(57)【要約】ＰＣＲ反応産物及び／又はＤＮＡ塩基配列決定反応産物を精製するための方法及びそのような精製のための材料。様々な実施形態によれば、本発明の教示は、イオン交換材料を含むコア及び高分子電解質材料を含むコーティングを含有する粒子を提供し、このコアとこのコーティングがＰＣＲ反応産物を分離するように適合されている。様々な実施形態によれば、本発明の教示は、ＰＣＲ反応産物を精製するための方法を提供し、この方法は、各々がイオン交換のためのコア及び高分子電解質のコーティングを含む複数の粒子を提供する工程、及びｄｓＤＮＡフラグメントを分離するためにＰＣＲ反応産物に接触させる工程を包含する。
2008536478.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン交換材料を含むコア；及び
高分子電解質材料を含むコーティング；
を含む粒子、ならびに
非イオン性界面活性剤を含む、溶液であって、
該コアと該コーティングはＤＮＡ塩基配列決定反応産物を分離するように適合されている、溶液。
【請求項２】
前記非イオン性界面活性剤が両性イオン界面活性剤である、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
前記両性イオン界面活性剤がＣＨＡＰＳである、請求項２に記載の溶液。
【請求項４】
安定化添加剤をさらに含む、請求項１に記載の溶液。
【請求項５】
前記安定化添加剤が両性イオン化合物である、請求項４に記載の溶液。
【請求項６】
前記両性イオン化合物がベタインである、請求項５に記載の溶液。
【請求項７】
前記非イオン性界面活性剤が、ＤＮＡ塩基配列決定反応からの組み込まれなかった色素ターミネーターの除去を促進するように適合されている、請求項１に記載の溶液。
【請求項８】
前記非イオン性界面活性剤が加熱なしで有効である、請求項７に記載の溶液。
【請求項９】
前記イオン交換材料が陽イオン性である、請求項１に記載の溶液。
【請求項１０】
陰イオン交換粒子をさらに含む、請求項９に記載の溶液。
【請求項１１】
前記イオン交換材料が陰イオン性である、請求項１に記載の溶液。
【請求項１２】
陽イオン交換粒子をさらに含む、請求項１１に記載の溶液。
【請求項１３】
ＤＮＡ塩基配列決定のための方法であって、該方法は、
精製媒質を提供する工程；
組み込まれなかった色素ターミネーター及び塩を除去するために該精製媒質とＤＮＡ塩基配列決定反応産物とを接触させる工程；
該精製媒質を単離する工程；及び
該精製媒質からの干渉を伴わずに該ＤＮＡ塩基配列決定産物からキャピラリー電気泳動のための試料を負荷する工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記精製媒質が複数の粒子を含み、各々の粒子が、イオン交換材料を含むコア及び高分子電解質材料を含むコーティングを含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記負荷する工程が動電注入を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記精製媒質が複数の粒子を含み、前記単離する工程が、複数の粒子を磁気的に操作すること、複数の粒子を浮遊させること又は複数の粒子に遠心力又は重力を適用することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
負荷する工程が、複数の粒子の上方又は下方で起こる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
試料注入位置を調節する工程、及び前記複数の粒子の上方の前記ＤＮＡ塩基配列決定産物からキャピラリー電気泳動のための試料を負荷する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
非イオン性界面活性剤を提供する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
非イオン性界面活性剤がＣＨＡＰＳである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液を両性イオン化合物で安定化する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
両性イオン化合物がベタインである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ塩基配列決定反応産物、前記精製媒質及び前記両性イオン化合物を少なくとも８時間、該ＤＮＡ塩基配列決定反応産物を不安定化させずに保存する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本教示は、イオン交換手法を使用することによって試料をろ過及び／又は精製するための装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は配列決定反応から得られる反応産物の精製は、その後の下流のプロセスのために多くの課題を提示し得る。不純物はその後のプロセス工程でアーティファクトを生じさせることがある。アーティファクトを排除するための数多くの精製工程は面倒であり、非効率的であり得る。プライマー、組み込まれなかったヌクレオチド、プライマーダイマー、小さなＤＮＡフラグメントを捕獲すること、及び一部の場合にはＰＣＲ産物を脱塩することが望ましくあり得る。プライマー、色素標識プライマー、ヌクレオチド、色素標識ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド及び色素標識ジデオキシヌクレオチドを捕獲すること及びＤＮＡ塩基配列決定反応産物を脱塩することが望ましくあり得る。従来の精製手法に付随するこれらや他の問題に対処する分離が求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（要旨）
様々な実施形態によれば、本発明の教示は、イオン交換材料を含むコア及び高分子電解質材料を含むコーティングを含有する粒子を提供し、このコアとこのコーティングがＰＣＲ反応産物を分離するように適合されている。様々な実施形態によれば、本発明の教示は、ＰＣＲ反応産物を精製するための方法を提供し、この方法は、各々がイオン交換のためのコア及び高分子電解質のコーティングを含む複数の粒子を提供する工程、及びｄｓＤＮＡフラグメントを分離するためにＰＣＲ反応産物に接触させる工程を包含する。
【０００４】
様々な実施形態によれば、本発明の教示は、イオン交換材料を含むコア及び高分子電解質材料を含むコーティングを含有する粒子を提供し、このコアとこのコーティングはＤＮＡ塩基配列決定反応産物を分離するように適合されている。様々な実施形態によれば、本発明の教示は、ＤＮＡ塩基配列決定反応産物を精製するための方法を提供し、この方法は、各々がイオン交換のためのコア及び高分子電解質のコーティングを含む複数の粒子を提供する工程、及び色素標識ｓｓＤＮＡフラグメントを分離するためにＤＮＡ塩基配列決定反応産物に接触させる工程を包含する。
【０００５】
様々な実施形態によれば、本発明の教示は、粒子を形成するための方法を提供し、この方法は、ＰＣＲ反応産物及びＤＮＡ塩基配列決定反応産物の少なくとも１つを分離するのに適合するコア材料及び高分子電解質材料を選択する工程、イオン交換材料を含むコアを提供する工程、及びコアを高分子電解質材料で被覆する工程を包含する。様々な実施形態によれば、本発明の教示は、高分子電解質材料を含有する組成物を提供し、この高分子電解質材料は、イオン交換材料を被覆すること及び少なくとも１つのＰＣＲ反応産物又はＤＮＡ塩基配列決定反応産物の分離を提供するように適合されている。様々な実施形態によれば、本発明の教示は、生物学的分離のためのシステムを提供し、このシステムは高分子電解質材料を含み、この高分子電解質材料は、イオン交換材料を被覆すること及び少なくとも１つのＰＣＲ反応産物又はＤＮＡ塩基配列決定反応産物の分離のためのふるいを提供するように適合されている。
【０００６】
様々な実施形態の付加的な特徴及び利点は、一部は以下の説明の中で述べられ、また一部は説明から明白であり、又は様々な実施形態の実施によって確認され得る。様々な実施形態の目的及び他の利点は、本明細書の説明および添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせによって理解され、達成される。
【０００７】
図面が一定の縮尺で描かれていないことは了解されるべきである。さらに、図面中の物体の間の関係は縮尺どおりではないことがあり、実際には大きさに関して逆の関係を有することがあり得る。図面は、理解を助け、示されている各々の物体の構造を明らかにすることを意図されており、それ故構造の特定の特徴を示すために一部の特徴が誇張されていることがある。
【０００８】
上記の一般的説明及び以下の詳細な説明は単なる例示及び説明であり、本発明の教示の様々な実施形態の説明を与えることを意図されていることは了解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（様々な実施形態の詳細な説明）
本明細書で使用される各項の見出しは、単に構成上の目的のためであり、述べられている主題を限定するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍及び論文を含むが、これらに限定されない、本出願の中で引用される全ての資料は、任意の目的のために、それらの全体が明白に参考として本明細書に援用される。
【００１０】
本明細書で使用される「粒子」という用語は、被覆することができる液体、固体及び／又は気体のイオン交換材料を指す。コーティングは、粒子の外側表面全体又はその実質的な部分を覆うことができる。コーティングは、粒子の内側表面の部分を被覆することができる。コーティングは、永続的に粒子を被覆するように不可逆性であり得るか又はコーティングの溶解時に粒子を放出するように可逆性であり得る。粒子は、単一材料又は、例えば融解、焼結、圧締、圧縮、相分離、沈殿、凝集及び合着によって製造され得るか、又はさもなければ相互に形成され得る材料の凝集体であり得る。粒子は、球状、楕円状、三角形又は円筒状等のような規則正しいか、又は不規則ないかなる形状も有し得る。
【００１１】
本明細書で使用される「材料」という用語は、分子レベル又はバルクのいかなる物質も指し、液体及び／又は固体、例えば乳剤又は樹脂であり得る。
【００１２】
本明細書で使用される「細孔径」という用語は、細孔径より大きい粒子は粒子の内部に入り込みにくいが、より小さな粒子は粒子の内部に入り込みやすいという指針を与える、平均測定値を指す。細孔に入ることが許容された又は細孔からそれた粒子が必ずしも正確に所与の「細孔径」ではないことは了解されるべきである。すなわち、細孔への侵入の許容又は細孔からの排除は、実際の細孔径（コアの各々の細孔は異なるサイズを有し得る）、立体障害因子、イオン引力、分極等を含む多くの因子に基づく。加えて、ミクロ細孔ゲル型イオン交換材料のような一部の粒子は、規定された細孔を持たない。粒子は、「サイズ排除限界を規定するためのゲルマトリックス内の分子間隔によって規定される細孔径」を有する。
【００１３】
本明細書で使用される「イオン交換」という用語は、イオン交換表面上で「結合」又は「捕獲」され得る各々の等しい電荷が、等しい電荷を適切な溶液中に放出する過程を指す。イオン交換コアからの対イオンのこの置換は、多数の対イオンを試料溶液中に放出することができる。イオン交換コアの選択性は、イオン交換コアの対イオンに対するよりも試料溶液から除去されるべきイオンに対してより大きい。対イオンとして同様の親和性のイオンは、イオン交換体に対するイオンの相対的親和性に基づき平衡分布を確立する。平衡は、溶液からのイオンの取り込みを与えることができるか又は与えることができない。対イオンは、塩化物、水酸化物、酢酸塩、ギ酸塩、臭化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩又は他の何らかの有機又は無機陰イオンを含むほとんどいかなるイオンでもあり得る。対イオンの選択は、除去されるべき溶液中のイオンの性質によって影響され得る。対イオンは、溶液中のイオンに比べてイオン交換コアに対して有意に低い親和性を有し、それ故溶液中のイオンとの交換を提供するように選択することができる。混床（ｍｉｘｅｄ  ｂｅｄ）で陽イオン交換樹脂を使用する中和は、溶液からのイオンの取り込みを促進することができる。これは、樹脂に対する陽イオンの親和性が対イオンに対する親和性より低い場合でも当てはまり得る。上記は陰イオン交換粒子の使用を説明しているが、本発明の教示は陽イオン交換粒子に関しても同様である。陽イオン交換粒子についての対イオンは、ヒドロニウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、又は他の何らかの有機又は無機陽イオンを含む。高分子電解質被覆イオン交換粒子はいかなるイオン形態でも製造することができる。
【００１４】
本明細書で使用される「混合物」という用語は、例えば充填カラム、混床、均一床、流動床、連続流を伴う静止カラム又はバッチ混合物において共に使用される２個以上の高分子電解質被覆粒子を指す。混合物は、高分子電解質被覆陽イオン交換粒子、高分子電解質被覆陰イオン交換粒子、非被覆陽イオン交換粒子、非被覆陰イオン交換粒子、不活性物質又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。混合物は、分離の技術分野において公知のいかなる物理的形状、及びイオン交換の技術分野において公知のいかなる化学的混合物も含み得る。混合物は、化学量論的に等しい量を含むいかなる割合でもあり得る。粒子の混合物は、溶液の脱塩によるサイズに基づく除去を提供し得る。一例は、ヒドロニウム形態の陽イオン交換粒子を含む混床における水酸化物形態の高分子電解質被覆イオン交換粒子である。粒子の混合物は、溶液を脱塩することなく小さなイオンのサイズに基づく除去を提供し得る。一例は、塩化物又は酢酸塩形態（又は水酸化物以外の他の何らかの陰イオン）で、陽イオン交換材料を含まない高分子電解質被覆イオン交換粒子である。高分子電解質被覆イオン交換粒子のために使用される対イオン形態の選択は、それらが実施される適用に基づき得る。
【００１５】
本明細書で使用される「コーティング」という用語及びその文法的変形は、粒子を覆う、同じ電荷を有する高分子電解質の単層未満、単層又は多層、又は反対の電荷を有する様々な高分子電解質の多層を指す。例えば無機緩衝イオン及びヌクレオチドのようなより小さな分子は、コーティングを通って侵入又は浸透することができ、粒子によって保持され得るか又は粒子とイオン交換され得る。コーティングは、例えば核酸のようなより大きな分子がコーティングを通って侵入又は浸透し、粒子と反応するのを妨げることができる。
【００１６】
本明細書で使用される「ポリマー」、「重合」、「重合する」、「架橋産物」、「架橋」、「架橋する」という用語及び他の同様の用語は、生じる産物が、例えば鎖状ポリマーと異なって、三次元構造を有する、重合の産物と方法、及び架橋の産物と方法の両方を含むことが意図されている。「ポリマー」という用語はまた、オリゴマー、ホモポリマー及びコポリマーを指す。重合は、熱によって、光化学的に、イオンによって、又はポリマー化学の当業者に公知の他の何らかの手段によって開始され得る。様々な実施形態によれば、重合は、縮合（又は段階）重合、開環重合、高エネルギー電子線開始重合、原子移動ラジカル付加（ＡＴＲＡ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合又は他の何らかのリビングフリーラジカル重合を含むフリーラジカル重合であり得る。
【００１７】
本明細書で使用される「（メト）アクリル」という接頭辞は、メタクリル及びアクリルを指す。例えばＮ−メチル（メト）アクリルアミドは、Ｎ−メチルメタクリルアミド及びＮ−メチルアクリルアミドを指し、２−ヒドロキシエチル（メト）アクリレートは、２−ヒドロキシエチルメタクリレート及び２−ヒドロキシエチルアクリレートを指す。
【００１８】
本明細書で使用される「ＤＮＡ」という用語は、ＲＮＡ、ＰＮＡ及び分子生物学の当業者に了解される他のものを含む、何らかの核酸を指す。
【００１９】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子は、例えば生体分子の分離におけるような多くの用途を有し得る。様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子は、大きな分子が粒子のイオン交換活性部位と相互作用する能力を制限することによって生体分子の分離を提供することができる。高分子電解質被覆粒子に入り込むことができる低分子は、イオン交換活性部位と相互作用することができ、それらの部位に保持され得る。より大きな、高い電荷を有する種は、コーティングによって又はコア粒子の細孔径によってイオン交換コアと相互作用することを制限され得る。そのような大型の高い電荷を有する種は、イオン交換粒子に結合せずに溶液中にとどまり得る。溶液中に残存するより大型の種を分離することができる。より大きな分子はコーティング上に固定化されない。様々な実施形態によれば、低分子は、高分子電解質被覆粒子から溶出され得る。様々な実施形態によれば、大型分子は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメント及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）フラグメントを含み得、低分子は、ヌクレオチド、ｓｓＤＮＡの短いフラグメント、ｄｓＤＮＡの短いフラグメント、及び塩化物、酢酸塩及び界面活性剤などの小さなイオンを含み得る。
【００２０】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子は、イオン交換コアを過剰の高分子電解質に暴露することによって提供され得る。コア表面は高分子電解質で被覆され得る。高分子電解質は、ＤＮＡのような天然に存在するバイオポリマーを含む生体高分子、又は本明細書で記載される合成ポリマーであり得る。
【００２１】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子は、イオン交換コアを、コアの電荷と反対の電荷を含む高分子電解質に暴露することによって提供され得る。最初の高分子電解質の被覆後、被覆した粒子を、最初の高分子電解質の電荷と反対の電荷を含むもう１つ別の高分子電解質に暴露する。交互に多価陰イオンと多価陽イオンから成る多数の層を有する高分子電解質被覆粒子を提供するために被覆工程を反復することができる。
【００２２】
様々な実施形態によれば、高分子電解質を含むコーティングは、サイズふるい作用によってコアと、ｓｓＤＮＡを含む大型分子との相互作用を低下させることができる。コーティングはイオン交換コアの外側表面を覆うことができ、表面と大型分子との相互作用を低下させ得る。コーティングは、コア粒子の内側への大型分子の侵入を低下させるサイズ排除障壁（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）を創造し得る。高分子電解質の化学的性質が、高分子電解質被覆粒子が示すふるい特性を決定し得る。電荷、電荷密度、疎水性、立体規則性、可撓性、コポリマー及びターポリマーにおいて使用されるモノマー単位の比率、及び分子量などの高分子電解質の性質は全て、所望のふるい特性を与えるために改変することができる。様々な実施形態によれば、高分子電解質コーティングは、所望の物理的性質及びサイズ排除特性を得るためにその後の工程で架橋することができる。
【００２３】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子は、イオン交換コアの固有の多孔性を利用することによってサイズ排除イオン交換体として機能することができる。イオン交換コアは、５オングストローム（ミクロ細孔）及び１０００オングストローム以上（マクロ細孔）などの多種多様な細孔径で得ることができる。イオン交換コアは、適用の必要条件に基づき所望のサイズの分子を排除するように、細孔径に基づいて選択することができる。様々な実施形態によれば、高分子電解質コーティングは、イオン交換コアの細孔から排除されるのに十分なほど大きく、それによって細孔の内部のコーティングを実質的に低くしながら外側表面を被覆することができる。高分子電解質コーティングは、表面イオン交換部位の実質的な量をブロックすることによってイオン交換コアの表面とｓｓＤＮＡなどの大型分子との相互作用を低下させることができる。イオン交換コアビーズの細孔径は、コアの細孔へのｓｓＤＮＡなどの大型分子の侵入及びコアのイオン交換部位との相互作用を低下させるのに十分なほど小さい。様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子が有意に少ないｄｓＤＮＡなどの大型分子を保持するように、表面イオン交換部位を実質的にブロックし、内側のイオン交換部位をよりアクセス困難にすることができる。これに対し、塩化物、酢酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、低分子オリゴヌクレオチド及びヌクレオチドなどのより小さなイオンは、イオン交換コアの細孔に入り込み、内部のイオン交換部位と相互作用することができる。コーティングは、表面部位が高分子電解質コーティングによって占められているので、表面イオン交換部位と、大型分子のような小さなイオンとの相互作用を低下させることができる。そのような高分子電解質被覆粒子の生じるイオン交換能力（小さなイオンについての）は、コアの表面の能力を差し引いた裸のイオン交換コアの作業能力に等しい。粒子の内部細孔は、表面イオン交換部位が高分子電解質コーティングによって占められた後、高分子電解質被覆粒子の実質的なイオン交換能力を提供する。
【００２４】
様々な実施形態によれば、コーティングは、コーティングが等価（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）単層未満から多層までの厚さを有するようにイオン交換コア上に形成され得る。コーティングの厚さはイオン交換コアの表面上にわたって異なり得るか、又はコーティングの厚さはイオン交換コアの表面全体にわたって均一であり得る。様々な実施形態によれば、コーティングは、イオン交換コアを少なくとも部分的に覆い得る。コーティング材料は、イオン交換コアの１以上の細孔又は表面特徴、例えば細孔、亀裂、間隙、くぼみ、流路、穴、陥凹又は溝を少なくとも部分的に充填し得る。例えばイオン交換コアは、コーティングを形成するのに適した高分子電解質で全ての内側及び外側表面を被覆することができる。
【００２５】
様々な実施形態によれば、図１は、生体高分子３００から成る高分子電解質層２０で被覆された細孔３２を有するイオン交換コア１２を含み得る高分子電解質被覆粒子３０を示す。図２は、合成ポリマー３１０から成る高分子電解質層２０で被覆された細孔３２を有するイオン交換コア１２を含み得る高分子電解質被覆粒子３０を示す。小さなイオン粒子（示していない）は、陰イオン交換コアの場合、篩過して及び／又は細孔３２に入って、正電荷に例示されるイオン交換部位に結合することができる。高分子電解質コーティングは、イオン交換コアに結合する、大きなｓｓＤＮＡフラグメントに例示される大型分子の量を実質的に減少させることができる。
【００２６】
様々な実施形態によれば、イオン交換コアは陰イオン性又は陽イオン性材料であり得る。イオン交換コアは、ポリマー、架橋ポリマー又は無機材料、例えばシリカであり得る。イオン交換コアは、イオン交換することができる固体コア材料、又はイオン交換樹脂で処理される固体コア材料であり得る。イオン交換コアは表面活性化され得る。イオン交換コアは、非磁性、常磁性又は磁性であり得る。例示的なイオン交換コア材料は、以下に列挙するものを含む。
【００２７】
様々な実施形態によれば、コアのためのイオン交換材料は、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ２５Ｑ、Ａｍｉｎｅｘ  Ａ−２７、ＡＧ  １−Ｘ２、ＡＧ  １−Ｘ４、ＡＧ  １−Ｘ８及びＡＧ  ２−Ｘ８（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＢＧ（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌａ  Ｃｙｎｗｙｄ，ＰＡ，ＵＳＡ）、ＰＯＲＯＳ  ＨＱ  ２０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＣＡ０８Ｙ及びＣＡ０８Ｓ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｗｈｉｔｅ  Ｐｌａｉｎｓ，ＮＹ，ＵＳＡ）、Ｐｏｗｄｅｘ  ＰＡＯ（Ｇｒａｖｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＤＥ，ＵＳＡ）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  ＳＢ（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）、ＩＥ  １−Ｘ８（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ−６５０Ｓ（ＴｏｓｏＨａａｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）、ＴＭＡＨＰ−１００（Ｉｏｎｔｏｓｏｒｂ  ＡＶ，  Ｃｚｅｃｈ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）、Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＢＡ（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）及びＡＮＥＸ−ＱＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）などの陰イオン交換樹脂を含み得る。様々な実施形態によれば、コア材料は、ＰＭＭＡ、ＰＳ−ＤＶＢ、シリカ及び／又はセルロースを含み得る。様々な実施形態によれば、イオン交換コアは、Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＡＧ（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）、ＡＧ  ５０ＷＸ８及びＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む陰イオン交換樹脂に関するものと同様の製造者によって提供される陽イオン交換樹脂を含み得る。イオン交換コアとして使用できる他の陽イオン及び陰イオン樹脂は、イオン交換樹脂の当業者には明白である。
【００２８】
イオン交換コアが、イオン交換することができる固体コア材料を含む様々な実施形態によれば、固体コア材料は、マクロ細孔シリカ、細孔性ガラス（ＣＰＧ）、内部細孔を有するマクロ細孔性ポリマーミクロスフェア、イオン交換分離の当業者に公知の他の細孔性材料、又はそれらの組み合わせであり得る。固体コア材料は、例えば細孔、亀裂、間隙、くぼみ、流路、穴、陥凹又は溝を含む、様々な表面特徴を有し得る。固体コア材料は、酸化ナトリウム、二酸化ケイ素、ホウ酸ナトリウム、又はそれらの組み合わせを含み得る。固体コア材料は、イオン交換できるように表面活性化され得、例えば陽イオン交換又は陰イオン交換できるように改変され得る。固体コア材料の改変は、固体コア材料の表面で陽イオン性又は陰イオン性置換基を形成するための固体コア材料の処理を含み得る。本明細書で使用される、「表面」という用語は、外側表面及び／又は内側表面を含み得る。内側表面は、例えば固体コア材料内の空隙又は細孔の表面であり得る。固体コア材料は、固体コア材料の表面で、四級化官能基、カルボン酸基、スルホン酸基、イオン交換分離の当業者に公知の他の陽イオン性又は陰イオン性官能基、又はそれらの組み合わせの１以上を含むように表面活性化され得る。
【００２９】
様々な実施形態によれば、バイオポリマー高分子電解質は、ＤＮＡのような天然に存在する生体高分子であり得る。天然に存在するＤＮＡの例は、断片化したサケ精子ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの制限消化物、ニシン精子ＤＮＡ、仔ウシ胸腺ＤＮＡ、及び他の天然由来のＤＮＡを含む。商業的に購入されるＤＮＡの一例は、断片化サケ精子ＤＮＡ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）である。様々な実施形態によれば、コーティング中の高分子電解質として使用できる天然に存在する生体高分子ＤＮＡは、その供給源が生物学的反応に供された試料ではないことを指示するために非試料ＤＮＡとして区別される。
【００３０】
様々な実施形態によれば、イオン交換コアは、合成ポリマー高分子電解質で被覆することができる。様々な実施形態によれば、イオン交換コアは、水溶性又は少なくともわずかに水溶性の多価陰イオンで被覆できる。様々な実施形態によれば、陰イオン性官能基を含む多価陰イオンはコーティングのために使用することができる。陰イオン性官能基は、カルボン酸基、ホウ酸基、スルホン酸基、スルフィン酸基、リン酸基又はリン基、又はそれらの組み合わせを含み得る。無機酸官能基を含む多価陰イオンも使用できる。様々な実施形態によれば、水溶性又は少なくともわずかに水溶性の多価陰イオンは、水溶性、少なくともわずかに水溶性又は水不溶性のコモノマーと、酸又はフェノール含有モノマー、例えばアクリル酸、メタクリル酸、フェノール基を与えるように加水分解され得る４−アセトキシスチレン、４−スチレンスルホン酸、スチリル酢酸又はマレイン酸無水物との共重合によって作製することができる。様々な実施形態によれば、合成ポリマーは、ホモポリマー、コポリマー、ターポリマー又はもう１つ別のポリマーであり得る。
【００３１】
様々な実施形態によれば、合成ポリマーは、以下を含むモノマーを含み得る：（メト）アクリルアミド、Ｎ−メチル（メチル）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メチル）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メト）アクリルアミド、Ｎ−イソ−プロピル（メト）アクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチル（メト）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）（メチル）アクリルアミド、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルアセトアミド、重合後ビニルアルコールを与えるように加水分解され得るビニルアセテート、２−ヒドロキシエチル（メト）アクリレート、３−ヒドロキシプロピル（メト）アクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、ポリ（エチレンオキシド）（メト）アクリレート、Ｎ−（メト）アクリルオキシスクシンイミド、ポリアネトールスルホネートＮ−（メト）アクリロイルモルホリン、Ｎ−２，２，２−トリフルオロエチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−アセチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−アミド（メト）アクリルアミド、Ｎ−アセトアミド（メト）アクリルアミド、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−（メチル）アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミド、（メチル）アクリロイル尿素、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、又はそれらの組み合わせ。様々な実施形態によれば、合成ポリマー高分子電解質は、ポリ（アクリル酸−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）又はポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−コ−スチレンスルホン酸）であり得る。
【００３２】
様々な実施形態によれば、イオン交換コアは、水溶性又は少なくともわずかに水溶性の多価陽イオンで被覆することができる。様々な実施形態によれば、陽イオン性官能基を含む多価陽イオンはコーティングのために使用できる。陽イオン性官能基は、プロトン化第一級、第二級及び第三級アミンを含み得る。様々な実施形態によれば、水溶性又は少なくともわずかに水溶性の多価陽イオンは、水溶性、少なくともわずかに水溶性又は水不溶性のコモノマーと、正電荷を有するモノマーとの共重合によって作製することができる。多価陽イオンの例は、アリルアミンヒドロクロリド、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド及びアミノ基を与えるように加水分解され得るＮ−ビニルアミドを含み得る。様々な実施形態によれば、合成ポリマーは、ポリ（Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）であり得る。
【００３３】
様々な実施形態によれば、図２ａは、列挙する合成ポリマーについてのモノマーサブユニットを示す。略語は、アクリル酸（ＡＡ）、アクリルアミド（ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、（ポリエチレンオキシド）モノアクリレート（ＰＥＯアクリレート）及びビニルスルホン酸（ＶＳＡ）を含む。様々な実施形態によれば、合成ポリマーの製造は、５０キロダルトンから１５．０メガダルトンまで、又は２００キロダルトンから４．０メガダルトンまで、又は５００キロダルトンから３．０メガダルトンまでの範囲の重量平均分子量（ＭＷ）を提供することができる。様々な実施形態によれば、負電荷又は正電荷を有するコモノマーのモル百分率は、０．０１％〜１００％、又は０．１％〜２０．０％、又は１．０％〜１０．０％を提供し得る。
【００３４】
様々な実施形態によれば、他の合成ポリマーは、スチレンスルホン酸のホモポリマー、アクリル酸、メタクリル酸、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、４−アセトキシスチレン（４−ヒドロキシスチレンの前駆体）及びビニルホスホン酸のホモポリマー及びコポリマーを含み得る。様々な実施形態によれば、他の合成ポリマーは、アリルアミンヒドロクロリド、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリドのホモポリマー及びコポリマーを含み得る。コモノマーは、アクリルアミド、メタクリルアミド、その後の工程でビニルアルコールに変換され得るビニルアセテート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルアセトアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレート及びビニルメチルエーテルを含み得る。
【００３５】
様々な実施形態によれば、高分子電解質は、ポリ（スチレンリン酸）、ポリ（リン酸）、マレイン酸のホモポリマー及びコポリマー、それらの誘導体等、フマル酸のホモポリマー及びコポリマー、それらの誘導体等のような多価陰イオン、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（ガラクトロン酸）、ポリ（グルタミン酸）などのペプチド型合成多価陰イオン、ポリ（アデニル酸）、ポリ（イノシン酸）、ポリ（ウリジル酸）などの核酸型合成多価陰イオン、及び多糖類のような天然多価陰イオンを含み得る。
【００３６】
様々な実施形態によれば、イオン交換コアは、高分子電解質の多層で被覆することができる。高分子電解質層は、多価陰イオンと多価陽イオンの交互の層を含み得る。そのような交互の層は、強度耐久性及びコーティングの透過率を調節するための手段を提供し得る。多層構造体の最も外側の高分子電解質が負に荷電していれば、ＤＮＡフラグメントはその溶液から固定化されない。例えば塩化物及びプライマーのような小さな陰イオンは、多層構造を貫通又は透過してコアに結合することができる。
【００３７】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子は混合物として提供され得る。混合物は床又はカラムに組み込むことができる。様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子はバルク様式で提供され得る。高分子電解質被覆粒子の十分に形成されたクロマトグラフィー床は必ずしも必要ではない。
【００３８】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子は装置中で提供され得る。装置は、１以上の経路を有する微小流動装置であり得、少なくとも１つの経路の少なくとも一部が高分子電解質被覆粒子を含む。装置は、高分子電解質被覆粒子と流体の交通がある入口と出口を有し得る。粒子は、例えばカラムに存在し得る。本明細書で使用されるカラムは、水平又は垂直方向であるか、又は水平と垂直方向の間のいかなる位置でもあり得る。カラムは、空洞、チャンバー、レザーバー、ウエル、反応領域、床、凹所、又は高分子電解質被覆粒子と反応産物とを含む又は保持するのに適した他の容器などの容器を含み得る。カラムは複数の高分子電解質被覆粒子を含み得る。装置の出口は、精製試料ウエル、チューブ、ガラスプレート又は精製試料を収集するための別の手段などの容器と流体の交通があり得る。様々な実施形態によれば、複数の高分子電解質被覆粒子は混合物であり得る。
【００３９】
様々な実施形態によれば、反応産物を分離するために装置が提供され得る。装置は高分子電解質被覆粒子の混合物を含み得る。その方法は、粒子を装置のカラムに添加することを含み得る。反応産物は、装置の入口に置かれるか又は入口へと導入され得る。反応産物は、入口から、高分子電解質被覆粒子と任意の添加材料を含むカラムを通って移動し得る。試料は、反応産物のろ過及び／又は精製を生じさせるサイズ排除分離とイオン交換の組み合わせに供され得る。ろ過及び／又は精製された溶液は、出口を通ってカラムから溶出又は除去され、分析及び／又はさらなるプロセスのために容器へと導かれ得る。反応産物は、求心力によってカラムを通って移動し得る。様々な実施形態によれば、複数の高分子電解質被覆粒子をバルクの反応産物と混合することができる。複数の高分子電解質被覆粒子は第一容積を形成し、反応産物が第二容積を形成し、第一容積は第二容積より小さいか又は等しい。
【００４０】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子を用いる反応産物の分離は、反応産物の少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のイオン交換のような、適切なイオン交換能力を提供するために十分な高分子電解質被覆粒子の容積を使用して達成され得る。分離は１０分以内、５分以内、又は２分以内で起こり得る。分離は、高分子電解質被覆粒子が反応産物とイオン交換するのに十分な期間、反応産物を高分子電解質被覆粒子と接触させること、及び精製反応産物を高分子電解質被覆粒子から除去することを含み得る。
【００４１】
様々な実施形態によれば、精製反応産物を粒子から分離することは、精製反応産物を高分子電解質被覆粒子から除去すること、精製反応産物から粒子を除去すること、及び／又は精製反応産物を粒子と精製反応産物の混合物から採集することを含み得る。精製反応産物を粒子と精製反応産物の混合物から採集することの一例は、キャピラリーを直接試験管内に浸し、さらなる分析のための装置に注入することにより、試験管内の産物を分析することを含み得る。
【００４２】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子のための分離は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の分離、ＤＮＡ塩基配列決定反応混合物の分離、及びＲＮＡの精製を含み得る。高分子電解質被覆粒子はまた、例えばオリゴヌクレオチド、リガーゼ連鎖反応産物、タンパク質、抗体結合反応産物、オリゴヌクレオチド連結反応アッセイ産物、ハイブリダイゼーション産物及び抗体の精製及び／又は分離のために使用できる。高分子電解質被覆粒子はまた、生物学的産物又は反応混合物の脱塩のためにも使用できる。
【００４３】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子の選択性は以下の判定基準の少なくとも１つに依存し得る：（１）コーティング中の高分子電解質の分子量、（２）コーティング中の高分子電解質の荷電官能基の化学的性質及び電荷密度又は電荷のモルパーセント、（３）イオン交換コアの細孔径、（４）コーティングポリマーのコモノマーの性質、及び（５）ポリマー中の様々なコモノマーの比率。各々の分離は、上記判定基準の少なくとも１つに関して種々の望ましい特徴を提供し得る。
【００４４】
様々な実施形態によれば、ＰＣＲ産物は、下流の分析に干渉し得る物質を含む。ＰＣＲ産物は、増幅された標的配列（アンプリコン）、緩衝塩、界面活性剤、金属イオン、酵素（例えばポリメラーゼ）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマー、及び溶液中の他の成分を含み得る。様々な実施形態によれば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の標的配列は、他のＰＣＲ産物の少なくとも一部に感受性であり得るその後の酵素反応において分析又は使用することができる。例えば遊離ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドプライマーは、下流の酵素反応に干渉し得る。様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマー及び緩衝塩をｄｓＤＮＡの標的配列から分離することができる。生じる溶液は、脱塩環境中に精製ＰＣＲ産物を含み得、それは下流の反応及び分析において使用できる。
【００４５】
様々な実施形態によれば、ＰＣＲ精製は、より大きな二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を、より小さなｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ（例えばプライマーダイマー、ｄｓＤＮＡである望ましくない副反応産物又は他の非特異的に増幅されたフラグメント）、遊離ヌクレオチド、及び塩から分離することを対象とし得る。様々な実施形態によれば、除去のためのＰＣＲ産物は、ヌクレオチド、ｓｓＤＮＡの４５ヌクレオチドを有するプライマー、ｄｓＤＮＡの６０ｂｐを有するプライマーダイマー、及び２００ｂｐより小さいｄｓＤＮＡフラグメントを含む。様々な実施形態によれば、プライマー、プライマーダイマー及び１００ｂｐより小さいＤＮＡフラグメントを高分子電解質被覆粒子によって捕獲することができる。様々な実施形態によれば、プライマー、プライマーダイマー及び３００ｂｐより小さいＤＮＡフラグメントを高分子電解質被覆粒子によって捕獲することができる。
【００４６】
様々な実施形態によれば、他のＰＣＲ産物からのより大きなｄｓＤＮＡの分離は、脱塩を含み得る。様々な実施形態によれば、他のＰＣＲ産物からのより大きなｄｓＤＮＡの分離は、脱塩を含まない。脱塩が、より大きなｄｓＤＮＡ  ＰＣＲ産物の分離及び検出などの下流のプロセスに干渉し得る状況が存在する。
【００４７】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子は、ＰＣＲの終結及び精製の前のＰＣＲ反応物と同じＰＣＲ条件に供することができる。高分子電解質被覆粒子は、６５〜９５℃の温度サイクリングに供することができる。高分子電解質被覆粒子は、ＰＣＲ及びその後の精製を提供する装置に組み込むことができる。
【００４８】
様々な実施形態によれば、１００オングストローム〜２０００オングストロームの範囲の細孔径を有し、１．０メガダルトン〜３．０メガダルトンの範囲のＭＷの高分子電解質で被覆されたイオン交換コアは、ＰＣＲ精製を提供する。様々な実施形態によれば、１０００オングストロームの細孔径を有し、１．７メガダルトン〜２．６メガダルトンのＭＷの高分子電解質で被覆されたイオン交換コアは、ＰＣＲ精製を提供する。
【００４９】
様々な実施形態によれば、ＤＮＡ塩基配列決定反応産物は、下流の分析に干渉し得る物質を含み得る。精製された配列決定反応産物の分離の質は、以下の判定基準の少なくとも１つを分析することによって評価できる：（１）配列データの上に重なる広いピークとして現われる残留色素アーティファクト（「ブロブ（ｂｌｏｂ）」）、（２）大型又は小型フラグメントの間のピーク強度の均衡、及び（３）配列決定反応産物の脱塩。
【００５０】
様々な実施形態によれば、ＤＮＡ塩基配列決定反応産物は、色素標識標的配列（「配列決定ラダー」）、緩衝塩、リン酸及びピロリン酸イオン、金属イオン、酵素（例えばポリメラーゼ）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマー、色素標識オリゴヌクレオチドプライマー、及び残留する、組み込まれなかった色素標識ジデオキシヌクレオチド（「色素ターミネーター」）などの他の成分を含み得る。様々な実施形態によれば、色素標識標的配列は、ＤＮＡ塩基配列決定（「ベースコーリング」）において誤差を引き起こし得る「ブロブ」を生じさせる他の配列決定反応産物の少なくとも一部に感受性であり得る電気泳動分析及び「ベースコーリング」に供することができる。様々な実施形態によれば、キャピラリーシーケンサーは、配列決定反応産物を電気泳動分離のためのキャピラリーに導入するために界面動電注入を使用することができる。配列決定反応産物中の塩の存在はキャピラリーへの導入に影響を及ぼすことがあり、塩濃度の低下はキャピラリーへの注入を増強し得る。
【００５１】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子は、配列決定反応産物から「ブロブ」を生じる物質を除去し、配列決定反応産物を脱塩することができる。様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆粒子で精製された配列決定反応産物は、１００μＭに等しい又はそれ以下、又は５０μＭに等しい又はそれ以下の塩濃度を有し得る。高分子電解質被覆粒子によって精製された試料溶液は、界面動電キャピラリー注入に適し得る。これらや他の目的のために、高分子電解質被覆粒子は、例えば１０ヌクレオチドｓｓＤＮＡ未満のサイズ排除限界を有することができ、溶液中にｓｓＤＮＡを遊離させたまま、試料溶液から塩及び色素標識プライマーなどの小さなイオンを除去することができる。高分子電解質被覆粒子を用いた配列決定反応物精製は、例えば１０ヌクレオチド〜１５００ヌクレオチド以上の大きさを有するｓｓＤＮＡを、例えば色素標識プライマー及び塩などのより小さな成分から分離するために使用できる。
【００５２】
様々な実施形態によれば、ＤＮＡ配列決定反応産物の分離は、４５ヌクレオチドより長い色素標識ｓｓＤＮＡフラグメントを実質的に排除することによって色素標識ｓｓＤＮＡ標的からプライマー、色素標識プライマー及び塩を分離することを含み得る。
【００５３】
様々な実施形態によれば、配列決定反応物試料の精製は、色素標識ジデオキシヌクレオチド及び塩を、コーティングを通過させ、イオン交換コアと反応させることによって配列決定反応産物から除去することができ、事前にろ過した量に比べて７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上の量のｓｓＤＮＡの量を含む精製試料を残す。
【００５４】
様々な実施形態によれば、５オングストローム〜１０００オングストロームの範囲の細孔径を有し、１０００ダルトン〜６．０メガダルトンの範囲のＭＷの高分子電解質で被覆されたイオン交換コアは、配列決定反応物精製を提供する。様々な実施形態によれば、１０オングストローム〜５０オングストロームの細孔径を有し、２．４メガダルトン〜４．９メガダルトンのＭＷの高分子電解質で被覆されたイオン交換コアは、配列決定反応物精製を提供する。
【００５５】
様々な実施形態によれば、ＤＮＡ塩基配列決定反応産物を精製するための方法は、複数の高分子電解質被覆粒子を提供すること、及び色素標識ｓｓＤＮＡフラグメントを分離するためにＤＮＡ塩基配列決定反応産物に接触させることを含み得る。前記方法は、配列決定分析においてブロブを生じさせ得る色素標識プライマーなどの残留色素アーティファクトを除去することを含み得る。前記方法は、色素標識ｓｓＤＮＡフラグメントの長さを維持することを含み得る。
【実施例】
【００５６】
生体高分子による粒子の被覆：
イオン交換樹脂を、樹脂１００μＬ容量を１Ｍ塩、酸又は塩基溶液１０００μＬで洗浄することによってイオン交換体に変換した。混合物を５分間ボルテックスし、遠心分離機で沈殿させた。上清を取り、塩、酸又は塩基溶液の別の１０００μＬアリコートを添加した。これを３回反復した。次にイオン交換コアを、ＤＩ水の１０００μＬアリコートを用いて５回洗浄し、遠心した。
【００５７】
イオン交換コアを、１ｍｇ／ｍＬ断片化サケ精子ＤＮＡ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１００μＬアリコートで反復洗浄することによってＤＮＡで被覆した。被覆は、樹脂１００μＬ容量を１ｍｇ／ｍＬ断片化サケ精子ＤＮＡ  １００μＬで洗浄することによって実施した。混合物を５分間ボルテックスし、遠心分離機で沈殿させた。上清を取り、１ｍｇ／ｍＬ断片化サケ精子ＤＮＡの別の１００μＬアリコートを添加した。これを２回反復した。次にＳＥＩＥ粒子を、ＤＩ水の１０００μＬアリコートを用いて３回洗浄し、遠心した。
【００５８】
合成ポリマーによる粒子の被覆：
粒子を被覆するためのポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）高分子電解質を、過硫酸アンモニウムを開始剤として、及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを触媒として使用して、４５℃で１５時間、アクリル酸０．３２ｇ（４．４４ｍｍｏｌ）とＤＩ水２００ｍＬ中のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド８．０４ｇ（８１．０７ｍｍｏｌ）のフリーラジカル重合によって提供した。生じたポリマーを透析（５０Ｋ  ＭＷＣＯ）及び凍結乾燥によって精製して、ポリマー７．７０ｇ（９２％収率）を得た；ＭＷ＝３．４０ＭＤａ、Ｍｎ＝２．６７ＭＤａ。
【００５９】
被覆の前に、陰イオン交換樹脂を、先の実施例と同じようにして最初に水酸化物陰イオン交換コアに変換した。ＤＩ水の１０００μＬアリコートを、塩化物形態の陰イオン交換コア０．２０〜０．２５ｍＬ容量に添加した。混合物を２分間ボルテックスし、遠心分離機で沈殿させた。上清を取り、このＤＩ水洗浄を２回反復した。２．０Ｍ水酸化アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）の１０００μＬアリコートを洗浄した樹脂に添加した。混合物を２分間ボルテックスし、周囲温度で５分間放置して、１分間ボルテックスし、遠心分離機で沈殿させた。上清を取り、この水酸化アンモニウム洗浄を２回反復した。ＤＩ水の１０００μＬアリコートをイオン交換粒子のペレットに添加し、１分間ボルテックスして、遠心分離機で沈殿させ、上清を除去した。この最終的なＤＩ水洗浄をもう一度反復した。樹脂を、スナップキャップポリプロピレンマイクロ遠心チューブにおいてＤＩ水５００μＬに再分散し、使用まで冷蔵庫で保存した。
【００６０】
湿潤陰イオン交換樹脂１５〜２０μＬを含む１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに、ポリマー溶液（脱イオン水中０．５重量％溶液）１．０ｍＬを添加した。それを１分間ボルテックスし、周囲温度で５分間放置して、さらに１分間ボルテックスし、遠心分離機で沈殿させて、上清を除去した。ポリマー溶液被覆をもう一度反復した。次にペレットをＤＩ水１ｍＬで３回洗浄し、遠心分離機で沈殿させた。この最終洗浄樹脂をＤＩ水５００μＬに再分散し、使用まで冷蔵庫で保存した。
【００６１】
あるいは、粒子を被覆するためのポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）高分子電解質を、不活性雰囲気（超純粋窒素）下での重合によって提供した。２”Ｔｅｆｌｏｎ攪拌刃、パージのためのガラス製ブリードチューブ及び水冷凝縮器を備えた５００ｍＬ丸底三つ口フラスコに、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水１５０．０ｍＬ、再蒸留したＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（Ｄａｊａｃ）８．０１６０ｇ（８０．８６ｍｍｏｌ）、再蒸留したアクリル酸（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）０．３２８５ｇ（４．５６ｍｍｏｌ）及び過硫酸アンモニウムの１．９９７２重量％水溶液０．８０４３ｇを入れた。この混合物を、２００ｒｐｍの一定速度で攪拌しながら、１５０ｍＬ／分の超純粋窒素で６０分間パージした。パージした溶液に、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌからの電気泳動試薬）８０μＬを添加した。混合物を５０±１℃の油浴に入れ、２００ｒｐｍで３時間半攪拌した。反応時間の終了時に、ＤＩ水５０ｍＬを添加し、５分間攪拌した。生じた無色透明の溶液を、ＤＩ水５ガロン中５０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ膜で４日間透析し、２４時間ごとに２回水を交換した。透析した溶液を凍結乾燥して、コポリマー７．７０ｇ（９２．０％収率）を得た。ＧＰＣ／ＭＡＬＬＳにより、分子量は２．４ＭＤａ  Ｍｗ及び１．２６ＭＤａ  Ｍｎと決定された。
【００６２】
生体高分子を含む高分子電解質被覆粒子によりＤＮＡ塩基配列決定反応物精製：
ＤＮＡ塩基配列決定反応物精製のために、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）４００μＬ、Ｍ１３ユニバーサル逆方向プライマー（３．２ｐｍｏｌ／μＬ）５０μＬ、鋳型アンプリコン（約１００ｎｇ／μＬ）２５μＬ、及びＤＩ水５２５μＬを含む試料を調製した。この溶液を、２０μＬ／穴の容量でサーマルサイクラープレートの穴に等しく分配した。混合物を２５サイクルの加熱に供し、各々のサイクルは、９５℃で１０秒間の加熱、５０℃で５秒間の加熱、及び６０℃で１２０秒間の加熱を含んだ。
【００６３】
生体高分子を含む高分子電解質被覆粒子を提供するため、Ａｍｉｎｅｘ  Ａ−２７、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ  １−Ｘ８及びＢｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ  ２−Ｘ８の各々１００μＬを、上述したように水酸化物高分子電解質被覆粒子として調製した。樹脂を、上述したように１ｍｇ／ｍＬ断片化サケ精子ＤＮＡで被覆し、ＤＩ水で洗浄した。被覆した陰イオン交換粒子各々１００μＬを、上述したように水素型（ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｆｏｒｍ）高分子電解質被覆粒子として作製した、Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＡＧ  １００μＬと混合して、混合型イオン交換床を形成した。混床を、上述したように１ｍｇ／ｍＬ断片化サケ精子ＤＮＡで洗浄し、ＤＩ水で洗浄した。被覆した混床の各々２μＬを、小さなＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）チューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）に添加した。被覆していないＡｍｉｎｅｘ  Ａ−２７及びＣｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＡＧから作製した混床を対照として調製した。
【００６４】
精製を実施するため、上述した配列決定反応物１μＬを、ＤＮＡ被覆混床イオン交換樹脂２μＬを含む各々のＭｉｃｒｏＡｍｐチューブに添加した。チューブを５分間ボルテックスした後、ＤＩ水５μＬを各々のチューブに添加し、ピペットで混合した。マイクロ遠心チューブを５０００×ｇで遠心し、上清５μＬを各々のチューブから取り、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００シーケンサーでの分析のために９６穴プレートにピペットで入れた。試料を、３６ｃｍアレイ、ＰＯＰ６（登録商標）ポリマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び標準配列決定モジュールを使用してＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００で分析した。
【００６５】
図３ａ〜３ｄは、この精製からの結果を示す。図３ａ〜３ｃは、生体高分子−高分子電解質被覆粒子が望ましい精製を提供したことを示す（図３ａはＤＮＡ被覆Ａｍｉｎｅｘ  Ａ−２７を示し、図３ｂはＤＮＡ被覆Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ１−Ｘ８を示し、及び図３ｃはＤＮＡ被覆Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ２−Ｘ８を示し、３つ全部が陽イオン−陰イオン混床である）。例えば色素ブロブ（残留色素標識ｄｄＮＴＰ）の実質的な除去及び比較的高いシグナル強度は、試料の望ましい脱塩を示した。これに対し、図３ｄは、非被覆混床（Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＡＧと混合したＡｍｉｎｅｘ  Ａ−２）が望ましい精製を提供しなかったことを示す。非被覆陰イオン交換樹脂での精製から予想されるようにＤＮＡフラグメントの大部分の損失が認められた。
【００６６】
生体高分子を含む高分子電解質被覆粒子によるＰＣＲ反応物精製：
ＰＣＲ反応物精製を明らかにするため、ＰＣＲ産物を蛍光キャピラリーシーケンサーで分析できるように蛍光標識プライマーを用いて試料を作製した。ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）１０２μＬ、ＦＡＭ標識正方向プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）４μＬ、逆方向プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）４μＬ、ヒトｇＤＮＡ  ２０μＬ、ＣＥＰＨ  １３４７−０２（５０μｇ／μＬ）、及び脱イオン水（ＤＩ）７０μＬを含む溶液を調製した。この溶液を２０μＬ／穴の容量でサーマルサイクラープレートの穴に等しく分配した。混合物を９６℃で５分間加熱し、その後４０サイクルの加熱に供した。各々のサイクルは９６℃で３０秒間、次に６０℃で１２０秒間の加熱を含んだ。
【００６７】
先の実施例と同様に、生体高分子で被覆した粒子を提供した。精製を実施するため、上述した溶液１μＬを、ＤＮＡ被覆混床イオン交換樹脂２μＬを含むＭｉｃｒｏＡｍｐチューブに添加した。チューブを５分間ボルテックスした後、ＤＩ水５μＬをチューブに添加し、ピペットで混合した。このマイクロ遠心チューブを５０００×ｇで遠心し、上清５μＬを取って、脱イオンホルムアミド５μＬに添加し、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００シーケンサーでの分析のために９６穴プレートにピペットで入れた。試料を、３６ｃｍアレイ、ＰＯＰ６（登録商標）キャピラリー電気泳動ポリマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び標準フラグメント分析モジュールを使用してＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００で分析した。
【００６８】
図４及び５は、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）ソフトウエアを用いて分析したこの精製からの結果を示す。実験は、二本鎖ＤＮＡアンプリコンを保持しながら、５５０ｂｐのＰＣＲ産物からの色素標識プライマーの大部分の除去を観察するために設計された。図４ａは、精製前のＰＣＲ反応溶液を示す。図４ｂは、高分子電解質被覆粒子によって精製され、脱塩されたＰＣＲ反応溶液を示す。図４ａは、プライマーによって生成された、３３０と表示される４０００〜５０００走査（ｓｃａｎ）からのピークを示し、一方３２０と表示される、１５，５００走査でのピークは５５０ｂｐアンプリコンによって生成された。ＰＣＲプライマーの存在は、しばしばＰＣＲ産物のその後の分析又はその後の反応に干渉し得る。ＰＣＲ産物からのプライマーの除去は望ましいと考えられる。図４ｂは、ＰＣＲ産物を、生体高分子を含む高分子電解質被覆粒子を用いて先の項で述べたように精製したときに生じるデータを示す。３２０と表示される５５０ｂｐアンプリコンはまだ可視であるが、プライマーは検出可能量未満に低減した。
【００６９】
図５ａ及び５ｂは、３３０と表示される、ＰＣＲプライマーの領域に焦点を合わせた、図４ａ及び４ｂに示す電気泳動図の領域の拡大図である。精製工程後、但しＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００での分析に先立って、内部標準物質を注入溶液に添加した。内部標準物質である２０ｎＭ濃度の合成ＲＯＸ標識オリゴヌクレオチドは、２つの溶液からの相対注入効率を測定するために使用した。内部標準物質は両方の電気泳動図において認められ、３４０と表示されている。図５は、２つの溶液からの注入効率が同様であることを示す。ピーク高を正規化するために内部標準物質を使用して、プライマーの減少は１００％であり、一方ＰＣＲ産物の損失は２２％である。この実施例は、高分子電解質被覆粒子との接触が、溶液中のＰＣＲ産物の７８％を残しながら、ＰＣＲ溶液からプライマーを実質的に減少させ得ることを示す。同じ溶液の非被覆イオン交換ビーズとの接触は、プライマーの大部分の損失並びに全てのＰＣＲ産物の損失を生じさせた（図示せず）。
【００７０】
合成ポリマーを含む高分子電解質被覆粒子によるＤＮＡ塩基配列決定反応物精製：
ＤＮＡ塩基配列決定反応物精製のために、配列決定反応産物を蛍光キャピラリーシーケンサーで分析できるように蛍光標識プライマーを用いて試料を作製した。ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）４００μＬ、Ｍ１３ユニバーサル逆方向プライマー（３．２ｐｍｏｌ／μＬ）５０μＬ、鋳型アンプリコン（約１００ｎｇ／μＬ）２５μＬ、及びＤＩ水５２５μＬを含む溶液を調製した。このマスター溶液を、２０μＬ／穴の容量でサーマルサイクラープレートの穴に等しく分配した。混合物を２５サイクルの加熱に供し、各々のサイクルは、９５℃で１０秒間の加熱、５０℃で５秒間の加熱、及び６０℃で１２０秒間の加熱を含んだ。
【００７１】
合成ポリマーで被覆した高分子電解質被覆粒子を提供するため、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑイオン交換樹脂２０μＬを、ここで述べるように水酸化物型高分子電解質被覆粒子として調製した。樹脂を、ここで述べるように、以下ポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡと称する、ポリ（アクリル酸−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）で被覆し、ＤＩ水で洗浄した。ポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）被覆したＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ  ２０μＬをＣｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＡＧ（ここで述べるように、水素型高分子電解質被覆粒子として）２０μＬと混合した。イオン交換粒子混合物５μＬを小さなＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）チューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）に添加した。
【００７２】
精製を提供するため、上述した配列決定反応物１μＬを、ＤＮＡ被覆混床イオン交換樹脂５μＬを含むＭｉｃｒｏＡｍｐチューブに添加した。チューブを５分間ボルテックスした後、ＤＩ水５μＬをチューブに添加し、ピペットで混合した。マイクロ遠心チューブを５０００×ｇで遠心し、上清５μＬを取って、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００シーケンサーでの分析のために９６穴プレートにピペットで入れた。試料を、３６ｃｍアレイ、ＰＯＰ６（登録商標）ポリマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び標準配列決定モジュールを使用してＡＢＩ  ３１００で分析した。
【００７３】
図６は、この精製からの結果を示す。図６は、合成ポリマー−高分子電解質被覆粒子が望ましい精製を提供したことを示す。例えばポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）高分子電解質被覆粒子は、色素ブロブ（残留色素標識ｄｄＮＴＰ）の実質的な除去及び比較的高いシグナル強度を提供し、試料の望ましい脱塩を示した。
【００７４】
他のｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ配列決定反応産物を高分子電解質被覆粒子によって精製した。図７ａは、ここで述べるように作製した、ポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）で被覆したＢｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ１−Ｘ８イオン交換樹脂による配列決定反応産物の精製を示す。図７ｂは、ここで述べるように作製した、ポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）で被覆したＡｍｉｎｅｘ  Ａ−２７イオン交換樹脂による配列決定反応産物の精製を示す。高分子電解質被覆粒子は、色素ブロブ（残留色素標識ｄｄＮＴＰ）の実質的な除去及び比較的高いシグナル強度を提供し、試料の望ましい脱塩を示した。Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ、Ｉｓｏｌｕｔｅ、Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＢＧ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ−Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉ−Ｑ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ  ２−Ｘ８、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ  １−Ｘ８、  Ａｍｉｎｅｘ  Ａ−２７、Ｐｏｗｄｅｘ−ＰＡＯを含む他のイオン交換樹脂を、配列決定反応産物精製に関して、ポリ（ＡＡ）、ポリ（ＡＡ−コ−ＡＡｍ）、ポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）、ポリ（ＡＡ−コ−ＰＥＯアクリレート）、ポリ（スチレンスルホン酸）、ポリ（スチレンスルホン酸−コ−ＤＭＡ）、及びポリ（ＡＡ−ＰＥＯアクリレート−ＶＳＡ）を含む様々な合成ポリマー高分子電解質で試験した。
【００７５】
図８は、ポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）で被覆した高分子電解質被覆粒子によって精製した配列決定反応産物の精製を示す。配列決定反応産物を、第一カラムと第二カラムの両方について電気泳動図の下から上へと増大する種々の分子量のポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）で精製した。高分子電解質被覆粒子のサイズ識別（ｓｉｚｉｎｇ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）を、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）５００  ＲＯＸ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に基づくアッセイを用いて評価した。サイズ標準は、３５ｂｐから５００ｂｐまでのサイズ範囲の１６個のｄｓＤＮＡフラグメントから成る。ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）５００  ＲＯＸ試薬５μＬを高分子電解質被覆粒子５μＬに添加することによってアッセイを実施した。混合物を５分間攪拌又はボルテックスし、液体を高分子電解質被覆粒子から分離する。液体からの高分子電解質被覆粒子の分離は、混合物を遠心分離し、上清をピペットで取ることによって、又は混合物のろ過によって実施した。生じた液体を、次に、ＤＮＡシーケンサーを用いて分析した。そのようなアッセイの結果を図８に示す。図８の第一カラムは、１０オングストローム〜１５オングストロームの細孔径を有する被覆樹脂による分離後の電気泳動図を示す。第二カラムは、１０００オングストロームの細孔径の被覆樹脂による分離後の電気泳動図を示す。電気泳動図において初期に認められる最大ピークはプライマーピークであり、２５ヌクレオチドのフラグメントを示す。図８の第一カラムの電気泳動図は、いずれの分子量のコーティングに関しても小さなフラグメントが除去されていないことを示し、これらの電気泳動図は未処理対照と同様である。図８の第二カラムの電気泳動図は、低分子量コーティングによる分離後の初期ピーク（より小さなフラグメント）の排除を示す。これらのデータは、図８の第二カラムにおける高分子電解質被覆粒子についてのサイズカットオフが１００ｂｐであり、一方図８の第一カラムにおける高分子電解質被覆粒子についてのサイズカットオフが３５ｂｐ未満であることを明らかにする。図８は、配列決定反応産物の精製のための高分子電解質被覆粒子による分離に関するサイズカットオフを示す。
【００７６】
図９ａ及び９ｂは、ポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）で被覆した、Ｐｏｗｄｅｘ−ＰＡＯイオン交換樹脂を含む高分子電解質被覆粒子によって精製した配列決定反応産物の精製を示す。図９ａは精製の前に実施した電気泳動図を示し、図９ｂは精製後に実施した電気泳動図を示す。高分子電解質被覆粒子は、図９ａに表示したように配列決定反応産物からＬＩＺ（登録商標）色素ｄＴＤＰ（２ＰＰ）及びＬＩＺ（登録商標）色素ｄＴＴＰ（３ＰＰ）を除去した。高分子電解質被覆粒子は、配列決定反応産物から他の陰イオンを除去し、配列決定反応産物の動電注入を改善して、シグナル強度の１０倍の上昇を生じさせた。
【００７７】
合成ポリマーを含む高分子電解質被覆粒子によるＰＣＲ反応物精製：
ＰＣＲ反応産物精製を、合成ポリマーを含む高分子電解質被覆粒子によって提供した。Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＨＱイオン交換樹脂をポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）で被覆した。図１０は、アクリル酸の様々なモル百分率及びポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）の分子量を示す。分子量及びモル百分率は下から上へと上昇し、一番下の電気泳動図は１．１モル％アクリル酸及び９８．９モル％ＤＭＡで被覆した樹脂による分離を示し、一番上の電気泳動図は１００モル％のアクリル酸又はＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）を含まないポリ（ＡＡ）で被覆した樹脂による分離を示す。１００％アクリル酸を含む高分子電解質被覆粒子は、プライマー、プライマーダイマー及び全てのＤＮＡフラグメントを除去した。同じ現象が、低いアクリル酸含量、すなわち１．１モル％アクリル酸を含むポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）に関して認められた。図１１は、上述した範囲のポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）で被覆した非脱塩Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ５０ＨＱ（塩化物形態）イオン交換樹脂によるオリゴヌクレオチドプライマー、プライマーダイマー及びＤＮＡフラグメントの除去を示す。図１１のレーン１にはサイズ標準を負荷し、レーン２には生（高分子電解質被覆イオン交換粒子による分離なし）ＰＣＲ産物１μＬとプライマー２０μＭを負荷し、レーン３〜７には高分子電解質被覆イオン交換粒子による分離後のＰＣＲ産物１μＬを負荷し、レーン８〜１２には高分子電解質被覆イオン交換粒子による分離後のＰＣＲ産物２μＬを負荷した。レーン２は、主バンドの下に拡散したバンドとしてプライマー、プライマーダイマー等のような分離されていないＰＣＲ産物を示す。レーン３〜１２はそのような対応するバンドを有さない。図１２は、上述した範囲のポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）で被覆した非脱塩Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ５０ＨＱ（塩化物形態）イオン交換樹脂による、ＰＣＲ産物からのプライマーダイマー及び非特異的増幅ｄｓＤＮＡのサイズに基づく除去を示す。上方の電気泳動図は、高分子電解質被覆イオン交換粒子で分離していないＰＣＲ産物を示す。下方の電気泳動図は、高分子電解質被覆イオン交換粒子で分離したＰＣＲ産物を示す。その相違は、１００ｂｐより小さいｄｓＤＮＡフラグメントが、高分子電解質被覆イオン交換粒子による分離後に溶液中に残存するより大きなフラグメントから分離されたことを示す。
【００７８】
合成ポリマー及び界面活性剤を含む高分子電解質被覆粒子によるＤＮＡ塩基配列決定反応物精製：
サイズに基づく精製方法を用いた精製の前に、界面活性剤をＤＮＡ塩基配列決定反応物に添加することができる。例えばサイズ排除スピンカラムを用いたＤＮＡ塩基配列決定反応物の精製の前に、精製を助けるためにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加することができる。さらに、サイズ排除スピンカラムを用いた精製の前に、ＳＤＳを含むＤＮＡ塩基配列決定反応物を加熱することができる。様々な実施形態では、高分子電解質被覆イオン交換粒子によって精製したＤＮＡ塩基配列決定反応物における陰イオン性界面活性剤を非イオン性界面活性剤で置換することができる。そのような置換は、高分子電解質被覆イオン交換粒子のイオン交換能力への有害作用を回避するために陰イオン性界面活性剤とイオン交換粒子の間の相互作用を防ぐことができる。本明細書で使用される「非イオン性」界面活性剤という用語は、非イオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、又は溶液の伝導率に実質的に寄与しない他の界面活性剤を指す。非イオン性界面活性剤の例は、Ｂｒｉｊ  ３５及びＢｒｉｊ  ５８（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、オクチル−β−Ｄ−グルコシド、オクチルグルコピラノシド及び（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）（「ＣＨＡＰＳ」）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を含む。様々な実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ＤＮＡ塩基配列決定反応物からの組み込まれなかった色素ターミネーターの除去を促進するために、加熱せずに有効であり得る。
【００７９】
ＤＮＡ塩基配列決定反応物精製のために、配列決定反応産物を蛍光キャピラリーシーケンサーで分析できるように蛍光標識ジデオキシヌクレオチドターミネーターを用いて試料を作製した。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（登録商標）バージョン３．１  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）８μＬを用いて２０μＬを含む溶液を調製した。配列決定プライマーは、Ｍ１３ユニバーサル逆方向プライマー（３．２ｐｍｏｌ／μＬ）であった。鋳型は、プラスミド、ｐＧＥＭ（２００ｎｇ／μＬ）であった。このマスター溶液をＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００サーマルサイクラープレートの穴に等しく分配した。混合物を２５サイクルの加熱に供し、各々のサイクルは、９６℃で１０秒間の加熱、５０℃で５秒間の加熱、及び６０℃で２４０秒間の加熱を含んだ。
【００８０】
プール後、プールした未精製反応混合物１０μＬを、精製のために新たな９６穴ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）トレーの１６穴の各々に再分配した。各々の穴は、反応混合物１０μＬ、脱イオン水２０μＬ、界面活性剤１０μＬ、及び上述したように作製したＡＧ５０ＷＸ−８との混床中にポリ（スチレンスルホン酸）被覆ＡＧ１Ｘ−８を含む高分子電解質被覆イオン交換粒子スラリー１０μＬを含んだ。混合物の最終容量は、高分子電解質被覆イオン交換スラリーが５０％水であったので、４５μＬであった。これらの実施例では、２つの異なる界面活性剤溶液を使用した：（１）３容量％のＢｒｉｊ  ３５水溶液１０μＬ、溶液全体中のＢｒｉｊ  ３５の最終濃度は０．６７％であった；及び（２）１０容量％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００水溶液１０μＬ、溶液全体中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の最終濃度は２．２％であった。界面活性剤の各々についての対照は、界面活性剤を水１０μＬで置き換えた。様々な実施形態では、界面活性剤は０．０１％〜１０％の範囲の濃度で有効であり得る。様々な実施形態では、界面活性剤は０．１％〜５％の範囲の濃度で有効であり得る。
【００８１】
次に、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）トレー中の試料を接着フィルムで覆い、ボルテクサーで３０分間混合した。混合後、試料を含むＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）トレーを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）トレーを、ＤＮＡ塩基配列決定のためにＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒに移した。ＤＮＡ塩基配列決定は、５０ｃｍキャピラリーアレイ及びＰＯＰ−６（登録商標）キャピラリー電気泳動ポリマーで実施する。注入条件は、以下で述べるように試料とビーズを含むチューブ内の上清から直接２２秒で１０００Ｖであった。図１５Ａ及び１５Ｂは、それぞれＢｒｉｊ  ３５界面活性剤を含む場合と含まない場合のＤＮＡ塩基配列決定精製を示す。Ｂｒｉｊ  ３５界面活性剤なしで精製した図１５Ａでは、例えば配列の１５〜６０ヌクレオチドの領域内に、色素アーティファクトが出現した。Ｂｒｉｊ  ３５界面活性剤を用いて精製した図１５Ｂでは、同じ領域内に色素アーティファクトは出現しなかった。図１６Ａ及び１６Ｂは、それぞれＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤を含む場合と含まない場合のＤＮＡ塩基配列決定精製を示す。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤なしで精製した図１６Ａでは、例えば配列の１５〜６０ヌクレオチドの領域内に、色素アーティファクトが出現した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤を用いて精製した図１６Ｂでは、同じ領域内に色素アーティファクトは出現しなかった。どちらの場合にも、界面活性剤は、加熱を伴わず、かつ直接動電注入又は高分子電解質被覆イオン交換粒子精製に干渉することなく、色素アーティファクトの除去を促進することができた。
【００８２】
複数の合成ポリマー層による粒子の被覆：
ポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）高分子電解質を上述したように作製した。ポリ（アリルアミンヒドロクロリド）又は「ＰＡＨ」、ＭＷ  ０．０７ＭＤａ及びポリ（アクリル酸）又は「ＰＡＡ」、ＭＷ  ４．００ＭＤａ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）は容易に入手可能であった。適切な量のポリマーを脱イオン水に添加することによって以下の高分子電解質溶液（０．５重量％）を調製し、周囲温度で一晩回転攪拌した：ポリ（ＡＡ−コ−ＤＭＡ）０．２２８６ｇ／３９．９１５ｇ  Ｈ２Ｏ；ＰＡＨ  ０．２２６８ｇ／４０．０３３ｇ  Ｈ２Ｏ；ＰＡＡ  ０．１１９２ｇ／１９．９９ｇ  Ｈ２Ｏ。
【００８３】
被覆の前に、陰イオン交換樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ  ５０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を脱イオン水で３回洗浄した。樹脂のスラリー溶液（３ｍＬ、湿潤樹脂０．３５ｇ）及び脱イオン水２０ｍＬを５０ｍＬチューブに添加した。樹脂を被覆するため、高分子電解質溶液（０．７５０ｍＬ）を添加した。チューブを１分間ボルテックスし、１７６０ｒｐｍで３分間遠心して、上清をデカントで捨てた。湿潤樹脂を高真空オーブン下に７０℃で２時間乾燥した。この被覆工程をさらに２回反復し、その後高分子電解質溶液を３つの高分子電解質コーティング層全体に適用した。最後の乾燥工程のために、コーティングを一晩乾燥した。乾燥したペレットを、脱イオン水４０ｍＬと共にボルテックスすることによって混合し、１６７０ｒｐｍで３回遠心して、上清を取った。最終洗浄した樹脂を脱イオン水１０ｍＬ中に再分散し、使用まで冷蔵庫で保存した。図１３は、実施例の１つにおいて樹脂に適用した複数の高分子電解質コーティングを示す。図１４は、より少数の塩基対（ｂｐ）の除去を示すことによる、非被覆樹脂、被覆樹脂、及びイオン交換樹脂への３つの順番での複数の高分子電解質コーティングのいくつかの試行の成績を示す。３つの順番での高分子電解質は以下の表１に示されており、第一層が樹脂の表面に最も近く、その後の層はそれに続く。
【００８４】
【表１】
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高分子電解質被覆樹脂の磁化：
ＰＡＡ  ＭＷ  ４．００ＭＤａ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及びＦｅ３Ｏ４（ＥＭＧ  １１１１）（Ｆｅｒｒｏｔｅｃ  Ｃｏｒｐ．）は容易に入手可能であった。ＰＰＡの溶液（０．７５０ｍＬ）を樹脂（湿潤樹脂０．２ｇ）のスラリー溶液及び脱イオン水１０ｍＬに添加した。混合物を１分間ボルテックスし、周囲温度で５分間インキュベートして、１７６０ｒｐｍで３分間遠心し、上清をデカントで捨てた。樹脂を脱イオン水（１０ｍＬ）で１回洗浄した。懸濁液を１７６０ｒｐｍで３分間遠心し、水をデカントで捨てた。脱イオン水によるＦｅ３Ｏ４（０．２０ｍＬ）の水溶液を湿潤樹脂に添加した。懸濁液をボルテックスによって１分間混合し、周囲温度で５分間インキュベートした。懸濁液を１６７０ｒｐｍで３分間遠心し、水溶液を取った。過剰の非結合Ｆｅ３Ｏ４を除去するために樹脂を３回洗浄した。被覆した樹脂を脱イオン水（１０ｍＬ）に再分散した。樹脂の磁化を認めた。
【００８５】
高分子電解質被覆イオン交換粒子の分離：
上記に提供した反応及び／又は実施例の各々のカテゴリー内で、数多くの特殊な適用が存在する。例えばＰＣＲ反応の高分子電解質被覆イオン交換粒子は、配列検出適用（エンドポイント及びリアルタイムの両方）、ＰＣＲクローニング適用等のための精製を提供することができ、ＤＮＡ塩基配列決定反応の高分子電解質被覆イオン交換粒子は、あらゆる種類の核酸配列決定、例えば配列決定、フラグメント分析、一ヌクレオチド多型特定等のための精製を提供することができる。
【００８６】
核酸を配列決定する前に、精製された上清液から高分子電解質被覆イオン交換粒子を分離することが望ましい場合がある。配列決定は、例えばキャピラリー電気泳動によって達成することができる。高分子電解質被覆イオン交換粒子から精製された上清液を単離することは、精製と配列決定の間にピペット分注（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）、試料の移動、遠心分離、磁気除去及び／又はサーマルサイクリングなどの工程を追加し得る。精製と配列決定の間の効率と速度を高め、使用者にとっての時間あたりの費用と手間を低減するためにはそのような工程を排除することが望ましい。
【００８７】
様々な実施形態によれば、精製上清液からの高分子電解質被覆イオン交換粒子の単離は、粒子を保持するためのろ過又は粒子を収集するための遠心分離とそれに続く上清液の吸引によって達成できる。キャピラリー電気泳動のための試料を上清液から直接負荷することにより、精製上清液から高分子電解質被覆イオン交換粒子を除去する工程を排除することが望ましい。しかし、高分子電解質被覆イオン交換粒子は、動電注入を阻害して配列データのランダムな分断を生じさせることによってか、又は高分子電解質被覆イオン交換粒子が試料チューブの底部でキャピラリーによって粉砕されるときにキャピラリーを詰まらせることによって、負荷に干渉し得る。
【００８８】
様々な実施形態によれば、本発明の教示は、試料のウエル、チューブ又はチャンバーの底部からキャピラリーを負荷するための方法を提供する。高分子電解質被覆イオン交換粒子をウエルの側面又は上部に移動させることができる。図１７Ａ〜１７Ｃは、高分子電解質被覆イオン交換粒子１７２が上清液１７４から単離されたウエル１７０を示す。本発明の教示は、図１７Ｂに示すように高分子電解質被覆イオン交換粒子１７２をウエル１７０の上部に位置づけること又は図１７Ｃに示すように高分子電解質被覆イオン交換粒子１７２をウエル１７０の側面に位置づけることを提供する。
【００８９】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆イオン交換粒子は、より高密度の溶媒で浮遊させることによってウエルの上部に位置づけることができる。上清液が高分子電解質被覆イオン交換粒子より高い密度を有するように上清液の密度を上昇させることができる。上清の密度を高めることができる溶媒の例は、エチレングリコール（密度＝１．１１３）、プロピレンカーボネート（密度＝１．１８９）、ポリエチレングリコール（密度＝１．１２７を有するろう状固体）、グリセロール（密度＝１．２６１）、及び様々な濃度でのそれらの組み合わせを含む。様々な実施形態において、イオン交換樹脂は１．０３レベルまでの低い密度を有し得る。上清液の密度を上昇させたとき、高分子電解質被覆イオン交換粒子はウエルの上部に浮上する。キャピラリーと電極を、その後、高分子電解質被覆イオン交換粒子の層の下のウエルに浸すことができる。キャピラリーの負荷は高分子電解質被覆イオン交換粒子を含まないようにすることができる。溶媒の添加は、試料調製における遠心分離工程を排除し、アレイピペッターによって自動化され得る。
【００９０】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆イオン交換粒子は磁力によってウエルの側面に位置づけることができる。上述したように、高分子電解質被覆イオン交換粒子は、磁化するためにＦｅ３Ｏ４で被覆できる。高分子電解質被覆イオン交換粒子は、磁石又は電気的に誘導される磁場によって提供されるウエルの側面又はウエルの周囲の磁場によってウエルの側面に誘引され得る。キャピラリーと電極を、その後、同心円層の無いウエルの中央部にか、又は高分子電解質被覆イオン交換粒子の層を外して浸すことができる。キャピラリーの負荷は高分子電解質被覆イオン交換粒子を含まないようにすることができる。高分子電解質被覆イオン交換粒子の磁化は、試料調製における遠心分離工程を排除する。
【００９１】
様々な実施形態によれば、本発明の教示は、試料のウエル、チューブ又はチャンバーの上部からキャピラリーを負荷するための方法を提供する。高分子電解質被覆イオン交換粒子をウエルの底部に移動させることができる。図１７Ａは、高分子電解質被覆イオン交換粒子１７２が上清液１７４から単離されたウエル１７０を示す。粒子は、上述したように遠心分離又は磁化によって底部に移動させることができる。シーケンサー装置は、高分子電解質被覆イオン交換粒子を含まないウエルのより高い位置から試料を負荷するように較正することができる。上清負荷のためのキャピラリー位置の修正は、キャピラリーの先端とチューブの底部までの距離を上昇させることによって提供され得る。標準的なマイクロタイタートレーに関して、そのような距離の一例は４．５ｍｍである。これは３０μＬの９６穴トレーについてのウエル容量に相当する。上清の容量は、キャピラリーが良好な動電注入のために上清中に浸されることを確実にするように上昇させ得る。これは、脱イオン水の添加によって上清の容量を上昇させることによって実施できる。脱イオン水と上清の混合物は、混合物を３０分間ボルテックスすることによって提供され得る。
【００９２】
様々な実施形態によれば、シーケンサー装置は、トレー又はトレーが係合するフレームを、トレーが装置の下部に位置するように機械的に変化させることによってウエル内のより高い位置から試料を負荷するように較正することができる。様々な実施形態によれば、シーケンサー装置は、Ｚ軸基準点を変更するためにファームウエア初期化ファイルを修正することによってウエル内のより高い位置から試料を負荷するように較正することができる。様々な実施形態によれば、シーケンサー装置は、キャピラリーを、底部の負荷位置から高分子電解質被覆イオン交換粒子の上の上清液層の位置に引き込むようにソフトウエアをプログラミングすることによってウエル内のより高い位置から試料を負荷するように較正することができる。図１８Ａ〜１８Ｂは、Ｚ軸基準点を変更するためにファームウエア初期化ファイルを修正することによってウエル内のより高い位置から試料を負荷するように較正されたシーケンサー装置を使用して、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（登録商標）化学（図１８Ａ）及びｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ化学（図１８Ｂ）を用いた上清からの核酸配列決定を示す。
【００９３】
合成ポリマーによる粒子の被覆：
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆イオン交換粒子は、粒子のサイズ排除特性のための所望のカットオフを選択するためにコポリマーで被覆することができる。所望のカットオフは、溶液中のより少数の塩基対（ｂｐ）によって示されるように（「ロールオフ（ｒｏｌｌｏｆｆ）」）一定サイズ以下の種の量の著しい減少である。カットオフを試験するためのロールオフアッセイは、キャピラリー電気泳動を用いてフラグメントの損失をサイズの関数として示すことにより、蛍光標識ｄｓＤＮＡサイズ標準を用いて高分子電解質被覆イオン交換粒子の性能を測定する。各々のフラグメントについてのピーク高を標準及びサイズ識別を示す曲線に対して正規化することができる。プロトコールの一例は、ＲＯＸ−５００をｄｓＤＮＡサイズ標準として及びＬＩＺ−５００を内部標準として使用することであり得る。ロールオフアッセイは精製の間のフラグメントの損失を示すことができる。低いロールオフを示す試料は、アッセイに用いられるＲＯＸ−５００標準の小さな塩基対フラグメントの有意な損失を示さない。高いロールオフを示す試料は、より小さな塩基対フラグメント、例えば３５、５０、１００及び１３９塩基対フラグメントの高い損失を示す。
【００９４】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆イオン交換粒子を被覆するためのコポリマーは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）とアクリル酸（ＡＡ）から作られるものとのコポリマーを含む。図１９に示すように、ＭＰ−１Ｍ  ＢｉｏＲａｄイオン交換樹脂を被覆するために使用したＤＭＡ−ＡＡコポリマーは、ＡＡの画分が１５％、１０％、７．５％及び５％から低下したので、より高いロールオフを示した。
【００９５】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆イオン交換粒子を被覆するためのコポリマーは、アクリルアミドとＡＡから作られるものとのコポリマーを含む。図２０に示すように、ＭＰ−１Ｍ  ＢｉｏＲａｄイオン交換樹脂を被覆するために使用したアクリルアミド−ＡＡコポリマーは、ＡＡの画分が１０％及び５％から低下したので、より高いロールオフを示した。
【００９６】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆イオン交換粒子を被覆するためのコポリマーは、２−ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）とＡＡから作られるものとのコポリマーを含む。図２１に示すように、ＭＰ−１Ｍ  ＢｉｏＲａｄイオン交換樹脂を被覆するために使用したＨＥＡ−ＡＡコポリマーは、ＡＡの画分が１０％及び５％から低下したので、より高いロールオフを示した。
【００９７】
様々な実施形態によれば、コポリマーは、ロールオフ性能及び処理したイオン交換樹脂の貯蔵寿命を高めることができる。助剤（ｃｏ−ａｇｅｎｔ）は、水溶性又はわずかに水溶性のホモポリマー又は、例えば（メト）アクリルアミド、Ｎ−メチル（メチル）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メチル）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メト）アクリルアミド、Ｎ−イソ−プロピル（メト）アクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチル（メト）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）（メト）アクリルアミド、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルアセトアミド、重合後ビニルアルコールを与えるように加水分解され得るビニルアセテート、２−ヒドロキシエチル（メト）アクリレート、３−ヒドロキシプロピル（メト）アクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、ポリ（エチレンオキシド）（メト）アクリレート、Ｎ−（メト）アクリルオキシスクシンイミド、Ｎ−（メト）アクリロイルモルホリン、Ｎ−２，２，２−トリフルオロエチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−アセチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−アミド（メト）アクリルアミド、Ｎ−アセトアミド（メト）アクリルアミド、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−（メチル）アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、（メチル）アクリロイル尿素、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、又はそれらの組み合わせを含むモノマーによって作製されるコポリマーであり得、アクリル酸と共重合され得る。
【００９８】
合成ポリマー、界面活性剤及び安定化添加剤を含む高分子電解質被覆粒子によるＤＮＡ塩基配列決定反応物精製：
ＤＮＡ塩基配列決定反応産物は、ＤＮＡシーケンサーにおけるキャピラリー電気泳動（ＣＥ）による分離の前に精製することができる。精製は、ＣＥによる分離に干渉し得る、取り込まれなかった色素標識ジデオキシヌクレオチドを除去し得る。ＣＥシステムへの注入は、適切な注入を提供するために、実質的に低いイオン強度、例えば１ｍＭ塩の溶液からであるべきである。ＣＥを備えるＤＮＡシーケンサーは、ＤＮＡ塩基配列決定試料の多数のトレーを保存し、処理することができる自動化装置であり得る。これらのシステムは、処理前２４時間まで、自動ＤＮＡシーケンサーの貯蔵領域に試料セットの列を形成し得る。ほとんどの既存の精製方法は、分解を避けるため８時間より長い期間精製媒質を試料セットと接触した状態で維持することができない。４８時間などの、８時間より長い期間分解に対して安定であり得る高分子電解質被覆粒子によるＤＮＡ塩基配列決定反応物精製を提供することが望ましい。
【００９９】
ＣＥシステムへのＤＮＡ塩基配列決定産物の動電注入を阻害することなく安定で、分解に抗する脱イオン注入水溶液中のＤＮＡ塩基配列決定反応産物を提供することが望ましい。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の添加などの他の安定化方法は、ＤＮＡ配列決定産物溶液のイオン強度を上昇させ、それによって動電注入を阻害する。高分子電解質被覆イオン交換粒子の混床でＤＮＡ塩基配列決定反応物を精製することが望ましい。混床は、ＤＮＡ配列決定溶液のイオン強度を実質的に低いイオン強度に維持することができる。イオン性の安定剤は、粒子によって吸収され、溶液から除去され得る。高分子電解質被覆イオン交換粒子によって溶液から除去される非イオン物質でＤＮＡ配列決定溶液を安定化することが望ましい。
【０１００】
ＣＥシステムのための動電注入溶液は、ＤＩ水又は脱イオンホルムアミド（ＤＩホルムアミド）を含み得る。ＥＤＴＡは、ＤＩホルムアミドを含むＤＮＡ塩基配列決定産物溶液のための安定剤として使用されてきた。重炭酸ナトリウムを添加した又は添加していないＤＴＴは、蛍光色素分解に抵抗するためにホルムアミドを含むＤＮＡ配列決定産物溶液のための安定剤として使用されてきた。ＤＩ水中でのＤＮＡ配列決定反応産物の不安定性はごくわずかとみなされてきた。しかし、ＤＩ水中で保存されたＤＮＡ配列決定反応産物は、不安定になり、分解し得る。例えばＤＩ水中で２４時間保存されたＤＮＡ配列決定反応産物は、分析したとき実質的なピークの広がりを示す。図２２Ａに示すように、３時間目のＤＩ水中のＤＮＡ配列決定反応産物はごくわずかなピークの広がりを示した。一方で、図２２Ｂに示すように、２４時間目のＤＩ水中のＤＮＡ配列決定反応産物は実質的なピークの広がりを示した。ＤＩ水は安価で非毒性であり、ＤＩ水はＤＩホルムアミドからの注入よりも高いシグナル強度を提供し、高分子電解質被覆イオン交換粒子と適合性であるので、ＣＥに注入するＤＮＡ配列決定産物溶液ではＤＩ水を使用することが望ましい。
【０１０１】
様々な実施形態によれば、両性イオン化合物はＤＩ水中でのＤＮＡ配列決定反応産物の分解に抵抗することができる。例えば１−カルボキシメチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−メタンアミニウムヒドロキシド内部塩（ベタイン）は、ＤＩ水中のＤＮＡ配列決定反応物を安定化して、動電注入のための安定な水溶液を形成することができる。両性イオン化合物は、ＣＥシステムへの動電注入のための実質的に中性の、実質的に低い伝導率及び／又はごくわずかなイオン条件を提供することができる。両性イオン化合物は、ＤＮＡ配列決定反応産物の精製において使用される高分子電解質被覆イオン交換粒子によって中性として処理され、塩などの他のイオン種のように粒子によって実質的に吸収されることはない。
【０１０２】
様々な実施形態によれば、安定化添加剤は、精製媒質、例えば高分子電解質被覆イオン交換粒子等と共にＤＮＡ配列決定反応産物に導入され得るか、又は他の手段、例えばエタノール沈殿、イソプロパノール沈殿、スピンカラム、高分子電解質被覆イオン交換粒子等によって既に精製されたＤＮＡ配列決定反応産物に導入され得、その後精製媒質から分離され得る。
【０１０３】
様々な実施形態によれば、上述したように、精製に先立つＤＮＡ配列決定反応産物への界面活性剤の添加は、試料がＤＮＡシーケンサーにおいてＣＥによって実質的に分離されたとき色素アーティファクトの除去を促進し得る。様々な実施形態では、界面活性剤は、安定化添加剤及び高分子電解質被覆イオン交換粒子を含むＤＮＡ配列決定反応産物溶液中に存在し得る。界面活性剤は、陰イオン、陽イオン、非イオン、両性イオン又はこれらのタイプの界面活性剤の組み合わせであり得る。界面活性剤は、０．０１％〜１０％又は０．５％〜５％又は１％〜１０％の濃度で添加され得る。安定化添加剤は、両性イオン、例えばベタイン、硫黄含有化合物、例えばジチオトレイトール、酸化性（ｏｘｉｄｉｚａｂｌｅ）フェノール、例えばカテコール、単糖、二糖、多糖又はアミノ酸であり得る。安定化添加剤は、１ｍＭ〜５Ｍ又は０．５Ｍ〜２Ｍ又は０．１ｍＭ〜２５０ｍＭ又は１Ｍ〜３Ｍの濃度であり得る。
【０１０４】
様々な実施形態によれば、界面活性剤は、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３５）、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（Ｂｒｉｊ  ５８）、オクチルフェノキシルポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）、Ｂｒｉｊ  ９７、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０）、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート内部塩（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−８、３−１２、３−１４）、３−［３］（コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［３−（コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス［３−Ｄ−グルコアミド］プロピル）コールアミド（Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ）、界面活性剤スルホベタイン（Ｃ７ＢｚＯ）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（ＮＰ７、９、１１、１３、１５）、Ｎ−（アルキルＣ１０−Ｃ１６）−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンベタイン（Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ）、ｎ−ドデシルマルトシド、Ｌｕｂｅｒｏｌ  ＰＸ、ｎ−オクチルグルコシド、３−（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシプロピル−ジメチルアンモニオ−プロパンスルホネート（Ｃ７ＢｚＯ）、非界面活性剤スルホベタイン、又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０１０５】
様々な実施形態によれば、安定化添加剤は、１−カルボキシメチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−メタンアミニウムヒドロキシド（ベタイン）、メチルグリシン、ジメチルグリシン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−（ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グッド緩衝液、２−メルカプトエタノール、ＤＴＴ、トリス（２−カルボキシルエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、及びそれらの組み合わせを含み得る。
【０１０６】
図２３Ａ〜２３Ｃ及び２４Ａ〜２４Ｃは、本発明を例示する実験に関してＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって作成したＤＮＡシーケンサー電気泳動図の結果を示す。図２３Ａは、１Ｍベタイン及び２．５ｍＭ  ＤＴＴと共にＤＮＡ塩基配列決定反応産物を界面活性剤なしで精製した場合の電気泳動図を示す。望ましくない色素アーティファクトが塩基７０近くでベースコーリングに干渉しているのが認められた。図２３Ｂは、安定化添加剤、ベタイン及びＤＴＴに加えて３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて精製した同じ反応産物を示す。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加は、色素アーティファクトのない電気泳動図を生じさせた。図２３Ｃは、安定化添加剤、ベタイン及びＤＴＴに加えて３％Ｂｒｉｊ  ３５を用いて精製した同じ反応産物を示す。Ｂｒｉｊ  ３５の添加は、色素アーティファクトのない電気泳動図を生じさせた。選択的実験は、ＤＴＴなしでも同様の結果を示した。
【０１０７】
図２４Ａ〜２４Ｃは、ＤＮＡ配列決定反応産物を１．５Ｍベタイン、２．５ｍＭ  ＤＴＴ及び３％ＣＨＡＰＳと組み合わせて、この溶液を、精製媒質として使用した高分子電解質被覆イオン交換粒子と接触させて維持したときの電気泳動図を示す。溶液を様々な時間インキュベートした。図２２Ｂは、添加剤の不在下では、ＤＮＡ配列決定電気泳動図の質が低下することを示した。図２４Ａは、室温（２０℃）で６時間インキュベートした溶液から生じた電気泳動図を示す。図２２Ｂで認められた劣化と比較して、図２４Ａにおけるピーク分解能は良好で、配列は８００ヌクレオチドまで読み取り可能であり、配列の初期部分に色素アーティファクトは認められなかった。図２４Ｂ及び２４Ｃは、それぞれ２４時間及び４８時間インキュベートした同じ反応物を示す。２４及び４８時間目でも、配列決定反応検出の質の有意の低下は存在しなかった。これらの実施例は、高分子電解質被覆イオン交換粒子の存在下であっても、色素アーティファクトの除去を増強し、脱イオン水溶液中のＤＮＡ配列決定反応物を安定化する安定化添加剤の能力を明らかにした。
【０１０８】
様々な実施形態によれば、高分子電解質被覆イオン交換粒子による精製のための方法は、配列決定反応産物へのＣＨＡＰＳ及びベタインの添加、高分子電解質被覆イオン交換粒子と非被覆イオン交換粒子の混合物の添加、溶液の密封、３０〜６０分間の混合、遠心分離、及び上清注入を含み得る。
【０１０９】
本明細書及び付属の特許請求の範囲の目的に関して、異なる指示がない限り、成分の量、物質のパーセンテージ又は割合、反応条件、及び本明細書と特許請求の範囲とにおいて使用される他の数値を表す全ての数字は、全ての場合に「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。従って、逆の指示がない限り、以下の明細書及び付属の特許請求の範囲において示される数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に依存して異なり得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲の等価物の教義の適用を限定する企図としてではなく、各々の数値パラメータは、少なくとも、報告される重要な数字の数に照らして及び通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。
【０１１０】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定実施例に示す数値はできる限り正確に報告されている。いかなる数値も、しかしながら、それぞれの試験測定値において認められる標準偏差から必然的に生じる若干の誤差を本質的に含む。さらに、ここで開示する全ての範囲は、その中に含まれるあらゆる部分的範囲を包含すると理解されるべきである。例えば「１〜１０」の範囲は、最小値の１と最大値の１０の間（及びそれらを含む）のあらゆる部分的範囲、すなわち１に等しいか又は１より大きい最小値と１０に等しいか又は１０未満の最大値を有するあらゆる部分的範囲、例えば５．５〜１０を含む。
【０１１１】
本明細書及び付属の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、明確にはっきりと１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を包含することが留意される。それ故、例えば「モノマー」への言及は２以上のモノマーを包含する。さらに、「含んで」という用語並びに「含む」及び「含まれる」などの他の形態の使用は、限定的ではない。
【０１１２】
様々な修正及び変形が、本発明の教示の精神又は範囲から逸脱することなくここで述べる様々な実施形態に施され得ることは、当業者には明白である。それ故、ここで述べる様々な実施形態は、付属の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の他の修正及び変形をカバーすることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、コーティングが生体高分子を含む、高分子電解質被覆粒子の断面図を示す。
【図２】図２は、コーティングが合成ポリマーである、高分子電解質被覆粒子の断面図を示す。
【図２ａ】図２ａは、高分子電解質被覆粒子のためのコーティングに含めることができるいくつかの合成ポリマーを示す。
【図３】図３ａ〜３ｄは、標準分離手法と比較した、生体高分子を含む高分子電解質被覆粒子による配列決定反応産物の分離を明らかにし、図３ａ〜３ｃは、様々な実施形態に従った高分子電解質被覆粒子による分離を示し、図３ｄは、非被覆イオン交換粒子による分離を示す。
【図４】図４ａ〜４ｂは、生体高分子を含む高分子電解質被覆粒子によるＰＣＲ反応産物の分離を明らかにし、図４ａは、色素標識アンプリコンと色素標識プライマーとの混合物を含む未精製ＰＣＲ反応産物を示し、図４ｂは、色素標識プライマーを除去するために高分子電解質被覆粒子で分離されたＰＣＲ反応産物を示す。
【図５】図５ａ〜５ｂは、それぞれ図４ａ〜４ｂの詳細を示す一組のグラフである。
【図６】図６は、合成ポリマーを含む高分子電解質被覆粒子による配列決定反応産物の分離を明らかにする。
【図７】図７ａ〜７ｂは、合成ポリマーを含む高分子電解質被覆粒子による配列決定反応産物の分離を明らかにする。
【図８】図８は、種々の分子量を有するコーティングポリマーを使用する分離のための、合成ポリマーを含む高分子電解質被覆粒子による分離についてのサイズカットオフを明らかにする。
【図９ａ】図９ａは、合成ポリマーを含む高分子電解質被覆粒子による配列決定反応産物の分離を明らかにする。
【図９ｂ】図９ｂは、合成ポリマーを含む高分子電解質被覆粒子による配列決定反応産物の分離を明らかにする。
【図１０】図１０は、合成ポリマーを含む高分子電解質被覆粒子を用いた、より大きなｄｓＤＮＡフラグメントからの小さなｄｓＤＮＡフラグメントのサイズに基づく除去を明らかにする。
【図１１】図１１は、２％アガロースゲルを用いたゲル電気泳動で成分を分離した結果を示すことにより、高分子電解質被覆粒子を用いたＰＣＲ産物からのオリゴヌクレオチドプライマーの除去を明らかにする。
【図１２】図１２は、非脱塩高分子電解質粒子を用いたＤＮＡサイズ識別を明らかにする。
【図１３】図１３は、付加的な例を示す。
【図１４】図１４は、付加的な例を示す。
【図１５】図１５は、付加的な例を示す。
【図１６】図１６は、付加的な例を示す。
【図１７】図１７は、付加的な例を示す。
【図１８】図１８は、付加的な例を示す。
【図１９】図１９は、付加的な例を示す。
【図２０】図２０は、付加的な例を示す。
【図２１】図２１は、付加的な例を示す。
【図２２】図２３は、付加的な例を示す。
【図２４】図２４は、付加的な例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図２ａ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【国際調査報告】
2008536478.tif 000046
2008536478.tif 000047