(57)【要約】  温度循環に対する依存なしに核酸序列の増幅を提供して通常的なベンチトップ温度循環装置から核酸序列の増幅方法を自由にする方法、装置、組成物が記載される。二重ストランド核酸の変性、プライマーアニーリング、及び重合酵素によるプライマー延長の精密な制御が、核酸に応力を適用することによってなされうる。この方法は、通常的なＰＣＲ方法に比べて：ＰＣＲ過程に対する精密な制御と、全般的に改善された忠実度と、ＧＣ−高含量領域または連続反復領域のような問題性のある序列に対する改善された正確性と、増大された序列長さと、増加された反応収率と、短縮された実験時間と、さらに大きい効率性と、さらに低いコストと、さらに高い移動性と、温度、ｐＨ、及びイオン強度のような多様な環境的なパラメータに対する堅固度と、を含む一つ以上の利点を提供しうる。
2008500029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド序列を増幅する方法であって、
前記方法は、
（ａ）一つ以上の単一ストランドＤＮＡの鋳型ストランドを、前記各鋳型ストランドの一部に相補的な一つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップと、
（ｂ）前記一つ以上のプライマーを前記鋳型ストランドの相補的な部分に混成化させるステップと、
（ｃ）前記鋳型ストランドをＤＮＡ重合酵素及び４種類以上のヌクレオシド三リン酸と接触させるステップと、
（ｄ）前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を進め、これにより、前記鋳型ストランドに結合された延長生成物を形成するステップと、
（ｅ）前記延長生成物を前記鋳型ストランドから分離させるステップと、
を含み、
その後、前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）を、各反復前に前記（ｅ）ステップを行って１回以上反復し、
前記一つ以上のプライマーを前記鋳型ストランドの相補的な部分に混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって、前記混成化を制御するステップを含む、または、
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって、各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含む、または、
前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離させるステップは、前記鋳型ストランドに応力を適用することによって、前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップを含む、または、
前記ステップ（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）のうち一つ以上の間に前記鋳型ストランドに応力が適用されるものであって、これらの組合わせである、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記一つ以上のプライマーを前記鋳型ストランドの相補的な部分に混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって前記混成化を制御するステップを含み、
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって、各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって、各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含み、
前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップは、前記鋳型ストランドに応力を適用することによって前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記一つ以上のプライマーを前記鋳型ストランドの相補的な部分に混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の提供を制御することによって前記混成化を制御するステップを含み、
前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップは、前記鋳型ストランドに応力を適用することによって前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップを含むか、またはこれらの組合わせを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含み、
前記一つ以上のプライマーを前記鋳型ストランドの相補的な部分に混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって前記混成化を制御するステップを含み、
前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップは、前記鋳型ストランドに応力を適用することによって前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップを含むか、またはこれらの組合わせを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御するステップは、前記鋳型ストランドに対する機械的張力、水力学的応力、または電場エネルギーの適用を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御するステップは、前記鋳型に制御された量の機械的張力を直接適用するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記鋳型ストランドに制御された量の機械的張力を直接適用するステップは、前記一つ以上の鋳型ストランドが付着された表面を移動するステップを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御するステップは、前記鋳型ストランドに対する水力学的応力を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記鋳型ストランドは、流体流れに露出された表面に固定される、流体流れに露出された表面に固定されたＤＮＡ重合酵素に結合される、または、逆伝搬性の流体流れによって維持されかつ延長される、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御するステップは、前記鋳型ストランドの一側または両側の末端に連結された粒子に力を適用するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ｅ）で、応力を適用するステップは、前記ステップ（ｄ）で適用される同じ応力の増加された量を適用するステップを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記鋳型ストランドの相補的な部分に前記一つ以上のプライマーを混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を約０ないし約３０ｐＮの範囲内で制御することによって前記混成化を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記鋳型ストランドの相補的な部分に前記一つ以上のプライマーを混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を約１０ないし約３０ｐＮの範囲内で制御することによって前記混成化を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を約３０ないし約６０ｐＮの範囲内で制御することによって、各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御し、前記ＤＮＡ上の難しい序列が複製される時期に該当する時点に前記応力を増大させることによって、各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡは、５０％を超えるＧＣ含量を有する数個の残分の一つ以上のセグメントを含み、前記ＤＮＡは、９０％より高い効率性に増幅されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡは、６０％より高いＧＣ含量を有する数個の残分の一つ以上のセグメントを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡは、８個以上の塩基対の反復単位を含む一つ以上のセグメントを含み、前記ＤＮＡは、９０％より高い効率性に増幅されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、約６５℃未満で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ステップは、約５０回以上反復されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
約１０００塩基より多くの塩基で構成された鋳型ストランドが増幅されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法は、約１時間以内に完了することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡを含む溶液は、ｐＨ４−７またはｐＨ８−１０を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
約１μｌ未満の容量を有する反応チャンバで行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップ（ａ）の前に、
ＲＮＡ試料を収得するステップと、
相補的なＤＮＡストランドを生成可能にするのに十分な組成物の存在下に、前記ＲＮＡを逆転写酵素と接触させるステップと、
単一ストランドＤＮＡを形成するために、前記ＤＮＡを前記ＲＮＡから分離するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ａ）の前に、
ＤＮＡ試料を収得するステップと、
前記ＤＮＡを変性させるステップと、
前記ＤＮＡストランドを反応チャンバ内で基板に結合させるステップと、
前記反応チャンバをフラッシングして前記試料から汚染物を除去するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップ（ａ）の第１の場合であって、前記一つ以上の鋳型ストランドは、一つのＤＮＡ分子から収得されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ａ）の少なくとも第１の場合であって、前記一つ以上の鋳型ストランドは、精製されていない試料物質内に含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記鋳型ストランドを基板に結合された分子を結合できる複合体化基を含むプライマーと接触させることによって、前記鋳型ストランドを前記基板に結合させるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記複合体化基は、活性化可能であることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３２】
前記基板の表面に結合された前記複合体化基及び分子は、ビオチン及びストレプトアビジンであることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３３】
前記プライマーは、光活性化可能な束縛されたビオチンを含むことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３４】
病原菌を検出する方法であって、
請求項１に記載の方法を含み、
前記病原菌と特異的に関連したヌクレオチド序列の存在如何に対して結果物であるＤＮＡを探索するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記病原菌は、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ：ＡＡＶ）、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ）、エプスタインバールウイルス、エンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、人間ヘルペスウイルスタイプ６、人間免疫欠乏症ウイルスタイプ１、人間免疫欠乏症ウイルスタイプ２、人間Ｔ−細胞リンパ営養性ウイルスタイプＩ、人間Ｔ−細胞リンパ営養性ウイルスタイプＩＩ、マイコバクテリア結核、マイコプラズマ、パーボウイルスＢ−１９及び豚内因性レトロウイルス（ＰｏｒｃｉｎｅＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＲｅｔｒｏＶｉｒｕｓ：ＰＥＲＶ）で構成される群から選択されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
第１増幅サイクルのための前記鋳型ストランドを準備するために、ｍｌ当り約１０００個未満の個体またはポリヌクレオチドを含む試料を収得するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
ＤＮＡ序列を増幅する方法であって、
（ａ）二重ストランドＤＮＡを二つの単一ストランドＤＮＡ分子に分離させるのに十分な応力を前記二重ストランドＤＮＡに適用するステップを含む方法によって、一つ以上の二重ストランドＤＮＡを変性させ、前記一つまたは二つの単一ストランドＤＮＡ分子は、以後のステップで鋳型ＤＮＡストランドとなるステップと、
（ｂ）前記鋳型ストランドを前記各鋳型ストランドの一部に相補的な一つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡ重合酵素及び４種類以上のヌクレオシド三リン酸と接触させるステップと、
（ｃ）前記ステップ（ａ）での応力適用を減少させて、前記プライマーを各鋳型ストランドの該当する相補的な部分にアニーリングさせるステップと、
（ｄ）前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御して前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップと、
（ｅ）前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）を１回以上反復するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
前記応力を適用する、前記応力を減少させる、および前記応力を制御するステップは、前記ＤＮＡを基板または一つ以上の粒子または両者に結合させるステップ及び前記基板または一つ以上の粒子の運動を制御するステップを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記応力を適用する、前記応力を減少させる、および前記応力を制御するステップは、前記ＤＮＡを一つ以上の粒子に結合させるステップ及び光学的な操作または磁気的な操作によって前記粒子の運動を制御するステップを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記応力を適用する、前記応力を減少させる、および前記応力を制御するステップは、前記ＤＮＡに対する流体流れを調整するステップを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＤＮＡは、基板に結合された重合酵素によって結合されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＤＮＡは、基板に結合されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＤＮＡは、流体流れの速度勾配で伸びることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＤＮＡは、逆伝搬性の流体流れによって伸びることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるために、前記鋳型ストランドに対する応力を制御するステップは、前記ＤＮＡ上の難しい序列が複製される時期に該当する時点に前記応力を増大させるステップを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
ａ）標的序列を含む二重ストランドＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）試料、前記標的序列の３’末端及びその相補体に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、４種類以上のヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡ重合酵素を提供するステップと、
ｂ）前記ｄｓＤＮＡを融解させるのに十分な張力を前記ｄｓＤＮＡから誘発して、前記ｄｓＤＮＡを単一ストランドＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に変性させるステップと、
ｃ）前記鋳型ストランド内の前記張力を、前記プライマーの相補的な鋳型ストランドへの混成化を許容するのに十分であるように減少させるステップと、
ｄ）前記鋳型ストランド内の張力を、前記ＤＮＡ重合酵素が前記プライマーを延長してｄｓＤＮＡを形成させうるレベルまで調整するステップと、
ｅ）前記ステップ（ｂ）ないし（ｄ）を１回以上反復するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４７】
前記の全体のプロセスは、周囲の温度と同じレベルの温度で行われることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記の全体のプロセスは、約２０℃より高く、約６０℃より低い温度で行われることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記の全体のプロセスは、室温で行われ、前記ステップ（ｂ）で、張力は、約６５ｐＮであり、前記ステップ（ｃ）で、張力は、約３０ｐＮないし６０ｐＮに減少し、前記ステップ（ｄ）で、張力は、約０ｐＮないし３０ｐＮに調整されることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記張力は、電気的に、磁気的に、または光学的に前記ＤＮＡに結合された一つ以上の粒子を操作するか、前記ＤＮＡが結合された表面を移動させるか、前記ＤＮＡが露出された流体流れを制御するか、またはこれらの組合わせによって誘発されかつ制御されることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
密閉された反応チャンバに連結された一つ以上の流体チャンネルを備える核酸序列を複製する装置であって、
前記反応チャンバが、その内部にＤＮＡ分子を維持する手段を備え、
前記装置は、その内部に維持された前記ＤＮＡ分子に可変的であり、制御された量の応力を適用するメカニズムをさらに含むことを特徴とする装置。
【請求項５２】
核酸プライマー、ヌクレオシド三リン酸、及び重合酵素の導入のための一つ以上の保存チャンバをさらに備えることを特徴とする請求項５１に記載の装置。
【請求項５３】
前記反応チャンバ内に維持された前記ＤＮＡ分子に応力を適用する前記メカニズムは、第１表面及び第２表面を含み、その上にＤＮＡ分子を固定するための手段を備え、前記装置は、前記表面のうち一つまたは両者何れもを相互間に移動させうるメカニズムをさらに含むことを特徴とする請求項５１に記載の装置。
【請求項５４】
前記反応チャンバ内に維持された前記ＤＮＡ分子に応力を適用する前記メカニズムは、一つ以上の表面を含み、その上にＤＮＡ分子を固定するための手段を備え、前記装置は、前記ＤＮＡ上に制御され、可変的な流体流れを提供するメカニズムをさらに含むことを特徴とする請求項５１に記載の装置。
【請求項５５】
ＤＮＡ分子を固定するための手段をその上に含む前記一つ以上の表面は、前記表面を通じた流路をさらに備えることを特徴とする請求項５４に記載の装置。
【請求項５６】
前記ＤＮＡ上に制御され、可変的な流体流れを提供するメカニズムは、層流において、速度勾配を形成するように配列されることを特徴とする請求項５４に記載の装置。
【請求項５７】
前記反応チャンバ内に維持された前記ＤＮＡ分子に応力を適用するメカニズムは、層流で速度勾配、流体流れ内の停滞点、逆伝搬性の流体流れまたはこれらの組合わせを提供するように配列された流体流れチャンネルを備えることを特徴とする請求項５５に記載の装置。
【請求項５８】
前記反応チャンバ内に維持された前記ＤＮＡ分子に応力を適用するメカニズムは、ＤＮＡ分子に結合された粒子を操作できる光学的、電気的、または磁気的操作器のアレイを含むことを特徴とする請求項５５に記載の装置。
【請求項５９】
ＤＮＡ増幅のための微細流体装置であって、
ａ）基板と、
ｂ）前記基板内に位置した流れチャンネルと、
ｃ）ＤＮＡ試料を前記流れチャンネルに導入させうる前記流れチャンネルと流体疎通関係がある流入口及び前記ＤＮＡに応力を適用する手段と、
を備え、
前記装置は、前記ＤＮＡの変性を促進するために前記流れチャンネルの一つ以上の領域内に温度を調節するために作動的に配置された温度制御器を備えていないことを特徴とする微細流体装置。
【請求項６０】
前記基板は、弾性重合体物質で構成されることを特徴とする請求項５９に記載の微細流体装置。
【請求項６１】
前記流れチャンネルは、前記流れチャンネルに導入された試料が前記流れチャンネルの周囲に循環されるように配列されることを特徴とする請求項５９に記載の微細流体装置。
【請求項６２】
前記微細流体装置は、前記チャンネルを通じて流体が移動するように作動的に配置されたポンプをさらに備えることを特徴とする請求項５９に記載の微細流体装置。
【請求項６３】
前記流れチャンネル内に核酸を固定化する手段を備えることを特徴とする請求項５９に記載の微細流体装置。
【請求項６４】
前記流れチャンネル内に固定化された一つ以上の重合酵素分子を含むことを特徴とする請求項５９に記載の微細流体装置。
【請求項６５】
前記流れチャンネルは、実質的に円形であることを特徴とする請求項６１に記載の微細流体装置。
【請求項６６】
前記微細流体装置は、前記チャンネルを通じて流体を移動させるために作動的に配置されたポンプをさらに備えることを特徴とする請求項６５に記載の微細流体装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅及び検出に関する。特定の具体例で、本発明は、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ：ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う改善された方法、装置及び材料を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲは、特定ＤＮＡ序列またはＲＮＡ序列を増幅するために利用される通常的な技法となった。１９８７年７月２８日にＭｕｌｌｉｓに許与された特許文献１及び２は、基本的なＰＣＲ技法を開示する。ＰＣＲ方法の最初公開以後に、ＰＣＲ方法は、生物工学及び生物医学の実施に非常な影響を及ぼしている。その以後に許与された数千件の米国特許は、前記二つの特許のうち一つまたは両者何れもの開示内容を援用する。
【０００３】
通常的に、ＤＮＡ序列の増幅は、まず標的ＤＮＡ序列の両末端に相補的な二つのオリゴヌクレオチドプライマーを選択しかつ収得するステップによって行われる。プライマー、重合酵素、４種類の共通されたヌクレオシド三リン酸の混合物、多様な塩類及び緩衝溶液を標的ＤＮＡと混合し、ＤＮＡを変性させるために、これを約９０℃まで加熱して標的二重ストランドＤＮＡを単一ストランドＤＮＡ鋳型に分離させる。プライマーのＤＮＡ鋳型の末端へのアニーリング（すなわち、序列−特異的混成化または結合）は、約６０℃未満まで反応混合物を徐々に冷却させることによって行われる。その後、複製、すなわち、プライマー延長とも知られた過程の間に、温度を約７０℃以上まで上昇させる。重合酵素は、各ＤＮＡ鋳型ストランドを３’から５’方向に解読し、プライマーの末端から相補的な序列を５’から３’方向に合成する。これは、ＤＮＡ増幅の１サイクルを完成し、新たなサイクルのための開始物質を生成する。それぞれの完全なサイクルは、変性、プライマーアニーリング、及びプライマー延長で構成され、その過程は、指数的に増加する数（２ｎ）の元来の標的ＤＮＡ序列のコピーを生成する。新たなサイクルを開始するために、反応混合物は、再び９０℃以上まで加熱されて、二重ストランド生成物を単一ストランドＤＮＡ鋳型に変性させる。その後、プライマーアニーリング及び延長ステップが反復される。
【０００４】
このような基本的なＰＣＲ増幅体系は、多様な拡張及び変形と共に、核酸の操作及び検出のための多数の異なる方法、例えば、診断分析及び法医学的分析を含む方法を可能にし、この方法は、少量の初期試料からしきい値量のＤＮＡを生成することを必要とする。ＰＣＲ技術は、例えば、伝染性疾患及び遺伝性疾患のモニタリング、ＤＮＡ及びＲＮＡの序列決定、遺伝子発現研究、薬物開発、及び法医学的フィンガープリンティングで利用される。これは、ウイルス性病原菌及び細菌性病原菌の検出、同定及び定量のための標準技術となった。色々なＰＣＲ−基盤の診断テストは、例えば、ＡＩＤＳを誘発するＨＩＶ−Ｉ；肝癌を誘発しうるＢ及びＣ型肝炎ウイルス；子宮頸部癌を誘発しうる人間乳頭腫ウイルス；乳児の肺炎及び気管支炎の主要な原因であるＲＳＶと、女性の骨盤炎症性疾患及び不妊を誘発しうるクラミジアトラコマチス及びネイセリアゴナホエア；移植患者及びその他の免疫弱化者の生命を威嚇する疾患を誘発しうるサイトメガロウイルス；及び活性状態で咳及び疲労を誘発し、感染された機関を回復不能に損傷させうるマイコバクテリア結核；を含む病原菌の検出及び／または定量のために利用可能である。しかし、多数の分野で必要性を充足させているにも拘わらず、現在のＰＣＲ及びＰＣＲ−基盤技術は、依然として色々な根本的な限界点を有する。
【０００５】
通常的なＰＣＲ及びＰＣＲ−基盤技術の限界点
忠実度：正常的な序列に対する正確性が通常的なＰＣＲを制限する。例えば、ＤＮＡの増幅のために通常的に利用される耐熱性重合酵素であるＴａｑは、ＰＣＲの間に約１×１０−４個のエラー／塩基対のエラー率を表す。これは、４００個の塩基対から構成されたＤＮＡ序列のＰＣＲ増幅は、２０サイクルの間にＰＣＲ生成物の全ての分子のうち、約４０,０００個のエラーを任意的に導入するということを意味する。
【０００６】
難しい標的序列（例えば、ＧＣ含量の高い序列または反復序列）に対する正確性は、通常的なＰＣＲ及びＰＣＲ−基盤技術の非常に重要な限界点である。Ｔａｑのような通常的な重合酵素反応のエラー率は、標的ヌクレオチド序列に大きく依存する。例えば、序列がＧ＋Ｃ含量が高い場合（例えば、鶏のアビジン遺伝子の５’調節領域での序列）、ＴａｑによるＰＣＲは、度々実行可能な方法ではない。同様に、トリヌクレオチド反復序列（ＡＧＣ）ｎまたは連続反復序列（Ａ）ｎのような単純な反復序列は、Ｔａｇのエラー率を反復序列当り１.５×１０−２個のエラーまで増加させうる。非特許文献１を参照する。この理由のため、さらに高い忠実度（すなわち、さらに低いエラー率）を有するように遺伝工学的に開発された重合酵素に対して、色々な特許が許与された。これらは、Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ及びＰｈｕｓｉｏｎ重合酵素を含む。
【０００７】
長さの制限：増幅される標的序列の長さもまた、現在のＰＣＲ技術を制限する。一部報告は、１０ないし２０キロベースまでの序列の増幅を主張するが、これは、通常的な実施では非常に稀であり、非常に難しい。また、長い標的鋳型のＰＣＲ増幅は、限定されたセットの適切なＤＮＡ序列上でのみ可能である。適切な序列上で非常に日常的であり、コスト効率的なＤＮＡ増幅のための現実的な上限は、約３００ないし４００個の塩基から構成された長さであり、一般的に、Ｇ−Ｃ含量の高い序列に対しては、その上限が低くなる。
【０００８】
制限された増幅：現在のＰＣＲ技法はまた、一つの反応混合物で行われうる増幅サイクルの数でも制限される。反復的な加熱及び冷却サイクルは、漸進的な酵素分解（劣化）をもたらし、これは、開始物質が増幅されうる増幅係数を制限する。通常的なＰＣＲ増幅が３０〜３５サイクルを超える場合は、非常に稀である。
【０００９】
堅固度：通常的なＰＣＲは、一般的に相当な容量の試薬、体積の大きい装置（例えば、温度循環器）、相当な人間労働力（例えば、退屈な最適化）、及び最少量の開始物質を必要とし、それぞれは、通常的なＰＣＲを高コスト及び相当な時間のかかる方法で作るのに寄与する。現在のＰＣＲ技法は、通常的に正常的な序列に対しては、数時間かかるが、難しい序列または長い鋳型に対しては、数日ないし数週がかかる。通常的なＰＣＲ技法は、反応混合物の温度を循環及び平衡化させるために、相当な量の時間を必要とする。また、理想的でない状態の標的をはっきりと増幅させるためには、時間のかかる最適化が要求される。
【００１０】
通常的なＰＣＲ技法を行うためには、細密に制御された条件（例えば、温度、ｐＨ及び緩衝溶液の構成成分）が要求される。また、多様な汚染物が標的ＤＮＡまたはＲＮＡをコピーするために利用される重合酵素を直接的に抑制または妨害して、ＰＣＲ増幅を妨害しうる。これは、増幅のために利用されうる開始物質の品質をさらに制限し、増幅ステップがはっきりと行われる前に、ＤＮＡまたはＲＮＡ抽出技法によって収得されねばならない純度のレベルに追加的な要件を賦課する。通常的なＰＣＲの実行環境は、一般的に実験室に限定され、遠距離場所、医者の診療室、患者の寝床、または野外ではほとんど実行できない。
【００１１】
診断の敏感度及び特異性：ＰＣＲ−基盤の診断及び法医学用キット及び分析法の敏感度は、ＰＣＲ反応で達成可能な全体収率、正確度、堅固度、及び標的の長さに依存的である。現在のＰＣＲの性能パラメータについての前述した限界点は、ＰＣＲ増幅をはっきりと行うために必要な開始ＤＮＡまたはＲＮＡの最少量に限界を設定する。これはまた、通常的なＰＣＲまたはＰＣＲ−基盤技術に依存する病原菌検出システム、診断または法医学用キットまたは分析法の敏感度を制限する。ＰＣＲ−基盤診断、法医学、または病原菌検出システムの特異性は、ＤＮＡが増幅されかつ解読される正確性及びはっきりと増幅されかつ確認されうる標的ＤＮＡまたはＲＮＡの長さに臨界的に依存的である。
【００１２】
このような理由及びその他の理由のため、現在のＰＣＲ−基盤技術及び検出システムは、全体速度、効率性、コスト−効率性、及び用途の範囲の側面で一般的に制限される。通常的なＰＣＲ方法及び装置に対する漸進的な改善が、前述した分離された性能パラメータのうち一部に対して提案された。例えば、Ｔｓｏらは、２００３年９月２日に許与された特許文献３で、試料流体の微量を利用してＤＮＡを増幅するＰＣＲマイクロ反応器を開示する。高温でのＤＮＡ変性に対する代案も提案された。例えば、Ｐｕｒｖｉｓは、２００１年９月１８日に許与された特許文献４で、二重ストランド核酸の電気化学的な変性方法を開示した。Ｓｔａｎｌｅｙは、２００１年３月６日に許与された特許文献５で、さらに他の核酸の電気化学的な変性方法を開示する。Ｄａｔｔａｇｕｐｔａらは、２００１年４月１０日に許与された特許文献６で鋳型からＤＮＡストランドを置換するためにプライマーを使用する方法を開示した。また、Ｍｕｌｌｉｓは、まずＤＮＡストランドを分離するためにヘリカーゼ酵素の利用を提案した。
【００１３】
通常的なＰＣＲの限界点を考慮するとき、多様な漸進的な改善に対する提案にも拘わらず、本発明が属する技術分野で核酸の増幅、操作、序列決定、及び検出のための改善された方法、装置及び組成物に対する必要性が存在する。
【特許文献１】米国特許第４,６８３,２０２号明細書
【特許文献２】米国特許第４,６８３,１９５号明細書
【特許文献３】米国特許第６,６１３,５６０号明細書
【特許文献４】米国特許第６,２９１,１８５号明細書
【特許文献５】米国特許第６,１９７,５０８号明細書
【特許文献６】米国特許第６,２１４,５８７号明細書
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１：９７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の方法及び装置は、ＰＣＲを行う革新技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本明細書に記載の技術は、ＰＣＲが温度循環に対する依存なしに実行可能にする。本技術は、広範囲な周囲温度でまたは制御された温度で適用されうる。複製及び増幅の間に、必要に応じて、正確な制御が可能であり、これにより、多数の性能パラメータでの実質的な改善を可能にする。“ナノ−ＰＣＲＴＭ”と呼ばれるこの技術は、核酸のＰＣＲ−基盤の検出及び増幅に新たなパラダイムを導入する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
定義
“核酸”、“ポリヌクレオチド”、及び“オリゴヌクレオチド”という用語は、本明細書でリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むが、これに限定されていない任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を含むために使われる。この用語間に長さに対して意図された区分はない。また、この用語は、該分子の一次構造のみを意味する。したがって、特定の具体例で、この用語は、三重ストランド、二重ストランド及び単一ストランドＤＮＡ及び三重ストランド、二重ストランド及び単一ストランドＲＮＡを含みうる。それらはまた、メチル化及び／またはキャッピングによるようなポリヌクレオチドの変形された形態及び変形されていない形態を含む。さらに詳細には、“核酸”、“ポリヌクレオチド”、及び“オリゴヌクレオチド”という用語は、（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）ポリデオキシリボヌクレオチド、（Ｄ−リボースを含む）ポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドのその他の種類のポリヌクレオチド及び非ヌクレオチド系バックボーン、例えば、ポリアミドを含むその他の重合体類（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））及びポリモルフォリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇ．からＮｅｕｇｅｎｅに購入可能である）重合体、及び重合体がＤＮＡ及びＲＮＡで発見されるような塩基対の形成または塩基スタッキングを可能にする配列で核塩基を含む場合、合成序列−特異的核酸重合体を含む。
【００１７】
本明細書で使われる“プライマー”は、適した温度及び適した緩衝溶液に浸された適した条件（すなわち、４種類のヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡ重合酵素またはＲＮＡ重合酵素または逆転写酵素のような重合作用剤の存在）下で、鋳型−誘導ＤＮＡ合成の開始点として作用できる単一ストランドのポリヌクレオチドを意味する。プライマーの適した長さは、プライマーの意図された用途に依存的であるが、一般的に７個以上のヌクレオチドで構成された長さであり、さらに一般的には、１０個ないし３０個のヌクレオチドで構成された長さである。他のプライマーは、３０ないし５０個のヌクレオチドで構成された長さのように、長さがさらに長いこともある。ＰＣＲプライマーは、通常的に約２０〜３０個の塩基対で構成される長さであり、標的序列の上流に位置した（すなわち、５’から３’方向）一側のストランド及びその序列の下流に位置した（すなわち、３’から５’方向）その反対側のストランドに相補的に選択される。プライマーの５’末端は、増幅されたＰＣＲ生成物の末端を限定する。プライマーは、ＡＴ含量とほぼ同じＧＣ含量を含み、一つの塩基で構成された長い部位は含めない。また、プライマーは、相互間に実質的に相補的な構造を含んではならない。これは、“プライマー二量体”または他の二次構造が形成されていないことを保証する。短いプライマー分子は、一般的に鋳型と十分に安定的なハイブリッド複合体とを形成するために、さらに低い温度を要求する。プライマーが鋳型の正確な序列を反映する必要はないが、鋳型と混成化されるのに十分な程度に相補的でなければならない。“プライマー部位”または“プライマー結合部位”という用語は、プライマーが混成化される標的ＤＮＡのセグメントを意味する。“プライマー対”という用語は、増幅されるＤＮＡ序列の５’末端の相補体と混成化する５’“上流プライマー”及び増幅される序列の３’末端と混成化する３’“下流プライマー”を含む一セットのプライマーを意味する。
【００１８】
本明細書で使われる“相補的”という用語は、一つの核酸が他の核酸分子と一致するか、またはそれに選択的に混成化されるということを意味する。混成化の選択性は、特異性の完全な不在よりさらに選択的な混成化が発生する場合に存在する。通常的に、選択的な混成化は、１４〜２５個以上のヌクレオチドで構成された部位に対して、約５５％以上の一致性、択一的に６５％以上、７５％以上、または９０％以上の一致性がある場合に発生するであろう。択一的な一具体例で、一つの核酸は、他の核酸に特異的に混成化される。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）を参照する。
【００１９】
“完壁に相補的な”プライマーは、プライマーの全体長さにわたって完全に相補的な序列を有し、不一致を含まない。プライマーは、通常的に標的序列の一部（サブ序列）に完壁に相補的である。“不一致”は、プライマーのヌクレオチドとそれと整列された標的核酸のヌクレオチドとが相補的でない部位を意味する。プライマーと関連して使われる場合、“実質的に相補的な”という用語は、プライマーがその標的序列に完壁に相補的ではなく、その代りに、プライマーの所望のプライマー−結合部位でそれぞれのストランドに選択的に混成化されるのに十分な程度にのみ相補的であるということを意味する。
【００２０】
本明細書で使われる“プローブ”は、一つ以上の種類の化学結合、通常的には相補的な塩基対の形成を通じて、通常的には水素結合の形成を通じて相補的な序列の標的核酸に結合し、これにより、二重ストランド構造を形成できる核酸である。プローブは、“プローブ結合部位”に結合するかまたは混成化される。プローブは、特に、一旦プローブがその相補的な標的に混成化された後、プローブの容易な検出を許容するために検出可能な標識で標識されうる。プローブに付着された標識は、例えば、化学または物理的な手段によって検出されうる、本発明が属する技術分野で公知された多様な標識を含みうる。プローブに付着されうる標識は、放射性同位元素、蛍光発光団、発色団、金粒子、量子点、質量標識、電子密集粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を放出する分子、電気化学的に活性である分子、酵素、補助因子及び酵素基質を含むが、これに限定されない。プローブは、サイズが非常に多様でありうる。一部プローブは、比較的短い。一般的に、プローブは、７個ないし１５個以上のヌクレオチドで構成された長さである。他のプローブは、２０個、３０個、または４０個以上のヌクレオチドで構成された長さである。さらに他のプローブは、長さがさらに長く、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個以上のヌクレオチドで構成された長さである。しかし、他のプローブは、長さがさらに長く、１００個、１５０個、２００個またはそれ以上のヌクレオチドで構成された長さである。プローブは、前述した範囲内に属する任意の特定長さでありうる。
【００２１】
“好熱性ＤＮＡ重合酵素”は、４０℃を超える、機能を発揮する最適温度を有する耐熱性ＤＮＡ重合酵素である。度々、好熱性ＤＮＡ重合酵素の機能のための最適温度は、５０℃ないし８０℃、または６０℃ないし８０℃の範囲である。このような耐熱性酵素は、通常的なＰＣＲの間に酵素の加熱及び冷却の反復されたサイクルに対して、堅固度をさらに提供するために導入された。
【００２２】
“難しい序列”は、重合酵素がその上で滑るか、ミスをするかまたは作用を中断する傾向のある序列を意味する。難しい序列の例は、ＧＣ−高含量序列と呼ばれる約５０％より高い比率のＧとＣの塩基対を有する一部残分の序列（例えば、６個、９個、１２個、１５個、または３０個の塩基対またはそれ以上の長さのセグメント）、連続的な反復セグメントを含む序列、ポリ−Ａ序列のようなポリ反復序列、ハンティングトン病のような特定の疾患と関連した序列で発見されるトリヌクレオチド反復領域、及びその他そのような問題性序列を含む。
【００２３】
通常的なＰＣＲの概要
好熱性（すなわち、耐熱性）ＤＮＡ重合酵素を利用した標準温度循環式のＰＣＲを行うために、通常的に下記のステップを実行する：１）チューブにＰＣＲ用の緩衝溶液、ｄＮＴＰ混合物、プライマー対、ＤＮＡ重合酵素、及び二重脱イオン水を含むカクテルを準備するステップと、２）前記チューブに増幅されるＤＮＡを添加するステップと、３）前記チューブを温度循環器（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＴＭ９６００または９７００ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）の温度ブロックに配置するステップと、４）約２５回ないし３０回のサイクルの間に反復される特定の反応条件（例えば、約１ないし２分間、約９０℃以上まで加熱して二重ストランドＤＮＡの熱変性を行う期間、２分間徐々に約５０ないし６５℃まで冷却してアニーリングする期間、及び数分間約７０ないし７５℃まで加熱してプライマー延長と呼ばれる重合を行う期間）で温度循環器をプログラミングするステップ。前記方法を実行すれば、開始物質の約２ｎ倍の増幅を生成し、前記で、ｎは、行われる増幅サイクルの総数である。
【００２４】
通常的なＰＣＲの一部の限界点は、通常的な技法が一般的に行われる方法から誘発される一方、性能パラメータにおける色々な限界点は、直接または間接的に温度循環に対する依存から誘発される。全体反応収率、増幅効率性、敏感度、堅固度、及び移動性はそれぞれ、例えば、温度循環によって制限される。Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、温度循環による限界点だけでなく、通常的なＰＣＲの一般的な実行に内在された限界点を克服する。
【００２５】
Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ
Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法及び装置は、通常的な方法によって賦課される色々な限界点を克服することによって、ＰＣＲの検出及び増幅能力を飛躍的に拡張させうる。表１は、現在のＰＣＲの一般的な性能パラメータをＮａｎｏ−ＰＣＲＴＭと比較する。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
現在まで実行されているＰＣＲ及びＰＣＲ−基盤技術の共通要素は、順次にＤＮＡを変性し、プライマーをアニーリングし、重合酵素を通じてプライマーを延長する温度循環の利用であった。Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭと呼ばれる、本明細書に記載の方法及びその方法を行うための装置は、ＤＮＡまたはＲＮＡ増幅を行うための温度循環に対する新たな代案を提供するために核酸分子に制御された量の力または応力を適用することを利用する。本明細書で使われるように、核酸に応力を適用することは、核酸を伸張または延長する傾向のある力の核酸に対する直接的及び間接的な適用を含む。例として、応力は、核酸分子自体及び／または核酸に結合された表面、基板、または粒子上に作用するか否かに関係なく、機械的張力の直接適用、流体流れで水力学的な応力または電磁気場によって核酸に適用されうる。複数の応用で、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭは、伝統的に通常的なＰＣＲの性能及び範囲を制限している一つまたはそれ以上の限界点を克服しうる。
【００２８】
機械的張力の循環
核酸に対する制御された張力の適用は、二重ストランドＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の熱変性に対する代案だけでなく、ＰＣＲ過程の各ステップを正確に制御できる独特の能力を提供する。Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭは、ＤＮＡ／ＲＮＡ分子及び／または重合酵素に対する機械的応力、水力学的応力、または電磁気的応力のような正確に制御される力の効果を利用してＤＮＡまたはＲＮＡを増幅する新たな接近方法を導入する。
【００２９】
ＤＮＡ分子を含む溶液の温度を上昇させること及びＤＮＡ分子に対する応力を増加させることは、類似した結果を生成する。したがって、重合酵素反応サイクルは、ＤＮＡを変性させるためにＤＮＡ鋳型に適用される張力を約６５ｐＮ以上まで増加させることによって開始されうる。プライマーのアニーリングに該当するステップは、プライマーが鋳型にアニーリングされるようにＤＮＡ鋳型に対する張力を徐々に約５０ｐＮ未満まで減少させることによって行われうる。その後、ＤＮＡ鋳型での張力は、複製の進行、速度及び／または正確度を制御するために、酵素による重合を通じたプライマーの延長の間に約０ないし約３０ｐＮで調節されうる。通常的なＰＣＲの温度循環のように、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法では、応力の循環が事前にプログラミングされたサイクルで反復されうる。
【００３０】
下記の実施例で、この方法が実行されうる多様な様式が記載される。機械的な張力のように、核酸分子に適用された水力学的応力及び／または電場が温度循環に対する依存なしにＮａｎｏ−ＰＣＲＴＭを行うために循環されうる。もちろん、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、いかなる温度循環なしにも行われうるが、これは、以下でさらに詳細に議論されるように、温度の制御が一部の具体例で有利でないということを意味しない。図１Ａ及び図１Ｂは、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法の代表的なフローチャートを示す。基本的なプロトコルに対する変形及び追加が、序列の決定、クローニング、突然変異の生成、突然変異の選別、及び病原菌の検出のような特定課題のために適合になされうるということが分かるであろう。
【００３１】
室温及び標準緩衝溶液の条件で、二重ストランドＤＮＡに約６５ｐＮ以上の張力を適用すれば、単一ストランドＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）への変性（すなわち、融解）を誘発しうる。本明細書で使われるように、“室温”は、安らかな実験室温度の正常的な範囲内の温度、一般的に、約２０−２２℃と理解される。室温でＤＮＡの力−誘導融解に対する理論的なモデルがＩｏｕｌｉａＲｏｕｚｉｎａ及びＶｉｃｔｏｒ Ａ.Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄによって説明された（“Ｆｏｒｃｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｅｌｔｉｎｇ ｏｆｔｈｅ ＤＮＡ Ｄｏｕｂｌｅ Ｈｅｌｉｘ １.Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ.，８０：８８２−９３，２００１；及び、“Ｆｏｒｃｅ−ＩｎｄｕｃｅｄＭｅｌｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ Ｄｏｕｂｌｅ Ｈｅｌｉｘ.２.Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ”Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ.,８０：８９４−９００,２００１）。本明細書に記載されたようなＲｏｕｚｉｎａ及びＢｌｏｏｍｆｉｅｌｄｉｎｇの式を利用して、本発明が属する技術分野の当業者が通常的な融点温度の計算と類似した方式でプライマーを融解する張力の正確なレベルを決定することが可能である。
【００３２】
プライマーオリゴヌクレオチドの存在下に適用された張力を約６５ｐＮ未満に徐々に減少させれば、温度循環器で変性されたＤＮＡをプライマーの融点温度未満に徐々に減少させることと類似した方式でプライマーを選択的に鋳型ＤＮＡに結合させうる。したがって、プライマーアニーリングステップの間に、核酸鋳型ストランドに適用された張力は、ｄｓＤＮＡの融解を誘発する量からプライマーアニーリングを可能にするは量まで徐々に減少しうる。また、非特異的な結合及び非特異的なプライマーの延長を最小化するために、結合されていないプライマーが反応チャンバから除去されるまで、ＤＮＡストランドに対する張力を、重合酵素作用を実質的に妨害するレベルで、例えば、約３０ｐＮまたはそれ以上や約５０ｐＮ未満で維持することが望ましい。
【００３３】
約０ないし約３０または３５ｐＮの範囲にある張力を核酸鋳型に適用することが重合酵素の活性の速度を低下させるために利用されうる。酵素の正確な速度は、重合酵素及び／またはヌクレオシド三リン酸基質の周囲温度または周囲濃度を含む多様な因子に依存する。室温で約３５−４５ｐＮより大きい張力は、重合酵素の自然的な校正エキソヌクレア-ゼの活性を促進する。
【００３４】
Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法の代表的な具体例は：（ａ）標的序列を含む二重ストランドＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の試料、一つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、例えば、標的序列の３’末端及びその相補体に相補的なプライマー対と、４種類以上のヌクレオシド三リン酸（すなわち、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ）と、ＤＮＡ重合酵素とを提供するステップと、（ｂ）非温度駆動過程、例えば、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに融解させるのに十分な張力（例えば、約６５ｐＮを超える張力）の適用を利用して前記ｄｓＤＮＡを単一ストランドＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鋳型ストランドに変性させるステップと、（ｃ）前記非温度駆動過程を制御して、プライマーの相補的な鋳型ストランドへの混成化を促進するステップ、例えば、ｄｓＤＮＡを変性させるために張力を利用した場合、ｓｓＤＮＡに適用される張力を減少させる場合と、（ｄ）前記ＤＮＡｐがｄｓＤＮＡを形成するためにプライマーを延長せしめるステップと、（ｅ）所望の量のＤＮＡ序列の増幅を収得するまでステップ（ｂ−ｄ）を反復するステップと、を含みうる。
【００３５】
本明細書に記載された方法で、“非温度駆動過程”の利用は、例えば、ｄｓＤＮＡの変性がｄｓＤＮＡの融点温度以上まで温度を増加させることを通じてのみ達成されるのではなく、温度に依存していない物理的または機械的な力が核酸に適用されるということを意味する。非温度駆動過程は、ＤＮＡストランドに張力を適用するステップ、例えば、機械的な力の直接適用によって、流体の流れによって、電場の適用によって、及び／または一つ以上の変性剤の作用によって張力を適用するステップを含みうる。本明細書に記載されたように、そのような力の効果は、温度によって影響を受けるので、所定の状況で前記方法の一つ以上のステップの間に温度を制御し、選択的に調整することが望ましい。
【００３６】
増幅される標的序列は、単離されたＤＮＡまたは核酸混合物に含まれ、同一または同一でない長さの相補的なストランド上に含まれうる。方法はまた、ＲＮＡを含む組成物として開始するステップ及び逆転写酵素または類似した方法を利用して、ＤＮＡ鋳型を生成するステップを含みうる。標的序列は、代案的に単一ストランドの核酸上に提供され、これは、第１循環でステップ（ｂ）が不要になる。ステップ（ａ）の反応成分は、手順の開始時に組合わせられるかまたは必要に応じて別途に導入されうる。選択的に、反応成分はまた、特定のステップの間に反応チャンバから除去されうる。例えば、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰｓ）は、ステップ（ｄ）の間またはその前に導入され、プライマーは、ステップ（ｃ）の間またはその前に導入され、結合されていないプライマーは、プライマー延長（複製）ステップ前にチャンバから除去されうる。また、本発明の多様な具体例で、約０−４５ｐＮ、約０−３５ｐＮ、または約０ないし２０ｐＮの範囲にある張力が、ステップ（ｄ）の間に鋳型ＤＮＡストランドに適用されうる。そのような具体例で、ステップ（ｄ）の間に鋳型ストランドに適用される張力の量は、選択的に経時的に変わりうる。ステップ（ｄ）で、鋳型ストランドに適用される張力の量は、Ｇ−Ｃ高含量のセグメント（例えば、約５０％以上のＧ−Ｃ塩基対または７０％以上のＧ−Ｃ塩基対を含むセグメント）のような難しいかまたはエラー発生の頻繁なサブ序列の位置または反復序列を含むセグメントの位置を基準として、重合酵素の公知のまたは推定された進行によって変わりうる。
【００３７】
正常序列及び“難しい”序列に対するＮａｎｏ−ＰＣＲＴＭの正確度
プライマー延長ステップの間に鋳型ＤＮＡに張力が適用される場合、重合酵素は、“逆方向”へ誘導され、重合酵素のエキソヌクレアーゼ活性が優勢でありうる。原子水準及び単一重合酵素／エキソヌクレアーゼステップの順序に対して、経時的にその過程は確率的であると理解されるであろう。しかし、色々なステップの時間規模に対する平均から考慮すれば、重合酵素は、適用される張力が所定の温度及び溶液条件で理論的に予測されうるしきい値より大きい時、持続的なエキソヌクレアーゼ活性を表すと見なされる。
【００３８】
重合酵素のエキソヌクレアーゼ活性が優勢になるしきい値未満の量に調整された量の張力、例えば、室温及び正常的なＰＣＲ溶液条件下で約３５ないし４５ｐＮ未満、さらに望ましくは、約１０ないし３０ｐＮの範囲にある量の張力を鋳型ＤＮＡに適用することによって、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭは、通常的なＰＣＲに比べて実質的に向上した正確性のＤＮＡ複製を提供しうる。また、この効果は、通常的なＰＣＲ方法を利用し難いサブ序列に対して達成されうる。多少問題性のあるセグメントの混合を含む鋳型に対するプライマー延長の間に、経時的に鋳型ＤＮＡストランドに適用される張力の量は、０ないし４５ｐＮ、約０ないし３５ｐＮ、または約０ないし２０ｐＮの範囲で調節されうる。例えば、序列のマップによれば、張力は、難しい領域に対して向上した正確性を図るために約３５ｐＮ未満のレベルまで必要に応じて増加させ、その後、問題性の少ないセグメント上でのさらに速い進行を許容するために注意して減少させうる。鋳型ストランドの長さは、プライマー延長の間に変わる。方法の一部変形で、鋳型ストランドの長さの変化に対する直接的な対応で鋳型に対する張力を調節して、重合反応の進行及び“難しい”サブ序列の特定位置によって正確に適用される張力を調整することが可能である。重合酵素の進行を直接的にモニタリングすることが現実的でない具体例で、重合酵素の位置は、適用された張力の量で重合酵素の公知の複製速度にかかった時間を乗算することによって推定されうる。
【００３９】
したがって、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭは、通常的なＰＣＲに比べて実質的に向上した正確度で正常的な標的鋳型だけでなく、難しい序列（例えば、ＧＣ−高含量ＤＮＡ、連続反復序列、マイクロサテライトまたはトリヌクレオチド反復ＤＮＡ）が複製されかつ増幅される正確な複製を可能にする。現在利用可能な最も高い忠実度の重合酵素のうち一つ（例えば、ＰｈｕｓｉｏｎＥｎｚｙｍｅ）が通常的な温度−駆動ＰＣＲで利用される一実施例で、有利な場合、すなわち、適切な序列上で約４.０ｘ１０−７個のエラー／塩基対のエラー率が観察される。これと対照的に、本明細書に記載されたＮａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、約１.０ｘ１０−７個未満のエラー／塩基対のエラー率、５.０ｘ１０−８個未満のエラー／塩基対のエラー率、１.０ｘ１０−８個のエラー／塩基対、５.０ｘ１０−９個のエラー／塩基対、１.０ｘ１０−９個のエラー／塩基対、５.０ｘ１０−１０個のエラー／塩基対、ひいては１.０ｘ１０−１０個のエラー／塩基対のエラー率をもたらしうる。また、本明細書に記載された方法は、５０％、６０％、７０％、７５％、ひいては８０％または８５％より高いＧＣ含量を有するオリゴヌクレオチド断片の効率的な増幅を可能にしうる。
【００４０】
特定の場合で、オリゴヌクレオチド断片は、８個以上の塩基対で構成された反復的な塩基対単位のセクション（例えば、ＡＡＡＡＡＡＡＡ、ＧＣＧＣＧＣＧＣ）を含む。通常的なＰＣＲのエラー率は、そのような場合で増加されて、通常的に１.０ｘ１０−２個のエラー／塩基対に接近する。本発明のＮａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、約１.０ｘ１０−３個未満のエラー／塩基対未満のエラー率で反復的な塩基対単位の増幅を提供する。特定の条件下で、１.０ｘ１０−４個未満のエラー／塩基対のエラー率、１.０ｘ１０−５個のエラー／塩基対、１.０ｘ１０−６個のエラー／塩基対、または１.０ｘ１０−７個のエラー／塩基対の誤り率が達成されうる。このような低いエラー率はまた、反復される塩基対単位が１０個以上の塩基対で構成された長さ、１５個以上の塩基対で構成された長さ、または２０個以上の塩基対で構成された長さの場合に収得されうる。本明細書に記載された方法で、そのような結果はまた、通常的なＰＣＲ方法を利用する場合、難しい序列であるマイクロサテライト領域、重合酵素のずれ領域、及びその他の連続反復領域に対して収得されうる。
【００４１】
増幅効率性
増幅効率性が式Ｎ１＝Ｎ２（ｌ＋Ｙ）ｎによって定義され、Ｎ１は、生成物コピーの数であり、Ｎ２は、鋳型オリゴヌクレオチドコピーの数であり、ｎは、サイクルの数、Ｙは、効率性の場合、８０％より高い効率性が達成される。特定条件下で、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、ひいては９９％より高い増幅効率が達成されうる。そのような増幅効率性はまた、オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が５５％、６０％、６５％、７０％、ひいては７５％より高い場合でも収得されうる。オリゴヌクレオチド断片のＧＣ含量が５０％、５５％、６０％、６５％または７０％より高い場合で、５０％より高い増幅効率性が達成されうる。６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、ひいては９９％より高い効率性が収得されうる。通常的なＰＣＲで、このようなＧＣ−高含量領域は、水酸化ナトリウム、塩化ＴＭＡ、シュウ酸ＴＭＡ、硝酸ＴＭＡ、ＴＭＡ硫酸水素、塩化アンモニウム、ベンジルジメチルヘキサデシル塩化アンモニウム、臭化ＨＴＡ、シュウ酸ＨＴＡ、ベタイン一水化物、ＤＭＳＯ、及びホルムアミドを含むが、これに限定されない多様な変性剤の添加と共に増幅され、その序列が決定される。Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭの特定の具体例では、そのようなＰＣＲ添加剤の不在下に本明細書に記載された方法を利用した効率的な増幅が観察される。
【００４２】
堅固度及び適応性
通常的なＰＣＲ方法は、一般的に温度の正確な制御及び循環に依存する。また、通常的なＰＣＲ方法は、多様な変性剤及び退屈な最適化のような追加的な因子を必要とするであろう。しかし、本明細書に記載されたように、増幅を推進するための張力循環の利用は、ＰＣＲ過程に対して温度循環単独によって許容されるよりはるかに高い正確度及び制御を可能にする。また、本明細書に記載された方法は、選択された重合酵素が作用できる温度範囲及び所定の張力でプライマー／鋳型結合の融点温度のような因子によってのみ限定され、広範囲な温度条件下で作用できる。
【００４３】
もちろん、温度が張力下で重合酵素の速度、正確度及びＤＮＡの融解に影響を及ぼしうると理解されるであろう。一般的に、ｄｓＤＮＡを融解させるために要求される張力の量は、温度上昇によって減少する。概略的なガイドとして、ｄｓＤＮＡを融解させるために約０ないし２０℃、約７５ｐＮまでの張力が要求されうる。約６０℃で、ｄｓＤＮＡを変性させるために要求される張力の量は、約４５ｐＮでありうる。融解張力は、ガラスＤＮＡ融点の直下で約７ｐＮまで減少する。
【００４４】
一般的には不要であるが、個別的な適用の要件によって本方法の一つ以上のステップの間に温度を制御することが有利でありうる。例えば、反応混合物の温度は、選択されたＤＮＡ重合酵素の正確度、重合速度、及び／または張力反応を最適化し、ＤＮＡ融解を達成するために要求される張力の量を増加または減少させるか、または個別的な装置または作業環境のために有利な温度で維持されうる。別途に所望しなければ、温度は、一般的に一定であり、全体過程は、正常的な室温またはその付近で行われうる。別途に表示されなければ、本明細書の実施例は、室温で適合な量の張力を利用して記載される。当業者は、さらに高いかまたは低い温度に対してＤＮＡ鋳型に適用される張力を容易に調節しうる。
【００４５】
少量の張力の適用を通じても、熱循環温度は、ＰＣＲ反応が行われねばならない温度をそれ以上制限しない。約７ないし４５ｐＮの張力を適用することによって、例えば、二重ストランドＤＮＡが変性される温度を約３０℃まで低下させうる。ＤＮＡに適用される張力の量を調整して通常的なＰＣＲで変性のために要求される量よりはるかに低い温度でＰＣＲの実行を可能にする。この効果は、小さい振幅の温度循環を利用したＰＣＲを可能にする。例えば、方法は、約６５ｐＮ未満の力が溶液の温度の約９０℃未満まで、約８０℃未満までの上昇と共に調和されて適用される変性ステップを含みうる。
【００４６】
本明細書に記載された方法及び装置は、９０℃未満の温度で行われるかまたは作動されうる。例えば、オリゴヌクレオチドの変性ステップは、８０℃、７０℃、６０℃、５０℃、４０℃、３０℃、ひいては２５℃未満で行われうる。アニーリングステップは、５０℃、４５℃、４０℃、３５℃、３０℃、ひいては２５℃未満で行われうる。また、重合ステップは、７０℃、６０℃、５０℃、４０℃、３０℃、ひいては２５℃未満で行われうる。
【００４７】
同様に、ＤＮＡが含浸される溶液のｐＨ及びイオン強度がＤＮＡの張力−誘導融解曲線に影響を及ぼしうる。したがって、本方法でＤＮＡに適用される力のレベルを調節することによって、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭは、通常的なＰＣＲに比べて、ＰＣＲ過程を行うためにさらに広範囲な溶液のｐＨ及びイオン強度の条件を利用可能にする。同様に、全てのかかるパラメータ及び追加的なパラメータは、プライマー延長の張力制御に影響を及ぼしうる。本明細書に記載の方法は、この効果のために調節され、ひいてはこの効果を利用しうる。したがって、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、一般的にさらに広範囲な温度、イオン強度、ｐＨ及び緩衝溶液の条件に対してさらに堅固であり、これは、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭがさらに広範囲な状況で開始ＤＮＡまたはＲＮＡの少なく厳格な抽出及び精製を必要として行われ、通常的なＰＣＲの範囲を一般的に制限する多様な汚染物質及び酵素抑制剤に対してさらに大きい耐性を有しうるということを意味する。望ましい具現例で、汚染させる物質の存在は、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ過程の一部であって試料をフラッシュンすることによって除去されうる。例えば、汚染物質を含む精製されていないＤＮＡ試料がＮａｎｏ−ＰＣＲＴＭ装置に導入され、そのＤＮＡは、例えば、張力の制御された適用のためにＤＮＡを維持させる、本明細書に記載の手段によって反応チャンバ内に維持される。汚染物質は、反応チャンバからフラッシュングされて除去され、試薬は、チャンバ内にフラッシュングされて供給される。これは、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ過程に実質的な堅固度を提供し、通常的なＰＣＲに不適合な環境で迅速かつ正確な増幅を可能にする。
【００４８】
機械的な力の直接適用を利用したＮａｎｏ−ＰＣＲＴＭ
Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、ＤＮＡ変性及び／またはＤＮＡ重合酵素活性の正確な制御を提供できる非温度駆動過程であって、ＤＮＡストランドに機械的な張力を直接適用する多様な方法を利用して行われうる。二重ストランドオリゴヌクレオチドに張力を適用する色々な相異な方法がある。例えば、ＤＮＡストランドは、移動可能な要素、個別的に制御可能な要素、または操作されうる粒子にアレイとして固定されうきる。
【００４９】
対向するコーティングされた表面の利用：
一例であって、図２Ａないし図２Ｃに示したように、対向するコーティングされた表面に固定された核酸を利用する方法が行われうる：コーティングされた表面は、各表面に対して同一かまたは相異なる第１複合体化分子（例えば、ストレプトアビジン）２０１,２０７を二つの基板表面２０３,２０９に付着させることによって製造される。コーティングされた基板表面は、適した距離ほど離隔されて相互間に逆に配列される。一つの両末端が第１複合体化分子を認識して結合できる第１複合体化分子（例えば、ビオチン）に相補的な複合体化分子を含むものである二重ストランド核酸２０５がコーティングされた表面に固定される。コーティングされた表面間の距離を増大させるか、または表面のうち一つまたは両者を側面移動させることによって固定された核酸の末端に力が適用されうる。例えば、基板のうち一つまたは両者は、圧電素子のような移動可能な要素であるか、または移動可能な要素を含みうる。ｄｓＤＮＡを融解させるのに十分な張力（例えば、室温で６５ｐＮを超える）が核酸に適用され、固定されたストランド及び遊離したストランドを生成しうる。固定されたストランド及び遊離したストランドは、何れも適したプライマー及び重合酵素を利用して複製されうる。望ましくは、固定されたストランドのみが複製されるように遊離したストランドは、フラッシュングされて除去され、選択的に回収されうる。対向する表面の位置は、固定された鋳型ストランドに適用される張力の量を調整するために複製の間に制御されうる。サイクルは、所望するほど反復されうる。
【００５０】
対向するコーティングされた表面２１５,２１７を利用する方法を行う装置の変形で、一つの表面または二つの表面何れも、個別的に移動可能な要素２１９のアレイを形成するために配列され、それぞれは、図２Ｃに示したようにプログラミング可能なプロセッサーによって駆動される制御回路によって個別的に処理されうる。そのような制御回路は、プロセッサーに力及び／または変位パラメータを報告するフィードバックチャンネルを含みうる。プリンティングまたはリソグラフィ技法が表面上に分子を固定する部位をパターン化するために利用されうる。前記方法を行う装置はまた、チャンバに試薬を導入するチャンネル、または前記コーティングされた表面を備えるチャンネル及び試薬を個別的にまたは組合わせて伝達（及び選択的に保存）する機器及び反応生成物を回収する機器を備えうる。共有結合、抗原−抗体、及びストレプタビジン−ビオチンを含むが、これに限定されていない核酸を表面に固定する広範囲に多様な適した方法が知られている。
【００５１】
流体流れの配列が対向する表面の間でＤＮＡストランドを配向しかつ延長させるために利用されうる。例えば、図２Ｂに示したように、ＤＮＡは、一端部で固定位置の間に分布された流体流れのための通路を有する表面２１３に固定されうる。この通路を通じて流体を流すのは、ＤＮＡストランドを所望の方向、例えば、対向する表面２１１または前記流体流れを受容するために固定表面の間に分布された通路を有しうる、移動可能な要素のアレイに向かって多少均一に配向して延長させるために利用されうる。したがって、方法は、ＤＮＡストランドを第１表面に固定するステップ、流体を第１表面にある開口部を通じて前記第１表面に対向する第２表面にある開口部に向かって流して通過させるステップ、及び前記流体流れで配向されたＤＮＡストランドを前記第２表面に固定するステップを含みうる。
【００５２】
各サイクルの進行によって固定されるストランドの数を増加させるために、活性化可能なプライマーが結合されたストランドを複製するために利用されうる。“活性化可能なプライマー”は、化学的または物理的な方法によって活性化されうる化学モイエティを含む。このような“活性化可能な基”は、例えば、適した波長のレーザを利用した光活性化によって活性化される前には不活性である。機能的な複合体化基に転換されるかまたは機能的な複合体化基の遮断を解除しうる複数の活性化可能な化学的な作用基が、本発明の属する技術分野に公知されている。本方法の変形で、活性化可能なプライマーは、固定された単一ストランドの核酸にアニーリングされうる。プライマー延長及び断片複製が行われる。結果物である二重ストランド核酸は、鋳型ストランドに対する張力の適用を通じて変性される。このとき、遊離状態のコピーストランドは、プライマーの活性化可能な基を含む。活性化は、コピーストランドが対向するコーティング表面上に固定させうる。このサイクルは、所望のレベルの増幅が収得されるまで反復されうる。所望の場合、固定された核酸は、例えば、核酸の固定された末端に隣接した序列またはプライマーによってコピーされた核酸の末端に導入された序列を認識する制限酵素の使用によって放出されうる。
【００５３】
光学的トラップまたは磁気的トラップの利用：
ＤＮＡに張力を直接的に適用するさらに他の方法は、ＤＮＡが固定された粒子を操作するために光学的なトウィーザーまたは磁気的トウィーザーまたはその他のトラップを利用しうる。光学的なトウィーザーは、光学強度の勾配によって生成される力で粒子を捉える。光の電場によって両極化された誘電体粒子は、勾配を通じて最も明るい地点に引かれる。これと対照的に、反射しかつ吸収する低誘電体粒子は、放射圧によって最も暗い地点に押される。三次元トラップを形成するほど十分に強い選択的に生成された力が、適した形状の波面を有するレーザビームを高い開口数値のレンズによる厳格なフォーカスでもたらすことによって収得されうる。図３Ａは、レーザビーム３０３のフォーカスにトラップされたビード３０１の間に延長されたＤＮＡストランドを示す。図３Ｂに示したように、光学的トウィーザーのアレイ３０７を利用して複数の粒子を操作することが可能である。購買可能な光学的トウィーザーアレイは、Ａｒｒｙｘ，Ｉｎｃ.によって生産されるアレイを含む。光学的トウィーザーのアレイのさらに他の具現は、Ｅ.Ｒ.Ｄｕｆｒｅｓｎｅ ａｎｄ Ｄ.Ｇ.Ｇｒｉｅｒ，Ｒｅｖ.Ｓｃｉ.Ｉｎｓｔｒ.６９：１９７４（１９９８）、及び米国特許第６,０５５,１０６号（２０００）を参照する。光学的トウィーザーアレイは、約１０３、１０４、１０５、１０６、またはそれ以上の対の光学的トウィーザーまたは磁気的トウィーザーを含みうる。
【００５４】
光学的トウィーザーまたは磁気的トウィーザーを利用した増幅は、一般的に次のように行われうる：核酸が流体媒質で適した粒子の各末端で固定される。粒子は、光学的トラップまたは磁気的トラップを利用して操作されるように改造されうる。ｄｓＤＮＡを変性化させるのに十分な張力、例えば、約６５ｐＮより大きい張力が粒子に対する力（例えば、光学的力または磁気力）の適用を通じてオリゴヌクレオチドに適用され、核酸の変性をもたらす。張力は、プライマーと核酸とをアニーリングさせるためにプライマーの存在下に減少しうる。ＤＮＡ重合酵素による重合は、張力をさらに弛緩させることによって開始されうる。サイクルを反復するために、結果物である二重ストランド核酸が変性されるように張力が増大しうる。変形で、核酸は、一末端で流体流れに、例えば、磁場によってトラップされたビードに固定されうる。核酸に対する張力を制御するために流体の流速が利用されうる。
【００５５】
単一標的分子から開始して順次にコピーストランドでアレイを満たすことが可能である。コピーストランドは、活性化可能なプライマーを利用して新たなビードに固定されうる。新たなビードは、コピーされたストランドに隣接するように位置しうる。代案的に、事前に固定されたプライマーを有するビードが変性化ステップと関連してコピーされたストランドに隣接するように位置しうる。このような方式によるビードの操作は、選択的に、プログラミング可能なプロセッサーによって自動に制御されうる。
【００５６】
水力学的な応力を利用したＮａｎｏ−ＰＣＲＴＭ
Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、制御された流体流れで水力学的な応力によって張力をＤＮＡに適用することを利用して行われうる。この方式を利用する方法は、ベンチトップ装置であるか、または代案的に携帯用装置に含まれうるような移動可能なサイズに縮少しうる微細流体装置で行われうる。制御された流体流れで水力学的な応力によってＤＮＡに張力を適用することを利用するＮａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、制御された流体の流速を提供する任意の配列を利用して行われうる。
【００５７】
固定されたＤＮＡ重合酵素の利用：装置において、表面に固定された重合酵素を利用するＮａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法を行う方法は、次のステップを含みうる。重合酵素は、流体が制御される速度でその表面上で流れるように配列された表面上に固定される。例えば、第１複合体化モイエティでコーティングされたチャンネルまたはチャンバ内の表面が、第２複合体化モイエティを含むために変形されたＤＮＡ重合酵素を固定するために利用されうる。代表的な複合体化モイエティは、抗原−抗体、ヒスチジン−Ｎｉ−ＮＴＡ、またはビオチン−ストレプトアビジン対を含む。標的ｄｓＤＮＡは、プライマーの存在下に変性され、例えば、ｄｓＤＮＡ及びプライマーは、ｄｓＤＮＡを融解させるのに十分な力（例えば、約６５ｐＮより大きい力）が前記ｄｓＤＮＡに適用されるように流速を作りうる。流速を低下させることによって重合酵素／ヌクレオチド／プライマー複合体を形成させうる。プライマー延長及び断片複製は、流速の追加的な低下によって促進されうる。鋳型及びコピーストランドを含む二重ストランドの核酸生成物は、向上した流速の適用を通じて変性され、所望のレベルの増幅が収得されるまでサイクルが反復されうる。そのような方法で、重合酵素は、微細チャンネル、例えば、微細流体“ラップオンチップ”型装置の微細チャンネルに固定されうる。
【００５８】
一つ以上のコーティングされた表面上に固定された重合酵素を利用する方法を実行するための装置の変形で、そのような装置はまた、試薬を前記コーティングされた表面を備える反応チャンバまたはチャンネルに導入するチャンネル及び個別的にまたは組合わせて試薬を伝達し、選択的に保存する機器及び反応生成物を回収する機器を含みうる。
【００５９】
本発明が属する技術分野で公知のプリンティングまたはリソグラフィ技法が分子を固定させる位置をパターン化するために利用されうる。そのような装置は、反応チャンバまたはチャンネルで流体流れを生成して制御する機器を備える。電気力学的な方法、ポンプ及び注射器機器を備える流体流れを生成しかつ制御する任意の適した方法が利用されうる。試薬溶液は、選択的に反応チャンバを通じて再循環されうる。
【００６０】
図４は、重合酵素４０１が基板４０７に、例えば、ストレプトアビジン結合によって固定される方式を例示する。ＤＮＡストランド４０３は、固定された重合酵素に結合しうる。基板４０７上を流れる制御された流体流れ４０９は、水力学的な応力の形態でＤＮＡストランドに対して伸張力の適用を誘発する。前述したように、図１に示した一般的体系によって、そのような力の適用を利用してＮａｎｏ−ＰＣＲが行われうる。
【００６１】
制御された流体流れで固定されたＤＮＡストランドを利用：核酸に張力を適用するさらに他の方法は、制御された流体流れに固定された核酸を含む。本方法は、一般的に次のように行われうる：一末端に表面にコーティングされた第２複合体化モイエティを認識し、これに結合できる第１複合体化モイエティを含む核酸をコーティングされた表面に固定させる。流体は、ｄｓＤＮＡを融解させるのに十分な力（例えば、約６５ｐＮより大きい力）が固定された二重ストランド核酸に適用され、ストランド分離をもたらすように表面上を流れる。ＤＮＡ重合酵素及びプライマー、選択的に活性化可能な基を含むプライマーが減少した流速で表面上にフラッシュンされる。低下したまたは中断された流速は、重合酵素／オリゴヌクレオチド／プライマー複合体の形成を可能にする。プライマー延長及び断片複製は、流速の追加的な低下または流れの中断を通じてＮＴＰの存在下に促進されうる。複製後に、流速は上昇して、ｄｓＤＮＡが変性されるように結果物であるｄｓＤＮＡが張力の適用を受ける。活性化可能なプライマーが利用される場合、延長されたプライマーが活性化されうる。このような活性化され、かつ延長されたプライマーは、コーティングされた表面に結合でき、所望の程度の増幅が収得されるまでサイクルが反復されうる。そのような方法で、重合酵素は、微細チャンネル、例えば、微細流体“ラップオンチップ”型装置の微細チャンネルに固定されうる。
【００６２】
図５は、ＤＮＡストランド５０３が固定用分子５０１を通じて基板５０７に固定された場合で、水力学的な応力による流体流れ内のＤＮＡの伸張を示す。方向５０９に流れる流体は、流速の関数として制御された方式でＤＮＡを延長して伸す。図５Ｂは、流体が制御された速度で構造物の間で流れるように、ＤＮＡストランド５０３が複数の基板構造５０５に結合分子５０１によって固定された変形を示す。類似した結果を達成するために利用されうる複数の他の変形があると理解されるであろう。
【００６３】
一つ以上のコーティングされた表面上に固定された核酸を利用する方法を行う装置の変形で、そのような装置はまた、試薬を前記コーティングされた表面を備える反応チャンバまたはチャンネルに導入するチャンネル及び個別的にまたは組合わせて試薬を伝達し、選択的に保存する機器及び反応生成物を回収する機器を備えうる。本発明が属する技術分野で公知のプリンティングまたはリソグラフィ技法が分子を固定させる位置をパターン化するために利用されうる。そのような装置は、反応チャンバまたはチャンネルで流体流れを生成しかつ制御する機器を備えうる。流体流れを生成しかつ制御する任意の適した方法が利用されうる。例えば、流れは、ポンプによって提供され、または静電気的に駆動されうる。試薬溶液は、選択的に反応チャンバを通じて再循環されうる。
【００６４】
速度勾配でＤＮＡの伸張及び水力学的なフォーカシングを利用：流体流れを利用して張力を適用する方式が、前記方法と組合わせられて利用されるか、または個別的ま方法の基礎を形成しうる。ＤＮＡは、速度勾配を有する流体で伸しうる。水力学的なフォーカシング及び逆伝搬性伸張流れに対する多様な代表的な配列が図６Ａないし図６Ｃに示される。
【００６５】
例えば、Ｗｏｎｇらは、複数のかかる技法の基礎を検討して水力学的なフォーカシング方法を説明した（Ｗｏｎｇｅｔ ａｌ.，“Ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ．”Ｊ．ＦｌｕｉｄＭｅｃｈ．４９７：５５−６５，２００３）。図６Ａに示したように、水力学的なフォーカシングで、比較的高速で流れる緩衝溶液６０７の２ストリームが低速で導入される中央ストリームを有する微細チャンネル６０５で収斂する。収斂するストリームは、実質的な混合なしに中央ストリームを加速させる。その結果は、流れ方向に強い速度勾配を有する流れの領域である。この勾配にあるＤＮＡ６０１が延長された状態まで伸張される。収斂するストリームの流速をさらに向上させれば、ｄｓＤＮＡを変性させて前記微細チャンネルからｓｓＤＮＡを抽出することが可能であろう。これは、ｓｓＤＮＡを反応チャンバに、例えば、重合酵素が固定されているチャンバに伝達可能にする。
【００６６】
いかなる固定の必要なしに核酸をトラップし、核酸に張力を提供するために停滞性流れが利用されうる。Ｐｅｒｋｉｎｓらは、平面形の伸張流れ機器でＤＮＡの伸張を記述した（“ＳｉｎｇｌｅＰｏｌｙｍｅｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ａｎ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆｌｏｗ”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：２０１６−２１，１９９７）。Ｐｅｒｋｉｎｓの機器で、図６Ｃに示したように、流体６２３は、逆方向からＴ字形の接合部６２５に流れる。前記接合部の中央に、停滞点６２９が定立される。この点の外部に、流速勾配が定立される。ＤＮＡ６０１は、速度勾配によって逆方向に同一に引かれ、停滞点にトラップされうる。図６Ｂに示したチャンネル６１５のような代案的な配列は、チャンネル６１５に流入される流体または核酸が位置するスロットを横切って逆方向に流れる緩衝溶液のオフセットジェット６１７を含みうる。
【００６７】
適用される電場の循環を利用したＮａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法
Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法で電場及び磁場の利用を通じてＤＮＡストランドに力を適用することが可能である。これが達成されうる多様な方式がある。例えば、電場は、微細流体装置で流体流れを駆動させることによってＤＮＡに間接的に力を適用するために利用されうる。前述したように、流体流れは、ＤＮＡ、例えば、表面及び／または粒子に固定されたＤＮＡ、または表面に固定されたＤＮＡ重合酵素に結合されたＤＮＡに水力学的な応力を適用するために利用されうる。電気泳動的な力が直接ＤＮＡストランドに力を適用しうる。
【００６８】
電場はまた、伝導性粒子に結合されたＤＮＡストランドを操作するために利用されうる。したがって、変性、アニーリング、及び／またはプライマー延長ステップが非−温度−駆動過程によって制御され、前記でＤＮＡストランドの一側末端または両側末端が前記ＤＮＡストランドに張力を提供するために電場によって操作されうる伝導性粒子、例えば、金ナノ粒子に結合されるＮａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法が行われうる。ＤＮＡ分子の一側末端が伝導性粒子に付着される場合、残りの末端は、装置内の反応チャンバ内で表面に固定されうる。そのような方法は、各サイクルで生成されるＤＮＡストランドを固定するために本明細書に記載されたような活性化可能なプライマーを利用しうる。
【００６９】
Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法の代表的な適用
Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、病原菌及び生物学的な武器検出用キット及びシステムに採用されうる。そのような病原菌の例は、次のものを含むが、これに限定されていない：アデノ−関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ：ＡＡＶ）、アデノウイルス、サイトメガローウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ）、エプスタイン−バールウイルス、エンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＡ Ｖｉｒｕｓ：ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ：ＨＣＶ）、人間ヘルペスウイルスタイプ６（ＨｕｍａｎＨｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ６：ＨＨＶ−６）、人間免疫欠乏症ウイルスタイプ１（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ１：ＨＩＶ−１）、人間免疫欠乏症ウイルスタイプ２（ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ２：ＨＩＶ−２）、ヘルペスシンプレックスウイルスタイプ１及びタイプ２（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ＶｉｒｕｓＴｙｐｅ １ａｎｄＴｙｐｅ２：ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２）、人間Ｔ−細胞リンパ営養性ウイルスタイプＩ及びタイプＩＩ（Ｈｕｍａｎ Ｔ−ＣｅＩｌ ＬｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃＶｉｒｕｓ ＴｙｐｅＩ ａｎｄ ＴｙｐｅＩＩ：ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ）、マイコバクテリア結核、マイコプラズマ、パーボウイルスＢ−１９、呼吸器細胞融合ウイルス（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｃｔｉｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ：ＲＳＶ）及び豚内因性レトロウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ：ＰＥＲＶ）。Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、この方法が提供できる敏感度、正確度及び堅固性の強化のために、全ての環境で全ての病原菌の検出のために利用されうる。
【００７０】
通常的なＰＣＲ−基盤診断法を利用した特定病原菌の検出及び確認は、一般的に病原性個体またはそのポリヌクレオチドが特定しきい値の濃度で生物学的な流体（例えば、血液、唾液など）に存在することを要求する。例えば、マイコバクテリア結核の検出下限は、７.５ｘ１０３個の個体／ｍｌと報告された。ＨＣＶ ＲＮＡは、１００ないし１０００個のＲＮＡ分子／ｍｌ範囲で検出可能である。Ｓｈｉｍは、ＰＣＲは立証されたマイコバクテリア結核−含有ノジュールの約８７.５％を検出すると報告した。その数値は、１２.５％の検出に対する偽−陰性率に該当する。望ましい具体例で、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、前述したような病原菌を一般的に１２.５％未満、１０％、５％、２.５％、１％、０.５％、０.２５％、または０.１％の偽−陰性率で検出するために利用されうる。
【００７１】
また、通常的なＰＣＲは、一般的に、約３０−３５回のサイクルに限定されるが、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭは、それに限定されないように行われうる。これは、ＤＮＡ融点温度以上に加熱する反復的なサイクル後の重合酵素の分解のためである。これと対照的に、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、選択的に４０回、５０回、６０回、７０回、１００回、またはそれ以上のサイクルを含みうる。Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭは、等温方式でまたは小さい振幅の温度変調で行われうるので、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭは、複数のサイクルのために反復され、（例えば、室温で）酵素の寿命によってのみ限定される。
【００７２】
したがって、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、通常的なＰＣＲによって要求される量より実質的に少ない量の開始物質（個体またはそのＤＮＡまたはＲＮＡ）を増幅するために利用されうる。Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法は、一つの分子のＤＮＡまたはＲＮＡだけの少量も検出してはっきりと増幅し、偽−陰性率を大きく低下させて１００％までの向上した敏感度を提供するために利用されうる。前述したような病原菌に対して、個体またはポリヌクレオチドは、１０００個未満の個体またはポリヌクレオチド／ｍｌ、１００個の個体またはポリヌクレオチド／ｍｌ、２５個の個体またはポリヌクレオチド／ｍｌ、１０個の個体またはポリヌクレオチド／ｍｌ、５個の個体またはポリヌクレオチド／ｍｌ、ひいては１個の個体またはポリヌクレオチド／ｍｌの濃度で検出されうる。
【００７３】
本方法の代表的な変形は、試料から一つ以上の特定のＤＮＡ序列の存在または不在を検出するか、または二つの相異なるＤＮＡ序列を区分するために利用されうる。そのような変形で、標的ＤＮＡは、前述したように増幅されうる。本方法はまた：増幅されたＤＮＡをプローブまたはプローブ（例えば、検出される序列に相補的であり、蛍光標識のような検出可能なモイエティを含むオリゴヌクレオチド）と接触させるステップと、前記増幅されたＤＮＡに結合されたプローブの存在または不在を観察することによって試料内に特定のＤＮＡ序列の存否を検出するか、または複数のプローブのうち如何なるプローブが前記増幅されたＤＮＡに結合されたかを検出して、二つの相異なる序列の間を区別するステップと、をさらに含みうる。
【００７４】
本方法のさらに他の変形は、ＲＮＡ上にコーディングされた序列の増幅及び／または検出のために利用されうる。標的序列は、単離されたＲＮＡまたは核酸混合物内のＲＮＡ上にコーディングされうる。本方法は：試料（例えば、組織または体液）からＲＮＡを単離するステップと、逆転写を行い、それにより該ｃＤＮＡを収得するステップと、前記標的序列を前述したように増幅するステップと、を含みうる。そのような方法は、前述したように、試料内に特定の序列の存在を検出するステップと、をさらに含みうる。
【００７５】
本発明のさらに他の変形は、ＤＮＡの序列決定のために利用されうる。そのような方法は、選択的に前述したようにＤＮＡを増幅するステップ及び前記ＤＮＡの序列を決定するステップを含みうる。前記ＤＮＡの序列決定は、（ａ）標的序列を含むｄｓＤＮＡの試料であって、前記試料は、４個の併行的な反応で分離される試料、前記標的序列の３’末端に相補的なプライマーと、４種類以上のヌクレオシド三リン酸（すなわち、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ）とを提供するステップと、併行的な反応それぞれに蛍光モイエティのような検出可能な化学的モイエティで選択的に標識されたｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰから選択された相異なるデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）、及びＤＮＡ重合酵素を提供するステップと、（ｂ）非温度−駆動過程、例えば、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに融解させるのに十分な張力（例えば、約６５ｐＮより大きい力）の適用によってｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡ鋳型ストランドに変性させるステップと、（ｃ）プライマーが相補的な鋳型ストランドに混成化されるように、例えば、ｄｓＤＮＡを変性させるために張力を利用した場合、ｓｓＤＮＡに適用される張力を減少させることによって非温度−駆動過程を制御するステップと、（ｄ）ｄｓＤＮＡを形成するためにＤＮＡｐがプライマーを延長させるステップと、（ｅ）所望の量のＤＮＡ序列の増幅が収得されるまで前記ステップ（ｂ−ｄ）を選択的に反復するステップと、多様な単一分子の序列決定体系のように、前記反応で生成される各ヌクレオチドの長さを検出することによって、または塩基−特異的な蛍光モイエティまたは一部の他の塩基−特異的な信号を検出することによって序列を決定するステップと、を含みうる。
【００７６】
Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ装置
本明細書に記載されたような非温度−駆動ＰＣＲを行うために利用される複数の相異なる装置の種類及び構成がある。そのような装置のうち一つは、装置上にある微細流体チャンネル内の流速が制御可能で可変的な微細流体装置である。望ましい具体例で、装置は、反応チャンバを有し、前記反応チャンバは、チャンネル、チャンネルの配列、または密閉された空間でありうる。反応チャンバは、一般的に核酸を維持する手段及びその内部に維持された前記核酸に応力または張力を適用する手段を含む。したがって、本明細書に記載の方法のうち一つを行うように設計された配列は、その内部に、核酸に結合できる粒子またはそれらの相補的な複合体化分子を獲得できる複合体化分子、複合体化分子を有する表面、移動可能な要素、流体流れを配向し、流速勾配を形成するチャンネル、ポンプ、弁及び膜を有するチャンネル及び密閉された空間の組合わせを含むと予想しうる。チャンバは、例えば、光学的微細操作器が利用される場合、光学的に透明な窓を含みうる。装置は、携帯用ユニットに含まれうる微細流体装置として製造されうる。所望の場合、Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭは、１μｌ未満、例えば、約５０−１０００ｎＬ、望ましくは、約１００−５００ｎＬの溶液容量で行われうる。
【００７７】
一実施例であって、図７Ａは、試薬が流入口７０１,７０７及び７１５を通じて導入されうる装置の可能な構成を示す。一つ以上の保存チャンバ７０５,７１１が準備された緩衝溶液、ジデオキシヌクレオシド三リン酸、重合酵素を込めるために提供されうる。弁７０３,７０９,７１７及び７１８は、チャンネルの間の接合部で流体流れを制御するために配列された一つ以上の流体ゲートを備えうる。反応チャンバ７１５は、例えば、図２ないし図６に示したように、その内部に含まれた核酸分子に対して張力の制御された適用が可能に配列されうる。チャンネル７２１及びポンプ７２３は、チャンバ７１５を通じた試薬の再循環及び制御された流れを可能にするために選択的に提供される。ポンプ７２３は、本発明が属する技術分野で認定される任意の適したメカニズム、例えば、連動式ポンピング、一つ以上のベローズまたはピストンの使用によるポンピング、電動力によるポンピング及びそのような装置の変形または組合わせによって作動されうる。再循環が望ましくない場合、流れは、チャンバ７１５内で、または外部的に、例えば、流入口及び／または流出口７０１及び７１９に付着された注射器によって制御されうる。円形、または概略的に円形のチャンネル構成を利用する微細流体装置の例は、図７Ｂによって示される。流入口７５１は、チャンネル給送反応チャンネル７６３に直接またはこれからの使用のために一つ以上の保存チャンバ７５３,７５４への試薬の導入を可能にする。弁７５５,７５７及び７５９は、反応チャンネルへの流入及び流出を制御する。ポンプ７６１は、連動式作用、例えば、連続的に制御される方式で一つ以上の弁ゲートのチャンネル７６３への撓み、電動力、または微細流体学部分で認定される任意の他の手段によって、チャンネル７６３で流速を制御するために作動されうる。例えば、国際公開特許ＷＯ／０２０８１７２９号公報に記載されたように、流れを制御するために制御される順序で装置のチャンネルに撓む弾性重合体物質で製造された構造を含む連動式ポンピングの配列及び弁を利用して装置が構築されうる。
【００７８】
図７Ｂに示した装置の作動は、非温度−駆動ＰＣＲの間に、その作動についての説明を通じてさらに理解されうる。核酸増幅反応の具体的な例で、標的核酸を含むかまたは潜在的に含む試料が流入口７５１を通じてループ７６３に導入される。一部の実施例で、ループ７６３の一つ以上の壁は、図４及び図５に示したように重合酵素またはヌクレオチドを固定するために製造された。代案的に、ループは、図６に示したように、追加的な流入口を利用するかまたは表面を回転させることによって流速勾配、逆伝搬性流体流れを生成するために配列されうる。増幅反応を行うために必要な他の試薬は、同様に流入口を通じて導入される。典型的な試薬は、標的核酸に特異的に混成化されるプライマーまたはプライマー（例えば、正方向プライマー及び逆方向プライマー、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）、重合酵素、緩衝溶液及び重合酵素によって要求される多様な補助因子（例えば、金属イオン）を含む。
【００７９】
試料及び必要な増幅試薬のループ７６３への導入後に、結果物である溶液は、ポンプ７６１の作用によって循環される。ポンプ作用の速度を変化させて、溶液循環／流速を調節しうる。標的核酸に対する約６５ｐＮの力の適用を招く流速は、核酸を変性させることで定立されている。流速は、標的核酸に適用される力が約３０ｐＮないし６０ｐＮの範囲に属するように低下する。これは、重合酵素／核酸／プライマー複合体の形成を可能にする。プライマー延長は、流速を３０ｐＮ未満の適用される力に該当する値にさらに低下させることによって開始される。プライマー延長の終了時、流速はまた、結果物である二重ストランド核酸を変性させるために上昇する。前記ステップは、所望の量の標的核酸が収得されるまで反復される。弁７５９を開放して流出口７６５を通じて溶液を流すことによって増幅された標的核酸に接近しうる。
【００８０】
Ｎａｎｏ−ＰＣＲＴＭ方法を行う機器は、個別的に反応装置の要素を扱って制御できるプログラミング可能な制御装置を備え、またセンサー及びフィードバック回路を含んで制御装置が適用された応力及び鋳型延長のような反応パラメータをモニタリングしかつ分析でき、所望の場合、それらを調節しうる。
【実施例】
【００８１】
実施例１：対向するコーティングされた表面を利用した方法及び装置
標準方法によって一対のストレプトアビジン−コーティングされた表面を製造した（Ｓａｂａｎａｙａｇａｍ，Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄＣａｎｔｏｒ．“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｓｕｒｆａｃｅｓ．”ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０００，Ｖｏｌ.２８，Ｎｏ.８ ｐｐｉ−ｉｖ）。ビオチン化されたｄｓＤＮＡ（一ストランドの両末端でビオチン化された）を前記表面に添加し、表面の間に前記ｄｓＤＮＡを固定化させた（ＪｅｆｆｒｅｙＭ．Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｍｅｉｒ Ｗｉｌｃｈｅｋ．ｐ−Ｄｉａｚｏｂｅｎｚｏｙｌ−ｂｉｏｃｙｔｉｎ：ａ ｎｅｗ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｆｏｒ ＤＮＡ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌｕｍｅ １６ Ｎｕｍｂｅｒ １４ １９８８）。表面に適用される鋳型の濃度を調整して、ＤＮＡ分子の表面密度は調節されうる。室温で、コーティングされた表面の間の距離を増大させて約６５ｐＮより大きい張力をｄｓＤＮＡに適用した。これは、ｄｓＤＮＡを変性させ、増幅のための標的ｓｓＤＮＡのみを残した。結合されたＤＮＡを束縛されたビオチン基を含むプライマーと接触させ、表面の間の距離を縮小させて３０ｐＮないし６０ｐＮの力が固定されたｓｓＤＮＡに適用させた。プライマーを標的ＤＮＡにアニーリングさせ、ＤＮＡ重合酵素及びヌクレオチドを結果物である複合体に添加した。プライマー延長は、適用される張力を３０ｐＮ未満までさらに減少させることによって開始された。プライマー延長が完了すれば、表面の間の距離を増大させて結果物である二重ストランドに６５ｐＮより大きい力を適用させた。この力の適用は、複製ヌクレオチドストランドをその鋳型から分離（変性）させた。束縛されたビオチンモイエティを含む複製ストランドを光活性化させ、ストレプトアビジン−コーティングされた対向する表面に結合させた。標的ヌクレオチドに対する所望の程度の増幅を収得するまで前記ステップを反復した。
【００８２】
束縛されたビオチン試薬は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓまたはＰｉｅｒｃｅのような商業的な供給会社から購買した。例えば、光活性化可能なニトロベンジル基を有するビオチン誘導体（ＭｅＮＰＯＣ−ｂｉｏｔｉｎ）が生物分子及び表面への容易な結合に適した形態で存在する（ＰｉｒｒｕｎｇＭＣ，Ｈｕａｎｇ ＣＹ．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｎ ｇｌａｓｓ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｕｓｉｎｇ“ｃａｇｅｄ”ｂｉｏｔｉｎ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．１９９６ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；７（３）：３１７−２１）。
【００８３】
実施例２：固定された重合酵素を利用した方法及び装置
標準方法によってストレプトアビジン−コーティングされた微細チャンネルの表面を製造した（Ｓａｂａｎａｙａｇａｍ，Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄＣａｎｔｏｒ．“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｓｕｒｆａｃｅｓ．”ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０００，Ｖｏｌ.２８，Ｎｏ.８ ｐｐｉ−ｉｖ）。ビオチン化されたＤＮＡ重合酵素を前記微細チャンネルに流し、表面飽和のために放置した。酵素のビオチン化のための商業用キットが、例えば、ＰｉｅｒｃｅＬａｂｓから利用可能である。結合されていない酵素は、微細チャンネルから流し、標的ヌクレオチド（例えば、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ）及びプライマーを６０ｐＮより大きい力を前記ヌクレオチドに適用するチャンバ流速で流入させた。３０ｐＮないし６０ｐＮの力が前記ヌクレオチドに適用されるように流速を低下させて重合酵素／ヌクレオチド／プライマー重合体を形成させた。チャンバ流速を３０ｐＮ未満にさらに低下させてプライマー延長を行った。プライマー延長が完了すれば、流速を上昇させて６５ｐＮより大きい力を結果物である二重ストランドに適用した。このような力の適用は、複製されたヌクレオチドストランドをその鋳型から（変性）分離させた。分離されたストランドを重合酵素結合がなされるまで微細流体チャンバを通じて循環させ、前記ステップは、標的ヌクレオチドに対して所望の程度の増幅が収得されるまで反復した。
【００８４】
実施例３：ＤＮＡ固定化を利用した方法及び装置
標準方法によってストレプトアビジン−コーティングされた微細チャンネルの表面を製造した（Ｓａｂａｎａｙａｇａｍ，Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄＣａｎｔｏｒ．“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｓｕｒｆａｃｅｓ．”ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０００，Ｖｏｌ.２８，Ｎｏ.８ ｐｐｉ−ｉｖ）。ビオチン化されたｄｓＤＮＡ（一ストランドの両末端でビオチン化された）を前記微細チャンネルに流し、表面結合のために放置した（ＪｅｆｆｒｅｙＭ.Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｍｅｉｒ Ｗｉｌｃｈｅｋ.ｐ−Ｄｉａｚｏｂｅｎｚｏｙｌ−ｂｉｏｃｙｔｉｎ：ａ ｎｅｗ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｆｏｒ ＤＮＡ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌｕｍｅ １６ Ｎｕｍｂｅｒ １４ １９８８）。結合されたｄｓＤＮＡに６５ｐＮより大きい力を適用するチャンバ流速は、定立されている。これは、ｄｓＤＮＡを変性させ、増幅のための標的ｓｓＤＮＡのみを残した。ＤＮＡ重合酵素、ヌクレオチド、及び束縛されたビオチン化プライマーを前記微細チャンネルに流した。束縛されたビオチン試薬は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓまたはＰｉｅｒｃｅのような商業的な供給企業から購買可能である。例えば、光活性化可能なニトロベンジル基を有するビオチン誘導体（ＭｅＮＰＯＣ−ｂｉｏｔｉｎ）が生物分子及び表面への容易な結合に適した形態で存在する（ＰｉｒｒｕｎｇＭＣ，Ｈｕａｎｇ ＣＹ．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｎ ｇｌａｓｓ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｕｓｉｎｇ“ｃａｇｅｄ”ｂｉｏｔｉｎ。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．１９９６ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；７（３）：３１７−２１）。３０ｐＮないし６０ｐＮの力が結合されたｓｓＤＮＡに適用されるように流速を低下させた。プライマーを標的ＤＮＡにアニーリングさせ、結果物である化合物がＤＮＡ重合酵素との複合体を形成しようとした。チャンバ流速を３０ｐＮ未満にさらに低下させてプライマー延長を行った。プライマー延長が完了すれば、流速を上昇させて６５ｐＮより大きい力を結果物である二重ストランドに適用した。このような力の適用は、複製されたヌクレオチドストランドをその鋳型から（変性）分離させた。束縛されたビオチンモイエティを含む複製ストランドを光活性化させ、ストレプトアビジン−コーティングされた微細チャンネルの表面に結合させた。標的ヌクレオチドに対する所望の程度の増幅を収得するまで、前記ステップを反復した。
【００８５】
実施例４：光学的トウィーザーを利用した方法及び装置
二重ストランドＤＮＡ複合体を周囲温度で適した媒質に込められたポリスチレンビードの間に固定化させた（“ＯｖｅｒｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇＢ−ＤＮＡ：ｔｈｅ Ｅｌａｓｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡＭｏｌｅｃｕｌｅｓ”ｂｙ Ｓｔｅｖｅｎ Ｂ．Ｓｍｉｔｈ，Ｙｕｊｉａ Ｃｕｉ，ａｎｄ Ｃａｒｌｏｓ Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）ｖｏｌ.２７１，ｐｐ７９５−７９９）。約６５ｐＮの伸張力を光学的トウィーザーの利用を通じてＤＮＡに適用した（Ｒｏｕｚｉｎａ，Ｌ，ａｎｄ Ｖ．Ａ．Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ．２００１ｂ．Ｆｏｒｃｅ−ｉｎｄｕｃｅｄｍｅｌｔｉｎｇｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ ｈｅｌｉｘ ２．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８０：８９４−９００）。その力は、ＤＮＡ変性を招いた。プライマーを媒質に添加し、伸張力を６０ｐＮ未満に減少させた。これは、プライマーを変性された単一ストランドＤＮＡにアニーリングさせた。ＤＮＡ重合酵素及びヌクレオチドを媒質に添加して伸張力を０ないし３０ｐＮに減少させて高度に正確な複製を開始させた。複製が完了すれば、約６５ｐＮの伸張力をそれぞれの二重ストランドＤＮＡ分子に適用して、単一ストランドＤＮＡ分子を放出させた。これは、操作器のアレイを利用することによってその規模が拡張されうる。例えば、Ａｒｒｙｘ,Ｉｎｃ．によって製造された光学的トラップアレイのようなアレイが利用されうる。
【００８６】
本発明は、その特定の具体例を参照して詳細に記載されたが、本発明の範囲を逸脱せずに多様な変更がなされ、その同等物が採用されうるということを、当業者ならば明確に分かるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１Ａ】温度循環に依存しないＰＣＲ方法の代表的なフローチャートである。
【図１Ｂ】温度循環に依存しないＰＣＲ方法の代表的なフローチャートである。
【図２Ａ】対向する表面の間に固定されたＤＮＡストランドに張力を適用するための代表的方法及びそのための反応チャンバの要素の配列を示す図面である。
【図２Ｂ】対向する表面の間に固定されたＤＮＡストランドに張力を適用するための代表的方法及びそのための反応チャンバの要素の配列を示す図面である。
【図２Ｃ】対向する表面の間に固定されたＤＮＡストランドに張力を適用するための代表的方法及びそのための反応チャンバの要素の配列を示す図面である。
【図３Ａ】光学的トラップまたは磁気的トラップを利用してＤＮＡストランドに張力を適用する方法及びそのための反応チャンバの要素の配列を示す図面である。
【図３Ｂ】光学的トラップまたは磁気的トラップを利用してＤＮＡストランドに張力を適用する方法及びそのための反応チャンバの要素の配列を示す図面である。
【図４】流体流れ内で基板に固定された重合酵素に結合されたＤＮＡストランドに張力を適用する代表的な方法及びそのための反応チャンバの要素の配列を示す図面である。
【図５Ａ】流体流れで一側末端に固定されたＤＮＡストランドに張力を適用する代表的な方法及びそのための反応チャンバの要素の配列を示す図面である。
【図５Ｂ】流体流れで一側末端に固定されたＤＮＡストランドに張力を適用する代表的な方法及びそのための反応チャンバの要素の配列を示す図面である。
【図６Ａ】流速勾配に浮遊しているＤＮＡストランドに張力を適用するための代表的な方法及びそのための反応チャンバの要素の配列を示す図面である。
【図６Ｂ】流速勾配に浮遊しているＤＮＡストランドに張力を適用するための代表的な方法及びそのための反応チャンバの要素の配列を示す図面である。
【図６Ｃ】流速勾配に浮遊しているＤＮＡストランドに張力を適用するための代表的な方法及びそのための反応チャンバの要素の配列を示す図面である。
【図７Ａ】温度循環または熱による変性に依存していないＰＣＲ方法を行うための代表的な装置の概略図である。
【図７Ｂ】温度循環または熱による変性に依存していないＰＣＲ方法を行うための代表的な装置の概略図である。
【図１Ａ】
2008500029.tif 000004
【図１Ｂ】
2008500029.tif 000005
【図２Ａ】
2008500029.tif 000006
【図２Ｂ】
2008500029.tif 000007
【図２Ｃ】
2008500029.tif 000008
【図３Ａ】
2008500029.tif 000009
【図３Ｂ】
2008500029.tif 000010
【図４】
2008500029.tif 000011
【図５Ａ】
2008500029.tif 000012
【図５Ｂ】
2008500029.tif 000013
【図６Ａ】
2008500029.tif 000014
【図６Ｂ】
2008500029.tif 000015
【図６Ｃ】
2008500029.tif 000016
【図７Ａ】
2008500029.tif 000017
【図７Ｂ】
2008500029.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月10日(2007.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド序列を増幅する方法であって、
（ａ）一つ以上の単一ストランドＤＮＡの鋳型ストランドを、前記各鋳型ストランドの一部に相補的な一つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップと、
（ｂ）前記一つ以上のプライマーを前記鋳型ストランドの相補的な部分に混成化させるステップと、
（ｃ）前記鋳型ストランドをＤＮＡ重合酵素及び４種類以上のヌクレオシド三リン酸と接触させるステップと、
（ｄ）前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を進め、これにより、前記鋳型ストランドに結合された延長生成物を形成するステップと、
（ｅ）前記延長生成物を前記鋳型ストランドから分離させるステップと、
を含み、
その後、前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）を、各反復する前に前記（ｅ）ステップを行って１回以上反復し、
前記一つ以上のプライマーを前記鋳型ストランドの相補的な部分に混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって、前記混成化を制御するステップを含む、または、
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって、各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含み、
及び、オープションに更に、
前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離させるステップは、前記鋳型ストランドに応力を適用することによって、前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップを含む、または、
前記ステップ（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）のうち一つ以上は、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記一つ以上のプライマーを前記鋳型ストランドの相補的な部分に混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって前記混成化を制御するステップを含み、
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって、各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって、各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含み、
前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップは、前記鋳型ストランドに応力を適用することによって前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記一つ以上のプライマーを前記鋳型ストランドの相補的な部分に混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の提供を制御することによって前記混成化を制御するステップを含み、
前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップは、前記鋳型ストランドに応力を適用することによって前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含み、
前記一つ以上のプライマーを前記鋳型ストランドの相補的な部分に混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって前記混成化を制御するステップを含み、
前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップは、前記鋳型ストランドに応力を適用することによって前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御するステップは、前記鋳型ストランドに対する機械的張力、水力学的応力、または電場の適用を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御するステップは、前記鋳型に制御された量の機械的張力を直接適用するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記鋳型ストランドに制御された量の機械的張力を直接適用するステップは、前記一つ以上の鋳型ストランドが付着された表面を移動するステップを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御するステップは、前記鋳型ストランドに対する水力学的応力を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記鋳型ストランドは、流体流れに露出された表面に固定される、流体流れに露出された表面に固定されたＤＮＡ重合酵素に結合される、または、逆伝搬性の流体流れによって維持されかつ延長される、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御するステップは、前記鋳型ストランドの一側または両側の末端に連結された粒子に力を適用するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ｅ）で、応力を適用するステップは、前記ステップ（ｄ）で適用される同じ応力の増加された量を適用するステップを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記鋳型ストランドの相補的な部分に前記一つ以上のプライマーを混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を約０ないし約６５ｐＮの範囲内で制御することによって前記混成化を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記鋳型ストランドの相補的な部分に前記一つ以上のプライマーを混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を約１０ないし約６５ｐＮの範囲内で制御することによって前記混成化を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を０ｐＮより大きい値ないし約４５ｐＮの範囲内で制御することによって、各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御し、前記ＤＮＡ上の難しい序列が複製される時期に該当する時点に前記応力を増大させることによって、各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡは、５０％を超えるＧＣ含量を有する数個の残分の一つ以上のセグメントを含み、前記ＤＮＡは、９０％より高い効率性に増幅されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡは、６０％より高いＧＣ含量を有する数個の残分の一つ以上のセグメントを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡは、８個以上の塩基対の反復単位を含む一つ以上のセグメントを含み、前記ＤＮＡは、９０％より高い効率性に増幅されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、約６５℃未満で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ステップは、約５０回以上反復されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
約１０００塩基より多くの塩基で構成された鋳型ストランドが増幅されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法は、約１時間以内に完了することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡを含む溶液は、ｐＨ４−７またはｐＨ８−１０を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
約１μｌ未満の容量を有する反応チャンバで行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップ（ａ）の前に、
ＲＮＡ試料を収得するステップと、
相補的なＤＮＡストランドを生成可能にするのに十分な組成物の存在下に、前記ＲＮＡを逆転写酵素と接触させるステップと、
単一ストランドＤＮＡを形成するために、前記ＤＮＡを前記ＲＮＡから分離するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ａ）の前に、
ＤＮＡ試料を収得するステップと、
前記ＤＮＡを変性させるステップと、
前記ＤＮＡストランドを反応チャンバ内で基板に結合させるステップと、
前記反応チャンバをフラッシングして前記試料から汚染物を除去するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップ（ａ）の第１の場合であって、前記一つ以上の鋳型ストランドは、一つのＤＮＡ分子から収得されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ａ）の少なくとも第１の場合であって、前記一つ以上の鋳型ストランドは、精製されていない試料物質内に含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記鋳型ストランドを基板に結合された分子を結合できる複合体化基を含むプライマーと接触させることによって、前記鋳型ストランドを前記基板に結合させるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記複合体化基は、活性化可能であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記基板の表面に結合された前記複合体化基及び分子は、ビオチン及びストレプトアビジンであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記プライマーは、光活性化可能な束縛されたビオチンを含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
病原菌を検出する方法であって、
請求項１に記載の方法を含み、
前記病原菌と特異的に関連したヌクレオチド序列の存在如何に対して結果物であるＤＮＡを探索するステップをさらに含む、
ことを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記病原菌は、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ）、エプスタインバールウイルス、エンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、人間ヘルペスウイルスタイプ６、人間免疫欠乏症ウイルスタイプ１、人間免疫欠乏症ウイルスタイプ２、人間Ｔ−細胞リンパ営養性ウイルスタイプＩ、人間Ｔ−細胞リンパ営養性ウイルスタイプＩＩ、マイコバクテリア結核、マイコプラズマ、パーボウイルスＢ−１９及び豚内因性レトロウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＲｅｔｒｏＶｉｒｕｓ：ＰＥＲＶ）で構成される群から選択されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
第１増幅サイクルのための前記鋳型ストランドを準備するために、ｍｌ当り約１０００個未満の個体またはポリヌクレオチドを含む試料を収得するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ＤＮＡ序列を増幅する方法であって、
（ａ）二重ストランドＤＮＡを二つの単一ストランドＤＮＡ分子に分離させるのに十分な応力を前記二重ストランドＤＮＡに適用するステップを含む方法によって、一つ以上の二重ストランドＤＮＡを変性させ、前記一つまたは二つの単一ストランドＤＮＡ分子は、以後のステップで鋳型ＤＮＡストランドとなるステップと、
（ｂ）前記鋳型ストランドを前記各鋳型ストランドの一部に相補的な一つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡ重合酵素及び４種類以上のヌクレオシド三リン酸と接触させるステップと、
（ｃ）前記ステップ（ａ）での応力適用を減少させて、前記プライマーを各鋳型ストランドの該当する相補的な部分にアニーリングさせるステップと、
（ｄ）前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御して前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップと、
（ｅ）前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）を１回以上反復するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
前記応力を適用する、前記応力を減少させる、および前記応力を制御するステップは、前記ＤＮＡを基板または一つ以上の粒子または両者に結合させるステップ及び前記基板または一つ以上の粒子の運動を制御するステップを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記応力を適用する、前記応力を減少させる、および前記応力を制御するステップは、前記ＤＮＡを一つ以上の粒子に結合させるステップ及び光学的な操作または磁気的な操作によって前記粒子の運動を制御するステップを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記応力を適用する、前記応力を減少させる、および前記応力を制御するステップは、前記ＤＮＡに対する流体流れを調整するステップを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＤＮＡは、基板に結合された重合酵素によって結合されることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＤＮＡは、基板に結合されることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＤＮＡは、流体流れの速度勾配で伸びることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＤＮＡは、逆伝搬性の流体流れによって伸びることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるために、前記鋳型ストランドに対する応力を制御するステップは、前記ＤＮＡ上の難しい序列が複製される時期に該当する時点に前記応力を増大させるステップを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
ａ）標的序列を含む二重ストランドＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）試料、前記標的序列の３’末端及びその相補体に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、４種類以上のヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡ重合酵素を提供するステップと、
ｂ）前記ｄｓＤＮＡを融解させるのに十分な張力を前記ｄｓＤＮＡから誘発して、前記ｄｓＤＮＡを単一ストランドＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に変性させるステップと、
ｃ）前記鋳型ストランド内の前記張力を、前記プライマーの相補的な鋳型ストランドへの混成化を許容するのに十分であるように減少させるステップと、
ｄ）前記鋳型ストランド内の張力を、前記ＤＮＡ重合酵素が前記プライマーを延長してｄｓＤＮＡを形成させうるレベルまで調整するステップと、、
ｅ）前記ステップ（ｂ）乃至（ｄ）を１回以上反復するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４７】
前記の全体プロセスは、周囲の温度と同じレベルの温度で行われることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記の全体プロセスは、約２０℃より高く、約６０℃より低い温度で行われることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記の全体プロセスは、室温で行われ、前記ステップ（ｂ）で、張力は、約６５ｐＮであり、前記ステップ（ｃ）で、張力は、０ｐＮより大きい値ないし約６０ｐＮに減少し、前記ステップ（ｄ）で、張力は、０ｐＮより大きい値ないし約４５ｐＮに調整されることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記張力は、電気的に、磁気的に、または光学的に前記ＤＮＡに結合された一つ以上の粒子を操作するか、前記ＤＮＡが結合された表面を移動させるか、前記ＤＮＡが露出された流体流れを制御するか、または、これらの組合わせ、によって誘発されかつ制御されることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
密閉された反応チャンバに連結された一つ以上の流体チャンネルを備える核酸序列を複製する装置であって、
前記反応チャンバが、その内部にＤＮＡ分子を維持する手段を備え、
前記装置は、前記装置の内部に維持された前記ＤＮＡ分子に可変的であり、制御された量の応力を適用するメカニズムをさらに含むことを特徴とする装置。
【請求項５２】
核酸プライマー、ヌクレオシド三リン酸、及び重合酵素の導入のための一つ以上の保存チャンバをさらに備えることを特徴とする請求項５１に記載の装置。
【請求項５３】
前記反応チャンバ内に維持された前記ＤＮＡ分子に応力を適用する前記メカニズムは、第１表面及び第２表面を含み、前記表面上にＤＮＡ分子を固定するための手段を備え、
前記装置は、前記表面のうち一つまたは両者何れもを相互間に移動させうるメカニズムをさらに含むことを特徴とする請求項５１に記載の装置。
【請求項５４】
前記反応チャンバ内に維持された前記ＤＮＡ分子に応力を適用する前記メカニズムは、一つ以上の表面を含み、その上にＤＮＡ分子を固定するための手段を備え、
前記装置は、前記ＤＮＡ上に制御され、可変的な流体流れを提供するメカニズムをさらに含むことを特徴とする請求項５１に記載の装置。
【請求項５５】
ＤＮＡ分子を固定するための手段をその上に含む前記一つ以上の表面は、前記表面を通じた流路をさらに備えることを特徴とする請求項５４に記載の装置。
【請求項５６】
前記ＤＮＡ上に制御され、可変的な流体流れを提供するメカニズムは、層流において、速度勾配を形成するように配列されることを特徴とする請求項５４に記載の装置。
【請求項５７】
前記反応チャンバ内に維持された前記ＤＮＡ分子に応力を適用するメカニズムは、層流で速度勾配、流体流れ内の停滞点、逆伝搬性の流体流れ、または、これらの組合わせ、を提供するように配列された流体流れチャンネルを備えることを特徴とする請求項５１に記載の装置。
【請求項５８】
前記反応チャンバ内に維持された前記ＤＮＡ分子に応力を適用するメカニズムは、ＤＮＡ分子に結合された粒子を操作できる光学的、電気的、または、磁気的操作器のアレイを含むことを特徴とする請求項５１に記載の装置。
【請求項５９】
ＤＮＡ増幅のための微細流体装置であって、
ａ）基板と、
ｂ）前記基板内に位置した流れチャンネルと、
ｃ）ＤＮＡ試料を前記流れチャンネルに導入させうる前記流れチャンネルと流体疎通関係にある流入口及び前記ＤＮＡに応力を適用する手段と、
を備え、
前記装置は、前記ＤＮＡの変性を促進するために前記流れチャンネルの一つ以上の領域内に温度を調節するために作動的に配置された温度制御器を備えていないことを特徴とする微細流体装置。
【請求項６０】
前記基板は、弾性重合体物質で構成されることを特徴とする請求項５９に記載の微細流体装置。
【請求項６１】
前記流れチャンネルは、前記流れチャンネルに導入された試料が前記流れチャンネルの周囲に循環されるように配列されることを特徴とする請求項５９に記載の微細流体装置。
【請求項６２】
前記微細流体装置は、前記チャンネルを通じて流体が移動するように作動的に配置されたポンプをさらに備えることを特徴とする請求項５９に記載の微細流体装置。
【請求項６３】
前記流れチャンネル内に核酸を固定化する手段を備えることを特徴とする請求項５９に記載の微細流体装置。
【請求項６４】
前記流れチャンネル内に固定化された一つ以上の重合酵素分子を含むことを特徴とする請求項５９に記載の微細流体装置。
【請求項６５】
前記流れチャンネルは、実質的に円形であることを特徴とする請求項６１に記載の微細流体装置。
【請求項６６】
前記微細流体装置は、前記チャンネルを通じて流体を移動させるために作動的に配置されたポンプをさらに備えることを特徴とする請求項６５に記載の微細流体装置。
【請求項６７】
ヌクレオチド序列を増幅する方法であって、
（ａ）一つ以上の単一ストランドＤＮＡの鋳型ストランドを前記各鋳型ストランドの一部に相補的な一つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップと、
（ｂ）前記一つ以上のプライマーを前記鋳型ストランドの相補的な部分に混成化させるステップと、
（ｃ）前記鋳型ストランドをＤＮＡ重合酵素及び４種類以上のヌクレオシド三リン酸と接触させるステップと、
（ｄ）前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を進め、これにより前記鋳型ストランドに結合された延長生成物を形成するステップと、
（ｅ）前記延長生成物を前記鋳型ストランドから分離させるステップと、
を含み、
その後、各反復前に前記（ｅ）ステップを行い、前記ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）を１回以上反復し、
前記一つ以上のプライマーを前記鋳型ストランドの相補的な部分に混成化させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって前記混成化を制御するステップを含む、または、
前記ＤＮＡ重合酵素によって前記プライマーを延長させるステップは、前記鋳型ストランドに対する応力の適用を制御することによって各鋳型ストランドに相補的な延長生成物を形成するための前記ＤＮＡ重合酵素による前記プライマーの延長を制御するステップを含む、または、
前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離させるステップは、前記鋳型ストランドに応力を適用することによって前記鋳型ストランドから前記延長生成物を分離するステップを含む、または、
前記ステップ（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）のうち一つ以上は、前記鋳型ストランドに対する応力の制御された適用を含む、
ことを特徴とする方法。
【請求項６８】
重合酵素を利用してＤＮＡを複製するステップを含む、ＤＮＡを増幅及び／または序列決定する方法の改善であって、
前記序列決定方法の一つ以上のステップの間に前記重合酵素の活性を制御するステップを含み、
前記重合酵素を制御するステップは、前記ＤＮＡに対する応力の適用を制御するステップを含む、
ことを特徴とするＤＮＡを増幅及び／または序列決定する方法の改善。
【請求項６９】
前記ＤＮＡに対する応力の適用は、機械的張力、水力学的応力、電磁気力、または、これらのうち一つ以上の組合わせの適用から選択された応力を適用する方式を含むことを特徴とする請求項６８に記載のＤＮＡを増幅及び／または序列決定する方法の改善。