(57)【要約】本出願は、スクレロスチン(sclerostin)を含む、キャン(CAN)サブファミリーのシスチンノットタンパク質などのシスチンノット含有BMPアンタゴニストに結合して、これを中和するTGF類似体/抑制解除因子に関する。本TGF抑制解除因子は、骨粗鬆症、およびBMP活性が所望する量よりも低い任意の病態を含む骨疾患などの疾患を治療する上で哺乳動物に投与するために、実質的に発熱物質を含まない薬学的組成物として調製され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型BMPタンパク質と1つまたは複数のアミノ酸残基が異なるBMP変種ポリペプチドであって、(i) 1つまたは複数のシスチンノット含有BMPアンタゴニストに結合して、これを中和し、かつ(ii) 別の方法で野生型BMPタンパク質に応答する細胞において、受容体介在性シグナル伝達を誘導する能力が野生型BMPタンパク質と比較して減少しているBMP変種ポリペプチド。
【請求項２】
点変異、欠失、切断、挿入、および/または化学的修飾により、野生型BMPタンパク質から得られる、請求項1記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項３】
受容体介在性シグナル伝達の誘導に関して、野生型BMPタンパク質よりも少なくとも5倍高いEC50を有する、請求項1または2記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項４】
受容体介在性シグナル伝達の誘導に関して、野生型BMPタンパク質よりも少なくとも100倍高いEC50を有する、請求項3記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項５】
BMP受容体との結合に関して、野生型BMPタンパク質よりも少なくとも5倍高いKdを有する、請求項1または2記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項６】
BMP受容体との結合に関して、野生型BMPタンパク質よりも少なくとも100倍高いKdを有する、請求項5記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項７】
I型受容体との結合に関して、野生型BMPタンパク質よりも少なくとも100倍高いKdを有する、請求項5記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項８】
キャン(CAN)(8員環)、ねじれた原腸形成(twisted gastrulation)(9員環)、コーディンおよびノギン(10員環)からなる群より選択されるシスチンノット含有BMPアンタゴニストに結合する、請求項1または2記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項９】
インビボにおいてスクレロスチン(sclerostin)と結合し、骨成長および骨石灰化を促進する、請求項1または2記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項１０】
BMP-5の配列変種である、請求項9記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項１１】
領域
2008509087.tif 000036
における1つまたは複数の残基において野生型BMP-5と異なる、請求項10記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項１２】
BMP-6の配列変種である、請求項9記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項１３】
領域
2008509087.tif 000037
における1つまたは複数の残基において野生型BMP-6と異なる、請求項12記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項１４】
BMP-2の配列変種である、請求項9記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項１５】
D30、W31、A34、H39、F49、P50、D53、S88、L100、およびE109からなる群より選択される1つまたは複数の残基において野生型BMP-2と異なる、請求項14記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項１６】
D30A、W31A、A34D、H39D、F49A、P50A、D53A、S88A、L100A、およびE109Rからなる群より選択される1つまたは複数の変異を有する、請求項15記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項１７】
ランダム突然変異誘発によって得られる、請求項1または2記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項１８】
1μMまたはそれ未満のKdでシスチンノット含有BMPアンタゴニストに結合する、請求項1または2記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項１９】
10 nMまたはそれ未満のKdでシスチンノット含有BMPアンタゴニストに結合する、請求項18記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項２０】
インビボ安定性、インビボ半減期、摂取/投与、組織局在性もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および/または精製の1つまたは複数を増強するもう1つのポリペプチド部分をさらに含む融合タンパク質である、請求項1または2記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項２１】
融合タンパク質が、免疫グロブリンFcドメインを含み、好ましくはFcドメインが抑制解除因子のN末端に融合されている、請求項20記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項２２】
融合タンパク質が精製サブ配列を含む、請求項20記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項２３】
精製サブ配列が、エピトープタグ、FLAGタグ、ポリヒスチジン配列、およびGST融合物からなる群より選択される、請求項20記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項２４】
グリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、プレニル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸、および有機誘導体化剤に結合したアミノ酸から選択される1つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む、請求項1または2記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項２５】
修飾アミノ酸残基が、インビボ安定性、インビボ半減期、摂取/投与、組織局在性もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および/または精製の1つまたは複数を増強する、請求項24記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項２６】
BMP-2(-2A)、BMP-3、BMP-3B(GDF-10)、BMP-4(-2B)、BMP-5、BMP-6、BMP-7(OP-1)、BMP-8(OP-2)、BMP-9(GDF-2)、BMP-10、BMP-11(GDF-11)、BMP-12(GDF-7)、BMP-13(GDF-6)、PC8(OP-3)、DPP、60A、Vg1、Vgr-1、ユニビン(Univin)、GDF-5、GDF-3、およびGDF-1から選択されるBMPファミリータンパク質の変種である、請求項1または2記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項２７】
ヒト治療薬または獣医治療薬としての投与に適切であるように、発熱物質を実質的に含まない、上記請求項のいずれか一項記載のBMP変種ポリペプチドの薬学的調製物。
【請求項２８】
哺乳動物における使用に適した薬学的調製物であって、(a) 上記請求項のいずれか一項記載のBMP変種ポリペプチドのコード配列；(b) インビボでBMP変種ポリペプチドの発現を制御するための転写調節配列を含むベクター；ならびに任意に(c) 薬学的に許容される担体および/またはトランスフェクション剤を含む薬学的調製物。
【請求項２９】
以下を含む包装された調合薬：(a) 請求項1〜26のいずれか一項記載のBMP変種ポリペプチドの薬学的に許容される調製物；および(b) ヒトまたは動物患者を治療するための調製物の使用について記載しているラベルまたは添付文書。
【請求項３０】
以下を含む包装された調合薬：(a) インビボにおいてスクレロスチンと結合し、骨成長および骨石灰化を促進する、請求項9〜15のいずれか一項記載のBMP変種ポリペプチドの薬学的に許容される調製物；ならびに(b) ヒトまたは動物患者において、骨密度の増加を促進するためおよび/または骨密度の減少率を低減するための調製物の使用について記載しているラベルまたは添付文書。
【請求項３１】
請求項1〜26のいずれか一項記載のBMP変種ポリペプチドを投与する段階を含む、BMPシグナル伝達を促進するための方法。
【請求項３２】
請求項9〜15のいずれか一項記載のBMP変種ポリペプチドを投与する段階を含む、ヒトまたは動物患者において、骨密度を促進するおよび/または骨密度の減少率を低減するための方法。
【請求項３３】
BMP変種ポリペプチドが、少なくとも一部は骨密度の減少または骨密度の減少率の増加を特徴とする病的状態の重症度を軽減するための有効量で投与される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、骨軟化症、腎性骨異栄養症、歯周病、および人工装具周辺の骨溶解に関連する局在性骨減少から選択される骨疾患の治療または予防の一部である、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、ステロイド誘導性骨粗鬆症、男性骨粗鬆症、疾患誘導性骨粗鬆症、または特発性骨粗鬆症である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
BMP変種ポリペプチドが、骨吸収を阻害する1つまたは複数の他の薬剤と共に投与される、請求項32記載の方法。
【請求項３７】
BMP変種ポリペプチドが骨標的部分と結合している、請求項32記載の方法。
【請求項３８】
骨標的部分が、ビスフォスフォネート、フッ化物、小酸性ペプチド、特定の骨タンパク質に対する抗体、Sr2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Co2+、Cr2+、もしくはMo2+から選択される金属イオン、トレーサー、または高い骨親和性を有する複素環分子である、請求項32記載の方法。
【請求項３９】
骨標的部分と結合している、請求項9〜15いずれか一項記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項４０】
骨標的部分が、ビスフォスフォネート、フッ化物、小酸性ペプチド、特定の骨タンパク質に対する抗体、Sr2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Co2+、Cr2+、もしくはMo2+から選択される金属イオン、トレーサー、または高い骨親和性を有する複素環分子である、請求項39記載のBMP変種ポリペプチド。
【請求項４１】
ヒトまたは動物患者において、骨密度を促進するおよび/または骨密度の減少率を低減するための医薬を調製するための、請求項9〜15いずれか一項記載のBMP変種ポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景：
トランスフォーミング増殖因子-βスーパーファミリータンパク質は、TGF-β、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質(BMP)、およびミュラー管抑制物質(MIS)を含むサイトカインの大きなファミリーを表す(総説に関しては、Massague et al., Trends Cell Biol. 7:187-192, 1997を参照されたい)。これらのタンパク質は保存されたC末端シスチンノットモチーフを含み、原形質膜受容体の多様なファミリーのリガンドとして機能する。TGF-βファミリーのメンバーは、多種多様な細胞種に対して広範な生物学的効果を及ぼす。例えば、それらは、細胞増殖、分化、基質産生、およびアポトーシスを制御する。それらの多くは、胚発生期にパターン形成および組織特異化において重要な機能を有し；成体では、組織修復および免疫系の調節などの過程に関与する。
【０００２】
TGF-βスーパーファミリータンパク質の活性は、様々な手段によって制御される。BMPサブファミリーのタンパク質は、いわゆる骨形成タンパク質(BMP)アンタゴニスト/抑制因子の大きなファミリーによって負に制御される。これらのBMP抑制因子は、BMPと結合して、BMPがそれらの膜受容体に結合するのを妨げ、それによって発生および形態形成期のBMPの活性を遮断するタンパク質の亜群を表す。
【０００３】
BMP抑制因子は、構造解析に基づいて、特にC末端の特徴的な「シスチンノット」構造における構造的に保存されたCys残基の数に基づいて、3群のタンパク質：8員環、9員環、または10員環シスチンノットBMP抑制因子にさらに分類され得る。8員環抑制因子の1つはスクレロスチン(Sclerostin)(SOST)であり、これは硬結性骨化症として知られる疾患状態に関与することが知られている。
【０００４】
硬結性骨化症とは、Hansen(Sklerosteose. In: Opitz, H.; Schmid, F.: Handbuch der Kinderheilkunde. Berlin: Springer (pub.) 6 1967. Pp. 351-355)によって、ファン・ブッヘム汎発性皮質性骨化過剰症に類似しているが、骨変化の放射線学的外観、および多くの症例で示指と中指との非対照皮膚性合指症が存在する点で異なる疾患に対して適用された用語である。この病態では、患者の顎は異常に四角い外観を有する。Hirsch(Radiology 13:44-84, 1929)、Falconer and Ryrie(Med. Press 195: 12-20, 1937)、Higinbotham and Alexander(Am. J. Surg. 53: 444-454, 1941)、Kelley and Lawlah(Radiology 47: 507-513, 1946)、Truswell(J. Bone Joint Surg. 40B: 208-218, 1958)、およびKlintworth(Neurology 13: 512-519, 1963)によって、罹患した兄弟が認められた。Falconer and Ryrie(Med. Press 195: 12-20, 1937)およびTruswell(J. Bone Joint Surg. 40B: 208-218, 1958)によって、親との密接な関係が認められた。
【０００５】
高度に多型的なマイクロサテライトマーカーを用いたゲノム全域にわたる探索により、Van Hul et al.(Am J Hum Genet. 62(2): 391-9, 1998)は、ファン・ブッヘム病の原因遺伝子を17q12-q21にマッピングした。Balemans et al.(Am. J. Hum. Genet. 64: 1661-1669, 1999)は、硬結性骨化症およびファン・ブッヘム病が同じ遺伝子の変異によって起こり得るという、Beighton et al.(Clin. Genet. 25: 175-181, 1984)の仮説について試験した。硬結性骨化症を有する2つの血縁家族における二点連鎖解析により、Balemans et al.(Am. J. Hum. Genet. 64: 1661-1669, 1999)は、この疾患の遺伝子座を、ファン・ブッヘム病遺伝子座が位置するのと同じ領域である17q12-q21に指定し、対立性の仮説の遺伝学的支持を提供した。
【０００６】
硬結性骨化症を有するアフリカーナ家族におけるホモ接合性マッピングおよびその後のポジショナルクローニングにより、Brunkow et al.(Am J Hum Genet. 68(3): 577-89, 2001; Epub 2001 Feb 09)は、彼らがSOSTと命名した新規遺伝子における2つの独立した変異を見出した。SOST遺伝子は、ラットおよびマウス相同体と89%および88%の配列同一性を共有する推定213アミノ酸タンパク質、スクレロスチンをコードする2つのエキソンを含む。このタンパク質は、推定上の分泌シグナルおよび2つのNグリコシル化部位を含む。このタンパク質はまた、トランスフォーミング増殖因子-βスーパーファミリーのメンバーのアンタゴニストとして作用することが示されている、ダン(dan)、ケルベロス(cerberus)、グレムリン(gremlin)、およびカロンテ(caronte)を含む分泌性糖タンパク質のダンファミリーと高い類似性を有するシスチンノットモチーフ(残基80位-167位)を含む。定量的RT-PCRから、SOSTの全体的な発現は比較的低いが、長骨全体、軟骨、腎臓、および肝臓においてに顕著に発現し、胎盤および胎児皮膚において低発現していることが示された。
【０００７】
罹患したアフリカーナにおいて、Brunkow et al.は、スクレロスチンのN末端においてナンセンス変異を見出した。Tacconi et al.(Clin. Genet. 53: 497-501, 1998)によって報告されたセネガル由来の罹患非血縁者において、彼らは、SOST遺伝子の1つのイントロン内にスプライス変異を見出した。Brunkow et al.は、ファン・ブッヘム病を有するオランダ人患者7名においてSOST遺伝子を解析したが、コード領域内に変異は検出されなかった。
【０００８】
Balemans et al.(Hum Mol Genet. 10(5): 537-43, 2001)は、独立してSOST遺伝子を単離し、変異を有する2つの硬結性骨化症家族について記載した。定量的RT-PCRにより、対照ヒト腎臓、次いで骨髄および骨芽細胞において、組織発現レベルが最も高いことが明らかになった。
【０００９】
上記のように、SOST遺伝子産物スクレロスチンは、ダン、ケルベロス、グレムリン、prdc、およびカロンテを含むシスチンノット含有因子のクラスといくらかの配列類似性を共有する。スクレロスチンタンパク質遺伝子は、1つまたは複数の骨形成タンパク質(BMP)と相互作用すると考えられている(Brunkow et al, 2001)。骨形成タンパク質は、骨を含む多くの組織種の細胞増殖、分化、およびアポトーシスに影響を及ぼす上で役割を担うことが示されているトランスフォーミング増殖因子(TGF-β)スーパーファミリーのメンバーである。骨形成タンパク質は新規の軟骨および骨形成を誘導し得り、哺乳動物の胚発生期の骨格発達に必須のようである(Wang 1993)。骨折治癒過程の初期には、骨形成タンパク質-4(BMP-4)の濃度が劇的に上昇する(Nakase et al. 1994、およびBostrom et al. 1995)。インビボ実験から、BMP-4転写の上方制御が、哺乳動物において骨治癒を促進し得ることが示される(Fang et al. 1996)。骨形成タンパク質は、間葉系の細胞から骨原性細胞への分化を誘導すること、および拘束細胞において骨芽細胞表現型マーカーの発現を増強することが報告されている(Gazzero et al. 1998、Nifuji & Noda, 1999)。骨芽細胞における骨形成タンパク質の活性は、骨形成タンパク質と結合してこれを不活性化することにより骨形成タンパク質アンタゴニストとして機能する、ノギンおよびグレムリンなどのタンパク質によって調節されるようである(Yamaguchi et al. 2000)。
【００１０】
BMP活性が必要な様々な疾患状態の治療のために、BMP活性の上昇が検討され得る。例えば、骨粗鬆症は、人の骨の脆弱性および多孔性をもたらす、骨量の減少を特徴とする骨疾患である。結果として、骨粗鬆症患者では骨折の危険性が増加する。閉経後の女性は、エストロゲン産生のレベルが低下する結果として、特に骨粗鬆症の危険性がある。エストロゲンは低レベルで投与した場合に、骨減少に有利な効果をもたらす。しかし、エストロゲン補充療法は、血液凝固、乳癌、子宮内膜過形成、および子宮内膜癌の危険性の増加をはじめとする、望ましくない副作用を有し得る。残りの現治療法は、骨粗鬆症患者の新規な骨の形成に関してほとんど効果がない。したがって、骨粗鬆症の別の治療法の必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要：
本発明の1つの局面は、BMPシグナル伝達、例えば、TGF/BMPファミリーのメンバーによる受容体介在性シグナル伝達を抑制解除する(促進する)ための薬学的調製物を提供する。本発明の例示的な調製物には、シスチンノット含有BMPアンタゴニスト(本明細書では「シスチンノットファミリー抑制因子」とも称される)と結合する能力を保持するが、I型および/またはII型受容体に結合する能力を減少するなどして、別の方法で野生型TGFタンパク質に応答する細胞において、受容体介在性シグナル伝達を誘導する能力が野生型BMPタンパク質と比較して減少している変異体BMP類似体を含むポリペプチドが含まれる。これらのいわゆる「BMP抑制解除因子」を用いて、少なくとも一部は対象における異常に低い骨密度を特徴とする病的状態の重症度を軽減することができる。例えば、本発明の薬学的調製物は、閉経後骨粗鬆症などの骨粗鬆症の重症度を予防する、改善する、または軽減するのに有効な量で投与することができる。
【００１２】
本発明の別の局面は、1つまたは複数のシスチンノットファミリータンパク質の阻害活性を中和するための薬学的調製物を提供する。本発明の例示的な調製物には、シスチンノットファミリータンパク質の、BMPタンパク質などのその通常の結合パートナーへの結合を阻害する方法で、シスチンノットファミリータンパク質の1つに結合するシスチンノットファミリー阻害剤が含まれる。好ましくは、シスチンノットファミリー阻害剤は、シスチンノットファミリータンパク質の「BMP結合ドメイン」に結合する。
【００１３】
特定の態様において、シスチンノットファミリー阻害剤/TGF抑制解除因子は、機能的なシスチンノットファミリー結合ドメインを含む変異体BMPポリペプチドである。
【００１４】
特定の態様において、TGF抑制解除因子は、BMP二量体の形成を妨げる二量体化ドメイン変異を含む。他の態様において、TGF抑制解除因子は、野生型BMP単量体と、I型もしくはII型または両方のBMP受容体と結合する能力が減少しているが、ダンファミリータンパク質と結合する能力が実質的に変化していない変異体BMP単量体のヘテロ二量体であってよい。
【００１５】
阻害剤の選択性を変更する(例えば、1つの特定のシスチンノットファミリータンパク質に対して)、シスチンノットタンパク質に関する他の結合特性(Kd、および/またはKonもしくはKoff速度)を変更する、または生体内分布もしくはインビボにおけるもしくは保存中の半減期を改善する手段として望ましいと考えられる、上記のTGF抑制解除因子の変種配列もまた含まれる。
【００１６】
特定の好ましい態様において、TGF抑制解除因子は、1μMもしくはそれ未満のKd、より好ましくは100 nM、10 nM、またはさらには1 nMもしくはそれ未満のKdでシスチンノットタンパク質と結合する。
【００１７】
特定の態様において、TGF抑制解除因子は、インビボ安定性、インビボ半減期、摂取/投与、組織局在性もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および/または精製の1つまたは複数を増強する1つまたは複数のポリペプチド部分を含む融合タンパク質の一部である。例えば、融合タンパク質は、好ましくはTGF抑制解除因子のN末端に融合された免疫グロブリンFcドメインを含み得る。融合タンパク質は、エピトープタグ、FLAGタグ、ポリヒスチジン配列、またはGST融合物などの精製サブ配列を含み得る。
【００１８】
特定の態様において、TGF抑制解除因子は、グリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸、または有機誘導体化剤に結合したアミノ酸などの、1つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含むタンパク質の一部である。これらの修飾の1つまたは複数を用いて、阻害剤の選択性を変更する(例えば、1つの特定のシスチンノットファミリータンパク質に対して)、TGF抑制解除因子の抗原性を減少させる、シスチンノットタンパク質に関する他の結合特性(Kd、および/またはKonもしくはKoff速度)を変更する、または生体内分布もしくはインビボにおけるもしくは保存中の半減期を改善することができる。
【００１９】
本発明はまた、シスチンノットファミリータンパク質に結合し、BMPなどのシスチンノット結合パートナーの結合と競合する他のポリペプチド親和性試薬の使用もまた意図する。例えば、そのような親和性試薬には、抗体剤、ならびにシスチンノットタンパク質に結合してこれを阻害するペプチドおよび足場ペプチドが含まれる。本発明の例示的な抗体には、組換え抗体およびモノクローナル抗体、ならびにVHドメイン、VLドメイン、scFv、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2構築物、Fv、およびジスルフィド結合したFvなどの、それらの抗原結合断片に由来する構築物が含まれる。特定の好ましい態様において、抗体剤は、完全なヒト抗体もしくはヒト化キメラ抗体、またはそれらの抗原結合断片である。
【００２０】
さらなる他の態様において、TGF抑制解除因子は、シスチンノットファミリータンパク質に選択的に結合し、BMPなどのシスチンノットファミリータンパク質の通常の結合パートナーの結合と競合する小有機分子である。このクラスの好ましい阻害剤は、2500 amu未満、さらにより好ましくは2000、1000、またはさらには750 amu未満の分子量を有する分子である。
【００２１】
特定の態様において、TGF抑制解除因子は、別のシスチンノットタンパク質とは対照的に、1つの特定のシスチンノットタンパク質の結合および阻害に対して選択的である。例えば、TGF抑制解除因子は、1つのシスチンノットタンパク質に対して、別のシスチンノットタンパク質と結合する際の解離定数(Kd)よりも少なくとも2倍低い、さらにより好ましくは少なくとも5、10、100、またはさらには1000倍低いKdを有するものであってよい。結合反応速度のせいであろうと生体内分布のせいであろうと、本TGF抑制解除因子はまた、別のシスチンノットタンパク質を阻害する際のEC50よりも少なくとも2倍低い、さらにより好ましくは少なくとも5、10、100、またはさらには1000倍低い、シスチンノットタンパク質活性の阻害または特定の生理的結果(骨成長の促進または骨密度増加など)に関するEC50を有する抑制解除因子のように、相対インビボ能力に基づいて選択され得る。
【００２２】
特定の好ましい態様において、TGF抑制解除因子は、1μMもしくはそれ未満のKd、より好ましくは100 nM、10 nM、またはさらには1 nMもしくはそれ未満のKdでシスチンノットタンパク質と結合する。
【００２３】
一般に、本TGF抑制解除因子調製物は、ヒト患者での使用に適している。好ましい態様において、TGF抑制解除因子の本調製物は、ヒト患者への投与に適切であるように、発熱物質を実質的に含まない。
【００２４】
他の態様において、本TGF抑制解除因子は、非ヒト動物、特に他の哺乳動物に対して使用することができる。例えば、本発明の化合物は、ニワトリ、シチメンチョウ、家畜動物(ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシなど)、ペット動物(例えば、ネコおよびイヌ)に与えることができ、または成長を促進するおよびタンパク質/脂肪比を改善するために水産養殖において役立ち得る。
【００２５】
本発明の別の局面は、本明細書に記載のTGF抑制解除因子の薬学的調製物、およびヒト患者において骨組織の成長促進に使用するためのラベルまたは説明書を含む包装された調合薬に関する。
【００２６】
本発明のさらに別の局面は、本明細書に記載のTGF抑制解除因子の薬学的調製物、および非ヒト哺乳動物において骨組織の成長促進に獣医師が使用するためのラベルまたは説明書を含む包装された調合薬に関する。
【００２７】
本発明のさらに別の局面は、シスチンノットタンパク質上のBMP結合部位に結合し、シスチンノットタンパク質によるBMP結合を阻害するポリペプチドTGF抑制解除因子のコード配列、および治療を受ける哺乳動物において、骨組織の成長を促進するのに有効な量のポリペプチドTGF抑制解除因子をインビボで発現させるための転写調節配列を含むベクターを含む、哺乳動物での使用に適した薬学的調製物を提供する。本調製物は、治療を受ける哺乳動物の細胞によるベクターの取り込みを増強する薬剤を含み得る。
【００２８】
本発明の別の局面は、本TGF抑制解除因子の1つまたは複数の薬学的調製物を投与することにより、インビボでBMPシグナル伝達を促進する方法に関する。本方法を用いて、ヒト患者または非ヒト動物における骨成長などの、BMP介在性生物学的効果のすべてを促進することができる。
【００２９】
特定の態様においては、本発明の治療法を用いて、少なくとも一部は対象における骨組織の異常な量、発達、または代謝活性を特徴とする病的状態の重症度を軽減することができる。例えば、本発明の薬学的調製物は、骨粗鬆症またはBMP活性の欠如に起因する任意の他の病態などの疾患による骨密度低下の重症度を予防、改善、または軽減するのに有効な量で投与することができる。
【００３０】
本発明はまた、上記に列挙する疾患または治療適応症を治療する試みにおいて有用な1つまたは複数の他の化合物と併用した、本TGF抑制解除因子製剤の使用も意図する。これらの併用において、治療剤と本発明のTGF抑制解除因子は、独立しておよび連続して投与され得るか、または同時に投与され得る。骨吸収を阻害する、骨粗鬆症を予防する、骨格破壊を減少させる、骨折治癒を増強する、骨形成を促進する、および骨ミネラル密度を増加させるための併用療法は、ビスフォスフォネートと本発明のTGF抑制解除因子の併用によって達成され得る。これらの有用性を有するビスフォスフォネートには、これらに限定されるわけではないが、アレンドロネート、チルドロネート、ジメチル-APD、リセドロネート、エチドロネート、YM-175、クロドロネート、パミドロネート、およびBM-210995(イバンドロネート)が含まれる。
【００３１】
本TGF抑制解除因子は、哺乳動物エストロゲンアゴニスト/アンタゴニストと併用され得る。エストロゲンアゴニスト/アンタゴニストという用語は、エストロゲン受容体と結合し、骨代謝回転を阻害し、骨減少を妨げる化合物を指す。特に、エストロゲンアゴニストは、本明細書では、哺乳動物組織においてエストロゲン受容体部位に結合し、1つまたは複数の組織においてエストロゲンの作用を模倣し得る化合物と定義する。エストロゲンアンタゴニストは、本明細書では、哺乳動物組織においてエストロゲン受容体部位に結合し、1つまたは複数の組織においてエストロゲンの作用を遮断し得る化合物と定義する。様々なこれらの化合物を以下に記載して言及するが、他のエストロゲンアゴニスト/アンタゴニストも当業者に周知であると考えられる。例示的なエストロゲンアゴニスト/アンタゴニストには、ドロロキシフェンおよび関連化合物(米国特許第5,047,431号を参照されたい)、タモキシフェンおよび関連化合物(米国特許第4,536,516号を参照されたい)、4-ヒドロキシタモキシフェン(米国特許第4,623,660号を参照されたい)、ラロキシフェンおよび関連化合物(4米国特許第4,418,068号を参照されたい)、ならびにイドキシフェンおよび関連化合物(米国特許第4,839,155号を参照されたい)が含まれる。
【００３２】
発明の詳細な説明：
I. 概要：
本発明は、シスチンノットファミリーのタンパク質、特に8員環ダンサブファミリーシスチンノットタンパク質(スクレロスチンなど)が、骨/軟骨形態形成活性を有する特定のBMP(骨形成タンパク質)ファミリータンパク質と結合し、その機能に拮抗するという知見に一部基づく。そのようなBMPタンパク質の典型的なメンバーを、以下に規定する。例えば骨粗鬆症、特に閉経後の女性に見られる骨粗鬆症のような、骨密度の過剰な減少を特徴とする病態を患っている患者など、これらのBMPタンパク質の活性を必要とする患者では、少なくとも1つのBMPを投与することが、そのような病態の治療に有利であると考えられる。しかし、BMPは、骨形態形成とは関係のない他の活性を有することが知られている。例えば、BMP-2は、神経分化(White et al., Neuron 29: 57-71, 2001)および関節周囲の骨化(Reddi Nature Biotech. 16: 247-252, 1998)に影響を及ぼし、かつ特定の細胞においてアポトーシスを誘導すること(Hallahan, Nature Med. 9: 1033-1038, 2003)が知られており：BMP-6は乾癬と関連があり(Blessing et al., J. Cell Biol. 135: 227-239, 1996)；TGF-βは瘢痕および線維症と関連がある(Lawrence, Eur. Cytokine Network 7: 363-374, 1996)。したがって、BMPまたはその類似体/アゴニストの全身投与は骨減少の治療に有益であると考えられるが、いくらかの望ましくない副作用を生じ得る。一方、スクレロスチンなどのシスチンノットタンパク質は、BMPの天然アンタゴニストである。スクレロスチンタンパク質の減少により、骨密度の増加‐骨密度の増加を必要とする患者における望ましい状態をもたらすことが実証されている。
【００３３】
したがって、理想的にはBMP活性をもたないが、スクレロスチンなどのシスチンノットタンパク質と結合し得る/シスチンノットタンパク質に拮抗し得るBMP類似体をこれらの患者に投与することができる。BMP類似体は、BMP活性をもたないため、患者において望ましくない副作用を誘導することがないと考えられる。一方、BMP類似体はシスチンノットタンパク質と結合し、BMPに対するその阻害機能に拮抗し、それによって内因性BMP活性を抑制解除して、そのような患者において骨密度の増加およびBMP活性の望ましい増加をもたらし得る。そのため、本発明のBMP類似体はまた、TGF抑制解除因子とも称される。
【００３４】
スクレロスチン、ダン、ケルベロス、グレムリン、およびカロンテを含むシスチンノットファミリーのタンパク質は、C末端にシスチンノットモチーフ(残基80位〜167位)を含む分泌性糖タンパク質の比較的大きなファミリーである。これらのタンパク質は、それらの標的であるBMPタンパク質と非常に類似した3次元折りたたみを共有する。異なるシスチンノットタンパク質は、TGF-βスーパーファミリータンパク質に対してわずかに異なる阻害範囲を有する。この関連で、本発明の各TGF抑制解除因子は、いくつかのシスチンノットタンパク質と選択的に結合し、その機能を抑制解除し得る。これらのTGF抑制解除因子は、理想的には野生型TGF-β受容体自体を介してシグナル伝達することができないが、TGF-βスーパーファミリータンパク質のシスチンノット抑制因子と結合し得る/シスチンノット抑制因子に拮抗し得る。
【００３５】
1つの態様において、本発明のTGF抑制解除因子は、I型受容体に対するBMPの結合親和性を実質的に減少させるが、シスチンノットファミリータンパク質に対する同様の全結合親和性を実質的に維持する変異を有するBMP類似体である。
【００３６】
シスチンノットファミリータンパク質ノギンと複合体を形成したBMP-7の結晶構造が、Groppe et al.(Nature 420(6916): 636-42, 2002)によって解明された。その構造から、ノギンが、I型およびII型受容体に対する結合エピトープの分子界面を遮断することによってBMPシグナル伝達を阻害することが示され、ノギンがそのリガンドを不活性型複合体中に隔離することによって機能することが確認された。この研究において、ノギンと相互作用するBMP-7上の重要な残基が同定された。一方、Kirsch et al.(EMBO J. 19(13): 3314-24, 2000)は、多くのBMP-2変異体タンパク質を用いて、BMPR-IA(I型)およびBMPR-IIまたはActR-II(II型)に対するBMP-2の結合エピトープを特徴づけた。高親和性BMPR-IA結合に関する大きなエピトープ1が、BMP-2二量体の界面にまたがって検出された。BMPR-IIの低親和性結合に関する小さなエピトープ2は、1つの単量体の決定基によって構築されることが見出された。2つの隣接したエピトープの対称関係の対が、BMP-2極の近傍で生じる。両エピトープにおける変異により、生物活性の減少したBMP-2変種が得られた。BMP-BMP受容体(I型およびII型の両方)相互作用に関与する多くの重要な残基が、この研究において同定される。
【００３７】
BMPファミリータンパク質間の配列相同性を考えると、これらの知見から、BMP/TGF-βスーパーファミリーにおける受容体/アンタゴニスト認識およびBMP活性化/不活化の分子的説明に関する基本的な枠組みが提供される。例えば、多くの標準的な分子生物学的手段(DNAStarのMegaAlignなど)のいずれかを使用して、任意のBMPファミリーメンバーをBMP-2またはBMP-7と整列させて、BMP-2またはBMP-7の受容体結合または抑制因子結合に重要である残基に相当する残基を同定することができる。多くの標準的な分子モデリング手段のいずれかにより、さらなるまたは独立した検証を得ることができる。例えば、以下の項に説明するように、http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~3dpssm/(64)における3次元折りたたみ認識サーバーおよびICM Browser(Molsoft L.L.C.) http://www.molsoft.com/products/icm_browser.htmなどの標準的な手段を用いて、密接に関連するタンパク質の3次元構造を配列相同性に基づいて正確に予測することができる(図5を参照されたい)。そのような情報に基づき、受容体結合には重要であるがシスチンノットタンパク質との結合には重要でない残基を選択的に変異させ、候補TGF抑制解除因子を作製することができる。BMP受容体およびシスチンノット抑制因子に関するインビトロ結合アッセイなどの、インビトロおよび/またはインビボアッセイを用いて、BMP受容体結合の減少/除去およびシスチンノット抑制因子結合の不変/増強を確認することができる。
【００３８】
例えば図6および7では、BMP受容体結合は減少するが、シスチンノットタンパク質結合は実質的に影響されないTGF抑制解除因子を同定するために、スキャンニング突然変異誘発で標的化され得るBMPの領域を強調している。
【００３９】
または、本発明のTGF抑制解除因子は、当技術分野において認識されている多くの選択的結合スクリーニング(ファージディスプレイ、ツーハイブリッドアッセイなど)のいずれかと共に、ランダム突然変異誘発により作製され得る。簡潔に説明すると、当技術分野において認識されている方法のいずれかを用いて、標的BMPタンパク質のランダム突然変異誘発を行うことができる。次いで、変異体のプールを、シスチンノット抑制因子と結合する能力は保持するが、BMP受容体と結合する能力は失われたかまたは実質的に減少した変異体に関してスクリーニングし得る。さらに、インビトロおよび/またはインビボアッセイを使用して、選択されたTGF抑制解除因子が、BMP受容体を介してシグナル伝達する能力を大きく失っていることを確認し得る。上記の標的化突然変異誘発アプローチと比較して、ランダム突然変異誘発は、その称するところによれば直接的なBMP受容体またはBMP抑制因子結合に重要である領域の外側の変異を同定できる点で有利である。この偏りのないアプローチはまた、ハイスループットスクリーニングにおいて自動化または半自動化することも可能である。
【００４０】
いかにしてTGF抑制解除因子を得るかにかかわらず、好ましい態様においては、1つより多いBMP変異を導入して、BMP受容体結合を相乗的に減少させ、かつ理想的にはシスチンノット抑制因子結合を同時に増強し得る。
【００４１】
別の好ましい態様において、TGF抑制解除因子は、BMP I型受容体もしくはII型受容体またはその両方に対する結合が、少なくとも2、3、5、10、20、50、100、200、500、1000倍またはそれ以上減少している。
【００４２】
1つの好ましい態様において、TGF抑制解除因子は、シスチンノット抑制因子結合において50%、30%、20%、または10%以下の減少を有する。最も好ましくは、TGF抑制解除因子は、シスチンノット抑制因子結合が少なくとも約20%、40%、50%、75%、100%、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍またはそれ以上増加している。
【００４３】
1つの態様において、BMP受容体に対する結合の減少は、konの減少のみ、もしくはkoffの増加のみ、またはその両方の組み合わせによって達成される。
【００４４】
1つの態様において、シスチンノット抑制因子に対する結合の増加は、konの増加のみ、もしくはkoffの減少のみ、またはその両方の組み合わせによって達成される。
【００４５】
表面プラズモン共鳴を用いて、これらの反応速度パラメータを測定することができる。
【００４６】
別の態様において、本TGF抑制解除因子は、ホモ二量体を形成する能力を失ったBMP変異体である。そのような単量体は、シスチンノット抑制因子に対する結合親和性の大部分をなお維持し得るが、野生型BMP受容体自体を介してシグナル伝達することができない。
【００４７】
本発明はまた、本明細書に列挙する疾患または治療適応症を治療する試みにおいて有用な1つまたは複数の他の化合物と併用した、本TGF抑制解除因子製剤の使用も意図する。これらの併用において、治療剤と本発明のTGF抑制解除因子は、独立しておよび連続して投与され得るか、または同時に投与され得る。骨吸収を阻害する、骨粗鬆症を予防する、骨格破壊を減少させる、骨折治癒を増強する、骨形成を促進する、および骨ミネラル密度を増加させるための併用療法は、ビスフォスフォネートと本発明のTGF抑制解除因子の併用によって達成され得る。これらの有用性を有するビスフォスフォネートには、これらに限定されるわけではないが、アレンドロネート、チルドロネート、ジメチル-APD、リセドロネート、エチドロネート、YM-175、クロドロネート、パミドロネート、およびBM-210995(イバンドロネート)が含まれる。
【００４８】
本TGF抑制解除因子はまた、哺乳動物エストロゲンアゴニスト/アンタゴニストと併用され得る。エストロゲンアゴニスト/アンタゴニストという用語は、エストロゲン受容体と結合し、骨代謝回転を阻害し、骨減少を妨げる化合物を指す。特に、エストロゲンアゴニストは、本明細書では、哺乳動物組織においてエストロゲン受容体部位に結合し、1つまたは複数の組織においてエストロゲンの作用を模倣し得る化合物と定義する。エストロゲンアンタゴニストは、本明細書では、哺乳動物組織においてエストロゲン受容体部位に結合し、1つまたは複数の組織においてエストロゲンの作用を遮断し得る化合物と定義する。様々なこれらの化合物を以下に記載して言及するが、他のエストロゲンアゴニスト/アンタゴニストも当業者に周知であると考えられる。例示的なエストロゲンアゴニスト/アンタゴニストには、ドロロキシフェンおよび関連化合物(米国特許第5,047,431号を参照されたい)、タモキシフェンおよび関連化合物(米国特許第4,536,516号を参照されたい)、4-ヒドロキシタモキシフェン(米国特許第4,623,660号を参照されたい)、ラロキシフェンおよび関連化合物(4米国特許第4,418,068号を参照されたい)、ならびにイドキシフェンおよび関連化合物(米国特許第4,839,155号を参照されたい)が含まれる。
【００４９】
II. 定義
本明細書で使用する用語は一般に、本発明の状況および各用語が用いられる特定の状況における、当技術分野での通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらの作製および使用方法の記載に際して、実施者にさらなる手引きが提供されるように、特定の用語を以下または本明細書の他所で考察する。用語のいかなる使用の範囲および意味も、その用語が用いられる特定の状況から明らかになると考えられる。
【００５０】
「約」および「およそ」は一般に、測定の性質または精度を前提として測定された量の許容可能な誤差の程度を意味するものとする。典型的には、例示的な誤差の程度は、所与の値または値域の20パーセント(%)以内、好ましくは10%以内、より好ましくは5%以内である。
【００５１】
または、特に生物系においては、「約」および「およそ」という用語は、所与の値の1オーダー以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内の値を意味し得る。本明細書で示す数量は、特記されない限り近似値であり、明確に記載されない場合でも、「約」または「およそ」という用語が推測され得ることを意味する。
【００５２】
本明細書で使用する「BMP」または「骨形成タンパク質」には、TGF-βスーパーファミリータンパク質のBMPサブファミリーが含まれる。今日までに、30を超えるBMPが同定されている(総説に関しては、Ducy and Karsenty, Kidny Int. 2000 Jun;57(6);2207-14を参照されたい)。分泌性分子のこのサブファミリーのメンバーは個別に、BMP、骨形成タンパク質(OP)、軟骨由来形態形成タンパク質(CDMP)、または増殖分化因子(GDF)と称される。これらは、構造類似性に従っていくつかの亜群に分類されている。BMPには、これらに限定されるわけではないが、以下のものが含まれる：BMP-2(-2A)、BMP-3、BMP-3B(GDF-10)、BMP-4(-2B)、BMP-5、BMP-6、BMP-7(OP-1)、BMP-8(OP-2)、BMP-9(GDF-2)、BMP-10、BMP-11(GDF-11)、BMP-12(GDF-7)、BMP-13(GDF-6)、PC8(OP-3)、DPP、60A、Vg1、Vgr-1、ユニビン(Univin)、GDF-5、GDF-3、GDF-1など、および様々な種におけるそれらの相同体(図8を参照されたい)。BMPには、ヒトOP-1のC末端102アミノ酸と少なくとも55%、60%、65%、70%、80%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性、または少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列類似性/相同性を共有する、天然のまたは人工的な任意の誘導体もまた含まれる。
【００５３】
BMP機能には、少なくとも異所性骨形成アッセイ(骨結節形成アッセイなど)における骨/軟骨形成、細胞増殖および分化；アポトーシス；形態形成；骨格を含む種々の器官のパターン形成；ならびに器官形成が含まれる(Graff JM, Cell 89: 171-174, 1997；Ebendal et al., J Neurosci Res 51: 139-146, 1998；Wozney, Eur J Oral Sci 106: 160-166, 1998)。
【００５４】
様々な文法形態の、本発明の「シスチンノットタンパク質」または「BMP阻害因子/抑制因子/アンタゴニスト」には、保存されたC末端8員環、9員環、または10員環構造(シスチンノット)を有して、BMPに結合し、それらがBMP受容体(I型もしくはII型または両方)に結合するのを妨げることによって、上記の少なくとも1つのBMPタンパク質の機能を阻害するタンパク質のファミリーが含まれる。ヒトおよび他の選択された動物におけるシスチンノットタンパク質の代表的なメンバーは、以下に詳述する。
【００５５】
本発明の「TGF抑制解除因子」には、BMP受容体(おそらく両方の受容体の型)の少なくとも1つの型と結合する能力が損なわれているかまたは減少しているが、シスチンノットタンパク質と結合する能力は実質的に保持するBMP類似体または変異体が含まれる。特定の態様において、本発明のTGF抑制解除因子は、シスチンノットタンパク質と結合する能力には実質的に影響しない、BMP受容体結合ドメイン内の変異を含む。
【００５６】
本発明の方法は、野生型配列から1つまたは複数の変異体/配列変種を含む、配列を相互に比較する段階を含み得る。そのような比較は典型的に、例えば当技術分野において周知である配列アライメントプログラムおよび/またはアルゴリズム(2〜3例を挙げると、例えば、BLAST、FASTA、およびMEGALIGN)を用いた、ポリマー配列のアライメントを含む。変異が残基の挿入または欠失を含むそのようなアライメントにおいて、配列アライメントは、挿入または欠失残基を含まないポリマー配列に「ギャップ」(典型的には、ダッシュ記号または「A」で表される)を導入することを当業者は容易に理解し得る。
【００５７】
「骨疾患」という用語は、健康または骨の完全性の喪失を招くかまたはそれらを特徴とし、骨密度、骨の成長および/または形成の好ましくないまたは望ましくない増減を含む、任意の骨疾患、骨障害、または骨状態を指す。骨疾患には、これらに限定されないが、骨粗鬆症、骨減少症、骨形成または骨吸収不全、パジェット病、骨折(fructure)および骨折(broken bone)、骨転移、大理石骨病、骨硬化症、および骨軟骨症が含まれる。β-アドレナリン拮抗薬を組み入れた薬物複合体の場合、本発明に従って治療および/または予防し得る例示的な骨疾患には、骨粗鬆症、骨減少症、およびパジェット病などの、対応する非疾患骨の骨量に対する骨量の減少を特徴とする骨疾患が含まれる。β-アドレナリン作用薬を組み入れた薬物複合体は、大理石骨病、骨硬化症、および骨軟骨症をはじめとする、対応する非疾患骨の骨量に対する骨量の増加を特徴とする骨疾患を治療するために使用し得る。
【００５８】
「相同的」という用語は、その文法形態および綴りの変化形のすべてにおいて、同じ生物種のスーパーファミリーに由来するタンパク質、ならびに異なる生物種に由来する相同タンパク質を含む、「共通の進化の起源」を有する2つのタンパク質間の関係を指す。このようなタンパク質(およびそれらをコードする核酸)は、パーセント同一性の点からであろうと、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであろうと、それらの配列類似性に反映される配列相同性を有する。
【００５９】
「配列類似性」という用語は、その文法形態のすべてにおいて、共通の進化の起源を共有する可能性があるかまたはない核酸またはアミノ酸配列間の類似または一致の程度を指す。
【００６０】
しかし、一般的な使用および本出願において、「相同的」という用語は、「高度に」などの副詞で修飾される場合には、配列類似性を指し得り、共通の進化の起源と関連する場合もあればそうでない場合もある。
【００６１】
温度および溶液イオン強度の適切な条件下で一本鎖形態の核酸分子が他の核酸分子にアニールし得る場合に、核酸分子はcDNA、ゲノムDNA、またはRNAなどの別の核酸分子に「ハイブリダイズし得る」(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい)。温度およびイオン強度の条件によって、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。相同核酸の予備スクリーニングには、55℃のTm(融解温度)に相当する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば5×SSC、0.1% SDS、0.25%乳、およびホルムアミドなし；または30%ホルムアミド、5×SSC、0.5% SDSを使用することができる。
【００６２】
中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いTmに相当し、例えば5×または6×SSCを伴う40%ホルムアミドである。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最も高いTmに相当し、例えば50%ホルムアミド、5×または6×SSCである。SSCは、0.15 M NaCl、0.015M Na-クエン酸である。
【００６３】
「高ストリンジェント条件」は、構造的に関連のある核酸のハイブリダイゼーションを可能にするが、構造的に似ていない核酸のハイブリダイゼーションは可能にしないハイブリダイゼーションの条件を包含することが、当技術分野において十分に理解される。「ストリンジェント」という用語は、高度に相補的な核酸のみのアニーリングを可能にする任意の多くの選択的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のいずれかを説明するための、当業者によって理解される専門用語である。
【００６４】
例示的な高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、約1 M塩中で形成されるDNA二本鎖の融解温度(Tm)よりも約20℃〜27℃低いTmに相当する。多くの等価な手法が存在し、いくつかの一般的な分子クローニング手引き書が、ストリンジェントハイブリダイゼーションの適切な条件について記載しており、さらに、これらの条件下で安定であると予測されるハイブリッドの長さを計算するための式を提供している(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 6もしくは13.6.6；またはSambrook, et al. (1989) Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Harbor Pressの9.47-9.57ページを参照されたい)。
【００６５】
ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当技術分野において周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのTm値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性(より高いTmに対応する)は、以下の順に低下する：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。100ヌクレオチド長を超えるハイブリッドに関して、Tmを算出するための式が導かれている(Sambrook et al.、前記、9.51を参照されたい)。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さによってその特異性が規定される(Sambrook et al.、前記、11.8を参照されたい）。ハイブリダイズし得る核酸の最小長は、少なくとも約10ヌクレオチド；好ましくは少なくとも約15ヌクレオチドであり；より好ましくは、その長さは少なくとも約20ヌクレオチドである。
【００６６】
特記しない限り、「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は約55℃のTmを指し、上記の条件を利用する。好ましい態様において、Tmは60℃；より好ましい態様において、Tmは65℃である。特定の態様において、「高ストリンジェンシー」とは、0.2×SSCにおける68℃での、50%ホルムアミド、4×SSCにおける42℃での、またはこれら2つのいずれかの条件下で見られるハイブリダイゼーションレベルと同等のレベルを与える条件下でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件を指す。
【００６７】
オリゴヌクレオチド(例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー)の適切なハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドの低い融解温度が理由で、典型的に全長核酸(例えば、全長cDNA)の条件とは若干異なる。オリゴヌクレオチドの融解温度は関連するオリゴヌクレオチド配列の長さに依存するため、適切なハイブリダイゼーション温度は用いるオリゴヌクレオチド分子に依存して変動することになる。例示的な温度は、37℃(14塩基オリゴヌクレオチドに対して)、48℃(17塩基オリゴヌクレオチドに対して)、55℃(20塩基オリゴヌクレオチドに対して)、および60℃(23塩基オリゴヌクレオチドに対して)であってよい。オリゴヌクレオチドの例示的な適切なハイブリダイゼーション条件には、6×SSC、0.05%ピロリン酸ナトリウム中での洗浄、または同等のハイブリダイゼーションレベルを与える他の条件が含まれる。
【００６８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、「ペプチド結合」と称する化学結合によって結合されたアミノ酸鎖を説明するために互換的に使用される。酵素を含むタンパク質またはポリペプチドは、天然で生じたことを意味する「天然型」または「野生型」であってよく；もしくは天然タンパク質または別の変異体から作製、改変、導出されるか、またはそれらと何らかの方法で異なるかもしくは変化していることを意味する、「変異体」、「変種」、または「改変体」であってよい。
【００６９】
「抗体」および「抗体剤」という用語は本明細書において互換的に使用され、液性応答のインビトロまたはインビボ生成によって得られる免疫グロブリン分子を指し、これにはポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が含まれる。この用語には、キメラ抗体(例えば、ヒト化マウス抗体)、ヘテロ結合抗体(例えば、二重特異性抗体)、および組換え一本鎖Fv断片(scFv)のような、遺伝子操作された形態もまた含まれる。「抗体」という用語には、抗体の抗原結合形態(例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG、および反転IgG)もまた含まれる。ALK7エピトープと免疫学的に反応する抗体は、インビボにおいて、または組換え法(ファージまたは類似のベクター中の組換え抗体ライブラリーの選択など)によって作製することができる。例えば、Hase et al. (1989) Science 246:1275-1281；およびWard et al. (1989) Nature 341:544-546；およびVaughan et al. (1996) Nature Biotechnology, 14:309-314を参照されたい。
【００７０】
「抗原結合断片」という用語には、標的エピトープに結合する抗体の任意の部分が含まれる。抗原結合断片は、例えば、CDR3領域を含むポリペプチド、またはミオスタチンエピトープの親和性および特異性を保持する免疫グロブリン分子の他の断片であってよい。
【００７１】
「特異的に結合する」には、標的分子を欠く組成物に対する、特定の標的分子(すなわち、「結合パートナー」または「結合部分」)との全体または一部における、リガンドの優先的な会合への参照が含まれる。当然のことながら、本ミオスタチン中和抗体と他のタンパク質との間には、ある程度の非特異的相互作用が生じ得ることが認識される。それにもかかわらず、特定の結合は、ミオスタチンタンパク質の特異的な認識を介して媒介されるとして区別され得る。典型的には、特異的な結合は、抗体と他のタンパク質との間よりも抗体と標的タンパク質との間ではるかに強い会合を生じる。このような条件下における標的に対する抗体による特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とする。その同種の一価抗原に対する抗体結合部位の親和定数(Kdの対語として、Ka)は、少なくとも107、通常は少なくとも108、好ましくは少なくとも109、より好ましくは少なくとも1010、および最も好ましくは少なくとも1011 Mである。標的と特異的に反応する抗体を選択するには、種々の免疫測定形式が適している。例えば、タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を選択するには、固相ELISA免疫測定法が日常的に使用される。特異的反応性を決定するために使用され得る免疫測定法の形式および条件の記載については、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい。
【００７２】
競合結合形式の免疫測定法を用いて、例えば被験抗体が標的中和抗体であるかどうかを同定するために、抗体と標的との交差反応性を決定することができる。例えば、標的タンパク質またはそのエピトープを固体支持体に固定化する。被験抗体をアッセイに添加して、固定化抗原に対する標的の結合と競合させる。被験抗体が、固定化抗原に対する標的の結合と競合する能力を比較する。
【００７３】
同様に、競合結合形式の免疫測定法を用いて、例えば標的中和抗体の特異性を決定するために、交差反応性を決定することができる。例えば、標的タンパク質またはそのエピトープを固体支持体に固定化する。他のタンパク質(GDF11またはミオスタチンと配列相同性を有する他のタンパク質など)のエピトープをアッセイに添加して、固定化抗原に対する潜在的標的中和抗体の結合と競合させる。被験ペプチドが、潜在的標的中和抗体の固定化抗原との結合と競合する能力を比較する。標準的な計算により、他の抗原に対する潜在的標的中和抗体のパーセント交差反応性を計算する。
【００７４】
III. シスチンノット含有BMPアンタゴニスト
多様な生物から完成したゲノム配列が入手できるため、BMPアンタゴニストの進化に関するバイオインフォマティクス解析が可能となり、またそれらの分類が促進される。常用の発現アルゴリズム(http://BioRegEx.stanford.edu)を用いて、ヒトゲノムを包括的に探索することにより、全てのシスチンノット含有BMPアンタゴニストが同定された。シスチン環の大きさに基づいて、これらのタンパク質は3つのサブファミリーに分類された：CAN(キャン)(8員環)、ねじれた原腸形成(twisted gastrulation)(9員環)、ならびにコーディンおよびノギン(10員環)。キャンファミリーは、さらなるシステイン残基の保存された配置に基づいて4つの亜群にさらに分類され得る‐グレムリンおよびPRDC、ケルベロスおよびココ(coco)、およびダン、ならびにUSAG-1およびスクレロスチン。いくつかのモデル生物のゲノムにおけるこれらのヒトBMPアンタゴニストのオルソログもまた同定されており、それらの系統学的関係が解析されている。既知遺伝子のオルソロガスな関係が実証されると共に、新規なヒトパラログも同定された。
【００７５】
独特な機能的モチーフの形成およびタンパク質折りたたみには、タンパク質内のシステイン残基の対によって形成されるジスルフィド結合が必須である。4つの半シスチン残基(システインの酸化型)が2つの鎖内ジスルフィド結合を形成し、最初に哺乳動物エンドセリンおよび昆虫由来神経毒で同定されたシスチン環モチーフを形成するための独特の骨格を表す(1、2)。この環構造は、システイン残基の第3の対の関与を特徴とするシスチンノットスーパーファミリーを含む、タンパク質の多様なファミリーで保存されている(3)。シスチンノットタンパク質では、環を縫って通る第3のジスルフィド結合が特徴的なノットモチーフを形成するように、ジスルフィド結合が配置され(4)、これらのタンパク質の構造を非常に安定なものにしている。シスチンノットを有するタンパク質は多くの関連のない種に存在するため、この構造的折りたたみが、収束進化の結果として何度も出現したと仮定されている(5)。シスチンノットモチーフを有するタンパク質は通常、細胞によって分泌され、多細胞後生動物における細胞外シグナル伝達において重要な役割を果たす。シスチンノット含有リガンドに加えて、それらには、イオンチャネル遮断薬、溶血剤、ならびに抗ウイルスおよび抗菌活性を有する分子もまた含まれる(4、6)。
【００７６】
シスチンノットスーパーファミリーのリガンドは、胚発生、器官形成、ならびに組織の再構築および修復に関与する多くのホモ二量体およびヘテロ二量体タンパク質を含む。このスーパーファミリーには、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-β、増殖分化因子(GDF)、骨形成タンパク質(BMP)、BMPアンタゴニスト、ゴナドトロピン、および血小板由来増殖因子(PDGF)が含まれる(7)。正常な細胞機能の制御に加えて、多くのシスチンノット含有タンパク質は、腫瘍形成にも関連づけられている(8〜10)。
【００７７】
BMPタンパク質は脱ミネラル化骨のタンパク質抽出物中に初めて同定され(11)、身体のパターン形成および形態形成に関与する(8)。脊椎動物BMPおよびそれらのハエオルソログであるデカペンタプレジック(DPP)によって媒介される発生上のシグナル伝達経路は、動物進化において高度に保存されている。この経路は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における初期胚の背側-腹側パターン形成に必要であり(8)、BMPファミリー遺伝子は進化過程において拡大を起こし、ヒトにおいて複数のパラログの生成をもたらした(8)。いくつかのBMPパラログは、多様な組織の増殖および分化における役割に基づいてGDFと命名された(8、12、13)。脊椎動物BMPおよびGDF遺伝子の機能喪失または機能獲得変異は、様々な発生上の欠陥を示す(8)。BMPタンパク質の中で、BMP7の3次元構造が解明されている(図1A)(14)。
【００７８】
BMPリガンドおよびそれらの細胞表面受容体の組織特異的発現に加えて、BMPシグナル伝達の重要な制御段階は、特定のBMPアンタゴニストによる調節である。BMPアンタゴニストのいくつかの群が、直接的結合を介してBMPタンパク質の作用を遮断する能力に基づいて同定された(15、16)。これらのアンタゴニストには、キャンファミリーのタンパク質(15、17、18)、ねじれた原腸形成タンパク質(19、20)、コーディンおよびベントロプチン(ventroptin)を含むコーディンファミリー(21、22)、ならびにノギン(22〜25)が含まれる。特に興味深いことには、これらのBMPアンタゴニストは、シスチンノット構造の形成と一致するシステイン配置を有し、シスチンノットタンパク質のサブファミリーを表す。無脊椎動物にBMPアンタゴニストのオルソログはほとんど存在せず、BMPアンタゴニスト亜群は、脊椎動物進化の過程で主要な拡大を起こした(7)。
【００７９】
近年、複数の脊椎動物(26、27)およびホヤ(カタユウレイボヤ(Ciona intestinalis))(28)からゲノム配列が入手できるようになり、それらの独特なシステイン配置に基づき、GenBankでBMPアンタゴニストのバイオインフォマティクス検索を行う機会が提供される。様々なヒトBMPアンタゴニストの系統学的関係に基づき、これらのタンパク質は、シスチン環の既知のまたは予測される大きさに基づいて3つのサブファミリーに分類され、よって多様な種に由来するこれらのタンパク質の進化的関係に基づいた分類が統一される。
【００８０】
特に関心が高いのは、8員環BMPアンタゴニストのキャンファミリーであり、そのオルソログがモデル生物で同定され、それらのシスチンノットモチーフの3次元折りたたみが予測されている。BMP7(図1A)および他の8員環シスチンノットタンパク質に関して示されるように、シスチンノットを形成するシステイン残基は1から6まで番号づけられている。システイン残基2、3、5、および6が環を形成し、システイン残基1および4がノットを形成する。シスチン環の大きさは、システイン残基2と3(図1においてC2およびC3と表記)およびシステイン残基5と6(図1においてC5およびC6と表記)の間の間隔によって決まる(同様に表1の灰色の残基も参照されたい)。8員環シスチンノットにおけるこの保存されたシステイン配置に基づき、シスチンノットモチーフにより全タンパク質のヒトプロテオームデータベースが検索された(図2)。既知タンパク質に加えて、8員環シスチンノットを含む仮定上のタンパク質および未知タンパク質が同定され選択された。他の種に由来するオルソログにおいて保存されていない複数のシステイン残基を有するタンパク質はすべて排除された。仮定上のタンパク質のうち、2つの新規な潜在的ヒトBMPアンタゴニストが同定された。1つめは、受容性ラット子宮内膜において優先的に発現するラットUSAG-1(32)のオルソログであることが判明し、2つめは、ツメガエルココ遺伝子(33)のオルソログであることが判明した。しかし、9員環および10員環シスチンノットタンパク質に関する同様の検索からは、ヒトプロテオームにおいて新規タンパク質は解明されなかった(図2)。検索された配列データはすべて、http://hormone.stanford.edu/BMP-antagonistsで閲覧することができる(参照により本明細書に組み入れられる)。
【００８１】
ヒトUSAG-1は染色体7p21に位置し、その新たに同定されたマウスオルソログと98%の相同性、およびラットUSAG-1と97%の相同性を共有する。最近、発生遺伝子の機能的スクリーニングに基づいて、USAG-1のオルソログがツメガエルで見出された(34)。EST検索に基づき、ヒトUSAG-1は広く発現されている(腎臓、皮膚、肝臓、乳腺、大動脈および静脈、胚組織など)。スクレロスチンをコードするSOSTは、USAG-1の最も近縁のヒトパラログである；これらの2つのタンパク質は、シスチンノットドメインでは64%の相同性を有し、全体で54%の相同性を共有する。ココは、ツメガエルで最近同定された、分泌性BMP阻害因子のキャンファミリーの新たなメンバーである(33)。1つの仮定上のヒトタンパク質(gi|22749329)はヒトココであると同定され、ツメガエルと同様に、ケルベロスと近縁関係にあった。
【００８２】
この検索から、ココと以前にマウスで同定されたダンテ(dante)(17)との間のオルソロガスな関係もまた明らかになった。マウスダンテ遺伝子は、予測されるマウスココの断片を表し、よって以下に示すように全長マウスココタンパク質の予測が可能になる。
【００８３】
すべての既知および潜在的BMPアンタゴニストの配列を整列させることにより、これらのタンパク質は、予測される構造およびシスチン環内のシステイン残基の間隔に基づいて3つのサブファミリーに分類される：8員環、9員環、および2つの種類の10員環モチーフ(表1、灰色の残基)。
【００８４】
1つめのサブファミリーは、8員環からなるシスチンノットを有するキャンファミリーである。これらのタンパク質は、BMP(図1、表1)および糖タンパク質ホルモンサブユニット(例えば、hCG-β)の環構造と類似した環構造を有するシスチンノットを有する。2つめのサブファミリーは、9員環を含むシスチンノットを形成し得るカルボキシ末端システイン配置を有するねじれた原腸形成タンパク質である(表1)。このシスチン環は、環の前半においてシステイン残基2番と3番の間にグリシン残基を有さないが(Cys2-X-X-X-Cys3)、環の後半においてさらなる残基を有する(Cys5-X-X-Cys6)。この配置により、環内に全部で9残基がもたらされる。3つめのサブファミリーは、10員環を有する2つの群のBMPアンタゴニストからなる。1つの群は、コーディンおよびそのハエオルソログSOGに加えて、ベントロプチン(Ventroptin)タンパク質を含むコーディンファミリーである。この群は、4つ(コーディン/SOGの場合)または3つ(ベントロプチンの場合)のシステインリッチドメインを有する。
【００８５】
各ドメインにおいてシステインの間隔および配置を解析することで、10員環を形成し得る保存された配置(同じタンパク質内の異なるドメイン間および2つのヒトパラログ間)が明らかになった(表1)。環の前半はさらなるシステイン残基を有し(Cys2-X-Cys-X-Cys3)、また後半はシステイン残基5と6の間に2残基を有する(Cys5-X-X-Cys6)。最後の群は、10員環を有するノギンタンパク質からなる(表1)。ノギンの3次元構造は既知である(24)。
【００８６】
ヒトにおける3つのBMPアンタゴニストサブファミリーの代表的なメンバーの系統学的解析(35)から(図3)、8員環キャン亜群が、9員環および10員環サブファミリーとよりも相互により近縁関係にあることが示される。9員環および10員環BMPアンタゴニストは、10員環タンパク質(ノギンおよびコーディン)が9員環サブファミリー(ねじれた原腸形成)とよりも相互により近縁である第2の分枝を形成する。この系統学的解析によって、BMPアンタゴニストがシスチンノットモチーフ内の環の大きさに基づいて3つのサブファミリーに分類されることがさらに支持される。
【００８７】
BMPアンタゴニストの8員環サブファミリーの共通構造‐キャンファミリー
ヒトキャンファミリータンパク質に加えて、多様な脊椎動物におけるそれらのオルソログがGenBank検索に基づいて同定された(図4A)。新たに同定された遺伝子にはすべて下線を引いてある。ヒトキャンファミリーの全メンバーおよびそれらのオルソログの配列比較から、共通のシステイン配置特性が明らかになった(図4A)。シスチンノットを形成する6つの保存されたシステイン残基に加えて、2つのさらなるシステイン残基(C')(図4Aおよび表1、黒い背景)が、それぞれシスチンノットモチーフのループ1およびループ2中に存在する。システイン残基のこの対は、ジスルフィド結合を形成し得る。
【００８８】
BMPアンタゴニストのキャンサブファミリーと既知のシスチンノット含有タンパク質との間のシステイン残基配置の比較により、キャンファミリータンパク質のシスチンノット折りたたみが予測され得る(図1B)(7)。BMP7と同様に、シスチンノットを形成するシステイン残基は1〜6として表記される。システイン残基2、3、5、および6は環を形成し、システイン残基1および4はノットを形成する。シスチンノットのループ内に位置するさらなるシステイン残基(C'と表記)は、さらなるサブユニット内ジスルフィド結合を形成すると予測される(図1B)。
【００８９】
キャンファミリーのいくつかのBMPアンタゴニストでは、さらなるシステイン残基、Cx(表1、図4A)が、Cys1と共にノットを形成するCys4の2残基上流の、シスチンノットの端部に存在する。このさらなるシステイン残基はホモ二量体の形成を可能にし得るが、スクレロスチンおよびUSAG-1には存在しない。一方、ダンタンパク質は、Cys6の2残基下流に別のシステインを有する(表1、図4A)。
【００９０】
BMPアンタゴニストのキャンサブファミリーのメンバーはすべて、ヒトおよびマウスにおいてシンテニー染色体領域に見出され得り、それらのオルソロガスな関係がさらに確認される(表2)。それらはすべて、カルボキシル末端にシスチンノットモチーフを有する保存されたタンパク質である(表3)(15、17、18、36〜40)。予測されるタンパク質は長さが異なるものの、それらはすべて分泌用のシグナルペプチドおよび推定上のN結合グリコシル化部位を有する(表3)。キャンファミリーのメンバーは、異なるBMPリガンドの活性と選択的に拮抗することによって、胚発生および器官発生を制御すると考えられている(15、41)(表4)。USAG-1と合わせて、全部で7つのキャンファミリーメンバーが存在する。
【００９１】
グレムリン/DRM/IHG-2
グレムリンは、ツメガエルの神経堤からBMPシグナル伝達のアンタゴニストとして初めて同定され(15、42)、他のBMPアンタゴニストと共に補足的様式で作用する、四肢発生の重要なBMP制御因子である(43)。グレムリンはBMP2/4に直接結合し、それらが受容体と相互作用するのを妨げる(表4)(44)。非分裂細胞および最終分化細胞(ニューロン、肺胞上皮細胞、および杯状細胞など)において、高レベルのグレムリン発現が認められた(18)。グレムリンはまた、mos形質転換細胞において下方制御される遺伝子として同定されたことから、DRM(v-mosによって下方制御される)としても知られる。グレムリンの別の名称は、腎臓の糸球体間質に由来するメサンギウム細胞におけるその発現が、周囲の高グルコース、機械的ひずみ、およびTGF-βによって誘導されるという理由で、IHG-2(高グルコース2で誘導される)である(45)。グレムリンは、糖尿病環境におけるメサンギウム細胞増殖および上皮間充織分化転換のモジュレーターであることが示唆された(46)。最近、糖尿病性腎症のいくつかのモデルにおいて、グレムリンの発現上昇が実証された。グレムリンは糸球体硬化症および尿細管間質性線維症の病態生理に関与し、進行性腎疾患の潜在的な治療標的を表す(47)。
ヒトグレムリン/DRM/IHG-2タンパク質(NCBI参照配列番号：NP_037504)：
2008509087.tif 000002
ヒトグレムリン/DRM/IHG-2 cDNA(NCBI参照配列番号：NM_013372)：
2008509087.tif 000003
2008509087.tif 000004
2008509087.tif 000005
2008509087.tif 000006
【００９２】
PRDC
ダンおよびケルベロス関連タンパク質(PRDC)は、マウスにおいて初めて記載され(48)、グレムリンと高い相同性を共有する。
ヒトPRDCタンパク質(NCBI参照配列番号：NP_071914)：
2008509087.tif 000007
ヒトPRDC cDNA(NCBI参照配列番号：NM_022469)：
2008509087.tif 000008
2008509087.tif 000009
2008509087.tif 000010
【００９３】
ケルベロス
この遺伝子は、前方内中胚葉において発現する(38、39、49)。ニワトリオルソログであるカロンテは、ニワトリ胚の左右非対称性に関与する(49)。ケルベロスは、細胞外間隙において多価増殖因子アンタゴニストとして機能し、BMP4、ノダル(nodal)、およびWntによるシグナル伝達を阻害する(50)。マウスケルベロスは、独立した部位を介してBMPタンパク質およびノダルに結合するが(39)、ツメガエルケルベロスはまたWntタンパク質にも結合し、それらの作用を阻害する(50)。ケルベロスは、躯幹構造を欠く異所性頭部を誘導する独特の特性を有する(39)。原腸形成期のケルベロスの発現は、内胚葉におけるノダル関連シグナルにより、およびシュペーマンオーガナイザー因子により活性化される(51)。
ヒトケルベロスタンパク質(NCBI参照配列番号：NP_005445)：
2008509087.tif 000011
ヒトケルベロスcDNA(NCBI参照配列番号：NM_005454)：
2008509087.tif 000012
【００９４】
ココ
ツメガエルにおける研究から、ココが、外胚葉においてBMPおよびTGF-βシグナルの遮断剤として機能し、神経の誘導が開始する前に細胞運命の特定化および応答能を制御することが示された。ココはまた、神経胚段階の胚において異所性頭部様構造を誘導し得る(33)。ココは、動物極・植物極勾配で母性発現し、その発現レベルは原腸形成後に急速に減少する、他の既知BMP阻害因子とは対照的に、ココは外胚葉において原腸形成期の終了時まで広く発現する(33)。
ヒトココタンパク質(NCBI参照配列番号：NP_689867)：
2008509087.tif 000013
ヒトココcDNA(NCBI参照配列番号：NM_152654)：
2008509087.tif 000014
【００９５】
ダン
NO3としても知られる(40、52、53)、神経芽細胞腫において逸脱した差次的スクリーニング選択遺伝子(ダン)は、キャンファミリーの設立メンバーである(15、40)。ダンはカエル胚アッセイにおいてGDF-5と相互作用し、ダンがBMPのGDF-5/6/7クラスによるシグナル伝達を制御することが示唆される(表4)(41)。ケルベロスと同様に、ダンは、ツメガエル動物極キャップアッセイにおいて、セメント腺、ならびに前方神経組織および内胚葉のマーカーを誘導し、BMPシグナル伝達の遮断におけるその役割が示唆される。ダンはまた、発生中の筋節においても発現する。形質転換細胞株においてダンを過剰発現させると、形質転換表現型が抑制され、細胞増殖が低下し、それによって細胞のS期への進入が遅延する(15、40、41、53、54)。ダンは、発生および細胞増殖の過程で調節的な役割を果たし得る。当初はヒト神経芽細胞腫の腫瘍抑制遺伝子として提唱されたが(55)、この可能性はその後排除された(56)。
ヒトダンタンパク質(NCBI参照配列番号：NP_005371)：
2008509087.tif 000015
ヒトダンcDNA(NCBI参照配列番号：NM_005380)：
2008509087.tif 000016
2008509087.tif 000017
2008509087.tif 000018
【００９６】
SOST
SOST遺伝子によってコードされるスクレロスチンは、破骨細胞由来分泌性BMPアンタゴニストである(57)。スクレロスチンは最初に硬結性骨化症の原因遺伝子として同定され(58)、脊椎動物種にわたって高度に保存されている(59)。スクレロスチンは、高親和性でBMP6およびBMP7に、ならびに低親和性でBMP2およびBMP4に結合し、BMP6およびBMP7活性の阻害をもたらす(57)。ヒトおよびマウスの長骨、軟骨、腎臓、肝臓、胎盤、および胎児皮膚において、高レベルのスクレロスチン発現が検出された(59)。スクレロスチンは骨再構築において重要な役割を果たし得り、骨吸収と骨付着を結びつける(57)。骨形成におけるその抑制的役割に基づき、SOSTは骨粗鬆症の治療戦略の開発において重要であると考えられる(58)。SOST遺伝子産物の機能の喪失は、硬結性骨化症、常染色体劣性遺伝疾患として知られる進行性骨過成長疾患を生じる(57)。いくつかのSOST配列を以下に記載する。
ヒトSOSTタンパク質(NCBI参照配列番号：NP_079513)：
2008509087.tif 000019
ヒトSOST cDNA(NCBI参照配列番号：NM_025237)：
2008509087.tif 000020
2008509087.tif 000021
マウスSOSTタンパク質(NCBI参照配列番号：NP_077769)：
2008509087.tif 000022
マウスSOST cDNA(NCBI参照配列番号：NM_024449)：
2008509087.tif 000023
2008509087.tif 000024
ラットSOSTタンパク質(NCBI参照配列番号：NP_085073)：
2008509087.tif 000025
ラットSOST cDNA(NCBI参照配列番号：NM_030584)：
2008509087.tif 000026
【００９７】
線虫(Caenorhabditis elegans)(17)およびカタユウレイボヤにおいて、グレムリンおよびPRDCの両方のオルソログとしてCeCan1(emb|Z74032.1|CEF35B12)が同定されたことから(表2)、キャンファミリーが古代起源のものであることが示唆される。表2に要約するように、グレムリンおよびPRDCは、ハエ以外の調べたモデル生物すべてにおいて見出され得る(ハエではダンオルソログのみが認められた(gi|24648796))。興味深いことに、遺伝子構造の解析から、オルソログであるグレムリンおよびPRDC遺伝子によってコードされるタンパク質はすべて、単一エキソンに由来することが示された(図4B)。シスチンノットドメインの5アミノ酸上流は、高度に保存された推定上のタンパク質分解部位(RKYまたはRRY)である(表3)。
【００９８】
ケルベロスおよびココのオルソログはニシツメガエル(Xenopus tropicalis)およびトラフグ(Fugu rubripes)において見出され得るが、無脊椎動物には存在しない(表2)。マウスダンテ(17)遺伝子は、マウスココオルソログの断片に相当する(図4A)。トラフグでは、ケルベロスおよびココの両方に対してオルソログが1つしか存在しない。ケルベロスおよびココのオルソログ遺伝子はすべて、2つのエキソンを有する；シスチンノットドメインの最初の8アミノ酸は第1エキソンの3'末端によってコードされ、モチーフの残りの部分は第2エキソンによってコードされる(図4B)。いくつかのオルソログでは、推定タンパク質切断部位が、シスチンノットドメインの先頭の上流に認められ得る(表3)。
【００９９】
ダンタンパク質は、線虫(Caenorhabditis elegans)以外のすべてのモデル生物で認められ得る(表3)。この遺伝子は、シスチンノットドメインをコードする3つのエキソンを有する(ハエ以外)(図4B)。ヒト、マウス、およびツメガエルオルソログがクローニングされており(15、40、60、61)、90%を超える同一性を共有する。ダンのカルボキシル末端プロリンリッチ領域は、タンパク質間相互作用に関与する可能性が考えられる。
【０１００】
USAG-1およびSOST遺伝子は、ハエおよび線虫には存在しない。トラフグおよびカタユウレイボヤでは、USAG-1およびSOSTの両方に対して単一のオルソログが見出された(表2)。USAG-1およびSOSTのオルソログ遺伝子はすべて、第2エキソンの6アミノ酸下流から始まるシスチンノットドメインをコードする2つのエキソンを有する(図4B)。
【０１０１】
これらのシスチンノット構造(表1)、全体的な配列類似性(図4A)、および保存されたエキソン-イントロン配置(図4B)に基づき、キャンファミリーは4つの亜群に分類される：1)グレムリンおよびPRDC；2) ケルベロスおよびココ；3) ダン；ならびにUSAG-1およびSOST。この細分化は、図4Cに示す系統樹と一致する。8員環BMPアンタゴニストの3次元構造。
【０１０２】
キャンファミリー遺伝子によって共有される相同性の領域は、TGF-βスーパーファミリーのメンバーに見出されるシスチンノットモチーフと酷似している。hCG-β構造の結晶解析から、このホルモンサブユニットが、示されるように6つのジスルフィド結合を有し；3つがシスチンノット構造を形成し、残りの3つがサブユニット内結合を形成することが示唆された(図5A)(62、63)。3次元構造予測サーバーhttp://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~3dpssm/(64)の支援によるBMPアンタゴニストのキャンファミリーとhCG-β(図5A)との相同性に基づき、キャンファミリーの3つの主要なメンバー、グレムリン、ダン、およびUSAG-1の構造が解析された(図5)。
【０１０３】
hCG-βと同様に、キャンファミリーのメンバーはすべて、ループ1と2の間でジスルフィド結合を形成して、その結果より安定でかつ密なシスチンノットを生じる可能性を有するさらなるシステイン残基を各ループ内に有する(図5B、C、およびD、2つのループ間の点線)。さらに、グレムリンは、シスチンノットの近傍に、ホモ二量体化の基礎となり得るさらなるシステイン残基を有する(図5B、矢印)。さらに、ダンは、さらなるサブユニット内ジスルフィド結合を形成するのに十分接近する2つのさらなるシステイン残基を有する(図5C、矢印)。一方、USAG-1はさらなるシステイン残基を有さず、そのためジスルフィド結合による共有結合二量体を形成する可能性は低い。スクレロスチンはUSAG-1の近縁パラログであり、組換えスクレロスチンタンパク質は単量体として分泌された(57)。これらのBMPアンタゴニストの翻訳後修飾を解明するには、さらなる研究が必要である。
【０１０４】
いくつかの脊椎動物および無脊椎動物に由来するゲノム配列の解析に基づき、BMPアンタゴニストの比較ゲノム学的見解が明らかになった。これらのシスチンノット含有タンパク質は、発生、器官形成、およびならびに組織の増殖および分化の過程において、重要な役割を果たす。上記のアプローチから、BMPのアンタゴニストの3つのサブファミリーおよび4つのキャン亜群の同定が可能になる。このファミリーの遺伝子のオルソロガスなおよびパラロガスな関係を解明することにより、これらのタンパク質に対して統一された命名および分類が可能になるばかりでなく、モデル生物を用いてそれらの機能を今後解析するための手がかりが提供される。比較ゲノム学的アプローチと併用した常用の発現解析から、公表されたおよび新たなゲノム配列においてシスチンノット含有遺伝子を調査するための有用なパラダイムが示される。
【０１０５】
IV. 抑制解除因子の作製
本発明のTGF抑制解除因子は、BMP受容体結合には重要であるが、シスチンノットタンパク質への結合には比較的重要ではない選択されたBMP残基の部位特異的突然変異誘発により、作製することができる。上記のように、BMPのこれらの残基は、シスチンノットタンパク質(例えば、ノギン)またはBMP受容体と複合体を形成したBMPの結晶構造の比較に基づいて、選択され得る。
【０１０６】
BMP-5およびBMP-6において改変し得る3つの領域の例を、図4および5に示す。改変し得る他の既知TGF-βファミリーメンバーを、図6のアライメントおよび以下の表に示す。図6のアライメントを用いて、抑制解除因子を作製するための、他のファミリーメンバーにおける改変に適した領域を推定することができる。例えば、BMP-2は、D30、W31、A34、H39、F49、P50、D53、S88、L100、およびE109からなる群より選択される1つまたは複数の残基において、改変することができる。変異は、例えば、D30A、W31A、A34D、H39D、F49A、P50A、D53A、S88A、L100A、およびE109Rからなる群より選択される1つまたは複数の変異であってよい。
【０１０７】
（表１）当技術分野において公知であるTGF-βスーパーファミリーメンバーの例
2008509087.tif 000027
2008509087.tif 000028
2008509087.tif 000029
【０１０８】
別の態様においては、選択されたBMPタンパク質のランダム突然変異誘発を用いて、BMPR結合は減少しているが、シスチンノット結合は実質的に変化していないかまたはさらには増加している変異体を同定することができる。このアプローチの利点は、事前に、どの残基がBMPR結合またはシスチンノット結合に重要であるかを予測する必要がない点である。
【０１０９】
具体的には、タンパク質をコードしている配列のインビトロ突然変異誘発または組み合わせ改変を用いる能力により、異なるリガンドに対する結合親和性についてスクリーニングされ得るタンパク質のライブラリーを作製することが可能になる。例えば、結合タンパク質をコードしているDNA配列中の1つまたは複数の部位において、1〜5個、5〜10個、または10個もしくはそれ以上のコドンの配列をランダム化し、発現構築物を作製してその発現構築物を単細胞微生物中に導入し、改変配列のライブラリーを構築することができる。次いで、コードされるポリペプチドの、1つまたは複数のリガンドに対する結合親和性について、ライブラリーをスクリーニングすることができる。次に、それらが導入される細胞と適合する最良の親和性配列を、所与のリガンドのリガンド結合ドメインとして使用し得る。リガンドは、内因性タンパク質に対するリガンドの結合レベルを決定するための所望の宿主細胞で評価され得る。改変されたリガンド結合ドメインに対するリガンド結合親和性と内因性タンパク質に対する親和性を比較して、そのようなそれぞれのリガンドについて結合プロファイルを決定することができる。次に、最良の結合プロファイルを有するリガンドを、リガンドとして使用し得る。前述の実施においては、非限定的な例として、ファージディスプレイ技術を用いることができる。
【０１１０】
例えば、米国特許第6,171,820号は、元の各コドン位置において、20の天然コードアミノ酸のそれぞれをコードする少なくとも1つの置換コドンが生成される、突然変異誘発された一連の子孫ポリヌクレオチドを、親鋳型ポリヌクレオチドから作製する迅速かつ容易な方法について記載している。したがって、この特許はまた、元の各アミノ酸位置において20の天然コードアミノ酸のそれぞれが存在する、突然変異誘発された一連の子孫ポリペプチドを、親鋳型ポリペプチドから作製する方法も提供する。提供される方法は、「部位飽和突然変異誘発」または単に「飽和突然変異誘発」と称され、上記の他の突然変異誘発工程と組み合わせて使用することができる。この方法は、最終的に選択されるTGF抑制解除因子が、BMP受容体結合の減少/除去と同時にシスチンノットタンパク質に対する結合の増加を含む所望の生物学的特性を示すように、それらを微調整/最適化するために適合化することができる。
【０１１１】
またはHatta et al.(Biopolymers 55(5):399-406, 2000)は、それぞれのBMPリガンドに結合し得ない変異体BMP受容体を同定するための一般的な図式について報告している。そのリガンド結合に関与するBMP I型受容体上のアミノ酸残基を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発によって、BMP IA型受容体の細胞外リガンド結合ドメイン(sBMPR-IA)の構造-活性関係が調べられた。変異体受容体ならびにsBMPR-IAは、大腸菌(Escherichia coli)においてチオレドキシンとの融合タンパク質として発現され、エンテロキナーゼによる切断後に逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を用いて精製された。CDによる溶液中の親タンパク質および代表的な変異体の構造解析から、それらの折りたたみ構造に検出可能な相違がないことが示された。表面プラズモン共鳴バイオセンサーにより、変異体のBMP-4に対する結合親和性が決定された。Y70Aを除く、試験されたすべての変異体受容体が、以下の減少する順位で、BMP-4に対する親和性の減少を示した：I52A(17倍)近似F75A(15倍)>>T64A(4倍)=T62A(4倍)近似E54A(3倍)。後者の3つの変異体について認められた結合親和性の減少は、主に会合速度定数の減少によるものであり、一方、会合および解離の両方に関する速度定数の変化は、前者2つの変異体に対して親和性の大幅な減少をもたらした。これらの結果から、sBMPR-IAが分子の凹面によってリガンドを認識することが示される。BMP IA型受容体の主要なリガンド結合部位は、ループ2中のPhe75、ならびに3本鎖βシート上のIle52、Glu54、Thr62、およびThr64からなる。この研究により、TGF-βスーパーファミリーにおけるリガンド/I型受容体認識の一般的な基礎が提供される。この研究から、BMP受容体結合の減少または排除をもたらすが、適切なリガンド折りたたみ構造、ひいてはSOSTのようなタンパク質への結合などの他のリガンド特性を維持する、対応するBMPリガンド(BMP受容体に対して)点変異を同定するための一般的図式もまた提供される。
【０１１２】
特定の態様において、本開示は、抑制解除因子型タンパク質を作製するための、c TGF-βスーパーファミリータンパク質配列の特定の変異を意図する。そのような変異は、図4および5に示すように、ポリペプチド内に新たなグリコシル化部位を生成し得る。そのような変異は、O結合またはN結合グリコシル化部位などの、1つまたは複数のグリコシル化部位を導入するように選択され得る。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は一般に、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列、アスパラギン-X-スレオニン(「X」は任意のアミノ酸)を含む。改変はまた、(O結合グリコシル化部位のための)野生型TGF-βスーパーファミリータンパク質の配列に対する、1つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加または置換によって作製され得る。哺乳動物、酵母、昆虫、および植物細胞はすべて、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るため、抑制解除因子タンパク質の配列は、必要に応じて、使用する発現系の種類に応じて調節し得る。
【０１１３】
V. TGF抑制解除因子の調製
本発明のTGF抑制解除因子は、標準的な分子生物学的技法を用いて組換えタンパク質として作製することができる。「組換えタンパク質」という用語は、組換えDNA技法によって生成される本発明のポリペプチドを指し、この技法では一般に、TGF抑制解除因子治療薬をコードするDNAを適切な発現ベクター内に挿入し、次いでそのベクターを用いて宿主細胞を形質転換して、異種タンパク質を産生させる。
【０１１４】
当技術分野において周知である組換え技法を用いて、標準的な生物学的技法により、または化学合成により、本発明のTGF抑制解除因子を生成することができる。例えば、本ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を指示する核酸ベクターをトランスフェクションした宿主細胞を適切な条件下で培養し、ペプチドを発現させることができる。組換えTGF抑制解除因子は分泌されて、細胞および培地の混合物から単離され得る。または、組換え遺伝子からシグナルペプチド配列を除去することによってタンパク質は細胞質に保持され得り、細胞を回収、溶解して、タンパク質を単離し得る。細胞培養物は、宿主細胞、培地、および他の副産物を含む。細胞培養に適した培地は、当技術分野において周知である。TGF抑制解除因子は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびそのようなペプチドに特異的な抗体による免疫アフィニティ精製を含む、タンパク質を精製するための当技術分野において公知である技法を用いて、細胞培養液、宿主細胞、またはその両方から単離することができる。
【０１１５】
TGF抑制解除因子に適した発現構築物は、タンパク質をコードする核酸を、原核細胞、真核細胞のいずれか、またはその両方における発現に適したベクターに連結することによって作製し得る。組換え型の本TGF抑制解除因子を産生させるための発現ベクターには、プラスミドまたは他のベクターが含まれる。例えば、TGF抑制解除因子の発現に適したベクターには、大腸菌などの原核細胞における発現用の以下の種類のプラスミドが含まれる： pBR322由来プラスミド、pEMBL由来プラスミド、pEX由来プラスミド、pBTac由来プラスミド、およびpUC由来プラスミド。
【０１１６】
酵母において組換えタンパク質を発現するための多くのベクターが存在する。例えば、YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2、およびYRP17は、遺伝子構築物を
S. セレビシエ(S. cerevisiae)に導入するのに有用なクローニングおよび発現媒体である(例えば、参照により本明細書に組み入れられるBroach et al. (1983) in Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye Academic Press, p. 83を参照されたい)。これらのベクターは、pBR322 oriの存在により大腸菌中で、および酵母2ミクロンプラスミドの複製決定因子によりS. セレビシエ中で複製し得る。さらに、アンピシリンなどの薬物耐性マーカーを使用することができる。
【０１１７】
好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を容易にするための原核生物配列、および真核細胞中で発現される1つまたは複数の真核生物転写単位の両方を含む。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo、およびpHyg由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。これらベクターのいくつかは、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、pBR322などの細菌プラスミドの配列を用いて修飾される。または、ウシパピローマウイルス(BPV-1)またはエプスタイン・バーウイルス(pHEBo、pREP由来、およびp205)などのウイルスの派生物を、真核細胞におけるタンパク質一過性発現に使用することができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換で用いられる様々な方法が、当技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方に適した他の発現系、ならびに一般的な組換え手順については、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Chapters 16 and 17を参照されたい。
【０１１８】
場合によっては、バキュロウイルス発現系を使用して、組換えTGF抑制解除因子を発現させることが望ましいと考えられる。そのようなバキュロウイルス発現系の例には、pVL由来ベクター(pVL1392、pVL1393、およびpVL941など）、pAcUW由来ベクター(pAcUW1など)、およびpBlueBac由来ベクター(β-gal含有pBlueBacIII)が含まれる。
【０１１９】
VI. TGF抑制解除因子の例示的な核酸組成物
本発明の別の局面は、宿主動物または培養細胞/組織において本TGF抑制解除因子単位を発現させるための発現ベクターを提供する。例えば、ポリペプチドTGF抑制解除因子をコードするヌクレオチド配列を含み、コード配列が少なくとも1つの転写制御配列に機能的に連結された発現ベクターが意図される。本ポリペプチドTGF抑制解除因子の発現を指示するための制御配列は、当技術分野において認識されており、多くの十分に理解されている基準によって選択される。例示的な制御配列は、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。例えば、これに機能的に連結された場合にDNA配列の発現を調節する多種多様な発現調節配列のいずれかを、これらのベクター中で使用して、本発明のポリペプチドTGF抑制解除因子をコードするDNA配列を発現させることができる。そのような有用な発現調節配列には、例えば、SV40の初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、lac系、trp系、TACまたはTRC系、発現がT7 RNAポリメラーゼにより指示されるT7プロモーター、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター(例えば、Pho5)、および酵母α-接合因子のプロモーター、および原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子発現を調節することが知られている他の配列、ならびにそれらの種々の組み合わせが含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換すべき標的宿主細胞の選択のような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、およびベクターによってコードされる抗生物質マーカーなどの任意の他のタンパク質の発現もまた考慮すべきである。
【０１２０】
明らかなように、本遺伝子構築物を使用して、培養において増殖させた細胞中で、本ポリペプチドTGF抑制解除因子の発現をもたらすこと(例えば、精製するための、ポリペプチドTGF抑制解除因子を含むタンパク質またはポリぺプチドを産生させること)ができる。
【０１２１】
本発明はまた、本ポリぺプチドの1つを発現させるために、組換え遺伝子をトランスフェクションした宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、本発明のポリペプチドは、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス)、酵母、または哺乳動物細胞において発現され得る。他の適切な宿主細胞は当業者に公知である。
【０１２２】
したがって、本発明はさらに、本ポリペプチドTGF抑制解除因子を産生する方法に関する。例えば、関心対象のタンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクションした宿主細胞を、タンパク質の発現を起こし得るのに適した条件下で培養し得る。タンパク質は、分泌シグナル配列を含めることによって分泌され、細胞およびタンパク質を含む培地の混合物から単離され得る。
【０１２３】
または、タンパク質は細胞質に保持され得り、細胞を回収、溶解して、タンパク質を単離し得る。細胞培養物は、宿主細胞、培地、および他の副産物を含む。
【０１２４】
細胞培養に適した培地は、当技術分野において周知である。タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびタンパク質の特定のエピトープに特異的な抗体による免疫アフィニティ精製をはじめとする、タンパク質を精製するための当技術分野において公知である技法を用いて、細胞培養液、宿主細胞、またはその両方から単離され得る。
【０１２５】
したがって、本発明のポリペプチドのコード配列を使用し、微生物または真核生物の細胞過程を介して、組換え型のタンパク質を産生させることができる。発現ベクターなどの遺伝子構築物へのポリヌクレオチド配列の連結、および真核生物(酵母、トリ、昆虫、または哺乳動物)または原核生物(細菌細胞)宿主への形質転換またはトランスフェクションは、標準的な手順である。
【０１２６】
組換えタンパク質を産生させるための発現媒体には、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、ポリペプチドTGF抑制解除因子の発現に適したベクターには、大腸菌などの原核細胞における発現用の以下の種類のプラスミドが含まれる：pBR322由来プラスミド、pEMBL由来プラスミド、pEX由来プラスミド、pBTac由来プラスミド、およびpUC由来プラスミド。詳細については上記を参照されたい。
【０１２７】
さらなる他の態様において、本発現構築物は、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスイウイルス-1を含むウイルスベクター、または組換え細菌プラスミドもしくは真核生物プラスミドに、本遺伝子を挿入することによって導出される。以下に詳述するように、本発現構築物のそのような態様は、様々なインビボおよびエクスビボ遺伝子治療手順における使用のために具体的に意図される。
【０１２８】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、一般に、外因性遺伝子をインビボで特にヒトに移入するために選択される組換え遺伝子送達系であると理解される。これらのベクターは細胞への遺伝子の効率的な送達を提供し、移入された核酸は宿主の染色体DNAに安定に組み込まれる。レトロウイルスの使用について主に必要なことは、それらの使用の安全性を、特に、細胞集団における野生型ウイルスの伝播の可能性に関して確実にすることである。複製欠損レトロウイルスのみを産生する特殊な細胞株(「パッケージング細胞」と称される)の開発により、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性が高まり、また欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的のための遺伝子移入における使用について十分に特徴づけられている(総説については、Miller, A.D. (1990) Blood 76:271を参照されたい)。したがって、レトロウイルスコード配列の一部(gag、pol、env)が、本発明のポリペプチドTGF抑制解除因子をコードする核酸によって置き換えられ、レトロウイルス複製欠損を付与する組換えレトロウイルスが構築され得る。次いで、複製欠損レトロウイルスをビリオンにパッケージングし、これを使用して、標準的な技法によりヘルパーウイルスを用いて標的細胞に感染させることができる。組換えレトロウイルスを作製するための手順、およびこのようなウイルスによりインビトロまたはインビボにおいて細胞を感染させるための手順は、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel，F.M. et al., (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9 9.14、および他の標準的な実験室手引書において見出され得る。適切なレトロウイルスの例には、当業者に周知であるpLJ、pZIP、pWE、およびpEMが含まれる。レトロウイルスは、インビトロおよび/またはインビボで、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多くの異なる細胞種に様々な遺伝子を導入するために使用されている(例えば、Eghits lo et al., (1985) Science 230:1395-1398；Danos and Mulligan, (1988) PNAS USA 85:64606464；Wilson et al., (1988) PNAS USA 85:3014-3018；Armentano et al., (1990) PNAS USA 87:6141-6145；Huber et al., (1991) PNAS USA 88:8039-8043；Ferry et al., (1991) PNAS USA 88:8377-8381；Chowdhury et al., (1991) Science 254:1082-1085；van Beusechem et al., (1992) PNAS USA 89:7640-7644；Kay et al., (1992) Human Gene Therapy 3:641-647；Dai et al., (1992) PNAS USA 89:10892-10895；Hwu et al., (1993) J. Immunol. 150:4104-4115；米国特許第4,868,116号；米国特許第4,980,286号；PCT出願WO 89/07136；PCT出願WO 89/02648；PCT出願WO 89/05345；およびPCT出願WO 92/07573を参照されたい）。
【０１２９】
さらに、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージングタンパク質を改変することによって、レトロウイルスおよびひいてはレトロウイルスに基づくベクターの感染範囲を制限することが可能であることが示されている(例えば、PCT出願WO 93/25234、WO 94/06920、およびWO 94/11524を参照されたい)。例えば、レトロウイルスベクターの感染範囲を変更するための戦略には、細胞表面抗原に特異的な抗体をウイルスenvタンパク質に結合する段階(Roux et al., (1989) PNAS USA 86:9079-9083；Julan et al., (1992) J. Gen Virol 73:3251-3255；およびGoud et al., (1983) Virology 163:251-254)、または細胞表面リガンドをウイルスenvタンパク質に結合する段階(Neda et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:14143-14146)が含まれる。
【０１３０】
本発明において有用な別のウイルス遺伝子送達系では、アデノウイルス由来ベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、関心対象の遺伝子産物をコードするが、通常の溶菌性ウイルス生活環において複製する能力に関して不活性であるように操作され得る(例えば、Berkner et al., (1988) Bio Techniques 6.616、Rosenfeld et al., (1991) Science 252: 431-434；およびRosenfeld et al., (1992) Cell  68: 155を参照されたい)。アデノウイルス株Ad 5型dl324またはアデノウイルスの他の株(例えば、Ad2、Ad3、Ad7など)に由来する適切なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、それらが非分裂細胞に感染し得ないという特定の状況において有利であり得り、気道上皮(前記で引用したRosenfeld et al., (1992)）、内皮細胞(Lemarchand et al., (1992) PNAS USA 89:6482-6486)、肝細胞(Herz and Gerard, (1993) PNAS USA 9 0:2812-2816)、および筋細胞(Quantin et al., (1992) PNAS USA 89:2581-2584)を含む多種多様な細胞種を感染させるために使用され得る。さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮を許容し、また上記のように感染性の範囲に影響を及ぼすように改変され得る。さらに、導入されたアデノウイルスDNA(およびそこに含まれる外来DNA)は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれずエピソームとして残存し、それによって、導入されたDNAが宿主ゲノム中に組み込まれる状況(例えば、レトロウイルスDNA)において、挿入突然変異誘発の結果として生じ得る潜在的な問題が回避される。さらに、外来DNAに対するアデノウイルスゲノムの保有能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい(最大8キロベース)(Berkner et al.、前記；HajAhmand and Graham (1986) J. Virol. 57:267)。現在使用され、それゆえ本発明にも好ましい大部分の複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスEtおよびE3遺伝子のすべてまたは一部が除去されているが、80%ものアデノウイルス遺伝子物質を保持している(例えば、Jones et al., (1979) Cell 16:683；Berkner et al.、前記；およびGraham et 2o al., in Methods in Molecular Biology, E.J. Murray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7. pp. 109-127を参照されたい)。挿入されたキメラ遺伝子の発現は、例えば、E1Aプロモーター、主要後期プロモーター(MLP)および関連のリーダー配列、ウイルスE3プロモーター、または外因的に付加されるプロモーター配列の調節下にあり得る。
【０１３１】
本キメラ遺伝子の送達に有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス(AAV)である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および生産的な生活環のために、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする、天然の欠損ウイルスである(総説に関しては、Muzyczka et al., Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129を参照されたい)。これはまた、非分裂細胞にそのDNAを組み込み得り、また高頻度の安定な組み込みを示す数少ないウイルスのうちの1つである(例えば、Flotte et al., (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356；Samulski et al., (1989) J. Virol. 63:3822-3828；およびMcLaughlin et al., (1989) J. Virol. 62:1963-1973を参照されたい)。300塩基対ほどの小ささのAAVを含有するベクターもパッケージングされ得り、組み込まれ得る。外因性DNAのためのスペースは、約4.5kbに制限される。
【０１３２】
Tratschin et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5:32513260に記載されているようなAAVベクターを用いて、DNAを細胞に導入することができる。AAVベクターを使用して、様々な核酸が異なる細胞種に導入されている(例えば、Hernio-nat et al., (1984) PNAS USA 81:6466-6470；Tratschin et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081；Wondisford et al., (1988) Mol. Endocrinol 2:32-39；Tratschin et al., (1984) J. Virol. 51:611-619；およびFlotte et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790を参照されたい)。
【０１３３】
AAVに基づくベクターは、BMP-2遺伝子治療(Chen et al., Gene therapy for new bone formation using adeno-associated viral bone morphogenetic protein-2 vectors. Gene Ther. 2003 Aug;10(16)1345-53)およびBMP-4遺伝子治療(Luk et al., Adeno-associated virus-mediated bone morphogenetic protein-4 gene therapy for in vivo bone formation. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Aug 29;308(3):636-45)における使用に成功している。
【０１３４】
遺伝子治療における用途を有し得る他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびいくつかのRNAウイルスから導出されている。特に、ヘルペスウイルスベクターは、中枢神経系および眼組織の細胞における組換え遺伝子の持続のための独特の戦略を提供し得る(Pepose et al., (1994) Invest Ophthalmol Vis Sci 35:2662-2666)。上記で説明したようなウイルス移入法に加えて、非ウイルス法を用いて、動物組織においてタンパク質発現をもたらすことも可能である。
【０１３５】
大部分の非ウイルス性遺伝子移入法は、高分子の取り込みおよび細胞内輸送のために、哺乳動物細胞が使用する通常の機構に依存している。好ましい態様において、本発明の非ウイルス性遺伝子送達系は、標的細胞による遺伝子の取り込みのために、エンドサイトーシス経路に依存する。この種類の例示的な遺伝子送達系には、リポソーム由来の系、ポリリジン複合体、および人工的ウイルスエンベロープが含まれる。
【０１３６】
臨床設定においては、多くの方法のいずれかにより遺伝子送達系を患者に導入することができるが、その方法はそれぞれ当技術分野において周知である。
【０１３７】
例えば、遺伝子送達系の薬学的調製物は、例えば静脈内注射によって全身に導入することができ、遺伝子送達媒体、遺伝子発現を調節する転写制御配列に起因する細胞型もしくは組織型発現、またはそれらの組み合わせによって提供されるトランスフェクションの特異性から、標的細胞における構築物の特異的な形質導入が優先的に起こる。他の態様において、組換え遺伝子の最初の送達は、動物への導入が非常に局所的であるために、より限定的である。例えば、遺伝子送達媒体は、カテーテルにより(米国特許第5,328,470号を参照されたい)または定位的注射により(例えば、Chen et al, (1994) PNAS USA 91: 3054-3057)導入され得る。
【０１３８】
VII. 例示的な薬学的調製物/製剤
特定の態様において、本発明のTGF抑制解除因子は、薬学的に許容される担体と共に治療剤として製剤化される。そのような治療剤は、単独で、または薬学的製剤(組成物)の成分として投与され得る。本組成物は、単独で、または他の化合物/薬学的組成物との同席療法の一部として使用することができる。
【０１３９】
長年にわたり、米国政府のFDAなどの規制健康機関は、薬学的組成物のヒトへの静脈内投与に対して、無菌性、非発熱性、および組成物の外来粒状物質の不在に関し、ますます厳しい基準を定めている。実際に、現在定められている基準は、実際にこれまで、複合型の、費用をかけた、かつ集中型の工場設備でのみ経済的に達成可能であるほど高レベルなものである。したがって、本発明の治療組成物を、ヒトおよび他の非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物に投与するためには、治療組成物は、好ましくは超高純度で発熱物質を含まない水を用いて、発熱物質を実質的に含まない薬学的組成物として調製されることが好ましい。本明細書で使用する「超高純度で発熱物質を含まない」水とは、少なくとも1千8百万オーム/cm(18 megオーム/cm)という比電気抵抗を有し、発熱物質を含まない水である。従来より、そのような純度の水は、混床式脱イオン化、およびそれに続く発熱物質を除去する蒸留によって生成されている。実際に、米国食品医薬品局(「FDA」)は、注射用水が蒸留または逆浸透によって精製された水であることを義務づけている。本明細書で使用する「注射用水」は、注射用水に対するFDAの純度要求を満たす水と定義する。しかし、蒸留は、非常にエネルギーを消費しかつ費用のかかる注射用水生成法である。米国特許第4,458,716号は、濾過、滅菌、および脱イオン化後に純オゾンで処理することによって、超高純度で発熱部質を含まない水を生成する方法を提供している。発熱物質を含まない水を生成する様々な他の方法は、米国特許第4,280,912号、第4,069,153号、および第4,230,571号に記載されている。
【０１４０】
本明細書で使用する「無菌の」および「滅菌した」とは、米国医師会の薬学および化学審議会(Council on Pharmacy and Chemistry)によって策定された古典的な定義によるものではなく、むしろ、静脈内投与可能な液体組成物に関して米国薬局方XIX(592ページ)によって規定される範囲内での、望ましくない微生物の不在(または死滅)を意味する。
【０１４１】
本明細書で使用する「発熱物質を含まない」という用語は、発熱物質を検出するための周知のリムルス試験において陰性反応を提供し、かつ米国薬局方、前記に記載される周知のウサギ試験の必要条件を満たす物質を意味する。
【０１４２】
米国特許第4,282,863号は、発熱物質を含まない静脈注射用溶液を得るための再構成に有用である、安定で、乾燥包装された、無菌の組成物として、静脈注射用組成物(タンパク質、ポリヌクレオチド、多糖などを含む)を調製および使用する方法について記載している。その全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４３】
化合物は、ヒトまたは動物薬で使用するために(例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびウマなどの家畜(live stock)、または例えばネコおよびイヌなどの家畜(domestic animal)を治療するため)、任意の簡便な方法で投与されるよう製剤化され得る。特定の態様において、薬学的調製物中に含まれる化合物は、それ自体で活性があってもよいし、またはプロドラッグであってもよい。「プロドラッグ」という用語は、生理的条件下で治療活性のある薬剤に変換される化合物を指す。例えば、TGF抑制解除因子は、無傷のプロドメインを伴う形態で送達され得る。
【０１４４】
本発明の方法はまた、再充電可能なまたは生分解性の装置により提供され得る。近年、様々な徐放性ポリマー装置が開発されており、タンパク質性生物薬剤を含む薬物の制御送達に関して、インビボで試験が行われている。生分解性および非分解性ポリマーの両方を含む様々な生体適合性ポリマー(ヒドロゲルを含む)を用いて、特定の標的部位において治療薬を持続放出するためのインプラントを形成することができる。
【０１４５】
本方法で使用するためのTGF抑制解除因子は、水、緩衝生理食塩水、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、またはそれらの適切な混合物などの生物学的に許容される媒体を用いて、投与用に簡便に製剤化され得る。選択された媒体中での有効成分の最適濃度は、医薬品化学者に周知の手順に従って、経験的に決定することができる。本明細書で用いる「生物学的に許容される媒体」には、薬学的調製物の所望の投与経路に適していると考えられるあらゆる溶媒、分散媒などが含まれる。薬学的に活性のある物質に対するそのような媒体の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒体または薬剤が本明細書に開示する治療薬の活性と適合しない場合を除き、本発明の薬学的調製物におけるその使用が意図される。適切な賦形剤および他のタンパク質を含めたそれらの製剤化は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA 1985)という本に記載されている。これらの賦形剤には、注射用「デポー(deposit)製剤」が含まれる。
【０１４６】
湿潤剤、乳化剤、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤に加え、着色剤、放出剤、被覆剤、甘味剤、香味剤および香料剤、保存剤および抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。
【０１４７】
TGF抑制解除因子治療薬の製剤には、経口/経鼻、局所、非経口、および/または膣内投与に適した製剤が含まれる。製剤は簡便に単位剤形で提供され得り、薬学の技術分野において周知である任意の方法によって調製され得る。単回剤形を生成するために担体材料と組み合わせることのできる有効成分の量は、治療を受ける宿主、特定の投与方法に応じて異なる。単回剤形を生成するために担体材料と組み合わせることのできる有効成分の量は、一般に、治療効果を生じる化合物の量である。
【０１４８】
これらの製剤または組成物を調製する方法は、TGF抑制解除因子治療薬および担体、ならびに任意に1つまたは複数の補助成分を混合する段階を含む。一般に、製剤は、液体担体もしくは微粒子化した固形担体、またはその両方を使用し、次いで必要に応じて産物を成形することで、調製され得る。
【０１４９】
経口投与用の製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤(香味基材、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントを使用)、粉末剤、顆粒剤の形態であってよく、あるいは水性液体もしくは非水液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型液体乳濁液として、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはパステル剤(ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基材を使用）として、および/または洗口剤などとして存在してもよく、それぞれ所定量のアルテミシニン関連化合物を有効成分として含む。アルテミシニン関連化合物はまた、巨丸剤、舐剤、またはペースト剤として投与され得る。
【０１５０】
経口投与用の固形剤形(カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣丸、粉末剤、顆粒剤など)においては、本発明の1つまたは複数のTGF抑制解除因子治療薬を、1つまたは複数の薬学的に許容される担体と混合し得、担体は、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および/または以下のうちのいずれかなどである：(1) 充填剤または増量剤、例えば澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および/またはケイ酸など；(2) 結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および/またはアラビアゴムなど；(3) 湿潤剤(humectant)、例えばグリセロールなど；(4) 崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなど；(5) 溶液遅延剤、例えばパラフィンなど；(6) 吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物など；(7) 浸潤剤(wetting agent)、例えばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど；(8) 吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土など；(9) 潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物など；ならびに(10) 着色剤。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、薬学的組成物はまた緩衝剤を含んでもよい。同様の種類の固形組成物はまた、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用いて、軟および硬ゼラチンカプセル剤の充填剤として使用することもできる。
【０１５１】
経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。液体剤形は、有効成分に加えて、例えば水または他の溶媒などの当技術分野で通常用いられる不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油(特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルなどの可溶化剤および乳化剤、ならびにそれらの混合物を含み得る。経口組成物は、不活性希釈剤に加えて、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、香料剤、および保存剤などの補助剤もまた含み得る。
【０１５２】
懸濁液は、活性化合物に加えて、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、ならびにこれらの混合物などの懸濁剤を含み得る。
【０１５３】
特に、本発明の方法は、頸部および膣上の皮膚または粘膜などの皮膚または粘膜に局所投与され得る。これによって、副作用を誘導する機会は最低に抑えられ、標的組織(骨折など)に直接送達される機会が最大になる。局所製剤は、皮膚または角質層浸透促進剤として有効であることが知られている多種多様な薬剤の1つまたは複数をさらに含み得る。これらの例としては、2-ピロリドン、N-メチル-2-ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルアルコールまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、およびアゾンが挙げられる。化粧的に許容される製剤を作製するために、さらなる薬剤を含めることも可能である。これらの例としては、脂肪、ろう、油、色素、香料、保存剤、安定剤、および界面活性剤が挙げられる。当技術分野において公知であるような角質溶解剤もまた含めることが可能である。その例はサリチル酸および硫黄である。
【０１５４】
局所または経皮投与用の剤形には、粉末剤、噴霧剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液、貼付剤、および吸入剤が含まれる。活性化合物は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要と考えられる任意の保存剤、緩衝剤、または推進剤と混合され得る。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、およびゲル剤は、アルテミシニン関連化合物に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ろう、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、ならびに酸化亜鉛、またはこれらの混合物などの賦形剤を含み得る。
【０１５５】
粉末剤および噴霧剤(sprays)は、可溶性エフリン治療薬に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含み得る。噴霧剤は、クロロフルオロ炭化水素などの慣用的な推進剤、ならびにブタンおよびプロパンなどの揮発性非置換炭化水素をさらに含み得る。
【０１５６】
非経口投与に適した薬学的組成物は、1つまたは複数のTGF抑制解除因子治療薬を、1つまたは複数の薬学的に許容される無菌の等張性の水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液、または乳濁液、あるいは使用する直前に無菌の注射用溶液または分散液に再構成され得る無菌粉末と組み合わせて含み得り、この無菌粉末は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を対象となるレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る。本発明の薬学的組成物に使用し得る適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、およびこれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆材の使用により、分散剤の場合には必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１５７】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含んでもよい。様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノールなどを含めることにより、微生物の作用の予防を確実にすることも可能である。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることもまた望ましいと考えられる。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる物質を含めることで、注射用調合薬形態の吸収を延長することも可能である。
【０１５８】
注射用デポー形態は、ポリラクチド-ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で、1つまたは複数のTGF抑制解除因子治療薬のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより作製される。薬物とポリマーの比および使用する特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を調節することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)が含まれる。デポー注射用製剤はまた、生体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン内に薬物を捕捉することによって調製される。
【０１５９】
膣内投与用の製剤は坐剤として提供され得り、これは、本発明の1つまたは複数の化合物を、例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤ろう、またはサリチレートを含む1つまたは複数の適切な非刺激性賦形剤または担体と混合することにより調製することができ、また坐剤は、室温では固体であるが体温では液体となるため、直腸または膣腔中で溶解して活性化合物を放出することになる。任意に、膣投与に適したそのような製剤には、適切であることが当技術分野において公知であるような担体を含む膣坐剤、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤、または噴霧製剤もまた含まれる。
【０１６０】
本発明による薬学的組成物は、単回用量または複数回用量として投与され得る。本発明の薬学的組成物は、個々の治療薬として、または他の治療薬と併用して投与され得る。本発明の治療は従来の治療法と併用することができ、これらは連続的にまたは同時に投与され得る。本発明の薬学的組成物は、TGF抑制解除因子を標的細胞/組織/器官に到達させ得る任意の手段によって投与することができる。いくつかの態様において、投与経路には、経口、膀胱内、静脈内、動脈内、腹腔内投与、標的細胞が存在する器官の血液供給への局所投与、または細胞への直接投与からなる群より選択される投与経路が含まれる。静脈内投与が好ましい投与方法である。これは、注入ポンプを使用して達成され得る。
【０１６１】
本明細書で使用する「非経口投与」および「非経口投与する」という語句は、腸内投与および局所投与以外の、一般に注射による投与方法を意味し、これには、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内注射および注入が含まれる。
【０１６２】
本明細書で使用する「全身投与」、「全身投与する」、「末梢投与」、および「末梢投与する」という語句は、それが患者の全身に進入して、代謝および他の同様の過程に供されるような、中枢神経系への直接投与以外の、化合物、薬物、または他の物質の投与(例えば、皮下投与)を意味する。
【０１６３】
これらの化合物は、経口、膀胱内、例えば噴霧剤によるような経鼻、直腸、膣内、非経口、大槽内、ならびに口腔内および舌下を含む、粉末剤、軟膏剤、またはドロップ剤によるような局所投与を含む、任意の適切な投与経路により、治療目的でヒトおよび他の動物に投与することができる。
【０１６４】
選択した投与経路に関係なく、適切な水和形態で使用することができる本発明の化合物および/または本発明の薬学的組成物は、下記に記述するような、または当業者に公知の他の従来法により説明されるような薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【０１６５】
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物、および投与方法に対し所望の治療応答を達成するのに効果的な有効成分の量を得るように変動し得る。
【０１６６】
選択される投薬量レベルは、本発明で使用される特定の化合物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄率、治療期間、使用される特定の治療薬と併用して使用される他の薬物、化合物、および/または物質、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、病状、全体的な健康状態、および以前の病歴、ならびに医学の技術分野において周知である同様の要因を含む様々な要因に依存することになる。
【０１６７】
当技術分野において通常の技術を有する医師もしくは獣医師は、必要な薬学的組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。例えば、医師もしくは獣医師は、薬学的組成物中で使用される本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルより低いレベルから開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることができる。
【０１６８】
一般に、本発明の化合物の適切な一日用量は、治療効果を得るために有効な最低用量の化合物量である。そのような有効用量は、一般に、上記の要因に依存することになる。
【０１６９】
必要に応じて、活性化合物の有効一日用量は、任意に単位剤形で、1日を通して適切な間隔で別個に投与する2、3、4、5、6、またはそれ以上の下位用量として投与してもよい。
【０１７０】
「治療」という用語は、予防、治療法、および治癒もまた包含することを意図する。
【０１７１】
この治療を受ける患者は、一般的に、霊長類(特にヒト)、ならびにウマ、ウシ、ブタ、およびヒツジなどの他の非ヒト哺乳動物；ならびに家禽およびペットを含む、それを必要としている任意の動物である。
【０１７２】
特定の製剤と併用することで、本TGF抑制解除因子は有効な可溶性薬剤となり得る。TGF抑制解除因子は、溶解度を促進する第2ペプチドとの融合ペプチドとして提供され得る。例えば、本発明のTGF抑制解除因子は、溶解度および/または血清安定性を促進し得る免疫グロブリンのヒンジまたはFc部分のすべてまたは断片を伴う融合ポリペプチドの一部として提供され得る。TGF抑制解除因子はまた、BMPタンパク質のプロドメイン配列と共に(ジスルフィド結合によるなど、共有結合されているか、または非共有結合により会合している；TGF抑制解除因子を導出したBMPと異種のBMPまたは同じBMPに由来する)送達されてもよい。
【０１７３】
本発明は、本明細書に記載する本TGF抑制解除因子のペプチド模倣配列もまた意図する。
【０１７４】
本発明のTGF抑制解除因子は、骨密度の減少を特徴とする病態の治療に使用する場合、TGF抑制解除因子の骨芽細胞に対する局所送達および/または有効性が、TGF抑制解除因子単独と比較して増大するように、骨標的部分を用いて骨組織に送達することができる。
【０１７５】
適切な骨標的分子は、本薬物複合体の成分として使用した場合に、複合体の少なくとも一部となる分子であり、具体的には、骨に送達される複合体のβ-アドレナリン作動薬である。言い換えれば、適切な骨標的分子は、治療薬に結合された場合に、骨、この場合は骨芽細胞に対して優先的に薬剤の薬理学的効果を発揮させる。標的化分子は、例えばホルモン(例えば、生物反応修飾因子)、および抗体(例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体)、または例えば特定の細胞表面抗原に対する、必要な標的特異性を有する抗体断片のように、標的特異性を示す化学官能性を適切に含む。
【０１７６】
骨疾患の治療に使用するための治療調製物は、テトラサイクリン、カルセイン、カルシトニン、ビスフォスフォネート、キレート剤、リン酸、ポリリン酸、ピロリン酸、ホスホネート、ジホスホネート、テトラホスホネート、ホスホナイト、イミドジリン酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、アミノリン酸糖、エストロゲン、例えばオステオネクチン、骨シアロタンパク質、およびオステオポンチンのような骨のミネラル相と会合することが知られているペプチド、ミネラル結合ドメインを有するタンパク質、オステオカルシンおよびオステオカルシンペプチドなどを含み得る。
【０１７７】
骨疾患の治療に使用するための治療調製物はまた、β-アドレナリン作動薬の運搬体として働き得る、反復性酸性アミノ酸のペプチドを含んでもよい。適切な小酸性ペプチドの例には、これらに限定されるわけではないが、Aspオリゴペプチド、Gluオリゴペプチド、γ-カルボキシル化Glu(Gla)オリゴペプチド、ならびにAsp、Glu、およびGlaの組み合わせを含むペプチドが含まれる。(Asp)6または(Glu)6は、AspオリゴペプチドおよびGluオリゴペプチドの例である。
【０１７８】
骨標的分子には、ビスフォスフォネート、エストロゲン、および他のステロイド(デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)など)のような、それ自体、骨吸収速度および骨形成速度に影響を及ぼす分子もまた含まれ得る。これらの骨標的分子は、骨に対する親和性を有し、およびまた骨成長治療特性を有し、ならびに/または骨吸収もしくは骨形成に対してβ-アドレナリン作動薬と共に相乗的もしくは付加的効果をもたらす可能性がある。そのような分子の例は、ビスフォスフォネートおよびフッ化物である。
【０１７９】
以下の項に、本発明の複合化薬物を形成するために用いられるいくつかの骨標的分子のより詳細な説明を提供する。
【０１８０】
1. ビスフォスフォネート
ビスフォスフォネートは、中心(ジェミナル)炭素に結合した2つのホスホネート基を含む合成化合物である。ビスフォスフォネートは、その2つの特徴により望ましい骨標的分子となる。第一に、ビスフォスフォネートは骨に対する親和性を有する：ビスフォスフォネートは、骨組織によって骨選択的に取り込まれる。これまでに、いくつかのビスフォスフォネート化合物の使用に基づく骨スキャン剤が、望ましい高解像度骨スキャンを達成するために用いられている(例えば、Kelly et. alの米国特許第4,810,486号を参照されたい)。第二に、ビスフォスフォネートは、骨疾患の有用な治療薬である。ビスフォスフォネートは骨減少を阻害し得り、破骨細胞の活性を妨げる様式で作用し、その結果骨減少が減少すると考えられている。ビスフォスフォネートは、パジェット病、骨粗鬆症、関節リウマチ、および骨関節炎を含む骨疾患の治療に有用である(例えば、Sugioka et. alの米国特許第5,428,181を参照されたい)。
【０１８１】
ビスフォスフォネートは、中心のジェミナル炭素に結合した2つのさらなる鎖(それぞれR-1およびR-2)を含む。2つの側鎖が利用できることにより、多くの置換および異なる薬理学的特性を有する様々な類似体の開発が可能になる。活性は化合物によって大きく異なり、最新のビスフォスフォネートは、記載されている最初のビスフォスフォネートであるエチドロネートよりも5,000〜10,000倍活性が高い。作用機序は以下を含む：
a) 破骨細胞活性に対する直接的効果；
b) 破骨細胞の補充に対する直接的および間接的効果、後者は骨芽細胞系列の細胞によって媒介され、破骨細胞補充の阻害因子の産生を含む；および
c) アポトーシスによる破骨細胞生存の短縮。大量のビスフォスフォネートはまた、結晶成長の物理化学的阻害を介して石灰化を阻害し得る。R-1構造は、P--C--Pと共に、主に骨ミネラルへの結合およびビスフォスフォネートの物理化学的作用に関与する。R-1におけるヒドロキシル基は、これらの作用に対する最適条件を提供する。R-2はビスフォスフォネートの吸収抑制作用に関与し、分子のこの部分のわずかな修飾または構造的制約により、吸収抑制能に顕著な相違が生じる。R-2のアルキル鎖または環構造に窒素官能基が存在することで、吸収抑制能および骨吸収に対するビスフォスフォネートの特異性は大きく増大し、より新しい強力なビスフォスフォネートは大抵これらの構造内に窒素を含む。
【０１８２】
本明細書で使用する「ビスフォスフォネート(bisphosphonate)」および「ビスフォスフォネート(bisphosphonates)」という用語は、ジホスホネート、ビスホスホン酸(biphosphonic acids)、およびジホスホン酸、ならびにこれら物質の塩および誘導体もまた包含することが意図される。ビスフォスフォネートに関する具体的な命名法の使用は、特記する場合を除き、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書において有用なビスフォスフォネートの非限定的な例には、以下のものが含まれる：アレンドロン酸、4-アミノ-1-ヒドロキシブチリデン-1,1-ビスホスホン酸。アレンドロネート(アレンドロン酸ナトリウムまたはアレンドロン酸一ナトリウム三水和物としても知られる)、4-アミノ-1-ヒドロキシブチリデン-1,I-ビスホスホン酸一ナトリウム三水和物。アレンドロン酸およびアレンドロネートは、1990年5月1日に公表されたKieczykowski et al.,の米国特許第4,922,007号、および1991年5月28日に公表されたKieczykowskiの米国特許第5,019,651号(いずれも参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)に記載されている。1990年11月13日に公表されたIsomura et al.の米国特許第4,970,335号(参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)に記載の、シクロヘプチルアミノメチレン-1,1-ビスホスホン酸、YM 175、Yarnanouchi(シマドロネート)。,1-ジクロロメチレン-1,1-ジホスホン酸(クロドロン酸)および二ナトリウム塩(クロドロネート、Procter and Gamble)は、ベルギー特許第672,205号(1966)およびJ. Org. Chem 32, 4111 (1967)(いずれも参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)に記載されている。1-ヒドロキシ(I-ピロリジニル)-プロピリデン-1,1-ビスホスホン酸(EB-1053)。1-ヒドロキシエタン-I,I-ジホスホン酸(エチドロン酸)。BM-210955としても知られる1-ヒドロキシ(N-メチル-N-ペンチルアミノ)プロピリデン-1,1ビスホスホン酸、Boehringer-Mannheim(イバンドロネート)は、1990年5月22日に公表された米国特許第4,927,814号(参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)に記載されている。6-アミノ-1-ヒドロキシヘキシリデン-1,1-ビスホスホン酸(ネンドロネート(nen'dronate)。3-(ジメチルアミノ)-1-ヒドロキシプロピリデン-1,1-ビスホスホン酸(オルパドロネート)。3-アミノ-1-ヒドロキシプロピリデン-I,I-ビスホスホン酸(パミドロネート)。[2-(2-ピリジニル)エチリデン]-I,I-ビスホスホン酸(ピリドロネート)は、米国特許第4,761,406号(参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)に記載されている。1-ヒドロキシ(3-ピリジニル)-エチリデン-1,1-ビスホスホン酸(リセドロネート)。Breliere et al.、1989年10月24日の米国特許第4,876,248号(参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)に記載の、(4-クロロフェニル)チオメタン-I,I-ジホスホン酸(チルドロネート)。1-ヒドロキシ(IH-イミダゾールイル)エチリデン-1,1−ビスホスホン酸(ゾレンドロネート)。好ましいのは、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、リセドロネート、ピリドロネート、パミドロネート、ゾレドロネート、それらの薬学的に許容される塩またはエステル、およびそれらの混合物からなる群より選択されるビスフォスフォネートである。より好ましいのは、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、それらの薬学的に許容される塩またはエステル、およ���それらの混合物である。さらに好ましいのは、アレンドロネート、その薬学的に許容される塩、およびそれらの混合物である。最も好ましいのは、アレンドロネート一ナトリウム三水和物である。他の態様において、他の好ましい塩は、イバンドロネートのナトリウム塩およびリセドロネート一ナトリウムヘミ五水和物(すなわち、一ナトリウム塩の2.5水和物)である。参照によりその内容が全体として本明細書に組み入れられるWO02/98354を参照されたい。
【０１８３】
2. フッ化物
フッ化物は、二機能性骨標的分子の別の例である。フッ化物は骨によって取り込まれ、骨ミネラルにおいて、骨構造および骨機能において、骨芽細胞のレベルで二相性作用を発揮する。フッ化物は、単独でまたは吸収抑制剤と併用して、骨粗鬆症の治療に用いられている。Rubin and Bilezikian, Endocrinol. Metab. Clin. North. Am., 32: 285-307：Pak et al., Trends Endocrinol. Metab. 6: 229-34。
【０１８４】
本発明で用いられるフッ化物は、フッ化ナトリウムの形態であってよい。フッ化ナトリウムという用語は、すべての形態のフッ化ナトリウム(例えば、徐放性フッ化ナトリウム、持続放出性フッ化ナトリウム)を指す。持続放出性フッ化ナトリウムは米国特許第4,904,478号に開示されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。フッ化ナトリウムの活性は、生物学的手順(例えば、Eriksen E. F. et al.，Bone Histomorphometry, Raven Press, New York, 1994, pages 1-74；Grier S. J. et al., The Use of Dual-Energy X-Ray Absorptiometry In Animals, Inv. Radiol., 1996,31(1):50-62；Wahner H. W. and Fogelman I., The Evaluation of Osteoporosis: Dual Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical Practice., Martin Dunitz Ltd., London, 1994, pages 1-296を参照されたい)に従い、当業者によって容易に決定される。
【０１８５】
3. 小酸性ペプチド
骨疾患の治療に使用するための治療調製物は、小酸性ペプチドであってもよい。ヒドロキシアパタイト(HA)は、骨および歯などの硬組織のマトリックスにおける主要な無機成分および構成物質であり、骨組織を標的とする上で特異的部位として作用し得り、小酸性ペプチドはこれに対して親和性を示し得る。
【０１８６】
例えば、その構造内に酸性アミノ酸(AspまたはGlu)の反復配列を有するいくつかの骨非コラーゲン性タンパク質は、ヒドロキシアパタイト(HA)に対して親和性を有し、これに結合する傾向がある。オステオポンチンおよび骨シアロタンパク質は、骨における2つの主要な非コラーゲン性タンパク質であり、それぞれAspおよびGlu反復配列を有する。オステオポンチンおよび骨シアロタンパク質はいずれも、HAに対して強い親和性を有し、これに速やかに結合する。したがって、β-アドレナリン拮抗薬部分を、これらおよび他の非コラーゲン性タンパク質と関連のあるペプチドと結合することは、会合したペプチドのH Aに対する親和性のために、β-アドレナリン拮抗薬の骨への標的化治療送達において効果的であると考えられる。(Asp)6のヒドロキシアパタイト(HA)に対する高い親和性のために、(Asp)6の結合は特に有効な送達手段であると考えられるが、(Glu)6も同程度に有効であると考えられる。
【０１８７】
ビスフォスフォネートの結合とは対照的に、ペプチドの結合で使用する酸性ペプチドは吸収過程で分解する傾向があり、薬理学的効果を示さないと考えられる。ビスフォスフォネートの結合では、治療を施した組織はいくらかのビスフォスフォネート効果を示す傾向がある。その内容が全体として参照により組み入れられるUS 20030129194を参照されたい。
【０１８８】
別の態様において、本発明のTGF抑制解除因子治療薬は、動物飼料として動物に投与することができる。例えば、これらの化合物を適切な飼料プレミックス中に含めることができ、次いでこのプレミックスを、動物に治療有効量を提供するのに十分な量で完全な配給分に組み入れる。または、TGF抑制解除因子治療薬を含む中間濃縮物または飼料補充物を、飼料に混合することができる。そのような飼料プレミックスおよび完全な配給分を調製し投与し得る方法は、参考図書に記載されている(例えば、「Applied Animal Nutrition」, W.H. Freedman and CO., San Francisco, U.S.A., 1969、または「Livestock Feeds and Feeding」, O and B books, Corvallis, Ore., U.S.A., 1977を参照されたい)。
【０１８９】
VII. TGF抑制解除因子によって治療できる例示的な疾患状態
本TGF抑制解除因子を用いて、BMP活性が所望するよりも低い任意の疾患状態を治療することができる。以下は、TGF抑制解除因子を含む本薬学的組成物の投与により治療または緩和し得る、数例の例示的な(しかし非限定的な)病態である。上記の骨粗鬆症の治療における使用に加えて、TGF抑制因子組成物はまた以下の病態で使用することが可能である。
【０１９０】
Hallahan et al.(Nat Med. 2003 Aug; 9(8):1033-8. Epub 2003 Jul 20)は、レチノイドが髄芽腫細胞の広範なアポトーシスを引き起こすことを報告した。異種移植片モデルでは、レチノイドは腫瘍増殖を大幅に抑止した。彼らは、受容体特異的レチノイドアゴニストを使用して、レチノイド感受性細胞株で活性レチノイドすべてによって誘導されるmRNAのサブセットを規定し、レチノイド活性の候補メディエータとしてBMP-2を同定した。彼らは、BMP-2タンパク質が髄芽腫細胞アポトーシスを誘導するのに対して、BMP-2アンタゴニストであるノギンがレチノイドおよびBMP-2誘導性アポトーシスの両方を遮断することを示した。BMP-2はまた、p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)を誘導したが、これは、BMP-2およびレチノイド誘導性アポトーシスに必要である。レチノイド耐性髄芽腫細胞は、BMP-2で処理した場合、またはレチノイド感受性髄芽腫細胞と共に培養した場合にアポトーシスを起こした。したがって、BMP-2のレチノイド誘導性発現は、レチノイド応答性細胞のアポトーシスに必要かつ十分であり、レチノイド感受性細胞によるBMP-2の発現は、周囲のレチノイド耐性細胞においてアポトーシスを誘導するのに十分である。したがって、本TGF抑制解除因子を用いて、同様の結果を達成するようBMP-2活性を増加させることができる。
【０１９１】
Waite and Eng(Hum Mol Genet. 2003 Mar 15;12(6):679-84)は、BMP2への曝露により、時間依存的および用量依存的様式で、腫瘍抑制因子PTENタンパク質レベルが上昇することを最近報告した。PTENタンパク質の増加は迅速であり、またシクロヘキシミド処理によってBMP2誘導性PTEN蓄積が阻害されないことから、この増加は新たなタンパク質合成の増加によるものではなく、BMP2刺激がPTENタンパク質分解を阻害したことが示唆された。さらに、MCF-7細胞をBMP2処理すると、PTENと分解経路の2つのタンパク質、UbCH7およびUbC9との会合が減少した。これらのデータから、BMP2曝露は、PTENと分解経路の会合を減少させることで、PTENタンパク質レベルを制御し得ることが示される。これにより、カウデン症候群、バナヤン・ライリー・ルバルカバ(Bannayan-Riley-Ruvalcaba)症候群、およびプロテウス症候群など、PTEN活性の減少に起因する疾患の新たな治療様式が広がる。
【０１９２】
緑内障は、一般的に高い眼圧(IOP)に関連する失明疾患である。いくつかの家族では、前部の異常な発達が緑内障に寄与している。これら家族の大部分において前部発育異常および緑内障の原因となる遺伝子は同定されておらず、罹患した発育過程は十分に理解されていない。Chang et al.(BMC Genet. 2001;2(1):18. Epub 2001 Nov 06.)は、眼の発達および発達緑内障に対するBmp4遺伝子量の重要性について検討し、Bmp4+/-(ハプロ不全)マウスが、小柱網およびシュレム菅排液構造の奇形、不在、または遮断を含む、前部異常を有することを見出した。角度範囲の80%を超えるまたはそれ以上の重篤な排液構造異常を有するマウスでは、IOPが上昇していた。C57BL/6Jバックグラウンドでは、硝子体血管系の遺残、網膜内細胞数の減少、および視神経の不在も認められる。このように、BMP4のヘテロ接合性欠損は、前部発育異常およびIPOの上昇をもたらす。この異常性は、発達緑内障を有するヒト患者の異常性と類似している。したがって、BMP4不足は、アクセンフェルド・リーガー(Axenfeld-Rieger)異常、およびヒト緑内障に関連する他の発育上の病態に寄与する強力な候補である。BMP4はまた後部発達にも関与し、野生型レベルは、一般的に、C57BL/6Jバックグラウンドにおける視神経の発達に重要である。本TGF抑制解除因子を用いてBMP4活性を増加させ、このような病態を治療することが可能である。
【０１９３】
Mathura et al.(Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Feb;41(2):592-600)は、遺伝性の光受容体変性を有するマウスでは、変性中および変性後に、網膜およびRPE(網膜色素上皮)のBMP4 mRNAが劇的に減少していることを示した。初期継代のRPE細胞におけるチミジン取り込みから、5%血清による対照を上回る14倍の促進が、BMP-2(10 ng/ml)、BMP4(10 ng/ml)、およびトランスフォーミング増殖因子(TGF)-β1(2 ng/ml)の存在下において、それぞれ322%、393%、および313%に減少することが示された。したがって、BMP-2およびBMP-4は、網膜およびRPEにおいて、損傷によって下方制御される負の増殖制御因子として働いて、組織修復を可能にし得る。BMP発現の調節は、増殖性網膜症で起こる過度の創傷修復を調節する手段を提供する。
【０１９４】
Marker et al.(Genomics. 1955 Aug 10;28(3):576-80)は、1つまたは複数の未同定の刷り込み遺伝子を含むと考えられる染色体領域内に、BMP-7を挿入した。直接試験から、BMP7は刷り込まれないことが示唆される。胚のRNA発現パターンの試験から、Bmp7が様々な骨格および非骨格組織で発現していることが示される。胚の発現パターン、およびマウスの位置から推測されるヒト染色体亜局在性により、BMP7が、何名かのホルト・オーラム症候群患者で影響を受けている遺伝子の有望な候補とされる。
【０１９５】
先天性閉塞性腎障害は、胎児および幼児を冒すよく見られる疾患である。腎臓は、著しい形態変化および機能変化を示す。大部分の進行型の症例では、生理的発生腎臓プログラムが障害を受けており、正常な腎発生を調節する遺伝子の時間的/空間的発現の変化が主張されている。過剰なアポトーシスは、これらの過程における明白な機構であり、アポトーシス阻害遺伝子(Bcl-2、HGF、IGF、BMP7)の発現の減少、ならびにBaxおよびTGF-βのようなアポトーシス促進遺伝子の過剰発現によって媒介される。したがって、本発明のTGF抑制解除因子を、BMP-7レベルを高めるために投与することができる。
【０１９６】
骨形成タンパク質-7(BMP7)は尿細管で高度に発現し、一般に上皮表現型の維持を促進する。Wang et al.(J Am Soc Nephrol. 2001 Nov;12(11)2392-9)は、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病の15週目に、BMP7の腎発現が約半分まで減少し、30週までには時間対照の<%10までさらに減少することを報告した。糖尿病性腎症の発症過程では、分泌性BMPアンタゴニストグレムリンが実質的に増加した。このように、実験上の糖尿病性腎症では、尿細管BMP7およびその受容体のいくつかが減少し、分泌性BMPアンタゴニストであるグレムリンが増加した。BMP7活性の減少はそれ自体、尿細管細胞において線維形成促進性である。したがって、この病態を回復させるまたは緩和するために、本発明のTGF抑制解除因子を投与することができる。
【０１９７】
また、Giannobile et al.(J Periodontol. 1998 Feb;69(2):129-37)は、組換えヒト骨形成タンパク質-1(OP-1)が、III級分岐部欠損において歯周部の創傷治癒を促進することを報告した。
【０１９８】
Perides et al.(Neurosci Lett. 1995 Feb 24;187(1):21-4)は、脳低酸素/虚血のラットモデルにおいて、骨形成タンパク質-1(OP-1)の神経保護作用について検討した。12日齢ラットにおいて、両側頚動脈の結紮および一過性低酸素の前に、50マイクログラムのOP-1を腹腔内注射すると、大脳の梗塞領域は、媒体注射対照における44.8+/-3.3%から29+/-4.9%まで減少した。14日齢ラットを、低酸素の1時間後に20マイクログラムのOP-1で処置すると、死亡率は45%から13%に低下した。したがって、OP-1は新規な種類の神経保護剤を表し得る。
【０１９９】
一般に、本明細書において使用する命名法および本発明において利用する実験手順は、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術、および組換えDNA技術を含む。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、「Molecular Cloning: A laboratory Manual」 Sambrook et al., (1989)；「Current Protocols in Molecular Biology」Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)；Ausubel et al., 「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)；Perbal, 「A Practical Guide to Molecular Cloning」, John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson et al., 「Recombinant DNA」, Scientific American Books, New York；Birren et al. (eds) 「Genome Analysis: A Laboratory Manual Series」, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号、および第5,272,057号に記載の方法；「Cell Biology: A Laboratory Handbook」, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)；「Current Protocols in Immunology」 Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)；Stites et al. (eds), 「Basic and Clinical Immunology」 (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell and Shiigi (eds), 「Selected Methods in Cellular Immunology」, W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい；利用できる免疫測定法は、特許および科学文献に広範囲に記載されており、例えば、米国特許第3,791,932号；第3,839,153号；第3,850,752号；第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,935,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；第4,098,876号；第4,879,219号；第5,011,771号、および第5,281,521号；「Oligonucleotide Synthesis」 Gait, M. J., ed. (1984)；「Nucleic Acid Hybridization」 Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)；「Transcription and Translation」 Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984)；「Animal Cell Culture」 Freshney, R. I., ed. (1986)；「Immobilized Cells and Enzymes」 IRL Press (1986)；「A Practical Guide to Molecular Cloning」 Perbal, B., (1984)、および「Methods in Enzymology」 Vol. 1-317, Academic Press；「PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications」, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)；Marshak et al., 「Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual」 CSHL Press (1996)を参照されたい；これらはすべて、本明細書において完全に記載されているがごとく、参照として組み入れられる。他の一般的な参考文献は、本文書中を通して提供されている。参考文献中の手順は当技術分野において周知であると考えられ、読者の利便性のために提供するものである。参考文献に含まれる情報はすべて、参照として本明細書に組み入れられる。
【０２００】
引用した参考文献
2008509087.tif 000030
2008509087.tif 000031
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【０２０１】
同等物
当業者は、通常の実験のみを使用して、本明細書に記載した本発明の特定の態様との多くの同等物を認識し、または確認することができると考えられる。このような同等物も、特許請求の範囲に含まれることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】8員環シスチンノットを有するタンパク質の既知および予測構造を示す。BMP-7構造に基づいた(14)、キャンファミリーの折りたたみ予測を図示する。C1、C2、C3、C4、C5、およびC6は、ノット構造を形成する6つのシステイン残基を表す。Gはグリシン残基を表し、Xはシステインおよびグリシン以外の任意の残基を表す。C'は、シスチンノットドメイン内に存在するが、基本のノット形成に関与しないさらなるシステイン残基を表し、S:Sはジスルフィド結合を表す。A) BMP-7シスチンノット構造。B) BMPアンタゴニストのキャンサブファミリーのモデル。
【図２】BMPアンタゴニストの系統学的関係を示す。各サブファミリーの代表的なメンバーのシスチンノット配列のアラインメントに基づいた、ヒトBMPアンタゴニストの系統樹。コーディンは4つのシスチンノットドメインを有し、そのどれもが同様の結果をもたらした‐ここでは、コーディンに関しては、4つめのシスチンノットドメインを使用する。系統樹の構築には、http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.htmlにおけるMultAlinサーバーを使用した(66)。
【図３】8員環サブファミリーのBMPアンタゴニストの配列アラインメント、ゲノム構成、および系統学的関係を示す。A) キャンファミリーメンバーの配列アラインメント。多配列アライメントには、http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.htmlにおけるBCM検索ランチャーを使用した。ノットを形成する6つのシステイン残基は黒い背景上に白字で示し、1〜6と表示してある。さらなるシステイン残基(C'およびCxと表示)は、濃灰色の背景上に示し、またC2とC3の間の保存されたG残基は、薄灰色の背景上に示してある。新たに同定されたBMPアンタゴニストには下線を引いた。B) BMPアンタゴニストのキャンサブファミリーのゲノム構成。エキソン-イントロン接合部を予測するため、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/index/htmlにおけるNCBIのSPIDEYツールを用いて、各遺伝子のゲノム配列およびmRNA配列を比較した。各ボックスはエキソンを表し、各線はイントロンを表す。各エキソンおよびイントロン上の番号は、塩基対で表した大きさである。格子縞パターンは、シスチンノットの位置を表す。
【図４】全長BMP-6配列、ならびにBMP I型およびII型受容体の少なくとも1つと結合しないが、BMPのCysノット抑制因子とはなお結合する変異を選択するために標的化突然変異誘発するためのBMP-6の領域(強調部分)を示す。領域1〜領域3のそれぞれにおいて選択された変異を下部に示す。変異は、グリコシル化部位が生じるように選択される。
【図５】全長BMP-5配列、ならびにBMP I型およびII型受容体の少なくとも1つと結合しないが、BMPのCysノット抑制因子とはなお結合する変異を選択するために標的化突然変異誘発するためのBMP-5の領域(強調部分)を示す。領域1〜領域3のそれぞれにおいて選択された変異を下部に示す。変異は、グリコシル化部位が生じるように選択される。
【図６】様々なTGF-βスーパーファミリーメンバータンパク質のアラインメントを示す。抑制解除因子タンパク質を作製するために改変され得る1〜3の領域を、アラインメントの上部に星印で示す。
【図１】
2008509087.tif 000038
【図２】
2008509087.tif 000039
【図３】
2008509087.tif 000040
【図４】
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【図５】
2008509087.tif 000042
【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年1月23日(2007.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008509087000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月19日(2007.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008509087000001.app
【国際調査報告】
2008509087.tif 000044
2008509087.tif 000045
2008509087.tif 000046
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