(57)【要約】  グリコロニトリルからのグリコール酸の酵素的製造のためにさまざまな方法が提供される。これらの方法としては、１）グリコロニトリルからグリコール酸へ変換するための改善されたニトリラーゼ活性を有するアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異の使用、および２）触媒安定性および／または生産性を改善する方法が挙げられる。触媒安定性／生産性を改善する方法としては、反応安定剤の使用、実質的に酸素を含まない条件下での反応の実行、および反応混合物における基質の濃度の制御が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコロニトリルからグリコール酸を製造する方法であって、
ａ）グリコロニトリルを適切な水性反応混合物中でニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒と接触させるステップであって、前記ポリペプチドが、
１）アミノ酸残基１６８でのリシン、メチオニン、トレオニン、またはバリンによる置換、および
２）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を有し、それによってグリコール酸が製造されるステップと、
（ｂ）塩または酸の形で（ａ）において製造されるグリコール酸を回収するステップを含み、前記酵素触媒が、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素触媒が、同一の反応条件下でＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）の活性に対してグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、ニトリラーゼ活性の少なくとも約２倍の改善を提供する改善されたニトリラーゼ触媒であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素触媒が、同一の反応条件下でＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）の活性に対してグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、ニトリラーゼ活性の少なくとも約４倍の改善を提供する改善されたニトリラーゼ触媒であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素触媒が全微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたは複数の細胞成分、部分的に精製された酵素、または精製酵素の形であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記全微生物細胞が前記ポリペプチドを組換え発現する形質転換微生物宿主細胞であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記形質転換微生物宿主細胞が、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、ラクトバチルス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）種、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、ハンセニュウラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）種、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）種、メチロバクテリア（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種からなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記形質転換微生物宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記形質転換微生物宿主細胞が、国際寄託番号ＡＴＣＣ４７０７６を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５および国際寄託番号ＡＴＣＣ５３９１１を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素触媒が可溶性または不溶性支持体中にもしくはその上で固定化されることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記水性反応混合物において製造されるグリコール酸アンモニウムの濃度が約０．０２ｗｔ％〜約９０ｗｔ％であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記水性反応混合物において製造されるグリコール酸アンモニウムの濃度が約０．０２ｗｔ％〜約４０ｗｔ％であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記水性反応混合物におけるグリコロニトリル濃度が約５ｍＭ〜約１Ｍの範囲であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記水性反応混合物におけるグリコロニトリル濃度が連続的またはアリコート添加によって維持されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記水性反応混合物におけるｐＨが約５．５〜約７．７に維持されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
グリコロニトリルのグリコール酸への酵素変換が実質的に酸素を含まない条件下で起こることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記水性反応混合物が、５ｗｔ％未満の濃度でチオ硫酸カリウムおよび亜ジオチオン酸ナトリウムからなる群から選択される安定剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵素触媒がリサイクルされた酵素触媒であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素触媒が乾燥細胞重量酵素触媒のグラム当り少なくとも３００グラムのグリコール酸の触媒生産性を提供することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素触媒が乾燥細胞重量酵素触媒のグラム当り少なくとも４５０グラムのグリコール酸の触媒生産性を提供することを特徴とする請求項１９に記載の方法
【請求項２１】
前記酵素触媒が乾燥細胞重量酵素触媒のグラム当り少なくとも１０００グラムのグリコール酸の触媒生産性を提供することを特徴とする請求項２０に記載の方法
【請求項２２】
ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子であって、前記ポリペプチドが、
ａ）アミノ酸残基１６８でのメチオニン、またはトレオニンによる置換、および
ｂ）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を有し、前記ポリペプチドが、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供することを特徴とする単離核酸分子。
【請求項２３】
配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２８、および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項２２に記載の単離核酸分子。
【請求項２４】
配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２７、および２９からなる群から選択される核酸配列を有することを特徴とする請求項２３に記載の単離核酸分子。
【請求項２５】
適切な調節塩基配列に機能しうるように連結された請求項２２から２４のいずれか一項に記載の単離核酸分子を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項２６】
請求項２５に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする発現カセット。
【請求項２７】
請求項２６に記載の発現カセットを含むことを特徴とする形質転換宿主細胞。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）種、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、ハンセニュウラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）種、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）種、メチロバクテリア（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種からなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項２９】
前記宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項２８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項３０】
前記宿主細胞が、国際寄託番号ＡＴＣＣ４７０７６を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５、および国際寄託番号ＡＴＣＣ５３９１１を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５からなる群から選択されることを特徴とする請求項２９に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項３１】
ニトリラーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
ａ）アミノ酸残基１６８でのメチオニン、またはトレオニンによる置換、および
ｂ）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を有し、前記ポリペプチドが、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供することを特徴とする単離ポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２８、および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項３１に記載の単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学および分子生物学の分野に関する。より具体的には、グリコロニトリルからのグリコール酸の酵素的製造の方法が、改善されたニトリラーゼ活性を有する変異ニトリラーゼを使用することにより提供される。
【０００２】
本出願は、いずれも２００４年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／６３８，１７６号明細書および同第６０／６３８，１２７号明細書の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
グリコール酸（ＨＯＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＡＳ登録番号は７９−１４−１）は、カルボン酸のα−ヒドロキシ酸ファミリーの最も単純なメンバーである。その特性は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）の調製におけるモノマーとして、およびパーソナルケア製品における構成要素として、井戸改修、皮革工業、およびオイルやガス工業、洗濯および繊維工業における使用を含む広範囲の消費者および工業用途のために理想的である。グリコール酸は、さまざまな工業（乳および食品加工器具洗浄剤、家庭および工業用洗浄剤、工業洗浄剤［輸送器具、石造、プリント基板、ステンレス鋼ボイラーおよび加工器具、冷却塔／熱交換器用］、および金属加工［金属酸洗い、銅光沢、エッチング、電気メッキ、電気研磨用］における洗浄剤の主成分でもある。最近、ポリグリコール酸が、食品および炭酸飲料を包装するためのガスバリヤ材として有用である（すなわち、高い酸素バリヤ特性を示す）ことが報告されている（特許文献１）。しかし、グリコール酸の伝統的な化学合成では、ガスバリヤ材用のポリグリコール酸の調製における使用前に除去する必要がある相当な量の不純物が生成される。グリコール酸を商業的に製造する新しい技術、特に高純度かつ低費用でグリコール酸を製造する技術は、業界によって熱心に受入れられるであろう。
【０００４】
開始材料として対応するα−ヒドロキシニトリルおよび触媒として微生物を使用するα−ヒドロキシ酸を調製するためのさまざまな方法が知られている。製造されるα−ヒドロキシ酸の例としては、グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシ−２−フェニルプロピオン酸、マンデル酸、２−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−４−ブチロラクトン、および４−メチルチオ酪酸が挙げられる。これらの生成物は、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、オウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、アルケリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ミコプラナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、バクテリジウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、コクリオボルス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、オブスムバクテリウム（Ｏｂｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、およびゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）属に属するものなどの微生物を使用して合成される。（米国特許公報（特許文献２）に対応する（特許文献３）、（特許文献４）、および（特許文献５）、米国特許公報（特許文献６）に対応する（特許文献７）、米国特許公報（特許文献８）に対応する（特許文献９）、（特許文献１１）、米国特許公報（特許文献１０）に対応する（特許文献１２）、（特許文献１３）に対応する（特許文献１４）、（特許文献１５）に対応する（特許文献１６）、米国特許公報（特許文献１７）に対応する（特許文献１８））。
【０００５】
しかし、上記の対応するα−ヒドロキシニトリルからα−ヒドロキシ酸を調製するための最も周知の方法では、商業的需要に合致する十分な高濃度で生成物が製造され、蓄積されることはない。これはしばしば、反応期間の早期の酵素不活性化の結果である。米国特許公報（特許文献１９）は、「α−ヒドロキシニトリルがニトリラーゼまたはニトリルヒドラターゼを使用して酵素的に加水分解または水和され、α−ヒドロキシ酸またはα−ヒドロキシアミドを生成する場合、酵素は短時間内に不活性化されるという点で問題が生じる。したがって、α−ヒドロキシ酸またはα−ヒドロキシアミドを高濃度および高収量で得ることは困難である。」ことを開示している（第１欄、４９−５４行）。反応混合物におけるアルデヒド濃度（アルデヒドおよびシアン化水素とのα−ヒドロキシニトリルの分離によって形成）および／またはα−ヒドロキシニトリル濃度を規定範囲内に維持することが、この問題を回避する１つの方法である。
【０００６】
米国特許公報（特許文献１７）はさらに、迅速な酵素不活性化に関する難点に対処する。具体的には、米国特許公報（特許文献１７）は、分離平衡化に従って、α−ヒドロキシニトリル化合物が部分的に対応するアルデヒドに分離することに言及している。これらのアルデヒドは、タンパク質との結合によって短時間内に酵素を不活性化し、それによって、α−ヒドロキシニトリルから高い生産性とともに高濃度でα−ヒドロキシ酸またはα−ヒドロキシアミドを得ることを困難にする（第２欄、１６−２９行）。アルデヒドの蓄積による酵素不活性化を阻止する解決法として、リン酸または次亜リン酸イオンが反応混合物に添加された。米国特許公報（特許文献１０）では、亜硫酸イオン、二亜硫酸イオン、または亜ジチオン酸イオンが使用され、アルデヒドを抑制し、かつ酵素不活性化を阻止する。しかし、さらに上記の通りかかる添加剤によって製造され、蓄積されるα−ヒドロキシ酸の濃度は大きくない。
【０００７】
米国特許公報（特許文献２０）は、α−ヒドロキシ酸生成物の低い蓄積が分離アルデヒド蓄積による短時間内の酵素不活性化に関係していることを開示している。これらの発明者は、酵素活性が、対応するアルデヒドまたはケトンと共に水中でα−ヒドロキシニトリルの部分分離において生成される（非特許文献１）シアン化水素の存在下に阻害されることを示している（非特許文献２）。これらの発明者は、その酵素活性が、反応混合物にシアン化物を添加することによって改善されうる微生物を使用することによってアルデヒド誘発酵素不活性化の課題を解決した。シアン化物の添加は、アルデヒドおよびシアン化水素とのα−ヒドロキシニトリルの分離を制限した。
【０００８】
特にグリコール酸の製造に関して、グリコロニトリルが、そのいずれかが酵素活性を不活性化にしうる、シアン化水素およびホルムアルデヒドと可逆的に分離することが知られている。米国特許公報（特許文献２１）は、「ニトリラーゼ」活性を有する細菌を使用する対応するニトリルから有機酸を調製する方法を記載し、基質としてのグリコロニトリルをリストアップしている。具体的には、この特許は、この目的のためのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテリジウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、およびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の使用を記載している。ニトリラーゼ活性を有すると記載されているが、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｒ３１２は、米国特許公報（特許文献２１）の実施例のすべてにおいて使用される唯一の株である。ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｒ３１２は、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を有するが、ニトリラーゼ活性を有さないことが知られている（非特許文献３）。
【０００９】
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種に属する微生物を使用することによって乳酸、グリコール酸、および２−ヒドロキシイソ酪酸を調製する方法が、（特許文献２２）に開示されている。（特許文献２３）は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）またはゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）ヒドロラーゼの作用によってグリコロニトリルからグリコール酸を製造するための方法を開示している。グリコール酸の選択性は、グリコール酸アミドの形成なしにほぼ１００％と報告されている。米国特許公報（特許文献２０）は、グリコール酸を含む、α−ヒドロキシニトリルからα−ヒドロキシ酸を製造するための方法の実施例を開示している。この開示により、すべての微生物触媒が前記課題により高濃度のグリコール酸を製造できるわけではないことが認められ、産業上、有利な微生物を見出すためにスクリーニング試験を行う必要があることが示される。米国特許公報（特許文献２０）は、具体的には、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）種およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）種を同定している。α−ヒドロキシニトリルまたはα−ヒドロキシ酸の抑制効果に耐性である微生物は、耐久性の活性を有し、高濃度で所望の生成物を製造しうる。
【００１０】
アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）は、脂肪族ニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．７）活性のほか、ニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８４）活性およびアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．４）活性の組合せによっても特徴づけられる。米国特許公報（特許文献２４）は、短時間に３５−７０℃下、適切な緩衝液中でアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ））７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）の懸濁液を加熱し、所望のニトリラーゼ活性の大幅な減少をもたらすことなく、全細胞触媒の望ましくないニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を非活性化することを開示している。
【００１１】
Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）ニトリラーゼをコードする遺伝子はクローン化され、組換え発現されている（米国特許公報（特許文献２５）に対応する（特許文献２６）および（非特許文献４）。Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼは、グリコール酸（米国特許公報（特許文献２７））を含む、α−ヒドロキシニトリルを対応するα−ヒドロキシカルボン酸に高い収量で変換する（米国特許公報（特許文献２８））。しかし、１００％変換までの高い収量でグリコロニトリルのグリコール酸への変換の改善されたニトリラーゼ活性を有する変異ニトリラーゼは、工業製造費用を削減するためにきわめて有用であろう。
【００１２】
酵素触媒を使用するグリコール酸を製造する方法は、高濃度でグリコロニトリルをグリコール酸に変換しうる酵素触媒の使用を経済的に必要とし、および高い触媒生産性（ｋｇグリコール酸／ｋｇ酵素触媒）および容積生産性（グリコール酸／Ｌ／時のグラム）がある。酵素触媒は多重連続バッチ反応、またはグリコロニトリルの一定の添加およびグリコール酸の除去を使用する連続反応で使用でき、いずれかの操作モードにおいて、触媒活性および寿命は高い容積生産性および触媒生産性が得られるようになり、かつバッチ反応の場合には、触媒は連続バッチ反応間の酵素活性の大幅な喪失なしに多重反応サイクルで利用されなければならない。グリコロニトリル加水分解に対する改善されたニトリラーゼ活性を有する変異性ニトリラーゼは容積生産性における改善を提供しうる。グリコロニトリル反応混合物における遊離ホルムアルデヒド（およびおそらく他の不純物）の不活性化効果が、さまざまな程度にすべてのニトリラーゼ触媒に好ましくない影響を及ぼすという事実を踏まえて、グリコロニトリルの加水分解のための反応条件下で酵素活性を安定化する改善（結果として触媒生産性の相対的増大をもたらす）も必要である。
【００１３】
解決すべき課題は、グリコロニトリルの加水分解のためのニトリラーゼ活性の大幅な改善を示す酵素触媒を使用するグリコール酸容積生産性を増大させる方法を提供することである。解決すべき追加の課題は、グリコール酸製造のために酵素触媒の生産性および安定性を増大させ、それによって、酵素触媒費用および全体的な製造費用を削減する方法を提供することである。
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００５／１０６００５Ａ１号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，２２３，４１６号明細書
【特許文献３】特開平０４−９９４９５号公報
【特許文献４】特開平０４−９９４９６号公報
【特許文献５】特開平０４−２１８３８５号公報
【特許文献６】米国特許第５，２３４，８２６号明細書
【特許文献７】特開平０４−９９４９７号公報
【特許文献８】米国特許第５，２９６，３７３号明細書
【特許文献９】特開平０５−９５７９５号公報
【特許文献１０】米国特許第５，３２６，７０２号明細書
【特許文献１１】特開平０５−２１９８７号公報
【特許文献１２】特開平０５−１９２１８９号公報
【特許文献１３】欧州特許第０６１００４８Ａ号明細書
【特許文献１４】特開平０６−２３７７８９号公報
【特許文献１５】欧州特許第０６１００４９Ａ号明細書
【特許文献１６】特開平０６−２８４８９９号公報
【特許文献１７】米国特許第５，５０８，１８１号明細書
【特許文献１８】特開平０７−２１３２９６号公報
【特許文献１９】米国特許第５，７５６，３０６号明細書
【特許文献２０】米国特許第６，０３７，１５５号明細書
【特許文献２１】米国特許第３，９４０，３１６号明細書
【特許文献２２】特開昭６１−５６０８６号公報
【特許文献２３】特開平０９−２８３９０号公報
【特許文献２４】米国特許第５，８１４，５０８号明細書
【特許文献２５】米国特許第６，８７０，０３８号明細書
【特許文献２６】国際公開第０１／７５０７７号パンフレット
【特許文献２７】米国特許第６，４１６，９８０号明細書
【特許文献２８】米国特許第６，３８３，７８６号明細書
【特許文献２９】米国特許第１０／９１９１８２号明細書
【特許文献３０】米国仮特許出願第６０／６３８１２８号明細書
【特許文献３１】米国仮特許出願第６０／６３８１４８号明細書
【特許文献３２】米国特許出願第６０／６３８１２６号明細書
【特許文献３３】米国特許第５，６０５，７９３号明細書
【特許文献３４】米国特許第５，８１１，２３８号明細書
【特許文献３５】米国特許第５，８３０，７２１号明細書
【特許文献３６】米国特許第５，８３７，４５８号明細書
【特許文献３７】米国特許第２，１７５，８０５号明細書
【特許文献３８】米国特許第２，８９０，２３８号明細書
【特許文献３９】米国特許第５，１８７，３０１号明細書
【特許文献４０】米国仮特許出願第６０／６３８１２７号明細書
【特許文献４１】米国特許第２００４／０２１００８７号明細書
【特許文献４２】米国特許第２００４／０１３８４０９Ａ１号明細書
【特許文献４３】米国特許第６，２９１，７０８  Ｂ１号明細書
【非特許文献１】Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  第４２巻、１８９頁（１９４８年）
【非特許文献２】Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４６巻、１１６５頁（１９８２年）
【非特許文献３】ツルネイックス（Ｔｏｕｒｎｅｉｘ）ら、Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、５２：１７３−１８２頁  （１９８６年）
【非特許文献４】チャーハン（Ｃｈａｕｈａｎ）ら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、６１：１１８−１２２頁（２００３年）
【非特許文献５】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：３０２１−３０３０頁（１９８５年）
【非特許文献６】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１９（第２号）：３４５−３７３頁（１９８４年）
【非特許文献７】オウチクロフ（Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ、２４（１）：１８−２４頁（２００２年）
【非特許文献８】フェング（Ｆｅｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（５０）：１５３９９−１５４０９頁（２０００年））
【非特許文献９】コワン（Ｃｏｗａｎ）ら、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ、２：２０７−２１６頁（１９９８年）
【非特許文献１０】ペース（Ｐａｃｅ），Ｈ．およびブレナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ），Ｃ．、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２（１）：ｒｅｖｉｅｗｓ  １−９頁（２００１年）
【非特許文献１１】オーレイリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ），Ｃ．およびターナー（Ｔｕｒｎｅｒ），Ｐ．、Ｊ    Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、９５：１１６１−１１７４頁（２００３年）
【非特許文献１２】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ、ゴルドン（Ｇｏｒｄｏｎ）Ｆ．ビッカースタッフ（Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ）編、フマーナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、米国（ＵＳＡ）、１９９７年
【非特許文献１３】Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ムロッカ（Ｍｕｒｏｏｋａ）ら編、マルセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）（１９９４年）
【非特許文献１４】メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（４）：１０５６−１０６２頁（１９９９年）
【非特許文献１５】（クームス（Ｃｏｏｍｂｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９８年）、２５９−３１１頁、１プレート。Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ、Ｒｕｔｈ  Ｈｏｇｕｅ編、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）：カリフォルニア州サンディアゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）
【非特許文献１６】フロマント（Ｆｒｏｍａｎｔ）ら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２２４（１）：３４７−５３頁（１９９５年）
【非特許文献１７】リン・ゲルケ（Ｇｏｅｒｋｅ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２３（３）：４０９−１２頁（１９９７年）
【非特許文献１８】サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州（ＮＹ）（１９８９年）
【非特許文献１９】ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）ら、ＰＮＡＳ、９４：１０６９−１０７３頁  （１９９７年）
【非特許文献２０】グルスリー（Ｇｕｒｔｈｒｉｅ），Ｊ．およびクリモア（Ｃｕｌｌｉｍｏｒｅ），Ｐ．、Ｃａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．、５８（１３）：１２８１−１２９４頁
【非特許文献２１】トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９年）シナウアー・アソシエーツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、マサチューセッツ州（ＭＡ）（１９８９年）
【非特許文献２２】デスパンデ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）、ムクンド（Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６（３）：  ２２７−２３４頁（１９９２年）
【非特許文献２３】Ｐｅｒｒｙ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ’  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第７版、ペリー（Ｐｅｒｒｙ）、ロバート（Ｒｏｂｅｒｔ）Ｈ．、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、ダウ（Ｄｏｗ）  Ｗ．、およびマロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）、ジェームス（Ｊａｍｅｓ）Ｏ．編、マグロウヒルカンパニー社（ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ニューヨーク州（ＮＹ）、１９９７年、以後「Ｐｅｒｒｙ’ｓ」を参照
【非特許文献２４】ワセワル（Ｗａｓｅｗａｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９７：５９−６８頁  （２００２年）
【非特許文献２５】タマダ（Ｔａｍａｄａ）ら、Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：１３１９−１３２６頁（１９９０年）、
【非特許文献２６】タマダ（Ｔａｍａｄａ）ら、Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．  ２９：１３２７−１３３３頁（１９９０年）
【非特許文献２７】インシ（Ｉｎｃｉ），Ｉ．（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｑ．，１６（２）：８１−８５年（２００２年）
【非特許文献２８】インシ（Ｉｎｃｉ），Ｉ．およびウスル（Ｕｓｌｕ），  Ｈ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｄａｔａ、５０：５３６−５４０頁（２００５年）
【非特許文献２９】グルスリー（Ｇｕｒｔｈｒｉｅ），Ｊ．およびクリモア（Ｃｕｌｌｉｍｏｒｅ），Ｐ．、Ｃａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．、５８（１３）：１２８１−１２９４頁、
【非特許文献３０】トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、（１９８９年）第２版、シナウアー・アソシエーツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、マサチューセッツ州（ＭＡ））
【非特許文献３１】Ｔ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベナン（Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、（１９８４年）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ、ニューヨーク州（ＮＹ）
【非特許文献３２】オーズベル（Ａｕｓｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９９４−１９９８年）ジョン・ワイリー（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ）＆サンズ（Ｓｏｎｓ）社（Ｉｎｃ．）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、グリコロニトリルからのグリコール酸の酵素的製造のための方法を提供する。
ａ）グリコロニトリルを適切な水性反応混合物中でニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒と接触させるステップであって、前記ポリペプチドが、
（１）アミノ酸残基１６８でのリシン、メチオニン、トレオニン、またはバリンによる置換、および
（２）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換と
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を有し、それによってグリコール酸が製造されるステップと、
（ｂ）塩または酸の形で（ａ）において製造されるグリコール酸を回収するステップを含み、前記酵素触媒が、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供することを特長とするグリコロニトリルからグリコール酸を製造する方法が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様において、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供されるが、前記核酸分子は、
ａ）アミノ酸残基１６８でのメチオニン、またはトレオニンによる置換、および
ｂ）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換による配列番号６のアミノ酸配列を有し、前記ポリペプチドが、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供する核酸分子が提供される。
【００１７】
さらなる態様において、ニトリラーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
ａ）アミノ酸残基１６８でのメチオニン、またはトレオニンによる置換、および
ｂ）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換による配列番号６のアミノ酸配列を有し、前記ポリペプチドが、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供する単離ポリペプチドが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（配列表）
以下の配列の説明および本明細書に添付された配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５に記載された特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示を規定する規則に従うものである。配列の説明は、参照により本明細書で援用される、（非特許文献５）および（非特許文献６）に記載されたＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に従って定義されたヌクレオチド配列の特徴を表す１文字表記およびアミノ酸を表す３文字表記を含む。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および書式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載された規則に従うものである。
【００１９】
配列番号１は、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼコード配列を増幅するために使用されるプライマー１６５のヌクレオチド配列である。増幅ＰＣＲ生成物はその後にｐＵＣ１９へクローン化され（ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｅｖｅｒｙ、マサチューセッツ州（ＭＡ）、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）Ｌ０９１３７）、プラスミドｐＳＷ１３８を作る。
【００２０】
配列番号２は、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼコード配列を増幅するために使用されるプライマー１６６のヌクレオチド配列である。増幅ＰＣＲ生成物はその後にｐＵＣ１９へクローン化され（ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｅｖｅｒｙ、マサチューセッツ州（ＭＡ）、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）Ｌ０９１３７）、プラスミドｐＳＷ１３８を作る。
【００２１】
配列番号３は、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼを増幅するために使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号４は、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼを増幅するために使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換え発現を促進するＴＴＧからＡＴＧへの開始コドンにおける変化を含むアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼコード配列のヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換え発現を促進するＴＴＧからＡＴＧへの開始コドンにおける変化を含む配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされるアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号７は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置２０１での単一アミノ酸置換をもたらした（Ｌ２０１Ｑ、Ｌｅｕ→Ｇｌｎ）。
【００２６】
配列番号８は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１（Ｌｅｕ２０１→Ｇｌｎ）での単一アミノ酸置換を含む変異ニトリラーゼ（配列番号７）の推定アミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号９は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌ２０１Ａ、Ｌｅｕ→Ａｌａ）をもたらした。
【００２８】
配列番号１０は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ａｌａ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号９）の推定アミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号１１は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌ２０１Ｃ、Ｌｅｕ→Ｃｙｓ）をもたらした。
【００３０】
配列番号１２は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｃｙｓ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号１１）の推定アミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号１３は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌ２０１Ｃ、Ｌｅｕ→Ｔｈｒ）をもたらした。
【００３２】
配列番号１４は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｔｈｒ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号１３）の推定アミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号１５は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌ２０１Ｇ、Ｌｅｕ→Ｇｌｙ）をもたらした。
【００３４】
配列番号１６は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌ２０１→Ｇｌｙ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号１５）の推定アミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１７は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌ２０１Ｈ、Ｌｅｕ→Ｈｉｓ）をもたらした。
【００３６】
配列番号１８は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌ２０１→Ｈｉｓ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号１７）の推定アミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１９は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌ２０１Ｋ、Ｌｅｕ→Ｌｙｓ）をもたらした。
【００３８】
配列番号２０は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌ２０１→Ｌｙｓ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号１９）の推定アミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号２１は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌ２０１Ｋ、Ｌｅｕ→Ａｓｎ）をもたらした。
【００４０】
配列番号２２は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ａｓｎ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号２１）の推定アミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号２３は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌ２０１Ｓ、Ｌｅｕ→Ｓｅｒ）をもたらした。
【００４２】
配列番号２４は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１での単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｓｅｒ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号２３）の推定アミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号２５は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置１６８での単一アミノ酸置換（Ｆ１６８Ｋ、Ｐｈｅ→Ｌｙｓ）をもたらした。
【００４４】
配列番号２６は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置１６８での単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｌｙｓ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号２５）の推定アミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号２７は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置１６８での単一アミノ酸置換（Ｆ１６８Ｍ、Ｐｈｅ→Ｍｅｔ）をもたらした。
【００４６】
配列番号２８は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置１６８での単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｍｅｔ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号２７）の推定アミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号２９は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置１６８での単一アミノ酸置換（Ｆ１６８Ｔ、Ｐｈｅ→Ｔｈｒ）をもたらした。
【００４８】
配列番号３０は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置１６８での単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｔｈｒ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号２９）の推定アミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号３１は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置１６８での単一アミノ酸置換（Ｆ１６８Ｖ、Ｐｈｅ→Ｖａｌ）をもたらした。
【００５０】
配列番号３２は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置１６８での単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｖａｌ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号３１）の推定アミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号３３は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置１６８での単一アミノ酸置換（Ｔ２１０Ａ、Ｔｈｒ→Ａｌａ）をもたらした。
【００５２】
配列番号３４は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置２１０での単一アミノ酸置換（Ｔｈｒ２１０→Ａｌａ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号３３）の推定アミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号３５は、コドン変化を含むＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異のヌクレオチド配列であり、これは結果として残基位置１６８での単一アミノ酸置換（Ｔ２１０Ｃ、Ｔｈｒ→Ｃｙｓ）をもたらした。
【００５４】
配列番号３６は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基位置２１０での単一アミノ酸置換（Ｔｈｒ２１０→Ｃｙｓ）を含む変異ニトリラーゼ（配列番号３５）の推定アミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号３７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７、参照により本明細書で援用される米国特許公報（特許文献２５）において発現されるＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００５６】
配列番号３８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）において発現されるＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（配列番号３３）の推定アミノ酸配列である。
【００５７】
以下の生物寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の下に行われた。すなわち、
【００５８】
【表１】
2008525030.tif 000002
【００５９】
本明細書で使用される「ＡＴＣＣ」は、ＡＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州（ＶＡ）２０１１０−２２０９、米国（ＵＳＡ）に設置されたアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション国際寄託機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）を指す。「国際寄託指定」はＡＴＣＣによる寄託における培養に対する登録番号である。
【００６０】
リストアップされた寄託は、指示国際寄託において少なくとも三十（３０）年間維持され、それを開示する特許の付与とともに一般の人々に利用可能となる。寄託の利用可能性は、政府の措置によって付与される特許権の特例において本発明を実践するための許可を構成することはない。
【００６１】
（発明を実施するための最良の形態）
上記の課題は、改善されたニトリラーゼ活性を有するアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ））７２Ｗニトリラーゼ変異を使用する高収量および高濃度で対応するグリコロニトリルからグリコール酸を調製する方法を提供することによって解決されている。上記課題を解決する方法としては、１）グリコロニトリルのグリコール酸への変換のための改善されたニトリラーゼ活性および／または改善された触媒生産性を有するアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ））７２Ｗニトリラーゼ変異の使用、および２）グリコロニトリルのグリコール酸への変換のための反応条件下で触媒安定性および／または生産性を改善する方法が挙げられる。グリコロニトリルのグリコール酸への変換のための反応条件下で触媒安定性／生産性を改善する方法としては、１）酵素触媒活性を安定化する添加剤の使用、２）実質的に酸素を含まない条件下の反応の実行、および３）グリコロニトリルの標的濃度が維持されるように反応混合物へのグリコロニトリルの供給速度の制御が挙げられる。
【００６２】
（定義）
本開示において、多くの用語および略語が使用される。以下の定義が、別段の規定がない限り適用される。
【００６３】
本明細書で使用される「を含む」は、請求の範囲において言及された規定された特徴、整数、ステップ、または成分の存在を意味するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分、またはそれのグループの存在または付加を排除することはない。
【００６４】
本明細書で使用される、使用される発明の成分または反応物質の量を修正する「約」という語は、例えば、現状で濃縮物製造または溶液使用のために使用される典型的な測定および液体処理手順を通じて、これらの手順における不注意による誤りを通じて、組成物を製造し、または方法を実行するなどために使用される成分の製造、供給源、または純度の差異を通じて生じる数量のばらつきを指す。「約」という語は、特定の初期混合物に由来する組成物に対する異なる平衡条件により異なる量をも包含する。「約」という語によって修正されているかどうかに関係なく、請求の範囲は、量の同等物を含む。１つの実施形態において、「約」という語は、報告された数値の１０％以内、好ましくは、報告された数値の５％以内を意味する。
【００６５】
本明細書で使用される「回収」は、本方法によって形成される生成物の単離、精製、または移動を意味する。当技術分野で公知である反応混合物から生成物を単離し、精製する方法は、選択的沈殿、結晶化、ろ過、反応性溶媒抽出、イオン交換、電気透析、重合、蒸留、熱分解、アルコール分解、およびそれらの組合せを含みうるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、「回収」という語は、生成物混合物（一般的に酵素触媒のろ過後）を別の反応に移し、１つまたは複数の追加の生成物を作成することをも含みうる。
【００６６】
本明細書で使用される「酵素触媒」または「微生物細胞触媒」という語は、グリコロニトリルをグリコール酸およびアンモニアに変更するためのニトリラーゼ活性（すなわち、ニトリラーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む）によって特徴づけられる触媒を指す。酵素触媒は、全微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたは複数の成分、部分的に精製された酵素、または精製酵素の形でありうる。酵素触媒は、可溶性または不溶性支持体内またはその上で遊離（非固定化）または固定化でありうる。本明細書で使用される「リサイクルされた酵素触媒」は、バッチ反応で酵素触媒として再使用される酵素触媒を指す。
【００６７】
本明細書で使用される「触媒生産性」および「酵素触媒生産性」という語は、触媒のグラム当りの製造される生成物の総量を指す。本発明において、触媒はニトリラーゼ酵素（ＥＣ３．５．５．７）であり、形成される生成物はグリコール酸および／またはグリコール酸アンモニウムである（反応のｐＨに依存）。一般に、本方法は、製造されるグリコール酸が主にグリコール酸の対応する塩の形であるように（すなわち、グリコール酸アンモニウム）本質的にｐＨが中性条件下で行われる。一般に、触媒リサイクルとのバッチ反応において、触媒活性は各々のリサイクル反応とともに減少する（酵素不活性化）。
【００６８】
本明細書で使用される「アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）」、「アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ」、および「Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）」は置き換え可能に使用され、登録番号５５７４６（「ＡＴＣＣ５５７４６」）を有するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（国際寄託機関）に寄託されたアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗを指す。
【００６９】
本明細書で使用される「大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）」および「Ｅ．ｃｏｌｉ」という語は置き換え可能に使用される。組換え発現に適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一部の株は、国際寄託番号ＡＴＣＣ４７０７６を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５、国際寄託番号ＡＴＣＣ５３９１１を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５、国際寄託番号ＡＴＣＣ２７３２５を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０、国際寄託番号ＡＴＣＣ３５６９５を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ４１００、および国際寄託番号ＡＴＣＣ１２４３５を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ１４８５を含むが、これらに限定されない。１つの実施形態において、適切な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５（ＡＴＣＣ５３９１１）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）を含む。
【００７０】
本明細書で使用される「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１」または「ＳＳ１００１」という語は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１７７を有するアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ））７２Ｗニトリラーゼを発現する形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を指す（米国特許公報（特許文献２５）、本明細書で全体として参照により援用される）。組換え発現大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１ニトリラーゼ（配列番号３８）は、野生型７２Ｗニトリラーゼ配列（配列番号６）と比べ２つの小さな配列変化を含有する。開始コドンはＧＴＧからＡＴＧに変化して組換え発現を促進し、アーチファクトがクローニング中に導入され、結果としてＣ末端近くに単一アミノ酸変化をもたらした（Ｐｒｏ３６７［ＣＣＡ］→Ｓｅｒ［ＴＣＡ］）。
【００７１】
本明細書で使用される「グリコロニトリル」という語は「ＧＬＮ」と略され、ヒドロキシアセトニトリル、２−ヒドロキシアセトニトリル、ヒドロキシメチルニトリル、およびＣＡＳ登録番号１０７−１６−４の他のすべての同義語と同義である。
【００７２】
本明細書で使用される「グリコール酸」という語は「ＧＬＡ」と略され、ヒドロキシ酢酸、ヒドロキシエタン酸と同義であり、ＣＡＳ登録番号７９−１４−１の他のすべての同義語である。本方法によって製造されるグリコール酸は、プロトン化したカルボン酸および／または対応するアンモニウム塩の形でありうる。
【００７３】
本明細書で使用される「グリコール酸アンモニウム」という語は、「ＮＨ4ＧＬＡ」と略される。
【００７４】
本明細書で使用される「グリコリド」という語は、ＣＡＳ登録番号５０２−９７−６の化合物を指す。
【００７５】
本明細書で使用される「適切な水性グリコロニトリル反応混合物」および「適切な水性反応混合物」という語は、グリコロニトリルおよび酵素触媒が接触することになる材料および水を指す。
【００７６】
本明細書で使用される「ニトリラーゼ触媒」という語は本明細書において、ニトリラーゼ活性（ＥＣ３．５．５．７）によって特徴づけられる酵素触媒を指す。ニトリラーゼ酵素が直接、中間体として対応するアミドを形成することなく脂肪族ニトリルを対応するカルボン酸に変換する（式１）。
【００７７】
【化１】
2008525030.tif 000003
【００７８】
本明細書で使用される「改善されたニトリラーゼ」、「変異ニトリラーゼ」、「アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ変異ニトリラーゼ」、および「タンパク質改変ニトリラーゼ」という語は、同一の反応条件下でＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼと比べグリコロニトリルのグリコール酸への変換に向けた大幅に改善されたニトリラーゼ活性を有する本ニトリラーゼを指すために置き換え可能に使用される。１つの実施形態において、ニトリラーゼ活性の改善は、組換え発現され（同一の発現系を使用）、本質的に同一の反応条件下でアッセイされる場合、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対する本変異ニトリラーゼ触媒のニトリラーゼ活性を比較することによって判定されうる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、本変異とそのそれぞれの対照（配列番号６）との間のタンパク質発現レベルが本質的に同一であることを示した。かかるものとして、ニトリラーゼ活性の改善は、天然Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼに対する構造的改良の結果と考えられている。
【００７９】
「ニトリラーゼ活性」という語は、グリコロニトリルをグリコール酸（または対応するグリコール酸アンモニウム）に変換する場合のタンパク質の単位質量（例えば、ミリグラム）、乾燥細胞重量、またはビーズ重量（固定化触媒）当りの酵素活性を指す。ニトリラーゼ活性の比較は、乾燥細胞重量またはビーズ重量に比例して測定された。Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ対照（配列番号６）と改善された変異との間のニトリラーゼ発現レベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーザー濃度分析を使用して数量的に区別できないため、ニトリラーゼ活性の比較および報告された改善は、乾燥細胞重量（ｄｃｗ）またはビーズ重量（ｂｗ）に対して測定された。
【００８０】
本明細書で使用される「酵素活性の１単位」または「ニトリラーゼ活性の１単位」または「Ｕ」という語は、規定温度（例えば、２５℃）で毎分１μｍｏｌのグリコール酸生成物（ＧＬＡ  Ｕ／ｇ乾燥細胞重量またはビーズ重量）の製造に必要とされる酵素活性の量と定義される。
【００８１】
本明細書で使用される「相対ニトリラーゼ活性」、「改善されたニトリラーゼ活性」、および「ニトリラーゼ活性の相対改善」という語は、基準（対照）ニトリラーゼ活性の倍数（または分数）として表現されるニトリラーゼ活性を指す。本変異ニトリラーゼは、天然アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼで確認されるニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の大幅な改善を示す。本発明において、相対ニトリラーゼ活性における「大幅な改善」は、同一の反応条件下で対照（Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ、配列番号６）のニトリラーゼ活性と比べ少なくとも１．５倍高いニトリラーゼ活性の改善である。別の実施形態において、この改善は、同一の反応条件下で対照のニトリラーゼ活性と比べ少なくとも２倍高いニトリラーゼ活性である。さらなる実施形態において、この改善は、同一の反応条件下で対照のニトリラーゼ活性と比べ少なくとも４倍高いニトリラーゼ活性である。
【００８２】
本明細書で使用される「初期反応速度」という語は、指定反応条件下でのグリコロニトリルのグリコール酸への変換の速度の測定であり、反応速度の測定はグリコロニトリルの反応混合物への初期添加とともに開始し、ここで反応速度はある期間にわたって測定され、グリコロニトリルの濃度は反応の経過中、約５０ミリモル（ｍＭ）を上回ったままである。反応速度は単位時間当りに製造されるグリコール酸の濃度の変化として測定される（例えば、モルグリコール酸／Ｌ／分またはｍＭグルコール酸／時）。
【００８３】
本明細書で使用される「組換え生物」、「形質転換宿主」、「形質転換体」、トランスジェニック生物」、および「形質転換微生物宿主」という語は、異種または外来ＤＮＡで形質転換されている宿主生物を指す。本発明の組換え生物は、活性ニトリラーゼ酵素をコードする外来コード配列または遺伝子を発現する。「形質転換」は、ＤＮＡ断片の宿主生物への移動を指す。移動ＤＮＡ断片は、染色体または染色体外に宿主生物へ（すなわち、ベクターによって）組込まれうる。本明細書で使用される「形質転換カセット」という語は、通常、プラスミドの一部として宿主細胞への挿入のための便利に配置された一連の遺伝要素を含有するＤＮＡの特定の断片を指す。本明細書で使用される「発現カセット」という語は、宿主における遺伝子発現の増強も可能にする、通常、プラスミドの一部として宿主細胞への挿入のために便利に配置される一連の遺伝要素を含有するＤＮＡの特定の断片を指す。
【００８４】
本明細書で使用される「核酸断片」および「核酸分子」という語は、コード配列に先行する（５’、上流）またはこれに続く（３’、下流）全遺伝子、コード配列、および／または調節塩基配列をコードしうるＤＮＡ分子を指す。１つの態様において、本核酸分子は、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００８５】
本明細書で使用される「遺伝子」という語は、特定のタンパク質を発現する核酸分子を指す。本明細書で使用される通り、これはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびこれに続く（３’非コード配列）調節配列を含むことも含まないこともありうる。「天然遺伝子」はそれ自身の調節配列で自然に存在する遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然にはいっしょに存在しない調節およびコード配列を含む天然遺伝子ではない遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源由来である調節配列およびコード配列、または同一の起源由来であるが、自然に存在するものと異なる形で配置された調節配列およびコード配列を含んで成りうる。「内在性遺伝子」は、生物のゲノムにおけるその自然の位置における天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物には通常存在しないが、遺伝子導入によって宿主生物へ導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物、またはキメラ遺伝子へ挿入される天然遺伝子を含んで成りうる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムへ導入されている遺伝子である。
【００８６】
本明細書で使用される「コード配列」という語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。本明細書で使用される通り、「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、範囲内、または下流（３’非コード配列）に位置し、かつ関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含みうる。
【００８７】
「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’に位置している。プロモーターは、全体として、天然遺伝子由来であり、自然に存在する異なるプロモーター由来の異なる要素から成り、または合成ＤＮＡ断片を含んでなりうる。ほとんどの細胞型でほとんどの時間にまたはほとんどの環境条件下で遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。特定の化合物または環境条件の存在下のみに遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「誘導的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に規定されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片は同一のプロモーター活性を有しうる。
【００８８】
本明細書で使用される「機能しうるように連結」という語は、１つの配列の機能がその他によって影響されるような単一核酸分子での核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を与えることが可能である場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）コード配列と機能しうるように連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンスの配向で調節配列に機能しうるように連結されうる。
【００８９】
本明細書で使用される「３’非コード配列」という語は、コード配列の下流に位置したＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列（通常、真核生物に限定）、およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナル（通常、真核生物に限定）は通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸断片の付加に影響を及ぼすことによって特徴づけられる。
【００９０】
当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用における特定の宿主細胞によって示される「コドン−バイアス」を十分に知っている。したがって、宿主における改善された発現のための遺伝子を合成する場合、そのコドンの用法が宿主細胞の好ましいコドンバイアスを反映するように遺伝子をデザインすることが望ましい。配列情報が入手可能である宿主細胞由来の遺伝子の調査によりそのコドンバイアスが決定されうる。コドン最適化が当技術分野で公知であり、酵母（非特許文献７）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（非特許文献８）を含むがこれらに限定されないさまざまな系について記載されている。
【００９１】
（アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）ニトリラーゼ）
Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．１）は脂肪族または芳香族ニトリルからカルボン酸を製造するための強固な触媒である（（特許文献２６）、米国特許公報（特許文献２５）、およびチャーハン（Ｃｈａｕｈａｎ）ら、上記）。これはα−ヒドロキシニトリル（すなわち、グリコロニトリル）のα−ヒドロキシカルボン酸（すなわち、グリコール酸）の変換を触媒することも証明されている（米国特許公報（特許文献２８）および米国特許公報（特許文献２７）を参照）；参照により全体として本明細書で援用される。
【００９２】
Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼを含む既知のニトリラーゼすべては、酵素活性部位において求核システインを有し（非特許文献９）、（非特許文献１０）、およびチャーハン（Ｃｈａｕｈａｎ）ら、上記）、かつすべてはチオール試薬（１．０ｍＭ濃度の塩化銅、硝酸銀、酢酸第二水銀、塩化第二鉄の各々がＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ酵素活性の主な減少をもたらした）によって不活性化の影響を受けやすい。システイン残基は、非可逆的にスルフィン酸に酸化されることも可能であり、結果として酵素活性の喪失をもたらす。さまざまな不活性化機序に対するニトリラーゼ酵素の感度にもかかわらず、固定化Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ細胞は強固であり、多くのリサイクル反応後にそのニトリラーゼ活性の多くを保持することが可能である（米国特許公報（特許文献２５））。
【００９３】
Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの他の細菌ニトリラーゼとの配列比較が報告されている（米国特許公報（特許文献２５）、チャーハン（Ｃｈａｕｈａｎ）ら、上記）。７２Ｗニトリラーゼは、アミノ末端近くの１６アミノ酸領域（配列番号６のアミノ酸残基４０−５５）および必須システイン残基を含有する触媒領域（配列番号６のアミノ酸残基１６０−１７３）を含むいくつかの保存署名ドメインを有する。このシステイン残基（配列番号６のＣｙｓ１６４）は、保存グルタミン酸（配列番号６のＧｌｕ４８）およびリシン残基（配列番号６のＬｙｓ１３０）とともに、すべてのニトリラーゼに存在する触媒トリアドモチーフを形成する（ペース（Ｐａｃｅ），Ｈ．およびブレナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ），Ｃ．、上記）。一部の構造的類似性が報告されたニトリラーゼの中に保たれていたが、基質特異性は大きく異なる（非特許文献１１）。
【００９４】
（突然変異ニトリラーゼ酵素特性）
Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ由来のいくつかの変異ニトリラーゼは以前に報告されている（米国特許公報（特許文献２９）、参照により本明細書で援用される）。米国特許公報（特許文献２９）において、さまざまな変異ニトリラーゼが選択され、３−ヒドロキシニトリルを３−ヒドロキシ酸（すなわち、３−ヒドロキシブチロニトリルおよび３−ヒドロキシバレロニトリル）に変換するためのニトリラーゼ活性における相対的改善（組換え発現された天然７２Ｗニトリラーゼの活性に対して）についてスクリーニングした。
【００９５】
米国特許公報（特許文献２９）に記載されたニトリラーゼ変異とともに使用される発現系は、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＴＯＰ１０（いずれもインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）製、カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に基づく。ニトリラーゼ変異Ｆ１６８Ｌ（配列番号６においてＰｈｅからＬｅｕに変化した残基１６８）、Ｆ１６８Ｖ（ＰｈｅからＶａｌに変化した残基１６８、配列番号３２）、Ｆ１６８Ｋ（ＰｈｅからＬｙｓに変化した残基１６８、配列番号２６）、Ｔ２１０Ａ（ＴｈｒからＡｌａに変化した残基２１０、配列番号３４）、およびＴ２１０Ｃ（ＴｈｒからＣｙｓに変化した残基２１０、配列番号３６）の活性を、実施例２に記載された方法を使用する同一の発現システムにおける天然酵素（「対照」、配列番号６）と比較した。おそらくＧＬＮをＧＬＡに変換させる場合大幅に改善されたニトリラーゼ活性を有するとして最初に同定された突然変異Ｆ１６８Ｌ、Ｔ２１０Ａ、およびＴ２１０Ｃは、その後に天然の７２Ｗニトリラーゼと同様のニトリラーゼ活性を有することがわかった。意外にも、米国特許公報（特許文献２９）に記載された変異ニトリラーゼの２つ（Ｆ１６８Ｋ、Ｐｈｅ１６８→Ｌｙｓ；Ｆ１６８Ｖ、Ｐｈｅ１６８→Ｖａｌ）（本明細書では、それぞれ、配列番号２６および３２によって示される）はグリコロニトリル（２−ヒドロキシニトリル）をグリコール酸に変換させる場合ニトリラーゼ活性の大幅な改善も示した。しかし、米国特許公報（特許文献２９）に記載された他の変異ニトリラーゼ（例えば、Ｔ２１０Ａ、配列番号３４、Ｔ２１０Ｃ、配列番号３６）は、グリコロニトリルをグリコール酸に変換してもニトリラーゼ活性の大幅な改善を示さなかった。
【００９６】
本実施例に記載されている通り、変異性ＰＣＲおよび標的飽和突然変異誘発を使用し、天然７２Ｗニトリラーゼコード配列（配列番号５）をランダムに突然変異させた。結果として、アミノ酸残基位置１６８（野生型配列におけるフェニルアラニン）および２０１（野生型配列におけるロイシン）でのアミノ酸置換をもたらした突然変異は、ニトリラーゼ活性を大幅に増大させると思われた。本明細書で使用される「アミノ酸残基位置）という語は、Ｎ末端メチオニン残基から測定されるとき基準配列（配列番号６）に対して特定の位置に存在するアミノ酸を指す。標的飽和突然変異誘発を行い、両方の残基位置（１６８および２０１）でのすべてのアミノ酸置換を評価した。グリコロニトリルをグリコール酸（すなわち、本反応条件下でグリコール酸アンモニウム塩の形で）に変換する大幅に改善されたニトリラーゼ活性を有するいくつかの追加の変異が同定された。本変異ニトリラーゼは、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ））７２Ｗニトリラーゼ配列（配列番号６）に対して少なくとも１つのアミノ酸置換からなる。かかるものとして、本変異のニトリラーゼの各々のアミノ酸配列は、本明細書に記載されている通り少なくとも１つのアミノ酸置換されたアミノ酸配列配列番号６（基準配列）を有する。
【００９７】
１つの実施形態において、本方法において有用な適切な変異ニトリラーゼは、
ａ）アミノ酸位置１６８でのリシン、メチオニン、トレオニン、またはバリンの置換、および
ｂ）アミノ酸位置２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンの置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換で配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列含んで成り、前記ポリペプチドは、グリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合ニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の改善を示す。
【００９８】
別の実施形態において、本方法において有用な適切な変異ニトリラーゼは、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。さらに別の実施形態において、本方法において有用な適切な変異ニトリラーゼは、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００９９】
１つの態様において、本発明は、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を含み、前記ポリペプチドが、
ａ）アミノ酸残基１６８でのメチオニン、またはトレオニンによる置換、および
ｂ）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を伴う配列番号６のアミノ酸配列を有し、前記ポリペプチドが、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供する。
【０１００】
別の態様において、本発明は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２８、および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を含む。さらなる態様において、本発明は、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２７、および２９からなる群から選択される核酸配列を有する単離核酸分子を含む。
【０１０１】
１つの実施形態において、本発明は、ニトリラーゼ活性を有する単離ポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは、
ａ）アミノ酸残基１６８でのメチオニン、またはトレオニンによる置換、および
ｂ）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を伴う配列番号６のアミノ酸配列を有し、前記ポリペプチドが、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供する。
【０１０２】
別の実施形態において、本発明は、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２８、および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１０３】
測定された活性の単位（Ｕ）を触媒重量で割ることによってニトリラーゼ活性を計算した。触媒重量は、精製タンパク質重量、湿細胞重量、乾燥細胞重量、または固定化触媒の重量に関して測定されうる（すなわち、カラギナンおよび／またはＧＡ／ＰＥＩ架橋触媒／アルギン酸ビーズを使用）。本発明において、ニトリラーゼ活性は、乾燥細胞重量のグラム当りの活性の単位（Ｕ／ｇ  ＤＣＷ）または触媒ビーズのグラム当りの活性の単位として報告された（固定化触媒比較）。単位触媒重量としての乾燥細胞重量に基づくニトリラーゼ活性比較により、ニトリラーゼタンパク質生成のレベルを考慮しなければならない。さまざまな形質転換体とそのそれぞれの対照との間のニトリラーゼ酵素の発現レベルを測定し、本質的に同一であることを確認した（すなわち、同一の遺伝背景において比較した場合）。したがって、さまざまな変異の報告されたニトリラーゼ活性における改善は、酵素の構造的変更の結果であると考えられた。
【０１０４】
変異ニトリラーゼの（およびＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）ニトリラーゼ対照の）コード配列を同一のベクター背景（ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）またはｐＵＣ１９）および宿主において発現させた。すなわち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（インビトロジェン）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５（ＡＴＣＣ５３９１１）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）。相対的改善は、同一のベクターおよび宿主背景を使用して適切な対照との比較に基づいた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（レーザー密度計を使用した量化）は、各変異（および対照）におけるニトリラーゼタンパク質発現レベルが本質的に等しいことを明らかに示した（使用された同一の発現システムおよび宿主により予想通り）。相対的酵素活性は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（配列番号６）を発現するそれぞれの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照形質転換体において測定されるニトリラーゼ活性に対してさまざまな変異触媒について測定されたニトリラーゼ活性の倍増として報告された。
【０１０５】
非固定化触媒について、変異ニトリラーゼのニトリラーゼ活性（Ｕ／ｇ乾燥細胞重量）を、乾燥細胞重量のグラム当り２５℃下、グリコロニトリルのグリコール酸への変換の速度（μｍｏｌ  ＧＬＡ／分）を測定することによって判定した。固定化触媒比較のために、２５℃下、グリコロニトリルのグリコール酸への変換の速度（μｍｏｌ  ＧＬＡ／分）を測定することによって活性を判定し、固定化細胞触媒ビーズのグラム当りのニトリラーゼ活性の単位（Ｕ／ｇビーズ）として報告した。ニトリラーゼ活性の１単位（Ｕ）は、２５℃下、１マイクロモルグリコール酸／分の生産と同等である。
【０１０６】
特定の変異ニトリラーゼについて、ＤＮＡコード領域内の点置換突然変異および結果として生じるアミノ酸変化は、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ））７２Ｗアミノ酸配列（配列番号６）を参照して、以下のフォーマットの１つを使用して規定される。すなわち
１．拡張フォーマット：野生型アミノ酸は（標準３文字略号を使用して）配列番号６内の対応するアミノ酸残基位置の後、同一の残基位置での変異内に存在する新しいアミノ酸ととともに提供される。例えば、「Ｐｈｅ１６８からＬｙｓ」または「Ｐｈｅ１６８→Ｌｙｓ」により、フェニルアラニンが突然変異の結果としてリシンに変化したアミノ酸残基位置１６８での配列番号６における突然変異が記載される。
２．短略フォーマット：野生型アミノ酸（標準単一文字略号によって表示）には配列番号６のアミノ酸残基位置が続いた後、変異アミノ酸（やはり標準単一文字略号によって表示）が続く。例えば、「Ｆ１６８Ｋ」により、フェニルアラニンが突然変異の結果としてリシンに変化したアミノ酸残基位置１６８での配列番号６における突然変異が記載される。
【０１０７】
（ニトリラーゼ触媒を使用するグリコロニトリルのグリコール酸への加水分解）
加水分解反応は、グリコロニトリルを含む水性反応混合物と酵素触媒を接触させることによって行われた。全組換え微生物細胞（本変異ニトリラーゼを発現する）を前処理なしに酵素触媒として使用することができる。微生物細胞触媒は反応混合物に直接添加され、または中空繊維膜カートリッジもしくは限外ろ過膜を使用してバルク反応混合物から別々に維持されうる。あるいは、微生物細胞はポリマーマトリックス（例えば、カラゲナンまたはポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）粒子）または不溶性固体支持体（例えば、セリット）に固定化され、酵素触媒の回収および再利用を促進する（米国特許公報（特許文献２５））。精製酵素または部分的精製酵素も全細胞から単離し、触媒として直接使用することができ、または触媒は、ポリマーマトリックスもしくは不溶性支持体に固定化されうる。細胞の固定化または単離酵素のための方法は広く報告されており、当業者に公知である（非特許文献１２）。Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ触媒の固定化は以前に報告されている（米国特許公報（特許文献２５））。
【０１０８】
水性反応混合物における酵素触媒の濃度は酵素触媒の特定の活性に依存し、反応の所望の速度を得るために選択される。加水分解反応における触媒として使用される微生物細胞の湿細胞重量は一般的に総反応体積のｍＬ当り０．００１グラム〜０．２５０グラムの湿細胞、好ましくは、ｍＬ当り０．００２グラム〜０．０５０グラムの湿細胞である。
【０１０９】
加水分解反応の温度は、反応速度および酵素触媒活性の安定性を制御するために選択される。反応の温度は、反応混合物の凝固点よりわずかに上（およそ０℃）〜約６５℃でありうるが、好ましい反応温度の範囲は約５℃〜約３５℃である。微生物細胞触媒懸濁液は、蒸留水中、または約５．０〜約１０．０、好ましくは、約５．５〜約８．０、より好ましくは、約５．５〜約７．７、かつ最も好ましくは、約６．０〜約７．７の反応の初期ｐＨを維持する緩衝液の水溶液中で細胞を懸濁することによって調製されうる。反応の進行とともに、反応混合物のｐＨは、対応するニトリル官能性からカルボン酸のアンモニウム塩の形成により変化しうる。反応は、ｐＨ制御なしにグリコロニトリルの変換を完了するために実行することができ、または適切な酸または塩基を反応の経過中に添加し、所望のｐＨを維持することができる。
【０１１０】
グリコロニトリルは２５℃下にすべての部分において水と完全に混和性であることがわかった。基質（すなわち、α−ヒドロキシニトリル）の可溶性も水相において溶液の温度および／または塩濃度（緩衝液またはグリコール酸アンモニウムとしても周知の生成物グリコール酸アンモニウム塩）に依存するよう反応条件が選ばれる場合、反応混合物は最初に２相から成りうる。すなわち、酵素触媒および溶解α−ヒドロキシニトリルを含有する水相、および有機相（非溶解α−ヒドロキシニトリル）。反応が進行すると、α−ヒドロキシニトリルは水相に溶解し、最終的に単一相の生成物混合物が得られる。反応は、酵素加水分解反応速度とほぼ同等の速度で反応混合物にα−ヒドロキシニトリルを添加することによって実行し、それによって単一相の水性反応混合物を維持し、高い開始材料濃度で酵素の基質阻害という潜在的な問題を回避することができる。
【０１１１】
グリコール酸はプロトン化したカルボン酸および／またはその対応するアンモニウム塩の混合物として生成物混合物において存在し（生成物混合物のｐＨに依存）、また生成物混合物に存在しうる緩衝液とともにカルボン酸の塩として存在しうる。グリコール酸生成物は、プロトン化したカルボン酸として、または、必要に応じて、カルボン酸の塩として、反応混合物から単離されうる。
【０１１２】
グリコロニトリルの完全変換時の生成物混合物におけるグリコール酸の最終濃度は、０．００１Ｍからグリコール酸生成物の溶解限度までの範囲でありうる。１つの実施形態において、グリコール酸の濃度は、約０．１０Ｍ〜約９．０Ｍとなる。別の実施形態において、グリコール酸の濃度は約０．２Ｍ〜約４．０Ｍとなる。グリコール酸は、反応混合物のｐＨを濃縮塩酸または硫酸などの適切な鉱酸で約１．０〜約３．０に調節し、適切な有機溶媒でグリコール酸を抽出することによって（触媒の除去後）生成物混合物から単離されうる。１つの実施形態において、適切な有機溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ（登録商標）３３６（アルキル基が長さＣ8〜Ｃ10である第３アルキルアミン、コグニス社（Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐ．）、オハイオ州シンチナティ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ））のメチルイソブチルケトン、１−オクタノール、１−デカノール、トルエン、キシレン（混合）、ケロシン、メチルｔ−ブチルエーテル、エチルエーテル、およびジクロロメタンからなる群から選択される１つまたは複数の希釈剤との混合物である（参照により本明細書で援用される（同時係属の（特許文献３０）を参照）。グリコール酸は水を使用して有機溶媒から逆抽出されうる。
【０１１３】
１つの実施形態において、有機抽出物は塩化ナトリウムで飽和され、適切な乾燥剤（例えば、硫酸マグネシウム）と接触され、ろ過され、溶媒は除去され（例えば、回転蒸発によって）高収量および高純度（一般的に純度９８．９９％）で所望の生成物が生じる。必要に応じて、生成物はさらに結晶化または蒸留によって精製されうる。
【０１１４】
別の実施形態において、グリコール酸は、直接脱アンモニアおよび／または濃縮、結晶化、反応性溶媒抽出、イオン交換、電気透析、解糖、重合、蒸留、熱分解（塩クラッキング）、アルコール分解、およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない他の精製方法を使用してグリコール酸アンモニウムから直接単離されうる（各出願が参照により全体として本明細書で援用される（同時係属の（特許文献３１）および同時係属の（特許文献３２））。
【０１１５】
（微生物発現）
本ニトリラーゼ変異は、異種宿主細胞、好ましくは、微生物宿主において製造されうる。本発明において特に有用となるのは、大規模な発酵方法に容易に適合される細胞である。かかる微生物は工業的バイオプロセスの当技術分野で公知であり、その例は、（非特許文献１３）において確認することができ、発酵性細菌のほか酵母および糸状菌を含む。宿主細胞としては、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）種、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、ハンセニュウラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）種、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）種、メチロバクテリア（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましいのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。変異ニトリラーゼ遺伝子が発現されうる適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞の例としては、本明細書に規定されている宿主細胞、およびＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）、ＦＭ５（ＡＴＣＣ５３９１１）、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、ＭＣ４１００（ＡＴＣＣ３５６９５）、Ｗ１４８５（ＡＴＣＣ１２４３５）、およびその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。別の態様において、好ましい大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株は、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）またはＦＭ５（ＡＴＣＣ５３９１１）である。
【０１１６】
Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの異種発現は以前に報告されている（チャーハン（Ｃｈａｕｈａｎ）ら、上記、および米国特許公報（特許文献２５））。チャーハン（Ｃｈａｕｈａｎ）らは、活性Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（配列番号３８）を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７７））を報告している。組換え発現（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１）ニトリラーゼのコード配列は、野生型７２Ｗニトリラーゼ配列（配列番号５および６）と比べ２つの小さな配列変化を含んだ。開始コドンはＧＴＧからＡＴＧに変化し、組換え発現を促進し、クローニング中にアーチファクトが導入され、結果としてＣ末端の近くに単一アミノ酸変化をもたらした（Ｐｒｏ３６７［ＣＣＡ］→Ｓｅｒ［ＴＣＡ］）。
【０１１７】
産業上適切な宿主における組換え発現はいくつかの利点を有する。第一に、一般的に使用される生産宿主の多くのための遺伝子ツールボックスは通常、目的の遺伝子が得られた微生物の多くのために利用可能な遺伝子ツールボックスと比べ十分に開発されている。これらの宿主における組換え発現は通常、天然宿主における発現よりも費用効果がある。例えば、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ細胞は、発酵によって増殖される場合、比較的高価な炭素基質であるグリセロール上で増殖し、安価なグルコースを使用して有効に増殖しないことが証明されている。対照的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体は、約半分の時間でＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ細胞と同一の細胞密度にグルコース上で増殖し、バイオ触媒製造費用を大幅に削減しうる（米国特許公報（特許文献２５））。
【０１１８】
外来タンパク質の高レベルの発現を方向づける調節塩基配列を含有する微生物発現システムおよび発現ベクターが当業者に公知である。これらを使用し、本変異ニトリラーゼの遺伝子産物の生成ためのキメラ遺伝子を構成しうる。次いで、これらのキメラ遺伝子は、形質転換によって適切な微生物へ導入され、変異ニトリラーゼ酵素の高レベルの発現を提供しうる。本発明の核酸分子は、天然Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのものに対して増強または変化したニトリラーゼ活性レベルを有する遺伝子産物を生成するために使用される。１つの態様において、本変異遺伝子によってコードされるポリペプチドは、グリコロニトリルをグリコール酸に変換するためにニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の改善（配列番号６によって表されるＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの活性と比べ）を提供する。
【０１１９】
キメラ遺伝子は宿主細胞の特性の変更において有効となる。例えば、適切なプロモーターの制御下に本ニトリラーゼをコードするキメラ遺伝子の少なくとも１つのコピーを宿主細胞に導入することにより、グリコロニトリルをグリコール酸に変換する改善された能力が宿主細胞に与えられる。本発明のキメラ遺伝子は、本変異ニトリラーゼ配列の遺伝子発現を推進するために有用な適切な調節塩基配列を含む。調節塩基配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、およびリボソーム結合部位を含むであろうが、これらに限定されない。これらの配列が宿主生物由来であれば好ましく、しかし、当業者は、異種調節塩基配列も使用されうることを理解するであろう。
【０１２０】
キメラ遺伝子は、それを適切な発現ベクターにクローニングすることによって適切な宿主へ導入されうる。適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットが当技術分野で公知である。一般的に、ベクターまたはカセットは関連遺伝子の転写および翻訳を方向づける配列、選択可能なマーカー、および自己複製または染色体の組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御を有するコード配列の領域５’および転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’を含む。両方の制御領域が宿主細胞と同種の遺伝子由来であることが最も好ましいが、かかる制御領域が生産宿主として選択される特定の種原産の遺伝子由来である必要はない。
【０１２１】
１つの実施形態において、調節塩基配列はプロモーターを含む。プロモーターは構成的または誘導的でありうる。誘導的プロモーターは一般に特定の刺激物（例えば、ｌａｃプロモーターを含むＩＰＴＧまたは乳糖）に反応する。誘導的プロモーターは、２−３例を挙げると、化学薬品、増殖サイクル、温度の変化、ｐＨの変化、およびオスモル濃度の変化を含む、さまざまな刺激物に反応しうる。
【０１２２】
所望の宿主細胞における本変異ニトリラーゼの発現を推進するために有用である開始制御領域またはプロモーターは無数であり、当業者に周知であるが、それらには、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）の発現に有用）、およびｌａｃ、ｔｒｐ、ｌＰL、ｌＰR、Ｔ７、ｔａｃ、ＰBAD、ｎｐｒ、およびｔｒｃ（特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の発現に有用）が含まれるが、これらに限定されない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現を推進するために特に有用なプロモーターの追加の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のトリプトファンオペロンプロモーターＰｔｒｐ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の乳糖オペロンプロモーターＰｌａｃ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｔａｃプロモーター、ラムダファージライトプロモーターＰR、ラムダファージレフトプロモーターＰL、Ｔ７プロモーター、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からのＧＡＰ遺伝子のプロモーター、またはコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、チゴミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセニュウラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテリア（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される微生物の群から単離される少なくとも１つのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
終結制御領域は、好ましい宿主原産のさまざまな遺伝子由来でもありうる。場合により、終結部位は不必要でありうるが、しかし、含まれることが最も好ましい。
【０１２４】
また、挿入遺伝物質は、リボソーム結合部位を含みうる。リボソーム結合部位はラムダファージＣＩＩ遺伝子由来でよく、またはコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセニュウラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテリア（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の遺伝子由来のリボソーム結合部位からなる群から選択される。
【０１２５】
場合により、遺伝子産物は、好ましくは、形質転換宿主の分泌生成物でありうる。所望のタンパク質の増殖培地への分泌は、精製手順を簡易化し、費用を削減する。分泌シグナル配列はしばしば細胞膜上の発現可能なタンパク質の活性輸送の促進に有用である。分泌が可能な形質転換宿主は、分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列の宿主に組込むことによってもたらされうる。適切なシグナル配列を選択する方法が当技術分野で公知である（例えば、（特許文献３３）、（特許文献３４）を参照）。分泌シグナルＤＮＡは発現制御ＤＮＡとそのコード配列またはコード配列断片との間、および後者を有するリーディングフレームに位置しうる。
【０１２６】
（タンパク質工学）
本変異ニトリラーゼを突然変異誘発によって製造した。本ヌクレオチドを使用し、さらに強化または変化した活性を有する遺伝子産物を製造しうることが考えられる。１）ランダム突然変異誘発、２）ドメインスワッピング（ジンクフィンガードメインまたは制限酵素を使用）、３）変異性ＰＣＲ（非特許文献１４）、４）部位特異的突然変異誘発（非特許文献１５）、および５）「遺伝子シャフリング」（参照により本明細書で援用される、米国特許公報（特許文献３５）、米国特許公報（特許文献３６）、米国特許公報（特許文献３７）、および米国特許公報（特許文献３８）を含むが、これらに限定されない活性の変化および強化を有する遺伝子産物を製造する天然遺伝子配列を変異させるためのさまざまな方法が周知である。
【０１２７】
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、ヌクレオチドのｍｉｓ取り込みによって多数の突然変異の同時作成によりＤＮＡ断片を増幅することができる。これはｄＮＴＰの比率の変化または反応におけるさまざまな量の塩化マンガンの添加などのＰＣＲ条件の変更によって達成されうる（（非特許文献１６）、（非特許文献１７））。次いで、突然変異ＤＮＡ断片のプールをクローン化し、突然変異プラスミドのライブラリーをもたらし、次いでこれらは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主における発現後にスクリーニングされうる。
【０１２８】
遺伝子シャフリングの方法は、その容易な実施、突然変異誘発の高い速度、スクリーニングの容易さにより特に魅力的である。遺伝子シャフリングの方法は、目的の遺伝子との類似性および／または相違を有する追加のＤＮＡ部位の集団の存在下に特定のサイズの断片への目的の遺伝子の制限酵素切断を含む。次いで、この断片のプールは変性および再アニールされ、突然変異遺伝子をもたらす。次いで、突然変異遺伝子は活性の変化についてスクリーニングされる。
【０１２９】
本微生物配列はさらに変異され、本方法による活性の変化または強化についてスクリーニングされうる。配列は二本鎖であり、５０ｂｐ〜１０ｋＢの範囲のさまざまな長さでありうる。配列はランダムに、当該技術分野で公知の制限酵素を使用して約１０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲の断片に消化されうる（非特許文献１８）（以後「マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）。本配列に加えて、本配列の全部または部分にハイブリダイズ可能である断片の集団を添加することができる。同様に、本配列にハイブリダイズ可能ではない断片の集団をも添加することができる。一般的に、これらの追加の断片の集団は、総核酸と比べ重量で約１０〜約２０倍過剰に添加される。一般に、本方法が行われる場合は、混合物中の異なる特定の核酸断片の数は約１００〜約１０００となる。ランダム核酸断片の混合集団は変性し、一本鎖核酸断片を形成し、次いで再アニールされる。他の一本鎖核酸断片と相同性の部位を有する一本鎖核酸断片のみが再アニールする。ランダム核酸断片は加熱によって変性されうる。当業者は、二本鎖核酸を完全に変性するのに必要な条件を決定しうる。好ましくは、温度は、約８０℃〜１００℃である。核酸断片は冷却によって再アニールされうる。好ましくは、温度は約２０℃〜約７５℃である。再生はポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩の添加によって加速されうる。適切な塩濃度は０ｍＭ〜約２００ｍＭでありうる。次いで、アニールされた核酸断片は、核酸ポリメラーゼおよび各ｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の存在下にインキュベートされる。核酸ポリメラーゼはクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片、Ｔａｑポリマー、または当該技術分野で周知の他のＤＮＡポリメラーゼでありうる。ポリメラーゼはアニーリング前に、アニーリングと同時に、またはアニーリング後にランダム核酸断片に添加されうる。ポリメラーゼの存在下の変性、再生、およびインキュベーションのサイクルは所望の回数反復される。好ましくは、サイクルは約２〜約５０回反復され、より好ましくは、配列は１０〜約４０回反復される。結果として生じる核酸は、約５０ｂｐ〜約１００ｋＢの大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準のクローニングおよび発現プロトコールによる発現および活性の変化についてスクリーニングされうる（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上記）。
【０１３０】
さらに、ハイブリッドタンパク質は遺伝子シャフリング（エクソンシャフリング）法を使用する機能的ドメインの融合によってアセンブリされうる（非特許文献１９）。本遺伝子の機能的ドメインは、他の遺伝子の機能的ドメインと結合し、所望の触媒機能を有する新規の酵素をもたらしうる。ハイブリッド酵素がＰＣＲオーバーラップ伸長法を使用して構成され、当業者に公知の方法を使用してさまざまな発現ベクターへクローン化されうる。
【０１３１】
（グリコロニトリルをグリコール酸に変換する場合のニトリラーゼの安定性および生産性を改善する安定化剤）
グリコロニトリルはホルムアルデヒドをシアン化水素と反応させることによって合成されうる（米国特許公報（特許文献３９）、米国特許公報（特許文献４０）、米国特許公報（特許文献４１）、および米国特許公報（特許文献４２））。反応物質の純度およびグリコロニトリルを製造するために使用される反応条件によって、さまざまな不純物が最終生成物に存在しうる。これらの不純物は、グリコロニトリルをグリコール酸に変換する効率を阻害しうる。１つの実施形態において、グリコロニトリル水溶液は、酵素的にグリコール酸に変換される前に望ましくない不純物を除去するために処理されうる。
【０１３２】
酵素触媒の安定性／生産性を増大させる別の方法が、触媒安定性および／または生産性を阻害しうるグリコロニトリル溶液における望ましくない化合物と反応する１つまたは複数の化合物の添加である。望ましくない化合物としては、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド由来不純物、ホルムアルデヒド由来オリゴマーおよびポリマー、グリコールアミド、グリコールアミド由来不純物、シアン化水素由来不純物、シアン化水素由来オリゴマーおよびポリマー、グリコロニトリル由来不純物、グリコロニトリル由来オリゴマーおよびポリマー、グリコリド、グリコール酸の線状オリゴマー、およびたぶん酸素（実質的に酸素を含まない条件下で行われた反応は触媒安定性を改善した）が挙げられるが、これらに限定されない。望ましくない化合物は、１）ニトリラーゼ触媒と反応し、これを不活性化し、２）反応においてグリコロニトリルと競合し、３）グリコロニトリルまたはグリコール酸と反応し、望ましくない副産物を形成し、または４）組換え宿主細胞に有害な影響を及ぼす（すなわち、細胞溶解を促進する）ものも含まれうる。グリコロニトリル反応混合物に添加されうる適切な化合物の例は、チオ硫酸（例えば、カリウムチオ硫酸、Ｋ2Ｓ2Ｏ3）、亜ジチオン酸（例えば、ナトリウム亜ジチオン酸、Ｎａ2Ｓ2Ｏ4）、およびシアン化物化合物（例えば、ＨＣＮ、ＮａＣＮ、ＫＣＮ等）を含みうるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、化合物は、酵素触媒の添加前、添加中、または添加後にグリコロニトリル反応混合物に添加される。別の実施形態において、反応混合物における最終濃度が反応混合物の少なくとも約０．００１Ｍ〜約５ｗｔ％未満になるように化合物が反応混合物に添加される。さらなる実施形態において、最終濃度が少なくとも約０．０１Ｍになるように化合物は反応混合物に添加される。さらに別の実施形態において、化合物の最終濃度が約０．０１Ｍ〜約１Ｍになるように化合物は反応混合物に添加される。
【０１３３】
本発明のさらなる態様において、本方法は実質的に酸素を含まない条件下で行われる。本明細書で使用される「酸素を含まない条件」、「酸素を含まない雰囲気」、および「実質的に酸素を含まない条件」という語は、窒素などの非反応性気体を使用し、反応管をパージおよび／またはブランケットし、酸素分子（Ｏ2）が本方法中に存在しないようにすることを指す。当業者は、微量の酸素分子が実質的に酸素を含まない条件下で存在しうることを認める。１つの態様において、「実質的に酸素を含まない」という語は、酸素分子濃度が反応管における気体の約５％未満、好ましくは、２％未満、より好ましくは、１％未満、かつ最も好ましくは、０．１％未満である反応条件である。別の態様において、本方法は、窒素（Ｎ2）を使用し、反応管における水性反応混合物をブランケットする実質的に酸素を含まない条件下で行われる。
【０１３４】
（触媒安定性および生産性を改善するグリコロニトリル濃度の制御）
ニトリラーゼ安定性を増大させる別の方法は、水性反応混合物におけるグリコロニトリルの最大濃度の制御である。以前に記載された通り、グリコロニトリルは極性溶媒で分解し、ホルムアルデヒドおよびシアン化水素を放出する。反応混合物におけるホルムアルデヒドは酵素触媒と反応し、早すぎる不活性化、および触媒生産性の減少をもたらす。溶液中のグリコロニトリルの濃度の制御は、触媒安定性および触媒の生産性（触媒のグラム当りで製造されるグリコール酸のグラム）を増大させうる。実施例１２−１５に示されているように（表９）、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ由来のニトリラーゼ触媒は、わずか３つのリサイクル反応後に３Ｍグリコロニトリルを含有する反応におけるその活性を迅速に喪失する。濃度を１Ｍに減少させ、および／または１Ｍ増分で３Ｍグリコロニトリルの段階的な添加（以前のグリコロニトリルの添加がグリコール酸アンモニウムに変換された後添加される）は、触媒生産性を大幅に増加させる（表９）。１つの実施形態において、グリコロニトリルの水性反応混合物への段階的な添加（アリコート）が触媒の生産性を増加させる。別の実施形態において、グリコロニトリルは段階的に水性反応混合物に添加され、グリコロニトリルの総濃度は反応中に約１Ｍ以下のままである。
【０１３５】
実施例１５に示されているように、グリコロニトリルの連続的添加によっても数リサイクルの反応にわたって触媒生産性が増加する。１つの実施形態において、グリコロニトリルからグリコール酸アンモニウムを製造する方法ではグリコロニトリルの連続的添加が使用される。別の実施形態において、グリコロニトリルの添加速度は、触媒のＫｍの少なくとも５倍である。本触媒は一般的におよそ１ｍＭ（野生型Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ、配列番号６）〜約２．７ｍＭのグリコロニトリルに対するＫｍを有する。当技術分野で周知の通り、Ｋｍ値のおよそ５倍の基質濃度（すなわち、５×２．７ｍＭ＝１３．５ｍＭ）は結果として、最大反応速度（Ｖｍａｘ）のおよそ９７％である反応速度をもたらす。さらに別の実施形態において、グリコロニトリル供給速度は、反応混合物におけるグリコロニトリル濃度が約５ｍＭ〜約１Ｍ、好ましくは、約１００ｍＭ〜約１Ｍ、より好ましくは、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭを維持するように制御される。
【０１３６】
（ｐＨの制御）
本発明のニトリラーゼ触媒を使用する反応は一般的に約５〜約１０、好ましくは、５．５〜約８、より好ましくは、約５．５〜約７．７、かつ最も好ましくは、約６〜約７．７のｐＨで実行される。
【０１３７】
（グリコール酸およびグリコロニトリルの分析）
グリコール酸の生成を分析するために適切な分析方法は当該技術分野で公知であり、ＨＰＬＣ、ＣＥ、ＧＣ、およびＭＳを含むが、これらに限定されない。例えば、ＨＰＬＣ分析を使用し、屈折率検出器およびＢｉｏ−Ｒａｄ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（３０ｃｍ×直径７．８ｍｍ）および５０℃下に移動相として１．０ｍＬ／分（等張）で０．０１Ｎ硫酸を使用してグリコール酸生産量を測定した。ＨＰＬＣ方法は基質（グリコロニトリル）および生成物（グリコール酸）の両方の定量化に適切であった。
【０１３８】
(微生物触媒の工業的製造)
本変異ニトリラーゼ遺伝子を使用する本ニトリラーゼの商業的製造が望ましい場合、さまざまな培養方法が使用されうる。一連の発酵は、バッチ、フェドバッチ、または連続的様式、当技術分野で公知の方法で実行されうる（（非特許文献２０）、（非特許文献２１））。
【０１３９】
代表的なバッチ培養方法は、培地の組成物が培養の開始時に設定され、培養方法中に人工的な変更にさらされない閉鎖システムである。したがって、培養方法の開始時に、培地には所望の微生物を接種し、増殖および代謝活性がシステムに何も添加せずに起こることを可能にする。しかし、一般的に、「バッチ」培養は炭素源の添加に関してバッチであり、しばしばｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御する試みが行われる。バッチシステムにおいて、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は培養が終了するまで一定に変化する。バッチ内では培養細胞は静止遅滞期から高い増殖対数期に、かつ最終的に静止期に抑制し、ここで増殖速度は減少または停止する。未処置の場合、静止期の細胞は最終的に死滅する。対数期における細胞はしばしば最終生成物の製造のバルクに関与し、一部のシステムにおいて介在する。静止または後対数期生産は他のシステムで得ることができる。
【０１４０】
標準バッチシステムでの変形物はフェドバッチシステムである。フェドバッチ培養方法も本発明において適切であり、基質が培養の進行とともに除々に添加されることを除き典型的なバッチシステムを含む。フェドバッチシステムは、カタボライトリプレッションが細胞の代謝を阻害する傾向があり、かつ培地において限定された量の基質を有することが望ましい場合に有用である。フェドバッチシステムにおける実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶解酸素、およびＣＯ2など排ガスの分圧など測定可能な因子の変化に基づき推定される。バッチおよびフェドバッチ培養方法が一般的であり、かつ当技術分野では周知であり、例はブロック（Ｂｒｏｃｋ）（上記）およびデスパンデ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）（上記）で確認されうる。
【０１４１】
本ニトリラーゼ触媒の商業的製造は連続的培養によっても達成されうる。連続的培養は開放システムであり、ここでは規定の培養培地が連続的にバイオ反応器に供給され、等量の馴化培地がプロセッシングのため同時に除去される。連続的培養は一般に一定の高い液相密度で細胞を維持するが、ここで細胞は主に対数期増殖にある。あるいは、連続的培養は、固定化細胞で実施されうるが、ここで炭素および栄養は連続的に添加され、有益な生成物、副産物、または廃棄物が連続的に細胞塊から除去される。細胞固定化は、天然および／または合成材料からなる広範囲の固体支持体を使用して実行されうる。
【０１４２】
連続的または半連続的培養は、細胞増殖または最終細胞濃度に影響を及ぼす１つの因子または多くの因子の調節を可能にする。例えば、１つの方法は、炭素源また窒素レベルなど制限栄養を固定速度で維持し、他のすべてのパラメータの抑制を可能にする。他のシステムにおいて、増殖に影響を及ぼす多くの因子が連続的変更されうると同時に、培地濁度によって測定される細胞濃度が一定に保持される。連続的システムは、定常増殖条件の維持をめざし、したがって除去される培地による細胞消失は培養における細胞増殖速度に対してバランスをとる必要がある。連続的培養方法のために栄養および増殖因子を調節する方法、および細胞形成の速度を最大限にするための方法は、工業微生物学の当技術分野で公知であり、さまざまな方法がブロック（Ｂｒｏｃｋ）（上記）によって詳述されている。
【０１４３】
本発明における発酵培地は適切な炭素基質を含有していなければならない。適切な基質は、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、乳糖またはショ糖などの二糖類、でんぷんもしくはセルロースまたはそれの混合物などの多糖類、およびチーズホエー液、コーンスティープリカー、ビート糖蜜、および大麦モルトなど再生可能な原料からの非精製混合物を含みうるが、これらに限定されない。したがって、本発明において使用される炭素源は基質を含有する幅広い炭素を包含し、微生物の選択によってのみ限定されることが意図されている。
【０１４４】
（グリコール酸アンモニウムからグリコール酸を回収する方法）
対応するアンモニウム塩から有機酸を回収および／または得る方法は当該技術分野で周知である。グリコール酸アンモニウムを含む水溶液からグリコール酸を回収および／または得る方法としては、イオン交換（陰イオンおよび／または陽イオン）、電気透析、反応性溶媒抽出、熱分解、アルコール分解（エステル化の後、グリコール酸エステルのグリコール酸への加水分解）、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
(イオン交換（陽イオン）)
陽イオン交換は、溶解イオン種が化学量論的に固体によって吸収される可逆性の方法である。陽イオン交換は当技術分野で公知である。本方法において、グリコール酸アンモニウムは陽イオン交換樹脂に供給されるが、そこでアンモニウムイオンは陽子と交換され、グリコール酸を形成する（実施例２８を参照）。グリコール酸はカラムを通過し、収集される。
【０１４６】
樹脂がアンモニウムイオンで飽和されると、酸、例えば、硫酸による再生により副産物である硫酸アンモニウム塩が生じる。陽イオン交換は、刺激移動床またはカルーセルを使用してバッチ中に実行されうる（（非特許文献２２）、以後「Ｐｅｒｒｙ’ｓ」を参照）。樹脂の選択は供給濃度に影響を及ぼしうるが、これは約０．０２ｗｔ％〜約５０ｗｔ％グリコール酸アンモニウム、好ましくは、約０．０２ｗｔ％〜約４０ｗｔ％でありうる。使用される再生酸は一般的に約０．５ｗｔ％〜約２０ｗｔ％である。
【０１４７】
(イオン交換（陰イオン）)
陰イオン交換も当技術分野で公知である。陰イオン交換は、弱陰イオン樹脂が使用されることを除き陽イオン交換と同様である（（非特許文献２２）を参照）。前と同様、樹脂の選択は供給濃度に影響を及ぼしうるが、これは約０．０２ｗｔ％〜約９０ｗｔ％グリコール酸アンモニウム、好ましくは、約０．０２ｗｔ％〜約４０ｗｔ％でありうる。樹脂の再生では一般的に弱酸が使用される。
【０１４８】
(溶媒抽出（反応性）)
カルボン酸を単離するために使用されている１つの方法が反応性抽出である。この方法は、乳酸アンモニウムから乳酸を抽出するために有用であることが報告されている（（非特許文献２３））。反応性抽出は、水相で酸と複合体を形成する反応性有機溶媒（すなわち、アミン）の使用を含む。この方法における第１のステップは一般的に所望の酸の塩を含有する水溶液の酸性化を含む。次いで、酸性化水溶液は、一般的に反応性第３アミンおよび１つまたは複数の希釈剤からなる有機溶媒と接触する。反応性アミン（一般的に、Ａｌａｍｉｎｅ（登録商標）３３６、コグニス社（Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐ）、オハイオ州シンシナティ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）など第３Ｃ８−Ｃ１０トリアルキルアミン）は、有機相で優先的に可溶性である酸／アミン錯体を形成するカルボン酸と反応する（（非特許文献２４）、（非特許文献２５））。第３アルキルアミンの使用は一般的に、通常の溶媒抽出物で得られるであろうものより高い分配係数を提供する。次いで、逆抽出を使用し、有機相から酸を回収する。
【０１４９】
(（非特許文献２６）、（非特許文献２７））は、グリコール酸の抽出のために反応性アミン溶媒の使用を報告している。しかし、これらの実験では、純水中に溶解した純粋なグリコール酸の抽出係数が報告された。インシ（Ｉｎｃｉ）は、濃縮水性グリコール酸アンモニウムなど、複合水性マトリックス（例えば、大量の鉱塩および他の不純物を含むグリコール酸の水溶液）からグリコール酸を得る方法を説明または教示していない。
【０１５０】
反応性溶媒抽出を使用し、グリコール酸アンモニウムの水溶液からグリコール酸を得ることもできる（例えば、同時係属中の米国仮特許出願第６０／６３８，１２８号明細書、参照により本明細書で援用される、を参照）。より具体的には、グリコール酸アンモニウムを含む水溶液からグリコール酸を単離する方法が提供されるが、この方法は、
ａ）第１の相を提供するステップであって、前記第１の相が、
ｉ）前記第１の相の約３０体積パーセント〜約９９体積パーセントが、式
【０１５１】
【化２】
2008525030.tif 000004
【０１５２】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は独立してＣ８〜Ｃ１２アルキル基である。］を有する少なくとも１つの第３アルキルアミンであり、かつ
ｉｉ）前記第１の相の約１体積パーセント〜約７０体積パーセントが、メチルイソブチルケトン、１−オクタノール、１−デカノール、塩化メチレン、１−クロロブタン、クロロベンゼン、クロロホルム、ケロシン、トルエン、混合キシレン、トリブチルリン酸、およびそれの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの希釈剤である
を含む水不混和有機混合物であるステップと、
ｂ）第２の相を提供するステップであって、前記第２の相が、約３以下のｐＨを有するグリコール酸を含む水溶液であり、前記第２の相が、
ｉ）グリコール酸アンモニウムの水溶液を提供する方法であって、前記グリコール酸アンモニウムの水溶液が約５重量％〜約４０重量％の濃度のグリコール酸アンモニウムを有する方法と、
ｉｉ）（ｂ）（ｉ）のグリコール酸アンモニウム水溶液のｐＨを約３以下に低下させるのに十分な量の鉱酸を添加し、それによってグリコール酸を含む水溶液が形成される方法と
によって形成されるステップと、
ｃ）前記第１の相を反応性抽出方法で前記第２の相と接触させ、それによってグリコール酸充填第１の相を形成するステップと、
ｄ）前記グリコール酸充填第１の相を単離するステップと、
ｅ）前記グリコール酸充填第１の相を逆抽出方法で第３の相と接触させ、それによってグリコール酸充填第１の相のグリコール酸が前記第３の相へ抽出されるステップであって、前記第３の相が前記グリコール酸充填第１の相で非混合性であるステップと、
ｆ）前記第３の相からグリコール酸を回収するステップと
を含む。
【０１５３】
１つの実施形態において、第３トリアルキルアミンは、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−イソオクチルアミン、トリ−ｎ−ノニルアミン、トリ−ｎ−デシルアミン、およびトリ−ｎ−ドデシルアミンからなる群から選択される。別の実施形態において、第３トリアルキルアミンは、Ａｌａｍｉｎｅ（登録商標）３０８（ＣＡＳ＃２７５７−２８−０）、Ａｌａｍｉｎｅ（登録商標）３００（ＣＡＳ＃１１１６−７６−３）、Ａｌａｍｉｎｅ（登録商標）３０４−１（ＣＡＳ＃１０２−８７−４）、およびＡｌａｍｉｎｅ（登録商標）３３６（ＣＡＳ＃６８８１４−９５−９）（コグニス社（Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐ．）、オハイオ州シンシナティ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）からなる群から選択される。さらなる実施形態において、希釈剤は、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、ケロシン、トルエン、混合キシレン、１−オクタノール、およびそれの混合物からなる群から選択される。さらに別の実施形態において、水非混合性有機溶媒は、９０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ａｌａｍｉｎｅ（登録商標）３３６：１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＭＩＢＫ、９０％Ａｌａｍｉｎｅ（登録商標）３３６：１０％１−オクタノール、９０％Ａｌａｍｉｎｅ（登録商標）３３６：１０％トルエン、および９０％Ａｌａｍｉｎｅ（登録商標）３３６：１０％混合キシレンからなる群から選択される。
【０１５４】
第１の相の第３トリアルキルアミンの濃度は、約３０パーセント（ｖｏｌ／ｖｏｌ）〜約９９パーセント（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、好ましくは、約５０パーセント（ｖｏｌ／ｖｏｌ）〜約９０パーセント（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、かつ最も好ましくは、約７０パーセント（ｖｏｌ／ｖｏｌ）〜約９０パーセント（ｖｏｌ／ｖｏｌ）でありうる。第１の相の希釈剤の量は、約１パーセント（ｖｏｌ／ｖｏｌ）〜約７０パーセント（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、好ましくは、約１０パーセント〜約５０パーセント、かつ最も好ましくは、約１０〜約３０パーセントでありうる。
【０１５５】
グリコール酸を抽出するための適切な有機抽出混合物は、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、１−オクタノール、１−デカノール、塩化メチレン、１−クロロブタン、クロロベンゼン、クロロホルム、ケロシン、トルエン、混合キシレン、およびトリブチルリン酸からなる群から選択される１つまたは複数の希釈剤とＡｌａｍｉｎｅ（登録商標）３３６との混合物からなる。１つの実施形態において、有機相抽出物は、ＭＩＢＫ、１−オクタノール、トルエン、キシレン、およびケロシンからなる群から選択される１つまたは複数の希釈剤と組合せたＡｌａｍｉｎｅ３３６からなる。別の実施形態において、反応性有機溶媒は、約５０％〜約９５％Ａｌａｍｉｎｅ（登録商標）３３６、好ましくは、約６５％〜約９５％ｏの有機溶媒混合物からなる。有機溶媒は、約５０％〜約５％希釈剤、好ましくは、３５％〜約５％の有機溶媒混合物での１つまたは複数の希釈剤からなる。１つの実施形態において、混合有機溶媒は、約７０％Ａｌａｍｉｎｅ（登録商標）３３６、約１０％ＭＩＢＫ、および約２０％ケロシンからなる。別の実施形態において、混合有機溶媒は、約９０％アラミン（Ａｌａｍｉｎｅ）（登録商標）３３６、およびＭＩＢＫ、１−オクタノール、トルエン、およびキシレンからなる群から選択される約１０％希釈剤からなる。
【０１５６】
当業者は、有機相の好ましい温度を決定することができる。１つの実施形態において、抽出反応は、約１０℃〜約９０℃、より好ましくは、約２０℃〜約７５℃、かつ最も好ましくは、約２５℃〜約７５℃の温度下に行われる。
【０１５７】
酸性化水相からグリコール酸を抽出するために必要とされる混合有機溶媒の量は溶媒充填の程度に依存する。当業者は、水相に存在するグリコール酸の量に依存するグリコール酸を抽出するために使用される混合有機溶媒の体積を調節することができる。グリコール酸は逆抽出によって有機相から回収されうる。
【０１５８】
グリコール酸アンモニウムからグリコール酸を得る別の方法が、エステル化剤の存在下での熱分解である。溶媒は、反応性アンモニアからグリコール酸を保護する（それによってアミド形成を阻止する）ことによって作用し、または有機反応性抽出溶媒として作用し、それによって酸の分離に役立ちうる（米国特許公報（特許文献４３）、参照により全体として本明細書で援用される）。場合により、この方法は、アルコールをも含みうるが、それによってエステル（有機溶媒中でより可溶性でありうる）をもたらす。有機溶媒は、第３アルキルアミン、アルコール、アミド、エーテル、ケトン、リンエステル、ホスフィンオキシド、ホスフィンスルフィド、アルキルスルフィド、およびそれらの組合せからなる群から選択されうる。次いで、グリコール酸（または対応するエステル）は、逆抽出ステップ中に有機溶媒（液相）から回収される。回収溶媒は塩分割反応ステップにリサイクルされうる。残念ながら、溶媒抽出／逆抽出は、さまざまな非混合性液体が分離することが困難である複雑な物理的混合物を形成するため問題が生じうる。
【０１５９】
(アルコール分解（エステル化）)
グリコール酸アンモニウムをアルコールと反応させ、対応するグリコール酸エステルを形成することができる。エステル結合の加水分解によってグリコール酸エステルをグリコール酸および対応するアルコールへ変換させることができる。加水分解は化学的または酵素的に（すなわち、エステラーゼ、プロテアーゼ等の使用）達成されうる。カルボン酸エステルを加水分解する方法は当該技術分野で公知である（参照により本明細書で援用される、（非特許文献２８）、および米国特許公報（特許文献４４）を参照）。
【０１６０】
例えば、コックレム（Ｃｏｃｋｒｅｍ）（米国特許公報（特許文献４５））は、酸、エステル、および未反応アンモニウム塩を含有する液体流れを製造するアルコールとの有機酸のアンモニウム塩の混合物の迅速な加熱を開示している。有機酸および／またはエステルはその後に液体生成物流れから単離されうる。
【０１６１】
あるいは、同時係属の（特許文献３２）は、
（ａ）（ｉ）グリコール酸アンモニウムを含む水溶液と、
（ｉｉ）式
Ｒ2−ＯＨ
［式中、Ｒ2はＣ１〜Ｃ４直鎖または分岐アルキル基である。］を有するアルコールを含む加熱アルコール蒸気供給流れと、
（ｉｉｉ）反応管と、を提供するステップと、
（ｂ）グリコール酸アンモニウムを含む前記水溶液を前記反応管における前記加熱アルコール蒸気供給流れと接触させ、それによってグリコール酸エステルを含む第１の蒸気生成物流れが生成されるステップと、
（ｃ）前記第１の蒸気生成物流れからグリコール酸エステルを回収するステップと、
を含むグリコール酸アンモニウムを含む水溶液からグリコール酸を得る方法を提供している。
【０１６２】
グリコール酸エステルは、エステル結合の加水分解によってグリコール酸および対応するアルコールへ変換されうる。加水分解は化学的または酵素的に（すなわち、エステラーゼ、プロテアーゼ等の使用）達成されうる。カルボン酸エステルを加水分解する方法は当該技術分野で公知である（参照により本明細書で援用される、（非特許文献２８）および米国特許公報（特許文献４４）を参照）。
【０１６３】
１つの実施形態において、アルコールは、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブチルアルコール、およびｔ−ブタノールからなる群から選択される。好ましい実施形態において、アルコールはメタノールである。
【０１６４】
カルボン酸アンモニウム塩と接触した加熱アルコール蒸気の量は、一般的に水性供給流れにおいてカルボン酸塩アンモニウムに対してモル過剰にある。加熱アルコール蒸気に対するカルボン酸アンモニウム塩のモル比は変動しうるが、一般的にカルボン酸アンモニウム塩のモル当り約５〜約３００モル（少なくとも約５：１〜約３００：１のモル比）、好ましくは、カルボン酸アンモニウム塩のモル当り約５〜約２００モル、最も好ましくは、カルボン酸アンモニウム塩のモル当り約２０〜約１００モルである。モル過剰のアルコール蒸気はアミド形成を阻害する傾向がある。
【０１６５】
アルコール蒸気供給流れ（例えば、メタノール）温度は一般的に、アルコールが一般にその蒸気相にとどまり、それがエステル化剤およびストリッピング／担体ガスとして確実に作用するように選択される。反応室に入る加熱アルコール蒸気供給流れの温度は、選択アルコールおよび特定の器具の形状に従って変動しうる。供給された加熱アルコール蒸気は、反応の熱源、エステル化剤、および本方法によって形成されるカルボン酸エステルのストリッピング／担体ガスとして作用する。
【０１６６】
本実施例ではグリコール酸メチル（その後にグリコール酸に加水分解される）を形成する加熱メタノール蒸気の使用が例示される。一般的に、加熱メタノール蒸気の温度は約１４０℃〜約３５０℃である。１つの実施形態において、メタノール蒸気供給流れの温度は約１７０℃〜約３００℃である。別の実施形態において、メタノール蒸気供給流れの温度は約２３０℃〜約２５０℃である。
【０１６７】
アルコール分解反応器の典型的な作業温度は、約１４０℃〜約３００℃、好ましくは約１７０℃〜約２００℃である。１つの態様において、カルボン酸アンモニウム塩はグリコール酸アンモニウムであり、アルコールはメタノールである。特定の組合せが使用される反応器温度は、一般的に約１００℃〜約３００℃、好ましくは、約１５０℃〜約２５０℃、より好ましくは、約１７０℃〜約２２５℃、かつ最も好ましくは、約１７０℃〜約２００℃である。
【０１６８】
反応器は、場合により、所望のカルボン酸エステルの収量を改善するパッキング材料または高沸点流体／液体を含む。パッキングまたは高沸点流体の利点は、塩水溶液とアルコール蒸気との間の接触を改善することである。パッキングはランダムパッキング、工学的パッキング、またはさまざまな蒸留プレートデザインでありうる。ペリー（Ｐｅｒｒｙ）の第７版第１４．２３〜１４．６１章（非特許文献２２）を参照。気液反応システムの商業的デザインがペリー（Ｐｅｒｒｙ）の図２３−２５、２３−２６、および１３−７９に示されている。高沸点流体は、選択作業条件で低い蒸気圧力を有するように選択され、回収エステルから容易に分離されなければならない。流体は、エステル化化学（鉱油など）に不活性またはポリアルキレングリコール（ポリオール）などエステル化化学に潜在的に関与しうる。ポリオールは分子量が１５０を上回り、少なくとも１つのヒドロキシル基などを有する材料である。典型的なポリオールとしては、ポリエチレンエーテルグリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびポリテトラメチレンエーテルグリコール（ＰＴＭＥＧ）のほか、これらのポリアルキレンエーテルグリコールのコポリマーが挙げられる。
【０１６９】
(電気透析)
双極膜による電気透析（ＥＤＢＭ）が対応するアンモニウム塩からの有機酸の回収に提案されている。ＥＤＢＭを作動するために、溶液は導電性でなければならない。弱酸のアンモニウム塩のために、ＥＤＢＭの生成物（有機酸および水酸化アンモニウム）はきわめて弱い導体であり、結果として溶液の高い抵抗および低い生産速度が生じる。これを弱めるために、導電性塩（すなわち、塩化アンモニウム）が塩基ループ（水酸化アンモニウム流れ）に添加される。塩基濃度が増加するとともに、アンモニアは溶液から除去され、アンモニウム塩はリサイクルされ、導電性を維持しうる。
【０１７０】
有機酸のアンモニウム塩の組成物は、カルシウムなどの多価陽イオンについて注意深くモニタリングする必要がある。これらの陽イオンはヒドロキシル基と結合させることによって沈殿し、膜を破壊しうる。多価陽イオンの濃度は、好ましくは、約５ｐｐｍ以下、最も好ましくは、約１ｐｐｍ以下である。
【０１７１】
例えば、典型的なラボスケールのＥＤＢＭシステムは、アンモニウム塩に適切な膜で構成されうる。まず、約５ｗｔ％塩化アンモニウムを含有する再循環塩基ループが確立される。約３Ｍのグリコール酸アンモニウム再循環ループもまた確立される。典型的なバッチテストランが約０．５〜約１．０ｋＡ／ｍ2の一定の電流で行われる。循環ループは約１時間〜約５時間維持される。ＥＤＢＭの続行とともに、グリコール酸アンモニウムループにおける導電性およびｐＨは減少する。一般的に、かかる条件下で実行されるＥＤＢＭは少なくとも約８０％のグリコール酸アンモニウムをグリコール酸へ変換することが予想される。結果として生じるグリコール酸／グリコール酸アンモニウム溶液はその後に強陽イオン交換樹脂または他の方法で処理され、変換を完了しうる。
【０１７２】
(重合)
ヒドロキシル基からなるカルボン酸のアンモニウム塩は、凝縮重合を受け、二量体、オリゴマー、およびポリマーを形成すると同時に、アンモニアを遊離しうる。結果として生じるポリマーは、任意の数の周知の方法を使用する反応混合物から分離されうる。反応混合物から分離されると、脱重合を使用して遊離酸を得ることができる。
【０１７３】
（熱塩クラッキング）
熱分解（「塩クラッキング」）を使用し、グリコール酸を含む生成物を得ることができる（参照により全体として本明細書で援用される同時係属の（特許文献３１）を参照）。本方法は、実質的に無水グリコール酸アンモニウム塩を熱分解する前に１つまたは複数の化学薬品の添加を必要としない。熱塩クラッキングは、１つまたは複数の本回収方法と結合し、さらにグリコール酸を単離することができる。
【０１７４】
この方法における第１のステップは、グリコール酸アンモニウムの水溶液を含む供給流れからの自由水の除去であり、これにより実質的無水のグリコール酸アンモニウム塩が形成される（実質的に無水の塩は室温（約２５℃）では粘性の液体である）。水性反応混合物から自由水を除去する、蒸留、真空蒸留、凍結乾燥、および蒸発を含むが、これらに限定されない方法が当技術分野で公知である。
【０１７５】
この方法における次のステップは、実質的に無水塩を真空下にアンモニウム塩をグリコール酸およびアンモニアへ熱分解させるのに十分な温度に加熱するステップを含む。使用される温度は、塩の熱分解が起こると同時に、酸の分解を最小限に抑え、かつ／またはグリコールアミドなどの望ましくない副産物を生成しうる望ましくない副反応を最小限に抑えるように選択しなければならない。実質的に無水グリコール酸アンモニウム塩は一般的に、グリコール酸を含む生成物へ塩を熱分解するのに十分な時間、真空（０．５〜約３８５ｍｍＨｇ絶対圧力）下に約１００℃〜約１４０℃以下の温度に加熱される。アンモニウムの除去を助けるために真空が使用される。適切な真空圧力は当業者によって決定されうる。典型的な真空範囲の例が、約０．５〜約３８５ｍｍ絶対圧力である。アンモニウム塩の熱分解ではすべての蒸発器デザインが使用されうるが、ワイプフィルム蒸発器が好ましい。
【０１７６】
規定条件下で塩を熱分解することにより、融解グリコール酸アンモニウムの相当な部分がグリコール酸およびグリコリド（グリコール酸の環状二量体）、グリコール酸の線状ポリマー形態（一般的に二量体で五量体までの）、グリコール酸の線状ポリマー形態のアンモニウム塩（一般的に二量体で五量体までの）、およびグリコールアミドなど一部の追加の副産物へ変換される。当業者は、グリコール酸アンモニウムを熱分解するために使用される条件を調節し、遊離グリコール酸生成を最適化すると同時に、グリコールアミドの生成など望ましくない副反応を最小限に抑えることができる。熱分解中に生成されるアンモニアは回収され、リサイクルされうる。場合により、水性グリコール酸アンモニウム溶液は部分的に脱アンモニア化され、大幅に少ないアンモニウムイオンを含有する脱アンモニア生成物を生成する。この脱アンモニア生成物は、それほど廃棄物（鉱塩）が発生しないためその後の加工に特に魅力である。
【０１７７】
グリコール酸アンモニウムを含む溶液からのグリコール酸の回収に加えて、グリコール酸アンモニウムを含む溶液は、傾斜法またはろ過を含むが、これらに限定されない既知の方法によるニトリラーゼ触媒からの分離、およびその後に場合によりろ過物からの水の蒸留による濃縮によって直接回収されうる。
【０１７８】
出願人は、具体的に、本開示においてすべての引例の全内容を援用する。さらに、量、濃度、もしくは他の値、またはパラメータが範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値として示されている場合、これは具体的には、範囲が個別に開示されているかどうかに関係なく、一対の上限範囲または好ましい値および下限範囲または好ましい値から形成されるすべての範囲を開示していると理解すべきである。数値の範囲が本明細書で開示されている場合、特に明記しない限り、範囲はそれの端点のほか、範囲内のすべての整数、および分数を含むことが意図されている。本発明の範囲が、範囲を規定する場合に挙げられた特定の値に限定されることは意図されていない。
【０１７９】
（一般方法）
細菌培養の維持および増殖に適切な材料および方法は当技術分野で公知である。以下の実施例における使用に適切な方法は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９４年）フィリップ・ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マリー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ（Ｒａｌｐｈ）Ｎ．コスティロウ（Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ）Ｗ．ネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス（Ｗｉｌｌｉｓ）Ａ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、ノエル（Ｎｏｅｌ）  Ｒ．クリーク（Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス  フィリップス（Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）または（非特許文献２９）における記載で確認されうる。
【０１８０】
ゲノムＤＮＡ調製、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡのクローニングの所望の目標を生成するためのエンドおよびエキソヌクレアーゼによるＤＮＡ修飾、ライゲーション、および細菌形質転換のために必要な手順は当技術分野で公知である。ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は当技術分野で公知であり、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上記、および（非特許文献３０）、（非特許文献３１）によって記載されている。
【０１８１】
明細書における略語は、測定単位、方法、特性、または化合物に以下の通り対応する。すなわち、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＭ］はマイクロモルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｗｔ」は重量を意味し、「ｗｔ％」は重量％を意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリトルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ＯＤ」は指定波長での光学密度を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味し、「Ｕ」はニトリラーゼ活性の単位を意味し、「ＧＬＡ」はグリコール酸または対応するアンモニウム塩を意味し、「ＮＨ4ＧＬＡ」はグリコール酸アンモニウムを意味し、「ＧＬＮ」はグリコロニトリルを意味し、「Ｒｘｎ」は反応を意味し、「ｍＭ  ＧＬＡ／ｈ」は毎時ｍＭ  ＧＬＡで測定された初期反応速度を意味し、「ｃａ．」はおよそを意味し、「ＨＣＮ」はシアン化水素を意味し、かつ「ＨＣＨＯ」はホルムアルデヒドを意味する。
【０１８２】
（実施例１）
（高複製ニトリラーゼ発現プラスミドの構成）
合成オリゴヌクレオチドプライマー１６５（５’−ＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＣＧＴＡＴＡＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣ−３’、配列番号１）および
１６６（５’−ＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＡＧＡＡＴＡＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧ−３’、配列番号２）
（これらは、それぞれ、ＰｓｔｌおよびＸｂａｌ制限部位（下線）を組込む）を使用し、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）ゲノムＤＮＡ（配列番号５）からのニトリラーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅した。
【０１８３】
典型的なＰＣＲパラメータは以下の通りである。
ステップ１：９５℃で５分
ステップ２：９５℃で０.５分（変性）
ステップ３：５５℃で０.５分（アニーリング）
ステップ４：７４℃で１分（伸長）
ステップ２−４は２５サイクル反復される
【０１８４】
ＰＣＲ試薬は、ロシュ・ディアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって供給され、かつ同社によって推奨されている通り使用される。
【０１８５】
天然アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ））７２Ｗ配列からの唯一の変化は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現を促進するＧからＡへの第１のヌクレオチドへの変化である。その際、ニトリラーゼ遺伝子の開始コドンは天然ＧＴＧからＡＴＧへ変化した。したがって、対応するニトリラーゼタンパク質の第１のアミノ酸は天然バリンからメチオニン（配列番号６）ヘ変化する。オリゴヌクレオチドプライマー１６５は、リボゾーム結合部位（太字）およびコドン（ＴＡＧ）をニトリラーゼの翻訳の開始前にｌａｃＺの翻訳を止めるためにも導入する。ＰＣＲ生成物をＰｓｔｌおよびＸｂａｌで消化し、ＰｓｔｌおよびＸｂａｌで消化したｐＵＣ１９へクローン化し（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）Ｌ０９１３７、ニュー・イングランド・バイオラボス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．））、ｐＳＷ１３８として同定されたプラスミドを生成した。
【０１８６】
（実施例２）
（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における活性ニトルラーゼの発現）
プラスミドｐＳＷ１３８を使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５（ＡＴＣＣ５３９１１）を変換し、それぞれ、（１）ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８および（２）ＦＭ５／ｐＳＷ１３８で識別された２つの株を生成した。各々の株を以下に記載した通り、ニトリラーゼ活性（グリコロニトリルのグリコール酸への変換）のために増殖、誘発、および分析した。６つの複製を各々の株について実行する。
１．細菌増殖
株接種材料をアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を補充したＬＢ培地で３７℃下、振盪させて（２００ｒｐｍ）１６−１８時間、増殖させた。
２．ニトリラーゼ発現の誘導
十分な接種材料をアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）およびＩＰＴＧ（１ｍＭ）を補充した新鮮ＬＢ培地に添加し、およそ０．１の初期ＯＤ（６００ｎｍ）を得た。培養物を３７℃下、振盪させて（２００ｒｐｍ）およそ６−８時間インキュベートした。
３．細菌回収
細菌細胞を遠心分離によって回収し、できる限り多くの液体を除去し、細胞ペレットを−７０℃下に凍結した。
４．ニトリラーゼ活性のアッセイ
マイクロ攪拌バーを備えた温度調節された（２５℃）２０ｍＬガラス製シンチレーションバイアルへ基質溶液（０．６６７Ｍグリコロニトリル、ＴＣＩ）３．０ｍＬおよび細胞懸濁液（１００ｍＭピロリン酸ナトリウムｐＨ６．０中４００ｍｇ湿細胞重量／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ  ＤＮＡｓｅ）１．０ｍＬを添加した。最終グリコロニトリル濃度は５００ｍＭであり、最終細胞濃度は１００ｍｇ／ｍＬであった。試料（１００μＬ）を５、１０、１５、３０、４５、および６０分の時点で除去し、アッセイ混合物（脱イオン水１００μＬ、６．０Ｎ  ＨＣｌ  ３μＬ、２００ｍＭ  ｎ−プロパノール２００μＬ）に添加した後、ボルテックスし、遠心分離した。結果として生じる上清をＨＰＬＣ（ＨＰＸ  ８７Ｈカラム、３０ｃｍ×７．８ｍｍ、０．０１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4移動相、５０℃で１．０ｍＬ／分の流れ、１０μＬ注入体積、２０分分析時間）によってグリコロニトリル（ＧＬＮ）およびグリコール酸（ＧＬＡ）について分析した。乾燥細胞重量（ｄｃｗ）をマイクロ波乾燥によって複製サンプルで測定した。ニトリラーゼ活性をＵ／ｇ  ｄｃｗとして報告したが、ここで１単位（Ｕ）は２５℃下１分での１μｍｏｌのＧＬＮをＧＬＡへ変換する（表２）。
【０１８７】
【表２】
2008525030.tif 000005
【０１８８】
（実施例３）
（変異性ポリメラーゼ連鎖反応によるＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼランダム突然変異誘発ライブラリの構成）
Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ単離キットをメーカーの指示（ジーントラ・システムズ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に従って使用することによりＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）からゲノムＤＮＡを調製した。ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ＰＣＲ突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））により供給された指示に従って配列番号３（５’−ＧＣＧＣＡＴＡＴＧ  ＧＴＴＴＣＧＴＡＴＡＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＣ３’）および配列番号４（５’−ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＧ−３’）として識別されたプライマーを使用することにより、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ遺伝子（コード配列、配列番号５）で変異性ＰＣＲを実行した。低い突然変異頻度（０−３突然変異／ｋｂ）および中間の突然変異頻度（３−７突然変異／ｋｂ）を誘発するために推奨される反応条件を使用した。１０パーセントの１．１ｋｂ  ＰＣＲ生成物をｐＴｒｃＨｉｓ２  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ発現キット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（ＣＡ，Ｃａｒｌｓｂａｄ））により供給された指示に従って発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２  ＴＯＰＯ（登録商標）へライゲートした。ライゲーション混合物の半分を供給元の勧告（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０ヘ形質転換した。１パーセントの形質転換混合物を５０ｍｇ／Ｌアンピシリンで補充したＬＢプレートへプレーティングした。結果として生じる形質転換体は合計２００−４００コロニーとなり、生成された総ＰＣＲ生成物が、改善された酵素活性をスクリーニングにするのに必要な十分すぎる４００，０００−８００，０００コロニーをもたらすことが可能であることを示した。突然変異の頻度はクローンのランダム選択試料のヌクレオチド配列解析によって確認された。配列解析では、およそ５０％の挿入が、予想通り順方向の配向にあったことも確認された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、順方向の配向の挿入を有する本質的にすべてのクローンが、勧告通り（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））増殖および誘発されると、約４１ｋＤａのニトリラーゼタンパク質を発現することが確認された。
【０１８９】
また、天然Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ遺伝子は、配列番号３および配列番号４で識別されたプライマーを使用する標準ＰＣＲによって増幅され、結果として生じるＤＮＡ生成物をメーカーの勧告に従ってｐＴｒｃＨｉｓ２  ＴＯＰＯ（登録商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローン化し、プラスミドｐＮＭ１８を生成した。ｐＮＭ１８による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５（ＡＴＣＣ５３９１１）の形質転換は、それぞれの対照として有用な株をもたらした。ｐＮＭ１８（配列番号５）におけるＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ「対照」配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現を促進する、ＧＴＧからＡＴＧへの開始コドンにおける変化を除き、野生型Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗのコード配列と同一である。
【０１９０】
（実施例４）
（ニトリラーゼ活性の増大に対するＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼランダム突然変異誘発ライブラリのスクリーニング）
低い突然変異頻度の変異性ＰＣＲライブラリ（実施例３に記載された通り構成）からおよそ１０，０００コロニーを５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを補充したＬＢ寒天上にプレーティングした。高い処理量のスクリーニングをロボットを使用する９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて実行した。３７℃下、２００ｒｐｍ振盪で１８時間、５０ｍｇ／Ｌアンピシリンおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラニシド）を補充した液体ＬＢ中で個々のコロニーの増殖後、培養物には３７℃下、８０Ｈｚ線形振盪で１時間５０ｍＭグリコロニトリル（ＧＬＮ）を供給した。細菌細胞をろ過して除去することによって反応を停止し、分析すべき上清をマイクロタイタープレートに密閉し、分析まで４℃下に保存した。
【０１９１】
グリコール酸（ＧＬＡ）の生成を単一イオンモードでＭ−Ｈイオン、ｍ／ｚ７５をモニタリングする陰イオンモードで大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）質量分析によって測定した。使用した質量分析計は、マイクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））クァットロ・ウルティマ（Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｕｌｔｉｍａ）トリプル・クワッドであり、設定は以下の通りであった。すなわち、ソース温度＝１５０℃、プローブ温度＝３００℃、コーンガス＝８０Ｌ／時、脱溶媒和ガス＝７００−８００Ｌ／時。コーン電圧＝３５Ｖ、コロナ電圧＝２０ｍＡ。増倍＝６００Ｖ、ドウェル＝０．１秒、チャンネル間遅延＝０．０２秒。移動相は、１針当たり３．５ｍＬ／分で５０／５０ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏであり、ＬＣパッキングス・アキュレート（Ｐａｃｋｉｎｇｓ  Ａｃｕｒａｔｅ）スプリッタを使用する質量分析計への導入前の溶離剤のスプリットが１：５であった。試料３０ｍＬを５ｍＬ試料ループに注入する８８９連続注入８弁バンクを備えたギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）２１５自動試料採取器によって試料を送達した。ハドソン・プレート・クレーン（Ｈｕｄｓｏｎ  Ｐｌａｔｅ  Ｃｒａｎｅ）ＸＴプレートハンドリングロボットが、プレートをギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）自動試料採取器のデッキに送達した。５ｍＬ／分での同じ溶媒による針および注入ポートの洗浄を各々一連の８回の注入間に行った。この方法によって、ニトリラーゼ活性が増大した７つの株を識別して単離した。
【０１９２】
（実施例５）
（ニトリラーゼ活性の増大を与えるＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼにおける突然変異の識別）
ヌクレオチド配列解析を使用し、実施例４に記載された通り単離された７つのＴＯＰ１０変異株のニトリラーゼ遺伝子に存在する突然変異を識別し、対応するアミノ酸変化を推定した。７つの株すべては同一のニトリラーゼ配列（配列番号８）を示し、ｐＮＭ１８−２０１Ｑとして識別されるプラスミドにおけるＧＬＮに変化した位置２０１で単一のアミノ酸変化、Ｌｅｕ（Ｌ２０１Ｑ）を有した。この変化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定される通り、ニトリラーゼタンパク質生成に対する検出可能な効果を（天然酵素と比べ）示さなかった。
【０１９３】
（実施例６）
（アミノ酸残基位置２０１でのニトリラーゼの飽和突然変異誘発）
Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ酵素のアミノ酸位置２０１での飽和突然変異誘発ライブラリを縮重オリゴヌクレオチドおよびＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））をメーカーの指示に従って使用することにより構成した。このライブラリのおよそ５００のメンバーを以前に記載した通り（実施例４）ニトリラーゼ活性の増大ついてスクリーニングした。ヌクレオチド配列解析を使用し、ニトリラーゼ活性の増大を与える位置２０１でのアミノ酸変化を判定した。Ｌ２０１Ｑ（配列番号８）に加えて、ニトリラーゼ活性の増大を与える以下の突然変異をスクリーニングから識別した。すなわち、それぞれ、ｐＮＭ１８−２０１Ｇ、ｐＮＭ１８−２０１Ｈ、ｐＮＭ１８−２０１Ｋ、ｐＮＭ１８−２０１Ｎ、ｐＮＭ１８−２０１Ｓ、ｐＮＭ１８−２０１Ａ、ｐＮＭ１８−２０１Ｃ、およびｐＮＭ１８−２０１Ｔとして識別されたプラスミドにおけるＬ２０１Ｇ（配列番号１６）、Ｌ２０１Ｈ（配列番号１８）、Ｌ２０１Ｋ（配列番号２０）、Ｌ２０１Ｎ（配列番号２２）、Ｌ２０１Ｓ（配列番号２４）、Ｌ２０１Ａ（配列番号１０）、Ｌ２０１Ｃ（配列番号１２）、およびＬ２０１Ｔ（配列番号１４）。
【０１９４】
（実施例７）
（Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ触媒ドメインの標的飽和突然変異誘発）
われわれは、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（配列番号６）内の触媒ドメインが、２−ヒドロキシニトリル、すなわちグリコール酸へのニトリラーゼ活性を増大させる試みにおいて突然変異する適切な部位であると仮定した。
【０１９５】
既知の細菌ニトリラーゼの中で一般に保存されていない残渣（下線）のＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（配列番号６）触媒ドメイン（１６０Ｇ  １６１Ｇ  １６２Ｌ  １６３Ｎ  １６４Ｃ  １６５Ｗ  １６６Ｅ  １６７Ｈ  １６８Ｆ  １６９Ｑ  １７０Ｐ  １７１Ｌ  １７２Ｓ  １７３Ｋ）内の飽和突然変異誘発を縮重オリゴヌクレオチドおよびＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））をメーカーの指示に従って使用することにより達成した。具体的には、９つのミニライブラリ（５００−１０００コロニー）を、標的された活性部位残渣（上記の下線）の各々について構成した。これらのライブラリを以前に記載した通りニトリラーゼ活性の増大についてスクリーニングした。ヌクレオチド配列解析を使用し、ニトリラーゼ活性の増大を与えるアミノ酸変化を判定した。ニトリラーゼ活性の増大を与える以下の変化を識別した。すなわち、それぞれ、ｐＮＭ１８−１６８Ｋ、ｐＮＭ１８−１６８Ｍ、ｐＮＭ１８−１６８Ｔ、およびｐＮＭ１８−１６８Ｖとして識別されたプラスミドにおけるＦ１６８Ｋ（配列番号２６）、Ｆ１６８Ｍ（配列番号２８）、Ｆ１６８Ｔ（配列番号３０）、およびＦ１６８Ｖ（配列番号３２）。
【０１９６】
（実施例８）
（ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｋ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｍ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｔ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−２０１Ｑ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−２０１Ｇ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−２０１Ｈ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−２０１Ｋ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−２０１Ｎ、およびＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−２０１Ｓの構成）
プラスミドｐＮＭ１８−１６８Ｋ、ｐＮＭ１８−１６８Ｍ、ｐＮＭ１８−１６８Ｔ、  ｐＮＭ１８−１６８Ｖ、ｐＮＭ１８−２０１Ｑ、ｐＮＭ１８−２０１Ｇ、ｐＮＭ１８−２０１Ｈ、ｐＮＭ１８−２０１Ｋ、ｐＮＭ１８−２０１Ｎ、およびｐＮＭ１８−２０１Ｓの各々をＥｃｏＲＩで切断し、より小さなＥｃｏＲｌ断片（９０７ｂｐ）をプラスミドｐＳＷ１３８にサブクローン化し（実施例１に記載）、これもＥｃｏＲｌで切断されていたが、それぞれ、プラスミドｐＳＷ１３８−１６８Ｋ、ｐＳＷ１３８−１６８Ｍ、ｐＳＷ１３８−１６８Ｔ、ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ、ｐＳＷ１３８−２０１Ｑ、ｐＳＷ１３８−２０１Ｇ、ｐＳＷ１３８−２０１Ｈ、ｐＳＷ１３８−２０１Ｋ、ｐＳＷ１３８−２０１Ｎ、およびｐＳＷ１３８−２０１Ｓを生成した。プラスミドｐＳＷ１３８−１６８Ｋ、ｐＳＷ１３８−１６８Ｍ、ｐＳＷ１３８−１６８Ｔ、ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ、ｐＳＷ１３８−２０１Ｑ、ｐＳＷ１３８−２０１Ｇ、ｐＳＷ１３８−２０１Ｈ、ｐＳＷ１３８−２０１Ｋ、ｐＳＷ１３８−２０１Ｎ、およびｐＳＷ１３８−２０１Ｓの各々を使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５を変換し、それぞれ、株ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｋ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｍ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｔ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−２０１Ｑ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−２０１Ｇ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−２０１Ｈ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−２０１Ｋ、ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−２０１Ｎ、およびＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−２０１Ｓを生成した。
【０１９７】
（実施例９）
（１０リットル発酵によって生成される突然変異のニトリラーゼ活性）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種培養を発酵槽の接種前に３０℃下、振盪して（３００ｒｐｍ６−１０時間（ＯＤ550＝１−２）ｍＬ当り０．１ｍｇのアンピシリンを補充したＬＢ培地５００ｍＬ中で増殖させた。
【０１９８】
ニトリラーゼ株の増殖は、グルコース、アンモニア、および塩を有する無機培地を使用する１４−Ｌブラウン・バイオスタット（Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ）Ｃ発酵槽（Ｂ．ブラウン・バイオスタット・インターナショナルＧｍｂｈ、ドイツ、メルズンゲン（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ））において行われた。ＩＰＴＧ（ＦＭ５／ｐＮＭ１８ベース株用）または乳糖（ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８ベース株用）を誘導のために使用した。
【０１９９】
滅菌前発酵槽培地（７．５Ｌ）が表２に示されている。滅菌後付加としては、フィルタ滅菌化微量元素（表３）、ｍＬ当り０．１ｍｇのアンピシリン、Ｌ当り２ｇのカザミノ酸（ジフコ（Ｄｉｆｃｏ）、Ｌ当り４ｇのグルコース、および５００ｍＬ種培養物が挙げられる。
【０２００】
発酵設定値は表４に示されている。ＮＨ4ＯＨ（４０％ｗ／ｖ）およびＨ2ＰＯ4（２０％ｗ／ｖ）をｐＨ調節用に使用した。溶解酸素濃度は攪拌により２５％の空気飽和で調節され、最初に酸素需要の増大および後に続く曝気とともに上昇した。ＩＰＴＧ誘導および乳糖誘導とともに使用される発酵供給プロトコールは、それぞれ、表５および６に示されている。グルコース供給速度は、グルコースが５ｇ／Ｌ以上に蓄積した場合は削減された。ＦＭ５／ｐＮＭ１８ベース株については、ＩＰＴＧがＯＤ550＝２０−３０で０．５ｍＭに添加された。４０−５６時間後、細胞を５−１０℃に冷却し、遠心分離によって回収した。ニトリラーゼ活性を記載した通り（実施例２）測定し、結果は表８に示されている。
【０２０１】
【表３】
2008525030.tif 000006
【０２０２】
【表４】
2008525030.tif 000007
【０２０３】
【表５】
2008525030.tif 000008
【０２０４】
【表６】
2008525030.tif 000009
【０２０５】
【表７】
2008525030.tif 000010
【０２０６】
【表８】
2008525030.tif 000011
【０２０７】
（実施例１０）
（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８−２０１Ａ、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８−２０１Ｃ、および大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１２８−２０１Ｔのニトリラーゼ活性の測定（振盪フラスコ））
複製で、一夜培養物（ＬＢ＋５０μｇ／ｍＬアンピシリン、振盪により３７℃）１０ｍＬを２００ｍＬ（ＬＢ＋５０μｇ／ｍｌアンピシリン＋１ｍＭ  ＩＰＴＧ）に添加し、３７℃下、振盪して４−５時間インキュベートした（最終ＯＤ６００およそ２．０）。細胞を４℃下に遠心分離によって収集し、８０℃下に保存した。
【０２０８】
磁気攪拌バーを備えた４−ｍＬガラスバイアルに水中１．０Ｍグリコロニトリル１．０ｍＬを添加し、バイアルとその内容物を温度調節水槽中２５℃に平衡化した。攪拌とともに、２５℃に前平衡化した湿細胞ペースト４０−１００ｍｇを含有する０．１００Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍＬをバイアルに添加した（最終［ＧＬＮ］＝０．５Ｍ）。試料（０．１００ｍＬ）を所定の時間で取り、水０．１００ｍＬ、６．０Ｎ酢酸０．０２０ｍＬ、および水中０．２Ｍ酪酸ナトリウム０．２００ｍＬからなる溶液（ＨＰＬＣ外部標準）と混合した。結果として生じる混合物を遠心分離し、結果として生じる上清をグリコール酸についてＳｕｐｅｌｃｏ（登録商標）（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．）ＬＣ−１８−ＤＢカラム（１５ｃｍ×４．６ｍｍ）：移動相：水性１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、１０ｍＭ酢酸（ＡｃＯＨ）、７．５％（ｖ／ｖ）メタノールを使用するＨＰＬＣによって分析した。各々の細胞ペーストの乾燥細胞重量（ｄｃｗ）を測定し、これを使用して細胞特異的ニトリラーゼ活性を計算した。表８は、天然ニトリラーゼと比較したニトリラーゼ変異のニトリラーゼ活性の増加の概要を示す。
【０２０９】
【表９】
2008525030.tif 000012
【０２１０】
（実施例１１）
（固定化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）の調製）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＳＳ１００１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７７）は、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼを発現する形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である（米国特許公報（特許文献２５）、参照により本明細書で援用される）。組換え発現（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））ＳＳ１００１）ニトリラーゼのコード配列（配列番号３７−３８）は、野生型７２Ｗニトリラーゼ配列（配列番号５）と比較して２つの小さな配列変化を含有する。開始コドンはＧＴＧからＡＴＧに変化して組換え発現を促進し、アーチファクトがクローニング中に導入され、これは結果としてＣ末端の近くに単一アミノ酸変化をもたらした（Ｐｒｏ３６７［ＣＣＡ］→Ｓｅｒ［ＴＣＡ］）。
【０２１１】
この株を以前に記載した通り（米国特許公報（特許文献２９）の実施例８を参照）１０−Ｌ発酵において増殖させ、細胞ペースト（グリコロニトリル（ＧＬＮ）を以下の通りＧＬＮをグリコール酸（ＧＬＡ）に変換する方法で使用した）。
【０２１２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１細胞を最初に以下の手順に従ってカラギナンビーズ（固定化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１）に固定化した。迅速な攪拌とともに、カラギナン（ＦＭＣ  ＧＰ９１１、ＦＭＣ社（Ｃｏｒｐ．）、ペンシルベニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）９ｇをゆっくりと５０℃下、脱イオン化蒸留水２３１ｇに添加し、結果として生じる混合物をカラギナンが完全に溶解するまで８０℃に加熱し、結果として生じる溶液を攪拌して４７℃に冷却した。攪拌バーを備えた分離ビーカーにおいて、凍結大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１細胞（３９．５３％ｄｃｗ）７５．９ｇを約２５℃下０．３５Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．３）８４．１ｇに添加し、細胞が完全に懸濁するまで混合し、次いでデオキシリボヌクレアーゼＩ溶液（１２，５００Ｕ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１０μＬ／細胞懸濁液１００ｍＬ）を添加した。細胞懸濁液を攪拌してカラギナン溶液に添加する直前に４５−４６℃に加熱した。攪拌とともに、４７℃下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１細胞懸濁液１６０．０ｇを４７℃下のカラギナン溶液に添加し、結果として生じる細胞／カラギナン懸濁液を電気加熱２０ゲージ針を通じて４７℃下に注入し、攪拌して室温（約２１−２２℃）下に０．２５Ｍ  ＫＨＣＯ3（ｐＨ＝７．３）に滴下し、針を通じる流速は５−８ｍＬ／分に設定した。結果として生じるビーズを１時間、攪拌して固化させ、０．２５Ｍ  ＫＨＣＯ3（ｐＨ７．３）に保存した。ビーズの化学架橋を水中２５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｍ７５２−０７）０．５ｇを０．２５Ｍ  ＫＨＣＯ3（ｐＨ７．３）４８ｍＬ中に懸濁したビーズ２０ｇに添加し、室温下に１時間攪拌することによって実行した。次いで、ビーズの懸濁液に水中１２．５ｗｔ％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ＢＡＳＦ  ＬＵＰＡＳＯＬ  ＰＳ、ＢＡＳＦ株式会社（Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）、ドイツ、ルードビヒスハーフェン（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ）２．０ｇを添加した後、さらに１時間、室温下に混合した。ＧＡ／ＰＥＩ架橋ビーズを５℃下に１．０Ｍ  ＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ７．３）に保存した。
【０２１３】
ＧＬＮのＧＬＡへのバイオ触媒変換後にＨＰＬＣを行った。反応混合物のアリコート（０．２ｍＬ）を水中６Ｍ  ＨＣｌ  ０．０１ｍＬおよび０．２５Ｍ  ｎ−プロパノール０．８ｍＬ（ＨＰＬＣ外部標準）に添加し、ＨＰＬＣ（ＨＰＸ  ８７Ｈカラム（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））、３０ｃｍ×７．８ｍｍ、０．０１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4移動相、５０℃下に１．０ｍＬ／分流、１０μＬ注入体積、屈折率（ＲＩ）検出器、２０分分析時間）によってＧＬＮおよびＧＬＡについて分析した。ＧＡ／ＰＥＩ架橋カラギナン／７．５％（ｄｃｗ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１ビーズのニトリラーゼ活性は、約１２Ｕ／ｇビーズであったが、ここで１単位（Ｕ）は２５℃下１分での１μｍｏｌのＧＬＮをＧＬＡへ変換する。
【０２１４】
（実施例１２）
（１Ｍグリコロニトリル（ＧＬＮ）のグリコール酸アンモニウム（ＮＨ4ＧＬＡ）への変換）
オーバーヘッド攪拌器を備えた５０−ｍＬジャケット付き反応管に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１ビーズ（実施例１１）４ｇ、脱イオン化水１３．７３ｍL、５Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ  ０．４ｍＬ、およびＧＬＮ（水中約５２ｗｔ％（ＴＣＩ））１．８７ｍＬ、０．８９Ｍ  ＧＬＮ最終濃度、ｐＨ７．６に調節したｐＨを充填し、混合物を２５℃下に攪拌し、アリコート０．２ｍＬを取出し、ＨＰＬＣによる反応経過に従った。すべてのＧＬＮがＮＨ4ＧＬＡに変換された場合、生成物溶液を静かに注ぎ、脱イオン水１４．１３ｍＬおよびＧＬＮ  １．８７ｍＬをｐＨ７．６にｐＨ調節したバイオ触媒に添加し、かつバイオ触媒リサイクルを反復した。最初のバイオ触媒リサイクルでのＮＨ4ＧＬＡ合成の初速度は１４３ｍＭ／時であった。ＮＨ4ＧＬＡ合成対リサイクル回数の初速度の減少率は表９に示されている（「１Ｍ」）。
【０２１５】
（実施例１３）
（およそ３Ｍグリコロニトリル（ＧＬＮ）のグリコール酸アンモニウム（ＮＨ4ＧＬＡ）への変換）
オーバーヘッド攪拌器を備えた５０−ｍＬジャケット付き反応管に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１ビーズ（実施例１１）４ｇ、脱イオン化水６．３９ｍL、１Ｍ  ＫＨＣＯ3  ４ｍＬ、およびＧＬＮ（水中約５２ｗｔ％（ＴＣＩ））５．６１ｍＬ、２．６８Ｍ  ＧＬＮ最終濃度、ｐＨ７．６に調節したｐＨを充填し、混合物を２５℃下に攪拌し、アリコート０．２ｍＬを取出し、ＨＰＬＣによる反応経過に従った。すべてのＧＬＮがＮＨ4ＧＬＡに変換された場合、生成物溶液を静かに注ぎ、脱イオン水６．３９ｍＬ、１Ｍ  ＫＨＣＯ3  ４ｍＬ、およびＧＬＮ  ５．６１ｍＬをｐＨ７．６にｐＨ調節したバイオ触媒に添加し、かつバイオ触媒リサイクルを反復した。最初のバイオ触媒リサイクルでのＮＨ4ＧＬＡ合成の初速度は２０７ｍＭ／時であった。ＮＨ4ＧＬＡ合成対リサイクル回数の初速度の減少率は表９に示されている（「３Ｍ」）。
【０２１６】
（実施例１４）
（グリコール酸アンモニウム（ＮＨ4ＧＬＡ）を得るおよそ１Ｍ増分（１Ｍ＋１Ｍ＋１Ｍ）でのおよそ３Ｍグリコロニトリルの添加）
オーバーヘッド攪拌器を備えた５０−ｍＬジャケット付き反応管に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１ビーズ（実施例１１）４ｇ、脱イオン化水８．１３ｍL、１Ｍ  ＫＨＣＯ3  ４ｍＬ、およびＧＬＮ（水中約５２ｗｔ％（ＴＣＩ））１．８７ｍＬ、０．８９Ｍ  ＧＬＮ最終濃度、ｐＨ７．６に調節したｐＨを充填し、混合物を２５℃下に攪拌し、アリコート０．２ｍＬを取出し、ＨＰＬＣによる反応経過に従った。すべてのＧＬＮがＮＨ4ＧＬＡに変換された場合、ＧＬＮ  １．８７ｍＬの第２の部分を添加し、ｐＨをｐＨ７．６に調節し、すべてのＧＬＮが消費された場合、ＧＬＮ  １．８７ｍＬの第３の部分を添加し、ｐＨをｐＨ７．６に調節し、反応を完了し、およそ３Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ溶液を得た。生成物溶液を静かに注ぎ、脱イオン水８．１３ｍＬ、１Ｍ  ＫＨＣＯ3  ４ｍＬ、およびＧＬＮ  １．８７ｍＬをｐＨ７．６にｐＨ調節したバイオ触媒に添加し、ＧＬＮ変換を完了に進め、ＧＬＮ、水、および緩衝剤の添加、ｐＨ調節、かつＧＬＮ変換の完了をさらに２回反復し、リサイクル（３つのおよそ１Ｍ増分でのＧＬＮの段階的変換）を終了し、バイオ触媒リサイクルを反復した。最初のリサイクル（リサイクル当りＧＬＮの３つの約１Ｍ部分）における最初の１Ｍ  ＧＬＮ溶液でのＮＨ4ＧＬＡ合成の初速度は１５５ｍＭ／時であった。ＮＨ4ＧＬＡ合成対リサイクル回数の初速度の減少率は表９に示されている（「１Ｍ＋１Ｍ＋１Ｍ）＝３Ｍ」）。
【０２１７】
（実施例２５）
（グリコール酸アンモニウム（ＮＨ4ＧＬＡ）を得るグリコロニトリルの０．２Ｍ  ＧＬＮへの連続的添加）
オーバーヘッド攪拌器を備えた５０−ｍＬジャケット付き反応管に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１ビーズ（実施例１１）４ｇ、脱イオン化水８ｍＬ、１Ｍ  ＫＨＣＯ3  ４ｍＬ、およびＧＬＮ（水中約５２ｗｔ％（ＴＣＩ））０．４ｍＬを充填し、ｐＨをｐＨ７．６に調節し、混合物を２５℃下に撹拌し、ＧＬＮ溶液を連続的に０．２Ｍ前後のＧＬＮ濃度を維持するために消費されるＧＬＮ消費の速度で３ＭまでＧＬＮを添加し、アリコート０．２ｍＬを取出し、ＨＰＬＣによる反応経過に従った。すべてのＧＬＮがＮＨ4ＧＬＡに変換された場合、生成物溶液を静かに注ぎ、脱イオン水８ｍＬ、１Ｍ  ＫＨＣＯ3  ４ｍＬ、およびＧＬＮ  ０．４ｍＬをｐＨ７．６にｐＨ調節したバイオ触媒に添加し、かつ新しいバイオ触媒リサイクルをＧＬＮ消費の速度で３Ｍ  ＧＬＮまでのＧＬＮの添加により反復した。最初のバイオ触媒リサイクル（リサイクル総当り３Ｍ  ＧＬＮ）のＮＨ4ＧＬＡ合成の初速度は１４４ｍＭ／時であった。ＮＨ4ＧＬＡ合成対リサイクル回数の初速度の減少率は表９に示されている（「０．２Ｍ連続」）。
【０２１８】
【表１０】
2008525030.tif 000013
【０２１９】
（実施例１６）
（さまざまなレベルの架橋からなるＧＡ／ＰＥＩ架橋カラギナン／大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８−２１０Ａビーズの調製）
プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）からニトリラーゼ変異２１０Ａｌａ（配列番号３４）を発現するプラスミドｐＮＭ１８−２１０Ａを使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５を変換し、ＦＭ５／ｐＮＭ１８−２１として識別される株を生成した。この株を以前に記載した通り（米国特許公報（特許文献２９）の実施例８を参照、参照により本明細書で援用される）１０−Ｌ発酵で増殖させ、細胞ペーストを以下の通りＧＬＮをグリコール酸（ＧＬＡ）に変換する方法で使用した。
【０２２０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８−２１０Ａ細胞を最初に以下の手順に従ってカラギナンビーズに固定化した。迅速な攪拌により、カラギナン（ＦＭＣ  ＧＰ９１１）１２ｇをゆっくりと５０℃下に脱イオン化蒸留水２２８ｇに添加し、結果として生じる混合物をカラギナンが完全に溶解するまで８０℃に加熱し、結果として生じる溶液を攪拌して５２℃に冷却した。攪拌バーを備えた分離ビーカーにおいて、凍結大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８−２１０Ａ細胞（２６．７％ｄｃｗ）７４．９ｇを約２５℃下０．３５Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．３）８５．１ｇに添加し、細胞が完全に懸濁するまで混合し、次いでデオキシリボヌクレアーゼＩ溶液（１２，５００Ｕ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））１０μＬ／細胞懸濁液１００ｍＬ）を添加した。細胞懸濁液を２３０ミクロンおよび１４０ミクロンＮｕｐｒｏ  ＴＦろ過エレメントフィルタを通じて連続的にろ過し、カラギナン溶液への添加直前に５０℃に攪拌しながら加熱した。攪拌とともに、５０℃下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８−２１０Ａ細胞懸濁液１６０．０ｇを５２℃下のカラギナン溶液に添加し、結果として生じる細胞／カラギナン懸濁液を電気加熱２０ゲージ針を通じて４７℃下に注入し、攪拌して室温（約２１−２２℃）下に０．２５Ｍ  ＫＨＣＯ3（ｐＨ＝７．３）に滴下し、針を通じる流速は５−８ｍＬ／分に設定した。結果として生じるビーズを１時間、攪拌して固化させ、０．２５Ｍ  ＫＨＣＯ3（ｐＨ７．３）に保存した。ビーズの化学架橋を水中２５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｍ７５２−０７）０．５ｇ（以後「バイオ触媒１」と呼ぶ）または２．０ｇ（以後「バイオ触媒２」と呼ぶ）のいずれかの０．２５Ｍ  ＫＨＣＯ3（ｐＨ７．３）４８ｍＬ中に懸濁したビーズ２０ｇへの添加、および室温下に１時間攪拌することによって実行した。次いで、ビーズの懸濁液に水中１２．５ｗｔ％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ＢＡＳＦ  ＬＵＰＡＳＯＬ  ＰＳ）２．０ｇ（バイオ触媒１）または４．０ｇ（バイオ触媒２）のいずれかを添加し、さらに１８時間、室温下に混合した。ＧＡ／ＰＥＩ架橋ビーズを５℃下に１．０Ｍ  ＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ７．３）に保存した。
【０２２１】
ＧＬＮのＧＬＡへのバイオ触媒変換後にＨＰＬＣを行った。反応混合物のアリコート（０．２ｍＬ）を水中６Ｍ  ＨＣｌ  ０．０１ｍＬおよび０．２５Ｍ  ｎ−プロパノール０．８ｍＬ（ＨＰＬＣ外部標準）に添加し、ＨＰＬＣ（ＨＰＸ  ８７Ｈカラム、３０ｃｍ×７．８ｍｍ、０．０１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4移動相、５０℃下に１．０ｍＬ／分流、１０μＬ注入体積、屈折率（ＲＩ）検出器、２０分分析時間）によってＧＬＮおよびＧＬＡについて分析した。ＧＡ／ＰＥＩ架橋カラギナン／５％（ｄｃｗ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８−２１０Ａビーズのニトリラーゼ活性は、約１３Ｕ／ｇビーズであったが、ここで１単位（Ｕ）は２５℃下１分での１μｍｏｌのＧＬＮをＧＬＡへ変換する。
【０２２２】
（実施例１７（比較））
（空気中の添加剤なしのグリコロニトリル（ＧＬＮ）のグリコール酸アンモニウム（ＮＨ4ＧＬＡ）への変換）
オーバーヘッド攪拌器を備えた５０−ｍＬジャケット付き反応管にバイオ触媒１  ４ｇ、脱イオン化水１２．４２ｍL、４Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ  ０．５ｍＬ、およびＧＬＮ（水中約５２ｗｔ％（フルカ（Ｆｌｕｋａ））１．７８ｍＬ、１Ｍ  ＧＬＮ最終濃度、ｐＨ７．６を充填し、混合物を２５℃下に攪拌し、アリコート０．２ｍＬを取出し、ＨＰＬＣによる反応経過に従った。すべてのＧＬＮがＮＨ4ＧＬＡに変換された場合、ＧＬＮ  １．７８ｍＬの第２の部分を添加し、ｐＨを水酸化アンモニウムでｐＨ７．６に調節し、すべてのＧＬＮが消費された場合、ＧＬＮ  １．７８ｍＬの第３の部分を添加し、ｐＨをｐＨ７．６に調節し、反応を完了し、３．１Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ溶液を得た。生成物溶液を静かに注ぎ、脱イオン水１２．４２ｍＬ、およびＧＬＮ  １．７８ｍＬをｐＨ７．６にｐＨ調節したバイオ触媒に添加し、ＧＬＮ変換を完了に進め、ＧＬＮの添加、ｐＨ調節、かつＧＬＮ変換の完了をさらに２回反復し、リサイクル（３つの１Ｍ増分でのＧＬＮの段階的変換）を終了し、バイオ触媒リサイクルを反復した。リサイクル対リサイクル回数における最初の１Ｍ  ＦＬＮ溶液の変換の初速度の減少率は表１０に示されている（リサイクル反応は反応２〜８である）。
【０２２３】
（実施例１８）
（酸素を含まない環境下に添加剤なしのグリコロニトリル（ＧＬＮ）のグリコール酸アンモニウム（ＮＨ4ＧＬＡ）への変換）
窒素下オーバーヘッド攪拌器を備えた５０−ｍＬジャケット付き反応管にバイオ触媒１  ４ｇ、脱イオン化水１２．４２ｍL、４Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ  ０．５ｍＬ、およびＧＬＮ（水中約５２ｗｔ％（フルカ（Ｆｌｕｋａ））１．７８ｍＬ、１Ｍ  ＧＬＮ最終濃度、ｐＨ７．６を充填し、混合物を２５℃下に攪拌し、アリコート０．２ｍＬを取出し、ＨＰＬＣによる反応経過に従った。すべてのＧＬＮがＮＨ4ＧＬＡに変換された場合、ＧＬＮ  １．７８ｍＬおよび水０．２ｍＬを添加し、ｐＨを水酸化アンモニウムでｐＨ７．６に調節し、すべてのＧＬＮが消費された場合、ＧＬＮ  １．７８ｍＬの第３の部分を添加し、ｐＨをｐＨ７．６に調節し、反応を完了し、３．１Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ溶液を得た。生成物溶液を静かに注ぎ、脱イオン水１２．４６ｍＬ、およびＧＬＮ  １．７８ｍＬをｐＨ７．６にｐＨ調節したバイオ触媒に添加し、ＧＬＮ変換を完了に進め、ＧＬＮ  １．７８ｍＬ、脱イオン水  ０．２ｍＬ、および緩衝剤の添加、ｐＨ調節、かつＧＬＮ変換の完了をさらに２回反復し、リサイクル（３つの１Ｍ増分でのＧＬＮの段階的変換）を終了し、バイオ触媒リサイクルを反復した。リサイクル反応対リサイクル反応回数における最初の１Ｍ  ＧＬＮ溶液の変換の初速度の減少率は表１０に示されている（リサイクル反応は反応２〜８である）。
【０２２４】
（実施例１９）
（酸素を含まない環境下チオ硫酸または亜ジオチン酸の存在下のグリコロニトリル（ＧＬＮ）のグリコール酸アンモニウム（ＮＨ4ＧＬＡ）への変換）)
バイオ触媒リサイクルを脱イオン水１２．４２ｍＬの代わりに、脱イオン水１２．２２ｍＬおよび水中添加剤（チオ硫酸カリウム、Ｋ2Ｓ2Ｏ3または亜ジオチン酸ナトリウム、Ｋ2Ｓ2Ｏ4）の１Ｍ溶液を添加してリサイクルを開始し、かつ水０．２ｍＬの代わりに、水中添加剤の１Ｍ溶液０．２ｍＬをＧＬＮ  １．７８ｍＬの各々の添加とともに反応管に添加することを除き、実施例２８に記載された通りに実行した。リサイクル対リサイクル回数における最初の１Ｍ  ＧＬＮ溶液の変換の初速度の減少率は表１０に示されている（リサイクル反応は反応２〜８である）。
【０２２５】
【表１１】
2008525030.tif 000014
【０２２６】
（実施例２０）
（ｐＨ６．０での空気中添加剤なしのグリコロニトリル（ＧＬＮ）のグリコール酸アンモニウム（ＮＨ4ＧＬＡ）への変換）)
オーバーヘッド攪拌器を備えた５０−ｍＬジャケット付き反応管にバイオ触媒１  ４ｇ、脱イオン化水１２．４２ｍＬ、４Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ  ０．５ｍＬ、およびＧＬＮ（水中約５２ｗｔ％（フルカ（Ｆｌｕｋａ））１．７８ｍＬ、１Ｍ  ＧＬＮ最終濃度、ｐＨ６．０を充填し、混合物を２５℃下に攪拌し、アリコート０．２ｍＬを取出し、ＨＰＬＣによる反応経過に従った。すべてのＧＬＮがＮＨ4ＧＬＡに変換された場合、ＧＬＮ  １．７８ｍＬの第２の部分を添加し、ｐＨを水酸化アンモニウムでｐＨ６．０に調節し、すべてのＧＬＮが消費された場合、ＧＬＮ  １．７８ｍＬの第３の部分を添加し、ｐＨをｐＨ６．０に調節し、反応を完了し、３．１Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ溶液を得た。生成物溶液を静かに注ぎ、脱イオン水１２．４２ｍＬ、およびＧＬＮ  １．７８ｍＬをｐＨ６．０にｐＨ調節したバイオ触媒に添加し、ＧＬＮ変換を完了に進め、ＧＬＮの添加、ｐＨ調節、かつＧＬＮ変換の完了をさらに２回反復し、リサイクル反応（３つの１Ｍ増分でのＧＬＮの段階的変換）を終了し、バイオ触媒リサイクルを反復した。バイオ触媒１についてのリサイクル反応対リサイクル反応回数における最初の１Ｍ  ＧＬＮ溶液の変換の初速度の減少は表１１に示されている（リサイクル反応は反応２〜４である）。
【０２２７】
【表１２】
2008525030.tif 000015
【０２２８】
（実施例２１）
（さまざまな反応ｐＨでＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼを発現する固定化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８細胞を使用するグリコロニトリル（ＧＬＮ）のグリコール酸アンモニウム（ＮＨ4ＧＬＡ）への変換)
オーバーヘッド攪拌器および温度調節器を備えた５０−ｍＬジャケット付き反応管にＧＡ／ＰＥＩ架橋カラギナンビーズ（実施例１１に記載された方法を使用して調製）４ｇを充填し、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（配列番号６）を発現する５％（ｄｃｗ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８を含有する０．１Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ（ｐＨ７．０）の７２ｍＬ）で１５分間２回洗浄した。次いで管には蒸留水１０．８８ｇおよび４．０Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ（ｐＨ７．５）２．９８ｍＬ、７０ｗｔ％グリコール酸（ＧＬＡ）（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）または水中１：４希釈の水酸化アンモニウム（２８−３０ｗｔ％）のいずれかの適量を添加し（表１２）、反応管を窒素で洗い流した。混合物を２５℃下に攪拌し、水中４９．８８ｗｔ％グリコロニトリル（ＧＬＮ）２．１５ｍＬ（２．２５ｇ、１９．６ｍｍｏｌ（フルカ（Ｆｌｕｋａ））を添加し、ｐＨ４．０、４．７、５．５、６．７、または７．５で１Ｍ  ＧＬＮを得た（表１３）。
【０２２９】
４つの０．１００−ｍＬ反応試料をＧＬＮ添加後の所定の時間に除去し、ＨＰＬＣによって分析し、初期反応速度を測定した。各々のｐＨで実行される複製での速度の平均としての初期反応速度は表１３に示されている。
【０２３０】
【表１３】
2008525030.tif 000016
【０２３１】
【表１４】
2008525030.tif 000017
【０２３２】
（実施例２２）
（シアン化水素（ＨＣＮ）の存在または非存在下にＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２ニトリラーゼを発現する固定化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８を使用するグリコロニトリルのグリコール酸アンモニウムへの加水分解）
オーバーヘッド攪拌器および温度調節器を備えた５０−ｍＬジャケット付き反応管にＧＡ／ＰＥＩ架橋カラギナンビーズ（実施例１１に記載された方法を使用して調製）４ｇを充填し、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（配列番号６）を発現する５％（ｄｃｗ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８を含有する０．１Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ（ｐＨ７．５）７２ｍＬ）で１５分間２回洗浄した。次いで管には蒸留水１０．９ｇおよび４．０Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ（ｐＨ７．５）３．０ｍＬを添加し、反応管を窒素で洗い流した。混合物を２５℃下に攪拌し、水中５０ｗｔ％ＨＣＮ０．０６３ｍＬ（０．０５４ｇ、１ｍｍｏｌ）の有無による水中６０．５１ｗｔ％グリコロニトリル（ＧＬＮ）の１．７７７ｍＬのアリコート（１．８８５ｇ、２０．０ｍｍｏｌ（フルカ（Ｆｌｕｋａ）、再蒸留））を最初に添加した直後に水中水酸化アンモニウム（２８−３０ｗｔ％）の１：１６希釈０．３２０ｍＬを添加した。４つの０．１００−ｍＬ反応試料を最初のＧＬＮ添加後の所定の時間に除去し、ＨＰＬＣによって分析し、初期反応速度を測定した。ＧＬＮ変換の完了時、ＧＬＮおよび水酸化アンモニウムの各々の第２のアリコートを添加してＧＬＮの濃度を＜１ＭおよびｐＨを７．０−７．５の範囲内に維持し、ＧＬＮ変換が完了した後、ＧＬＮおよび水酸化アンモニウムの各々の第３のアリコートを添加した。反応の完了時、＞９９％の収量でグリコール酸（アンモニウム塩として）を生成するＧＬＮの１００％変換が認められ、添加ＧＬＮから生成されたグリコール酸アンモニウムの濃度はおよそ２．５Ｍであった（約２３．７ｍＬの最終反応体積で初期グリコール酸アンモニウム緩衝液を含む、３．０Ｍ総グリコール酸アンモニウム）。
【０２３３】
第１の反応の終了時、水性生成物混合物を触媒から静かに注ぎ（窒素下）、次いで反応管には蒸留、脱イオン化水１３．９ｍＬを添加し、真上に記載した通り水性ＧＬＮおよび水酸化アンモニウムのアリコートの添加によって２５℃下に第２の反応を実行した。触媒リサイクルによる連続バッチ反応の初期反応速度は表１４に示されている（リサイクル反応は反応２〜９である）。
【０２３４】
【表１５】
2008525030.tif 000018
【０２３５】
（実施例２４）
（Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼを発現する固定化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８を使用するグリコロニトリルのグリコール酸アンモニウムの加水分解の連続バッチ反応におけるホルムアルデヒドまたはシアン化水素のいずれかの添加の影響）
反応を実行し、特徴づけ、かつ水中６０．５１ｗｔ％グリコロニトリル（ＧＬＮ）１．７７７ｍＬ（１．８８５ｇ、２０．０ｍｍｏｌ（フルカ（Ｆｌｕｋａ）、再蒸留））の各々のアリコートが、水中３７ｗｔ％ＨＣＨＯ  ０．０７４ｍＬ（０．０８１ｇ、１ｍｍｏｌ）（リサイクル１、２、３、および６）または水中５０ｗｔ％ＨＣＮ  ０．０６３ｍＬ（０．０５４ｇ、１ｍｍｏｌ）（リサイクル４、５、およ７）のいずれかを含むことを除き、ＨＣＮの添加なしの反応のために実施例２３に記載された通りバイオ触媒をリサイクルした（表１５）。ＨＣＨＯまたはＨＣＮの添加なしの反応のデータは比較のために表１４から反復されている。
【０２３６】
【表１６】
2008525030.tif 000019
【０２３７】
（実施例２５）
（Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ突然変異Ｌ２０１Ｑを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８−Ｌ２０１Ｑ細胞を使用するグリコロニトリルのグリコール酸アンモニウムへの加水分解)
５０−ｍＬ遠心分離管にＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異Ｌ２０１Ｑ（配列番号８）を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８−Ｌ２０１Ｑ  ６ｇおよび０．３５Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．５）７．５４ｍＬ、０．３５Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．５）３５ｍＬを添加し、管を５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を注意深く、かつ完全に細胞ペーストから除去し、遠心分離細胞ペースト９３５ｍｇをオーバーヘッド攪拌器および温度調節器を備えた１５０−ｍＬジャケット付き反応管に移した。次いで管には０．３Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ（ｐＨ７．５）５２．５４ｍＬ、４．０Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ（ｐＨ７．５）７．８８ｍＬ、および蒸留水９．６３ｍＬを添加し、反応管を窒素で洗い流した。混合物を２５℃下に攪拌し、水中５４．６１ｗｔ％グリコロニトリル（ＧＬＮ）７．８２ｍＬ（８．１８ｇ、７８．３ｍｍｏｌ（フルカ（Ｆｌｕｋａ））を添加し、ｐＨを水中水酸化アンモニウム（２８−３０ｗｔ％）の１：４希釈によってｐＨ７．５に調節した。初期反応速度を測定するために、４つの０．０５０−ｍＬ反応試料を第１のＧＬＮの添加後の所定の時間に除去し、アッセイ混合物（６．０Ｎ  ＨＣｌ  ０．０２５ｍＬおよび０．１８Ｍ  ｎ−プロパノール０．８００ｍＬ）に添加し、ボルテックスし、１２，０００ｒｐｍで６分間、遠心分離し、上清を実施例２に記載されている通りＨＰＬＣによって分析した。ＧＬＮ変換の完了時、ＧＬＮの第２のアリコートを添加し、ｐＨを水酸化アンモニウムで７．５に調節し、ＧＬＮ変換が完了した後、第３のＧＬＮアリコートを添加し、ｐＨをｐＨ７．５に調節した。反応の完了時、＞９９％収量でグリコール酸（アンモニウム塩として）を生成するＧＬＮの１００％変換が認められ、添加ＧＬＮから生成されたグリコール酸アンモニウムの濃度はおよそ２．５Ｍであった（約９４．０５ｍＬの最終反応体積で初期グリコール酸アンモニウム緩衝液を含む、２．９Ｍ総グリコール酸アンモニウム）。
【０２３８】
第１の反応の終了時、水性生成物混合物を細胞ペーストから遠心分離した（５０００ｒｐｍ、２０分）。細胞ペーストを秤量し、元の反応管に移した。次いで管には０．３Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ（ｐＨ７．５）５２．５４ｍＬ、４．０Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ（ｐＨ７．５）７．８８ｍＬ、および蒸留水９．６３ｍＬを添加し、反応管を窒素で洗い流し、第２の反応を真上に記載されている通り水性ＧＬＮおよび水酸化アンモニウムのアリコートの添加によって２５℃下に実行した。上記の反応溶液の遠心分離による反応４後に回収された細胞ペーストの重量は９６４ｍｇであった。
【０２３９】
触媒リサイクルとの連続バッチ反応の初期反応速度は表１６に示されている（リサイクル反応は反応２〜４である）。
【０２４０】
【表１７】
2008525030.tif 000020
【０２４１】
（実施例２６）
（Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２ＷニトリラーゼまたはＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ突然変異を発現する固定化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８形質転換体を使用するグリコロニトリルのグリコール酸アンモニウムへの加水分解）
オーバーヘッド攪拌器および温度調節器を備えた５０−ｍＬジャケット付き反応管にＧＡ／ＰＥＩ架橋カラギナンビーズ（実施例１１に記載された方法を使用して調製）８ｇを充填し、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（配列番号６）、またはＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異Ｆ１６８Ｖ（配列番号３２）、Ｆ１６８Ｍ（配列番号２８）、Ｆ１６８Ｋ（配列番号２６）、Ｆ１６８Ｔ（配列番号３０）、およびＬ２０１Ｑ（配列番号８）を発現する５％（ｄｃｗ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８形質転換体を含有する０．１Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ（ｐＨ７．０）７２ｍＬ）で１５分間２回洗浄した。次いで管には蒸留水１４．６３２ｇおよび４．０Ｍ  ＮＨ4ＧＬＡ（ｐＨ７．０）６．０ｍＬを添加し、反応管を窒素で洗い流した。混合物を２５℃下に攪拌すると同時にプログラム可能な注射器ポンプを使用し、水中５９ｗｔ％グリコロニトリル（ＧＬＮ）（１．１４ｇ、１２．０ｍｍｏｌ（フルカ（Ｆｌｕｋａ）、再蒸留）１．０８ｍＬおよび水（合計２．３０４ｍＬ）中水酸化アンモニウム（２８−３０ｗｔ％）の１：１６希釈０．２８８ｍＬの８つのアリコートを添加し、ＧＬＮおよび水酸化アンモニウムの各々１つのアリコートを２時間毎に同時に添加し、ＧＬＮの濃度を＜４００ｍＭおよびｐＨを６．５−７．５の範囲内に維持した。４つの０．０５０−ｍＬ反応試料をＧＬＮ添加後の所定の時間に除去し、ＨＰＬＣによって分析し、初期反応速度を測定した。反応の完了時、＞９９％の収量でグリコール酸（アンモニウム塩として）を生成するＧＬＮの１００％変換が認められ、添加ＧＬＮから生成されたグリコール酸アンモニウムの濃度はおよそ２．４Ｍであった（約３９．５ｍＬの最終反応体積で初期グリコール酸アンモニウム緩衝液を含む、３．０Ｍ総グリコール酸アンモニウム）。
【０２４２】
第１の反応の終了時、水性生成物混合物を触媒から静かに注ぎ（窒素下）、固定化細胞触媒（８．０ｇ）と残りの生成物混合物（約２．３ｇ）の混合物約１０．３ｇを残した。次いで、反応管には蒸留、脱イオン化水１８．３ｍＬを添加し、真上に記載した通り水性ＧＬＮおよび水酸化アンモニウムのアリコートの添加によって２５℃下に第２の反応を実行した。触媒リサイクルによる連続バッチ反応の初期反応速度は表１７に示されている（リサイクル反応は反応２〜５５である）。
【０２４３】
触媒生産性（生成された総グラムＧＬＡ／グラム乾燥細胞重量（ｄｃｗ）酵素触媒）を結果としてグリコロニトリルの１００％変換をもたらした触媒リサイクルとの連続バッチ反応の総数から各々のニトリラーゼについて計算した。各々の酵素触媒についての触媒生産性は以下の通りであった。すなわち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−Ｆ１６８Ｖ、ＧＬＡ／ｇ  ｄｃｗ（５５連続バッチ反応）１００１ｇ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−Ｆ１６８Ｍ、ＧＬＡ／ｇ  ｄｃｗ（２６連続バッチ反応）４７３ｇ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−Ｆ１６８Ｋ、ＧＬＡ／ｇ  ｄｃｗ（２６連続バッチ反応）４７３ｇ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−Ｆ１６８Ｔ、ＧＬＡ／ｇ  ｄｃｗ（２０連続バッチ反応）３６４ｇ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−Ｌ２０１Ｑ、ＧＬＡ／ｇ  ｄｃｗ（１９連続バッチ反応）３４６ｇ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８、ＧＬＡ／ｇ  ｄｃｗ（１０連続バッチ反応）１８２ｇ。
【０２４４】
【表１８】
2008525030.tif 000021
【０２４５】
【表１９】
2008525030.tif 000022
【０２４６】
（実施例２７）
（Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ変異Ｆ１６８Ｖを発現する固定化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８形質転換体を使用するＧＬＮの変換によって得られるグリコール酸アンモニウムの特性化）
固定化ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−Ｆ１６８Ｖバイオ触媒によるＧＬＮ（フルカ（Ｆｌｕｋａ）、再蒸留）加水分解（実施例２６、表１７を参照）によって得られる生成物溶液の組成物を評価するために、反応５、１０、および３８で生成された生成物溶液をＨＰＬＣおよび1Ｈ  ＮＭＲ分光法によって特性化した。ＨＰＬＣによって測定されたグリコール酸の濃度は３．１Ｍであった。量的1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを５００ＭＨｚで作動するバリアン・ユニティー・イノバ（Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  Ｉｎｏｖａ）分光計（バリアン（Ｖａｒｉａｎ）社（Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ））を使用して得た。反応生成物１５０μＬをＤ2Ｏ  ４００μＬとともに５ｍｍのＮＭＲ管に添加することによって試料を調製した。
【０２４７】
1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを５ｐｐｍ、および９０度パルス（４９ｄｂのトランスミッタ出力で５．９マイクロ秒）で配置したトランスミッタにより６０００Ｈｚのスペクトル幅を使用して取得した。４８，０００点の総データサイズをもたらす４秒の取得時間を使用した。最長の1Ｈ  Ｔ1（８秒）はメタノールＣＨ3陽子と関連し、したがって、取得前の総遅延時間は５０秒（すなわち、メタノールＣＨ3Ｔ1の５倍超）に設定した。この前遅延時間は、単純遅延時間（「ｄ１」）と−６ｄｂのトランスミッタ出力での残留水の共鳴に適用される３０秒の溶媒飽和パルスとの間で分割された。３２スキャンの信号加算平均に先立ち、４つの定常状態（「ダミー」）スキャンがあり、およそ３２分の総実験時間を示した。割当は1Ｈ  ＮＭＲ化学シフトを以前の二次元ＮＭＲ相関実験で得られたものと比較することによって、かつスパイク実験によって得られた。
【０２４８】
1Ｈ  ＮＭＲ分光法によってグリコール酸アンモニウム生成物溶液で得られた不純物は、その官能基に基づき、以下の官能基カテゴリーに分類された。すなわち、ホルムアルデヒド由来、ギ酸由来、メタノール由来、およびメチル由来。カテゴリーの各々の陽子信号の積分ピーク面積は以下の通り割当てられた。すなわち、２つの陽子はホルムアルデヒド官能性に割当てられ、１つの陽子はギ酸官能性に割当てられ、３つの陽子はメタノール官能性に割当てられ、かつ３つの陽子はメチル官能性に割当てられた。グリコール酸アンモニウムの集積ピーク面積は２（グリコール酸アンモニウム陽子の数）で割られ、１００％の値が割当てられた。不純物官能基カテゴリーの各々で確認された集積ピーク面積を対応する電子の数で割り（上記参照）、結果として生じる集積ピーク面積を存在するグリコール酸アンモニウムの濃度に対して不純物のパーセント濃度を測定する試料に存在する１つのグリコール酸陽子の集積ピーク面積で割った。グリコール酸アンモニウムの収量（ＧＬＮの１００％変換に基づく）およびグリコール酸アンモニウムの％純度（グリコール酸および総不純物の相対濃度に基づく）は表１７に示されている。
【０２４９】
【表２０】
2008525030.tif 000023
【０２５０】
（実施例２８）
（固定床イオン交換クロマトグラフィーによるグリコール酸アンモニウムからのグリコール酸の単離）
同時係属の（特許文献４２）（参照により本明細書で援用される）の実施例４−８に記載されたシアン化水素およびホルムアルデヒドから合成されたＧＬＮを、添加剤なしに（反応体積を１８倍に拡大したことを除き）、実施例１２に記載されている通りグリコール酸アンモニウムに変換し、固定床イオン交換を使用し、グリコール酸アンモニウム生成物溶液をグリコール酸に変換した。
【０２５１】
テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）（登録商標）ＰＴＦＥエンドキャプおよびＨ+形態でのＤｏｗｅｘ（登録商標）Ｇ−２６強酸陽イオン樹脂（ダウ・ケミカル社（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）を備えた５ｃｍ内径×６０ｃｍホウケイ酸ガラスカラム（スペクトル−クロマトグラフィー）を使用した。５ガロンポリプロピレン供給水差しを使用し、樹脂の前後洗浄のために超高純度水（Ｓｙｂｒｏｎ−Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ  ＩＩ  ｕｎｉｔによって製造された１８＋ＭΩ）をカラム供給ポンプ（オールテフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）（登録商標）ヘッド付のＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ可変速隔膜ポンプ）に供給した。水差しをつねに窒素パージし、大気ＣＯ2の吸収を阻止した。充填カラム（初期高＝２３”、床体積＝１１４７ｍＬ）を＞５ＭΩの流出物に超高純度水で前洗浄後、グリコール酸アンモニウム（１．３リットル（１４２８ｇ）、ｐＨ＝７．０９）を４０ｍＬで床上向流にポンプで通し、グリコール酸が使い果たされるとユニットを同一の速度でポンピングする超高純度水に切替え、供給材料を床に押通し続けた。実行中、カラム流出物を前洗浄ＨＤＰＰ（高密度ポリプロピレン）試料瓶を使用して連続的に５０ｍＬ増分で捕捉し、合計３８の流出物の５０−ｍＬ試料を連続的に採取し、ｐＨ（ｐＨ計）、グリコール酸濃度（ＨＰＬＣ）、およびアンモニウムイオン含有量（イオンクロマトグラフィーによる）について分析した。
【０２５２】
アンモニウムイオン含有量の測定は、ＣＤ２０導電性検出器を備えたＤｉｏｎｅｘ  ＩＰ２５ポンプおよびＤｉｏｎｅｘ  ＣＳ１７カラム（３−１１ｍＭスルホン酸メタン、１．０ｍＬ／分、１００マイクロアンプに設定したＤｉｏｎｅｘ  ＣＳＲＳウルトラで抑制、１．０ｍＬ／分、１００マイクロリットル試料ループ）を使用して行い、陽イオン３−１１ｍＭ  ＣＳ１７法を分析に適用した。
【０２５３】
フラクション１２〜２３を複合し（総６００ｍＬ）、一夜、新鮮なＤｏｗｅｘ（登録商標）Ｇ−２６樹脂（脱イオン化水４５ｍＬで２０分間、３回前洗浄）５ｇで攪拌し、グリコール酸溶液６５１ｇをろ過によって収集した。溶液を回転蒸発によって濃縮し、７０ｗｔ％グリコール酸（生成物１４０ｇ）を生成した。不純物についての７０ｗｔ％グリコール酸の分析は、グリコール酸の純度が９９．９％を上回ることを示した。
【配列表】
2008525030000001.app
【国際調査報告】
2008525030.tif 000024
2008525030.tif 000025
2008525030.tif 000026