(57)【要約】  本発明は、神経変性障害を治療するための、装置、小干渉ＲＮＡ、及び方法であって、カテーテルを外科手術により移植することにより脳内の予め決定された注入部位に隣接するようにカテーテルの放出部分を留め、そして少なくとも一つの神経変性蛋白質の生産を阻害することができる少なくとも一つの物質を予め決定された用量にてカテーテルの放出部分を通して放出する工程を含む。本発明は、貴重な小干渉ＲＮＡベクター、及び神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型、２型、３型、及び／又は歯状核赤核の治療方法も提供する。
2008500049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１−２３、又はそれらの部分配列によりコードされる配列、又は神経変性疾患に関連する蛋白質をコードするＲＮＡの相補鎖にハイブリダイズ可能な塩基配列を含む、小干渉ＲＮＡ。
【請求項２】
蛋白質コーディングＲＮＡ配列の分割を誘導するための、神経変性疾患に関連した蛋白質をコードするＲＮＡ配列にハイブリダイズ可能なＲＮＡ配列を含む小干渉ＲＮＡ。
【請求項３】
蛋白質コーディングＲＮＡ配列の分割を誘導するための、神経変性疾患に関連した蛋白質をコードするＲＮＡ配列にハイブリダイズ可能なＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含む小干渉ＲＮＡ発現配列。
【請求項４】
神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型、脊髄小脳変形症２型、マシャド−ジョゼフ病としても知られる脊髄小脳変形症３型、及びＤＲＰＬＡとしても知られる歯状核赤核のいずれかである、請求項１乃至３のいずれか１項記載の小干渉ＲＮＡ。
【請求項５】
小干渉ＲＮＡが、アルファシヌクレインのｍＲＮＡ、又はベータアミロイド分割酵素１型、又はＢＡＣＥ１のｍＲＮＡ、又はハンチンチン蛋白質のコードを含むＩＴ１５遺伝子からのｍＲＮＡ転写物、又はアタキシン１蛋白質のコードを含むＳＣＡ１遺伝子からのｍＲＮＡ転写物、又はアタキシン２蛋白質のコードを含むＳＣＡ２遺伝子からのｍＲＮＡ転写物、又はマシャド−ジョゼフ蛋白質としても知られるアタキシン３蛋白質のコードを含むＳＣＡ３遺伝子からのｍＲＮＡ転写物、又はアトロピン１蛋白質のコードを含むＤＲＰＬＡ遺伝子からのｍＲＮＡ転写物に相補である、請求項１乃至３のいずれか１項記載の小干渉ＲＮＡ。
【請求項６】
配列番号２４−４０、又はそれらの部分配列によりコードされる配列、又は配列番号２４−４０によりコードされるＲＮＡ配列の相補鎖に付加的にハイブリダイズ可能なＲＮＡ配列を含む小干渉ＲＮＡ。
【請求項７】
配列番号４１−５３、又はそれらの部分配列によりコードされる配列、又は配列番号２４−４０によりコードされるＲＮＡ配列の相補鎖に付加的にハイブリダイズ可能なＲＮＡ配列を含む小干渉ＲＮＡ。
【請求項８】
ニューロン内の蛋白質の発現又は生産を当該蛋白質の生産の発現を低下させる小干渉ＲＮＡの頭蓋内デリバリーにより変調することを含む方法により神経変性障害を治療するための薬学組成物の製造のための、薬学上受容可能な担体中の小干渉ＲＮＡの使用。
【請求項９】
治療における使用のための請求項１乃至７のいずれか１項記載の小干渉ＲＮＡ。
【請求項１０】
ニューロン内の蛋白質の発現又は生産を当該蛋白質の生産の発現を低下させる小干渉ＲＮＡの頭蓋内デリバリーにより変調することを含む方法により神経変性障害を治療するための薬学組成物の製造のための、薬学上受容可能な担体中の請求項１乃至７のいずれか１項記載の小干渉ＲＮＡの使用。
【請求項１１】
工程：
頭蓋内アクセスデリバリー装置を外科手術により移植し；そして
脳内の予め決定された部位へ小干渉ＲＮＡ及び／又は小干渉ＲＮＡをコードするベクターを注入すること
を含む方法による、脳内の位置へ小干渉ＲＮＡをデリバリーするための薬学組成物の製造のための小干渉ＲＮＡ及び／又は小干渉ＲＮＡをコードするベクターの使用。
【請求項１２】
神経変性疾患の少なくとも一つの特性が低下するか、又はその進行が遅くされるか又は停止する、請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１３】
神経変性障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型、脊髄小脳変形症２型、マシャド−ジョゼフ病としても知られる脊髄小脳変形症３型、及びＤＲＰＬＡとしても知られる歯状核赤核である、請求項１１又は１２記載の使用。
【請求項１４】
脳内の予め決定された部位が、黒質、又はマイネルト基底核又は大脳皮質又は海馬、又は尾状核、果核、又は線条体、又は歯状核、栓状核、淡蒼球核（ｇｌｏｂｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ）、又は室頂核（集合的には深部小脳核として知られる）、又は小脳皮質、又は視床下核である、請求項１１又は１２記載の使用。
【請求項１５】
小干渉ＲＮＡが請求項１乃至７のいずれか１項記載のＲＮＡである、請求項１１又は１２記載の使用。
【請求項１６】
小干渉ＲＮＡがデリバリーベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス、又はＡＡＶ、アデノウイルス、又はヘルペスシンプレックスウイルス、又はＨＳＶ、又はレンチウイルス、又はＤＮＡプラスミドによりデリバリーされる、請求項１１又は１２記載の使用。
【請求項１７】
ＤＮＡプラスミドがリポソーム化合物又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合体形成される、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
脳内の予め決定された部位に注入された小干渉ＲＮＡ及び／又は小干渉ＲＮＡをコードするベクターが配列番号２４−４０からコードされる一つ又はそれより多い配列を含む、請求項１１又は１２記載の使用。
【請求項１９】
神経変性疾患の少なくとも一つの特性が低下するか、又はその進行が遅くされるか又は停止する、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１８又は１９記載の使用。
【請求項２１】
脳内の予め決定された部位が海馬である、請求項１８又は１９記載の使用。
【請求項２２】
脳内の予め決定された部位に注入された小干渉ＲＮＡ及び／又は小干渉ＲＮＡをコードするベクターが配列番号４１−５３からコードされる一つ又はそれより多い配列を含む、請求項１１又は１２記載の使用。
【請求項２３】
神経変性疾患の少なくとも一つの特性が低下するか、又はその進行が遅くされるか又は停止する、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
神経変性疾患がハンチントン病である、請求項２２又は２３記載の使用。
【請求項２５】
脳内の予め決定された部位が、尾状核、果核、又は線条体である、請求項２２又は２３記載の使用。
【請求項２６】
頭蓋内アクセス装置；
脳内の予め決定された位置に局在化させるためのマッピング手段；及び
頭蓋内アクセス装置から脳の位置へ小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡをコードするベクターをデリバリーするために適合されたデリバリー手段
を含む、神経変性障害のための医学装置。
【請求項２７】
頭蓋内アクセス装置が頭蓋内カテーテル又は頭蓋内アクセスポートである、請求項２６記載の医学装置。
【請求項２８】
頭蓋内アクセスデリバリー装置が頭蓋内カテーテルの近位エンドにカップリングされた頭蓋内アクセスポートである、請求項２７記載の医学装置。
【請求項２９】
デリバリー手段が頭蓋内アクセスポートに注射するために適合された外部シリンジである、請求項２６記載の医学装置。
【請求項３０】
デリバリー手段が注入ポンプ、特に電気機械的ポンプ又は浸透圧ポンプである、請求項２６記載の医学装置。
【請求項３１】
ポンプが脳外に移植されるように適合されるか、又はポンプが頭蓋内カテーテルの近位エンドにカップリングされている、請求項３０記載の医学装置。
【請求項３２】
ポンプが、頭蓋内カテーテルの放出部分によりポンプから小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡをコードするベクターを予め決定された用量にてデリバリーするのに適合されている、請求項３０又は３１記載の医学装置。
【請求項３３】
少なくとも一つの基質によりポンプがリフレッシュされるようにポンプが適合されている、請求項３０乃至３２のいずれか１項記載の医学装置。
【請求項３４】
頭蓋内アクセス装置；
脳内の予め決定された位置に局在化させるためのマッピング手段；及び
デリバリー可能な量の小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡをコードするベクター；及び
頭蓋内アクセス装置から脳の位置へ小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡをコードするベクターをデリバリーするためのデリバリー手段
を含む、神経変性障害のための医学システム。
【請求項３５】
神経変性障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型、脊髄小脳変形症２型、マシャド−ジョゼフ病としても知られる脊髄小脳変形症３型、及びＤＲＰＬＡとしても知られる歯状核赤核のいずれかである、請求項３４記載の医学システム。
【請求項３６】
予め決定された部位が、黒質、又はマイネルト基底核又は大脳皮質又は海馬、又は尾状核、果核、又は線条体、又は歯状核、栓状核、淡蒼球核（ｇｌｏｂｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ）、又は室頂核（集合的には深部小脳核として知られる）、又は小脳皮質、又は視床下核である、請求項３４記載の医学システム。
【請求項３７】
小干渉ＲＮＡが請求項１乃至７のいずれか１項記載のＲＮＡである、請求項３４記載の医学システム。
【請求項３８】
頭蓋内アクセス装置；
脳内の予め決定された位置に局在化させるためのマッピング手段；及び
配列番号２４−４０の一つ又はそれより多い配列からコードされる、デリバリー可能な量の小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡをコードするベクター；及び
頭蓋内アクセス装置から脳の位置へ小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡをコードするベクターをデリバリーするためのデリバリー手段
を含む、神経変性障害のための、請求項３４記載の医学システム。
【請求項３９】
神経変性障害がアルツハイマー病である、請求項３８記載の医学システム。
【請求項４０】
頭蓋内アクセス装置；
脳内の予め決定された位置に局在化させるためのマッピング手段；及び
配列番号４１−５３の一つ又はそれより多い配列からコードされる、デリバリー可能な量の小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡをコードするベクター；及び
頭蓋内アクセス装置から脳の位置へ小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡをコードするベクターをデリバリーするためのデリバリー手段
を含む、神経変性障害のための、請求項３４記載の医学システム。
【請求項４１】
神経変性障害がハンチントン病である、請求項４０記載の医学システム。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
この発明は、神経変性障害を治療するための、小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターの脳注入（ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）による、装置、システム、及び方法に関する。
発明の背景
この発明は、神経変性障害の発生と進行を阻害するか又は停止させるための、脳内の標的化部位への小干渉ＲＮＡのデリバリーのための新規な装置、システム、及び方法に関する。いくつかの神経変性障害、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型、２型、及び３型、及び歯状核赤核（ＤＲＬＰＡ）に関しては、疾患の全体的病理進行に関与する蛋白質が同定されている。これらの神経変性疾患の治療法は現在存在しない。これらの疾患は、衰弱を進行させ、ほとんどが最終的には死に至る。
【０００２】
これらの「神経変性疾患（特にアルツハイマー病及びパーキンソン病）のさらなる問題は、それらの罹患率が増加し続けていることであり、即ち、重大な公衆の健康問題を引き起こす。最近の研究は、これらの疾患各々の病理における主要な因子として、それぞれ、アルファシヌクレイン（パーキンソン病）、ベータアミロイド分割酵素１（ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む））（アルツハイマー病）、ハンチンチン（ハンチントン病）、及びアタキシン１（脊髄小脳変形症１型）に焦点が絞られている。
【０００３】
パーキンソン病及びアルツハイマー病における神経変性のプロセスは、シナプスの損傷及びアストログリオシスを伴う選択された神経細胞集団の広範囲な損失により特徴付けられる。アルツハイマー病の病理学上の顕著な特徴は、アミロイドプラークの形成、神経繊維のもつれ及び神経網スレッド（ｎｅｕｒｏｐｉｌ  ｔｈｒｅａｄ）の形成を含み；パーキンソン病の病理学上の顕著な特徴は、レビ小体と呼ばれる神経内封入物の形成及び黒質内のドーパミン作用性のニューロンの損失を含む。細胞の機能不全と細胞死を誘発する機構は不明であるが、一般的な考察は神経の変性が特定のニューロンの細胞蛋白質、例えば、アルファシヌクレイン（パーキンソン病）及びアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）（アルツハイマー病−ベータアミロイドへＢＡＣＥ１によりプロセシングを受ける（そのさまざまなバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む））の蓄積に続く障害性作用によりもたらされるということである。
【０００４】
アルファシヌクレインはパーキンソン病において影響を及ぼすが、なぜならばそれがレビ小体において豊富に見いだされ、トランスジェニックマウス内でのその過剰発現がパーキンソン病様の病理を導き、そしてこの分子内の変異が家族性パーキンソン病に関連するからである。アルファシヌクレインはベータ及びガンマシヌクレインを含む大きなファミリーの分子に属し、１４０アミノ酸の非アミロイドシナプス蛋白質であり、アミロイドプラークに見いだされる３５アミノ酸の非アミロイド成分蛋白質の前駆体である。
【０００５】
アルツハイマー病は、知力の低下、記憶喪失、錯乱及び失見当により特徴付けされる脳の進行性の変性障害である。この病理に寄与する細胞機構のうち２種類の原繊維（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ）蛋白質が脳内に沈着する：ポリマー化されたｔａｕ蛋白質から構成される細胞内神経原繊維のもつれ、及び主としてベータアミロイドから構成される豊富な細胞外フィブリル（ｆｉｂｒｉｌｓ）。ベータアミロイドはＡｂｅｔａとしても知られており、ベータ及びガンマのセクレターゼ分割部位においてアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）の蛋白質分解プロセシングにより生じて、２つの主要な形態のＡｂｅｔａ（Ａｂｅｔａ４０及びＡｂｅｔａ４２）の細胞障害性及びアミロイド形成能力を生じさせる。即ち、Ａｂｅｔａのプラーク生産形態のアミロイドへのプロセシングを阻止することは、この疾患を抑制するか又は阻止する臨床上の標的であるＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）を作る疾患の形成及び進行に決定的に影響するかもしれない。類似の報告は、プレセニリンが異常なプロセシングを再度指図する（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）候補の標的であることを示唆する。
【０００６】
ハンチントン病は、致死性で遺伝性の神経変性障害であり、不随意の「衝撃性」動作、鬱病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、及び痴呆により特徴付けられる。原因は、ＤＮＡ中のＣ，Ａ，Ｇ，Ｃ，Ａ，Ｇ，．．．Ｃ，Ａ，Ｇ，ヌクレオチドの広範囲に長いシリーズからなる単一の遺伝子内の変異であると確認された。ＣＡＧリピートは、遺伝子が生産する蛋白質をコードする遺伝子の領域内にある。即ち、結果のハンチンチン蛋白質も「拡張され（ｅｘｐａｎｄｅｄ）」、「ＣＡＧ」がコードするアミノ酸グルタミンから構成される広く長い領域を含む。簡単に言うと、ハンチントン病の原因としてこの変異が正確に位置決めされた（ｐｉｎｐｏｉｎｔｅｄ）後には、他の遺伝子内での類似のＣＡＧリピートの拡張が探索されて、多数の他の致死性で遺伝性の神経変性疾患の原因であることがわかった。これらのいわば「ポリグルタミン」疾患のリストは、今、少なくとも１１より多くのものを含み、脊髄小脳変形症１型、２型、及び３型、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ又はケネディー病）及び歯状核赤核（ＤＲＰＬＡ）を含む。拡張されたＣＡＧパリンドロームを含む特定の遺伝子は各疾患において異なるが、それが、各疾患を引き起こす脳中の拡張されたポリグルタミン蛋白質の生産物である。兆候は、一般に、若いころから（ｉｎ  ｅａｒｌｙ）中年期の成人までに出現し、そのごの１０年から１５年後に死ぬ。これらの致死性の疾患の有効な治療法は現在存在しない。
【０００７】
ニューロン中の異常な蛋白質の生産をシャットオフすることがポリグルタミン疾患において治療法となることを示唆する相当な証拠が存在する。これらの疾患の原因は、変異蛋白質による新規な機能の獲得であることが知られており、当該蛋白質のオリジナルの機能の損失はない。脊髄小脳変形症１型（ＳＣＡ１）に関するヒトの拡張されたトランス遺伝子を有するマウスは、若い成人において重度の萎縮症になる（Ｃｌａｒｋ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １７：７３８５−７３９５（１９９７））が、対応するマウスの遺伝子がノックアウトされたマウスは萎縮症にならず、そして他の主要な異常性を示さない（Ｍａｔｉｌｌａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８：５５０８−５５１６（１９９８））。異常なアタキシン１蛋白質が生成されるが細胞核に入れないように遺伝子操作されたＳＣＡ１のトランスジェニックマウスは、萎縮症を発症しない（Ｋｌｅｍｅｎｔ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９５：４１−５３（１９９８））。最後に、テトラサイクリンを投与することにより（通常は、マウス及びヒトにおいて、当該抗生物質の投与は上記疾患に効果がない）変異体ヒトトランス遺伝子が人工的に「ターンオフ」し得るように操作されたハンチントン病のトランスジェニックマウスモデルが作成された。これらのマウスが兆候を発症し始めた後で、テトラサイクリンの長期の投与による異常性蛋白質生産のシャットオフ生産がそれらの挙動において改善を導く（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０１：５７−６６（２０００））。これは、異常なハンチンチン蛋白質のヒトにおける発現の低下がハンチントン病の新たに診断された患者における進行を阻止したかもしれないというのみならず、その兆候を既に罹患している患者の生活の質を改善するかもしれないことを示唆する。
【０００８】
様々なグループが、ｓｉＲＮＡｓの有効性を最近研究している。Ｃａｌｐｅｎら（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１（２）：１７５−１８４（２００２））は、別のＣＡＧリピートを含むヒトアンドロジェン受容体遺伝子のｍＲＮＡ転写物の細胞発現を阻害するそれらの能力に関して様々な異なる二重鎖ＲＮＡｓを評定した。かれらの仕事は、ＣＡＧリピートに対してフランキング配列が二重鎖ＲＮＡｓ中に存在したときにのみ、ＣＡＧリピートを含む二重鎖ＲＮＡｓにより遺伝子特異的阻害が起こったことを見いだした。かれらは、拡張されたポリグルタミン領域による蛋白質の発現により誘導されたカスパーゼ−３活性化を、構築された二重鎖ＲＮＡｓが救済できたことを示すこともできた。Ｘｉａ，Ｍａｏら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１００６−１０１０（２００２））は、緑色蛍光蛋白質をコードするｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡｓを発現する構築された組換えアデノウイルスを用いて、融合されたポリグルタミン蛍光蛋白質を発現する、工作された神経ＰＣ１２クローン細胞のポリグルタミン（ＣＡＧ）発現の阻害を証明した。
【０００９】
特定の蛋白質を生産するｍＲＮＡ標的に対して相補な小干渉ＲＮＡのデザインと使用が、特定のｍＲＮＡｓの翻訳を阻止するための分子生物学者により採用される最近の手段である。翻訳の前に蛋白質の発現を干渉するための分子生物学者により用いられる他の手段は、アルツハイマー病（ＷＯ０１／１６３１２Ａ２を参照）及びパーキンソン病（ＷＯ９９／５０３００Ａ１及びＷＯ０１／６０７９４Ａ２を参照）の治療上の標的に対するリボザイムを用いたｍＲＮＡ配列の分割である。しかしながら、上記のいずれの特許も、神経変性疾患の局所治療が可能な様式にて脳の標的化細胞に小干渉ＲＮＡベクターを特異的に局所デリバリーする方法を開示していない。上記の特許は、小干渉ＲＮＡベクターの脳へのデリバリー又は注入のデリバリー装置又は方法の使用を開示していない。例えば、上記特許は、頭蓋内デリバリー装置による脳への小干渉ＲＮＡのデリバリー又は注入の方法を開示も示唆もしていない。
【００１０】
さらに、上記の先行技術は、脳へ小干渉ＲＮＡベクターを注入するための何の技術も開示していないし、脳への注入に際して小干渉ＲＮＡベクターがニューロンに侵入できて所望の小干渉ＲＮＡを生産でき、そして神経変性障害の病理に関与する少なくとも一つの蛋白質の生産を減らすことができるか否かを当該先行技術は開示していない。
【００１１】
先行技術は、リボザイムの直接の全身デリバリーを記載する。神経変性障害を治療するためのこのアプローチは、可能でもなければ望まれてもいないはずである。第１に、干渉ＲＮＡｓは明らかにリボザイムとは異なる。第２に、全身デリバリーされる小干渉ＲＮＡ分子は、所望の標的に到達するのに十分にインビボにおいて長く存続しないし、血液脳バリヤーを越えられそうにはない。さらに、先行技術において採られたアプローチは、脳の中で有効な質を達成するためにこの方法により投与されなければならないかもしれない大量の小干渉ＲＮＡのために、実用的ではないかもしれない。血液脳バリヤーが一時的に開いているときでさえ、血流によりデリバリーされるオリゴヌクレオチドの大多数は体内の他の器官のシステム、特に肝臓により失われるかもしれない。
【００１２】
米国特許第５，７３５，８１４号及び第６，０４２，５７９号は、ハンチントン病の治療のための薬剤の注入の使用を開示するが、これらの特許において特に特定された薬剤はニューロンの興奮のレベルを変化させることができる薬剤に属するものであって、細胞に侵入して細胞内で蛋白質の生産を変更させるように意図された薬剤を特別に同定はしない。
【００１３】
本発明は、小干渉ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態の小干渉ＲＮＡを直接にウイルスベクターを用いて脳の標的細胞にデリバリーすることにより、核酸の全身デリバリーに関係する先行技術において存在する以前の問題を解決する。脳注入の冒された領域への小干渉ＲＮＡベクターの直接のデリバリーは、デリバリーに関係する以前の障害を克服する。さらに、ウイルスベクターの使用は、標的細胞への有効な侵入及び小干渉ＲＮＡ剤の短期間及び長期間の生産を、細胞の機構を小干渉ＲＮＡ自体の生産に向けさせることにより、可能にさせる。最後に、本発明は、オフェンディング蛋白質の配列をコードするｍＲＮＡ内の特定の部位に活性な小干渉ＲＮＡ剤をあつらえることにより、唯一の標的化プロファイル及び選択性のプロファイルを提供する。
発明の概要
本発明は、神経変性障害の治療のために小干渉ＲＮＡをデリバリーするための装置、システム及び方法を提供する。
【００１４】
記載された治療の第１の対象は、パーキンソン病の治療のための治療剤として、特別にあつらえられた小干渉ＲＮＡをデリバリーすることである。パーキンソン病のための特別にあつらえられた小干渉ＲＮＡは、神経細胞（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｅｌｌ）中にて生産されるアルファシヌクレイン蛋白質の量を低下させるためにアルファシヌクレイン蛋白質のｍＲＮＡを標的とする。関連する態様において、本発明は、抗アルファシヌクレイン小干渉ＲＮＡのデリバリーのために黒質に特異的にアクセスする装置を提供する。
【００１５】
所望の治療法の第２の対象は、アルツハイマー病の治療のための治療剤として、特別にあつらえられた小干渉ＲＮＡをデリバリーすることである。アルツハイマー病のための特別にあつらえられた小干渉ＲＮＡは、神経細胞中にて生産されるＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）蛋白質の量を低下させ、それによりベータアミロイドの生産を干渉するためにＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）蛋白質のｍＲＮＡを標的とする。関連する態様において、本発明は、抗ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）小干渉ＲＮＡのデリバリーのためにマイネルト基底核及び大脳皮質に特異的にアクセスする装置を提供する。
【００１６】
所望の治療法の第３の対象は、ハンチントン病の治療のための治療剤として、特別にあつらえられた小干渉ＲＮＡをデリバリーすることである。アルツハイマー病のための特別にあつらえられた小干渉ＲＮＡは、神経細胞中にて生産されるハンチンチン蛋白質の量を低下させるためにハンチンチン蛋白質のｍＲＮＡを標的とする。関連する態様において、本発明は、抗ハンチンチン小干渉ＲＮＡのデリバリーのために尾状核及び果核（集合的には線条体として知られる）に特異的にアクセスする装置を提供する。
【００１７】
所望の治療法の第４の対象は、脊髄小脳変形症１型（ＳＣＡ１）の治療のための治療剤として、特別にあつらえられた小干渉ＲＮＡをデリバリーすることである。脊髄小脳変形症１型のための特別にあつらえられた小干渉ＲＮＡは、神経細胞中にて生産されるアタキシン１蛋白質の量を低下させるためにアタキシン１蛋白質のｍＲＮＡを標的とする。関連する態様において、本発明は、抗アタキシン１小干渉ＲＮＡのデリバリーのために、小脳の、歯状核、栓状核（ｅｂｏｌｉｆｏｒｍ  ｎｕｃｌｅｕｓ）、淡蒼球核（ｇｌｏｂｕｓ  ｎｕｃｌｅｕｓ）、及び室頂核（集合的には深部小脳核として知られる）に特異的にアクセスする装置を提供する。
【００１８】
所望の治療法の第５の対象は、脊髄小脳変形症３型（ＳＣＡ３）の治療のための治療剤として、特別にあつらえられた小干渉ＲＮＡをデリバリーすることである。脊髄小脳変形症３型のための特別にあつらえられた小干渉ＲＮＡは、神経細胞中にて生産されるアタキシン３蛋白質の量を低下させるためにアタキシン３蛋白質のｍＲＮＡを標的とする。関連する態様において、本発明は、抗アタキシン３小干渉ＲＮＡのデリバリーのために、小脳の、歯状核、栓状核、淡蒼球核、及び室頂核（集合的には深部小脳核として知られる）に特異的にアクセスする装置を提供する。
【００１９】
所望の治療法の第６の対象は、歯状核赤核（ＤＲＰＬＡ）の治療のための治療剤として、特別にあつらえられた小干渉ＲＮＡをデリバリーすることである。ＤＲＰＬＡのための特別にあつらえられた小干渉ＲＮＡは、神経細胞中にて生産されるアトロピン１蛋白質の量を低下させるためにアトロピン１蛋白質のｍＲＮＡを標的とする。関連する態様において、本発明は、抗ＤＲＰＬＡ小干渉ＲＮＡのデリバリーのために、小脳の、歯状核、栓状核、淡蒼球核、及び室頂核、（集合的には深部小脳核として知られる）、淡蒼球、及び赤核に特異的にアクセスする装置を提供する。
【００２０】
発明の目的は、独立請求項の主題による有利な範囲に対してであって、発明の好ましい態様は、従属項において特性が記載される。
本発明は、患者のケアのための短期間又は長期間の脳内の標的部位への小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター（小干渉ＲＮＡベクター）の標的化デリバリーを許容する神経変性疾患のための小干渉ＲＮＡベクター治療のためのデリバリーシステムを提供する。
【００２１】
本発明の一つの主要な態様において、小干渉ＲＮＡベクターは、小干渉ＲＮＡベクターがニューロンにより拾い上げられる（ｔａｋｅｎ  ｕｐ）か又は標的細胞の核に輸送される脳内の標的部位へ注入される。次に、小干渉ＲＮＡベクターは、宿主細胞の機構によりＲＮＡに転写されることにより、標的とされた神経変性蛋白質の生産を阻止する小干渉ＲＮＡを生産する。
【００２２】
本発明は、脳の選択された領域へ治療用の小干渉ＲＮＡベクターをデリバリーするための神経外科装置を用いる方法も提供する。特に、本発明は、小干渉ＲＮＡベクターの脳への単一のデリバリー、繰り返しのデリバリー又は長期のデリバリーのための外科移植されたカテーテルを用いる方法を提供する。冒された細胞に導入された小干渉ＲＮＡベクターは、細胞により必要な小干渉ＲＮＡの転写のための必要なＤＮＡ配列を有し、プロモーター配列、小干渉ＲＮＡ配列、及び任意に治療用小干渉ＲＮＡの規定された末端が生産されることを可能にさせるフランキング配列、及び任意にポリアデニル化シグナル配列を含む。
【００２３】
請求項１０の使用、請求項２５の装置、及び請求項３３のシステムの好ましい態様においては、移植可能なカテーテルが用いられ、そして当該カテーテルは、上記神経変性障害が診断された後であり且つ上記神経変性障害の兆候が顕在化する前又はそれらの上記神経変性障害及び顕在化の後に、移植してよい。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、従来技術の２つの問題：（１）病理的特性を有する蛋白質のニューロン内の生産により引き起こされる神経変性疾患を如何に治療するかという問題及び（２）冒されたニューロンへの治療用小干渉ＲＮＡのデリバリーの問題を同時に解決する。
【００２４】
本発明をよりよく理解するために、用語及び用語の理解の意図（ｓｃｏｐｅ）のリストを以下に提供する。
用語
「アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン３、及び／又はアトロピン−１蛋白質」は、それぞれ、アルファシヌクレイン（パーキンソン病）、及びベータアミロイド分割酵素１（ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む））（アルファ病）、ハンチンチン（ハンチントン病）、及びアタキシン１（脊髄小脳変形症１型）、アタキシン３（脊髄小脳変形症３型又はマシャド−ジョゼフ病）、及び／又は歯状核赤核（ＤＲＰＬＡ）遺伝子及び／又はヒトゲノミックＤＮＡにより発現され及び／又はコードされるアミノ酸配列を含む、蛋白質又はその変異蛋白質誘導体を意味する。
【００２５】
本明細書にて使用される「細胞」は、その通常のセンスにおいて使用され、完全な多細胞生物を意味しない。細胞は、生物中に存在してよく、ヒトであってよいが、好ましくは哺乳類起源が好ましく、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、サル（ａｐｅｓ）、モンキー、ブタ、イヌ、ネコ等である。しかしながら、小干渉ＲＮＡを生産するいくつかの工程は、原核細胞（例えば、細菌細胞）又は真核細胞（例えば、哺乳類細胞）の使用を必要とするかもしれず、そしてそれにより用語「細胞」に含まれる。
【００２６】
「相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」は、伝統的なワトソンクリック対合又は他の非伝統的な種類の何れかにより一つ又はそれより多い核酸から構成される別の分子と水素結合を形成できる一つ又はそれより多い核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）から構成される分子を意味する。
【００２７】
アルファシヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン３、及び／又はアトロピン−１に「均等な」ＤＮＡは、アルファシヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン３、及び／又はアトロピン−１蛋白質をコードするＤＮＡ又はアルファシヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン３、及び／又はアトロピン−１と類似の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡに対して相同性（一部又は全体）を有する天然に生じるＤＮＡ分子を、ヒト、齧歯類、霊長類、ウサギ、ブタ、及び微生物を含む様々な生物中に含むことを意味する。均等なＤＮＡ配列は、任意に感染性ウイルス、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に取り込んだ、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、イントロン、イントロン−エクソンジャンクション、小干渉ＲＮＡ標的部位等のような領域も含む。
【００２８】
用語「機能上均等な」は、レファレンス配列又は蛋白質に機能上類似のあらゆる誘導体を意味する。特に、用語「機能上均等な」は、ヌクレオチド塩基が生物学上の機能に対して逆作用なしに付加、欠失又は置換された誘導体を含む。
【００２９】
「遺伝子」は、ＲＮＡの生産を調節するＤＮＡの領域を意味する。機能性小干渉ＲＮＡを生産するコンテクストにおいて、この定義は、小干渉ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、非コーディング制御配列及びあらゆる含まれるイントロンを包含する必要なＤＮＡ配列情報を含む。本定義は、蛋白質をコードする追加の遺伝子が小干渉ＲＮＡをコードする遺伝子に結び付いてか（ｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）又は直列にて（ｉｎ  ｔａｎｄｅｍ  ｗｉｔｈ）機能するかもしれない可能性を排除しない。
【００３０】
用語「ベクター」は、当業界で一般に知られており、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ等を規定し、本発明のＤＮＡが挿入され得て、ＲＮＡが転写され得る、ＤＮＡ媒体として機能することができる。用語「ベクター」は、所望の核酸をデリバリーするために使用されるこれら核酸及び／又はウイルスに基づく技術の何れかを意味する。莫大な種類のベクターが存在し、そして当業界において知られている。
【００３１】
用語「発現」は、遺伝子がＲＮＡに転写されるプロセスを規定し（転写）；ＲＮＡはさらに成熟した小干渉ＲＮＡに加工されてよい。
用語「発現ベクター」は、上記のようなベクター又は媒体を規定するが、宿主中での形質転換後に挿入された配列の発現を可能にさせるようにデザインされる。クローン化された遺伝子（挿入された配列）は、通常、プロモーター配列のような調節要素配列の制御下に置かれる。クローン化された遺伝子のそのような調節配列下への配置は、しばしば、調節要素又は配列に作動可能に連結されたと言われる。
【００３２】
「プロモーター」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに直接又は間接に結合することができ、且つ下流の（３’方向）コーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域を意味する。本発明のためには、プロモーターは、その３’末端において転写開始部位により結合されて、下流に伸びる（５’方向）ことにより、バックグラウンドより大きい検出可能なレベルにおいて転写を開始するのに必要な塩基又は要素の最小の数を含む。
【００３３】
プロモーター内では、転写開始部位（Ｓ１ヌクレアーゼによるマッピングにより便利に定義される）、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に必須の蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされる。真核生物のプロモーターは、しばしば、いつもではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物のプロモーターは、−１０及び−３５コンセンサス配列を含み、転写を開始するために機能する。
【００３４】
「相同性」は、２つ又はそれより多い核酸分子のヌクレアーゼ配列が一部又は全体で同一のことを意味する。
「高度に保存された配列領域」は、標的遺伝子中の一つ又はそれより多くの領域のヌクレオチド配列が、一つの世代と他の世代とで、あるいは一つの生物系と他の生物系とで、顕著に異ならないことを意味する。
【００３５】
「阻害する」又は「阻害」は、標的遺伝子の活性又は標的遺伝子をコードするｍＲＮＡｓ又は均等なＲＮＡｓのレベルが提供された小干渉ＲＮＡの不在下で観察されるよりも低いことを意味する。好ましくは、阻害は、小干渉ＲＮＡの不在下より少なくとも１０％未満、２５％未満、５０％未満、７５％未満、８５％未満、又は９５％未満である。
【００３６】
「阻害された発現」は、アルファシヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン３、及び／又はアトロピン−１のｍＲＮＡレベルの低下、即ち、疾患又は症状の兆候をある程度緩解するための各蛋白質のレベルの低下を意味する。
【００３７】
「ＲＮＡ」は、リボ核酸、リン酸−リボース（糖）バックボーンにより接続されたリボヌクレオチドからなる分子を意味する。「リボヌクレオチド」は、グアニン、シトシン、ウラシル、又はアデニン又はいくつかのヌクレオチドとベータ−Ｄ−リボ−フラノース部分の２’位のヒドロキシル基を意味する。当業界でよく知られるとおり、遺伝子コードは、ＤＮＡ配列中ではチミジンを、そしてＲＮＡ中ではウラシルを用いる。当業者は、書かれたＤＮＡ配列を書かれたＲＮＡ配列に変換するために、又はその逆において、書かれた核酸配列中においてチミジンをウラシルに如何に置換するかを知っている。
【００３８】
「患者」は生物を意味し、外植された（ｅｘｐｌａｎｔｅｄ）細胞のドナー又はレシピエント又は細胞自身である。「患者」は、発明の核酸分子が投与され得る生物も意味する。好ましくは、患者は、哺乳類又は哺乳類細胞、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、サル、モンキー、ブタ、イヌ、ネコ、等であるか、又は移植のために使用されるこれら動物の細胞である。より好ましくは、患者はヒト又はヒト細胞である。
【００３９】
用語「シヌクレイン」は、アルファ−シヌクレイン（特に、ヒト又はマウス）又はベータ−シヌクレイン（特に、ヒト又はマウス）を意味してよい。ヒトアルファ−シヌクレインをコードする全ヌクレオチド配列は、アクセス番号ＡＦ１６３８６４（配列番号７）にて利用可能である。ヒトアルファ−シヌクレイン配列の２つのバリアントが、アクセス番号ＮＭ０００３４５４（配列番号１４）及びアクセス番号ＮＭ＿００７３０８（配列番号２３）にて利用可能である。マウスアルファ−シヌクレインはアクセス番号ＡＦ１６３８６５（配列番号１０）にて利用可能である。
【００４０】
用語「ＢＡＣＥ１」は、ベータ部位アミロイド前駆体蛋白質分割酵素タイプ１（特に、人又はマウス）を意味してよい。ＢＡＣＥ１のいくつかのバリアントは配列決定され、バリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む。いくつかの科学文献においては、ＢＡＣＥ１はＡＳＰ２及びメンパシン２（Ｍｅｍｐａｓｉｎ２）としても知られる。ヒトＢＡＣＥ１、及びそれに近縁のバリアントをコードする全ヌクレオチド配列は、アクセス番号ＮＭ＿１３８９７１（配列番号２０）、アクセス番号ＮＭ＿１３８９７２（配列番号１９）、アクセス番号ＮＭ＿１３８９７３（配列番号２１）、及びアクセス番号ＮＭ＿０１２１０４（配列番号１８）にて利用可能である。マウス相同体の配列はアクセス番号ＮＭ＿０１１７９２（配列番号２２）にて利用可能である。
【００４１】
用語「ハンチンチン」はハンチントン病遺伝子（ＩＴ−１５）（特に、ヒト又はマウス）によりコードされる蛋白質産物を意味してよい。ヒトＩＴ−１５をコードする全ヌクレオチド配列は、アクセス番号ＡＨ００３０４５（配列番号９）にて利用可能である。マウスの配列はアクセス番号Ｕ２４２３３（配列番号１２）にて利用可能である。
【００４２】
用語「アタキシン１」は、脊髄小脳変形症１型遺伝子（特に、ヒト又はマウス）によりコードされる蛋白質産物を意味してよい。ヒトＳＣＡ−１をコードする全ヌクレオチド配列は、アクセス番号ＮＭ＿０００３３２（配列番号１５）にて利用可能である。マウスのｓｃａ１はアクセス番号ＮＭ＿００９１２４（配列番号１３）にて利用可能である。
【００４３】
用語「アタキシン３」は、脊髄小脳変形症３型遺伝子（特に、ヒト又はマウス）によりコードされる蛋白質産物を意味してよい。ヒトＳＣＡ−３をコードする全ヌクレオチド配列は、アクセス番号ＮＭ＿００４９９３（スプライスバリアント１）（配列番号１６）及びアクセス番号ＮＭ＿０３０６６０（スプライスバリアント２）（配列番号１７）にて利用可能である。（マウスの相同体の配列はまだ利用可能ではない。）
用語「アトロピン−１」は、歯状核赤核（ＤＲＰＬＡ）遺伝子（特に、ヒト又はマウス）によりコードされる蛋白質産物を意味してよい。ヒトＤＲＰＬＡをコードする全ヌクレオチド配列は、アクセス番号ＸＭ＿０３２５８８（配列番号８）にて利用可能である。マウスの配列はアクセス番号ＸＭ＿１３２８４６（配列番号１１）にて利用可能である。
【００４４】
用語「修飾」は、参照配列又は蛋白質に実質上類似の誘導体を含む。
本明細書にて使用される「核酸分子」は、ヌクレオチドを有する分子を意味する。核酸は、一本、二本、又は複数鎖であり得て、修飾されているか又は未修飾のヌクレオチド又は非ヌクレオチド又は様々な混合物及びそれらの組み合わせを含んでよい。発明による核酸分子の例は、小干渉ＲＮＡをコードする遺伝子であるが、蛋白質の生産のためのコードする、そのより一般的な手段は必ずしも有さない。
【００４５】
「小干渉ＲＮＡ」は、特定の遺伝子標的に対して基質結合領域中に相補性を有する分子であって、標的ＲＮＡを分割するように宿主細胞中で特異的に酵素をガイドするように作用する分子である。即ち、その配列の特異性及びそのＲＮＡ標的に対する相同性のために、小干渉ＲＮＡはＲＮＡ鎖の分割を誘導することができて、それにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができるが、なぜならばもはや転写されないからである。これらの相補領域は、小干渉ＲＮＡの標的ＲＮＡへの十分なハイブリダイゼーションを可能にさせ、即ち分割を許容する。１００％の相補性が生物活性にはしばしば必要であり、よって好まれるが、９０％ほどの相補性も、この発明においては有用である。本出願において記載された特定の小干渉ＲＮＡは限定することを意味せず、そして当業者は、この発明の小干渉ＲＮＡにおいて重要な全ては、一つ又はそれより多い標的核酸領域に相補な特定の基質結合部位を有することであることを認識する。対立遺伝子間を選択する場合に、長さの選択ももっとも重要な因子であるが、なぜならば、パーセント相補性及び対立遺伝子の相違を識別する能力に関与する他の因子だからである。
【００４６】
小核酸ＲＮＡ配列は、相補塩基対相互作用を通して小干渉ＲＮＡと標的ＲＮＡを結び合わせるのに十分な長さである必要がある。発明の小干渉ＲＮＡは、長さを変えてよい。小干渉ＲＮＡの長さは、好ましくは、１０ヌクレオチドより長いか又は等しく、標的ＲＮＡと安定に相互作用するのに十分な長さであり；特定すれば１５−３０ヌクレオチド；より特定すれば１５から３０ヌクレオチドの間のあらゆる整数、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０である。「十分な長さ」は、予測された条件下で意図された機能を提供するのに十分長い長さである１５ヌクレオチドより長いか又は等しいオリゴヌクレオチドを意味する。「安定に相互作用する」は、小干渉ＲＮＡと標的核酸との相互作用を意味する（例えば、生理条件下で標的内の相補ヌクレオチドと水素結合を形成することにより）。
【００４７】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、限定ではないが、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」に従う如何なるものも含むことを意味する。即ち、用語「含む」の使用は、掲載された要素が必要とされるか又は強制的であるが他の要素は任意であって存在してもしなくてもよいことを示す。
【００４８】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、限定ではないが、単語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」に従う如何なるものも含むことを意味する。即ち、句「からなる」は、掲載された要素が必要とされるか又は強制的であること、及び他の要素は存在しなくてもよいことを示す。
【００４９】
「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、当該句の後に掲載される如何なる要素も含むことを意味し、そして掲載された要素に関する開示において特定された活性又は作用を干渉しないか又は寄与しない他の要素に限定される。即ち、句「本質的にからなる」は、掲載された要素が必要とされるか又は強制的であるが、他の要素は任意であってそれらが掲載された要素の活性又は作用に影響するかしないかに依存して存在してもしなくてもよいことを示す。
【００５０】
本発明は、ポリグルタミン疾患（例えば、ハンチントン病及び脊髄小脳変形症１型）、パーキンソン病及びアルツハイマー病を、疾患誘導蛋白質又は疾患悪化蛋白質の発現を沈黙化するためにデザインされて、一つ又はそれより多い移植された頭蓋内カテーテルによりデリバリーされる、小干渉ＲＮＡをコードするベクターの頭蓋内デリバリーにより治療するための手段及びツールを提供する。特に、発明は、（１）ハンチンチン蛋白質の発現を沈黙化するようにデザインされた小干渉ＲＮＡをコードするベクターの頭蓋内デリバリーによりハンチントン病を治療する方法；（２）アタキシン１蛋白質の発現を沈黙化するようにデザインされた小干渉ＲＮＡをコードするベクターの頭蓋内デリバリーにより脊髄小脳変形症１型を治療する方法；（３）アルファ−シヌクレイン蛋白質の発現を沈黙化するようにデザインされた小干渉ＲＮＡをコードするベクターの頭蓋内デリバリーによりパーキンソン病を治療する方法；及び（４）ベータ−アミロイド分割酵素１（ＢＡＣＥ１）の発現を沈黙化するようにデザインされた小干渉ＲＮＡをコードするベクターの頭蓋内デリバリーによりアルツハイマー病を治療する方法である。
【００５１】
以前に示されたとおり、本明細書にて記載された小干渉ＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡ）は、１５から３０ヌクレオチドの長さの二重鎖ＲＮＡのセグメントである。それは、ＲＮＡ干渉として知られる細胞反応を誘導するために使用される。ＲＮＡ干渉においては、二重鎖ＲＮＡをダイサーと呼ばれる細胞内酵素で消化し、ｓｉＲＮＡ二重鎖を生成する。当該ｓｉＲＮＡ二重鎖は別の細胞内酵素複合体に結合して、それにより如何なるｍＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡ配列に相同（又は相補）なものも標的化するように活性化される。活性化された酵素複合体は標的化ｍＲＮＡを分割し、それを破壊し、そしてその相当する蛋白質生成物の合成を指示するために使用されることを阻止する。最近の証拠は、ＲＮＡ干渉がウイルス感染に対する防御（多くのウイルスが外来ＲＮＡを細胞へ導入する）のためのみならず、極めて基礎的なレベルにおける遺伝子制御のためでもある、古来の内在的機構であることを示唆する。ＲＮＡ干渉は、植物、昆虫、下等動物、及び哺乳類において起こることが示され、そして他の遺伝子サイレンシング技術、例えばアンチセンス又はリボザイムよりも劇的に効率よいことが見いだされた。バイオテクノロジーを用いれば、ｓｉＲＮＡは、細胞へ、侵入する二重鎖ＲＮＡウイルスからダイサーにより生産されるはずのものと類似のＲＮＡの短い二重鎖分子を導入する（又は細胞が生産するように誘導する）ことを含む。人工の誘導されたＲＮＡ干渉プロセスが、次にその点から続く。
【００５２】
小干渉ＲＮＡを患者の脳にデリバリーするために、好ましい方法は、ｓｉＲＮＡ分子自体よりもｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを脳の細胞内へ導入することになる。特定の治療用ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、（ａ）標的ｍＲＮＡの小さくて接近可能な部分に関する配列（公的なヒトゲノムデータベース内で利用可能）、及び（ｂ）ＤＮＡが細胞により転写されたときに対応するＲＮＡ配列の生産をもたらすＤＮＡを如何にして特定するかについてのよく知られた科学上の規則を知った際に、特定され得る。ＤＮＡ配列が一度特定されたなら、実験室の供給者からオーダーされた合成分子から実験室内で構築でき、そしてＤＮＡの細胞へのデリバリーのためのいくつかの別の「ベクター」の一つに標準生物学手法を用いて挿入することができる。患者の脳のニューロンにデリバリーされたなら、それらのニューロン自体が、挿入されたＤＮＡをＲＮＡに転写することにより、治療用のｓｉＲＮＡになるＲＮＡを生産することになる。結果は、細胞自身が標的化遺伝子を沈黙化するｓｉＲＮＡを生産する、ということになる。結果は、細胞により生産された標的化蛋白質の量の低下になる。
小干渉ＲＮＡ及び小干渉ＲＮＡベクター
本発明によれば、冒された細胞内で生産された特定のｍＲＮＡに対する小干渉ＲＮＡがニューロン内の疾患に関連する蛋白質の生産を阻止する。本発明によれば、標的細胞に小干渉ＲＮＡをデリバリーするようにデザインされた特別にあつらえられたベクターの使用である。デザインされた小干渉ＲＮＡの成功は、神経変性疾患を治療するための脳の標的化された細胞へのそれらのデリバリーの成功に基づいて予測される。
【００５３】
小干渉ＲＮＡはヒト細胞へ特定のｍＲＮＡ分子を標的化可能であることが示された。ヒト細胞をトランスフェクトし、そして標的ＲＮＡの分割を誘導してコードされた蛋白質の生産を妨害する小干渉ＲＮＡを生産するための、小干渉ＲＮＡを構築することができる。
【００５４】
本発明の小干渉ＲＮＡベクターは、神経病原蛋白質自体の生産を抑圧するか、又は神経病原蛋白質の生産又はプロセシングに関与する蛋白質の生産を抑圧することにより、病原性蛋白質の生産を阻止する。治療剤の患者への繰り返しの投与は、患者の生活の質を改善するために十分多い数のニューロンの変化を成し遂げることが必要かもしれない。個々のニューロン内では、しかしながら、治療上の利益を提供するに十分な変化は長年にわたる。神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は脊髄小脳変形症１型に冒された多くの患者の絶望的な状況は、治療からの利益が治療のデリバリーと投与の危険よりも勝るような強い見込みを提供する他の治療剤及び投与の経路により神経病原性蛋白質の生産のいくらかの低下を成し遂げることは可能かもしれないが、ニューロンのインビボにおける直接のトランスフェクションを含む成功した治療法の開発は、小干渉ＲＮＡベクターの標的細胞へのデリバリーに基づいた最良のアプローチを提供するかもしれない。
【００５５】
脳内のニューロンへの外来のＤＮＡのデリバリーのための好ましいベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、例えば組換えアデノ随伴ウイルス血清型２又は組換えアデノ随伴ウイルス血清型５である。あるいは、他のウイルスベクター、例えば、ヘルペスシンプレックスウイルスを外来ＤＮＡの中枢神経系ニューロンへのデリバリーに使用してよい。非ウイルスベクター、例えば、単独でデリバリーされるか又はリポソーム化合物又はポリエチレンイミンと共に複合体形成されるプラスミドＤＮＡを用いて脳内のニューロンへ外来ＤＮＡをデリバリーされることも可能である。
【００５６】
本明細書に例示された抗−アタキシン１小干渉ＲＮＡ、抗−ＢＡＣＥ１小干渉ＲＮＡ、及び抗−ハンチンチン小干渉ＲＮＡ、並びに神経変性疾患を治療するための他の小干渉ＲＮＡは、発明の態様の当然のいくつかの例（ｊｕｓｔ  ｂｕｔ  ｓｏｍｅ  ｅｘａｍｐｌｅｓ）である。神経科学において経験をした者には知られている、神経外科手法を動物と共に用いる実験は、候補の小干渉ＲＮＡを同定するために使用することができる。ｍＲＮＡ及びこれらの経験的な方法により同定された対応する小干渉ＲＮＡの標的部位は、主題の神経変性疾患の患者に投与されたときに多大な治療効果を導くものになる。
【００５７】
本発明の核酸分子に関して、小干渉ＲＮＡは、実際の蛋白質コーディング配列内か又は５’非翻訳領域あるいは３’非翻訳領域内の何れかにおいて、標的蛋白質の生産をコードするｍＲＮＡ配列内の相補配列を標的とする。ハイブリダイゼーションの後に、ｓｉＲＮＡによりガイドされた宿主の酵素がｍＲＮＡ配列を分割することができる。パーフェクトか又は高度の相補性が、小干渉ＲＮＡが有効になるのには必要である。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対）を形成できる核酸分子内の連続する残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補性）。「パーフェクトの相補性」は、核酸配列の連続する残基全てが第２の核酸配列中の連続する残基の同じ数と水素結合することを意味する。しかしながら、ｓｉＲＮＡ配列中の単一のミスマッチ又は塩基置換は小干渉ＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を実質上低下させ得ることに注目するべきである。
【００５８】
アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン３及び／又はアトロピン−１のＲＮＡｓ内の特定の部位を標的とする小干渉ＲＮＡは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型、脊髄小脳変形症３型及び／又は歯状核赤核を細胞又は組織中で治療するための新規な治療上のアプローチを代表する。
【００５９】
本発明の好ましい態様において、小干渉ＲＮＡは、１５から３０ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、核酸分子は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０である。好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ配列の長さは、１９−３０塩基対の間であり得て、より好ましくは、２１から２５塩基対の間であり、そしてより好ましくは、２１から２３塩基対の間であり得る。
【００６０】
好ましい態様において、発明は、所望の標的のＲＮＡに関して高い程度の特異性を呈する、核酸に基づく遺伝子阻害剤のクラスを生成するための方法を提供する。例えば、小干渉ＲＮＡは、好ましくは、アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン３及び／又はアトロピン−１のＲＮＡをコードする標的ＲＮＡの高保存配列領域を標的とし、疾患又は症状の特異的な処置が発明の一つ又はいくつかの核酸分子に提供され得るようにする。さらに、一般には、アデニン塩基の対（ＡＡ）で始まる標的配列内の領域を同定することにより（実施例を参照）、干渉ＲＮＡ配列が選択される。ｓｉＲＮＡｓは適切な転写酵素又は発現ベクターを用いてインビトロ又はインビボにおいて構築することができる。
【００６１】
ｓｉＲＮＡｓは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いてインビトロにおいて構築することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、サイレンサーｓｉＲＮＡ内に含まれるＴ７プロモーターのプライマーの５’エンドに相補な８塩基の配列を含むように構築することができる（アンビオンコンストラクションキット１６２０）。各遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを供給されたＴ７プロモータープライマーにアニールさせ、そして、クレノー断片によるフィルイン反応がＲＮＡへの転写のための完全長ＤＮＡ鋳型を生成する。インビトロ転写反応により、２つのインビトロ転写されたＲＮＡｓ（一方が他方に対してアンチセンス）が生成され、そして二重鎖ＲＮＡを作成するために互いにハイブリダイズされる。二重鎖ＲＮＡ産物はＤＮａｓｅ（ＤＮＡ転写鋳型を除去するため）及びＲＮａｓｅ（二重鎖ＲＮＡのエンドをポリッシュするため）により処理されて、カラム精製されることにより、細胞内にデリバリーされて試験できるｓｉＲＮＡが提供される。
【００６２】
哺乳類細胞内でｓｉＲＮＡｓを発現するｓｉＲＮＡベクターの構築は、一般には、ｓｉＲＮＡの構造を模した短いヘアピンＲＮＡの発現を推進するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いる。このヘアピンをコードする挿入物は、短いスペーサー配列により分離された２つのインバーテッドリピートを有するようにデザインされる。一つのインバーテッドリピートは、ｓｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡに相補性である。３’エンドに付加された６つの連続するチミジンの糸は、ｐｏｌ  ＩＩＩ転写鋳型部位として機能する。細胞内部に入ったら、当該ベクターは構成的にヘアピンＲＮＡを発現する。ヘアピンＲＮＡは標的遺伝子の発現のサイレンシングを誘導するｓｉＲＮＡに加工されて、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる。
【００６３】
これまでに記載されたほとんどのｓｉＲＮＡ発現ベクターにおいては、３つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）プロモーターの内のひとつが用いられることにより、小さなヘアピンｓｉＲＮＡの発現を推進する（１−５）。これらのプロモーターは、よく特性決定されたヒト及びマウスのＵ６プロモーター及びヒトＨ１プロモーターを含む。ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩは哺乳類細胞において小さなＲＮＡｓを相対的に大量に発現し、そして３−６ウリジンの糸を取り込んだ際に転写を終結させるから、ｓｉＲＮＡの発現を推進するために用いられた。
【００６４】
構築された核酸分子は、必要に応じて、特定の組織又は細胞標的物へ外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙ）デリバリーされ得る。あるいは、核酸分子（例えば、小干渉ＲＮＡ）は、特定の細胞にデリバリーされる、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡウイルスベクター、及び／又はＲＮＡレトロウイルスから発現され得る。
【００６５】
標的の細胞又は組織にデリバリーされた小さな核ＲＮＡ配列は、アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン３及び／又はアトロピン−１の発現の核酸に基づく阻害剤（例えば、転写阻害剤）であって、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハイブリダイズ病、脊髄小脳変形症１型、脊髄小脳変形症３型及び／又は歯状核赤核を含む神経変性疾患及びアルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン３及び／又はアトロピン−１のレベルに関連するその他のあらゆる疾患又は症状を細胞又は組織内で阻止するのに有用である。
【００６６】
発明の核酸に基づく阻害剤は、標的の細胞又は組織に、直接加えられるか、カチオン性脂質と複合体形成されるか、リポソーム内に封入されるか、ウイルスベクター内に封入されるか、又はその他によりデリバリーされる。上記の核酸又は核酸複合体は、関連する組織へ、エクスビボ、又はインビボにて、注射、、注入ポンプ又はステントにより、バイオポリマー内のそれらの取り込みを伴うか又は伴わずに局所投与することができる。好まし態様において、核酸阻害剤は、十分な長さを有し、そして／又は、配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３に登録されたそれらの相補性基質配列と安定に相互作用する配列を含む。そのような小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の例は、アタキシン１のｍＲＮＡを抑圧するｓｉＲＮＡｓに関する配列番号に関して、配列番号：１、２、３、４においても示される（実施例１−４を参照）。そのような小干渉ＲＮＡの例は、ＢＡＣＥ１のｍＲＮＡを抑圧するｓｉＲＮＡｓに関する配列番号に関して、配列番号：２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０においても示される（実施例５も参照）。そのような小干渉ＲＮＡの例は、ハンチントンのｍＲＮＡを抑圧するｓｉＲＮＡｓに関する配列番号に関して、配列番号：４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、及び５３においても示される（実施例６も参照）。
【００６７】
別の側面において、発明は、この発明の一つ又はそれより多い核酸分子及び／又は発現ベクターを含む哺乳類細胞を提供する。一つ又はそれより多い核酸分子は、同じか又は別の部位を独立に標的としてよい。
【００６８】
本発明の別の側面においては、標的ＲＮＡ分子に相互作用して、アルファ−シヌクレイン、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン３及び／又はアトロピン−１のＲＮＡ活性を阻害する小干渉ＲＮＡ分子が、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現される。組換えベクターは、好ましくは、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。ウイルスベクターから発現された小干渉ＲＮＡは、限定ではないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、又はアデノウイルスのベクター配列に基づいて構築され得る。好ましくは、小干渉ＲＮＡを発現することができる組換えベクターが上記のようにデリバリーされて、標的細胞中で存続する。あるいは、ウイルスベクターは、小干渉ＲＮＡの一時的な発現を提供するものを使用してよい。そのようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与されてよい。一度発現されたら、小干渉ＲＮＡが標的ＲＮＡに結合して、宿主の機構の使用を通して、その発現を、そしてそれによりその機能を阻害する。
【００６９】
本発明の核酸分子は、個別に、又は他のドラッグと組み合わせるか又は共に用いられることにより、上で論じられた疾患又は症状を治療することができる。例えば、アルファ−シヌクレイン（パーキンソン病）、及びベータ−分割酵素（アルツハイマー病）、ハンチンチン（ハンチントン病）、及びアタキシン１（脊髄小脳変形症）に関連した疾患又は症状を治療するためには、当業者には明らかなとおり、治療のために適した条件下で一つ又はそれより多くのドラッグを個別にか又は組み合わせるかにより、患者を治療してよいか、又は他の適切な細胞を処置してよい。
【００７０】
さらなる態様において、記載された小干渉ＲＮＡは、上で論じられた症状又は疾患を治療するために他の公知の処置法と組み合わせて使用することができる。
別の好ましい態様において、発明は、核酸に基づく阻害剤（例えば、小干渉ＲＮＡ）及びパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型、脊髄小脳変形症３型、及び歯状核赤核の進行及び／又は持続に関与する蛋白質をコードするＲＮＡ（例えば、ＢＡＣＥ１（そのバリアント、例えばバリアントＡ，Ｂ，Ｃ，及びＤを含む）、ハンチンチン、アタキシン１、アタキシン３及び／又はアトロピン−１）の発現をダウン制御するか又は阻害するためのそれらの使用方法を提供する。
【００７１】
本発明は、公知の真核プロモーターから細胞内で発現され得る核酸分子も提供する（例えば、Ｉｚａｎｔ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，−２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８３，３９９；Ｓｃａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５３１−；Ｏｊｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２２５９；Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５，これらの文献全てはそれらの全体を引用により本明細書に編入する）。当業者は、如何なる核酸も真核細胞において適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現できることを十分に理解している。そのような核酸の活性は、リボザイムにより初期転写物からのそれらの放出により増加させることができる（Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ  ＷＯ  ９３／２３５６９，及びＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ  ＷＯ  ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８５６；これらの文献全てはそれらの全体を引用により本明細書に編入する）。
【００７２】
発明の別の側面においては、本発明のＲＮＡ分子が、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写ユニット（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５  １０を参照）から発現させる。当該組換えベクターは、好ましくは、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。小干渉ＲＮＡを発現するウイルスベクターは、限定ではないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアルファウイルスに基づいて構築することができた。
【００７３】
一つの側面において、発明は、本発明の核酸分子の少なくとも一つの機能性セグメントをコードする核酸を含む発現ベクターを特徴とする。本発明の核酸分子をコードする核酸配列は、その核酸分子の発現を許容する様式にて作動可能なように連結される。
【００７４】
別の側面において、発明は、ａ）転写開始領域（例えば、真核ｐｏｌ  Ｉ，ＩＩ又はＩＩＩ開始領域）；ｂ）本発明の核酸因子（ａｇｅｎｔ）少なくとも一つをコードする核酸配列；及びｃ）転写終結領域（例えば、真核ｐｏｌ  Ｉ，ＩＩ又はＩＩＩ終結領域）を含む発現ベクターを特徴とし、上記配列が核酸分子の発現及び／又はデリバリーを許容する様式にて、上記開始領域及び上記終結領域に作動可能に連結されている。
【００７５】
核酸分子配列の転写は、当業界で知られており認識されているとおり、真核ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ），ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ），又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のプロモーターにより推進される。これらの文献の全ては、本明細書に引用により編入される。幾人かの研究者は、ＲＮＡ分子がそのようなプロモーターから発現できて、哺乳類において機能し得ることを証明した（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０，６３４０−４：Ｌ’Ｈｕｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＥＭＢＯ  Ｊ，１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ＆  Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より特定すれば、転写ユニット、例えば、Ｕ６小核（ｓｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものが、細胞中で小干渉ＲＮＡのような所望のＲＮＡ分子を高濃度で生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｃｏｕｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，前出；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，米国特許第５，６２４，８０３号；Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４，４５；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９６１１８７３６；これらの文献全てはそれらの全体を引用により本明細書に編入する）。上記の小干渉ＲＮＡ転写ユニットは、哺乳類細胞への導入のために様々なベクターに取り込むことができ、限定ではないが、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクター）、又はウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルス又はアルファウイルスベクター）を含む（総説に関しては、Ｃｏｕｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６前出を参照）。
【００７６】
疾患、脊髄小脳変形症１型のための小干渉ＲＮＡに基づく治療法を用いてアタキシン１のｍＲＮＡの低下を標的とすることは、しかし、発明の一つの態様であることに注目することも重要である。他の態様は、ハンチントン病の治療のための、ヒト脳の線条体に投与される抗−ハンチンチン小干渉ＲＮＡの使用、及びパーキンソン病の治療のための、ヒト脳の黒質に投与される抗−ハンチンチン小干渉ＲＮＡの使用を含む。
【００７７】
発明において治療剤として使用される小干渉ＲＮＡを構築するための例示の方法（即ち、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写及び二重鎖ＲＮＡへのアッセンブリー、又はＲＮＡのヘアピン構造をコードするＤＮＡのアデノ随伴ウイルス発現ベクター内へのクローン化）は、治療用小干渉ＲＮＡを作成するためのたった２つの可能な手段である。小干渉ＲＮＡを製造するための他のより大きなスケールのより有効な方法を用いることにより、発明の本質を変更することなしに、ヒト患者を治療するために使用される臨床グレード及び臨床グレード上の量を生じさせてよい。
【００７８】
当業者は、レミントンのファーマシューティカルサイエンス（１７版、マックパブリッシング社、イーストン、ＰＡ，１９８５）及びグッドマンとギルマンのファーマシューティカルベイシスオブセラピュティックス（８版、パーガモンプレス、エルムスフォード、ＮＹ，１９９０）として広く知られており利用可能であり、両者は引用により本明細書に編入される。
【００７９】
本発明の好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ剤又はその前駆体又はその誘導体を含む組成物が標準手法に従いヒト又は他の哺乳類へのデリバリー投与に適合された薬学組成物として製剤化される。一般には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性バッファー中の溶液である。
【００８０】
必要なら、上記組成物は、注射のための部位においてあらゆる苦痛を改善するために可溶化剤及び局所麻酔剤を含んでもよい。一般に、上記成分は、別々に又は混合されて、ユニット投薬量にて、例えば、乾燥凍結粉末又は水不含濃縮物として密封されてシールされたコンテナ、例えば、アンプル又は活性剤の量を示すにおい袋（ｓｃｈｅｔｔｅ）として供給される。組成物を注入により投与する場合、薬剤グレードの滅菌水又は塩水を含む注入ボトルにより投薬することができる。組成物を注射により投与する場合には、注射用滅菌水又は塩水のアンプルを用意することができ、成分を投与前に混合してよい。
【００８１】
静脈内投与以外の場合、組成物は、湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤をマイナーな量で含むことができる。組成物は、流体溶液、懸濁液、ゲル、ポリマー又は徐放性製剤であり得る。組成物は、当業界で知られているとおり、伝統の結合剤及び担体と製剤化することができる。製剤は、標準の担体、例えば、薬剤グレードのマニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ソディウムサッカライド、セルロース、炭酸マグネシウム、等、薬剤の製造においてよく確立された官能性を有する不活性担体を含み得る。様々なデリバリー系が知られており、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル等への封入を含む本発明の治療剤の投与に使用することができる。
【００８２】
またさらに別の好ましい態様において、小干渉ＲＮＡ又はその前駆体又は誘導体を含む治療剤は、中性又は塩形態として製剤化できる。薬学上受容可能な塩は、遊離アミノ基を用いて形成されるもの、例えば、塩化水素、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸等由来のもの、及び遊離カルボキシル基を用いて形成されるもの、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン又は類似物由来のものを含む。
【００８３】
特定の障害又は症状の治療において有効となる本発明の治療剤の量は、障害又は症状の性質に依存することになり、そして治療剤の投与においてよく確立された標準臨床技術により決定することができる。製剤において用いられる正確な用量は、投与経路、及び疾患又は障害の重度にも依存し、そして医師の判定及び患者の要求に従い決定されるべきである。頭蓋内投与のための適切な用量の範囲は、一般に、約１０３から１０１５感染ユニットのウイルスベクター／単一注射容量１から３０００マイクロリットルにてデリバリーされるマイクロリットルである。マイクロリットルあたりの追加の量の感染ユニットは、一般に、約１０、５０、１００、２００、５００、１０００、又は２０００マイクロリットルにてデリバリーされる、約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４感染ユニットウイルスベクターを含む。有効な用量は、インビトロ又はインビボ試験系に由来する用量応答曲線から外挿してよい。
【００８４】
本発明の神経変性疾患の小干渉ＲＮＡベクターの治療のためには、アクセスポート（ｐｏｒｔ）を有する複数のカテーテルを完全な治療のために所定の患者に移植することができる。好ましい態様においては、大脳（ｃｅｒｅｂｒａｌ）又は小脳の半球（ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ）あたり一つの部分及びカテーテルシステムがあり、そして恐らくはいくつかある。神経外科医によりにより移植が実施されたら、患者の神経科医は、週から月の期間にわたり小干渉ＲＮＡ発現ベクターの繰り返しの丸球注射（ｂｏｌｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）からなる治療のコースを時間をかけて治療効果を監視しながら、実施することができる。フルコースの治療のためには数カ月又は数年間、上記装置が移植されたままであり得る。治療効果の確認後に、アクセスポートを任意に外植し、そしてカテーテルをシールして廃棄するか又はさらに外植することができる。装置の材料は、磁気共鳴イメージングと干渉すべきではなく、もちろん、小干渉ＲＮＡ調製物はアクセスポート及びカテーテル材料及びあらゆる表面コーティングと適合可能でなければならない。
【００８５】
他に定義しないかぎり、本明細書において使用される化学用語及び技術用語及び命名（ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）は、発明の属する業界の人により共通に認識されるのと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学の方法等の手法は、例えば、Ｓａｍｂｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）のような参照マニュアルにおいて見いだすことができる。
【００８６】
ｓｉＲＮＡ発現プラスミド及び／又はウイルスベクターの構築において使用されるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、公知の技術を用いて実施することができる。例えば、米国特許番号４，６８３，１９５：４，６８３，２０２；４，８００，１５９；及び４，９６５，１８８を参照（３つの米国特許全ての開示は引用により本明細書に編入する）。一般に、ＰＣＲは、ハイブリダイズ条件下での核酸サンプルの処理（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ存在下）を含み、検出される特定の配列の各鎖のための一つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。合成される各プライマーの伸長産物は、２つの核酸鎖の各々に相補であり、プライマーはハイブリダイズする特定の配列の各鎖に相補である。各プライマーから伸長合成された産物は、同じプライマーを用いた伸長産物の次の合成のための鋳型としても機能し得る。十分な数の伸長産物の合成のラウンドの後に、検出されるべき配列が存在するか否かについて、サンプルを分析する。増幅された配列の検出は、電気泳動後のＤＮＡのＥｔＢｒ染色による可視化によるか、又は公知技術により検出可能な標識等を用いて実施してよい。ＰＣＲ技術に関する総説（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ，Ａｃａｄ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照）。
装置
前に記載された小干渉ＲＮＡベクターを用いて、本発明は、脳の局所を標的とするための小干渉ＲＮＡのデリバリーのための、装置、システム、及び方法も提供する。想像されたデリバリー経路は、局所脳組織に直接ＡＡＶ又は他のベクターを含む少量の流体を注射するための手段を提供する、移植された、内在する、柔組織内カテーテルの使用による。これらのカテーテルの近位エンドは、患者の頭蓋に外科手術により固定された、移植された頭蓋内アクセスポートに、又は患者の胴内に配置した移植されたドラッグポンプに、接続させてよい。
【００８７】
本発明の範囲内のデリバリー装置の例は、モデル８５０６研究装置（ミネアポリスのメドトロニック社による、ＭＮ）を含み、頭蓋内に皮下移植することができ、治療剤が脳にデリバリーされるアクセスポートを提供する。デリバリーは、定位に移植されたポリウレタンカテーテルにより起こる。モデル８５０６は図４及び５において模式的に描写される。モデル８５０６アクセスポートと共に機能し得るカテーテルの２つのモデルは、頭蓋内脳室へのデリバリーのためのメドトロニック社によるモデル８７７０脳室カテーテルであって、引用により本明細書に編入される米国特許番号６，０９３，１８０に開示されているもの、及び、脳組織自体へのデリバリーのためのメドトロニック社によるＩＰＡ１カテーテルであって、引用により本明細書に編入される米国シリアル番号０９／５４０，４４４及び０９／６２５，７５１に開示されているものを含む。後者のカテーテルは、カテーテルのパスに沿って複数の部位へ治療剤をデリバリーするために、その遠位エンドに複数の出口を有する。上記の装置に加え、本発明による小干渉ＲＮＡベクターのデリバリーは様々な装置により達成することができ、限定ではないが、米国特許番号５，７３５，８１４，５，８１４，０１４，及び６，０４２，５７９を含み、それら全ての開示は引用により本明細書に編入される。本発明の技術を用いて、当業者らは、これらの装置及び他の装置が本発明により神経変性疾患の治療のための小干渉ＲＮＡベクターのデリバリーに適しているかもしれないことを認識する。
【００８８】
一つの好ましい態様によれば、上記方法は、さらに、カテーテルの近位エンドにカップリングされたポンプを脳の外に移植し、そしてカテーテルの放出部分により予め決定された用量の少なくとも一つの小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡベクターをデリバリーするようにポンプを操作する工程を含む。さらなる態様は、少なくとも一つの小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡベクターの脳外へのポンプの供給を定期的にリフレッシュする工程をさらに含む。
【００８９】
即ち、本発明は、移植可能なポンプ又はカテーテルを用いた小干渉ＲＮＡベクターのデリバリーを含み、米国特許番号６，７３５，８１４及び６，０４２，５７９に教示されたようなものであり、そして注入システムの一部としてセンサーを用いることにより、脳へデリバリーされる小干渉ＲＮＡベクターの量を制御する物であり、米国特許番号５，８１４，０１４に教示されたようなものである。他の装置及びシステムを本発明の方法に従い使用することができ、例えば、引用により本明細書に編入される米国シリアル番号０９／８７２，６９８（２００１年６月１日出願）及び０９／８６４，６４６（２００１年５月２３日出願）に開示された装置及びシステムである。
【００９０】
要約すると、本発明は、ヒト中枢神経系に小干渉ＲＮＡベクターをデリバリーし、即ち、ニューロン内の病原性蛋白質の生産を低下させることにより神経変性疾患を治療するための方法を提供する。
【００９１】
本発明は、神経変性障害及び／又は疾患の治療のための使用に向けられ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄小脳変形症１型、２型、及び３型、及び／又は病原性蛋白質の生産により引き起こされるか又は悪化させられるあらゆる神経変性疾患、又は変異蛋白質による新規な病原性機能の獲得により引き起こされるあらゆる他の神経変性疾患を含む。
実施例
実施例１：ヒトアタキシン１のｍＲＮＡを標的とする小干渉ＲＮＡの構築
発明の態様の例として、我々は、ヒトアタキシン１のｍＲＮＡを標的とする小干渉ＲＮＡを作成した。この小干渉ＲＮＡは、ヒト細胞において、細胞培養物中でヒトアタキシン１のｍＲＮＡの量を低下させる。脊髄小脳変形症１型（ＳＣＡ１）の治療法として、これと同じ小干渉ＲＮＡ又は類似の小干渉ＲＮＡが、移植されたアクセスポート及びカテーテルを用いて患者の脳の小脳の細胞にデリバリーされる。結果は、これらの細胞中のアタキシン１蛋白質の量の低下であり、それにより患者のＳＣＡ１疾患の進行を遅くさせるか又は停止させる。
【００９２】
ヒトアタキシン１に対する小干渉ＲＮＡはヒトアタキシン１のヌクレオチド配列から構築された。ヒトアタキシン１の配列は、ＮＣＢＩにより提供される公的にアクセス可能なヌクレオチドデータベースから引き出すことができ、ＮＣＢＩアクセス番号ＮＭ＿０００３３２（配列番号１５）として引き出すことができる。アタキシン１のヒトｍＲＮＡ配列の一部は小干渉ＲＮＡ分割のための有力な部位として同定され、そしてＭＦＯＬＤ分析により一本鎖かされるとも予測された。アクセス番号ＮＭ＿０００３３２（配列番号：１５）においては、抗アタキシン１  ｓｉＲＮＡ標的の３つの対が構築された：
１．９４５から９６５の番号の部位のｍＲＮＡ配列を標的とする抗−アタキシン１  ｓｉＲＮＡ：
【００９３】
【化１】
2008500049.tif 000003
【００９４】
２．１６７１から１６９１の番号の部位のｍＲＮＡ配列を標的とする抗−アタキシン１  ｓｉＲＮＡ：
【００９５】
【化２】
2008500049.tif 000004
【００９６】
３．２７５０から２７７０の番号の部位のｍＲＮＡ配列を標的とする抗−アタキシン１  ｓｉＲＮＡ：
【００９７】
【化３】
2008500049.tif 000005
【００９８】
一連の６つのデオキシオリゴヌクレオチド断片を、デザインし、ＭＷＧバイオテック社カスタムオリゴヌクレオチド合成サービスから注文及び購入することにより、３つの標的部位を構成する６つの断片を用意した。さらに、これらのオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ構築キット（アンビオン社、カタログ番号１６２０）中に含まれるＴ７プロモータープライマーの５’エンドに相補な８塩基配列を含むように構築された。各々の特定のオリゴヌクレオチドを供給されたＴ７プロモーターにアニールして、クレノー断片によりフィルインし、ＲＮＡに転写されるための完全長のＤＮＡ鋳型を生成した。２つのインビトロで転写されたＲＮＡ（一方が他方に対するアンチセンス）をインビトロ転写反応により生成し、そして次に各々をハイブリダイズさせることにより、二重鎖ＲＮＡを作成した。二重鎖のＲＮＡ産物をＤＮａｓｅ（二重鎖ＲＮＡのエンドをポリッシュするため）で処理し、そしてカラム精製することによりｓｉＲＮＡを用意し、細胞のデリバリーされて試験された。
実施例：２ヒトアタキシン１のｍＲＮＡを標的とする小干渉ＲＮＡのデリバリー
実施例１に記載された構築されたｓｉＲＮＡ分子をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞により生産されたＲＮＡを回収し、そしてヒトアタキシン１のｍＲＮＡの量を測定するためにアッセイした。
【００９９】
図１は、ＨＥＫ２９３Ｈ細胞の培養物に関しての全ＲＮＡのマイクログラムあたりのアタキシン１のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量に関する定量性リバーストランスクリプターゼポリメラーゼ鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示す。４つの細胞集団をアッセイした。第１は、アタキシン１のｍＲＮＡ発現には知られている関係性がない「ハウスキーピング遺伝子」であるＧＡＰＤＨに対する細胞によりトランスフェクトされた２９３Ｈ細胞であった。（ＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡはアンビオン社による標準対照として、特にｓｉＲＮＡを作成して試験するための彼らの市販のキットにおいて供給された。）第２は、アタキシン１のｍＲＮＡ配列中の１６７１位のアタキシン１のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡにより一時的にトランスフェクトされた２９３Ｈ細胞であった。第３は、アタキシン１のｍＲＮＡに対するリボザイム（アタキシン１のｍＲＮＡ配列中の１３６４位にてアタキシン１のｍＲＮＡを分割する）を含むプラスミドにより一時的にトランスフェクトされた２９３Ｈ細胞であった。第４は、０９４５位におけるアタキシン１のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡにより一時的にトランスフェクトされた２９３Ｈ細胞であった。全ての細胞集団を、全細胞ＲＮＡに関して、トランスフェクションの４８時間後の時間点において同時に回収した。
【０１００】
写真に撮られたゲルにおいて、ＲＴ−ＰＣＲ反応の増幅されたＤＮＡ産物を分子サイズによりゲル電気泳動により分離し、そして強度の違うバンドとして可視化した。記載された各細胞集団を一連の平行反応を用いて各ゲルの上部又は底部のレーンのセットに示されるとおりにアッセイした。レーンの各セットは、レーンあたり２つのバンドを含む。上部のバンドは、細胞ｍＲＮＡから逆転写された内生ｃＤＮＡと競合させるために反応に加えられた公知の量のＤＮＡから増幅されたＤＮＡ産物である。所定のレーン中のバンドが同じ強度であれば、次に、オリジナル細胞サンプル中の細胞ｍＲＮＡの量は反応チューブに加えられた公知量のＤＮＡの量と等しいと推定できる。レーン全域で左から右へ、加えられた公知のＤＮＡ鎖の量が低下し、ピコグラム量にて示される。アッセイは、バンドの強度がＤＮＡ鎖に関してもっとも明るいことから「クロスオーバーする」ことによりそれより下に細胞生成物に関して明るくなるレーンのセットを探すことにより解釈されることから、ＤＮＡ鎖の量は今細胞ｍＲＮＡの量よりも低いことが示される。
【０１０１】
図１に示されるゲルにおいては、レーンの上部のセットがアタキシン１のｍＲＮＡに対するリボザイムをトランスフェクトされた細胞からである。この細胞サンプルからのバンドとＤＮＡ標準物からのバンドの比較は、これらの細胞中のアタキシン１のｍＲＮＡの量が全細胞ＲＮＡのマイクログラムあたり．５０５から．３０３ピコグラムの間であることを示す。レーンの底部のセットは、０９４５位のアタキシン１に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞からである。これらのレーンの分析は、これらの細胞中のアタキシン１のｍＲＮＡの量が全細胞ＲＮＡのマイクログラムあたり．３０３から．２０２ピコグラムの間であることを示す。
【０１０２】
図２に示されるゲルにおいては、レーンの上部のセットがＧＡＰＤＨに対する対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞からである。これらのレーンの分析は、これらの細胞中のアタキシン１のｍＲＮＡの量が全細胞ＲＮＡのマイクログラムあたり．７１１から．４００ピコグラムの間であることを示す。最後に、レーンの底部のセットは、１６７１位のアタキシン１に対する別のｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞からである。これらのレーンの分析は、これらの細胞中のアタキシン１のｍＲＮＡの量が全細胞ＲＮＡのマイクログラムあたり．４０４から．３０３ピコグラムの間であることを示す。
【０１０３】
要約したこの特別の分析の結果である。
【０１０４】
【表１】
2008500049.tif 000006
【０１０５】
これらのデータは、アタキシン１に対するＡＴ１６７１とＡＴ０９４５のｓｉＲＮＡの両方がトランスフェクションの４８時間後にこれらの細胞中でアタキシン１のｍＲＮＡの量を低下させることに有効であったこと、及び上記ｓｉＲＮＡが、この抗−アタキシン１のリボザイムよりも、アタキシン１のｍＲＮＡの低下に関してより有効であったことを示す。
【０１０６】
小干渉ＲＮＡが発明の治療剤として使用される為に構築する例示の方法（即ち、インビトロ転写及びハイブリダイゼーションを用いたオリゴヌクレオチドからのアッセンブリー）が治療用小干渉ＲＮＡを作成する唯一の可能な方法であることにも注目するべきである。他のよりスケールの大きくてより有効な小干渉ＲＮＡ製造方法を用いることにより、特許請求の範囲に記載されたとおりに発明の本質を変更することなく且つこの発明の精神及び範囲を逸脱することなしに、ヒト患者を治療するために使用される臨床グレード及び臨床量を生じさせてよい。
実施例３：小干渉ＲＮＡウイルスベクターの構築
我々は、ｓｉＲＮＡをクローン化するために選択可能なリポータープラスミドｐＡＡＶ−Ｕ６−トレーサーを構築した。（図３参照）。プラスミドｐＡＡＶ−Ｕ６−トレーサーは、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（アンビオン）の周辺にＵ６  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの周囲に、アデノ随伴ウイルスのインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）、及びＥＦ１ａプロモーター、緑色蛍光蛋白質、ゼオシンンｒ耐性、及びｐＴｒａｃｅｒ（インビトロジェン）からのＳＶ４０ポリＡを含むように構築された。遺伝子セグメントを図３に示すようにクローン化する。ｓｉＲＮＡを発現するためのオリゴヌクレオチドを、Ｕ６のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから３’方向のちょうど下流のマルチクローニング領域にクローン化する。
【０１０７】
ＨＥＫ２９３細胞にｐＡＡＶ−ｓｉＲＮＡ、ｐＨｅｌｐｅｒ，及びｐＡＡＶ−ＲＣを同時トランスフェクトすることにより、ウイルス生産細胞を作成するが、但し、ｐＡＡＶ−ＲＣとｐＨｅｌｐｅｒプラスミドは３つのプラスミドＡＡＶ生産システム（アビジェン社）の一部である。生産性２９３細胞を培養により成長させ、そして組換えウイルスの単離に用い、当該ウイルスは処理効果の評価のために細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＤＡＯＹ細胞及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞をトランスフェクトするのに使用される。
実施例４：ベータアミロイド分割酵素（ＢＡＣＥ１）を標的とするＲＮＡ干渉を用いたアルツハイマー病の治療
発明の例示的な態様として、我々は、アルツハイマー病の治療法を開発して実行した。我々は、上記疾患のトランスジェニックマウスモデルにおいてアルツハイマー病の我々の治療法を試験した。この治療法は、神経細胞による取り込みに際して、その神経細胞において生産されたベータ−アミロイド分割酵素タイプ１（ＢＡＣＥ１）のｍＲＮＡの量を低下させるｓｉＲＮＡ配列をコードするウイルスベクターを用いる。細胞中のＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの量を低下させることは、生産される酵素の量の低下をもたらし、次いでＢＡＣＥ１酵素によるアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）から分割されるベータ−アミロイド断片の量の低下をもたらす。脳中のベータ−アミロイド断片の量の低下は、アルツハイマー病がこの治療により処置される生物学上の機構である。
【０１０８】
この作業に含まれる工程は、（１）効率のための候補抗−ＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡ配列のインビトロスクリーニング、（２）抗−ＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの哺乳類の脳へのインビボデリバリーのためのウイルスベクターの構築、（３）ベクターのマウスへの神経外科的投与、（４）処置の効果を評価するためのマウスの挙動の試験、及び（５）処置の効果を評価するためのマウスの脳組織の試験を含んだ。これらの工程は以下において詳細に記載される。アルツハイマー病が年齢に関連する異常であるため、これらのマウスにおける処置の評価はマウスが老齢に達するほど進行する（ｏｎ−ｇｏｉｎｇ）。
（１）インビトロの効果に関する抗−ＢＡＣＥ１のｓｉＲＮＡ配列のスクリーニング
候補の抗−ＢＡＣＥ１のｓｉＲＮＡ配列の同定：神経細胞中のＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの発現を低下させるのに有効なｓｉＲＮＡ配列を同定するために、我々は、ジェンバンクデータベースにて利用可能なＢＡＣＥ１遺伝子のヒト及びマウスのｃＤＮＡ配列を分析した（ナショナルキャンサーフォーバイオテクノロジーインフォメーション、ヒトに関してはアクセス番号ＮＭ＿０１２１０４，ＮＭ＿１３８９７１，ＮＭ＿１３８９７２，及びＮＭ＿１３８９８３、そしてマウスに関してはＮＭ＿０１１７９２）。分析は、２つの連続するアデニンヌクレオチド（ＡＡ）又はシトシンとアデニン（ＣＡ）で始まり、それら２つのヌクレオチドプラス１９の連続するヌクレオチドを含むｃＤＮＡ配列のセクションを同定することからなった。これらの候補の配列を、ナショナルキャンサーフォーバイオテクノロジーインフォメーションのウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）により提供されるＢＬＡＳＴソフトウエアプログラムを用いて、他の遺伝子の他の配列との可能な部分的な適合（ｍａｔｃｈｅｓ）に関して試験され、そして他の遺伝子への多大な部分的適合を有する配列（例えば、ＡＡ又はＣＡヌクレオチドに続く１９の連続するヌクレオチドのうちの１５より多くの適合）をさらなる考慮から外した。配列中のグアニン又はシトシン（Ｇ又はＣ）ヌクレオチドの最高の（ｅｘｔｒｅｍｅ）パーセンテージを有する候補配列（例えば、１９の連続するヌクレオチドの６５％より高いか又は３５％未満がＡ又はＴよりもＧ又はＣである）も、考慮から外した。残りの候補から、以下が実験室スクリーニングのために選択された：
【０１０９】
【表２】
2008500049.tif 000007
【０１１０】
実験室においてスクリーニングされるセットは、マウスＢＡＣＥ１配列のｃＤＮＡ内の広い位置からの候補を含むように選択された。アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいてこの治療を試験するために、このマウスで過剰発現されるヒトトランス遺伝子（アミロイド−前駆体蛋白質ＡＰＰのヒト遺伝子）ではなく、これらのトランスジェニックマウス内の天然マウスＢＡＣＥ１酵素を抑圧することにｓｉＲＮＡ配列が有効であることが必須であった。よって、ヒトＢＡＣＥ１のｃＤＮＡの相同性の量に拘わらず、マウスｃＤＮＡに相当する候補ｓｉＲＮＡ配列に優先権が与えられた。しかしながら、候補ｓｉＲＮＡ配列のいくつかは、ヒト並びにマウスのＢＡＣＥ１のｃＤＮＡに１００％一致する。特に、もっとも有効であることを我々が発見した候補であるＭＢ１７４９は、ヒト及びマウスの種にわたり１００％同一であるＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの領域を標的とし、即ち、ヒト並びにマウスに適用可能な治療用成分を構成する。
インビトロ試験のためのｓｉＲＮＡ候補の生産：我々は、Ａｍｂｉｏｎ  ＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭｓｉＲＮＡ構築キット（アンビオン社、オースチン、テキサス；カタログ番号１６２０）を用いて製造者により推奨される手法に従いカスタムＤＮＡオリゴヌクレオチド及び他の試薬からインビトロ転写によりＭＢ０８０３，ＭＢ１６６３，ＭＢ１７４９，又はＭＢ３２４９  ｓｉＲＮＡ候補に対応する二重鎖ＲＮＡを作成した。我々の特定のｓｉＲＮＡを製造するために用いられたカスタムＤＮＡオリゴヌクレオチドは、以下のとおりであったｉ。ｓｉＲＮＡ標的配列を大文字で示し、インビトロ転写方法のために必要な他のオリゴヌクレオチドは小文字で示す。
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
我々は、ダーマコン社（ラファイエット、ＣＯ）からのＤｈＭＢ０９１８，ＤｈＭＢ１１３１，ＤｈＭＢ１２３３，及びＤｈＭＢ１５０９  ｓｉＲＮＡ候補に対応する二重鎖ＲＮＡの化学合成を依頼した。この供給者が我々に製造してくれた、我々が特定した配列は、以下のとおりであった：
【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
我々は、カスタムＤＮＡオリゴヌクレオチドプラスＡｍｂｉｏｎ  ＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｉＲＮＡ発現カセットキット（アンビオン社、オースチン、テキサス；カタログ番号１６８２）を用いて製造者により推奨される手法に従いポリメラーゼ鎖反応により、ＳＥＣ０６８３，ＳＥＣ１７２２，ＳＥＣ２１６３，ＳＥＣ２４６６，又はＳＥＣ２４７３  ｓｉＲＮＡ候補に対応するヘアピンを形成するＲＮＡを細胞が転写するＤＮＡ発現カセットを作成した。我々の特定のｓｉＲＮＡ発現カセットを製造するために使用されたカスタムＤＮＡオリゴヌクレオチドは以下のとおりであった。ｓｉＲＮＡ標的配列を大文字で示し、インビトロ転写方法のために必要な他のオリゴヌクレオチドは小文字で示す。
【０１１５】
【表５】
2008500049.tif 000010
【０１１６】
神経細胞培養へのｓｉＲＮＡ候補のインビトロ適用：インビトロにおいてＢＡＣＥ１のｍＲＮＡを抑圧することにおける各抗−ＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡ候補の有効性を評価するために、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞系のマウス神経細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、カタログ番号ＣＣＬ−１３１）を、これらの細胞の標準細胞培養条件下を用いて培養した。５０−７０％コンフルエントに達したら、細胞にｓｉＲＮＡ候補の一つ、及びマウスＢＡＣＥ並びに緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のｃＤＮＡを含むプラスミドを同時トランスフェクトした。このプラスミドは、ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ１と呼ばれ、この目的のために、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ハンツビル、ＡＬ；カタログ番号ＥＭＭ１００２−７００７５７０）からのマウスＢＡＣＥのｃＤＮＡを得て、標準の分子生物学の方法を用いて、このｃＤＮＡをｐＴｒａｃｅｒＴＭ−ＣＭＶ２（インビトロジェン、カールズバッド、ＣＡ；カタログ番号Ｖ８８５−２０）に移すことにより、我々が構築した。ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ１中では、マウスＢＡＣＥのｃＤＮＡをＣＭＶプロモーターから下流のポリリンカー領域に挿入し、即ち、ＢＡＣＥのｍＲＮＡをＣＭＶプロモーターから発現する。ＧＦＰのｍＲＮＡをＥＦ−１ａ／ＥＭ７プロモーターの次のプラスミドの領域から、製造者に推奨されるとおりに、発現する。
【０１１７】
インビトロ試験を実施するために用いられた細胞トランスフェクション手法及び試薬は、ｓｉＲＮＡ候補が適用される形態（ＲＮＡ又はＤＮＡ）のために適切に変更した。インビトロ転写によるか（ＭＢ０８０３，ＭＢ１６６３，ＭＢ１７４９，ＭＢ３２４９）又は直接の化学合成により（ＤｈＭＢ０９１８，ＤｈＭＢ１１３１，ＤｈＭＢ１２３３，ＤｈＭＢ１５０９）生産されたプラスミドプラスｓｉＲＮＡ候補による細胞のトランスフェクションのため、最初に、Ｔｒａｎｓｉｔ−Ｎｅｕｒａｌトランスフェクション試薬（ミルス社、マジソン、ＷＩ；カタログ番号２１４４）中のｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ１プラスミドの混合物を、製造者の薦める手法に従い形成させた。次に、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯトランスフェクション試薬（ミルス社、カタログ番号２１５４）をＴｒａｎｓｉｔ−Ｎｅｕｒａｌ混合物に滴下して加え、そして室温において１０分間インキュベートした。次に、ｓｉＲＮＡを混合物に加え、そしてｓｉＲＮＡがＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯと複合体を形成することを許容させ、そして最終的に、細胞に滴下して加えた。全ての場合に、ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ１プラスミドの細胞培養ウエルあたりの量は、様々な条件を通して（６ウエルの培養プレートの）ウエルあたり１マイクログラムであり、そして細胞培養ウエルあたりの細胞の最終濃度は２５ナノモラーであった。
【０１１８】
ＤＮＡの形態のプラスミドプラスｓｉＲＮＡ候補による細胞のトランスフェクションに関して（サイレンサー発現カセットＳＥＣ０６８３，ＳＥＣ１７２２，ＳＥＣ２１６３，ＳＥＣ２４６６，ＳＥＣ２４７３）、方法は類似であったが、ＳｉＰｏｒｔ−ＸＰ１トランスフェクション試薬（アンビオン社、オースチン、ＴＸ；カタログ番号４５０６）を、発現カセットを構成する二重鎖ＤＮＡ  ＰＣＲ産物による細胞のトランスフェクションのために用いた。これらの場合に、アンビオン社により推奨される手法に従い、ＳｉＰｏｒｔ−ＸＰ１試薬をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）により戻された（ｒｅｄｕｃｅｄ）血清培地（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ；カタログ番号２２６００）に滴下して加え、渦巻き撹拌し、そして室温において１５分間インキュベートした。次に、ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ１プラスミドをＳｉＰｏｒｔ−ＸＰ１混合物の一つのアリコート加え、そしてｓｉＲＮＡ発現カセットＤＮＡをＳｉＰｏｒｔ−ＸＰ１混合物の別のアリコートに加えた。各アリコートを室温において１５分間インキュベートすることにより、当該ＤＮＡ分子がＳｉＰｏｒｔ−ＸＰ１試薬と複合体を形成することを許容し、次に、２つの混合物を化合して細胞に滴下して加えた。ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ１プラスミドの細胞培養ウエルあたりの量は様々な条件を通してウエルあたり１マイクログラムであり、そしてウエルあたりに加えられたｓｉＲＮＡ発現カセットＤＮＡの量はウエルあたり５００ナノグラムであった。
細胞内のＢＡＣＥ１  ｍＲＮＡレベルに対するｓｉＲＮＡ候補の効果のアッセイ：細胞内のＢＡＣＥ１  ｍＲＮＡレベルに対するｓｉＲＮＡ候補の効果を測定するため、細胞をｓｉＲＮＡとｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ１プラスミドによるトランスフェクションの４８時間から７２時間後に回収し、そして全細胞ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ；カタログ番号７４１０６）を用いて細胞溶解物から回収した。ＲＮＡをこの単離の間にＤＮａｓｅで処理し、サンプルからゲノミックＤＮａｓｅとプラスＤＮＡを排除した。当該ＲＮＡサンプルを、ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン社、ラホーヤ、ＣＡ；カタログ番号２００４２０）を用いて、製造者の指示書に従い、そしてｃＤＮＡ合成を開始するためのオリゴ−ｄＴを用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。平行のサンプルが同じプロトコルに含まれたが、逆転写酵素の含有を省略し、ゲノミック又はプロトコルＤＮＡのＰＣＲ分析への影響の欠如を評価するために使用した。
【０１１９】
次に、サンプル中のＢＡＣＥ１  ｃＤＮＡ，ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡ，及びＧＦＰ  ｃＤＮＡの相対量のリアルタイム定量性ＰＣＲ分析を実施するために、逆転写反応から得られたｃＤＮＡサンプルを使用した。様々なＤＮＡ種のアッセイを平行して同じサンプルのアッセイにて実施し、ＰＣＲ反応のための適切なＰＣＲプライマーと蛍光基質の追加の直前に分割した。全ての反応は平行してＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ３０００リアルタイムＰＣＲマシン（コルベットリサーチ社、シドニー、オーストラリア）においてＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲ  ＭｉｘのＡｍｐｅｒａｓｅ  ＵＮＧなし（アプライドシステムズフォスターシティ、ＣＡ；カタログ番号４３２４０１８）をポリメラーゼ及びヌクレオチド試薬として用いて実施した。ＧＦＰのアッセイ（トランスフェクトされた細胞にｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ１プラスミドにより導入された）はＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（キアゲン；カタログ番号２０４１４３）及び１２８塩基対の予測されるＰＣＲ産物サイズを生じる以下のカスタムＰＣＲプライマー：フォワード：５’−ＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣ−３’  リバース：５’−ＧＣＧＴＣＴＴＧＴＡＧＴＴＣＣＣＧＴＣＡ−３’を用いた。
【０１２０】
様々な細胞サンプル中のｍＲＮＡの相対量を定量するため、ｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ１によりトランスフェクトされたが如何なるｓｉＲＮＡ候補によっても処理されていない細胞のサンプルからのｃＤＮＡの希釈シリーズを用いて、ｃＤＮＡ量に対してのＰＣＲサイクルの閾値に関する標準曲線を生じさせたところ、サンプルのマイクロリットルあたり１から１００ナノグラムのｍＲＮＡの範囲であった。各ｍＲＮＡ標的（ＢＡＣＥ１，ＧＡＰＤＨ，又はＧＦＰ）に関しての標準曲線に基づいて、各遺伝子産物のｍＲＮＡのマイクロリットルあたりのナノグラムを各細胞サンプルに関して得た。最後に、細胞サンプル中のＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの量を同じサンプル中のＧＦＰのｍＲＮＡの量に対して標準化した。これらの標準化された量のＢＡＣＥ１のｍＲＮＡに関して、所定のｓｉＲＮＡ処理によりもたらされたＢＡＣＥ１のｍＲＮＡ中の未処理細胞に対する低下のパーセンテージを計算した。以下の表は一つのそのようなアッセイの結果を提供し、そして方法を例示する。
【０１２１】
【表６】
2008500049.tif 000011
【０１２２】
結果
トランスフェクトされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞中のＧＦＰのｍＲＮＡのレベルに対してのＢＡＣＥ１のｍＲＮＡレベルに関する細胞トランスフェクション及び定量性リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを少なくとも２人の人物により別個に反復した。個別のアッセイにわたり平均化された、各ｓｉＲＮＡ候補に関してのＢＡＣＥ１のｍＲＮＡ抑圧のパーセンテージの結果を以下の表に示す。
【０１２３】
【表７】
2008500049.tif 000012
【０１２４】
この表が示すとおり、１３の試験された候補のうちの８つがＢＡＣＥ１のｍＲＮＡをいくらか統計上有意な量まで抑圧し（０より高い低い結合の９５％信頼区間に基づいてｐ＜０．０５）、ＭＢ１７４９はもっとも高い抑圧を提供した。
（２）抗−ＢＡＣＥ１のｓｉＲＮＡをコードするＡＡＶベクターの開発：
ＭＢ１７４９抗−ＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡ治療をトランスジェニックマウスに処理するために、ＭＢ１７４９のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを選択した。ＡＡＶは、脳組織中の外科的注射後に齧歯類の脳にてインビボにおいて神経細胞を形質導入すること、及び形質導入された細胞内でデリバリーされたＤＮＡの長期継続する発現を生じることが知られている。形質導入された細胞内でＭＢ１７４９のｓｉＲＮＡの発現を推進するために、我々は、アンビオン社から利用可能な（カタログ番号７２０７）ｐＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ１．０−Ｕ６プラスミドにより提供されるマウスＵ６のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを選択した。我々は、以下の方法を用いて、ＡｐａＩとＥｃｏＲＩ制限部位の間にｐＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭへＲＮＡのヘアピンループ（ＭＢ１７４９の配列、ループ配列、及びＭＢ１７４９のリバース相補体からなる）をコードするＤＮＡを遺伝子操作した。
オリゴヌクレオチド濃縮を用いたｓｉＲＮＡ発現カセットの構築：ＭＢ１７４９に対応するＲＮＡのヘアピンループをコードするＤＮＡを構築するため、我々は、合成サービスから以下の４つのオリゴヌクレオチドを得た：
【０１２５】
【表８】
2008500049.tif 000013
【０１２６】
上の表において、ＢＡＣＥ１に対する有効なｓｉＲＮＡ配列に対応するオリゴヌクレオチド配列の一部に下線を引く。オリゴヌクレオチドＡＡＶのリバース相補体はオリゴヌクレオチドＣの配列内に見いだされ、そしてオリゴヌクレオチドＤの最初の４塩基を除く全てがオリゴヌクレオチドＢの３’エンドのリバース相補体であることを注目されたい。即ち、ＡとＣは互いに大きく相補性であり、そしてＢとＤは互いに大きく相補性である。
【０１２７】
ｐＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ１．０−Ｕ６へクローン化される二重鎖ＤＮＡ挿入物を構築するために、４つのオリゴヌクレオチドを水に懸濁して２５マイクロモラーの濃度にして、それらのエンドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いてリン酸化した。次に、一つのチューブにおいて、オリゴＭＢ１７４９ＡをオリゴＭＢ１７４９Ｃと混合して、そして、別のチューブにおいては、オリゴＭＢ１７４９ＢをオリゴＭＢ１７４９Ｄと混合した。混合物を摂氏６５度に５分間加熱し、そしてゆっくりと室温に冷却することにより、一本鎖突出によりこれらの相補オリゴヌクレオチドが二重鎖形態にアニールすることを誘導した。次に、オリゴＡ／ＣとオリゴＢ／Ｄを、標準分子生物学の手法を用いてＡｐａＩとＥｃｏＲＩ制限酵素消化により直鎖状化されたｐＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ１．０−Ｕ６と混合することにより、３成分のライゲーション反応を実施した。結果のライゲーション産物を細菌にクローン化し、そしてコロニーを選択することにより所望のプラスミド産物を同定したところ、以下の構築物がｐＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ１．０−Ｕ６のＡｐａＩとＥｃｏＲＩ制限部位の間に挿入されていた：
【０１２８】
【表９】
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【０１２９】
我々は、単一のセンス及びアンチセンス対よりも４つのオリゴヌクレオチドを集合させるこの戦略がＭＢ１７４９ヘパリンｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを有効にクローン化するのに必要であることを見いだした。単一のセンス及びアンチセンス鎖（例えば、ＭＢ１７４９ＡとＭＢ１７４９Ｂの配列を鎖状につなぐことにより一つの長いセンス鎖オリゴヌクレオチドを作成し、そしてＭＢ１７４９ＣとＭＢ１７４９Ｄの配列を鎖状につなぐことにより一つの長いセンス鎖オリゴヌクレオチドを作成し得るようなもの）の使用は、分子間ヘアピンを形成する傾向のある分子鎖をもたらし、二重鎖ＤＮＡにアニールしてプラスミドにライゲーションされるのを阻止する。
ＭＢ１７４９プラスミドによるＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの発現の確認：ＭＢ１７４９に相当するＲＮＡのヘアピンループをコードするｐＭＢ１７４９プラスミドが実際に細胞においてＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの量を低下させるｓｉＲＮＡを生成することを確認するために、マウスＮｅｕｒｏ２ａ神経細胞にｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅ１プラスミドとｐＭＢ１７４９プラスミドをＳｉＰｏｒｔ−ＸＰ１トランスフェクション試薬を上記の通りに用いて同時トランスフェクトした。４８時間後に、全細胞ＲＮＡをこれらの細胞から回収し、そして上記のとおりに、逆転写定量リアルタイムＰＣＲアッセイを実施するのに用いた。結果は、プラスミドｐＭＢ１７４９の細胞への適用がｐＭＢ１７４９で処理していない細胞に比較して、ＢＡＣＥ１のｍＲＮＡのレベルにおいて（上記のとおりＧＦＰのｍＲＮＡの量に関して標準化された）９４％の抑圧を生じたことを示した。これは、ＭＢ１７４９のｓｉＲＮＡをＲＮＡ形態にて細胞に適用することにより以前に得られた結果に、好適に匹敵する。
ＭＢ１７４９ウイルスベクターによるＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの発現の確認：抗−ＢＡＣＥ１のｓｉＲＮＡ治療をマウスの脳へインビボにおいて施すために、我々は、ＭＢ１７４９のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを脳のニューロンにデリバリーするための手段として主題の発明の様式にて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いた。このためのウイルスベクターの供給を得るため、我々が構築したｐＭＢ１７４９を、Ｕ６プロモーター、我々のＭＢ１７４９，及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター配列（連続して６つのチミンからなる）を、ＡＡＶインバーテッドターミナルリピートとチキンベータアクチンエンハンサーから発現された緑色蛍光蛋白質リポーター遺伝子及びＣＭＶプロモーターを含むそれらのプラスミドに移動させることを任命されたジーンディテクト社（オークランド、ニュージーランド）に提供した。我々のＭＢ１７４９発現カセット（Ｕ６プロモーター、ＭＢ１７４９構築物及びターミネーター配列）を、ＡＡＶの５’インバーテッドターミナルリピートの次であってＧＦＰ発現カセットの前に挿入した。結果のＡＡＶプラスミドは、次に、ジーンディテクトによりＡＡＶ−抗−ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９を生成するために用いられた。さらに、我々は、ＡＡＶ−対照ベクターの生産のために、ＢＡＣＥ１のｍＲＮＡ発現を抑圧することにインビボでは活性ではないことが確認されジェンバンクのあらゆる公知の遺伝子と相同でないことが確認されたＭＢ１７４９のスクランブル配列を含む別のプラスミドをジーンディテクトに提供した。
【０１３０】
結果のＡＡＶ−抗−ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９ベクターが細胞に感染するために使用されるとＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの抑圧をもたらし、そしてＡＡＶ−対照ベクターが抑圧しないことをインビトロにおいて確認するために、我々は、細胞にｐＴｒａｃｅｒＢａｃｅをトランスフェクトし、そして２４時間後に、それらにＡＡＶ−抗−ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９又はＡＡＶ対照を感染させた。２つの別々の細胞培養において、我々は、ＡＡＶ−抗−ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９がＢＡＣＥ１のｍＲＮＡの７２．８％及び５７．６％（平均、６５．２％）の低下をもたらしたこと、一方ＡＡＶ−対照ベクターは顕著な効果がなかったこと（２つの別々の培養において１６．２％と＜０％低下）を見いだした。
（３）抗−ＢＡＣＥ１のｓｉＲＮＡをコードするＡＡＶベクターのＴｇ２５７６マウスへの神経外科的投与
アルツハイマー病の受容された動物モデルはＡＰＰのヒトトランス遺伝子を過剰に発現するトランスジェニックマウスである（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。Ｔｇ２５７６トランスジェニックマウス系列は、約１０から１２月齢から始まるベータ−アミロイドを含むアミロイドプラークを発症する（Ｇａｕ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。当該プラークは、大脳皮質と海馬において特に頻繁である。それらは、容易に検出可能な１５月齢であり、そして１９月齢及びそれを超えるとより重度になる（Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。老齢のメスＴｇ２５７６マウスは、老齢のオスマウスに比べて脳中のベータ−アミロイドをより顕著に沈積する（Ｃａｌｌａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。１９月齢までに、Ｔｇ２５７６マウスはバランス、機敏性及び空間記憶の測定において行動性及び認識性の欠損を呈する（Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｒａｎｄａｓｈ，２００２）。
【０１３１】
これらの考察に基づいて、我々は、マウスＢＡＣＥ１を標的とするＭＢ１７４９  ｓｉＲＮＡをコードするＡＡＶベクターを１２月齢のメスＴｇ２５７６マウスの海馬に外科手術により注射し、そして１５月齢及びそれ以上における治療の効果に関してマウスを評価することにより、我々の発明を確認することを選択した。
パイロット注射（定位コーディネートを確認するため）：マウスのこの齢及び株におけるマウス海馬の正確な解剖学上の標的化を証明するため、そしてＡＡＶベクターからの発現を証明するために、３匹の９月齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６メスマウス（Ｔｇ２５７６トランスジェニックマウスに関してバックグラウンドの株）に、ＧＦＰリポーター遺伝子（ｒＡＶＥ−ＧＦＰ  １／２，ジーンディテクト、オークランド、ニュージーランド）を含む標準ＡＡＶベクター（ミリリットルあたり約２．３ｘ１０１２ウイルス粒子の濃度にて）を５マイクロリットル注射した。注射は、以下の定位コーディネートにおいてであり、ブレグマからのミリメートルにて表現され、−５ｍｍにおいて門歯バーを用いた：ＡＰ−２．７０，ＭＬ±３．００，ＤＶ−２．２５。注射を実施するために用いられた神経外科的手法の詳細は、本明細書においてさらに記載される。
【０１３２】
手術の１３日後に、これらのマウスを安楽死させ、塩水、次いで４％パラホルムアルデヒドにより心臓を通して（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）還流することにより、それらの器官の組織をフラッシュして固定した。脳を３０ミクロンの厚さに傍矢状（ｐａｒａｓａｇｉｔｔａｌ）平面に切断し、連続する切片を全左半球及び右半球から回収した。これらの切片に連続番号を付したが、小さい数字は半球の側面の縁に付され、大きい数字は半球のより中央のセクションに付された。
【０１３３】
図７は、このパイロット研究からのマウス番号３の左半球の脳組織セクション番号６７の３つの視野を含む。この切片は、メチルグリーンにより染色し、そして明視野及び蛍光顕微鏡ライティング条件下で写真を撮った。右上の角の明視野の写真から観察され得るとおり、針の経路はこの組織切片内で可視化され（太い矢印により示される水平のパス）、そしてアンモン角内（短い矢印、ＣＡ１，ＣＡ２，及びＣＡ３領域）の海馬の中央（門（ｈｉｌａｒ）領域、星印により示される）を正確に標的とする。即ち、この図面は、我々の定位コーディネートがマウスのこの齢及び株において海馬への注射剤を正確に標的化することを示す。
【０１３４】
図８は、切片２９（側面）から切片１２５（動物の中線近辺、矢状平面）へのこの同じマウスの左半球のいたるところの複数の脳組織切片の写真を含む。この図面は、海馬の組織の広い領域のいたるところのデリバリーされたリポーター遺伝子の発現をＡＡＶベクター血清型の１／２の単一点における注射がもたらすことを示し、切片３５から切片１０７の範囲である。これらの切片は、マウスの脳の半球の側面範囲の２１６０ミクロン（２．１６ミリメートル）に及ぶ。即ち、この図面は、我々の定位コーディネートにおけるＡＡＶベクターの注射がマウス海馬の容積の実質的な部分のいたるところにデリバリーされた遺伝物質の分布と発現をもたらし得ることを示す。
【０１３５】
神経外科的方法：我々の治療法をＴｇ２５７６マウスにデリバリーするのに使用される神経外科的方法の詳細を以下に示す。イソフルオレン吸入を用いた外科的麻酔の誘導の後に、マウスを定位フレーム中に置き、そしてその頭部を、装置に付随するイヤーバー、門歯バー及び麻酔マスクを用いて固定した（マイニューロラブ（ＭｙＮｅｕｒｏＬａｂ）、セントルイス、ＭＯ；ＢｅｎｃｈｍａｒｋＴＭ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ）。マウスの気道の開放性を確認した。頭部の下毛をクリップで留め、そしてベタジン（ｂｅｔａｄｙｎｅ）を用いて頭皮を消毒した。マウスの麻酔の深さを確認した後（即ち、尾部及び前足をつねることに応答しない）、１．０から１．５ｃｍの長さの中線の切開を矢状平面の頭蓋全体の皮膚内に行った。皮膚をマニュアルにより開き（ｒｅｔｒａｃｔｅｄ）、そして頭蓋を覆う膜組織を滅菌＃１１メスのブレードを用いてすりはがした（ｓｃｒａｐｅｄ  ａｗａｙ）。ハミルトンシリンジ（ハミルトンカンパニー、レノ、ＮＹ；モデル８８０１１）を定位フレームのシリンジホルダー内に入れ、そしてシリンジの針の先端をマウスの頭蓋のブレグマポイントに動かした；（くちばし−中央側面骨縫合線及び中線縫合線、視覚診断により同定可能）。次に、針を頭蓋の左側面上の以下の定位コーディネートへ配置する：ＡＰ＝−２．３０ｍｍ，ＭＬ＝−２．００ｍｍ。頭蓋上の対応するポイントを外科手術顕微鏡を用いて視覚で記録した。滅菌バールの先端部分を有する歯科用ドリルを用いてこの部位において頭蓋骨全体にわたりバールの穴を形成する（ｅｒｏｄｅ）。シリンジの針をブレグマポイントに再び配置し、次に、頭蓋の右半球のＡＰ＝−２．３０ｍｍ，ＭＬ＝＋２．００ｍｍに動かした。当該部位を視覚で記録し、そしてバールの穴をこの部位に作成した。
【０１３６】
バールの穴を作成したら、ハミルトンシリンジに５マイクロリットルのＡＡＶベタジンを負荷し（ＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９又はＡＡＶ−対照をミリリットルあたり１．３から３．９ｘ１０１２ゲノミック粒子）、ブレグマからＡＰ  −２．３０，ＭＬ  −２．００に配置し、次に、脳を覆う硬膜（ｄｕｒａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を針の先端が突き抜けるまでおろした。次に、針を硬膜の下１．２５ｍｍまでおろして、２分間その場に放置した。次に、５．０マイクロリットルのＡＡＶ溶液を海馬へハミルトンシリンジを用いて自動シリンジポンプを用いて１分あたり０．３３３マイクロリットルの流速で注射した。１５分間の注射の終わりに、針を２分間その場に放置した。最後に、針をゆっくりと脳から１分あたり約１ｍｍの速度で抜いた。針の先端に硬膜がなければ、この部位への注射は完了した。右半球の部位への注射を同じ様式にて処置した。両方の注射の完了後に、頭蓋全体の皮膚の切り出しを鉗子により接合し、そして皮膚を絹糸の縫合により閉じた。皮膚にアルコールを綿棒で塗り、そしてマウスを定位装置から取り出し、そして清潔な回復ケージに入れた。滅菌塩水（０．５ｍＬ）を水和作用（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）の助けを借りて背中の部位へ皮下注射し、そしてジアゼパム（１−２ｍｇ／ｋｇ）を投与することにより回復の間の発作の発症を阻止した。麻酔からの完全な回復の際、動物は標準のハウジングに戻した。
【０１３７】
Ｔｇ２５７６トランスジェニックマウスにおけるインビトロ試験の実験デザイン：Ｔｇ２５７６同腹子からの６匹の異型接合性トランスジェニック及び１０匹の齢が適合した野生型対照（タコニックファームズ（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）社、及びミネソタ大学から入手）に、ＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９又はＡＡＶ−対照の何れかを上記の手法を用いて１２月齢目に注射した。マウスの半分がＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９の両側（ｂｉｌａｔｅｒａｌ）注射を受け、そして残りの半分はＡＡＶ−対照の両側注射を受け、２ｘ２デザインであった：
【０１３８】
【表１０】
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【０１３９】
（４）Ｔｇ２５７６マウスにおける抗−ＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡ処理の行動の効果の試験：
哺乳類においては、海馬が新たな記憶の形成のために必須の脳構造である。アルツハイマー病のヒト患者においては、当該疾患の兆候である記憶形成の能力の損失が、他の脳構造の間では、患者の海馬に対する疾患の影響によると推測されている。マウスにおいては、海馬は空間の配置又は位置のための記憶の形成に関与する。野生型対照に比較して、Ｔｇ２５７６マウスは海馬依存性機能に欠損があることが以前に示された（Ｓｔａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。Ｔｇ２５７６マウスの我々の抗−ＢＡＣＥ１処置がそれらのアルツハイマー様の疾患に有益な効果を有することを示すために、我々は、これらのマウスにおける海馬依存性記憶機能の指標として恐怖条件付け法（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ  ｆｅａｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いた。
【０１４０】
方法：恐怖条件付け法は、公表された研究文献の中でよく確立された方法であり、そしてこの方法が海馬依存性脳機能の測定法を提供することを確定した。以下のプロトコルの詳細は、Ｄｉｎｅｌｅｙら（２００２）から採用したが、著者らは、この方法を様々なアルツハイマーのマウスにおいて用いており、Ｔｇ２５７６トランスジェニック株を含んだ。当該手法は２日の連続する日にわたり実施される行動試験である。初日に、マウスはケージのコンテクストと聴覚合図を温和な脚への電気ショックと連想により結び付ける（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）ようなトレーニングを受けた。２日目には、マウスを最初と同じケージのコンテクストに置いたが、ショックは与えず；それどころか、マウスの移動の量（又は逆に、行動上の「フリージング」）を観察して、装置により定量した。マウスを１時間そのホームのケージに戻し、次に、新しい装置に入れて、再びその移動の量（又は「フリージング」）を定量した。我々のＴｇ２５７６マウスと野生型対照マウスを我々が試験した特定の行動試験の手法は以下のとおりであった：
初日（トレーニング）：
１．マウスを恐怖条件付け装置に置き、そして１８０秒間マウスを調査するために自由にさせた。
２．以下を５回繰り返した：
ａ．聴覚合図（ホワイトノイズ、８０ｄＢ）を２０秒間与えた。
ｂ．上記の２０秒間の最後の２秒間の間、０．３ｍＡｍｐの脚のショックを装置の床グリッド（ｆｌｏｏｒ  ｇｒｉｄ）によりマウスに与えた。
ｃ．次の聴覚合図の前に４０秒間の停止（ｐａｕｓｅ）があった。
３．この時間の間の最後に（全部で８分間）、マウスをそのホームのケージに戻した。
２日目［２４時間後］（試験）：
１．マウスを恐怖条件付け装置に置き、そしてその移動（又は、逆に行動的フリージング）を３００秒間観察した（５分間）。
２．マウスをそのホームケージに６０分間戻した。
３．マウスをそのフロアリング（固形プラスチック対ワイヤーグリッド）、視覚合図（壁の色及びパターン）、及び臭い（シトラス気がある溶液を用いてプラスチックの床を隅々まで拭いた）において条件付け装置と異なる新たな装置の中に入れた、マウスの移動（又は「フリージング」）を１８０分間観察した（３分間）。
【０１４１】
この手法に由来する鍵となる測定は、マウスが平常に恐怖の状況にあるような、動物が動かずに過ごした、即ち、行動上のフリージングの各観察における時間のパーセンテージである。コンテクスト依存性条件付けは、トレーニングされた環境におけるフリージングのパーセント対新規な環境（基底ラインとして使用した）におけるフリージングのパーセントの差により示される。動物がショックが与えられた空間的コンテクストに関する特定の記憶を形成した範囲まで、トレーニングされた環境（２日目に測定された）の行動上のフリージングのパーセンテージは、新規な環境（これも２日目に測定された）における行動上のフリージングのパーセンテージに比較して大きい。
【０１４２】
結果：Ｔｇ２５７６マウスと野生型の対照を上記プロトコルを用いて１５月齢のマウスに試験したが、それらはＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９又はＡＡＶ−対照の何れかの外科手術処置の術後３カ月であった。トレーニングされた環境と新規な環境におけるマウスの行動をビデオで記録して、この目的のためにデザインされたソフトウエア（ＦｒｅｅｚｅＦｒａｍｅＴＭ，アクチメトリックス（Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｘ）社、ウイルメット、ＩＬ）により行動上のフリージングに関して自動的にスコアした。結果は、このソフトウエアにより用いられる調節可能なパラメーターにおける変化に対して鈍感であることがわかった。以下のパラメーター値を報告された結果におけるスコアリングに関して使用した：１）動物の動きの欠如が１５ピクセルよりも低い（ソフトウエアによりピクセル値から計算された）ビデオフレーム対ビデオフレーム差として規定された、及び２）マウスによるフリージングが持続における全秒を超える動きの欠如の「発作（ｂｏｕｔ）」として規定された。
【０１４３】
１５月齢目に、ＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９処置を受けたＴｇ２５７６マウスにより呈されたトレーニングされた環境対新規な環境に置ける行動上のフリージングのパーセンテージの差は、ＡＡＶ−対照処置を受けたトランスジェニックＴｇ２５７６マウスよりも大きかった（ｐ＜０．０５、図９参照）。逆に、ＡＡＶ−抗ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９対ＡＡＶ−対照処置の野生型マウスにより呈されるコンテクスト依存性フリージングの程度に対する効果はなかった（平均３７．５８％対１９．７４％，ｐ＝０．３２５，ｎ．ｓ．）。
【０１４４】
【表１１】
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【０１４５】
全体に、異型接合体Ｔｇ２５７６マウスは、野生型マウスよりも恐怖条件付けに対して、より敏感であった。しかしながら、ＡＡＶ−抗−ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９対ＡＡＶ−対照の処置は、野生型のマウスの行動を変えなかったが、処置されたＴｇ２５７６マウスにおいて観察された恐怖条件付けの程度を変えた。これらのデータは、ＡＡＶ−抗−ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９処置が異型接合体Ｔｇ２５７６のコンテクスト依存性記憶を形成する能力を改善したという結論を支持し、そしてそれは野生型のマウスにおいて匹敵する能力を変化させなかった。
（５）Ｔｇ２５７６マウスの脳組織中の抗−ＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡ処置の効果の組織学的分析
ＡＡＶ−抗−ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９又はＡＡＶ−対照で処理されたマウスが１９月齢に達すると、かれらを安楽死させ、そしてかれらの脳組織を海馬の処理された領域内のＢＡＣＥ１蛋白質のレベルに対する処置の効果、及びそれらの領域内のベータ−アミロイドプラーク形成の程度に対する処置の効果を測定するために試験した。処理された領域は図７及び８に示されたのと同様に、神経細胞内の緑色蛍光蛋白質の発現に基づいて同定され得ることになる。ＢＡＣＥ１蛋白質のレベルは標準の方法を用いて免疫組織染色に基づいて同定可能になり、そして可視化のために、抗−Ｂａｃｅ１一次抗体、及びパーオキシダーゼコンジュゲート抗体を用いる。図１０は、この染色方法の一例を示す。当該図面においては、マウス海馬のアンモン角領域のニューロンの細胞体が明確に見えることから、ＢＡＣＥ１蛋白質は抗体染色方法により検出されること、及びＢＡＣＥ１蛋白質は未処理のマウス海馬のニューロンにおいて通常存在することを示す。
【０１４６】
我々の処理された動物（ＡＡＶ−抗−ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９を受ける異型接合体Ｔｇ２５７６又は野生型マウス）において、我々は、ＢＡＣＥ１蛋白質の量がＧＦＰリポーター遺伝子を発現する領域において低下すること、及び異型接合体Ｔｇ２５７６マウスのこれらの領域においてもベータ−アミロイドプラークが減少することを予測した。
実施例４の要約：我々は、哺乳類の神経細胞においてベータ−アミロイド分割酵素の発現を沈黙化させるｓｉＲＮＡ配列をコードするウイルスベクターを用いることの有用性を示した。このウイルスベクターは、ＡＡＶ−抗−ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９と呼ばれ、マウス及びヒト種の間で１００％相同のｓｉＲＮＡ配列をコードする（即ち、マウスとヒトのヌクレオチド配列は同一である）。そうして、この同じＡＡＶ−抗−ＢＡＣＥ１−ＭＢ１７４９は、我々の発明の一つの態様であるヒトアルツハイマー病患者の治療のためのバイオマテリアル成分である。我々は、この治療がアルツハイマー病のＴｇ２５７６トランスジェニックマウスモデルにより証明された疾患の行動上の側面に対しての陽性の効果を有し得ることを示した。
実施例５：ハンチントン遺伝子を標的とするＲＮＡ干渉を用いたハンチントン病の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のための処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）
発明の別の実施例の態様として、我々は、ヒト細胞の培養においてハンチントンｍＲＮＡの発現を抑圧するｓｉＲＮＡ配列を同定した。さらに、大きな哺乳類の脳においてハンチンチン蛋白質発現を抑圧する安全性を確認するための研究を実施するため、我々は、ヒトハンチントン遺伝子に相同なヒツジ遺伝子の最初の８４６ヌクレオチドをクローン化して配列決定し、そしてヒツジの細胞の培養においてハンチントンのｍＲＮＡの発現を抑圧するｓｉＲＮＡ配列を同定した。この作業に関与する工程は、（１）有効性に関して候補の抗−ヒトハンチントンｓｉＲＮＡ配列のインビトロスクリーニング、（２）ヒツジハンチントン遺伝子の最初の８４６ヌクレオチド領域のクローン化と配列決定、及び（３）候補の抗ヒツジハンチントンｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニングを含んだ。これらの工程は、以下において詳細に記載される。
（１）インビトロ有効性に関しての抗−ヒトハンチントンｓｉＲＮＡ配列のスクリーニング
候補の抗−ハンチントンｓｉＲＮＡ配列の同定：ヒト細胞においてハンチントンｍＲＮＡの発現を低下させるのに有効なｓｉＲＮＡ配列を同定するために、我々は、ジェンバンクデータベース（ナショナルキャンサーフォーバイオテクノロジーインフォメーション、アクセス番号ＮＭ＿００２１１．３）にて利用可能なハンチントン遺伝子のヒトｃＤＮＡ配列を分析した。分析は、２つの連続するアデニンヌクレオチド（ＡＡ）又はシトシンとアデンニン（ＣＡ）で始まり、そしてそれらの２つのヌクレオチドプラス１９の連続するヌクレオチドを含むｃＤＮＡ配列の同定セクションからなった。これらの候補配列を、他の遺伝子中の他の配列への潜在的部分適合に関して試験したが、ナショナルキャンサーフォーバイオテクノロジーインフォメーションのウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）により提供されているＢＬＡＳＴソフトウエアプログラムを用いた。配列中の極端なパーセンテージのグアニン又はシトシン（Ｇ又はＣ）ヌクレオチドの候補配列（例えば、６５％より高いか又は３５％より低い１９の連続するヌクレオチドがＡ又はＴよりもＧ又はＣであった）も、考慮から排除した。残りの候補から、以下の表から実験室スクリーニングのために以下を選択した：
【０１４７】
【表１２】
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【０１４８】
インビトロ試験のためのｓｉＲＮＡ候補の生産：我々は、製造者の指示書に従い、Ａｍｂｉｏｎ  ＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭｓｉＲＮＡ構築キット（アンビオン社、オースチン、テキサス；カタログ番号１６２０）を用いてカスタムＤＮＡオリゴヌクレオチド及び他の試薬からインビトロ転写により、ＨＤ０１８８，ＨＤ０３５８，ＨＤ１６３９，及びＨＤ２０６０  ｓｉＲＮＡ候補に対応する二重鎖ＲＮＡを作成した。カスタムＤＮＡオリゴヌクレオチドは我々の特定のｓｉＲＮＡを作成するために用いられ、以下のとおりであった。ｓｉＲＮＡ標的配列を大文字で標記し、そしてインビトロ転写方法のために必要な他のオリゴヌクレオチドを小文字で標記する。
【０１４９】
【表１３】
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【０１５０】
我々は、アンビオン社（オースチン、ＴＸ）からのＨＤ０８１３，ＨＤ１０６６，及びＨＤ２７１４のｓｉＲＮＡ候補に対応する二重鎖ＲＮＡの化学合成を注文した。我々のためにこの供給者が生産する我々が特定した配列を以下に示す：
【０１５１】
【表１４】
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【０１５２】
ｓｉＲＮＡ候補の細胞培養へのインビトロの応用：インビトロにおいてハンチントンｍＲＮＡの抑圧に関して各抗−ハンチントンｓｉＲＮＡ候補の有効性を評価するために、ＨｅＬａ細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、カタログ番号ＣＣＬ−１３１）を試験システムとして用いたが、これらの細胞が検出可能なレベルのハンチンチンｍＲＮＡを発現するからである。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）を最小必須培地中で、アール塩、Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清（ギブコ）と共に３７℃及び５％ＣＯ２において培養した。ｓｉＲＮＡ候補によるトランスフェクションに関しては、４．３ｘ１０５のＨｅＬａ細胞を、７ｍｌの生育培地を含むが抗生物質を含まない２５ｃｍ２の培養フラスコにトランスフェクションの前日に入れて、トランスフェクションの時点で５０％コンフルエントにした。細胞に８４０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡをオリゴフェクタミントランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いてトランスフェクトした。インビトロトランスフェクションにより生成したｓｉＲＮＡ候補を１セットの実験において試験し、直接化学合成により生成したｓｉＲＮＡ候補を第２のセットの実験において試験した。
【０１５３】
細胞中のハンチントンｍＲＮＡレベルに対するｓｉＲＮＡ候補の効果のアッセイ：細胞内のハンチントンｍＲＮＡレベルに対するｓｉＲＮＡ候補の効果を決定するために、ＲＮＡをインキュベーションの３６時間後に単離した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ−４Ｎａ，ギブコ）を１ｍｌ含む培養フラスコから回収し、そして細胞の数を生存性カウンター（ベックマンコールター）を用いた細胞カウントにより評価した。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（キアゲン）を用いて細胞から単離し、そしてｇＤＮＡをオンカラムＤＮａｓｅ処理（３０分間）を用いて除去した。単離の後、ｇＤＮＡの不在をＰＣＲにより確認した。波長２６０ｎｍの吸収を測定することによりＲＮＡの量を補正した。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（バイオラッド）を用いて逆転写が起こった。次に、２つのリアルタイムＰＣＲをｉＱ  ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（バイオラッド）を用いて実施し、一つはハンチントンプライマーを用い、もう一つはＧＡＰＤＨプライマーを用いた。２５μｌ反応にて以下の数：１ｘ１０１０，１ｘ１０９，１ｘ１０８，１ｘ１０７，１ｘ１０６，１ｘ１０５，１ｘ１０４及び１ｘ１０３のＤＮＡ対照分子を増幅することにより、標準曲線を生じさせた。ＤＮＡ対照分子は化学合成し（ライフテクノロジーズ）、そしてＰＣＲ産物として同じ配列を有いた。
【０１５４】
定量性リアルタイムＰＣＲアッセイ結果：ゲノミックＤＮＡの不在を確認するため、リアルタイムＰＣＲをＳＹＢＲグリーンを用いて実施した。陽性対照のみが顕著なシグナルを生じたことから、全てのＲＮＡサンプルがゲノミックＤＮＡの持ち込みを含まなかったことが示される。逆転写酵素反応を続ける前に全てのＲＮＡサンプルを同じ濃度に希釈し、次に、各サンプルの２μｇのＲＮＡ逆転写して４０μｌ反応において相補なＤＮＡを生成した。最後に、リアルタイムＰＣＲ反応を各サンプルに実施することにより、各サンプル中のハンチントンｍＲＮＡの量を測定した。各サンプル中のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの量も平行のＰＣＲ反応において測定し、ハンチントンｍＲＮＡの相対量の標準化のベースラインを測定した。
【０１５５】
ｓｉＲＮＡ候補の第１のセットの結果（インキュベーション転写を用いて生じた）は、以下のとおりであった：
【０１５６】
【表１５】
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【０１５７】
ｓｉＲＮＡ候補の第２のセットの結果（直接化学合成により生じた）は以下の通りであった：
【０１５８】
【表１６】
2008500049.tif 000021
【０１５９】
上の２つの表においては、サンプル中にて測定されたハンチントンｍＲＮＡの平均量をサンプル中に測定されたＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの平均量で割ることにより、ハンチントンｍＲＮＡの相対量を計算する。ハンチントンｍＲＮＡの相対抑圧パーセントは、未処理の対照細胞内の相対量からハンチントンの相対量を差し引いて、この差異を未処理対照細胞内の相対量のパーセンテージとして表現することにより、計算される。（例えば、、（２．６５Ｅ−０３マイナス６．２９Ｅ−０４）を２．６５Ｅ−０３で割ると、イコール、０．７６又は７６パーセント抑圧、ＨＤ０８１３による）。
【０１６０】
これらのデータが示すとおり、後の３つの候補の全て（ＨＤ０８１３，ＨＤ１０６６，及びＨＤ２７１４）は、ＨｅＬａ細胞培養においてハンチントンｍＲＮＡの実質的な抑圧を生じ、一方、最初の４つ（ＨＤ０１８８，ＨＤ０３５８，ＨＤ１６３９，及びＨＤ２０６０）は、ＨｅＬａ細胞においてハンチントンｍＲＮＡ抑圧には本質的に有効ではない。一致して、３つの有効な候補を化学合成したｓｉＲＮＡを用いてこれらの実験において試験し、一方、有効ではない候補をインビトロ転写により生じさせた。しかしながら、我々は、すでに、スクリーニングのための材料の生産の方法がｓｉＲＮＡの一つのセットの有効性対他方の無効性の原因ではないことを示す抗−ＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡの我々の開発からの実験データをもっている。よって、我々は、ＨＤ０８１３，ＨＤ１０６６，及びＨＤ２７１４がヒトハンチントンを標的とする各有効なｓｉＲＮＡであると結論する。
（２）ヒトハンチントンに相同なヒツジ遺伝子のクローン化
我々は我々の発明によりヒトを治療する前に大きな哺乳類の脳においてハンチンチン蛋白質の発現を抑圧する安全性を確立することを意図して、我々は、ヒツジハンチントン遺伝子の発現を抑圧するのに有効なｓｉＲＮＡ候補を同定することに着手した。ヒトハンチントン遺伝子に相同なヒツジゲノム内の遺伝子の配列は現在ジェンバンク又は他の公的に利用可能なゲノム配列データベースにより利用可能ではない。よって、我々はヒツジハンチントン遺伝子の最初の８４６ヌクレオチドをクローン化して配列決定し、そして、我々がヒツジハンチンチン蛋白質の開始から最初の２８２アミノ酸までに相当するＤＮＡ配列を同定したヒト遺伝子配列（ＮＭ＿００２１１１．３）と、我々の配列のアラインメントをコンピューターにより確立した。ヒツジの遺伝物質の源は、無関係の医学研究目的のために使用されて（心臓装置の試験）脳組織の回収の前の１時間以内に安楽死された実験動物から回収されたフラッシュ凍結ヒツジ脳組織のサンプルからであった。さらに、ＯＡ１ヒツジ細胞系からのヒツジ遺伝物質（アメリカンタイプカルチャーコレクション、カタログ番号ＣＲＬ−６５３８）を、脳組織源から得られた結果を確認するために用いられたクローンの源として使用した。各々の場合に、全細胞ＲＮＡを源物質から単離して、次に、ＰＣＲを用いてハンチントン配列の一部が増幅されたｃＤＮＡを生じさせるのに使用した。増幅されたＰＣＲ産物のクローン化と配列決定は、標準の分子生物学の手法を用いて実施した。
得られたヒツジのハンチントン遺伝子配列は以下のとおりである：
【０１６１】
【化４】
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【０１６２】
このヒツジ配列とヒトハンチントン遺伝子配列のコーディング領域の５’エンドのアラインメントを図１１に示す。
（３）インビトロの有効性に関して抗−ヒツジハンチントンｓｉＲＮＡ配列のスクリーニング
我々の発明に基づくハンチントン病の治療のための開発におけるさらなる工程として、我々は、ヒツジハンチントン遺伝子を標的とするいくつかの候補ｓｉＲＮＡ配列を同定し、そしてヒツジ細胞培養においてヒツジハンチントンｍＲＮＡを抑圧するのに有効なものをスクリーニングした。候補配列を同定することにおいて、我々は、２つのアデニン（ＡＡ）又はシトシンとアデニン（ＣＡ）で始まるものに候補を限定せず、グアニンとアデニン（ＧＡ）では始まらない候補も許容した。これらの開始ヌクレオチドを以下の表において小文字にて示す。
【０１６３】
【表１７】
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【０１６４】
我々は、ダーマコン社のＥＢ１，ＥＢ２，ＥＢ３，ＥＢ４，及びＥＢ５  ｓｉＲＮＡ候補に対応する二重鎖ＲＮＡの化学合成を依頼した。この供給者が我々に作成すると我々が特定した配列は以下のとおりであった。化学合成されるｓｉＲＮＡのために、標的配列は上の表の右手の欄に示される１９塩基であり、最初の２ヌクレオチドを欠く（ａａ，ｃａ，又はｇａ）。
【０１６５】
【表１８】
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【０１６６】
抗−ＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡ候補のスクリーニングに関して既に記載されたものに匹敵する方法を用いて、我々は、これらのｓｉＲＮＡ候補、及びヒツジハンチントン遺伝子配列及び緑色蛍光蛋白質（ｐＴｒａｃｅｒ−ｓｈｅｅｐＨＤ）を含むプラスミドでＨＥＫ２９３細胞を同時トランスフェクトした（及び別の実験において、ＨｅＬａ細胞）。４８から７２時間後に、我々は、全細胞ＲＮＡをこれらの細胞から回収し、そして定量性リアルタイム逆転写ＰＣＲを用いて、細胞サンプル中のＧＦＰ  ｍＲＮＡのレベルに比較してのヒツジハンチントンｍＲＮＡのレベルを測定した。４つの別個の実験の結果を以下に示す。示された値は、ｐＴｒａｃｅｒ−ｓｈｅｅｐＨＤにより処理された細胞内で得られたヒツジハンチントンｍＲＮＡとｓｉＲＮＡ候補の一つの、ｐＴｒａｃｅｒ−ｓｈｅｅｐＨＤでトランスフェクトされたが如何なるｓｉＲＮＡによっても処理されていない細胞内に見いだされたヒツジハンチントンｍＲＮＡの量に比較したパーセント抑圧である。
【０１６７】
【表１９】
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【０１６８】
これらのデータから、我々は、ＥＢ２，ＥＢ３，及びＥＢ４がヒツジハンチントンに対する有効なｓｉＲＮＡ配列であること、及びＥＢ４がＨｅＬａ又はＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされたプラスミドから発現されたときに、ヒツジハンチントンｍＲＮＡの発現をもっとも有効に抑圧すると結論する。
【０１６９】
ヒツジハンチントンｍＲＮＡを標的とするＥＢ４配列を用いることにより、我々は、このｓｉＲＮＡに対応する短いヘアピン配列をコードするＤＮＡのデリバリーのためのアデノ随伴ウイルスベクターを作成することができ、そしてヒト患者における適用の前にハンチントン病のためのこの治療の安全性を確立するために、我々の発明の様式において、定位神経外科手術によりヒツジの脳へこのベクターをデリバリーすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、抗アタキシン１リボザイムを含むプラスミド（図１の上部レーン）又はアタキシン１に対するｓｉＲＮＡ（図１の底部レーン）によりトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から得られたアタキシン１のｍＲＮＡのアッセイ（当業者に知られている定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた）を示す。
【図２】図２は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡを標的とする対称のｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から得られたｍＲＮＡに比較しての、抗アタキシン１小干渉ＲＮＡ（底部レーン）によりトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から得られたアタキシン１のｍＲＮＡのアッセイ（当業者に知られている定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた）を示す。
【図３】図３は、アデノ随伴ウイルス発現ベクターｐＡＡＶ−ｓｉＲＮＡの構築を示す。
【図４】図４は、研究装置を示し（メドトロニック社、ミネアポリス、ＭＮモデル８５０６）、頭蓋上で皮下移植することができ、そして、治療剤が脳にデリバリーされるかもしれないアクセスポートを提供する。
【図５】図５は、研究装置を示し（メドトロニック社、ミネアポリス、モデル８５０６のＭＮ模式図）、頭蓋上で皮下移植することができ、そして、治療剤が脳にデリバリーされるかもしれないアクセスポートを提供する。
【図６】図６は、本明細書において記載された様々な神経変性疾患の関連と、それらの意図された標的遺伝子産物に向けられた小干渉ＲＮＡベクターによる治療の位置を示す。
【図７】図７は、緑色蛍光蛋白質をコードするＡＡＶベクターのＣ５７Ｂ１／６マウスへの投与からのマウス番号３の左の大脳半球（ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ）からの傍矢状（ｐａｒａｓａｇｇｉｔａｌ）脳組織切片の連続するシリーズからの脳組織切片６７の３つの視野を含む。
【図８】図８は、緑色蛍光蛋白質をコードするＡＡＶベクターの投与からの切片１２５（動物の中線付近、矢状面）に対する切片２９（側面）からの、このマウス番号３の左の小脳半球中の複数の脳組織切片の写真を含む。
【図９】図９は、抗ＢＡＣＥ１のｓｉＲＮＡをコードするＡＡＶベクター又はＢＡＣＥ１のｍＲＮＡを抑圧することに関しては不活性であると予測される対照のｓｉＲＮＡをコードするＡＡＶベクターにより１２月齢にて神経外科手術されたマウスの１５カ月後に恐怖条件付けを受けた処理Ｔｇ２５７６マウスと対照Ｔｇ２５７６マウスの比較である。
【図１０】図１０は、正常なマウス海馬中のＢＡＣＥ１蛋白質の免疫染色を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、我々のヒツジハンチントン遺伝子配列と、ジェンバンク（ＮＭ＿００２１１１．３）にて利用可能なヒトハンチントン遺伝子配列との配列アラインメントである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、我々のヒツジハンチントン遺伝子配列と、ジェンバンク（ＮＭ＿００２１１１．３）にて利用可能なヒトハンチントン遺伝子配列との配列アラインメントである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、我々のヒツジハンチントン遺伝子配列と、ジェンバンク（ＮＭ＿００２１１１．３）にて利用可能なヒトハンチントン遺伝子配列との配列アラインメントである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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