(57)【要約】  修飾されたヒト成長ホルモンポリペプチドの製剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの医薬製剤であり、
ａ）緩衝液と；
ｂ）少なくとも１つの、担体、賦形剤又は安定化剤と；及び
ｃ）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の医薬的有効量と、
を含む前記製剤。
【請求項２】
ポリペプチドがリンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項１に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが水溶性ポリマーに連結されている、請求項２に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項４】
水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項３に記載のｈＧＨポリペプチド。
【請求項５】
緩衝液が、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、ヒスチジン、ヒスチジン誘導体、イミダゾール、酢酸塩及び重炭酸塩からなる群から選択される成分を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
緩衝液のｐＨが約ｐＨ４．０と約ｐＨ８．５の間にある、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
緩衝液のｐＨが約ｐＨ４．０と約ｐＨ７．５の間にある、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
緩衝液のｐＨが約ｐＨ６．０と約ｐＨ７．５の間にある、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
緩衝液のｐＨが約ｐＨ６．０と約ｐＨ７．３の間にある、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
緩衝液のｐＨが約ｐＨ５．５と約ｐＨ８．０の間にある、請求項６に記載の製剤。
【請求項１１】
ｈＧＨの医薬的有効量が約０．１ｍｇと約３０ｍｇの間にある、請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
ｈＧＨの医薬的有効量が約２ｍｇと約３０ｍｇの間にある、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
ｈＧＨの医薬的有効量が約０．１ｍｇと約８ｍｇの間にある、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１４】
ｈＧＨの医薬的有効量が約０．５ｍｇと約８ｍｇの間にある、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１５】
ｈＧＨの医薬的有効量が約０．５ｍｇと約６ｍｇの間にある、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
ｈＧＨの医薬的有効量が約１ｍｇと約５ｍｇの間にある、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
ｈＧＨの医薬的有効量が約２ｍｇと約２５ｍｇの間にある、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１８】
緩衝液が約０．１ｍＭないし約２００ｍＭの濃度である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１９】
緩衝液が約１ｍＭないし約７５ｍＭの濃度である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
緩衝液が約１ｍＭないし約２０ｍＭの濃度である、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２１】
緩衝液が約５ｍＭないし約２０ｍＭの濃度である、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２２】
少なくとも１つの、担体、賦形剤又は安定化剤が、抗酸化剤、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖アルコール、塩形成対イオン及び非イオン性界面活性剤からなる群から選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項２３】
担体、賦形剤又は安定化剤が抗酸化剤である、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２４】
抗酸化剤がアスコルビン酸である、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
担体、賦形剤又は安定化剤がアミノ酸である、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２６】
アミノ酸が、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、ヒスチジン誘導体、メチオニン、アスパラギン、グルタミン酸、リジン及びアルギニンからなる群から選択される、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
アミノ酸が約０．１ｇ／Ｌないし約１００ｇ／Ｌである、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２８】
アミノ酸が約１ｇ／Ｌないし約５０ｇ／Ｌである、請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
アミノ酸が約５ｇ／Ｌないし約２５ｇ／Ｌである、請求項２８に記載の製剤。
【請求項３０】
アミノ酸が約０．１ｇ／Ｌないし約６０ｇ／Ｌである、請求項２７に記載の製剤。
【請求項３１】
担体、賦形剤又は安定化剤が炭水化物である、請求項２２に記載の製剤。
【請求項３２】
炭水化物が、単糖、二糖及び他の炭水化物からなる群から選択される、請求項３１に記載の製剤。
【請求項３３】
炭水化物が、トレハロース、スクロース、マンノース、グルコース及びデキストリンからなる群から選択される、請求項３２に記載の製剤。
【請求項３４】
炭水化物が約０．１ｇ／Ｌないし約１００ｇ／Ｌである、請求項３１に記載の製剤。
【請求項３５】
炭水化物が約０．１ｇ／Ｌないし約５０ｇ／Ｌである、請求項３４に記載の製剤。
【請求項３６】
炭水化物が約２ｇ／Ｌないし約２５ｇ／Ｌである、請求項３５に記載の製剤。
【請求項３７】
炭水化物が約０．１ｇ／Ｌないし約５０ｇ／Ｌである、請求項３４に記載の製剤。
【請求項３８】
担体、賦形剤又は安定化剤が糖アルコールである、請求項２２に記載の製剤。
【請求項３９】
糖アルコールがマンニトールである、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４０】
糖アルコールが約０．１ｇ／Ｌないし約１００ｇ／Ｌである、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４１】
糖アルコールが約１ｇ／Ｌないし約５０ｇ／Ｌである、請求項４０に記載の製剤。
【請求項４２】
糖アルコールが約２ｇ／Ｌないし約２５ｇ／Ｌである、請求項４１に記載の製剤。
【請求項４３】
糖アルコールが約０．１ｇ／Ｌないし約６０ｇ／Ｌである、請求項４０に記載の製剤。
【請求項４４】
担体、賦形剤又は安定化剤が非イオン性界面活性剤である、請求項２２に記載の製剤。
【請求項４５】
非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート８０及びポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８）からなる群から選択される、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４６】
非イオン性界面活性剤が約０．０００１％ないし約１０％である、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４７】
非イオン性界面活性剤が約０．０１％ないし約１０％である、請求項４６に記載の製剤。
【請求項４８】
非イオン性界面活性剤が約０．１％ないし約５％である、請求項４７に記載の製剤。
【請求項４９】
非イオン性界面活性剤が約０．１％ないし約１％である、請求項４８に記載の製剤。
【請求項５０】
非イオン性界面活性剤が約０．０００１％ないし約１％である、請求項４６に記載の製剤。
【請求項５１】
製剤が２つの非イオン性界面活性剤を含む、請求項４４に記載の製剤。
【請求項５２】
担体、賦形剤又は安定化剤がキレート剤である、請求項２２に記載の製剤。
【請求項５３】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項５２に記載の製剤。
【請求項５４】
請求項１に記載の製剤の有効量を用いて、ｈＧＨによって調節される疾患を有する患者を治療する方法。
【請求項５５】
緩衝液が約ｐＨ５．５と約ｐＨ８．０の緩衝能を有する成分を含む、請求項１に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００４年１２月２２日に出願された米国仮特許出願６０／６３８，６１６号、２００５年５月１３日に出願された米国仮特許出願６０／６８０，６１７号及び２００５年１０月１７日に出願された米国仮特許出願６０／７２８，０３５号の優先権を主張し、これらの明細書は、それらの全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）に共有結合された非天然アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの安定化されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト成長ホルモンは、正常なヒトの成長及び発育の制御の多くに関わっている。天然に存在するこの一本鎖下垂体ホルモンは１９１個のアミノ酸残基からなり、約２２ｋＤａの分子量を有する。ｈＧＨは、とりわけ、線形成長（体発生（ｓｏｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ））、授乳、マクロファージの活性化並びにインシュリン様及び糖尿病誘発効果などの多数の生物学的効果を惹起する（Ｃｈａｗｌａ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  ３４：５１９−５４７  （１９８３）；  Ｉｓａｋｓｓｏｎ，  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ４７：４８３−４９９  （１９８５）；  Ｈｕｇｈｅｓ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｓｅｎ，  Ｙｉ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ４７：４６９−４８２  （１９８５））。
【０００４】
ｈＧＨの構造は周知であり（Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４−５４８  （１９７９））、ｈＧＨの三次元構造はＸ線結晶学によって解明されている（ｄｅ  Ｖｏｓ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２  （１９９２））。本タンパク質は、Ｎ末端から始まり、ループによって連結された、Ａ−Ｄと名付けられた４つの両親媒性αヘリックス束を含むコンパクトな球状構造を有する。ｈＧＨの受容体及びバリアント並びに他のＧＨスーパーファミリーのメンバーを含むｈＧＨのさらなる論述は、「Ｍｏｄｉｆｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ」と題された米国特許出願１１／０４６，４３２号及び「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｕｒ  Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｂｕｎｄｌｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ」と題されたＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／０３５３７号に記載されており、これらは、それらの全内容が参照により組み込まれる。
【０００５】
組換えｈＧＨは治療剤として使用されており、多数の適応症の治療に対して承認されている。ｈＧＨの欠乏は、例えば、ホルモンの外因性投与によって、１０年超にわたって首尾よく治療されてきた小人症を引き起こす。ｈＧＨ欠乏に加えて、ｈＧＨは、腎不全（小児）、ターナー症候群及びＡＩＤＳ患者における悪液質の治療に対しても承認されてきた。最近、食品医薬局（ＦＤＡ）は、非ＧＨ依存性の小人症の治療に対してｈＧＨを承認した。
ｈＧＨは、現在、老化、高齢者における脆弱性、短腸症候群及びうっ血性心不全の治療に対しても調査中である。ｈＧＨ治療に対する標的集団には、特発性小人症（ＩＳＳ）を有する小児及びＧＨＤ様症候群を有する成人が含まれる。
【０００６】
組換えｈＧＨは、現在、毎日注射可能な製品として販売されており、現在、ＨｕｍａｔｒｏｐｅＴＭ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）、ＮｕｔｒｏｐｉｎＴＭ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＮｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎＴＭ（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＴＭ（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／ＳｅｒｏｓｔｉｍＴＭ（Ｓｅｒｏｎｏ）という５つの主要な製品が販売されている。しかしながら、治療剤として成長ホルモンを使用することに対する著しい困難は、本タンパク質が短いインビボ半減期を有しており、従って、最大の有効性のためには、毎日、皮下注射によって投与しなければならないということである（ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８１：１８０６−１８０９（１９９６））。製造コストを低減し、患者に対する投与を容易にし、効力及び安全性特性を向上させ、並びに優位な利点を与えるその他の特性を作り出すことによって、ｈＧＨアゴニスト及びアンタゴニストの投与を改善するための手段に対して、多大な努力が注力されている。例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＡｌｋｅｒｍｅｓは、小児成長ホルモン欠乏症に対するｈＧＨのデポー製剤であるＮｕｔｒｏｐｉｎ  ＤｅｐｏｔＴＭを以前に販売していた。本デポー製剤は、より少ない頻度での投与（毎日１回ではなく、２−３週毎に１回）を可能とするが、生体への利用性が低いこと及び注射部位での痛みなどの望ましくない副作用も伴い、２００４年に市場から撤収された。別の製品ＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔＴＭ（Ｐｆｉｚｅｒ）も、最近、ＦＤＡによって承認された。ＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔＴＭは、末端肥大症の治療を適応症とする高度に選択的な成長ホルモン受容体アンタゴニストとして機能する、ｈＧＨの遺伝的に改変された類縁体である（ｖａｎ  ｄｅｒ  ＬｅＩｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３５８：１７５４−１７５９  （２００１）。ＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔＴＭ中のアミノ酸残基の幾つかはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーで誘導体化されているが、本製品は、なお、毎日１回投与され、医薬特性が最適でないことを示唆する。ＰＥＧ化及びデポー製剤の他に、ｈＧＨの吸入される剤形及び経口剤形など、他の投与経路が、初期段階の前臨床及び臨床開発中であり、ＦＤＡから未だ承認を受けていない。従って、成長ホルモン活性を示すが、より長い血清半減期も提供し、従って、より最適なｈＧＨの治療レベル及びより長い治療半減期を提供するポリペプチドに対する必要性が存在する。
【０００７】
親水性ポリマーポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧと略される。）の共有結合は、タンパク質、ペプチド及び特に疎水性分子を含む、多くの生物活性分子の水溶性、生物学的利用性を増加させ、血清半減期を増加させ、治療半減期を増加させ、免疫原性を増加させ、生物学的活性を調節し、又は循環時間を延長する方法である。ＰＥＧは、医薬中で、人工のインプラント上で、及び生体適合性、毒性の欠如及び免疫原性の欠如が重要であるその他の用途において広く使用されてきた。ＰＥＧの所望される特性を最大化するために、生物活性分子に付着される１又は複数のＰＥＧポリマーの総分子量及び水和状態は、親分子の生物活性に悪影響を与えずに、増加された水溶解度及び循環半減期などの、ＰＥＧポリマーの付着に典型的に付随する有利な特性を付与するのに十分に大きくもしくは高くなければならない。
【０００８】
最近、タンパク質の部位特異的な修飾に付随する制約の多くを克服することを約束する、タンパク質科学における全く新しい技術が報告された。具体的には、原核生物であるエシェリヒア・コリ（Ｅ．コリ）（例えば、Ｌ．  Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００）及び真核生物であるサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（例えば、Ｊ．Ｃｈｉｎ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７（２００３））のタンパク質生合成装置に新しい成分が付加され、これによって、遺伝的にコードされていないアミノ酸を、インビボでタンパク質に取り込むことが可能となった。この方法を用いて、光親和性標識及び光異性化可能なアミノ酸、光架橋アミノ酸（例えば、Ｃｈｉｎ，  Ｊ．  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ９９：１１０２０−１１０２４；及びＣｈｉｎ，  Ｊ．  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２４：９０２６−９０２７参照）、ケトアミノ酸、重原子含有アミノ酸及びグリコシル化されたアミノ酸など、新しい化学的、物理的又は生物学的特性を有する多数のアミノ酸が、アンバーコドンＴＡＧに応答して、Ｅ．コリ及び酵母中のタンパク質中に、効率的に及び高い精度で取り込まれている。例えば、「Ｊ．  Ｗ．  Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２），  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７」；「Ｊ．  Ｗ．  Ｃｈｉｎ，  ＆  Ｐ．  Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  （２００２），  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ３（１１）：１１３５−１１３７」；  「Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２），  ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４」；及び「Ｌ．  Ｗａｎｇ，  ＆  Ｐ．  Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  （２００２），  Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，  １：１−１１」を参照されたい。全ての参考文献は、それらの全内容が参照により組み込まれる。これらの研究は、タンパク質中に見出されず、遺伝的にコードされた２０個の共通アミノ酸中に見出される官能基の全てに対して化学的に不活性であり、並びに効率的及び選択的に反応して安定な共有結合を形成するために使用され得るケトン基、アルキン基及びアジド部分などの化学的官能基を選択的及び日常的に導入することが可能であることを示した。
【０００９】
遺伝的にコードされていないアミノ酸をタンパク質中に取り込ませる能力によって、リジンのε−ＮＨ２、システインのスルフヒドリルーＳＨ、ヒスチジンのイミノ基などの、天然に存在する官能基に対する価値ある代替物を提供することができる化学的官能基の導入が可能となる。
【００１０】
ヒト成長ホルモン製剤は、再構成又は水性製剤を必要とする凍結乾燥された調製物であり得る。バイアル当り、ＰｒｏｔｒｏｐｉｎＴＭ  ｈＧＨは、５ｍｇのｈＧＨ、４０ｍｇのマンニトール、０．１ｍｇのリン酸二水素ナトリウム、１．６ｍｇのリン酸水素二ナトリウムからなり、ｐＨ７．８になるように再構成される（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．，  Ｏｒａｗｅｌｌ，  ＮＪ．，  ｐ．  １０４９，  １９９２）。バイアル当り、ＨｕｍａｔｒｏｐｅＴＭｈＧＨは、５ｍｇのｈＧＨ、２５ｍｇのマンニトール、５ｍｇのグリシン、１．１３ｍｇのリン酸水素二ナトリウムからなり、ｐＨ７．５になるように再構成される（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ｐ．  １２６６，  １９９２）。水性ヒト成長ホルモン製剤の例は、米国特許第５，７６３，３９４号；第５，９８１，４８５号；第６，４４８，２２５号及び米国特許公開２００３／００１３６５３号に記載されており、これらの各々は、参照により、本明細書中に組み込まれる。
【００１１】
成長ホルモン製剤に関する一般的な総説については、「Ｐｅａｒｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．  Ｄ．  Ｍａｒｓｈａｋ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｌｉｕ，  ｐｐ．２３−３０，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９」（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。タンパク質の安定化に関する興味深いその他の公報は、以下のとおりである。
【００１２】
米国特許第４，２９７，３４４号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、グリシン、アラニン、ヒドロキシプロリン、グルタミン及びアミノ酪酸などの選択されたアミノ酸並びに単糖、オリゴ糖又は糖アルコールなどの炭水化物を付加することによって、凝固因子ＩＩ及びＶＩＩＩ、アンチトロンビンＩＩＩ及びプラスミノーゲンを熱に対して安定化することを開示している。
【００１３】
米国特許第４，７８３，４４１号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、ｐＨ６．８−８．０での、交互に存在する弱い親水性及び弱い疎水性ゾーンの鎖を含む最大５００ｐｐｍの界面活性物質の添加により、界面での水溶液中のタンパク質（インシュリンなど）の変性を防ぐ方法を開示している。
【００１４】
米国特許第４，８１２，５５７号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、ヒト血清アルブミンを用いて、インターロイキン−２を安定化する方法を開示している。
【００１５】
欧州特許出願公報第０  ３０３  ７４６号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、非還元糖、糖アルコール、糖酸、ペンタエリスリトール、ラクトース、水溶性デキストラン及びＦｉｃｏｌｌ、生理的ｐＨで帯電した側基を有するアミノ酸のポリマー並びにコリン塩からなるポリオールで、成長促進ホルモンを安定化することを開示している。
【００１６】
欧州特許出願公開第０  ２１１  ６０１号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン単位を含有し、約１，１００ないし約４０，０００の平均分子量を有するブロック共重合体によって形成されるゲルマトリックス中での、成長促進ホルモンの安定化を開示している。
【００１７】
欧州特許出願公開第０  １９３  ９１７号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、タンパク質と炭水化物間の複合体の水溶液によって特徴付けられる、遅い放出のための生物学的に活性な組成物を開示している。
【００１８】
国際特許公開ＷＯ８９／０９６１４号及びオーストラリア特許出願３０７７１／８９号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、ヒト成長ホルモン、グリシン及びマンニトールを含有する安定な医薬製剤を開示している。このような調製物は、凍結乾燥された状態での通常の加工及び保存中に、並びに再構成後の使用の期間中に改善された安定性を示している。
【００１９】
米国特許第５，０９６，８８５号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、グリシン、マンニトール、非イオン性界面活性剤及び緩衝液を含有する、凍結乾燥のためのｈＧＨの製剤を開示している。
【００２０】
米国特許第４，８７６，５６８号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、動物の成長ホルモンは様々な安定化剤で安定化されて、水性環境中での、不溶物の形成の減少及び溶解活性の保存が得られることを開示している。このような安定化剤は、ある種のポリオール、アミノ酸、生理的ｐＨで帯電した側基を有するアミノ酸のポリマー及びコリン塩を含む。ポリオールは、非還元糖、糖アルコール、糖酸、ペンタエリスリトール、ラクトース、水溶性デキストラン及びＦｉｃｏｌｌからなる群から選択され、アミノ酸は、グリシン、サルコシン、リジン又はその塩、セリン、アルギニン又はその塩、ベタイン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−グリシン、アスパラギン酸又はその塩、グルタミン酸又はその塩からなる群から選択され、生理的ｐＨで帯電した側基を有するアミノ酸のポリマーは、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン及びその塩から選択され得、並びにコリン誘導体は、塩化コリン、クエン酸二水素コリン、重酒石酸水素コリン、重炭酸コリン、クエン酸トリコリン、アスコルビン酸コリン、ホウ酸コリン、グルコン酸コリン、リン酸コリン、硫酸二（コリン）及び粘液酸二コリンからなる群から選択される。米国特許第４，８７６，５６８号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、ポリヒスチジンが動物の成長ホルモンに対する安定化剤として使用できる可能性があることに言及しているが、ポリヒスチジンが動物の成長ホルモン又はヒトの成長ホルモンを安定化するかどうかについての示唆は全く存在しない。さらに、米国特許第４，８７６，５６８号は、ポリ−ＤＬ−リジンＨＢｒが好ましいことを記載している。
【００２１】
ＥＰ３７４１２０号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、３つの水酸基を有するポリオールを含む緩衝化されたポリオール賦形剤と、及び成長ホルモンが、十分な期間、その生物活性を保持する範囲にｐＨを達成するための緩衝液とを含む成長ホルモンの安定化された調製物を開示する。ヒスチジンが、３つの水酸基を有するポリオールに対する緩衝剤として挙げられている。具体的には、ＥＰ３７４１２０号は、ヒスチジン塩酸塩が、成長ホルモンの高濃度と安定化剤としてのポリオールとを含む溶液の形態の成長ホルモン調製物の安定性を改善するために、３つの水酸基を有するポリオールを緩衝化するための緩衝液として使用し得ることを教示している。さらに、ヒスチジン塩酸塩は、ヒスチジン塩酸塩の約０．１５Ｍ溶液の濃度に対応する溶液の約３重量％の量で添加しなければならない。ＥＰ３７４１２０号は、ヒスチジン単独では、成長ホルモン調製物に化学的及び物理的安定性を付与しないことも教示している。
【００２２】
ＳｏｒｅｎｓｅｎらのＷＯ９３／１２８１２号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、成長ホルモンがヒスチジン又はヒスチジン誘導体の存在によって安定化され得ることを教示している。成長ホルモンが凍結乾燥されている場合には、組成物は、充填剤、すなわち、糖アルコール、二糖及びこれらの混合物も含むことが可能である。Ｓｏｒｅｎｓｅｎらの米国特許第５，８４９，７０４号（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、成長ホルモンと、成長ホルモン中のペプチド結合の脱アミド化、酸化又は切断に対して安定性を与えるために付加された添加物又は緩衝物質としてのヒスチジン又はヒスチジンの誘導体とを含む医薬製剤を開示している。ヒスチジン又はヒスチジンの誘導体の存在下での成長ホルモンの結晶化は、公知の方法より高い純度を有する結晶のより高い収率を与えることも開示されている。ヒト成長ホルモンバリアントの製剤は、米国特許第６，１３６，５６３号及び米国特許第５，８４９，５３５号（参照により明細書中に組み込まれる。）に記載されている。
【００２３】
ｈＧＨは、ペプチド骨格の脱アミド化、凝集、切り取り及びメチオニン残基の酸化を含む、幾つかの分解経路を介して分解される。ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに共有結合されたｈＧＨの抱合体の分解から、さらなる産物が生じる。分解産物の許容可能な調節を与え、長期にわたって、ｈＧＨの維持される安定性を長期にわたって有し、及び、激しい撹拌（凝集を誘導する。）に対して安定であるｈＧＨの医薬製剤は、特に有利であろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの製剤を提供する。
【００２５】
幾つかの実施形態において、ｈＧＨポリペプチドは、１つ又はそれ以上の翻訳後修飾を含む。幾つかの実施形態において、ｈＧＨポリペプチドは、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている。幾つかの実施形態において、ｈＧＨポリペプチドは、二官能性ポリマー、二官能性リンカー又は少なくとも１つのさらなるｈＧＨポリペプチドに連結されている。
【００２６】
幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、リンカーによって水溶性ポリマーに連結され、又は水溶性ポリマーに結合される。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、本発明は、ｈＧＨポリペプチドの凍結乾燥された単回投薬製剤である。幾つかの実施形態において、本発明は、ｈＧＨポリペプチドの液体製剤である。
【００２７】
幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａと約１００ｋＤａの間の分子量を有する。幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、０．１ｋＤａと５０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００２８】
幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は分岐したポリマーである。幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分岐ポリマーの各分岐は、１ｋＤａと１００ｋＤａの間、又は１ｋＤａと５０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００２９】
一実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの医薬製剤は、緩衝剤、少なくとも１つの担体、賦形剤又は安定化剤と、及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の医薬量を含む。別の実施形態において、前記少なくとも１つの、担体、賦形剤又は安定化剤が、抗酸化剤、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖アルコール、塩形成カウンターイオン及び非イオン性界面活性剤からなる群から選択される。本発明は、本発明のｈＧＨ分子の製剤の有効量を用いて、ｈＧＨによって調節される疾患を有する患者を治療する方法も提供する。
【００３０】
本発明の一実施形態において、望ましくない凝集した種の形成を最小限に抑え、又は生物学的活性を低減する化学的変化を引き起こし、若しくは受容体認識を変化させる天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの製剤が提供される。このような製剤は、適切な保存時間にわたって活性を維持することが可能であり、容易に調合され、及び患者への投与に対して許容され得る。
【００３１】
一実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド（ＰＥＧ化されたｈＧＨを含むが、これに限定されない。）の製剤は、皮下注射のために使用される前に再構成される凍結乾燥された製剤である。本発明の製剤は、医薬製剤、特に、皮下投与用の製剤であり得る。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に開示されている製剤を用いて、調合されたタンパク質（ＰＥＧ化されたｈＧＨを含むが、これに限定されない。）によって治療可能な疾患の予防的又は治療的な処置のための方法を提供する。このような製剤は、特に、皮下投与に対して有用である。
【００３３】
本明細書に開示された製剤を封入する容器及び予め充填された注射器を備える製品も提供される。
【００３４】
定義
本発明は、本明細書に記載されている具体的な方法、プロトコール、細胞株、構築物及び試薬に限定されるものではなく、従って、変化し得る。本明細書で使用されている用語は、具体的な実施形態を記載するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定する意図ではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００３５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されている単数形（「ａ」、「ａｎ」  ａｎｄ  「ｔｈｅ」）には、文脈から別段の意味であることが明らかである場合を除き、複数表記も含まれる。従って、例えば、「ｈＧＨ」という表記は、１つ以上のこのようなタンパク質を表し、当業者に公知のこれらの均等物などを含む。
【００３６】
別段の定義がなければ、本明細書に使用されている全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解する意味と同一の意味を有する。本発明の実施又は検査においては、本明細書に記載されているものと類似又は均等な、あらゆる方法、装置及び材料を使用可能であるが、ここでは、好ましい方法、装置及び材料が記載されている。
【００３７】
本明細書に挙げられている全ての公報及び特許は、例えば、公報中に記載された、本明細書に記載されている発明に関連して使用され得る構築物及び方法を記載及び開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に論述されている公報は、専ら、本願の出願日より前の開示に対してのみ提供される。本明細書の記載は、以前の発明に基づいて、又は何らかの理由によって、本発明者らがこのような開示の日付を先行させる権利を有することを認めるものと解釈すべきではない。
【００３８】
米国特許出願第１１／０４６，４３２号は、参照により、その全体を組み込まれる。従って、米国特許出願第１１／０４６，４３２号中の７９−１５３と付番されたパラグラフ中に提供された開示内容は、あたかも、このような開示内容が本明細書中に完全に記されているのと同じ程度まで、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ｈＧＨポリペプチド及び修飾された非天然アミノ酸ｈＧＨポリペプチドを作製し、精製し、性質決定し、及び使用するための本明細書中に記載されている方法、組成物、技術及び戦略に対して適用される。
【００３９】
本明細書において使用される「成長ホルモン」又は「ＧＨ」には、ヒト成長ホルモンの少なくとも１つの生物活性を有するポリペプチド及びタンパク質が含まれ、並びに、その生物活性に関わらず、及び組換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は核酸の他の形態から作製されるかどうかを問わない。）、インビトロ、インビボ、核酸分子のマイクロインジェクション、合成、トランスジェニック及び遺伝子活性化された方法など（これらに限定されない。）、その合成又は製造の方法に関わらず、ＧＨ類縁体、ＧＨイソフォーム、ＧＨ模倣体、ＧＨ断片、ハイブリッドＧＨタンパク質、融合タンパク質、オリゴマー及び多量体、相同体、グリコシル化パターンバリアント、バリアント、スプライスバリアント及び突然変異タンパク質が含まれる。「ｈＧＨポリペプチド」という用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含むｈＧＨポリペプチドを包含する。
【００４０】
完全な完全長の天然に存在するＧＨアミノ酸配列並びに成熟した天然に存在するＧＨアミノ酸配列及び天然に存在する変異体については、それぞれ、米国特許出願第１１／０４６，４３２号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）中の配列番号１、配列番号２及び配列番号３を参照。幾つかの実施形態において、本発明のｈＧＨポリペプチドは、これらの配列と、又は成長ホルモンポリペプチドの他の何れかの配列と実質的に同一である。
【００４１】
「ｈＧＨポリペプチド」という用語には、天然に存在するｈＧＨの、医薬として許容される塩及びプロドラッグ、並びに前記塩のプロドラッグ、多形体、水和物、溶媒和物、生物学的に活性な断片、生物学的に活性なバリアント及び立体異性体並びに天然に存在するｈＧＨのアゴニスト、模倣体及びアンタゴニストバリアント及びそのポリペプチド融合物も含まれる。アミノ末端、カルボキシル末端又は両方に追加のアミノ酸を含む融合物は、「ｈＧＨポリペプチド」という用語に包含される。典型的な融合物には、例えば、組換え発現から得られたｈＧＨのＮ末端にメチオニンが連結されたメチオニル成長ホルモン、分泌シグナルペプチド又はそれらの一部を欠如するｈＧＨの成熟型、精製のための融合物（ポリヒスチジン又はアフィニティーエピトープが含まれるが、これらに限定されない。）、血清アルブミン結合ペプチドとの融合物及び血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合物が含まれるが、これらに限定されない。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５０，３７３号は、成長ホルモン及びそれらの各受容体分子に対する変化した結合特性を有する抗体断片バリアントなどの新規タンパク質を選択するための方法を記載している。本方法は、線状ファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩコートタンパク質のカルボキシ末端ドメインに、目的のタンパク質をコードする遺伝子を融合することが含まれる。
【００４２】
様々な参考文献が、ポリマー抱合又はグリコシル化によるポリペプチドの修飾を開示している。「ｈＧＨポリペプチド」という用語には、ＰＥＧなどのポリマーに抱合されたポリペプチドが含まれ、システイン、リジン又は他の残基の１つ以上の追加の誘導体化から構成され得る。さらに、ｈＧＨポリペプチドは、リンカー又はポリマーが接合しているアミノ酸が本発明の非天然アミノ酸であり得るか、又はリジン若しくはシステインへの結合など、本分野で公知の技術を用いて天然においてコードされていないアミノ酸へ抱合され得るリンカー又はポリマーを含み得る。
【００４３】
ｈＧＨポリペプチドのポリマー抱合が報告されている。例えば、米国特許第５，８４９，５３５号、第６，１３６，５６３号及び６，６０８，１８３号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。米国特許第４，９０４，５８４号は、少なくとも１つのリジン残基が欠失され、又は他の何れかのアミノ酸残基で置換されている、ＰＥＧ化された、リジン除去されたポリペプチドを開示している。ＷＯ９９／６７２９１号は、タンパク質上の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失されており、及び該タンパク質がタンパク質への抱合を達成するのに十分な条件下でＰＥＧと接触される、タンパク質にＰＥＧを抱合する方法を開示している。ＷＯ９９／０３８８７号は、システイン残基がポリペプチドの指定された領域中に位置する非必須アミノ酸残基で置換されている、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドのＰＥＧ化されたバリアントを開示している。ＷＯ００／２６３５４号は、対応する親ポリペプチドと比べて、少なくとも１つの追加のグリコシル化部位を含む、アレルギー誘発性が低減された、グリコシル化されたポリペプチドバリアントを製造する方法を開示している。米国特許第５，２１８，０９２号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、固有ポリペプチドに比べて、少なくとも１つの追加の炭水化物鎖を導入するために、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び他のポリペプチドを修飾することを開示している。
【００４４】
「ｈＧＨポリペプチド」という用語には、何れかのアミノ酸位置がグリコシル化されたポリペプチド、ポリペプチドのＮ−結合型又はＯ結合型グリコシル化形態などのグリコシル化されたｈＧＨが含まれるが、これらに限定されない。単一のヌクレオチド変化を含有するバリアントも、ｈＧＨポリペプチドの生物学的に活性なバリアントとして考えられる。さらに、スプライスバリアントも含まれる。「ｈＧＨポリペプチド」という用語には、化学的手段によって連結された、又は融合タンパク質として発現された、１つ又はそれ以上の何れかのｈＧＨポリペプチド又は他のあらゆるポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リンカー、リガンド又はあらゆる種類の他の生物活性分子のｈＧＨポリペプチドヘテロ二量体、ホモ二量体、ヘテロ多量体又はホモ多量体及び例えば、特異的な欠失又は他の修飾を含有するが、生物活性をなお維持するポリペプチド類縁体も含まれる。
【００４５】
本明細書に記載されているｈＧＨ中のアミノ酸位置に対する全ての表記は、別段の記載（すなわち、比較が配列番号１、３又はその他のｈＧＨ配列に基づいていると記載されている場合）がなければ、「Ｍｏｄｉｆｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ」と題された米国特許出願第１１／０４６，４３２号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に列記されているような配列番号２中の位置に基づいている。当業者であれば、米国特許出願第１１／０４６，４３２号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に列記されている配列番号１、２、３又は他の何れかのＧＨ配列中の位置に対応するアミノ酸位置は、ｈＧＨ融合物、バリアント、断片などの他の何れかのｈＧＨ分子中に容易に同定可能であることが自明である。米国特許出願第１１／０４６，４３２号（参照により、本明細書に組み込まれる。）の配列番号１、２、３又は他のＧＨ配列中の位置と対応する、タンパク質中の特定の位置を整列及び同定するために、例えば、ＢＬＡＳＴなどの配列整列プログラムを使用することが可能である。米国特許出願第１１／０４６，４３２号（参照により、本明細書に組み込まれる。）の配列番号１、２、３又は他のＧＨ配列に関して本明細書に記載されているアミノ酸の置換、欠失又は付加は、本明細書に記載され又は本分野で公知のｈＧＨ融合物、バリアント、断片などの、他のあらゆるｈＧＨ分子中の対応する位置の置換、欠失又は付加も表すものとして、本発明によって明示的に包含される。
【００４６】
「ｈＧＨポリペプチド」又は「ｈＧＨ」という用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含むｈＧＨポリペプチドを包含する。本発明のｈＧＨポリペプチドは、１又はそれ以上の非天然アミノ酸修飾とともに、１つ又はそれ以上の天然アミノ酸を用いた修飾から構成され得る。アゴニスト活性を増加する置換、ポリペプチドの溶解度を増加する置換、プロテアーゼ感受性を減少する置換、ポリペプチドをアンタゴニストに変換するなど（これらに限定されない。）、ｈＧＨポリペプチドの生物活性の１つ又はそれ以上を調節する置換など（これらに限定されない。）、天然に存在するｈＧＨポリペプチド中の様々なアミノ酸位置における典型的な置換が記載されており、「ｈＧＨポリペプチド」という用語によって包含される。
【００４７】
幾つかの実施形態において、ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨポリペプチドの生物活性を調節する付加、置換又は欠失をさらに含む。例えば、付加、置換又は欠失は、ｈＧＨの１又はそれ以上の特性又は活性を調節し得る。例えば、付加、置換又は欠失は、ｈＧＨポリペプチド受容体に対する親和性を調節し、受容体の二量体化を調節し（増加又は減少させることを含むが、これらに限定されない。）、受容体の二量体を安定化し、循環半減期を調節し、治療半減期を調節し、ポリペプチドの安定性を調節し、プロテアーゼによる切断を調節し、用量を調節し、放出若しくは生物学的利用可能性を調節し、精製を促進し、又は投与の具体的経路を改善若しくは改変し得る。同様に、ｈＧＨポリペプチドは、本ポリペプチドの検出（ＧＦＰを含むが、これに限定されない。）、精製又は他の形質を改善する、プロテアーゼ切断配列、分泌シグナル配列、反応性の基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧ又はポリ−Ｈｉｓを含むが、これらに限定されない。）又はアフィニティーを基礎とした他の配列（ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどを含むが、これらに限定されない。）又は連結された分子（ビオチンを含むが、これに限定されない。）を含み得る。
【００４８】
「ｈＧＨポリペプチド」という用語には、天然においてコードされていないアミノ酸側鎖を介して、同一若しくは別異の天然においてコードされていないアミノ酸側鎖に、天然にコードされているアミノ酸側鎖に直接的に連結されたもの又はリンカーを介して間接的に連結されたものなど、連結されたホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体及びヘテロ多量体も包含される。典型的なリンカーには、小有機化合物、ポリ（エチレングリコール）若しくはポリデキストランなどの様々な長さの水溶性ポリマー又は様々な長さのポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
「天然においてコードされていないアミノ酸」とは、２０の共通アミノ酸うちの一つ又はピロリジン（ｐｙｒｏｌｙｓｉｎｅ）又はセレノシステインでないアミノ酸を表す。「天然においてコードされていないアミノ酸」という用語と同義的に使用され得る他の用語は、「非天然アミノ酸」、「不天然アミノ酸」、「天然に存在しないアミノ酸」、並びに様々にハイフンが付されたそのバージョン及びハイフンが付されていないそのバージョンである。「天然においてコードされていないアミノ酸」という用語には、天然にコードされているアミノ酸（２０の共通アミノ酸又はパイロリジン及びセレノシステインを含むが、これらに限定されない。）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じるが、それ自体は、成長しているポリペプチド鎖中に翻訳複合体によって本来取り込まれないアミノ酸も含まれるが、これに限定されない。このような天然に存在しないアミノ酸の例には、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン及びＯ−ホスホチロシンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
「アミノ末端修飾基」は、ポリペプチドのアミノ末端に付着させることが可能なあらゆる分子を表す。同様に、「カルボキシ末端修飾基」とは、ポリペプチドのカルボキシ末端に付着させることが可能な任意の分子を表す。末端修飾基には、様々な水溶性ポリマー、血清アルブミンなどの様々な水溶性ポリマー、ぺプチド若しくはタンパク質又はペプチドの血清半減期を増加させるその他の部分が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応性部位」、「化学的反応基」及び「化学的反応部分」という用語が、分子の異なる、確定可能な部分又は単位を表すために、本分野及び本明細書において使用されている。前記用語は、化学の分野において若干同義的であり、何らかの機能又は活性を発揮し、他の分子と反応する分子の部分を表すために本明細書に使用される。
【００５２】
本明細書において「結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」又は「リンカー」という用語は、化学反応の結果として通常形成される基又は結合を表すために使用され、典型的には、共有結合である。加水分解に対して安定な結合とは、該結合が水中で実質的に安定であり、生理的条件下を含む（これに限定されない。）有用なｐＨ値で、長期にわたって、おそらくは永久に水と反応しない結合を意味する。加水分解に対して不安定な結合又は分解可能な結合とは、該結合が、水又は例えば、血液などの水溶液中で分解可能であることを意味する。酵素的に不安定な結合又は分解可能な結合とは、該結合が１つまたはそれ以上の酵素によって分解可能であることを意味する。本分野で理解されているように、ＰＥＧ及び関連ポリマーは、ポリマー骨格中に、又はポリマー骨格とポリマー分子の末端官能基の１つまたはそれ以上との間のリンカー基中に分解可能な結合を含み得る。例えば、ＰＥＧカルボン酸又は活性化されたＰＥＧカルボン酸の、生物活性因子上のアルコール基との反応によって形成されたエステル結合は、一般的には、生理的条件下で加水分解されて、前記因子を放出する。加水分解によって分解可能な他の結合には、カルボナート結合；アミンとアルデヒドの反応から得られたイミン結合；アルコールとホスファート基との反応によって形成されたリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドの反応産物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールの反応産物であるアセタール結合；ギ酸塩とアルコールの反応産物であるオルトエステル結合；アミン基（ＰＥＧなどのポリマーの末端に位置するものを含むが、これに限定されない。）とペプチドのカルボキシ基によって形成されるペプチド結合；及びホスホルアミダイト基（ポリマーの末端に位置するものを含むが、これに限定されない。）とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成されるオリゴヌクレオチド結合が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
「生物活性分子」、「生物活性部分」又は「生物活性因子」という用語は、本明細書中で使用する場合、以下に限定されないが、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物及びヒトを含む、生物系、生物に関連する、経路、分子もしくは相互作用の何らかの身体的又は生化学的特性に影響を与え得るあらゆる物質を意味する。特に、本明細書中で使用する場合、生物活性分子には、以下に限定されないが、ヒトもしくは動物における疾患の、診断、治療、緩和、処置もしくは予防のための、又は、ヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的健康を促進するためのあらゆる物質が含まれる。生物活性分子の例には、以下に限定されないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、炭水化物、無機原子又は分子、顔料、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微小粒子及びミセルが含まれる。本発明とともに使用するのに適した生物活性因子のクラスには、以下に限定されないが、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管作動薬、抗不安薬、ホルモン、増殖因子、ステロイド剤、微生物由来毒素などが含まれる。
【００５４】
「二官能性ポリマー」とは、他の部分（アミノ酸側鎖基を含むが、これに限定されない。）と特異的に反応して、共有又は非共有結合を形成することができる２つの別個の官能基を含むポリマーを表す。第一の生物活性成分と、二官能性リンカーと、及び第二の生物活性成分とを含む抱合体を形成するために、ある生物活性成分上の基と反応する１つの官能基と、第二の生物成分上の基と反応する別の基とを有する二官能性リンカーを使用することができる。ペプチドに様々な化合物を付着するための数多くの手順及びリンカー分子が公知である。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号、米国特許第４，６７１，９５８号、第４，６５９，８３９号、第４，４１４，１４８号、第４，６９９，７８４号；第４，６８０，３３８号及び第４，５６９，７８９号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。「多官能性ポリマー」とは、他の部分（アミノ酸側鎖基を含むが、これに限定されない。）と特異的に反応して、共有又は非共有結合を形成することができる２つ以上の別個の官能基を含むポリマーを表す。二官能性ポリマー又は多官能性ポリマーは、あらゆる所望の分子長又は分子量であってもよく、ＧＨ、例えば、ｈＧＨ分子に連結された１つ以上の分子の間に特定の所望されるスペース又は立体構造を提供するように選択され得る。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、「水溶性ポリマー」という用語は、水性溶媒中で可溶性であるあらゆるポリマーを指す。ｈＧＨポリペプチドへの水溶性ポリマーの結合は、非修飾形態に比べて、増加若しくは調節された血清半減期、又は増加若しくは調節された治療半減期、調節された免疫原性、凝集及び多量体の形成、改変された受容体結合並びに改変された受容体二量体化又は多量体化などの調節された物理的会合特性を含む（これらに限定されない。）変化をもたらすことが可能である。水溶性ポリマーは、それ自身の生物活性を有していてもよく、又は有していなくてもよい。適切なポリマーとしては、以下に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ１−Ｃ１０アルコキシ又はそれらのアリールオキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号に記載（本明細書中に参照により組み込む。）。）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、オリゴ糖、グリカン、セルロース及びセルロース誘導体（以下に限定されないが、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含む。）、デンプン及びデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコール及びそれらの誘導体、ポリアルキレングリコールとそれらの誘導体とのコポリマー、ポリビニルエチルエーテル及びα−β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミドなど又はそれらの混合物が挙げられる。このような水溶性ポリマーの例には、ポリエチレングリコール及び血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、「ポリアルキレングリコール」又は「ポリ（アルケングリコール）」という用語は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール及びこれらの誘導体を指す。「ポリアルキレングリコール」及び／又は「ポリエチレングリコール」という用語は、直鎖及び分岐ポリマーの両方、並びに０．１ｋＤａないし１００ｋＤａの平均分子量を包含する。他の例示的な実施形態は、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ「“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（２００１）」など、供給業者のカタログに列記されている。
【００５７】
本明細書において使用される、「調節された血清半減期」という用語は、修飾されていない形態に比した、修飾されたｈＧＨの循環半減期の正又は負の変化を意味する。血清半減期は、ＢＳＰの投与後の様々な時点に血液試料を採取し、各試料中のその分子の濃度を決定することによって測定される。血清濃度と時間の相関関係は、血清半減期の循環を可能とする。望ましくは、増加された血清半減期は、少なくとも約２倍を有するが、それより小幅な増加も有用であり得、例えば、これにより、満足のいく投与計画を可能とするか、又は毒性の影響を避けることができる。幾つかの実施形態では、増加は、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍である。
【００５８】
「調節された治療半減期」という用語は、本明細書中で使用する場合、その非修飾形態と比較して、ｈＧＨの治療的有効量の半減期が正又は負に変化することを意味する。治療半減期は、投与後に、様々な時点で分子の薬物動態及び／又は薬力学特性及びを測定することにより測定される。増加された治療的半減期は、望ましくは、特定の有益な投薬治療、特定の有益な総投薬を可能とし、又は所望でない効果を回避する。幾つかの実施形態において、効力の増強、その標的に対する修飾された分子の結合の増加又は減少、このようなプロテアーゼなどの酵素による分子の増加若しくは減少した分解、又は別のパラメータの増加若しくは減少又は非修飾分子の作用機構の結果、治療半減期が延びる。
【００５９】
「実質的に精製された」という用語は、それが天然に存在する環境中に、すなわち、野生型細胞、又は組換え的に産生されたｈＧＨポリペプチドの場合には宿主細胞中に見出されるタンパク質を伴い、又は該タンパク質と相互作用する成分を実質的に又は本質的に含まない場合があり得るｈＧＨポリペプチドを表す。細胞物質を実質的に含まないことができるｈＧＨポリペプチドには、莢雑タンパク質の約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満（乾燥重量に対して）を有するタンパク質の調製物が含まれる。ｈＧＨポリペプチド又はそのバリアントが宿主細胞によって組換え的に産生される場合には、該タンパク質は、細胞の乾燥重量の、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％若しくは１％未満で存在し得る。ｈＧＨポリペプチド又はそのバリアントが宿主細胞によって組換え的に産生される場合には、該タンパク質は、細胞の乾燥重量の、約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ又は約１ｍｇ／Ｌ若しくは約１ｍｇ／Ｌ未満で、培地中に存在し得る。従って、本発明の方法によって作製された「実質的に精製された」ｈＧＨポリペプチドは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ及びキャピラリー電気泳動（これらに限定されない。）などの適切な方法によって測定された場合に、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、具体的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％以上及びそれ以上の純度レベル、より具体的には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％又はそれ以上の純度レベルを有し得る。
【００６０】
「単離された」という用語は、核酸又はタンパク質に対して適用される場合、核酸若しくはタンパク質が自然の状態でそれとともに随伴している他の細胞成分の少なくとも幾つかを、該核酸若しくはタンパク質が含まないことを表し、又はそのインビボ若しくはインビトロ産生の濃度より大きなレベルまで核酸若しくはタンパク質が濃縮されていることを表す。それは、均質な状態であり得る。単離された物質は、乾燥若しくは半乾燥状態、又は溶液（水溶液を含むが、これに限定されない。）とすることができる。単離された物質は、さらなる医薬として許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物の成分であり得る。純度及び均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーなどの分析的化学技術を用いて測定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製される。特に、単離された遺伝子は、該遺伝子に隣接し、対象遺伝子とは別のタンパク質をコードする読み取り枠から分離されている。「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル中で実質的に一つのバンドを生じることを表す。特に、「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％又はそれ以上純粋であることを意味し得る。
【００６１】
本明細書において使用される「対象」という用語は、治療、観察又は実験の対象である動物、幾つかの実施形態においては哺乳動物、及び別の実施形態においてはヒトを表す。
【００６２】
本明細書において使用される「有効量」という用語は、治療されている、疾病、症状又は疾患の症候の１つ又はそれ以上をある程度緩和する、投与されている非天然アミノ酸ポリペプチドの量を指す。本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、予防的、強化的及び／又は治療的処置のために投与することが可能である。
【００６３】
「強化する」又は「強化すること」という用語は、所望の効果の強度又は持続時間の何れかを増加又は延長させることを意味する。従って、治療薬の効果を促進するということに関して、「強化すること」という用語は、系において他の治療薬の強度又は持続時間、効果を増大又は延長させる能力を表す。本明細書において使用される「強化有効量」とは、所望の系において、別の治療剤の効果を強化するのに十分な量を表す。患者に使用される場合、この使用に対して有効な量は、疾病、疾患又は症状の重度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する応答、並びに担当医の判断に依存する。
【００６４】
本明細書において使用される「修飾された」という用語は、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、アミノ酸組成、化学的構造に対する変化、ポリペプチドの翻訳時修飾又は翻訳後修飾など、あるポリペプチドに対して施された任意の変化を表す。「（修飾された）」形態という用語は、論述されているポリペプチドが場合によって修飾されていること、すなわち、論述されているポリペプチドは修飾されてもよく、又は修飾されなくてもよいことを意味する。
【００６５】
「翻訳後修飾された」という用語は、天然又は非天然アミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれた後、このようなアミノ酸に起こる、天然又は非天然アミノ酸のあらゆる修飾を指す。この用語は、一例に過ぎないが、インビボ翻訳時修飾、インビトロ翻訳時修飾（無細胞翻訳系など）、インビボ翻訳後修飾及びインビトロ翻訳後修飾を包含する。
【００６６】
予防的な適用では、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、ある疾病、疾患又は症状が発生しやすく、又はその他該疾病、疾患又は症状に対してリスクがある患者に投与される。このような量は、「予防的有効量」であると定義される。この使用において、正確な量は、患者の健康状態、体重などにも依存する。このような予防的有効量を定型的な実験作業（例えば、用量漸増臨床試験）によって決定することは、当業者の能力の範囲内に十分属すると考えられる。
【００６７】
治療的な適用では、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、疾病、症状又は疾患に既に罹患している患者に、該疾病、疾患又は症状の症候を治癒し、又は少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与される。このような量は、「治療的有効量」であると定義され、疾病、疾患又は症状の重度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する応答、並びに担当医の判断に依存するであろう。このような治療的有効量を定型的な実験作業（例えば、用量漸増臨床試験）によって決定することは、当業者の能力の範囲内に十分属すると考えられる。
【００６８】
「治療する」という用語は、予防的及び／又は治療的処置の何れかを表すために使用される。
【００６９】
天然にコードされないアミノ酸ポリペプチドは、所望の効果（所望の治療効果を含む。）を生じさせるためにその後使用される代謝物を産生させるのに必要な生物に投与した際に代謝され得る。
【００７０】
別段の記載がなければ、本分野の技術に属する質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の慣用法が使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
Ｉ．序論
本発明において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｈＧＨ分子が提供される。本発明のある種の実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するｈＧＨポリペプチドは、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。一実施形態において、少なくとも１つの翻訳後修飾は、特定の反応基に対して適切であることが当業者に公知である化学の方法を利用した、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質又はポリペプチドもしくはポリペプチド類縁体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、インターカレートする基、発色団、エネルギー転移剤、生物活性剤、検出可能標識、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、ニュートロン捕捉剤又は上記のあらゆる組み合わせその他の何らかの所望の化合物もしくは物質のあらゆる組合せなどの（これらに限定されない。）、第二の反応性基を含む分子を、第一の反応性基を含む少なくとも１つの非天然アミノ酸へ付着することを含む。
【００７２】
目的のタンパク質又はポリペプチドは、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、又は１０若しくはそれ以上の非天然アミノ酸を含有することが可能である。非天然アミノ酸は、同一又は別異とすることが可能であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる部位が存在することが可能である。ある種の実施形態において、タンパク質の天然に存在する様式中に存在する、少なくとも１つ、但し、全部より少ないアミノ酸が、非天然アミノ酸で置換される。
【００７３】
本発明は、天然においてコードされていない少なくとも１つのアミノ酸を含む、ＧＨスーパー遺伝子ファミリー、特にｈＧＨを基礎とする方法及び組成物を提供する。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー中に天然においてコードされていない少なくとも１つのアミノ酸を導入することによって、１つ以上の天然においてコードされていないアミノ酸など（これに限定されない。）との特異的化学反応を伴うが、一般に存在する２０アミノ酸とは反応しない抱合化学の適用が可能となる。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー（ｈＧＨなど）は、天然においてコードされていないアミノ酸の側鎖を介して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーに連結されている。本発明は、ケトン、アジド又はアセチレン部分など（これに限定されない。）、天然に取り込まれる２０個のアミノ酸中に見出されない官能基又は置換基を含有するアミノ酸など（これらに限定されない。）、遺伝的にコードされていないアミノ酸を、セレクターコドンに応答してタンパク質中に、選択的に取り込み、それらのアミノ酸を、適切に反応性を有するＰＥＧ誘導体でその後修飾することを含む、ＰＥＧ誘導体を用いてタンパク質を選択的に修飾する極めて効率的な方法を提供する。一旦取り込まれれば、次いで、このアミノ酸側鎖は、天然においてコードされていないアミノ酸中に存在する官能基又は置換基に適していることが当業者に公知の化学方法を使用することによって修飾することができる。多様な公知の化学方法が、水溶性ポリマーをタンパク質中に取り込むために本発明において使用するのに適している。
【００７４】
ＰＥＧは、生物材料の表面を修飾するために使用できることが本分野では十分に確立されている（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号、Ｍｅｈｖａｒ，  Ｒ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．，  ３（１）：１２５−１３６（２０００）参照、これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）。
【００７５】
組換え核酸方法、セレクターコドン、オルソゴナルｔＲＮＡ、オルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ並びにカルボニル基、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ、アジド及びアルキン基などの（これらに限定されない。）様々な反応性基を有する天然にコードされないアミノ酸の考察は、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ」と題された米国特許出願第１１／０４６，４３２号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されている。天然においてコードされていないアミノ酸の細胞取り込み及び生合成も、本願において論述されている。本願は、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸のｈＧＨ中への取り込みのための部位及びｈＧＨポリペプチドの発現についても詳述している。ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニン及びｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンなどの、カルボニル基を含有する非天然アミノ酸の合成が、「Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６  （２００３）」に記載されており、参照により、本明細書中に組み込まれる。
【００７６】
ＩＩ．非天然アミノ酸を有するポリペプチド
以下に限定されないが、タンパク質構造及び／又は機能の変化の適合化、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位の接近可能性の変更、部分（以下に限定されないが、タンパク質アレイに対してなど）への標的化、生物活性分子の付加、ポリマーの結合、放射性核種の結合、血清半減期の調節、組織浸透性の調節（例えば腫瘍）、能動輸送の調節、組織、細胞又は器官特異性又は分布の調節、免疫原性の調節、プロテアーゼ耐性の調節など、様々な目的で非天然アミノ酸の取り込みを行うことができる。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、増強された特性、又は完全に新しい触媒若しくは生物物理学的特性を有することが可能である。例えば、タンパク質に非天然アミノ酸を取り込ませることにより、次の特性を場合によっては変更する：毒性、生体内分布、構造特性、分光学的特性、化学及び／又は光化学的特性、触媒能、半減期（以下に限定されないが、血清半減期など）、他の分子との反応能（以下に限定されないが、共有又は非共有的な反応など）など。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、以下に限定されないが、新規治療、診断、触媒酵素、工業用酵素、結合タンパク質（以下に限定されないが、抗体など）及び、以下に限定されないが、タンパク質構造及び機能の研究などに有用である。例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２を参照のこと。
【００７７】
本発明の一態様において、組成物は、少なくとも１個の、以下に限定されないが、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０若しくはそれ以上などの、非天然アミノ酸を有する少なくとも１個のタンパク質を含む。非天然アミノ酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる非天然のアミノ酸を含むタンパク質中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる部位が存在することが可能であるなど（これに限定されない。）、同一又は別異とすることが可能である。別の態様において、組成物は、少なくとも１個の、しかし、総数より少ない、タンパク質に存在する特定のアミノ酸が非天然アミノ酸で置換されているタンパク質を含む。２以上の非天然アミノ酸を有するある一定のタンパク質の場合、非天然アミノ酸は、同じ又は異なるものであり得る（以下に限定されないが、タンパク質は、非天然アミノ酸の２つ又はそれ以上の異なる型を含むか、又は同じ非天然アミノ酸２個を含み得る。）。３以上の非天然アミノ酸を有するある一定のタンパク質の場合、非天然アミノ酸は、同じもの、異なるもの、又は、同じ種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の異なる非天然アミノ酸との組合せであり得る。
【００７８】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する目的のタンパク質又はポリペプチドは、本発明の特徴である。本発明はまた、本発明の組成物及び方法を用いて産生された少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する、ポリペプチド又はタンパク質も含む。賦形剤（以下に限定されないが、医薬として許容される賦形剤を含む。）もまた、タンパク質とともに存在し得る。
【００７９】
少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する目的のタンパク質又はポリペプチドを真核細胞中で産生することによって、タンパク質又はポリペプチドには、典型的には、真核細胞の翻訳後修飾が含まれる。ある一定の実施形態において、タンパク質は、少なくとも１個の非天然アミノ酸及び真核細胞によりインビボで為された少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、この翻訳後修飾は、原核生物細胞によっては行われない。例えば、翻訳後修飾には、以下に限定されないが、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミタート付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、グリコシル化などが含まれる。ある態様において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖（以下に限定されないが、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）など。）のアスパラギンへの結合を含む。真核生物タンパク質のＮ結合型オリゴ糖の幾つかの例を列記する（さらなる残基も存在可能であるが、これらは図示されていない。）、「Ｍｏｄｉｆｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ」と題された米国特許第１１／０４６，４３２号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）の表１参照。別の態様において、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン若しくはＧａｌＮＡｃ−スレオニン結合による、又はＧｌｃＮＡｃ−セリン若しくはＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合による、オリゴ糖（以下に限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含む。）の、セリン又はスレオニンへの結合を含む。
【００８０】
さらに別の態様において、翻訳後修飾は、前駆体のタンパク質分解プロセシング、マルチサブユニットタンパク質へのアセンブリーもしくは巨大分子アセンブリー、細胞の別の部位（以下に限定されないが、小胞体、ゴルジ装置、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞小器官へ、又は分泌経路を通じて、などを含む。）への変換を含む。ある一定の実施形態において、タンパク質は、分泌又は局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合などを含む。米国特許第４，９６３，４９５号及び第６，４３６，６７４号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、ｈＧＨポリペプチドの分泌を改善するように設計された構築物を詳述している。
【００８１】
非天然アミノ酸の１つの長所は、これが、さらなる分子を付加するために使用できるさらなる化学部分を与えることである。真核又は非真核細胞においてインビボで、又はインビトロで、これらの修飾を行い得る。したがって、ある一定の実施形態において、翻訳後修飾は、非天然アミノ酸によるものである。例えば、翻訳後修飾は、求核−求電子反応によるものであり得る。タンパク質の選択的修飾のために現在使用されている殆どの反応は、以下に限定されないが、ヒスチジン又はシステイン側鎖とのα−ハロケトンの反応など、求核反応パートナーと求電子反応パートナーとの間での共有結合形成を含む。これらの事例での選択性は、タンパク質中の求核残基の数及び接近可能性により決定される。本発明のタンパク質において、非天然ケト−アミノ酸とヒドラジド又はアミノオキシ化合物とのインビトロ及びインビボでの反応など、より選択的な他の反応を使用することができる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１５０−８１５１；Ｍａｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１２５−１１２８；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ１００：５６−６１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：６７３５−６７４６；及びＣｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７を参照のこと（これらは全て、参照により、本明細書に組み込まれる。）。これにより、フルオロフォア、架橋剤、糖誘導体及び細胞毒性分子を含む多数の試薬による、事実上あらゆるタンパク質の選択的標識が可能となる。「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」と題された米国特許第６，９２７，０４２号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）も参照されたい。ｈＧＨへ付着され得る分子には、以下に限定されないが、色素、フルオロフォア、架橋剤、糖誘導体、ポリマー（以下に限定されないが、ポリエチレングリコールの誘導体など）、光架橋リンカー、細胞毒性化合物、親和性標識、ビオチンの誘導体、レジン、ビーズ、第二のタンパク質又はポリペプチド（又はさらなるもの）、ポリヌクレオチド（以下に限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物などが含まれる。
【００８２】
本発明は、非天然アミノ酸の遺伝的取り込みを含む、タンパク質の選択的修飾を介して生成された非天然アミノ酸ポリペプチドの製剤を提供する。
【００８３】
ＩＩＩ．遺伝的にコードされないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのインビボ生成
本発明のｈＧＨポリペプチドは、天然に存在する系ではコードされていないアミノ酸を付加し、又は置換するために修飾されたｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼを用いて、インビボで生成することが可能である。
【００８４】
天然に存在する系でコードされていないアミノ酸を使用する、ｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼを生成させるための方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５号（第１０／１２６，９３１号）（これらを参照により本明細書中に組み込む。）で述べられている。これらの方法は、翻訳系に対して内在性である、シンテターゼ及びｔＲＮＡとは独立に機能する（したがって、「オルソゴナル」と呼ばれることがある。）翻訳機構を生成させることを含む。通例、この翻訳系は、オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。通例、Ｏ−ＲＳは、この翻訳系中に少なくとも１個の天然に存在しないアミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡは、この系において他のｔＲＮＡにより認識されない少なくとも１個のセレクターコドンを認識する。したがって、この翻訳系は、コードされたセレクターコドンに反応して、この系で産生されたタンパク質に天然においてコードされていないアミノ酸を挿入し、それにより、コードされたポリペプチドの位置においてアミノ酸を「置換」する。
【００８５】
特定の合成アミノ酸をポリペプチド中に挿入するために、多岐にわたるオルソゴナルｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが当技術分野で述べられており、これらは一般に本発明での使用に適切である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが、Ｗａｎｇ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：５６−６１（２００３）及びＺｈａｎｇ，Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２（２２）：６７３５−６７４６（２００３）で述べられている。代表的なＯ−ＲＳ又はその一部はポリヌクレオチド配列によりコードされ、米国特許第出願公開第２００３／００８２５７５号及び２００３／０１０８８８５号（それぞれ、参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されているアミノ酸配列を含む。Ｏ−ＲＳとともに使用するための対応するＯ−ｔＲＮＡ分子もまた、米国特許願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５号（第１０／１２６，９３１号）（参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。
【００８６】
アジド特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ系の例は、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅに対するＯ−ＲＳ配列の代表例としては、米国特許第出願公開第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（参照により本明細書中に組み込む。）に開示されているように、以下に限定されないが、ヌクレオチド配列、配列番号：１４から１６及び２９から３２、並びにアミノ酸配列、配列番号：４６から４８及び６１から６４が挙げられる。さらなるＯ−ｔＲＮＡ配列には、米国特許第出願公開第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（本明細書中に参照により組み込む。）で開示されているように、以下に限定されないが、ヌクレオチド配列、配列番号：１から３が挙げられる。特定の天然においてコードされていないアミノ酸に特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルＬ−ｔＲＮＡシンテターゼペアのその他の例は、米国特許願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）（参照により本明細書中に組み込む。）で記載されている。Ｓ．セレビシエにおいてケト及びアジド含有アミノ酸の両方を取り込む、Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡは、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−９６７（２００３）に記載されている。
【００８７】
幾つかの他のオルソゴナル対が報告されている。Ｅ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）中への非天然アミノ酸の取り込みの可能性に関して、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｔＲＮＡに由来するグルタミル（例えば、Ｌｉｕ，  Ｄ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．  Ｇ．（１９９９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ９６：４７８０−４７８５参照）、アスパルチル（例えば、Ｐａｓｔｒｎａｋ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）  ＨｅＩｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  ８３：２２７７−２２８６参照）及びチロシル（例えば、Ｏｈｎｏ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ．  Ｊｐｎ．）  １２４：１０６５−１０６８；及びＫｏｗａｌ，  Ａ．  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ９８：２２６８−２２７３参照）系及びシンテターゼが記載されている。Ｅ．コリのグルタミル（例えば、Ｋｏｗａｌ，  Ａ．  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ９８：２２６８−２２７３参照）及びチロシル（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，  Ｐ．（１９９０）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０：１６３３−１６４１参照）シンテターゼに由来する系が、Ｓ．セレビシアエでの使用について記載されている。哺乳動物細胞における、インビボでの３−ヨード−Ｌ−チロシンの取り込みのために、Ｅ．コリのチロシル系が使用されている。「Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４６９２−４６９９」を参照されたい。
【００８８】
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの使用は、天然においてコードされていないアミノ酸をコードする特定のコドンの選択を含む。あらゆるコドンを使用できるが、一般的には、Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが発現される細胞において殆ど使用されないか、又は全く使用されないコドンを選択することが望ましい。例えば、代表的なコドンには、停止コドン（アンバー、オーカー及びオパール）などのナンセンスコドン、４又はそれ以上の塩基のコドン及び、殆ど使用されないか又は全く使用されないその他の天然の３塩基コドンが含まれる。
【００８９】
当技術分野で公知の突然変異誘発法（以下に限定されないが、部位特異的突然変異誘発法、カセット突然変異誘発法、制限選択突然変異誘発法などを含む。）を用いて、配列をコードするｈＧＨポリヌクレオチド中の適切な位置に特異的セレクターコドンを導入することができる。
【００９０】
天然においてコードされていないアミノ酸を取り込むために使用できる、Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及びオルソゴナルＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアなどのタンパク質生合成機構の成分を生成させるための方法は、Ｗａｎｇ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００（２００１）；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。天然においてコードされていないアミノ酸のインビボ取り込みのための方法及び組成物は、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）（参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。生物のインビボ翻訳系での使用のためのオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼペアを選択する方法もまた、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。「Ｓｉｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｅｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題されたＰＣＴ公報ＷＯ０４／０３５７４３号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）は、ケトアミノ酸を取り込むためのオルソゴナルＲＳ及びｔＲＮＡ対を記載している。「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ」と題されたＰＣＴ公報ＷＯ０４／０９４５９３号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）は、真核生物の宿主細胞中に、天然においてコードされていないアミノ酸を取り込むためのオルソゴナルＲＳ及びｔＲＮＡ対を記載している。このような方法は、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ」と題された米国特許出願第１１／０４６，４３２号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）中にも詳述されている。
【００９１】
オルソゴナルｔＲＮＡ及びＲＳ対を生成する方法において使用される生物は、様々な生物及び様々な組み合わせを含む。例えば、前記方法の第一及び第二の生物は、同じであるか又は異なり得る。ある実施形態において、生物は、場合により、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ａ．フルギドゥス（Ａ．  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、Ｐ．フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．ホリコシ（Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ａ．ペルニクス（Ａ．ｐｅｒｎｉｘ）、Ｔ．サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの（これらに限定されない。）原核生物である。あるいは、生物は、場合によって、植物（単子葉植物又は双子葉植物などの複雑な植物を含むが、これらに限定されない。）、藻類、原生生物、真菌（酵母などを含むが、これに限定されない。）、動物（哺乳動物、昆虫、節足動物などを含むが、これらに限定されない。）などを含む（これらに限定されない。）真核生物を含む。別の実施形態において、第二の生物は、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ａ．フルギドゥス（Ａ．  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｐ．フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．ホリコシ（Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ａ．ペルニクス（Ａ．ｐｅｒｎｉｘ）、Ｔ．サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの（これらに限定されない。）原核生物である。あるいは、第二の生物は、酵母、動物細胞、植物細胞、真菌、哺乳動物細胞などを含む（これらに限定されない。）真核生物とすることが可能である。様々な実施形態において、第一及び第二の生物は異なる。
【００９２】
Ｖ．ｈＧＨポリペプチドにおける天然に存在しないアミノ酸の位置
本発明は、１つ又はそれ以上の天然に存在しないアミノ酸の、ｈＧＨポリペプチド中への取り込みを想定する。ポリペプチドの活性を妨害しない特定の位置において、１つ又はそれ以上の天然に存在しないアミノ酸が取り込まれ得る。「保存的」置換（以下に限定されないが、疎水性アミノ酸の疎水性アミノ酸による置換、大きなアミノ酸の大きなアミノ酸による置換、親水性アミノ酸の親水性アミノ酸による置換など）を行うことにより、及び／又は活性に必要のない位置に、天然に存在しないアミノ酸を挿入することにより、これを遂行することができる。
【００９３】
ｈＧＨの領域は、以下のように図示することが可能であり、ここにおいて、ｈＧＨ中のアミノ酸位置は、真ん中の列に記されている（米国特許出願１１／０４６，４３２号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）の配列番号２）。
【００９４】
【化１】
2008525494.tif 000002
【００９５】
様々な生化学的及び構造的アプローチを利用して、天然においてコードされていないアミノ酸を用いた置換を行うための所望の部位を、ｈＧＨポリペプチド内に選択することができる。当業者にとって当然のことながら、ポリペプチド鎖のあらゆる位置が、天然においてコードされていないアミノ酸を取り込むための選択に適切であり、選択は、合理的設計に基づくか、又は、何らかの所望の目的のための、又は所望の目的なしの、ランダム選択によるものであり得る。所望の部位の選択は、以下に限定されないが、アゴニスト、スーパーアゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合調節物質、受容体活性調節物質、二量体又は多量体形成などの、何らかの所望の特性又は活性を有するが、ネイティブ分子と比較して活性又は特性に変化がないｈＧＨ分子を産生するためのもの、又は、溶解性、凝集又は安定性などのポリペプチドの何らかの物理的又は化学的特性を操作するためのものであり得る。例えば、当技術分野で公知の点変異分析、アラニンスキャニング又はホモローグスキャニング法を用いて、ｈＧＨの生物活性に必要とされるポリペプチド中の位置を同定することができる。例えば、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，  Ｊ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）」（ｈＧＨ生物活性に対して極めて重要である１４個の残基を同定している。）及び「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１３３０−１３３６（１９８９）」（相同体スキャニング突然変異誘発を用いて、抗体及び受容体エピトープを同定している。）を参照されたい。米国特許第５，５８０，７２３号；第５，８３４，２５０号；第６，０１３，４７８号；第６，４２８，９５４号；及び第６，４５１，５６１号（これらは、参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、標的物質との、ポリペプチドの活性に影響を与える活性ドメインを同定することによって、ｈＧＨなどのポリペプチドの構造及び機能を系統的に分析するための方法を記載している。アラニン又はホモローグスキャニング突然変異誘発により生物活性に重要と同定されるもの以外の残基は、ポリペプチドに対して求められる所望の活性に依存した天然においてコードされていないアミノ酸による置換に適切な候補であり得る。あるいは、生物活性に重要と同定される部位もまた、ポリペプチドに対して求められる所望の活性に依存した天然においてコードされていないアミノ酸による置換に適切な候補であり得る。別の代替法は、ポリペプチド鎖の各位置において天然においてコードされていないアミノ酸で単純に連続した置換を行い、ポリペプチドの活性に対する影響を観察することである。当業者にとって当然のことながら、何らかのポリペプチド中への非天然アミノ酸による置換を行う位置を選択するための、あらゆる手段、技術又は方法が本発明での使用に適切である。
【００９６】
天然においてコードされていないアミノ酸による置換を許容する可能性があるタンパク質の領域を決定するために、欠失を含有するｈＧＨポリペプチドの天然に存在する変異体の構造及び活性を調べることも可能である。例えば、ｈＧＨについては、「Ｋｏｓｔｙｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ９２５：３１４（１９８７）；Ｌｅｗｉｓ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５３：２６７９−２６８７（１９７８）」を参照されたい。同様に、プロテアーゼ消化及びモノクローナル抗体は、ｈＧＨ受容体を結合するために必要とされるｈＧＨの領域を同定するために使用することが可能である。例えば、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１３３０−１３３６（１９８９）；Ｍｉｌｌｓ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １０７：３９１−３９９（１９８０）；Ｌｉ，  Ｃ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４６：３１−４１（１９８２）」（残基１３４−１４９間のアミノ酸は、活性を喪失させずに欠失させることができることを示している。）を参照されたい。天然においてコードされていないアミノ酸による置換基を許容できない可能性がある残基が一旦除去されれば、残りの位置の各々における提案された置換の影響は、ｈＧＨ及びその結合タンパク質の三次元結晶構造から調べることが可能である。ｈＧＨについては、「ｄｅ  Ｖｏｓ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５５：３０６−３１２（１９９２）」を参照。ｈＧＨの全ての結晶構造は、タンパク質及び核酸の巨大分子の三次元構造データを含有する集中管理されたデータベースであるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（３ＨＨＲ、１ＡＸＩ及び１ＨＷＧを含む。）（ＰＤＢ，Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂにおいて、ｒｃｓｂ．ｏｒｇで利用可能）において入手可能である。従って、当業者は、天然においてコードされていないアミノ酸で置換できるアミノ酸位置を容易に同定できる。
【００９７】
幾つかの実施形態において、本発明のｈＧＨポリペプチドは、ポリペプチドのヘリックス又はβシート二次構造を破壊しないタンパク質の領域中に位置する一つ又はそれ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。
【００９８】
天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みの典型的な残基は、その受容体に結合した又は結合していないｈＧＨポリペプチドの三次元結晶構造、二次、三次又は四次構造によって予測されるように、受容体結合領域である可能性がある領域（部位Ｉ及び部位ＩＩを含むが、これらに限定されない。）から除外される残基であり得、完全に又は部分的に溶媒曝露され得、近くの残基と最小限の水素結合相互作用又は非水素結合相互作用を有し、近くの反応性残基へ最小限度で曝露され得、及び高度に柔軟であり（Ｃ−Ｄループを含むが、これに限定されない。）、又は構造的に堅固である（Ｂヘリックスを含むが、これに限定されない。）領域中に存在し得る。
【００９９】
幾つかの実施形態において、以下のように、天然にコードされない一つ又はそれ以上のアミノ酸は、ｈＧＨ中の二次構造に対応する以下の領域の一つ又はそれ以上の中の任意の位置に取り込まれる。配列番号２から得られる１−５（Ｎ末端、６−３３（Ａヘリックス、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）に対応する位置。他の実施形態において、本発明のＧＨポリペプチド、例えばｈＧＨポリペプチドは、例えば、配列番号２のＮ末端（１−５）、Ａ−ＢループのＮ末端（３２−４６）；Ｂ−Ｃループ（９７−１０５）、Ｃ−Ｄループ（１３２−１４９）及びＣ末端（１８４−１９１）に対応する領域からなる群から選択されるＧＨ、例えばｈＧＨの少なくとも一つの領域中に位置する少なくとも一つのアミノ酸に対して置換された天然に存在しない少なくとも一つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、配列番号２の位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸に対応するＧＨ、例えばｈＧＨの位置の１つ又はそれ以上に取り込まれる。
【０１００】
１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みの典型的な部位には、配列番号２から得られる２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６及び１８７に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。
【０１０１】
１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のサブセットには、配列番号２から得られる２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６及び１８７に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。ＧＨ、例えば、ｈＧＨの結晶構造の調査、及びＧＨ、例えば、ｈＧＨ受容体とのその相互作用は、これらのアミノ酸残基の側鎖が完全に又は部分的に溶媒に接近可能であること、及び天然においてコードされていないアミノ酸の側鎖はタンパク質表面から遠ざかり、溶媒中を向き得ることを示唆している。
【０１０２】
１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な位置には、配列番号２から得られる３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５及び１５５に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。ＧＨ、例えばｈＧＨの結晶構造の調査、及びＧＨ、例えば、ｈＧＨ受容体とのその相互作用は、これらのアミノ酸残基の側鎖が完全に溶媒に曝露されていること、及びネイティブ残基の側鎖は溶媒中を向いていることを示唆している。
【０１０３】
１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のサブセットには、配列番号２から得られる３０、７４、１０３に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位の別のサブセットには、配列番号２から得られる３５、９２、１４３、１４５に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のさらなるサブセットには、配列番号２から得られる３５、９２、１３１、１３４、１４３、１４５に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のさらなるサブセットには、配列番号２から得られる３０、３５、７４、９２、１０３、１４５に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のさらなるサブセットには、配列番号２から得られる３５、９２、１４３、１４５に対応する部位若しくはこれらのあらゆる組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。ある種の実施形態において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための部位には、配列番号２から得られる３５に対応する部位又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が含まれる。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えば、ｈＧＨ中に取り込まれる天然においてコードされていないアミノ酸の少なくとも一つは、カルボニル基、例えばケトン基を含有する。ある種の実施形態において、ＧＨ、例えば、ｈＧＨ中に取り込まれる天然においてコードされていないアミノ酸の少なくとも一つは、ｐ−アセチルフェニルアラニンである。ＧＨ、例えば、ｈＧＨが、天然においてコードされていないアミノ酸の複数を含有する幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる天然においてコードされていないアミノ酸の２以上が、ｐ−アセチルフェニルアラニンである。ＧＨ、例えば、ｈＧＨが、天然においてコードされていないアミノ酸の複数を含有する幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる天然においてコードされていないアミノ酸の実質的に全てが、ｐ−アセチルフェニルアラニンである。
【０１０５】
幾つかの実施形態において、非天然アミノ酸は、位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸に対応する。）に対応する位置など（これらに限定されない。）において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然に存在しないアミノ酸は、これらの位置：３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に対応する位置を含む（これらに限定されない。）位置において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然に存在しないアミノ酸は、これらの位置：３５、９２、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）の１つ又はそれ以上に対応する位置を含む（これらに限定されない。）位置において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然に存在しないアミノ酸は、配列番号２から得られるこれらの位置：３５、９２、１３１、１３４、１４３、１４５の１つ又はそれ以上の位置に対応する位置若しくはこれらのあらゆる組み合わせを含む（これらに限定されない。）位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然に存在しないアミノ酸は、配列番号２から得られるこれらの位置：３０、３５、７４、９２、１０３、１４５の１つ又はそれ以上の位置に対応する位置若しくはこれらのあらゆる組み合わせを含む（これらに限定されない。）位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然に存在しないアミノ酸は、配列番号２から得られるこれらの位置：３５、９２、１４３、１４５の１つ又はそれ以上の位置に対応する位置若しくはこれらのあらゆる組み合わせを含む（これらに限定されない。）位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において、水溶性ポリマーに連結される。幾つかの実施形態において、天然に存在しないアミノ酸は、配列番号２から得られる位置３５（これに限定されない。）に対応する位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において、水溶性ポリマーに連結される。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨに連結される水溶性ポリマーには、１つ又はそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。ポリマー、例えばＰＥＧは、直鎖又は分岐であり得る。典型的には、本発明において使用される直鎖ポリマー、例えばＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有することが可能である。典型的には、本発明において使用される分岐ポリマー、例えばＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有することが可能である。ＰＥＧなどのポリマーは、本明細書中にさらに記載されている。ある種の実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨと水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの間の結合は、オキシム結合である。
本発明のある種の実施形態は、オキシム結合である共有結合によって、少なくとも１つの水溶性ポリマーに連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含む組成物を包含する。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧである。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された少なくとも１つの直鎖ＰＥＧを包含する幾つかの実施形態において、ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有することが可能である。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された直鎖ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された少なくとも１つの分岐ＰＥＧを包含する幾つかの実施形態において、ＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有することが可能である。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された分岐ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態において、前記ＧＨはＧＨ、例えばｈＧＨであり、これらの実施形態のうち幾つかにおいて、ＧＨ、例えばｈＧＨは、配列番号２と少なくとも約８０％同一である配列を有する。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨは、配列番号２の配列である配列を有する。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えば、ｈＧＨは、少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有する。これらの実施形態の幾つかにおいて、少なくとも１つのオキシム結合は、天然においてコードされていないアミノ酸と少なくとも１つの水溶性ポリマーの間に存在する。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸はケトン基などのカルボニル基を含有する。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸はｐ−アセチルフェニルアラニンである。幾つかの実施形態において、ｐ−アセチルフェニルアラニンは、配列番号２の位置３５に対応する位置において置換される。
【０１０７】
従って、幾つかの実施形態において、本発明は、オキシム結合である共有結合によって、少なくとも１つの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。ある種の実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧであり、ＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。これらの実施形態においては、直鎖ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された直鎖ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの分子量を有する。ある種の実施形態において、水溶性ポリマーは、分岐ＰＥＧであるＰＥＧである。これらの実施形態においては、分岐ＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された分岐ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。
【０１０８】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＧＨ、例えばｈＧＨが、天然においてコードされていないアミノ酸を含有し、ここに、ＧＨが、共有結合によって、少なくとも１つの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結されており、及び共有結合が、天然においてコードされていないアミノ酸と水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの間のオキシム結合である、ＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる。ある種の実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧであり、ＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。これらの実施形態において、直鎖ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された直鎖ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは分岐ＰＥＧである。これらの実施形態においては、分岐ＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された分岐ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。
【０１０９】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＧＨ、例えばｈＧＨが、天然においてコードされていないカルボニル含有アミノ酸である天然においてコードされていないアミノ酸を含有し、ここに、ＧＨが、共有結合によって、少なくとも１つの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結されており、及び共有結合が、天然においてコードされていないカルボニル含有アミノ酸と水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの間のオキシム結合である、ＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。幾つかの実施形態において、天然にコードされないカルボニル含有アミノ酸は、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。これらの実施形態においては、直鎖ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された直鎖ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは分岐ＰＥＧである。これらの実施形態においては、分岐ＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された分岐ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。
【０１１０】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＧＨ、例えばｈＧＨが、ケトン基を含む天然においてコードされていないアミノ酸を含有し、ここに、ＧＨが、共有結合によって、少なくとも１つの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結されており、及び共有結合が、ケトン基を含有する天然においてコードされていないアミノ酸と水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの間のオキシム結合である、ＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。幾つかの実施形態において、ケトン基を含有する天然においてコードされていないアミノ酸は、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。これらの実施形態においては、直鎖ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された直鎖ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは分岐ＰＥＧである。これらの実施形態において、分岐ＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された分岐ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。
【０１１１】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＧＨが、共有結合によって、少なくとも１つの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結されており、及び共有結合が、ｐ−アセチルフェニルアラニンと水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの間のオキシム結合である、ｐ−アセチルフェニルアラニンである天然においてコードされていないアミノ酸を含有するＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。幾つかの実施形態において、ｐ−アセチルフェニルアラニンは、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは直鎖ＰＥＧである。これらの実施形態においては、直鎖ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された直鎖ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約３０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマーがＰＥＧである、ある種の実施形態において、ＰＥＧは分岐ＰＥＧである。これらの実施形態においては、分岐ＰＥＧは、約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する。ＧＨ、例えばｈＧＨへのオキシム結合によって連結された分岐ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。
【０１１２】
ある種の実施形態において、本発明は、配列番号２を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２の位置３５に対応する位置において、約３０ｋＤａの分子量の直鎖ＰＥＧへのオキシム結合によって連結されたｐ−アセチルフェニルアラニンで置換されているＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。
【０１１３】
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば、直鎖ＰＥＧへのオキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えば、ｈＧＨを含むホルモン組成物であり、ＧＨ、例えば、ｈＧＨが、配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に対応する位置を含む（これらに限定されない。）１つ又はそれ以上の位置において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有する、前記ホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に対応する位置を含む（これらに限定されない）１つ又はそれ以上の位置において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、３５、９２、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に対応する位置を含む（これらに限定されない）１つ又はそれ以上の位置において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる位置３５、９２、１３１、１３４、１４３、１４５若しくはこれらのあらゆる組み合わせに対応する位置（これらに限定されない。）を含む１つもしくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる３０、３５、７４、９２、１０３、１４５若しくはこれらのあらゆる組み合わせなど（これらに限定されない。）に対応する１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる３５、９２、１４３、１４５若しくはこれらのあらゆる組み合わせに対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる位置３５など（これらに限定されない。）に対応する１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換された少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。ＰＥＧが直鎖ＰＥＧである実施形態において、ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有することが可能である。
【０１１４】
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば、直鎖ＰＥＧへオキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えば、ｈＧＨを含むホルモン組成物であり、ＧＨ、例えば、ｈＧＨが、配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に対応する位置を含む（これらに限定されない。）１つ又はそれ以上の位置において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有する、前記ホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ又はそれ以上の位置において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、３５、９２、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に対応する位置などの（これらに限定されない）１つ又はそれ以上の位置において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる３５、９２、１３１、１３４、１４３、１４５若しくはこれらのあらゆる組み合わせに対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる３０、３５、７４、９２、１０３、１４５若しくはこれらのあらゆる組み合わせに対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる３５、９２、１４３、１４５若しくはこれらのあらゆる組み合わせに対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ、例えば直鎖ＰＥＧへ、オキシム結合を介して連結されたＧＨ、例えばｈＧＨを含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧＨ、例えばｈＧＨが、配列番号２から得られる位置３５に対応する位置などの（これらに限定されない。）１つ若しくはそれ以上の位置又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸において置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するホルモン組成物を提供する。ＰＥＧが直鎖ＰＥＧである実施形態において、ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有することが可能である。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＧＨ，例えばｈＧＨが、少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸を含有し、ここに、ＧＨが、共有結合によって、複数の水溶性ポリマー、例えば複数のＰＥＧに連結されており、共有結合の１つ又はそれ以上が、天然においてコードされていないアミノ酸の少なくとも１つと水溶性ポリマー、例えばＰＥＧとの間のオキシム結合である、ＧＨ、例えばｈＧＨを提供する。ＧＨ、例えば、ｈＧＨは、約２〜１００個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約２〜５０個の水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ、又は約２〜２５個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約２〜１０個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約２〜５個の水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ、又は約５〜１００個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約５〜５０個の水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ、又は約５〜２５個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約５〜１０個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約１０〜１００個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約１０〜５０個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約１０〜２０個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約２０〜１００個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約２０〜５０個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、又は約５０〜１００個の水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結され得る。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸は、本明細書に記載されている任意の位置において、ＧＨ、例えば、ｈＧＨ中に取り込まれ得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの天然においてコードされていないアミノ酸は、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれる。幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸は、天然にコードされないカルボニル含有アミノ酸、例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニンなどの天然にコードされないケトン含有アミノ酸である天然にコードされない少なくとも１つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えば、ｈＧＨは、ｐ−アセチルフェニルアラニンを含む。幾つかの実施形態において、ｐ−アセチルフェニルアラニンは、配列番号２の位置３５に対応する位置において、ＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込まれ、ここに、ｐ−アセチルフェニルアラニンは、オキシム結合によって、ポリマーの１つ、例えば、ＰＥＧの１つに連結される。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの少なくとも１つは、天然においてコードされていないアミノ酸の少なくとも１つへの共有結合によって、ＧＨ、例えばｈＧＨへ連結される。幾つかの実施形態において、共有結合はオキシム結合である。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの複数は、天然においてコードされていないアミノ酸の複数への共有結合によって、ＧＨ、例えばｈＧＨへ連結される。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの共有結合は、オキシム結合である。幾つかの実施形態において、共有結合の複数がオキシム結合である。幾つかの実施形態において、結合の実質的に全部がオキシム結合である。水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの複数は、直鎖、分岐又はこれらのあらゆる組み合わせであり得る。１つ又はそれ以上の直鎖ＰＥＧを取り込む実施形態において、直鎖ＰＥＧは、約０．１ないし約１００ｋＤａ又は約１ないし約６０ｋＤａ又は約２０ないし約４０ｋＤａ又は約３０ｋＤａの分子量を有する。１つ又はそれ以上の分岐ＰＥＧを取り込む実施形態において、分岐ＰＥＧは約１ないし約１００ｋＤａ又は約３０ないし約５０ｋＤａ又は約４０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの複数を使用する実施形態は、一般に、単一のＰＥＧが使用される実施形態より少ない分子量のこのようなポリマーを使用することが理解される。従って、幾つかの実施形態において、ＰＥＧの複数の総分子量は、約０．１−５００ｋＤａ又は約０．１−２００ｋＤａ又は約０．１−１００ｋＤａ又は約１−１０００ｋＤａ又は約１−５００ｋＤａ又は約１−２００ｋＤａ又は約１−１００ｋＤａ又は約１０−１０００ｋＤａ又は約１０−５００ｋＤａ又は約１０−２００ｋＤａ又は約１０−１００ｋＤａ又は約１０−５０ｋＤａ又は約２０−１０００ｋＤａ又は約２０−５００ｋＤａ又は約２０−２００ｋＤａ又は約２０−１００ｋＤａ又は約２０−８０ｋＤａ、約２０−６０ｋＤａ、約５−１０ＯｋＤａ、約５−５０ｋＤａ又は約５−２０ｋＤａである。
【０１１６】
ヒトＧＨアンタゴニストには、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３及び１２７に置換若しくは位置１に（すなわち、Ｎ末端に）付加又はこれらのあらゆる組み合わせ（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他の任意のＧＨ配列中の対応するアミノ酸）を有するものが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１７】
天然にコードされない多様なアミノ酸が、ｈＧＨポリペプチド中の所定の位置に対して置換され、又はｈＧＨポリペプチド中の所定の位置に取り込まれることが可能である。一般に、具体的な天然においてコードされていないアミノ酸は、その受容体を伴うｈＧＨポリペプチドの三次元結晶構造の調査、保存的置換に対する選好性（すなわち、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ又はＴｒｐを置換するｐ−アセチルフェニルアラニン又はＯ−プロパルギルチロシンなど、アリールをベースとした天然においてコードされていないアミノ酸）及びｈＧＨポリペプチド中への導入を希望する特異的な抱合化学（例えば、アルキン部分を有する水溶性ポリマーを用いたＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加、又はアリールエステルを有し、続いて、ホスフィン部分を取り込む水溶性ポリマーを用いたアミド結合形成を実施することを望む場合には、４−アジドフェニルアラニンの導入）に基づいて、取り込みのために選択される。
【０１１８】
ある実施形態において、本発明はさらに、タンパク質中に非天然アミノ酸を取り込むこと（この非天然アミノ酸は、第一の反応基を含む。）；及び第二の反応性基を含む分子（以下に限定されないが、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質又はポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害的リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、インターカレート基、発色団、エネルギー転移剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、ニュートロン捕捉剤又は上記のあらゆる組み合わせ又は他のあらゆる望ましい化合物若しくは物質を含む。）と、タンパク質を接触させること、を含む。
【０１１９】
ある場合において、天然においてコードされていないアミノ酸置換は、ｈＧＨポリペプチド内の他の付加、置換又は欠失と組み合わされて、ｈＧＨポリペプチドの他の生物学的特性に影響を与える。ある場合において、他の付加、置換又は欠失により、ｈＧＨポリペプチドの安定性（以下に限定されないが、タンパク質分解性の分解に対する抵抗性など）が向上するか、又はｈＧＨポリペプチド受容体に対するｈＧＨポリペプチドの親和性が向上し得る。ある場合において、他の、付加、置換又は欠失により、ｈＧＨポリペプチドの溶解性（以下に限定されないが、Ｅ．コリ又はその他の宿主細胞で発現させた場合など）が向上し得る。幾つかの実施形態において、付加、置換又は欠失により、Ｅ．コリ又はその他の組み換え宿主細胞での発現後、ポリペプチド溶解性が向上し得る。幾つかの実施形態において、Ｅ．コリ又はその他の組み換え宿主細胞での発現後、ポリペプチド溶解性を増加させる非天然アミノ酸取り込みのための別の部位に加えて、天然コードアミノ酸又は非天然アミノ酸での置換のための部位を選択する。幾つかの実施形態において、ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨポリペプチド受容体に対する親和性を調節する、受容体二量体化を調節する（増加又は減少が含まれるが、これらに限定されない。）、受容体二量体を安定化する、循環半減期を調節する、放出もしくは生物利用可能性を調節する、精製を促進するか、又は特定の投与経路を改善するかもしくは変更する、別の付加、置換又は欠失を含む。このような多数の改変は、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｉｅｒ  Ｕｓｅｓ」と題された米国特許出願１１／０４６，４３２号（参照により、その全体が本明細書中に組み込まれている。）に記載されている。同様に、ｈＧＨポリペプチドは、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ又はポリ−Ｈｉｓなど）又はその他の親和性ベースの配列（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなど）又は、検出（以下に限定されないが、ＧＦＰなど）、精製若しくはポリペプチドのその他の形質を改善する連結された分子（ビオチンが含まれるが、これに限定されない。）を含み得る。
【０１２０】
幾つかの実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸の置換は、ＧＨ、例えばｈＧＨアンタゴニストを生成する。１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための典型的な部位のサブセットには、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、１２７又は位置１の前への付加（配列番号２又は配列番号１、３若しくは他のあらゆるＧＨ配列中の対応するアミノ酸）が含まれる。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨアンタゴニストは、ＧＨをアンタゴニストとして作用させる、領域１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａヘリックス）、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）中に少なくとも１つの置換を含む。他の実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みの典型的部位には、ヘリックスＡのアミノ末端領域及びヘリックスＣの一部内の残基が含まれる。別の実施形態において、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン又はＯ−プロパルギル−Ｌ−チロシンなどの天然においてコードされていないアミノ酸との、Ｇ１２０の置換。他の実施形態において、上掲の置換は、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを、ＧＨ、例えばｈＧＨアンタゴニストにする他の置換と組み合わされる。例えば、天然においてコードされていないアミノ酸は、本明細書中に同定された位置の１つにおいて置換され、同時の置換がＧ１２０に導入される（例えば、Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｗ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ又はＧ１２０Ｅ）。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨアンタゴニストは、ＧＨ、例えばｈＧＨ分子の受容体結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された天然においてコードされていないアミノ酸を含む。
【０１２１】
幾つかの事例において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸が、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸で置換される。幾つかの事例において、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸を、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の置換をさらに含む。例えば、幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨの以下の領域中に存在する１つ又はそれ以上の残基は、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸：１−５（Ｎ末端）；３２−４６（Ａ−ＢループのＮ末端）、９７−１０５（Ｂ−Ｃループ）；及び１３２−１４９（Ｃ−Ｄループ）及び１８４−１９１（Ｃ末端）で置換される。幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えば、ｈＧＨの以下の領域：１−５（Ｎ末端、６−３３（Ａヘリックス、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）中の１つ又はそれ以上の残基は、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸で置換される。幾つかの事例において、１つ又はそれ以上の天然にコードされない残基は、１つ又はそれ以上のより低分子量の直鎖又は分岐ＰＥＧ（約５〜２０ｋＤａ又はこれ未満の質量）に連結されることにより、より高分子量の単一のＰＥＧに付着された種に比べて、結合親和性及びそれと同等の血清半減期を増大させる。
【０１２２】
幾つかの実施形態において、ＧＨ、例えばｈＧＨの以下の残基の最大２つが、位置：２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６及び１８７において、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸で置換される。幾つかの事例において、置換の以下の対：Ｋ３８Ｘ＊及びＫ１４０Ｘ＊；Ｋ４１Ｘ＊及びＫ１４５Ｘ＊；Ｙ３５Ｘ＊及びＥ８８Ｘ＊；Ｙ３５Ｘ＊及びＦ９２Ｘ＊；Ｙ３５Ｘ＊及びＹ１４３Ｘ＊；Ｆ９２Ｘ＊及びＹ１４３Ｘ＊（Ｘ＊は、天然においてコードされていないアミノ酸を表す。）の何れかの置換が為される。２つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための好ましい部位には、以下の残基：２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６及び１８７の組み合わせが含まれる。２つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸の取り込みのための特に好ましい部位には、以下の残基：３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５及び１５５の組み合わせが含まれる。
【０１２３】
２つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸のＧＨ、例えばｈＧＨ中に取り込むための好ましい部位には、以下の残基：配列番号２から得られる位置１（すなわち、Ｎ末端）の前、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）又はこれらのあらゆる組み合わせが含まれる。
【０１２４】
Ｖ．非真核生物及び真核生物における発現
クローニングしたｈＧＨポリヌクレオチドの高レベル発現を得るために、通例、転写、転写／翻訳ターミネーターを支配するための強力なプロモーターを含有し、タンパク質をコードする核酸に対する場合は、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクター中に、本発明のｈＧＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは、当業者に公知であり、例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００１）」及び「Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）」に記載されている。
【０１２５】
本発明のｈＧＨポリペプチドを発現させるための細菌発現系は、以下に限定されないが、Ｅ．コリ、バチルス種、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）及びサルモネラなどにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３０２：５４３−５４５（１９８３））。このような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核発現系は当業者に公知であり、これも市販されている。オルソゴナルｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用して本発明のｈＧＨポリペプチドを発現させる場合、オルソゴナル成分を宿主細胞が使用する能力に基づいて発現用の宿主細胞を選択する。代表的な宿主細胞としては、グラム陽性細菌（以下に限定されないが、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）など）及びグラム陰性細菌（Ｅ．コリ、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）など）、ならびに酵母及び他の真核細胞が挙げられる。本明細書中に記載されているとおりに、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを含む細胞を使用することができる。
【０１２６】
本発明の真核宿主細胞又は非真核宿主細胞により、大量の有用な量で非天然アミノ酸を含むタンパク質を合成することができるようになる。ある態様において、前記組成物は、場合によっては、以下に限定されないが、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム若しくはそれ以上含むか、又はインビボタンパク質産生方法により達成され得る量を含む（組み換えタンパク質産生及び精製に対する詳細は本明細書中に記載されている。）。別の態様において、このタンパク質は、場合によっては、以下に限定されないが、細胞可溶化液、緩衝液、医薬緩衝液又はその他の懸濁液などの中で（以下に限定されないが、約１ｎＬから約１００Ｌ又はそれ以上などの何れかの体積で）、以下に限定されないが、１Ｌあたり少なくともタンパク質１０マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質５０マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質７５マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク１００マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質２００マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質２５０マイクログラム、１Ｌあたり少なくともタンパク質５００マイクログラム、１Ｌあたり少なくとも１ミリグラム又は１Ｌあたり少なくともタンパク質１０ミリグラム又はそれ以上の濃度で、組成物中に存在する。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む真核細胞でのタンパク質の大量産生（以下に限定されないが、他の方法（以下に限定されないが、インビトロ翻訳など）で通常可能なものを超える量など）は、本発明の特徴である。
【０１２７】
本発明の真核宿主細胞又は非真核宿主細胞により、大量の有用な量で非天然アミノ酸を含むタンパク質を生合成することができるようになる。例えば、細胞抽出液、細胞可溶化液、培養液、緩衝液などの中で、以下に限定されないが、少なくとも、タンパク質１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル又は少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットル又はそれ以上などの濃度で、非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生させることができる。
【０１２８】
ｈＧＨポリペプチドの宿主細胞からの発現系、ベクター、宿主細胞、培養条件及び培地並びに単離は、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ」と題された米国特許出願第１１／０４６，４３２号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）中にもさらに詳述されている。
【０１２９】
Ｖ．一般的な精製方法
本発明のｈＧＨポリペプチドは、通常、組換え系での発現後に精製される。本分野で公知の様々な方法により、宿主細胞からｈＧＨポリペプチドを精製し得る。細菌宿主細胞中で産生されたｈＧＨポリペプチドは、溶解性が低いか、又は不溶性であり得る（封入体形態において）。本明細書中に開示されている方法及び当業者にとって公知の方法を利用して、組み換え産生されたタンパク質の溶解性を高める目的で選択されたｈＧＨポリペプチドにおいて、アミノ酸置換は容易に行い得る。不溶性タンパク質の場合、遠心分離により宿主細胞細胞溶解液からタンパク質を回収し得、さらに続いて、細胞のホモジェナイズを行い得る。溶解性の乏しいタンパク質の場合、化合物（以下に限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。）を添加して、ある程度可溶性のタンパク質の沈殿を誘導し得る。次に、沈殿したタンパク質を従来どおり遠心分離により回収し得る。当業者にとって公知である様々な方法を用いて、組換え宿主細胞を破壊又はホモジェナイズして細胞内から封入体を放出させ得る。以下に限定されないが、酵素的細胞破壊、超音波破砕、ダウンス型ホモジェナイズ又は高圧放出破壊法などの当業者に公知の技術を用いて、宿主細胞破壊又はホモジェナイズを行い得る。本発明の方法のある実施形態において、高圧放出技術を使用して、Ｅ．コリ宿主細胞を破壊し、ｈＧＨポリペプチドの封入体を放出させ得る。ｈＧＨポリペプチドの封入体を扱う場合、可溶化、機械的せん断又はタンパク質分解などの要素による喪失なく封入体の回収率を最大にするために、繰り返しでのホモジェナイズ時間を最短にすることが有利である。
【０１３０】
次に、当技術分野で公知の多くの適切な可溶化剤の何れかを用いて、不溶性のｈＧＨポリペプチド又は沈殿したｈＧＨポリペプチドを可溶化し得る。尿素又は塩酸グアニジンを用いてｈＧＨポリペプチドを可溶化し得る。都合よく操作できるバッチサイズを用いて大量に産生できるように、可溶化されたｈＧＨポリペプチドの体積は最少に抑えるべきである。数千リットルもの体積であるバッチにおいて組み換え宿主を増殖させ得る大規模な工業的設定において、この要素は重要であり得る。さらに、大規模な工業的設定でｈＧＨポリペプチドを製造する場合、特にヒトの医薬品の用途の場合、機械類もしくは容器類又はタンパク質産物そのものに損傷を与え得る強い化学物質の回避は、可能であれば避けるべきである。本発明の方法においては、より強い変性剤である塩酸グアニジンの代わりに、より穏やかな変性剤である尿素を使用してｈＧＨポリペプチド封入体を可溶化できることが示されている。尿素を使用することにより、ｈＧＨポリペプチド封入体を効率的に可溶化しながら、ｈＧＨポリペプチドの製造及び精製過程で利用するステンレス鋼の設備に損傷を与えるリスクが顕著に低下する。
【０１３１】
可溶性ｈＧＨタンパク質の場合には、ペリプラスム間隙又は培地中にｈＧＨを分泌させ得る。さらに、宿主細胞の細胞質に可溶性ｈＧＨが存在し得る。精製段階を行う前に、可溶性ｈＧＨを濃縮することが望ましいものであり得る。当業者に公知の標準的技術を用いて、例えば、細胞可溶化液又は培地から、可溶性ｈＧＨを濃縮し得る。さらに、当業者にとって公知の標準的技術を用いて、宿主細胞を破壊し、宿主細胞の細胞質又はペリプラスム間隙から可溶性ｈＧＨを放出させ得る。
【０１３２】
融合タンパク質としてｈＧＨポリペプチドが産生される場合には、融合配列は除去され得る。酵素的又は化学的切断によって、融合配列の除去を行い得る。当業者にとって公知の方法を用いて、融合配列の酵素的除去を行い得る。融合配列を除去するための酵素の選択は、融合物が何であるかによって決まり、当業者にとって当然のことながら、反応条件は選択した酵素によって特定される。化学的切断は、臭化シアン、ＴＥＶプロテアーゼ及びその他の試薬など（これらに限定されない。）、当業者に公知の試薬を用いて行い得る。切断されたｈＧＨポリペプチドは、切断された融合配列から、当業者に公知の方法により精製され得る。当業者にとって当然のことながら、融合配列及びｈＧＨポリペプチドが何であるか及びそれらの特性により、このような方法が決定される。精製方法には、以下に限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーもしくは透析又はそれらの何らかの組合せが含まれ得る。
【０１３３】
タンパク質溶液からＤＮＡを除去するために、ｈＧＨポリペプチドも精製され得る。沈殿又はイオン交換クロマトグラフィーなど、何らかの適切な当技術分野で公知の方法により、ＤＮＡを除去し得るが、以下に限定されないが硫酸プロタミンなどの、核酸沈殿剤を用いた沈殿により除去され得る。以下に限定されないが遠心分離又はろ過などの、標準的な周知の方法を用いて、沈殿されたＤＮＡからｈＧＨポリペプチドを分離し得る。ヒトを治療するためにｈＧＨポリペプチドを使用すべき状況において、宿主核酸分子の除去は重要な要素であり、本発明の方法により、宿主細胞ＤＮＡが医薬として許容されるレベルに低下する。
【０１３４】
小規模又は大規模発酵の方法はまた、以下に限定されないが、発酵槽、振盪フラスコ、流動層バイオリアクター、中空ファイバーバイオリアクター、ローラーボトル培養系及び撹拌タンクバイオリアクター系など、タンパク質発現において使用することもできる。バッチ、半回分式又は連続様式過程において、これらの方法のそれぞれを行うことができる。
【０１３５】
本発明のヒトｈＧＨポリペプチドは、一般に、当技術分野で標準的な方法を用いて回収し得る。例えば、培地又は細胞可溶化液を遠心分離又はろ過して、細胞残屑を除去することができる。上清を所望の体積に濃縮もしくは希釈するか、又はさらなる精製のための調製に馴化するために適切な緩衝液中に透析ろ過することができる。本発明のｈＧＨポリペプチドのさらなる精製には、変形されていない形態からのｈＧＨポリペプチドの脱アミド化及び短縮型を分離することが含まれる。
【０１３６】
次の代表的な操作の何れかを本発明のｈＧＨポリペプチドの精製に用いることができる：アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー以下に限定されないが、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥなどを用いる。）；シリカにおけるクロマトグラフィー；高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（以下に限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５などを用いる。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／透析ろ過；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；電気泳動操作（以下に限定されないが、分取等電点電気泳動を含む。）、異なる溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（以下に限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿を含む。）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出。
【０１３７】
当業者にとって公知であり、当業者により使用されている標準的手段に従い、以下に限定されないが非天然アミノ酸を含むタンパク質、非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する抗体、非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する結合対などを含む、本発明のタンパク質を、部分的に又は実質的に均一になるように精製することができる。したがって、以下に限定されないが硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸もしくは塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法などを含む、当業者に公知の多くの方法の何れかにより、本発明のポリペプチドを回収及び精製することができる。正しくフォールディングされた成熟タンパク質の生成において、所望のとおりに、タンパク質リフォールディング段階を使用することができる。高純度が望まれる最終精製段階において、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又はその他の適切な方法を利用することができる。一実施形態において、以下に限定されないが、１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を含むタンパク質又の親和性を利用した精製のためなど、非天然アミノ酸（又は非天然アミノ酸を含むタンパク質）に対して作製された抗体を精製試薬として使用する。望みどおり、ある程度又は均一になるまで精製した後、以下に限定されないがアッセイ成分、治療剤、予防剤、診断薬、研究試薬及び／又は抗体産生のための免疫原などとして、ポリペプチドを多岐にわたる用途に場合によっては使用する。
【０１３８】
本明細書で示した他の参考文献に加えて、様々な精製／タンパク質フォールディング法が当業者に公知であり、これには、以下に限定されないが、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｎｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ、（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．第２版  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ、（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ、（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  第３版  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ及びＲｙｄｅｎ，（１９８８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９８８），ＣＤ−ＲＯＭのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；及び上記文献で引用されている参考文献が含まれる。
【０１３９】
真核宿主細胞又は非真核宿主細胞での、非天然アミノ酸を有する関心のあるタンパク質又はポリペプチドの産生の長所の１つは、通常、ネイティブの立体構造でタンパク質又はポリペプチドが折り畳まれていることである。しかし、本発明のある一定の実施形態において、合成、発現及び／又は精製後、タンパク質が、適切なポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有し得ることを当業者は認識する。本発明の一態様において、発現されたタンパク質を場合によっては変性させ、次いで再生する。以下に限定されないが、関心のあるタンパク質又はポリペプチドへのシャペロニンの添加によるもの、グアニジンＨＣｌなどのカオトロピック剤中でタンパク質を可溶化することによるもの、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを利用することなど、当技術分野で公知の方法を利用してこれを行う。
【０１４０】
一般に、発現されたポリペプチドを変性及び還元し、次いで好ましい立体構造にポリペプチドをリフォールディングすることが望ましい場合がある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ及び／又はシャペロニンを関心のある翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元、変性及び再生する方法は、当業者にとって公知である（上記の参考文献及び、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔｍａｎ及びＰａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１−５８５；及びＢｕｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−２７０を参照のこと。）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉらは、グアニジンＤＴＥ中での封入体タンパク質の変性及び還元を記載している。以下に限定されないが、酸化されたグルタチオン及びＬ−アルギニンなどを含有するレドックス緩衝液中でタンパク質をリフォールディングすることができる。リフォールディング剤を流動させるか、あるいは１もしくはそれ以上のポリペプチド又はその他の発現産物と接触させるように移動させるか、又はその逆を行うことができる。
【０１４１】
原核生物によるｈＧＨポリペプチドの産生の場合、このように産生されたｈＧＨポリペプチドをミスフォールディングさせて、生物活性を失わせるか又は低下させることができる。「リフォールディング」することにより、タンパク質の生物活性を復元し得る。一般に、例えば１又はそれ以上のカオトロピック剤（例えば尿素及び／又はグアニジン）及びジスルフィド結合を還元することができる還元剤（例えば、ジチオスレイトール、ＤＴＴ又は２−メルカプトエタノール、２−ＭＥ）を用いて、ポリペプチド鎖を可溶化し（ｈＧＨポリペプチドも不溶性である場合）、フォールディングを解き、還元することにより、ミスフォールドされたｈＧＨポリペプチドをリフォールディングする。カオトロープの中程度の濃度において、次いで酸化剤（例えば、酸素、シスチン又はシスタミン）を添加し、これにより、ジスルフィド結合を再形成させる。米国特許第４，５１１，５０２号、同第４，５１１，５０３号及び同第４，５１２，９２２号に記載の方法などの、当技術分野で公知の標準的方法を用いて、ｈＧＨポリペプチドをリフォールディングし得る。ｈＧＨポリペプチドは、他のタンパク質と共フォールディングしてヘテロ二量体又はヘテロ多量体を形成する。
【０１４２】
リフォールディング（もしくはコフォールディング）後、ｈＧＨポリペプチドをさらに精製し得る。ｈＧＨポリペプチドの精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高性能液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど又はこれらのあらゆる組み合わせを含む、当業者に公知の様々な技術を用いて達成され得る。さらなる精製は、精製されたタンパク質の乾燥又は沈殿の工程も含み得る。
【０１４３】
精製後、ｈＧＨは、限外ろ過、透析ろ過及び透析などの（これらに限定されない。）、当業者に公知の様々なあらゆる方法によって異なる緩衝液中に交換し、及び／又は濃縮し得る。単一の精製されたタンパク質として与えられるｈＧＨは、凝集及び沈殿に供し得る。
【０１４４】
精製されたｈＧＨは、逆相高性能液体クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ又はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された場合に）少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋、又は少なくとも９８％純粋、又は少なくとも９９％又はこれより純粋であり得る。ｈＧＨの複数の正確な数値に関わらず、ｈＧＨは、医薬品として使用するために、又はＰＥＧなどの水溶性ポリマーとの抱合など、さらなる加工のために十分に純粋である。
【０１４５】
ある種のｈＧＨ分子は、他の活性成分若しくはタンパク質（賦形剤、担体及び安定化剤、血清アルブミンなど以外）の不存在下で、治療剤として使用することができ、又は他のタンパク質若しくはポリマーと複合体を形成させ得る。
【０１４６】
ｈＧＨポリペプチドを含む、細胞可溶化液、抽出物、細胞培地、封入対、宿主細胞の細胞膜周辺腔、宿主細胞の細胞質若しくは他の物質に対して、又は何らかの単離段階（以下に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）、膨張層吸着又はこれらの何らかの組合せ及び／又は繰り返し（あらゆる適切な順番で）など）の結果生じるあらゆるｈＧＨポリペプチド混合物に対して、様々な単離段階のうち何れかを行い得る。
【０１４７】
本明細書中に記載の技術を行う際に使用する装置及びその他の必要な材料は市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、レコーダー及びシステム全体は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）及びＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手できる。以下に限定されないが、交換マトリックス材料、溶液及び緩衝液を含むクロマトグラフィーの材料もまた、このような会社から入手可能である。
【０１４８】
ポンプなどの特別に設計された装置を用いて、平衡化並びに洗浄及び溶出などの本明細書中に記載のカラムクロマトグラフィー過程におけるその他の段階をより迅速に行うことができる。市販のポンプとしては、以下に限定されないが、ＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）ポンプＰ−５０、Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  Ｐｕｍｐ  Ｐ−１、Ｐｕｍｐ  Ｐ−９０１及びＰｕｍｐ  Ｐ−９０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
【０１４９】
フラクションコレクターの例としては、ＲｅｄｉＦｒａｃフラクションコレクター、ＦＲＡＣ−１００及びＦＲＡＣ−２００フラクションコレクター及びＳＵＰＥＲＦＲＡＣ（Ｒ）フラクションコレクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。ミキサーはまた、ｐＨ及び直線的な濃度勾配を形成するために利用できる。市販されているミキサーとしては、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｉｘｅｒ  ＧＭ−１及びＩｎ−Ｌｉｎｅ  Ｍｉｘｅｒｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が挙げられる。
【０１５０】
何らかの市販のモニターを使用してクロマトグラフィー過程をモニタリングし得る。このようなモニターを使用して、ＵＶ、ｐＨ及び伝導度などの情報を収集し得る。検出器の例としては、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−１、ＵＶＩＣＯＲＤ（Ｒ）Ｓ  ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−Ｍ  ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＰＣ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ｐＨ／Ｃ９００及びＣｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。実際に、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から得られる様々なＡＫＴＡ（Ｒ）システムなど、全体的なシステムが市販されている。
【０１５１】
本発明の一実施形態において、まず、得られた精製ｈＧＨポリペプチドを尿素中で変性させた後、還元剤（ＤＴＴなど）を含有する適切なｐＨのＴＲＩＳ緩衝液中に希釈することによって、例えば、ｈＧＨポリペプチドを還元及び変性させ得る。別の実施形態において、ｈＧＨポリペプチドは、約２Ｍと約９Ｍの間の濃度範囲の尿素中で変性された後、約５．０ないし約８．０の範囲のｐＨのＴＲＩＳ緩衝液中に希釈される。本実施形態のリフォールディング混合物は、次いで、インキュベートし得る。一実施形態において、リフォールディング混合物は、４ないし２４時間の室温でインキュベートする。次いで、還元及び変性されたｈＧＨポリペプチド混合物は、さらに単離又は精製し得る。
【０１５２】
本明細書中で述べるように、何らかの以降の単離段階を行う前に、第一のｈＧＨポリペプチド混合液のｐＨを調整し得る。さらに、当技術分野で公知の技術を用いて、第一のｈＧＨポリペプチド混合物又は何らかのその後のそれらの混合物を濃縮し得る。さらに、当業者にとって公知である技術を用いて、第一のｈＧＨポリペプチド混合物又は何らかのその後のそれらの混合物を含む溶出緩衝液を、次の単離段階に適切な緩衝液に交換し得る。
【０１５３】
イオン交換クロマトグラフィー  イオン交換クロマトグラフィーを行い得る。全般的に、ＩＯＮ  ＥＸＣＨＡＮＧＥ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１１１４−２１、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を参照のこと。市販されているイオン交換カラムとしては、ＨＩＴＲＡＰ（Ｒ）、ＨＩＰＲＥＰ（Ｒ）及びＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。このようなカラムは、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ及びＱ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）ＸＬなどの強力な陰イオン交換体；ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ及びＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）ＸＬなどの強力な陽イオン交換体；ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの弱い陰イオン交換体；及びＣＭ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの弱い陽イオン交換体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を利用する。精製過程の何れかの段階でｈＧＨポリペプチドに対して陰イオン又は陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、実質的に精製されたｈＧＨポリペプチドを単離し得る。
【０１５４】
何らかの適切な陽イオン交換マトリクスを用いて、陽イオン交換クロマトグラフィー段階を行い得る。有用な陽イオン交換マトリクスとしては、以下に限定されないが、繊維状、多孔性、非多孔性、微小顆粒、ビーズ状又は架橋された陽イオン交換マトリクス材料が挙げられる。このような陽イオン交換マトリクス材料としては、以下に限定されないが、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリラート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル又は前出のものの何れかの複合物が挙げられる。
【０１５５】
陽イオン交換マトリクスは、強及び弱陽イオン交換体を含む、何らかの適切な陽イオン交換体であり得る。強い陽イオン交換体は、広範囲のｐＨにわたりイオン化したままであり、したがって、広範囲のｐＨにわたり、ｈＧＨを結合することが可能であり得る。しかし、弱い陽イオン交換体は、ｐＨの関数として、イオン化性を失い得る。例えば、弱い陽イオン交換体は、約ｐＨ４又はｐＨ５より下にｐＨが低下すると電荷を失い得る。適切な強い陽イオン交換体には、スルホプロピル（ＳＰ）、メチルスルホナート（Ｓ）又はスルホエチル（ＳＥ）などの帯電した官能基が含まれるが、これらに限定されるものではない。陽イオン交換マトリクスは、強い陽イオン交換体であり得、約２．５から約６．０のｈＧＨ結合ｐＨ範囲を有するものであり得る。あるいは、約２．５から約５．５のｈＧＨ結合ｐＨ範囲を有する強い陽イオン交換体であり得る。この陽イオン交換マトリクスは、約３．０のｈＧＨ結合ｐＨを有する強い陽イオン交換体であり得る。あるいは、この陽イオン交換マトリクスは、約６．０から約８．０のｈＧＨ結合ｐＨ範囲を好ましく有する強い陽イオン交換体であり得る。この陽イオン交換マトリクスは、約８．０から約１２．５のｈＧＨ結合ｐＨ範囲を有する強い陽イオン交換体であり得る。あるいは、強い陽イオン交換体は、約８．０から約１２．０のｈＧＨ結合ｐＨ範囲を有し得る。
【０１５６】
ｈＧＨを載せる前に、例えば、希釈弱酸の数カラム体積、例えば２０ｍＭ酢酸、ｐＨ３の４カラム体積を用いて、陽イオン交換マトリクスを平衡化し得る。平衡化した後、ｈＧＨを添加し得、実質的に精製されたｈＧＨを溶出する前に、また弱い酢酸などの弱酸溶液又はリン酸溶液を用いて、カラムを１回から数回洗浄し得る。例えば、２０ｍＭ酢酸、ｐＨ３のおよそ２から４カラム体積を使用して、カラムを洗浄し得る。例えば０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５又は、０．１Ｍ塩化ナトリウムと混合した０．０５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５の２から４カラム体積を使用して、さらなる洗浄を行うことができる。あるいは、当技術分野で公知の方法を用いて、希釈した弱塩基の数カラム体積を用いて、陽イオン交換マトリクスを平衡化し得る。
【０１５７】
あるいは、十分に低いｐＨ又はイオン強度を有する緩衝液と陽イオン交換マトリクスを接触させてマトリクスからｈＧＨを排除することにより、実質的に精製されたｈＧＨを溶出し得る。溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ６．０であり得る。より具体的には、溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．５、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．０の範囲であり得る。溶出緩衝液は、約３．０のｐＨを有し得る。さらに、溶出緩衝液の量は広く変動することができ、一般に、約２から約１０カラム体積の範囲である。さらに、当業者に公知の適切な緩衝液には、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭまでの濃度のシトラート、ホスファート、ホルマート、ＨＥＰＥＳ及びＭＥＳ緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
陽イオン交換マトリクスへのｈＧＨの吸着後、十分に高いｐＨ又はイオン強度を有する緩衝液とマトリクスを接触させてマトリクスからｈＧＨを排除することにより、実質的に精製されたｈＧＨを溶出し得る。溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ８．０から約ｐＨ１２．５までの範囲であり得る。より具体的には、溶出緩衝液は、約ｐＨ８．０から約ｐＨ１２．０の範囲を変動し得る。実質的に精製されたｈＧＨの高ｐＨ溶出での使用に適切な緩衝液としては、以下に限定されないが、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度範囲の、シトラート、ホスファート、ホルマート、アセタート、ＨＥＰＥＳ及びＭＥＳ緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。さらに、０．１Ｍホウ酸カリウム、０．６Ｍ塩化カリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．７を有する緩衝液を使用し得る。実質的に精製されたｈＧＨは、約５０ないし１００ｍＭビシン、約７５ｍＭビシン、２５ないし約１００ｍＭ塩化ナトリウム、約５０ｍＭ塩化ナトリウム及び約０．０５ないし約０．５ＥＤＴＡ、約０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５を含むビシン緩衝液などの標準的な緩衝液を用いても溶出し得る。
【０１５９】
逆相クロマトグラフィー  当業者にとって公知である適切なプロトコールに従い、ＲＰ−ＨＰＬＣを行って、タンパク質を精製し得る。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＮＡＬ  ＢＩＯＣＨＥＭ．（１９８２）１２４：２１７−２３０（１９８２）；Ｒｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８３）２６８：１１２−１１９；Ｋｕｎｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８６）３５９：３９１−４０２を参照のこと。ｈＧＨポリペプチドに対してＲＰ−ＨＰＬＣを行って、実質的に精製されたｈＧＨポリペプチドを単離し得る。この場合、以下に限定されないが、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ３０、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ２０又は少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ１８など、様々な長さのアルキル官能基によるシリカ誘導体化樹脂を使用し得る。あるいは、ポリマー性樹脂を使用し得る。例えば、ＴｏｓｏＨａａｓ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ１０００ｓｄ樹脂を使用し得る（これは、スチレンポリマー樹脂である。）。様々なアルキル鎖長を有するシアノ又はポリマー性樹脂も使用し得る。さらに、エタノールなどの溶媒を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを洗浄し得る。ＳｏｕｒｃｅＲＰカラムは、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムの別の例である。
【０１６０】
イオン対合剤及びメタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル又はエタノールなどの有機変性剤を含有する適切な溶出緩衝液を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムからｈＧＨポリペプチドを溶出し得る。最も一般的に使用されるイオン対合剤としては、以下に限定されないが、酢酸、ギ酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム及び酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられる。分離時間を短くし、ピーク幅を狭めるのに好ましい勾配条件を用い、１つ又はそれ以上の勾配もしくは定組成条件を用いて、溶出を行い得る。別の方法は、異なる溶媒濃度範囲の２種類の勾配を使用することを含む。本明細書中での使用に適切な溶出緩衝液の例には、以下に限定されないが、酢酸アンモニウム及びアセトニトリル溶液が含まれ得る。
【０１６１】
ｈＧＨは、例えば、アセトニトリル勾配を用いたＳＯＵＲＣＥ  ＲＰカラムを使用して単離又は精製され得る。
【０１６２】
疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術  ｈＧＨポリペプチドに対して疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を行い得る。全般的に、ＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ  ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２０−９０、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を参照のこと（参照により本明細書中に組み込む。）。適切なＨＩＣマトリクスとしては、以下に限定されないが、アガロース、架橋されたアガロース、セファロース、セルロース、シリカ、デキストラン、ポリスチレン、ポリ（メタクリラート）マトリクス及び混合された様式の樹脂（以下に限定されないが、ポリエチレンアミン樹脂又はブチルもしくはフェニル置換されたポリ（メタクリラート）マトリクスなど）を含む、アルキル又はアリール置換されたマトリクス、例えばブチル、ヘキシル、オクチル又はフェニル置換されたマトリクスなどが含まれ得る。疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーのための市販ソースとしては、以下に限定されないが、ＨＩＴＲＡＰ（Ｒ）、ＨＩＰＲＥＰ（Ｒ）及びＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）が挙げられる。
【０１６３】
簡単に述べると、酢酸／塩化ナトリウム溶液又は硫酸アンモニウム含有ＨＥＰＥＳなどの、当業者にとって公知の標準的緩衝液を用いて、試料添加前にＨＩＣカラムを平衡化し得る。ＨＩＣカラムに搭載するための緩衝液として、硫酸アンモニウムを使用し得る。ｈＧＨポリペプチドを添加した後、次に、望ましくない物質を除去するが、ＨＩＣカラム上にｈＧＨポリペプチドを保持するために、標準的緩衝液及び条件を用い、カラムを洗浄し得る。特に、ＥＤＴＡ及び平衡化緩衝液より低濃度の硫酸アンモニウムを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液又は酢酸／塩化ナトリウム緩衝液などの標準的緩衝液の約３から約１０カラム体積でｈＧＨポリペプチドを溶出し得る。例えばリン酸カリウム勾配を用いて、塩を直線的に低下させる勾配を使用して、ｈＧＨ分子を溶出することもできる。次に、例えば透析ろ過又は限外ろ過などのろ過により、溶出物を濃縮し得る。透析ろ過を利用して、ｈＧＨを溶出するために用いた塩を除去し得る。
【０１６４】
例えば、ゲルろ過（ＧＥＬ  ＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２２−１８、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（参照により本明細書中に組み込む。）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（以下に限定されないが、ＨＡ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ、Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＣＨＴ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（ＢｉｏＲａｄ）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴＰヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ）などの、適切なマトリクス）、ＨＰＬＣ、膨張層吸着、限外ろ過、透析ろ過、凍結乾燥などを用いて、第一のｈＧＨポリペプチド混合物又は何らかのその後のそれらの混合物に対して単離段階を行い、あらゆる過剰な塩を除去し、緩衝液を次の単離段階もしくは最終薬剤産物の処方にも適した緩衝液で置換することができる。
【０１６５】
当業者にとって公知の技術を用いて、本明細書中に記載されている各段階で、実質的に精製されたｈＧＨポリペプチドを含むｈＧＨポリペプチドの収率をモニタリングし得る。最後の単離段階後に、このような技術を用いて、実質的に精製されたｈＧＨポリペプチドの収率を評価することもできる。例えば、シアノＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ；ならびに陽イオン交換ＨＰＬＣ及びゲルろ過ＨＰＬＣなどの、様々なアルキル鎖長を有する幾つかの逆相高圧液体クロマトグラフィーカラムの何れかを用いて、ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの収率をモニタリングし得る。
【０１６６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの標準的技術を用いて、又はウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイを用いてｈＧＨポリペプチドを測定することにより、純度を決定し得る。例えば、陰性対照の酵母発酵及び陽イオン交換回収から単離したタンパク質に対してポリクローナル抗体を生成させ得る。この抗体を使用して、混入宿主細胞タンパク質の存在を調べることもできる。
【０１６７】
ＲＰ−ＨＰＬＣ物質、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４（Ｖｙｄａｃ）は、シリカゲル粒子、Ｃ４−アルキル鎖を有する表面からなる。タンパク質性不純物からのｈＧＨポリペプチドの分離は、疎水性相互作用の強度の相違に基づく。希釈されたトリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いて溶出を行う。ステンレス鋼カラムを用いて分取ＨＰＬＣを行う（Ｖｙｄａｃ  Ｃ４シリカゲル２．８から３．２Ｌで満たす。）。トリフルオロ酢酸を添加することにより、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ溶出液を酸性化し、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４カラムに添加する。洗浄及び溶出のために、希釈されたトリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いる。画分を回収し、すぐにリン酸緩衝液で中和する。ＩＰＣ限界内のｈＧＨポリペプチド画分をプールする。
【０１６８】
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）物質は、セファロースビーズの表面に共有結合されたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなる。ＤＥＡＥ基への選択したｈＧＨポリペプチドの結合は、イオン性相互作用によって媒介される。保持されることなく、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸がカラムを通過する。これらの物質を洗い流した後、低ｐＨの酢酸緩衝液でカラムを洗浄することにより、微量の不純物を除去する。次に、このカラムを中性リン酸緩衝液で洗浄し、イオン強度が上昇していく緩衝液を用いてｈＧＨポリペプチドを溶出する。カラムにＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ｆｌｏｗを充填する。３から１０ｍｇのｈＧＨポリペプチド／ｍｌゲルの範囲でｈＧＨポリペプチドを添加することができるようにするために、カラム体積を調整する。水及び平衡化緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）でカラムを洗浄する。ＨＰＬＣ溶出の画分をプールしたものを添加し、カラムを平衡化緩衝液で洗浄する。次に、カラムを洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）で洗浄し、続いて平衡化緩衝液で洗浄する。続いて、溶出緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）を用いてカラムからｈＧＨポリペプチドを溶出し、主たる溶出プロファイルに従い、単一の画分中に回収する。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの溶出液を指定の伝導度に調整する。得られた薬物物質をろ過滅菌してＴｅｆｌｏｎボトルに入れ、−７０℃で保管する。
【０１６９】
利用し得るさらなる方法としては、エンドトキシンを除去する段階が挙げられるが、これに限定されない。エンドトキシンは、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのグラム陰性宿主細胞の外膜に位置するリポ多糖類（ＬＰＳ）である。エンドトキシンレベルを低下させる方法は当業者にとって公知であり、これには、以下に限定されないが、シリカ支持体、ガラス粉末又はヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相、アフィニティー、サイズ排除、陰イオンクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、これらの方法の組合せなどが含まれる。一緒に移動したタンパク質などの夾雑物を目的のポリペプチドから除去するために、変法又はさらなる方法が必要であり得る。エンドトキシンのレベルを測定するための方法は当業者に公知であり、カブトガニアメーバ様細胞可溶化液（ＬＡＬ）アッセイが含まれるが、これに限定されない。
【０１７０】
以下に限定されないが、ブラッドフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、マススペクトロメトリー（以下に限定されないが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む。）及び当業者にとって公知の、タンパク質の特徴を調べるためのその他の方法など、多岐にわたる方法及び手段を使用して、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨタンパク質の収率及び純度を評価することができる。さらなる方法には、タンパク質染色法と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、等電点電気泳動、分析的陰イオン交換、クロマトフォーカシング及び円二色性が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７１】
単離及び精製のための本明細書に列記されているものを含む（これらに限定されない。）手順は、本発明のｈＧＨポリペプチドの安定性、ｈＧＨポリペプチドのＰＥＧ化された形態の安定性及びＰＥＧ化反応の進行を評価するための製剤研究においても使用し得る。
【０１７２】
ＶＩＩ．代替系での発現
非組み換え宿主細胞、突然変異誘発された宿主細胞又は細胞を使用しない系においてタンパク質に非天然アミノ酸を導入するために、いくつかの戦略が利用されてきた。これらの系はまた、天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの作製での使用にも適切である。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ及びＴｙｒなどの反応性側鎖によるアミノ酸の誘導体化により、リジンがＮ２−アセチル−リジンに変換された。化学合成によっても、非天然アミノ酸を取り込む直接的な方法が得られる。ペプチド断片の、酵素的ライゲーション及びネイティブ化学ライゲーションの最近の開発により、より大きなタンパク質を調製することが可能である。例えば、Ｐ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ及びＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６９：９２３（２０００）。化学的ペプチド連結及び固有化学的連結は、米国特許第６，１８４，３４４号、米国特許公開第２００４／０１３８４１２号、米国特許公開第２００３／０２０８０４６号、ＷＯ  ０２／０９８９０２号及びＷＯ  ０３／０４２２３５号に記載されており、これらは、参照により本明細書中に組み込まれる。１００を超える非天然アミノ酸を実質的にあらゆるサイズの様々なタンパク質へ部位特異的に取り込むために、所望の非天然アミノ酸により化学的にアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、タンパク質生合成を支持可能なインビトロ抽出物に添加するという一般的なインビトロ生合成法が使用されてきた。例えば、Ｖ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌ及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９５、３４：６２１（１９９５）；Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，ＳＪ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２−１８８（１９８９）；及びＪ．Ｄ．Ｂａｉｎ、ＣＧ．Ｇｌａｂｅ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｘ，Ａ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．Ｓ．Ｄｉａｌａ、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８０１３−８０１４（１９８９）を参照のこと。タンパク質安定性、タンパク質フォールディング、酵素機構及びシグナル伝達の研究のために、幅広い官能基がタンパク質に導入されてきた。
【０１７３】
野生型シンテターゼの乱雑性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）を利用するために、選択圧取り込みと呼ばれるインビボ法が開発された。例えば、Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ、Ｓ．Ａｌｅｆｅｌｄｅｒ、Ｗ．Ｗｅｎｇｅｒ、Ｆ．Ｍ．Ｄｏｎｇ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１３：４１（１９９９）を参照のこと。天然アミノ酸の限定濃度を含有する最小培地で、特定の天然アミノ酸を細胞に供給する関連代謝経路のスイッチがオフになっている栄養要求性株を増殖させ、同時に標的遺伝子の転写を抑制する。定常増殖期の開始時に、天然アミノ酸を枯渇させ、非天然アミノ酸類似体で置き換える。組み換えタンパク質の発現の誘発により、非天然類似体を含有するタンパク質の蓄積が起こる。例えば、この戦略を用いて、ｏ、ｍ及びｐ−フルオロフェニルアラニンをタンパク質に取り込み、容易に同定できる、ＵＶスペクトルの２つの特徴的な肩が示され（例えば、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ、Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８４：２９（２０００）を参照。）；トリフルオロメチオニンを使用して、バクテリオファージＴ４ライソザイムにおいてメチオニンを置換し、１９Ｆ  ＮＭＲによりチトオリゴ糖リガンドとのその相互作用が調べられ（例えば、Ｈ．Ｄｕｅｗｅｌ，Ｅ．Ｄａｕｂ，Ｖ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＪ．Ｆ．Ｈｏｎｅｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：３４０４（１９９７）；及びトリフルオロロイシンをロイシンの代わりに取り込み、その結果、ロイシンジッパ―タンパク質の温度及び化学安定性が高まった。例えば、Ｙ．Ｔａｎｇ、Ｇ．Ｇｈｉｒｌａｎｄａ、Ｗ．Ａ．Ｐｅｔｋａ、Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ、Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４０：１４９４（２００１）を参照のこと。さらに、セレノメチオニン及びテルロメチオニンを様々な組み換えタンパク質に取り込み、Ｘ線結晶解析での相の溶解を促進させる。例えば、Ｗ．Ａ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｊ．Ｒ．Ｈｏｒｔｏｎ及びＤ．Ｍ．Ｌｅｍａｓｔｅｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９：１６６５（１９９０）；Ｊ．Ｏ．Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．Ｌｅｗｉｎｓｋｉ、Ｍ．Ｋｕｎｋｅｌ、Ｊ．Ｄ．Ｏｄｏｍ、Ｂ．Ｄｕｎｌａｐ、Ｌ．Ｌｅｂｉｏｄａ及びＭ．Ｈａｔａｄａ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：２８３（１９９４）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｂ．Ｓｔｅｉｐｅ、Ｐ．Ｄｅｍａｎｇｅ、Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎ、Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３０：７８８（１９９５）；及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｗ．Ｋａｒｎｂｒｏｃｋ、Ｓ．Ｓｔｅｉｎｂａｃｈｅｒ、Ａ．Ｈｕｍｍ、Ｌ．Ｐｒａｄｅ、Ｔ．Ｎｅｕｅｆｅｉｎｄ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：６１６（１９９７）を参照のこと。アルケン又はアルキン官能基を有するメチオニン類似体もまた効率的に取り込まれ、これにより、化学的手段によるタンパク質のさらなる修飾が可能となった。例えば、Ｊ．Ｃ．ｖａｎ  Ｈｅｓｔ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４２８：６８（１９９８）；Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎ  Ｈｅｓｔ、Ｋ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１２８２（２０００）；及びＫ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５６：９４８７（２０００）；米国特許第６，５８６，２０７号；米国特許公開２００２／００４２０９７（参照により本明細書中に組み込む。）を参照のこと。
【０１７４】
この方法の成功は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによる非天然アミノ酸類似体の認識に依存し、一般に、これにはタンパク質翻訳の忠実度を確実にする高い選択性が必要である。本方法の範囲を広げるある方法は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を緩めることであり、これが遂行されたのは限られたケースである。例えば、エシェリヒア．コリのフェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）においてＡｌａ２９４をＧｌｙで置換することにより、基質結合ポケットが大きくなり、その結果、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡＰｈｅのアシル化が起こる。Ｍ．Ｉｂｂａ、Ｐ．Ｋａｓｔ及びＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：７１０７（１９９４）を参照のこと。この突然変異ＰｈｅＲＳを有するエシェリヒア・コリ株により、フェニルアラニンの代わりに、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン又はｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの取り込みが可能となる。例えば、Ｍ．Ｉｂｂａ及びＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．３６４：２７２（１９９５）；及びＮ．Ｓｈａｒｍａ、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ、Ｐ．Ｋａｓｔ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．，４６７：３７（２０００）を参照のこと。同様に、エシェリヒア．コリのチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位付近の点突然変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒにより、アザチロシンがチロシンよりも効率的に取り込まれることが分かった。Ｆ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ、Ｔ．Ｉｗａｍａ、Ｓ．Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ、Ｋ．Ｔａｋａｋｕ、Ｙ．Ｍｏｎｄｅｎ、Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ、Ｄ．Ｓｏｌｌ及びＳ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：４０３２４（２０００）を参照のこと。
【０１７５】
非天然アミノ酸をタンパク質にインビボで取り込むための別の戦略は、校正機構を有するシンテターゼを改変することである。これらのシンテターゼは識別することができず、したがって、同種の天然アミノ酸と構造的に類似のアミノ酸を活性化する。このエラーは別の部位で補正され、タンパク質翻訳の忠実度を維持するために、ｔＲＮＡからのミスチャージアミノ酸が脱アシル化される。シンテターゼの校正活性が機能しない場合、間違って活性化された構造類似体が編集機能を逃れ、取り込まれる。バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）により、このアプローチが近年明らかにされた。Ｖ．Ｄｏｒｉｎｇ、Ｈ．Ｄ．Ｍｏｏｔｚ、Ｌ．Ａ．Ｎａｎｇｌｅ、Ｔ．Ｌ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｖ．ｄｅ  Ｃｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ、Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ及びＰ．Ｍａｒｌｉｅｒｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：５０１（２００１）を参照のこと。ＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌをＣｙｓ、Ｔｈｒ又はアミノブチラート（Ａｂｕ）で間違ってアミノアシル化し得；続いて、編集ドメインによりこれらの非同種アミノ酸を加水分解する。エシェリヒア・コリ染色体のランダム突然変異誘発後、ＶａｌＲＳの編集部位に突然変異を有する突然変異エシェリヒア・コリ株を選択した。この編集機能欠損ＶａｌＲＳは、ＣｙｓによりｔＲＮＡＶａｌを不正確に処理する。Ａｂｕは立体的にＣｙｓに類似しているので（Ｃｙｓの−ＳＨ基はＡｂｕにおいて−ＣＨ３に置き換えられている。）、この突然変異エシェリヒア・コリ株をＡｂｕ存在下で増殖させた場合、突然変異ＶａｌＲＳもまたタンパク質にＡｂｕを取り込む。質量分析から、ネイティブタンパク質中の各バリン位置においてバリンの約２４％がＡｂｕにより置換されることが示される。
【０１７６】
固相合成及び半合成法によってもまた、新規アミノ酸を含有する多くのタンパク質の合成が可能となった。例えば、次のような、以下の刊行物及びそこで引用されている参考文献を参照のこと：Ｃｒｉｃｋ，Ｆ．Ｈ．Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．，Ｗａｔｔｓ−Ｔｏｂｉｎ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｒａｌ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ、１９２：１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂｏｈｎ，Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＸＶＩ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｙｒａｚｏｌｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｎ  Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．８８（２４）：５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ，２２：４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈｉｏｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ  ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６（５０５４）：２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１（３）：２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅａｎｓ？ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１（３）：１５１−１５７（１９８７）；及びＪａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．，Ｂｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．Ｑｕａｎ，Ｃ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．，Ｔｏｍ，Ｊ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．Ａ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｓｅ  ｆｏｒ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ  ｗｉｔｈ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６（５１８３）：２４３（１９９４）。
【０１７７】
インビトロでタンパク質に補因子、スピン標識及びオリゴヌクレオチドなどの様々な非天然側鎖を導入するために、化学修飾が使用されてきた。例えば、Ｃｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８（４８３２）：１４０１−１４０３（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｄ．Ｓ．，Ｒｏｋｉｔａ，Ｓ．Ｅ．Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，５４：５６５−５９５（１９８５）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｄ．Ｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６（４６７４）：５０５−５１１（１９８４）；Ｎｅｅｔ，Ｋ．Ｅ．，Ｎａｎｃｉ  Ａ，Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３（２４）：６３９２−６４０１（１９６８）；Ｐｏｌｇａｒ，Ｌ．ｅｔ  Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｄｅｒ  Ａ  ｎｅｗ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  ｆｏｒｍｅｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ．Ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ．Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，８８：３１５３−３１５４（１９６６）；及びＰｏｌｌａｃｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２（４８８１）：１０３８−１０４０（１９８８）を参照のこと。
【０１７８】
あるいは、いくつかの生物物理学的プローブをインビトロで合成されたタンパク質に取り込むために、化学的に修飾されたアミノアシル−ｔＲＮＡを用いる生合成法が使用されてきた。例えば、次の刊行物及びそこで引用されている参考文献を参照のこと：Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．Ｎｅｗ  Ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｉｏｃｈｅｍ，６２：４８３−５１４（１９９３）；及びＫｒｉｅｇ，Ｕ．Ｃ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｅ．Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｒｅｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５４−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３（２２）：８６０４−８６０８（１９８６）。
【０１７９】
以前、所望のアンバーナンセンス突然変異を含有する遺伝子を用いてプログラムされたタンパク質合成反応に化学的アミノアシル化サプレッサーｔＲＭＡを加えることにより、非天然アミノ酸がインビトロでタンパク質に部位特異的に取り込まれ得ることが示された。これらのアプローチを用いて、特定のアミノ酸に対して栄養要求性である株を使用し、多くの一般的な２０種類のアミノ酸を構造が近い相同体で、例えばフェニルアラニンに対してフルオロフェニルアラニンで、置換することができる。例えば、Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：４３９−４２（１９９５）；Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｄｉｘ，Ｔ．Ａ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ａ．Ｒ．，Ｄｉａｌａ、Ｅ．Ｓ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１１１：８０１３−８０１４（１９８９）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１３：４１−５１（１９９９）；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．，Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．，ｖｏｌ．２０２  ３０１−３３６（１９９２）；及びＭｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．２４、４３５−６２（１９９５）を参照のこと。
【０１８０】
例えば、停止コドンＵＡＧを認識するサプレッサーｔＲＮＡを調製し、非天然アミノ酸を用いて化学的にアミノアシル化した。従来の部位特異的突然変異誘発を使用して、タンパク質遺伝子の関心のある部位に停止コドンＴＡＧを導入した。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．５’−３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１６（３）：７９１−８０２（１９８８）を参照のこと。アシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ及び突然変異遺伝子をインビトロ転写／翻訳系において組合せた場合、指定の位置にそのアミノ酸を含有するタンパク質を与えるＵＡＧコドンに反応して非天然アミノ酸が取り込まれた。［３Ｈ］−Ｐｈｅを用いた実験及びα−ヒドロキシ酸を用いた実験から、所望するアミノ酸のみがＵＡＧコドンにより指定された位置に取り込まれること、及びこのアミノ酸がタンパク質中の他の何れの位置にも取り込まれないことが分かった。例えば、Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０（６）：４２５−４３２；及びＥｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５（５０４１）：１９７−２００（１９９２）を参照のこと。
【０１８１】
ｔＲＮＡは、化学的又は酵素的なアミノアシル化を含む（これらに限定されない。）あらゆる方法又は技術によって、所望のアミノ酸でアミノアシル化され得る。
【０１８２】
アミノアシル化は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによって、又はリボザイムを含む（これに限定されない。）他の酵素分子によって達成し得る。「リボザイム」という用語は、「触媒的ＲＮＡ」と互換的である。Ｃｅｃｈと共同研究者ら（Ｃｅｃｈ，  １９８７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３６：１５３２−１５３９；ＭｃＣｏｒｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２２１−２２６）は、触媒として作用することが可能な天然に存在するＲＮＡ（リボザイム）の存在を実証した。しかしながら、これらの天然ＲＮＡ触媒は、リボ核酸基質に対して、切断及びスプライシングのために作用することが示されているに過ぎず、リボザイムの人工的な進化の最近の発展により、様々な化学反応に対する触媒のレパートリーが拡大している。研究によって、それら自身の（２’）３’末端に対してアミノアシルＲＮＡ結合を触媒することが可能なＲＮＡ分子（Ｉｌｌａｎｇａｋｅｋａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：６４３−６４７）及びあるＲＮＡ分子から別のＲＮＡ分子へとアミノ酸を転移させることが可能なＲＮＡ分子（Ｌｏｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：４４２−４４４）が同定されている。
【０１８３】
米国特許出願公開２００３／０２２８５９３号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、リボザイムを構築する方法並びに天然にコードされるアミノ酸及び天然においてコードされていないアミノ酸を用いた、ｔＲＮＡのアミノアシル化におけるそれらの使用について記載している。ｔＲＮＡをアミノアシル化させることが可能な酵素的分子（リボザイムを含むが、これに限定されない。）の基質に固定された形態は、アミノアシル化された産物の効率的なアフィニティー精製を可能とし得る。適切な基質の例には、アガロース、セファロース及び磁気ビーズが含まれる。アミノアシル化用リボザイムの基質固定化された形態の作製及び使用は、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３，  １０：１０７７−１０８４」及び米国特許出願公開２００３／０２２８５９３号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【０１８４】
化学的なアミノアシル化の方法には、アミノアシル化におけるシンテターゼの使用を回避するために、Ｈｅｃｈｔと共同研究者ら（Ｈｅｃｈｔ，  Ｓ．  Ｍ．  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  １９９２，  ２５，  ５４５；Ｈｅｃｋｌｅｒ，  Ｔ．  Ｇ．；Ｒｏｅｓｓｅｒ，  Ｊ．  Ｒ．；Ｘｕ，  Ｃ；Ｃｈａｎｇ，  Ｐ．；Ｈｅｃｈｔ，  Ｓ．  Ｍ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８，  ２７，  ７２５４；Ｈｅｃｈｔ，  Ｓ．  Ｍ．；Ａｌｆｏｒｄ，  Ｂ．  Ｌ．；Ｋｕｒｏｄａ，  Ｙ．；Ｋｉｔａｎｏ，  Ｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９７８，  ２５３，  ４５１７）並びにＳｃｈｕｌｔｚ、Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びその他（Ｃｏｒｎｉｓｈ，  Ｖ．  Ｗ．；Ｍｅｎｄｅｌ，  Ｄ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．  Ｇ．  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  １９９５，  ３４，  ６２１；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｓ．  Ａ．；Ｅｌｌｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．  Ｇ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９１，  １１３，  ２７２２；Ｎｏｒｅｎ，  Ｃ．  Ｊ．；Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，  Ｓ．  Ｊ．；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，  Ｍ．  Ｃ；Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．  Ｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９，  ２４４，  １８２；Ｂａｉｎ，  Ｊ．  Ｄ．；Ｇｌａｂｅ，  Ｃ．  Ｇ．；Ｄｉｘ，  Ｔ．  Ａ．；Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，  Ａ．  Ｒ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９８９，  １１１，  ８０１３；Ｂａｉｎ，  Ｊ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９２，  ３５６，  ５３７；Ｇａｌｌｉｖａｎ，  Ｊ．  Ｐ．；Ｌｅｓｔｅｒ，  Ｈ．  Ａ．；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，  Ｄ．  Ａ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １９９７，  ４，  ７４０；Ｔｕｒｃａｔｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９６，  ２７１，  １９９９１；Ｎｏｗａｋ，  Ｍ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９５，  ２６８，  ４３９；Ｓａｋｓ，  Ｍ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．１９９６，  ２７１，  ２３１６９；Ｈｏｈｓａｋａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９９，  １２１，  ３４）（これらは、参照により、本明細書中に組み込まれる。）によって導入された方法が含まれるが、これらに限定されない。このような方法又は他の化学的アミノアシル化の方法は、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化するために使用し得る。
【０１８５】
触媒的ＲＮＡを生成するための方法は、ランダム化されたリボザイム配列の分離したプール生成すること、プールに対して誘導された進化を実施すること、所望のアミノアシル化活性についてプールをスクリーニングすること、及び所望のアミノアシル化活性を示すリボザイムの配列を選択すること、を含み得る。
【０１８６】
リボザイムは、ＧＧＵモチーフ及びＵが豊富な領域などの、アシル化活性を促進させるモチーフ及び／又は領域を含むことが可能である。例えば、Ｕが豊富な領域はアミノ酸基質の認識を促進させ得ること、及びＧＧＵモチーフはｔＲＮＡの３’末端と塩基対を形成し得ることが報告されている。共同して、ＧＧＵ及びモチーフ及びＵが豊富な領域は、アミノ酸とｔＲＮＡの両方の同時認識を同時に促進し、これにより、ｔＲＮＡの３’末端のアミノアシル化を促進する。
【０１８７】
リボザイムは、ｔＲＮＡＡｓｎＣＣＣＧが抱合された、部分的にランダム化されたｒ２４ｍｉｎｉを使用し、続いて、活性なクローン中に見出されるコンセンサス配列の体系的エンジニアリングを行うインビトロ選択によって生成することが可能である。本方法によって得られた典型的なリボザイムは、「Ｆｘ３リボザイム」と名付けられ、米国出願公開２００３／０２２８５９３号（その内容は、参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載されており、同族非天然アミノ酸が搭載された様々なアミノアシル−ｔＲＮＡの合成のための多目的触媒として作用する。
【０１８８】
基質上への固定は、アミノアシル化されたｔＲＮＡの効率的なアフィニティー精製を可能とするために使用し得る。適切な基質の例には、アガロース、セファロース及び磁気ビーズが含まれるが、これらに限定されない。対応するジアルデヒドを生じさせて樹脂上のＲＮＡの固定化を促進するために、ＲＮＡのリボース上の３’−シス−ジオールを過ヨウ素酸塩で酸化することが可能であるなど、ＲＮＡの化学的構造を活用することによって、樹脂の上にリボザイムを固定することが可能である。安価なヒドラジド樹脂など、樹脂の様々な種類を使用することが可能であり、還元的アミノ化が樹脂とリボザイム間の相互作用を不可逆的連結とする。アミノアシル−ｔＲＮＡの合成は、このオンカラムアミノアシル化技術によって著しく促進することが可能である。「Ｋｏｕｒｏｕｋｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００５；３６：２３９−４」は、カラムを基礎としたアミノアシル化システムを記載している。
【０１８９】
アミノアシル化されたｔＲＮＡの単離は、様々な様式で達成することが可能である。１つの適切な方法は、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えた酢酸ナトリウム溶液、５０ｍＭ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンーＮ’−（３−プロパンスルホン酸）、１２．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液又は単純にＥＤＴＡ緩衝化された水（ｐＨ７．０）などの緩衝液で、アミノアシル化されたｔＲＮＡをカラムから溶出することである。
【０１９０】
翻訳反応によって作製されるポリペプチド中の選択された位置に、ｔＲＮＡのアミノアシル化に用いたアミノ酸を取り込ませるために、翻訳反応にアミノアシル化されたｔＲＮＡを添加することが可能である。本発明のアミノアシル化されたｔＲＮＡが使用され得る翻訳系の例には、細胞可溶化液が含まれるが、これに限定されない。細胞可溶化液は、入力ｍＲＮＡからポリペプチドをインビトロ翻訳するために必要な反応成分を提供する。このような反応成分の例には、リボソームタンパク質、ｒＲＮＡ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始及び伸長因子及び翻訳と関連するさらなる因子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、翻訳系は、バッチ翻訳又は区画化された翻訳であり得る。バッチ翻訳系は単一コンパートメント中の反応成分を組み合わせるのに対して、区画化された翻訳系は翻訳効率を阻害することが可能な反応産物から翻訳反応成分を分離する。このような翻訳系は市販されている。
【０１９１】
さらに、連結された転写／翻訳系を使用し得る。連結された転写／翻訳系は、対応するｍＲＮＡへの入力ＤＮＡの両転写を可能とし、次いで、対応するｍＲＮＡは反応成分によって翻訳される。市販の連結された転写／翻訳の例は、Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ，  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．）である。系は、リボソーム及び翻訳因子などの翻訳成分を提供するために、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）可溶化液を含有する混合物を含む。さらに、翻訳において使用するためのｍＲＮＡテンプレートへと、入力ＤＮＡを転写するために、ＲＮＡポリメラーゼが含められる。ＲＴＳは、供給／廃棄コンパートメント及び転写／翻訳コンパートメントを含む反応コンパートメントの間に介在される膜によって反応成分のコンパートメント化を使用することが可能である。
【０１９２】
ｔＲＮＡのアミノアシル化は、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、触媒的抗体、多機能タンパク質などを含む（これらに限定されない。）他の因子によって実行し得る。
【０１９３】
「Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ．２００１  Ｏｃｔ；８（４）：７５９−６９」は、非天然アミノ酸を含有する合成ペプチドに、タンパク質を化学的に連結させる方法（発現されたタンパク質の連結）を記載している。
【０１９４】
非天然アミノ酸をタンパク質に取り込むために、マイクロインジェクション技術も使用されてきた。例えば、Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ，Ｐ．Ｃ．Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｒ．Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｓａｋｓ，Ｃ．Ｇ．Ｌａｂａｒｃａ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｗ．Ｇ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｔｈｏｒｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｎ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：４３９（１９９５）；及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６４５（２０００）を参照のこと。インビトロで作製された２種類のＲＮＡ種（関心のあるアミノ酸位置にＵＡＧ停止コドンを有する標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ及び所望の非天然アミノ酸でアミノアシル化されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）をアフリカツメガエル卵母細胞に同時に注入した。次に、卵母細胞の翻訳機構は、ＵＡＧにより指定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法により、膜内在性タンパク質のインビボ構造−機能研究が可能となった（これは、通常、インビトロ発現系に適さない。）。例としては、蛍光共鳴エネルギー転移により距離を測定するための蛍光アミノ酸のタキキニンニューロキニン−２受容体への取り込み（例えば、Ｇ．Ｔｕｒｃａｔｔｉ，Ｋ．Ｎｅｍｅｔｈ，Ｍ．Ｄ．Ｅｄｇｅｒｔｏｎ，Ｕ．Ｍｅｓｅｔｈ，Ｆ．Ｔａｌａｂｏｔ，Ｍ．Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｈ．Ｖｏｇｅｌ及びＡ．Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９９９１（１９９６）を参照。）；イオンチャネルにおいて表面に曝露された残基を同定するためのビオチン化アミノ酸の取り込み（例えば、Ｊ．Ｐ．Ｇａｌｌｉｖａｎ，Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：７３９（１９９７）を参照。）；イオンチャネルにおける立体構造変化をリアルタイムでモニタリングするためのケージ化されたチロシン類似体の使用（例えば、Ｊ．Ｃ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｎｅｕｒｏｎ、２０：６１９（１９９８）を参照；及びそれらのゲーティング機構を調べるためにイオンチャネル骨格を変化させるためのαヒドロキシアミノ酸の使用が挙げられる。例えば、Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ、９６：８９（１９９９）；及びＴ．Ｌｕ，Ａ．Ｙ．Ｔｉｎｇ，Ｊ．Ｍａｉｎｌａｎｄ，Ｌ．Ｙ．Ｊａｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ及びＪ．Ｙａｎｇ，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：２３９（２００１）を参照のこと。
【０１９５】
インビボでタンパク質に非天然アミノ酸を直接取り込むことができることから、突然変異タンパク質の収率が高くなること、技術が容易であること、細胞もしくは可能であれば生きている生物での突然変異タンパク質の研究の可能性、ならびに、治療処置でのこれらの突然変異タンパク質の使用などの（これらに限定されない。）様々な長所が得られる。様々な大きさ、酸性度、求核性、疎水性及びその他の特性を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含有させることができれば、タンパク質機能を調べ、かつ新規の特性を有する新しいタンパク質又は生物を作製するための、タンパク質構造に対する合理的かつ体系的な操作能が飛躍的に拡大し得る。
【０１９６】
部位特異的にパラ−Ｆ−Ｐｈｅを取り込むある試みにおいて、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性の、Ｐｈｅ栄養要求性エシェリヒア．コリ株で、酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼペアが使用された。例えば、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，７：４１９（１９９８）を参照のこと。
【０１９７】
無細胞（インビトロ）翻訳系を用いて本発明のｈＧＨポリヌクレオチドの発現を得ることも可能であり得る。翻訳系は、細胞又は無細胞であり得、及び原核生物又は真核生物であり得る。細胞翻訳系には、所望の核酸配列をｍＲＮＡへ転写し、ｍＲＮＡを翻訳することができる透過化された細胞又は細胞培養物などの完全な細胞調製物が含まれるが、これらに限定されるものではない。無細胞翻訳系は市販されており、多くの異なる種類及び系が周知である。無細胞系の例には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）可溶化液などの原核生物可溶化液並びに麦芽抽出物などの真核生物可溶化液、昆虫細胞可溶化液、ウサギ赤血球可溶化液、ウサギ卵母細胞及びヒト細胞可溶化液が含まれるが、これらに限定されない。得られるタンパク質が、グリコシル化され、リン酸化され、又はその他の修飾を受けている場合には、このような多くの修飾は真核生物系でのみ可能なので、真核生物抽出物又は可溶化液が好ましいことがあり得る。これらの抽出物及び可溶化液の幾つかは市販されている（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆ．；Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  １１１．；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  Ｎ．Ｙ．）。分泌タンパク質を翻訳するのに有用である、ミクロソーム膜を含有するイヌ膵臓抽出物などの膜抽出物も使用できる。これらの系では（テンプレートとしてのｍＲＮＡ（インビトロ翻訳）又はテンプレートとしてのＤＮＡ（組み合わされたインビトロ転写と翻訳）の何れかを含むことができる。）、インビトロ合成は、リボソームによって誘導される。無細胞タンパク質発現系の開発に対して多大な努力が行われてきた。例えば、Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７４：３０９−３１６（２００１）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１５３７−１５４２（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，１６，３８５−３９０（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６６，１８０−１８８（１９９９）；及びＰａｔｎａｉｋ，Ｒ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４，８６２−８６８（１９９８）；米国特許第６，３３７，１９１号；米国特許公開２００２／００８１６６０；ＷＯ００／５５３５３；ＷＯ９０／０５７８５（参照により本明細書中に組み込む。）を参照のこと。天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの発現に対して適用し得る別のアプローチとしては、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術が含まれる。例えば、Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＪ．Ｓｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９４：１２２９７−１２３０２（１９９７）；Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１０４３−１０５０（２００３）を参照のこと。この��プローチにおいて、ピューロマイシンに連結されているｍＲＮＡテンプレートがリボソーム上でペプチドに翻訳される。１つ又はそれ以上のｔＲＮＡ分子が改変されている場合、非天然アミノ酸もそのペプチドに取り込ませることができる。最後のｍＲＮＡコドンが読まれた後、ピューロマイシンがペプチドのＣ末端を捕獲する。生じたｍＲＮＡ−ペプチド抱合体が関心のある特性を有することがインビトロアッセイにおいて分かった場合、ｍＲＮＡ配列からそれが何であるかを容易に明らかにすることができる。このようにして、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのライブラリをスクリーニングして、所望の特性を有するポリペプチドを同定し得る。さらに最近、精製された成分を用いたインビトロリボソーム翻訳により、天然においてコードされていないアミノ酸で置換されたペプチドの合成が可能となることが報告された。例えば、Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：６３５３（２００３）を参照のこと。
【０１９８】
再構成された翻訳系も使用し得る。ｍＲＮＡをタンパク質へと首尾よく翻訳するために精製された翻訳因子の混合物も使用され、及び可溶化液の組み合わせ又は開始因子−１（ＩＦ−１）、ＩＦ−２、ＩＦ−３（α又はβ）、伸長因子Ｔ（ＥＦ−Ｔｕ）又は終結因子などの精製された翻訳因子が補充された可溶化液も使用されてきた。無細胞系は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９３）」に記載されているように（参照により、特に本明細書に具体的に組み込まれる。）、ＤＮＡが系に導入され、ｍＲＮＡへと転写され、ｍＲＮＡが翻訳される連結された転写／翻訳系でもあり得る。真核生物転写系中で転写されたＲＮＡは、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）又は５’末端ｃａｐｓ（７−メチルグアノシン）及び３’末端ポリＡ尾部化された成熟ｍＲＮＡの形態であり得、これは、ある種の翻訳系において有利であり得る。例えば、キャップされたｍＲＮＡは、赤血球可溶化液系中で、高い効率で翻訳される。
【０１９９】
ＶＩＩＩ．ｈＧＨポリペプチドに連結された巨大分子ポリマー
本明細書に記載されている組成物、方法、技術及び戦略を用いて、本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドに対する様々な修飾を為すことができる。これらの修飾には、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分へのさらなる官能基の取り込み（以下に限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害的リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、インターカレート基、発色団、エネルギー転移剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、ニュートロン捕捉剤又は上記のあらゆる組み合わせ又は他のあらゆる望ましい化合物若しくは物質が含まれる。）を含む。本明細書に記載されている、組成物、方法、技術及び戦略の例示的な非限定例として、本明細書に記載の組成物、方法、技術及び戦略がまた、他の官能基（以下に限定されないが上記で挙げたものなど）を添加するのに適用可能（必要に応じて適切な改変を行い、これは当業者が本明細書中開示を用いて行い得る。）であるという了解のもと、以下の記述は、非天然アミノ酸ポリペプチドに巨大分子ポリマーを添加することに焦点を当てる。
【０２００】
本発明のｈＧＨポリペプチドに多岐にわたる巨大分子ポリマー及びその他の分子を連結してｈＧＨポリペプチドの生物学的特性を調節する、及び／又はｈＧＨ分子に新しい生物学的特性を与えることができる。天然コードアミノ酸を介して、天然においてコードされていないアミノ酸を介して、又は天然もしくは非天然アミノ酸の何らかの官能置換基又は、天然もしくは非天然アミノ酸に付加されている何らかの置換基もしくは官能基を介して、これらの巨大分子ポリマーをｈＧＨポリペプチドに連結することができる。このポリマーの分子量は、広範囲にわたり、以下に限定されないが、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上などである。ポリマーの分子量は、１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。
【０２０１】
本発明は、ポリマー：タンパク質抱合体の実質的に均一な調製物を与える。「実質的に均一な」とは、本明細書中で使用する場合、ポリマー：タンパク質抱合体分子がタンパク質全体の半分よりも多いことが観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質抱合体は、生物活性を有し、本明細書中で提供される本発明の「実質的に均一な」ＰＥＧ化されたｈＧＨポリペプチド調製物は、均一な調製物の長所（例えば、ロットの異なるものの薬物動態の予測可能性において臨床適用が容易であるなど）を示すよう十分均一であるものである。
【０２０２】
ポリマー：タンパク質抱合体分子の混合物を調製することを選択することもでき、それにより与えられる長所とは、混合物に含めるためのモノポリマー：タンパク質抱合体の比を選択し得るということである。したがって、所望であれば、様々な数の結合されたポリマー部分を有する（即ち、ジ−、トリ−、テラ−など）様々なタンパク質の混合物を調製し、本発明の方法を用いて調製されたモノ−ポリマー：タンパク質抱合体と前記抱合体を組み合わせ、モノ−ポリマー：タンパク質抱合体の前もって決定された比率を有する混合物を有することができる。
【０２０３】
選択されたポリマーは、これに結合させるタンパク質が水性環境（生理的環境など）で沈殿しないように水溶性であり得る。このポリマーは、分枝又は非分枝であり得る。最終産物調製物の治療用途の場合、このポリマーは医薬として許容される。
【０２０４】
反応混合物中の濃度により、タンパク質分子に対するポリエチレングリコール分子の比率は変化する。一般に、最適な比率（過剰な非反応タンパク質又はポリマーが最小限となる反応効率の観点で）は、選択したポリエチレングリコールの分子量により、及び利用可能な反応基の数において決定され得る。分子量に関連して、典型的には、ポリマーの分子量が高いほど、タンパク質に結合させ得るポリマー分子の数は少なくなる。同様に、これらのパラメータを最適化する場合、ポリマーの分枝を考慮すべきである。一般に、分子量が高いほど（又は分枝が多いほど）、ポリマー：タンパク質の比率が高くなる。
【０２０５】
ポリマーの例には、ポリアルキルエーテル及びそのアルコキシキャップ化類縁体（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレン／プロピレングリコール、及びメトキシ又はエトキシキャップ化されたその類縁体、特にポリオキシエチレングリコール、後者は、ポリエチレングリコール又はＰＥＧとしても知られる。）；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキルエーテル；ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリン及びポリヒドロキシアルキルオキサゾリン；ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド及びポリヒドロキシアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド及びその誘導体）；ポリヒドロキシアルキルアクリラート；ポリシアル酸及びその類縁体；親水性ペプチド配列；デキストラン及びデキストラン誘導体、例えば、カルボキシメチルデキストラン、デキストランサルファート、アミノデキストランを含む多糖及びそれらの誘導体；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース；キチン及びその誘導体、例えば、キトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン；ヒアルロン酸及びその誘導体；デンプン；アルギナート；コンドロイチンサルファート；アルブミン；プルラン及びカルボキシメチルプルラン；ポリアミノ酸及びその誘導体、例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルタミド；スチレンマレイン酸無水物共重合体、ジビニルエチルエーテルマレイン酸無水物共重合体などのマレイン酸無水物共重合体；ポリビニルアルコール；その共重合体；そのターポリマー；その混合物及び先述されているものの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０６】
反応混合物中におけるそれらの濃度のように、タンパク質分子に対するポリエチレングリコール分子の比率は変化する。一般に、最適な比率（過剰な非反応タンパク質又はポリマーが最小限となる反応効率の観点で）は、選択したポリエチレングリコールの分子量により、及び利用可能な反応性基の数において決定され得る。分子量に関連して、典型的には、ポリマーの分子量が高いほど、タンパク質に結合させ得るポリマー分子の数は少なくなる。同様に、これらのパラメータを最適化する場合、ポリマーの分枝を考慮すべきである。一般に、分子量が高いほど（又は分枝が多いほど）、ポリマー：タンパク質の比率が高くなる。
【０２０７】
本明細書中で使用する場合、及びＰＥＧ：ｈＧＨポリペプチド抱合体を想定する場合、「治療的有効量」という用語は、患者に対して所望の有効性を与える量を指す。この量は、個々の患者により変化し、患者の全体的な身体的状態及び治療を行うべき状態の根本的な原因を含む、多くの要因に依存する。治療に使用されるｈＧＨポリペプチドの量は、許容可能な変化の速度を与え、有用なレベルで所望の応答を維持する。本発明の組成物の治療的有効量は、公に入手可能な物質及び手段を用いて当業者により容易に確定され得る。
【０２０８】
水溶性ポリマーは、以下に限定されないが、直鎖状、フォーク状又は分枝状を含む、あらゆる構造形態であり得る。典型的には、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などであるが、その他の水溶性ポリマーも利用できる。一例として、ＰＥＧを使用して、本発明のある一定の実施形態を説明する。
【０２０９】
ＰＥＧは、市販されている周知の水溶性ポリマーであるか、又は、当業者に公知の方法に従い、エチレングリコールの開環ポリマー化により調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ及びＫａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，１３８−１６１頁）。「ＰＥＧ」という用語は、大きさ又はＰＥＧの末端の修飾に関わらずあらゆるポリエチレングリコール分子を包含するように広く使用され、ｈＧＨポリペプチドに連結される場合、式：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
により表すことができる
（式中、ｎは、２から１０，０００であり、及びＸはＨであり、又は、以下に限定されないがＣ１−４アルキル、保護基又は末端修飾基などの末端修飾である。）。
【０２１０】
ある場合において、本発明で使用されるＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシ又はメトキシで終わっている（即ち、Ｘは、Ｈ又はＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。）。あるいは、ＰＥＧは反応性基で終結することができ、これにより、二官能性ポリマーが形成される。典型的な反応性基には、２０種類の一般的アミノ酸で見られる官能基（以下に限定されないが、マレイミド基、活性化されたカーボナート（以下に限定されないが、ｐ−ニトロフェニルエステルなど）、活性化されたエステル（以下に限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルなど）及びアルデヒドなど）ならびに、２０種類の一般的アミノ酸に対して不活性であるが天然においてコードされていないアミノ酸中に存在する相補的官能基と特異的に反応する官能基（アジド基、アルキン基などを含むが、これらに限定されない。）と反応させるために一般に使用される反応性基が含まれ得る。ＰＥＧの他方の末端（上記式中では、Ｙによって示される。）は、天然又は天然においてコードされていないアミノ酸を介して、ｈＧＨポリペプチドに直接又は間接的に結合することに留意されたい。例えば、Ｙは、アミド、カルバマート又は、ポリペプチドのアミノ基（以下に限定されないが、リジンのεアミン又はＮ末端が含まれるが、これらに限定されない。）への尿素結合であり得る。あるいは、Ｙは、チオール基（以下に限定されないが、システインのチオール基が含まれるが、これらに限定されない。）へのマレイミド結合であり得る。あるいは、Ｙは、２０種類の一般的アミノ酸を介して通常は接近可能ではない残基への結合であり得る。例えば、ＰＥＧ上のアジド基をｈＧＨポリペプチド上のアルキン基と反応させて、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化産物を形成させることができる。あるいは、ＰＥＧ上のアルキン基を天然においてコードされていないアミノ酸中に存在するアジド基と反応させて、同様の産物を形成させることができる。幾つかの実施形態において、強い求核試薬（以下に限定されないが、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドなど）を天然においてコードされていないアミノ酸中に存在するアルデヒド又はケトン基と反応させて、ヒドラゾン、オキシム又はセミカルバゾンを形成させることができ、規定どおりに、ある場合においては、適切な還元剤を用いた処理によりそれをさらに還元することができる。あるいは、天然においてコードされていないアミノ酸を介して強い求核試薬をｈＧＨポリペプチド中に取り込み、これを使用して水溶性ポリマーに存在するケトン又はアルデヒド基と優先的に反応させることができる。
【０２１１】
実際に所望される場合は、以下に限定されないが、要望どおり、約１００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａ又はそれ以上（以下に限定されないが、時には、０．１から５０ｋＤａ又は１０から４０ｋＤａなど）など、ＰＥＧに対するあらゆる分子量を使用することができる。ＰＥＧの分子量は、広範囲にわたり、それは、以下に限定されないが、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上が含まれる。ＰＥＧの分子量は、１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１０，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。以下に限定されないが、各鎖が１から１００ｋＤａの範囲のＭＷを有する（以下に限定されないが、１から５０ｋＤａ又は５から２０ｋＤａなど）ＰＥＧ分子を含む分枝鎖ＰＥＧもまた使用することができる。分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、以下に限定されないが、約１，０００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上であり得る。分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、及び１，０００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１，０００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａと２０，０００Ｄａの間である。以下に限定されないが、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．カタログ、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓカタログ（参照により本明細書中に組み込む。）などに、多岐にわたるＰＥＧ分子が記載されている。
【０２１２】
一般に、天然においてコードされていないアミノ酸との反応に、少なくとも１つのＰＥＧ分子の末端を利用できる。例えば、アミノ酸側鎖との反応のためのアルキン及びアジド部分を有するＰＥＧ誘導体を使用して、天然においてコードされていないアミノ酸にＰＥＧを連結させることができる。天然においてコードされていないアミノ酸がアジドを含む場合、ＰＥＧは、典型的には、［３＋２］付加環化産物の形成を実現するためのアルキン部分又は、アミド結合の形成を実現するためのホスフィン基を含有する活性化ＰＥＧ種（即ち、エステル、カルボナート）の何れかを含有する。あるいは、天然においてコードされていないアミノ酸がアルキンを含む場合、ＰＥＧは、典型的には、［３＋２］Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化産物の形成を実現するためのアジド部分を含有する。天然においてコードされていないアミノ酸がカルボニル基を含有する場合、ＰＥＧは、典型的には、対応するヒドラゾン、オキシム及びオキシム及びセミカルバゾン結合の形成をそれぞれ実現するために、強力な求核試薬（以下に限定されないが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジド官能基など）を含む。あるいは、上述の反応基の方向が逆であるものを使用することができ、即ち、アルキンを含有するＰＥＧ誘導体と天然においてコードされていないアミノ酸中のアジド部分を反応させることができる。
【０２１３】
幾つかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体を有するｈＧＨポリペプチドバリアントは、天然においてコードされていないアミノ酸の側鎖上に存在する化学官能基と反応性がある化学官能基を含有する。
【０２１４】
本発明は、幾つかの実施形態において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格を含む、アジド−及びアセチレン−含有ポリマー誘導体を提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）であり得る。しかし、以下に限定されないが、ポリ（エチレン）グリコール及びその他の関連ポリマーを含む（ポリ（デキストラン）及びポリ（プロピレングリコール）など）多岐にわたる水溶性ポリマーもまた、本発明の実施における使用に適切であり、ＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）という用語の使用は、このような分子全てを包含し、含むものとすることを理解すべきである。ＰＥＧという用語は、以下に限定されないが、そのあらゆる形態でのポリ（エチレングリコール）（二官能性ＰＥＧ、複数アーム化されたＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、懸垂ＰＥＧ（即ち、ポリマー骨格に垂れ下がった、１つ又はそれ以上の官能基を有する、ＰＥＧ又は関連ポリマー）又はその中に分解性の結合を有するＰＥＧなど）を含む。
【０２１５】
ＰＥＧは、典型的には、透明で無色、無臭、水溶性、熱安定性、多くの化学物質に対して不活性であり、加水分解又は分解せず、通常は無毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性であるとみなされ、つまり、ＰＥＧは、害を与えることなく生体組織又は生物と共存可能である。より具体的には、ＰＥＧは、実質的に非免疫原性であり、つまり、ＰＥＧは、身体において免疫反応を生じさせる傾向がない。生物活性物質など、身体においていくつかの望ましい機能を有する分子に付着させる場合、ＰＥＧは、その物質をマスクする傾向があり、生物がその物質の存在を耐容できるように、あらゆる免疫反応を低下させるか、又は取り除くことができる。ＰＥＧ抱合体は実質的な免疫反応を引き起こさないか、又は凝固もしくはその他の不必要な影響を生じさせない傾向がある。式：−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−を有するＰＥＧ（式中、ｎは約３から約４０００、典型的には約２０から２０００である。）は、本発明での使用に適切である。約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧは、本発明の幾つかの実施形態において、ポリマー骨格として特に有用である。ＰＥＧの分子量は、広範囲にわたり、これは、以下に限定されないが、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上であり得る。ＰＥＧの分子量は、１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１０，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。
【０２１６】
ポリマー骨格は、直鎖又は分岐であり得る。分枝ポリマー骨格は、一般的には、当技術分野において公知である。典型的には、分枝ポリマーは、中央分枝コア部分を有し、直鎖状ポリマー鎖の複数が中央分枝コアに連結されている。ＰＥＧは、一般に、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール及びソルビトールなどの様々なポリオールへのエチレンオキシドの添加により調製することができる分枝形態で使用される。中央分枝部分はまた、リジンなどのいくつかのアミノ酸由来であり得る。Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（式中、Ｒはグリセロール、グリセロールオリゴマー又はペンタエリスリトールなどのコア部分由来であり、ｍは腕部分の数を表す。）のような一般式で分枝ポリ（エチレングリコール）を表すことができる。米国特許第５，９３２，４６２号、同第５，６４３，５７５号；同第５，２２９，４９０号；同第４，２８９，８７２号；米国特許公開２００３／０１４３５９６；ＷＯ９６／２１４６９；及びＷＯ９３／２１２５９（それぞれ本明細書中にその全体を参照により組み込む。）に記載のものなどの、マルチアーム化されたＰＥＧ分子もまたポリマー骨格として使用できる。
【０２１７】
分枝ＰＥＧは、ＰＥＧ（−ＹＣＨＺ２）ｎ（式中、Ｙは、連結基であり、Ｚは指定された長さの原子鎖によりＣＨに連結された活性化末端基である。）によって表されるフォーク状ＰＥＧの形態であり得る。
【０２１８】
さらに別の分枝形態である懸垂ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなく、ＰＥＧ骨格に沿ってカルボキシルなどの反応基を有する。
【０２１９】
ＰＥＧのこれらの形態に加えて、骨格中の弱い又は分解性結合を用いて、ポリマーを調製することもできる。例えば、加水分解に供されるポリマー骨格中のエステル結合を用いてＰＥＧを調製できる。下記で示すように、この加水分解の結果、ポリマーがより低分子量の断片に切断される：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ→ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
ポリ（エチレングリコール）又はＰＥＧという用語が、以下に限定されないが、本明細書中に開示されているものなど、当技術分野で公知の形態全てを表すか又は含むことが、当業者により理解される。
【０２２０】
多くの他のポリマーもまた本発明での使用に適切である。幾つかの実施形態において、水溶性であり、２から約３００の末端を有するポリマー骨格は本発明において特に有用である。適切なポリマーの例としては、以下に限定されないが、その他のポリ（アルキレングリコール）、例えばポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）など、そのコポリマー（以下に限定されないが、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーなど）、そのターポリマー、それらの混合物などが挙げられる。ポリマー骨格の各鎖の分子量は様々であり得るが、典型的には、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａ、多くの場合、約６，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａの範囲である。ポリマー骨格の各鎖の分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａなど（これらに限定されない。）、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であり得る。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａと５０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。幾つかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１０，０００Ｄａと４０，０００Ｄａの間である。
【０２２１】
実質的に水溶性の骨格に対する前述の一覧は、網羅的なものではなく、単なる例示に過ぎず、上述の質を有する全てのポリマー性物質が本発明での使用に適切なものとして想定されることを、当業者は認識する。
【０２２２】
本発明の幾つかの実施形態において、ポリマー誘導体は、「多官能性」であり、これは、つまり、ポリマー骨格が少なくとも２つの末端を有し、官能基により官能化又は活性化された、約３００末端にのぼる末端を有する可能性があることを意味する。多官能性ポリマー誘導体としては、以下に限定されないが、２つの末端（各末端は同じもしくは異なり得る官能基に結合されている。）を有する直鎖状ポリマーが挙げられる。
【０２２３】
一実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ポリ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（Ｎ＝Ｎ＝Ｎはアジド部分であり；
Ｂは連結部分（存在してもよく、存在しなくてもよい。）であり；
ポリは、水溶性の非抗原性ポリマーであり；
Ａは、連結部分（存在してもよく存在しなくてもよく、Ｂと同じであるか、又は異なっていてもよい。）であり；
Ｘは、第二の官能基である。）
Ａ及びＢに対する連結部分の例としては、以下に限定されないが、１８個以下の炭素原子を含有する多官能性アルキル基が挙げられ、１個から１０個などの（これらに現地されない。）炭素原子を含有し得る。窒素、酸素又は硫黄などの複素原子がこのアルキル鎖に含まれ得る。アルキル鎖はまた、複素原子において分枝され得る。Ａ及びＢに対する連結部分の他の例としては、以下に限定されないが、１０個以下の炭素原子を含有する多官能性アリール基が挙げられ、５個から６個などの（これらに限定されない。）炭素原子を含有し得る。このアリール基は、もう１つの炭素原子、窒素、酸素又は硫黄原子により置換され得る。適切な連結基のその他の例としては、米国特許第５，９３２，４４６２号；同第５，６４３，５７５号；及び米国特許公開２００３／０１４３５９６（それぞれを本明細書中に参照により組み込む。）に記載の連結基が挙げられる。連結部分に対する前述の一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的としたものであり、上述の質を有する全ての連結部分が本発明での使用に適切なものとして想定されることを、当業者は認める。
【０２２４】
Ｘとしての使用に適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル及び１−ベンゾトリアゾリルエステルなど、活性カルボナート、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルカルボナート及び１−ベンゾトリアゾリルカルボナートなど、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシラート、トレシラート、アルケン、ケトン及びアジドが挙げられる。当業者により理解されるように、選択されたＸ部分は、アジド基との反応が起こらないよう、アジド基と適合可能であるべきである。アジド含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であり得、これは、第二の官能基（即ちＸ）もアジド部分であることを意味するか、又はヘテロ二官能性であり、つまり、第二の官能基が異なる官能基であることを意味する。
【０２２５】
「保護された」という用語は、ある一定の反応条件下で、化学的に反応性のある官能基の反応を妨げる、保護基又は部分の存在を指す。保護基は、保護される化学的に反応性のある反応基のタイプにより異なる。例えば、化学的に反応性のある基がアミン又はヒドラジドである場合、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から保護基を選択することができる。化学的に反応性のある基がチオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。化学的に反応性のある基が酪酸もしくはプロピオン酸などのカルボン酸又はヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル又はアルキル基（メチル、エチル又はｔｅｒｔ−ブチルなど）であり得る。当技術分野で公知のその他の保護基もまた、本発明において使用し得る。
【０２２６】
未精製産物の精製は、通常、産物の沈殿後、必要に応じて行われるクロマトグラフィーなど（これらに限定されない。）本分野で公知の方法によって達成することが可能である。
【０２２７】
水溶性ポリマーは、本発明のｈＧＨポリペプチドに連結することが可能である。水溶性ポリマーは、ｈＧＨポリペプチド中に取り込まれた天然においてコードされていないアミノ酸又は何れかの官能基又は天然においてコードされていない、若しくは天然にコードされたアミノ酸の置換基、又は天然においてコードされていない、若しくは天然にコードされたアミノ酸に付加された何らかの官能基若しくは置換基を介して連結され得る。あるいは、水溶性ポリマーは、天然に存在するアミノ酸（システイン、リジン又はＮ末端残基のアミン基を含むが、これらに限定されない。）を介して、天然においてコードされていないアミノ酸を取り込むｈＧＨポリペプチドに連結される。幾つかの事例では、本発明のｈＧＨポリペプチドは、１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸が水溶性ポリマー（ＰＥＧ及び／又はオリゴ糖を含むが、これらに限定されない。）に連結されている１、２、３、４、５、６、７、８．９、１０個又はそれ以上の非天然アミノ酸を含む。幾つかの事例では、本発明のｈＧＨポリペプチドは、さらに、水溶性ポリマーに連結されている１、２、３、４、５、６、７、８．９、１０個又はそれ以上の天然にコードされたアミノ酸を含む。幾つかの事例において、本発明のｈＧＨポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された１つ又はそれ以上の天然においてコードされていないアミノ酸及び水溶性ポリマーに連結された天然に存在する１つ又はそれ以上のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、本発明において使用される水溶性ポリマーは、抱合されていない形態に比べて、ｈＧＨポリペプチドの血清半減期を増大させる。
【０２２８】
本発明のｈＧＨポリペプチドに連結された水溶性ポリマーの数（すなわち、ＰＥＧ化又はグリコシル化の程度）は、インビボ半減期などの変化された（増加又は減少を含むが、これらに限定されない。）薬理学的、薬物動態的又は薬力学的特性を提供するように調整することが可能である。幾つかの実施形態において、ｈＧＨの半減期は、修飾されていないポリペプチドに比べて、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、２倍、５倍、１０倍、５０倍又は少なくとも約１００倍増加する。
【０２２９】
強い求核基（すなわち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジド）を含有するＰＥＧ誘導体
本発明のある実施形態において、カルボニル含有天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドをＰＥＧ骨格へ直接連結される、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾する。
【０２３０】
幾つかの実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）を有する。
【０２３１】
幾つかの実施形態において、ヒドラジン含有又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００であり、Ｘは場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）を有する。
【０２３２】
幾つかの実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）
を有する。
【０２３３】
本発明の別の実施形態において、アミド結合によりＰＥＧ骨格に連結している、末端ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体により、カルボニル含有アミノ酸を含むＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを修飾する。
【０２３４】
幾つかの実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）
を有する。
【０２３５】
幾つかの実施形態において、ヒドラジン含有又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、及びＸは場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）
を有する。
【０２３６】
幾つかの実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００である。）
を有する。
【０２３７】
本発明の別の実施形態において、カルボニル含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有し、分枝ＰＥＧ誘導体で修飾され、分枝ＰＥＧの各鎖は１０から４０ｋＤａの範囲の分子量を有する。分子ＰＥＧの各鎖は、５−２０ｋＤａの範囲の分子量を有し得る。
【０２３８】
本発明の別の実施形態において、天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、分枝構造を有するＰＥＧ誘導体で修飾される。例えば、幾つかの実施形態において、ヒドラジン含有又はヒドラジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、Ｘは、場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）を有する。
【０２３９】
幾つかの実施形態において、セミカルバジド基を含有するＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは場合によってはＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず、ｍは２から１０であり、及びｎは１００から１，０００である。）
を有する。
【０２４０】
幾つかの実施形態において、ヒドロキシルアミン基を含有するＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは場合によってはＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）
を有する。
【０２４１】
水溶性ポリマーがｈＧＨポリペプチドに連結している程度及び部位により、ｈＧＨポリペプチド受容体への、部位１におけるｈＧＨポリペプチドの結合を調節することができる。幾つかの実施形態において、ｈＧＨについて「Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６３：７８６２−７８６７  （１９８８）」に記載されているように、平衡結合アッセイによって測定された場合に、ｈＧＨポリペプチドが、約４００ｎＭ又はそれ以下のＫｄで、１５０ｎＭ又はそれ以下のＫｄで、幾つかの事例では、１００ｎＭ又はそれ以下のＫｄで、部位１においてｈＧＨポリペプチド受容体を結合するように、結合が用意される。
【０２４２】
ポリマーの活性化のための、ならびに、ペプチドの抱合のための、方法及び化学反応は、文献中に記載されており、当技術分野で公知である。ポリマーの活性化のために一般に使用される方法としては、以下に限定されないが、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタールアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどによる官能基の活性化が挙げられる。（Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ、（１９９１）、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＩＭＭＯＢＩＬＩＳＡＴＩＯＮ．ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，（１９９２）ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３），ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ  ＡＦＦＩＮＩＴＹ  ＬＩＧＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｕｎｎ，Ｒ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照。）。
【０２４３】
ＰＥＧの官能化及び抱合のいくつかの概説及び論文が利用可能である。例えば、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５−３７３（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０−６５（１９８７）；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６−８７４（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ９：２４９−３０４（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５（１９９５）を参照のこと。
【０２４４】
ポリマーの活性化のための方法はまた、ＷＯ９４／１７０３９、米国特許第５，３２４，８４４号、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／０４１９３、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、ＷＯ９０／１３５４０、米国特許第５，２８１，６９８号及びＷＯ９３／１５１８９においても、並びに活性化されあたポリマーと、以下に限定されないが、凝固因子ＶＩＩＩ（ＷＯ９４／１５６２５）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９）、リボヌクレアーゼ及びスーパーオキシドジムスターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−５２（１９８５））を含む酵素との間の抱合に対するものも見出すことができる。引用する参考文献及び特許を全て、参照により本明細書中に組み込む。
【０２４５】
何らかの従来法により、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンなどの天然においてコードされていないアミノ酸を含有するｈＧＨポリペプチドのＰＥＧ化（即ち、何らかの水溶性ポリマーの付加）を行う。例えば、アルキン末端ｍＰＥＧ誘導体によりｈＧＨポリペプチドをＰＥＧ化する。簡潔に述べると、室温にて、撹拌しながら、ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ−含有ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドの水溶液に固体ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨの過剰量を添加する。典型的には、反応を行うｐＨ付近（通常約ｐＨ４から１０）のｐＫａを有する緩衝液で水溶液を緩衝化する。ｐＨ７．５でのＰＥＧ化のための適切な緩衝液の例としては、例えば、以下に限定されないが、ＨＥＰＥＳ、ホスファート、ボラート、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＰＰＳ及びＴＥＳが挙げられる。ｐＨを連続してモニタリングし、必要であれば調整する。反応は、典型的には、約１時間から４８時間連続して行う。
【０２４６】
続いて反応産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、フリーのｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ及び、ブロックされていないＰＥＧが分子の両末端で活性化されている場合に形成され得、それによりｈＧＨポリペプチドバリアント分子を架橋する、ＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチドの全ての高分子量複合体から、ＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチドを分離する。疎水性相互作用クロマトグラフィーの際の条件は、フリーのｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨがカラムから流出し、一方であらゆる架橋ＰＥＧ化ＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドバリアント複合体が、１又はそれ以上のＰＥＧ基に抱合されている１個のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドバリアント分子を含有する所望の形態の後に、溶出するようなものである。適切な条件は、架橋複合体対所望の抱合体の相対サイズにより異なり、当業者は容易にこれを決定する。所望の抱合体を含有する溶出物を限外ろ過により濃縮し、透析ろ過により脱塩する。
【０２４７】
必要に応じて、以下に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー（以下に限定されないが、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥなどを使用する。）；シリカでのクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（以下に限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５などを使用する。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／透析ろ過；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；クロマト分画；置換クロマトグラフィー；電気泳動操作（以下に限定されないが、分取等電点電気泳動など）、異なる溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（以下に限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿を含む。）又は抽出などの、当業者にとって公知の１つ又はそれ以上の手段により、疎水性クロマトグラフィーから得たＰＥＧ化されたｈＧＨポリペプチドをさらに精製することが可能である。球状タンパク質標準（Ｐｒｅｎｅｔａ，ＡＺ  ｉｎ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＭＥＴＨＯＤＳ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ編）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，２９３−３０６）と比較することによるＧＰＣによって、見かけの分子量を推定し得る。タンパク質分解（以下に限定されないが、トリプシン切断など）を行い、次いでマススペクトロメトリー分析を行うことにより、ＧＨ、例えばｈＧＨ−ＰＥＧ抱合体の純度を評価することができる。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７（３）：１０５９−６６（２００１）。
【０２４８】
制限なしで、本発明のｈＧＨポリペプチドのアミノ酸に連結されている水溶性ポリマーをさらに誘導体化するか、又は置換することができる。
【０２４９】
他のＰＥＧ誘導体及び一般的なＰＥＧ化技術
アジド含有、アルキン含有及びホスフィン含有ＰＥＧ誘導体が、「Ｍｏｄｉｆｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ」と題された米国特許出願１１／０４６，４３２号に記載されている。
【０２５０】
ｈＧＨポリペプチドへ連結され得るその他の典型的なＰＥＧ分子及びＰＥＧ化方法には、米国特許公開２００４／０００１８３８；２００２／００５２００９；２００３／０１６２９４９；２００４／００１３６３７；２００３／０２２８２７４；２００３／０２２０４４７；２００３／０１５８３３３；２００３／０１４３５９６；２００３／０１１４６４７；２００３／０１０５２７５；２００３／０１０５２２４；２００３／００２３０２３；２００２／０１５６０４７；２００２／００９９１３３；２００２／００８６９３９；２００２／００８２３４５；２００２／００７２５７３；２００２／００５２４３０；２００２／００４００７６；２００２／００３７９４９；２００２／０００２２５０；２００１／００５６１７１；２００１／００４４５２６；２００１／００２１７６３；米国特許第６，６４６，１１０号；同第５，８２４，７７８号；同第５，４７６，６５３号；同第５，２１９，５６４号；同第５，６２９，３８４号；同第５，７３６，６２５号；同第４，９０２，５０２号；同第５，２８１，６９８号；同第５，１２２，６１４号；同第５，４７３，０３４号；同第５，５１６，６７３号；同第５，３８２，６５７号；同第６，５５２，１６７号；同第６，６１０，２８１号；同第６，５１５，１００号；同第６，４６１，６０３号；同第６，４３６，３８６号；同第６，２１４，９６６号；同第５，９９０，２３７号；同第５，９００，４６１号；同第５，７３９，２０８号；同第５，６７２，６６２号；同第５，４４６，０９０号；同第５，８０８，０９６号；同第５，６１２，４６０号；同第５，３２４，８４４号；同第５，２５２，７１４号；同第６，４２０，３３９号；同第６，２０１，０７２号；同第６，４５１，３４６号；同第６，３０６，８２１号；同第５，５５９，２１３号；同第５，７４７，６４６号；同第５，８３４，５９４号；同第５，８４９，８６０号；同第５，９８０，９４８号；同第６，００４，５７３号；同第６，１２９，９１２号；ＷＯ９７／３２６０７、ＥＰ２２９，１０８、ＥＰ４０２，３７８、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８０２４、ＷＯ９５／００１６２、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９５／１３０９０、ＷＯ９５／３３４９０、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９７／１８８３２、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３２１３９、ＷＯ９９／３２１４０、ＷＯ９６／４０７９１、ＷＯ９８／３２４６６、ＷＯ９５／０６０５８、ＥＰ４３９５０８、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９５／１３３１２、ＥＰ９２１１３１、ＷＯ９８／０５３６３、ＥＰ８０９９９６、ＷＯ９６／４１８１３、ＷＯ９６／０７６７０、ＥＰ６０５９６３、ＥＰ５１０３５６、ＥＰ４００４７２、ＥＰ１８３５０３及びＥＰ１５４３１６（これらを参照により本明細書中に組み込む。）に記載されているものが含まれる。本明細書に記載されているＰＥＧ分子の何れも、一本鎖、分枝鎖、マルチアーム鎖、単一官能性、二官能性、多官能性又はこれらのあらゆる組み合わせを含む（これらに限定されない。）あらゆる形態で使用され得る。「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ」と題された米国特許出願第１１／０４６，４３２号（参照により組み込まれる。）は、ＰＥＧ及びその形態のさらなる考察を提供する。
【０２５１】
ＩＸ．効力、機能的インビボ半減期及び薬物動態学的パラメータの測定
本発明の重要な態様は、水溶性ポリマー部分へのポリペプチドの抱合あり又は無しで、ｈＧＨポリペプチドの構築により得られる生物学的半減期の延長である。ｈＧＨポリペプチド血清濃度が急激に減少することにより、抱合及び非抱合ｈＧＨポリペプチド及びそれらのバリアントを用いた治療に対する生物学的反応を評価することが重要となる。好ましくは、本発明の、抱合及び非抱合ｈＧＨポリペプチドならびにそれらのバリアントは、皮下又は静脈内投与後にも延長された血清半減期を有することができ、これにより、例えばＥＬＩＳＡ法により、又は一次スクリーニングアッセイにより測定することが可能となる。ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）又はＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｂｓｔｅｒ，  ＴＸ）から得られるＥＬＩＳＡ又はＲＩＡキットを使用し得る。インビボ生物学的半減期の測定は、本明細書に記載されているとおりに実施される。
【０２５２】
天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの効力及び機能的インビボ半減期は、「Ｃｌａｒｋ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１（３６）：２１９６９−２１９７７（１９９６）」に記載されているプロトコールに従って決定することが可能である。
【０２５３】
天然においてコードされていないアミノ酸を含むＧＬＰ−１ポリペプチドに対する薬物動態学的パラメータは、正常なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（Ｎ＝５動物／処置群）において評価することが可能である。動物は、２５μｇ／ラット静脈内又は５０μｇ／ラット皮下の単回投与の何れかを受け、予め確定された時間（一般に、水溶性ポリマーに抱合されていない、天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの場合には、約６時間、天然においてコードされていないアミノ酸を含み、水溶性ポリマーに抱合されているｈＧＨポリペプチドの場合には、約４日に及ぶ。）に従って、約５−７個の血液試料を採取する。ｈＧＨポリペプチドに対する薬物動態データは、幾つかの種において詳しく研究されており、天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドに対して得られたデータに対して直接比較することが可能である。ｈＧＨに関する研究については、「Ｍｏｒｄｅｎｔｉ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（ｌｌ）：１３５１−５９（１９９１）」（参照により本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
【０２５４】
薬物動態学的パラメータは、霊長類、例えば、カニクイザルにおいて評価することも可能である。単一の注射は、皮下又は静脈内の何れかで投与することができ、経時的に、血清ｈＧＨレベルがモニターされる。
【０２５５】
本発明のｈＧＨポリペプチドの比活性は、本分野において公知の様々なアッセイによって測定することが可能である。本発明に従って取得及び精製されたｈＧＨポリペプチド突然変異タンパク質又はその断片の生物学的活性は、本明細書に記載され、若しくは参照された方法によって、当業者に公知の方法によって検査することが可能である。
【０２５６】
Ｘ．投与及び医薬組成物
以下に限定されないが、適切な医薬担体と組み合わせるなどして、治療用途のために、本発明の、ポリペプチド又はタンパク質（以下に限定されないが、ｈＧＨ、シンテターゼ、１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を含むタンパク質など）を場合によっては使用することができる。このような組成物は、例えば、化合物の治療的有効量と医薬として許容される担体又は賦形剤とを含有する。このような担体又は賦形剤としては、以下に限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及び／又はこれらの組合せが挙げられる。製剤は、投与様式に適切となるように作製される。一般に、タンパク質の投与方法は、当業者に周知であり、本発明のポリペプチドの投与に適用することができる。
【０２５７】
当業者に公知の方法に従い、本発明の１つ又はそれ以上のポリペプチドを含む治療用組成物を、場合によっては１つ又はそれ以上の適切なインビトロ及び／又はインビボ疾患動物モデルにおいて試験し、有効性、組織代謝を確認し、投与量を推定する。特に、投薬量は最初、天然アミノ酸相同体に対する本明細書中の非天然物（以下に限定されないが、天然アミノ酸ｈＧＨポリペプチドに対する、１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾されたｈＧＨポリペプチドの比較など）の、活性、安定性又はその他の適切な指標により、即ち、適切なアッセイにおいて、決定することができる。
【０２５８】
投与は、血液又は組織細胞と最終的に接触するように分子を導入するために通常使用されるあらゆる経路による。何らかの適切な様式で、場合により、医薬として許容される１又はそれ以上の担体とともに、本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドを投与する。本発明の関連におけるこのようなポリペプチドを患者に投与する適切な方法が利用可能であるが、２以上の経路を用いて特定の組成物を投与することができ、特定経路によって、別の経路よりも迅速かつ効果的な作用又は反応を得られることが多い。
【０２５９】
一部、投与される特定の組成物によって、ならびに、組成物を投与するのに使用される特定の方法によって、医薬として許容される担体を決定する。したがって、本発明の医薬組成物の多岐にわたる適切な製剤が存在する。
【０２６０】
本発明のｈＧＨポリペプチド（ＰＥＧ化されたｈＧＨを含むが、これに限定されない。）は、タンパク質又はペプチドに適したあらゆる慣用経路（皮下若しくは静脈内又は注射若しくは注入の他のあらゆる形態を含む（これらに限定されない。）非経口、例えば注射を含むが、これに限定されない。））によって投与し得る。ポリペプチド組成物は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下又は直腸手段を含む（これらに限定されない。）多数の経路によって投与することが可能である。リポソームを介して修飾又は非修飾の非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物を投与することもできる。このような投与経路及び適切な製剤は通常、当業者にとって公知である。天然においてコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチド（ＰＥＧ化されたｈＧＨを含むが、これに限定されない。）は、単独で、又は医薬担体などの他の適切な成分と組み合わせて使用し得る。
【０２６１】
単独又はその他の適切な成分と組み合わせて非天然アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドは、エアロゾル製剤に調製して（即ち、これらは「霧状」にすることができる。）、吸入により投与することもできる。加圧された許容可能なプロペラント（ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）にエアロゾル製剤を入れることができる。
【０２６２】
例えば、関節内投与（関節中に）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内及び皮下経路などの非経口投与に適切な製剤としては、水性及び非水性の等張滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。）並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。アンプル及びバイアルなど、単位用量又は複数回用量の密封容器において、ｈＧＨの製剤を提供することができる。
【０２６３】
非経口投与及び静脈内投与は好ましい投与方法である。特に、現在使用されている製剤とともに、天然アミノ酸相同体治療薬に対して既に使用されている投与経路（以下に限定されないが、ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体及び／又は医薬として送達される何らかの他のタンパク質に対して典型的に使用されるものなど）は、本発明のポリペプチドに対する好ましい投与経路及び処方を与える。
【０２６４】
ポリペプチド組成物の粘度及び調合特性は、従来の調合に比べて、より小さなプランジャ圧を使用することによって、小さなゲージの針での投与を可能とし得る。本発明のポリペプチド組成物を対象へ投与するために、２７、２８、２９、３０又は３１ゲージの針を含む（これらに限定されない。）より小さなゲージの針を使用し得る。米国特許第６，８７５，４３２号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、タンパク質製剤の粘度及び皮下投与用のタンパク質製剤の粘度に伴う問題について論述している。投薬計画の患者による遵守を向上させる注射の痛みの減少のため、小ゲージの針は有利である。注射のために必要とされるプランジャ圧がより小さくなることによって、ｈＧＨポリペプチド（ＰＥＧ化されたｈＧＨを含むが、これに限定されない。）は、短い注射時間で投与することがより容易になる。針の種類には、ペン針、薄壁（ｔｈｉｎ  ｗａｌｌｅｄ）、通常壁（ｎｏｒｍａｌ  ｗａｌｌｅｄ）及びルアー針（ｌｕｅｒ  ｎｅｅｄｌｅ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６５】
粘度は、当業者に公知の標準的な技術によって測定し得る。「粘度」は、「運動学的粘度」又は「絶対粘度」であり得る。「運動学的粘度」とは、重力の影響下での流体の抵抗性流の指標である。等しい容量の２つ流体が同一の毛細管粘度計に配置され、重力によって流される場合、粘性の流体は毛細管を通じて流動するために、より小さな粘度の流体より長時間を要する。ある流体がその流動を完了するのに２００秒を要し、別の流体が４００秒を要するのであれば、第二の流体は、毛細管粘度のスケールで、第一の流体より２倍の粘度である。「絶対粘度」（時に、動的粘度又は単純粘度と称される。）は、運動学的粘度と流体密度の積である。すなわち、絶対粘度＝運動学的粘度×密度。
【０２６６】
運動学的粘度の次元は、Ｌ２／Ｔ（Ｌは長さであり、Ｔは時間である。）である。一般に、運動学的粘度は、センチストークス（ｃＳｔ）で表される。運動学的粘度のＳＩ単位は、ｍｍ２／ｓであり、これは１ｃＳｔである。絶対粘度は、センチポワズ（ｃＰ）の単位で表される。絶対粘度のＳＩ単位は、ミリパスカル−秒（ｍＰａ−ｓ）であり、１ｃＰ＝１ｍＰａ−ｓである。
【０２６７】
本発明において、患者に投与される用量は、時間とともに患者において有効な治療応答を有するのに十分なものであるか、又は、適用に応じて、その他の適切な活性を有するのに十分なものである。特定のベクターもしくは処方の効率及び使用される非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性もしくは血清半減期及び患者の状態、ならびに処置される患者の、体重もしくは表面積により、用量を決定する。特定の患者における、特定のベクター、処方などの投与に付随する何らかの不都合な副作用の、存在、性質及び程度によっても、用量サイズが決定される。
【０２６８】
疾患（以下に限定されないが、癌、遺伝性疾患、糖尿病、ＡＩＤＳなど）の治療又は予防において投与されるべきベクター又は製剤の有効量を決定する場合、医師は、循環血漿レベル、製剤の毒性、疾患の進行及び／又は適切な場合は、抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を評価する。
【０２６９】
例えば、７０ｋｇの患者に投与する用量は、典型的には、現在使用されている治療用タンパク質の投薬量と等しい範囲であり、関連組成物の変化した活性又は血清半減期に対して調節される。本発明のベクター又は医薬製剤は、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性物質、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、生物反応調節物質などの投与など、何らかの公知の従来の治療による治療状態を補完することができる。
【０２７０】
投与に対して、以下に限定されないが大部分及び全体的な患者の健康に対して適用する場合を含め、適切な製剤のＬＤ−５０又はＥＤ−５０及び／又は様々な濃度での非天然アミノ酸の何らかの副作用の観察により決定される速度で本発明の製剤を投与する。単回投与又は分割投与で投与を行うことができる。単回投与又は分割投与で投与を行うことができる。
【０２７１】
製剤の注入を行っている患者が発熱、悪寒又は筋肉痛を発症した場合、その患者にアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン又はその他の疼痛／発熱制御薬の適量を与える。発熱、筋肉痛及び悪寒など、注入に対する反応が出たことがある患者には、それ以降の注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミドフェン又は以下に限定されないがジフェンヒドラミンなどの何れかを前もって与える。解熱剤及び抗ヒスタミン剤に対して迅速に応答しないより重度の悪寒及び筋肉痛には、メペリジンを使用する。反応の重症度によって、細胞注入の速度を遅くするか、又は中断する。
【０２７２】
哺乳動物対象に、本発明のヒトｈＧＨポリペプチドを直接投与することができる。投与は、ｈＧＨポリペプチドを対象に導入するために通常使用される何れかの経路による。本発明の実施形態によるｈＧＨポリペプチド組成物には、経口、直腸、局所、吸入（以下に限定されないが、エアロゾルを介したものなど）、口腔内（以下に限定されないが、舌下など）、膣内、非経口（以下に限定されないが、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹腔内、脳内、動脈内又は静脈内など）、局所（即ち、皮膚及び粘膜表面の両方、気道表面を含む。）及び経皮投与に適切なものが含まれるが、いかなる場合も、最適な経路は、治療されている状態の性質及び重症度に依存する。投与は局所又は全身投与の何れかであり得る。アンプル及びバイアルなど、単位用量又は複数回用量の密封容器中に、化合物の製剤を提供することができる。単位用量の注射用形態（以下に限定されないが、溶液、懸濁液又はエマルジョンなど）での医薬として許容される担体との混合物において本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを調製することができる。持続注入（以下に限定されないが、浸透圧ポンプなどのミニポンプなどを用いる。）、単一ボーラス又は徐放デポー製剤により、本発明のＧＨ、例えばｈＧＨポリペプチドを投与することもできる。
【０２７３】
投与に適切な製剤としては、水性及び非水性の溶液、等張滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び製剤を等張にする溶質を含有し得る。）並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。既に述べられた種類の、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から、溶液及び懸濁液を調製し得る。
【０２７４】
フリーズドライは、タンパク質を提示するために一般的に使用されている技術であり、これは、目的のタンパク質調製物から水を除去する役割を果たす。フリーズドライ又は凍結乾燥は、乾燥されるべき材料をまず凍結した後、真空環境中で、昇華により、氷又は凍結した溶媒を除去するプロセスである。フリーズドライプロセス中に安定性を増強させるために、及び／又は、凍結乾燥された産物の保存時における安定性を向上させるために、予め凍結乾燥された製剤中に賦形剤を含めることができる。Ｐｉｋａｌ，  Ｍ．  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．  ３（９）２６−３０（１９９０）及びＡｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ８（３）：２８５−２９１（１９９１）。
【０２７５】
医薬の噴霧乾燥も、当業者に公知である。例えば、「Ｂｒｏａｄｈｅａｄ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔｈｅ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，”  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  Ｉｎｄ．  Ｐｈａｒｍ，  １８（１１  ＆  １２），  １１６９−１２０６（１９９２）」を参照されたい。小分子医薬に加えて、様々な生物学的材料が噴霧乾燥されており、これらには、酵素、血清、血漿、微生物及び酵母が含まれる。噴霧乾燥は、一段階の工程で、液体の医薬調製物を、微細な、無粉塵の粉末又は凝集した粉末に変換することができるので、有用な技術である。基本的な技術は、以下の４つの工程：ａ）スプレー中への、フィード溶液の微粒化；ｂ）スプレー−空気接触；ｃ）スプレーの乾燥；ｄ）及び乾燥空気からの、乾燥された産物の分離を含む。米国特許第６，２３５，７１０号及び第６，００１，８００号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、スプレー乾燥による、組換えエリスロポエチンの調製について記載している。
【０２７６】
本発明の医薬組成物及び製剤は、医薬として許容される担体、賦形剤又は安定化剤を含み得る。一部、投与する特定の組成物によって、ならびに、組成物を投与するのに使用される特定の方法によって、医薬として許容される担体を決定する。したがって、本発明の医薬組成物（場合により、医薬として許容される担体、賦形剤又は安定化剤を含む。）の多岐にわたる適切な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈ  ｅｄ．  １９８５参照。）。
【０２７７】
適切な担体には、スクシナート、ホスファート、ボラート、ＨＥＰＥＳ、シトラート、ヒスチジン又はヒスチジン誘導体、イミダゾール、アセタート、バイカーボナート及びその他の有機酸を含有する緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量ポリペプチド（約１０残基未満のものを含むが、これに限定されない。）；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどの（これらに限定されない。）タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの（これらに限定されない。）親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、ヒスチジン又はヒスチジン誘導体、メチオニン、アスパラギン、アルギニン、グルタミン酸又はリジンなどの（これらに限定されない。）のアミノ酸；トレハローズ、スクロース、グルコース、マンノース又はデキストリンなどの（これらに限定されない。）、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；亜鉛、コバルト又は銅などの（これらに限定されない。）二価金属イオン；マンニトール又はソルビトールなどの（これらに限定されない。）糖アルコール；ナトリウムなどの（これに限定されない。）塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎＴＭ（Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルバート８０）及びＴｗｅｅｎ２０（ポリソルバート２０；ＰＳ２０））、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ及び他のプルロニック酸（プルロニック酸Ｆ６８（ポロキサマー１８８）を含むが、これに限定されない。）などの非イオン性界面活性剤又はＰＥＧが含まれるが、これらに限定されない。。適切な界面活性剤には、例えば、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）、すなわち（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）又はポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレノキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）、すなわち、（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）又はこれらの組み合わせを基礎としたポリエーテル（これらに限定されない。）が含まれる。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ及びＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、Ｒ−ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、ＴｅｔｒｏｎｉｃｓＴＭ及びＲ−ＴｅｔｒｏｎｉｃｓＴＭ（ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ，  Ｍｉｃｈ．）の商品名で市販されており、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許第４，８２０，３５２号にさらに記載されている。他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマーは、適切な界面活性剤であり得る。撹拌から生じるストレスを含む（これに限定されない。）１つ又はそれ以上のストレスに対して、ＰＥＧ化されたｈＧＨを安定化するために界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせを使用し得る。上記の幾つかは、「充填剤」と表記され得る。幾つかは、「張度調整剤」とも称され得る。さらなる担体には、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）が含まれるが、これに限定されない。硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）は、２００ｍＭ、１９０ｍＭ、１８０ｍＭ、１７０ｍＭ、１６０ｍＭ、１５０ｍＭ、１４０ｍＭ、１３０ｍＭ、１２０ｍＭ、１１０ｍＭ、１００ｍＭ、９５ｍＭ、９０ｍＭ、８５ｍＭ、８０ｍＭ、７５ｍＭ、７０ｍＭ、６５ｍＭ、６０ｍＭ、５５ｍＭ、５０ｍＭ、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２���ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭ、０．９ｍＭ、０．８ｍＭ、０．７ｍＭ、０．６ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ及び０．１ｍＭなど（これらに限定されない。）、約０．１ｍＭ〜約２００ｍＭの範囲で、本発明の製剤中に使用され得る。ヒスチジンは、２００ｍＭ、１９０ｍＭ、１８０ｍＭ、１７０ｍＭ、１６０ｍＭ、１５０ｍＭ、１４０ｍＭ、１３０ｍＭ、１２０ｍＭ、１１０ｍＭ、１００ｍＭ、９５ｍＭ、９０  ｎｉＭ、８５ｍＭ、８０ｍＭ、７５ｍＭ、７０  ｎｉＭ、６５ｍＭ、６０ｍＭ、５５ｍＭ、５０ｍＭ、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭ、０．９ｍＭ、０．８ｍＭ、０．７ｍＭ、０．６ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ及び０．１ｍＭなど（これらに限定されない。）、約０．１ｍＭ〜約２００ｍＭの範囲で、本発明の製剤中に使用され得る。幾つかの実施形態において、ヒスチジンは、製剤中で約５ｍＭと約３０ｍＭの間である。
【０２７８】
本発明の製剤の緩衝液は、２００ｍＭ、１９０ｍＭ、１８０ｍＭ、１７０ｍＭ、１６０ｍＭ、１５０ｍＭ、１４０ｍＭ、１３０ｍＭ、１２０ｍＭ、１１０ｍＭ、１００ｍＭ、９５ｍＭ、９０ｍＭ、８５ｍＭ、８０ｍＭ、７５ｍＭ、７０ｍＭ、６５ｍＭ、６０ｍＭ、５５ｍＭ、５０ｍＭ、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭ、０．９ｍＭ、０．８ｍＭ、０．７ｍＭ、０．６ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ及び０．１ｍＭなど（これらに限定されない。）、約０．１ｍＭ〜約２００ｍＭの範囲であり得る。幾つかの実施形態において、緩衝液は、約０．１ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度である。幾つかの実施形態において、緩衝液は、約１ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度である。幾つかの実施形態において、緩衝液は、約１ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度である。幾つかの実施形態において、緩衝液は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度である。本発明の製剤の緩衝液は、ｐＨ８．５、ｐＨ８．０、ｐＨ７．５、ｐＨ７．０、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、ｐＨ５．０、ｐＨ４．５及びｐＨ４．０など（これらに限定されない。）、約ｐＨ４．０から約ｐＨ８．５までのｐＨ範囲を与え得る。ｐＨは、上に列挙されているものの任意の１／１０のｐＨ値、例えば、ｐＨ８．５、ｐＨ８．４、ｐＨ８．３、ｐＨ８．２、ｐＨ８．１、ｐＨ８．０、ｐＨ７．９、ｐＨ７．８、ｐＨ７．７、ｐＨ７．６、ｐＨ７．５、ｐＨ７．４、ｐＨ７．３、ｐＨ７．２、ｐＨ７．１、ｐＨ７．０、ｐＨ６．９、ｐＨ６．８、ｐＨ６．７、ｐＨ６．６、ｐＨ６．５、ｐＨ６．４、ｐＨ６．３、ｐＨ６．２、ｐＨ６．１、ｐＨ６．０、ｐＨ５．９、ｐＨ５．８、ｐＨ５．７、ｐＨ５．６、ｐＨ５．５、ｐＨ５．４、ｐＨ５．３、ｐＨ５．２、ｐＨ５．１、ｐＨ５．０、ｐＨ４．９、ｐＨ４．８、ｐＨ４．７、ｐＨ４．６、ｐＨ４．５、ｐＨ４．４、ｐＨ４．３、ｐＨ４．２、ｐＨ４．１及びｐＨ４．０である。幾つかの実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ６．０と約ｐＨ７．３の間である。幾つかの実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ５．５と約ｐＨ８．０の間である。幾つかの実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ４．０と約ｐＨ８．５の間である。幾つかの実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ４．０と約ｐＨ７．５の間である。幾つかの実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ６．０と約ｐＨ７．５の間である。
【０２７９】
本発明の製剤のアミノ酸は、１００ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ及び０．１ｇ／Ｌなど（これらに限定されない。）、約０．１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの範囲であり得る。幾つかの実施形態において、アミノ酸は約０．１ｇ／Ｌと６０ｇ／Ｌの間である。幾つかの実施形態において、アミノ酸は約０．１ｇ／Ｌと１００ｇ／Ｌの間である。幾つかの実施形態において、アミノ酸は約１ｇ／Ｌと５０ｇ／Ｌの間である。幾つかの実施形態において、アミノ酸は約５ｇ／Ｌと２５ｇ／Ｌの間である。
【０２８０】
本発明の製剤の糖アルコールは、１００ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ及び０．１ｇ／Ｌなど（これらに限定されない。）、約０．１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの範囲であり得る。幾つかの実施形態において、糖アルコールは約０．１ｇ／Ｌと約６０ｇ／Ｌの間である。幾つかの実施形態において、糖アルコールは約０．１ｇ／Ｌと約１００ｇ／Ｌの間である。幾つかの実施形態において、糖アルコールは約１ｇ／Ｌと約５０ｇ／Ｌの間である。  幾つかの実施形態において、アミノ酸は約２ｇ／Ｌと約２５ｇ／Ｌの間である。
【０２８１】
本発明の製剤の炭水化物は、１００ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ及び０．１ｇ／Ｌなど（これらに限定されない。）、約０．１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの範囲であり得る。幾つかの実施形態において、炭水化物は約０．１ｇ／Ｌと約１００ｇ／Ｌの間である。幾つかの実施形態において、炭水化物は約１ｇ／Ｌと約５０ｇ／Ｌの間である。幾つかの実施形態において、炭水化物は約２ｇ／Ｌと約２５ｇ／Ｌの間である。幾つかの実施形態において、炭水化物は約０．１ｇ／Ｌと約５０ｇ／Ｌの間である。
【０２８２】
本発明の製剤の二糖は、１００ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ及び０．１ｇ／Ｌなど（これらに限定されない。）、約０．１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの範囲であり得る。幾つかの実施形態において、二糖は約０．１ｇ／Ｌと約５０ｇ／Ｌの間である。
【０２８３】
本発明の製剤の単糖は、１００ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ及び０．１ｇ／Ｌなど（これらに限定されない。）、約０．１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの範囲であり得る。
【０２８４】
本発明の製剤の非イオン性界面活性剤は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８５％、０．００８％、０．００７５％、０．００７％、０．００６５％、０．００６％、０．００５５％、０．００５％、０．００４５％、０．００４％、０．００３５％、０．００３％、０．００２５％、０．００２％、０．００１５％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％及び０．０００１％など（これらに限定されない。）、約０．０１％〜約１０％の範囲であり得る。幾つかの実施形態において、非イオン性界面活性剤は約０．０００１％〜約１０％である。幾つかの実施形態において、非イオン性界面活性剤は約０．０１％〜約１０％である。幾つかの実施形態において、非イオン性界面活性剤は約０．１％〜約５％である。幾つかの実施形態において、非イオン性界面活性剤は約０．１％〜約１％である。幾つかの実施形態において、非イオン性界面活性剤は約０．０００１％〜約１％である。
【０２８５】
本発明の製剤中のＧＨの医薬量は、５０ｍｇ、４９ｍｇ、４８ｍｇ、４７ｍｇ、４６ｍｇ、４５ｍｇ、４４ｍｇ、４３ｍｇ、４２ｍｇ、４１ｍｇ、４０ｍｇ、３９ｍｇ、３８ｍｇ、３７ｍｇ、３６ｍｇ、３５ｍｇ、３４ｍｇ、３３ｍｇ、３２ｍｇ、３１ｍｇ、３０ｍｇ、２９．５ｍｇ、２９ｍｇ、２８．５ｍｇ、２８ｍｇ、２７．５ｍｇ、２７ｍｇ、２６．５ｍｇ、２６ｍｇ、２５．５ｍｇ、２５ｍｇ、２４．５ｍｇ、２４ｍｇ、２３．５ｍｇ、２３ｍｇ、２２．５ｍｇ、２２ｍｇ、２１．５ｍｇ、２１ｍｇ、２０．５ｍｇ、２０ｍｇ、１９．５ｍｇ、１９ｍｇ、１８．５ｍｇ、１８ｍｇ、１７．５ｍｇ、１７ｍｇ、１６．５ｍｇ、１６ｍｇ、１５．５ｍｇ、１５ｍｇ、１４．５ｍｇ、１４ｍｇ、１３．５ｍｇ、１３ｍｇ、１２．５ｍｇ、１２ｍｇ、１１．５ｍｇ、１１ｍｇ、１０．５ｍｇ、１０ｍｇ、９．５ｍｇ、９ｍｇ、８．５ｍｇ、８ｍｇ、７．５ｍｇ、７．０ｍｇ、６．５ｍｇ、６．０ｍｇ、５．５ｍｇ、５．０ｍｇ、４．５ｍｇ、４．０ｍｇ、３．５ｍｇ、３．０ｍｇ、２．５ｍｇ、２．０ｍｇ、１．５ｍｇ、１．０ｍｇ、０．９ｍｇ、０．８ｍｇ、０．７ｍｇ、０．６ｍｇ、０．５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．３ｍｇ、０．２ｍｇ、及び０．１ｍｇなど（これらに限定されない。）、約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲であり得る。幾つかの実施形態において、製剤中のｈＧＨの医薬量は約２ｍｇと約３０ｍｇの間である。幾つかの実施形態において、製剤中のｈＧＨの医薬量は約２ｍｇと約２５ｍｇの間である。幾つかの実施形態において、製剤中のｈＧＨの医薬量は約０．１ｍｇと約３０ｍｇの間である。幾つかの実施形態において、製剤中のｈＧＨの医薬量は約０．１ｍｇと約８ｍｇの間である。幾つかの実施形態において、製剤中のｈＧＨの医薬量は約０．５ｍｇと約８ｍｇの間である。幾つかの実施形態において、製剤中のｈＧＨの医薬量は約０．５ｍｇと約６ｍｇの間である。幾つかの実施形態において、製剤中のｈＧＨの医薬量は約１ｍｇと約５ｍｇの間である。
【０２８６】
徐放システムにより、又は徐放システムの一部として、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに連結されているものを含む、本発明のｈＧＨポリペプチドを投与することもできる。徐放組成物としては、以下に限定されないがフィルム又はマイクロカプセルなどの（これらに限定されない。）、造形品の形態の半透性ポリマーマトリクスなど（これに限定されない。）が挙げられる。徐放マトリクスには、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２）、エチレンビニルアセタート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，前出）又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）、ポリラクチド（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ５８，４８１）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド共グリコリド（乳酸とグリコール酸とのコポリマー）ポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，５４７−５５６（１９８３）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン及びシリコーンなどの生体適合性の物質由来のものが含まれる。徐放組成物にはまた、リポソームに封入された化合物が含まれる。それ自身公知の方法により、化合物を含有するリポソームを調製する：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本特許公開８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；及びＥＰ１０２，３２４。引用する参考文献及び特許を全て、参照により本明細書中に組み込む。
【０２８７】
例えばＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；米国特許第４，４８５，０４５号；ＥＰ１４３，９４９；米国特許第５，０２１，２３４号；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；及びＥＰ１０２，３２４に記載の方法により、リポソーム中に封入されたｈＧＨポリペプチドを調製することができる。組成物及びリポソームサイズは周知であるか、又は当業者により経験的に容易に決定可能である。リポソームのいくつかの例が、例えばＰａｒｋ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１３２７−１３３１（１９９５）；Ｌａｓｉｃ  Ｄ及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  Ｄ（編）：ＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＬＹＰＯＳＯＭＥＳ（１９９８）；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ＤＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｅｉｃｈｅｒ  Ｂ（編）：ＣＡＮＣＥＲ  ＤＲＵＧ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＡＮＤ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ（２００２）；Ｐａｒｋ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．８：１１７２−１１８１（２００２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＵＢ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５９１（１−３）：１０９−１１８（２００２）；Ｍａｍｏｔ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３１５４−３１６１（２００３）に記載されている。引用する参考文献及び特許を全て、参照により本明細書中に組み込む。
【０２８８】
本発明に関連して、患者へ投与される用量は、時間とともに対象において有効な応答を生じさせるのに十分な用量とすべきである。一般に、非経口的に投与される本発明のｈＧＨポリペプチドの、投与あたりの総医薬的有効量は、約０．０１μｇ／ｋｇ／日から約１００μｇ／ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲であるが、これは治療での判断に委ねられる。投与頻度もまた、治療での判断に委ねられ、ヒトでの使用が認可されている市販のｈＧＨポリペプチド製品よりも多い又は少ない頻度であり得る。一般に、上述の何れかの投与経路により、本発明のＰＥＧ化されたｈＧＨポリペプチドを投与することができる。
【０２８９】
ＸＩ．本発明のｈＧＨポリペプチドの治療的使用
本発明のｈＧＨポリペプチドは、多岐にわたる疾患を治療するのに有用である。
【０２９０】
本発明のｈＧＨアゴニストポリペプチドは、例えば、発育不全、免疫疾患を治療するのに、及び心機能を刺激するのに有用であり得る。成長欠乏の個体には、例えば、ターナー症候群を有する個体、ＧＨ欠乏の個体（子供を含む。）、成長板が閉じる約２−３年前の正常な成長曲線に遅れ又は遅延を経験する子供（時折、「低身長の正常児（ｓｈｏｒｔ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ）」として知られる。）及びインシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のＧＨに対する応答が化学的に（すなわち、グルココルチコイド処理によって）又はＧＨに対するＩＧＦ−Ｉ応答が自然な状態で減少している成体患者におけるような正常状態によって遮断されている個体が含まれる。本発明のｈＧＨポリペプチドは、以下の症状：小児成長ホルモン欠乏、突発性低身長症、小児期発生の成体成長ホルモン欠乏、成体発生の成体成長ホルモン欠乏又は続発性成長ホルモン欠乏を有する個体を治療するのに有用であり得る。成体期に成長ホルモン欠乏を有すると診断された成体は、下垂体腫瘍又は放射線被爆を有している場合があり得る。メタボリックシンドローム、頭部傷害、肥満、骨粗鬆症又はうつ病を含む（これらに限定されない。）症状は、成体における成長ホルモン欠乏様の症候をもたらし得る。
【０２９１】
アゴニストｈＧＨバリアントは、増加が抗体の媒介によるものであれ、又は細胞の媒介によるものであれ、及び免疫系がｈＧＨポリペプチドで処理される宿主にとって内在性のものであれ、又はｈＧＨポリペプチドが与えられる宿主レシピエントにドナーから移植されるものであれ（骨髄移植におけるように）、哺乳動物の免疫機能を増加させることによって、哺乳動物の免疫系を刺激するように作用し得る。「免疫疾患」には、個体の免疫系が、抗原に対して正常より低下した抗体又は細胞応答を有するあらゆる症状が含まれ、薬物（例えば、化学療法）治療のために低下した免疫を有する小さな脾臓を有する個体が含まれる。免疫疾患を有する個体の例には、例えば、高齢の患者、化学療法又は放射線療法を行っている個体、大病から回復した個体又は手術を行おうとしている個体、ＡＩＤＳを有する個体、低ガンマグロブリン血症、一般的な多様な無ガンマグロブリン血症及び選択的な免疫グロブリン欠乏（例えば、ＩｇＡ欠乏）などの先天性及び後天的Ｂ細胞欠乏を有する患者、患者の免疫応答より短いインキュベーション時間で狂犬病などのウイルスに感染した患者、及びディジョージ症候群などの遺伝性疾患を有する個体が含まれる。
【０２９２】
本発明のｈＧＨアンタゴニストポリペプチドは、巨人症及び末端肥大症状、糖尿病及び糖尿病に起因する合併症（糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症）、血管性眼疾患（例えば、増殖性新血管形成を含む。）、神経症及びＧＨ反応性悪性腫瘍の治療にとって有用であり得る。
【０２９３】
血管性眼疾患には、例えば、（例えば、未熟児又は鎌型赤血球貧血症によって引き起こされる）網膜症及び黄斑変性が含まれる。
【０２９４】
ＧＨ反応性悪性腫瘍には、例えば、ウィルムス腫瘍、肉腫（例えば、骨原性肉腫）、乳癌、大腸癌、前立腺癌及び甲状腺癌並びにＧＨ受容体ｍＲＮＡを発現する組織（すなわち、胎盤、胸腺、脳、唾液腺、前立腺、骨髄、骨格筋、気管、脊髄、網膜、リンパ節及びバーキットリンパ腫、大腸直腸癌、肺癌、リンパ芽球性白血病及び悪性黒色腫から得た組織）の癌が含まれる。
【０２９５】
本発明のｈＧＨアゴニストポリペプチドは、例えば、慢性腎不全、慢性腎不全（ＣＲＩ）に伴う成長不全、ターナー症候群に伴う低身長、小児性プラダーウィリ症候群（ＰＷＳ）、消耗又は悪液質を有するＨＩＶ患者、不当軽量児（ＳＧＡ）として生まれた子供、肥満及び骨粗鬆症を治療するのに有用であり得る。
【０２９６】
ｈＧＨの平均量は変動することができ、特に、資格を有する医師の推奨及び処方に基づくべきである。ｈＧＨの正確な量は、治療されている症状の正確な種類、治療されている患者の状態及び組成物中の他の成分などの因子に従う好みの問題である。与えられるべき量は、ｈＧＨを用いた治療に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
【０２９７】
本発明の医薬組成物は、従来の様式で製造され得る。
【０２９８】
ＸＩＩ．製品
本発明の別の実施形態において、本発明の製剤を含有する製品が提供され、及びその使用のための指示書を提供する。製品は容器を含む。製品は、凍結乾燥された形態、液体形態、スプレー乾燥された形態、凍結された形態又は他の形態など（これらに限定されない。）、本発明の製剤を含有し得、及び必要であれば、その調製又は再構成のための指示書を含有し得る。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、注射器、自動注射装置及び試験チューブが含まれるが、これらに限定されない。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は製剤を保持し、及び容器の上にラベルを保持し、若しくは容器にラベルが添付され、容器は、必要であれば、凍結乾燥された製剤の再構成及び／又は使用のための指示を示し得る。例えば、ラベルは、製剤が特定のタンパク質濃度へ再構成されることを示し得る。さらに、ラベルは、製剤が皮下投与に有用であり、又は皮下投与を意図されることをさらに示し得る。製剤を保持する容器は、単回使用又は複数回使用のバイアルであり得る。一実施形態において、製剤を保持する容器は、単回使用のバイアルである。製品は、さらに、適切な希釈剤を含む第二の容器を含み得る。一実施形態において、適切な希釈剤は、注射用の滅菌水又は静菌水（米国薬局方）である。必要に応じて、希釈剤と凍結乾燥された製剤を混合すると、製剤中の最終タンパク質濃度は、一般的には、約２ｍｇ／ｍＬと約５０ｍｇ／ｍＬの間であり得る。必要に応じて、希釈剤と凍結乾燥された製剤を混合すると、製剤中の最終タンパク質濃度は、一般的には、約２ｍｇ／ｍＬと約２５ｍｇ／ｍＬの間であり得る。製剤中の最終タンパク質濃度は、一般的には、約２ｍｇ／ｍＬと約２５ｍｇ／ｍＬの間であり得る。一実施形態において、最終タンパク質濃度は約８ｍｇ／ｍＬである。製品は、さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器及び使用説明書付き添付文書など、商業的見地及び使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０２９９】
実施例
特許請求の範囲に記載された本発明を説明するために以下の実施例を提供するが、本発明を限定するためのものではない。
【実施例１】
【０３００】
Ｍｅｔ−Ｙ３５ｐＡＦ  ｈＧＨのための製剤のための材料及び方法
本実施例は、ＰＥＧと抱合する前の保存の間にＭｅｔ−Ｙ３５ｐＡＦ  ｈＧＨのタンパク質構造及び活性を保存する適切な条件及び賦形剤を同定及び評価した製剤研究について述べる。ｈＧＨの液体製剤は、（１）ｐＨ７．３の、２．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、２０ｇ／Ｌグリシン、２ｇ／Ｌマンニトール、２ｇ／Ｌ乳糖、又は（２）ｐＨ６．０の、クエン酸ナトリウム、２０ｇ／Ｌグリシン、５ｇ／Ｌマンニトールを含有する凍結した製剤である。ＰＥＧ−ｈＧＨの０．５ないし４ｍｇ／ｍＬの推定用量を活性成分として添加する。これらの製剤は、現在、−２０℃で保存されている。天然においてコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨの単回用量の凍結乾燥製剤、又は天然においてコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨの液体製剤の開発が望まれる。
【０３０１】
方法
Ｍｅｔ−Ｙ３５ｐＡＦ  ｈＧＨの物理的及び化学的安定性を特徴付けるために、いくつもの方法を実施した。これらの方法は、ＰＥＧ化されたｈＧＨを使用する製剤研究において使用されうる。
【０３０２】
Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｇｅｌ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−Ｒ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥは、専ら分子量に基づいてｈＧＨ分離して、生じ得る全ての分解産物を可視化させるが、この技術は、全てのジスルフィド結合を完全に開裂させ、ポリペプチドを完全にアンフォールディングさせるからである。還元剤なしでタンパク質がアンフォールディングされ、したがってジスルフィド結合が完全な状態のままに保たれるので、非還元型ゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ＮＲ）は、分子量に基づいた分子の分離を与え、生じ得るｈＧＨの二量体の同定を可能にした。
【０３０３】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、熱変性によるアンフォールディングのΔＨ（エンタルピー）を測定した。この技術は、タンパク質の全体的な融解温度（Ｔｍ）の上昇又は低下に反映されるタンパク質の安定性に及ぼす様々な溶液条件及び賦形剤の効果を評価した。使用される別の技術は、相対的な疎水性に基づいて分子を分離する逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）であった。特に、この方法を使用して、脱アミノ化及び酸化などの構造修飾と関連した疎水性及び保持挙動の微妙な差異に基づいてｈＧＨを分離した。
【０３０４】
マトリクス及び溶液
４８個の組み合わせの製剤マトリクスを米国薬局方級又は高分析級のいずれかの賦形剤とともにデザインした。使用されるマトリクス、試料調製物及び手法は以下（表１）のとおりであった。
【０３０５】
【表１】
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【０３０６】
すべての賦形剤の原液をろ過滅菌し、日付を記入し、４℃で保存した。糖類を１００ｍＭ原液として、（ＮＨ４）ＳＯ４を１Ｍ原液として、アミノ酸を以下の原液濃度、すなわち１Ｍグリシン、６６６ｍＭアルギニン、又は１Ｍグルタミン酸塩で調製した。
【０３０７】
特異的緩衝液は、（ろ過滅菌し日付を入れた）２５０ｍＭないし１Ｍ原液として実験日に調製し、賦形剤を終濃度へ添加し、ろ過滅菌し、４℃で保存した。
【０３０８】
試料の調製
ＷＨＯ緩衝液中の、位置３５に置換された非天然アミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを有するメチオニル−ｈＧＨ（ＭｅｔＹ３５ｐＡＦ  ｃＢ１）の試料を、４．４２５ｍｇ／ｍＬで、６個の異なるバイアルへ割り当て、研究日まで−８０℃で凍結した。実験日に、ＭｅｔＹ３５ｐＡＦを０．１ないし０．５ｍＬＳｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ中での透析によって、４℃の特異的緩衝液へと緩衝液交換した。４２５ｍｇ／ｍＬのＭｅｔ−Ｙ３５ｐＡＦ  ｈＧＨの約８００μｌを、２５０ｍＬの緩衝液中で少なくとも４時間透析し、透析緩衝液を一晩の透析のために交換した（２５０ｍＬ）。５００ｍＬを使用することによって、ＷＨＯ緩衝液賦形剤の１０，０００，０００倍希釈が得られた。
【０３０９】
試料を透析から取り出し、濃度を測定した。適切な濃度になるように各試料を希釈した。ＤＳＣの場合、望ましい最終濃度は０．７５ｍｇ／ｍＬ（４５０μｌ容積）であった。ＲＰ−ＨＰＬＣの場合、最終濃度は２ｍｇ／ｍＬ（３０μｌ容積）であった。マトリクスの各個々のグループについて、１０個の試料をＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。４個の時点（３日間、１週間、２週間及び１ヶ月間）を可能とするのに十分な試料を４℃でチューブ中に保存した。５回の凍結／解凍周期に十分な試料を、−８０℃でバイアル中に保存した。本研究の一部として完了した凍結／解凍周期の回数（１、２、３、４及び５周期）の前に、１回又は２回のさらなる凍結／解凍周期が存在してもよい。０時点における４℃の試料は、ＨＰＬＣバイアル中に直ちに入れた。
【０３１０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−Ｒの場合、材料の３０μｇ（２ｍｇ／ｍＬで０．０１５ｍＬ）を分析に使用した。試料は、ＲＰ−ＨＰＬＣについて示されるように、３個のバイアルへ一定分量に分注した。
【０３１１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ＮＲの場合、材料の３０μｇ（２ｍｇ／ｍＬで０．０１５ｍＬ）を分析に使用した。試料は、ＲＰ−ＨＰＬＣについて示されるように、３個のバイアルへ一定分量に分けた。何れの場合にも、全ての残余試料を−８０℃で即時凍結した。
【実施例２】
【０３１２】
Ｍｅｔ−Ｙ３５ｐＡＦ  ｈＧＨについての製剤研究の結果
緩衝液ｐＨ
すべての製剤緩衝液のｐＨを、４℃で６週間後に分析した。図１に示される炭酸水素ナトリウム（グループＥ）を除き、選択されたすべての緩衝液のｐＨは６週間にわたって安定であることが明らかとなった。グループＥのｐＨは経時的に上昇した。
【０３１３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−Ｒ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ＮＲ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元型及び非還元型ゲルを用いた試料の分析によって、４℃で４週間（１ヶ月間）後又は５回の凍結／解凍周期の間のいずれにおいても変化が示されなかった。二量体形成も分解産物も、本方法によって見出されなかった。（４℃でｔ＝０、ｔ＝４週間での）グループＡの還元型ゲルは図２Ｃ及び２Ｄとして示し、（４℃でｔ＝０、ｔ＝４週間での）グループＢの非還元型ゲルは図２Ａ及び２Ｂとして示す。
【０３１４】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＭｅｔＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨの熱安定性に対する緩衝液及び賦形剤の効果を図３ないし８として示す。図３ＡないしＦは、製剤グループＡないしＦの上書きされた熱特性を示す。図５は、全マトリクスについてのＤＳＣ融解温度及びＴｍへの変化を要約する表を提供する。マトリクスのＢ７及びＦ２からの熱特性を図４ＡないしＢに示す。
【０３１５】
緩衝液Ａは、図５及び６に示されるように最低のＴｍを示した。アルギニンは、図５及び６のマトリクスのＢ７及びＣ７に示されるように、グループＢ及びＣにおけるＴｍを上昇させた。より高いｐＨ（つまり、ｐＨ＞７．０）では、ＭｅｔＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨはより大きな熱安定性を示したが、図３及び４に示されるずっと高い融点及びより幅広い曲線を有するさらなる部分集団を示した。これらの部分集団は、より大きな安定性又は凝集傾向を示しうる。アミノ酸、特にＡｒｇ及びＧｌｕは、（ＮＨ４）２ＳＯ４と同様、より高いｐＨでＴｍ値を低下させた。糖類は全体的なＴｍに効果を及ぼさなかった。
【０３１６】
図７に示されるすべての群について、ΔＨｖ／ΔＨの比を分析した。組換えｈＧＨはΔｖ／ΔＨ＞４を示すことが公知である。この比の変動を観察し、これらの値はＭｅｔＹ３５ｐＡＦが不可逆的であることを示す。ｐＨが上昇するにつれ、さらなる部分集団を同定した（グループＦの第２の部分集団についての比も、図７でのｐＨ７．５でプロットした。）。各試料のエンタルピー（ＡＵＣ）の変化は、より高いｐＨを除き、図８に示されるものと同様であった。全てのグループについてΔＨ（適合のＡＵＣ）をプロットし、同様の値が各群内で得られることを確認した。
【０３１７】
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、４℃で４週間保存する間のＭｅｔＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨの純度及び化学的分解を分析した。それぞれＭｅｔＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨをＷＨＯ  ｈＧＨ標準物質と比較するグループＢ、Ｃ、Ｅ及びＦについてのデータ群が、図９ＡないしＤに示されている。図１０Ａは、グループＥ５中に存在する異なるピーク（主要ピーク、一次脱アミノ化／酸化ピーク、二次脱アミノ化ピーク）を分析するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアの使用を示す。一次脱アミノ化／酸化ピークは、図１０Ｂ及び１１に示されるように、グループＥで経時的に増大し、また、より高いｐＨは、より低いｐＨに比べて、脱アミノ化／酸化の量が大きいことを示した。図１２は、二次脱アミノ化／酸化ピークがすべての製剤グループで経時的にあまり変動しないことを示したことを示す。主要ＧＨピークは図１３に示されるように、すべての製剤グループについて経時的に低下したが、グループＢ及びＣは他のグループと比較して変化がより少なかった。グループＡは、脱アミノ化が非常に乏しかったが、主要ＧＨピークは経時的に低下し、公知の脱アミノ化／酸化ピーク以外のさらなるピークが経時的に発達した。しかしながら、グループＡのデータは、ＭｅｔＹ３５ｐＡＦがこのｐＨで０ないし３日間かなり安定であることを示しているが、ＰＥＧ化反応は１ないし２日間にわたってｐＨ４．０で起こるので、これは重要である。
ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、凍結−解凍周期を経験した試料も分析した。Ｂ及びＣ内の個々のグループは図１４（一次脱アミノ化／酸化ピーク）及び図１５（二次脱アミノ化ピーク）において示されるのと同様に出現した。２回の凍結／解凍周期の後、主要ＧＨピークは図１６に示されるように低下し、凍結／解凍効果を示した。しかしながら、１回又は２回の凍結／解凍周期は、この製剤研究の開始前にこの試料で生じた。
【０３１８】
発見された知見の要約
ｈＧＨがより低いｐＨで高度に柔軟な構造を示すこと、及びｈＧＨがより高いｐＨで非常に硬い構造を形成することは十分に確立されている（Ｋａｓｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２００２  ３１８：６７９−６９５）。
【０３１９】
検査した緩衝液のうち、ｐＨ６．０での緩衝液Ｂ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム）は、ＭｅｔＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨの化学的及び熱力学的安定性に関して最高の挙動を示すことがわかった。ｐＨ６．０でのアルギニンの添加は、ＭｅｔＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨの熱安定性を上昇させた。このとき、糖類は、ＭｅｔＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨに対して正の効果も負の効果も及ぼさなかったが、糖類はＰＥＧ化事象前後のｐＨシフトについて重要でありうる。経時的なオキシム連結も、ｐＨ７．５などのより高いｐＨに比べて、ｐＨ６．０においてより安定であるように見える。
【実施例３】
【０３２０】
ＰＥＧ−ｈＧＨの安定性特性を、加速した安定性条件の下で、重要な製剤パラメータを用いて検査し、主要な分解産物を同定し、安定性を示すアッセイを確認する。単回用量の製剤開発の主な目的は、最低限、冷蔵温度で十分な保存安定性が得られるように製剤を最適化することであり、外界温度で保存した場合にも、十分な保存安定性を有しうる。凍結乾燥した製剤の開発に加えて、露光及び撹拌に対する感度、ＰＥＧ化されたｈＧＨをＰＥＧ化されていない形態と識別するＲＰ−ＨＰＬＣ法の開発、構造分析及びその他の研究について、さらなる研究が調査を行っている。適切な凍結乾燥製剤は通常、以下の属性、すなわち、製剤時及び充填完了時の取り扱いについての溶液中での安定性、凍結乾燥時の良好な安定性、良好な保存安定性、乾燥状態におけるネイティブ構造（該当する場合）、明白な試料崩壊又は再融解がないこと、最適な湿気含有レベル、高いガラス遷移温度、頑丈なケーキ構造、効率のよい乾燥周期、疼痛を伴う最少の注射、再構成されるときに１分以内に注射可能な水充填物中に溶解することを示す。いくつかの実施形態において、最適な湿気含有レベルは、凍結乾燥された製剤の場合、３％未満の水である。好ましい実施形態において、最適な湿気含有レベルは、凍結乾燥した製剤の場合、１％未満の水である。
【０３２１】
製剤変数を求める。凍結乾燥した製剤の候補の安定性を、４０℃、外界温度、冷蔵温度で、週ごとに、最長４週間、６週間、及び２ヶ月間まで検討した。また、凍結乾燥した製剤の候補の安定性を、外界温度及び冷蔵温度で、３、４、及び６ヶ月の増分まで検討した。２ないし８℃で１週間保存する際の各製剤の再構成された形態の安定性についても検査した。分析方法には、上述のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及び他の構造分析が含まれる。
【０３２２】
最も安定な製剤について凍結乾燥周期を最適化するのに有用な基本的なパラメータを求める。例えば、崩壊温度（又はガラス遷移温度）、アニーリング温度及び凍結した製剤の他の重要な物理的特性を求める。理想のケーキが最適化した周期で得られることを確認するために、検査凍結乾燥工程を実施する。
【実施例４】
【０３２３】
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、相対的な疎水性に基づいて分子を分離する技術である。試料は、炭水化物鎖へ共有結合されたシリカの固定相を通過する。対象分子が固定相により遅滞され、均一濃度の溶媒で溶出する。クロマトグラフィー溶出時間は特定の分子について固有である。本方法は、脱アミノ化などの構造上の修飾と関連した疎水性及び保持挙動の微妙な差異に基づいてｈＧＨを分離する。
【０３２４】
Ｃ４  ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、組換えヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の相対的な純度及び潜在的な化学分解（脱アミノ化及び酸化）を評価した。本方法を使用して、ｈＧＨの同定及び純度評価を支持した。本技術を使用して、ｈＧＨのいくつかの部分分解の産物を観察した。本技術についての参考文献には、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２００２，  ｐ．  １９３；  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２００１，  ｐ．１９３８  −  １９３９、及びＲ．Ｍ．  Ｒｉｇｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６７，  １９９−２０９  （１９８７）による「Ａ  Ｒｅｖｅｒｓｅｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ」がある。
【０３２５】
本手法のための装置には、以下のもの又はその均等物が含まれる。ＵＶ／可視光分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３又は均等物）、５０μｌクォーツキュベット、ＰＤ−１０、  Ｎａｐ−１０、又はＮａｐ５脱塩カラム（試料容積に依存、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｎａｐ５カラム１７−０８５３−０２又は均等物）、（必要な場合）０．５ｍＬＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  １０，０００  ＭＷＣＯ，  ＰＥＳ，  ＶＳＯ１０２又は均等物）、ＨＰＬＣバイアル及びキャップ（Ａｌｌｔｅｃｈ１００μｌねじキャップポリプロピレンバイアル１２９６２番、ＴＦＥライナーキャップ７３０４８番、開口ねじキャップ７３０４４番、又は均等物）、清潔な１及び２Ｌガラス瓶、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４  ２１４ＴＰ５４などのカラム、４．６×２５０ｍｍ、５μの粒子サイズ及び３００Åの孔サイズの寸法のＣ４シリカ逆相ＨＰＬＣカラム、及び（真空脱気装置、四つ組ポンプ、サーモスタットつき自動サンプリング装置、サーモスタットつきカラム区画、ダイオード配列検出器（ＤＡＤ）、及びＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎクロマトグラフィーソフトウェアの装備されたＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣなどの）線形勾配を実施できる高圧液体クロマトグラフィー装置。
【０３２６】
本手法のための試薬には、別段の記載がなければ、分析用等級以上である固体の化学物質、及びＨＰＬＣ等級以上である溶媒が含まれた。このような化学物質の例には、トリス−トロメタミン米国薬局方級スペクトルＴＲ１４９又は均等物、Ｎ−プロパノールＨＰＬＣ級９９．９％Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ３４８７１又は均等物、及び炭酸水素アンモニウム９９．５％超Ｆｌｕｋａ０９８３０番又は均等物が含まれる。さらなる溶液には、脱アミノ化対照用緩衝液（３０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ９．０）及び移動相溶液が含まれる。脱アミノ化対照用緩衝液の場合、炭酸アンモニウム２．３７ｇをミリＱ水０．９５Ｌへ溶解し、ｐＨをＮａＯＨで９．０にし、容積をミリＱ水で１Ｌにした。０．２２μｍＰＥＳフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ４３１０９８番、又は均等物）を使用して、得られた緩衝液をろ過滅菌した。移動相溶液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び２９％ｎ−プロパノール）の場合、６．０５ｇのトロメタミン（米国薬局方級、スペクトル１Ｒ１４９番又は均等物）を０．９５ＬのミリＱ水に溶解した。溶液をＨＣｌでｐＨ７．５にし、容積をミリＱ水で１Ｌにした。２つの溶媒（トリス及びプロパノール）を混合し、０．２２μｍＰＥＳフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ４３１０９８番又は均等物）を使用して混合物をろ過滅菌した。
【０３２７】
ＲＰ−ＨＰＬＣにおける標準物質として使用するための試料には、水１．０ｍｌで１．９ないし２．１ｍｇ／ｍＬへ再構成された世界保健機構（ＷＨＯ）ｈＧＨ（カタログ番号９８／５７４）が含まれる。他のｈＧＨ参考標準物質は１．９ないし２．１ｍｇ／ｍＬ濃度で使用しうる。分離溶液の場合、ＰＤ−１０、Ｎａｐ−１０又はＮａｐ−５脱塩カラム（試料容積に依存する）を使用して、３０ｍＭ炭酸水素ナトリウムｐＨ９．０緩衝液中へｈＧＨ標準物質を緩衝液交換する。０．５ｍＬのＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置を使用して、１．９ないし２．１ｍｇ／ｍＬになるように標準物質を濃縮し、３７℃で２４時間インキュベートした後、用時まで−８０℃で保存した。分析のために、２．０ｍｇ／ｍＬタンパク質濃度になるように検査材料を希釈した。標準技術を使用して試料濃度を測定した。
【０３２８】
操作
以下の条件で、装置をセットアップした。１）カラム：Ｖｙｄａｃ  Ｃ４  ２１４ＴＰ５４カラム、２）ポンプセットアップ勾配：均一濃度、流速０．５ｍｌ／分、時間９０分、最大圧２００バール、３）自動サンプリング装置温度：４℃、４）注入器セットアップ―注入：標準注入、注入容積：２０μｌ、引き抜き速度：１００μｌ／分、針洗浄：水で１００μｌ、注入速度：１００μｌ／分、停止時間：ポンプに同じ、５）ＤＡＤ信号―表２、ピーク幅０．１分超、スリット４ｎｍ、停止時間：７５分、
【０３２９】
【表２】
2008525494.tif 000004
【０３３０】
６）カラムサーモスタット―温度：４５℃、保存：温度、７）予備積分事象―傾斜感度：０．１、ピーク幅０．５、面積除去：１．０、高さ除去：１．０、積分オン：１０分間であった。
【０３３１】
移動相の１０カラム容積（４１．５ｍｌ＝０．５ｍｌ／分で８３分間）で、カラムを平衡化した。自動サンプリング装置を使用して標準物質２０μｌを注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。ＷＨＯ標準物質の保持時間が３３ないし３５分でない場合、又は他の標準物質が３７ないし４０分でない場合、移動相の組成を調整し、カラムを再度平衡化し、標準物質を再度測定した。示唆される調整には、保持時間が３３分未満の場合、移動相１Ｌにつき５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の５ｍｌ未満を、保持時間が３５超の場合、ｎ−プロパノール２ｍｌ未満を添加することが含まれた。プロパノールの蒸発が生じうるため、試料を検査する各日に標準物質を測定し、緩衝液をそれに従って調整した。
【０３３２】
分離溶液の２０μｌを注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。デスアミドｈＧＨは、先頭のピークに対して約０．８５の保持時間で小さなピークとして現れた。ｈＧＨ及びデスアミドｈＧＨに対応するピーク間の分離が少なくとも１．０であり、ｈＧＨピークの対称因子が０．８ないし１．８でなければ、検査は有効ではなかった。試料を３回測定した。平均保持時間を報告した。
【０３３３】
さまざまな条件及び／又はパラメータへの修飾が、ＰＥＧ化されたｈＧＨ及び他の形態を分析するのに必要でありうる。ＲＰ−ＨＰＬＣへの修飾は、当業者に公知である。
【０３３４】
データ解析
検査品の平均保持時間を標準物質と比較した。検査品の平均純度：（主要ピークの積分面積／全ピークの積分面積）×１００％を算出した。溶媒に起因するピークは一切認められなかった。
【０３３５】
ＷＨＯｈＧＨ標準物質を用いてＭｅｔＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨについてＲＰ−ＨＰＬＣからの結果を表３及び図１７に記載する。検査品と参考標準物質との保持時間差などの仕様及び純度は、異なる分子又は分子の形態とともに変動しうる（すなわち、ｍｅｔＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨと比較したＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨ）。
【０３３６】
【表３】
2008525494.tif 000005
2008525494.tif 000006
【実施例５】
【０３３７】
サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）は、移動相分子によって浸透される多孔性マトリクスとして固定相を使用する技術である。多孔性構造に入るのに十分小さな試料分子が遅滞するのに対し、より大きな分子は排除され、それゆえカラムを通して迅速に運搬される。したがって、サイズ排除クロマトグラフィーは、サイズによって分子を分離し、クロマトグラフィー溶出時間は特定の分子について固有である。
【０３３８】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して、組換えヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の有効性を評価した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、（ＰＥＧ化された及びＰＥＧ化されていない）単量体ｈＧＨの％を測定する方法であった。本技術を使用して、二量体及び他の高分子量タンパク質を観察することができた。したがって、本技術は、ＰＥＧ化された形態及びＰＥＧ化されていない形態と同様、試料中の単量体を、二量体及び他の分子量のより大きな物質から分離する。本技術についての参考文献には、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２００２，  ｐ．  １９３、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２００１，  ｐ．１９４１、及びＲ．Ｍ．  Ｒｉｇｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４３５（１９８８），  ｐ．  ３０７−３１８による「Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｉｚｅ−Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」が含まれるが、これらには限定されない。
【０３３９】
本手法用の装置には、以下のもの又はその均等物、すなわち、ＵＶ／可視光分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３又は均等物）、５０μｌクォーツキュベット、（必要な場合）０．５ｍＬＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ１０，０００ＭＷＣＯ、ＰＥＳ、ＶＳ０１０２又は均等物）、ＨＰＬＣバイアル及びキャップ（Ａｌｌｔｅｃｈ１００μｌねじキャップポリプロピレンバイアル１２９６２番、ＴＦＥライナーキャップ７３０４８番、開口ねじキャップ７３０４４、又は均等物）、清潔な１及び２Ｌガラス瓶、ＴｏｓｏｈａａｓＴＳＫ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００  １８６７５及びＳｕｐｅｒＳＷガードカラム１８７６２などのカラム、４．６×３５ｍｍ及び４μ粒子サイズの寸法を有するガードカラムとともにある４．６×３００ｍｍ、粒子サイズ４μｍ及び孔サイズ２５０Åの寸法を有するシリカベースのゲルろ過ＨＰＬＣカラム、（真空脱気装置、四つ組ポンプ、サーモスタットつき自動サンプリング装置、サーモスタットつきカラム区画、ダイオード配列検出器（ＤＡＤ）、屈折率検出器（ＲＩＤ）及びＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎクロマトグラフィーソフトウェアの装備されたＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣなどの）線形勾配を実施できる高圧液体クロマトグラフィー装置が含まれた。
【０３４０】
本手法用の試薬には、別段の記載がなければ、分析用等級以上である固体の化学物質及びＨＰＬＣ等級以上である溶媒が含まれた。このような化学物質の例には、一塩基性リン酸ナトリウムスペクトル米国薬局方級Ｓ０１３０又は均等物、二塩基性リン酸ナトリウムスペクトル米国薬局方級Ｓ０１４０又は均等物、２−プロパノールＦｉｓｈｅｒＨＰＬＣ級Ａ４５１−４又は均等物が含まれる。さらなる溶液には、移動相溶液（６３ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０の９７％、２−プロパノールの３％）が含まれる。移動相溶液を調製するため、二塩基性リン酸ナトリウム２６．８ｇを１ＬのミリＱ水に溶解し、１３．７９ｇの一塩基性リン酸ナトリウムを１ＬのミリＱ水に溶解した。２つの溶液を混合し、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液を付与した。１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０緩衝液をミリＱ水で６３ｍＭへ希釈した。６３ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０の９７０ｍＬを２−プロパノールの３０ｍＬ（又は６３ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０の９７％、２−プロパノールの３％を得るための他の適切な容積）と混合した。０．２２μＰＥＳフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ４３１０９８番、又は均等物）を使用して、得られた緩衝液をろ過滅菌した。溶液Ａは、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０である。１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０の２５０ｍＬを７５０ｍＬのミリＱ水で希釈した。０．２２μｍＰＥＳフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ４３１０９８番、又は均等物）を使用して、得られた緩衝液をろ過滅菌した。
【０３４１】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣにおいて標準物質として使用するための試料には、水１．０ｍｌで再構成され、０．９ないし１．１ｍｇ／ｍＬへ希釈される世界保健機構（ＷＨＯ）ｈＧＨ（カタログ番号９８／５７４）が含まれる。他のｈＧＨ参考標準物質は０．９ないし１．１ｍｇ／ｍＬ濃度で使用しうる。分離溶液について、ｈＧＨ標準物質を５０℃で１２ないし２４時間インキュベートし、溶液Ａに溶解した後、溶液Ａで１ｍｇ／ｍＬへ希釈し、−８０℃で用時まで保存した。検査材料を溶液Ａで１．０ｍｇ／ｍＬへ希釈した。標準技術を使用して試料濃度を測定した。
【０３４２】
操作
装置を以下の条件でセットアップした。１）カラム：ＴＳＫＳｕｐｅｒＳＷ３０００  １８６７５及びガードカラム１８７６２自動サンプリング装置、２）温度：室温、３）ポンプセットアップ―勾配：均一濃度、流速０．３ｍｌ／分、時間２５分、最大圧１２０バール、４）注入器セットアップ―注入：標準注入、注入容積：２０μｌ、引き抜き速度：１００μｌ／分、注入速度：１００μｌ／分、針洗浄：水１００μｌ、停止時間：ポンプに同じ、４）ＤＡＤ信号―表４、ピーク幅０．０５分超、スリット：２ｎｍ、停止時間：ポンプに同じ、
【０３４３】
【表４】
2008525494.tif 000007
【０３４４】
５）ＲＩＤ信号―温度：３５℃、反応時間：０．２分超、４秒間、標準、６）カラムサーモスタット：温度：２３℃、保存：温度であった。
【０３４５】
カラムを移動相の１０カラム容積（５０ｍｌ＝０．３ｍｌ／分で１６６分間）で平衡化し、試料を注入する前にＲＩＤを２０分間パージした。分離溶液２０μｌを注入した。得られたクロマトグラムにおいて、１）主要なＰＥＧ化されていないピークは、約１３ないし１３．５分の保持時間で溶出し、２）ｈＧＨ二量体に対応するピークは、約１２．２ないし１２．６分の保持時間で溶出し、及び３）より大きな分子量のタンパク質（ＰＥＧ化されていない）は、７．４ないし８．０分の相対的な保持時間で溶出した。主要なＰＥＧ化したピークは、約８．３ないし８．８分の保持時間で溶出した。標準物質２０μｌを注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。検査品２０μｌを注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。試料を３回測定した。平均保持時間を記録した。
【０３４６】
ＰＥＧ化されたｈＧＨ又は他の形態をさらに特徴付けるために、さまざまな条件及び／又はパラメータに対する修飾が必要でありうる。ＳＥＣ−ＨＰＬＣに対する修飾は当業者に公知である。
【０３４７】
データ解析
ｈＧＨ検査品の保持時間を標準物質と比較する。ＰＥＧ化されていないｈＧＨの純度を求めるために、ｈＧＨ検査品及び標準物質の積分した主要ピーク面積を比較し、ｈＧＨ検査品における単量体の％：（ｈＧＨ試料のピーク面積／標準物質のピーク面積）×１００％を算出する。ｈＧＨ検査品における二量体及び／又はより高次の凝集体の％も算出する。ＰＥＧ化されたｈＧＨの純度を求めるため、ＰＥＧ化されたｈＧＨ試料及び標準物質の積分した主要ピーク面積を比較し、ＰＥＧ化されたｈＧＨ試料におけるＰＥＧ化した単量体の％を、（ＰＥＧ化されたｈＧＨ試料のピーク面積／標準物質のピーク面積）×１００％によって算出する。ｈＧＨ検査品におけるＰＥＧ化した二量体、より高次の凝集体及びＰＥＧ化されていない単量体の割合も算出する。あるいは、ＰＥＧ化されていないｈＧＨ又はＰＥＧ化されたｈＧＨの純度を、（ｈＧＨ試料の主要ピークの積分面積／ｈＧＨ試料の全ピークの積分面積）×１００％によって求める。溶媒に起因するピークは一切認められなかった。純度決定は、参考標準物質の％によるのではなく、絶対質量又は直接的なピーク面積を使用しても算出される。
【０３４８】
仕様：ｈＧＨ検査費と標準物質との保持時間差は約±３０秒未満である。二量体及びより大きな分子量のタンパク質の場合、検査品で得られたクロマトグラムにおいて、主ピークの保持時間よりも短い保持時間を有する全てのピークの面積の合計は、それぞれ、ピークの総面積の４．０％又は６．０％以下である。溶媒に起因するピークは一切認められなかった。
【０３４９】
図１８は、３０ＫのＰＥＧ−ｍｅｔＹ３５ｐＡＦ及びｍｅｔＹ３５ｐＡＦからのＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを示す。
【実施例６】
【０３５０】
陽イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ｃＩＥＸ−ＨＰＬＣ）
陽イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ｃＩＥＸ−ＨＰＬＣ）は、タンパク質と樹脂上に固定された電荷との電荷−電荷相互作用に基づく技術である。陽イオン交換クロマトグラフィーは、負に荷電した樹脂へ結合するタンパク質の正に荷電したイオンを利用する。ｈＧＨの共通の構造上の修飾は、アスパラギン（Ａｓｎ）残基の脱アミノ化であり、このｃＩＥＸ−ＨＰＬＣ法によって、ＰＥＧ化された及びＰＥＧ化されていないｈＧＨの脱アミノ化物及び脱アミノ化中間体の分離が可能となる。
【０３５１】
以下の方法を使用して、組換えヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の相対的な純度及び潜在的な化学分解（つまり、脱アミノ化）を評価した。本方法を使用して、ＰＥＧ化された及びＰＥＧ化されていないｈＧＨの同定及び純度評価を支持した。ｈＧＨの幾らかの部分分解の産物が、本技術を使用して観察可能であった。
【０３５２】
本手法のための装置には、以下のもの又はその均等物、ＵＶ／可視光分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３又は均等物）、５０μｌクォーツキュベット、（必要な場合）０．５ｍＬＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  １０，０００ＭＷＣＯ、ＰＥＳ、ＶＳ０１０２又は均等物）、ＨＰＬＣバイアル及びキャップ（Ａｌｌｔｅｃｈ１００μｌねじキャップポリプロピレンバイアル１２９６２番、ＴＦＥライナーキャップ７３０４８番、開口ねじキャップ７３０４４番、又は均等物）、清潔な１及び２Ｌガラス瓶、ＰｏｌｙＣＡＴ  Ａ  ４．６×２００ｍｍ、５μ、１０００Å（２０４ＣＴ０５１０）及びＰｏｌｙＣＡＴ  Ａガードカラム、４．６×１０ｍｍ、５μ、１０００Å（ＪＧＣＣＴ０５１０）などのカラム、及び（真空脱気装置、四つ組ポンプ、サーモスタットつき自動サンプリング装置、サーモスタットつきカラム区画、ダイオード配列検出器（ＤＡＤ）、屈折率検出器（ＲＩＤ）及びＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎクロマトグラフィーソフトウェアの装備されたＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣなどの）線形勾配を実施できる高圧液体クロマトグラフィー装置が含まれた。
【０３５３】
本手法のための試薬には、別段の記載がなければ、分析用等級以上である固体の化学物質、及びＨＰＬＣ等級以上である溶媒が含まれた。このような化学物質の例には、酢酸アンモニウムスペクトルＨＰＬＣ級Ａ２１４９又は均等物、アセトニトリルＦｉｓｈｅｒＨＰＬＣ級Ａ９９８又は均等物、炭酸水素アンモニウムが含まれる。さらなる溶液には、移動相Ａ（４０％アセトニトリル、Ｈ２Ｏ）、移動相Ｂ（４０％アセトニトリル、５００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５）及び脱アミノ化対照についての緩衝液（３０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐ９．０）が含まれる。移動相Ａの緩衝液について、４００ｍＬのＨＰＬＣ級アセトニトリルを６００ｍｌのろ過滅菌したミリＱ水と混合し、０．２２μｍＰＥＳフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ４３１０９８番）又は均等物を使用して、得られた混合物をろ過滅菌した。移動相Ｂの緩衝液について、３８．５４ｇの酢酸アンモニウムを９７０ｍＬのミリＱ水に溶解した。溶液を氷酢酸でｐＨ４．５にした後、容積をミリＱ水で１０００ｍＬにした。０．２２μｍＰＥＳフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ４３１０９８番）を使用して、緩衝液をろ過滅菌した。１００ｍＬのミリＱ水、４００ｍＬのＨＰＬＣ級アセトニトリル及び５００ｍＬの５００ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４．５を混合した。脱アミノ化対照用緩衝液の場合、炭酸水素アンモニウム２．３７ｇを０．９５ＬのミリＱ水に溶解し、ｐＨをＮａＯＨで９．０にした。次に、容積をミリＱ水で１Ｌにした。得られた緩衝液を、０．２２μｍＰＥＳフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ４３１０９８番、又は均等物）を使用してろ過滅菌した。
【０３５４】
ｃＩＥＸ−ＨＰＬＣにおける標準物質として使用するための試料には、水１．０ｍｌで再構成され、０．９ないし１．１ｍｇ／ｍＬへ希釈した世界保健機構（ＷＨＯ）ｈＧＨ（カタログ番号９８／５７４）が含まれた。他のｈＧＨ参考標準物質を０．９ないし１．１ｍｇ／ｍＬ濃度で使用しうる。分離溶液の場合、ＰＤ−１０、Ｎａｐ−１０、又はＮａｐ−５脱塩カラム（試料容積による）を使用して、ｈＧＨ標準物質を３０ｍＭ炭酸水素アンモニウムｐＨ９．０緩衝液へ緩衝液交換した。０．５ｍＬＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置を使用して、標準物質を０．９ないし１．１ｍｇ／ｍＬへ濃縮し、３７℃で２４時間インキュベートした後、−８０℃で用時まで保存した。検査品を１．０ｍｇ／ｍＬへ希釈した。脱アミノ化した分離標準物質を含んだ。あるいは、検査品及び標準物質をある範囲の濃度にわたって希釈する。標準技術を使用して試料濃度を測定した。
【０３５５】
操作
装置を次の条件でセットアップした。１）カラム：ＰｏｌｙＣＡＴ  Ａ  ２０４ＣＴ０５１０及びＪＧＣＣＴ０５１０、２）自動サンプリング装置温度：４℃、３）ポンプセットアップ―勾配：５０  ５０ないし２５０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４．５、
【０３５６】
【表５】
2008525494.tif 000008
【０３５７】
４）注入器セットアップ―注入：標準注入、注入容積：１５μｌ、引き抜き速度：５０μｌ／分、注入速度：５０μｌ／分、針洗浄：１５μｌＨ２Ｏ、停止時間：ポンプに同じ、５）ＤＡＤ信号―表５、ピーク幅０．１分超、スリット：４ｎｍ、停止時間：ポンプに同じ、
【０３５８】
【表６】
2008525494.tif 000009
【０３５９】
６）カラムサーモスタット：温度：２０℃、保存：温度であった。
【０３６０】
カラムを９０％移動相Ａ及び１０％移動相Ｂの１０カラム容積で平衡化した。分離溶液１５μｌを注入した。得られたクロマトグラムにおいて、主要なＰＥＧ化されていないピークは約６４ないし６７分の保持時間で溶出し、ＰＥＧ化されていない脱アミノ化ピークは約６２ないし６５分の保持時間で溶出し、主要なＰＥＧ化したピークは約４３ないし４６分の保持時間で溶出し、ＰＥＧ化されていない脱アミノ化ピークは約４１ないし４４分の保持時間で溶出する。標準物質１５μｌを注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。検査品１５μｌを注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。試料を３回測定した。平均保持時間を報告した。
【０３６１】
さまざまな条件及び／又は因子への修飾が、ＰＥＧ化されたｈＧＨ及び他の形態を分析するのに必要とされうる。ｃＩＥＸ−ＨＰＬＣへの修飾は当業者に公知である。さらなる参考標準物質には、バルクのｐＹ３５ｐＡＦの処理中の放出についての処理中のｐＹ３５ｐＡＦ、ＰＥＧ化したｐＹ３５ｐＡＦにおける残余遊離ｐＹ３５ｐＡＦを定量化するための精製したｐＹ３５ｐＡＦ及び精製したＰＥＧ−ｐＹ３５ｐＡＦが含まれるが、それらには限定されない。
【０３６２】
データ解析
ｈＧＨ検査品の保持時間を標準物質と比較し、ＰＥＧ化されていないｈＧＨ及びＰＥＧ化されたｈＧＨの純度決定を算出した。（ｈＧＨ試料の主要ピークの積分面積／ｈＧＨ試料の全ピークの積分面積）×１００％などの算出により、純度を決定しうる。溶媒によるいずれのピークも無視した。
【０３６３】
表６及び図１９は、３０ＫのＰＥＧｍＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨ及びｍＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨのｃＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【０３６４】
【表７】
2008525494.tif 000010
【実施例７】
【０３６５】
本実施例は、ｐ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＦ）誘導体及びｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体の合成について記載する。
【０３６６】
Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｂ．  Ａ．  Ｃ，  Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  Ｂｒｏｃｋ，  Ａ．，  Ｃｈｏ，  Ｃ．  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．  Ｇ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  （２００３）  ４２，  ６７３５−６７４６においてすでに記載された手法を使用して、ラセミ体ｐＡＦを合成した。
【０３６７】
ｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体を合成するため、以下の手法を完了した。室温（ＲＴ）で１時間撹拌された、ジクロロメタン（ＤＣＭ、７０ｍＬ）中の（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸（０．３８２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）及び１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（０．１６ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液へ、メトキシ−ポリエチレングリコールアミン（ｍ−ＰＥＧ−ＮＨ２、７．５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、Ｍｔ．３０Ｋ、ＢｉｏＶｅｃｔｒａ社製）及びジイソプロピルエチルアミン（０．１ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で４８時間撹拌した後、約１００ｍＬまで濃縮した。冷エーテル（８００ｍＬ）へ混合物を滴加した。ｔ−Ｂｏｃ保護した生成物を沈殿させ、ろ過により回収し、エーテル３×１００ｍＬにより洗浄した。ＤＣＭ（１００ｍＬ）に再度溶解し、エーテル（８００ｍＬ）で２回沈殿させることによって、さらに精製した。生成物を真空乾燥させると、７．２ｇ（９６％）を生じ、これをＮＭＲ及びニンヒドリン検査によって確認した。
【０３６８】
前述に得られた保護された生成物（７．０ｇ）の脱Ｂｏｃを、５０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（４０ｍＬ）中、０℃で１時間実施した後、ＲＴで１．５時間実施した。真空でＴＦＡのほとんどを除去した後、ヒドロキシルアミン誘導体のＴＦＡ塩をＨＣｌ塩へ、ジオキサン（１ｍＬ）中の４ＮＨＣｌを残渣へ添加することによって変換した。沈殿物をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、エーテル（８００ｍＬ）中に再度沈殿させた。最終生成物（６．８ｇ、９７％）をろ過により回収し、エーテル３×１００ｍＬで洗浄し、真空乾燥させ、窒素下で保存した。他のＰＥＧ（５Ｋ、２０Ｋ）ヒドロキシルアミン誘導体を、同一手法を使用して合成した。
【実施例８】
【０３６９】
本実施例は、非天然アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドに使用される発現方法及び精製方法について記載する。宿主細胞は、オルソゴナルｔＲＮＡ、オルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びｈＧＨコンストラクトで形質転換されている。
【０３７０】
凍結したグリセロールストックからの、形質転換したＤＨ１０Ｂ（ｆｉｓ３）細胞の小さな穿刺を、まず、１００μｇ／ｍｌアンピシリンの入った２ｍｌの所定の培地（ロイシン、イソロイシン、微量金属、及びビタミンで補強されたグルコース最小培地）中で３７℃で生育させた。ＯＤ６００が２ないし５に到達した時点で、６０μｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリン入りの６０ｍｌの新鮮な所定の培地へ移し、３７℃でＯＤ６００が２ないし５になるまで再度生育させた。５Ｌ発酵槽（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＢＢＩ）中の１００μｇ／ｍｌアンピシリンの入った所定の培地２Ｌへ、培養物５０ｍｌを移した。ｐＨ６．９に炭酸カリウムで、発酵槽のｐＨを調節し、温度を３７℃にし、空気流速を５ｌｐｍにし、ポリアルキレン発泡装置ＫＦＯ  Ｆ１１９（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ）で発泡させた。撹拌器の速度を自動調整して、溶解酸素レベルを３０％以上に維持し、撹拌器の速度が最大値に到達する場合、純粋な酸素を使用して空気噴霧を補強した。３７℃で８時間後、指数関数的に増大する速度で、所定された培地の５０倍濃縮物を培養物に供給し、０．１５時−１の特異的生育速度を維持した。ＯＤ６００が約１００に到達したとき、ｐ−アセチル−フェニルアラニンのラセミ混合物を３．３ｍＭの最終濃度へ添加し、温度を２８℃まで低下させた。０．７５時間後、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、最終濃度を０．２５ｍＭにした。細胞を２８℃でさらに８時間生育させ、ペレットにし、さらなる処理まで−８０℃で凍結した。
【０３７１】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書によって提供される標準的なＨｉｓタグつきのタンパク質の精製を介して、ＰｒｏＢｏｎｄニッケルキレート樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用した後、陰イオン交換カラムを使用して、Ｈｉｓタグ付き突然変異体ｈＧＨタンパク質を精製した。
【０３７２】
精製したｈＧＨを８ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、反応緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ４．０）中に緩衝液交換した。ＭＰＥＧ−オキシアミン粉末をｈＧＨ溶液へ、ＰＥＧ：ｈＧＨの２０：１のモル濃度比で添加した。２８℃で２日間、穏やかに振とうしながら、反応を実施した。陰イオン交換カラムを介して、反応していないＰＥＧ及びｈＧＨからＰＥＧ−ｈＧＨを精製した。
【実施例９】
【０３７３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後の総タンパク質の染色によってＰＥＧ組換えｈＧＨ結合体の純度を評価するため、以下の方法を使用した。タンパク質などの全ての荷電した分子は、電場に置かれると移動する。電場におけるタンパク質の移動の速度は、電場の強度、タンパク質中の正味の電荷及び摩擦抵抗に依存する。摩擦抵抗は、タンパク質の大きさと形状の関数である。過剰のＳＤＳの存在下で変性させると、たいていのタンパク質はＳＤＳを一定の重量比で結合することにより、実質的に同一の電荷密度を有し、タンパク質の大きさに従って、ポリアクリルアミドゲル中を移動する。ゲル電気泳動によって分離されるタンパク質は、クーマシーブリリアントブルー染色によって検出できる。
【０３７４】
本手法についての装置には、以下のもの又はその均等物、すなわち、ＸＣｅｌｌ  Ｓｕｒｅｌｏｃｋミニセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、＋７０ないし８０℃へ設定された熱ブロック、（２００Ｖまでの）電源、（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ１８又は２２Ｒなどの）微量遠心器、及び往復振とう器が含まれた。試薬には、ＮｕＰＡＧＥ  ＭＯＰＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液（２０×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ  ＮＰ０００１）、ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液（２０×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ  ＮＰ０００２）、ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ緩衝液（４×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ  ＮＰ０００７）、ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（１０×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ  ＮＰ０００９）、１２％ビス−トリスＮｕＰＡＧＥプレキャストゲル、１．０ｍｍ×１０穴（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ  ＮＰ０３４１ＢＯＸ）、４ないし１２％ビス−トリスＮｕＰＡＧＥプレキャストゲル、１．０ｍｍ×１０穴（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ  ＮＰ０３２１ＢＯＸ）、染色済み分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ  ＬＣ５９２５）、ミリＱ純度のＨ２Ｏ又は均等物、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＮ  ＬＣ６０６５）又は均等物、参考標準物質（ＷＨＯ  ｒｈＧＨ標準物質、ｒｈＧＨについての較正溶液（ＹＳ３５ｐＡＦ−ｐＢ２／ｐＢ３、２ｍｇ／ｍＬ）ｐＥＧ−ｒｈＧＨ結合体についての較正溶液（Ｙ３５ｐＡＦ−ｐＢ２／ｐＢ３、２ｍｇ／ｍＬ））であった。標準物質及び検査品のタンパク質濃度を、当分野で公知の標準技術を使用して測定した。
【０３７５】
ＰＥＧ化されたｒｈＧＨ生成物の分析
非還元条件下及び還元条件下で、参考標準物質（ＲＳ、例、較正溶液ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１）１０μｇを調製した。ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１（２ｍｇ／ｍＬ）１０μｇを４×ＬＤＳ及びミリＱ水へ添加し、１×ＬＤＳ中の最終的な２８μｌ試料を得た。還元条件の場合、参考標準物質１０μｇを４×ＬＤＳ、１０×還元剤、及びミリＱ水へ添加し、１×ＬＤＳ及び１×還元剤中の２８μｌ試料を得た。同様に、ＰＥＧ化されたｒｈＧＨ検査品１０μｇも、非還元条件下及び還元条件下で調製した。ＰＥＧ−ｒｈＧＨ検査品及びＰＥＧ−ｒｈＧＨ参考標準物質を加熱しなかったが、製造者の説明書に従って、１×ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液で調製した４ないし１２％のビス−トリスＮｕＰＡＧＥプレキャストゲル上に負荷する前に、軽く遠心分離した。ゲルに染色済み分子量マーカー、１０μｇの参考標準物質、空のレーン（電位持ち越し効果を最小化するために推奨される）、検査品の順序で負荷し、２００Ｖで３５分間の最大設定にした。蒸留水中でゲルをインキュベートし、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ又は均等物を使用して振とうしながら染色し、水で脱染色した。
【０３７６】
ＰＥＧ−ｒｈＧＨ検査品の電気泳動図は、ＰＥＧ−ｒｈＧＨ参考標準物質で得られた電気泳動図と一致するはずである。参考標準物質と符合しない何らかのバンドは分解産物又は凝集体でありうる。より大きな分子量のバンドは凝集体を表し、より小さな分子量のバンドはＰＥＧへもはや結合していないポリペプチドを表し得る。
【実施例１０】
【０３７７】
ＣＥＸ−ＨＰＬＣ／ＩＥＸ−ＨＰＬＣによるｒｈＧＨの純度及び化学分解分析
陽イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によってＰＥＧ化された組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）の相対的な純度及び潜在的な化学分解（つまり脱アミノ化）を評価するために、以下の方法を使用した。ＣＥＸ−ＨＰＬＣは、タンパク質と樹脂上に固定された電荷との電荷−電荷相互作用に基づく技術である。陽イオン交換クロマトグラフィーは、負に荷電した樹脂へ結合するタンパク質の正に荷電したイオンを利用する。アスパラギン（Ａｓｎ）残基のｒｈＧＨ脱アミノ化の共通の構造上の修飾及び本ＣＥＸ−ＨＰＬＣ法によって、ＰＥＧ化されたｒｈＧＨ及びＰＥＧ化されていないｒｈＧＨの脱アミノ化物及び脱アミノ化中間体の分離が可能になる。本方法を使用して、ＰＥＧ化されたｒｈＧＨの同定及び純度評価を支持した。ｒｈＧＨのいくつかの部分分解の産物は、本技術を使用して観察可能である。
【０３７８】
本手法についての装置には、以下のもの又はその均等物、すなわち、ＵＶ／可視光分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３又は均等物）、５０μｌクォーツキュベット、（必要な場合）０．５ｍＬＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  １０，０００  ＭＷＣＯ，  ＰＥＳ，  ＶＳＯ１０２又は均等物）、ＰＤ−１０、Ｎａｐ−１０又はＮａｐ−５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−０８５１−０１、１７−０８５３−０１、１７−０８５４−０１）、ＨＰＬＣバイアル及びキャップ（Ａｌｌｔｅｃｈ１００μｌねじキャップポリプロピレンバイアル１２９６２番、ＴＦＥライナーキャップ７３０４８番、開口ねじキャップ７３０４４番、又は均等物）、清潔な１及び２Ｌガラス瓶、カラム―ＰｏｌｙＣＡＴ  Ａ  ４．６×２００ｍｍ、５μ、１０００Å（ＰｏｌｙＬＣ、２０４ＣＴ０５１０）及びＰｏｌｙＣＡＴ  Ａガードカラム、４．６×１０ｍｍ、５μ、１０００Å（ＰｏｌｙＬＣ、ＪＧＣＣＴ０５１０）、（真空脱気装置、四つ組ポンプ、サーモスタットつき自動サンプリング装置、サーモスタットつきカラム区画、ダイオード配列検出器（ＤＡＤ）、及びＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎクロマトグラフィーソフトウェアの装備されたＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣなどの）線形勾配を実施できる高圧液体クロマトグラフィー装置が含まれた。
【０３７９】
本手法のための試薬には、別段の記載がなければ、水（ミリＱ純度又は均等物）が含まれ、固体の化学物質は分析用等級以上であり、溶媒はＨＰＬＣ等級以上である。試薬の保存及び手法段階は、別段の記載がなければ室温で実施した。このような化学物質の例には、酢酸アンモニウム、スペクトルＡ２１４９、ＨＰＬＣ等級又は均等物、アセトニトリル、Ｆｉｓｈｅｒ  Ａ９９８、ＨＰＬＣ等級又は均等物、重炭酸アンモニウム、Ｆｌｕｋａ０９８３０番、９９．５％超又は均等物、氷酢酸、Ｆｉｓｈｅｒ６４−１９−７番、ＨＰＬＣ級又は均等物、クエン酸ナトリウム二水和物、スペクトルＳ０１６５、米国薬局方級又は均等物、グリシン、スペクトルＡＭ１２５又は均等物、マンニトール、スペクトルＭＡ１６５又は均等物、６Ｎ  ＨＣｌ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ２６６２−４６又は均等物が含まれる。
【０３８０】
移動相Ａの緩衝液は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．２５、４０％アセトニトリル（ＡｃＣＮ）であり、移動相Ｂの緩衝液は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．２５、４０％ＡｃＣＮであった。調製されたさらなる試薬は、１０％酢酸、脱アミノ化のための緩衝液（３０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ９．０）、試料希釈緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｇ／Ｌグリシン、５ｇ／Ｌマンニトール、ｐＨ６．０、各々０．２２μｍＰＥＳフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ４３１０９８番又は均等物）を使用してろ過滅菌済み）であった。
【０３８１】
世界保健機構（ＷＨＯ）ｒｈＧＨ（カタログ番号９８／５７４）をＰＥＧ化されていないｈＧＨ標準物質として使用した。これを水１．０ｍｌ中で再構成し、希釈緩衝液を使用して１．１ｍｇ／ｍＬへ希釈した。１０％酢酸の１０％（ｖ／ｖ）を添加して、ｐＨを１．０ｍｇ／ｍＬ（許容可能な範囲０．９ないし１．１ｍｇ／ｍＬ）の終濃度でｐＨ３．８ないし４．３にした。別のＰＥＧ化されていないｈＧＨ標準物質である較正溶液Ｙ３５ｐＡＦ−ｐＢ２／ｐＢ３を同様の様式で調製した。ＰＥＧ化されたｈＧＨ標準物質である較正溶液ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１も同様の様式で調製した。
【０３８２】
ＰＥＧ化された分離溶液について、ＰＤ−１０、Ｎａｐ−１０又はＮａｐ−５脱塩カラムを使用して、ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１較正溶液を３０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ９．０緩衝液へと緩衝液交換した。０．５ｍＬＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置を使用して、標準物質を約２ｍｇ／ｍＬ（許容可能な範囲１．９ないし２．１ｍｇ／ｍＬ）まで濃縮し、試料を３７℃で２４時間インキュベートした。試料又は必要とされる試料の一部を、希釈緩衝液を使用して１．１ｍｇ／ｍＬへ希釈し、１０％酢酸の１０％（ｖ／ｖ）を添加し、１．０ｍｇ／ｍＬ（許容可能な範囲０．９ないし１．１ｍｇ／ｍＬ）の最終濃度でｐＨをｐＨ３．８ないし４．３にした。
【０３８３】
希釈緩衝液を使用して、検査品を１．１ｍｇ／ｍＬへ希釈し、１０％酢酸の１０％（ｖ／ｖ）を添加して、１．０ｍｇ／ｍＬ（許容可能な範囲０．９ないし１．０ｍｇ／ｍＬ）の最終濃度でｐＨをｐＨ３．８ないし４．３にした。標準物質及び検査品のタンパク質濃度は、当分野で公知の標準技術を使用して測定した。
【０３８４】
操作
装置を以下の条件でセットアップした。１）カラム：ＰｏｌｙＣＡＴ  Ａ  ２０４ＣＴ０５１０及びＪＧＣＣＴ０５１０、２）自動サンプリング装置温度：室温、３）ポンプセットアップ：段階勾配：８１．５ないし１０８．５ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４．２５（７ないし１３％Ｂ）の後、１０８．５ないし５００ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４．２５（１３ないし１００％Ｂ）、４）表７、
【０３８５】
【表８】
2008525494.tif 000011
【０３８６】
５）注入器セットアップ―注入：標準注入、注入容積：２５μｌ、引き抜き速度：５０μｌ／分、注入速度：５０μｌ／分、針洗浄：１５μｌＨ２Ｏ、停止時間：ポンプに同じ、６）ＤＡＤ信号：表８、
【０３８７】
【表９】
2008525494.tif 000012
【０３８８】
ピーク幅：０．１分超：スリット：４ｎｍ、停止時間：ポンプに同じ、７）カラムサーモスタット：温度：３０℃、温度を記録であった。
【０３８９】
カラムを１００％移動相Ａの１０ないし１５カラム容積で平衡化した。ＰＥＧ化された較正溶液ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１の２５ないし５０μｌを注入した。主要なＰＥＧ化されたピークは５６．９７分（±０．５分）の保持時間で溶出した。次に、ＷＨＯ又は較正溶液Ｙ３５ｐＡＦ−ｐＢ２／ｐＢ３の２５ないし５０μｌを注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。主要なＰＥＧ化されていないピークは９８．５４分（±０．５分）の保持時間で溶出し、主要なＰＥＧ化したピークに対する相対的な保持時間は１．７３±０．０１であった。
【０３９０】
次に、ＰＥＧ化された分離溶液の２５ないし５０μｌを注入した。得られたクロマトグラムにおいて、主要なＰＥＧ化されたピークは５６．９７分（±０．５分）の保持時間で溶出し、ＰＥＧ化した脱アミノ化したピークは主要ピーク（４５．２３±０．３分）に対する０．７９±０．０２の保持時間で溶出した（最新条件は２．３±０．０２の分離を生じる。）。
【０３９１】
ＰＥＧ化された検査品の２５ないし５０μｌを次に注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。試料を３回測定し、平均保持時間を記した。クロマトグラムを吸光度（２８０ｎｍ）で生じた。
【０３９２】
データ解析
ＰＥＧ化されたｒｈＧＨ検査品の保持時間を較正溶液ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１と比較した。（主要ピークの積分面積／全ピークの積分面積）×１００％を使用して、検査品の平均純度を算出した。溶媒に起因するピークは一切認められなかった。
【実施例１１】
【０３９３】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるｒｈＧＨの純度決定
サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって、組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）及びＰＥＧ化したｒｈＧＨの純度を評価するために、本手法を使用した。本検査は、二量体及び試料中のより大きな分子量の他の関連物質並びにＰＥＧ化された試料及びＰＥＧ化されていない試料から単量体を分離する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、移動相分子によって浸透される多孔性マトリクスとして固定相を使用する技術である。多孔性構造に入るのに十分小さな試料分子は遅滞する一方、より大きな分子は排除され、それゆえカラムを通して迅速に運搬される。したがって、サイズ排除クロマトグラフィーは、大きさによる分子の分離を意味し、クロマトグラフィー溶出時間は特定の分子について特徴的である。本手法を使用して、単量体の（ＰＥＧ化された及びＰＥＧ化されていない）ｒｈＧＨの％を決定する。二量体及び他の高分子量タンパク質は、本技術を使用して観察可能である。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ積分の例は、ｙ軸を吸光度（２１４ｎｍ）として、ｘ軸を時間（分）として有する図２０として示される。
【０３９４】
本技術についての参考文献には、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２００２，  ｐ．  １９３、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２００１，  ｐ．１９４１、Ｒ．Ｍ．  Ｒｉｇｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４３５（１９８８），  ｐ．  ３０７−３１８による「Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｉｚｅ−Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」が含まれる。
【０３９５】
本手法についての装置には、以下のもの又はその均等物、すなわち、ＵＶ／可視光分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３又は均等物）、５０μｌクォーツキュベット、（必要な場合）０．５ｍＬＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  １０，０００  ＭＷＣＯ，  ＰＥＳ，  ＶＳ０１０２又は均等物）、ＨＰＬＣバイアル及びキャップ（Ａｌｌｔｅｃｈ１００μｌねじキャップポリプロピレンバイアル１２９６２番、ＴＦＥライナーキャップ７３０４８番、開口ねじキャップ７３０４４番、又は均等物）、清潔な１及び２Ｌガラス瓶、カラム―Ｔｏｓｏｈａａｓ  ＴＳＫ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００  １８６７５及びＳｕｐｅｒＳＷガードカラム１８７６２、４．６×３００ｍｍの寸法、４μｍの粒子サイズ、２５０Åの孔サイズ、ならびに４．６×３５ｍｍの寸法と４μの粒子サイズを有するガードカラムを備えたシリカベースのゲルろ過ＨＰＬＣカラム、（真空脱気装置、四つ組ポンプ、サーモスタットつき自動サンプリング装置、サーモスタットつきカラム区画、ダイオード配列検出器（ＤＡＤ）、屈折率検出器（ＲＩＤ）及びＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎクロマトグラフィーソフトウェアの装備されたＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣなどの）線形勾配を実施できる高圧液体クロマトグラフィー装置が含まれた。
【０３９６】
本手法のための試薬には、別段の記載がなければ、水（ミリＱ品質又は均等物）が含まれ、固体の化学物質は分析用等級以上であり、溶媒はＨＰＬＣ等級以上である。試薬の保存及び手法段階は、別段の記載がなければ、室温で実施した。このような化学物質の例には、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、スペクトル米国薬局方級Ｓ０１３０又は均等物、二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、スペクトル米国薬局方級Ｓ０１４０又は均等物、２−プロパノール、ＦｉｓｈｅｒＨＰＬＣ級Ａ４５１−４、又は均等物が含まれた。
【０３９７】
移動相の緩衝液は、６３ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０の９７％、２−プロパノールの３％であった。溶液Ａは２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０であった。両者とも、０．２２μｍＰＥＳフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ４３１０９８番又は均等物）を使用してろ過滅菌した。
【０３９８】
世界保健機構（ＷＨＯ）ｒｈＧＨ（カタログ番号９８／５７４）を、ＰＥＧ化されていないｈＧＨ標準物質として使用した。これを水１．０ｍｌで再構成し、ＷＨＯ緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬ濃度（許容可能な範囲０．９ないし１．１ｍｇ／ｍＬ）まで希釈した。別のＰＥＧ化されていないｈＧＨ標準物質である較正溶液Ｙ３５ｐＡＦ−ｐＢ２／ｐＢ３を同様の様式で調製し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％グリシン、０．５％マンニトール、ｐＨ６で希釈した。ＰＥＧ化されたｈＧＨ標準物質である較正溶液ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１も同様の様式で調製し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％グリシン、０．５％マンニトール、ｐＨ６で希釈した。分離溶液の場合、ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０２のより大きな分子量の標準物質を１ｍｇ／ｍＬ濃度（許容可能な範囲０．９ないし１．１ｍｇ／ｍＬ）にした。この溶液は、約３３％のＰＥＧ−ＰＥＧ−ＧＨ、６６．５％のＰＥＧ−ＧＨを含有する。検査材料を溶液Ａで約１．０ｍｇ／ｍＬ（許容可能な範囲０．９ないし１．１ｍｇ／ｍＬ）へ希釈した。すべての試料濃度は、当分野で公知の標準技術を使用して測定した。試料の希釈は、いずれかの適切な緩衝液で実施しうる。
【０３９９】
操作
装置を次の条件でセットアップした。１）カラム：ＴＳＫ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００  １８６７５及びガードカラム１８７６２、２）ポンプセットアップ―勾配：均一濃度、流速：０．３ｍｌ／分、時間：２５分、最大圧力：１２０バール、３）注入器セットアップ―注入：標準注入、注入容積：１０μｌ、引き抜き速度：１００μｌ／分、注入速度：１００μｌ／分、針洗浄：１００μｌＨ２Ｏ、停止時間：ポンプに同じ、４）ＤＡＤ信号―表９、
【０４００】
【表１０】
2008525494.tif 000013
【０４０１】
ピーク幅０．０５分超、スリット：２ｎｍ、停止時間：ポンプに同じ、５）ＲＩＤ信号―温度：３５℃、反応時間：０．２分超  ４秒、標準物質、６）カラムサーモスタット：温度：２３℃、温度を記録であった。
【０４０２】
カラムを移動相の１０カラム容積（５０ｍｌ＝０．３ｍｌ／分で１６６分）で平衡化し、試料を注入する前の少なくとも２０分間、ＲＩＤをパージした。ＤＡＤ検出器及びＲＩ検出器を試料の測定前に自動平衡化した。
【０４０３】
較正溶液Ｙ３５ｐＡＦ−ｐＢ２／ｐＢ３（又はＷＨＯ標準物質）の２０μｌを注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。得られたクロマトグラムにおいて、主要なＰＥＧ化されていないピークは、約１２．９６（±０．０５）分の保持時間で溶出した。より大きな分子量のＰＥＧ化されていないｒｈＧＨ二量体は、主要ピークに相対的な０．９４±０．０２の保持時間で溶出した。より大きな分子量の凝集体は、７．３ないし８．０分の保持時間で溶出した。
【０４０４】
較正溶液ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１の２０μｌを注入した。主要なＰＥＧ化したピークは、約８．３３（±０．０８）分の保持時間（ＰＥＧ化されていないｒｈＧＨに対する０．６４の相対的な保持時間）で溶出した。より大きな分子量のＰＥＧ化したｒｈＧＨ凝集体は、８．０分を超える時間で溶出した。
【０４０５】
分離溶液の２０μｌを注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。主要なＰＥＧ化したピークは８．２８分の保持時間で溶出し、より大きな分子量の種は７．５４分で溶出し、主要なＰＥＧ化したピークに対する０．９（±０．０５）の相対的な保持時間であった。
【０４０６】
検査品の２０μｌを注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。試料を３回測定し、平均保持時間を記した。ｒｈＧＨ検査品の保持時間をｒｈＧＨ標準物質と比較した。
【０４０７】
検査品からのＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを参考標準物質から得られるデータと比較した。ＰＥＧ化したｒｈＧＨの純度を決定するため、ＰＥＧ化したｒｈＧＨ試料の積分した主要ピーク面積を総ピーク面積と比較し、ＰＥＧ−ｒｈＧＨ試料中のＰＥＧ化した単量体の％を、（ＰＥＧ−ｒｈＧＨ試料の主要ピーク面積／総ピーク面積）×１００％により算出した。ＰＥＧ化した二量体、より高分子の凝集体、及びＰＥＧ化されていない単量体の％を、ＰＥＧ化されたｈＧＨ検査品において算出した。溶媒に起因するピークは一切認められなかった。主要なＰＥＧ化されたｈＧＨピークの前にクロマトグラム中で溶出するピークは、より大きな分子量の種を表す。このようなより大きな分子量の種には、（ＰＥＧ−ＰＥＧ−ｈＧＨ及び他の可能な二量体などの）二量体または可溶性凝集体が含まれ得るが、それらには限定されない。主要なＰＥＧ化されたｈＧＨピーク後に溶出するピークはより小さな分子量の種を表す。このようなより小さな分子量の種には、ＰＥＧ化されていない単量体及びＰＥＧ化されたｈＧＨのクリップされた形態が含まれうるが、これらには限定されない。
【実施例１２】
【０４０８】
ＲＰ−ＨＰＬＣによるＰＥＧ−ｈＧＨの純度及び化学分解分析
逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって、ＰＥＧ化された組換えヒト成長ホルモン（ＰＥＧ−ｈＧＨ）の相対的な純度及び潜在的な化学分解（つまり酸化）を評価するために、以下の方法を使用した。ＲＰ−ＨＰＬＣは、相対的な疎水性に基づいて分子を分離する技術である。試料は、炭化水素鎖へ共有結合されたシリカの固定相を通過する。対象分子は固定相によって遅滞され、均一濃度の溶媒で溶出される。クロマトグラフィー溶出時間は、特定の分子について特徴的である。本方法は、酸化などの構造上の修飾と関連する疎水性及び保持挙動の微妙な差異に基づいて、ＰＥＧ化されていないｈＧＨ並びにイソフォームからＰＥＧ−ｈＧＨを分離する。本方法は、ＰＥＧ−ｈＧＨの同定及び純度評価を裏付けるために使用した。ｒｈＧＨのいくつかの部分分解の産物が、本技術を使用して観察可能である。ＲＰ−ＨＰＬＣ積分の例を、ｙ軸を吸光度（２１４ｎｍ）として、ｘ軸を時間（分）として有する図２１として示す。
【０４０９】
本手法のための装置には、以下のもの又はその均等物、すなわち、ＵＶ／可視光分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３又は均等物）、５０μｌクォーツキュベット、（必要な場合）０．５ｍＬＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  １０，０００  ＭＷＣＯ，  ＰＥＳ，  ＶＳ０１０２又は均等物）、ＨＰＬＣバイアル及びキャップ（Ａｌｌｔｅｃｈ１００μｌねじキャップポリプロピレンバイアル１２９６２番、ＴＦＥライナーキャップ７３０４８番、開口ねじキャップ７３０４４番、又は均等物）、清潔な１及び２Ｌガラス瓶、カラム―Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ  Ｂｕｔｙｌ、２５０×４．６ｍｍ（カタログ番号７１１６−００）、（真空脱気装置、四つ組ポンプ、サーモスタットつき自動サンプリング装置、サーモスタットつきカラム区画、ダイオード配列検出器（ＤＡＤ）、及びＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎクロマトグラフィーソフトウェアの装備されたＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣなどの）線形勾配を実施できる高圧液体クロマトグラフィー装置が含まれた。
【０４１０】
本手法のための試薬には、別段の記載がなければ、水（ミリＱ品質又は均等物）が含まれ、固体の化学物質は分析用等級以上であり、溶媒はＨＰＬＣ等級以上である。試薬の保存及び手法段階は、別段の記載がなければ室温で実施した。このような化学物質の例には、アセトニトリル、ＦｉｓｈｅｒＡ９９８、ＨＰＬＣ級、又は均等物、トリフルオロ酢酸、Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ  ＵＮ２６９９、バイオグレード、又は均等物、リン酸ナトリウム、スペクトルＭＡ１６５４、米国薬局方級、又は均等物、グリシン、スペクトルＡＭ１２５又は均等物、マンニトール、スペクトルＭＡ１６５、又は均等物、トレハロース、Ｆｌｕｋａ９０２０８、又は均等物、１０Ｎ水酸化ナトリウム、又は均等物が含まれる。移動相Ａは、Ｈ２Ｏ中の０．１％ＴＦＡであり、移動相Ｂは、アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡであった。
【０４１１】
ＰＥＧ化されていない標準物質のうちの一つは、世界保健機構（ＷＨＯ）ｒｈＧＨ（カタログ番号９８／５７４）であった。これを水１．０ｍｌで再構成し、ＷＨＯ緩衝液で１．０ｍｇ／ｍＬ（許容可能な範囲０．９ないし１．１ｍｇ／ｍＬ）へ希釈した。別のＰＥＧ化されていない標準物質である較正溶液Ｙ３５ｐＡＦ−ｐＢ２／ｐＢ３を同様の様式で調製し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％グリシン、０．５％マンニトール、ｐＨ６で希釈した。ＰＥＧ化した標準物質である較正溶液ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１も同様の様式で調製し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％グリシン、０．５％マンニトール、ｐＨ６で希釈した。ＰＥＧ化した分離溶液について、ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１を０．１％Ｈ２Ｏ２とともに４℃で２４時間インキュベートし、ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１を酸化した。５％ないし２０％酸化したＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１を得るため、このＨ２Ｏ２とのインキュベーション時間は４ないし２４時間で変動し得る。必要な場合、カタラーゼ（２０ｍｇ／ｍＬストック）を添加し、酸化反応を停止できる。
【０４１２】
希釈緩衝液を使用して、検査品を１．０ｍｇ／ｍＬ（許容可能な範囲０．９ないし１．０ｍｇ／ｍＬ）まで希釈した。試料希釈緩衝液はいずれかの適切な緩衝液でありうる。標準物質及び検査品のタンパク質濃度は、当分野で公知の標準技術を使用して測定した。
【０４１３】
操作
装置を以下の条件でセットアップした。１）カラム：Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ  Ｂｕｔｙｌ、２５０×４．６ｍｍ（カタログ番号７１１６−００）、２）自動サンプリング装置―温度：４℃、３）ポンプセットアップ：表１０、
【０４１４】
【表１１】
2008525494.tif 000014
【０４１５】
４）注入器セットアップ―注入：標準注入、注入容積：１０μｌ、引き抜き速度：１００μｌ／分、注入速度：１００μｌ／分、針洗浄：２０μｌＨ２Ｏ、停止時間：ポンプに同じ、５）ＤＡＤ信号：表１１、
【０４１６】
【表１２】
2008525494.tif 000015
【０４１７】
ピーク幅：０．１分超、スリット４ｎｍ、停止時間：ポンプに同じ、６）カラムサーモスタット：温度：ＲＴ、温度を記録であった。
【０４１８】
蒸留したＨＰＬＣ級の水の１０カラム容積を新しいカラムに流し、輸送溶媒を除去した。ミリＱ水中の６０％イソプロパノール中の０．１％ＴＦＡの１０ないし１５カラム容積（ＣＶ）で及び１０ないし１５ＣＶのＨ２Ｏでカラムを洗浄した。この後、必要な場合、５０：５０のＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏの５カラム容積を流すか、あるいは、移動相Ａでカラムを平衡化した。
【０４１９】
１００％移動相Ａの１０ないし１５カラム容積でカラムを平衡化した。ＰＥＧ化された較正溶液であるＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１の１０μｌを注入した。主要なＰＥＧ化されたピークは１７．０５分（±０．５分）の保持時間で溶出した。
【０４２０】
ＷＨＯ又は較正溶液Ｙ３５ｐＡＦ−ｐＢ２／ｐＢ３の１０μｌを注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。主要なＰＥＧ化されていないピークは１９．０４分（±０．５分）の保持時間で溶出し、主要なＰＥＧ化したピークに対して１．１±０．０５の相対的保持時間であった。
【０４２１】
ＰＥＧ化された分離溶液の１０μｌを注入した。得られたクロマトグラムにおいて、主要なＰＥＧ化されたピークは１７．１２分（±０．５分）の保持時間で溶出し、ＰＥＧ化された酸化したピークは、主要ピークに対して０．９３±０．０２の保持時間で溶出した（１５．９４±０．３分及び２．９７±０．０５の分離）。
【０４２２】
ＰＥＧ化された検査品の１０μｌを注入し、ＨＰＬＣプログラムを実行した。試料を３回測定し、平均保持時間を記した。
【０４２３】
ＰＥＧ化されたｒｈＧＨ検査品の（Ａ２１４を使用する）保持時間を較正溶液ＰＥＧ３０−ｐＹ３５ｐＡＦ−０１と比較した。（Ａ２１４を使用する）検査品の平均純度を、（（Ａ２１４を使用する）検査品の平均純度を、（主要ピークの積分面積／全ピークの積分面積）×１００％を使用して算出した。溶媒によるいずれのピークも無視した。
【実施例１３】
【０４２４】
製剤開発に使用される方法の要約を表１１に示す。長期保存、塩基性、又は賛成条件は、以下の製品関連不純物、すなわち、脱アミノ化ｈＧＨ―Ａｓｎ１４９、Ａｓｎ１５２、酸化ｈＧＨ―Ｍｅｔ１４、Ｍｅｔ１２５、異性化ｈＧＨ―Ａｓｐ１３０、脱水ｈＧＨ―Ａｓｐ１３０、脱Ｐｈｅ／脱−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ―Ｐｈｅ１、Ｐｒｏ２（非酵素的開裂）、二量体（共有結合種及び非共有結合種）、クリップつきｈＧＨ（Ｔｈｒ１４２及びＴｙｒ１４３の間の開裂）を生じうる。湿度分析、ｐＨ及び増殖アッセイを含む（これらに限定されない。）バイオアッセイなどのさらなる方法を使用して、天然においてコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨについての製剤を評価する。
【０４２５】
【表１３】
2008525494.tif 000016
【０４２６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、及びｃＩＥＸ−ＨＰＬＣは、鍵となる分解産物を示す。ｃＩＥＸ−ＨＰＬＣは、環状イミド、イソ−ａｓｐ（異性化したｈＧＨ−Ａｓｐ１３０）、及び脱アミノ化中間体を示しうる。
【実施例１４】
【０４２７】
凍結乾燥された製剤の研究
２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％グリシン、０．５％マンニトール、ｐＨ６中の、天然においてコードされていないアミノ酸を含む精製したＰＥＧ化されたｈＧＨ試料を、安定性分析の前に、製剤マトリクス（表１２）から得られた緩衝液中へ透析した。ｈＧＨの位置３５のチロシンが置換された天然においてコードされていないアミノ酸（パラ−アセチルフェニルアラニン）とｍＰＥＧ−オキシアミンとの反応は、ｈＧＨとＰＥＧとの間にオキシム結合を形成した。次に、試料を凍結乾燥し、４、２５、及び４０℃で保存した。時間のさまざまな長さ（０、１週間、２週間、４週間、６週間、２ヶ月間、及び３ヶ月間）で凍結乾燥した試料を保存した後、水中で２ｍｇ／ｍＬになるように試料を再構成し、再構成後に、当業者に公知の標準技術を使用して、湿気含有量（Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ）、ｐＨ及び濃度などの特徴を観察した。実施例９ないし１３に記載の方法を使用して、分解産物について、ＰＥＧ化されたｈＧＨを分析した。リン酸ナトリウム及びコハク酸ナトリウムを製剤マトリクス中に含めた。さらなる分析には４ヶ月及び６ヶ月の時点が含まれる。
【０４２８】
【表１４】
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【０４２９】
結果
湿気含有量、ｐＨ及び濃度の結果を表１４ないし３２に示す。
【０４３０】
【表１５】
2008525494.tif 000019
【０４３１】
【表１６】
2008525494.tif 000020
【０４３２】
【表１７】
2008525494.tif 000021
【０４３３】
【表１８】
2008525494.tif 000022
【０４３４】
【表１９】
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【０４３５】
【表２０】
2008525494.tif 000024
【０４３６】
【表２１】
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【０４３７】
【表２２】
2008525494.tif 000026
【０４３８】
【表２３】
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【０４３９】
【表２４】
2008525494.tif 000028
2008525494.tif 000029
【０４４０】
【表２５】
2008525494.tif 000030
【０４４１】
【表２６】
2008525494.tif 000031
【０４４２】
【表２７】
2008525494.tif 000032
【０４４３】
【表２８】
2008525494.tif 000033
【０４４４】
【表２９】
2008525494.tif 000034
【０４４５】
【表３０】
2008525494.tif 000035
【０４４６】
【表３１】
2008525494.tif 000036
【０４４７】
【表３２】
2008525494.tif 000037
【０４４８】
【表３３】
2008525494.tif 000038
【０４４９】
本研究のためのＳＤＳゲルが図２２ないし５８に示されている。微弱な２１．５ｋＤａのバンドが図２２のレーン３及び４で認められた。
【０４５０】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：図２０は、一例のＳＥＣ−ＨＰＬＣ積分である。表３３ないし５０は、本研究から得られた結果を示す。主要なＰＥＧ化されたｈＧＨピークとＰＥＧ化されていないピークとの間にクリップピークが溶出した。
【０４５１】
【表３４】
2008525494.tif 000039
【０４５２】
【表３５】
2008525494.tif 000040
【０４５３】
【表３６】
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【０４５４】
【表３７】
2008525494.tif 000042
【０４５５】
【表３８】
2008525494.tif 000043
【０４５６】
【表３９】
2008525494.tif 000044
【０４５７】
【表４０】
2008525494.tif 000045
【０４５８】
【表４１】
2008525494.tif 000046
【０４５９】
【表４２】
2008525494.tif 000047
【０４６０】
【表４３】
2008525494.tif 000048
【０４６１】
【表４４】
2008525494.tif 000049
【０４６２】
【表４５】
2008525494.tif 000050
【０４６３】
【表４６】
2008525494.tif 000051
【０４６４】
【表４７】
2008525494.tif 000052
【０４６５】
【表４８】
2008525494.tif 000053
【０４６６】
【表４９】
2008525494.tif 000054
【０４６７】
【表５０】
2008525494.tif 000055
【０４６８】
【表５１】
2008525494.tif 000056
【０４６９】
ＲＰ−ＨＰＬＣ：図２１は、ＲＰ−ＨＰＬＣ積分の例である。表５１ないし６９は、本研究からのＲＰ−ＨＰＬＣの結果を示す。
【０４７０】
【表５２】
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【０４７１】
【表５３】
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【０４７２】
【表５４】
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【０４７３】
【表５５】
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【０４７４】
【表５６】
2008525494.tif 000061
【０４７５】
【表５７】
2008525494.tif 000062
【０４７６】
【表５８】
2008525494.tif 000063
【０４７７】
【表５９】
2008525494.tif 000064
【０４７８】
【表６０】
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【０４７９】
【表６１】
2008525494.tif 000066
【０４８０】
【表６２】
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【０４８１】
【表６３】
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【０４８２】
【表６４】
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【０４８３】
【表６５】
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【０４８４】
【表６６】
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2008525494.tif 000072
【０４８５】
【表６７】
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【０４８６】
【表６８】
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【０４８７】
【表６９】
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【０４８８】
本研究からのＣＥＸ／ＩＥＸ分析は、表６９ないし７１に示されている。
【０４８９】
【表７０】
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【０４９０】
【表７１】
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【０４９１】
【表７２】
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【０４９２】
より低いｐＨの製剤を、４週間（ｐＨ４）及び６週間（ｐＨ５）研究した。研究した時間フレームについて、以下の傾向が認められた。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、凍結した材料を４℃で保存した後に、より低いｐＨの製剤（ｐＨ４及び５）はより高いｐＨの製剤（ｐＨ６及び７）に比べて、ＰＥＧ化されていない材料のレベルを上昇させることを示した。さらに、ｐＨ６及び７の製剤よりも低いｐＨの製剤で、より高い凝集レベルを２５及び４０℃で観察した。また、ｐＨ６及び７の製剤は、ｃＩＥＸ−ＨＰＬＣによって分析されるように、より低いｐＨの製剤よりも主要ピーク面積の％が大きいことを示した。
【０４９３】
凍結乾燥されたｈＧＨを２５及び４０℃で保存する３ヶ月の研究時間枠を通じて、ヒスチジンを有する製剤は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示される高分子量凝集体の量が最も少なかった。グリシンと組み合わせてマンニトールを含有する製剤は、撹拌により誘導される凝集に対して安定化されたｈＧＨであることが明らかとなり、この組み合わせが良好なバルキング剤であることを示した。しかしながら、マンニトールと組み合わせたヒスチジンも、撹拌により誘導される凝集に対してｈＧＨの安定化を示した。トレハロースは効果的な安定剤であった。
【実施例１５】
【０４９４】
注射可能性研究
４つの異なる濃度のＰＥＧ化されたｈＧＨの製剤を使用して、注射可能性研究を実施した。２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％グリシン、０．５％マンニトール、ｐＨ６中のＰＥＧ−ｈＧＨを、１０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、４％マンニトール、２％トレハロース、０．０１％ポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ｐＨ６．０（製剤ＩＤ＝Ｐ６ＭＴ）へ、遠心濃縮を介して緩衝液交換した。Ｐ６ＭＴ緩衝液中のＰＥＧ−ｈＧＨを、８、１０、１２、及び１４ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。１ｍＬの充填物をバイアルへ入れ、試料を凍結乾燥した。凍結乾燥したバイアルを水１ｍＬで再構成した。注射可能性を、力４ポンドで２７ゲージ針を通じて各濃度１ｍＬを押すことによって検査した。検査したＰＥＧ化されたｈＧＨの全濃度で、即時再構成が見られた。８ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ化されたｈＧＨは３．５ｓ（秒）で注入し、１０ｍｇ／ｍＬは３．６ｓで注入し、１２ｍｇ／ｍＬは３．９ｓで注入し、及び１４ｍｇ／ｍＬは４．５ｓで注入した。
【０４９５】
さらなる注射可能性研究を３０ゲージの針で実施した。１０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、４％マンニトール、２％トレハロース、０．０１％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０（製剤ＩＤ＝Ｐ６ＭＴ緩衝液）中の８、１０、１２、及び１４ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ化されたｈＧＨを、３０ゲージの針による注射可能性について検査した。試料を力８ポンドのもとで３０ゲージの針を通じて押し、注入時間を計時した。８ポンドの力のもとで３０ゲージの針を通じて各濃度１ｍＬを押したとき、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ及び１４ｍｇ／ｍＬ濃度は、それぞれ、７．４ｓ（秒）、９．９ｓ、９．９ｓ、及び１０．７ｓで注入した。
【０４９６】
平均的な人間は最大８ポンドの力をシリンジに対して加えることが可能であるので、８ポンドの力の下で１０秒以内に１ｃｃを注入することは、注入には、標準的なものとして一般に許容される。
【実施例１６】
【０４９７】
１週間再構成研究
本研究では、再構成した試料を４℃で１週間保存した。本研究に使用される製剤マトリクスは表１４と同一であった。１週間の保存の後、濃度及びｐＨを測定した。表７２ないし７４及び図５８ないし５９に示されるように、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによっても、試料を分析した。
【０４９８】
【表７３】
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【０４９９】
【表７４】
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【０５００】
【表７５】
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【０５０１】
再構成した試料の４℃での１週間の保存によって、Ｐ６ＭＴ、Ｐ６ＭＴＭｅｔ、Ｐ７ＧＴ、及びＰ６ＧＴ−Ｐの前ピーク１がわずかに増大した（約１％）。より低いｐＨの試料は、ｐＨ６及び７の試料に比べて脱ＰＥＧ化が大きいことを示した。
【実施例１７】
【０５０２】
撹拌／ＵＶ研究
長期保存条件を模擬し得るストレスへ試料を供し、分解又は凝集の産物の誘導を観察した。ＵＶ光への曝露に際する分解が分子中に生じ、又は特にオキシム若しくはＰＥＧに特異的に生じうる。二つの撹拌研究を実施した。４時間の撹拌研究において、表１４からの再構成した試料を、外界温度で４時間激しく撹拌した後、濃度及びｐＨを測定し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析を実施した。これらの試料のサブセットを、４℃で１週間保存した後、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析し、凝集体が単量体へ解離しうるか否かを研究した。対照試料は、周囲の室温で４時間保存した再構成された試料であった。
【０５０３】
２時間の撹拌研究において、ポリソルベートを含まない試料、それらのポリソルベート含有対応物及びＰ６ＭＡを、外界温度で２時間やさしくボルテックスし、撹拌後のＰＥＧ化されたｈＧＨの安定性に及ぼすポリソルベートの効果を確認した。表８６を参照してほしい。
【０５０４】
ＵＶ曝露研究の場合、対照は、周囲室温で４時間保存した再構成された試料であった。凍結乾燥した試料を、ＵＶ光へ４時間、外界温度で曝露し、水中で再構成した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０５０５】
表７５ないし８５を参照してほしい。これらの試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図６１ないし６６に示す。ＳＥＣ−ＨＰＬＣデータは、０．０１％でポリソルベート２０を含有するすべての製剤が撹拌時に凝集を誘導する（３０ないし８０％）ことを示した。Ｂａｍ，ＮＢらは、組換えｈＧＨ（ｒｈＧＨ）の撹拌時の不溶性凝集体の阻害におけるトゥイーン２０（ポリソルベート２０）の使用を記載する（Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．  １９９８  Ｄｅｃ；  ８７（１２）：  １５５４−９）。さらに、Ｍａａ，ＹＦらは、ポリソルベート２０が、スプレー乾燥したｒｈＧＨ粉末の製造において、不溶性タンパク質凝集体を減少させることを示した（Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  １９９８  Ｆｅｂ；８７（２）：１５２−９）。撹拌により誘導される凝集体は、不可逆的な非共有結合凝集体であることが分かった。主要な光誘導性分解経路は、脱ＰＥＧ化及び共有結合性前ピーク２の形成であった。
【０５０６】
【表７６】
2008525494.tif 000082
【０５０７】
【表７７】
2008525494.tif 000083
【０５０８】
【表７８】
2008525494.tif 000084
【０５０９】
【表７９】
2008525494.tif 000085
【０５１０】
【表８０】
2008525494.tif 000086
【０５１１】
【表８１】
2008525494.tif 000087
【０５１２】
【表８２】
2008525494.tif 000088
【０５１３】
【表８３】
2008525494.tif 000089
【０５１４】
【表８４】
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【０５１５】
【表８５】
2008525494.tif 000091
【０５１６】
【表８６】
2008525494.tif 000092
【実施例１８】
【０５１７】
撹拌研究
表８６に示される製剤マトリクスで、別の撹拌研究を実施した。ガラスバイアル中に充填した２５μＬで２ｍｇ／ｍＬ試料に対して、撹拌を実施した。試料を室温で４時間撹拌した。室温で、かく乱せずにインキュベートした試料の二重セットを陽性対照（「対照」）として使用した。試料のｐＨ及び濃度を測定し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析をｔ＝０、対象及び撹拌した試料に関して、表８７ないし９０に示されるように実施した。
【０５１８】
【表８７】
2008525494.tif 000093
【０５１９】
【表８８】
2008525494.tif 000094
【０５２０】
【表８９】
2008525494.tif 000095
【０５２１】
【表９０】
2008525494.tif 000096
【０５２２】
【表９１】
2008525494.tif 000097
【０５２３】
ポリソルベートの微量は、撹拌下で凝集を誘導した。撹拌したとき、ヒスチジン製剤はグリシン含有製剤と同等に挙動した。
【実施例１９】
【０５２４】
加速した凝集の研究
長期保存条件を模擬し、潜在的な分解又は凝集の産物を同定するために、加速したストレスの研究を実施した。約８及び１４ｍｇ／ｍＬで２製剤（製剤ＩＤＨ７ＭＴ−Ｐ及びＨ７ＭＧＴ−Ｐ）を使用して、加速した凝集の研究を実施した。製剤の成分を表９１に記載する。「−Ｐ」という表記は、ポリソルベート２０が存在しないことを示す。研究されるストレスは、凍結−解凍条件、撹拌、ＵＶ曝露及び温度であった。上述に記載の方法を使用して、ＰＥＧ化されたｈＧＨを評価した。実施例９及び１１にそれぞれ記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ法によって、試料を評価した。分析のためのさらなる時点には、１ヶ月、２ヶ月等が含まれる。試料の分析のためのさらなる技術には、動的光散乱（ＤＬＳ）及び分析用超遠心が含まれる。
【０５２５】
【表９２】
2008525494.tif 000098
【０５２６】
（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％グリシン、０．５％マンニトール、ｐＨ６中の）５．７ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ化されたｈＧＨの６３ｍＬを１４．２ｍｇ／ｍＬへ濃縮した。濃縮液の半分をＨ７ＭＴ−Ｐに対して、残り半分をＨ７ＭＧＴ−Ｐに対して透析した。透析によってタンパク質が希釈されたため、Ｈ７ＭＴ−Ｐ中の試料を１３．６ｍｇ／ｍＬへ濃縮し、Ｈ７ＭＧＴ−Ｐを１３．５ｍｇ／ｍＬへ濃縮した。１３．６ｍｇ／ｍＬでのＨ７ＭＴ−Ｐ中のＰＥＧ化されたｈＧＨの一部（約４．５ｍＬ）を７．８ｍｇ／ｍＬへＨ７ＭＴ−Ｐ緩衝液で希釈した。同様に、１３．５ｍｇ／ｍＬのＨ７ＭＧＴ−Ｐ中のＰＥＧ化されたｈＧＨの約４．５ｍＬを、Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ緩衝液で、８．０ｍｇ／ｍＬになるように希釈した。
【０５２７】
凍結／解凍研究
−７０℃で１５分間、製剤を凍結した。次に、これを２５℃で解凍した。次に、バイアルのキャップをはずし、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために試料の一部を採取し、バイアルに再度キャップをした。本手法を５回繰り返した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を表９２ないし９５に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図６７ないし７０に示す。
【０５２８】
【表９３】
2008525494.tif 000099
【０５２９】
【表９４】
2008525494.tif 000100
【０５３０】
【表９５】
2008525494.tif 000101
【０５３１】
【表９６】
2008525494.tif 000102
【０５３２】
試料の凍結／解凍によって、より大きな分子量の凝集体が０．２ないし０．３％増大し、８ｍｇ／ｍＬ試料での第一凍結−解凍周期の後、より大きな分子量の凝集体が解離する可能性があった。
【０５３３】
ボルテックス／ＵＶ曝露
本研究では、表９２に示されている製剤マトリクスを使用した。撹拌（ボルテックス）及びＵＶ曝露研究における対照試料として、製剤を室温で６時間保持した。撹拌研究において、液体試料を室温で６時間高速でボルテックスした。ＵＶ曝露研究において、凍結乾燥した試料をＵＶ光へ室温で４時間曝露し、分析前に再構成した。試料をＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために採取した。表９６ないし９８は、対照試料、ボルテックスした試料及びＵＶ曝露した試料についてのＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを示す。これらの試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、図７１及び７２として示されている。
【０５３４】
【表９７】
2008525494.tif 000103
【０５３５】
【表９８】
2008525494.tif 000104
【０５３６】
【表９９】
2008525494.tif 000105
【０５３７】
ポリソルベート２０を含まないヒスチジン製剤は激しい撹拌で形成される凝集体の量を減少させることを確認した。
【０５３８】
脱ＰＥＧ化は主要な分解現象であり、ｈＧＨのより低い濃度の試料においてより顕著であった。ＵＶ曝露は、対照と比較して、％前ピーク２（二量体化）を増大させた。
【０５３９】
別の撹拌研究では、４℃又は４０℃で１週間又は２週間、凍結乾燥した試料を保存した。次に、試料を再構成した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した。表１００ないし１０３は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果を示す。図７３ないし７４は、１週間試料についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図７５ないし７６は、２週間試料についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【０５４０】
【表１００】
2008525494.tif 000106
【０５４１】
【表１０１】
2008525494.tif 000107
【０５４２】
【表１０２】
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【０５４３】
【表１０３】
2008525494.tif 000109
【０５４４】
１週間後、Ｈ７ＭＴ−Ｐは、４℃でＨ７ＭＧＴ−Ｐと比べ、より大きな分子量の凝集体の産生量が少なかった。Ｈ７ＭＴ−Ｐは、４０℃でＨ７ＭＧＴ−Ｐよりもわずかに多くの二量体形成をしたが、脱ＰＥＧ化されたｈＧＨの産生量は少なかった。２週間後、二量体化の増量を４０℃で観察した。有意な脱ＰＥＧ化を４０℃で観察した。Ｈ７ＭＴ−Ｐは、４０℃でＨ７ＭＧＴ−Ｐよりも脱ＰＥＧ化されたｈＧＨの形成は少なかった。
【０５４５】
さらに、ＰＥＧ化されたｈＧＨの試料を熱変性条件へ曝露した。８２℃の融点（Ｔｍ）を上回る８５℃で、熱変性試料を１０分間インキュベートした。熱変性は凝集を誘導した。表１０３は、熱変性へ曝露した試料のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図７３ないし７４に示す。
【０５４６】
【表１０４】
2008525494.tif 000110
【実施例２０】
【０５４７】
ＦＴ／ＩＲ（フーリエ変換赤外分光法）走査
ＰＥＧ化されたｈＧＨの分析をＦＴ／ＩＲで実施した。ＦＴ／ＩＲ走査をＪａｓｃｏモデルＦＴ／ＩＲ６６０プラスで実施した。４ｃｍ−１の解像度で、各試料を３２０回走査し、Ｊａｓｃｏ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ１．５３．００で分析した。空気バックグラウンド及び水ブランクを各日の試料測定前に測定した。１７００ｃｍ−１での吸光度がないことによって、水から派生した信号の除去を確認した。適切なバックグラウンド及びブランク対照を各試料スペクトルから差し引いた後、残りのタンパク質ピーク及び賦形剤ピークの第二派生分析を、アミドＩ領域（１６００ないし１７００ｃｍ−１）で実施した。液体対照として、６ｍｇ／ｍＬでのＰＥＧ−ｈＧＨバルクを使用した。
【０５４８】
ＰＥＧ−ｈＧＨのアミドＩ信号は、凍結乾燥後でさえ、他のタンパク質よりも比較的弱かった。しかしながら、ほとんどの試料は１６５１ｃｍ−１でα螺旋信号を示し、そのため、製剤候補間の定量的な比較が達成できた。グリシンは、アミドＩ領域で強い信号を示し、そのため、グリシン信号をもとのデータから差し引く経過の間に、信号がゆがんだかもしれない。
【０５４９】
液体対照と比較したＰ６ＭＴ、Ｓ４ＭＴ、Ｓ５ＭＴ、Ｈ６ＭＴ、Ｐ６ＧＴ、Ｐ６ＭＳ、Ｐ６ＭＴｍｅｔ、Ｐ７ＭＴ及びＰ６ＭＴ−Ｐ製剤の二次派生ＦＴＩＲスペクトル［信号強度（ｙ軸）対ｃｍ−１における波数（ｘ軸）］は、次のことを示した。１）ほとんどのマンニトール製剤が緩衝液又はｐＨにかかわらず良好なα螺旋信号を保存した。２）グリシンを含有する一製剤Ｐ６ＧＴは、帯域信号における有意な移行を示した。３）他のピークを、１６２０、１６３０、１７２５、及び１７５０で観察した。Ｓ５ＧＴ、Ｐ６ＭＡ、Ｐ７ＧＴ、Ｐ６ＭＧＴ、Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ及びＰ６ＧＴ−Ｐ製剤の二次派生ＦＴＩＲスペクトルはα螺旋信号をあまり有しなかった。さらに、すべてのグリシン製剤は、液体試料の本来の信号から著しい逸脱を示した。凍結乾燥の間、アルギニン含有製剤が主要な構造変化を示した。
【０５５０】
凍結乾燥した材料を４℃で２ヶ月間保存した後、ＦＴ／ＩＲを実施した。ＰＥＧ−ｈＧＨのアミドＩ信号は、凍結乾燥の後でさえ、他のタンパク質よりも比較的弱かった。しかしながら、ほとんどの試料は、１６５１ｃｍ−１でα螺旋信号を示し、これにより製剤候補間の定量的な比較が達成できた。グリシンは、アミドＩ領域で強い信号を示した。２ヶ月間で、すべてのグリシン製剤は、液体試料の本来の信号から著しい逸脱を示した。ほとんどのマンニトール製剤は、緩衝液又はｐＨにかかわらず良好なα螺旋信号を保存した。
【実施例２１】
【０５５１】
撹拌（界面活性剤検査）
２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％グリシン、０．５％マンニトール、ｐＨ６中のＰＥＧ−ｈＧＨを２ｍｇ／ｍＬへＨ７ＭＴ−Ｐで希釈した。０．０１％ポリソルベート２０（ＰＳ）を一つの試料へ添加し、０．０１％プルロニックＦ６８（Ｆ６８）を別の試料へ添加し、３番目には界面活性剤を添加しなかった。ガラスバイアルに充填した５００μＬで撹拌を実施した。試料を室温で１時間撹拌した。試料のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を表１０４に示す。撹拌した試料を「Ｖｔｘ」で記す。
【０５５２】
【表１０５】
2008525494.tif 000111
【０５５３】
検査した他の試料に比べて、プルロニックＦ６８は、表１０４に示されるように、撹拌により誘導される凝集を防止する上で最も効果的であった。
【０５５４】
さらなる実験には、試料を希釈して残余賦形剤を除去する代わりに試料を透析すること、及び／又はポリソルベート８０を含む（これには限定されない。）他の界面活性剤を検査することが含まれうる。界面活性剤は、単独で又は１つ又はそれ以上の他の界面活性剤と組み合わせて使用しうる。さらなる研究には、撹拌により誘導される凝集に対するＨ７ＭＴ製剤中のＰＥＧ−ｈＧＨの安定性に対して、以下の界面活性剤が及ぼす効果を検査することが含まれる。１）界面活性剤なし（ネガティブ対照）、２）０．０１％を含む（これには限定されない。）様々な量でのポリソルベート２０、３）０．００５％、０．０１％、０．０５％及び０．１％を含む（これには限定されない。）様々な量でのプルロニックＦ６８（又はポロキサマー１８８）、４）０．０１％を含む（これには限定されない。）様々な量でのポリソルベート８０、並びに５）プルロニックＦ６８及びポリソルベート２０又はプルロニックＦ６８及び他の界面活性剤の組み合わせである。最良の界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせを含有するさらなる凍結乾燥した製剤（Ｈ７ＭＴ）を調製し、４０℃でのそれらの安定性をＨ７ＭＴ製剤と比較する。ＰＥＧ−ｈＧＨの濃度は２ｍｇ／ｍＬであり、分析のための時点は０、１、２、３及び４週間又はそれより長期であろう。本明細書に記載の技術を分析のために使用するであろう。
【実施例２２】
【０５５５】
長期研究
さらなる長期安定性研究には、４℃及び２９℃で、０、３、６、９、１２、１８、及び２４ヶ月間を含む（これに限定されない。）様々な温度での保存後の製剤の評価が含まれる。凍結乾燥後に再構成される試料の安定性を、０、１日間、３日間及び１週間などの時間の様々な長さの間に、２ないし８℃で保存する間に研究し得る。
【実施例２３】
【０５５６】
凍結乾燥した製剤の研究
さらなるデータを、実施例１４で論議した凍結乾燥した製剤の研究から得た。４ヶ月の時点に対して得られたデータには、ＳＤＳ−ゲル（４℃及び２５℃で４ヶ月間保存した試料；図７７ないし８０）、再構成後の濃度及びｐＨ（表１０６ないし１０７）、４℃及び２５℃で４ヶ月間保存した試料のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析（表１０８ないし１０９）並びに４℃及び２５℃で４ヶ月間保存した試料のＲＰ−ＨＰＬＣ分析（表１１０ないし１１１）が含まれる。４ヶ月後、ヒスチジンを含有する製剤は、検査した製剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して共有結合性凝集体の最少量を示し続けた。最後の２ヶ月間にわたって、Ｈ６ＭＴ及びＰ７ＭＴは、２５℃で最小の変化を示した。
【０５５７】
【表１０６】
2008525494.tif 000112
【０５５８】
【表１０７】
2008525494.tif 000113
【０５５９】
【表１０８】
2008525494.tif 000114
【０５６０】
【表１０９】
2008525494.tif 000115
【０５６１】
【表１１０】
2008525494.tif 000116
【０５６２】
【表１１１】
2008525494.tif 000117
【実施例２４】
【０５６３】
ＰＥＧ−ＨＧＨとのヒスチジン相互作用研究
本研究の目的は、少なくとも８ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＥＧ−ｈＧＨを添加した場合の、１０ｍＭヒスチジン緩衝液、４％マンニトール、２％トレハロース、ｐＨ７．０において観察されたｐＨ低下を研究することである。本研究は、ヒスチジン製剤における濃度依存的ｐＨ変化がヒスチジンのＰＥＧ−ｈＧＨとの結合によるかどうかを研究した。
【０５６４】
遊離／結合ヒスチジンを決定するためのＲＰ−ＨＰＬＣ及び／又はＩＥＸ−ＨＰＬＣ法をこのような研究において使用しうる。
【０５６５】
５ｍｇ／ｍＬ及び２５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ｈＧＨの透析
ＰＥＧ−ｈＧＨの１つないし２つの濃度を以下の緩衝液のうちの１つに対して透析した。すなわち、１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．１、１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ７．０）、１０ｍＭヒスチジン（遊離塩基）、ｐＨ７．７、３０ｍＭヒスチジン（遊離塩基）、ｐＨ７．７であった。タンパク質のｐＨを透析後に測定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを実行し、タンパク質ピーク後に溶出するヒスチジンピークを測定することによって、ヒスチジンの量を決定した。２１４ｎｍ：２８０ｎｍを比較して、ヒスチジンがＰＥＧ−ｈＧＨへ結合するかどうかを決定した。
【０５６６】
１０ｍＭヒスチジン（遊離塩基）、ｐＨ７．７について、４．５ｍｇ／ｍＬタンパク質試料は７．１８のｐＨを有し、１４．０ｍｇ／ｍＬタンパク質試料は６．８９のｐＨを有した。２１４ｎｍ：２８０ｎｍの比は、両タンパク質濃度について同一であった（１９．２）。３０ｍＭヒスチジン（遊離塩基）、ｐＨ７．７では、１３．３ｍｇ／ｍＬのタンパク質試料は、７．１９のｐＨを有した。２１４ｎｍ：２８０ｎｍ比は１９．２であった。１０ｍＭＨｉｓ、ｐＨ７．０では、４．６ｍｇ／ｍＬのタンパク質試料は、６．９４のｐＨを有し、１３．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質試料は、６．７６のｐＨを有した。２１４ｎｍ：２８０ｎｍの比は、両タンパク質濃度について同一であった（１９．１）。１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．１では、４．６ｍｇ／ｍＬのタンパク質試料は、７．１０のｐＨを有し、１３．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質試料は、７．０９のｐＨを有した。２１４ｎｍ：２８０ｎｍの比は、より低いタンパク質濃度について１９．２であり、より高いタンパク質濃度について１９．１であった。
【０５６７】
濃縮中のｐＨ変化
濃縮中のタンパク質のｐＨ変化を測定した。１０ｍＭヒスチジン（遊離塩基）及び３０ｍＭＨｉｓ（遊離塩基）を検査した。タンパク質濃度は１ｍｇ／ｍＬで開始した。１０ｍＭＨｉｓ（遊離塩基）、ｐＨ７．７を使用して、以下の結果を見出した。１．０ｍｇ／ｍＬタンパク質はｐＨ７．４１であり、１１．７ｍｇ／ｍＬタンパク質はｐＨ６．８２であり、１５．０ｍｇ／ｍＬタンパク質はｐＨ６．７１であった。３０ｍＭＨｉｓ（遊離塩基）、ｐＨ７．７を使用して、以下の結果を見出した。１．０ｍｇ／ｍＬタンパク質はｐＨ７．５８であり、１１．４ｍｇ／ｍＬタンパク質はｐＨ７．２２であり、１７．１ｍｇ／ｍＬタンパク質はｐＨ７．０５であった。
【０５６８】
ヒスチジンの添加
ＰＥＧ−ｈＧＨを１４ｍｇ／ｍＬへ濃縮し、水に対して透析した。濃縮したヒスチジンの少量をタンパク質へ添加することによって、ヒスチジン濃度を増大させた。以下のｐＨ測定結果をヒスチジン濃度（ｍＭ）とともに決定した。０ｍＭヒスチジンでｐＨ５．５７、０．２５ｍＭヒスチジンでｐＨ５．６８、０．５ｍＭヒスチジンでｐＨ５．７４、１ｍＭヒスチジンでｐＨ５．８６、２．５ｍＭヒスチジンでｐＨ６．１３、５ｍＭヒスチジンでｐＨ６．３６、１０ｍＭヒスチジンでｐＨ６．６３、３０ｍＭヒスチジンでｐＨ７．０５であった。
【０５６９】
これらの研究において、ヒスチジンはＰＥＧ−ｈＧＨへ結合しないことがわかった。ヒスチジンの緩衝能は、タンパク質の緩衝能を凌駕することはできなかった。ｐＨを維持するのに十分な緩衝能を提供できるかどうかを決定するため、一塩基性リン酸塩を検査する。一塩基性リン酸塩を含む（これに限定されない。）ｐＨ約５．５ないしｐＨ約８．０で緩衝能を有するいずれかの緩衝液が適切でありうる。ヒスチジン含有製剤は、共有結合性凝集体及び撹拌由来の凝集体の量が少なかった。
【０５７０】
一塩基性一リン酸塩を以下のアッセイにおいて検査する。ＰＥＧ−ｈＧＨを１４ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、水に対して透析する。濃縮したリン酸塩の少量をタンパク質へ添加することによって、リン酸塩濃度を増大させる。ｐＨを各リン酸塩増量時に測定し、ｐＨ対リン酸塩濃度（ｍＭ）でプロットする。
【実施例２５】
【０５７１】
実施例１９で論議した加速した凝集の研究からさらなるデータを得た。４週の時点について得られたデータには、ＳＤＳ−ゲル（４℃及び４０℃で４週間保存した試料、図８１ないし８２）、ｐＨ（表１１１）並びに４℃及び４０℃で４週間保存した試料のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析が含まれる。
【０５７２】
【表１１２】
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【０５７３】
【表１１３】
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【０５７４】
【表１１４】
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【０５７５】
４週間後、Ｈ７ＭＴ−Ｐは、４℃及び４０℃の両者において、Ｈ７ＭＧＴ−Ｐよりも少ない脱ＰＥＧ化されたｈＧＨを、４０℃で共有結合性凝集体の少量を形成した。全体的に、４０℃で、主要分解産物は脱ＰＥＧ化されたｈＧＨであり、４℃でよりも二量体化の量が増大し、より多くの共有結合性凝集体があった。
【実施例２６】
【０５７６】
撹拌研究（界面活性剤）
実施例２１に記載の研究に対して経過観察研究を実施した。ＰＥＧ−ｈＧＨをＨ７ＭＴで透析し、透析したタンパク質をＨ７ＭＴで２ｍｇ／ｍＬに希釈した。界面活性剤プルロニックＦ６８の様々な量を試料へ添加した。すなわち、プルロニックＦ６８なし、０．０１％プルロニックＦ６８、０．０５％プルロニックＦ６８、０．１％プルロニックＦ６８、０．２５％プルロニックＦ６８又は０．５％プルロニックＦ６８であった。二つの対照試料は、タンパク質を有さない０．０１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）を有するＨ７ＭＴ緩衝液を含有した。一つの試料にはボルテックスを行ったのに対して、もう一つの試料にはボルテックスを行わなかった（ｔ＝０）。ガラスバイアルに充填した５００μＬで撹拌を実施し、試料を室温で２時間撹拌した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析をさまざまな試料に関して実施し、結果を表１１４に示す。
【０５７７】
【表１１５】
2008525494.tif 000121
【０５７８】
凝集可逆性を研究する研究において、ボルテックスした対照（界面活性剤なし）試料へ０．１％プルロニックＦ６８を添加し、撹拌により誘導される凝集がプルロニックＦ６８によって解離できるかどうかを検討した。試料をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した。本研究の結果は、プルロニックＦ６８が撹拌により誘導される凝集を低下させ得るが、その凝集を解離しないことを示した。０．１％プルロニックＦ６８を有するＨ７ＭＴは、プルロニックＦ６８のより少ない量を有する製剤よりも凝集体の量が少なかった。
【実施例２７】
【０５７９】
沈降速度分析
次の３つの試料、すなわち、３９．９ｍｇ／ｍＬ、２４．３ｍｇ／ｍＬ及び１．０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ｈＧＨポリペプチドの凝集を測定するために、本分析を実施した。これらのストックを０．６ｍｇ／ｍＬまで希釈した直後、ダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（Ｇｉｂｃｏパート番号１４４１９０−１４４）を用いて測定した。これらの試料についての高解像度沈降係数分布は、濃度を付与する垂直軸及び沈降係数に基づいた分離を示す水平軸を用いて得られた。試料間の濃度差を考慮するために、各分布を標準化した。３９．９ｍｇ／ｍＬでのＰＥＧ−ｈＧＨは１．２７Ｓでその主要ピークを有し、そのピークは吸光度全体の９８．７％を表した。２４．３ｍｇ／ｍＬでのＰＥＧ−ｈＧＨは１．２９Ｓでその主要ピークを有し、そのピークは吸光度全体の９７．５％を表した。主要ピーク（単量体）より速く沈降する小さなピークが見られた。
【実施例２８】
【０５８０】
ＡＵＣ／ＳＥＣ研究
ＰＥＧ化されたｈＧＨポリペプチドの異なる濃度（３９．９ｍｇ／ｍＬ、２４．３ｍｇ／ｍＬ、及び１．１ｍｇ／ｍＬ）の試料及び表１１５に示される製剤は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＡＵＣによって凝集の同様の量を示すことがわかった。表１１６は、カラムへ負荷される材料の２０μｇからのＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（各レーンに負荷された１０μｇ）を図８３として示す。
【０５８１】
【表１１６】
2008525494.tif 000122
【０５８２】
【表１１７】
2008525494.tif 000123
【実施例２９】
【０５８３】
中間体安定性研究
表１１７は、中間体安定性研究を詳述する。製剤ＩＤ  Ｈ７．３ＭＴは、３０ｍＭヒスチジン、４％マンニトール、２％トレハロース、ｐＨ７．３である。製剤ＩＤ  Ｈ７．３ＭＴ＋Ｆは、０．１％プルロニックＦ６８を含有する３０ｍＭヒスチジン、４％マンニトール、２％トレハロース、ｐＨ７．３である。製剤ＩＤ  ＨＰ７ＭＴは、１０ｍＭヒスチジン、１０ｍＭリン酸塩、４％マンニトール、２％トレハロース、ｐＨ７．０である。製剤ＩＤ  ＨＰ７ＭＴ＋Ｆは、０．１％プルロニックＦ６８を含有する１０ｍＭヒスチジン、１０ｍＭリン酸塩、４％マンニトール、２％トレハロース、ｐＨ７．０である。位置３５で置換されたｐ−アセチルフェニルアラニンを有するＰＥＧ化されたｈＩＦＮの３つの異なる濃度を使用する。すなわち、８ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ及び１６ｍｇ／ｍＬである。本研究は、ｔ＝０、１週間、８週間及び２４週間での、４℃、２５℃及び４０℃での分析を包含する。本研究に包含される方法は、上述のとおりであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元型及び非還元型）、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＩＥＸ、ＦＴＩＲ、湿気含有量等である。ＢｒｄＵ標識を包含する増殖アッセイを使用して、生物活性を測定する。簡潔には、血清不足のラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）を発現するＢＡＦ３細胞系２Ｅ２−２Ｂ１２−Ｆ４を使用して、本アッセイを実施する。９６穴プレート中に、細胞／ウェルの指定された密度で細胞を播種する。ＰＥＧ化されたｈＧＨポリペプチドの複数点用量範囲で細胞を活性化し、５０μＭＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で同時に標識する。培養の４８時間後、ＢＤ細胞固定／細胞透過溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、室温で３０分間、細胞を固定／透過する。ＢｒｄＵエピトープを曝露するため、固定／透過した細胞をＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）の３０μｇ／ウェルで、３７℃で１時間処理する。ＡＰＣ結合抗ＢｒｄＵ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による免疫蛍光染色によって、ＦＡＣＳアレイ上での試料分析が可能となる。本方法に対するバリエーションは、当業者に公知である。
【０５８４】
【表１１８】
2008525494.tif 000124
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【０５８５】
再構成研究
製剤ＩＤ  Ｈ７．３ＭＴは、３０ｍＭヒスチジン、４％マンニトール、２％トレハロース、ｐＨ７．３である。製剤ＩＤ  Ｈ７．３ＭＴ＋Ｆは、０．１％プルロニックＦ６８を含有する３０ｍＭヒスチジン、４％マンニトール、２％トレハロース、ｐＨ７．３である。製剤ＩＤ  ＨＰ７ＭＴは、１０ｍＭヒスチジン、１０ｍＭリン酸塩、４％マンニトール、２％トレハロース、ｐＨ７．０である。製剤ＩＤ  ＨＰ７ＭＴ＋Ｆは、０．１％プルロニックＦ６８を含有する１０ｍＭヒスチジン、１０ｍＭリン酸塩、４％マンニトール、２％トレハロース、ｐＨ７．０である。凍結乾燥した試料を４℃で８週間保持した後、試料を室温で再構成し、ｔ＝０、４、８及び２４時間保持し、上述の方法で分析する。表１１８を参照してほしい。
【０５８６】
【表１１９】
2008525494.tif 000129
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【０５８７】
注射可能性研究
ＰＥＧ化されたｈＧＨポリペプチド（製剤ＩＤ  Ｈ７．３ＭＴ）の８、１２、１６及び２５ｍｇ／ｍＬにより、注射可能性を検査する。結合していないＰＥＧ（製剤ＩＤ  Ｈ７．３ＭＴ）も、約１６ｍｇ／ｍＬ及び２５ｍｇ／ｍＬで分析し、同様に、ポリペプチド又はＰＥＧを含まない緩衝液対照も同様に分析する。インストロン（ｉｎｓｔｒｏｎ）機を使用して、４ポンドの力を２７及び２９ゲージの針とともに使用する。
【０５８８】
本明細書に記載されている技術に対する様々な条件及び／又はパラメータへの修正が当業者に公知である。上述の方法又は当業者に公知の他の方法などの方法を、製剤研究において使用し得る。試料に関する有効性の研究は、当業者に公知のアッセイで実施しうる。
【０５８９】
適切な製剤には、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ入りのＨ７ＭＴ−Ｐ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ入りのＨ７ＭＧＴ−Ｐ、Ｈ７ＭＴ−Ｐ、Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ入りのＨ６ＭＴ−Ｐ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ入りのＨ６ＭＧＴ−Ｐ、Ｈ６ＭＴ−Ｐ、Ｈ６ＭＧＴ−Ｐ、ＨＰ７ＭＴ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ入りのＨＰ７ＭＴ、Ｈ７．３ＭＴ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ入りのＨ７．３ＭＴが含まれるが、これらには限定されない。適切な製剤は約６ないし約７．３のｐＨ範囲を有し得る。適切な製剤は約５．５ないし約８のｐＨ範囲を有し得る。適切な製剤は、約５ないし約３０ｍＭでヒスチジンを含み得る。適切な製剤は、最大約６０ｇ／Ｌのマンニトールを必要に応じて含み得る。適切な製剤は、最大約５０ｇ／Ｌのトレハロースを必要に応じて含み得る。適切な製剤は、最大約６０ｇ／Ｌのグリシンを必要に応じて含み得る。
【０５９０】
本明細書に記載の実施例及び態様は例示に過ぎず、これらの様々な修正又は変更が、当業者に示唆され、本出願の精神及び範囲並びに添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることが理解される。本明細書中に引用されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のために、それらの全体が、参考文献により本明細書中に組み込まれる。
【０５９１】
【表１２０】
2008525494.tif 000131
【図面の簡単な説明】
【０５９２】
【図１】図１は、４℃で６週間後の製剤緩衝液のｐＨ安定性分析を示す。
【図２−１】図２は、Ｍｅｔ  Ｙ３５ｐＡＦ  ｈＧＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの還元型（図２Ｃ及び２Ｄ）並びに非還元型ゲル（図２Ａ及び２Ｂ）を示す。Ｆｉｇ．２Ａ及び２Ｂにおけるゲルは次のとおり負荷される。レーン１：分子量、レーン２：ＷＨＯ  ｈＧＨ、レーン３：ＷＨＯ  ｈＧＨ１％、レーン４：Ａ１、レーン５：Ａ２、レーン６：Ａ３、レーン７：Ａ４、レーン８：Ａ５、レーン９：Ａ６、レーン１０：Ａ７、レーン１１：Ａ８、レーン１２：分子量である。図２Ｃ及び２Ｄにおけるゲルは次のとおり負荷される。レーン１：分子量、レーン２：ＷＨＯ  ｈＧＨ、レーン３：ＷＨＯ  ｈＧＨ  １％、レーン４：Ｂ１、レーン５：Ｂ２、レーン６：Ｂ３、レーン７：Ｂ４、レーン８：Ｂ５、レーン９：Ｂ６、レーン１０：Ｂ７、レーン１１：Ｂ８、レーン１２：分子量である。
【図２−２】図２は、Ｍｅｔ  Ｙ３５ｐＡＦ  ｈＧＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの還元型（図２Ｃ及び２Ｄ）並びに非還元型ゲル（図２Ａ及び２Ｂ）を示す。Ｆｉｇ．２Ａ及び２Ｂにおけるゲルは次のとおり負荷される。レーン１：分子量、レーン２：ＷＨＯ  ｈＧＨ、レーン３：ＷＨＯ  ｈＧＨ１％、レーン４：Ａ１、レーン５：Ａ２、レーン６：Ａ３、レーン７：Ａ４、レーン８：Ａ５、レーン９：Ａ６、レーン１０：Ａ７、レーン１１：Ａ８、レーン１２：分子量である。図２Ｃ及び２Ｄにおけるゲルは次のとおり負荷される。レーン１：分子量、レーン２：ＷＨＯ  ｈＧＨ、レーン３：ＷＨＯ  ｈＧＨ  １％、レーン４：Ｂ１、レーン５：Ｂ２、レーン６：Ｂ３、レーン７：Ｂ４、レーン８：Ｂ５、レーン９：Ｂ６、レーン１０：Ｂ７、レーン１１：Ｂ８、レーン１２：分子量である。
【図３−１】図３ＡないしＦは、製剤グループＡないしＦの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）熱特性を示す。
【図３−２】図３ＡないしＦは、製剤グループＡないしＦの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）熱特性を示す。
【図３−３】図３ＡないしＦは、製剤グループＡないしＦの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）熱特性を示す。
【図４−１】図４は、マトリクスのグループＢ７（図４Ａ）及びＦ２（図４Ｂ）由来のＤＳＣ熱特性を示す。
【図４−２】図４は、マトリクスのグループＢ７（図４Ａ）及びＦ２（図４Ｂ）由来のＤＳＣ熱特性を示す。
【図５】図５は、全マトリクスについてのＤＳＣ融解温度及びＴｍへの変化を要約する表を提供する。
【図６】図６は、全マトリクスについてのＤＳＣ融解温度の要約を示す。
【図７】図７は、製剤グループについてのΔＨｖ／ΔＨの比の分析を示す。
【図８】図８は、各試料のエンタルピー（ＡＵＣ）における変化の分析を示す。
【図９Ａ】図９ＡないしＤは、ＷＨＯ  ｈＧＨ標準物質と比較したグループＢ、Ｃ、Ｅ、及びＦにおける試料のＲＰ−ＨＰＬＣデータセットを示す。
【図９Ｂ】図９ＡないしＤは、ＷＨＯ  ｈＧＨ標準物質と比較したグループＢ、Ｃ、Ｅ、及びＦにおける試料のＲＰ−ＨＰＬＣデータセットを示す。
【図９Ｃ】図９ＡないしＤは、ＷＨＯ  ｈＧＨ標準物質と比較したグループＢ、Ｃ、Ｅ、及びＦにおける試料のＲＰ−ＨＰＬＣデータセットを示す。
【図９Ｄ】図９ＡないしＤは、ＷＨＯ  ｈＧＨ標準物質と比較したグループＢ、Ｃ、Ｅ、及びＦにおける試料のＲＰ−ＨＰＬＣデータセットを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、グループＥ５についての異なるＹ３５ｐＡＦピークの分析を示し（全ピークの相対的な％を各時点でプロットし、主要ＭｅｔＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨピークへのいずれかの及びすべての変化を可視化した。）、図１０Ｂは、一次脱アミノ化／酸化ピークのズームを示す（脱アミノ化ピークにおいてズームした。経時的な脱アミノ化における増大（ｔ＝０ないし４週間））。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施した。
【図１０Ｂ】図１０Ａは、グループＥ５についての異なるＹ３５ｐＡＦピークの分析を示し（全ピークの相対的な％を各時点でプロットし、主要ＭｅｔＹ３５ｐＡＦ  ｈＧＨピークへのいずれかの及びすべての変化を可視化した。）、図１０Ｂは、一次脱アミノ化／酸化ピークのズームを示す（脱アミノ化ピークにおいてズームした。経時的な脱アミノ化における増大（ｔ＝０ないし４週間））。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施した。
【図１１】図１１は、マトリクスにわたる一次脱アミノ化／酸化ピークの分析を示す。（４℃で４週間にわたるＭｅｔ  Ｙ３５ｐＡＦ  ｈＧＨの分析）
【図１２】図１２は、製剤グループによる二次脱アミノ化／酸化ピークの分析を示す。（４℃で４週間にわたるＭｅｔ  Ｙ３５ｐＡＦ  ｈＧＨの分析）
【図１３】図１３は、製剤グループについての主要ＧＨピークの分析を示す。（４℃で４週間にわたるＭｅｔ  Ｙ３５ｐＡＦ  ｈＧＨの分析）
【図１４】図１４は、製剤グループＢ及びＣによる凍結解凍周期を経験した試料における一次脱アミノ化／酸化ピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【図１５】図１５は、製剤グループＢ及びＣによる凍結解凍周期を経験した試料における二次脱アミノ化ピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【図１６】図１６は、製剤グループＢ及びＣによる凍結解凍周期を経験した試料における主要ＧＨピークのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。（５回の凍結／解凍周期にわたるＭｅｔ  Ｙ３５ｐＡＦ  ｈＧＨの分析）
【図１７】図１７は、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析からの結果を示す。
【図１８】図１８は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる分析からの結果を示す。
【図１９】図１９は、ｃＩＥＸ−ＨＰＬＣによる分析からの結果を示す。
【図２０】図２０は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ積分の例を示す。
【図２１】図２１は、ＲＰ−ＨＰＬＣ積分の例を示す。
【図２２】図２２は、製剤研究（ｔ＝０）における対照試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：マーク１２、レーン２：参考標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。
【図２３】図２３は、製剤研究（ｔ＝０）における対照試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：マーク１２、レーン２：参考標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図２４Ａ】図２４は、製剤研究（ｔ＝０）における対照試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図２４、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質：レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図２４、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図２４Ｂ】図２４は、製剤研究（ｔ＝０）における対照試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図２４、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質：レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図２４、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図２５Ａ】図２５は、４℃で１週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図２５、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図２５、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図２５Ｂ】図２５は、４℃で１週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図２５、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図２５、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図２６Ａ】図２６は、４℃で１週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図２６、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図２６、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図２６Ｂ】図２６は、４℃で１週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図２６、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図２６、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図２７Ａ】図２７は、４℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図２７、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図２７、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図２７Ｂ】図２７は、４℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図２７、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図２７、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図２８Ａ】図２８、４℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図２８、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図２８、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図２８Ｂ】図２８、４℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図２８、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図２８、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図２９Ａ】図２９は、４℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図２９、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図２９、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図２９Ｂ】図２９は、４℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図２９、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図２９、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３０Ａ】図３０は、４℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図３０、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図３０、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３０Ｂ】図３０は、４℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図３０、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図３０、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３１】図３１は、４℃で６週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ５ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＧＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３２】図３２は、４℃で６週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ５ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＧＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３３】図３３は、４℃で２ヶ月保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン５：Ｐ６ＭＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３４】図３４は、４℃で２ヶ月保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン５：Ｐ６ＭＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３５】図３５は、４℃で３ヶ月間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン５：Ｐ６ＭＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３６】図３６は、４℃で３ヶ月間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン５：Ｐ６ＭＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ＊（夾雑）、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３７Ａ】図３７は、２５℃で１週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図３７、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５；Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図３７、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図３７、パネルＢについて、パネル１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３７Ｂ】図３７は、２５℃で１週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図３７、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５；Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図３７、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図３７、パネルＢについて、パネル１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３８Ａ】図３８は、２５℃で１週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図３８、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図３８、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３８Ｂ】図３８は、２５℃で１週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図３８、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図３８、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３９Ａ】図３９は、２５℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図３９、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図３９、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図３９Ｂ】図３９は、２５℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図３９、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図３９、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４０Ａ】図４０は、２５℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図４０、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図４０、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４０Ｂ】図４０は、２５℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図４０、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図４０、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４１Ａ】図４１は、２５℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図４１、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質：レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図４１、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４１Ｂ】図４１は、２５℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図４１、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質：レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図４１、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４２Ａ】図４２は、２５℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図４２、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図４２、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４２Ｂ】図４２は、２５℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図４２、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図４２、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４３】図４３は、２５℃で６週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ５ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＧＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４４】図４４は、２５℃で６週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ５ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＧＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４５】図４５は、２５℃で２ヶ月間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン５：Ｐ６ＭＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４６】図４６は、２５℃で２ヶ月間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン５：Ｐ６ＭＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４７】図４７は、２５℃で３ヶ月間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン５：Ｐ６ＭＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４８】図４８は、２５℃で３ヶ月間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン５：Ｐ６ＭＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４９Ａ】図４９は、４０℃で１週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図４９、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図４９、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図４９Ｂ】図４９は、４０℃で１週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図４９、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図４９、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５０Ａ】図５０は、４０℃で１週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図５０、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図５０、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５０Ｂ】図５０は、４０℃で１週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図５０、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図５０、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５１Ａ】図５１は、４０℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図５１、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図５１、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５１Ｂ】図５１は、４０℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図５１、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図５１、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５２Ａ】図５２は、４０℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図５２、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図５２、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５２Ｂ】図５２は、４０℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図５２、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図５２、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５３Ａ】図５３は、４０℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図５３、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図５３、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５３Ｂ】図５３は、４０℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図５３、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図５３、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５４Ａ】図５４は、４０℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図５４、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図５４、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５４Ｂ】図５４は、４０℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図５４、パネルＡについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図５４、パネルＢについて、レーン１：マーク１２標準物質、レーン２：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５５】図５５は、４０℃で６週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ５ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＧＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５６】図５６は、４０℃で６週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ５ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＧＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５７】図５７は、４０℃で２ヶ月間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン５：Ｐ６ＭＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５８】図５８は、４０℃で２ヶ月間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン５：Ｐ６ＭＴ、レーン６：Ｈ６ＭＴ、レーン７：Ｐ６ＧＴ、レーン８：Ｐ６ＭＳ、レーン９：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン１０：Ｐ６ＭＴ、レーン１１：Ｐ７ＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１３：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１５：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５９Ａ】図５９は、４℃で１週間保存した再構成した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図５９、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図５９、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図５９Ｂ】図５９は、４℃で１週間保存した再構成した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図５９、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図５９、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６０Ａ】図６０は、４℃で１週間保存した再構成した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図６０、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６０、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６０Ｂ】図６０は、４℃で１週間保存した再構成した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図６０、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６０、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６１Ａ】図６１は、製剤研究における対照試料（撹拌／ＵＶ対照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図６１、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６１、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６１Ｂ】図６１は、製剤研究における対照試料（撹拌／ＵＶ対照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図６１、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６１、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６２Ａ】図６２は、製剤研究における対照試料（撹拌／ＵＶ対照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図６２、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６２、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６２Ｂ】図６２は、製剤研究における対照試料（撹拌／ＵＶ対照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図６２、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６２、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６３Ａ】図６３は、外界室温で４時間撹拌した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図６３、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６３、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６３Ｂ】図６３は、外界室温で４時間撹拌した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図６３、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６３、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６４Ａ】図６４は、外界室温で４時間撹拌した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図６４、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６４、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６４Ｂ】図６４は、外界室温で４時間撹拌した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図６４、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６４、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６５Ａ】図６５は、外界温度で４時間ＵＶ光へ曝露した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図６５、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６５、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６５Ｂ】図６５は、外界温度で４時間ＵＶ光へ曝露した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。図６５、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６５、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６６Ａ】図６６は、外界温度で４時間ＵＶ光へ曝露した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図６６、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６６、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６６Ｂ】図６６は、外界温度で４時間ＵＶ光へ曝露した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。図６６、パネルＡについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｓ４ＭＴ、レーン５：Ｓ５ＭＴ、レーン６：Ｓ５ＧＴ、レーン７：Ｈ６ＭＴ、レーン８：Ｐ６ＧＴ、レーン９：Ｐ６ＭＡ、レーン１０：Ｐ６ＭＳである。図６６、パネルＢについて、レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン３：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン４：Ｐ７ＭＴ、レーン５：Ｐ７ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン８：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン９：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図６７】図６７は、凍結／解凍条件へ供された試料（Ｈ７ＭＴ−Ｐ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン３：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ｔ＝０、レーン４：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  １、レーン５：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ２、レーン６：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ３、レーン７：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ４、レーン８：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ５、レーン１０：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ｔ＝０、レーン１１：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  １、レーン１２：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ２、レーン１３：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ３、レーン１４：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ４、レーン１５：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ５である。
【図６８】図６８は、凍結／解凍条件へ供した試料（Ｈ７ＭＴ−Ｐ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン３：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ｔ＝０、レーン４：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  １、レーン５：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ２、レーン６：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ３、レーン７：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ４、レーン８：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ５、レーン１０：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ｔ＝０、レーン１１：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  １、レーン１２：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ２、レーン１３：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ３、レーン１４：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ４、レーン１５：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ５である。
【図６９】図６９は、凍結／解凍条件へ供した試料（Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン３：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ｔ＝０、レーン４：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  １、レーン５：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ２、レーン６：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ３、レーン７：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ４、レーン８：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ５、レーン１０：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ｔ＝０、レーン１１：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  １、レーン１２：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ２、レーン１３：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ３、レーン１４：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ４、レーン１５：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ５である。
【図７０】図７０は、凍結／解凍条件へ供した試料（Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン３：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ｔ＝０、レーン４：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  １、レーン５：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ２、レーン６：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ３、レーン７：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ４、レーン８：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ５、レーン１０：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ｔ＝０、レーン１１：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  １、レーン１２：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ２、レーン１３：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ３、レーン１４：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ４、レーン１５：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  Ｆ／Ｔ  ５である。
【図７１】図７１は、対照試料並びに６時間の撹拌及び４時間のＵＶ光へ供した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン４：ボルテックス／ＵＶ対照Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ、レーン５：ボルテックス／ＵＶ対照Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ、レーン６：ボルテックス／ＵＶ対照Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ、レーン７：ボルテックス／ＵＶ対照Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ、レーン８：ボルテックスＨ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ、レーン９：ボルテックスＨ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ、レーン１０：ボルテックスＨ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ、レーン１１：ボルテックスＨ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ、レーン１２：ＵＶ  Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ、レーン１３：ＵＶ  Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ、レーン１４：ＵＶ  Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ、レーン１５：ＵＶ  Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬである。
【図７２】図７２は、対照試料並びに６時間の撹拌及び４時間のＵＶ光へ供した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン４：ボルテックス／ＵＶ対照Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ、レーン５：ボルテックス／ＵＶ対照Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ、レーン６：ボルテックス／ＵＶ対照Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ、レーン７：ボルテックス／ＵＶ対照Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ、レーン８：ボルテックスＨ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ、レーン９：ボルテックスＨ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ、レーン１０：ボルテックスＨ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇｍＬ＊（夾雑していた）、レーン１１：ボルテックスＨ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ、レーン１２：ＵＶ  Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ、レーン１３：ＵＶ  Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ、レーン１４：ＵＶ  Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ、レーン１５：ＵＶ  Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬである。
【図７３】図７３は、４℃又は４０℃で１週間保存した試料及び熱変性条件へ曝露した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン４：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン５：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン６：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン７：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン８：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン９：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン１０：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン１１：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン１２：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ熱変性、レーン１３：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ熱変性、レーン１４：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ熱変性、レーン１５：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ熱変性である。
【図７４】図７４は、４℃又は４０℃で１週間保存した試料及び熱変性条件へ曝露した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン４：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン５：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン６：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン７：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン８：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン９：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン１０：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン１１：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン１２：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ熱変性、レーン１３：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ熱変性、レーン１４：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ熱変性、レーン１５：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ熱変性である。
【図７５】図７５は、４℃又は４０℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン３：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン４：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン５：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン６：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン７：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン８：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン９：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン１０：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４０℃である。
【図７６】図７６は、４℃又は４０℃で２週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン３：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン４：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン５：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン６：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン７：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン８：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン９：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン１０：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４０℃である。
【図７７】図７７は、４℃で４ヶ月間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン４：Ｐ６ＭＴ、レーン５：Ｈ６ＭＴ、レーン６：Ｐ６ＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＳ、レーン８：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン９：Ｐ６ＭＴ、レーン１０：Ｐ７ＧＴ、レーン１１：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１３：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図７８】図７８は、４℃で４ヶ月間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン４：Ｐ６ＭＴ、レーン５：Ｈ６ＭＴ、レーン６：Ｐ６ＧＴ、レーン７：Ｐ６ＭＳ、レーン８：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン９：Ｐ６ＭＴ、レーン１０：Ｐ７ＧＴ、レーン１１：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１２：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１３：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１４：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図７９】図７９は、２５℃で４ヶ月間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｈ６ＭＴ、レーン５：Ｐ６ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＳ、レーン７：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン８：Ｐ６ＭＴ、レーン９：Ｐ７ＧＴ、レーン１０：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１１：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１２：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１３：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図８０】図８０は、２５℃で４ヶ月間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン３：Ｐ６ＭＴ、レーン４：Ｈ６ＭＴ、レーン５：Ｐ６ＧＴ、レーン６：Ｐ６ＭＳ、レーン７：Ｐ６ＭＴＭｅｔ、レーン８：Ｐ６ＭＴ、レーン９：Ｐ７ＧＴ、レーン１０：Ｐ６ＭＧＴ、レーン１１：Ｐ６ＭＧＴ−Ｐ、レーン１２：Ｐ６ＭＴ−Ｐ、レーン１３：Ｐ６ＧＴ−Ｐである。
【図８１】図８１は、４℃又は４０℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（０．５μｇ）、レーン３：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン４：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン５：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン６：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン７：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン８：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン９：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン１０：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４０℃である。
【図８２】図８２は、４℃又は４０℃で４週間保存した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元型）を示す。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質、レーン２：ｈＧＨ（０．５μｇ）、レーン３：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン４：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン５：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン６：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４℃、レーン７：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン８：Ｈ７ＭＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン９：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  ８ｍｇ／ｍＬ  ４０℃、レーン１０：Ｈ７ＭＧＴ−Ｐ  １４ｍｇ／ｍＬ  ４０℃である。
【図８３】図８３は、試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。レーン１：ＰＥＧ−ｈＧＨ標準物質（バッチ２）、レーン２：ｈＧＨ（１μｇ）、レーン４：３９．９ｍｇ／ｍＬ非還元型、レーン５：２４．３ｍｇ／ｍＬ非還元型、レーン６：１．１ｍｇ／ｍＬ非還元型、レーン８：３９．９ｍｇ／ｍＬ還元型、レーン９：２４．３ｍｇ／ｍＬ還元型、レーン１０：１．１ｍｇ／ｍＬ還元型である。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６５Ａ】
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【図６５Ｂ】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【配列表】
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