(57)【要約】本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞型急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、およびＴ細胞型急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）に特異的な診断用マーカーを開示する。また、前記マーカーの存在を検出する製剤を含む組成物およびキット、並びにこれを用いてＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬを診断する方法を開示する。
2008525047.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、ＡＭＬ診断マーカー検出用キット。
【請求項２】
ＣＩＴＥＤ２とＭＧＳＴ１の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、Ｂ−ＡＬＬ診断マーカー検出用キット。
【請求項４】
ＴＣＬ１ＡとＣＤ１９の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質；
（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質；並びに
（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよび／またはＴ−ＡＬＬを区別するための診断マーカー検出用キット。
【請求項６】
ＣＩＴＥＤ２とＭＧＳＴ１、ＴＣＬ１ＡとＣＤ１９、およびＴＣＦ７とＴＲＢの遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
検出用キットはＤＮＡチップ、ＲＴ−ＰＣＲまたはＥＬＩＳＡ検出用キットである、請求項１、請求項３および請求項５のいずれか１項に記載の検出用キット。
【請求項８】
（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子に対して特異的なプライマー対を含む、ＡＭＬ診断マーカー検出用組成物。
【請求項９】
ＣＩＴＥＤ２とＭＧＳＴ１の遺伝子に対して特異的なプライマー対を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
（ｉ）ＣＩＴＥＤ２タンパク質、または（ii）ＣＩＴＥＤ２タンパク質とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上のタンパク質に特異的な抗体を含む、ＡＭＬ診断マーカー検出用組成物。
【請求項１１】
ＣＩＴＥＤ２とＭＧＳＴ１のタンパク質に特異的な抗体を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプライマー対を含む、Ｂ−ＡＬＬ診断マーカー検出用組成物。
【請求項１３】
ＴＣＬ１ＡとＣＤ１９の遺伝子に特異的なプライマー対を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
（ｉ）ＴＣＬ１Ａタンパク質、または（ii）ＴＣＬ１Ａタンパク質とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上のタンパク質に特異的な抗体を含む、Ｂ−ＡＬＬ診断マーカー検出用組成物。
【請求項１５】
ＴＣＬ１ＡとＣＤ１９のタンパク質に特異的な抗体を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子；
（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子；並びに
（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプライマー対を含む、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよび／またはＴ−ＡＬＬを区別するための診断マーカー検出用組成物。
【請求項１７】
ＣＩＴＥＤ２とＭＧＳＴ１、ＴＣＬ１ＡとＣＤ９、およびＴＣＦ７とＴＲＢの遺伝子に特異的なプライマー対を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２タンパク質、または（ii）ＣＩＴＥＤ２タンパク質とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上のタンパク質；
（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａタンパク質、または（ii）ＴＣＬ１Ａタンパク質とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上のタンパク質；並びに
（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７タンパク質、または（ii）ＴＣＦ７タンパク質とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上のタンパク質に特異的な抗体を含む、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよび／またはＴ−ＡＬＬを区別するための診断マーカー検出用組成物。
【請求項１９】
ＣＩＴＥＤ２とＭＧＳＴ１、ＴＣＬ１ＡとＣＤ１９、およびＴＣＦ７とＴＲＢのタンパク質に特異的な抗体を含む、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞型急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、およびＴ細胞型急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）に特異的な診断用マーカーに関する。さらに詳しくは、本発明は、前記マーカーの存在を検出する製剤を含む組成物およびキット、並びにＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬを診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病とは、白血球が腫瘍性に増殖する疾患を総称する。白血病の種類は、その起源によって骨髄性白血病とリンパ性白血病に分けられ、進行速度によっては急性白血病と慢性白血病に分けられる。白血病の臨床様相は、疾患の類型と浸潤細胞の性質によって様々である。リンパ性白血病はリンパ系血液細胞が、骨髄性白血病は骨髄系血液細胞が、慢性骨髄性白血病は成熟期にある細胞がそれぞれ変異して発生し、急性骨髄性白血病は比較的初期段階の造血過程で分化を始める骨髄系母細胞の障害により引き起こされる。
【０００３】
前記種類の急性白血病は、互いに異なるメカニズムによって発病され、種類によって治療剤や治療方法などが異なるので、正確なタイプの診断が非常に重要である。現在まで、急性白血病の分類は一次的に骨髄細胞を顕微鏡で観察して非正常的な癌細胞の形態と染色様相を観察する過程によって行われる。診断に役に立つタンパク質に対する単クローン抗体を用いる免疫学的方法も併用されているが、病理学的或いは組織学的に急性白血病の種類を区分することが可能な基準が未だに明確でない実情である。
【０００４】
最近、１回で数千〜数万個の遺伝子発現を検索することが可能なマイクロアレイ技術が開発された。Ｇｏｌｕｂなどは５０個の遺伝子発現を用いてＡＭＬとＡＬＬを区分することができることを報告した(Golub et al., Science 1998, 286:531-537)。この報告は、遺伝子発現を用いてＡＭＬまたはＡＬＬを診断することができるという可能性を示したが、実際適用可能性を確認してみなかったので、実際診断に適用されるには限界がある。
【０００５】
したがって、より迅速且つ一正確にＡＭＬとＡＬＬを区分するために、現在まで、有意性の高いマーカーの開発が依然として要求されている。
【０００６】
本発明では、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−Ａｌｌを簡単且つ正確に区分する生物学的マーカーを解決するために、ＤＮＡチップを用いて各タイプ別白血病でのみ過多発現を示す遺伝子を１次スクリーニングし、ＲＴ−ＰＣＲを行い、有意性の高いマーカーを確認した。その結果、本発明者らは、ＡＭＬマーカーとして使用可能な遺伝子であるＣＩＴＥＤ２、ＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５；Ｂ−ＡＬＬマーカーとして使用可能な遺伝子であるＴＣＬ１Ａ、ＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１；並びにＴ−ＡＬＬとして使用可能な遺伝子であるＴＣＦ７、ＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌを発掘し、これを実際白血病試料に適用したとき、各タイプ別白血病を迅速、簡便、正確に診断することを確認し、本発明を完成した。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の一つの目的は、（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、ＡＭＬ診断マーカー検出用キットを提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、Ｂ−ＡＬＬ診断マーカー検出用キットを提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質；（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質；並びに（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬを区別するための診断マーカー検出用キットを提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子に対して特異的なプライマー対を含む、ＡＭＬ診断マーカー検出用組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、（ｉ）ＣＩＴＥＤ２タンパク質、または（ii）ＣＩＴＥＤ２タンパク質とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上のタンパク質に特異的な抗体を含む、ＡＭＬ診断マーカー検出用組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプライマー対を含む、Ｂ−ＡＬＬ診断マーカー検出用組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、（ｉ）ＴＣＬ１Ａタンパク質、または（ii）ＴＣＬ１Ａタンパク質とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上のタンパク質に特異的な抗体を含む、Ｂ−ＡＬＬ診断マーカー検出用組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子；（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子；並びに（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプライマー対を含む、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬを区別するための診断マーカー検出用組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２タンパク質、または（ii）ＣＩＴＥＤ２タンパク質とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上のタンパク質；（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａタンパク質、または（ii）ＴＣＬ１Ａタンパク質とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上のタンパク質；並びに（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７タンパク質、または（ii）ＴＣＦ７タンパク質とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上のタンパク質に特異的な抗体を含む、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬを区別するための診断マーカー検出用組成物を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、前記白血病の中でも、白血病が正常的な分化過程を経ずに増殖して骨髄と末消血に未成熟(immature)、非正常的(abnormal)な白血球が存在する特徴を示す、急性白血病、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞型急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、およびＴ細胞型急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）を診断するマーカーに関する。本発明は、生物学的試料から各タイプの急性白血病に特異的な診断マーカーを検出し、各タイプ別急性白血病を容易且つ簡単に診断する方法を提供する。
【００１７】
本発明において、用語「診断用マーカー、診断するためのマーカー、または診断マーカー」とは、白血病細胞を正常細胞と区分して診断することが可能な物質であって、正常細胞に比べて白血病を持つ細胞において増加または減少を示すポリペプチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡなど）、脂質、糖脂質、糖タンパク質、糖（単糖類、二糖類、オリゴ糖類など）などの有機生体分子などを含み、特定の条件、表現型または細胞型と関連のあるこれらは分析によって検出できる。本発明の目的上、白血病診断マーカーはＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、およびＴ−ＡＬＬを診断することが可能な核酸およびポリペプチドマーカーであり、マーカーは各タイプ別ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、およびＴ−ＡＬＬ細胞でのみ発現が増加する特徴を持つ。
【００１８】
有意性のある診断マーカーの選択と適用は、診断結果の信頼度を決定付ける決定的要素である。有意性のある診断マーカーとは、診断して得た結果が正確であって妥当度(validity)が高く、反復測定の際にも一貫した結果を示すように信頼度(reliability)の高いマーカーを意味する。本発明の白血病診断マーカーは、特定タイプの白血病の発病と共に直接的または間接的要因によって発現が常に増加する遺伝子であって、反復実験にも同一の結果を示し、発現水準の差異が対照群とは異なるタイプの白血病でと比較するときに非常に大きくて、間違った結果を下した確率が殆どない信頼度の高いマーカーである。したがって、本発明の有意性のある診断マーカーの発言程度を測定し、得られた測定結果に基づいて、診断された白血病のタイプを妥当に信頼することができる。
【００１９】
本発明において、用語「生物学的試料」とは、白血病の発病によって白血病診断マーカーとして用いられる遺伝子またはタンパク質の水準の差異を検出することが可能な組織、細胞などであって、骨髄(bone marrow)、リンパ節(lymph node)、脾臓(spleen)、末消血(peripheral blood)、リンパ液(lymph fluid)、漿液(serous fluid)、尿(urine)、唾液(saliva)などを含むが、これに制限されない。
【００２０】
本発明において、用語「診断」は、病理状態の存在または特徴を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は急性白血病の発病有無を確認するもので、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬに区分される急性白血病の正確なタイプまで確認することができることを特徴とする。
【００２１】
一つの様態として、本発明は、白血病疑心患者の生物学的試料から（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する段階と、これを正常対照群試料のｍＲＮＡまたはタンパク質の水準と比較してｍＲＮＡまたはタンパク質の水準の増加を確認する段階とを含んで、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を診断する方法に関する。
【００２２】
本発明において、用語「急性骨髄性白血病（ＡＭＬ：Acute Myeloid Leukemia）」は、骨髄系細胞が骨髄内で増殖して末消血またはその他の臓器を浸襲する悪性血液疾患であって、成人で発病頻度が高い疾患である。
【００２３】
本発明のＣＩＴＥＤ２（Cbp/p300-interacting transactivator with Glu/Asp-rich Carboxy-terminal domain, 2）、ＭＧＳＴ１(microsomal glutathione S-transferase 1)、ＲＡＢ３２(RAB32, member RAS oncogene family)、ＢＩＮ２(bridging intergrator 2)、ＩＣＡＭ−３(Intercellular Adhesion Molecule-3)、ＰＸＮ(Paxilline)、ＰＰＧＢ(protective protein for beta-galactosidase)、およびＴＡＦ１５(TAF15 RNA polymerase II, TATA box binding protein(TBP)-associated factor, 68kDa)遺伝子は、正常細胞および他のタイプの急性白血病細胞に比べて、ＡＭＬ細胞で特異的に高い水準の発現を示すので、ＡＭＬ診断マーカーとして提供される。
【００２４】
この際、全急性白血病においてほぼ同一の量で発現される遺伝子ＲＲＡＧＢ（GTP-binding protein ragB）および／またはＤＣＫ(deoxycytidine kinase)を定量対照群として使用することができる。
【００２５】
ＣＩＴＥＤ２遺伝子は、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬでは殆ど発現されず、ＡＭＬでのみ特異的に発現されるので、単独でも敏感、正確、精密にＡＭＬを診断することが可能な、信頼度の非常に高いマーカーである。ＣＩＴＥＤ２マーカーを単独で検出してＡＭＬを診断し、或いはＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子をマーカーとして検出してＡＭＬを診断するようにする。ＭＧＳＴ１を選択してＣＩＴＥＤ２と共にＡＭＬ診断マーカーとして使用することが好ましい。
【００２６】
生物学的試料中の遺伝子の発現水準は、ｍＲＮＡまたはタンパク質の量を確認することにより分かり、生物学的試料からｍＲＮＡとタンパク質を分離する過程は公知の工程を用いて行うことができ(Chomczynski and Sacchi Anal. Biochemistry. 1987, 162: 156-159)、ｍＲＮＡとタンパク質の量は様々な方法で測定することができる。
【００２７】
本発明において、用語「ｍＲＮＡ発現水準の測定」とは、ＡＭＬを診断するために、生物学的試料においてＡＭＬマーカー遺伝子のｍＲＮＡ存在有無と発現程度を確認する過程によってｍＲＮＡの量を測定する。このための分析方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ(Competitive RT-PCR)、実時間ＲＴ−ＰＣＲ(Real-time RT-PCR)、ＲＮａｓｅ保護分析法(ＲＰＡ；RNase protection assay)、ノーザンブロット(Northern blotting)、およびＤＮＡチップなどがあるが、これに制限されない。
【００２８】
前記検出方法によって、正常対照群におけるｍＲＮＡ発現量とＡＭＬ疑心患者におけるｍＲＮＡ発現量とを比較することができ、ＡＭＬマーカー遺伝子からｍＲＮＡの有意な発現量の増加有無を判断してＡＭＬ疑心患者の実際ＡＭＬ患者有無を診断することができる。
【００２９】
ｍＲＮＡ発現水準の測定は、好ましくはＡＭＬ診断マーカーとして用いられる遺伝子に特異的なプライマーを利用するＲＴ−ＰＣＲ法を用いる。
【００３０】
ＲＴ−ＰＣＲは、Ｐ．Ｓｅｅｂｕｒｇ(Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986, Pt 1:669-677)によってＲＮＡの分析に導入された方法であって、ｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅して分析する。この際、増幅段階でＡＭＬ診断マーカーに特異的に製造されたプライマー対を使用するようにする。ＲＴ−ＰＣＲの後、電気泳動してバンドのパターンとバンドの厚さを確認することにより、ＡＭＬ診断マーカーとして用いられる遺伝子のｍＲＮＡ発現有無と程度を確認可能であり、これを対照群と比較することにより、ＡＭＬ発生有無を簡便に診断することができる。
【００３１】
これとは異なり、前記ＡＭＬマーカー遺伝子またはその断片に該当する核酸がガラスなどの基板に高密度で付着されているＤＮＡチップを利用する。ＤＮＡチップは、試料からｍＲＮＡを分離し、その末端または内部を蛍光物で標識したｃＤＮＡプローブを調製し、ＤＮＡチップに混成化させた後、判読して遺伝子の存在または発現程度を確認することにより、ＡＭＬ発病有無を診断することができる。
【００３２】
本発明において、用語「タンパク質発現水準の測定」とは、ＡＭＬを診断するために、生物学的試料におけるＡＭＬマーカー遺伝子で発現されたタンパク質の存在有無と発現程度を確認する過程であって、前記遺伝子のタンパク質に対して特異的に結合する抗体を用いてタンパク質の量を確認する。
【００３３】
抗体を用いてタンパク質の水準を測定するための分析方法としては、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ(enzyme linked immunosorbent assay)、放射線免疫分析(ＲＩＡ：Radioimmunoassay)、放射免疫拡散法(radioimmunodiffusion)、オクタロニー(Ouchterlony)免疫核酸法、ロケット(rocket)免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法(Immunoprecipitation Assay)、補体固定分析法(Complement Fixation Assay)、ＦＡＣＳ、およびタンパク質チップなどがあるが、これに制限されない。
【００３４】
前記分析方法によって、正常対照群における抗原−抗体複合体の形成量とＡＭＬ疑心患者における抗原−抗体複合体の形成量とを比較することができ、ＡＭＬマーカー遺伝子からタンパク質の有意な発現量の増加有無を判断し、ＡＭＬ疑心患者の実際ＡＭＬ患者有無を診断することができる。
【００３５】
本発明において、用語「抗原−抗体複合体」とはＡＭＬマーカータンパク質とこれに特異的な抗体の結合物を意味し、抗原−抗体複合体の形成量は検出ラベル(detection label)のシグナルの大きさによって定量的に測定可能である。
【００３６】
このような検出ラベルは、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微粒子(microparticle)、レドックス分子、および放射線同位元素よりなる群から選択することができ、これらに制限されない。検出ラベルとして酵素が使用される場合、利用可能な酵素は、例えばβ−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼおよびＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシダーゼおよびルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスフェノールピルビン酸デカルボキシラーゼ、またはβ−ラタマーゼなどがあり、これに制限されない。蛍光物は、例えばフルオレシン、イソチオシアン酸塩、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレサミンなどがあり、これに制限されない。リガンドは、例えばビオチン誘導体などがあり、これに制限されない。発光物は、例えばアクリジウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼなどがあり、これに制限されない。微粒子は、例えばコロイド金、着色ラテックスなどがあり、これに制限されない。レドックス分子は、例えばフェロセン、ルテニウム錯体、ビオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジイミド、１，４−ベンゾキノン、ヒドロキノン、Ｋ４Ｗ（ＣＮ）８、［Ｏｓ（ｂｐｙ）３］２＋、［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋または［ＭＯ（ＣＮ）８］４−などがあり、これに制限されない。放射線同位元素は、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉまたは１８６Ｒｅなどがあり、これに制限されない。
【００３７】
タンパク質発現水準の測定は、好ましくはＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assay)法を用いる。ＥＬＩＳＡは、固体支持体に付着された抗原を認知する標識付き抗体を利用する直接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着された抗原を認知する抗体の複合体において捕獲抗体を認知する標識付き抗体を利用する間接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に抗体と抗原の複合体において抗原を認知する別の標識付き抗体を利用する直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着された抗体と抗原の複合体において抗原を認知する別の抗体と反応させた後、この抗体を認知する標識付き２次抗体を利用する間接的サンドイッチＥＬＩＳＡなどの様々なＥＬＩＳＡ方法を含む。より好ましくは、固体支持体に抗体を付着させ、試料を反応させた後、抗原−抗体複合体の抗原を認知する標識付き抗体を付着させて酵素的に発色させるか、或いは抗原−抗体複合体の抗原を認知する抗体に対して標識付き２次抗体を付着させて酵素的に発色させるサンドイッチＥＬＩＳＡ方法によって検出する。ＡＭＬマーカータンパク質と抗体の複合体形成程度を確認して、ＡＭＬ発病有無を確認することができる。
【００３８】
また、好ましくは、前記ＡＭＬマーカーに対する一つ以上の抗体が基板上の所定の位置上に配列され、高密度で固定化されているタンパク質チップを用いる。タンパク質チップを用いて試料を分析する方法は、試料からタンパク質を分離し、分離したタンパク質をタンパク質チップと混成化させ、抗原−抗体複合体を形成させ、これを判読して、タンパク質の存在または発現程度を確認することにより、ＡＭＬ発病有無を確認することができる。
【００３９】
また、好ましくは、前記ＡＭＬマーカーに対する一つ以上の抗体を用いたウエスタンブロットを用いる。試料から全体タンパク質を分離し、これを電気泳動して、タンパク質をサイズに応じて分離した後、ニトロセルロース膜に移動させて抗体と反応させる。生成された抗原−抗体複合体の量を標識付き抗体を用いて確認する方法で、遺伝子の発現により生成されたタンパク質の量を確認することにより、ＡＭＬ発病有無を確認することができる。
【００４０】
前記検出方法は、白血病にかかっていない対照群におけるマーカー遺伝子の発現量と、白血病が発病した細胞におけるマーカー遺伝子の発現量を調査する方法で行われる。ｍＲＮＡまたはタンパク質の水準は、前述したマーカータンパク質の絶対的（例：μｇ／ｍｌ）または相対的（例：シグナルの相対強度）差異で表わすことができる。
【００４１】
別の様態として、本発明は、白血病疑心患者の生物学的試料から（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する段階、およびこれを正常対照群試料のｍＲＮＡまたはタンパク質の水準と比較してｍＲＮＡまたはタンパク質の水準の増加を確認する段階を含んで、Ｂ細胞型急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）を診断する方法に関する。
【００４２】
本発明において、「Ｂ細胞型リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）」は、ＷＨＯ分類によるもので、ｔ（８；１４）、ｔ（８；２２）、ｔ（２；８）、ｔ（９；２２）、ｔ（４；１１）、ｔ（１；１９）などの染色体変異が発生したＢ−ＡＬＬを含む。
【００４３】
本発明のＴＣＬ１Ａ(T-cell leukemia/lymphoma 1A)、ＣＤ１９、ＩＮＳＲ(insulin receptor)、ＯＦＤ１(oral-facial-digital syndrome 1)、ＡＫＲ１Ｂ１(aldo-keto reductase family 1, member B1)、ＣＤ７９Ｂ、およびＵＨＲＦ１(ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1)遺伝子は、正常細胞および他のタイプの急性白血病細胞に比べて、Ｂ−ＡＬＬ細胞で特異的に高い水準の発現を示すので、Ｂ−ＡＬＬマーカーとして使用される。
【００４４】
この際、全ての急性白血病においてほぼ同一の量で発現される遺伝子ＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫを定量対照群として使用することができる。
【００４５】
ＴＣＬ１Ａ遺伝子は、ＡＭＬおよびＴ−ＡＬＬではほぼ発現されず、Ｂ−ＡＬＬでのみ特異的に発現されるので、単独でも敏感、正確、精密にＢ−ＡＬＬを診断することが可能な、信頼度の非常に高いマーカーである。ＴＣＬ１Ａマーカーを単独で検出してＢ−ＡＬＬを診断し、或いはＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９およびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子をマーカーとして検出してＢ−ＡＬＬを診断するようにする。ＣD１９遺伝子を選択してＴＣＬ１Ａ遺伝子と共にＢ−ＡＬＬ診断マーカーとして使用することが好ましい。
【００４６】
Ｂ−ＡＬＬマーカーのｍＲＮＡ水準は、ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ、実時間ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ）、ノーザンブロット、ＤＮＡチップなどの分析方法によって、正常対照群におけるＲＮＡ発現量とＢ−ＡＬＬ疑心患者におけるＲＮＡ発現量とを比較することができ、Ｂ−ＡＬＬマーカー遺伝子からｍＲＮＡの有意な発現量の増加有無を判断し、Ｂ−ＡＬＬ疑心患者の実際Ｂ−ＡＬＬ患者有無を診断することができる。好ましくは、Ｂ−ＡＬＬ診断マーカーとして用いられる遺伝子に特異的なプライマーを利用するＲＴ−ＰＣＲまたはＤＮＡチップを用いる。
【００４７】
Ｂ−ＡＬＬマーカーのタンパク質の水準は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、放射免疫拡散法、オクタロニー(Ouchterlony)免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法(Immunoprecipitation Assay)、補体固定分析法(Complement Fixation Assay)、ＦＡＣＳ、タンパク質チップなどの分析方法によって、正常対照群における抗原−抗体複合体の形成量とＢ−ＡＬＬ疑心患者における抗原−抗体複合体の形成量とを比較することができ、Ｂ−ＡＬＬマーカー遺伝子からタンパク質の有意な発現量の増加有無を判断し、Ｂ−ＡＬＬ疑心患者の実際Ｂ−ＡＬＬ患者有無を診断することができる。好ましくは、ＥＬＩＳＡ、タンパク質チップまたはウエスタンブロットを用いる。
【００４８】
別の様態として、本発明は、白血病疑心患者の生物学的試料から（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する段階；およびこれを正常対照群試料のｍＲＮＡまたはタンパク質の水準と比較してｍＲＮＡまたはタンパク質の水準の増加を確認する段階を含んで、Ｔ細胞型急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）を診断する方法に関する。
【００４９】
本発明において、「Ｔ細胞型急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）」は、ＷＨＯ分類によるものであって、１４ｑ１１、７ｑ３４などの染色体変異が発生したＴ−ＡＬＬを含む。
【００５０】
本発明のＴＣＦ７(transcription factor 7:T-cell specific, HMG-box)、ＴＲＢ(T cell receptor beta locus)、ＴＲＧＣ２(T cell receptor gamma constant 2)、ＮＫ４(natural killer cell transcript 4)、ＣＨＣ１Ｌ(chromosome condensation 1-like)遺伝子は、正常細胞および他のタイプの急性白血病細胞に比べて、Ｔ−ＡＬＬ細胞で特異的に高い水準の発現を示すので、Ｔ−ＡＬＬマーカーとして使用される。
【００５１】
この際、全ての急性白血病においてほぼ同一の量で発現される遺伝子ＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫを定量対照群として使用することができる。
【００５２】
ＴＣＦ７遺伝子は、ＡＭＬおよびＢ−ＡＬＬではほぼ発現されず、Ｔ−ＡＬＬでのみ特異的に発現されるので、単独でも敏感、正確、精密にＴ−ＡＬＬを診断することが可能な、信頼度の非常に高いマーカーである。そのＴＣＦ７マーカーを単独で検出してＴ−ＡＬＬを診断し、またはＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子をマーカーとして検出してＴ−ＡＬＬを診断するようにする。ＴＲＢを選択してＴＣＦ７遺伝子と共にＴ−ＡＬＬ診断マーカーとして使用することが好ましい。
【００５３】
Ｔ−ＡＬＬマーカーのｍＲＮＡ水準は、ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ、実時間ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ）、ノーザンブロット、ＤＮＡチップなどの分析方法によって、正常対照群におけるＲＮＡ発現量とＴ−ＡＬＬ疑心患者におけるＲＮＡ発現量とを比較することができ、Ｔ−ＡＬＬマーカー遺伝子からｍＲＮＡの有意な発現量の増加有無を判断し、Ｔ−ＡＬＬ疑心患者の実際Ｔ−ＡＬＬ患者有無を診断することができる。好ましくは、Ｔ−ＡＬＬ診断マーカーとして用いられる遺伝子に特異的なプライマーを利用するＲＴ−ＰＣＲまたはＤＮＡチップを用いる。
【００５４】
Ｔ−ＡＬＬマーカーのタンパク質の水準は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、放射免疫拡散法、オクタロニー(Ouchterlony)免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法(Immunoprecipitation Assay)、補体固定分析法(Complement Fixation Assay)、ＦＡＣＳ、タンパク質チップなどの分析方法によって、正常対照群における抗原−抗体複合体の形成量とＴ−ＡＬＬ疑心患者における抗原−抗体複合体の形成量とを比較することができ、Ｔ−ＡＬＬマーカー遺伝子からタンパク質の有意な発現量の増加有無を判断し、Ｔ−ＡＬＬ疑心患者の実際Ｔ−ＡＬＬ患者有無を診断することができる。好ましくは、ＥＬＩＳＡ、タンパク質チップまたはウエスタンブロットを用いる。
【００５５】
別の様態として、本発明は、白血病疑心患者の生物学的試料から、（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質；（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質、並びに（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する段階；およびこれを正常対照群試料のｍＲＮＡまたはタンパク質の水準と比較してｍＲＮＡまたはタンパク質の水準の増加を確認する段階を含んで、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、およびＴ−ＡＬＬを区別して診断する方法を提供する。
【００５６】
ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬ患者検出マーカー遺伝子の発現水準を同時に測定することにより、白血病のタイプを１回で決定することが可能な方法の効率性を図ることができる。
【００５７】
この際、全ての急性白血病においてほぼ同一の量で発現される遺伝子ＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫを定量対照群として使用することができる。
【００５８】
より好ましくは、ＣＩＴＥＤ２とＭＧＳＴ１の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質、ＴＣＬ１ＡとＣＤ１９の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質、およびＴＣＦ７とＴＲＢの遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する方法を提供する。ＣＩＴＥＤ２とＭＧＳＴ１の遺伝子はＡＭＬ診断のための有意性の高いマーカーである。ＴＣＬ１ＡとＣＤ１９の遺伝子はＢ−ＡＬＬ診断のための有意性の高いマーカーである。ＴＣＦ７とＴＲＢの遺伝子はＴ−ＡＬＬ診断のための有意性の高いマーカーである。整列された６個の遺伝子の発現パターンおよび量を比較することにより、白血病の発病有無とタイプを一目で診断することができる。
【００５９】
ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬの診断は、本発明で提供する白血病診断マーカー遺伝子に対するｍＲＮＡまたはタンパク質の水準を検出することが可能な製剤を含むキットによって容易に可能である。
【００６０】
別の様態として、本発明は、（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または(ii)ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、ＡＭＬ診断マーカー検出用キットに関する。
【００６１】
本発明の検出用キットは、分析方法に適した１種類またはそれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置から構成される。
【００６２】
好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲを行うために必要な必須要素を含む診断マーカー検出用キットに関する。ＲＴ−ＰＣＲキットは、マーカー遺伝子に対する特異的なそれぞれのプライマー対を含む。プライマーは、各マーカー遺伝子の核酸配列に特異的な配列を持つヌクレオチドであって、約７ｂｐ〜５０ｂｐの長さ、より好ましくは約１０ｂｐ〜３０ｂｐの長さである。また、対照群遺伝子の核酸配列に特異的なプライマーを含むことができる。その他に、ＲＴ−ＰＣＲキットは、テストチューブまたは他の適切なコンテイナー、反応緩衝液（ｐＨ およびマグネシウム濃度は多様である）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、例えばＴａｑ−ポリメラーゼおよび逆転写などの酵素、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ−水、および滅菌水などを含むことができる。
【００６３】
また、好ましくは、ＤＮＡチップを行うために必要な必須要素を含む診断マーカー検出用キットに関する。ＤＮＡチップキットは、遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドが付着されている基板、および蛍光標識プローブを製作するための試薬、製剤、酵素などを含むことができる。また、基板は、対照群遺伝子として用いられるＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫ遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡを含むことができる。
【００６４】
また、好ましくは、ＥＬＩＳＡを行うために必要な必須要素を含む診断マーカー検出用キットに関する。ＥＬＩＳＡキットは、マーカータンパク質に対する特異的な抗体を含む。抗体は、各マーカータンパク質に対する特異性および親和性が高く、他のタンパク質に対する交差反応性が殆どない抗体であって、単クローン抗体、多クローン抗体または組み換え抗体である。また、ＥＬＩＳＡキットは、対照群タンパク質に特異的な抗体を含むことができる。その他に、ＥＬＩＳＡキットは、結合された抗体を検出することが可能な試薬、例えば、標識付き２次抗体、発色団(Chromophores)、酵素（例えば、抗体とコンジュゲートされる）、およびその基質または抗体と結合できる他の物質などを含むことができる。
【００６５】
ＡＭＬマーカー検出用ＲＴ−ＰＣＲキットは、（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子に対して特異的なそれぞれのプライマー対を含む。また、ＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫ遺伝子に対して特異的なプライマー対を含むことができる。
【００６６】
ＡＭＬマーカー検出用ＤＮＡチップキットは、（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡが付着されている基板を含む。また、ＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫ遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡを基板に付着および固定することができる。
【００６７】
ＡＭＬマーカー検出用ＥＬＩＳＡキットは、（ｉ）ＣＩＴＥＤ２タンパク質、または（ii）ＣＩＴＥＤ２タンパク質とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上のタンパク質に対して特異的な抗体を含む。また、ＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫタンパク質に対して特異的な抗体を含むことができる。
【００６８】
別の様態として、本発明は、（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、Ｂ−ＡＬＬ診断マーカー検出用キットに関する。
【００６９】
Ｂ−ＡＬＬマーカー検出用ＲＴ−ＰＣＲキットは、（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子に対して特異的なそれぞれのプライマー対を含む。また、ＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫ遺伝子に対して特異的なプライマー対を含むことができる。
【００７０】
Ｂ−ＡＬＬマーカー検出用ＤＮＡチップキットは、（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡがある基板を含む。また、ＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫ遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド基板に付着および固定することができる。
【００７１】
Ｂ−ＡＬＬマーカー検出用ＥＬＩＳＡキットは、（ｉ）ＴＣＬ１Ａタンパク質、または（ii）ＴＣＬ１Ａタンパク質とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上のタンパク質に対して特異的な抗体を含む。また、ＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫタンパク質に対して特異的な抗体を含む。
【００７２】
別の様態として、本発明は、（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、Ｔ−ＡＬＬ診断マーカー検出用キットに関する。
【００７３】
Ｔ−ＡＬＬマーカー検出用ＲＴ−ＰＣＲキットは、（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子に対して特異的なそれぞれのプライマー対を含む。また、ＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫ遺伝子に対して特異的なプライマー対を含むことができる。  
Ｔ−ＡＬＬマーカー検出用ＤＮＡチップキットは、（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡが付着されている基板を含む。また、ＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫ遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡを基板に付着および固定することができる。
【００７４】
Ｔ−ＡＬＬマーカー検出用ＥＬＩＳＡキットは、（ｉ）ＴＣＦ７タンパク質、または（ii）ＴＣＦ７タンパク質とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上のタンパク質に対して特異的な抗体を含む。また、ＲＲＡＧＢおよび／またはＤＣＫタンパク質に対して特異的な抗体を含むことができる。
【００７５】
別の様態として、本発明は、（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質；（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質；並びに（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質の水準を測定する製剤を含む、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬを区別するための診断マーカー検出用キットに関する。
【００７６】
ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、およびＴ−ＡＬＬ区別検出用ＲＴ−ＰＣＲキットは、（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子；（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子；並びに（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子に対して特異的なそれぞれのプライマー対を含む。
【００７７】
ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、およびＴ−ＡＬＬ区別検出用ＤＮＡチップキットは、（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子；（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子；並びに（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡが付着されている基板を含む。
【００７８】
ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、およびＴ−ＡＬＬ区別検出用ＥＬＩＳＡキットは、（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２タンパク質、または（ii）ＣＩＴＥＤ２タンパク質とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上のタンパク質；（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａタンパク質、または（ii）ＴＣＬ１Ａタンパク質とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上のタンパク質；並びに（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７タンパク質、または（ii）ＴＣＦ７タンパク質とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上のタンパク質に対して特異的な抗体を含む。
【００７９】
別の様態として、本発明は、（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子に対して特異的なプライマー対を含む、ＡＭＬ診断マーカー検出用組成物に関する。
【００８０】
本発明の「プライマー」は、短い自由３末端水酸化基(free 3' hydroxyl group)を持つ核酸配列で相補的なテンプレートと塩基対(base pair)を形成することができ、テンプレート鎖の複製のための開始点として機能する短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝溶液および温度で重合反応（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）のための試薬および相異なる４つのヌクレオシドトリホスフェートの存在下でＤＮＡ合成が開始できる。本発明のプライマーは、各マーカー遺伝子に特異的なプライマーであって、７個〜５０個のヌクレオチド配列を持つセンスおよびアンチセンス核酸である。プライマーは、ＤＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの基本性質を変化させない追加の特徴を混入することができる。
【００８１】
本発明のプライマーは、ホスホルアミダイト固体支持体方法、またはその他の公知の方法を用いて化学的に合成することができる。このような核酸配列は、また、当該分野の公知の多くの手段を用いて変形させることができる。このような変形の非−制限的な例としては、メチル化、カプセル化、天然ヌクレオチドの一つ以上の同族体への置換、およびヌクレオチド間の変形、例えば荷電されていない連結体（例：メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）または荷電された連結体（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）への変形がある。核酸は、一つ以上の付加的な共有結合した残基、例えばタンパク質（例：ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、挿入剤（例：アクリジン、プソラレンなど）、キレート化剤（例：金属、放射性金属、鉄、酸化性金属など）、およびアルキル化剤を含有することができる。本発明の核酸配列は、また、検出可能なシグナルを直接的または間接的に提供することが可能な標識を用いて変形させることができる。標識の例としては放射性同位元素、蛍光性分子、ビオチンなどがある。
【００８２】
ＡＭＬ診断マーカー検出用組成物は、好ましくはＣＩＴＥＤ２とＭＧＳＴ１診断マーカー検出用組成物であり、ＣＩＴＥＤ２を増幅するための配列番号１および２、ＭＧＳＴ１を増幅するための配列番号３および４に該当するそれぞれのプライマー対を含む。また、対照群遺伝子ＲＲＡＧＢを増幅するための配列番号１３および１４、ＤＣＫを増幅するための配列番号１５および１６をさらに含むことができる。
【００８３】
別の様態として、本発明は、（ｉ）ＣＩＴＥＤ２タンパク質、または（ii）ＣＩＴＥＤ２タンパク質とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上のタンパク質に特異的な抗体を含む、ＡＭＬ診断マーカー検出用組成物に関する。
【００８４】
本発明において、「抗体」とは、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、抗体は、マーカータンパク質に対して特異的に結合する抗体を意味し、多クローン抗体、単クローン抗体および組み換え抗体を全て含む。
【００８５】
上述したように、ＡＭＬマーカータンパク質が究明されたので、これを用いて抗体を生成することは当業界に広く知られている技術を用いて容易に製造することができる。
【００８６】
多クローン抗体は、前述したＡＭＬマーカータンパク質抗原を動物に注射し、動物から採血して抗体含有血清を得る当業界の公知の方法によって生産することができる。このような多クローン抗体は、山羊、ウサギ、羊、猿、馬、豚、牛、犬などの任意の動物種宿主から製造可能である。
【００８７】
単クローン抗体は、当業界に広く知られているハイブリドーマ方法(Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519参照)またはファージ抗体ライブラリ(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991)技術を用いて製造できる。
【００８８】
ハイブリドーマ方法は、免疫学的に適した宿主動物、例えばＡＭＬ診断マーカータンパク質抗原を注射したマウスなどからの細胞を利用し、残りの一つの集団からは癌または骨髄腫細胞株を利用する。このような２集団の細胞をポリエチレングリコールなどの当業界における公知の方法によって融合させてから、抗体−生産細胞を標準的な組織培養方法によって増殖させる。限界希釈法(limited dilution technique)によるサブクローニングによって均一な細胞集団を得た後、ＡＭＬ診断汚染マーカータンパク質に対して特異的な抗体を生成することが可能なハイブリドーマを標準技術によって試験管内でまたは生体内で多量培養する。前述したハイブリドーマが生産する単クローン抗体は、精製しなくても使用することができるが、当業界における公知の方法に従って精製して使用することが好ましい。
【００８９】
ファージ抗体ライブラリ方法は、細胞内に存在する、様々なＡＭＬタンパク質マーカーに対する抗体遺伝子(Single chain Fragmentvariable、ｓｃＦｖ形態)を獲得し、これをファージの表面に融合タンパク質の形で発現させることにより抗体ライブラリを試験管内で製作し、このライブラリから単クローン抗体を分離、製作する方法である。
【００９０】
また、本発明の抗体は、２つの全長の軽鎖および２つの全長の重鎖を持つ完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片も含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。
【００９１】
ＡＭＬ診断マーカー検出用組成物は、好ましくはＣＩＴＥＤ２とＭＧＳＴ１診断マーカー検出用組成物であり、ＣＩＴＥＤ２特異的抗体、ＭＧＳＴ１特異的抗体を含む。また、対照群遺伝子ＲＲＡＧＢに特異的な抗体、ＤＣＫに特異的な抗体をさらに含むことができる。
【００９２】
別の様態として、本発明は、（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプライマー対を含む、Ｂ−ＡＬＬ診断マーカー検出用組成物に関する。
【００９３】
Ｂ−ＡＬＬ診断マーカー検出用組成物は、好ましくは、ＴＣＬ１ＡとＣＤ１９診断マーカー検出用組成物であり、ＴＣＬ１Ａを増幅するための配列番号５および６、ＣＤ１９を増幅するための配列番号７および８に該当するそれぞれのプライマー対を含む。また、対照群遺伝子ＲＲＡＧＢを増幅するための配列番号１３および１４、ＤＣＫを増幅するための配列番号１５および１６をさらに含むことができる。
【００９４】
別の様態として、本発明は、（ｉ）ＴＣＬ１Ａタンパク質、または（ii）ＴＣＬ１Ａタンパク質とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上のタンパク質に特異的な抗体を含む、Ｂ−ＡＬＬ診断マーカー検出用組成物に関する。
【００９５】
Ｂ−ＡＬＬ診断マーカー検出用組成物は、好ましくは、ＴＣＬ１ＡとＣＤ１９診断マーカー検出用組成物であり、ＴＣＬ１Ａ特異的抗体、ＣＤ１９特異的抗体を含む。また、対照群遺伝子ＲＲＡＧＢに特異的な抗体、ＤＣＫに特異的な抗体をさらに含むことができる。
【００９６】
別の様態として、本発明は、（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプライマー対を含む、Ｔ−ＡＬＬ診断マーカー検出用組成物に関する。
【００９７】
Ｔ−ＡＬＬ診断マーカー検出用組成物は、好ましくは、ＴＣＦ７とＴＲＢ診断マーカー検出用組成物であり、ＴＣＦ７を増幅するための配列番号９および１０、ＴＲＢを増幅するための配列番号１１および１２に該当するそれぞれのプライマー対を含む。また、対照群遺伝子ＲＲＡＧＢを増幅するための配列番号１３および１４、ＤＣＫを増幅するための配列番号１５および１６をさらに含むことができる。
【００９８】
別の様態として、本発明は、（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上のタンパク質に特異的な抗体を含む、Ｔ−ＡＬＬ診断マーカー検出用組成物に関する。
【００９９】
Ｔ−ＡＬＬ診断マーカー検出用組成物は、好ましくは、ＴＣＦ７とＴＲＢ診断マーカー検出用組成物であり、ＴＣＦ７特異的抗体、ＴＲＢ特異的抗体を含む。また、対照群遺伝子ＲＲＡＧＢに特異的な抗体、ＤＣＫに特異的な抗体をさらに含むことができる。
【０１００】
別の様態として、本発明は、（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２遺伝子、または（ii）ＣＩＴＥＤ２遺伝子とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上の遺伝子；（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａ遺伝子、または（ii）ＴＣＬ１Ａ遺伝子とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上の遺伝子；並びに（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７遺伝子、または（ii）ＴＣＦ７遺伝子とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプライマー対を含む、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬ診断マーカーの区別検出用組成物に関する。
【０１０１】
好ましくは、前記組成物は、ＣＩＴＥＤ２とＭＧＳＴ１の遺伝子、ＴＣＬ１ＡとＣＤ１９の遺伝子、およびＴＣＦ７とＴＲＢの遺伝子に特異的なプライマー対を含む組成物であり、ＣＩＴＥＤ２を増幅するためのプライマー対は、配列番号１および２、ＭＧＳＴ１を増幅するためのプライマー対は配列番号３および４、ＴＣＬ１Ａを増幅するためのプライマー対は配列番号５および６、ＣＤ１９を増幅するためのプライマー対は配列番号７および８、ＴＣＦ７を増幅するためのプライマー対は配列番号９および１０、ＴＲＢを増幅するためのプライマー対は配列番号１１および１２である。また、対照群遺伝子ＲＲＡＧＢを増幅するための配列番号１３および１４、ＤＣＫを増幅するための配列番号１５および１６をさらに含むことができる。
【０１０２】
別の様態として、本発明は、（ａ）（ｉ）ＣＩＴＥＤ２タンパク質、または（ii）ＣＩＴＥＤ２タンパク質とＭＧＳＴ１、ＢＩＮ２、ＲＡＢ３２、ＩＣＡＭ−３、ＰＸＮ、ＰＰＧＢおよびＴＡＦ１５の中から選択される一つ以上のタンパク質；（ｂ）（ｉ）ＴＣＬ１Ａタンパク質、または（ii）ＴＣＬ１Ａタンパク質とＣＤ１９、ＩＮＳＲ、ＯＦＤ１、ＡＫＲ１Ｂ１、ＣＤ７９ＢおよびＵＨＲＦ１の中から選択される一つ以上のタンパク質；並びに（ｃ）（ｉ）ＴＣＦ７タンパク質、または（ii）ＴＣＦ７タンパク質とＴＲＢ、ＴＲＧＣ２、ＮＫ４およびＣＨＣ１Ｌの中から選択される一つ以上のタンパク質に特異的なプライマー対を含む、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬ診断マーカーの区別検出用組成物に関する。
【０１０３】
好ましくは、前記組成物は、ＣＩＴＥＤ２とＭＧＳＴ１タンパク質、ＴＣＬ１ＡとＣＤ１９タンパク質、およびＴＣＦ７とＴＲＢタンパク質に特異的な抗体を含む組成物である。
【０１０４】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。ところが、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１０５】
実施例１：ＤＮＡチップ技術を利用した、ＡＭＬおよびＡＬＬ患者の骨髄細胞の遺伝子発現調査
<１−１>骨髄細胞のＲＮＡ分離
本発明者らは、８２名のＡＭＬ患者、２３名のＢ−ＡＬＬ患者、および２名のＴ−ＡＬＬ患者の骨髄試料からＲＮＡを分離して実験に利用した。保管された骨髄試料からＲＮＡを分離するために、１ｍＬの骨髄試料に５ｍｌのＴｒｉＺｏｌ試薬（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０１８）を添加して組織ホモジナイザーで１分間細胞を破壊させた。以後のＲＮＡ分離過程は、ＴｒｉＺｏｌ試薬の製造社から提供された実験方法によって行った。ＲＮＡを分離した後、純度をさらに高めるために、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０６）用いて、製造社から提供された実験方法によってＲＮＡを追加精製した。
【０１０６】
<１−２>分離されたＲＮＡの定量分析
分離されたＲＮＡはスペクトロフォトメーター(spectrophotometer)を用いて２６０ｎｍ波長で吸光度を測定してＲＮＡを定量した。
【０１０７】
<１−３>参照ＲＮＡの製造
ＤＮＡチップとハイブリッド化の際に骨髄細胞から分離されたＲＮＡと共にハイブリッド化する参照ＲＮＡは、血液細胞に起因した細胞株からＲＮＡを分離して使用した。参照ＲＮＡを製造するために、ＨＬ−６０、Ｋ−５６２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２、ＣＥＭ−ＣＭ３、Ｍｏｌｔ−４、ＴＨＰ−１の７種の細胞株（韓国細胞株銀行(http;//cellbank.snu.ac.kr)から購入）から<１−１>の方法でＲＮＡを分離した。分離されたＲＮＡは<１−２>の方法で定量した後、同量を混ぜて参照ＲＮＡとして使用した。
【０１０８】
<１−４>実験に使用されたＤＮＡチップ
ＤＮＡチップは、１５，９７２個のｃＤＮＡプローブを含む１６ＫヒトｃＤＮＡチップ（１６ＫヒトｃＤＮＡチップ）を用いた(Vivian G. Cheung et al., Nature Genetics, Making and reading microarrays, 1999 Jan 21: 15-19; Microarray Biochip Technology, Mark Schena, 2000, Eaton Publishing)。簡単に製作過程を説明すると、次の通りである。ｃＤＮＡがクローニングされているプラスミドを含むバクテリアストックからプラスミドを分離し、分離されたプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲを行って増幅した。増幅されたｃＤＮＡは、プローブを使用するために、ＰＣＲクリーンアップキット(clean-up kit)を用いて不純物を除去した。精製されたｃＤＮＡを５０％ＤＭＳＯ含有スポッティング溶液に１００〜２００ｎｇ／μｌの濃度で溶かしてＧＡＰＳIIスライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４０００６）にスポッティングした後、適量の紫外線照射によって固定させて本発明の１６ＫヒトｃＤＮＡチップを製造した。
【０１０９】
<１−５>チップ実験および遺伝子発現定量
１０μｇの骨髄試料から分離されたＲＮＡと参照試料ＲＮＡをアミノアーリル−ｄＵＴＰの存在下に逆転写してｃＤＮＡを製造した後、それぞれモノエステル−Ｃｙ５およびモノエステル−Ｃｙ３と反応させてＣｙ５とＣｙ３を標識した。標識付き試料は、ＰＣＲクリーンアップキットを用いて精製した後、ＤＮＡチップに１６時間以上ハイブリッド化した。ハイブリッド化の後、非特異的ハイブリッド化を除去するために、ＳＳＣ含有洗浄溶液を用いてＤＮＡチップを洗浄した。洗浄されたＤＮＡチップは、共焦点(confocal)をレーザースキャナ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｓｃａｎａｒｒａｙ  Ｌｉｔｅ）を用いてスキャニングし、各スポットに存在する蛍光のデータを得てＴＩＦＦ形態のイメージファイルとして格納した。ＴＩＦＦイメージファイルをＧｅｎｅＰｉｘ３．０（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で定量して各スポットの蛍光値を定量した。ＧｅｎｅＰｉｘ３．０から得られた定量結果は、Ｙａｎｇなど(Nucleic Acids Res 2002, 30:e15)が提案した方法によって、Ｓ−ｐｌｕｓ統計パッケージ（ＩｎＳｉｇｈｔｆｕｌ）から提供する「ｌｏｗｅｓｓ」機能を用いて補正した。
【実施例２】
【０１１０】
実施例２：ＤＮＡチップ結果からの、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬにおける発現に差異がある遺伝子の選別および対照群遺伝子の選別
使用されたＤＮＡチップに存在する１５，９７２個のプローブに対し、ＡＭＬ試料、Ｂ−ＡＬＬ、およびＴ−ＡＬＬ試料における発現に差異がある遺伝子をｐ＜１０−６の有意水準でｔ−ｔｅｓｔによって選別した。この場合、１５，９７２回のｔ−ｔｅｓｔを反復するので、ｐ＜１０−６の有意水準では０．０２回の偽陽性(flase positive)が発現するものと予想されるので、選別された遺伝子はいずれも実際発現に差異がある遺伝子である。ｔ−ｔｅｓｔ結果、２６８個の遺伝子が、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、およびＴ−ＡＬＬにおける発現に差異があるものとして選別された。
【０１１１】
ＲＴ−ＰＣＲを用いたＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、およびＴ−ＡＬＬの診断のための遺伝子を選別するために、ｔ−ｔｅｓｔから得られたｐ値とＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、およびＴ−ＡＬＬ試料の発現水準の差異を共に考慮して、ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、およびＴ−ＡＬＬで高く発現する遺伝子１０個以内で選別した（表１、表２および表３）。
【表１】
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【表２】
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【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
また、試料の種類を問わずに、一定の水準で発現する遺伝子を選別するために、全体試料におけるそれぞれの遺伝子発現の分散を求め、分散が最も小さい７個の遺伝子を選別した（表４）。
【表４】
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【実施例３】
【０１１４】
実施例３：ＲＴ−ＰＣＲを用いたＢ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、ＡＭＬ特異的診断マーカー遺伝子および対照群遺伝子の選別
実施例２で選別された診断マーカー候補遺伝子の発現差異を用いて実際にＡＭＬとＡＬＬを区分し得るかを調査するために、４個のＡＭＬ試料と２個のＴ−ＡＬＬ試料、２個のＢ−ＡＬＬ試料における遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲによって調査した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は次の方法で行った。５μｇのＲＮＡ試料を取って２０μｌ反応体積で逆転写させ、蒸留水を添加して１００μｌに希釈した。希釈された逆転写産物２μｌを取ってテンプレートとして用い、８個のマーカー遺伝子に特異的なプライマー対の存在下に２５μｌ反応体積で２５回のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応産物のうち８μｌを取って０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドの存在下に２％アガロースゲルで電気泳動してバンドを観察した。遺伝子の中から、最もＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、およびＴ−ＡＬＬに特異的な遺伝子および全試料において一定の水準で発現する２個の対照群遺伝子を選別した。図１は選定された８個の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。
【実施例４】
【０１１５】
実施例４：５７個の急性白血病骨髄細胞における８個の診断マーカー遺伝子を用いたＡＭＬおよびＡＬＬの診断
実施例３で選定された８個の診断用遺伝子の発現を追加的な４１個のＡＭＬ試料と１６個のＡＬＬ試料で調査した。急性白血病は、特徴的な染色体変異を持っているものと知られている。例えば、ＡＭＬはｔ（８；２１）、ｔ（１５；１７）、ｉｎｖ（１６）などの染色体変異が最も頻繁に発生し、ＡＬＬはｔ（９；２２）の染色体変異を持つ場合に予後がが良くないものと知られている。実施例４で選別された診断マーカー遺伝子が前述した様々な染色体変異を持つ急性白血病への適用が可能なのかを調査するために、様々な染色体変異を持つ試料で８個の診断マーカー遺伝子の発現を調査した。図２は正常的な染色体を持つＡＭＬ試料で、図３はｔ（１５；１７）染色体変異を持つＡＭＬ試料で、図４はｔ（８；２１）の染色体変異を持つＡＭＬ試料で、図５は正常的な染色体を持つＢ−ＡＬＬ試料で、図６はｔ（９；２２）染色体変異を持つＢ−ＡＬＬ試料で、図７はＴ−ＡＬＬ試料で８個の診断マーカー遺伝子の発現を調査したものである。
【０１１６】
総合的に３９個のＡＭＬ試料のうち３８個の試料は、ＡＭＬに特異的な診断マーカー遺伝子を一つ以上発現し、ＡＬＬに特異的なマーカー遺伝子は発現しなかった。１個のＡＭＬ試料はＡＭＬマーカーだけでなく、ＡＬＬマーカー遺伝子を発現した。また、１６個のＡＬＬ試料のうち１５個の試料はＡＬＬに特異的な診断マーカー遺伝子を一つ以上発現し、ＡＭＬに特異的なマーカー遺伝子を発現しなかった。１個のＡＬＬ試料は、ＡＬＬマーカーだけでなくＡＭＬマーカーも発現した。５５個の急性白血病試料はいずれも１つ以上の対照群遺伝子を発現した。このような結果は、実施例４で発掘した８個のマーカー遺伝子の発現を確認することによりＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬの区別が可能であることを示す。
【０１１７】
前記結果より、３９個のＡＭＬ試料のうち３８個を正確に診断することができ、１６個のＡＬＬ試料のうち１５個を正確に診断することができるため、本診断の敏感度はＡＭＬ診断に対して９７．４％、ＡＬＬ診断に対して９３．８％、全体的に９６．４％と計算された。また、１６個のＡＭＬではない試料のうち１５個をＡＭＬではないと診断することができ、３９個のＡＬＬではない試料のうち３８個をＡＬＬではないと診断することができるため、特異度はＡＭＬ診断に対して９３．８％、ＡＬＬ診断に対して９６．４％、全体的に９６．４％と計算された（表５）。
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明の白血病診断マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を検出してＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬを区別する方法によって急性白血病のタイプを正確且つ簡便に診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は４つのＡＬＬ(Acute Lymphoblastic Leukemia)サンプルと４つのＡＭＬ(Acute Myeloid Leukemia)サンプルにおいて、表１、表２、表３に含まれた遺伝子のうち、Ｂ細胞型ＡＬＬ(B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia：Ｂ−ＡＬＬ)、Ｔ細胞型ＡＬＬ(T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia：Ｔ−ＡＬＬ)、ＡＭＬそれぞれで特異的に発現する２個ずつの遺伝子と全細胞で一定の水準に発現する２個の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ結果である。
【図２】図２は正常染色体を持つＡＭＬ患者における８個の診断マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって調査した結果である。患者２１を除いた全患者がＡＭＬマーカー遺伝子と対照群遺伝子のみを発現する。
【図３】図３はｔ（１５；１７）染色体変異を持つＡＭＬ患者における８個の診断マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって調査した結果である。全患者がＡＭＬマーカー遺伝子と対照群遺伝子のみを発現する。
【図４】図４はｔ（８；２１）染色体変異を持つＡＭＬ患者における８個の診断マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって調査した結果である。全患者がＡＭＬマーカー遺伝子と対照群遺伝子のみを発現する。
【図５】図５は正常染色体を持つＢ−ＡＬＬ患者における８個の診断マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって調査した結果である。全患者がＢ−ＡＬＬマーカー遺伝子と対照群遺伝子のみを発現する。
【図６】図６はｔ（９；２２）染色体変異を持つＢ−ＡＬＬ患者における８個の診断マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって調査した結果である。患者５１を除いた全患者がＢ−ＡＬＬマーカー遺伝子と対照群遺伝子のみを発現する。
【図７】図７はＴ−ＡＬＬ患者における８個の診断マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって調査した結果である。全患者がＴ−ＡＬＬマーカー遺伝子と対照群遺伝子のみを発現する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008525047.tif 000016
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