【事件の表示】
　特許第２９１６０４７号「ホエー蛋白分画の製造法」の請求項１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２９１６０４７号の請求項１に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
  本件特許第２９１６０４７号の請求項１に係る発明についての出願は、平成４年８月２０日に特許出願され、平成１１年４月１６日に特許の設定登録がされ、その後、その特許について異議申立人　役　昌明により特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１２年７月１４日に、訂正請求がなされ、さらに、異議申立人に、訂正請求書を添付して審尋書を発し、意見を求めたが、指定された期間内に応答はされなかったものである。
２．訂正の適否についての判断
Ａ）訂正の内容
　a)特許明細書の特許請求の範囲請求項１記載の「……（中略）……、そのまま陰イオン交換体……（中略）……、そのまま陰イオン交換体……（中略）……、吸着したα−ラクトアルブミンを塩溶液で溶出させる・・・」を「……（中略）……、そのまま弱塩基性陰イオン交換体……（中略）……、そのまま弱塩基性陰イオン交換体……（中略）……、吸着したα−ラクトアルブミンを０．４乃至１．０％の塩溶液で溶出させる・・・」と訂正する。
　b)特許明細書段落【００１２「……（中略）……、そのまま陰イオン交換体……（中略）……、そのまま陰イオン交換体……（中略）……、吸着したα−ラクトアルブミンを塩溶液で溶出させる・・・」を「……（中略）……、そのまま弱塩基性陰イオン交換体……（中略）……、そのまま弱塩基性陰イオン交換体……（中略）……、吸着したα−ラクトアルブミンを０．４乃至１．０％の塩溶液で溶出させる・・・」と訂正する。
Ｂ）訂正の目的の適否、新規事項の有無および拡張・変更の存否
　上記訂正事項ａ）は、用いる各陰イオン交換体を下位概念である弱塩基性陰イオン交換体に限定し、また、吸着したα−ラクトアルブミンを塩溶液で溶出するのに、該塩溶液の濃度を数値限定したものであるから、訂正事項ａ）は、特許請求の範囲の減縮を目的とした訂正に該当する。また訂正事項ｂ）は、前記訂正事項ａ）と整合を図るものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とした明細書の訂正に該当し、さらにこれら訂正は、新規事項の追加に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張または変更するものではない。
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項および同条第３項で準用する特許法第１２６条第２および第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
３．特許異議申立についての判断
（ａ）異議申立の理由の概要
　異議申立人は、下記甲第１号証を提出し、請求項１に係る発明は、甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項に違反してなされたものであり、同法第１１３条第１項第２号の規定により取り消されるべきである旨主張する。
                  記
甲第１号証：英国特許第１５６３９９０号明細書
　
（ｂ）訂正発明
　上記２．で示したように上記訂正が認められるから、本件請求項１に係る発明は、上記訂正請求に係る訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１に記載された次のとおりのものである。
「【請求項１】ホエー又は濃縮ホエーを、そのｐＨを調整せずに、そのまま弱塩基性陰イオン交換体を充填したカラムに通液し、β−ラクトグロブリンを選択的に当該陰イオン交換体に吸着させ、当該陰イオン交換体に吸着せずに溶出した液を回収し、回収した溶出液を、そのｐＨを調整せずに、そのまま弱塩基性陰イオン交換体を充填した別のカラムに通液し、α−ラクトアルブミンを選択的に当該陰イオン交換体に吸着させ、吸着したα−ラクトアルブミンを０．４乃至１．０％の塩溶液で溶出させることを特徴とするホエー蛋白分画の製造法。」（以下、本件発明という）　　　　　　　　　　　
（ｃ）甲第１号証の記載内容
　甲第１号証には、以下の記載事項がある。
（１）「本発明は、ミルクからの蛋白質類の抽出に関する」（第１頁９行〜１０行）
（２）陰イオン交換樹脂は、・・・通常第３級アミン、第４級アンモニウム塩の交換基をもつものであること（第１頁右欄７３行〜８６行）
（３）「陰イオン交換樹脂によって保持される上記蛋白質類は、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン及び血清アルブミン、並びに少量の免疫グロブリン（大部分の免疫グロブリンはシリカに固定されている）である。」（第２頁６８〜７３行）
（４）「各樹脂及びシリカからの上記蛋白質類の分離は、高イオン性の溶液、例えば塩化ナトリウムの１モル溶液や炭酸アンモニウム、又は陰イオン用の酸性ｐＨ溶液、シリカ用の塩基性ｐＨ溶液で処理することによって達成される。」(第２頁７４〜８０行)
（５）「選択的に分離するために、シリカ処理の前又は後にミルクを連続的に数種の同種又は異種の陰イオン交換体（樹脂）によって処理することができる。２種の陰イオン交換体を使用した場合には、最初の樹脂で分離されるものはβ−ラクトグロブリンのリッチのものであり、次の樹脂で分離されるものにはα−ラクトアルブミン、血清アルブミン並びに少量のβ−ラクトグロブリン及び免疫グロブリンが含まれる。」（第２頁８８行〜９８行、実施例３参照）
（６）「他の態様について、この発明の方法は、ミルクセラム、すなわちカゼインが除去されたスキムミルクに適用できる。」（第３頁２３行〜２６行）
（７）ミルクセラムから蛋白質を陰イオン交換樹脂、或いは樹脂およびシリカから抽出する場合は、ｐＨ４以上、好ましくは５．５〜７．５、温度０〜５０℃、好ましくは０〜３０℃で行う旨記載されている。（第３頁左欄４９行）
（８）実施例５においては、ｐＨ６．５であるミルクセラムを陰イオン交換樹脂、シリカが充填されたカラム１、カラム２に通過させること、前記カラム１にN/100のHCl溶液を用いてα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、少量のイミノグロブリンを溶出し、カラム２には、N/100のアンモニア溶液を用いて、イミノグロブリンを溶出すること。（第４頁右欄９０行〜第５頁左欄８行）
（９）実施例７は、実施例５と同様の方法であるが、カラム１の前に、カラム１と同一の陰イオン交換樹脂が充填されたカラム１とは直径が異なるカラムＡをおき、このカラムＡに対し、N/100ＨＣｌ溶液により溶出させて、得られた蛋白質の殆どは、β−ラクトグロブリンであること、続いて陰イオン交換樹脂の入ったカラム１に対して、N/100ＨＣｌにより溶出させて、得られたものは、主として、α−ラクトアルブミンであり、その他、少量のβ−ラクトグロブリンおよびイミノラクトグロブリンが含まれていること、カラム２からは、実施例５と同様の蛋白質（イミノグロブリン）が溶出されること。（第５頁左欄１５行〜３１行）
（ｄ）対比・判断
　従来、ホエーから、β−ラクトグロブミン、α−ラクトアルブミンを製造するのに、濃縮、ｐＨ調整、および分離精製が行われ、そのため中和等により生ずる食塩の除去が必要であったこと、或いは、強塩基性陰イオン交換体を用いて分離精製する際も前処理としてｐＨ調整が行われ、これら従来方法は、煩雑で工業的規模には適さない不利な点があったところ、本件発明は、ホエー又は濃縮ホエーに何らの前処理も施さずにβ−ラクトグロブリン、およびα−ラクトアルブミンを簡便に製造し、しかも純度の高いものを得ることを目的として、前記の構成を採用したものである。
　ところで、甲第１号証には、ミルクを連続的に数種の異種、または同種の陰イオン交換体、シリカを充填したカラム用いて、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン等を溶出させる蛋白分画の製造法が記載され、２つの陰イオン交換樹脂カラムを用いる場合は、最初のカラムからβ−ラクトグロブリンに富む液が溶出され、２つ目のカラムからは、α−ラクトアルブミン，セラムアルブミン等が溶出されること、および溶出液には、１モルの塩化ナトリウム溶液等が用いられることが記載されている。さらに、この手段は、ミルクセラム（ホエーに相当する）についても適用されることが記載され（摘示事項６）、ミルクセラム（ホエー）を原料とする場合には、陰イオン交換体による分画の前に、まず、ミルクセラム（ホエー）のｐＨを４以上、好ましくは５．５〜７．５とすると記載され（摘示事項７）、実施例にもｐＨ６．５で実施されている（摘示事項８，９）。また、最初のカラムからβ−ラクトグロブリンを溶出する際、およびその後、α−ラクトアルブミンをカラムから溶出するための溶液は、共にN/100のＨＣｌ溶液が用いられることが記載されている（摘示事項９）。
　このように、本件発明と甲第１号証記載のものとは、乳原料を、複数カラムを用いて陰イオン交換樹脂が充填されたカラムに通液し、最初のカラムから主としてβ−ラクトグロブリンを、後のカラム（別のカラム）からはα−ラクトアルブミン等を溶出する点で共通する部分が認められるものの、甲第１号証には、用いるカラムの何れにも、そのホエーのｐＨを調整せずにそのまま弱塩基性陰イオン交換体を充填したカラムに通液する点、および後のカラム（別のカラム）に吸着したα−ラクトアルブミンを０．４乃至１．０％の塩溶液で溶出する点については、記載されておらず、示唆もされていない。
　そして、本件発明は、これらの点を必須の構成要件とすることにより、前記所期の目的を達成することができ、さらに、後のカラム（別のカラム）の溶出に用いる塩溶液の濃度を前記の特定の範囲とすることにより、α−ラクトアルブミンの溶出量を増加せしめ、しかも純度の高いものが得られるという甲第１号証記載のものから予期できない効果を奏するものと認めることができる。
　
４．まとめ
　以上のことから、特許異議申立の前記理由及び提出された証拠方法によっては、本件請求項１に係る発明の特許を取り消すことはできない。
　又、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
  よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年２月２７日（２００１．２．２７）
【訂正の要旨】
　（訂正の要旨）
１．特許請求の範囲の減縮を目的として、
　「【請求項１】ホエー又は濃縮ホエーを、そのｐＨを調整せずに、そのまま陰イオン交換体を充填したカラムに通液し、β−ラクトグロブリンを選択的に当該陰イオン交換体に吸着させ、当該陰イオン交換体に吸着せずに溶出した液を回収し、回収した溶出液を、そのｐＨを調整せずに、そのまま陰イオン交換体を充填した別のカラムに通液し、α−ラクトアルブミンを選択的に当該陰イオン交換体に吸着させ、吸着したα−ラクトアルブミンを塩溶液で溶出させることを特徴とするホエー蛋白分画の製造法。」を
　「【請求項１】ホエー又は濃縮ホエーを、そのｐＨを調整せずに、そのまま弱塩基性陰イオン交換体を充填したカラムに通液し、β−ラクトグロブリンを選択的に当該陰イオン交換体に吸着させ、当該陰イオン交換体に吸着せずに溶出した液を回収し、回収した溶出液を、そのｐＨを調整せずに、そのまま弱塩基性陰イオン交換体を充填した別のカラムに通液し、α−ラクトアルブミンを選択的に当該陰イオン交換体に吸着させ、吸着したα−ラクトアルブミンを０．４乃至１．０％の塩溶液で溶出させることを特徴とするホエー蛋白分画の製造法。」と訂正する。
２．明細書の段落００１２を、明りょうでない記載の釈明を目的として、
　「ホエー又は濃縮ホエーを、そのｐＨを調整せずに、そのまま陰イオン交換体を充填したカラムに通液し、β−ラクトグロブリンを選択的に当該陰イオン交換体に吸着させ、当該陰イオン交換体に吸着せずに溶出した液を回収し、回収した溶出液を、そのｐＨを調整せずに、そのまま陰イオン交換体を充填した別のカラムに通液し、α−ラクトアルブミンを選択的に当該陰イオン交換体に吸着させ、吸着したα−ラクトアルブミンを塩溶液で溶出させることを特徴とするホエー蛋白分画の製造法。」を
　「ホエー又は濃縮ホエーを、そのｐＨを調整せずに、そのまま弱塩基性陰イオン交換体を充填したカラムに通液し、β−ラクトグロブリンを選択的に当該陰イオン交換体に吸着させ、当該陰イオン交換体に吸着せずに溶出した液を回収し、回収した溶出液を、そのｐＨを調整せずに、そのまま弱塩基性陰イオン交換体を充填した別のカラムに通液し、α−ラクトアルブミンを選択的に当該陰イオン交換体に吸着させ、吸着したα−ラクトアルブミンを０．４乃至１．０％の塩溶液で溶出させることを特徴とするホエー蛋白分画の製造法。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
ホエー蛋白分画の製造法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　ホエー又は濃縮ホエーを、そのｐＨを調整せずに、そのまま
弱塩基性
弱塩基性
０．４乃至１．０％
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、ホエー蛋白分画の製造法に関するものである。更に詳しくは、本発明は、高純度で、かつ簡便にβ−ラクトグロブリン、及びα−ラクトアルブミンをホエーから製造する方法に関するものである。
　尚、本明細書において％の表示は、特に断りのない限り重量による値である。
　【０００２】
　【従来の技術】
　チーズ製造において副産物として生成するホエーは、ウルトラフィルトレーション（以下ＵＦと記載することがある）により濃縮され、蛋白質濃度を増加させるととも乳糖及び灰分の濃度を低下させ、いわゆるホエー蛋白質濃縮物（以下ＷＰＣと記載することがある）として、育児用食品の製造における蛋白源、各種食品の製造における原料等として利用されている。
　【０００３】
　ところで、ＷＰＣの有する特性をより有効に利用する方法として、従来からホエー蛋白質の各蛋白質成分を分画、精製する種々の試みがなされている。例えば、ホエーをＵＦで１０倍に濃縮し、ｐＨを２．０〜４．０に調整し、食塩を２〜１５％添加し、β−ラクトグロブリンと、α−ラクトアルブミンとを分離する方法［ピー・メリジェー及びビー・リバデュー・デュマ：ジャーナル・オブ・フード・サイエンス（Ｐ．Ｍａｉｌｌｉａｒｔ　ａｎｄ　Ｂ．Ｒｉｂａｄｅａｕ−Ｄｕｍａｓ：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ），第５３巻，第３号，第７４３ページ（１９８８年）、以下文献１と記載する］、ホエーをＵＦで濃縮し、ｐＨを４．６５に調整し、電気透析により脱塩し、加熱せずにβ−ラクトグロブリンと、α−ラクトアルブミンとを分離する方法［エー・ダブリュウ・スラックら：ジャーナル・オブ・フード・プロセッシング・アンド・プレザベーション（Ａ．Ｗ．Ｓｌａｃｋ，ｅｔ　ａｌ：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ａｎｄ　Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ），第１０巻，第１９ページ（１９８６年）、以下文献２と記載する］等が知られている。
　【０００４】
　また、ホエーをＵＦで濃縮し、ｐＨを４．２に調整し、６４℃で加熱し、β−ラクトグロブリンと、α−ラクトアルブミンとを分離する方法［アール・ジェイ・ピールス：ブレティン・オブ・ザ・インターナショナル・デイリー・フェデレーション（Ｒ．Ｊ．Ｐｅａｒｃｅ：Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄａｉｒｙ　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ），ドキュメント第２１２号（１９８７年）、以下文献３と記載する］が知られている。
　【０００５】
　更に、ホエー又はＷＰＣを９０％以上脱塩し、ｐＨを４．２〜４．５に調整し、４５〜７０℃で加熱し、その温度に１時間保持し、α−ラクトアルブミンを沈澱物、β−ラクトグロブリンを上清液として分離する方法（特開昭６１−２６８１３８号公報、以下文献４と記載する）、ホエー又は精製ホエー蛋白質を、灰分含量が０〜１％のときｐＨを４〜６に、灰分含量が１〜３％のときｐＨを６〜８に、それぞれ調整し、強塩基性陰イオン交換体と接触させ、β−ラクトグロブリンを該イオン交換体に吸着させ、次いで高イオン強度の溶液によりβ−ラクトグロブリンを該イオン交換体から溶出させる方法（特開平３−１９６５４号公報、以下文献５と記載する）等が知られている。
　【０００６】
　【発明が解決しようとする課題】
　しかしながら、前記従来の方法においては、工業的規模での実施において種々の問題点があった。即ち、具体的には、文献１記載の方法においては、ｐＨを酸性にするため、中和により生じた塩及び添加した食塩の効果的除去が必要とされる点、また、文献２記載の方法においては、文献１記載の方法と同様に中和により生じた塩の効果的除去が必要とされる点、及び電気透析による歩留まりの低下と生産コストの増加の点、文献３記載の方法においては、文献１及び文献２記載の方法と同様に中和により生じた塩の効果的除去が必要とされる点、及び加熱により分離したα−ラクトアルブミン沈澱物の再溶解が必要とされる点等種々の問題点があった。
　【０００７】
　また、文献４記載の方法においては、文献１、文献２及び文献３記載の方法と同様に中和により生じた塩の効果的除去が必要とされる点、文献３記載の方法と同様に加熱により分離したα−ラクトアルブミン沈澱物の再溶解が必要とされる点、９０％以上の脱塩を行うため歩留まりの低下、及び生産コストの増加の点、更に、文献５記載の方法においては、文献１、文献２及び文献３記載の方法と同様に中和により生じた塩の効果的除去が必要とされる点、及びβ−ラクトグロブリンのみを分離してα−ラクトアルブミンを廃棄している点等種々の問題点があった。
　【０００８】
　従って、従来種々の方法が提案されているにもかかわらず、ホエー又は濃縮ホエーから工業的規模で、高純度のβ−ラクトグロブリン、及びα−ラクトアルブミンの製造は、実施されていなかったのが実情である。
　【０００９】
　このような状況を踏まえ、本発明者らは、ホエー又は濃縮ホエーから工業的規模で、高純度のβ−ラクトグロブリン、及びα−ラクトアルブミンを簡便に製造するための新しい方法を開発することを目標として、鋭意研究を行った結果、陰イオン交換体、特に弱塩基性陰イオン交換体が前処理をしないホエー又は濃縮ホエー中のβ−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミンを選択的に吸着し、塩溶液で容易に溶出し得ることを見出し、本発明を完成した。
　【００１０】
　すなわち、本発明は、ホエー又は濃縮ホエーに何らの前処理も施さずにβ−ラクトグロブリンとα−ラクトアルブミンとを同時に、変性させずに、高純度で、かつ簡便に工業的規模で製造するための方法を提供することを目的とするものである。
　【００１１】
　【課題を解決するための手段】
　前記目的を達成するための本発明の構成は、次の技術手段からなるものである。
　【００１２】
　ホエー又は濃縮ホエーを、そのｐＨを調整せずに、そのまま
弱塩基性
弱塩基性
０．４乃至１．０％
　【００１３】
　【００１４】
　【００１５】
　【００１６】
　次に本発明の方法について詳述する。
　本発明の方法において出発物質として使用するホエー又は濃縮ホエーは、通常のチーズ製造において副産物として生成する甘性ホエー、又はこれを常法により濃縮した濃縮ホエーである。通常、甘性ホエー、及び濃縮ホエーのｐＨは、それぞれ５．８〜６．６、及び５．８〜６．８であり、本発明の方法においては、当該ホエーのｐＨを調整することなく、そのまま使用することを特徴とするものである。また、ホエー及び濃縮ホエーには、蛋白質の他、各種ミネラル、乳糖等が含まれているが、本発明の方法においては、これらの成分を予め除去する必要がなく、そのまま使用することができる。
　【００１７】
　本発明の方法において使用する陰イオン交換体は、市販の弱塩基性陰イオン交換体であり、イオン交換基としてジエチルアミノエチル基を有する弱塩基性陰イオン交換体が好適であり、特に望ましい弱塩基性陰イオン交換体としては、市販のＤＥＡＥセファデックスＡ５０（商標、ファルマシア社製）、インディオンＨＡ（商標、フェニックス・ケミカルズ社製）、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（商標、東ソー製）等を例示することができる（試験例８及び試験例９参照）。
　【００１８】
　陰イオン交換体は、常法により水洗、膨潤し、例えばカラム等に所定量が充填される。陰イオン交換体の量は、処理するホエー又は濃縮ホエーの量、及び陰イオン交換体の種類により適宜決定されるが、通常ホエー又は濃縮ホエーの固形分（ただし、濃縮ホエーの場合は濃縮前のホエーの固形分換算、以下同じ）１Ｋｇ当たり１０〜１７００ｇの割合を例示できる。特に望ましい量を例示すれば、ホエー又は濃縮ホエーの固形分１Ｋｇ当たりＤＥＡＥセファデックスＡ５０では、１０〜４５ｇ、インディオンＨＡでは、１４０〜６５０ｇ、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍでは、３７０〜１７００ｇである。
　【００１９】
　ホエー又は濃縮ホエーと陰イオン交換体との接触は、０〜２０℃の温度で２０〜６０分間攪拌することによって行われ、この処理により陰イオン交換体にβ−ラクトグロブリンが選択的に吸着される。陰イオン交換体へのβ−ラクトグロブリンの吸着は、０〜６０℃の間でほとんど差異がないので、処理中の細菌の増殖を防止する点から可及的に低い温度が望ましい。攪拌時間は、後記する試験例１から２０〜６０分間、望ましくは４０〜６０分間である（試験例１参照）。
　【００２０】
　接触終了後、液を排出する。この排出液は、次のα−ラクトアルブミンを分画する工程に利用する。液を排出した後、陰イオン交換体を水洗し、不要の成分を除去する。次いで低濃度の塩溶液を通液し、不要の蛋白質等を除去する。塩の種類は、一価の塩が望ましく、特に食塩が好適である。塩の濃度は、０．２〜１．０％、特に０．８〜１．０％が望ましい（試験例２参照）。使用する塩溶液の量は、ホエー又は濃縮ホエーの固形分１Ｋｇ当たり６００〜１５００ｇであり、特にホエー又は濃縮ホエーの固形分１Ｋｇ当たり８００〜１０００ｇが望ましい（試験例３参照）。
　【００２１】
　本発明の方法において所望のホエー蛋白分画の溶出は、イオン強度の差を利用して行われるので、一価の塩がイオン強度の調整が容易である。特に食塩は、安価であり、入手も容易であり、食品衛生上も安全であり、望ましい。塩類の濃度は、後記する試験例２から０．２〜１．０％、望ましくは０．８〜１．０％である。
　【００２２】
　低濃度の塩溶液で洗浄した陰イオン交換体に、高濃度の塩溶液を通液し、β−ラクトグロブリンを溶出する。塩の種類は、一価の塩が望ましく、一価の塩であれば、特にその種類は限定されないが、その中でも特に食塩が好適である。塩の濃度は、２〜５％、特に４〜５％が望ましい（試験例４参照）。使用する塩溶液の量は、ホエー又は濃縮ホエーの固形分１Ｋｇ当たり１５００〜２７００ｇであり、特にホエー又は濃縮ホエーの固形分１Ｋｇ当たり２３００〜２７００ｇが望ましい（試験例５参照）。使用する塩の種類は、前記洗浄処理に使用する塩と同一の理由である。
　【００２３】
　β−ラクトグロブリンを含有する溶出液を、常法により脱塩し、そのままβ−ラクトグロブリン溶液とすることもでき、この溶液を常法により濃縮し、β−ラクトグロブリン濃縮液とすることもでき、更にこの濃縮液を常法により乾燥し、粉末のβ−ラクトグロブリンとすることもできる。
　【００２４】
　前記排出液を、前記と同一の陰イオン交換体に通液し、α−ラクトアルブミンを選択的に吸着させ、陰イオン交換体を水洗し、不要の成分を除去する。次いで低濃度の塩溶液を通液し、陰イオン交換体に吸着したα−ラクトアルブミンを溶出する。塩の種類は、一価の塩が望ましく、一価の塩であれば、特にその種類は限定されないが、その中でも特に食塩が好適である。塩の濃度は、０．４〜１．０％、特に０．４〜０．７％が望ましい（試験例６参照）。使用する塩溶液の量は、ホエー又は濃縮ホエーの固形分１Ｋｇ当たり１５００〜３０００ｇであり、特にホエー又は濃縮ホエーの固形分１Ｋｇ当たり２０００〜３０００ｇが望ましい（試験例７参照）。使用する塩の種類は、前記β−ラクトグロブリンの溶出に使用する塩と同一の理由である。
　【００２５】
　α−ラクトアルブミンを含有する溶出液を、常法により脱塩し、そのままα−ラクトアルブミン溶液とすることもでき、この溶液を常法により濃縮し、α−ラクトアルブミン濃縮液とすることもでき、更にこの濃縮液を常法により乾燥し、粉末のα−ラクトアルブミンとすることもできる。
　【００２６】
　以上のようにして製造したホエー蛋白分画は、従来法により製造されたＷＰＣ等と同様に育児用食品の製造における蛋白源、各種食品の製造における原料等として使用することができる。
　【００２７】
　次に試験例を示して本発明を詳述する。
（試験例１）
　この試験は、陰イオン交換体との接触処理時間を調べるために行った。
　２ｌのカラム５個に、インディオンＨＡ（商標、フェニックス・ケミカルズ社製）をそれぞれ１０ｇを入れ、十分水洗し、次いで各カラムにエメンタール・チーズ製造時副産物として生成した甘性ホエー１２００ｇをｐＨ調整せずそのまま通液し、１０℃で１０、２０、４０、６０及び８０分間攪拌し、次いでカラム内の液を回収し、陰イオン交換体に吸着した蛋白質の量を次の方法により測定し、好適な攪拌時間を試験した。
　【００２８】
　即ち、甘性ホエー及び回収液の蛋白質含量をケールダール法により定量し、前者と後者の差を陰イオン交換体に吸着した蛋白質量とした。
　【００２９】
　この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から明らかなように２０分未満の攪拌時間では、蛋白質の陰イオン交換体への吸着量が少なく、６０分を超える攪拌時間では、蛋白質の陰イオン交換体への吸着量の増加が認められなかった。
　従って、攪拌時間は、２０〜６０分間が適当であり、特に４０〜６０分間が望ましい。
　尚、陰イオン交換体の種類を変更して試験してもほぼ同様の結果が得られた。
　【００３０】
　【表１】
　【００３１】
（試験例２）
　この試験は、陰イオン交換体に吸着した不要な蛋白質を洗浄する塩の濃度を調べるために行った。
　３ｌのカラム６個に、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（商標、東ソー製）をそれぞれ６０ｇを入れ、各カラムにエメンタール・チーズ製造時副産物として生成した甘性ホエー２５００ｇをｐＨ調整せずそのまま通液し、１０℃で６０分間攪拌し、カラム内の液を排出し、次いでカラムを十分水洗し、０．１％、０．２％、０．６％、０．８％、１．０％及び１．２％の濃度に調整した食塩水溶液各１５０ｇを通液し、３０分間攪拌し、カラム内の溶液を排出し、各排出液のβ−ラクトグロブリンとその他の蛋白質の量を後記する参考例と同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により測定し、好適な洗浄用塩の濃度を試験した。
　【００３２】
　この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から明らかなように食塩濃度が０．２％未満では陰イオン交換体に吸着した不要な蛋白質が溶出されず、β−ラクトグロブリンを精製することができない。一方、１．０％を超える食塩濃度では陰イオン交換体に吸着したβ−ラクトグロブリンも溶出され、β−ラクトグロブリンの収量が低下することが判明した。
　【００３３】
　従って、塩類の濃度は、０．２％〜１．０％が適当であり、特に０．８％〜１．０％が望ましい。
　尚、陰イオン交換体及び塩類の種類を変更して試験してもほぼ同様の結果が得られた。
　【００３４】
　【表２】
　【００３５】
（試験例３）
　この試験は、陰イオン交換体に吸着した不要な蛋白質を洗浄する塩類溶液の量を調べるために行った。
　３ｌのカラム６個に、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（商標、東ソー製）をそれぞれ６０ｇを入れ、十分水洗し、各カラムにエメンタール・チーズ製造時副産物として生成した甘性ホエー２５００ｇを通液し、１０℃で６０分間攪拌し、カラム内の液を排出し、次いでカラムを十分水洗し、０．９％の濃度に調整した食塩水溶液をホエーの固形分１Ｋｇ当り４００ｇ、６００ｇ、８００ｇ、１０００ｇ、１５００ｇ及び１７００ｇの割合で通液し、３０分間攪拌し、カラム内の溶液を排出し、各排出液のβ−ラクトグロブリン及びその他の蛋白質の量を後記する参考例と同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により測定し、好適な洗浄用塩類溶液の量を試験した。
　【００３６】
　この試験の結果は、表３に示すとおりである。表３から明らかなように食塩溶液の量がホエーの固形分１Ｋｇ当り６００ｇ未満では陰イオン交換体に吸着した不要な蛋白質が溶出されず、β−ラクトグロブリンを精製することができない。一方、ホエーの固形分１Ｋｇ当り１５００ｇを超える食塩溶液の量では陰イオン交換体に吸着した目的の蛋白質も溶出され、β−ラクトグロブリンの収量が低下することが判明した。
　従って、塩類の量は、６００〜１５００ｇが適当であり、特に８００〜１０００ｇが望ましい。
　尚、陰イオン交換体及び塩類の種類を変更して試験してもほぼ同様の結果が得られた。
　【００３７】
　【表３】
　【００３８】
（試験例４）
　この試験は、陰イオン交換体に吸着したβ−ラクトグロブリンを溶出する塩類溶液の濃度を調べるために行った。
　前記試験例２において１％食塩溶液１５０ｇで洗浄した陰イオン交換体を６ｇずつ２００ｍｌのビーカー５個に分注し、１％、２％、４％、５％及び６％の食塩水溶液各１５ｇを添加し、１０℃で６０分間攪拌し、次いで食塩溶液を採取し、各採取液のβ−ラクトグロブリン及びその他の蛋白質の含量を後記する参考例と同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により測定し、好適な溶出用塩類溶液の濃度を試験した。
　【００３９】
　この試験の結果は、表４に示すとおりである。表４から明らかなように食塩の濃度が２％未満ではβ−ラクトグロブリンが十分溶出されない。一方、５％を超える食塩の濃度では、５％の食塩濃度の場合に比してβ−ラクトグロブリンの溶出の増加がないことが判明した。
　従って、塩類の濃度は、２〜５％が適当であり、特に４〜５％が望ましい。
　尚、陰イオン交換体及び塩類の種類を変更して試験してもほぼ同様の結果が得られた。
　【００４０】
　【表４】
　【００４１】
（試験例５）
　この試験は、陰イオン交換体に吸着したβ−ラクトグロブリンを溶出する塩類溶液の量を調べるために行った。
　前記試験例２において１％食塩溶液１５０ｇで洗浄した陰イオン交換体を６ｇずつ２００ｍｌのビーカー５個に分注し、５％の食塩水溶液をホエーの固形分１Ｋｇ当り１０００ｇ、１５００ｇ、２３００ｇ、２７００ｇ及び３０００ｇの割合でそれぞれの容器に添加し、１０℃で３０分間攪拌し、次いで食塩溶液を採取し、各採取液のβ−ラクトグロブリン及びその他の蛋白質の量を後記する参考例と同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により測定し、好適な溶出用塩類溶液の量を試験した。
　【００４２】
　この試験の結果は、表５に示すとおりである。表５から明らかなように食塩溶液の量がホエーの固形分１Ｋｇ当り１５００ｇ未満ではβ−ラクトグロブリンが十分溶出されない。一方、ホエーの固形分１Ｋｇ当り２７００ｇを超える食塩溶液の量では、ホエーの固形分１Ｋｇ当り２７００ｇの食塩溶液の場合に比してβ−ラクトグロブリンの溶出の増加がないことが判明した。
　従って、塩類の量は、１５００〜２７００ｇが適当であり、特に２３００〜２７００ｇが望ましい。
　尚、陰イオン交換体及び塩類の種類を変更して試験してもほぼ同様の結果が得られた。
　【００４３】
　【表５】
　【００４４】
（試験例６）
　この試験は、陰イオン交換体に吸着したα−ラクトアルブミンを溶出する塩類溶液の濃度を調べるために行った。
　前記試験例２と同様に陰イオン交換体６０ｇに甘性ホエー２５００ｇを添加し、１０℃で６０分間攪拌し、次いでホエーを採取し、５等分した。前処理済の前記と同一の陰イオン交換体１２ｇが入っている１ｌの容器５個に採取したホエーを添加し、前記と同様に６０分間攪拌し、ホエーを排出し、陰イオン交換体を十分水洗した。０．２％、０．４％、０．７％、１．０％及び１．２％の食塩水溶液各６０ｇを添加し、１０℃で３０分間攪拌し、次いで食塩溶液を採取し、各採取液のα−ラクトアルブミン及びその他の蛋白質の含量を後記する参考例と同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により測定し、好適な溶出用塩類溶液の濃度を試験した。
　【００４５】
　この試験の結果は、表６に示すとおりである。表６から明らかなように食塩の濃度が０．４％未満ではα−ラクトアルブミンが十分溶出されない。一方、１．０％を超える食塩の濃度では、１．０％の食塩濃度の場合に比してα−ラクトアルブミンの溶出量は増加するが、その他の蛋白質の溶出量も増加し、α−ラクトアルブミンの純度が低下することが判明した。
　従って、塩類の濃度は、０．４〜１．０％が適当であり、特に０．４〜０．７％が望ましい。
　尚、陰イオン交換体及び塩類の種類を変更して試験してもほぼ同様の結果が得られた。
　【００４６】
　【表６】
　【００４７】
（試験例７）
　この試験は、陰イオン交換体に吸着したα−ラクトアルブミンを溶出する塩類溶液の量を調べるために行った。
　前記試験例２と同様に陰イオン交換体６０ｇに甘性ホエー２５００ｇを添加し、１０℃で６０分間攪拌し、次いでホエーを採取し、５等分した。前処理済の前記と同一の陰イオン交換体１２ｇが入っている１ｌの容器５個に採取したホエーを添加し、前記と同様に６０分間攪拌し、ホエーを排出し、陰イオン交換体を十分水洗した。次いで０．６％の食塩水溶液をホエーの固形分１Ｋｇ当り１０００ｇ、１５００ｇ、２０００ｇ、３０００ｇ及び３５００ｇの割合でそれぞれの容器に添加し、１０℃で３０分間攪拌し、次いで食塩溶液を採取し、各採取液のα−ラクトアルブミン及びその他の蛋白質の量を後記する参考例と同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により測定し、好適な溶出用塩類溶液の量を試験した。
　【００４８】
　この試験の結果は、表７に示すとおりである。表７から明らかなように食塩溶液の量がホエーの固形分１Ｋｇ当り１５００ｇ未満ではα−ラクトアルブミンが十分溶出されない。一方、ホエーの固形分１Ｋｇ当り３０００ｇを超える食塩溶液の量では、ホエーの固形分１Ｋｇ当り３０００ｇの食塩溶液の量の場合に比してα−ラクトアルブミンの溶出の増加がないことが判明した。
　従って、塩類の量は、１５００〜３０００ｇが適当であり、特に２０００〜３０００ｇが望ましい。
　尚、陰イオン交換体及び塩類の種類を変更して試験してもほぼ同様の結果が得られた。
　【００４９】
　【表７】
　【００５０】
（試験例８）
　この試験は、本発明の第１段階、即ちβ−ラクトグロブリンの精製（分離）に好適な陰イオン交換体を調べるために行った。
１）試料の調製
　【００５１】
▲１▼濃縮ホエーの調製
　ゴーダ・チーズ製造時副産物として生成したホエー５０Ｋｇを分画分子量２０，０００の限外瀘過膜（ＤＤＳ社製、ＧＲ６１ＰＰ）を装着した限外瀘過装置を用いたダイヤフィルトレーションにより濃縮し、固形分含量６％、蛋白質含量４．８％のＷＰＣ溶液約６．２Ｋｇを得た。
　【００５２】
▲２▼陰イオン交換体
　次の市販陰イオン交換体を使用した。
　ａ）強塩基性陰イオン交換体
　ＱＡＥセファデックスＡ５０（商標、ファルマシア社製）
　インディオンＱＡＥ（商標、フェニックス・ケミカルズ社製）
　【００５３】
　ｂ）弱塩基性陰イオン交換体
　インディオンＨＡ（商標、フェニックス・ケミカルズ社製）
　ＤＥＡＥセファデックスＡ５０（商標、ファルマシア社製）
　ＤＥＡＥトヨパール（商標、東ソー製）
　【００５４】
２）試験方法
　前処理済の前記５種類の陰イオン交換体（総交換容量を等量に調整した）を入れた２ｌの容器に、前記濃縮ホエーをｐＨ調整せずにそのまま５等分して添加し、１０℃で１時間攪拌し、濃縮ホエーを排出し、各陰イオン交換体を十分水洗し、次いで０．９％食塩水溶液各５４０ｇを添加し、１０℃で３０分間攪拌し、食塩水溶液を排出した。
　【００５５】
　次いで５％食塩水溶液各１５００ｇを添加し、１０℃で３０分間攪拌し、食塩水溶液を採取し、各食塩水溶液β−ラクトグロブリン及びその他の蛋白質の含量を後記する参考例と同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法により定量し、β−ラクトグロブリンの純度（β−ラクトグロブリン及びその他の蛋白質の含量に対するβ−ラクトグロブリン含量の百分率）を算出し、陰イオン交換体の種類によるβ−ラクトグロブリンの精製の程度を試験した。
　【００５６】
３）試験結果
　この試験の結果は表８に示すとおりである。表８から明らかなように弱塩基性陰イオン交換体は、強塩基性陰イオン交換体よりも高い純度でβ−ラクトグロブリンを分離し得ることが判明した。
　尚、使用する原料、精製条件を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
　【００５７】
　【表８】
　【００５８】
（試験例９）
　この試験は、本発明の第２段階、即ちα−ラクトアルブミンの精製に好適な陰イオン交換体を調べるために行った。
　試験例８において各容器から排出した濃縮ホエーを、ｐＨ調整せずにそのまま別途用意した前処理済の前記５種類の陰イオン交換体（総交換容量を等量に調整した）を入れた２ｌの容器に添加し、１０℃で６０分間攪拌し、液を排出し、陰イオン交換体を十分水洗し、次いで０．６％食塩水溶液１８００ｇを各容器に添加し、１０℃で３０分間攪拌し、次いで食塩水溶液を採取し、試験例８と同一の方法によりα−ラクトアルブミンの純度（α−ラクトアルブミン及びその他の蛋白質の含量に対するα−ラクトアルブミン含量の百分率）を算出し、陰イオン交換体の種類によるα−ラクトアルブミンの精製の程度を試験した。
　【００５９】
　この試験の結果は表９に示すとおりである。表９から明らかなように弱塩基性陰イオン交換体は、強塩基性陰イオン交換体よりも高い純度でα−ラクトアルブミンを分離し得ることが判明した。
　尚、使用する原料、精製条件を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
　【００６０】
　【表９】
　【００６１】
参考例
　インディオンＨＡ（商標、フェニックス・ケミカルズ社製）３００ｇを充填した容積２０ｌのカラムを十分水洗し、エメンタール・チーズ製造時副産物として生成したホエー１０ＫｇをｐＨ調整せずにそのまま通液し、２０℃の温度で１時間攪拌しながら保持し、次いで液を排出した。カラムを水で洗浄し、１．０％塩化ナトリウム水溶液６００ｇを１５ｌ／時の流量で通液し、次いで４％塩化ナトリウム水溶液１６００ｇを１５ｌ／時の流量で通液し、溶出液を回収した。
　【００６２】
　この溶出液を分画分子量６０００の限外瀘過膜（旭化成工業社製、ＳＩＰ１０１３）を用いて限外瀘過し、ダイヤフィルトレーションにより食塩を除去し、常法により濃縮し、凍結乾燥し、粉末状のホエー蛋白分画約２０ｇを得た。
　得られた粉末を常法により分析した結果、水分５．１％、蛋白質９１．７％、灰分３．２％であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法（日本生化学会編，新生化学実験講座１，タンパク質Ｉ，第３２９ページ，１９９０年）による分析結果蛋白質に占めるβ−ラクトグロブリンの割合は、８４％であった。
　【００６３】
　【実施例】
　次に実施例を示して本発明を更に詳述するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
実施例１
　ＤＥＡＥセファデックスＡ５０（商標、ファルマシア社製）２５ｇを容積２０ｌのカラム（カラム１）に充填し、陰イオン交換体重量の約２００倍の水で２４時間膨潤させて十分水洗し、次いでエメンタール・チーズ製造時副産物として生成したホエー１０ＫｇをｐＨ調整せずにそのまま通液し、２０℃の温度で１時間攪拌しながら保持し、次いで液を排出し、排出した液をｐＨ調整せずにそのまま前記と同一のイオン交換体を充填した別のカラム（カラム２）に通液し、１５℃の温度で１時間攪拌しながら保持し、次いで液を排出した。
　【００６４】
　カラム１を水で洗浄し、０．９％塩化ナトリウム水溶液６２５ｇを１５ｌ／時の流量で通液し、次いで５％塩化ナトリウム水溶液１５００ｇを１５ｌ／時の流量で通液し、溶出液を回収した。この溶出液を分画分子量６０００の限外瀘過膜（旭化成工業社製、ＳＩＰ１０１３）を用いて限外瀘過し、ダイヤフィルトレーションにより食塩を除去し、常法により濃縮し、凍結乾燥し、粉末状のホエー蛋白分画約１８ｇを得た。
　【００６５】
　得られた粉末を常法により分析した結果、水分４．５％、蛋白質９２．１％、灰分３．４％であり、参考例と同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法による分析結果蛋白質に占めるβ−ラクトグロブリンの割合は、８６％であった。
　尚、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法による分析結果は、ＨＰＬＣ法（日本分析化学会関東支部編，高速液体クロマトグラフィーハンドブック，第３０９ページ，昭和６０年）による分析結果と一致していた。
　【００６６】
　カラム２を水で洗浄し、０．６％塩化ナトリウム水溶液１２５０ｇを１５ｌ／時の流量で通液し、溶出液を回収した。この溶出液を分画分子量６０００の限外瀘過膜（旭化成工業社製、ＳＩＰ１０１３）を用いて限外瀘過し、ダイヤフィルトレーションにより食塩を除去し、常法により濃縮し、凍結乾燥し、粉末状のホエー蛋白分画約５ｇを得た。得られた粉末を常法により分析した結果、水分５．０％、蛋白質９１．５％、灰分３．５％であり、前記した参考例と同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法による分析結果蛋白質に占めるα−ラクトアルブミンの割合は、９０％であった。
　【００６７】
　【００６８】
　【００６９】
　【００７０】
実施例２
　ゴーダ・チーズ製造時副産物として生成したホエー１００Ｋｇを分画分子量２０，０００の限外瀘過膜（ＤＤＳ社製、ＧＲ６１ＰＰ）を装着した限外瀘過装置を用いたダイヤフィルトレーションにより濃縮し、固形分含量５％、蛋白質含量３．９％のＷＰＣ溶液約１５Ｋｇを得た。この濃縮ホエーを、ｐＨ調整せずにそのままＤＥＡＥセファデックスＡ５０（商標、ファルマシア社製）７５ｇを充填し、陰イオン交換体重量の約２００倍の水で２４時間膨潤させ、十分水洗した容積２０ｌのカラム（カラム１）に通液し、１５℃の温度で１時間攪拌しながら保持し、次いで液を排出し、排出した液をｐＨ調整せずにそのまま前記と同一のイオン交換体を充填した別のカラム（カラム２）に通液し、１５℃の温度で１時間攪拌しながら保持し、次いで液を排出した。
　【００７１】
　カラム１を水で洗浄し、０．９％塩化ナトリウム水溶液５４００ｇを１５ｌ／時の流量で通液し、次いで５％塩化ナトリウム水溶液１４０００ｇを１５ｌ／時の流量で通液し、溶出液を回収した。この溶出液を分画分子量６０００の限外瀘過膜（旭化成工業社製、ＳＩＰ１０１３）を用いて限外瀘過し、ダイヤフィルトレーションにより食塩を除去し、常法により濃縮し、凍結乾燥し、粉末状のホエー蛋白分画約１８０ｇを得た。
　【００７２】
　得られた粉末を常法により分析した結果、水分４．９％、蛋白質９２．２％、灰分２．９％であり、参考例と同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法による分析結果蛋白質に占めるβ−ラクトグロブリンの割合は、８７％であった。
　尚、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法による分析結果は、実施例１と同一のＨＰＬＣ法による分析結果と一致していた。
　【００７３】
　カラム２を水で洗浄し、０．６％塩化ナトリウム水溶液１２５００ｇを１５ｌ／時の流量で通液し、溶出液を回収した。この溶出液を分画分子量６０００の限外瀘過膜（旭化成工業社製、ＳＩＰ１０１３）を用いて限外瀘過し、ダイヤフィルトレーションにより食塩を除去し、常法により濃縮し、凍結乾燥し、粉末状のホエー蛋白分画約４４ｇを得た。
　【００７４】
　得られた粉末を常法により分析した結果、水分５．３％、蛋白質９１．１％、灰分３．６％であり、参考例と同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法による分析結果蛋白質に占めるα−ラクトアルブミンの割合は、９１％であった。
　【００７５】
　【発明の効果】
　以上詳述したように、本発明のホエー蛋白分画の製造方法は、ホエー又は濃縮ホエーを、そのｐＨを調整せずに、そのまま陰イオン交換体を充填したカラムに通液し、段階的、かつ選択的にβ−ラクトグロブリン、及びα−ラクトアルブミンを吸着させ、これを溶出させることを特徴とするものであり、従来方法により得られることのできない以下のような種々の効果を有する。
　【００７６】
　即ち、本発明によって奏せられる効果は、次のとおりである。
（１）本発明の方法は、従来方法において必須の工程とされていたホエー又は濃縮ホエーのｐＨ調整、脱塩等の余分な前処理を必要としないことからホエー蛋白分画を単純な工程で簡便に製造できる長所を有する。
（２）ホエー又は濃縮ホエーを加熱しないので、未変性のホエー蛋白分画を得ることができる。
　【００７７】
（３）単純な工程で、高純度のα−ラクトアルブミンを得ることができる。
（４）単純な工程なので、大量のホエーを処理することができ、大量のホエー蛋白分画の製造手段として有用なものである。