(57)【要約】  本発明は、マウスＣＭＶプロモーターおよびヒトサイトメガロウイルスの主要最初期遺伝子の第１イントロンを含む哺乳類発現ベクター、当該発現ベクターを含む哺乳類宿主細胞、ならびに、当該発現ベクターの使用による組換えタンパク質の製造方法に関する。【選択図】なし
2008536506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスＣＭＶプロモーター、および異種性コード配列に実施可能的につながった第１ヒトＣＭＶイントロンを含む、哺乳類発現ベクター。
【請求項２】
前記マウスＣＭＶプロモーターが、−４９１の位置から＋３６の位置のｍＣＭＶプロモーター配列を含む、請求項１に記載の哺乳類発現ベクター。
【請求項３】
前記マウスＣＭＶプロモーターが、−１３３６の位置から＋３６の位置のｍＣＭＶプロモーター配列を含む、請求項１に記載の哺乳類発現ベクター。
【請求項４】
選択マーカー、好ましくはグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）マーカーをコード化する第２転写単位を含む、請求項１から３の何れか１項に記載の哺乳類発現ベクター。
【請求項５】
請求項１から４の何れか１項に記載の哺乳類発現ベクターを含む哺乳類宿主細胞。
【請求項６】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項５に記載の哺乳類宿主細胞。
【請求項７】
以下の工程を含む、組換えタンパク質の製造方法：
ａ）哺乳類宿主細胞に、マウスＣＭＶプロモーター、および組換えタンパク質をコードする配列に実施可能的につながった第１ヒトＣＭＶイントロンを含む発現ベクターを形質移入すること；
ｂ）細胞の増殖および組換えタンパク質の発現を可能とする適切な条件の下、細胞を培養すること；および
ｃ）産生される組換えタンパク質を収集すること。
【請求項８】
前記哺乳類宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
組換えタンパク質の発現のためのマウスＣＭＶプロモーターの活性を増強するための第１ヒトＣＭＶイントロンの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、マウスＣＭＶプロモーターおよびヒトサイトメガロウイルスの主要最初期遺伝子の第１イントロンを含む哺乳類発現ベクター、この発現ベクターを含むＣＨＯ細胞およびＣＨＯ細胞株、ならびに、この発現ベクターの使用による組換えタンパク質の製造方法に関する。
【０００２】
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の哺乳類発現システムは、組換えタンパク質の生産に広く使われている。ＮＳ−０といったリンパ細胞株とは別に、これは、動物細胞の単純で効率的な高密度懸濁バッチ式培養が可能な、数少ない細胞種のうちの１つである。さらに、リンパ球では産業的スケールで培養を行うのが困難であるのに対して、ＣＨＯ細胞では非常に高い生成物収率が得られ、代謝ストレスに対して比較的強い。生産における多額の費用を考慮すれば、バイオリアクターの稼動当りの組換えタンパク質の収率を最大化することは最も重要性が高い。培地組成の選択ならびにバイオリアクターの設計および操作は、収率に影響を与えるパラメータであり、最適化が非常に複雑となる可能性がある。株化細胞によって生産されるポリペプチドの量に有意に影響を及ぼすその他の因子は、遺伝子コピー数、遺伝子が転写される効率およびｍＲＮＡが翻訳される効率、ｍＲＮＡの安定性ならびにタンパク質の分泌の効率である。従って、生成されるタンパク質の発現を制御するプロモーターの強度または転写の活性の増加は、収率を増強させる。単一細胞の濃度における増加性の増加（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ）は、高密度バッチ式培養法または流加培養法（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）において、１０６から１０７細胞／ｍｌの範囲の細胞密度にて定常期な遺伝子発現を示し、生成物収率の相当な改善を意味するだろう。
【０００３】
哺乳動物細胞の形質導入のために、これまでの大多数の遺伝子移入実験においては、ウイルス由来のプロモーター因子の調節のもと導入遺伝子をコード化するウィルスベクターが使用されてきた。これらの発現カセットにおいて最も頻繁に使われるプロモーターの１つは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）最初期（ＩＥ）遺伝子のものである。この遺伝子のエンハンサー／プロモーターは、多種多様な細胞種において、高いレベルの導入遺伝子の発現を導く。このプロモーターの活性は、一連の１７、１８、１９および、２１ｂｐの不完全な繰り返しに依存し、その幾つかはＮＦ−κＢ、ｃＡＭＰ応答性結合タンパク質（ＣＲＥＢ）および核因子−１ファミリーの転写因子と結合する。しかしながら、ｈＣＭＶ ＩＥプロモーターの不利な点は、その顕著な種の選り好みである。
【０００４】
ＵＳ ５，８６６，３５９には、弱いプロモーターからアデノウイルスＥ１Ａタンパク質を同時発現させることによるＣＨＯおよびＮＳＯ細胞における、既に強力なｈＣＭＶプロモーターからの発現を強化する方法が記載されている。Ｅ１Ａは、細胞周期調節に作用する可能性がある多機能性の転写制御因子であり、独立した機能的活性および抑制作用ドメインの両方を有す。Ｅ１Ａ発現の微調整は、遺伝子のトランス活性化および何れかの細胞周期の進行における負の影響の間の理想的なバランスを達成するために重要である。しかしながら、Ｅ１Ａ発現の望ましくない過剰発現は、関心ある組換えタンパク質を合成する細胞の能力を減らし得る。
【０００５】
ＵＳ ５，５９１，６３９には、プロモーター、エンハンサー、および異種性の遺伝子の上流にイントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルスの主要最初期遺伝子（ｈＣＭＶ−ＭＩＥ）の完全な５’−非翻訳領域を含むベクターが記載されている。この約２１００ｂｐのＤＮＡ配列は、幾つかの異種性遺伝子産物の高いレベルの発現をもたらす。しかしなから、チャップマンらは、このヒト配列の最初の４００ｂｐが発現プラスミドに存在した場合、サル腎細胞（ＣＯＳ７）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＤＸＢ１１）において、糖タンパク質の発現が低下することが観察されたと報告している（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９ （１９９１）， ３９７９−３９８６）。これらの上流の修飾的配列を欠失させると、これらの細胞種の幾つかの哺乳類糖タンパク質において、より高いレベルの発現につながった。さらに、ＳＶ４０初期およびｈＣＭＶ最初期のプロモーター／エンハンサーの比較から、ｈＣＭＶプロモーターの活性は、ヒトサイトメガロウイルスの主要最初期遺伝子のイントロンＡの挿入によって増大させることができることが示された。
【０００６】
ＣＨＯ細胞におけるマウスサイトメガロウイルスの主要最初期遺伝子のプロモーター（ｍＣＭＶ ＩＥプロモーター）の転写活性は、ｈＣＭＶプロモーターのそれより非常に高いことが知られている。ｍＣＭＶ ＩＥプロモーターは、ｈＣＭＶ ＩＥプロモーターで観察される顕著な種の選り好みがなく、高い発現レベルをもたらすことが可能である（Ａｄｄｉｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （７８ （１９９７）， １６５３−１６６１）。しかしながら、ｍＣＭＶプロモーターの下流にマウスの主要最初期遺伝子の天然の第１イントロンを挿入することによって、ｈＣＭＶプロモーターに類似させてｍＣＭＶプロモーターの活性を強化しようとする試みは失敗した。ｈＣＭＶプロモーターによる場合（ＵＳ ５，５９１，６３９参照）とは対照的に、ｍＣＭＶのそのような天然の第１イントロンは、ｍＣＭＶプロモーター由来の組換え遺伝子の発現を有意に減少させることがわかった（ＷＯ ２００４／００９８２３ Ａ１参照）。
【０００７】
当該分野において、ｍＣＭＶプロモーターの活性を増強する必要がなお残っている。従って、本発明の根底にある技術的な課題は、哺乳類の宿主細胞、特定のＣＨＯ細胞における、ｍＣＭＶプロモーターからのタンパク質発現の増強を可能とする、ｍＣＭＶプロモーターに基づく発現系を提供することである。
【０００８】
本発明によると、この技術的課題は、マウスＣＭＶプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルスの主要最初期遺伝子の第１イントロン（第１ｈＣＭＶイントロン）（異種性遺伝子配列に実施可能的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）繋がる）を含む哺乳類発現ベクターを提供することによって解決される。ｍＣＭＶプロモーターと、さらに、ｍＣＭＶプロモーターの下流に位置する第１ｈＣＭＶイントロンは、下流のコード配列の発現を駆動する（ｄｒｉｖｅ）調節単位を形成する。本発明による哺乳類発現ベクターは、ＣＨＯ細胞における組換え遺伝子産物の高いレベルの発現のための、特定の有用な発現ベクター構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）である。驚くべきことに、発現カセット内に、第１ｈＣＭＶイントロンと組み合わせてｍＣＭＶプロモーターを含む本ベクターは、ｍＣＭＶプロモーターのみを含むベクターの場合よりも高いレベルの異種タンパク質産物の発現をもたらす。ｍＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロンによって発現される異種性タンパク質のレベルは、少なくとも、ｈＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロンによって発現されるタンパク質レベルに等しい。何れの特定の理論に束縛されることを望むことなく、第１ｈＣＭＶイントロンの存在は、明らかに、対応するｍＲＮＡからの効果的なタンパク質合成を促進すると考えられる。これらの知見は、ｍＣＭＶプロモーターの活性は、第１ｍＣＭＶイントロンと組み合わせても増大させることができなかったという事実を考慮すると、予想外で驚くべきである。
【０００９】
本発明の状況において、「哺乳類発現ベクター」は、好ましくは単離されたおよび精製されたＤＮＡ分子であって、適当な哺乳類の宿主への形質移入において、宿主細胞内で組換え遺伝子産物の高いレベルの発現を提供するものである。組換えまたは異種性遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に加えて、発現ベクターは、コード配列からのｍＲＮＡの効率的な転写および宿主細胞株のｍＲＮＡの効果的な翻訳のために必要な調節性ＤＮＡ配列を含む。特に、本発明による発現ベクターは、ヒトサイトメガロウイルスの主要最初期遺伝子の第１イントロン（イントロンＡ）（組換えタンパク質をコードする配列に実施可能的に繋がり、コードされたタンパク質の発現を駆動する）との組み合わせで少なくとも１つのｍＣＭＶプロモーター配列を含む、少なくとも１つの調節単位を含む。ｍＣＭＶプロモーターと第１ｈＣＭＶイントロンを含む調節単位は、異種性遺伝子のコード配列に直接繋がっているか、または、例えば異種性遺伝子またはそれらの一部の５’非翻訳領域といったＤＮＡが介在することで、それらから分離しているかの何れかである。
【００１０】
本発明によれば、哺乳類発現ベクターのプロモーターは、マウスのサイトメガロウイルスの主要最初期遺伝子のプロモーター（ｍＣＭＶ ＩＥまたはｍＣＭＶプロモーター）である。マウスのＣＭＶ（ｍＣＭＶ）ＩＥプロモーターは、始めにドルシュ−ハースラーらによって記述され（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２ （１９８５）， ８３２５−８３２９）、この文献によって開示されるものは全て、本願に援用される。
【００１１】
マウスのサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）は、ヘルペスウイルス科（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）の高度に多様化したグループに属す。宿主種が異なるサイトメガロウイルスの間でさえ、広く変化し得る。例えば、ｍＣＭＶは、生物学的性質、最初期（ＩＥ）遺伝子の構成および全体的なヌクレオチド配列に関して、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）とかなり異なる。２３５ｋｂｐゲノムのｍＣＭＶも、ｈＣＭＶの特徴である、大きな内部および末端反復がない。したがって、ｍＣＭＶゲノムの異性の形態は存在しない（Ｅｂｅｌｉｎｇ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， （１９８３）， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４７， ４２１−４３３； Ｍｅｒｃｅｒ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， （１９８３）， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２９， ９４−１０６）。
【００１２】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡと結合させおよびＲＮＡ合成を開始させることによって、転写の開始を介在するＤＮＡ配列として定義される。ｍＣＭＶプロモーターは、強いプロモーターであること、すなわち、転写を高頻度に開始させるプロモーターであることが知られている。さらに、好ましくは異種性遺伝子のための第１の転写単位（宿主細胞における発現によりタンパク質産物をもたらし、およびｍＣＭＶプロモーターに調節される）を含み、さらにグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）マーカー遺伝子を含む第２の転写単位を含む発現ベクターを使用する場合に、ベクターにおけるｍＣＭＶプロモーターの存在が、ＣＨＯ細胞における形質移入の割合を増強するであろうことが知られている。
【００１３】
本発明によれば、使用されるプロモーターはまた、ｍＣＭＶプロモーターの機能的断片または機能的配列変種（ｖａｒｉａｎｔ）でありえる。したがって、転写の開始を調節する際に機能的でありまたはその能力があり、そのため組換えまたは異種性産物遺伝子を一過的にまたは安定的に発現させることができるｍＣＭＶプロモーターの何れの配列変種または断片も、ｍＣＭＶプロモーターとして使用することが可能である。ｍＣＭＶプロモーターの「機能的変種」は、とりわけ、天然のｍＣＭＶ配列に塩基の挿入、欠失または点変異が生じたものを含み、および、当該分野で周知の方法によって作製することが可能であり、例えば、プライマー誘導性ＰＣＲ、「エラープローン」ＰＣＲ、オーバーラップしたＤＮＡ断片のＰＣＲ再構築である「遺伝子シャッフリング」、細菌クローンのｉｎ ｖｉｖｏランダム変異誘発およびそれに続くＣＨＯ細胞におけるライブラリーの形質移入と機能的選択によって作製することが可能である。例えば、ランダムな変異原性は、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．によって記述されるように、アルキル化薬剤またはＵＶ−照射によって達成できる（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９７２））。任意に、宿主バクテリアの天然の変異誘発株（ｍｕｔａｔｏｒ−ｓｔｒａｉｎ）を使用してもよい。好ましくは、そのような変種配列は、天然のマウスＣＭＶプロモーターの対応する部分に対して、少なくとも６５％、より好ましくは７５％、最も好ましくは９０％のＤＮＡ配列が相同的である。ｍＣＭＶプロモーターの機能的な配列変種の例は、組換え産物遺伝子を挿入するための適した制限部位をつくるために設計された、転写開始部位をもったプロモーター配列である。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様において、基本的に使用されるｍＣＭＶプロモーターは、ＵＳ ４，９６８，６１５に記載される、大きな約２．１ｋｂのＰｓｔＩ断片に対応する。別の好ましい実施態様において、使用されるｍＣＭＶプロモーターは、転写開始点（＋０）を含み約−５００の位置まで上流に伸びる、その断片である。別の好ましい実施態様において、転写開始点から、天然の転写開始点から約−１５０の位置のＸｈｏＩ制限部位まで上流に伸び、または天然の転写開始点から−１００の位置まで上流に伸びるコアのプロモーター領域が使用される。さらに別の好ましい実施態様において、使用されるｍＣＭＶプロモーターは、Ａｄｄｉｓｏｎらによって記載されるように、−４９１から＋３６のｍＣＭＶプロモーターの断片または−１３３６から＋３６の断片である（Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ７８ （１９９７）， １６５３−１６６１）。
【００１５】
本発明による好ましい実施態様において、使用される第１のｈＣＭＶイントロン（ｈＣＭＶイントロンＡまたはヒトＣＭＶイントロンＡ）は、基本的に、Ｃｈａｐｍａｎによって記述されるように８２３ｂｐの配列に相当する（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９ （１９９１）， ３９７９−３９８６）。
【００１６】
本発明によると、使用される第１ｈＣＭＶイントロンはまた、その機能的な断片または機能的な配列変種でありえる。従って、ｍＣＭＶプロモーターの転写活性の増強において機能的でありまたはその能力を有するｈＣＭＶイントロンＡの何れかの配列変種または断片を、ｈＣＭＶイントロンＡとして使用することができる。第１ｈＣＭＶイントロンの「機能的変種」は、とりわけ、天然のｍＣＭＶ配列における塩基の挿入、欠失または点変異を含む。機能的変種には、翻訳開始シグナルが、翻訳開始のためのコザック共通配列に、より近くなる一塩基の修飾を行った配列を持たせることができる。機能的変種はまた、チャップマンらに定義されるような（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９ （１９９１）， ３９７９−３９８６）８２３ｂｐの配列の切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）を含み、それによって、本発明によると、機能的変種の配列は、少なくとも１００−１５０ｂｐ、好ましくは少なくとも２００−３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも４００−５００ｂｐおよび、最も好ましくは少なくとも６００−７００ｂｐの長さを有する。本発明によると、機能的変種の配列は、その配列全体にわたって、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％および最も好ましくは少なくとも９０％または９５％の相同性をチャップマンらに定義される８２３ｂｐ配列（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９ （１９９１）， ３９７９−３９８６）に対して示す。
【００１７】
本発明に関連して、「異種性コード配列」、「異種性遺伝子配列」、「異種性遺伝子」、「組換え遺伝子」、「関心ある遺伝子」および「導入遺伝子」という用語は、互換的に用いられる。これらの用語によって、ＤＮＡ配列とは、組換えまたは異種性遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を意味する。異種性遺伝子配列は、天然には宿主細胞中には存在せず、異なる種の生物に起因するものである。本発明による組換えまたは異種性遺伝子産物は、哺乳動物細胞で発現させ大量に採取しようとする組換えタンパク質である。遺伝子産物はまた、ペプチドまたはポリペプチドであってよい。それは、何れかの関心あるタンパク質であってよく、例えばインターロイキンもしくは酵素のような治療的なタンパク質、または、抗体のような多量体のタンパク質サブユニット、あるいはそれらの断片であってよい。組換え産物遺伝子は、宿主産生細胞から一度発現されたポリペプチドの分泌を可能とするシグナルペプチドをコードするシグナル配列を含んでよい。従って、本発明による更なる好ましい実施態様において、産生タンパク質は、分泌されたタンパク質である。より好ましくは、産生タンパク質は、抗体、遺伝子操作された抗体またはそれらの断片であり、最も好ましくは、それは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体である。
【００１８】
本発明の別の好ましい実施態様において、哺乳類発現ベクターは、さらに、マウスＩｇＧ２Ａの遺伝子座のＤＮＡ由来の一部を含み、この部分は、ＷＯ ２００４／００９８２３ Ａ１（この文献は本願に援用される）に開示されるように、ｍＣＭＶプロモーターの活性を更に増強する。ＷＯ ２００４／００９８２３ Ａ１から、マウスＩｇＧ２Ａがターゲティングする配列は、発現ベクターによってＣＨＯ細胞に一時的に形質移入されると、ＣＨＯ細胞における遺伝子発現が改善することがわかる。好ましくは、マウスＩｇＧ２Ａの遺伝子座のＤＮＡ由来の一部は、大部分のＣＨ１エキソンの５’部分以外のマウスＩｇガンマ２Ａのコード領域の全てを含む、５．１ｋｂ ＢａｍＨＩゲノム断片である（Ｙａｍａｗａｋｉ−Ｋａｔａｏｋａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． （１９８２） ７９： ２６２３−２６２７； Ｈａｌｌ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９８９） ２６：８１９−８２６； Ｙａｍａｗａｋｉ−Ｋａｔａｏｋａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９８１） ９： １３６５−１３８１）。
【００１９】
好ましくは、本発明による発現ベクターはまた、ｍＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロン配列に調節される組換え遺伝子を含む発現カセットの挿入のための、限定された数の有用な制限部位を含む。特に、一過的な（ｔａｎｓｉｅｎｔ）／エピソームの（ｅｐｉｓｏｍａｌ）発現のみに使用される場合、本発明による発現ベクターは、さらに、真核宿主細胞における自律的複製／エピソーム維持のためのエプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）またはＳＶ４０ウイルスの起点といった複製開始点を含んでよく、しかし選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ）を欠いていてもよい。本発明による発現ベクターは、例えば、限定されることなく、直鎖状のＤＮＡ断片、核標的配列を包含するＤＮＡ断片とすることができ、または、形質移入試薬、動物ウイルス、もしくは適切なプラスミド（シャトルとして機能でき細菌中で作製される）との相互作用に特別に最適化されていてよい。
【００２０】
好ましくは、本発明による哺乳類発現ベクターは、更に、動物細胞にて選択可能な少なくとも１つの発現可能なマーカーを含む。チミジンキナーゼ（ｔｋ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）といった一般的に使用される何れの選択マーカーも使用してよい。好ましい実施態様において、発現可能なＧＳ選択マーカーが使用される（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， 増幅可能な選択マーカーとしてグルタミンシンセターゼ遺伝子を使用する、骨髄腫細胞からの組換え抗体の高レベルの発現（Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒｏｍ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｇｅｎｅ ａｓ ａｎ ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ）， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５； Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９０， グルタミン合成酵素遺伝子の増幅を使用する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるメタロプロテイナーゼの組織阻害物質の高レベルの発現（Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ （ＣＨＯ） ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ６６２−６６７）。ＧＳ−ｓｙｓｔｅｍは、治療的なタンパク質の生産においてきわめて重要なただ２つのシステムのうちの１である。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）システムと比較して、ＧＳシステムは、発現の際に大きな時間的有利さを提供する。というのは、しばしば初期の形質移入体から非常に生産的な細胞株を作成することが可能であり、それによって、遺伝子の増幅を達成するために濃度を増加させた選択薬剤の存在下で複数回にわたり選択をする必要がないためである（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）システムを使用する、組換え抗体の生産のためのプロセス開発（Ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ （ＧＳ） ｓｙｓｔｅｍ）， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２３１−２３６）。言うまでもなく、マーカー遺伝子の発現のための第２転写単位と同等に、発現単位は、例えば当該分野において日常的に使用されるような内部リボソーム挿入部位を使用することによって、産物遺伝子およびマーカー遺伝子の両方のためのモノシストロニック（ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）な発現カセットを使用することができる。
【００２１】
本発明による哺乳類発現ベクターの好ましい実施態様において、組換えまたは異種性遺伝子産物および選択マーカーは、単一のジシストロニック（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）な転写単位から産生される。すなわち、ｍＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロンからなる調節単位は、下流に位置する異種性または組換え遺伝子配列の発現および下流に位置する選択マーカーの発現の両方を駆動する。ジシストロニックなベクターは、効率的に選択マーカーおよび組換え遺伝子を共増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｙ）することが知られている。また、単一の転写単位からの２つの翻訳領域の発現は、高いレベルのタンパク質を生産することが示された。本発明による哺乳類発現ベクターの別の好ましい実施態様において、関心ある遺伝子、すなわち組換えまたは異種性遺伝子および選択マーカー遺伝子は別々の転写単位上にあり、すなわち、それらの発現は別々のプロモーターによって駆動される。この実施態様において、選択マーカー遺伝子はまた、ｍＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロンからなる調節単位に調節され得る。しかしながら、選択マーカーの発現はまた、別のプロモーター（例えば、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ハイブリッドモロニーマウス白血病ウイルス−ＳＶ４０プロモーターＳＲＭまたはｈＣＭＶプロモーターのうちの１つ）によって駆動することができる。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施態様は、少なくとも２つの別々の転写単位を含む哺乳類発現ベクターに関する。そのような発現ベクターはまた、二重遺伝子ベクター（ｄｏｕｂｌｅ−ｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒ）と呼ばれる。好ましい実施態様において、第１および第２転写単位のそれぞれは、異なる関心ある組換え遺伝子を含む。好ましくは、第１転写単位は、本発明による調節単位、すなわちｍＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロンによる調節のもと、第１産物遺伝子または異種性コード配列を含み、宿主細胞における発現によって第１の産物タンパク質を作り出し、および、第２の転写単位は、本発明の調節単位の調節のもと、第２の産物遺伝子または異種性コード配列を含み、宿主細胞における発現によって第２の産物タンパク質を作り出す。そのようなベクターの例は二重遺伝子ベクターであり、このベクターでは、第１転写単位は、抗体の重鎖をコードする遺伝子を含み、第２転写単位はこの抗体の軽鎖をコードする遺伝子を含む。しかしながら、組換え遺伝子配列を含む第２転写単位の発現を、本発明による調節単位以外の調節単位によって駆動することも可能である。第２転写単位は、例えばｈＣＭＶプロモーターを含んでよい。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施態様において、哺乳類発現ベクターは、少なくとも産物遺伝子のための（第１）転写単位を含み、宿主細胞における発現にて産物タンパク質を作り出し、この転写単位は、本発明による調節単位（すなわちｍＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロン）に制御され、さらにマーカー遺伝子（好ましくはグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）マーカー遺伝子）を含む第２転写単位を含む。産物遺伝子または関心ある遺伝子（ｇｅｎｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＧＯＩ）は、例えば免疫グロブリンをコードする配列でありえる。グルタミンシンセターゼマーカー遺伝子は、何れかの酵素的活性のあるＧＳをコードする配列であり、それは天然の遺伝子配列またはその変種である。上に説明したような「機能的変種」の上記の定義は、好ましい範囲の配列相同性を含み、同様にここに適用する。そのような発現ベクターは、例えば関心ある遺伝子を有する第１転写単位がｈＣＭＶプロモーターに調節される発現ベクターよりも、ＣＨＯ細胞における形質移入において非常に高い形質移入率を可能とする。ＣＨＯ細胞では、ｍＣＭＶプロモーターの転写活性が、ｈＣＭＶプロモーターのそれより非常に高いにもかかわらず；通常、形質移入によって、より高い代謝性の負荷が、形質移入したクローンの生存性を低下させ、形質移入体の数を減少させると考えられている。従って、明らかな様式では、効果と、発現し、後におそらく形質移入体の増殖に悪影響を与える産物タンパク質の量または予期しない毒性とを関係付けることができない。
【００２４】
本発明のもう一つの側面は、ｍＣＭＶプロモーターおよびｍＣＭＶプロモーター配列の下流に位置する第１ｈＣＭＶイントロンを含む調節単位に関する。本発明による調節単位が遺伝子配列に実施可能的につなげられた場合、それは、この遺伝子配列の転写の開始を調節し、およびＲＮＡ転写物を安定化させ、および哺乳類細胞の環境内において対応するｍＲＮＡからの効果的なタンパク質合成を促進するだろう。好ましくは、本発明による調節単位は、ベクターにおいて異種性の遺伝子産物をコードする配列の上流への調節単位の挿入を可能にし、および／またはベクターからのその放出を可能とするために、１以上の適した制限部位が隣接している。本発明の好ましい実施態様において、調節単位は、上流にＡｓｃＩ制限部位が、下流にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が隣接している。従って、本発明による調節単位は、発現ベクター、特に哺乳類発現ベクターの構築のために使用することができる。
【００２５】
本発明のさらに別の側面は、本発明による調節単位および転写単位、すなわち組換えまたは異種性タンパク質産物をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットに関する。調節単位は、転写単位の上流に位置し、それに対して実施可能的につながっている。本発明による調節単位は、転写単位、すなわち異種性遺伝子のコード配列に直接つながっており、または、例えば異種性遺伝子の５’非翻訳領域といったＤＮＡが介在することによって、それから分離されている。好ましくは、発現カセットは、ベクターへの発現カセットの挿入および／またはベクターからのその切除を可能とするために、１以上の適した制限部位が隣接している。従って、本発明による発現カセットは、発現ベクター、特に哺乳類発現ベクターの構築に使用することができる。
【００２６】
本発明の更なる側面は、本発明による哺乳類発現ベクターを含む哺乳類の宿主細胞に関する。哺乳類宿主細胞は、ヒトの細胞であってよくまたはヒト以外の細胞でありえる。哺乳類宿主細胞の好ましい例は、ＭＲＣ５ヒト線維芽細胞、９８３Ｍヒト黒色腫細胞、ＭＤＣＫイヌ腎臓細胞、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから単離されたＲＦ培養ラット肺線維芽細胞、Ｂ１６ＢＬ６マウス黒色腫細胞、Ｐ８１５マウス肥満細胞腫細胞およびＭＴ１Ａ２マウス乳腺腺癌細胞を含むが、これらに限定されない。特定の好ましい実施態様において、哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または細胞株である（Ｐｕｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９５８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １０８： ９４５−９５５）。適切なＣＨＯ細胞株は、例えばＣＨＯ Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ ｐｒｏ３−、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ Ｐ１２またはｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞株ＤＵＫ−ＢＩＩ（Ｃｈａｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ７７， １９８０， ４２１６−４２２０）またはＤＵＸＢ１１（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８０， １９８３， ２４９５−２４９９）を含む。
【００２７】
本発明による哺乳類宿主細胞に発現ベクターを導入するために、例えば電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入法、リポフェクション法といった当該分野において周知の方法等の何れかの形質移入技術が、所定の宿主細胞種に適す場合に使用することが可能である。本発明によるベクターを形質移入された哺乳類宿主細胞は、一過的に（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ）または安定的に（ｓｔａｂｌｙ）形質移入された細胞株であるものとして解されるべき点に留意すべきである。従って、本発明によると、本発明による哺乳類発現ベクターは、エピソームにて維持することができ、または、哺乳類宿主細胞のゲノムに安定的に組み込むことができる。
【００２８】
一過的形質移入は、選択マーカーを有するベクターに対する何れかの選択圧の非適用によって特徴づけられる。一過的形質移入によりできる細胞のプールまたは一群（ｂａｔｃｈ）は、外因性ＤＮＡを取得し発現する細胞および外因性ＤＮＡを取得しなかった細胞を含む、蓄積された（ｐｏｏｌｅｄ）細胞集団である。形質移入後、一般に２０−５０時間にわたる一過的発現の実験において、形質移入されたベクターは、エピソーム因子として維持され、ゲノムにはまだ組み込まれない。すなわち、形質移入されたＤＮＡは、通常宿主細胞ゲノムに組み込まれない。宿主細胞は、一過的に形質移入された細胞プールの培養により、形質移入されたＤＮＡを失い、形質移入された細胞より過剰に増殖する傾向がある。従って、発現は、形質移入の直後に最も強く、時間とともに低下する。好ましくは、本発明による一過的な形質移入体は、形質移入後９０時間まで、選択圧がない細胞培養液にて維持される細胞であると理解される。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様において、例えばＣＨＯ宿主細胞といった哺乳類宿主細胞には、本発明による哺乳類発現ベクターを安定に形質移入できる。安定した形質移入とは、ベクターＤＮＡといった新たに導入された外因性ＤＮＡが、通常ランダムな、非相同的な組換えの現象によって、ゲノムのＤＮＡに組み込まれることを意味する。ベクターＤＮＡのコピー数および付随する遺伝子産物の量は、宿主細胞のＤＮＡへの組み込みの後にベクター配列が増幅された細胞株を選択することによって増大させることができる。従って、そのような安定した組換えは、遺伝子増幅に対する更なる選択圧にさらし、ＣＨＯ細胞における微小染色体（ｍｉｎｕｔｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）を倍加することで、作製される可能性がある。さらに、ベクター配列の場合、安定した形質移入により、組換え遺伝子産物の発現に直接関連していないベクター配列部位、例えば細菌のコピー数調節領域（ゲノムへの組み込みにおいて不要なもの与える）などが失われる可能性がある。従って、形質移入された宿主細胞は、発現ベクターの少なくとも一部または異なる一部がゲノムに組み込まれている。同様に、本発明による哺乳類発現ベクターの必須の要素の機能的等価体（すなわち、マウスＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロンに制御される異種性遺伝子産物）を少なくともｉｎ ｖｉｖｏで生じさせる２つまたは複数のＤＮＡ断片のＣＨＯ細胞への形質移入が、そのような形質転換された宿主細胞の定義に含まれる。断片化されたＤＮＡの形質移入後の、機能的ＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｖｏにおける組立て（ａｓｓｅｍｂｌｙ）は、例えばＷＯ ９９／５３０４６に記載される。
【００３０】
本発明の更なる側面は、以下の工程を含む、組換えタンパク質の生産のための方法に関する、
ａ）哺乳類宿主細胞または宿主細胞株に、マウスＣＭＶプロモーター、および組換えタンパク質をコードする配列に実施可能的につながった第１ｈＣＭＶイントロンを含む発現ベクターを形質移入すること
ｂ）細胞の成長および／または増殖ならびに組換えタンパク質の発現／産生を可能とする適切な条件の下、細胞を培養すること、および
ｃ）産生される組換えタンパク質を収集すること。
【００３１】
哺乳類宿主細胞または哺乳類宿主細胞株にベクターを形質移入する方法は、当該分野において周知である。本発明による方法において、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入法、リポフェクション法といった当該分野において周知の方法といった何れかの形質移入技術が、所定の宿主細胞種に適す場合に使用することが可能である。発明によると、宿主細胞に、安定的にまたは一過的に発現ベクターを形質移入することができる。
【００３２】
「宿主細胞」または「宿主細胞株」といった用語は、培養にて増殖できおよび所望のタンパク質組換え産物タンパク質を発現することができる何れかの細胞、特に哺乳類細胞を意味する。本発明の方法に使用される哺乳類宿主細胞は、ヒトまたは非ヒト細胞でありえる。好ましい実施態様において、形質移入に使用される哺乳類宿主細胞株は、何れかのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株とすることができる（Ｐｕｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９５８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １０８： ９４５−９５５）。適切な細胞株は、例えばＣＨＯ Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ ｐｒｏ３−、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ Ｐ１２またはｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞株ＤＵＫ−ＢＩＩ（Ｃｈａｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ７７， １９８０， ４２１６−４２２０）またはＤＵＸＢ１１（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８０， １９８３， ２４９５−２４９９）を含む。マウスサイトメガロウイルスの主要最初期遺伝子のプロモーター（ｍＣＭＶプロモーター）の転写活性は、ＣＨＯ細胞において非常に高いことが知られている。さらに、本発明による哺乳類発現ベクターがマウスＩｇＧ２ａ配列を含む場合、この配列は、本発明による発現ベクターによるＣＨＯ細胞の一過的な形質移入により、ＣＨＯ細胞における遺伝子発現を改善しさえするだろう。
【００３３】
哺乳類細胞株のための適切な培地および培養方法は、例えばＵＳ ５，６３３，１６２に記載されるように、当該分野において周知である。研究室のフラスコまたは低密度細胞培養のためのおよび特定の細胞種の要求に応じた標準的な細胞培養の例は、ロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＲＰＭＩ）１６４０培地（Ｍｏｒｒｅ， Ｇ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， １９９， ｐ．５１９ ｆ． １９６７）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒ． Ｊ． ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ， ７８， １ｐ．１７３ ｆｆ， １９６３）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小基本培地（ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ．５３， ｐ２８８ ｆｆ． １９６５）またはアルブミン、トランスフェリンおよびレシチンを欠くイスコーブ（Ｉｓｃｏｖｅｓ）改変ＤＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． ｍｅｄ． １， ｐ． ９２３ ｆｆ．， １９７８）を含むが、これらに限定されない。例えば、ハムＦ１０またはＦ１２培地は、ＣＨＯ細胞の培養のために特別に設計された。ＣＨＯ細胞の培養に特別に適すその他の培地は、ＥＰ−４８１ ７９１に記載される。そのような培養培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ウシ胎児血清ＦＣＳとも呼ばれる）を添加することができ、後者は、過度のホルモンおよび成長因子の天然の供給源を提供することが知られている。哺乳動物細胞の細胞培養は、今日では、科学分野の教科書およびマニュアルにて十分記載される日常的な操作であり、詳細は、例えば、Ｒ． Ｉａｎ Ｆｒｅｓｎｅｙの文献（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ， ａ ｍａｎｕａｌ， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ／Ｎ．Ｙ．， ２０００）に記載されている。
【００３４】
本発明の好ましい実施態様において、使用される細胞培養培地は、ウシ胎児血清（ＦＣＳまたはＦＢＳ）を欠いており、このことは「無血清（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ）」と呼ばれる。無血清培地において細胞は、一般に、最適な成長のために無血清培地にインスリンおよびトランスフェリンを必要とする。トランスフェリンは、非ペプチドキレート剤またはＷＯ ９４／０２５９２に記載されるようなトロポロンといったシデロホアによって少なくとも部分的に置換されてよく、または有利にビタミンＣのような酸化防止剤と関連して有機鉄の供給源のレベルを増大させてよい。ほとんどの細胞株は、例えば上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦＩ、ＩＧＦＩＩ）含む、１以上の合成的な成長因子（組換えポリペプチドを含む）を必要とする。必要となる可能性のあるその他のクラスの因子は、プロスタグランジン、輸送および結合タンパク質（例えば、セルロプラスミン、高および低密度リポタンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、ステロイドホルモンを含むホルモン、および脂肪酸を含む。ポリペプチド因子試験（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ）は、成長を刺激するような因子の存在下で新規のポリペプチド因子を試験する段階的な方法にて最適に行われる。それらの成長因子は、合成的または組換え体である。動物細胞の培養において周知のいくつかの方法論的アプローチが存在し、その典型は、以下に記載される。最初のステップは、細胞が、血清添加培地から移した後３−６日の間、生存しおよび／またはゆっくりと増殖する条件を得ることである。大部分の細胞種において、これは、少なくとも部分的に接種密度（ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｄｅｎｓｉｔｙ）が作用する。一旦最適なホルモン／成長因子／ポリペプチド添加が見つかれば、生存に必要な接種密度は小さくなるだろう。
【００３５】
好ましい別の実施態様において、細胞培養培地は、タンパク質を含まず、すなわち、胎児血清および個々のタンパク質成長因子添加物の両方または組換えトランスフェリンのような他のタンパク質を含まない。
【００３６】
別の実施態様において、組換え産物タンパク質の発現および収集に向けられる本発明の方法は、例えば産業的流加培養法における、動物宿主細胞の高密度の増殖を含む。それに続く（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）従来の処理をその後適用してもよい。従って、高密度増殖培地を使用しなければならない。そのような高密度増殖培地は、通常、全アミノ酸といった栄養素、上述した範囲のグルコースといったエネルギー源、無機塩類、ビタミン、微量元素（通常、終濃度がマイクロモルの範囲で存在する無機化合物として定義される）、緩衝剤、４つのヌクレオシドまたはそれらの対応するヌクレオチド、グルタチオン（還元型）といった酸化防止剤、ビタミンＣおよび重要な膜脂質といったその他の構成要素、例えばコレステロールまたはホスファチジルコリンまたは脂質前駆体（例えばコリンまたはイノシトール）を添加することができる。高密度培地は、大部分のまたは全てのこれらの化合物に富むと予想され、および、ＲＰＭＩ１６４０との比較によりＧＢ２２５１２４９から招かれ得るように、無機塩類（基本的に等張性である培地のモル浸透圧濃度を調節する）を除くそれらを、前述した標準培地よりも高い量で（強化されて）含む。好ましくは、本発明による高密度培地は、トリプトファン以外の全てのアミノ酸が７５ｍｇ／ｌ培地を上回るよう強化される。好ましくは、一般的なアミノ酸の必要量とともに、グルタミンおよび／またはアスパラギンは、高密度培地において１ｇ／ｌ、より好ましくは２ｇ／ｌ過剰である。本発明に関連して、高密度細胞培養は、少なくとも１０５細胞／ｍｌまたは１０５細胞／ｍｌを越える、好ましくは少なくとも１０６細胞／ｍｌまたは１０６細胞／ｍｌを越える生細胞の密度を一時的に有する動物細胞の集団であり、一定のまたは増加する培養容積の細胞培養培地において、単一の細胞またはより低い生細胞密度の接種細胞（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）から連続的に増殖した集団と定義される。
【００３７】
更なる好ましい実施態様において、本発明の方法は流加培養法を含む。流加培養法は、ＧＢ２２５１２４９に記載されるように、任意に１または複数のその他のアミノ酸、好ましくはグリシンと一緒に、少なくともグルタミンが細胞カルチャーに供給される培養システムであり、その供給は、異なる供給によるグルコース濃度の調節とは別に、培地におけるそれらの濃度を維持するために行われる。より好ましくは、グルタミンおよび任意な１または複数のその他のアミノ酸の供給は、ＥＰ−２２９ ８０９Ａで述べられるように、例えばグルコースといった１以上のエネルギー供給源の細胞培養への供給と組み合わせられる。供給は、通常、培養の開始後２５−６０時間に開始される；例えば、細胞が約１０６細胞／ｍｌの密度に達したときに供給を開始することが有用である。培養された動物細胞において、「グルタミノリシス（ｇｌｕｔａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ）」（ＭｃＫｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｇｌｕｔａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ，ｉｎ： Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ， ｅｄ． Ｍ．Ｊ． Ｍｏｒｇａｎ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． １１−１５０）は、増殖相の間の重要なエネルギー源としてよいことが当該分野において周知である。全グルタミンおよび／またはアスパラギン供給（アスパラギンによるグルタミンの置換のための供給、Ｋｕｒａｎｏ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５， １１３−１２８参照）は、通常、０．５から１０ｇ／ｌ培養体積、好ましくは１から２ｇ／ｌ培養体積の範囲である；供給に含むことができるその他のアミノ酸は、培地１リットルにつき１０から３００ｍｇの全供給量であり、特に、グリシン、リジン、アルギニン、バリン、イソロイシンおよびロイシンは、通常、その他のアミノ酸と比較して、少なくとも１５０から２００ｍｇの高い量で供給される。供給は、投げ入れ（ｓｈｏｔ−ａｄｄｉｔｉｏｎ）または連続的なポンプ供給で添加することができ、好ましくは、供給は、ほぼ連続的にバイオリアクターにポンプで送りこまれる。言うまでもなく、バイオリアクターにおける流加培養法の際、ｐＨは、塩基（ｂａｓｅ）または緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ）の添加により、所定の細胞株に最適な、おおよそ生理的なｐＨに慎重に調節される。グルコースが、エネルギー源として使用される場合、全グルコース供給量は、通常、１から１０ｇ／ｌ培地、好ましくは３から６ｇ／ｌ培地である。アミノ酸の含有とは別に、好ましくは５〜２０ｍｇ／ｌ培地の範囲の低い量のコリンを供給に含む。より好ましくは、そのようなコリンの供給は、ＵＳ６，０４８，７２８で基本的に述べられるように、エタノールアミンの添加と組み合わせられ、特にグルタミンの供給と組み合わせられる。言うまでもなく、ＧＳマーカーシステムの使用において、非ＧＳ発現システムと比較して、要求されるグルタミンの量は低い。というのは、内因的にできるグルタミンに加えて過剰なグルタミンの蓄積により、アンモニア産生および付随した毒性が生じるためである。ＧＳのために、培地または供給におけるグルタミンは、大部分は、その等価物および／または前駆体（すなわちアスパラギンおよび／またはグルタミン酸塩）によって置換される。
【００３８】
収集方法、すなわち細胞から得られたタンパク質の分離および／または精製方法、細胞培養方法、または細胞を培養する培地は、当該分野において周知である。タンパク質は、例えば、塩類または有機溶媒による分画沈殿（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー等によって、生物由来の物質から単離および／または精製することができる。
【００３９】
本発明のさらに別の側面は、第１ｈＣＭＶイントロンを用いて、哺乳類宿主細胞において組換えまたは異種性遺伝子産物を発現するためのｍＣＭＶプロモーターの活性を増加させる方法に関する。本発明のこの方法によると、ｍＣＭＶプロモーターからの望ましい異種性遺伝子産物の発現は、既存のベクター分子のｍＣＭＶプロモーター配列と所望のタンパク質をコードする遺伝子配列との間に、分子クローニング方法によってｈＣＭＶイントロンＡ配列を、ｍＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロンが実施可能的に異種性遺伝子配列につながるように挿入することで、増強することが可能である。分子クローニング方法は、当該分野において周知であり、および例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ． およびＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．の、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９））に記載される。その後、ＣＨＯ細胞といった哺乳類宿主細胞に、このように構築したベクター構築物（ｍＣＭＶプロモーターと、下流に位置し所望のタンパク質をコードする異種性のＤＮＡ配列との間に、第１ｈＣＭＶイントロンを含む）を形質移入する。形質移入体を、その後、細胞の成長および／または増殖ならびに組換えタンパク質の発現／生産を可能とするのに適切な条件のもと培養する。最後に、生産された組換えタンパク質を収集、すなわち単離および精製する。本発明の方法における第１ｈＣＭＶイントロンの使用によって、組換えタンパク質がｍＣＭＶプロモーターから発現する効率を有意に増強し、より高い発現レベルで組換えタンパク質を得ることが可能となる。このように、本発明によると、組換え遺伝子の発現がｍＣＭＶプロモーターのみによって駆動される、既存の発現ベクターの発現効率を改善することが可能である。
【００４０】
本発明は、それゆえ、ｍＣＭＶプロモーターの活性を改善するための第１ｈＣＭＶイントロンの使用に関するものでもある。
【００４１】
本発明は、以下の実施例によって更に詳細に説明される。
【実施例】
【００４２】
材料および方法
使用した細胞
ＣＨＯ細胞株ＣＨＯＫ１ＳＶ：細胞株ＣＨＯ−Ｋ１の変種であり、懸濁液および無タンパク質培地での増殖に適していた。
【００４３】
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞の増殖：
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞は、懸濁振盪フラスコで、６ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて日常的に増殖させた。播種濃度は２ｘ１０５細胞／ｍｌとした。細胞は４日ごとに分裂する。フラスコに５％ＣＯ２を供給し、１４０ｒｐｍの環状振盪で、３６．５℃（３５．５℃および３７．０℃の間）でインキュベートした。
【００４４】
安定的形質移入：
形質移入に使用する細胞は、以前に詳述したように細胞懸濁培養で培養した。増殖する培養液由来の細胞を、遠心し無血清培地で一度洗浄し、１．４３ｘ１０７細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。０．７ｍＬの細胞懸濁液および４０μｇのプラスミドＤＮＡを、電気穿孔法用キュベットに添加した。次にキュベットを電気穿孔法装置に設置し、２５０Ｖおよび４００μＦのシングルパルスを送った。形質移入の後、１０％ｄＦＣＳを添加した非選択的ＤＭＥＭベースの培地を用いて、細胞を、約２，５００宿主細胞／ウェル（５ｘ１０４／ｍＬ）で、９６ウェルプレートに分配した。プレートを、１０％ＣＯ２の下、３６．５℃（３５．５℃および３７．０℃の間）でインキュベートした。
【００４５】
形質移入の日後、１０％ｄＦＣＳ／６６μＭ Ｌ−メチオニンスルホキシミン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）を添加したＤＭＥＭベース培地を、それぞれのウェルに添加し（１５０μＬ／ウェル）、Ｌ−メチオニンスルホキシミンの終濃度を５０μＭとした。プレートをモニターし、形質移入していない細胞が死ぬとき、および形質移入された細胞の中心（ｆｏｃｉ）が現れたときを測定した。形質移入された細胞の中心は、形質移入から約３〜４週後に現れた。試験したおよび増殖した細胞株は全て、単一のコロニーのみを含むウェルから更に生じたものであった。
【００４６】
静置培養における、細胞株の生産性の評価
９６ウェルの形質移入プレートを、約３週間インキュベートしてコロニー形成させた。できたコロニーを顕微鏡によって調べ、コロニーが分析に適切なサイズ（ウェルの底面の６０％超を覆っている）であるか、および各々のウェルにたった１コロニーが存在するかを検証した。
【００４７】
適切なコロニーを、１ｍＬの選択増殖培地（ＤＭＥＭベース培地／１０％ｄＦＣＳ／２５μＭ Ｌ−メチオニンスルホキシミン）を含む２４ウェルプレートのウェルに移した。これらの培養液を、１０％ＣＯ２下で、３６．５℃（３５．５℃および３７．０℃の間で）で１４日間インキュベートした。各々のウェルの上清を収集し、プロテインＡ ＨＬＰＣ法によって存在する抗体の濃度を分析した。
【００４８】
ＥＬＩＳＡの組み立て：
サンプルの抗体濃度は、構築したヒトＩｇＧを評価するサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して決定した。これは、抗ヒトＦｃ抗体で覆った９６ウェルプレート上への、サンプルおよび標準物の捕獲を含むものであった。結合した抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼが繋がった抗ヒト軽鎖および色素生産性基質ＴＭＢを用いて検出した。標準物と比較した場合、発色はサンプル中の抗体の濃度と比例した。
【００４９】
プロテインＡ ＨＰＬＣ：
ＩｇＧの測定のためのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー方法は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣにて行った。ＩｇＧ産物は、ＰｏｒｏｓプロテインＡ免疫検出カラムに選択的に結合する。非結合物質をカラムから洗浄し、残留する結合抗体を、溶媒のｐＨを低下させて放出させた。溶出物を２８０ｎｍにおける吸光度にてモニターし、産物を一般的な抗体標準物に対して定量化し（Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用）、吸光係数の違いについて修正を行った。
【００５０】
ベクターの構築
【表１】
2008536506.tif 000003
【００５１】
プライマー１から９の配列は、配列表にてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１から９として示される。
【００５２】
ベクターＤｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４の作製
ベクターＤｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４は、ＧＳベクターｐＥＥ１２．４内にあるＲＥサイトＢｇｌＩＩとＳｓｐＢＩとの間の、ｈＣＭＶプロモーター領域の一部と、ＰＣＲ断片とを交換することで作製した。これによって、３’末端にＡｓｃＩサイトが導入される。このために、フォワードプライマー１およびリバースプライマー２を使用した（表１参照）。
【００５３】
両ＰＣＲプライマーを、ＤＮＡテンプレートとしてのベクターｐＥＥ１２．４のＤＮＡとともに、ＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ産物は以下の配列を有する（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １０）。
【化１】
2008536506.tif 000004
【００５４】
図１は、このようにして得られたベクターＤｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４の物理地図を示す。ベクターＤｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４は、ｍＣＭＶプロモーターのショート断片（ｓｈｏｒｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ）のクローニングのために使用した。
【００５５】
ｍＣＭＶプロモーターのショート断片の、ベクターＤｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４へのクローニング
ｍＣＭＶショート断片は、フォワードプライマー３およびリバースプライマー４を用いてＰＣＲによって増幅した。テンプレートとして、ｍＣＭＶプロモーターを含むｍＣＭＶ ＤＮＡ（バーミンガム大学Ｃｌｉｖｅ Ｓｗｅｅｔ博士によるご厚意）を用いた。ＰＣＲ増幅の模式図を図２に示す。
【００５６】
このように得られたＰＣＲ断片（０．５ｋｂ）は、ｍＣＭＶショート断片を表し、以下の配列を有する（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １１；プライマー配列に下線を施し、制限サイトを太字で示す）。
【化２】
2008536506.tif 000005
【００５７】
図３に模式的に示したこの断片は、予めＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したベクターＤｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４にクローン化した。これによって、ベクターにおけるヒトＣＭＶ配列の５’−ＵＴＲおよびイントロンＡ領域が除去される。
【００５８】
ベクターＤｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４への、ｍＣＭＶショートイントロンＡ領域のクローニング
ｍＣＭＶショート断片およびヒトイントロンＡ断片は、２つの別々のＰＣＲ反応にて作製し、その後以下のように一緒に連結させた。
【００５９】
ａ）ｍＣＭＶショート断片の増幅およびクローニング
ｍＣＭＶショート断片の増幅のために、フォワードプライマー５およびリバースプライマー６を使用した。ＰＣＲ増幅のスキームを図２に示す。
【００６０】
このようにして得られたＰＣＲ産物は、以下の配列を有する（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １２； プライマー配列に下線を施し、制限サイトを太字で示す）。
【化３】
2008536506.tif 000006
【００６１】
このＰＣＲ断片をクローニングベクターｐＣＲ４−ＴＯＴＯ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、これによってベクターｐＣＲ−４−ＴＯＴＯ ＋ ｍＣＭＶショートが得られた。
【００６２】
ｂ）ヒトイントロンＡ断片の増幅およびクローニング
ヒト５’−ＵＴＲ−イントロンＡ断片の増幅のために、フォワードプライマー７およびリバースプライマー８を使用した。テンプレートＤＮＡとして、ベクターｐＥＥ１２．４を用いた。
【００６３】
得られたＰＣＲ産物は以下の配列を有する（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １３； プライマー配列に下線を施し、制限サイトを太字で示す）。
【化４】
2008536506.tif 000007
【００６４】
このようにして得られたＰＣＲ断片を、クローニングベクターｐＣＲ４−ＴＯＴＯ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、これによってベクターｐＣＲ４−ＴＯＴＯ ＋イントロンＡを得た。
【００６５】
ｃ）ｍＣＭＶ−ショート−イントロンＡ断片の連結
ショートｍＣＭＶプロモーター断片を含むｍＣＭＶ−ショートＰＣＲ産物を、ベクターｐＣＲ４−ＴＯＴＯ ＋ ｍＣＭＶショートからＡｓｃＩおよびＢｓｕ３６Ｉで切り出し、ベクターｐＣＲ４−ＴＯＴＯ ＋ イントロンＡにクローン化した。これによって、ベクターｐＣＲ４−ＴＯＴＯ １ ｍＣＭＶ−イントロンＡを得た。このベクターから、ｍＣＭＶプロモーターおよび第１ヒトイントロンＡを含む断片ｍＣＭＶ−ショート−イントロンＡをＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切り出した。この断片の構造は、模式的に図４に示してある。この断片の配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １４）は、以下の通りである（プライマー配列に下線を施し、制限サイトを太字で示す）。
【化５】
2008536506.tif 000008
【００６６】
この断片を次に、ＡｓｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトを用いて、上述のような、ＧＳベクターｐＥＥ１２．４の改変バージョン、Ｄｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４ベクターにクローン化し、これによって、Ｄｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４−ｍｃｍｖ／ｉｎｔが得られた。
【００６７】
ｍＣＭＶプロモーターのショート断片の、ベクターｐＥＥ６．４へのクローニング
ｍＣＭＶ−ショート断片を、フォワードプライマー９およびリバースプライマー４を用いて、ＰＣＲによって増幅した。テンプレートとして、ｍＣＭＶプロモーターを含むｍＣＭＶ ＤＮＡを用いた。ＰＣＲ増幅のスキームは図２に概略が示される。
【００６８】
このようにして得られたＰＣＲ産物（０．５ｋｂ）は、ｍＣＭＶ−ショート断片を表し、以下の配列を有する（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １５； プライマー配列に下線を施し、制限サイトを太字で示す）。
【化６】
2008536506.tif 000009
【００６９】
この断片は、図３のものと非常に似ているが、ＡｓｃＩサイトに加えてＮｏｔＩサイトを有している。断片を、予めＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したベクターｐＥＥ６．４にクローン化した。このようにして、ベクターｐＥＥ６．４−ｍＣＭＶショートを作製した。
【００７０】
ｍＣＭＶ−ショートイントロンＡ断片の、ベクターｐＥＥ６．４へのクローニング
ｍＣＭＶ−ショート断片およびヒトイントロンＡ断片を、以下のように、別々のＰＣＲ反応によって作製し、その後一緒に連結させた。
【００７１】
ａ）ｍＣＭＶ−ショート断片の増幅およびクローニング
ｍＣＭＶ−ショート断片の増幅のために、フォワードプライマー９およびリバースプライマー６を使用した（表１）。ＰＣＲ増幅のスキームは図２に概略が示される。
【００７２】
このようにして得られたＰＣＲ産物（ｍＣＭＶショート−ｐＥＥ６．４）は以下の配列を有する（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １６； プライマー配列に下線を施し、制限サイトを太字で示す）。
【化７】
2008536506.tif 000010
【００７３】
このＰＣＲ断片を、クローニングベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯ ＋ イントロンＡにクローン化し、この結果、ベクターｐＣＲ４−ＴＯＴＯ−ｍＣＭＶショート（ｐＥＥ６．４）が得られた。
【００７４】
ｂ）ｍＣＭＶ（ｐＥＥ６．４）−ショート−イントロンＡ断片の連結
ショートｍＣＭＶプロモーター断片を含むｍＣＭＶ−ショート（ｐＥＥ６．４）ＰＣＲ産物を、ＡｓｃＩおよびＢｓｕ３６Ｉで、ｐＣＲ４−ＴＯＴＯ−ｍＣＭＶショート（ｐＥＥ６．４）から切り出し、ベクターｐＣＲ４−ＴＯＴＯ ＋ イントロンＡにクローン化し、これによって、ベクターｐＣＲ４−ＴＯＴＯ １ ｍＣＭＶ（ｐＥＥ６．４）−イントロンＡを得た。このベクターから、ｍＣＭＶプロモーターおよび第１ヒトイントロンＡを含む断片ｍＣＭＶ−ショート（ｐＥＥ６．４）−イントロンＡを、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切り出した。この断片の構造は、図４に模式的に示されるものと、５’末端にＮｏｔＩサイトが新たに導入された以外は、同一である。この断片の配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １７）は以下の通りである（プライマー配列に下線を施し、制限サイトを太字で示す）。
【化８】
2008536506.tif 000011
【００７５】
タンパク質発現研究
抗体発現研究の目的は、ｍＣＭＶプロモーターまたはｈＣＭＶプロモーターのどちらかの調節による、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞におけるＩｇＧ４／ｋａｐｐａ抗体の発現を比較することであった。
【００７６】
それゆえ、ＩｇＧ４／ｋａｐｐａ抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方をそれぞれ含むように、ＩｇＧ４／ｋａｐｐａ抗体ｃＢ７２．３の発現のための二重遺伝子ベクターを構築した。ここにおいてそれぞれの遺伝子は、同一の調節単位に別々に調節される。
【００７７】
抗体ｃＢ７２．３の重鎖および軽鎖をコードする完全な領域を、別々に、現存のベクターからＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩでクローン化して出し、上述のように作製したベクターにクローン化した：軽鎖は（ｉ）Ｄｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４＋ｍＣＭＶおよび（ｉｉ）Ｄｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４／ｍＣＭＶ＋イントロンＡに、および重鎖コード断片は（ｉ）ｐＥＥ６．４−ｍＣＭＶおよび（ｉｉ）ｐＥＥ６．４−ｍＣＭＶ＋イントロンＡにクローン化した。
【００７８】
二重遺伝子ベクターは、全てのベクターをＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化し、適切な断片（ＣＭＶプロモーターおよび抗体鎖コード配列）を一緒にクローニングすることで作製した。そのようにして、２つの二重遺伝子ベクター、すなわち、Ｄｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４＋ｍＣＭＶおよびｐＥＥ６．４−ｍＣＭＶからの適した断片を含むベクターｐｃＢ７２．３−ｍＣＭＶ（図５）、およびＤｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４／ｍＣＭＶ＋イントロンＡおよびｐＥＥ６．４−ｍＣＭＶ＋イントロンＡからの適した断片を含むベクターｐｃＢ７２．３−ｍＣＭＶ＋イントロンＡ（図６）を作製した。ベクターｐｃＢ７２．３−ｍＣＭＶにおいて、抗体発現は、ｍＣＭＶプロモーターに駆動される。ベクターｐｃＢ７２．３−ｍＣＭＶ＋イントロンＡにおいて、抗体発現は、ｍＣＭＶプロモーターおよび第１ヒトＣＭＶイントロンに駆動される。
【００７９】
対照となるベクター、ｐｃＢ７２．３（図７）は、ヒトＣＭＶプロモーターおよびヒトイントロンＡの調節のもと、同一の重鎖および軽鎖コード領域を含む。
【００８０】
これらの構築物を、安定的形質移入によってＣＨＯ細胞に導入し、抗体発現を研究した。
【００８１】
これらの実験の結果を図８に示す。図８から、安定的に形質移入されたＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞における、ｍＣＭＶプロモーターおよびｈＣＭＶイントロンからなる調節単位からのＩｇＧ４／ｋａｐｐａ抗体の発現レベルが、ショートｍＣＭＶプロモーターのみからの発現よりもずっと高いことがわかる（ｐ＜０．０００１において統計学的に有意）。さらに、これは、ｈＣＭＶプロモーターおよびｈＣＭＶイントロンからの抗体発現レベルに相当する。従って、ｍＣＭＶプロモーターおよびｈＣＭＶイントロンからなる調節単位からの異種性タンパク質の発現は、少なくともｈＣＭＶプロモーターおよびｈＣＭＶイントロンＡからの発現と同程度に良い。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図３に表されるショートｍＣＭＶプロモーターならびに図４で表されるｍＣＭＶヒトイントロンＡ断片（ショートｍＣＭＶプロモーターおよびヒトイントロンＡを含む）を含む、ｍＣＭＶ（ショート）−Ｅｘ１ ＰＣＲ産物のクローニングに使用される、ベクターＤｅｌｔａ−ｐＥＥ１２．４の物理地図。
【図２】ｍＣＭＶプロモーターのＰＣＲ増幅のために使用されるｍＣＭＶテンプレートの物理地図。使用される様々なプライマーの位置が示される。
【図３】ｍＣＭＶプロモーター＋第１ヒトＣＭＶイントロンを含む断片ｍＣＭＶ−ヒトイントロンＡを得るために、イントロンＡ−ＰＣＲ断片の連結に使用される、ショートｍＣＭＶプロモーターを含むｍＣＭＶ（ショート）−Ｅｘ１ ＰＣＲ産物の物理地図。
【図４】ｍＣＭＶプロモーター＋第１ヒトＣＭＶイントロンを含む断片ｍＣＭＶヒトイントロン Ａの物理地図。
【図５】ヒトＩｇＧ４／Ｋａｐｐａ抗体を発現するための二重遺伝子発現ベクターｐｃＢ７２．３−ｍＣＭＶのプラスミド地図。ここにおいて、抗体の発現は、ショートｍＣＭＶプロモーターに制御される。ベクターは更に、選択可能なＧＳマーカー遺伝子を含む。
【図６】ヒトＩｇＧ４／Ｋａｐｐａ抗体の発現のための二重遺伝子発現ベクターｐｃＢ７２．３−ｍＣＭＶ＋イントロンＡのプラスミド地図。ここにおいて、抗体の発現は、ショートｍＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロンに制御される。ベクターは更に、選択可能なＧＳマーカー遺伝子を含む。
【図７】ヒトＩｇＧ４／Ｋａｐｐａ抗体を発現するための二重遺伝子発現ベクターｐｃＢ７２．３のプラスミド地図。ここにおいて、抗体の発現は、ｈＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロンに調節される（対照）。ベクターは更に、選択可能なＧＳマーカー遺伝子を含む。
【図８】ショートｍＣＭＶプロモーターのみ、ｍＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロン、ならびにｈＣＭＶプロモーターおよび第１ｈＣＭＶイントロン（対照）からの、安定的に形質移入されたＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞におけるＩｇＧ４／Ｋａｐｐａ抗体の相対的な発現レベル。
【図１】
2008536506.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008536506.tif 000016
【図６】
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【図７】
2008536506.tif 000018
【図８】
2008536506.tif 000019
【配列表】
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【国際調査報告】
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