(57)【要約】  脂肪酸源を含まない無タンパク質培地中で、脂肪酸源を連続的又は断続的に供給する、レプトスピラを培養する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸源を含まない無タンパク質培地中で、レプトスピラを培養する方法であって、レプトスピラの比増殖速度（μ）がその最大増殖速度（μｍａｘ）を下回るように、脂肪酸源を連続的又は断続的に供給する方法。
【請求項２】
（ａ）タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドのいずれも含まず、加えて毒性物質除去剤も含まない無タンパク質培地を半回分発酵槽に導入するステップ、
（ｂ）この培地に、レプトスピラ株を接種するステップ、
（ｃ）前記培養物に、比増殖速度（μ）がレプトスピラ株の最大増殖速度（μｍａｘ）を下回る供給速度で、未処理Tween（登録商標）を含有する栄養溶液を供給するステップ、
（ｄ）レプトスピラバイオマスが実質的に増加する、又はレプトスピラの増殖が終了するまで、培養を継続するステップ、
（ｅ）レプトスピラバイオマスを集菌するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）投入培地を連続的に供給し、且つ培養物を連続的に除去すること、（ｂ）培地が、毒性物質除去剤及び脂肪酸源を含むこと、（ｃ）レプトスピラの増殖が開始したときに、投入培地を供給して、レプトスピラの最大増殖速度（μｍａｘ）を下回る培養物の希釈率を得ること、（ｄ）投入培地が、培地の脂肪酸源濃度より低い濃度の脂肪酸源を含み、該脂肪酸源が増殖制限栄養物であること、並びに（ｅ）この方法によって得られるレプトスピラが、毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地中で、増殖することができるように、培地の毒性物質除去剤濃度を低下させることを含む、レプトスピラを一定量で培養する方法。
【請求項４】
比増殖速度（μ）が０．０４５ｈ−１を下回る、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
比増殖速度（μ）が０．０３ｈ−１以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
比増殖速度（μ）が０．０２５ｈ−１以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地中での継代培養で増殖させるための、請求項１〜６のいずれかに記載の方法によって得られるレプトスピラの使用。
【請求項８】
継代培養を、レプトスピラの最大増殖速度（μｍａｘ）を下回る比増殖速度（μ）で実施する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
継代培養を、レプトスピラの最大増殖速度（μｍａｘ）に等しい比増殖速度（μ）で実施する、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の培養方法を使用して、脂肪酸源を含み、毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地中で増殖するようレプトスピラを馴化させる方法。
【請求項１１】
未処理のTween（登録商標）を含み、毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地中で増殖するようにレプトスピラを馴化させることが、１回のみの継代で実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項３に記載の培養方法を使用して、脂肪酸源を含み、毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地中で増殖するように、レプトスピラを馴化させる方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の馴化方法によって、毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地中で増殖するように馴化させたレプトスピラ。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれかに記載の培養方法若しくは請求項７〜９のいずれかに記載の使用によって得られた免疫原としてのレプトスピラ、及び獣医学的に許容される希釈剤若しくは担体を含有する、免疫原性組成物又はワクチン組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の免疫原としての馴化レプトスピラ及び獣医学的に許容される希釈剤若しくは担体を含有する、免疫原性組成物又はワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本願は、２００５年４月２０日出願の米国仮特許出願第６０／６７３，２２７号の優先権を主張するものであり、参照によりその内容は本明細書に明示的に援用される。
【０００２】
［参照による援用］
前記米国仮特許出願第６０／６７３，２２７号に引用された又はその手続中に引用された全ての文献（「出願引用文献」）及びかかる出願引用文献における全ての引用文献又は参考文献、並びに本明細書における全ての引用文献又は参考文献（「本明細書引用文献」）及びかかる本明細書引用文献における全ての引用文献又は参考文献は、本明細書又は参照によって本明細書に組み込まれる任意の文献に記載された任意の製品に関する製造者の指示書、説明書、製品仕様書、及びプロダクトシートと共に、参照によって本明細書に組み込まれ、本発明の実施に使用することができる。
【０００３】
本発明は、培地への血清タンパク質又は血清アルブミンの使用を低減するレプトスピラの培養方法を提供する。本発明はまた、レプトスピラを、無タンパク質培地での増殖に馴化させるための方法に関する。本発明はまた、馴化させたこれらのレプトスピラ、培養方法におけるそれらの使用、並びに免疫原性組成物及びワクチン組成物を包含する。
【背景技術】
【０００４】
多くの病原性レプトスピラが、実利上重要であることが知られている。なぜなら、それらが様々な動物種、例えばイヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びウマに疾患を生じるからである。とりわけ、ブタの流産、死産、及び新生仔死亡、イヌの腎臓及び肝臓疾患の一般的原因となっている。このような疾患を予防するために、死菌体からなるワクチンがレプトスピラの培養物から調製されている。
【０００５】
レプトスピラは、様々な血清型を含む細菌であり、それらのうちカニコラ（canicola）、イクテロヘモリジア（icterohaemorrhagiae）、ポモナ（pomona）、グリポティフォーサ（grippotyphosa）、ブラティスラヴァ（bratislava）、オーストラリス（australis）、バルム（ballum）、オールムナリス（aulumnalis）、及びハージョ（harjo）は、動物及びヒトのレプトスピラ症に最も頻繁に関与するものである。
【０００６】
レプトスピラは、タンパク質含有培地で培養されることが最も多い。これらの培地は、様々な種、特にウサギ、ウシ、ウマ等からの血清を含有する。このようなワクチンを調製するために、培地中に高密度のレプトスピラを有すること、及び／又は濃縮手順によって前記高密度を実現することが望ましい。このような血清成分を含むワクチンを投与した後、副作用が生じることがある。全身性副作用のリスクは、異種血清タンパク質、特に血清アルブミンの濃度により増加する。全身性副作用には、アナフィキラシー、過敏性、並びに嘔吐及び下痢などの非定型反応が含まれる。
【０００７】
レプトスピラの増殖のための、様々な化学的に定義された無タンパク質培地が提案されている。ワクチンの効率的な生成のために必要な、迅速で多量の望ましい有機体増殖を得るためには、このような培地に、レプトスピラが代謝可能である脂肪酸源、特にTween（登録商標）を補うことが必要とされている。しかし、脂肪酸源はレプトスピラにとって有毒になることもあり、したがってこの欠点を低減するために、動物源からの血清又は血清アルブミンが培地に添加された。
【０００８】
脂肪酸は、レプトスピラにとって主要な炭素源及びエネルギー源である(Bey R.F. and Johnson R.C., Infection and Immunity, 1978, 19 (2), 562-569）。さらに、レプトスピラは長鎖脂肪酸をデノボ合成できないため、長鎖脂肪酸は必須栄養素である。レプトスピラは脂肪酸の炭素鎖の長さを短くすることができ、脂肪酸を不飽和とすることができるが、これら化合物の長さを長くすることができない。遊離脂肪酸はレプトスピラにとって有害であるため、脂肪酸を結合させて有用な非毒性の形態とするために、血清又は血清アルブミンを培地に組み込む。レプトスピラワクチンを生成するためのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びTween（登録商標）を含有する培地は、製造者等の間で最も一般的に受け入れられてきた。Ellinghausen and McCullough (American Journal of Veterinary Research, 1965, 26 (1), 39-44）には、アルブミン及び脂質の複合体が供給される場合、無血清培地でレプトスピラが増殖できることが示されている。さらにこれらの研究者（Ellinghausen and McCullough, American Journal of Veterinary Research, 1965, 26 (1), 45-51）は、レプトスプピラ・ポモナ用の脂質源としてTween（登録商標）80が働き得るものの、過度の脂質（０．１％を超えるTween（登録商標）80）によって、レプトスピラの溶解及びそれらの増殖の減衰が生じたことを示した。
【０００９】
ワクチン生成には多量の培地の使用が必要とされ、最も高価な成分は動物の血清又は血清アルブミンである。これらの血清タンパク質は、有害な全身性ワクチン反応の原因ともなる。
【００１０】
全身性反応を低減するために、ワクチンを精製して、全身性反応を生ずるその成分を除去することができる。一般に、ろ過、ダイアフィルトレーション、又は遠心分離などの通常の方法により上清を除去して、動物性ワクチン調製物を精製することができる。高純度の抗原を得る他の精製方法は、動物性ワクチンの調製においては非常に費用がかかるためにほとんど使用されていない。いずれにせよこれらの精製方法は、アルブミンをワクチン又はそれらの前駆物質から除去するには効果的ではなかった。
【００１１】
有害な全身性反応の欠点及び動物性血清又は血清アルブミンの使用の欠点を回避するために、当技術分野では、レプトスピラ培養のための多くの化学的に定義された培地が提案されている。
【００１２】
アニオン交換樹脂も脂肪酸を結合することから、レプトスピラ培養のアルブミンの代用物として使用することができる。このような樹脂の使用の主な欠点は、レプトスピラを集菌するときに、レプトスピラから樹脂を分離しなければならないことである（Bey R.F. and Johnson R.C., Infection and Immunity, 1978, 19 (2), 562-569）。
【００１３】
レプトスピラは長鎖脂肪酸を利用するため、これらの試みでは、レプトスピラの代謝の脂肪酸源として、通常Tween（登録商標）（ソルビタンのエトキシル化脂肪酸エステル、ポリソルベート）が使用された。しかし、市販のTween（登録商標）は、通常、非エステル化脂肪酸、ポリエチレングリコール、及び他の副産物で汚染されており、これらの物質は、レプトスピラの増殖を妨害する。したがって、イオン交換樹脂処理、活性炭処理、及びポリビニルピロリドン処理などの方法による、市販のTween（登録商標）からの汚染物の除去が試みられた。
【００１４】
Staneckら（Staneck et al., Infect. Immun., 1973, 7 (6), 886-897）は、Tween（登録商標）80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）をアニオン交換カラムに通しその遊離脂肪酸含量を低減する場合、Ｌ．カニコラ及びＬ．ポモナの培養にはアルブミンが必要ではないことを報告した。しかし、Tween（登録商標）をアニオン交換カラムに通過することによって毒性物質除去するためのBey & Johnsonの試みは不成功であった（Bey R.F. and Johnson R.C., Infection and Immunity, 1978, 19 (2), 562-569）。
【００１５】
Bey & Johnsonは、活性炭処理したTween（登録商標）を含有する合成培地でのレプトスピラの増殖を報告した（Bey R.F. and Johnson R.C., Infection and Immunity, 1978, 19 (2), 562-569）。
【００１６】
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）処理したTween（登録商標）を使用して、レプトスピラ培養のための無タンパク質培地を調製した（Schonberg A., Zbl. Bakt. Hyg., 1983, 254, 540-544）。ＰＶＰは、血清タンパク質の挙動に類似の挙動を示す合成コロイドである。しかし、レプトスピラのある種の血清型、特にＬ．グリポティフォーサは、この培地では増殖しなかった。
【００１７】
Kojima等（Kojima et al., Microbiol. Immunol., 1984, 28 (8), 949-954）は、毒性物質を除去したTween（登録商標）を含有する合成培地でのレプトスピラの増殖を報告した。その毒性物質除去は、非エステル化脂肪酸をｎ−ヘキサンで抽出することによって行った。
【００１８】
Tween（登録商標）の汚染物の除去又はTween（登録商標）の毒性物質除去は容易ではない。特に、供給者間及びロット間で市販Tween（登録商標）の組成が大きく異なるため、これらの方法は不完全な可能性がある。その上、これらの方法は時間がかかり、高価であった。
【００１９】
無タンパク質培地で、直接未処理のTween（登録商標）を用いてレプトスピラを増殖させるためのいくつかの実験が試みられた。Stalheim（Stalheim O.H.V., J. Bacteriol., 1966, 92（4), 946-951）は、タンパク質、特にアルブミンを含まず、毒性物質除去剤も含まない培地で、未処理のTween（登録商標）を脂肪酸源として用いてレプトスピラを増殖させようとした。培養の問題に対し、Stalheimは、各継代時に、より高濃度の未処理のTween（登録商標）を含有する培地で連続的継代することによって、これらのレプトスピラが生存し、未処理のTween（登録商標）を消費するよう馴化させることを提案した。数回継代培養後、１回の継代培養につき７〜２７日もの間、レプトスプピラ・ポモナは高濃度のTween（登録商標）80（０．０６％）に耐性を示した。しかし、０．１％濃度のTween（登録商標）80は、レプトスピラにとって溶菌性を示した。０．０６％のTween（登録商標）80を用いた場合、レプトスピラの最終的なバイオマスは、２．０×１０８細菌／ｍｌしかなく、これは、処理済みのTween（登録商標）、特に活性炭処理したTween（登録商標）80を使用する従来の培養方法で得られたバイオマスよりも少なかった。例えば、レプトスピラ・カニコラは５×１０８細菌／ｍｌであり、又はレプトスピラ・イクテロヘモリジアは８．４×１０８細菌／ｍｌであった（上記 Bey and Johnson）。
【００２０】
したがって、レプトスピラのより優れた培養方法が依然として必要とされている。
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／６７３，２２７号
【非特許文献１】Bey R.F. and Johnson R.C., Infection and Immunity, 1978, 19 (2), 562-569
【非特許文献２】Ellinghausen and McCullough（American Journal of Veterinary Research, 1965, 26 (1), 39-44
【非特許文献３】Ellinghausena and McCullough, American Journal of Veterinary Research, 1965, 26 (1), 45-51
【非特許文献４】Staneck et al., Infect. Immun., 1973, 7 (6), 886-897
【非特許文献５】Schonberg A., Zbl. Bakt. Hyg., 1983, 254, 540-544
【非特許文献６】Kojima et al., Microbiol. Immunol., 1984, 28 (8), 949-954
【非特許文献７】Stalheim O.H.V., J. Bacteriol., 1966, 92 (4), 946-951
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の一目的は、レプトスピラを無タンパク質培地での増殖に馴化させる方法を提供することである。本発明の第２の目的は、無タンパク質培地での大規模なレプトスピラ培養のための新しい方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の第１の実施形態は、脂肪酸源を含まない無タンパク質培地中でレプトスピラを培養する方法であって、レプトスピラの比増殖速度（μ）がその最大増殖速度（μｍａｘ）を下回るように、脂肪酸源を連続的又は断続的に供給する方法である。
【００２３】
本発明の第２の実施形態は、（ａ）投入培地を連続的に供給し、且つ培養物を連続的に除去すること、（ｂ）培地が、毒性物質除去剤及び脂肪酸源を含むこと、（ｃ）レプトスピラの増殖が開始したときに、投入培地を供給して、レプトスピラの最大増殖速度（μｍａｘ）を下回る培養物の希釈率を得ること、（ｄ）投入培地が、培地の脂肪酸源濃度より低い濃度の脂肪酸源を含み、かかる脂肪酸源が増殖制限栄養物であること、並びに（ｅ）この方法によって得られるレプトスピラが、毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地中で増殖することができるように培地の毒性物質除去剤濃度を低下させることを含む、レプトスピラを一定量で培養する方法である。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の第１又は第２の実施形態による方法によって得られたレプトスピラを、継代培養で、毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地中で増殖させることである。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、本発明の培養方法を使用して、無タンパク質培地での増殖にレプトスピラを馴化させる方法である。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の方法によって無タンパク質培地での増殖に馴化させたレプトスピラである。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、脂肪酸源を含み、毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地中での継代培養で増殖させるための、馴化させたレプトスピラの使用である。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、免疫原としてのこのようなレプトスピラ、及び獣医学的に許容される希釈剤又は担体を含有する、免疫原性組成物又はワクチン組成物である。
【００２９】
本開示、特に請求項の範囲において、「含む（comprises）」、「含んだ（comprised）」、「含んでいる（comprising）」等の用語は、米国特許法においてそれらに付与される意味を有することができ、例えばそれらは、「含む（includes）」、「含んだ（included）」、「含んでいる（including）」等を意味することができ、「本質的に〜からなっている」及び「本質的に〜からなる」などの用語は、米国特許法においてそれらが属する意味を有し、例えば明示されていない要素が考慮に入れられるものの、従来技術にみられる要素又は本発明の基本的な若しくは新規な特徴に影響を与える要素は排除されることに留意されたい。
【００３０】
開示されるこれら及び他の実施形態は、以下の詳細な説明から明らかであり、かかる詳細な説明に包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
細菌、特にレプトスピラの培養のために、様々な培養方法を使用することができる。
【００３２】
回分培養法では、細菌の増殖は、主に栄養分の枯渇によって培養期間のある時点で停止する。この単一の回分培養法を改善するために、枯渇した栄養分、例えば糖分、アミノ酸、又は脂肪酸を培養期間中に連続的又は断続的に添加する、いわゆる半回分培養法を実施する。
【００３３】
本明細書では、「回分培養法」は、培養容器中の培地に細菌を接種し、培養の終了まで、栄養分の一部又は全て、或いは新しい培地を実質的に添加することなく培養を実施することを含む方法を意味し、「半回分培養法」は、培養容器中の培地に細菌を接種し、栄養分の一部又は全て、或いは新鮮な培地（供給）を連続的又は断続的に培養容器に添加しながら、その培養容器から培養液を実質的に取り出すことなく培養を実施することを含む方法を意味する。
【００３４】
ケモスタット培養法は、細菌濃度が一定であり、増殖速度が制御された指数関数的な細菌増殖を長期間維持することができる方法を意味する（ケモスタットについてはYee and Blanch, Biotechnol. Bioengineer., 1993, 41, 221-230; Dauner et al., J. Bacteriol., 2001, 183 (24), 7308-7317参照）。
【００３５】
増殖速度（μ）は、時間で表す細菌の倍加時間で割ったｌｎ２（自然対数）の比である。この倍加時間は、温度、ｐＨ、水分活性、圧力等の培養条件によって決まる。最大増殖速度（μｍａｘ）は、基質（炭素源、脂肪酸源、窒素源等）が細菌増殖を制限しない所与の培養条件での、より短い倍加時間に相当する。
【００３６】
毒性物質除去剤は、レプトスピラ用の培地に混合すると、遊離脂肪酸に結合して利用可能な非毒性の形態にすることができる。毒性物質除去剤のいくつかの例には、アルブミン、アニオン交換樹脂がある。別法では、培地に脂肪酸源を混合する前に、脂肪酸源の毒性物質除去処理を実施することができる。これらの処理のいくつかの例には、イオン交換樹脂処理、活性炭処理、及びポリビニルピロリドン処理がある。一方、未処理の脂肪酸源（例えば未処理のTween（登録商標））は毒性物質除去されていない。
【００３７】
無タンパク質培地は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを全く含まない培地である。
【００３８】
馴化方法は、制御された環境下で、制御された増殖で培養増殖させるものである。かかる方法において培地の脂肪酸源濃度は、そのプロセス全体を通じて０に近似又は０に等しく、毒性物質除去剤については非存在下で培養を行うか、又は半回分では培養の最初から、若しくはケモスタットでは培養の最後に、微量存在下で培養を行う。半回分については、接種条件によって、接種によって毒性物質除去剤の残量を培養物に持ち越されることがある。馴化方法から得られた細菌集団は、必要とされる全ての基質を含み、毒性物質除去剤を含まない培地中で増殖することができる。
【００３９】
本発明は、脂肪酸源を含まない無タンパク質培地中でレプトスピラを培養及び馴化させる方法であって、レプトスピラの比増殖速度（μ）が、最大増殖速度（μｍａｘ）を下回るように、脂肪酸源を連続的又は断続的に供給する方法に関する。
【００４０】
一実施形態では、その方法は、レプトスピラを馴化させるための半回分培養である。
【００４１】
回分培養法と比較した半回分培養法の１つの具体的な利点は、容器中の培養物の増殖速度の制御である。供給物中に１つの必須栄養分を使用し、経時的な供給速度の展開を定義することによって、比増殖速度を得ることが可能となる。例えば、大腸菌（Escherichia coli）の半回分培養については、酢酸形成を生じない増殖速度が得られている（Korz et al., J. Biotechnol., 1995, 39 (1), 59-65）。
【００４２】
本発明は、半回分培養懸濁液中、レプトスピラの最大増殖速度（μｍａｘ）を下回る比増殖速度で、レプトスピラを長期間安定に培養するステップを含む方法を提供する。
【００４３】
その半回分培養法は、
（ａ）発酵槽に、脂肪酸源及び毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地を導入するステップ、
（ｂ）この培地に、レプトスピラ株培養物を接種するステップ、
（ｃ）その培養物に、比増殖速度（μ）がレプトスピラ株の最大増殖速度（μｍａｘ）を下回る供給速度で、脂肪酸源を含有する栄養溶液を供給するステップ、
（ｄ）レプトスピラバイオマスが実質的に増加、又はレプトスピラの増殖が終了するまで、培養を継続するステップ、
（ｅ）レプトスピラバイオマスを集菌するステップ
を含む。
【００４４】
比増殖速度（μ）は、レプトスピラの最大増殖速度（μｍａｘ）を下回る。比増殖速度（μ）は、一定でもそうでなくてもよい。比増殖速度（μ）は、有利には０．０４５ｈ−１を下回り、特に０．０３ｈ−１以下であり、特に０．０２５ｈ−１以下である。レプトスピラ株の最大増殖速度の決定については、実施例１でさらに述べる。
【００４５】
半回分容器中の培地及び半回分培養中の栄養溶液供給物は、血清タンパク質又は血清アルブミンを含有せず、無タンパク質である。
【００４６】
半回分用の培地は、アルブミン及びTween（登録商標）を含まないＪＨ培地であってよい（Johnson and Harris, J. Bacteriol., 1967, 14 (1), 27-31）。
【００４７】
有利には、半回分方法のための培地は、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、グリセロール、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＣｕＳＯ４、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、チアミンＨＣｌ（ビタミンＢ１）を含む。
【００４８】
本発明の半回分方法の培地では、従来技術で実施されるように毒性物質除去剤を添加する必要がない（例えばアルブミン又はアニオン交換樹脂の添加）。
【００４９】
半回分方法のための栄養溶液は、脂肪酸源を含む。
【００５０】
脂肪酸源は、特に、脂肪酸のナトリウム塩、脂肪酸乳濁液、エトキシル化脂肪酸、エステル化脂肪酸、例えばソルビタン、ソルビトール、ポリグリセロール、ポリエチレングリコール、及び脂肪酸のエステルであり、好ましくはTween（登録商標）80、Tween（登録商標）60、Tween（登録商標）40、Tween（登録商標）20、Tween（登録商標）85である。１２〜１８個の残基（Ｃ１２〜Ｃ１８）の炭素鎖を有するこれらの脂肪酸が選択される。これらのTween（登録商標）は、本発明では未処理のまま使用する。処理済みのTween（登録商標）、特に活性炭処理、ＰＶＰ処理、又はイオン交換樹脂処理されたものを使用することもできる。
【００５１】
本発明の半回分方法の特定の一実施形態では、栄養溶液は、従来技術で実施されるような処理、特に毒性物質除去（例えば、活性炭処理、ＰＶＰ処理、イオン交換樹脂を入れたカラムの通過）する必要のないTween（登録商標）を含む。
【００５２】
レプトスピラ株の培地への接種は、１．０×１０８〜５．０×１０９、好ましくは約０．８×１０９細菌／ｍｌの接種菌液で実施する。接種量は、培養物量の１％〜２０％体積／体積（ｖ／ｖ）、特に５％〜１０％である。
【００５３】
培養温度は、＋２７℃〜＋３７℃の間で選択する。好ましくは、培養温度は＋２９℃である。
【００５４】
培地のｐＨ値は、６．８〜７．６の範囲に維持する。好ましくは、培地のｐＨは約７．２である。
【００５５】
レプトスピラは、偏性好気性菌である。したがって、培養物の曝気、例えば純酸素ガスの添加を実施しなければならない。
【００５６】
本発明の半回分培養法によるレプトスピラのバイオマス濃度は、少なくとも５．０×１０８細菌／ｍｌ、有利には少なくとも１．０×１０９細菌／ｍｌ、より有利には少なくとも２．０×１０９細菌／ｍｌに達した。半回分培養時間は、６０時間〜２００時間の間、特に９０時間〜１２０時間の間である。
【００５７】
本発明の半回分培養法を用いる場合、レプトスピラの馴化は、レプトスピラ約３〜８代に相当する１継代のみで実施した。
【００５８】
毒性物質除去剤を含まない培地のレプトスピラについては、未処理のTween（登録商標）の毒性閾値は、レプトスピラ株の馴化前では０．００２％であり、選択後では０．０６％である（Stalheim O.H.V., J. Bacteriol., 1966, 92 (4), 946-951）。
【００５９】
本発明の半回分馴化方法を用いる場合、有利には、１回継代のみで、毒性物質除去剤、特にアルブミンを含まない無タンパク質培地で、増殖するようにレプトスピラ株を馴化させる。馴化させた株は、毒性物質除去剤を含まず、高濃度の未処理Tween（登録商標）を含む無タンパク質培地中で増殖することができたが、従来技術では、前記未処理Tweenは馴化方法において溶菌性であることが知られている（Stalheim, supra）。特に、未処理Tween（登録商標）の高濃度は、少なくとも１．２５ｇ／ｌ、特に少なくとも２．５ｇ／ｌであってよい。
【００６０】
本発明の第２の態様は、（ａ）投入培地を連続的に供給し、且つ培地を連続的に除去すること、（ｂ）培地が、毒性物質除去剤及び脂肪酸源を含むこと、（ｃ）レプトスピラの増殖が開始したときに、投入培地を供給してレプトスピラの最大増殖速度（μｍａｘ）を下回る培養物の希釈率を得ること、（ｄ）投入培地が、培地の脂肪酸源濃度より低い濃度の脂肪酸源を含み、脂肪酸源が、増殖制限栄養物であること、並びに（ｅ）この方法によって得られるレプトスピラが、毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地中で増殖することができるように、培養の間、培地の毒性物質除去剤濃度を低下させることを含む、レプトスピラの一定量でのケモスタット培養である。
【００６１】
特定の一実施形態では、レプトスピラの一定量でのケモスタット培養は、（ａ）投入培地を連続的に供給すること及び培地を連続的に除去すること、（ｂ）培地が、毒性物質除去剤及び脂肪酸源を含むこと、（ｃ）レプトスピラの増殖が開始したときに、投入培地を供給して、レプトスピラの最大増殖速度（μｍａｘ）を下回る培養物の希釈率を得ること、（ｄ）投入培地が培地の脂肪酸源濃度より低い濃度の脂肪酸源を含み、脂肪酸源が増殖制限栄養物であること、並びに（ｅ）この方法によって得られるレプトスピラが、毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地で増殖することができるように、培養の間、投入培地の毒性物質除去剤濃度を低下させることを含む。
【００６２】
比増殖速度（μ）は、有利には０．０４５ｈ−１を下回り、特に０．０３ｈ−１以下であり、特に０．０２５ｈ−１以下である。レプトスピラ株の最大増殖速度の決定は、実施例１でさらに述べる。
【００６３】
ケモスタット用の培地は、ＪＨ培地であってよい（Johnson and Harris, J. Bacteriol., 1967, 14 (1), 27-31）。
【００６４】
有利には、ケモスタット法のための培地は、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、グリセロール、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＣｕＳＯ４、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、チアミンＨＣｌ（ビタミンＢ１）、Tween（登録商標）80、及びＢＳＡの画分Ｖを含む。
【００６５】
アルブミンの濃度は、約０．５％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ（重量／体積）の間、好ましくは１％ｗ／ｖであってよい。Tween（登録商標）の濃度は、約０．１％ｗ／ｖ〜０．３５％ｗ／ｖの間であってよい。
【００６６】
投入培地を、レプトスピラ株の最大増殖速度を下回る希釈率でケモスタットに供給する。投入培地は、アルブミン濃度をゼロまで低減されている。
【００６７】
レプトスピラ株のケモスタットへの培地の接種は、１．０×１０８〜５．０×１０９、好ましくは約０．８×１０９細菌／ｍｌの接種菌液で実施する。接種量は、培養物量の１％〜２０％体積／体積（ｖ／ｖ）、好ましくは５％〜１０％ｖ／ｖである。
【００６８】
培養温度、ｐＨ値、及び培養物の曝気は、半回分培養について先に記載したように実施する。
【００６９】
本発明のケモスタット培養法を用いる場合、レプトスピラの馴化は、レプトスピラ約１００代、特に約４０代で実施する。
【００７０】
アルブミンを用いる従来の培養方法とは異なり、本発明の培養方法は、アルブミンを除去するために最終生成物を精製するステップを必要としない。一般に、このステップはタンパク質除去である。これによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）後に得られるタンパク質プロファイルに観測され得るタンパク質組成の差異が生じることがある。タンパク質プロファイルの消失部（break）は、従来の培養方法において、アルブミンを除去するために使用されるタンパク質除去後にのみ観測される。
【００７１】
本発明の半回分又はケモスタット法によってこれまでに得られたレプトスピラは、毒性物質除去剤を含まず、脂肪酸源、好ましくは未処理のTween（登録商標）を含む無タンパク質培地での１回又は数回の連続的な継代培養に使用することができる。
【００７２】
一実施形態では、継代培養は、レプトスピラの最大増殖速度（μｍａｘ）を下回る比増殖速度（μ）で実施する。特に、その継代培養は半回分培養である。
【００７３】
別の実施形態では、継代培養は、レプトスピラの最大増殖速度（μｍａｘ）に等しい比増殖速度（μ）で実施する。特に、その継代培養は回分培養である。
【００７４】
特定の一実施形態では、本発明に従って馴化させたレプトスピラは、回分発酵槽で、毒性物質除去剤、特にアルブミンを含まず、脂肪酸源を含む無タンパク質培地でさらに増殖することができる。
【００７５】
これらの無タンパク質培地は、半回分培養法の培地として記載されたものであってよいが、先に記載したように脂肪酸源を添加してもよい。
【００７６】
別の実施形態では、本発明に従って馴化させたレプトスピラは、回分発酵槽において、毒性物質除去剤、特にアルブミンを含まず、高濃度で存在し得る未処理のTween（登録商標）を含む無タンパク質培地中でさらに増殖することができる。特に、未処理Tween（登録商標）の高濃度は、少なくとも１．２５ｇ／ｌ、より具体的には少なくとも２．５ｇ／ｌである。
【００７７】
本発明に従って馴化させたレプトスピラのバイオマス濃度は、少なくとも５．０×１０８細菌／ｍｌ、特に１．０×１０９細菌／ｍｌ、有利には少なくとも２．０×１０９細菌／ｍｌ、より有利には少なくとも４．０×１０９細菌／ｍｌに達した。
【００７８】
本発明は、本発明の方法によって無タンパク質培地で増殖するように馴化させたレプトスピラを包含する。本発明はまた、本発明の１回又は数回の連続的な継代培養後に得られる馴化させたレプトスピラを包含する。
【００７９】
レプトスピラは、特に、メルチオレート（例えば、チメロサール（登録商標）、Sigma Chemical Co. St Louis, Mo. USA）又はホルムアルデヒド又はＮａＣｌ、エチレンイミン又はその誘導体（二元性エチレンイミン）、β−プロピオラクトンで不活化される。不活化後、獣医学的に許容される希釈剤又は担体、特に滅菌水にレプトスピラを懸濁して、不活化免疫原性組成物又はワクチン組成物を形成する。
【００８０】
本発明はまた、本発明の方法によって、毒性物質除去剤を含まない無タンパク質培地中で、増殖するように馴化させ不活化した、免疫原としてのレプトスピラ、及び獣医学的に許容される希釈剤若しくは担体を含有する、免疫原性組成物又はワクチン組成物を含む。
【００８１】
本発明はまた、本発明による継代培養によって増殖させ不活化した、免疫原としてのレプトスピラ、及び獣医学的に許容される希釈剤若しくは担体を含有する、免疫原性組成物又はワクチン組成物を含む。
【００８２】
本発明の培養後に得られたレプトスピラ懸濁液、或いは免疫原性組成物又はワクチン組成物に、少なくとも１種類のアジュバントを添加してもよい。適切なアジュバントには、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、Pluronic（登録商標）などのブロックコポリマー、アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー、好ましくはCarbopol（登録商標）などのカルボマー、ＥＭＡ（登録商標）などの無水マレイン酸及びアルケニルのコポリマー、油乳濁液、サポニン、QuilA、並びに水酸化アルミニウム及びサポニンの組合せなど、それらの組合せが含まれる。
【００８３】
油乳濁液は、特に水中油型乳濁液、特に、M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995編「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」１４７ページに記載の乳濁液ＳＰＴ、及び同文献の１８３ページに記載の乳濁液ＭＦ５９であってよい。水中油型乳濁液は特に、軽質流動パラフィン油（欧州薬局方タイプ、例えばDrakeol（登録商標）、Bayol F（登録商標）、又はMarcol 52（登録商標）のもの）；スクアラン、スクアレンなどのイソプレノイド油；アルケン、特にイソブテン又はデセンのオリゴマー化から得られる油；直鎖アルキル基を含有する酸又はアルコールのエステル、より具体的には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリレート／カプレート）、グリセリルトリ（カプリレート／カプレート）、プロピレングリコールジオレアート；分岐脂肪アルコール又は酸のエステル、具体的にはイソステアリン酸のエステルをベースとしてよい。その油を乳化剤と併用して、乳濁液を形成する。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタン、マンニド、グリセロール、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、又はヒドロキシステアリン酸の、エトキシル化されていてもよいエステル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、具体的にはPluronic（登録商標）コポリマー、特にＬ１２１である。
【００８４】
アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、並びに無水マレイン酸とアルケニルのコポリマーは、次式の基本単位から形成される同じアジュバントファミリーを構成する。
【００８５】
【化１】
2008536516.tif 000002
【００８６】
式中、
Ｒ１及びＲ２は、同じ又は異なっており、Ｈ又はＣＨ３を表し、
ｘ＝０又は１、好ましくはｘ＝１であり、
ｙ＝１又は２であり、ｘ＋ｙ＝２である。
【００８７】
無水マレイン酸とアルケニルのコポリマーでは、ｘ＝０であり、ｙ＝２である。アクリル酸又はメタクリル酸のポリマーでは、ｘ＝ｙ＝１である。
【００８８】
アクリル酸又はメタクリル酸のポリマーは、好ましくは、特に糖類又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルと架橋されている。これらの化合物は、カルボマーという用語で知られている（Pharmeuropa vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者は、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基（少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子は、少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基で置換されている）を有するポリヒドロキシル化化合物で架橋されたアクリルポリマーが記載されている米国特許Ａ−２，９０９，４６２号を参照することもできる。好ましい基は、２〜４個の炭素原子を含有するもの、例えばビニル、アリル、及び他のエチレン性不飽和基である。不飽和基それら自体は、メチルなどの他の置換基を含有することができる。名称Carbopol（登録商標）（BF Goodrich, Ohio, USA）で市販の製品が特に適切である。それらは、アリル供給源又はアリルペンタエリスリトールと架橋されている。それらの中でも、Carbopol（登録商標）974P、934P、及び971Pが挙げられる。
【００８９】
無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーの中でも、無水マレイン酸とエチレンのコポリマーであるＥＭＡ（登録商標）コポリマー（Monsanto社製）が好ましく、これは直鎖であり、又は例えばジビニルエーテルと架橋されている。J. Fields et al., Nature, 186: 778-780, Jun. 4, 1960を参照することができる。
【００９０】
有用なアジュバントの割合は当業者に周知であり、容易に入手可能である。例えば、最終ワクチン組成物におけるアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、或いは無水マレイン酸とアルケニルのコポリマーの濃度は、０．０１％〜１．５％Ｗ／Ｖ、より具体的には０．０５〜１％Ｗ／Ｖ、好ましくは０．１〜０．４％Ｗ／Ｖである。
【００９１】
さらにレプトスピラは、同じ領域に共生する場合、ある種から別の種へと容易に伝播し、起こり得るいくつかの血清型の感染をもたらす。したがって、不活化されたレプトスピラの様々な血清型が、多価免疫原生組成物及びワクチン組成物に存在することができる。
【００９２】
免疫原性組成物という用語は、標的種に投与されると、レプトスピラ菌に対して直接的な免疫反応を誘発する組成物を包含する。ワクチンという用語は、効果的防御を誘発することができる組成物を意味すると理解される。標的種は、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヒト、好ましくは犬、雌犬、子犬、豚、子豚、雌豚、牛、子牛、肉用牛、乳牛、馬、雄馬、子馬、雌馬、羊、雌羊、子羊である。
【００９３】
ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、及びイヌに最も頻繁に見られるレプトスピラ血清型は、カニコラ、イクテロヘモリジア、グリポティフォーサ、ポモナ、ハージョ、ブラティスラヴァ、バルム、オールムナリス、及びオーストラリスである。
【００９４】
本発明の免疫原性組成物又はワクチン組成物は、非経口経路、好ましくは皮下経路（ＳＣ）、皮内経路（ＩＤ）、筋肉内経路（ＩＭ）で、又は無針注射器を用いて実施することができる。
【００９５】
免疫原性組成物又はワクチン組成物の投与量は、０．２ｍｌ〜５ｍｌの間、好ましくは１ｍｌ〜２ｍｌの間であってよく、約５．０×１０７〜約５．０×１０９細菌／ｍｌ（レプトスピラ血清型１種類当たり）を含有する。
【００９６】
有利には、本発明の免疫原性組成物又はワクチン組成物は、有害な全身性ワクチン反応のリスクを増大せずに、同じ動物に数回投与することができる。
【００９７】
以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに詳細に述べる。
【実施例１】
【００９８】
３種類のレプトスピラ株の最大増殖速度の決定
レプトスピラ・イクテロヘモリジア、レプトスピラ・カニコラ、及びレプトスピラ・グリポティフォーサを、１０ｍｌの半固体改変ＪＨ培地を充填した数本の１４ｍｌガラス試験管中、３０℃で増殖させた（Johnson R.C. & Seiter C.W.（1977）"The Leptospira and their cultivation - a monograph", Reheis Chemical Company （a division of Armour Pharmaceutical), Phoenix, Arisona, USA, page 8）。
【００９９】
半固体の改変ＪＨ培地は、Ｎａ２ＨＰＯ４を０．９ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２７ｇ／ｌ、ＮａＣｌを０．９ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌを０．２２５ｇ／ｌ、グリセロールを０．１１３ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２を０．０１ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ２を０．０１ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４を０．００４ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４を０．０５ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４を０．０００３ｇ／ｌ、シアノコバラミン（Ｂ１２ビタミン）を０．０００２ｇ／ｌ、ＨＣｌチアミン（Ｂ１ビタミン）を０．００４５ｇ／ｌ、寒天を２．０ｇ／ｌ、ウシアルブミン因子Ｖを１０ｇ／ｌ、Tween（登録商標）80を２．５ｇ／ｌ含む。
【０１００】
３０℃で４〜１０日インキュベートした後、各試験管中、培地の表面近くで濃密な増殖のディスクを得た。濃密な増殖のディスクは、Czekalowski等、British J. Exp. Pathol., 1953, 34, 588-595に記載されている。
【０１０１】
各株について、２つの濃密な増殖のディスクをピペットで取り、液体の改変ＪＨ培地３００ｍｌを入れた２リットルのエルレンマイヤーに接種した（Johnson R.C. & Seiter C.W. （1977） "The Leptospira and their cultivation - a monograph", Reheis Chemical Company （a division of Armour Pharmaceutical), Phoenix, Arisona, USA, page 8）。
【０１０２】
液体の改変ＪＨ培地は、Ｎａ２ＨＰＯ４を０．９ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２７ｇ／ｌ、ＮａＣｌを０．９ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌを０．２２５ｇ／ｌ、グリセロールを０．１１３ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２を０．０１ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ２を０．０１ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４を０．００４ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４を０．０５ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４を０．０００３ｇ／ｌ、シアノコバラミン（Ｂ１２ビタミン）を０．０００２ｇ／ｌ、ＨＣｌチアミン（Ｂ１ビタミン）を０．００４５ｇ／ｌ、ウシアルブミン因子Ｖを１０ｇ／ｌ、Tween（登録商標）80を２．５ｇ／ｌ含む。
【０１０３】
これらのエルレンマイヤーを、オービタルシェイカー中、８０ｒｐｍ（１分当たりの回転数）で振とうしながら３０℃で４〜６日間インキュベートした。
【０１０４】
培養中、細菌濃度を決定するために、レプトスピラ懸濁液のアリコート（aliquots）を頻繁に取った。
【０１０５】
細菌濃度を決定した。
【０１０６】
細菌濃度が０．８×１０９細菌／ｍｌに達したら、各レプトスピラ株接種物を回分発酵槽に移した。
【０１０７】
培地を導入する前に、３つの７リットル容量の回分発酵槽を加熱滅菌した。３リットルの滅菌ＪＨ培地を、これらの回分発酵槽に移した。１種類のレプトスピラ株接種物２００〜３００ｍｌを、回分発酵槽に導入した。次に各回分発酵槽について、ｐＨ値、温度、及び溶存酸素値は以下の通りであった。ＮＨ３滅菌溶液７％（ｗ／ｖ）を添加することによってｐＨ値を７．２に調節し、自動的に維持した。温度を３０℃に調節し維持した。スパージャーを介して純酸素ガスを培地に添加することによって、溶存酸素値を５０％飽和に維持した。
【０１０８】
ラシュトンタービンによって、１８０ｒｐｍで撹拌し混合した。
【０１０９】
８０〜１００時間後、酸素制御を停止すると培養が終了した。
【０１１０】
培養の間、毎日アリコートを取った。細菌濃度を決定した。
【０１１１】
次いで、各レプトスピラ株培養の増殖速度を、次式によって決定した。
増殖速度＝［ｌｎ（時間２での濃度）／ｌｎ（時間１での濃度）］／（時間２−時間１）
【０１１２】
「時間（time）」は、接種から始まる培養時間に相当し、時間（hour）で表される。
【０１１３】
最大増殖速度は、各レプトスピラ株培養について得られた最も高い増殖速度とした。
【０１１４】
レプトスピラ・イクテロヘモリジア及びレプトスピラ・カニコラについては、最大増殖速度は約０．０４５ｈ−１であった。レプトスピラ・グリポティフォーサについては、最大増殖速度は０．０６ｈ−１であった。
【実施例２】
【０１１５】
レプトスピラ・イクテロヘモリジア、レプトスピラ・カニコラ、及びレプトスピラ・グリポティフォーサの半回分培養
実施例１に記載のようにして得られたレプトスピラ・イクテロヘモリジア、レプトスピラ・カニコラ、及びレプトスピラ・グリポティフォーサを、液体の改変ＪＨ培地３５０ｍｌを入れた３つのエルレンマイヤーの１つにそれぞれ接種した（実施例１）。ＪＨ培地中のアルブミンの濃度は、株の性質によって決まり、レプトスピラ・イクテロヘモリジアは１０ｇ／ｌ、レプトスピラ・カニコラは１ｇ／ｌ、及びレプトスピラ・グリポティフォーサは１ｇ／ｌである。
【０１１６】
これらのエルレンマイヤーを、オービタルシェイカー中、８０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で４〜６日間インキュベートした。培養の間、細菌濃度を決定するために、レプトスピラ懸濁液のアリコートを頻繁に取った。
【０１１７】
細菌濃度が０．８×１０９細菌／ｍｌに達したら、予め加熱滅菌し、アルブミン及びTween（登録商標）を含まない３リットルの滅菌ＪＨ培地を入れた３つの半回分発酵槽の１つに、各レプトスピラ株接種物を移した。
【０１１８】
アルブミン及びTween（登録商標）を含まないＪＨ培地は、Ｎａ２ＨＰＯ４を０．９ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２７ｇ／ｌ、ＮａＣｌを０．９ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌを０．２２５ｇ／ｌ、グリセロールを０．１１３ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２を０．０１ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ２を０．０１ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４を０．００４ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４を０．０５ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４を０．０００３ｇ／ｌ、シアノコバラミン（Ｂ１２ビタミン）を０．０００２ｇ／ｌ、ＨＣｌチアミン（Ｂ１ビタミン）を０．００４５ｇ／ｌ含む。
【０１１９】
接種物の量は、株の性質によって決まり、レプトスピラ・イクテロヘモリジアは１５０ｍｌ、レプトスピラ・カニコラは３００ｍｌ、及びレプトスピラ・グリポティフォーサは３００ｍｌである。
【０１２０】
各半回分発酵槽について、ｐＨ値、温度、及び溶存酸素値は以下の通りであった。
【０１２１】
ＮＨ３滅菌溶液７％（ｗ／ｖ）を添加することによってｐＨ値を７．２に調節し、自動的に維持した。温度を３０℃に調節し維持した。スパージャーを介して純酸素ガスを培地に添加することによって、溶存酸素値を５０％飽和に維持した。ラシュトンタービンによって、１８０ｒｐｍで撹拌し混合した。
【０１２２】
Tween（登録商標）80の１０ｇ／ｌの溶液１．８リットルを、供給用の管及び変速ぜん動式ポンプを備えたボトル内で、栄養溶液として調製した。
【０１２３】
接種直後、供給を開始した。各レプトスピラ株の比増殖速度が一定であり、実施例１で決定した最大増殖速度未満となるように、時間内の供給速度の展開を設定した。
【０１２４】
全てのレプトスピラ株に関して、この一定の比増殖速度は０．０３ｈ−１であった。
【０１２５】
このような条件下で、この培養でのレプトスピラの増殖を制限する要素はTween（登録商標）80である。
【０１２６】
Tween（登録商標）80の供給速度と比増殖速度との間の関係は、"The relationship between the nutrient feed rate and specific growth rate in fed batch cultures", R.C. Jones and R.M. Anthony, European J. Appl. Microbiol, 1977, 4, 87-92、特に８８ページ１章"Constant specific growth rate"に詳説されている。
【０１２７】
供給速度プロファイルは、以下の想定と共に上記文献から予想される。
【０１２８】
Tween（登録商標）は、増殖制限栄養分である。
【０１２９】
Ｋｖは、この文献では、産出係数と供給物中の増殖制限栄養分の濃度との積で割った、０時間での細胞の重量に等しいことが開示されている。
【０１３０】
簡素化のために、Ｋｖは、供給物中の増殖制限栄養分の濃度で割った、培地に導入された接種物に最初に存在するTween（登録商標）の質量に等しいと想定した。
【０１３１】
本発明の実施例では、レプトスピラ・イクテロヘモリジア接種物１５０ｍｌは、Tween（登録商標）溶液の濃度が１０ｇ／ｌならば、Tween（登録商標）０．１５０×２．５ｇ／ｌ＝０．３７５ｇを含有する。Ｋｖは、０．０３７５リットルである。
【０１３２】
Tween（登録商標）80栄養溶液を約１．１〜２リットル供給すると発酵が終了した。
【０１３３】
各レプトスピラ半回分培養の結果を、以下の表に示す。
【０１３４】
【表１】
2008536516.tif 000003
【０１３５】
これらの最終バイオマス濃度は、従来の１回のレプトスピラ回分培養で通常得られる範囲のものである。別の利点は、文献では、例えば活性炭、ＰＶＰ等で処理されてTween（登録商標）が無毒化されるのとは逆に、毒性物質除去剤を添加せず、且つ／又はTween（登録商標）80の処理を実施しないことである。
【実施例３】
【０１３６】
半回分及び無タンパク質培地における培養によるレプトスピラ・カニコラの馴化
レプトスピラ・カニコラ冷凍バンク０．５ｍｌを解凍し、５００ｍｌのエルレンマイヤー中の液体の改変ＪＨ培地（実施例１）１００ｍｌに導入した。オービタルシェイカー中、８０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で６日間インキュベートした後、細菌濃度は１．２×１０９細菌／ｍｌに達し、この事前接種培養物１を、別の事前接種培養物に移した。
【０１３７】
１．６７ｍｌの事前接種培養物１を、５００ｍｌのエルレンマイヤー中の液体の改変ＪＨ培地に導入した。オービタルシェイカー中、８０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で８日間インキュベートした後、細菌濃度は１．６×１０９細菌／ｍｌに達し、この事前接種培養物２を、接種培養物に移した。
【０１３８】
９．３７ｍｌの事前接種培養物２を、２リットルのエルレンマイヤー中、アルブミン３ｇ／ｌを含有する液体の改変ＪＨ培地２５０ｍｌに導入した。オービタルシェイカー中、８０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で６日間インキュベートした後、細菌濃度が７．５×１０８細菌／ｍｌに達し、その接種物を、半回分発酵槽に移した。
【０１３９】
アルブミン及びTween（登録商標）を含まない３リットルの滅菌ＪＨ培地（実施例２）を、別の容器で調製し、発酵槽に移した。
【０１４０】
レプトスピラ・カニコラ接種培養物１５０ｍｌをその培地に移した。
【０１４１】
ＮＨ３滅菌溶液７％（ｗ／ｖ）を添加することによってｐＨを７．２に調節し、自動的に維持した。温度を３０℃に調節し維持した。スパージャーを介して純酸素ガスを培地に添加することによって、溶存酸素を５０％飽和に維持した。１分当たり１８０回転（ＲＰＭ）で運転させたラシュトンタービンによって、撹拌し混合した。
【０１４２】
Tween（登録商標）１０ｇ／ｌの溶液１．８リットルを、供給用の変速ぜん動式ポンプと互換性のある管を備えたボトル内で、栄養溶液として調製した。細菌集団の比増殖速度が一定であり、実施例１で決定した最大増殖速度未満となるように、時間に伴う供給速度の展開を設定した。比増殖速度は、０．０２５ｈ−１に等しかった。
【０１４３】
７．５×１０８細菌／ｍｌの細菌濃度が得られたら、このレプトスピラ・カニコラ懸濁液１０ｍｌを、５００ｍｌのエルレンマイヤー中、アルブミンを含まない液体ＪＨ培地１００ｍｌに接種した。このエルレンマイヤーを、オービタルシェイカー中、８０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で６日間インキュベートした。レプトスピラ・カニコラは、１０．０×１０８細菌／ｍｌに増殖した。
【０１４４】
他の継代培養を、アルブミンを含まず、Tween（登録商標）80を１．２５又は２．５ｇ／ｌ含むＪＨ培地を用いて、同じように実施した。
【０１４５】
半回分培養後８代継代から、類似の増殖及び細菌濃度が得られ観測された。８代、６代、及び５代継代について、より多くの増殖及び高い細菌濃度が得られ、それぞれ４．８×１０９、２．１×１０９、及び３．２×１０９細菌／ｍｌと観測された。さらなる継代が培養されている。
【０１４６】
アルブミンなどの毒性物質除去剤を用いずに未処理のTween（登録商標）80を用いる培養方法に関わらず、本発明の最終バイオマス濃度は、従来のレプトスピラ回分培養で通常得られるものよりも高い。
【実施例４】
【０１４７】
アルブミンを含まない培地でのケモスタット培養による増殖へのレプトスピラ株の馴化
半固体の改変ＪＨ培地１０ｍｌを充填したいくつかの１４ｍｌガラス試験管中、レプトスピラを３０℃で増殖させる（実施例１）。４〜１０日のインキュベーション後に、表面近くに濃密な増殖のディスクが見られる。
【０１４８】
２つの濃密な増殖のディスクをピペットで取り、５００ｍｌのエルレンマイヤーに入れた液体の改変ＪＨ培地１００ｍｌに接種した（実施例１）。
【０１４９】
これらのエルレンマイヤーを、オービタルシェイカー中、８０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で４〜６日間インキュベートした。培養の間、細菌濃度を決定するために、レプトスピラ懸濁液のアリコートを頻繁に取った。細菌濃度が０．８×１０９細菌／ｍｌに達したら、レプトスピラ株接種物をケモスタットに移した。
【０１５０】
培地を導入する前に、ケモスタットを加熱滅菌する。液体の滅菌改変ＪＨ培地（実施例１）２分の１リットルを、別の容器で調製し、その滅菌のために、ろ過システムを介してケモスタットに移す。
【０１５１】
レプトスピラ接種培養物１００ｍｌを、ケモスタットに導入する。
【０１５２】
ＮＨ３滅菌溶液７％（ｗ／ｖ）を添加することによってｐＨ値を７．２に調節し、自動的に維持する。温度を３０℃に調節し維持する。スパージャーを介して純酸素ガスを培地に添加することによって、溶存酸素を５０％飽和に維持する。１８０ｒｐｍで運転させたラシュトンタービンによって、撹拌し混合する。
【０１５３】
５種類の栄養溶液を調製する。それらは、Ｎａ２ＨＰＯ４を０．９ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２７ｇ／ｌ、ＮａＣｌを０．９ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌを０．２２５ｇ／ｌ、グリセロールを０．１１３ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２を０．０１ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ２を０．０１ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４を０．００４ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４を０．０５ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４を０．０００３ｇ／ｌ、シアノコバラミン（Ｂ１２ビタミン）を０．０００２ｇ／ｌ、ＨＣｌチアミン（Ｂ１ビタミン）を０．００４５ｇ／ｌ、Tween（登録商標）80を１．２５ｇ／ｌ含有し、それぞれ様々なアルブミン濃度：１０ｇ／ｌ、５ｇ／ｌ、２ｇ／ｌ、１ｇ／ｌのもの、及びアルブミンを含まないものである。
【０１５４】
これらの栄養溶液を、ぜん動式ポンプに連結した管を備えたフラスコ内で滅菌調製した。
【０１５５】
４〜６日のインキュベーション後、細菌濃度が０．８×１０９細菌／ｍｌに達したら、アルブミン１０ｇ/ｌを含有する栄養溶液を０．０３ｈ−１の速度で供給する（つまり、実施例１で決定された最大増殖速度未満）。培養物量５００ｍｌに対して、供給速度は１５ｍｌ／ｈである。
【０１５６】
ケモスタット培養の間、ぜん動式ポンプを備えた別の管を介して、余分な培地を廃棄容器に排除することによって、培養物の重量を一定に保つ。
【０１５７】
３体積当量の培養物量が除去すると、定常状態のケモスタット培養物が得られる。ここで、アルブミン栄養溶液１０ｇ／ｌをアルブミン栄養溶液５ｇ／ｌで置換する。さらなる３体積の除去後、次いでその栄養溶液をアルブミン栄養溶液２ｇ／ｌで置換し、栄養溶液がアルブミン１ｇ／ｌを含有するまでのもの、最終的には栄養溶液がアルブミンを全く含有しなくなったもので置換する。
【０１５８】
また１０体積当量の培養物が除去されると、細菌は、回分式において微量のアルブミンを含有する培地での増殖するよう馴化させ、アルブミンを含まない培地での増殖に挑むことができる。
【実施例５】
【０１５９】
レプトスピラワクチンの生成
レプトスピラ・イクテロヘモリジア冷凍バンク１ｍｌを解凍し、５００ｍｌのエルレンマイヤーに入れた液体の改変ＪＨ培地１００ｍｌに導入した（実施例１）。オービタルシェイカー中、８０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で１６８時間インキュベートした後、細菌濃度は、１．０×１０９細菌／ｍｌに達し、事前接種物を接種培養物に移した。
【０１６０】
事前接種培養物３０ｍｌを、全容量２リットルのエルレンマイヤーに入れた液体の改変ＪＨ培地３００ｍｌに導入した。オービタルシェイカー中、８０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で１２０時間インキュベートした後、細菌濃度は、２．４×１０９細菌／ｍｌに達し、レプトスピラ・イクテロヘモリジア接種物１５０ｍｌを、半回分培養物に移した。
【０１６１】
培地を導入する前に、全容量７リットルの半回分発酵槽を加熱滅菌した。アルブミン及びTween（登録商標）を含まない３リットルの滅菌ＪＨ培地（実施例２）を、別の容器で調製し、その滅菌のために、ろ過システムを介して発酵槽に移した。
【０１６２】
ＮＨ３滅菌溶液７％（ｗ／ｖ）を添加することによってｐＨを７．２に調節し、自動的に維持した。温度を３０℃に調節し維持した。スパージャーを介して純酸素ガスを培地に添加することによって、溶存酸素を５０％飽和に維持した。１８０ｒｐｍで運転させたラシュトンタービンによって、撹拌し混合する。
【０１６３】
１０ｇ／ｌのTween（登録商標）80溶液１．８リットルを、供給用の変速ぜん動式ポンプに連結した管を備えたボトル内で、栄養溶液として調製した。
【０１６４】
発酵槽の接種直後、供給を開始した。細菌集団の比増殖速度が一定であり、実施例１で決定した最大増殖速度未満となるように、時間に伴う供給速度の展開を設定した。この比増殖速度は０．０３ｈ−１に等しかった。
【０１６５】
発酵の結果を、以下の表に示す。
【０１６６】
【表２】
2008536516.tif 000004
【０１６７】
細菌懸濁液を集菌した。細菌懸濁液の第１の部分を、濃度０．０１％ｗ／ｖのThimerosal（登録商標）（Sigma Chemical Co.社製、St Louis, Mo. USA）を用いて、３０℃で２４時間不活化した。細菌懸濁液の第２の部分を、濃度０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドを用いて、３０℃で２４時間不活化した。
【０１６８】
インキュベーションの終了時、生理食塩水を添加することによって不活化細菌懸濁液を希釈して、６．０×１０８細菌／ｍｌの最終濃度を得た。ワクチンの用量は、この希釈された不活化細菌懸濁液を１ｍｌ含有する。
【実施例６】
【０１６９】
ワクチン接種の研究
実施例５のワクチンを、４倍種の希釈での効果についてハムスターで試験し、その後チャレンジした。
【０１７０】
０日目の体重が約３５ｇ〜約４５ｇの４１匹の雌ハムスターを５つの群に分けて置いた（４群は動物５匹からなる「ワクチン接種群」とし、１群は動物１匹からなる「対照群」とする）。
【０１７１】
実施例５の２種類のワクチンを、希釈剤（食塩水、ｐＨ７．５）を添加することによって希釈して、それぞれ１／４０、１／１６０、１／６４０、及び１／１２８０の希釈物を得た。
【０１７２】
ハムスターの各ワクチン接種群に、０日目に、これら４種類のワクチン希釈物を用量１ｍｌで皮下的にワクチン接種した。
【０１７３】
ワクチン接種及び対照の全てのハムスターを、１５日目に、有毒なレプトスピラ・イクテロヘモリジア株２００ＬＤ５０（致死量５０）でチャレンジした。
【０１７４】
チャレンジ後、２１日の期間中、ハムスターを毎日観測した。
【０１７５】
期間終了時（３６日目）、生存数を使用してワクチンの効果を測定した。
【０１７６】
【表３】
2008536516.tif 000005
【０１７７】
対照群において観測した生存率ゼロによって、チャレンジを有効とする。
【０１７８】
ワクチン接種群で観測した生存率は、用量効果を有するワクチンの効果を示すものである。
【国際調査報告】
2008536516.tif 000006
2008536516.tif 000007
2008536516.tif 000008
2008536516.tif 000009
2008536516.tif 000010