(57)【要約】本発明は、１種以上の胆汁酸と、水可溶性でんぷん転化物または非でんぷん多糖類の透明な水溶液に関するものである。本発明の前記溶液は、一つ以上の毒性作用を有する薬剤学的化合物と一緒に対象に投与される。一部の実施形態において、本発明の溶液は、神経病性作用を減少または除去するために、末梢神経毒性と関連した薬剤学的化合物（例えば、シスプラチン及び／またはスラミン）と一緒に哺乳動物に投与される。
2008516977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における薬剤学的化合物の毒性作用を改善または除去する方法であって、
（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミンとアマイド結合によってコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された第１の物質と、
（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、
（ｃ）水とを含み、第１の物質と前記炭水化物の両方が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態である透明な水溶液を対象に投与する段階と、
前記対象に毒性作用を有する薬剤学的化合物を投与する段階と、を含む方法。
【請求項２】
前記毒性作用は、ｐ５３−媒介神経病性作用である請求項１に記載の透明な水溶液。
【請求項３】
前記毒性作用は、軸索変性である請求項１に記載の透明な水溶液。
【請求項４】
前記対象は、哺乳動物である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象は、ヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象は、前記水溶液の投与後に、前記薬剤学的化合物の少なくとも一つの投与容量を受けるものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対象は、前記水溶液の投与前に、前記薬剤学的化合物を受けるものである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記対象は、前記水溶液の投与と同時に、前記薬剤学的化合物を受けるものである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の物質は、ケノデオキシコール酸、コール酸、ヒオデオキシコール酸、デオキシコール酸、７−オキソリトコール酸、リトコール酸、アイオドデオキシコール酸、イオコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコウルソデオキシコール酸、タウロコール酸、グリココル酸、ステロイド核にあるヒドロキシル基またはカルボキシル酸基でのそれらの誘導体、及びこれらのアミンとのコンジュゲート類からなる群から選択されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の物質は、ウルソデオキシコール酸またはウルソデオキシコール酸のナトリウム塩である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択されたｐＨ範囲は、約ｐＨ１〜１０である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記水可溶性でんぷん転化物は、マルトデキストリン、デキストリン、液体ブドウ糖、コーンシロップ固形物及び可溶性でんぷんからなる群から選択されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記水可溶性でんぷん転化物は、マルトデキストリンである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記水可溶性非でんぷん多糖類は、デキストラン、グアーガム、ペクチン、難消化性の可溶性繊維からなる群から選択されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤学的化合物は、化学療法剤化合物、抗腫瘍剤化合物、免疫活性化合物、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素阻害剤、プロテオソーム阻害剤、抗レトロウイルス薬物及びこれらの組み合わせからなる群から選択されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤学的化合物は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、スラミン、硫酸ブレオマイシン、アザチオプリン、アザシチジン、ブスルファン、塩酸ドキソルビシン、パクリタキセル、マイトマイシン、エポシロン、コルヒチン、メトロニダゾール、サプソン（ｓａｐｓｏｎｅ）、ミソニダゾール、スルファサラジン、ジスルフィラム、ニトロフラントイン、タクロリムス、ヌクレオシド類似体類、タキサン類（ｔａｘｅｎｅｓ）、ガングリオシド類（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ）、ビンクリスチン、ペニシラミン、サリドマイド、ビダラビン、イソニアジド、ビンカアルカロイド類、アミオダロン、ペルヘキシリン、レフルノミド、ボルテゾミブ、ディダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、プレバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチンからなる群から選択されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤学的化合物は、シスプラチンである請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
透明な水溶液であって、
（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミンとアマイド結合によってコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された第１の物質と、
（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、
（ｃ）薬剤学的有効量の薬剤学的化合物と、
（ｄ）水とを含み、
第１の物質と前記炭水化物の両方が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値において溶液状態であり、前記薬剤学的化合物は、哺乳動物に投与された場合、毒性作用を有するものである透明な水溶液。
【請求項１９】
前記毒性作用は、ｐ５３−媒介神経病性作用である請求項１８に記載の透明な水溶液。
【請求項２０】
前記毒性作用は、軸索変性である請求項１８に記載の透明な水溶液。
【請求項２１】
前記第１の物質は、神経保護量で存在する請求項１８に記載の透明な水溶液。
【請求項２２】
前記薬剤学的化合物は、選択された範囲内の全てのｐＨ値に対して溶液状態である請求項１８に記載の透明な水溶液。
【請求項２３】
前記第１の物質は、ケノデオキシコール酸、コール酸、ヒオデオキシコール酸、デオキシコール酸、７−オキソリトコール酸、リトコール酸、アイオドデオキシコール酸、イオコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコウルソデオキシコール酸、タウロコール酸、グリココル酸、ステロイド核にあるヒドロキシル基またはカルボキシル酸基でのそれらの誘導体、それらの塩またはアミンとのコンジュゲートからなる群から選択されたものである請求項１８に記載の透明な水溶液。
【請求項２４】
前記第１の物質は、ウルソデオキシコール酸またはウルソデオキシコール酸のナトリウム塩である請求項１８に記載の透明な水溶液。
【請求項２５】
前記選択されたｐＨ範囲は、約ｐＨ１〜１０である請求項１８に記載の透明な水溶液。
【請求項２６】
前記水可溶性でんぷん転化物は、マルトデキストリン、デキストリン、液体ブドウ糖、コーンシロップ固形物及び可溶性でんぷんからなる群から選択されたものである請求項１８に記載の透明な水溶液。
【請求項２７】
前記水可溶性でんぷん転化物は、マルトデキストリンである請求項２６に記載の透明な水溶液。
【請求項２８】
前記水可溶性非でんぷん多糖類は、デキストラン、グアーガム、ペクチン及び難消化性の可溶性繊維からなる群から選択されたものである請求項１８に記載の透明な水溶液。
【請求項２９】
前記薬剤学的化合物は、化学療法剤化合物、抗腫瘍剤化合物、免疫活性化合物、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素阻害剤、プロテオソーム阻害剤、抗レトロウイルス薬物及びこれらの組み合わせ物からなる群から選択されたものである請求項１８に記載の透明な水溶液。
【請求項３０】
前記薬剤学的化合物は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、スラミン、硫酸ブレオマイシン、アザチオプリン、アザシチジン、ブスルファン、塩酸ドキソルビシン、パクリタキセル、マイトマイシン、エポシロン、コルヒチン、メトロニダゾール、サプソン（ｓａｐｓｏｎｅ）、ミソニダゾール、スルファサラジン、ジスルフィラム、ニトロフラントイン、タクロリムス、ヌクレオシド類似体類、タキサン類（ｔａｘｅｎｅｓ）、ガングリオシド類（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ）、ビンクリスチン、ペニシラミン、サリドマイド、ビダラビン、イソニアジド、ビンカアルカロイド類、アミオダロン、ペルヘキシリン、レフルノミド、ボルテゾミブ、ディダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、プレバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン及びロスバスタチンからなる群から選択されたものである請求項１８に記載の透明な水溶液。
【請求項３１】
前記薬剤学的化合物は、シスプラチンである請求項１８に記載の透明な水溶液。
【請求項３２】
神経病性作用を有する薬剤学的化合物を受けるか、受け瑠可能性のある対象における薬剤学的化合物の神経病性作用を減少または除去する方法であって、
（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミンとアマイド結合によってコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された第１の物質と、
（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、
（ｃ）水と、を含み、
第１の物質と前記炭水化物の両方が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態である透明な溶液をヒトに投与する段階を含む方法。
【請求項３３】
前記薬剤学的化合物は、シスプラチン及びスラミンからなる群から選択されたものである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
透明な水溶液であって、
（ａ）水可溶性胆汁酸、胆汁酸塩、及びアミンとアミド結合によってコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された第１の物質と、
（ｂ）でんぷんの水可溶性加水分解物と、
（ｃ）シスプラチン及びスラミンからなる群から選択された薬剤学的有効量の化学療法剤化合物と、
（ｄ）水とを含み、
前記第１の物質と前記でんぷんの水可溶性加水分解物の両方が、約ｐＨ１〜ｐＨ１４の全てのｐＨ値で溶液状態である透明な水溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質（例えば、化学療法剤）の毒性作用を改善するために用いられる１種以上の胆汁酸の透明な水溶液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの薬剤学的化合物（例えば、薬物、薬）の最大の治療的価値は、毒性作用の相殺によって実現困難であるか、実現不可能である。あるケースでは、薬剤の一つ以上の毒性作用が非常に激しいので、当該の製剤がヒトに対して安全に用いることができない。また、別のケースでは、毒性作用を避けるために容量を制限する必要がある。更に別のケースでは、療法過程を短縮する必要がある。加えて、切迫した状況下や、生命を脅かす疾病である場合、薬剤学的化合物の利得を得るために、その毒性作用にただ耐えるよう患者に強要することもある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、薬剤学的化合物の毒性を改善または除去する方法や組成物の必要性が生じている。
本発明は、薬剤学的化合物の毒性（例えば、毒性作用）を改善または除去できる方法及び組成物に関するものである。例えば、薬剤学的化合物の毒性作用を改善または除去する方法は、薬剤学的化合物と胆汁酸組成物を併用して投与することを含む。薬剤学的化合物は、一部の実施形態において、化学療法剤類、スタテイン類（ｓｔａｔｅｉｎｓ）、プロテオソーム阻害剤（Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及び抗レトロウイルス薬物（ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔ）からなる群から選択されてもよい。また、一部の実施形態において、併用投与は、同時にまたは同一時間内に、１種以上の製剤を投与することを含む。例えば、併用投与は、薬剤学的化合物と胆汁酸を単一組成物として投与することを含む。また、複数の組成物を同時に投与することを含む。そうでなければ、併用投与は、同一時間の間の異なる時刻に複数の組成物を投与することを含む。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一部の実施形態において、 本発明は、（１）胆汁酸、胆汁酸誘導体、胆汁酸塩またはアミンとの胆汁酸コンジュゲートと、（２）水と、（３）胆汁酸とでんぷん転化物を、選択されたｐＨ範囲内の如何なるｐＨでも溶液状態に維持させるための充分な量の水可溶性でんぷん転化物とを含む組成物を提供する。
【０００５】
また、本発明は、（１）胆汁酸、胆汁酸誘導体、胆汁酸塩またはアミンとの胆汁酸コンジュゲートと、（２）水と、（３）胆汁酸と多糖類を、選択されたｐＨ範囲内の如何なるｐＨでも溶液状態に維持させるための充分な量の水可溶性非でんぷん（ｎｏｎ−ｓｔａｒｃｈ）多糖類とを含む組成物に関するものである。
【０００６】
また、本発明は、（１）胆汁酸、胆汁酸誘導体、胆汁酸塩またはアミンとの胆汁酸コンジュゲートと、（２）水と、（３）薬剤学的に適正量の薬剤学的化合物と、（４）胆汁酸、薬剤学的化合物及び炭水化物を、選択されたｐＨ範囲内の如何なるｐＨレベルでも溶液状態に維持させるための充分な量の水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類と、を含む薬剤学的組成物に関するものである。本発明の非制限的な実施形態によると、薬剤学的化合物は、シスプラチン、シスプラチンの薬剤学的活性誘導体または類似体、スラミン、スラミンの薬剤学的活性誘導体または類似体、化学療法剤、スタチン、プロテオソーム阻害剤及び抗ウイルス剤からなる群から選択される。
【０００７】
また、本発明は、胆汁酸組成物の溶液投薬形態に関するものである。これら投薬形態は、胆汁酸の改善された生体利用率及び吸収性を有する。これら組成物が薬剤学的化合物をさらに含有する場合、前記薬剤学的化合物の改善された生体利用率及び吸収性も有する。
【０００８】
本発明の一部の実施形態においては、（１）胆汁酸、胆汁酸誘導体、胆汁酸塩またはアミンとの胆汁酸コンジュゲートと、（２）水と、（３）胆汁酸成分と炭水化物を、選択されたｐＨ範囲内の如何なるｐＨでも溶液状態に維持させるための充分な量の、水可溶性でんぷん転化物と水可溶性非でんぷん多糖類との組み合わせである炭水化物とを含む組成物を提供する。可溶性非でんぷん多糖類及び高分子量でんぷん転化物を全て含有する実施形態において、それぞれの量は、それらが一緒に組成物に配合される場合、前記胆汁酸成分、高分子量でんぷん転化物、可溶性非でんぷん多糖類及びもしあれば薬剤学的化合物が、選択されたｐＨ範囲内の如何なるｐＨでも溶液状態に維持させるのに充分な量であればよい。
【０００９】
本発明の一部の実施形態において、配合治療用組成物は、薬剤学的化合物の反応強度または効能を増加する。このような組成物は、薬剤学的化合物の低容量投与を可能にし、異なる地点で疾病複合体を攻撃し、 薬剤学的化合物の排泄に影響を及ぼし、および／または吸収の度合いを変更することができる。このような組成物は、薬物の毒性及び／または副作用の減少をもたらすか、減少に寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
治療における薬剤学的化合物の利得は、その製剤が毒性も示す場合、軽減されるか、無効になることもある。例えば、シスプラチン及びスラミンは、化学療法剤のうち最も効果的なものであるが、これらは、治療後、癌患者の感覚神経病症を引き起こす。シスプラチン−誘発またはスラミン−誘発神経毒性の標的は、後根神経節（ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ：ＤＲＧ）ニューロンである。シスプラチンまたはスラミンに慢性的に曝された動物は、ＤＲＧニューロンの軸索運搬及び微細管アセンブリーが撹乱し、ＤＲＧニューロンでの細胞自滅死を起こす。シスプラチンは、化学療法後、病理的な中間体の一つである酸素ラジカルを生成する。化学療法剤、スタチン、プロテオソーム阻害剤及び抗レトロウイルス薬物などのその他の製剤もまた、ＤＲＧニューロンを標的し、軸索変性と関連していることがある。
【００１１】
スタチンは、末梢神経病症を誘発しうるが、その発生率は低い。心臓血管保護の観点でスタチンの有益な効果を勘案すると、この発生による影響は、比較的害のないものと見なされる。サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）神経病症は、その発生率が高いこともある（例えば、ある場合は３／４にまで）。容量依存性に関する情報には変動があるが、低い累積容量ほど毒性は低い。サリドマイドと同様に、新規のプロテオソーム阻害剤であるボルテゾミブは、多発性骨髄腫の治療時に効果的であると報告されており、また末梢神経病症と関連している。オキサリプラチン及びエポシロンは、神経毒性を有する可能性のある抗ガン剤として市販されている。これと同様に、関節リウマチの治療用として承認された新規の疾患緩和剤であるレフルノミドは、神経病症を引き起こすものと報告されている。抗レトロウイルス薬物は、抗レトロウイルス毒性神経病症（ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｏｘｉｃ  ｎｅｕｒｏｐｈａｔｈｙ）と関連しており、この障害は、ほぼ、末端領域での長い軸索の"黒色に染色された"軸索変性、無髄神経線維の損失、及び末梢神経及び後根神経節での多様なマクロファージ浸潤度を含む感覚症候群として特徴づけられる。一部の抗酸化剤は、神経毒性からニューロンを効果的に保護できるが、この神経保護メカニズムは確立されていない。毒性及び／または抗酸化神経保護を媒介できる細胞因子は、ｐ５３、Ｆａｓ及びＦａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）を含む。
【００１２】
胆汁を担時する主成分であるウルソデオキシコール酸（３α−７β−ジヒドロキシ−５β−コラン酸（"ＵＤＣＡ"）は、多くの種類の疾患（例えば、肝疾患）に対する治療及び予防用の薬剤学的化合物として有用である。その医薬的用途は、放射線透過性の胆石の分解、胆汁性消化不良（ｂｉｌｉａｒｙ  ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、原発性の胆汁性肝硬変、原発性の硬化性胆管炎、慢性活性肝炎及びＣ型肝炎の治療を含む。
【００１３】
治療的活性物質として、そして、担体及び／またはアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）としての胆汁酸の非常に価値ある治療的効果と医薬的用途にもかかわらず、胆汁酸の商業的用途は、胆汁酸が固体形態（例えば、錠剤、カプセル及び懸濁剤）で存在する薬剤学的製剤に制限されてきた。これは、約ｐＨ１〜８のでの水性媒質中の胆汁酸の不溶性に起因する。胆汁は、非常に苦い味と、数時間の間持続される同等の苦い後味を有し、これらは、全て胆汁の不溶性に起因する。いくつかの利用可能な水溶性剤形は不安定であり、その用途はｐＨ制御及び維持の問題点のために非常に制限されてしまう。さらに、市販されているいくつかの胆汁酸の薬剤学的投薬形態は、不充分な生体利用率を有するものと報告されている。
【００１４】
本発明は、薬物剤の毒性を改善または軽減する、可溶性胆汁酸の透明かつ安定的な溶液を提供する。本発明の溶液は、一つ以上の毒性作用を有する薬剤の伝達ビヒクルとして用いられる。また、本発明の溶液は、投与経路及び時間の両観点から、分けて投与される。本発明の一部の実施形態において、胆汁組成物は、ｐ５３によって媒介された毒性作用を遮断する。本発明の一部の実施形態において、胆汁組成物は、酸化過程によって媒介された毒性作用を遮断する。
【００１５】
一実施形態において、本発明の溶液は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物での薬剤学的化合物（例えば、化学療法剤、スタチン、プロテオソーム阻害剤及び抗レトロウイルス薬物）の神経毒性作用を減少または除去するのに用いられる。本発明の溶液は、抗腫瘍剤及び／または免疫活性薬物（例えば、シスプラチン、 カルボプラチン、オキサリプラチン、スラミン、硫酸ブレオマイシン、アザチオプリン、アザシチジン、ブスルファン、塩酸ドキソルビシン、パクリタキセル、マイトマイシン、エポシロン、コルヒチン、メトロニダゾール、サプソン（ｓａｐｓｏｎｅ）、ミソニダゾール、スルファサラジン、ジスルフィラム、ニトロフラントイン、タクロリムスヌクレオシド類似体類、タキサン類（ｔａｘｅｎｅｓ）、ガングリオシド類（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ）、ビンクリスチン、ペニシラミン、サリドマイド、ビダラビン、イソニアジド、ビンカアルカロイド類、アミオダロン、ペルヘキシリン及びレフルノミド）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、抗レトロウイルス薬物（例えば、ディダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン）及び／またはヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素阻害剤（例えば、プレバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン）の毒性作用を減少または除去することもできる。
【００１６】
本発明は、（１）１種以上の可溶性胆汁酸、水可溶性胆汁酸誘導体、胆汁酸塩またはアミンとコンジュゲートされた胆汁酸（総括的に"胆汁酸"という）と、（２）水と、（３）所望のｐＨ範囲内の如何なるｐＨでも析出物を形成しない溶液を生成するのに充分な量の１種以上の水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類を含む水溶液に関するものである。前記組成物は、それ自体で薬剤学的効果を有する胆汁酸または胆汁酸塩を含有する。本発明の剤形は、所望のｐＨ範囲において、本発明の組成物に溶解状態にある薬剤学的原料を伝達するための担体、アジュバントまたは増強剤として作用する。また、本発明の一部の実施形態によると、本組成物は、不完全な可溶性の非胆汁酸薬剤を含む。
【００１７】
一部の実施形態において、前記胆汁酸と前記炭水化物は、酸性からアルカリ性までの任意のｐＨで析出されることなく、溶液状態であることが利点である。胆汁酸のこれら水溶液系は、析出物または粒子を実質的に含有しない。本発明の追加的な利点は、強酸またはアルカリの添加後に、水溶液系を５０℃の加速保存条件下で数カ月観察した後にも、透明度、色相または臭いなどの物理的外観の変化がないことからも示される。
【００１８】
本発明の一部の実施形態において、胆汁酸の水溶液系は、経口投与されることで、腸の酸性胃液及びアルカリ性胃液に曝され、胆汁酸の析出なしにも胃腸管を通して腸に到達する。これら溶解された胆汁酸剤形は、腸内の固有の溶液系が効果的かつ完全に吸収されることで、腸間に循環されることが示される。本発明の実施形態によると、胆汁酸の溶解度（例えば、物理的外観の変化及び析出）は、任意の胆汁酸のカルボキシル酸側鎖がプロトン化（非イオン化）できるか、イオン化されているか、または、単純なカルボキシル酸であるかによって影響を受ける。
【００１９】
胆汁酸カルボキシル酸側鎖のイオン化状態は、これら水溶液系において胆汁酸の疎水性及び親水性に大きな影響を与える。本発明の一部の実施形態において、そのイオン化状態は、胆汁酸の毒性、吸収性及び両親媒性を制御するようにｐＨを調整して調節される。１種以上の胆汁酸は、治療的活性剤として、薬物のアジュバントとして、薬物の担体としてまたは薬物溶解度の増強剤として、これら水溶液系に溶解される。これら水溶液系は、口腔消費用、浣腸剤、口腔洗浄剤、うがい剤（ｇａｒｇｌｅ）、鼻腔製剤、耳製剤、注射剤、洗浄剤（ｄｏｕｃｈｅ）、局所皮膚製剤、その他の局所製剤及び化粧製剤用に製造され、これら製剤は、長時間の経過後、物理的外観の劣化や析出などの問題のない所望のｐＨを有する。
【００２０】
可溶性胆汁酸は、水可溶性の任意のタイプの胆汁酸である。胆汁酸塩は、胆汁酸の任意の水可溶性の塩である。胆汁塩は、燐脂質及びコレステロールに対する大きな可溶化能力を発揮するので、良好な洗浄剤である。さらに、疎水性の胆汁塩は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）及び試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）両方の多様な隔膜に対して一層有害である。胆汁酸の水性溶解塩は、上述した胆汁酸とアミンとの反応によって形成される。このアミンは、限定されるものではないが、トリエンチン、ジエチレントリアミン、テトラエチレンペンタミンなどの脂肪族遊離アミン類；アルギニン、リシン、オルニチンなどの塩基性アミノ酸；アンモニア；Ｄ−グルカミン、Ｎ−アルキルグルカミンなどのアミノ糖類；コリンなどの４次アンモニウム誘導体；ピペラジン、Ｎ−アルキルピペラジン、ピペリジン、Ｎ−アルキルピペリジン、モルホリン、Ｎ−アルキルモルホリン、ピロリジンなどの複素環式アミン；トリエタノールアミン及びトリメタノールアミンなどを含む。本発明によると、胆汁酸の水可溶性金属塩、胆汁酸とシクロデキストリン及びその誘導体間の包接化合物及び水可溶性Ｏ−スルホン化胆汁酸も可溶性胆汁酸塩として含まれる。
【００２１】
本発明の一部の実施形態による可溶性胆汁酸誘導体は、対応する脱誘導体化胆汁酸に比べて、水溶液中での溶解性が同等であるか、それより大きい誘導体である。胆汁酸誘導体は、これに限定されるものではないが、胆汁酸のヒドロキシル基及びカルボキシル酸基において、他の作用基、これに限定されるものではないが、ハロゲン及びアミノ基が形成された誘導体を含む。可溶性胆汁酸は、ＨＣｌ、リン酸、クエン酸、酢酸、アンモニアまたはアルギニンのうち一つと配合される胆汁酸の遊離酸形態の水性製剤を含む。
【００２２】
本発明の教示によって用いられる胆汁酸としては、これに限定されるものではないがウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、コール酸、ヒオデオキシコール酸、デオキシコール酸、７−オキソリトコール酸、リトコール酸、アイオドデオキシコール酸、イオコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロリトコール酸、グリコウルソデオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、ステロイド核にあるヒドロキシル基またはカルボキシル酸基でのそれらの誘導体が挙げられる。
【００２３】
本発明の一部の実施形態において、主な利点は、溶液中の胆汁酸の輸送が、従来の製剤より一層高い生体内胆汁酸レベルを達成できる点にある。したがって、胆汁酸による治療の可能性は、従来の剤形よりも遥かに充分に達成される。胆汁がの可溶が不完全な既存の剤形によって達成される胆汁酸の生体内レベルは低く、多量の胆汁酸投与が必要とされる。本発明の剤形では、胆汁酸が完全に溶解されるので、より低い容量で投与された場合であっても、より高い胆汁酸の生体内レベルが達成される。
【００２４】
本発明の一部の実施形態において、複数の胆汁酸が、単一剤形中で用いられる。疎水性活性の異なる２種以上の胆汁塩の混合物は、中間の疎水性活性の単一胆汁塩として挙動する。その結果、疎水性活性の異なる２種以上の胆汁酸の混合物の洗浄性及び毒性は、個別成分に対するものの中間である場合もある。
【００２５】
疎水性活性の異なる２種以上の胆汁酸の混合物は、中間の疎水性活性の単一胆汁塩として挙動される。その結果、疎水性活性の異なる２種以上の胆汁酸の混合物の洗浄性及び毒性は、しばしば個別成分に対するものの中間になる。
【００２６】
本発明で適切に用いられる炭水化物は、水可溶性でんぷん転化物及び水可溶性非でんぷん多糖類を含む。本発明の一部の実施形態によると、水可溶性でんぷん転化物は、各種のｐＨ条件下での、でんぷんの部分または不完全加水分解から直接得られた炭水化物を含む。非制限的な例としては、マルトデキストリン、デキストリン、液体グルコース、コーンシロップ固形物（液体グルコースの乾燥粉末）及び可溶性でんぷんが挙げられるが、マルトデキストリンまたはコーンシロップ固形物であることが好ましく、コーンシロップ固形物であることが最も好ましい。例えば、コーンシロップ固形物であるＭＡＬＴＲＩＮ（商標登録）  Ｍ２００及びマルトデキストリンであるＭＡＬＴＲＩＮ（商標登録）  Ｍ７００は、共に米国アイオワ州のマスカティン所在のＧｒａｉｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社の商品名ＧＰＣ（商標登録）で製造されている。本実施形態で、"コーンシロップ"という用語は、コーンシロップと液体グルコースの両者を含む。でんぷん転化物が重合体からなる場合、この重合体は、少なくとも一つの還元末端と、少なくとも一つの非還元末端を有し、直鎖または分岐鎖である。また、分子量は、約１００質量単位〜１０６質量単位以上である。高分子量の水可溶性でんぷん転化物は、分子量１０５以上を有するものである。
【００２７】
本発明の一部の実施形態によると、水可溶性非でんぷん多糖類は、各種のｐＨ条件下で各種の加水分解により得られるか、合成メカニズムによって得られる。非制限的な例としては、デキストラン、グアーガム、ペクチン、難消化性の可溶性繊維などが挙げられる。また、重合体からなる場合、該当の重合体は、少なくとも一つの還元末端と、少なくとも一つの非還元末端を有する。前記重合体は、直鎖または分岐鎖である。分子量は、約１００質量単位〜１０６質量単位以上である。分子量は、１０５質量単位以上を有することが好ましい。
【００２８】
本発明の実施形態で用いられる高分子量の水可溶性でんぷん転化物及び／または可溶性非でんぷん多糖類の量は、少なくとも製剤において選択された胆汁酸に、所望の濃度及び所望のｐＨ範囲での可溶性を与えるのに必要な量である。本発明の一部の実施形態において、ＵＤＣＡ析出を防止するために必要なＵＤＣＡに対するマルトデキストリンの最小重量比は、６：１（すなわち、水１００ｍＬ中、ＵＤＣＡ０.２ｇごとに１.２ｇ、ＵＤＣＡ１ｇごとに６ｇ、及びＵＤＣＡ２ｇごとに１２ｇ）である。本発明の一部の実施形態において、マルトデキストリンの最小量は、ケノデオキシコール酸２００ｍｇごとに３０ｇ、７−ケトリトコール酸２００ｍｇごとに１２ｇ、コール酸２００ｍｇごとに１０ｇ、及びデオキシコール酸２００ｍｇごとに５０ｇである。本発明の一部の実施形態において、本発明の水溶液投薬形態から胆汁酸の析出を防止するために必要なＵＤＣＡに対する液体グルコース（市販の低廉なコーンシロップ）の最小重量比は、約２５：１（すなわち、水１００ｍＬ中、ＵＤＣＡ５００ｍｇごとに１２.５ｇ、及び水２００ｍＬ中、ウルソデオキシコール酸１ｇごとに２５ｇ）である。本発明の一部の実施形態において、本発明の水溶液投薬形態から胆汁酸の析出を防止するために必要な液体グルコース（コーンシロップ固形物、例えば、ＭＡＬＴＲＩＮ（商標登録）  Ｍ２００）の乾燥粉末の最小量は、水１００ｍＬ中、ウルソデオキシコール酸１ｇごとに３０ｇ、水２００ｍＬ中、ウルソデオキシコール酸２ｇごとに６０ｇである。本発明の一部の実施形態において、本発明の水溶液投薬形態から胆汁酸の析出を防止するために必要な可溶性非でんぷん多糖類の最小量は、水１００ｍＬ中、ウルソデオキシコール酸５００ｍｇごとにグアーガム５０ｇ、水１００ｍＬ中、ウルソデオキシコール酸５００ｍｇごとにペクチン８０ｇである。高分子量水可溶性でんぷん転化物または可溶性非でんぷん多糖類の最小必要量は、主に濃度よりも溶液剤形での胆汁酸の絶対量によって決定される。
【００２９】
本発明の一部の実施形態において、剤形は、でんぷん転化物及び／または非でんぷん多糖類の他にも、サイクロデキストリンを含む。
【００３０】
本発明の一部の実施形態において、前記剤形は、食物繊維をさらに含む。食物繊維の非制限的な例としては、グアーガム、ペクチン、オオバコ、オートガム、ダイズ繊維、オーツ麦、コーン皮、セルロース及びふすまなどが挙げられる。
【００３１】
本発明の一部の実施形態において、前記剤形は、乳化剤をさらに含む。本発明において、“乳化剤”という用語は、乳化剤及び懸濁剤を含む。乳化剤の非制限的な例としては、グアーガム、ペクチン、アカシア、カラギーナン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポビドン、トラガカントガム、キサンタンガム及びソルビタンエステルが挙げられる。
【００３２】
剤形がその胆汁酸、でんぷん転化物、可溶性非でんぷん多糖類及び／またはその薬剤学的化合物を析出させない選択されたｐＨ範囲は、水系で得られる任意の範囲のｐＨレベルである。この範囲は、約ｐＨ１〜ｐＨ１４であることが好ましく、約ｐＨ１〜ｐＨ１０であることが一層好ましい。さらに、この範囲は、投与方法によって薬剤学的剤形が製剤から溶液状態に維持され、体内に投与されて吸収されるのに充分な水系で得られる任意の下位セットのｐＨレベルである。したがって、前記組成物は、口腔、胃及び腸で優勢なｐＨレベルで薬剤学的化合物が析出されることなく、溶液状態にある薬剤学的剤形として用いられる。本発明の一部の実施形態において、胆汁酸は、酸性条件下での胆汁酸の一般的な不溶性にもかかわらず、遊離胆汁酸として酸性条件下で溶解状態に置かれる。
【００３３】
本発明の一部の実施形態において、薬剤はシスプラチンである。その他の薬剤学的化合物の非制限的な例としては、ホルモン、ホルモン拮抗制、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症薬物、免疫活性薬物、抗新生物性薬物、抗生物質、抗炎症剤、交感神経興奮剤、抗感染薬、抗腫瘍剤及び麻酔剤を含む。さらに、非制限的な例としては、胃腸管、肝、心血管系及び呼吸系統を標的とするか影響を及ぼす薬物を含む。さらに、薬剤学的化合物の非制限的な例としては、インシュリン、ヘパリン、カルシトニン、アンピシリン、オクトレオチド、クエン酸シルディナフィル、カルシトリオール、ジヒドロタキステロール、アポモルヒネ、ヨヒンビン、トラザドン、アシクロビル、アマンタジン・ＨＣｌ、リマンタジン・ＨＣｌ、シドフォビル、メシル酸デラビルジン、ディダノシン、ファムシクロビル、フォスカルメットナトリウム（ｆｏｓｃａｒｍｅｔ  ｓｏｄｉｕｍ）、フルオロウラシル、ガンシクロビルナトリウム、イドクスウリジン、インターフェロン−α、ラミブジン、ネビラピン、ペンシクロビル、リバビリン、スタブジン、トリフルリジン、バラシクロビル・ＨＣｌ、ザルシタビン、ジドブジン、インディナビル・Ｈ２ＳＯ４、リトナビル、ネルフィナビル・ＣＨ３ＳＯ３Ｈ、サクイナビル・ＣＨ３ＳＯ３Ｈ、ｄ−ペニシラミン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、アウロチオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィンレバミソール、ダカルバジン、イソプリノシン、メチルイノシンモノフォスフェート、ムラミールジペプチド、ジアゾキシド、ヒドララジン・ＨＣｌ、ミノキシジル、ジピリダモール 、イソクスプリン・ＨＣｌ、ナイアシン、ナイリドリン ・ＨＣｌ、フェントラミン、ドキサゾシン・ＣＨ３ＳＯ３Ｈ、プラゾシン・ＨＣｌ、テラゾシン・ＨＣｌ、クロニジン・ＨＣｌ、ニフェジピン、モルシドミン、アミオダロン、アセチルサリチル酸、ベラパミル、ジルチアゼム、ニソルジピン、イスラジピン、ベプリジル、イソソルビド・ジニトレート、ペンタエリスリトール・テトラナイトレート、ニトログリセリン、シメチジン、ファモチジン、ニザチジン、ラニチジン、ランソプラゾール、オメプラゾール、ミソプロストル、スクラルフェート、メトクロプラミド・ＨＣｌ、エリスロマイシン、ビスマス化合物、アルプロスタジル、アルブテロール、ピルブテロール、テルブタリン・Ｈ２ＳＯ４、サルメテロール、アミノフィリン、ダイフィリン、エフェドリン、エチルノルエピネフリン、イソエタリン、イソプロテレノール、メタプロテレノール、ネドクロミル、オクストリフィリン、テオフィリン、ビトルテロール、フェノテロール、ブデソニド、フルニソリド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、コデイン、硫酸コデイン、リン酸コデイン、デキストロメトルファン・ＨＢｒ、トリアムシノロン・アセトニド、モンテルカストナトリウム、ザフィルルカスト、ジレウトン、クロモグリク酸ナトリウム、臭化イプラトロピウム、ネドクロミルナトリウムベンゾエート、ジフェンヒドラミン・ＨＣｌ、ヒドロコドン・二酒石酸塩、メタドン・ＨＣｌ、硫酸モルヒネ、アセチルシステイン、グアイフェネシン、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酒石酸カリウムアンチモン、グリセリン、抱水テルピン、パルミチン酸コルホスセリル、アトロバスタチン・カルシウム、セリバスタチン・ナトリウム、フルバスタチン・ナトリウム、ロバスタチン、プラバスタチン・ナトリウム、シンバスタチン、ピクロリザクロア（Ｐｉｃｒｏｒｒｈａｚｉａ  ｋｕｒｒｏａ）、アンドログラフィスパニクラタ、モリンガオレイフェラ、アルピッツァレベック（ａｌｂｉｚｚｉａ  ｌｅｂｅｃｋ）、アドハトーダバシカ、クルクマ・ロンガ（ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ）、苦瓜（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）、ギムネマシルベスタ（ｇｙｍｎｅｍａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ）、ターミナリアアルジュナ（ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ  ａｒｊｕｎａ）、アザデラクチャインディカ、ティノスポリアコルディフォリア（ｔｉｎｏｓｐｏｒｉａ  ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）、メトロニダゾール、アムホテリシンＢ、クロトリマゾール、フルコナゾール、ハロプロジン、ケトコナゾール、グリセオフルビン、イトラコナゾール、テルビナフィン・ＨＣｌ、エコナゾール・ＨＮＯ３、ミコナゾール、ニスタチン、オキシコナゾール・ＨＮＯ３、スルコナゾール・ＨＮＯ３、セチリジン・２ＨＣｌ、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、コーチゾン、カテキン及びその誘導体、グリシルリジン、グリシルリジン酸、ベタメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、メチルプレドニゾロン、ソマトスタチン、リスプロ、グルカゴン、プロインシュリン、不溶性インシュリン、アカルボース、クロルプロパミド、グリピザイド、グリブライド、メトホルミン・ＨＣｌ、レパグリニド、トルブタミド、アミノ酸、コルヒチン、スルフィンピラゾン、アロプリノール、ピロキシカム、トルメチンナトリウム、インドメタシン、イブプロフェン、ジフルニサル、メフェナム酸、ナプロキセン及びトリエンチンが挙げられる。
【００３４】
前記剤形に含まれる薬剤学的化合物の追加的な例としては、剤形に添加された場合、可溶性が維持される化合物であれば如何なるものも含まれる。剤形中の追加的な薬剤学的化合物と共に、溶液中の胆汁酸は、アジュバント、担体、または、任意の治療的活性剤の溶解度の増強剤として作用する。治療的活性剤は、可溶性であり、酸及び／またはアルカリで安定的であり、必要な場合、本発明における胆汁酸の所定濃度のこれら水溶液投薬形態内に添加されるが、その例としては、限定的なものではないが、インシュリン（ｐＨ７.４〜７.８）、ヘパリン（ｐＨ５〜７.５）、カルシトニン、アンピシリン、アマンタジン、リマンタジン、シルデナフィル、硫酸ネオマイシン（ｐＨ５〜７.５）、アポモルヒネ、ヨヒンビン、トラザドン、リバビリン、パクリタキセル及びその誘導体、レチノール及びトレチノインなどが挙げられる。また、可溶性で、酸及び／またはアルカリに安定的なある種の治療的活性剤は、必要によって、本発明のウルソデオキシコール酸を含有する水溶液投薬剤形に添加される。、その治療的活性剤の例としては、特に限定されるものではないが、メトホルミンＨＣｌ（ｐＨ５〜７）、ラニチジンＨＣｌ、シメチジン、ラミブジン、セチリジン２ＨＣｌ（ｐＨ４〜５）、アマンタジン、リマンタジン、シルデナフィル、アポモルヒネ、ヨヒンビン、トラザドン、リバビリン及びデキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、コーチゾン、ナイアシン、タウリン、ビタミン、自然産アミノ酸、カテキン及びその誘導体、グリシルリザル抽出物（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｌ  ｅｘｔｒａｃｔ）、グリシルリジン及びグリシルリジン酸などのその主成分、そして、水可溶性ビスマス化合物（例えば、ビスマスナトリウム酒石酸塩などを含む。
【００３５】
本発明の一部の実施形態は、ｐＨ調節剤によって実施される。非制限的な例としては、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、ＣＨ３ＣＯＯＨ、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、リン酸塩及びエイデット酸（ｅｉｄｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）及びアルカリ類を含む。
【００３６】
本発明の一部の実施形態において、剤形は、ヒト及び哺乳動物の疾患を治療するのに用いられる。本発明は、胃腸障害、肝疾患、胆石及び高脂血症の治療を想定することができる。肝疾患の非制限的な例としては、アルコール−誘発肝疾患及び非アルコール−誘発肝疾患を含む。胃腸障害の非制限的な例としては、慢性胃炎、逆流胃炎及び消化潰瘍疾患を含む。非アルコール−誘発肝疾患の非制限的な例としては、原発性胆汁性肝硬変、急性及び慢性肝炎、原発性硬化性胆管炎、慢性活動性肝炎及び肝での脂肪過多蓄積を含む。また、本発明は、ウイルス疾患、細菌性疾患及び真菌疾患の治療を想定することができる。本発明の一部の実施形態において、剤形は、ヘリコバクター・ピロリ感染を治療及び／または撲滅するために投与される。本発明の一部の実施形態において、剤形は、Ｃ型肝炎ウイルス感染、Ａ型インフルエンザー、Ｃ型インフルエンザー、第１型パラインフルエンザー、センダイ（ｓｅｎｄａｉ）、風疹及び仮性光犬病ウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）を治療及び／または撲滅するために投与される。本発明の一部の実施形態において、剤形は、急性または慢性炎症性疾患を治療するために投与される。炎症性疾患の非制限的な例としては、気管支炎、慢性咽頭炎及び慢性へんとう炎を含む。本発明の一部の実施形態において、剤形は、高コレステロール血症を治療するために投与される。
【００３７】
本発明の一部の実施形態において、剤形は、液体、固体、粉末または錠剤として投与されるように変形される。本発明の一部の実施形態において、剤形は、溶液、シロップ、濃厚シロップまたはペーストを含む。溶液の非制限的な例は、マルトデキストリンの濃度が５００ｇ／Ｌ未満であるマルトデキストリン溶液である。シロップの非制限的な例は、マルトデキストリンの濃度が５００ｇ／Ｌ以上、１.０ｋｇ／Ｌ以下であるマルトデキストリン溶液である。濃厚シロップの非制限的な例は、マルトデキストリンの濃度が１.０ｋｇ／Ｌ以上、１.２ｋｇ／Ｌ以下であるマルトデキストリン溶液である。ペーストの非制限的な例は、マルトデキストリンの濃度が１.２ｋｇ／Ｌより高いマルトデキストリン溶液である。
【００３８】
本発明の投薬剤形の安定性は、可溶性胆汁酸、高分子量水可溶性でんぷん転化物及び水を含む製剤を、多様なｐＨ及び温度レベルで、時間の経過による当該の胆汁酸の濃度を測定することで評価される。各胆汁酸のリテンションタイム（高性能液体クロマトグラフィー）は、必要によって複合サンプル、すなわち、複数の胆汁酸を有するサンプルに存在する各胆汁酸の個別的な分析を許容するように調整される。安定性試験は、試験溶液の光散乱特性を評価することでも行われる。加えて、既存の促進試験条件がを用いることもできる。
【００３９】
本発明の溶液に対して行われた全ての安定性試験は、ＨＰＬＣによって測定された胆汁酸の濃度が多様なｐＨレベルで時間の経過によって著しく変化しない点で満足するに足りる。特に、試験された全ての胆汁酸溶液剤形は、試験期間中、析出や物理的な外観変化がなくな、安定性試験において優れた結果を示した。一部の剤形は、２年以上の間安定的に維持される。試験された本発明に係る水溶液投薬形態は、塩化水素酸溶液中で安定的かつ可溶性である治療的活性剤及び化学的活性剤の添加にもかかわらず、促進条件下、多様なｐＨ条件で物理的または化学的に変化しなかった。したがって、これら水溶液系は、酸性条件での析出等の安定性の問題なしに、多様なｐＨ条件でミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）形成によって胆汁酸が薬物のアジュバント、薬物の担体または薬物の溶解度増強剤としての役割をする治療効果のある胆汁酸製剤及び／または薬物（薬剤学的化合物）輸送製剤のために、非常に価値ある薬剤学的投薬形態である。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明は、以下の実施例からより良く理解されるであろう。しかし、当業者は、開示された具体的な材料、組成物及び結果は、説明のために例示されたものに過ぎず、本発明の範囲及び各種の実施形態を制限するためものではないことを容易に認識するであろう。
【００４１】
実施例１：胆汁酸溶液の製造
まず、５００ｍＬのＮａＯＨ（６.７ｇ）溶液中にＵＤＣＡ（６０ｇ）を溶解させて胆汁酸の原液を準備した。次に、得られた透明な溶液に、激しく攪拌しながらマルトデキストリン３７５ｇを少しずつ添加した。次いで、高い処理量で超音波分解（７５０Ｗ、２０ｋＨｚ）を実施しながらＨＣｌを滴加してｐＨを７.０〜７.２に調整した。次に、注射用蒸溜水によって体積を１.０Ｌにまで調整した。最後に、得られた透明な溶液を無菌条件下で０.２２μ  ＧＰ  エクスプレス  プラス  メンブレイン（ｅｘｐｒｅｓｓ  ｐｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いてろ過して滅菌処理した。この溶液の所望のＵＤＣＡ濃度への希釈液は、標準薬剤実務によって行った。
【００４２】
実施例２：Ｎ１８Ｄ３ハイブリッド神経細胞株の特徴付
安定的なＮ１８Ｄ３マウスハイブリッドニューロン細胞株をモデル神経細胞培養系として使用し、シスプラチン−誘発神経病症に内包された病理メカニズムを調査した。この細胞株は、４週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスから単離されたマウスＤＲＧニューロンとマウス神経芽腫細胞株Ｎ１８ＴＧ２とのハイブリッド体である。Ｎ１８Ｄ３細胞は、６ｃｍデッシュ中、５％のウシ胎児血清及び５％のウマ血清を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いて増殖させ、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃で培養させた。
クローンＮ１８Ｄ３細胞は、親（Ｐａｒｅｎｔａｌ）神経芽細胞腫によって発現されないニューロン形状の特性を示した。例えば、Ｎ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンは、これらがニューロン特異表現型を有することを示す高分子量神経微細繊維蛋白質（ＮＦ−Ｈ）に対する特異免疫反応性を発現した。Ｎ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンは、全体細胞クランプ実験によって提示されたナトリウムチャネル活性、免疫細胞化学によって提示された低分子量及び高分子量神経微細繊維、そして、微細管と関連した蛋白質−２も発現した。
【００４３】
実施例３：ＭＴＴアッセイ
細胞生存率は、細胞のピリジンヌクレオチド酸化還元状態の指標である３−（４,５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）還元の測定によって評価した。Ｎ１８Ｄ３細胞（１×１０５）を、９６−ウェルプレート上で培地０.１ｍＬ中に接種し、２４時間後にシスプラチン及び／または実施例１によるＵＤＣＡ溶液に曝した。次に、細胞をシスプラチン、ＵＤＣＡまたはこれら全ての存在下で予め選択された時間培養した。
ＭＴＴ溶液［リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５ｍｇ／ｍＬ］１０μＬを各ウェルに添加した後、前記プレートを３７℃で３時間培養した。ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ社製）による染料の溶離後、５７０ｎｍでの吸光度を、６３０ｎｍを基準とし、二重光マイクロタイタープレートリーダで測定した。
【００４４】
実施例４：ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８による核染色
カバースリップ上で増殖させたＮ１８Ｄ３細胞を、予め選択された時間、シスプラチンによって処理し、４％のパラホルムアルデヒド（ｐＨ７.４）で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した後、１０μｇ／ｍＬのヘキスト３３２５８を含むＰＢＳによって１０分間培養した。核形態の変化は、オリンパス共焦点蛍光顕微鏡下で調査した。
【００４５】
実施例５：ＤＮＡフラグメント分析
シスプラチンまたは実施例１によって製造されたシスプラチン＋０.１ｍｇ／ｍＬのＵＤＣＡ溶液に曝されたＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンから、全体のＤＮＡを抽出した。ＤＮＡフラグメンテーションパターンを分析するために、細胞を０.５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び２０ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７.４の５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中で溶解させた。溶解物を１６,０９０ｇで、４℃、１５分間遠心分離した。上清液をフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）によって抽出し、０.３Ｍの酢酸ナトリウムを含有するエタノール中で沈殿させた後、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中に再び懸濁させた。可溶性ＤＮＡサンプルについて、１.２％のアガロース・ゲル上で電気泳動を実施した。
【００４６】
実施例６：Ｎ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンでのシスプラチン誘発細胞自滅死
Ｎ１８Ｄ３ニューロンの、容量−依存及び時間−依存の細胞毒性を誘発させるためのシスプラチン処理は、実施例３のＭＴＴ還元アッセイによって決定したように行った（図１中Ａ、図１中Ｂ、図６中Ａ及び図６中Ｂ）。２０μＭのシスプラチンに３６時間の間曝した後、細胞生存率は、未処理対照群細胞（図１中Ａ）の４０％に減少した。シスプラチンで誘導されたＮ１８Ｄ３ニューロンの細胞死は、細胞収縮及び細胞質ブレブ発生などの形態的変化を伴っていた（図２中Ｂ、図２中Ｃ及び図７中Ｂ）。シスプラチンに曝されたＮ１８Ｄ３ニューロンも、実施例４に従ったヘキスト３３２５８の染色で示されるように、細胞自滅死の特徴である凝縮・分節された核変化を示した（図３中Ｂ、図３中Ｃ及び図８中Ｂ）。さらに、シスプラチンは、実施例５のＤＮＡフラグメンテーションアッセイによってシスプラチン処理した後、明白な１８０〜２００個の塩基ヌクレオソーム間（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ）ＤＮＡ開裂を誘発した（図４及び図９）。これら結果は、本発明を作用の任意の特定メカニズムに制限するものではないが、Ｎ１８Ｄ３ハイブリッドニューロン中のシスプラチン−誘発細胞毒性がシスプラチン−媒介細胞自滅死病理メカニズムに起因することを示唆する。
【００４７】
実施例７：Ｎ１８Ｄ３ハイブリッドニューロン中のシスプラチン−誘発細胞自滅死を実
質的に低減させたＵＤＣＡ溶液
Ｎ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンは、シスプラチン処理する前の１時間前に、実施例１の胆汁溶液で前処理した。胆汁溶液（１ｍｇ／ｍＬのＵＤＣＡ）で前処理した後、２０μＭのシスプラチンに曝したニューロンの生存率を、実施例３のＭＴＴアッセイによって評価した結果、有意に増加した（図６中Ａ）。ＵＤＣＡを欠如することを除けば、実施例１によって製造された対照群溶液による前処理は、シスプラチン存在中での生存率に影響を及ぼさないことが分かる（最も右側の棒、図６中Ａ）。加えて、実施例１の胆汁溶液は、ＭＴＴアッセイによって測定されるように、細胞生存率に不利な効果を持たないことが分かる（図６中Ｂ）。
さらに、胆汁溶液によって前処理したＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンは、細胞収縮及び細胞質ブレブ発生などのシスプラチン−誘発形態学的変化が少なかったし（図７中Ｃ）、凝縮または断裂された核形態を示さなかった（図８中Ｃ）。シスプラチンに３６時間曝された、胆汁前処理Ｎ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンは、胆汁前処理なしに、シスプラチンに曝された細胞で観察されたヌクレオソーム間のＤＮＡ断裂がなかった。
本実施例において、シスプラチン−誘発神経毒性を緩和させるためのＵＤＣＡの最適な濃度は、１ｍｇ／ｍＬ（ＵＤＣＡ０.１ｍＭと等価である）であった。
【００４８】
実施例８：ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）分析
Ｎ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンをＰＢＳで洗浄し、氷上のＲＩＰＡ緩衝液（５０ｎＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１５０ｍＭのＮaＣｌ、１％のＮＰ−４０、０.５％のデオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する０.１％のドデシル硫酸ナトリウム及び１μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ）中で１５分間かけて溶解させた。細胞溶解物を１８,８９０ｇで１５分間遠心分離によって透明にした。ビオ−ラッド蛋白質アッセイによって決定された蛋白質４０ｍｇを、１２％のアクリルアミド−ドデシル硫酸ナトリウム変性ゲルで電気泳動を実施した。ゲルを、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ；マサチューセッツ州ベッドフォード市所在のＭｉｌｌｉＰｏｒｅ社製）に移し、供給社が推奨する抗体でプローブを実施した。エンハンスド・ケミルミネッセンス・システム（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、特定の蛋白質を検出した。
【００４９】
実施例９：胆汁酸溶液のｐ５３及びｐ２１蓄積遮断
胆汁溶液がＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンでの神経保護効果を発揮する主要効果分子及び調節メカニズムを、予め細胞自滅死と関連した多様な蛋白質の発現を評価することで調査した。２０μＭのシスプラチンによる４時間の処理後に増加するｐ５３蛋白質の蓄積は、２４時間に最大のレベルに達し、その後にやや減少した（図５中Ｂ）。これに対し、胆汁前処理されたニューロンは、ｐ５３蛋白質の実質的に少ない蓄積を示した（図１０中Ａ、図１０中Ｂ及び図１１）。
これら結果は、ＵＤＣＡの同一の最適な濃度、すなわち、１ｍｇ／ｍＬを含み、実施例６及び７で論議された結果と一致した。本発明を作用の任意の特定メカニズムに制限するものではないが、これら結果は、ｐ５３のシスプラチン−誘発蓄積がニューロンの細胞自滅死の主な要因の一つであり、胆汁溶液によるｐ５３蓄積の抑制が神経保護の主な要件であることを示唆している。
これらＰ５３発現データと並行して、活性化されたｐ５３の下流標的であるｐ２１は、シスプラチン処理の４時間後に増加し、８時間目に最高になり、その後、恐らくカスパーゼ活性によって減少した。実施例１の胆汁酸溶液は、ｐ２１の蓄積を有意に抑制した（図１０中Ａ、図１０中Ｃ及び図１１）。この結果も、ＵＤＣＡの同一の最適な濃度、すなわち、１ｍｇ／ｍＬを含み、実施例６及び７の結果と同一であった。
これに対して、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ及びＢａｘ（Ｂｃｌ２−関連Ｘ蛋白質）を含むｐ５３の他の下流遺伝子産物は、シスプラチン処理後、それらの発現に変化を示さなかった（図１０中Ａ）。本発明は、一緒に採用された任意の特定モデルに制限されることなく、これら結果は、シスプラチン−誘発細胞自滅死がニューロンにおけるｐ５３活性化と密接に関連しており、本発明の胆汁溶液がｐ２１を介在したｐ５３信号伝達経路の制御を通してそれらの保護効果を発揮できることを示唆した。
【００５０】
実施例１０：本発明の胆汁溶液の抗酸化特性
細胞生存率は、細胞のピリジンヌクレオチド酸化還元状態の指標であるＭＴＴ還元測定によって評価した。ヒトハイブリッド神経細胞株（１×１０５）（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １１、１８４−１９８、２００２）を９６−ウェルプレート上で培地０.１ｍＬ中に接種し、２４時間後に実施例１の溶液に曝した。また、一部の細胞を胆汁溶液に曝し（事前培養）、１時間後に過酸化水素にも曝した。他の細胞は、前記過酸化水素に曝した同一時刻に胆汁溶液に曝した。ＭＴＴアッセイは、実施例３によって行った。
同時に曝された細胞と同一の、事前培養された細胞に対する結果は、図１２に示されている。過酸化水素のみに曝した未処理対照群では、細胞の約７５％が死滅した。しかし、本発明のＵＤＣＡ溶液で前処理したハイブリッドニューロンの約８０％は、過酸化水素による処理でも生存した。これらデータは、本発明の作用の如何なる特定のメカニズムに制限されるものではないが、本発明の溶液が酸化防止特性を有することを示唆する。
【００５１】
［図１中Ａの表］
４８時間シスプラチンによる処理
ＣＴＬ：１００±１１.２（％、平均±ＳＥＭ）
シスプラチン１μＭ：８９.０±９.７
シスプラチン５μＭ：６７.３±１２.３
シスプラチン１０μＭ：４７.２±８.４
シスプラチン２０μＭ：３９.０±３.６
シスプラチン５０μＭ：３７.１±５.７
【００５２】
［図１中Ｂの表］
２０μＭのシスプラチンによる処理
０ｈｒ：１００±１３.７
８ｈｒ：１０１.２±１５.３
１２ｈｒ：９６.７±８.９
２４ｈｒ：５７.６±９.２
３６ｈｒ：４２.３±７.６
４８ｈｒ：４１.３±４.３
【００５３】
［図６中Ａの表（ｎ＝６）］
対照群＝１００±１３.７％
シスプラチン２０μＭ＝３８.２±４.６％
シスプラチン２０μＭ＋ＵＤＣＡ（０.１ｍｇ／ｍＬ）＝４１.３±７.３５％
シスプラチン２０μＭ＋ＵＤＣＡ（０.２ｍｇ／ｍＬ）＝６１.３±８.６７％
シスプラチン２０μＭ＋ＵＤＣＡ（０.５ｍｇ／ｍＬ）＝７９.２±４.７２％
シスプラチン２０μＭ＋ＵＤＣＡ（１.０ｍｇ／ｍＬ）＝８６.７±６.８４％
シスプラチン２０μＭ＋ビヒクル＝３５.２±５.１７％
【００５４】
［図６中Ｂの表（ｎ＝６）］
対照群＝１００±１３.７％
ＵＤＣＡ（０.１ｍｇ／ｍＬ）＝９７.６±１５.７％
ＵＤＣＡ（０.２ｍｇ／ｍＬ）＝１０４.３±１１.６％
ＵＤＣＡ（０.５ｍｇ／ｍＬ）＝１０２.７±４.８％
ＵＤＣＡ（１.０ｍｇ／ｍＬ）＝９５.３±１３.２％
ビヒクル＝１０３.２±９.７％
【００５５】
［Ｐ５３に対する図１０中Ｂの表（ｎ＝３）］
対照群＝１００±２１.３％
シスプラチン２０μＭ＝３８３.５±３１.２％
シスプラチン２０μＭ＋ＵＤＣＡ（０.１ｍｇ／ｍＬ）＝３８６.９±１３.５％
シスプラチン２０μＭ＋ＵＤＣＡ（０.２ｍｇ／ｍＬ）＝３３９.０±２７.３％
シスプラチン２０μＭ＋ＵＤＣＡ（０.５ｍｇ／ｍＬ）＝１９８.９±１９.７％
シスプラチン２０μＭ＋ＵＤＣＡ（１.０ｍｇ／ｍＬ）＝１７５.１±１５.２％
シスプラチン２０μＭ＋ビヒクル＝３７６.３５±２２.６％
【００５６】
［Ｐ２１に対する図１０中Ｃの表］
対照群＝１００±９.７％
シスプラチン２０μＭ＝２０９.７±１１.８％
シスプラチン２０μＭ＋ＵＤＣＡ（０.１ｍｇ／ｍＬ）＝２０２.２±１３.６％
シスプラチン２０μＭ＋ＵＤＣＡ（０.２ｍｇ／ｍＬ）＝１８６.７±１０.３％
シスプラチン２０μＭ＋ＵＤＣＡ（０.５ｍｇ／ｍＬ）＝１２２.３±４.７％
シスプラチン２０μＭ＋ＵＤＣＡ（１.０ｍｇ／ｍＬ）＝１１９.８±８.８％
シスプラチン２０μＭ＋ビヒクル＝２００.１５±１５.２％
＊Ｐ＜０.０５
＊＊Ｐ＜０.０１
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図中Ａは、シスプラチンの濃度を増加させながら、Ｎ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンを４８時間培養した場合の細胞生存率測定結果を示した棒グラフ（シスプラチン処理と対比して＊Ｐ＜０.０５；＊＊Ｐ＜０.００１）である。  図中Ｂは、Ｎ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンを、所定時間１０μＭシスプラチンで培養した場合の細胞生存率測定結果を示した棒グラフである。
【図２】図中Ａは、対照群溶液中で培養されたＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンの顕微鏡写真である。  図中Ｂは、１０μＭシスプラチンを含有する溶液中で培養されたＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンの顕微鏡写真である。  図中Ｃは、２０μＭシスプラチンを含有する溶液中で培養されたＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンの顕微鏡写真である。
【図３】図中Ａは、対照群溶液中で培養し、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８で染色したＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンを示す蛍光顕微鏡写真である。  図中Ｂは、１０μＭシスプラチンを含有する溶液中で培養し、ヘキスト３３２５８で染色したＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンを示す蛍光顕微鏡写真である。  図中Ｃは、２０μＭシスプラチンを含有する溶液中で培養し、ヘキスト３３２５８で染色したＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンを示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４】市販のＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）（"Ｍ"）と、対照群溶液（"ＣＴＬ"）、１０μＭのシスプラチンを含有する溶液（"Ｃｉｓ１０μＭ"）及び２０μＭのシスプラチンを含有する溶液（"Ｃｉｓ２０μＭ"）中で培養したＮ１８Ｄ３ニューロンからのサイズフラクションＤＮＡを示した図である。
【図５】図中Ａは、Ｎ１８Ｄ３ニューロンを、対照群溶液（"０"）中で、または、シスプラチンを１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭまたは２０μＭの濃度で含有する溶液中で４８時間培養し、ｐ５３、ｐ２１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＡＸ及びβ−アクチンに対する抗体を用いておこなったウェスタンブロットを示した図である。  図中Ｂは、所定時間、２０μＭのシスプラチンで培養したＮ１８Ｄ３ニューロンについて、ｐ５３、ｐ２１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＡＸ及びβ−アクチンに対する抗体を用いて行ったウェスタンブロットを示した図である。
【図６】図中Ａは、ＵＤＣＡの濃度を増加させながら、シスプラチン中でＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンを培養した場合の細胞生存率測定結果を示した棒グラフ（＊Ｐ＜０.０５；＊＊Ｐ＜０.００１）。  図中Ｂは、ＵＤＣＡの濃度を増加させながら、Ｎ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンを培養した場合の細胞生存率測定結果を示した棒グラフである。
【図７】図中Ａは、対照群溶液中で培養したＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンを示す顕微鏡写真である。  図中Ｂは、２０μＭのシスプラチンを含有する溶液中で培養したＮ１８Ｄ３ハイブリットニューロンを示す顕微鏡写真である。  図中Ｃは、２０μＭのシスプラチン及び１ｍｇ／ｍＬのＵＤＣＡを含有する溶液中で培養したＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンを示す顕微鏡写真である。
【図８】図中Ａは、対照群溶液中で培養し、ヘキスト３３２５８で染色したＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンを示す蛍光顕微鏡写真である。  図中Ｂは、２０μＭのシスプラチンを含有する溶液中で培養し、ヘキスト３３２５８で染色したＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンを示す蛍光顕微鏡写真である。  図中Ｃは、２０μＭのシスプラチン及び１ｍｇ／ｍＬのＵＤＣＡを含有する溶液中で培養し、ヘキスト３３２５８で染色したＮ１８Ｄ３ハイブリッドニューロンを示す蛍光顕微鏡写真である。
【図９】市販のＤＮＡラダー（"Ｍ"）と、対照群溶液（"ＣＴＬ"）、２０μＭのシスプラチンを含有する溶液（"Ｃｉｓ２０μＭ"）、２０μＭのシスプラチン及び１ｍｇ／ｍＬのＵＤＣＡを含有する溶液（"Ｃｉｓ＋ＵＤＣＡ"）中で培養したＮ１８Ｄ３ニューロンからのサイズフラクション化ＤＮＡを示した図である。
【図１０】図中Ａは、対照群溶液（"ビヒクル"）、シスプラチンを含有する溶液（"Ｃｉｓ（μＭ）"）及びＵＤＣＡを含有する溶液（"ＵＤＣＡ（ｍｇ／ｍＬ）"）中で培養したＮ１８Ｄ３ニューロンについて、ｐ５３、ｐ２１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＡＸ及びβ−アクチンに対する抗体を用いて行ったウェスタンブロットを示した図である。  図中Ｂは、図中Ａのｐ５３ウェスタンブロットの濃度計測値を示した棒グラフである。  図中Ｃは、図中Ａのｐ２１ウェスタンブロットの濃度計測値を示した棒グラフである。
【図１１】前処理なしに２０μＭのシスプラチンを含有する対照群溶液（"ＣＴＬ"）中で培養したＮ１８Ｄ３ニューロン、ＵＤＣＡを欠如した溶液（"Ｖｅ"）中で前処理後、培養したＮ１８Ｄ３ニューロン、所定の量のＵＤＣＡを有する溶液中で前処理後、培養したＮ１８Ｄ３ニューロンについてのそれぞれのウェスタンブロットを示した図である。
【図１２】５０μＭの過酸化水素の存在下、ＵＤＣＡの濃度を増加させながら、Ａｌヒトハイブリッドニューロンを培養した場合の細胞生存率測定結果を示した棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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