(57)【要約】一般的方法及び細菌株であって、これによって、ゲノムＤＮＡ、及びＲＮＡに関してプラスミドＤＮＡを劇的に精製できる一般的方法及び細菌株を記載する。１つの好ましい態様では、宿主の核酸の溶解及びヌクレアーゼによる除去は、発酵／回収工程の一体的構成要素であり、これによって下工程の精製を簡素化して収率及び純度を上げ、かつ排液を減らすことができ、その結果製造コストを下げることができる。【選択図】図１
2008509704.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合性スーパーコイル状プラスミドＤＮＡの製造方法であって：
Ａ）１又はそれ以上のプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）をコードする遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内に導入する段階；及びＢ）シグナルペプチド及び均等のプロセスを手段とすることによって前記酵素が周辺細胞質内に向けられるように導入遺伝子配列からの前記ヌクレアーゼの産生を方向付けする段階；及びＣ）プラスミド、コスミド、又は細菌人工染色体レプリコン等のＤＮＡレプリコン存在下に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を増殖させる段階；及びＤ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡは消化されるが、導入されたレプリコンＤＮＡは消化されないようにヌクレアーゼを、細胞質内容物に導く段階；及びＥ）導入された前記レプリコンＤＮＡを細菌内容物から精製する段階を含み；
それにより、前記方法が、プラスミドの純度を上げることを特徴とする製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が、１又はそれ以上のキメラ酵素を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が、融合相手として、ＲＮａｓｅ酵素の少なくとも一部を有するＤＮＡｓｅを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が、ファージＴ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼとＲＮａｓｅＡとを融合したキメラ酵素を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が、ファージＴ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼとＲＮａｓｅＳとを融合したキメラ酵素を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
共有結合性スーパーコイル状プラスミドＤＮＡの製造方法であって：
Ａ）１又はそれ以上のプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）をコードする遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内に導入する段階；及びＢ）シグナルペプチド及び均等のプロセスを手段とすることによって前記酵素が周辺細胞質内に向けられるように導入遺伝子配列からの前記ヌクレアーゼの産生を方向付けする段階；及びＣ）プラスミド、コスミド、又は細菌人工染色体レプリコン等のＤＮＡレプリコン存在下に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を増殖させる段階；及びＤ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡは消化されるが導入されたレプリコンＤＮＡは消化されないように細胞を自己溶解する段階；及びＥ）導入された前記レプリコンＤＮＡを細菌内容物から精製する段階を含み；
それにより、前記方法が、プラスミドの純度を上げる前期製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が、１又はそれ以上のキメラ酵素を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が、ファージＴ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼとＲＮａｓｅＡとを融合したキメラ酵素を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項６に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が、ファージＴ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼとＲＮａｓｅＳとを融合したキメラ酵素を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が、融合相手として、ＲＮａｓｅ酵素の少なくとも一部を有するＤＮａｓｅを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項６に記載の方法において、前記自己溶解を、ファージ溶解タンパク質を用いて行うことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項６に記載の方法において、前記自己溶解を、抗生物質を用いて行うことを特徴とする方法。
【請求項１３】
１又はそれ以上の細菌の菌株を具える物質の組成物であって：
Ａ）１又はそれ以上の融合相手と共に、或いは無しに、少なくとも１つのＴ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼ等のプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）と；Ｂ）少なくとも１つのプラスミドであって、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）を用いて精製により得られるプラスミドの純度を向上させるプラスミドと；を含有する組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）がＴ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼであることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所が交付した研究助成金番号Ｉ  Ｒ４３  ＧＭ０７２１４１−０１による政府の支援を一部受け、行われた。
【０００２】
本出願は、２００４年８月１６日に提出された米国仮特許出願番号第６０／６０２０７４号の利益を主張する。
【０００３】
技術分野
本発明は、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージ、ウイルスベクター、及びそれらのハイブリッド等の、共有結合性環状（ｃｃｃ）組換え体ＤＮＡ分子の産生に関し、より具体的には、前記ＤＮＡ分子を発酵に伴う汚染核酸分子から精製する方法である。
【０００４】
背景技術
本発明は、共有結合性環状（ｃｃｃ）組換え体ＤＮＡ分子の産生に関する。このような分子は、バイオテクノロジー、トランスジェニック生物、遺伝子治療、治療ワクチン接種、農業、及びＤＮＡワクチンに有用である。
【０００５】
発明を考慮しながら、先行技術調査を行った。大腸菌プラスミドは長い間、組換え体ＤＮＡ分子の唯一の重要な供給源として研究者及び産業界に用いられてきた。今日プラスミドＤＮＡは、次世代のバイオテクノロジー製品（遺伝子医薬品及びＤＮＡワクチン）として重要性を増しつつあり、臨床試験にかけられ、最終的には医薬品市場に登場することになるだろう。プラスミドＤＮＡワクチンについては、ウイルス、細菌、又は寄生虫疾患用の予防ワクチン；高い免疫グロブリン産生をもたらすための免疫化剤；感染症用治療ワクチン；又は癌ワクチンとしての応用を見出すことができるだろう。
【０００６】
プラスミドを獲得するための（細菌発酵による）、及びアルカリ溶解法によるそれらの精製に関する基本的な方法は周知である（Ｂｉｍｂｏｉｍ，ＨＣ，Ｄｏｌｙ  Ｊ．１９７９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７：１５１３−１５２３）。まず発酵した細菌細胞のペーストを懸濁して溶解し（水酸化ナトリウム及びドデシル硫酸ナトリウムを組み合わせたものを用いて）、その後酸性塩（例えば酢酸カリウム）を加えて溶液を中和し、細菌ＤＮＡ及び大部分の細胞破砕物を沈殿させる。スーパーコイルを形成しているプラスミドＤＮＡの大部分は、汚染細菌ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質、更に大腸菌エンドトキシン（リポ多糖類若しくはＬＰＳ）と共に溶液中に残る。
【０００７】
代替として、非イオン性界面活性剤の存在下での熱／リソゾーム処理を用いた溶解を用いて、未変性のプラスミドＤＮＡを放出する。超臨界液に高圧を加えるか、又は有機溶媒若しくは界面活性剤による処理でも細胞を溶解して、核酸を放出させることができる。
【０００８】
これらの溶解法は、細胞不純物を放出させ、次にこれらを取り除くための精製段階を必要とする。更に、現在プラスミドＤＮＡ製造に利用されているアルカリ溶解又は熱変性細胞溶解法は、コストが高く、効率が低く、また大量の有毒な廃液物を発生させる。これに代わる、コスト効率的な溶解法はまだ開発されていない。
【０００９】
次に可溶性分画は、濾過により分けられ、ＲＮａｓｅ消化；クロマトグラフィー（イオン交換ゲル濾過、ハイドロキシアパタイト、ゲル濾過、疎水性相互作用、逆相、ＨＰＬＣ等）；透析濾過；有機的抽出、選択的沈殿等を含む、様々な精製段階に供される。
【００１０】
当技術分野で記述されている、溶解後の例示的な下工程のプラスミド精製工程は、ゲノムＤＮＡのレベルを０．０１〜１％以下まで下げる。当技術分野に記述されている以下の工程は網羅的なリストではないが、特定のゲノムＤＮＡを削減する段階を含んでいる：ハイドロキシアパタイトによる０．０１％のゲノム（Ｗｉｌｓ  Ｐ，ａｎｄ  Ｏｌｌｉｖｉｅｒ，Ｍ．２００４  米国特許第６７３０７８１号）、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる０．０５％のゲノム（Ｎｏｃｈｕｍｓｏｎ  Ｓ，Ｄｕｒｌａｎｄ  Ｈａｙｅｓ  Ｒ，Ｙｕ−Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ａ，Ｗｅｌｐ  Ｊ，Ｗｕ  Ｋ，ａｎｄ  Ｒ．２００１  米国特許出願第２００１／００３４４３５号；Ｄｉｏｇｏ  ＭＭ，Ｑｕｅｒｉｏｚ  ＪＡ，Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，ＧＡ，Ｍａｒｔｉｎｓ  ＳＡＭ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ，ＧＮＭ，ａｎｄ  Ｐｒａｚｅｒｅｓ  ＤＭＦ．２０００  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｅｎｇ  ６８：５７６−５８３）、硫安沈殿による１％ゲノム（ＭｃＮｅｉｌｌｙ  ＤＳ．２００１  米国特許第６２１４５８６号）、サイズ排除クロマトグラフィーによる０．２％ゲノム（Ｌｅｍｍｅｎｓ  Ｒ，Ｏｌｓｓｏｎ  Ｕ，Ｎｙｈａｍｍａｒ  Ｔ，ａｎｄ  Ｓｔａｄｌｔｅｒ  Ｊ．２００３．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ  ７８４：２９１−３００）、タンジェンシャルフロー限外濾過による＜１％ゲノム（Ｂｕｓｓｅｙ  ＬＢ，Ａｄｍｓｏｎ  Ｒ  ａｎｄ  Ａｔｃｈｌｅｙ  Ａ．２０００  米国特許第６０１１１４８号）、ポリエチレングリコール分別沈殿による＜１％ゲノム（Ｍａｒｑｕｅｔ  Ｍ，Ｈｏｒｎ  Ｎ，Ｍｅｅｋ  Ｊ，ａｎｄ  Ｂｕｄａｈａｚｉ  Ｇ．米国特許第５５９１０６４号）、ＣＴＡＢ沈殿及びグリオライトＬＲＡ吸着（Ｌａｎｄｅｒ  ＲＪ，Ｗｉｎｔｅｒｓ  ＭＡ，ａｎｄ  Ｍｅａｃｌｅ  ＦＪ．２００２  米国特許出願第２００２／０１５１０４８号）、トリプルへリックスクロマトグラフィーによる０．１％ゲノム（Ｃｒｏｕｚｅｒ  Ｊ，Ｓｃｈｅｒｍａｎ  Ｄ，ａｎｄ  Ｗｉｌｓ  Ｐ．２００１  米国特許第６２８７７６２号）。
【００１１】
プラスミドＤＮＡのヒトへの導入には、幾つかの特別に考慮すべき問題及び困難が存在しており、これらについては感染症予防プラスミドＤＮＡワクチンに関する考慮点を含めＦＤＡ行政指針に説明されている（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９９６  Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  ｃｏｎｓｉｄｅｒ  ｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ＤＯＣＫＥＴ  ＮＯ．９６Ｎ−０４００、及びＦｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９９８  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．）。これら文書は、様々な汚染物質に関する関心事を示しており、また各汚染物質のレベルの評価に使用できる試験を提示している。しかしながらこの指針文書は、汚染ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はタンパク質の最大許容レベルについては、それらが不明であるために提示していない。しかしながら、ゲノムＤＮＡの許容可能な限界が１００ｐｇであるゲノムＤＮＡ／組換え体タンパク質薬物に関するＦＤＡガイドラインが現在要求している投与量規格（ＦＤＡ．１９９３  Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  ｃｏｎｓｉｄｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を１ｍｇのＤＮＡワクチン投与量に当てはめると、それは０．００００１％となる。この値は、標準的な、大規模なＤＮＡ調製（０．０１〜５％ゲノムＤＮＡ）に比べ数桁低いレベルであり、現時点で利用可能な経済効果的な製造方法を用いて達成することはできない。ゲノムＤＮＡから、汚染物質を更に減らすための新規の方法が必要とされている。
【００１２】
核酸は、工程の初期（例えばヌクレアーゼ消化によって）又は後期（例えばクロマトグラフィー分離によって）取り除くことができる。最近まで、比較的一般的な方法では、ＲＮＡを分解するために、溶解バッファーの中にウシ膵臓リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  Ａ）を使用していた。それは、ＲＮＡの量及びサイズの低減に関して応分の効果を有しているものの、同時にウシ由来のＲＮａｓｅを持ち込むこととなり、これがウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）病原体として知られるプリオン病原体に汚染されている可能性があることから、管理上望ましくなかった。実際、動物製品を用いない（ＡＰＦ）状態で、細菌産物（ヒト又は動物への使用を目的とする）の発酵及び精製を全て実施することへの要望がますます強くなっている。
【００１３】
現在、我々は、大腸菌のゲノムＤＮＡを、スーパーコイルを形成したプラスミドを未変性のまま特異的に分解できる、効率の高い市販酵素を知らない（「プラスミドセーフヌ」クレアーゼ）。しかしながら、特殊な例では、ＡＴＰ依存性Ｒｅｃ  ＢＣＤエクソヌクレアーゼ酵素（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌａｒｇｅ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  Ｋｉｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｊｕｎｅ  ２００３；Ｗａｈｌｅ，Ｓ，Ｓｃｈｏｒｒ  Ｊ，ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ  Ｍ．２００１  米国特許第６２４２２２０；Ｉｓｆｏｒｔ  ＲＪ  １９９２  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：７９８−８０４）のようなヌクレアーゼが、部分精製したプラスミドＤＮＡ調製物に加えられている。これと関連するアプローチでは、粗プラスミド調製物を加熱処理し、非環状ＤＮＡを全て単鎖型に変性し、次にＳＩヌクレアーゼ、ヤエナリヌクレアーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、Ｔ７エクソヌクレアーゼ、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼＩ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、エクソヌクレアーゼＶＩＩ又はラムダエクソヌクレアーゼ（Ｈｙｍａｎ  ＥＤ．国際特許出願第９２／１３９６３号）のような単鎖エクソヌクレアーゼが加えられる。これらのＤＮａｓｅ酵素は溶解物に直接加えることはできないが（ＲＮａｓｅのように）、それはこれらの酵素が一般的にＲＮａｓｅよりも脆弱であり、かつアルカリ／ＳＤＳ環境内で不活性化されるからである。それ故にこのようなアプローチは、商業規模のプラスミド製造にとっては不経済であり、実用的ではない。
【００１４】
プラスミドＤＮＡ調製物への精製ヌクレアーゼ添加に伴う障害を克服するために、内因性ヌクレアーゼを利用してゲノムＤＮＡを除去する別の方法が開発されている。初期の方法は、全体的なＤＮＡ損傷（修復欠失宿主での紫外線照射（Ｓａｎｃａｒ  Ａ，Ｈａｃｋ  ＡＭ，ａｎｄ  Ｒｕｐｐ  ＷＤ．１９７９  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３７：６９２−６９３）、又は染色体に比べ損傷を受ける確率が低いことで（即ちゲノムより標的の方が小さい）プラスミドが生き残る電離放射線照射（ＭａｃＰｈｅｅ  ＤＧ，Ｒａｄｆｏｒｄ，ＡＪ，ａｎｄ  Ｒｅａｎｎｅｙ  ＤＣ、１９８８  米国特許第４７５５４６４号）を用いた；内因性ヌクレアーゼ（例えばＲｅｃＢＣＤ）が仲介する分解は、ゲノム内のＤＮＡ切断部位から進行する。制限エンドヌクレアーゼを用いてゲノムＤＮＡを切断する、より特異的なシステムが報告されているが、このシステムでは制限エンドヌクレアーゼ活性は、熱感受性メチラーゼによって制御されている。制限温度への移行によりメチラーゼは不活性化され、ゲノムＤＮＡの切断、続いて内因性エクソヌクレアーゼ消化が起こる（Ｈａｎａｋ，Ｊ，Ａｌｅｘｉｓ  Ｊ，ａｎｄ  Ｗａｒｄ  ＪＭ．２００１  国際特許出願第０１／２９２０９号）。しかしながら、これらの方法でのゲノムの減少レベルは小さく、またプラスミドは遺伝子工学的に作り変えて制限酵素部位を欠くようにする必要があることもあり、この方法を一般的に利用することはできない。
【００１５】
組換え体ヌクレアーゼをその周辺細胞質空間内に発現させて、細胞増殖中の大腸菌遺伝子の発現を妨害しないようにした特殊な大腸菌株が開発されている。１つの例では、ウシ膵臓ＲＮａｓｅは、分泌シグナルを用いて周辺細胞質空間に向けられており、溶解するとＲＮａｓｅはＲＮＡと混じり合い、これを分解する（Ｃｏｏｋｅ  ＧＤ，Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈ  ＲＭ，Ｈａｎａｋ  ＪＡＪ，Ｄｕｎｎｉｌｌ  Ｐ，Ｔｈａｔｃｈｅｒ  ＤＲ，Ｗａｒｄ  ＪＭ．２００１  Ａ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８５：２９７−３０４）。このシステムを利用し、アルカリ溶解中にＲＮＡレベルを下げる。この方法では、ゲノムＤＮＡは減らない。タンパク質又はその他生物材料調製物の核酸汚染を減らすために、周囲細胞質にブドウ球菌ヌクレアーゼ（Ｃｏｏｋｅ  ＧＤ，Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈ  ＲＭ，Ｈａｎａｋ  ＪＡＪ，Ｗａｒｄ  ＪＭ．２００３  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０１：２２９−２３９；Ｈｕｉｓｍａｎ  ＧＷ，Ｌｕｏ  ＬＺ，ａｎｄ  Ｐｅｏｐｌｅｓ  ＯＰ．２００４  米国特許出願第２００４／００１４１９７号；Ｂｏｙｎｔｏｎ  ＺＬ，Ｋｏｏｎ  ＪＬ，Ｂｒｅｎｎａｎ  ＥＭ，Ｃｌｏｕａｒｔ  ＪＤ，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ  ＤＭ，Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ  ＴＵ，ａｎｄ  Ｈｕｉｓｍａｎ  ＧＷ．１９９９  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：１５２４−１５２９）、又は内因性大腸菌ＥｎｄＡ周辺細胞質ヌクレアーゼ（Ｌｅｕｎｇ  ＷＳ，ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ  ＪＲ．２００１  米国特許第６２５８５６０号）を過剰発現させる類似のシステムが開発されている。これらのシステムはプラスミドにとって安全ではなく、活性にとって穏やかなタンパク質精製工程及び緩衝液を必要とする。発酵培養におけるプラスミド−セーフＤＮａｓｅの誘導は、２００３年にＫｅｌｌｙによって理論的な観点で論じられているが（Ｋｅｌｌｙ  ＷＪ．２００３  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３７：２１９−２２３）、方法論又はヌクレアーゼについては明記されていない。
【００１６】
タンパク質製造を容易にするための自己溶解細胞株が開発されている（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ、上記、２００１）。この細胞株では、細胞はリソゾームを細胞質内で発現しており、リソゾームが漏出できるチャンネルを作るホリン（膜拡張ペプチド又はタンパク質）を同時発現させることによって、望む時間に周辺細胞質に放出させることができる。利用可能な例示的リソゾーム／ホリンの組み合わせは、当技術分野で公知である。いくつかのリソゾーム／ホリンの組み合わせは、１９９２年Ｙｏｕｎｇが論じており（Ｙｏｕｎｇ  Ｒ  １９９２  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌｅｃ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５６：４３０−４８１）、参照によって本明細書内に組み入れられている。ラムダファージ溶解タンパク質が、タンパク質製造向け自己溶解細胞株に用いられている（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ、上記２００１）。
【００１７】
自己溶解条件では、アルカリ又は熱溶解とは異なりゲノムＤＮＡを選択的に変性することはない。溶解産物は非常に粘性であり、処理上問題となっている。タンパク質の製造では、細胞株に非特異的ヌクレアーゼを加えるか、又は周辺細胞質に発現させて（例えば、ｅｎｄＡヌクレアーゼ  Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ、上記、２００１、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｃｏｏｋｅら、上記、２００３、Ｈｕｉｓｍａｎら、上記、２００５、Ｂｏｙｎｔｏｎら、上記１９９９）細胞溶解後に粘度を下げる。このようなシステムは、プラスミド製造には利用できない。
【００１８】
プラスミド製造に用いられる精製工程は、非経済的、非効率であり、かつ大量の有毒廃液を生じる。残留ゲノムＤＮＡのレベルは、市販製品に関する現在受け入れ可能な基準よりも遙かに高い。これら制約は、プラスミドＤＮＡ製造工程の商業化にとって大きな費用及び純度の負担となっている。
【００１９】
先行技術を見る限り、ゲノムＤＮＡ削減の経済効果的な方法は今も求められている。同様に、不経済な、又は有毒な化学物質を減らす、簡便で安価な精製工程も求められている。
【発明の開示】
【００２０】
発明は、ＤＮＡ精製方法であり、この方法ではプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）をコードする１又はそれ以上の遺伝子が細菌ゲノム内に挿入され、それは周辺細胞質空間内に分泌されるタンパク質として発現される。プラスミド又はＤＮＡレプリコンが細胞内で増殖すると、ヌクレアーゼが細胞質に再導入され、所望のレプリコン以外の核酸を排除し、レプリコンの精製を容易にする。１つの好ましい態様では、ヌクレアーゼはキメラヌクレアーゼである。別の好ましい態様では、キメラヌクレアーゼは、融合相手としてＲＮａｓｅ酵素の少なくとも一部分を有するＤＮＡｓｅである。更に別の好ましい態様は、ファージＴ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼとＲＮａｓｅＡ又はＲＮａｓｅＳを融合したキメラ酵素を利用する。好ましい形態の方法では、ヌクレアーゼは、シグナルペプチド又は同等の工程を手段として周辺細胞質空間に向けられ、細胞は、細菌ゲノムＤＮＡ及び／又はＲＮＡは消化され、導入されたレプリコンのＤＮＡは消化されない形で自己溶解し、それによって導入されたレプリコンの精製を容易にする。更に別の好ましい態様では、自己溶解は細胞内で発現させたファージ溶解タンパク質の使用を通じて、又は抗生物質の使用を通じて達成される。発明は、融合相手を持つ、又は持たない、少なくとも１つのプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）を有する細菌株、及びプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）によりその精製が簡便化されるプラスミドを含む。
【００２１】
本発明の概要
本発明の目的、及び／又は目標は、問題の組成物及びプラスミド精製工程を提供することである。本発明の別の目標は、精製したプラスミドＤＮＡ中の核酸不純物を減らす方法を提供することである。本発明の更に別の目標は、プラスミドＤＮＡ精製の製造コストを下げることである。本発明の更に別の目的及び／又は目標は、プラスミドＤＮＡ精製中の有毒廃液を減らすことである。別の開示は、：切れ目の入った（開環型）又は直鎖型のプラスミドの量を減らすことによるプラスミドの品質の向上；複数の製造段階を排除することによる簡素化；複数の製造段階を排除することによるコスト軽減；下工程進行前に主要な汚染物質を排除することによる、プラスミド精製後の核酸不純物の減量によるプラスミドの品質向上；最終プラスミド調製物からのゲノムＤＮＡ排除による法律遵守の向上；リボヌクレアーゼＡのような動物産物起源材料を排除することによる法律遵守の向上；並びに有害廃液を排除することによる法律遵守の向上により改善された、当技術分野に画定されている工程に対し改良されたプラスミド製造工程である。
【００２２】
本発明の更なる目標及び利点は、図面及び以下の記載を考慮することによって明らかになるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の詳細な説明
次に図面１を見ると、大規模なプラスミド調製における、Ｔ５エクソヌクレアーゼを用いた変性プラスミド及び大腸菌ゲノムＤＮＡの消化が描かれている：１）ＤＮＡ分子量マーカー［最大バンドは１２キロベースである］；２）大規模プラスミド調製工程中のプラスミドサンプル；３）Ｔ５エクソヌクレアーゼ付加なしのコントロールＴ５エクソヌクレアーゼで反応させた同一のサンプル；４）２％ｗ／ｗのＴ５エクソヌクレアーゼで消化した同一のサンプル。最下部のバンドは、スーパーコイル体、中央のバンドは、スーパーコイル形成ダイマーと切れ目の入ったモノマーの混合物、最上部のバンドは切れ目の入ったダイマーとゲノムＤＮＡとの混合物である。ゲノムＤＮＡ及び切れ目入りプラスミドは、中央及び最上部のバンドから定量的に取り除かれる。同様の結果は、１％ｗ／ｗのＴ５エクソヌクレアーゼでも見られる。
【００２４】
図２には、ｐＶＥＸＳａｐＩスタッファーベクターを例示している。
【００２５】
図３には、ｃＤＮＡ配列の定方向増幅及びｐＶＥＸベクター内へのクローニングの方法を例示している：Ａ）クラスＩＩＳ酵素を用いた消化により創られた切断点間に位置する、２つの固有のアドレスタグを含むプラスミド、及び；Ｂ）クラスＩＩＳ酵素認識シグナル（ＳａｐＩ）、少なくとも１つの介在ヌクレオチド、及び固有の非パリンドローム配列を有する重複領域（ＧＧＧ、この例でのアドレスタグ）を含む、典型的プライマー。
【００２６】
図４には、ｐＶＥＸＳａｐＩＯｍｐＡスタッファーベクターを例示している。
【００２７】
図５には、ｐＶＥＸＢＳａｐＩＯｍｐＡスタッファーベクターが示されている。
【００２８】
図６には、ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＲＮａｓｅベクターを例示している。
【００２９】
図７には、ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＴ５ＲＮａｓｅベクターが示されている。
【００３０】
図８には、Ｔ５ＲＮａｓｅエクソヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの除去が示されている。好ましいＴ５エクソヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅ遺伝子が存在する場合と存在しない場合のプラスミドＤＮＡ調製物のゲルの写真が示されている：レーン１、５及び９は、Ｔ５ＲＮａｓｅ誘導例である；レーン３、７及び１１はＴ５ＲＮａｓｅ非誘導例である；レーン２、６及び１０は、ＲＮａｓｅ誘導例であり；レーン４、８及び１２はＲＮａｓｅ非誘導例である。サンプル１〜８は、Ｑｉａｇｅｎ調製したアルカリ溶解後の核酸である。サンプル９〜１２は、急速抽出した全ＤＮＡである。サンプル５〜１２は、４℃保存した細胞のものであり、一方サンプル１〜４は−２０℃保存した細胞のものである。Ｍ）はＤＮＡ分子量マーカーを表す。最大のバンドは１２キロメースである。上から、最大分子量バンドはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）であり、次のバンドはスーパーコイル形成ダイマープラスミドＤＮＡ［ｐＤＮＡ（２ｘ）］、次がスーパーコイル形成モノマープラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）であり、最も速く移動するバンドはＲＮＡ（ＲＮＡ）である。レーン１の矢印は、ゲノムＤＮＡの減少を強調している。
【００３１】
図９では、Ｓペプチド及びＳタンパク質の会合を用いたＲＮａｓｅＳ−Ｔ５キメラ作成を図解している。
【００３２】
図１０には、キメラヌクレアーゼによる核酸の加水分解が示されている。
【００３３】
図１１には、Ｓペプチド−Ｔ５＋Ｓタンパク質及びＴ５ＲＮａｓｅ構築体によるＲＮＡの減少が示されている。アルカリ溶解物を、指示したプラスミドを含むＤＨ５α細胞の誘導培養物から調製し、核酸をエタノールで沈殿させてから１％アガロースゲルで分析した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた後染色によって、ＲＮＡ（主要バンド）が検出された：レーン１＝ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＳ−ペプチドＴ５＋ｐＡＣＹＣＢＯｍｐＡＳタンパク質；レーン２＝ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＴ５−Ｓペプチド＋ｐＡＣＹＣＢＯｍｐＡＳタンパク質；レーン３＝ｐＶＥＸＢＰｈｏＲＮａｓｅ；レーン４＝ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＴ５ＲＮａｓｅ；レーン５＝ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＴ５；及びレーン６＝ｐＶＥＸＢＰｈｏＡ（フレームシフト）ＲＮａｓｅ（陰性コントロール）。
【００３４】
図１２には、Ｓペプチド−Ｔ５＋Ｓタンパク質構築体によるＲＮＡ及びゲノムＤＮＡの削減が示されている。アルカリ溶解物は、指示したプラスミドを含むＤＨ５α細胞の誘導（レーン１〜４及び６）並びに非誘導（レーン５）培養物から調製し、核酸をエタノールで沈殿させ、１％アガロースゲルで分析した。ＲＮＡ及びＤＮＡは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩを用いた後染色によって検出した：レーン１＝ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＳ−ペプチドＴ５；レーン２＝ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＳ−ペプチドＴ５＋ｐＡＣＹＣＢＯｍｐＡＳタンパク質；レーン３＝ｐＡＣＹＣＢＯｍｐＡＳタンパク質；レーン４＝ｐＶＥＸＢＰｈｏＡＳペプチド−Ｔ５；レーン５＝ｐＶＥＸＢＰｈｏＡＳペプチド−Ｔ５＋ｐＡＣＹＣＢＯｍｐＡＳタンパク質（非誘導）；及びレーン６＝ｐＶＥＸＢＰｈｏＡＳペプチド−Ｔ５＋ｐＡＣＹＣＢＯｍｐＡＳタンパク質（誘導）。レーン２の矢印は、ＲＮＡバンド（最下層）及びゲノムＤＮＡバンド（最上部）の削減を強調している。
【００３５】
図１３には、ＰｈｉＸ１７４遺伝子Ｅ小孔を通る、大腸菌細胞質内容物の放出が示されている
【００３６】
図１４には、ｐＡＣＹＣＢ未変性スタッファーベクターが示されている。
【００３７】
図１５には、ｐＡＣＹＣＢ遺伝子Ｅベクターを例示している。
【００３８】
図１６には、遺伝子Ｅ溶解タンパク質が仲介するプラスミド放出が示されている。１のｐＡＣＹＣＢ遺伝子Ｅ＋ｐＤＮＡＶＡＣＣＵｌｔｒａ−ＥＧＦＰと共に培養した細胞は非誘導であり、２はアラビノースＡで４０分間誘導したものである：Ａ＝全核酸（沈殿）；Ｂ＝ＰＩバッファー抽出後に残った全核酸（沈殿）；Ｃ＝ＰＩ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）抽出核酸；Ｄ＝ＬＢ（培地）核酸；Ｅ＝ＰＢＳ抽出核酸；Ｆ＝１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５抽出核酸；Ｇ＝５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７抽出核酸；及びＨ＝１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２抽出核酸。Ｍ）はＤＮＡ分子量マーカーを表す。最大バンドは１２キロベースである。上から、最大分子量バンドはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）であり、次のバンドはスーパーコイル形成ダイマープラスミドＤＮＡ［ｐＤＮＡ（２ｘ）］及びスーパーコイル形成モノマープラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）であり、最も速く移動しているバンドはＲＮＡ（ＲＮＡ）である。
【００３９】
図１７には、抗生物質誘導自己溶解後の、ヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡ除去が示されている。レーン１＝ＤＮＡ分子量マーカー；レーン２＝自己溶解後の全ＤＮＡ（ｐＡＣＹＣＢＴ５ＲＮａｓｅ＋ｇＷｉｚＧＦＰ株）；レーン３＝自己溶解後の全ＤＮＡ（ｐＡＣＹＣＢ未変性スタッファー＋ｇＷｉｚＧＦＰ株）；及びレーン４＝レーン２のサンプルを３７℃で３０分間インキュベーションしたもの。矢印は、Ｔ５ＲＮａｓｅ株においてゲノムＤＮＡバンドが除去されていることを強調している。
【００４０】
図１８には、プラスミド製造での周辺細胞質ヌクレアーゼ発現製造用宿主の使用が示されている。形式１は、細胞溶解前に前処理を利用してゲノムＤＮＡ、切れ目入り、若しくは直鎖型プラスミド、及び／又はＲＮＡを除去しているが、形式２は細胞溶解後の後処理（又は同時処理）を利用して、ゲノムＤＮＡ、切れ目入り若しくは直鎖型プラスミド、及び／又はＲＮＡを除去する。
【００４１】
図１９には、自己溶解プラスミド製造工程での周辺細胞質ヌクレアーゼ発現製造用宿主の使用を例示している。
【００４２】
定義
自己溶解：βラクタム誘導細胞溶解、ｐｈｉＸ１７４ファージ溶解タンパク質誘導ゴースト形成、ファージリソゾーム／ファージホリン同時発現によるＴ４又はラムダファージ誘導細胞溶解等の細胞を自己溶解させる溶解方法。
【００４３】
ｃｃｃ：共有結合性環状
【００４４】
キメラ酵素：酵素と第二タンパク質との融合物、例えばファージＴ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼとウシＲＮａｓｅＡの断片若しくは全体との融合物。
【００４５】
ＤＮＡレプリコン：プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、バクテリオファージ、ウイルスベクター、及びそれらのハイブリッド。
【００４６】
ゴーストバンド：変性したｃｃｃＤＮＡ。
【００４７】
ｐＤＮＡ：プラスミドＤＮＡ
【００４８】
ファージ溶解タンパク質：細胞に自己溶解又はｐｈｉＸ１７４ファージ溶解タンパク質により誘導されるゴースト形成のようなゴースト形成を引き起こす、或いはＴ４、又はラムダファージリソゾーム−ホリン同時発現により誘導される細胞溶解を引き起こすタンパク質。
【００４９】
プラスミド：プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、バクテリオファージ、ウイルスベクター、及びそれらのハイブリッド。
【００５０】
プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）：様々な形態のＤＮＡを分解するが、プラスミドを含む共有結合性環状（ｃｃｃ）ＤＮＡは分解しないエンドヌクレアーゼ。
【００５１】
ＲＮａｓｅ：リボヌクレアーゼ。
【００５２】
ＲＮａｓｅＡ：ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ。
【００５３】
Ｔ５エクソヌクレアーゼ：バクテリオファージＴ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼ。
【００５４】
本発明は、機械式発酵容器を用いた、グラム陰性細菌の大腸菌を製造用宿主として用いるプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）製造中にゲノムＤＮＡを削減するための方法に関する。
【００５５】
精製技術の大きな問題は、大腸菌ゲノムＤＮＡからのｐＤＮＡの分離である。本発明は、共有結合性環状（ｃｃｃ）ＤＮＡを単離する間にゲノムＤＮＡを削減するための方法である。プラスミド製造にヌクレアーゼを利用する、費用効率の良いアプローチが開発されている。「プラスミド−セーフ」ヌクレアーゼを周辺細胞質空間に分泌させて、それにより細胞増殖中は細胞を保護し、かつ回収時又は細胞溶解中にはヌクレアーゼとゲノムＤＮＡとが接触するように制御する。
【００５６】
ヌクレアーゼ産生の好ましい態様
発明の、１つの好ましい態様では（図１０）、１又はそれ以上の特殊な「プラスミド−セーフ」加水分解酵素（Ｔ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼ、ＲｅｃＢＣＤエクソヌクレアーゼ、その他ＡＴＰ依存的エクソヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、エクソヌクレアーゼＶＩＩ、又はキメラ、ハイブリッド酵素）は、シグナルペプチド又はその等価物を手段として周辺細胞質空間内に分泌され、その後酵素は細胞増殖又はｐＤＮＡ誘導／製造が完了するまでその場所に隔離される。酵素と細胞質内容物とが制御的に合わされると（膜の破断又は細胞質内への制御的な移入により）、酵素は、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、タンパク質、炭水化物、リポ多糖類等のような不要な細菌性物質を消化又は加水分解し、実質的に精製されたプラスミドＤＮＡを生ずる。
【００５７】
未変性ヌクレアーゼを用いることもできる。ＲｅｃＢＣ（エクソヌクレアーゼＶ）、及びＲｅｃＢＣＤエクソヌクレアーゼ、関係するグラム陽性ＲｅｘＡＢ若しくはＡｄｄＡＢエクソヌクレアーゼ、アルケオン（Ａｒｃｈｅｏｎ）エクソヌクレアーゼ（例えばＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ＡｄｄＡＢ）その他ＡＴＰ依存性エクソヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、エクソヌクレアーゼＶＩＩのような任意のプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が利用できる。これは網羅的なリストではなく、大腸菌由来の、又はその他細菌、アルケオン、又は真核生物を供給源とするヌクレアーゼも考えられる。「ゴーストバンド」を除去するバクテリオファージＴ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼのようなヌクレアーゼが好ましい。
【００５８】
プラスミド−セーフ好熱性ヌクレアーゼの場合は、必要とされる増殖温度において酵素の活性が十分低いのであれば、ヌクレアーゼを周辺細胞質に分泌させる必要はないだろう。これにより、発酵中に熱処理（４２〜９５℃）するといった別のゲノム削減法が利用できるようになるだろう。
【００５９】
本発明は、スーパーコイルを形成したプラスミドＤＮＡを消化することなく、ゲノムＤＮＡ、及び好ましくは変性され、切れ目の入ったプラスミドＤＮＡを消化する「プラスミド−セーフ」エクソヌクレアーゼの使用を考える。好ましくは、バクテリオファージＴ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼ（Ｔ５エクソヌクレアーゼ）は、プラスミド処理に用いる候補ＤＮａｓｅである。Ｔ５エクソヌクレアーゼは、スーパーコイルを形成したプラスミドは消化しないが、直鎖型の単鎖及び二本鎖ＤＮＡ（Ｓａｙｅｒｓ  ＪＲ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ．１９９０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８３１１−１８３１７）を消化するだけでなく、生物学的活性を保持していることが多く、かつ制限酵素消化に対し退縮性である「ゴースト又はシャローバンド」ＤＮＡのような変性ループを持つＤＮＡも消化できる（Ｓａｙｅｒｓ  ＪＲ，Ｅｖａｎｓ  Ｄ，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＢ．  １９９６  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４１：１８６−１８９）。我々は、精製されたＴ５エクソヌクレアーゼを利用して、大規模（１グラム）なプラスミド調製のサンプルに存在する、全ての非スーパーコイル形成ＤＮＡ種を特異的に排除できることを証明した（図１）。
【００６０】
キメラヌクレアーゼも考えられる。これは、ヌクレアーゼ酵素を、それ自体はアルカリ溶解、又は想定される大規模なプラスミド調製方法の最中に予想される不活性化又は除去に対し耐性である融合相手と会合させることによって達成できる可能性がある。融合相手は、所望する安定化又は局在化の特性を付与する任意のタンパク質又はペプチドでよい。好ましい態様では、「プラスミド−セーフ」ヌクレアーゼの１つであるＴ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼを融合相手と融合させたキメラヌクレアーゼが用いられる。例えば、ウシ膵臓ＲＮａｓｅ  Ａは、過酷なアルカリ溶解プラスミド調製法における不活性化又は除去に耐性である。同様に、大腸菌で発現されたＲＮａｓｅは、アルカリ溶解物の透明な上清中に、活性な形で回収される。又は、チオレドキシン（Ｌｕ  Ｚ，ＤｉＢｌａｉｏ−Ｓｍｉｔｈ  ＥＡ，Ｇｒａｎｔ  ＫＬ，Ｗａｒｎｅ  ＮＷ，ＬａＶａｌｌｉｅ  ＥＲ，Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ  ＬＡ，Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ  ＭＴ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ＭＪ，ａｎｄ  ＭｃＣｏｙ  ＪＭ  １９９６  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１：５０５９−５０６５）、アルファ−シヌクレインのＣ末端安定化ドメイン（Ｋｉｍ  ＪＳ．２００３、米国特許出願第２００３／０１２５５２２号；Ｐａｒｋ  ＳＭ，Ａｈｎ  ＫＪ，Ｊｕｎｇ  ＨＹ，Ｐａｒｋ  ＪＨ，ａｎｄ  Ｋｉｍ  Ｊ．２００４  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．ＳｅＩ．１７：２５１−６０）、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  Ｋａｎｄｌｅｒｉ由来の熱安定性Ｆｔｒ（ｄｅ  Ｍａｒｃｏ  Ａ，Ｃａｓａｔｔａ  Ｅ，Ｓａｖａｒｅｓｉ  Ｓ，Ｇｅｅｒｌｏｆ  Ａ．２００４  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０７：１２５−３３）、又は融合相手の安定性を高めるその他のタンパク質（Ｚｈｏｕ  Ｐ，Ａｌｅｘｅｙ  Ｌ，ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ  Ｇ．２００３  米国特許出願第２００３／００９２８８５号；Ｓａｎｄｅｒｓ  ＭＣ．２００２．米国特許出願第２００２／０１４２３８４）も考えられる。
【００６１】
最も好ましくは、ＲＮａｓｅとＤＮａｓｅ酵素の活性を、ＤＮＡ処理方法に適合するような様式に合わせることが望ましい。これを行う１つの方法は、少なくともＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅ活性を含むハイブリッド酵素が同時発現している細菌株を開発することである。このアプローチを成功させるためには、ハイブリッド酵素をまずは周辺細胞質に分泌させて（核溶解から細胞保護する）、溶解中にその活性を失わないようにＤＮａｓｅ酵素を保護する必要がる。
【００６２】
我々は、本明細書の中で、ＲＮａｓｅＡ又はＲＮａｓｅＳと融合したＴ５エクソヌクレアーゼを周辺細胞質に局在的に発現している複数の細胞株において、プラスミド製造中にゲノムＤＮＡ及びＲＮＡが除去されることを証明する。我々は、これら融合酵素が、アルカリ溶解、自己溶解、又は抽出によるプラスミド加工中の汚染核酸の除去に応用できることを証明した。
【００６３】
プラスミドＤＮＡ製造を改善するための、製造用宿主へのＴ５エクソヌクレアーゼの使用は、先行技術において提案も実施もされていない。キメラヌクレアーゼへのＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅヌクレアーゼの結合もまた、先行技術において提案されていない。これに加えて、キメラヌクレアーゼのプラスミド製造への使用も、先行技術で提案されていない。本明細書に報告されているＴ５エクソヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅの新規の融合は、二種類の主要な核酸汚染物を同時に削減することを可能にする。二つの重要な要素を組み合わせることに加え、ＲＮａｓｅ要素は、予想外にもＤＮａｓｅ成分の活性を増進した（図１２）。この相乗的な結果が、キメラヌクレアーゼの性能を、非融合型の親構築体に対し高いものにしている。同様に、会合していない二成分（例えばＲＮａｓｅ及びＴ５エクソヌクレアーゼ）に比べると、単一のタンパク質成分は製造用細胞株に遺伝子工学的に作り変え易く、かつ発現時の制御も容易である。
【００６４】
プラスミド製造工程の好ましい態様
プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）発現細胞は、発酵培養によって製造される。製造後、細胞からプラスミドを精製する。プラスミド精製は、当技術分野に記載されているアルカリ溶解、熱溶解、又は機械式溶解法を選好して利用できる。
【００６５】
ゲノムＤＮＡの削減は、溶解前、及び／又は溶解中、及び／又は溶解後に起こってよい。ゲノムの削減は、浸透圧ショック（Ｂａｋｅｒ，Ｍ，Ｔａｙｌｏｒ  Ｍ，ａｎｄ  Ｕｐｐａｌ  Ｓ．２００３  ＷＯ  ０３／０４６１７７Ａｌ）のようなプラスミド抽出中に起こってもよいが、この場合、発明の周辺細胞質に存在するか、又は分泌されたヌクレアーゼは、細胞からＤＮＡを抽出する間にゲノムＤＮＡを排除する。
【００６６】
プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）含有株は、二つの好ましいプラスミド精製形式に利用される（形式１及び２、図１８）。
【００６７】
形式１は、細胞溶解前（前処理段階）のゲノムＤＮＡ（及びキメラヌクレアーゼによるＲＮＡ）の排除を含む。ヌクレアーゼは、製造後に細胞質内に導入される（即ち内膜浸透化）。我々は、ＯｍｐＡＳ−ペプチドＴ５＋ＯｍｐＡＳタンパク質構築体（図１１〜１２）及びＯｍｐＡＴ５ＲＮａｓｅ（図８）構築体を用いた前処理とアルカリ溶解により、ＲＮＡ及びＤＮＡが削減されることを証明した。
【００６８】
バクテリオファージホリンのような誘導性の膜破壊因子、又は膜破壊化学物質若しくは界面活性剤を相前後して使用して、発酵サイクルの最後、加工が始まる前に加水分解酵素を細胞質に直接、選択的に誘導できるかもしれない。この前処理によって、細胞ペーストを加工する前に細胞内での消化範囲をいくらか制御することができる。この改良によって、酵素を溶解剤から保護する必要がなくなる（それらが溶解前に活性となるため）。同様に、この形式では、ＲｅｃＢＣＤのような内因性ヌクレアーゼも、標的となるゲノムＤＮＡの分解に関与することができる。
【００６９】
形式２は、特定の前処理段階を加えないゲノムＤＮＡ（及びキメラヌクレアーゼによるＲＮＡ）の排除を含む。ゲノムＤＮＡの削減は、細胞調製中、又は溶解中若しくは溶解後に起こってよい。削減が溶解後に起こる場合は、細胞溶解状態中は酵素が安定であること、及びその後の後処理による酵素の活性化が必要となるだろう。熱溶解及びアルカリ溶解の場合は、それぞれ高い熱安定性又はアルカリＳＤＳ安定性と、その後のバッファー交換による高濃度のＥＤＴＡ及びＳＤＳの除去が求められるだろう。我々は、ＯｍｐＡＴ５ＲＮａｓｅ（図１７）構築体を用いた前処理なし（形式２）の自己溶解において、ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡが削減されることを証明している。
【００７０】
形式２は、圧縮化剤存在下での機械式溶解（Ｗｉｌｓｏｎ  ＲＣ  ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＣ．２００２  米国特許出願第２００２０１９７６３７号）、又は微小流体（含浸ジェットホモジェナイザー）又はビーズミリング（Ｊｅｍ  ＫＪ  ２００２米国特許第６４５５２８７号）を用いた機械式溶解法のような、熱安定性又はアルカリＳＤＳ安定性を要しないその他溶解法についても有望である。
【００７１】
好ましい態様では、細胞は自己溶解を利用し溶解する。自己溶解の１つの方法は、Ｂラクタム系抗生物質のような細胞壁破壊剤を発酵物に加えることによって細胞を破壊することである。又は、リソゾーム、若しくはペプチド系抗生物質をコードするファージを宿主菌株に産生させて細胞を破壊させることもできる。組換え体リソゾームは、細胞に細胞質型として発現させ、かつ細胞質から周辺細胞質に漏洩させるチャンネルを作るホリン（膜拡張ペプチド又はタンパク質）を同時発現させることによって、リソゾーム及びその他細胞質タンパク質を希望する時間に周辺細胞質に放出させることができる。利用可能なリソゾーム／ホリンの組み合わせの例は、当技術分野で公知であり、かつ参照により本明細書に組み入れられる。
【００７２】
自己溶解状態は、アルカリ又は熱溶解とは逆に、選択的にゲノムＤＮＡを変性しない。溶解産物は非常に粘性であり、加工に際して問題となる。
【００７３】
我々は、本明細書において、抗生物質又はファージが仲介する溶解のような自己溶解が、プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が存在するとゲノムＤＮＡを選択的に除去し、粘度を下げることを証明する（図１７）。
【００７４】
自己溶解とプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）との組み合わせは、当技術分野において提案も実施もされていない。実際自己溶解法は、おそらくは、発明のプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）がなければゲノムＤＮＡの汚染レベルが高いことを理由に、プラスミド製造での使用は考えられていない。今日の自己溶解法は、ＤＮＡ以外の生体分子の製造への使用だけが考えられており、プラスミド及びゲノムＤＮＡを排除するために非特異的ヌクレアーゼが組み入れられることが多い。発明のプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）は、プラスミドＤＮＡ大規模製造への各種自己溶解法の使用を容易にする。
【００７５】
自己溶解プラスミド精製はまた、従来解決不可能と思われていた問題、即ちプラスミド加工処理における、多重的な細胞溶解及び清浄化段階の削減の問題も解決する。典型的なプラスミド精製工程は、発明の自己溶解精製を組み入れることによって劇的に短縮化でき、経済的効果的にすることができる（図１９）。この精製法は、その能力を犠牲にすることなしに、有毒な試薬及びプラスミド精製の多重的要素（段階）を排除する。
【００７６】
ヌクレアーゼ産生
ヌクレアーゼ遺伝子の発現は、構成的、又は、より好ましくは誘導性プロモータによって駆動できる。好ましい誘導性プロモータとしては、ラムダＲＰ及びＰＬ、Ｔ５、Ｔ７のようなその他ファージプロモータ、ｔａｃ及びｔｒｃのような合成プロモータ、ｌａｃのような内因性プロモータ、コールドショックプロモータ（ｃｓｐＡ）、ａｒａＢＡＤ、定常期若しくは飢餓期プロモータ、増殖速度（ｒｍｆ）ｐＨ（ｃａｄＡ）、又は低酸素反応性（ｎａｒ）プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。誘導は、温度上昇（ＰＬ、ｔａｃ）、熱安定性レプレッサー（ラムダレプレッサー、ｌａｃレプレッサー）と同時の温度低下（ｃｓｐＡ；コールドショックプロモータ）、インデューサー（ｔａｃ、ｔｒｃ及びｌａｃについてはＩＰＴＧ；ＡｒａＢＡＤについてはアラビノース）、又はその他の手段（例えば定常期への移行、ｐＨ若しくは酸素シフト、グルコース若しくはアミノ酸飢餓；Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ＳＣ．１９９６  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２−５３８に概説されている）によって実施できる。又は、遺伝子は、調整されたアンチセンスＲＮＡによって誘導できる。
【００７７】
当技術分野では、複数の周辺細胞質又は細胞外を標的とするシグナルペプチドが知られており、参照によって本明細書に組み入れられる（例えば、Ｃｈｏｉ  ＪＨ，ａｎｄ  Ｌｅｅ  ＳＹ．２００４  Ｓ  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４：６２５−６３５）。周辺細胞質を標的とする例示のリーダーペプチドはＯｍｐＡ、ＰｈｏＡＯｍｐＴ、及びＰｅｌＢである。
【００７８】
ヌクレアーゼはまた、ＮｌｐＡリーダー及びファーストシックス（ｆｉｒｓｔ  ｓｉｘ）アミノ酸のようなリーダーを用いた「アンカード周囲細胞質発現」のような公知のアンカータグを利用して膜に固定化してもよい（Ｈａｒｖｅｙ  ＢＲ，Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  Ｇ，Ｈａｙｈｕｒｓｔ  Ａ，Ｊｅｏｎｇ  ＫＪ，Ｉｖｅｒｓｏｎ  ＢＬ，ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ  ＧＫ．２００４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１：９１９３−９１９８）。又は、ヌクレアーゼは、細胞から増殖培地に分泌させ、溶解中にＤＮＡと接触させることもできる。
【００７９】
代替として、ヌクレアーゼは、部位指定突然変異誘導を用いるか、小型のペプチド標的化タグの付加、又は分子育種法（Ｎｅｓｓ  ＪＥ，Ｋｉｍ  Ｓ，Ｇｏｔｔｍａｎ  Ａ，Ｐａｋ  Ｒ，Ｋｒｅｂｂｅｒ  Ａ，Ｂｏｒｃｈｅｒｔ  ＴＶ，Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ  Ｓ，Ｍｕｎｄｏｒｆｆ  ＥＣ，ａｎｄ  Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  Ｊ．２００２  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１２５１−５；Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ＡＬ，Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ  Ｓ，Ｖａｈｌｅ  Ｋ，Ｊｏｎｅｓ  ＪＴ，Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ  Ｖ，Ｐａｔｔｅｎ  ＰＡ．２００１  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３６１−７０）を利用した定方向進化（Ｚｈａｏ  Ｈ，Ｃｈｏｃｋａｌｉｎｇａｍ  Ｋ，ａｎｄ  Ｃｈｅｎ  Ｚ．２００２  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１０４−１０）を用いて遺伝子工学的に変更し、活性若しくは安定性を高めるか、又は精製中に分離するようにすることもできる（Ｃｏｌｌｅｎ  Ａ，Ｗａｒｄ  Ｍ，Ｔｊｅｒｎｅｌｄ  Ｆ，ａｎｄ  Ｓｔａｌｂｒａｎｄ  Ｈ．２００１  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．９１０：２７５−８４）。
【００８０】
細胞自己溶解のためのポーリンシステム
膜に孔を作るファージポーリンタンパク質には二種類ある。これらは文献に明らかにされており、発明の実施の可能性を有するポーリンの非限定的リストは、参照により本明細書に組み入れられている（Ｙｏｕｎｇ  １９９２，Ｓｕｐｒａ；Ｗａｎｇ  ＩＮ，Ｓｍｉｔｈ  ＤＬ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  Ｒ．２０００  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：７９９−８２５）。１つの種類は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴ４及びラムダファージ、又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージＬＬ−Ｈのような二本鎖型ＤＮＡバクテリオファージに由来するものである。これらのポーリンタンパク質はホリンと呼ばれ、それらは細胞質膜内に集まり、周辺細胞質内に放出される細胞壁消化タンパク質のための孔を創る。これらの孔の範囲は、小さな（リソゾームに適合すると思われるＴ４ｔタンパク質で、細胞質から周辺細胞質に漏れる）ものからＢガラクトシダーゼのような１００ｋｄを超えるタンパク質が通り抜けるのに適した（ラムダＳ；孔内径＞１０〜１２ｎｍ、ステプチノマイシンＯ／リステリアリシンＯサイトトキシンと同様のサイズ）十分大きなものまである。我々は、これらポーリン及びリソゾームを、発明のプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）と組み合わせて利用する製造用菌株の、プラスミド製造への使用法を考えている。これらポーリンを利用する自己溶解株は、タンパク質製造のために創られたものであり（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，Ｓｕｐｒａ，２００１）、プラスミド製造での利用については当技術分野では記載されていない。
【００８１】
又は、ＰｈｉＸ１７４のような単鎖型ＤＮＡファージは、ファージの放出に必要な単一の溶解タンパク質（遺伝子Ｅ）を産生する。このタンパク質、及びその他の単鎖型ＤＮＡファージに由来する溶解タンパク質は、ペニシリンに類似の様式で細胞壁の形成を阻止できる（Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ  ＴＧ，Ｗａｎｇ  ＩＮ，Ｓｔｒｕｃｋ  ＤＫ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  Ｒ．２００２  Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４９３−５０１に概説されている）。遺伝子Ｅ産物は、外膜と内膜の間に直径１μＭのチャンネルを形成し、周辺細胞質を効果的に密封して、プラスミドＤＮＡを含む細胞質内容物を非溶解性に（Ｗｉｔｔｅ  Ａ  ａｎｄ  Ｌｕｂｉｔｚ  Ｗ．１９８９  Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０：３９３−３９８）培地内に放出する（図１３；Ｙｏｕｎｇ  Ｒ，Ｗａｎｇ  ＩＮ  ａｎｄ  Ｒｏｏｆ  ＷＤ．２０００  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏ．８：１２０−１２８に概説されている）。ｐｈｉＸ１７４遺伝子Ｅシステムは、抗原又はＤＮＡワクチン送達のための細菌ゴーストの作製に用いられている（Ｊａｌａｖａ  Ｋ，Ｉｋｏ  ＦＯ，Ｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｅ  ａｎｄ  Ｌｕｂｉｔｚ  Ｗ．２００３  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２：４５−５１）。ＤＮＡワクチンの送達では、ゴーストはプラスミドＤＮＡで埋め戻される。ゴーストの製造方法は、高マグネシウム（例えば０．１Ｍ  ＭｇＳＯ４）中での増殖が溶解を防止するという観察に基づいて開発されている。製造法は：１）ｍｇ存在下での遺伝子Ｅの発現する段階；２）細胞のバッファーを交換する段階；及び３）マグネシウムを下げてチャンネルを形成させ、細胞質内容物を放出させる段階を含む（Ｊａｌａｖａ  ｅｔ  ａｌ，上記、２００３に概説されている）。
【００８２】
細菌ゴーストは、ＤＮＡプラスミド製造への応用について評価されたことはなく、放出されたプラスミドの完全性がこれまで評価されたことはない（Ｗｉｔｔｅ  ａｎｄ  Ｌｕｂｉｔｚ，Ｓｕｐｒａ，１９８９）
【００８３】
ヌクレアーゼ及び／又は自己溶解遺伝子発現のための宿主株
ヌクレアーゼ遺伝子は、標的プラスミドに適合するプラスミドの中に存在してよく、又は好ましくはゲノム中に組み入れることができる。株の遺伝子工学的変更は、プラスミド製造に好適な任意の細菌株で実施できる。
【００８４】
ヌクレアーゼ発現プラスミドの統合コピーを持つ細菌株は、例えばラムダｒｅｄ  ｇａｍ組換えのような様々な技術を用いて作られる（Ｍｕｒｐｈｙ  ＫＣ  １９９８  Ｊ．Ｂａｄ．１８０：２０６３−２０７１；Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ，Ｗａｎｎｅｒ  ＢＬ．２０００  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ（ＵＳＡ）．；９７：６６４０−６６４５）。この技術は、一般的なプラスミド製造用宿主であるＤＨ５αのようなｒｅｃＡ−株で上手く利用されている。要約すると、フランキング抗生物質耐性遺伝子を含む発現カセットを、統合部位に相同な配列を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。標的のＤＨ５α株を、アンピシリン耐性ラムダＲｅｄ組み換え機能を含むプラスミドｐＫＤ４６を用いて、アラビノースを用いてＲｅｄリコンビナーゼ産生を誘導して形質転換する。細胞を調製し、報告されているようにしてＰＣＲ断片をエレクトロポレーションする。相同組換え体を、カナマイシンを用いて選択し、非許容温度（ｐＫＤ４６は複製の温度感受起点有する）にシフトさせてｐＫＤ４６ヘルパープラスミドを治癒し、アンピシリン耐性の消失を確認する。
【００８５】
プラスミド製造
統合ヌクレアーゼ遺伝子を持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を利用して、発酵培養でプラスミドＤＮＡを製造でききる。例示的発酵工程は、当技術分野で公知である（概説についてはＣａｒｎｅｓ  ２００５参照：Ｃａｒｎｅｓ  ＡＥ．２００５  ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００５，印刷中）。Ｎａｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、プラスミド製造に最適化された無動物産物バッチ（ＮＴＣ３０１８）及び供給バッチ（ＮＴＣ３０１９）発酵培地に、バッチ及び供給バッチ工程を用いている。これらの培地は、低い増殖速度を支持し、プラスミドの安定性と完全性を維持するために開発された。比増殖速度を０．１２／時に維持するように供給が管理された、自動供給バッチ工程により、１１００ｍｇ／Ｌ、及びＯＤ６００が１２０のプラスミド収量が達成されている。
【００８６】
我々は、プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）を産生する宿主株を利用して、例示的なプラスミド精製工程に、発酵培養物からプラスミドを多く含む供給流を作ることを考えている。ヌクレアーゼ株と高収率発酵及び例示的精製工程との組み合わせは、遺伝子治療及びＤＮＡワクチン応用に受け入れ可能なレベルまでゲノムＤＮＡを更に削減する、経済効果的な方法を提供するだろう。
【００８７】
実施例
発明の方法を、以下の実施例で詳しく例示する。これらは例示であり、いかなる形でも、発明の範囲を制限するものではない。
【００８８】
実施例１：ｐＶＥＸ発現ベクター
ｐＶＥＸＳａｐＩスタッファータンパク質発現ベクターは、図２に示している。プラスミドはｐＢＲ３２２の複製起点（ＲＯＰ欠失）及びアンピシリン耐性マーカーを有している。
【００８９】
このベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対象の遺伝子を発現させる誘導性Ｔａｃプロモータを有している。発現はｌａｃＩｑ遺伝子産物（プラスミドにコードされている）によって抑制され、培地へのＩＰＴＧの付加によって誘導される。
【００９０】
対象の遺伝子は、図３に概要を示すようにＡＴＧ及びＴＡＡの接着末端を作り出すＳａｐＩタイプＩＩＳクローニング部位からなる「スタッファー」にクローニングされる。遺伝子は、クローンからの増幅、又は一般的なアドレスタグ及び固有配列特異的な配列を持つプライマーを用いたゲノムＤＮＡからの増幅によってコピーが作られる。標的遺伝子内部にあるＳａｐＩ部位が害を及ぼすことは、内部のＳａｐＩ部位がアドレスタグの１つに一致する確率は１／１６に過ぎないことから一般的にはない。
【００９１】
このプラスミドの誘導体、ｐＶＥＸＳａｐＩＨＮタグスタッファーは、対象の遺伝子を、エンテロキナーゼ切断部位が後に続いているＮ末端ＮＨタグと融合させる。このタグは、ｈｉｓタグ同様に固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂に結合し、アフィニティー精製を可能にする。遺伝子は、ＳａｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ  ＮＪ）で消化されて５’ＴＡＡＧ（エンテロキナーゼ切断部位の最後のリジン残基）及び３’ＴＡＡの３ｂｐの接着末端を生ずるＳａｐＩ部位を末端に組み入れたプライマーを用いてＰＣＲ増幅される。
【００９２】
実施例２：ｐＶＥＸＳａｐＩＯｍｐＡ分泌ベクターの構築
ＯｍｐＡ分泌シグナルペプチドは、次のようにして遺伝子工学的にｐＶＥＸスタッファーベクターに組み入れられる。ＯｍｐＡ分泌シグナルペプチドをコードしているオリゴヌクレオチドをｐＶＥＸＳａｐＩスタッファーのＮｃｏＩ部位にアニーリングさせて、その中にクローニングし、ｐＶＥＸＳａｐＩＯｍｐＡスタッファーを作った。得られたクローンは、対象のタンパク質を周辺細胞質に向かわせるＯｍｐＡリーダーを発現する。ＯｍｐＡリーダーを切り離して、対象の遺伝子のＭｅｔコドンの前に２アミノ酸リーダー（Ａｌａ−Ｔｈｒ）が付いた対象のタンパク質を残す。このべクターのマップは図４に示されている。細胞質構築体は、対象の遺伝子を含むＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ断片を、このベクター内に移入させることで分泌型構築体に変換できる。Ｎ末端ＨＮタグをコードしているＯｍｐＡＨＮタグスタッファーは、オリゴをアニーリング挿入するためにＮｃｏＩ消化したｐＶＥＸＳａｐＩＨＮタグスタッファーを用いて、上記と全く同じに構築された。
【００９３】
実施例３：ｐＶＥＸＯｍｐＡＨＮＲＮａｓｅ発現ベクターの構築
ウシ膵臓ＲＮａｓｅ遺伝子を、ウシゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。全てのＰＣＲは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて（余分な塩基が平滑断片の端部に付加されるのを回避するため）、標準的なＰＣＲ法により行われた。
【００９４】
４００ｂｐのＰＣＲ産物をＳａｐＩで消化し、１００及び３００ｂｐ（内部ＳａｐＩ部位）の断片をゲル精製し、標準的なクローニング法を用いて、ＳａｐＩ消化したｐＶＥＸＯｍｐＡＨＮスタッファーベクターにクローニングした。組換え体（ｐＶＥＸＯｍｐＡＨＮＲＮａｓｅ）は配列を確認した。
【００９５】
実施例４：Ｔ５エクソヌクレアーゼのクローニング
Ｔ５  Ｄ１５エクソヌクレアーゼ遺伝子をファージＴ５（ＡＴＣＣ  １１３０３−Ｂ５）からＰＣＢ増幅し、クローニングして、配列の確認を行った。９００ｂｐの断片を精製し、鋳型として用いてＨＮスタッファー適合断片をＰＣＲ増幅した。これらの断片を精製し、変更されたポリリンカーを持つｐＵＣ１９誘導体であるｐＷ２．０ベクターのＳｍａＩ部位に平滑断端クローニングした。ＰＷ２．０−Ｔ５及びｐＷ２．０−ＨＮＴ５クローンを単離し、配列を確認した。
【００９６】
実施例５：ｐＶＥＸＢＯｍｐＡスタッファー発現ベクターの構築
漏洩発現及び全体の誘導性発現がより低い第二発現系を構築した。このベクター、ｐＶＥＸＢＳａｐＩＯｍｐＡスタッファーは、ＡｒａＢＡＤプロモータを含み、かつｔａｃプロモータを含む親のｐＶＥＸＳａｐＩＯｍｐＡスタッファーベクターがＩＰＴＧで誘導されるのに対し、アラビノースの付加によって誘導ができる。
【００９７】
ＡｒａＢＡＤプロモータ及び、それに続くａｒａＣレプレッサーを、ＤＨ５αゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。この増幅産物（１．３ｋｂ）をＡｒａＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＶＥＸベクターにクローニングした。得られたクローンは、スタッファーの下流にＡｒａＢＡＤオペロンを含んだ。ＡｒａＢＡＤ領域をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで切り出し、ｄＮＴＰ及びクレノーで埋めて接着端を平端化した。１．３ｋｂの断片をｐＶＥＸＳａｐＩＯｍｐＡスタッファーベクター（ｂｐ２４７〜３１０８）及びｐＶＥＸＳａｐＩＯｍｐＡＮＨタグスタッファーベクターの２．８ｋｂの主鎖断片にクローニングした。主鎖断片は、ＭｌｕＩ及びＸｂａＩで消化したベクターをゲル精製して獲得し、クレノー及びｄＮＴＰで平滑端化し、ＣＩＰ処理した。得られたクローンを、制限消化及び配列確認によってＡｒａＢＡＤの方向についてスクリーニングした。最終的な構築体、ｐＶＥＸＢＳａｐＩＯｍｐＡスタッファー（図５）及びｐＶＥＸＢＳａｐＩＯｍｐＨＮタグスタッファーは、ｌａｃＩｑ遺伝子及びｔａｃプロモータが、ＡｒａＣレプレッサー及びａｒａＢＡＤプロモータで交換されている。
【００９８】
実施例６：ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＨＮＲＮａｓｅの構築
ＮＨＲＮａｓｅ遺伝子を、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩを用いた消化によってｐＶＥＸＯｍｐＡＨＮＲＮａｓｅから切り出し、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＶＥＸＢＳａｐＩＯｍｐＡＨＮタグスタッファーベクターに移入した。
【００９９】
実施例７：ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＲＮａｓｅ発現ベクターの構築
ＨＮタグは、ＡｒａＩを含むプライマーを用いてプラスミド全体をＰＣＲ増幅することによって、ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＨＮＲＮａｓｅから取り除いた。ＰＣＲ増幅はベクター長のＰＣＲ断片を生じた。精製したＰＣＲ産物をＡａｒＩで切断し、連結するとＨＮタグが正確に削除される適合接着端（プライマー中に二重下線を付けた）を創った。ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＲＮａｓｅのクローン（図６）を単離し、制限消化及び配列決定によって確認した。
【０１００】
実施例８：ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＴ５ＲＮａｓｅ発現ベクターの構築
ＨＮタグは、ＡａｒＩ含有プライマーを用いたプラスミド全体のＰＣＲ増幅によってｐＶＥＸＢＯｍｐＡＨＮＲＮａｓｅから削除した。次にＴ５エクソヌクレアーゼを、ギャップを入れたプラスミドにクローニングした。ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＨＮＲＮａｓｅのＰＣＲ増幅は、ベクター長のＰＣＲ断片を生じた。Ｔ５特異的プライマーを用いたｐＷ２．０Ｔ５のＰＣＲ増幅は、９００ｂｐのＴ５遺伝子を生じた。精製したＰＣＲ産物をＡａｒＩで切断し、連結によってＨＮタグが正確に削除され、かつＴ５遺伝子が挿入される適合接着端を創った。ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＴ５ＲＮａｓｅ（図７）のクローンを単離し、制限消化及び配列決定によって確認した。
【０１０１】
実施例９：プラスミド調製中のゲノムＤＮＡのＴ５ＲＮａｓｅ消化
ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ）又はｐＶＥＸＢＯｍｐＡＴ５ＲＮａｓｅ（Ｔ５ＲＮａｓｅ）プラスミドを含むＤＨ５α細胞株を、５ｍＭのＭｇＳＯ４を含むＬＰ液体培地の中で、３７℃で増殖させ、対数期半ばに（約０．５ＯＤ６００／ｍＬ）アラビノースを０．２％まで加えてタンパク質の発現を誘導した。４時間、２９℃で誘導した後、培養物を回収した。コントロールの非誘導培養物も、同一条件で増殖した。細胞を沈降させ、−２０℃、又は４℃で一晩貯蔵した。
【０１０２】
−２０℃に貯蔵した細胞を融解し、１０分間、３７℃でインキュベーションした。４℃の細胞は、追加の前処理を行わずに加工した。ＲＮａｓｅ誘導細胞には溶解が観察されたが、Ｔ５ＲＮａｓｅ誘導細胞又は非誘導細胞には溶解は観察されなかった。
【０１０３】
核酸の分解は、二つのアッセイで評価した。第一のアッセイでは、全ＤＮＡを４℃の細胞から、Ｗｉｌｌｉａｍｓらの迅速スクリーニングプロトコール（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ａ．，Ｌａｎｇｅｌａｎｄ，Ｊ．Ａ．，Ｔｈａｌｌｅｙ，Ｂ．，Ｓｋｅａｔｈ，Ｊ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｓ．Ｂ．（１９９４）．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）．ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）を利用して抽出した。簡単に説明すると、細胞を細胞破壊バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に浮遊し、フェノールで抽出して、ＲＮａｓｅ処理し、トラッカー色素を加えた後ＤＮＡを１％アガロースゲルで分析した。第二のアッセイでは、全核酸（ＲＮａｓｅを含む）をＱｉａｇｅｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐのバッファー（Ｐ１、Ｐ２、Ｎ３）を用い、Ｐ１バッファーにＲＮａｓｅを加えない以外はそのプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｐｒｅｐ  ｍｉｎｐｒｅｐ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｍａｒｃｈ  ２００２）に従って単離した。遠心分離により浄化した溶解液を調製した後、溶解液を３７℃で１０分間インキュベーションし、３倍容積量の９５％エタノールを加えて核酸を沈降させ、遠心分離して回収し、７０％エタノールで洗った後、１０ｍＭのＭｇＳＯ４を含むＱｉａｇｅｎバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５）に再浮遊した。サンプルを１０分間、３７℃でインキュベーションし、トラッカー色素を加え、１％アガロースゲルで核酸を分析した。
【０１０４】
結果（図８）は、アルカリ溶解プラスミド製造において、Ｔ５ＲＮａｓｅ融合体による「プラスミド−セーフ」ゲノムＤＮＡの特異的分解を証明した。誘導した細胞は生存し（誘導後引き続き増殖し）、凍結融解中も溶解しなかった。レーン１及び５では、非誘導及びＲＮａｓｅコントロールと比べると、誘導されたＴ５ＲＮａｓｅによりアルカリ溶解物中から染色体のＤＮＡバンド（＞１２ｋｂの大バンド）が完全に除去されていることに注意せよ。−２０℃貯蔵サンプルにはプラスミドＤＮＡの分解が見られないのに対し（レーン１と３を比較せよ；レーン１に残った大きなバンドはスーパーコイルを形成しているダイマーである）、４℃で調製したサンプルではゲノムＤＮＡは完全に除去され、かつプラスミドＤＮＡの部分的な消化が観察される。このことは、前処理が異なると（４℃一晩のインキュベーション、対−２０℃サンプルの凍結溶解及び１０分間、３７℃）、細胞質へのヌクレアーゼの誘導に差が生じることを示している。全核酸抽出物からゲノムＤＮＡがＴ５ＲＮａｓｅによって一部除去されることはレーン９にも観察されるが、アルカリ溶解によって精製した前処理サンプルほど完全なものではない。ゲルをスキャニングし、レーン１〜４のバンドを積算して定量化した。結果を表１にまとめる。ゲノムＤＮＡのレベルは、ＲＮａｓｅ誘導レーンでは低いが、これは観察された細胞溶解によるものである。Ｔ５ＲＮａｓｅ誘導サンプルでは、Ｔ５ＲＮａｓｅ非誘導サンプルに比べ、ゲノムＤＮＡ量は５０倍減少しているが、プラスミドのレベルは下がっていない。このことは、キメラヌクレアーゼがプラスミド下降中のゲノムＤＮＡ削減に利用できることを証明している。
【０１０５】
2008509704.tif 000003
【０１０６】
実施例１０：ＲＮａｓｅＳ−Ｔ５融合体
ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡの除去に有用なキメラヌクレアーゼを作るために、Ｔ５エクソヌクレアーゼとは別のプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）を、ＳペプチドＳタンパク質システムを用いて創った。ここでは、我々は、このような融合体の構築と評価について記載し、プラスミド製造における有用性を証明する。これら融合体は、以下に示すように、ＲＮａｓｅ活性と強化されたＤＮａｓｅ活性の両方を保持している。
【０１０７】
ＲＮａｓｅＡのＮ末端Ｓペプチドに異種タンパク質を融合させたものは、ＲＮａｓｅのＳタンパク質と会合した後ＲＮａｓｅ活性を獲得することが証明されている。Ｓペプチドは、２０アミノ酸長のウシ膵臓ＲＮａｓｅＡのＮ末端断片であり、サブチリシン切断によって放出され、Ｃ末端断片（２１〜１２４）はＳタンパク質である。Ｓタンパク質とＳペプチドは、高い親和力（ｐＨ８．３において３．１×１０〜１１Ｍ）で結合してＲＮａｓｅＳとなり、これは元のＲＮａｓｅ７と同等の酵素活性を有している。Ｓタグシステム（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  Ｍ  ａｎｄ  Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ  Ｒ．１９９４  ＩｎＮｏｖａｔｉｏｎｓ  １：４−７）は、機能的なＲＮａｓｅに異種タンパク質を融合させるのに利用されているタンパク質精製システムである。ＳタグはＳペプチドのＮ末端側１５アミノ残基であり、異種タンパク質と結合した場合でもＳタンパク質と相互作用して活性なＲＮａｓｅを生成する。Ｓタグ（及びＳペプチド）はきわめて可溶性であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ないで高レベルに発現され、いずれの末端と融合した場合でも、Ｓタンパク質との高親和性相互作用を仲介できる。Ｓタグ又はＳペプチド、融合体を迅速に検出し、定量化するための、Ｓタンパク質との会合（Ｓタグウエスタンブロット）又は機能的ＲＮａｓｅＳの再構築（Ｓタグ陣属アッセイ）に基づいた試薬がＮｏｖａｇｅｎより市販されている。キメラヌクレアーゼ作製へのこのシステムの利用を図９に示す。
【０１０８】
ｐＶＥＸＢＯｍｐＡ−Ｓタンパク質は、ＯｍｐＡ分泌リーダー配列（シグナル配列）をＲＮａｓｅのＳタンパク質断片に融合する。ＯｍｐＡＳタンパク質（１６〜１２４）又はＯｍｐＡＳタンパク質（２０〜１２４）のいずれかをコードする二種類のベクターを作製した。両ベクターとも、インビボでは同様の機能を示す。これら構築体は、周辺細胞質分泌中にＯｍｐＡリーダーが切断された後、正確にＳタンパク質断片を放出するように設計されている。これら構築体の発現ベクターは、同時発現研究のために、ｐＡＣＹＣ１７７（ｐＶＥＸに適合している）に移された。ｐＡＣＹＣ１７７は、ｐＶＥＸに比べるとコピー数が少なく、作られるＳタンパク質の数はＳペプチドより少なくなる。これは、Ｓタンパク質の折りたたみ促進にはＳペプチドが必要とされることから、意図的に行ったものである。
【０１０９】
Ｓ−ペプチド（Ｓ−タンパク質と会合するための）をＴ５エクソヌクレアーゼのＮ末端（Ｓ−ペプチド−Ｔ５）に融合させ分泌型Ｓ−ペプチド−Ｔ５融合ベクター（ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＳ−ペプチドＴ５）を作るか、又はＣ末端に融合させ分泌型のＴ５−Ｓペプチドベクター（ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＴ５−Ｓペプチド）を作製した。Ｓ−ペプチドの未変性のＮ末端を正確に放出させるために、ＯｍｐＡ又はＰｈｏＡ分泌リーダー配列を利用した。
【０１１０】
同時発現させた時、Ｓペプチド及びＳタンパク質断片はＲＮａｓｅＳとして会合し、ＲＮａｓｅ機能だけでなく、融合したＴ５エクソヌクレアーゼからＤＮａｓｅ機能も与えられるように設計されている。
【０１１１】
実施例１１：プラスミド生成ＲＮａｓｅＳ−Ｔ５融合体
一例として、ＲＮａｓｅＳ−Ｔ５を用いたゲノムＤＮＡ削減の全般的な方策を図１０に示す。発現及び分析は、実施例９のＴ５ＲＮａｓｅに関する記載と同様にして行われた。これら融合体を発現している細胞株では、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡの削減か観察された（図１１〜１２）。ＯｍｐＡＳペプチド−Ｔ５構築体は、いずれかのＯｍｐＡＳタンパク質構築体（１６〜１２４又は２０〜１２４）が共存すると、いずれかの構築体単独の場合に比べてゲノムＤＮＡ及びＲＮＡを削減した。ＯｍｐＡＴ５−Ｓペプチド構築体はタンパク質分解感受性（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分解バンドが検出された）であり、予想通りＯｍｐＡＳペプチド−Ｔ５構築体に比べＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅの活性が低下していた。他のＴ５又はＳペプチド−Ｔ５構築体は全てタンパク質分解安定（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、予想通りのバンドが観察された）であった。このことは、Ｔ５エクソヌクレアーゼの活性が、ＲＮａｓｅＳとの会合によって高められ、かつＲＮａｓｅ活性も保持していることを証明している。
【０１１２】
実施例１２：ＰｈｉＸ１７４遺伝子Ｅ発現ベクターの構築
ｐｈｉＸ１７４遺伝子Ｅタンパク質を、ＡｒａＢＡＤ制御の下で、既存の高コピーｐＵＣ起源プラスミド（たとえばｇＷｉｚ−ＧＦＰ、ｐＤＮＡＶＡＣＣＵｌｔｒａ−ＥＧＦＰ）及びｐＢＲ３２２起源プラスミド（例えばｐＶＥＸＢＴ５ＲＮａｓｅ）と適合するプラスミドにクローニングした。
【０１１３】
ｐＶＥＸＢ−未変性スタッファー
ｐＶＥＸＳａｐｌスタッファーベクターをＸｈａＩ及びＭｌｕＩで消化した。接着端はクレノー及びｄＮＴＰを用いて埋め、加熱して殺した。この端部を、ウシ小腸ホスファターゼを使って脱リン酸化した。２．８ｋｂの断片を、１．５ｋｂの断片からゲル精製した。ｐＶＥＸＢベクターをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した。接着端はクレノー及びｄＮＴＰを用いて埋めた。ａｒａＢプロモータを含む１．３ｋｂの断片を４．３ｋｂからゲル精製した。ステップ１の断片とステップ２の断片を連結し、形質転換し、Ａｍｐについてスクリーニングした。正しい方向のクローン（ｐＶＥＸＢ−未変性スタッファー）を制限消化により選び、配列決定して確認した。
【０１１４】
ｐＡＣＹＣＢの未変性ベクター（図１４）及びＯｍｐＡスタッファーベクター
ｐＶＥＸＢＯｍｐＡスタッファー及び未変性のスタッファー発現ベクターからのカセットは、ｐＡＣＹＣベクターに移して、ｐＵＣとｐＢＲ３２２をベースとする起源ベクター（例えばｐＶＥＸ及びｐＤＮＡＶＡＣＣＵｌｔｒａベクター）と同時発現させることができる。ＣＩＰ処理し、ゲル精製したＸｍｎＩ消化ｐＡＣＹＣ−ＲＩＬプラスミド（断片Ａ）を発現させた。ｐＶＥＸＢＯｍｐＡスタッファー及びｐＶＥＸＢ未変性スタッファーをＥｃｏＲＩで消化し（クレノー及びｄＮＴＰで埋める）、より小型の断片（ｐＶＥＸＢＯｍｐＡスタッファーは２７０３、１４６６、断片Ｂ１である；ｐＶＥＸＢ未変性スタッファーはわずかにこれより小さい断片Ｂ２である）を精製した。断片Ａ、Ｂ１（ｐＡＣＹＣＢＯｍｐＡスタッファー）又はＡとＢ２（ｐＡＣＹＣＢ未変性スタッファー）を混合し、連結した。連結物でＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し、黒ラムふぇにコール寒天プレートで選択した。クローン、及び方向を、制限消化により確認した。
【０１１５】
ｐＡＣＹＣＢ遺伝子（図１５）
ｐｈｉＸ１７４遺伝子Ｅタンパク質は、１０ｎｇのｐｈｉＸ１７４ゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ増幅した。５×４５Ｃアニーリング、２５×５５Ｃアニーリングを、１分間、７２℃での伸張及び９５℃での３０秒間の変性と組み合わせて用いた。ｐＡＣＹＣ−Ｂ未変性スタッファーをＳａｐＩで消化し、二種類の断片（４３７５、２８２、３４）を精製した。ＰＣＲ断片もＳａｐＩで消化した。三種類の断片を混合し、連結した。連結物でＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ＋クロラムフェニコール＋グルコース（０．２％）上で形質転換させた（グルコースは漏洩発現を下げるために加えられる）。ｐＡＣＹＣＢ  ｐｈｉＸ１７４遺伝子Ｅベクターを、制限消化で確認し、配列を決定した。
【０１１６】
実施例１３：遺伝子Ｅ誘導細胞のゴースト化による高コピーｐＵＣ起源プラスミドの放出
細胞株は、Ｚコンピテント（Ｚｙｍｏｓ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を精製したプラスミドで形質転換し、抗生物質及び０．２％グルコース（アラビノースプロモーターからの遺伝子Ｅ漏洩発現を低下させるため）を含むアガロースプレートで増殖させて作製した。この細胞株を、３４ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（遺伝子Ｅ発現プラスミドを含む株）及び／又は５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシン（ｐＤＮＡＶＡＣＣＵｌｔｒａプラスミドを含む株）、又は１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリン（ｐＶＥＸプラスミドを含む株）を含有するＬＢ培地で、３７℃で増殖させ、対数増殖期に誘導した（約０．５ＯＤ６００／ｍＬ）。１００倍濃度の保存液から最終濃度０．２％になるようにアラビノースを加え、アラビノース誘導を行った。ゲル分析用の培地抽出物は、１）浄化した培地を用いるか、又は２）フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿及びＴＥ（２０倍濃度）へ再懸濁することによって調製した。ゲル分析用の細胞沈殿抽出物は、細胞沈殿物をバッファー（１０〜２０倍濃度）に再懸濁し、規定温度及び時間インキュベーションし、続いてフェノールクロロホルム抽出することで調製した。上清は、ゲル電気泳動により直接分析した。細胞沈殿物中の全核酸は、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、上記、１９９４に記載されている細胞破壊バッファーを用いて、１０〜２０倍濃度（元の培地容積と比べ）の細胞破壊バッファーを用いて、かつＲＮａｓｅは加えずに抽出した。抽出物はアガロースゲル電気泳動を用いて核酸について分析し、ＲＮＡ及びＤＮＡは、１／１０，０００に希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅ  ＩＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて後染色して視覚化した。
【０１１７】
遺伝子Ｅ溶解タンパク質発現による核酸の放出
三種類の細胞株：１）ｐＡＣＹＣ−Ｂ−遺伝子Ｅ、２）ｐＡＣＹＣ−Ｂ−遺伝子Ｅ＋ｐＤＮＡＶＡＣＣＵｌｔｒａ−ＧＣＰ、及び３）ｐＤＮＡＶＡＣＣｕｌｔｒａ−ＧＦＰを作製し、評価した。ｐＤＮＡＶＡＣＣｕｌｔｒａは、ｐＡＣＹＣプラスミドと適合する、高コピーカナマイシンｐＭＢ１起源プラスミドである。
【０１１８】
細胞は；Ａ）非誘導；又はＢ）０．２％までのアラビノースにより誘導；又はＣ）０．２Ｍ  ＭｇＳＯ４存在下（ゴースト化を阻害するため）で０．２％までのアラビノースにより誘導した。上清を、アガロースゲル電気泳動を用いて、核酸について分析し、ＲＮＡ及びＤＮＡは、１／１０，０００希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（Ｓｉｇｍａ）で後染色して視覚化した。１．５ｍＬの細胞からの沈殿物を１００ｕＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、ＲＴで１時間インキュベーションし、細胞を沈降させた。ＴＥ細胞抽出物を、ゲル電気泳動を用いて上記同様に分析した。
【０１１９】
誘導後、プラスミド（ｐＤＮＡＶＡＣＣｕｌｔｒａ−ＧＦＰ）からＬＢ及び抽出上清へのＰｈｉＸ１７４遺伝子Ｅの放出が観察された。ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡもまた放出された。細胞内のプラスミドは、その大部分が誘導されたサンプルから（ＭｇＳＯ４なし）培地及びＴＥ抽出物中に放出された。遺伝子Ｅを０．２ＭのＭｇＳＯ４存在下に誘導すると、プラスミドはＬＢには放出されなかったが、ＴＥ抽出バッファーのＭｇ濃度を下げると放出された。これらの実験は、培養物のゴースト化が、遺伝子Ｅ及び高コピープラスミドが存在すると起こること、及びプラスミドの放出が遺伝子Ｅ誘導に依存していることを証明している。ｐＤＮＡＶＡＣＣＵｌｔｒａのみの細胞株からはプラスミドは放出されず、プラスミドの放出がｐｈｉＸ１７４遺伝子Ｅ産物に依存していることが実証された。更に培地へのプラスミドの放出は、培地に０．２ＭのＭｇＳＯ４を加えることによって阻止できる。これにより細胞を回収することができ、バッファーを交換してマグネシウムを取り除き、プラスミドを放出させることができるようなる。
【０１２０】
ｐｈｉＸ１７４遺伝子Ｅ誘導によるｐＤＮＡＶＡＣＣｕｌｔｒａ−ＧＦＰプラスミド放出の経時変化を追った。２０〜４０分誘導後に、細胞から無傷のプラスミドが放出された。
【０１２１】
Ｐｈｉｘ１７４遺伝子Ｅ＋ｐＤＮＡＶＡＣＣｕｌｔｒａ−ＧＦＰ非誘導及び誘導沈殿物由来のプラスミドをＰＩ、ＴＥ、ＰＢＳ、ＥＢ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５）、ＢＢ（５０ｍＭ  ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）又は１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を用いて抽出した。プラスミド及びＲＮＡ及びゲノムＤＮＡは、すべてのこれらの条件で抽出した（図１６）。ＰＩ又はＥＢを用いて大量のプラスミドを抽出したところ、抽出後細胞沈殿物中のプラスミドはほとんど残っていなかった（図１６、レーンＢ２とＢ１とを比較せよ）。ＥＢでのプラスミド放出は、プラスミドの放出にＥＤＴＡが必要ないことを証明している。このことは、加工中にＥＤＴＡなしの処理でＬＰＳの放出が可能になることから有益である。
【０１２２】
プラスミド及びゲノムＤＮＡの抽出、及びＲＮＡの完全性を比較すると、いくつか差が見られた。例えば、ＲＮＡの抽出は  ＢＢ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及びＰＢＳで少なく、一方ゲノムＤＮＡ及びプラスミドは１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で少なかった。これらの塩及びカチオンの作用を最適化して、放出されるプラスミドの純度を高めることができる。
【０１２３】
非誘導、誘導及び誘導＋１０又は３０ｍＭスペルミン時のプラスミド放出を比較することで、スペルミン存在下でのｐＤＮＡＶＡＣＣｕｌｔｒａ−ＧＦＰのｐｈｉＸ１７４遺伝子Ｅ放出を決定した。ＬＢへのプラスミド及びゲノムの放出は、３０ｍＭのスペルミンによって阻害され、１０ｍＭのスペルミンにより部分的に阻害された。全沈殿物及び３０ｍＭスペルミンの溶出物については、ＲＮＡは検出されなかった。スペルミン処理細胞は、ＰＩ、ＴＥ、又はＥＢによるプラスミド抽出に耐性であったが、３０ｍＭスペルミン処理細胞からは、ＰＢＳ、ＢＢ（５０ｍＭ  ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）又は１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で一部のプラスミドが抽出された。誘導化細胞を一晩ＲＴでインキュベーションすると、三種類の誘導条件全てについて、培地へのプラスミドの放出が観察された。スペルミンによってより多くのＲＮＡが放出され（又は圧縮された）、かつＬＢ中で一晩インキュベーションした後のプラスミドへの切れ込みがきわめて少ないことが観察された。このことは、放出されたプラスミドが、培地中に保存された場合は安定であることを証明している。
【０１２４】
ｐｈｉＸ１７４遺伝子Ｅが仲介するプラスミドの放出について、細胞沈殿物を、バッファーＰＩ又は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０の中、ＲＴ、３７℃、５５℃、及び６５℃で３０分間インキュベーションして試験した。ＲＴ、３７℃、又は５５℃は、プラスミドの放出及び完全性に影響せず、ＰＩ中、６５℃では一部が溶解し、プラスミドに切れ目が入り、またゲノムが増加した。ＲＴと比較したとき、３７℃での一部ＲＮＡの分解がＰＩで観察されたが、Ｔｒｉｓ／ｍｇでは観察されなかった。
【０１２５】
全体として、これらの結果は、遺伝子Ｅ溶解タンパク質が誘導するプラスミドの放出が、細胞からの、高い収率での無傷プラスミドの放出に適していることを実証している。プラスミドの放出は、培地中にスペルミジン、又はその他圧縮剤があってもなくても、抽出バッファーのイオン強度／ｐＨを変えることによって制御できる。このことはまた、バッファーを各種バッファーに交換することによって、酵素によるゲノムＤＮＡ／ＲＮＡ除去の最適条件下で細胞からプラスミドを放出させられることも証明している。しかしながら、この方法を用いると、高レベルのゲノムＤＮＡ及びＲＮＡが放出される。
【０１２６】
実施例１４：遺伝子Ｅ溶解タンパク質が誘導する細胞ゴースト化で放出されたゲノムＤＮＡ及びＲＮＡの除去
ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡのヌクレアーゼによる削減
五種類の細胞株：１）ｐＡＣＹＣ−Ｂ−遺伝子Ｅ；２）ｐＡＣＹＣ−Ｂ−遺伝子Ｅ＋ｐＤＮＡＶＡＣＣＵｌｔｒａ−ＧＦＰ；３）ｐＤＮＡＶＡＣＣｕｌｔｒａ−ＧＦＰ；４）ｐＡＣＹＣ−Ｂ−遺伝子Ｅ＋ｐＶＥＸＢＴ５ＲＮａｓｅ；及び５）ｐＶＥＸＢＴ５ＲＮａｓｅを作製し、評価した。ｐＶＥＸＢＴ５ＲＮａｓｅは、適度のコピーを持つアンピシリン耐性ｐＭＢ１起源のプラスミドで、ｐＡＣＹＣプラスミドに適合しており、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡに対し活性であるが、スーパーコイルを形成しているプラスミドには活性でないアラビノース誘導性ヌクレアーゼを含んでいる。
【０１２７】
培養物を誘導しないか、又は誘導後（０．２％アラビノースで遺伝子Ｅ及びＴ５ＲＮａｓｅの両方を誘導）７０分間増殖させ、培養上清及び浸透圧ショック処理した細胞沈殿物中の核酸をゲル電気泳動を使って調べた。ＰｈｉＸ１７４遺伝子Ｅ溶解タンパク質及びｐＶＥＸＢＴ５ＲＮａｓｅを含む誘導処理された細胞株では、Ｔ５ＴＮａｓｅを誘導すると、培地中に放出されるゲノムＤＮＡの量が大きく減少した。同じ効果は、浸透圧ショックを加えた細胞沈殿物（５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、データ未提示）についても観察された。非誘導細胞からのゲノムの放出は、今回の実験で、高いＯＤ６００値の非誘導コントロールにおいてゴースト化が起こった原因である、溶解タンパク質の漏洩発現によるものである。このことは、Ｔ５ＲＮａｓｅの同時発現が、遺伝子Ｅが放出させたゲノムＤＮＡを破壊すること、並びに放出されたプラスミドの純度の向上及び溶解物の粘度の低下に利用できることを証明している。
【０１２８】
実施例１５：ＰｈｉＸ１７４遺伝子Ｅタンパク質仲介自己溶解を用いたプラスミドＤＮＡの製造
プラスミド製造では、プリオン遺伝子の発現をゲノム内に組み入れる必要があるだろう。プリオン遺伝子の発現は、誘導性プロモータによって駆動できる。好ましい誘導性プロモータとしては、ラムダＲＰ及びＰＬ、Ｔ５、Ｔ７のようなその他ファージプロモータ、ｔａｃ及びｔｒｃのような合成プロモータ、ｌａｃのような内因性プロモータ、コールドショックプロモータ（ｃｓｐＡ）、ａｒａＢＡＤ、定常期若しくは飢餓期プロモータ、増殖速度（ｒｍｆ）ｐＨ（ｃａｄＡ）、又は低酸素反応性（ｎａｒ）プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。誘導は、温度上昇（ＰＬ、ｔａｃ）、熱安定性レプレッサー（ラムダレプレッサー、ｌａｃレプレッサー）と同時の温度低下（ｃｓｐＡ；コールドショックプロモータ）、インデューサー（ｔａｃ、ｔｒｃ及びｌａｃについてはＩＰＴＧ；ＡｒａＢＡＤについてはアラビノース）、又はその他の手段（例えば定常期への移行、ｐＨ若しくは酸素シフト、グルコース若しくはアミノ酸飢餓；Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ＳＣ．１９９６  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２−５３８に概説されている）によって実施できる。又は、遺伝子は、調整されたアンチセンスＲＮＡによって誘導できる。様々な誘導性ｐｈｉＸ１７４遺伝子Ｅ発現システムが開発されており、熱（Ｃ１８５７により制御される突然変異誘導ラムダＰＲ；Ｊｅｃｈｌｉｎｇｅｒ  Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ  ＭＰ，Ｗｉｔｔｅ  Ａ，ａｎｄ  Ｌｕｂｉｔｚ  Ｗ．１９９９  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ．１７３：３４７−３５２）、寒さ（ｌａｃ又はファージレギュレータと組み合わせたＣ１８５７により制御されるラムダＰＲ、Ｊｅｃｈｌｉｎｇｅｒ  Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ  ＭＰ  ａｎｄ  Ｌｕｂｉｔｚ  Ｗ．１９９８  Ｇｅｎｅ  ２１８：１−７）、或いは化学物質（ラクトース若しくはＩＰＴＧとｌａｃＰＯ／Ｐｔａｃ、又は３ＭＢＺとｘｙｌＳレプレッサー−ＰＴｏｌ）によって制御される。
【０１２９】
培地へのプラスミド放出は、遺伝子Ｅ発現により誘導されるだろう。バッファーを培地に直接加えることにより、放出又は選択性を高めることができる。次に、濾過又は遠心分離によって細胞塊を取り除いて、プラスミドを浄化したブロスに残す。浄化したブロス中のゲノムＤＮＡ及びＲＮＡは、ヌクレアーゼ（株のゲノム内に取り込まれ、細胞株で発現しているもの、又は外から加えられたもののいずれか）の使用により削減できる。
【０１３０】
又は、汚染ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡは、清明化ブロスの熱又はアルカリ処理による選択的変性又は分解のような、既存の公知の方法を利用して削減できる。この例では、清明化した培養物からのゲノムＤＮＡ及びＲＮＡの除去は完全な細胞溶解後ではなく、むしろゴースト化後に起こり、ＬＰＳのような細胞成分の放出は減少するだろう。細胞からのプラスミドの放出はまた、ＥＤＴＡのような金属キレート化剤なしでも実施でき、ゴースト化細胞からのＬＰＳ流出を更に減らすことができる。ＰＥＧ又はＣＴＡＢのような圧縮剤、或いはＣａＣｌ２のような二価カチオンを利用して、ゲノム及びＲＮＡ汚染物からプラスミドＤＮＡを選択的に精製できる。このようなゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ削減法は、当技術分野で公知である。
【０１３１】
又は、プラスミド放出は、膜の剛性を変える（例えば０．２Ｍ  ＭｇＳＯ４又はＤＮＡの圧縮度を挙げる（例えばスペルミン）作用物質を、遺伝子Ｅ誘導の前後に加えることによって遅らせることができる。最終的な細胞集団を回収し、バッファーをプラスミド放出を促進するバッファー（例えばＭｇＳＯ４の例では、Ｍｇ濃度を下げることによる）に交換する。
【０１３２】
実施例１６：抗生物質仲介自己溶解を用いたプラスミドＤＮＡの製造
細胞壁阻害抗生物質を利用する別の自己溶解法を評価した。ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＴ５ＲＮａｓｅ構築体中のＴ５ＲＮａｓｅカセットをｐＡＣＹＣＢ構築体に移した。それぞれｇＷｉｓＧＦＰプラスミドと同時形質転換した、ｐＡＣＹＣＢＴ５ＲＮａｓｅ又はｐＡＣＹＣＢ未変性スタッファー（コントロール）の培養物を、ＬＢ＋５０ｕｇ／ｍＬカナマイシン＋３４ｕｇ／ｍＬクロラムフェニコール＋４ｍＭ  ＭｇＳＯ４で増殖させ、対数増殖中期に最終濃度０．２％のアラビノースを用いて、１時間、３０℃でタンパク質発現を誘導し、ペニシリン及びセフォタキシム（Ｆｌｕｋａ）（βラクタム系抗生物質）をそれぞれ最終濃度１００及び１０ｕｇ／ｍＬ加えて細胞の自己溶解を誘導した。培養物は、一晩、３０℃で振盪して溶解及びヌクレアーゼ消化した。細胞破砕物を遠心分離によって取り除き、フェノールクロロホルム抽出によってタンパク質を除いた後に、アガロースゲル（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎＩＩ後染色）を用いて上清の核酸含有量を調べた。Ｔ５ＲＮａｓｅ株では、ゲノムＤＮＡが劇的に減少したが、コントロールでは減少しなかった。残留ゲノムＤＮＡは、インキュベーション（３７℃、３０分）によって取り除いた。溶解培養物を、温度を上げ、更に長時間インキュベーションしても、プラスミドの減少は観察されなかった。予想通り、Ｔ５ＲＮａｓｅ細胞株では、コントロールの細胞株に比べ溶解物の粘度が大きく低下した。
【０１３３】
これらの結果は、プラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）と各種自己溶解法の組み合わせの、プラスミド製造に関する普遍的有用性を証明している。
【０１３４】
従って、読者は、発明のプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）及び関係する製造工程が、改良されたプラスミド製造のための組成物及び方法を提供することが分かるだろう。
【０１３５】
上記の記載は多くの特異性を含むが、これらは発明を制限するものと解釈してはならず、むしろその１つの好ましい態様の例示として解釈しなければならない。多くのその他の変形が可能である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ（Ｈａｎａｋ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ、２００１）又はガンマー線照射（ＭａｃＰｈｅｅら、１９８８）を用いて染色体切断を誘導した時には、内因性のエクソヌクレアーゼ（ｒｅｃＢＣＤ）を利用したゲノムＤＮＡの削減が観察されている；これら産物は、次にエンドヌクレアーゼの基質となる。この形式では、細胞は染色体切断誘導（放射線照射の場合一晩）後も増殖を続ける。この方法は、内因性エクソヌクレアーゼ活性を利用してＤＮＡを除く場合には上手く機能しないが、発明のプラスミド−セーフヌクレアーゼ（ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）を用いることで大きく改善されるだろう。
【０１３６】
従って、発明の範囲は、例示の態様によってではなく、添付の請求の範囲、及びそれらの合法的均等物によって決定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１は、変性プラスミド及び大腸菌ゲノムＤＮＡのＴ５エクソヌクレアーゼによる消化を例示する。
【図２】図２は、ｐＶＥＸＳａｐＩスタッファーベクターを示す。
【図３】図３は、ｃＤＮＡ配列を定方向増幅してｐＶＥＸベクター内にクローニングする方法を示す図。
【図４】図４は、ｐＶＥＸＳａｐＩＯｍｐＡスタッファーベクターを例示する。
【図５】図５は、ｐＶＥＸＢＳａｐＩＯｍｐＡスタッファーベクターを示す。
【図６】図６は、ｐＶＥＸＢＯｍｐＡＲＮａｓｅベクターを曝露する。
【図７】図７は、ｐＶＥＸＢＯｍｐＴ５ＲＮｓｅベクターを例示する。
【図８】図８は、Ｔ５ＲＮａｓｅエクソヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの除去を示す図。プラスミドＤＮＡのゲルの写真。調製物は、好ましいＴ５エクソヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅ遺伝子を使用した場合と、使用していない場合について示す。
【図９】図９は、Ｓペプチド及びＳタンパク質の会合を利用したＲＮａｓｅＳ−Ｔ５キメラの作成を例示する。
【図１０】図１０は、キメラヌクレアーゼによる核酸の加水分解を明示する。
【図１１】図１１は、Ｓペプチド−Ｔ５＋Ｓタンパク質及びＴ５ＲＮａｓｅ構築体によるＲＮＡの削減を示す。
【図１２】図１２は、Ｓペプチド−Ｔ５＋Ｓタンパク質構築体によるＲＮＡ及びゲノムＤＮＡの削減を曝露する。
【図１３】図１３は、ＰｈｉＸ１７４遺伝子Ｅ小孔を介した大腸菌細胞質内容物の放出を例示する。
【図１４】図１４は、ｐＡＣＹＣＢ未変性スタッファーベクターを示す。
【図１５】図１５は、ｐＡＣＹＣＢ遺伝子Ｅベクターを例示する。
【図１６】図１６は、遺伝子Ｅ溶解タンパク質が仲介するプラスミド放出を示す。
【図１７】図１７は、抗生物質誘導自己溶解後の、ヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡ除去を例示する。
【図１８】図１８は、プラスミド製造での、周辺細胞質ヌクレアーゼ発現製造用宿主の使用を例示する。
【図１９】図１９は、自己溶解プラスミド製造工程での、周辺細胞質ヌクレアーゼ発現製造用宿主の使用を例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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