(57)【要約】  本発明は、被験体において、免疫応答を調節するための新規の組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、ＮＫ細胞の活性を調節し、哺乳動物被験体におけるＮＫ細胞の細胞障害性の増強を可能にする特異的抗体に関する。本発明はまた、そのような抗体のフラグメントおよび誘導体、ならびにそれらを含んでなる薬学的組成物および特に治療において、被験体におけるＮＫ細胞活性または細胞障害性を増加させるためのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体であって、前記２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体のうちの少なくとも１つを発現するＮＫ細胞におけるＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能である、抗体。
【請求項２】
ＮＫＶＳＦ１ではない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のフラグメントである、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体ＤＦ２００またはそのフラグメントである、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、二重特異性抗体、一本鎖抗体フラグメント、または多くの異なる抗体フラグメントを含んでなる多特異性抗体から選択される抗体フラグメントである、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項６に記載の抗体。
【請求項１０】
ａ）下記（ｂ）に融合した、阻害型ＫＩＲポリペプチド上に存在するエピトープを含んでなる抗原で免疫されている非ヒト哺乳動物宿主由来のＢ細胞と、
ｂ）不死化細胞
を含んでなるハイブリドーマであって、
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合するモノクローナル抗体を産生し、前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能である、ハイブリドーマ。
【請求項１１】
モノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１を産生しない、請求項１０に記載のハイブリドーマ。
【請求項１２】
前記抗体がＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合する、請求項１０に記載のハイブリドーマ。
【請求項１３】
８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する抗体を産生する、請求項１２に記載のハイブリドーマ。
【請求項１４】
ハイブリドーマＤＦ２００より産生されるモノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する抗体を産生する、請求項１２に記載のハイブリドーマ。
【請求項１５】
ＤＦ２００である、請求項１４に記載のハイブリドーマ。
【請求項１６】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を産生させるための方法であって、ここで、前記抗体は前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、以下の工程：
ａ）非ヒト哺乳動物を阻害型ＫＩＲポリペプチドを含んでなる免疫原で免疫する工程；
ｂ）前記免疫動物から抗体を調製する工程であって、ここで、前記抗体が前記ＫＩＲポリペプチドに結合し、
ｃ）少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物と交差反応する（ｂ）の抗体を選択する工程、次いで
ｄ）前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能な（ｃ）の抗体を選択する工程を含み、
ここで、工程（ｃ）および（ｄ）の順序は場合により逆にされる、方法。
【請求項１７】
工程ｃ）またはｄ）において選択される前記抗体がＮＫＶＳＦ１ではない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）において調製される抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
免疫のために使用される阻害型ＫＩＲポリペプチドがＫＩＲ２ＤＬポリペプチドであり、工程（ｃ）において選択される抗体が少なくともＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３と交差反応する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃ）において選択される前記抗体が、８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｄ）において選択される抗体がＮＫ細胞障害性において少なくとも約５０％の増強を生じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体または抗体フラグメントがモノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
選択されるモノクローナル抗体のフラグメントを作製するさらなる工程を含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を産生させるための方法であって、ここで、前記抗体は前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、以下の工程：
ａ）ライブラリーまたはレパートリーから、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物と交差反応するモノクローナル抗体もしくは抗体フラグメントを選択する工程、次いでがｂ）前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能な（ａ）の抗体を選択する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項２５】
工程ｂ）において選択される前記抗体はＮＫＶＳＦ１ではない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｂ）において選択される抗体が、８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｂ）において選択される抗体がＮＫ細胞障害性において少なくとも５０％の増強を生じる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体がモノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
選択されるモノクローナル抗体のフラグメントを作製するさらなる工程を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を産生させるための方法であって、ここで、前記抗体は前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、以下の工程：
ａ）前記モノクローナル抗体の発現を生じる条件下で、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のハイブリドーマを培養する工程；次いで
ｂ）前記ハイブリドーマから前記モノクローナル抗体を分離する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項３１】
前記モノクローナル抗体のフラグメントを作製するさらなる工程を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を産生させるための方法であって、ここで、前記抗体は前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、以下の工程：
ａ）請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のハイブリドーマから前記モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離する工程；
ｂ）ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体もしくは抗体の免疫反応性フラグメントから選択される修飾または誘導体化された抗体をコードするように、場合により前記ＤＮＡを修飾する工程；
ｃ）前記ＤＮＡまたは修飾ＤＮＡを発現ベクターに挿入する工程であって、ここで、前記発現ベクターが適切な条件下で増殖される宿主内に存在する場合、前記抗体もしくは抗体フラグメントが発現可能である工程；
ｄ）宿主細胞を前記発現ベクターでトランスフェクトする工程であって、ここで、さもなくば前記宿主細胞が免疫グロブリンタンパク質を産生しない工程；
ｅ）前記抗体または抗体フラグメントの発現を生じる条件下で、前記トランスフェクト宿主細胞を培養する工程；次いで
ｆ）前記トランスフェクト宿主細胞より産生される抗体または抗体フラグメントを単離する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項３３】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体（ここで、前記抗体は前記２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体のうちの少なくとも１つを発現するＮＫ細胞に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であって、前記抗体は、患者またはＮＫ細胞を含んでなる生物学的サンプルにおいてＮＫ細胞の細胞障害性を検出可能な程度に増強するのに有効な量で存在する）；および薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでなる薬学的組成物。
【請求項３４】
免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、抗血管新生剤、およびアポトーシス誘導剤、阻害型ＫＩＲ受容体に結合し、阻害する第二抗体、抗感染剤、ターゲット剤または補助化合物から選択される治療剤をさらに含んでなる、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記免疫調節剤が、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、またはＩＦＮ−γから選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞障害性抗生物質、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキサート、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン（系薬剤）、他のビンカアルカロイド、およびそれらの誘導体またはプロドラックから選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ホルモン剤が、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、ブセレリン、タモキシフェン、トレミフェン、フルタミド、ニルタミド、シプロテロン、ビカルタミド、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール、メドロキシ、クロルマジノン、メゲストロール、他のＬＨＲＨアゴニスト、他の抗エストロゲン、他の抗アンドロゲン、他のアロマターゼ阻害剤、および他のプロゲスターゲンから選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
前記補助化合物が、フェノチアジン系薬剤、置換ベンズアミド系薬剤、抗ヒスタミン系薬剤、ブチロフェノン系薬剤、副腎皮質ステロイド、ベンゾジアゼピン系薬剤、カンナビノイド系薬剤、ゾレドロン酸、パミドロン酸、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、フィルグラスチム、レノグラスチム、ダルベポエチン、他の制吐剤、他のセロトニン拮抗薬、他のビスホスホネート系薬剤または他の造血成長因子から選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３９】
前記抗アポトーシス剤が、アンチセンスヌクレオチド配列、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたはｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ１、Ｍｃｌ−１、Ｂａｋ、Ａ１、もしくはＡ２０から選択される遺伝子の発現を阻害する小分子化学化合物である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４０】
前記抗血管新生剤が、ＶＥＧＦをコードする遺伝子、ＶＥＧＦ受容体をコードする遺伝子、ＶＥＧＦ、もしくはＶＥＧＦ受容体に対する中和抗体、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＲＮＡアプタマーまたはリボザイム；あるいはＶＥＧＦに対する拮抗特性を有するＶＥＧＦの変異体から選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４１】
阻害型ＫＩＲ受容体に結合し、阻害する前記第二抗体が、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する共通の決定基に結合する前記抗体により結合されるエピトープとは異なる阻害型ＫＩＲ受容体のエピトープに結合する抗体であるか、またはその誘導体もしくはフラグメントである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４２】
ＮＫ細胞活性を、それを要する患者において増強する方法であって、前記患者に請求項３３に記載の組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項４３】
前記患者が癌、別の増殖性障害、感染性疾患または免疫障害を患っている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記患者が扁平上皮癌、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性または急性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫；黒色腫、精上皮腫、奇形癌種、神経芽細胞腫、神経膠腫、星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経鞘腫；線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒｏｍａ）、骨肉腫、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、奇形癌種、膀胱、乳、直腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、頚部、甲状腺もしくは皮膚の他の癌腫、リンパ球系統の他の造血器腫瘍、骨髄系統の他の造血器腫瘍、間葉起源の他の腫瘍、中枢または末梢神経系の他の腫瘍、または間葉起源の他の腫瘍を患っている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記患者がリンパ球系統の造血器腫瘍を患っている、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記腫瘍が、小細胞および大脳様細胞型のＴ細胞性前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）；Ｔ細胞型の大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄＴ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；多形性もしくは免疫芽球性サブタイプの末梢性／胸腺後段階Ｔ細胞リンパ腫；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心性（鼻部）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ１＋）大細胞型リンパ腫；腸Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球性白血病；またはリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記患者が、過形成、線維症、血管新生、乾癬、アテローム硬化症、狭窄または血管形成術後の再狭窄、および血管における平滑筋増殖により特徴付けられる他の疾患から選択される増殖性障害を患っている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記患者が、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−１）、２型単純ヘルペス（ＨＳＶ−２）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、RSウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルスまたはＩ型もしくは２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）から選択されるウイルスによって生じる感染性疾患を患っている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記患者が、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｌ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、Ｇ．バギナリス（Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）；ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）；ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；好熱性放線菌（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｒｎａ）；カンピロバクター（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、緑膿菌（Ｒａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）；淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）；Ｆ．メニンゴゼプチクム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）；Ｆ．オドラタム（Ｆ．ｏｄｏｒａｔｕｒｎ）；ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）；百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；気管支敗血症菌（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）；Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）；Ｓ．リケファシエンス（Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）；エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）；Ｐ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）；Ｐ．ブルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）；ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；Ｒ．リケッチー（Ｒ．ｆｉｃｋｅｔｔｓｆｉ）；Ｃ．シッタキ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）；Ｃ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｒｎａｔｉｓ）；結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．イントラセルラール（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｌｌｕｉｔｕｒｎ）、らい菌（Ｍ．ｌａｐｒａｅ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、アフリカ型結核菌（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．イントラセルラール（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）；Ｍ．レプレヌリアム（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｒｎｕｒｉｕｍ）；ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、他の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、他のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、他のガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、他のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、他のナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、他のフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、他のボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、他のエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、他のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、他のプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、他のリケッチア科（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）、他のクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、他のマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リ−シュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、コクジジオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、トリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）もしくはリケッチア属（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）から選択される細菌、原生動物または寄生体により生じる感染性疾患を患っている、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤、阻害型ＫＩＲ受容体に結合し、阻害する第二抗体、抗感染剤、ターゲット剤もしくは補助化合物から選択される適切なさらなる治療剤を前記患者に投与するさらなる工程を含んでなり、ここで、前記さらなる治療剤が、前記抗体と共に単回投与形態として、または個別の投与形態として、前記患者に投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が、毒素、検出可能な部分、もしくは固相支持体に共役または共有結合される、請求項１に記載の抗体。
【請求項５２】
生物学的サンプルまたは生体生物におけるそれらの細胞表面上に阻害型ＫＩＲを有するＮＫ細胞の存在を検出する方法であって、以下の工程：
ａ）前記生物学的サンプルまたは生体生物と請求項５１に記載の抗体とを接触させる工程、ここで、前記抗体は検出可能な部分に共役または共有結合され；次いで
ｂ）前記生物学的サンプルまたは生体生物において前記抗体の存在を検出する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項５３】
サンプルから細胞表面上に阻害型ＫＩＲを有するＮＫ細胞を精製する方法であって、以下の工程：
ａ）前記サンプルと請求項５１に記載の抗体とを、細胞表面上に阻害型ＫＩＲを有する前記ＮＫ細胞が前記抗体に結合することを可能にする条件下で、接触させる工程、ここで、前記抗体は固相支持体に共役または共有結合され；次いで
ｂ）固相支持体に共役または共有結合した前記抗体から前記結合ＮＫ細胞を溶出させる工程、
を含んでなる、方法。
【請求項５４】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する共通の決定基に結合する抗体を含んでなる組成物であって、ここで、前記抗体は前記２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体の少なくとも１つを発現するＮＫ細胞に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、ここで、前記抗体はリポソームに組み入れられる、組成物。
【請求項５５】
遺伝子治療用遺伝子の送達のための核酸分子；ＮＫ細胞において遺伝子を抑制するためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｉＲＮＡの送達のための核酸分子；またはＮＫ細胞の標的化された死滅のための毒素もしくは薬物から選択されるさらなる物質が前記リポソームにさらに組み入れられる、請求項５４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ＮＫ細胞の細胞表面上に存在する２つもしくはそれ以上の阻害受容体と交差反応し、哺乳動物被験体または生物学的サンプルにおけるＮＫ細胞の細胞障害性を増強する抗体、抗体フラグメント、およびそれらの誘導体に関する。本発明はまた、そのような抗体、フラグメント、変異体、および誘導体；それらを含んでなる薬学的組成物の製造方法；ならびに特に治療において、被験体におけるＮＫ細胞活性または細胞障害性を増加させるためのそのような分子および組成物の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、従来にない免疫に関与するリンパ球のサブ集団である。ＮＫ細胞は、例えば、血液サンプル、細胞分離（ｃｙｔａｐｈｅｒｅｓｉｓ）、コレクションなどから当該分野において公知の多様な技術によって入手することができる。
【０００３】
ＮＫ細胞の特徴および生物学的特性として、ＣＤ１６、ＣＤ５６、および／またはＣＤ５７を含む表面抗原の発現；細胞表面上におけるα／βまたはγ／δＴＣＲ複合体の不在；特定の細胞溶解性酵素の活性化により、「自己の」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合し、死滅させる能力；腫瘍細胞またはＮＫ活性化受容体−リガンドを発現する他の罹患した細胞を死滅させる能力；免疫応答を刺激または阻害するサイトカインを放出する能力；および複数回の細胞分裂を経て、親細胞と類似の生物学的特性を有する娘細胞を産生する能力が挙げられる。本発明では、「活性な」ＮＫ細胞は、生物学的に活性なＮＫ細胞、より詳細には、標的細胞を溶解する能力を有するＮＫ細胞を表す。例えば、「活性な」ＮＫ細胞は、ＮＫ活性化受容体−リガンドを発現し、「自己の」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原（ＫＩＲ不適合細胞）を発現することができない細胞を死滅させることが可能である。
【０００４】
それらの生物学的特性に基づき、ＮＫ細胞の調節に依存する技術において、多様な治療およびワクチンストラテジーが提唱されている。しかし、ＮＫ細胞活性は、刺激および阻害シグナルの両方に関与する複雑な機構によって調節される。従って、有効なＮＫ細胞仲介治療は、これらの細胞の刺激および阻害シグナルの中和の両方を必要とし得る。
【０００５】
ＮＫ細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ特異的阻害型受容体によって負に調節される（カリー（Ｋａｅｒｒｅ）ら、１９８６年；エーレン（Ｏｅｈｌｅｎ）ら、１９８９年）。これらの特異的受容体は、他の細胞上に存在するＭＨＣクラスＩ分子またはＨＬＡの多形性決定基に結合し、ＮＫ細胞溶解を阻害する。ヒトでは、キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ）と呼ばれる所定の数の受容体のファミリーがＨＬＡクラスＩ対立遺伝子のグループを認識する。
【０００６】
ＫＩＲは、ＮＫ細胞を含む所定のサブセットのリンパ球上に存在する受容体の大きなファミリーである。ＫＩＲの命名法は、細胞外ドメインの数（ＫＩＲ２ＤもしくはＫＩＲ３Ｄ）および細胞質尾部が長いか（ＫＩＲ２ＤＬもしくはＫＩＲ３ＤＬ）または短いか（ＫＩＲ２ＤＳもしくはＫＩＲ３ＤＳ）に基づく。ヒトでは、所定のＫＩＲの有無は、単一の個体に存在するＮＫ集団内でもＮＫ細胞によってばらつきがある。また、ヒト集団では、ＫＩＲ分子の相対的に高いレベルの多形性が認められ、所定のＫＩＲ分子がいくつかには存在するが、すべての個体に認められるわけではない。所定のＫＩＲ遺伝子産物は、適切なリガンドに結合する場合、リンパ球活性の刺激を引き起こす。確認されているすべての刺激性ＫＩＲが、免疫刺激モチーフ（ＩＴＡＭ）を有するアダプター分子と会合する荷電した膜貫通残基を伴う短い細胞質尾部を有する。他のＫＩＲ遺伝子産物は、天然では阻害的である。確認されているすべての阻害型ＫＩＲは長い細胞質尾部を有し、ＫＩＲサブタイプに依存して、ＨＬＡ抗原の異なるサブセットと相互作用するようである。阻害型ＫＩＲは、それらの細胞質内部分において、ホスファターゼを補充する１つもしくはいくらかの阻害型モチーフを示す。既知の阻害型ＫＩＲ受容体は、ＫＩＲ２ＤＬおよびＫＩＲ３ＤＬサブファミリーのメンバーを含む。２つのＩｇドメイン（ＫＩＲ２Ｄ）を有するＫＩＲ受容体がＨＬＡ−Ｃアロタイプ：ＫＩＲ２ＤＬ２（以前はｐ５８．２と命名された）を同定するか、または緊密に関連する遺伝子産物ＫＩＲ２ＤＬ３がグループ２のＨＬＡ−Ｃアロタイプ（Ｃｗ１、３、７、および８）と共有するエピトープを認識する一方、ＫＩＲ２ＤＬ１（ｐ５８．１）が対抗グループ１のＨＬＡ−Ｃアロタイプ（Ｃｗ２、４、５、および６）と共有するエピトープを認識する。ＫＩＲ２ＤＬ１による認識は、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の８０位のＬｙｓ残基の存在によって決まる。ＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３の認識は、８０位のＡｓｎ残基の存在によって決まる。重要なことに、最も大部分のＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子は、８０位にＡｓｎまたはＬｙｓのいずれか一方の残基を有する。３つのＩｇドメインを伴う１つのＫＩＲ、ＫＩＲ３ＤＬ１（ｐ７０）は、ＨＬＡ−Ｂｗ４対立遺伝子と共有するエピトープを認識する。最後に、３つのＩｇドメインを伴うホモダイマーの分子ＫＩＲ３ＤＬ２（ｐ１４０）は、ＨＬＡ−Ａ３および−Ａ１１を認識する。
【０００７】
阻害型ＫＩＲおよび他のクラスＩ阻害型受容体（モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら、１９９７；バリアンテ（Ｖａｌｉａｎｔｅ）ら、１９９７ａ；ラニーア（Ｌａｎｉｅｒ）、１９９８）は、ＮＫ細胞によって同時発現され得るが、いかなる個体のＮＫレパートリーにも、単一のＫＩＲを発現する細胞が存在し、従って、対応するＮＫ細胞は、特定のクラスＩ対立遺伝子のグループを発現する細胞のみによって、阻止される。
【０００８】
ＫＩＲが一致しないＮＫ細胞集団またはクローン、即ち、宿主のＨＬＡ分子に適合しないＫＩＲを発現するＮＫ細胞の集団は、同種移植において認められる移植片抗白血病効果（ｇｒａｆｔ  ａｎｔｉ−ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｅｆｆｅｃｔ）の最も可能性の高いメディエーターであることが示されている（ルグゲリ（Ｒｕｇｇｅｒｉ）ら、２００２）。所定の個体においてこの効果を再現する１つの方法は、ＫＩＲ／ＨＬＡ相互作用を阻止する試薬を使用することである。
【０００９】
ＫＩＲ２ＤＬ１に特異的なモノクローナル抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１のＣｗ４（などの）対立遺伝子の相互作用を阻止することが示されている（モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら、１９９３）。ＫＩＲ２ＤＬ２／３に対するモノクローナル抗体はまた、ＫＩＲ２ＤＬ２／３のＨＬＡＣｗ３（などの）対立遺伝子との相互作用を阻止することが記載されている（モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら、１９９３）。しかし、臨床現場でそのような試薬を使用するには、いかなる患者がクラス１またはクラス２ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を発現していたかどうかにかかわらず、すべての患者を処置するための２種の治療用ｍＡｂを開発することが必要である。さらに、どの治療用抗体を使用するかを決定する前に、それぞれの患者がどのＨＬＡタイプを発現していたかを予め決定しなければならず、それ故、極めて高い処置費用が生じる。
【００１０】
ヴァッツル（Ｗａｔｚｌ）ら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，５６、２４０頁（２０００年）は、ＫＩＲの複数のアイソタイプを認識する交差反応抗体を生成したが、それらの抗体はＮＫ細胞活性の増強を示さなかった。Ｇ．Ｍ．スパギアラ（Ｇ．Ｍ．Ｓｐａｇｇｉａｒａ）ら、Ｂｌｏｏｄ，１００、４０９８−４１０７頁（２００２年）は、多様なＫＩＲに対する多数のモノクローナル抗体を利用した実験を行った。それらの抗体のうちの１つＮＫＶＳＦ１がＣＤ１５８ａ  ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ２）およびｐ５０．３（ＫＩＲ２ＤＳ４）の共通のエピトープを認識することが述べられた。ＮＫＶＳＦ１がＮＫ細胞活性を増強することができることは示唆されず、それが治療薬として使用し得ることを示唆するものは認められない。従って、ＮＫ細胞活性の調節における実践的および効果的アプローチは、これまで当該分野において利用されておらず、特定の試薬を使用するＨＬＡ対立遺伝子特異的介入がなお必要である。
【００１１】
（発明の開示）
今回、本発明は、ＮＫ細胞活性化における現在の困難を克服する新規の抗体、組成物、および方法を提供し、さらなる有利な特徴および利益を提供する。１つの例示的態様では、本発明は、事実上すべてのヒトにおけるヒトＮＫ細胞の活性化を容易にする単一の抗体を提供する。より具体的には、本発明は、多様な阻害型ＫＩＲグループと交差反応する新規の特異的抗体を提供して、それらの阻害シグナルを中和し、その結果、そのような阻害型ＫＩＲ受容体を発現するＮＫ細胞においてＮＫ細胞の細胞障害性の増強を生じる。このような複数のＫＩＲ遺伝子産物と交差反応する能力は、被験体のＨＬＡタイプを予め決定する負担または費用を伴うことなく、ほとんどのヒト被験体においてＮＫ細胞活性を増加させるために本発明の抗体を効率的に使用することが可能である。
【００１２】
第１の態様では、本発明は、抗体、抗体フラグメント、およびそのいずれかの誘導体を提供し、ここで、前記抗体、フラグメント、または誘導体は、ＮＫ細胞の表面上の少なくとも２つの阻害型ＫＩＲ受容体と交差反応し、ＮＫ細胞の阻害シグナルを中和し、ＮＫ細胞の活性を増強する。より好ましくは、抗体はヒトＫＩＲ２ＤＬ受容体の共通の決定基に結合する。さらにより具体的には、本発明の抗体は、少なくともＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、およびＫＩＲ２ＤＬ３受容体に結合する。本発明の目的のために、用語「ＫＩＲ２ＤＬ２／３」は、ＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３受容体のいずれか一方または両方を指す。これらの２つの受容体は、極めて高い相同性を有し、おそらく同じ遺伝子の対立遺伝子形態であり、当該分野において交換可能であるとみなされている。従って、ＫＩＲ２ＤＬ２／３は、本発明の目的のための単一の阻害型ＫＩＲ分子、従って、ＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３とのみ交差反応する抗体であると考えられ、他の阻害型ＫＩＲ受容体こそが本発明の範囲内にある。
【００１３】
本発明の抗体は、少なくとも２つの阻害型ＫＩＲ受容体へのＭＨＣまたはＨＬＡ分子の結合を特異的に阻害し、ＮＫ細胞活性を容易にする。両方の活性は、本明細書において使用される用語「ＫＩＲの阻害活性を中和する」によって推察される。本発明において、本発明の抗体が「ＮＫ細胞活性を容易にする」、「ＮＫ細胞の細胞障害性を容易にする」、「ＮＫ細胞を容易にする」、「ＮＫ細胞活性を増強する」、「ＮＫ細胞の細胞障害性を増強する」または「ＮＫ細胞を増強する」能力とは、抗体が、表面上で阻害型ＫＩＲ受容体を発現するＮＫ細胞が、それらの表面上で、該特定の阻害型ＫＩＲ受容体に対する対応するリガンド（例えば、特定のＨＬＡ抗原）を発現する細胞を溶解することができるようにすることを意味する。特定の態様では、本発明は、ＨＬＡ−Ｃ分子のＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を特異的に阻害する抗体を提供する。別の特定の態様では、本発明は、インビボでＮＫ細胞活性を容易にする抗体を提供する。
【００１４】
ＫＩＲ２ＤＬ１またはＫＩＤ２ＤＬ２／３のうちの少なくとも１つは少なくとも約９０％のヒト集団に存在するため、本発明のより好適な抗体は、ＨＬＡ−Ｃアロタイプ会合細胞（それぞれグループ１ＨＬＡ−Ｃアロタイプおよびグループ２ＨＬＡ−Ｃアロタイプ）のほとんどに対するＮＫ細胞活性を容易にすることが可能である。従って、本発明の組成物を使用して、ほとんどのヒト個体、典型的に約９０％もしくはそれ以上のヒト個体において、ＮＫ細胞を効率的に活性化するかまたは増強することができる。従って、本発明の単一の抗体組成物を使用して、ほとんどのヒト被験体を処置することができ、対立遺伝子群を決定するまたは抗体カクテルを使用する必要がほとんどない。
【００１５】
本発明は、はじめに、阻害型ＫＩＲに対する交差反応性および中和抗体を作製することができること、およびそのような抗体は、広範囲のヒトグループにおけるＮＫ細胞の有効な活性化を可能にすることを実証する。
【００１６】
従って、本発明の特定の目的は抗体にあって、ここで、前記抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体の両方に特異的に結合し、これらのＫＩＲによって仲介されるＮＫ細胞の細胞障害性の阻害を反転する。１つの実施形態では、抗体はハイブリドーマＤＦ２００より産生されるモノクローナル抗体ＤＦ２００と競合する。場合により、抗体ＤＦ２００と競合する前記抗体はＤＦ２００自体ではない。
【００１７】
別の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１と競合し、場合により、ここで、抗体ＮＫＶＳＦ１と競合する抗体は抗体ＮＫＶＳＦ１ではない。
【００１８】
別の実施形態では、抗体は抗体１−７Ｆ９と競合する。
【００１９】
好ましくは、前記抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。
【００２０】
特定のモノクローナル抗体（例えば、ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１、１−７Ｆ９、ＥＢ６、ＧＬ１８３）を指す場合の用語「と競合する」は、組換えＫＩＲ分子または表面発現ＫＩＲ分子のいずれかを使用する結合アッセイにおいて、抗体がモノクローナル抗体（例えば、ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１、１−７Ｆ９、ＥＢ６、ＧＬ１８３）と競合することを意味する。例えば、抗体が、結合アッセイにおけるＤＦ２００のＫＩＲ分子への結合を減少する場合、抗体はＤＦ２００と「競合」する。ＤＦ２００と「競合」する抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１ヒト受容体、ＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体、またはＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体の両方に対する結合について、ＤＦ２００と競合し得る。
【００２１】
好適な実施形態では、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体の両方に結合する抗体を提供し、これらのＫＩＲによって仲介されるＮＫ細胞の細胞障害性の阻害を反転し、ＫＩＲ２ＤＬ１ヒト受容体、ＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体、もしくはＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体の両方に対する結合について、ＤＦ２００、１−７Ｆ９、またはＮＫＶＳＦ１と競合する。場合により、前記抗体はＮＫＶＳＦ１ではない。場合により、前記抗体はキメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体の両方に結合する抗体を提供するか、これらのＫＩＲによって仲介されるＮＫ細胞の細胞障害性の阻害を反転するか、ＫＩＲ２ＤＬ１ヒト受容体への結合についてＥＢ６と競合するか、ＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体への結合についてＧＬ１８３と競合するか、またはＫＩＲ２ＤＬ１ヒト受容体への結合についてＥＢ６およびＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体への結合についてＧＬ１８３の両方と競合する。場合により、前記抗体はＮＫＶＳＦ１ではなく；場合により前記抗体はＤＦ２００ではない。場合により、前記抗体はキメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
【００２３】
有利な態様では、本発明は、ＤＦ２００と競合し、ＫＩＲ分子上のモノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的にまたは本質的に同じか、あるいは同じエピトープもしくは「エピトープ部位」に対する免疫特異性を認識、結合、あるいは有する抗体を提供する。好ましくは、前記ＫＩＲ分子はＫＩＲ２ＤＬ１ヒト受容体またはＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体である。
【００２４】
本発明の特定の目的は抗体にあって、ここで、前記抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体の両方に存在する共通の決定基に結合し、これらのＫＩＲによって仲介されるＮＫ細胞の細胞障害性の阻害を反転する。抗体は、ハイブリドーマＤＦ２００より産生されるモノクローナル抗体ＤＦ２００またはハイブリドーマＮＫＶＳＦ１より産生される抗体ＮＫＶＳＦ１と実質的に同じＫＩＲ上のエピトープにより特異的に結合し、ここで、抗体はＮＫＶＳＦ１ではない。
【００２５】
好適な実施形態では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本発明の最も好適な抗体はハイブリドーマＤＦ２００より産生されるモノクローナル抗体ＤＦ２００である。
【００２６】
抗体ＤＦ２００を産生するハイブリドーマは、識別番号「ＤＦ２００」、登録番号ＣＮＣＭＩ−３２２４としてＣＮＣＭカルチャー・コレクションに寄託され、２００４年６月１０日に登録されている（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５，Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ１５、仏国）。抗体ＮＫＶＳＦ１はセロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）（Ｃｅｒｇｙ  Ｓａｉｎｔｅ−Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ、仏国）、カタログ番号ＭＣＡ２２４３より市販されている。ＮＫＶＳＦ１は、本明細書ではｐａｎ２ＤｍＡｂとも称される。
【００２７】
本発明はまた、実質的に類似の抗原特異性および活性を有する本明細書に記載の抗体の機能的フラグメントおよび誘導体（例えば、親抗体と交差反応することができ、阻害型ＫＩＲ受容体を発現するＮＫ細胞の細胞障害性活性を増強する）を提供し、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、イムノアドヘシン、二重特異性抗体、ＣＤＲ、およびＳｃＦｖを含むが、これらに限定されない。さらに、本発明の抗体はヒト化、ヒト、またはキメラであってもよい。
【００２８】
本発明はまた、毒素、放射性核種、検出可能な部分（例えば、フルーア（ｆｌｕｏｒ））、もしくは固相支持体に共役または共有結合された本発明の抗体を含んでなる抗体誘導体を提供する。
【００２９】
本発明はまた、上記で開示された抗体、そのフラグメント、またはそのいずれかの誘導体を含んでなる薬学的組成物を提供する。従って、本発明はまた、医薬品の製造のための方法における本明細書において開示される抗体の使用に関する。好適な実施形態では、前記医薬品あるいは薬学的組成物は、癌もしくは他の増殖性障害、感染の処置、または移植における使用のためのものである。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を含んでなる組成物であって、ここで、前記抗体は前記２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体のうちの少なくとも１つを発現するＮＫ細胞に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、ここで、前記抗体はリポソームに組み入れられる、組成物を提供する。場合により、前記組成物は、遺伝子治療用遺伝子の送達のための核酸分子；ＮＫ細胞において遺伝子を抑制するためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｉＲＮＡの送達のための核酸分子；またはＮＫ細胞の標的化された死滅のための毒素もしくは薬物から選択される、前記リポソームにさらに組み入れられたさらなる物質を含んでなる。
【００３１】
本発明はまた、ヒトＮＫ細胞と有効量の本発明の抗体、そのような抗体のフラグメント、そのいずれかの誘導体、もしくはそのいずれかの少なくとも１つを含んでなる薬学的組成物と接触させることを含んでなる、ヒトＮＫ細胞活性をインビトロ、エクスビボ、またはインビボで調節する方法を提供する。好適な方法は、有効量の本発明の薬学的組成物の投与を含んでなり、癌、感染性疾患、もしくは免疫疾患を有する被験体においてヒトＮＫ細胞の細胞障害性活性を、最も好ましくは、エクスビボまたはインビボで増加するときに指令される。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）阻害型ＫＩＲポリペプチド上に存在するエピトープを含んでなる抗原で免疫されている哺乳動物宿主（典型的に、非ヒト哺乳動物宿主）由来のＢ細胞と、（ｂ）不死化細胞（例えば、骨髄腫細胞）とを融合する形で含んでなるハイブリドーマを提供し、ここで、前記ハイブリドーマは、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体に結合するモノクローナル抗体を産生し、前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体を発現するＮＫ細胞の集団におけるＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を少なくとも実質的に中和することが可能である。場合により、前記ハイブリドーマはモノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１を産生しない。好ましくは、前記抗体はＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体に結合する。好ましくは、前記抗体はＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３上に存在する共通の決定基に結合する。好ましくは、前記ハイブリドーマは８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する抗体を産生する。好ましくは、前記ハイブリドーマは、ＫＩＲ２ＤＬ１もしくはＫＩＲ２ＤＬ２／３のいずれか一方またはＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３の両方上のハイブリドーマＤＦ２００により産生されるモノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する抗体を産生する。そのようなハイブリドーマの例はＤＦ２００である。
【００３３】
本発明はまた、複数のＫＩＲ２ＤＬ遺伝子産物と交差反応し、そのようなＫＩＲの阻害活性を中和する抗体を産生させる方法を提供し、前記方法は、以下の工程を含んでなる。
（ａ）非ヒト哺乳動物をＫＩＲ２ＤＬポリペプチドを含んでなる免疫原で免疫する工程；
（ｂ）前記免疫哺乳動物から抗体を調製する工程であって、ここで、前記抗体は前記ＫＩＲ２ＤＬポリペプチドに結合する工程、
（ｃ）少なくとも２つの異なるＫＩＲ２ＤＬ遺伝子産物と交差反応する工程（ｂ）の抗体を選択する工程、次いで
（ｄ）ＮＫ細胞を増強する（ｃ）の抗体を選択する工程。１つの実施形態では、前記非ヒト哺乳動物は、ヒト抗体レパートリーを発現するように操作されたトランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭ（アブゲニクス（Ａｂｇｅｎｉｘ）−Ｆｒｅｍｏｎｔ、カリフォルニア州、米国）などのヒト免疫グロブリン遺伝子座および生来の免疫グロブリン遺伝子欠損を含んでなる非ヒト哺乳動物またはＨｕＭａｂ−ｍｏｕｓｅＴＭ（メダレックス（Ｍｅｄａｒｅｘ）−Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ニュージャージー州、米国）などのヒトＩｇコード遺伝子の小座位（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を含んでなる非ヒト哺乳動物）である。場合により、方法は、霊長類、好ましくはカニクイザルのＮＫ細胞またはＫＩＲポリペプチドに結合する抗体を選択することをさらに含んでなる。場合により、本発明は、抗体を評価する方法をさらに含んでなり、ここで、上記の方法に従って産生される抗体は、霊長類、好ましくは、カニクイザルに投与され、好ましくは、ここで、サルは、抗体の毒性の徴候の有無について観察される。
【００３４】
本発明者らはまた、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を産生させるための方法を提供し、ここで、前記抗体は前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、前記方法は、以下の工程を含んでなる。
ａ）非ヒト哺乳動物を阻害ＫＩＲポリペプチドを含んでなる免疫原で免疫する工程；
ｂ）前記免疫動物から抗体を調製する工程であって、ここで、前記抗体は前記ＫＩＲポリペプチドに結合する工程、
ｃ）少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物と交差反応する（ｂ）の抗体を選択する工程、次いで
前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能な（ｃ）の抗体を選択する工程、ここで、工程（ｃ）および（ｄ）の順序は場合により逆にされ、工程の回数は、場合により１もしくはそれ以上の回数反復される。好ましくは、免疫のために使用される阻害ＫＩＲポリペプチドは、ＫＩＲ２ＤＬポリペプチドであり、工程（ｃ）において選択される抗体は少なくともＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３と交差反応する。好ましくは、前記抗体は少なくとも２つの異なるＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する共通の決定基を認識する；最も好ましくは、前記ＫＩＲはＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３である。場合により、前記方法は、霊長類、好ましくはカニクイザルのＮＫ細胞またはＫＩＲポリペプチドに結合する抗体を選択することをさらに含んでなる。場合により、本発明は、抗体を評価する方法をさらに含んでなり、ここで、上記の方法に従って産生される抗体は、霊長類、好ましくは、カニクイザルに投与され、好ましくは、ここで、サルは、抗体の毒性の徴候の有無について観察される。
【００３５】
場合により、上記の方法において、工程ｃ）またはｄ）において選択される抗体はＮＫＶＳＦ１ではない。好ましくは、上記の方法の工程（ｂ）において調製される抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、上記方法の工程（ｃ）において選択される抗体は、８０位でＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位でＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する。好ましくは、上記の方法の工程（ｄ）において選択される抗体は、ＮＫ細胞障害性の増強、例えば、任意の実質的な増強、またはＮＫ細胞障害性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％もしくはそれ以上の増強、例えば、標的ＮＫ細胞障害性の少なくとも約５０％の増強（例えば、ＮＫ細胞の細胞障害性の（例えば、約６５〜１００％のような）少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の増強）を生じる。好ましくは、抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１および／またはＫＩＲ２ＤＬ２／３上のモノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する。場合により、前記方法はまたもしくは代替的に、選択されるモノクローナル抗体のフラグメントを作製するか、（例えば、放射性核種、細胞障害性薬剤、レポーター分子などとのコンジュゲーションによって）選択されるモノクローナル抗体の誘導体を作製するか、またはそのようなモノクローナル抗体の配列に対応する配列から産生されるもしくは該配列を含んでなる抗体フラグメントの誘導体を作製するさらなる工程を含んでなる。
【００３６】
本発明は、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を産生させるための方法をさらに提供し、ここで、前記抗体は前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、前記方法は、以下の工程を含んでなる。
（ａ）ライブラリーまたはレパートリーから、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物と交差反応するモノクローナル抗体もしくは抗体フラグメントを選択する工程、次いで
（ｂ）前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団におけるＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能な（ａ）の抗体を選択する工程。好ましくは、抗体はＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３上に存在する共通の決定基に結合する。場合により、工程（ｂ）において選択される前記抗体はＮＫＶＳＦ１ではない。好ましくは、工程（ｂ）において選択される抗体は８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する。好ましくは、工程（ｂ）において選択される抗体は、ＮＫ細胞障害性の増強、例えば、任意の実質的な増強、またはＮＫ細胞障害性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％もしくはそれ以上の増強、例えば、標的ＮＫ細胞障害性の少なくとも約５０％の増強（例えば、ＮＫ細胞の細胞障害性の（例えば、約６５〜１００％のような）少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の増強）を生じる。好ましくは、抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１および／またはＫＩＲ２ＤＬ２／３上のモノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する。場合により、方法は、選択されるモノクローナル抗体のフラグメントを作製するか、選択されるモノクローナル抗体の誘導体を作製するか、または選択されるモノクローナル抗体フラグメントの誘導体を作製するさらなる工程を含んでなる。
【００３７】
さらに、本発明は、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を産生させるための方法を提供し、ここで、前記抗体は前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団におけるＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、前記方法は、以下の工程を含んでなる。
ａ）前記モノクローナル抗体の産生に許容される条件下で、本発明のハイブリドーマを培養する工程；次いで
ｂ）前記ハイブリドーマから前記モノクローナル抗体を分離する工程。場合により、方法は、前記モノクローナル抗体のフラグメントを作製するか、モノクローナル抗体の誘導体を作製するか、またはそのようなモノクローナル抗体フラグメントの誘導体を作製するさらなる工程を含んでなる。好ましくは、抗体はＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３上に存在する共通の決定基に結合する。
【００３８】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を産生させるための方法もまた本発明によって提供され、ここで、前記抗体は前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団におけるＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、前記方法は、以下の工程を含んでなる。
ａ）本発明のハイブリドーマから前記モノクローナル抗体をコードする核酸を単離すること；
ｂ）場合により、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗体の免疫反応性フラグメント、またはそのような免疫反応性フラグメントを含んでなる融合タンパク質から選択される、モノクローナル抗体の機能的配列に対応するかもしくはそれに実質的に類似する（例えば、そのような配列に（約７０〜９９％のような）少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％同一である）アミノ酸配列を含んでなる修飾されたまたは誘導体化された抗体をコードする配列を含んでなる修飾された核酸が得られるように、前記核酸を修飾すること；
ｃ）前記核酸もしくは修飾された核酸（または同じアミノ酸配列をコードする関連核酸）を発現ベクターに挿入することであって、ここで、前記発現ベクターが適切な条件下で増殖される宿主細胞内に存在する場合、前記コードされた抗体または抗体フラグメントは発現可能である；
ｄ）宿主細胞を前記発現ベクターでトランスフェクトすることであって、ここで、さもなくば前記宿主細胞は免疫グロブリンタンパク質を産生しない；
ｅ）前記抗体または抗体フラグメントの発現を生じる条件下で、前記トランスフェクト宿主細胞を培養すること；次いで
ｆ）前記トランスフェクト宿主細胞より産生される抗体または抗体フラグメントを単離すること。好ましくは、抗体はＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３上に存在する共通の決定基に結合する。
【００３９】
本発明はまた、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体（ここで、前記抗体は前記２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体のうちの少なくとも１つを発現するＮＫ細胞におけるＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であって、前記抗体は、患者またはＮＫ細胞を含んでなる生物学的サンプルにおいてＮＫ細胞の細胞障害性を検出可能な程度に増強するのに有効な量で存在する）；および薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでなる組成物を提供することが理解される。好ましくは、抗体はＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３上に存在する共通の決定基に結合する。前記組成物は、場合により、たとえば、免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、抗血管新生剤、およびアポトーシス誘導剤、阻害型ＫＩＲ受容体に結合し、阻害する第二抗体、抗感染剤、ターゲット剤または補助化合物から選択される第２の治療剤をさらに含んでなり得る。有利な免疫調節剤は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、またはＩＦＮ−γから選択され得る。前記化学療法剤の例として、アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞障害性抗生物質、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキサート、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン（系薬剤）、他のビンカアルカロイド、およびそれらの誘導体またはプロドラックが挙げられる。ホルモン剤の例として、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、ブセレリン、タモキシフェン、トレミフェン、フルタミド、ニルタミド、シプロテロン、ビカルタミドアナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾールメドロキシ、クロルマジノン、メゲストロール、他のＬＨＲＨアゴニスト、他の抗エストロゲン、他の抗アンドロゲン、他のアロマターゼ阻害剤、および他のプロゲスターゲンが挙げられる。好ましくは、阻害ＫＩＲ受容体に結合し、阻害する前記第二抗体は、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する共通の決定基に結合する前記抗体により結合されるエピトープとは異なる阻害ＫＩＲ受容体のエピトープに結合する抗体またはその誘導体もしくはフラグメントである。
【００４０】
本発明は、ＮＫ細胞活性を、それを要する患者において検出可能な程度に増強する方法であって、前記患者に本発明の組成物を投与する工程を含んでなる、方法をさらに提供する。ＮＫ細胞活性増強を要する患者は疾患もしくは障害を有する任意の患者であり得、ここで、そのような増強は、治療効果を促進、増進、および／または誘導し得る（あるいは例えば、臨床治験によって決定され得るように、疾患もしくは障害および患者と実質的に類似の特徴を伴う患者の少なくとも実質的な割合において、そのような効果を促進、増進、および／または誘導し得る）。そのような処置を要する患者は、例えば、癌、別の増殖性障害、感染性疾患または免疫障害を患い得る。好ましくは、前記方法は、免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤、阻害ＫＩＲ受容体に結合し、阻害する第二抗体、抗感染剤、ターゲット剤もしくは補助化合物から選択される適切なさらなる治療剤を前記患者に投与するさらなる工程を含んでなり、ここで、前記のさらなる治療剤は、前記抗体と共に単回投与形態として、または個別の投与形態として、前記患者に投与される。抗体（または抗体フラグメント／誘導体）の投与およびさらなる治療剤の投与は、集合的に、ＮＫ細胞活性の増強を含んでなる患者において治療応答を検出可能な程度で誘導、促進、および／または増進するのに十分である。個別に投与される場合、抗体、フラグメント、または誘導体およびさらなる治療剤は、患者に対して検出可能な併用治療有益性が認められる（例えば、投与時期、回数などに関する）条件下で投与されることが所望される。
【００４１】
非ヒト霊長類、好ましくは、サルＮＫ細胞および／またはサルＫＩＲ受容体に特異的に結合することが可能である本発明の抗体も本発明にさらに包含される。また、候補医薬品である本発明の抗体の毒性、用量および／または活性あるいは効力を評価するための方法も包含される。１つの態様では、本発明は、ＮＫ細胞を有する非ヒト霊長類レシピエント動物に本発明の抗体を投与し、動物、または好ましくは標的組織に対する薬剤の任意の毒性、有毒もしくは有害作用を評価することによって、動物あるいは標的組織に対して毒性な抗体の用量を決定するための方法を包含する。別の態様では、本発明は、ＮＫ細胞を有する非ヒト霊長類レシピエント動物に本発明の抗体を投与し、動物、または好ましくは標的組織に対する薬剤の任意の毒性、有毒もしくは有害作用を評価することによって、動物あるいは標的組織に対して毒性な抗体を同定するための方法である。別の態様では、本発明は、感染、疾患もしくは癌の非ヒト霊長類モデルに本発明の抗体を投与し、感染、疾患もしくは癌、およびそれらの症状を改善する抗体を同定することによって、感染、疾患あるいは腫瘍の処置において効果的である抗体を同定するための方法である。好ましくは、本発明の前記抗体は、（ａ）ヒトＮＫ細胞の表面で少なくとも２つの阻害型ヒトＫＩＲ受容体と交差反応し、（ｂ）非ヒト霊長類のＮＫ細胞またはＫＩＲ受容体と交差反応する抗体である。
【００４２】
生物学的サンプルまたは生体生物におけるそれらの細胞表面上に阻害ＫＩＲを有するＮＫ細胞の存在を検出する方法が本発明にさらに包含され、前記方法は、以下の工程を含んでなる。
ａ）前記生物学的サンプルまたは生体生物と本発明の抗体とを接触させる工程であって、ここで、前記抗体が検出可能な部分に共役または共有結合される工程；および
ｂ）前記生物学的サンプルまたは生体生物において前記抗体の存在を検出する工程。
【００４３】
本発明はまた、サンプルから細胞表面上に阻害ＫＩＲを有するＮＫ細胞を精製する方法を提供し、以下の工程を含んでなる。
ａ）前記サンプルと本発明の抗体とを、細胞表面上に阻害ＫＩＲを有する前記ＮＫ細胞が前記抗体に結合することを可能にする条件下で、接触させる工程であって、ここで、前記抗体が固相支持体（例えば、ビーズ、マトリックスなど）に共役または共有結合される工程；次いで
ｂ）固相支持体に共役または共有結合した前記抗体から前記結合ＮＫ細胞を溶出させる工程。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、抗体、抗体フラグメント、あるいは図１２において例示されるような抗体ＤＦ２００あるいは抗体Ｐａｎ２Ｄの軽鎖可変領域または１つもしくはそれ以上の軽鎖可変領域ＣＤＲを含んでなるそれらのいずれかの誘導体を提供する。なお別の態様では、本発明は、抗体、抗体フラグメント、あるいはＤＦ２００またはＰａｎ２Ｄの軽鎖可変領域配列あるいはこれらの抗体の１つまたは両方の１つもしくはそれ以上の軽鎖可変領域ＣＤＲのすべてまたは本質的にすべてに高度に類似する配列を含んでなるそれらのいずれかの誘導体を提供する。
【００４５】
さらなる態様では、本発明は、抗体、抗体フラグメント、あるいは図１３において例示されるような抗体ＤＦ２００の重鎖可変領域または１つもしくはそれ以上の軽鎖可変領域ＣＤＲを含んでなるそれらのいずれかの誘導体を提供する。なお別の態様では、本発明は、抗体、抗体フラグメント、あるいはＤＦ２００の重鎖可変領域配列のすべてまたは本質的にすべてに高度に類似する配列を含んでなるそれらのいずれかの誘導体を提供する。
【００４６】
本発明のこれらおよびさらなる有利な態様ならびに特徴については、本明細書の他の箇所においても説明され得る。
【００４７】
（発明の詳細な記述）
抗体
本発明は、ヒト阻害型ＫＩＲ受容体の共通の決定基、好ましくは、少なくとも２つの異なるＫＩＲ２ＤＬ遺伝子産物上に存在する決定基に結合し、それらのＫＩＲ受容体うちの少なくとも１つを発現するＮＫ細胞の増強を生じる新規の抗体およびフラグメントまたはそれらの誘導体を提供する。本発明は、はじめに、予想外の結果を提示し、特にヒト被験体における新規かつ効果的なＮＫに基づく治療に道を開くそのような交差反応かつ中和抗体を産生させることができることを開示する。好適な実施形態では、抗体はモノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１ではない。
【００４８】
本発明において、「共通の決定基」は、ヒト阻害型ＫＩＲ受容体のいくらかの遺伝子産物によって共有される決定基またはエピトープを標示する。好ましくは、共通の決定基は、ＫＩＲ２ＤＬ受容体グループの少なくとも２つのメンバーによって共有される。より好ましくは、決定基は、少なくともＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３によって共有される。本発明の所定の抗体はまた、ＫＩＲ２ＤＬの複数の遺伝子産物を認識することに加えて、ＫＩＲ３ＤＬ受容体グループの遺伝子産物のような他の阻害型ＫＩＲ上に存在する決定基を認識することができる。決定基またはエピトープは、前記メンバーによって共有されるペプチドフラグメントもしくは構造依存性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープを提示することができる。より特定の実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体ＤＦ２００によって認識される実質的に同じエピトープに特異的に結合する。この決定基は、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３の両方に存在する。
【００４９】
本発明において、共通の決定基に「結合する」抗体という用語は、特異性および／または親和性を伴う前記決定基に結合する抗体を標示する。
【００５０】
本明細書で使用される用語「抗体」は、他に述べるかまたは文脈において明らかに矛盾しない限り、ポリクロナールおよびモノクローナル抗体、ならびに前記ポリクロナールおよびモノクローナル抗体のフラグメントおよび誘導体を指す。重鎖の定常ドメインのタイプに依存して、完全長の抗体は、典型的に、５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てられる。これらのうちのいくらかは、さらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのようなサブクラスまたはイソタイプに分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ「α」、「δ」、「ε」、「γ」および「μ」と呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元構造が周知である。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは生理学的状況において最も一般的な抗体であり、それらは実験施設において最も容易に作成されるため、それらは本発明において用いられる好適なクラスの抗体である。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本発明の目的の１つは、ＮＫ細胞を枯渇させずに、阻害型ＫＩＲとその対応するＨＬＡリガンドとのインビボでの相互作用を阻止することであるため、ＩｇＧ４のような低いエフェクター機能を仲介するＦｃ受容体に対応するアイソタイプが典型的に好適である。
【００５１】
本発明の抗体は、様々な当該分野において公知の技術によって産生させることができる。典型的に、それらは、非ヒト動物、好ましくはマウスの阻害型ＫＩＲポリペプチド、好ましくはＫＩＲ２ＤＬポリペプチド、より好ましくはヒトＫＩＲ２ＤＬポリペプチドを含んでなる免疫原による免疫によって産生される。阻害型ＫＩＲポリペプチドは、ヒト阻害型ＫＩＲポリペプチドの全長配列、またはそのフラグメントもしくは誘導体、典型的に、免疫原性フラグメント、即ち、阻害型ＫＩＲ受容体を発現する細胞の表面上に暴露されたエピトープを含んでなるポリペプチドの部分を含んでなり得る。そのようなフラグメントは、典型的に、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７連続アミノ酸、さらにより好ましくは、その少なくとも約１０連続アミノ酸を含有する。フラグメントは、典型的に、受容体の細胞外ドメインから本質的に誘導される。全長ＫＩＲＤＬポリペプチドのうち少なくとも１つ、より好ましくは両方の細胞外Ｉｇドメインを含み、ＫＩＲ２ＤＬ受容体に存在する少なくとも１つの構造依存性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープを模倣することが可能であるヒトＫＩＲ２ＤＬポリペプチドがさらにより好適である。他の実施形態では、前記ポリペプチドは、ＫＩＲ２ＤＬ１ポリペプチドのアミノ酸１〜２２４位（ＫＩＲ遺伝子ファミリーについて記載しているＰＲＯＷウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｗ／ｇｕｉｄｅ／１３２６０１８０８２．ｈｔｍに従うアミノ酸番号付け）の細胞外Ｉｇドメインの少なくとも約８連続アミノ酸を含んでなる。
【００５２】
最も好適な実施形態では、免疫原は、脂質膜、典型的に細胞表面の野生型ヒトＫＩＲ２ＤＬポリペプチドを含んでなる。特定の実施形態では、免疫原は、無傷（ｉｎｔａｃｔ）なＮＫ細胞、特に、無傷なヒトＮＫ細胞、場合により処置または溶解された細胞を含んでなる。
【００５３】
マウスにおける抗体の産生を刺激するための分野において周知の任意の様式で、非ヒト哺乳動物を抗原で免疫する工程を行うことができる（例えば、Ｅ．ハーロー（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ）およびＤ．レーン（Ｄ．Ｌａｎｅ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州（１９８８年）を参照のこと）。次いで、免疫原は、場合により完全フロイントアジュバントなどのアジュバントと共に、緩衝液に懸濁または溶解される。免疫原の量、緩衝液のタイプおよびアジュバントの量を決定するための方法は当該分野において周知であり、本発明に対する任意の方法において限定されない。これらのパラメータは異なる免疫原に対し異なり得るが、容易に説明される。
【００５４】
同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫の場所および回数もまた、当該分野において周知である。典型的な免疫プロトコルでは、１日目に非ヒト動物に抗原が腹腔内に注入され、１週間後に再度注入される。これに続いて、場合により、不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントを伴って、約２０日目に抗原が再注入される。再注入は静脈内で実施され、数日間連続で反復され得る。これに続いて、静脈内または腹腔内のいずれかで、典型的にアジュバントを伴わずに、４０日目に追加注入が行われる。このプロトコルにより、約４０日後に、抗原特異的抗体産生Ｂ細胞が生じる。他のプロトコルもまた、それらが、免疫に使用される抗原に対する抗体を発現するＢ細胞の産生を生じる限り、利用することができる。
【００５５】
ポリクローナル抗体調製物では、免疫非ヒト動物から血清が得られ、それに存在する抗体が、周知の技術によって単離される。血清は、阻害型ＫＩＲ受容体と反応する抗体が得られるように、固相支持体に連結された上記の任意の免疫原を使用して、アフィニティー精製することができる。
【００５６】
代替的実施形態では、非免疫非ヒト哺乳動物由来のリンパ球が単離され、インビトロで増殖され、次いで、細胞培養において免疫原に暴露される。次いで、リンパ球を回収し、下記の融合工程を行う。
【００５７】
モノクローナル抗体では、次の工程は、免疫非ヒト哺乳動物からの脾臓細胞の単離および抗体産生ハイブリドーマを形成させるための脾臓細胞と不死化細胞との以後の融合である。非ヒト哺乳動物からの脾臓細胞の単離は当該分野において周知であり、麻酔した非ヒト哺乳動物から脾臓を取り出し、それを小片に切断し、単一の細胞懸濁液が生成されるように、脾包（ｓｐｌｅｎｉｃ  ｃａｐｓｕｌｅ）から圧搾により、セルストレーナーのナイロンメッシュを介して、脾臓細胞を、適切な緩衝液に取り出す。細胞を洗浄し、遠心分離し、任意の赤血細胞を溶解する緩衝液に再懸濁する。溶液を再度遠心分離し、ペレット内に残留するリンパ球を最終的に新鮮緩衝液に再懸濁する。
【００５８】
一旦、単離され、単一細胞懸濁液中に存在すると、リンパ球を不死細胞系統に融合させることができる。これは、典型的にはマウス骨髄腫細胞系統であるが、ハイブリドーマを作製するのに有用な他の多くの不死細胞系統が当該分野において公知である。好適なマウス骨髄腫系統として、サルク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国より市販されているＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州、米国より市販されているＸ６３  Ａｇ８６５３およびＳＰ−２細胞由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。融合は、ポリエチレングリコールなどを使用して行う。次いで、得られるハイブリドーマを、非融合親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つもしくはそれ以上の物質を含有する選択培地で増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）（該物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する）。
【００５９】
ハイブリドーマは、典型的にマクロファージのフィーダー層上で増殖される。マクロファージは、脾臓細胞を単離するために使用される非ヒト哺乳動物の同腹仔由来であることが好ましく、典型的に、ハイブリドーマプレート化の数日前に、不完全フロイントアジュバントなどで刺激（ｐｒｉｍｅ）する。融合方法は、ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、５９〜１０３頁（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８６年）に記載されており、この開示内容は、本明細書において参考として援用される。
【００６０】
コロニー形成および抗体産生に十分な時間、選択培地で細胞を増殖させる。これは、通常、約７〜約１４日間の間である。次いで、ハイブリドーマコロニーを複数の阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物と交差反応する抗体の産生について、アッセイする。アッセイは、典型的に発色ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマが増殖するウェルに適応することができるいずれのアッセイを用いてもよい。他のアッセイとしては、免疫沈降およびラジオイムノアッセイが挙げられる。所望の抗体産生に陽性のウェルを試験して、１つもしくはそれ以上の異なるコロニーが存在するかどうかを決定する。１を超えるコロニーが存在する場合、細胞を再クローニングして、増殖させ、ただ単一の細胞が所望の抗体を産生するコロニーを生じていることを確実にする。明らかに単一のコロニーを伴う陽性ウェルを、典型的に再クローニングし、再アッセイし、ただ１つの抗体が検出され、産生されていることを保証する。抗体はまた、例えば、ウォード（Ｗａｒｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９年）５４４頁に開示されているような免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によって、産生させてもよい。
【００６１】
本発明の抗体は、ＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害；詳細には、ＫＩＲ２ＤＬ受容体によって仲介される阻害およびより詳細には、少なくとも両ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３阻害を中和することが可能である。従って、これらの抗体は、それらがＭＨＣクラスＩ分子と相互作用する場合、それらが少なくとも部分的および検出可能な程度で、ＫＩＲ受容体によって仲介される阻害シグナル伝達経路を阻止する意味で、「中和」または「阻害」抗体である。さらに重要なことに、この阻害活性は、これらの抗体が多様な被験体において高い効力で使用され得るように、いくらかのタイプの阻害型ＫＩＲ受容体、好ましくは、いくらかのＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物、およびより好ましくは、少なくともＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３の両方について示される。ＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害の阻害は、結合または細胞アッセイのような多様なアッセイまたは試験によって、評価することができる。
【００６２】
一旦、複数の阻害物質ＫＩＲ受容体と交差反応する抗体が同定されると、無傷なＮＫ細胞におけるこれらのＫＩＲ受容体の阻害効果を中和するその能力について、それを試験することができる。特定の変異体では、ＨＬＡ−Ｃ陽性標的のＫＩＲ２ＤＬ陽性ＮＫクローンにより、前記抗体が溶解を再構築する能力によって、中和活性を例示することができる。別の特定の実施形態では、抗体の中和活性は、ＨＬＡ−Ｃ分子のＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３（または緊密に関連するＫＩＲ２ＤＬ２）受容体への結合を阻害する抗体の能力によって規定され、抗体の能力が以下を改変する場合はさらに好ましい。
−Ｃｗ１、Ｃｗ３、Ｃｗ７、およびＣｗ８から選択されるＨＬＡ−Ｃ分子（または８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ分子）のＫＩＲ２ＤＬ２／３に対する結合；および
−Ｃｗ２、Ｃｗ４、Ｃｗ５およびＣｗ６から選択されるＨＬＡ−Ｃ分子（または８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−Ｃ分子）のＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合。
【００６３】
別の変異体では、本発明の抗体の阻害活性を、本明細書において提供される実施例に開示されるように、細胞に基づく細胞障害性アッセイで評価することができる。
【００６４】
別の変異体では、本発明の抗体の阻害活性は、サイトカイン放出アッセイで評価することができ、ここで、ＮＫ細胞は、試験抗体およびＮＫ集団のＫＩＲ分子によって認識される１つのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を発現する標的細胞系統と共にインキュベートされ、ＮＫ細胞サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦ産生）が刺激される。例示的プロトコルでは、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生は、培養約４日後に、細胞表面および細胞質内染色ならびにフローサイトメトリーによる分析によって評価される。簡単に説明すると、培養の少なくとも約４時間、ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））を、約５μｇ／ｍｌの最終濃度で添加することができる。次いで、細胞を、透過化（ＩｎｔｒａＰｒｅｐＴＭ；ベックマン・カルチャー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））およびＰＥ−抗ＩＦＮ−γまたはＰＥ−ＩｇＧ１（ファルミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））による染色の前に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ５６ｍＡｂと共にインキュベートすることができる。ＥＬＩＳＡ（ＧＭ−ＣＳＦ：ＤｕｏＳｅｔ  Ｅｌｉｓａ、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州；ＩＦＮ−γ：ＯｐｔＥ１Ａセット、ファルミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を使用して、上清におけるポリクローナル活性型ＮＫ細胞からのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γ産生を測定することができる。
【００６５】
本発明の抗体は、ＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を部分的または完全に中和することができる。本明細書において使用する用語「ＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和する」とは、それらのＫＩＲによって阻止されないＮＫ細胞またはＮＫ細胞系統により同じ比率で得られる特異的溶解が、細胞障害性の古典的クロム遊離試験によって測定されるように、所定のＫＩＲを発現するＮＫ細胞集団が（ＮＫ細胞上で発現されるＫＩＲによって認識される）同系のＭＨＣクラスＩ分子を発現する標的細胞と接触される場合、抗体を伴わずに得られる特定の溶解のレベルと比較して、少なくとも約２０％まで、好ましくは、少なくとも約３０％まで、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％もしくはそれ以上（例えば、約２５〜１００％）増加する能力を意味する。例えば、本発明の好適な抗体は、一致したまたはＨＬＡ適合性もしくは自家移植標的細胞集団、即ち、前記抗体の非存在下ではＮＫ細胞により効果的に溶解されない細胞集団の溶解を誘導することが可能である。従って、本発明の抗体はまた、インビボでＮＫ細胞活性を容易にすると規定することができる。
【００６６】
あるいは、用語「ＫＩＲ仲介阻害を中和する」は、１つもしくはいくらかの阻害型ＫＩＲを発現するＮＫ細胞クローンまたはトランスフェクタントおよびＮＫ細胞上のＫＩＲのうちの１つによって認識されるただ１つのＨＬＡ対立遺伝子を発現する標的細胞を使用するクロムアッセイにおいて、抗体により得られる細胞障害性のレベルがＷ６／３２抗ＭＨＣクラスＩ抗体などの既知の抑制型抗ＭＨＣクラスＩ分子で得られる細胞障害性の少なくとも約２０％、好ましくは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％（例えば、約２５〜１００％）、もしくはそれ以上であるべきであることを意味する。
【００６７】
特定の実施形態では、抗体は、（ハイブリドーマＤＦ２００より産生される）モノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する。そのような抗体は、本明細書において「ＤＦ２００様抗体」と称せられる。さらに好適な実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。本発明の好適な「ＤＦ２００様抗体」は、モノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１以外の抗体である。（ハイブリドーマＤＦ２００より産生される）モノクローナル抗体ＤＦ２００が最も好適である。
【００６８】
目的の抗体と「実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する」という用語は、抗体が前記目的の抗体と「競合する」ことを意味する。モノクローナル抗体と「実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する」という用語は、抗体がＤＦ２００と「競合する」ことを意味する。一般に、目的のモノクローナル抗体（例えば、ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１、１７Ｆ９）と「実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する」抗体は、抗体が、さらなるＫＩＲ分子のいずれか１つ、好ましくは、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３よりなる群から選択されるＫＩＲ分子のために、前記目的の抗体と「競合する」ことを意味する。他の例では、ＫＩＲ２ＤＬ１分子上にある目的の抗体と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合するため、目的の抗体と「競合する」。ＫＩＲ２ＤＬ２／３分子上にある目的の抗体と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合するため、目的の抗体と「競合する」。
【００６９】
目的の抗体と「実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する」という用語は、抗体が、前記目的の抗体が特異的に結合する任意およびすべてのＫＩＲ分子のために、前記目的の抗体と「競合する」ことを意味する。モノクローナル抗体ＤＦ２００と「実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する」という用語は、抗体が、ＤＦ２００が特異的に結合する任意およびすべてのＫＩＲ分子のために、ＤＦ２００と「競合する」ことを意味する。例えば、モノクローナル抗体ＤＦ２００またはＮＫＶＳＦ１と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＳ１およびＫＩＲ２ＤＳ２への結合のために、それぞれ前記ＤＦ２００またはＮＫＶＳＦ１と「競合する」。
【００７０】
本明細書に記載のモノクローナル抗体と実質的または本質的に同じエピトープに結合する１つもしくはそれ以上の抗体の同定は、抗体の競合を評価することができる様々な免疫学的スクリーニングアッセイの１つを使用して、容易に決定することができる。多くのそのようなアッセイが日常的に実践され、当該分野において周知である（例えば、米国特許第５，６６０，８２７号明細書、１９９７年８月２６日出願を参照のこと、該文献は、本明細書において具体的に参考として援用される）。本明細書に記載の抗体がどのエピトープに決定するかを実際に決定するのに、いずれの方法においても、本明細書に記載のモノクローナル抗体と同じか実質的に同じエピトープに結合する抗体を同定する必要はないことが理解されよう。
【００７１】
例えば、調べようとする試験抗体が異なる供給源動物から得られるか、または異なるＩｇアイソタイプである場合、コントロール（例えば、ＤＦ２００）および試験抗体とを混合（または予め吸着）され、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３の両方（それぞれはＤＦ２００により結合されることが公知である）を含有するサンプルに適用される簡便な競合アッセイを用いることができる。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング、および（例えば、実施例のセクションにおいて記載のような）ＢＩＡＣＯＲＥ分析の使用に基づくプロトコルは、そのような簡便な競合研究における使用に適切である。
【００７２】
特定の実施形態では、阻害型ＫＩＲ抗原サンプルに適用する前のある期間にコントロール抗体（例えば、ＤＦ２００）と様々な量の試験抗体（例えば、約１：１０または約１：１００）とを予め混合し得る。他の実施形態では、コントロールおよび様々な量の試験抗体を、ＫＩＲ抗原サンプルへの暴露中に簡便に混合することができる。（例えば、非結合型抗体を除去するための分離または洗浄技術を使用することによって）結合型と遊離型の抗体および（例えば、種特異的もしくはアイソタイプ特異的第二抗体を使用することによって、または検出可能な標識でＤＦ２００を特異的に標識することによって）ＤＦ２００と試験抗体とを識別することができる限り、試験抗体がＤＦ２００の２つの異なるＫＩＲ２ＤＬ抗原への結合を減少するかどうかを決定し、試験抗体がＤＦ２００と実質的に同じエピトープを認識することを示すことができる。完全に関連のない抗体の非存在下での（標識された）コントロール抗体の結合は、コントロールの高値としての役割を果たし得る。コントロール低値は、標識された（ＤＦ２００）抗体を正確に同じタイプ（ＤＦ２００）の非標識抗体と共にインキュベートすることによって得ることができ、ここで、競合が生じ、標識された抗体の結合を減少する。試験アッセイでは、試験抗体の存在下における標識された抗体反応性の有意な減少は、実質的に同じエピトープ（即ち、標識された（ＤＦ２００）抗体と交差反応するもの）を認識する試験抗体を示唆する。ＤＦ２００のそれぞれのＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３抗原への結合を、約１：１０〜約１：１００の間のＤＦ２００：試験抗体の任意の比で、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、またはより好ましくは少なくとも約７０％（例えば、約６５〜１００％）減少する任意の試験抗体は、ＤＦ２００と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体とみなされる。好ましくは、そのような試験抗体は、ＤＦ２００のそれぞれのＫＩＲ２ＤＬ抗原への結合を少なくとも約９０％（例えば、約９５％）減少する。
【００７３】
競合は、例えば、フローサイトメトリー試験によって評価することができる。そのような試験では、所定のＫＩＲを有する細胞を、まず、例えば、ＤＦ２００、次いで、蛍光色素またはビオチンで標識された試験抗体と共にインキュベートすることができる。飽和量のＤＦ２００とのプレインキュベーション時に得られる結合が、ＤＦ２００とのプレインキュベーションを伴わない抗体によって得られる結合（蛍光の平均として測定される）の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％もしくはそれ未満（例えば、約３０％）である場合、抗体はＤＦ２００と競合すると言われている。あるいは、飽和量の試験抗体と共にプレインキュベートした細胞上の標識された（蛍光色素またはビオチンによる）ＤＦ２００により得られる結合が、抗体とのプレインキュベーションを伴わずに得られる結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％、もしくはそれ未満（例えば、約３０％）である場合、抗体はＤＦ２００と競合すると言われている。
【００７４】
試験抗体を予め吸着させ、飽和濃度で濃度ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３の両方が固定化された表面に適用する簡便な競合アッセイもまた、有利に用いることができる。簡便な競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥチップ（または表面プラズモン共鳴分析に適した他の媒体）である。次いで、コントロール抗体（例えば、ＤＦ２００）を、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３飽和濃度で表面と接触させ、コントロール抗体のＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３表面結合を測定する。コントロール抗体のこの結合を、試験抗体非存在下のコントロール抗体のＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３含有表面への結合と比較する。試験アッセイでは、試験抗体存在下におけるコントロール抗体によるＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３含有表面の結合における有意な減少は、試験抗体がコントロール抗体と「交差反応する」ように、試験抗体がコントロール抗体と実質的に同じエピトープを認識することを示す。（ＤＦ２００のような）コントロール抗体のそれぞれのＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３抗原への結合を少なくとも約３０％またはより好ましくは約４０％減少する任意の試験抗体は、コントロール（例えば、ＤＦ２００）と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体とみなすことができる。好ましくは、そのような試験抗体は、コントロール抗体（例えば、ＤＦ２００）のそれぞれのＫＩＲ２ＤＬ抗原への結合を、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％もしくはそれ以上）減少する。コントロールおよび試験抗体の順序は逆にすることができることが理解されよう。即ち、コントロール抗体をはじめに、表面に結合させることができ、その後、試験抗体を、競合アッセイにおいて表面と接触させる。好ましくは、まず、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３抗原により高い親和性を有する抗体をＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３含有表面に結合させると、予想されるとおり、第二抗体について認められる結合の減少（抗体が交差反応しているものとみなす）は、より大きな大きさになる。そのようなアッセイのさらなる例は、実施例および例えば、サウナル（Ｓａｕｎａｌ）およびリゲンモーテル（Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ）、（１９９５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８３：３３−４１（その開示内容は本明細書において参考として援用される）において提供される。
【００７５】
例示の目的のためにＤＦ２００について記載する一方、上記の免疫学的スクリーニングアッセイもまた、ＮＫＶＳＦ１、１−７Ｆ９、ＥＢ６、ＧＬ１８３、および本発明の他の抗体と競合する抗体を同定するために使用することができることが理解されよう。
【００７６】
免疫化および脊椎動物または細胞における抗体の産生時において、特許請求の範囲に記載の抗体を単離するために、特定の選択工程を実施することができる。これに関して、特定の実施形態では、本発明はまた、そのような抗体を産生させる方法に関し、以下を含んでなる。
（ａ）非ヒト哺乳動物を阻害ＫＩＲポリペプチドを含んでなる免疫原で免疫する工程；
（ｂ）前記免疫動物から抗体を調製する工程であって、ここで、前記抗体が前記ＫＩＲポリペプチドに結合する工程、
（ｃ）少なくとも２つの異なる阻害型ＫＩＲ遺伝子産物と交差反応する（ｂ）の抗体を選択する工程、次いで
（ｄ）前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能な（ｃ）の抗体を選択する工程。
【００７７】
少なくとも２つの異なる阻害型ＫＩＲ遺伝子産物と交差反応する抗体の選択は、例えば、上記のような２つもしくはそれ以上の異なる阻害型ＫＩＲ抗原に対する抗体をスクリーニングすることによって、達成することができる。
【００７８】
より好適な実施形態では、工程（ｂ）において調製される抗体はモノクローナル抗体である。従って、本明細書において使用される用語「前記免疫動物から抗体を調製すること」は、免疫動物からＢ細胞を入手すること、およびそれらのＢ細胞を使用して、抗体を発現するハイブリドーマを産生させること、ならびに免疫動物の血清から直接抗体を入手することを含む。別の好適な実施形態では、工程（ｃ）において選択される抗体は、少なくともＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３と交差反応する抗体である。
【００７９】
さらなる別の好適な実施形態では、工程（ｄ）において選択される抗体は、標準的なクロム遊離アッセイにおいて測定されるように、同系のＨＬＡクラスＩ分子を発現する標的細胞に対し、それらのＫＩＲによって阻止されないＮＫ細胞による同じエフェクター／標的比で得られる溶解または細胞障害性と比較して、抗体によって認識される少なくとも１つのＫＩＲを示すＮＫ細胞によって仲介される少なくとも約１０％特異的溶解、およびより好ましくは少なくとも約４０％特異的溶解、少なくとも約５０％特異的溶解、またはより好ましくは、少なくとも約７０％特異的溶解（例えば、約６０〜１００％特異的溶解）を生じる。あるいは、工程（ｄ）において選択される抗体が１つもしくはいくらかの阻害型ＫＩＲを発現するＮＫ細胞クローンおよびＮＫクローン上のＫＩＲのうちの１つによって認識されるただ１つのＨＬＡ対立遺伝子を発現する標的細胞を用いるクロムアッセイにおいて使用される場合、抗体により得られる細胞障害性のレベルがＷ６／３２抗ＭＨＣクラスＩ抗体などの抑制型抗ＭＨＣクラスＩｍＡｂで得られる細胞障害性の少なくとも約２０％、好ましくは、少なくとも約３０％、もしくはそれ以上であるべきである。
【００８０】
すぐ上に記載した方法の工程（ｃ）および（ｄ）の順序は、変更することができる。場合により、方法はまたもしくは代替的に、モノクローナル抗体のフラグメントまたはモノクローナル抗体の誘導体あるいは例えば、本明細書において他に記載したようなフラグメントを作製するさらなる工程をさらに含んでなることができる。
【００８１】
好適な実施形態では、本発明の適用可能な方法に従う抗体を産生するために使用される非ヒト動物は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物である。また、非ヒト哺乳動物を、遺伝子的に改変または操作して、ＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭ（アブゲニクス（Ａｂｇｅｎｉｘ））またはＨｕＭＡｂ−ＭｏｕｓｅＴＭ（メダレックス（Ｍｅｄａｒｅｘ））などの「ヒト」抗体を産生させてもよい。
【００８２】
別の変異体では、本発明は、以下を含んでなる抗体を得るための方法を提供する。
（ａ）ライブラリーまたはレパートリーから、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物と交差反応するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、もしくはそれらのいずれかの誘導体を選択すること、次いで
（ｂ）前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能である（ａ）の抗体、フラグメント、または誘導体を選択すること。
【００８３】
レパートリーは、場合により、任意の適切な構造（例えば、ファージ、細菌、合成複合体など）によって示される抗体またはそのフラグメントの任意の（組換え）レパートリーであってもよい。阻害型抗体の選択は、上記に開示されるように実施することができ、実施例においてさらに例示される。
【００８４】
別の実施形態に従えば、本発明は、非ヒト宿主由来のＢ細胞を含んでなるハイブリドーマを提供し、ここで、前記Ｂ細胞は、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する決定基に結合する抗体を産生し、前記抗体は、前記受容体の阻害活性を中和することが可能である。より好ましくは、本発明のこの態様のハイブリドーマは、モノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１を産生するハイブリドーマではない。本発明のこの態様に従うハイブリドーマは、免疫非ヒト哺乳動物由来の脾臓細胞と不死細胞系統との融合によって上記のように作製してもよい。この融合によって産生されるハイブリドーマは、本明細書において他で記載されるような交差反応する抗体の存在についてスクリーニングすることができる。好ましくは、ハイブリドーマは、少なくとも２つの異なるＫＩＲ２ＤＬ遺伝子産物上に存在する決定基を認識し、それらのＫＩＲ受容体のうちの少なくとも１つを発現するＮＫ細胞の増強を生じる抗体を産生する。さらにより好ましくは、ハイブリドーマは、ＤＦ２００と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合し、ＮＫ細胞活性を増強する抗体を産生する。最も好ましくは、該ハイブリドーマは、モノクローナル抗体ＤＦ２００を産生するハイブリドーマＤＦ２００である。
【００８５】
本発明のモノクローナル抗体を産生することが確認されるハイブリドーマは、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０などの適切な培地において、より多量に培養させることができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【００８６】
所望されるモノクローナル抗体を産生させるのに十分な増殖後、モノクローナル抗体（または腹水液）を含有する増殖培地を細胞から分別し、そこに存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、ゲル電気泳動、透析、タンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、またはアガロースもしくはＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズのような固相支持体に連結された抗マウスＩｇを使用するクロマトグラフィーによって、典型的に達成される（すべて、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、出版番号１８−１０３７−４６、ＥｄｉｔｉｏｎＡＣ（その開示内容は参考として本明細書に援用される）に記載されている）。結合型抗体は、低ｐＨ緩衝液（グリシンまたはｐＨ３．０もしくはそれ未満の酢酸緩衝液）を使用し、抗体を含有する画分を直ちに中和することによって、タンパク質Ａ／タンパク質Ｇカラムから典型的に溶出される。これらの画分をプールし、透析し、必要であれば濃縮する。
【００８７】
代替的実施形態に従えば、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する決定基に結合する抗体をコードするＤＮＡは、本発明のハイブリドーマから単離され、適切な宿主へのトランスフェクションのための適切な発現ベクターに配置される。次いで、宿主は、抗体、または該モノクローナル抗体のヒト化バージョン、抗体の活性フラグメント、もしくは抗体の抗原認識部分を含んでなるキメラ抗体のようなその変異体の組換え産生のために使用される。好ましくは、本実施形態において使用されるＤＮＡは、少なくとも２つの異なるＫＩＲ２ＤＬ遺伝子産物上に存在する決定基を認識し、それらのＫＩＲ受容体のうちの少なくとも１つを発現するＮＫ細胞の増強を生じる抗体をコードする。さらにより好ましくは、ＤＮＡは、ＤＦ２００と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合し、ＮＫ細胞活性を増強する抗体をコードする。最も好ましくは、該ＤＮＡはモノクローナル抗体ＤＦ２００をコードする。
【００８８】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、マウス抗体の重および軽鎖をコードする遺伝に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）従来の手順を使用して、容易に単離され、配列決定される。一旦単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに配置することができ、次いで、それは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サル（ｓｉｍｉａｎ）ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成が得られる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現は当該分野において周知である（例えば、スケラ（Ｓｋｅｒｒａ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５、２５６頁（１９９３年）；およびプリュックサン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１３０、１５１頁（１９９２）を参照のこと）。
【００８９】
モノクローナル抗体のフラグメントおよび誘導体
本発明の抗体のフラグメントおよび誘導体（多で述べるかまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明において使用される用語「抗体」または「複数の抗体」に包含される）、好ましくは、ＤＦ−２００様抗体は、当該分野において周知である技術によって産生させることができる。「免疫反応性フラグメント」は、無傷な抗体の部分を含んでなり、一般に、抗体は結合部位または可変領域である。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；連続アミノ酸残基の１つの不断配列よりなる１次構造を有するポリペプチドである任意の抗体フラグメント（本明細書において「一本鎖抗体フラグメント」または「一本鎖ポリペプチド」と称される）が挙げられ、（１）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）関連重鎖部分を伴わない唯一の軽鎖可変ドメイン、または軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するそのフラグメントを含有する一本鎖ポリペプチドおよび（３）関連軽鎖部分を伴わない唯一の重鎖可変領域、または重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するそのフラグメントを含有する一本鎖ポリペプチド；ならびに抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を含むが、これらに限定されない。例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントは、従来の技術に従って、単離された抗体のプロテアーゼ消化によって、産生され得る。免疫反応性フラグメントは、例えば、インビボでのクリアランスを遅延させ、より所望される薬物動態プロフィールを得るための既知の方法を使用して、修飾することができ、フラグメントをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾してもよいことが理解されよう。ＰＥＧをＦａｂ’フラグメントにカップリングおよび部位特異的に共役するための方法は、例えば、レオング（Ｌｅｏｎｇ）ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ１６（３）：１０６−１１９（２００１年）およびデルガド（Ｄｅｌｇａｄｏ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７３（２）：１７５−１８２（１９９６年）に記載されており、それらの開示内容は、本明細書において参考として援用される。
【００９０】
特定の態様では、本発明は、抗体、抗体フラグメント、および図１２に記載のＤＦ−２００の軽鎖可変領域配列を含んでなる抗体誘導体を提供する。別の特定の態様では、本発明は、抗体、抗体フラグメント、および図１２に記載のＰａｎ２Ｄの軽鎖可変領域配列を含んでなる抗体誘導体を提供する。別の態様では、本発明は、抗体、抗体フラグメント、および図１２に記載のＤＦ−２００の１つもしくはそれ以上の軽鎖可変領域ＣＤＲを含んでなるそれらの誘導体を提供する。さらに別の態様では、本発明は、抗体、抗体フラグメント、および図１２に記載のＰａｎ２Ｄの１つもしくはそれ以上の軽鎖可変領域ＣＤＲを含んでなるそれらの誘導体を提供する。そのような配列の機能的変異体／類似体は、標準的な技術を使用して、これらの開示されたアミノ酸配列の適切な置換、付加、および／または欠失を行うことによって、作製することができ、配列の比較によって援助され得る。従って、例えば、Ｐａｎ２ＤとＤＦ−２００との間で保存されているＣＤＲ残基は、そのような残基が本明細書において開示された他の抗体についてこれらの抗体が有する競合における異なるプロフィールに寄与し得ないような修飾のための適切な標的であり得（Ｐａｎ２ＤおよびＤＦ−２００は競合するが）、それ故、それらの特定のそれぞれのエピトープに対するこれらの抗体の特異性に寄与し得ない。別の態様では、残基がこれらの抗体のうちの１つの配列に存在し、別の抗体の配列には存在しないような位置は、欠失、置換、および／または挿入に適切であり得る。
【００９１】
特定の態様では、本発明は、抗体、抗体フラグメント、および図１３に記載のＤＦ−２００の重鎖可変領域配列を含んでなる抗体誘導体を提供する。別の態様では、本発明は、抗体、抗体フラグメント、および図１３に記載のＤＦ−２００の１つもしくはそれ以上の重鎖可変領域ＣＤＲを含んでなるそれらの誘導体を提供する。そのような配列の機能的変異体／類似体は、標準的な技術を使用して、これらの開示されたアミノ酸配列の適切な置換、付加、および／または欠失を行うことによって、作製することができ、配列の比較によって援助され得る。別の態様では、残基がこれらの抗体のうちの１つの配列に存在し、別の抗体の配列には存在しないような位置は、欠失、置換、および／または挿入に適切であり得る。
【００９２】
あるいは、本発明の抗体、好ましくは、ＤＦ−２００様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、本発明のフラグメントをコードするように修飾することができる。次いで、修飾されたＤＮＡを発現ベクターに挿入し、適切な細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用し、次いで該細胞は所望されるフラグメントを発現する。
【００９３】
代替的実施形態では、本発明の抗体、好ましくは、ＤＦ−２００様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、発現ベクターへの挿入前に、例えば、相同非ヒト配列の代わりにヒト重および軽鎖定常ドメインのコーディング配列を置換することによって（例えば、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１頁（１９８４年））、または免疫グロブリンコーディング配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列のすべてもしくは一部を共有結合させることによって、修飾することができる。該様式では、本来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。典型的に、そのような非免疫グロブリンポリペプチドが、本発明の抗体の定常ドメインに対して置換される。
【００９４】
それ故、別の実施形態に従い、本発明の抗体、好ましくはＤＦ−２００様抗体はヒト化される。本発明の抗体の「ヒト化」形態は、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはマウス免疫グロブリンから誘導される最小配列を含有する（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合配列のような）それらのフラグメントである。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、本来の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置き換えられる一方、本来の抗体の所望される特異性、親和性、および能力は維持される。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基によって置き換えてもよい。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはインポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含んでなることができる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改質し、最適化するために作製される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的に２つの可変ドメインの実質的にすべてを含んでなり、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが本来の抗体の該領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の該領域である。ヒト化抗体はまた、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的に、ヒト免疫グロブリンの部分を含んでなる。より詳細については、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１、５２２頁（１９８６年）；ライヒマン（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３頁（１９８８年）；およびプレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２、５９３頁（１９９２年）を参照のこと。
【００９５】
本発明の抗体をヒト化するための方法は当該分野において周知である。一般に、本発明に従うヒト化抗体は、本来の抗体から該抗体に導入された１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらのマウスまたは他の非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「インポート」残基と称され、典型的に「インポート」可変ドメインから採取される。ヒト化は、本質的に、ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）および共同研究者ら（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１、５２２頁（１９８６年）；ライヒマン（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３頁（１９８８年）；ベルホイエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９、１５３４頁（１９８８年））の方法に従って、実施することができる。従って、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体（キャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であって、ここで、実質的に無傷でないヒト可変ドメインが、本来の抗体由来の対応する配列によって置換されている。実際には、本発明に従うヒト化抗体は、典型的にヒト抗体であり、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、本来の抗体における類似部位由来の残基によって置換される。
【００９６】
ヒト化抗体を作製するのに使用すべきヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を減少させるのに極めて重要である。いわゆる「ベスト−フィット」方法に従えば、本発明の抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、マウスの配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容される（シムズ（Ｓｉｍｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１、２２９６頁（１９９３年）；チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）およびレスク（Ｌｅｓｋ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６、９０１頁（１９８７年））。別の方法は、軽または重鎖の特定の亜群のすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくらかの異なるヒト化抗体に使用することができる（カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９、４２８５頁（１９９２）；プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５１、１９９３頁））。
【００９７】
複数の阻害型ＫＩＲ受容体に対する高い親和性および他の好適な生物学的特性を保持して抗体をヒト化することはさらに重要である。この目的を達成するために、好適な方法に従い、親配列の解析のプロセスならびに親およびヒト化配列の３次元モデルを使用する多様な概念上のヒト化産物によって、ヒト化抗体が調製される。３次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に熟知している。選択された候補免疫グロブリン配列の見込まれる３次元コンフォメーション構造を例示および示すコンピュータプログラムが利用可能である。これらの標示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能性における残基の可能な役割の解析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の解析を可能にする。この方法では、ＦＲ残基が選択され、標的抗原の増加した親和性などの所望される抗体の特徴が達成されるように、コンセンサスおよびインポート配列から合わせられる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に、直接的および最も実質的に関与する。
【００９８】
「ヒト化」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、免疫に使用するマウスとしてＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（アブゲニクス（Ａｂｇｅｎｉｘ），Ｆｒｅｍｏｎｔ、カリフォルニア州）を使用することである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子によって置き換えられるその免疫グロブリン遺伝子を有した本発明に従うマウス宿主である。従って、このマウスによりまたはこのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマにおいて産生される抗体は、すでにヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、米国特許第６，１６２，９６３号明細書において説明されており、該文献は本明細書においてその全体が参考として援用される。ＨｕＭＡｂ−ＭｏｕｓｅＴＭ（メダレックス（Ｍｅｄａｒｅｘ））を使用して、類似の方法を達成することができる。
【００９９】
ヒト抗体はまた、免疫化のために、ヒト抗体レパートリーを発現するように操作されている他のトランスジェニック動物を使用すること（ヤコブビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３６２（１９９３年）２５５）、またはファージディスプレイ法を使用する抗体レパートリーの選択のような他の多様な技術に従って、産生させてもよい。そのような技術は当業者に公知であり、本出願において開示されるモノクローナル抗体から出発して遂行することができる。
【０１００】
本発明の抗体、好ましくはＤＦ−２００様抗体はまた、それらが所望される生物学的活性を示す限り、重および／または軽鎖の部分が本来の抗体における対応する配列と同一かあるいは相同である一方、鎖の残りの部分は別の種から誘導されるかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一かあるいは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体のフラグメントに誘導体化され得る（キャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、上掲；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ａ．，８１、６８５１頁（１９８４））。
【０１０１】
本発明の範囲内にある他の誘導体は、官能化抗体、即ち、リシン、ジフテリア毒素、アブリンおよびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素のような毒素；蛍光部分、放射性同位元素もしくは画像化剤のような検出可能な部分；またはアガロースビーズなどのような固相支持体に共役あるいは共有結合されている抗体を含む。他のこれらの薬剤の抗体へのコンジュゲーションまたは共有結合のための方法は、当該分野において周知である。
【０１０２】
毒素へのコンジュゲーションは、細胞表面上に交差反応性のＫＩＲ受容体の１つを示すＮＫ細胞の標的死滅に有用である。一旦、本発明の抗体がそのような細胞の細胞表面に結合すると、それは内在化され、毒素が細胞内部に放出され、該細胞を選択的に死滅させる。そのような使用は、本発明の代替的実施形態である。
【０１０３】
検出可能な部分へのコンジュゲーションは、本発明の抗体が診断目的に使用される場合、有用である。そのような目的として、細胞表面上に交差反応性ＫＩＲを有するＮＫ細胞の存在のために生物学的サンプルをアッセイすることおよび生体生物内に交差反応性ＫＩＲを有するＮＫ細胞の存在を検出することが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアッセイおよび検出方法もまた、本発明の代替的実施形態である。
【０１０４】
本発明の抗体の固相支持体へのコンジュゲーションは、生物学的液体のような供給源からの細胞表面上に交差反応性ＫＩＲを有するＮＫ細胞のアフィニティー精製のためのツールとして有用である。この精製方法は、得られた精製されたＮＫ細胞の集団であることから、本発明の別の代替的実施形態である。
【０１０５】
代替的実施形態では、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する共通の決定基に結合する抗体であって、ここで、ＮＫＶＳＦ１を含む前記抗体は、本発明の前記２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体のうちの少なくとも１つを発現するＮＫ細胞上のＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、単独でまたは動物への標的化された送達のための別の物質と共にリポソーム（「イムノリポソーム」）に組み入れられ得る。他のそのような物質として、遺伝子治療のための遺伝子の送達またはＮＫ細胞において遺伝子を抑制するためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｉＲＮＡの送達のための核酸、あるいはＮＫ細胞の標的化された死滅のための毒素または薬物が挙げられる。
【０１０６】
公開された結晶構造（マエナカ（Ｍａｅｎａｋａ）ら（１９９９年）、ファン（Ｆａｎ）ら（２００１年）、ボイングトン（Ｂｏｙｉｎｇｔｏｎ）ら（２０００年））に基づくＫＩＲ２ＤＬ１、−２および−３（ＫＩＲ２ＤＬ１−３）の細胞外ドメインのコンピュータモデリングは、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ１−３交差反応性マウスモノクローナル抗体ＤＦ２００とＮＫＶＳＦ１との間の相互作用における所定の領域またはＫＩＲ２ＤＬ１、−２および−３の関与を予測した。従って、１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸残基（１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１８１、１９２）によって規定される領域内のＫＩＲ２ＤＬ１に排他的に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、残基（１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１８１、１９２）によって規定される領域以外のアミノ酸残基と相互作用せずに、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合する抗体を提供する。
【０１０７】
別の実施形態では、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合し、Ｒ１３１がＡｌａであるＫＩＲ２ＤＬ１の変異体には結合しない抗体を提供する。
【０１０８】
別の実施形態では、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合し、Ｒ１５７がＡｌａであるＫＩＲ２ＤＬ１の変異体には結合しない抗体を提供する。
【０１０９】
別の実施形態では、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合し、Ｒ１５８がＡｌａであるＫＩＲ２ＤＬ１の変異体には結合しない抗体を提供する。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１残基（１３１、１５７、１５８）に結合する抗体を提供する。
【０１１１】
別の実施形態では、本発明は、ＫＩＲ２ＤＳ３（Ｒ１３１Ｗ）に結合するが、野生型ＫＩＲ２ＤＳ３には結合しない抗体を提供する。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３の両方ならびにＫＩＲ２ＤＳ４に結合する抗体を提供する。
【０１１３】
別の実施形態では、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３の両方には結合するが、ＫＩＲ２ＤＳ４には結合しない抗体を提供する。
【０１１４】
抗体が上記で規定されたエピトープ領域のうちの１つの内部に結合するかどうかの決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。そのようなマッピング／特徴付け方法の１つの例として、抗ＫＩＲ抗体に対するエピトープ領域は、ＫＩＲ２ＤＬ１またはＫＩＲ２ＤＬ２／３タンパク質における暴露されたアミン／カルボキシルの化学修飾を使用するエピトープ「フット−プリンティング」によって決定することができる。そのようなフット−プリンティング技術の１つの特定の例は、ＨＸＭＳ（質量分析によって検出される水素−重水素交換）の使用であって、ここで、受容体およびリガンドタンパク質アミドプロトンの水素／重水素交換、結合、および逆交換が生じ、ここで、タンパク質結合に参加している骨格アミド基は、逆交換から保護され、従って重水素化が保持される。関連領域は、このポイントで、ペプシンによるタンパク質分解、ファスト・マイクロボア（ｆａｓｔ  ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）高速液体クロマトグラフィー分離、および／またはエレクトロスプレーイオン化質量分析によって同定することができる。例えば、エーリングＨ（Ｅｈｒｉｎｇ  Ｈ）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６７巻（２）２５２−２５９頁（１９９９年）および／またはエンジェン，Ｊ．Ｒ．（Ｅｎｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．）およびスミス，Ｄ．Ｌ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．）（２００１年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，２５６Ａ−２６５Ａを参照のこと。適切なエピトープ同定技術のもう１つの例は、核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であって、ここで、典型的に、遊離の抗原および抗体のような抗原結合性ペプチドと複合体形成した抗原の２次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置が比較される。ＮＭＲスペクトルにおいて抗原に対応するシグナルのみが認められ、抗原結合性ペプチド由来のシグナルは認められないように、抗原は、典型的に、選択的に同位体の１５Ｎで標識される。抗原結合性ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸から生じる抗原シグナルは、遊離の抗原のスペクトルと比較して、典型的に複合体のスペクトルの位置をシフトし、該方法で、結合に関与するアミノ酸を同定することができる。例えば、Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．２００４年；（４４）：１４９−６７；ハング（Ｈｕａｎｇ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２８１巻（１）６１−６７頁（１９９８）；およびサイト（Ｓａｉｔｏ）およびパターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９６年６月；９（３）：５１６−２４頁を参照のこと。
【０１１５】
エピトープマッピング／特徴付けもまた、質量分析方法を使用して実施することができる。例えば、ダウンワード，Ｊマス（Ｄｏｗｎｗａｒｄ，Ｊ  Ｍａｓｓ）Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００年４月；３５（４）：４９３−５０３頁ならびにキセラー（Ｋｉｓｅｌａｒ）およびダウンワード（Ｄｏｗｎａｒｄ）、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９年５月１日；７１（９）：１７９２−８０１頁を参照のこと。
【０１１６】
プロテアーゼ消化技術もまた、エピトープマッピングおよび同定に関して有用であり得る。抗原性決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化、例えば、３７℃およびｐＨ７〜８での消化においてＫＩＲ２ＤＬ１またはＫＩＲ２ＤＬ２／３に対し約１：５０の比でトリプシンを使用し、続いて、ペプチド同定のための質量分析（ＭＳ）によって、決定することができる。抗ＫＩＲバインダーによってトリプシン切断から保護されたペプチドは、その後、トリプシン消化に供されたサンプルと、抗体と共にインキュベーションし、次いで、例えば、トリプシンによる消化に供された（それによって、バインダーに対するフットプリントを示す）サンプルとの比較によって同定することができる。キモトリプシン、ペプシンなどのような他の酵素もまた、もしくは代替的に、類似のエピトープ特徴付け方法において使用することができる。さらに、酵素的消化は、表面に露出しておらず、従って、免疫原性／抗原性に最も関連しない可能性が最も高い抗ＫＩＲポリペプチドについて、潜在的抗原性決定基配列がＫＩＲ２ＤＬ１の領域内にあるかどうかを分析するための迅速な方法を提供することができる。類似の技術の考察については、例えば、マンカ（Ｍａｎｃａ）、Ａｎｎ  Ｉｓｔ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓａｎｉｔａ．１９９１；２７（１）：１５−９頁を参照のこと。
【０１１７】
カニクイザルとの交差反応
抗体ＮＫＶＳＦ１もまた、カニクイザル由来のＮＫ細胞に結合することを見出した。実施例７を参照のこと。従って、本発明は、抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体を提供し、ここで、前記抗体、フラグメントまたは誘導体がヒトＮＫ細胞の表面における少なくとも２つの阻害型ヒトＫＩＲ受容体と交差反応し、さらに、カニクイザル由来のＮＫ細胞に結合する。その１つの実施形態では、抗体は抗体ＮＫＶＳＦ１ではない。本発明はまた、抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体の毒性を試験する方法を提供し、ここで、前記抗体、フラグメントまたは誘導体は、ヒトＮＫ細胞の表面における少なくとも２つの阻害型ヒトＫＩＲ受容体と交差反応し、ここで、方法は、カニクイザルの抗体を試験することを含んでなる。
【０１１８】
組成物および投与
本発明はまた、抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体を含んでなる薬学的組成物を提供し、ここで、前記抗体、フラグメントまたは誘導体は、任意の適切なビヒクルにおいて、ＮＫ細胞を含んでなる患者または生物学的サンプルのＮＫ細胞の細胞障害性を検出可能な程度で増強するのに有効な量で、ＮＫ細胞の表面における少なくとも２つの阻害型ＫＩＲ受容体と交差反応し、それらの阻害シグナルを中和し、該細胞の活性を増強する。組成物は、薬学的に許容可能なキャリアをさらに含んでなる。そのようの組成物はまた、「本発明の抗体組成物」とも称される。１つの実施形態では、本発明の抗体組成物は、上記の抗体実施形態において開示される抗体を含んでなる。抗体ＮＫＶＳＦ１は、本発明の抗体組成物に存在し得る抗体の範囲内に含まれる。
【０１１９】
本明細書において使用する用語「生物学的サンプル」として、生物学的液体（例えば、血清、リンパ、血液）、細胞サンプルまたは組織サンプル（例えば、骨髄）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
これらの組成物に使用され得る薬学的に許容可能なキャリアとして、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本発明の組成物は、患者または生物学的サンプルのＮＫ細胞の活性を増強する方法において用いることができる。本方法は、前記組成物と前記患者または生物学的サンプルとを接触させる工程を含んでなる。そのような方法は、診断および治療目的の療法に有用である。
【０１２２】
生物学的サンプルと併せて（ｉｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）使用するために、抗体組成物を、サンプルの性質（液体もしくは固体）に依存して、簡単にサンプルと混合するかまたは直接適用することによって、投与することができる。生物学的サンプルは、任意の適切なデバイス（プレート、ポーチ、フラスコなど）中の抗体と直接接触させてもよい。患者と併せて使用するためには、組成物は、患者への投与のために処方しなければならない。
【０１２３】
本発明の組成物は、経口的、非経口的、吸入スプレーにより、局所的、直腸内、経鼻的、頬側的、膣内にまたはインプラントされたリザーバを介して投与することができる。本明細書で使用する「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注入または輸注技術を含む。好ましくは、組成物は、経口的、腹腔内または静脈内に投与される。
【０１２４】
本発明の無菌注入可能な形態は、水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を使用して、当該分野において公知の技術に従って処方することができる。無菌注入可能な調製物はまた、非毒性の非経口的な許容可能な希釈剤もしくは溶媒における無菌注入可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中溶液として）であってもよい。なかでも、用いられ得る許容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来的に用いられる。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含む任意の低刺激不揮発性油を用いることができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、注入可能物の調製に有用であり、それらは、特に、ポリオキシエチレンバージョン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ）のオリーブ油またはヒマシ油のような天然の薬学的に許容可能な油である。これらの油溶液または懸濁液はまた、エマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的許容可能な剤形の処方において一般に使用される長鎖アルコール希釈液または分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤を含有してもよい。薬学的に許容可能な固体、液体、または他の剤形の製造に一般に使用される他の一般に使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤またはバイオアベイラビリティーの増強剤もまた、処方の目的のために使用することができる。
【０１２５】
本発明の組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含むがこれらに限定されない任意の経口的な許容可能な剤形で経口的に投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用されるキャリアとして、乳糖およびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた、典型的に添加される。カプセル形態の経口投与のための有用な希釈剤として、乳糖および乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。経口用途に水性懸濁液が必要な場合、有効成分は乳化および懸濁剤と組み合わせられる。所望であれば、所定の甘味、風味付け、または着色剤もまた添加することができる。
【０１２６】
あるいは、本発明の組成物は、直腸内投与のための坐剤の形態で投与することもできる。これらは、薬剤と、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、従って、直腸内では融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤とを混合することによって調製することができる。そのような材料として、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１２７】
本発明の組成物は、特に、処置の標的が眼、皮膚、もしくは下部腸管の疾患を含む局所投与によって用意にアクセス可能な領域または器官を含む場合、局所的に投与することができる。適切な局所処方は、これらの領域または器官のそれぞれについて容易に調製される。
【０１２８】
下部腸管のための局所適用は、直腸用坐剤処方（上記を参照のこと）または適切な浣腸処方で行うことができる。局所用経皮パッチも使用することができる。
【０１２９】
局所適用のために、組成物は、１つもしくはそれ以上のキャリアに懸濁または溶解された有効成分を含有する適切な軟膏において処方してもよい。本発明の化合物の局所投与のためのキャリアとして、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、組成物は、１つもしくはそれ以上の薬学的に許容されたキャリアに懸濁または溶解された有効成分を含有する適切なローションまたはクリームにおいて処方することができる。適切なキャリアとして、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベイト６０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ６０）、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
眼科用途のために、組成物を、等張性、ｐＨ調整した滅菌食塩水中の微粉化懸濁液、または好ましくは、等張性、ｐＨ調整した食塩水中の溶液として、塩化ベンジルアルコニウムのような保存剤を伴うもしくは伴わずに、処方してもよい。あるいは、眼科用途として、組成物を、ワセリン（ｐｅｔｒｏｐａｔｕｍ）のような軟膏において処方してもよい。
【０１３１】
本発明の処方物はまた、経鼻エアゾルまたは吸入によって投与してもよい。そのような組成物は、薬学的処方の分野に周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールもしくは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティーを増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来の可溶化もしくは分散剤を用いる食塩水中の溶液として調製してもよい。
【０１３２】
いくらかのモノクローナル抗体は、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ））、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ））またはＸｏｌａｉｒ（オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ））、ならびに類似の投与レジメン（即ち、処方および／または用量および／または投与プロトコル）が本発明の抗体と共に使用され得るような臨床的状況において効率的であることが示されている。本発明の薬学的組成物における抗体の投与のためのスケジュールおよび用量は、例えば、製造者に指示を使用して、これらの生成物のための既知の方法に従って決定することができる。例えば、本発明の薬学的組成物に存在する抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）の単回使用のバイアルのいずれかにおいて１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給することができる。生成物は、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベイト（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）８０、および注射用滅菌水において、静脈内投与のために処方される。ｐＨは６．５に調整される。本発明の薬学的組成物における抗体のための例示的に適切な用量範囲は、約１０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２であり得る。しかし、これらのスケジュールは例示的であること、至適スケジュールおよびレジメンは、臨床治験において決定されなければならない薬学的組成物における特定の抗体の親和性および忍容性を考慮して適応することができることが理解されよう。２４時間、４８時間、７２時間または１週間もしくは１箇月間、ＮＫ細胞を飽和する本発明の薬学的組成物における抗体の注入の量およびスケジュールは、抗体の親和性およびその薬物動態パラメータを考慮して決定される。
【０１３３】
別の実施形態に従えば、本発明の抗体組成物は、抗体が投与されている特定の治療目的に通常利用される薬剤を含む別の治療剤をさらに含んでなることができる。さらなる治療剤は、通常、処置されている特定の疾患または状態のための単剤治療における該薬剤に典型的に使用される量で組成物中に存在する。そのような治療剤として、癌の処置に試用される治療剤、感染性疾患を処置するために使用される治療剤、他の免疫療法において使用される治療剤、（ＩＬ−２またはＩＬ−１５のような）サイトカイン、他の抗体のおよび他の抗体のフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
例えば、多くの治療剤が癌の処置のために利用可能である。本発明の抗体組成物および方法は、特定の疾患、特定の腫瘍、癌疾患、または患者が示す他の疾患もしくは他の障害の処置において一般に用いられる他の任意の方法と併用してもよい。特定の治療アプローチが、患者の状態自体に有害であることが知られておらず、本発明の薬学的組成物における抗体の活性を有意に妨げない限り、その本発明との併用が考慮される。
【０１３５】
固形腫瘍の処置に関連して、本発明の薬学的組成物は、手術、放射線療法、化学療法などのような古典的なアプローチと組み合わせて使用してもよい。従って、本発明は、本発明の薬学的組成物が手術または放射性処置と同時、前、または後に使用されるか；あるいは従来の化学療法、放射線治療剤もしくは抗血管新生剤または標的化された免疫毒素もしくはコアギュリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）と共に、前または後に患者に投与される併用療法を提供する。
【０１３６】
１つもしくはそれ以上の薬剤を、治療レジメンにおいて本発明の抗体含有組成物と組み合わせて使用する場合、組み合わされた結果が、それぞれの処置を個別に行う場合に観察される効果の相加を求める要件は存在しない。少なくとも相加的効果は一般に所望されるが、単回治療のうちの１つを超える増加した抗癌効果は、有益で得あり得る。また、併用処置が相乗効果を示すことを求める特定の要件は存在しないが、このことは間違いなく可能であり、有利である。
【０１３７】
併用抗癌治療を実践するためには、動物に本発明の抗体組成物を、動物内において併用抗癌作用が生じる有効な様式で、別の抗癌剤と併用して、簡単に投与する。従って、薬剤は、腫瘍の脈管構造内においてそれらが組み合わされた形で存在し、腫瘍環境においてそれらが組み合わされて作用するのに有効な量ならびに有効な期間、提供される。この目的を達成するために、本発明の抗体組成物および抗癌剤は、単一の組み合わされた組成物、または異なる投与経路を使用する２つの異なる組成物としてのいずれか一方で、動物に同時に投与することができる。
【０１３８】
あるいは、本発明の抗体組成物の投与は、例えば、数分〜数週間および数箇月の範囲の間隔で、抗癌剤処置の前、または後に行うことができる。抗癌剤および本発明の抗体組成物における抗体は、癌に対し、有利に組み合わされた効果を発揮することが確実にされる。
【０１３９】
ほとんどの抗癌剤は、抗血管新生療法における本発明の阻害型ＫＩＲ抗体組成物の前に、与えられる。しかし、抗体の免疫共役が本発明の抗体組成物において使用される場合、多様な抗癌剤を、同時またはその後に投与することができる。
【０１４０】
状況により、処置の期間の顕著に延長することさえ所望され得、ここで、数日間（２、３、４、５、６もしくは７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８）または数箇月（１、２、３、４、５、６、７もしくは８）が、抗癌剤または抗癌処置のそれぞれの投与と本発明の抗体組成物の投与との間に経過する。これは、抗癌処置が実質的に腫瘍を破壊する（手術または化学療法のように）ことを目的とし、本発明の抗体組成物の投与が微小転移または腫瘍の再成長を防止することを目的とする環境において有利である。
【０１４１】
本発明の阻害型ＫＩＲ抗体に基づく組成物または抗癌剤のいずれかの１回を超える投与を利用することも想定される。これらの薬剤は、１日もしくは１週間おき；または本発明の阻害型ＫＩＲ抗体組成物による処置のサイクルの後、抗癌剤療法のサイクルが続く形で、交換可能に投与することができる。いずれにせよ、併用療法を使用して腫瘍の抑制を達成するためには、必要なことは、投与時間にかかわらず、抗腫瘍効果を発揮するのに十分な組み合わされた量で両方の薬剤を送達することだけである。
【０１４２】
手術について、任意の外科的介入は、本発明と組み合わせて実践することができる。放射線療法に関して、γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波および電子放射などのように、癌細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘発する任意の機構が考慮される。放射性同位元素の癌細胞への指令された送達もまた考慮され、これは、標的化抗体または他の標的化手段とあわせて使用され得る。
【０１４３】
他の態様では、免疫調節化合物またはレジメンを、本発明の抗体組成物と組み合わせて、またはその部分として投与することができる。免疫調節化合物の好適な例はサイトカインを含む。そのような併用アプローチでは、多様なサイトカインを用いることができる。本発明によって考慮される組み合わせにおいて有用なサイトカインの例として、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、またはＩＦＮ−γが挙げられる。本発明の併用処置または組成物において使用されるサイトカインは、患者の状態およびサイトカインの相対的毒性のような臨床適応に一致する標準的なレジメンに従って、投与される。
【０１４４】
特定の実施形態では、本発明の交差反応性阻害型ＫＩＲ抗体を含んでなる治療組成物は、化学療法もしくはホルモン治療剤と併用投与され得るか、または該化学療法もしくはホルモン治療剤をさらに含んでなり得る。様々なホルモン治療および化学療法剤は、本明細書において開示される併用処置方法において使用することができる。例示的に考えられる化学療法剤として、アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞障害性抗生物質、ビンカアルカロイド、例えば、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキサート、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン（系薬剤）、ならびにそれらの誘導体およびプロドラックが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
ホルモン剤としては、例えば、ＬＨＲＨアゴニスト、例えば、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、およびブセレリン；抗エストロゲン、例えば、タモキシフェンおよびトレミフェン；抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、シプロテロンおよびビカルタミド；アロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾールおよびファドロゾール；ならびにプロゲスターゲン、例えば、メドロキシ、クロルマジノンおよびメゲストロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
当業者に理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、臨床治療においてすでに用いられている用量に近似し、ここで、化学療法剤は、単独か、または他の化学療法剤との併用で投与される。唯一の例として、シスプラチンのような薬剤、および他のＤＮＡアルキル化剤を使用することができる。シスプラチンは癌を処置するために広範に使用されており、臨床適用において使用される有効量は２０ｍｇ／ｍ２であり、３週間ごとに５日間の投与を合計で３クール行う。シスプラチン経口的には吸収されず、従って、静脈内、皮下、腫瘍内または腹腔内注入を介して送達されなければならない。
【０１４７】
さらに有用な化学療法剤として、ＤＮＡ複製、有糸分裂および染色体分離を妨害する化合物、ならびにポリヌクレオチド前駆体の合成および忠実度を破壊する薬剤が挙げられる。併用治療のための多くの例示的化学療法剤が米国特許第６，５２４，５８３号明細書の表Ｃに列挙されており、該薬剤および適応に関する開示内容は、具体的に、本明細書において参考として援用される。列挙されたそれぞれの薬剤は例示的であり、限定的ではない。当業者は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、第３３章、特に６２４〜６５２頁を参照されたい。用量の変動は、治療中の状態に依存して生じる可能性がある。処置を施行する医師は、個々の被験体に対する適切な用量を決定することが可能である。
【０１４８】
本発明の交差反応性阻害型ＫＩＲ抗体組成物は、任意の１つもしくはそれ以上の他の抗血管新生療法をと組み合わせて使用され得るか、または抗血管新生剤をさらに含んでなり得る。そのような薬剤の例として、それぞれＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対して指向される中和抗体、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムが挙げられる（米国特許第６，５２４，５８３号明細書、その開示内容は本明細書において参考として援用される）。国際公開第９８／１６５５１号パンフレット（具体的に本明細書において参考として援用される）に記載されているように、拮抗特性を伴うＶＥＧＦの変異体もまた用いることができる。併用治療に関して有用であるさらなる例示的抗血管新生剤が米国特許第６，５２４，５８３号明細書の表Ｄに列挙されており、薬剤および適応に関する開示内容は、具体的に、本明細書において参考として援用される。
【０１４９】
本発明の阻害型ＫＩＲ抗体組成物はまた、アポトーシスを誘導する方法と組み合わせて有利に使用され得るか、またはアポトーシス誘導剤を含んでなり得る。例えば、アポトーシス、またはプログラムされた細胞死を阻害する多くの発癌遺伝子が同定されている。このカテゴリー内の例示的発癌遺伝子として、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｌ−２（ｂｃｌ−１、サイクリン（ｃｙｃｌｉｎ）Ｄ１とは異なる；（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｍ１４７４５、Ｘ０６４８７；米国特許第５，６５０，４９１号明細書；および同第５，５３９，０９４号明細書；それぞれ、本明細書において参考として援用される）ならびにＢｃｌ−ｘ１、Ｍｃｌ−１、Ｂａｋ、Ａ１、およびＡ２０を含むファミリーメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。ｂｃｌ−２の過剰発現はＴ細胞リンパ腫においてはじめて発見された。癌遺伝子ｂｃｌ−２は、Ｂａｘ、アポトーシス経路におけるタンパク質に結合し、不活化することによって、機能する。ｂｃｌ−２機能を阻害すると、Ｂａｘの不活化が防止され、アポトーシス経路を促進させることが可能である。例えば、アンチセンスヌクレオチド配列、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたは小分子の化学化合物を使用するこのクラスの発癌遺伝子の阻害が、アポトーシスの増強を生じさせるための本発明での使用のために考慮される（米国特許第５，６５０，４９１号明細書；同第５，５３９，０９４号明細書；および同第５，５８３，０３４号明細書；それぞれは本明細書において参考として援用される）。
【０１５０】
本発明の阻害型ＫＩＲ抗体組成物はまた、標的化タンパク質、例えば、標的細胞、例えば、標的腫瘍細胞の特異的マーカー（「ターゲット剤」）に指向される抗体、リガンド、もしくはそれらの共役を含んでなる分子を含んでなり得るかまたは該分子と組み合わせて使用され得る。一般的に言えば、本発明のこれらのさらなる態様における使用のためのターゲット剤は、好ましくは、腫瘍部位において好適または特異的に発現されるアクセス可能な腫瘍抗原を認識する。ターゲット剤は、一般に、腫瘍細胞の表面に発現された、表面にアクセス可能なまたは表面に局在した成分に結合する。ターゲット剤はまた、好ましくは、高い親和性の特性を示し；ヒト身体における心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、直腸、乳、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚、あるいは他の生命を維持する器官または組織から選択される１つもしくはそれ以上の組織のような生命を維持する正常な組織に対して顕著なインビボでの副作用を発揮しない。本明細書で使用する用語「顕著な副作用を発揮しない」は、インビボで投与する場合、ターゲット剤が化学療法中に通常遭遇するような極僅かなまたは臨床的に管理可能な副作用しか生じないという事実を指す。
【０１５１】
腫瘍の処置では、本発明の抗体組成物は、補助化合物をさらに含んでなり得るかまたは該補助化合物との組み合わせで使用され得る。補助化合物はとしては、その例として、制吐剤、例えば、セロトニン拮抗薬および治療薬、例えば、フェノチアジン系薬剤、置換ベンズアミド系薬剤、抗ヒスタミン系薬剤、ブチロフェノン系薬剤、副腎皮質ステロイド、ベンゾジアゼピン系薬剤およびカンナビノイド系薬剤；ビスホスホネート系薬剤、例えば、ゾレドロン酸およびパミドロン酸；ならびに造血成長因子、例えば、エリスロポエチンおよびＧ−ＣＳＦ、例えば、フィルグラスチム、レノグラスチムおよびダルベポエチンを挙げることができる。
【０１５２】
別の実施形態では、ＮＫＶＳＦ１を含む異なる交差反応性を有する本発明の２つもしくはそれ以上の抗体は、できるだけ多くの阻害型ＫＩＲ遺伝子産物の阻害効果を中和するように単一の組成物内に組み合わせてもよい。本発明の交差反応性阻害型ＫＩＲ抗体、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体の組み合わせを含んでなる組成物は、単一の交差反応性抗体によって認識される阻害型ＫＩＲ遺伝子産物のそれぞれを欠き得るヒト集団が小さな百分率で存在する可能性があるため、さらに広範な有用性を可能にする。同様に、本発明の抗体組成物は、単一の阻害型ＫＩＲサブタイプを認識する１つもしくはそれ以上の抗体をさらに含んでなり得る。そのような組み合わせはさらに、治療設定において広範な有用性を提供する。
【０１５３】
本発明はまた、前記患者に本発明の組成物を投与する工程を含んでなる、ＮＫ細胞活性を、それを要する患者において増強する方法をさらに提供する。本発明は、より具体的には、ＮＫ細胞活性の増加が有益であるか、ＮＫ細胞による溶解に感受性である細胞に関与するか、影響を及ぼすか、もしくは該細胞によって生じるか、あるいは癌、別の増殖性障害、感染性疾患もしくは免疫障害のような不十分なＮＫ細胞活性によって生じるかまたは特徴付けられる疾患を有する患者においてＮＫ細胞活性を増加させることに関する。より具多的には、本発明の方法は、膀胱、乳、直腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、頚部、甲状腺および扁平上皮癌を含む皮膚の癌種を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫を含むリンパ球系統の造血器腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血器腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；黒色腫、精上皮腫、奇形癌種、神経芽細胞腫および神経膠腫を含む他の腫瘍；星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒｏｍａ）、および骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌および奇形癌種を含む他の腫瘍を含むがこれらに限定されない様々な癌ならびに他の増殖性疾患の処置のために利用される。
【０１５４】
本発明に従って処置することができる好適な障害は、リンパ球系統の造血器腫瘍、例えば、小細胞および大脳様細胞型を含むＴ細胞性前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）のようなＴ細胞障害を含むが、これらに限定されないＴ細胞ならびにＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄＴ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢性／胸腺後段階Ｔ細胞リンパ腫（多形性もしくは免疫芽球性サブタイプ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心性（鼻部）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ１＋）大細胞型リンパ腫；腸Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球性；およびリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）を含む。
【０１５５】
例えば、過形成、線維症（具体的には、肺、但し、腎線維症のような他のタイプの線維症も含む）、血管新生、乾癬、アテローム硬化症および狭窄または血管形成術後の再狭窄のような血管における平滑筋増殖を含む他の増殖性障害もまた、本発明に従って処置することが可能である。本発明の交差反応性阻害型ＫＩＲ抗体を使用して、好ましくは、ウイルス、細菌、原生動物、糸状菌もしくは真菌によって生じる任意の感染症を含む感染性疾患を処置または防止することができる。そのようなウイルス感染性生物体として、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−１）、２型単純ヘルペス（ＨＳＶ−２）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルスまたはＩ型もしくは２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
本発明に従って処置することができる細菌感染として、以下、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）；化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）を含む連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）；腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｌ）；炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；Ｇ．バギナリス（Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）を含むガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）；ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）；ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；好熱性放線菌（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｒｎａ）；カンピロバクター（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、緑膿菌（Ｒａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）；淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）を含むナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）；Ｆ．メニンゴゼプチクム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）およびＦ．オドラタム（Ｆ．ｏｄｏｒａｔｕｒｎ）を含むフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）；百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）および気管支敗血症菌（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）を含むボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含むエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびＳ．リケファシエンス（Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）を含むセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）；エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）；Ｐ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）およびＰ．ブルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）を含むプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）；ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；Ｒ．リケッチー（Ｒ．ｆｉｃｋｅｔｔｓｆｉ）を含むリケッチア科（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）、Ｃ．シッタキ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）およびＣ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｒｎａｔｉｓ）を含むクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）；結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．イントラセルラール（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｌｌｕｉｔｕｒｎ）、らい菌（Ｍ．ｌａｐｒａｅ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、アフリカ型結核菌（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．イントラセルラール（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、およびＭ．レプレヌリアム（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｒｎｕｒｉｕｍ）を含むマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；ならびにノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）によって生じる感染が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
本発明に従って処置され得る原生動物感染として、リ−シュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、コクジジオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、およびトリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）によって生じる感染が挙げられるが、これらに限定されない。感染性疾患の完全なリストを、疾病対策センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＣＤＣ）の国立感染症センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＮＣＩＤ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｎｃｉｄｏｄ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／）（本明細書において参考として援用される）上に見出すことができる。前記疾患のすべてが、本発明の交差反応性阻害型ＫＩＲ抗体を使用する処置のための候補である。
【０１５８】
多様な感染性疾患を処置するそのような方法は、単独かあるいは抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗細菌剤、抗生物質、抗寄生体剤および抗原生動物剤を含むそのような疾患を処置するのに他の公知の処置および／または治療剤との組み合わせのいずれかで、抗体組成物を用いることができる。これらの方法がさらなる治療剤でのさらなる処置に関与する場合、該薬剤は、本発明の抗体と共に、単一の剤形かまたは個別の複数の剤形のいずれかで投与することができる。個別の剤形として投与する場合、さらなる薬剤は、本発明の抗体の投与の前、同時、または後に投与することができる。
【０１５９】
本発明のさらなる態様および利点を、以下の実施例のセクションで開示するが、これは例示的であり、本出願の範囲を制限するものではないとみなすべきである。
【０１６０】
実施例１
ＰＢＬの精製およびポリクローンまたはクローンＮＫ細胞系統の作製
ＰＢＬを、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ勾配およびプラスチック粘着細胞の枯渇によって、健常なドナーから誘導した。富化されたＮＫ細胞を得るために、ＰＢＬを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４および抗ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂ（４℃で３０分間）、続いて、ヤギ抗マウス磁気ビーズ（ダイナル（Ｄｙｎａｌ））（４℃で３０分間）と共にインキュベートし、当該分野において既知の方法（ペンデ（Ｐｅｎｄｅ）ら、１９９９年）によって免疫磁気選択を行った。ＣＤ３−、ＣＤ４−、ＤＲ−細胞を、照射したフィーダー細胞、１００Ｕ／ｍｌインターロイキン２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、カイロン・コーポレーション（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））および１．５ｎｇ／ｍｌ  ＰｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＡ（ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））上で培養し、ポリクローンＮＫ細胞集団を得た。ＮＫ細胞を限界希釈によりクローニングし、ＮＫ細胞のクローンを細胞表面受容体の発現についてのフローサイトメトリーによって特徴付けた。
【０１６１】
使用したｍＡｂは、ＪＴ３Ａ（ＩｇＧ２ａ、抗ＣＤ３）、ＥＢ６およびＧＬ１８３（それぞれＩｇＧ１抗ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３）、ＸＡ−１４１  ＩｇＭ（ＥＢ６と同じ特異性を伴う抗ＫＩＲ２ＤＬ１）、抗ＣＤ４（ＨＰ２．６）、ならびに抗ＤＲ（Ｄ１．１２、ＩｇＧ２ａ）であった。出願人らにより生成されたＪＴ３Ａ、ＨＰ２．６、およびＤＲ１．１２の代わりに、同じ特異性の市販のｍＡｂを使用することもできる（ベックマン・コールター・インク（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．）、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、カリフォルニア州）。ＥＢ６およびＧＬ１８３は市販されている（ベックマン・コールター・インク（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．）、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、カリフォルニア州）。ＸＡ−１４１は市販されていないが、ＥＢ６を、（モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら、１９９３）に記載のような溶解のコントロール再構築のための使用することができる。
【０１６２】
細胞を適切な抗体（４℃で３０分間）、続いて、ＰＥまたはＦＩＴＣ共役ポリクローナル抗マウス抗体（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ・インク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ））で染色した。サンプルを、ＦＡＣＳＡＮ装置（ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州）上での細胞蛍光測定分析により分析した。
【０１６３】
以下のクローンを、本研究に使用した。ＣＰ１１、ＣＮ５およびＣＮ５０５はＫＩＲ２ＤＬ１陽性クローンであり、ＥＢ６（（ＩｇＧ１抗ＫＩＲ２ＤＬ１）またはＸＡ−１４１（ＥＢ６抗体と比較して同じ特異性を伴うＩｇＭ抗ＫＩＲ２ＤＬ１）により染色される。ＣＮ１２およびＣＰ５０２はＫＩＲ２ＤＬ３陽性クローンであり、ＧＬ１８３抗体（ＩｇＧ１抗ＫＩＲ２ＤＬ３）により染色される。
【０１６４】
ＮＫクローンの細胞障害活性を、標準的な４時間５１Ｃｒ遊離アッセイによって評価し、ここで、エフェクターＮＫ細胞を、ＮＫ細胞溶解に対する感受性について既知のＣｗ３またはＣｗ４陽性細胞系統に対して試験した。すべての標的を、マイクロ滴定プレートのウェルあたり５０００個の細胞で使用し、エフェクター：標的比を図に示す（通常、標的細胞あたり４エフェクター）。細胞溶解アッセイを、示されたモノクローナル抗体の１／２希釈での懸濁液を伴うかまたは伴わすに実施した。手順は、本質的に（モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら、１９９３）の記載に同じであった。
【０１６５】
実施例２
新たなｍＡｂの作製
ｍＡｂを、（モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら、１９９０）に記載のように、５週齢のＢａｌｂＣマウスを活性型ポリクローンまたはモノクローンＮＫ細胞系統で免疫することによって、作製した。異なる細胞融合後、はじめに、ＥＢ６およびＧＬ１８３陽性ＮＫ細胞系統ならびにクローンとの交差反応する能力について、ｍＡｂを選択した。それぞれ、Ｃｗ４またはＣｗ３陽性標的のＥＢ６陽性もしくはＧＬ１８３陽性ＮＫクローンによって溶解を再構築する能力について、陽性モノクローナル抗体をさらにスクリーニングした。
【０１６６】
細胞染色は、以下の通りに行った。細胞を、抗体のパネル（１μｇ／ｍｌまたは５０μｌ上清、４℃で３０分間）、続いて、ＰＥ−共役ヤギＦ（ａｂ’）２フラグメント抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）またはＰＥ共役ヤギＦ（ａｂ’）２フラグメント抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）抗体（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））で染色した。細胞蛍光測定分析を、ＥｐｉｃｓＸＬ．ＭＣＬ装置（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））上で実施した。
【０１６７】
モノクローナル抗体のうちの１つであるＤＦ２００ｍＡｂが、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３を含むＫＩＲファミリーの多様なメンバーを交差反応することを見出した。ＫＩＲ２ＤＬ１＋およびＫＩＲ２ＤＬ２／３＋ＮＫ細胞の両方を、ＤＦ２００ｍＡｂで鮮明に染色した（図１）。
【０１６８】
これらのＨＬＡクラスＩ特異的阻害型受容体のうちの１つもしくは別のもの（または両方）を発現するＮＫクローンを、１つもしくはそれ以上のＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を発現する標的細胞に対するエフェクター細胞として使用した。細胞障害性アッセイを、以下の通りに行った。ＹＴＳ−ＫＩＲ２ＤＬ１またはＹＴＳ−Ｅｃｏ細胞系統の細胞溶解活性を、標準的な４時間５１Ｃｒ遊離アッセイによって評価した。エフェクター細胞を、ＨＬＡ−Ｃｗ４陽性または陰性ＥＢＶ細胞系統およびＨＬＡ−Ｃｗ４トランスフェクト７２１．２２１細胞に対して試験した。すべての標的は、マイクロ滴定プレートのウェルあたり３０００個の細胞で使用した。エフェクター／標的比を図に示す。細胞溶解アッセイを、モノクローナルマウスまたはヒト抗体の示された全長もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントを伴うあるいは伴わずに実施した。予想されるように、ＨＬＡ−Ｃｗ４およびＫＩＲ２ＤＬ３＋ＮＫクローンを発現する標的細胞に対するいずれの細胞溶解活性もＣｗ３陽性標的に対してほとんどもしくはまったく活性を示さない場合、ＫＩＲ２ＤＬ１＋ＮＫクローンはほとんど示さなかった。しかし、ＤＦ２００ｍＡｂ（それらのＫＩＲ２ＤＬ受容体を遮蔽するために使用した）の存在下では、ＮＫクローンは、それらのＨＬＡ−Ｃリガンドを認識することができなくなり、Ｃｗ３またはＣｗ４標的に対して強い細胞溶解活性を示した。
【０１６９】
例えば、Ｃ１Ｒ細胞系統（ＣＷ４＋ＥＢＶ細胞系統、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１９９３）は、ＫＩＲ２ＤＬ１＋ＮＫクローン（ＣＮ５／ＣＮ５０５）では死滅されなかったが、阻害は、ＤＦ２００または従来の抗ＫＩＲ２ＤＬ１ｍＡｂのいずれか一方の使用によって、効率的に反転させることができた。一方、ＫＩＲ２ＤＬ２／３＋ＫＩＲ２ＤＬ１−表現型（ＣＮ１２）を発現するＮＫクローンは、Ｃ１Ｒ細胞を効率的に死滅させ、この死滅は、ＤＦ２００ｍＡｂの影響を受けなかった（図２）。Ｃｗ３陽性標的に対するＫＩＲ２ＤＬ２−またはＫＩＲ２ＤＬ３−陽性ＮＫクローンによっても同様の結果が得られる。
【０１７０】
同様に、Ｃｗ４＋２２１ＥＢＶ細胞系統は、ＫＩＲ２ＤＬ１＋トランスフェクトＮＫ細胞によって死滅されなかったが、阻害は、ＤＦ２００、ＤＦ２００Ｆａｂフラグメント、または従来の抗ＫＩＲ２ＤＬ１ｍＡｂＥＢ６もしくはＸＡ１４１のいずれかの使用によって、効率的に反転させることができた。また、Ｃｗ３＋２２１ＥＢＶ細胞系統は、ＫＩＲ２ＤＬ２＋ＮＫ細胞によって死滅されなかったが、阻害は、ＤＦ２００またはＤＦ２００Ｆａｂフラグメントのいずれかの使用によって、反転させることができた。最後に、Ｃｗ３＋２２１ＥＢＶ細胞系統は、ＫＩＲ２ＤＬ３＋ＮＫ細胞によって死滅されなかったが、この阻害は、ＤＦ２００Ｆａｂフラグメントまたは従来の抗ＫＩＲ２ＤＬ３ｍＡｂＧＬ１８３もしくはＹ２４９のいずれかの使用によって、反転させることができた。結果を図３に示す。
【０１７１】
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントもまた、Ｃｗ４陽性標的の溶解を再構築する能力について試験した。ＤＦ２００のＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＥＢ６Ａｂは、両方とも、Ｃｗ４トランスフェクト２２１細胞系統およびＣｗ４＋ＴＵＢＯ  ＥＢＶ細胞系統のＫＩＲ２ＤＬ１−トランスフェクトＮＫ細胞による溶解の阻害を反転することが可能であった。結果を図４に示す。
【０１７２】
実施例４
新たなヒトｍＡｂの作製
ヒト抗体レパートリーを発現するように操作されたトランスジェニックマウスを組換えＫＩＲタンパク質で免疫し、ヒトモノクローナル抗ＫＩＲ  Ａｂを作製した。異なる細胞融合後、はじめに、固定化されたＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２タンパク質と交差反応する能力について、ｍＡｂを選択した。１−７Ｆ９、１−４Ｆ１、１−６Ｆ５および１−６Ｆ１を含むいくらかのモノクローナル抗体がＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３と交差反応することを見出した。
【０１７３】
陽性モノクローナル抗体を、Ｃｗ４陽性標的細胞のＫＩＲ２ＤＬ１を発現するＥＢ６陽性ＮＫトランスフェクタントによる溶解を再構築する能力について、さらにスクリーニングした。ＨＬＡクラスＩ特異的阻害型受容体を発現するＮＫ細胞を、１つもしくはそれ以上のＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を発現する標的細胞に対するエフェクター細胞として使用した（図５および６）。細胞障害性アッセイを、上記の通りに行った。エフェクター／標的比を図に示し、抗体を１０μｇ／ｍｌまたは３０μｇ／ｍｌのいずれかで使用した。
【０１７４】
（予想されるように、ＨＬＡ−Ｃｗ４を発現する標的細胞に対するいずれの細胞溶解活性がそうである場合、ＫＩＲ２ＤＬ１＋ＮＫ細胞はほとんど示さなかった。）しかし、１−７Ｆ９  ｍＡｂの存在下では、ＮＫ細胞は、それらのＨＬＡ−Ｃリガンドを認識することができなくなり、Ｃｗ４標的に対して強い細胞溶解活性を示した。例えば、試験した２つの細胞系統（ＨＬＡ−Ｃｗ４トランスフェクト７２１．２２１およびＣＷ４＋ＥＢＶ細胞系統）は、ＫＩＲ２ＤＬ１＋ＮＫ細胞で死滅されなかったが、阻害は、Ｍａｂ１−７Ｆ９または従来の抗ＫＩＲ２ＤＬ１ｍＡｂ  ＥＢ６のいずれかの使用により効率的に反転された。ＡｂＤＦ２００およびｐａｎＫＩＲ（ＮＫＶＳＦ１とも称される）を１−７Ｆ９と比較した。一方、抗体１−４Ｆ１、１−６Ｆ５および１−６Ｆ１は、Ｃｗ４陽性標的に対するＮＫ細胞による細胞溶解を再構築することができなかった。
【０１７５】
実施例５
ＤＦ２００  ｍＡｂ／ＫＩＲ２ＤＬ１およびＤＦ２００  ｍＡｂ／ＫＩＲ２ＤＬ３相互作用のＢｉａｃｏｒｅ分析
組換えタンパク質の産生および精製
ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３組換えタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生させた。ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３の細胞外ドメイン全体をコードするｃＤＮＡを、以下のプライマーを使用して、それぞれ、ｐＣＤＭ８クローン４７．１１ベクター（バイアソニ（Ｂｉａｓｓｏｎｉ）ら、１９９３年）およびＲＳＶＳ（ｇｐｔ）１８３クローン６ベクター（ワグマン（Ｗａｇｔｍａｎ）ら、１９９５年）から、ＰＣＲによって増幅した。
センス：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＴＡＡＡＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＧ−３’
アンチセンス：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＴＡＣＣ−３’
それらを、ビオチン化シグナルをコードする配列でフレームにおいて、ｐＭＬ１発現ベクター（ソウルクイン（Ｓａｕｌｑｕｉｎ）ら、２００３年）にクローニングした。
【０１７６】
タンパク質発現は、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌株（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））において実施した。トランスフェクト細菌を、ＯＤ６００＝０．６まで、３７°Ｃ、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した培地中で増殖させ、発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。
【０１７７】
タンパク質を、変性条件（８Ｍ尿素）下の封入体から回収した。組換えタンパク質のリフォールディングを、Ｌ−アルギニン（４００ｍＭ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））およびβ−メルカプトエタノール（１ｍＭ）を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ緩衝液において、室温で、尿素濃度を、６段階の透析（それぞれ、４、３、２、１、０．５および０Ｍ尿素）で減少することによって、実施した。還元型および酸化型グルタチオン（それぞれ５ｍＭおよび０．５ｍＭ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を、０．５および０Ｍ尿素の透析工程中に添加した。最後に、タンパク質を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ緩衝液に対して、広範に透析した。可溶性のリフォールドしたタンパク質を濃縮し、次いで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ＡＫＴＡシステム（ＡＫＴＡ  ｓｙｓｔｅｍ））上で精製した。
【０１７８】
表面プラズモン共鳴測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ））上で実施した。すべてのＢｉａｃｏｒｅ実験において、ＨＢＳ緩衝液にランニング緩衝液としての役割を果たす０．０５％サーファクタント（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）Ｐ２０を補充した。
【０１７９】
タンパク質の固定化
上記のように産生された組換えＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３タンパク質をＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（バイオコア（Ｂｉａｃｏｒｅ））上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合で固定化した。ｓｅｎｓｏｒ  ｃｈｉｐ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド、バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ））で活性化した。カップリング緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５）中タンパク質を注入した。残留する活性型基の失活を、１００ｍＭエタノールアミンｐＨ８（バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ））を使用して実施した。
【０１８０】
親和性測定
動態測定のため、多様な濃度の可溶性抗体（１×１０−７〜４×１０−１０Ｍ）を固定化されたサンプル上に適用した。測定は、２０μｌ／分連続流速で実施した。各サイクルについて、ｓｅｎｓｏｒ  ｃｈｉｐの表面を、１０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１の５μｌ注入によって、再生した。ＢＩＡｌｏｇｕｅ動態評価プログラム（ＢＩＡｌｏｇｕｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ）（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１，バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ））をデータ分析に使用した。可溶性分析物（多様な濃度での４０μｌ）を、２０μｌ／分の流速、ＨＢＳ緩衝液において、それぞれ、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３の５００または５４０反射率単位（ＲＵ）、および１０００または７００ＲＵを含有するデキストラン層上で、注入した。データは、６つの独立した実験の代表値である。結果を以下の表１に示す。
【０１８１】
【表１】
2008500947.tif 000002
【０１８２】
実施例６
マウスおよびヒト抗ＫＩＲ抗体のＢｉａｃｏｒｅ競合結合分析
固定化されたＫＩＲ２ＤＬ１（９００ＲＵ）、ＫＩＲ２ＤＬ３（２０００ＲＵ）およびＫＩＲ２ＤＳ１（１０００ＲＵ）上、マウス抗ＫＩＲ２Ｄ抗体ＤＦ２００、Ｐａｎ２Ｄ、ｇｌ１８３およびＥＢ６、ならびにヒト抗ＫＩＲ２Ｄ抗体１−４Ｆ１、１−６Ｆ１、１−６Ｆ５および１−７Ｆ９により、先に記載のようにエピトープマッピング分析を実施した（ガウトハイヤー（Ｇａｕｔｈｉｅｒ）ら、１９９９年、サウナル（Ｓａｕｎａｌ）およびバン・レゲンモルテル（ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ）１９９５年）。
【０１８３】
すべての実験は、５μｌ／分の流速、ＨＢＳ緩衝液中、１５μｌ／ｍｌでの異なる抗体の２分間注入により、行った。各組の抗体について、２工程で競合結合分析を実施した。第１の工程では、第一のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をＫＩＲ２Ｄ標的タンパク質に対して注入し、続いて、第二ｍＡｂ（第一ｍＡｂは取り出さない）を注入し、第二ｍＡｂのＲＵ値（ＲＵ２）をモニターした。第２の工程では、第二ｍＡｂを最初に裸のＫＩＲ２Ｄタンパク質上に直接注入し、ｍＡｂのＲＵ値（ＲＵ１）をモニターした。第一のｍａｂによる第二ｍＡｂのＫＩＲ２Ｄタンパク質への阻害パーセントは、１００＊（１−ＲＵ２／ＲＵ１）によって産出した。
【０１８４】
表２、３、および４に結果を示し、ここで、「第一抗体」と命名された抗体を垂直カラムに列挙し、「第二抗体」を水平カラムに列挙する。試験したそれぞれの抗体の組み合わせについて、抗体のチップに対する直接結合レベルの値（ＲＵ）を表に列挙し、ここで、第二抗体のＫＩＲ２Ｄチップへの直接結合を区画の頂部に列挙し、第一抗体が存在する場合の第二抗体のＫＩＲ２Ｄチップへの直接結合に対する値を区画の底部に列挙する。各区画の右側には、第二抗体結合の阻害百分率を列挙する。表２は、ＫＩＲ２ＤＬ１チップに対する結合を示し、表３は抗体のＫＩＲ２ＤＬ３チップへの結合を示し、表４は、抗体のＫＩＲ２ＤＳ１チップへの結合を示す。マウス抗体ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１およびＥＢ６、ならびにヒト抗体１−４Ｆ１、１−７Ｆ９および１−６Ｆ１の固定化されたＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３およびＫＩＲ２ＤＳ１への競合結合を評価した。抗ＫＩＲ抗体のＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合による実験由来のエピトープマッピング（図７）は、（ａ）抗体１−７Ｆ９はＥＢ６および１−４Ｆ１と競合的であるが、ＮＫＶＳＦ１およびＤＦ２００とは競合的ではなく；（ｂ）次いで、抗体１−４Ｆ１はＥＢ６、ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１および１−７Ｆ９と競合的であり；（ｃ）ＮＫＶＳＦ１はＤＦ２００、１−４Ｆ１およびＥＢ６と競合するが、１−７Ｆ９とは競合せず；（ｄ）ＤＦ２００はＮＫＶＳＦ１、１−４Ｆ１およびＥＢ６と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しないことを示した。抗ＫＩＲ抗体のＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合による実験由来のエピトープマッピング（図８）は、（ａ）１−４Ｆ１はＮＫＶＳＦ１、ＤＦ２００、ｇｌ１８３および１−７Ｆ９と競合的であり；（ｂ）１−７Ｆ９はＤＦ２００、ｇｌ１８３および１−４Ｆ１とは競合的であるが、ＮＫＶＳＦ１とは競合的ではなく；（ｃ）ＮＫＶＳＦ１はＤＦ２００、１−４Ｆ１およびＧＬ１８３と競合するが、１−７Ｆ９とは競合せず；（ｄ）ＤＦ２００はＮＫＶＳＦ１、１−４Ｆ１および１−７Ｆ９と競合するが、ＧＬ１８３とは競合しないことを示した。抗ＫＩＲ抗体のＫＩＲ２ＤＳ１に対する結合による実験由来のエピトープマッピング（図９）は、（ａ）１−４Ｆ１はＮＫＶＳＦ１、ＤＦ２００および１−７Ｆ９と競合的であり；（ｂ）１−７Ｆ９は１−４Ｆ１とは競合的であるが、ＤＦ２００およびＮＫＶＳＦ１とは競合的ではなく；（ｃ）ＮＫＶＳＦ１はＤＦ２００および１−４Ｆ１と競合するが、１−７Ｆ９とは競合せず；（ｄ）ＤＦ２００はＮＫＶＳＦ１および１−４Ｆ１と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しないことを示した。
【０１８５】
実施例７
カニクイザルＮＫ細胞による抗ＫＩＲｍＡｂ滴定
抗ＫＩＲ抗体ＮＫＶＳＦ１を、カニクイザル由来のＮＫ細胞に結合する能力について試験した。抗体のサルＮＫ細胞への結合を図１０に示す。
【０１８６】
サル  ＰＢＭＣの精製およびポリクローンＮＫ細胞バルクの作製
カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅ）ＰＢＭＣを、クエン酸ナトリウムＣＰＴチューブ（ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から調製した。ＮＫ細胞の精製を、ネガティブな枯渇によって実施した（ＭａｃａｑｕｅＮＫ細胞富化キット、ステム・セル・テクノロジー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））。ＮＫ細胞を、照射したヒトフィーダー細胞、３００Ｕ／ｍｌインターロイキン２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、カイロン・コーポレーション（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））および１ｎｇ／ｍｌ  ＰｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＡ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））上で培養し、ポリクローンＮＫ細胞集団を得た。
【０１８７】
カニクイザルＮＫ細胞によるＰａｎ２ＤｍＡｂ滴定
カニクイザルＮＫ細胞（ＮＫバルク１６日目）を、異なる数量のＰａｎ２ＤｍＡｂ、続いて、ＰＥ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと共にインキュベートした。陽性細胞の百分率は、アイソタイプコントロール（精製マウスＩｇＧ１）により決定した。サンプルを２回繰り返した。蛍光強度の平均値＝ＭＦＩ。
【０１８８】
【表２】
2008500947.tif 000003
【０１８９】
【表３】
2008500947.tif 000004
【０１９０】
【表４】
2008500947.tif 000005
【０１９１】
実施例８
ＫＩＲ２ＤＬ１に対するＤＦ２００−およびｐａｎ２Ｄ−結合性のエピトープマッピング
公開された結晶構造（マエナカ（Ｍａｅｎａｋａ）ら（１９９９年）、ファン（Ｆａｎ）ら（２００１年）、ボイングトン（Ｂｏｙｉｎｇｔｏｎ）ら（２０００年））に基づくＫＩＲ２ＤＬ１、−２および−３（ＫＩＲ２ＤＬ１−３）の細胞外ドメインのコンピュータモデリングは、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ１−３交差反応性マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＤＦ２００とｐａｎ２Ｄとの間の相互作用におけるアミノ酸Ｒ１３１１の関与を予測した。これを確認するために、ＫＩＲ２ＤＬ１の完全細胞外ドメイン（アミノ酸Ｈ１〜Ｈ２２４）、ヒトＦｃ（ｈＦｃ）に融合した野生型または点変異型（例えば、Ｒ１３１Ｗ２）のいずれかよりなる融合タンパク質を調製した。多様なＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ融合タンパク質を産生させ、評価するために使用される材料および方法については記載されている（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）およびロング（Ｌｏｎｇ）（２０００年））。簡単に説明すると、ＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃをコードするｃＤＮＡベクターを、ＣＬ４２−Ｉｇ、野生型ＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃの産生のための公開されたｃＤＮＡベクター（ワグマン（Ｗａｇｔｍａｎ）ら（１９９５年））のＰＣＲに基づく変異誘発（ＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅＩＩ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））によって、作製した。ＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃおよびＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃをＣＯＳ７細胞において産生させ、本質的に記載（ワグマン（Ｗａｇｔｍａｎ）ら（１９９５年））のように組織培養培地から単離した。それらの正確なフォールディングを試験するために、ＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃおよびＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃを、ＨＬＡ−Ｃｗ３（ＫＩＲ２ＤＬ１リガンドなし）またはＨＬＡ−Ｃｗ４（ＫＩＲ２ＤＬ１リガンド）のいずれか一方を発現するＬＣＬ７２１．２２１細胞と共にインキュベートし、ＫＩＲ−Ｆｃ融合タンパク質と細胞との間の相互作用を、細胞表面でのタンパク質相互作用の研究に標準的な方法を使用し、ＦＡＣＳにより分析した。独立した実験の例を図１１、パネルＡに示す。文献から予想されるように、ＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ融合タンパク質のうちＨＬＡ−Ｃｗ３発現ＬＣＬ７２１．２２１細胞に結合したものは認められなかった。対照的に、ＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃおよびＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃの両方とも、ＨＬＡ−Ｃｗ４発現ＬＣＬ７２１．２２１細胞に結合し、それによって、それらの正確なフォールディングが確認された。
１１文字アミノ酸コード
２ＫＩＲ２ＤＬ１における（Ｎ末端からの）アミノ酸１３１位におけるＷに対するＲの置換
【０１９２】
ＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃおよびＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃのＫＩＲ特異的ｍＡｂ（ＤＦ２００、ｐａｎ２Ｄ、ＥＢ６およびＧＬ１８３）への結合について、ＥＬＩＳＡ、タンパク質相互作用を研究するための標準的な技術を使用して、研究した。簡単に説明すると、ＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃおよびＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃを、ヤギ抗ヒト抗体を介して、９６ウェルに連結し、その後、ＫＩＲ特異的ｍＡｂを多様な濃度（ＰＢＳ中０〜１μｇ／ｍｌ）で添加した。ＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ変異体とｍＡｂとの間の相互作用を、ＴＭＢ基質を変換するためのマウス抗体に特異的なペルオキシダーゼ結合第二抗体を使用して、分光側光法（４５０ｎｍ）によって可視化した。独立した実験の例を図１１、パネルＢに示す。ＫＩＲ２ＤＬ２−３特異的ｍＡｂＧＬ１８３がＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ融合タンパク質のいずれにも結合できなかった一方、ＫＩＲ２ＤＬ１特異的ｍＡｂＥＢ６、ＤＦ２００およびｐａｎ２Ｄは、用量依存的様式でＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ変異体に結合した。単一の点変異（Ｒ１３１Ｗ）は、ＤＦ２００およびｐａｎ２Ｄの結合に影響を及ぼし、ｍＡｂの最大濃度（１μｇ／ｍｌ）で、野生型と比較して約１０％の結合の減少を伴ったことから、Ｒ１３１は、ＫＩＲ２ＤＬ１の細胞外ドメイン２におけるＤＦ２００およびｐａｎ２Ｄの結合部位の部分であることが確認された。
【０１９３】
参考文献
モレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）、ボッティノ，Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．）、ペンデ，Ｄ．（Ｐｅｎｄｅ，Ｄ．）、トリポディ，Ｇ．（Ｔｒｉｐｏｄｉ，Ｇ．）、タンブッシ，Ｇ．（Ｔａｍｂｕｓｓｉ，Ｇ．）、ビアレ，Ｏ．（Ｖｉａｌｅ，Ｏ．）、オレンゴ，Ａ．（Ｏｒｅｎｇｏ，Ａ．）、バーバレシ，Ｍ．（Ｂａｒｂａｒｅｓｉ，Ｍ．）、メルリ，Ａ．（Ｍｅｒｌｉ，Ａ．）、シッコネ，Ｅ．（Ｃｉｃｃｏｎｅ，Ｅ．）ら、（１９９０年）、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３−ＣＤ１６＋  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  （ＮＫ）  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｕｂｓｅｔ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ＮＫ  ｃｌｏｎｅｓ  ａｎｄ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１７２，１５８９−１５９８頁
モレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）、ビタレ，Ｍ．（Ｖｉｔａｌｅ，Ｍ．）、ボッティノ，Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．）、オレンゴ，Ａ．（Ｏｒｅｎｇｏ，Ａ．Ｍ．）、モレリ，Ｌ．（Ｍｏｒｅｌｌｉ，Ｌ．）、オーゴリアロ，Ｒ．（Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ，  Ｒ．）、バーバレシ，Ｍ．（Ｂａｒｂａｒｅｓｉ，Ｍ．）、シッコネ，Ｅ．（Ｃｉｃｃｏｎｅ，Ｅ．）、およびモレッタ，Ｌ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ｌ．）（１９９３年）、「Ｐ５８  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｓ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  （ＭＨＣ）  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  （ＮＫ）  ｃｅｌｌｓ．  Ａｎｔｉ−ｐ５８  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＮＫ  ｃｌｏｎｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１７８，５９７−６０４頁
ペンデ，Ｄ．（Ｐｅｎｄｅ，Ｄ）、パロリニ，Ｓ．（Ｐａｒｏｌｉｎｉ，Ｓ．）、ペッシノ，Ａ．（Ｐｅｓｓｉｎｏ，Ａ．）、シボリ，Ｓ．（Ｓｉｖｏｒｉ，Ｓ．）、オーゴリアロ，Ｒ．（Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ，Ｒ．）、モレリ，Ｌ．（Ｍｏｒｅｌｌｉ，Ｌ．）、マルセナロ，Ｅ．（Ｍａｒｃｅｎａｒｏ，Ｅ．）、アッカメ，Ｌ．（Ａｃｃａｍｅ，Ｌ．）、マラスピナ，Ａ．（Ｍａｌａｓｐｉｎａ，Ａ．）、ビアッソニ，Ｒ．（Ｂｉａｓｓｏｎｉ，Ｒ．）ら、（１９９９年）、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫｐ３０，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ」Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１９０，１５０５−１５１６頁
ルグゲリ，Ｌ．（Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｌ．）、カパンニ，Ｍ．（Ｃａｐａｎｎｉ，Ｍ．）、アーバニ，Ｅ．（Ｕｒｂａｎｉ，Ｅ．）、ペルッシオ，Ｋ．（Ｐｅｒｒｕｃｃｉｏ，Ｋ．）、シュロムチク，Ｗ．Ｄ．（Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ，Ｗ．Ｄ．）、トスティ，Ａ．（Ｔｏｓｔｉ，Ａ．）、ポサティ，Ｓ．（Ｐｏｓａｔｉ，Ｓ．）、ロガイア，Ｄ．（Ｒｏｇａｉａ，Ｄ．）、フラッソニ，Ｆ．（Ｆｒａｓｓｏｎｉ，Ｆ．）、アーベルア，Ｆ．（Ａｖｅｒｓａ，Ｆ．）ら、（２００２年）、「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２９５，２０９７−２１００頁
ワグマンＮ（Ｗａｇｔｍａｎｎ  Ｎ）、ビアッソニＲ（Ｂｉａｓｓｏｎｉ  Ｒ）、カントニＣ（Ｃａｎｔｏｎｉ  Ｃ）、ベルディアニＳ（Ｖｅｒｄｉａｎｉ  Ｓ）、マルナティＭＳ（Ｍａｌｎａｔｉ  ＭＳ）、ビタレＭ（Ｖｉｔａｌｅ  Ｍ）、ボッティノＣ（Ｂｏｔｔｉｎｏ  Ｃ）、モレッタＬ（Ｍｏｒｅｔｔａ  Ｌ）、モレッタＡ（Ｍｏｒｅｔｔａ  Ａ）、ロングＥＯ（Ｌｏｎｇ  ＥＯ）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ５８  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｖｅａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａ−  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎｓ」Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１９９５年５月；２（５）：４３９−４９頁
ビアッソニＲ（Ｂｉａｓｓｏｎｉ  Ｒ）、ベルディアニＳ（Ｖｅｒｄｉａｎｉ  Ｓ）、カンビアギＡ（Ｃａｍｂｉａｇｇｉ  Ａ）、ロミオＰＨ（Ｒｏｍｅｏ  ＰＨ）、フェリーニＳ（Ｆｅｒｒｉｎｉ  Ｓ）、モレッタＬ（Ｍｏｒｅｔｔａ  Ｌ）、「Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３−ＣＤ１６＋  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  ｈＧＡＴＡ−３  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ａｎ  ｕｎｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ２．３−ｋｂ  ＴｃＲ  ｄｅｌｔａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ」Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３年５月；２３（５）：１０８３−７頁
ソウルクインＸ（Ｓａｕｌｑｕｉｎ  Ｘ）、ガスティネルＬＮ（Ｇａｓｔｉｎｅｌ  ＬＮ）、ビビエルＥ（Ｖｉｖｉｅｒ  Ｅ）、「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＫＩＲ２ＤＳ２  （ＣＤ１５８ｊ）」Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００３年４月７；１９７（７）：９３３−８頁
ガウティエル，Ｌ．（Ｇａｕｔｈｉｅｒ，Ｌ．）、レンマース，Ｂ．（Ｌｅｍｍｅｒｓ，Ｂ．）、グエルパ−フォンルプト，Ｖ．（Ｇｕｅｌｐａ−Ｆｏｎｌｕｐｔ，Ｖ．）、フォーガーロウ，Ｍ．（Ｆｏｕｇｅｒｅａｕ，Ｍ．）、およびシュッフィ，Ｃ．（Ｓｃｈｉｆｆ，Ｃ．）「μ−ＳＬＣ  ｐｈｙｓｉｃｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｅＢ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＶＨ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｒｅＢ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｇｅ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６２．，４１−５０頁（１９９９年）
サウナル，Ｈ．（Ｓａｕｎａｌ，Ｈ．）およびバン・レゲンモーテル，Ｍ．Ｈ．Ｖ．（Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｍ．Ｈ．Ｖ．）「Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８３：３３−４１頁（１９９５年）
ボイングトンＪＣ（Ｂｏｙｉｎｇｔｏｎ  ＪＣ）；モティカＳＡ（Ｍｏｔｙｋａ  ＳＡ）；シュックＰ（Ｓｃｈｕｃｋ  Ｐ）；ブルックスＡＧ（Ｂｒｏｏｋｓ  ＡＧ）；スンＰＤ（Ｓｕｎ  ＰＤ）、Ｎａｔｕｒｅ、第４０５巻（６７８６）５３７−５４３頁（２０００年）
ファンＱＲ（Ｆａｎ  ＱＲ）；ロングＥＯ（Ｌｏｎｇ  ＥＯ）；ワイリーＤＣ（Ｗｉｌｅｙ  ＤＣ）、Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２巻（５）４５２−４６０頁（２００１年）
マエナカＫ（Ｍａｅｎａｋａ  Ｋ）；ジュジＴ（Ｊｕｊｉ  Ｔ）；スチュアートＤＩ（Ｓｔｕａｒｔ  ＤＩ）；ジョーンズＥＹ（Ｊｏｎｅｓ  ＥＹ）、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ」、第７巻（４）３９１−３９８頁（１９９９年）
ワグマンＮ（Ｗａｇｔｍａｎｎ  Ｎ）；ラジャゴパーランＳ（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  Ｓ）；ウィンターＣＣ（Ｗｉｎｔｅｒ  ＣＣ）；ペルッジＭ（Ｐｅｒｕｚｚｉ  Ｍ）；ロングＥＯ（Ｌｏｎｇ  ＥＯ）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第３巻（６）８０１−８０９頁（１９９５年）
ウィンターＣＣ（Ｗｉｎｔｅｒ  ＣＣ）；ロングＥＯ（Ｌｏｎｇ  ＥＯ）、「Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」  （キャンベルＫＳ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＫＳ）およびコロンナＭ（Ｃｏｌｏｎｎａ  Ｍ）編）、ヒューマン・プレス（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ）、２１９−２３８頁（２０００年）
【０１９４】
本明細書において引用された刊行物、特許出願および特許を含むすべての参考文献は、あたかも各文献が個々におよび具体的に参考として援用されることが意図され、その全体が本明細書に記載されているかのごとく、本明細書において参考として援用される。
【０１９５】
すべての表題および副題は、簡便のためのみに本明細書において使用され、いかなる方法においても本発明を制限するものと解釈されるべきではない。
【０１９６】
すべての可能なバリエーションにおける上記の要素のいかなる組み合わせも、本明細書において他に示すかまたは文脈において他に明らかな食い違いが認められない限り、本発明に包含される。
【０１９７】
本発明の説明に関して使用される用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の指示対象は、本明細書において他に示すかまたは文脈において他に明らかな食い違いが認められない限り、単数および複数の両方を含むものと解釈されるべきである。
【０１９８】
本明細書に記載の値の範囲の詳細な記載は、本明細書において他に示さない限り、範囲に当てはまる各個別の値について個々に言及する簡潔な表現方法としての役割を果たすことを単に目的としており、各個々の値は、あたかもそれが本明細書において個々に引用されているがごとく、本明細書に援用される。他に説明しない限り、本明細書において提供されるすべての正確な値は、対応するおおよその値の代表値である（例えば、特定の因子または測定について提供されるすべての正確な値もまた、対応するおおよその測定値を提供し、近似を示唆する「約」によって修飾される）。
【０１９９】
本明細書に記載のすべての方法は、本明細書において他に示すかまたは文脈において他に明らかな食い違いが認められない限り、任意の適切な順序で実施することができる。
【０２００】
本明細書において提供される任意およびすべての例、または例示的語句（例えば、「のような（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）は、単に本発明をより良好に例示することを目的としており、他に示さない限り、本発明の範囲を制限しない。本明細書における語句は、明白に説明しない限り、あらゆる要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきである。
【０２０１】
本明細書における特許明細書の引用および援用は、簡便のために行われており、そのような特許明細書の妥当性、特許可能性および／または施行可能性のあらゆる見解に反映しない。
【０２０２】
要素もしくは複数の要素に関する「含んでなる」、「有する」、「含む」または「含有する」などの用語を使用する本発明のあらゆる態様あるいは実施形態の本明細書における説明は、他に説明するかまたは文脈において他に明らかな食い違いが認められない限り、該特定の要素もしくは複数の要素「よりなる」、「より本質的になる」、または「実質的に含んでなる」本発明の類似の態様または実施形態への支持を提供することを目的とする（例えば、本明細書において特定の要素を含んでなるものとして説明される組成物は、他に説明するかまたは文脈において他に明らかな食い違いが認められない限り、該要素よりなる組成物をもまた説明しているものと理解すべきである）。
【０２０３】
本発明は、適用可能な法律によって許可された最大限の範囲で本明細書に記載の態様または特許請求の範囲に引用される主題事項のすべての修飾物および等価物を含む。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】多様なヒトＫＩＲ２ＤＬ受容体の共通の決定基に結合しているモノクローナル抗体ＤＦ２００を示す。
【図２】Ｃｗ４陽性標的細胞に対するＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ２ＤＬ仲介阻害を中和するモノクローナル抗体ＤＦ２００を示す。
【図３】モノクローナル抗体ＤＦ２００、ＤＦ２００のＦａｂフラグメントならびにＣｗ４陽性標的細胞に対するＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ２ＤＬ仲介阻害およびＣｗ３陽性標的細胞に対するＫＩＲ２ＤＬ２／３陽性ＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ２ＤＬ仲介阻害を中和するＫＩＲ２ＤＬ１またはＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的な従来の抗体を示す。
【図４】ＤＦ２００およびＥＢ６抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントの存在下におけるＨＬＡＣｗ４陽性標的細胞のＮＫクローンによる細胞溶解物の再構築を示す。
【図５】モノクローナル抗体ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１（ｐａｎ２Ｄ）、ヒト抗体１−７Ｆ９、１−４Ｆ１、１−６Ｆ５および１−６Ｆ１、ならびにＣｗ４陽性標的細胞（Ｃｗ４トランスフェクト細胞）に対するＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ２ＤＬ仲介阻害を中和するＫＩＲ２ＤＬ１またはＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的な従来の抗体を示す。
【図６】モノクローナル抗体ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１（ｐａｎ２Ｄ）、ヒト抗体１−７Ｆ９、１−４Ｆ１、１−６Ｆ５および１−６Ｆ１、ならびにＣｗ４陽性標的細胞（ＥＢＶ細胞）に対するＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ２ＤＬ仲介阻害を中和するＫＩＲ２ＤＬ１またはＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的な従来の抗体を示す。
【図７】ＫＩＲ２ＤＬ１に対する抗ＫＩＲ抗体による表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））分析によって得られる競合結合実験の結果を示すエピトープマップを示し、ここで、重複している円はＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合における重複を標示する。結果は、ＫＩＲ２ＤＬ１に対し、１−７Ｆ９はＥＢ６および１−４Ｆ１に競合的であるが、ＮＫＶＳＦ１およびＤＦ２００とは競合的ではないことを示す。次いで、抗体１−４Ｆ１は、ＥＢ６、ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１、および１−７Ｆ９に競合的である。抗体ＮＫＶＳＦ１は、ＫＩＲ２ＤＬ１に対し、ＤＦ２００、１−４Ｆ１、およびＥＢ６と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しない。ＤＦ２００は、ＫＩＲ２ＤＬ１に対し、ＮＫＶＳＦ１、１−４Ｆ１、およびＥＢ６と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しない。
【図８】ＫＩＲ２ＤＬ３に対する抗ＫＩＲ抗体によるＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析によって得られる競合結合実験の結果を示すエピトープマップを示し、ここで、重複している円はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合における重複を標示する。結果は、ＫＩＲ２ＤＬ３に対し、１−４Ｆ１がＮＫＶＳＦ１、ＤＦ２００、ｇｌ１８３、および１−７Ｆ９に競合的であることを示す。１−７Ｆ９は、ＫＩＲ２ＤＬ３に対し、ＤＦ２００、ｇｌ１８３、および１−４Ｆ１には競合的であるが、ＮＫＶＳＦ１には競合的ではない。ＮＫＶＳＦ１は、ＫＩＲ２ＤＬ３に対し、ＤＦ２００、１−４Ｆ１、およびＧＬ１８３と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しない。ＤＦ２００は、ＫＩＲ２ＤＬ３に対し、ＮＫＶＳＦ１、１−４Ｆ１、および１−７Ｆ９と競合するが、ＧＬ１８３とは競合しない。
【図９】ＫＩＲ２ＤＳ１に対する抗ＫＩＲ抗体によるＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析によって得られる競合結合実験の結果を示すエピトープマップを示し、ここで、重複している円はＫＩＲ２ＤＳ１に対する結合における重複を標示する。結果は、ＫＩＲ２ＤＳ１に対し、抗体１−４Ｆ１がＮＫＶＳＦ１、ＤＦ２００、および１−７Ｆ９に競合的であることを示す。抗体１−７Ｆ９は、ＫＩＲ２ＤＳ１に対し、１−４Ｆ１には競合的であるが、ＤＦ２００およびＮＫＶＳＦ１には競合的ではない。ＮＫＶＳＦ１は、ＫＩＲ２ＤＳ１に対し、ＤＦ２００および１−４Ｆ１と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しない。ＤＦ２００は、ＫＩＲ２ＤＳ１に対し、ＮＫＶＳＦ１および１−４Ｆ１と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しない。
【図１０】ｍＡｂのカニクイザルＮＫ細胞への結合を実証するＮＫＶＳＦ１（ｐａｎ２Ｄ）ｍＡｂ滴定を示す。カニクイザルＮＫ細胞（ＮＫバルク１６日目）を、異なる数量のＰａｎ２ＤｍＡｂ、続いて、ＰＥ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと共にインキュベートした。陽性細胞の百分率は、アイソタイプコントロール（精製マウスＩｇＧ１）により決定した。サンプルを２回繰り返した。蛍光強度の平均値＝ＭＦＩ。
【図１２】抗体ＤＦ２００およびＰａｎ２ＤｍＡｂの軽鎖可変領域および軽鎖可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列の比較アラインメントを提供する。
【図１３】抗体ＤＦ２００の重鎖可変領域を提供する。
【図１】
2008500947.tif 000006
【図２】
2008500947.tif 000007
【図３】
2008500947.tif 000008
【図４】
2008500947.tif 000009
【図５】
2008500947.tif 000010
【図６】
2008500947.tif 000011
【図７】
2008500947.tif 000012
【図８】
2008500947.tif 000013
【図９】
2008500947.tif 000014
【図１０】
2008500947.tif 000015
【図１１】
2008500947.tif 000016
【図１２】
2008500947.tif 000017
【図１３】
2008500947.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月23日(2007.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体であって、前記２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体のうちの少なくとも１つを発現するＮＫ細胞におけるＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能である、抗体。
【請求項２】
ＮＫＶＳＦ１ではない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のフラグメントである、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体ＤＦ２００またはそのフラグメントである、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、二重特異性抗体、一本鎖抗体フラグメント、または多くの異なる抗体フラグメントを含んでなる多特異性抗体から選択される抗体フラグメントである、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項６に記載の抗体。
【請求項１０】
ａ）下記（ｂ）に融合した、阻害型ＫＩＲポリペプチド上に存在するエピトープを含んでなる抗原で免疫されている非ヒト哺乳動物宿主由来のＢ細胞と、
ｂ）不死化細胞
を含んでなるハイブリドーマであって、
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合するモノクローナル抗体を産生し、前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能である、ハイブリドーマ。
【請求項１１】
モノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１を産生しない、請求項１０に記載のハイブリドーマ。
【請求項１２】
前記抗体がＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合する、請求項１０に記載のハイブリドーマ。
【請求項１３】
８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する抗体を産生する、請求項１２に記載のハイブリドーマ。
【請求項１４】
ハイブリドーマＤＦ２００より産生されるモノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する抗体を産生する、請求項１２に記載のハイブリドーマ。
【請求項１５】
ＤＦ２００である、請求項１４に記載のハイブリドーマ。
【請求項１６】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を産生させるための方法であって、ここで、前記抗体は前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、以下の工程：
ａ）非ヒト哺乳動物を阻害型ＫＩＲポリペプチドを含んでなる免疫原で免疫する工程；
ｂ）前記免疫動物から抗体を調製する工程であって、ここで、前記抗体が前記ＫＩＲポリペプチドに結合し、
ｃ）少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物と交差反応する（ｂ）の抗体を選択する工程、次いで
ｄ）前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能な（ｃ）の抗体を選択する工程を含み、
ここで、工程（ｃ）および（ｄ）の順序は場合により逆にされる、方法。
【請求項１７】
工程ｃ）またはｄ）において選択される前記抗体がＮＫＶＳＦ１ではない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）において調製される抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
免疫のために使用される阻害型ＫＩＲポリペプチドがＫＩＲ２ＤＬポリペプチドであり、工程（ｃ）において選択される抗体が少なくともＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３と交差反応する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃ）において選択される前記抗体が、８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｄ）において選択される抗体がＮＫ細胞障害性において少なくとも約５０％の増強を生じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体または抗体フラグメントがモノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
選択されるモノクローナル抗体のフラグメントを作製するさらなる工程を含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を産生させるための方法であって、ここで、前記抗体は前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、以下の工程：
ａ）ライブラリーまたはレパートリーから、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物と交差反応するモノクローナル抗体もしくは抗体フラグメントを選択する工程、次いでがｂ）前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能な（ａ）の抗体を選択する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項２５】
工程ｂ）において選択される前記抗体はＮＫＶＳＦ１ではない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｂ）において選択される抗体が、８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｂ）において選択される抗体がＮＫ細胞障害性において少なくとも５０％の増強を生じる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体がモノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
選択されるモノクローナル抗体のフラグメントを作製するさらなる工程を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を産生させるための方法であって、ここで、前記抗体は前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、以下の工程：
ａ）前記モノクローナル抗体の発現を生じる条件下で、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のハイブリドーマを培養する工程；次いで
ｂ）前記ハイブリドーマから前記モノクローナル抗体を分離する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項３１】
前記モノクローナル抗体のフラグメントを作製するさらなる工程を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体を産生させるための方法であって、ここで、前記抗体は前記少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、以下の工程：
ａ）請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のハイブリドーマから前記モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離する工程；
ｂ）ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体もしくは抗体の免疫反応性フラグメントから選択される修飾または誘導体化された抗体をコードするように、場合により前記ＤＮＡを修飾する工程；
ｃ）前記ＤＮＡまたは修飾ＤＮＡを発現ベクターに挿入する工程であって、ここで、前記発現ベクターが適切な条件下で増殖される宿主内に存在する場合、前記抗体もしくは抗体フラグメントが発現可能である工程；
ｄ）宿主細胞を前記発現ベクターでトランスフェクトする工程であって、ここで、さもなくば前記宿主細胞が免疫グロブリンタンパク質を産生しない工程；
ｅ）前記抗体または抗体フラグメントの発現を生じる条件下で、前記トランスフェクト宿主細胞を培養する工程；次いで
ｆ）前記トランスフェクト宿主細胞より産生される抗体または抗体フラグメントを単離する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項３３】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物に結合する抗体（ここで、前記抗体は前記２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体のうちの少なくとも１つを発現するＮＫ細胞に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であって、前記抗体は、患者またはＮＫ細胞を含んでなる生物学的サンプルにおいてＮＫ細胞の細胞障害性を検出可能な程度に増強するのに有効な量で存在する）；および薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでなる薬学的組成物。
【請求項３４】
免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、抗血管新生剤、およびアポトーシス誘導剤、阻害型ＫＩＲ受容体に結合し、阻害する第二抗体、抗感染剤、ターゲット剤または補助化合物から選択される治療剤をさらに含んでなる、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記免疫調節剤が、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、またはＩＦＮ−γから選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞障害性抗生物質、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキサート、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン（系薬剤）、他のビンカアルカロイド、およびそれらの誘導体またはプロドラックから選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ホルモン剤が、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、ブセレリン、タモキシフェン、トレミフェン、フルタミド、ニルタミド、シプロテロン、ビカルタミド、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール、メドロキシ、クロルマジノン、メゲストロール、他のＬＨＲＨアゴニスト、他の抗エストロゲン、他の抗アンドロゲン、他のアロマターゼ阻害剤、および他のプロゲスターゲンから選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
前記補助化合物が、フェノチアジン系薬剤、置換ベンズアミド系薬剤、抗ヒスタミン系薬剤、ブチロフェノン系薬剤、副腎皮質ステロイド、ベンゾジアゼピン系薬剤、カンナビノイド系薬剤、ゾレドロン酸、パミドロン酸、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、フィルグラスチム、レノグラスチム、ダルベポエチン、他の制吐剤、他のセロトニン拮抗薬、他のビスホスホネート系薬剤または他の造血成長因子から選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３９】
前記抗アポトーシス剤が、アンチセンスヌクレオチド配列、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたはｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ１、Ｍｃｌ−１、Ｂａｋ、Ａ１、もしくはＡ２０から選択される遺伝子の発現を阻害する小分子化学化合物である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４０】
前記抗血管新生剤が、ＶＥＧＦをコードする遺伝子、ＶＥＧＦ受容体をコードする遺伝子、ＶＥＧＦ、もしくはＶＥＧＦ受容体に対する中和抗体、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＲＮＡアプタマーまたはリボザイム；あるいはＶＥＧＦに対する拮抗特性を有するＶＥＧＦの変異体から選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４１】
阻害型ＫＩＲ受容体に結合し、阻害する前記第二抗体が、少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する共通の決定基に結合する前記抗体により結合されるエピトープとは異なる阻害型ＫＩＲ受容体のエピトープに結合する抗体であるか、またはその誘導体もしくはフラグメントである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４２】
ＮＫ細胞活性を、それを要する患者において増強する薬剤を調製するための請求項３３から４１に記載のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項４３】
前記患者が癌、別の増殖性障害、感染性疾患または免疫障害を患っている、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
前記患者が扁平上皮癌、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性または急性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫；黒色腫、精上皮腫、奇形癌種、神経芽細胞腫、神経膠腫、星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経鞘腫；線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒｏｍａ）、骨肉腫、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、奇形癌種、膀胱、乳、直腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、頚部、甲状腺もしくは皮膚の他の癌腫、リンパ球系統の他の造血器腫瘍、骨髄系統の他の造血器腫瘍、間葉起源の他の腫瘍、中枢または末梢神経系の他の腫瘍、または間葉起源の他の腫瘍を患っている、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記患者がリンパ球系統の造血器腫瘍を患っている、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記腫瘍が、小細胞および大脳様細胞型のＴ細胞性前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）；Ｔ細胞型の大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄＴ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；多形性もしくは免疫芽球性サブタイプの末梢性／胸腺後段階Ｔ細胞リンパ腫；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心性（鼻部）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ１＋）大細胞型リンパ腫；腸Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球性白血病；またはリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）から選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記患者が、過形成、線維症、血管新生、乾癬、アテローム硬化症、狭窄または血管形成術後の再狭窄、および血管における平滑筋増殖により特徴付けられる他の疾患から選択される増殖性障害を患っている、請求項４２に記載の使用。
【請求項４８】
前記患者が、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−１）、２型単純ヘルペス（ＨＳＶ−２）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、RSウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルスまたはＩ型もしくは２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）から選択されるウイルスによって生じる感染性疾患を患っている、請求項４２に記載の使用。
【請求項４９】
前記患者が、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｌ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、Ｇ．バギナリス（Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）；ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）；ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；好熱性放線菌（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｒｎａ）；カンピロバクター（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、緑膿菌（Ｒａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）；淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）；Ｆ．メニンゴゼプチクム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）；Ｆ．オドラタム（Ｆ．ｏｄｏｒａｔｕｒｎ）；ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）；百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；気管支敗血症菌（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）；Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）；Ｓ．リケファシエンス（Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）；エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）；Ｐ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）；Ｐ．ブルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）；ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；Ｒ．リケッチー（Ｒ．ｆｉｃｋｅｔｔｓｆｉ）；Ｃ．シッタキ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）；Ｃ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｒｎａｔｉｓ）；結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．イントラセルラール（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｌｌｕｉｔｕｒｎ）、らい菌（Ｍ．ｌａｐｒａｅ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、アフリカ型結核菌（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．イントラセルラール（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）；Ｍ．レプレヌリアム（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｒｎｕｒｉｕｍ）；ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、他の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、他のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、他のガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、他のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、他のナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、他のフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、他のボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、他のエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、他のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、他のプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、他のリケッチア科（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）、他のクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、他のマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リ−シュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、コクジジオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、トリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）もしくはリケッチア属（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）から選択される細菌、原生動物または寄生体により生じる感染性疾患を患っている、請求項４２に記載の使用。
【請求項５０】
前記薬剤が、免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤、阻害型ＫＩＲ受容体に結合し、阻害する第二抗体、抗感染剤、ターゲット剤もしくは補助化合物から選択される適切なさらなる治療剤と組み合わせて使用されることを特徴とする使用であって、ここで、前記さらなる治療剤が、前記抗体と共に単回投与形態として、または個別の投与形態として、前記患者に投与される、請求項４２に記載の使用。
【請求項５１】
前記抗体が、毒素、検出可能な部分、もしくは固相支持体に共役または共有結合される、請求項１に記載の抗体。
【請求項５２】
生物学的サンプルにおける、表面上に阻害型ＫＩＲを有するＮＫ細胞の存在を検出する方法であって、以下の工程：
ａ）前記生物学的サンプルと請求項５１に記載の抗体とを接触させる工程、ここで、前記抗体は検出可能な部分に共役または共有結合され；次いで
ｂ）前記生物学的サンプルにおいて前記抗体の存在を検出する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項５３】
サンプルから細胞表面上に阻害型ＫＩＲを有するＮＫ細胞を精製する方法であって、以下の工程：
ａ）前記サンプルと請求項５１に記載の抗体とを、細胞表面上に阻害型ＫＩＲを有する前記ＮＫ細胞が前記抗体に結合することを可能にする条件下で、接触させる工程、ここで、前記抗体は固相支持体に共役または共有結合され；次いで
ｂ）固相支持体に共役または共有結合した前記抗体から前記結合ＮＫ細胞を溶出させる工程、
を含んでなる、方法。
【請求項５４】
少なくとも２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する共通の決定基に結合する抗体を含んでなる組成物であって、ここで、前記抗体は前記２つの異なるヒト阻害型ＫＩＲ受容体の少なくとも１つを発現するＮＫ細胞に対するＮＫ細胞の細胞障害性のＫＩＲ仲介阻害を中和することが可能であり、ここで、前記抗体はリポソームに組み入れられる、組成物。
【請求項５５】
遺伝子治療用遺伝子の送達のための核酸分子；ＮＫ細胞において遺伝子を抑制するためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｉＲＮＡの送達のための核酸分子；またはＮＫ細胞の標的化された死滅のための毒素もしくは薬物から選択されるさらなる物質が前記リポソームにさらに組み入れられる、請求項５４に記載の組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月1日(2007.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008500947000001.app
【国際調査報告】
2008500947.tif 000019
2008500947.tif 000020
2008500947.tif 000021
2008500947.tif 000022
2008500947.tif 000023