(57)【要約】免疫原性の強いポリペプチドを免疫原性の弱いポリペプチドに結合させることにより、ＣｐＧアジュバントを沈殿かつ集中させて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の応答のプライミングを増強し、よって前記免疫原性の弱いポリペプチドの免疫原性を増強することができる。従って、本明細書では二分型の免疫原性ポリペプチドを含む組成物が提供される。この二分型ポリペプチドは、ＣＴＬ活性化アミノ酸配列に融合したＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列を含みうるものであり、該ＣＴＬ活性化アミノ酸配列はＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に対して不均一（ヘテロ）でもよい。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列および二分型の免疫原性ポリペプチドを特定および使用する方法も提供される。
2008509072.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドとＣｐＧ分子とを含んでなる組成物であって、前記ポリペプチドは細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列とＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列とを含んでなり、前記細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列は前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に対して不均一であり、前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は少なくとも１つのシステイン残基を含み、前記ＣｐＧ分子は少なくとも１つの硫黄原子を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列が少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列が１５個以下のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列が１０個以下のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列が本質的に６アミノ酸残基で構成されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列がＢ−Ｘ、Ｘ−Ｂ、またはＢ−Ｘ−Ｂ配列を含み、前記配列においてＢは正に荷電したアミノ酸残基でありＸはアミノ酸残基であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列がＢ−Ｘ−Ｂ−Ｘ−Ｂ配列を含み、前記配列においてＢは正に荷電したアミノ酸残基でありＸはアミノ酸残基であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列が少なくとも２つのシステイン残基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列が少なくとも４つの正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列の少なくとも１つのシステイン残基のうち少なくとも１つが、正に荷電したアミノ酸残基に隣接している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列が配列番号１に記載の配列（ＫＣＳＲＮＲ）を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列が配列番号１に記載の配列（ＫＣＳＲＮＲ）で本質的に構成されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列が配列番号２に記載の配列（ＡＣＳＡＮＡ）で本質的に構成されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸残基がアルギニンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸残基がリジンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列は５０個以下のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列は２５個以下のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列は２０個以下のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列は１０個以下のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ポリペプチドは５０アミノ酸残基未満の長さである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ポリペプチドは４０アミノ酸残基未満の長さである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ポリペプチドは３０アミノ酸残基未満の長さである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ポリペプチドは２０アミノ酸残基未満の長さである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＣｐＧ分子はホスホロチオエート結合を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＣｐＧ分子はホスホロチオエート骨格を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
免疫原性が増強された組成物を製造する方法であって、
（ａ）細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列とＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列とを有するポリペプチドを得る工程であって、前記細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列は前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に対して不均一であり、前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は少なくとも１つのシステイン残基を含むことを特徴とする工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドを、硫黄原子を含むＣｐＧ分子と接触させて、前記組成物を形成する工程と
からなる方法。
【請求項２７】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列が少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
沈殿物を含んでなる溶液であって、前記沈殿物はポリペプチドとＣｐＧ分子とを含んでなり、前記ポリペプチドは細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列とＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列とを含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列は前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に対して不均一であり、前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は少なくとも１つのシステイン残基と少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸残基とを含み、前記ＣｐＧ分子は硫黄原子を含むことを特徴とする溶液。
【請求項２９】
前記溶液は水溶液である、請求項２８に記載の溶液。
【請求項３０】
沈殿物を含んでなる溶液を製造する方法であって、
（ａ）細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列とＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列と
を有するポリペプチドを得る工程であって、前記細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列は前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に対して不均一であり、前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は少なくとも１つのシステイン残基と少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸残基とを含むことを特徴とする工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドを、硫黄原子を含むＣｐＧ分子と接触させる工程であって、溶液中で実施され、かつ前記ポリペプチドと前記ＣｐＧ分子とが沈殿を形成する条件下で実施されることによって、前記沈殿物を含んでなる溶液が形成されることを特徴とする工程と
からなる方法。
【請求項３１】
哺乳動物において細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する方法であって、ポリペプチドとＣｐＧ分子とを含んでなる組成物を前記哺乳動物に投与することからなり、前記ポリペプチドは細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列とＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列とを含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列は前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に対して不均一であり、前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は少なくとも１つのシステイン残基を含み、前記ＣｐＧ分子は硫黄原子を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
前記ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列が少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するポリペプチドを特定する方法であって、
（ａ）試験ポリペプチドをＣｐＧ分子と組み合わせて混合物を形成する工程と、
（ｂ）前記混合物を哺乳動物に投与する工程と、
（ｃ）前記哺乳動物から細胞傷害性Ｔ細胞を採取する工程と、
（ｄ）前記哺乳動物におけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のレベルが、工程（ｂ）の前の前記哺乳動物におけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のレベルに比べて上昇しているかどうかを判定する工程であって、上昇が、前記試験ポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するポリペプチドであることを示すことを特徴とする工程と
からなる方法。
【請求項３４】
前記細胞傷害性Ｔ細胞が前記哺乳動物の脾臓から採取されることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物はマウスである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列を特定する方法であって、
（ａ）試験アミノ酸配列をＣｐＧ分子と接触させる工程であって、溶液中で実施されることを特徴とする工程と、
（ｂ）前記試験アミノ酸配列と前記ＣｐＧ分子とが沈殿物を形成するかどうかを判定する工程であって、沈殿物の形成が、前記試験アミノ酸配列がＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列であることを示すことを特徴とする工程と
からなる方法。
【請求項３７】
ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列を特定する方法であって、
（ａ）ポリペプチド／ＣｐＧ分子混合物を哺乳動物に投与する工程であって、前記ポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するアミノ酸配列と試験アミノ酸配列とを含むことを特徴とする工程と、
（ｂ）前記混合物が、前記哺乳動物の細胞傷害性Ｔ細胞を、対照のポリペプチド／ＣｐＧ分子混合物を投与された対照の哺乳動物において生じる活性化レベルよりも高いレベルに活性化するかどうかを判定する工程であって、前記対照のポリペプチド／ＣｐＧ分子混
合物のポリペプチドは前記試験アミノ酸配列を欠いており、前記高いレベルの細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は前記試験アミノ酸配列がＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列であることを示すことを特徴とする工程と
からなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して免疫療法の分野に関し、より具体的には増強された免疫原性ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連出願）
本願は２００４年２月６日に出願された米国仮特許出願第６０／５４２，３７１号の優先権を主張する。
【０００３】
（政府の支援）
本明細書に記載の研究は、少なくとも一部については、米国国立衛生研究所の助成番号ＡＩ−１６０５２として米国政府より受けた基金を用いて実施されたものである。
【０００４】
（背景）
腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、腫瘍細胞特異的な細胞溶解に優れており一般の細胞への被害が少ないことから、免疫療法に関して主要な関心を集めてきた。そのような免疫療法の目的は、腫瘍特異的なポリペプチドに対して特異的なＣＴＬの増殖の開始刺激を与えること（プライミング）である。
【０００５】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）にマッピングされる遺伝子にコードされているタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞に対して短いポリペプチドを提示する。これらの短いポリペプチドは、特異的なＴ細胞の活性化および増殖を刺激する。ワクチン投与により感染性因子や腫瘍から個体を保護するために、これらの免疫原性ポリペプチドを用いることが、これまでの主たる関心の対象となっていた。主に注目されてきたのは、ＭＨＣクラスＩ分子が細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に対して提示するポリペプチドであった。ヒトのがんの場合、通常これらのポリペプチドはサイトカインやアジュバントとともに油中エマルジョンとして注射される。重要なことは、使用されるポリペプチドが一般にＭＨＣクラスＩ分子に最適に結合する長さであることである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、改良型ワクチン用のポリペプチド‐アジュバント複合体を提供することである。また本発明の目的は、増強された免疫原性ポリペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、少なくとも部分的には、免疫原性の比較的弱いポリペプチドに結合した免疫原性の強い短いポリペプチドが、ＣｐＧアジュバントを補完してｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の応答の開始刺激（プライミング）を増強し、その結果免疫原性の比較的弱いポリペプチドの免疫原性を増強するという発見に基づいている。免疫原性の強いポリペプチド（本明細書では「ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列」と称する）は、少なくとも１つのシステイン（Ｃｙｓ）残基と、任意選択で少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸残基とを含みうる。さらにＣｐＧ分子は、ホスホロチオエートジエステル結合に含まれるような少なくとも１つの硫黄原子を含みうる。従って、本発明は、ＣＴＬ活性化アミノ酸配列に融合したＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列を含む二分型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）免疫原性ポリペプチドであって、該ＣＴＬ活性化アミノ酸配列はＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に対して不均一（ヘテロ）でもよいことを特徴とする免疫原性ポリペプチド
を含む組成物に関する。また、例えば免疫原性を増強するために、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列および二分型免疫原性ポリペプチドを特定しこれを用いる方法も提供される。
【０００８】
一態様では、ポリペプチドとＣｐＧ分子とを含む組成物が提供される。該ポリペプチドは、（１）細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化しうるアミノ酸配列（本明細書では「ＣＴＬ活性化配列」と称する）、および（２）ＣＴＬ活性化配列に対して不均一であるＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列を含みうる。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、少なくとも１つのシステイン残基と、任意選択で、少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸残基とを含むことができ、ＣｐＧ分子は少なくとも１つの硫黄原子を含みうる。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は１５個以下（例えば１２、１０、８、または６個）のアミノ酸残基を含むことが可能であり、かつ、Ｂ−ＸもしくはＸ−Ｂ配列またはＢ−Ｘ−Ｂ配列（Ｂは正に荷電したアミノ酸残基、Ｘは任意のアミノ酸残基）を含みうる。Ｂ残基は、例えばアルギニンまたはリジンである。一実施形態では、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、Ｂ−Ｘ−Ｂ−Ｘ−Ｂ、Ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｂ−Ｘ−Ｂ、Ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｂなどであってよい。さらに、該アミノ酸配列は少なくとも１つのシステイン残基および少なくとも１つの（例えば２、３、４個またはそれ以上の）正に荷電したアミノ酸残基を含みうる。例えば、正に荷電したアミノ酸残基がＣｙｓ残基に隣接していてもよい。一実施形態では、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は配列ＫＣＳＲＮＲ（配列番号１）を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、ＣｐＧ相互作用性ポリペプチドは、システイン残基を含み正に荷電したアミノ酸残基は含んでいなくてもよい。システイン残基はＣｐＧ分子との相互作用を促進して免疫原性の高い複合体を創出することができる。従ってＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は配列ＸＣＸ（Ｃはシステイン、Ｘは任意のアミノ酸）を含みうる。例えば、一実施形態では、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は配列ＡＣＳＡＮＡ（配列番号２）を含む。
【００１０】
一実施形態では、ＣＴＬ活性化アミノ酸配列は約５０アミノ酸残基以下の長さであり（例えば、約２５、２０、１５、１０アミノ酸またはさらに少数のアミノ酸）、別の実施形態ではポリペプチド全体（ＣＴＬ活性化配列＋ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列）が５０アミノ酸残基以下（例えば、約４０、３５、３０、２５、２０アミノ酸またはさらに少数のアミノ酸）の長さである。
【００１１】
一実施形態では、組成物のＣｐＧ分子はホスホロチオエート骨格を有する。
また本明細書では、免疫原性の高い組成物を製造する方法も提供される。例示的な１つの方法には、（ａ）ＣＴＬ活性化配列とＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列とを有するポリペプチドを得る工程と、（ｂ）該ポリペプチドを、硫黄原子を含むＣｐＧ分子と接触させる工程とを含む。ＣＴＬ活性化アミノ酸配列はＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に対して不均一でもよく、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は少なくとも１つのシステイン残基と、任意選択で少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸残基とを含みうる。
【００１２】
沈殿物を含む、水溶液などの溶液も提供される。本明細書で用いられるように、「沈殿物」とは肉眼または光学顕微鏡で見ることのできる固体物質である。溶液の沈殿物にはポリペプチドとＣｐＧ分子とが含まれ得る。上述のように、該ポリペプチドはＣＴＬ活性化配列とＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列とを含みうる。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は少なくとも１つのシステイン残基と、任意選択で少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸残基とを含むことが可能であり、ＣｐＧ分子は硫黄原子を含みうる。
【００１３】
本明細書において提供される方法には溶液を作成する方法も含まれる。そのような方法の１つは、ＣＴＬ活性化配列とＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列とを有するポリペプチドを得る工程と、該ポリペプチドを、少なくとも１つの硫黄原子を含むＣｐＧ分子と接触させ
る工程とを含む。接触工程は、水溶液などの溶液中や、ポリペプチドとＣｐＧ分子との沈殿物の形成に好適な条件の下で実施可能である。ＣＴＬ活性化配列はＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に対して不均一であってもよく、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は少なくとも１つのシステイン残基と、少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸残基とを含みうる。
【００１４】
細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する方法も提供される。例えば、哺乳動物において細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する１つの方法は、ポリペプチドとＣｐＧ分子とを有する組成物を哺乳動物に投与することを含む。上述のように、該ポリペプチドは、ＣＴＬ活性化配列と、ＣＴＬ活性化配列に対して不均一であるＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列とを含みうる。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は少なくとも１つのシステイン残基と、任意選択で少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸残基とを含むことが可能であり、ＣｐＧ分子は少なくとも１つの硫黄原子を含みうる。
【００１５】
スクリーニング方法も提供される。そのようなスクリーニング方法の１つは、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するポリペプチドを特定する手段を含む。該方法は、（ａ）試験ポリペプチドをＣｐＧ分子と組み合わせて混合物を形成する工程と、（ｂ）この混合物をマウスやラットなどの哺乳動物に投与する工程と、（ｃ）哺乳動物から、例えば該動物の脾臓またはリンパ節などから細胞傷害性Ｔ細胞を採取する工程と、（ｄ）該哺乳動物におけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のレベルが工程（ｂ）より前の該動物におけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のレベルに比べて上昇しているかどうかを判定する工程とを含む。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のレベルの上昇は、その試験ポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞を活性化しうることを示す。
【００１６】
別のスクリーニング方法を使用してＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列を特定することも可能である。そのような方法の１つによれば、試験アミノ酸配列をＣｐＧ分子と（例えば溶液中で）接触させ、試験アミノ酸配列およびＣｐＧ分子が沈殿物を形成しうるかどうかを判定する。沈殿物の形成は、その試験アミノ酸配列がＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列であることを示す。判定工程は、例えば、溶液中の沈殿物の形成を見て確認するなどして直接視覚化することにより実施可能である。判定工程はまた、接触工程前後の溶液の吸光度を比較するなどして溶液の吸光度を測定することによっても実施可能である。ＣｐＧ分子とともに沈殿物を形成するポリペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化能についてさらに試験可能な候補ポリペプチドである。しかしながら、ＣｐＧ分子を沈殿させないポリペプチドでも、特にシステインを含む場合は、必ずしも細胞傷害性Ｔ細胞を活性化できないとは限らない。
【００１７】
ＣｐＧ相互作用性の候補アミノ酸配列を特定する方法も提供される。一実施形態では、該方法は、（ａ）ポリペプチド／ＣｐＧ分子混合物を哺乳動物に投与する工程と、（ｂ）該混合物が前記哺乳動物由来のＣＴＬを、対照のポリペプチド／ＣｐＧ分子混合物を投与された対照の哺乳動物における活性化レベルよりも高いレベルで活性化するかどうかを判定する工程とを含む。ポリペプチド／ＣｐＧ分子混合物のポリペプチドは、ＣＴＬ活性化配列と試験アミノ酸配列とを含みうるものであり、対照のポリペプチド／ＣｐＧ分子混合物のポリペプチドは、試験アミノ酸配列を欠くことになる。ＣＴＬ活性化のレベルが試験アミノ酸配列の存在下でより大きいと判定されることは、該配列がＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列であるかもしれないことを示唆するものである。判定工程には、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの免疫組織化学的技法も含まれ得る。
【００１８】
本発明の１つの特徴は、ＣｐＧ分子と、連続した約１００アミノ酸の配列の中に約４つ以上のシステイン（および約２つ以上のジスルフィド結合）を含むポリペプチドとを含んでなる組成物である。該ポリペプチドは、合成または天然の抗原性ポリペプチドなどの抗原性ポリペプチドであってよい。本明細書において使用されるように、「天然のポリペプ
チド」とは、哺乳動物（例えばヒト）などでｉｎ  ｖｉｖｏで見出されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
ポリペプチド（例えばＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列とＣＴＬ活性化配列とを有するポリペプチド）およびＣｐＧ分子を、治療用処方として、または治療用ワクチンとして一緒に送達することには多くの利点がある。これら２種の分子を１つの免疫治療用組成物に含めて送達することはワクチン接種を簡略化し、さらに各成分を分解から保護して細胞への該成分の輸送を容易にすることもできる。本明細書に記載のワクチンの製造は比較的簡単であるため、ワクチン開発に要する時間を数ヶ月または数週間または数日にまで低減することができる。また、ワクチン製造が比較的簡単であることにより、個々の腫瘍の種類または特定の病原性疾患について、適時に施用できるように特注設計とすることが容易にもなる。
【００２０】
ＣｐＧ分子を複合体中に含めておくことにより、遊離型合成ＣｐＧ分子を投与した場合によくみられる、有害な全身性の応答を抑制することもできる。理論に拘泥することは望むものではないが、本発明の複合体により、抗原とＣｐＧとから構成される小ユニットの「遅延放出」がもたらされる可能性がある。
【００２１】
別の利点としては、複合体化するという事象を用いて、遺伝子治療への応用など、小分子を細胞内へ送達するために標的化することも可能である。
多種多様なヒトのがんに対する有効なポリペプチド系ワクチンを開発することは、それらのがんにおいて特定のポリペプチドが選択的に発現するという利点を活かすために模索されてきた。これらの試みは原則として、エフェクターＴ細胞に直接提示されるのに適した長さのポリペプチドの使用に重点が置かれていた。本明細書に記載のワクチンポリペプチドを含む本明細書の組成物は、本来の（professional）抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるポリペプチドのエフェクターＴ細胞への提示を制御する機構を考慮して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのプライミング用に特に最適化することもできる。
【００２２】
別途定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有するものである。本明細書に記載されるのと同様または等価な方法および材料は、本発明の実施または試行において使用することが可能であり、有用な方法および材料については以降に記載されている。材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定を意図するものではない。本発明のその他の特徴および利点については、添付の図面および説明、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。本願全体を通して引用される全ての参照文献、係属中の特許文献および公開特許文献は、参照により本願に援用される。矛盾が生じる場合は、定義を含めた本明細書に従うものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、少なくとも部分的には、免疫原性の弱いポリペプチド（本明細書では「ＣＴＬ活性化」ポリペプチドと称する）に結合した免疫原性の強い短いポリペプチドが、ＣｐＧアジュバントを補完してｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の応答の開始刺激（プライミング）を増強する、という発見に基づいている。免疫原性の強いポリペプチド（本明細書ではＣｐＧ相互作用性ポリペプチドと称する）は、少なくとも１つのシステイン（Ｃｙｓ）残基と、任意選択で少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸残基を含む。さらに、ＣｐＧ分子は少なくとも１つの硫黄原子を含む。免疫原性の強いＣｐＧ相互作用性ポリペプチドとＣＴＬ活性化ポリペプチドとの融合により、本発明において特徴付けられる二分型ポリペプチドが提供されうる。ＣＴＬ活性化ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣｐＧ相互作用性ポリペプチドのアミノ酸配列に対して不均一であってよい。得られる二分型の免疫原性ポリペプチドは「プライモトープ（ｐｒｉｍｏｔｏｐｅ）」とも呼
ばれる。
【００２４】
二分型の免疫原性ポリペプチドのＣＴＬ活性化アミノ酸配列は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合するポリペプチドであってよい。従って、本発明の二分型免疫原性ポリペプチドは開始刺激（プライミング）能力が増強されたＣＴＬ活性化ポリペプチド、またはプライミング能力が増強されたＭＨＣクラスＩ結合性ポリペプチドとしても理解されうる。プライミング能力の増強は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する該ポリペプチドに融合された短いＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に由来する。この短いアミノ酸配列は少なくとも１つのＣｙｓ残基と、任意選択で少なくとも１つの（例えば２、３個またはそれ以上の）正に荷電したアミノ酸とを含む。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列の少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓでありうる。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列の全長は約２０アミノ酸長よりも短くてよい（例えば約１５、１２、１０、８、または６アミノ酸長よりも短くてよい）。
【００２５】
ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列を、対象の抗原の免疫原性を増強するために該抗原に付加することが可能である。ＣｐＧ相互作用性ポリペプチド（および同ポリペプチドが結合している抗原）のシステイン残基は、ＣｐＧ分子と相互作用、例えば共有結合することができる。ＣｐＧ分子は、細胞仲介性の強力な免疫応答を誘発する免疫系刺激剤である。これらのＣｐＧ分子は日常的にワクチン探索においてアジュバントとして使用され、使用時には遊離型で提供される（ＣｐＧ分子は通常、本開示に記載されるような他のいかなる分子とも結合していない）。しかしながら、ＣｐＧ分子は全身投与すると有害なショック反応を誘発するため（このことは本開示が克服する課題の１つである）、現在はヒトでの使用は承認されていない。アジュバントとして用いられるＣｐＧ分子の大部分は、該オリゴヌクレオチドの安定性を高め、かつヌクレアーゼ感受性を低減するためにホスホロチオエート骨格を用いて合成される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート骨格の硫黄基が存在すると、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に含まれるシステインの硫黄基とのジスルフィド結合の形成が可能となる。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列とＣｐＧオリゴヌクレオチドとの間のこのジスルフィド共有結合は、抗原の免疫原性の増強を促進する助けとなる。
【００２６】
いくつかのポリペプチド−ＣｐＧ分子化合物の凝集により沈殿が形成されて抗原の免疫原性の増大が実証されうる。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列の、正に荷電したアミノ酸は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの負に荷電した骨格と相互作用して凝集物を形成することができる。生じた沈殿物は２つの機能を示しうる。すなわち、（１）抗原提示細胞による凝集物（抗原）の取り込み（抗原に対する免疫応答の第１段階）を増大させうること、ならびに（２）ＣｐＧ分子を局在化させて全身への循環（およびそれゆえの有害なショック）を防止すること、である。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は正に荷電したアミノ酸について周期性を有していてもよい。１または複数のＣｐＧ分子がらせん形の性質を有するので、負の荷電はある一定の方向を向いている。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列について、正に荷電したアミノ酸を、ＣｐＧ分子の負の荷電と最も結合しやすい構造に配置するには、スペーサーとして単一または複数のアミノ酸を使用することができる。一般的な配置は、Ｂ−ＸもしくはＸ−Ｂ、またはＢ−Ｘ−Ｂであってよく、ここでＢは正に荷電したアミノ酸残基で、Ｘはアミノ酸残基である。Ｂ残基は、例えば、アルギニンまたはリジンまたはヒスチジンであってよい。一実施形態では、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、Ｂ−Ｘ−Ｂ−Ｘ−Ｂ、Ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｂ−Ｘ−Ｂ、Ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｂなどであってよい。
【００２７】
一部の場合においては、ＣｐＧ相互作用性ポリペプチドはシステイン残基を含み、正に荷電したアミノ酸残基は含んでいなくてもよい。システイン残基は、免疫原性が増強された複合体を創出するためのＣｐＧ分子との相互作用を促進しうる。従って、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、配列ＸＣＸ（ここでＣはシステインでＸは任意のアミノ酸である）
を含むことができる。
【００２８】
免疫療法の開発は、化学療法および放射線療法を含む標準的な治療法に抵抗性のヒトの腫瘍に対する代替療法を提供しうる。腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、腫瘍細胞特異的な細胞溶解に優れており一般の細胞への被害が少ないことから、免疫療法に関して主要な関心を集めてきた。そのような免疫療法の目的は、主要組織適合性複合体のクラスＩ遺伝子の産物により提示される腫瘍特異的なポリペプチドに対して特異的なＣＴＬの増殖の開始刺激を与えること（プライミング）である。
【００２９】
正に荷電した複数アミノ酸と少なくとも１つのシステイン残基とを含むクラスＩ結合性ポリペプチドは、ＣｐＧ分子と複合体を形成して同分子を沈殿させる能力を示し、これらのアミノ酸が免疫原性の弱いポリペプチドに付加されると、免疫化のためにＣｐＧ分子と組み合わせたときの免疫原性が増大する。このような免疫原性の増大と同時にＣｐＧ分子による全身性の作用は低減され、このことから、共沈したポリペプチドとＣｐＧ分子とにより、免疫原性と半減期が増大しアジュバント仲介性の毒性は低減されたワクチン開発の基盤が提供されることが示唆される。２つの構成成分を同時に送達することから、ワクチン投与が簡便となり、各構成成分が分解から保護されることも期待される。これらのワクチンの製造は比較的簡単であることから、個々の腫瘍の種類について適時に投与するためのワクチンの特注設計が可能となりうる。
【００３０】
二分型免疫原性ポリペプチド
本発明の二分型免疫原性ポリペプチドは、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列（例えば、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸の「尾部」）と、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に対して不均一でありうるＣＴＬ活性化配列とから構成されうる。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、本発明の二分型免疫原性ポリペプチド中の任意の部位に配置可能であり、例えばＮ末端もしくはＣ末端またはその近傍にあってもよいし、該ポリペプチドの中ほどにあってもよい。ＣＴＬ活性化配列はＭＨＣクラスＩ結合性ポリペプチドであってよい。本発明の免疫原性ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、クラスＩ分子が結合したＡＰＣによって効率よくプロセシングかつ提示され、特異的ＣＴＬによって認識されうる最短のポリペプチドである。本発明の二分型免疫原性ポリペプチドの全長は約１００アミノ酸長よりも短く、好ましくは約５０アミノ酸長よりも短い（例えば、約４０、３５、３０、２５、２０、もしくは１５アミノ酸長である）とよい。
【００３１】
完全にプロセシングされたポリペプチドは、ＭＨＣ分子に最適に結合してエフェクターＴ細胞により認識されるポリペプチドである。理論に拘泥することを望むものではないが、正に荷電したＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列により、本発明の免疫原性ポリペプチドがＡＰＣにより取り込まれるのを可能にする必須の特徴が付与される可能性がある。
【００３２】
ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列
ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、局在化したＡＰＣを活性化させるために、ＣｐＧモチーフと複合体を形成しＣｐＧモチーフのアジュバント活性を集中させることができる。
【００３３】
ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、０、１、２、３またはそれ以上の正に荷電したアミノ酸を含むことができる。正に荷電したアミノ酸が過剰であると、短期的な筋書きとしてはＴ細胞の活性化および増殖を阻止しうるが、長期的には（例えば３０、４０、５０、７５、１００または１５０日またはさらに長期にわたって）Ｔ細胞の活性化の刺激に有効となりうる。上記阻害は、ＣｐＧが濃縮され沈殿してポリペプチドとＣｐＧのいずれをも不活性な複合体の中に押さえ込んでしまうことに起因する可能性がある。Ｃｙｓおよび正に荷電したアミノ酸はＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列の中の任意の部位にあってよく、その他のアミノ酸は任意のアミノ酸であってよいが、好ましくは正に荷電したアミノ酸は配列
全体にわたって規則的な間隔となっているとよい。例えば、正に荷電したアミノ酸が１つおき、２つおき、または３つおきのアミノ酸部位に配置されてもよい。正に荷電したアミノ酸残基の配置は完全に周期的である必要はない。例えば、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、本明細書に記載の任意のＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列であってよい。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、例えば、ＫＣＳＲＮＲまたはＡＣＳＡＮＡであってよい。
【００３４】
理論に拘泥することは望むものではないが、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列のシステイン残基は、例えば、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列（および同様に該配列が結合しているＣＴＬ活性化アミノ酸配列）をＣｐＧ分子と相互作用（例えば共有結合）させることができる。
【００３５】
ＣＴＬ活性化アミノ酸配列
「ＣＴＬ活性化」ポリペプチドは、ＣＴＬ活性化アミノ酸配列として定義される。ポリペプチドは、マウスもしくはヒトなどの哺乳動物に投与されると活性化ＣＴＬレベルの上昇をもたらす場合、ＣＴＬ活性化ポリペプチドとして分類することができる。活性化ＣＴＬのレベルは、ＥＬＩＳＡアッセイやＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどを含むがそれらに限定はされない、当技術分野において周知の種々の方法により測定することができる。
【００３６】
ジスルフィド結合に富むポリペプチド（ＩｇＧなど）は、不均一なＣｐＧ相互作用性配列を必要としない場合もあり、その代わりにそれ自体が十分にＣｐＧ分子に結合して強力な免疫応答を誘発することができる。このような抗原性の高いポリペプチドは、連続した１００個のアミノ酸あたり少なくとも４つのシステイン残基（例えば５、１０、１５、２０、２５または３０個のシステイン）を有しうる。該ポリペプチドはジスルフィド結合も豊富でありうる。例えば、該ポリペプチドは本来の状態に折りたたまれたときに少なくとも２つのジスルフィド結合（例えば３、４、５、６、７、８、９、１０または１５個のジスルフィド結合）を含みうる。該抗原性ポリペプチドは、変性剤、例えば尿素、塩化グアニジン、チオシアン酸グアニジンＧｄｍＳＣＮ、または熱およびβメルカプトエタノールなどによって処理してジスルフィド結合を切断し、次いで変性ポリペプチドをＣｐＧ分子と混合して沈殿を形成させることができる。得られた混合物を、本明細書に記載のような免疫療法用製剤として使用することもできる。
【００３７】
ＣｐＧ分子
本明細書に記載のように、ＣｐＧ分子は、少なくとも１つの非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。ＣｐＧ分子は約１５〜２５ヌクレオチド長で、好ましくは約１８〜２０ヌクレオチド長であるとよい。該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのＣｐＧコンセンサスモチーフＲＲＣｐＧＹＹ（ＲはプリンでＹはピリミジン）を含みうる。ＣｐＧ分子は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む骨格を備えうるが、好ましくはＣｐＧ分子全体の骨格がホスホロチオエート結合で構成されているとよい。ホスホロチオエート骨格の側鎖は酸素の代わりに少なくとも１つまたは複数の硫黄原子を含み、そしてホスホロチオエート骨格によって、硫黄原子を含まないオリゴヌクレオチド骨格に比べて半減期が延び、活性レベルが上昇し、かつ活性の特異性の変化はごくわずかとなりうる（クレイグ（Ｋｒｅｉｇ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２０巻、ｐ．７０９、２００２年）。理論に拘泥することは望むものではないが、ホスホロチオエート骨格の硫黄原子は、免疫性の応答を増強しうるＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列のＣｙｓ残基とともにジスルフィド結合を形成する可能性がある。
【００３８】
任意のＣｐＧ分子、またはジスルフィド結合を介して結合するためのホスホロチオエート結合を有する任意のＤＮＡ分子を、本明細書に記載の組成物および方法において用いることができる。例えば、マウスのＴＬＲに特異的なＣｐＧ分子１８２６（５’‐ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴ‐３’）（デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６０巻、ｐ．８７０、１９９８年）を記載されるように使用することができる。例えばリングナウ（Ｌｉｎｇｎａｕ）らの文献（Ｖａｃｃｉｎｅ、第２０巻、ｐ．３４９８−３５０８、２００２年）に記載のＣｐＧ分子も参照されたい。
【００３９】
免疫療法用製剤
本明細書に記載の組成物および方法を、がんなどの疾患または障害を治療または予防するために、ワクチン接種の形態で使用することができる。免疫療法用の例示的組成物は、二分型免疫原性ポリペプチドおよびＣｐＧ分子を不完全フロイントアジュバントなどの油中乳剤の状態で含む。任意選択で、免疫療法用組成物にＭＰＬ−ＡＦ（ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）と混合したモノホスホリルリピドＡアジュバント（ＭＰＬ））を含めてもよい。
【００４０】
本明細書に記載の免疫療法用組成物は、二分型免疫原性ポリペプチドの不均一な（ヘテロの）混合物を含みうる。例えば、該混合物は相異なるＣＴＬ活性化配列およびＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよいし、ある１種類のＣＴＬ活性化配列が種々の異なるＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列に結合されてもよい。種々のＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列を使用することによって、様々な安定性および様々なＣＴＬ活性化能を備えた二分型免疫原性ポリペプチドの集団が提供されうる。例えば、また理論に拘泥することを望むものではないが、数個または１つのシステイン残基を含む短いＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列が、短い期間でＣＴＬを活性化して即時的なプライミング作用を示す一方、多数のシステイン残基または多数の正に荷電したアミノ酸を含む長いＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、長期のプライミング活性を示す可能性がある。
【００４１】
本明細書で用いられるように、ワクチンとは、ウイルス感染、がんもしくはその他の障害からの保護、またはウイルス感染、がんもしくはその他の障害の治療を施す組成物である。ウイルス感染、がんもしくはその他の障害からの保護により、感染または腫瘍またはその他の障害が完全に予防されるか、あるいは、その後感染、腫瘍またはその他の障害を被った場合でも、感染や障害の重篤度または期間が低減されることになる。治療は、１つまたは複数の症状を軽減したり、重篤度または期間を低減したりすることになる。本明細書における目的に関しては、ワクチンは、本明細書に記載の二分型免疫原性ポリペプチドおよびＣｐＧ分子を投与することによってもたらされる。本明細書において用いられるように、特定の組成物の投与による特定の障害の症状の軽減を、恒久的であれ一時的であれ、該組成物の投与に起因または関連して永続的であれ一過性であれ、何らかの緩和と称する。
【００４２】
本明細書に記載の免疫療法用組成物の投与によりランゲルハンス細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）が活性化されるが、これらの細胞はそれぞれ抗原性ポリペプチドをＣＴＬに提示することによってＣＴＬを活性化することができる。本発明の免疫療法用組成物は、第２の治療剤または投薬計画とともに投与することもできる。例えば、免疫療法剤を、例えばがんに対する化学療法または放射線療法も受けている患者に投与することもできる。
【００４３】
本明細書に記載の免疫療法用組成物は、滅菌水または緩衝液に含めるなど溶液として提供されてもよいし、組成物が凍結乾燥形態として包装されてもよい。該組成物を含むキットは、滅菌水もしくは緩衝液などの溶解剤、および／または目的の用途に応じて調製するべく溶液を希釈する、および／またはそれ以外には溶液の特性を調節するための試薬を含みうる。キットはまた情報提供資料を備えてもよい。情報提供資料には、本明細書に記載の方法および／または本明細書に記載の方法のための免疫療法用組成物の使用に関する説明書、指示書、販売用資料またはその他の資料が挙げられる。
【００４４】
キットの情報提供資料の形態に制限はない。多くの場合、情報提供資料は、印刷された
文書、図面、および／または写真などの印刷物として提供される。指示書はラベルや印刷されたシートの形態であってもよい。しかしながら、情報提供資料は、点字、コンピュータで読み取り可能な資料、録画ビデオ、または録音などの他の形態で提供されてもよい。情報提供資料は、実際の住所、電子メールアドレス、ウェブサイト、または電話番号など、キットの使用者が免疫療法用組成物および／または本明細書に記載の方法における該組成物の使用について実質的な情報を得られる連絡先を含んでいてもよい。当然ながら、情報提供資料は形式を任意に組み合わせた状態で提供されてもよい。
【００４５】
本発明の組成物は種々の適切な容器に入れて包装可能である。例えば、組成物を、ガラスまたはプラスチックなどの材料で構成されたボトル、バイアル、またはシリンジに入れてもよい。任意選択で、組成物を、アンプル、シリンジ、またはブリスターパックなどに入れて単回投与形態として包装してもよい。容器は気密性および／または耐水性としてもよいし、ワクチン用、またはＣＴＬ応答を刺激するため、あるいはがんを治療するためなどの用途をラベルしてもよい。
【００４６】
有効用量
本明細書に記載の組成物は、複数回として様々な濃度で投与することができる。
本明細書に開示された組成物（例えば、免疫療法用組成物）の毒性および治療的有効性は、ＬＤ５０（集団のうち５０％が死亡する用量）およびＥＤ５０（集団のうち５０％において治療上有効な用量）を決定するための培養細胞または実験動物のいずれかを使用した標準的な薬学的手段を用いて測定可能である。毒性と治療的有効性との用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。治療指数が大きいポリペプチドまたは他の化合物が好ましい。
【００４７】
細胞培養アッセイおよびさらなる動物実験から得られたデータを用いてヒト用の用量範囲を決定することができる。そのような化合物の用量は、毒性をほとんどまたは全く伴わずにＥＤ５０を含む血中濃度範囲内にあることが好ましい。用量は、この範囲内で、使用した投与形態および投与経路に応じて変更可能である。本明細書に記載の方法において使用される全ての組成物に関して、治療的有効用量はまず細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養で測定したようにして、ＩＣ５０（すなわち、最大限の半分だけ症状の抑制（例えば腫瘍の治療および／またはＣＴＬ活性化）を達成する免疫原性ポリペプチドおよびＣｐＧ分子（遊離型および複合体型）の濃度）を含む循環血漿中の濃度範囲を達成するための用量を動物モデルで決定することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することが可能である。ワクチン投与形態における二分型免疫原性ポリペプチドおよびＣｐＧ分子の量は、ワクチンの被接種者において重大かつ有害な副作用を伴わずに免疫保護反応を誘導する量として選択される。そのような量は、標的（例えば腫瘍または全身用ワクチン接種処置）に応じて変更可能である。一般に、各用量は、二分型免疫原性ポリペプチドおよびＣｐＧ分子全体で約５００μｇ未満（例えば、約４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、２０、１０、５または１μｇ未満）ずつを含むことになろうと予想される。用量は、任意選択で２つの構成成分を等モル比で含むこともできる。あるワクチンに最適の量は、被接種者におけるＣＴＬの応答、抗体価、およびその他の反応を観察することを含む標準的な検討により確定することが可能である。
【００４８】
最初のワクチン接種に続いて、被接種者は約４週間内に追加接種を受けてもよい。投与用製剤および投与経路は、治療しようとする特定の障害や治療を受ける特定の人によって調整可能である。例えば、その人が白血病などのがんである場合もあるし、胸部、大腸、前立腺、膵臓または肺の腫瘍などの腫瘍を有している場合もある。
【００４９】
一般に、免疫療法剤の投与は、毒性、炎症またはアレルギー反応などの望ましくない副
作用を伴わずに予防および治療のいずれの目的も促進する。個別に必要とされることは様々であるが、製剤の有効量の最適な範囲の決定は当技術分野の範囲内にある。ヒトでの用量は動物実験から容易に外挿することができる（カトクス（Ｋａｔｏｃｓ）ら、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１８版、ジェンナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、米国ぺンシルバニア州イーストン所在のマックパブリシング社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、１９９０年の第２７章）。一般に、有効な量の製剤を提供するために必要な用量は、被投与者の年齢、健康状態、生理学的状態、体重、疾患または障害の種類および程度や、治療の頻度や、必要であれば併用する治療法の性質や、所望の効果の性質および範囲などのいくつかの要因に応じて変化することになる（ニース（Ｎｉｅｓ）ら、「Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」第９版、ハードマン（Ｈａｒｄｍａｎ）ら編、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在のマグロウヒル社（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）、１９９６年の第３章）。
【００５０】
スクリーニング法
本明細書において様々なスクリーニング法も提供される。そのようなスクリーニング法の１つを用いて、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するポリペプチドを特定することができる。このＣＴＬ活性化ポリペプチドを、本明細書に記載の二分型免疫原性物質の製造に使用することができる。該方法は、例えば、試験ポリペプチドをＣｐＧ分子と組み合わせることと、該混合物をマウスまたはラットなどの哺乳動物に投与することと、該哺乳動物から細胞傷害性Ｔ細胞を採取することと、該哺乳動物における細胞傷害性Ｔ細胞（例えばＣＤ８＋ＣＴＬ）のレベルが上昇したかどうか測定することとを含みうる。
【００５１】
その他のスクリーニング方法には、二分型免疫原性ポリペプチド中に使用するためのものなどＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列を特定するための手法が挙げられる。例えば、試験アミノ酸配列をＣｐＧ分子と接触させて、該混合物を沈殿形成について観察する。沈殿の形成は、その試験アミノ酸配列がＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列であることを示唆する。本発明の方法はさらに、特定されたＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列を含む二分型免疫原性ポリペプチドを投与することを含みうる。該ポリペプチドは、ＣｐＧ分子を含む製剤中に含めて哺乳動物に投与することができる。このポリペプチド／ＣｐＧ分子組成物が哺乳動物においてＣＴＬを活性化しうるかどうかを判定することにより、試験対象のＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列がｉｎ  ｖｉｖｏで有効な免疫療法剤の一部として機能しうることを判定することができる。
【００５２】
ＣＴＬ活性化配列またはＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列として特定された配列は、印刷物または機器で読み取り可能な形態に記録することができる。さらに、特定された配列を含むポリペプチドをさらにヒトにおいて試験し、免疫反応についてアッセイすることも可能である。
【００５３】
本発明について以下の実施例によりさらに説明するが、実施例はさらに限定を加えるものとみなすべきではない。
【実施例１】
【００５４】
免疫原性ポリペプチドはＣｐＧを沈殿させ、ＣＴＬの活性化を増強する
本発明者らの研究室における初期の実験は、マウスにおいて非主要組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）ポリペプチドに対するＴ細胞の応答を増大させるための方法に焦点を当てていた。過去１０年にわたり、本発明者らはＭｉＨＡポリペプチドに特異的なＣＴＬを作製するマウスの能力が低下し続けることを観察してきた。このような低下は、マウス室における飼育手法が厳格さを増し、マウスの免疫系がホメオスタシスを維持する以外に何もする理由がなくなるまで病原体への曝露が低減されたことに起因する可能性がある。刺激の際に
ＩＦＮγを産生するＣＴＬを定量するために第一次ＥＬＩＳＰＯＴへと変更して以来、本発明者らは、バックグラウンドのスポットが本発明者らのマウスにおいては事実上存在しないことを見出した。このことは、バックグラウンド活性が依然存在しているヒトＣＴＬを用いた第一次ＥＬＩＳＰＯＴと直接の対比をなしている。これらの観察結果は、ＣＴＬの応答を有効に生じさせるために克服しなければならない免疫活性の全体的低下と一致している。
【００５５】
問題点が病原体への曝露の制限にあるらしいことが見出されたので、本発明者らは、薬理学的方法、例えば抗体を介した同時刺激などの使用よりもむしろ、細菌アジュバントを用いてＣＴＬのＭｉＨＡに対する応答を増大させることについて検討した。ＣＴＬの応答を増強する能力について報告のある、それぞれＴＬＲ−４およびＴＬＲ−９に結合するリピドＡおよびＣｐＧ分子を使用することとした。リピドＡは、ＭＰＬ−ＡＦ（界面活性剤様のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）と混合したＭＰＬアジュバント（モノホスホリルリピドＡ））の形態でコリキサ・コーポレイション（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（米国ワシントン州シアトル所在）より供給された。使用したＣｐＧ分子は、マウスのＴＬＲ−９に特異的な１８２６オリゴヌクレオチド（ＴＣＣＡ  ＴＧＡＣ  ＧＴＴＣ  ＣＴＧＡ  ＣＧＴＴ）であり（デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６０巻、ｐ．８７０、１９９８年）；このＣｐＧオリゴヌクレオチドは、マヨ・クリニック・モレキュラー・バイオロジー・コア（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ）によりホスホロチオエート骨格を用いて合成された（別途指定のない限り、本発明者が用語ＣｐＧを用いるときはこの合成型を指している）。ＣｐＧで繰り返し処理されたマウスにおいて以前観察された強力な全身性の炎症を回避する努力の中で、本発明者らは単回の投与で使用するためにＣｐＧ、ＭＰＬ、および抗原を混合した。１０μｇのＭＰＬ−ＡＦ＋１００μｇのＣｐＧをＭｉＨＡ不適合の脾細胞または合成ＭｉＨＡポリペプチド（１００μｇ）のいずれかと混合して、尾の基部への皮下（ｓ．ｃ．）注射用に用いて予備的実験を実施した。
【００５６】
ＩＦＮγを分泌するＭｉＨＡ特異的ＣＴＬの出現頻度を、第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの使用により概算したが、同アッセイではＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ８＋ネガティブ選択キット（米国カリフォルニア州オーバーン所在のミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた他のリンパ球集団のネガティブ選択により富化されたＣＤ８＋の応答細胞を用いた。
【００５７】
ＷＭＨＨＮＭＤＬＩペプチド（ＨＹ１）およびＫＣＳＲＮＲＱＹＬペプチド（ＨＹ２）は、ネズミのＹ連鎖遺伝子にコードされるタンパク質由来のものであり、Ｈ２Ｄｂ分子によりＣＴＬに提示される（キング（Ｋｉｎｇ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  第２４巻、ｐ．１５９−１６８、１９９４年；グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  第１４巻、ｐ．４７４−４７８、１９９６年）。これら２種のペプチドおよびＭＰＬ−ＡＦとＣｐＧアジュバントとの組み合わせの混合物について、ＣＴＬの応答をプライミングする能力を試験した。上記２種のペプチドについては、ｉｎ  ｖｉｖｏでのプライミング効率について、免疫的に優勢なＨ６０ペプチド（ＬＴＦＮＹＲＮＬ）（マラルカナン（Ｍａｌａｒｋａｎｎａｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６１巻、ｐ. ３５０１−３５０９、１９９８年）とも比較した。Ｂ６のメスをｓ．ｃ．でプライミングし、免疫化１０日後に脾臓を採取した。ＣＤ８＋ＣＴＬをネガティブ選択により富化し、ＩＦＮγを分泌するＣＴＬの出現頻度を概算するために、第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて（１）同系のメスの脾細胞、（２）同系のオスの脾細胞、（３）抗Ｈ６０  ＣＴＬについて同種異系（ＢＡＬＢ．Ｂ）の脾細胞、および（４）ペプチドでパルスしたＲＭＡ／Ｓ細胞で刺激した。第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、１００μｇのポリペプチド＋１００μｇのＣｐＧおよび１０μｇのＭＰＬ−ＡＦを用いて単回免疫されたネズミ由来のＣＤ８＋脾細胞の応答細胞を用いて実施した。ＲＭＡ／Ｓ細胞は、濃度１０ｎＭのそれぞ
れの標的ポリペプチドでパルスした。応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）および抗原細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）を、抗ＩＦＮγ捕捉抗体でコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートで４８時間培養し、その後ビオチン化した抗ＩＦＮγ検出抗体を、次いでストレプトアビジンと結合したＨＲＰおよびＡＥＣ基質を添加した。最初にウェルのデジタル画像を得ることにより（Ｃ．Ｔ．Ｌ．アナライザーズ社（Ｃ．Ｔ．Ｌ．Ａｎａｌｙｚｅｒｓ）、米国オハイオ州クリーブランド所在により実施）、スポットを計数し、次いでＣ．Ｔ．Ｌ．アナライザーズ社から入手したＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（登録商標）ソフトウェアを用いてこれらの画像を分析した。応答細胞のＣＴＬの出現頻度に基づくと、ＨＹ２ポリペプチドが最も効率良くＣＴＬをプライミングし、Ｈ６０ポリペプチドは最も効率が悪かった（図１Ａおよび１Ｂ）。米国仮特許出願第６０／５４２，３７１号も参照されたい。
【００５８】
ＨＹ２ポリペプチドは、ＭＰＬ＋ＣｐＧと混合すると沈殿を形成するという点において他の試験ポリペプチド（ＨＹ１、Ｈ６０その他数種）とは異なっていた。沈殿に必要なのはＨＹ２およびＣｐＧのみであった（ＭＰＬは必要なかった）。免疫原性の増大およびＣｐＧ分子との複合体形成を促進しうる特徴について、ＨＹ２のアミノ酸配列を調べた。一部はＣｐＧを添加しても沈殿を生じない、一連のポリペプチドについて試験したところ、正に荷電したアミノ酸をこれらの沈殿を生じないポリペプチドに添加すると、ＣｐＧとともに沈殿を形成するようになることが見出された。
【００５９】
本発明者らは、仮説として（１）沈殿の形成はＨＹ２の正に荷電した残基とＣｐＧ分子の負の電荷との間のイオン結合による、（２）この沈殿形成によりＣＴＬの刺激が増強される、とした。これらの仮説について検証するために、アミノ末端にＫＣＳＲＮＲ配列およびＲＫＫＲＲＱ配列が付加された２つのＨＹ１バリアントを合成した。ＫＣＳＲＮＲ配列はＨＹ２由来であり、ＲＫＫＲＲＱ配列は活性型のＨＩＶ  ＴＡＴポリペプチド（ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列の長さを６アミノ酸に維持）（バイブス（Ｖｉｖｅｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、ｐ．１６０１０、１９９７年）由来であった。２つの二分型ポリペプチドはＣｐＧを沈殿させ（天然型ＨＹ１では沈殿しない）、第１の仮説が支持された。混合してＣｐＧ＋ＭＰＬとともに注射したところ、ＫＣＳＲＮＲアミノ酸配列と融合させたＨＹ１ポリペプチドはＨＹ１特異的ＣＴＬの出現頻度を著しく高めた（図２を参照）。
【００６０】
ＲＫＫＲＲＱを含むポリペプチドについても、トロイの構築物（ルー（Ｌｕ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６６巻、ｐ．７０６３、２００１年）に用いられた完全長の活性型ＨＩＶ  ＴＡＴポリペプチドにより、注射が困難な程度にまで強力にＣｐＧが沈殿し、短期の機能アッセイではＣｐＧの初期のアジュバント活性が阻害されることが観察された。正の電荷が多すぎるとＴ細胞の活性および増殖が阻害される可能性がある。このことは、ポリＡｒｇ（６０残基）によりＣｐＧが急速に沈殿しうるという観察（リングナウ（Ｌｉｎｇｎａｕ）ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  第２０巻、ｐ．３４９８、２００２年）と一致する；そのような沈殿物は組織内に堆積してｉｎ  ｖｉｖｏで非常に長期間存在する可能性があり、その証拠として、該沈殿物は関連する免疫原性ポリペプチドとともに少なくも３７２日間はプライミングを続けることができる（リングナウ（Ｌｉｎｇｎａｕ）ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  第２０巻、ｐ．３４９８、２００２年）。免疫原性ポリペプチドおよびＣｐＧを選択的かつ強力に沈殿させることができれば、長期間かつ恒久的なＣＴＬ応答を刺激する手段が提供される。
【００６１】
二分型ポリペプチドのＣＴＬプライミング能力を試験するために、Ｂ６のメスを、ＣｐＧアジュバントとＨＹ１、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１、ＲＫＫＲＲＱ−ＨＹ１、およびＨＹ２との混合物を用いてプライミングした。１０日後に脾臓を採取してＣＤ８＋ＣＴＬを富化し、抗原細胞としてペプチドでパルスしたＲＭＡ／Ｓ細胞を用いてＩＦＮγの第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した（図２）。図１Ａおよび１Ｂに示した結果と一致して、試
験した全てのペプチド濃度についてＨＹ２はＨＹ１よりも高頻度でＣＴＬをプライミングした。ＨＹ１標的ペプチドにＫＣＳＲＮＲの尾部を連結した結果、ＨＹ２について得られた結果に匹敵するＨＹ１特異的なＣＴＬ出現頻度が得られた。ＲＫＫＲＲＱの尾部では、ＨＹ１とＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１との比較に対して中間レベルのプライミング効率まで上昇した。ＨＹ２、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１、およびＲＫＫＲＲＱ−ＨＹ１ペプチドはいずれもＣｐＧオリゴヌクレオチドを沈殿させた。ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１におけるプライミング効率の上昇から、正に荷電した残基を３つ有しているこの６アミノ酸配列を付加することにより、ＨＹ１特異的なプライミングが高まったことが示唆された。しかしながら、正に荷電した残基を５つ備えたＲＫＫＲＲＱ−ＨＹ１ペプチドでは中間的な効率であったことから、正に荷電したアミノ酸の数の増大とさらなるプライミングの増強とは関連がないことが示唆された。
【実施例２】
【００６２】
システイン残基は免疫原性の増大に重要である
ＨＹ１二分型ポリペプチドのＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列ＫＣＳＲＮＲのＡｒｇ／Ｌｙｓ残基の役割を調べるために、３つの正に荷電した残基をＡｌａ残基で置換した。この改変型の二分型ポリペプチドをそれぞれＣｐＧと混合してメスのＢ６マウスをプライミングした。１０日目に脾細胞を採取して、第一次および第二次のＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのためにＣＤ８＋ＣＴＬを富化した。先述の実験において、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１によるプライミングでは、第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、完全にプロセシングされたＨＹ１ペプチドでプライミングした場合よりも高いＨＹ１特異的なＣＴＬ出現頻度が得られた（図３Ａおよび３Ｂ）。この順位は、同系のオス（図３Ａ）およびＨＹ１でパルスした同系メス脾細胞の抗原細胞（図３Ｂ）のいずれにおいても観察された。驚いたことに、Ａｒｇ／Ｌｙｓ残基を全てＡｌａに置換したＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１ポリペプチドについて、ＣｐＧを沈殿させる能力が失われたにもかかわらずプライミング効力は失われなかった。実際に、ポリペプチドでパルスしたメスの細胞の刺激により、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１でプライミングしたマウスよりもＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１でプライミングしたマウスからより高い出現頻度でＨＹ１特異的ＣＴＬが得られた（図３Ｂ）。第一次ＭＬＣにおいて同系オスの脾細胞を用いた刺激によって増殖させたＣＴＬの第二次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで確認結果を得た（図４）。応答細胞ＣＴＬがＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１でプライミングしたマウス由来である場合、同系オスの脾細胞およびペプチドでパルスした脾細胞の刺激により、同程度のＨＹ１特異的ＣＴＬ出現頻度が得られた。
【００６３】
合成ＣｐＧオリゴヌクレオチドは一般にｉｎ  ｖｉｖｏでのヌクレアーゼ感受性を低減するためにホスホロチオエート結合で合成される（スタイン（Ｓｔｅｉｎ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第１６巻、ｐ．３２０９−３２２１、１９８８年）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのプライミングの促進におけるＣｙｓの傑出した役割に関する１つの説明は、Ｃｙｓを含むＨＹ１プライモトープと合成ＣｐＧオリゴヌクレオチドとの間のジスルフィド結合の形成である。ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１プライモトープを用いたｉｎ  ｖｉｖｏでのプライミングにおけるＣｙｓの重要性は、Ａｌａ置換を加えることにより確認された。ＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１プライモトープ（Ｃｙｓ＞Ａｌａ）は、第一次および第二次のＥＬＩＳＰＯＴいずれにおいても検証されたように事実上プライミング能を示さなかった（図３Ａおよび３Ｂ、ならびに図４）。しかしながら、ＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１ポリペプチドは視認できる程度にＣｐＧを沈殿させる能力を依然として維持していた。ＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１ポリペプチドはｉｎ  ｖｉｖｏでのプライミング能を失っている点でＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１と同じであった。これらの結果は、おそらくは合成ＣｐＧオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート結合とのジスルフィド結合の形成を介する、最適なＨＹ１特異的プライミングには、１つのＣｙｓ残基が必要であるという仮説を支持するものであった。本発明者らは、該ペプチドにＣｙｓを追加すると複数のＣｐＧ分子と架橋できるため免疫原性が増大するという可能性について調べた。アミノ末端およびカルボキ
シ末端に１つずつＣｙｓ残基を備えたＨＹ１ポリペプチド、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１−ＡＮＡＳＣＡを合成した。このポリペプチドをＣｐＧと組み合わせてＢ６のメスをプライミングし、第一次および第二次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＨＹ１特異的ＣＴＬの出現頻度を概算した。第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける同系オスの抗原細胞に応答したＨＹ１特異的ＣＴＬの出現頻度から、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１ポリペプチドによるプライミングに比べて顕著なプライミング効率の増大が認められた（図３Ａ）。さらに、Ｃｙｓ残基を備えた尾部、ＡＣＳＡＮＡ、ＫＣＳＲＮＲ、および二重のＡＣＳＡＮＡ尾部を有する３種いずれのポリペプチドでプライミングしたマウス由来のＣＤ８＋ＣＴＬの第二次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいても、同程度のＨＹ１特異的ＣＴＬ出現頻度が認められた（図４）。
【実施例３】
【００６４】
プライミング効率の増大は濃度依存的である
ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１によるプライミング効率の増大が、二分型ポリペプチドおよびＣｐＧの用量を低減しても観察可能であるかどうかについて調べた。Ｂ６のメスを、ＣｐＧ＋ＨＹ１およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１の混合物を用いて、これら２種の構成成分それぞれについて１００、４０、および１０μｇの用量としてプライミングした。１０日後に脾臓を採取してＣＤ８＋ＣＴＬを富化し、同系のオスおよびメスの脾細胞の抗原細胞を用いて第一次および第二次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施したが、同系メスの脾細胞については未処理のものとＨＹ１でパルス処理したものとを使用した。第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて（図５Ａおよび５Ｂ）、プライミング効率は、同系オスの抗原細胞（図５Ａ）および１０ｎＭのＨＹ１ペプチドでパルスしたメスの抗原細胞（図５Ｂ）で試験した場合、４０μｇ用量のＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１ペプチドでは維持されていたが、完全にプロセシングされたＨＹ１ペプチドでは維持されていなかった。１０μｇではＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１またはＨＹ１のいずれを用いた第一次ＥＬＩＳＰＯＴにおいてもプライミングは検出できなかった。同系オスの抗原細胞およびＨＹ１でパルスした同系メスの抗原細胞を用いた第二次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいても同程度の結果が認められた。すなわち、ＨＹ１でパルスした抗原細胞の場合、いずれの用量のＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１でプライミングされたＣＴＬの出現頻度も、対応する用量のＨＹ１でプライミングされたＣＴＬの出現頻度より顕著に高かった。
【実施例４】
【００６５】
二分型ポリペプチドによるプライミング効率は時間とともに変化する
本発明者らはＨＹ１プライモトープの尾部にＡｒｇ／Ｌｙｓ残基が存在するとＣｐＧの沈殿が促進されることを観察したが、他の研究者らは、ポリＡｒｇがＣｐＧオリゴヌクレオチドを沈殿させ、該オリゴヌクレオチドが長期にわたり注射部位に堆積した状態になりＣＴＬのプライミング期間の延長を伴うことを観察している（リングナウ（Ｌｉｎｇｎａｕ）ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  第２０巻、ｐ．３４９８−３５０８、２００２年）。このような長期の堆積は、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１においても生じると考えられ、したがってＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを沈殿させないが強力にＣＴＬの初期応答をプライミングするＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１よりも長い期間プライミングすることになるであろうとの仮説が立てられた。Ｂ６のメスを、ＣｐＧとＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１またはＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１とでプライミングし、脾臓および流入領域リンパ節を１５、２９、５０日目に採取して、ペプチドでパルスした同系メスの抗原細胞を用いて第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った（図６Ａおよび６Ｂ）。これらの結果から、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１は、ＨＹ１ペプチド１０ｎＭ（図６Ａ）および１μＭ（図６Ｂ）でパルスした抗原細胞では、１５日目に採取された脾臓および流入領域リンパ節のいずれにおいても最も良くＣＴＬをプライミングすることが示された。しかしながら、この差異は２９日目には消失し、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１のプライミングによりリンパ節および脾臓のいずれにおいても同様のＨＹ１特異的ＣＴＬの出現頻度であった。このＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１の間の、同程度のプライミングレベルを伴う類似性
は、５０日目まで持続した。５０日目の試験では、脾臓よりも流入領域リンパ節において高いＨＹ１特異的ＣＴＬの出現頻度への変化がみられ、このことからこの時点までの注射部位における２種のポリペプチドの保持状態にはＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１およびＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１の間で一貫した差異がないことが示唆された。
【実施例５】
【００６６】
免疫原性ポリペプチドによる免疫原性の増大にＭＰＬ−ＡＦは必要ではない
ＣｐＧを効率よく沈殿させることのできるＭｉＨＡポリペプチドについて、ＭＰＬ−ＡＦを使用しなくてもよいかどうかを調べた。ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１免疫原性ポリペプチド＋ＣｐＧ（本発明者らが用いる標準的濃度）を用いて、ＭＰＬ−ＡＦを使用または未使用としてメスのＢ６マウスをプライミングした。ＩＦＮγ分泌ＣＴＬについてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果から、プライミング用混合物にＭＰＬ−ＡＦを含めてもＨＹ１特異的ＣＴＬの刺激の効率は増大せず、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１を用いたプライミングにはＣｐＧで十分であることが実証された（図７）。実際、ＭＰＬ−ＡＦを除外するとＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１およびＣｐＧのみを用いたプライミングの効率は増大したようである。
【実施例６】
【００６７】
免疫原性ポリペプチドはメラノーマポリペプチドの免疫原性を増大させた
ＫＣＳＲＮＲアミノ酸配列の付加によりＨＹ１およびＨ６０以外のポリペプチドの免疫原性を増大させることができるかどうかを調べるため、ＫＣＳＲＮＲアミノ酸配列を含む一連のＨＬＡ−Ａ２結合ポリペプチドを合成した。該ポリペプチド群には、メラニン細胞およびメラノーマ細胞で特異的に発現されるチロシナーゼｇｐ１００およびメランＡタンパク質由来の５つのポリペプチドが含まれる。これらのタンパク質はマウスおよびヒトで正常に発現されるので、ＣＴＬをプライミングするためにはトレランスを打破しなければならない。本発明者らはまた、マウスおよびヒトにとって外来タンパク質である免疫優勢のインフルエンザポリペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）も含めた。これらの二分型ポリペプチドはいずれもＣｐＧを沈殿させたが、原型のポリペプチドはいずれもＣｐＧを沈殿させなかった。レシピエントのマウスは、Ｂ６をバックグラウンドとして選択されたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスとした（リ（Ｌｅ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４２巻、ｐ．１３６６、１９８９年）。これらのマウスでは細胞表面上にＨ２Ｄｂ分子に匹敵する密度でＨＬＡ−Ａ２分子が発現されたが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性のインフルエンザ特異的ＣＴＬの出現頻度は、Ｈ２Ｄｂ拘束性のインフルエンザ特異的ＣＴＬの出現頻度に比べて著しく低かった（リ（Ｌｅ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４２巻、ｐ．１３６６、１９８９年）。さらに、ＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬの免疫原性ポリペプチドに対する応答はこれらのトランスジェニック体では低いことが示されており（エンゲルハート（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４６巻、ｐ．１２２６、１９９１年）、これはおそらくはマウスのｂ２ＭおよびＣＤ８に対するＨＬＡ−Ａ２分子の結合の低下によると思われる。ジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から入手したこれらのマウスは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性のポリペプチドに対する応答性が低下していた。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニック体を、１００μｇのＣｐＧと（１）１００μｇの原型ポリペプチドおよび（２）ＣｐＧ：ペプチド比が等モルとなる量のＫＣＳＲＮＲ含有ポリペプチドとの混合物でｓ．ｃ．によりプライミングした。免疫１０日後に脾臓を採取し、ＣＤ８＋ＣＴＬをＣＤ８＋ネガティブ選択キット（米国カリフォルニア州オーバーン所在のミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で精製して第一次ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。抗原細胞（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）には、濃度を漸増させた原型メラノーマポリペプチドでパルスしたＴ２細胞を含めた。パルスしていないＴ２細胞はＩＦＮγ産生を刺激しなかった。このアッセイの結果から、ＫＣＳＲＮＲアミノ酸配列の付加により、インフルエンザポリペプチドならびに２種のメラノーマ特異的ポリペプチド、メランＡ由来のＡＡＧＩＧＩＬＴＶおよびｇｐ１００由来のＫＴＷＧＱＹＷＱＶについてのプライミングが増大されることが実証された（図８）。ＫＣＳＲ
ＮＲ含有ポリペプチドの応答はそれぞれの原型ポリペプチドの応答より６〜１０倍高かった。従って、プライミング技法を全く変更せずに、ＣＴＬの応答に劣るレシピエントのマウスについて、ＨＬＡ−Ａ２により提示されたポリペプチドに対する応答を高めることができた。
【実施例７】
【００６８】
免疫原性の二分型ＨＹ１ポリペプチドはＣｐＧを沈殿させた
沈殿物中にＣｐＧが存在することを確認するために、ＨＹ１および一連の免疫原性二分型ＨＹ１ポリペプチドを１００μｇのＣｐＧとモル比がおよそ７：１となるように混合した。室温で１５分間インキュベートした後、混合物を１０００×ｇで１５秒間遠心分離した。遠心分離後に、上清の希釈物の光学密度（２６０／２８０ｎｍ）を測定してＣｐＧの沈殿率を概算した（図９）。これらの結果から、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１ポリペプチドおよびＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１ポリペプチドが溶液中のほぼ全てのＣｐＧを沈殿させ、天然のＨＹ１ポリペプチドは〜３０％のＣｐＧを沈殿させたことが確認された。これらの結果は、ＣｐＧの沈殿には正に荷電したアミノ酸が重要であるという仮説を支持し、かつ、上記濃度の二分型ポリペプチドおよびＣｐＧが実際に遊離ＣｐＧを沈殿ＣｐＧへと完全に変換させることを示している。
【００６９】
ＣｐＧをＨＹ１尾部付きポリペプチドと混合した場合に生じる沈殿についてさらに調べるために、ポリペプチド尾部のＡｒｇ／ＬｙｓおよびＣｙｓ残基の役割について調べる実験を計画した。ＫＡＳＲＮＲ、ＡＣＳＡＮＡ、およびＡＡＳＡＮＡの各尾部を含むＨＹ１二分型ポリペプチドを分析に用いた。ＣｐＧオリゴヌクレオチド（６ｎｍｏｌ）とＨＹ１二分型ポリペプチド（２０ｎｍｏｌ）とを、３連として室温で１５分間混合した。沈殿物を１０，０００ｇでペレット化し、上清を１／１００に希釈して２６０ｎｍで分光分析した。図１０に示すように、ＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１は可溶性ＣｐＧの約９０％を沈殿させ、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１およびＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１はＣｐＧ濃度に顕著な作用を示さなかった。これらの結果は、最初に観察された粒子状の沈殿が、極性の高い核酸とプライモトープ尾部の荷電したＡｒｇ／Ｌｙｓアミノ酸との間の相互作用によるものであるという議論を支持している。
【００７０】
ペプチド＋ＣｐＧの混合物中に存在する遊離ペプチドを、逆相ＨＰＬＣで定量したが、この分析方法ではＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび結合した可能性のあるペプチドを検出するのは不可能であった。２種類のＣｐＧオリゴヌクレオチドをこれらの実験に用いた。すなわち、（１）ホスホジエステル結合を有する天然型ＣｐＧおよび（２）ヌクレオチドの４番目と５番目の間に１つのホスホロチオエート結合を有するＣｐＧ（Ｓ１−ＣｐＧ）である。Ｓ１−ＣｐＧを使用することにより、多数の結合が形成されて複雑化する可能性を排除した。ＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１とＳ１−ＣｐＧとの混合物ではＲＰ−ＨＰＬＣにより単一ピークとしてペプチドが検出された（図１１Ａ）。同様に、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１と天然型ＣｐＧとの混合物ではＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１のシグナルが検出可能であった（図１１Ｂ）が、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１とＳ１−ＣｐＧとの混合物では検出できなかった（図１１Ｃ）。ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１と天然型ＣｐＧの試料における２組のピークは、モノマーおよびダイマーを表すものと推定された。これらの結果から、１個のＣｙｓ残基によりＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１二分型ポリペプチドのＳ１−ＣｐＧへの結合は促進されるが天然型ＣｐＧへの結合は促進されないことが示唆された。この結合がＣｙｓを含むペプチドとＳ１−ＣｐＧとの間のジスルフィド結合の形成によるものとすれば、このペプチド：ＣｐＧ混合物の還元およびこれら構成成分のいずれかのアルキル化により結合が除かれるはずである。ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１とＳ１−ＣｐＧとを混合し、ＲＰ−ＨＰＬＣで直接分析するか、あるいは５０ｍＭジチオスレイトールで還元してから分析した。図１１Ｄに示すように、ジチオスレイトールで還元することによりＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１プライモトープが放出され、未処理のＳ１−ＣｐＧとの混合物の場合（図１１Ｆ）には見られないＡＣＳＡＮＡ
−ＨＹ１プライモトープの検出が認められた。この還元条件では、モノマーのペプチドについて予想される単一ピークの溶出が認められた（図１１Ｄ）。さらに、ヨードアセトアミドでＳ１−ＣｐＧをアルキル化してからＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１と混合した結果、モノマーおよびダイマーのＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１プライモトープと推定される検出で示されるように、結合がなくなった（図１１Ｅ）。これらの結果は、硫黄を含むＣｐＧオリゴヌクレオチドとＣｙｓを含むポリペプチドとが、アルキル化やジチオスレイトールによる還元で防止可能なジスルフィド結合を形成しうるという強力な証拠を成すものである。
【実施例８】
【００７１】
免疫原性ポリペプチドおよびＣｐＧによりランゲルハンス細胞によるポリペプチドの吸収効率が上昇した
本明細書に記載の方法は、二分型で免疫原性のクラスＩ結合ポリペプチドによるＣｐＧの直接的な沈殿をもたらしうるものである。両分子が直接沈殿することから、両者がｉｎ
ｖｉｖｏにおいて沈殿および堆積の際に存在するであろうことが確実である。該沈殿物を取り込む抗原提示細胞（ＡＰＣ）も、ＣｐＧを受け取って活性化し、クラスＩ結合ポリペプチドを受け取ってＣＴＬに提示しＣＴＬによって認識される。ＡＰＣによる沈殿物の取り込みを試験するために、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１およびＨＹ１ポリペプチドを、アミン反応色素のＡｌｅｘａ（Ｒ）４８８を用いて製造業者のプロトコール（米国オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に従って染色した。ＣｐＧ分子は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを利用する５’ＥｎｄＴａｇ
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名：米国カリフォルニア州バーリンゲイム所在のベクター・ラボラトリー（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を用いてＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）マレイミドで染色した。Ｂ１０マウスの耳にＡｌｅｘａ４８８−ポリペプチド（耳１つあたり１０μｇ）とＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ＣｐＧ（耳１つあたり１０μｇ）との混合物を注射した。耳に注射したのは、（Ａ）ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１＋ＣｐＧ、または（Ｂ）ＨＹ１＋ＣｐＧとした。１２時間目に耳を採取したが、この時点ではＣｐＧの局所注射によりランゲルハンス細胞（ＬＣ）が活性化されていることが示されている（ヤコブ（Ｊａｋｏｂ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６１巻、ｐ．３０４２、１９９８年）。耳を分割し、Ｖｅｒｓｅｎｅ（商品名）中０．２５％のトリプシンで穏やかに処理してＬＣを抽出した。ＬＣ集団を、ＦＩＴＣ（Ａｌｅｘａ４８８）およびＴＲＩＴＣ（ｒｅｄ）用のトリプルパスフィルタを用いてオリンパスＢＸ５１型蛍光顕微鏡で観察した。
【００７２】
細胞像から、ＨＹ１＋ＣｐＧを注射した耳ではＬＣが１２時間以内にＨＹ１ポリペプチドおよびＣｐＧ分子の両方を吸収するが、これらの分子はＬＣ内の別個のコンパートメント内に集中するようであることが明らかとなった。ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１＋ＣｐＧを注射した耳では、該ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドは共に一部のＬＣの全体にわたって分散した。その他のＬＣは限られたコンパートメント内に集中したＣｐＧならびに細胞表面上に分散したポリペプチドを示した。従って、ＣｐＧおよびＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１の沈殿物が共にＬＣによって取り込まれた後、ポリペプチドが（ＨＹ１に比べて）効率よくかつ迅速に細胞表面に移送される可能性がある。
【００７３】
尾部付きＨＹ１ペプチド内のＡｒｇ／Ｌｙｓ残基およびＣｙｓ残基の、クラスＩ結合ペプチドをＣＴＬに提示することができるランゲルハンス細胞（ＬＣ）のｉｎ  ｖｉｖｏにおける遊走に対する作用についても調べた。ＬＣなどの樹状細胞（ＤＣ）のＣｐＧによる活性化にはＴＬＲ９の発現が必要であり、活性化の結果サイトカインおよび共刺激分子の発現、ならびに流入領域リンパ節への遊走が増大する。ＬＣの遊走に対する二分型ポリペプチドの効果を調べるため、Ｂ６マウスのメス（一群当たり３匹）の後肢足蹠に、Ａｌｅｘａ４８８を結合させたＨＹ１、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１と混合したＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ染色したＣｐＧを注射した。２４時間後に流入領域膝窩リンパ節を
採取してリンパ球様細胞を分離し、二重に染色された細胞の出現頻度を蛍光顕微鏡で概算した。結果を図１２に示すが、同図には、尾部ＫＣＳＲＮＲおよびＡＣＳＡＮＡを付加することにより、二重に染色される細胞の出現頻度が、ＨＹ１ペプチド＋ＣｐＧで刺激した場合の出現頻度に比べておよそ２．５倍高くなったことが示されている。
【実施例９】
【００７４】
二分型ポリペプチドによりＣｐＧのマクロファージへの取り込み効率が上昇した
ＲＡＷ−２６４マクロファージによるＣｐＧの取り込み機構に対する二分型ポリペプチドの作用についても調べた。ＣｐＧの末端をＴｅｘａｓ  Ｒｅｄで標識し、次の二分型ポリペプチド、すなわちＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１、ＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１、およびＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１と混合した。Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ＣｐＧをプライモトープと混合し（５μｇ＋５μｇ）、混合物を増殖培地で希釈して、ＬＳＭ５１０型レーザー走査共焦点顕微鏡（独国オベルコッヘン（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ）所在のカール・ツァイス社（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．））に搭載されたＰＯＣ−Ｒ細胞培養システム（独国スタイヒ（Ｓｔａｉｇ）所在のラコン（ＬａＣｏｎ）社）のカバースリップ上のＲＡＷ細胞に加えた。ＰＯＣ−Ｒチャンバを３７℃に加熱し、加湿システムで５％ＣＯ２／空気混合物を送達した。試料を５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザーで励起し、６３×／１．２Ｎ．Ａ．のＣ−アポクロマート水浸対物レンズで観察した。エアリユニット（ａｉｒｙ
ｕｎｉｔ）が１になるようにピンホールを設定して５６０−６１５ｎｍのバンドパスフィルタでエピ蛍光を集光した。取り込みは５秒間隔でデータを取得して５分間測定した。微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像を透過光検出器で集めた。５１２×５１２の画像を解像度８ビットで集め、データを、Ｗｉｎｄｏｗｓ（Ｒ）ＸＰのＰＣでＬＳＭ画像ブラウザ（ＬＳＭ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ）（カール・ツァイス）を利用し、かつＭａｃｉｎｔｏｓｈ（Ｒ）コンピュータでＩｍａｇｅＪ（米国立精神健康研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ））を用いて分析した。
【００７５】
二分型ポリペプチドはＣｐＧの取り込みに対する作用が明確に異なっていた。ＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１＋ＣｐＧで観察された取り込みが最も遅く、ＣｐＧは取り込まれて細胞全体に分布した。ＣｐＧの取り込みが最も速かったのはＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１によるものであった。ＫＡＳＲＮＲ＋ＣｐＧを添加すると、細胞は即座に膨潤して気泡を形成した後にＣｐＧを取り込み、取り込みは５分間の観察時間中、継続的に増大した。ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１およびＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１と混合したＣｐＧを用いて処理した結果、ＣｐＧの取り込みはＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１よりも速く、細胞内の個別の位置に集中した。このような集中的取り込みに続いて顕著な細胞の運動が認められたが、これは上記のＣｙｓを含むプライモトープ＋ＣｐＧの場合にのみ認められた。ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１にＣｙｓが追加されることにより、正に荷電したこのプライモトープの急速かつ明らかに有害な作用が減弱されたことは明らかであった。重要なことは、Ｃｙｓを含むプライモトープについて観察されたＣｐＧの集中的取り込みは、ＣＴＬ増殖の増大を促進する能力と関連していたことである。
【実施例１０】
【００７６】
既知抗原は免疫原性ポリペプチドの特徴を有している
ＨＹ２ポリペプチドすなわちＫＣＳＲＮＲＱＹＬは、ＣＴＬによって認識され、Ｈ２Ｄｂ分子への結合を制御し、ＣｐＧへの結合を仲介し（Ｃｙｓ）、ＣｐＧを沈殿させる（ＡｒｇおよびＬｙｓ）アミノ酸を含んでいる。これらの特徴が組み合わさって、ＣｐＧとともに投与した場合のＨＹ２の免疫原性が比較的高くなっている可能性がある。さらに、二分型のＨＹ１その他のポリペプチドに最初の６アミノ酸（ＫＣＳＲＮＲ）を使用することにより、ＣｐＧと組み合わせた場合の免疫原性が増大する。これらの観察結果から、種々の免疫原性ポリペプチドを含むタンパク質のアミノ酸配列を調べ、認識ポリペプチドのみならずＣｐＧに結合可能なＣｙｓおよび正に荷電した残基を備えた隣接配列をも含む「天
然型免疫原性ポリペプチド」の存在を探索した。既知の腫瘍抗原、ウイルス抗原、非主要組織適合性抗原について先に調べたところ、クラスＩ結合ポリペプチドではＡｒｇ残基およびＬｙｓ残基のうち少なくともいずれか一方が複数隣接しているという顕著な傾向が明らかとなった。表１は、そのような関連について、腫瘍関連タンパク質３種およびウイルスにコードされたタンパク質１種の一部分において例示している（クラスＩ結合ポリペプチドは太字で示されている）。
【００７７】
【表１】
2008509072.tif 000003
Ａｒｇは、選択的かつわずかしかタンパク質には用いられていない（ダイア（Ｄｙｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ、第５巻、ｐ．１５、１９７１年；キング（Ｋｉｎｇ）およびジュークス（Ｊｕｋｅｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１６４巻、ｐ．７８８、１９６９年）。このことは、クラスＩ結合ポリペプチドの隣接領域におけるＡｒｇの存在が偶発的なものではないであろうことを示している。観察対象とした正に荷電したアミノ酸領域は、該ポリペプチド自体の一部であるか、あるいは該ポリペプチドから最大４０アミノ酸離れて位置する傾向にあるかのいずれかである。本発明者らは、免疫原性ポリペプチドを備えた上記の正に荷電した領域と、機能がＡｒｇ残基の機能に依存する遺伝子との間に明らかな関連を認めた。Ａｒｇ残基に機能上依存しているタンパク質、例えば核膜を横切ってＤＮＡおよび疎水性ＡＢＣ輸送体ファミリーの輸送体に結合しなければならないＤＮＡ結合タンパク質は、特に抗原供給源として示されるものである。既知抗原を継続的に分析することにより、正に荷電したアミノ酸領域との繋がりを共有するクラスタ内に複数の免疫原性ポリペプチドが見出されうることがさらに判明した。従って、１つの比較的大きな領域の膜輸送体は、複数のエピトープを同時に与える可能性を有している。
【００７８】
（その他の実施形態）
本発明のいくつかの実施形態について述べてきた。しかしながら、本発明の思想および範囲から逸脱することなく種々の変更形態が可能であることは理解されよう。従って、その他の実施形態は特許請求の範囲の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１Ａ】３種の非主要Ｈ抗原ペプチドＨ６０、ＨＹ１、ＨＹ２に特異的なＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。抗原細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）には同系および異系の脾細胞を含めた。
【図１Ｂ】３種の非主要Ｈ抗原ペプチドＨ６０、ＨＹ１、ＨＹ２に特異的なＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。抗原細胞にはそれぞれの標的ペプチド１０ｎＭでパルスしたＲＭＡ／Ｓ細胞を含めた。
【図２】ＣｐＧと混合した異なる濃度の記載の抗原ポリペプチド（ＨＹ２、ＨＹ１、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１、およびＲＫＫＲＲＱ−ＨＹ１）に応答したＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。
【図３Ａ】ＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＨＹ１および記載のＨＹ１ポリペプチドと混合したＣｐＧを用いてマウスをプライミングした。ＣＤ８＋ＣＴＬを、第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、同系のオスおよびメスの脾細胞の抗原細胞と混合した。
【図３Ｂ】ＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＨＹ１および記載のＨＹ１ポリペプチドと混合したＣｐＧを用いてメスのＢ６マウスをプライミングした。Ｃｙｓを含むアミノ末端部およびカルボキシ末端部（尾部）を備えたポリペプチドを含めた。ＣＤ８＋ＣＴＬを、第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、未処理または１μＭのＨＹ１ペプチドでパルスしたＢ６メスの脾細胞と混合した。
【図４】図３Ｂに記載のＢ６メスの応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）由来の脾細胞を、第一次ＭＬＣにおいてＢ６オスの抗原細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｃｅｌｌ）で再刺激した場合のＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＣＤ８＋ＣＴＬを、第二次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、Ｂ６オスの脾細胞、未処理のＢ６メスの脾細胞、および１μＭのＨＹ１ペプチドでパルスしたＢ６メスの脾細胞と混合した。
【図５Ａ】第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて検出されたＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＣｐＧ＋漸減量のペプチド（各成分を１００、４０、１０μｇ）を用いてメスのＢ６マウスをプライミングし、１０日後に脾細胞を採取してＣＤ８＋ＣＴＬを富化した。ＣＴＬを、第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、Ｂ６のオスおよびメスの抗原細胞と混合した。
【図５Ｂ】第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて検出されたＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＣｐＧ＋漸減量のペプチド（各成分を１００、４０、１０μｇ）を用いてメスのＢ６マウスをプライミングし、１０日後に脾細胞を採取してＣＤ８＋ＣＴＬを富化した。ＣＴＬを、第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、未処理または１０ｎＭのＨＹ１ペプチドでパルスしたＢ６メスの抗原細胞と混合した。
【図６Ａ】第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて検出されたＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＣｐＧ＋ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１を用いてメスのＢ６マウスをプライミングし、１５日目（１５ｄ）、２９日目（２９ｄ）、５０日目（５０ｄ）に脾臓および流入領域リンパ節を採取した。ＣＤ８＋ＣＴＬを富化し、第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、未処理のＢ６メスの脾細胞または１０ｎＭのペプチドでパルスしたＢ６メスの抗原細胞と混合した。塗りつぶした棒グラフおよび白抜きの棒グラフはそれぞれ流入領域リンパ節および脾臓に対応する。未処理のＢ６メスの抗原細胞に応答するＣＴＬの出現頻度を差し引いて、グラフに示した特異的な出現頻度を求めてある。
【図６Ｂ】第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて検出されたＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＣｐＧ＋ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１を用いてメスのＢ６マウスをプライミングし、１５日目（１５ｄ）、２９日目（２９ｄ）、５０日目（５０ｄ）に脾臓および流入領域リンパ節を採取した。ＣＤ８＋ＣＴＬを富化し、第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、未処理のＢ６メスの脾細胞または１μＭのＨＹ１ペプチドでパルスしたＢ６メスの細胞と混合した。塗りつぶした棒グラフおよび白抜きの棒グラフはそれぞれ流入領域リンパ節および脾臓に対応する。未処理のＢ６メスの抗原細胞に応答するＣＴＬの出現頻度を差し引いて、グラフに示した特異的な出現頻度を求めてある。
【図７】第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果の例を示す図。ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１とＣｐＧとを組み合わせたプライミングからＭＰＬ−ＡＦアジュバントを除くことにより、プライミング効率が増大したように見える。図に示したウェルには、応答細胞として２．５×１０５個のＣＤ８＋ＣＴＬと、ＨＹ１ポリペプチドでパルスしたＲＭＡ−Ｓ抗原細胞が含まれている。グラフは、ポリペプチド刺激に応答して活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度を示している。
【図８】第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果の例を示す図。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列ＫＣＳＲＮＲを、２種のメラノーマのＣＴＬ活性化ポリペプチド（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（メランＡ）およびＫＴＷＱＹＷＱＶ（ｇｐ１００））および免疫優勢のインフルエンザポリペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴ）に連結した結果、それぞれの天然型ポリペプチドに比べて、ＣｐＧ＋ＭＰＬ−ＡＦと混合したときのＨＬＡ−Ａ２トランスジェニック体のプライミングが増大した。図に示したウェルには、応答細胞として３×１０５個のＣＤ８＋ＣＴＬと、ポリペプチドでパルスしたＴ２抗原細胞が含まれている。グラフは、ポリペプチド刺激に応答して活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度を示している。
【図９】吸光度のデータを示すグラフ。沈殿が形成されると吸光度は低下する。データは、ＨＹ１のＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列内の正に荷電した残基が、ｉｎ  ｖｉｖｏプライミングにおいて用いられた濃度のＣｐＧのほぼ完全な沈殿を仲介することを示している。
【図１０】ＨＹ１−尾部付き二分型ポリペプチドを含む溶液からＣｐＧを沈殿させた後の上清について吸光度の値を示すグラフ。沈殿物を上清から除き、次いで１／１００に希釈して２６０ｎｍで分光分析を実施した。
【図１１】ＲＰ−ＨＰＬＣトレースを示す図。（Ａ）混合物ＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１＋Ｓ１−ＣｐＧのＲＰ−ＨＰＬＣトレース。Ｓ１−ＣｐＧはホスホロチオエート基を１つ含んでいる。０．１％トリフルオロ酢酸中７５分間の０−９５％アセトニトリル勾配を用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより混合物を分離した。（Ｂ）混合物ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１＋天然型ＣｐＧのＲＰ−ＨＰＬＣトレース。図１０Ａに記載したようにしてＲＰ−ＨＰＬＣにより混合物を分離した。（Ｃ）混合物ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１＋Ｓ１−ＣｐＧ（図１０Ａ参照）のＲＰ−ＨＰＬＣトレース。図１０Ａに記載したようにしてＲＰ−ＨＰＬＣにより混合物を分離した。（Ｄ）混合物ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１＋Ｓ１−ＣｐＧ（図１０Ａ参照）のＲＰ−ＨＰＬＣトレース。該混合物はＲＰ−ＨＰＬＣで分離する直前に０．０５ＭのＤＴＴで還元された。図１０Ａに記載したようにしてＲＰ−ＨＰＬＣにより混合物を分離した。（Ｅ）混合物ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１＋Ｓ１−ＣｐＧ（図１０Ａ参照）のＲＰ−ＨＰＬＣトレース。Ｓ１−ＣｐＧは混合前に１０ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化済みである。図１０Ａに記載したようにしてＲＰ−ＨＰＬＣにより混合物を分離した。（Ｆ）混合物ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１＋Ｓ１−ＣｐＧ（図１０Ａ参照）のＲＰ−ＨＰＬＣトレース。図１０Ａに記載したようにしてＲＰ−ＨＰＬＣにより混合物を分離した。
【図１２】二重染色されたランゲルハンス細胞の割合（％）を示すグラフ。メスのＢ６マウス（一群あたり３匹）を麻酔し、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄを結合させたＣｐＧと、Ａｌｅｘａ４８８を結合させてあるＨＹ１、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１ペプチドとを足蹠に注射した。注射したマウスを２４時間後に屠殺し、膝窩リンパ節を切除した。二重に染色された細胞の出現頻度を蛍光顕微鏡で概算した。
【図１Ａ】
2008509072.tif 000004
【図１Ｂ】
2008509072.tif 000005
【図２】
2008509072.tif 000006
【図３Ａ】
2008509072.tif 000007
【図３Ｂ】
2008509072.tif 000008
【図４】
2008509072.tif 000009
【図５Ａ】
2008509072.tif 000010
【図５Ｂ】
2008509072.tif 000011
【図６Ａ】
2008509072.tif 000012
【図６Ｂ】
2008509072.tif 000013
【図７】
2008509072.tif 000014
【図８】
2008509072.tif 000015
【図９】
2008509072.tif 000016
【図１０】
2008509072.tif 000017
【図１１】
2008509072.tif 000018
【図１２】
2008509072.tif 000019
【配列表】
2008509072000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月6日(2006.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
（関連出願）
本願は２００４年２月６日に出願された米国仮特許出願第６０／５４２，３７１号の優先権を主張する２００５年２月４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００３７５４号の国内移行段階である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、０、１、２、３またはそれ以上の正に荷電したアミノ酸を含むことができる。正に荷電したアミノ酸が過剰であると、短期的な筋書きとしてはＴ細胞の活性化および増殖を阻止しうるが、長期的には（例えば３０、４０、５０、７５、１００または１５０日またはさらに長期にわたって）Ｔ細胞の活性化の刺激に有効となりうる。上記阻害は、ＣｐＧが濃縮され沈殿してポリペプチドとＣｐＧのいずれをも不活性な複合体の中に押さえ込んでしまうことに起因する可能性がある。Ｃｙｓおよび正に荷電したアミノ酸はＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列の中の任意の部位にあってよく、その他のアミノ酸は任意のアミノ酸であってよいが、好ましくは正に荷電したアミノ酸は配列全体にわたって規則的な間隔となっているとよい。例えば、正に荷電したアミノ酸が１つおき、２つおき、または３つおきのアミノ酸部位に配置されてもよい。正に荷電したアミノ酸残基の配置は完全に周期的である必要はない。例えば、ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、本明細書に記載の任意のＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列であってよい。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列は、例えば、ＫＣＳＲＮＲ（配列番号１）またはＡＣＳＡＮＡ（配列番号２）であってよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
ＣｐＧ分子
本明細書に記載のように、ＣｐＧ分子は、少なくとも１つの非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。ＣｐＧ分子は約１５〜２５ヌクレオチド長で、好ましくは約１８〜２０ヌクレオチド長であるとよい。該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのＣｐＧコンセンサスモチーフＲＲＣｐＧＹＹ（配列番号８）（ＲはプリンでＹはピリミジン）を含みうる。ＣｐＧ分子は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む骨格を備えうるが、好ましくはＣｐＧ分子全体の骨格がホスホロチオエート結合で構成されているとよい。ホスホロチオエート骨格の側鎖は酸素の代わりに少なくとも１つまたは複数の硫黄原子を含み、そしてホスホロチオエート骨格によって、硫黄原子を含まないオリゴヌクレオチド骨格に比べて半減期が延び、活性レベルが上昇し、かつ活性の特異性の変化はごくわずかとなりうる（クレイグ（Ｋｒｅｉｇ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２０巻、ｐ．７０９、２００２年）。理論に拘泥することは望むものではないが、ホスホロチオエート骨格の硫黄原子は、免疫性の応答を増強しうるＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列のＣｙｓ残基とともにジスルフィド結合を形成する可能性がある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
任意のＣｐＧ分子、またはジスルフィド結合を介して結合するためのホスホロチオエート結合を有する任意のＤＮＡ分子を、本明細書に記載の組成物および方法において用いることができる。例えば、マウスのＴＬＲに特異的なＣｐＧ分子１８２６（５’‐ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴ‐３’（配列番号１６））（デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６０巻、ｐ．８７０、１９９８年）を記載されるように使用することができる。例えばリングナウ（Ｌｉｎｇｎａｕ）らの文献（Ｖａｃｃｉｎｅ、第２０巻、ｐ．３４９８−３５０８、２００２年）に記載のＣｐＧ分子も参照されたい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
問題点が病原体への曝露の制限にあるらしいことが見出されたので、本発明者らは、薬理学的方法、例えば抗体を介した同時刺激などの使用よりもむしろ、細菌アジュバントを用いてＣＴＬのＭｉＨＡに対する応答を増大させることについて検討した。ＣＴＬの応答を増強する能力について報告のある、それぞれＴＬＲ−４およびＴＬＲ−９に結合するリピドＡおよびＣｐＧ分子を使用することとした。リピドＡは、ＭＰＬ−ＡＦ（界面活性剤様のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）と混合したＭＰＬアジュバント（モノホスホリルリピドＡ））の形態でコリキサ・コーポレイション（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（米国ワシントン州シアトル所在）より供給された。使用したＣｐＧ分子は、マウスのＴＬＲ−９に特異的な１８２６オリゴヌクレオチド（ＴＣＣＡ  ＴＧＡＣ  ＧＴＴＣ  ＣＴＧＡ  ＣＧＴＴ（配列番号１６））であり（デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６０巻、ｐ．８７０、１９９８年）；このＣｐＧオリゴヌクレオチドは、マヨ・クリニック・モレキュラー・バイオロジー・コア（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ）によりホスホロチオエー
ト骨格を用いて合成された（別途指定のない限り、本発明者が用語ＣｐＧを用いるときはこの合成型を指している）。ＣｐＧで繰り返し処理されたマウスにおいて以前観察された強力な全身性の炎症を回避する努力の中で、本発明者らは単回の投与で使用するためにＣｐＧ、ＭＰＬ、および抗原を混合した。１０μｇのＭＰＬ−ＡＦ＋１００μｇのＣｐＧをＭｉＨＡ不適合の脾細胞または合成ＭｉＨＡポリペプチド（１００μｇ）のいずれかと混合して、尾の基部への皮下（ｓ．ｃ．）注射用に用いて予備的実験を実施した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
ＷＭＨＨＮＭＤＬＩペプチド（ＨＹ１）（配列番号９）およびＫＣＳＲＮＲＱＹＬペプチド（ＨＹ２）（配列番号１０）は、ネズミのＹ連鎖遺伝子にコードされるタンパク質由来のものであり、Ｈ２Ｄｂ分子によりＣＴＬに提示される（キング（Ｋｉｎｇ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  第２４巻、ｐ．１５９−１６８、１９９４年；グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  第１４巻、ｐ．４７４−４７８、１９９６年）。これら２種のペプチドおよびＭＰＬ−ＡＦとＣｐＧアジュバントとの組み合わせの混合物について、ＣＴＬの応答をプライミングする能力を試験した。上記２種のペプチドについては、ｉｎ  ｖｉｖｏでのプライミング効率について、免疫的に優勢なＨ６０ペプチド（ＬＴＦＮＹＲＮＬ（配列番号１９））（マラルカナン（Ｍａｌａｒｋａｎｎａｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６１巻、ｐ. ３５０１−３５０９、１９９８年）とも比較した。Ｂ６のメスをｓ．ｃ．でプライミングし、免疫化１０日後に脾臓を採取した。ＣＤ８＋ＣＴＬをネガティブ選択により富化し、ＩＦＮγを分泌するＣＴＬの出現頻度を概算するために、第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて（１）同系のメスの脾細胞、（２）同系のオスの脾細胞、（３）抗Ｈ６０  ＣＴＬについて同種異系（ＢＡＬＢ．Ｂ）の脾細胞、および（４）ペプチドでパルスしたＲＭＡ／Ｓ細胞で刺激した。第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、１００μｇのポリペプチド＋１００μｇのＣｐＧおよび１０μｇのＭＰＬ−ＡＦを用いて単回免疫されたネズミ由来のＣＤ８＋脾細胞の応答細胞を用いて実施した。ＲＭＡ／Ｓ細胞は、濃度１０ｎＭのそれぞれの標的ポリペプチドでパルスした。応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）および抗原細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）を、抗ＩＦＮγ捕捉抗体でコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートで４８時間培養し、その後ビオチン化した抗ＩＦＮγ検出抗体を、次いでストレプトアビジンと結合したＨＲＰおよびＡＥＣ基質を添加した。最初にウェルのデジタル画像を得ることにより（Ｃ．Ｔ．Ｌ．アナライザーズ社（Ｃ．Ｔ．Ｌ．Ａｎａｌｙｚｅｒｓ）、米国オハイオ州クリーブランド所在により実施）、スポットを計数し、次いでＣ．Ｔ．Ｌ．アナライザーズ社から入手したＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（登録商標）ソフトウェアを用いてこれらの画像を分析した。応答細胞のＣＴＬの出現頻度に基づくと、ＨＹ２ポリペプチドが最も効率良くＣＴＬをプライミングし、Ｈ６０ポリペプチドは最も効率が悪かった（図１Ａおよび１Ｂ）。米国仮特許出願第６０／５４２，３７１号も参照されたい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
本発明者らは、仮説として（１）沈殿の形成はＨＹ２の正に荷電した残基とＣｐＧ分子の負の電荷との間のイオン結合による、（２）この沈殿形成によりＣＴＬの刺激が増強される、とした。これらの仮説について検証するために、アミノ末端にＫＣＳＲＮＲ配列（配列番号１）およびＲＫＫＲＲＱ配列（配列番号３）が付加された２つのＨＹ１バリアン
トを合成した。ＫＣＳＲＮＲ配列（配列番号１）はＨＹ２由来であり、ＲＫＫＲＲＱ配列（配列番号３）は活性型のＨＩＶ  ＴＡＴポリペプチド（ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列の長さを６アミノ酸に維持）（バイブス（Ｖｉｖｅｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、ｐ．１６０１０、１９９７年）由来であった。２つの二分型ポリペプチドはＣｐＧを沈殿させ（天然型ＨＹ１では沈殿しない）、第１の仮説が支持された。混合してＣｐＧ＋ＭＰＬとともに注射したところ、ＫＣＳＲＮＲ（配列番号１）アミノ酸配列と融合させたＨＹ１ポリペプチドはＨＹ１特異的ＣＴＬの出現頻度を著しく高めた（図２を参照）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
ＲＫＫＲＲＱ（配列番号３）を含むポリペプチドについても、トロイの構築物（ルー（Ｌｕ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６６巻、ｐ．７０６３、２００１年）に用いられた完全長の活性型ＨＩＶ  ＴＡＴポリペプチドにより、注射が困難な程度にまで強力にＣｐＧが沈殿し、短期の機能アッセイではＣｐＧの初期のアジュバント活性が阻害されることが観察された。正の電荷が多すぎるとＴ細胞の活性および増殖が阻害される可能性がある。このことは、ポリＡｒｇ（６０残基）によりＣｐＧが急速に沈殿しうるという観察（リングナウ（Ｌｉｎｇｎａｕ）ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  第２０巻、ｐ．３４９８、２００２年）と一致する；そのような沈殿物は組織内に堆積してｉｎ  ｖｉｖｏで非常に長期間存在する可能性があり、その証拠として、該沈殿物は関連する免疫原性ポリペプチドとともに少なくも３７２日間はプライミングを続けることができる（リングナウ（Ｌｉｎｇｎａｕ）ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  第２０巻、ｐ．３４９８、２００２年）。免疫原性ポリペプチドおよびＣｐＧを選択的かつ強力に沈殿させることができれば、長期間かつ恒久的なＣＴＬ応答を刺激する手段が提供される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
二分型ポリペプチドのＣＴＬプライミング能力を試験するために、Ｂ６のメスを、ＣｐＧアジュバントとＨＹ１、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）、ＲＫＫＲＲＱ−ＨＹ１（配列番号２１）、およびＨＹ２との混合物を用いてプライミングした。１０日後に脾臓を採取してＣＤ８＋ＣＴＬを富化し、抗原細胞としてペプチドでパルスしたＲＭＡ／Ｓ細胞を用いてＩＦＮγの第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した（図２）。図１Ａおよび１Ｂに示した結果と一致して、試験した全てのペプチド濃度についてＨＹ２はＨＹ１よりも高頻度でＣＴＬをプライミングした。ＨＹ１標的ペプチドにＫＣＳＲＮＲの尾部を連結した結果、ＨＹ２について得られた結果に匹敵するＨＹ１特異的なＣＴＬ出現頻度が得られた。ＲＫＫＲＲＱの尾部（配列番号３）では、ＨＹ１とＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）との比較に対して中間レベルのプライミング効率まで上昇した。ＨＹ２、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）、およびＲＫＫＲＲＱ−ＨＹ１（配列番号２１）ペプチドはいずれもＣｐＧオリゴヌクレオチドを沈殿させた。ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）におけるプライミング効率の上昇から、正に荷電した残基を３つ有しているこの６アミノ酸配列を付加することにより、ＨＹ１特異的なプライミングが高まったことが示唆された。しかしながら、正に荷電した残基を５つ備えたＲＫＫＲＲＱ−ＨＹ１ペプチド（配列番号２１）では中間的な効率であったことから、正に荷電したアミノ酸の数の増大とさらなるプライミングの増強とは関連がないことが示唆された。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
システイン残基は免疫原性の増大に重要である
ＨＹ１二分型ポリペプチドのＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列ＫＣＳＲＮＲ（配列番号１）のＡｒｇ／Ｌｙｓ残基の役割を調べるために、３つの正に荷電した残基をＡｌａ残基で置換した。この改変型の二分型ポリペプチドをそれぞれＣｐＧと混合してメスのＢ６マウスをプライミングした。１０日目に脾細胞を採取して、第一次および第二次のＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのためにＣＤ８＋ＣＴＬを富化した。先述の実験において、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）によるプライミングでは、第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、完全にプロセシングされたＨＹ１ペプチドでプライミングした場合よりも高いＨＹ１特異的なＣＴＬ出現頻度が得られた（図３Ａおよび３Ｂ）。この順位は、同系のオス（図３Ａ）およびＨＹ１でパルスした同系メス脾細胞の抗原細胞（図３Ｂ）のいずれにおいても観察された。驚いたことに、Ａｒｇ／Ｌｙｓ残基を全てＡｌａに置換したＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）ポリペプチドについて、ＣｐＧを沈殿させる能力が失われたにもかかわらずプライミング効力は失われなかった。実際に、ポリペプチドでパルスしたメスの細胞の刺激により、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）でプライミングしたマウスよりもＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）でプライミングしたマウスからより高い出現頻度でＨＹ１特異的ＣＴＬが得られた（図３Ｂ）。第一次ＭＬＣにおいて同系オスの脾細胞を用いた刺激によって増殖させたＣＴＬの第二次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで確認結果を得た（図４）。応答細胞ＣＴＬがＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）でプライミングしたマウス由来である場合、同系オスの脾細胞およびペプチドでパルスした脾細胞の刺激により、同程度のＨＹ１特異的ＣＴＬ出現頻度が得られた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
合成ＣｐＧオリゴヌクレオチドは一般にｉｎ  ｖｉｖｏでのヌクレアーゼ感受性を低減するためにホスホロチオエート結合で合成される（スタイン（Ｓｔｅｉｎ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第１６巻、ｐ．３２０９−３２２１、１９８８年）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのプライミングの促進におけるＣｙｓの傑出した役割に関する１つの説明は、Ｃｙｓを含むＨＹ１プライモトープと合成ＣｐＧオリゴヌクレオチドとの間のジスルフィド結合の形成である。ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）プライモトープを用いたｉｎ  ｖｉｖｏでのプライミングにおけるＣｙｓの重要性は、Ａｌａ置換を加えることにより確認された。ＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１プライモトープ（Ｃｙｓ＞Ａｌａ）は、第一次および第二次のＥＬＩＳＰＯＴいずれにおいても検証されたように事実上プライミング能を示さなかった（図３Ａおよび３Ｂ、ならびに図４）。しかしながら、ＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２２）ポリペプチドは視認できる程度にＣｐＧを沈殿させる能力を依然として維持していた。ＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２４）ポリペプチドはｉｎ  ｖｉｖｏでのプライミング能を失っている点でＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１と同じであった。これらの結果は、おそらくは合成ＣｐＧオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート結合とのジスルフィド結合の形成を介する、最適なＨＹ１特異的プライミングには、１つのＣｙｓ残基が必要であるという仮説を支持するものであった。本発明者らは、該ペプチドにＣｙｓを追加すると複数のＣｐＧ分子と架橋できるため免疫原
性が増大するという可能性について調べた。アミノ末端およびカルボキシ末端に１つずつＣｙｓ残基を備えたＨＹ１ポリペプチド、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１−ＡＮＡＳＣＡ（配列番号１８）を合成した。このポリペプチドをＣｐＧと組み合わせてＢ６のメスをプライミングし、第一次および第二次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＨＹ１特異的ＣＴＬの出現頻度を概算した。第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける同系オスの抗原細胞に応答したＨＹ１特異的ＣＴＬの出現頻度から、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）ポリペプチドによるプライミングに比べて顕著なプライミング効率の増大が認められた（図３Ａ）。さらに、Ｃｙｓ残基を備えた尾部、ＡＣＳＡＮＡ（配列番号２）、ＫＣＳＲＮＲ（配列番号１）、および二重のＡＣＳＡＮＡ（配列番号２）の尾部を有する３種いずれのポリペプチドでプライミングしたマウス由来のＣＤ８＋ＣＴＬの第二次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいても、同程度のＨＹ１特異的ＣＴＬ出現頻度が認められた（図４）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
プライミング効率の増大は濃度依存的である
ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）によるプライミング効率の増大が、二分型ポリペプチドおよびＣｐＧの用量を低減しても観察可能であるかどうかについて調べた。Ｂ６のメスを、ＣｐＧ＋ＨＹ１およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）の混合物を用いて、これら２種の構成成分それぞれについて１００、４０、および１０μｇの用量としてプライミングした。１０日後に脾臓を採取してＣＤ８＋ＣＴＬを富化し、同系のオスおよびメスの脾細胞の抗原細胞を用いて第一次および第二次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施したが、同系メスの脾細胞については未処理のものとＨＹ１でパルス処理したものとを使用した。第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて（図５Ａおよび５Ｂ）、プライミング効率は、同系オスの抗原細胞（図５Ａ）および１０ｎＭのＨＹ１ペプチドでパルスしたメスの抗原細胞（図５Ｂ）で試験した場合、４０μｇ用量のＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）ペプチドでは維持されていたが、完全にプロセシングされたＨＹ１ペプチドでは維持されていなかった。１０μｇではＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）またはＨＹ１のいずれを用いた第一次ＥＬＩＳＰＯＴにおいてもプライミングは検出できなかった。同系オスの抗原細胞およびＨＹ１でパルスした同系メスの抗原細胞を用いた第二次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいても同程度の結果が認められた。すなわち、ＨＹ１でパルスした抗原細胞の場合、いずれの用量のＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）でプライミングされたＣＴＬの出現頻度も、対応する用量のＨＹ１でプライミングされたＣＴＬの出現頻度より顕著に高かった。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
二分型ポリペプチドによるプライミング効率は時間とともに変化する
本発明者らはＨＹ１プライモトープの尾部にＡｒｇ／Ｌｙｓ残基が存在するとＣｐＧの沈殿が促進されることを観察したが、他の研究者らは、ポリＡｒｇがＣｐＧオリゴヌクレオチドを沈殿させ、該オリゴヌクレオチドが長期にわたり注射部位に堆積した状態になりＣＴＬのプライミング期間の延長を伴うことを観察している（リングナウ（Ｌｉｎｇｎａｕ）ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  第２０巻、ｐ．３４９８−３５０８、２００２年）。このような長期の堆積は、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）においても生じると考えられ、したがってＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを沈殿させないが強力に
ＣＴＬの初期応答をプライミングするＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）よりも長い期間プライミングすることになるであろうとの仮説が立てられた。Ｂ６のメスを、ＣｐＧとＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）またはＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）とでプライミングし、脾臓および流入領域リンパ節を１５、２９、５０日目に採取して、ペプチドでパルスした同系メスの抗原細胞を用いて第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った（図６Ａおよび６Ｂ）。これらの結果から、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）は、ＨＹ１ペプチド１０ｎＭ（図６Ａ）および１μＭ（図６Ｂ）でパルスした抗原細胞では、１５日目に採取された脾臓および流入領域リンパ節のいずれにおいても最も良くＣＴＬをプライミングすることが示された。しかしながら、この差異は２９日目には消失し、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）のプライミングによりリンパ節および脾臓のいずれにおいても同様のＨＹ１特異的ＣＴＬの出現頻度であった。このＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）の間の、同程度のプライミングレベルを伴う類似性は、５０日目まで持続した。５０日目の試験では、脾臓よりも流入領域リンパ節において高いＨＹ１特異的ＣＴＬの出現頻度への変化がみられ、このことからこの時点までの注射部位における２種のポリペプチドの保持状態にはＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）およびＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）の間で一貫した差異がないことが示唆された。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
免疫原性ポリペプチドによる免疫原性の増大にＭＰＬ−ＡＦは必要ではない
ＣｐＧを効率よく沈殿させることのできるＭｉＨＡポリペプチドについて、ＭＰＬ−ＡＦを使用しなくてもよいかどうかを調べた。ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１免疫原性ポリペプチド＋ＣｐＧ（本発明者らが用いる標準的濃度）を用いて、ＭＰＬ−ＡＦを使用または未使用としてメスのＢ６マウスをプライミングした。ＩＦＮγ分泌ＣＴＬについてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果から、プライミング用混合物にＭＰＬ−ＡＦを含めてもＨＹ１特異的ＣＴＬの刺激の効率は増大せず、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）を用いたプライミングにはＣｐＧで十分であることが実証された（図７）。実際、ＭＰＬ−ＡＦを除外するとＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）およびＣｐＧのみを用いたプライミングの効率は増大したようである。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
免疫原性ポリペプチドはメラノーマポリペプチドの免疫原性を増大させた
ＫＣＳＲＮＲ（配列番号１）アミノ酸配列の付加によりＨＹ１およびＨ６０以外のポリペプチドの免疫原性を増大させることができるかどうかを調べるため、ＫＣＳＲＮＲ（配列番号１）アミノ酸配列を含む一連のＨＬＡ−Ａ２結合ポリペプチドを合成した。該ポリペプチド群には、メラニン細胞およびメラノーマ細胞で特異的に発現されるチロシナーゼｇｐ１００およびメランＡタンパク質由来の５つのポリペプチドが含まれる。これらのタンパク質はマウスおよびヒトで正常に発現されるので、ＣＴＬをプライミングするためにはトレランスを打破しなければならない。本発明者らはまた、マウスおよびヒトにとって外来タンパク質である免疫優勢のインフルエンザポリペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１７））も含めた。これらの二分型ポリペプチドはいずれもＣｐＧを沈殿させたが、原型のポリペプチドはいずれもＣｐＧを沈殿させなかった。レシピエントのマウスは、
Ｂ６をバックグラウンドとして選択されたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスとした（リ（Ｌｅ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４２巻、ｐ．１３６６、１９８９年）。これらのマウスでは細胞表面上にＨ２Ｄｂ分子に匹敵する密度でＨＬＡ−Ａ２分子が発現されたが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性のインフルエンザ特異的ＣＴＬの出現頻度は、Ｈ２Ｄｂ拘束性のインフルエンザ特異的ＣＴＬの出現頻度に比べて著しく低かった（リ（Ｌｅ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４２巻、ｐ．１３６６、１９８９年）。さらに、ＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬの免疫原性ポリペプチドに対する応答はこれらのトランスジェニック体では低いことが示されており（エンゲルハート（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４６巻、ｐ．１２２６、１９９１年）、これはおそらくはマウスのｂ２ＭおよびＣＤ８に対するＨＬＡ−Ａ２分子の結合の低下によると思われる。ジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から入手したこれらのマウスは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性のポリペプチドに対する応答性が低下していた。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニック体を、１００μｇのＣｐＧと（１）１００μｇの原型ポリペプチドおよび（２）ＣｐＧ：ペプチド比が等モルとなる量のＫＣＳＲＮＲ（配列番号１）含有ポリペプチドとの混合物でｓ．ｃ．によりプライミングした。免疫１０日後に脾臓を採取し、ＣＤ８＋ＣＴＬをＣＤ８＋ネガティブ選択キット（米国カリフォルニア州オーバーン所在のミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で精製して第一次ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。抗原細胞（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）には、濃度を漸増させた原型メラノーマポリペプチドでパルスしたＴ２細胞を含めた。パルスしていないＴ２細胞はＩＦＮγ産生を刺激しなかった。このアッセイの結果から、ＫＣＳＲＮＲ（配列番号１）アミノ酸配列の付加により、インフルエンザポリペプチドならびに２種のメラノーマ特異的ポリペプチド、メランＡ由来のＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号４）およびｇｐ１００由来のＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号５）についてのプライミングが増大されることが実証された（図８）。ＫＣＳＲＮＲ（配列番号１）含有ポリペプチドの応答はそれぞれの原型ポリペプチドの応答より６〜１０倍高かった。従って、プライミング技法を全く変更せずに、ＣＴＬの応答に劣るレシピエントのマウスについて、ＨＬＡ−Ａ２により提示されたポリペプチドに対する応答を高めることができた。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
免疫原性の二分型ＨＹ１ポリペプチドはＣｐＧを沈殿させた
沈殿物中にＣｐＧが存在することを確認するために、ＨＹ１および一連の免疫原性二分型ＨＹ１ポリペプチドを１００μｇのＣｐＧとモル比がおよそ７：１となるように混合した。室温で１５分間インキュベートした後、混合物を１０００×ｇで１５秒間遠心分離した。遠心分離後に、上清の希釈物の光学密度（２６０／２８０ｎｍ）を測定してＣｐＧの沈殿率を概算した（図９）。これらの結果から、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）ポリペプチドおよびＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２２）ポリペプチドが溶液中のほぼ全てのＣｐＧを沈殿させ、天然のＨＹ１ポリペプチドは〜３０％のＣｐＧを沈殿させたことが確認された。これらの結果は、ＣｐＧの沈殿には正に荷電したアミノ酸が重要であるという仮説を支持し、かつ、上記濃度の二分型ポリペプチドおよびＣｐＧが実際に遊離ＣｐＧを沈殿ＣｐＧへと完全に変換させることを示している。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
ＣｐＧをＨＹ１尾部付きポリペプチドと混合した場合に生じる沈殿についてさらに調べるために、ポリペプチド尾部のＡｒｇ／ＬｙｓおよびＣｙｓ残基の役割について調べる実験を計画した。ＫＡＳＲＮＲ（配列番号１１）、ＡＣＳＡＮＡ（配列番号２）、およびＡＡＳＡＮＡ（配列番号７）の各尾部を含むＨＹ１二分型ポリペプチドを分析に用いた。ＣｐＧオリゴヌクレオチド（６ｎｍｏｌ）とＨＹ１二分型ポリペプチド（２０ｎｍｏｌ）とを、３連として室温で１５分間混合した。沈殿物を１０，０００ｇでペレット化し、上清を１／１００に希釈して２６０ｎｍで分光分析した。図１０に示すように、ＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２２）は可溶性ＣｐＧの約９０％を沈殿させ、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）およびＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２４）はＣｐＧ濃度に顕著な作用を示さなかった。これらの結果は、最初に観察された粒子状の沈殿が、極性の高い核酸とプライモトープ尾部の荷電したＡｒｇ／Ｌｙｓアミノ酸との間の相互作用によるものであるという議論を支持している。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
ペプチド＋ＣｐＧの混合物中に存在する遊離ペプチドを、逆相ＨＰＬＣで定量したが、この分析方法ではＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび結合した可能性のあるペプチドを検出するのは不可能であった。２種類のＣｐＧオリゴヌクレオチドをこれらの実験に用いた。すなわち、（１）ホスホジエステル結合を有する天然型ＣｐＧおよび（２）ヌクレオチドの４番目と５番目の間に１つのホスホロチオエート結合を有するＣｐＧ（Ｓ１−ＣｐＧ）である。Ｓ１−ＣｐＧを使用することにより、多数の結合が形成されて複雑化する可能性を排除した。ＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２４）とＳ１−ＣｐＧとの混合物ではＲＰ−ＨＰＬＣにより単一ピークとしてペプチドが検出された（図１１Ａ）。同様に、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）と天然型ＣｐＧとの混合物ではＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１のシグナルが検出可能であった（図１１Ｂ）が、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）とＳ１−ＣｐＧとの混合物では検出できなかった（図１１Ｃ）。ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）と天然型ＣｐＧの試料における２組のピークは、モノマーおよびダイマーを表すものと推定された。これらの結果から、１個のＣｙｓ残基によりＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）二分型ポリペプチドのＳ１−ＣｐＧへの結合は促進されるが天然型ＣｐＧへの結合は促進されないことが示唆された。この結合がＣｙｓを含むペプチドとＳ１−ＣｐＧとの間のジスルフィド結合の形成によるものとすれば、このペプチド：ＣｐＧ混合物の還元およびこれら構成成分のいずれかのアルキル化により結合が除かれるはずである。ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）とＳ１−ＣｐＧとを混合し、ＲＰ−ＨＰＬＣで直接分析するか、あるいは５０ｍＭジチオスレイトールで還元してから分析した。図１１Ｄに示すように、ジチオスレイトールで還元することによりＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）プライモトープが放出され、未処理のＳ１−ＣｐＧとの混合物の場合（図１１Ｆ）には見られないＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１プライモトープの検出が認められた。この還元条件では、モノマーのペプチドについて予想される単一ピークの溶出が認められた（図１１Ｄ）。さらに、ヨードアセトアミドでＳ１−ＣｐＧをアルキル化してからＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）と混合した結果、モノマーおよびダイマーのＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）プライモトープと推定される検出で示されるように、結合がなくなった（図１１Ｅ）。これらの結果は、硫黄を含むＣｐＧオリゴヌクレオチドとＣｙｓを含むポリペプチドとが、アルキル化やジチオスレイトールによる還元で防止可能なジスルフィド結合を形成しうるという強力な証拠を成すものである。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
免疫原性ポリペプチドおよびＣｐＧによりランゲルハンス細胞によるポリペプチドの吸収効率が上昇した
本明細書に記載の方法は、二分型で免疫原性のクラスＩ結合ポリペプチドによるＣｐＧの直接的な沈殿をもたらしうるものである。両分子が直接沈殿することから、両者がｉｎ
ｖｉｖｏにおいて沈殿および堆積の際に存在するであろうことが確実である。該沈殿物を取り込む抗原提示細胞（ＡＰＣ）も、ＣｐＧを受け取って活性化し、クラスＩ結合ポリペプチドを受け取ってＣＴＬに提示しＣＴＬによって認識される。ＡＰＣによる沈殿物の取り込みを試験するために、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）およびＨＹ１ポリペプチドを、アミン反応色素のＡｌｅｘａ（Ｒ）４８８を用いて製造業者のプロトコール（米国オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に従って染色した。ＣｐＧ分子は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを利用する５’ＥｎｄＴａｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名：米国カリフォルニア州バーリンゲイム所在のベクター・ラボラトリー（Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を用いてＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）マレイミドで染色した。Ｂ１０マウスの耳にＡｌｅｘａ４８８−ポリペプチド（耳１つあたり１０μｇ）とＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ＣｐＧ（耳１つあたり１０μｇ）との混合物を注射した。耳に注射したのは、（Ａ）ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）＋ＣｐＧ、または（Ｂ）ＨＹ１＋ＣｐＧとした。１２時間目に耳を採取したが、この時点ではＣｐＧの局所注射によりランゲルハンス細胞（ＬＣ）が活性化されていることが示されている（ヤコブ（Ｊａｋｏｂ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６１巻、ｐ．３０４２、１９９８年）。耳を分割し、Ｖｅｒｓｅｎｅ（商品名）中０．２５％のトリプシンで穏やかに処理してＬＣを抽出した。ＬＣ集団を、ＦＩＴＣ（Ａｌｅｘａ４８８）およびＴＲＩＴＣ（ｒｅｄ）用のトリプルパスフィルタを用いてオリンパスＢＸ５１型蛍光顕微鏡で観察した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
細胞像から、ＨＹ１＋ＣｐＧを注射した耳ではＬＣが１２時間以内にＨＹ１ポリペプチドおよびＣｐＧ分子の両方を吸収するが、これらの分子はＬＣ内の別個のコンパートメント内に集中するようであることが明らかとなった。ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）＋ＣｐＧを注射した耳では、該ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドは共に一部のＬＣの全体にわたって分散した。その他のＬＣは限られたコンパートメント内に集中したＣｐＧならびに細胞表面上に分散したポリペプチドを示した。従って、ＣｐＧおよびＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）の沈殿物が共にＬＣによって取り込まれた後、ポリペプチドが（ＨＹ１に比べて）効率よくかつ迅速に細胞表面に移送される可能性がある。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
尾部付きＨＹ１ペプチド内のＡｒｇ／Ｌｙｓ残基およびＣｙｓ残基の、クラスＩ結合ペプチドをＣＴＬに提示することができるランゲルハンス細胞（ＬＣ）のｉｎ  ｖｉｖｏにおける遊走に対する作用についても調べた。ＬＣなどの樹状細胞（ＤＣ）のＣｐＧによる活性化にはＴＬＲ９の発現が必要であり、活性化の結果サイトカインおよび共刺激分子の
発現、ならびに流入領域リンパ節への遊走が増大する。ＬＣの遊走に対する二分型ポリペプチドの効果を調べるため、Ｂ６マウスのメス（一群当たり３匹）の後肢足蹠に、Ａｌｅｘａ４８８を結合させたＨＹ１、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）と混合したＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ染色したＣｐＧを注射した。２４時間後に流入領域膝窩リンパ節を採取してリンパ球様細胞を分離し、二重に染色された細胞の出現頻度を蛍光顕微鏡で概算した。結果を図１２に示すが、同図には、尾部ＫＣＳＲＮＲ（配列番号１）およびＡＣＳＡＮＡ（配列番号２）を付加することにより、二重に染色される細胞の出現頻度が、ＨＹ１ペプチド＋ＣｐＧで刺激した場合の出現頻度に比べておよそ２．５倍高くなったことが示されている。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
二分型ポリペプチドによりＣｐＧのマクロファージへの取り込み効率が上昇した
ＲＡＷ−２６４マクロファージによるＣｐＧの取り込み機構に対する二分型ポリペプチドの作用についても調べた。ＣｐＧの末端をＴｅｘａｓ  Ｒｅｄで標識し、次の二分型ポリペプチド、すなわちＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２４）、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）、ＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２２）、およびＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）と混合した。Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ＣｐＧをプライモトープと混合し（５μｇ＋５μｇ）、混合物を増殖培地で希釈して、ＬＳＭ５１０型レーザー走査共焦点顕微鏡（独国オベルコッヘン（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ）所在のカール・ツァイス社（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．））に搭載されたＰＯＣ−Ｒ細胞培養システム（独国スタイヒ（Ｓｔａｉｇ）所在のラコン（ＬａＣｏｎ）社）のカバースリップ上のＲＡＷ細胞に加えた。ＰＯＣ−Ｒチャンバを３７℃に加熱し、加湿システムで５％ＣＯ２／空気混合物を送達した。試料を５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザーで励起し、６３×／１．２Ｎ．Ａ．のＣ−アポクロマート水浸対物レンズで観察した。エアリユニット（ａｉｒｙ  ｕｎｉｔ）が１になるようにピンホールを設定して５６０−６１５ｎｍのバンドパスフィルタでエピ蛍光を集光した。取り込みは５秒間隔でデータを取得して５分間測定した。微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像を透過光検出器で集めた。５１２×５１２の画像を解像度８ビットで集め、データを、Ｗｉｎｄｏｗｓ（Ｒ）ＸＰのＰＣでＬＳＭ画像ブラウザ（ＬＳＭ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ）（カール・ツァイス）を利用し、かつＭａｃｉｎｔｏｓｈ（Ｒ）コンピュータでＩｍａｇｅＪ（米国立精神健康研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ））を用いて分析した。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
二分型ポリペプチドはＣｐＧの取り込みに対する作用が明確に異なっていた。ＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２４）＋ＣｐＧで観察された取り込みが最も遅く、ＣｐＧは取り込まれて細胞全体に分布した。ＣｐＧの取り込みが最も速かったのはＫＡＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２２）によるものであった。ＫＡＳＲＮＲ（配列番号１１）＋ＣｐＧを添加すると、細胞は即座に膨潤して気泡を形成した後にＣｐＧを取り込み、取り込みは５分間の観察時間中、継続的に増大した。ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）およびＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）と混合したＣｐＧを用いて処理した結果、ＣｐＧの取り込みはＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２４）よりも速く、細胞内の個別の位置に集中した。このような集中的取り込みに続いて顕著な細胞の運動が認められたが、これは上記の
Ｃｙｓを含むプライモトープ＋ＣｐＧの場合にのみ認められた。ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）にＣｙｓが追加されることにより、正に荷電したこのプライモトープの急速かつ明らかに有害な作用が減弱されたことは明らかであった。重要なことは、Ｃｙｓを含むプライモトープについて観察されたＣｐＧの集中的取り込みは、ＣＴＬ増殖の増大を促進する能力と関連していたことである。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
既知抗原は免疫原性ポリペプチドの特徴を有している
ＨＹ２ポリペプチドすなわちＫＣＳＲＮＲＱＹＬ（配列番号１０）は、ＣＴＬによって認識され、Ｈ２Ｄｂ分子への結合を制御し、ＣｐＧへの結合を仲介し（Ｃｙｓ）、ＣｐＧを沈殿させる（ＡｒｇおよびＬｙｓ）アミノ酸を含んでいる。これらの特徴が組み合わさって、ＣｐＧとともに投与した場合のＨＹ２の免疫原性が比較的高くなっている可能性がある。さらに、二分型のＨＹ１その他のポリペプチドに最初の６アミノ酸（ＫＣＳＲＮＲ）（配列番号１）を使用することにより、ＣｐＧと組み合わせた場合の免疫原性が増大する。これらの観察結果から、種々の免疫原性ポリペプチドを含むタンパク質のアミノ酸配列を調べ、認識ポリペプチドのみならずＣｐＧに結合可能なＣｙｓおよび正に荷電した残基を備えた隣接配列をも含む「天然型免疫原性ポリペプチド」の存在を探索した。既知の腫瘍抗原、ウイルス抗原、非主要組織適合性抗原について先に調べたところ、クラスＩ結合ポリペプチドではＡｒｇ残基およびＬｙｓ残基のうち少なくともいずれか一方が複数隣接しているという顕著な傾向が明らかとなった。表１は、そのような関連について、腫瘍関連タンパク質３種およびウイルスにコードされたタンパク質１種の一部分において例示している（クラスＩ結合ポリペプチドは太字で示されている）。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
【表１】
2008509072.tif 000020
Ａｒｇは、選択的かつわずかしかタンパク質には用いられていない（ダイア（Ｄｙｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ、第５巻、ｐ．１５、１９７１年；キング（Ｋ
ｉｎｇ）およびジュークス（Ｊｕｋｅｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１６４巻、ｐ．７８８、１９６９年）。このことは、クラスＩ結合ポリペプチドの隣接領域におけるＡｒｇの存在が偶発的なものではないであろうことを示している。観察対象とした正に荷電したアミノ酸領域は、該ポリペプチド自体の一部であるか、あるいは該ポリペプチドから最大４０アミノ酸離れて位置する傾向にあるかのいずれかである。本発明者らは、免疫原性ポリペプチドを備えた上記の正に荷電した領域と、機能がＡｒｇ残基の機能に依存する遺伝子との間に明らかな関連を認めた。Ａｒｇ残基に機能上依存しているタンパク質、例えば核膜を横切ってＤＮＡおよび疎水性ＡＢＣ輸送体ファミリーの輸送体に結合しなければならないＤＮＡ結合タンパク質は、特に抗原供給源として示されるものである。既知抗原を継続的に分析することにより、正に荷電したアミノ酸領域との繋がりを共有するクラスタ内に複数の免疫原性ポリペプチドが見出されうることがさらに判明した。従って、１つの比較的大きな領域の膜輸送体は、複数のエピトープを同時に与える可能性を有している。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
【図１Ａ】３種の非主要Ｈ抗原ペプチドＨ６０（配列番号１９）、ＨＹ１（配列番号９）、ＨＹ２（配列番号１０）に特異的なＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。抗原細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）には同系および異系の脾細胞を含めた。
【図１Ｂ】３種の非主要Ｈ抗原ペプチドＨ６０（配列番号１９）、ＨＹ１（配列番号９）、ＨＹ２（配列番号１０）に特異的なＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。抗原細胞にはそれぞれの標的ペプチド１０ｎＭでパルスしたＲＭＡ／Ｓ細胞を含めた。
【図２】ＣｐＧと混合した異なる濃度の記載の抗原ポリペプチド（ＨＹ２、ＨＹ１、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）、およびＲＫＫＲＲＱ−ＨＹ１（配列番号２１））に応答したＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。
【図３Ａ】ＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＨＹ１および記載のＨＹ１ポリペプチド（それぞれ配列番号２０、２２、２３、２４および１８）と混合したＣｐＧを用いてマウスをプライミングした。ＣＤ８＋ＣＴＬを、第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、同系のオスおよびメスの脾細胞の抗原細胞と混合した。
【図３Ｂ】ＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＨＹ１および記載のＨＹ１ポリペプチド（それぞれ配列番号２０、２２、２３、２４および１８）と混合したＣｐＧを用いてメスのＢ６マウスをプライミングした。Ｃｙｓを含むアミノ末端部およびカルボキシ末端部（尾部）を備えたポリペプチドを含めた。ＣＤ８＋ＣＴＬを、第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、未処理または１μＭのＨＹ１ペプチドでパルスしたＢ６メスの脾細胞と混合した。
【図４】図３Ｂに記載のＢ６メスの応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）由来の脾細胞を、第一次ＭＬＣにおいてＢ６オスの抗原細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｃｅｌｌ）で再刺激した場合のＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＣＤ８＋ＣＴＬを、第二次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、Ｂ６オスの脾細胞、未処理のＢ６メスの脾細胞、および１μＭのＨＹ１ペプチドでパルスしたＢ６メスの脾細胞と混合した。
【図５Ａ】第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて検出されたＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＣｐＧ＋漸減量のペプチド（各成分を１００、４０、１０μｇ）を用いてメスのＢ６マウスをプライミングし、１０日後に脾細胞を採取してＣＤ８＋ＣＴＬを富化した。ＣＴＬを、第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、Ｂ６のオスおよびメスの抗原細胞と混合した。
【図５Ｂ】第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて検出されたＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＣｐＧ＋漸減量のペプチド（各成分を１００、４０、１０μｇ）を用いてメスのＢ６マウスをプライミングし、１０日後に脾細胞を採取してＣＤ８＋ＣＴＬを富化した。ＣＴＬを、第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、未処理または１０ｎＭのＨＹ１ペプチドでパルスしたＢ６メスの抗原細胞と混合した。
【図６Ａ】第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて検出されたＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＣｐＧ＋ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）を用いてメスのＢ６マウスをプライミングし、１５日目（１５ｄ）、２９日目（２９ｄ）、５０日目（５０ｄ）に脾臓および流入領域リンパ節を採取した。ＣＤ８＋ＣＴＬを富化し、第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、未処理のＢ６メスの脾細胞または１０ｎＭのペプチドでパルスしたＢ６メスの抗原細胞と混合した。塗りつぶした棒グラフおよび白抜きの棒グラフはそれぞれ流入領域リンパ節および脾臓に対応する。未処理のＢ６メスの抗原細胞に応答するＣＴＬの出現頻度を差し引いて、グラフに示した特異的な出現頻度を求めてある。
【図６Ｂ】第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて検出されたＩＦＮγ分泌ＣＴＬの出現頻度を示すグラフ。ＣｐＧ＋ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）およびＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）を用いてメスのＢ６マウスをプライミングし、１５日目（１５ｄ）、２９日目（２９ｄ）、５０日目（５０ｄ）に脾臓および流入領域リンパ節を採取した。ＣＤ８＋ＣＴＬを富化し、第一次ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、未処理のＢ６メスの脾細胞または１μＭのＨＹ１ペプチドでパルスしたＢ６メスの細胞と混合した。塗りつぶした棒グラフおよび白抜きの棒グラフはそれぞれ流入領域リンパ節および脾臓に対応する。未処理のＢ６メスの抗原細胞に応答するＣＴＬの出現頻度を差し引いて、グラフに示した特異的な出現頻度を求めてある。
【図７】第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果の例を示す図。ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）とＣｐＧとを組み合わせたプライミングからＭＰＬ−ＡＦアジュバントを除くことにより、プライミング効率が増大したように見える。図に示したウェルには、応答細胞として２．５×１０５個のＣＤ８＋ＣＴＬと、ＨＹ１ポリペプチドでパルスしたＲＭＡ−Ｓ抗原細胞が含まれている。グラフは、ポリペプチド刺激に応答して活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度を示している。
【図８】第一次ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果の例を示す図。ＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列ＫＣＳＲＮＲ（配列番号１）を、２種のメラノーマのＣＴＬ活性化ポリペプチド（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号４）（メランＡ）およびＫＴＷＱＹＷＱＶ（配列番号５）（ｇｐ１００））および免疫優勢のインフルエンザポリペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴ（配列番号６））に連結した結果、それぞれの天然型ポリペプチドに比べて、ＣｐＧ＋ＭＰＬ−ＡＦと混合したときのＨＬＡ−Ａ２トランスジェニック体のプライミングが増大した。図に示したウェルには、応答細胞として３×１０５個のＣＤ８＋ＣＴＬと、ポリペプチドでパルスしたＴ２抗原細胞が含まれている。グラフは、ポリペプチド刺激に応答して活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度を示している。
【図９】吸光度のデータを示すグラフ。沈殿が形成されると吸光度は低下する。データは、ＨＹ１のＣｐＧ相互作用性アミノ酸配列内の正に荷電した残基が、ｉｎ  ｖｉｖｏプライミングにおいて用いられた濃度のＣｐＧのほぼ完全な沈殿を仲介することを示している。
【図１０】ＨＹ１−尾部付き二分型ポリペプチドを含む溶液からＣｐＧを沈殿させた後の上清について吸光度の値を示すグラフ。沈殿物を上清から除き、次いで１／１００に希釈して２６０ｎｍで分光分析を実施した。
【図１１】ＲＰ−ＨＰＬＣトレースを示す図。（Ａ）混合物ＡＡＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２４）＋Ｓ１−ＣｐＧのＲＰ−ＨＰＬＣトレース。Ｓ１−ＣｐＧはホスホロチオエート基を１つ含んでいる。０．１％トリフルオロ酢酸中７５分間の０−９５％アセトニトリル勾配を用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより混合物を分離した。（Ｂ）混合物ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）＋天然型ＣｐＧのＲＰ−ＨＰＬＣトレース。（Ａ）に記載したようにしてＲＰ−ＨＰＬＣにより混合物を分離した。（Ｃ）混合物ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１＋Ｓ１−ＣｐＧ（図１０Ａ参照）のＲＰ−ＨＰＬＣトレース。（Ａ）に記載したようにしてＲＰ−ＨＰＬＣにより混合物を分離した。（Ｄ）混合物ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）＋Ｓ１−ＣｐＧ（図１０Ａ参照）のＲＰ−ＨＰＬＣトレース。該混合物はＲＰ−ＨＰＬＣで分離する直前に０．０５ＭのＤＴＴで還元された。（Ａ）に記載したようにしてＲＰ−ＨＰＬＣにより混合物を分離した。（Ｅ）混合物ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）＋Ｓ１−ＣｐＧ（図１０Ａ参照）のＲＰ−ＨＰＬＣトレース。Ｓ１−ＣｐＧは混合前に１０ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化済みである。（Ａ）に記載したようにしてＲＰ−ＨＰＬＣにより混合物を分離した。（Ｆ）混合物ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）＋Ｓ１−ＣｐＧ（図１０Ａ参照）のＲＰ−ＨＰＬＣトレース。（Ａ）に記載したようにしてＲＰ−ＨＰＬＣにより混合物を分離した。
【図１２】二重染色されたランゲルハンス細胞の割合（％）を示すグラフ。メスのＢ６マウス（一群あたり３匹）を麻酔し、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄを結合させたＣｐＧと、Ａｌｅｘａ４８８を結合させてあるＨＹ１、ＫＣＳＲＮＲ−ＨＹ１（配列番号２０）、ＡＣＳＡＮＡ−ＨＹ１（配列番号２３）ペプチドとを足蹠に注射した。注射したマウスを２４時間後に屠殺し、膝窩リンパ節を切除した。二重に染色された細胞の出現頻度を蛍光顕微鏡で概算した。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008509072000001.app
【国際調査報告】
2008509072.tif 000021
2008509072.tif 000022
2008509072.tif 000023