(57)【要約】本発明は、標的とする抗原を高い親和力で結合するヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを含む濃縮製剤、及びその方法について提供するものである。本製剤における可変ドメインポリペプチドは、従来の抗体に比較して極めて小さく、VドメインモノマーはscFv分子よりも更に小さいため、治療に用いられる場合はインビボ標的にアクセスが容易になる。このポリペプチドの比較的小さいサイズと高い結合親和力により、より大きな抗体分子の製剤よりも、単位マス辺り、より多くの標的を結合させることができる。それにより、より良い効率で少量の投与で済むこととなる。【選択図】図１３
2008500268.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Kdが100nM以下であるペプチド抗原を結合するヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドが、280nm波長での吸光度による濃度は少なくとも400μMで存在する組成物.
【請求項２】
前記ポリペプチドが400μMから20mMの濃度で存在する請求項1の組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチド抗原がヒトのポリペプチド抗原である請求項1の組成物。
【請求項４】
前記ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインがVHドメインである請求項１の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドがヒトの免疫グロブリンVドメインよりなる請求項１の組成物。
【請求項６】
前記シングル免疫グロブリン可変ドメインがユニバーサルフレームワークを含む請求項1の組成物。
【請求項７】
前記ユニバーサルフレームワークが、ヒトの生殖細胞系列遺伝子セグメントDP47, DP45, およびDP38によりコードされるフレームワークよりなる群から選択されるVHフレームワーク、またはヒトの生殖細胞系列遺伝子セグメントDPK9によりコードされるVL フレームワークを含む請求項6の組成物。
【請求項８】
前記免疫グロブリン可変ドメインの、Kabatにより定義される一または二以上の前記フレームワーク領域が(a)ヒトのフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトのフレームワーク領域の少なくとも8つの連続するアミノ酸配列のアミノ酸、または（c）ヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む請求項1の組成物。
【請求項９】
一又は二以上の前記フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、または一又は二以上の前記フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応する前記フレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、全体で5つまでのアミノ酸の相違を含む請求項8の組成物。
【請求項１０】
フレームワーク領域FW1, FW2, FW3 およびFW4のアミノ酸配列が、ヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、またはFW1, FW2, FW3 およびFW4のアミノ酸配列が、前記ヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、全体で10までのアミノ酸の相違を含む請求項8の組成物。
【請求項１１】
前記VHドメインが、生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP47によりコードされる配列を含むが、H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, およびH98, よりなる群から選択される一又は二以上の位置においてDP47によりコードされる配列と異なっている請求項4の組成物。
【請求項１２】
前記VHドメインは、生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP47によりコードされる配列を含むが、H30, H31, H32, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H54, H55, H56, H58, H94, H95, H96, H97, H08, H99, H100, H100a, H100b, H100c, H100d, H100e, H100f, H100g, H101,およびH102よりなる群から選択される一又は二以上の位置においてDP47によりコードされる配列と異なっている請求項4の組成物。
【請求項１３】
前記VHドメインは、生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP47によりコードされる配列を含むが、H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H08, H99, H100, H100a, H100b, H100c, H100d, H100e, およびH100fよりなる群から選択される一又は二以上の位置においてDP47によりコードされる配列と異なっている請求項4の組成物。
【請求項１４】
前記VHドメインは、生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP47によりコードされる配列を含むが、H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a, およびH100b,よりなる群から選択される一又は二以上の位置においてDP47によりコードされる配列と異なっている請求項4の組成物。
【請求項１５】
前記ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインがVLドメインである請求項1の組成物。
【請求項１６】
前記ポリペプチドがヒトのシングル免疫グロブリンVLドメインよりなる請求項15の組成物。
【請求項１７】
前記VLドメインがVkドメインである請求項15の組成物。
【請求項１８】
前記VKドメインは、生殖細胞系列VK遺伝子セグメントDPK9によりコードされる配列を含むが、L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94,および L96よりなる群から選択される一又は二以上の位置においてDP47によりコードされる配列と異なっている請求項17の組成物。
【請求項１９】
前記VKドメインは、生殖細胞系列VK遺伝子セグメントDPK9によりコードされる配列を含むが、L28, L30, L31, L32, L34, L50, L51, L53, L91, L92, L93, L94,および L96よりなる群から選択される一又は二以上の位置においてDP9によりコードされる配列と異なっている請求項17の組成物。
【請求項２０】
さらに薬剤として受け入れられるキャリアーを含む請求項1の組成物。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、100nMから50pMのKdにおいて前記抗原を結合する請求項1の組成物。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、30nMから50pMのKdにおいて前記抗原を結合する請求項1の組成物。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、10nMから50pMのKdにおいて前記抗原を結合する請求項1の組成物。
【請求項２４】
ヒトの抗原が、ヒトのサイトカイン（cytokines）、サイトカイン受容体、酵素、酵素の補因子、およびDNA結合タンパク質よりなる群から選択される請求項1の組成物。
【請求項２５】
前記抗原がヒトのTNF-αである請求項1の組成物。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、100nM以下のIC50で、標準L929インビトロ  アッセイにおいて前記ヒトのTNF-αを中和する請求項25の組成物。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、TAR1-5-19(配列番号１６)を含み、または配列番号１６と少なくとも90％類似する配列を含む請求項26の組成物。
【請求項２８】
前記抗原はヒトのTNF-α受容体p55である請求項1の組成物。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、100nM以下のIC50で、標準L929インビトロ  アッセイにおいて、ヒトのTNF-αの細胞障害効果を抑制する請求項28の組成物。
【請求項３０】
前記ポリペプチドがTAR2(配列番号１４)含み、または配列番号14と少なくとも90％類似する配列を含む請求項28の組成物。
【請求項３１】
請求項１の組成物を生成する方法であって、
宿主細胞においてシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドをコードする核酸を発現させるステップであり、前記ポリペプチドは100nM以下のKdにおいてポリペプチド抗原を結合するステップ、及び
シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを、A280での吸光度により測定される数値で少なくとも400μMの濃度に濃縮するステップ
を含む、請求項1の組成物を生成する方法。
【請求項３２】
前記核酸が配列番号1, 3 ,5, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, および85の内の一の配列、またはこれらの内のひとつと少なくとも90％が同一である配列を含む請求項31の方法。
【請求項３３】
前記ポリペプチドがヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインのホモ多量体を含む請求項1の組成物。
【請求項３４】
前記ホモ多量体がホモ二量体またはホモ三量体である請求項33の組成物。
【請求項３５】
ホモ多量体のモノマーはマルチーサブユニット（multi-subunit）標的に特異である請求項34の組成物。
【請求項３６】
標的がヒトのTNF-αである請求項３5の組成物。
【請求項３７】
ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインを含む前記ポリペプチドが、前記ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインを含むヘテロ多量体を含む請求項1の組成物。
【請求項３８】
前記へテロ多量体が、ヘテロ二量体、またはヘテロ三量体である請求項37の組成物。
【請求項３９】
前記へテロ多量体のモノマーが、血清アルブミンを結合するシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを含む請求項37の組成物。
【請求項４０】
前記ホモ多量体に含まれる一又は二以上のモノマーが、遊離C-末端システイン残基を通してリンクされる請求項33の組成物。
【請求項４１】
さらに前記モノマーがリンカーぺプチド配列を含み、前記遊離システイン残基は前記リンカーペプチド配列のC末端に位置している請求項４０の組成物。
【請求項４２】
前記ホモ二量体中のモノマーがジスルフィド結合によりリンクされている請求項４１の組成物。
【請求項４３】
前記ホモ多量体はホモ三量体であり、前記ホモ三量体中のモノマーはTMEAとチオール（thiol）リンクにより化学的にリンクされている請求項３３の組成物。
【請求項４４】
治療を必要とする個体の病気または異常を、治療または予防する方法であって、前記個体に請求項１の組成物の治療上有効な量を投与することを含む方法。
【請求項４５】
前記ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインが、特にTNF-αまたは TNF-α  p55受容体を結合する請求項４４の方法。
【請求項４６】
請求項１の組成物のインビボ半減期を増大させる方法であって、該組成物にポリマー分子を共有結合させることを含む方法。
【請求項４７】
前記ポリマーが、置換され、または置換されていない直線状、または枝分かれした炭素鎖のポリアルキレン(polyalkylene)、ポリアルケニレン(polyalkenylene)、またはポリオキィシアルキレン（polyoxyalkylene）ポリマー、または枝分かれした、または枝分かれのない多糖類（polysaccharide）を含む請求項４６の方法。
【請求項４８】
前記ポリマーが、置換され、または置換されていない直線状の、または枝分かれした炭素鎖のポリエチレン  グリコール（polyethlene glycol）またはポリビニル  アルコール（polyvinyl alcohol）を含む請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記ポリマーがメトオキシ（ポリエチレン  グリコール）((methoxy)polyrthlane glycol))を含む請求項４8の組成物。
【請求項５０】
前記ポリマーがポリエチレン  グリコールを含む請求項４６の組成物。
【請求項５１】
前記ポリエチレン  グリコールの分子量が5,000から50,000kDである請求項５０の方法。
【請求項５２】
シングル免疫グロブリン可変ドメインを含む前記ポリペプチドが、少なくとも一つの共有結合しているポリマー分子を含む請求項1の組成物。
【請求項５３】
前記ポリマーが、前記ポリペプチドに含まれるシステイン(cysteine)、またはリシン（lysine）残基を通して該シングル免疫グロブリン可変ドメインを含む前記ポリペプチドにリンクされている請求項５２の組成物。
【請求項５４】
前記システインまたはリシン残基が、シングル免疫グロブリン可変ドメインを含む前記ポリペプチドに追加されている請求項53の組成物。
【請求項５５】
前記システインまたはリシン残基が、シングル免疫グロブリン可変ドメインを含む前記ポリペプチドのアミノ末端、またはカルボキシ末端に加えれられている請求項５４の組成物。
【請求項５６】
前記システインまたはリシン残基が、前記免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのC末端に存在する請求項52の組成物。
【請求項５７】
前記ポリマーが、置換され、または置換されていない直線状の、または枝分かれした炭素鎖のポリアルキレン(polyalkylene)、ポリアルケニレン(polyalkenykene)、またはポリオキシアルキレン（polyoxyalkylene）ポリマー、または枝分かれした、または枝分かれのない多糖類（polysaccharide）を含む請求項５２の組成物。
【請求項５８】
前記ポリマーが、置換された、または置換されていない直線状の、または枝分かれした炭素鎖のポリエチレン  グリコールまたはポリビニル  アルコールを含む請求項５２の方法。
【請求項５９】
前記ポリマーがメトキシ（methoxy）(polyethlene glycol）を含む請求項58の組成物。
【請求項６０】
前記ポリマーがポリエチレン  グリコールを含む請求項52の組成物。
【請求項６１】
前記ポリエチレン  グリコールの分子量が5,000から50,000kDである請求項６０の組成物。
【請求項６２】
前記ポリペプチドの流体力学サイズが少なくとも２４kDaである請求項60の組成物。
【請求項６３】
前記ポリペプチドの全PEGサイズが20から60kDaである請求項６２の組成物。
【請求項６４】
前記ポリペプチドの流体力学サイズが少なくとも２００kDaである請求項60の組成物。
【請求項６５】
前記ポリペプチドの全PEGサイズが20から60kDaである請求項６４の組成物。
【請求項６６】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの標的リガンドに対する親和力により測定する活性度が、PEG分子を欠いている同じポリペプチドに比べて少なくとも９０％の活性度のある請求項60の組成物。
【請求項６７】
前記組成物が、共有結合によりリンクされているポリエチレン  グリコールを欠いている同じ組成物に比べ増大したインビボ半減期を持つ請求項60の組成物。
【請求項６８】
tα半減期が、10％以上増大している請求項67の組成物。
【請求項６９】
tα半減期が、５0％以上増大している請求項67の組成物。
【請求項７０】
tα半減期が、2倍以上増大している請求項67の組成物。
【請求項７１】
tα半減期が、10倍以上増大している請求項67の組成物
【請求項７２】
tα半減期が、５0倍以上増大している請求項67の組成物。
【請求項７３】
tα半減期が、30分から12時間の範囲である請求項67の組成物。
【請求項７４】
tα半減期が、１時間から６時間の範囲である請求項67の組成物。
【請求項７５】
tβ半減期が、10％以上増大している請求項67の組成物。
【請求項７６】
tβ半減期が、５0％以上増大している請求項67の組成物。
【請求項７７】
tβ半減期が、2倍以上増大している請求項67の組成物。
【請求項７８】
tβ半減期が、10倍以上増大している請求項67の組成物。
【請求項７９】
tβ半減期が、５0倍以上増大している請求項67の組成物。
【請求項８０】
tβ半減期が、12時間から60時間の範囲である請求項67の組成物。
【請求項８１】
tβ半減期が、１２時間から２６時間の範囲である請求項67の組成物。
【請求項８２】
15mg.min/mlから150mg.min/mlのAUC値を持つ請求項67の組成物。
【請求項８３】
15mg.min/mlから100mg.min/mlのAUC値を持つ請求項67の組成物。
【請求項８４】
15mg.min/mlから75mg.min/mlのAUC値を持つ請求項67の組成物。
【請求項８５】
15mg.min/mlから50mg.min/mlのAUC値を持つ請求項67の組成物。
【請求項８６】
Kdが100nM以下において標的抗原を結合するシングル免疫グロブリンVLドメインを含むポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、280nm波長の吸光度により測定した濃度が少なくとも400μMで存在する組成物。
【請求項８７】
前記シングル免疫グロブリンVLドメインはヒトのVLドメインである請求項８６の組成物。
【請求項８８】
前記標的抗原はポリペプチド抗原である請求項86の組成物。
【請求項８９】
前記標的抗原はヒトのポリペプチド抗原である請求項86の組成物。
【請求項９０】
さらに薬剤として受け入れられるキャリアーを含む請求項８６の組成物。
【請求項９１】
前記ポリペプチドがヒトのシングル免疫グロブリンVLドメインのホモ多量体を含む請求項86の組成物。
【請求項９２】
前記ホモ多量体がホモ二量体またはホモ三量体である請求項９１の組成物。
【請求項９３】
請求項８６の組成物を生成する方法であって、
宿主細胞においてシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドをコードする核酸を発現させるステップであって、前記ポリペプチドは100nM以下のKdにおいてポリペプチド抗原を結合するステップ、及び
シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドをA280の吸光度による測定により少なくとも400μMの濃度に濃縮するステップ
を含む方法。
【請求項９４】
Kdが100nM以下においてポリペプチド抗原を結合するヒトのシングル免疫グロブリンVHドメインを含むポリペプチドを含む組成物であって、位置103（Kabatナンバーリングによる）の残基がアルギニン（arginine）であり、また前記ポリペプチドが、280nm波長での吸光度により測定した濃度が少なくとも400μMで存在する組成物.。
【請求項９５】
前記ポリペプチドが400μMから20mMの濃度で存在する請求項９４の組成物。
【請求項９６】
前記ポリペプチド抗原がヒトのポリペプチド抗原である請求項９４の組成物。
【請求項９７】
45の位置のアミノ酸残基が非荷電アミノ酸である請求項９４の組成物。
【請求項９８】
45の位置のアミノ酸残基がロイシン（leucine）である請求項９７の組成物。
【請求項９９】
４４の位置のアミノ酸残基がグリシン（glycine）である請求項９４の組成物。
【請求項１００】
47の位置のアミノ酸残基が非荷電アミノ酸である請求項９４の組成物。
【請求項１０１】
４７の位置のアミノ酸残基がトリプトファン（tryptophan）である請求項100の組成物。
【請求項１０２】
４４の位置のアミノ酸残基がグリシンであり、45の位置のアミノ酸残基がロイシンである請求項９４の組成物。
【請求項１０３】
４４の位置のアミノ酸残基がグリシンであり、４７の位置のアミノ酸残基がトリプトファンである請求項９４の組成物。
【請求項１０４】
45の位置のアミノ酸残基がロイシンであり、４７の位置のアミノ酸残基がトリプトファンである請求項９４の組成物
【請求項１０５】
４４の位置のアミノ酸残基がグリシンであり、45の位置のアミノ酸残基がロイシンであり、そして４７の位置のアミノ酸残基がトリプトファンである請求項９４の組成物。
【請求項１０６】
請求項９４の組成物を生成する方法であって、
宿主細胞においてシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドをコードする核酸を発現させるステップであって、前記ポリペプチドは100nM以下のKdにおいてポリペプチド抗原を結合するステップ、及び
シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドをA280での吸光度による測定により少なくとも400μMの濃度に濃縮するステップ
を含む方法。
【請求項１０７】
前期抗原が, TNF-α, p55 TNFR, EGFR, MMP-12, IgE, 血清アルブミン、インターフェロンガンマ、CEA およびPDK1よりなる群から選択される請求項1、８６または９４のいずれか一の組成物。
【請求項１０８】
Kdが100nM以下においてポリペプチド抗原を結合するシングル免疫グロブリン可変ドメインを含む持続放出投薬製剤であって、前記ポリペプチドは、280nm波長での吸光度により測定した濃度で少なくとも400μMで存在する組成物.
【請求項１０９】
経口または非経口投与用に調合される請求項108の持続放出投薬製剤。
【請求項１１０】
前記投薬製剤が、静脈、筋肉内、または腹腔内注射、あるいは着床、直腸および経皮投与からなる群より選択されるルートによる非経口投与に適している、請求項108の持続放出投薬製剤。
【請求項１１１】
前記着床は腫瘍内着床を含む請求項110の持続放出投薬製剤。
【請求項１１２】
請求項108の持続放出投薬製剤の投与を含む病気、または異常の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的とする抗原を高い親和力で結合するヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを含む濃縮製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００３年１０月８日出願の米国仮出願番号60/509,613に基づく優先権を主張するものである。本出願は、さらに２００４年６月３０日出願の米国を指定国とする、PCT/GB2004/002829に基づく優先権を、また、２００４年１月８日出願の米国仮出願番号60/535,076に基づく優先権を主張するものである。これらの優先権の基礎となる各出願の開示事項は、そのすべてが、引用により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
通常型抗体は、少なくとも４つのポリペプチド鎖を持つマルチサブユニットタンパク質分子である。例えば、ヒトのIgGは、機能的抗体を構成するジスルフィド結合である２の重鎖及び２つの軽鎖を持つ。通常型IgGのサイズは、約150ＫＤである。比較的大きなサイズであるため、完全な抗体（例えば、IgG,IgA, IgMなど）は、例えば、組織透過性で問題があるため、治療上の用途は限られている。そのため、抗原結合機能及び溶解性を持つ、より小さい抗体断片を同定し、生成することに非常に大きな努力がなされて来た。
【０００４】
抗体のポリペプチド重鎖及び軽鎖は、抗原の相互作用に直接関わる可変領域（Ｖ）、及び免疫エフェクターと非抗原特異相互作用において、構造的サポート及び機能を提供する不変領域（Ｃ）を有する。通常型の抗体の抗原結合ドメインは２つの別々のドメインから成りたっている。すなわち、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ：ＶＬはＶＫまたはＶλのいずれかであり得る）。抗体結合サイトは自身は、６つのポリペプチドループからなっており、その３つはＶＨドメイン（Ｈ１，Ｈ２及びＨ３）であり、３つはＶＬ（Ｌ１，Ｌ２及びＬ３）ドメインである。インビボでは、遺伝子セグメントの組合せの再配置により、ＶＨドメイン、及びＶＬドメインをコードするＶ遺伝子の種々の主要レパートリーが生み出される。Ｃ領域は軽鎖Ｃ領域（ＣＬと呼ぶ）、及び重鎖Ｃ領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域と呼ぶ）を含む。
【０００５】
多くの自然に発生する抗体の比較的小さい抗原結合断片が、タンパク質分解酵素による消化の後で同定されている。たとえば、これには、「Faｂ断片」（ＶＬ- ＣＬ‐Ｃ1Ｈ‐ＶＨ）、「Fab’ 断片」（重鎖ヒンジ領域をもつFab）及び「F(ab’)2断片」（重鎖ヒンジ領域により連結されたFab断片の二量体）を含む。遺伝子組み換え法は、「単鎖Fv」（可変断片部）または合成ペプチドリンカーにより結合されたＶL及びVH  よりなる「scFv」と呼ばれる、さらに小さい抗原結合断片を生成するのに用いられてきた。
【０００６】
自然発生的な抗体（例えば、ヒトの及び他の殆どの哺乳類）の抗原結合単位が、一組のＶ領域より成り立っていることは一般に知られている(VL/VH)が、ラクダ科においては軽鎖配列を欠く、十分機能的な、高度に特異な抗体を大きな割合で発現する。ラクダ科の重鎖抗体は、その不変領域を通じて二量体となるシングル重鎖のホモ二量体として存在する。これらのラクダの重鎖抗体の可変ドメインは、VHHドメインと呼ばれ、VHの断片として分離される場合は、高度な特異性を持って、抗原を結合する能力を持つ（Hamers-Casterman et al,.1993, Nature 363:446-449; Gahroudi et al.,1997, FEBS Lett. 414:521-526）。. 抗原結合シングルVHドメインは、また、例えば、免疫のあるハツカネズミ科の秘蔵から採った遺伝子ＤＮＡから増幅され、大腸菌で発現されたハツカネズミ科のVH遺伝子ライブラリーから同定されている（Ward et al., 1989, Nature 341:544-546）。Ward et al.,は分離されたシングルVHドメインを「ドメイン抗体」を意味する「dAb(s)」と名づけた。「dAb」は本明細書では、特に抗原を結合するシングル免疫グロブリン可変ドメイン（VH 、またはVL ）ポリペプチドを指す。「dAb」は他のＶドメインとは関係なく抗原を結合する。しかし、ここで用いられる「dAb」は、他のVH 、またはVLドメインとホモ、またはへテロ多量体して存在しうる。その場合他のドメインはdAbによる抗原結合には必要とされない、すなわちdAbはVH 、またはVLドメインを追加することなく独立に抗原を結合する。
【０００７】
シングル免疫グロブリン可変領域、例えば、VHHは知られている中で最小の抗原結合抗体単位である。治療で用いる場合ヒトの抗体が望ましい。主な理由は患者に投与した場合免疫反応を引き起こす可能性が小さいからである。上で見たように、分離した非ラクダ科VHドメインは、比較的溶解度が小さく、しばしば発現性が低い。
【０００８】
ラクダ科VHHをヒトの抗体と比べた場合、ヒトのVHドメインのVH /VLインターフェイスに対応するラクダ科VHHドメインのフレームワーク（framework）領域において、いくつかの重要な違いが明らかとなる。ヒトのVH３のこれら残基の変異は、よりVHH配列（特に、Gly44→Glu, Leu45→Arg, 及びTrp47→Gly）に近似しており、抗原結合活性を維持しているヒトのラクダ科化したVHドメインを作り出すために実施されている（Davies & Riechmann, 1994, FEBS Lett. 339:285-290）が、それは発現性及び溶解度を改善した。（本明細書で用いる可変ドメインのアミノ酸番号は、カバット（Kabat）ナンバリングによる（Kabat et al., 1991, Sequence of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.）。WO 03/035694 (Muylder-  mans) には、Trp103→Arg変異は非ラクダ科VHドメインの溶解度を改善することが報告されている。Davies & Riechmann(1995, Biotechnology N.Y. 13:475-479)にもまた、ラクダ科したヒトのVHドメインのファージ提示法によるレパートリーの作成、及び100-400nMの範囲において、親和力を持ってハプテン（hapten）を結合するクローンの選択について報告がされているが、タンパク質抗原を結合するために選択されるクローンの親和性は低いものであった。
【０００９】
WO00/29004(Plaskin et al) 及びReiter et al.(1999. J.Mol.Biol. 290:685-698)には、非常に安定性のある、かつ、ナノモル領域で親和性を持ってたんぱく質抗原を結合する、大腸菌で発現するハツカネズミの抗体の分離されたＶＨについての開示がある。WO 90/05144(Winter et al.)には、19nMの解離定数で、実験的な抗原リゾチームを結合するハツカネズミのＶＨドメイン抗体の断片についての記載がある。WO 02/051870(Entwistle et al.)には、117nMの親和力を持ち、Brucella抗原に特異なscFvを結合するＶＨドメイン、及びアンチFLAG IgGを結合するＶＨドメインを含む実験的抗原を結合するヒトのＶＨシングルドメイン抗体の断片についての記載がある。
【００１０】
Tanha et al(2001, J.Biol.Chem.276:24774-24780)には、実験的な抗原として用いられる、2つのモノクローン抗体を結合し、ミクロモルの範囲の解離定数を持つラクダ科化したヒトのＶＨドメインの選択についての記載がある。
【００１１】
US6,090,382(Safeld et al.)には、10 -8M以下の親和力でヒトのTNF-αを結合し、ヒトのTNF―αの解離のオフレート（Ｋoff）が10-3以下であり、標準L929細胞アッセイでヒトのTNF―α活性を中立化する、ヒトの抗体についての記載がある。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、標的とする抗原を高い親和力で結合するヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを含む濃縮製剤について提供するものである。本製剤における可変ドメインポリペプチドは、従来の抗体に比較して極めて小さく、VドメインモノマーはscFv分子よりも更に小さいため、治療に用いられる場合はインビボ標的にアクセスが容易になる。このポリペプチドの比較的小さいサイズと高い結合親和力により、より大きな抗体分子の製剤よりも、単位マス辺り、より多くの標的を結合させることができ、より良い効率で、投与量も少量で済む。
【００１３】
本明細書に記載のヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、非ラクダ科シングルドメイン抗体にしばしば見られる凝集や沈殿が伴うことなく高度に凝縮することができ、その結果、例えば、発現を比較的容易にし、保存安定性は増し、治療上でより多くの投与が可能となる。本明細書に記載の比較的小さいサイズの、ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、また特定の目的に使用のため、そのポリペプチドを結合させる形式を柔軟に選ぶことが可能となる。例えば、そのサイズが小さいため、本明細書に記載のヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、例えば、エフェクター、標的分子、または生物学的半減期を伸ばすエージェントと融合し、またはリンクさせることができる一方、通常の抗体を用いると同様な手順で、比較的小さなサイズの分子のまま止まることができる。本ポリペプチドはまた、単量体型に比べ、親和力が大きいホモ二量体やホモ三量体のような多量体や、またヘテロ（heteromeric）組成物に起因する追加機能特性を持ったヘテロ多量体のような、ポリペプチド多量体も含む。
【００１４】
本発明の，一つの特徴として100nM以下のKdを持で、ポリペプチド抗原を結合するヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを持つポリペプチドを含む組成物を包含することであり、そのポリペプチド濃度は、280nm波長による吸光度測定による数値で少なくとも400μMある。
【００１５】
ある実施の形態においては、ポリペプチドは400μMから20mMの濃度で存在する。
【００１６】
他の実施の形態においては、ポリペプチド抗原はヒトのポリペプチド抗原である。
【００１７】
他の実施の形態においては、ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインはVHドメインである。
【００１８】
他の実施の形態においては、ポリペプチドはヒトの免疫グロブリンVドメインからなる。
【００１９】
他の実施の形態においては、免疫グロブリンVドメインはヒト以外の哺乳類を起源とし、例えば、ヒト以外のVLドメインである。VLドメインが由来するヒト以外の哺乳類は、これに限らないが、例えば、ハツカネズミ、家ねずみ、雌牛、豚、ヤギ、馬、猿などが含まれる。
【００２０】
本発明の，他の一つの特徴としては100nM以下のKdにおいてポリペプチド抗原を結合するシングル免疫グロブリンVHドメインを含むポリペプチドをもつ組成物を包含することであり、その場合、103の位置（Kabatナンバーリングによる）の残基はアルギニンであり、またポリペプチドは、280nmの波長による吸光度測定による数値で少なくとも400μM濃度である。この場合VH ドメインはヒト、またはヒト以外、例えば、ラクダ科VHH、または、ハツカネズミ、家ねずみ、雌牛、豚、ヤギ、馬、猿などのヒト以外の種であってもよい。ある実施の形態においては、ポリペプチドは、その濃度が400μMから20mMで存在する。他の実施の形態においては、ポリペプチド抗原はヒトのポリペプチド抗原である
他の実施の形態においては、位置45のアミノ酸残基は非荷電アミノ酸である。他の実施の形態においては、位置45のアミノ酸残基はロイシンである。
【００２１】
他の実施の形態においては、位置44のアミノ酸残基はグリシンである。
【００２２】
他の実施の形態においては、位置４7のアミノ酸残基は非荷電アミノ酸である。他の実施の形態においては、位置47のアミノ酸残基はトリプトファンである。
【００２３】
他の実施の形態においては、位置４4のアミノ酸残基はグリシンであり、位置45のアミノ酸残基はロイシンである。
【００２４】
他の実施の形態においては、位置４4のアミノ酸残基はグリシンであり、位置47のアミノ酸残基はトリプトファンである。
【００２５】
他の実施の形態においては、位置４5のアミノ酸残基はロイシンであり、位置47のアミノ酸残基はトリプトファンである。
【００２６】
他の実施の形態においては、位置４４のアミノ酸残基はグリシンであり、位置45のアミノ酸残基はロイシンであり、位置４7のアミノ酸残基はトリプトファンである。
【００２７】
他の実施の形態においては、シングル免疫グロブリン可変ドメインはユニバーサルフレームワーク(universal framework)を持つ。他の実施の形態においては、ユニバーサルフレームワークはヒトの生殖細胞系列遺伝子セグメントDP47, DP45,及びDP38によりコードされるものの群から選択されるVHフレームワーク、またはヒトの生殖細胞系列遺伝子セグメントDPK9によりコードされるVLフレームワークを含む。
【００２８】
他の実施の形態においては、免疫グロブリン可変ドメインの一または二以上のフレームワーク（FW）領域（region）は(a)ヒトのフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトのフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも8つの隣接するアミノ酸、または（c）ヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸配列を含み、そのフレームワーク領域はKabatによる定義に従う。例えば、ある実施の形態においては、免疫グロブリン可変ドメインはヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによってコードされるFW2領域を含む。
【００２９】
他の実施の形態においては、一または二以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる、対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、または一または二以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列に比べて全体として最大5つまでのアミノ酸の違いを含む。
【００３０】
他の実施の形態においては、フレームワーク領域FW1,FW2,FW3,及びFW４のアミノ酸配列は、ヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、またはFW1, FW2, FW3, 及びFW４のアミノ酸配列は、ヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域の配列に比べて全体として、1,2,3,4,5,6,7,8,9,または10までのアミノ酸の違いを含む。
【００３１】
他の実施の形態においては、ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインは、生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP47によりコードされる配列を持つVHドメインであるが、H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97,及び H98よりなる群れから選択される一または二以上の位置においてDP47によりコードされる配列とその配列が異なっている。
【００３２】
他の実施の形態においては、VHドメインは、生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP47によりコードされる配列を持つが、H30, H31, H32,H33, H35, H50, H52, H52a, H53,H54,H55, H56, H58, H94, H95, H96, H97, H08, H99, H100, H100a, H100b, H100c, H100d, H100e, H100f, H100g, H101, 及びH102,よりなる群れから選択される一または二以上の位置においてDP47によりコードされる配列とその配列が異なっている。
【００３３】
他の実施の形態においては、VHドメインは、生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP47によりコードされる配列を持つが、H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58,  H95, H96, H97, H08, H99, H100, H100a, H100b, H100c, H100d, H100e,及び H100fよりなる群れから選択される一または二以上の位置においてDP47によりコードされる配列とその配列が異なっている。
【００３４】
他の実施の形態においては、ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインは、生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP47によりコードされる配列を持つVHドメインであるが、H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a, 及びH100bよりなる群れから選択される一または二以上の位置においてDP47によりコードされる配列とその配列が異なっている。
【００３５】
他の実施の形態においては、ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインはVLドメインである。他の実施の形態においては、ポリペプチドは、ヒトのシングル免疫グロブリンVLドメインよりなる。
【００３６】
他の実施の形態においては、VLドメインはVK ドメインである。
【００３７】
他の実施の形態においては、VKドメインは、生殖細胞系列VK遺伝子セグメントDPK9にコードされる配列を持つが、L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94, 及びL96よりなる群れから選択される一または二以上の位置においてDPK9によってコードされる配列とその配列が異なっている。
【００３８】
他の実施の形態においては、VKドメインは、生殖細胞系列VK遺伝子セグメントDPK9によりコードされる配列を持つが、L28, L30, L31, L32, L34, L50, L51, L53, L91, L92, L93, L94, 及びL96よりなる群れから選択される一または二以上の位置においてDPK9によりコードされる配列とその配列が異なっている。
【００３９】
他の実施の形態においては、組成物はさらに薬剤として受け入れられるキャリアーを含んでいる。
【００４０】
他の実施の形態においては、ポリペプチドは標的抗原を100nMから50pMのKdで結合する。
【００４１】
他の実施の形態においては、ポリペプチドは標的抗原を30nMから50pMのKd で結合する。
【００４２】
他の実施の形態においては、ポリペプチドは標的抗原を10nMから50pMのKdで結合する。
【００４３】
本明細書に記載のいずれの実施の形態においても、抗原は、例えば、ヒトのサイトカイン（cytokine）、サイトカイン受容体、酵素、酵素の補助因子、及びDNA結合タンパク質を含む、またはこれらよりなる群れから選択することができる。本明細書に記載のいずれの実施の形態においても、シングルドメイン免疫グロブリンポリペプチドの好ましい標的抗原は、これに限定されるものではないが、例えば、TNF-α、p55 TNFR, EGFR,マトリクス  メタロプロティナーゼ（MMP）−12, IgE, 血清アルブミン、インタフェロンγ、CEA 及びPDKIを含む。
【００４４】
これらの標的抗原のアミノ酸配列は、当業者によく知られている。抗原のアミノ酸配列が判れば、当業者は特にその抗原に結合する免疫グロブリンポリペプチドを選択する際に用いる抗原を作り出すことができる。例えば、ヒトのMMP-12配列はShariro et al.,1993,J.Biol.Chem.268:23824-23829に記載され、またジーンバンク受入番号P39900 にあり、ヒトのTNF-α配列は、Shirai  et al., 1985, Nature 313:803-806で報告されており、またジーンバンク受入番号P01375にある。ヒトのp55 TNFR配列はLoetscher et al., 1990, Cell 61:351-359に記載され、またジーンバンク受入番号P19438にある。ヒトの血清アルブミンの配列は、ジーンバンク受入番号AAU21642にある。ヒトのIgE配列は,  ジーンバンク受入番号CAA65057にある。ヒトのインフェロンγ配列は、ジーンバンク受入番号CAA00226にある。ヒトの癌胎児性抗原の配列は、ジーンバンク受入番号AAA51971にある。ヒトのPDK1配列は、ジーンバンク受入番号O15530にある。抗原ポリペプチドは、またしばしば商業的にも手に入れることが可能である。必須要件ではないが、これら、及び他の抗原はヒトの抗原であることが望ましい。
【００４５】
他の実施の形態においては、抗原はヒトのTNF-αである。他の実施の形態においては、ポリペプチドは、100nM以下のIC5で、ヒトのTNF-αを標準的L929によりインビトロアッセイにより無力化する。
【００４６】
他の実施の形態においては、ポリペプチドはTAR1-5-19 (配列番号16)、または配列番号16と少なくとも90％類似の配列を持つ。
【００４７】
他の実施の形態においては、抗原はヒトのTNF-αレセプターp55である。他の実施の形態においては、ポリペプチドはヒトのTNF-αの細胞毒性を100nM以下のIC50において、標準的L929でインビトロアッセイで抑制する。
【００４８】
他の実施の形態においては、ポリペプチドはTAR2 (配列番号14)と同じ、または配列番号14と少なくとも90％類似の配列を含む。
【００４９】
他の実施の形態においては、本明細書に記載の、濃縮されたシングル免疫グロブリン可変ドメイン組成物の各特長としては、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、配列番号2, 4, 6, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 87, 89, 90及び91よりなる群れから選択される一の配列を含む。
【００５０】
本発明はさらに、100nM以下のKdで、ポリペプチド抗原を結合するヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを含む組成物を作る方法を含み、その場合、ポリペプチドは、280nMの波長による吸光度測定による数値で少なくとも400μM濃度で存在する。この方法は、宿生細胞でシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドをコードする核酸を発現させるステップを含み、その場合、ポリペプチドは、100nM以下のKdでポリペプチド抗原を結合し、また、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを、A280による吸光度測定による数値で少なくとも400μMに濃縮される。
【００５１】
ある実施の形態においては、核酸は次の配列のうちの一つの配列を含むか、またはこれらの一つと90％類似する配列を含む。すなわち、配列番号1, 3, 5, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 及び85である。他の実施の形態においては、そのような核酸を持つベクターを含む。
【００５２】
本発明は、さらに100nM以下のKdでヒトの抗原を結合する、ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのホモ多量体を含み、その場合ポリペプチドは少なくとも400μMに濃縮されている。
【００５３】
ある実施の形態においては、ホモ多量体はホモ二量体またはホモ多量体である。
【００５４】
他の実施の形態においては、ホモ多量体を構成する一または二以上のモノマーは、遊離C末端のシステイン残基を通してリンクされる。他の実施の形態においては、モノマーはさらに、リンカーペプチド配列を含み、遊離システイン残基はリンカーペプチド配列のC末端に位置する。他の実施の形態においては、このホモ二量体中のモノマーはジスルフィド結合によりリンクされる。
【００５５】
他の実施の形態においては、ホモ多量体はこのホモ三量体であり、ホモ三量体中のモノマーはTMEAとチオール結合により化学的にリンクされる。
【００５６】
他の実施の形態においては、ホモ多量体のモノマーは、マルチサブユニット（multi-subunit）標的に特異である。他の実施の形態においては、標的はヒトのTNF-αである。
【００５７】
本発明はさらに、100nM以下のKdを持つポリペプチド抗原を結合するシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのヘテロ多量体を含むものであり、その場合ポリペプチドは、少なくとも400μMの濃度で存在する。ある実施の形態においては、ヘテロ多量体はヘテロ二重体、またはヘテロ三重体である。他の実施の形態においては、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドである。他の実施の形態においては、ポリペプチド抗原は、ヒトのポリペプチド抗原である。
【００５８】
本発明はさらに、シングル免疫グロブリン可変ドメインを含む持続放出製剤を含む組成物を含む。ある実施の形態においては、シングル免疫グロブリン可変ドメインは、ヒト以外の哺乳類のシングル免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、ラクダ科、または他のヒト以外の種のシングル免疫グロブリン可変ドメインの様な、ヒト以外の哺乳類のシングル免疫グロブリン可変ドメインである。他の実施の形態においては、シングル免疫グロブリン可変ドメインは、ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインである。
【００５９】
本発明はさらに、そのような治療を必要とする個体の病気、または異常を治療し、または予防する方法を含み、100nM以下のKdで、ポリペプチド抗原を結合するヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドを有する組成物の、治療上有効な量を個体に処方する方法を含んでいる。その場合ポリペプチドは少なくとも400μMの濃度で存在する。
【００６０】
ある実施の形態においては、ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインは、ヒトのポリペプチド抗原を特異的に結合する。他の実施の形態においては、ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインは、TNF-α、またはTNF-αp55受容体を特異的に結合する。
【００６１】
本発明はさらに、100nM以下のKdで、ポリペプチド抗原を結合するヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドを含む組成物の、インビボ（invivo）半減期を増大させる方法を含む。その場合ポリペプチドは、少なくとも400μMの濃度で存在する。その方法は、高分子を組成物に共有結合させることを含む。
【００６２】
ある実施の形態においては、ポリマーは置換した、または置換のない直線状、または枝分かれした炭素鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン、またはポリオキシアルキレン  ポリマー、または枝分かれした、あるいは枝分かれのない多糖類を含む。
【００６３】
他の実施の形態においては、ポリマーは置換した、または置換のない直線状、または枝分かれした炭素鎖ポリエチレン  グリコール  またはポリビニル  アルコールを含む。
【００６４】
他の実施の形態においては、ポリマーはメトキシ（ポリエチレン  グリコール）を含む。
【００６５】
他の実施の形態においては、ポリマーはポリエチレン  グリコールを含む。他の実施の形態においては、ポリエチレン  グリコールの分子量は5,000から50,000kDである。
【００６６】
本発明は、さらにシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド組成物の半減期を増大させる方法を含む。その方法は、構築物の血中半減期を増大させるポリペプチドを結合する第二のシングル免疫グロブリン可変ドメインに、シングル免疫グロブリン可変ドメインをリンクさせることを含む。ある実施の形態においては、第二のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、血清アルブミン、例えば、ヒトの血清アルブミンを結合する。
【００６７】
本発明はさらに、100nM以下のKdで、ポリペプチド抗原と結合するシングル免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドを有する組成物を含む。そのポリペプチドは、少なくとも400μMの濃度で存在し、またポリペプチドは、さらに、構築物の半減期を増大させる分子を結合する第二のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドにリンクしている。ある実施の形態においては、第二のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、血清アルブミン、例えば、ヒトの血清アルブミンを結合する。
【００６８】
本発明はさらに、100nM以下のKdで、ポリペプチド抗原を結合するヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドを有する組成物を含む。そのポリペプチドは、少なくとも400μMの濃度で存在し、またポリペプチドは共有結合した高分子を含んでいる。ある実施の形態においては、ポリペプチド抗原は、ヒトのポリペプチド抗原である。
【００６９】
ある実施の形態においては、ポリマーは、ペプチドに含まれるシステイン(cysteine)、またはリシン（lysine）残基を通してリンクされるシングル免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドにリンクされている。可変ドメインの全体的な折り畳み、あるいは立体構造に潜在的な影響を与える可能性より、−これはまた、抗原の結合親和性または特異性にも影響を与えるが‐、ポリマーは、可変ドメインポリペプチドのアミノ末端、またはカルボキシ末端に、あるいはその近辺に付加されていることが望ましい。したがって、他の実施の形態においては、システイン、またはリシン残基は免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのＣ末端にある。他の実施の形態においては、システイン、またはリジン残基は、シングル免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドに追加されたものである。他の実施の形態においては、システイン、またはリシン残基は、シングル免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドのアミノ末端、またはカルボキシ末端に追加されたものである。
【００７０】
他の実施の形態においては、ポリマーは置換した、または置換のない直線状、または枝分かれしたの炭素鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン、またはポリオキシアルキレン  ポリマー、または枝分かれした、または枝分かれのない多糖類を含む。
【００７１】
他の実施の形態においては、ポリマーは置換した、または置換のない直線状、または枝分かれした炭素鎖エチレン  グリコール、またはポリビニル  アルコールを含む。
【００７２】
他の実施の形態においては、ポリマーはメトキシ（ポリエチレン  グリコール）を含む。
【００７３】
他の実施の形態においては、ポリマーはポリエチレン  グリコールを含む。ある実施の形態においては、ポリエチレン  グリコールの分子量は5,000から50,000kDである.
他の実施の形態においては、ポリペプチドは少なくとも24kDaの流体力学サイズを持つ。他の実施の形態においては、ポリペプチドの全ポリエチレングリコール(PEG)サイズは20から60kDaである。
【００７４】
他の実施の形態においては、ポリペプチドは少なくとも200kDaの流体力学サイズを持つ。他の実施の形態においては、ポリペプチドの全PEGサイズは20から60kDaである。
【００７５】
他の実施の形態においては、PEG結合のポリペプチドは、PEG分子を欠いている同じポリペプチドに比較し、少なくとも90％の活性を維持している。活性はポリペプチドの標的リガンドとの親和性により測定する。
【００７６】
ある実施の形態においては、ポリペプチドはポリエチレングリコールと共有結合のリンクを欠いている同じポリペプチド組成物のものと比較して、インビボ半減期が増大している。
【００７７】
他の実施の形態においては、このポリペプチド組成物のｔα半減期は10％以上増大している。他の実施の形態においては、ポリペプチド組成物のｔα半減期は50％以上増大している。他の実施の形態においては、ポリペプチド組成物のｔα半減期は2倍以上増大している。他の実施の形態においては、ポリペプチド組成物のｔα半減期は10倍以上増大している。他の実施の形態においては、ポリペプチド組成物のｔα半減期は50倍以上増大している。
【００７８】
他の実施の形態においては、このポリペプチド組成物のｔα半減期は30分から12時間の範囲である。他の実施の形態においては、ポリペプチド組成物のｔα半減期は1時間から６時間の範囲にある。
【００７９】
他の実施の形態においては、このポリペプチド組成物のｔβ半減期は10％以上増大している。他の実施の形態においては、ポリペプチド組成物のｔβ半減期は50％以上増大している。他の実施の形態においては、ポリペプチド組成物のｔβ半減期は2倍以上増大している。他の実施の形態においては、ポリペプチド組成物のｔβ半減期は10倍以上増大している。他の実施の形態においては、ポリペプチド組成物のｔβ半減期は50倍以上増大している。
【００８０】
他の実施の形態においては、ｔβ半減期は12時間から60時間の範囲にある。他の実施の形態においては、ｔβ半減期は12時間から26時間の範囲にある。
【００８１】
他の実施の形態においては、組成物のAUC値は15mg.min/ml から150mg.min/mlである。他の実施の形態においては、組成物のAUC値は15mg.min/mlから100mg.min/mlである。実施の形態においては、組成値はAUC15mg.min/mlから75mg.min/mlである。
【００８２】
実施の形態においては、組成物のAUC値は15mg.min/mlから50mg.min/mlである。
【００８３】
本発明はさらに、100nM以下のKdで、標的抗原を結合するシングル免疫グロブリン可変VLドメインを含むポリペプチドを含む組成物を含むものであり、そこでのポリペプチドは、280nMの波長による吸光度測定による数値は少なくとも400μMの濃度で存在する。
【００８４】
ある実施の形態においては、シングル免疫グロブリン可変VLドメインはヒトのVLドメインである。
【００８５】
他の実施の形態においては、標的抗原はヒトの抗原である。
【００８６】
他の実施の形態においては、組成物はさらに薬品として受け入れられるキャリヤーを含む。
【００８７】
他の実施の形態においては、ポリペプチドは、シングル免疫グロブリン可変VLドメインのホモ多量体を含む。他の実施の形態においては、ホモ多量体はホモ二量体、またはホモ三量体である。
【００８８】
本発明はさらに、本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの非経口の、または経口での持続放出薬剤の剤形、及び製剤を含む。ある実施の形態においては、投薬剤形は静脈注射、筋肉内注射、腹腔内注射、移植、直腸及び経皮投与よりなる群れから選択されたルートによる非経口的投与に適している。他の実施の形態においては、移植は腫瘍内移植を含む。
【００８９】
本発明はさらに、本明細書に記載のようにシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド製剤の持続放出製剤処方を含む、病気、または異常を治療する方法を含む。
【００９０】
定義
ここで用いる「ドメイン」（domain）は、タンパク質の他の部分から独立した三次構造を保持する折り畳みタンパク質構造をいう。通常ドメインはタンパク質の離散的機能特質を掌り、多くの場合、他の残りのタンパク質、及び/またはドメインの機能を損なうことなく他のタンパク質に、追加され、移転され、または転位されることがある。
【００９１】
「シングル免疫グロブリン可変ドメイン」(single immunoglobulin variable domain)は、免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳みポリペプチドドメインをいい、抗原（例えば、解離定数500nM以下）を特異的に結合するものである。「シングル免疫グロブリン可変ドメイン」は、したがって、修飾された可変ドメインのみならず、完全な抗体可変ドメインを含む。修飾された可変ドメインは、例えば、一又は二以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列により代替されている。または「シングル免疫グロブリン可変ドメイン」は、また解離定数500nM以下（例えば、450nM以下、400nM以下、350nM以下、300nM以下、250nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下）および、完全長のドメインの標的抗原特異性を保持する可変ドメインの折り畳み断片のみならず、端が切断されたか、またはＮ−またはＣ−末端で末端伸張を含む抗体可変ドメインを含む。「ドメイン抗体」または「dAb」は、本明細書では「シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド」と同義である。
【００９２】
「シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド」(single immunoglobulin variable domain polypeptide)の用語は、単に分離したシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを含むのみならず、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド配列の一又は二以上のモノマーを含むより大きなポリペプチドを含む。そのような一又は二以上のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドモノマーを含む、より大きなポリペプチドは、共同で抗原分子を結合するVHドメイン及びVL ドメインを含むscFvポリペプチドと極めて対照的である。本明細書に記載のポリペプチドのモノマーはお互い独立に抗原を結合することができる。
【００９３】
ここで用いる「シングル免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列」(sequence characteristic of immunoglobulin variable domain)は、免疫グロブリン可変ドメインに包含される配列と、連続したアミノ酸が20を超えて（すなわち、少なくとも20を超える）、25を超え、30を超え、35を超え、40を超え、45を超え、さらに50を超えて相同なアミノ酸配列をいう。
【００９４】
ここで用いる「相同」(homology)または「類似」(similarity)は二つの核酸、あるいはアミノ酸配列が構造的に互いに似ている程度をいう。ここで用いる配列の「類似」は配列アラインメントの対応する位置においてアミノ酸配列が類似のアミノ酸残基を持つ程度をいう。その側鎖が類似して場合はアミノ酸は類似している。特に「類似」は互いに同類置換であるアミノ酸を含む。「同類」置換（“conservative”substitution）はブローサム（blosum）62置換マトリックス（Hentikoff and Hentikoff, 1992, Peoc. Natl. Acad. Sci. USA89:10915-10919）でのプラス点を持つ置換の何れをもいう。「配列Aが配列Ｂとｎ％似ている」とは、配列ＡとＢ間の最適全体アラインメントの位置のｎ％が同一のアミノ酸、または同類置換より成ることをいう。最適全体アラインメントは、ニードルマンーブンシュ（Needleman-Wunsh）アラインメントアルゴリズムの以下のパラメーターを用いて行うことができる：
ポリペプチドについて、
置換マトリクス：  ブローサム（blosum）62
ギャップ得点関数  -A-B*LG, ここでA=11(ギャップペルティ)、B=1(ギャップ  長さ  ペナルティ)、LＧはギャップの長さ。
【００９５】
ヌクレオチド配列について
置換マトリクス：  一致に対して10、不一致に対して０、
ギャップ得点関数：  -A-B*LG, ここでA=50(ギャップペルティ)、B=3(ギャップ  長さ  ペナルティ)、LＧはギャップの長さ。
【００９６】
典型的な、同類置換は、Met, Val, Leu 及びlle;   Ser, 及びThr;   Asp, Glu及びAsn残基;   Gle, Lys  及びArg残基,; またはPhe、及びTyr芳香族残基に見られる。
【００９７】
ここで用いる二つの配列が互いに「相同である」または「類似している」とは、ニードルマンーブンシュ（Needleman-Wunsh）アルゴリズム、またはTatusova & Madden, 1999, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250に記載された「BLAST 2配列」のいずれかを用いてアラインした場合に、その配列の少なくとも、85％が類似している場合をいう。アミノ酸配列が、「BLAST 2配列アルゴリズム」を用いてアラインする場合、Blosum 62 マトリクスは初期設定マトリクスである。
【００９８】
ここで用いる「低厳格」（low stringency）「中厳格」（medium stringency） 「高厳格」（high stringency）あるいは「極めて高い厳格条件」（very high stringency）は核酸のハイブリッド形成及び洗浄の条件についていう。ハイブリッド形成反応を実行するための手引きはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1.-6.3.6, に記載がある。この全ての記載は、この明細書に引用により組み入れられる。水性、及び非水性の何れの方法も、この参考文献に記載されており、いずれをも用いることができる。ここで特に取り上げるハイブリッド形成条件としては：（１）６Ｘ塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）温度約45℃、低厳格条件でハイブリッド形成し、続いて0.2XSSC, 0.1%SDS、少なくとも 50℃で2度洗浄する（洗浄温度は低厳格条件では55℃まで上げてもよい）（２）６Ｘ塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）温度約45℃、中厳格条件でハイブリッド形成し、続いて0.2XSSC, 0.1%SDS 60℃で1度または2度以上洗浄する。（３）６Ｘ塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）温度約45℃、高厳格条件でハイブリッド形成し、続いて0.2XSSC, 0.1%SDS 65℃で1度または2度以上洗浄する。そして望ましくは、(4) 0.5Mリン酸ナトリウム, 7%SDS, 65℃極めて高い厳格条件でハイブリッド形成し、続いて0.2XSSC, 1%SDS 65℃で1度または2度以上洗浄する。
【００９９】
ここで用いる「特異的に結合する」(specifically binding)は、表面プラスモン共鳴（surface plasmon resonance）分析、例えば、BIAcoreTM表面プラスモン共鳴システム及びBIAcoreTM運動評価ソフト（例えば、バージョン2.1）を用いて測定した解離定数（Kd）が１μM以下の免疫グロブリン可変ドメインにより、抗原を結合することをいう。特異的結合相互作用の親和性またはKdは、好ましくは、約500nM以下、より好ましくは300nM以下である。
【０１００】
ここで用いる「高親和性結合」(high affinity binding)は、100nM以下のKdで結合することをいう。
【０１０１】
ここで用いる「ヒトの免疫グロブリン可変ドメイン」(human immunoglobulin variable domain)は、ヒトの生殖細胞系列免疫グロブリンＶ領域に由来する配列を含むポリペプチドについていう。配列がヒトの個体から分離され、複製されたヒトの抗体遺伝子配列のライブラリー（またはヒトの抗体Ｖ領域遺伝子配列のライブラリー）から分離され、または複製されたヒトの生殖細胞系列Ｖ領域配列を用いて、一又は二以上の多様な配列（ランダム、あるいは標的を定めた変異生成による）が生み出される（その配列は、そして目標とする標的抗原に結合させるために選択されるが）場合、その配列は「ヒトの生殖細胞系列Ｖ領域に由来する」。最小でも、ヒトの免疫グロブリン可変ドメインは、自然発生するヒトの免疫グロブリン可変ドメイン配列と、少なくとも85%アミノ酸が類似である（例えば、87%, 90%, 93%, 95%,97%,99%,あるいはそれ以上の％で類似）。
【０１０２】
代替的に、または追加的に、「ヒトの免疫グロブリン可変ドメイン」は4つのヒトの免疫グロブリン可変ドメインフレームワーク領域（FW1-FW4）を含む可変領域である。ここでフレームワーク領域はKabat et al.,(1991,上記)の定義による。「ヒトの免疫グロブリン可変ドメインフレームワーク領域」はa)  ヒトのフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトのフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも8つの連続したアミノ酸を含むフレームワーク領域を含む。ヒトの免疫グロブリン可変ドメインは、ヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるFW1-FW4のアミノ酸配列を含むことがあり、またはヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列に比べ、FW1-FW4配列は全体として、最大10まで（例えば、１,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, あるいは10までのアミノ酸配列の違い）のアミノ酸配列の違いのある可変ドメインを含むことがある。
【０１０３】
ここで用いる「ヒトの免疫グロブリン可変ドメイン」は、可変領域が単にシングル免疫グロブリン可変ドメインとして存在するか、またはシングル免疫グロブリン可変ドメインが一又は二以上の追加的ポリペプチド配列と関連して存在するかを問わず、抗原を独自に特異的に結合することができるものをいう。 ここで用いる「ヒトの免疫グロブリン可変ドメイン」は、ヒト化された（humanized）免疫グロブリンポリペプチド、すなわち、不変領域において修飾され、ヒトにおいて免疫原性を低下させたヒト科以外の（例えば、ハツカネズミ、ラクダ等）免疫グロブリンを含まない。
【０１０４】
ここで用いる「の濃度」は、与えられたポリペプチドが単位容積当り規定の量、またはモル量で液体（好ましくは、水溶液）に溶解されることをいう。したがって、「濃度Ｘ」、または「少なくとも濃度Ｘ」のポリペプチドという場合、乾燥した、及び結晶化した形でのポリペプチド製剤は除く。
【０１０５】
ここで用いる「レパートリー」（repetoire）は、種々の変異体の集合体をいう。例えば、その一次配列で異なるポリペプチド変異体がある。本発明で用いられれるライブラリーは少なくとも1,000のメンバーを含むポリペプチドのレパートリーを含む。
【０１０６】
ここで用いる「ライブラリー」（library）は、異種のポリペプチド、または核酸の混合をいう。ライブラリーは、その各々がシングルポリペプチド、または核酸配列を持つメンバーより成る。この意味においては、ライブラリーはレパートリーと同義である。ライブラリーメンバー間の配列の違いはライブラリーの中の多様性が生ずる原因である。ライブラリーは単にポリペプチド、または核酸の混合した形、または核酸のライブラリーが変形を受けた、バクテリア、ビールス、動物あるいは植物の細胞などのような、有機体、または細胞の形をとることがある。好ましくは、各個々の有機体、または細胞は唯一の、または限られた数のライブラリーメンバーを含むのが良い。都合のよいことに、核酸にコードされるポリペプチドを発現させるために、核酸は発現ベクターに組み入れられる。したがって、好ましい態様として、ライブラリーは、宿生有機体の集団の形をとることもある。そこでは、各有機体は、、対応するポリペプチドメンバーを生み出すために発現させることが可能な核酸の形のシングルライブラリーメンバーを含む、一又は二以上の発現ベクターのコピーを持っている。したがって、宿生有機体の集団は、遺伝子的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードする潜在力を持つ。
【０１０７】
ここで用いる「抗原」（antigen）は、抗体、または抗体の結合領域（例えば、可変領域）に結合される分子をいう。典型的には、抗原はインビボで抗体応答を起こすことができる。抗原はペプチド、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、脂質、炭水化物、あるいは他の分子であってもよい。通常は、免疫グロブリン可変ドメインは特定抗原に対する標的特異性により選択される。
【０１０８】
ここで用いる「エピトープ」（epitope）は、免疫グロブリンVH /VL ペアーにより従来の方法で結合される単位構造をいう。エピトープは抗体の最小結合部位をいう。したがって、抗体の特異を示す標的を表す。シングルドメイン抗体の場合、エピトープは分離された可変ドメインに結合した単位構造を示す。
【０１０９】
ここで用いる「中和する」は、本明細書のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドについて用いる場合、ポリペプチドが、標的抗原の測定可能な活性、または機能に干渉することをいう。ポリペプチドは、標的抗原の測定可能な活性、または機能を少なくとも50％、好ましくは少なくとも60%, 70%, 80%, 90%, 95%以上、100%を含み100%まで抑制する(すなわち、標的抗原の効果、あるいは機能が検出されない)場合は、「中和する」ポリペプチドである。この標的抗原の測定可能な活性、または機能の減少は、当業者が一又は二以上のそのような活性、または機能を示す指標を測る標準的な方法を用いることにより評価することができる。例えば、標的がTNF-αである場合、中和活動は標準L929細胞殺滅アッセイにより、またはTNF-αに誘発される細胞活性化を測定するにより、TNF-αに誘発されるHUVECでのELAM-1の発現を抑制するシングル免疫グロブリン可変ドメイン活性を測定することにより評価することができる。
【０１１０】
ここで用いる「標的抗原の測定可能な活性、または機能」（measurable ativity or function of a target antigen）は、これに限定されるものではないが、例えば、細胞シグナリング、酵素活性、結合活性、リガンドに依存した内在化、細胞殺滅、細胞活性化、細胞生存の促進、及び遺伝子発現を含む。当業者は、標的抗原が与えられればそのような活性を測定するアッセイを実施することができる。
【０１１１】
ここで用いる「アゴニスト」（agonist）は、本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドに関して用いる場合、ポリペプチドが標的抗原の測定可能な機能、または活性を高め、または活性化することをいう。例えば、細胞表面にある受容体を結合するシングル免疫グロブリン可変ドメインが、受容体により細胞内シグナル伝達を活性化し、天然リガンドにより結合、またはシグナリングを高め、あるいは受容体/リガンド複合体の内面化を高める場合、可変ドメインポリペプチドはアゴニストである。アゴニストは、アゴニストが存在しない場合に比べ、または、代替的に、標的抗原の天然リガンドによる場合の増加に比べ、標的抗原の測定可能な活性を少なくともて50%増加させ、また好ましくは、それらの活性に比べ、少なくとも2倍、３倍、５倍、10倍、20倍、50倍、100倍以上増加させる。
【０１１２】
ここで用いる「ホモ二量体」（homodimer）、「ホモ三量体」（homotrimer）、「ホモ四量体」（homotetramer）、及び「ホモ多量体」（homomultimer）、は2，3、あるいはそれ以上（例えば、4，5等）数の、あるシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド配列のモノマーを含む分子をいう。例えば、ホモ二量体は、同じＶＨ配列の二つのコピーを持つこともある。シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのモノマーは、特異的に抗原を結合するシングルＶＨまたはＶL配列である。ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体、あるいはホモ多量体のモノマーは、例えば、モノマー間をペプチドリンカーで繋ぐ融合ポリペプチドとして発現させ、または翻訳後にモノマーを互いに直接、またはジスルフィド結合によるリンカーを通じて化学的に繋ぐ、または2、3、または多価のリンク部分にリンクさせることにより、リンクさせることができる。ある実施の形態においては、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体、あるいはホモ多量体のモノマーは、多腕（multi-arm）PEGポリマーによりリンクすることができる。その場合、二量体、三量体、四量体、あるいは多量体の各モノマーは多腕（multi-arm）PEGのPEGの一部分にリンクされる。
【０１１３】
ここで用いる「ヘテロ二量体」（heterodimer）、「ヘテロ三量体」（heterotrimer）、及び「ヘテロ多量体」（hetero-multimer）、は2，3、またはそれ以上（例えば、4，5等）の、少なくとも一つのシングル免疫グロブリン可変ドメインが、他の抗原と異なる抗原を結合するシングル免疫グロブリン可変ドメインを含む、分子をいう。例えば、ヘテロ二量体はある抗原を結合するシングル免疫グロブリンＶＨドメインであって、異なる抗原を結合する他の免疫グロブリンＶドメイン（例えば、他のＶＨドメイン）に融合している、シングル免疫グロブリンＶＨドメインを含むことがある。個々の結合ドメイン（モノマー）は、融合たんぱく質として発現させることで、直接に、またはペプチドリンカーにより、あるいは上述のホモ多量体について述べたように化学的にリンクさせることができる。同様に、ヘテロ多量体の「モノマー」は、また、シングルポリペプチドとして発現させることにより、または化学結合によりリンクさせることができる。
【０１１４】
ここで用いる「高分子」（polymer molecule）は、二またはそれ以上（すなわち、3以上、4以上、好ましくは、5, 10, 20, 50, 70, 90, 100以上、しばしばこれより大きい、例えば、1,000以上）の同一の結合単位を持つ共有化学結合により形成された化合物の部分をいう。ここで用いる「高分子」は、特に、当技術分野でしばしばポリマー（polymer）として呼ばれるポリペプチド、または核酸を除く。したがって、他のポリペプチドに融合したポリペプチドはポリマーに融合したポリペプチドではない。「高分子」はまた共重合体分子（co-polymer molecule）を含む。
【０１１５】
ここで用いる「半減期」（half-life）は、血清中のリガンド（シングル免疫グロブリン可変ドメイン）濃度がインビボで50％減少する時間をいい、例えば、リガンドの分解、及び/またはリガンドの自然のメカニズムによる消失（clearnce）
あるいは隔離によるものがある。本発明におけるリガンドは、インビボで安定しており、分解、及び/または消失、あるいは隔離に抵抗する分子に結合することによりその半減期を増大させる。典型的な場合、そのような分子は天然タンパク質であり、それ自身インビボで長い半減期を持っている。インビボで半減期を増大させる分子に特徴的とは言えない類似のリガンドよりその機能活性が長く続くならば、リガンドの半減期は増大する。したがって、HAS及び標的分子に特異なリガンドは、HASの特異性が存在しない同じリガンド−そのリガンドはHASを結合せず、他の分子を結合する−と比べられる。例えば、標的分子の第2のエピトープを結合することもある。典型的な場合、半減期は10%, 20%, 30%, 40%,50%またはそれ以上長くなる。半減期を2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍の範囲、またはそれ以上に増大させることも可能である。代替的に、または追加的に、半減期を30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍の範囲で増大させことも可能である。
【０１１６】
ここで用いる「持続放出」(extended release)、または、同等な用語である「制御放出」(controlled release)、あるいは「徐放」（slow release）は、個体に投与した後ある期間にわたり、ポリペプチド薬剤のような活性薬剤を放出する薬剤剤形（drug formation）をいう。ポリペプチド薬剤の持続放出は、薬剤形成の内容により、例えば、分、時、日、週、またはそれ以上に長い期間に亘り起こりうるが、実質的にすべての投与単位が、血液流を通して即座に吸収、または即座に分配される標準的な剤形と対照的である。好ましい持続放出剤形は一回の投与で、薬剤が、例えば、8時間以上、12時間以上、24時間以上、36時間以上、48時間以上、60時間以上、72時間以上、84時間以上、96時間以上、またはされには、例えば、1週間、または2週間以上、あるいは、例えば、1ヶ月以上持続して循環するレベルの場合である。
【０１１７】
ここで用いる「リガンド属」（generic ligand）は、レパートリー（repetoire）のすべてのメンバーに結合するリガンドをいう。リガンド属は、一般的には、抗体、または可変ドメインの抗原結合部位（binding site）を通して結合しない。リガンド属の、例としてタンパク質A 及びＬがあるが、これに限定されるものではない。
【０１１８】
ここで用いる「ユニバーサルフレームワーク」（universal framework）は、Kabat et al.(1991,上記)により定義される配列に保存される抗体の領域に対応する、またはChothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917,で定義されるヒトの生殖細胞系列免疫グロブリンレパートリー、または構造に対応するシングル抗体フレームワーク配列をいう。本発明は、またそのフレームワークにより、超可変領域のみでの変異により実質的にどの結合特異性をも誘導することができるを明らかにした、シングルフレームワーク、またはそのような一組のフレームワークの使用を提供する。
【０１１９】
発明の詳細な説明
本発明はシングル免疫グロブリン可変ドメイン、特定の標的分子、または抗原と高い結合親和力をもつシングル免疫グロブリン可変ドメイン、またはそのようなドメインの多量体を含むポリペプチドに関する。本発明はまた、高いモル濃度のかかるポリペプチドに関する。ラクダ科（VHH）のシングル免疫グロブリン可変VHドメインは高い結合親和力をもち、非ラクダ科のＶドメインに比べ溶解性が高いことが知られている。しかし、ラクダ科の抗体は、非ラクダ科の個体、例えばヒト、に投与した場合それ自身抗原性を持つため、治療用途の可能性は限られる。本発明は、高い結合親和力と高い溶解性を持つ、ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインを提供する。これらのＶドメインは共にVHドメイン 及びVLドメインである。
【０１２０】
本発明はまた、高い結合親和力と高い溶解性を持つVLシングル免疫グロブリン可変ドメインに関するものであり、そして高い溶解性を持つように、例えば、カバット（Kabat）ナンバーリングによる位置44, 45, 47 及び103のVH残基を変える場合等のように、修飾されたVドメインポリペプチドに関する。
【０１２１】
ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインの生成
ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインは種々の方法で生成することができる。これらの各アプローチには、核酸配列を準備し（例えば、増幅、変異などさせる）、操作する周知の方法が適用される。
【０１２２】
一つの方法は、重鎖、または軽鎖遺伝子のVH領域及びVL領域を増幅し、発現させ、クローンされた抗体を、望む抗原に結合させる方法である。VHドメイン及びVLドメインの境界はKabal et al.,(1991, 上記)に規定されている。重鎖、または軽鎖遺伝子のVHドメイン及びVLドメインの境界に関する情報は、ある抗原を結合することが知られている抗体によりコードされる、クローンされた重鎖、または軽鎖コード配列のVドメインを増幅するPCRプライマーのデザインに用いられる。増幅されたVドメインは、適当な発現ベクター、例えば、pHEN-1  (Hoogenboom et al.,1991, Nucleic Acids Res. 19:4133-4137)に挿入され、単独で、あるいは他のポリペプチド配列と融合して発現される。発現したVHドメインまたはVLドメインは、その後に、他の重鎖、または軽鎖ポリペプチドから分離され望む抗原に結合する高い親和性を持つものが、スクリーニングされる。本発明においては、結合のためのスクリーニングは技術分野で公知の技術により、または本明細書で以下述べる方法により行う。
【０１２３】
VHドメインまたはVLドメインのレパートリーは、例えば、ファージ提示法により、目標とする抗原に対してパニング（panning）することによりスクリーニングされる。バクテリオファージ展示ライブラリー及びラムダファージ（lambda phage library） 発現ライブラリーの構築は業界でよく知れており、また、例えば、以下のものに記載がある。すなわち、McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552; Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al, 1991, Nature 352: 624; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832; Burton et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci U.SA. 88: 10134; Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133; Chang et al.,1991, J. Immunol. 147: 3610; Breitling et al., 1991, Gene 104:147; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 16007; 及び Lemer et al. (1992) Science, 258: 1313。scFV ファージライブラリーは、例えば、以下に記載がある。Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85: 5879-5883; Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87: 1066-1070; McCafferty et al., 1990, 上記; Clackson et al., 1991, 上記; Marks et al., 1991, 上記; Chiswell et al., 1992, Trends Biotech. 10: 80; 及び Marks et al., 1992, （上記）。. バクテリオファージ  コートタンパク質に示されるscFV ライブラリーの種々の実施態様は記載した通りである。ファージ提示法のアプローチを改良したものもまた知られており、例えば、W096/06213  及びWO092/01047  (Medical Research Council et al)  WO97/08320 (Morphosys, 上記)に記載されている。 
VHドメイン またはVLドメインレパートリーは、自然発生的免疫グロブリン配列レパートリー、または合成レパートリーであっても良い。自然発生的レパートリーは、例えば、一又は二以上の個体から採取した免疫グロブリン発現細胞から採ったものである。そのようなレパートリーは、「純真な」（naive）、すなわち、ヒトの胎児、または新生児の免疫グロブリン発現細胞から、または、例えば、ヒトの成人のＢ細胞から採取したものを再配列したものである場合もある。自然のレパートリーは、例えば、Marks et al., 1991, J,  Mol. Biol. 222:582 及び Vaughan et al., 1996, Nature Biotech, 14:309 に記載されている。もし、望むなら、自然のレパートリーから同定されたクローン、または、標的抗体を結合するものであれば何れのレパートリーのものでも良いが、クローンは突然変異誘発に付され、さらに結合特性の改善された変異体を生成し、選択するためのスクリーングにかけられる。
【０１２４】
シングル免疫グロブリン可変ドメインの合成レパートリーは、クローンされたＶドメインに人工的に多様性を導入することにより準備される。合成レパートリーは例えば、Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227: 381; Barbas et at., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Nissim et al., 1994, EMBO J. 13:692; Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13: 3245; DeKriuf et al., 1995, J. Mol. Biol. 248: 97;及び WO 99/20749に記載されている。
【０１２５】
従来型の抗体の抗原結合ドメインは二つの離れた領域を含む。重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ：ＶＬは、ＶＫまたはＶλのいずれであっても良い）。そのような抗体の抗原結合部位は6つのポリペプチドループよりなり、3つはＶＨドメイン（H1, H2 及びＨ３）であり、3つはＶＬドメイン（L1, L2 及びL3）である。これらループの境界は、例えば、Kabat et al., (1991, 上記）に記載がある。VHドメイン及びVLドメインをコードするＶ遺伝子の種々のプライマリーレパートリーは、遺伝子セグメントの再配置の組合せにより、インビボで作り出すことができる。
【０１２６】
ＶＨ遺伝子は3つの遺伝子セグメント、ＶＨ、D及びＪH の組み換えで作り出す。ヒトにおいては、ハプロタイプ（haplotype）により、約51の機能ＶＨセグメント(Cook and Tomlinson (1995) Immunol Today 16: 237), 25の機能 D セグメント (Corbett et al.(1997) J. Mol. Biol. 268: 69） 及び 6 機能ＪH セグメント (Ravetch et al. (1981) Cell  27: 583)がある。ＶＨセグメントは、ＶＨドメイン（Ｈ1, 及びH2）の第1及び第２の抗原結合ループを形成するポリペプチドの領域をコードする。一方、ＶＨセグメント、Ｄ,及びＪH セグメントは、全体でＶＨドメイン（Ｈ3）の第3の抗原結合ループを形成する。
【０１２７】
ＶＨ遺伝子は、2つの遺伝子セグメント、ＶL、及びＪLのみの組換えで作り出す。ヒトにおいては、ハプロタイプにより、約40の機能ＶＫセグメント（Shaeble and Zachau(1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:1001）, 約31の機能Ｖλセグメント（Williams et al.,(1996).J. Mol. Biol. 264:220; Kawasaki et al., (1997) Genome Res.7: 250） 約5 の機能ＪＫセグメント(Hieter et al., (1982) J. Biol. Chem. 257:1516),及び約4 の機能Jλセグメント(Vasicek and Leder(1990) J.Exp.Med.172:609)がある。ＶＬセグメントは、ＶＬドメイン（L1 及びL2）の第1及び第２の抗原結合ループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードする。一方、ＶLセグメント、及びＪL セグメントは、両者でＶLドメイン（L3）の第3の抗原結合ループを形成する。このプライマリーレパートリーから選択される抗体は、少なくとも適度の親和性を持って殆ど全ての抗原に結合することできるほどの十分多様性を持っていると信じられている。高度の親和性をもつ抗体は再配置された遺伝子の「親和性成熟」により、インビボで作りだされ、その場合には、変異は改善された結合をベースとして免疫システムにより生成、かつ選択される。
【０１２８】
抗体の構造及び配列の分析により分るように、6つの抗原結合ループの内の5つ（H1, H2, L1, L2 L3）は、限られた数の主鎖コンフォメーション、あるいは極限構造(canonical structure)を持っている（Clothia and Lesk(1987) J.Mol Biol 196:901;Clothis et al.,(1989) Nature 342:877）主鎖コンフォメーションは、(i) 抗原結合ループの長さ、及び (ii)抗原結合ループ及び抗体フレームワーク中のキーポジションにある特定の残基、または残基のタイプにより決まる。ループの長さ、及びキーとなる残基の分析により、ヒトの抗体配列の大部分にコードされるH1, H2, L1, L2 及びL3の主鎖コンフォメーションを予測することができるようになった（Clothis et al.,(1992) J.Mol.Biol. 227:799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628;Williams et al(1996) J.Mol Biol. 264:220.  配列、長さ及び構造については（Ｄセグメントの使用により）Ｈ3領域はより多様であるが、また、それはループ、及び抗体フレームワークのキーポジションにある特定の残基の長さ、及びその存在、または残基のタイプに依存するショートループの長さに対して、限れらた数の主鎖コンフォメーションを形成する（Martin et all,(1996)  J.Mol.Biol.263:800; Shirai et al.(1996) FEBS Letters 399:1）。
【０１２９】
発明のある実施の形態においては、種々の抗原結合ループのCDRのいかなる部位における合成レパートリーに対し多様性を与えることはできるが、このアプローチは、適切に折り畳むことのできないドメインを増やし、抗原を結合する潜在力を持つ分子の割合が少なくなる結果を生ずる。残基が抗原結合ループの主鎖コンフォメーションに寄与していることを理解することにより、ＶＨドメイン、または、ＶＬドメインの合成レパートリーにおいて特定残基の多様化を同定することができる。すなわち、多様化は、主鎖コンフォメーションを維持するために必須ではない残基に導入するのが最も適しているのである。例として、ループＬ2の多様化について言えば、従来のアプローチはKabal et al.,(1991, 上記)に規定されているように、対応するCDR(CDR2)のすべての残基、7つ程度の残基であるが、を多様化するものである。しかし、L2については、自然発生抗体において位置50 及び53は多様であり、抗原と接触するのが観察されることが知られている。好ましいアプローチは、このループのこれらの２つの残基のみを多様化することであろう。この事実はは、抗原結合特異性の範囲を作り出すために必要な機能を多様化する点において、極めて大きな進歩を意味する。
【０１３０】
発明のある特徴として、合成可変ドメインレパートリーは、人工的に多様化された生殖細胞系列ＶＨ、またはＶK配列に基づく、ＶＨまたはＶKの背景から作りだされたものである。例えば、ＶＨドメインレパートリーは、クローンされた生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメントＶ3-23/DP47  (Tomlinson et al., 1992,J.Mol Biol.227:7768) 及び JH4b(図1及び2参照)に基づく。Ｖkドメインレパートリーは、例えば、生殖細胞系列ＶＫ遺伝子セグメントO2/O12/DPK9(Cox et al., 1994,Eur.J Immunol.24:827) 及び JK1(図3参照).に基づく。  多様性は、例えば、PCR変異によりこれらの、または他の遺伝子セグメントに導入される。多様性は、例えば、変異性のPCR（Hawkins, et al., 1992, J.Mol.Biol.  226：889）により、または化学的変異によりランダムに導入される。しかしながら、既に検討したように、多様性の導入は特定の残基を標的として導入されるのが好ましい。さらに、望む残基は、すべてのアミノ酸及びTAG 終止コドンをコードする変異プライマー（IUPAC 命名法を用い、N=G,A, T またはＣ，K=G, またはＴ）を用いるNNKコドンを導入して標的とすることが好ましい。
【０１３１】
同様な目的を達成する他のコドンも使用されており、その中にはNNNコドン（追加の終止コドンであるTGA 及びTAAを生み出す）、DVTコドン（(A/G/T)(A/G/C)T）, DVCコドン((A/G/T)(A/G/C)C)及びDVYコドン（(A/G/T)  (A/G/C) (C/T)）。DVTコドンはセリンの22％、チロシンの11％、アスパルギン酸（asgpargine）、グリシン（glycine）、アラニン（alanine）,アスパルギン（
aspartate),トレオニン（threonine） 及びシステイン（cysteine）をコードし、自然に存在するヒトの抗体の抗原結合部位のアミノ酸残基配分を最も近接して模倣する。レパートリーは、PCRプライマーを用いて、各部位において選択され縮重コドンを多様化することにより作られる。PCR変異は業界でよく知られている。しかし、本発明の方法において有用な、プライマーデザイン及びPCR変異について、以下の「PCR変異」のタイトルの項で検討する。
【０１３２】
一つの特徴として、図１に示すように、CDRs 1,2 及び3の多様性に対応して、部位H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97,及び H98,において、NNKコドンを用いて、ヒトの生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメントV3-23/DP47(Tomlinson et al. (1992), J.Mol.Biol.227：7768)及びJH4bに多様性が導入される。
【０１３３】
他の一つの特徴として、図２に示すように、CDRs 1,2 及び3の多様性に対応して、部位H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a, 及び H100bにおいて、例えば、NNKコドンを用いて、ヒトの生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメントV3-23/DP47及びJH4bに多様性が導入される。
【０１３４】
他の一つの特徴として、図3に示すように、CDRs 1,2 及び3の多様性に対応して、部位L30, L31,L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94, 及びL96において、NNKコドンを用いて、ヒトの生殖細胞系列ＶK遺伝子セグメント  O2/O12/DPK9及びJK1に多様性が導入される。
【０１３５】
多様化されたレパートリーは、業界でよく知られており、また例えば、WO99/20749に記載されているように、ファージ提示法ベクターにクローンされる。通常、本発明の実施に必要とされる核酸分子及びベクター構築物は、業界で入手可能であり、例えば、Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor, USA.にある標準的な実験室マニュアルに規定したやり方で構築され、かつ操作される。
【０１３６】
本発明の核酸の操作は典型的な場合としては、組み換えベクターにおいて行われる。ここで用いる「ベクター」(vector)は、をその発現、及び/またはその複製のために異種DNA（heterologous DNA）を細胞に導入するのに用いる個々の要素をいう。そのようなベクターを選択し、あるいは構成し、そして最終的に用いる方法は当業者に良く知られている。細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工染色体  及びエピソマルベクターを含む多くの種類のベクターが、一般に入手可能である。そのようなベクターは、単にクローン及び変異のために用いられることがある。代替的に、本発明のレパートリー（あるいは、プレレパートリー）メンバーが実施される場合に典型的であるが、遺伝子発現ベクターが用いられる。本発明で使用されるベクターは、望むサイズ、特に長さが0.25キロベース（kb）から40キロベース（kb）を含むポリペプチドコード配列に対応できるものが選択される。
【０１３７】
適当な宿生細胞は、インビトロのクローン操作の後にベクターにより形質転換される。各ベクターは種々の機能要素を持つており、その中には、通常、クローンする（ポリリンカー）（polylinker）部位、複製起点、及び少なくとも選択可能な一つの標識遺伝子（marker gene）を含む。もし、ベクターが発現ベクターである場合は、そのベクターはさらに、次の内の一つ、または二以上を持つ。すなわち、エンハンサー要素、プロモーター、転写終結及びシグナル配列であり、その各々はクローン部位の近くに位置しており、そのため本発明のポリペプチドレパートリーをコードする遺伝子に操作可能なようにリンクされる（operatively linked）。
【０１３８】
クローンベクター、及び発現ベクターは何れも、通常一又は二以上の選択された宿生細胞において、ベクターの複製を可能とする核酸配列を持っている。特にクローンベクターにおいて特徴的であるのは、この配列はベクターに宿生染色体DNAとは独立に複製を可能とするもので、また複製起点、または自己複製配列を含む。このような配列は種々の細菌、イースト、及びビールスにおいてよく知られている。プラスミドpBR322からの複製起点は殆どのグラム陰性バクテリアに適しており、2ミクロンプラスミド複製起点はイーストに適しており、種々のビールス複製起点（例えば、SV40, アデノビールス）は、哺乳類細胞でのベクターをクローンするのに役立つ。一般的に、COS細胞のような高レベルのDNAを複製することのできる哺乳類の細胞で用いるのでなければ、哺乳類発現ベクターには複製起点は必要とされない。
【０１３９】
都合の良いことには、クローンベクター、または発現ベクターはまた選択可能なマーカーと呼ばれる選択遺伝子も持っている。この遺伝子は選択培地で培養された形質転換宿生細胞の生存、あるいは成長に必要なタンパク質をコードする。したがって、選択遺伝子を持つベクターにより形質転換されない宿生細胞は、培地では生存できないであろう。典型的な選択遺伝子は、抗生物質及び他の毒素、例えば、アンピシリン(ampicillin)、ネオマイシン(neomycin)、メソトレクサート(methotrexate)、またはテトラサイクリン(tetracycline)等に対する抵抗力を与え、栄養要求性欠如を補填し、成長培地で得られない必須の栄養素を供給する。
【０１４０】
本発明のベクターの複製は、大腸菌で行うのが最も都合が良いため、大腸菌選択マーカーは、例えば、抗生物質アンピシリン（ampicillin）に対する抵抗力を与えるβラクタマーゼ（lactamase）遺伝子が有用である。これらは、pBR322,のような大腸菌プラスミド、またはpUC18,またはpUC19のようなpUCプラスミドから得ることができる。
【０１４１】
発現ベクターは、通常宿生生物により認識され、対象とするコード配列に操作可能にリンクされているプロモータを持っている。そのようなプロモータは誘導性があり、恒常的に形成される。「操作可能にリンクされ」という用語は、本明細書に記載の構成が、意図される方法で機能するような関係で並置されていることをいう。コード配列に「操作可能にリンクされ」ている制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合できる条件の下で達成できるように結紮される。
【０１４２】
原核宿生生物での使用に適したプロモータは、例えば、βラクタマーゼ（lactamase）及びラクトースプロモータ系、アルカリ（性）ホスファターゼ（alkaline phosphatase）、トリプトファン（tryptophan (trp)）プロモータ系、及びタック（tac）プロモータのようなハイブリッドプロモータを含む。バクテリア系で用いるプロモータは、また通常コード配列に操作可能にリンクされるShine-Dalgarno 配列を含む。
【０１４３】
本明細書に記載されるライブラリー、あるいはレパートリーにおいては、好ましいベクターは、ポリペプチドライブラリーメンバーに対応するヌクレオチド配列の発現を可能とする発現ベクターである。したがって、選択は別々の増殖、及びポリペプチドライブラリーメンバーを発現させる単一のクローンの発現により、またはどのような選択呈示システムによっても行うことができる。
【０１４４】
上述したごとく、好ましい選択呈示システムとしてバクテリオファージ呈示を使用する。その場合、ファージ、またはファージミド（phagemid）ベクターを用いることができる。好ましいベクターはファージミド（phagemid）ベクターであり、ファージミド（phagemid）ベクターは大腸菌複製起点（二重鎖複製）を持ち、またファージ複製起点（一本鎖DNAの生成）も持つ。そのようなベクターの操作及び発現は、当技術界で周知である（Hoogenboom & Winter, (1992),上記；Nissim et al. (1994) 上記）。簡潔にいえば、ベクターはファージミドに対する選択性を与えるため、βラクタマーゼ、または選択可能なマーカー遺伝子、及びpelBリーダー配列（これは発現ポリペプチドをペリプラスミド  スペースに向ける）、多重クローニング部位（ライブラリーメンバーのヌクレオチド版クローニング）、任意選択的に、一又は二以上のペプチドタッグ（検出のため）、任意選択的に、一又は二以上のTAG終止コドン、及びファージタンパク質pIIIよりなる発現カセットのラック（lac）プロモータ上流部分を含む（NからC末端まで）。大腸菌の種々のサプレッサー種及びノンサプレッサー種を使い、またグルコース、イソプロピル  チオーβ―Ｄガラクトシド（IPTG;  iso-propyl thio-β-D-galactoside）,またはVCS M13のようなヘルパーファージを加えることにより、ベクターは発現のないプラスミドとして複製され、大量のポリペプチドライブラリーメンバーのみを、またいはそのうちのいくつかは少なくとも一つのポリペプチドpIII融合コピーを表面にもつファージを作ることができる。
【０１４５】
好ましいベクターの一例としては、pHEN1 ファージミドベクター（Hoogenboom et al. 1991, Nucl.Acids Res. 19:4133-4137;  配列は、例えば、WO 03/031611 の配列番号７にある様に、入手可能である）であり、pIII融合タンパク質の生成はLacZプロモータのコントロール下にあり、LacZプロモータはグルコースの存在下で抑制され、そしてIPTGにより誘発される。例えば、TGIのような大腸菌サプレッサー種で生育される場合、遺伝子III融合タンパク質は生成されファージに包まれる、一方、例えば、HB2151のようなノンサプレッサー種で生育されると、、バクテリアペリプラスマ（bacterial periplasm）及び培地への可溶解性融合タンパク質の分泌を許すこととなる。遺伝子IIIの発現は、ヘルパーファージによる後の感染を防ぐが、ファージミドベクターを宿すバクテリアは、ファージを救済するVCSM13ヘルパーファージによる感染が起きる前にグルコースの存在下で増殖する。
【０１４６】
本発明によるベクターの構築では、通常の結紮技術を用いる。分離されたベクター、またはDNA断片は、必要とするベクターを作り出すために望ましい形に切裂かれ、仕立てられ、そして再結紮される。もし必要なら、正しい配列が構築されたベクターに存在するか否かを確認するための配列の分析が、標準的方法により行われる。発現ベクターの構築、インビトロでの転写、DNAの宿生細胞への導入、並びに発現、及び機能評価分析の実施に相応しい方法は、当業者に知られている。サンプル中の遺伝子配列の存在の検出、または、その増幅、及び/または発現は、例えば、Southern 分析、または Northern,分析、Western  吸着（blotting）,DNA, RNA またはタンパク質のドット吸着、インシツ（in situ） ハイブリッド形成、免疫細胞化学、または核酸またはタンパク質分子の配列分析等の通常の方法により数値化される。
【０１４７】
もし望むなら、当業者はこれらの方法の改変を容易に試みることであろう。
【０１４８】
PCR変異：
プライマーは、ポリペプチドレパートリーメンバーをコードする核酸レパートリーメンバーの組を準備するのに用いられる核酸分子プールの存在する標的分子の部分に相補的である。非常にしばしばプライマーは、化学的な、または酵素的な合成方法により準備される。変異オリゴヌクレオチド  プライマーは、異なる長さのオリゴヌクレオチドが使用されるが、通常その長さは15から100ヌクレオチドより成り、理想的には20から40ヌクレオチドである。
【０１４９】
典型的には、選択ハイブリッド形成は、2つの核酸配列が実質的に相補的である（少なくとも、14から25ヌクレオチド以上の長さにわたり、少なくとも約65％相補的であり、好ましくは、少なくとも約75％、より好ましくは少なくとも約85％、あるいは90％相補的である場合に起こる）。引用により、本明細書に組により組み入れられるKanehisa、1984、Nucleic Acid Res. 12:203を参照のこと。その結果、プライム部位（priming site）である程度のミスマッチが生じることは許容されると思われる。そのようなミスマッチは、モノ、ジ、またはトリ（mono-, di-, tri-）核酸のように、少ないと思われる。代替的に、ミスマッチは連続する一続きの4以上のヌクレオチドを含む領域（region）として本明細書において規定されるヌクレオチドのループを含んでいても良い。
【０１５０】
全体として、プライマーの、第二核酸分子へのハイブリッド形成の効率及び選択性に影響を与えるものとして5つの要素がある。それは、(i)プライマーの長さ、(ii)ヌクレオチド配列、及び/または構成、(iii) ハイブリッド温度、(iv)化学緩衝液作用（buffer chemistry）(v)プライマーがハイブリッド形成するのに必要とする領域での立体障害の可能性であり、ノンランダムプライマー配列がデザインされる場合には考慮されねばならない重要点である。
【０１５１】
プライマーの長さと、プライマーが標的配列にアニールする際の効率及び精度の両者との間には明らかな相関関係がある。長い配列ほど短いものより溶解温度（TM）が高く、その標的配列の中で繰り返される度合い少ない。そのため無差別ハイブリッド形成を最小限にすることができる。高いG-C結合をもつ配列、またはパリンドローム 配列（palindromic  sequence）を含むプライマー配列は、その目標とする標的部位がそうである様に、自己ハイブリッド形成し易い。
【０１５２】
2分子であるよりも単分子であるため、ハイブリッド運動は通常溶液中の方が有利であるためである。また、同時に標的配列を固く結合させるために十分な数のG-Cヌクレオチドペアーを持つプライマーをデザインすることが重要である。なぜなら、A-T塩基ペアーには2つしかないが、各ペアーは3つの水素結合で結合しているからである。ハイブリッドの温度は、例えば、ハイブリッド混合物に含まれることもあるフォルムアルデヒドのように有機溶剤の濃度、プライマーのアニールの効率と正反対方向に変化する。その一方、塩濃度が増すと結合を促進する。厳格なハイブリッド形成条件の下では、プローブ（probe）が長ければ長いほど、短い場合よりも効率よくハイブリッド形成することができる。短いプローブは、緩い条件下ではそれで十分であろう。プライマーにとり厳格なハイブリッド条件には、典型的な場合として、塩濃度条件が約1M未満、通常は約500mM未満、好ましくは約200mM未満であることを含む。ハイブリッド温度は低い場合は０℃から２２℃以上、約30℃以上であり、さらに（非常にしばしば）約37℃を超える。断片が長い場合には特定のハイブリッド形成にはより高いハイブリッド温度が要求される場合がある。ハイブリッド形成条件は幾つかの要件により影響を受けるため、その内のどれか一つを絶対基準よりも、それらのパラメータの組合せがより重要となる。
【０１５３】
プライマーはこれらを考慮してデザインしなければならない。当業者は頭の中で多くの配列の相対的なメリットを判断することもできるかもしれないが、これらの幾つかのパラメータの評価を助けまた及びプライマー配列の適正化を支援するためのコンピュータプログラムがデザインされている。そのようなプログラムは、例えば、”PrimeSelect” of the DNAStarTM ソフトパック（DNAStar, Inc.; Madison, WI）及び OLIGO 4.0 (National Bioscience, Inc) がある。デザインが一度決まれば、適当なオリゴヌクレオチドが適当な方法で準備される。例えば、Beaucage and Carruthers, 1981, Tetrahendron Lett. 22:1859, に記載されているフォスフォラミダイト（phosphoramidite）法、あるいはMatteucci and Caruthers, 1981,J.Am.Chem.Soc, 103:3185, のトリエステル（Triester）法であり、その何れも本明細書に引用により組み入れられる。あるいは、商業的自動オリゴヌクレオチド合成、あるいは例えば、VLSIPSTM 技術を用いる他の化学的方法によるものがある。
【０１５４】
PCRは、テンプレートDNA（少なくとも１fg; より有用には1-1000ng）と少なくとも25pmolのヌクレオチドプライマーを使って行う。プライマープールが非常に不均一である場合には、各配列がプールの一部分の分子によってのみ代表され、その量は後の増幅サイクルで限定的となるため、より大量のプライマーを使うのが都合が良い。典型的な反応ミックスには、DNA  2μl, オリゴヌクレオチプライマー  25pmol,  10XPCR buffer 1（Perkin Elmer）を 2.5μl,  1.25μM dNTP を0.4μl, Taq DNA ポリメラーゼ、0.15μl (または2.5 単位)  （Perkin Elmer）及び非イオン化水前容量で25μl。ミネラルオイルで薄く覆い、PCRはプログラム可能な熱循環装置（thermal cycler）を用いて行う。
【０１５５】
PCRサイクルの各ステップの時間、温度はサイクル数と同様に効果に求められる厳格度により調整する。アニール温度及びそのタイミングは、プライマーが鋳型にアニールする効率及び許容されるミスマッチの程度の両者により決める。明らかに、核酸分子が同時に増幅され、かつ変異される場合は、ミスマッチは少なくとも合成の第一ラウンドでは認める必要がある。変異プライマーのミックスプールを使用して分子集合を増幅する場合、低融解温度にのみ起因する変異製品としての可能性のある製品についての、厳格な（高温）アニール条件でのロスが、標的部位以外へのプライマーの無差別なアニールによる配列に対して比較される。プライマーアニール条件を最適化することは、十分に当業者の知識の範囲に入るものである。アニールは30℃から72℃の間の温度で行われる。鋳型分子の最初の変性（denaturation）は通常92℃及び99℃の間の温度で4分間行い、続いて変性（94−99℃で15秒から1分）、アニール（温度は上で検討した通り、1−2分）、及び延長（extension）(72℃で1−5分、増幅される製品の長さによる)）を行う。最終延長は通常72℃で4分間であり、さらに4℃で時間不定（0から24時間）のステップが続く場合もある。
【０１５６】
抗原結合シングル免疫グロブリン可変ドメインのスクリーニング
ファージの表面でのシングル免疫グロブリン可変ドメインのレパートリーの発現に続いて、選択はファージレパートリーを固定化標的抗原に接触させ、結合していないファージを除くために洗浄し、結合ファージを増殖されることにより行う。全体の工程は、しばしば「パニング」（panning）と呼ばれる。代替的に、ファージは、折り畳まれたメンバーのみにより結合される固定化リガンド属（例えば、タンパク質A、または、タンパク質Ｌ）に対しパニングすることにより、適切に折り畳まれたメンバー変異体の発現のために事前に選択されることもある。これは、機能しないメンバー（non-functional member）の割合を減らし、その結果標的抗原と結合するメンバーの比率を増やすという利益がある。リガンド属を用いて予め選択することは、WO 99/20749に教示がある。ファージ抗体ライブラリーのスクリーニングについては、例えば一般的にHarrison et al., 1996, Meth. Enzymol. 267:83-109に記載されている。
【０１５７】
スクリーニングは通常、固定化した土台、例えば、プラスチックのチューブ、またはウエル（well）、あるいはクロマトグラフィーマトリクス、例えば、SepharoseTM  (Pharmacia)  に固定化された精製抗原を使い行う。スクリーニングまたは選択はまた、細胞の表面のような、複合抗原で行うこともできる。（Marks et al., 1993, Bio Technology11:1145; de Kruif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:3938）他の代替的方法は、溶液中でビオチニル化抗原（biotinylated antigen）を結合することにより選択し、続いてストレプトアビジン(streptavidin)によりコートされた小球上で捕捉する方法がある。
【０１５８】
好ましい場合として、パニングは、抗原（包括的、または特定の）をチューブ、または皿のウエル、例えば、Nunc MAXISORPTM  immunotube 8 well strip上に固定化することにより行う。ウエルは、150μl の抗原（100μg/ml 生理食塩水（PBS））で覆い、一夜培養する。ウエルはその後、生理食塩水（PBS）で3度洗浄し、37℃、400μl の生理食塩水（PBS）-2%スキムミルク（2％MPBS）で2時間遮断する。ウエルはPBSで３度すすぎ、そしてファージは2％のMPBSに加える。混合物は室温で90分間培養され、非結合ファージを含む液体は除かれる。ウエルはPBS-0.1% tween 20 で10度すすぎ、その後PBSで10度すすいで洗剤を除去する。結合ファージは、新たに準備した100mM  トリエチルアミン（triethylamine）を200μl加えて、ウエルを攪拌し室温で10分間培養して溶離する。溶離されたファージは、100μl の1M Tris-HCL, pH7.4を含むチューブに移し、トリエチルアミンを中和するために攪拌する。幾何級数的に成長する大腸菌宿生細胞（例えば、TG1）には,例えば、37℃で30分培養することにより、150mlの溶離ファージが感染する。感染した細胞はスピンダウンし、新たな媒体で再懸濁され、そしてアガロース上で平板培養される。ファージプラーク（plaque）は溶離され、または分析用に増殖させるためまたはさらに選択をするために、宿生細胞ので新たな培養中に取り出される。選択されたファージが純粋な集合のものであるかを確認するため、必要なら、１または2回以上のプラーク精製が行われる。他のスクリーニングアプローチはHarrison et.al.,1996, （上記）に記載されている。
【０１５９】
望む標的を結合するシングル免疫グロブリン可変ドメインを発現するファージの同定の後に、pHEN1のようなファージミドベクターが使用された場合は、可変領域融合タンパク質は、例えば、可溶性遺伝子III溶融タンパク質の分泌を可能にするHB2151のような、ノンサプレッサーバクテリア種を感染させることにより液状の形式により容易に作り出すことができる。代替的に、Ｖドメイン配列は、業界で公知の方法により、適当な発現ベクターにサブクローンされ（sub-cloned）、可溶性タンパク質を作り出すことができる。
【０１６０】
シングル免疫グロブリン可変ドメインの精製、及び濃縮
ペリプラスミド  スペース（periplasmic space）またはバクテリア培地に分泌されたシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、公知の方法で集菌され、精製される（Harrison et.al.,1996,  上記）。Skerra & Pluckman(1988, Science 240:1038) and Breitling et al.,(1991, Gene 104:147)には、ペリプラスミからの抗体ポリペプチドの集菌についての記載がある。Better et al. (1988, science 240:1041)には培養上澄みからの集菌についての記載がある。精製はまた、タンパク質Aまたはタンパク質Lのようなリガンド属に結合させることにより実現することができる。代替的に、可変ドメインは、例えば、親和性クロマトグラフィーによる精製を容易にするMyc, HA または6X-His タッグのようなペプチドタッグによリ発現させることができる。
【０１６１】
ポリペプチドは業界でよく知られた幾つかの方法、例えば、限外ろ過、ジアフィルトレイション（diafiltration）、接線流ろ過を含む幾つかの方法で濃縮することができる。限外ろ過のプロセスでは半浸透性の細胞膜を使い、サイズと形によって分子種を分離するため圧力を加える。圧力はガス圧、もしくは遠心力によるものである。商業的な限外ろ過製品は、例えば、Millipore(Bedford, MA:その例には、CentriconTM  及びMicroconTM濃縮器を含む)及びVivascience(Hannover, Germany, その例には、VivaspinTM濃縮器を含む)。
【０１６２】
標的ポリペプチドよりの小さい分子量（通常標的ポリペプチドの分子量の1/3から1/6、しかしその差が、10kD程度に小さいものは有用に使用することができる）のものを切り離して選択することにより、溶媒、及びより小さな溶質は細胞膜を通過するが、ポリペプチドは留まる。したがって、約5kDの分子量のものを切り離すことは、本明細書記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの濃縮には有用である。
【０１６３】
「洗浄」プロセスをもつ限外ろ過細胞膜を使う、ダイアフィルトレイション（diafiltration）は、ポリペプチドの調合液の塩、または緩衝剤を除去し、またはこれを交換したい場合に使用する。ポリペプチドは溶媒,及び小さな溶質は細胞膜を通過させることにより濃縮し、残っている塩、または緩衝剤は、得たポリペプチドを、限外ろ過はその間継続して行いながら、必要に応じて、新しい緩衝液または塩溶媒、あるいは水で洗って除去する。さらに継続するダイアフィルトレイションでは新しい緩衝液を、細胞膜を通過する率と同率で加える。一ダイアフィルトレイションの容量はダイアフィルトレイションを開始する前のポリペプチド溶液の容量である。ダイアフィルトレイションを継続して行い、新しい緩衝液を用いて、６ダイアフィルトレイション容量を通して洗浄することにより、完全に浸透する溶媒の99.5％が除去される。代替的に、非継続プロセスで行うこともできる。その場合は、塩または緩衝剤を除き、あるいは交換するために、サンプルは繰り返し希釈され、ろ過されて再び元の容量にもどされて、最終的にポリペプチドを濃縮する。ダイアフィルトレイションのための機器、及びその使用方法詳細は、例えば、Pall Life Sciences (Ann Arbor, MI) 及びSartorius AG/Vivascience (Hanover, Germany)から入手が可能である。
【０１６４】
接線流ろ過（TFF）は、また「クロスフローろ過」（cross−flow filtration）としても知られているが、この方法もまた限外ろ過細胞膜を使用する。標的ポリペプチドを含む液は細胞膜の表面に沿って接線方向に押し出される。圧力により液の一部は細胞膜を通過するが、標的ポリペプチドはフィルターの上に残る。
【０１６５】
しかし、標準的限外ろ過に比べ、残った分子は細胞膜の表面に堆積しないで接線流により運ばれる。フィルターを通過しない液（標的ポリペプチドを含む）は、所望濃度を得るために細胞膜を通して繰り返し循環させることができる。TFF用の機器及びその使用方法詳細は、例えば、Millpore(例えば、Proflux M12TM Benchtop TFF system 及び PekiconTM systems), Pall Life Sciences (例えば、MinimTM Tangential Flow Filtration system)から入手可能である。
【０１６６】
タンパク質の濃縮は、業界でよく知られた多くの方法で測定される。これには、例えば、アミノ酸分析280nmでの吸光度測定による、「Bradford」 及び 「Lowry 」方法  及びSDS−PAGE がある。最も精度の高い方法は、全加水分解の後にHPLCによるアミノ酸分析をする方法である。その後既知のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド配列と比べて、濃度を決定する。この方法は最も正確ではあるが、費用と時間がかかる。280nmのUV吸光度の測定によるタンパク質の決定が、より速く、また費用もかなり少なくて済み、精度も比較的高いので、アミノ酸分析の妥協策として好まれる。
【０１６７】
280nmでの吸収度測定は、本明細書に記載の実施例に報告されているタンパク質濃度の決定に用いられた。
【０１６８】
「Bradford」及び「 Lowry」タンパク質アッセイ（Bradford、1976, Anal, Biochem. 72:248−245; Lowry et al., 1951.J..Biol.Chem.193:265−275）は、サンプルタンパク質濃度を、多くの場合ウシの血清アルブミン（BSA）に基づく標準曲線と比較している。これらの方法は精度が劣り、シングル免疫グロブリン可変ドメインの濃度を低く見積もり勝ちである。しかし、この精度は、ＶHまたは、ＶＫシングル可変ドメインポリペプチドを標準に用いることで改善させることができよう。
【０１６９】
その他のタンパク質アッセイ方法として、米国特許No. 4,839.295(本明細書に引用により組み入れられる)  及び「BCA Protein Assy」（例えば、Pierce Catalog No.23227）として Pierce Biotchnology(Rockford, IL)から、販売されているものがある。
【０１７０】
SDS−PAGE 法はゲル電気泳動と、例えば、既知のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの量のような既知の濃縮標準と比較したCoomassie Blue  staining を用いる。数量化は、肉眼または写真濃度測定により行うことができる。
【０１７１】
本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメイン抗原結合ポリペプチドは、高濃度で高い溶解度を持っている（例えば、水溶液（例えば、PBS）中で少なくとも4.8mg(~400μＭ), 好ましくは少なくとも5mg(~417μＭ), 
10 mg/ml (〜833 μM), 20 mg/ml (〜1. 7 mM), 25 mg/ml (〜2. 1 mM), 30 mg/ml (〜2. 5 mM), 35 mg/ml (〜2. 9 mM), 40 mg/ml (〜3. 3 mM), 45 mg/ml (〜3. 75 mM), 50 mg/ml (〜4. 2 mM), 55 mg/ml (〜4. 6 mM) 60 mg/ml (〜5. 0 mM), 65 mg/ml (〜5. 4 mM), 70 mg/ml (〜5. 8 mM), 75 mg/ml (〜6. 3 mM), 100 mg/ml (〜8. 33 mM), 150 mg/ml (〜12. 5 mM), 200 mg/ml (〜16. 7 mM), 240 mg/ml (〜20 mM) またはこれ以上)。
【０１７２】
高い溶解度を示す、一つの構造的な特徴として、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのサイズが比較的小さいことがある。通常の４鎖抗体の全長は、例えば、IgGはそのサイズは150kDである。これに対し、シングル免疫グロブリン可変ドメインは、すべて4つのフレームワーク（FW）領域及び3つCDRを含む一般的構造をもっており、そのサイズは約12kDであり、これは通常の抗体の1/10以下のサイズである。同様に、シングル免疫グロブリン可変ドメインは、scFV分子（~26kD）の約1/2のサイズであり、またFab分子（~60kD）の約1/5のサイズである。本明細書に開示のシングル免疫グロブリン可変ドメイン構造を含むサイズは、100kD 以下であることが望ましく、例えば、約90kD以下、約80kD以下、約70kD以下、約60kD以下、約50kD以下、約40kD以下、約30kD以下、約20kD以下、さらに約12kDまでのものを含み、あるいは分離されたシングル免疫グロブリン可変ドメインである。
【０１７３】
ポリペプチドの溶解度は主に、アミノ酸側鎖の周辺溶媒（surrounding solvent）との相互作用より決まる。疎水性側鎖はポリペプチドが折り畳まれると、その内部において、ポリペプチドの溶媒と作用する表面から離れる傾向がある。逆に親水基はポリペプチドの溶媒作用表面に集まるようになる傾向がある。通常は、分子が水性環境に対してより多くの親水性残基をさらすように、り畳まれることを可能にする主配列を持つポリペプチドは、表面にそれほど親水基をさらすことないように折り畳まれるポリペプチドよりも溶解し易い。したがって、疎水性、及び親水性基の配置、及び数は溶解度を決める上で重要な要素である。ポリペプチドの溶解度を決定する他のパラメータには、溶媒のpH、温度及びイオン強度が含まれる。通例として、ポリペプチドの溶解度はグリセロール（例えば、〜10%v/v）を加えることにより維持し、または高めることができる。
【０１７４】
上で議論したように、特定のアミノ酸残基は、ヒトのＶHドメインの保存残基に同定されており、ヒトのＶHドメインは、通常ヒトのＶHドメインより溶解し易いラクダ科のＶHドメインで変異する。これには、例えば、Gly44(ラクダ科のGlu) , Leu45(ラクダ科のArg)及びTrp47(ラクダ科のGly)を含む。ＶHのアミノ酸残基103はまた、TrpからArgの変異がＶHの溶解性を高める傾向にある点で、溶解性に関係している。
【０１７５】
本発明の好ましい特徴としては、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、DP47生殖細胞系列ＶH遺伝子セグメント、またはDPK9生殖細胞系列ＶK遺伝子セグメントに基づいていることである。本明細書には、これらの高い溶解性を持つ生殖細胞系列遺伝子セグメントグに基づいた、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドも実施例が開示されている。したがって、これらの生殖細胞系列遺伝子セグメントは、高い溶解性をもつ特異結合をするシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを作り出すことができ、本明細書に記載の選択された構造上の位置において多様化している場合には、特にそうである。望ましくは多様化されていないことが望ましいが、特に4つのフレームワーク領域は結果物のタンパク質の高溶解性に寄与しうる。
【０１７６】
既知の高溶解性を持つドメインと高い相同性をもつシングル免疫グロブリン可変ドメインもまた、高い溶解性を持つと思われる。したがって、あるシングル免疫グロブリン可変ドメインが、本明細書に記述の高溶解性を持つことを予測、または認識する一つの方法として、その溶解度が知られている、一又は二以上のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドと、そのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの配列を比べる方法である。そして、その溶解度は分っていないが、高い結合親和性を持つシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドが同定された場合、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのアミノ酸配列を、高い溶解性を持つことが知られている、一又は二以上（好ましくはそれ以上）のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のdAb 配列）と比較することにより、その溶解度を予測することができる。これは、絶対的なものとは言えないが、既知の高溶解性を持つ配列と高い類似性がある場合、例えば、90−95％またはそれ以上、特に、親水アミノ酸残基、または溶媒界面にさらされる可能性のある残基について、高い類似性がある場合は、新たに同定された結合ポリペプチドは既知の高溶解性をもつ配列と類似の溶解度を持つ可能性がより高いと思われる。
【０１７７】
分子モデルソフトはまた、既知のポリペプチドの配列との対比によって、ポリペプチド配列の溶解度を予測するのに用いることができる。例えば、溶媒露出部に疎水基を置換または追加することにより、より疎水性が小さく、または親水性残基さえその位置に露出している溶解度が知られている分子と比較しても、そのポリペプチドの比較溶解性は減少すると予想される。同様に、そのような位置により多くの親水基を置換または追加することにより比較溶解性は増加すると予想される。すなわち、その溶解度が知られているシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの構造に比べて、分子表面にあるネットの疎水性、または親水性残基の数（または、表面露出残基全体としての疎水性、あるいは親水性性質）を変えることにより、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの相対的溶解度を予測することができる。
【０１７８】
このような予測とは代替的に、または関連して、単純にポリペプチドを濃縮することにより、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド溶解度の限界を定めることができる。
【０１７９】
親和性の決定
本明細書に記載の分離されたシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、少なくとも300nM以下の親和性（解離定数  Kd=Koff/Kon）及び好ましくは少なくとも300nM−50pHm 200nM−50pH,  より好ましくは、少なくとも 100 nM−50 pM, 75 nM−50 pM, 50 nM−50 pM, 25 nM−50 pM, 10 nM−SO pM, 5 nM−50 pM, 1 nM−50 pM, 950 pM−50 pM, 900 pM−50 pM, 850 pM−50 pM, 800 pM−50 pM, 750 pM−50 pM, 700 pM−50 pM, 650 pM−50 pM, 600 pM− 50 pM, 550 pM−50 pM, 500 pM−50 pM, 450 pM−50 pM, 400 pM−50 pM, 350 pM − 50 pM, 300 pM−50 pM, 250 pM−50 pM, 200 pM−50 pM, 150 pM−50 pM, 100 pM−50 pM, 90 pM−50 pM, 80 pM−50 pM, 70 pM−50 pM, 60 pM−50 pM, またはさらに50 pM 迄小さくてもよい。
【０１８０】
可変ドメインポリペプチドの抗原結合親和性は、BIAcore システム（Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.）を用いるSPRにより簡便に測定することができる。この方法では、抗原は既知の濃度でBIAcoreチップに連結され、そして可変ドメインポリペプチドが導入される。可変ドメインポリペプチドと固定化抗原間の特異結合はチップマトリクス上のタンパク質の濃度を増加させ、SPRシグナルを変化させる。SPRシグナルの変化は、共振単位（resonance unit）として記録され、時間に対してセンサ−グラム（sensorgram）のＹ軸に表示される。基準線シグナルは、溶媒のみ（例えば、PBS）がチップを通る場合を示す。基準線と可変ドメインポリペプチドが完全に注入された後の両シグナルのネット差は、そのサンプルの結合値を示す。オフレート（Koff）、オンレート（Kon）及び解離定数（Kd）を決めるために、BIAcore運動評価ソフト（例えば、2.1バージョン）が使われる。
【０１８１】
高い親和性は、抗原の表面と抗体または抗体断片のCDRs間の相補性による。相補性は、例えば、イオン相互作用の可能性、ファンデルワールス力、水素結合、あるいは起こりうる他の相互作用のような、標的部分とCDRとの間に発生しうる分子相互作用の種類と強さにより決まる。CDR3は、CDR１及びCDR2よりも抗原の結合の相互作用に寄与する傾向が強い。これは、多分、そのサイズが大きいためであり、そのため表面で相互作用が生ずるのにより都合が良いからであろう（例えば、Padlan et al.,1994, Mol. Immunol. 31:169−217; Chothia & Lesk, 1987, J.Mol.Biol. 196:904−917: 及び Chothia et al.,1985, J.Mol.Biol. 186 :  661−663）。高親和性は、高いレベルの相補性を持つシングル免疫グロブリン可変ドメイン/抗原の対合を示しており、それは可変ドメイン、及び標的の構造に直接関連している。
【０１８２】
シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドに、ある抗原に対する高い親和性を与える構造は、抗原をポリペプチド構造にドッキングさせる分子モデルソフトを使うことよって際立たせることができる。
【０１８３】
通常、既知の親和性を持つシングル免疫グロブリン可変ドメインの構造のコンピュータモデルは、相互作用表面を決定するために、ポリペプチド、または既知の構造を持つ他の標的抗原のコンピュータモデルにドッキングさせることができる。そのように既知の相互作用をする相互作用表面の構造が分っている場合、相互作用に基づいて、可変ドメイン配列における同類置換、または非同類置換でのポジティブ、またはネガティブな影響を予測することができ、その結果、結合分子のデザインを合理的に改良することが可能となる。
【０１８４】
シングル免疫グロブリン可変ドメインの多重体形（multimeric forms）
本発明の一つの特徴として、本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインは、例えば、ホモ二量体、ホモ三量体、または、さらに高いホモ多量体、のように多量体化される（multimerized）。多量体化は親和力効果により抗原を結合する力を増大することができるが、その結合力は多重結合部位の結合親和性の総和に関連している。
【０１８５】
ホモ多量体は、例えば、ペプチドリンカー（linker）を通して、融合したシングル免疫グロブリン可変ドメインの発現を通じ生成され、それによりdAd−リンカ−−dAdの配置、またはその配置でのより高い多量体化を生み出す。ホモ多量体は、追加される一部、例えば、血中半減期を増やすポリペプチド配列のような追加的部分、または、毒素、あるいは標的部分のような他のエフェクター(effector)部分にリンクさせることができる。どのリンカーペプチド配列でも、scFvを生み出すために一般に用いられるリンカー配列のように、ホモ多量体を生成するのに用いることができる。通常用いられる一つの有用なリンカーは、ペプチド配列（Gly４Ser）n の繰り返しを含んでいる。ここでｎ=1から約10である。例えば、リンカーは、（Gly4Ser）3,（Gly4Ser）5,（Gly4Ser）7、または（Gly4Ser）配列のその他の多量体形であってもよい。
【０１８６】
多量体をペプチド配列によりリンクされたモノマー(monomer)として発現させる代替として、モノマーシングル免疫グロブリン可変ドメインを、翻訳後に、例えば、ジスルフィド結合、または他の化学的リンクによりリンクする方法がある。例えば、モノマー  ポリペプチドのＣ末端において生成されるように、遊離システインが操作して作られ、モノマー間にジスルフィド結合を生みだす。本発明の、あるいは他の遊離システインを必要とする場合において、システインはシステインコドン（TGT, TGC）をdAb配列の最後のコドンに近い、そして一又は二以上の終止コドンの直ぐ直前のPCRプライマーに含むことにより導入される（下流PCRプライマーに組み入れられるため、Ｃ末端システインで、プライマーの配列は事実上逆相補の関係になろう、すなわち、ACA、またはGCAである）。もし、望むならば、例えば、（Gly４Ser）n のようなリンカーペプチド配列、はdAb配列と遊離システインの間に置くこともできる。遊離システイン配列をもつモノマーの発現は、モノマーと二量体の混合になり、その比率は凡そ1：1である。二量体は例えば、塩勾配溶離によるイオン交換クロマトグラフィーのような、ゲルクロマトグラフィーを用いてモノマーから分離する。
【０１８７】
代替的に、操作され作られた遊離システインは、三量体マレイミド分子（例えば、トリ（2−マレイミドエチル）アミン（Tris[2−maleimidoethyl]amine, TMEA））またはバイ−マレイミド（bi−maleimido）PEG分子（例えば、Nekter (Shearwater)から調達可能）のようなチオールリンクから多価の化学結合によりモノマーを結合することに使用される。
【０１８８】
標的抗原
本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの標的抗原は、ポリペプチド抗原であり、好ましくは病気、または異常に関係したヒトのポリペプチド抗原である。すなわち、本明細書に記載の標的抗原は治療に関係した標的である。「治療に関係した」とは、標的抗原を結合し、その標的の活性の敵対者（antagonist）、または競技者(agonist)として働くシングル免疫グロブリン可変ドメインまたは他の抗体ポリペプチドにより結合された場合に、標的が結合されたヒトの個体に有益な効果を与えるものをいう。「有益な効果」は一または二以上の病気、または異常の臨床において、少なくとも10％の効果の改善が見られるモノマーたは、代替的に、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの予防的使用が望まれる場合に、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド製剤により治療を受けていない個体に比べて、標的とする病気、または異常の症状が現れる前に、少なくとも10％の増加が見られる場合をいう。本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの適当な標的の例としては、これに限定されるものではないが、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素補因子、またはDNA結合タンパク質を含む。適当なサイトカイン及び成長因子には、これに限定されるものではないが、ApoE, Apo−SAA, BDNF, カルジオトロフィン−１（Cardiotrophin−1） EGF, EGF 受容体、  ENA−78, エオタキシン（Eotaxin）, Eotaxin−2, エオタキシン−2（Exodus −2）,  FGF−acidic, FGF−basic, 線維芽細胞成長因子−10（（fibroblast growth factor−10）,  FLT3 リガンド（ligand,） フラクタルカイン（Fractalkine） (CX3C), GDNF, G−CSF, GM−CSF, GF−β1, インスリン（insulin）, IFN−g, IGF−I IGF−II, IL−1α, IL−1β,  IL−2, IL−3, IL−4, IL−5, IL−6, IL−7, IL−8 (72 a. a. ), IL−8 (77 a. a. ), IL−9, IL−10, IL−11, IL−12, IL−13, IL−15, IL−16, IL−17, IL−18 (IGIF), インヒビン（Inhibin） α, インヒビン（Inhibi） β, IP−10, ケラチノサイト（keratinocyte）成長因子−2 (KGF−2), KGF, レプチン（Leptin,） LIF, リンフォタクチン（Lymphotactin）, ムレりン抑制物質（Mullerian inhibitory substance,） モノサイトコロニー抑制因子（monocyte colony inhibitory factor）, モノサイト誘引タンパク質（monocyte attractant protein）, M−CSF, MDC (67 a. a.), MDC (69 a. a. ), MCP−1 (MCAF), MCP−2, MCP−3, MCP−4, MDC (67 a. a.), MDC (69 a. a. ), MIG, MIP−1a, MIP−1β, MIP− 3α, MIP−3β, MIP−4, 骨髄始原細胞抑制因子−１（myeloid progenitor inhibitor factor−1） (MPIF−1), NAP−2, ノイルツリン（Neurturin）, 神経成長因子（Nerve growth factor）, β−NGF, NT−3, NT−4, オンコスタチンM（Oncostatin M）, PDGF−AA, PDGF−AB, PDGF−BB, PF−4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 幹細胞因子（stem cell factor） (SCF), TARC, TACE 認識部位（recognition site,） TGF−α, TGF−β, TGF−β 2, TGF−β 3, 腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor ）(TNF), TNF−α, TNF−β, TNF受容体（receptor） I (p55), TNF受容体（receptor） II, TNIL−1, TPO, VEGF, VEGF受容体（receptor） 1, VEGF受容体（receptor） 2, VEGF受容体（receptor） 3, GCP−２, GRO/MGSA, GRO−β, GRO−γ, HCC1,1−309, HER 1, HER 2, HER 3 および HER 4。 サイトカイン受容体は上記に記載の各サイトカインの受容体を含む，例えば、IL−1R, IL−6R, IL−1 OR, IL− 18R, 等 である。 上記のリストは、これですべてを表しているものではない点に留意願いたい。
【０１８９】
発明の一つ特徴として、あるシングル免疫グロブリン可変ドメインは他のシングル免疫グロブリン可変ドメインにリンクして、各個々のドメインはその同種の抗原を結合する能力を持つホモ二量体、ヘテロ二量体を形成する。シングル免疫グロブリン可変ドメインをホモ二量体として融合させることにより、例えば、親和力効果により、標的を結合する能力を増加させる。シングル免疫グロブリン可変ドメインを、各モノマ−が異なる標的抗原を結合するヘテロ二量体として融合させることにより、例えば、各標的抗原をブリッジすることのできる二重特異性を持つリガンドを生み出すことができる。そのような二重特異性を持つリガンドは、治療をする情況において、有機体の体内で相乗的に働くサイトカイン及び他の分子を標的とするのに用いることができる。したがって、二またそれ以上のサイトカインを結合することのできる、二重特異性を持つシングル免疫グロブリン可変ドメインへテロ二量体の投与を含む二またそれ以上のサイトカイン活性を相乗的に働かせる方法がある。この特徴に関しては、二重特異性を持つリガンドは、相補的、及び/または非相補的ドメインからなるリガンドを含むどのような二重特異性を持つリガンドであっても良い。例えば、この特徴は、ＶHドメイン及びＶLドメインの組合せ、ＶHドメインのみ、及び、ＶLドメインのみに関するものである。
【０１９０】
好ましくは、本発明のこの特徴を示す二重特異性を持つシングル免疫グロブリン可変ドメインへテロ二量体により結合されるサイトカインは、以下のリストから選択される。
【０１９１】
ペア（組合せ）、及び治療上の影響（impact）の根拠
FNF/FGF−β
・TGF−βおよびＴＮＦをハツカネズミの足関節に注射したところ、コラーゲン誘発の関節炎モデルにおいて関節の炎症を極めて悪化させた。コラーゲンを原因としないハツカネズミでは、効果は見られなかった。
【０１９２】
TNF/IL−1
・TNF およびIL−１はブドウ膜炎の病状で相乗効果がある。
【０１９３】
・TNF およびIL−１はマラリヤ（低血糖症  NO）の病状で相乗効果がある。
【０１９４】
・TNF およびIL−１は炎症を起こしている多核（PMN）白血球移動誘発で相乗効果がある。
【０１９５】
・IL−１およびTNFはPMNのハツカネズミの腹膜への浸透で相乗効果がある。
【０１９６】
・IL−１およびTNFは内皮細胞によるIL−1の分泌に相乗効果がある。炎症において重要。
【０１９７】
・ IL−１またはTNFは単独で、ウサギのひざ滑膜細胞の浸透を誘発させた。IL−１はPMNsを誘発し、TNFは単球を誘発する。両者を同時に使うことにより、PMNsの増加により、さらに強い浸透を誘発する。
【０１９８】
・ 循環心筋抑制物質（敗血症に見られる）はIL−１およびTNFが相乗的に働くため、低レベルである。
【０１９９】
TNF/IL−2
・キラ−Ｔ−細胞の相乗的活性化に関する。
【０２００】
TNF/IL−3
TNF/IL−4
・IL−４およびTNFは内皮細胞上で相乗的にVCAMの発現を誘発する。喘息において何らかの役割があると思われる。関節リウマチに関係し、滑膜についても同様。
【０２０１】
・TNF およびIL−４は、角化細胞で相乗的にIL−６の発現を誘発する。
【０２０２】
TNF/IL−６
TNF/IL−８
TNF およびIL−８はPMNsと共に相乗的に血小板を活性化する。急性呼吸窮迫症候群に関係していると思われる。
【０２０３】
TNF/IL−10
IL−10はTNFとともに、慢性的に感染しているＴ細胞で、HIVの発現を誘発させ、および相乗的に作用する。
【０２０４】
TNF/IL−12
TNF/IFN−γ
・ 脳にMHCを誘発
・ 抗ビ−ルス反応/IFN−b誘発で相乗作用
・ 好中生白血球の活性化/呼吸バ−スト
・ 内皮細胞活性化
・ アンチビ−ルス治療としてTNF/IFN−γを処置した患者に毒性が見られた（なお、検証要）。
・ ヒトの星状細胞によるフラクタルカイン（fractalkine） 発現
・ 炎症反応に関する発表多数、すなわち、LPS, またマクロファ−ジ活動
・ アンチTNFおよびアンチIFN−γの、ハツカネズミを致死的内毒素血症から保護する相乗効果
TGF−β/IL−１
・造骨細胞（osteoblast）によるプロスタグランジン（prostaglandin）合成
・ 腸の内皮細胞による活性化IL−６の生成（炎症モデル）
・ 肺の線維芽細胞のIL−11およびIL−6を刺激（炎症モデル）
・ 網膜でのIL−6およびIL−8の生成
TGF−β/IL−６
・軟骨肉腫（chondrosarcome）の増殖
IL−1/IL−2
・ Ｂ細胞活性化
・ ラック細胞（LAK cell）活性化
・ Ｔ細胞活性化
IL−1/ IL−3
IL−1/ IL−4
・ Ｂ細胞活性化
・ IL−4による内皮細胞活性化でのIL−1の発現の誘発
IL−1/ IL−６
・ Ｂ細胞活性化
・ Ｔ細胞活性化（アクセサリー細胞を代替可能）
・ IL−１はIL−1の発現を誘発
・ C3および血清アミロイド発現（急性期反応）
・ HIV発現
・ 軟骨コラーゲン分解
IL−1/ IL−8
IL−1/ IL−10
IL−1/ IFN−g
IL−2/ IL− 3
・ Ｔ細胞増殖
・ Ｂ細胞増殖
IL−2/ IL− 4
・ B細胞増殖
・ T細胞増殖
IL−2/ IL−５
・ B細胞増殖/Ig分泌
・ IL−5はB細胞でIL−2受容体を誘発する
IL−2/ IL−6 
・ 有毒なＴ細胞の発育
IL−2/ IL−7
IL−2/ IL−10
・ B細胞増殖
IL−2/ IL−12
IL−2/ IL−15 
IL−2/ IFN−γ
・ B細胞によるIg分解
・ IL−2はT細胞によりIFN−gの発現を誘発する
IL−2/ IFN−α/β
IL−3/ IL−4
・ マスト細胞生育に相乗効果
IL−3/ IL−5
IL−3/ IL−6
IL−2/ IFN−γ
IL−4/ IL−5
・ マスト細胞ヒスタミン等を高め、IgEに反応して分泌
IL−4/ IL−6
IL−4/ IL−10
IL−4/ IL−12
IL−4/ IL−13
IL−4/ IFN−γ
IL−4/ SCF
・ マスト細胞増殖
IL−5/ IL−6
IL−5/ IFN−γ
IL−6/ IL−10
IL−6/ IL−11
IL−6/ IFN−γ
IL−10/ IL−12
IL−10/ IFN−γ
IL−12/IL−18
IL−12/ IFN−γ
・ 免疫刺激の一部としてIL−12はＢ細胞およびＴ細胞によりIFN−gの発現を誘発
IL−18/IFN−γ
アンチTNF/アンチCD4
・DBA/1関節炎のハツカネズミの相乗的治療効果
上記にリストされた、及び他の標的抗原のアミノ酸及び核酸の配列は当業者に公知であり、また入手可能である。遺伝子組み換えタンパク質、及び必要に応じて、他の抗原を発現させ、修飾する標準的な方法、例えば、標的抗原を結合するシングル免疫グロブリン可変ドメインを抽出する（pan）等の方法は当業者に用いられている。
【０２０５】
機能アッセイ
本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインは、標的抗原を中和させ（例えば、拮抗活性）、あるいは苦痛（agonizing）を与える活性を持つ。本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのこの活性（中和する、または苦痛を与える）は、受け入れられているそのような活性のアッセイにおいて使用されるポリペプチドがない場合に標的抗原の活性と比べて測定される。例えば、もし標的抗原が酵素である場合、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの活性、また効果をモニターするために、その酵素の活性をモニターするインビボ、またはインビトロ機能アッセイが用いられる。
【０２０６】
例えば、標的抗原が、例えば、サイトカイン受容体のような受容体である場合、活性はリガンドの受容体への結合の減少、または増加によって測定され、またはシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの存在する中での受容体によるシグナル活性の減少または増加によって測定される。受容体のシグナル活動は、例えば、受容体のコンフォーメーション（conformation）、補因子、またはパートナーポリペプチド結合、GTPのGDPへの交換、キナーゼ、フォスファターゼ（phosphatase）、または活性化された受容体により支配される他の酵素活動、をモニターすることにより、または、遺伝子の発現（レポータ遺伝子を含む）、または例えば、細胞の死亡、DNA複製、細胞粘着、または受容体の活性化の結果通常起こる一または二以上の分子の分泌を含む他の効果のような下流での活動結果をモニターすることにより測定する。
【０２０７】
例えば、標的抗原が、サイトカインまたは成長因子である場合、活性はサイトカインの受容体への結合をアッセイすることにより、または例えば、上で検討したように受容体のシグナル活性のような、受容体の活性をモニターすることによりモニターされる。サイトカインの下流効果を測定する機能アッセイの例として、技術分野で周知（例えば、US6,090,382参照）のTNFーα活性を測るL929細胞殺滅アッセイがある。以下のL929細胞傷害（cytotoxity）アッセイは、本明細書では「標準」L929細胞傷害アッセイと呼ぶ。アンチTNFシングル免疫グロブリン可変ドメイン（「アンチTNF dAbs」）は、ハツカネズミのL929繊維芽細胞のTNFの細胞傷害活性を中和する能力をテストされる（Evans, T.(2000) Molecular Biotechnology 15, 243−248）。簡潔にいえば、マイクロタイタープレート（microtiter plate）に塗布されたL929細胞は、アンチTNF dAbs, 100pg/ml TNF及び1mg/ml アクチノマイシン（actinomycin）D(Sigma,Poole, UK)と共に一夜培養される。細胞の生育力は、3−(4, 5−dimethylthiazol−2−yl)−5−  (3−carbboxymethoxyphenyl)−2−(4− sulfophnyl) −2H−tetrazolium (Promega, Madison, USA).と共に培養の後、490nmでの吸光度を測ることにより測定する。アンチTNF dAbs 活性によりTNF細胞毒性は減少し、したがって、TNFのみのコントロールに比べ吸光度は増加する。
【０２０８】
本明細書に記載のTNF−α、またはTNF−α受容体に特異のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、本標準L929 細胞アッセイにおいてIC50が500nM以下 、好ましくは50nM以下、5nM以下、500pM以下、200pM以下、100pM以下、またはさらに50pM以下でさえある。
【０２０９】
例えば、サイトカインなどの、リガンドによる受容体の結合を測定するアッセイは公知の技術である。例えば、アンチTNF dAbsによる、組み換え TNF受容体１（p55）への結合を阻害する能力をテストすることができる。簡潔にいえば、Maxisorp  プレートは30mg/mlのアンチヒトFc  ハツカネズミ単クローン抗体で一夜培養される（Zymed, San Francisco, USA）。ウエル（well）は100ng/ｍl TNF受容体１Fc 融合タンパク質で培養される前に、0.05%Tween−20 を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄され、そして1%BSAを含むPBSで遮断（block）される（R&D System, Minneapolis, USA）。アンチTNF dAbsは、最終的に10ng/ml濃度で、洗浄されたウエルに加えられTNFと混合される。TNF結合は、0.2mg/ml のビオチニル化されたアンチTNF抗体（HyCult biotechnology , Uben, Netherlands）により検出され、続いて1対500の割合で希釈したホースラディシュ・ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（horse radish perioxidase lebelled streptavidin）（Amersham Bioscience, UK）で希釈され、そしてTMB基質（subtrate）（KPL, Gaithersburg, MD）により培養される。反応はHCLを加え停止され、そして450nmで吸光測定される。アンチTNF dAb抑制活動により、TNF結合が減少し、そのためTNFのみのコントロールの場合に比べて吸光度が低下する。
【０２１０】
シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのp55 TNF−α受容体に対する効果を評価する場合の代替として、HeLa細胞でのTNFによるIL−8分泌誘発に基づく以下のHeLa細胞アッセイを用いることができる。（この方法はAkeson, L.et al(1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517−30523から採用するが、HUVECにおいてはIL−1によるIL−8の誘発について記載している。ここではヒトのTNFアルファによる誘発を対象にし、HUVEC細胞株の代わりにHeLa細胞を用いる）。簡潔に言えば、マイクロタイタ−板に塗布されたHeLa細胞はdAb及び300pg/mlＴＮＦにより一夜培養される。培養に続き、上澄みは細胞から吸いだされ、IL−8濃度がサンドウィッチELISA(R&D Systems)を通じて測定される。アンチTNFR1及び dAb活性により、TNFコントロールのみの場合に比べて、IL−8の上澄みへの分泌が減少する。
【０２１１】
他のリガンド（サイトカイン、成長因子等）または他の受容体の活性についての同様な機能アッセイは、当業者に知られており、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの敵対的、または競争的効果を評価するのに用いることができる。
【０２１２】
シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのインビボ半減期を増大させる
半減期の増大は、免疫グロブリンがインビボで適用される場合有用であり、特に抗体、中でも特に小さいサイズの抗体断片の場合においては有用である。そのような断片（Fvs, Fabs, scFvs, dAbs）体内から急速に消えてしまう。これらは体内の殆どの部分にすばやく到達し、すばやく作り出せ、また取り扱いが容易であるが、インビボでの適用はインビボでの存在が短いため限界がある。
【０２１３】
ある一つの特徴として、本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、リガンドのインビボ半減期を増大させるように作用することのできるタンパク質、またはポリペプチド抗原、あるいはエピトープを結合する部分と融合することによりインビボで安定する。半減期を増大させるように作用することのできるタンパク質、またはポリペプチド抗原、あるいはエピトープは本明細書で「エフェクターグループ」と呼ぶ。シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの安定を達成する一つの方法は、一または二以上のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの融合を生成することである。その場合、すくなくとも一つの可変ドメインポリペプチドが一つのエフェクターグループを結合し、融合される残りのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの少なくとも一つが、治療上関連する標的を結合する。したがって、この特徴をもつ分子は少なくとも、二重特異性を持つリガンドであり、治療上関連する標的に特異の少なくとも一つのシングル免疫グロブリン可変ドメイン、及びリガンドのインビボ半減期を増大させるタンパク質、またはポリペプチドに特異な少なくとも一つのシングル免疫グロブリン可変ドメインを含む。半減期を増大させるポリペプチドエフェクターグループを持つそのような二重特異性を備えたシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの複合体は、本明細書において、「dAb−エフェクターグループ」組成物という。この特徴を持つエフェクターグループの例は本明細書以下に記載される。
【０２１４】
本明細書に記載のリガンドの半減期を増大させる抗原、またエピトープは、都合の良いことに、有機生物体内に見出だされるタンパク質またはポリペプチドに存在する。
【０２１５】
その例には、細胞外のマトリクスタンパク質、血漿タンパク質、及び有機体中の各種組織にあるタンパク質を含む。タンパク質は、例えば、膨張性薬剤として作用し、またはリガンドを活動させたい部位に繋げることにより、リガンドが血液から消失する割合を減少させ、または抑える。薬物動態分析方法,  及びリガンドの半減期を決定することは、当業者によく知られている。詳細は、Kenneth, A et al., Chemical Stability of Pharmaceticals: A Handbook for Pharmatists 及び  Peters et al.,Pharmacokinetic analysis: Practical Approach (1996)に記載がある。また、Pharmacokinetics, M. Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker, 出版  2nd  Rev. ex. edition(1982),にｔアルファ、及びｔベータ半減期,及びカーブでの領域（area under the curve, AUC）薬物動態分析についての記載がある。
【０２１６】
半減期（t1/2アルファ及び t1/2ベータ）及びAUCは時間に対するリガンドの血清濃度のカーブにより決定することができる。WinNonlin分析セット（Pharsight Corp., Mountain view, CA94040, USAより入手可能）は、例えば、カーブ（curve）をモデルするために用いることができる、第一のフェーズ（アルファフェーズ）では、リガンドは一部は排出されるが、患者の体内で主に配送される。第二フェーズ（ベータフェーズ）では、リガンドは配送され終わりリガンドが患者から消えるにつれて、血清濃度が減少する。ｔαの半減期は第一フェーズの半減期であり、ｔβの半減期は第二フェーズの半減期である。したがって、都合の良いことには、本発明は、例えば、ｔαは15分以上の範囲の半減期を持つdAbエフェクターグループ組成のような、dAbを含む組成を提供する。ある実施の形態においては、その下限は30分、45分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間、12時間である。さらに、または代替的に、dAbエフェクターグループ組成のような、dAbを含む組成は、ｔαの半減期が12時間を含み、12時間までの範囲であることがある。ある実施の形態においては、範囲の上限は、11時間、10時間、9時間、8時間、7時間、6時間、または5時間、である。適当な範囲の例としては、１から6時間、2から5時間、または3から4時間である。
【０２１７】
都合の良いことには、本発明は例えば、dAbエフェクターグループ組成のようなdAbを含む組成を持ち、ｔβ半減期が2.5時間以上ある本発明のリガンドを含んでいる。ある実施の形態においては、その下限は3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間、12時間である。さらに、または代替的に、例えば、dAbエフェクターグループ組成のようなdAbを含む組成物では、ｔβ半減期が2１日を含み、21日まである。一つの実施の形態においては、範囲の上限は、12時間、24時間、2日,3日, 5日, 10日, 15日, または20日である。
【０２１８】
都合の良いことには、本発明におけるdAbを含む組成のｔβ半減期は12から60時間の範囲である。他の実施形態においては、12時間から48時間である。また、さらに他の実施形態では、12時間から26時間である。
【０２１９】
上記の基準に加えまたは代替的に、本発明は、本発明での、1mg.min/ml以上の範囲のAUC値を持つリガンドを含む組成をもつdAbを含む組成物を提供する。ある実施の形態においては、その下限は5, 10, 15, 20, 30, 100, 200または300mg.min/mlである。さらに、または代替的に本発明のリガンドまたは、組成物は、60mg.min/mlまでの範囲のAUC値を持つ。ある実施の形態においては、その上限は500, 400, 300, 200, 150, 100, 75, または50 mg.min/mlである。都合の良いことには、本発明のリガンドは、次の範囲からなる群から選択される範囲のAUCをもつであろう、すなわち、15から150mg.min/ml、 15から100mg.min/ml、15から75mg.min/ml、及び15から50mg.min/mlである。
【０２２０】
リガンドの半減期を増加させることのできる抗原
本発明の二重特異性をもつリガンドは、インビボでリガンドの半減期を増大させることのできる一または二以上の分子に結合することができる。典型的には、その様な分子はインビボで自然発生し、また有機体から、必要とされない物質を除く細胞の同化作用による分解、または除去に抵抗するポリペプチドである。例えば、有機体の半減期を増大させる分子は以下の中から選択されうる。
【０２２１】
・細胞外マトリクスから得られるタンパク質、例えば、コラーゲン、ラミニン（laminins）,インテグリン（integrins）及びフィブロネクチン（fibronectin）.である。コラーゲンは細胞外マトリクスの主要なタンパク質である。約15種のコラーゲン分子が現在知られており、身体の各部で見つかっている。例えば、Ｉタイプのコラーゲン（身体のコラーゲンの90％を占める）は骨、皮膚、腱、じんたい（靱帯）角膜、内部器官に、またはIIタイプのコラーゲンは軟骨、無脊椎動物椎間板、脊索、眼の硝子体液である。
【０２２２】
・血液中のタンパク質は、以下を含む：
フィブリン（fibrin）、αー２  マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲンA（fibrinogen A）,フィブリノゲンＢ（fibrinogen B）、血清アミロイド  タンパク質A,  へプタグロビン（heptaglobin）、プロフィリン（profilin）,ユビクイティン（ubiquitin）,ユテログロブリン（uteroglobulin）,及びβ−２−ミクログロブリンの様なプラズマタンパク質。
【０２２３】
・酵素、及びプラスミノゲン，リゾチーム，シスタチンＣ（cystatin c），α−アンチトリプシン（antitrypsin）、及び脾臓チプシンインヒビターの様なインヒビター。プラスミノゲンはトリプシンのようなセリン プロテーゼ プラスミンの不活性前躯体である。通常、血流を通じて循環している。プラスミノゲンが活性化し、プラスミンへ転換されると、血球を血栓に絡ませるフィブリノゲン  繊維を分解する能力を持つ酵素ドメインを開く。これは、フィブリノシス（fibrinolysis）と呼ばれる。
【０２２４】
・IgE, IgG, IgMのような免疫システムタンパク質
・レチノール（retinol）結合タンパク質、α−1−ミクログロブリンのような輸送タンパク質
・βデフェンシン（defensin）1、好中球（neutrophil）デフェンシン  1,2 及び3のようなデフェンシン
・メラノコルチン（melanocortin）受容体、ミエリン（myelin）、アスコルビン酸輸送体、のような血液脳関門、または神経組織にあるタンパク質、
・トランスフェリン(transferrin)受容体特異のリガンド神経性調剤溶解タンパク質（US5977307）脳毛細血管内皮細胞(brain capillary endothelial cell)受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、インスリン、インスリン様成長因子１（IGF 1）受容体、インスリン様成長因子２（IGF 2）受容体、インスリン受容体、
・ポリシチン(polycystin)、タイプＩVコラーゲン、有機陰イオン輸送体Ｋ１、Heymann抗原などの腎臓に局所化されたタンパク質
・例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、G250のような肝臓に局所化されたタンパク質
・血液凝固因子Ｘ
・α１アンチトリプシン（antitrypsin）
・HNF 1α
・分泌組成（IgAを結合）のような、肺に局所化されたタンパク質
・HSP27（これは拡張型心筋症(dilated cardiomyopathy)に関連する）のように心臓に局所化されたタンパク質
・ケラチンのように皮膚に局所化されたタンパク質
・骨形態形成（bone mophogenic）タンパク質（BMP）のような骨に特異なタンパク質、これらは、骨形成の活性を示す形質転換成長因子βス−パ−ファミリ−のサブセットである。その例には、BMP−2,−4,−5,−6, −7(また、骨形成タンパク質（OP−1）及び8(OP−2) と呼ばれる)。
・ヒトの栄養胞（human trophoblast）抗原、ヘルセプチン（herceptin）受容体、エストロゲン（oestrogen）受容体、カテプシン(cathepsin)、例えば、カテプシンB(肝臓及び脾臓にある)を含む腫瘍に特異なタンパク質
・活性Ｔ細胞でのみ発現する抗原のような、病気に特異のタンパク質（これに限定されるものではない）は以下を含む：
LAG‐3(リンパ球活性遺伝子) (lymphocyte activation gene)、骨前駆リガンド（osteoprotegerin ligand）（OPGL）,Nature 402,304‐309; 1999, OX40参照。（TNF受容体ファミリ−メンバー、活性化されたＴ細胞で発現し、ヒトのT細胞白血病ビールスタイプ１(HTLV‐I)を生み出す細胞で特に上昇させる（upregulated）ことが知られている唯一の共刺激Ｔ細胞分子）J. Immunol. 2000 Jul 1;165(1):263−70 参照。金属プロテアーゼ（Matelloproteases）(関節炎/癌に関係)；CG6512 ショウジョウバエ、ヒトの対麻痺(human paraplegin)、ヒトのFtsH, ヒトのAFG3L2, ネズミのftsHを含む。血管由来成長因子(angiogenic growth factor)；酸性線維芽細胞成長（acidic fibroblast growth factor）(FGF‐1), 塩基線維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor）(FGF‐2),血管内皮成長因子/血管浸透因子（vascular endothelial growth factor/vascular permeability growth factor）(VEGE/VPF), 形質転換成長因子‐a(transforming growth factor‐a) (TGF a), 腫瘍壊死因子アルファ（tumor necrosis factor‐alpha）(TNF‐α)、アンギオジェニン（angiogenin）,インターロイキン-３（interleukin‐3）(IL‐3), インターロイキン‐8（interleukin‐8）,(IL‐8), 血小板由来内皮成長因子（platelet‐derived endothelial growth factor）（PD‐ECGF）, 胎盤成長因子(PlGF),ミッドカイン(midkine)血小板由来成長因子‐BB(PDGF),及びフラクタルカイン（fractalkine）を含む。
【０２２５】
・ストレスタンパク質（心臓ショックタンパク質）−HSPは通常細胞間に存在する。細胞外に発見される場合は、細胞が死に、その内容物が漏れ出した印である。このプログラムされていない細胞の死（壊死、necrosis）は、外傷（tauma）、病気または怪我の場合にのみ起きる。したがって、インビボで、細胞外HSPは感染、及び病気と闘う免疫システムからの反応を引き起こす。細胞外HSPと結合する二重特異性をもつリガンドは、病変の部位に局所化される。
【０２２６】
・Fc運搬に関与するタンパク質
Brambell 受容体（また、FcRBとして知られる）。このFc受容体は2つの機能を持っており、その何れもが運送にとり有益である可能性を持っている。その機能とは、１）胎盤を通して、母親から子供にIgGを運搬すること、２）IgGを劣化から保護し、IgGの血清半減期を延ばすことである。受容体はIgGをエンドソームからリサイクルすると考えられている。
【０２２７】
ポリマー安定部分を用いてインビボの安定化を図る
他の特徴として、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを含む組成は、インビボで（非ポリペプチド）ポリマーを安定化させる部分とリンクし、または連携して安定化する。この種の安定化は、例えば、WO99/64460  (Chaoman et al.)及びEP1,160,255(King er al.)に記載されている。この何れも、本明細書に引用により組み入れられる。特に、これら参考文献は、免疫グロブリンポリペプチドのインビボ 半減期を増大させるために、例えば、ポリアルキレン（polyalkylene）、ポリアルケニレン(polyalkenylene)、ポリオキリシアルキレン(polyoxyalkylene)、またはポリサッカライド(polysaccharide)のような、合成、または自然発生ポリマー分子を用いることについて記載する。安定化させる部分の典型的例としては、ポリエチレン  グリコール、またはPEG, ポリアルキレンがある。PEGを免疫グロブリンポリペプチドにリンクするプロセスは、これらの参考文献に記載されており、本明細書で「PEGylation」と呼ぶ。これら文献に記載のとおり、免疫グロブリンポリペプチドは、PEGがリジンまたはタンパク質の表面の他のアミノ酸に付着することにより、または特異部位、または、人工的に導入された表面システイン残基へのPEG付着により、ランダムにPEGylationされうる。免疫グロブリンによっては、ポリマーの非ランダム付着を用いることが望ましい場合もある。ランダムな付着は、分子の抗原結合部位、またはその近辺への付着はしばしば標的抗原に対する分子の親和性、または特異性を変えることがあるからである。
【０２２８】
PEG、または他のポリマーを加えることにより、抗体可変ドメインポリペプチドの抗原結合親和性、または特異性を損なわないことが望ましい。「抗原結合親和性、または特異性を損なわない」とは、PEGリンクの抗体シングル可変ドメインのIC50またはND50が、同じ抗体シングル可変ドメインを持つ非PEGリンクの抗体可変ドメインのIC50またはND50それぞれよりも10％を超えないことをいう。言い換えると、「抗原結合親和性、または特異性を損なわない」の語句は、抗体シングル可変ドメインのPEGリンクの形が、ポリペプチドのペグレートされていない（non-PEGylated）形と比べ、少なくとも90％の抗原結合活性をもつことを意味する。
【０２２９】
インビボ  半減期を増大させるのに有用なPEG、または、他のポリマーは一般的に約5,000から50,000Daltonのサイズである。例えば、5,000kDー10,000kD, 5,000kD−15,000kD, 5,000kD−20,000kD, 5,000kD−25,000kD, 5,000kD−  30,000kD,  5,000kD−35,000kD, 5,000kD−40,000kD, または約5,000kD−  45,000kDである。ポリマーサイズの選択は、その複合体の使用目的により異なる。例えば、固形組織に浸透する場合、例えば、腫瘍の場合には、比較的小さい5,000kD台、または約5,000kDのポリマーを用いるのが都合が良い。反対に、複合体を循環させることを目的とする場合には、比較的大きなポリマー、例えば、25,000kDから−40,000kDまたはそれ以上のポリマーを用いることができる。
【０２３０】
相同配列
本発明は、シングル免疫グロブリン可変ドメインクローン、及び標的抗原を高い親和性を持って結合し、高い濃度において溶解するそのクローンと本質的に、類似または相同な配列を持つクローンを含む。本明細書で用いる「本質的」配列類似または相同は、少なくとも85％類似、または相同であることをいう。
【０２３１】
二つの配列の「相同」または「配列同一」（これらの語句は、本明細書においては、相互に言い換え可能である）の計算は以下の通りに行う。配列は、最適な比較が可能なようにアラインされる（例えば、最適アラインメントのために、ギャップは第一、及び第二のアミノ酸の一またはその両方、または核酸配列に導入することができ、比較する場合には、非相同配列は考慮することは不要である）。好ましい実施の態様においては、比較目的でアラインされる参考配列の長さは、参考とされる配列の長さの、少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、80%, 90%, 100%ある。対応するアミノ酸残基、または核酸の位置のアミノ酸残基、または核酸が対比される。第一の配列における位置が、第二の配列の対応する位置にあるアミノ酸残基、または核酸と同じアミノ酸残基、または核酸により占められている場合は、分子はその位置において同一（identical）である（本明細書で用いる、アミノ酸または核酸の「相同」（homology）はアミノ酸または核酸の「同一」（identity）と同等である）。両配列の間の％同一値は、両配列の最適アラインメントを導入するために必要なギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れることを考慮して、両配列において占める同一の位置の数の関数になる。
【０２３２】
ここで用いる「類似」は、ある配列アラインメントにおいて、アミノ酸配列が、対応する位置で類似のアミノ酸残基を持っている程度をいう。アミノ酸はその側鎖が類似している場合は、互いに類似する。特に「類似」は互いに同類置換であるアミノ酸を含む。「同類」置換はblosum62置換マトリクスでプラス点を持つすべての置換である（Hentikoff and Hentikoff, 1992, Proc. Natl.Acad. Sci USA 89:10915−10919）。「配列Aが配列Ｂとｎ％類似」とは、配列AとＢ間の最適全アラインメント中のｎ％の位置が、同一（identical）アミノ酸、または同類置換よりなることをいう。最適全アラインメントはNeedleman−wunsh アラインメントアルゴリズムの以下のパラメータを使い実施することができる、
ポリペプチドについて、
置換マトリクス  ：blosum62
ギャップスコアー関数  ：−A−B＊LG,  ここでA=11(ギャップペナルティ)、Ｂ＝1(ギャップ長さペナルティ)、LGはギャップの長さ。
【０２３３】
ヌクレオチド配列について、
置換マトリクス  ：マッチした場合  10、マッチしない場合  ０
ギャップスコア−関数  ：−A−B＊LG,  ここでA=50(ギャップペナルティ)、Ｂ＝3(ギャップ長さペナルティ)、LGはギャップの長さ。
【０２３４】
典型的な同類置換には、Met, Val, Leu, 及びlle,間、Ser, 及びThr間、残基Asp, Glu, 及びAsn間、残基Gln, Lys, 及びArgの間、または芳香族残基Phr 及びTyr間の場合がある。二つのポリペプチド配列間の類似の程度（大半の場合％である）を計算する場合、二つの対比する分子の全長について、二つのポリペプチド配列中の対応するアミノ酸残基が同一、または類似が観察される位置の数を考慮する。
【０２３５】
代替的に、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)アルゴリズムは，配列アラインメント測定に、パラメータを初期設定数値にして行う。BLASTアルゴリズム「BLAST2配列」は米国政府（”.gov”）National Library of Medicine(“.nlm”)  of the National Instututes of Health(“.nih”)のNational Center for Biotechnology Information of Health（”.ncbi”） のウェッブサイト（”www”）、”/blast/” directory, sub−directory”bl2seq/bl2.html”で入手可能である。このアルゴリズムは比較する二つの配列をアラインしており、Tatusova & Madden, 1999,FEMS Microbiol Lett. 174:247−250に記載がある。
【０２３６】
相同、または類似を測る他の方法として、高い厳格なハイブリッド条件でハイブリッド形成をする能力によることである。したがって、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドをコードする第一の配列が、もし、第一の配列が高い厳格なハイブリッド条件下（SAMBROOK et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring Harbor Laboratory press, New York）で第二の配列（またはその補体）にハイブリッドする場合は、本質的に第二のコード配列と類似している。「高い厳格なハイブリッド条件」は約45℃で、6X SSCでハイブリッド形成し、続いて65℃、0.2X SSC, 0.1% SDS で一または二以上洗浄することを言う。「極めて高い厳格なハイブリッド条件」は、65℃で、0.5Ｍのリン酸ナトリウム、7％SDSでハイブリッド形成し、その後65℃で0.2X SSC, 1%SDSで一または二回以上洗浄することをいう。
【０２３７】
シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの使用
本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドはインビボ及びインビトロの診断、治療及び予防での種々の応用に有用に用いることができる。例えば、ポリペプチドは、生物サンプルにおいて標的抗原を探知する免疫アッセイ（例えば、ELISAs, RIA, 等）に組み込むことができる。シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドはまた、例えば、ウエスターンブロット応用（Western  blotting application）及び親和性クロマトグラフィー（affinity chromatography）法において用いることができる。そのような技術は、当業者によく知られている。
【０２３８】
シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの非常に重要な使用分野は標的抗原に関連する病気，または異常の治療または予防の分野である。重要なことは、病気，または異常で、抗体剤形による治療または予防の対象となりうるものは、本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドによる治療または予防の対象となりうるのである。本明細書のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、高い結合親和力を持つ、ヒトの配列を基本にしていること、サイズが小さく、溶解度が高いことより、例えば、完全長の抗体、またはさらには、例えば、ヒトの病気の治療または予防のためのscFVよりも優れている。
【０２３９】
本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを用いて治療または予防が可能な病気，または異常は、例えば、以下のものがある。
【０２４０】
炎症（inflammation）, 敗血症（sepsis） (例えば、敗血性ショック（septic shock）、 内毒素ショック（endotoxic shock）,グラム陰性敗血症（Gram negative sepsis）及び中毒ショック症候群（toxic shock syndrome）を含む),  アレルギー過敏症（allergic hypersensitivity）, 癌（cancer）または他の過剰増殖性異常（hyperproliferative disorders）,自己免疫性異常（autoimmune disorders） (例えば、糖尿病（diabetes）,リューマチ性喘息（rheumatoid arthritis）,多発性硬化症（multiple sclerosis）,紅班性狼瘡（lupus erythematosis）,重症筋無力症（myasthenia gravis）,強皮症（scleroderma）,クローン病（Crohn's disease）潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis）,ハシモト病（Hashimoto's disease）,グラーべス病（Graves'disease）,ショーグレン症候群（Sjogren's syndrome）,多内分泌不良（polyendocrine failure）,  白班（vitiligo）, 末梢神経傷害（peripheral neuropathy）,対宿主性移植症（graft−versus− host disease）,自己免疫多腺性症候群タイプI（autoimmune polyglandular syndrome type I）,急性糸球体腎炎（acute glomerulonephritis）,アジソン病（Addison's disease）, 成人発症特発性ハイポパラシロイヂズム（adult−onset idiopathic hypoparathyroidism） (AOIH), 完全脱毛症（alopecia totalis）,筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）,強直性脊椎関節炎（ankylosing spondylitis）,自己免疫性再生不良性貧血（autoimmune aplastic anemia）,自己免疫性溶血性貧血（autoi
mmune hemolytic anemia）,ベーチェット病（Behcet's disease）, セーリアック病（Celiac disease）,慢性活動性肝炎（chronic active hepatitis）,クレスト症候群（CREST syndrome）,皮膚筋炎（dermatomyositis）,拡張型心筋症（dilated cardiomyopathy）,好酸球増加筋痛症候群（eosinophilia−myalgia syndrome）, 栄養障害性表皮（epidermolisis bullosa acquisita） (EBA), 巨細胞動脈炎（giant cell arteritis）,グッドパスチャー症候群（Goodpasture's syndrome）, ギランーバール症候群（Guillain−Barre syndrome）,血色素症（hemochromatosis）, ヘノッホーシェーンレイン紫斑病（Henoch−Schonlein  purpura）,特発性IgA腎症（idiopathic IgA nephropathy）,インスリン依存性糖尿病（insulin−dependent diabetes mellitus） (IDDM), 若年性関節リューマチ（juvenile rheumatoid arthritis）, ランベルトーイートン症候群（Lambert−Eaton syndrome）,リニアーIgA皮膚病（linear IgA dermatosis）,心筋炎（myocarditis, narcolepsy）,壊死性血管炎（necrotizing vasculitis）,新生児狼瘡症候群（neonatal lupus syndrome） (NLE), ネフローゼ症候群（nephrotic syndrome）, 類天疱瘡（pemphigoid）, 天疱瘡 （pemphigus）, 多発筋炎原発性硬化胆管炎（polymyositis, primary sclerosing cholangitis）,乾癬（psoriasis）,急速進行性腎炎（rapidly− progressive glomerulonephritis） (RPGN), ライター症候群（Reiter's syndrome）,スティフマン症候群（stiff−man synd
rome）及び甲状腺炎（thyroiditis）),感染症の結果  (例えば、炎症、サイトカイン媒介組織傷害の悪液質を限定,（cachexia of cytokine−mediated tissue damage）),移植による拒絶反応、（transplant rejection）及び対宿生性移植症（graft versus host disease）,肺疾患（pulmonary disorders） (例えば、 呼吸困難症候群（respiratory distress syndrome）,ショック肺（shock lung）,慢性肺炎症性疾患（chronic pulmonary inflammatory disease）,肺サルコイドーシス（pulmonary sarcoidosis）,肺線維症（pulmonary fibrosis）及び珪肺（silicosis）),心疾患（cardiac disorders） (例えば、虚血（ischemia of the heart）,心不全（heart insufficiency）),炎症性骨疾患（inflammatory bone disorders）及び骨吸収疾患（bone resorption disease）,肝臓炎（hepatitis） (アルコール性肝炎（alcoholic hepatitis）及びビールス性肝炎（viral hepatitis）を含む)、凝固傷害（coagulation disturbances）,再かん流傷害（reperfusion injury）、ケロイド形成（keloid formation），瘢痕組織形成（ scar tissue formation）及び発熱（pyrexia）。
【０２４１】
癌は、例えば、一または二以上の分子例えば、腫瘍の成長、及び/または新陳代謝活動に必要なサイトカイン、または成長因子、細胞表面の受容体、または抗原、酵素等を標的にすることで、または例えば、潰瘍細胞を標的として、よく用いられる細胞障害（cytotoxic）  または自殺死(apoptosis)誘発剤を使い、潰瘍に特異の、または潰瘍に豊富な抗原に特異のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを使うことにより治療が可能である。
【０２４２】
炎症性、または自己免疫性異常等の他の病気，または異常は、同様に本明細書に記載の中和シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドにより、一または二以上の病気のメディエイターを標的にすることにより、治療が可能である。最も通用的には、そのようなメディエイターは、例えば、内因性サイトカイン（例えば、TNF−α）または、炎症、または、他の組織に損傷を与えるその受容体であろう。
【０２４３】
薬剤組成物、投薬量、及び投与
本発明のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、対象に対して投与する適切な薬剤の組成物として組み入れることができる。典型的には、薬剤組成は、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド及び薬剤として受け入れ可能なキャリアーを含む。ここで用いる「薬剤として受け入れ可能なキャリアー」には、生理的に適合性のある、あらゆる種類の溶剤、分散媒体、コーティング、抗菌剤、及び抗真菌剤、等張遅延剤、及び吸収遅延剤等を含む。「薬剤として受け入れ可能なキャリアー」には、牛、馬の血清を含む組織培養媒体は除く。「薬剤として受け入れ可能なキャリアー」の例には、一または二以上の水、塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びそれらの組合せを含む。多くの場合、例えば、砂糖、およびマニトール、ソルビトール等のポリマーアルコール、または塩化ナトリウム等の等張剤を含むことが望ましい。薬剤として受け入れ可能な物質には、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの有効期間を伸ばし、またはその効果を促進する少量の補助物質、例えば、湿潤剤、または乳化剤、保存剤、または緩衝剤を含む。
【０２４４】
本明細書に記載の組成は、多様な形を採ることができる。これらには、例えば、溶解液（例えば、注射、及び点滴液）、拡散、懸濁、錠剤、丸薬、粉末、リポソーム、及び座薬等の、液体、半固体、固体の薬剤形式を含む。投与及び治療への適用形式により、望ましい形は異なってくる。典型的な、望ましい組成物は、例えば、他の抗体によるヒトの受動免疫に用いられると同様な組成のような、注射可能な、または点滴が可能な溶液の形である。望ましい投与の形式としては、非経口投与である（例えば、静脈、皮下、腹腔内、筋肉内投与である）。
【０２４５】
治療用の組成物は、典型的には、製造過程、及び保存時に、無菌かつ安定した状態に置かれていなければならない。組成物は、溶液、ミクロ乳濁液、分散形、リポソーム、または他の高濃度薬剤に適した、所望される構造を持つ形とすることができる。無菌注射液は、必要な量の活性物質を、上記の一の成分またはそれらの組合せ適当な溶剤中で混合し、必要に応じてその後フィルターによる滅菌をして生成することができる。拡散は、一般的に、基本となる拡散媒体、及び上記のうちの必要な他の成分を含む滅菌された賦形剤中に、活性組成物を混合することにより生成する。滅菌注射液を作るための滅菌粉末の場合は、望ましい生成の方法としては、活性成分、プラス事前に滅菌フィルターされた溶液から得た所望の成分の何れをも加えた粉末を生成する真空乾燥及びフリーズドライである。
【０２４６】
溶液の適切な流動性は，例えば、レシチン（lecithin）の皮膜により拡散の場合は必要な粒子サイズを保ち、また表面活性剤を使用することにより維持することができる。
【０２４７】
治療における多くの適用形態としては、好ましい投与の経路・方式としては静脈注射、または点滴であるが、本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、公知の種々の方法を用いて投与することができる。ポリペプチドはまた筋肉内、または皮下注射によって投与することができる。本発明における製剤にはシングル免疫グロブリン可変ドメインの以下の濃縮溶液を含む。例えば、水性溶液中（例えば、PBS）少なくとも5mg/ml(~417μM)を含む溶液、好ましくは、少なくとも10mg/ml(~833μM), 20mg/ml(~1.7ｍM), 25mg/ml(~2.1ｍM), 30mg/ml(~2.5ｍM), 35mg/ml(~2.9ｍM), 40mg/ml(~3.3ｍM), 45mg/ml(~3.75ｍM), 50mg/ml(~4.2ｍM), 55mg/ml(~4.6ｍM), 60mg/ml(~5.0ｍM), 65mg/ml(~5.4ｍM), 70mg/ml(~5.8ｍM), 75mg/ml(~6.3ｍM), 100mg/ml  (~8.33ｍM), 150mg/ml(~12.5ｍM), 200mg/ml(~16.7ｍM), 200mg/ml  (~16.7ｍM),またはこれ以上である。いくつかの実施形態においては、製剤は、例えば、250mg/ml(~20.8ｍM), 300mg/ml(~25ｍM), 350mg/ml(~29.2ｍM), またはさらにこれ以上であっても良いが、使用前に200mg/ml以下に希釈しても良い。
【０２４８】
当業者によく知られているように、投与の経路・方式はその望む結果により変わる。ある実施の態様においては、活性合成物は、例えば、移植、経皮膏薬、及びミクロカプセルによる送達システムを含む、迅速な放出から合成物を保護する制御放出製剤のようなキャリアーを使い生成される。シングル免疫グロブリン可変ドメインは、部分的には、その小さいサイズにより持続放出製剤の形に適している。一投与あたりのモル数は例えば、フルサイズの抗体の投薬量に比べて非常に大きい。エチレンビニル酢酸、無水物(polyanhydride)、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル（polyorthoester）、及びポリ乳酸のような、微生物分解、生体適合性ポリマーを用いることができる。注射液として使用する組成の吸収時間を延ばすために、組成中に、例えば、モノステアリン酸塩類、及びゼラチンなどの吸収遅延剤を含ませることができる。そのような製剤を生成する方法が、多く特許されており、または一般的に、当業者に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.を参照のこと。本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのような、ポリペプチド剤の制御放出、または持続放出に適用される他の方法としては、例えば、米国特許出願  US20020182254 及びUS20020051808 の他に、米国特許US6,306,406及び6,346,274があるが、これらは何れも本明細書に引用により組み入れられる。
【０２４９】
ある実施の態様においては、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、例えば、不活性希釈剤、または吸収可能な食料品のキャリアーと共に経口で投与されることもある。合成物（及び望むなら、他の成分）はまた、固いもしくは軟らかいゼラチン外皮のカプセルに封入することもでき，錠剤として圧縮し、直接個々の食品に組み入れることもできる。経口治療投与では、合成物は添加材に入れることにより、また摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシール、懸濁液、シロップ、ウェハース等の形で使用することもできる。本発明の合成物の非経口的投与以外の投与方法は、合成物が不活性とならないように適当な材料でコートし、または他の材料と併せて投与することが必要になることもある。
【０２５０】
組成物の中に他の追加的活性を持つ合成物を入れることもできる。ある実施の態様においては、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは一または二以上の追加治療剤と共に調剤し、及び/または投与される。例えば、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、他の標的（例えば、他のサイトカインを結合する、または細胞表面分子を結合する抗体）または例えば、一または二以上のサイトカインを結合する、一または二以上の追加的抗体と共に調剤、または投与することができる。そのような組合せ治療では、投与される治療剤低い投薬量であることもある。それにより、各種の単剤療法に関連して起こる可能性のある毒性、または合併症を避けることができるからである。
【０２５１】
本発明の薬剤組成物にはシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの「治療上効果的な量」、または「予防上効果的な量」を含む。「治療上効果的な量」は投薬量において、また必要期間の間好ましい治療結果を達成するために要する量をいう。シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの治療上効果的な量は、個体の病気の段階、年齢、性別、及び体重のような要因、及びシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドが個体に望ましい反応を起こすことができる能力により変わる。治療上効果的な量はまた、抗体、または抗体の部分の有毒な、または有害な影響に比べて、治療上の有益な効果が勝る量でもある。「予防上効果的な量」は、投薬量において、また必要期間の間、好ましい予防的効果を達成するために要する量をいう。典型的には、予防的投薬は、病気にかかる前、またはその初期の段階で用いられるので、予防上効果的な量は、治療上効果的な量より少ないであろう。
【０２５２】
投薬用法は、最適な望ましい反応（例えば、治療上の、または予防上の反応）を得るように調整される。例えば、単一の大粒剤が投与されることもある、投薬をを数回に分けて投与することもある、あるいは投薬量を治療上の必要により、それに比例して減少、あるいは増加させることもある。投与の管理上の便宜、及び投薬量を均一にするために、非経口組成物を、投与単位の形式で調剤
するのが都合が良い。本発明で用いる投与単位の形式は、治療対象となる哺乳類の統一的投与量として適している、物理的に不連続単位をいう。すなわち、各単位は必要な薬剤キャリアーとともに、望まれる治療効果を生み出すよう計算された活性合成物の量を含む事前に設定された量を含む。
【０２５３】
シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの治療上、または予防上効果的な量の範囲として、これに限定するものではないが、0.1−20mg/kgより好ましくは1−10 mg/kgである。投薬数値は、及び軽減すべき状態のタイプ、重症度に応じ変わることに留意すべきである。さらに、特定の対象に対する特定の投薬用法は個々の必要、及び投与を担当する臨床医師の判断により、投与期間にわたり調整される必要があることを理解しなければならない。
【０２５４】
本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドでの治療の効果は、治療される病気，または異常の一または二以上の症状、または状態を示す指標の改善に基づいて熟練した臨床医師により判断される。一または二以上の臨床上の指標で、少なくとも10％の改善（測定される指標にもよるが、増大または減少）があれば「有効な治療」と考えられる。より大きな数値の改善、例えば、20%, 30%,40%,50%,75%,90%, または100%,あるいは測定される指標にもよるが、100%以上（例えば、2倍、3倍、10倍、等病状のない状態にまで達した状態を含み）であることが望ましい。指標は、例えば、酵素、サイトカイン、成長因子、または代謝レベル、細胞成長率、またはその死亡率、または異常細胞の存在、またはその量などの物理的計測値であっても良い。また、例えば、病気，または異常の症状の再燃（例えば、多発性硬化症のような軽減・再発の症状）する時間間隔の変化に基づき測ることもできる。代替的に、例えば、苦痛、不快感を訴える回数の減少のような非物理的要素による測定、またはその他の、病気の状態を示す指標により治療の効果を測ることもできる。非物理的要素による測定がされる場合には、様々な、臨床的に認められる尺度、または指標を用いることができる。例えば、Crohn’s Disease Activity Index またはCDAI(Best et al., 1976, Gastroenterology 70:439) があるが、これは、ヘマトクリット（hematocrit）及び、中でも小水の回数、または、非常に軟らかい便の両方の物理的指標と、腹部のひどい痛み、または痙攣及び一般的な健康状態などの患者の訴える要素と組み合わせて病気の点数を算出している。
【０２５５】
ここで用いる本明細書に記載の組成物を用いて行う「予防」（prophylaxis）は、その組成物により治療されていない個体（ヒトまたは動物モデル）でのそのような症状との比較で、一または二以上の症状の始まり、または激化が少なくとも10％遅れ、または減少し、または消失した場合、「有効である」。ヒトの病気で、動物で認められているモデルは、本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの病気また異常の治療、または予防効果を評価するために用いることができる。そのような病気のモデルには、以下を含む。例えば、Savoie et al.,1995, Am. J.Respir. Cell Biol. 13:133−143に記載のアレルギー喘息でのギニアピッグモデル、多発性硬化症の動物モデル、多くの種で誘発させることができる実験的な自己免疫性脳脊髄炎（autoimmune encephalomyelitis (EAE)）、例えば、ギニアピッグ（Suckling et al., 1984, Lab.Anim. 18:36−39）, Lewis家ネズミ（Feurer et al., 1985, J. Neuroimmunol. 10: 159−166）, ウサギ (Brenner et al. , 1985, Isr. J. Med. Sci. 21: 945−949), 及びハツカネズミ (Zamvil et al., 1985, Nature 317: 355−358) 公知の糖尿病の動物モデルは以下を含む。すなわち、インスリン依存性糖尿病（IDDM）及び非インスリン依存性糖尿病（NIDDM）の両方、具体例は、非肥満性糖尿病（NOD）ハツカネズミ（例えば、Li et al. , 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 11128−11132）, the BB/DP 家ネズミ(Okwueze et al., 1994, Am. J. Physiol. 266: R572−R577), the Wistar 肥満ネズミ (Jiao et al. , 1991, Int. J. Obesity 15: 487−495), 及びZucker 糖尿病肥満家ネズミ (Lee et al. , 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91"10878−10882) ; 前立腺病の動物モデル(Loweth et al. , 1990, Vet. Pathol. 27: 347−353), アテロース性動脈硬化のモデル(Chao et al. , 1994, J. によるモデルを含み多くのモデルがある、Lipid Res. 35: 71−83 ; Yoshida et al. , 1990, Lab. Anim. Sci. 40: 486−489 ; and Hara et al., 1990, Jpn. J. Exp. Med. 60: 315−318) ; ネフローゼ症候群(Ogura e tal. , 1989, Lab. Anim. 23: 169−174); 自己免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis） (Dietrich et al., 1989, Lab. Anim. 23: 345− 352);高尿酸血症/痛風（hyperuricemia/gout） (Wu et al. , 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 742−746), 腎炎（gastritis） (Engstrand et al. , 1990, Infect. Immunity 58 : 1763−1768); タンパク尿/腎臓糸球体欠陥（proteinuria/kidney glomerular defect）、 (Hyun et al. , 1991, Lab. Anim. Sci. 41: 442−446); 食物アレルギー（food allergy） (例えば、 Ermel et al. , 1997, Lab. Anim. Sci. 47: 40−49; Knippels et al. , 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 368−375; Adel−Patient et al. , 2000, J. Immunol. Meth. 235: 21−32; Kitagawa et al., 1995, Am. J. Med. Sci. 310: 183−187; Panush et al. , 1990, J. Rheumatol. 17: 285−290) ; リューマチ（rheumatoid disease） (Mauri et al. , 1997, J. Immunol. 159: 5032−5041; Saegusa et al., 1997, J. Vet. Med. Sci. 59: 897−903; Takeshita et al. , 1997, Exp. Anim. 46: 165−169); 変形性関節症（osteoarthritis） (Rothschild et al. , 1997, Clin. Exp. Rheumatol. 15: 45−51; Matyas et al., 1995, Arthritis Rheum. 38: 420−425); 狼瘡（lupus） (Walker et al. , 1983, Vet. Immunol. Immunopathol. 15: 97−104; Walker et al. , 1978, J. Lab. Clin. Med. 92: 932−943); 及び クローン病（Crohn's disease）(Dieleman et al. , 1997, Scand. J. Gastroenterol. Supp. 223: 99−104; Anthony et al. , 1995, Int. J. Exp. Pathol. 76: 215−224; Osborne et al. , 1993, Br. J. Surg.  80: 226−229)。 他の動物モデルは当業者に知られている。
【０２５６】
本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは高い親和性を持ちヒトの抗原とを結合する必要があるが、この効果を動物のモデルシステムにおいて確かめることができる場合は、ポリペプチドは動物のモデルシステムのおいて一または二以上の抗原に対しても、好ましくは高い親和性を持って反応すると思われる。当業者は容易にこの条件が特定の動物モデルシステム、及び特定のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドについて満足されるかを確かめることができる。もし、この条件が満たされるなら、病気と同じ状態である動物モデルに、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを投与し、そしてその病気の状態を示す一または二以上の指標によって、少なくとも10％の改善が見られるかをモニターすることにより、ポリペプチドの効果を検証することができる。
【０２５７】
実施例
実施例１.ヒトの血清アルブミン（HAS）及びハツカネズミの血清アルブミン（MSA）を標的とするシングルドメイン抗体（dAbs）の集合の選択
特定の残基で多様性を持つＶH配列、またはＶL配列のライブラリーを作り出すことは、WO 99/20749に記載されているが、この文献は引用により本明細書に組み入れられる。HAS 及びMSAに特異のシングルドメイン抗体の同定においては、以下の3つの異なるライブラリーを作り出すのに同じアプローチを用いた。その何れも、CDR1,2 及び３に組み入れられるNNKコドンによりコードされる多様性のある側鎖をもつ、ＶH、またはＶLの単一のヒトのフレームワークをベースとしている。
【０２５８】
相補性決定領域（CDR1, CDR2 及びCDR３）に組み入れられるNNKコドンによりコードされる多様な側鎖をもつ、ＶH（図面1及び２を参照：V3−23/DP47 及びJH4bに基づくダミーＶH配列）、またはＶK（図面３を参照：  012/02/DPK9 及びJk1に基づくダミーＶK配列）
ライブラリー１（ＶH、V3−23/DP47 及びJH4bに基づく、図面1を参照）
多様性の位置：H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98,
ライブラリーサイズ：          6.2x109
ライブラリー２：（ＶH、V3−23/DP47 及びJH4bに基づく、図面２を参照）
多様性の位置：H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a, H100b,
ライブラリーサイズ：          4.3x109
ライブラリー３：（ＶK、012/02/DPK9 及びJk1に基づく、図面３を参照）
多様性の位置：L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94, L96, 
ライブラリーサイズ：          2x109
ＶH、またはＶKライブラリーはリガンド属のタンパク質A 及びＬそれぞれに結合するために事前選択されており、したがって選択されてないライブラリーのクローンの大半は機能的である。上に示したライブラリーのサイズは事前選択後のサイズに対応する。
【０２５９】
それぞれのライブラリーを別個に用い、血清アルブミン上で2回のラウンドの選択がなされた。各回の選択において抗原は100μg/ml濃度のPBS4ml中でイミュノチューブ（immunotube）（nunc）にコートされた。第一ラウンドの選択では、3つのライブラリーのそれぞれは、HAS(Sigma) 及びMSA(Sigma)に対してそれぞれ別個に選別された。第二ラウンドの選別では最初の6回の第一ラウンド選別の各回から得たファージは(i)同じ抗原に再度（例えば、第一ラウンドMSA、第二ラウンドのHAS）,(ii)相互抗原（例えば、第一ラウンドMSA、第二ラウンドのHAS）に対して選別された。合計12ラウンドの選択がなされた。各々の場合、第二ラウンドの選択の後、48のクローンのHAS 及びMSAに対する結合が試験された。Harrison er al, Methods Enzymol 1996;267:83−109によるscFv断片として示した、可溶性のdAb断片が作られた。2％ツイーン（tween）乳化剤PBSがブロック緩衝液として用いられた以外は標準のELISAプロトコールに従った（Hoogenboom et al.,1991; Nucleic Acids Res. 19:4133）。そして結合されたdAbが、タンパク質L−HPR(Sigma) (ＶKSについて)、及びタンパク質A−HRP(Amersham Pharmacia Biotech)(ＶＨＳについて)により確認された。
【０２６０】
MSA, HASまたはその両者に結合することを示す上述の背景をシグナルするdAbは、ELISA不溶性形態でプラスチックにのみ結合するかどうかが試験されたが、これらはすべて血清アルブミンに特異であった。クローンは配列が決定され（下記の表を参照）21のユニークdAb配列が同定された。選択されたＶK   dAbクローン間の最小の類似率は86.25%(69/80)x100−すべての多様化残基が異なる場合の結果、例えば、クローン24及び34）であった。選択されたＶH  dAbクローン間の最小類似率は94%((127/136)x100)。
【０２６１】
次に、血清アルブミン結合dAbが、液からビオチン化(biotinylated)抗原を捕捉する能力を持っているかについて試験された。ELISAプレートが1μg/mlタンパク質L（ＶKクローンについて）及び1μg/mlタンパク質A（ＶHクローンについて）によりコートされたこと以外、ELISAプロトコール（上記）の手続に従った。可溶性dAbがプロトコールにあるように液から捕捉され、ビオチン化されたMSA, またはHAS、及びストレプトアビジン（streptavidin）HRPにより検出が行われた。ビオチン化されたMSA,及び HASは、血清アルブミン分子ごとに平均２ビオチン（biotin）を達成することを目的とし、製造者のマニュアル指示にしたがって準備された。ELISA中の液からビオチン化されたMSAを捕捉した24のクローンが同定された（表１）。このうち2は（クローン2及び38）はまた、ビオチン化されたHASを捕捉した。次にdAbの、CM5 TM  Biacore 表面プラスモン共鳴（surface plasmon resonance）チップにコートされたMSAを結合する能力を試験された。８クローンがBiacore  チップ上でMSAを結合しているのが見出された。
【表１】
2008500268.tif 000003
2008500268.tif 000004
すべてのケースにおいて、フレームワークは上記表に示すようにCDRにおいて多様性を持ち、対応するダミー配列のフレームワークと同一であ
った。
【０２６２】
Biacore  チップ上でMSAを結合した8つのクローンの内、大腸菌で高度に発現した2つのクローン（クローンMSA16 及びMSA26）がさらに研究のために選択された（実施例2参照）。MSA16及び26のすべてのヌクレオチド及びアミノ酸配列は図４に記載されている。
【０２６３】
実施例２.MSA結合dAb MSA16 及びMSA26 のハツカネズミにおける親和性、及び血清半減期の決定
dAb MSA 16 及びMSA26は大腸菌ぺリプラズマで発現させ、タンパク質Ｌ−アガロース親和樹脂（Affitech, Norway）へのバッチ吸収、さらにグリシンpH2.2による溶出を利用し精製した。精製されたdAbは、Kdを決定するためその後、抑制（inhibition）表面プラスモン共鳴により分析された。簡潔に言えば、精製MSA16 及びMSA26は高密度のMSAでコートされた Biacore CM5 TM  SPR チップ上で、200RUの反応を得るために必要なdAbの濃度を決定するための試験がなされた。必要な濃度のdAbが決まれば、予想されるKdに近い濃度範囲でMSA抗原がdAbと事前に混合され、一夜培養された。各事前混合のいて、dAbのSPRチップにコートされたMSAに対する結合が、30μl/分の高流速下で測定された。Klotz プロットを作成するために結果を曲線で示し、それによるとMSA16に対し200nM  Kd (図5)、及びMSA26に対して70nM   Kdであると予測された(図６)。
【０２６４】
つぎに、MSA16, 及びMSA26は、HA タッグ（tag）（核酸配列：TATCCTTA TGATGTTCCTGATTATGCA(配列番号167)、及びアミノ酸配列YPYDVPDYA(配列番号168)を持つ発現ベクターにクローンされ、2−10ｍg量が大腸菌で発現され、そしてタンパク質L−アガロース親和性樹脂（Affitech Norway）を用い上澄みから精製され、pH2.2グリシンにより溶出された。dAbの血清半減期はハツカネズミで確認された。MSA16, 及びMSA26は一つのシングル免疫グロブリン可変ドメイン注射により、約1.5mg/kg濃度でCD１ハツカネズミに投薬された。血清レベルの分析は、ヤギのanti−HA（Abcam, UK）捕捉、及び4％Marvelでブロックした、タンパク質L−HPR(invitrogen)検出ELISAにより行った。洗浄は0.05%Tween PBSで行った。テストサンプルとの適合性を確実にするため、１xハツカネズミの血清の既知濃度dAbの標準カーブを出した。2コンパートメント化したモデルは、MSA26、はt1/2αが0.16時間、t1/2βが14.5時間、またエリア・アンダー・カーブ（AUC）が465時間mg/ml（データは表示されていない）、であり、MSA16は、t1/2αが0.98時間、t1/2βが36.5時間、またエリア・アンダー・カーブ（AUC）が913時間mg/mlであったことを示す(図7)。何れの場合も、アンチMSAクローンは,その半減期が、HEL4（アンチヘン  エッグ  ホワイト  リソチーム  dAb）（anti−hen egg white lysozyme  dAb）のt1/2αでは0.06時間、t1/2βは、0.34時間であるに比べ,大幅に増大している。
【０２６５】
実施例３.  ヘン  エッグ  リソチーム、TNF−α 及び TNF−β受容体に特異のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの同定。
【０２６６】
実施例1に記載のライブラリーと類似のdAbライブラリーから、ヘン  エッグ  リソチーム（HEL）、TNF−α 及び TNF−β受容体を結合する多くのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドが同定された。HEL特異の、及びTNF−受容体dAbは、DP47ベースのＶHライブラリーから同定され、またTNF−αdAbはDPK9ベースのＶKライブラリーから同定された。代表的な核酸及びアミノ酸配列は図８に記載されている。
【０２６７】
実施例４.  TNF−α特異のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの二量化
本明細書に記載のシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドのホモ二量体は、その結合活性効果（avidity effect）が最大の理由と考えられるが、ポリペプチドの抗原結合力を増大させる。これについては上で説明し図８に記載の、分離されたTAR1−5−19 dAbのホモ二量体化により調査した。
【０２６８】
TAR1−5−19 dAbは、Ｃ末端に遊離システインを持つ様操作されていた。システインの修飾がされたdAbの大腸菌での発現により、単量体と二量体（ジスルフィド結合）の混合を得た。
【０２６９】
特に TAR1−5−19をSal1 及びBamHI部位でのPCRクローニングのために、、またＣ末端に遊離システインを導入するため、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
【０２７０】
フォワードプライマー（forward primer）
5'-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3' (配列番号169) 
逆プライマー（reverse primer）
5'-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3'(配列番号170)
【化１】
2008500268.tif 000005
【０２７１】
2008500268.tif 000006
【０２７２】
（配列番号171（ヌクレオチド）、配列番号172（アミノ酸）、＊TAR1-5-19CYS配列の開始）
PCR反応（50μl 容量）は以下の通りに設定した：200μM dNTP’s, 各プライマー0.4μM、10ｘPfu Turbo 緩衝液（Stratagene）5μl, テンプレートプラスミド100ng(TAR1-5-19をコードする)、1μl Turbo酵素 （Stratagene）及び滅菌された水を用いて容量を50μlに調整。PCR条件は以下の通り：イニシアル変性ステップ  94℃  2分、その後94℃  30秒間、64℃  30秒間、及び72℃  30秒間を25サイクル。最終持続ステップは、また72℃  5分を含む。PCR製品は精製され、SalI及びBamHIで分解され、そして同じ制限酵素で切断されているベクターに結紮された。正しいクローンはDNA配列により確認された。
【０２７３】
TARL1-5-19CYSの発現と精製
製造者プロトコールに従い、TAR1-5-19CYSベクターはBL21(DE3)pLysS化学的に応答力のある（chemically competent）細胞（Novagen）に形質転換（transform）された。100μｇ/mL のカルベニシリン（carbenicillin）及び37μｇ/mLのクロラムフェニコール（chloramphenicol）を用いてｄAb プラスミドをもつ細胞が選択された。培養は500mLの過激溶媒（teriffic broth）(Sigma-Aldrich) 、100μｇ/mL のカルベニシリン、及び37μｇ/mLのクロラムフェニコールを含む2Lの調節板付きフラスコで行った。30℃，200rpmで、1-1.5のO.D.600まで培養され、その後1mM IPTG（イソプロピルーβ―D-チオガラクトピラノシド（(isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside, Melford Laboratories)で誘発された。DAbの発現は30℃で12−16時間続けられた。殆どのdAbは培養地に存在することが分った。したがって、細胞は媒体から遠心分離（8,000xgで30分間）により分離され、上澄みはdAbを精製するために用いられた。リッター当りの上澄みに、30mLのタンパク質Lアガロース（Affitech）が加えられ、そしてdAbは2時間の間掻き混ぜられながらバッチ結合する状態におかれた。上澄みがサイフォンで吸いだされる前に、樹脂がさらに1時間重力沈下に任せて落ち着くのを待った。アガロースは、その後XK50カラム(Amersham Phamacia)に詰め、10カラム容量のPBSで洗浄された。結合したdAbは100mMグリシン  pH2.0 で溶出され、断片を含むタンパク質は1M Tris pH8.0の1/5容量を追加することにより中和された。1リッター当りの培養上澄みに対し、20mgの純粋タンパク質が分離され、その内訳は、モノマーと二量体が50:50の割り合いであった。
【０２７４】
TAR1-5-19CYS二量体からTAR1-5-19CYSモノマーの分離
ホモ二量体からモノマーを分離するためにカチオン交換クロマトグラフィーを用した。カチオン交換分離を行う前に、モノマー/二量体の混合サンプルが製造者ガイドラインに従いPD-10カラムを用いて、50mM、pH4.0の酢酸ナトリウム緩衝液に緩衝液交換された(Amersham Phamacia)。サンプルは、その後、事前に50mM、pH4.0の酢酸ナトリウムで平衡化された1mL Resource S カチオン交換コラムに容れられた。モノマーと二量体は50mM、pH4.0の酢酸ナトリウムで次の塩勾配を用い分離された：
15カラム容量に対し150 - 200 mM  塩化ナトリウム
10カラム容量に対し200 - 450 mM塩化ナトリウム
15カラム容量に対し450 - 1000 mM塩化ナトリウム
二量体のみを含む破片はSDS-PAGEを用いて同定され、プールされ、1M Tris pH8.0の1/5容量を追加することによりpHが８に上げられた。
【０２７５】
インビトロ機能的結合アッセイ：TNF 受容体アッセイ及び細胞アッセイ
ヒトのTNFαの二量体の親和性を、TNF受容体及び細胞アッセイを用いて決定した。受容体アッセイのIC50はおおよそ0.3-0.8nMであり、細胞アッセイのND50はおおよそ3-8nMであった。
【０２７６】
他のTAR1-5-19CYS二量体のフォーマットには、例えば、PEG二量体、及び注文合成のマレイミド（maleimide）二量体を含む。Ncktar (Shearwater)  は、小さなリンカーがdAbを分けて、両dAbは5-40kDaのサイズのPEGにリンクされる、モノマーを二量体にフォーマットする範囲のビーマレイミド（bi-maleimide）PEG （mPEG2- (MAL) 2 または mPEG- (MAL) 2）を提供する。5kDa mPEG-(MAL)2 (すなわち、[TARl-5-19]-Cys-maleimide-PEG x 2,  この場合マレイミドは二量体中でお互いにリンクされている)  はTNF受容体アッセイにおいて1-3nMの親和性を持っていることが示されている（データは非表示）。代替的に、二量体はまた、TMEA (トリ（２−マレイミドエチル）アミン) (Tris [2- maleimidoethyl]amine) (Pierce Biotechnology)または、他の二機能的（bi-functional）リンカーを用いて作り出すことができる。
【０２７７】
他の代替的な方法として、2,2’-ジチオジピリジン（2, 2'-dithiodipyridine） (Sigma Aldrich)及び還元モノマーを用いる化学結合プロセスにより、ジスルフィド結合された二量体を作ることができる。ｄAbのC末端にポリペプチドリンカーまたはヒンジを追加する。小さいリンカーである(Gly4Ser) n、（ここで n= 1から10, 例えば、1, 2,3, 4,5, 6 または7である）、または免疫グロブリン（例えば、IgG）ヒンジ領域、またはランダムペプチド配列（例えば、ランダムペプチド配列ライブラリーから選択された）は、dAbと末端システイン残基の間に操作し、挿入することができる。これにより、上記に記載の二量体を作るのに用いることができる。
【０２７８】
実施例５  ：シングル免疫グロブリン可変ドメインホモ二量体に関する追加の考察
二量体化については、軟性ポリペプチドリンカーを用いてdAb-リンカー-dAbフォーマットにおいてVH 及び VK ホモ二量体が作り出されるところについて調査した。異なる長さのグリシンーセリン（glysin-serine）リンカー(3U: (Gly4Ser) 3,５U : (Gly4Ser) 5,7U: (Gly4Ser)7)を含むdAb-リンカー-dAbフォーマットに、ベクターが作りだされた。リンカーのガイドdAb上流（TAR1-5 (VK), TAR1-27 (VK), TAR2 (VH)または TARlh-6 (VK ; DOMlh-6とも呼ぶ)  及びリンカーの後の対応する第二のdAbライブラリーを用いて、二量体ライブラリーが作り出された。
【０２７９】
この方法を用いて、新たな二量体dAbが選択された。二量体化の抗原結合効果はELISA及びBIAcore研究、及び細胞及び受容体アッセイにより決定された。TAR1-5 及びTAR1-２７両方の二量体化は結合親和力、及び中和化のレベルにおいて重要な改善をもたらした。
【０２８０】
方法
A. ライブラリーの生成
１．  ベクター
pEDA3U, pEDA5U 及び pEDA7Uベクターは、dAb-リンカー-dAbフォーマットと適合性のある異なるリンカー長さを導入する様にデザインされていた。pEDA3Uについては、センス、及びアンチセンス73−塩基ペアーオリゴリンカーが、0.1MNaCl, 10mM Tris-HCl pH7.4を含む緩衝液中でゆっくりしたアニールプログラム(95°C-5分, 80°C-l0分, 70°C-15分, 56°C-15分,  使用するまで 42°C)を用いアニールされ、そしてXho1 及びNot1制限部位を用い、クローンされた。リンカーは3つの(Gly4Ser)単位、及びSal1 及びNo1lクローン部位の間に収容されるスタッファー（stuffer）領域を含む。ファージ提示法によりモノマーdAbが選択される可能性を減少させるために、第二のdAbが存在しない場合にはその領域をフレームから除くように、スタッファー領域は3つの終止コドン、Sal1制限部位、及びフレームシフト変異を含むようにデザインされた。PEDA5U、及びpEDA7Uについては、要求されるリンカーの長さのために、各ベクターについて、重複するオリゴリンカーがデザインされ、アニールされ、そして、Klenowを用い伸長された。  その後断片は、Xho1、及びNot1制限部位を用いクローンする前に適当な酵素を使って、生成され、分解された。
【化２】
2008500268.tif 000007
【０２８１】
２．ライブラリー生成
ガイドdAbに対応するN末端の遺伝子は、Not1、及びXho1制限部位を用いるリンカーの上流でクローンされた。VH遺伝子は既存の適合部位をもつが、VK遺伝子のクローンには適当な制限部位の導入が必要である。これはPCRプライマー(VK-DLIBF: 5' CGGCCATGGCGTCAACGGACAT (配列番号173); VKXholR： 5' ATGTGCGCTCGAGCGTTTGATTT 3' (配列番号174) )を修飾する方法を用い、2:1  混合のSuperTaq (HTBiotechnology Ltd) 及びpfu ターボ（pfu turbo） (Stratagene)を用いて30サイクルPCR増幅により可能となった。  この方法により、5’末端にNo1lの部位を維持しながら、隣接するSal1 部位を破壊しつつ、3’末端にXho1部位を導入した。5つのガイドdAbは前記３つの二量体ベクターの各々にクローンされた：TAR1-5 (VK), TAR1-27 (VK), TAR2 (VH), TAR2h-6 (VK; またDOMlh-6ともいう)及びTAR2h-7 (VK;  またDOMlh-7ともいう)すべての構築は配列分析により確認された。
【０２８２】
各ベクター（pEDA3U, pEDA5U 及び pEDA7U）： TAR1-5 (VK), TAR1-27 (VK), TAR2 (VH), TAR2h-6 (VK)において、リンカーの上流にガイドdAbをクローンしたことにより、第二のdAbに対応するライブラリーがリンカーに倣いクローンされた。これを達成するため、相補dAbライブラリーが、以下のラウンド１の選択から回収されたファージからPCR増幅された。そのライブラリーは、TAR1-5 または TAR1-27 がガイドdAbである場合は、TNF-α（共にラウンド１の終了後約１ｘ106の多様性）に対してVKライブラリー、またはTAR2 または TAR2h-6 がそれぞれガイドdAbである場合は、p55 TNFR（ラウンド１の終了後約１ｘ105の多様性）に対してVHまたはVKライブラリーである。VKライブラリーについては、PCR増幅は、2:1混合のSuperTaq及びpfu ターボ（pfu turbo）を用い、30サイクルのPCR増幅でプライマーを用いて行う。VHライブラリーは、遺伝子の5’末端にSal1制限部位を導入するためにプライマーを用いてPCR増幅された。dAbライブラリーPCRは適当な制限酵素を用いて分解され、Sat1/Not1制限部位を用いてリンカーの下流の対応するベクター結紮され、そして電気穿孔法により新たに準備された適格TG1細胞に導入された。
【０２８３】
各ライブラリーにつき達成したタイター（titre）は次の通りである。
【０２８４】
TAR1-5: pEDA3U= 4x108, pEDA5U = 8x107, pEDA7U = 1X108 
TAR1-27: pEDA3U = 6.2x108, pEDA5U = 1x108, pEDA7U = 1x109 
TAR2: pEDA3U = 4x107, pEDA5U = 2 x 108, pEDA7U = 8x107 
TAR2h-6: pEDA3U = 7.4x108, pEDA5U = 1.2 x 108, pEDA7U = 2.2x108 
B. 選択
１．TNF-α
選択は免疫チューブ（immunotube）に受動的にコート（coat）されたヒトのTNF-αを用いて行った。得られたアンチTNF-αdAbは分類接頭辞「TAR1」を用いて呼ぶ。簡潔に言えば、免疫チューブは必要な抗原1-4mlで一夜コートされる。免疫チューブは、その後PBSで３度洗浄され、PBSに2％の粉ミルクを含んだもので１−２時間遮断され、さらにPBSで３度洗浄された。ファージ溶液はPBS中に２％の粉ミルクを含む液で薄められ、室温で２時間培養される。チューブは，その後PBSで洗浄され、ファージは1mg/mlトリプシンーPBS(trypsin-PBS)で溶離される 。TAR1-5二量体ライブラリーについは３回選択ストラテジー（strategy）により調査された。第１ラウンドの選択は、PBS 0.1% Tween で２０回洗浄され、1μg/ml または20μg/ml皮膜のヒトのTNF-αを用いて免疫チューブで実施された。TGI細胞は溶離されたファージに汚染されており、タイター量が決定された（例えば、Marks et al J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222 (3): 581-97, Richmann et al Biochemistry. 1993 Aug 31 ; 32 (34): 8848-55）。
【０２８５】
回収されたタイターは
pEDA3U = 2.8x107 (1μg/ml TNF) 1.5x108 (20μg/mlTNF), 
pEDA5U= 1.8x107 (1μg/ml TNF), 1.6x108 (20μg/ml TNF) 
pEDA7U = 8X106 (lμg/ml TNF), 7x107 (20μg/ml TNF). 
であった。
【０２８６】
第２ラウンドの選択は、３つの異なる方法により実施した：
１．   免疫チューブ内で、２０回洗浄、一夜培養の後さらに１０回洗浄
２．   免疫チューブ内で、２０回洗浄後、洗浄緩衝液（1μg/ml  TNF-α）中、室温で１時間培、その後さらに１０回洗浄
３．   33pモル  のビチニン化されたヒトのTNF-αを用い、ストレプトアビジン  ビーズ（streptavidin  beads）上で選択。第２ラウンドの選択によるシングルクローンが96ウエルプレートに採られ、荒い上澄みプレップ（preps）を2mlウエルプレートフォーマットで作った。
【表２】
2008500268.tif 000008
【０２８７】
TAR1-27については、選択は、既に述べた内容に以下の修飾をして実施し
た。第１ラウンドの選択は、PBS 0.1% Tween で２０回洗浄され、1μg/ml または20μg/ml皮膜のヒトのTNF-αを用いて免疫チューブで実施された。第２ラウンドの選択は、免疫チューブ内で、２０回洗浄後、１夜培養し、その後さらに２０回洗浄した。第２ラウンドの選択によるシングルクローンが96ウエルプレートに採られ、荒い上澄みプレップ（preps）を2mlの96ウエルプレートフォーマットで行った。
【０２８８】
TAR1-27のタイター量は以下の通りである。
【表３】
2008500268.tif 000009
【０２８９】
２．P55 TNFR
選択は、p55TNFRを標的抗原として用い、アンチTNF結合剤の場合と本質的に同様に行われる。3ラウンドの選択が免疫チューブで実施され、PBS 0.1% Tween で２０回洗浄され、1μg/ml または10μg/ml  p55 TNFRを用い、一夜培養の後さらに２０回洗浄した。第２及び第３ラウンドの選択によるシングルクローンが96ウエルプレートに採られ、荒い上澄みプレップ（preps）を2mlの96ウエルプレートフォーマットで作った。結果物のアンチp55 TNFR  dAbは分類接頭辞「TAR2」を使い示す。
【０２９０】
TAR2のタイター量は以下の通りである。
【表４】
2008500268.tif 000010
【０２９１】
C. スクリーニング
第２及び第３ラウンドの選択によるシングルクローンは、適当な場合は、異なる選択方法から選ばれた各３Ｕ、５Ｕ、７Ｕライブラリーの各々からピックアップされた。クローンは、100μg/mlアンピシリン（ampicillin）及び１％グルコースの37℃、２ｘＴＹ中で一夜培養された。この培養の1/100希釈液が、96ウエルプレートフォーマットの、0.2ml に100μg/mlアンピシリン（ampicillin）及び中に0.1％グルコースを含む0.2mlの２ｘＴＹ中に植え付けられ、ＯＤ600が約0.9となるまで、３７℃で振とう生長させた。培養はその後1mM IPTGにより、30℃の温度で一夜誘発された。上澄みは、Sorval  プレートで遠心分離機により、4000rpmで15分間遠心分離浄化された。上澄みプレップ（preps）はイニシアルスクリーニングに用いた。
【０２９２】
1.ELISA
二量体遺伝子組替えタンパク質の結合活性を、タンパク質 A/L ELISA, または抗原ELISAによりモノマーと比較した。簡潔に言えば、96ウエルプレートは抗原、またはタンパク質 A/Lにより4℃で一夜コート（coat）される。プレートは0.05% Tween PBSで洗浄し、２% Tween PBSで2時間ブロックされる。サンプルがプレートに追加され、室温で1時間培養される。プレートは洗浄され、二次試薬により室温で1時間培養される。  プレートは洗浄され、TMB気質により発現（develop)される。  タンパク質 A/L−HRPまたはIndia-HRPが二次試薬として用いられた。抗原ELISAについては、使用された抗原の濃度は, TNF-α及びp55 TNFRに対し、PBS中で1μg/mlであった。殆どの場合、ガイドdAbが存在するため、二量体はELISAシグナルがプラスであり、したがって、オフレート（off rate）の決定はBIAcore(SPR)分析によって行った。
【０２９３】
２．BIAcore(SPR)分析
BIAcore(SPR)分析はTAR1-5, 及びTAR2クローンについて行った。スクリーニングのため、TNF-αは高密度で（約10000RUs）CM5チップに連結された。50μlのTNF-α（50μg/ml）が毎分5μlアセテート緩衝液―pH5.5―中でチップに連結された。TNF-αが不安的なため、標準方法を用いた以下の分析によるチップの再生をすることは不可能である。したがって、各サンプルが分析された後にチップは緩衝液で10分洗浄された。
【０２９４】
TAR1-5について、ラウンド2の選択によるクローン上澄みはBIAcoreによりスクリーニングされた。
【０２９５】
48のクローンが,  以下の選択方法を用いて得られた各３Ｕ，５Ｕ及び７Ｕのライブラリーからスクリーニングされた；
Ｒ１：１μg/ml のヒトのTNF-α  イミュノチューブ、Ｒ２  １μg/ml のヒトのTNF-α  イミュノチューブ、一夜洗浄。
【０２９６】
Ｒ１：２０μg/ml のヒトのTNF-α  イミュノチューブ、Ｒ２  ２０μg/ml のヒトのTNF-α  イミュノチューブ、一夜洗浄。
【０２９７】
Ｒ１：１μg/ml のヒトのTNF-α  イミュノチューブ、Ｒ２  ３３pmolのビオチニ化されたヒトのTNF-α、小球上（on beads）。
【０２９８】
Ｒ１：20μg/ml のヒトのTNF-α  イミュノチューブ、Ｒ２  ３３pmolのビオチニ化されたヒトのTNF-α、小球上（on beads）。
【０２９９】
スクリーニングのために、p55 TNFR（前記のDOM1と呼ぶ抗原、統一的な呼び方とするため、ここではp55 TNFRとする；結果物であるアンチp55  dAbは接頭辞「TAR2」が付されることに注意）は高密度（約4000RU）でCM5チップに連結された。100μlのp55 TNFR-α（10μg/ml）が毎分5μlアセテート緩衝液―pH5.5―流中で毎分チップに連結された。標準再生条件（グリシン  pH2, または3）で調査が試みられたが、TNF-αの場合と同様に毎回抗原はチップの表面から、除去された。したがって、各サンプルが分析された後にチップは緩衝液で10分間洗浄された。
【０３００】
Tar2については、ラウンド2の選択によるクローン上澄みがスクリーニングされた。48のクローンは以下の選択方法を用いて,各３Ｕ，５Ｕ及び７Ｕのライブラリーからスクリーニングされた；
Ｒ１：１μg/ml p55 TNFR  イミュノチューブ、Ｒ２  １μg/ml p55 TNFR  イミュノチューブ、一夜洗浄。
【０３０１】
Ｒ１：10μg/ml のp55 TNFR  イミュノチューブ、Ｒ２  10μg/ml のp55 TNFR  イミュノチューブ、一夜洗浄。
【０３０２】
3.受容体及び細胞アッセイ
受容体アッセイにおいて二量体の中和能力が評価された。アンチTNFシングル免疫グロブリン可変ドメイン（anti-TNF dAb）の、ハツカネズミL929線維芽細胞でTNFの有毒活性の中和能力が試験された(Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15,243-248)。簡潔にいえば、マイクロタイタープレートに塗られたL929細胞はアンチTNF dAb、100pg/ml TNF-α及び1mg/mlアクチノマイシン  D（antinomycin D）(Sigma, Poole, UK)とともに一夜培養された。[3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-yl)-5-(3-カルボオキシメチオキシフェニル)-2-(4-サルフォフェニール)-2H-テトラゾリウム] [3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3- carbboxymethoxyphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (Promega, Madi- son, USA).による培養に続いて、490nmでの吸光度による細胞生育力が測定された。アンチTNFdAb活性によりTNFの有毒活性が減少しており、その結果TNFのみのコントロールの場合に比較して、吸光度が増加していることが分った。
【０３０３】
好ましいアプローチとして、P55 TNF-α受容体でのシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの効果を評価する場合に、HeLa細胞においてTNFによるIL-8の分泌の誘発に基づく、以下のHeLa細胞アッセイが用いられる（この方法はAkeson, L. et al (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523, 記載の方法を採用する。そこではHUVEC細胞おいてIL-1によりIL-8の誘発について記載しているが、ここではヒトのTNFアルファによる誘発を検討しているため、HUVEC細胞系に代わり、HeLa細胞を用いる）。簡潔に言えば、マイクロタイタープレートに塗られたHeLa細胞はdAb、及び300pg/ml TNFとともに一夜培養された。培養に続き、上澄みは細胞から吸い出され、IL-8の濃度がサンドイッチELISA(R&D Systems)により測定された。アンチTNFR1  dAb活性により、TNFのみのコントロールに比べて、IL-8の上澄みへの分泌が減少した。
【０３０４】
アンチTNF  dAbについては、以下述べるように、TNFの遺伝子組換えTNF受容体１（p55）への結合抑制能力を試験した。簡潔に言えば、Maxisorp プレートが30mg/ml  抗ヒトFcハツカネズミ単クローン抗体で一夜培養された(Zymed, San Francisco, USA)。ウエルは0.05%Tween-20リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄され、そして100ng/ml TNF受容体１Fc 融合タンパク質で培養される前に、1%BSAを含むPBSでブロックされた(R&D Systems, Minneapolis, USA)。アンチTNF dAbは、洗浄されたウエルに最終濃度10ng/mlで加えられたTNFと混合された。TNF結合は、0.2mg/mlのビチニオ化されたアンチTNF抗体(HyCult biotechnology, Uben, Netherlands)で検出され、続いて、1：500の希釈濃度のホースラディシュペロキシダーゼ標識ストレプトアビジン(horseradish perioxidase lebelled streptavidin) (Amersham Biosciences, UK)で薄め、TMB基質で培養した(KPL, Gaithersburg, MD)。反応はHCLを加えて停止され、そして450nmで吸光度がを測定された。アンチTNF dAbの阻害活動により、TNF結合が減少し、そのためTNFのみのコントロールに比べて吸光度が減少した。
【０３０５】
当初のスクリーニングにおいては、上記で述べたようにBIAcoreのために用意された上澄みが受容体アッセイで用いられた。さらに選択された二量体についての分析が精製タンパク質を用いて受容体、及び細胞アッセイで行われた。
【０３０６】
Ｄ．配列分析
BIAcore及び受容体アッセイスクリーニングで興味ある特性を示した、二量体、の配列が決められた。配列の詳細は表5に示す。
【０３０７】
E. フォーマッティング
１．    TAR1-5-19二量体
良好な中和特性を示したTAR1-5二量体は再フォーマットされ、細胞及び受容体アッセイで分析された。TAR1-5ガイドdAbは親和性の十分あるクローンTAR1-5-  19により置換された。これを達成するために、TAR1-5は個々の二量体ペアーからクローンされ、PCRで増幅されたTAR1-5-19によって置換された。さらに、TAR1-5-19ホモ二量体はまた、３Ｕ，５Ｕ及び７Ｕベクターで構築された。遺伝子のＮ末端コピーはPCRにより増幅され、上に記載のようにクローンされ、またＣ末端遺伝子断片は既存のSalI及びNot1制限部位を使ってクローンされた。
【０３０８】
２．    変異
TAR1-5二量体ペアーのＣ末端dAbの一つである、dAb2に存在するアンバー終止コドンは、部位特異的変異誘発（site directed mutagenesis）によりグルタミンに変異された。
【０３０９】
３．    Fabs
TAR1-5、またはTAR1-5-19を含む二量体はFab発現ベクターに再フォーマットされた。dAbは Sfi1及び Not1制限部位を用い、CK または CH遺伝子を含む発現ベクターにクローンされ、配列分析により確認された。CK ベクターはpUCベースのアンピシリン抵抗ベクター、CHベクターはpACYCクロラムフェニコール(chloramphenicol)抵抗ベクターに由来する。Fab発現のために、dAb-CH及びdAb-CK構築は一体でHB1251細胞に形質転換され、0.1%グルコース、10μg/mlアンピシリン、及び10μg/mlクロラムフェニコールを含む２ｘTYで生育された。
【０３１０】
４．    ヒンジ二量体化（hinge dimerization）
システイン結合フォーメイションによるｄAbの二量体化について調査した。短いアミノ酸配列EPKSGDKTHTCPPCP (配列番号175)は、ヒトのIgGC1ヒンジの修飾された形であるが、dAbのＣ末端において操作されたものである。既に記載の通り、この配列をコードするオリゴリンカーが合成され、アニールされた。リンカーは、Xho１制限部位及び Not1制限部位を用いてTAR1-5- 19を含むpEDAベクターにクローンされた。二量体化はペリプラスマ（periplasm）自体で起きる。
【０３１１】
F. 発現及び精製
１．    発現
上澄みは、上に記載のように最初のスクリーニングのための2ml, 96-ウエルプレートフォーマットで作られた。最初のスクリーニングプロセスに続き選択された二量体はさらに分析された。二量体の構築はTOP10F’またはHB2151細胞で上澄みとして発現された。簡潔に言えば、新たに綿球などで擦られ、プレートから採られた個々のコロニーは37℃で、100μg/mlアンピシリン（ampicillin）及び1％グルコースを含む２ｘＴＹ中で一夜成長させた。この培養の1/100希釈液は、100μg/mlアンピシリン及び0.1％グルコースを含む２ｘＴＹに植えつけられ、OD600が約0.9となるまで37℃で振とう育成された。培養は、その後1mM IPTGにより30℃で一夜誘発された。細胞は、遠心分離により除かれ、上澄みはタンパク質A, またはＬアガロースによって精製された。
【０３１２】
Fab及びシステインヒンジ二量体はHB2151細胞内でペリプラズム(periplasmic)タンパク質として発現された。一夜培養の1/100希釈液が、0.1％グルコース及び適当な抗生物質とともに２ｘＴＹ中に植えつけられ、OD600が約0.9となるまで振とう育成された。培養は、その後1mM IPTGにより，25℃で3−4時間かけ誘発された。細胞は、遠心分離により収集され、ペレットはペリプラスム準備緩衝液（30mM Tris-HCL pH8.0, 1mM EDTA, 20% スクロース）中で再懸濁された。遠心分離に続いて、上澄みが採られ、ペレットは5mM MgSO4で再懸濁された。上澄みは、再度遠心分離によって収集され、プールされ、精製された。
【０３１３】
２．    Protein A/L精製
Protein Lアガロース（Affitech, Norway）またはProtein Aアガロース（Sigma, UK）から得られる二量体タンパク質の精製の最適化について調査した。タンパク質は蠕動ポンプを使いバッチ、またはカラムにより溶出した。3つの緩衝液について調査した。0.1Mクエン酸リン酸塩緩衝液pH2.6, 0.2MグリシンpH2.5, 及び0.1グリシンpH2.5である。すなわち、0.1グリシンpH2.5を10カラム容積以上を用いて蠕動ポンプ条件下で、最適条件を決めた。タンパク質 Aの精製は、蠕動ポンプ条件で0.1グリシンpH2.5を用いて行った。
【０３１４】
３．    FPLC精製
精製についてさらにAKTA  Explorer 100 system (Amersham Biosciences Ltd)によるFPLC分析により実施した。TAR1-5及びTAR1-5-19二量体はカチオン交換クロマトグラフィーにより分画され(１ml Resource S-Amersham Biosciences Ltd)  0-1M勾配のNaClで、ｐH4の50mMアセテート緩衝液に溶出させた。ヒンジ二量体はイオン交換(１ml Resource Q Amersham Biosciences Ltd)  は0- 1M 勾配のNaCIで、pH 8.0 25mM Tris HClにより溶出した。Fabは、superose 12 (Amersham Biosciences Ltd)サイズ排除クロマトグラフィーを使い、精製され、カラムは0.05% tween含み、毎分0. 5mlのＰＢＳ流量で流した。精製に続いて、サンプルはVIVASPINTM 5K カットオフ濃縮器を用いて濃縮された(Vivascience Ltd)。
【０３１５】
結果
A. TAR1-5二量体
6ｘ96クローンが、すべてのライブラリーと選択条件を含む第2ラウンド選択からピックアップされた。上澄みプレップ（preps）が作られ、抗原及びProtein L ELISA, BIAcore1により、そして受容体アッセイにおいてアッセイされた。ELISAにおいては、明確に結合しているクローンが、各選択方法において同定され、３Ｕ，５Ｕ及び７Ｕライブラリーに割り振られた。しかし、何れもガイドdAbが存在し、この方法では結合親和性の高、低を判別することはできないため、BIAcore分析を行った。
【０３１６】
BIAcore分析は2mlの上澄みを用いて行った。BIAcore分析により、モノマーのTAR1-5に比べ二量体のＫoff率は大きく改善していた。モノマーのＫoff率は、二量体のＫoff率が10-3 −10-4Mの範囲であるのに比べ 10-1Mの範囲であった。非常に遅いオフレート持つと見られる16クローンが選ばれたが、これらは３Ｕ，５Ｕ及び７Ｕライブラリーから得られたものであり、その配列が決められた。さらに、受容体アッセイにおいて、上澄みはヒトのTNFαを中和する能力が分析された。
【０３１７】
これらのアッセイで中和された、6リードクローン（下記のd1-d6）の配列が決められた。その結果によれば、得られた６クローンの内には、３つの異なる第２のdAb（dAb１、dAb２、及びdAb３）しかない。しかし第２のdAbがあるところでは、それらは、しばしば異なる長さのリンカーにより結合されている。
【０３１８】
TAR1-5d1 : 3U リンカー第２の dAb=dAb1 -1μg/ml Ag イミュノチューブ  一夜  洗浄 
TAR1-5d2 : 3U リンカー 第２の dAb=dAb2 -1μg/ml Ag イミュノチューブ  一夜  洗浄 
TAR1-5d3 : 5U リンカー 第２の dAb=dAb2 - 1μg/ml Ag イミュノチューブ  一夜  洗浄 
TAR1-5d4 : 5U リンカー 第２のAb=dAb3 -20μg/ml Ag イミュノチューブ  一夜  洗浄 
TAR1-5d5 : 5U リンカー 第２の dAb=dAb1 -20μg/ml Ag イミュノチューブ  一夜  洗浄 
TAR1-5d6 : 7U リンカー 第２の dAb=dAb1-R1 : 1μg/ml Ag イミュノチューブ  一夜  洗浄,R2: 小球(beads)
６つのリードクローンをさらに調査した。タンパク質がペリプラズマ及び上澄みから作られ、タンパク質 Lアガロースにより精製され、細胞及び受容体アッセイにおいて調査された。中和のレベルは一定していなかった（表５）。タンパク質生成の最適条件が決められた。上澄みとして、HB2151細胞から得られるタンパク質が収率が最も高かった（約10mg/L当り培養液）。上澄みは、タンパク質 L アガロースにより室温で培養され、または４℃で一夜培養された。小球は、PBS/NaClで洗浄され、蠕動ポンプを用いてFPLCカラムに詰めれらた。小球（beads）はPBS/NaCl１０カラム容量で洗浄され、pH2.5の0.1M のグリシンで溶離された。通常、二量体タンパク質はモノマーの後に溶離される。
【０３１９】
TAR1-5d1-6二量体はFPLCにより精製された。FPLC精製により３種類が得られ、SDS PAGEにより同定された。１種はモノマーに対応し、他の２種は異なるサイズの二量体に対応している。この２種の内の大きい方は、多分Ｃ末端タッグがあるためと思われる。これらタンパク質は受容体アッセイにおいて調査された。表５のデータは２つの二量体種から得られた最適結果を示す
二量体ペアーから得られる３つの第２のdAb（すなわち、dAb１、dAb２及びdAb３）はモノマーとしてクローンされ、ELISA及び細胞並びに受容体アッセイによって調査された。すべての３つのdAbは抗原ELISAにより特異的にTNFに結合し、樹脂（plastic）またはBSAと交差反応することはない。モノマーとして、何れのdAbも細胞、または受容体アッセイにおいて中和することはない。
【０３２０】
Ｂ．TAR1-5-19  二量体
TAR1-5-19は６リードクローンにおいてTAR1-5を置換した。細胞及び受容体アッセイでの、すべてのTAR1-5-19二量体のについての分析では、特に断らない限り、全タンパク質（精製タンパク質 Lのみ）を用いて行った（表６）。TAR1-5-19d4及びTAR1-5-19d3が、細胞アッセイにおいての最良のND50  (〜5nM)を持ち、これは受容体アッセイの結果と一致しており、TAR1-5-19モノマー（DN50〜30nM）に対し改善を示している。精製TAR1-5二量体は受容体、及び細胞アッセイでの結果は一定しないが、TAR1-5-19二量体はより一貫している。タンパク質精製の際に異なる溶出液を使った場合は結果が一定しないことが分った。0.1Mクエン酸リン酸塩緩衝液pH2.6,または 0.2MグリシンpH2.5,を使って溶出した場合、殆どの場合にタンパク質 L アガロースからすべてのタンパク質を除去するが、機能はより劣ったものであった。
【０３２１】
TAR1-5-19d4は発酵体で発現され、完全な純粋二量体を得るために、カチオン交換FPLCで精製された。TAR1-5d4の場合と同様に、FPLC精製により１種のモノマーと2種の二量体に対応する3種類を得た。
【０３２２】
TAR1-5-19d4二量体はアミノ酸分析がなされた。TAR1-5-19モノマー及びTAR1-5-19d4は、その後受容体アッセイで調査され、モノマーのIC50は30nMで、二量体のそれは8nmであった。TAR1-5-19モノマーと、TAR1-5-19d4 及びTAR1-5d4の受容体アッセイの比較結果は図１０に示す。
【０３２３】
TAR1-5-19ホモ二量体は、３Ｕ，５Ｕ及び７Ｕベクターで作られ、タンパク質 Lで発現され、精製された。細胞アッセイ及び受容体アッセイにおいてタンパク質が調査され、IC50S(受容体アッセイ)及びND50S(細胞アッセイ)が決定された（表７、図１１）。
【０３２４】
Ｃ．Fabs
TAR1-5及びTAR1-5-19二量体はまたFabフォーマットでクローンされ、タンパク質 L  アガロースで発現され、精製された。Fabは受容体アッセイで評価された（表８）。その結果によれば、TAR1-5-19及びTAR1-5二量体の中和レベルは、それが由来した元のGly4Serリンカー二量体と類似していた。TAR1-5-19がCH及びCKの両方で現れていたTAR1-5-19Fabは発現され、タンパク質 L精製され、受容体アッセイで評価された。その結果のIC50は約1nMであった。
【０３２５】
D. TAR1-27二量体
3x96クローンが、すべてのライブラリー及び選択条件を含むラウンド２から選択されピックアップされた。ELISA 及びバイオアッセイによる分析のために2mlの上澄みプレップ（preps）が作られた。抗原ELISAは71の陽性クローンを検出した。粗上澄みの受容体アッセイは抑制特性（TNF結合0-60%）を持つ42のクローンを生み出した。大半のケースにおいて、抑制特性は、ELISAシグナルの強さと相関している。42のクローンは配列が決められ、その内39はユニーク第二dAb配列を持っている。抑制特性の最も大きい12の二量体についてはさらに分析が行われた。
【０３２６】
12の中和クローンは200ml上澄みプレップ（preps）して発現され、タンパク質 L上で精製された。これらはタンパク質 L 及び抗原ELISA, BIAcore及び受容体アッセイで評価された。すべてのケースにおいて強いELISAの陽性信号が得られた。BIAcore分析により、すべてのクローンは速い結合、解離率を持っていることが分った。解離率はモノマーTAR1-27に比べ改善されていたが、TAR1-27二量体の解離率は前に調査したTAR1-5二量体（Koffレートはおおよそ10-3 から 10-4 Mの範囲）より速かった（Koffレートはおおよそ10-1 から 10-2 Mの範囲）。精製された二量体の安定性に疑問があったため、安定性を改善するため２TAR1-27二量体（d2及び d16）の精製において、5％グリセロールに加え、0.5％TritonX100または0.5％NP40(Sigma)が入れられた。NP40または TritonX100TMの追加により精製された製品のイールドは約2倍改善された。何れの二量体も受容体アッセイで評価された。TAR1-27d2はすべての精製条件下で約〜30nMのIC50を示した。TAR1-27d16は、安定剤の使用をしないで精製された場合に中和効果を示さないが安定化条件下において精製された場合ではIC50は約〜50nMであった。
【０３２７】
E. TAR２二量体
3x96クローンが、すべてのライブラリー及び選択条件を含むラウンド２選択からピックアップされた。分析のために2mlの上澄みプレップ（preps）作られた。タンパク質 A及び抗原ELISAが、各プレートで実施された。30の興味あるクローンが、BIAcoreにより良好なオフレートを持つもの（Koffレートは10-2 から 10-3 Mの範囲）として同定された。クローンは配列が決められ、13のユニーク二量体が配列分析により同定された。
【０３２８】
Ｆ.配列
本実施例に記載のdAbのヌクレオチド及びアミノ酸配列は図12に示す。
【表５】
2008500268.tif 000011
【０３２９】
*注：二量体2及び３は同じ第二のdAb（dAb２と呼ぶ）を持っている。しかし、リンカー長さが異なる（d2=(Gly4Ser)3, d3=(Gly4Ser)3,）。dAb１はd1, d5 及びd6のパートナーdAbである。dAb3はd4のパートナーdAbである。これらの何れのdAbも単独では中和しない。FPLC生成は特に断らない限りカチオン交換である。FPLCで得られる各二量体の最適二量体種はこれらのアッセイで決められた。
【表６】
2008500268.tif 000012
【表７】
2008500268.tif 000013
【表８】
2008500268.tif 000014
【０３３０】
実施例６ TNFα特異のシングル免疫グロブリン可変ドメインホモ三量体の構成
dAb三量体化のために、実施例4に記載のTAR1-5-19CYSの発現から分離されたシステイン修飾モノマーが還元され遊離チオール作り、そして三量体マレイミド分子と反応して化学的リンクされたホモトリマーが作られた。
【０３３１】
TAR1-5-19CYSの三量体化
100μM TAR1-5-19CYS 2.5mlを5mlのジチオスレイトール（dithiothreitol）で還元し、室温中で20分間置かれた。サンプルは、その後PD-10カラムを用いて緩衝液交換された(Amersham Pharmacia)。カラムは5mM EDTA,50mM pH6.5のリン酸ナトリウムにより事前に平衡状態にされており、サンプルは製造者ガイドラインに従って取り扱われ、溶出された。サンプルは必要となるまで氷上に置かれた。TMEA (Tris [2-maleimidoethyl] amine)はPierce Biotechnologyから購入した。TMEAの20mMストック液が100%DMSO(dimethyl sulfoxide)中で作られた。3:1比率以上のTMEA（dAbとTMEAのモル比率）の濃度がある場合は、急速な沈降が生じ、タンパク質は交差結合することが分った。また、pHが増大するにつれ、沈降レート及び交差結合の比率が増大した。従って、100μMの還元 TAR1-5-19CYSを用いて、タンパク質を三量体化するために、25μM TMEAが加えられ、室温で2時間反応が続けられた。グリセロール、またはエチレン  グリコールのような添加物を20％(v/v)までを加えると共役反応が進むにつれ、三量体の沈降が著しく減少することが分った。共役後のSDS-PAGE分析により液中にモノマー、二量体、及び三量体が存在することが分った。
【０３３２】
TAR1-5-19-CYS三量体の精製
PHを4以下に下げるために、TMEA-TAR1-5-19Cys反応において、mL当たり40μLの40％の氷酢酸が加えられた。サンプルは、その後事前にpH4.0の50mM酢酸ナトリウムにより平衡状態とされた１mL Resource Sカチオン交換カラム(Amersham Pharmacia)に通された。二量体および三量体は，340から450mM塩勾配の塩化ナトリウム、pH4.0の50mM酢酸ナトリウム30カラム以上の容量を用いて一部が分離された。三量体のみを含む破片がSDS-PAGEを用い同定され、プールされ、そして1/5容量の１Tris pH8.0の追加により、pHが8に上げられた。
【０３３３】
濃縮過程（5K cut off Vivaspin concentrators; Vivascienceを使用）で三量体の沈降を防ぐために、サンプルに10％グリセロールが加えられた。
【０３３４】
インビトロ機能結合アッセイ：  TNF 受容体アッセイ及び細胞アッセイ
ヒトのTNFαの三量体の親和性が、TNF受容体アッセイ及び細胞アッセイを用いて決定された。受容体アッセイのIC50は0.3nMであり、細胞アッセイのND50は3-10nM(例えば、3nM)の範囲であった。
【０３３５】
他の可能なTAR1-5-19CYS  三量体フォーマット
AR1-5-19CYSはまた以下の試薬を用いて三量体にフォーマットが可能である。PEG三量体及びオーダーメイドの合成マレイミド三量体である。Nektar (Shear-  water)は、PEGの末端で化学的に修飾可能な多腕PEGの範囲を提供している。したがって、各腕の末端にマレイミド官能基をもつPEG 三量体を用いて、TMEAを使って上記に記載と同様方法でdAbの三量体化させることができるであろう。PEGはまた、三量体の溶解度を増すという利点を持っており、そのため集合化を防ぐことができる。従って、各dAbがマレイミド官能基にリンクされたC末端システインを待ち、そのマレイミド官能基がPEG 三量体にリンクしている、dAb三量体を作り出すことができよう。
【０３３６】
ポリペプチドリンカー、またはヒンジ（hinge）dAbのC末端への追加
小リンカー、(Gly4Ser) n （ここで n= 1 から 10, 例えば、 1,2, 3,4, 5,6 または 7である）, 免疫グロブリン(例えば、 IgG) ヒンジ領域またはランダムペプチド配列(例えば、ランダムペプチド配列のライブラリーから選択された)はdAbと末端システイン残基の間に操作生成することができであろう。多量体を作るのに（例えば、二量体、または三量体）を用いれば、個々のモノマー間の柔軟性、及び距離を増すこととなり、その結果、例えば、ヒトのTNFαのようなマルチサブユニットの標的に対する結合特性を改善することとなるであろう。
【０３３７】
本明細書に記載の典型的なシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの濃縮、親和性及び機能特性に関する入手可能なデータのサマリーは表9に示す。
【表９】
2008500268.tif 000015
【０３３８】
2008500268.tif 000016
【０３３９】
2008500268.tif 000017
【０３４０】
2008500268.tif 000018
【０３４１】
2008500268.tif 000019
【０３４２】
実施例７  アンチTNFα及びアンチTNFR1シングル免疫グロブリン可変ドメインンの溶解性に関する研究
幾つかの異なるドメイン抗体ポリペプチド製剤について、達成可能な濃度が調査された。抗原特異性にはヒトのTNFα、ヒトのTNFR1及び、実験対照（コントロール）として鶏卵リゾチームを含む。異なるフォーマットを示すdAbの製剤について溶解度を評価した。溶解性はまた、異なる緩衝剤での製剤の効果についても評価をした。測定されたパラメータは測定濃度が計算濃度（280nmでの吸光度測定による）と一致した最高濃度であり、また沈降によるタンパク質ロスを考慮した達成可能な最高濃度である。
【０３４３】
材料
TAR1-5-19；モノマーdAb  を標的抗原TNFαに使用；30nM Kd;以下の緩衝液を使用；
1. TARl-5-19 ；20mM    クエン酸ナトリウム pH6.0 原液 19.7mg/ml ; 
2. 2. TAR1-5-19 in l0mM   リン酸カリウム pH7.4 原液 15. 8mg/ml ; 
3. 3. TAR1-5-19 ；l00mM  グリシン/200mM Tris pH8.0 原液 7.2mg/ml. 
HeL4; モノマーdAb を、高い溶解性を持つ鶏卵リゾチームの実験対照（コントロール）と比較した。 20mM クエン酸ナトリウム/100mM NACL/0.01%Tween 20 pH6.0 原液51.3mg/ml。
【０３４４】
TAR2h-10-27；モノマーdAb を、標的抗原TNF受容体１に使用；400pM  Kd; 以下記載のように種々のフォーマット、及び緩衝液を使用。TAR2h-10-27の核酸及びポリペプチド配列は図15に示す。
【０３４５】
1.TAR2h-10-27cys ；l00mM グリシン/Tris 〜pH4.0 + 10% グリセロール0.75mg/ml中で還元。
【０３４６】
2. TAR2h-10-27 野生型； Tris/グリシンpH7.0 + 10% グリセロール 0.06mg/ml中ストック（stock）。
【０３４７】
3. TAR2h-10-27cys   50mM 酢酸ナトリウムpH4.0、 0.24mg/ml中で2 x l0K PEGで ペギレイト化（PEGylated）
4. TAR2h-10-27野生型；l00mM グリシン/Tris 〜 pH5.0 + 10% グリセロール 0.29mg/ml
5. TAR2h-10-27cys, 50mM 酢酸ナトリウム pH4.0、 0.14mg/ml.中で、イオドアセタミド（iodoacetamide）により還元及びアルキル化 
6. TAR2h-10-27cys  PBS pH7.2、1mg/ml 
方法
TAR1-5-19のサンプルに対して、各20mlの緩衝液でのスタート時の濃度である３mg/mlにまで希釈を行った。
【０３４８】
リン酸塩緩衝液のTAR1-5-19を希釈するためにPBSを用いた。すなわち、サンプル２。HEL4サンプルを希釈するために20mM  pH6.0のクエン酸ナトリウムを用いた。
【０３４９】
実験開始時にすべてのサンプルについてA280波長による測定をした。A280より、TAR1-5-19については0.66を、HEL4には0.51, TAR2h-10-27は0.41を乗じて濃度を得ることができた。これらの補正率は理論上の減衰係数から得ることができる。
【０３５０】
容量はGilson ピッペトを使い50μl精度近くまで測定した。サンプルは、20ml Vivaspin 機器 (Vivaspin AG, Germany) PES 膜（membrane）、  5kDa中MWCOで濃縮した。 機器は実験開始時にベンチトップ（bench top）遠心分離器で、3000gで一度に10分間遠心分離したが、今回はサンプルの濃度が増大しているため間隔を増し，濃縮速度を遅くした。
【０３５１】
各スピンの後にサンプルは機器から取り除かれて、容量が測定された。1ml  アリコート（aliquot）がEppendorf 管に移され、すべての沈殿物を小球にするためミクロヒュージ（microfuge）中で5分間16,000gで回転させ、１00μl緩衝液に希釈された１μl上澄みのA280が測定された。アリコートはその後再懸濁され、元のVivaspin機器に戻され濃縮が継続される前に、A280の測定に使われた１00μlとともにメインプールに再度加えられた。
【０３５２】
A280の観測からサンプルの実験的濃縮が計算され、測定容量と対比しプロットした。また、濃度と容量の間に直線関係があること、すなわち、C1V1=C2V2をベースとして各容量に対する開始時のA280数値から推定した 期待濃度もプロットした。
【０３５３】
４．    結果
溶解度の研究結果は表１０（TAR1-5-19及びHEL4の濃度）及び11（TAR2h-10-27の濃度）、及び図１３（TAR1-5-19）及び14（TAR2h-10-27）に示す。
【表１０】
2008500268.tif 000020
【０３５４】
2008500268.tif 000021
【表１１】
2008500268.tif 000022
【０３５５】
2008500268.tif 000023
【０３５６】
ポイント：
TAR2h-10-27 (a) = TAR2h-10-27-cys Tris/Gly + 10% グリセロール pH4中で還元
TAR2h-10-27 (b) = TAR2h-10-27 野生型 Tris/Gly + 10% グリセロール pH7液中 
TAR2h-10-27 (c) = TAR2h-10-27Cys PEG 2 x 10K、50mM アセテート pH4液中
TAR2h-10-27 (d) = TAR2h-10-27野生型、Tris/Gly + 10% グリセロール pH5液中
TAR2h-10-27 (e) = TAR2h-10-27Cys、50mM アセテート中, ブロック（block）された、すなわち、非ペグレイト化（non-PEGylated）
TAR2h-10-27 (f) = TAR2h-10-27Cys、PBS pH 7.2中で還元
結論
A) TAR1-5-19：
pH6酢酸中：  溶解度の限界は〜20mg/ml と思われる。達成可能な最高濃度は約40mg/mlであるが、この濃度を達成中に約20mg/mlは沈殿中に失われた。
【０３５７】
pH7.2 PBS中:  溶解度の限界は〜40mg/ml と思われる。これはまた、達成可能な最高濃度と思われる。この閾値までは沈殿によるロスはなかった、これを超えた後の濃縮で始めて沈殿が生じた。
【０３５８】
pH8 Tris/Gly中:   溶解度の限界は〜30mg/ml と思われる。この濃度までは殆どタンパク質のロスはない。この濃度を越えると沈殿が見られる。達成可能な最高濃度は〜40mg/mlであるが、〜20mg/mlのロスがある。
【０３５９】
B)  TAR2h-10-27：
グリセロールの緩衝液のTAR2h-10-27 野生型（TAR2h-10-27 (b)） は期待値とよく一致した。このサンプルは、本プロジェクトの始まる早い段階で準備されたものであり、したがって緩衝液の不適合のため何度か沈殿が起きたため、その後に再懸濁ステップを採った。したがって異常折り畳み構造の、及び/または不安定な材料は除去することが可能であった。TAR2h-10-27はIEFゲル上で操作すると、3つの択一的なpIsを呈示することが注目された。このことは、他の代替的な折り畳みを意味し、その内の幾つかは他より溶解性が高いものであるかもしれない。
【０３６０】
ペギレイト化された（PEGylated）TAR2h-10-27cysはまた期待値と良く一致し、沈殿を起こすことなく濃度〜60mg/mlに達した。
【０３６１】
PBS中で還元されたTAR2h-10-27cys(DOM1h-10-27(f))は沈殿によるタンパク質のロスの影響を最も強く受けた。PBSのpHはTAR2h-10-27に観察されたpIの一つに近いものである。
【０３６２】
イドアセタイミド（idoacetamide）で還元され、ブロックされたTAR2h-10-27cysプール(TAR2h-10-27（e））は結論を引き出すに十分なタンパク質を含んでいなかった。
【０３６３】
pH4 または５（TAR2h-10-27(a) 及びTAR2h-10-27(d)）は、野生型かまたはC末端cysを持ったものかを問わず、観察された結果は類似しており、各々〜20mg/mlまたは〜10mg/mlの濃度限界に達すると沈殿をした。到達最高濃度は各々40mg/ml及び20mg/mlであったが、これを達成するのに75mg及び10mgのタンパク質ロスが生じた。
【０３６４】
C) HEL4:
達成濃度は〜130mg/mlであるが、タンパク質ロスは10-15mg/mlと測定された、しかしこのロスは実験中を通じて、おおよそ一定であり、このことは膜への結合があることを示唆している。
【０３６５】
実施例８．アンチCD40LdAbの濃縮製剤
CD40Lに特異のdAbは分類のための接頭辞「TAR4」を付して用いる。CD40Lに特異性の高い濃縮dAb製剤は本明細書に記載のVivaspin 5 kDa MWCO濃縮器を用いて行った。濃度はA280により測定した。
【０３６６】
特に、〜100nm 及び〜100-250nm のIC５０sをもつヒトのCD40Lに特異のdAb  TAR4-10及びTAR4-116(ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列は図16記載)は、トリグリシン（Tris-Glycine）緩衝液pH８で、5.8及び17.7mg/mlに濃縮された。
【０３６７】
実施例９  ペグレイト化された（PEGlylated）dAbの濃縮製剤
ペグレイト化することによりポリぺプチド分子の溶解度が増す傾向がある。したがって、ペグレイト化されたdAbは、同じdAbのペグレイト化されていない型のものに比べて通常より高い濃縮度を達成できるであろう。しかし、ペグレイト化されたdAbが濃縮される程度を決めるのにPEGポリマー部分の分子量が役割を果たすことに注目する必要がある。大きなPEGポリマーは溶液の粘性を高める傾向があり、そのため製剤を遠心分離器を用いて効果的に濃縮できない場合がある。したがって、同じdAb分子上で小さなPEGポリマー,  例えば、5kDa または10kDaポリマーは、例えば、 30kDaまたは50kDa  PEGポリマーよりも、通常最終的に高い濃度を示す。
【０３６８】
PEG化されたdAbにより達成可能な濃度の例として、直線状30kDa PEG化（PEGylation）形状をもつアンチTNFR1 dAb TAR2h-10-27のPEG化ヴァージョンが、Vivaspin濃縮器を使って、65mg/ml Tris酢酸緩衝液 pH8中で濃縮された。定量評価はA280 により行った。
【０３６９】
より大きなPEG部分を持つPEG化されたdAbを含めて、PEG化dAbのより高い濃縮度を達成するには、最初に遠心分離器、例えば、Vivaspin 5kDa MWCOにより可能な範囲までPEG化されたdAbを濃縮し、その後に残りの溶液を凍結乾燥することによっても達成できることに注目すべきである。PEGは、少容量で再水和した場合にタンパク質を安定させ、その溶解を助ける傾向がある
実施例１０：p55 TNFRに特異のdAb濃縮製剤
ヒトのp55 TNF受容体（Kd=10-15nM）に高度に特異のdAbが、pDOM5ベクターから分離され、発現された。TAR2h10-55 dAb のアミノ酸配列は以下に示す。
【０３７０】
発現後に、TAR2h10-55 dAbはVivaspin spin MWCO  3,000Da濃縮器を用い4℃、4,000rpmでPBS、pH7.4中で濃縮された。A280による測定で、88.2mg/ml濃度が達成された。細胞ベースの抗原結合アッセイでは、非濃縮dAbと高度に濃縮されたdAb製剤に効能の差はなかった。
【０３７１】
TAR2h10-55 dAbのアミノ酸配列*
【化３】
2008500268.tif 000024
【０３７２】
* pDOM5ベクターはdAb分子のN末端に二つの残基（セリン-トレオニン  ジペプチド、（serine-threonine dipeptide））を、C末端にMyc タッグ(AAAEQKLISEEDLN)（配列番号88）を加える。
【０３７３】
実施例１１．ヒトの血清アルブミン(HAS)に特異のdAb濃縮製剤
ヒトの血清アルブミンに特異のdAbがpDOM5ベクターから分離され、発現された。アンチ血清アルブミンdAbは分類接頭辞「TAR3」を付けて呼ばれる（血清アルブミン結合は、分類接頭辞「DOM7」を付けて呼ばれる、例えば、本明細書の表９）。下記の表に示すように、TAR3h-22, TAR3h-23 及び TAR3h-26 の例示クローンのKdは800 nMから50 nMの範囲であった。アミノ酸配列は以下に示す。
【０３７４】
発現後、HAS dAbはVivaspin spin MWCO  3,000Da濃縮器を用い4℃、4,000rpmでPBS、pH7.4中で濃縮された。達成濃度はA280による測定で、83mg/mlから138mg/mlの範囲であった。これらの濃度では沈殿観測されていないため、さらに濃縮が可能と思われる。
【化４】
2008500268.tif 000025
【０３７５】
2008500268.tif 000026
【０３７６】
本明細書に引用されたすべての特許、特許出願及び参考刊行物は、その全てを引用により本明細書に組み入れる。本願発明は特にその好ましい実施の形態について記載し明らかにしているが、当業者は本願の特許請求の範囲に含まれる発明の範囲から外れることなく、その形式、詳細に種々の変更を加えることが可能であると了解される。
【図面の簡単な説明】
【０３７７】
【図１】図１Ａ、１Ｂは、ライブラリー1を生成するために多様化されたダミーＶＨの配列を示す配列は生殖細胞系列配列DP47-JH4bに基づくＶＨフレームワークである。NNKランダム化（N=A, またはT, またはC,または Gヌクレオチド；K=G, またはTヌクレオチド）がライブラリー1に組み入れられた位置は太字、下線を付した文で示す。HCDRs 1-3は下線を付して示す。
【図２】図２Ａ，２Ｂは、ライブラリー２を生成するために多様化されたダミーＶＨの配列を示す。
【０３７８】
配列は生殖細胞系列配列DP47-JH4bに基づくＶＨフレームワークである。NNK
ランダム化（N=A, またはT, またはC,または Gヌクレオチド；K=G, またはTヌクレオチド）がライブラリー２に組み入れられた位置は太字、下線を付した文で示す。HCDRs 1-3は下線を付して示す。
【図３】図３Ａ、３Ｂは、ライブラリー３を生成するために多様化されたダミーＶKの配列を示す。
【０３７９】
配列は生殖細胞系列配列DPK9-JK1に基づくＶKフレームワークである。NNK
ランダム化（N=A, またはT, またはC,または Gヌクレオチド；K=G, またはTヌクレオチド）がライブラリー3に組み入れられた位置は太字、下線を付した文で示す。LCDRs 1-3は下線を付して示す。
【図４】図４は、アンチMSA dAbs、MSA16 及びMSA26の核酸及びアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、MSA16 及び26のSPR分析を示す。精製されたdAbs MSA16及びMSA26は、Ｋdを定めるためBIAcore表面プラスモン共鳴抑制分析により分析した。概略すると、高密度のMSAでコートされたBIAcore CM5TMチップで200RUの反応を得るのに必要なdAb濃度定めるためにdAbがテストされた。必要なdAb濃度が定まれば、MSA抗原が予期されるＫdの濃度付近でdAbと前もって混合され、一夜培養される。各事前混合物中の、BIAcoreCMTMチップでコートされたMSAに対するdAbの結合を30μlの高流速で測定した。
【図６】図６は、MSA16 及び26のSPR分析を示す。精製されたdAbs MSA16及びMSA26は、Ｋdを定めるためBIAcore表面プラスモン共鳴抑制分析により分析した。概略すると、高密度のMSAでコートされたBIAcore CM5TMチップで200RUの反応を得るのに必要なdAb濃度定めるためにdAbがテストされた。必要なdAb濃度が定まれば、MSA抗原が予期されるＫdの濃度付近でdAbと前もって混合され、一夜培養される。各事前混合物中の、BIAcoreCMTMチップでコートされたMSAに対するdAbの結合を30μlの高流速で測定した。
【図７】図７は、注射をした後のMSA16の血中濃度を示す。dAb MSA16の血清半減期をハツカネズミで測定した。 MSA16が、約1.5mg/kgの量をシングル免疫グロブリン可変ドメイン注射によりCD1ハツカネズミに投与した。二つのコンパートメントモデルによるモデル計測では、MSA16はt1/2αが0.98時間、t1/2βが36.5 時間、913hr.mg/mlのAUCを示した。  MSA16はt1/2αが0.06時間、t1/2βが0.34 時間のHEL4（アンチ鶏卵  エッグホワイトリソザイム dAb）と比べ半減期が極めて長かった。
【図８】図８は、シングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドHEL4(鶏卵  リソザイムを結合)、TAR1-5-19(TNF-αを結合)、TAR2(p55 TNFRを結合)の核酸、及びアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、TAR1-5二量体1-6を比較したTNF受容体アッセイの結果を示す。
【図１０】図10は、TAR1-5  二量体4、TAR1-5-19  二量体４、及びTAR1-5-19モノマーを比較したTNF受容体アッセイの結果を示す。
【図１１】図11は、TAR1-5-19ホモ二量体のTNF受容体アッセイの異なるフォーマットの結果、すなわち、3U, 5U,  または7Uリンカーを持つ dAb-リンカー-dAbフォーマット、Fab フォーマット、システインヒンジリンカーフォーマット、の結果を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｋは、実施例5に記載したシングル免疫グロブリン可変ドメイン配列を示す。
【図１３】図13は、異なる緩衝液条件でのアンチ-TNF-α dAb TAR1-5-19の溶解度試験結果を示すグラフである。「Obs」はここに示す異なる容積においての濃度の観察結果を表し、「exp」は出発材料の量に基づいた予想濃度である。
【図１４】図14は、異なる緩衝液条件におけるアンチ-TNFR1  dAb   TAR2h-10-27の、溶解度試験結果を示すグラフである。
【０３８０】
Tar2a＝TAR2h-l0-27-cys は Tris/Glycine プラス 10% グリセロール, pH4で還元; Tar2b = TAR2h-l0-27 野生型（wild type）Tris/Glycine 液  プラス10% グリセロール, pH7; Tar2c = TAR2h-l0-27Cys PBS 2 x 10K, 50mM トリス  アセテート（Tris Acetate）, pH4;
Tar2d = TAR2h-l0-27野生型 Tris/Glycin プラス 10% グリセロール, pH5; Tar2e TAR2h-l0-27Cys  50mM トリス  アセテート（Tris Acetate）,ブロックされた（blocked）すなわち ぺギレイト化されない（non-PEGylated）, 及びTar2f= TAR2h-10-27Cys   リン酸緩衝生理食塩水（PBS）, pH7.2. で還元。・
「Obs」は異なる容積における濃度の観察結果を表し、「exp」は開始時の量に基づいた予想濃度である。観察結果と予想値の差は、一部は、沈降のためのロスが発生したか否かを示す。
【図１５】図15は、TAR2h-10-27アンチ-TNFR1  dAbの、ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。103の位置（Kabatナンバリング）はアルギン酸残基であることに留意すべきである。
【図１６】図16Ａ、１６Ｂは、TAR4-10、及び TAR4-116 アンチ-CD40L dAbsのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ａ】
2008500268.tif 000027
【図１Ｂ】
2008500268.tif 000028
【図２Ａ】
2008500268.tif 000029
【図２Ｂ】
2008500268.tif 000030
【図３Ａ】
2008500268.tif 000031
【図３Ｂ】
2008500268.tif 000032
【図４】
2008500268.tif 000033
【図５】
2008500268.tif 000034
【図６】
2008500268.tif 000035
【図７】
2008500268.tif 000036
【図８】
2008500268.tif 000037
【図９】
2008500268.tif 000038
【図１０】
2008500268.tif 000039
【図１１】
2008500268.tif 000040
【図１２Ａ】
2008500268.tif 000041
【図１２Ｂ】
2008500268.tif 000042
【図１２Ｃ】
2008500268.tif 000043
【図１２Ｄ】
2008500268.tif 000044
【図１２Ｅ】
2008500268.tif 000045
【図１２Ｆ】
2008500268.tif 000046
【図１２Ｇ】
2008500268.tif 000047
【図１２Ｈ】
2008500268.tif 000048
【図１２Ｉ】
2008500268.tif 000049
【図１２Ｊ】
2008500268.tif 000050
【図１２Ｋ】
2008500268.tif 000051
【図１３】
2008500268.tif 000052
【図１４】
2008500268.tif 000053
【図１５】
2008500268.tif 000054
【図１６Ａ】
2008500268.tif 000055
【図１６Ｂ】
2008500268.tif 000056
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月4日(2007.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Kdが100nM以下の抗原を結合する重鎖免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドが、280nm波長での吸光度により決定される濃度が少なくとも400μMで存在し、可変ドメインの４４の位置のアミノ酸残基がグリシンである前記組成物。
【請求項２】
Kdが100nM以下のポリペプチド抗原を結合する重鎖免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドが、280nm波長での吸光度により決定される濃度が少なくとも400μMで存在し、可変ドメインの45の位置のアミノ酸残基が非荷電アミノ酸である前記組成物。
【請求項３】
前記可変ドメインの45の位置のアミノ酸残基がロイシンである請求項２の組成物。
【請求項４】
Kdが100nM以下のポリペプチド抗原を結合する重鎖免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドが、280nm波長での吸光度により決定される濃度が少なくとも400μMで存在し、可変ドメインの47の位置のアミノ酸残基が非荷電アミノ酸である前記組成物。
【請求項５】
前記可変ドメインのフレームワークFW2（Kabat番号による）のアミノ酸配列がヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされるFW2のアミノ酸配列と同じである、請求項1乃至４のいずれか1項の組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドがヒトの免疫グロブリンVHドメインよりなる請求項1、２、及び４のいずれか1項の組成物。
【請求項７】
前記VHドメインが、生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP47によりコードされる配列であるが、H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H99, H100, H100a, H100b, H100c, H100d, H100e, 及び H100fよりなる群から選択される一以上の位置においてDP47によりコードされる配列と異なっている配列を含む請求項1、２、及び４のいずれか1項の組成物。
【請求項８】
前記VHドメインが、生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP47によりコードされる配列であるが、H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a,及び H100bよりなる群から選択される一以上の位置においてDP47によりコードされる配列と異なっている配列を含む請求項1、２、及び４のいずれか1項の組成物。
【請求項９】
前記VHドメインは、生殖細胞系列VH遺伝子セグメントDP47によりコードされる配列であるが、H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97及びH98よりなる群から選択される一以上の位置においてDP47によりコードされる配列と異なっている配列を含む請求項1、２、及び４のいずれか1項の組成物。
【請求項１０】
前記抗原がヒトのサイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素の補因子、およびDNA結合たんぱく質よりなる群から選択される請求項1、２、及び４のいずれか1項の組成物。
【請求項１１】
前記抗原がヒトのTNF-αである請求項1、２、及び４のいずれか1項の組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、100nM以下のIC50で、標準L929インビトロ  アッセイにおいて前記ヒトのTNF-αを中和する請求項１１の組成物。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが前記ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインのホモ多量体を含む請求項1、２、及び４のいずれか1項の組成物。
【請求項１４】
前記ホモ多量体がホモ二量体またはホモ三量体である請求項１３の組成物。
【請求項１５】
前記ホモ多量体のモノマーがマルチーサブユニット標的に特異である請求項１４の組成物。
【請求項１６】
前記標的がヒトのTNF-αである請求項１５の組成物。
【請求項１７】
前記ポリペプチドがヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインヘテロ多量体を含む、請求項1、２、及び４のいずれか1項の組成物。
【請求項１８】
前記へテロ多量体が、ヘテロ二量体、またはヘテロ三量体である請求項１７の組成物。
【請求項１９】
前記へテロ多量体のモノマーが、血清アルブミンを結合するシングル免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを含む請求項１７の組成物。
【請求項２０】
前記ホモ多量体に含まれる一以上のモノマーが、遊離C-末端のシステイン残基によりリンクされる請求項１３の組成物。
【請求項２１】
前記モノマーがさらにリンカーペプチド配列を含み、前記遊離システイン残基は前記リンカーペプチド配列のC末端に位置している請求項２０の組成物。
【請求項２２】
前記ホモ多量体中のモノマーがジスルフィド結合によりリンクされている請求項２１の組成物。
【請求項２３】
前記ホモ多量体がホモ三量体であり、前記ホモ三量体中のモノマーがTMEAとチオール（thiol）結合により化学的にリンクしている請求項１３の組成物。
【請求項２４】
治療を必要とする個体の病気または異常を治療または予防する方法であって、前記個体に請求項1、２、及び４のいずれか1項の組成物の治療上有効な量を投与することを含む前記方法。
【請求項２５】
前記ヒトのシングル免疫グロブリン可変ドメインが、TNF-α, p55  TNFR, EGFR, MMP-12, IgE, 血清アルブミン、インターフェロンガンマ、CEA 又はPDK1を結合する請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記可変ドメインがKdが100nM以下のポリペプチド抗原を結合し、前記ポリペプチドが280nm波長での吸光度により決定される濃度が少なくとも400μMで存在する組成物の製造において、４４の位置でグリシンを含む重鎖免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むポリペプチドの使用。
【請求項２７】
前記可変ドメインがKdが100nM以下のポリペプチド抗原を結合し、前記ポリペプチドが280nm波長での吸光度により決定される濃度が少なくとも400μMで存在する組成物の製造において、４５及び/又は４７の位置で非荷電アミノ酸を含む重鎖免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むポリペプチドの使用。
【請求項２８】
請求項２６又は２７の使用であって、その使用の結果が請求項１乃至２３のいずれか1項の組成物となる前記使用。
【請求項２９】
軽鎖免疫グロブリンシングル可変ドメインが、Kdが100nM以下のポリペプチド抗原を結合し、ポリペプチドが、280nm波長での吸光度により決定される濃度が少なくとも400μMで存在し、前記可変ドメインのフレームワークFW2（Kabat番号による）のアミノ酸配列がヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされるFW2のアミノ酸配列と同じである、前記軽鎖免疫グロブリンシングル可変ドメインを含む前記ポリペプチドを含む組成物。
【請求項３０】
前記ポリペプチドがヒトの免疫グロブリンVLドメインよりなる請求項２９の組成物。
【請求項３１】
前記ヒトの生殖細胞系列遺伝子セグメントがDPK9である請求項２９の組成物。
【請求項３２】
軽鎖免疫グロブリンシングル可変ドメインが、Kdが100nM以下のポリペプチド抗原を結合し、ポリペプチドが、280nm波長での吸光度により決定される濃度が少なくとも400μMで存在する組成物の製造において、前記可変ドメインのフレームワークFW2（Kabat番号による）のアミノ酸配列がヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされるFW2のアミノ酸配列と同じである、前記軽鎖免疫グロブリンシングル可変ドメインを含む前記ポリペプチドの使用。
【請求項３３】
Kdが100nM以下のポリペプチド抗原を結合する重鎖免疫グロブリンシングル可変ドメインを含むポリペプチドを含む組成物であって、１０３の位置（Kabat番号による）の残基がアルギニンであり、前記ポリペプチドが、280nm波長での吸光度により決定される濃度が少なくとも400μMで存在する、前記組成物。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが400μMから20mMの濃度で存在する請求項３３の組成物。
【請求項３５】
前記ポリペプチド抗原がヒトのポリペプチド抗原である請求項３３の組成物。
【請求項３６】
45の位置のアミノ酸残基が非荷電アミノ酸である請求項３３の組成物。
【請求項３７】
45の位置のアミノ酸がロイシンである請求項３６の組成物。
【請求項３８】
４４の位置のアミノ酸残基がグリシンである請求項３３の組成物。
【請求項３９】
47の位置のアミノ酸残基が非荷電アミノ酸である請求項３３の組成物。
【請求項４０】
４７の位置のアミノ酸残基がトリプトファンである請求項1、２、４及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項４１】
４４の位置のアミノ酸残基がグリシンであり、45の位置のアミノ酸残基がロイシンである請求項1、２、４及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項４２】
４４の位置のアミノ酸残基がグリシンであり、４７の位置のアミノ酸残基がトリプトファンである請求項1、２、４及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項４３】
45の位置のアミノ酸残基がロイシンであり、４７の位置のアミノ酸残基がトリプトファンである請求項1、２、４及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項４４】
４４の位置のアミノ酸残基がグリシンであり、45の位置のアミノ酸残基がロイシンであり、そして４７の位置のアミノ酸残基がトリプトファンである請求項1、２、４及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項４５】
一以上のフレームワーク領域がヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる請求項1、２、４及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項４６】
FW1がヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる請求項４５の組成物。
【請求項４７】
FW２がヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる請求項４５の組成物。
【請求項４８】
FW３がヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる請求項４５の組成物。
【請求項４９】
一以上のフレームワーク領域がヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントDP４７, DP４５又はDP３８によりコードされる請求項４５の組成物。
【請求項５０】
FW３がヒトの生殖細胞系列抗体遺伝子セグメントDP４７によりコードされる請求項４９の組成物。
【請求項５１】
前記抗原がヒトのp55 TNFRである請求項３３の組成物。
【請求項５２】
一以上の前記フレームワーク領域のアミノ酸配列がヒトの生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、または一以上の前記フレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒトの生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる前記対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比べて全体で5つまでのアミノ酸の相違を含む、請求項1、２、４、２９及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項５３】
フレームワーク領域FW1, FW2, FW3 およびFW4のアミノ酸配列がヒトの生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、またはFW1, FW2, FW3 およびFW4のアミノ酸配列がヒトの生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域の配列と比べて全体で10までのアミノ酸の相違を含む、請求項1、２、４、２９及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項５４】
前記抗原が、TNF-α, p55  TNFR, EGFR, MMP-12, IgE, 血清アルブミン、インターフェロンガンマ、CEA およびPDK1よりなる群から選択される請求項２９又は３３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記抗原がヒトの血清アルブミンである請求項５４の組成物。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが400μMから20mMの濃度で存在する請求項1、２、４、２９及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項５７】
前記ポリペプチド抗原がヒトのポリペプチド抗原である請求項1、２、４、２９及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項５８】
前記ポリペプチドが100nMから50pMのKdの前記抗原を結合する請求項1、２、４、２９及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項５９】
前記ポリペプチドが30nMから50pMのKdの前記抗原を結合する請求項1、２、４、２９及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項６０】
さらに薬剤として受け入れられるキャリアーを含む請求項1、２、４、２９及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項６１】
前記免疫グロブリン可変ドメインが、置換され、または置換されていない直線、または枝分かれ鎖のポリアルキレン(polyalkylene)、ポリアルケニレン(polyalkenylene)、またはポリオキサアルキレン（polyoxyalkylene）ポリマー、または枝分かれし、または枝分かれのない多糖類（polysaccharide）を含むポリマーに結合している請求項1、２、４、２９及び３３のいずれか1項の組成物。
【請求項６２】
重鎖免疫グロブリンシングル可変ドメインがKdが100nM以下のポリペプチド抗原を結合し、ポリペプチドが、280nm波長での吸光度により決定される少なくとも400μMの濃度で存在する組成物の製造において、１０３の位置にアルギニンを含む前記重鎖免疫グロブリンシングル可変ドメインを含む前記ポリペプチドの使用。
【請求項６３】
請求項1、２、４、２９及び３３のいずれか1項の組成物を含む持続放出投薬製剤。
【請求項６４】
経口または非経口用に製剤される、請求項６３の持続放出投薬製剤。
【請求項６５】
前記投薬製剤が、静脈、筋肉内、または腹腔内注射、あるいは皮下植込み、直腸および経皮投与よりなる群から選択されるルートによる非経口投与に供される、請求項６４の持続放出投薬製剤。
【請求項６６】
前記皮下植込みは腫瘍内皮下植込みを含む請求項６５の持続放出投与製剤。
【請求項６７】
請求項６３の持続放出投与製剤の投与を含む病気、または異常の治療方法。
【請求項６８】
免疫グロブリン可変ドメインがモノマーとして存在する請求項29又は３３の組成物。
【請求項６９】
前記ポリペプチドが前記ヒトのシングル免疫グロブリンドメインのホモ多量体を含み、前記ホモ多量体に含まれる一以上のモノマーは遊離C末端システイン残基によりリンクされる請求項29又は３３の組成物。
【請求項７０】
前記ポリペプチド抗原がp55 TNFRである請求項６９の組成物。
【請求項７１】
前記ポリペプチド抗原がp55 TNFRである請求項６８乃至７０のいずれか1項の組成物。
【請求項７２】
請求項1、２、４、２９及び３３のいずれか1項の組成物であって、(i)pH6のクエン酸 (ii)pH7.2 又は7.4 のPBS,(iii)pH8のTri/Gly,  (iv)pH4の酢酸塩, (v)pH7.7, 4.0又は5.0 のTri/Gly+グリセロール、及び(vi) pH8のTri/酢酸塩よりなる群れから選択される緩衝剤を含む前記組成物。
【国際調査報告】
2008500268.tif 000057
2008500268.tif 000058
2008500268.tif 000059
2008500268.tif 000060