(57)【要約】  多形とメタボリックシンドローム、肥満、治療誘発性体重増加及びインスリン抵抗性の相関を提供する。メタボリックシンドローム、肥満、治療誘発性体重増加及びインスリン抵抗性の診断及び治療方法も提供する。メタボリックシンドローム、肥満、治療誘発性体重増加及びインスリン抵抗性の診断及び治療用システム及びキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体又は生体に由来する生体サンプルについて治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型を同定する方法であって、
ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、及びＨＳＦ２から選択される蛋白質をコードする遺伝子又は前記遺伝子に密接に連鎖する遺伝子座の多形として、治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型に関連する多形を生体又は生体サンプルで検出する段階と；
治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型と前記多形を相関させることにより、治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型を同定する段階を含む前記方法。
【請求項２】
メタボリックシンドローム表現型がインスリン抵抗性又は中心性肥満を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療誘発性体重増加表現型が非定型抗精神病薬治療により誘発される体重増加を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
治療誘発性体重増加表現型がオランザピン治療により誘発される体重増加を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生体が哺乳動物であるか、又は生体サンプルが哺乳動物に由来する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生体がヒト患者であるか、又は生体サンプルがヒト患者に由来する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
検出段階が多形又は多形に関連する配列を増幅する段階と、得られたアンプリコンを検出する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
増幅段階が、
ａ）前記遺伝子もしくは密接に連鎖する多形の少なくとも一部、又はその近接配列に相補的又は部分的に相補的であり、核酸鋳型でポリメラーゼによる核酸重合を開始することが可能な増幅用プライマー又は増幅用プライマー対を生体又は生体サンプルから単離した核酸鋳型と混合する段階と；
ｂ）ポリメラーゼと鋳型核酸を含むＤＮＡ重合反応でプライマー又はプライマー対を伸長させてアンプリコンを生成する段階を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アンプリコンをアレーとハイブリダイズさせる方法、アンプリコンを制限酵素で消化する方法、又はリアルタイムＰＣＲ分析の１種以上を含む方法によりアンプリコンを検出する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
アンプリコンを部分的又は完全に配列決定する段階を含む請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
増幅段階が生体又は生体サンプルから単離した核酸をＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、又はＬＣＲの鋳型として使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を実施する段階を含む請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
多形がＳＮＰである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
多形が付表１に記載の対立遺伝子から構成される群から選択される対立遺伝子を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
密接に連鎖する遺伝子座が遺伝子から約５ｃＭ以下に位置する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
多形を相関させる段階が多形の対立遺伝子と表現型の相関を含むルックアップテーブルを参照する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
生体が非ヒト哺乳動物であり、方法が表現型に基づいて非ヒト哺乳動物集団から非ヒト哺乳動物を選択する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
得られた選択非ヒト哺乳動物を別の非ヒト哺乳動物と交配し、１頭以上の子孫で表現型を最適化する段階を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型のモジュレーターの同定方法であって、
ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、及びＨＳＦ２から選択される蛋白質をコードする遺伝子又は遺伝子産物と潜在的モジュレーターを接触させる段階と；
遺伝子又は遺伝子産物に及ぼす潜在的モジュレーターの効果を検出することにより、潜在的モジュレーターが治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型を調節するか否かを識別する段階を含む前記方法。
【請求項１９】
メタボリックシンドローム表現型がインスリン抵抗性又は中心性肥満を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
治療誘発性体重増加表現型がオランザピン治療により誘発される体重増加を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子又は遺伝子産物が付表１に記載の多形から構成される群から選択される多形を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
効果が、
（ａ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、又はＨＳＦ２の発現増減；
（ｂ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＰＰＡによるＩＧＦＢＰ４の開裂増減；
（ｃ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＭによるペプチド開裂の触媒増減；
（ｄ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＰＰＡによるＩＧＦＢＰ４の開裂増減；
（ｅ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＭによるペプチド開裂の触媒増減；
（ｆ）モジュレーターの存在下におけるｐｆ２０及び／又はＤＮＡＨ１１を含む繊毛の機能変化；
（ｇ）モジュレーターの存在下におけるＰＫＤ１遺伝子産物ポリシスチン−１とＰＫＤ２遺伝子産物ポリシスチン−２の会合（親和性等）変化；
（ｈ）モジュレーターの存在下における原形質膜に対するポリシスチン−２の局在変化；
（ｉ）モジュレーターの存在下におけるポリシスチン−１を含むチャネルの活性変化；
（ｊ）モジュレーターの存在下におけるＫＣＮＭＡ１遺伝子産物の局在変化；及び
（ｋ）モジュレーターの存在下におけるＫＣＮＭＡ１遺伝子産物を含むチャネルの活性変化から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、肥満素因表現型又はインスリン抵抗性表現型の治療用キットであって、請求項１８に記載の方法により同定されたモジュレーターと、治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、肥満素因表現型又はインスリン抵抗性表現型を治療するために患者に化合物を投与するための説明書を含む前記キット。
【請求項２４】
メタボリックシンドローム表現型が肥満素因又はインスリン抵抗性表現型である請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
生体又は生体に由来する生体サンプルについて治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型を同定するためのシステムであって、
ａ）メタボリックシンドローム表現型に関連しており、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、もしくはＨＳＦ２をコードする１種以上の遺伝子又は連鎖する遺伝子座の少なくとも１個の対立遺伝子を検出するように構成されたマーカープローブ又はプライマーセットと；
ｂ）マーカープローブもしくはプライマーセット、又はマーカープローブもしくはプライマーセットから生成されたアンプリコンからの１個以上のシグナル出力を検出することにより、対立遺伝子の有無を識別するように構成された検出器と；
ｃ）予想される治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型と対立遺伝子の有無を相関させることにより、生体又は生体に由来する生体サンプルについてメタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型を同定するシステム命令を含む前記システム。
【請求項２６】
メタボリックシンドローム表現型がインスリン抵抗性又は中心性肥満を含む請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
治療誘発性体重増加表現型がオランザピン治療により誘発される体重増加を含む請求項２５に記載のシステム。
【請求項２８】
マーカープローブセットが付表１に記載のヌクレオチド配列を含む請求項２５に記載のシステム。
【請求項２９】
検出器が１種以上の発光を検出し、発光が対立遺伝子の有無を示す請求項２５に記載のシステム。
【請求項３０】
命令が対立遺伝子の有無とメタボリックシンドローム、治療誘発性体重増加、インスリン抵抗性又は肥満素因の相関を含む少なくとも１個のルックアップテーブルを含む請求項２５に記載のシステム。
【請求項３１】
システムがサンプルを含む請求項２５に記載のシステム。
【請求項３２】
サンプルがゲノムＤＮＡ、増幅ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又は増幅ＲＮＡを含む請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
サンプルが哺乳動物に由来する請求項３１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願はＵＳＳＮ  ６０／６３５，２８１、発明の名称「メタボリックシンドローム、肥満及びインスリン抵抗性のマーカー（Ｍａｒｋｅｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」、発明者ＣｏｘとＢａｌｌｉｎｇｅｒ、出願日２００４年１２月９日；ＵＳＳＮ  ６０／６４３，００６、発明の名称「メタボリックシンドローム、肥満及びインスリン抵抗性のマーカー（Ｍａｒｋｅｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」、発明者ＣｏｘとＢａｌｌｉｎｇｅｒ、出願日２００５年１月１１日；及びＵＳＳＮ  ６０／７１１，８０２、発明の名称「メタボリックシンドローム、肥満及びインスリン抵抗性のマーカー（Ｍａｒｋｅｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」、発明者ＣｏｘとＢａｌｌｉｎｇｅｒ、出願日２００５年８月２５日の優先権と特典を主張し、各々その開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドロームは心臓病、卒中、及び糖尿病の発症の危険を増す健康障害又は危険の総称である。この疾患はシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群、及び代謝異常症候群等の名称でも知られる。メタボリックシンドロームはインスリン抵抗性及び／又は肥満素因表現型等の各種基本的代謝表現型のいずれかを含むことができる。
【０００３】
メタボリックシンドロームは多数の代謝障害又は危険因子のいずれかにより特徴付けられることが多く、これらの因子の２種以上が単一個体に存在する場合に一般にメタボリックシンドロームの最典型であるとみなされる。これらの因子としては、中心性肥満（腹部及びその周囲の不均衡な脂肪組織）、粥腫発生腫異常症（例えば動脈壁を含む血管系でプラーク蓄積を助長し得る高トリグリセリドや低ＨＤＬコレステロール等の一群の血中脂肪障害）、高血圧（１３０／８５ｍｍＨｇ以上）、インスリン抵抗性又はグルコース不耐（インスリン又は血糖を適正に使用できない）、（例えば高血中フィブリノーゲン又はプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター［−１］値を特徴とする）慢性易血栓形成状態、及び（例えば正常値よりも高い血中高感受性Ｃ反応性蛋白を特徴とする）慢性易炎症性状態が挙げられる。メタボリックシンドローム患者は冠状動脈性心臓病、動脈壁のプラーク蓄積に関連する他の疾患（例えば卒中や末梢血管疾患）及び２型糖尿病の危険が高い。
【０００４】
更に、各種環境因子のいずれかに暴露された患者集団に肥満、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性及び／又は同等疾患の素因が生じる可能性がある。例えば、肥満素因は現代食摂取時の単なる体重増加素因として発現する場合もあるし、特定誘発イベントの結果として生じる場合もある。肥満の原因となる１つの因子は「治療誘発性体重増加」と呼ばれ、各種治療レジメンを受ける患者に生じる重大な体重問題である。例えば、抗精神病治療（例えば非定型抗精神病薬、例えばオランザピンを使用する治療）中に観察される治療誘発性体重増加は重大な臨床問題であり、肥満、メタボリックシンドローム及びインスリン抵抗性と全く同様に、治療誘発性体重増加にも遺伝的因子が大きな役割を果たしていると思われる。実際に、治療誘発性体重増加の体重増加における遺伝的関与については候補遺伝子アプローチを使用して調査されている（例えばＭｕｌｌｅｒら（２００４）“Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．４９：３０９−３２９）。セロトニン５−ＨＴ２ｃ受容体遺伝子（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら（２００２）“Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ  ｗｉｔｈ  ５−ＨＴ２ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ”Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：２０８６−２０８７）やＣＹＰ２Ｄ６（Ｅｌｌｉｎｇｒｏｄら（２００２）“ＣＹＰ２Ｄ６  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ．”Ｐｓｖｃｈｉａｔｒ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５−５８）等の候補遺伝子との有意関連が報告されているが、マイナスの結果も記載されている（Ｍｕｌｌｅｒら（２００４）“Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．２００４；４９：３０９−３２９，Ｈｏｎｇら“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈａｎｇｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｌｏｚａｐｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：２６５−２６８）。一致した結果が得られていないため、報告されている数件の関連の意義は確定していない。
【０００５】
メタボリックシンドロームは特に米国で非常に一般的であり、米国では約５０００万人が罹患していると考えられる。米国人のほぼ５人に１人がメタボリックシンドロームである。メタボリックシンドロームの患者数は年齢と共に増加し、６０代と７０代では４０％を越える。メタボリックシンドロームの基礎原因は多くの点で全く不明であるが、肥満や身体活動低下等の障害の所定効果も実際に原因となることが多い。障害の遺伝パターンによると、メタボリックシンドロームの原因には遺伝的因子もあると思われる。
【０００６】
例えば、メタボリックシンドローム患者には一般に肥満の原因となるインスリン抵抗性の遺伝的素因をもつものがある。他方、肥満がインスリン抵抗性を誘発する場合もある。従って、大半のインスリン抵抗性患者が中心性肥満であることは事実であるが、インスリン抵抗性が中心性肥満の原因であるのか、中心性肥満がインスリン抵抗性の原因であるのかは必ずしも明らかではない。（分子レベルでの）インスリン抵抗性と代謝危険因子の間の基礎生体メカニズムは十分に解明されておらず、極めて複雑であると思われる。
【０００７】
メタボリックシンドロームは数種の相互作用する遺伝的因子と環境因子の結果であると思われるばかりでなく、メタボリックシンドロームの診断基準も多少の変動がある。“Ｔｈｉｒｄ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  （ＮＣＥＰ）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ（Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩＩ）”により代謝障害診断に最も適切であるとみなされている基準が広く使用されている現行診断基準の１つである。
【０００８】
ＮＣＥＰ基準によると、（１）胴囲により測定した中心性肥満（女性では胴囲＞３５インチ；男性では＞４０インチ）；（２）空腹時血中トリグセリド値１５０ｍｇ／ｄＬ以上；（３）血中ＨＤＬコレステロール（女性では５０ｍｇ／ｄＬ未満、男性では４０ｍｇ／ｄＬ未満）；（４）血圧１３０／８５ｍｍＨｇ以上；及び（５）空腹時血糖値１１０ｍｇ／ｄＬ以上のうちの３項目以上に１人の患者が該当する場合にメタボリックシンドロームてあると臨床的に判断することができる。インスリン抵抗性（例えば空腹時血中インスリン値上昇）、易血栓形成状態又は易炎症性状態等の他の特徴は一般に臨床診断には必要ないが、確実にメタボリックシンドロームの徴候であり、これらの属性の追跡調査を使用してメタボリックシンドロームの診断を更に確認することができる。例えば、インスリン抵抗性はＮＣＥＰ基準に該当しない場合でもメタボリックシンドロームの徴候であることが多い。
【０００９】
メタボリックシンドローム、肥満、治療誘発性体重増加、インスリン抵抗性等の治療方法としては減量と運動（これらの最も安全で最も有効な２種の治療方法は実際には極めて達成しにくいことが多い）や、食事変更等の各種臨床アプローチが挙げられる。これらの食事変更としては、糖質を総カロリーの５０％以下に制限する食事の維持；（白パンでなく）全粒パン、（白米でなく）玄米、未精製糖等の複合糖質と定義される食品の摂取、マメ科（例えば、豆類）、全粒、果物及び野菜の摂取による繊維消費量増加、赤身肉及び家禽肉摂取量低下、オリーブ油、亜麻仁油及びナッツ類等の「健康によい」脂肪の消費、アルコール摂取量低下等が挙げられる。更に、血圧と血中トリグセリド値は血液凝固障害（例えばアスピリン投与）や一般に易血栓形成状態又は易炎症性状態と同様に各種市販薬（例えばコレステロール調節薬）により調節することができる。メタボリックシンドロームが糖尿病を誘発する場合には、当然のことながら、上記のものを含むこの疾患に利用可能な多くの治療法をインスリン治療と併用する。
【００１０】
このように、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因、インスリン抵抗性等には食事と運動、薬物療法等の各種治療方法があるが、これらの障害の分子基礎が不明であるため、これらの代謝障害の診断は問題があり、これらの障害を治療するための治療薬の設計は極めて困難である。
【００１１】
しかし、例えばメタボリックシンドロームの分子基盤の解明が進んでいないわけではない。例えば、脳が血糖値と末梢からの神経シグナルを評価することによりエネルギー需要をモニターすることは明らかである。脳におけるグルコース感知とエネルギー恒常性のメカニズムはＬｅｖｉｎら（１９９９）“Ｂｒａｉｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｅｎｅｒｇｙ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ：ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ”  Ａｍ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７６  （ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）Ｒ１２２３−Ｒ１２３１により記載されている。脳はグルコース値を直接感知すると共に末梢のグルコースセンサーからの神経入力を受容することができる各種ニューロンをもつ。例えば、脳内グルコース値が上昇すると、グルコース応答性（ＧＲ）ニューロンはその発火率を上げ、グルコース感受性（ＧＳ）ニューロンは下げる。ＧＲニューロンはＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネルを使用してニューロン発火率を調節するが、ＧＳニューロンのメカニズムは不明である。糖尿病と肥満（メタボリックシンドロームの主要原因又は結果）はいずれも脳内グルコース感知の変化に関係がある。ＧＲニューロンは食事により肥満と高インスリン血症を誘発した動物でグルコースに対する応答性が低下する。インスリン依存性糖尿病ラットはＧＲニューロンと脳内グルコース感知に関与する神経伝達系に異常があることが示されている。しかし、肥満と糖尿病の病理生理でエネルギーバランスの生理的調節における脳内グルコース感知の役割は不明である。
【００１２】
少なくとも１件の報告（Ｍａｅｋａｗａら（２０００）“Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ−Ｌｉｋｅ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｌｏｗｅｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｓｔｅｍ：ｆｏｒ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｒａｉｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ０Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，”  Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４１（１）：３７５−３８４）は脳内のグルコース感知装置の位置が上衣細胞、内皮細胞及び多数のセロトニン作動性ニューロンを含むことを示唆している。この報告では、免疫組織化学的アプローチを使用し、膵臓β細胞のグルコース感知装置における必須酵素である膵臓グルコキナーゼ（「ＧＫ」）に対する抗体に対して免疫反応性の脳細胞及びサブ細胞位置を同定している。ＧＫ陽性細胞を各種グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ−１，ＧＬＵＴ−２，ＧＬＵＴ−４）に対する抗体で免疫組織化学的に探査することにより、ＧＫ抗体に対して免疫反応性の細胞をグルコーストランスポーター様免疫反応性の有無について更に分析している。
【００１３】
この免疫組織化学的分析によりどの細胞及びサブ細胞構造がグルコース感知に関与している可能性があると判明したかを理解することは脳内グルコース感知装置に予想される作用メカニズム及び構造を検討するのに有用である。Ｍａｅｋａｗａ（２０００），前出はＧＫ陽性上衣細胞が繊毛にグルコーストランスポーター−２（ＧＬＵＴ２）様免疫反応性をもつことを示した。更に、上衣細胞は繊毛にＧＬＵＴ１様免疫反応性をもち、細胞の細胞質領域に高密度でＧＬＵＴ４様免疫反応性をもち、後者反応性は細胞の原形質膜にも認められた。セロトニン作動性ニューロンでも、細胞質とその突起にＧＫ様免疫反応性が検出された。
【００１４】
例えば繊毛上衣細胞は脳脊髄液（ＣＳＦ）の変化を直接検出する可能性があるので、上衣細胞繊毛にグルコースセンサーが存在することは興味深い。グルコースは血液からＣＳＦに移動して両者の間に濃度勾配を設定するので、脳はＣＳＦグルコース値をモニターすることにより血糖値をモニターすることができる。繊毛構造一般は多様な感知及びシグナル伝達プロセス、パターン形成プロセス、脳脊髄液及び他の体液流動プロセス、粘膜毛様体クリアランス、腎疾患等に関与している。繊毛機能は例えばＴａｌｌｏｎら（２００３）“Ｔｏ  ｂｅａｔ  ｏｒ  ｎｏｔ  ｔｏ  ｂｅａｔ：ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｃｉｌｉａ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ”  １２（１）Ｒ２７−Ｒ３５に記載されている。繊毛機能に関する他の該当文献としては、Ｅｂｅｒｌら（２０００）“Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｓｉｍｉｌａｒ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｔｏｕｃｈ  ａｎｄ  Ｈｅａｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０（１６）：５９８１−５９８８（触覚及び聴覚における繊毛の役割）；Ｚｈａｎｇら（２００２）“Ａ  ｓｐｅｒｍ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＷＤ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ＰＦ２０  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｐａｇ６，ｔｈｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ＰＦ１６”  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２（２２）：７９９３−８００４（精子運動における繊毛の役割）；Ｐｅｎｎａｒｕｎら（２００２）“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ｈＰＦ２０  Ｇｅｎｅ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｐｆ２０：Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｆｏｒ  Ａｘｏｎｅｍａｌ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃｉｌｉａ  ａｎｄ  Ｓｐｅｒｍ  Ｆｌａｇｅｌｌａ”  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇ．２６：３６２−３７０（例えば逆位、カルタゲネル症候群及び男性不妊症に関連する一次性毛様体ジスキネジーにおける繊毛の役割）；Ｂａｒｔｏｌｏｎｉら（２００２）“Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＮＡＨ１１（ａｘｏｎｅｍａｌ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｄｙｎｅｉｎ  ｔｙｐｅ  １１）ｇｅｎｅ  ｃａｕｓｅ  ｏｎｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｓｉｔｕｓ  ｉｎｖｅｒｓｕｓ  ｔｏｔａｔｌｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｓｔ  ｌｉｋｅｌｙ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｉｌｉａｒｙ  ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ”  ＰＮＡＳ  ９９（１６）：１０２８２−１０２８６（例えば逆位、カルタゲネル症候群及び男性不妊症に関連する一次性毛様体ジスキネジーにおける繊毛の役割）；及びＳｕｐｐら（１９９７）“Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｘｏｎｅｍａｌ  ｄｙｎｅｉｎ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｉｎｖｅｒｓｕｓ  ｖｉｓｃｅｒｕｍ  ｍｉｃｅ”  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：９６３−９６６（内臓逆位における毛様体蛋白質の役割）が挙げられる。更に、多発性腎嚢胞症（ＰＫＤ）等の毛様体蛋白質に関連する所定疾患と糖尿病発症の危険の相関は少なくとも予備的に考察されている（Ｄｕｃｌｏｘら（１９９９）“Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｓ  ａ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ”  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １４：１２４４−１２４６）。
【００１５】
このように、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン抵抗性、及び治療誘発性体重増加について臨床レベルではかなりの情報があるが、これらの中心的ヒト疾患の疾患診断は比較的不正確であり、罹患し易い個体の早期検出は困難である。更に、種々の脳構造がグルコース感知に関連付けられているが、これらの構造とメタボリックシンドローム等の代謝障害の相関は従来示されていない。本発明は（例えば肥満素因やインスリン抵抗性を含む）メタボリックシンドローム、治療誘発性体重増加等と各種多形対立遺伝子の多数の新規遺伝的相関を提供し、疾患診断の改善、（例えばメタボリックシンドローム又は体重増加が臨床的に発現する前の）罹患し易い個体の早期検出、潜在的疾患モジュレーターのターゲット、更にはメタボリックシンドローム、肥満、及び治療誘発性体重増加の分子レベル及び細胞レベルでの解明改善の基礎を提供する。本発明の上記及び他の特徴は以下の開示から自明である。
【非特許文献１】Ｍｕｌｌｅｒら（２００４）“Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．４９：３０９−３２９
【非特許文献２】Ｒｅｙｎｏｌｄｓら（２００２）“Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ  ｗｉｔｈ  ５−ＨＴ２ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ”Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：２０８６−２０８７
【非特許文献３】Ｅｌｌｉｎｇｒｏｄら（２００２）“ＣＹＰ２Ｄ６  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ．”Ｐｓｖｃｈｉａｔｒ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５−５８
【非特許文献４】Ｈｏｎｇら“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈａｎｇｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｌｏｚａｐｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：２６５−２６８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は各種多形と、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因及び／又はインスリン抵抗性の従来未知の相関を提供する。従って、これらの多形の検出により、メタボリックシンドローム、肥満素因及び／又はインスリン抵抗性をもつか又はその危険のある患者を識別するための強力で正確な方法及びシステムが得られる。更に、これらの多形の同定により、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因及び／又はインスリン抵抗性のモジュレーターを同定するための高スループットシステム及び方法が得られる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って、第１の側面では、生体又は生体に由来する生体サンプルについて治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型を同定する方法を提供する。本方法は遺伝子又は前記遺伝子に密接に連鎖する遺伝子座の多形を生体又は生体サンプルで検出する段階を含む。代表的遺伝子は、妊娠関連血漿蛋白質Ａ（ＰＡＰＰＡ）、ペプチジルグリシンαアミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、及び／又はＨＳＦ２等の蛋白質をコードし、前記多形はメタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型に関連している。同様に、付表１の多形、又は前記多形に密接に連鎖する遺伝子座の検出を使用して治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型に関連する多形を同定することができる。いずれの場合も、治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型と該当多形の存在を相関させることにより、該当表現型を同定することができる。
【００１８】
該当表現型はメタボリックシンドロームの任意特徴から構成することができ、例えば表現型としてはインスリン抵抗性、中心性肥満、粥腫発生腫異常症、高血圧、グルコース不耐、慢性易血栓形成状態、慢性易炎症性状態等が挙げられる。従って、治療誘発性体重増加表現型、肥満素因及びインスリン抵抗性表現型はこれらを検出するために本発明で使用するマーカーと共にメタボリックシンドロームとオーバーラップする。
【００１９】
生体又は生体サンプルは哺乳動物とするか、又は哺乳動物に由来することができる。例えば、生体はヒト患者とすることができ、又は生体サンプルはヒト患者に由来することができる（血液、リンパ液、皮膚、組織、唾液、これらから誘導される一次又は二次細胞培養液等）。
【００２０】
多形の検出は多形又は多形に関連する配列を増幅する段階と、得られたアンプリコンを検出する段階を含むことができる。例えば、多形を増幅する段階は増幅用プライマー又は増幅用プライマー対を生体又は生体サンプルから単離した核酸鋳型と混合する段階を含むことができる。プライマー又はプライマー対は一般に前記遺伝子もしくは他の多形の少なくとも一部又はその近接配列と相補的又は部分的に相補的であり、核酸鋳型でポリメラーゼによる核酸重合を開始することができる。増幅は更にポリメラーゼと鋳型核酸を使用するＤＮＡ重合反応でプライマー又はプライマー対を伸長させてアンプリコンを生成する段階を含むことができる。アンプリコンはアンプリコンをアレーとハイブリダイズさせる方法、アンプリコンを制限酵素で消化する方法、リアルタイムＰＣＲ分析、アンプリコンのシーケンシング等により検出することができる。場合により、増幅は生体又は生体サンプルから単離した核酸をＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、又はＬＣＲの鋳型として使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を実施する段階を含むことができる。他のフォーマットとしては対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、１塩基伸長法等が挙げられる。
【００２１】
多形は検出可能な任意多形（例えばＳＮＰ）とすることができる。例えば、対立遺伝子は付表１に記載の任意対立遺伝子とすることができる。対立遺伝子は治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因、及び／又はインスリン抵抗性と正相関するか、又は負相関することができる。各々の例を付表１に記載する。
【００２２】
ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７及び／又はＨＳＦ２に密接に連鎖する多形、及び／又は付表１の任意多形をメタボリックシンドローム、肥満素因及び／又はインスリン抵抗性のマーカーとして使用することができる。このような密接に連鎖するマーカーは一般に該当遺伝子又は他の多形（例えば、付表１の対立遺伝子マーカー遺伝子座）から約２０ｃＭ以下、例えば１５ｃＭ以下、多くの場合には１０ｃＭ以下、所定の好ましい態様では５ｃＭ以下に位置する。連鎖するマーカーは当然のことながら付表１の遺伝子又はマーカー遺伝子座から５ｃＭ未満とすることができ、例えば４、３、２、１、０．５、０、２５、０．１ｃＭ以下とすることができる。一般に、連鎖（又は関連）が密接なほど、連鎖するマーカーは遺伝子又は所与マーカー遺伝子座の対立遺伝子（又は関連）をもつ可能性が高い。
【００２３】
典型的な１態様では、多形の相関は多形の対立遺伝子と表現型の相関を含むルックアップテーブルを参照することにより実施される。このテーブルは例えば該当相関情報を含む紙又は電子データベースとすることができる。１側面では、データベースは多重相関を含み、同時に多重相関関係を考慮する多次元データベースとすることができる。ルックアップテーブルのアクセスはルックアップテーブルにより相関情報を抽出してもよいし、主成分分析（ＰＣＡ）、相関情報を追跡及び／又は更新するヒューリスティックアルゴリズム（例えば神経ネットワーク）、隠れマルコフモデリング等のより複雑な統計分析でもよい。
【００２４】
相関情報は疾患易罹患性（例えば、肥満、インスリン抵抗性及び／又はメタボリックシンドロームに罹患し易い患者）、疾患診断（例えば、メタボリックシンドロームの診断）、及び疾患予後（例えば、患者遺伝子型を考慮して食事と運動等の従来の治療が有効である確率）を調べるのに有用である。更に、非ヒト用途では、メタボリックシンドローム、肥満素因及びインスリン抵抗性を予測できることは、例えば家畜の脂肪生産を制御するために（従来方法又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ発酵（ＩＶＦ）法により）マーカーによる交配を実施したい家畜飼育者にとって有用である。従って、生体が非ヒト哺乳動物である場合には、前記方法は決定された表現型との相関に基づいて、非ヒト哺乳動物集団から非ヒト哺乳動物、又は前記動物に由来する生殖質（例えば、精子又は卵子）を選択する段階を場合により更に含む。得られた選択非ヒト哺乳動物を（従来方法又はＩＶＦ法により）別の非ヒト哺乳動物と交配し、１頭以上の子孫で遺伝子型とその結果として表現型を最適化することができる。
【００２５】
例えば治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型と検出された対立遺伝子を相関させるための説明書と共に適切な容器にパッケージングされた例えば本発明のマーカーを同定するためのプローブを含むキットも本発明の特徴である。
【００２６】
付加側面では、治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型のモジュレーターの同定方法も提供する。本方法は、遺伝子又は遺伝子産物（例えばＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２に対応する遺伝子産物、及び／又は付表１に記載の任意遺伝子産物、及び／又はこれらの遺伝子産物のいずれかに対応する遺伝子）と潜在的モジュレーターを接触させる段階を含む。遺伝子又は遺伝子産物に及ぼす潜在的モジュレーターの効果を検出することにより、潜在的モジュレーターが治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型を調節するか否かを識別する。対立遺伝子、遺伝子、マーカー等について上述した全特徴がこれらの方法にも適用可能である。
【００２７】
スクリーニングすることができる該当効果としては、（ａ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２及び／又は付表１の任意遺伝子産物の発現増減；（ｂ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２及び／又は付表１の任意遺伝子産物の発現タイミング又は位置の変化；（ｃ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２の遺伝子又は付表１の他の遺伝子によりコードされる蛋白質の局在変化；（ｄ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＰＰＡによるＩＧＦＢＰ４の開裂増減；（ｅ）ＰＡＭによるペプチド開裂の触媒増減；（ｆ）ｐｆ２０及び／又はＤＮＡＨ１１を含む繊毛の機能変化；（ｇ）ＰＫＤ１遺伝子産物（例えばポリシスチン−１）とＰＫＤ２遺伝子産物（例えばポリシスチン−２）の会合（親和性等）変化；（ｈ）原形質膜に対するポリシスチン−２の局在変化；（ｉ）ポリシスチン−１を含むチャネルの活性変化；（ｊ）ＫＣＮＭＡ１遺伝子産物の局在変化；及び／又は（ｋ）ＫＣＮＭＡ１遺伝子産物を含むチャネルの活性変化が挙げられる。
【００２８】
本発明は更に治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、肥満素因表現型又はインスリン抵抗性表現型の治療用キットを含む。１側面では、キットは上記方法により同定されたモジュレーターと、メタボリックシンドローム表現型、治療誘発性体重増加表現型、肥満素因表現型又はインスリン抵抗性表現型を治療するために患者に化合物を投与するための説明書を含む。
【００２９】
付加側面では、生体又は生体に由来する生体サンプルについて治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型を同定するためのシステムを提供する。このようなシステムは、例えば治療誘発性体重増加表現型、インスリン抵抗性表現型、肥満素因表現型又はメタボリックシンドローム表現型に関連する１種以上の遺伝子又は連鎖する遺伝子座の少なくとも１個の対立遺伝子を検出するように構成されたマーカープローブ又はプライマーセットを含み、前記遺伝子はＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２及び／又は付表１の任意遺伝子もしくは遺伝子産物を含むか又はコードする。一般に、マーカープローブ又はプライマーセットは付表１のヌクレオチド配列、又は前記配列に密接に連鎖する対立遺伝子を含むか又は検出することができる。システムは一般にマーカープローブもしくはプライマーセット、又はマーカープローブもしくはプライマーセットから生成されたアンプリコンからの１個以上のシグナル出力（例えば発光）を検出することにより、対立遺伝子の有無を識別するように構成された検出器を更に含む。予想されるメタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型と対立遺伝子の有無を相関させることにより、生体又は生体に由来する生体サンプルについてメタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型を同定するシステム命令もシステムの特徴である。前記命令は１個以上の対立遺伝子の有無とインスリン抵抗性又は肥満素因の相関を含む少なくとも１個のルックアップテーブルを含むことができる。システムは更に、一般に哺乳動物に由来するサンプルを含むことができ、例えばゲノムＤＮＡ、増幅ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又は増幅ＲＮＡが挙げられる。
【００３０】
当然のことながら、上記方法、システム及びキットはいずれも種々に組み合わせて使用することができ、方法の特徴をシステム及びキットで反映させることができ、その逆も同様である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明はＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２の遺伝子又は付表１に記載の他の任意遺伝子もしくは遺伝子座又はその近傍の多形と、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因及び／又はインスリン抵抗性の相関を提供する。従って、これらの遺伝子座、遺伝子又は遺伝子産物における特定多形の検出により、メタボリックシンドローム、肥満素因及び／又はインスリン抵抗性をもつか又はその危険のある患者の識別方法が得られる。例えば前記方法を実施するために、対立遺伝子を検出し、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因及び／又はインスリン抵抗性と相関するためのシステムも本発明の特徴である。更に、これらの多形の同定により、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因及び／又はインスリン抵抗性のモジュレーターを同定するための高スループットシステム及び方法が得られる。
【００３２】
以下の定義は本発明の各種側面をより明白にすることを目的とする。これらの定義は他の関連又は非関連出願又は特許に適用するものではない。
定義
【００３３】
本発明は特定態様に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの記載を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形の用語と単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、場合により複数も意味する。従って、例えば「プローブ」と言う場合には場合により複数のプローブ分子を含み、同様に、内容に応じて、「核酸」なる用語の使用は場合により実際問題としてこの核酸分子の多数のコピーを含む。遺伝子又は蛋白質の文字表示は内容に応じて遺伝子形態及び／又は蛋白質形態を表すことができる。当業者は本明細書に記載する配列、公知配列及び遺伝コードを参照することにより該当生体分子の核酸形態とアミノ酸形態を関係づけることが十分に可能である。
【００３４】
特に指定しない限り、核酸は左から右に向かって５’→３’方向に記載する。明細書内に記載する数値範囲は範囲を定義する数値を含み、定義する範囲内の各整数又は任意分数を含む。特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。本発明の試験の実施には本明細書に記載するものと類似又は等価の任意方法及び材料を使用することができるが、好ましい材料及び方法は本明細書に記載する。本発明の記載及び特許請求の範囲において、以下の用語は以下の定義に従って使用する。
【００３５】
「表現型」とは個体又は集団に認められる形質又は形質集合である。形質は量的（量的形質ないしＱＴＬ）でも質的でもよい。
【００３６】
「メタボリックシンドローム表現型」とは個体でメタボリックシンドロームを発症させる素因を示すか又は個体でメタボリックシンドロームを示す表現型である。メタボリックシンドロームの素因を示す表現型は例えば、高カロリー、例えば高脂肪、及び／又は高糖質食、及び／又は低身体活動等の一連の所与環境条件下で一般集団のメンバーよりもこの表現型をもつ個体に高いメタボリックシンドローム発症確率を示す可能性がある。メタボリックシンドロームは多数の代謝傷害又は危険因子のいずれかにより特徴付けることができ、これらの因子の２項目以上が単一個体に存在する場合に一般にメタボリックシンドロームの最典型であるとみなされる。これらの因子としては、中心性肥満（腹部及びその周囲の不均衡な脂肪組織）、粥腫発生腫異常症（例えば動脈壁を含む血管系でプラーク蓄積を助長し得る高トリグリセリドや低ＨＤＬコレステロール等の一群の血中脂肪障害）、高血圧（１３０／８５ｍｍＨｇ以上）、インスリン抵抗性又はグルコース不耐（身体がインスリン又は血糖の適正に使用できない）、（例えば高血中フィブリノーゲン又はプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター［−１］値を特徴とする）慢性易血栓形成状態、及び（例えば正常値よりも高い血中高感受性Ｃ反応性蛋白を特徴とする）慢性易炎症性状態が挙げられる。
【００３７】
「インスリン抵抗性表現型」とは個体でインスリン抵抗性を発症させる素因を示すか又は個体でインスリン抵抗性を示す表現型である。例えば、この表現型をもつ個体は一連の所与環境条件（例えばメタボリックシンドロームについて上述した条件）下で一般集団のメンバーよりも高いインスリン抵抗性の発症確率を示す可能性がある。インスリン抵抗性を測定するためには現在使用されている各種試験の任意のものを使用することができ、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）、空腹時血糖値（ＦＢＧ）、正常耐糖能（ＮＧＴ）、耐糖能異常（ＩＧＴ）、空腹時血糖値異常（ＩＦＧ）、恒常性モデルアセスメント（ＨＯＭＡ）、定量的インスリン感受性検査指数（ＱＵＩＣＫＩ）及び静脈内インスリン耐性試験（ＩＶＩＴＴ）が挙げられる。ｗｗｗ．ｒｅｔｒｏｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．ｏｒｇ／２００２／Ｐｏｓｔｅｒｓ／１２８１４．ｐｄｆ；Ｄｅ  Ｖｅｇｔ（１９９８）“Ｔｈｅ  １９９７  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｖｅｒｓｕｓ  ｔｈｅ  １９８５  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：ｐｏｏｒ  ａｇｒｅｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｏｏｒｎ  Ｓｔｕｄｙ．”  Ｄｉａｂ  Ｃａｒｅ  １９９８，２１：１６８６−１６９０；Ｍａｔｔｈｅｗｓ（１９８５）“Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ：ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍａ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍａｎ．”  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２８：４１２−４１９；Ｋａｔｚ，Ａ（２０００）“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｅｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃｈｅｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ，Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ．”  ＪＣＥ  ＆  Ｍ  ８５：２４０２−２４１０も参照。当然のことながら、インスリン抵抗性患者はメタボリックシンドローム及び／又は肥満を併発している可能性がある。
【００３８】
「肥満素因表現型」とは個体で肥満（例えば中心性肥満）を発症させる素因を示すか又は個体で肥満を示す表現型である。例えば、この表現型をもつ個体は一連の所与環境条件（例えばメタボリックシンドロームについて上述した条件）下で一般集団のメンバーよりも高い肥満発症確率を示す可能性がある。「中心性肥満」とはウエスト周囲の大量及び／又は不均衡な脂肪沈着を特徴とする形質である。ウエストが３５インチを上回る大半の女性と４０インチを上回る大半の男性は中心性肥満であると分類される。当然のことながら、メタボリックシンドローム患者は肥満、及び／又はインスリン抵抗性であることが多く、３種の表現型はいずれも相関している。
【００３９】
「治療誘発性体重増加表現型」とはこの表現型をもつ患者が特定治療を受けているときに体重増加素因を示す表現型である。例えば、各種薬物療法（例えば抗精神病薬治療中の非定型抗精神病薬、例えばオランザピンによる治療）のいずれかを施療中の患者は体重増加素因を示す可能性がある。
【００４０】
「多形」とは多様な遺伝子座であり、即ち、集団内で多形のヌクレオチド配列は２種以上の形態又は対立遺伝子をもつ。「対立遺伝子」なる用語は特定遺伝子座に存在するかもしくは前記遺伝子座でコードされる２種以上の異なるヌクレオチド配列、又は前記遺伝子座によりコードされる２種以上の異なるポリペプチド配列の一方を意味する。例えば、ヘテロ接合個体の異なる染色体や、集団内の異なるホモ接合又はヘテロ接合個体間の場合のように、例えば、第１の対立遺伝子は第１の染色体に存在し、第２の対立遺伝子は第２の相同染色体に存在することができる。多形の１例はゲノムの１ヌクレオチド位置の多形である「１塩基多形」（ＳＮＰ）である（特定位置のヌクレオチドが個体又は集団間で異なる）。
【００４１】
対立遺伝子はある形質に連鎖しており、この対立遺伝子の存在がこの対立遺伝子を含む個体にこの形質又は形質形態が存在することの指標であるときに、この形質と「正」相関する。対立遺伝子はある形質に連鎖しており、この対立遺伝子の存在がこの対立遺伝子を含む個体にこの形質又は形質形態が存在しないことの指標であるときにこの形質と「負」相関する。
【００４２】
マーカー多形又は対立遺伝子は特定表現型（メタボリックシンドローム、肥満素因、インスリン抵抗性等）と統計的に（正又は負）連鎖できるときにこの表現型と「相関」される。この相関は本質的原因であるとみなされることが多いが、必ずしもそうでなくてもよく、表現型の基礎である形質の遺伝子座との単なる遺伝的連鎖（関連）で十分である。
【００４３】
「有利な対立遺伝子」とは望ましい表現型（例えば肥満に対する抵抗性、又はメタボリックシンドロームに対する抵抗性）と正相関するか、又は望ましくない表現型と負相関する特定遺伝子座の対立遺伝子（例えば肥満素因又はメタボリックシンドローム素因と負相関する対立遺伝子）である。所望表現型は当然のことながら変動する場合があり、例えば肥満素因は多くのヒト集団では望ましくないが、動物飼育では望ましい場合がある。連鎖マーカーの有利な対立遺伝子は有利な対立遺伝子と共分離するマーカー対立遺伝子である。染色体セグメントの有利な対立遺伝子形態は染色体セグメントに物理的に配置された１個以上の遺伝子座で所望表現型と正相関するか、又は望ましくない表現型と負相関するヌクレオチド配列を含む染色体セグメントである。
【００４４】
「不利な対立遺伝子」とは望ましい表現型と負相関するか、又は望ましくない表現型と正相関する特定遺伝子座の対立遺伝子である（例えば肥満素因、もしくはメタボリックシンドローム素因との正相関、又は肥満抵抗性もしくはメタボリックシンドローム抵抗性との負相関）。この場合も、所望表現型は当然のことながら変動する場合があり、例えば肥満素因は多くのヒト集団では望ましくないが、動物飼育では望ましい場合がある。連鎖マーカーの不利な対立遺伝子は不利な対立遺伝子と共分離するマーカー対立遺伝子である。染色体セグメントの不利な対立遺伝子形態は染色体セグメントに物理的に配置された１個以上の遺伝子座で所望表現型と負相関するか、又は望ましくない表現型と正相関するヌクレオチド配列を含む染色体セグメントである。
【００４５】
「対立遺伝子頻度」とは個体内、系統内、又は系統集団内で対立遺伝子が遺伝子座に存在する頻度（割合又は百分率）を意味する。例えば、対立遺伝子「Ａ」では、遺伝子型「ＡＡ」、「Ａａ」又は「ａａ」の二倍体個体は夫々対立遺伝子頻度１．０、０．５、又は０．０である。系統又は集団に由来する個体のサンプルの対立遺伝子頻度を平均することによりこの系統又は集団内の対立遺伝子頻度を推定することができる。同様に、集団を構成する系統の対立遺伝子頻度を平均することによりこの系統集団内の対立遺伝子頻度を計算することができる。
【００４６】
個体は所与遺伝子座にただ１種の対立遺伝子をもつ場合に「ホモ接合」である（例えば、二倍体個体は２個の相同染色体の各々の遺伝子座に同一対立遺伝子１コピーをもつ）。所与遺伝子座に２種以上の対立遺伝子が存在する場合に個体は「ヘテロ接合」である（例えば、２種の異なる対立遺伝子各１コピーをもつ二倍体個体）。「均質性」なる用語は群のメンバーが１個以上の特定遺伝子座に同一遺伝子型をもつことを意味する。他方、「不均質性」なる用語は群内の個体の遺伝子型が１個以上の特定遺伝子座で異なることを意味する。
【００４７】
「遺伝子座」とは染色体位置又は領域である。例えば、多形遺伝子座は多形核酸、形質決定基、遺伝子又はマーカーが配置された位置又は領域である。別の例では、「遺伝子座」とは特定遺伝子が存在し得る種のゲノム内の特定染色体位置である。同様に、「量的形質遺伝子座」ないし「ＱＴＬ」なる用語は発現に示差的に作用するか又は少なくとも１種の遺伝バックグラウンド（例えば少なくとも１個の育種集団又は子孫）で量的もしくは連続的表現型形質の変動を変化させる少なくとも２個の対立遺伝子をもつ遺伝子座を意味する。
【００４８】
「マーカー」、「分子マーカー」又は「マーカー核酸」とは遺伝子座又は連鎖遺伝子座を同定する際に参照点として使用されるヌクレオチド配列又はそのコード化産物（例えば蛋白質）を意味する。マーカーはゲノムヌクレオチド配列又は発現ヌクレオチド配列｛例えばＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）、又はコード化ポリペプチドから誘導することができる。この用語はマーカー配列に相補的であるか又はその両側核酸配列（例えばマーカー配列を増幅することが可能なプローブ又はプライマー対として使用される核酸）も意味する。「マーカープローブ」とはマーカー遺伝子座の存在を識別するために使用することができる核酸配列又は分子（例えばマーカー遺伝子座配列に相補的な核酸プローブ）である。核酸は例えばワトソン・クリック塩基対合規則に従って溶液中で特異的にハイブリダイズするときに「相補的」である。「マーカー遺伝子座」とは第２の連鎖遺伝子座（例えば表現型形質の集団変動をコードするか又はこれに寄与する連鎖又は相関遺伝子座）の存在を追跡するために使用することができる遺伝子座である。例えば、マーカー遺伝子座はマーカー遺伝子座に遺伝的又は物理的に連鎖する遺伝子座（例えばＱＴＬ）の対立遺伝子の分離をモニターするために使用することができる。従って、「マーカー対立遺伝子」、あるいは「マーカー遺伝子座の対立遺伝子」とはマーカー遺伝子座に多形の集団でマーカー遺伝子座に存在する複数の多形ヌクレオチド配列の１つである。１側面では、本発明は該当表現型（例えば治療誘発性体重増加／肥満素因／インスリン抵抗性／メタボリックシンドローム）と相関するマーカー遺伝子座を提供する。同定されたマーカーの各々は該当表現型に寄与する遺伝子エレメント（例えばＱＴＬ）と物理的又は遺伝的に密接に近接している又はオーバーラップしている（その結果、物理的及び／又は遺伝的に連鎖している）と予想される。集団のメンバー間の遺伝的多形に対応するマーカーは当分野で定着している方法により検出することができる。これらの方法としては、例えばＰＣＲによる配列特異的増幅法、制限断片長多形（ＲＦＬＰ）の検出、アイソザイムマーカーの検出、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）の検出、１塩基伸長の検出、ゲノムの増幅可変配列の検出、自律配列複製の検出、単純反復配列（ＳＳＲ）の検出、１塩基多形（ＳＮＰ）の検出、又は増幅断片長多形（ＡＦＬＰ）の検出が挙げられる。
【００４９】
「遺伝子マップ」とは所与種内の１個以上の染色体（又は連鎖群）上の遺伝子座間の遺伝的連鎖（又は関連）関係を一般に図又は表形式で表したものである。「マッピング」とは遺伝子マーカー、マーカーの集団分離、及び組換え頻度の標準遺伝原理を使用することにより、遺伝子座の連鎖関係を定義する方法である。「マップ位置」とは所与種内で特定マーカーを検出できる場合に連鎖遺伝子マーカーに対して遺伝子マップ上に割り当てられた位置である。「染色体セグメント」なる用語は単一染色体に位置するゲノムＤＮＡの連続直線部分を表す。同様に、「ハプロタイプ」とは個体又は集団の遺伝的材料に存在する遺伝子座セットである（このセットは連続でも不連続でもよい）。本発明の文脈では、本発明の１個以上の対立遺伝子と１個以上の連鎖マーカー対立遺伝子等の遺伝子エレメントを染色体セグメント内に配置することができるので、２０センチモルガン（ｃＭ）以下の特定遺伝子組換え距離（例えば１５ｃＭ以下、多くの場合は１０ｃＭ以下、例えば約９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．７５、０．５、０．２５、又は０．１ＣＭ以下）で遺伝的に連鎖している。即ち、単一染色体セグメント内の２個の密接に連鎖する遺伝子エレメントは減数分裂中に約２０％以下、例えば約１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、又は０．１％以下の頻度で相互に組換えられる。
【００５０】
「遺伝子組換え頻度」とは２個の遺伝子座間の組換えイベントの頻度である。組換え頻度は減数分裂中にマーカー及び／又は形質の分離を追跡することにより観測することができる。本発明の文脈では、該当遺伝子座が関連により同一連鎖群の一部であり、連鎖不平衡状態にあるとき、マーカー遺伝子座は別のマーカー遺伝子座又は他の所定遺伝子座（例えば、肥満又はメタボリックシンドローム遺伝子座）と「関連」している。これは遺伝子座がランダムに分離している場合よりもマーカー遺伝子座と連鎖遺伝子座が同時に子孫に存在する場合に高頻度で生じる。同様に、マーカー遺伝子座は形質と関連している場合もあり、例えばマーカー遺伝子座が形質と連鎖不平衡状態にあるとき、マーカー遺伝子座は所与形質と「関連」している可能性がある。「連鎖不平衡」なる用語は遺伝子座又は形質（又は両者）の非ランダム分離を意味する。いずれの場合も、連鎖不平衡は該当遺伝子座が染色体の長さ方向に十分に物理的に近接しているため、ランダム頻度よりも高頻度で共分離することを意味する（形質を共分離する場合には、形質の基礎となる遺伝子座は相互に十分に近接している）。連鎖遺伝子座は＞５０％、例えば約５１％〜約１００％の確率で共分離する。減数分裂中に２個の遺伝子座間に相同染色体対間の組換えが高頻度で生じないように、例えば密接に連鎖する遺伝子座が少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７５％、又は９９．９０％以上の確率で共分離するように、２個の遺伝子座が密接に近接していると有利である。
【００５１】
本明細書において「密接に連鎖」なる用語は２個の連鎖遺伝子座（例えば本明細書の付表１に記載のもの等のＳＮＰと第２の連鎖対立遺伝子）の間の組換えが約２０％以下の頻度で生じることを意味する。換言するならば、密接に（又は「緊密に」）連鎖する遺伝子座は少なくとも８０％の確率で共分離する。マーカー遺伝子座は本発明ではターゲット遺伝子座（例えばメタボリックシンドローム、肥満素因，及び／又はインスリン抵抗性のＱＴＬ、あるいは、単に他のマーカー遺伝子座）と密接に連鎖しているときに特に有用である。マーカーがターゲット遺伝子座と密接に連鎖しているほど、マーカーは連鎖しているターゲット遺伝子座の良好な指標となる。従って、１態様では、マーカー遺伝子座と第２の遺伝子座等の緊密に連鎖する遺伝子座は約２０％以下、例えば１５％以下、例えば１０％以下、好ましくは約９％以下、更に好ましくは約８％以下、更に好ましくは約７％以下、更に好ましくは約６％以下、更に好ましくは約５％以下、更に好ましくは約４％以下、更に好ましくは約３％以下、更に好ましくは約２％以下の遺伝子座間組換え頻度を示す。特に好ましい態様では、該当遺伝子座（例えばマーカー遺伝子座とＱＴＬ等のターゲット遺伝子座）は約１％以下、例えば約０．７５％以下、より好ましくは約０．５％以下、又は更に好ましくは約０．２５％以下、又は更に好ましくは約０．１％以下の組換え頻度を示す。２個の遺伝子座間の組換えが約２０％未満、例えば１５％、より好ましくは１０％（例えば約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．１％以下）の頻度で生じるような距離で同一染色体に局在する２個の遺伝子座を相互に「近接」しているとも言う。形質に寄与する遺伝子エレメントと近接マーカー等の２個の連鎖遺伝子エレメント間の関係について言うとき、「相引」相連鎖とは、形質遺伝子座の「有利な」対立遺伝子が夫々の連鎖マーカー遺伝子座の「有利な」対立遺伝子と同一染色体鎖上で物理的に関連している状態を意味する。相引相では、２個の有利な対立遺伝子はこの染色体鎖を受け継ぐ子孫により同時に遺伝される。「相反」相連鎖では、該当遺伝子座（例えば、肥満又はメタボリックシンドロームのＱＴＬ）の有利な対立遺伝子は近接マーカー遺伝子座の「不利な」対立遺伝子と同一染色体鎖上で物理的に関連しており、２個の「有利な」対立遺伝子は同時に遺伝されない（即ち、２個の遺伝子座は相互に「相がずれている」）。
【００５２】
核酸増幅の文脈において「増幅」なる用語は選択された核酸（又はその転写形態）の付加コピーが生成される任意プロセスである。典型的な増幅法としては各種ポリメラーゼ複製法が挙げられ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）等のリガーゼ法及び（例えば転写による）ＲＮＡポリメラーゼ増幅法が挙げられる。「アンプリコン」とは増幅された核酸、例えば利用可能な増幅法（例えばＰＣＲ、ＬＣＲ、転写等）により鋳型核酸を増幅することにより生産された核酸である。
【００５３】
「ゲノム核酸」とは細胞中の遺伝性核酸に配列が対応する核酸である。一般的な例としては、核内ゲノムＤＮＡとそのアンプリコンが挙げられる。スプライシングされたＲＮＡ又はｃＤＮＡはイントロンを除去するために例えばスプライシング機構によりプロセシングされるので、ゲノム核酸は場合により、スプライシングされたＲＮＡ、又は対応するｃＤＮＡと異なる。ゲノム核酸は場合により非転写（例えば染色体構造配列、プロモーター領域、エンハンサー領域等）及び／又は非翻訳配列（例えばイントロン）を含み、スプライシングされたＲＮＡ／ｃＤＮＡは一般に非転写配列又はイントロンをもたない。「鋳型ゲノム核酸」とは増幅反応（例えばＰＣＲ等のポリメラーゼ増幅反応、ＬＣＲ等のリガーゼ増幅反応、転写反応等）で鋳型として機能するゲノム核酸である。
【００５４】
「外来核酸」とは配列、ゲノム位置、又は両者に関して特定系（例えば生殖質、細胞、個体等）に非固有の核酸である。本明細書でポリヌクレオチド又はポリペプチドに適用する「外来」又は「異種」なる用語は一般に生体系（例えば細胞、個体等）に人工的に供給され、この特定生体系に固有ではない分子を意味する。この用語は該当材料が天然源以外の資源に由来することを意味する場合もあるし、非天然構成、遺伝子位置又は部分配置をもつ分子を意味する場合もある。
【００５５】
異種又は外来核酸の細胞移入について言うとき、「導入」なる用語は任意方法を使用して核酸を細胞に組込むことを意味する。この用語は「トランスフェクション」、「形質転換」及び「形質導入」等の核酸導入法を意味する。
【００５６】
本明細書で使用する「ベクター」なる用語は核酸セグメントを細胞に導入するポリヌクレオチド又は他の分子に関して使用する。「ビヒクル」なる用語を「ベクター」と同義に使用する場合もある。ベクターは場合によりベクター維持を助長し、その所期使用を可能にする部分（例えば複製に必要な配列、薬剤又は抗生物質耐性を付与する遺伝子、多重クローニング部位、クローニングした遺伝子の発現を可能にする機能的に連結したプロモーター／エンハンサーエレメント等）を含む。ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、又は植物もしくは動物ウイルスから誘導されることが多い。「クローニングベクター」又は「シャトルベクター」又は「サブクローニングベクター」はサブクローニング段階を助長する機能的に連結した部分（例えば多重制限エンドヌクレアーゼ部位を含む多重クローニング部位）を含む。
【００５７】
本明細書で使用する「発現ベクター」なる用語は特定宿主生物におけるコーディング配列の発現を助長する機能的に連結したポリヌクレオチド配列を含むベクター（例えば細菌発現ベクター又は哺乳動物細胞発現ベクター）を意味する。原核生物における発現を助長するポリヌクレオチド配列は一般に例えばプロモーターと、オペレーター（場合により）と、リボソーム結合部位と、多くの場合には他の配列を含む。真核細胞はプロモーター、エンハンサー、終結シグナル、ポリアデニル化シグナル及び原核生物により使用されるものとは一般に異なる他の配列を使用することができる。
【００５８】
特定核酸は所与核酸の配列を使用して構築される場合、又は所与核酸を使用して構築される場合に所与核酸から「誘導」される。
【００５９】
「遺伝子」とは共同して１個以上の発現分子（例えばＲＮＡ、又はポリペプチド）をコードするゲノム内の１個以上のヌクレオチド配列である。遺伝子はＲＮＡに転写された後にポリペプチド配列に翻訳され得るコーディング配列を含むことができ、更に、遺伝子の複製又は発現を助長する関連構造又は調節配列を含むことができる。本発明の該当遺伝子は例えば、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２又は付表１に記載の遺伝子もしくは遺伝子産物をコードするゲノム配列を含む。
【００６０】
「遺伝子型」とは１個以上の遺伝子座における個体（又は個体群）の遺伝子構成である。遺伝子型は個体の１個以上の既知遺伝子座の対立遺伝子、一般に、その親から遺伝された対立遺伝子の集合により決定される。「ハプロタイプ」とは１本のＤＮＡ鎖上の複数の遺伝子座における個体の遺伝子型である。一般に、ハプロタイプにより表される遺伝子座は物理的及び遺伝的に連鎖しており、即ち、同一染色体鎖上にある。
【００６１】
マーカー又はプローブの「セット」とは共通目的、例えば特定表現型（例えば治療誘発性体重増加、肥満素因，メタボリックシンドローム障害等）をもつ個体を識別するために使用されるマーカーもしくはプローブ、又はこれらから誘導される情報の集合又は群を意味する。多くの場合には、マーカーもしくはプローブに対応するか、又はその使用により誘導されるデータは電子媒体に保存される。セットの各メンバーは特定目的に関する用途をもつが、セットから選択される個々のマーカーと、マーカーの全部ではないが、一部を含むサブセットも特定目的を達成するのに有効である。
【００６２】
「ルックアップテーブル」とはデータの１形態を別の形態と相関するか、又はデータの１種以上の形態をこのデータが関連する予想結果と相関する表である。例えば、ルックアップテーブルは対立遺伝子データと、１個以上の所与対立遺伝子を含む個体が示す可能性が高い予想形質の相関を含むことができる。これらの表は、例えば複数の対立遺伝子を同時に考慮し、場合により、例えば形質予想の実施において、遺伝的バックグラウンド等の他の因子も考慮して多次元とすることができ、多次元が一般的である。
【００６３】
「コンピューター読取り可能な媒体」とは市販又は注文インターフェースを使用してコンピューターによりアクセスすることができる情報記憶媒体である。例としてはメモリー（例えばＲＯＭ又はＲＡＭ、フラッシュメモリー等）、光学記憶媒体（例えばＣＤ−ＲＯＭ）、磁気記憶媒体（コンピューターハードドライブ、フロッピーディスク等）、パンチカード、及び他の多数の市販媒体が挙げられる。保存するため又は保存情報にアクセスするために、該当システムとコンピューター、又はコンピューターと双方向、又はコンピューター読取り可能な媒体と双方向で情報を伝送することができる。この伝送は電気的伝送でもよいし、ＩＲリンク、ワイヤレス接続等の他の利用可能な方法により実施してもよい。
【００６４】
「システム命令」とはシステムにより部分的又は完全に実施することができる命令セットである。一般に、命令セットはシステムソフトウェアとして存在する。
【００６５】
「翻訳産物」とは核酸の翻訳の結果として生産された産物（一般にポリペプチド）である。「転写産物」とは核酸（例えばＤＮＡ）の転写の結果として生産された産物（例えば、ｍＲＮＡ、触媒としてもしくは生物学的に活性なＲＮＡ等のＲＮＡ）である。
【００６６】
「アレー」とはエレメントの集合である。集合は空間的に規則的（「パターンアレー」）でもよいし、不規則（「ランダムパターン」アレー）でもよい。アレーは１個以上の機能エレメント（例えばマイクロアレーのプローブ領域）を形成するか又は含むこともできるし、非機能的でもよい。
【００６７】
本明細書で使用する「ＳＮＰ」ないし「１塩基多形」なる用語は個体間の遺伝子変動（例えば、生物のＤＮＡにおける変動性の１窒素塩基位置）を意味する。本明細書で使用する「ＳＮＰ」とは複数のＳＮＰである。当然のことながら、本明細書でＤＮＡと言う場合には、アンプリコン、そのＲＮＡ転写産物等のＤＮＡの誘導体も含むことができる。
概説
【００６８】
本発明はＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２の遺伝子又は連鎖遺伝子座及び／又は付表１の遺伝子、産物又は遺伝子座と、メタボリックシンドローム、肥満素因、インスリン抵抗性及び治療誘発性体重増加等の各種関連代謝障害の新規相関を含む。これらの遺伝子又は遺伝子産物に内在又は連鎖する所定対立遺伝子はこれらの代謝障害の１種以上を発症する。従って、利用可能な任意方法によるこれらの対立遺伝子の検出は代謝障害易罹患性の早期検出、代謝障害をもつ患者の予後、及び例えば現行基準が決定的診断に不十分である診断の補助等の診断目的に使用することができる。更に、家畜飼育者にとっては家畜の脂肪生産が重要であるので、肥満表現型をポジティブ又はネガティブ選択するためにこのような対立遺伝子相関を使用して家畜及び家畜生殖質でマーカー選抜育種（ＭＡＳ）を実施することが可能である。
【００６９】
ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２の遺伝子及び／又は付表１の遺伝子もしくは遺伝子産物を上記代謝障害と相関させる同定により、代謝障害の潜在的モジュレーターをスクリーニングするためのプラットフォームも得られる。これらの遺伝子のいずれか又はそれによりコードされる蛋白質の活性のモジュレーターは治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因、及びインスリン抵抗性に効果があると予想される。従って、スクリーニング方法、スクリーニングシステム等も本発明の特徴である。これらのスクリーニングアプローチにより同定されたモジュレーターも本発明の特徴である。
【００７０】
治療誘発性体重増加、メタボリックシンドロームの診断及び治療用キットとして、例えば該当対立遺伝子を同定するためのプローブと、パッケージング材料と、該当対立遺伝子の検出を代謝疾患と相関させるための説明書を含むキットも本発明の特徴である。これらのキットは更に該当疾患のモジュレーター及び／又は従来方法を使用して患者を治療するための説明書も含むことができる。
治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び肥満素因の同定方法
【００７１】
上記のように、本発明は治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、肥満素因及び他の関連表現型と所定遺伝子又は他の遺伝子座（例えばＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２及び／又は付表１の遺伝子もしくは遺伝子座）を連鎖させる発見を提供する。従って、該当表現型と正又は負相関するマーカー（例えば付表１／表３ＢのＳＮＰ又はこれに密接に連鎖する遺伝子座）を検出することにより、個体又は集団がこれらの表現型に罹患し易いか否かを判定することができる。こうして、これらの表現型に最終的に罹患し易い患者を識別する早期検出法を強化し、場合により、例えば早期予防処置（例えば食事、運動、利用可能な薬剤等の任意既存治療）を行うことにより、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満、糖尿病等の実際の発症を予防することが可能になる。更に、患者が例えばメタボリックシンドロームに罹患しているか否かを識別するための既存診断技術は例えば上記「背景技術」の欄に記載したように、従来方法を使用すると多少不明瞭な場合があるが、本発明の各種マーカーを使用すると、既存診断技術の確実性も増す。更に、肥満、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性等の分子基盤の有無に関する情報は、例えば患者が該当障害の従来治療に応答する可能性がどの程度であるか、又は胃手術等のより深刻な選択が必要になるか否かの指標を提供することにより、患者予後の決定にも役立つと思われる。患者がどの型の分子障害を示すかに基づいて疾患治療を標的化することもできる。
【００７２】
非ヒト対象（例えば家畜等の非ヒト哺乳動物）でもヒトと同様に疾患診断及び予防（例えばイヌやネコ等のペット類の治療）の両者にこの情報を使用することができる。更に、必要に応じて脂肪生産又は赤身肉生産を強化するようにマーカー選抜動物育種を実施することが可能である。要約すると、実際に家畜を飼育して所望形質を測定しなくても、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因と正又は負相関するマーカー対立遺伝子について家畜動物又は生殖質を選択することができる。マーカー選抜育種（ＭＡＳ）は所望表現型を選択し、所望形質を家畜群に移入（例えば所望形質をエリート群集団に移入）するための強力な近道である。ＭＡＳは該当マーカーについて遺伝子材料を迅速にスクリーニングすることが可能な高スループット分子分析法に容易に応用され、家畜を飼育して目に見える形質を観察するよりも著しくコストパフォーマンスが高い。
【００７３】
該当対立遺伝子を検出するための検出法としては利用可能な任意方法（例えば増幅技術）が挙げられる。例えば、検出は多形又は多形に関連する配列を増幅する段階と、得られたアンプリコンを検出する段階を含むことができる。これは、増幅プライマー又は増幅プライマー対を（例えばＳＮＰ又は他の多形を含む）生体又は生体サンプルから単離した核酸鋳型と混合する段階を含むことができ、例えばプライマー又はプライマー対は遺伝子もしくは緊密に連鎖する多形の少なくとも一部、又はこれに近接する配列に相補的又は部分的に相補的である。プライマーは一般に核酸鋳型でポリメラーゼによる核酸重合を開始することが可能である。例えばポリメラーゼと鋳型核酸を含むＤＮＡ重合反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ等）でプライマー又はプライマー対を伸長させ、アンプリコンを生成する。アンプリコンは利用可能な任意方法により検出され、例えばシーケンシング、アンプリコンをアレーとハイブリダイズさせる（又はアンプリコンをアレーと結合し、プローブをこれにハイブリダイズさせる）、アンプリコンを制限酵素で消化する（例えばＲＦＬＰ）、リアルタイムＰＣＲ分析、１塩基伸長、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション等の方法が挙げられる。
【００７４】
検出された多形と形質の相関は対立遺伝子と表現型の関係を識別することが可能な任意方法により実施することができる。最も一般には、これらの方法は多形の対立遺伝子と表現型の相関を含むルックアップテーブルを参照する段階を含む。ルックアップテーブルは多重対立遺伝子−表現型関係のデータを含むことができ、例えば主成分分析、ヒューリスティックアルゴリズム等の統計ツールを使用することにより多重対立遺伝子−表現型関係の相加効果又は他の高次効果を考慮することができる。
【００７５】
これらの方法の文脈内で、マーカーと対立遺伝子をどのように連鎖させ、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因の同定方法の文脈においてこの現象をどのように使用できるかについて以下にまず記載し、次にマーカー検出法について記載する。付加セクションではデータ分析についても記載する。
マーカー、連鎖及び対立遺伝子
【００７６】
従来の連鎖（又は関連）分析では、染色体上の遺伝子の物理的関係に関する直接情報は不要である。メンデルの第１法則は形質対因子が分離するというものであり、即ち二倍体形質の対立遺伝子は２個の配偶子に分離した後、異なる子孫に伝達される。古典的な連鎖分析は異なる形質の共分離の相対頻度の統計的説明であると考えることができる。連鎖分析は形質が共分離する頻度に基づいてどのようにまとめられるかについての十分に特徴付けられた記述的構成である。即ち、２個の非対立遺伝子形質がランダム頻度を上回る頻度で同時に遺伝される場合に、これらの形質は「連鎖」していると言う。形質が同時に遺伝される頻度は形質が如何に緊密に連鎖しているかを示す第１の尺度であり、即ち、高頻度で同時に遺伝される形質のほうが（ランダム頻度よりは高いが）低頻度で同時に遺伝される形質よりも密接に連鎖している。形質の基礎にある遺伝子は同一染色体上で相互に近傍に位置するので、形質は連鎖している。相同染色体は減数分裂中に組換えを生じるので、染色体上で遺伝子が離れているほど、共分離しにくくなる。従って、染色体上で遺伝子が離れているほど、減数分裂中に組換えイベントが生じて２個の遺伝子が別々に子孫に分離する可能性が高くなる。
【００７７】
連鎖（又は関連）の一般的な尺度は形質が共分離する頻度である。これは共分離百分率（組換え頻度）又は一般に、実際に組換え頻度の相対単位であるセンチモルガン（ｃＭ）で表すことができる。ｃＭは先駆的遺伝学者トーマス・ハント・モーガンの名にちなみ、遺伝子組換え頻度の尺度単位である。１ｃＭはある遺伝子座の形質が１世代で組換えにより別の遺伝子座の形質から分離される１％の確率に等しい（即ち、形質は９９％の確率で共分離する）。染色体上の距離は形質間の組換えイベント頻度にほぼ比例するので、組換え頻度と相関する概算物理的距離が存在する。例えば、ヒトでは、１ｃＭは平均約１，０００，０００塩基対（１Ｍｂｐ）と相関する。
【００７８】
マーカー遺伝子座はそれ自体形質であり、分離中のマーカー遺伝子座を追跡することにより標準連鎖分析により評価することができる。従って、本発明の文脈では、１ｃＭはマーカー遺伝子座が１世代で組換えにより別の遺伝子座（他の任意形質とすることができ、例えば別のマーカー遺伝子座、又は治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因のＱＴＬをコードする別の形質遺伝子座が挙げられる）から分離される１％の確率に等しい。本発明のマーカー（例えば付表１に記載のマーカー）は治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因と相関することができる。これはマーカーが形質自体の予測指標として使用できる治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因のＱＴＬを含むか又はこれに十分近接していることを意味する。これは疾患診断面と、家畜用途でマーカー選抜育種（ＭＡＳ）に極めて有用である。
【００７９】
上記から明らかなように、該当形質遺伝子座に連鎖する任意マーカー（例えば、本発明の場合では、例えば付表１に示すような治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因のＱＴＬ又は同定された連鎖マーカー遺伝子座）をこの形質のマーカーとして使用することができる。従って、付表１に記載のマーカーに加え、付表１に列挙したマーカーに密接に連鎖する他のマーカーも付表１に記載のマーカー対立遺伝子（従って、該当表現型形質）の存在を有効に予測することができる。このような連鎖マーカーは所与遺伝子座との間に低い組換え頻度を示すように十分にこの所与遺伝子座と近接しているときに特に有用である。本発明では、このような密接に連鎖するマーカーも本発明の特徴である。密接に連鎖する遺伝子座は所与マーカーとの間に約２０％以下の組換え頻度を示す（所与マーカーは所与マーカーの２０ｃＭ以内にある）。換言するならば、密接に連鎖する遺伝子座は少なくとも８０％の確率で共分離する。より好ましくは、組換え頻度は１０％以下、例えば９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２５％、又は０．１％以下である。１典型的類の態様では、密接に連鎖する遺伝子座は相互に５ｃＭ以内にある。
【００８０】
当業者に自明の通り、組換え頻度（及び、その結果としてマップ位置）は使用するマップ（及びマップ上のマーカー）により変動し得る。付表１に記載のマーカーと密接に連鎖する（例えば、約２０ｃＭ以内、より好ましくは約１０ｃＭ以内）付加マーカーも治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因のＱＴＬを同定するために容易に使用することができる。
【００８１】
マーカー遺伝子座はこれらをマーカーとして使用しているターゲット遺伝子座（例えば治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因のＱＴＬ、あるいは、前記ＱＴＬとそれ自体連鎖する付表１に記載のもの等の単なる他のマーカー遺伝子座）と密接に連鎖しているときに本発明では特に有用である。マーカーが表現型形質をコード又はこれに影響を与えるターゲット遺伝子座と密接に連鎖しているほど、（ターゲット遺伝子座とマーカー間の交差頻度の低下により）マーカーはターゲット遺伝子座の良好な指標となる。従って、１態様では、マーカー遺伝子座等の密接に連鎖する遺伝子座と第２の遺伝子座（例えば付表１の所与マーカー遺伝子座と第２の付加遺伝子座）は約２０％以下、例えば１５％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは約９％以下、更に好ましくは約８％以下、更に好ましくは約７％以下、更に好ましくは約６％以下、更に好ましくは約５％以下、更に好ましくは約４％以下、更に好ましくは約３％以下、更に好ましくは約２％以下の遺伝子座間交差頻度を示す。特に好ましい態様では、該当遺伝子座（例えばマーカー遺伝子座とＱＴＬ等のターゲット遺伝子座）は約１％以下、例えば約０．７５％以下、より好ましくは約０．５％以下、更に好ましくは約０．２５％又は０．１％以下の組換え頻度を示す。従って、遺伝子座は約２０ｃＭ、１９ｃＭ、１８ｃＭ、１７ｃＭ、１６ｃＭ、１５ｃＭ、１４ｃＭ、１３ｃＭ、１２ｃＭ、１１ｃＭ、１０ｃＭ、９ｃＭ、８ｃＭ、７ｃＭ、６ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、ＩｃＭ、０．７５ｃＭ、０．５ｃＭ、０．２５ｃＭ、又は０．１ｃＭ以下の距離に位置する。換言するならば、２個の遺伝子座間の組換えが２０％未満（例えば約１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．１％以下）の頻度で生じるような距離で同一染色体に局在する２個の遺伝子座を相互に「近接」していると言う。１側面では、連鎖マーカーは相互に１００ｋｂ（ヒトでは局所組換え率に応じて約０．１ｃＭに相関）、例えば５０ｋｂ、又は２０ｋｂ以内にある。
【００８２】
２個の遺伝子エレメント（例えば治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因に寄与する遺伝子エレメントと近接マーカー）間の関係について言うとき、「相引」相連鎖とは遺伝子座の「有利な」対立遺伝子が夫々の連鎖マーカー遺伝子座の「有利な」対立遺伝子と同一染色体鎖上で物理的に関連している状態を意味する。相引相では、２個の有利な対立遺伝子はこの染色体鎖を受け継ぐ子孫により同時に遺伝される。「相反」相連鎖では、該当遺伝子座（例えば、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因のＱＴＬ）の「有利な」対立遺伝子は近接マーカー遺伝子座の「不利な」対立遺伝子と物理的に連鎖しており、２個の「有利な」対立遺伝子は同時に遺伝されない（即ち、２個の遺伝子座は相互に「相がずれている」）。
【００８３】
ゲノム、並びに対応する発現された核酸及びポリペプチドにおけるＳＮＰ及び他の多形の追跡に加え、ｍＲＮＡ又は蛋白質形態のＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２、又は付表１の遺伝子産物の個体又は集団間の発現レベル差を治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因表現型と相関させることもできる。従って、本発明のマーカーとしては、例えばゲノム遺伝子座、転写された核酸、スプライシングされた核酸、発現された蛋白質、転写された核酸レベル、スプライシングされた核酸レベル、及び発現された蛋白質レベルの任意のものが挙げられる。
マーカー増幅ストラテジー
【００８４】
マーカー（例えばマーカー遺伝子座）を増幅するための増幅プライマーと、前記マーカーを検出するため又はサンプルを多重マーカー対立遺伝子についてゲノタイピングするための適切なプローブも本発明の特徴である。付表１には、特定増幅部位と、当業者がこのようなプライマーの設計で（場合により既知フランキング配列と共に）容易に使用することができるアンプリコン配列を示す。例えば、長距離ＰＣＲのためのプライマー選択はＵＳＳＮ  １０／０４２，４０６（出願日２００２年１月９日）及びＵＳＳＮ  １０／２３６，４８０（出願日２００２年９月５日）に記載されており、短距離ＰＣＲについては、ＵＳＳＮ  １０／３４１，８３２（出願日２００３年１月１４日）がプライマー選択に関する手引きを記載している。「Ｏｌｉｇｏ」等の公共入手可能なプログラムもプライマー設計に利用できる。このような入手可能なプライマー選択及び設計ソフトウェアと、公共入手可能なヒトゲノム配列及び付表１に記載の多形位置を利用すれば、当業者は本発明のＳＮＰを増幅するためのプライマーを設計することができる。更に、当然のことながら、ＳＮＰを含む核酸（例えばＳＮＰを含むアンプリコン）の検出に使用する厳密なプローブは一定ではなく、本発明では例えば検出するマーカーンプリコンの領域を同定することができる任意プローブを使用することができる。更に、検出プローブの構成も当然のことながら一定ではない。従って、本発明は本明細書に記載する配列に限定されない。
【００８５】
実際に、当然のことながら、増幅はマーカー検出の要件ではなく、例えば、単にゲノムＤＮＡのサンプルでサザンブロットを実施することにより未増幅ゲノムＤＮＡを直接検出することができる。サザンブロット、標準増幅（ＰＣＲ、ＬＣＲ等）及び他の多数の核酸検出法を実施するための手順は確立されており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００２年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）に教示されている。
【００８６】
例えば産物への組込み後に該当増幅プライマーの修飾により産物形成を検出するリアルタイム増幅反応を実施するか、標識ヌクレオチドをアンプリコンに組込むか、又は未増幅前駆体と比較して（例えば蛍光偏光により）アンプリコンの分子回転特性の変化をモニターすることにより、増幅／検出法で別個の検出プローブを省略することもできる。
【００８７】
一般に、分子マーカーは当分野で入手可能な任意確立方法により検出され、限定されないが、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）、１塩基伸長の検出、アレーハイブリダイゼーション（場合によりＡＳＨを含む）、又は１塩基多形（ＳＮＰ）を検出するための他の方法、増幅断片長多形（ＡＦＬＰ）検出、増幅可変配列検出、ランダム増幅多形ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）検出、制限断片長多形（ＲＦＬＰ）検出、自律配列複製検出、単純反復配列（ＳＳＲ）検出、１本鎖コンフォメーション多形（ＳＳＣＰ）検出、アイソザイムマーカー検出、（発現レベルをマーカーとして使用する）ノーザン分析、ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡの定量的増幅等が挙げられる。本明細書の図面と表に記載する代表的マーカーはＳＮＰマーカーであるが、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因に影響又は作用する連鎖遺伝子座を同定するために本発明の文脈では上記マーカー種の任意のものを使用することができる。
代表的マーカー検出方法
【００８８】
本発明は治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因のＱＴＬを含むか又はこれに連鎖する分子マーカーを提供する。マーカーは疾患素因診断、予後、治療及び家畜における所望形質のマーカー選抜育種に有用である。本発明はこれらのマーカーの任意特定検出法に限定するものではない。
【００８９】
集団のメンバー間の遺伝的多形に対応するマーカーは当分野で確立された多数の方法（例えばＰＣＲによる配列特異的増幅法、制限断片長多形（ＲＦＬＰ）、アイソザイムマーカー、ノーザン分析、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）、アレーハイブリダイゼーション、ゲノムの増幅可変配列、自律配列複製、単純反復配列（ＳＳＲ）、１塩基多形（ＳＮＰ）、ランダム増幅多形ＤＮＡ（「ＲＡＰＤ」）又は増幅断片長多形（ＡＦＬＰ））により検出することができる。１付加態様では、単に多形マーカー領域のヌクレオチドシーケンシングにより分子マーカーの有無を判定する。これらの任意方法は高スループット分析に容易に応用される。
【００９０】
所定の遺伝子マーカー検出法は遺伝子マーカーに対応する核酸（例えばゲノムＤＮＡを鋳型として使用して生産された増幅核酸）とプローブ核酸のハイブリダイゼーションを利用する。限定されないが、溶液相、固相、混合相、又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ等のハイブリダイゼーションフォーマットが対立遺伝子検出に有用である。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋや、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ及びＡｕｓｕｂｅｌに記載されている。
【００９１】
例えば、制限断片長多形（ＲＦＬＰ）を含むマーカーは、例えば一般に検出する核酸のサブフラグメント（又はサブフラグメントに対応する合成オリゴヌクレオチド）であるプローブを制限消化ゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせることにより検出される。制限酵素は異なる個体又は集団で少なくとも２種の代替（又は多形）長の制限フラグメントを提供するように選択される。マーカーの各対立遺伝子の情報フラグメントを生じる１種以上の制限酵素の決定は当分野で周知の単純な方法である。適当なマトリックス（例えばアガロース又はポリアクリルアミド）で長さにより分離し、膜（例えばニトロセルロース、ナイロン等）に転写した後、プローブとターゲットの平衡結合を生じる条件下で標識プローブをハイブリダイズさせた後に、過剰のプローブを洗浄により除去する。
【００９２】
マーカー遺伝子座の核酸プローブをクローニング及び／又は合成することができる。本発明のプローブでは適切な任意ラベルを使用することができる。核酸プローブで使用するのに適した検出可能なラベルとしては、例えば、分光分析、放射性同位体、光化学、生化学、免疫化学、電気、光学又は化学的手段により検出可能な任意組成物が挙げられる。有用なラベルとしては、標識ストレプトアビジンコンジュゲート染色用ビオチン、磁気ビースー、蛍光色素、放射性ラベル、酵素及び色差ラベルが挙げられる。他のラベルとしてはフルオロフォア、化学発光剤、及び酵素で標識した抗体と結合するリガンドが挙げられる。プローブは放射性標識アンプリコンを生成するために使用される放射性標識ＰＣＲプライマーも構成することができる。核酸標識ストラテジーと対応する検出ストラテジーは例えばＨａｕｇｌａｎｄ（２００３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  第９版  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）に記載されている。マーカー検出ストラテジーに関するその他の詳細については以下に記載する。
増幅による検出法
【００９３】
ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ及びＬＣＲは該当核酸（例えばマーカー遺伝子座を含む核酸）を増幅し、該当核酸の検出を助長するための増幅及び増幅−検出方法として特に広く使用されている。これら及び他の増幅法の使用に関する詳細は例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、及びＢｅｒｇｅｒ等の各種標準教科書のいずれかに記載されている。多数の入手可能な生物学教科書もＰＣＲと関連増幅法について詳細に記載している。当業者に自明の通り、逆転写酵素とポリメラーゼを使用してほぼ任意ＲＮＡを制限消化、ＰＣＲ増幅及びシーケンシングに適した２本鎖ＤＮＡに変換できる（「逆転写（−ＰＣＲ」、ないし「ＲＴ−ＰＣＲ」）。Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＢｅｒｇｅｒ、前出も参照。これらの方法を使用してｍＲＮＡ又は対応するｃＤＮＡを定量的に増幅し、個体におけるＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２又は付表１の遺伝子もしくは遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの発現レベルの指標を提供することができる。治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因及びインスリン抵抗性のマーカーとして個体、家族、系統及び／又は集団間のこれらの遺伝子の発現レベルの差を使用することができる。
リアルタイム増幅／検出法
【００９４】
１側面では、例えば分子ビーコン又はＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用して、本明細書に記載する増幅混合物でリアルタイムＰＣＲ又はＬＣＲを実施する。分子ビーコン（ＭＢ）は適当なハイブリダイゼーション条件下で自己ハイブリダイズしてステム及びループ構造を形成するオリゴヌクレオチド又はＰＮＡである。ＭＢはオリゴヌクレオチド又はＰＮＡの末端にラベル又はクエンチャーをもつので、分子内ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でラベルは一般にクエンチャーにより消光（又は少なくともその蛍光を変化）される。ＭＢが分子内ハイブリダイゼーションを示さない条件下では（例えばターゲット核酸に結合しているとき、例えば増幅中にアンプリコンの領域に結合しているとき）、ＭＢラベルは消光されない。ＭＢの標準作製及び使用方法に関する詳細は文献に広く記載されており、ＭＢは多数の商業的試薬供給業者から市販されている。例えばＬｅｏｎｅら（１９９５）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＮＡＳＢＡ  ｅｎａｂｌｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ．”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２１５０−２１５５；Ｔｙａｇｉ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ（１９９６）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ：ｐｒｏｂｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ  ｕｐｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８；Ｂｌｏｋ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ（１９９７）“Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈ”  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  １１：１８７−１９４；Ｈｓｕｉｈら（１９９７）“Ｎｏｖｅｌ，ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ”  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３４：５０１−５０７；Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓら（１９９８）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ：ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｌｅｌｅｓ”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１２２８−１２２９；Ｓｏｋｏｌら（１９９８）“Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ：ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ”  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１１５３８−１１５４３；Ｔｙａｇｉら（１９９８）“Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｌｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：４９−５３；Ｂｏｎｎｅｔら（１９９９）“Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ”  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：６１７１−６１７６；Ｆａｎｇら（１９９９）“Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｆｏｒ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ���  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ”  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：２９２１−２９２２；Ｍａｒｒａｓら（１９９９）“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ”  Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１４：１５１−１５６；及びＶｅｔら（１９９９）“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ”  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：６３９４−６３９９も参照。ＭＢ作製及び使用に関するその他の詳細は特許文献に記載されており、例えばＵＳＰ  ５，９２５，５１７（１９９９年７月２０日）、発明者Ｔｙａｇｉら、発明の名称「検出可能に標識されたデュアルコンフォメーションオリゴヌクレオチドプローブ、アッセイ、及びキット（Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｄｕａｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ，ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ）」；ＵＳＰ  ６，１５０，０９７、発明者Ｔｙａｇｉら（２０００年１１月２１日）、発明の名称「非ＦＲＥＴ蛍光消光型核酸検出プローブ並びに前記プローブを含むキット及びアッセイ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｎｏｎ−ＦＲＥＴ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ  ａｎｄ  ａｓｓａｙｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｕｃｈ  ｐｒｏｂｅｓ）」；及びＵＳＰ  ６，０３７，１３０、発明者Ｔｙａｇｉら（２０００年３月１４日）、発明の名称「波長シフトプローブ及びプライマー並びにアッセイ及びキットにおけるその使用（Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｓｈｉｆｔｉｎｇ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ）」が挙げられる。
【００９５】
二重標識蛍光発光オリゴヌクレオチドプローブ（通称「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ）を使用するＰＣＲ検出及び定量も本発明により実施することができる。これらのプローブは２種の異なる蛍光色素で標識した短い（例えば２０〜２５塩基）オリゴデオキシヌクレオチドから構成される。各プローブの５’末端にレポーター色素を配置し、各プローブの３’末端に消光色素を配置する。オリゴヌクレオチドプローブ配列はＰＣＲアンプリコンに存在する内部ターゲット配列に相補的である。プローブが無傷の場合には、２種のフルオロフォアの間にエネルギー移動が生じ、レポーターからの発光はＦＲＥＴによりクエンチャーによって消光される。ＰＣＲの伸長相で、プローブは反応で使用されるポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により開裂され、レポーターがオリゴヌクレオチド−クエンチャーから放出され、レポーター発光強度が増す。従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブはラベルとクエンチャーをもつオリゴヌクレオチドであり、ラベルは増幅で使用されるポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ作用により増幅中に放出される。こうして、合成中に増幅のリアルタイム測定が得られる。各種ＴａｑＭａｎ（登録商標）試薬が例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）やＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えばブラックホールクエンチャープローブ）等の各種専門業者から市販されている。デュアルラベルプローブストラテジーに関するその他の詳細は例えばＷＯ９２／０２６３８に記載されている。
【００９６】
他の同様の方法としては例えば例えばＵ．Ｓ．６，１７４，６７０に記載されている「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）」フォーマットを使用する２個の隣接してハイブリダイズしたプローブ間の蛍光共鳴エネルギー移動が挙げられる。
アレーによるマーカー検出
【００９７】
アレーによる検出は例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）又は他の製造業者から市販されているアレーを使用して実施することができる。核酸アレーの操作に関する文献としては、Ｓａｐｏｌｓｋｙら（１９９９）“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ．”  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：１８７−１９２；Ｌｏｃｋｈａｒｔ（１９９８）“Ｍｕｔａｎｔ  ｙｅａｓｔ  ｏｎ  ｄｒｕｇｓ”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１２３５−１２３６：Ｆｏｄｏｒ（１９９７）“Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ．”  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１：Ａ８７９；Ｆｏｄｏｒ（１９９７）“Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：３９３−３９５；及びＣｈｅｅら（１９９６）“Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：６１０−６１４が挙げられる。アレーによる検出はアレーによる検出の固有の高スループット性により、本発明のマーカーをサンプル中で同定するために好ましい方法である。
【００９８】
各種プローブアレーが文献に記載されており、本発明の文脈では本明細書に記載する表現型（治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因、インスリン抵抗性等）に相関させることができるマーカーを検出するために使用することができる。例えば、本発明の１態様では、ＤＮＡプローブアレーチップ又は（ウェーハを分割することにより個々のチップが得られる）大型ＤＮＡプローブアレーウェーハを使用する。ＤＮＡプローブアレーウェーハは一般にＤＮＡプローブの高密度アレー（ＤＮＡの短いセグメント）が配置されたガラスウェーハを含む。これらのウェーハは各々、（例えば該当マーカーを含む個体又は集団に由来する）長いサンプルＤＮＡ配列を認識するために使用される例えば約６０，０００，０００個のＤＮＡプローブを保持することができる。ガラスウェーハ上のＤＮＡプローブセットによるサンプルＤＮＡの認識はＤＮＡハイブリダイゼーションにより実施される。ＤＮＡサンプルがＤＮＡプローブアレーとハイブリダイズすると、サンプルはサンプルＤＮＡ配列に相補的なプローブと結合する。個体のサンプルＤＮＡがどのプローブとより強くハイブリダイズするかを評価することにより、サンプルに既知配列の核酸が存在するか否かを調べることができ、その結果、核酸に存在するマーカーの有無を調べることができる。例えばＳＮＰ同定及び１個以上のＳＮＰについてサンプルをゲノタイピングするために、１塩基識別を可能にするようにハイブリダイゼーション条件を調節することにより、このアプローチを使用してＡＳＨを実施することもできる。
【００９９】
対立遺伝子情報を得るためにＤＮＡプローブアレーを使用する方法は一般に以下の一般段階を含む：ＤＮＡプローブアレーの設計と作製、サンプルの調製、サンプルＤＮＡとアレーのハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションイベントの検出及び配列を決定するためのデータ分析。好ましいウェーハはコストパフォーマンスと高品質を達成するように半導体製造から応用した方法を使用して製造され、例えばＳａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに所在のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃから市販されている。
【０１００】
例えば、プローブアレーは半導体産業で利用されているようなフォトリソグラフィー作製技術と固相化学合成を組み合わせた光による化学合成法により製造することができる。一連のフォトリソグラフィーマスクを使用してチップ露光位置を規定した後に特定化学合成段階を実施するこの方法は、アレーの予め規定された位置に各プローブを配置した高密度オリゴヌクレオチドアレーを作製する。大型ガラスウェーハ上で複数のプローブアレーを同時に合成することができる。この平行法は再現性を増し、量産効果を得るのに役立つ。
【０１０１】
ＤＮＡプローブアレーを作製したら、該当マーカーの存在及び／又は発現レベルに関するデータを得るために使用することができる。ＤＮＡサンプルは標準生化学法によりビオチン及び／又は蛍光レポーター基で標識することができる。標識サンプルをアレーと共にインキュベートすると、サンプルのセグメントはアレー上の相補配列と結合又はハイブリダイズする。アレーを洗浄及び／又は染色すると、ハイブリダイゼーションパターンを生成することができる。次にアレーを走査し、蛍光レポーター基からの発光によりハイブリダイゼーションパターンを検出する。これらの手順に関するその他の詳細は下記実施例に記載する。アレー上の各プローブの種類と位置は分かっているので、アレーに添加したサンプル中のＤＮＡ配列の種類を決定することができる。これらのアレーをゲノタイピング実験に使用するときには、ゲノタイピングアレーと言うことができる。
【０１０２】
分析する核酸サンプルを単離し、増幅し、一般にビオチン及び／又は蛍光レポーター基で標識する。次にフルイディクスステーションとハイブリダイゼーションオーブンを使用して標識核酸サンプルをアレーと共にインキュベートする。検出法に応じて適宜アレーを洗浄及び／又は染色又は対比染色することができる。ハイブリダイゼーション、洗浄及び染色後にアレーをスキャナーに挿入し、ハイブリダイゼーションパターンを検出する。プローブアレーと結合した標識核酸に予め組込んだ蛍光レポーター基からの発光としてハイブリダイゼーションデータを取得する。標識核酸と最も明白にマッチするプローブはミスマッチをもつプローブよりも強いシグナルを発生する。アレー上の各プローブの配列と位置は分かっているので、相補性により、プローブアレーに添加された核酸サンプルを同定することができる。
【０１０３】
１態様では、２個のＤＮＡサンプルを示差的に標識し、指定ゲノタイピングアレー１セットとハイブリダイズさせることができる。こうして、同一物理的アレーから２個のデータセットが得られる。使用できるラベルとしては限定されないが、ＣｙＣｈｒｏｍｅ，フルオレセイン、又はビオチン（その後、ハイブリダイゼーション後にフィコエリスリン−ストレプトアビジンで染色）が挙げられる。その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む米国特許第６，３４２，３５５号には２色標識が記載されている。両方のラベルからのシグナルを同時に検出するように各アレーを走査してもよいし、各シグナルを別々に検出するように２回走査してもよい。
【０１０４】
マーカーの存在を試験する各個体の全マーカーについて強度データをスキャナーにより収集する。測定した強度は所与個体のサンプルに存在する特定マーカーの量（ゲノムを分析するか発現された核酸を分析するかに応じて発現レベル及び／又は個体に存在する対立遺伝子のコピー数）を表す指標である。これを使用して個体が該当マーカーにホモ接合であるかヘテロ接合であるかを判定することができる。強度データを処理すると、各種強度の対応するマーカー情報が得られる。
増幅可変配列、ＳＳＲ、ＡＦＬＰ、ＡＳＨ、ＳＮＰ及びアイソザイムマーカーに関するその他の詳細
【０１０５】
増幅可変配列とは、同一種のメンバー間に高い核酸残基変動性を示すゲノムの増幅配列を意味する。全生体は可変ゲノム配列をもち、（クローンを除く）各生体は異なる可変配列セットをもつ。特定可変配列の存在が確認されたら、表現型形質を予測するために使用することができる。ＤＮＡの可変配列の両側に配置したプライマーで増幅するための鋳型としてゲノムに由来するＤＮＡを利用することが好ましい。可変配列を増幅した後に配列決定する。
【０１０６】
あるいは、自律配列複製を使用して遺伝子マーカーを同定することもできる。自律配列複製とは、レトロウイルス複製に関与する３種の酵素活性である（１）逆転写酵素、（２）Ｒｎａｓｅ  Ｈ、及び（３）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して実質的に等温条件下で指数的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製されるターゲット核酸配列を使用する核酸増幅法を意味する（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１８７４）。ｃＤＮＡ中間体によるＲＮＡ複製のレトロウイルスストラテジーを模倣することにより、この反応は元のターゲットのｃＤＮＡ及びＲＮＡコピーを蓄積する。
【０１０７】
増幅断片長多形（ＡＦＬＰ）を遺伝子マーカーとして使用することもできる（Ｖｏｓら（１９９５）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：４４０７）。「増幅断片長多形」なる用語は制限エンドヌクレアーゼによる開裂前又は後に増幅される選択制限フラグメントを意味する。増幅段階により特定制限フラグメントの検出を容易にすることができる。ＡＦＬＰは多数の多形マーカーの検出を可能にし、遺伝子マッピングに使用されている（Ｂｅｃｋｅｒら（１９９５）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４９：６５；及びＭｅｋｓｅｍら（１９９５）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４９：７４）。
【０１０８】
対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）を使用して本発明の遺伝子マーカーを同定することもできる。ＡＳＨ法は短い１本鎖オリゴヌクレオチドプローブと完全に相補的な１本鎖ターゲット核酸の安定的アニーリングに基づく。検出はプローブに結合した同位体又は非同位体ラベルにより実施することができる。
【０１０９】
各多形について、多形ヌクレオチド以外に同一ＤＮＡ配列をもつように２個以上の異なるＡＳＨプローブを設計する。各プローブは一連のプローブが全既知代替対立遺伝子配列を識別できるように１個の対立遺伝子配列と厳密な相同性をもつ。各プローブをターゲットＤＮＡとハイブリダイズさせる。適当なプローブ設計及びハイブリダイゼーション条件下で、プローブとターゲットＤＮＡの間の１塩基ミスマッチはハイブリダイゼーションを妨げる。こうして、代替プローブの１個のみが対立遺伝子にホモ接合又は均質のターゲットサンプルとハイブリダイズする。２個の対立遺伝子にヘテロ接合又は不均質のサンプルは２個の代替プローブの両方とハイブリダイズする。
【０１１０】
ＡＳＨマーカーはただ１個のプローブによるハイブリダイゼーションの有無からただ１個の対立遺伝子の有無を判定する優性マーカーとして使用される。代替対立遺伝子はハイブリダイゼーションの不在から推測することができる。ＡＳＨプローブ及びターゲット分子は場合によりＲＮＡ又はＤＮＡであり、ターゲット分子はプローブに相補的な配列よりも長い任意ヌクレオチド長であり、プローブはＤＮＡターゲットのいずれかの鎖とハイブリダイズするように設計され、プローブは各種ストリンジェントハイブリダイゼーション条件等に合致するような寸法とする。
【０１１１】
ＰＣＲは比較的小容量の低濃度核酸からＡＳＨのターゲット配列を増幅することができる。また、ゲノムＤＮＡからのターゲット配列を制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル電気泳動によりサイズ分離する。ハイブリダイゼーションは一般にターゲット配列を膜表面に結合して実施され、あるいは、米国特許第５，４６８，６１３号に記載されているように、ＡＳＨプローブ配列を膜に結合してもよい。
【０１１２】
１態様では、ＡＳＨデータは一般にＰＣＲを使用してゲノムＤＮＡからの核酸フラグメント（アンプリコン）を増幅し、ドットブロットフォーマットでアンプリコンターゲットＤＮＡを膜に転写し、標識オリゴヌクレオチドプローブをアンプリコンターゲットにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションドットをオートラジオグラフィーにより観察することにより得られる。
【０１１３】
１塩基多形（ＳＮＰ）は１塩基に基づいて区別される共通配列から構成されるマーカーである。一般に、この差異は例えばアクリルアミドゲルでＳＮＰを含むアンプリコンの示差的泳動により検出される。しかし、ハイブリダイゼーション（例えばＡＳＨ）、又はＲＦＬＰ分析等の代替検出方法も適切である。
【０１１４】
例えば本発明のマーカーに連鎖するアイソザイムマーカーを追跡するためには、アイソザイムマーカーを遺伝子マーカーとして使用することができる。アイソザイムはそのアミノ酸配列、従ってその核酸配列が相互に異なる酵素の多重形態である。所定のアイソザイムは僅かに異なるサブユニットを含むマルチマー酵素である。また、マルチマー又はモノマーであるが、アミノ酸配列の異なる部位でプロ酵素から開裂しているものもある。アイソザイムは蛋白質レベルで特性決定及び分析することができ、あるいは、核酸レベルで異なるアイソザイムを決定することができる。このような場合には、本明細書に記載する任意核酸法を使用してアイソザイムマーカーを分析することができる。
核酸増幅に関するその他の詳細
【０１１５】
上記のように、ＰＣＲやＬＣＲ等の核酸増幅法は当分野で周知であり、マーカー遺伝子座を含む核酸等の該当核酸を増幅及び／又は検出するために本発明に適用することができる。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ法により当業者が実施するために十分な技術の例としてはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＱＢ−レプリカーゼ増幅及び他のＲＮＡポリメラーゼ法（例えばＮＡＳＢＡ）が挙げられ、上記文献（例えばＩｎｎｉｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、及びＢｅｒｇｅｒ）に記載されている。その他の詳細はＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，１９９０）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３，８１−９４；（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  ３５，１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，２９１−２９４；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４，５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９，１１７、及びＳｏｏｋｎａｎａｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４に記載されている。位置クローニングの文脈において有用なＰＣＲにより大型核酸を増幅する改善方法は更にＣｈｅｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４とその引用文献に要約されており、４０ｋｂまでのＰＣＲアンプリコンが作製される。長距離ＰＣＲ法は例えば、米国特許出願第１０／０４２，４０６号、出願日２００２年１月９日、発明の名称「プライマー対の選択用アルゴリズム（Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐａｉｒｓ）」；米国特許出願第１０／２３６，４８０号、出願日２００２年９月９日、発明の名称「核酸増幅法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）」；及び米国特許第６，７４０，５１０号、発行日２００４年５月２５日、発明の名称「核酸増幅法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）」に開示されている。ＵＳＳＮ  １０／３４１，８３２（出願日１／１４／０３）も短距離ＰＣＲを実施するためのプライマーピッキング法に関する詳細を記載している。
蛋白質発現産物の検出
【０１１６】
ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２及び付表１に記載の遺伝子によりコードされる他の蛋白質等の蛋白質は本発明の該当表現型に相関されるマーカーを含む核酸等の核酸によりコードされる。ＤＮＡ→ＲＮＡ→蛋白質への発現（転写及び／又は翻訳）を含む分子生物学の基本パラダイムの記載については、Ａｌｂｅｒｔｓら（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第４版  Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｉｎｃ．，ＩＳＢＮ：０８１５３３２１８１（「Ａｌｂｅｒｔｓ」）、及びＬｏｄｉｓｈら（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版  Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ，ＩＳＢＮ：０７１６７３７０６Ｘ（「Ｌｏｄｉｓｈ」）参照。、従って、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２又は付表１に記載の遺伝子に対応する蛋白質は例えば個体又は集団間で異なる蛋白質アイソタイプを検出するか、又はこのような該当蛋白質の示差的存在、不在又は発現レベル（例えばＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２又は付表１の遺伝子産物の発現レベル）を検出することにより、マーカーとして検出することができる。
【０１１７】
各種蛋白質検出法が公知であり、マーカーを識別するために使用することができる。上記各種文献に加え、各種蛋白質操作及び検出法が当分野で周知であり、例えばＲ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，第２版  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  第３版  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；並びにその引用文献に記載されているものが挙げられる。蛋白質精製及び検出法に関するその他の詳細はＳａｔｉｎｄｅｒ  Ａｈｕｊａ編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）に記載されている。
【０１１８】
多数の蛋白質を同時に検出する「プロテオミック」検出法が記載されている。これらの方法としては各種多次元電気泳動法（例えば２−ｄゲル電気泳動）、質量分析法（例えばＳＥＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレー等）、又は表面プラズモン共鳴法が挙げられる。例えば、ＭＡＬＤＩでは、一般にサンプルを適当なマトリックスと混合し、プローブの表面に載せ、レーザー脱離／イオン化により試験する。ＭＡＬＤＩ技術は当分野で周知である。例えば米国特許第５，０４５，６９４号（Ｂｅａｖｉｓら）、米国特許第５，２０２，５６１号（Ｇｌｅｉｓｓｍａｎｎら）、及び米国特許６，１１１，２５１号（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ）参照。同様に、ＳＥＬＤＩでは、第１のアリコートを固体支持体に結合（例えば基板に結合した）吸着剤と接触させる。基板は一般に、気相イオンスペクトロメーターと照合可能な関係で配置することができるプローブ（例えばバイオチップ）である。ＳＥＬＤＩも周知技術であり、診断プロテオミクスに応用されている。例えばＩｓｓａｑら（２００３）“ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ”  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：１４９  Ａ−１５５Ａ参照。
【０１１９】
一般に、上記方法は蛋白質の各種形態（対立遺伝子）を検出するために使用することができ、及び／又は個体、家族、系統、集団等の間の（対立遺伝子差によると思われる）蛋白質の種々の発現レベルを検出するために使用することができる。コードされる示差的に発現される蛋白質自体は同一であっても、環境因子を制御しているときの発現レベルの差は該当遺伝子のＱＴＬにおける各種対立遺伝子の指標とすることができる。これは、例えば、非コーディング領域（例えば遺伝子発現を制御するプロモーターやエンハンサー等の領域）に遺伝子の多重多形形態が存在する場合に生じる。従って、示差的発現レベルの検出を対立遺伝子差の検出方法として使用することができる。
【０１２０】
本発明の他の側面では、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、又は肥満に関連する核酸を含むか、これと不平衡連鎖しているか、又はその制御下にある遺伝子は示差的対立遺伝子発現を示すことができる。本明細書で使用する「示差的対立遺伝子発現」とは細胞に存在する単一遺伝子の多重対立遺伝子の対立遺伝子発現の質的及び量的差を意味する。従って、示差的対立遺伝子発現を示す遺伝子は同一細胞／組織で第２の対立遺伝子に比較して異なる時間又はレベルで発現される１個の対立遺伝子をもつことができる。例えば、両方とも同一遺伝子の対立遺伝子であり、同一細胞／組織に存在するとしても、メタボリックシンドロームに関連する対立遺伝子はメタボリックシンドロームに関連しない対立遺伝子よりも高レベル又は低レベルで発現することができる。示差的対立遺伝子発現及び分析方法は米国特許出願第１０／４３８，１８４号（出願日２００３年５月１３日）及び米国特許出願第１０／８４５，３１６号（出願日２００４年５月１２日）、いずれも発明の名称「対立遺伝子特異的発現パターン（Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）」に詳細に開示されている。治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、又は肥満に対する易罹患性に関連する１種以上の核酸、又はフラグメント、誘導体、多形、変異体又はその相補体の示差的対立遺伝子発現パターンの検出は夫々メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、又は肥満に対する易罹患性の予後及び診断であり、同様に、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、又は肥満に対する抵抗性に関連する１種以上の核酸、又はフラグメント、誘導体、多形、変異体又はその相補体の示差的対立遺伝子発現パターンの検出は夫々メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、又は肥満に対する抵抗性の予後及び診断である。
スクリーニングに適したマーカー種に関するその他の詳細
【０１２１】
本発明の表現型との相関についてスクリーニングされる生体マーカーはスクリーニングにより検出可能なマーカー種の任意のものとすることができ、例えば（例えばＳＮＰにおける）遺伝子座の対立遺伝子変異体等の遺伝子マーカー、発現マーカー（例えばｍＲＮＡ及び／又は蛋白質の存在又は量）、及び／又は同等マーカーが挙げられる。
【０１２２】
本発明の方法で増幅、転写、翻訳及び／又は検出する該当核酸はほぼ任意核酸とすることができるが、ヒト資源に由来する核酸が疾患診断及び臨床用途に関連するマーカーの検出に特に適切である。ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２及び／又は付表１の遺伝子又は遺伝子産物の配列を含めて（逆転写により核酸配列を誘導することができる）多数の核酸及びアミノ酸の配列が入手可能である。公知核酸の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。増幅、転写、翻訳及び／又は検出する核酸はＲＮＡ（例えば増幅がＲＴ−ＰＣＲ又はＬＣＲ、Ｖａｎ−Ｇｅｌｄｅｒ  Ｅｂｅｒｗｉｎｅ反応又はＲｉｂｏ−ＳＰＩＡを含む場合）又はＤＮＡ（例えば増幅ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、又は（例えば該当サンプルが人工核酸を含むか又は人工核酸を誘導もしくは合成するために使用される場合に、例えば合成核酸又はその類似体を検出するためには）その任意類似体とすることができる。個体又は集合間の核酸配列又は発現レベルの任意変動をマーカー（例えば突然変異、多形、１塩基多形（ＳＮＰ）、対立遺伝子、アイソタイプ、ＲＮＡ又は蛋白質発現等）として検出することができる。治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因及び／又はインスリン抵抗性に相関させることができるマーカーとして配列、発現レベル又は遺伝子コピー数の変動を検出することができる。
【０１２３】
例えば、本発明の方法は患者に由来するサンプルを例えば患者からの体液（血液、唾液、尿等）、組織、及び／又は老廃物に由来する該当マーカー核酸についてスクリーニングするのに有用である。従って、適当な核酸を含むほぼ任意該当組織と同様に、大便、痰、唾液、血液、リンパ液、涙液、汗、尿、膣分泌液、射精液等を本発明の方法により核酸について容易にスクリーニングすることができる。これらのサンプルは一般にインフォームドコンセント後に標準医学実験室法により患者から採取される。
【０１２４】
マーカーを含む核酸の増幅及び／又は検出前に、核酸を場合により例えばＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；及び／又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００２年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））に教示されている方法等の入手可能な任意方法でサンプルから精製する。細胞又は他のサンプルから核酸を精製するための多数のキットも市販されている（例えばいずれもＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製品であるＥａｓｙＰｒｅｐ（登録商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（登録商標）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製品ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（登録商標）；及びＱｉａｇｅｎ製品ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）参照）。あるいは、例えば分注及び／又は希釈後にサンプルを単に直接増幅又は検出することもできる。
【０１２５】
マーカーの例としては多形、１塩基多形、サンプル中の１種以上の核酸の存在、サンプル中の１種以上の核酸の不在、１種以上のゲノムＤＮＡ配列の存在、１種以上のゲノムＤＮＡ配列の不在、１種以上のｍＲＮＡの存在、１種以上のｍＲＮＡの不在、１種以上のｍＲＮＡの発現レベル、１種以上の蛋白質の存在、１種以上の蛋白質の発現レベル、及び／又は前記事項又はその組み合わせのいずれかから誘導されるデータが挙げられる。利用可能な方法（例えば高密度、高スループットマーカーマッピングを実現するアレー技術）を使用してほぼ任意数のマーカーを検出することができる。従って、第１及び／又は第２の集団で該当表現型と相関させるために少なくとも約１０、１００、１，０００、１０，０００、又は１００，０００個以上の遺伝子マーカーを同時又は順次（又はその組み合わせで）試験することができる。例えば表現型に相関される集団内の遺伝子組み合わせ又は発現パターン組み合わせを識別するためには、マーカー組み合わせを試験できることも望ましい。
【０１２６】
上記のように、検出する生体マーカーは検出可能な任意生体成分とすることができる。一般に検出されるマーカーとしては、遺伝子マーカー（例えばゲノムＤＮＡ又はその発現産物に存在するＤＮＡ配列マーカー）と（遺伝的にコードされる因子、環境因子、又は両者を反映することができる）発現マーカーが挙げられる。マーカーが発現マーカーである場合には、方法は（例えば１個以上の発現されたマーカー、例えば発現されたマーカーセットの）第１の個体又は集団の第１の発現プロフィルを測定する段階と、第１の発現プロフィルを第２の個体又は集団の第２の発現プロフィルと比較する段階を含むことができる。この例では、発現マーカーを特定表現型に相関させる段階は、第１又は第２の発現プロフィルを該当表現型と相関させる段階を含むことができる。
プローブ／プライマー合成法
【０１２７】
一般に、プローブ、プライマー、分子ビーコン、ＰＮＡ、ＬＮＡ（ロック核酸）等のオリゴヌクレオチドを作製するための合成法は周知である。例えば、オリゴヌクレオチドは例えばＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：６１５９−６１６８に記載されているような市販自動合成器を使用してＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．，２２（２０）：１８５９−１８６２に記載の固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成することができる。修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは当業者に公知の各種業者に注文することもできる。多数のオリゴ合成サービス供給業者があるので、これは広く利用可能な技術である。Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）及び他の多数の業者等の各種業者のいずれかに任意核酸を特別注文することができる。同様に、ＰＮＡもＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ（ｐｋｉｍ＠ｃｃｎｅｔ．ｃｏｍ）、ＨＴＩ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｉｎｃ．（ｈｔｉｂｉｏ．ｃｏｍ）、ＢＭＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ（Ｕ．Ｋ．）、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．、及び他の多数の業者等の各種業者のいずれかに特別注文することができる。
Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏマーカー検出
【０１２８】
所定態様では、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して該当マーカー遺伝子座を検出することができる。例えば、該当マーカー遺伝子座を含む核酸の配列をコンピューターに保存することができる。例えば、ＢＬＡＳＴ等の容易に入手可能なプログラムで得られるような適切な核酸検索アルゴリズムや、又は単純なワードプロセッサーを使用して所望マーカー遺伝子座配列又はそのホモログを同定することができる。完全ヒトゲノムは配列決定されているので、配列情報を使用してマーカー領域、フランキング核酸等を同定することができる。
マーカー検出用増幅プライマー
【０１２９】
所定の好ましい態様では、本発明の分子マーカーはＰＣＲアンプリコンのサイズ又は配列がマーカー（例えば特定マーカー対立遺伝子）の有無を示す適切なＰＣＲ検出法を使用して検出される。この種の方法では、多形マーカー領域の両側の保存領域にＰＣＲプライマーをハイブリダイズさせる。
【０１３０】
当然のことながら、本明細書にはプライマーの多数の具体例を示す（付表１参照）が、本発明で使用するのに適切なプライマーは適切な任意方法を使用して設計することができる。本発明は特定プライマー又はプライマー対に限定するものではない。例えば、プライマーは例えば公共入手可能な配列情報を考慮してＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（登録商標）等の適切な任意ソフトウェアプログラムを使用して設計することができる。
【０１３１】
所定態様では、付加標識段階又は可視化段階を加えずに増幅反応後に各種サイズのアンプリコンを迅速に可視化できるように、本発明のプライマーを放射性標識するか又は（例えば非放射性蛍光タグを使用して）適切な任意手段により標識する。所定態様では、プライマーを標識せず、そのサイズ分解後（例えばアガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動後）にアンプリコンを可視化する。所定態様では、サイズ分解後にＰＣＲアンプリコンを臭化エチジウム染色することにより各種サイズのアンプリコンを可視化することができる。
【０１３２】
本発明のプライマーは特定サイズのアンプリコンの生成に限定するものではない。例えば、本発明でマーカー遺伝子座及び対立遺伝子を増幅するために使用されるプライマーは該当遺伝子座の全領域の増幅に限定されない。プライマーは付表１に代表的アンプリコンとして示すものよりも長いか又は短い適切な任意長さのアンプリコンを生成することができる。所定態様では、マーカー増幅は少なくとも２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも１００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも２００ヌクレオチド長のアンプリコンを生成する。
位置クローニングのためのマーカー検出
【０１３３】
所定態様では、マーカー配列を含む核酸を検出するために核酸プローブを使用する。このようなプローブは例えば、マーカーヌクレオチド配列と連鎖するヌクレオチド配列を単離するために位置クローニングで使用することができる。本発明の核酸プローブは任意特定サイズに限定するものではない。所定態様では、核酸プローブは少なくとも２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも１００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも２００ヌクレオチド長である。
【０１３４】
ハイブリダイズしたプローブは検出するラベルに応じてオートラジオグラフィー、フルオログラフィー又は他の同様の検出法を使用して検出される。特定ハイブリダイゼーションプロトコールの例は文献に広く記載されており、例えば、いずれも本明細書に引用するＢｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、及びＡｕｓｕｂｅｌを参照されたい。
トランスジェニック細胞及び生物の作製
【０１３５】
本発明は本発明により同定されたＱＴＬに対応する核酸で形質転換された細胞及び生物も提供する。例えば、このような核酸としては治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び／又は肥満素因のＱＴＬに対応又は連鎖する遺伝子をコードする染色体区間（例えばゲノムフラグメント）、ＯＲＦ及び／又はｃＤＮＡが挙げられる。更に、本発明は肥満、インスリン抵抗性、治療誘発性体重増加、及びメタボリックシンドロームに影響を与えるポリペプチドの生産方法も提供する。これは例えば家畜集団で治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因又はインスリン抵抗性に影響を与えるために有用である。トランスジェニック細胞の作製は表現型に影響を与える規定遺伝子をもつ商業的に有用な細胞を提供することにより、表現型の潜在的モジュレーターをスクリーニングするためのプラットフォームと、該当遺伝子の各々の作用メカニズムの基礎研究も提供する。更に、望ましい遺伝子を個体又はその集団に導入するために遺伝子治療を使用することができる。このような遺伝子治療は個体が示す障害の治療を提供するために使用することもできるし、危険のある個体にこのような障害が発症するのを予防するための予防手段として使用することもできる。遺伝子の表現型効果を更に確認するためには、本明細書に記載する任意遺伝子についてノックアウトマウス等のノックアウト動物を作製することができる。同様に、例えば本明細書に記載する任意天然遺伝子をノックアウトし、（例えば相同組換えにより）ヒト（又は他の種）遺伝子を動物に導入することにより組換えマウス又は他の動物をヒト疾患モデルとして使用することができる。その後、得られたｉｎ  ｖｉｖｏモデル動物システムで異種ヒト遺伝子及び遺伝子産物に及ぼすモジュレーターの効果をモニターすることができる。
【０１３６】
核酸をクローニング及び操作し、コードされるポリペプチドを生産するための分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター、更に例えば該当核酸（例えば遺伝子、マーカー遺伝子座、マーカープローブ、マーカー遺伝子座と共分離するＱＴＬ等）を含むクローンの作製に関連する他の多くの関連事項について記載している。
【０１３７】
例えば、クローニングベクター、シャトルベクター又は発現ベクターとすることができる本発明のベクター（例えばＱＴＬに由来又は関連するＯＲＦを含む発現ベクター等のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質導入、トラクスフェクション、形質転換等）する。このようなベクターは例えば、プラスミド、ファージミド、アグロバクテリウム、ウイルス、裸のポリヌクレオチド（線状又は環状）、又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態である。ベクターは特に増殖及び拡大の目的で細菌に導入することができる。核酸導入法に関するその他の詳細はＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ及びＡｕｓｕｂｅｌ，後出に記載されている。本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法は本発明には重要ではなく、本発明は外来遺伝子材料を宿主細胞に導入する任意特定方法に限定するものではない。従って、核酸を細胞又はプロトプラストに有効に導入するための適切な任意方法（例えば限定されないが、本明細書に記載する方法）を利用することができ、本発明で有用である。
【０１３８】
組換え宿主細胞は例えば、プロモーターの活性化や形質転換細胞の選択等の操作に合わせて適宜改変した従来の栄養培地で培養することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ及びＡｕｓｕｂｅｌ，いずれも後出に加え、Ａｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬや、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から刊行されたＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（２００４）（「Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ」）等の入手可能な商業文献もその他の詳細について記載している。
ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製
【０１３９】
トランスジェニック動物は遺伝子機能を試験し、推定遺伝子又は遺伝子産物モジュレーターを試験するための有用なツールである。実験室動物の内在遺伝子の代わりに本発明のヒト（又は他の選択種）遺伝子を導入すると、操作と試験の容易な実験室動物でヒト（又は他の動物、例えば家畜）遺伝子又は遺伝子産物の機能を試験できる。
【０１４０】
当然のことながら、異なる動物の相同遺伝子間でモジュレーター応答は必ずしも厳密に一致しないので、実験室動物でヒト又は他の該当種（例えば家畜種）を試験できるならば特に有用である。同様の遺伝子操作を組織培養液でも実施できるが、無傷生物における遺伝子及び遺伝子産物の相互作用により、単純な細胞スクリーニングアッセイで得られるよりもこのような遺伝子及び遺伝子産物のより完全な生体該当状況が得られる。従って、本発明の１特徴は該当異種遺伝子（例えば異種（ＰＡＰＰＡ）、ペプチジルグリシンαアミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、及び／又はＨＳＦ２）を含むトランスジェニック動物の作製である。
【０１４１】
一般に、このようなトランスジェニック動物は単にその細胞の１個以上に人工的に導入された適切な遺伝子（又は例えばプロモーターに結合したコーディング配列を含む部分遺伝子）をもつ動物である。これは２つの方法の一方で実施することが最も一般的である。まず、ＤＮＡを受精卵の前核に注入することによりランダムに組込むことができる。この場合には、ＤＮＡはゲノムの任意場所に組込むことができる。このアプローチでは、注入したＤＮＡと宿主ゲノムの間に相同性は不要である。第２に、（異種）ＤＮＡを胚性幹（ＥＳ）細胞に導入し、異種ＤＮＡが核内ゲノムの相同配列と相同組換えした細胞を選択することにより、標的挿入を実施することができる。一般に、異種ＤＮＡとゲノムＤＮＡの間には数キロベースの相同性があり、形質転換細胞を選択できるようにポジティブ選択マーカー（例えば抗生物質耐性マーカー）を異種ＤＮＡに加える。更に、非相同組換え（ランダム挿入）によりＤＮＡを組込んだ細胞をネガティブ選択するためにネガティブ選択マーカー（例えばバルナーゼ等の「毒性」遺伝子）を使用することができる。
【０１４２】
ＤＮＡの標的挿入の一般的な１使用例はノックアウトマウスの作製である。一般に、破壊したい遺伝子の必須エキソン（例えば最初のコーディングエキソン）に構成的プロモーターにより誘導された選択遺伝子を挿入するために相同組換えを使用する。これを実施するためには、所望挿入点の周囲のゲノム配列にマッチする長いＤＮＡ配列を選択マーカーの両側に配置する。この構築物をＥＳ細胞にエレクトロポレーションすると、細胞自身の機構が相同組換えを実施する。非相同組換えによりＤＮＡを組込むＥＳ細胞をネガティブ選択できるようにするためには、一般にターゲティング構築物が組換えを生じさせる領域の外側にネガティブ選択遺伝子を含むようにする（一般に２つのゲノム相同性領域のうちの短いほうの近くに遺伝子をクローニングする）。ゲノム相同性領域の外側にあるＤＮＡは相同組換え中に失われるので、相同組換えを受ける細胞はネガティブ選択することができないが、ＤＮＡのランダム組込みを受ける細胞はネガティブ選択できることが多い。ネガティブ選択に一般に使用される遺伝子は薬剤ガンシクロビルに対する感受性を付与するヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子である。
【０１４３】
必要に応じてポジティブ選択及びネガティブ選択後に、正しいゲノム遺伝子座への構築物の組込みについてＥＳ細胞クローンをスクリーニングする。一般に、相同組換えが生じる場合にサザンブロット上又はＰＣＲ増幅後に通常認められるバンドが予想サイズのバンドで置き換えられるように、ターゲティング構築物を設計する。ＥＳ細胞は二倍体であるので、一般に一方の対立遺伝子のみが組換えイベントにより改変され、従って、適当なターゲティングが生じた場合には通常は野生型及び標的両者の対立遺伝子に相当するバンドが認められる。
【０１４４】
標的挿入に使用される胚性幹（ＥＳ）細胞は胚盤胞（初期マウス胚）の内部細胞塊に由来する。これらの細胞は多能性であり、即ち任意種の組織に発生することができる。
【０１４５】
ポジティブＥＳクローンを成長及び凍結させたら、トランスジェニック動物の作製を開始することができる。ドナー雌を交配させ、胚盤胞を回収し、数個のＥＳ細胞を各胚盤胞に注入する。その後、胚盤胞を各レシピエントの子宮角に移植する。適当なドナー系統を選択することにより、キメラ子孫（即ち、組織の一部フラクションがトランスジェニックＥＳ細胞に由来するもの）の検出は毛髪及び／又は目の色を観察するという程度に簡単にすることができる。トランスジェニックＥＳ細胞が生殖細胞系列（精子又は卵子）に加わらない場合には、トランスジーンを子孫に伝達することができない。
マーカーと表現型の相関
【０１４６】
本発明の１側面はＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２の遺伝子又は付表１に記載の他の遺伝子に内在又は連鎖する多形と、治療誘発性体重増加、肥満素因，インスリン抵抗性及びメタボリックシンドローム表現型の相関の説明である。本発明ではこれらの相関の知識を利用し、個体又はサンプルがもつと判断される多形セットと、個体又はサンプルが示す可能性が高い表現型に関する情報を相関することができる。更に、１種以上の異なる遺伝子で対立遺伝子の組み合わせを考慮する高次相関も表現型との相関のために評価することができる。
【０１４７】
これらの相関は対立遺伝子と表現型、又は対立遺伝子の組み合わせと表現型の組み合わせの関係を識別することができる任意方法により実施することができる。例えば、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２の１種以上又は付表１に記載の他の遺伝子もしくは遺伝子座の対立遺伝子を１種以上の治療誘発性体重増加、肥満素因，インスリン抵抗性及び／又はメタボリックシンドローム表現型と相関させることができる。最も一般には、これらの方法は多形の対立遺伝子と表現型の相関を含むルックアップテーブルを参照する段階を含む。ルックアップテーブルは多重対立遺伝子−表現型関係のデータを含むことができ、例えば主成分分析、ヒューリスティックアルゴリズム等の統計ツールを使用することにより多重対立遺伝子−表現型関係の相加効果又は他の高次効果を考慮することができる。
【０１４８】
マーカーと表現型の相関は場合により相関のために１種以上の統計的検定を実施する段階を含む。多数の統計的検定が公知であり、大半は分析し易くするためにコンピューターで実施される。表現型形質と生体マーカーの関連／相関を判定する各種統計法が公知であり、本発明に適用することができる。この点の手引きとしては、Ｈａｒｔｌ（１９８１）Ａ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ  ＩＳＢＮ：０−０８７８９３−２７１−２参照。適切な各種統計モデルがＬｙｎｃｈ  ａｎｄ  Ｗａｌｓｈ（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｒａｉｔｓ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ  ＭＡ  ＩＳＢＮ  ０−８７８９３−４８１−２に記載されている。これらのモデルは例えば、遺伝子型値と表現型値の相関を提供し、表現型に及ぼす遺伝子座の影響を特性決定し、環境と遺伝子型の関係を分類し、遺伝子の優性又は浸透率を決定し、母性及び他のエピジェネティック効果を判定し、分析の主成分を決定する（主成分分析、ないし「ＰＣＡ」による）等の操作を実施することができる。これらの教科書に引用されている文献はマーカーと表現型を相関させるための統計モデルについて更に詳細に記載している。
【０１４９】
相関を判定するための標準統計法に加え、パターン認識及びトレーニングにより相関を判定する他の方法（例えば遺伝的アルゴリズムの使用）を使用してマーカーと表現型の相関を判定することもできる。これは多重対立遺伝子と多重表現型の高次相関を判定する場合に特に有用である。例えば、遺伝情報と表現型結果の相関を判定する構造−機能データ空間モデルのヒューリスティック開発用遺伝的アルゴリズム型プログラミングと神経ネットワークアプローチを併用することができる。例えば、神経ネットワークと遺伝的アルゴリズムを併用する入手可能なプログラムの１例はＮＮＵＧＡ（Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ）である（例えばワールドワイドウェブｃｓ．ｂｇｕ．ａｃ．ｉｌ／〜ｏｍｒｉ／ＮＮＵＧＡで入手可能）。神経ネットワークの手引きは例えばＫｅｖｉｎ  Ｇｕｒｎｅｙ，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ，ＵＣＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）とワールドワイドウェブｓｈｅｆ．ａｃ．ｕｋ／ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ／ｇｕｒｎｅｙ／ｎｏｔｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌに記載されている。その他の有用な神経ネットワーク文献としては、遺伝的アルゴリズムについて上記に挙げたものに加え、例えばＢｉｓｈｏｐ，Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）、及びＲｉｐｌｅｙら，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）が挙げられる。
【０１５０】
相関、主成分分析、神経ネットワークモデリング等を使用及び設定するためのデータ分析応用を理解するのに有用なその他の文献としては例えばＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅ，Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９６），Ｇｉｂａｓ  ａｎｄ  Ｊａｍｂｅｃｋ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｋｉｌｌｓ，Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ（２００１），Ｐｅｖｚｎｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ（２０００），Ｄｕｒｂｉｎら，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）、及びＲａｓｈｉｄｉ  ａｎｄ  Ｂｕｅｈｌｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ（２０００）が挙げられる。
【０１５１】
いずれにせよ、標準プログラミング法、又はこのような統計分析を実施する各種「既成」ソフトウェアパッケージのいずれかを使用することにより、ほぼ任意統計的検定をコンピューター実施モデルで適用することができ、このようなパッケージとしては例えば、上記に挙げたものや、例えば多変量データ分析、対話型視覚化、変数選択、神経ネットワーク及び統計モデリング等に使用される遺伝的アルゴリズムに適用可能なパターン認識用ソフトウェアを提供する（例えばＰａｒｔｅｋ  Ｐｒｏ  ２０００  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを提供する）Ｐａｒｔｅｋ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ；ｗｗｗ．ｐａｒｔｅｋ．ｃｏｍ）から市販されているものが挙げられる。例えば主成分分析（ＰＣＡ）マップスキャッタープロット及びバイプロット、多次元スケーリング（ＭＤＳ）マップスキャッタープロット、星形図等により関係を分析することができる。相関分析を実施するために利用可能なソフトウェアとしてはＳＡＳ，Ｒ及びＭａｔｈＬａｂが挙げられる。
【０１５２】
いずれにせよ、多形であるにせよ発現パターンであるせよ、マーカーを各種遺伝分析の任意のものに使用することができる。例えば、本発明の場合のようにマーカーが同定されたら、関連試験用の多数の異なるアッセイで使用することができる。例えば、これらのマーカーと照合するマイクロアレーに合わせてプローブを設計することができる。他の代表的アッセイとしては、例えば上記に記載したＴａｑｍａｎアッセイ及び分子ビーコンアッセイや、従来のＰＣＲ及び／又はシーケンシング法が挙げられる。
【０１５３】
関連試験に関するその他の詳細は１０／１０６，０９７、出願日２００２年３月２６日、発明の名称「ゲノム分析方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」；１０／０４２，８１９、出願日２００２年１月７日、発明の名称「ゲノム分析システム及び方法（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」；１０／２８６，４１７、出願日２００２年１０月３１日、発明の名称「ゲノム分析方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」；１０／７６８，７８８、出願日２００４年１月３０日、発明の名称「核酸配列を分析及び特性決定するための装置及び方法（Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」；１０／４４７，６８５、出願日２００３年５月２８日、発明の名称「肝関連疾患組成物及び方法（Ｌｉｖｅｒ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」；１０／９７０，７６１、出願日２００４年１０月２０日、発明の名称「個別ゲノタイピング用改善分析方法及び装置（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」（個別ゲノタイピング法）；１０／９５６，２２４、出願日２００４年９月３０日、発明の名称「遺伝子分析法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」に記載されている。
【０１５４】
所定態様では、マーカーデータを使用してマーカーと表現型の相関を示すために相関試験を実施する。これは該当表現型をもつ個体（即ち、該当表現型を示す個体又は集団）におけるマーカー特性を測定し、これらの個体におけるマーカーの対立遺伝子頻度又は他の特性（発現レベル等）をコントロール個体群における対立遺伝子頻度又は他の特性と比較することにより実施することができる。このようなマーカー測定はゲノムワイドで実施することもできるし、ゲノムの特定領域（例えば該当ハプロタイプブロック）に集中することもできる。１態様では、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２の遺伝子、及び／又は付表１に記載の他の遺伝子もしくは遺伝子座と連鎖するマーカーを１種以上の特定表現型との相関について評価する。
【０１５５】
本明細書に開示する本発明の方法の他の態様に加え、本方法は更に表現型の「解析」を可能にする。即ち、特定表現型は２種以上の異なる遺伝的基盤に起因し得る。例えば、ある個体における治療誘発性体重増加、肥満、インスリン抵抗性又はメタボリックシンドローム易罹患性表現型はＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２の遺伝子及び／又は付表１に記載の他の遺伝子の単一「欠陥」（又は単に特定対立遺伝子−易罹患性表現型に関する「欠陥」は例えば表現型が所与環境において個体で望ましいか望ましくないかに関係なくコンテキスト依存性である）の結果であるが、別の個体では同一の基本表現型がＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２及び／又は付表１に記載の他の遺伝子の多重「欠陥」の結果である場合がある。従って、（例えばゲノム又はハプロタイプブロック走査の場合のように）複数のマーカーを走査すると、類似（又は段階的）表現型の種々の遺伝的基盤を解析することができる。
【０１５６】
前段落に記載したように、関連試験を実施する１方法は該当表現型をもつ個体（「ケース群」）におけるマーカーの対立遺伝子頻度（又は発現レベル）をコントロール個体群における対立遺伝子頻度と比較する方法である。１方法では、情報ＳＮＰを使用してＳＮＰハプロタイプパターン比較を行う（「情報ＳＮＰ」はあるＳＮＰ又はゲノム又はハプロタイプパターンを他のＳＮＰ、ゲノム又はハプロタイプパターンから区別する傾向があるゲノム又はハプロタイプブロック内のＳＮＰ又は（２個以上の）ＳＮＰのサブセット等の遺伝的ＳＮＰマーカーである）。情報ＳＮＰを使用するアプローチは当分野で公知の他の全ゲノムスキャニング又はゲノタイピング法に比較して、各個体のゲノムの３０億個の全塩基を解読するか、又は存在し得る３〜４百万個の共通ＳＮＰを解読する代わりに、サンプル集団から情報ＳＮＰのみを検出すればよいという利点がある。これらの特定情報ＳＮＰを解読すれば、上記のように特定実験集団から統計的に正確な関連データを抽出するために十分な情報が得られる。
【０１５７】
従って、遺伝的関連の１測定方法の１態様では、表現型を示さないコントロール集団のゲノムについて情報ＳＮＰの対立遺伝子頻度を測定する。表現型を示す集団のゲノムについても情報ＳＮＰの対立遺伝子頻度を測定する。情報ＳＮＰ対立遺伝子頻度を比較する。対立遺伝子頻度比較は例えば、各集団における各情報ＳＮＰ位置の対立遺伝子頻度（集団における特定対立遺伝子の数を合計対立遺伝子数で割った値）を測定し、これらの対立遺伝子頻度を比較することにより実施することができる。コントロール対ケース集団／群における対立遺伝子頻度の差を示す情報ＳＮＰを分析用に選択する。情報ＳＮＰを選択したら、情報ＳＮＰを含むＳＮＰハプロタイプブロックを同定し、表現型と相関させる該当ゲノム領域を同定する。ゲノム領域は例えば薬剤発見ターゲット又は診断マーカーとして使用するために当分野で公知の遺伝的又は任意生物学的方法により分析することができる。
治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム表現型、及びインスリン抵抗性表現型又は肥満素因表現型を同定するためのシステム
【０１５８】
上記相関を実施するためのシステムも本発明の特徴である。一般に、本システムは予想される治療誘発性体重増加表現型、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型と（直接検出されるか、又は例えば発現レベルを介して検出されるかに関係なく）対立遺伝子の有無を相関するシステム命令を含む。システム命令は対立遺伝子と該当表現型の相関を含むデータベースと対立遺伝子配列又は発現レベルに関する検出情報を比較することができる。上記のように、このデータベースは多次元とし、対立遺伝子と該当表現型の組み合わせ間の高次関係を含むことができる。例えばスプレッドシート（例えばＥｘｃｅｌ（登録商標）スプレッドシート）又はＡｃｃｅｓｓ（登録商標）、ＳＱＬ（登録商標）、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）、Ｐａｒａｄｏｘ（登録商標）、もしくは同様のデータベース等のデータベースの形態をとる任意数のルックアップテーブルにこれらの関係を保存することができる。システムは例えば自動又はユーザーインターフェースにより対立遺伝子検出情報に関するサンプル特異的情報を入力し、この情報をルックアップテーブルと比較するための条件を含む。
【０１５９】
場合により、システム命令は更に検出された任意対立遺伝子情報に関連する診断情報（例えば該当対立遺伝子をもつ対象が特定表現型（治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因、インスリン抵抗性）をもつという診断）を受容するソフトウェアを含むことができる。このソフトウェアはルックアップテーブルの確度及び／又はシステムによるルックアップテーブルの解釈を改善するためにこのような入力関連を使用して、本来ヒューリスティックとすることができる。神経ネットワーク、マルコフモデリング、及び他の統計分析等の多様なこのようなアプローチについては上記に記載した通りである。
【０１６０】
本発明は１個以上の検出可能な遺伝子マーカーを検出するためのデータ獲得モジュール（例えば１個以上の生体分子プローブ、検出器、流体ハンドラー等を含む１個以上のアレー）を提供する。このようなデータ獲得モジュールの生体分子プローブとしては、生体マーカーを検出するのに適した任意プローブが挙げられ、例えばオリゴヌクレオチドプローブ、蛋白質、アプタマー、抗体等が挙げられる。これらは例えばサンプルを獲得、サンプルを希釈又は分注、マーカー材料（例えば核酸又は蛋白質）を精製、マーカー核酸を増幅、増幅したマーカー核酸を検出する等のために、サンプルハンドラー（例えば流体ハンドラー）、ロボット、マイクロフルイディックシステム、核酸又は蛋白質精製モジュール、アレー（例えば核酸アレー）、検出器、サーモサイクラー又はその組み合わせを含むことができる。
【０１６１】
例えば、本発明のシステムに組込むことができる自動装置は、例えば選択刺激に応答する遺伝子発現レベル（Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９９８）“Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ  Ａｒｒａｙｓ  Ｐｕｔ  ＤＮＡ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｐｏｔ”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：３９６−３９９）、高スループットＤＮＡゲノタイピング（Ｚｈａｎｇら（１９９９）“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｆｒｏｍ  Ｂｌｏｏｄ”  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：１１３８−１１４５）及び他の多くの現象を含む各種生体現象を評価するために使用されている。同様に、混合実験、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡシーケンシング等を実施するための統合システムも入手可能である。例えばＳｅｒｖｉｃｅ（１９９８）“Ｃｏｍｉｎｇ  Ｓｏｏｎ：ｔｈｅ  Ｐｏｃｋｅｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：３９９−４０１参照。一般に例えばロボットと流体操作モジュールを含む各種Ｚｙｍａｔｅシステムを利用する各種自動システムコンポーネントが例えばＣａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）から市販されている。同様に、例えばマイクロタイタートレー操作のために各種実験システムで使用されている共通ＯＲＣＡ（登録商標）ロボットも例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）から市販されている。同様に、本発明でシステムコンポーネントとして使用することができる市販マイクロフルイディックシステムとしてはＡｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓとＣａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているものが挙げられる。更に、特許及び技術文献は自動流体操作のためにマイクロウェルプレートと直接インターフェースすることができるものを含めてマイクロフルイディックシステムの多数の例を記載している。
【０１６２】
本発明のシステムでは各種液体操作及び／又はアレー構造の任意のものを使用することができる。本発明のシステムで使用するための１つの一般フォーマットはアレー又は液体ハンドラーがマイクロタイタートレーを含むマイクロタイタープレートである。このようなトレーは市販されており、各種ウェルサイズ及びトレー当たりウェル数と、アッセイ又はアレーコンポーネントの結合のために各種機能化表面の任意のものを備えるように注文することができる。一般的なトレーとしては汎用９６ウェルプレートが挙げられ、３８４及び１５３６ウェルプレートも一般に使用される。このようなトレーでサンプルを処理することができ、全処理段階はトレーで実施される。マイクロフルイディック装置、又はマイクロタイター装置とマイクロフルイディック装置の組み合わせでサンプルを処理することもできる。
【０１６３】
液相アレー以外に固相アレーで成分を保存又は分析することもできる。これらのアレーは膜（例えばナイロン又はニトロセルロース）、ポリマー又はセラミック表面、ガラス又は改質シリカ表面、金属表面等の固体基板に空間的にアクセス可能なパターン（例えば行列格子）で材料をを固定する。例えばハイブリダイゼーション、（例えばピペット又は他の流体操作エレメントを使用する）局所再水和及び流体移動、又はアレーを掻き取るかもしくはアレー上の該当部位を切り取ることにより成分にアクセスすることができる。
【０１６４】
システムは更に本明細書に記載する任意アプローチを使用して対立遺伝子情報を検出するために使用される検出装置を含むことができる。例えば、リアルタイムＰＣＲ産物を検出するように構成された検出器（例えば蛍光検出器等の光検出器）又はアレーリーダーをシステムに組込むことができる。例えば、検出器は該当対立遺伝子を含むハイブリダイゼーション又は増幅反応からの発光を検出するように構成することができ、発光は対立遺伝子の有無を示す。場合により、検出器と上記システム命令を含むコンピューターを作動可能に連鎖させ、検出された対立遺伝子特異的情報をコンピューターに自動入力し、例えばデータベース情報を保存するか、及び／又は検出された対立遺伝子特異的情報をルックアップテーブルと比較するためにシステム命令を実行することができる。
【０１６５】
アンプリコンを検出するためにプローブを使用するための他の任意ハードウェア又はソフトウェアと共に、検出器により検出される情報を生成するために使用されるプローブもシステムに組込むことができる。これらのプローブとしては、（例えばプローブにより検出する対立遺伝子のＰＣＲ又はＬＣＲ増幅を実施するための）サーモサイクラーエレメント、プローブを整列及び／又はハイブリダイズさせるアレー等が挙げられる。サンプルを処理するための上記流体操作エレメントを使用してサンプル材料（例えば検出する鋳型核酸及び／又は蛋白質）プライマー、プローブ、アンプリコン等を移動して相互に接触させることができる。例えば、システムは治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因又はインスリン抵抗性表現型に関連する１種以上の遺伝子又は連鎖する遺伝子座の少なくとも１個の対立遺伝子を検出するように構成されたマーカープローブ又はプライマーセットを含むことができ、遺伝子はＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２及び／又は付表１に記載の他の蛋白質をコードする。検出器モジュールはマーカープローブもしくはプライマーセット、又はマーカープローブもしくはプライマーセットから生成されたアンプリコンからの１個以上のシグナル出力を検出することにより、対立遺伝子の有無を識別するように構成される。
【０１６６】
分析するサンプルは場合によりシステムの一部であるか、又はシステムとは別個であるとみなすことができる。サンプルは場合により、例えば本明細書に記載するようにゲノムＤＮＡ、増幅ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、増幅ＲＮＡ、蛋白質等を含む。１側面では、サンプルはヒト患者等の哺乳動物に由来する。
【０１６７】
場合により、ユーザーとインターフェースするためのシステムコンポーネントを提供する。例えば、システムはコンピューターで実施されるシステム命令の出力を表示するためのユーザーに表示可能なディスプレイ、ユーザーコマンドを入力し、システムを起動するためのユーザー入力装置（例えばキーボード又はマウス等のポインティング装置）等を含むことができる。一般に、該当システムはコンピューターを含み、コンピューターにより実施される各種システム命令はコンピューターソフトウェアで具体化され、例えばコンピューターで読取り可能な媒体に保存されている。
【０１６８】
本発明の対立遺伝子、又は対立遺伝子と表現型の関連に対応する文字列を入力することにより、ワードプロセシングソフトウェア（例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄ（登録商標）又はＣｏｒｅｌ  ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ（登録商標））やデータベースソフトウェア（例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）、Ｃｏｒｅｌ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｏ（登録商標）等のスプレッドシートソフトウェア、又はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）、Ｓｅｑｕｅｌ（登録商標）、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）、Ｐａｒａｄｏｘ（登録商標）等のデータベースプログラム）等の標準デスクトップアプリケーションを本発明に応用することができる。例えば、システムは例えば文字列を操作するためにユーザーインターフェース（例えばＷｉｎｄｏｗｓ、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ又はＬＩＮＵＸシステム等の標準オペレーティングシステムのＧＵＩ）と併用される適当な文字列情報をもつソフトウェアを含むことができる。例えば対立遺伝子を同定及び関係付けるために核酸又は蛋白質（又は対応する文字列）を整列させるために本発明のシステムにＢＬＡＳＴ等の特殊配列アラインメントプログラムを組込むこともできる。
【０１６９】
上記のように、システムは適当なデータベースと本発明の対立遺伝子配列又は相関を搭載したコンピューターを含むことができる。配列を整列させるためのソフトウェアと、本発明の任意配列を含むソフトウェアシステムに入力されたデータセットも本発明の特徴とすることができる。コンピューターは例えばＰＣ（Ｉｎｔｅｌ  ｘ８６又はＰｅｎｔｉｕｍチップコンパティブルＤＯＳ（登録商標）、ＯＳ２（登録商標）ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）ＷＩＮＤＯＷＳ  ＮＴ（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ９５（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ９８（登録商標）、Ｗ１ＮＤＯＷＳ２０００，ＷＩＮＤＯＷＳＭＥ，又はＬＩＮＵＸ系マシン、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨ（登録商標）、Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ、又はＵＮＩＸ系（例えばＳＵＮ（登録商標）ワークステーション又はＬＩＮＵＸ系マシン）又は当業者に公知の他の市販コンピューターとすることができる。配列を入力及び整列又は他の方法で操作するためのソフトウェアは入手可能である（例えばＢＬＡＳＴＰやＢＬＡＳＴＮ）か、又はＶｉｓｕａｌｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ等の標準プログラミング言語を使用して当業者が容易に作製することができる。
治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性．又は肥満素因のモジュレーターの同定方法
【０１７０】
メタボリックシンドローム等を同定するための各種診断及び予後マーカーの提供に加え、本発明は治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型のモジュレーターの同定方法も提供する。この方法では、潜在的モジュレーターを該当蛋白質（ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２又は付表１に記載の遺伝子もしくは遺伝子座の他の蛋白質）又は前記蛋白質をコードする核酸と接触させる。潜在的モジュレーターが遺伝子又は遺伝子産物に及ぼす効果を検出することにより、潜在的モジュレーターが治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム表現型、インスリン抵抗性表現型、又は肥満素因表現型の基本分子基盤を調節するか否かを識別する。
【０１７１】
更に、本方法は、例えば該当表現型を示す個体に１種以上の推定モジュレーターを投与する段階と、推定モジュレーターが例えば臨床試験又は治療の文脈において個体で表現型を調節するか否かを判定する段階を含むことができる。こうして、推定モジュレーターが臨床的に有用であるか否かを判定する。
【０１７２】
モジュレーターを接触させる遺伝子又は遺伝子産物としては本明細書に記載する任意対立遺伝子型が挙げられる。遺伝子であるか蛋白質であるかに関係なく、望ましくない治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満又はインスリン抵抗性表現型に正相関する対立遺伝子形態がモジュレータースクリーニングの好ましいターゲットである。
【０１７３】
スクリーニングすることができる該当効果としては、（ａ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２又は付表１の他の遺伝子産物の発現増減；（ｂ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２及び／又は付表１の他の遺伝子産物の発現タイミング又は位置の変化；（ｃ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２及び／又は他の遺伝子によりコードされる蛋白質の局在変化；（ｄ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＰＰＡによるＩＧＦＢＰ４の開裂増減；（ｅ）モジュレーターの存在下におけるＰＡＭによるペプチド開裂の触媒増減；（ｆ）モジュレーターの存在下におけるｐｆ２０及び／又はＤＮＡＨ１１を含む繊毛の機能変化；（ｇ）モジュレーターの存在下におけるＰＫＤ１遺伝子産物（例えばポリシスチン−１）とＰＫＤ２遺伝子産物（例えばポリシスチン−２）の会合（親和性等）変化；（ｈ））モジュレーターの存在下における原形質膜に対するポリシスチン−２の局在変化；（ｉ）モジュレーターの存在下におけるポリシスチン−１を含むチャネルの活性変化；（ｊ）モジュレーターの存在下におけるＫＣＮＭＡ１遺伝子産物の局在変化；及び（ｋ）モジュレーターの存在下におけるＫＣＮＭＡ１遺伝子産物を含むチャネルの活性変化が挙げられる。
【０１７４】
モジュレータースクリーニングの厳密なフォーマットは当然のことながら検出する効果と入手可能な装置により異なる。上記遺伝子発現レベルを識別するためにはノーザン分析、定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はアレーによる検出フォーマットを使用することができる。ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ分析、抗体ハイブリダイゼーション、ＢＩＡｃｏｒｅ等の利用可能な方法を使用して蛋白質発現レベルを検出することもできる。これらの方法のいずれかを使用して潜在的モジュレーターに起因するＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２、又は付表１に記載の他の蛋白質の発現レベルの変化を識別することができる。
【０１７５】
従って、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２又は付表１に記載の他の遺伝子の潜在的モジュレーターを活性又は発現についてスクリーニングすることができる。例えば、該当対立遺伝子を含む細胞と潜在的モジュレーター（小分子、有機分子、無機分子、蛋白質、ホルモン、転写因子等）を接触させ、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２又は付表１に記載の他の蛋白質の活性又は発現（又は両者）に及ぼす効果を検出することができる。例えば、潜在的発現モジュレーターの添加前後に、例えばノーザン分析又は定量的（場合によりリアルタイム）ＲＴ−ＰＣＲにより、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、及び／又はＨＳＦ２の発現を検出することができる。同様に、各種遺伝子のプロモーター領域（例えば一般に転写開始部位の領域内の配列、例えば開始部位から５ＫＢ以内、例えば１ＫＢ以下、例えば開始部位から５００ＢＰ又は２５０ＢＰ又は１００ＢＰ以内）をレポーター構築物（ＣＡＴ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ又は他の入手可能な任意レポーター）と結合し、同様に潜在的モジュレーターによる発現活性調節を試験することができる。いずれの場合も、アッセイは例えば自動流体操作及び／又は検出システムを順次又は並列使用して高スループットで実施することができる。同様に、検出される活性が活性調節、発現調節又は両者の結果であるかに関係なく、本明細書に記載する活性検出法の任意のものを使用して潜在的モジュレーターを適当な細胞と接触させることにより、活性モジュレーターを試験することができる。これらのアッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでも細胞アッセイでもよいし、該当遺伝子を含むノックアウトトランスジェニックマウス等の実験室動物で実施するモジュレーター活性のスクリーニングでもよい。
【０１７６】
モジュレーター活性を検出するためのバイオセンサーも本発明の特徴である。これらのバイオセンサーとしては、蛋白質の１種以上の活性を測定又は表示する読み出し装置と結合したＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２又は付表１の他の遺伝子を含む装置又はシステムが挙げられる。従って、適当なアッセイコンポーネントを読み出し装置と結合することにより、上記アッセイコンポーネントの任意のものをバイオセンサーとして構成することができる。読み出し装置は（例えば細胞マーカー又は細胞生存を検出するために）光学装置でもよいし、（例えばＦＥＴ、ＢＩＡｃｏｒｅ、又は他の各種装置の任意のものと結合した）電気装置でもよいし、分光学的装置等でもよく、場合によりユーザーに表示可能なディスプレイ（例えばＣＲＴ又は光学ビューイングステーション）を含むことができる。バイオセンサーは例えば推定モジュレーター活性の自動高スループット分析のために、推定モジュレーターを本発明の蛋白質と接触させるロボット又は他の自動システム（例えばマイクロフルイディックシステム）と結合することができる。本発明のバイオセンサーで使用するように応用可能な多様な自動システムが市販されている。例えば、選択刺激に応答する遺伝子発現レベル（Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９９８）“Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ  Ａｒｒａｙｓ  Ｐｕｔ  ＤＮＡ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｐｏｔ”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：３９６−３９９）等の各種生体現象を評価するために自動システムが製造されている。実験室システムは例えば各種自動実験法の基本容器エレメントとして使用されるマイクロタイタートレー又は他のチップトレー等のアレーを含む試薬保存システムとの間で材料を移出入するための反復流体操作オペレーション（例えばピペッティング）を実施することもできる。同様に、システムは例えばマイクロタイタートレーを操作し、温度、光又は空気暴露等の各種環境条件を制御する。多数のこのような自動システムが市販されており、上記に記載したものを含めて本明細書に記載している。これらのシステムとしては各種Ｚｙｍａｔｅシステム、ＯＲＣＡ（登録商標）ロボット、マイクロフルイディックデバイス等が挙げられる。例えば、モジュレーター活性についてスクリーニングするために本発明で使用するようにＣａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ製品ＬａｂＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ（登録商標）高スループットスクリーニングシステム（ＨＴＳ）を応用することができる。
【０１７７】
一般に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，第２版  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  第３版  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；及びＳａｔｉｎｄｅｒ  Ａｈｕｊａ編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）等の上記各種文献に教示されているものを含めて蛋白質発現レベル及び活性を検出するための方法及びセンサーが入手可能である。多数の蛋白質を同時に検出する「プロテオミック」検出法が記載され、上記にも記載したが、これらの方法としては各種多次元電気泳動法（例えば２−ｄゲル電気泳動）、質量分析法（例えばＳＥＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレー等）、又は表面プラズモン共鳴法が挙げられる。これらの方法も蛋白質活性及び／又は発現レベルを追跡するために使用することができる。
【０１７８】
同様に、ノーザン分析、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等の利用可能な任意方法を使用して核酸発現レベル（例えばｍＲＮＡ）を検出することができる。当業者がこれらの方法を使用する手引きとして十分な文献（例えばＡｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＢｅｒｇｅｒ）が容易に入手可能である。
【０１７９】
例えば細胞現象に及ぼす効果、表示された動物表現型の変化等をモニターすることにより、細胞又は動物体（例えばトランスジェニックノックアウトマウス）に及ぼすモジュレーターの効果を評価するために動物体アッセイを使用することもできる。
【０１８０】
ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２等の発現及び／又は活性に及ぼす効果についてスクリーニングする潜在的モジュレーターライブラリーも入手可能である。これらのライブラリーはランダムでもよいし、標的化してもよい。
【０１８１】
標的化ライブラリーとしてはコンビナトリアルライブラリーを作製するためのスカフォールド又は構成要素を選択する任意合理的設計技術を使用して設計されるものが挙げられる。これらの技術としては標的集中ライブラリーの多数の設計及びコンビナトリアル合成方法が挙げられ、バイオアイソステリックな形質転換による形態変化、ターゲット特異的優先構造の分析等が挙げられる。一般に、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２又は付表１の他の遺伝子の構造に関する情報が入手可能な場合には、例えばフレキシブルドッキングアプローチ等を使用して有望な結合パートナーを設計することができる。同様に、各種基本化学スカフォールドのランダムライブラリーも存在する。いずれの場合も、ポリペプチド、核酸、糖質、及び他の主鎖をもつもの等の多数の化学ライブラリー用スカフォールド及び構成要素が入手可能である。市販ライブラリー及びライブラリー設計サービスとしては、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＴｉｍＴｅｃ（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）、Ｎｕｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ／Ｓ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）及び他の多数の業者から提供されるものが挙げられる。
【０１８２】
治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因又はインスリン抵抗性表現型の治療用キットは上記のように同定されたモジュレーターと、治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満素因及び／又はインスリン抵抗性を治療するために患者に化合物を投与するための説明書を含むことができる。
細胞レスキュー及び治療投与
【０１８３】
１側面では、本発明はＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２及び／又は付表１の他の遺伝子の１種以上の内在遺伝子又はポリペプチドの機能を欠損する（従って、例えば治療誘発性体重増加、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン抵抗性等の該当表現型を付与する）細胞のレスキューを含む。これは単に前記遺伝子の新規コピー（又は該当蛋白質を発現する異種核酸）、即ち所望対立遺伝子をもつ遺伝子を細胞に導入することにより実施することができる。欠損遺伝子を（例えばキメラ形成法により）修復するための他のアプローチ（例えば相同組換え）も実施できる。いずれの場合も、機能のレスキューは例えば本明細書に記載する任意アッセイで測定することができる。実際に、この方法はＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、及び／又はＨＳＦ２発現又は活性（あるいは付表１の任意遺伝子又は遺伝子産物の発現又は活性）について細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングする一般方法として使用することができる。従って、機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏレスキューはこの文脈において多数の上記ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法に有用である。レスキューされる細胞としては培養細胞が挙げられる（患者に由来する一次又は二次細胞培養液と、株化細胞の培養液を含む）。細胞を患者から単離する場合には、該当表現型をもつ患者にＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、及び／又はＨＳＦ２又は付表１の他の配列のうちのどれが欠損しているかを確認する付加診断用途もある。
【０１８４】
別の側面では、細胞レスキューは例えば代謝欠陥を治療するために患者（例えばヒト又は動物患者）で実施される。従って、本発明の１側面はヒト又は獣医学用途で代謝欠陥を治療する（又は単に代謝表現型を強化する）ための遺伝子治療である。これらの用途では、本発明の細胞を場合により適当な遺伝子治療用ベクターにクローニングした後、場合により適当なキャリヤー又は送達物質と共に送達する（及び／又は単に裸又はリポソームと結合した核酸として送達する）。蛋白質を直接送達することもできるが、安定した発現が所望される用途では核酸送達が一般に好ましい。同様に、本発明の方法により同定される任意代謝欠陥のモジュレーターを治療用に使用することもできる。
【０１８５】
投与用組成物は例えば治療有効量のモジュレーターと、遺伝子治療用ベクター又は他の該当核酸と、医薬的に許容可能なキャリヤー又は賦形剤を含有する。このようなキャリヤー又は賦形剤としては限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及び／又はその組み合わせが挙げられる。製剤は投与方法に適合させる。一般に、局所用遺伝子治療用ベクターの投与方法は当分野で周知であり、本発明の核酸の投与に適用することができる。
【０１８６】
本発明の１種以上のモジュレーター又は遺伝子治療用核酸を含有する治療用組成物を場合により１種以上の適当なｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ動物疾患モデルで試験し、効力、組織代謝を確認し、当分野で周知の方法により用量を推定する。特に、用量は製剤の活性、安定性又は他の適切な尺度により初期に決定することができる。
【０１８７】
投与は分子を最終的に細胞と接触させるために通常使用されている経路のいずれかにより実施される。ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、及び／又はＨＳＦ２及び／又は付表１の他の配列をコードするモジュレーター及び／又は核酸は場合により１種以上の医薬的に許容可能なキャリヤーと共に適切な任意方法で投与することができる。本発明の文脈においてこのような核酸を患者に投与する適切な方法は入手可能であり、２種以上の経路を使用して特定組成物を投与することもできるが、多くの場合には特定経路のほうが別の経路よりも迅速で有効な作用又は反応が得られる。
【０１８８】
医薬的に許容可能なキャリヤーは投与する特定組成物と、組成物を投与するために使用する特定方法によりある程度決定される。従って、本発明の医薬組成物の適切な製剤は多様である。組成物は多数の経路で投与することができ、限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下、又は直腸投与が挙げられる。組成物はリポソーム（例えば局所）、又は裸のＤＮＡもしくはウイルスベクターの局所送達により投与することもできる。このような投与経路と適切な製剤は一般に当業者に公知である。
【０１８９】
組成物を単独で使用するか又は他の適切な成分と併用し、吸入により投与するエアゾール製剤とすることもできる（即ち、「噴霧」することができる）。エアゾール製剤はジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の許容可能な加圧噴射剤に配置することができる。例えば、関節内、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路等の非経口投与に適した製剤としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を所期レシピエントの血液と等張にする溶質を添加することができる水性及び非水性等張滅菌注射溶液と、懸濁剤、溶解補助剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を添加することができる水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。パッケージングした核酸の製剤はアンプルやバイアル等の単位用量又は多用量密閉容器の形態とすることができる。
【０１９０】
本発明の文脈において患者に投与する量は患者に経時的に有益な治療応答を生じるために十分な量とする。用量は特定ベクター、又は他の製剤の効力、発現されるポリペプチドの活性、安定性又は半減期、患者の状態、及び治療する患者の体重又は体表面積により決定される。用量サイズは特定患者で特定ベクター、製剤等の投与に付随する副作用の存在、種類及び程度によっても決定される。疾患の治療で投与するベクター又は製剤の有効量を決定する際には、医師が局所発現、又は循環血漿値、製剤毒性、該当疾患の進行、及び／又は該当する場合には、ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に対する抗体の生産を検討する。例えば体重７０キロの患者の投与量は一般に現行使用されている治療用蛋白質の用量と等価の範囲であり、該当組成物の活性又は血清半減期の変化に合わせて調整する。本発明のベクターは公知任意従来治療により治療条件を補足することができる。
【０１９１】
投与に当たり、本発明の製剤は該当製剤のＬＤ−５０、及び／又は例えば患者の全身又は局所送達面積及び総合健康状態に適用される各種濃度の本発明のベクターの副作用の所見により決定される頻度で投与される。投与は単回又は用量を分割して実施することができる。
【０１９２】
治療を受ける患者が発熱、寒気、又は筋肉痛を生じる場合には、適当な用量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン又は他の鎮痛／解熱薬を投与する。組成物に対して発熱、筋肉痛、及び寒気等の反応を生じる患者には次の輸液の３０分前にアスピリン、アセトアミノフェン、又は例えばジフェンヒドラミンを前投薬する。解熱薬や抗ヒスタミン剤に迅速に応答しない重症の寒気及び筋肉痛にはメペリジンを使用する。反応の重度に応じて治療を遅らせるか又は中断する。
【０１９３】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。ほぼ同様の結果が得られるように変更可能な各種非必須パラメーターが当業者に自明である。
【実施例１】
【０１９４】
いずれも参考資料として本明細書に組込む米国出願第１０／１０６，０９７号、発明の名称「ゲノム分析方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、出願日２００２年３月２６日、本願と同一譲受人；米国出願第１０／２８４，４４４号、発明の名称「染色体２１  ＳＮＰ、ＳＮＰ群及びＳＮＰパターン（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２１  ＳＮＰｓ，ＳＮＰ  Ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ＳＮＰ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ）」、出願日２００２年１０月３１日、本願と同一譲受人；及び第１０／０４２，８１９号、発明の名称「全ゲノムスキャニング（Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ）」、出願日２００２年１月７日、本願と同一譲受人に記載されているようなマイクロアレー技術プラットフォームを使用して全ヒトゲノムを走査し、共通多形を同定した。マイクロアレーはコストパフォーマンスと高品質を達成するように半導体製造から応用した方法を使用して製造される。
【実施例２】
【０１９５】
参考資料として本明細書に組込む米国出願第１０／１０６，０９７号、発明の名称「ゲノム分析法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、出願日２００２年３月２６日（代理人整理番号２００／１００５−１０）に開示されている方法を使用して実施例１で同定した多形をハプロタイプブロックとハプロタイプパターン毎に分類した。全長ヒト染色体（染色体２１）に由来する代表的多形、ハプロタイプブロック及びハプロタイプパターンは例えば、参考資料として本明細書に組込むＰａｔｉｌ，Ｎ．ら，“Ｂｌｏｃｋｓ  ｏｆ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２１”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，１７１９−１７２３（２００１）と関連付属資料に開示されている。
【実施例３】
【０１９６】
ケース（肥満表現型）群とコントロール（非肥満表現型）群の各個体に由来するＤＮＡを当分野で周知の方法により精製した。サンプルは各２〜１０ｍｌとした。各ＤＮＡサンプルの濃度を調整し、ＤＮＡ濃度０．４μｇ／μｌ〜０．６μｇ／μｌのストック溶液を形成した。
【０１９７】
精製ＤＮＡを更に評価するために、アガロース１００ｍｌ当たり１０ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム３〜５μｌを加えた０．８％アガロースゲルでアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ  ０．１μｇを分析した。０．０５μｇ／μｌ希釈液を形成するために十分な水にＤＮＡストック溶液２μｌを加えた。標準ローディングバッファーをサンプルに加え、サンプルをゲルにロードした。ゲルを１５０ボルトで４０〜４５分間泳動させた後、写真を撮影できるように紫外光を照射した。ゲル上にゲノムＤＮＡの強いバンドが出現した場合にはＤＮＡの大部分が分解されなかったと判断し、ゲル上にスミアが出現した場合にはＤＮＡがほぼ分解され、恐らく後期試験に利用できないと判断した。ほぼ分解されたものは後期試験に使用しなかった。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅用鋳型としてのＤＮＡの品質を評価した。１μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを加えた０．８％アガロースゲルでアガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ後ＤＮＡを分析した。ゲル上に増幅ＤＮＡの強いバンドが出現した場合にはＤＮＡが増幅反応で使用するために十分高い品質であると判断し、このようなバンドが出現しない場合にはＤＮＡが後期試験に利用できないと判断した。精製ＰＣＲ前ＤＮＡを含むゲル上のゲノムＤＮＡの大きなバンドの存在は後続増幅反応の成功の良好な予測指標であることが分かった。そのため、所定サンプルでは、後続ＰＣＲ評価を省略した。
【実施例４】
【０１９８】
各ＤＮＡサンプルの一部をバックアップサンプルとして−８０℃で保存し、各ＤＮＡサンプルの残余を「正規化」法に付し、各ＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を平衡させた。正規化後、各プールサンプルに等しい集団構造値を得るように補正を加えられるようにサンプルを集団層化について更に試験した。層化及び補正アッセイは米国特許出願第１０／４２７，６９６号、出願日２００３年４月３０日、及びＰＣＴ特許出願第ＵＳ０４／０１３５７７号、出願日２００４年４月３０日、いずれも発明の名称「マッチ群の同定方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｍａｔｃｈｅｄ  Ｇｒｏｕｐｓ）」に詳細に記載されている。各ケースサンプルから等容量をプールして「ケースプール」を形成し、各コントロールサンプルから等容量をプールして「コントロールプール」を形成した。ケース又はコントロールサンプルの残りの部分を−８０℃で保存した。
【実施例５】
【０１９９】
ケースプールとコントロールプールを各々３個の等しいプールに分離し、合計プール６個とした（例えば３個の同一ケースプールと３個の同一コントロールプール）。１塩基多形（ＳＮＰ）を含むゲノムＤＮＡを増幅するように設計したプライマーを使用して各プールを別々に長距離ＰＣＲに付した。合計で１，７００，０００個を上回るＳＮＰを増幅した。長距離ＰＣＲ法は例えば、米国特許出願第１０／０４２，４０６号、出願日２００２年１月９日、発明の名称「プライマー対の選択用アルゴリズム（Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐａｉｒｓ）」；米国特許出願第１０／２３６，４８０号、出願日２００２年９月９日、発明の名称「核酸の増幅方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）」；及び米国特許第６，７４０，５１０号、発行日２００４年５月２５日、発明の名称「核酸の増幅方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）」に開示されている。要約すると、プライマー対を分配した３８４ウェルプレートにＰＣＲ反応カクテル、ＤＮＡ鋳型（上記プールの１個）、Ｔａｑ抗体（及びその緩衝液）、及び長距離ＤＮＡポリメラーゼを加えてＰＣＲを実施した。ＰＣＲの最終ＤＮＡ濃度は１００ｎｇ／μｌとした。ＰＣＲプレートはＰＣＲ前にシールした。長距離ＰＣＲを約１３．５時間実施した。ＰＣＲプレートをサーモサイクラーに入れる前にサーモサイクラーブロックを９０℃にした。ＰＣＲに使用したサーモサイクラープログラムを表１に示す。
【表１】
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【実施例６】
【０２００】
市販遠心フィルター装置を使用してＰＣＲ後プールを精製した。分光光度計を使用して各ＰＣＲ後プールの濃度を希釈倍率２００倍で１回と希釈倍率３００倍で１回ずつ２回測定した。次にこれらの２回の測定値を平均し、最終濃度を得た。次に、約１．５μｇ／μｌの最終ＤＮＡ濃度に達するように各プールを希釈した。プールの濃度が１．３μｇ／μｌ〜１．７μｇ／μｌの場合には、プールは１．５μｇ／μｌに十分近似するとみなし、濃度を調整しなかった。プールの濃度が１．７μｇ／μｌを上回る場合には、濃度を１．５μｇ／μｌまで低下させるために十分な分子グレード水を加えた。プールの濃度が１．３μｇ／μｌ未満の場合には、市販濃縮遠心フィルター装置を使用して濃度を１．５μｇ／μｌまで上げるように濃縮した。最後に、分光光度計を使用して各〜１．５μｇ／μｌプールの濃度を再確認した。
【０２０１】
ＰＣＲ後プールの品質を検査するために、１μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを加えた０．８％アガロースゲルを１×ＴＢＥバッファーに浸し、各プールのアリコートをアガロースゲル電気泳動に付した。増幅ＤＮＡ約３μｇを含むアリコートをローディングバッファーに加えた後、ゲル内のウェルに移した。市販ＤＮＡラダー等のコントロールと既知量のゲノムＤＮＡもゲルに加えた。ゲルを２５０〜２７５ボルトで約３０分間泳動させた後、紫外光を照射しながら撮影した。ゲル上のそのバンドの輝度がゲノムＤＮＡコントロールに近似する場合にＰＣＲ後プールは良好な品質であるとみなした。
【実施例７】
【０２０２】
ＰＣＲ後プールをＤＮａｓｅ  Ｉ消化により断片化した。各断片化反応は２ｍｌエッペンドルフチューブで以下のように実施した。まず、０．００２９Ｕ／μｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉを加えた緩衝溶液をＰＣＲ後ＤＮＡ９．６μｇに加えて総容量３７μｌとし、３７℃に約８分間維持した。次に、反応混合物を９５℃熱ブロックに移して１０分間ＤＮａｓｅ  Ｉを変性させた。ＤＮａｓｅ  Ｉ変性後、エッペンドルフチューブを氷上に少なくとも５分間置き、ＰｉｃｏＦｕｇｅを使用してチューブの壁の凝縮水を遠心した。
【０２０３】
各断片化反応の成功をゲル電気泳動により試験した。各断片化反応液２μｌをゲルローディング色素８μｌに加え、混合物５μｌを１×ＴＢＥバッファー中Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｎｏｖｅｘ  Ｐｒｅｃａｓｔゲル（４〜２０％ＴＢＥゲル）にロードした。ＤＮＡラダーもゲルにロードした。サンプルがウェルから流出するまで（約５分間）約８０ボルトで電気泳動を実施した後、約４０分間かけて電圧を１３２〜１４６ボルトまで上げた。０．０１％臭化エチジウムを加えた１×ＴＢＥでゲルを１分間室温で染色した。最後に、紫外光を照射しながらゲルを撮影した。良好品質とみなす断片化反応では、反応はフラグメントの「スミア」として出現し、フラグメントの大半が４０〜１００塩基対長であった。断片化反応が良好品質であると思われた場合には、次段階は以下のような標識反応とした。
【実施例８】
【０２０４】
まず、良好品質の完了断片化反応液を入れた各チューブにビオチンミックスストック（ビオチン１６−ｄＵＴＰ及びビオチン１６−ｄｄＵＴＰ各０．５ｍＭから構成される１ｍＭストック）１．５μｌを加えた。次に、天然ＴｄＴ（ターミナルトランスフェラーゼ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１μｌ（２５単位）又は組換えＴｄＴ（Ｒｏｃｈｅ）１μｌ（２００単位）を各チューブに加えた。チューブ内の液体を混合し、ＰｉｃｏＦｕｇｅで遠心した後に、予熱したサーモサイクラーに入れた。標識反応液を３７℃で９０分間、次いで９５℃で１０分間インキュベートし、最後に４℃に保持した。
【実施例９】
【０２０５】
増幅したゲノムＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを分配したマイクロアレーに各断片化標識ＰＣＲ後プールを添加した。マイクロアレーオリゴヌクレオチドプローブを使用してゲノム内の約１，７００，０００個の多形について増幅ＰＣＲ産物の両鎖を探査した。所与多形遺伝子座には一般に２個の対立遺伝子が存在するので、所与多形の両方の対立遺伝子について増幅ＤＮＡを同時にスクリーニングできるように、各多形位置の相補的オリゴヌクレオチドの両方の対立遺伝子をマイクロアレーに分配した。ケース群とコントロール群の間に有意差のある低い対立遺伝子頻度を該当疾患に関連しているとみなした。プール分析に基づいてケース群又はコントロール群と潜在的に関連する多形について個別サンプルをゲノタイピングすることにより、結果を確認した。
【０２０６】
マイクロアレーに添加する前に、５Ｍ  ＴＭＡＣｌ（塩化テトラメチルアンモニウム）１３０μｌ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）２．２μｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２．２μｌ、５ｎＭコントロールオリゴｂ−９４８  ２．２μｌ、１０ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ２．２μｌ、及びＨ２Ｏ  ４８．７μｌを含有するハイブリダイゼーション溶液１８７．５μｌを標識プールサンプル３７．５μｌに加えた。この混合物（総容量２２５μｌ）を１０分間９５℃に加熱し、ＰｉｃｏＦｕｇｅで遠心し、サーモサイクラーに入れ、９５℃で１０分間インキュベートした後、５０℃に保持した。次に、５０℃に加温しておいたマイクロアレーにプールサンプル２００μｌを移した。プールサンプルを添加したマイクロアレーを５０℃ハイブリダイゼーションオーブンに入れ、プールサンプルがインキュベーション中にマイクロアレー上を自由に流動できるように２５ｒ．ｐ．ｍ．で一晩（１４〜１９時間）回転させた。
【実施例１０】
【０２０７】
インキュベーション（即ち、ハイブリダイゼーション）後、マイクロアレーをハイブリダイゼーションオーブンから取出し、サンプルを取出し、−２０℃で保存した。次に、マイクロアレーを１×ＭＥＳ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２００μｌで１〜２回洗浄した。洗浄溶液がマイクロアレーの表面上を自由に移動するようにマイクロアレーを数回反転させた後、洗浄溶液を真空吸引により除去した。
【０２０８】
次に、「第１染色溶液」（１×ＭＥＳ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  １７４μｌ、２０ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ  ２５μｌ、及び１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン１μｌ）２００μｌを各マイクロアレーに加えた。第１染色溶液がマイクロアレーの表面上を自由に移動するようにマイクロアレーを数回反転させた。次に、マイクロアレーを２５ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間室温にて回転させた。次に、マイクロアレーをＰｅｒｌｅｇｅｎ  ＲｅｖＤ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎで１×ＭＥＳ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００洗浄溶液により洗浄した。洗浄が終了したら、マイクロアレーをフルイディクスステーションから取出し、１×ＭＥＳ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００洗浄溶液を真空吸引により除去した。
【０２０９】
次に、「第２染色溶液」（１×ＭＥＳ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  １７５μｌ、２０ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ  ２５μｌ、及び０．５ｍｇ／ｍｌビオチン化抗ストレプトアビジン０．５μｌ）２００μｌを各マイクロアレーに加えた。第２染色溶液がマイクロアレーの表面上を自由に移動するようにマイクロアレーを数回反転させた。次に、マイクロアレーを２５ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間室温にて回転させた。次に、マイクロアレーをＲｅｖＤ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎで１×ＭＥＳ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００洗浄溶液により洗浄した。洗浄が終了したら、マイクロアレーをフルイディクスステーションから取出し、１×ＭＥＳ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００洗浄溶液を真空吸引により除去した。
【０２１０】
次に、「第３染色溶液」（１×ＭＥＳ／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  １７４μｌ、２０ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ  ２５μｌ、及び０．２ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンＣｙ−ｃｈｒｏｍｅ  １μｌ）２００μｌを各マイクロアレーに加えた。第３染色溶液がマイクロアレーの表面上を自由に移動するようにマイクロアレーを数回反転させた。次に、マイクロアレーを２５ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間室温にて回転させた。次に、マイクロアレーをＲｅｖＤ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎで１×ＭＥＳ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００洗浄溶液により洗浄した。洗浄が終了したら、マイクロアレーをフルイディクスステーションから取出し、１×ＭＥＳ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００洗浄溶液を真空吸引により除去した。
【０２１１】
次に、６×ＳＳＰＥ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の洗浄溶液をマイクロアレーに加えた。６×ＳＳＰＥ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００がマイクロアレーの表面上を自由に移動するようにマイクロアレーを数回反転させた後、真空吸引により除去した。次に、３７℃まで予熱しておいた０．２×ＳＳＰＥ／０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の洗浄溶液をマイクロアレーに加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。０．２×ＳＳＰＥ／０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を真空吸引により除去し、１×ＭＥＳ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の溶液をマイクロアレーに加えた。次にマイクロアレーを数回反転させた後、１×ＭＥＳ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を真空吸引により除去した。最後に、新鮮な１×ＭＥＳ／０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００をマイクロアレーに加え、ホイルで包んだ後、４℃で保存するか又はマイクロアレーを走査した。
【実施例１１】
【０２１２】
マイクロアレーを染色及び洗浄した同日に、アークスキャナーを使用して走査した。走査後、マイクロアレーをスキャナーから取出し、ホイルに包んで４℃で保存した。スキャナーにより作成された走査ファイルを次に、マイクロアレーからの強度データを解釈するように設計されたソフトウェアプログラムにより分析した。このソフトウェアにより、ケースプールをコントロールプールから区別するハイブリダイゼーションパターンを識別することができた。いずれも本願の譲受人に譲渡された以下の米国特許出願、即ち米国予備特許出願第６０／４６０，３２９号、出願日２００３年４月３日、発明の名称「核酸配列を分析及び特性決定するための装置及び方法（Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」；及び米国特許出願第１０／７６８，７８８号、出願日２００４年１月３０日、発明の名称「核酸配列を分析及び特性決定するための装置及び方法（Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」に開示されている方法に従ってデータを分析した。以下のように、潜在的に関連する核酸について個別サンプルをゲノタイピングすることにより、プールゲノタイピング分析に基づいてケース群又はコントロール群と強く関連するとみなされた核酸を再分析した。こうして、元の１，７００，０００個のＳＮＰのうちの約３０，０００個（〜２％）で個別ゲノタイピングを実施した。
【実施例１２】
【０２１３】
上記のようなプールゲノタイピング法で同定された約３０，０００個の潜在的に関連する核酸（例えばＳＮＰ）を含むゲノムＤＮＡを増幅するように設計されたプライマーを使用して、各個体からのサンプルを複数の多重（〜７８個）短距離ＰＣＲに付した。ＤＮＡ鋳型（１０ｎｇ）とＰＣＲカクテル（１０×ＡＫ２バッファー（０．５Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ、０．１４Ｍ硫酸アンモニウム、及び２７ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１．４７μｌ、０．０３Ｍトリシン、０．６７μｌ  ＭａｓｔｅｒＡｍｐ  １０×ＰＣＲ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、３．９％  ＤＭＳＯ、０．０５Ｍ  ＫＣｌ、ｄＮＴＰ（各０．５４ｍＭ）、ＰＣＲプライマー（０．４２ｐｍｏｌ／μｌ／プライマー）、及び〜２×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））を加えた３８４ウェルプレートでＰＣＲを実施した。ＰＣＲプレートはＰＣＲ前にシールした。短距離ＰＣＲを約３時間実施した。ＰＣＲプレートをサーモサイクラーに入れる前にサーモサイクラーブロックを９０℃にした。短距離ＰＣＲに使用したサーモサイクラープログラムを表２に示す。
【表２】
2008536474.tif 000003
【０２１４】
ＰＣＲが完了したら、プレートをサーモサイクラーから取出し、以下に記載するようにプールした。（この時点で、必要に応じてプレートを−２０℃で長期保存してもよい。）
【０２１５】
増幅サンプルを含むＰＣＲプレートを卓上Ｓｏｒｖａｌｌ遠心機で１０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５秒間遠心した。シングルチップ（マイクロアレー）デザインに対応する単一個体からの増幅サンプルをプールした。プールしたサンプルを次に９６ウェルプレートに分配し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒ  Ｔｅｃａｎ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して定量した。１００ｎｇ／μｌ未満の増幅サンプルはＰＣＲ増幅できなかったとみなし、それ以上分析しなかった。
【実施例１３】
【０２１６】
ＰＣＲ後プールをエビ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）で処理した。各処理を９６ウェルプレートのウェルで実施し、増幅サンプル８μｇ、ＳＡＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）５Ｕ、及び〜１×Ｏｎｅ  Ｐｈｏｒ  ＡＵ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で総容量１００μｌとした。反応混合物を３７℃で３０分間、８０℃で２０分間インキュベートした後、４℃まで冷却した。ＳＡＰ処理サンプルを次にビオチン標識した。（この時点で、ＳＡＰ処理サンプルをビオチン標識前に−２０℃で一晩保存してもよい。）
【実施例１４】
【０２１７】
ＳＡＰ処理したプールをビオチン標識した。各標識反応を９６ウェルプレートの１個のウェルで実施し、ＳＡＰ処理プール１００μｌ容量に０．５ｍＭビオチンｄ／ｄｄ−ＵＴＰ３μｌ及び組換えＴｄＴ  ８００Ｕを加えた。プレートをシールし、短時間ボルテックスし、卓上Ｓｏｒｖａｌｌ遠心機で１０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５秒間遠心した。プレートをサーモサイクラーに入れ、３７℃で９０分間、９９℃で１０分間インキュベートした後、４℃まで冷却した。ビオチン標識プールを標識した同日にマイクロアレーとハイブリダイズさせた。
【実施例１５】
【０２１８】
ハイブリダイゼーションバッファー（１．５Ｍ  ＴＭＡＣＬ（塩化テトラメチルアンモニウム）、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．８又は８．０）、０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，２６ｐＭ  ｂ−９４８コントロールオリゴ（Ｇｅｎｓｅｔ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、及び０．０５ｍｇ／ｍｌ  ＨＳ（ニシン精子）ＤＮＡ）を６０℃に最低３０分間予熱した。マイクロアレー（例えばチップ）をハイブリダイゼーションオーブンで５０℃に約３０分間予熱した。６０℃に最低３０分間予熱した９６ウェルプレートの各ウェルにハイブリダイゼーションバッファー１９５μｌを加え、プレート（「ハイブリダイゼーションプレート」）をシールし、熱ブロックに戻した。標識サンプルを加えた９６ウェルプレートを卓上Ｓｏｒｖａｌｌ遠心機で１０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５秒間遠心した後、プレートを９９℃に１０分間加熱した後、プレートを６０℃まで（５分間以内）冷却して標識サンプルを変性させた。変性の完了後、ハイブリダイゼーションバッファーアリコート１９５μｌを加えたハイブリダイゼーションプレートのウェルに変性サンプル（１０５μｌ）を移し、溶液を２回上下にピペッティングすることにより混合した。ハイブリダイゼーションプレートを再シールし、６０℃の熱ブロックに戻した。
【０２１９】
変性サンプルとハイブリダイゼーションバッファーを含む混合物を予熱したマイクロアレーに移した。アレーをシールし、５０℃のハイブリダイゼーションオーブンに戻し、２０ｒ．ｐ．ｍ．で一晩（１４〜１９時間）回転した。一晩インキュベーション後、プールゲノタイピング法について上述したようにアレーを染色、洗浄、及び走査した。
【０２２０】
走査後、マイクロアレーをスキャナーから取出し、ホイルに包んで４℃で保存した。スキャナーにより作成された走査ファイルを次に、マイクロアレーからの強度データを解釈するように設計されたソフトウェアプログラムにより分析した。このソフトウェアにより、ケース群とコントロール群の各個体の各ＳＮＰ位置に遺伝子型を割り当てた。いずれも本願の譲受人に譲渡された以下の米国特許出願、即ち米国特許出願第１０／３５１，９７３号、出願日２００３年１月２７日、発明の名称「個別遺伝子型を決定するための装置及び方法（Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ）」；及び米国特許出願第１０／７８６，４７５号、出願日２００４年２月２４日、発明の名称「個別ゲノタイピングのための分析方法の改善（Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」に開示されている方法に従ってデータを分析した。付表１に記載の核酸がケース群又はコントロール群に強く関連していることが確認された。下表は付表１の見出し語の摘要である。
【表３】
2008536474.tif 000004
【実施例１６】
【０２２１】
本実施例はオランザピン治療誘発性体重増加のゲノムワイド関連試験に関する。非定型抗精神病薬治療で観察される治療誘発性体重増加は依然として臨床問題であり、遺伝的因子が役割を果たしていると思われる。体重増加における遺伝的関与については候補遺伝子アプローチを使用して調査されている（Ｍｕｌｌｅｒら  ２００４）。セロトニン５−ＨＴ２ｃ受容体遺伝子（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら  ２００２）やＣＹＰ２Ｄ６（Ｅｌｌｉｎｇｒｏｄら  ２００２）等の候補遺伝子との有意関連が報告されているが、マイナスの結果も記載されている（Ｍｕｌｌｅｒら  ２００４，Ｈｏｎｇら  ２００１）。一致した結果が得られていないため、報告されている関連の意義は確定していない。従って、本発明者らは治療誘発性体重増加について大きな患者コホートでゲノム内の多数の遺伝子を調査する大規模調査を実施した。
概説
【０２２２】
非定型抗精神病薬治療で観察される治療誘発性体重増加は依然として臨床問題であり、遺伝的因子が役割を果たしていると思われる。体重増加における遺伝的関与については候補遺伝子アプローチを使用して調査されている（Ｍｕｌｌｅｒら  ２００４）。セロトニン５−ＨＴ２ｃ受容体遺伝子（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら  ２００２）やＣＹＰ２Ｄ６（Ｅｌｌｉｎｇｒｏｄら  ２００２）等の候補遺伝子との有意関連が報告されているが、マイナスの結果も記載されている（Ｍｕｌｌｅｒら  ２００４，Ｈｏｎｇら  ２００１）。一致した結果が得られていないため、報告されている関連の意義は確定していない。従って、本発明者らは治療誘発性体重増加について大きな患者コホートでゲノム内の多数の遺伝子を調査する大規模調査を実施した。
【０２２３】
統合失調症、分裂情動性、又は分裂病様障害をもつと診断され、最低６カ月間オランザピンを経口投与した成人患者コホートを使用し、体重増加分布のテールからケース・コントロール集団を選択した。ケース（ｎ＝２５８）は２０％の最大体重増加者とし、コントロール（ｎ＝２５５）は体重増加が最少の個体（非増加者）の２０％から構成し、両群ともボディマス指数の変化により測定した。体重増加者の平均（±ＳＤ）ボディマス指数は３３．９±６．１ｋｇ／ｍ２であり、非増加者では２７．１±６．３ｋｇ／ｍ２であった。年齢、性別、及び人種を共変量とする回帰モデルを使用し、これらの因子について体重増加者と非増加者が均衡する体重増加分布を決定した。
【０２２４】
分析のフェーズＩでは体重増加者及び非増加者の各群でＤＮＡのプーリングを行った。Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓプラットフォームを使用して各ＤＮＡプールを〜１，７００，０００個の１塩基多形（ＳＮＰ）についてゲノタイピングした。ゲノタイピングしたＳＮＰの各々について、各プール３回の反復測定値から体重増加者と非増加者のプール間の対立遺伝子頻度差を計算した。次に、合計３０，０００個のＳＮＰをフェーズＩＩに進め、全５１３個の個体を夫々ゲノタイピングした。各個体でゲノタイピングした３０，０００個のＳＮＰは以下の３つの基準に基づいて選択した。１）２つのプール間の推定対立遺伝子頻度差が最大（±０．０８４）のＳＮＰ（ｎ＝２３，２８１個のＳＮＰ）；２）プール間の推定対立遺伝子頻度差が±０．０６５であり、複数のＳＮＰからのプールデータがＰｅｒｌｅｇｅｎのハプロタイプマップで定義されるハプロタイプに基づく予想相関構造とマッチしたＳＮＰ（ｎ＝５，０００個のＳＮＰ）；３）４７個の候補遺伝子に由来する１，７１９個のＳＮＰ。
【０２２５】
フィッシャーの正確確率検定を使用して３０，０００個のＳＮＰと体重増加表現型の関連分析を実施した。３１１個のＳＮＰが体重増加者と非増加者の間で有意差があると判断された（ｐ＜０．００１、多重検定で未補正）。バイオインフォマティクスツール、付加スコアリングアルゴリズム、及び統計分析を使用して最も興味深いＳＮＰと遺伝子領域に縮小した。
方法
【０２２６】
統合失調症、分裂情動性、又は分裂病様障害をもつと診断され、最低６カ月間オランザピンを経口投与した成人患者コホートを使用し、体重増加分布のテールからケース・コントロール集団を選択した。ケース（ｎ＝２５８）は２０％の最大体重増加者とし、コントロール（ｎ＝２５５）は体重増加が最少の個体（非増加者）の２０％から構成し、両群ともボディマス指数の変化により測定した。体重増加者の平均（±ＳＤ）ボディマス指数は３３．９±６．１ｋｇ／ｍ２であり、非増加者では２７．１±６．３ｋｇ／ｍ２であった。共変量として年齢、性別、及び人種との一次及び二次相関を試験した回帰モデルを使用し、これらの因子について体重増加者と非増加者が均衡する体重増加分布を決定した。図１は治療誘発性体重増加分布のグラフであり、２０％の最少増加者（ｎ＝２５８）と２０％の最大増加者（Ｎ＝２５５）を含む合計患者集団に対してＢＭＩ（ボディマス指数）変化をプロットする。
【０２２７】
集団内のＤＮＡプーリングに伴う１つの大きな問題は２つのプールの人種構成である。各プールに同一人種効果が存在しない場合には、単に進化因子による頻度差をもつ遺伝的変異体、従って異なる人種群で発現量の異なる遺伝的変異体が有意に存在すると思われ、更に偽陽性結果が増加する。このため、フェーズＩは集団層化検定を加えた。ゲノムに均等に分配され、十分な集団間異種性を示す２８９個のＳＮＰのランダムセットを各個患者でゲノタイピングした。
【０２２８】
関連を検出するために、２８０個のＳＮＰ（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら，（２００４）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５５：９４５−９５９；Ｈｉｎｄｓら（２００４））を増加者と非増加者の間の対立遺伝子頻度のピアソンのカイ二乗検定により試験した（Ｎ＝〜２８０）。
【表４】
2008536474.tif 000005
【０２２９】
遺伝子型クラスターの自動検出のために、サンプルをクラスターにランダムに割り当てた後に、安定になるまで遺伝子型により再割り当てした（例えばＰｒｉｃｈａｒｄら（１９９９）ＡＪＨＧ  ６５：２２０−２２８参照）。
【表５】
2008536474.tif 000006
【表６】
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【０２３０】
２つのプールに選択した５１３個体におけるこれらのＳＮＰの層化及びクラスター分析の結果、サブ集団構造（人種構成）に有意差はないことが分かった。
【０２３１】
図２は本実施例で使用した全ゲノム関連試験の概要を示す。分析のフェーズＩでは体重増加者及び非増加者の各群でＤＮＡのプーリングを行った。Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓプラットフォームを使用して各ＤＮＡプールを〜１，７００，０００個の１塩基多形（ＳＮＰ）についてゲノタイピングした。技術的変動性と偽陽性数を低減するために、ゲノタイピングしたＳＮＰの各々について、各プール３回の反復測定値から体重増加者と非増加者のプール間の対立遺伝子頻度差を計算した。
【表７】
2008536474.tif 000008
【表８】
2008536474.tif 000009
表１１及び１２も参照。
【表９】
2008536474.tif 000010
【０２３２】
注：分類情報について：プールゲノタイピング段階から個別ゲノタイピングのためにＳＮＰサブセットを選択する際には２つの広範なＳＮＰセットを考慮した。
（ａ）．該当表現型との関連が従来証明されている遺伝子内又はその近傍のＳＮＰ：プールゲノタイピングデータ内で関連の証拠を示すか否かに関係なく、これらの全ＳＮＰを選択した。こうして選択されたＳＮＰは本明細書では「ＬＬＹ候補遺伝子」（「候補遺伝子におけるＳＮＰ」とも言う）に該当する。
（ｂ）．プールゲノタイピングデータで関連の証拠を示したＳＮＰ：これらを選択する際には、ＳＮＰ選択の品質を改善するためにＰｅｒｌｅｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｔｉｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１）で先に無関係に誘導されたヒトハプロタイプマップを使用した。
【０２３３】
ハプロタイプマップが試験でサンプリングした集団を正確に表す領域では、ハプロタイプブロック内のＳＮＰの対立遺伝子頻度差とその共通パターンの対立遺伝子頻度差の直線関係を規定する。プールしたＤｐ−ハット（推定又は概算対立遺伝子頻度差）を真の対立遺伝子頻度差のプロキシとして使用して、この関係を全ハプロタイプブロックについて試験する。あるブロックのＳＮＰのＤｐ−ハット値をハプロタイプマップと一致するように決定する場合（直線回帰のｐ値＜０．０５）には、共通ハプロタイプパターンのプール間の推定頻度差を使用して個別ＳＮＰのＤｐ−ハットの「フィット」推定値を生成する。これらの「フィットＤｐ−ハット」値は各ブロック内の冗長ＳＮＰで有効に平均されるため、対立遺伝子頻度差推定値を改善する。冗長はより少数の選択でより有効なカバーを可能にするか、又は同一数のＳＮＰでより小さい対立遺伝子頻度差を試験することを可能にする。フィットＤｐ−ハットはＤｐ−ハット自体よりも個別ゲノタイピングから決定された真の対立遺伝子頻度と良好に相関する。
【０２３４】
上記のようにハプロタイプマップと一致するハプロタイプブロックのメンバーであるＳＮＰは表９の分類「ハプロタイプ一致」に該当する。Ｐｅｒｌｅｇｅｎハプロタイプマップに一致しないハプロタイプブロックに該当するか又はＰｅｒｌｅｇｅｎハプロタイプマップに全く含まれないＳＮＰは分類「不一致」に該当する。「カットオフ」の列は選択のためのＤｐ−ハット閾値、又はプールゲノタイピングからの推定対立遺伝子頻度差の閾値である。前段落に記載した理由により、一致するハプロタイプブロックでは他のＳＮＰよりも低い閾値をＳＮＰに使用した。
【０２３５】
フェーズＩＩでは個別ゲノタイピングと後期分析用に３０，０００個のＳＮＰを選択した。フィッシャーの正確確率検定を使用して、フェーズＩＩでゲノタイピングしたＳＮＰと体重増加表現型の関連分析を実施した。バイオインフォマティクスツール、付加スコアリングアルゴリズム、及び統計分析を使用して最も興味深いＳＮＰと遺伝子領域に縮小した。結果を以下に示す。
【表１０】
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【表１１】
2008536474.tif 000012
【０２３６】
「ＲＲ」は相対危険度であり、素因対立遺伝子１コピーをもつ個体間で表現型を示す危険と、素因対立遺伝子をもたない個体間の危険の比である。
【表１２】
2008536474.tif 000013
図３は第２フェーズ試験で体重増加と相関するＳＮＰをもつと判断された遺伝子の２種であるＰＫＨＤ１とＰＡＭの代表的スキャッタープロットを示し、ｐ値をｙ軸に示し、所与ＳＮＰが遺伝子内でマッピングする位置をｘ軸に示す。図４はジプレキサ（オランザピン）全ゲノムスキャン試験全体の概要を示す。
参考文献
【０２３７】
Ｅｌｌｉｎｇｒｏｄ  ＶＬ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｄ，Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＳＫ，Ｗｅｈｒｉｎｇ  Ｈ，Ａｒｎｄｔ  Ｓ．ＣＹＰ２Ｄ６  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｇｅｎｅｔ  ２００２；１２：５５−５８。
【０２３８】
Ｈｉｎｄｓ  ＤＡ，Ｓｔｏｋｏｗｓｋｉ  ＲＰ，Ｐａｔｉｌ  Ｎ，Ｋｏｎｖｉｃｋａ  Ｋ，Ｋｅｒｓｈｅｎｏｂｉｃｈ  Ｄ，Ｃｏｘ  ＤＲ，  Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ  ＤＧ．Ｍａｔｃｈｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７４：３１７−３２５，２００４。
【０２３９】
Ｈｏｎｇ  ＣＪ，Ｌｉｎ  ＣＨ，Ｙｕ  ＹＷ，Ｙａｎｇ  ＫＨ，Ｔｓａｉ  ＳＪ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈａｎｇｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｌｏｚａｐｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００１；１１：２６５−２６８。
【０２４０】
Ｍｕｌｌｅｒ  ＤＪ，Ｍｕｇｌｉａ  Ｐ，Ｆｏｒｔｕｎｅ  Ｔ，Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＪＬ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｓ  ２００４；４９：３０９−３２９。
【０２４１】
Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＧＰ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｚｈａｎｇ  ＸＢ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ  ｗｉｔｈ  ５−ＨＴ２ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．Ｌａｎｃｅｔ  ２００２；３５９：２０８６−２０８７。
【実施例１７】
【０２４２】
非定型抗精神病薬治療誘発性体重増加におけるＰＫＨＤ１を含む遺伝子の役割
非定型抗精神病薬治療誘発性体重増加は臨床問題であり、今日までこの治療作用の機械的原因は不明である。上記のようにオランザピンを投与した患者での全ゲノム関連試験により体重増加と関連する新規遺伝子が同定された。これらの結果はプロバンドを肥満表現型に選択した親子３人組コホートでも再現された。体重増加及び肥満の両者表現型に関連する該当遺伝子はＰＫＨＤ１を含んでいた。ＰＫＨＤ１ノックアウトマウスにおける異常脂肪代謝は脂肪過多症におけるこの遺伝子の役割を更に裏付け、従来過小評価されていた脂肪沈着における繊毛機能を浮き彫りにした。
【０２４３】
多くの患者は現在では非定型抗精神病薬を処方されているので、この投薬で観察される治療誘発性体重増加は臨床問題である。１０週間の治療期間にわたって使用された抗精神病薬のメタ分析では、オランザピン投与中の平均体重増加は４．１５ｋｇであり、クロザピン投与中は４．４５ｋｇであった。過剰体重増加の後遺症（例えば心臓病、糖尿病）は広く記載されているが、統合失調症における体重増加はクオリティ・オブ・ライフの低下と投薬ノンコンプライアンスにも結び付けられている。治療誘発性体重増加の基本メカニズムは殆ど分かっていないが、遺伝的影響が示唆されている。遺伝的関与は候補遺伝子アプローチを使用して調査されているが、結果は一致せず、遺伝子の関与の意義は確定していない（Ｍｕｌｌｅｒら（２００４）“Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｇａｉｎ”  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９：３０９−３２９；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら（２００２）“Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ  ｗｉｔｈ  ５−ＨＴ２ｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，”  Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：２０８６−２０８７；Ｅｌｌｉｎｇｒｏｄら（２００２）“Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ａｔｙｐｉｃａｌ  Ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｇａｉｎ”  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：５５−５８；Ｈｏｎｇら（２００１）“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｈａｎｇｅ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｃｌｏｚａｐｉｎｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：２６５−２６８）。候補遺伝子試験は神経生理機能、体重恒常性及び／又は食物満腹感の調節、並びに非定型抗精神病薬の薬理作用及び動態に関与する遺伝子に集中している。全ゲノムスキャン技術の最近の実用化に伴い、仮定できるものを越えてこの現象に関与する潜在的遺伝メカニズムを解明するために、独立コホートでの全ゲノムＳＮＰ関連試験及び反復とその後のノックアウトマウスでの機能観察を実施した。
【０２４４】
治療誘発性体重増加−全ゲノム関連試験。仮定できないメカニズムを調査し、公知生物学への典型的バイアスを排除するように、治療誘発性体重増加の全ゲノム関連試験である第１段階を選択した。この試験は１，４００，０００個を上回る１塩基多形（ＳＮＰ）の定量的プールゲノタイピングと、その後に１．４×１０６個のＳＮＰのうちで最高有意を示した約３０，０００個のＳＮＰを個別ゲノタイピングする２フェーズから構成した。コホートは統合失調症、分裂情動性、又は分裂病様障害をもつと診断され、最低６カ月間オランザピンを経口投与した患者集団のボディマス指数変化により測定した２０％の最大体重増加者と非増加者とした。
【０２４５】
プーリング前に、２８９個のＳＮＰの規定セットをゲノタイピングし、集団基礎バイアスについて試験した（Ｈｉｎｄｓら（２００４）“Ｍａｔｃｈｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ”  Ａｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７４（２）：３１７−３２５参照）。集団基礎バイアスによる交絡の兆候は認められなかった。体重増加との関連分析のフェーズＩでは体重増加者と非増加者に別々にＤＮＡの定量的プーリングを行い、文献に記載されているように１．４×１０６個のＳＮＰの各々のプール間の推定対立遺伝子頻度差（Δｐｈａｔ）を計算した（Ｈｉｎｄｓら（２００４）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｏｌｅｄ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｔｏ  Ｓｃａｎ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＨＤＬ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｅｖｅｌｓ”  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １（６）：４２１−４３４）。フェーズ２では２つのプール間のΔｐｈａｔが最大（Δｐｈａｔ≧０．０８４）のＳＮＰ２３，２８１個と；プール間にΔｐｈａｔ（Δｐｈａｔ≧０．０６５）があり、複数のＳＮＰからのプールデータがＰｅｒｌｅｇｅｎのハプロタイプマップで定義されるハプロタイプに基づく予想相関構造とマッチした非冗長ＳＮＰ５，０００個からなるＳＮＰ２８，２８１個について全個体をゲノタイピングした。アッセイ開発、ハーディー・ワインベルグ平衡検定で不適格であるか、又は十分な観測が得られなかったものを除去した後にＳＮＰを体重増加との関連について試験した。関連分析の結果、１０７個の遺伝子からの２９０個のＳＮＰで体重増加者と非増加者の間に有意差があると判断された（フィッシャーの正確なｐ値＜０．００１）（方法に関する文献中の記載と付属資料のデータ）。数個の遺伝子には複数の有意ＳＮＰがあった。
【０２４６】
ｍＲＮＡマイクロアレー、プロテオミック、及びメタボノミック試験と同様に、大規模遺伝試験では偽陽性結果を含む可能性のある大きなデータセットが得られる。独立した確認なしには、真の陽性結果を識別するのは難しい。しかし、これらの試験からの数個の遺伝子は数個のハプロタイプ及び連鎖不平衡ブロックでＳＮＰのクラスタリングを示したので、これらの知見は有意義であると思われる。これらのＳＮＰは本明細書に記載するように体重増加への関与が仮定されているＰＡＭ、ＦＡＢＰ２及びＰＡＰＰＡ等の遺伝子の遺伝子境界に含まれる。ＰＫＨＤ１、ＲＯＳ１、ＴＯＸ及びＮＲＸＮ３等の最強クラスタリングを示す遺伝子は従来体重制御メカニズムに結びつけられていなかった。
【０２４７】
これらの新規遺伝的関連を確認するために非定型抗精神病薬関連治療誘発性体重増加を示す患者からのサンプルの付加的独立集団は学術又は商業ソースから直接入手することはできなかった。しかし、体重管理の中枢及び末梢メカニズムの二重の役割について発見された内容によると、治療誘発性体重増加及び全身肥満の遺伝的影響はオーバーラップしていると予想される。従って、肥満に選択したコホートで初期反復を実施した。
【０２４８】
肥満コホートにおける反復。プロバンド（この場合には子）を肥満表現型（ＢＭＩ＞３５）に選択した親子３人組（ｎ＝３４８）をゲノタイピングし、結果を再現した。以下のＳＮＰ選択ストラテジーを使用して３７４１個のＳＮＰを含むチップを設計した。ゲノムワイド関連試験のフェーズ２からのｐ＜０．００２の全有意ＳＮＰ（ｎ＝６６８）；及び有意ＳＮＰ付近の冗長と有意ＳＮＰの周囲の連鎖不平衡ビンに相当する非冗長ＳＮＰの両者に選択した付加ＳＮＰ（ｎ＝３０７３）。これらの３７４１個のＳＮＰのうちの３２８６個（８８％）がアッセイに成功し、伝達不平衡検定（ＴＤＴ）を使用して肥満との関連に使用した。試験を進めた１０７個の遺伝子のうちの１３個に相当するＳＮＰは肥満コホートにおいてｐ＜０．０１で少なくとも１回のＳＮＰ反復があった。
【０２４９】
全身肥満と治療誘発性体重増加の共通メカニズムを示唆したが、治療誘発性体重増加コホートと肥満コホートの間で反復した遺伝子数は予想外であった。遺伝子の少なくとも１個は体重管理との連鎖が妥当であると思われる代謝経路ＦＡＢＰ２に存在するが、反復したその他の遺伝子は脂肪過多症との連鎖が従来知られていない。他方、無関係な肥満コホートにおける反復はＰＫＨＤ１、ＥＰＨＡ７、ＩＮＰＰ４Ｂ及びＬＡＭＡ４等の遺伝子が体重制御に関与していることを強く暗示している。
【０２５０】
ＰＫＨＤ１ノックアウトマウス。独立試験で、保存エキソン３及び４を除去したマウスノックアウトモデルを開発し、多発性肝腎嚢胞症に及ぼすＰＫＨＤ１の影響を調査した。ヒトにおける多発性腎嚢胞症と同様に、ＰＫＨＤ１エキソン３及び４ノックアウト動物は各種程度の顕在症状をもつ。動物は腎臓、膵臓、又は肝臓疾患の明白な兆候を示し、疾患による体重低下を示す。他方、顕在症状のないホモ接合ノックアウト動物では、異常内臓脂肪沈着が認められた。この種の脂肪沈着はこれらの系統の遺伝子操作していない動物では認められず、文献にも報告されていない。恐らく遺伝子寸法とこの遺伝子に見られる複数の代替エキソン転写産物により、疾患表現型はヒト及び動物のいずれでも変動するので、全ホモ接合ＫＯ動物が異常内臓脂肪沈着を示す訳ではないことは予想外ではなかった。
【０２５１】
異常脂肪代謝の発現に遺伝子の両方のコピーが必要であるか否かを調べるために、ヘテロ接合動物の脂肪沈着を調査した。多発性嚢胞症症状と異なり、ヘテロ接合動物は全身肥満表現型を示し、そのホモ接合野生型同腹子の体重の約２倍であった。これらの知見から、マウスノックアウトモデルの繊毛機能の変化は異常脂肪沈着の一因であり、観察されるＳＮＰ関連情報と生態連鎖があることが確認された。
【０２５２】
繊毛構造及び機能に関与する遺伝子が治療誘発性体重増加と肥満に関与しているという結果は予想外であった。一方、ＰＫＨＤ１が治療誘発性体重増加と全身肥満に関与しているという点については現在相当の証拠がある。全ゲノム関連試験の結果、ＰＫＨＤ１内のＳＮＰのクラスターは体重増加と有意に関連していることが判明した。３個の独立ハプロタイプブロックに相当する５０ｋｂ領域内の８個のＳＮＰは有意であり、非有位ＳＮＰは散在していなかった。この点だけでもＰＫＨＤ１が治療誘発性体重増加に関与している可能性は非常に高い。肥満集団における独立反復はこの関連を更に裏付け、ＰＫＨＤ１が非定型抗精神病薬治療とは別の脂肪代謝にも関与していることを示唆した。ＰＫＨＤ１  ＫＯマウスモデルにより得られた生態との直接連鎖はＰＫＨＤ１が肥満及び関連代謝欠陥に関与していることを更に実証している。
【０２５３】
大半の複雑な表現型でそうであるように、体重増加の基礎には複数の遺伝メカニズムが内在している。新規生態原理に基づく共通メカニズムの発見は非常に魅力的である。本実施例はゲノム関連試験、反復及び生体調査を使用して新規遺伝メカニズムを発見できることを立証するものである。ＰＫＨＤ１、ＦＡＢＰ２、ＥＰＨＡ７、ＩＮＰＰ４Ｂ及びＬＡＭＡ４はこの場合も肥満コホートで関連していた。これらの全遺伝子が代謝と体重管理にどのように関与しているかはまだ不明である。
【０２５４】
候補遺伝子と肥満の関連はバルデー・ビードル症候群と呼ばれる先天性多発性嚢胞症でも示される。この稀な形態の多発性腎嚢胞症では、肥満が顕著である。しかし、バルデー・ビードル症候群には６種の異なる遺伝子が関与するとされており、ＰＫＨＤ１に関連する一般型の常染色体性優性多発性腎嚢胞症がバルデー・ビードル症候群とどの程度関係があるかは不明である。
【０２５５】
本発明者らは全身肥満と治療誘発性体重増加の共通メカニズムを提示するが、完全なオーバーラップを予想するものではない。いずれも全ゲノム関連試験で高度に有位であり、各々有位ＳＮＰのクラスタリングを示すＮＲＸＮ３やＰＡＭ等の所定の遺伝子は肥満コホートで反復しなかった。これは予想外でも驚くべきことでもない。逆に、本発明者らは本試験で肥満表現型の基礎となる全遺伝子を発見しようとは思っていなかった。肥満にはその他の遺伝素因関連が存在するものと思われる。
【０２５６】
以上、特定方法、システム及び装置により本発明を説明したが、本発明は更に広い適用範囲がある。更に、上記では、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全方法、技術、システム、デバイス、キット、装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【図面の簡単な説明】
【０２５７】
【図１】治療誘発性体重増加分布のグラフであり、２０％の最少増加者（ｎ＝２５８）と２０％の最大増加者（Ｎ＝２５５）を含む合計患者集団に対してＢＭＩ（ボディマス指数）変化をプロットする。
【図２】全ゲノム関連試験の概要を示す。
【図３】第２フェーズ試験で体重増加と相関するＳＮＰをもつと判断された遺伝子の２種であるＰＫＨＤ１とＰＡＭの代表的スキャッタープロットを示し、ｐ値をｙ軸に示し、所与ＳＮＰが遺伝子内でマッピングする位置をｘ軸に示す。
【図４】ジプレキサ（オランザピン）全ゲノムスキャン試験全体の概要を示す。
【０２５８】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【表１３−６】
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【表１３−７】
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【表１３−８】
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【表１３−９】
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【表１３−１０】
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【表１３−１１】
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【表１３−１２】
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【表１３−１３】
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【表１３−１４】
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【表１３−１５】
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【表１３−１６】
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【表１３−１７】
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【表１３−１８】
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【表１３−１９】
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【表１３−２０】
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【表１３−２１】
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【表１３−２２】
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【表１３−２３】
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【表１３−２４】
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【表１３−２５】
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【表１３−２６】
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【表１３−２７】
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【表１３−２８】
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【表１３−２９】
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【表１３−３０】
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【表１３−３１】
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【表１３−３２】
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【表１３−３３】
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【表１３−３４】
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【表１３−３５】
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【表１３−３６】
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【表１３−３７】
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【表１３−３８】
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【表１３−３９】
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【表１３−４０】
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【表１３−４１】
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【表１３−４２】
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【表１３−４３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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