(57)【要約】本発明は、ウイルス発現ベクターを含み、該ウイルス発現ベクターは、関心の対象である遺伝子、ベクター発現ウイルスの下流に置かれたレポーター遺伝子、真核細胞遺伝子の発現に適した遺伝子、または、構成的プロモーターの下流に置かれた関心の対象である遺伝子を含む構成物の上流に、構成的かつ普遍的プロモーターを含み、これらの構成物が、前記構成的かつ普遍的プロモーターの下流に置かれた、イネ黄色モットルウイルス（RYMV、Rice Yellow Mottle Virus）のサイレンシングサプレッサーであるＰ１遺伝子を更に含む構成物によって補完されることを特徴とする植物における組み換えタンパク質の一過性発現系を対象とする。応用：治療的関心の対象であるタンパク質の生成。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス発現ベクターを含み、該ウイルス発現ベクターは、関心の対象である遺伝子、ベクター発現ウイルスの下流に置かれたレポーター遺伝子、真核細胞遺伝子の発現に適した遺伝子、または、構成的プロモーターの下流に置かれた関心の対象である遺伝子を含む構成物の上流に、構成的かつ普遍的プロモーターを含み、これらの構成物が、前記構成的かつ普遍的プロモーターの下流に置かれた、イネ黄色モットルウイルス（RYMV、Rice Yellow Mottle Virus）のサイレンシングサプレッサーであるＰ１遺伝子を更に含む構成物によって補完されることを特徴とする植物における組み換えタンパク質の一過性発現系。
【請求項２】
関心の対象である遺伝子の上流にＲＹＭＶの複製部分を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の系。
【請求項３】
前記ベクターが、前記構成的かつ普遍的プロモーターの下流に置かれた、サイレンシングサプレッサー遺伝子を発現する１つまたは幾つかの独立した構成物を追加されることを特徴とする請求項１または２に記載の系。
【請求項４】
関心の対象である遺伝子が、β−グルクロニダーゼをコードするＧＵＳ遺伝子のような、可視又は蛍光定量法によって容易に検出可能な遺伝子から選択されるレポーター遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の系。
【請求項５】
ＧＵＳ遺伝子が、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターの下流に置かれることを特徴とする請求項４に記載の系。
【請求項６】
使用されるベクターが、ｐＣａｍｂｉａ  １３０５．１のような、プラスミドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の系。
【請求項７】
病原菌を介して植物系中に、請求項１〜６のいずれか１つに定義されたようなベクターを導入することと、一過性ベクター発現を検出することを含むことを特徴とする組み換えタンパク質の生成方法。
【請求項８】
利用される植物系が、植物全体であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
利用される植物系が、細胞懸濁液であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
植物系中への導入が、アグロバクテリウム浸潤、又は同時培養によって行われることを特徴とする請求項７〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
細胞懸濁液中へのベクター導入が、細胞懸濁液による細菌の同時培養によって行われることを特徴とする請求項７〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
工業的、特に医薬上の関心の対象であるタンパク質を生成するための、請求項１〜６のいずれか１つに記載の組み換えタンパク質の一過性発現系又は請求項７〜１１のいずれか１つに記載の方法の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関心の対象である組み換えタンパク質の生成を対象とする。本発明は特に、かかるタンパク質の新規な発現系、並びにその工業的、特に医薬上の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的な生成系は、哺乳動物、昆虫、微生物及びトランスジェニック動物の細胞培養を使用する。これらの系による生成費用は、高く、タンパク質生成を工業的な規模で行うことを可能にしない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明者らによって設定された戦略は、植物への病原菌を介したウイルス発現ベクターの使用を拠り所とする。
【０００４】
従って、本発明は、タンパク質の生成費用の減少、及び大規模な製造を特に可能にする、関心の対象であるタンパク質を生成するために新規な一過性発現系を提供することを目的とする。
【０００５】
本発明は、かかる一過性発現系を用いた新規なタンパク質生成方法も同様に対象とする。
【０００６】
本発明は、特にワクチン特性、特に抗リーシュマニア（Leishmania）特性を有するタンパク質生成への新規な発現系の応用を更に対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明による、植物におけるタンパク質の一過性発現系は、ウイルス発現ベクターを含み、該ウイルス発現ベクターは、関心の対象である遺伝子、ベクター発現ウイルスの下流に置かれたレポーター遺伝子、真核細胞遺伝子の発現に適した遺伝子、または、構成的プロモーターの下流に置かれた関心の対象である遺伝子を含む構成物の上流に、構成的かつ普遍的プロモーターを含み、これらの構成物が、前記構成的かつ普遍的プロモーターの下流に置かれた、イネ黄色モットルウイルス（RYMV、Rice Yellow Mottle Virus）のサイレンシングサプレッサーであるＰ１遺伝子を更に含む構成物によって補完されることを特徴とする。
【０００８】
好適には、好ましくはサイレンシングサプレッサーに組み合わされた関心の対象である遺伝子の上流にＲＹＭＶの複製部分を使用する。
【０００９】
本発明の実施態様において、組み換えタンパク質の一過性発現系は、前記ベクターが、前記構成的かつ普遍的プロモーターの下流に置かれた、サイレンシングサプレッサー遺伝子を発現する１つ又は幾つかの独立した構成物を追加されることを特徴とする。
【００１０】
レポーター遺伝子は、β−グルクロニダーゼをコードするＧＵＳ遺伝子のような、可視又は蛍光定量法によって容易に検出可能な遺伝子から選択される。
【００１１】
このＧＵＳ遺伝子は、好ましい構成において、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターの下流に置かれる。
【００１２】
使用されるベクターは、ｐＣａｍｂｉａ  １３０５．１のような、特に市販のプラスミドである。
【００１３】
これらの発現系は、多数の利点を有する。特に、それらによって（ｉ）真核細胞系中で複合タンパク質が生成されることと、（ｉｉ）可能な生成レベルと、タンパク質の生物活性と、生成費用を識別することと、（ｉｉｉ）最良の生成系（植物、組織タイプ、一過性又は構成的系、構成的又は誘導性プロモーター、及び最適なタンパク質／サプレッサーの組み合わせ）を識別することと、（ｉｖ）タンパク質の生物活性（突然変異生成、欠失、翻訳後修飾、細胞内局在のためのアドレッシング配列）に対して働きかけることが可能になる。
【００１４】
本発明によれば、組み換えタンパク質の生成方法は、病原菌を介して植物系中に以上に定義したようなベクターを導入することと、一過性ベクター発現を検出することを含むことを特徴とする。
【００１５】
好適には、利用される植物系は、植物全体である。応用例では、細胞懸濁液のことである。
【００１６】
植物全体の場合に、特には実生（plantule）を使用する。
【００１７】
満足させる結果が得られる植物には、ベンサミアナタバコ（Nicotonia benthamiana）、特にNicotonia benthamiana var.BY2と、イネ（Oryza sativa）、特にOryza sativa var.O2428を含む。
【００１８】
植物系中への導入は、アグロバクテリウムツメファシエンスのようなアグロバクテリウム浸潤、又は同時培養によって行われる。
【００１９】
細胞懸濁液中へのベクター導入に関して、細胞懸濁液による細菌同時培養に頼る。
【００２０】
一過性発現を明らかにすることは、特に組織化学テストによって視覚的に、又は特に蛍光定量テストによって定量的に行われる。
【００２１】
本発明は、工業的、特に医薬上の関心の対象であるタンパク質を大量に生成する方法をこのようにして提供する。特に、本発明の手段は、ワクチン特性、例えば抗リーシュマニア特性を有するタンパク質を生成することに特に適している。
【００２２】
本発明のその他の特性及び利点は、以下に続く、図１及び２を参照する実施例において現れるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（実施例１：アグロインフィルトレーション法（methode d’agroinfiltration）による植物中への発現ベクターの一過性導入）
アグロバクテリウムは、ベクター及び細菌の選択に不可欠な抗生物質の存在下で、２８℃で培養される。２日間の培養後、６００ｎｍでの細菌の光学濃度は、分光光度計を用いて評価される。細菌は、０．５のＤＯを得るために、ＭｇＣｌ２溶液中で沈殿し、かつ懸濁状態に置かれる。この溶液は、アグロバクテリウムの毒性を増加させるために、アセトシリンゴンを添加される。溶液は、３〜２４時間、外界温度でインキュベートされる。アグロバクテリウムは、針のない注射器によって浸潤される。植物の葉に加えられる１回の圧力によって溶液が葉全体に浸潤することが可能になる。植物は、培養室に戻され、かつ採取は、浸潤後の異なる時間で行われる。
【００２４】
（実施例２：同時培養法による細胞懸濁液中へのベクターの導入）
アグロバクテリウムツメファシエンスの液体培養物は、２８℃で一晩インキュベートされる。細菌培養物は、固体培地に塗布され、かつ２８℃でインキュベートされる。２日後、細菌の床は、液体培地（ＢＹ２の細胞懸濁液を培養するための培地、又はOryza sativa var.O2428の同時培養の培地）中で懸濁状態に置かれる。この培地は、アセトシリンゴンを添加される。アグロバクテリウム溶液は、細胞懸濁液によって数時間インキュベートされる。洗浄後、細胞懸濁液は、培養室に戻される。
【００２５】
（実施例３：組織化学テストにより一過性発現を明らかにすること）
基質中に、葉の断片又は採取された細胞懸濁液を置く。基質の浸透を容易にするために、１０分間の真空の後、テストは、３７℃に一晩置かれる。ＧＵＳ遺伝子が発現される時に、葉又は細胞の青い着色が現れる。図１に、Oryza sativa var.O2428の細胞懸濁液中（図１Ａ）、及びＢＹ２の細胞懸濁液中（図１Ｂ）での視覚化を可能にするテストの結果を報告する。
【００２６】
植物全体に対するテストは、ＧＵＳレポーター遺伝子を含むアグロバクテリウムを浸潤させると、レポーター遺伝子の発現を示す葉の青い着色が観察されることを示している。
【００２７】
タンパク質発現の出現時間を決定するために、酵素発現速度が得られた。得られた結果は、葉の青い着色が、浸潤後２４時間から現れることを示した。
【００２８】
（実施例４：蛍光定量テストにより一過性発現を明らかにすること）
葉又は細胞は、破砕される。次にタンパク質は、タンパク質用抽出緩衝液（Ｎａ２ＥＤＴＡ  ０．５ｍ  ｐＨ８、Ｎ−ラウリルサルコシン、純トリトン、ＮａＨＰＯ４、５０ｍＭ、ｐＨ７）を用いて抽出され、かつ２回繰り返して遠心分離される。蛍光定量テストは、上清に適用される。タンパク質の量に応じた上清の酵素活性を決定するために、ブラッドフォードテストによってタンパク質の定量化を実施する。このために、クーマシーブルーが、タンパク質に添加される。外界温度で１５分間の撹拌及びインキュベーション後、５９５ｎｍで光学濃度を測定する。５９５ｎｍでの光学濃度と、タンパク質の量を対応させるために、標準範囲は、様々なＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）濃度によって確立される。その場合、試料１μｌ当たりのタンパク質のμｇでの濃度が得られる。
【００２９】
蛍光定量テストは、４６０ｎｍの波長での蛍光化合物への基質の加水分解に基づく。試料は、基質に添加される。ＤＯの３回の測定が、３０分毎に４６０ｎｍで行われる。４６０ｎｍでの光学濃度と、酵素活性を対応させるために、ＤＯの差は、分毎に計算され、かつ報告され、基質の加水分解から生じた生成物の様々な濃度による標準範囲が得られる。ブラッドフォードテストの定量化によって、タンパク質１μｇ当たり報告される毎分モルでの生成物の量が得られる。その場合、毎分及びタンパク質１μｇ当たりの基質のｐモルでの酵素活性が得られる。
【００３０】
蛍光定量テストによるタンパク質発現の定量化が、行われる。
【００３１】
浸潤後３日まで増加し、かつ６日後に減少する酵素活性が観察される。
【００３２】
（実施例５：レポーター遺伝子と、サイレンシングサプレッサー遺伝子を組み合わせて含むベクターの使用）
タンパク質発現を増加させるために、ＧＵＳレポーター遺伝子を含むベクターは、Ｐ１、ｐ１９又はＰ１及びｐ１９サイレンシングサプレッサー遺伝子に組み合わされた。
【００３３】
酵素活性速度を得ると、図２に示すように、ｐ１９サイレンシングサプレッサーを使用すると、１７倍大きな発現が観察される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】細胞懸濁液Oryza sativa var.O2428による組織化学テストによって得られた結果である。
【図１Ｂ】ＢＹ２の細胞懸濁液中で得られた結果である。
【図２】時間及び発現ベクターに応じたタンパク質１μｇ当たり毎分の基質のｎｍでのＧＵＳ酵素活性である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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