(57)【要約】  本発明は、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明は、また、ポリペプチドを含んでなる核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞ならびにポリペプチドを製造する方法および使用する方法に関する。本発明は、また、本発明のグルコアミラーゼを含んでなる組成物ならびにデンプン転化法、醸造法、例えば、発酵生成物またはシロップを製造する方法におけるこのような組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド:
(a)    配列番号2の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1)   配列番号37の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜561のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b)    少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号1のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号3のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1)   少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号36のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c)    配列番号2のアミノ酸1〜556の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1)   配列番号37のアミノ酸1〜561の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
【請求項２】
下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド:
(a)    配列番号5の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜575のアミノ酸に対して少なくとも70% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1)   配列番号40の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜565のアミノ酸に対して少なくとも70% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b)    少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号4のヌクレオチド55〜2189とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号6のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1)   少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号39のヌクレオチド55〜2182とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c)    配列番号5のアミノ酸1〜575の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1)   配列番号40のアミノ酸1〜565の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
【請求項３】
下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド:
(a)    配列番号26の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1)   配列番号24の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜548のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a2)   配列番号43の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜523のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b)    少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号23のヌクレオチド117〜2249とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも低いストリンジェンシイ条件下に配列番号25のヌクレオチド55〜1719中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1)   少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c)    配列番号26のアミノ酸1〜556の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1)   配列番号24のアミノ酸1〜548の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1)   配列番号43のアミノ酸1〜523の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
【請求項４】
それぞれ配列番号2または37の成熟部分、またはグルコアミラーゼ活性を有するそのフラグメントから成る請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５】
それぞれ配列番号5または40、またはグルコアミラーゼ活性を有するそのフラグメントから成る請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号24、26または43、またはグルコアミラーゼ活性を有するそのフラグメントから成る請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸1〜556または配列番号37のアミノ酸1〜561の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型である、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドが配列番号5のアミノ酸1〜575または配列番号40のアミノ酸1〜565の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型である、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが配列番号26のアミノ酸1〜556または配列番号24のアミノ酸1〜548の1または2以上のアミノ酸または配列番号43のアミノ酸1〜523の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型である、請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号2中のアミノ酸1〜455または配列番号37のアミノ酸1〜561の触媒領域を含んでなる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号5中のアミノ酸1〜475または配列番号40のアミノ酸1〜561に位置する触媒領域を含んでなる、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号26中のアミノ酸1〜451または配列番号24のアミノ酸1〜455または配列番号43のアミノ酸1〜418に位置する触媒領域を含んでなる、請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に位置する結合性ドメインを含んでなる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に位置する結合性ドメインを含んでなる、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号26のアミノ酸463〜556または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に位置する結合性ドメインを含んでなる、請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
大腸菌 (E. coli) DSM 17106中に収容されているプラスミドpHUda595中に含有されるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
大腸菌 (E. coli) DSM 17105中に収容されているプラスミドpHUda594中に含有されるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
下記から成る群から選択される、炭水化物結合性アフィニティーを有するポリペプチド:
(a)    i)   それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
ii)   それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
iii)   それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
(b)   低いストリンジェンシイの条件下に下記から成る群から選択されるポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド:
(i)   それぞれ配列番号3のヌクレオチド1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737の相補鎖;
(ii)   それぞれ配列番号6のヌクレオチド1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749の相補鎖;
(iii)  それぞれ配列番号25のヌクレオチド1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1399〜1620の相補鎖;
(c)   炭水化物結合性アフィニティーを有する (a) または (b) のフラグメント。
【請求項１９】
炭水化物結合性アフィニティーがデンプン結合性アフィニティーである、請求項18に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して少なくとも60%の同一性、それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して好ましくは少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、またはより好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項18または19に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561を含んでなる、請求項17に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に対して少なくとも60% の同一性、それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に対して好ましくは少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、またはより好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項18または19に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565を含んでなる、請求項22に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に対して少なくとも60% の同一性、それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に対して好ましくは少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、またはより好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項18または19に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523を含んでなる、請求項24に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
ポリペプチドが、それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561またはそれぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565またはそれぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に比較してアミノ酸の少なくとも1つの置換、欠失および/または挿入を有するアミノ酸を含んでなる人工変異型である、請求項18〜25のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２７】
ポリペプチドが、それぞれ配列番号3中の位置1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737; またはそれぞれ配列番号6の位置1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749; またはそれぞれ配列番号25中の位置1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1339〜1620に示すポリヌクレオチド配列の炭水化物結合性ドメインエンコーディング部分によりコードされるアミノ酸配列に比較して、アミノ酸の少なくとも1つの置換、欠失および/または挿入を有するアミノ酸配列を含んでなる人工変異型である、請求項18〜26のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２８】
低いストリンジェンシイの条件下に、好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、下記から成る群から選択されるポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる、請求項18〜27のいずれかに記載のポリペプチド:
(i)    それぞれ配列番号3のヌクレオチド1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737の相補鎖;
(ii)   それぞれ配列番号6のヌクレオチド1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749の相補鎖;
(iii)  それぞれ配列番号25のヌクレオチド1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1339〜1620の相補鎖。
【請求項２９】
リンカー領域が配列番号22に示すリンカーで置換されている、請求項1〜28のいずれかに記載のポリペプチドから成るグルコアミラーゼ活性を有するハイブリッドポリペプチド。
【請求項３０】
請求項1〜29のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項３１】
発現宿主におけるポリペプチドの産生を指令する1または2以上の制御配列に作用可能に連結された請求項30に記載のポリペプチドを含んでなる核酸構築物。
【請求項３２】
請求項31に記載の核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクター。
【請求項３３】
請求項31に記載の核酸構築物または請求項32に記載の組換え発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項３４】
下記の工程を含んでなる請求項1〜29のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法:
(a)    ポリペプチドの産生を促進する条件下に、野生型の形態においてポリペプチドを産生することができる細胞を培養し、そして
(b)    ポリペプチドを回収する。
【請求項３５】
下記の工程を含んでなる請求項1〜29のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法:
(a)    ポリペプチドの産生を促進する条件下に、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物を含んでなる宿主細胞を培養し、そして
(b)    ポリペプチドを回収する。
【請求項３６】
下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(a)    配列番号2の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1)   配列番号37の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜561のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b)    配列番号1のヌクレオチド55〜2166に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(b1)   配列番号36のヌクレオチド55〜2166に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c)    配列番号3のヌクレオチド55〜1725に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1)   配列番号38のヌクレオチド55〜1737に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d)    少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号1のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号3のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1)   少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号36のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
【請求項３７】
下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(a)    配列番号5の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜575のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1)   配列番号40の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜565のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b)    配列番号4のヌクレオチド55〜2189に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(b1)   配列番号39のヌクレオチド55〜2182に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c)    配列番号6のヌクレオチド55〜1725に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1)   配列番号41のヌクレオチド55〜1749に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d)    少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号4のヌクレオチド55〜2189とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号6のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1)   少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号39のヌクレオチド55〜2182とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
【請求項３８】
下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(a)    配列番号26の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1)   配列番号24の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜548のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a2)   配列番号43の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜523のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b)    配列番号23のヌクレオチド117〜2249に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c)    配列番号25のヌクレオチド52〜1719に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1)   配列番号42のヌクレオチド52〜1620に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d)    少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号23のヌクレオチド117〜2249とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または少なくとも低いストリンジェンシイ条件下に配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1)   少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号25のヌクレオチド52〜1719中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
【請求項３９】
下記の工程を含んでなるデンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法:
(a)    α-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を液化し、
(b)    工程 (a) において得られた液化物質を請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼで糖化し、そして
(c)    発酵生物により糖化物質を発酵させる。
【請求項４０】
発酵後、好ましくは蒸留により、発酵生成物を回収する、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
工程 (b) および (c) を順次にまたは同時に (すなわち、SSFプロセス) 実施する、請求項39または40に記載の方法。
【請求項４２】
発酵生成物がエタノールである、請求項39〜41のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
デンプン含有出発物質が全穀粒、好ましくは全トウモロコシまたはコムギ穀粒である、請求項39〜42のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
発酵生物がサッカロマイセス (Saccharomyces) の菌株である、請求項39〜43のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
工程 (a) の前に、下記の工程をさらに含んでなる、請求項39〜44のいずれかに記載の方法:
x)     デンプン含有物質の粒度を減少させ、そして
y)       デンプン含有物質および水を含んでなるスラリーを形成する。
【請求項４６】
スラリーを糊化温度より上に加熱する、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
スラリーを95〜140℃、好ましくは105〜125℃の温度において1〜15分間、好ましくは3〜10分間、特に約5分間ジェット煮沸する、請求項45に記載の方法。
【請求項４８】
下記の工程を含んでなるデンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法:
(a)    請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼおよび/または
i)     配列番号2中のアミノ酸1〜556または配列番号37中のアミノ酸1〜561として示す配列を有するグルコアミラーゼまたは前記配列に対して少なくとも75%の同一性を有するグルコアミラーゼおよび/または
ii)    配列番号5中のアミノ酸1〜575または配列番号40中のアミノ酸1〜565として示す配列を有するグルコアミラーゼまたは前記配列に対して少なくとも70%の同一性を有するグルコアミラーゼおよび/または
iii)   配列番号24中のアミノ酸1〜548または配列番号26中のアミノ酸1〜556または配列番号43中のアミノ酸1〜523として示す配列を有するグルコアミラーゼまたは前記配列に対して少なくとも60%の同一性を有するグルコアミラーゼ、
でデンプン含有物質の初期糊化温度より低い温度においてデンプン含有物質を糖化し、そして
(b)    発酵生物を使用して発酵させる。
【請求項４９】
このプロセスを1〜250時間、好ましくは25〜190時間、より好ましくは30〜180時間、より好ましくは40〜170時間、さらにより好ましくは50〜160時間、なおより好ましくは60〜150時間、さらになおより好ましくは70〜140時間、最も好ましくは80〜130時間の間実施する、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
このプロセスをpH 3〜7、好ましくはpH 3.5〜6、より好ましくはpH 4〜5において実施する、請求項48または49に記載の方法。
【請求項５１】
乾燥固形分 (DS) が20〜55重量%、好ましくは25〜40重量%、より好ましくは30〜35重量%の範囲内である、請求項48〜50のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
糖濃度が糖化および発酵の間において約6重量%より低いレベルに保持される、請求項48〜51のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
工程 (a) 前に水およびデンプン含有物質を含んでなるスラリーを調製する、請求項48〜52のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
デンプン含有物質の粒度を0.1〜0.5 mmの粒度に減少することによって、デンプン含有物質を調製する、請求項48〜53のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
デンプン含有物質の粒度の減少を微粉砕により実施する、請求項48〜53のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
デンプン含有物質が粒状デンプンである、請求項48〜55のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
デンプン含有物質が全穀粒である、請求項48〜55のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
糖化および発酵を同時に実施する、請求項48〜57のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
同時の糖化および発酵または工程 (b) における発酵の間の温度が28℃〜36℃、例えば、29℃〜35℃、例えば、30℃〜34℃、例えば、約32℃である、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
グルコアミラーゼが0.001〜10 AGU/g DS、好ましくは0.01〜5 AGU/g DS、特に0.1〜0.5 AGU/g DSの量で存在する、請求項48〜59のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
α-アミラーゼが存在する、請求項48〜60のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
α-アミラーゼが真菌α-アミラーゼであり、好ましくはアスペルギルス (Aspergillus) 属、アスペルギルス・ニガー (A. niger) 、アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 、アスペルギルス・アワモリ (A. awamori) またはアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) の菌株に由来し、またはリゾムコル (Rhizomucor) 属、好ましくはリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) の菌株に由来し、またはメリピルス (Meripilus) 属、好ましくはメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) の菌株に由来する真菌α-アミラーゼである、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
真菌α-アミラーゼがα-アミラーゼの触媒ドメイン (CD) および炭水化物結合性モジュール/ドメイン (CBM) および必要に応じてリンカーまたは野生型真菌酸性α-アミラーゼ触媒ドメイン (CD) および炭水化物結合性モジュール (CBM) および必要に応じてリンカーを含んでなるハイブリッド酵素である、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
ハイブリッドα-アミラーゼが触媒ドメインJA118およびアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) SBD (配列番号28) をもつフンガミル変異型、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBD (配列番号29) をもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼ、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼリンカーおよびSBD (配列番号30) をもつメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) α-アミラーゼから成る群から選択される、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
ハイブリッドα-アミラーゼがアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) リンカーおよびデンプン結合性ドメイン (SBD) をもつアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) α-アミラーゼである、請求項63に記載の方法。
【請求項６６】
α-アミラーゼが0.01〜10 AFAU/g DS、好ましくは0.1〜5 AFAU/g DS、特に0.3〜2 AFAU/g DSの量で存在する、請求項61〜64のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
α-アミラーゼおよびグルコアミラーゼを0.1〜10 AGU/AFAU、好ましくは0.30〜5 AGU/AFAU、特に0.5〜3 AGU/AFAUの比で添加する、請求項48〜66のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
他のグルコアミラーゼをまた添加する、請求項48〜67のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
他のグルコアミラーゼがアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼおよびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼまたはそれらの混合物から成る群から選択される、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
発酵生成物を発酵後に回収する、請求項48〜69のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
発酵生成物がアルコール、好ましくはエタノール、特に燃料エタノール、飲用エタノールおよび/または工業用エタノールである、請求項48〜70のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
デンプン含有物質が塊茎、根、幹、果実、種子または全穀粒から得られる、請求項48〜71のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
デンプン含有物質がトウモロコシ、穂軸、コムギ、オオムギ、ライムギ、マイロ、サゴヤシ、カッサバ (cassava) 、カッサバ (manioc) 、タピオカ、モロコシ、イネまたはジャガイモから得られる、請求項48〜72のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
デンプン含有物質が粒状デンプンである、請求項48〜73のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
工程 (a) における糖化間の温度が30℃〜75℃、好ましくは45〜60℃である、請求項48〜74のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
工程 (a) または (b) を順次にまたは同時に (すなわち、1工程発酵) 実施する、請求項48〜75のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
下記の工程を含んでなる、デンプン含有物質からシロップを製造する方法:
(a)    α-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を液化し、そして
(b)    工程 (a) において得られた物質を請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼで糖化する。
【請求項７８】
シロップの精製、転化および/または回収をさらに含んでなる、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
シロップおよび/または発酵生成物を製造するための請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼの使用。
【請求項８０】
出発物質が糊化または非糊化デンプン含有物質である、請求項79に記載の使用。
【請求項８１】
醸造のための請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼの使用。
【請求項８２】
請求項1〜29のいずれかに記載のグルコアミラーゼを含んでなる組成物。
【請求項８３】
α-アミラーゼをさらに含んでなる、請求項82に記載の組成物。
【請求項８４】
α-アミラーゼが酸性α-アミラーゼ、好ましくは真菌酸性α-アミラーゼである、請求項83に記載の組成物。
【請求項８５】
α-アミラーゼが真菌由来である、請求項83または84に記載の組成物。
【請求項８６】
α-アミラーゼがアスペルギルス (Aspergillus) 属、アスペルギルス・ニガー (A. niger) 、アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 、アスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) またはアスペルギルス・カワチイ (A. kawachii) の菌株、またはリゾムコル (Rhizomucor) 属、好ましくはリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) の菌株、またはメリピルス (Meripilus) 属、好ましくはメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) の菌株に由来する、請求項83〜85のいずれかに記載の組成物。
【請求項８７】
α-アミラーゼがハイブリッドであり、好ましくは触媒ドメインJA118およびアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) SBD (配列番号28) をもつフンガミル変異型、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBD (配列番号29) をもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼまたはアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼリンカーおよびSBD (配列番号30) をもつメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) α-アミラーゼである、請求項83〜85のいずれかに記載の組成物。
【請求項８８】
他のグルコアミラーゼをさらに含んでなる、請求項82〜87のいずれかに記載の組成物。
【請求項８９】
グルコアミラーゼがアスペルギルス (Aspergillus) 属、好ましくはアスペルギルス・ニガー (A. niger) 、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) またはアスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) の菌株、アテリア (Athelia) 属、好ましくはアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) の菌株、タラロマイセス (Talaromyces) 属、好ましくはタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) の菌株、リゾプス (Rhizopus) 属、例えば、リゾプス・ニビウス (Rhizopus nivius) の菌株、またはフミコラ (Humicola) 、好ましくはフミコラ・グリセアvar. テラモイデス (Humicola grisea var. thermoides) の菌株に由来する、請求項88に記載の組成物。
【請求項９０】
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼに由来するグルコアミラーゼ、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBDをもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼに由来するα-アミラーゼおよびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) に由来するグルコアミラーゼを含んでなる、請求項88または89に記載の組成物。
【請求項９１】
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) に由来するグルコアミラーゼ、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBDをもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼに由来するα-アミラーゼおよびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) に由来するグルコアミラーゼを含んでなる、請求項88または89に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は、また、ポリペプチドを含んでなる核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞ならびにポリペプチドを製造する方法および使用する方法およびデンプンを転化して発酵生成物、例えば、エタノールおよびシロップ、例えば、グルコースを製造するために本発明のグルコアミラーゼを使用することに関する。本発明は、また、本発明のグルコアミラーゼを含んでなる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
関係する技術の説明
グルコアミラーゼ (1,4-α-D-グルカン-グルコヒドロラーゼ、EC 3.2.1.3) は、デンプンまたは関係するオリゴ糖および多糖の分子の非還元性末端からのD-グルコースの解放を触媒する酵素である。グルコアミラーゼはいくつかの糸状真菌および酵母菌により産生され、アスペルギルス (Aspergillus) からのグルコアミラーゼは商業的に最も重要である。
【０００３】
商業的に、グルコアミラーゼは、既にα-アミラーゼにより部分的に加水分解された、デンプン物質をグルコースに転化するために使用される。次いで、グルコースは発酵生物を使用して発酵生成物に直接的または間接的に転化することができる。商用発酵生成物の例は次の通りである: アルコール (例えば、エタノール、メタノール、ブタノール、1,3-プロパンジオール) ; 有機酸 (例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸塩、コハク酸、2,5-ジケト-D-グルコン酸) ; ケトン (例えば、アセトン) ; アミノ酸 (例えば、グルタミン酸) ; 気体 (例えば、H2およびCO2) ; およびより複雑な化合物、例えば、抗生物質 (例えば、ペニシリンおよびテトラサイクリン) ;  酵素; ビタミン (例えば、リボフラビン、B12、β-カロテン) ; ホルモンおよび合成的製造が困難である他の化合物。また、発酵法は消費可能なアルコール (例えば、ビールおよびワイン) 、酪農 (例えば、ヨーグルトおよびチーズの製造) 、なめし革およびタバコ産業において商業的に使用されている。
【０００４】
最終生成物は、また、シロップである。例えば、最終生成物はグルコースであることができるが、また、グルコースイソメラーゼにより、フルクトースまたはほとんど等しくグルコースおよびフルクトースから構成された混合物に転化することができる。この混合物またはフルクトースにさらに富んだ混合物は、世界を通じて商業化されている、最も普通に使用されている高フルクトースコーンシロップ (HFCS) である。
【０００５】
Boel 他 (1984) 、EMBO J. 3 (5) 1097-1102には、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) G1またはG2グルコアミラーゼが開示されている。
米国特許第4,727,046号には、コルチシウム・ロルフシイ (Corticium rolfsii) (これはまたアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) と呼ばれる) に由来するグルコアミラーゼが開示されている。
【０００６】
WO 84/02921には、アスペルギルス・アワモリ (A. awamori) に由来するグルコアミラーゼが開示されている。
WO 99/23248には、タラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) に由来するグルコアミラーゼが開示されている。
WO 00/75296には、サーモアスクス・クルスタセウス (Thermoascus crustaceus) に由来するグルコアミラーゼが開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、発酵生成物製造法、例えば、エタノール製造法、例えば、非糊化生 (または非煮沸) デンプンからの1工程エタノール発酵法において高い収量を提供する、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明は、下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドに関する:
(a)    配列番号2の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1)   配列番号37の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜561のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b)    少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号1のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号3のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1)   少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号36のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c)    配列番号2のアミノ酸1〜556の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1)   配列番号37のアミノ酸1〜561の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
【０００９】
本発明は、下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する:
(a)    配列番号2の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1)   配列番号37の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜561のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b)    配列番号1のヌクレオチド55〜2166に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(b1)   配列番号36のヌクレオチド55〜2166に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c)    配列番号3のヌクレオチド55〜1725に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1)   配列番号38のヌクレオチド55〜1737に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d)    少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号1のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号3のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1)   少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号36のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
【００１０】
好ましい態様において、ポリペプチドは、トラメテス (Trametes) 属、好ましくはトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) の菌株または大腸菌 (E. coli) 菌株 (DSMZに受託され、No. DSM 17106を与えられた) に由来することができる。受託されたDSM 17106は、配列番号1と同一の配列を含んでなるプラスミドHUda595を収容する。本発明の特定のポリペプチドは、実施例6に記載するように、適当な真菌宿主細胞、例えば、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 中でプラスミドpHUda440を発現するとき得られる成熟ポリペプチドである。
【００１１】
第2の面において、本発明は、下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドに関する:
(a)    配列番号5の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜575のアミノ酸に対して少なくとも70% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1)   配列番号40の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜565のアミノ酸に対して少なくとも70% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b)    少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号4のヌクレオチド55〜2189とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号6のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1)   少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号39のヌクレオチド55〜2182とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c)    配列番号5のアミノ酸1〜575の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1)   配列番号40のアミノ酸1〜565の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
【００１２】
本発明は、また、下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する:
(a)    配列番号5の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜575のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1)   配列番号40の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜565のアミノ酸に対して少なくとも75% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b)    配列番号4のヌクレオチド55〜2189に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(b1)   配列番号39のヌクレオチド55〜2182に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c)    配列番号6のヌクレオチド55〜1725に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1)   配列番号41のヌクレオチド55〜1749に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d)    少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号4のヌクレオチド55〜2189とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号6のヌクレオチド55〜1725中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1)   少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号39のヌクレオチド55〜2182とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
【００１３】
好ましい態様において、ポリペプチドは、パチキトスポラ (Pachykytospora) 、好ましくはパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) の菌株または大腸菌 (E. coli) 菌株 (DSMZに受託され、No. DSM 17105を与えられた) に由来することができる。受託されたDSM 17105は、配列番号4と同一の配列を含んでなるプラスミドHUda594を収容する。本発明の特定のポリペプチドは、実施例6に記載するように、適当な真菌宿主細胞、例えば、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 中でプラスミドpHUda450を発現するとき得られる成熟ポリペプチドである。
【００１４】
第3の面において、本発明は、下記から成る群から選択されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドに関する:
(a)    配列番号26の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a1)   配列番号24の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜548のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(a2)   配列番号43の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜523のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド; または
(b)    少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号23のヌクレオチド117〜2249とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも低いストリンジェンシイ条件下に配列番号25のヌクレオチド55〜1719中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(b1)   少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; および
(c)    配列番号26のアミノ酸1〜556の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1)   配列番号24のアミノ酸1〜548の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型; または
(c1)   配列番号43のアミノ酸1〜523の1または2以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる変異型。
【００１５】
本発明は、また、下記から成る群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する:
(a)    配列番号26の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜556のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a1)   配列番号24の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜548のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(a2)   配列番号43の成熟ポリペプチドアミノ酸1〜523のアミノ酸に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; または
(b)    配列番号23のヌクレオチド117〜2249に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c)    配列番号25のヌクレオチド52〜1719に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(c1)   配列番号42のヌクレオチド52〜1620に対して少なくとも60% の同一性を有するポリヌクレオチド; または
(d)    少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号23のヌクレオチド117〜2249とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i)、または少なくとも低いストリンジェンシイ条件下に配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (ii)、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド; または
(d1)   少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に配列番号25のヌクレオチド52〜1719中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列 (i) 、または (i) もしくは (ii) の相補鎖 (iii) によりコードされるポリペプチド。
【００１６】
好ましい態様において、ポリペプチドは、レウコパキシルス (Leucopaxillus) 属、好ましくはレウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) の菌株または配列番号26に示す配列に由来することができる。本発明の特定のポリペプチドは、実施例11に記載するように、適当な真菌宿主細胞、例えば、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中でプラスミドpENI3372を発現するとき得られる成熟ポリペプチドである。
【００１７】
本発明は、また、それぞれ配列番号1または3 (cDNA) または36または38 (cDNA); または配列番号4または6 (cDNA) または39または41 (cDNA); または配列番号23または25 (cDNA) または42 (cDNA) 中のポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、組換え発現ベクターおよび組換え宿主細胞に関する。
【００１８】
本発明者らが最もよく信ずるところによると、配列番号1および4と同一であるクローンは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に関してDSMZ (Deutsge Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturenn GmbH、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweig DE) に2005年2月2日に寄託された。クローンは、寄託番号それぞれDSM 17106およびDSM 17105を与えられた。 
【００１９】
本発明は、また、下記の工程を含んでなるデンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法に関する: (a) ポリペプチドの製造を促進する条件下にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物を含む組換え宿主細胞を培養し、そして (b) ポリペプチドを回収する。
本発明は、また、発酵生成物またはシロップを製造する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
定義
グルコアミラーゼ活性:
用語 「グルコアミラーゼ (1,4-α-D-グルカン-グルコヒドロラーゼ、EC 3.2.1.3) 」 は、デンプンまたは関係するオリゴ糖および多糖の分子の非還元性末端からのD-グルコースの解放を触媒する酵素であるとして定義される。本発明の目的に対して、グルコアミラーゼ活性は下記の節 「材料および方法」 に記載されている手順に従い決定される。
【００２１】
本発明のポリペプチドはそれぞれ配列番号2のアミノ酸1〜556または配列番号37のアミノ酸1〜561; または配列番号5のアミノ酸1〜575または配列番号40のアミノ酸1〜565; または配列番号24のアミノ酸1〜548または配列番号26のアミノ酸1〜556または配列番号43のアミノ酸1〜523として示すアミノ酸配列から成るポリペプチドのグルコアミラーゼ活性の少なくとも20%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、さらに最も好ましくは少なくとも100%を有する。
【００２２】
ポリペプチド:
用語 「ポリペプチド」 は、本明細書において使用するとき、SDS-PAGEにより決定して、少なくとも20%の純度、好ましくは少なくとも40%の純度、より好ましくは少なくとも60%の純度、さらにより好ましくは少なくとも80%の純度、最も好ましくは少なくとも90%の純度、さらに最も好ましくは少なくとも95%の純度を有する単離されたポリペプチドを意味する。
【００２３】
実質的に純粋なポリペプチド:
用語 「実質的に純粋なポリペプチド」 は、ここにおいて最大10%、好ましくは最大8%、より好ましくは最大6%、より好ましくは最大5%、より好ましくは最大4%、より好ましくは最大3%、さらにより好ましくは最大2%、最も好ましくは最大1%、さらに最も好ましくは最大0.5%の天然に関連する他のポリペプチド物質を含有するポリペプチド調製物を意味する。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、調製物中に存在する全ポリペプチド物質の少なくとも92%の純度、好ましくは少なくとも94%の純度、より好ましくは少なくとも95%の純度、より好ましくは少なくとも96%の純度、より好ましくは少なくとも97%の純度、より好ましくは少なくとも98%の純度、さらにより好ましくは少なくとも99%の純度、最も好ましくは少なくとも99.5%の純度、さらに最も好ましくは100%の純度を有することが好ましい。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形態である。特に、ポリペプチドは 「本質的に純粋な形態」 であること、すなわち、ポリペプチド調製物は天然に関連する他のポリペプチド物質を本質的に含まないことが好ましい。これは、例えば、よく知られている組換え法または古典的精製法により、ポリペプチドを製造することによって、達成することができる。
【００２５】
本明細書において、用語 「実質的に純粋なポリペプチド」 は 「単離されたポリペプチド」 または「単離された形態のポリペプチド」 と同義である。
【００２６】
同一性:
2つのアミノ酸の間または2つのヌクレオチド配列の間の関係をパラメーター 「同一性」 で記載する。
本発明の目的に対して、2つのアミノ酸間の同一性の程度は、クルスタル (Clustal) 法 (Higgins、1989、CABS/OS 5: 151-153) により、LASERGENETM MEGALIGNTMソフトウェア (DNASTAR, Inc.、ウィスコンシン州マディソン) を同一性の表および下記の多重アラインメントパラメーターとともに使用して決定される: 10のギャップペナルティーおよび10のギャップ長さペナルティー。対アラインメントパラメーターは次の通りである: Ktuple = 1、ギャップペナルティー= 3、ウィンドウズ= 3およびダイアゴナルス= 5。
【００２７】
本発明の目的に対して、2つのヌクレオチド配列間の同一性の程度は、ウィルブル-リプマン (Wilbur-Lipman) 法 (WilburおよびLipman、1983、Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730) により、LASERGENETM MEGALIGNTMソフトウェア (DNASTAR, Inc.、ウィスコンシン州マディソン) を同一性の表および下記の多重アラインメントパラメーターとともに使用して決定される: 10のギャップペナルティーおよび10のギャップ長さペナルティー。対アラインメントパラメーターは次の通りである: Ktuple = 1、ギャップペナルティー= 3およびウィンドウズ= 3。
【００２８】
ポリペプチドフラグメント:
用語 「ポリペプチドフラグメント」 は、それぞれ配列番号2または37; または配列番号5または40; または配列番号24、26または43、またはそれらの相同配列のアミノ末端および/またはカルボキシル末端から1または2以上のアミノ酸が欠失されたポリペプチドとして本明細書において定義され、ここでフラグメントはグルコアミラーゼ活性を有する。
【００２９】
サブ配列:
用語 「サブ配列」 は、それぞれ配列番号1、36または38; またはそれぞれ配列番号4、39または41; またはそれぞれ配列番号23、25または42、またはそれらの相同配列の5’末端および/または3’末端から1または2以上のヌクレオチドが欠失されたヌクレオチド配列として本明細書において定義され、ここでサブ配列はグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする。
【００３０】
対立遺伝子変異型:
用語 「対立遺伝子変異型」 は、本明細書において同一染色体位置を占有する遺伝子の2またはそれ以上の選択的形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異型は自然に突然変異を通して生じ、そして集団内で多形性を生ずることがある。遺伝子の突然変異はサイレントである (コードされたポリペプチドにおける変化が存在しない) か、あるいは変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドの対立遺伝子変異型は、遺伝子の対立遺伝子変異型によりコードされるポリペプチドである。
【００３１】
実質的に純粋なポリヌクレオチド:
用語 「実質的に純粋なポリヌクレオチド」 は、本明細書において使用するとき、他の外来性または不必要なヌクレオチドを含まず、遺伝子操作されたタンパク質製造系内の使用に適した形態であるポリヌクレオチド調製物を意味する。こうして、実質的に純粋なポリヌクレオチドは最大10重量% 、好ましくは最大8%、より好ましくは最大6%、より好ましくは最大5%、より好ましくは最大4%、より好ましくは最大3%、さらにより好ましくは最大2%、最も好ましくは最大1%、さらに最も好ましくは最大0.5%の天然に関連する他のポリヌクレオチド物質を含有する。
【００３２】
しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然に存在する5’および3’非翻訳領域、例えば、プロモーターおよびターミネーターを含むことができる。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、少なくとも90%の純度、好ましくは少なくとも92%の純度、より好ましくは少なくとも94%の純度、より好ましくは少なくとも95%の純度、より好ましくは少なくとも96%の純度、より好ましくは少なくとも97%の純度、さらにより好ましくは少なくとも98%の純度、最も好ましくは少なくとも99%の純度、さらに最も好ましくは少なくとも99.5%の純度を有することが好ましい。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドは好ましくは実質的に純粋な形態である。特に、本明細書に開示するポリヌクレオチドは 「本質的に純粋な形態」 であること、すなわち、ポリヌクレオチド調製物は天然に関連する他のポリペプチド物質を本質的に含まないことが好ましい。本明細書において、用語 「実質的に純粋なポリヌクレオチド」 は 「単離されたポリヌクレオチド」 または 「単離された形態のポリヌクレオチド」 と同義である。ポリヌクレオチドはゲノム、cDNA、RNA、半合成、合成由来またはそれらの任意の組み合わせであることができる。
【００３４】
cDNA:
用語 「cDNA」 は、真核細胞から得られる成熟スプライスドmRNA分子から逆転写により調製することができるDNA分子として本明細書において定義される。cDNAは対応するゲノムDNA中に通常存在するイントロン配列を欠如する。初期の一次RNA転写物はmRNAに対する前駆体であり、これは1系列の段階に通してプロセスされた後、成熟スプライスドmRNAとして出現する。これらの段階は、スプライシングと呼ぶプロセスによるイントロン配列の除去を含む。したがって、mRNAに由来するcDNAはイントロン配列を欠如する。
【００３５】
核酸構築物:
用語 「核酸構築物」 は、本明細書において使用するとき、天然に存在する遺伝子から単離された一本鎖または二本鎖の核酸分子、またはそうでなければ天然に存在しない方法で核酸のセグメントを含有するように修飾された一本鎖または二本鎖の核酸分子を意味する。用語 「核酸構築物」 は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要な制御配列を含有するとき、用語 「発現カセット」 と同義である。
【００３６】
制御配列:
用語 「制御配列」 は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要なまたは有利であるすべての構成要素を含むとして、本明細書において定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して自然または外来であることができる。このような制御配列は下記のものを包含するが、これらに限定されない: リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーター。最小、制御配列はプロモーター、転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコーディング領域との制御配列の連結を促進する、特異的制限部位を導入する目的で、リンカーを有することができる。
【００３７】
作用可能に連結された:
用語 「作用可能に連結された」 は、本明細書において、制御配列がポリペプチドのコード配列の発現を指令するように、ポリヌクレオチド配列のコード配列に関して適当な位置に制御配列が配置されている立体配置を意味する。
【００３８】
コード配列:
本発明において使用するとき、用語 「コード配列」 は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定する、ヌクレオチド配列を意味する。一般に、コード配列の境界はオープンリーディングフレームにより決定され、このオープンリーディングフレームはATG開始コドンまたは選択的開始コドン、例えば、GTGおよびTTGで通常開始する。コード配列は、DNA、cDNAまたは組換えヌクレオチド配列であることができる。
【００３９】
発現:
用語 「発現」 は、下記を包含するが、これらに限定されないポリペプチド産生に関係づけられる任意の段階を包含する: 転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌。
【００４０】
発現ベクター:
用語 「発現ベクター」 は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、そしてその発現を提供する追加のヌクレオチドに作用可能に連結された、線状または環状のDNA分子として本明細書において定義される。
【００４１】
宿主細胞:
用語 「宿主細胞」 は、本明細書において使用するとき、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物による形質転換、トランスダクションおよびその他に対して感受性である、任意の細胞型を包含する。
【００４２】
修飾:
用語 「修飾」 は、本明細書において、それぞれ配列番号2のアミノ酸1〜556または配列番号37のアミノ酸1〜561; または配列番号5のアミノ酸1〜575または配列番号40のアミノ酸1〜565; または配列番号26のアミノ酸1〜556または配列番号24のアミノ酸1〜548または配列番号43のアミノ酸1〜523から成るポリペプチドの任意の化学的修飾、ならびに前記ポリペプチドをコードするDNAの遺伝子操作を意味する。1または2以上の修飾は、1または2以上のアミノ酸の1または2以上の置換、1または2以上の欠失および/または1または2以上の挿入、ならびに1または2以上のアミノ酸側鎖の1または2以上の置換であることができる。
【００４３】
人工変異型:
本発明において使用するとき、用語 「人工変異型」 は、配列番号1または3 (cDNA); または配列番号36または38 (cDNA); または配列番号4または6 (cDNA) または配列番号39または41 (cDNA); または配列番号23または25 (cDNA) または42 (cDNA) の修飾されたヌクレオチド配列を発現する生物により産生されるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。修飾されたヌクレオチド配列は、ヒトの関与に通して、それぞれ配列番号1または3; または配列番号36または38; または配列番号4または6; または配列番号39または41; または配列番号23または25または42に開示されるヌクレオチド配列の修飾により得られる。
【００４４】
発明の詳細な説明
グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド
第1の面において、本発明は、それぞれ配列番号2のアミノ酸1〜556または配列番号37のアミノ酸1〜561; または配列番号5のアミノ酸1〜575または配列番号40のアミノ酸1〜565; または配列番号26のアミノ酸1〜556または配列番号24のアミノ酸1〜548または配列番号43のアミノ酸1〜523 (すなわち、成熟ポリペプチド) に対してある程度の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【００４５】
ある態様において、アミノ酸配列はグルコアミラーゼ活性を有し、そしてそれぞれ配列番号2または配列番号37の成熟部分に対して少なくとも75%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも85%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも90%の同一性、最も好ましくは少なくとも95%の同一性、より好ましくは少なくとも96%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも97%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも98%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性を有する (以後において 「相同ポリペプチド」 ) 。
【００４６】
他の態様において、アミノ酸配列はグルコアミラーゼ活性を有し、そしてそれぞれ配列番号5または配列番号40の成熟部分に対して少なくとも70%の同一性、より好ましくは少なくとも75%の同一性、より好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも85%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも90%の同一性、最も好ましくは少なくとも95%の同一性、より好ましくは少なくとも96%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも97%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも98%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性を有する (以後において 「相同ポリペプチド」 ) 。
【００４７】
ある態様において、アミノ酸配列はグルコアミラーゼ活性を有し、そしてそれぞれ配列番号26、24または43の成熟部分に対して少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも85%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも90%の同一性、最も好ましくは少なくとも95%の同一性、より好ましくは少なくとも96%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも97%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも98%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性を有する (以後において 「相同ポリペプチド」 ) 。
【００４８】
好ましい面において、相同ポリペプチドは、それぞれ配列番号2のアミノ酸1〜556または配列番号37のアミノ酸1〜561; または配列番号5のアミノ酸1〜575または配列番号40のアミノ酸1〜565; または配列番号26のアミノ酸1〜556または配列番号24のアミノ酸1〜548または配列番号43のアミノ酸1〜523と10アミノ酸、好ましくは5アミノ酸、より好ましくは4アミノ酸、さらにより好ましくは3アミノ酸、最も好ましくは2アミノ酸、さらに最も好ましくは1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を有する。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、それぞれ配列番号2または37; 配列番号5または40; または配列番号24、26または43の成熟アミノ酸配列、またはそれらの対立遺伝子変異型; またはグルコアミラーゼ活性、例えば、触媒ドメインを有するそれらのフラグメントを含んでなることが好ましい。
【００５０】
触媒ドメイン
1つの面において、本発明は、それぞれ配列番号2または37; 配列番号5または40; または配列番号24、26または43のアミノ酸配列の触媒領域/ドメインを含んでなるポリペプチドに関する。
【００５１】
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼの触媒領域/ドメインは、配列番号2中のアミノ酸1〜455からまたは配列番号37のアミノ酸1〜460に位置する。1つの態様において、この領域はそれぞれ配列番号2のアミノ酸456〜465または配列番号37のアミノ酸461〜470またはそれらの一部分からのリンカー領域を含むと考えることができる。結合性ドメインは、それぞれ配列番号3中のポリヌクレオチド1423〜1725または配列番号36のポリヌクレオチド1774〜2163または配列番号38のポリヌクレオチド1465〜1737によりコードされる。
【００５２】
パチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) グルコアミラーゼの触媒領域/ドメインは、配列番号5中のアミノ酸1〜475からまたは配列番号40のアミノ酸1〜465に位置する。1つの態様において、この領域はそれぞれ配列番号5のアミノ酸476〜484または配列番号40のアミノ酸466〜474またはそれらの一部分からのリンカー領域を含むと考えることができる。結合性ドメインは、それぞれ配列番号6中のポリヌクレオチド1420〜1725または配列番号39のポリヌクレオチド1763〜2182または配列番号41のポリヌクレオチド1477〜1749によりコードされる。
【００５３】
レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) グルコアミラーゼの触媒領域/ドメインは、それぞれ配列番号26のアミノ酸1〜451または配列番号24のアミノ酸1〜455または配列番号43のアミノ酸1〜418に位置する。1つの態様において、この領域はそれぞれ配列番号26のアミノ酸452〜461または配列番号24のアミノ酸456〜466または配列番号43のアミノ酸419〜429またはそれらの一部分のリンカー領域を含むと考えることができる。結合性ドメイン (CBM) は、それぞれ配列番号25中のポリヌクレオチド1438〜1719または配列番号23のポリヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のポリヌクレオチド1330〜1620によりコードされる。
【００５４】
好ましい態様において、本発明は、それぞれ配列番号2中のアミノ酸1〜455または配列番号37のアミノ酸1〜460 (トラメテス (Trametes)) ; または配列番号5中のアミノ酸1〜475または配列番号40のアミノ酸1〜465 (パチキトスポラ (Pachykytospora)) ; または配列番号26中のアミノ酸1〜451または配列番号24のアミノ酸1〜455または配列番号43中のアミノ酸1〜418 (レウコパキシルス (Leucopaxillus)) に対して少なくとも60%の同一性、好ましくは少なくとも65%の同一性、より好ましくは少なくとも70%の同一性、より好ましくは少なくとも75%の同一性、より好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも85%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも90%の同一性、最も好ましくは少なくとも95%の同一性、より好ましくは少なくとも96%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも97%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも98%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性、特に100%の同一性を有し、そしてグルコアミラーゼ活性を有する触媒領域に関する (以後において 「相同ポリペプチド」 ) 。
【００５５】
好ましい面において、相同触媒領域は、それぞれ配列番号2のアミノ酸1〜455または配列番号37のアミノ酸1〜460 (トラメテス (Trametes)) ; または配列番号5のアミノ酸1〜475または配列番号40のアミノ酸1〜465 (パチキトスポラ (Pachykytospora)) ; または配列番号26中のアミノ酸1〜451または配列番号24のアミノ酸1〜455または配列番号43中のアミノ酸1〜418 (レウコパキシルス (Leucopaxillus)) と10アミノ酸、好ましくは5アミノ酸、より好ましくは4アミノ酸、さらにより好ましくは3アミノ酸、最も好ましくは2アミノ酸、さらに最も好ましくは1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を有する。
【００５６】
結合性ドメイン
他の面において、本発明は、炭水化物結合性アフィニティー、好ましくはデンプン結合性アフィニティーを有するポリペプチドに関する。
トラメテス (Trametes) グルコアミラーゼ中の結合性ドメインは、配列番号2のアミノ酸466〜556に位置し、そして配列番号3中のポリヌクレオチド1420〜1725によりコードされるか、あるいは配列番号37のアミノ酸471〜561に位置し、そして配列番号38中のポリヌクレオチド1465〜1737によりコードされる。
【００５７】
パチキトスポラ (Pachykytospora) グルコアミラーゼ中の結合性ドメインは、配列番号5中のアミノ酸485〜575 (パチキトスポラ (Pachykytospora)) に位置し、そして配列番号6中のポリヌクレオチド1423〜1725によりコードされるか、あるいは配列番号40のアミノ酸475〜565に位置し、そして配列番号41中のポリヌクレオチド1477〜1749によりコードされる。
【００５８】
レウコパキシルス (Leucopaxillus) グルコアミラーゼ中の結合性ドメインは、それぞれ配列番号26のアミノ酸453〜556または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に位置し、そしてそれぞれ配列番号23のポリヌクレオチド1854〜2249または配列番号25のポリヌクレオチド1339〜1620によりコードされる。
【００５９】
結局、この面において、本発明は、下記から成る群から選択される、炭水化物結合性アフィニティーを有するポリペプチドに関する:
(a)    i)   それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド; または
ii)   それぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド; または
iii)   それぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556のアミノ酸または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523に対して少なくとも60% の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
【００６０】
(b)   低いストリンジェンシイの条件下に下記から成る群から選択されるポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド:
(i)   それぞれ配列番号3のヌクレオチド1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737の相補鎖;
(ii)   それぞれ配列番号6のヌクレオチド1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749の相補鎖;
(iii)  それぞれ配列番号25のヌクレオチド1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1399〜1620の相補鎖;
(c)   炭水化物結合性アフィニティーを有する (a) または (b) のフラグメント。
【００６１】
好ましい態様において、本発明は、それぞれ配列番号2中のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561 (トラメテス (Trametes)) またはそれぞれ配列番号5中のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565 (パチキトスポラ (Pachykytospora)) またはそれぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523 (レウコパキシルス (Leucopaxillus)) に対して少なくとも60%の同一性、好ましくは少なくとも70%の同一性、より好ましくは少なくとも75%の同一性、より好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも85%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも90%の同一性、最も好ましくは少なくとも95%の同一性、より好ましくは少なくとも96%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも97%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも98%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性、特に100%の同一性をもつ炭水化物結合性アフィニティーを有するポリペプチドに関する。
【００６２】
好ましい面において、相同結合性ドメインは、それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561 (トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata)) またはそれぞれ配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565 (パチキトスポラ (Pachykytospora)) またはそれぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523 (レウコパキシルス (Leucopaxillus)) と10アミノ酸、好ましくは5アミノ酸、より好ましくは4アミノ酸、さらにより好ましくは3アミノ酸、最も好ましくは2アミノ酸、さらに最も好ましくは1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を有する。
【００６３】
他の態様において、本発明は、下記から成る群から選択される、炭水化物結合性アフィニティーを有するポリペプチドに関する:
(a)    低いストリンジェンシイの条件下に、好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、下記から成る群から選択されるポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド:
(i)    それぞれ配列番号3のヌクレオチド1420〜1725または配列番号38のヌクレオチド1465〜1737の相補鎖;
(ii)   それぞれ配列番号6のヌクレオチド1423〜1725または配列番号41のヌクレオチド1477〜1749;
(iii)  それぞれ配列番号25のヌクレオチド1438〜1719または配列番号23のヌクレオチド1854〜2249または配列番号42のヌクレオチド1339〜1620;
(b)   炭水化物結合性アフィニティーを有する (a) のフラグメント。
【００６４】
本発明は、また、ポリペプチドが、それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜556または配列番号37のアミノ酸471〜561 (トラメテス (Trametes)); または配列番号5のアミノ酸485〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565 (パチキトスポラ (Pachykytospora)); または配列番号26のアミノ酸463〜556または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523 (レウコパキシルス (Leucopaxillus)) に比較してアミノ酸の少なくとも1つの置換、欠失および/または挿入を有するアミノ酸を含んでなる人工変異型である、炭水化物結合性アフィニティーを有するポリペプチドに関する。
【００６５】
本発明は、また、ポリペプチドが、それぞれ配列番号3中の位置1420〜1725または配列番号38中の位置1465〜1737; または配列番号6の位置1423〜1725または配列番号41中の位置1477〜1749; または配列番号25の位置1438〜1719または配列番号23の位置1854〜2249または配列番号42中のヌクレオチド1339〜1620に示すポリヌクレオチド配列の炭水化物結合性ドメインコード部分によりコードされるアミノ酸配列に比較して、アミノ酸の少なくとも1つの置換、欠失および/または挿入を有するアミノ酸配列を含んでなる人工変異型である、炭水化物結合性アフィニティーを有するポリペプチドに関する。
【００６６】
ハイブリッド
本発明のグルコアミラーゼまたは触媒領域は、1または2以上の外来結合性ドメイン (また、結合性モジュール (CBM) と呼ばれる) に、リンカーを介してまたは直接結合することができる。「外来」 結合性ドメインは、問題の本発明の野生型グルコアミラーゼに由来しない結合性ドメインである。結合性ドメインは、好ましくは炭水化物結合性ドメイン (すなわち、炭水化物に対する結合性のアフィニティーを有する) 、特にデンプン結合性ドメインおよびセルロース結合性ドメインである。好ましい結合性ドメインは真菌または細菌由来である。特に考えられるデンプン結合性ドメインの例は、WO 2005/003311に開示されており、これは引用することによって本明細書の一部とされる。
【００６７】
好ましい態様において、本発明のグルコアミラーゼ中のリンカーは、より安定なリンカー、すなわち、親リンカーよりも切断が困難であるリンカーと置換される。この置換は結合性ドメインが切断されるのを回避するために実施される。特別に考えられる安定なリンカーはアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) のリンカーを包含する:
TTTTTTAAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSS (配列番号22) 
【００６８】
こうして、好ましい態様において、本発明は、それぞれ配列番号2または37に示すアミノ酸配列を有するハイブリッドグルコアミラーゼに関し、ここでそれぞれ配列番号2のアミノ酸456〜465または配列番号37中のアミノ酸461〜470またはその一部分に位置する天然のリンカーが配列番号22に示すアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) リンカーで置換されている。
【００６９】
こうして、好ましい態様において、本発明は、それぞれ配列番号5または40に示すアミノ酸配列を有するハイブリッドグルコアミラーゼに関し、ここでそれぞれ配列番号5中のアミノ酸476〜484または配列番号40中のアミノ酸466〜474またはその一部分に位置する天然のリンカーが配列番号22に示すアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) リンカーで置換されている。
【００７０】
こうして、他の好ましい態様において、本発明は、それぞれ配列番号26または24に示すアミノ酸配列を有するハイブリッドグルコアミラーゼに関し、ここでそれぞれ配列番号26中のアミノ酸452〜462または配列番号24中のアミノ酸419〜429またはその一部分に位置する天然のリンカーが配列番号22に示すアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) リンカーで置換されている。
【００７１】
こうして、本発明は、また、本発明のグルコアミラーゼまたは安定なリンカー (例えば、ペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) リンカー) に融合したグルコアミラーゼ活性を有する本発明の触媒ドメインおよび1または2以上の炭水化物結合性ドメイン、例えば、WO 2005/003311、第5ページ、第30行〜第8ページ、第12行 (これは引用することによって本明細書の一部とされる) に開示されている炭水化物結合性モジュール (CBM) から成るハイブリッドに関する。
【００７２】
ハイブリダイズ
他の面において、本発明は、下記のポリヌクレオチドによりコードされるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドに関する: (i) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に、好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、さらにより好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、それぞれ配列番号1のヌクレオチド55〜2166または配列番号36のヌクレオチド55〜2166をもつヌクレオチド配列 (トラメテス (Trametes) ゲノムDNA) とハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
【００７３】
(ii) 少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に、好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、それぞれ配列番号3のヌクレオチド55〜1725または配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列をもつヌクレオチド配列 (トラメテス (Trametes) cDNA) とハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
【００７４】
(iii) 上記 (i) もしくは (ii) のサブ配列、または (iv) 上記 (i) 、(ii) もしくは (iii) の相補鎖 (J. Sambrook 、E. F. FritschおよびT. Maniatis、1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー) 。配列番号1または3、または配列番号36または38のサブ配列 (トラメテス (Trametes)) は、少なくとも100の連続的ヌクレオチドまたは好ましくは少なくとも200の連続的ヌクレオチドを含有する。その上、サブ配列はグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントによりコードされる。
【００７５】
本発明は、また、下記のポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチドに関する: (i) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に、好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、さらにより好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、それぞれ配列番号4のヌクレオチド55〜2189または配列番号39のヌクレオチド55〜2182をもつヌクレオチド配列 (パチキトスポラ (Pachykytospora) ゲノムDNA) とハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
【００７６】
(ii) 中程度のストリンジェンシイ条件下に、好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、それぞれ配列番号6のヌクレオチド55〜1725または配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列をもつヌクレオチド配列 (パチキトスポラ (Pachykytospora) cDNA) とハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
(iii) 上記 (i) もしくは (ii) のサブ配列、または (iv) 上記 (i) 、(ii) または (iii) の相補鎖。
【００７７】
本発明は、また、下記のポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチドに関する: (i) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に、好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、さらにより好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、配列番号23のヌクレオチド117〜2249をもつヌクレオチド配列 (レウコパキシルス (Leucopaxillus) ゲノムDNA) とハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
【００７８】
(ii) 少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に、好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、さらにより好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、さらにより好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、配列番号25のヌクレオチド52〜1719または配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列をもつヌクレオチド配列 (レウコパキシルス (Leucopaxillus) cDNA) とハイブリダイズするポリヌクレオチド、または (iii) 上記 (i) または (ii) のサブ配列、または
(iv) 上記 (i) 、(ii) もしくは (iii) の相補鎖。
【００７９】
それぞれ配列番号1、3、36または38のヌクレオチド配列、またはそれらのサブ配列、またはそれぞれ配列番号4、6、39または41のヌクレオチド配列、またはそれらのサブ配列、またはそれぞれ配列番号23、25または42のヌクレオチド配列、またはそれらのサブ配列、ならびにそれぞれ配列番号2または37のアミノ酸配列、またはそれらのフラグメント、またはそれぞれ配列番号5または40のアミノ酸配列、またはそれらのフラグメント、またはそれぞれ配列番号、26、24または43のアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントは、この分野においてよく知られている方法に従い、種々の属または種の菌株からグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを同定し、クローニングする核酸プローブを設計するために使用することができる。
【００８０】
特に、このようなプローブは、標準的サザンブロッティング法に従い、問題の属または種のゲノムまたはcDNAとハイブリダイズさせて、その中の対応する遺伝子を同定または単離するために使用できる。このようなプローブは全配列よりもかなり短いが、少なくとも14、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、最も好ましくは少なくとも70ヌクレオチド長さであるべきである。しかしながら、核酸プローブは少なくとも100ヌクレオチド長さであることが好ましい。例えば、核酸プローブは少なくとも200ヌクレオチド、好ましくは少なくとも300ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも400ヌクレオチドまたは最も好ましくは少なくとも500ヌクレオチド長さであることができる。
【００８１】
さらに、これより長いプローブ、例えば、少なくとも600ヌクレオチド、好ましくは少なくとも700ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも800ヌクレオチドまたは最も好ましくは少なくとも900ヌクレオチド長さである核酸プローブを使用することができる。DNAプローブおよびRNAプローブの両方を使用できる。典型的には、プローブは対応する遺伝子を検出するために標識化される (例えば、32P、3H、35S、ビオチンまたはアビジン) 。このようなプローブは本発明に含まれる。
【００８２】
したがって、このような他の生物から調製されたゲノムDNAまたはcDNAライブラリーを、前述のプローブとハイブリダイズし、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAについてスクリーニングすることができる。このような他の生物からのゲノムDNAまたは他のDNAは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動または他の分離技術により分離できる。ライブラリーからのDNAまたは分離されたDNAをニトロセルロースまたは他の適当な担体物質上に移し、固定化することができる。それぞれ配列番号1、3、36または38、またはそれらのサブ配列、またはそれぞれ配列番号4、6、39または41、またはそれらのサブ配列、またはそれぞれ配列番号23、25または42、またはそれらのサブ配列と相同的であるクローンまたはDNAを同定するために、担体物質をサザンブロットにおいて使用する。
【００８３】
本発明の目的に対して、ハイブリダイズは、それぞれ配列番号1、3、36または38、またはそれぞれ配列番号4、6、39または41、またはそれぞれ配列番号23、25または42に示すヌクレオチド配列、その相補鎖、またはそれらのサブ配列に対応する標識化核酸プローブに対して低いまたは中程度の〜非常に高いストリンジェンシイ条件下にヌクレオチド配列がハイブリダイズすることを示す。これらの条件下に核酸プローブがハイブリダイズする分子は、X線フィルムを使用して検出することができる。
【００８４】
好ましい態様において、核酸プローブは、配列番号1のヌクレオチド55〜2166または配列番号36のヌクレオチド55〜2166、または配列番号3のヌクレオチド1〜1725または配列番号38のヌクレオチド55〜1737 (トラメテス (Trametes) cDNA) である。好ましい態様において、核酸プローブは、配列番号4のヌクレオチド55〜2186または配列番号39のヌクレオチド55〜2182または配列番号6のヌクレオチド1〜1725または配列番号41のヌクレオチド55〜1749 (パチキトスポラ (Pachykytospora) cDNA) である。
【００８５】
好ましい態様において、核酸プローブは、配列番号23のヌクレオチド117〜2249または配列番号25のヌクレオチド52〜1719 (レウコパキシルス (Leucopaxillus) cDNA) または配列番号42のヌクレオチド52〜1620 (レウコパキシルス (Leucopaxillus) cDNA) である。他の好ましい面において、核酸プローブは、配列番号2のアミノ酸1〜455または配列番号37のアミノ酸1〜460 (トラメテス (Trametes)) の間または配列番号5のアミノ酸1〜475または配列番号40のアミノ酸1〜456 (パチキトスポラ (Pachykytospora)) の間または配列番号24のアミノ酸1〜455または配列番号26のアミノ酸1〜451または配列番号43の1〜418 (レウコパキシルス (Leucopaxillus)) の間の触媒領域をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００８６】
他の面において、本発明は、それぞれ配列番号2のアミノ酸466〜456または配列番号37のアミノ酸471〜561、またはそれぞれ配列番号5のアミノ酸486〜575または配列番号40のアミノ酸475〜565、またはそれぞれ配列番号26のアミノ酸463〜556または配列番号24のアミノ酸467〜548または配列番号43のアミノ酸430〜523中の結合性ドメインをコードする核酸プローブに関する。
【００８７】
他の好ましい面において、核酸プローブはそれぞれ配列番号1、3、36または38の成熟ポリペプチドコーディング領域 (トラメテス (Trametes)) である。他の好ましい態様において、核酸プローブは配列番号4、6、39または41の成熟ポリペプチドコーディング領域 (パチキトスポラ (Pachykytospora)) である。他の好ましい態様において、核酸プローブは配列番号23、25または42の成熟ポリペプチドコーディング領域 (レウコパキシルス (Leucopaxillus)) である。他の好ましい態様において、核酸プローブは、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、それぞれプラスミドpHUda595およびpHUda594中の配列の一部分である。プラスミドpHUda595およびpHUda594は、それぞれ大腸菌 (Escherichia coli) DSM 17106および大腸菌 (Escherichia coli) DSM 17105中に含有され、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００８８】
少なくとも100ヌクレオチド長さの長いプローブについて、低い〜高いストリンジェンシイ条件は、最適には12〜24時間の標準的サザンブロッティング法に従う、42℃における5×SSPE、0.3%のSDS、200μg/mlの剪断し変性したサケ精子DNAおよび低いストリンジェンシイについて25%のホルムアミド、中程度および中程度〜高いストリンジェンシイについて35%のホルムアミドまたは非常に高いストリンジェンシイについて50%のホルムアミド中のプレハイブリダイズまたはハイブリダイズであると定義される。
【００８９】
少なくとも100ヌクレオチド長さの長いプローブについて、担体物質は最後に2×SSC、0.2%のSDS中で、少なくとも50℃ (低いストリンジェンシイ) 、より好ましくは少なくとも55℃ (中程度のストリンジェンシイ) 、より好ましくは少なくとも60℃ (中程度〜高いストリンジェンシイ) 、さらにより好ましくは少なくとも65℃ (高いストリンジェンシイ) 、最も好ましくは少なくとも70℃ (非常に高いストリンジェンシイ) において各回15分間3回洗浄する。
【００９０】
約15〜約70ヌクレオチド長さの短いプローブについて、ストリンジェンシイ条件は、標準的サザンブロッティング法に従う、ボルトン (Bolton) およびマクカーティ (McCarty) (1962、Proceedings of the National Academy of Science USA 48: 1390) に従う計算を使用して計算されたTmよりも約5℃〜約10℃だけ低い温度における0.9 MのNaCl、0.09 MのTris-HCl pH 7.6、6 mMのEDTA、0.5%のNP-40、1×デンハルト溶液、1 mMのピロリン酸ナトリウム、1 mMの一塩基性リン酸ナトリウム、0.1 mMのATPおよび0.2 mg/mlのRNA中のプレハイブリダイズ、ハイブリダイズおよびハイブリダイズ後の洗浄であると定義される。
【００９１】
約15〜約70ヌクレオチド長さの短いプローブについて、担体物質は計算されたTmよりも約5℃〜約10℃だけ低い温度において、6×SSC + 0.1%のSDS中で15分間1回洗浄され、そして6×SSC中で各回15分間2回洗浄される。
塩含有ハイブリダイズ条件下に、有効Tmは有望なハイブリダイズのためにプローブとフィルター結合DNAとの間の要求される同一性の程度を制御する温度である。有効Tmは下記の式を使用して種々のストリンジェンシイ条件下にハイブリダイズする2つのDNAに必要な同一性の程度を決定するために決定することができる。
有効Tm = 81.5+16.6(log M[Na+])+0.41(G+C%)-0.72 (ホルムアミド%) 
(www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm参照) 
【００９２】
配列番号1または配列番号1のヌクレオチド55〜2166のG+C含有量は60.5%である。配列番号3 (cDNA)または配列番号3のヌクレオチド55〜1725のG+C含有量は62.3%である。
配列番号4または配列番号4のヌクレオチド55〜2189のG+C含有量は60.7%である。配列番号6 (cDNA)または配列番号6のヌクレオチド55〜1725のG+C含有量は63.7%である。
中程度のストリンジェンシイについて、ホルムアミドは35%であり、そして5×SSPE中のNa+濃度は0.75 Mである。この式中これらを値に適用すると、有効Tmは79.0℃である。
他の関係する関係は、2つのDNAの1%のミスマッチがTmを1.4℃だけ低下させるころである。2つのDNAが42℃において中程度のストリンジェンシイ条件下にハイブリダイズするために要求される同一性の程度を決定するために、下記式を使用する:
相同性% = 100-[(有効Tm-ハイブリダイズ温度) /1.4]
(www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm参照) 
【００９３】
この式中これらを値に適用すると、42℃において中程度のストリンジェンシイ条件下にハイブリダイズするために2つのDNAに要求される同一性の程度は100-[(79.0-42) /1.4]=51%である。
【００９４】
変異型
それ以上の面において、本発明は、それぞれ配列番号2、5、24、26、37、40および43、またはそれらの成熟ポリペプチド中に1または2以上の保存的置換、欠失および/または挿入を含んでなる人工変異型に関する。アミノ酸の変化は小さい特質、すなわち、下記の特質を有することが好ましい: タンパク質のフォールディングおよび/または活性に有意に影響を与えない保存的アミノ酸の置換または挿入; 小さい欠失、典型的には1〜約30の欠失; 小さいアミノ末端またはカルボキシル末端のエクステンション、例えば、アミノ末端のメチオニン残基; 約20〜25残基までの小さいリンカーペプチド; または正味の電荷または他の機能を変化させることによって精製を促進する小さいエクステンション、例えば、抗原エピトープまたは結合性ドメイン。
【００９５】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸 (例えば、アルギニン、リシンまたはヒスチジン) 、酸性アミノ酸 (グルタミン酸およびアスパラギン酸) 、極性アミノ酸 (グルタミンおよびアスパラギン) 、疎水性アミノ酸 (ロイシン、イソロイシン、バリンおよびメチオニン) 、芳香族アミノ酸 (フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン) および小さいアミノ酸 (グリシン、アラニン、セリンおよびトレオニン) のグループ内である。一般に比活性を変更しないアミノ酸置換はこの分野において知られており、そして、例えば、下記の文献に記載されている: H. NeurathおよびR. L. Hill、1979、The Proteins、Academic Press, New York。最も普通に発生する変化は次の通りである: Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Al/GluおよびAsp/Glyならびにそれらの逆。
【００９６】
20の標準的アミノ酸に加えて、非標準的アミノ酸 (例えば、4-ヒドロキシプロリン、6-N-メチルリシン、2-アミノイソ酪酸、イソバリンおよびアルファ-メチルセリン) を野生型ペプチドのアミノ酸残基で置換することができる。限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸および非天然のアミノ酸をアミノ酸残基で置換することができる。 「非天然のアミノ酸」 はタンパク質合成後に修飾されておりおよび/または1または2以上の側鎖の化学的構造が標準的アミノ酸のそれと異なる。非天然のアミノ酸は化学的に合成することができ、商業的に入手可能であり、そして下記を包含する: ピペコリン酸、チアゾリンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-および4-メチルプロリンおよび3,3-ジメチルプロリン。
【００９７】
選択的に、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの物理化学的性質が変更されるような特質を有する。例えば、アミノ酸の変化はポリペプチドの熱安定性を改良し、基質の特異性を変更し、pHおよびその他を変化させる。
【００９８】
親ポリペプチド中の必須アミノ酸は、この分野において知られている方法、例えば、位置指定突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発に従い同定することができる (CunninghamおよびWella、1989、Science 244: 1081-1085) 。後者の技術において、単一のアラニンの突然変異を分子中のすべての残基に導入し、そして生ずる突然変異分子を生物学的活性 (すなわち、グルコアミラーゼ活性) について試験して、その分子の活性に対して重大であるアミノ酸残基を同定する。また、下記の文献を参照のこと: Hilton 他、1996、J. Biol. Chem. 271: 4699-4708。
【００９９】
また、酵素の活性部位または他の生物学的相互作用は、アミノ酸の推定上の接触部位の突然変異と組合わせて、下記の技術により決定されるような、構造の物理的分析により決定することができる: 核磁気共鳴、結晶構造解析、電子回折またはフォトアフィニティー標識化。例えば、下記の文献を参照のこと: de Vos 他、1992、Science 255: 306-312; Smith 他、1992、J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wiodaver 他、1992、FEBS Lett. 309: 59-64。また、必須アミノ酸の同一性は、本発明によるポリペプチドに関係するポリペプチドとの同一性の分析から推定することができる。
【０１００】
突然変異誘発、組換えおよび/またはシャフリングの既知の方法、次いで関係するスクリーニング手順、例えば、下記の文献に記載されている手順に従い、単一または複数のアミノ酸置換を実施し、試験することができる: Reidhaar-OlsonおよびSauer、1988、Science 241: 53-57; BowieおよびSauer、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413またはWO 95/22625。使用できる他の方法は下記を包含する: 誤りがちのPCR、ファージ展示 (例えば、Loeman 他、1991、Biochem. 30: 10832-10837; 米国特許第5,223,409号; WO 92/06204) および領域指定突然変異誘発 (Derbyshire 他、1986、Gene 46: 145; Ner 他、1988、DNA 7: 127) 。
【０１０１】
突然変異誘発/シャフリング法を高い処理量の自動化スクリーニング法と組合わせて、宿主細胞により発現された、クローニングされ、突然変異誘発されたポリペプチドを検出することができる。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発されたDNA分子は、この分野における標準的方法に従い、宿主細胞から回収し、迅速に配列決定できる。これらの方法は、問題のポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能とし、未知構造のポリペプチドに適用することができる。
【０１０２】
配列番号2の位置1〜556または配列番号37の位置1〜561 (トラメテス (Trametes) グルコアミラーゼ) ; または配列番号5中の位置1〜575または配列番号40中の位置1〜565 (パチキトスポラ (Pachykytospora) グルコアミラーゼ) ; または配列番号26の位置1〜556または配列番号24の位置1〜548または配列番号43の位置1〜523 (レウコパキシルス (Leucopaxillus) グルコアミラーゼ) におけるアミノ酸の置換、欠失および/または挿入の総数は、10、好ましくは9、より好ましくは8、より好ましくは7、より好ましくは最大6、より好ましくは最大5、より好ましくは4、より好ましくは、さらにより好ましくは3、最も好ましくは2、さらに最も好ましくは1である。
【０１０３】
グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドの源
本発明のポリペプチドは任意の属の微生物から得ることができる。本発明の目的に対して、用語 「から得る」 は、本明細書において使用するとき、所定の源に関して、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドがその源により、またはそのヌクレオチド配列が挿入されている菌株により産生されることを意味する。好ましい面において、所定の源から得られるポリペプチは細胞外に分泌される。
【０１０４】
好ましい態様において、本発明のグルコアミラーゼはバシディオミセテス (Basidiomycetes) クラスに由来する。より好ましい態様において、本発明のグルコアミラーゼはトラメテス (Trametes) 属の菌株、より好ましくはトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) 種の菌株、または寄託されたDSM 17106、またはパチキトスポラ (Pachykytospora) 属の菌株、より好ましくはパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) 種の菌株、または寄託されたDSM 17105、またはレウコパキシルス (Leucopaxillus) 属の菌株、より好ましくはレウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) 種の菌株に由来する。
【０１０５】
理解されるように、前述した種について、本発明は、完全な状態および不完全な状態の両方およびそれらが知られている種の名称を無視して、他の分類学上の同等物、例えば、アナモルフを包含する。当業者は適当な同等物を容易に認識するであろう。
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) 菌株は、1995〜1997年にジムバブウェ (Zimbabwe) において収集された。
【０１０６】
パチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) 菌株は、1995〜1997年にジムバブウェ (Zimbabwe) において収集された。
レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) 菌株は、2003年にデンマークにおいて収集された。
【０１０７】
さらに、このようなポリペプチドは、前述のプローブを使用して、他の源、例えば、天然 (例えば、土壌、堆肥、水およびその他) から同定し、得ることができる。天然の生息環境から微生物を単離する技術は、この分野において知られている。次いで、ポリヌクレオチドは他の微生物のゲノムまたはcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることによって得ることができる。いったんポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が1または2以上のプローブで検出されると、当業者に十分に知られている技術により、ポリヌクレオチドを単離またはクローニングすることができる (例えば、下記の文献を参照のこと: Sambrook 他、1989、前掲) 。
【０１０８】
また、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドまたはそのフラグメントのN-末端またはC-末端に他のポリペプチドが融合されている、融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドを包含する。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 (またはその一部分) を本発明のヌクレオチド配列 (またはその一部分) に融合することによって製造される。融合ポリペプチドを製造する技術はこの分野において知られており、そしてポリペプチドをコードするコード配列がインフレームでありかつ融合したポリペプチドの発現が1または2以上の同一プロモーターおよびターミネーターの制御下にあるように、コード配列を連結することを包含する。
【０１０９】
ポリヌクレオチド
本発明は、また、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドに関する。好ましい面において、ヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号1、3、4、6、23、25、36、38、39、41または42のいずれかに記載される。他のより好ましい面において、ヌクレオチド配列はそれぞれ大腸菌 (Escherichia coli) DSM 17106または大腸菌 (Escherichia coli) DSM 17105中に含有されるプラスミドpHUda595またはpHUda594中に含有される配列である。他の好ましい面において、ヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号1、3、4、6、23、25、36、38、39、41または42のいずれかの成熟ポリペプチドコーディング領域である。
【０１１０】
本発明は、また、それぞれ配列番号2、5、24、26、37、40または43のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれぞれ配列番号1、3、4、6、23、25、36、38、39、41または42と、遺伝暗号のデジェネラシーにより異なる、それらの成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。本発明は、また、グルコアミラーゼ活性を有する、それぞれそれぞれ配列番号2、5、24、26、37、40または43のフラグメントをコードする、それぞれ配列番号1、3、4、6、23、25、36、38、39、41または42のいずれかのサブ配列を包含する。
【０１１１】
本発明は、また、それぞれ配列番号1、3、4、6、23、25、36、38、39、41または42のいずれかの成熟ポリペプチドコード配列中に少なくとも1つの突然変異を含んでなる突然変異体ポリヌクレオチドに関し、ここで突然変異体ヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号2のアミノ酸1〜556、配列番号5のアミノ酸1〜575、配列番号24のアミノ酸1〜548、配列番号26のアミノ酸1〜556、配列番号37のアミノ酸1〜561、配列番号40のアミノ酸1〜565または配列番号43のアミノ酸1〜523から成るポリペプチドをコードする。
【０１１２】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離またはクローニングするために使用する技術はこの分野において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの製造またはそれらの組合わせを包含する。このようなゲノムDNAからの本発明のポリペプチドのクローニングは、例えば、よく知られているポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) または共有する構造的特徴をもつクローニングされたDNAフラグメントを検出する発現ライブラリーの抗体スクリーニングにより実施することができる。
【０１１３】
例えば、下記の文献を参照のこと: Innis 他、1990、PCR: A Guide to Methods and Application、Academic Press、New York。他の核酸増幅手順、例えば、リガーゼ連鎖反応 (LCR) 、結合活性化転写 (LAT) およびヌクレオチド配列に基づく増幅 (NASBA) を使用することができる。ポリヌクレオチドはトラメテス (Trametes) 属、パチキトスポラ (Pachykytospora) 属、レウコパキシルス (Leucopaxillus) 属の菌株または他のまたは関係する生物からクローニングすることができ、こうして、例えば、ヌクレオチド配列のポリペプチドエンコーディング領域の対立遺伝子または種の変異型であることができる。
【０１１４】
本発明は、また、下記の成熟ポリペプチドコード配列、配列番号1 (すなわち、ヌクレオチド55〜2166) 、または配列番号3 (すなわち、ヌクレオチド1〜1725) 、または配列番号4 (すなわち、ヌクレオチド55〜2182) 、または配列番号6 (すなわち、ヌクレオチド1〜1725) 、または配列番号25 (すなわち、ヌクレオチド52〜1719) 、または配列番号38 (すなわち、ヌクレオチド55〜1737) 、または配列番号41 (すなわち、ヌクレオチド55〜1749) 、または配列番号42 (すなわち、ヌクレオチド52〜1620) に対して少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性の程度を有し、活性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに関する。
【０１１５】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異は、そのポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成に必要であることがある。そのポリペプチドに 「実質的に類似する」 という用語は、ポリペプチドの天然に存在しない形態を意味する。これらのポリペプチドは、天然源から単離されたポリペプチドといくつかの操作された方法において異なり、例えば、比活性、熱安定性、pH最適値またはその他が異なる人工変異型である。変異型の配列は、それぞれ配列番号1、3、4、6、23、25、36、38、39、41または42のいずれかの成熟ポリペプチドエンコーディング領域、例えば、そのサブ配列として提示されるヌクレオチド配列に基づいて、および/またはヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの他のアミノ酸配列を生じないが、酵素の産生に意図される宿主生物のコドン使用頻度に対応するヌクレオチド置換の導入により、または異なるアミノ酸配列を生ずるヌクレオチド置換の導入により、構築することができる。ヌクレオチド配列の一般的説明については、例えば、下記の文献を参照のこと: Ford 他、1991、Protein Expression and Purification 2: 95-107。
【０１１６】
当業者にとって明らかなように、このような置換は分子の機能に対して重大である領域の外側で行い、なお活性ポリペプチドを生ずることができる。本発明の単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性に対して必須であり、したがって好ましくは置換にさらされないアミノ酸残基は、この分野において知られている方法、例えば、位置指定突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発に従い同定することができる (例えば、下記の文献を参照のこと: CunninghamおよびWella、1989、Science 244: 1081-1085) 。
【０１１７】
後者の技術において、突然変異を分子中のすべての残基に導入し、そして生ずる突然変異分子をグルコアミラーゼ活性について試験して、その分子の活性に対して重大であるアミノ酸残基を同定する。また、核磁気共鳴分析、結晶構造解析またはフォトアフィニティー標識化のような技術により決定される、三次元構造の分析により、基質-酵素の相互作用部位を決定することができる (例えば、下記の文献を参照のこと: de Vos 他、1992、Science 255: 306-312; Smith 他、1992、Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wiodaver 他、1992、FEBS Letters 309: 59-64) 。
【０１１８】
本発明は、また、下記の本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する: (i) 低いストリンジェンシイの条件下に、より好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、さらにより好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、それぞれ配列番号1のヌクレオチド55〜2166または配列番号36のヌクレオチド55〜2166とハイブリダイズする、または (ii) 中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、さらにより好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、それぞれ配列番号3のヌクレオチド55〜1726または配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズする、または (iii) 上記 (i) または (ii) の相補鎖; 本明細書において定義した、それらの対立遺伝子変異型またはサブ配列 (Sambrook 他、1989、前掲) 。
【０１１９】
本発明は、また、下記の本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する: (i) 低いストリンジェンシイの条件下に、より好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、さらにより好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、それぞれ配列番号4のヌクレオチド55〜2189または配列番号39のヌクレオチド55〜2182とハイブリダイズする、または (ii) 中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、さらにより好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、配列番号6のヌクレオチド55〜1725または配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズする、または (iii) 上記 (i) または (ii) の相補鎖; 本明細書において定義した、それらの対立遺伝子変異型またはサブ配列 (Sambrook 他、1989、前掲) 。
【０１２０】
本発明は、また、下記の本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する: (i) 低いストリンジェンシイの条件下に、より好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、さらにより好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、配列番号23のヌクレオチド117〜2249とハイブリダイズする、または (ii) 低いストリンジェンシイの条件下に、より好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシイ条件下に、さらにより好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、それぞれ配列番号25のヌクレオチド52〜1719または配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列とハイブリダイズする、または (iii) 上記 (i) または (ii) の相補鎖; 本明細書において定義した、それらの対立遺伝子変異型またはサブ配列 (Sambrook 他、1989、前掲) 。
【０１２１】
本発明は、また、下記の方法により得られた単離されるポリヌクレオチドに関する: (a) 低い、中程度、中程度-高いまたは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、(i) それぞれ配列番号1のヌクレオチド55〜2166または配列番号36のヌクレオチド55〜2166、または (ii) 中程度、中程度-高いまたは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、それぞれ配列番号3のヌクレオチド55〜1726または配列番号38のヌクレオチド55〜1737中に含有されるcDNA配列とDNAの集団をハイブリダイズさせ、または (iii) 上記 (i) または (ii) の相補鎖とDNAの集団をハイブリダイズさせ; そして (b) グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを単離する。
【０１２２】
本発明は、また、下記の方法により得られた単離されたポリヌクレオチドに関する: (a) 低い、中程度、中程度-高いまたは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、(i) それぞれ配列番号4のヌクレオチド55〜2189または配列番号39のヌクレオチド55〜2182、または (ii) 中程度、中程度-高いまたは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、それぞれ配列番号6のヌクレオチド55〜1725または配列番号41のヌクレオチド55〜1749中に含有されるcDNA配列とDNAの集団をハイブリダイズさせ、または (iii) 上記 (i) または (ii) の相補鎖とDNAの集団をハイブリダイズさせ; そして (b) グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを単離する。
【０１２３】
本発明は、また、下記の方法により得られた単離されたポリヌクレオチドに関する: (a) 低い、中程度、中程度-高いまたは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、(i) それぞれ配列番号23のヌクレオチド117〜2249、または (ii) 中程度、中程度-高いまたは非常に高いストリンジェンシイ条件下に、それぞれそれぞれ配列番号25のヌクレオチド52〜1719または配列番号42のヌクレオチド52〜1620中に含有されるcDNA配列とDNAの集団をハイブリダイズさせ、または (iii) 上記 (i) または (ii) の相補鎖とDNAの集団をハイブリダイズさせ; そして (b) グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを単離する。
【０１２４】
核酸構築物
本発明は、また、制御配列と適合性の条件下に適当な発現宿主中でコード配列の発現を指令する1種または2種以上の制御配列に作用可能に連結された、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物に関する。
【０１２５】
本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するように種々の方法で操作することができる。ベクター中にポリヌクレオチド配列を挿入する前に、ポリヌクレオチド配列を操作することは発現ベクターに依存して望ましいか、あるいは必要であることがある。ヌクレオチド配列を操作する技術はこの分野においてよく知られている。
【０１２６】
制御配列は、適当なプロモーター配列、すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列であることができる。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性であることを示す任意のヌクレオチド配列であることができ、突然変異体、トランケーテッドおよびハイブリッドプロモーターを包含し、そして宿主細胞に対して相同的または異種的である細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０１２７】
糸状真菌宿主細胞細胞中で本発明の核酸構築物の転写を指令するために適当なプロモーターの例は、下記の遺伝子から得られるプロモーター、よびそれらの突然変異体、トランケーテッドおよびハイブリッドプロモーターである: アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性α-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 酸安定性α-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはアスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) グルコアミラーゼ (glaA) 、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) リパーゼ、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アセトアミダーゼ、フザリウム・ベネナツム (Fusarium venenatum) グルコアミラーゼ (WO 00/56900) 、フザリウム・ベネナツム (Fusarium venenatum) ダリア (Daria) (WO 00/56900) 、フザリウム・ベネナツム (Fusarium venenatum) クイン (Quinn) (WO 00/56900) 、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) トリプシン様プロテアーゼ (WO 96/00787) 、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) β-グルカナーゼ、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) セルロビオヒドラーゼI、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) エンドグルカナーゼI、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) エンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) エンドグルカナーゼV、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) キシラナーゼI、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) キシラナーゼII、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) β-キシロシダーゼ、ならびにNA2-tpiプロモーター (アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性α-アミラーゼおよびアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド) 。
【０１２８】
酵母宿主において、有効なプロモーターは下記の遺伝子から得られるプロモーターである: サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) エノラーゼ (ENO-1) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) ガラクトキナーゼ (GAL1) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) アルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ (ADH1/ADH2/GAP) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) トリオースリン酸イソメラーゼ (TPI) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) メタロチオネイン (CUP1) およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ。酵母宿主細胞に有効な他のプロモーターは下記の文献に記載されている: Romanos 他、1992、Yeast 8: 423-488。
【０１２９】
また、制御配列は、適当な転写停止配列、すなわち、転写を停止するために宿主細胞により認識される配列である。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の3’末端に作用可能に連結されている。選択した宿主細胞中で機能的である任意のターミネーターを本発明において使用することができる。
【０１３０】
糸状真菌宿主細胞のために好ましいターミネーターは、下記の遺伝子から得られる: アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) α-グルコシダーゼおよびフザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) トリプシン様プロテアーゼ。
【０１３１】
酵母宿主細胞のために好ましいターミネーターは下記の遺伝子から得られる: サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) エノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) シトクロムC (CYC1) およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ。酵母宿主細胞に有効な他のターミネーターは下記の文献に記載されている: Romanos 他、1992、Yeast 8: 423-488。
【０１３２】
制御配列は、また、適当なリーダー配列、すなわち、宿主細胞による翻訳に重要であるmRNAの非翻訳領域であることができる。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5'末端に作用可能に連結されている。選択した宿主細胞において機能的である任意のリーダー配列を本発明の方法において使用できる。
糸状真菌宿主細胞に好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼおよびアスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【０１３３】
酵母宿主細胞に適当なリーダーは下記の遺伝子から得られる: サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) エノラーゼ (ENO-1) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) α-因子およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) アルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (ADH2/GAP) 。
【０１３４】
また、制御配列は、ポリアデニル化配列、すなわち、ヌクレオチド配列の3’末端に作用可能に連結されており、そして転写されたとき、ポリアデノシン残基を転写されたmRNAに付加するシグナルとして宿主細胞により認識される配列である。選択した宿主細胞中で機能的である任意のポリアデニル化配列を本発明において使用することができる。
【０１３５】
糸状真菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は下記の遺伝子から得られる: アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) トリプシン様プロテアーゼおよびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) α-グルコシダーゼ。
酵母宿主細胞に有効なポリアデニル化配列は下記の文献に記載されている: GuoおよびSherman、1995、Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990。
【０１３６】
また、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に結合したアミノ酸配列をコードしかつコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向ける、シグナルペプチドコード領域であることができる。ヌクレオチド配列のコード配列の5’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳リーデイングフレームで自然に結合した、シグナルペプチドコード領域を固有に含有することがある。選択的に、コード配列の5’末端は、制御配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含有することがある。コード配列がシグナルペプチドコード領域を自然に含有しない場合、外来性のシグナルペプチドコード領域は必要とされることがある。選択的に、外来性のシグナルペプチドコード領域を自然のシグナルペプチドコード領域と単に置換して、ポリペプチドの分泌を増強することができる。しかしながら、発現されたポリペプチドを選択した宿主細胞の分泌経路に向けるシグナルペプチドコード領域を、本発明において使用することができる。
【０１３７】
糸状真菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード領域は、下記の遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である: アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) アスパラギン酸プロテアーゼ、フミコラ・インソレンス (Humicola insolens) セルラーゼおよびフミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa) リパーゼ。
【０１３８】
酵母宿主細胞に有効なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) α-因子およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有効なシグナルペプチドコード領域は下記の文献に記載されている: Romanos 他、1992、前掲。
【０１３９】
また、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であることができる。生ずるポリペプチドはプロ酵素またはプロポリペプチド (またはある場合においてチモーゲン) として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断により、成熟活性ポリペプチドに転化することができる。プロペプチドコード領域は下記の遺伝子から得ることができる: バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) アルカリ性プロテアーゼ (aprE) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) 中性プロテアーゼ (nprT) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) α-因子、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) アスパラギン酸プロテイナーゼおよびミセリオフトラ・サーモフィラ (Myceliophthora thermophila) ラッカーゼ (WO 95/33836) 。
【０１４０】
シグナルペプチドおよびプロペプチドの両方の領域がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチド領域はプロペプチド領域の次に位置する。
【０１４１】
また、宿主細胞の生長に関してポリペプチドの発現の調節を可能とする調節配列を付加することが望ましいことがある。調節系の例は、化学的または物理的刺激、例えば、調節化合物の存在に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにする系である。酵母において、ADH2系またはGAL1系を使用することができる。糸状真菌において、TAKAα-アミラーゼのプロモーター、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼのプロモーターおよびアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) グルコアミラーゼのプロモーターを調節配列として使用することができる。調節配列の他の例は、遺伝子の増幅を可能とするものである。真核生物系において、これらはメトトレキセートの存在下に増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。これらの場合において、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は調節配列と作用可能に連結されるであろう。
【０１４２】
発現ベクター
本発明は、また、本発明のポリヌクレオチド、プロモーターおよび転写および翻訳停止シグナルを含んでなる組換え発現ベクターに関する。前述の種々の核酸および制御配列を一緒に結合させて、1または2以上の好都合な制限部位を包含することができる組換え発現ベクターを製造し、このような部位におけるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入または置換を可能とすることができる。選択的に、本発明のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド構築物を適当な発現用ベクター中に挿入することによって、発現させることができる。発現ベクターをつくるとき、コード配列が発現のために適当な制御配列に作用可能に連結されるように、コード配列はベクター中に位置する。
【０１４３】
組換え発現ベクターは、組換えDNA手順に好都合に付すことができ、そしてヌクレオチド配列を発現させることができる任意のベクター (例えば、プラスミドまたはウイルス) であることができる。典型的には、ベクターの選択は、ベクターを導入すべき宿主細胞とのベクターの適合性に依存するであろう。ベクターは線形または閉じた円形のプラスミドであることができる。
【０１４４】
ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外の実在物として存在するベクターであることができ、その複製は染色体の複製に対して独立である。このようなベクターの例は、プラスミド、染色体外因子、ミニ染色体、または人工的染色体である。ベクターは自己複製を保証する手段を含有することができる。選択的に、ベクターは、宿主細胞中に導入したとき、ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれている1または2以上の染色体と一緒に複製するものであることができる。さらに、単一のベクターまたはプラスミドまたは一緒になって宿主細胞のゲノムの中に導入すべき全DNAを含有する2またはそれ以上のベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンを使用することができる。
【０１４５】
本発明のベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能とする、1または2以上の選択可能なマーカーを含有することが好ましい。選択可能なマーカーは、その産物が生物致死剤またはウイルスに対する耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性株に対するプロトトロフィーおよびその他を提供する遺伝子である。
【０１４６】
酵母宿主細胞に適当なマーカーの例は、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1およびURA3である。糸状真菌宿主細胞において使用する選択可能なマーカーは下記のものを包含するが、これらに限定されない：amdS (アセトアミダーゼ) 、argB (オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ) 、bar (ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ) 、hph (ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ) 、niaD (硝酸レダクターゼ) 、pyrG (オロチジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼ) 、sC (硫酸アデニルトランスフェラーゼ) およびtrpC (アントラニレートシンターゼ) ならびにそれらの同等物。アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) またはアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) のamdSおよびpyrG遺伝子およびストレプトマイセス・ヒグロスコピカス (Streptomyces hygroscopicus) のbar遺伝子は、アスペルギルス (Aspergillus) 細胞において使用するために好ましい。
【０１４７】
本発明のベクターは、宿主細胞ゲノム中への安定な組込みまたはゲノムに対して独立に細胞中のベクターの自律的複製を可能とする、1または2以上の因子を含有することが好ましい。
【０１４８】
宿主細胞ゲノム中への組込みのために、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、または相同的または非相同的組換えによりベクターをゲノム中に安定に組込むベクターの任意の他の因子に頼ることができる。選択的に、ベクターは、相同的組換えにより組込みを宿主細胞ゲノムにおいて1または2以上の染色体中の1または2以上の正確な位置に向ける追加のヌクレオチド配列を含有することができる。正確な位置における組込みの確度を増加させるために、組込み因子は好ましくは十分な数の核酸、例えば、100〜10,000塩基対、より好ましくは400〜10,000塩基対、最も好ましくは800〜10,000塩基対を含有し、これらは対応するターゲット配列と高度に相同的であって相同的組換えの確率を増加させる。組込み因子は、宿主細胞ゲノム中のターゲット配列と相同的である任意の配列であることができる。さらに、組込み因子は非エンコーディングまたはコーディングヌクレオチド配列であることができる。他方において、ベクターは非相同的組換えにより宿主細胞ゲノム中に組込むことができる。
【０１４９】
自律的複製のために、ベクターは問題の宿主細胞中でベクターを自律的に複製させる複製起点をさらに含んでなることができる。複製起点は、細胞中で機能する自律的複製を仲介する任意のプラスミドレプリケーターであることができる。用語 「複製起点」 または 「プラスミドレプリケーター」 は、本明細書において、プラスミドまたはベクターのin vivo複製を可能とするヌクレオチド配列であると定義される。
酵母宿主細胞において使用する複製起点の例は、2ミクロンの複製起点、AR81、AR84、ARS1とCEN3との組合わせおよびARS4とCEN6との組合わせである。
【０１５０】
糸状真菌細胞において有効な複製起点の例は、AMA1およびANS1である (Gems 他、Gene 98: 61-67; Cullen 他、Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883) 。AMA1の遺伝子およびこの遺伝子を含んでなるプラスミドまたはベクターの構築は、WO 00/24883に記載されている方法に従い達成できる。
【０１５１】
本発明のポリヌクレオチドの2以上のコピーを宿主細胞中に挿入して、遺伝子産物の産生を増加させることができる。ポリヌクレオチドのコピー数は、宿主細胞ゲノム中に少なくとも1つ追加の配列のコピーを組込むか、あるいは細胞が選択可能なマーカー遺伝子の増幅したコピーを含有する場合、ポリヌクレオチドをもつ増幅可能、選択可能なマーカーを含めることによって増加させることができ、これにより細胞を適当な選択可能な因子の存在下に培養することによって、ポリヌクレオチドの追加のコピーを選択することができる。
前述の因子を結合して本発明の組換え発現ベクターを構築するために使用する手順はこの分野においてよく知られている (例えば、下記の文献を参照のこと: Sambrook 他、1989、前掲) 。
【０１５２】
宿主細胞
本発明は、また、ポリペプチドの組換え製造において好都合に使用される、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる、組換え宿主細胞に関する。本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを宿主細胞中に導入して、ベクターを染色体組込み体としてまたは前述した自己複製染色体外ベクターとして維持する。用語 「宿主細胞」 は、複製間に起こる突然変異のために、親細胞と同一ではない親細胞の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、大きい程度に、ポリペプチドをコードする遺伝子およびその源に依存する。
【０１５３】
宿主細胞は真核生物、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞であることができる。
【０１５４】
好ましい態様において、宿主細胞は真菌細胞である。「真菌」は、本明細書において使用するとき、下記を包含する: 子嚢菌門 (Ascomycota) 、担子菌門 (Basidiomycota) 、ツボカビ菌門 (Chytridiomycota) および接合菌門 (Zygomycota) (下記において定義されている: Hawksworth 他、Alnsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi、第8版、1995、CAB International、University Press、英国ケンブリッジ) ならびに卵菌門 (Oomycota) (下記の文献に記載されている: Hawksworth 他、前掲、p. 171) およびすべての栄養胞子真菌 (Hawksworth 他、1995、前掲) 。
【０１５５】
より好ましい態様において、真菌宿主細胞は酵母細胞である。「酵母」は、本明細書において使用するとき、下記を包含する: 子嚢胞子酵母 (腸内細菌科 (Enterobacteriaceae)) 、担子胞子酵母および不完全菌類 (Fungi Imperfecti) に属する酵母 (ブラストミセテス (Blastomycetes)) 。酵母の分類は、この出願の目的に対して、将来において変化することがあるが、酵母はBiology and Activities of Yeast に記載されているように定義されるであろう (Skinner F. A. およびDavenport R. R. 編者、Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9、1980) 。
【０１５６】
なおより好ましい態様において、酵母宿主細胞は、カンジダ (Candida) 、ハンゼヌラ (Hansenula) 、クルイベロマイセス (Kluyveromyces) 、ピキア (Pichia) 、サッカロマイセス (Saccharomyces) 、シゾサッカロマイセス (Scizosaccharomyces) 、またはヤロウィア (Yarrowia) 細胞である。
【０１５７】
最も好ましい態様において、酵母宿主細胞はサッカロマイセス・カリスベルゲンシス (Saccharomyces carisbergensis) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) 、サッカロマイセス・ジアスタチカス (Saccharomyces diastaticus) 、サッカロマイセス・ドウグラシイ (Saccharomyces douglasii) 、サッカロマイセス・クルイベリ (Saccharomyces kluyveri) 、サッカロマイセス・ノルベンシス (Saccharomyces norbensis) またはサッカロマイセス・オビフォルミス (Saccharomyces oviformis) 細胞である。他の最も好ましい態様において、酵母宿主細胞はクルイベロマイセス・ラクチス (Kluyveromyces lactis) 細胞である。他の最も好ましい態様において、酵母宿主細胞はヤロウィア・リポリチカ (Yarrowia lipolytica) 細胞である。
【０１５８】
他のより好ましい態様において、真菌宿主細胞は糸状真菌の細胞であることができる。「糸状真菌」は、亜門の真菌門 (Eumycota) および卵菌門 (Oomycota) のすべての糸状の形態を包含する (Hawksworth 他、1995、前掲において定義されている) 。糸状真菌は、キチン、セルロース、グルカン、マンナンおよび他の複合多糖から構成されている菌糸体壁により特徴づけられる。栄養成長は菌糸の伸長により、そして炭素異化作用は無条件的に好気性である。対照的に、酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) による栄養成長は単細胞葉状体の発芽により、そして炭素異化作用は発酵的である。
【０１５９】
なおより好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞の例は下記を包含するが、これらに限定されない種の細胞である: アクレモニウム (Acremonium) 、アスペルギルス (Aspergillus) 、アウレオバシジウム (Aureobasidium) 、ブジェルカンデラ (Bjerkandera) 、セリポリオプシス (Ceriporiopsis) 、コプリヌス (Coprinus) 、コリオルス (Coriolus) 、クリプトコッカス (Cryptococcus) 、フロバシジウム (Fllobasidium) 、フザリウム (Fusarium) 、フミコラ (Humicola) 、マグナポルテ (Magnaporthe) 、ケカビ (Mucor) 、ミセリオフトラ (Myceliophthora) 、ネオカイリマスチックス (Neocailimastix) 、ニューロスポラ (Neurospora) 、ペシロマイセス (Paecilomyces) 、ペニシリウム (Penicillium) 、ファネロカエテ (Phanerochaete) 、フレビア (Phlebia) 、ピロマイセス (Piromyces) 、プレウロツス (Pleurotus) 、シゾフィルム (Schizophyllum) 、タラロマイセス (Talaromyces) 、テルモアスカス (Thermoascus) 、チエラビア (Thielavia) 、トリポクラジウム (Tolypocladium) 、トラメテス (Trametes) またはトリコデルマ (Trichoderma) 細胞。
【０１６０】
最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は次の通りである: アスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) 、アスペルギルス・フミガツス (Aspergillus fumigatus) 、アスペルギルス・フェチヅス (Aspergillus foetidus) 、アスペルギルス・ジャポニカス (Aspergillus japonicus) 、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) 、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 細胞。
【０１６１】
他の最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は次の通りである: フザリウム・バクトリディオイデス (Fusarium bactridioides) 、フザリウム・セレアリス (Fusarium cerealis) 、フザリウム・クルックウェレンセ (Fusarium crookwellense) 、フザリウム・クルモルム (Fusarium culmorum) 、フザリウム・グラミネアラム (Fusarium graminearum) 、フザリウム・グラミナム (Fusarium graminum) 、フザリウム・ヘテロスポルム (Fusarium heterosporum) 、フザリウム・ネグンジ (Fusarium negundi) 、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) 、フザリウム・レチクラツム (Fusarium reticulatum) 、フザリウム・ロセウム (Fusarium roseum) 、フザリウム・サムブシヌム (Fusarium sambucinum) 、フザリウム・サルコクロウム (Fusarium sarcochroum) 、フザリウム・スポロトリキオイデス (Fusarium sporotrichioides) 、フザリウム・スルフレウム (Fusarium sulphureum) 、フザリウム・トルロクム (Fusarium torulocum) 、フザリウム・トリコテキオイデス (Fusarium trichothecioides) またはフザリウム・ベネナツム (Fusarium venenatum) 細胞。
【０１６２】
他の最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は次の通りである: ブジェルカンデラ・アヅスタ (Bjerkandera adusta) 、セリポリオプシス・アネイリナ (Ceriporiopsis aneirina) 、セリポリオプシス・カレギエア (Ceriporiopsis caregiea) 、セリポリオプシス・ギルヴェセンス (Ceriporiopsis gilvescens) 、セリポリオプシス・パンノシンタ (Ceriporiopsis pannocinta) 、セリポリオプシス・リブロサ (Ceriporiopsis rivulosa) 、セリポリオプシス・スブルファ (Ceriporiopsis subrufa) 、セリポリオプシス・スブベルミスポラ (Ceriporiopsis subvermispora) 、コプリヌス・シネレウス (Coprinus cinereus) 、コリオルス・ヒルスツス (Coriolusu hirsutus) 、コリオルス・ヒルスツス (Coriolusu hirsutus) フミコラ・インソレンス (Humicola insolens) 、フミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa) 、ムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) 、ミセリオフトラ・サーモフィラ (Myceliophthora themophila) 、ニューロスポラ・クラッサ (Neurospora crassa) 、ペニシリウム・パープロゲナム (Penicillium purpurogenum) 、ファネロカエテ・クリソスポリウム (Phanerochaete chrysosporium) 、フレビア・ラジアタ (Phlebia radiata) 、プレウロツス・エリンギル (Pleurotus eryngil) 、チエラビア・テレストリス (Thielavia terrestris) 、トラメテス・ビロサ (Trametes villosa) 、トラメテス・ベルシコロル (Trametes versicolor) 、トリコデルマ・ハルジアナム (Trichoderma harzianum) 、トリコデルマ・コニンギイ (Trichoderma koningii) 、トリコデルマ・ロンギブラキアツム (Trichoderma longibrachiatum) 、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) またはトリコデルマ・ビリデ (Trichoderma viride) 細胞。
【０１６３】
真菌細胞は、それ自体知られている方法におけるプロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換および細胞壁の再生を包含する方法により形質転換することができる。アスペルギルス (Aspergillus) およびトリコデルマ (Trichoderma) 宿主細胞の形質転換に適当な手順は下記の文献に記載されている: EP 238 023およびYelton 他、1984、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474。フザリウム (Fusarium) 種の形質転換に適当な方法は下記の文献に記載されている: Malardier 他、1989、Gene 78: 147-156およびWO 96/00787。
【０１６４】
酵母は下記の文献に記載されている手順を使用して形質転換することができる: BeckerおよびGuarente、編者Abelson J. N. およびSimon M. I. 、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology、Methods in Enzymology Vol. 194、pp. 182-187、Academic Press, Inc.、New York; Ito 他、1983、Journal of Bacteriology 153: 163; およびHinnen 他、1978、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920。
【０１６５】
製造方法
本発明は、また、下記の工程を含んでなる本発明のポリペプチドを製造する方法に関する: (a) ポリペプチドの製造を促進する条件下に、野生型の形態でポリペプチドを製造できる細胞を培養し、そして (b) ポリペプチドを回収する。好ましくは、細胞はトラメテス (Trametes) 、パチキトスポラ (Pachykytospora) またはレウコパキシルス (Leucopaxillus) 属、より好ましくはトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) 、パチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) またはレウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) である。
【０１６６】
本発明は、また、(a) ポリペプチドの製造を促進する条件下に宿主細胞を培養し、そして (b) ポリペプチドを回収することを含んでなる、ポリペプチドを製造する方法に関する。
【０１６７】
本発明は、また、下記の工程を含んでなる本発明のポリペプチドを製造する方法に関する: (a) ポリペプチドの製造を促進する条件下に宿主細胞を培養し、ここで宿主細胞はそれぞれ配列番号1、3、4、6、23、25、36、38、39、41または42の成熟ポリペプチドエンコーディング領域を有するヌクレオチド配列を含んでなり、ここでヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号2のアミノ酸1〜556または配列番号37のアミノ酸1〜561; またはそれぞれ配列番号5のアミノ酸1〜575または配列番号40のアミノ酸1〜565; または配列番号26のアミノ酸1〜556または配列番号24のアミノ酸1〜548または配列番号43のアミノ酸1〜523から成るポリペプチドをコードし、そして (b) ポリペプチドを回収する。
【０１６８】
本発明の製造方法において、この分野において知られている方法に従いポリペプチドの製造に適当な栄養培地中で細胞を培養する。例えば、震蘯フラスコ培養、小規模または大規模の発酵 (連続的、バッチ式、供給バッチ式または固体状態の発酵を包含する) により、ポリペプチドの発現および/または単離を可能とする適当な培地中でかつ条件下に実施される実験室または工業的発酵槽において、細胞を培養することができる。炭素源および窒素源および無機塩を含んでなる適当な栄養培地中で、この分野において知られている手順を使用して、培養を実施する。適当な培地は商業的供給会社から入手可能であるか、あるいは発表された組成に従い調製することができる (例えば、American Type Culture Collectionのカタログ) 。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、それを培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞ライゼイトから回収することができる。
【０１６９】
ポリペプチドに対して特異的である、この分野において知られている方法を使用して、ポリペプチドを検出することができる。これらの検出方法は特異的抗体の使用、酵素産物の生成または酵素基質の消失を包含することができる。例えば、酵素アッセイを使用して、本明細書に記載するポリペプチドの活性を決定することができる。
生ずるポリペプチドはこの分野において知られている方法により回収することができる。例えば、ポリペプチドは下記を包含するが、これらに限定されない手順により回収することができる: 遠心、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿。
【０１７０】
本発明のポリペプチドはこの分野において知られている種々の手順により精製することができ、このような手順は下記を包含するが、これらに限定されない: クロマトグラフィー (例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除) 、電気泳動手順 (例えば、調製用等電点電気泳動) 、溶解度の差 (例えば、硫酸アンモニウム沈降法) 、SDS-PAGEまたは抽出 (例えば、下記の文献を参照のこと: Protein Purification、J. -C. JansonおよびLars Ryden、編者、VCH Publishers、New York、1989) 。
【０１７１】
植物
本発明は、また、回収可能な量でポリペプチドを発現し、産生するように、本発明のグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換されたトランスジェニック植物、植物部分または植物細胞に関する。ポリペプチドは植物または植物部分から回収できる。選択的に、組換えポリペプチドを含有する植物または植物部分は、例えば、食物または飼料の品質を改良するために、例えば、栄養価、味の良さおよび流動学的性質を改良するために、または抗栄養因子を破壊するために使用できる。
【０１７２】
トランスジェニック植物は、双子葉植物源または単子葉植物であることができる。単子葉植物の例は、イネ科植物、例えば、ナカハグサ (イチゴツナギ、イネ科、イチゴツナギ科) 、飼料の草、例えば、フェスツカ (Festuca) 、ロリウム (Lolium) 、温帯イネ科植物、例えば、アグロスチス (Agrostis) および穀物、例えば、コムギ、カラスムギ、ライムギ、オオムギ、イネ、モロコシおよびトウモロコシ (コーン) である。
【０１７３】
双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、例えば、ハウチワマメ、ジャガイモ、テンサイ、エンドウマメ、ソラマメ・インゲン・ササゲの類およびダイズおよびアブラナ科植物 (アブラナ科 (Brassicaceae)) 、例えば、カリフラワー、ナタネおよび密接に関係するモデル生物アラビドプシス・タリアナ (Arabidopsis thaliana) である。
【０１７４】
植物部分の例は、幹、カルス、葉、根、果実、種子および塊茎ならびにこれらの部分を含んでなる個々の組織、例えば、表皮、葉肉、柔組織、脈管組織および分裂組織である。また、特定の植物細胞隔室、例えば、葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソームおよび細胞質は植物部分であると考えられる。さらに、任意の植物細胞は、組織由来が何であっても、植物部分であると考えられる。同様に、植物部分、例えば、本発明の利用を促進するように単離された特定の組織および細胞は、また、考えられる植物部分、例えば、胚、内乳、アリューロンおよび種子外皮である。
【０１７５】
また、このような植物、植物部分および植物細胞の子孫は本発明の範囲内に含まれる。
この分野において知られている方法に従い、本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物または植物細胞を構築することができる。簡単に述べると、本発明のポリペプチドをコードする1または2以上の発現構築物を植物宿主ゲノム中に組込み、そして生ずる修飾された植物または植物細胞をトランスジェニック植物または植物細胞に増殖させることによって、植物または植物細胞を構築する。
【０１７６】
好都合には、発現構築物は核酸構築物であり、これは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、このポリヌクレオチドは選択した植物または植物部分中のヌクレオチド配列の発現に必要な適当な調節配列に作用可能に連結されている。さらに、発現構築物はそれが組込まれている宿主細胞を同定するために有効な選択可能なマーカーと、問題の植物中に構築物を導入するために必要なDNA配列とを含んでなる (後者は使用すべきDNA導入法に依存する) 。
【０１７７】
調節配列、例えば、プロモーターおよびターミネーター配列および必要に応じてシグナルまたはトラシット配列の選択は、例えば、ポリペプチドを発現しようとする時間、場所および方法に依存して決定される。例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は構成的または誘導可能であるか、あるいは発育、段階または組織に対して特異的であり、そして遺伝子産物は特定の組織または植物部分、例えば、種子または葉にターゲッティングすることができる。調節配列は、例えば、下記の文献に記載されている: Tague 他、1988、Plant Physiology 86: 506。
【０１７８】
構成的発現のために、35S-CaMV、トウモロコシユビクイチン1およびイネアクチン1プロモーターを使用することができる (Franck 他、1980、Cell 21: 285-294; Christensen 他、1992、Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang 他、1991、Plant Cell 3: 1155-1165) 。
【０１７９】
器官特異的プロモーターは、例えば、次の通りである: 貯蔵シンク組織、例えば、種子、ジャガイモ塊茎および果実からのプロモーター (EdwardsおよびCoruzzi、1990、Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) または代謝シンク組織、例えば、分裂組織からのプロモーター (Ito 他、1994、1994、Plant Mol. Biol. 24: 863-878) 、種子特異的プロモーター、例えば、イネからのグルテリン、プロラミン、グロブリンまたはアルブミンのプロモーター (Wu 他、1998、Plant and Cell Physiology 39: 885-889) 、ソラマメ・ナンテンハギ (Vicia faba) からのレグミンB4および未知の種子タンパク質遺伝子からのソラマメ・ナンテンハギ (Vicia faba) プロモーター (Conrad 他、1998、Journal of Plant Physiology 152: 708-711) 、種子油ボディタンパク質からのプロモーター (Chen 他、1998、Plant and Cell Physiology 39: 935-941) 、ブラシカ・ナプス (Brassica napus) からの貯蔵タンパク質napAプロモーターまたはこの分野において知られている、例えば、WO 91/14772に記載されている、任意の他の種子特異的プロモーター。
【０１８０】
さらに、プロモーターは次のものであることができる: 葉特異的プロモーター、例えば、イネまたはトマトからのrbcsプロモーター (Kyozuka 他、1993、Plant Physiology 102: 991-1000) 、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター (MitraおよびHiggins、1994、Plant Molecular Biology 26: 85-93) またはイネからのaldP遺伝子プロモーター(Kagaya 他、1995、Molecular and General Genetics 248: 668-674)  または傷誘導性プロモーター、例えば、ジャガイモpin2プロモーター (Xu 他、1993、Plant Molecular Biology 22: 573-588) 。同様に、プロモーターは非生物的処理、例えば、温度、乾燥または塩分変更により誘導可能であるであるか、あるいはプロモーターを活性化する外因的に適用された物質、例えば、エタノール、エストロゲン、植物ホルモン、例えば、エチレン、アブシジン酸およびジベレリン酸、および重金属により誘導することができる。
【０１８１】
また、プロモーターエンハンサー因子を使用して、植物中の本発明のポリペプチドのより高い発現を達成することができる。例えば、プロモーターエンハンサー因子はプロモーターと、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に配置されたイントロンであることができる。例えば、Xu 他、1993、前掲には、発現を増強するためにイネアクチン1遺伝子の第1イントロンを使用することが開示されている。
【０１８２】
選択可能なマーカーおよび発現構築物の他の部分は、この分野において入手可能なものから選択することができる。
核酸構築物をこの分野において知られている慣用技術、例えば、下記の技術に従い植物ゲノム中に組込む: アグロバクテリウム (Agrobacterium) 仲介形質転換、ウイルス仲介形質転換、マイクロインジェクション、粒子衝撃およびエレクトロポレーション (Gasser 他、1990、Science 244: 1293; Potrykus、1990、Bio/Technology 8: 535; Shimamoto 他、1989、Nature 338: 274) 。
【０１８３】
現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens) 仲介遺伝子転移は、トランスジェニック双子葉植物を発生させるために選択される方法である (概観については下記の文献を参照のこと：HooykasおよびSchilpercort、1992、Plant Molecular Biology 19: 15-38) 。また、それは単子葉植物の形質転換に使用することもできるが、他の形質転換法はしばしばこれらの植物のために好ましい。現在、トランスジェニック単子葉植物を発生させるために選択される方法は、胚カルスまたは発育する胚の粒子衝撃 (形質転換性DNAで被覆した微視的金またはタングステン粒子) である (Christou、1992、Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto、1994、Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil 他、1992、Bio/Technology 10: 667-674) 。単子葉植物の別の形質転換法は、下記の文献に記載されているようにプロトプラスト形質転換に基づく: Omirulleh 他、1993、Plant Molecular Biology 21: 415-428。
【０１８４】
形質転換後、当業者によく知られている方法に従い、その中に発現構築物を組込んで有する形質転換細胞を選択し、全植物に再生させる。しばしば形質転換手順は、再生間にまたは発生後に、例えば、下記の手順により選択遺伝子を選択的に排除するために設計される: 2つの別のT-DNA構築物との共形質転換または特異的リコンビナーゼによる選択遺伝子の部位特異的切除。
【０１８５】
本発明は、また、下記工程を含んでなる本発明のポリペプチドを製造する方法に関する：(a) 本発明のグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドの産生を促す条件下に、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック植物または植物細胞を培養し、そして (b) ポリペプチドを回収する。
【０１８６】
組成物
本発明は、また、本発明のポリペプチドを含んでなる組成物に関する。好ましくは、組成物はこのようなポリペプチドに富んでいる。用語 「富んでいる」 は、組成物のグルコアミラーゼ活性が、例えば、1.1の増分係数で増加されていることを示す。
【０１８７】
組成物は、主要な酵素成分として本発明のポリペプチドを含んでなり、例えば、1成分組成物である。選択的に、組成物は、多数の酵素添加物、例えば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼを含んでなることができる。
【０１８８】
1種または2種以上の追加の酵素を下記に属する微生物により製造することができる: アスペルギルス (Aspergillus) 属、好ましくはアスペルギルス・アクレアツス (Aspergillus aculeatus) 、アスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) 、アスペルギルス・フミガツス (Aspergillus fumigatus) 、アスペルギルス・フェチヅス (Aspergillus foetidus) 、アスペルギルス・ジャポニカス (Aspergillus japonicus) 、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) 、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) ; フザリウム (Fusarium) 属、好ましくはフザリウム・バクトリジオイデス (Fusarium bactridioides) 、フザリウム・セレアリス (Fusarium cerealis) 、フザリウム・クロックウェレンセ (Fusarium crookwellense) 、フザリウム・クルモルム (Fusarium culmorum) 、フザリウム・グラミネアラム (Fusarium graminearum) 、フザリウム・グラミヌム (Fusarium graminum) 、フザリウム・ヘテロスポルム (Fusarium heterosporum) 、フザリウム・ネグンドル (Fusarium negundl) 、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) 、フザリウム・レチクラツム (Fusarium reticulatum) 、フザリウム・ロゼウム (Fusarium roseum) 、フザリウム・サムブシヌム (Fusarium sambucinum) 、フザリウム・サルコクロウム (Fusarium sarcochroum) 、フザリウム・スルフリウム (Fusarium sulphurium) 、フザリウム・トルロクム (Fusarium torulocum) 、フザリウム・トリコテキオイデス (Fusarium trichothecioides) またはフザリウム・ベネナツム (Fusarium venenatum) ; フミコラ (Humicola) 、好ましくはフミコラ・インソレンス (Humicola insolens) またはフミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa) ; またはトリコデルマ (Trichoderma) 、好ましくはトリコデルマ・ハルジアナム (Tricoderma harzianum) 、トリコデルマ・コニンギイ (Trichoderma koningii) 、トリコデルマ・ロンギバキアツム (Trichoderma longibachiatum) 、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) またはトリコデルマ・ビリデ (Trichoderma viride) 。
【０１８９】
ポリペプチド組成物はこの分野において知られている方法に従い製造することができ、そして液状または乾燥組成物の形態であることができる。例えば、ポリペプチド組成物は粒体または微小粒体の形態であることができる。組成物に添加すべきポリペプチドは、この分野において知られている方法に従い安定化することができる。
【０１９０】
グルコアミラーゼとα-アミラーゼとの組合わせ
本発明のこの面によれば、本発明のグルコアミラーゼは、0.3〜5.0のAFAU/AGU比で酸性α-アミラーゼと組合わせることができる。より好ましくは、酸性α-アミラーゼ活性/グルコアミラーゼ活性の比は、少なくとも0.35、少なくとも0.40、少なくとも0.50、少なくとも0.60、少なくとも0.7、少なくとも0.8、少なくとも0.9、少なくとも1.0、少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5、少なくとも1.6、少なくとも1.7、少なくとも1.8、少なくとも1.85またはさらに少なくとも1.9 AFAU/AGUである。しかしながら、酸性α-アミラーゼ活性/グルコアミラーゼ活性の比は、好ましくは4.5より小、4.0より小、3.5より小、3.0より小、2.5より小またはさらに2.25より小のAFAU/AGUであるべきである。
【０１９１】
AUU/AGIにおいて、酸性α-アミラーゼおよびグルコアミラーゼの活性は好ましくは0.4〜6.5のAUU/AGI比で存在する。より好ましくは、酸性α-アミラーゼ活性/グルコアミラーゼ活性の比は、少なくとも0.45、少なくとも0.50、少なくとも0.60、少なくとも0.7、少なくとも0.8、少なくとも0.9、少なくとも1.0、少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5、少なくとも1.6、少なくとも1.7、少なくとも1.8、少なくとも1.85またはさらに少なくとも1.9、少なくとも2.0、少なくとも2.1、少なくとも2.2、少なくとも2.3、少なくとも2.4またはさらに少なくとも2.5 AUU/AGIである。しかしながら、酸性α-アミラーゼおよびグルコアミラーゼの活性は、好ましくは6.0より小、5.5より小、5.0より小、4.5より小、4.0より小、3.5より小またはさらに3.0より小のAUU/AGI比で存在する。
【０１９２】
上記組成物は、シロップおよび発酵生成物、例えば、エタノールの製造について後述するデンプン転化プロセスにおいて使用するために適当である。
本発明のポリペプチド組成物の好ましい使用例を後述する。本発明のポリペプチド組成物の投与量および組成物を使用する他の条件は、この分野において知られている方法に基づいて決定できる。
【０１９３】
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼと他のグルコアミラーゼおよび酸性α-アミラーゼとの組合わせ
本発明のトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼは、他のグルコアミラーゼ、例えば、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) 、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) およびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) よりも4〜7倍高いα-1,6-脱分枝活性を有することが発見された (実施例12参照) 。
【０１９４】
したがって、本発明によれば、トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼは酸性α-アミラーゼおよびそれ以上の他のグルコアミラーゼと組合わせることができる。このような酵素の組合わせは、デンプン転化を含んでなる方法、例えば、エタノールの生産、例えば、1段階の発酵法において適当であろう。
【０１９５】
α-アミラーゼは任意のα-アミラーゼであることができる。好ましい態様において、α-アミラーゼは下記の節 「α-アミラーゼ」 に列挙するα-アミラーゼのいずれかである。好ましい態様において、α-アミラーゼは真菌α-アミラーゼ、特に節 「真菌α-アミラーゼ」 に開示するもの、特にアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) α-アミラーゼである。
【０１９６】
下記の節 「真菌ハイブリッドα-アミラーゼ」 に開示するハイブリッドα-アミラーゼ、例えば、下記のハイブリッドは好ましい: 米国特許公開No. 2005/0054071に開示されているハイブリッド (表3に列挙されているハイブリッドが特に考慮される) およびさらに同時係属米国特許出願第60/638,614号に開示されているハイブリッド、例えば、触媒ドメインJA118およびアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) SBD (本明細書において配列番号28およびUS 60/638,614において配列番号100) をもつフンガミル変異型; アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBD (本明細書において配列番号29およびUS 60/638,614において配列番号101) をもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼ; およびアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼリンカーおよびSBD (本明細書において配列番号30およびUS 60/638,614において配列番号102) をもつメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) α-アミラーゼ。
【０１９７】
グルコアミラーゼは、下記から成る群から選択される真菌または細菌由来のグルコアミラーゼを包含する任意のグルコアミラーゼであることができる: アスペルギルス (Aspergillus) グルコアミラーゼ、特にアスペルギルス・ニガー (A. niger) G1またはQ2グルコアミラーゼ (Boel 他 (1984) 、EMBO J. 3 (5) 、p. 1097-1102) またはその変異型、例えば、WO 92/000381、WO 00/04136およびWO 01/04273 (Novozymes、デンマーク) に開示されている変異型; アスペルギルス・アワモリ (A. awamori) グルコアミラーゼ (WO 84/02921) 、アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) (Agric. Biol. Chem. (1991) 、55 (4) 、p. 941-949) またはそれらの変異型またはフラグメント。
【０１９８】
他のアスペルギルス (Aspergillus) グルコアミラーゼ変異型は熱安定性を増強する変異型を包含する: G137AおよびG139A (Chen 他 (1996) 、Protein Eng. 9、499-505) ; D257EおよびD293E/Q (Chen 他 (1995) 、Prot. Engng. 8: 575-582) ; N182 (Chen 他 (1994) 、Biochem. J. 301: 275-281); ジサルファイド結合、A246C (Fierobe 他 (1996) 、Biochemistry 36: 8698-8704; および位置A435およびS436におけるPro残基の導入 (Li 他 (1997) 、Prot. Engng. 10: 1199-1204。
【０１９９】
他のグルコアミラーゼは下記を包含する: コルチシウム・ロルフシイ (Corticium rolfsii) グルコアミラーゼ (米国特許第4,727,046号) 、また、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) 、タラロマイセス (Talaromyces) グルコアミラーゼと呼ばれる、特に下記に由来するグルコアミラーゼ、タラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) (WO 99/28448) 、タラロマイセス・レイセタヌス (Talaromyces leycettanus) (米国特許No. Re. 32,153) 、タラロマイセス・ズポンチ (Talaromyces duponti) 、タラロマイセス・サーモフィルス (Talaromyces thermophilus) (米国特許第4,587,215号) 、リゾプス・ニビウス (Rhizopus nivius) (例えば、新日本ケミカルス (日本) から商品名 「CU CONC」 で入手可能である酵素) 、フミコラ・グリセアvar. テラモイデス (Humicola grisea var. thermoides) (例えば、ATCC 16453、NRRL 15222、NRRL 15223、NRRL 15224、NRRL 15225) 。
【０２００】
考えられる細菌グルコアミラーゼは下記を包含する: クロストリジウム (Clostridium) 属、特にクロストリジウム・テルモアミロリチカム (C. thermoamylolyticum) (EP 135,138) およびクロストリジウム・テルモヒドロスルフリカム(C. thermohydrosulfuricum) (WO 86/01831) 。
【０２０１】
他のグルコアミラーゼを含んでなる商業的に入手可能な組成物の例は下記を包含する: AMG 200L; AMG 300L; SANTM SUPER、SANTM EXTRA L、SPIRIZYMETM PLUS、SPIRIZYMETM FUEL、SPIRIZYMETM B4UおよびAMGTM E (Novozymes A/Sから) ; OPTIDEXTM 300 (Genencor Int. から) ; AMIGASETMおよびAMIGASETM PLUS (DSMから) ; G-ZYMETM G900、G-ZYMETMおよびG9900 ZR (Genencor Int. から) 。
【０２０２】
本発明の特別の態様において、本発明のトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼは下記の1つに由来するグルコアミラーゼと組合わされる: アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) およびアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBD (本明細書において配列番号29およびUS 60/638,614において配列番号101) をもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼ。
【０２０３】
使用
本発明は、また、本発明のグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドを使用するプロセス/方法に関する。
本発明による使用は、デンプンを、例えば、シロップおよび発酵生成物、例えば、エタノールおよび飲料に転化することを包含する。本発明のグルコアミラーゼを使用できるプロセスの例は下記の特許に開示されているプロセスを包含する: WO 2004/081193、WO 2004/080923、WO 2003/66816、WO 2003/66826およびWO 92/20777 (これらのすべては引用することによって本明細書の一部とされる) 。
【０２０４】
発酵生成物の製造
糊化デンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法
この面において、本発明は、デンプン含有物質から発酵生成物、特にエタノールを製造する方法に関する。この方法は液化工程および順次にまたは同時に実行する糖化および発酵工程を含む。
【０２０５】
本発明は、下記の工程を含んでなるデンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法に関する:
(a)    α-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を液化し、
(b)    工程 (a) において得られた液化物質を糖化し、そして
(c)    糖化された物質を発酵生物で発酵させる。
【０２０６】
発酵生成物、特にエタノールは、発酵後、例えば、蒸留により回収することができる。適当なデンプン含有出発物質は下記の節 「デンプン含有物質」 に列挙されている。考えられる酵素は下記の節 「酵素」 に列挙されている。発酵は好ましくは酵素、例えば、サッカロマイセス (Saccharomyces) の菌株の存在下に実施する。 適当な発酵生物は下記の節 「発酵生物」 に列挙されている。好ましい態様において、工程 (a) および (c) は同時に実施される (SSFプロセス) 。
【０２０７】
特定の態様において、本発明の方法は、工程 (a) の前に、下記の工程をさらに含んでなる:
x)       デンプン含有物質の粒度を、好ましくは微粉砕により、減少させ、そして
y)       デンプン含有物質および水を含んでなるスラリーを形成する。
【０２０８】
水性スラリーは10〜40重量%、好ましくは25〜35重量%のデンプン含有物質を含有することができる。このスラリーを糊化温度以上に加熱し、そしてα-アミラーゼ、好ましくは細菌および/または真菌α-アミラーゼを添加して液化 (減粘) を開始することができる。スラリーはある態様においてジェット煮沸してスラリーをさらに糊化した後、本発明の工程 (a) においてα-アミラーゼに暴露させることができる。
【０２０９】
より詳しくは、液化は3工程のホットスラリープロセスとして実施することができる。スラリーを60〜95℃、好ましくは80〜85℃に加熱し、そしてα-アミラーゼを添加して液化 (減粘) を開始する。次いでスラリーを95〜140℃、好ましくは105〜125℃の温度において1〜15分間、好ましくは3〜10分間、特に約5分間ジェット煮沸することができる。スラリーを60〜95℃に冷却し、そしてさらにα-アミラーゼを添加して加水分解 (第2 液化) を完結する。液化プロセスは通常pH 4.5〜6.5、特にpH 5〜6において実施する。微粉砕し、液化された全穀粒はマッシュとして知られている。
【０２１０】
工程 (b) における糖化はこの分野においてよく知られている条件下に実施することができる。例えば、全糖化プロセスは約24〜約72時間まで連続するが、30〜65℃、典型的には約60℃の温度において典型的には40〜90分間前糖化を実施し、次いで同時の糖化および発酵プロセス (SSFプロセス) において完全な糖化を実施することが普通である。典型的には、糖化は30〜65℃、典型的には約60℃の温度およびpH 4〜5、通常pH 4.5において実施される。
【０２１１】
エタノール製造において最も広く使用されているプロセスは同時の糖化および発酵 (SSF) プロセスであり、ここで糖化の保持工程は存在せず、発酵生物、例えば、酵母菌および1種または2種以上の酵素を一緒に添加することを意味する。SSFを実施するとき、発酵直前に、50℃以上における前糖化工程を導入することが普通である。
【０２１２】
本発明によれば、発酵工程 (c) は、制限なしに、下記のものを製造するために使用される発酵プロセスを包含する: アルコール (例えば、エタノール、メタノール、ブタノール) ; 有機酸 (例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸) ; ケトン (例えば、アセトン) ; アミノ酸 (例えば、グルタミン酸) ; 気体 (例えば、H2およびCO2) ; 抗生物質 (例えば、ペニシリンおよびテトラサイクリン) ; 酵素; ビタミン (例えば、リボフラビン、B12、β-カロテン) ; およびホルモン。好ましい発酵プロセスは、この分野においてよく知られているように、アルコール発酵プロセスを包含する。好ましい発酵プロセスは、この分野においてよく知られているように、嫌気性発酵プロセスである。
【０２１３】
非糊化デンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法
この面において、本発明は、デンプン含有物質を糊化しないで、デンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法に関する。1つの態様において、本発明のグルコアミラーゼを糖化および発酵の間に使用する。本発明によれば、デンプン含有物質を含有する水性スラリーを液化しないで、必要な発酵生成物、例えば、エタノールを製造することができる。1つの態様において、本発明の方法は、糊化温度以下の温度において本発明のグルコアミラーゼの存在下に微粉砕されたデンプン含有物質を糖化して糖を製造することを包含し、この糖は適当な発酵生物により必要な発酵生成物に発酵させることができる。
【０２１４】
下記の実施例7および8において、トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) およびパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) に由来する本発明のグルコアミラーゼを使用して、非糊化 (非煮沸) 微粉砕トウモロコシからエタノールを製造することを開示する。両方のグルコアミラーゼは、それぞれアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) およびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) に由来するグルコアミラーゼを使用して実施した対応するプロセスに比較して、有意により高いエタノール収量を示す。
【０２１５】
したがって、この面において、本発明は、下記の工程を含んでなるデンプン含有物質から発酵生成物を製造する方法に関する:
(a)    下記の配列を有するグルコアミラーゼを使用して、デンプン含有物質を前記ンプン含有物質の初期糊化温度より低い温度において糖化し、
i)     配列番号2中のアミノ酸1〜556または配列番号37中のアミノ酸1〜561として示す配列またはそれに対して少なくとも75%の同一性を有するグルコアミラーゼおよび/または
ii)    配列番号5中のアミノ酸1〜575または配列番号40中のアミノ酸1〜565として示す配列またはそれに対して少なくとも70%の同一性を有するグルコアミラーゼおよび/または
iii)   配列番号24中のアミノ酸1〜548または配列番号26中のアミノ酸1〜556または配列番号43中のアミノ酸1〜523として示す配列またはそれに対して少なくとも60%の同一性を有するグルコアミラーゼ、
そして
(b)    発酵生物を使用して発酵させる。
本発明のプロセスの工程 (a) および (b) は順次にまたは同時に実施することができる。
【０２１６】
用語 「初期糊化温度」 は、デンプンの糊化が開始する最低温度を意味する。水中で加熱したデンプンは50℃〜75℃で糊化し始める; 糊化の正確な温度は特定のデンプンに依存し、訓練した職人により容易に決定される。こうして、初期糊化温度は植物種および植物種の特定の変種に従いかつ生長とともに変化することがある。本発明の関係において、所定のデンプン含有物質の初期糊化温度は、下記の文献に記載されている方法によりデンプン粒体の複屈折が5%失われる温度である: Gorinstein S. およびLii C.、Starch/St（商標）rke Vol. 44 (12) pp. 461-466。
【０２１７】
工程 (a) 前に、デンプン含有物質の20〜55重量%の乾燥固形分、好ましくは25〜40重量%の乾燥固形分、より好ましくは30〜35%の乾燥固形分を有するデンプン含有物質のスラリー、例えば、粒状デンプンを調製することができる。スラリーは水および/またはプロセス水、例えば、スチレージ (stillage) (バックセット) 、スクラバー水、蒸発器凝縮物または蒸留物、蒸留からのサイドストリッパー水または他の発酵生成物プラントプロセス水を含むことができる。本発明のプロセスは糊化温度以下において実施され、こうして有意な粘度増加は起こらず、高いレベルのスチレージを必要に応じて使用できる。ある態様において、水性スラリーは約1〜約70容量%のスチレージ、好ましくは15〜60容量%のスチレージ、特に約30〜50容量%のスチレージを含有する。
【０２１８】
デンプン含有物質は、デンプン含有物質の粒度を0.1〜0.5 mmの粒度に減少することによって調製することができる。本発明の方法に付した後、デンプン含有物質の乾燥固形分の少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、好ましくは少なくとも99%は可溶性デンプン加水分解物に転化される。
【０２１９】
本発明のプロセスは初期糊化温度以下の温度において実施される。好ましくは、工程 (a) を実施する温度は30〜75℃、好ましくは45〜60℃である。
好ましい態様において、工程 (a) および工程 (b) は同時の糖化および発酵プロセスとして実施される。このような好ましい態様において、このプロセスは典型的には28℃〜36℃、例えば29℃〜35℃、例えば30℃〜34℃、例えば約32℃の温度において実施される。本発明によれば、温度は発酵の間に上下に調節できる。
【０２２０】
ある態様において、同時の糖化および発酵は、糖レベル、例えばグルコースレベルが低いレベル、例えば、6重量%以下、好ましくは約3重量%以下、好ましくは約2重量%以下、より好ましくは約1重量%以下、さらにより好ましくは約0.5重量%以下、さらにより好ましくは約0.25重量%以下、例えば、約0.1重量％以下に保持される。このような糖の低いレベルは、単に調節した量の酵素および発酵生物を使用することによって達成できる。当業者は酵素および発酵生物の使用量を容易に決定できる。また、酵素および発酵生物の使用量は、発酵ブロス中のマルトースを低い濃度に維持するように選択できる。例えば、マルトースのレベルは約0.5重量％以下または約0.2重量％以下に保持する。
【０２２１】
本発明の方法は、pH 3〜7、好ましくはpH 3.5〜6、より好ましくはpH 4〜5において実施できる。
【０２２２】
デンプン含有物質
任意の適当なデンプン含有物質、例えば、粒状デンプンを本発明に従い使用できる。出発物質は一般に必要な発酵生成物に基づいて選択される。本発明の方法において使用するために適当なデンプン含有物質の例は下記のものを包含する: 塊茎、根、幹、果実、全穀粒、トウモロコシ、穂軸、コムギ、オオムギ、ライムギ、マイロ、サゴヤシ、カッサバ、タピオカ、モロコシ、イネ、エンドウまたはサツマイモまたはそれらの混合物、または穀物、糖含有原料、例えば、糖蜜、果実、サトウキビまたはテンサイ、およびセルロース含有物質、例えば、木材または植物残留物またはそれらの混合物。蝋質および非蝋質の両方の型のトウモロコシおよびオオムギが考えられる。
【０２２３】
用語 「粒状デンプン」 は、生の非煮沸デンプン、すなわち、穀物、塊茎または穀粒において見出される天然の形態のデンプンを意味する。デンプンは植物細胞内で水不溶性の小さい粒体として産生される。冷水中に入れると、デンプン粒子は少量の液体を吸収し、膨潤する。50℃〜75℃までの温度において、膨潤は可逆的である。しかしながら、温度が高くなると、「糊化」 と呼ぶ不可逆的膨潤が開始する。加工すべき粒状デンプンは高度に精製されたデンプンの品質、好ましくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%または少なくとも99.5%の純度であることができるか、あるいは非デンプン部分、例えば、胚芽残留物および繊維を包含する微粉砕された全穀粒を含んでなる物質を含有する、いっそう粗製のデンプンであることができる。
【０２２４】
原料、例えば、全穀粒を微粉砕して、構造を開き、それ以上の処理を可能とする。2つの微粉砕プロセスは本発明において好ましい: 湿式微粉砕および乾式微粉砕。乾式微粉砕において、全仁を微粉砕し、使用する。湿式微粉砕は胚芽および粉末 (デンプン粒子およびタンパク質) のすぐれた分離を与え、デンプン加水分解物がシロップの製造において使用される位置においてしばしば適用される。乾式微粉砕および湿式微粉砕の両方ははこの分野においてよく知られており、そして本発明の方法において等しく考えられる。
【０２２５】
デンプン含有物質は、好ましくは微粉砕により、大きさを減少させて、表面積をより多く暴露させる。ある態様において、粒度は0.05〜3.0 mm、好ましくは0.1〜0.5 mmであるか、あるいは微粉砕されたデンプン含有物質の少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも90%は0.05〜3.0 mmの篩、好ましくは0.1〜0.5 mmの篩を通過するような大きさである。
【０２２６】
発酵生成物
用語 「発酵生成物」 は、発酵生物を使用する発酵工程を含むプロセスにより製造された生成物を意味する。本発明に従い考えられる発酵生成物は下記を包含する: アルコール (例えば、エタノール、メタノール、ブタノール) ; 有機酸 (例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸塩) ; ケトン (例えば、アセトン) ; アミノ酸 (例えば、グルタミン酸) ; 気体 (例えば、H2およびCO2) ;抗生物質 (例えば、ペニシリンおよびテトラサイクリン) ;  酵素 ; ビタミン (例えば、リボフラビン、B12、ベータ-カロテン) ; およびホルモン。
【０２２７】
好ましい態様において、発酵生成物はエタノール、例えば、燃料エタノール; 飲料エタノール、すなわち、飲用中性スピリット; または工業用エタノールまたは消費可能なアルコール産業 (例えば、ビールおよびワイン) 、酪農産業 (例えば、発酵した酪農生成物) 、なめし革産業およびタバコ産業において使用する生成物。好ましいビールのタイプは、この分野においてよく知られているように、アレス、スタウト、ポーター、ラーガー、ビター、モルトリカー、ハッポウシュー、高アルコールビール、低アルコールビール、低カロリービールまたはライトビールを含んでなる。好ましい発酵生成物は、この分野においてよく知られているように、嫌気性発酵プロセスである。
【０２２８】
発酵生物
「発酵生物」 は、発酵プロセスにおいて使用するために適当であり、必要な発酵生成物を産生することができる、細菌および真菌の生物を包含する、任意の生物を意味する。特に適当な生物は、糖、例えば、グルコースまたはマルトースを必要な発酵生成物に直接的または間接的に発酵、すなわち、転化することができる。発酵生物の例は真菌生物、例えば、酵母菌を包含する。好ましい酵母菌は、サッカロマイセス (Saccharomyces) 種の菌株、特にサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) を包含する。商業的に入手可能な酵母菌は下記を包含する: 例えば、Red StarTM/lesaffre Etanol Red (入手先: Red Star/lesaffre、米国) 、FALI (入手先: Feischmann’s Yeast、Burns Phlip Food Inc. の部、米国) 、SUPERSTART (入手先: Alltech) 、GERT STRAND (入手先: Gert Strand AB、スウェーデン) およびFERMIOL (入手先: DSM Specialties) 。
【０２２９】
酵素
グルコアミラーゼ
グルコアミラーゼは好ましくは本発明のグルコアミラーゼである。しかしながら、前述したように、本発明のグルコアミラーゼは他のグルコアミラーゼと組合わせることもできる。
グルコアミラーゼは0.001〜10 AGU/g DS、好ましくは0.01〜5 AGU/g DS、例えば、約0.1、0.3、0.5、1または2 AGU/g DS、特に0.1〜0.5 AGU/g DSまたは0.02〜20 AGU/g DS、好ましくは0.1〜10 AGU/g DSの量で添加することができる。
【０２３０】
α-アミラーゼ
α-アミラーゼは、本発明によれば、任意の由来であることができる。真菌または細菌の由来のα-アミラーゼは好ましい。
好ましい態様において、α-アミラーゼは酸性α-アミラーゼ、例えば、真菌酸性α-アミラーゼまたは細菌酸性α-アミラーゼである。用語 「酸性α-アミラーゼ」 は、α-アミラーゼ (EC 3.2.1.1) であり、これはpH 3〜7、好ましくはpH 3.5〜6、より好ましくはpH 4〜5において最適活性を有する。
【０２３１】
細菌α-アミラーゼ
本発明によれば、細菌α-アミラーゼは好ましくはバシラス (Bacillus) 属に由来することができる。
好ましい態様において、細菌α-アミラーゼはバシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis) 、バシラス・アミロリクファシエンス (B. amyloliquefaciens) 、バシラス・サチリス (B. subtilis) またはバシラス・ステアロサーモフィラス (B. stearothermophilus) の菌株に由来するが、他のバシラス (Bacillus) 種に由来することができる。
【０２３２】
考えられるα-アミラーゼの特定の例は下記を包含する: WO 99/19467中の配列番号4に示すバシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) α-アミラーゼ (BLA) 、WO 99/19467中の配列番号5に示すバシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) α-アミラーゼ (BAN) およびWO 99/19467中の配列番号3に示すバシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) α-アミラーゼ (BSG) 。本発明の態様において、α-アミラーゼは、WO 99/19467中のそれぞれ配列番号1、2、3、4または5に示すいずれかの配列に対して少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性の程度を有する酵素である。
【０２３３】
バシラス (Bacillus) α-アミラーゼは、また、変異型および/またはハイブリッド、特にWO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059およびWO 02/10355 (すべての文献は引用することによって本明細書の一部とされる) のいずれかに記載されているものであることができる。
【０２３４】
特別に考えられるα-アミラーゼ変異型は米国特許第6,093,562号、米国特許第6,297,038号または米国特許第6,187,576号 (引用することによって本明細書の一部とされる) に開示されており、そしてバシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) (BSGα-アミラーゼ) 変異型を包含し、これらの変異型は下記の欠失を有する: 位置179〜182における1または2つのアミノ酸の欠失、好ましくはWO 1996/023873、例えば、第20ページ、第1〜10行 (引用することによって本明細書の一部とされる) に開示されている二重欠失、好ましくはデルタ (181-182) に対応する、これは下記と比較される: WO 99/19467に開示されている配列番号3に記載される野生型BSGα-アミラーゼのアミノ酸配列; またはナンバリングのためにWO 99/19467 (この文献は引用することによって本明細書の一部とされる) 中の配列番号3を使用するアミノ酸179および180の欠失。
【０２３５】
デルタ (181-182) に対応する二重欠失を有し、そしてWO 99/19467に開示されている配列番号3に記載される野生型BSGα-アミラーゼのアミノ酸配列に比較して、N193F置換 (また、I181* + G182* + N193Hを意味する) をさらに含んでなるバシラス (Bacillus) α-アミラーゼ、特にバシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) α-アミラーゼはさらにより好ましい。
【０２３６】
α-アミラーゼは、また、マルトジェニックα-アミラーゼであることができる。「マルトジェニックα-アミラーゼ」  (グルカン1,4-α-マルトヒドロラーゼ、EC 3.2.1.133) は、また、アミロースおよびアミロペクチンをα-立体配置のマルトースに加水分解することができる。バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) 菌株NCIB 11837からのマルトジェニックα-アミラーゼは商業的に入手可能である (Novozymes A/S、デンマークから) 。マルトジェニックα-アミラーゼは、米国特許第4,598,048号、米国特許第4,604,355号および米国特許第6,162,628号 (これらは引用することによって本明細書の一部とされる) に記載されている。
【０２３７】
細菌ハイブリッドα-アミラーゼ
特別に考えられるハイブリッドα-アミラーゼは、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) α-アミラーゼの445 C末端のアミノ酸残基 (WO 99/19467中の配列番号4として示す) およびバシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) に由来するα-アミラーゼの37 N-末端のアミノ酸残基 (WO 99/19467中の配列番号3として示す) を含んでなり、下記の置換の1または2以上、特にすべてを有する:
G48A + T49I + G107A + H156Y + A181T + N190F + I201F + A209V + Q254S (バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) のナンバリングを使用する) 
【０２３８】
また、下記の突然変異 (または他のバシラス (Bacillus) α-アミラーゼ主鎖中の対応する突然変異) の1または2以上: H154Y、A181T、N190F、A209VおよびQ264Sおよび/または位置176〜179の2つの残基の欠失、好ましくはE178およびG179 (WO 99/19467の配列番号5のナンバリングを使用する) を有する変異型は好ましい。
【０２３９】
細菌α-アミラーゼは、この分野においてよく知られているような量で添加できる。KNU単位 (節 「材料および方法」 において後述する) で測定するとき、α-アミラーゼ活性は0.5〜5,000 NU/g DS、好ましくは1〜500 NU/g DS、より好ましくは5〜1,000 NU/g DS、例えば、10〜100 NU/g DSの量で存在することが好ましい。
【０２４０】
真菌α-アミラーゼ
真菌α-アミラーゼは、アスペルギルス (Aspergillus) 属の菌株、例えば、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、アスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) α-アミラーゼに由来する酸性α-アミラーゼを包含する。
【０２４１】
好ましい酸性真菌α-アミラーゼは、好ましくはアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) の菌株に由来する、フンガミル様α-アミラーゼである。本発明の開示において、用語 「フンガミル様α-アミラーゼ」 は、WO 96/23874中の配列番号10に示すアミノ酸配列の成熟部分に対して70%より大きい、75%より大きい、80%より大きい、85%より大きい、90%より大きい、95%より大きい、96%より大きい、97%より大きい、98%より大きい、99%より大きいまたは特に100%の同一性を有するα-アミラーゼを示す。
【０２４２】
他の好ましい酸性α-アミラーゼはアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) に由来する。好ましい態様において、酸性真菌α-アミラーゼはSwiss-prot/TeEMBLデータベース中に一次受け入れ番号P56271で 「ANYA ASPNG」 として開示され、WO 99/01969 (実施例3) 中にいっそう詳細に記載されているアスペルギルス・ニガー (A. niger) に由来するものである。
【０２４３】
また、この酸性アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 酸性α-アミラーゼはWO 2004/080923 (Novozymes) (引用することによって本明細書の一部とされる) 中に配列番号1として示されている。WO 2004/080923中の配列番号1に対して少なくとも70%の同一性、例えば、少なくとも80%またはさらに少なくとも90%の同一性、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%の同一性または少なくとも99%の同一性を有する前記酸性真菌アミラーゼの変異型が考えられる。アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) に由来する適当な商業的に入手可能な酸性真菌α-アミラーゼはSP288 (入手先: Novozymes A/S、デンマーク) である。
【０２４４】
好ましい態様において、α-アミラーゼはアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) に由来し、そして下記の文献に開示されている: Kaneko 他、J. Ferment. Bioeng. 81: 292-298 (1996) “Molecular - cloning and determination of the nucleotide - sequence of a gene encoding an acid - stable alpha-amnylase from Aspergillus kawachii”; およびさらにEMBL: # AB008370として。
【０２４５】
真菌酸性α-アミラーゼは、また、炭水化物結合性モジュール (CBM) およびα-アミラーゼ触媒ドメインを含んでなる野生型酵素 (すなわち、非ハイブリッド) またはその変異型であることができる。ある態様において、野生型酸性α-アミラーゼはアスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) の菌株に由来する。
【０２４６】
真菌ハイブリッドα-アミラーゼ
好ましい態様において、真菌酸性α-アミラーゼはハイブリッドα-アミラーゼである。真菌ハイブリッドα-アミラーゼの好ましい例は、 WO 2005/003311または米国特許公開No. 2005/0054071 (Novozymes) または米国特許出願No. 60/638,614 (Novozymes) (引用することによって本明細書の一部とされる) に開示されているハイブリッドα-アミラーゼである。ハイブリッドα-アミラーゼは、触媒ドメイン (CD) および炭水化物結合性ドメイン/モジュール (CBM) および任意のリンカーを含んでなる。
【０２４７】
考えられるハイブリッドα-アミラーゼの特別の例は次の通りである: 触媒ドメインJA118およびアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) SBD (本明細書において配列番号28および米国特許出願第60/638,614号において配列番号100) をもつフンガミル変異型を包含する米国特許出願第60/638,614号に開示されているハイブリッド; アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBD (本明細書において配列番号29および米国特許出願第60/638,614号において配列番号101) をもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼ; およびアテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) グルコアミラーゼリンカーおよびSBD (本明細書において配列番号30および米国特許出願第60/638,614号において配列番号102) をもつメリピルス・ギアンテウス (Meripilus giganteus) α-アミラーゼ。
【０２４８】
考えられるハイブリッドα-アミラーゼの他の特別の例は次の通りである: 米国特許公開No. 2005/0054071に開示されているハイブリッド、例えば、第15ページの表3に開示されているハイブリッド、例えば、アスペルギルス・カワチイ (Aspergillus kawachii) リンカーおよびデンプン結合性ドメインをもつアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) α-アミラーゼ。
【０２４９】
商用α-アミラーゼ製品
α-アミラーゼを含んでなる好ましい商用組成物は下記を包含する: DSM (Gist-Brocades) からのMYCOLASE、BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM XおよびSANTM SUPER、SANTM EXTRA L (Novozymes A/S) およびCLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETM FRED、SPEZYMTM DELTA AA (Genecor Int.) 、および商品名SP288で販売されている酸性真菌α-アミラーゼ (入手先: Novozymes A/S、デンマーク) 。
酸性α-アミラーゼは、本発明によれば、0.1〜10 AFAU/g DS、好ましくは0.10〜5 AFAU/g DS、特に0.3〜2 AFAU/g DSの量で添加することができる。
【０２５０】
シロップの製造
本発明は、また、デンプン含有物質からシロップ、例えば、グルコースおよびその他を製造するためにグルコアミラーゼを使用するプロセスを提供する。適当な出発物質は上記節 「デンプン含有物質」 において例示されている。一般に、このプロセスはα-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を部分的に加水分解 (液化) し、次いで本発明のグルコアミラーゼの存在下にさらに糖化して、デンプンまたは関係するオリゴ糖および多糖の非還元性末端からグルコースの解放する工程を含んでなる。
【０２５１】
液化および糖化は、発酵生成物の製造について前述したように実施することができる。
本発明のグルコアミラーゼは、また、固定化された形態で使用することができる。これは特別のシロップ、例えば、マルトースシロップの製造およびさらにフルクトースシロップ、例えば、高フルクトースシロップ (HFS) の製造と関係するオリゴ糖のラフィネート流ために適当でありかつしばしば使用される。
【０２５２】
結局、本発明のこの面は、下記の工程を含んでなる、デンプン含有物質からシロップを製造する方法に関する:
(a)    α-アミラーゼの存在下にデンプン含有物質を液化し、そして
(b)    工程 (a) において得られた物質を本発明のグルコアミラーゼで糖化する。
シロップは工程 (b) において得られた糖化された物質から回収することができる。
適当な条件の詳細な説明は前述されている。
【０２５３】
醸造
本発明のグルコアミラーゼは、また、醸造プロセスにおいて使用することができる。本発明のグルコアミラーゼは、当業者が容易に決定できる量で添加できる。例えば、「低炭水化物」 または超希薄ビールの製造において、より高い比率のアルコールおよび少量の残留デキストリンが望ましい。これらのビールは、限界デキストリンを脱分枝できる酵素添加物を含んでなる外因的酵素組成物を使用して配合される。本発明のグルコアミラーゼ、好ましくはトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) を適用して、限界デキストリンの含有量を減少し、そしてα-1,4-結合を加水分解することができる。
【０２５４】
本明細書に記載しかつ特許請求の範囲に記載する発明は、本明細書に開示する特定の態様によりその範囲を限定されない。なぜなら、これらの態様は本発明のいくつかの面を例示することを意図するからである。任意の同等の態様は本発明の範囲内に入る。事実、本明細書に示しかつ記載するものに加えて、本発明の種々の変更は前述の説明から当業者にとって明らかとなるであろう。このような変更は、また、添付された特許請求の範囲の範囲内に入る。矛盾する場合、定義を含む本発明の開示は調節するであろう。
種々の参考文献は本明細書中に引用され、それらの開示は引用することによって本明細書の一部とされる。下記の実施例により本発明をさらに説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【０２５５】
材料および方法
グルコアミラーゼ:
*  配列番号2に開示するトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) に由来するグルコアミラーゼ (入手先: Novozymes A/S) 。
*  配列番号5に開示するパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) に由来するグルコアミラーゼ (入手先: Novozymes A/S) 。
*  配列番号24に開示するレウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) に由来するグルコアミラーゼ (入手先: Novozymes A/S) 。
*  Boel 他 (1984) 、EMBO J. 3 (5) p. 1097-1102に開示されているアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) に由来するグルコアミラーゼ (入手先: Novozymes A/S) 。
*  WO 99/28448に開示されているタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) に由来するグルコアミラーゼ (入手先: Novozymes A/S) 。
【０２５６】
DNA操作のための酵素 (例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼおよびその他) は商業的に入手可能であり (New England Biolabs, Inc.から) 、そして製造業者の使用説明書に従い使用した。
【０２５７】
α-アミラーゼ:
ハイブリッドα-アミラーゼA: 米国特許出願第60/638,614号および本明細書において配列番号29に開示されている、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) AMGリンカーおよびSBDをもつリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼ。
【０２５８】
酵母:
Red StarTM (入手先: Red Star/lesaffre、米国) 。
【０２５９】
微生物の菌株
-      大腸菌 (E. coli) DH12α (GIBCO BRL、Life Technologies、米国) 。
-      アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) IFO 4177 (入手先: Institute for Fermentation、大阪 (IFO) 、Culture Collection of Microorgansims、日本国〒532-8686 大阪府大阪市淀川区十三本町2丁目17-85。
-      アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) BECh-2はWO 2000/39322 (Novozymes) に記載されている。それはIFP 4177の突然変異体であるJaL228 (WO 98/12300に記載されている) の突然変異体である。
-      アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 菌株Mbin 119はWO 2004/090155 (実施例11参照) 。
他の材料
プルラン (入手先: Wako Pure Chemical、日本国) 。
【０２６０】
生物学的物質の寄託
下記の生物学的物質は、ブダペスト条約に関してDSMZ (Deutsge Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturenn GmbH、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweig DE) に2005年2月2日に寄託され、そして下記の受け入れ番号が与えられた。
【０２６１】
【表１】
2008525035.tif 000002
【０２６２】
菌株は、この出願の係属中に米国特許法施行規則第1.14条および米国特許法第122条下に権利を与えられた米国特許商標庁長官により決定される者に対して、培養物へのアクセスが可能であることが保証される条件下に寄託された。寄託物は寄託された菌株の実質的に純粋な培養物を表す。寄託物は、主題の出願の対応出願またはその継続出願が提出されている国における外国の法律により要求される。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政府の行為により許可された特許権の部分的取消しにおいて主題の発明を実施するためのライセンスを構成しないことを理解すべきである。
【０２６３】
媒質および試薬:
緩衝剤および基質として使用する化学物質は少なくとも試薬等級の商品である。
PDA2:  39 g/lのジャガイモデキシトロース寒天、20 g/lの寒天、50 ml/lのグリセロール。
Cove:  342.3 g/lのスクロース、20 ml/lのCOVE塩溶液、10 mMのアセトアミド、30 g/lのノーブル寒天。
Cove塩溶液:   g/lのKCl、26 g/lのMgSO4・7H2O、76 g/lのK2HPO4、50 ml/lのCove微量金属。
【０２６４】
Cove微量金属:  0.04 g/lのNaB4O7・10H2O、0.4 g/lのCuSO4・5H2O、1.2 g/lのFeSO4・7H2O、0.7 g/lのMnSO4・H2O、0.7 g/lのNa2MoO2・2H2O、0.7 g/lのZnSO4・7H2O。
YPG:  4 g/lの酵母エキス、1 g/lのKH2PO4、0.5 g/lのMgSO4・7H2O、5 g/lのグルコース、pH 8.0。
STC:  0.8 Mのソルビトール、2 mMのTris pH 8、25 mMのCaCl2。
STPC:  STC 緩衝液中の40%のPEG 4000。
【０２６５】
Coveトップアガロース:  342.3 g/lのスクロース、20 ml/lのCove塩溶液、10 mlのアセトアミド、10 g/lの低融点アガロース。
MS-9:  30 g/lの大豆粉末、20 g/lのグリセロール、pH 8.0。
MDU-pH 5:  45 g/lのマルトース・1H2O、7 g/lの酵母エキス、12 g/lのK2HPO4、1 g/lのMgSO4・7H2O、2 g/lのK2SO4、0.5 ml/lのAMG微量金属溶液および25 g/lの2-メルカプタトエタンスルホン酸、pH 5.0。
【０２６６】
方法
特記しない限り、DNA操作および形質転換は下記の文献に記載されている分子生物学の標準方法に従い実行した: Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY; Ausubel F. M. (編者) “Current Protocols in Molecular Biology”、John Wiley and Sons、1995; Harwood C. R. およびCutting S. M. (編者) “Molecular Biological Methods for Bacillus”、John Wiley and Sons、1990。
【０２６７】
グルコアミラーゼ活性
グルコアミラーゼ活性はAGI単位またはグルコアミラーゼ単位 (AGU) で測定できる。
グルコアミラーゼ活性 (GA) 
グルコアミラーゼ (アミログルコシダーゼに等しい) はデンプンをグルコースに転化する。グルコースの量は、本明細書において、活性測定のグルコースオキシダーゼ法により決定される。この方法は下記の文献に記載されている: 節76-11 Starch-Glucoamylase Method with Subsequent Measurement of Glucose with Glucose Oxidase in “Approved methds of the American Association of Cereal Chemists”、Vol. 1-2 AACC、American Association of Cereal Chemists (2000); ISBN: 1-891127-8。
1グルコアミラーゼ単位 (AGI) は、この方法の標準条件下に1μM/分のグルコースを生成する酵素の量である。
【０２６８】
標準条件/反応条件:
基質:                      デンプン、濃度ほぼ16 gの乾燥物質/l
緩衝剤:                    酢酸塩、ほぼ0.04 M、pH 4.3
pH:                        4.3
インキュベーション温度:    60℃
反応時間:                  15分
反応の停止                 ほぼ0.2 g/l (pH約9) 濃度へのNaOH
酵素濃度:                  0.15〜0.55 AA U/ml
【０２６９】
デンプンはリンター (Linter) であるべきであり、これは実験室において比色インジケーターとして使用する希薄沸騰デンプンである。リンターデンプンは、デンプンがヨウ素で青色に着色する能力を保持するように、天然のデンプンを塩酸で処理することによって得られる。
【０２７０】
グルコアミラーゼ活性 (AGU) 
ノボグルコアミラーゼ単位 (Novo Glucoamylase Unit) (AGU) は、下記の標準条件下に1μM/分のマルトースを加水分解する酵素の量である: 37℃、pH 4.3、基質: マルトース 23.2 mM、緩衝剤: 酢酸塩 0.1 M、反応時間: 5分。
自動分析装置を使用することができる。存在するα-D-グルコースがβ-D-グルコースに転化されるように、ムタロターゼをグルコースデヒドロゲナーゼ試薬に添加する。グルコースデヒドロゲナーゼは前述の反応においてβ-D-グルコースと特異的に反応してNADHを生成し、これは340 nmにおいて測光計を使用してもとのグルコース濃度の測度として測定される。
【０２７１】
AMGインキュベーション:
基質:                      マルトース 23.2 mM
緩衝剤:                    酢酸塩  0.1 M
pH:                        4.30±0.05
インキュベーション温度:    37℃±1
反応時間:                  5分
酵素使用範囲:              0.5〜4.0 AGU/ml
【０２７２】
色反応:
GlucDH:                    430 U/l
ムタロターゼ:              9 U/l
NAD:                       0.21 mM
緩衝液:                    リン酸塩 0.12 M;
0.15 M NaCl
pH:                        7.60±0.05
インキュベーション温度:    37℃±1
反応時間:                  5分
波長:                      340 nm
【０２７３】
この分析法をいっそう詳しく記載するフォルダー(EB-SM-0131.02/01) は、ノボザイムA/S (Novozymes A/S、デンマーク) に対する要求に応じて入手可能であり、引用することによって本明細書の一部とされる。
【０２７４】
α-アミラーゼ活性 (KNU) 
α-アミラーゼ活性は、基質としてジャガイモデンプンを使用して決定することができる。この方法は酵素による変性されたジャガイモデンプンの破壊に基づき、次いでこの反応においてデンプン/酵素溶液をヨウ素溶液と混合する。最初に、黒みがかった青色が発生するが、デンプンの破壊間に、青色は薄くなり、徐々に赤みがかった褐色になり、これを着色したガラス標準と比較する。
【０２７５】
1キロノボ (Novo) α-アミラーゼ単位 (KNU) は、標準条件 (すなわち、37℃ ± 0.05; 0.0003 MのCa+2; およびpH 5.6) 下に5260 mgのデンプン乾燥基質 (Merck Amylum solubile) をデキストリン化する酵素の量であると定義される。
この分析法をいっそう詳しく記載するフォルダー(EB-SM-0009.02/01) は、ノボザイムA/S (Novozymes A/S、デンマーク) に対する要求に応じて入手可能であり、引用することによって本明細書の一部とされる。
【０２７６】
α-アミラーゼ活性
本発明に従い使用するとき、任意の酸性α-アミラーゼの活性はAFAU (酸性真菌α-アミラーゼ単位) で測定できる。選択的に、酸性α-アミラーゼの活性はAAU (酸性α-アミラーゼ単位) で測定できる。
【０２７７】
酸性α-アミラーゼ単位 (AAU) 
酸性α-アミラーゼの活性はAAU (酸性α-アミラーゼ単位) で測定でき、これは絶対的方法である。1酸性アミラーゼ単位 (AAU) は標準条件下に1 g/時間のデンプン (100%の乾燥物質) を、色参照の1つに等しい既知強度のヨウ素溶液との反応後、620 nmにおける透過率を有する生成物に転化する酵素の量である。
【０２７８】
標準条件/反応条件:
基質:                       可溶性デンプン、濃度ほぼ20 g DS/l
緩衝剤:                     クエン酸塩、ほぼ0.13 M、pH 4.2
ヨウ素溶液:                 40.176gのヨウ化カリウム+0.088 gヨウ素/l
都市水:                     15〜20°dH (ドイツ硬度) 
pH:                         4.2
インキュベーション温度:     30℃
反応時間:                   11分
波長:                       620 nm
酵素濃度:                   0.13〜0.19 AA U/ml
酵素作用範囲:               0.13〜0.19 AA U/ml
【０２７９】
デンプンはリンターであるべきであり、これは実験室において比色インジケーターとして使用する希薄沸騰デンプンである。リンターデンプンは、デンプンがヨウ素で青色に着色する能力を保持するように、天然のデンプンを塩酸で処理することによって得られる。それ以上の詳細な説明はEP 014041 B2において見出すことができ、この開示は引用することによって本明細書の一部とされる。
【０２８０】
酸性α-アミラーゼ活性 (AFAU) 
酸性α-アミラーゼの活性は、酵素標準に関して決定されるAFAU (酸性真菌α-アミラーゼ単位) で測定することができる。1 AFAUは後述する標準条件下に1時間当たり5.260 mgのデンプン乾燥固体を分解する酵素の量として定義される。
酸性α-アミラーゼ、すなわち、エンド-α-アミラーゼ (1,4-α-D-グルカン-グルカノヒドロラーゼ、EC 3.2.1.1) は、デンプン分子の内側領域中のα-1,4-グリコシド結合を加水分解して、異なる鎖長をもつデキストリンおよびオリゴ糖を形成する。ヨウ素で生成される色強度はデンプン濃度に対して直接比例する。アミラーゼ活性は、特定した分析条件下におけるデンプン濃度の減少として、逆比色分析を使用して決定される。
【０２８１】
【表２】
2008525035.tif 000003
【０２８２】
標準条件/反応条件:
基質:                     デンプン、ほぼ0.17 g/l
緩衝剤:                   クエン酸塩、ほぼ0.03 M
ヨウ素 (I2):              0.03 g/l
CaCl2:                    1.85 mM
pH:                       2.50±0.05
インキュベーション温度:   40℃
反応時間:                 23秒
波長:                     590 nm
酵素濃度:                 0.025 AFAU/ml
酵素作用範囲:             0.01〜0.04 AFAU/ml
【０２８３】
この分析法をいっそう詳しく記載するフォルダーEB-SM-0259.02/01は、ノボザイムA/S (Novozymes A/S、デンマーク) に対する要求に応じて入手可能であり、引用することによって本明細書の一部とされる。
【実施例】
【０２８４】
実施例１．グルコアミラーゼ遺伝子の分子スクリーニング
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) をPDA2培地上で増殖させ、製造業者の使用説明書に従いキット (FastDNA SPIN for SOIL、Obiogen、米国) を使用して、0.2 gの菌糸体からゲノムDNAを単離した。
縮重プライマーArAF1およびArAF3を使用して、ゲノムDNAに対してPCR反応を実施した:
ArAF1: 5’-CRTRCTYDVCAACATYGG-3’ (配列番号7) 
ArAF3: 5’-GTCAGARCADGGYTGRRASGTG-3’ (配列番号8) 
ここでD=AまたはGまたはT; R=AまたはG; S=CまたはG; V=AまたはCまたはG; Y=CまたはT。
【０２８５】
増幅反応物 (13 μl) は1 μlのゲノムDNA溶液、1 μM のプライマーArAF1、1 μM のプライマーArAF3および11 μlのマスター混合物 (Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix) (ABgene、英国) から構成した。反応物を次のようにプログラミングしたDNA エンジン (DNA Engine Dyad PTC-0220) (MJ Research、米国) 中でインキュベートした: 1サイクル、94℃において2分間; 20サイクル、各94℃において30秒間、65℃において45秒間、ここで1℃/サイクルのアニリーング温度の下降、および72℃において1分30秒間; 次いで20サイクル、各94℃において30秒間、45℃において45秒間および72℃において1分30秒間; 1サイクル、72℃において7分間; および4℃における保持。ExoSAP-IT (USB、米国) を製造業者の使用説明書に従い使用して、PCR生成物を精製し、配列決定した。引き続いて、配列をアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ遺伝子と比較し、PCR生成物がグルコアミラーゼの一部分をコードすることが示された。
【０２８６】
実施例２．グルコアミラーゼ遺伝子の分子スクリーニング
パチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) をPDA2培地上で増殖させ、製造業者の使用説明書に従いキット (FastDNA SPIN Kit for SOIL、Qbiogen、米国) を使用して、0.2 gの菌糸体からゲノムDNAを単離した。
縮重プライマーAM2FおよびAM4R2を使用して、ゲノムDNAに対してPCR反応 (PCR 1) を実施した:
AM2F:  5’-TGGGGIMGNCCNCARMGNGAYGG-3’ (配列番号9) 
AM4R2: 5’-RTCYTCNGGRTANCKNCC-3’ (配列番号10) 
ここでI=イノシン; K=GまたはT; M=AまたはC; N=AまたはCまたはGまたはT; R=AまたはG; Y=CまたはT。
【０２８７】
増幅反応物 (25 μl) は1 μlのゲノムDNA溶液、2 μM のプライマーAM2F、2 μM のプライマーAM4R2および22 μlのマスター混合物 (Reddy PCR Master Mix) (ABgene、英国) から構成した。反応物を次のようにプログラミングしたDNA エンジン (DNA Engine Dyad PTC-0220) (MJ Research、米国) 中でインキュベートした: 1サイクル、94℃において2分間; 20サイクル、各94℃において1分間、55℃において1分間、ここで1℃/サイクルのアニリーング温度の下降、および72℃において1分間; 次いで20サイクル、各94℃において1分間、40℃において1分間および72℃において1分間; 1サイクル、72℃において7分間; および4℃における保持。
【０２８８】
引き続いて、縮重プライマーAM3FおよびAM4R2を使用して、第1 PCR反応 (PCR 1) のアリコートに対してPCR反応を実施した:
AM3F:  5’-TAYGAYYTNYGGGARGA-3’ (配列番号11) 
AM4R2: 5’-RTCYTCNGGRTANCKNCC-3’ (配列番号10) 
ここでK=GまたはT; N=AまたはCまたはGまたはT; R=AまたはG; Y=CまたはT。
【０２８９】
増幅反応物 (13 μl) は1 μlの第1 PCR反応 (PCR 1) 、1 μM のプライマーAM3F、1 μM のプライマーAM4R2および11 μlのマスター混合物 (Reddy PCR Master Mix) (ABgene、英国) から構成した。反応物を次のようにプログラミングしたDNA エンジン (DNA Engine Dyad PTC-0220) (MJ Research、米国) 中でインキュベートした: 1サイクル、94℃において2分間; 5サイクル、各94℃において45秒間、45℃において45秒間および72℃において1分間; 次いで30サイクル、各94℃において45秒間、40℃において45秒間および72℃において1分間; 1サイクル、72℃において7分間; および4℃における保持。0.5 kbの増幅されたPCRバンドが得られた。
【０２９０】
TBE緩衝液を使用して1.0%のアガロースゲル上に反応生成物を単離し、GFX PCR DNAおよびゲルバンド精製キット (Gel band Purification Kit) (Amersham Bioscience、英国) を使用して、ゲルから反応生成物を単離し、精製した。切除したバンドを配列決定し、引き続いてアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ遺伝子と比較し、PCR生成物がグルコアミラーゼの一部分をコードすることが示された。
【０２９１】
実施例３．トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) からのグルコアミラーゼ遺伝子のクローニング
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼの部分的配列から、ベクトレッテキット (Vectorette Kit) (SIGMA-Genosys) によりPCRに基づく遺伝子歩行を使用して、さらに遺伝子配列を得た。遺伝子歩行は基本的には製造業者のプロトコルに記載されているようにして実施した。トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) の0.15 μgのゲノムDNAを独立してEcoRI、BamHIおよびHindIIIで消化した。
【０２９２】
次のようにプログラミングされたDNA エンジン (DNA Engine Dyad PTC-0220) (MJ Research、米国) 中で製造会社により供給された対応するベクトレッテ (Vectorette) ユニットを使用して、消化したDNAを結合した: 1サイクル、16℃において60分間; 4サイクル、各37℃において20分間; 16℃において60分間; 37℃において10分間; 次いで1サイクル、16℃において60分間および4℃における保持。引き続いて、結合反応物を無菌水で5回希釈した。
【０２９３】
次のようにプログラミングされたDNA エンジン (DNA Engine Dyad PTC-0220) (MJ Research、米国) を使用して、テンプレートとしてトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) のリンカー結合ゲノムDNAを使用するPCR反応を実行した: 1サイクル、94℃において2分間; 40サイクル、各94℃において15秒間、72℃において1分間および72℃において1分間; 1サイクル、72℃において7分間; および4℃における保持、供給されたベクトレッテ (Vectorette) プライマーおよび下に示すプライマーTraF1を使用した:
TraF1: 5’-TAGTCGTACTGGAACCCCACC-3’ (配列番号12) 
【０２９４】
増幅反応物 (12.5 μl) は0.5 μlのリンカー結合ゲノムDNA、400 nMのベクトレッテ (Vectorette) プライマー、400 nMのTraF1プライマーおよび11 μlのマスター混合物 (Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix) (ABgene、英国) から構成した。
HindIII消化ゲノムDNAからのPCR反応により、0.5 kbの増幅されたPCRバンドが得られた。TBE緩衝液を使用して1.0%のアガロースゲル上に反応生成物を単離し、このゲルから切除した。100 μlの無菌水を切除したアガロースゲルフラグメントに添加し、それを95℃における5分間のインキュベーションにより融解してDNAを解放した。リンカー結合ゲノムDNAの代わりに0.5 μlの単離したDNAフラグメントを使用して、前述のPCR反応を反復することによって、DNAバンドを再増幅した。
【０２９５】
PCR反応後、ExoSAP-IT (USB、米国) を製造業者の使用説明書に従い使用してDNAを精製し、配列決定し、引き続いてアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ遺伝子と比較し、それがグルコアミラーゼのそれ以上の250 bpの部分をコードすることが示された。
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) からのグルコアミラーゼ遺伝子のミッシング部分をクローニングするために、クローニングキット (LA PCRTM in vitro Cloning Kit、TAKARA、日本国) を製造業者の使用説明書に従い使用して、PCRに基づく遺伝子歩行を実施した。
【０２９６】
5 μgのトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) のゲノムDNAを独立してBamHI、EcoRI、HindIII、PstI、SalIおよびXbaIで消化し、200 mlの氷冷エタノールを反応混合物 (50 μl) に添加し、次いで4℃、15,000×gにおいて30分間遠心することによって、消化されたDNAを回収した。回収されたDNAを製造会社により供給された対応する人工リンカーと結合した。反応混合物 (50 μl) に200 mlの氷冷エタノールを添加し、次いで4℃、15,000×gにおいて30分間遠心することによって、リンカー結合DNAを回収した。
【０２９７】
下記に示すように、ミッシング5’-グルコアミラーゼ遺伝子をクローニングするためにプライマーC1およびTC5’を使用し、そしてミッシング3’-グルコアミラーゼ遺伝子をクローニングするためにC1およびTC3’を使用して、LA PCRシステム (TAKARA、日本国) により、テンプレートとしてトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) のリンカー結合ゲノムDNAを使用するPCR反応を実行した。
C1:    5’-gtacatattgtcgttagaacgcgtaatacgactca-3’ (配列番号13) 
TC5’: 5’-cgtatatgtcagcgctaccatgt-3’ (配列番号14) 
TC3’: 5’-aaacgtgagcgaccattttctgt-3’ (配列番号15) 
【０２９８】
増幅反応物 (50 μl) は1 ng/μlのテンプレートDNA、250 mMの各dNTP、250 nMのプライマー、250 nMのプライマーおよび0.1 U/μlの1×緩衝液中のLA Taqポリメラーゼ (TAKARA、日本国) から構成した。反応物を次のようにプログラミングしたDNA エンジン (DNA Engine PTC-200) (MJ-Research、日本) 中でインキュベートした: 1サイクル、94℃において2分間; 30サイクル、各94℃において0.5分間、55℃において2分間および72℃において2分間; 1サイクル、72℃において10分間; および4℃における保持。
【０２９９】
それぞれ、SalI消化ゲノムDNAからプライマーC1およびTC5’を使用してそしてXbaI消化ゲノムDNAからプライマーC1およびTC3’を使用して、0.4 kbおよび1.0 kbの増幅されたバンドが得られた。TAE緩衝液を使用して1.0%のアガロースゲル上にこれらの反応生成物を単離し、このゲルから切除し、そしてゲル抽出キット (QIAquickTM Gel Extraction Kit) (QIAGEN, Inc.、カリフォルニア州バレンシア) を製造業者の使用説明書に従い使用して精製した。
【０３００】
増幅したDNAフラグメントを独立してpT7Blue (Invitrogen、オランダ) 中に結合した。次いで結合混合物を大腸菌 (E. coli) DH12α (GIBCO BRL、Life Technologies、米国) 中に形質転換して、それぞれ0.4 kbの増幅されたバンドおよび1.0 kbの増幅されたバンドのためにpHUda438およびpHUda439をつくった。生ずるプラスミドを配列決定し、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ遺伝子と比較し、クローンがグルコアミラーゼのミッシング部分をコードすることが示された。
【０３０１】
実施例４．pHUda440発現ベクターの構築
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) からのグルコアミラーゼ遺伝子を転写するために、発現ベクターpHUda440を構築した。テンプレートとしてトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) のゲノムDNAを使用するPCR反応をPCRシステム (ExpandTM PCR system) (Roche Diagnostics、日本国) により実行して、下記に示すように、プライマーTFFを使用してBamHI部位を導入し、そしてプライマーTFRを使用してXhoIを導入した。
TFF:  5’-tttggatccaccatgcgtttcacgctcctcacctcc-3’ (配列番号16) 
TFR:  5’-tttctcgagctaccgccaggtgtcattctg-3’ (配列番号17) 
【０３０２】
増幅反応物 (50 μl) は1 ng/μlのテンプレートDNA、250 mMの各dNTP、250 nMのプライマーTFF、250 nMのプライマーTFRおよび0.1 U/μlの1×緩衝液中のTaqポリメラーゼ (Roche Diagnostics、日本国) から構成した。反応物を次のようにプログラミングしたDNA エンジン (DNA Engine PTC-200) (MJ-Research、日本) 中でインキュベートした: 1サイクル、94℃において2分間; 30サイクル、各94℃において1分間、55℃において1分間および72℃において2分間; 1サイクル、72℃において10分間; および4℃における保持。
【０３０３】
TAE緩衝液を使用して1.0%のアガロースゲル上に反応生成物を単離し、ここで2.2 kbの生成物がゲルから切除され、そしてこの生成物を抽出キット (QIAquickTM Gel Extraction Kit) (QIAGEN, Inc.、カリフォルニア州バレンシア) を製造業者の使用説明書に従い使用して精製した。
【０３０４】
2.2 kbの増幅したDNAフラグメントをBamHIおよびXhoIで消化し、そしてBamHIおよびXhoIで消化したアスペルギルス (Aspergillus) 発現カセットpCaHj483中に結合した。結合混合物を大腸菌 (E. coli) DH12α (GIBCO BRL、Life Technologies、米国) 中に形質転換して、発現プラスミドpHUda440をつくった。キット (QiAprepTR Spin Miniprep kit) (QIAGEN, Inc.、カリフォルニア州バレンシア) を製造業者の使用説明書に従い使用して、増幅されたプラスミドを回収した。
【０３０５】
プラスミドpCaHj483は、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) トリオースリン酸イソメラーゼ非翻訳リーダー配列 (Na2/tplプロモーター) に融合したアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性アミロースIIプロモーターおよびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼターミネーター (AMGターミネーター) 、唯一の窒素源としてアセトアミド上で増殖できるアスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) からの選択マーカーamdSから構築された。
【０３０６】
実施例４．パチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) からのグルコアミラーゼ遺伝子のクローニング
パチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) からのグルコアミラーゼ遺伝子のミッシング部分をクローニングするために、クローニングキット (LA PCRTM in vitro Cloning Kit) (TAKARA、日本国) を製造業者の使用説明書に従い使用して、PCRに基づく遺伝子歩行を実施した。
【０３０７】
5 μgのパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) のゲノムDNAを独立してBamHI、EcoRI、HindIII、PstI、SalIおよびXbaIで消化し、200 mlの氷冷エタノールを反応混合物 (50 μl) に添加し、次いで4℃、15,000×gにおいて30分間遠心することによって、消化されたDNAを回収した。回収されたDNAを製造会社により供給された対応する人工リンカーと結合した。反応混合物 (50 μl) に200 mlの氷冷エタノールを添加し、次いで4℃、15,000×gにおいて30分間遠心することによって、リンカー結合DNAを回収した。
【０３０８】
下記に示すように、ミッシング5’-グルコアミラーゼ遺伝子をクローニングするためにプライマーC1およびPP5’を使用して、そしてミッシング3’-グルコアミラーゼ遺伝子をクローニングするためにC1およびPP3’を使用して、LA PCRシステム (TAKARA、日本国) により、テンプレートとしてパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) のリンカー結合ゲノムを使用するPCR反応を実行した。
C1:    5’-gtacatattgtcgttagaacgcgtaatacgactca-3’ (配列番号13) 
PP5’: 5’-cctccctgagtgagcgatgctgc-3’ (配列番号18) 
PP3’: 5’-caactccggcctctcctccagcg-3’ (配列番号19) 
【０３０９】
増幅反応物 (50 μl) は1 ng/μlのテンプレートDNA、250 mMの各dNTP、250 nMのプライマー、250 nMのプライマーおよび0.1 U/μlの1×緩衝液中のLA Taqポリメラーゼ (TAKARA、日本国) から構成した。反応物を次のようにプログラミングしたDNA エンジン (DNA Engine PTC-200) (MJ-Research、日本) 中でインキュベートした: 1サイクル、94℃において2分間; 30サイクル、各94℃において0.5分間、55℃において2分間および72℃において2分間; 1サイクル、72℃において10分間; および4℃における保持。
【０３１０】
それぞれ、XbaI消化ゲノムDNAからプライマーC1およびPP5’を使用しそしてEcoRI消化ゲノムDNAからプライマーC1およびPP3’を使用して、0.5 kbおよび0.9 kbの増幅されたバンドが得られた。TAE緩衝液を使用して1.0%のアガロースゲル上にこれらの反応生成物を単離し、このゲルから切除し、そしてゲル抽出キット (QIAquickTM Gel Extraction Kit) (QIAGEN, Inc.、カリフォルニア州バレンシア) を製造業者の使用説明書に従い使用して精製した。
【０３１１】
増幅したDNAフラグメントを独立してpT7Blue (Invitrogen、オランダ国) 中に結合した。次いで結合混合物を大腸菌 (E. coli) DH12α (GIBCO BRL、Life Technologies、米国) 中に形質転換して、それぞれ0.5 kbの増幅されたバンドおよび0.9 kbの増幅されたバンドのためにpHUda448およびpHUda449をつくった。生ずるプラスミドを配列決定し、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ遺伝子と比較し、クローンがグルコアミラーゼのミッシング部分をコードすることが示された。
【０３１２】
実施例５．pHUda450発現ベクターの構築
パチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) からのグルコアミラーゼ遺伝子を転写するために、発現ベクターpHUda450を構築した。テンプレートとしてパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) のゲノムDNAを使用するPCR反応を、PCRシステム (ExpandTM PCR system) (Roche Diagnostics、日本国) により実行して、下記に示すように、プライマーPPFを使用してBamHI部位を導入し、そしてプライマーPPRを使用してXhoI部位を導入した。
PPF:  5’-tttggatccaccatgcgcttcaccctcctctcctcc-3’ (配列番号20) 
PPR:  5’-tttctcgagtcaccgccaggtgtcgttctg-3’ (配列番号21) 
【０３１３】
増幅反応物 (50 μl) は1 ng/μlのテンプレートDNA、250 mMの各dNTP、250 nMのプライマーPPF、250 nMのプライマーPPRおよび0.1 U/μlの1×緩衝液中のTaqポリメラーゼ (Roche Diagnostics、日本国) から構成した。反応物を次のようにプログラミングしたDNA エンジン (DNA Engine PTC-200) (MJ-Research、日本) 中でインキュベートした: 1サイクル、94℃において2分間; 30サイクル、各94℃において1分間、55℃において1分間および72℃において2分間; 1サイクル、72℃において10分間; および4℃における保持。
【０３１４】
TAE緩衝液を使用して1.0%のアガロースゲル上に反応生成物を単離し、ここでこのゲルから2.2 kbの生成物が切除され、そして抽出キット (QIAquickTM Gel Extraction Kit、QIAGEN, Inc.、カリフォルニア州バレンシア) を製造業者の使用説明書に従い使用して前記生成物を精製した。
【０３１５】
2.2 kbの増幅したDNAフラグメントをBamHIおよびXhoIで消化し、そしてBamHIおよびXhoIで消化したアスペルギルス (Aspergillus) 発現カセットpCaHj483中に結合した。結合混合物を大腸菌 (E. coli) DH12α (GIBCO BRL、Life Technologies、米国) 中に形質転換して、発現プラスミドpHUda450をつくった。キット (QiAprepTR Spin Miniprep kit) (QIAGEN, Inc.、カリフォルニア州バレンシア) を製造業者の使用説明書に従い使用して、増幅されたプラスミドを回収した。
【０３１６】
実施例６．アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 中のトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) およびパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) に由来するグルコアミラーゼ遺伝子の発現
アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 菌株BECn-2を100 mlのYPG培地に接種し、32℃、80 rpmにおいて16時間インキュベートした。ペレットを収集し、0.6 MのKClで洗浄し、20 mlの商用β-グルカナーゼ生成物 (GULCANEXTM、Novozymes A/S、デンマーク、バグスバード) を含有する0.6 MのKCl中に600 μl/mlの最終濃度で再懸濁させた。この懸濁液を32℃、80 rpmにおいて、プロトプラストが形成されるまで、インキュベートし、次いでSTS緩衝液で2回洗浄した。
【０３１７】
プロトプラストをヘマトメーターでカウントし、STC:STPC:DMSOの8:2:0.1溶液中に再懸濁させ、2.5×107/mlのプロトプラストの最終濃度に調節した。ほぼ3 μgのpHUda440またはpHUda450を100 μlのプロトプラスト懸濁液に添加し、おだやかに混合し、氷上で20分間インキュベートした。1 mlのSPTCを添加し、このプロトプラスト懸濁液を37℃において30分間インキュベートした。10 mlの50℃ COVEトップアガロースを添加した後、反応物をCOVE寒天平板上に注ぎ、寒天平板を32℃においてインキュベートした。5日後、形質転換細胞をCOVE培地から選択した。
【０３１８】
4つのランダムに選択した形質転換細胞を100 mlのMS-9培地中に接種し、32℃において1日間インキュベートした。3 mlのMS-9培地を100 mlのMDU-pH 5培地中に接種し、30℃において3日間培養した。3,000×gにおいて10分間遠心することによって、上清を得た。
発生するグルコースとのグルコースデヒドロゲナーゼおよびムタロターゼの反応により、上清試料中のグルコアミラーゼ活性をNADH産生の増加として決定し、340 nmにおける吸収を測定した。6 μlの100 mMの酢酸ナトリウムpH 4.3緩衝液中に溶解した酵素試料を、31 μlの100 mMの酢酸ナトリウムpH 4.3緩衝液中の23.2 mMのマルトースと混合し、37℃において5分間インキュベートした。次いで、313 μlの色試薬 (0.12 Mのリン酸塩pH 7.6緩衝液中の430 U/lのグルコースデヒドロゲナーゼ、9 U/lのムタロターゼ、0.21 mMのNADおよび0.15 MのNaCl) を反応混合物に添加し、37℃において5分間インキュベートした。活性を340 nmにおいて分光光度計で測定した。対照として6 μlの蒸留水を酵素試料の代わりに使用した。
【０３１９】
下記表3および4は、1.0に正規化した、宿主株アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) BECh-2の活性に関して、選択した形質転換細胞のグルコアミラーゼ活性を示す。
【０３２０】
【表３】
2008525035.tif 000004
【０３２１】
【表４】
2008525035.tif 000005
【０３２２】
実施例７．1工程燃料エタノール発酵におけるトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼの評価
アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼおよびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼに対するトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) の相対的性能を小規模発酵を介して評価した。約380 gの微粉砕したトウモロコシ (パイロット規模のハンマーミル中で微粉砕して1.65 mmの篩に通した) を約620 gの水道水に添加した。この混合物に3 mlの1 g/lのペニシリンを補充した。このスラリーを40%のH2SO4でpH 5.0に調節した。乾燥固形分 (DS) レベルは三重反復実験において約32%であることが決定された。ほぼ5 gのこのスラリーを15 mlの管に添加した。
【０３２３】
各酵素を使用して、2つの投与量の投与量-応答を試験した。使用した投与量は0.3および0.6 nmol/g DSであった。各処理を6回反復した。
投与後、トウモロコシマッシュ上で22.5時間増殖させた酵母増殖細胞 (RED STARTM酵母) の0.04 ml/gのマッシュを管に接種した。管に上部に小さい針で穴あけして気体の放出を可能とした蓋をし、短時間攪拌した後、秤量し、32℃においてインキュベートした。70時間の発酵を実施し、管を秤量することによって、エタノール収量を決定した。管を短時間攪拌した後、秤量した。この実験の結果を表5に示す。
【０３２４】
表5から理解できるように、野生型アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) およびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼについての収量に比較して、トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼを使用したとき、1 gのDS当たりのエタノール収量は有意により高い。
【０３２５】
【表５】
2008525035.tif 000006
【０３２６】
実施例８．1工程燃料エタノール発酵におけるパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) グルコアミラーゼの評価
アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼおよびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼに対するパチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) の相対的性能を小規模発酵を介して評価した。約380 gの微粉砕したトウモロコシ (パイロット規模のハンマーミル中で微粉砕して1.65 mmの篩に通した) を約620 gの水道水に添加した。この混合物に3 mlの1 g/lのペニシリンを補充した。このスラリーを40%のH2SO4でpH 5.0に調節した。乾燥固形分 (DS) レベルは三重反復実験において約32%であることが決定された。ほぼ5 gのこのスラリーを15 mlの管に添加した。
【０３２７】
各酵素を使用して、2つの投与量の投与量-応答を試験した。使用した投与量は0.3および0.6 nmol/g DSであった。各処理を6回反復した。
投与後、トウモロコシマッシュ上で22.5時間増殖させた酵母増殖細胞 (RED STARTM酵母) の0.04 ml/gのマッシュを管に接種した。管に上部に小さい針で穴あけして気体の放出を可能とした蓋をし、短時間攪拌した後、秤量し、32℃においてインキュベートした。70時間の発酵を実施し、管を秤量することによって、エタノール収量を決定した。管を短時間攪拌した後、秤量した。この実験の結果を表6に示す。
【０３２８】
表6から理解できるように、野生型アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) およびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) グルコアミラーゼについての収量に比較して、パチキトスポラ・パピラセア (Pachykytospora papyracea) グルコアミラーゼを使用したとき、1 gのDS当たりのエタノール収量は有意により高い。
【０３２９】
【表６】
2008525035.tif 000007
【０３３０】
実施例９．1工程発酵についてのリゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) からのハイブリッドα-アミラーゼと組合わせたトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼ
小規模発酵を介して、すべての処理を評価した。410 gの粉砕トウモロコシを590 gの水に添加した。この混合物に3.0 mlの1 g/lのペニシリンおよび1 gの尿素を補充した。このスラリーを5 N NaOHでpH 4.5に調節した (調節前の初期のpHは約3.8であった) 。乾燥固形分 (DS) レベルは約35%であることが決定された。ほぼ5 gのこのスラリーを20 mlのバイアルに添加した。各バイアルに適当量の酵素を投与し、次いで200 μlの酵母増殖細胞/5 gの発酵物を添加した。
【０３３１】
実際の投与量は各バイアルにおいてトウモロコシスラリーの正確な重量に基づいた。バイアルを32℃においてインキュベートした。各処理について9回の反復発酵を実施した。24時間、48時間および70時間の時点の分析のために、3回の反復実験を選択した。24、48および70時間の時点に、バイアルを攪拌した。この時点の分析は、バイアルを秤量し、HPLCのための試料を調製することから成っていた。HPLC調製は、50 μlの40%のH2SO4の添加による反応の停止、遠心および0.45 μmのフィルターに通す濾過から成っていた。HPLC分析を待つ試料は4℃において貯蔵した。
【０３３２】
【表７】
2008525035.tif 000008
【０３３３】
結果
α-アミラーゼおよびグルコアミラーゼの相乗効果が下記表において表されている。トラメテス・シングラタ (T. cingulata) グルコアミラーゼを単独で1工程発酵において使用したとき、それはそれぞれ24、48および70時間の発酵後に54.1、81.2および99.0 g/lのエタノールを生産した。リゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) からのハイブリッドα-アミラーゼAを発酵において使用したとき、それはそれぞれ24、48および70時間の発酵後に90.5、124.6および138.1 g/lのエタノールを生産した。
【０３３４】
【表８】
2008525035.tif 000009
【０３３５】
トラメテス・シングラタ (T. cingulata)/リゾムコル・プシルス (Rhizomucor pusillus) α-アミラーゼからのハイブリッドα-アミラーゼAの最適な比は、約6.5 AGU/AFAU (上記表) である。70時間後にエタノール収量に関して本質的に同様な性能が0.76〜38.7 AGU/AFAU比の範囲において観測され、トラメテス・シングラタ (T. cingulata) グルコアミラーゼ/ハイブリッドα-アミラーゼAの混合物の広い作用比範囲について強固な性能が示された。
【０３３６】
実施例１０．レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) のDNA抽出およびPCR増幅
キット (AastDNA SPIN Kit for Soil) (Qbiogen、米国) を製造業者の使用説明書に従い使用して、レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) の新鮮な果実本体の胞子形成層の0.2〜2 gをゲノムDNA抽出に使用した。
縮重プライマーArAF1およびArAF3を使用して、ゲノムDNAに対してPCR反応を実施した:
ArAF1  5’-CRTRCTYDVCAACATYGG-3’ (配列番号7) 
ArAF3  5’-GTCAGARCADGGYTGRRASGTG-3’ (配列番号8) 
ここでD=AまたはGまたはT; R=AまたはG; S=CまたはG; V=AまたはCまたはG; Y=CまたはT。
【０３３７】
増幅反応物 (13 μl) は1 μlのゲノムDNA溶液、1 μM のプライマーArAF1 (25 pmol/μl) 、1 μM のプライマーArAF3  (25 pmol/μl) および11 μlのマスター混合物 (Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix) (ABgene、英国) から構成した。反応物を次のようにプログラミングしたDNA エンジン (DNA Engine Dyad PTC-0220) (MJ Research、米国) 中でインキュベートした: 1サイクル、94℃において2分間; 20サイクル、各94℃において30秒間、65℃において45秒間、ここで1℃/サイクルのアニリーング温度の下降、および72℃において1分30秒間; 次いで20サイクル、各94℃において30秒間、45℃において45秒間および72℃において1分30秒間; 1サイクル、72℃において7分間; および4℃における保持。ExoSAP-IT (USB、米国) を製造業者の使用説明書に従い使用して、PCR生成物を精製し、配列決定した。引き続いて、配列をアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ遺伝子と比較し、PCR生成物がグルコアミラーゼの一部分をコードすることが示された。
【０３３８】
レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) グルコアミラーゼの部分的配列から、ベクトレッテキット (Vectorette Kit) (SIGMA-Genosys) によりPCRに基づく遺伝子歩行を使用して、さらに遺伝子配列を得た。遺伝子歩行は基本的には製造業者のプロトコルに記載されているようにして実施した。レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) の0.15 μgのゲノムDNAを独立してEcoRI、BamHIおよびHindIIIで消化した。次のようにプログラミングされたDNA エンジン (DNA Engine Dyad PTC-0220) (MJ Research、米国) 中で製造会社により供給された対応するベクトレッテ (Vectorette) ユニットを使用して、消化したDNAを結合した: 1サイクル、16℃において60分間; 4サイクル、各37℃において20分間; 16℃において60分間; 37℃において10分間; 次いで1サイクル、16℃において60分間および4℃における保持。引き続いて、結合反応物を無菌水で5回希釈した。
【０３３９】
次のようにプログラミングされたDNA エンジン (DNA Engine Dyad PTC-0220) (MJ Research、米国) を使用して、テンプレートとしてレウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) のリンカー結合ゲノムを使用するPCR反応を実行した: 1サイクル、94℃において2分間; 40サイクル、各94℃において15秒間、72℃において1分間および72℃において1分間; 1サイクル、72℃において7分間; および4℃における保持、供給されたベクトレッテ (Vectorette) プライマーおよび下に示す特異的レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) AMGプライマーNc1R2およびNc1F0を使用した:
Nc1R2: 5’-GGTAGACTAGTTACCTCGTTGG-3’ (配列番号31) 
Nc1F0: 5’-GCTTCCCTAGCCACTGCCATTGG-3’ (配列番号32) 
【０３４０】
増幅反応物 (12.5 μl) は0.5 μlのリンカー結合ゲノムDNA、400 nMのベクトレッテ (Vectorette) プライマー、400 nMのレウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) 特異的プライマーおよび1 μlのマスター混合物 (Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix) (ABgene、英国) から構成した。
【０３４１】
PCR反応後、ExoSAP-IT (USB、米国) を製造業者の使用説明書に従い使用してDNAを精製し、配列決定し、引き続いてアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ遺伝子と比較した。
プライマーNc1R2で増幅したHindIII消化ゲノムDNAからのPCR反応により、1.7 kbの増幅されたPCRバンドが得られた。このプライマーを使用するPCR生成物の配列決定は、それがグルコアミラーゼ遺伝子の残りの600塩基対を5’方向にコードすることを示した。
【０３４２】
プライマーNc1F0で増幅したHindIII消化ゲノムDNAからのPCR反応により、1.8 kbの増幅されたPCRバンドが得られた。このプライマーを使用するPCR生成物の配列決定は、それがグルコアミラーゼ遺伝子のほぼ530塩基対をさらにコードしたが、この遺伝子の末端に到達しないことを示した。したがって、グルコアミラーゼ遺伝子の新しく得られた追加の配列に基づいて、追加の配列決定プライマーNc1R2を設計した。同一PCR生成物上のNc1F0の下流のプライマーとしてNc1R2を使用して、それがグルコアミラーゼ遺伝子の残りのほぼ520塩基対を3’方向にコードすることが示された。
Nc1R2: 5’-GTTGATTTAACTTGGAGCTATGC (配列番号33) 
【０３４３】
実施例１１．レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) グルコアミラーゼのクローニングおよび発現
レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) グルコアミラーゼの部分的配列から、遺伝子配列がさらに得られた。
下記のPCRクローニングプライマーを使用した:
前方向プライマー:
5’-TCCCTTGGATCCAGGATGCATTTCTCTGTCCTCTC-3’ (配列番号34)   BamHI
逆方向プライマー:
5’-CTTATCCTCGAGCTACTTCCACGAGTCATTCTGG-3’ (配列番号35)     XhoI
【０３４４】
ポリメラーゼとしてルージョン (Rhusion) およびそれぞれBamHIおよびXhoIを導入する上記プライマーを使用して、テンプレートとしてレウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) からのgDNAを用いてPCRを実施した。5 μlのPCR生成物を1%のアガロースゲルにおいて試験し、そして約2.2 kbにバンドが示された。PCR生成物をQIAquickカラムで精製した。
【０３４５】
精製した生成物およびアスペルギルス (Aspergillus) ベクターpENI2516レウコパキシルス・ギガンテウス (Leucopaxillus giganteus) (WO 2004/069872参照) をBamHIおよびXhoIで消化した。QIAquick法に従い1%の調製用アガロースゲルから、ベクターおよび挿入フラグメントを精製した。2.2 kbのフラグメントをベクターpENI2516中に結合し、TOP10大腸菌 (E. coli) コンピテント細胞中に形質転換した。生ずるプラスミドをpENI3372と命名した。
【０３４６】
アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中の形質転換
アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 菌株Mbin119 (WO 2004/090155参照) のプロトプラストを作った。約5 μgのpENI3372をプロトプラスト中に形質転換した。生ずるアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 形質転換細胞をグルコアミラーゼ活性について試験した。
【０３４７】
実施例１２．トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) グルコアミラーゼのプルランに向かう脱分枝活性
トラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) 、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) 、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) およびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) に由来するグルコアミラーゼのα-1,6-脱分枝活性を研究した。
【０３４８】
プルラン (分子量50,000〜100,000) をMilliQ水中に溶解し、50 mMのNaAc緩衝液、pH 4.0を含有する反応混合物に3%の最終濃度で37℃において0.42 μgの酵素/mgのプルランの投与量において添加した。オリゴ糖の分布をHPLCにより周期的に分析した。
試験の結果は図1に示される。
【０３４９】
記載しかつ特許請求した本発明は、本明細書に開示される特別の面により限定されるべきでない。なぜなら、これらの面は本発明のいくつかの面の例示を意図するからである。いかなる同等の面も本発明の範囲内であることを意図する。事実、本明細書において示し、記載したものに加えて種々の変更は前述の説明から当業者にとって明らかとなるであろう。このような変更は、また、添付された特許請求の範囲本発明の範囲内に入ることを意図する。矛盾する場合、定義を含む本発明の開示は調節するであろう。
種々の参考文献は本明細書中に引用され、それらの開示は引用することによって本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【０３５０】
【図１】図1は、アテリア・ロルフシイ (Athelia rolfsii) 、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) およびタラロマイセス・エメルソニイ (Talaromyces emersonii) からのグルコアミラーゼと比較したトラメテス・シングラタ (Trametes cingulata) のプルランに向かう脱分枝活性を示す。
【図１】
2008525035.tif 000010
【配列表】
2008525035000001.app
【国際調査報告】
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