(57)【要約】  本発明は、一般に、試料中での微生物の有無を決定するのに使用するプローブ、方法、およびキットに関する。このプローブ、方法、およびキットは、少なくとも１つの捕獲プローブおよび／または少なくとも１つの検出プローブを含む。
2008509664.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中での少なくとも１つの微生物の存在を同定する方法であって、この方法は、
（ａ）試料中の少なくとも１つの微生物からＲＮＡまたはＤＮＡを遊離させるステップと、
（ｂ）ＲＮＡまたはＤＮＡの第１の標的配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つの捕獲プローブとＲＮＡまたはＤＮＡを接触させるステップであり、その接触は、第１の標的配列と少なくとも１つの捕獲プローブの間のハイブリダイゼーションを可能にし、微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体を形成する条件下で行われ、少なくとも１つの捕獲プローブは配列番号１〜５３、５５、５６、６１、６２、６７、６８、および７２〜７８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むステップと、
（ｃ）（ｉ）ＲＮＡまたはＤＮＡの第２の標的配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つの検出プローブとＲＮＡまたはＤＮＡを接触させるステップであり、検出プローブは少なくとも１つのレポーター基を含み、その接触は、第２の標的配列と少なくとも１つの検出プローブの間のハイブリダイゼーションを可能にし、微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体を形成する条件下で行われ、少なくとも１つの検出プローブも配列番号１〜５３、５５、５６、６１、６２、６７、６８、および７２〜７８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むステップ；および
（ｉｉ）少なくとも１つのレポーター基を検出することによって微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体を検出するステップ
によって、微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体の存在を検出するステップと
を含み、
微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体の存在は、少なくとも１つの微生物の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
第１の標的配列および第２の標的配列は同じ配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の標的配列とハイブリダイズさせる前に、捕獲プローブを固体支持体上に固定化することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体を固体支持体上に固定化することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体を固体支持体上に固定化することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
固体支持体は、ラテックスビーズ、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、酸化第二鉄、マイクロアレイチップ、濾紙、ニトロセルロースフィルター、ナイロン膜、スライドガラスおよび細胞膜からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
固体支持体はマイクロアレイチップであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
２つ以上の捕獲プローブを固体支持体の単一スポット上に固定化することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
固体支持体上に固定化される捕獲プローブとハイブリダイズすることができる固定化プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
レポーター基は、放射性同位体、酵素、蛍光分子および増幅配列からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
増幅配列は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅およびＱβレプリカーゼ増幅からなる群から選択される増幅反応を開始することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体の検出は、ハイブリッド複合体を非特異的に標識することにより実現されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
試料中での１つまたは複数の微生物の種を同定する方法であって、この方法は、
（ａ）試料中の少なくとも１つの微生物からＲＮＡまたはＤＮＡを遊離させるステップと、
（ｂ）ＲＮＡまたはＤＮＡの第１の標的配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つの種特異的捕獲プローブとＲＮＡまたはＤＮＡを接触させるステップであり、その接触は、第１の標的配列と少なくとも１つの種特異的捕獲プローブの間のハイブリダイゼーションを可能にし、種特異的な微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体を形成する条件下で行われ、少なくとも１つの種特異的捕獲プローブは配列番号１〜５３、５５、５６、６１、６２、６７、６８、および７２〜７８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むステップと、
（ｃ）（ｉ）ＲＮＡまたはＤＮＡの第２の標的配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つの検出プローブとＲＮＡまたはＤＮＡを接触させるステップであり、検出プローブは少なくとも１つのレポーター基を含み、その接触は、第２の標的配列と少なくとも１つの検出プローブの間のハイブリダイゼーションを可能にし、種特異的な微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体を形成する条件下で行われ、少なくとも１つの検出プローブも配列番号１〜５３、５５、５６、６１、６２、６７、６８、および７２〜７８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むステップ；および
（ｉｉ）少なくとも１つのレポーター基を検出することによって種特異的な微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体を検出するステップ
によって、種特異的な微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体の存在を検出するステップと
を含み、
種特異的な微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体の存在は、その種に属する少なくとも１つの微生物の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項１４】
第１の標的配列および第２の標的配列は同じ配列を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第１の標的配列とハイブリダイズさせる前に、種特異的捕獲プローブを固体支持体上に固定化することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
種特異的な微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体を固体支持体上に固定化することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
種特異的な微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体を固体支持体上に固定化することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
固体支持体は、ラテックスビーズ、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、酸化第二鉄、マイクロアレイチップ、濾紙、ニトロセルロースフィルター、ナイロン膜、スライドガラスおよび細胞膜からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
固体支持体はマイクロアレイチップであることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
２つ以上の種特異的捕獲プローブを固体支持体の単一スポット上に固定化することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
固体支持体上に固定化される種特異的捕獲プローブとハイブリダイズすることができる固定化プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
レポーター基は、放射性同位体、酵素、蛍光分子および増幅配列からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
増幅配列は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅およびＱβレプリカーゼ増幅からなる群から選択される増幅反応を開始することを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体の検出は、ハイブリッド複合体を非特異的に標識することにより実現されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
抗菌患者療法の有効性を決定する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の方法に従って第１の患者試料中での微生物の有無を確認するステップと、
（ｂ）請求項１に記載の方法に従って第２の患者試料中での微生物の有無を確認するステップと
を含み、
第１の患者試料および第２の患者試料を経時的に連続して採取し、第１の試料中で微生物の核酸が検出されそれに続いて第２の試料中で核酸が検出されないことは、療法にうまく反応したことを示し、第２の試料中で微生物の核酸が検出されることは、試料中に生存する生物が引き続き存在することを示すことを特徴とする方法。
【請求項２６】
固体支持体は、ラテックスビーズ、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、酸化第二鉄、マイクロアレイチップ、濾紙、ニトロセルロースフィルター、ナイロン膜、スライドガラスおよび細胞膜からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
固体支持体はマイクロアレイチップであることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
２つ以上の捕獲プローブを固体支持体の単一スポット上に固定化することを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
固体支持体上に固定化される捕獲プローブとハイブリダイズすることができる固定化プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
レポーター基は、放射性同位体、酵素、蛍光分子および増幅配列からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
増幅配列は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅、およびＱβレプリカーゼ増幅からなる群から選択される増幅反応を開始することを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体の検出は、ハイブリッド複合体を非特異的に標識することにより実現されることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
試料中での少なくとも１つの微生物の有無を検出するキットであって、
（ａ）固体支持体と、
（ｂ）微生物からのＲＮＡおよび／またはＤＮＡの少なくとも１つの標的配列とハイブリダイズして微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体を形成することができる少なくとも１つの捕獲配列を含む少なくとも１つの捕獲プローブであり、少なくとも検出プローブも配列番号１〜５３、５５、５６、６１、６２、６７、６８、および７２〜７８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む捕獲プローブと、
（ｃ）ＲＮＡまたはＤＮＡの第２の配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つの検出プローブであり、検出プローブは少なくとも１つのレポーター基を含み、検出プローブは配列番号１〜５３、５５、５６、６１、６２、６７、６８、および７２〜７８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むものと、
（ｄ）ＲＮＡまたはＤＮＡを収集、濃縮、増幅または単離する容器と
を含むことを特徴とするキット。
【請求項３４】
容器は、真空採血管、エッペンドルフ管および試験管からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
固体支持体は、ラテックスビーズ、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、酸化第二鉄、マイクロアレイチップ、濾紙、ニトロセルロースフィルター、ナイロン膜、スライドガラスおよび細胞膜からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカスゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、エンテロコッカスデュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスアガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉｃａｅ）、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびエンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）からなる群から選択される微生物の検出で使用するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、配列番号１、２、４４、４７、５０、６１、６２、７３および７６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、配列番号３〜７、４３、４６、４９、５２、５３、５５、５６、７２、７５および７８からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は、配列番号８〜１０、４５、４８、５１、６７、６８、７４および７７からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、配列番号１１〜１３からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）は、配列番号１４〜１６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、配列番号１７および１８からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、配列番号１９および２０からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）は、配列番号２１および２２からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
ストレプトコッカスゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）は、配列番号２３および２４からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）は、配列番号２７および２８からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）は、配列番号２９および３０からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）は、配列番号３１および３２からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
エンテロコッカスデュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）は、配列番号３５〜３７からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、配列番号３８〜４０からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５１】
ストレプトコッカスアガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉｃａｅ）は、配列番号４１および４２からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、配列番号２５および２６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５３】
エンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）は、配列番号３３および３４からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２００４年８月１０日に出願した米国仮出願第６０／５９９，８５８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、一般に、試料中での微生物の有無を決定するのに使用するプローブ、方法、およびキットに関する。このプローブ、方法、およびキットは、少なくとも１つの捕獲プローブおよび／または少なくとも１つの検出プローブを含む。
【背景技術】
【０００３】
下記の論述では、背景を示し導入する目的で特定の物品および方法を記載する。本明細書において含まれるものは、先行技術を「自認」するものとみなすべきではない。出願人は、適当な場合に、本明細書で参照した物品および方法が適用可能な法的規定の下で先行技術を構成しないことを示す権利を明白に留保するものである。
【０００４】
菌血症および真菌血症は、生死にかかわる感染症であり、著しく高い死亡率を防ぐ適当な抗菌療法を適時に行うことを必要とする。「敗血症」という用語は、発熱、悪寒、倦怠感、頻脈、過換気、ショックや白血球増加などの感染を示す検査所見および／または臨床所見を伴った、血液内での生物の存在を示すのに使用する。菌血症および真菌血症の発症例５００例中の全体的な死亡率が４２％であり、死亡例の約半数が敗血症に直接起因することが決定された（非特許文献１）。しかし、大部分の菌血症および真菌血症では、血液から非常に少数の生物しか回収されないことが長い間認められている。実際、特に抗菌療法の開始後では、血液１ｍＬ当たり１個未満の生物しか存在しないことはまれではない。したがって、そのような感染の重篤さおよび潜在的な病原体の多様なスペクトルによって、広範囲の細菌および真菌のスペクトルを同定することができる高感度な診断法が必要となる。古典的には、診断は、低レベルの接種物からの多種多様な病原体の成長に適用できる広い基盤を持つ培養法を使用することにより行う。純粋培養で成長させ単離した後、一連の生化学的試験を行うことにより生物を同定する。次いで、抗菌剤感受性試験を行って、経験的な療法を、コストおよび毒性を最小限にする有効な病原体特異的投与計画に改変する。
【０００５】
【非特許文献１】Weinstein et al. Rev. Infect. Dis. 5: 54-70 (1983)
【非特許文献２】Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)
【非特許文献３】Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)
【非特許文献４】Hellyer et al., J. Clin. Microbiol. 37: 290-295 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、依然として、患者からの標本の収集と、罹患率および死亡率を低下させる機会をもたらす標的を定めた抗菌療法の適用との間の時間を短縮し、治療および入院のコストを負担し、無効なまたは不適当な療法によって生じた抗菌薬耐性の広がりを最小限にする必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、試料中での少なくとも１つの微生物の存在を同定する方法に関し、その方法は、（ａ）試料中の少なくとも１つの微生物からＲＮＡまたはＤＮＡを遊離させるステップと、（ｂ）ＲＮＡまたはＤＮＡの第１の標的配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つの捕獲プローブとＲＮＡまたはＤＮＡを接触させるステップであって、その接触が、第１の標的配列と少なくとも１つの捕獲プローブの間のハイブリダイゼーションを可能にし、微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体を形成する条件下で行われ、少なくとも１つの捕獲プローブが配列番号１〜５３、５５、５６、６１、６２、６７、６８、および７２〜７８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むステップと、（ｃ）（ｉ）ＲＮＡまたはＤＮＡの第２の標的配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つの検出プローブとＲＮＡまたはＤＮＡを接触させるステップであって、検出プローブが少なくとも１つのレポーター基を含み、その接触が、第２の標的配列と少なくとも１つの検出プローブの間のハイブリダイゼーションを可能にし、微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体を形成する条件下で行われ、少なくとも１つの検出プローブも配列番号１〜５３、５５、５６、６１、６２、６７、６８、および７２〜７８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むステップ；（ｉｉ）少なくとも１つのレポーター基を検出することによって微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体を検出するステップによって、微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体の存在を検出するステップを含み、微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体の存在が、少なくとも１つの微生物の存在を示す。他の実施形態では、レポーター基は、放射性同位体、酵素、蛍光分子および増幅配列からなる群から選択される。さらなる実施形態では、増幅配列は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅およびＱβレプリカーゼ増幅からなる群から選択される増幅反応を開始する。追加の実施形態では、微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体の検出は、ハイブリッド複合体を非特異的に標識することにより実現される。
【０００８】
追加の態様では、第１の標的配列および第２の標的配列は同じ配列を含む。他の態様では、第１の標的配列とハイブリダイズさせる前に、捕獲プローブを固体支持体上に固定化する。さらに他の態様では、微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体を固体支持体上に固定化する。さらなる態様では、微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体を固体支持体上に固定化する。他の態様では、固体支持体は、ラテックスビーズ、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、酸化第二鉄、マイクロアレイチップ、濾紙、ニトロセルロースフィルター、ナイロン膜、スライドガラスおよび細胞膜からなる群から選択される。さらなる態様では、固体支持体はマイクロアレイチップである。追加の態様では、２つ以上の捕獲プローブを固体支持体の単一スポット上に固定化する。さらなる態様では、上記に記載の方法は、固体支持体上に固定化される捕獲プローブとハイブリダイズすることができる固定化プローブをさらに含む。
【０００９】
本発明の方法は、試料中での１つまたは複数の微生物の種を同定する方法をさらに提供し、その方法は、（ａ）試料中の少なくとも１つの微生物からＲＮＡまたはＤＮＡを遊離させるステップと、（ｂ）ＲＮＡまたはＤＮＡの第１の標的配列にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの種特異的捕獲プローブとＲＮＡまたはＤＮＡを接触させるステップであって、その接触が、第１の標的配列と少なくとも１つの種特異的捕獲プローブとの間のハイブリダイゼーションを可能にし、種特異的な微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体を形成する条件下で行われ、少なくとも１つの種特異的捕獲プローブが配列番号１〜５３、５５、５６、６１、６２、６７、６８、および７２〜７８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むステップと、（ｃ）（ｉ）ＲＮＡまたはＤＮＡの第２の標的配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つの検出プローブとＲＮＡまたはＤＮＡを接触させるステップであって、検出プローブが少なくとも１つのレポーター基を含み、その接触が、種特異的な微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体を形成する、第２の標的配列と少なくとも１つの検出プローブとの間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で行われ、少なくとも１つの検出プローブも配列番号１〜５３、５５、５６、６１、６２、６７、６８、および７２〜７８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むステップ；（ｉｉ）少なくとも１つのレポーター基を検出することによって種特異的な微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体を検出するステップであって、種特異的な微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体の存在が、その種に属する少なくとも１つの微生物の存在を示すステップを含む。さらなる実施形態では、増幅配列は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅およびＱβレプリカーゼ増幅からなる群から選択される増幅反応を開始する。他の実施形態では、レポーター基は、放射性同位体、酵素、蛍光分子および増幅配列からなる群から選択される。さらなる実施形態では、微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体の検出は、ハイブリッド複合体を非特異的に標識することにより実現される。
【００１０】
さらなる態様では、第１の標的配列および第２の標的配列は同じ配列を含む。他の態様では、第１の標的配列とハイブリダイズさせる前に、種特異的捕獲プローブを固体支持体上に固定化する。さらに他の態様では、種特異的な微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体を固体支持体上に固定化する。さらなる態様では、種特異的な微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体を固体支持体上に固定化する。他の態様では、固体支持体は、ラテックスビーズ、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、酸化第二鉄、マイクロアレイチップ、濾紙、ニトロセルロースフィルター、ナイロン膜、スライドガラスおよび細胞膜からなる群から選択される。さらなる態様では、固体支持体はマイクロアレイチップである。さらなる態様では、２つ以上の種特異的捕獲プローブを固体支持体の単一スポット上に固定化する。さらなる態様では、上記に記載の方法は、固体支持体上に固定化される捕獲プローブとハイブリダイズすることができる固定化プローブをさらに含む。
【００１１】
本発明は、抗菌患者療法の有効性を決定する方法をさらに提供し、その方法は、（ａ）請求項１に記載の方法に従って第１の患者試料中での微生物の有無を確認するステップと、（ｂ）請求項１に記載の方法に従って第２の患者試料中での微生物の有無を確認するステップとを含み、第１の患者試料および第２の患者試料を経時的に連続して採取し、第１の試料中で微生物の核酸が検出され、それに続いて第２の試料中で核酸が検出されないことが療法にうまく反応したことを示し、第２の試料中で微生物の核酸が検出されることが試料中に生存する生物が引き続き存在することを示す。追加の実施形態では、レポーター基は、放射性同位体、酵素、蛍光分子および増幅配列からなる群から選択される。他の実施形態では、増幅配列は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅およびＱβレプリカーゼ増幅からなる群から選択される増幅反応を開始する。さらなる実施形態では、固体支持体は、ラテックスビーズ、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、酸化第二鉄、マイクロアレイチップ、濾紙、ニトロセルロースフィルター、ナイロン膜、スライドガラスおよび細胞膜からなる群から選択される。追加の実施形態では、固体支持体はマイクロアレイチップである。他の実施形態では、２つ以上の捕獲プローブを固体支持体の単一スポット上に固定化する。追加の実施形態では、その方法は、固体支持体上に固定化される捕獲プローブとハイブリダイズすることができる固定化プローブをさらに含む。さらに他の実施形態では、微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体の検出は、ハイブリッド複合体を非特異的に標識することにより実現される。
【００１２】
本発明は、試料中での少なくとも１つの微生物の有無を検出するキットを提供し、そのキットは、（ａ）固体支持体と、（ｂ）微生物からのＲＮＡおよび／またはＤＮＡの少なくとも１つの標的配列とハイブリダイズして微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体を形成することができる少なくとも１つの捕獲配列を含む少なくとも１つの捕獲プローブであって、少なくとも検出プローブも配列番号１〜５３、５５、５６、６１、６２、６７、６８、および７２〜７８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む捕獲プローブと、（ｃ）ＲＮＡまたはＤＮＡの第２の配列とハイブリダイズすることができる少なくとも１つの検出プローブであって、検出プローブは少なくとも１つのレポーター基を含み、検出プローブは配列番号１〜５３、５５、５６、６１、６２、６７、６８、および７２〜７８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むものと、（ｄ）ＲＮＡまたはＤＮＡを収集、濃縮、増幅または単離する容器とを含む。一態様では、容器は、真空採血管、エッペンドルフ管および試験管からなる群から選択される。他の態様では、固体支持体は、ラテックスビーズ、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、酸化第二鉄、マイクロアレイチップ、濾紙、ニトロセルロースフィルター、ナイロン膜、スライドガラスおよび細胞膜からなる群から選択される。
【００１３】
本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカスゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、エンテロコッカスデュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスアガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉｃａｅ）、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびエンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）からなる群から選択される微生物の検出で使用するオリゴヌクレオチドをさらに提供する。一実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、配列番号１、２、４４、４７、５０、６１、６２、７３および７６からなる群から選択される。他の実施形態では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、配列番号３〜７、４３、４６、４９、５２、５３、５５、５６、７２、７５および７８からなる群から選択される。さらなる実施形態では、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は、配列番号８〜１０、４５、４８、５１、６７、６８、７４および７７からなる群から選択される。さらなる実施形態では、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、配列番号１１〜１３からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）は、配列番号１４〜１６からなる群から選択される。一態様では、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、配列番号１７および１８からなる群から選択される。他の態様では、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、配列番号１９および２０からなる群から選択される。さらなる態様では、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）は、配列番号２１および２２からなる群から選択される。追加の態様では、ストレプトコッカスゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）は、配列番号２３および２４からなる群から選択される。さらに他の態様では、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）は、配列番号２７および２８からなる群から選択される。他の実施形態では、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）���、配列番号２９および３０からなる群から選択される。さらなる実施形態では、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）は、配列番号３１および３２からなる群から選択される。追加の実施形態では、エンテロコッカスデュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）は、配列番号３５〜３７からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、配列番号３８〜４０からなる群から選択される。さらなる態様では、ストレプトコッカスアガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉｃａｅ）は、配列番号４１および４２からなる群から選択される。他の態様では、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、配列番号２５および２６からなる群から選択される。追加の態様では、エンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）は、配列番号３３および３４からなる群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、試料中での少なくとも１つの微生物の有無を確認するためのプローブ、方法、およびキットに関する。本発明のプローブは、一本鎖の核酸、またはペプチド核酸などの核酸誘導体を含む。本発明のプローブは、（ａ）微生物に特異的な核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列、および／または（ｂ）本発明に従った他のプローブとハイブリダイズすることができる核酸配列を含む。
【００１５】
微生物のＲＮＡおよび／またはＤＮＡと結合することができるプローブは、本明細書において「捕獲プローブ」および／または「検出プローブ」と呼ぶ。捕獲プローブは、固体支持体にしばしば固定化するが、固定化する必要はない。検出プローブは、微生物のＲＮＡおよび／またはＤＮＡの検出を促進する手段をしばしば含むが、含む必要はない。例えば、検出プローブは、レポーター基をしばしば含むが、含む必要はない。本発明の方法は、試料中の少なくとも１つの微生物からＲＮＡおよび／またはＤＮＡを遊離させるステップと、ハイブリッド複合体を形成する、微生物のＲＮＡおよび／またはＤＮＡとプローブの少なくとも一部分の間の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを少なくとも１つの捕獲プローブと接触させるステップとを含む。捕獲プローブと微生物のＲＮＡおよび／またはＤＮＡのハイブリッド複合体は、本明細書において「微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体」と呼ぶことができる。微生物−捕獲プローブハイブリッド複合体は、同様に微生物のＲＮＡおよび／またはＤＮＡと特異的なハイブリッドを形成する検出プローブで検出してもよいが、それで検出する必要はない。捕獲プローブともハイブリダイズする、検出プローブと微生物のＲＮＡおよび／またはＤＮＡのハイブリッド複合体は、本明細書において「微生物−捕獲プローブ−検出プローブハイブリッド複合体」と呼ぶことができる。特異的なハイブリッド複合体の有無は、微生物の有無と相関する。
【００１６】
本発明のプローブおよび／または同定方法を使用して、１つまたは複数の微生物の属および／または種を同定することができる。本発明のプローブおよび／または同定方法を使用して、特定の属および／または種の１つまたは複数の微生物が試料中に存在するかどうかを決定することができる。あるいは、本発明のプローブおよび／または同定方法を使用して、試料が、分類学上の科などの一般的な分類の区分に属し、またはさらに広い区分に属する１つまたは複数の微生物を含むかどうかを確認することもできる。非限定的な例として、本発明のプローブおよび／または方法を使用して、試料が、真菌、細菌、ウイルス、または寄生性微生物を含むかどうかを決定することができる。本発明のプローブおよび／または方法を使用して、抗菌薬耐性遺伝子ｍｅｃＡ、ｖａｎＡやｖａｎＢなど特定のマーカーの有無および／または発現を決定することにより抗菌剤に対する感受性を決定することもできる。
【００１７】
本発明の目的では、「微生物」という用語は、原核生物、細菌、真菌、寄生生物、原生動物、またはウイルスを意味するのに使用する。これらの用語は、相互に排他するものではない；２つの非限定的な例として、原生動物の多くは寄生生物であり、細菌はすべて原核生物である。「試料」は、その用語が本明細書で使用されるとき、動物に由来する可能性があり、それには、例えば、血液、尿、または他の体液、器官、組織およびその任意の一部分が含まれる可能性があり、あるいは、それは、空気、水や土壌などの環境から、または肉、魚や乳製品、さらには化粧品などのヒトもしくは動物の使用もしくは消費を意図する物質から得ることができる。さらに、本発明の方法は、試料全体に対して行うこともでき、あるいはそのわずか一部分または画分に対して行うこともできる。非限定的な例として、試料は、対象からの全血でもよく、あるいは対象の血液から単離または濃縮した血小板の収集物でもよい。本明細書において、「対象」とは動物を意味する。「動物」という用語には、それだけに限らないが、トリ、魚、ならびに、それだけに限らないがヒトおよびヒトでない霊長類、家畜や伴侶動物などの哺乳動物が含まれる。本明細書において、「対象」および「患者」という用語は、同義的に使用する。試料は、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物に由来してもよい。細胞培養物の細胞は、それだけに限らないが、動物細胞、植物細胞、および細菌細胞を含めた真核細胞または原核細胞である可能性がある。細胞培養物は、例えば、動物または植物の組織、器官、または体液から単離された派生細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、対象に由来する動物細胞を含む。「試料」という用語はまた、試料中に存在する任意の微生物が検出可能なレベルまで複製することを可能にする、哺乳動物、食物、環境、化粧品などから採取した試料を接種した培地をも包含する。
【００１８】
特定の実施形態では、試料を処理して微生物を濃縮または単離した後に、その微生物から核酸を遊離させる。微生物は、核酸を遊離させる前に試料中で濃縮することもでき、あるいは核酸の遊離と同時に濃縮することもできる。あるいは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡは、濃縮工程の前に遊離させることもできる。
【００１９】
微生物を濃縮および／または単離する多数の方法が当技術分野で知られている。生物試料中の微生物を濃縮する方法の例には、それだけに限らないが、Ｗａｍｐｏｌｅ  Ｉｓｏｌａｔｏｒ（商標）管（Ｗａｍｐｏｌｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国ニュージャージー州）、ＢＤ  ＣＰＴ（商標）管（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ニュージャージー州）、誘電泳動、進行波電界移動（ｔｒａｖｅｌｉｎｇ  ｗａｖｅ  ｆｉｅｌｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、および電気泳動の使用がある。例えば、図１に、Ｗａｍｐｏｌｅ  ｉｓｏｌａｔｏｒ管を使用して血液中の細菌を濃縮して体積３００μＬにする本発明の方法の一実施形態を示す。他の例として、図４に、血液などの試料中の微生物を濃縮することができる容器を示し、本発明の方法およびキットでそれを使用することができる。いくつかの実施形態では、試料を処理して、分画により（differentially）微生物を分離する。そのような実施形態では、異なる微生物を含む分離試料を得ることができる。下記の実施例１〜３は、密度勾配およびマトリックスを使用する微生物の分画分離（differential separation）を示すものである。
【００２０】
本発明が意図する通り、微生物および／またはその核酸の濃縮は、それだけに限らないが、１つ、２つまたは３つのステップを含めた任意の数のステップで実現することができ、各ステップで、試料は漸次濃縮される。非限定的な例として、微生物またはその核酸は、例えば、Ｗａｍｐｏｌｅ  Ｉｓｏｌａｔｏｒ（商標）管を使用して最初に濃縮することができる。この例について引き続き述べると、次いで濃縮試料をさらに濃縮し、例えば電気泳動を使用して完全な微生物またはその核酸を分離することができる。
【００２１】
本明細書において、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、当技術分野で認識されている通り、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味するのに使用する。核酸は、一本鎖でもよく、あるいは二本鎖でもよい。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズするように捕獲プローブが到達することを可能にする任意の手段を使用して、微生物から「遊離させる」ことができる。したがって、「遊離した」核酸は、核酸プローブがそれと結合することが可能である物理的化学的環境中にある核酸である。さらに、同じ方法によってＤＮＡとＲＮＡをどちらも遊離させることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡを遊離させることができる方法の例には、それだけに限らないが、例えば、熱、酵素、界面活性剤、緩衝液、酸、塩基、カオトロープ、ビーズまたは粒子の存在下での物理的剪断、および圧力の適用を使用する微生物の溶解が含まれる。本発明によって意図される通り、試験される試料またはその一部分を収集、単離、または濃縮する行為によって、捕獲される核酸を十分に遊離させることができる。本発明の目的では、使用されるＤＮＡまたはＲＮＡは、遊離させた後にさらに精製、単離または濃縮してもよいが、そうする必要はない。核酸を精製し、単離し、濃縮する方法は、当技術分野で周知である。微生物から遊離した核酸は、本発明に従った（複数の）プローブと接触させる前に、一本鎖の形態であり、内部二次構造を欠いていることが好ましい。したがって、本発明の方法はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡを捕獲プローブと接触させる前に、微生物から遊離した任意の二本鎖核酸または内部二次構造を有する核酸を変性させるために、１つまたは複数の変性ステップを含んでもよい。しかし、特に核酸を遊離、精製、単離、および／または濃縮する行為によってその変性も生じる場合には、そのような変性ステップは必要でない。核酸を変性させる方法は、当技術分野で周知である。
【００２２】
検出される微生物は、「標的微生物」と呼ぶことができる。検出される、微生物から遊離した核酸は、「標的核酸」または「標的オリゴヌクレオチド」と呼ぶことができる。標的オリゴヌクレオチドは通常、試料中での微生物の検出に使用される捕獲プローブおよび／または検出プローブと結合することができる少なくとも１つの配列を含む。そのような配列は、本明細書において「標的配列」と呼ぶことができる。
【００２３】
微生物から核酸が遊離されると、固体支持体上に固定化した１つまたは複数の捕獲プローブとそれらが接触されうる。代替方法として、遊離した核酸は遊離（非固定化）捕獲プローブと接触され、ハイブリッド複合体を形成することができ、次いで、これを、ハイブリッド複合体を固定化する固体支持体と接触させる。さらに他の代替方法としては、捕獲プローブは、遊離した（すなわち、固定化されていない）ままでもよい。そのような場合、電気泳動などの当技術分野で知られている手段によってハイブリッド複合体を単離することができる。
【００２４】
本明細書において、「捕獲プローブ」とは、遊離した核酸と結合することができる核酸、またはペプチド核酸のような核酸誘導体である。捕獲プローブは、遊離した微生物核酸と接触しハイブリダイズすることができる少なくとも１つの一本鎖部分、または配列を含む。遊離した微生物核酸と接触しハイブリダイズすることができる配列は、本明細書において「捕獲配列」と呼ぶことができる。本明細書において、捕獲プローブは、例えば、その１または複数の捕獲配列が結合することができる１または複数の微生物によって分類することができる。したがって、同じ「型」の捕獲プローブは、同じ１または複数の微生物と結合することができる１または複数の捕獲配列を含む。捕獲プローブは、少なくとも１つの捕獲配列を含む。捕獲プローブはまた、少なくとも１つの捕獲配列の他に配列をしばしば含むが、それを含まなくてもよい。そのような追加の配列は、例えば、捕獲プローブの固定化を促進することができる。
【００２５】
検出プローブを使用して、微生物から遊離した核酸の検出を促進することができる。微生物から遊離した核酸は、１つまたは複数の検出プローブと接触させることができる。本明細書において、「検出プローブ」とは、遊離した核酸と結合することができ、検出されることができ、それによって遊離した核酸の検出が促進される核酸、またはペプチド核酸のような核酸誘導体である。検出プローブは、遊離した微生物核酸と接触しハイブリダイズすることができる少なくとも１つの一本鎖部分、または配列を含む。捕獲プローブと同様に、遊離した微生物核酸と接触しハイブリダイズすることができる検出プローブの配列は、本明細書において「捕獲配列」と呼ぶことができる。検出プローブは、好ましくは、検出を促進するレポーター基と結合している。検出プローブが標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする前後に、検出プローブをレポーター基と結合することができる。レポーター基は、当技術分野で既知であり、下記でより詳細に論じる。
【００２６】
検出プローブの捕獲配列は通常、捕獲プローブの捕獲配列がハイブリダイズする標的配列より、標的オリゴヌクレオチドの異なる標的配列とハイブリダイズする。したがって、標的オリゴヌクレオチドは、捕獲プローブと結合しながら、検出プローブと結合しそれによって検出することができる。そのような実施形態では、捕獲プローブまたは検出プローブを最初に標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。特定の実施形態では、同じ標的配列と結合する捕獲配列をそれぞれ有する捕獲プローブおよび検出プローブを利用することが望ましい可能性がある。そのような実施形態では、標的オリゴヌクレオチドを捕獲プローブにより捕獲することができ、捕獲プローブ−標的複合体を単離することができ、捕獲プローブ−標的複合体を変性することができ、次いで検出プローブを標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。
【００２７】
捕獲プローブと同様に、検出プローブは、例えば、その１または複数の捕獲配列が結合することができる１または複数の微生物によって分類することができる。したがって、同じ「型」の検出プローブは、同じ１または複数の微生物と結合することができる１または複数の捕獲配列を含む。検出プローブは、少なくとも１つの捕獲配列を含む。検出プローブはまた、少なくとも１つの捕獲配列の他に配列をしばしば含むが、それを含まなくてもよい。そのような追加の配列は、例えば、検出プローブとレポーター基の結合を促進することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、捕獲プローブおよび／または検出プローブは、それだけに限らないが、炭素鎖や、標的オリゴヌクレオチドと相補的でない核酸配列のようなリンカー分子を含む。リンカー分子は、例えば、プローブと固体表面の結合に、プローブと他の型の分子（例えば、タンパク質など）の結合に、プローブとレポーター基の結合に、またはプローブと他のプローブの結合に使用することができる。固体表面への捕獲プローブの固定化に使用する配列は、本明細書において「固定化配列」と呼ぶことができる。固定化配列を含むプローブは、本明細書において「固定化プローブ」と呼ぶことができる。そのような非相補的結合は、立体障害を減らすことができ、プローブ、特に１または複数の捕獲配列の、大部分の溶液への到達可能性を高めることによってハイブリダイゼーションの動態を向上させることもできる。リンカー分子として使用することができる核酸配列の例には、ヒト遺伝子のＫ−α（チューブリンα−１）、ＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ）、およびＵＢＣ（ユビキチン結合酵素Ｅ２Ａ）、ならびにその部分がある。図５Ａ〜Ｃに、Ｋ−α、ＰＰＩＡ、およびＵＢＣの部分を含むリンカーを使用してアレイに固定化した、本発明に従った捕獲プローブの非限定的な説明図を示す。
【００２９】
本発明の捕獲プローブは、固体支持体上に「固定化」することができる。本明細書において、「固定化」とは、溶液中の捕獲プローブの動きが制限される、すなわち、その解離を引き起こす状態または処置にさらされない限り固体支持体上に固定化された捕獲プローブが固体支持体から解離しないように固体支持体に付着させることを意味する。
【００３０】
本明細書において、「固体支持体」とは、液体または気体の溶体中に溶解しない構造または足場である。固体支持体の例には、それだけに限らないが、ラテックスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、常磁性ビーズ、酸化第二鉄、マイクロアレイチップ、濾紙、ニトロセルロースフィルター、ナイロン膜、容器、スライドガラス、さらに細胞膜も含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、例えば、ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ（登録商標）Ｆｌｏｗ−Ｔｈｒｕ  Ｃｈｉｐ（登録商標）（ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州）などの、ハイブリダイゼーション動態の向上を促進する三次元マイクロアレイを利用する。ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ（登録商標）Ｆｌｏｗ−Ｔｈｒｕ  Ｃｈｉｐ（登録商標）の例を図３に示す。そのような多孔性アレイは、従来の二次元チップよりも増大したプローブ結合用表面の面積を提供し、アレイのチップ表面を液体が往復して流れることを可能にし、それによって捕獲プローブと標的配列が接触する機会が増す。いくつかの実施形態では、アレイ上の各スポットは、非限定的な例として、異なる種の微生物、微生物の集団または疫学的マーカーに対応することができる。他の実施形態では、異なる型の捕獲プローブは、アレイの同じスポット上に固定化することができる。それぞれの分析対象または分析対象の集団に対して複数のスポットが存在してもよい。
【００３１】
当技術分野で知られている多数の方法のいずれかを使用して、捕獲プローブを固体支持体上に固定化することができる。好ましくは、固定化は、捕獲プローブの、微生物ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、あるいは他のプローブとの結合能に悪影響を及ぼさない。捕獲プローブは、固体支持体と直接固定化することもでき、あるいは、固体支持体上に固定化された他の分子との結合を介して間接的に固定化することもできる。例えば、捕獲プローブは、炭素鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの化学的部分またはリンカー部分を使用して固定化することができる。そのような場合、捕獲プローブの結合は非特異的なものでよい。あるいは、化学的部分を使用して特定の核酸配列と結合する方法は既知であり、本発明で使用することができる。非限定的な例として、アビジンまたはストレプトアビジンとの結合能を有するビオチンで捕獲プローブをビオチン化することができる。この例を続けると、固体支持体は、それと結合したアビジンまたはストレプトアビジンを有してもよい。微生物のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（「捕獲配列」と呼ぶことができる）と結合することができる配列と反対側の分子の末端にビオチンを位置付けることができ、あるいは捕獲プローブの内部の分枝上にビオチンを位置付けることができ、その結果捕獲配列と微生物のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの結合を妨げないほど十分に捕獲配列から離れてそれが位置することになるので、そのようなスキームは、微生物のＤＮＡおよび／またはＲＮＡとのその結合能に悪影響を及ぼさずに捕獲プローブを固定化する方法の非限定的な例である。
【００３２】
他の例として、捕獲プローブは、それ自体が固定化され、固定化される捕獲プローブとハイブリダイズすることができる他の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを使用して固定化することもできる。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、「固定化プローブ」と呼ぶことができる。微生物のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（「捕獲配列」と呼ぶことができる）と結合することができる配列と反対側の分子の末端に、固定化プローブ（「固定化配列」と呼ぶことができる）と結合することができる捕獲プローブ上の配列を位置付けることができ、あるいは捕獲プローブの内部の分枝上に固定化配列を位置付けることができ、その結果捕獲配列と微生物のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの結合を妨げないほど十分に捕獲配列から離れてそれが位置することになるので、固定化プローブの使用は、微生物のＤＮＡおよび／またはＲＮＡとのその結合能に悪影響を及ぼさずに捕獲プローブを固定化する方法の他の非限定的な例である。固定化プローブを介する捕獲プローブの固定化の例を図２Ｂに示す。固定化プローブとして使用することができる核酸配列の例には、ヒト遺伝子のＫ−α（チューブリンα−１）、ＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ）、およびＵＢＣ（ユビキチン結合酵素Ｅ２Ａ）が含まれる（図５Ａ〜Ｃ）。代替の実施形態では、固定化プローブは、ポリＡまたはポリＴオリゴマーなどの非特異的な配列を含んでよい。さらなる実施形態では、それらはまた、天然に存在する核酸配列と相同性または相補性を有さないヌクレオチドまたはヌクレオチド相同体のランダムな配列を含んでもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態では、捕獲プローブは、別個の領域または「スポット」のパターンで固体支持体上に直接的にまたは間接的に固定化することができる。そのようなパターン、またはそのようなパターンを支持することができる固体支持体は、本明細書において「アレイ」、「マイクロアレイ」または「チップ」と呼ぶことができる。単一のマイクロアレイまたはチップに異なる型のプローブを固定化すると、異なる微生物が単一の試料中に存在するかどうかを同時に決定することが促進される。
【００３４】
特定の実施形態では、単一の型の捕獲プローブだけを任意の１個のスポットに固定化し、異なる型の捕獲プローブを異なるスポットに固定化することができる。そのような実施形態では、任意の所与のスポット中に固定化された捕獲プローブの同定が知られ、そのように、異なるスポット中の捕獲プローブとハイブリダイズした微生物を同定し、その位置によってそれを互いに区別することができる。アレイの異なるスポット中に異なる型の捕獲プローブを固定化する例を図２Ａおよび２Ｂならびに図５Ａ〜Ｃに示す。
【００３５】
図５Ａ〜Ｃに、固定化プローブおよび固定化配列を使用してアレイの異なるスポットに固定化された、本発明に従った異なる型の捕獲プローブの非限定的な例示的説明図を示す。ヒト遺伝子Ｋ−α（チューブリンα−１）（図５Ａ）、ＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ）（図５Ｂ）、またはＵＢＣ（ユビキチン結合酵素Ｅ２Ａ）（図５Ｃ）に対する長さ約６０ヌクレオチドを含む固定化プローブをアレイに固定化する。それぞれの固定化プローブを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（図５Ａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（図５Ｂ）、または表皮ブドウ球菌（Ｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）（図５Ｃ）に特異的な捕獲配列の３’にある、Ｋ−α（図５Ａ）、ＰＰＩＡ（図５Ｂ）、またはＵＢＣ（ユビキチン結合酵素Ｅ２Ａ）（図５Ｃ）と相補的な約３０塩基の配列を含む捕獲プローブとハイブリダイズさせる。
【００３６】
他の実施形態では、複数の型の捕獲プローブを単一スポット中に固定化する。そのような実施形態では、同じ型の各検出プローブが、任意の他の型の検出プローブと結合したレポーター基と区別可能なレポーター基に結合するような検出プローブを使用することがしばしば有用となる。非限定的な例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の標的配列と結合する検出プローブをフルオレセインで標識し、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来の標的配列と結合する検出プローブをローダミンで標識するアッセイを行うことができる。そのようなアッセイでは、蛍光標識の色の違いによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の存在を黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の存在と区別することができる。もちろん、区別可能な標識を有する検出プローブを、異なるスポット中への異なる型の捕獲プローブの固定化と併せて使用することもでき、それによって複雑なアッセイの実施が促進される。
【００３７】
検出プローブは、レポーター基と直接的にまたは間接的に結合することができる。リンカー分子を使用する間接的な結合の例として、検出プローブは、「レポーターアダプター配列」リンカーを含んでよい。レポーターアダプター配列とは、レポーター基を有する一本鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して結合することができる検出プローブの一部分であり、それは、本明細書において「レポータープローブ」と呼ぶことができる。図２Ａ〜Ｂに、標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした捕獲プローブであって、次に検出プローブとハイブリダイズしたものの例示的な説明図を示す。検出プローブはレポータープローブとハイブリダイズする。特定の実施形態では、異なる型の検出プローブは、同じレポーターアダプター配列を含んでもよく、それによって単一のレポータープローブを使用する異なる微生物の検出が促進され、そのレポータープローブは、本明細書において「ユニバーサルレポータープローブ」と呼ぶ。そのような実施形態を図２ＡおよびＢに示す。他の実施形態では、異なる型の検出プローブは、異なるレポーターアダプター配列を含んでもよく、それによって、区別可能なレポータープローブを使用して異なる微生物を検出することが容易となる。
【００３８】
捕獲または検出プローブ上にまたはその近くに保護基を位置付けることによって、捕獲プローブおよび検出プローブを、ランダムな核酸と早期にハイブリダイズすることから「保護する」ことができる。非限定的な例として、保護基には、保護される捕獲プローブと部分的に相補的な一本鎖核酸、あるいは保護される捕獲または検出プローブの一本鎖部分と結合する抗体またはその結合性断片が含まれる。
【００３９】
微生物核酸と捕獲プローブまたは検出プローブの間のハイブリダイゼーションは、本明細書において「ハイブリダイゼーション事象」と呼ぶことができる。ハイブリダイゼーション事象は、「ハイブリッド複合体」を形成する。本明細書において、「ハイブリッド複合体」とは、捕獲プローブまたは検出プローブの少なくとも一部分（通常は捕獲配列）と、標的オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分（通常は標的配列）とを含む二本鎖核酸である。ハイブリッド複合体は、その全長にわたって二本鎖である必要はない。さらに、本発明の目的では、捕獲プローブまたは検出プローブおよび標的オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション事象で生じたすべての塩基の相補的な塩基対形成を有する必要はない。さらに、本発明の目的では、捕獲配列および検出配列は、ハイブリダイゼーション事象で生じたすべての塩基の相補的な塩基対形成を有する必要はない。言い換えると、本発明は、標的オリゴヌクレオチドが捕獲または検出プローブの全長とハイブリダイズしなかったために、たとえ標的オリゴヌクレオチドが捕獲または検出プローブとハイブリダイズし、その結果捕獲または検出プローブあるいは標的核酸の一部分がハイブリダイゼーション後一本鎖となったとしても、ハイブリッド複合体が形成されることを意図するものである。本発明のいくつかの実施形態では、標的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後、捕獲または検出プローブの一部分は一本鎖のままである。いくつかの他の実施形態では、捕獲または検出プローブとのハイブリダイゼーション後、標的オリゴヌクレオチドの一部分は一本鎖のままである。さらに他の実施形態では、互いとのハイブリダイゼーション後、標的オリゴヌクレオチドおよび捕獲または検出プローブそれぞれの１または複数の部分は一本鎖のままである。「部分」は、長さとして１個または複数個の核酸である可能性がある。そのような一本鎖部分は、捕獲配列および／または標的配列の中でおよび／またはその外側で生じる可能性がある。捕獲配列および／または標的配列の中の一本鎖部分は、非限定的な例として、捕獲配列および標的配列が１００％相補的でないために生じる可能性がある。捕獲配列および／または標的配列の外側の一本鎖部分は、非限定的な例として、捕獲および／または検出プローブが標的オリゴヌクレオチドと結合することを意図しない部分を含むために生じる可能性がある。捕獲配列および／または標的配列の外側の一本鎖部分は、他の非限定的な例として、標的オリゴヌクレオチドが標的配列の他に配列を含むために生じる可能性がある。例えば、捕獲プローブは、それを固体支持体に固定化するのに使用する配列をしばしば含む（が含む必要はない）。他の例として、検出プローブは、それをレポーター基と結合するのに使用する配列をしばしば含む（が含む必要はない）。さらに他の例として、標的オリゴヌクレオチドは、１または複数の標的配列の３’および／または５’にある配列をしばしば含む（が含む必要はない）。
【００４０】
固体支持体は、それにまたはその上に、微生物特異的なプローブ、疫学的マーカー用のプローブ（例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に使用するＩＳ６１１０に基づくプローブ）、および／または薬物耐性マーカー用のプローブ（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるメチシリン耐性用の、ｍｅｃＡに基づくプローブ、または結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）におけるリファンピン耐性の検出用の、ｒｐｏＢに基づくプローブ）の１つまたは様々な組合せを固定化したものでもよい。本明細書において、「微生物特異的プローブ」という用語は、単一の微生物種に由来しまたはそれから遊離した標的配列とハイブリダイズすることができるプローブを含む。そのようなプローブはまた、本明細書において「種特異的プローブ」と呼ぶこともできる。「微生物特異的プローブ」という用語はまた、単一属の微生物に由来する複数種の微生物の標的配列とハイブリダイズすることができるプローブ（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体（結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．ミクロティ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、およびＭ．アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ））検出用のＩＳ６１１０；１６Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＲＮアーゼＰまたはｓｓｒＡ遺伝子配列の保存されている領域に基づくプローブ）をも含む。例えば、微生物特異的プローブは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来の核酸配列とも表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来の核酸配列ともハイブリッドを形成するが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とは形成しないように設計することができる。そのようなプローブはまた、本明細書において「属特異的プローブ」と呼ぶこともできる。いくつかの実施形態では、属特異的プローブは、同じ属の分類に属するすべてのまたは多数の微生物に由来する配列とハイブリダイズする。本明細書において、「多属プローブ」とは、２種以上の異なる属に属する微生物由来の核酸とハイブリダイズするものである。プローブは、例えば、１つまたは複数の種中に存在する可能性がある抗菌耐性マーカーとハイブリダイズすることができる。そのようなプローブは、抗菌耐性マーカーが系統発生を通じてどれだけ広く分布しているかに応じて、種特異的、属特異的、または多属プローブでもよい。微生物特異的プローブが、本発明によって意図される通り、単一の微生物種に由来しまたはそれから遊離した標的配列と、同じ属の微生物内における複数種の微生物に由来しまたはそれから遊離した標的配列と、あるいは異なる属の微生物に由来しまたはそれから遊離した標的配列とハイブリダイズするかどうかはまた、アッセイで使用するハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件にも依存する。
【００４１】
捕獲プローブについて上記に記載したように、検出プローブは、微生物特異的プローブ、疫学的マーカー用のプローブ、および／または薬物耐性マーカー用のプローブでもよい。捕獲プローブおよび検出プローブの様々な組合せを使用して、試料中に存在する生物を識別することができる。例えば、属特異的捕獲プローブを使用して選択された属の微生物を固定化することができ、次いで、１つまたは複数の属特異的検出プローブでそれを属として検出することもでき、あるいは、１つまたは複数の種特異的検出プローブで種を識別することができる。複数の型の捕獲プローブを本発明の方法で同時に使用することができる。同様に、複数の型の検出プローブを本発明の方法で同時に使用することができる。
【００４２】
非限定的な例として、下記の表（表１）で示す１つまたは複数の配列を含むオリゴヌクレオチドプローブは、示された種の細菌の検出および同定に特に有用である。表１で示す１つまたは複数の配列を含むオリゴヌクレオチドプローブは、示された細菌種由来の核酸を検出する捕獲および／または検出プローブとして使用することができる。表１で示すオリゴヌクレオチドプローブと相同な領域を含むオリゴヌクレオチドプローブも、示された種の捕獲および／または検出に有用である。一般に、表１のオリゴヌクレオチドと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％相同である配列を含むオリゴヌクレオチドは有用である。
【００４３】
微生物の特定の種を検出および／または区別する種特異的な捕獲および／または検出配列として、表１の配列を使用することができる。表１の配列は、それより長いオリゴヌクレオチドの（複数の）部分を含んでもよいが、含む必要はない。例えば、本発明に従ったプローブは、表１の１つまたは複数の配列および／あるいはさらなる配列を含んでもよい。
【００４４】
【表１】
2008509664.tif 000003
【００４５】
【表２】
2008509664.tif 000004
【００４６】
【表３】
2008509664.tif 000005
【００４７】
【表４】
2008509664.tif 000006
【００４８】
【表５】
2008509664.tif 000007
【００４９】
【表６】
2008509664.tif 000008
【００５０】
本発明の目的では、捕獲プローブは、試料由来のオリゴヌクレオチドを、捕獲されるオリゴヌクレオチドの配列（例えば、標的配列）と少なくとも部分的に相補的な配列（例えば、捕獲配列）でそれとハイブリダイズすることにより（それと結合することにより）捕獲する。同様に、検出プローブは、試料由来のオリゴヌクレオチドを、捕獲されるオリゴヌクレオチドの配列（例えば、標的配列）と少なくとも部分的に相補的な配列（例えば、捕獲配列）でそれとハイブリダイズすることにより（それと結合することにより）検出する。本明細書において、「部分的に相補的な」という語句は、相補性が１００％未満であるが、少なくとも約８５％相補的であることを意味する。したがって、「部分的に相補的な」という語句は、捕獲および／または検出プローブの捕獲配列が、本発明に従って有用な標的配列と約８５％の相補性から約１００％の相補性があってもよいことを示す。捕獲配列および捕獲されるオリゴヌクレオチドの標的配列は、非限定的な例として、互いに少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％相補的でもよい。例えば、捕獲配列が長さ１００塩基であり、標的配列が捕獲配列と９５％相補的である場合、捕獲配列および標的配列の塩基対は、捕獲配列１００塩基のうち９５塩基が整合する。
【００５１】
実際的な問題として、特定の核酸分子が標的核酸と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的であるかどうかは、例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘ（登録商標）用第８版、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、米国ウィスコンシン州）などの既知のコンピュータプログラムを使用して通常決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（非特許文献２）を使用して、２つの配列間で相同性がある最良のセグメントを見つけ出す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明に従った基準配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と９５％相補的であるかどうかを決定するとき、同一性の百分率が、捕獲プローブであれ標的核酸であれ基準ヌクレオチド配列の完全長にわたって計算され、かつ、類似性のギャップが基準配列中におけるヌクレオチドの総数の５％まで許容されるようにパラメーターを設定する。
【００５２】
捕獲プローブおよび／または検出プローブの捕獲配列が標的オリゴヌクレオチドの標的配列とハイブリダイズするかどうかは、標的配列と捕獲配列との相補性の程度、ならびにハイブリダイゼーション条件とハイブリダイゼーション後の洗浄の厳密性の両方に依存する。本明細書において使用する、「ハイブリダイゼーションを許容する条件」という語句は、当技術分野で理解されている通り、２つのオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを許容するハイブリダイゼーションのパラメーター、ならびに洗浄のパラメーターを指す。例えば、ハイブリダイゼーションを許容する条件には、それだけに限らないが、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃でのインキュベーション、その後の０．１×ＳＳＣを用いた約６５℃、６８℃または７０℃での洗浄などのより厳密なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件がある。もちろん、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を低い厳密性に設定することができる。厳密性の低いハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件には、それだけに限らないが、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃でのインキュベーション、その後の２×ＳＳＣまたは１×ＳＳＣまたは０．５×ＳＳＣの溶液中、約５５℃または６０℃または６５℃でのフィルター洗浄がある。当業者の能力の範囲内であるように、ハイブリダイゼーションを許容する条件は、ハイブリダイゼーションが行われる前に、捕獲プローブおよび／または検出プローブと標的核酸との間の低いまたは高い程度の相補性の要求に対して容易にかつ日常的に最適化することができる。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン性界面活性剤を使用して、ハイブリダイゼーションまたは洗浄の厳密性を高めることができ、ＰＥＧなどの排除性分子を使用して、反応構成成分の有効濃度を増大させることができる。
【００５３】
捕獲プローブまたは検出プローブは、これらの用語が当技術分野で理解されている通りオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドでもよい。捕獲プローブまたは検出プローブは、例えば、長さが少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または７５０ヌクレオチドでもよい。便宜上、本明細書において「オリゴヌクレオチド」という用語は、これらすべての長さを包含する。いくつかの実施形態では、捕獲プローブおよび／または検出プローブは、約２０００ヌクレオチドまでを含む長さでもよい。いくつかの実施形態では、捕獲プローブおよび／または検出プローブは、長さが約１５から約６０ヌクレオチドである。
【００５４】
捕獲プローブおよび／または検出プローブならびにその１または複数の捕獲配列の長さとハイブリダイゼーションの条件を調整して、意図された標的の核酸との特異的な複合体を形成することができる。その融解温度によって通常測定されるハイブリッド複合体の安定性は、プローブの濃度、ハイブリダイゼーションの条件、ハイブリッド複合体の長さ、および捕獲配列と標的配列との配列同一性の程度と関係する。ハイブリッド複合体の安定性は不整合によって低下し、ハイブリッド複合体中の塩基対の数によって増大する。そのような関係は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている非特許文献３に詳細に説明されている。プローブを使用して、ハイブリッド複合体において異なる密接に関連した配列をわずか単一塩基の差で区別することができる。すなわち、プローブは、微生物の種の１つに由来する標的核酸と完全に整合してもよいが、例えば、第２の種の核酸標的とは配列が１塩基異なってもよい。適切な条件下では、不整合が存在すると、プローブは１つの標的とハイブリッド複合体を形成するが、他の標的とは形成しない。整合複合体と不整合複合体との融解温度の相対的な差が、プローブのサイズが大きくなるにつれて低下するので、プローブは、好ましくは、単一の不整合を検出するのに長さ２５塩基以下であるべきである。非特許文献３を参照されたい。それより長いプローブを使用して密接に関連した標的を区別することができるが、標的は、好ましくは、プローブのサイズが大きくなるにつれて相違の程度が漸次大きくなるべきである。
【００５５】
ハイブリッド複合体が形成された後、次いで本発明の方法はハイブリッド複合体を検出する。ハイブリッド複合体が検出される場合、ハイブリッド複合体の存在は、標的配列が試験した試料中に微生物から遊離されたことを示す。したがって、ハイブリッド複合体の存在は、試料中での標的配列を含む微生物および／または疫学的マーカーの存在を示す。その一方で、ハイブリッド複合体が検出されないとき、ハイブリッド複合体の不在は、試験した試料中の微生物から標的配列が遊離されなかったことを示す。したがって、ハイブリッド複合体の不在は、試料が標的配列を含む微生物および／または疫学的マーカーを含まない可能性が最も高いことを示す。
【００５６】
当業者がその検出方法を利用してハイブリッド複合体の存在を確認することができるという条件で、ハイブリッド複合体を検出する任意の方法を本発明で使用することができる。いくつかの実施形態では、捕獲プローブに加えて、少なくとも１つの検出プローブを使用してハイブリッド複合体を検出する。検出プローブは、捕獲される標的核酸の一本鎖部分（または「標的配列」）とハイブリダイズする。
【００５７】
検出プローブは、検出を促進するレポーター基を含んでもよい。本明細書において、「レポーター基」とは、検出可能なシグナルを発生することができる実体を意味する。レポーター基は、検出プローブ中に組み込むこともでき、検出プローブと直接連結または結合することもでき、あるいは検出プローブと間接的に連結または結合することもできる。上記でより詳細に説明したように、リンカー分子を使用する間接的な結合の例として、検出プローブは、ハイブリダイゼーションを介してレポータープローブと結合することができ、レポーター基と結合しているレポーターアダプター配列リンカーを含んでいてもよい。レポーター基を「含む」検出プローブには、それに組み込まれたレポーター基、レポーターアダプター配列リンカーなどを有する検出プローブ、ならびにレポーター基、レポーターアダプター配列リンカーなどと直接的にまたは間接的に連結または結合した検出プローブが含まれる。
【００５８】
多数の異なるレポーター基が当技術分野で知られている。例えば、放射性同位元素は、レポーター基として使用することができる。放射性同位元素は、例えば、検出プローブ中に組み込まれるか、またはそれと結合させることができ、それによって放射性プローブが得られる。レポーター基として使用することができる放射性同位元素の例には、それだけに限らないが、３２Ｐ、３３Ｐ、１３１Ｉ、９０Ｙ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、６７Ｃｕ、１９８Ａｕ、１０３Ｐｄおよび２１２Ｐｂ／２１２Ｂｉがある。
【００５９】
検出可能なシグナルを発生させるのに使用することができる酵素および／または酵素系はまた、レポーター基として使用することもできる。酵素および／または酵素系の他の構成成分は、検出プローブに直接結合することもでき、あるいは検出プローブに間接的に結合することもできる。例えば、検出プローブは、ビオチン化することができる。特定の非限定的な例として、検出プローブは、１５原子のテトラエチレングリコールのスペーサーが付いたビオチンであるＢｉｏＴＥＧと結合してもよい。ビオチンは、アビジンまたはストレプトアビジンと結合する能力を有する。この例について続けると、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素をアビジンまたはストレプトアビジンと結合し、それにより、ビオチン化検出プローブのビオチンとアビジン−酵素結合体のアビジンの結合を介して西洋ワサビペルオキシダーゼがハイブリッド複合体に局在することを可能にする。当技術分野で容易に理解されるように、基質の添加後、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼが検出可能な比色定量シグナルを発生させる。レポーター基として使用することができる酵素のさらなる例には、それだけに限らないが、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼおよびルシフェラーゼが含まれる。
【００６０】
蛍光または他の検出可能な分子はまた、レポーター基として使用することもでき、それを検出プローブに直接的にまたは間接的に結合することができる。レポーター基として使用することができる検出可能な分子の非限定的な例には、それだけに限らないが、フルオレセイン、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンレッド、ＲＯＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）、Ｃｙ（商標）色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ、米国ニュージャージー州）、Ｂｏｄｉｐｙ（商標）色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州）、ＴＡＭＲＡ（商標）色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州）、ＴＥＴ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州）、ユーロピウム色素、発色性部分および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が含まれる。
【００６１】
レポーター基はまた、「増幅配列」、すなわち核酸増幅を開始することができるヌクレオチド配列を含んでもよい。例えば、増幅配列は、検出プローブに付加してもよく、あるいは、検出プローブの不可欠な部分でもよい。増幅配列は、それだけに限らないが、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）増幅（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、米国テキサス州）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅、およびＱβレプリカーゼ増幅を含めた任意の増幅形態を使用して、核酸の複製または増幅を開始することができる。核酸は、捕獲プローブと接触させる前に増幅することもでき、あるいは、捕獲プローブと接触させた後に増幅することもできる。
【００６２】
検出プローブの使用の代わりにまたはそれに加えて、ハイブリッド複合体の非特異的標識などの標準的な方法を使用して、ハイブリッド複合体を検出することもできる。例えば、エチジウムブロマイドなどの挿入色素を使用して、検出用にハイブリッド複合体を標識することができる。ハイブリッド複合体の非特異的標識の他の例には、それだけに限らないが、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＲ（商標）ＧｒｅｅｎＩ／ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州）、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ヨウ化プロピジウム、およびシアニンのモノマーまたはダイマーがある。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および／またはプローブを使用して、経時的に標本を連続して採取することにより抗菌的患者療法の有効性をモニターする。ｍＲＮＡの検出は、微生物の生存に相関している。（非特許文献４）。したがって、第１の試料中でＲＮＡが検出され、その後抗菌療法を行い、続いて第２の試料中でＲＮＡが検出されないことは、療法にうまく反応したことを示す可能性が最も高い。その一方で、第２の試料中でＲＮＡが検出されることは、標本中に生存する生物が引き続き存在し、療法を継続しまたは治療法を変更する必要があることを示す可能性が最も高い。
【００６４】
他のいくつかの実施形態では、本発明の方法および／またはプローブを使用して、内部標準物質の使用を介し、シグナル強度を対照と比較することにより、試料中の生物の数を定量化する。内部標準物質は、溶液中に含まれないか、または分解から保護するためにＡｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、米国テキサス州）粒子や組換え細菌などの中に被包化されたＲＮＡまたはＤＮＡでありうる。内部標準物質は、検出前の任意の時点で試料中に入れることができる。いくつかの実施形態では、内部標準物質は、１または複数の微生物の濃縮および溶解前に試料中に入れる。標的核酸および存在する可能性がある他の核酸と標準物質を区別することを可能にする特定の捕獲プローブを使用して、内部標準物質を検出する。試験試料中の内部標準物質によって生じたシグナルを、固相と直接結合した異なるレベルの標準核酸を含む対照由来のものと比較する。対照のシグナル強度の曲線をプロットすることによって、標本から回収された内部標準物質の割合を計算することができる。同様にして、固相と直接結合した異なるレベルの標的配列を含む対照を使用して、処理した試料中に存在する標的の量を定量化することができる。内部標準物質を使用する核酸の回収率で補正することにより、次いで元の試料中の標的核酸の量を計算することができる。
【００６５】
本発明の方法が、ヒトおよび動物の感染性疾患の分野外にも適用され、複数の分析対象の迅速で感度がよく特異的な検出および／または同定を必要とする適用に特に適することに留意することが重要である。したがって、本発明の方法を使用して、非限定的な例として治療モニタリング、食物および環境の試験、ならびにバイオテロ兵器配備のモニタリングを含めた多数の分野における試料中の微生物を検出することができる。
【００６６】
本発明はまた、試料中での少なくとも１つの微生物の有無を検出するキットにも関する。キットは、上記で定義したように固体支持体を含み、やはり上記で定義したように少なくとも１つの捕獲プローブを含む。少なくとも１つの捕獲プローブは、微生物特異的プローブ、疫学的マーカー用のプローブ、および／または薬物耐性マーカー用のプローブでもよい。本発明のキットはまた、上記で以前に記載したように、少なくとも１つのレポーター基をも含む。キットはまた、容器を含んでもよい。容器を使用して、試料を収集または濃縮し、および／または微生物から遊離した核酸を単離することができる。容器はまた、所望されまたは必要とする場合に微生物から遊離した核酸を増幅するときに使用することもできる。容器の例には、それだけに限らないが、真空採血管、エッペンドルフ管、試験管などがある。キットは、試料中に存在する微生物の溶解に使用する媒体、界面活性剤、緩衝液、酸、塩基やカオトロープなどの酵素または他の化学物質をさらに含んでもよい。キットの１または複数のレポーター基は、少なくとも１つの検出プローブをさらに含む。そのような実施形態では、レポーター基は、本明細書の前記に記載したように、検出プローブ中にまたはその上に組み込むことができる。捕獲プローブと同様に、検出プローブは、ユニバーサルプローブでもよく、あるいは種特異的プローブでもよい。本発明のキットはまた、陽性対照、陰性対照、および／または内部対照を含んでいてもよい。特定の実施形態では、本発明のキットは、本発明に従ったプローブを使用する単独のアッセイまたは一群の関連アッセイの実施を可能にするのに十分な数のプローブおよび／または十分な量の他の構成成分を含んでいてもよい。他の実施形態では、本発明のキットは、本発明に従ったプローブを使用する複数のアッセイの実施を可能にするのに十分な数のプローブおよび／または十分な量の他の構成成分を含んでいてもよい。
【００６７】
図面は、本発明の実施形態の非限定的な例示的説明図、ならびに本発明の実施で有用な機器および非限定的な例示的配列を提供するものである。本発明のプローブおよび方法の例示的な一実施形態を図１に示す。図１において、Ｗａｍｐｏｌｅ  ｉｓｏｌａｔｏｒ管を使用して血液中の細菌を濃縮して体積３００μＬにする。次に、細菌を溶解してＲＮＡまたはＤＮＡを遊離し、未精製のまたは精製された形でこのＲＮＡおよび／またはＤＮＡを含む溶液を、捕獲プローブが固定化されたマイクロアレイの固体支持体に添加する。捕獲プローブは、例えば、微生物特異的プローブ、疫学的マーカー用のプローブ、および／または薬物耐性マーカー用のプローブでもよい。この特定の実施形態では、微生物のＲＮＡおよび／またはＤＮＡを捕獲プローブとハイブリダイズさせてハイブリッド複合体を形成した後、レポーター基を有する検出プローブを使用して複合体を検出する。
【００６８】
本発明のプローブおよび方法を使用する２つの例示的な実施形態を図２Ａおよび２Ｂに示す。図２の２つの実施形態は、捕獲プローブを固体支持体上に固定化する方法が異なる。図２Ａに示す実施形態の捕獲プローブは、固体支持体上に直接固定化されている。捕獲プローブは種特異的であり、種Ａ特異的捕獲プローブが１つのスポット（Ａ）に固定化され、一方、種Ｂ特異的捕獲プローブが異なるスポット（Ｂ）に固定化されている。さらなる実施形態では、２つ以上の捕獲プローブを単一スポット上に固定化して、単一の位置で異なる生物に由来する２つ以上の標的配列の捕獲および検出を可能にする。
【００６９】
その一方で、図２Ｂに示す実施形態の捕獲プローブは、固定化プローブの使用を介して固体支持体上に間接的に固定化されている。各種特異的捕獲プローブは、固定化プローブとハイブリダイズした固定化配列を含む。固定化プローブは、固体支持体上のスポットに固定化されている。図２Ｂに示す実施形態の各固定化プローブは、特定の型の捕獲プローブに特異的である。固定化プローブＡは、（種Ａに特異的な）捕獲プローブＡと特異的にハイブリダイズし、固定化プローブＢは、（示していないが、種Ｂに特異的な）捕獲プローブＢと特異的にハイブリダイズする。捕獲プローブＡ特異的固定化プローブは１つのスポット（Ａ）に固定化され、一方、捕獲プローブＢ特異的固定化プローブは異なるスポット（Ｂ）に固定化されている。さらなる実施形態では、２つ以上の固定化プローブを単一スポット上に固定化して、単一の位置で異なる生物に由来する２つ以上の標的配列の捕獲および検出を可能にする。
【００７０】
図２Ａの実施形態および図２Ｂの実施形態それぞれにおいて、微生物種Ａから遊離した標的オリゴヌクレオチドの第１の標的配列は、種Ａ捕獲プローブ上の種Ａ特異的捕獲配列とハイブリダイズし、ハイブリッド複合体を形成する。標的オリゴヌクレオチド上の第２の標的配列を種Ａ特異的検出プローブ上の種Ａ特異的捕獲配列とハイブリダイズさせることによってハイブリッド複合体を検出する。検出プローブ上のレポーターアダプター配列を、レポーター基が結合したユニバーサルレポータープローブとハイブリダイズさせる。
【００７１】
しかし、固定化プローブ−捕獲プローブの組合せは変更し改変することができる。非限定的なほんの一例として、例示的な目的で図２Ｂを使用すると、種Ａ特異的捕獲プローブに特異的な固定化プローブはまた、第２の種（「種Ｃ」）に特異的な捕獲プローブと結合することもできる。種Ｃは、例えば、種Ａと同じ属である可能性がある。そのような場合、種Ａ特異的捕獲プローブおよび種Ｃ特異的捕獲プローブは、種ＡまたはＣにそれぞれ特異的な捕獲配列を有しつつ、同じ固定化配列を含む。
【００７２】
図３に、本発明のプローブの固定化に使用することができ、本発明の方法およびキットで使用することができる例示的な固体支持体を示す。図３に示す固体支持体は、フロースルーマイクロアレイチップであり、捕獲プローブと微生物のＲＮＡおよび／またはＤＮＡとのハイブリダイゼーションの速度を高くする利点を有する。図３に示すフロースルーチップは、ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（米国メリーランド州）によって製造された。
【００７３】
図４に、血液などの試料中の微生物を濃縮することができる容器を示し、それを本発明の方法およびキットで使用することができる。
【００７４】
図５Ａ〜Ｃに、ヒト遺伝子のＫ−α（チューブリンα−１）、ＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ）、およびＵＢＣ（ユビキチン結合酵素Ｅ２Ａ）由来の配列を含む固定化プローブが固体支持体の異なる領域（または「スポット」）上に固定化されている本発明の実施形態を示す。各固定化プローブは、（１）固定化プローブに相補的な固定化配列と、（２）生物に特異的な捕獲配列とを含むオリゴヌクレオチド捕獲プローブとハイブリダイズする。捕獲プローブの捕獲配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）に特異的な配列とハイブリダイズするように設計する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の標的オリゴヌクレオチドは、捕獲プローブの捕獲配列と標的オリゴヌクレオチドの第１の標的配列とのハイブリダイゼーションを介して各捕獲プローブと結合する。
【００７５】
ビオチン化検出プローブは、検出プローブの捕獲配列と標的オリゴヌクレオチドの第２の標的配列とのハイブリダイゼーションを介して各標的オリゴヌクレオチドと結合する。西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素と結合したストレプトアビジンは、ビオチン化検出プローブのビオチン分子と結合する。西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素の基質を添加し、検出可能なシグナルが発生する。
【００７６】
図６に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）のｓｓｒＡ遺伝子（低分子安定ＲＮＡ  Ａ）内の離れている領域に由来する合成標的オリゴヌクレオチドを示す。標的オリゴヌクレオチド中の標的配列を下線でまたは枠で囲って示す。これらの配列の捕獲および検出に使用することができる捕獲プローブおよび検出プローブも示し、その捕獲配列を下線でまたは枠で囲って示す。具体的には、捕獲プローブと標的核酸の間で相補性がある領域を下線で示し、検出プローブと標的核酸の間で相補性がある領域を枠で囲って示す。捕獲プローブはまた、ヒト遺伝子のＫ−α（チューブリンα−１）、ＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ）、およびＵＢＣ（ユビキチン結合酵素Ｅ２Ａ）由来の固定化配列をも含む。これらのヒト遺伝子配列（配列番号５９、６５、および７１）は、図６にイタリック体で示し、下記の表４ａに示す。図６は、下記の実施例をより詳細に説明するものである。
【００７７】
図７Ｆに、本発明に従ったチップ上の固定化プローブおよび対照の配置を示す。図７Ａ〜Ｅに、本発明に従ったプローブおよび方法を使用する例示的なアッセイの結果を示す。図７Ａ〜Ｆは、下記の実施例をより詳細に説明するものである。
【００７８】
図８Ａに、本発明に従ったチップ上の捕獲プローブおよび対照の配置を示す。図８Ｂ〜Ｅに、本発明に従ったプローブおよび方法を使用する例示的なアッセイの結果を示す。図８Ａ〜Ｅは、下記の実施例をより詳細に説明するものである。
【００７９】
下記の実験的な実施例は、本発明の特定の実施形態を示すのに提供するが、本発明を限定するものではない。本明細書に記載の実施例および実施形態は、本発明のプローブ、方法およびキットを例示するものであるが、それを限定するものではない。典型的な実験室で通常遭遇し、当業者には明らかな様々な条件およびパラメーターの他の適切な改変および適合形態は、本明細書に記載した本発明の趣旨および範囲の中にある。
【実施例１】
【００８０】
ヒト全血と比較した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の比重の決定
密度勾配を調製するために、６０％イオジキサノール（１．３２ｇ／ｍｌ）を、ダルベッコリン酸緩衝食塩水で密度１．０８０、１．１０１、１．１２１および１．１４３ｇ／ｍｌまで希釈した。体積２ｍｌの各密度溶液を、最も高いものから開始して、濃度の順に円錐型遠心管に順次添加した。
【００８１】
体積１．２５ｍｌの抗凝固処理したヒト全血を、ダルベッコリン酸緩衝食塩水で４倍に希釈した。希釈した血液に、終濃度が１ｍｌ当たり生物２５００個になるまで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を接種した。生物スパイク血液を密度勾配上に重層した。３０００×ｇで２０分間、周囲温度で勾配を遠心分離した。遠心分離後、密度勾配から２ｍｌの画分を取り出した。体積０．１ｍｌの各画分を血液寒天プレート上にピペットで加え、生物単離用に画線した。周囲空気下で、各プレートを３５℃で約１８時間インキュベートした。
【００８２】
密度が１．１０１と１．１２１および１．１２１と１．１４３ｇ／ｍの間である画分からそれぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が単離された。密度１．１４３ｇ／ｍｌの画分からＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）が単離された。血液細胞は、密度が１．０８０と１．１０１ｇ／ｍｌの間である画分で観察された。後者のデータは、血液の密度が１．０９０〜１．１０１ｇ／ｍｌであると推定する文献中の報告と一致する。これらのデータは、その比重が血液より大きいという条件で、密度溶液中で血液から分画により生物を分離することができることを示すものである。
【実施例２】
【００８３】
密度溶液中における血液からの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の分画分離
体積５ｍｌの抗凝固処理したヒト全血に、終濃度が１ｍｌ当たり生物２５００個になるまで黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を接種した。接種後、体積２ｍｌを、ダルベッコリン酸緩衝食塩水での６０％（１．３２ｇ／ｍｌ）イオジキサノールの希釈によって調製した体積３ｍｌの１．０９０ｇ／ｍｌ密度溶液上に重層した。５４４５×ｇで４０分間、周囲温度で密度溶液を遠心分離した。遠心分離後、密度溶液から１ｍｌの画分を収集した。実施例１に記載のように密度区画から生物が単離された。その一方で、血液細胞が密度溶液の最上部に残存していることが観察された。
【００８４】
これらのデータは、密度マトリックスを介した遠心分離によって、全血から黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）をどちらも分離することができることを示すものである。これらの生物をさらに処理して、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡを精製することができ、下流の分子の適用例または微生物学的適用例でそれを使用することができる。
【実施例３】
【００８５】
溶解したヒト血液からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の分画分離
体積５ｍｌのヒト全血を終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で溶解した。界面活性剤処理血液に、終濃度が１ｍｌ当たり生物２５００個になるまで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を接種した。６０％イオジキサノール（１．３２ｇ／ｍｌ）を、ダルベッコリン酸緩衝食塩水で１．０９０ｇ／ｍｌに希釈した。体積３ｍｌの１．０９０ｇ／ｍｌ密度溶液に、３つの生物を含む体積２ｍｌの溶解した血液を重層した。実施例１および２に記載のように密度溶液を遠心分離し画分を収集した。実施例１に記載のように画分から生物が単離された。３つすべての生物が密度溶液の最下部から回収された。その一方で、溶解した血液細胞の残骸が、密度溶液の最上部で観察された。
【００８６】
これらのデータは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で溶解した血液から、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を効率よく分離することができることを示すものである。実施例２に記載のように、回収した生物は、その後の下流の分子の適用例または微生物学的適用例で使用することができる。
【実施例４】
【００８７】
ＭＧＸ（登録商標）ユニバーサルチップを使用する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）特異的オリゴヌクレオチドの検出
下記の実施例は、ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ（登録商標）４Ｄ（商標）ＤＮＡチップを使用する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）特異的合成オリゴヌクレオチドの検出を示すものである。
【００８８】
ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ（登録商標）チップ（ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州）に、ヒト遺伝子のＫ−α（チューブリンα−１）（配列番号８４）、ＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ）（配列番号８５）、およびＵＢＣ（ユビキチン結合酵素Ｅ２Ａ）（配列番号８６）由来の配列を含む長さ約６０ヌクレオチドの固定化プローブをスポット化した。固定化プローブ（配列番号８４〜８６）の配列を表４ｂに示す。チップ上に固定化された固定化プローブの位置を図７Ｆに示す。緩衝液のスポット化またはビオチン化β−アクチン由来オリゴヌクレオチドの固定化によってそれぞれ調製された陰性（「緩衝液」）対照および陽性（「染色」）対照のスポットも各チップ上に含まれていた。「緩衝液」スポットは、非特異的ハイブリダイゼーションの陰性対照として働いた。「染色」スポットは、化学発光検出反応の陽性染色対照として働いた。陽性染色対照のビオチン化β−アクチン由来オリゴヌクレオチド（配列番号８３）の配列は下記の通りであった：５’−ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＡＧＣ−ビオチン。この実施例で使用したチップ（チップＡ〜Ｅ）はそれぞれ、図７Ｆで示された配置で、示された捕獲プローブを有していた。
【００８９】
各固定化プローブは、（１）固定化プローブに相補的な約３０塩基の固定化配列と、（２）約２０ヌクレオチドの生物特異的ｓｓｒＡ遺伝子捕獲配列とを含むオリゴヌクレオチド捕獲プローブとハイブリダイズさせた。捕獲プローブ（配列番号５５、６１、６７）の配列を表２および図６に示す。
【００９０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）に特異的な配列とハイブリダイズするように捕獲プローブの捕獲配列を設計した。捕獲プローブの捕獲配列（配列番号１、６、１０）を、図６に下線で示し、表３に示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に特異的な捕獲プローブはまた、Ｋ−α固定化プローブと相補的な固定化配列（配列番号５９；図６にイタリック体で示し、表４ａに示す）をも含む。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に特異的な捕獲プローブはまた、ＰＰＩＡ固定化プローブと相補的な固定化配列（配列番号６５；図６にイタリック体で示し、表４ａに示す）をも含む。表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）に特異的な捕獲プローブはまた、ＵＢＣ固定化プローブと相補的な固定化配列（配列番号７１；図６にイタリック体で示し、表４ａに示す）をも含む。（概略図については図５Ａ〜Ｃを参照されたい。）
【００９１】
【表７】
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【００９２】
【表８】
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【００９３】
【表９】
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【００９４】
【表１０】
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【００９５】
試料中での微生物由来標的オリゴヌクレオチドの存在を模倣するために、各生物に特異的な捕獲プローブの捕獲配列と相補的な第１の標的配列を含む合成標的オリゴヌクレオチドを使用して、ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ（登録商標）チップを満たした。合成標的オリゴヌクレオチド（配列番号５４、６０、６６）の配列を表５および図６に示す。合成標的オリゴヌクレオチドは、捕獲プローブの捕獲配列と合成標的オリゴヌクレオチドの第１の標的配列とのハイブリダイゼーションを介して生物特異的固定化プローブと結合した（または「それによって捕獲された」）。（概略図については図５Ａ〜Ｃを参照されたい。）合成標的オリゴヌクレオチドの第１の標的配列（配列番号５７、６３、６９）の配列を図６に下線で示し、表６に示す。
【００９６】
【表１１】
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【００９７】
【表１２】
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【００９８】
合成標的オリゴヌクレオチドはまた、５’−ビオチン化検出プローブの生物特異的捕獲配列と相補的な第２の標的配列（配列番号５８、６４、７０；図６に枠で囲って示し、表７に示す）をも含んでいた。検出プローブ（配列番号５６、６２、６８）の配列を表８および図６に示す。検出プローブと結合した５’ビオチン標識も表８および図６に示す。捕獲された合成標的オリゴヌクレオチドの検出は、合成標的オリゴヌクレオチドの第２の標的配列（配列番号５８、６４または７０）とその標的オリゴヌクレオチドに特異的な検出プローブの捕獲配列（配列番号１、６または１０）とのハイブリダイゼーションを介して行われた。したがって、捕獲された標的オリゴヌクレオチドに特異的な検出プローブが固定化された。結合しなかった検出プローブは、洗浄によって除去した。次いでストレプトアビジンが結合した西洋ワサビペルオキシダーゼおよび適当な化学発光基質（ルミノール）を添加した。ストレプトアビジンが結合した西洋ワサビペルオキシダーゼは、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介して、ビオチンを有する固定化された検出プローブと結合した。過酸化水素の存在下で、西洋ワサビペルオキシダーゼは、基質ルミノールの酸化を触媒し、その結果、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって取り込まれる光が放出される。（概略図については図５Ａ〜Ｃを参照されたい。）検出プローブの捕獲配列（配列番号２、７、８）は、図６に枠で囲って示し、表９に示す。
【００９９】
【表１３】
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【０１００】
【表１４】
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【０１０１】
【表１５】
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【０１０２】
１０ｎＭの生物特異的捕獲プローブ、１００ｎＭのビオチン化生物特異的検出プローブ、および５０ｎＭの標的オリゴヌクレオチドを含む試料混合物を、この実施例で使用した各チップ（チップＡ〜Ｅ）上に添加した。標的オリゴヌクレオチドおよびプローブを含む試料混合物を９５℃の加熱ブロック上で５分間加熱し、直ちに氷上で２分間冷却した。ＭＧＸ（登録商標）２０００ハイブリダイゼーションステーション（ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州）を使用して、ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ（登録商標）チップに下記の通りに試薬を順次流した：
ａ．流速５００μＬ／分で緩衝液１（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む塩化ナトリウム−リン酸−ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ））２５００μＬ、
ｂ．ブロッキング試薬（緩衝ヤギ血清）；流速１０μＬ／分で６分、
ｃ．流速５００μＬ／分で緩衝液２（ホルムアミド、ＥＤＴＡ、サルコシンおよびＮａＣｌを含むモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ））１２５０μＬ、
ｄ．ハイブリダイゼーション混合物（１０ｎＭの捕獲プローブ、１００ｎＭの検出プローブ、５０ｎＭの標的オリゴヌクレオチドを含む緩衝液１）；流速１０μＬ／分で２時間、
ｅ．流速５００μＬ／分で緩衝液１  ２０００μＬ、
ｆ．ブロッキング試薬；流速２０μＬ／分で６分、
ｇ．流速５００μＬ／分で緩衝液１  １０００μＬ、
ｈ．染色試薬（ＮａＨ２ＰＯ４、ＥＤＴＡ、ＮＰ４０およびＴｗｅｅｎ−２０を含む溶液中の、ストレプトアビジンが結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ）
ｉ．流速５００μＬ／分で緩衝液１  ２０００μＬ、
基質（ルミノール）。
【０１０３】
３７℃で行った２時間のハイブリダイゼーションのインキュベーションを除いて、ステップはすべて周囲温度で行った。アレイの画像は、ＣＣＤカメラを使用して、ＭＧＸ（登録商標）１２００ＣＬ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ上に取り込んだ。
【０１０４】
【表１６】
2008509664.tif 000018
【０１０５】
結果を図７Ａ〜Ｅに示す。チップＡ（図７Ａ）上で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）に基づくＤＮＡオリゴヌクレオチドが同時に検出された。チップＢ（図７Ａ）は、標的オリゴヌクレオチドを含まない陰性対照を含み、低いバックグラウンドシグナルしか生じなかった。チップＣ、ＤおよびＥ（それぞれ図７Ｃ〜Ｅ）は、それぞれ独立に３つの各病原生物の特異的な検出を示した。３つの生物のいずれについても捕獲系と検出系の間に交差反応はなく、それによって、本発明のプローブおよび方法を使用してこれらの種を識別することができることが示された。
【実施例５】
【０１０６】
標的としてｓｓｒＡまたはＲＮアーゼＰのＲＮＡを使用する、全血からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、および表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の特異的検出の予想実施例
試料の加工処理：体積１０ｍｌの抗凝固処理したヒト全血に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）各１０，０００個を播き、それを周囲温度で１０分間、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理する。イオジキサノール（１．３２ｇ／ｍｌ）を、ダルベッコリン酸緩衝食塩水で密度１．０９０ｇ／ｍｌに希釈することによって密度マトリックスを形成する。上記の生物を含む、溶解した血液の全体積を密度マトリックス１５ｍｌ上に重層する。周囲温度、５４４０×ｇで４０分間の遠心分離によって血液の残骸から生物を分離する。遠心分離ステップの終了時に、密度マトリックスをデカントし、得られた生物ペレットを全ＲＮＡの単離前にＲＮアーゼを含まない水１００μＬ中に再懸濁する。この段階で３つの生物が回収されていることを、確認培地上での増殖、その後の生化学的同定により確認することができる。
【０１０７】
標的調製：ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（ＱＩＡＧＥＮ、ＧｍｂＨ）を使用して、細菌懸濁液１００μＬから全ＲＮＡを調製する。全細菌ＲＮＡを回収し、最終体積６０μＬのＲＮアーゼを含まない水中に再懸濁する。場合によっては、断片化緩衝液（４０ｍＭトリス、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ酢酸マグネシウム、ｐＨ８．０）中でＲＮＡを９５℃で３０分間断片化して、ＲＮＡの２次構造を減らす。
【０１０８】
ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ（登録商標）チップ上での分析：各標的生物、ならびに潜在的に対象となる他の種由来のｓｓｒＡまたはＲＮアーゼＰのＲＮＡに特異的なＤＮＡ捕獲プローブを含むカスタムＤＮＡチップは、ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘによって製造される（ＭＧＸ（登録商標）、ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州）。ハイブリダイゼーションおよび検出の工程は、ＭＧＸ（登録商標）２０００ハイブリダイゼーションステーション上で行うことができる。各捕獲プローブは、長さ約２０塩基の標的特異的領域（捕獲配列）を含み、それは、配列ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＴ（配列番号８７）を有する、５’にある９塩基のリンカーを介して、チップの表面上に固定化される。各標的生物の捕獲プローブは、チップの別個の領域（スポット）内に集中して存在し、それによって試料内に存在する各種の特異的な検出および同定が可能となる。リン酸緩衝食塩水溶液だけをチップ上にスポット化した非特異的ハイブリダイゼーションの陰性対照が含まれる。化学発光検出反応の陽性染色対照として働く、ビオチン標識したＤＮＡオリゴヌクレオチドも表面上に直接スポット化する。図５に示すように、ビオチン標識した検出プローブは、長さが約５０ヌクレオチドであり、捕獲プローブの下流、すなわちその３’に位置する。検出プローブは、ハイブリダイゼーション緩衝液（３０％ホルムアミドを含むまたは含まない、４×ＳＳＰＥ、２．５×デンハルト溶液、ｐＨ７．７）中、終濃度１４０ｎＭで様々な量の断片化全ＲＮＡと混合する。プローブ−標的ＲＮＡ混合物を９５℃で５分間インキュベートし、次いで４５℃の水浴中に入れて１０分間置いた後、非特異的結合を減らすためにヤギ血清で予めブロッキング処理したチップ表面に合計体積６６μＬを添加する。ハイブリダイゼーション工程は、４℃または室温で１０時間、流速１０μＬ／分で行う。次いでストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液（１．２５ｐｇ／μＬ）を使用してチップを満たす。ストレプトアビジン分子は、検出プローブ上のビオチン標識と結合し、そのプローブは、捕獲されたＲＮＡ標的配列と結合する。結合しなかった物質は、４×ＳＳＰＥ、ｐＨ７．７で洗浄することによって除去する。
【０１０９】
検出：ＭＧＸ（登録商標）１２００ＣＬ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用して、標的ＲＮＡの特異的捕獲物を化学発光によって視覚化する。過酸化水素の存在下で、西洋ワサビペルオキシダーゼは、基質ルミノールの酸化を触媒し、その結果、ＣＣＤカメラによって取り込まれる光が放出される。局所バックグラウンドに対してシグナル強度を補正するＭｅｔｒｉＳｏｆｔ（商標）ソフトウェアによってシグナルを収集し分析する。
【０１１０】
予測される結果：陰性対照に対応するスポットではシグナルは検出されないが、染色対照では強い陽性シグナルが生じる。陽性シグナルはまた、元の試料中に存在する特定の１または複数微生物に対応する位置でも検出される。元の血液試料中に播かなかった生物に対応するスポット、すなわち黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の生物に対応するスポットからは、バックグラウンドを上回るシグナルは認められない。
【実施例６】
【０１１１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ（ｓｓｒＡ転写物）、およびＲＮアーゼ−Ｐ転写物用のプローブを使用する、細菌ＲＮＡの特異的検出
下記の実施例は、ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘのＭＧＸ（商標）４Ｄ（商標）ＤＮＡチップ（ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州）を使用する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＲＮＡの特異的な検出を示すものである。
【０１１２】
チップの調製：ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ（登録商標）チップに、（１）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、または表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）のｓｓｒＡ遺伝子（トランスファー−メッセンジャーＲＮＡ（「ｔｍＲＮＡ」）をコードする）の転写物の配列、（２）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、または表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）のリボヌクレアーゼＰ（「ＲＮアーゼＰ」または「ｒｎｐ」）遺伝子の転写物の配列、（３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、（４）膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）１８Ｓ  ｒＲＮＡ、あるいは（５）カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）１８Ｓ  ｒＲＮＡに対する長さ２７〜３３ヌクレオチドの捕獲プローブをスポット化した。生物特異的捕獲配列に加えて、各捕獲プローブは５’−ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＴ（配列番号８７）の９−ｍｅｒの固定化配列を含み、それを介して捕獲プローブをチップ表面に結合した。５’固定化配列を含めた捕獲プローブの配列を表１１に示す。捕獲プローブの捕獲配列を表１２に示す。
【０１１３】
チップ上に固定化した捕獲プローブの位置を図８Ａに示す。図８Ａで認めることができる通り、（「緩衝液」と示された）特定の位置では、緩衝液だけをチップ上にスポット化した。この位置は、非特異的ハイブリダイゼーションの陰性対照として働いた。（「染色」と示された）他の位置では、化学発光検出反応の陽性染色対照として働くビオチン標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドをやはり表面上に直接スポット化した。染色対照オリゴヌクレオチドの配列（配列番号８３）は下記の通りであった：５’−ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＡＧＣ−ビオチン。この実施例で使用したチップ（チップ番号１〜４）はそれぞれ、図８Ａで示された配置で、示された捕獲プローブを有していた。
【０１１４】
【表１７】
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【０１１５】
【表１８】
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【０１１６】
標的ＲＮＡの添加：ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）に基づく抽出プロトコールを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、および表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）から全ＲＮＡを単離した。１×ＳＳＰＥ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液に各生物由来のＲＮＡ（１．５μｇ）を単独でまたは組み合わせて添加し、それを使用して、基本的には実施例４に記載のように複製のＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ（登録商標）チップを満たした。ハイブリダイゼーションは、流速１０μＬ／分で、室温で１０時間にわたって行った。ＲＮＡを使用した組合せを下記および表１３に示す。染色前に、０．８８Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、０．５％サルコシン、３３％ホルムアミドを含むＭＥＳ緩衝液でチップを２回洗浄した。
【０１１７】
捕獲されたＲＮＡの検出：生物特異的な５０−ｍｅｒの検出プローブの３’末端をＢｉｏＴＥＧ（１５原子のテトラエチレングリコールのスペーサーが付いたビオチン）で標識した。下記および表１３に示す組合せで、検出プローブでチップを洗浄した。検出プローブの配列を表１４に示す。検出プローブと結合した３’のＢｉｏＴＥＧ標識も表１４に示す。次いで、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液（１．２５ｐｇ／μＬ）を使用してチップを満たした。ストレプトアビジン分子は検出プローブ上のビオチン標識と結合し、そのプローブは、捕獲されたＲＮＡ標的配列と結合した。結合しなかった物質は、１×ＭＥＳで洗浄することによって除去した。結合した検出プローブを化学発光によって視覚化した。具体的には、化学発光基質（ルミノール）を使用してチップを満たした。過酸化水素の存在下で、西洋ワサビペルオキシダーゼは、基質ルミノールの酸化を触媒し、その結果、ＣＣＤカメラによって取り込まれる光が放出された。ＭＧＸ（登録商標）２０００ハイブリダイゼーションステーション（ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州）上でアッセイを行った。ＣＣＤカメラを備えたＭＧＸ（登録商標）１２００ＣＬ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＭｅｔｒｉＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州）を使用して、アレイの画像を１０秒間にわたって取り込んだ。結果を図８Ｂ〜Ｅに示す。
【０１１８】
【表１９】
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【０１１９】
【表２０】
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【０１２０】
図８Ｂは、この実施例で記載したアッセイを実施した後のチップ番号１を示すＣＣＤ画像である。チップ番号１を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの全ＲＮＡで満たした。洗浄して結合しなかったＲＮＡを除去した後、チップ上の固定化されたＲＮＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｓｓｒＡ、ｒｎｐおよび１６Ｓ  ｒＲＮＡの転写物の配列に特異的な検出プローブ（Ｅｃｏ＿ｓｓｒＡ＿ＤＰ５０（配列番号４３）、Ｅｃｏ＿Ｒｎｐ＿ＤＰ５０（配列番号４９）、およびＥｃｏ＿１６＿ＤＰ５０（配列番号５３））と接触させた。図８Ｂで認めることができる通り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）特異的標的配列および陽性染色対照に対応するチップ上のスポットにのみバックグラウンドを上回るシグナルが生じた。
【０１２１】
図８Ｃは、この実施例で記載したアッセイを実施した後のチップ番号２を示すＣＣＤ画像である。チップ番号２を黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）からの全ＲＮＡで満たした。洗浄して結合しなかったＲＮＡを除去した後、チップ上に固定化されたＲＮＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｓｓｒＡ、ｒｎｐおよび１６Ｓ  ｒＲＮＡの転写物の配列に特異的な検出プローブ（Ｅｃｏ＿ｓｓｒＡ＿ＤＰ５０（配列番号４３）、Ｅｃｏ＿Ｒｎｐ＿ＤＰ５０（配列番号４９）、およびＥｃｏ＿１６＿ＤＰ５０（配列番号５３））と接触させた。図８Ｃで認めることができる通り、陽性染色対照に対応するチップ上のスポットにのみバックグラウンドを上回るシグナルが生じた。
【０１２２】
図８Ｄは、この実施例で記載したアッセイを実施した後のチップ番号３を示すＣＣＤ画像である。チップ番号３を黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からの全ＲＮＡで満たした。洗浄して結合しなかったＲＮＡを除去した後、チップ上の固定化されたＲＮＡを、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｓｓｒＡおよびｒｎｐの転写物の配列に特異的な検出プローブ（Ｓａｕ＿ｓｓｒＡ＿ＤＰ５０（配列番号４４）およびＳａｕ＿Ｒｎｐ＿ＤＰ５０（配列番号５０））と接触させた。図８Ｄで認めることができる通り、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）特異的標的配列および陽性染色対照に対応するチップ上のスポットにのみバックグラウンドを上回るシグナルが生じた。
【０１２３】
図８Ｅは、この実施例で記載したアッセイを実施した後のチップ番号４を示すＣＣＤ画像である。チップ番号４を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）からの全ＲＮＡで満たした。洗浄して結合しなかったＲＮＡを除去した後、チップ上の固定化されたＲＮＡを、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｓｓｒＡおよびｒｎｐの転写物の配列に特異的な検出プローブ（Ｓａｕ＿ｓｓｒＡ＿ＤＰ５０（配列番号４４）およびＳａｕ＿Ｒｎｐ＿ＤＰ５０（配列番号５０））と接触させた。図８Ｅで認めることができる通り、陽性染色対照に対応するチップ上のスポットにのみバックグラウンドを上回るシグナルが生じた。
【０１２４】
試験したすべての組合せについて、陰性対照に対応するスポットでシグナルは検出されず、一方、染色対照では強い陽性シグナルが生じた。強い陽性シグナルは、所与の特定の生物に特異的な検出プローブをチップ上の固定化されたＲＮＡと接触させたときに、その生物に由来する固定化されたＲＮＡを有するスポットでも検出された。所与の特定の生物に特異的な検出プローブをチップ上の固定化されたＲＮＡと接触させなかったときには、その生物に由来するＲＮＡを有するスポットでシグナルは検出されなかった。所与の特定の生物に由来するＲＮＡを、異なる１または複数の生物に特異的な１または複数の検出プローブと接触させても、シグナルは生じなかった。これらのデータは、使用した捕獲プローブと検出プローブがどちらも選択的に特定の標的ＲＮＡと結合できることを示すものである。３つの生物のいずれについても捕獲系と検出系の間に交差反応は認められず、それによって、本発明のプローブおよび方法を使用してこれらの種を識別することができることが示された。
【０１２５】
元の試料中に播かなかった生物に対応するスポット、すなわち黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の生物に対応するスポットからは、バックグラウンドを上回るシグナルは認められない。
【０１２６】
本発明の好ましい実施形態に関して詳細に説明したように、本発明は多数の異なる形の実施形態によって達せられるが、本開示は、本発明の原理を例示するものとみなすべきであり、本明細書で示し説明した特定の実施形態に本発明を限定するものでないことが理解されよう。本発明の趣旨を逸脱することなく、当業者は多数の変更を行うことができる。本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲およびそれと同等のものによって判定される。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】本発明のプローブおよび方法の使用の一実施形態を示す図である。
【図２Ａ】固体支持体に直接固定化した種特異的捕獲プローブを使用する標的オリゴヌクレオチドの検出を示す図である。
【図２Ｂ】固定化プローブを介して固体支持体に固定化した種特異的捕獲プローブを使用する標的オリゴヌクレオチドの検出を示す図である。
【図３】本発明のプローブの固定化に使用することができ、本発明の方法およびキットで使用することができる固体支持体の例を示す図である。
【図４】血液などの試料中の微生物を濃縮することができ、本発明の方法およびキットで使用することができる容器を示す図である。
【図５】ＡからＣは固定化プローブを使用するアレイの異なるスポットに固定化された、本発明に従った例示的な捕獲プローブを示す図である。標的オリゴヌクレオチドは捕獲プローブと結合し、検出プローブは標的オリゴヌクレオチドと結合する。
【図６】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）のｓｓｒＡ（小さく安定なＲＮＡ  Ａ）遺伝子内の離れている領域に由来する合成標的配列を示す図である。これらの配列の捕獲および検出に使用することができる捕獲プローブおよび検出プローブも示す。
【図７Ａ】本発明に従ったプローブを使用する本明細書に記載の方法を使用する例示的なアッセイの結果を示す図である。
【図７Ｂ】本発明に従ったプローブを使用する本明細書に記載の方法を使用する例示的なアッセイの結果を示す図である。
【図７Ｃ】本発明に従ったプローブを使用する本明細書に記載の方法を使用する例示的なアッセイの結果を示す図である。
【図７Ｄ】本発明に従ったプローブを使用する本明細書に記載の方法を使用する例示的なアッセイの結果を示す図である。
【図７Ｅ】本発明に従ったプローブを使用する本明細書に記載の方法を使用する例示的なアッセイの結果を示す図である。
【図７Ｆ】本発明に従ったチップ上の固定化プローブおよび対照の配置を示す図である。
【図８Ａ】記載した方法を使用する例示的なアッセイで使用した、本発明に従った捕獲プローブおよび対照のチップ上での配置を示す図である。
【図８Ｂ】本発明に従ったプローブを使用する本明細書に記載の方法を使用する例示的なアッセイの結果を示す図である。
【図８Ｃ】本発明に従ったプローブを使用する本明細書に記載の方法を使用する例示的なアッセイの結果を示す図である。
【図８Ｄ】本発明に従ったプローブを使用する本明細書に記載の方法を使用する例示的なアッセイの結果を示す図である。
【図８Ｅ】本発明に従ったプローブを使用する本明細書に記載の方法を使用する例示的なアッセイの結果を示す図である。
【図１】
2008509664.tif 000023
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008509664.tif 000028
【図６】
2008509664.tif 000029
【図７Ａ】
2008509664.tif 000030
【図７Ｂ】
2008509664.tif 000031
【図７Ｃ】
2008509664.tif 000032
【図７Ｄ】
2008509664.tif 000033
【図７Ｅ】
2008509664.tif 000034
【図７Ｆ】
2008509664.tif 000035
【図８Ａ】
2008509664.tif 000036
【図８Ｂ】
2008509664.tif 000037
【図８Ｃ】
2008509664.tif 000038
【図８Ｄ】
2008509664.tif 000039
【図８Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2008509664.tif 000041
2008509664.tif 000042
2008509664.tif 000043
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