの同系リガンドのバイオアベイラビリティに影響を及ぼすことができる。リガンド/レセプター相互作用の阻害は、増殖性および分化障害を治療し、細胞の生存を調節(例えば、促進または阻害)するその両方のために治療的に有用でありうる。さらに、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質を、対象において本発明のポリペプチドに対する抗体を産生するための免疫原として、リガンドの精製に、またレセプターとリガンドの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイに用いることができる。
【０１６３】
本発明のキメラおよび融合タンパク質は、標準的組換えDNA技術により製造することができる。別の態様において、該融合遺伝子は、自動化DNA合成装置を含む常套的技術により合成することができる。あるいはまた、遺伝子断片のPCR増幅は、2つの連続的遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行うことができ、次いでキメラ遺伝子配列を生成するためにアニールおよび再増幅することができる(例えば、Ausubel et al.、上記参照)。さらに、すでに融合部分(例えば、GSTポリペプチド)をコードする多くの発現ベクターが市販されている。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、該融合部分が本発明のポリペプチドとインフレームに連結するように、そのような発現ベクターにクローンすることができる。
【０１６４】
分泌タンパク質または他の目的タンパク質の分泌および単離を促進するためにシグナル配列を用いることができる。シグナル配列は、典型的には、一般的に1またはそれ以上の開裂事象において分泌中の成熟タンパク質から開裂される疎水性アミノ酸のコアによって特徴付けられる。そのようなシグナルペプチドは、分泌経路を通過するため、成熟タンパク質からシグナル配列を開裂させることができるプロセシング部位を含む。すなわち、本発明は、シグナル配列を有する前記ポリペプチド、およびシグナル配列がタンパク質分解により開裂されているポリペプチド(すなわち、開裂産物)に関する。ある態様において、シグナル配列をコードする核酸配列は、発現ベクター中で、目的タンパク質、例えば、通常分泌されないか、または単離するのが困難なタンパク質と操作可能に連結することができる。該シグナル配列は、例えば、発現ベクターが形質転換される真核宿主からのタンパク質の分泌を指示し、シグナル配列はその後または同時に開裂される。次に、該タンパク質は、当該分野で認識された方法により細胞外媒質から容易に精製することができる。あるいはまた、該シグナル配列は、例えばGSTドメインのような精製を促進する配列を用いて目的タンパク質に連結することができる。
【０１６５】
本発明は、本発明の個々のマーカーに対応するポリペプチドの変異体にも関する。そのような変異体は、アゴニスト(模倣物)またはアンタゴニストとして機能することができる変化したアミノ酸配列を有する。変異体は、突然変異誘発、例えば、分離した点突然変異またはトランケーションにより生成することができる。アゴニストは、実質的に該タンパク質の天然型の生物活性の同じものまたはサブセットを保持しうる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、目的タンパク質を含む細胞情報伝達カスケードの下流または上流メンバーと競合的に結合することにより、該タンパク質の天然型の活性の1またはそれ以上を阻害することができる。すなわち、特異的生物学的効果は、機能が限られた変異体で処理することにより誘発することができる。該タンパク質の天然型の生物活性のサブセットを有する変異体により対象の処置は、該タンパク質の天然型で処置するのに比べて対象における副作用を少なくすることができる。
【０１６６】
アゴニスト(模倣物)またはアンタゴニストとして機能する本発明のタンパク質の変異体は、該タンパク質の突然変異体、例えばトランケーション突然変異体の組み合わせライブラリーをアゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。ある態様において、変化に富んだ変異体ライブラリーは、核酸レベルの組み合わせ突然変異誘発により生成され、変化に富んだ遺伝子ライブラリーによりコードされる。変化に富んだ変異体ライブラリーは、例えば潜在的タンパク質配列の縮重セットが個々のポリペプチドとしてか、またはより大きな融合タンパク質(例えば、ファージ表現のための)のセットとして発現することができるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素的に結合することにより作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの潜在的変異体のライブラリーを作製するのに用いることができる種々の方法がある。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該分野で知られている(例えば、Narang、1983、Tetrahedron 39:3；Itakura et al.、1984、Annu. Rev. Biochem. 53:323；Itakura et al.、1984、Science 198:1056；Ike et al.、1983 Nucleic Acid Res. 11:477参照)。
【０１６７】
さらに、ポリペプチド本発明のマーカーに対応するポリペプチドのコーディング配列の断片のライブラリーを用いて、変異体をスクリーニングし、次いで選択するためのポリペプチドの変化に富んだポピュレーションを作製することができる。例えば、コーディング配列断片のライブラリーは、目的のコーディング配列の二本鎖PCR断片を、ニッキングは1分子あたり約1回起きるのみである条件下、目的のコーディング配列の二本鎖PCR断片をヌクレアーゼで処理し、二本鎖DNAを変性させ、DNAを復元して異なるニックのある生成物からセンス／アンチセンスペアを含み得る二本鎖DNAを形成し、S1ヌクレアーゼで処理することによりリフォームした二本鎖から一本酸部分を除去し、得られた断片ライブラリーを発現ベクター内に連結することにより作製することができる。この方法により、目的タンパク質の種々のサイズのアミノ末端および内部断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０１６８】
点突然変異またはトランケーションにより作製した組み合わせライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、選択した特性を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で知られている。大遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に適した最も広く用いられる技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーの複製可能な発現ベクターにクローンし、得られたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換し、望ましい活性の検出によりその生成物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離が促進される条件下で組み合わせ遺伝子を発現することを含む。該ライブラリーにおける機能的突然変異の頻度を増強する技術である再帰的集合突然変異誘発(REM)は、本発明タンパク質の変異体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて用いることができる(Arkin and Yourvan、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815；Delgrave et al.、1993、Protein Engineering 6(3):327-331)。
【０１６９】
本発明のマーカーに対応する単離されたポリペプチドまたはその断片を免疫原に用い、は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を製造するための標準的技術を用いて抗体を作製することができる。完全長ポリペプチドまたはタンパク質を用いるか、または本発明は、免疫原として用いるための抗原性ペプチド断片を提供する。本発明タンパク質の抗原性ペプチドは、本発明のポリペプチドの1つのアミノ酸配列の少なくとも8(好ましくは10、15、20、または30、またはそれ以上)アミノ酸残基を含み、該ペプチドに対する抗体が該タンパク質が対応する本発明のマーカーと特異的免疫複合体を形成する様に該タンパク質のエピトープを含む。抗原性ペプチドが含む好ましいエピトープは、該タンパク質の表面に位置する領域、例えば親水性領域である。疎水性配列分析、親水性配列分析、または同様な分析を用いて親水性領域を同定することができる。
【０１７０】
典型的には、免疫原を用いて、適切な(すなわち、免疫応答性の)対象、例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物もしくは脊椎動物を免疫することにより抗体を製造する。適切な免疫原性調製物は、例えば組換え発現または化学合成ポリペプチドを含みうる。該調製物は、さらに、アジュバント、例えばFreund完全または不完全アジュバント、または同様の免疫刺激剤を含むことができる。
【０１７１】
したがって、本発明の別の局面は、本発明のポリペプチドに対する抗体に関する。本明細書において互換性に用いる用語「抗体」および「抗体物質」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原、例えば本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を表す。本発明の該ポリペプチドと特異的に結合する分子は、該ポリペプチドと結合するが、天然に該ポリペプチドを含む試料、例えば生物試料中の他の分子と実質的に結合しない、分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の例には、抗体をペプシンのような酵素で処理することにより生成することができるF(ab)およびF(ab')2断片を含む。本発明は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書で用いている用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、特定のエピトープと免疫応答することができる抗原結合部位の1種のみを含む抗体分子のポピュレーションを表す。ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドを免疫原として適切な対象を免疫することにより上記のごとく製造することができる。免疫した対象の抗体価は、標準的技術、例えば固定化ポリペプチドを用いる酵素免疫測定法(ELISA)を用いて経時的にモニターすることができる。所望により対象から(例えば、対象の血液または血清から)抗体分子を回収または単離し、さらに、よく知られた技術、例えばIgG分画を含むプロテインAクロマトグラフィにより精製することができる。免疫後の適当な時、例えば特異抗体価が最も高い時に、抗体産生細胞を対象から得、標準的技術、例えば、Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495-497に最初に記載のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al.、1983、Immunol. Today 4:72参照)、EBV-ハイブリドーマ技術(Cole et al.、pp. 77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss、Inc.、1985参照)、またはトリオーマ(trioma)技術によりモノクローナル抗体を製造することができる。ハイブリドーマ製造技術はよく知られている(一般的には、Current Protocols in Immunology、Coligan et al. ed.、John Wiley & Sons、New York、1994参照)。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的ELISAアッセイを用い、目的のポリペプチドと結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出する。
【０１７２】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの別の製造方法として、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を、目的のポリペプチドを用いて組換え組み合わせ免疫グロブリンライブラリー(例えば抗体ファージ表現ライブラリー)をスクリーニングすることにより同定および単離することができる。ファージ表現ライブラリーを作製しスクリーニングするためのキットは市販されている(例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System、Catalog No. 27-9400-01；およびStrata Gene SurfZAP Phage Display Kit、Catalog No. 240612)。さらに、抗体表現ライブラリーを作製しスクリーニングするのに用いるのに特に適した方法および試薬の例は、例えば、米国特許No.5,223,409；PCT公開公報WO 92/18619；PCT公開公報WO 91/17271；PCT公開公報WO 92/20791；PCT公開公報WO 92/15679；PCT公開公報WO 93/01288；PCT公開公報WO 92/01047；PCT公開公報WO 92/09690；PCT公開公報WO 90/02809；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay et al.(1992)Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huse et al.(1989)Science 246:1275- 1281；Griffiths et al.(1993)EMBO J. 12:725-734に記載されている。
【０１７３】
さらに、標準的組換えDNA技術を用いて作製することができる、組換え抗体、例えばヒトおよび非ヒト部分を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は本発明の範囲内にある。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で知られた組換えDNA技術、例えば、PCT公開公報WO 87/02671；欧州特許出願184,187；欧州特許出願171,496；欧州特許出願173,494；PCT公開公報WO 86/01533；米国特許No.4,816,567；欧州特許出願125,023；Better et al.(1988)Science 240:1041-1043；Liu et al.(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443；Liu et al.(1987)J. Immunol. 139:3521- 3526；Sun et al.(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218；Nishimura et al.(1987)Cancer Res. 47:999-1005；Wood et al.(1985)Nature 314:446-449；and Shaw et al.(1988)J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559)；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Oi et al.(1986)Bio/Techniques 4:214；U.S. Patent 5,225,539；Jones et al.(1986)Nature 321:552-525；Verhoeyan et al.(1988)Science 239:1534；and Beidler et al.(1988)J. Immunol. 141:4053-4060に記載の方法を用いて製造することができる。
【０１７４】
完全なヒト抗体は、ヒト対象の治療的処置に特に望ましい。そのような抗体は、内因性免疫グロブリン重および軽鎖を発現することができないが、ヒト重および軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて作製することができる。トランスジェニックマウスは、選んだ抗原、例えば、本発明のマーカーに対応するポリペプチドのすべてまたは部分と正常な方法で免疫される。該抗原に対するモノクローナル抗体は、常套的ハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが保持するヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、B細胞分化中に再配列され、次いでクラス変換および体細胞突然変異を受ける。すなわち、そのような技術を用い、治療的に有用なIgG、IgA、およびIgE抗体を製造することができる。ヒト抗体を製造するためのこの技術の概説については、Lonberg and Huszar(1995)Int. Rev. Immunol. 13:65-93)参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのこの技術、およびそのような抗体を製造するためのプロトコールの詳細な記載については、例えば、米国特許5,625,126；米国特許5,633,425；米国特許5,569,825；米国特許5,661,016；および米国特許5,545,806参照。さらに、Abgenix、Inc.(Freemont、CA)のような会社は、上記と同様の技術を用いる、選択した抗原に対するヒト抗体の提供を保証することができる。
【０１７５】
選択したエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択(guided selection)」と呼ばれる技術を用いて作製することができる。この方法では、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えばネズミ抗体を用いて同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を誘導する(Jespers et al.、1994、Bio/technology 12:899-903)。癌に過剰発現する本発明のマーカー(例えば、表2に記載のマーカーセット)を特異的に結合する抗体、抗体誘導体、またはその断片を用いて、マーカー、例えば表2に記載のマーカーの活性を阻害することができ、対象の癌を治療、阻害、または予防することもできる。さらに、結合抗体、好ましくはモノクローナル抗体、またはその断片は、薬剤、毒素、または放射性原子と結合することができる抗体であり、癌細胞に直接該物質を送達するための送達ビークルとして用いる。抗体、例えば本発明のマーカー(例えば表2に記載のマーカー)と特異的に結合する抗体は、対象に投与され、該マーカーと結合することにより、癌細胞に毒性物質を送達し、身体の他の部分の正常細胞に対する損傷を最小限にする。
【０１７６】
結合抗体は、「タグ付」、「標識(された)」または「ロードされた」ともいう。化学療法剤が結合した抗体は、一般に化学標識されたともいう。放射性粒子が結合した抗体は放射性標識されたともいい、このタイプの療法は放射免疫療法(RIT)としても知られている。癌を治療するのに用いるほかに、放射性標識抗体は、身体中の癌が広がった領域を検出するのに用いることもできる。毒素が結合した抗体はイムノトキシンと呼ばれる。
【０１７７】
イムノトキシンは、毒素(例えば、植物または細菌由来の毒性物質)をモノクローナル抗体と結合させることにより作製する。イムノトキシンは、モノクローナル抗体を、ジフテリア毒素(DT)または緑膿菌菌体外毒素(PE40)のような細菌毒素、またはリシンまたはサポリンのような植物毒素と結合させることにより作製することができる。
【０１７８】
本発明のマーカーに対応するポリペプチドに対する抗体(例えば、モノクローナル抗体)は、標準的技術、例えばアフィニティクロマトグラフィまたは免疫沈降法により該ポリペプチドを単離するのに用いることができる。さらに、そのような抗体は、マーカーの発現レベルおよびパターンを評価するために、該マーカー(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)を検出するのに用いることができる。該抗体は、例えば、特定の治療方法の有効性を検討するために、臨床試験方法の部分として組織または体液中(例えば肺関連体液中)のタンパク質レベルをモニターするのに診断的に用いることもできる。該抗体を検出可能な物質と結合させることにより検出を促進することができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光(ルミネッセント)物質、生物発光物質、および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子団の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれる。適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリスリンが含まれる。適切な発光物質の例にはルミノールが含まれ、生物発光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびアエクオリンが含まれる。適切な放射性物質の例には125I、131I、35S、または3Hが含まれる。
V. 組換え発現ベクターおよび宿主細胞
【０１７９】
本発明の別の局面は、本発明のマーカーに対応するポリペプチド(またはそのようなポリペプチドの部分)をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で用いている用語「ベクター」は、結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を表す。あるタイプのベクターは「ベクター」であり、これはさらなるDNA断片を結合することができる環状二本鎖DNAループをいう。別のタイプのベクターは、さらなるDNA断片をウイルスゲノム内に結合することができるウイルスベクターである。あるベクターは、導入する宿主細胞中で自立的に複製することができる(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞中に導入されると宿主細胞のゲノム内に統合され、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクター、すなわち発現ベクターは、操作可能に連結された遺伝子の発現をもたらすことができる。一般的に、組換えDNA技術に有用な発現ベクターは、しばしばプラスミド(ベクター)の形である。しかしながら、本発明は、同等の機能をもたらす他の形の発現ベクター、例えばウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス)を含むことを意図する。
【０１８０】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現に適した形の本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現すべき核酸配列と操作可能に連結した、発現に用いる宿主細胞に基づいて選択した1またはそれ以上の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で「操作可能に連結する」とは、目的のヌクレオチド配列が該ヌクレオチド配列(例えば、in vitro 転写/翻訳系中、またはベクターが宿主細胞内に導入されるときの宿主細胞中の)の発現を可能にするように制御配列と連結していることを意味することを意味することを意図する。用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図する。そのような制御配列は、例えばGoeddel、Method in Enzymology：Gene Expression Technology vol.185、Academic Press、San Diego、CA(1991)に記載されている。制御配列には、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現をもたらすもの、およびある種の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現をもたらすもの(例えば、組織特異的制御配列)が含まれる。当業者は、発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存しうることを認識するであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入し、融合タンパク質、または本明細書に記載の核酸によりコードされるペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを生成することができる。
【０１８１】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞(例えばE. coli)または真核細胞(例えば、昆虫細胞(バクロウイルス発現ベクターを用いる)、酵母細胞、または哺乳動物細胞)における本発明のマーカーに対応するポリペプチドを発現させるために設計することができる。適切な宿主細胞は、さらにGoeddel(上記)に記載されている。あるいはまた、組換え発現ベクターは、例えば、T7 プロモーター制御配列およびT7ポリメラーゼを用いてin vitroで転写および翻訳することができる。
【０１８２】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質の発現をもたらす構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いてE. coli中で行われることが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多くのアミノ酸を加える。そのような融合ベクターは、典型的には以下の3つの目的に役立つ：1)組換えタンパク質の発現の増加；2)組換えタンパク質の溶解性の増加；および3)アフィニティ精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解開裂部位を融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入し、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離することができる。そのような酵素、およびその同種認識配列には、Xa因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。典型的融合発現ベクターには、それぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質と融合する、pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith and Johnson、1988、Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs、Beverly、MA)、およびpRIT5(Pharmacia、Piscataway、NJ)が含まれる。
【０１８３】
適切な誘導性非融合E. coli 発現ベクターの例には、pTrc(Amann et al.、1988、Gene 69:301-315)およびpET 11d(Studier et al.、p. 60-89、In Gene Expression Technology： Method in Enzymology vol.185、Academic Press、San Diego、CA、1991)が含まれる。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依存する。pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現したウイルスRNAポリメラーゼ(T7 gn1)を介したT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、lacUV 5 プロモーターの転写制御下でT7 gn1遺伝子を有する常在プロファージから宿主株BL21(DE3)またはHMS174(DE3)により供給される。
【０１８４】
E. coli中で組換えタンパク質発現を最小化するためのある戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に開裂させる能力を欠く宿主細菌中で該タンパク質を発現させることである(Gottesman、p. 119-128、In Gene Expression Technology：Method in Enzymology vol. 185、Academic Press、San Diego、CA、1990)。別の戦略は、各アミノ酸に対する個々のコドンがE. coli中で優先的に利用されるものにするために、発現ベクター中に挿入されるように該核酸の核酸配列を変化させることである(Wada et al.、1992、Nucleic Acids Res. 20:2111-2118)。本発明の核酸配列のそのような変化は、標準的DNA合成技術により行うことができる。
【０１８５】
別の態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母S. cerevisiae中で発現するためのベクターの例には、pYepSec1(Baldari et al.、1987、EMBO J. 6:229-234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz、1982、Cell 30:933-943)、pJRY88(Schultz et al.、1987、Gene 54:113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation、San Diego、CA)、およびpPicZ(Invitrogen Corp、San Diego、CA)が含まれる。
【０１８６】
あるいはまた、発現ベクターはバクロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞(例えば、Sf 9細胞)中のタンパク質発現に利用可能なバクロウイルスベクターには、pAcシリーズ(Smith et al.、1983、Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)およびpVLシリーズ(Lucklow and Summers、1989、Virology 170:31-39)が含まれる。
【０１８７】
さらに別の態様において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現する。哺乳動物発現ベクターの例には、pCDM8(Seed、1987、Nature 329:840)およびpMT2PC(Kaufman et al.、1987、EMBO J. 6:187-195)が含まれる。哺乳動物細胞で用いるときは、該発現ベクターの制御機能はしばしばウイルス制御エレメントにより提供される。例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス40由来である。原核および真核細胞両方に適した他の発現系については、上記の16および17章参照。
【０１８８】
別の態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞種において優先的な核酸の発現をもたらすことができる(例えば、組織特異的制御エレメントを核酸の発現に用いる)。組織特異的制御エレメントは当該分野で知られている。適切な組織特異的プロモーターの非限定的例には、アルブミンプロモーター(肝特異的；Pinkert et al.、1987、Genes Dev. 1:268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton、1988、Adv. Immunol. 43:235-275)、特にT細胞レセプターのプロモーター(Winoto and Baltimore、1989、EMBO J. 8:729-733)、および免疫グロブリン(Banerji et al.、1983、Cell 33:729-740；Queen and Baltimore、1983、Cell 33:741-748)、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrne and Ruddle、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund et al.、1985、Science 230:912-916)、および乳腺特異的プロモーター(例えば、乳清プロモーター；米国特許No.4,873,316および欧州出願公開公報No.264,166)が含まれる。発生的に制御されるプロモーターには、例えばネズミポックスプロモーター(Kessel and Gruss、1990、Science 249:374-379)およびα-フェトタンパク質プロモーター(Camper and Tilghman、1989、Genes Dev. 3:537-546)が含まれる。
【０１８９】
本発明は、さらに発現ベクター中にアンチセンス方向にクローンされた本発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、該DNA分子は、本発明のポリペプチドをコードするmRNAに対してアンチセンスであるRNA分子の発現(DNA分子の転写により)を可能にするように制御配列と操作可能に連結している。種々の細胞種におけるアンチセンスRNA分子の連続的発現をもたらす、核酸と操作可能に連結した制御配列を選ぶことができ、例えば、アンチセンスRNAの構成的、組織特異的または細胞種特異的発現をもたらす、ウイルスプロモーターおよび/またはエンハンサー、または制御配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率制御領域の制御核酸配列の制御下で生成される組換えプラスミド、ファージミッド、または弱毒ウイルスの形であり、その活性は該ベクターが導入される細胞種により測定することができる。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の制御についての考察は、Weintraub et al.、1986、Trends in Genetics、Vol. 1(1)参照。
【０１９０】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は本明細書では互換性に用いる。そのような用語は特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫を表すと理解される。ある種の修飾は、突然変異または環境的影響により後世代に生じることがあるので、そのような子孫は、実際に親細胞と同一でないかもしれないが、まだ本明細書で用いる用語の範囲内に含まれる。
【０１９１】
宿主細胞は、あらゆる原核(例えば、E. coli)または真核細胞(例えば、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞)でありうる。
【０１９２】
ベクターDNAは、常套的形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核また真核細胞内に導入することができる。本明細書で用いている用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポーレーションを含む、宿主細胞内に外来核酸を導入するための当該分野で認識された種々の技術を表すことを意図する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするのに適した方法は、Sambrook、et al.(上記)、および他の実験マニュアルに記載されている。
【０１９３】
哺乳動物細胞の適切なトランスフェクションについては、用いる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞の小分画のみが外来DNAをそのゲノム内に統合することがあることが知られている。これら統合体を同定および選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する耐性に関する)をコードする遺伝子を、一般的には、宿主細胞中に目的の遺伝子とともに導入する。好ましい選択可能なマーカーには、G418、ヒグロマイシン、およびメトトレキセートのような薬剤に対する耐性をもたらすものが含まれる。導入した核酸で安定にトランスフェクションした細胞は、薬剤選別により同定することができる(例えば、選択可能なマーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生存し、その他の細胞は死滅する)。
【０１９４】
培養中の、本発明の宿主細胞、例えば原核または真核宿主細胞を用いて、ポリペプチド本発明のマーカーに対応するポリペプチドを生成することができる。あるいはまた、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いて本発明のマーカーに対応するポリペプチドを製造する方法を提供する。ある態様において、該方法は、該マーカーが生成される様に適切な培地中で本発明の宿主細胞(その中に本発明のポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入される)を培養することを含む。別の態様において、該方法は、さらに、培地または宿主細胞からマーカーポリペプチドを単離することを含む。
【０１９５】
本発明の宿主細胞を用いて、非ヒトトランスジェニックマウスを作製することもできる。例えば、ある態様において、本発明の宿主細胞は、本発明のマーカーに対応するポリペプチド配列が導入された受精卵母細胞または胎児幹細胞である。次に、そのような宿主細胞を用いて、本発明のマーカータンパク質をコードする外因性配列がそれらのゲノムに導入されるか、またはポリペプチド本発明のマーカーに対応する配列をコードする内因性遺伝子が変化しているホモローガスな組換え動物に導入された非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる。そのような動物は、ポリペプチド活性の調節因子を同定および/または評価するための該マーカーに対応するポリペプチドの機能および/または活性の試験に、ならびにマーカーを発見または評価、例えば治療的および診断的マーカーを発見または評価するための治療薬または診断用分子の前臨床試験に、または薬剤効果および特異性の代用物として有用である。
【０１９６】
本明細書で用いている「トランスジェニック動物」は、該動物の1またはそれ以上の細胞がトランス遺伝子を含む、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは齧歯類、例えばラットまたはマウスである。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、乳牛、ヤギ、鶏、両生類などが含まれる。トランス遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に統合され、成熟動物のゲノム中にとどまって、トランスジェニック動物の1またはそれ以上の細胞種または組織中にコードされた遺伝子産物の発現をもたらす外来DNAである。本明細書で用いている「ホモローガスな組換え動物」は、内在遺伝子が、動物の発生前に、動物の細胞、例えば該動物の胚細胞に導入された内在遺伝子と外来DNA分子の間のホモローガスな組換えにより変化した、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。トランスジェニック動物は、例えば、Chan I.T. et al.(2004)J Clin Invest. 113(4):528-38およびChin L. et al(1999)Nature 400(6743):468-72に記載のような誘導性トランスジェニック動物も含む。
【０１９７】
本発明のトランスジェニック動物は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核に、例えばマイクロインジェクション、レトロウイルス感染により導入し、該卵母細胞を偽妊娠雌里親動物中で発育させることにより作製することができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルを、トランス遺伝子の発現効率を増大するためにトランス遺伝子中に含むことができる。組織特異的制御配列は、特定の細胞に本発明のペプチドの発現をもたらすためにトランス遺伝子と操作可能に連結することができる。胚操作およびマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物、特にマウスの様な動物、の作製方法は、当該分野では常套的になっており、例えば、米国特許No. 4,736,866 and 4,870,009、米国特許No.4,873,191、およびHogan、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986に記載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の作製に用いられる。初代トランスジェニック動物は、そのゲノム中のトランス遺伝子の存在、および/または該動物の組織または細胞中のトランス遺伝子をコードするmRNAの発現に基づいて同定することができる。次に、初代トランスジェニック動物を用いてトランス遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させることができる。さらに、トランス遺伝子を有するトランスジェニック動物をさらに他のトランス遺伝子を有する他のトランスジェニック動物と交配させることができる。
【０１９８】
ホモローガスな組換え動物を作製するには、その中に欠失、付加または置換が導入され、該遺伝子を変化させる、例えば機能的に崩壊させる、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも部分を含むベクターを作製する。好ましい態様において、該ベクターは、ホモローガスに組換えすると内在遺伝子が機能的に破壊されるように(すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない。「ノックアウト」ベクターともいう)設計される。あるいはまた、該ベクターは、ホモローガスに組換えすると内在遺伝子が突然変異するか、または変化するがまだ機能的タンパク質(例えば、上流制御領域を変化させ、内在タンパク質の発現を変化させることができる)ように設計することができる。ホモローガスな組換えベクターにおいて、該ベクターに保持された外来遺伝子と胎児幹細胞中の内在遺伝子の間にホモローガスな組換えが起きるのを可能にするため、遺伝子の変化した部分の5'および3'末端に遺伝子のさらなる核酸を隣接させる。さらなる隣接核酸配列は、内在遺伝子とのホモローガスな組換えを成功させるのに十分な長さがある。典型的には、数キロ塩基の隣接DNA(5'および3'末端両方)は該ベクターに含まれる(ホモローガスな組換えベクターの説明は、例えば、Thomas and Capecchi、1987、Cell 51:503参照)。該ベクターを胎児肝細胞株(例えば、エレクトロポーレーションにより)に導入し、導入された遺伝子が内在遺伝子とホモローガスに組み換えられた細胞を選択する(例えば、Li et al.、1992、Cell 69:915参照)。次に、選択した細胞を動物(例えばマウス)の胚盤胞内に注射し、凝縮キメラを形成する(例えば、Bradley、Teratocancers and Embryonic Stem Cell：A Practical Approach、Robertson、Ed.、IRL、Oxford、1987、pp. 113-152参照)。次に、キメラ胎児を適切な偽妊娠雌里親動物に移植し、該胎児を出産させることができる。その胚細胞中にホモローガスに組み換えられたDNAを有する子孫を用いて、該動物の全ての細胞がトランス遺伝子の生殖細胞系伝達によりホモローガスに組み換えられたDNAを含む動物を繁殖させることができる。ホモローガスな組換えベクターおよびホモローガスな組換え動物の構築方法は、さらにBradley(1991)Current Opinion in Bio/Technology 2:823-829、およびPCT公開公報 WO 90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968、およびWO 93/04169に記載されている。
【０１９９】
別の態様において、トランス遺伝子の制御された発現を可能にする選択系を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。そのような系の一例に、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼ系がある。cre/loxPリコンビナーゼ系の説明は、例えば、Lakso et al.(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236参照。リコンビナーゼ系の別の例には、Saccharomyces cerevisiae のFLPリコンビナーゼ系がある(O'Gorman et al.、1991、Science 251:1351-1355)。cre/loxPリコンビナーゼ系を用いてトランス遺伝子の発現を制御すると、Creリコンビナーゼと選択タンパク質両方をコードするトランス遺伝子を含む動物が必要である。そのような動物は、例えば、1つが選択タンパク質をコードするトランス遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードするトランス遺伝子を含む、2つのトランスジェニック動物を交配させることによる「二重」トランスジェニック動物の構築により提供することができる。
【０２００】
本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Wilmut et al.(1997)Nature 385:810-813およびPCT公開公報WO 97/07668およびWO 97/07669に記載の方法に従って作製することもできる。
VI. 治療方法
【０２０１】
本発明は、癌、例えば肺癌、例えばNSCLCを有するかまたはそのリスクがある(またはそれに感受性の対象、例えばヒトの予防および治療方法を提供する。本明細書で用いている対象の「治療(処置)」は、疾患または障害、疾患または障害の症状、または疾患または障害のリスク(または感受性)に影響を及ぼし、またはそれを、治癒し、阻害し、治療し、変化させ、是正し、軽減し、改善するために、疾患または障害を有するか、疾患または障害の症状を有するか、または疾患または障害のリスクがある(またはそれに感受性である)対象に治療剤を適用または投与するか、または該対象由来の細胞または組織に治療剤を適用または投与することを含む。本明細書で用いている「治療剤」または「化合物」には、限定されるものではないが、小分子、ペプチド、ペプチド模倣物、ポリペプチド、RNA干渉剤、例えば、siRNA分子、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０２０２】
本明細書に記載の対象の癌は、1またはそれ以上の表2に記載のマーカー(例えば、癌で増加することが解ったマーカー)の量および/または活性の変化、例えば増加、または該構造の変化、および/または1またはそれ以上の表1に記載のマーカー(例えば、癌において減少することが解ったマーカー)の量および/または活性の変化、例えば低下、または該構造の変化と関連する。上記のごとく、量、構造、および/または活性のこれら変化のいくつかは癌の発生から生じるが、これら変化の他のものは癌細胞の癌状態を誘導、維持、および促進する。すなわち、表2に記載の1またはそれ以上のマーカー(例えば、癌において増加することが示されているマーカー)の量および/または活性の増加、または構造変化を特徴とする癌は、該マーカーの量、例えば、発現またはタンパク質レベル、および/または活性を阻害することにより阻害することができる。同様に、表1に記載の1またはそれ以上のマーカー(例えば、癌において減少することが示されているマーカー)の量および/または活性の低下、または構造変化を特徴とする癌は、それらマーカーの量、例えば、発現またはタンパク質レベル、および/または活性を増強することにより阻害することができる。
【０２０３】
したがって、本発明の別の局面は、癌に罹患した対象の治療方法に関する。これら方法は、1またはそれ以上の本発明マーカーの量および/または活性を調節する化合物を対象に投与する。例えば、癌の治療または予防方法には、1またはそれ以上の表2に記載のマーカー(例えば、癌で増加することが解ったマーカー)の量および/または活性を低下させる化合物を対象に投与することが含まれる。化合物、例えば、表2に記載の量および/または活性を阻害することにより、癌を治療または予防するのに用いることができる化合物、例えばアンタゴニストには、抗体(例えば、結合抗体)、小分子、RNA干渉剤、例えば、siRNA分子、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。ある態様において、治療に用いる抗体を、毒素、化学療法剤、または放射性粒子と結合と結合させる。
【０２０４】
癌の治療または予防方法には、1またはそれ以上の表1に記載のマーカー(例えば、癌において減少することが解ったマーカー)の量および/または活性を増加する化合物を対象に投与することが含まれる。表1に記載のマーカーの発現または活性を増加させるのに用いることにより癌を治療または予防することができる化合物、例えばアゴニストには、小分子、ペプチド、ペプトイド、ペプチド模倣物、およびポリペプチドが含まれる。
【０２０５】
本発明の方法に用いる小分子には、マーカーの量および/または活性を増加または減少させるものが含まれる。さらに、サイレンス遺伝子、例えば腫瘍抑制因子の再発現をもたらす、調節因子、例えば小分子も本発明に含まれる。例えば、そのような分子には、DNA結合またはメチルトランスフェラーゼ活性と干渉する化合物が含まれる。
【０２０６】
アプタマーを用いて、本発明のマーカーの発現または活性を調節、例えば増加または阻害し、癌を治療、予防、または阻害することができよう。アプタマーは、他の分子と結合する活性に基づいてランダムプールから選択されたDNAまたはRNA分子である。核酸またはタンパク質と結合するアプタマーを選択することができる。
VII. スクリーニングアッセイ
【０２０７】
本発明は、(a)本発明のマーカーと結合するか、(b)本発明のマーカーの活性に対する調節(例えば刺激または阻害)作用を有し、または、より具体的には(c)本発明のマーカーと1またはそれ以上のその天然物質(例えば、ペプチド、タンパク質、ホルモン、補助因子、または核酸)との相互作用に対する調節作用を有するか、または(d)本発明のマーカーの発現に対する調節作用を有する、調節因子、すなわち、候補または被検化合物または薬剤(例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、小分子、または他の薬剤)を同定するための方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」ともいう)も提供する。他の成分は、被検化合物それ自身かまたは被検化合物の組み合わせ、および該マーカーの天然の結合パートナーであってよい。アッセイにより同定された化合物、例えば本明細書に記載の化合物は、癌の、例えば調節、例えば阻害、改善、治療、または予防に有用でありうる。
【０２０８】
本発明の被検化合物は、天然および/または合成化合物の系統的ライブラリーを含むあらゆる利用可能な供給源から得てよい。被検化合物は、生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー(生物活性を有するにも関わらず酵素的分解に耐性な新規非ペプチド骨格を有するペプチドの機能性を有する分子、のライブラリー、例えば、Zuckermann et al.、1994、J. Med. Chem. 37:2678-85参照)；空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー；デコンボルーションを要する合成ライブラリー法；「1ビーズ1化合物」ライブラリー法；アフィニティクロマトグラフィ選別を用いる合成ライブラリー方法、を含む当該分野で知られた組み合わせライブラリー法を用いる多くのあらゆる方法により得てもよい。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリー法は、ペプチドライブラリーに限定されるが、その他の4つの方法は、化合物の、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分ライブラリーに適用可能である(Lam、1997、Anti Cancer Des. 12:145)。
【０２０９】
分子ライブラリーを合成するための方法の例は、当該分野において、例えばDeWitt et al.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909；Erb et al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA  91:11422；Zuckermann et al.(1994). J. Med. Chem. 37:2678；Cho et al.(1993)Science 261:1303；Carrell et al.(1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059；Carell et al.(1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061；and in Gallop et al.(1994)J. Med. Chem. 37:1233に記載されている。
【０２１０】
化合物ライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten、1992、Biotechniques 13:412-421)、またはビーズ上(Lam、1991、Nature 354:82-84)、チップ(Fodor、1993、Nature 364:555-556)、細菌および/または胞子(Ladner、USP 5,223,409)、プラスミド(Cull et al、1992、Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)、またはファージ上(Scott and Smith、1990、Science 249:386-390；Devlin、1990、Science 249:404-406；Cwirla et al、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382；Felici、1991、J. Mol. Biol. 222:301-310；Ladner、上記.)に存在しうる。
【０２１１】
ある態様において、本発明は、本発明のマーカーの基質である候補または被検化合物またはその生物学的に活性な部分のスクリーニングアッセイを提供する。別の態様において、本発明は、本発明のマーカーと結合する候補または被検化合物またはその生物学的に活性な部分のスクリーニングアッセイを提供する。被検化合物のマーカーと直接結合する能力の決定は、該化合物の該マーカーに対する結合を複合体中の標識マーカー化合物を検出することにより決定することができるように、例えば、該化合物を放射性同位元素または酵素標識を結合させることにより達成することができる。例えば、化合物(例えば、マーカー基質)を、125I、35S、14C、または3Hで直接または間接的に標識し、該放射性同位元素を放射能放出の直接カウントまたはシンチレーションカウンティングにより検出することができる。あるいはまた、アッセイ成分は、例えばホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで標識することができ、該酵素標識は適切な基質の生成物への変換を検出することにより検出される。
【０２１２】
別の態様において、本発明は、本発明のマーカーの活性を調節する候補または被検化合物、またはその生物学的に活性な部分をスクリーニングするためのアッセイを提供する。すべての可能性において、該マーカーは、1またはそれ以上の分子、例えば限定されるものではないが、ペプチド、タンパク質、ホルモン、補助因子、および核酸と相互作用することができる。この議論のために、そのような細胞分子および細胞外分子は本明細書において「結合パートナー：またはマーカー「基質」という。
【０２１３】
そのようなスクリーニングを促すための本発明のある必要な態様は、その天然のin vivo結合パートナーを同定するためのマーカーの使用である。これを達成するには当業者に知られた多くの方法がある。1例は、該マーカーと結合または相互作用し、該マーカーの天然の機能に関与すると思われる他のタンパク質(結合パートナー)を同定するための、2ハイブリッドアッセイまたは3ハイブリッドアッセイにおける該マーカータンパク質の「おとりタンパク質」としての使用である(例えば、米国特許No.5,283,317；Zervos et al、1993、Cell 72:223-232；Madura et al、1993、J. Biol. Chem. 268:12046-12054；Bartel et al ,1993、 Biotechniques 14:920-924；Iwabuchi et al、1993 Oncogene 8:1693-1696；Brent WO94/10300)。そのようなマーカー結合パートナーは、マーカー介在情報伝達経路の下流エレメントまたは該マーカーによる情報の伝搬にも関与するようである。あるいはまた、そのようなマーカー結合パートナーは、該マーカーの阻害剤であることもわかるかもしれない。
【０２１４】
2ハイブリッドシステムは、分離可能なDNA結合および活性ドメインからなる、ほとんどの転写因子のモジュール特性に基づく。簡単には、該アッセイは2つの異なるDNA構築物を利用する。1つの構築物において、マーカータンパク質をコードする遺伝子は、既知の転写因子(例えば、GAL-4)のドメインと結合するDNAをコードする遺伝子と融合する。他の構築物において、同定されていないタンパク質(「獲物(prey)」または「試料」)をコードするDNA配列のライブラリー由来のDNAは、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子と融合する。「おとり」および「獲物」タンパク質がin vivoで相互作用し、マーカー依存性複合体を形成することができれば、転写因子のDNA結合および活性化ドメインは近接する。この近接は、転写因子と反応する転写制御部位と操作可能に連結したレポーター遺伝子(例えば、LacZ)の転写を可能にする。該レポーター遺伝子の発現は容易に検出することができ、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、これを用いて該マーカータンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
【０２１５】
さらなる態様において、マーカーとその基質および/または結合パートナーの相互作用を調節する(例えば、肯定的または否定的に影響する)化合物を同定するために本発明を使用するアッセイを考案することができる。そのような化合物には、限定されるものではないが、抗体、ペプチド、ホルモン、オリゴヌクレオチド、核酸、およびその類似体のような分子が含まれうる。そのような化合物は、天然および/または合成化合物の系統的ライブラリーを含むあらゆる利用可能な供給源から得てもよい。この態様に用いる好ましいアッセイ成分には、本明細書で同定された癌マーカー、既知の結合パートナー、および/またはその基質、および被検化合物がある。被検化合物はあらゆる供給源から供給することができる。
【０２１６】
該マーカーとその結合パートナーの相互作用に干渉する化合物を同定するのに用いるアッセイ系の基本原理は、2つの生成物が相互作用し結合する、すなわち複合体を形成するのに十分な条件および時間で、該マーカーとその結合パートナーを含む反応混合物を作製することを含む。物質の阻害活性を試験するため、反応混合物を被検化合物の存在下および非存在下で作製する。被検化合物は最初に反応混合物中に含まれるか、または該マーカーおよびその結合パートナーの付加の後の時点で加えることができる。対照反応混合物は、被検化合物なしでかまたはプラセボとともにインキュベーションする。次いで、該混合物とその結合パートナーのあらゆる複合体の形成を検出する。対照反応中で該複合体が形成されるが、被検化合物を含む反応混合物ではそのような形成がほとんどまたは全くないことは、該化合物が該混合物とその結合パートナーの相互作用と干渉することを示す。反対に、対照反応中より化合物存在下でより複合体が形成されると、該化合物が該混合物とその結合パートナーの相互作用を増強しうることを示す。該マーカーとその結合パートナーの相互作用と干渉する化合物のアッセイは、不均質または均質フォーマットで行ってよい。不均質アッセイは、該マーカーまたはその結合パートナーを固相上に固定し、反応終了時に固相に固定された複合体を検出することを含む。均質アッセイでは、全反応が液相中で行われる。いずれの方法でも、反応物質を加える順序は、被検化合物について異なる情報を得るために変えることができる。例えば、マーカーと結合パートナーの相互作用に干渉する(例えば、競合により)被検化合物は、被検物質の存在下で反応を行うことによりすなわち、被検物質を、該混合物とその相互作用する結合パートナーの前にかまたは同時に、反応混合物に加えることにより、同定することができる。あるいはまた、予め形成された複合体を崩壊させる被検化合物、例えば、該複合体から成分の1つを置換する、より高い結合定数を有する化合物を、複合体の形成後に被検化合物を反応混合物に加えることにより試験することができる。種々のフォーマットを以下に簡単に記載する。
【０２１７】
不均質アッセイ系では、該マーカーまたはその結合パートナーは固体表面またはマトリックス上に固定されるが、他の対応する非固定成分を直接または間接的に標識してよい。実際に、マイクロタイタープレートをこの方法に用いることが多い。固定種は、典型的には当該分野でよく知られた多くの方法により非共有結合または共有結合的に固定することができる。非共有結合は、しばしば該マーカーまたはその結合パートナーの溶液で固体表面をコーティングし、次いで乾燥することにより簡単に達成することができる。あるいはまた、固定するアッセイ成分に特異的な固定抗体をこの目的に用いることができる。そのような表面は、予め作製し、保存することができることが多い。
【０２１８】
関連する態様において、アッセイ成分の1または両方をマトリックスに固定するのを可能にするドメインを加える融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/マーカー融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ/結合パートナーをグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical、St. Louis、MO)またはグルタチオン被覆マイクロタイタープレート上に吸着させ、次いでこれを被検化合物、または被検化合物および非吸着マーカーまたはその結合パートナーと混合し、該混合物を複合体形成を行う条件(例えば、生理学的条件)下でインキュベーションする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄してあらゆる非結合アッセイ成分を除去し、例えば上記のごとく直接または間接的に固定混合物を評価する。あるいはまた、該複合体をマトリックスから解離させ、マーカーの結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することができる。
【０２１９】
マトリックス上にタンパク質を固定する他の技術は、本発明のスクリーニングアッセイにも用いることができる。例えば、マーカーまたはマーカー結合パートナーは、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して固定することができる。ビオチン化マーカータンパク質または標的分子は、当該分野で知られた技術(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals、Rockford、IL)を用いてビオチン-NHS(N-ヒドロキシ-スクシンイミド)から作製し、ストレプトアビジンコートした96ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェルに固定することができる。ある種の態様において、タンパク質固定表面は予め作製し、保存することができる。
【０２２０】
該アッセイを行うには、固定アッセイ成分の対応パートナーを、被検化合物を含むか含まないコート表面に曝露する。反応が完結した後、非反応アッセイ成分を除去し(例えば洗浄により)、形成されたあらゆる複合体は固体表面上に固定されたままであろう。固体表面上に固定された複合体の検出は、多くの方法で達成することができる。非固定成分を予め標識する場合は、該表面に固定された標識の検出は、複合体の形成を示す。非固定成分を予め標識しない場合は、例えば、最初に非固定種に特異的な標識抗体を用い(すなわち、該抗体は、例えば、標識抗Ig抗体で直接または間接的に標識することができる)、間接標識を用いて該表面に固定された複合体を検出することができる。反応生物を加える順序に応じて、複合体形成を調節(阻害または増強)するかまたは予め形成された複合体を崩壊させる被検化合物を検出することができる。
【０２２１】
本発明の別の態様において、均質アッセイを用いてよい。これは、典型的には、上記と類似の反応であり、被検化合物の存在下または非存在下で液相中で行われる。次に、形成された複合体は非反応成分から分離され、形成された複合体の量を測定する。不均質アッセイ系で記載したように、液相に反応物質を加える順序は、被検化合物が複合体形成を調節(阻害または増強)し、予め形成された複合体を崩壊させる情報をもたらし得る。
【０２２２】
そのような均質アッセイにおいて、反応産物は、限定されるものではないが、分別遠心分離、クロマトグラフィ、電気泳動、および免疫沈降法を含む、多くのあらゆる標準的技術により非反応アッセイ成分から分離することができる。分別遠心分離では、分子の複合体を、種々のサイズおよび密度に基づく複合体の異なる沈降平衡により一連の遠心工程により非複合体分子から分離することができる(例えば、Rivas、G.、およびMinton、A.P.、Trends Biochem Sci 1993 Aug;18(8):284-7参照)。標準的クロマトグラフィ技術を用いて複合体分子を非複合体分子から分離してもよい。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィは、サイズに基づき、カラムフォーマット中の適切なゲルろ過樹脂の利用を通して分子を分離し、例えば、比較的大きい複合体を比較的小さい非複合体成分から分離することができる。同様に、非結合分子と比較して複合体の比較的異なる荷電特性を用いて、残存する個々の反応物質から、例えばイオン交換クロマトグラフィ樹脂の使用により、分別的に分離することができる。そのような樹脂およびクロマトグラフィ技術は当該分野でよく知られている(例えば、Heegaard、1998、J Mol. Recognit. 11:141-148；Hage and Tweed、1997、J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl.、699:499-525参照)。ゲル電気泳動を用いて複合体分子を非結合種から分離してもよい(例えば、Ausubel et al(eds.)、Current Protocols in Molecular Biology、J. Wiley & Sons、New York. 1999参照)。この技術では、タンパク質または核酸複合体を例えばサイズまたは荷電に基づいて分離する。電気泳動プロセス中の結合相互作用を維持するため、還元剤の非存在下の非変性ゲルが典型的には好ましいが、特定の反応物質に適した条件も当業者によく知られている。免疫沈降は、タンパク質-タンパク質複合体を溶液から単離するために利用される別の一般的技術である(例えば、Ausubel et al(eds.)、In：Current Protocols in Molecular Biology、J. Wiley & Sons、New York. 1999参照)。この技術において、結合分子の1つに特異的な抗体と結合するすべてのタンパク質は、遠心分離により容易に回収することができるポリマービーズに該抗体を結合させることにより、溶液から沈降する。結合アッセイ成分は該ビーズから放出され(特異的タンパク質分解事象、または複合体中のタンパク質-タンパク質相互作用を妨げない当業者によく知られた他の技術により)、第2免疫沈降工程を行う(この時は対応する異なる相互作用アッセイ成分に特異的な抗体を利用する)。このようにして、形成された複合体のみがビーズに結合したままのはずである。被検化合物の存在下および非存在下の両方における複合体形成の変化を比較し、該混合物とその結合パートナーの相互作用を調節する該化合物の能力に関する情報を提供することができる。さらなる試料操作を行わない均質または不均質アッセイ系において該混合物とその天然結合パートナーおよび/または被検化合物の相互作用を直接検出するための方法も本発明の範囲内である。例えば、蛍光エネルギー伝達技術を用いることができる(例えば、Lakowicz et al、米国特許No.5,631,169；Stavrianopoulos et al、米国特許No.4,868,103参照)。一般的に、この技術は、その放射蛍光エネルギーが第2「アクセプター」分子(例えば、マーカーまたは被検化合物)上の蛍光標識により吸収され、次いで吸収されたエネルギーにより蛍光を発す��ことができるように、第1「ドナー」分子(例えば、マーカーまたは被検化合物)上に蛍光色素分子標識を付加することを含む。あるいはまた、「ドナー」タンパク質分子は、単にトリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを利用することができる。標識は、「アクセプター」分子標識が「ドナー」のそれから分別できるように異なる光の波長を放射する標識を選ぶ。標識間のエネルギー伝達効率は、分子を隔てる距離に関連するので、分子間の空間的関係を評価することができる。分子間に結合が生じる状況では、アッセイ中の「アクセプター」分子標識の蛍光放射は最大になるはずである。FET結合事象は、当該分野でよく知られた標準的蛍光分析検出手段により(例えば、フルオロメーターを用いて)好都合に測定することができる。予め形成された複合体中の種の1つの関与を増強または妨害する被検物質は、バックグラウンドのそれに対するシグナル変化の発生をもたらすであろう。このようにして、マーカーとその結合パートナーの相互作用を調節する被検物質を、対照のあるアッセイにおいて同定することができる。別の態様において、マーカー発現の調節因子は、候補化合物と接触させ、細胞中のマーカーに対応するmRNAまたはタンパク質の発現を検出する方法を用いて同定される。候補化合物存在下においてmRNAまたはタンパク質の発現レベルを候補化合物非存在下のmRNAまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次に、候補化合物をこの比較に基づいてマーカー発現の調節因子として同定することができる。例えば、候補化合物の存在下のマーカーmRNAまたはタンパク質の発現がその非存在下より大きい(統計的に有意に大きい)ときは、候補化合物は、マーカーmRNAまたはタンパク質発現の調節因子として同定される。反対に、候補化合物の存在下のマーカーmRNAまたはタンパク質の発現がその非存在下より小さい(統計的に有意に小さい)ときは、候補化合物は、マーカーmRNAまたはタンパク質発現の阻害剤として同定される。細胞中のマーカーmRNAまたはタンパク質発現のレベルは、マーカーmRNAまたはタンパク質を検出するための本明細書に記載の方法により決定することができる。
【０２２３】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の2またはそれ以上のアッセイを組み合わせに関する。例えば、調節物質は、細胞ベースのまたは無細胞アッセイを用いて同定することができ、マーカータンパク質の活性を調節する該物質の能力は、in vivoで、例えば、癌の全動物モデル、細胞毛質点間、および/または腫瘍誘発により確認することができる。肺癌の動物モデルは、例えば、Tanaka、E. et al.(2003)Chest 123:1248-1253.、Jackson EL、et al.(2001)Genes Dev 15(24):3243-8、およびFisher GH、et al.(2001)Genes Dev 15(24):3249-62に記載されている(この内容は本明細書の一部を構成する)。
【０２２４】
癌のさらなる動物ベースのモデルは、当該分野でよく知られており(Animal Models of Cancer Predisposition Syndromes、Hiai、H and Hino、O(eds.)1999、Progress in Experimental Tumor Research、Vol. 35；Clarke AR Carcinogenesis(2000)21:435-41に記載)、それには、例えば、発癌物質誘発腫瘍(Rithidech、K et al. Mutat Res(1999)428:33-39；Miller、ML et al. Environ Mol Mutagen(2000)35:319-327)、腫瘍細胞の動物への注射および/または移植、ならびに増殖制御遺伝子、例えば、発癌遺伝子(例えばras)(Arbeit、JM et al. Am J Pathol(1993)142:1187-1197；Sinn、E et al. Cell(1987)49:465-475；Thorgeirsson、SS et al. Toxicol Lett(2000)112-113:553-555)、および腫瘍抑制遺伝子(例えば、p53)(Vooijs、M et al. Oncogene(1999)18:5293-5303；Clark AR Cancer Metast Rev(1995)14:125-148；Kumar、TR et al. J Intern Med(1995)238:233-238；Donehower、LA et al.(1992)Nature 356215-221)に突然変異を有する動物が含まれる。さらに、実験モデル系は、例えば、卵巣癌(Hamilton、TC et al. Semin Oncol(1984)11:285-298；Rahman、NA et al. Mol Cell Endocrinol(1998)145:167-174；Beamer、WG et al. Toxicol Pathol(1998)26:704-710)、胃癌(Thompson、J et al. Int J 癌(2000)86:863-869；Fodde、R et al. Cytogenet Cell Genet(1999)86:105-111)、乳癌(Li、M et al. Oncogene(2000)19:1010-1019；Green、JE et al. Oncogene(2000)19:1020-1027)、黒色腫(Satyamoorthy、K et al. Cancer Metast Rev(1999)18:401-405)、および前立腺癌(Shirai、T et al. Mutat Res(2000)462:219-226；Bostwick、DG et al. Prostate(2000)43:286-294)の研究に利用できる。例えば、Chin L. et al(1999)Nature 400(6743):468-72に記載の動物モデルを本発明の方法に用いてもよい。
【０２２５】
本発明は、さらに、上記スクリーニングアッセイにより同定される新規物質に関する。したがって、適切な動物モデルを用いて本明細書に記載のごとく同定された物質のさらなる使用も本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載のごとく同定された物質(例えば、マーカー調節物質、小分子、アンチセンスマーカー核酸分子、リボザイム、マーカー特異的抗体、またはその断片、マーカータンパク質、マーカー核酸分子、RNA干渉剤、例えば、本発明のマーカーを標的とするsiRNA分子、またはマーカー結合パートナー)を動物モデルに用いて、そのような物質による治療の効果、毒性、または副作用を決定することができる。あるいはまた、本明細書に記載のごとく同定された物質を動物モデルに用いて、そのような物質の作用メカニズムを決定することができる。さらに、本発明は上記治療のための上記スクリーニングアッセイにより同定された新規物質の使用に関する。
VIII. 医薬組成物
【０２２６】
本発明のマーカーに対応する小分子、ペプチド、ペプトイド、ペプチド模倣物、ポリペプチド、RNA干渉剤、例えば、siRNA分子、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド(本明細書では「活性化合物」または「化合物」ともいう)を投与するのに適した医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、小分子、ペプチド、ペプトイド、ペプチド模倣物、ポリペプチド、RNA干渉剤、例えば、siRNA分子、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド、および医薬的に許容される担体を含む。本明細書で用いている用語「医薬的に許容される担体」は、医薬投与に適合するあらゆるおよび全ての溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬的に活性な物質へのそのような媒質および物質の使用は当該分野でよく知られている。あらゆる常套的媒質および物質は活性化合物と不適合である場合を除き、該組成物におけるその使用が予期される。補助的活性化合物を該組成物に組み込むこともできる。
【０２２７】
本発明は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するための医薬組成物を製造するための方法を含む。そのような方法は、医薬的に許容される担体を、本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節する物質とともに製剤化することを含む。そのような組成物は、さらにさらなる活性物質を含むことができる。すなわち、本発明は、さらに、医薬的に許容される担体を、本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節する物質および1またはそれ以上のさらなる活性化合物とともに製剤化することにより医薬組成物を製造する方法を含む。
【０２２８】
適切な用量の小分子物質およびタンパク質またはポリペプチド物質は、通常の技術を有する医師、獣医師、または研究者の知識内の多くの因子に依存すると理解される。これら物質の用量は、例えば、治療する対象または試料の同一性、サイズ、および病状に依存して、さらに該当する場合は該組成物を投与する投与経路、および施術者が望む本発明の核酸分子またはポリペプチドに対して望む該物質の効果に依存して変化するであろう。小分子には、限定されるものではないが、分子重量が約10,000グラム/モル以下の、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機または無機化合物(すなわち、ヘテロ有機および有機金属化合物を含む)、分子の重量が約5000グラム/モル以下の有機または無機化合物、分子の重量が約1,000グラム/モル以下の有機または無機化合物、分子の重量が約500グラム/モル以下の有機または無機化合物、およびそのような化合物の塩、エステル、および他の医薬的に許容される形が含まれる。
【０２２９】
小分子の典型的用量には、対象または試料重量1キログラム(kg)あたりミリグラム(mg)またはマイクログラム(μg)量(例えば、約1μg/kg〜約500mg/kg、約100μg/kg〜約5mg/kg、または約1μg/kg〜約50μg/kg)が含まれる。
【０２３０】
本明細書に記載の、RNA干渉剤、例えばsiRNAの治療的有効量(すなわち有効用量)は、約0.001〜3,000mg/kg体重、好ましくは約0.01〜2500mg/kg体重、より好ましくは約0.1〜2000、約0.1〜1000mg/kg体重、0.1〜500mg/kg体重、0.1〜100mg/kg体重、0.1〜50mg/kg体重、0.1〜25mg/kg体重、さらにより好ましくは約1〜10mg/kg、2〜9mg/kg、3〜8mg/kg、4〜7mg/kg、または5〜6mg/kg体重の範囲である。治療的有効量のRNA干渉剤による対象の治療には、単回治療を含むことができ、好ましくは一連の治療を含むことができる。好ましい例では、対象を、約0.1〜20mg/kg体重の範囲のRNA干渉剤で、1回/週で約1〜10週間、好ましくは2〜8週間、より好ましくは約3〜7週間、さらにより好ましくは約4、5、または6週間治療する。
【０２３１】
タンパク質またはポリペプチドの典型的用量には、対象または試料重量1kgあたりg、mg、またはμg量(例えば、約1μg/kg〜約5g/kg、約100μg/kg〜約500mg/kg、または約1mg/kg〜約50mg/kg)が含まれる。さらに、これら物質の1つの適切な用量は、調節すべき発現または活性に対する該物質の効力に依存すると理解される。そのような適切な用量は、本明細書に記載のアッセイを用いて決定することができる。1またはそれ以上のこれら物質を動物(例えばヒト)に投与し、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するときは、医師、獣医師、または研究者は、例えば最初は比較的低用量を処方し、次いで適切な反応が得られるまで用量を増加させることができる。さらに、あらゆる特定の動物対象のための特定の用量レベルは、用いる特定物質の活性、対象の年齢、体重、一般健康状態、性別、および食習慣、投与時間、投与経路、排泄速度、あらゆる薬剤の組み合わせ、および調節すべき発現または活性の程度に依存すると理解される。
【０２３２】
本発明の医薬組成物は、意図する投与経路に適合するよう製剤化される。投与経路の例には、非経口的、例えば静脈内、皮内、皮下、経口(例えば吸入)、経皮(局所)、経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用に用いる溶液剤またはサスペンジョン剤は以下の成分を含みうる：無菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン4酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような毒性を調節するための物質。pHを、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口用製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジ、または多用量バイアルに含まれ得る。
【０２３３】
注射可能な用途に適した医薬組成物には、無菌注射可能溶液剤または分散剤を即時調製するための無菌水性溶液剤(水溶性の場合)、または分散剤、および無菌粉末剤が含まれる。静脈内投与用に適した担体には、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL(BASF；Parsippany、NJ)、またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が含まれる。すべての例において、該組成物は無菌でなければならず、容易に注入可能である程度に液体であるべきである。該組成物は製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌や真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、および適切なその混合物を含む溶媒または分散媒質でありうる。適切な流動性は、レシチンのようなコーティングを用いることにより、分散物の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、また界面活性剤を用いることにより維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能組成物の持続吸収は、組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらすことができる。
【０２３４】
無菌注射可能溶液剤は、必要に応じ上記成分の1または組み合わせを含む適切な溶媒中に必要量の活性化合物(例えば、ポリペプチドまたは抗体)を組み込み、次いでろ過滅菌することにより製造することができる。一般的には、分散剤は、塩基性分散媒質を含む無菌ビークル中に活性化合物を組み込み、次いで上記のものから必要な他の成分を組み込むことにより製造することができる。無菌注射可能溶液剤を製造するための無菌粉末剤の場合は、好ましい製造方法は、予めろ過滅菌したその溶液から活性成分とあらゆるさらなる所望の成分との粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２３５】
経口用組成物は、一般的には不活性希釈剤または食用担体を含む。該組成物はゼラチンカプセル中に封入されるか、または圧縮して錠剤にとすることができる。経口治療投与用には、活性化合物を賦形剤に組み込み、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形で用いることができる。経口用組成物は、液体担体中の化合物を経口的に適用し、うがいし(swished)、吐き出すかまたは飲み込むうがい液として用いるために液体担体を用いて製造することもできる。
【０２３６】
医薬的に適合性の結合剤および/またはアジュバント物質を該組成物の部分として用いることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、あらゆる以下の成分または同様の性質の化合物を含むことができる：結合剤、例えば微晶質セルロース、トラガカントガム、またはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンまたはラクトース；崩壊剤、例えばアルギン酸、Primogel(プリモゲル)、またはコーンスターチ：潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはSterotes(ステロテス）；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えばショ糖またはサッカリン；または香味料、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味。
【０２３７】
吸入投与用には、該化合物は、適切なプロペラント、例えばガス、例えば二酸化炭素を含む加圧容器またはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形で送達される。
【０２３８】
全身投与は、経粘膜または経皮法によることもできる。経粘膜または経皮投与用には、透過すべきバリアーに適した浸透剤を製剤に用いる。そのような浸透剤は、一般的に当該分野で知られており、例えば経粘膜投与用には界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻内スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与用には、活性化合物を当該分野で一般に知られた軟膏(ointments)、軟膏(salves)、ゲル、またはクリームに製剤化する。
【０２３９】
該化合物は、直腸送達用の、坐剤(例えば、常套的坐剤基剤、例えばココアバターおよび他のグリセリド)または残留浣腸の形で製造することもできる。
【０２４０】
ある態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル送達システムを含む制御放出製剤のような身体からの急速な排泄から化合物を保護する担体を用いて製造される。例えばエチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸を含む、生体分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤の製造方法は当業者に明らかであろう。該物質は、Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals、Inc.から市販品を得ることもできる。リポソームサスペンジョン(その中またはその上に組み込まれたモノクローナル抗体を有するリポソームを含む)を医薬的に許容される担体として用いることもできる。これは、例えば米国特許No.4,522,811に記載の、当業者に知られた方法にしたがって製造することができる。
【０２４１】
それは、経口または非経口用組成物を投与し易い、用量の均一性な剤形で製剤化するのに特に好都合である。本明細書で用いている単位剤形は、各単位が、必要な医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じるよう計算された、予め決定された量の活性化合物を含む、治療する対象のための単位用量として適した物理的に分離した単位を表す。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物のユニークな特性、および達成すべき特定の治療効果、および個体を治療するためのそのような活性化合物を配合する当該分野に特有の制限に直接依存し、決定される。
【０２４２】
抗体について、好ましい用量は、0.1mg/kg〜100mg/kg体重(一般的には10mg/kg〜20mg/kg)である。抗体が脳で作用する場合は、通常、50mg/kg〜100mg/kgの用量が適切である。一般的には、部分的ヒト抗体および完全ヒト抗体は、他の抗体よりヒト体内で半減期が長い。したがって、より低用量で低頻度の投与が可能なことが多い。脂質化のような修飾を用いて、抗体を安定化させ、取り込みおよび組織透過性(例えば上皮内)を増強することができる。抗体の脂質化方法は、Cruikshank et al.(1997)J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193に記載されている。
【０２４３】
本発明のマーカーに対応する核酸配列をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与(米国特許5,328,470)、または定位注射(例えば、Chen et al.、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057参照)により対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬製剤は、許容される希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含むか、または遺伝子送達ビークルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいはまた、完全遺伝子送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターを組換え細胞から完全に生成することができる場合は、医薬製剤は遺伝子送達系をもたらす1またはそれ以上の細胞を含むことができる。
【０２４４】
RNA干渉剤、例えば、本発明の方法に用いるsiRNAはベクター内に挿入することができる。この構築物は、例えば、静脈内注射、局所投与(米国特許5,328,470参照)、または定位注射(例えば、Chen et al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057参照)により対象に送達することができる。該ベクターの医薬製剤は、RNA干渉剤、例えば、許容される希釈剤中のsiRNAベクターを含むか、または遺伝子送達ビークルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいはまた、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターを組換え細胞から完全に生成することができる場合は、該医薬製剤は、遺伝子送達系をもたらす1またはそれ以上の細胞を含むことができる。
【０２４５】
医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー中に投与のための取り扱い説明書とともに含まれ得る。
IX. 予測医学
【０２４６】
本発明は、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノム学、および臨床経過のモニタリングを予後(予測)目的で用いることにより個体を予防的に処置する予測医学の分野にも関する。したがって、本発明のある局面は、本発明の1またはそれ以上のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の量、構造、および/または活性を決定する、個体が癌を生じるリスクがあるか否かを決定するための診断アッセイに関する。そのようなアッセイを予後または予測目的に用い、癌が発生する前に個体を予防的に処置することができる。
【０２４７】
本発明のさらに別の局面は、例えば、癌を阻害し、またはあらゆる他の障害を治療または予防するために投与する薬剤(すなわち、そのような処置が有するかもしれないあらゆる発癌作用を理解するための)薬剤または他の化合物)の、臨床試験における本発明のマーカーの量、構造、および/または活性に対する影響をモニターすることに関する。これらおよび他の薬剤について以下の項により詳細に説明する。
A. 診断アッセイ
1. コピー数の検出方法
【０２４８】
特定マーカーまたは染色体領域(例えばMCR)のコピー数の評価方法は当業者によく知られている。染色体獲得または欠失の存在の有無は、本明細書に記載の領域またはマーカーのコピー数を検出することにより簡単に評価することができる。
【０２４９】
試料中のコーディング核酸のコピー数の評価方法には、限定されるものではないが、ハイブリダイゼーションベースのアッセイが含まれる。例えば、試料中のコーディング核酸のコピー数のある評価方法には、Southernブロットが含まれる。Southernブロットでは、ゲノムDNA(典型的には電気泳動ゲル上で断片化および分離される)は、標的領域に特異的なプローブとハイブリダイズする。標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルと正常ゲノムDNA(例えば、同じまたは関連細胞、組織、器官などの非増幅部分)の分析からの対照プローブシグナルの強度の比較は、標的核酸の相対コピー数の推定値をもたらす。あるいはまた、Northernブロットを、試料中のコーディング核酸のコピー数の評価に用いてもよい。Northernブロットでは、mRNAは標的領域に特異的なプローブとハイブリダイズする。標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルと正常mRNA(例えば、同じまたは関連細胞、組織、器官などの非増幅部分)の分析からの対照プローブシグナルの強度の比較は、標的核酸の相対コピー数の推定値をもたらす。コピー数を決定する別の方法には、in situ ハイブリダイゼーション(例えば、Angerer(1987)Meth. Enzymol 152：649)がある。一般的には、in situ ハイブリダイゼーションは以下の工程を含む：(1)分析する組織または生体構造の固定；(2)標的DNAの接近可能性を増加し、非特異的結合を低下させる生体構造のハイブリダイゼーション前処理；(3)生体構造または組織中の核酸に対する核酸マーカーのハイブリダイゼーション；(4)ハイブリダイゼーションで結合していない核酸断片を除去するためのハイブリダイゼーション後洗浄；および(5)ハイブリダイズした核酸断片の検出。これら工程のそれぞれに用いる試薬および用いる条件は特定の適用に応じて変化する。
【０２５０】
好ましいハイブリダイゼーションベースのアッセイには、限定されるものではないが、、伝統的「直接プローブ」方法、例えばSouthernブロットまたはin situ ハイブリダイゼーション(例えば、FISHおよびFISHプラスSKY)、および「比較プローブ」方法、例えば比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、例えば、cDNAベースまたはオリゴヌクレオチドベースのCGHが含まれる。該方法には、限定されるものではないが、基質(例えば、膜またはガラス)結合法またはアレイベースのアプローチを含む種々のフォーマットを用いることができる。
【０２５１】
典型的in situハイブリダイゼーションアッセイにおいて、細胞は、固体支持体、典型的にはガラススライドに固定される。核酸をプローブする場合は、細胞を典型的には熱またはアルカリで変性させる。次に、細胞を、タンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識プローブのアニーリングを可能にする中程度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させる。次に、標的(例えば、細胞)を、典型的には適切なシグナル/ノイズ比が得られるまで予め決定したストリンジェンシーまたは増加するストリンジェンシーで洗浄する。
【０２５２】
該プローブは、典型的には例えば放射性同位元素または蛍光レポーターで標識される。好ましいプローブは、ストリンジェント条件下で標的核酸と特異的にハイブリダイズするように十分に長い。好ましいサイズ範囲は約200塩基〜約1000塩基である。
【０２５３】
ある適用において、反復配列のハイブリダイゼーション能をブロックする必要がある。すなわち、ある態様において、tRNA、ヒトゲノムDNA、またはCot-I DNAを用いて非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする。
【０２５４】
CGH法において、核酸の第1収集物(例えば試料、例えば腫瘍と思われるもの由来)は、第1標識で標識されるが、核酸の第2収集物(例えば対照、例えば健康細胞/組織由来)は第2標識で標識される。該核酸のハイブリダイゼーション比は、アレイの各繊維と結合する2(第1および第2)標識の比により決定される。染色体欠失または増幅がある場合は、2つの標識からのシグナルの比の違いが検出され、該比はコピー数の指標をもたらすであろう。アレイベースのCGHは単色標識で行うこともできる(対照および可能性のある腫瘍試料の2つの異なる色素で標識し、ハイブリダイゼーション前にそれらを混合するのとは異なり、アレイ上のプローブの競合ハイブリダイゼーションにより比が生じるであろう。)。単色CGHにおいて、対照を標識し、一方のアレイとハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読み、および可能性のある腫瘍試料を標識し、第2アレイ(同じ容量の)とハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読む。コピー数の差を、2つのアレイからの絶対シグナルに基づいて計算する。本発明の方法で用いるのに適したハイブリダイゼーションプロトコールは、例えばAlbertson(1984)EMBO J. 3：1227-1234；Pinkel(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：9138-9142；EPO Pub. No. 430,402；Method in Molecular Biology、Vol. 33：In situ Hybridization Protocols、Choo、ed.、Humana Press、Totowa、N.J.(1994)などに記載されている。ある態様において、Pinkel、et al.(1998)Nature Genetics 20：207-211、またはKallioniemi(1992)Proc. Natl Acad Sci USA 89:5321-5325(1992)のハイブリダイゼーションプロトコールを用いる。
【０２５５】
本発明の方法は、アレイベースのハイブリダイゼーションフォーマットに特に好適である。アレイベースのCGHは、米国特許No.6,455,258(この内容は本明細書の一部を構成する。)に記載されている。
【０２５６】
さらに別の態様において、増幅ベースのアッセイを用いてコピー数を測定することができる。そのような増幅ベースのアッセイにおいて、核酸配列は、増幅反応(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において鋳型として作用する。定量的増幅において、増幅産物の量は最初の試料中の鋳型の量に比例するであろう。適切な対照、例えば健康組織との比較はコピー数の測定をもたらす。
【０２５７】
「定量的」増幅の方法は、当業者によく知られている。例えば、定量的PCRは、同じプライマーを用いる既知量の対照配列の同時増幅を含む。これは、PCR反応を較正するのに用いることができる内部標準を提供する。定量的PCRに対する詳細なプロトコールは、Innis、et al.(1990)PCR Protocols、Guide to Method and Applications、Academic Press、Inc. N.Y.)に記載されている。定量的PCR分析を用いるマイクロサテライト遺伝子座のDNAコピー数の測定は、Ginzonger et al.(2000)Cancer Research 60:5405-5409に記載されている。該遺伝子に対する知られた核酸配列は、当業者が該遺伝子のあらゆる部分を増幅するためのプライマーを常套的に選択することができるようにするのに十分である。蛍光定量的PCRも本発明の方法に用いてよい。蛍光定量的PCRにおいて、定量は、蛍光シグナル、例えば、TaqManおよびsybrグリーンの量に基づく。
【０２５８】
他の適切な増幅方法には、限定されるものではないが、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Wu and Wallace(1989)Genomics 4：560、Landegren、et al.(1988)Science 241:1077、およびBarringer et al.(1990)Gene 89：117参照)、転写増幅(Kwoh、et al.(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：1173)、自己維持配列複製(Guatelli、et al.(1990)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87：1874)、ドットPCR、およびリンカーアダプターPCRなどが含まれる。
【０２５９】
ヘテロ接合性(LOH)マッピングの損失(Wang、Z.C. et al.(2004)Cancer Res 64(1):64-71；Seymour、A. B. et al.(1994)Cancer Res 54、2761-4；Hahn、S. A. et al.(1995)Cancer Res 55、4670-5；Kimura、M. et al.(1996)Genes Chromosomes Cancer 17、88-93)を用いて、増幅または欠失の領域を同定してもよい。
2. 遺伝子発現の検出方法
【０２６０】
マーカー発現レベルは、癌または癌発生のリスクの診断方法としてアッセイすることができる。本発明のマーカーの発現は、転写分子またはタンパク質の発現を検出するための種々のあらゆるよく知られた方法により評価してよい。そのような方法の非限定的例には、分泌、細胞表面、細胞質、または核タンパク質の免疫学的検出方法、タンパク質精製方法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法、および核酸増幅法が含まれる。
【０２６１】
好ましい態様において、特定遺伝子の活性は、遺伝子転写物(例えばmRNA)の測定、翻訳タンパク質の量の測定、または遺伝子産物活性の測定により特徴づけられる。マーカー発現は、mRNAレベル、タンパク質レベル、またはタンパク質活性の検出を含む種々の方法(いずれも標準技術を用いて測定することができる)を用いてモニターすることができる。検出は、遺伝子発現(例えば、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、タンパク質、または酵素活性)のレベルの定量を含むことができる。あるいはまた、特に対照レベルと比較した遺伝子発現レベルを定量的に評価することができる。検出されるレベルの種類は文脈から明らかであろう。
【０２６２】
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いる遺伝子転写物(それから作製したmRNAまたはcDNA)の検出および/または定量方法は当業者によく知られている(Sambrook et al. 上記)。例えば、cDNAの存在、非存在、または量のある評価方法には上記Southernトランスファーが含まれる。簡単には、mRNAを単離し(例えば、酸グアニジニウム-フェノール-クロロホルム抽出法、Sambrook et al. 上記を含む)、逆転写してcDNAを作製する。次に、cDNAを所望により消化し、緩衝液中でゲルに流し、膜に移す。次に、標的cDNAに特異的な核酸プローブを用いてハイブリダイゼーションを行う。
【０２６３】
そのような診断および予後的アッセイの一般的原理は、マーカーおよびプローブの相互作用および結合を可能にするのに十分な時間、適切な条件下でマーカーおよびプローブを含む試料または反応混合物を作製し、反応混合物中に除去および/または検出することができる複合体を形成させることを含む。これらアッセイは種々の方法で行うことができる。
【０２６４】
例えば、そのようなアッセイを行うためのある方法には、マーカーまたはプローブを固相支持体(基質ともいう)上に固定し、反応の終わりに固相上に固定された標的マーカー/プローブ複合体を検出することが含まれよう。そのような方法のある態様において、マーカーの存在および/または濃度をアッセイする対象の試料は、担体または固相支持体上に固定することができる。別の態様において、逆の状況が可能であり、プローブを固相に固定し、対象由来の試料を該アッセイの非固定成分と反応させることができる。
【０２６５】
アッセイ成分を固相に固定するため多くの確立された方法がある。これには、限定されるものではないが、ビオチンとストレプトアビジンの結合を介して固定されるマーカーまたはプローブ分子が含まれる。そのようなビオチン化アッセイ成分は、当該分野で知られた技術(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals、Rockford、IL)を用いてビオチン-NHS(N-ヒドロキシ-スクシンイミド)から作製し、ストレプトアビジンコートした96ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェル中に固定することができる。ある態様において、固定アッセイ成分を有する表面を予め作製し、保存することができる。
【０２６６】
そのようなアッセイのための他の適切な担体または固相支持体には、マーカーまたはプローブが属する分子のクラスと結合することができるあらゆる物質が含まれる。よく知られた支持体または担体には、限定されるものではないが、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロス(gabbros)、およびマグネタイト(magnetite)が含まれる。
【０２６７】
上記アプローチを用いるアッセイを行うために、非固定成分を第2成分が固定される固相に加える。反応が完結した後、形成されたあらゆる固相上に固定されたままであるような条件下で非複合体成分を除去してよい(例えば洗浄により)。固相に固定したマーカー/プローブ複合体の検出は、本明細書に記載の多くの方法を用いて達成することができる。
【０２６８】
好ましい態様において、プローブは、それが非固定アッセイ成分であるときは、アッセイの検出および読み取りのために、本明細書に記載の、当業者によく知られた検出可能な標識で直接または間接的に標識することができる。
【０２６９】
例えば、蛍光エネルギートランスファー技術を利用して(例えば、Lakowicz et al.、米国特許No.5,631,169；Stavrianopoulos、et al.、米国特許No.4,868,103参照)いずれかの成分(マーカーまたはプローブ)をさらに操作または標識することなくマーカー/プローブ複合体形成を直接検出することもできる。第1「ドナー」分子の蛍光色素分子標識は、適切な波長の入射光で励起すると、その放射蛍光エネルギーが順に吸収エネルギーにより蛍光を発することができる第2「アクセプター」分子の蛍光標識に吸着されるように選択される。あるいはまた、「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを簡単に利用することができる。「アクセプター」分子標識を「ドナー」のそれから識別できるように、異なる波長の光を放射する標識を選択する。標識間のエネルギー伝達の効率は分子を分離する距離に関連するので、分子間の空間的関係を評価することができる。結合が分子間に生じる状況において、アッセイ中の「アクセプター」分子標識の蛍光放射は最大になるはずである。FET結合事象は、当該分野でよく知られた標準的蛍光分析検出手段により(例えば蛍光光度計を用いて)好都合に測定することができる。
【０２７０】
別の態様において、プローブのマーカー認識能の検出は、リアルタイムBiomolecular Interaction Analysis(BIA)のような技術を利用し、いずれのアッセイ成分(プローブまたはマーカー)も標識せずに達成することができる(例えば、Sjolander、S. and Urbaniczky、C.、1991、Anal. Chem. 63:2338-2345およびSzabo et al.、1995、Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705参照)。本明細書で用いている、「BIA」または「表面プラズモン共鳴」は、いかな反応体(例えば、BIAcore)も標識せずにリアルタイムで生体特異的相互作用を研究するための技術である。結合表面の質量変化(結合事象を示唆する)は該表面付近の光の反射インデックスの変化(表面プラズモン共鳴(SPR)の光学現象)を生じ、生物分子間のリアルタイム反応の指標として用いることができる検出可能なシグナルを生じる。
【０２７１】
あるいはまた、別の態様において、類似診断および予後アッセイは、マーカーおよびプローブを溶質として液相中で行うことができる。そのようなアッセイにおいて、複合体化したマーカーおよびプローブを、限定されるものではないが、分画遠心法、クロマトグラフィ、電気泳動、および免疫沈降法を含むあらゆる多くのあらゆる標準的技術により非複合体化成分から分離する。分画遠心法において、マーカー/プローブ複合体は、その異なるサイズおよび密度に基づく複合体の異なる沈降平衡により一連の遠心工程を介して非複合体アッセイ成分から分離することができる(例えば、Rivas、G.、およびMinton、A.P.、1993、Trends Biochem Sci. 18(8):284-7参照)。標準的クロマトグラフィ技術を利用して複合体分子を非複合体分子から分離することができる。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィは、サイズに基づき、カラムフォーマット中の適切なゲルろ過樹脂の利用により分子を分離し、例えば比較的大きな複合体を比較タンパク質系小さな非複合体成分から分離することができる。同様に、マーカー/プローブ複合体の非複合体成分に比べて比較的異なる荷電特性を、例えば、イオン交換クロマトグラフィ樹脂の利用を通して複合体から非複合体成分を分別するのに生かすことができる。そのような樹脂およびクロマトグラフィ技術は当業者によく知られている(例えば、Heegaard、N.H.、1998、J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8；Hage、D.S.、およびTweed、S.A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(1-2):499-525参照)。ゲル電気泳動を用いて、複合体アッセイ成分を非結合成分から分離してよい(例えば、Ausubel et al.、ed.、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、1987-1999参照)。この技術において、タンパク質または核酸複合体は、例えばサイズまたは荷電に基づいて分離する。電気泳動プロセス中の結合相互作用を維持するために、非変性ゲルマトリックス物質および還元剤の非存在下条件が典型的には好ましい。特定のアッセイおよびその成分に適した条件は当該分野によく知られている。
【０２７２】
特定の態様において、該マーカーに対応するmRNAのレベルは、当該分野で知られた方法を用いる生物試料のin situおよびin vitroフォーマットの両方により決定することができる。用語「生物試料」は、組織、細胞、生体液、および対象、ならびに対象中に存在する組織、細胞、および液体から単離したその単離物を含むことを意図する。多くの発現検出方法には単離されたRNAを用いる。in vitro法において、mRNAの単離に対して選択しないあらゆるRNA単離技術を細胞からのRNAの精製に利用することができる(例えば、Ausubel et al.、ed.、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York 1987-1999参照)。あるいはまた、多数の組織試料を、例えばChomczynskiの1ステップRNA単離法(1989、米国特許No.4,843,155)のような当業者によく知られた技術を用いて容易に処理することができる。
【０２７３】
単離核酸を、限定されるものではないが、SouthernまたはNorthern分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析、およびプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに用いることができる。mRNAレベルを検出するためのある好ましい診断法は、該単離mRNAを、検出する遺伝子によりコードされるmRNAとハイブリダイズすることができる核酸分子(プローブ)と接触させることを含む。該核酸プローブは、例えば、完全長cDNA、またはその部分、例えば長さ少なくとも7、15、30、50、100、250 または500ヌクレオチドの、本発明のマーカーをコードするmRNAまたはゲノムDNAとストリンジェント条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドでありうる。本発明の診断アッセイに用いるのに適した他のプローブは本明細書に記載されている。mRNAと該プローブのハイブリダイゼーションは、目的のマーカーが発現していることを示す。
【０２７４】
あるフォーマットにおいて、例えば、アガロースゲルに単離mRNAを流し、mRNAをゲルからニトロセルロースのような膜に移すことにより、mRNAを固体表面に固定し、プローブと接触させる。別のフォーマットにおいて、例えば、Affymetrix遺伝子チップアレイにおいて、プローブを固体表面に固定し、mRNAをプローブと接触させる。当業者は、本発明のマーカーによりコードされるmRNAのレベルの検出に用いる既知のmRNA検出法を容易に適応させることができる。
【０２７５】
該プローブは、タンパク質をコードする核酸配列の完全長または完全長以下でありうる。より短いプローブについて、経験的に特異性が試験される。好ましい核酸プローブは長さ20塩基またはそれ以上である。(核酸ハイブリダイゼーションに使用するための核酸プローブ配列の選択方法については、例えばSambrook et al.参照。)ハイブリダイズした部分の可視化はcDNAの存在の有無の定性的決定を可能にする。
【０２７６】
試料中の本発明のマーカーに対応する転写物のレベルを測定する別の方法は、例えば、rtPCR(Mullis、1987、米国特許No.4,683,202に記載の実験的態様)、リガーゼ連鎖反応(Barany、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:189-193)、自己持続配列増幅(Guatelli et al.、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh et al.、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-ベータレプリカーゼ(Lizardi et al.、1988、Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークル複製(Lizardi et al.、米国特許No.5,854,033)、またはあらゆる他の核酸増幅法による核酸増幅、次いで当業者によく知られた技術を用いて増幅した分子の検出を含む。蛍光性rtPCRを本発明の方法に用いてもよい。蛍光性rtPCRにおいて、定量は、蛍光シグナル、例えばTaqManおよびsybrグリーンの量に基づく。これら検出スキームは、特に、非常に小数の核酸分子が存在する場合に、該分子の検出に有用である。本明細書で用いている増幅プライマーは、遺伝子の5'または3'領域(それぞれ、プラスおよびマイナス鎖、またはその逆もある)とアニールすることができ、その間に短領域を含む核酸分子のペアとして定義される。一般的には、増幅プライマーは、長さ約10〜30ヌクレオチドであり、長さ約50〜200ヌクレオチドのフランク領域である。適切な条件下、適切な試薬を用いて、そのようなプライマーはプライマーの側面に位置するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【０２７７】
in situでは、mRNAは、検出前に細胞から単離する必要がない。そのような方法では、細胞または組織試料は既知の組織学的方法を用いて製造/処理される。次に、該試料を支持体、典型的にはガラススライド上に固定し、次いで該マーカーをコードするmRNAとハイブリダイズすることができるプローブと接触させる。
【０２７８】
該マーカーの絶対発現レベルに基づいて測定する代替法として、測定はマーカーの正規化発現レベルに基づいてよい。発現レベルは、マーカーの絶対発現レベルを、マーカーでない遺伝子、例えば、構成的に発現するハウスキーピング遺伝子の発現と比較することにより修正することにより正規化される。正規化に適した遺伝子には、ハウスキーピング遺伝子、例えばアクチン遺伝子、または上皮細胞特異的遺伝子が含まれる。この正規化は、ある試料、例えば対象試料中の発現レベルを別の試料、例えば非癌試料についての、または異なる供給源由来の試料間での発現レベルと比較を可能にする。
【０２７９】
あるいはまた、該発現レベルを相対発現レベルとして得ることができる。マーカーの相対発現レベルを測定するため、目的の試料について発現レベルを測定する前に、該マーカーの発現レベルを正常対癌細胞単離物の10またはそれ以上の試料、50またはそれ以上の試料について測定する。より多数の試料におけるアッセイした遺伝子それぞれの平均発現レベルを測定し、これを該マーカーのベースライン発現レベルとして用いる。次に、被検試料について測定した該マーカーの発現レベル(絶対発現レベル)を該マーカーについて得られた平均発現値で割る。これにより相対発現レベルが得られる。
【０２８０】
好ましくは、ベースラインの決定に用いる試料は、同じ組織タイプの癌細胞または正常細胞由来であろう。細胞供給源の選択は、相対発現レベルの仕様に依存する。正常組織に見られる発現を平均発現スコアとして用いることは、アッセイしたマーカーが細胞が由来する組織に特異的か否か(対正常細胞)の検証を助ける。さらに、よりデータが蓄積されるにつれ、平均発現値を訂正し、蓄積データに基づく改善された相対発現値を得ることができる。正常細胞からの発現データは癌の状態の重症度をグレード付けする手段を与える。
【０２８１】
別の好ましい態様において、マーカーの発現は、対象試料中の細胞由来のゲノムDNAまたはmRNA/cDNA(すなわち、転写ポリヌクレオチド)を調製し、該ゲノムDNAまたはmRNA/cDNAを、マーカーおよびその断片を含むポリヌクレオチドの相補物である参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより評価する。cDNAは、所望により、参照ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション前に種々のあらゆるポリメラーゼ連鎖反応法を用いて増幅させることができる。1またはそれ以上のマーカーの発現は、同様にマーカーの発現レベルを評価するための定量的PCR(QPCR)を用いて検出することができる。あるいはまた、本発明のマーカーの突然変異または変異体(例えば、単ヌクレオチド多形、欠失など)のあらゆる多くの知られた検出方法を用いて対象の突然変異マーカーの出現を検出することができる。
【０２８２】
関連する態様において、試料から得た転写ポリヌクレオチドの混合物を、本発明のマーカーの少なくとも部分(例えば、少なくとも7、10、15、20、25、30、40、50、100、500ヌクレオチド残基またはそれ以上)と相補的またはホモローガスなポリヌクレオチドと固定された基質と接触させる。相補的またはホモローガスなポリヌクレオチドが基質(例えば、異なる発色団または蛍光色素分子を用いて検出できるか、または異なる選択した位置に固定した)を用いて分別的に検出可能である場合は、複数のマーカーの発現レベルを1つの基質(例えば、選択した位置に固定されたポリヌクレオチドの「遺伝子チップ」マイクロアレイ)を用いて同時に評価することができる。該核酸と別の核酸のハイブリダイゼーションを含むマーカー発現の評価方法を用いる場合は、ハイブリダイゼーションをストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で行うことが好ましい。
【０２８３】
別の態様において、マーカーの発現を評価する方法の組み合わせを利用する。
【０２８４】
本発明の組成物、キット、および方法は、1またはそれ以上の本発明のマーカーの発現レベルまたはコピー数の差の検出を利用するので、該マーカーの発現レベルまたはコピー数は、少なくとも1の正常細胞および癌性細胞中の発現またはコピー数を評価するのに用いる方法の最小検出限界より有意に大きいことが好ましい。
3. 発現タンパク質の検出方法
【０２８５】
マーカータンパク質の活性またはレベルは、発現ポリペプチドを検出または定量することにより検出および/または定量することもできる。該ポリペプチドは当業者によく知られた多くのあらゆる手段により検出および定量することができる。これらは、分析的生化学的方法、例えば電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)、薄層クロマトグラフィ(TLC)、高拡散クロマトグラフィなど、または種々の免疫学的方法、例えば液体またはゲル沈降反応、免疫拡散(単または二重)、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫測定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、Westernブロッティングなどを含むことができる。当業者は、細胞が本発明のマーカーを発現するか否かを検出するのに用いるための既知のタンパク質/抗体検出方法を容易に適応させることができる。
【０２８６】
本発明のポリペプチドを検出するための好ましい物質は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドと結合することができる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナル、より好ましくはモノクローナルである。完全抗体またはその断片(例えば、FabまたはF(ab')2)を用いることができる。プローブまたは抗体に関して用語「標識された」は、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングさせる(すなわち、物理的に結合させる)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、および直接標識された別の試薬と反応させることによるプローブまたは抗体の間接標識を含むことを意図する。間接標識の例には、蛍光標識第2抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識したストレプトアビジンで検出できるようにDNAプローブの末端をビオチンで標識することが含まれる。
【０２８７】
好ましい態様において、該抗体は、標識、例えば、放射性標識、発色団標識、蛍光色素分子標識、または酵素標識された抗体である。別の態様において、抗体誘導体(例えば、タンパク質-リガンドペア{例えば、ビオチン-ストレプトアビジン}のタンパク質またはリガンドとまたは基質と結合した抗体)、またはその正常翻訳後修飾のすべてまたは部分を受けた該マーカーまたはそのようなタンパク質に対応するオープンリーディングフレームによりコードされるタンパク質のような、該マーカーに対応するタンパク質と特異的に結合する抗体断片(例えば、一本鎖抗体、単離された超可変ドメインなど)を用いる。
【０２８８】
細胞由来のタンパク質は当業者によく知られた技術を用いて単離することができる。用いるタンパク質単離方法は、例えば、Harlow and Lane(Harlow and Lane、1988、Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York)に記載のものでありうる。
【０２８９】
あるフォーマットにおいて、抗体または抗体断片を、発現タンパク質を検出するためのWesternブロットまたは免疫蛍光技術のような方法に用いることができる。そのような使用において、一般的には固体支持体上に抗体またはタンパク質を固定することが好ましい。適切な固相支持体または担体には、抗原または抗体と結合することができるあらゆる支持体が含まれる。よく知られた支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロス、およびマグネタイトが含まれる。
【０２９０】
当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適切な担体を知っており、本発明に用いるそのような支持体を適合させることができるであろう。例えば、細胞から単離したタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースのような固相支持体上に固定することができる。次に、該支持体を適切な緩衝液で洗浄し、次いで検出可能な標識抗体で処理することができる。次に、該固相支持体を2度目に緩衝液で洗浄し、非結合抗体を除去することができる。次いで、固相支持体上の結合標識量を常套的手段により検出することができる。電気泳動技術を用いるタンパク質の検出手段は当業者によく知られている(一般的には、R. Scopes(1982)Protein Purification、Springer-Verlag、N.Y.；Deutscher、(1990)Method in Enzymology Vol. 182：Guide to Protein Purification、Academic Press、Inc.、N.Y.参照)。
【０２９１】
別の好ましい態様において、Westernブロット(イムノブロット)分析を用いて試料中のポリペプチドの存在を検出および定量する。この技術は、一般に、分離量に基づくゲル電気泳動により試料タンパク質を分離し、分離したタンパク質を適切な固体支持体(例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化ナイロンフィルター)に移し、次いで、該試料を、ポリペプチドと特異的に結合する抗体とインキュベーションすることを含む。抗ポリペプチド抗体は、固体支持体上のポリペプチドと特異的に結合する。この抗体は直接標識するか、または抗ポリペプチドと特異的に結合する標識抗体(例えば、標識ヒツジ抗ヒト抗体)を用いてその後検出することができる。 
【０２９２】
より好ましい態様において、該ポリペプチドはイムノアッセイを用いて検出される。本明細書で用いているイムノアッセイは、検体と特異的に結合する抗体を利用するアッセイである。すなわち、イムノアッセイは、検体を単離、標的化、および定量するための他の物理的または化学的特性を用いるのと対照的に、抗抗体(anti-antibody)に対するポリペプチドの特異的結合を検出することを特徴とする。
【０２９３】
該ポリペプチドは、多くのあらゆるよく知られた免疫結合アッセイ(例えば、U.S. Pat. Nos. 4,366,241；4,376,110；4,517,288；and 4,837,168参照)を用いて検出および/または定量される。一般的イムノアッセイの概説についてはAsai(1993)方法in Cell Biology Volume 37：Antibodies in Cell Biology、Academic Press、Inc. New York；Stites & Terr(1991)Basic and Clinical Immunology 第7版参照のこと。
【０２９４】
免疫結合アッセイ(またはイムノアッセイ)は、典型的には検体(ポリペプチドまたは部分配列)と特異的に結合し、しばしば固定するための「捕捉剤(補足物質)」を利用する。捕捉剤は、検体と特異的に結合する部分である。好ましい態様において、捕捉剤はポリペプチドと特異的に結合する抗体である。抗体(抗ペプチド)は、当業者によく知られた多くのあらゆる手段により製造することができる。
【０２９５】
イムノアッセイは、しばしば、捕捉剤および検体により形成される結合複合体と特異的に結合し、標識する標識剤も利用する。標識剤は、それ自身、抗体/検体複合体を含む部分の1つであってよい。すなわち、標識剤は、標識ポリペプチドまたは標識抗抗体であってよい。あるいはまた、標識剤は、抗体/ポリペプチド複合体と特異的に結合する別の抗体のような第3部分であってよい。
【０２９６】
ある好ましい態様において、標識剤は標識を有する第2ヒト抗体である。あるいはまた、該第2抗体は、標識を欠いてもよいが、該第2抗体が誘導される種の抗体に特異的な、標識された第3抗体により結合されることができる。第2抗体は、第3標識分子、例えば酵素標識ストレプトアビジンが特異的に結合することができるビオチンのような検出可能な部分で修飾することができる。
【０２９７】
プロテインＡまたはプロテインＧのような免疫グロブリン定常領域と特異的に結合することができる他のタンパク質を標識剤として用いてもよい。これらタンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の正常構成成分である。それらは種々の種由来の免疫グロブリン定常領域と強い非特異反応性を有する(一般的には、Kronval、et al.(1973)J. Immunol.、111：1401-1406、およびAkerstrom(1985)J. Immunol.、135：2589-2542参照)。
【０２９８】
上記のごとく、ポリペプチドの検出および/または定量のためのイムノアッセイは、当業者によく知られた種々のフォーマットをとることができる。
【０２９９】
ポリペプチドを検出するための好ましいイムノアッセイは、競合的または非競合的である。非競合的イムノアッセイは、捕捉された検体の量を直接測定するアッセイである。ある好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、例えば捕捉剤(抗ペプチド抗体)は、それが固定される固体基質と直接結合することができる。次に、この固定抗体は被検試料中に存在するポリペプチドを捕捉する。このように固定されたポリペプチドは、標識剤、例えば標識保持第2ヒト抗体により結合される。
【０３００】
競合アッセイでは、試料中に存在する検体(ポリペプチド)の量を、試料中に存在する検体により捕捉剤(抗ペプチド抗体)から置換(または競合除去(competed away))された加えた(外来)検体の量を測定することにより間接的に測定する。ある競合アッセイにおいて、既知量の(この場合は)ポリペプチドを試料に加え、次いで試料を捕捉剤と接触させる。抗体と結合したポリペプチドの量は、試料中に存在するポリペプチドの濃度と逆比例する。
【０３０１】
ある特定の好ましい態様において、抗体を固体基質上に固定する。抗体と結合したポリペプチドの量は、ポリペプチド/抗体複合体中に存在するポリペプチドの量を測定するか、または残存する非複合体化ポリペプチドの量を測定することにより測定することができる。ポリペプチドの量は標識ポリペプチドを得ることにより検出することができる。
【０３０２】
本発明のアッセイは、当業者によく知られた標準的方法に従ってスコア付けされる(ポリペプチドの陽性または陰性または量として)。特定のスコアリング法は、アッセイフォーマットおよび標識の選択に依存する。例えば、Westernブロットアッセイは、酵素標識により産生される着色生成物を可視化することによりスコア付けすることができる。正しい分子量の明確に可視的な着色バンドまたはスポットを陽性結果とスコア付けするが、明確な可視的スポットまたはバンドがなければ陰性としてスコア付けする。バンドまたはスポットの強度はポリペプチドの定量的測定をもたらすことができる。
【０３０３】
本明細書に記載の種々のイムノアッセイに用いる抗体は本明細書に記載のごとく製造することができる。
【０３０４】
別の態様において、レベル(活性)は、遺伝子産物の酵素活性を測定することによりアッセイされる。酵素活性のアッセイ法は、当業者によく知られている。
【０３０５】
マーカータンパク質を検出するためのin vivo技術には、該タンパク質に対する標識抗体を対象に導入することが含まれる。例えば、該抗体は、対象中の存在および局在を標準的画像化技術により検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
【０３０６】
本発明の方法により同定されるある種のマーカーは分泌タンパク質であってよい。あらゆる特定のマーカータンパク質が分泌タンパク質であるか否かを決定することは当業者には簡単な事である。この決定を行うには、該マーカータンパク質を、例えば、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞株中で発現させ、細胞外液を回収し、細胞外液中の該タンパク質の有無を評価する(例えば、該タンパク質と特異的に結合する標識抗体を用いて)。
【０３０７】
以下のものがタンパク質の分泌を検出するのに用いることができる方法の例である。約8 x 105 293T細胞を、5%(v/v)CO2/95%空気雰囲気下、増殖培地(10%ウシ胎児血清添加Dulbecco改良Eagle培地(DMEM))を含むウェル中で37℃で〜約60-70%コンフルエントまでインキュベーションする。次に、該細胞を、1ウェルあたり該タンパク質をコードする発現ベクターを含むDNA 2mgと10μLのLipofectAMINE(登録商標)(GIBCO/BRL Catalog no. 18342-012)を含む標準的トランスフェクション混合物を用いてトランスフェクションする。該トランスフェクション混合物を約5時間維持し、次いで新鮮増殖培地で交換して空気雰囲気下で維持する。各ウェルをメチオニンまたはシステイン不含DMEM(DMEM-MC；ICN Catalog no. 16-424-54)で2回静かにリンスする。約1mLのDMEM-MCおよび約50μキュリーのTrans-35S(登録商標)試薬(ICN Catalog no. 51006)を各ウェルに加える。ウェルを上記5%CO2雰囲気下で維持し、特定の期間37℃でインキュベーションする。インキュベーション後、150μLの順化培地を取り出し、遠心して浮遊細胞およびデブリ(屑)を除去する。上清中の該タンパク質の存在が該タンパク質が分泌されたことを示す。
【０３０８】
対象試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、口腔掻き取り物、唾液、脳脊髄液、尿、大便、気管支肺胞洗浄物、および肺組織を含む試料は、特に細胞が癌性、より具体的には該癌が転移性である時は細胞を含み得るので、本発明の方法に用いることができると認識されよう。もちろん、細胞試料には、種々のよく知られた回収後調製および保存技術(例えば、核酸および/またはタンパク質抽出、固定、保存、凍結、限外ろ過、濃縮、蒸発、遠心など)を施し、次いで、試料中の該マーカーの発現レベルを評価することができる。すなわち、本発明の組成物、キット、および方法を用い、マーカーを発現する細胞の表面上に表現される少なくとも1の部分を有するタンパク質に対応するマーカーの発現を検出することができる。あらゆる特定のマーカーに対応するタンパク質が細胞表面タンパク質を含むか否かを決定することは当業者には簡単な事である。例えば、免疫学的方法を用いて、全細胞上のそのようなタンパク質を検出するか、またはよく知られたコンピューターを用いる配列分析方法(例えば、シグナルPプログラム；Nielsen et al.、1997、Protein gineering 10:1-6)を用い、少なくとも1の細胞外ドメイン(すなわち、少なくとも1の細胞表面ドメインを有するタンパク質および分泌タンパク質の両方を含む)の存在を予測することができる。マーカーを発現する細胞の表面に表現される少なくとも1の部分を有するタンパク質に対応するマーカーの発現は、(例えば、該タンパク質の細胞表面ドメインと特異的に結合する標識抗体を用いて)必ずしも細胞を溶解させずに検出することができる。
【０３０９】
本発明は、生物試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、口腔掻き取り物、唾液、脳脊髄液、尿、大便、気管支肺胞洗浄物、および肺組織を含む試料中の、本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の存在を検出するためのキットも含む。そのようなキットは対象が癌に罹患しているか、または癌を生じるリスクが増大しているかを検討するのに用いることができる。例えば、該キットは、生物試料中の、本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたはポリペプチドをコードするmRNAを検出することができる標識された核酸配列または物質、および試料中のポリペプチドまたはmRNAの量を測定するための手段(例えば、該ポリペプチドと結合する抗体、または該ポリペプチドをコードするDNAまたはmRNAと結合するオリゴヌクレオチドプローブ)を含むことができる。キットは該キットを用いて得られる結果を解釈するための説明書を含むこともできる。
【０３１０】
抗体ベースのキットについては、該キットは、例えば、(1)本発明のマーカーに対応するポリペプチドと結合する第1抗体(例えば固体支持体と結合した)；および、所望により(2)ポリペプチドまたは第1抗体と結合する、検出可能な標識と結合した、異なる第2抗体を含むことができる。
【０３１１】
オリゴヌクレオチドベースのキットでは、該キットは、例えば、(1)本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能な標識オリゴヌクレオチド、または(2)本発明のマーカーに対応する核酸分子を増幅するのに有用なプライマー対を含むことができる。該キットは、例えば、緩衝剤、保存料、またはタンパク質安定化剤を含むこともできる。該キットは、さらに、検出可能な標識(例えば、酵素または基質)を検出するのに必要な成分を含むことができる。該キットは、アッセイし、被検試料と比較することができる対照試料または一連の対照試料を含むことができる。該キットの各成分は個々の容器中に入れることができ、種々の容器はすべて該キットを用いて行ったアッセイの結果を解釈するための使用説明書とともに1包装中に入れることができる。
4.  構造変化の検出方法
【０３１２】
本発明は、癌試料中のマーカーの構造変化、例えば、突然変異または対立遺伝子変異体を、対照試料中のマーカーの構造変化、例えば、正常、例えば突然変異と比較することにより、対象が癌に罹患しているか、または癌を生じるリスクがあるか否かを評価する方法も提供する。癌試料中のマーカーの構造変化、例えば、突然変異または対立遺伝子変異体は対象が癌に罹患したことを示す。好ましい検出方法は、多形領域周辺の約5、10、20、25、または30ヌクレオチドを有する、多形部位と重複するプローブを用いる対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の好ましい態様において、対立遺伝子変異体と特異的にハイブリダイズすることができるいくつかのプローブを固相支持体、例えば「チップ」に結合させる。オリゴヌクレオチドは、リソグラフィを含む種々の方法により固体支持体と結合させることができる。例えば、チップは250,000までのオリゴヌクレオチド保持することができる(GeneChip、Affymetrix(登録商標))。「DNAプローブアレイ」とも呼ばれるオリゴヌクレオチドを含むこのチップを用いる突然変異検出分析は、例えばCronin et al.(1996)Human Mutation 7:244に記載されている。ある態様において、チップは、遺伝子の少なくとも1の多形領域のすべての対立遺伝子変異体を含む。次に、固相支持体を被検核酸と接触させ、特異的プローブとのハイブリダイゼーションを検出する。したがって、1またはそれ以上の遺伝子の多くの対立遺伝子変異体の同定は簡単なハイブリダイゼーション実験により同定することができる。例えば、5'上流制御エレメント中のヌクレオチド多形の対立遺伝子変異体の同定は、簡単なハイブリダイゼーション実験により同定することができる。他の検出方法では、対立遺伝子変異体を同定する前にマーカーの少なくとも部分を最初に増幅する必要がある。増幅、例えばPCRおよび/またはLCRは、当該分野で知られた方法に従って実施することができる(Wu and Wallace(1989)Genomics 4:560参照)。ある態様において、細胞のゲノムDNAを2つのPCRプライマーに曝露し、必要量の増幅DNAを得るのに十分な多くのサイクルについて増幅する。好ましい態様において、該プライマーは150〜350塩基対離れて位置する。
【０３１３】
別の増幅方法には、自己持続配列複製(Guatelli、J.C. et al.、(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh、D.Y. et al.、(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-ベータ複製(Lizardi、P.M. et al.、(1988)Bio/Technology 6:1197)、および自己持続配列増幅(Guatelli et al.、(1989)Proc. Nat. Acad. Sci. 87:1874)、および核酸ベースの配列増幅(NABSA)、またはあらゆる他の核酸増幅法が含まれ、次いで当業者によく知られた技術を用いて増幅された分子を検出する。これら検出スキームは、核酸分子が非常に小数で存在する場合のそのような分子の検出に特に有用である。
【０３１４】
ある態様において、当該分野で知られたあらゆる種々のシーケンシング反応を用いて本発明の少なくとも部分を直接シーケンスし、次いで試料配列の配列を対応する参照(対照)配列と比較することにより対立遺伝子変異体、例えば突然変異を検出することができる。典型的シーケンシング反応には、Maxam and Gilbert(Proc. Natl Acad Sci USA(1977)74:560)またはSanger(Sanger et al.(1977)Proc. Nat. Acad. Sci 74:5463)によって開発された技術に基づくものが含まれる。対象アッセイ(Biotechniques(1995)19:448)を行う時は以下によるシーケンシングを含むあらゆる種々の自動化シーケンシング法を利用してよいことも予期される：質量分析法(例えば、米国特許No.5,547,835および国際特許出願公開公報WO 94/16101、発明の名称「DNA Sequencing by Mass Spectrometry」H. Koeter；米国特許No.5,547,835および国際特許出願公開公報WO 94/21822、発明の名称「DNA Sequencing by Mass Spectrometry Via Exonuclease Degradation」、H. Koester)、および米国特許No.5,605,798および国際特許出願 PCT/US96/03651、発明の名称「DNA Diagnostics Based on Mass Spectrometry」、H. Koester；Cohen et al.(1996)Adv Chromatogr 36:127-162；およびGriffin et al.(1993)Appl Biochem Biotechnol 38:147-159)。ある態様において、1、2、または3核酸塩基のみの存在が該シーケンシング反応の決定に必要であることが当業者には明らかであろう。例えば、例えば1ヌクレオチドのみを検出する場合は、A-トラックなどを実施することができる。
【０３１５】
さらに他のシーケンシング法が、例えば、米国特許No.5,580,732、発明の名称「Method of DNA sequencing employing mixed DNA polymer chain probe」および米国特許No.5,571,676、発明の名称「Method for mismatch directed in vitro DNA sequencing」に記載されている。
【０３１６】
ある場合には、対象由来のDNA中のマーカーの特異的対立遺伝子の存在は、制限酵素分析により示すことができる。例えば、特異的ヌクレオチド多形は、別の対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列から欠失している制限部位を含むヌクレオチド配列を生じうる。
【０３１７】
さらなる態様において、開裂剤(例えばヌクレアーゼ、ヒドロキシルアミン、または四酸化オスミウム、およびピペリジン)からの保護を用いて、RNA/RNA DNA/DNA、またはRNA/DNAヘテロ二本鎖中のミスマッチ塩基を検出することができる(Myers、et al.(1985)Science 230:1242)。一般的には、「ミスマッチ開裂」技術は、所望により標識された対照配列、例えば、マーカー対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列を含むRNAまたはDNAを試料核酸、例えば組織試料から得たRNAまたはDNAとハイブリダイズさせることにより形成されるヘテロ二本鎖を得ることにより開始する。二本鎖の二本鎖(double-stranded duplexes)を、対照鎖と試料鎖の塩基対ミスマッチに基づいて形成された二本鎖のような二本鎖の一本鎖領域を開裂する薬剤で処理する。例えば、RNA/DNA二本鎖をRNアーゼで処理し、DNA/DNAハイブリッドをS1ヌクレアーゼで処理してミスマッチ領域を酵素的に消化することができる。他の態様において、ミスマッチ領域を消化するため、DNA/DNAまたはRNA/DNA二本鎖をヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域の消化後、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲルでサイズによって分離し、対照および試料核酸が同じヌクレオチド配列を持つかまたはその中のヌクレオチドが異なるかを決定することができる。例えば、Cotton et al(1988)Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397；Saleeba et al(1992)Methods Enzymol. 217:286-295参照。好ましい態様において、対照または試料核酸を検出するために標識する。
【０３１８】
別の態様において、対立遺伝子変異体は、変性高速液体クロマトグラフィ(DHPLC)により同定することができる(Oefner and Underhill、(1995)Am. J. Human Gen. 57:Suppl. A266)。DHPLCは、逆相イオンペアリングクロマトグラフィを用い、その断片内の特定のヌクレオチド遺伝子座がヘテロ接合体である個体からのPCR断片の増幅中に生じるヘテロ二本鎖を検出する(Oefner and Underhill(1995)Am. J. Human Gen. 57:Suppl. A266)。一般的には、PCR産物は、目的のDNAの側面に位置するPCRプライマーを用いて生成される。DHPLC分析を実施し、得られたクロマトグラムを分析し、特異的クロマトグラフィプロフィールに基づき塩基対の変化または欠失を同定する(O'Donovan et al.(1998)Genomics 52:44-49参照)。
【０３１９】
他の態様において、電気泳動移動度の変化を用いてマーカー対立遺伝子変異体のタイプを同定する。例えば、一本鎖コンフォメーション多形(SSCP)を用いて突然変異体と野生型核酸の電気泳動移動度の差を検出する(Orita et al.(1989)Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766、Cotton(1993)Mutat Res 285:125-144；およびHayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 9:73-79も参照)。試料および対照核酸の一本鎖DNA断片を変性させ、次いで復元させる。一本鎖核酸の二次構造は配列に従って変化し、生じる電気泳動移動度の変化は1塩基の変化でも検出することができる。DNA断片を標識するか標識プローブを用いて検出することができる。アッセイの感受性をRNA(DNAよりも)を用いて増大することができる(ここで、二次構造は配列変化により感受性である)。別の好ましい態様において、対象方法は、ヘテロ二本鎖分析を利用し、電気泳動移動度の変化に基づき二本鎖ヘテロ二本鎖分子を分離する(Keen et al.(1991)Trends Genet 7:5)。
【０３２０】
さらに別の態様において、多形領域の対立遺伝子変異体の同一性は、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中で多形領域を含む核酸の移動を分析することにより得られる(変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)を用いてアッセイする)(Myers et al.(1985)Nature 313:495)。DGGEを分析法に用いる場合は、DNAを修飾して、例えば、PCRにより約40bpの高融点GCリッチDNAのGCクランプを加えることにより完全に変性しないことを保障する。さらなる態様において、変性剤勾配の代わりに温度勾配を用い、対照および試料DNAの移動度の変化を同定する(Rosenbaum and Reissner(1987)Biophys Chem 265:1275)。
【０３２１】
2つの核酸間の少なくとも1のヌクレオチドの違いを検出するための技術の例には、限定されるものではないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が含まれる。例えば、既知の多形ヌクレオチドを中心に置いたオリゴヌクレオチドプローブ(対立遺伝子特異的プローブ)を製造し、次いでこれを完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを許す条件下で目的DNAとハイブリダイズさせる(Saiki et al.(1986)Nature 324:163)；Saiki et al(1989)Proc. Natl Acad. Sci USA 86:6230；およびWallace et al.(1979)Nucl. Acids Res. 6:3543)。そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術は、マーカーの異なる多形領域の種々のヌクレオチド変化の同時検出に用いることができる。例えば、特異的対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズ膜と結合し、次いでこの膜は標識試料核酸とハイブリダイズする。次に、ハイブリダイゼーションシグナルの分析は、試料核酸のヌクレオチドの同定を示すであろう。
【０３２２】
あるいはまた、選択的PCR増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と共に用いてよい。特異的増幅のプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、該分子の中心に(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように)(Gibbs et al(1989)Nucleic Acids Res. 17:2437-2448)、または1プライマーの極(extreme)3'末端に(ここで、適切な条件下で、ミスマッチはポリメラーゼ伸長を防ぐか低下させることができる)(Prossner(1993)Tibtech 11:238；Newton et al.(1989)Nucl. Acids Res. 17:2503)、目的の対立遺伝子変異体を保持してよい。この技術は、「PROBE」(Probe Oligo Base Extension(プローブオリゴ塩基伸長))とも呼ばれる。さらに、開裂に基づく検出をもたらすために、突然変異の領域に新規制限部位を導入することが望ましいことがある(Gasparini et al(1992)Mol. Cell Probes 6:1)。
【０３２３】
別の態様において、対立遺伝子変異体の同定は、例えば、米国特許No.4,998,617およびLandegren、U. et al.、(1988)Science 241:1077 1080に記載のオリゴヌクレオチド・ライゲーション(連結)・アッセイ(OLA)を用いて行われる。OLAプロトコールは、標的の一本鎖の隣接配列とハイブリダイズすることができるよう設計された2つのオリゴヌクレオチドを用いる。該オリゴヌクレオチドの1つを分離マーカーと結合させ、例えばビオチン化し、他方を直接標識する。正しい相補配列が標的分子中にある場合は、該オリゴヌクレオチドは、それらの末端が隣接し、連結基質を生じるようにハイブリダイズするであろう。次に、連結は、該標識オリゴヌクレオチドがアビジンまたは別のビオチンリガンドを用いて回収されるのを可能にする。Nickerson、D. A. et al.は、PCRおよびOLAの特性を組み合わせた核酸検出アッセイについて記載している(Nickerson、D. A. et al.、(1990)Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)87:8923 8927)。この方法において、PCRは、標的DNAの指数的増幅を達成するのに用いられ、次いでOLAを用いて検出される。本発明は、さらに、マーカーの1ヌクレオチド多形の検出方法を提供する。1ヌクレオチド多形は、不変配列の領域が側面に位置する変化部位を構成する。その分析は、変化部位に存在する1ヌクレオチドの同一性の決定を必要とするのみであり、各対象について完全な遺伝子配列を決定する必要はない。そのような1ヌクレオチド多形の分析を促進する種々の方法が開発されている。
【０３２４】
ある態様において、1塩基多形は、例えば、Mundy、C. R.(米国特許No.4,656,127)に記載の特殊なエクスヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを用いて検出することができる。該方法によれば、多形部位の直ぐ3’側の対立遺伝子配列に相補的なプライマーは、特定の動物またはヒトから得た標的分子とハイブリダイズするのを可能にする。存在する特定のエクソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体と相補的なヌクレオチドを含む場合は、該誘導体は該ハイブリダイズしたプライマーの末端に組み込まれるであろう。そのような組み込みは、該プライマーをエクソヌクレアーゼに耐性にすることによりその検出を可能にする。試料のエクソヌクレアーゼ耐性誘導体の同定は知られているので、該プライマーがエクソヌクレアーゼに耐性になっている知見は、標的分子の多形部位中に存在する該ヌクレオチドが反応に用いたヌクレオチド誘導体のそれと相補的であることを示す。この方法は、大量の余分な配列データの検討を必要としない利点がある。
【０３２５】
本発明の別の態様において、溶液ベースの方法を、多形部位のヌクレオチドの同一性を決定するのに用いる(Cohen、D. et al. フランス特許2,650,840；PCT出願公開公報WO91/02087)。米国特許No.4,656,127のMundyの方法のごとく、多形部位の直ぐ3'側の対立遺伝子配列と相補的なプライマーを用いる。該方法は、多形部位のヌクレオチドと相補的であれば、該プライマーの末端に組み込まれるようになる標識ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて該部位のヌクレオチドの同一性を決定する。Genetic Bit Analysis(遺伝子ビット分析)またはGBA(登録商標)として知られる別の方法が、Goelet、P. et al.(PCT Appln. No. 92/15712)に記載されている。Goelet、P. et al.の方法は、多形部位の3'側の配列と相補的なプライマーと標識終止暗号の混合物を用いる。すなわち、取り込まれた標識終止暗号は、評価する標的分子の多形部位中に存在するヌクレオチドと相補的であり、それにより決定される。Cohen et al.(French Patent 2,650,840；PCT Appln. No. WO91/02087)の方法と対照的に、Goelet、P. et al.の方法は、好ましくはプライマーまたは標的分子を固相に固定する異種相アッセイである。DNA中の多形部位をアッセイするための種々のプライマー誘導ヌクレオチド組み込み法が記載されている(Komher、J. S. et al.、(1989)Nucl. Acids. Res. 17:7779 7784；Sokolov、B. P.、(1990)Nucl. Acids Res. 18:3671；Syvanen、A.  C. et al.、(1990)Genomics 8:684 692；Kuppuswamy、M. N. et al.、(1991)Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)88:1143 1147；Prezant、T. R. et al.、(1992)Hum. Mutat. 1:159 164；Ugozzoli、L. et al.、(1992)GATA 9:107 112；Nyren、P.(1993)et al.、Anal. Biochem. 208:171 175)。これら方法は、それらがすべて、多形部位の塩基間で識別される標識デオキシヌクレオチドの組み込みに依存する点でGBA(登録商標)と異なる。そのようなフォーマットでは、該シグナルは組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するので、同じヌクレオチドの操作(run)において生じる多形は、該操作の長さに比例したシグナルを生じることができる(Syvanen、A.C. et al.、(1993)Amer. J. Hum. Genet. 52:46 59)。
【０３２６】
マーカーのコーディング領域中に位置する多形領域の対立遺伝子変異体の同一性を決定するには、さらに上記以外の方法を用いることができる。例えば、突然変異マーカーをコードする対立遺伝子変異体の同定は、例えば、免疫化学または免疫沈降法において突然変異体タンパク質を特異的に認識する抗体を用いることにより行うことができる。野生型マーカーまたは突然変異マーカーに対する抗体は当該分野で知られた方法に従って製造することができる。
【０３２７】
あるいはまた、マーカーの活性、例えばマーカーリガンドとの結合を測定することもできる。結合アッセイは当該分野で知られており、例えば、対象から細胞を得、標識リガンドとの結合実験を行い、突然変異タンパク質に対する結合が野生型タンパク質に対する結合と異なるか否かを決定することを含む。
B. 薬理ゲノム学
【０３２８】
本発明のマーカーの量および/または活性に対する刺激または阻害効果を有する物質またはモジュレーターは、対象の癌を(予防的または治療的に)処置するために個体に投与することができる。そのような処置と組み合わせて、個体の薬理ゲノム学(すなわち、個体の遺伝子型とその個体に外来化合物または薬剤に対する応答の関係の研究)を考慮してよい。治療薬の代謝の違いは、薬理学的に活性な薬剤の用量と血中濃度の関係を変化させることにより重大な毒性または治療の失敗をもたらし得る。すなわち、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のための有効な物質(例えば薬)の選択を可能にする。そのような薬理ゲノム学を用いてさらに適切な用量および治療方法を決定することができる。したがって、個体における本発明の量、構造、および/または活性を決定し、個体の治療的または予防的処置に適した物質を選択することができる。
【０３２９】
薬理ゲノム学は、罹患したヒトにおける薬剤の体内動態の変化および異常作用により薬剤に対する応答の臨床的に有意な変化を取り扱う。例えば、Linder(1997)Clin. Chem. 43(2):254-266参照。一般的には、2つのタイプの薬理ゲノム学的状態を区別することができる。薬物が身体に作用する方法を変化させる1因子として伝達された遺伝的状態は、「薬物作用変化」と呼ばれる。身体が薬物に作用する方法を変化させる1因子として伝達された遺伝的状態は、「薬物代謝変化」と呼ばれる。これら薬理ゲノム学的状態は、希な欠陥または多形として生じうる。例えば、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(G6PD)不全は、酸化薬の摂取(抗マラリア薬、スルホンアミド、ニトロフラン)およびソラマメの摂取後の主な臨床的合併症が溶血である一般的遺伝的酵素病である。
【０３３０】
典型的態様において、薬剤代謝酵素の活性は、薬物作用の強度と持続時間の両方の主な決定因子である。薬剤代謝酵素(例えば、N-アセチルトランスフェラーゼ2(NAT 2)およびチトクロームP450酵素CYP2D6およびCYP2C19)の遺伝子多形の発見は、ある対象がなぜ標準的および安全な用量の薬剤を摂取後に期待した薬物効果を得ないのか、または過剰な薬物反応および重大な毒性を示すのかについての説明を与えた。これら多形は、ポピュレーション中の2つの表現型、迅速(extensive)代謝者(EM)および不全代謝者(PM)に発現する。PMの患者数は、種々のポピュレーション間で異なる。例えば、CYP2D6をコードする遺伝子は高度に多形であり、機能的CYP2D6の欠損をもたらす種々の突然変異がPMにおいて同定されている。CYP2D6およびCYP2C19の不全代謝者は、標準的用量を服用すると過剰な薬物反応と副作用を経験することがきわめて多い。代謝物が活性な治療的成分である場合は、PMは、そのCYP2D6形成代謝物モルフィンにより介在されるコデインの鎮痛効果について示されるように、治療的応答を示さないであろう。その他の極端な状態は、標準的用量に応答しない、いわゆる超急速代謝者である。最近、超急速代謝の分子的機序が、CYP2D6遺伝子増幅により同定された。
【０３３１】
すなわち、個々の本発明のマーカーの量、構造、および/または活性を決定することにより、個体の治療的または予防的処置に適した物質を選択することができる。さらに、薬理ゲノム学的研究を用いて、個体の薬物応答性表現型の同定に薬物代謝酵素をコードする多形対立遺伝子の遺伝子型別を適用することができる。この知識は、投薬または薬物選択に適用すると、本発明のマーカーの量、構造、および/または活性のモジュレーターで対象を処置する時に副作用や治療的失敗を避け、治療的または予防的効果を増大させることができる。
C. 臨床試験のモニタリング
【０３３２】
本発明のマーカーの量、構造、および/または活性に対する物質(例えば薬物化合物)の影響のモニタリングは、基本的薬物スクリーニングだけでなく、臨床試験にも適用することができる。例えば、マーカーの量、構造、および/または活性に影響を与える物質の有効性を癌治療を受けた対象の臨床試験においてモニターすることができる。好ましい態様において、本発明は、以下の工程を含む、物質(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、小分子、RNA干渉剤、または他の薬物候補)による対象の治療効果のモニタリング方法を提供する：(i)該物質の投与前に対象から投与前試料を得、(ii)投与前試料中の本発明の1またはそれ以上の選択したマーカーの量、構造、および/または活性を検出し、(iii)対象から1またはそれ以上の投与後試料を得、(iv)投与後試料中のマーカーの量、構造、および/または活性を検出し、(v)投与前試料中のマーカーの量、構造、および/または活性を投与後試料中のマーカーの量、構造、および/または活性を比較し、(vi)それに従って対象に対する該物質の投与を変更する。例えば、該物質の投与量の増加は、該マーカーの量および/または活性を検出されるより高いレベルに増加させる、すなわち該物質の有効性を増加させることが好ましいことがありうる。あるいはまた、該物質の投与量の減少は、該マーカーの量および/または活性を検出されるより低いレベルに低下させる、すなわち該物質の有効性を低下させることが好ましいことがありうる。
【実施例】
【０３３３】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これは限定と解釈すべきではない。本明細書に記載の参考文献、図面、配列表、特許、および公開特許出願の内容は、本明細書の一部を構成する。
実施例1
A. 材料と方法
【０３３４】
細胞株および原発腫瘍。すべての原発腫瘍は、Cooperative Human Tissue Network(CHTN、Philadelphia、PA)およびBrigham and Women Hospital Tissue Bank(Boston、MA)から得た。すべての細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA)から得た。組織像を確認した。細胞株および原発腫瘍の特徴をそれぞれ表4および5に記載する。
【０３３５】
cDNAマイクロアレイにおけるアレイ-CGHプロファイリング。細胞株および原発腫瘍から得たゲノムDNAをメーカーの使用説明書(Gentra System Lie、Minneapolis、MN)に従って抽出した。ゲノムDNAを断片化し、公開されたプロトコール(Pollack、J. R. et al.(1999a)Nat Genet 23、41-46.)(一部変更)に従ってランダムプライム標識した。詳細は、Aguirre、A. J. et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101、9067-72参照。標識DNAを、ヒトcDNAマイクロアレイまたはオリゴマイクロアレイとハイブリダイズさせた。cDNAマイクロアレイは、約11,211のユニークなマップ位置が定義された、13,281マッピング可能クローンを含む14,160 cDNAクローン(Agilent Technologies、Human 1クローンセット)(NCBI、Build 35)を含む。マッピングしたエレメント間の平均間隔は72.7キロベースであり、間隔の94.1%は1Mb以下であり、98.9%は3Mb以下である。オリゴアレイは22Kオリゴヌクレオチドを含む(Agilent Technologies)。すべてのプローブを、ヒト/マウスゲノム配列の最新ドラフト(NCBI、Build 35)を用いたBLASTアラインメントにかけた。BLASTの結果に基づき、55 bp以下のベストヒットのアラインメント長で任意に定義したマッピング不能なプローブおよびベストヒットのアラインメント長において95%またはそれ以上の第2ベストヒットスコアを有することにより確認された有益でない(un-informative)プローブを除去した。この基準により、ヒトアレイのための16022の有益な(informative)プローブを選択した。マッピングしたエレメント間の中央値間隔は54.7キロベースであり、間隔の96.7%が1Mbであり、99.5%は3Mb以下である。
【０３３６】
該アレイのスキャン画像の蛍光比を計算し、生アレイ-CGHプロフィールを処理し、生データ中の変化点の有意性を決定するために置換を用いるセグメンテーションアルゴリズムを用いてコピー数中の統計的に有意な変化を同定した(Olshen、A. B. et al.(2004)Biostatistics 5(4):557-72)。各断片には、含まれたプローブの中央値であるLog2比を割り当てる。データは、断片化値の分布中の最も高いモードを中心に置く。モードセンタリング後、獲得および欠失(loss)を+0.11または0.11に等しいかまたはそれより大きいLog2比として定義し(データの中央50%分位の+/-4標準偏差)、増幅および欠失(deletion)をそれぞれ0.4以上または0.4以下の比として定義した。cDNAデータセットについて、獲得および欠失を+0.13または0.13に等しいかまたはそれより大きいLog2比として定義し(データの中央50%分位の+/-4標準偏差)、増幅および欠失をそれぞれ0.55以上または0.5以下の比として定義した。扁平上皮細胞癌および腺癌の癌ゲノムを比較するための置換(permutation)試験は以下のごとく行った。断片化アレイCGHデータを扁平上皮細胞癌群と腺癌群に分けた。閾値0.1(以上(over))および-0.1(以下(under))を用いてゲノム変化を得た。各プローブで、該閾値を超える全ての試料をそれぞれ扁平上皮細胞癌群と腺癌群についてカウントした。次に、該スコアを以下のごとく計算した：
スコア.over=(扁平上皮癌.over-腺癌.over)2/(扁平上皮癌.over+腺癌.over)
スコア.under=(扁平上皮癌.under-腺癌.under)2/(扁平上皮癌.under+腺癌.under)
【０３３７】
試料群ラベルをスクランブルして1000回置換を行った。スコアを上記のごとく計算し、すべてのプローブのピークスコアを各置換について維持した。統計的に有意なプローブは、5%誤陽性率(false positive rate)をカットオフ値とする置換試験からの1000ピークスコア間でスコアを比較することにより同定した。
【０３３８】
扁平上皮癌および腺癌中の増幅/欠失の比較を以下のごとく行った。1腫瘍サブタイプ中の試料の少なくとも15%でLog2比が0.6以上であり、他のデータセットには存在しない、断片化データのすべてのプローブを同定するために、カスタムメイドアルゴリズムを設計した。欠失について、該アルゴリズムを、1腫瘍サブタイプ中の試料の少なくとも15%でLog2比が-0.6以下であり、他のデータセットには存在しない、断片化データのすべてのプローブを検索した。
【０３３９】
自動化遺伝子座定義。最小共通領域(Minimal Common Region(MCR))を、以下の規則に基づく断片化データを適用する自動化アルゴリズムにより定義した：
1.  0.4以上または0.4以下(cDNAでは0.5および0.55)の断片(セグメント)を変化と同定した。
【０３４０】
2.  2またはそれ以上の変化断片が1プロフィール中で隣接しているか、または500KB以下で分離している場合は、該断片が及ぶ全領域は、変化したスパンと考えられる。
【０３４１】
3.  20mBより短い高度に変化した断片またはスパンは、分離した遺伝子座境界を定義するための「有益な(informative)スパン」として保持される。より長い領域は、遺伝子座境界の定義に含めない。
【０３４２】
4.  有益なスパンは、陽性値または陰性値断片の重複する群を同定するために試料にわたり比較する(各群を「重複群」と呼ぶ。)。
【０３４３】
5.  反復(recurrence)率が全群についてのピーク反復の25%以下であれば、重複群を別個の群に分ける。反復は、高閾値の変化(0.4、-0.4)を有する試料の数をカウントすることにより計算する。
【０３４４】
6.  最小共通領域(MCR)は、ピーク反復の少なくとも75%を有する連続スパンと定義する。2つのMCRはただ1つのプローブ位置のギャップにより分離している場合は、それらは結合する。遺伝子座中に3個以上のMCRがある場合は、全領域を1複合体MCRとして報告する。
【０３４５】
MCRの特徴付け。各MCRについて、ピーク断片値を確認する。獲得または欠失の反復を、先に定義した下限閾値(〜+/-0.11)に基づいてすべての試料にわたり計算する。断片値または長についての閾値と独立したさらなる反復の測定のように、中央値異常(Median Aberration)(MA)は、増幅領域についてはゼロ以上の、欠失領域についてはゼロ以下のすべての断片値の中央値をとることにより各プローブ位置について計算する。この値のペアを、各試料プロフィールにおいて無関係にプローブラベルの順序を変えた後に得た値の分布と比較する。MAの大きさが順序を変えた平均の95%を超える場合は、該領域を有意な獲得または欠失としてマークし、これを優先順位付けのための投票(voting)システムに用いる。既知の遺伝子数を2003年7月のHuman assembly at NCBI(build 35)に基づいてカウントする。
【０３４６】
複雑性解析。コピー数推定データについて用いた変化点統計モデル(Olshen、A. B. et al.(2004)Biostatistics 5(4):557-72)は、一様な(uniform)コピー数の連続ゲノム領域を断片(セグメント)と定義し、各断片は、その隣り合った断片と異なるコピー数を含み、隣り合った断片間の変化(transition)は、コピー数の変化を描く(delineate)。断片数およびこれら断片のサイズは、ゲノムにわたるコピー数変化頻度の指標である。0.4以上または以下の断片のみをこの解析において考慮した。
【０３４７】
シーケンシング。FGFR1チロシンキナーゼドメイン(Celera受託hCT1964964、エクソン12-18)のシーケンシングおよびPCR増幅用のプライマーを先に記載のごとく設計した(Bardelli、A. et al.(2003)Science 300、94.)。PCR増幅エクソンのホワードおよびリバース配列は、8p11ゲノム増幅を有する2個の肺癌細胞株および6個の原発肺腫瘍から得た。Sequencher(Gene Codes Corporation、Ann Arbor、MI)を用いてクロマトグラムを作製し、可能性のある突然変異を同定するため、FGFR1のNCBI参考配列と手動で比較した(表6参照)。
【０３４８】
定量的PCR(QPCR)検査。標的および対照配列内の100-150bpの生成物を増幅するためのPCRプライマーを設計した(表6参照)。各細胞株中の対照配列に対するプライマーを、アレイ-CGH分析により示された正倍数体のコピー数の領域内に設計した。定量的PCRは、ABI 7700配列検出システム(Perkin Elmer Life Sciences、Boston、MA)を用いてSYBRグリーン色素(Qiagen、Valencia、CA)の蛍光の増加をリアルタイムでモニターすることにより実施した。相対的遺伝子コピー数を標準曲線法により計算した(Ginzinger、D. G.(2002)Exp Hematol 30、503-512)。遺伝子量の推定を試料内の最も共通のコピー数と比較して行った。PCR検証のため、豊富なLineエレメントをコピー数変化を比較するための基準として用いた。他のデータセットを用いた以前の経験に基づき(Aguirre、A. J. et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101、9067-9072；Brennan、C. et al.(2004)Cancer Res 64、4744-4748)、閾値2(相対遺伝子量として)を変化のカットオフとして用いた。発現の検証のために、エクソンにわたる100-150bpの生成物を増幅するRNA特異的PCRプライマーを設計した(表6参照)。正常肺RNAを基準として用いた(Ambion、Austin、TX)。
【０３４９】
Affymetrix遺伝子チップにおける発現プロファイリング。ビオチン化標的cRNAを総試料RNAから作製し、標準的プロトコール(Golub、T. R. et al.(1999)Science 286、531-537)にしたがってヒトオリゴヌクレオチドプローブアレイ(U133Plus 2.0、Affymetrix、Santa Clara、CA)とハイブリダイズさせる。発現値をdChip(Li、C.、およびWong、W. H.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98、31-36)を用いて正規化し、次いで各遺伝子について該コホートの中央値に対するLog2比により標準化した。28細胞株、29腫瘍、および主要組織付近の正常細胞をこれらオリゴアレイを用いて分析した。
【０３５０】
総合コピー数および発現分析。各発現値をその対応コピー数値に対してマッピングすることができるようにアレイ-CGHデータを組み込んだ。各遺伝子位置について、試料を、アレイ-CGHがコピー数の変化を示すか否かに基づいて、または組み込んだCGH値に基づかないで群分けした。発現に対する遺伝子量の影響を、変化および無変化試料群における発現値の標準偏差の合計で割った変化および無変化試料群の発現値の平均の差として定義した遺伝子重量を計算することにより測定した(Aguirre、A. J. et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101、9067-9072；Hyman、E. et al.(2002)Cancer Res 62、6240-6245)。各遺伝子に対する重量の有意性は、試料ラベルの順序を10,000回変え、アルファ閾値0.05を適用することにより推定した。
【０３５１】
蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)。(有糸分裂)中期塗布スライドを標準的プロトコールに従って製造した(Protopopov、A. I. et al.(1996)Chromosome Res 4、443-447)。凍結組織切片(4μm)をメーカーのプロトコールに従って前処理した(Frozen Tissue Prep for FISH、Vysis、Downers Grove、IL)。BACs RP11-138J2(27MB、CHR 8)、RP11-265K5(CHR 8上のHTPAP〜LETM2；BAC #1)、RP11-100B16(CHR 8上のFGFR1およびFLJ43582に及ぶ；BAC#2)、およびRP11-90P5(CHR 8上のLSM1〜DDHD2に及ぶ；BAC#3)をハイブリダイゼーションに用いた。FISH分析用のプローブは、メーカーの使用説明書(Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN)に従い、ビオチン-14-dATPまたはジゴキシゲニン-11-dUTPを用いるニックトランスレーションを用いて標識した。ビオチン化プローブを、Cy3結合アビジン(Accurate Chemical、Westbury、NY)を用いて検出した。ジゴキシゲニン標識プローブ、抗ジゴキシゲニン-FITC Fab断片(Enzo Life Sciences、Farmingdale、NY)を用いた。スライドを5μg/ml 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(Merck、Wilmington、DE)で対比染色し、Vectashieldアンチフェド媒質メディウム(Vector Laboratories、Burlingame、CA)を用いてマウントした。FISHシグナルの取得およびスペクトル分析は、Applied Spectral Imaging(Carlsbad、CA)が開発したフィルターセットとソフトウエアを用いて行った。
B.  結果
【０３５２】
肺癌は、2004年の全癌死亡者数の1/4以上を占める米国の癌関連死亡の主要原因である。独特の臨床的および病理学的特徴が肺癌を2つの主要サブタイプ：小細胞肺癌(SCLC)および非小細胞肺癌(NSCLC)に分類するのを助ける。NSCLCは、肺癌症例の75%を構成し、さらに腺癌、扁平上皮細胞癌、および大細胞癌を含む3種の主要な組織学的に異なるサブタイプに細分される。腺癌および扁平上皮癌のサブタイプは、NSCLC症例の85%以上に相当する。これらNSCLCサブタイプは、明確な臨床的および病理学的特徴を有し、治療方法は、細胞毒性薬、放射線療法、および臨床的管理の進歩にも関わらず依然として一般的なものであり大部分無効のままである。進行性NSCLC癌の治癒率は、腫瘍学において最悪のままである。NSCLCのすべての段階で、5年生存率は、最近15年間15%に固定したままである。特定の癌遺伝子型を有する、限られた数の症例に対する分子標的療法の最近の成功(Lynch、T. J. et al.(2004). N Engl J Med 350、2129-2139；Paez、J. G. et al.(2004)Science 304、1497-1500)は、肺癌の遺伝子病変のスペクトルのより詳細な知識は次に有意義な治療的進歩をもたらすであろうという見通しを強めた。
【０３５３】
今まで、肺癌遺伝子研究の大部分は、既知の癌遺伝子の突然変異またはプロモーター メチル化状態を列記し、ゲノム規模のヘテロ接合性欠失(genome-wide loss-of-heterozygosity)調査を実施し、次いでCGHを適用して中期染色体または小規模BACアレイ上の限局性コピー数変化(CNA)を監査する。この協調努力は、p53およびRb経路におけるK-RAS活性化突然変異および機能欠損突然変異を含む病変のコアセットを同定した(Minna、J. D. et al.(2002)Cancer Cell 1、49-52)。同時に、観察された多数の反復染色体異常、特に増幅および欠失は、現在までに小分画の肺癌遺伝子のみが同定されたことと矛盾する。
【０３５４】
統合CGHおよび発現プロフィールは、癌遺伝子発見に対する有効性の高いアプローチとして浮上してきており、これは癌ゲノムにわたる局所的獲得および欠失のゲノム規模の考察(Kallioniemi、O. P. et al.(1994)Genes Chromosomes Cancer Cancer 10、231-243)および遺伝子発現における関連コピー数性変化(Aguirre、A. J. et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101、9067-9072；Pollack、J. R. et al.(1999b)Nat Genet 23、41-46；Pollack、J. R. et al.(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99、12963-12968)をもたらすことができる。NSCLCの症例において、染色体CGH試験は、1q31、3q25-27、5p13-14、および8q23-24の反復獲得、および3p21、8p22、9p21-22、13q22、および17p12-13の欠失(Balsara、B. R.、およびTesta、J. R.(2002)Oncogene 21、6877-6883；Bjorkqvist、A. M. et al.(1998)Br J Cancer 77、260-269；Luk、C. et al.(2001)Cancer Genet Cytogenet 125、87-99；Pei、J. et al.(2001)Genes Chromosomes Cancer 31、282-287；Petersen、I. et al.(1997)Cancer Res 57、2331-2335)を明らかにした。肺癌に関与する可能性がある既知遺伝子/遺伝子座の最近の限られたアレイCGH調査は、反復染色体3p欠失および3q獲得の確認によるこのアプローチの有用性を明らかにし、染色体3q単位複製配列の常在物としてPIK3CAを同定した(Massion、P. P. et al.(2002)Cancer Res 62、3636-3640)。次に、この遺伝子は、ある肺癌症例において活性化点突然変異を有することが示された(Samuels、Y. et al.(2004)Science 304 554)。
【０３５５】
マイクロアレイフォーマットにおいて、CGHの解析は、ゲノムに沿って位置する、マッピングされたプローブの数と質により決定される(Albertson、D. G.、およびPinkel、D.(2003)Hum Mol Genet 12、145R-152)。本明細書に記載のごとく、高密度cDNAおよびオリゴヌクレオチドベースのアレイを用いて、原発腺癌および扁平上皮細胞癌の明確なコレクションおよび樹立NSCLC細胞株のパネル中に存在するCNAの高解像度調査を行った。発現プロフィールおよび公開されたデータベースの統合と共に新規カスタムバイオインフォーマティクス手段の適用は、NSCLCゲノム中の検出可能な反復増幅および欠失の数の劇的な増加をもたらした。高度のNSCLCゲノム複雑性、これら病変の反復性、および多数の常在遺伝子の予備的機能的特性は多数の関連発癌事象を示し、治療的および診断的組成物、およびその使用方法をもたらす。
NSCLCゲノム中の既知および新規CNAの同定
【０３５６】
最初の切除の時に凍結した、腺癌(n=19)または扁平上皮細胞癌(n=26)と確認され、70%以上の腫瘍細胞性を有する45の腫瘍に対しゲノム規模CGHプロファイリングを行った(表4)。原発腫瘍に加え、CGHおよび発現プロファイリングを34のNSCLC細胞株のパネルについて行った(表5)。すべての原発腫瘍および14 NSCLC細胞株を、オリゴヌクレオチドアレイプラットフォーム(メジアン分解能50kB)を用いて分析し(Brennan、C. et al.(2004)Cancer Res 64、4744-4748)、および残りの20のNSCLC細胞株をcDNAアレイプラットフォーム(メジアン分解能100kB)を用いて検討した(Aguirre、A. J. et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101、9067-9072)。11細胞株を両プラットフォームにより分析し、2つのデータセット間の高レベルの一致が示された(相関係数0.88-0.95)。さらに、先に示されたように(Brennan、C. et al.(2004)Cancer Res 64、4744-4748)、cDNAアレイに対するオリゴヌクレオチドアレイプラットフォームのより高い解像度は、種々のさらなる高度に限局性CNAおよび各CNAのより大きな構造的詳細を明らかにした(図7)。
【０３５７】
ノイズバックグラウンド以上のコピー数変化を確認するため、先に記載のごとく循環的二元セグメンテーション方法論の変法を適用した(Aguirre、A. J. et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101、9067-9072；Olshen、A. B. et al.(2004)Biostatistics 5、557-572)(材料と方法も参照)。NSCLCデータセットの最も顕著な特徴は多数のCNA(n=334)であり、これは、各CNAに対する高度の構造的複雑性と共に大きな高度に複雑なアレイ-CGHデータセットにわたるCNAの定義と優先順位付けに有効と思われるアルゴリズムを通して該データセットのフィルタリング(情報選択)を促す(Aguirre、A. J. et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101、9067-9072)。このアルゴリズムは、(i)少なくとも2の標本中の高閾値増幅または欠失の反復(97パーセンタイル以上または3パーセンタイル以下)、(ii)少なくとも1の原発腫瘍標本における高閾値事象の存在、(iii)統計的に有意な中央値異常、および(iv)細胞株または原発腫瘍における絶対Log2値0.8に等しいかまたはそれ以上のピーク強度(すなわち、0.5% 5分位数以上)を含む種々の基準を適用する。334CNAのコレクションから、このアルゴリズムは4基準の少なくとも3つを満たす126のいわゆる「高信頼」最小共通領域(MCR)を生じた(表7)。これらMCRの91は増幅であり35は欠失であった。アルゴリズムにより自動的に定義した126高信頼MCRの中央値サイズは1.42Mbと計算され、これらMCRの23%(29)は0.5Mbまたはそれ以下(中央値4遺伝子)に及んだ(表7；表7は、1MB以下に及ぶ肺腺および癌扁平上皮細胞癌中の高信頼MCRを示す)。獲得または欠失、および増幅または欠失を有する原発腫瘍(T)または細胞株(C)の数をそれぞれ示す。11q11のMCRは、最近Sebat et al.(Sebat、et al.(2004)Science 305:525)によりコピー数多形(ORF5I1、染色体11q11)であることが示された。さらに、自動化MCR定義プログラムにより使用したパラメーターは比較的保守的であり、すべての遺伝子がこれらマイクロアレイ上のプローブにより示されるわけではないという事実を考えると、遺伝子量およびFISH分析のリアルタイムQPCR測定をさらに洗練させ、8p12-p11.2単位複製配列によって示されるように(表7および図4)MCRの境界を狭めることにより、さらなる分析のための扱いやすい数の候補癌遺伝子を有する多数の遺伝子座をもたらすことができる。
【０３５８】
最初の分析において、データセットは、1q31、3q25-27、5p13-14、および8q23-24に既知の獲得、および3p、8p22、9p21-22、13q22、および17p12-13に既知の欠失を含む染色体CGHおよび常套的ゲノム方法論によりNSCLC中に先に同定されたすべての領域的獲得および欠失を含んだ(図1)。さらに、NSCLCの病因論において示唆された実質的に全ての遺伝子は、p16INK4AおよびRB1腫瘍抑制遺伝子、およびMYC、EGFRおよびKRAS2発癌遺伝子を含む高信頼MCR内に含まれた(表7)。染色体3の全短腕は常に欠失し、ピーク反復は約50MBであった(79試料中29、36%)。セグメンテーションでは明らかなホモ接合体欠失は確認されず、これは3pのこの反復欠失領域中の特定の標的を指摘するが、この領域はNSCLC中にLOHを有することが先に示された遺伝子であるRASSF1、TUSC2、SEMA3B、およびFHITを含む(Balsara and Testa、(2002 Oncogene 21:6877)(図1および図8)。これらの126の選択されたMCRが有する信頼レベルは、さらに17の無作為に選択したMCRに対するリアルタイムQPCRによる確認により裏付けられた。
共通および疾患特異的ゲノムの特徴
【０３５９】
原発NSCLCは2つの主なサブタイプ、扁平上皮細胞癌および腺癌サブタイプからなる。これら2つのサブタイプのゲノムにわたる高強度事象についての全コピー数変化の比較は、扁平上皮細胞癌サブタイプにおける高度のゲノム複雑性を示した(図2)。さらなる分析は、さらに腺癌サブセットと比較したとき扁平上皮癌試料が一緒に結合した複数の短断片を有するより複雑な再配列を有することを明らかにした。
【０３６０】
しかしながら、そのゲノムプロフィールの定性的相違にも関わらず、サブタイプ比較の最も顕著な局面は、1q、5p、および20qに獲得/増幅および3pおよび9pに欠失(loss)/欠失(deletion)を含む2つの原発腫瘍データセット間のCNAの有意なオーバーラップであった。各病理学的データセットについて異なった反復獲得/増幅または欠失/欠失領域を同定するため、各原発腫瘍群における事象の出現率を比較し、有意性を置換試験により推定した(材料と方法参照)。きわだって、これら2群は、群内変化と比較して非常にわずかなユニークな変化を示した。特に、染色体3の長湾上の2領域、3q11.2〜3q13.2および3q26.3〜3q29は、肺扁平上皮細胞癌において選択的に獲得および/または増幅された。この知見は、扁平上皮細胞癌と腺癌を常に識別するゲノム領域のみが扁平上皮癌の染色体3qのテロメア部分の獲得/増幅であることを示す以前の報告と一致する(Balsara and Testa、2002；Bjorkqvist et al.、1998；Luk et al.、2001；Pei et al.、2001；Petersen et al.、1997)。さらに、染色体22の長腕上の獲得/増幅、22q11〜22q12.2が肺扁平上皮細胞癌において選択的に存在した(この領域は以前に関与しなかった)。分析は、本データセットにおいて肺扁平上皮細胞癌を腺癌から区別するいかなるゲノム領域の欠失(loss)または欠失(deletion)も示さなかった。さらに、分析は、肺腺癌で独特ないかなるゲノム領域も確認しなかった。
【０３６１】
2つの細胞タイプにおけるCNAのパターンに顕著な類似性があることを前提として、扁平上皮細胞癌と腺癌の間に報告された発現プロフィールの差のどの部分が染色体3qおよび22q内に存在する遺伝子に関連したかを検討した。t検定を用い、発現プロフィールデータセット中の2つの病的サブグループを最も有意に識別したプローブを同定した。肺扁平上皮細胞癌を腺癌から識別することができることが以前に報告された遺伝子に対応するプローブには、p63を含む、ケラチンファミリー、コラーゲンタイプVII、α1、およびデスモグレイン3の種々のメンバーが含まれた(Bhattacharjee、A. et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98、13790-13795；Garber、M. E. et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98、13784-13789)。扁平上皮細胞癌を腺癌から有意に識別するほとんどの遺伝子は、扁平上皮細胞癌において急激な上方調節、および腺癌において無変化または中程度の下方調節を示した。2つのサブセット間で有意差を示したプローブをそのゲノム位置にマッピングしたとき、2つの染色体腕、染色体3および22の長腕のみが、マッピングしたプローブにおいて偶然のみで予期されたものに比べて統計的に有意な豊富化を示した。同じ分析を、別の最近公開された肺癌発現プロフィールデータセットを用いて実施した(Bhattacharjee、A. et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98、13790-13795)。22qではなく染色体3qのみが、肺扁平上皮細胞癌において腺癌に比べて過剰発現したプローブ数の統計的に有意な豊富化を示した。これらの知見は、3qおよびおそらく22q内に存在する遺伝子がしばしば扁平上皮細胞癌におけるコピー数性発現を示すことを示唆する。3qの獲得/増幅は、本データセット(試料の54%に存在した)および文献(報告された頻度は症例の50〜85%である)の両方において、扁平上皮細胞癌に常にではないがしばしば存在する事象である(Balsara、B. R.、およびTesta、J. R.(2002)Oncogene 21、6877-6883；Bjorkqvist、A. M. et al.(1998)Genes Chromosomes Cancer 22、79-82；Luk、C. et al.(2001)Gene Genet Cytogenet 125、87-99；Pei、J. et al.(2001)Genes Chromosomes Cancer 31、282-287；Petersen、I. et al.(1997)Cancer Res 57、2331-2335)。したがって、3q獲得/増幅のない扁平上皮細胞癌は、それにもかかわらず3qにマッピングした遺伝子の過剰発現を示したことがわかった。さらなる木ベースの系統樹を3q上に位置した遺伝子のみを用いて作成すると、ほとんどの扁平上皮試料は3qの獲得の存在の有無にかかわらす一緒にクラスターとなった(図3)。これら知見は、3qに存在する1またはおそらくそれ以上の種々の遺伝子の遺伝子量増幅または転写脱制御が細胞扁平上皮表現型の誘導に重要であることを示唆する。興味深いことに、3qおよび22q遺伝子のこの選択したポピュレーションを用い、S1、S5、およびS14は、3qおよび22qの両系統樹中の他の扁平上皮細胞癌試料と一緒にクラスターにならなかった(図3)が、腺癌ではクラスターとなり、3qまたは22q中に存在する遺伝子と関連しない扁平上皮細胞癌のサブグループ中の扁平上皮細胞癌表現型を誘導する少なくとも1の異なる経路があることを示唆する。
【０３６２】
発癌遺伝子は通常高レベルの増幅と関連し、腫瘍抑制遺伝子はしばしば狭いホモ接合体の欠失、高強度事象の存在により定義されるので、これら事象があるデータセットに選択的に存在し、他のデータセットには存在しないかどうかを検討した。腺癌試料の15%またはそれ以上に存在するすべての増幅および欠失は、染色体8の長腕上の増幅を除き、少なくとも1の扁平上皮細胞癌試料中に存在した。反対に、2つの例外(以下参照)を除き、すべての反復(>15%)扁平上皮細胞癌の増幅および欠失は腺癌腫瘍中に存在し、高強度事象においても扁平上皮細胞癌および腺癌間の高度の類似性を示唆した。
【０３６３】
上記のごとく、扁平上皮細胞癌データセットにのみ存在することがわかった2つの高反復(>15%)増幅があり、このことは病因的に重要な重要性サブタイプ特異的CNAがみいだされる可能性を示す。第1領域は、染色体3の長腕にマッピングされた(3q26-3qter)。8p12-p11.2に位置する第2扁平上皮細胞癌特異的単位複製配列は新規単位複製配列であり、これを詳細な構造解析にかけた。
ACおよびSCCの共通および異なるゲノム特性
【０３６４】
低解像度染色体またはBACアレイCGHを用いるNSCLCゲノムの先の分析は、SCCをACから識別するゲノムの唯一の領域が3q26-q29であることを一致して示した(Bjorkqvist、A. et al.(1998)Genes Chromosomes Cancer 22、79-82； Luk、C. et al.(2001)Cancer Genet Cytogenet 125、87-99；Pei、J. et al.(2001)Genes Chromosomes Cancer 31、282-7；Petersen、I. et al.(1997)Cancer Res 57、2331-5；Balsara、B. R. & Testa、J. R.(2002)Oncogene 21、6877-83)。以前に認識されていない限局性CNA(上記参照)を検出することができる高解像度プラットフォームを用い、SCCまたはACの特徴であるさらなるゲノム事象が存在するか否かを明らかにしようとした。驚くべきことに、ACおよびSCCのゲノムプロフィールは高度に重複し、全CGHプロフィールの監視および非監視クラスタリングはいずれもこれら腫瘍をその組織病理学的サブタイプに従って分類することができなかった(図1およびデータ示さず)。次に、ACとSCCサブタイプ間の有意な地域差があるか否かを検討した。このために、置換試験は、各原発腫瘍サブタイプにおける事象の発生率を比較し、有意性を推定するように設計した(材料と方法参照)。この置換試験は、3q26〜3q29に対応する、SSC中に有意に標的化された染色体3の長腕上の獲得/増幅の1領域、180Mb〜199Mbのみを同定した(図3a)。したがって、著しく異なる組織学的症状にもかかわらず、SCCおよびACは、ゲノムレベルで極めて類似しており、多くの同じ発癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子突然変異が決定要因となるようである。
【０３６５】
180〜199Mbの3qの獲得/増幅は、SCC間で共通であるが、SCCのすべての例には存在しないので(本発明者らの試料中54%および文献中50〜85%(Bjorkqvist、A. et al.(1998)Genes Chromosomes Cancer 22、79-82； Luk、C. et al.(2001)Cancer Genet Cytogenet 125、87-99；Pei、J. et al.(2001)Genes Chromosomes Cancer 31、282-7；Petersen、I. et al.(1997)Cancer Res 57、2331-5；Balsara、B. R. & Testa、J. R.(2002)Oncogene 21、6877-83))、さらに、3q上の明確なMCRがSCC表現型をもたらす遺伝子を保持し、そのような常在標的が遺伝子増幅以外の機序により上方調節されることが仮定された。すなわち、3q180〜199Mb領域内に存在するプローブの発現パターンを比較することにより、コピー数の状態にかわわらずSCC対ACで常に過剰発現する遺伝子が同定され、そのような遺伝子はSCC表現型をもたらすのに重要な役割を果たす可能性が高いかもしれない。このために、3qの180〜199Mb境界内に存在するすべてのプローブ(n=166、106遺伝に対応する)を用いる(材料と方法参照)一元ANOVAおよびpost-hoc Bonferroni検定は、SCC対AC中で有意な過剰発現を示す遺伝子のサブセットを同定し、SCC中の3qにおける遺伝子コピー数の獲得がない場合でも過剰発現した：p63、クラウジン1、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスX、およびディスク大相同体(表8)。p63遺伝子は、扁平上皮組織の発生およびその扁平上皮癌サブタイプとの関連に大きな役割を考えると最も重要である(McKeon、F.(2004)Genes Dev 18、465-9；Massion、P. P.et al.(2003)Cancer Res 63、7113-21；Westfall、M. D. & Pietenpol、J. A.(2004)Carcinogenesis 25、857-64；Koster、M. I. et al.(2004)Genes Dev 18、126-31)。
【０３６６】
上記知見を裏付けるため、全発現プロフィールデータを、SAM(Significant Analysis for Microarray Data、(Tusher、V. G.、Tibshirani、R. & Chu、G.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98、5116-21))を用いて同じNSCLC試料を分析した。合計297プローブが、q値(誤発見率、FDR)カットオフ0.05に基づきSCCとAC間で有意に異なることがわかった(Storey、J. D. & Tibshirani、R.(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100、9440-5)。異なった形で発現される遺伝子のこのリストでは、その異なる形の発現が根本的なコピー数事象によりもたらされるか否かであった。このために、すべての297の異なる形で発現したプローブをその対応するゲノム位置にマッピングし、ゲノムにわたる10Mb移動ウインドウ分析を用い、次いでFisherの直接確率検定を適用し(材料と方法参照)、異なった形で発現されるプローブが有意に豊富化されたそのゲノム領域を同定した。図3bに示すように、この全分析は、またその常在遺伝子がACとSCC間で異なる形で発現された遺伝子のリストのうちで最も有意に豊富化されるゲノム領域として3q 180〜199MBを同定した。同様の結果が、公開された肺癌発現プロフィールデータベースを利用したときにも得られた(Bhattacharjee、A. et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98、13790-5)(データ示さず)。結論として、総合aCGHおよび発現分析は、SCC組織病理学的表現型の鍵となる決定要因として3q内に存在する限られた数の遺伝子を強く示唆する。
8p12-p11.2上の扁平上皮細胞癌サブタイプ特異的単位複製配列の特性
【０３６７】
MCRの定義における自動化アルゴリズムの保存的パラメーターおよびマイクロアレイの限られた解像度は、事象境界をよりよく定義するためにリアルタイムQPCRによる8p12-p11.2単位複製配列の詳細なマッピングを促した。プライマーペアを、推定単位複製配列内および周辺に存在する遺伝子のために設計し、対応する遺伝子量を複数の原発腫瘍および細胞株試料を用い、QPCRにより決定した(図4A)。2つの有益な(informative)原発腫瘍症例のPT3およびPT5に基づいて、この分析はMCRを、2つの注釈付き(annotated)遺伝子を含むサイズ0.14MBと定義した(図4A)。
【０３６８】
図4Aに示すように、QPCR分析では、このMCRのテロメア境界の外側にFGFR1遺伝子を明確に配置した。FGFR1は他のタイプの癌におけるこの8p単位複製配列の主な候補であると考えられた(Edwards、J. et al.(2003)Clin Cancer Res 9、5271-5281；Mao、X. et al.(2003)J Invest Dermatol 121、618-627；Simon、R. et al.(2001)Cancer Res 61、4514-4519)ので、間期(interphase)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を行い、この境界の定義を確認した。BAC #1(単位複製配列の部分に及び、FGFR1を含まない)をプローブに用い、全8試料(2細胞株および6原発腫瘍)のFISH分析により8p12-p11.2に高コピー数の単位複製配列の存在を確認した(図4A-F、図9-11)。QPCRデータと一致して、PT3に関するBAC#2(MCRの外側、FGFR1を含む)を用いるFISH分析は2コピーのみを示し(図4Aおよび4D)、FGFR1がこの試料中で増幅されないことを明解に証明した。BAC#3を用いるFISH分析は、aCGHおよびQPCRデータに従ってPT5中のテロメア境界を定義した(図4EおよびF)。
【０３６９】
コピー数異常は、遺伝子発現変化の機序の1つであると考えられるため、DNAコピー数およびRNA発現データの統合は、真の標的から第三者を選びとるための有効な初期フィルターとして役立ちうる。このために、このMCR内に存在する遺伝子の発現パターンを遺伝子発現プロファイリングおよび指向性(directed)RT-QPCRの両方により評価した(図5)。RAB11FIP1およびFGFR1を、それぞれMCRのセントロメアおよびテロメア境界の外側の対照としてこれら分析に含めた。具体的には、該標的は、正常に比べて過剰発現するはずであり、そのような過剰発現、すなわち、単位複製配列を保持する試料中に観察された過剰発現はコピー数決定(driven)パターンを示すはずである。図5に示すように、WHSC1L1のみが増幅の候補標的のそれと一致する発現パターンを示した。反対に、LETM2は、増幅のない正常および腫瘍試料と比較して一貫性のないコピー数決定過剰発現に基づいて予想される第三者であることを示した。RAB11FIP1およびFGFR1は、ともに単位複製配列MCRの外側のその配置と一致した発現パターンを示した。
肺CNAと膵CNAの比較
【０３７０】
ヒト肺癌における非常に多数の増幅は、さらなる証明のためにそれら増幅された発癌遺伝子を優先させる重要な課題を示す。複数の癌タイプにわたる多くの真正な発癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の共通および重複する役割を前提として、他の癌タイプからのアレイ-CGHデータセットとの比較は重要性の高い発癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を有する共通CNAを同定するという仮定を試験した。このために、NSCLCゲノムを膵管腺癌(PA)ゲノムのそれと比較した(Aguirre、A. J. et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101、9067-9072)。これらの比較は、KRAS、c-MYCおよびINK4a/ARF遺伝子座、および他の新規遺伝子座を含むこれら癌中に一般的に標的化されることが知られている種々の遺伝子座を確認した。これらの内で20q11上の1遺伝子座(位置29.66-29.88MB)が、1膵細胞株、ならびに1肺腺癌原発腫瘍および4肺細胞株で増幅された。aCGHプロフィールの重複は、5遺伝子、ID1、COX4I2、BCL2L1、TPX2、およびMYLK2を含むサイズ220kBのMCR(位置29.66〜29.88MB)の限界設定を可能にした。これらのうちでBCL2L1(複数の癌タイプ中で示唆される既知の発癌遺伝子である)およびTPX2のみがコピー性発現であることを示した(図6)。興味深いことに、TPX2は、正常対照に比べて試験したほとんどの肺細胞株および原発腫瘍において高レベルの発現を示した(図6)。これらの知見は、この遺伝子座中のBCL2L1に加え、TPX2も肺および膵臓での発癌に役割を果たすことを示唆する。
【０３７１】
本明細書に記載のごとく、NSCLCゲノムはきわめて複雑であり、すべてこの致死的疾患における潜在的病因的関連性を有する、多くの以前に認識されていない増幅および欠失領域で再配置される。特に、126の高信頼CNAが同定および定義された。これらの20%以上(126のうちの29)が0.5MB以下(中央値4常在遺伝子)に及ぶことは注目に値する。これら知見の重要性は、今まで限られた数の遺伝子のみが非小細胞肺癌の病原性および維持に重要であることが示されたという事実に基づく(Minna、J. D. et al.(2002)Cancer Cell 1、49-52)。
【０３７２】
このデータセットから新規NSCLC 遺伝子を発見する可能性の推定値として、高信頼MCR内に存在する遺伝子のリストを、推定癌関連チロシンキナーゼ(Bardelli、A. et al.(2003)Science 300、949)、ホスファターゼ(Wang、Z. et al.(2004)Science 304、1164-1166)、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)(Samuels、Y. et al.(2004)Science 304 554)、およびFutreal、et al.((2004)Nat Rev Cancer 4、177-183)により蓄積された癌遺伝子の最新のセンサス(census)と比較した。多くの関与する癌遺伝子は、実際により大きいCNAにマッピングされるが、これら既知の癌遺伝子はいずれも0.5MBまたはそれ以下の限局性MCRの配置内にある(表3)。すなわち、ここで同定した高信頼MCR内に存在する遺伝子は新規肺癌発癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子が出現する候補を示すと結論することができる。さらに、プロウイルス共通統合部位はいずれもいかなる限局性MCRにもマッピングされなかったが、既知のマイクロRNA(miRNA)はMCR内に位置した(表7)。癌におけるマイクロRNAの役割が最近確立され、MCR内のmiRNAの存在は、それが肺癌の癌遺伝子において役割を果たすかもしれないことを示唆する(Calin、G. A. et al.(2004a)Proc Natl Acad Sci USA 101、11755-11760；Calin、G. A. et al.(2004b)Proc Natl Acad Sci USA 101、2999-3004；Metzler、M. et al.(2004)Genes Chromosomes Cancer 39、167-169)。
【０３７３】
臨床的組織病理学的関連を有するカスタムバイオインフォーマティック手段を用い、今回の高解像度ゲノム規模分析は、NSCLCの2つの主なサブタイプ間の全体のゲノム複雑性の相違も明らかにした。具体的には、扁平上皮細胞癌サブタイプは、以前の報告と一致して腺癌サブタイプと比較して高度のゲノム不安定を示唆するゲノム特性を有する(Massion、P. P. et al.(2002)Cancer Res 62、3636-3640)。この差の根拠は明確ではないが、この高い複雑性はタバコの煙への曝露に関連する可能性がある。疫学的研究は、肺扁平上皮癌が他の肺癌サブタイプよりタバコの煙と原因的に関連があることを示した。相応して、細胞遺伝学的分析は、喫煙者に生じる腺癌は、非喫煙者のそれよりより高頻度の染色体再配列を示す傾向があることを示した(Sanchez-Cespedes、M. et al.(2001)Cancer Res 61、1309-1313)。これらをもとに、これらの観察結果は、タバコの煙はゲノム安定性および/またはチェックポイント対照を規定する経路を標的とする可能性をもたらす。その発癌物質の遺伝子毒性特性に加え、タバコは、肺上皮細胞再生の増加をもたらし、テロメアの侵食を加速し、最終的に危期(複合体ゲノム再配列(Chin、K. et al.(2004)Nat Genet 36、984-988；Kinouchi、Y. et al.(1998)J Gastroenterol 33、343-348；O'Sullivan、J. N. et al.(2002)Nat Genet 32、280-284；Romanov、S. R. et al.(2001)Nature 409、633-637)および上皮の発癌(Artandi、S. E. et al.(2000)Nature 406、641-645)を引き起こすことが知られている三者関係(トライアド)である)となる局所の炎症も促進しうる。
【０３７４】
しかしながら、その展開の機序的相違にかかわらず、大多数のCNAは扁平上皮細胞癌および腺癌サブタイプ間で共有されることが最も驚くべきことであり、観察は、肺上皮細胞の形質転換を決定する共通の病因的事象を示唆する。本明細書に示す結果は、肺扁平上皮細胞癌のゲノムが肺腺癌のそれよりより限局性のCNAを有することを明確に示す。さらに、これらの広範囲のゲノムの相違にもかかわらず、2染色体領域のみがこれら2組織学的表現型間で一貫して異なることは特筆すべきことである。22qの獲得は、扁平上皮細胞癌特異的と以前に報告されていないが、染色体3qのテロメア領域における獲得は一貫して(ユニークではないが)扁平上皮細胞癌サブタイプと関連した(Balsara、B. R.、およびTesta、J. R.(2002)Oncogene 21、6877-6883；Bjorkqvist、A. M. et al.(1998)Genes Chromosomes Cancer 22、79-82；Luk、C. et al.(2001)Cancer Genet Cytogenet 125、87-99；Pei、J. et al.(2001)Genes Chromosomes Cancer 31、282-287；Petersen、I. et al.(1997)Cancer Res 57、2331-2335)。この領域が、肺の扁平上皮細胞癌と同様の発生的、組織学的、および病因的特徴を共有する癌のグループである、頭部および頸部の扁平上皮細胞癌の最も一般的な早期遺伝子変化であると報告した観察結果は重要と思われる(Huang、Q. et al.(2002)Genes Chromosomes Cancer 34、224-233)。
【０３７５】
扁平上皮細胞癌と腺癌の類似性に関するある可能な説明は、肺癌のこれら2つの組織学的タイプは同じ肺幹/前駆体細胞から誘導され、少数のユニークな遺伝子変化のみがこれら細胞に腺癌または扁平上皮細胞癌表現型をもたらすのに十分であるということである。実際に、肺胞タイプII細胞はヒト腺癌および扁平上皮細胞癌の発生に関与する多能性幹細胞であるといういくつかの実験的証拠がある(Ten Have-Opbroek、A. A. et al.(1997)Histol Histopathol 12、319-336)。さらに、約2%の肺癌は、腺および扁平上皮ポピュレーション両方の細胞を含む(腺扁平上皮癌)(Nakagawa、K. et al.(2003)Ann Thorac Surg 75、1740-1744；Sridhar、K. S. et al.(1992)Am J Clin Oncol 15、356-362)。興味深いことに、遺伝子および免疫組織化学分析により、各腫瘍内の2つのポピュレーションはモノクローナルであることが示された(Kanazawa、H. et al.(2000)Am J Pathol 156、1289-1298)。本明細書に記載のデータは、増幅または他の機序が介在する3qおよび恐らく22q内に存在する遺伝子の過剰発現は、腺癌および扁平上皮細胞癌に共通の遺伝子的背景において肺扁平上皮細胞癌表現型を選択的に誘導することを示す。興味深いことに、コピー数変化に関わらず、扁平上皮試料において過剰発現を示した遺伝子にはp63があった。p63の選択的スプライス変異体の過剰発現が種々の扁平上皮癌において報告されており(Massion、P. P. et al.(2003)Cancer Res 63、7113-7121；McKeon、F.(2004)Genes Dev 18、465-469)、p63における突然変異が外胚葉性の発生に影響を及ぼす種々のヒトの遺伝子障害において報告されている(Westfall、M. D.およびPietenpol、J. A.(2004)Carcinogenesis 25、857-864)。p63ヌルマウスは、上皮組織の全範囲の顕著な欠陥またはフランク欠失を示す(Mills、A. A. et al.(1999)Nature 398、708-713；Yang、A. et al.(1999)Nature 398、714-718)。肺の細気管支の内側を覆う上皮細胞にp63アイソフォームを発現する条件付きトランスジェニックマウスは重度の扁平上皮化生を生じた(Koster、M. I. et al.(2004)Genes Dev 18、126-131)。これらの知見とともに、他の実験データは、p63が、上皮細胞ポピュレーションの増殖能を維持し、上皮層化プログラムを機能させるのに重要な役割を示すという見解を支持する(McKeon、F.(2004)Genes Dev 18、465-469)。コピー数変化にかかわらず、他の遺伝子過剰発現は、上皮発生および扁平上皮細胞癌に関連した(例えばシスタチン(Ebert、E. et al.(1997)Adv Exp Med Biol 421、259-265；Pernu、H. et al.(1990)Acta Histochem 88、53-57)およびRP42(またはSCRO、扁平上皮細胞癌関連癌遺伝子)(Estilo、C. L. et al.(2003)Clin Cancer Res 9、2300-2306))。これらデータおよび3qに過剰発現した遺伝子の優位性に基づいて、腺癌および扁平上皮細胞癌はともに、共通の起源、おそらく幹細胞から生じる可能性がある。次に、遺伝子、例えば3q内に存在する遺伝子の調節異常は、共通の発癌性背景において扁平上皮細胞表現型を誘導するかもしれない。
【０３７６】
発癌遺伝子は、通常、高レベル増幅と関連し、腫瘍抑制遺伝子はしばしば狭いホモ接合体欠失により定義されるので、高強度事象の存在が1データセットに選択的にみられ、その他にはみられないか否かを検討した。3qの増幅に加え、扁平上皮細胞癌サブタイプに関連する第2単位複製配列は、1.48MBの領域に及ぶ染色体8p12-p11.2にマッピングされた。NSCLCについて新規であるが、この単位複製配列は、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、およびT細胞リンパ腫を含む種々の他の癌タイプに観察された(Dib、A. et al.(1995)Oncogene 10、995-1001；Edwards、J. et al.(2003)Clin Cancer Res 9、5271-5281；Mao、X. et al.(2003)J Invest Dermatol 121、618-627；Ray、M. E. et al.(2004)Cancer Res 64、40-47；Simon、R. et al.(2001)Cancer Res 61、4514-4519)。FGFR1はこのより大きいCNA内に存在し、この増幅の主要な候補標的であると考えられたが、この試験において行った詳細なQPCRおよびFISHマッピングは、両境界を定義し、FGFR1遺伝子を除く最小共通領域を制限した。相応して、発現分析は、この単位複製配列を有する5腫瘍のうちの4つで過剰発現せず、FGFR1の膜近傍およびキナーゼドメインをコードするエクソンの配列分析ではいかなる突然変異もみいだせなかった。肺癌におけるこの知見は、FGFR1はこの8p遺伝子座の増幅を有する乳癌細胞における病因的役割を果たさず(Dib、A. et al.(1995)Oncogene 10、995-1001；Ray、M. E. et al.(2004)Cancer Res 64、40-47)、例えば、腫瘍細胞増殖アッセイにおいて活性を示す遺伝子のようなこの8p12-p11.2単位複製配列の真の標的として他の常在遺伝子を指摘することを示す最近の乳癌における研究と一致する。
【０３７７】
遺伝子量変化は、その標的遺伝子の発現を調節することにより、発癌遺伝子活性化および腫瘍抑制遺伝子の不活化の共通機序を示す。すなわち、DNAコピー数と発現の統合は、CNAのバイスタンダーを選択するための強力な初期フィルターをもたらす。言い換えればCNAの真の標的は、コピー数的方法で適切な発現の変化を示す必要がある。しかしながら、過剰発現レベルまたは発現不足レベルの定義は、特に真の細胞の起源が未知であり、前癌病理学的視点が利用できない場合には、それ自体が課題である。本研究において、近傍の組織学的正常肺組織から単離した3つの独立した正常RNA基準がある。LETM2は増幅を示すいくつかの試料で過剰発現しないため、そのような基準を用いてLETM2(貫膜タンパク質2を含むロイシンジッパー-EF-ハンド)を排除することができる。この遺伝子は、Ca(2+)結合タンパク質のEF-ハンドファミリーの推定メンバーをコードするLETM1と広範囲の配列相同性を有する(Endele、S. et al.(1999)Genomics 60、218-225)。これらタンパク質は、2つのEF-ハンド、貫膜ドメイン、ロイシンジッパー、および種々のコイルドコイルドメインを含む。LETM1は、内部ミトコンドリア膜に必須であり、K+恒常性およびオルガネラ容量調節の両方に関与する(Nowikovsky、K. et al.(2004)J Biol Chem 279、30307-30315)。LETM1のハプロ不全は、WHS患者の神経筋特性に関与していた。
【０３７８】
ヒトWHSC1を羊膜細胞cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いてマウスNsd1でESTデータベースを検索することにより、Angrand et al.((2001)Genomics 74、79-88)は、WHSC1L1についての部分配列をクローンした。推定1,437-アミノ酸タンパク質は、タンパク質-タンパク質相互作用に関与する2つのPWWPドメイン、クロマチン結合タンパク質にみられる5つのPHD-タイプジンクフィンガーモチーフ、SAC(SET結合cys-リッチ)ドメイン、SETドメイン、およびC末端C5HCHドメインを含む。彼らは、1つのPWWPドメインを含む推定645アミノ酸ペプチドをコードする交互ポリアデニル化およびエクソンスプライシングから生じる変異体も同定した。WHSC1L1は、SAC、SET、およびC5HCHドメインを含む700アミノ酸ブロックにわたり、それぞれマウスNsd1およびヒトNSD1と68%および55%の同一性を共有する。WHSC1L1の増幅は、肺癌で示されている(Angrand、P. O. et al.(2001)Genomics 74、79-88)。さらに、この遺伝子は、NUP98とともに、1つのPWWPドメインを除くWHSC1L1中のすべてのドメインを保存する染色体転座、t(8;11)(p11.2;p15)に関与する(Rosati、R. et al.(2002)Blood 99、3857-3860)。この遺伝子は、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼのSET2ファミリーに属する(Schneider、R. et al.(2002)Trends Biochem Sci 27、396-402)。このファミリー内の他の2つの遺伝子は、WHSC1L1、NSD1、およびWHSC1と広範囲の配列類似性を示し、その両方が癌に関与していた。NSD1は、前立腺癌細胞のアンドロゲンレセプターを同時制御し(coregulates)、転写活性化する(Wang、X. et al.(2001)J Biol Chem 276、40417-40423)。さらに、それは、新小児急性骨髄性白血病の反復染色体転座t(5;11)(q35;p15.5)においてヌクレオポリン遺伝子NUP98と融合する(Jaju、R. J. et al.(2001)Blood 98、1264-1267)。WHSC1は、多発性骨髄腫において頻繁な染色体転座t(4;14)(p16.3;q32.3)に関与する(Stec、I. et al.(1998)Hum Mol Genet 7、1071-1082)。
【０３７９】
NSCLC中に同定された多数のCNAは、詳細な分析のためのMCRの優先順位付けと選択に課題を示す。すでに記載した発癌遺伝子および癌抑制遺伝子の多くは種々の組織タイプにわたる発癌に関与するので、種々の癌タイプのaCGHデータベースにわたる重複MCRのマッピングは、発癌に必須なさらなる遺伝子を有する新規遺伝子座をもたらすかもしれないと推論された。実際に、最近公開されたMCRの膵コレクション(Aguirre、A. J. et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101、9067-9072)を腺癌および扁平上皮細胞癌CNAと比較し、KRAS、c-MYC、およびINK4a/ARFのような、両癌にすでに関与する既知の遺伝子を含むCNAが同定された。2つのデータベースに共通のさらなる他の新規遺伝子座がみいだされた。それらのうち染色体20中のMCRが膵癌および肺癌の両方の高信頼リスト中に存在し、これには5遺伝子が含まれ、そのうちの2つのみがコピー数性発現を示した(図6)。NSCLCおよび膵腺癌が共有する限局性単位複製配列内のBCL2L1の同定は、肺癌中のBCL2L1活性化の機序の1つが染色体増幅を介することを示唆し、以前に示唆されたように、BCL2L1の膵腺癌における重要な発癌的役割を確認する(Bold、R. J. et al.(2001)Cancer 92、1122-1129；Trauzold、A. et al.(2003)Br J 癌89、1714-1721；Xu、Z. et al.(2001)Int J Cancer 94、268-274)。より驚くべき事は、この高反復単位複製配列におけるTPX2の関与である。TPX2は、増幅試料のみならずゲノム量変化を示さない試料においても高発現レベルを示した。TPX2は、Aurora(オーロラ)-Aキナーゼを紡錘体装置に標的化するために必要である。Aurora-Aキナーゼの発現上昇は、乳癌、膀胱癌、結腸癌、および膵臓癌において報告されており、染色体の不安定性および臨床的侵攻性疾患に関連する。遺伝子増幅が検出されない場合にも、62%以下の乳癌にAurora-Aキナーゼが過剰発現する。Aurora-Aキナーゼ発現の上昇は、有糸分裂および染色体セグレゲーションの異常をもたらし、異所的に発現したAurora-Aキナーゼは齧歯類細胞を形質転換することができる(Anand、S. et al.(2003)Cancer Cell 3、51-62；Bischoff、J. R. et al.(1998)Embo J 17、3052-3065；Miyoshi、Y. et al.(2001)Int J Cancer 92、370-373)。しかしながら、Aurora-Aキナーゼの特異的増幅または過剰発現はNSCLCにおいて報告されていない。実際に、本データセットにおいて、Auroraキナーゼの増幅も明らかでなかった。TPX2はAurora-Aキナーゼを活性化し(Gruss、O. J. et al.(2002)Nat Cell Biol 4、871-879)、それが過剰発現するとG2-M期の細胞の蓄積と倍数体化を誘導する(Heidebrecht、H. J. et al.(2003)Mol Cancer Res 1、271-279)。Manda et al.((1999)Genomics 61、5-14)は、正常肺と比較したときこの遺伝子が肺癌組織に過剰発現し、その発現が神経芽細胞腫の患者の予後不良と密接に関連することを明らかにした(Krams、M. et al.(2003)J Clin Oncol 21、1810-1818)。さらに、Oncomine(Rhodes、D. R. et al.(2004)Neoplasia 6、1-6)を用い、種々の癌タイプにおけるTPX2の発現レベルを正常組織の対応するレベルと比較した。肺扁平上皮細胞癌および腺癌、肺小細胞癌(Bhattacharjee、A. et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98、13790-13795；Garber、M. E. et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98、13784-13789)、および前立腺癌(Dhanasekaran、S. M. et al.(2001)Nature 412、822-826；LaTulippe、E. et al.(2002)Cancer Res 62、4499-4506)、および肝細胞癌(Chen、X. et al.(2002)Mol Biol Cell 13、1929-1939)は、各正常組織と比較したときTPX2の有意な過剰発現を示した。興味深いことに、本発現データセットにおいて、TPX2��Aurora-Aキナーゼ発現の間に高い相関がみられ(r= 0.7801、P<0.001)、さらに紡錘体形成および有糸分裂に関与する多くの他の遺伝子とも相関があった(例えば、Bub1(r=0.93、P<0.001)、CDC20(r=0.93、P<0.001)、Aurora-Bキナーゼ(r=0.90、P<0.001))。TPX2の増幅、ならびにその発現と細胞周期全体の進行および紡錘体形成に関与する遺伝子との相関は、肺および膵臓の発癌におけるTPX2に対する重要な役割の可能性を示唆する。
交差腫瘍タイプゲノム比較
【０３８０】
肺癌サブタイプ間の顕著な重複は、別の致死的上皮腫瘍タイプ、膵臓腺癌(PDAC)の最近もたらされた高解像度ゲノムプロフィールとの比較を促した。定義されたCNAの大部分は肺とPDACで異なるが、これら2つのデータセット間の共通部分は、予期された共通ゲノム変化(例えばKRAS、c-MYCおよびINK4a/ARF)に加えて20の共有新規遺伝子座を明らかにした(表3)。すなわち、交差腫瘍タイプ比較は、複数の癌タイプと潜在的に関連がある標的を有するCNAに対するフィルターとして役立つ可能性がある。
【０３８１】
該共有遺伝子座の1つは、以前は肺癌に関連しなかった癌関連遺伝子であるFGFR1を含む8p12-p11.2(位置37.84-39.72MB)の限局性増幅であった。リアルタイム定量的PCR(QPCR)による8p12-p11.2単位複製配列の詳細なマッピングは、MCRをサイズ0.14 MBに狭めた(2つのインフォーマティブ原発腫瘍症例、PT3およびPT5によって定義された)(図4aおよびデータ示さず)。QPCR分析はテロメア境界の外側のFGFR1遺伝子を明確に位置づけるので、この限局性MCRは、2つの注釈付き遺伝子：WHSC1L1およびLETM2のみを含んだ(図4a)。種々の研究が他の癌タイプにおける8p単位複製配列の主要標的としてFGFR1を示唆したので(Simon、R. et al.(2001)Cancer Res 61、4514-9)、間期FISHを行い、種々の有益な試料における単位複製配列境界を明らかにした。増幅を示す6原発腫瘍および2細胞株に対するFISHは、8pに高コピー数単位複製配列の存在を確認した(図4a-b、図9-12)。QPCRデータと一致して、PT3上のFGFR1を含むMCRの外側のBACによるFISHは2コピーのみを示し(図12aおよび12d)、FGFR1がこの試料中で増幅されない明確な証拠をもたらす。DNAコピー数とRNA発現データの統合を用いて、単位複製配列の真の標的からバイスタンダーを選択した(Pollack、J. R. et al.(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99、12963-8)。遺伝子発現プロファイリングおよびRT-QPCR(図5およびデータ示さず)はいずれもWHSC1L1の一貫した過剰発現を示した。他のMCR常在遺伝子、LETM2は、遺伝子増幅の存在下で一貫した過剰発現を示さなかった。RAB11FIP1およびFGFR1の2つの遺伝子は、MCRのテロメアおよびセントロメア境界の外側に位置し、それぞれ、単位複製配列MCRの外側の、それらの配置と一致する発現パターンを示した。
【０３８２】
肺癌におけるFGFR1とWHSC1L1の関連性をさらに評価するため、各標的のsiRNA介在ノックダウンの生物学的影響を、8p増幅を有する細胞株とそれを有しない細胞株(それぞれNCI-H1703およびNCI-H1395)において評価した。すべての遺伝子について、RT-QPCRは、SMART siRNAプール形質導入後に>70%のノックダウンを示した(データ示さず)。NCI-H1703を用いる軟寒天アッセイにおいて、WHSC1L1のsiRNA介在ノックダウンは、H1703軟寒天コロニー数の50%の減少をもたらしたが、ほぼ完全なFGFR1の枯渇は、軟寒天中のコロニー形成に影響を及ぼさなかった。予期したように、これら2遺伝子のノックダウンは、NCI-H1395コロニー形成に影響しなかった。コピー数性発現データはノックダウン試験と組み合わせて、8p単位複製配列を有する肺癌におけるFGFR1に対する役割に反論し、この増幅事象の潜在的標的としてWHSC1L1を示唆する。
【０３８３】
NSCLCおよびPDACデータセットが共有する別の単位複製配列は、複数の癌タイプに関与する既知の発癌遺伝子であるBCL2L1(以前はBCL-xL)を保有する20q11.2にマッピングされた。この単位複製配列は、1つの原発肺AC、1つの腺扁平上皮細胞株、1つのSCC細胞株、および2つのAC細胞株に検出された。この試料はともにMCRを、位置29.66〜29.88Mbに及ぶ、5遺伝子：ID1、COX4I2、BCL2L1、TPX2、およびMYLK2を含む220kBに区切った。実際に、BCL2L1は穏やかな発現増加を示したが、TPX2は、正常肺由来のRNAと比較したとき、試験したほとんどの肺細胞株および原発腫瘍に高レベルのコピー数性発現を示す唯一の遺伝子であった(図4)。これらの知見は、既知発癌遺伝子BCL2L1に加え、TPX2が肺癌および膵癌の両方における増幅を標的とする潜在的候補発癌遺伝子であることを示唆する。
実施例II
【０３８４】
肺癌中で増幅する1848遺伝子の最初のリストから、アレイCGH分析に基づいて肺癌および膵管腺癌の両方で増幅する共通の遺伝子セットを選択した。これら遺伝子は、アフィメトリックス発現プロフィール分析から得られるほとんどの肺癌原発腫瘍試料におけるその存在でさらに選択された。肺癌試料のアフィメトリックス発現プロフィールを、Bioconductor(バイオコンダクター)オープンソースプロジェクトで実施されるmas5 P/M/Aコールアルゴリズムを用いて分析した。次に、該遺伝子リストに、抗体または小分子治療剤の標的のためにフィルターをかけた。既知の貫膜タンパク質または分泌タンパク質をコードする遺伝子は抗体療法の潜在的標的として分類された。コンピューター内(in silico)推定貫膜ドメインまたはシグナルペプチドを含む産物を有する遺伝子も、他の証拠が、該遺伝子産物が細胞表面上にないかまたは細胞外にあることを示さない限り、抗体療法の潜在的標的として分類した。既知のGタンパク質結合レセプター、酵素、イオンチャンネル、核レセプター、および上記クラスのコンピューター内推定機能的ドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子は、小分子療法の潜在的標的として分類された。本明細書に記載のフィルターをかけた遺伝子リストを表9Aに示す。表9は、LU最小単位複製配列(0.5kbまたはそれ以下)から選ばれた11の遺伝子も含む(表9B参照)。
等価物
【０３８５】
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、または常套的実験のみを用いて確認することができるであろう。そのような等価物は以下の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。
【０３８６】
表1. 欠失のMCRに存在し、発現低下を表現する本発明のマーカー
【表１−１】
2008536480.tif 000002
【０３８７】
表1. 欠失のMCRに存在し、発現低下を表現する本発明のマーカー
【表１−２】
2008536480.tif 000003
【０３８８】
表2. 増幅のMCRに存在し、発現増加を表現する本発明のマーカー
【表２−１】
2008536480.tif 000004
【０３８９】
表2. 増幅のMCRに存在し、発現増加を表現する本発明のマーカー
【表２−２】
2008536480.tif 000005
【０３９０】
表2. 増幅のMCRに存在し、発現増加を表現する本発明のマーカー
【表２−３】
2008536480.tif 000006
【０３９１】
表2. 増幅のMCRに存在し、発現増加を表現する本発明のマーカー
【表２−４】
2008536480.tif 000007
【０３９２】
表2. 増幅のMCRに存在し、発現増加を表現する本発明のマーカー
【表２−５】
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【０３９３】
表3. 高信頼限局性MCR
【表３】
2008536480.tif 000009
【０３９４】
表4. 細胞株の説明
【表４】
2008536480.tif 000010
【０３９５】
表5. 
【表５−１】
2008536480.tif 000011
【０３９６】
表5続き
【表５−２】
2008536480.tif 000012
【０３９７】
表6. オリゴ
【表６−１】
2008536480.tif 000013
【０３９８】
表6. オリゴ
【表６−２】
2008536480.tif 000014
【０３９９】
表6. オリゴ
【表６−３】
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【０４００】
表6. オリゴ
【表６−４】
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【０４０１】
表6. オリゴ
【表６−５】
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【０４０２】
表6. オリゴ
【表６−６】
2008536480.tif 000018
【０４０３】
表7. 肺ACおよびSCC原発腫瘍および細胞株における高信頼MCRのリスト
【表７−１】
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【０４０４】
表7. 肺ACおよびSCC原発腫瘍および細胞株における高信頼MCRのリスト
【表７−２】
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【０４０５】
【表７−３】
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【０４０６】
表8. 
【表８】
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【０４０７】
表9. 肺癌原発腫瘍における発現増加を表現する本発明のマーカー
【表９】
2008536480.tif 000023
【図面の簡単な説明】
【０４０８】
【図１】原発肺腺および扁平上皮癌、および肺癌細胞株の遺伝子プロフィールを示す。
【図２】染色体断片長分布を示す。
【図３】染色体3qの180MB〜199MBが両aCGHおよび発現プロファイリングによりACとSCC間の有意差を示す、唯一のゲノム領域であることを示す。
【図４】8p12-p11.2単位複製配列の検証および限界の設定を示す。
【図５】染色体8p12-p11.2単位複製配列に存在する遺伝子の発現分析を示す。
【図６】染色体20q11単位複製配列に存在する遺伝子の発現分析を示す。
【図７】cDNA-およびオリゴ-aCGHプロフィールの間の高レベルの一致を示す。
【図８】染色体3変化の反復を示す。
【図９】細胞株NCI-H520中の8p12-p11.2単位複製配列のFISH分析を示す。
【図１０】隣接する腫瘍と正常組織を比較する、原発腫瘍PT1から得た組織切片中の8p12-p11.2単位複製配列のFISH分析を示す。
【図１１】原発腫瘍PT2(左)およびPT4(右)から得た切片中の8p12-p11.2単位複製配列のFISH分析を示す。
【図１】
2008536480.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月17日(2007.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008536480000001.app