(57)【要約】  本発明は、初期段階の感染を検出するための、特に、敗血症を最も発生し易い患者を同定するためのシステム及び方法を記述する。任意に予測アルゴリズムの使用と組み合せた、サイトカイン及び／又は細胞活性化マーカーの特定の組合せにおける発現レベルの測定が、高精度の予測を可能にする。この方法は、民間の及び軍事的な事情において適用可能である。【選択図】          図１
2008522604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染、ＳＩＲＳ又は敗血症の初期段階を検出するために生物学的サンプルをスクリーニングする方法であって、
ａ）ＲＴ−ＰＣＲによって一組の情報的に有益なバイオマーカーの発現を検出し、及び／又はフローサイトメトリーにより一組の情報的に有用な細胞表面バイオマーカーの発現を検出し、及び／又は一組の標準の臨床測定値をモニターする工程、
ｂ）前記検出の結果を、ニューラルネットワーク又は多変量統計解析により解析する工程、
ｃ）明白な感染の発症の可能性及びタイミングに従って、前記サンプルを分類する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記結果の解析により、臨床的ＳＩＲＳ又は敗血症の発症の可能性を予測する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結果の解析により、臨床的ＳＩＲＳ又は敗血症の発症のイエス／ノーの二値予測を行う請求項１に記載の方法。
【請求項４】
臨床的ＳＩＲＳ又は敗血症の発症が予測されたら、前記結果は、前記臨床的疾患の可能異性のあるタイミング及び／又は重篤度を決定するために二次解析にかけられる請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
発現がＲＰ−ＰＣＲによって検出される前記一組の情報的に有益なバイオマーカーが、ＦａｓＬ、ＭＣＰ−１、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−α、及びＩＮＦ−γからなる群から選択される少なくとも６種類からなる請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも７種のバイオマーカーの発現が検出される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
フローサイトメトリーによって発現が検出される前記一組の情報的に有益な細胞表面バイオマーカーが、ＣＤ３１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ８０及びＣＤ９７からなる群から選択される少なくとも２種からなる請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
解析される前記標準の臨床的測定値が、温度、心拍速度、白血球細胞野合計数及び 区別された数（単球、リンパ球、顆粒球、好中球）、血小板数、血清クレアチニン、尿素、乳酸塩、塩基過剰、ｐＯ2、ＨＣＯ3-、及びＣ−反応性タンパク質からなる群から選択される請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
主成分解析及び／又は判別関数解析を含む多変量統計解析により、前記解析が行われる請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記多変量統計解析が、判別関数解析を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記解析が、ニューラルネットワークにより行われる請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ニューラルネットワークが、多層パーセプトロン・ニューラルネットワークである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記解析が、８０％超の症例において臨床的なＳＩＲＳ又は敗血症を正確に予測できる請求項９〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
初期段階の感染、ＳＩＲＳ又は敗血症を検出するために生物学的サンプルをスクリーニングするためのシステムであって、
前記サンプルにおける細胞からＲＮＡを抽出及び精製する手段と、
選択されたＲＮＡ配列を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅するためのサーマルサイクラー又は他の手段と、
前記ＲＴ−ＰＣＲの結果を検出及び定量するための手段と、
このような結果を解析できるようにトレーニングされたコンピュータに基づくニューラルネットワークと、
前記ニューラルネットワーク解析の結果がオペレータに伝達され得るディスプレー手段と、
を含むことを特徴とするシステム。
【請求項１５】
初期段階のＳＩＲＳ又は敗血症を検出するために生物学的サンプルをスクリーニングするためのシステムであって、
特定の細胞表面マーカーを標識して該マーカーの発現を定量する手段と、
前記標識及び定量の結果を検出及び定量する手段と、
このような結果を解析できるようにトレーニングされたコンピュータに基づくニューラルネットワークと、
前記ニューラルネットワーク解析の結果がオペレータに伝達され得るディスプレー手段と、
を含み、好ましくは、前記標識が、標識された抗体又は抗体断片によるものであり、前記定量は蛍光活性化された細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は他の形態のフローサイトメトリーによるものであることを特徴とするシステム。
【請求項１６】
ＲＴ−ＰＣＲ及びＦＡＣＳ解析の両方を行う手段を含む請求項１３又は１４の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
更に、標準的な臨床測定値からデータを取得して解析する手段を含む請求項１３〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
感染、ＳＩＲＳ又は敗血症の診断のための診断手段を調製するための、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法に従う解析又は請求項１３〜１６の何れか１項のシステムを使用する解析。
【請求項１９】
感染、ＳＩＲＳ又は敗血症の診断のための診断手段を調製するための、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法又は請求項１３〜１６の何れか１項のシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
大幅に改善された診断、治療及び支援にも拘わらず、重篤な感染及び敗血症は未だ重要な死亡原因のままであり、また急性の発症における生存患者においても、慢性の不健康状態又は能力障害をもたらすことが多い。健康な成人の間では突然の抗し難い感染は比較的稀であるが、免疫無防備状態の個体、集中治療を受けている重篤な疾患の患者、火傷の患者及び幼児の場合には、それは増大したリスクを構成する。一部の症例では、明らかに治療可能な感染が敗血症の発症を導く；敗血症とは、腎不全及び呼吸器不全、血液凝固異常、重大で且つ無応答性の低血圧、並びに約３０％の症例での死亡を導く進行性の循環器崩壊を特徴とした、感染に対する制御不能な不適切な応答である。北アメリカの人口における敗血症の発生は、年間で人口の約０．３％（約４５０，０００症例）であり、死亡率は高齢者で４０％、最も重篤な形態である敗血症ショックの症例では５０％に昇る（Angus et al, 2001, Crit Care Med 29: 1303-1310）。
【０００２】
感染性微生物での感染の後、身体は、最初は先天的な非特異的免疫応答、その後は特異的な後天的免疫応答といった、古典的な炎症反応及び活性化を伴って反応する。細菌感染において、菌血症は迅速な（３０〜９０分以内）発熱、並びに敗血症性抗原に誘導された免疫応答の発生よりもかなり前に、細菌毒素の検出にトリガーされたインターロイキン１（ＩＬ−１）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）等の炎症性サイトカインの放出を導く。
【０００３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ又は  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのようなグラム陰性腸内細菌に由来する腸チフス、疫病、野兎病及びブルセラ症、又は腹膜炎のような感染に起因するグラム陰性菌血症において、これは、殆どが細菌の細胞壁に由来するリポ多糖（ＬＰＳ）及び他の成分に対する反応である。循環するＬＰＳ、特にその成分であるリピドＡは、広範囲な全身的反応を誘発する。それは、おそらくは肝臓内において星細胞と接触し、最初にＩＬ−１放出及び発熱を導く。循環する単球及びマクロファージの活性化は、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）のようなサイトカイン、並びに高移動度群Ｂ１（ＨＭＧＢ１）のようなサイトカイン様分子の放出を導き、ついでこれらが好中球、リンパ球及び血管内皮を活性化し、細胞接着分子をアップレギュレートし、プロスタグランジン、一酸化窒素シンターゼ及び急性期タンパク質を誘導する。血小板活性化因子（ＰＡＦ）、プロスタグランジン、ロイコトリエン及びトロンボキサンの放出は、血管内皮を活性化し、血管緊張を調節し、外因性凝固カスケードを活性化させる。これら応答の調節不全は、敗血症の合併症及び低血圧を導く末梢血管拡張に関する敗血症ショック、並びに血栓症及び血管内凝血を生じる異常凝固及び繊維素溶解をもたらす（Cohen, 2002, Nature 420: 885-891）。
【０００４】
ＬＰＳは、血清ＬＰＳ結合性タンパク質（ＬＢＰ）、並びに単球及びマクロファージに発現したＣＤ１４に結合することによって、主として細胞に作用する。ＬＰＳ及びＬＢＳの複合体を結合する際、ＣＤ１４は、共受容体であるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）及び更なる成分であるＭＤ−２と共に作用して、シグナリング複合体を形成し、マクロファージの活性化及びサイトカインの放出を開始させる
2008522604.tif 000003
2004, Immunology 113: 153-162）。Ｔｏｌｌ様受容体ファミリーは、先天的な免疫システムのためのトリガーとして作用するある範囲の細菌及び真菌のリガンドに関与する一群の細胞表面受容体であり、該リガンドにはグラム陽性細胞壁構造、フラゲリン、及びバクテリアＤＮＡに特徴的なＣｐＧ反復が含まれる。
【０００５】
グラム陽性病原体での感染の場合、敗血症ショックは、外毒素の産生に関連している。例えば、そうでなければ健康である固体を屡々冒す毒素ショック症候群、特に、急性形態の敗血症ショックは、毒性ショック症候群トキシン−１（ＴＳＳＴ−１）として知られる外毒素を産生する、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ・ａｕｒｅｕｓ株によるものである。同様の症状は、一定の群Ａ・Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ・ｐｙｏｇｅｎｅｓ株での侵襲的感染によって惹起され、連鎖球菌発熱性エンテロトキシンＡ（ＳＰＥ−Ａ）に関連することが多い。幾つかのグラム陽性外毒素（ＴＳＳＴ−１を含む）は、それらの超抗原特性の結果として、それらの影響を支配的に及ぼすと考えられる。超抗原は、抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子を一定のクラスのＴ細胞受容体に架橋することによって、Ｔリンパ球を非特異的に刺激することができる。通常は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の相互作用が高度に特異的であり、ＭＨＣにより提示される短い抗原由来のペプチドを特異的に認識するＴＣＲを担持したＴ細胞だけが結合及び活性化されることができ、抗原特異的なＴ細胞応答を保証する。超抗原はこの機構をバイパスして、Ｔ細胞の大量かつ不適切な活性化を生じる。しかし、ＳＰＥ−Ａは効率的な超抗原ではなく、何等かの更なる機構が関係しているに違いない。なお、臨床的な敗血症はまた、幾つかのウイルス（例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス）及び真菌での感染からも生じ得ること、及びこのような場合に他の機構が関与する可能性があることに留意すべきである。
【０００６】
潜在的に重篤な感染をできるだけ早期に検出する能力、特に、疑わしき個体において敗血症の発症を予測する能力は、明らかに有利である。ショック、敗血症、敗血症ショック、毒素ショック、全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）のような臨床的実体を定義する明瞭な基準を確立するための試みにおいて、長年に亘ってかなりの努力が費やされてきた。同様に、ある範囲の臨床的、化学的、生化学的、免疫学的、及び細胞計数的なパラメータを測定すること、及び変化する予後の成功及び洗練の多くの評価システム基づいて、頑丈な予測モデルを設計するために多くの試みがなされてきた。
【０００７】
１９９１年のアメリカ胸部医師大学（ＡＣＣＰ）及び集中治療医学学会（ＳＣＣＭ）の合意会議に従えば、患者が下記の１以上を有するときに「ＳＩＲＳ」が存在するとみなされる：即ち、３８℃超又は３６℃未満の体温、９０／分より大きい心拍速度、２０／分を越える呼吸速度又は３２ｍｇＨｇ未満のＰａＣＯ2を含む過呼吸、１２０００細胞／μＬ超又は４０００細胞／μＬ未満の白血球数（Bone et al, 1992, Crit Care Med 20: 864-874）。
【０００８】
「敗血症」は、感染により生じるＳＩＲＳとして定義されてきた。ＳＩＲＳは、例えば火傷、膵炎、及び他の疾患状態においては、感染の不存在下でも生じ得ることが承認されている。「感染」は、病原性又は潜在的に病原性の微生物が、正常な無菌の組織、体液又は体腔に侵入することにより生じる病理学的プロセスとして定義された。
【０００９】
「重篤敗血症」は、臓器不全の合併症を生じた敗血症として定義され、それ自身はＭａｒｓｈａｌｌ等（1995, Crit Care Med 23: 1638-1652）によって、又は臓器不全後遺症評価（ＳＯＦＡ）スコア（Ferreira et al, 2002, JAMA 286: 1754-1758）によって定義された。
【００１０】
「敗血症ショック」とは、他の原因によって説明されない持続的な動脈低血圧を特徴とする、（成人における）敗血症＋急性循環不全の状態を言う。
【００１１】
集中治療を受けている患者の敗血症の重篤度を評価し、合理的な治療計画を可能にするために、敗血症のための多数の臨床的重篤度モデルが開発され、或いはより一般的なモデルから適合されてきた。最初の一般的に許容されたシステムは、急性病理学及び慢性健康評価スコア（ＡＰＡＣＨＥ、並びにその改良型のＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ及びＩＩＩ）（Knaus et al, 1985, Crit Care Med 13: 818-829; Knaus et al, 1991, Chest 100: 1619-1636）であったが、死亡率予測モデル（ＭＰＭ）（Lemeshow et al ,1993, JAMA 270: 2957-2963）及び単純化された急性病理学スコア（ＳＡＰＳ）（Le Gall et al, 1984, Crit Care Med 12: 975-977）もまた、広く使用されている一般的な予測モデルである。敗血症を含むより重篤な症状のために、多臓器機能障害スコア（ＭＯＤＳ）（Marshall et al, 1995, Crit Care Med 23: 1638-1652）、臓器不全後遺症評価スコア（ＳＡＦＡ）（Ferreira et al, 2002, JAMA 286: 1754-1758）、及び論理的臓器機能不全スコア（ＬＯＤＳ）（Le Gall et al, 1996, JAMA 276: 802-810）のような、更に専門的なモデルが開発された。更に最近になって、特殊なモデルであるＰＩＲＯ（Levy et al, 2003, Intensive Care Med 29: 530-538）が提案された。これら全てのモデルは、患者の状態の重篤度及び生じ得る結果を反映する有用なスコアを誘導するように試みるために、広範囲の一般的及び特異的な臨床測定値を使用する。
【００１２】
上記で述べた標準の予測方法に加えて、特異的な診断及び予後試験を開発する観点から、敗血症と多くの特殊な血清マーカーとの間の相関が広範に研究されてきた。その中には下記のものが含まれる。
【００１３】
Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、炎症の非特異的マーカーとして周知の、肝臓由来の血清急性期タンパク質である。もっと最近になって（Toh et al, 2003, Intensive Care Med 29: 55-61）、リポタンパク質複合Ｃ−反応性タンパク質（ＬＣＣＲＰ）として知られるカルシウム依存性のＣＲＰ及び超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の複合体が、敗血症の際の凝集機構への影響に関与することが示されている。特に、活性化された部分的なトロンボプラスチン時間として知られる共通試験は、敗血症の場合の特別なプロファイルを発生させ、これは迅速な診断試験のための基礎として提案されている。
【００１４】
ＴＮＦ−α及びＩＬ−１は、敗血症において上昇することが長年に亘って知られていた典型的な急性炎症性サイトカインであり（Damas et al, 1989, Critical Care Med 17: 975-978）、敗血症の重篤な合併症である成人呼吸困難症候群における臓器不全の有用な予測因子であることが報告されてきた（Meduni et al, 1995, Chest 107: 1062-1073）。
【００１５】
活性化された補体生成物C３（Ｃ３ａ）及びＩＬ−６は、微生物侵入に対する宿主反応の有用な予測因子であり、発熱及び白血球カウントよりも優れていることが提案されてきた。分泌生のホスホリパーゼＡ2は、同じ研究において、信頼性のより低いマーカーであることが分かった。
【００１６】
プロカルシトニンは、カルシトニンのプロペプチド前駆体であり、その血清濃度はＬＰＳに応答して上昇し、またＩＬ−６及びＴＮＦ−αのレベルと相関することが知られている。敗血症の予測因子としてのその使用が評価されてきた（Al-Nawas et al, 1996, Eur J Med Res 1: 331-333）。０．１ｎｇ／ｍＬの閾値を使用することにより、それは敗血症患者の３９％を正しく識別した。しかし、他の報告は、それがＩＬ−６又はＩＬ−８よりも優れているものの（Harbarth et al, Am J Resp Crit Care Med 164: 396-402）、一連のＣＲＰ測定の使用よりも信頼性が低いことを示唆している（Neely et al, 2004, J Burn Care Rehab 25: 76-80）。
【００１７】
白血球活性化マーカー（例えばＣＤ１１ｂ、ＣＤ３１、ＣＤ３５、Ｌ−セレクチン、ＣＤ１６）の好中球表面での発現の変化は、ＳＩＲＳのマーカーとして使用されており、ＩＬ−６及びその後の臓器不全の発症と相関することが分かっている。同様に、ＣＤ６３、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ３６及びＣＤ３１のような血小板表面抗原の発現が調べられたが、信頼性のある予測モデルは構築されていない。
【００１８】
最後に、単球ＨＬＡ−ＤＲ発現のダウンレギュレーションは、敗血症における劣悪な結果の予測因子であり、ＴＮＦ−αの産生を損なう単球不活性化の指標であり得ることが示されている。ＩＦＮ−γでの治療が、このような場合には有益であることが示されている（Docke et al, 1997, Nature Med 3: 678-681）。
【００１９】
しかし、これらマーカーの多くが敗血症に関連しており、幾つかは状態の重篤さの指標を与えるが、未だ一つのマーカー又はマーカーの組合せが信頼性のある診断試験であること、ましてや敗血症発症の予測因子であることは示されていない。２００１年国債敗血症定義会議は、「敗血症を診断するためのバイオマーカーの使用は時期尚早である」と結論した（Levy et al, 2003, Intensive Care Med 29: 530-538）。
【００２０】
伝統的な臨床所見、臨床化学、生化学、免疫及び細胞数測定のデータを含む複雑な変数の組における経時的な変化から、信頼性のある診断パターン及び頑丈な予後の指標を抽出することは、洗練された分析方法を必要とする。医療診断用途のための、ニューラルネットワークを含む専門的システム及び人工知能の使用が以前に開発されている（Place et al, 1995, Clinical Biochemistry 28: 373-389; Lisboa, 2002, Neural Networks 15: 11-39）。上記で述べたＡＰＡＣＨＥスコア及び１９９１年のＡＣＣＰ／ＳＣＣＭ・ＳＩＲＳ基準（Bone et al, 1992, Crit Care Med 20: 864-874）を用いた多変量ロジスティック回帰及びニューラルネットワークモデルを使用することによって、敗血症患者の生存を予測する試みにおいて特定のシステムが開発されている（Flanagan et al, 1996, Clinical Performance & Quality Health Care 4: 96-103）。このような研究は、両アプローチが共に良好な予測結果を与えることができるが、ニューラルネットワークシステムは、予め選択された閾値に対する感度がより低いことを示唆している（Rosenberg, 2002, Curr Opin Crit Care 8:321-330によって論評された多くの研究の結果）。Brause et al（2004, Journal fur Anaesthesie und Intensivbehandlung 11: 40-43）は、敗血症の予測のために使用されるニューラルネットワークモデルの一例を提供している。このモデル（ＭＥＤＡＮ）は、ある範囲の標準の臨床手段を分析し、その結果をＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ、ＳＯＦＡ、ＳＡＰＳ  ＩＩ、及びＭＯＤＳモデルを使用することによって得たものと比較した。この研究は、利用可能なマーカーのうちで、最も情報価値があるのは収縮期血圧及び拡張期血圧、並びに血小板カウントであると結論付けた。
【００２１】
ニューラルネットワークは、複雑なデータシステムにおけるパターンを同定できる非線型関数である。これは、ネットワークがノイズデータ組内の構造を識別することを可能にする多くの数学的関数を使用することによって達成される。これは、システムからのデータが、該データ内の変数間の関係に基づいてパターンを作製し得るからである。ニューラルネットワークが、「トレーニング」として知られる期間にこのようなデータ点の充分な例を認識すれば、それはこの構造を「学習」することができ、次いで、更なるデータ点又は試験データにおいてこれらパターンを識別することができる。この方法において、ニューラルネットワークは、それが認識しているデータ内に存在するパターンをモデル化することによって、将来の例を予測又は分類することができる。次いで、該ネットワークが前記データ内の新のパターンを首尾よく識別したことを示す高い精度スコアで試験データを正しく予測又は分類するその能力によって、該ネットワークの性能が評価される。ニューラルネットワークの並列処理能力は、そのプロセッシング素子のアーキテクチャに依存し、これら素子は生物学的ニューロンのモデルに従って相互作用するように構成される。プロセッシング素子内での刺激レベルを変化さえるために、１以上の入力が接続重み（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ  ｗｅｉｇｈｔ）によって調節される。前記プロセッシング素子の出力はその活性化レベルに関連しており、該出力は非線型であってもよく、又は不連続であってもよい。従って、ニューラルネットワークのトレーニングは、前記素子の移送機能、該相互接続構造の詳細、及び当該システムが従う学習の規則に依存した、相互接続重みの調節を含んいる（Place et al, 1995, Clinical Biochemistry 28: 373-389）。このようなシステムは、外傷患者の健康結果モデルを含む多くの臨床状況に適用されてきた（Marble & Healy (1999) Art Intell Med 15: 299-307）。
【００２２】
Warner et al（1996, Ann Clin Lab Sci 26: 471-479）は、多層フィードフォワードニューラルネットワークモデルの四つの入力の成分として、「敗血症ショック因子」（患者が本人の認めるところにより敗血症ショックの徴候を有するかどうか）、ＩＬ−６、可溶性ＩＬ−６受容体（酵素結合免疫吸着試験による測定として）、及びＡＰＡＣＨＥ  ＩＩスコアの測定値を使用して、敗血症の結果を予測するための多重パラメータ方法を記載している。しかし、このシステムは、未だ臨床的徴候を有していない個体については予測性がなく、また議論の余地はあるが、ＩＬ−６のようなサイトカインの血清レベルが上昇するときまでには、診断（結果でないにしても）は臨床的に明らかである。
【００２３】
Dybowski et al（1996, Lancet 347: 1146-1150）は、分類及び回帰ツリー（ＣＡＲＴ）を使用して、１５７の可能な敗血症予測基準からの入力を選択し、次いで、遺伝子アルゴリズムを実行するニューラルネットワークを使用して、予測的なマーカーの最良の組合せを選択する。これらは、血清又は細胞表面バイオマーカーよりも、むしろ多くのルーチンの臨床値及び代理指標を含んでいる。しかし、取扱われている問題は、既に敗血症の明瞭な診断を有し、且つ既に決定的に病気である患者の予後である。
【００２４】
遺伝子アルゴリズムのアプローチの更なる改良は、人工免疫系の使用を含んでおり、その一つのバージョンは人工免疫認識系（ＡＩＲＳ）であり（Timmis et al,  An overview of Artificial Immune Systems. In: Paton, Bolouri, Holcombe, Parish and Tateson (eds.) “Computation in Cells and Tissues: Perspectives and Tools for Thought” , Natural Computation Series, pp51-86, Springer, 2004; Timmis (L.N. De Castro and J, Timmis. Artifical Immune Systems: A New Computational Intelligence Approach.  Springer-Verlag, 2002）、これは人工知能に適用される生物学的免疫系のクローン選別及び親和性成熟処理によって触発された順応系である。
【００２５】
免疫学的に言えば、ＡＩＲＳは、免疫系のクローン選別理論によって触発される（F. Burnett.  The Clonal SelectionTheory of Acquired Immunity.  Cambridge University Press, 1959）。このクローン選別理論は、適合、クローニング、変異及び選別のプロセスを通して、如何にして感染物質を認識できる抗体が作製されるかを説明しようと試みている。ＡＩＲＳは、このプロセスを利用して、適合、クローニング及び変異のプロセスを通して、未経験のデータ項目のための分類子として使用できる一組の記憶検出体を発生させる。陰性選別のような免疫に触発される他のアプローチとは異なり、ＡＩＲＳは、分類において、より詳細にはワンショット管理された学習に使用するために特別に設計される。
【００２６】
米国特許出願２００２／００５２５５７は、患者の心拍速度の変動に基づいて、多くの破滅的な病気の発症を予測する方法を記載している。ここでも、ニューラルネットワークが、データをモデル化及び分析する可能な方法の中の一つである。
【００２７】
国際特許出願ＷＯ００／５２４７２は、ＣＤ１１ｂ又は「ＣＤ１１ｂ複合体」（Ｍａｃ−１、ＣＲ３）の血清もしくは好中球表面レベルに基づいて、幼児において使用するための迅速なアッセイ方法を記載している。この方法は、単一のマーカーだけを使用し、その一つは、議論の余地は残るが、炎症への応答における好中球活性化の周知のマーカーである。
【００２８】
このような複雑なデータ組（ここでのデータは、定量的かつ連続的であるよりも、定性的かつ不連続であることが多い）を分析するための別のアプローチは、ロジスティック回帰法のような、洗練された統計的解析技術を使用することである。定性的な二元従属変数を使用するロジスティック回帰が、有意な変数を選択することに関して不充分に差別的であるときは、多変量技術が使用されてよい。多変量ロジスティック回帰モデル及びニューラルネットワークの両方からの出力は連続的な変動量であるが、ニューラルネットワークモデルによって計算される見込みは、通常は一方の極端又は他方の極端にあり、僅か数個の値だけが中間領域に入る。臨床的な状態において、これは屡々有用であり、より明瞭な決定を与えることができる（Flanagan et al, 1996, Clinical Performance & Quality Health Care 4: 96-103）。
【００２９】
感染及び／又は敗血症の最も初期の徴候を検出する能力は、できるだけ早期の治療を可能にする点で明らかな利益を有している。状態の重篤度及び治療しなかったときの起こりうる結果の指標は、治療オプションに関する決定を知らせる。これは、集中治療を受けている人、又は火傷を負ったもしくは免疫障害のある人のような無防備な入院集団、又は深刻な感染及びその後の敗血症の増大したリスクが存在する他のグループの両方に関連している。戦場及び市民環境の両方における生物兵器の使用又は疑われる使用は、露出されたこ他における感染の初期徴候について試験するための迅速且つ信頼性のある手段が有利である場合の一例である。
【００３０】
（発明の説明）
感染の後、免疫系の細胞は、活性化に至ることにより病原体を認識し応答する。これは異なるメッセンジャータンパク質（例えばサイトカイン及びケモカイン）の産生、及び細胞表面の活性化マーカ及び接着分子の発現もたらす（図１）。これらの産生は、細胞間の情報交換を促進し、特定の物質に対する調和された免疫応答をもたらす。この炎症性免疫応答は、感染に対する応答において比較的一定であり、疾患プロセスの極めて早期の段階に生じるので、このようなマーカー発現の変化をモニターすることにより、敗血症発症の初期の段階が予測される。本発明の目的は、初期の段階、好ましくは介入の治療窓の間、臨床症状及び疾患の発生の前に、重篤な感染を検出する手段を提供することである（図１）。
【００３１】
第一の側面において、本発明は、臨床的徴候が現れる数日前に、感染、ＳＩＲＳ又は敗血症の初期徴候を検出するシステム及び方法を記述する。また、該状態の臨床的経路のタイミングを予測できる方法を提供する。当該システムは、生物学的サンプル、好ましくは血液サンプルに基づいて、１以上の組の試験結果を分析することを含んでなるものである。任意に、ルーチンの他の臨床的測定値を分析に含めてもよい。
【００３２】
第一の組の試験は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりサイトカインｍＲＮＡを増幅することによって、血液中の白血球におけるケモカイン及びサイトカインのパネルの発現レベルを決定することを含むものである。この群には、ＣＤ１７８（ＦＡＳ−Ｌ）、ＭＣＰ−１（単球ケモスタティックタンパク質−１）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−α及びＩＮＦ−γが含まれる。ＣＤ１７８は、ＩＩ型膜タンパク質としてコード化及び発現されるが、メタロプロテアーゼにより開裂されて可溶性ホモトリマー、可溶性のＦａｓＬ又はｓＦａｓＬを放出するので、サイトカインと看做されてよい。
【００３３】
第二の組の試験は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３１、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２５及びＣＤ９７を含んでなる表面マーカ群の細胞表面発現を決定することを含んでいる。これは標準の方法、好ましくは、細胞を特異的な標識を付した抗体又はその断片でラベルし、フローサイトメトリーにより分析することによって行われてよい。
【００３４】
当該分析に含めてよい第三の組の試験には、温度、心拍速度、白血球細胞の合計数及び区別された数（単球、リンパ球、顆粒球、好中球）、血小板数、血清クレアチニン、尿素、乳酸塩、塩基過剰、ｐＯ2、ＨＣＯ3-、及びＣ−反応性タンパク質を含んだルーチンの臨床データが含まれる。
【００３５】
好ましくは、サンプルを収集した患者が敗血症を発症することについての、イエス／ノー予測を計算することを可能にするニューラルネットワークプログラムによって、１以上の組の試験結果が分析される。
【００３６】
陽性の予測の場合、好ましくは、次に顕性の臨床的徴候及び症候群の発症までの時間に関する評価を行うことを可能にするように、更なる分析が行われる。或いは、両方の分析を多変量ロジスティック回帰によって行ってよい。
【００３７】
試験郡の分析は、個別に又は同時に行うことができる。好ましくは、ＰＣＲデータに対する補充データとして、臨床データがニューラルネットに入力される。同時に、フローサイトメトリーのデータを、該ニューラルネットワークによって処理することができる。該ニューラルネットを介した処理のためには一組のデータだけが必要とされるが、これら追加の例のような三つのデータ組の一つ、二つ、又は全てを入力することには、当該ニューラルネットワークを「トレーニングし」、該プログラムからの出力における信頼性を改善する利点が存在する。
【００３８】
更なる側面において、当該ニューラルネットワークは、予め記録された臨床データを処理するために使用され、或いは、このようなデータのデータベースは、当該ニューラルネットワークをトレーニングしてその予測能力を改善するために使用されてもよい。
【００３９】
当該方法は、集中治療患者のルーチンモニタリングの一部として使用されてよく、ここでは正規の血液サンプルが他の目的のために採取される。感染及び／又は敗血症の素因を与えられる他の入院患者も、モニターされてよい。このような素因を与える条件には、遺伝的又は後天的免疫不全（ＨＩＶ／ＡＩＤＳを含む）、又は免疫抑制剤（例えば一般の手術患者、移植のレシピエント又はステロイド治療を受けている患者）、糖尿病、リンパ腫、白血病、又は他の悪性疾患、貫通性もしくは汚染された外傷、火傷又は腹膜炎が含まれる。もう一つの側面において、本発明の方法は、感染症の大発生の際に個体をスクリーニングするために、或いは、バイオテロ又は武力衝突の際の生物兵器使用の結果として、偶発的であっても故意であっても、感染性病原体に露出されたか、又は露出されたことが疑われる個体をスクリーニングするために使用されてよい。
【００４０】
従って、本発明は、感染、ＳＩＲＳ又は敗血症の初期段階を検出するために生物学的サンプルをスクリーニングするための方法であって：ＲＴ−ＰＣＲにより一組の情報的に有用なバイオマーカーの発現を検出し、及び／又はフローサイトメトリーにより一組の情報的に有用な(informative)細胞表面バイオマーカーを検出し、及び／又は一組の標準の臨床測定値をモニターする工程と；ニューラルネットワーク又は多変量統計解析により前記検出の結果を分析する工程と；明白な感染の発症の可能性及びタイミングに従って、サンプルを前記サンプルを分類する工程とを含んでなる方法を提供する。
【００４１】
好ましくは、前記生物学的サンプルは血液サンプルである。更に好ましくは、前記ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はフローサイトメトリー及び／又は標準の臨床測定の結果が、第一の分析にかけられて、ＳＩＲＳ又は感染症の発症に関する予測を生じる。一つの別の実施形態において、これは確率として表現される。別の実施形態において、それはイエス／ノーの二者択一の結果として表現される。
【００４２】
必要に応じ、第一の分析によりＳＩＲＳもしくは敗血症の可能性があることが示唆されるときは（予め定められた任意の閾値確率を越えるとき、又は「イエス」の予測として定義される）、前記結果は第二の分析にかけられて、明白な臨床的徴候の発生までの可能な時間、又は臨床的疾患のあり得る重篤度の徴候を与えるまでの可能な時間が決定される。
【００４３】
好ましくは、情報的に価値のある一組のバイオマーカー（その発現はＲＴ−ＰＣＲによって検出される）は、ＣＤ１７８（ＦａｓＬ）、ＭＣＰ−１（或いはＣＣＬ−２として知られる）、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−α及びＩＮＦ−γからなる群から選択される少なくとも四つ、好ましくは少なくとも六つ、更に好ましくは少なくとも七つ、最も好ましくはその全部からなる。
【００４４】
或いは、その発現がフローサイトメトリーによって検出される前記一組の情報的に有用な細胞表面バイオマーカーは、ＣＤ３１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ８０及びＣＤ９７からなる群から選択される少なくとも一つ、好ましくは少なくとも二つ、もっとも好ましくは少なくとも三つからなる。
【００４５】
標準の臨床的測定が分析されるときは、これらは温度、心拍速度、白血球細胞の合計数及び区別された数（単球、リンパ球、顆粒球、好中球）、血小板数、血清クレアチニン、尿素、乳酸塩、塩基過剰、ｐＯ2、ＨＣＯ3-、及びＣ−反応性タンパク質からなる群から選択される少なくとも一つ、好ましくは三つ、最も好ましくは少なくとも五つからなっている。
【００４６】
一つの極めて好ましい実施形態において、前記分析は、ニューラルネットワークによるものである。最も好ましくは、それは多層パーセプトロン・ニューラルネットワークである。
【００４７】
好ましくは、このようなニューラルネットワークは、症例の７０％超、より好ましくは症例の少なくとも８０％、更に好ましくは症例の少なくとも８５％、最も好ましくは症例の少なくとも９５％で、ＳＩＲＳ又は敗血症を正確に予測することができる（コントロール群でのこのような発症が予防的治療により予防されない場合の試験において決定される）。ＳＩＲＳ又は敗血症は、明らかな臨床的徴候の少なくとも１日前、より好ましくは少なくても２日前、更に好ましくは少なくとも３日前、最も好ましくはＳＩＲＳ又は敗血症が診断される４日以上前に予測できることが好ましい。
【００４８】
もう一つの好ましい実施形態では、分析は、多変量の統計的解析、好ましくは主成分解析及び／又は判別関数解析によるものである。多変量の統計的解析は、判別関数解析を含んでなることが更に好ましい。
【００４９】
更なる側面において、本発明は、初期段階の感染、ＳＩＲＳ又は敗血症を検出するために生物学的サンプルをスクリーニングするためのシステムであって：前記サンプルから得た細胞からＲＮＡを抽出及び精製する手段と、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により選択されたＲＮＡ配列を増幅するためのサーマルサイクラー又は他の手段と、前記ＲＴ−ＰＣＲの結果を検出及び定量する手段と、このような結果を分析できるようにトレーニングされたコンピュータに基づくニューラルネットワークと、それによってニューラルネットワーク解析の結果がオペレータに伝達され得るディスプレー手段とを具備してなるシステムを提供する。
なお、この側面において、ＲＴ−ＰＣＲの結果は判別関数解析を使用して解析されてもよいが、ニューラルネットワークが好ましい実施形態である。
【００５０】
或いは、システムは、生物学的サンプルから得られた細胞上の特定の細胞表面マーカーを標識し、且つ前記マーカーの発現を定量する手段と、前記標識及び定量の結果を検出及び定量する手段と、このような結果を解析できるようにトレーニングされたコンピュータに基づくニューラルネットワークと、それによってニューラルネットワーク解析の結果がオペレータに伝達され得るディスプレー手段とを具備する。好ましくは、前記標識することは、標識された抗体又は抗体断片によるものであり、また前記定量は蛍光で活性化された細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は他の形態のフローサイトメトリーによるものである。
【００５１】
好ましくは、前記システムは、ＲＴ−ＰＣＲ及びＦＡＣＳ分析の両方のための手段を具備し、より好ましくは、他のルーチンの臨床試験結果も解析でき、これら全ての結果をその解析に組込むことができる。
【００５２】
更なる側面において、本発明は、ＳＩＲＳ、敗血症もしくは感染を診断するための診断手段を調製するための、上記で述べた方法の何れかの実施形態に従う解析、又は感染を診断するための診断手段を調製するための上記で述べたシステムの使用を提供する。
【００５３】
また、上記で述べた方法に従って、ＳＩＲＳ、感染又は敗血症を早期診断する方法も提供される。
【００５４】
（発明の詳細な説明）
以下、図面及び実施例を参照して、本発明を更に詳細に説明する。
実施例１：  サイトカイン発現、細胞表面マーカー及び臨床測定値のニューラルネットワーク解析による敗血症の予測
＜研究設計及び患者＞
クイーンンアレクサンドラ病院ＩＣＵ部門からの敗血症の発症についての研究は、９１人の患者集団をもたらした（Ｄｓｔｌ／ＣＲ０８６３１）。血液サンプルは、ＩＣＵに滞在している全期間に亘ってこれら患者から毎日採取され、合計で２４人の患者が敗血症を発症していると診断された。臨床的敗血症が診断された当日に採取されたサンプル（０日）は、敗血症診断の６日前（−６日）まで遡って、ＲＴ−ＰＣＲ及びフローサイトメトリーにより、活性化マーカー及びサイトカインｍＲＮＡの発現について分析された。加えて、標準の病院データ及び臨床所見が記録された。伝統的な統計分析のためのデータを提供するために、対照患者からのサンプルもまた同じ方法で処理された。
【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲは、通常使用される実験室技術に従って行った。簡単に言えば、血液サンプルの場合、全血を採取し、次いでＲＮＡ安定化剤の存在下で細胞を溶解する。ＲＮＡは、ビーズの親和性結合によって分離され、該ビーズは遠心分離（又は適切なときは磁気的に）により単離され、汚染物のＤＮＡはＤＮａｓｅ消化により除去され、ＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲにかけられる。
【００５６】
蛍光活性化された細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）フローサイトメトリーは、当該技術において極めて周知であり、また如何なる標準技術を使用してもよい。
【００５７】
＜データ解析＞
生物学的システムの複雑さ、及びこの研究に使用されるマーカー間の複雑な関係は、データ解析の標準の線型技術に不確かな結果を生じさせる。結局、当該データの中に如何なるパターンが存在するかが不明瞭であり、データ組の複雑さに対処するために、非線型モデリングが可能な更に強力な技術が探究された。
【００５８】
解析のために、患者からのデータは敗血症の発生の１〜４日前に照合され、敗血症を発症しなかったＩＣＵ患者からなる年齢／性別の合致する対照群と比較された。個別のサンプルは、５６以下の異なるパラメータを測定するデータを提供し、選択された変数の組合せが、多層パーセプトロンニューラルネットワーク（Proforma, Hanon Solutions, Glasgow, Scotland）に供給された。
【００５９】
各ネットワークは、逆行性伝播アルゴリズムを使用して、バランスされた敗血症及び対照データのランダムな７０％選別でトレーニングされ、次いでデータの残りの３０％を用いて試験した。このネットワーク内のデータをモデリングすることを狙って５回の試みが行われたが、各モデルは当該データに対して一般化する能力において相違した。最も成功したモデルは、敗血症群又は非敗血症対照群の何れかである以前に会ったことのない患者を、最も正確に分類できるものであった。
【００６０】
＜結果＞
表２は、試験患者を正確に分類し、又は２９／３５（又は８２．９％）と評価された成功モデルの一例を示している。
【表１】
2008522604.tif 000004
このモデルにおける信頼性を増大させるために、これは、各回において当該ネットワークをトレーニング及び試験するためのデータのランダムな異なる選択を使用して５回行われた。完了したら、患者を正確な敗血症群又は非敗血症の対照群に分類するネットワーク能力の全体の指標を与えるために、個々のモデルについてのスコアを平均した。
【００６１】
下記の表３に示すように、一連の５つのデータベースは、約８０％の予測平均精度を与える。
【００６２】
【表２】
2008522604.tif 000005
128 / 157 = 81.5%
79.3 + 85.2 + 80 + 82.9 + 80.8 = 408.2 / 5 = 81.64%
【００６３】
表４は、異なる変数の組み合せを使用して構築された、ある範囲のネットワークについての平均された予測精度値を列記している。
最も成功したモデルは、フローサイトメトリーデータからのＣＤ３１発現％と組み合せてサイトカインｍＲＮＡ発現を使用して構築され（８１．０％精度、表３のモデル１）、臨床データもまた高いスコアになった（８０．４％、表３のモデル２）。
【００６４】
【表３】
2008522604.tif 000006
【００６５】
我々の予測モデルを更に試験するために、我々は、当該ネットワークを臨床症状の開始の１〜４日前に得られたサイトカインデータの１００％までについて、該ネットワークをトレーニングした。次いで、我々は「０日」敗血症患者、−５日及び６日からの敗血症患者を含む試験データを選択した。０日、５日及び６日からの敗血症患者を含む試験データを選択し、また別のボランティア研究からの１４人の対照患者も選択し、そのうちの７人がサンプリングの９日以内に上部気道感染（ＵＲＴＩ）の症状を発症した（Ｄｓｔｌ／ＣＲ０８６３１）。その結果を下記の表５に示す。
【００６６】
【表４】
2008522604.tif 000007
この表は、臨床的敗血症の発症の４日前までの敗血症患者によって発現されたパターンから構築された我々のモデルが、０日の敗血症患者の８９％、−５日の敗血症患者の７８％、−６日の敗血症患者の８３％を正しく同定又は「スコアリング」したこと示している。ニューラルネットワークを使用した全体の分析は、敗血症についての多くの予測モデルの作製を導いた。サイトカインデータのみを使用して構築されたモデルは、敗血症を発症するであろう個体とそうでない個体とを、一貫して成功裏に識別できることを立証した。
【００６７】
実施例２：  ニューラルネットワークモデルを使用すると、非敗血症ボランティアからの擬陽性結果は存在しない
表６は、サイトカインＲＴ−ＰＣＲによってボラティア群を試験した結果を示しており、ＳＩＲＳ又は敗血症の兆候を発症した者はいなかった。
【００６８】
【表５】
2008522604.tif 000008
【００６９】
実施例３：  臨床データを使用した、９０％超の精度でのニューラルネットワーク敗血症予測
ニューラルネットワークモデルは、表４のモデル２に定義された臨床データ組を使用し、下記の表７に記載され且つ図３に更に示されたパラメータを使用して試験された。
【００７０】
【表６】
2008522604.tif 000009
【００７１】
【表７】
2008522604.tif 000010
【００７２】
実施例４：  人工免疫認識系の使用
＜描写＞
初期のＡＩＲＳ（A. Watkins. An Artificial Immune Recognition System.  Mississippi Sate University: MSc Thesis., 2001）は、単純な実数値形状空間を使用した。最近になって、他の人々は、該表現をハミング形状空間（J. Hanamaker and L. Boggess. The effect of distance metrics on AIRS. In Proc. Of Congress on Evolutionary Computation (CEC).  IEEE, 2004）及び自然言語（D. Goodman, L. Boggess and A. Watkins. “An investigation into the source of power for AIRS, an artificial immune classification system”. In Proc. Int Joint Conference on Neural Networks, pp1678-1683. IEEE, 2003）へと拡張した。ＡＩＲＳは、学習されるデータのベクトル、刺激レベル及び資源の数を含む一組の人工認識ボール（ＡＲＢｓ）を維持している。トレーニングに際しては、ＡＲＢにおけるデータベクトルのトレーニング項目に対する親和性を評価することにより刺激レベルが計算され、一致が強いほど刺激は大きい。この刺激レベルを使用して、ＡＲＢがどれだけ多くのクローンを産生するかが指示され、またＡＲＢの生存に影響を与える。
【００７３】
＜親和性の尺度＞
これは、用いられる表現に依存する。ハミング距離、ユークリッド距離等を含む、ＡＩＲＳに使用するための多くの親和性尺度が提案されてきた。この研究では、ユークリッド距離及びハミング距離の両方の尺度を使用したが、ユークリッド距離が最良の結果を与えた。
【００７４】
＜免疫アルゴリズム＞
本質的に、ＡＩＲＳは二つのポピュレーション、即ち、記憶プール及びＡＲＢプールＣを発生させる。それは別々のトレーニング段階及び試験段階を有しており、試験段階はｋ−最近接分類子に類似している。トレーニング段階の際に、トレーニングデータ項目がＭに提示される。この組はランダムに播種することができ、実験的証拠は、ＡＩＲＳが初期の開始点に対して非感受性であることを示唆するであろう。トレーニング項目は、組Ｍにおける全ての記憶細胞に対して適合され、高適合ＭＣmatchとして一つの細胞が同定される。次いで、このＭＣmatchはクローニングされ、突然変異される。クローニングは刺激に比例して行われ（刺激が高いほどクローン率が高い）、突然変異は反比例する（刺激が高いほど突然変異率は低い）。これらのクローンは、ＡＲＢプールＣに挿入される。次いで、トレーニング項目がＡＲＢプールのメンバーに提示され、ここでは、新しい候補記憶細胞のクローニング及び突然変異を許容する反復法が採用される。ＡＲＢが請求できる多くの資源によって生存が指令されるポピュレーション制御のプロセスを通して、新たな候補記憶細胞が作製される。この機構は、J. Timmis and M. Neal. A Resource Limited Artificial Immune System.  Knowledge Based Systemsm 14(3/4): 121-130, 2001に提案された資源割当てアルゴリズムに基づいている。この新たな候補は、トレーニング項目を用いてＭＣmatchに対して比較される。該候補細胞とＭＣmatchとの間の親和性が高ければ、該記憶細胞は該候補細胞で置換えられる。
【００７５】
このプロセスは各トレーニング項目について行われ、その際に、記憶組は分類のために使用できる多くの細胞を含むであろう。未知のデータ項目の分類は、ｋ−最近接法で行われる。
【００７６】
＜実験設定＞
このデータ組へのニューラルネットワークの適用に匹敵する実験手順を使用するための試みがなされた。全ての研究において、マーク：ａｓＬ、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＩＬ−１０が使用された。しかし、ニューラルネットワーク研究の際のデータの予備処理に関する不完全な情報に起因して、データ組を完全に正確に再現することは不可能であった。
【００７７】
実験１
最初の組の実験では、敗血症の発症の１日〜４日前に患者から収集したデータを、対照組の患者からのデータと共に、トレーニングデータとして使用した。詳細に言えば、敗血症の兆候を示した患者についての、１日、２日、３日及び４日からの組み合わされたデータを使用し、またＡＩＲＳをトレーニングするために、対照患者のランダムな集合を使用した。合計で５９のトレーニングデータ項目を使用した。ＡＩＲＳを試験するために、対照群からの患者のランダムな集合及び全ての日からの組み合わされたデータ（トレーニングプロセスに使用したデータは排除した）が使用された。合計で３４の試験データ点を使用した。ＡＩＲＳのための設定が表９に示されている。
【００７８】
【表８】
2008522604.tif 000011
【００７９】
実験２
我々の第二の組の実験のために、患者は、０日、５日及び６日についてのデータを使用して敗血症の兆候を示した患者、及び対象患者に分類された。ＡＩＲＳシステムは、実験１について使用したのと同じデータを使用する一方、同じパラメータを使用してトレーニングされた。
【００８０】
＜結果＞
結果は、当初の報告からは、データが如何にして数日の期間に亘って最初に組み合わされ、次いでトレーニング及び試験の組に分割されたかを正確に確認するのが困難であったので、ニューラルネットワーク解析から得られた結果と直接比較可能なものではない。従って、得られた結果は、これを念頭において考慮されるべきである。
【００８１】
実験１
ＡＩＲＳアルゴリズムの１０回の独立した実行を行い、次いで平均及び標準偏差を計算する。ＡＩＲＳは、平均で７３（２．９３）％の分類精度を達成できることが分かった。これは、（同じマーカーを用いた）ニューラルネットワーク解析よりも約１０％低い。しかし、直接比較での配慮がとられるべきである。
【００８２】
実験２
ここでも再度、ＡＩＲＳアルゴリズムの１０回の独立した実行が行われ、平均及び標準偏差がとられた。このときは、敗血症の発症前の先行日（０、５及び６）、及び対照群が解析された。ここでも、ＡＩＲＳは、１日〜４日からとられたデータ及び対照群に対してトレーニングされた。これらの結果が表１０に提示される。
【００８３】
【表９】
2008522604.tif 000012
【００８４】
表１０から分かるように、ＡＩＲＳは高パーセンテージで敗血症の症例を同定する（５日及び６日におけるニューラルネットワークの性能を凌ぐことができるが、この場合も比較警告を伴う）。対照群も同様に明瞭ではなく、予測された結果よりも低く、ニューラルネットワークアプローチよりも顕著に低い。これは、トレーニングのために利用可能なデータの量が非敗血症の場合よりも大きいことに起因して、ＡＩＲＳが敗血症患者の方にバイアスされた事実による可能性がある。
【００８５】
＜結論＞
ＡＩＲＳは、敗血症の潜在的な症例を予め識別でき、また一定のレベルにおいてニューラルネットワークアプローチに匹敵するように思える。
【００８６】
実施例５：  敗血症を予測するためのＣＤ３１発現の使用
＜研究設計及び患者＞
実施例１参照
＜フローサイトメトリー＞
血液をヘパリンナトリウム容器（HM&S, Chessington, Surrey）の中に採取し、室温で実験室に輸送した。１００μＬアリコートの血液と免疫蛍光染料とを、製造業者（Beckman Coulter limited, High Wycombe, Buckinghamshire, and Becton Dickinson UK Limited, Cowley, Oxford）が推奨する容積を使用して混合した。ＣＤ３及びＣＤ４についての同時染色によりＴヘルパー細胞を識別し、またＣＤ３及びＣＤ８の両方について染色することによりＴ細胞毒性細胞を同定した。これらの細胞集団は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２５、ＣＤ５４及びＣＤ６９について染色された。Ｂ細胞は、ＣＤ１９について染色することにより同定され、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２５、ＣＤ５４で調査された。ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６を染色することによって識別され、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ５４及びＣＤ６９と共にインターロゲートされた。単球集団は、ＣＤ１４についての染色により選択され、これらの細胞はＣＤ１１ｂ、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ染色を用いてプローブされた。顆粒球集団を同定するためにはゲーティングが使用され、これはＣＤ１１ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ３１、ＣＤ５４及びＣＤ６２Ｌについて染色された。この染料は、室温で２０分間インキュベートされた。５００μＬのオプティライズ（Ｏｐｔｉｌｙｓｅ）Ｃ（Beckman Coulter limited）を各々の管に添加し、直ちに渦混合した。このサンプルを、室温で１０分間インキュベートして赤血球を溶解し、次いで染色を固定するために５００ミクロンのイソトン（Isoton；Beckman Coulter limited）を添加した。この管を直ちに渦混合し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、フローサイトメータ（Beckman Coulter Epics XL System 2）上で細胞を計数した。
【００８７】
＜統計学＞
データは、ＳＰＳＳソフトウエアパッケージ１１．０版上での二変量ロジスティック回帰モデルを使用して分析された。この分析は、免疫モジュレータ発現についての対照群の平均を、７つの時点（診断の６、５、４、３、２、及び１日前、及び診断の当日である０日）で敗血症患者から得た平均と比較した。データ点が失われた場合は、許容可能なｎ値を維持するために、当該群についての平均値で置換された。当該モデルからの結果は、置換されたデータ点が、可能な予測子として当該モデルにより強調されたマーカーを含まなかったときにのみ報告された。
【００８８】
＜結果＞
該データの分析により、予測子効果＝０．１１４の弱い証拠が存在することが分かった。ＣＤ３１の減少した発現は、診断３日前の敗血症の可能な予測子であることが示されたｐ＝０．０３７（ｎ＝６）。診断の６日前について得られた結果は、この日のサンプルサイズが小さいため（ｎ＝４）、確定的ではなかった。診断の５、４、２又は１日前、又は診断の当日については、統計的に有意な予測子は見つからなかった。
【００８９】
＜結論＞
敗血症の発症前の患者、及びこの疾患を発症しなかった患者から得られたフローサイトメトリーデータが照合された。敗血症の診断以前の日における患者からの結果を使用して群が構築され、対照群は敗血症を発症しなかった年齢の一致する患者から得た測定値からなるものであった。中間値ならびに第９０及び第１０百分位棒を表示するグラフの調査は、データの広がりのために解釈が困難であり、従って統計的解析が行われた。
【００９０】
このための生データをプロットすると（図２参照）、６人の敗血症患者のうち４人（６６．６％）が対照群よりも低いＣＤ３１発現を有していた。対照群（非敗血症）のデータ点は１１．８％〜１００％に分布する一方、診断の３日前の６データ点のうち４データ点は９％未満であったことが見て取れる。従って、ＣＤ３１は、臨床的徴候及び症状の出現に先立つ３日前に敗血症の発症を予測するために使用してよい。このことは、ＣＤ３１が、特に他の有益な敗血症バイオマーカーと組み合せたときに、有用な予測マーカーであり得ることを示唆している。
【００９１】
実施例６：  敗血症を予測するための多変量統計解析
＜序文＞
敗血症の症状の発生前１〜６日に患者から収集されたデータに対して、多変量データ解析法が適用された。測定値にはフローサイトメトリー、ＰＣＲ及び古典的臨床所見が含められた。三つの分類の所見の各々を個別に、また完全なデータ組として組み合せて考慮することにより、このデータマトリックスに対して主成分解析（ＰＣＡ）が適用された。判別関数解析（ＤＦＡ）を使用して、複数の群が変数の平均に関して異なるかどうかを決定し、次いで群のメンバーシップ（例えば新規症例）を予測するために当該変数を使用した。これは、ＰＣＡからの結果に対して、また三つの分類の所見に対して、各々を個別にまた完全なデータ組として組み合せて行われた。
【００９２】
＜データの記述、操作及び多変量技術＞
ＰＣＡ及びＤＦＡに先立って分布の正規性が必要とされるので、ＰＣＡに先立って確率密度関数を生じさせることによりデータが要約され、非正規データはジョンソン変形アルゴリズムを使用して変形された。
【００９３】
ＰＣＡは、次元減少技術であり、多変量データマトリックスを、変数の線型組み合せで構成された幾つかの潜在的変数に分解するように努力し、これは元のマトリックスの変数の大きさを説明する。この方法では、データ組内でのパラメータの相関（正又は負の）を確立することができる。
【００９４】
本質的に、ＤＦＡは変数の解析（ＡＮＯＶＡ）に対するアプローチにおいて類似している。ＤＦＡ問題は、一方向解析ＡＮＯＶＡ問題と言い換えることができる。即ち、特定の変数の平均に関して、二つの群が相互に有意に異なっているかどうかを問合せることができる。しかし、一つの変数についての平均が異なるグループにおいて有意に異なれば、この変数は、これら群の間を識別すると結論してよいことは明瞭であろう。
【００９５】
単一変数の場合、ある変数が群の間を識別するかどうかの最終的な有意差検定は、Ｆ検定である。Ｆは、本質的に、プールされた（平均）群内分散に対する、当該データにおける群間分散の比率として計算される。群間分散が優位に大きければ、平均値間には有意差が存在するはずである。
【００９６】
多変量を考慮するときには、幾つかの変数のどれが群間の判別に寄与するかを確立することが可能である。このことは、全ての分散及び共分散のマトリックス；同様に、プールされた群内の分散及び共分散のマトリックスを生じる。これらのマトリックスは、次いで、群の間に何等かの有意差（全ての変数に関して）が存在するか否かを決定するために、多変量Ｆ検定を介して比較される。この方法は、多変量解析又はＭＡＮＯＶＡと同一である。ＭＡＮＯＶＡにおけると同様に多変量検定が行われ、統計的に有意であれば、何れの変数が群に亘って有意に異なる平均を有しているのかが調査される。こうして、複数の変数を用いたコンピュータ処理が更に複雑であっても、主要な理論はそのまま適用される。即ち、観察された平均の差において明らかな、群の間を識別する変数が探索される。
【００９７】
ＤＦＡは、完全なデータマトリックス（置換された平均値を含む）を使用し、また１以上のパラメータがそのために置換された平均値を含むデータ点を排除することにより、臨床的フローサイトメトリー及びＲＴ−ＰＣＲデータに対して行われる。モデル１で開発されたモジュールからＰＣＡスコアの解析を可能にする類似のモジュールが開発された。後者の目的は、所見を分類するために、変形されたデータマトリックス（ＰＣＡ）が使用できるかどうかを確立することであった。
【００９８】
モデル１．  所見データの主成分解析（ＰＣＡ）
ｉ）  臨床データに基づくＰＣＡモデル
所定のモデルにおいて誘導及び使用されるＰＣの数は、通常は１を越える固有値を有するものとして定義される。６ＰＣは、臨床データのためのこの基準に合致し、合計で７４．３％のデータ組の変動を説明する。ＰＣの各々は他のＰＣに関して直交（非相関）しているので、特定のＰＣとの臨床パラメータの関連は、該ＰＣを定義し、且つ該パラメータが如何にしてデータ組の分散に影響するかを説明する。
【００９９】
表１２は、臨床データからの六つの誘導されたＰＣを伴った各パラメータの読み込みを要約している。０．５を越える読み込み値は、所定のＰＣに対する特定のパラメータの強い寄与を示している。当該データ組から誘導されたＰＣは、次のように解釈されてよい。
【０１００】
ＰＣ１    これは、ＷＣＣ、単球、好中球及び血小板の強い相関によって支配される。クレアチニンと乳酸塩（lactate)との間に強い相関が存在する。これらの群の両者は負の関係（ＰＣ１スケールの反対端）を有しており、従って負に相関している。ＢＸＳ及びＨＣＯ3-は高度に相関しており、ＰＣ１及びＰＣ２に等しく寄与する。後者のパラメータは、ＰＣ１におけるクレアチニン及び乳酸塩によって対比される。これらの相関は、表２及び図２に要約されている。
【０１０１】
ＰＣ２    ＷＣＣ、単球、好中球及び血小板で構成される群と、ＢＸＳ及びＨＣＯ3-で構成される群との間の負の相関を示している。
【０１０２】
ＰＣ３    このＰＣは、図３に示すように、温度、ＨＲ及びＣＲＰの間の強い相関によって特徴付けられる。
【０１０３】
ＰＣ４    多くのパラメータがこのＰＣについての優位性に接近するが、図５によって示されるように、ＣＲＰのみが決定的にこのＰＣと関連している。
【０１０４】
ＰＣ５    ｐＯ2は、この成分における尿素及びＭＡＰの両方と対比される。
【０１０５】
ＰＣ６    この入ＰＣは、専ら、リンパ球によって当該データセットの中に導入された分散を説明する。
【０１０６】
ＰＣローディングを解釈する際に、相関した臨床パラメータは、これら種／生理的パラメータのレベルが、ＰＣ１、２等に属するとして特徴付けられた患者において上昇又は減少するであろうことを示唆する。これは、判別解析の節において行われるであろう。
【０１０７】
ｉｉ）  フローサイトメトリーデータに基づくＰＣＡモデル
パラメータは明瞭化のために略語化されており、略語は表１３に列記されている。９個のＰＣが、表１４における固有値マトリックスに示されたデータ組の分散の８０．５％を説明しており、関連のローディングが表１５に纏められている。測定されたパラメータ間の相関が表１６に示されており、下記の間で誘導されたＰＣ内では強い相関を有する：
ｆｃ１及びｆｃ３
ｆｃ５及びｆｃ６
ｆｃ７及びｆｃ８
ｆｃ９と、ｆｃ１０及びｆｃ１１，
ｆｃ１２及びｆｃ１３
ｆｃ１１及びｆｃ１４
ｆｃ１７と、ｆｃ２０及びｆｃ２３
ｆｃ２１と、ｆｃ１７、２０及び２２
ｆｃ２３と、ｆｃ２０及びｆｃ２２
ｆｃ２８及びｆｃ２９
【０１０８】
ＰＣ構造は次のように解釈されてよい：
ＰＣ１：    ＣＤ３  ＣＤ４におけるＣＤ３  ＣＤ４  ＣＤ２５、ＣＤ３  ＣＤ４におけるＣＤ３  ＣＤ４  ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３  ＣＤ８におけるＣＤ３  ＣＤ８  ＣＤ２５、ＣＤ１９におけるＣＤ１９  ＣＤ８０、ＣＤ１９におけるＣＤ１９  ＣＤ８６、ＣＤ１４におけるＣＤ１４  ＣＤ８０、ＣＤ１４におけるＣＤ１４  ＣＤ８６、ＣＤ１９におけるＣＤ１９  ＣＤ５４を、ＣＤ１９におけるＣＤ１９  ＣＤ２５、及びＣＤ５６におけるＣＤ５６  ＣＤ５４を相関させる。
ＰＣ２：    ＣＤ１９におけるＣＤ１９  ＣＤ８６を、ＣＤ１４におけるＣＤ１４  ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４におけるＣＤ１４  ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１４におけるＣＤ１４  ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＤ１１Ｂ  ＣＤ５４と対比する。
ＰＣ３：    ＣＤ３  ＣＤ４におけるＣＤ３  ＣＤ４  ＣＤ５４、ＣＤ３  ＣＤ４におけるＣＤ３  ＣＤ４  ＣＤ６９、ＣＤ３  ＣＤ８におけるＣＤ３  ＣＤ８  ＣＤ５４  、ＣＤ３  ＣＤ８におけるＣＤ３  ＣＤ８  ＣＤ６９。
ＰＣ４：    ＣＤ５６、ＣＤ６９（％）、ＣＤ１１Ｂ  ＣＤ６９（％）におけるＣＤ５６  ＣＤ６９。
ＰＣ５：    ＣＤ３  ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ（％）におけるＣＤ３  ＣＤ８  ＣＤ５４。
ＰＣ６：    ＣＤ３１（％）
ＰＣ７：    ＥＶ＞０．５の有意な成分はなし。
ＰＣ８：    ＣＤ５４（％）
ＰＣ９：    ＣＤ１４におけるＣＤ１４  ＣＤ１１Ｂ
【０１０９】
対又は群の一つのパラメータだけを考慮することにより、９個のパラメータを除去して、データマトリックスのｙ成分を増大させることが可能であろう。しかし、ＣＤ３１（％）、ＣＤ５４（％）、ＣＤ６２Ｌ（％）、ＣＤ１１Ｂ（％）、ＣＤ６９（％）及びＣＤ１１Ｂ  ＣＤ６９（％）だけを統計的解析にかけることが決定された（ｆｃ２４〜ｆｃ２９）。
【０１１０】
選択されたフローサイトメトリー変数の固有値マトリックスが表１７に示されており、構築されたＰＣＡモデルのローディングが表１８に纏められている。３ＰＣの使用は、データ組の７６．６％の変動を説明する。このＰＣモデルは下記を示している：
ＰＣ１：    ＣＤ６９（％）及びＣＤ１１Ｂ  ＣＤ６９（％）を相関させる。
ＰＣ２：    ＣＤ３１（％）、ＣＤ６２Ｌ（％）及びＣＤ１１Ｂ（％）を相関させる。
ＰＣ３：    ＣＤ５４（％）に関連した分散で構成される。
【０１１１】
ｉｉｉ）  ＲＴ−ＰＣＲデータに基づくＰＣＡモデル
表１９は、ＲＴ−ＰＣＲデータの７２．９％の分散が３つのＰＣだけによって説明されることを示している。このモデルについての読み取りは表２０に示されている。変数の各ＰＣとの相関が図２３及び２４に示されており、以下のことを明らかにしている。
ＰＣ１：  Ｆａｓ−Ｌ、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＩＬ−６及びＩｌ−８を相関させる。
ＰＣ２：  ＩＬ−１及びＩＬ−１０を相関させる。
ＰＣ３：  ＩＬ−１及びＩＬ−１０を対比する。
【０１１２】
ＰＣ２におけるＩＬ−１及びＩＬ−１０の相関、及びＰＣ３におけるこれら変数のその後の対比は興味深いものである。幾人かの患者において、これらの変数は高度に相関又は対比されてよく、患者を識別する強力な手段を提供する可能性がある。
【０１１３】
ｉｖ）  臨床、フローサイトメトリー及びＲＴ−ＰＣＲの組み合わされたデータに基づくＰＣＡモデル
表２１は、この最終モデルに含められるパラメータ、及び相関マトリックスのための関連の固有値を要約している。表２１は、９個のＰＣが１よりも大きい固有値を有することを示しており、これは６８．７％のデータ分散を説明する。解析は、ＰＣＡモデルの以下の解釈を可能にする：
ＰＣ１：    ＷＣＣ、好中球、単球、ＡＰＴＲ、ＨＣＯ3-、ＢＸＳ、血小板、ＣＤ６９（％）及びＣＤ１１Ｂ  ＣＤ６９（％）の間の正の相関を示す。このＰＣはまた、上記を、相関している乳酸塩及びクレアチニンと対比する。
ＰＣ２：    ＣＤ６９（％）、ＣＤ１１Ｂ  ＣＤ６９（％）、ＷＣＣ、好中球、単球及びＩＮＲを相関させる。これらのパラメータは、ＴＮＦ−αと対比される。
ＰＣ３：    ＰＣＲパラメータであるＦａｓ−Ｌ、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−８を強く相関させる。
ＰＣ４：    ＣＲＰ及びＩＬ−１０を対比する。
ＰＣ５：    フローサイトメトリーのパラメータであるＣＤ３１（％）、ＣＤ５４（％）、ＣＤ６２Ｌ（％）及びＣＤ６９（％）を相関させる。
ＰＣ６：    ＣＤ６２Ｌ（％）及びＨＲを相関させる。
ＰＣ７：    温度と関連付けられる。
ＰＣ８：    ＩＬ−１と関連付けられる。
ＰＣ９：    ＰＯ2と関連付けられる。
【０１１４】
モデル２：  所見及びＰＣＡスコアのデータに基づく判別関数解析（ＤＦＡ）
開発されたＤＦＡモデルにおける全てのモデル定義に共通の用語が以下で説明され、また数値は表２３に示される。
【０１１５】
モデル：
この解析の目的は、ある症例が何れの群に属するかを最良に予測する「モデル」を構築することである。以下の議論において、「該モデルにおいて」の用語は、群のメンバーシップの予測に含められる変数を言うために使用され、またそれらが含まれなければ「該モデルの中にはない」。
【０１１６】
・順方向の段階的解析
段階的判別関数解析において、判別のモデルは徐々に構築される。即ち、各工程において、全ての変数が検討及び評価されて、群間の識別に何れが最も寄与するかが確立される。次いで、該変数は当該モデルに含められるであろう。
【０１１７】
・逆方向の段階的解析
逆向きに進めることが可能である；その場合、当該プログラムは最初に全ての変数を当該モデルに含め、次いで、各工程において、群のメンバーシップの予測に最も小さく寄与する変数を除外する。従って、成功裏の判別関数解析の結果として、「重要な」変数、即ち、群の間の識別に最も寄与する変数のみが当該モデルにおいて維持されるであろう。
【０１１８】
・導入するためのＦ、除去するためのＦ
段階的手順は、導入するためのＦ及び除去するためのＦによって「案内」される。変数についてのＦ値は、群間の識別におけるその統計的有意性を示す。即ち、それは変数が群のメンバーシップの予測に対して独特の寄与をする程度の尺度である。一般に、プログラムは、これら変数についてのそれぞれのＦ値がユーザにより特定された導入のためのＦよりも大きい限り、当該モデルに含められるべき変数を選択し続け；またそれらの優位性がユーザにより特定された除去するためのＦよりも小さければ、変数を当該モデルから排除（除去）する。
【０１１９】
・許容度
変数の許容値は、当該モデルにおける他の全ての変数を用いて、それぞれの変数の１−Ｒ2として計算される。従って、許容度は、それぞれの変数の冗長性の尺度である。例えば、０．１０の許容度値は、該変数が当該モデルにおける他の変数と９０％の冗長をもつことを意味する。
【０１２０】
・Ｗｉｌｋｓのλ
このパラメータは、当該モデルの識別能力の尺度を与え、０（完全な識別）〜１（識別なし）の範囲の値を取ることができる。
【０１２１】
・部分的λ
これは、当該モデルの識別力に対するそれぞれの変数の独特の寄与（直交的に測定される）に関連したＷｉｌｋｓのλである
【０１２２】
注意点としては、段階的な判別解析の結果の共通の誤解釈は、額面上の統計的優位性レベルを取ることである。解析の次の工程において何れの変数を含め、又は排除するかをプログラムが決定するとき、それは考慮している各変数の寄与の優位性を実際に計算する。従って、この段階的手順は、最大の識別力を生じるように当該モデルに含めるべき変数を「念入りに選ぶ」ので、本来的に確率を利用するであろう。従って、段階的アプローチを使用するときは、その優位性レベルが真のアルファ誤差率を反映しないことの認識、即ち、Ｈ０（群間の識別が存在しないゼロ仮定）を誤って拒絶する可能性の認識が維持されなければならない。
【０１２３】
・正準相関解析（ＣＣＡ）
これは、変数間の関係を評価するための追加の手順である。即ち、この操作は、二組の変数の間の関係を解明することを可能にする。この解析を特徴付けるパラメータを以下に詳述する。
【０１２４】
・ルートの有意性（χ2検定）
ルートの用語は、個別の判別関数（ＤＦ）を記述するために使用される。誘導されたＤＦの統計的有意性は、連続するＤＦのχ2検定によって試験される。全正準ルートの段階的低下試験の報告が得られ、この報告には全ＤＦの有意性及びこれに続く第二行が含まれ、該第二行は、第一のルートを除去した後の残りのルートの有意性を報告する。従って、解釈するＤＦの数が得られる。
【０１２５】
・判別関数係数
二つの出力さ発生される。一つは生の係数のためのものであり、一つは標準化された係数のためのものである。ここで、生のとは、該係数が（生の）判別関数スコアを計算するために観察されたデータと共に使用され得ることを意味する。標準化された係数は、それが標準化された変数に関し、従って比較可能な尺度を意味するので、解釈のために慣習的に使用される係数である。
【０１２６】
・固有値
各ＤＦの固有値、及び各関数によって占められる説明された分散の累積比率が得られる。この値は、ＰＣＡ及びＤＦＡにおいて同一の方法で定義される。この値が大きいほど、ＤＦによって説明される分散の量が大きい。
【０１２７】
・因子構造係数
これらの係数は、変数とＤＦの間の相関を表すものであり、判別関数の「意味するもの」を解釈するために普通に使用される。ＰＣＡに類似の方法において、因子の解釈は、因子構造係数に基づくべきである。
【０１２８】
・正準変数の平均
変数が如何にして異なる群の間での識別に関与するかの知識が得られたら、次の論理工程は、各ＤＦの性質及び区別を決定することである。この質問に答える最初の工程は、正準変数平均を調べることである。所定のＤＦの正準平均及び所見群が大きいほど、当該ＤＦの識別力は大きい。
【０１２９】
ｉ）臨床データのＰＣＡスコアに基づくＤＦＡモデル
ａ）置換された平均値を含む
表１９は、この解析の結果を要約している。０．４のＷｉｌｋｓのλ値は、比較的非効率的な分類モデルを示している。三つの誘導されたＤＦは、データ組の合計８９．９％の分散を説明し、またＤＦは主にＰＣ１、３及び４で構成される。因子構造係数は次のことを示している：
・ＤＦ１は、ＰＣ１及びより低い程度でＰＣ４により説明される変動で構成される。
・ＤＦ２は、専ら、ＰＣ３により説明される変動で構成される。
・ＤＦ３は、ＰＣ４によって説明される変動で構成される。
【０１３０】
これらの相関は、標準化された係数によって確認される。正準変数の平均は次のことを示す。
・ＤＦ１は、１日、２日及び３日を、５日及び６日に対して負に相関させる。
・ＤＦ２は、対照群所見を定義する。
・ＤＦ３は、２日のための所見を定義する。
【０１３１】
このモデル及びそのＰＣに対する識別性質の分類の要約が、表２５に示されている。該モデルの分類マトリックスが、表２６に示されている。表２６は、対照及び６日のデータについて良好な分類が得られ、それぞれ８０％及び８３％の所見が正しく分類されることを示唆している。しかし、当該モデルの全体の分類能力は乏しく、全ての所見の４８％だけが正しく分類されるに過ぎない。
【０１３２】
ｂ）置換された平均値を排除する
表２４は、この解析の結果を要約している。０．４５のＷｉｌｋｓのλ値は、比較的非効率的な分類モデルを示している。三つの誘導されたＤＦは、データ組の合計９５％の分散を説明し、またＤＦは主にＰＣ１、３及び５で構成される。因子構造係数は次のことを示している：
・ＤＦ１は、ＰＣ１とＰＣ５の間の負の相関によって説明される分散で構成。
・ＤＦ２は、ＰＣ３により説明される分散で構成される。
・ＤＦ３は、ＤＦ２よりは程度が低いが、ＰＣ３により説明される分散で構成される。
【０１３３】
これらの相関は、標準化された係数によって確認される。正準変数の平均は下記のことを示す：
・ＤＦ１は、１日、２日及び３日を、５日及び６日に対して負に相関させる。
・ＤＦ２は、１日及び６日を対照群に対して負に相関させる。
・ＤＦ３は、６日についての所見を定義する。
【０１３４】
この方法の分類及びそのＰＣに対する識別特性が、表２５に示されている。当該モデルの分類マトリックスが表２６に示されている。表２６は、対照群及び６日のデータについて良好な分類を得ることができ、それぞれ８３％及び６７％の所見が正しく分類されることを示唆している。しかし、該モデルの全体の分類能力は乏しく、全所見の４４％だけが正しく分類されるに過ぎず、平均置換された変数を使用する場合よりも低い。
【０１３５】
平均置換された値を用いた、及びこの値を用いないで行った同様の予測効率は、これらの値を含めてＤＦＡを行うために、その後のアプローチを確証した。
【０１３６】
ｉｉ）臨床データの変換された値に基づくＤＦＡモデル
所見の分類を改良するための努力において、元のデータマトリックスから変換された変数値がＤＦＡにかけられた。この命題は、ＰＣＡが次元を減少させる技術であるから、恐らくは或るデータの品質は失われ、またＰＣＡスコアに対してＤＦＡを実行することは予測能力の低いモデルを導くということである。
【０１３７】
表２７はこの解析の結果を要約している。０．２２のＷｉｌｋｓのλ値は、ＰＣＡスコア分類モデルに対する改善である。五つの誘導されたＤＦは、該データ組の合計９９％の分散を説明し、該ＤＦは、ＢＸＳ、ＣＲＰ、乳酸塩、尿素、温度、クレアチニン、好中球、ｐＯ2及びＨＣＯ3-で構成され、他の臨床的変数は所見の分類に対する影響をもたない。因子構造係数は下記のことを示す：
・ＤＦ１は、乳酸塩に対して負に相関するＢＸＳとＨＣＯ3-の間の相関を分類する。
・ＤＦ２は、ＢＸＳ、ＣＲＰ及びＨＣＯ3-の間で高度の相関を示す所見を分類する。
・ＤＦ３は、温度とクレアチニンの間の負の相関を用いてサンプルを分類する。
・ＤＦ４は、温度とｐＯ2の間の負の相関を用いてサンプルを分類する。
・ＤＦ５は、尿素と好中球の間の負の相関を用いてサンプルを分類する。
【０１３８】
このモデルの分類及び臨床的変数に対するその識別特性が、表３１に示されている。該モデルの分類マトリックスが表３２に示されている。表３２は、対照及び６日のデータについて良好な分類を得ることができ、それぞれ８０％及び８３％の所見が正しく分類されることを示唆している。１日、２日及び５日はＰＣＡスコアモジュールに比較して大きく改善されるが、該モデルの全体の分類能力は乏しく、全所見の５５％が正しく分類される。
【０１３９】
ｉｉｉ）フローサイトメトリーのＰＣＡスコアに基づくＤＦＡモデル
表３３は、この解析の結果を要約している。０．３９のＷｉｌｋｓのλ値は、比較的非効率的な分類モデルを示している。二つの誘導されたＤＦは、データ組の合計７１％の分散を説明し、また該ＤＦは主にＰＣ１、５及び８で構成される。因子構造係数は次のことを示す。
・ＤＦ１は、ＰＣ１及びＰＣ８によって説明される分散で構成される。
・ＤＦ２は、専らＰＣ５によって説明される分散で構成される。
【０１４０】
このモデルの分類及びＰＣに対するその識別特性の要約が、表３４に示されている。該モデルについての分類マトリックスが表３５に示されている。表３５は、対照データ及び６日データについて合理的な分類が得られ、６６％の所見が両群に正しく分類されることを示唆している。しかし、該モデルの全体の分類能力は乏しく、全所見の４４％だけが正しく分類されるに過ぎない。
【０１４１】
ｉｖ）フローサイトメトリーデータに基づくＤＦＡモデル
このモデルの分類及び変数に関するその識別特性が表３６に示されている。０．０３４のＷｉｌｋｓのλ値は、優れた分類モデルを示している。三つの誘導されたＤＦは、データ組の合計７４％の分散を説明し、また該ＤＦは主にｆｃ７−８、ｆｃ１１、ｆｃ１６、ｆｃ２５、ｆｃ２８、ｆｃ２９で構成される。因子構造係数は次のことを示す：
・ＤＦ１は、ｆｃ７、１６、２８及び２９を相関させ、またこれらをｆｃ８及び２５と対比させる。
・ＤＦ２は、ｆｃ７、８、１６及び２５を相関させ、またこれらをｆｃ１２と対比させる。
・ＤＦ３は、ｆｃ１１と相関される。
表３７はこの情報を要約している。
【０１４２】
これらの相関は、標準化された係数によって確認される。正準変数の平均は以下のことを示す：
・ＤＦ１は、１日を、５日及び６日と対比させる。
・ＤＦ２は、対照群を３日、４日及び５日と対比させ、また対照を６日と相関させる。
・ＤＦ３は、２日及び３日を４日と対比させる。
【０１４３】
表３８は、全ての群について良好な分類が得られることを示唆する。該モデルの全体の分類能力は印象的であり、全所見の７６．６％が正しく分類される。
【０１４４】
ＲＴ−ＰＣＲについてのＤＦＡモデルはＰＣＡスコア及び変形されたデータの両方にとって乏しく、Ｗｉｌｋｓのλ値＞０．８であり、それらは捨象されて更に考慮されることはないであろう。
【０１４５】
ｖ）臨床、フローサイトメトリー及びＲＴ−ＰＣＲの組み合されたデータに基づくＤＦＡモデル
このモデルの分類及び変数に関するその識別特性が表３９に示されている。０．００８７のＷｉｌｋｓのλ値は、優れた分類モデルを示している。四つの誘導されたＤＦは、データ組の合計８９．２％の分散を説明し、また該ＤＦ因子構造は、ＢＸＳ、ｆｃ２５、ｆｃ２２、ｆｃ１１、温度、ＣＲＰ、ｆｃ１８、ｆｃ６、ＩＬ−６、ＩＮＲ、ＡＰＴＲ、ｆｃ１６、尿素、乳酸塩、Ｆａｓ−Ｌ、ｆｃ１３、ｆｃ２４、ｆｃ１、ｆｃ３、ＭＣＰ−１、ｆｃ２８、ＩＬ−１０、ｆｃ２７、ｆｃ２６、好中球、ｆｃ１４、ＷＣＣ、ｆｃ２９、血小板、ｐＯ2が該モデルに含められることを示している。全ての他のパラメータは、段階的基準に合致せず、従って当該モデルから排除された。
【０１４６】
正準変数の平均は次のことを示している。
・ＤＦ１は、１日を５日及び６日と相関させる。
・ＤＦ２は、対照群を６日と相関させ、またこれらを３、４及び５日と対比させる。
・ＤＦ３は、対照群を５日と相関させ、またこれらを２、３及び６日と対比させる。  ・ＤＦ４は、４日及び５日と対比させる。
表３７はこの情報を要約している。
【０１４７】
表４０は、７６％の最小適性割当て率で、全ての群について優れた分類が得られることを示している。該モデルの全体の分類能力は印象的であり、全ての所見の８６．９％が正しく分類される。各ＤＦがこのモデルを使用してデータに適用されるときには、患者の群がクラスターを形成し、また他の群から空間的に分離されることを明瞭に見て取ることができる。
【０１４８】
＜結論＞
ＰＣＡは、全てのクラスの患者についての測定された変数の間の相関を強調した。分子生物学の観点から多くの相関が予測される。ＰＣＡモデルの幾つかは、データ組の次元を大きく減少させたが、得られたスコアは患者の群を空間的に分離させなかった。
【０１４９】
ＰＣＡから得られたスコア上のＤＦＡは、失望させる結果を示した。ＰＣＡスコアが使用されたとき、該モデルの識別能力は４４〜５６％の範囲に亘った。これらモデルの低い識別能力は、顕著な詳細を備えたＰＣＡが失われる際の、データ組の次元減少の結果であるかもしれない。臨床及びフローサイトメトリーモデルの識別能力は、それぞれ５５％及び７６％であった。ＤＦＡが完全なデータ組（臨床、フローサイトメトリー及びＲＴ−ＰＣＲの変数）上で実施されたとき、８６．９％の予測効率が得られた。従って、この後者のモデルに含められる変数（表３６）は、敗血症に罹り易いことが疑われる新たな患者を分類するために、測定及び使用されることが推奨される。
【０１５０】
当該モデルの最も印象的な特徴は、症状の発症の正確に６日前に、患者に正確に割当てるためのその能力である。従って、重要な識別変数をモニターでき、又はそのレベルで医療的治療が与えられなければならない閾値レベルを確率できるであろう。表３４に示したパラメータを使用すれば、患者からデータを取得し、また変換アルゴリズムを使用してデータをＤＦＡモデルに入力することが可能である。次いで、これは９０％に近い効率で、患者を適切な群に分類することができる。これは、臨床実験室で使用するときに大きな価値をもち得るであろう。
【０１５１】
【表１０】
2008522604.tif 000013
【０１５２】
【表１１】
2008522604.tif 000014
【０１５３】
【表１２】
2008522604.tif 000015
【０１５４】
【表１３】
2008522604.tif 000016
【０１５５】
【表１４】
2008522604.tif 000017
【０１５６】
表１５  続き
2008522604.tif 000018
【０１５７】
【表１５】
2008522604.tif 000019
【０１５８】
表１６続き
2008522604.tif 000020
【０１５９】
【表１６】
2008522604.tif 000021
【０１６０】
【表１７】
2008522604.tif 000022
【０１６１】
【表１８】
2008522604.tif 000023
【０１６２】
【表１９】
2008522604.tif 000024
＊９５％ＣＩに有意性境界線
【０１６３】
【表２０】
2008522604.tif 000025
【０１６４】
表２１  続き
2008522604.tif 000026
【０１６５】
【表２１】
2008522604.tif 000027
【０１６６】
【表２２】
2008522604.tif 000028
【０１６７】
【表２３】
2008522604.tif 000029
【０１６８】
【表２４】
2008522604.tif 000030
【０１６９】
【表２５】
2008522604.tif 000031
【０１７０】
【表２６】
2008522604.tif 000032
【０１７１】
【表２７】
2008522604.tif 000033
【０１７２】
【表２８】
2008522604.tif 000034
【０１７３】
【表２９】
2008522604.tif 000035
【０１７４】
【表３０】
2008522604.tif 000036
【０１７５】
【表３１】
2008522604.tif 000037
【０１７６】
【表３２】
2008522604.tif 000038
【０１７７】
【表３３】
2008522604.tif 000039
【０１７８】
【表３４】
2008522604.tif 000040
【０１７９】
【表３５】
2008522604.tif 000041
【０１８０】
【表３６】
2008522604.tif 000042
【０１８１】
【表３７】
2008522604.tif 000043
【０１８２】
【表３８】
2008522604.tif 000044
【０１８３】
表３９続き  臨床的変数、ＲＴ−ＰＣＲ変数及びフローサイトメトリー変数の組合せに基づくＤＦＡモデルの要約
2008522604.tif 000045
【０１８４】
表３９続き  臨床的変数、ＲＴ−ＰＣＲ変数及びフローサイトメトリー変数の組合せに基づくＤＦＡモデルの要約
2008522604.tif 000046
【０１８５】
【表３９】
2008522604.tif 000047
【０１８６】
実施例７：  敗血症を予測するための二変量ロジスティック回帰分析
二変量ロジスティック回帰モデルを使用して、敗血症を発症し且つ陽性の微生物学的結果を呈したＩＣＵ患者からのＲＴ−ＰＣＲ、フローサイトメトリーの結果及び臨床データを別々に解析した。このモデルは、対照群と年齢の一致し且つ敗血症と診断されなかったＩＣＵ患者群から得た結果を使用した。該モデルは多くの可能な予測因子を同定したが、発症前の敗血症患者について得られた値が非感染症患者について得られた範囲内なので、幾つかは使用が制限されるように見える。非感染症データとは異なる幾つかの前敗血症データ点を生じる潜在的な予測マーカーが、表３６に列記されている。しかし、組合されたときには、これら予測マーカーは２４人の前敗血症患者のうちの８人だけを同定できたに過ぎない。
【０１８７】
【表４０】
2008522604.tif 000048
【０１８８】
後でＳＩＲＳを発症して感染が確認された２４人のうちの８人において、敗血症を予測できたマーカーの組合せの発見は、診断試験を構成しない。顆粒球上のＣＤ３１の予測能力は有望であるように見えるが（６６％）、このマーカーは臨床症状の出現の３日前に有効であるに過ぎない。ＣＤ３１単独に基づく試験は、有効であるためには大きな診断窓の存在が必要であるから、診断試験を構成しないかもしれない。これは、より多くのマーカーの発見によって達成できるであろう。しかし、この研究は将来の診断試験の一部を形成し得るマーカーを見付けるかもしれないが、注意払わなければならない。１９８０年代の半ばに、ＨＬＡ−ＤＲは感染症及び敗血症の発症についての予後徴候であると信じられた（Spittler, A. & Roth, E. 2003, Intensive Care Med , vol. 29, pp. 1211-121）。しかし、より多くの最近の研究によって、このマーカーの術後レベルはＳＩＲＳ、敗血症又は感染合併症を予測しないことが示された（Oczenski, W. et al 2003, Intensive Care Med, vol. 29, pp. 1253-1257 and Perry, S.et al. 2003, Intensive Care Med, vol. 29, pp. 1245-1252）。ＨＬＡ−ＤＲの場合におけるこれらの矛盾する報告は、本研究結果に対して注意が払われなければならない理由を示している。これらの発見は、抗生物質ポリシー、診断基準、臨床実務、外科的手術、治療方針、環境因子、及び患者の罹患素因のような地理的因子に起因するかもしれない（Angus, D. & Wax, R. 2001, Critical Care Medicine, vol. 29, no. 7 (suppl), pp. 109-116）。同定されたマーカーの有用性を更に評価するためには、幾つかの異なる病院（好ましくは異なる健康オーソリティーに亘る）からの更に多くの患者を含んだ大規模の研究を行う必要がある。
【０１８９】
実施例８：  生物兵器に対する対応のモデルとしての敗血症
＜背景及び方法＞
特許請求の範囲に記載された発明の一つの応用は、生物兵器に対する露出から生じる故意の感染の早期検出であるから、このような感染のモデルとしての敗血症の適用可能性が試験された。Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ・ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ・ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓのような推定される生物兵器病原体は、明らかな理由のためにモデル化が困難な重篤な敗血症を生じることが予測される（表４２参照）。
【０１９０】
しかし、全血のインビトロ感染はモデルとして使用されてよく、また活性化マーカー発現及びサイトカイン応答が測定されてよい。これをインビトロ感染モデルと比較するために、インビボでの後天的院内感染データと直接比較可能なモデル感染物質として、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ・ａｕｒｅｕｓ感染が選択された。
【０１９１】
【表４１】
2008522604.tif 000049
【０１９２】
表４２  続き
2008522604.tif 000050
【０１９３】
２５人の健康なボランティアからの血液を、インビトロでＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ・ａｕｒｅｕｓに感染させ、先に述べたように、感染後２４時間及び４８時間においてマーカー及びサイトカインレベルを測定した。
【０１９４】
ＦＡＣＳ
樹状細胞：  ＣＤ５４、ＣＤ９７、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７
ＮＫ細胞：  ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９７
単球：      ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９７、ＣＤ１０７ａ
好中球：    ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ
リアルタイムＲＴ−ＰＣＴ
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、
ｓＦａｓＬ
【０１９５】
これらの組の入力パラメータ（即ち、樹状細胞マーカー、ＮＫ細胞マーカー、単球マーカー、好中球マーカー、２４時間でのＲＴ−ＰＣＲデータ、及び４８時間でのＲＴ−ＰＣＲデータ）を使用して、それ自身のニューラルネットワークモデルをトレーニングした。トレーニング（７０％）及びその後の試験（３０）％のために、感染した血液サンプル又は非感染血液サンプルのランダムな選択を使用した。ニューラルネットワークの試験段階は、入力されたパラメータの試験組が感染サンプル又は非感染サンプルの何れに由来するかを正確に予測する回数の％に基づいて、予測精度を与えた。各組の入力パラメータの試験が５回繰返された。試験が行われる毎に、新たにランダム化された７０％の感染サンプル及び非感染サンプルを使用して、新しいニューラルネットワークが構築された。５個のランダム化された入力データ組に関して構築された５個のニューラルネットワークから計算された５個の予測精度を平均することにより、各組の入力パラメータについて、平均予測精度が誘導された。この方法論は、敗血症患者の研究に使用したものと類似していた。
【０１９６】
＜結果＞
最も一貫した結果は、ＲＴ−ＰＣＲの結果から得られた。図４は、三人の患者から得られたデータを示しており、これはプロファイルにおける変化のパターンの幾分不均一なパターンを例証している。しかし、上記で述べたニューラルネットワーク解析にかけたときに、該アルゴリズムは、非感染対照に対する感染サンプルの良好なレベルの同定を達成した（図５）。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】図１：感染の後、免疫系の細胞は活性化されることにより病原体を認識し、これに応答する。これにより、異なるメッセンジャータンパク質（例えばサイトカイン及びケモカイン）の産生、及び細胞表面上での活性化マーカー及び接着分子の発現がもたらされる。これらの産生は、細胞間の情報伝達を促進し、特定の物質に対する調整された免疫応答を生じる。この炎症性免疫応答は、感染に対する応答において比較的一定であり、且つ疾患プロセスの非常に初期の段階で生じるので、このようなマーカーの発現における変化をモニターすることは、敗血症発症の初期段階を予測するために使用することができる。理想的に言えば、これは臨床症状及び疾患の開始前の、介入の治療窓の間に行われる。
【図２】図２：フローサイトメトリーにより、顆粒球上で測定されたＣＤ３１発現のプロット。敗血症の患者（ｎ＝６）及び敗血症発症には至らなかったＩＣＵ患者（ｎ＝２４）の診断の３日前に、患者から採取した血液サンプルからのもの。各符号は、一人の患者からの測定値を表す。
【図３】図３：表４、モデル２に従って臨床データを解析するニューラルネットワークの設計。ＷＣＣ＝白血球数、ＣＲＰ＝Ｃ反応性タンパク質
【図４】図４：Ｓ．Ａｕｒｅｕｓによるインビトロでの血液感染後に得られた、サイトカインプロファイルの変化。実施例８に詳述した三人のボランティアから採取された血液からのデータ。
【図５】図５：Ｓ，Ａｕｒｅｕｓによるインビボ敗血症モデルにおけるニューラルネットワーク解析の結果。
【図１】
2008522604.tif 000051
【図２】
2008522604.tif 000052
【図３】
2008522604.tif 000053
【図４】
2008522604.tif 000054
【図５】
2008522604.tif 000055
【国際調査報告】
2008522604.tif 000056
2008522604.tif 000057
2008522604.tif 000058
2008522604.tif 000059