(57)【要約】  呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための方法であって、前記動物の体重１ｋｇ当たり０．００１から１０００μｇの、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含有する組成物を当該動物に投与することを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための方法であって、前記動物の体重１ｋｇ当たり０．００１から１０００μｇの、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含有する組成物を当該動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物の、呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための医薬の製造における使用であって、前記医薬が、前記動物の体重１ｋｇ当たり０．００１から１０００μｇのアンチセンス化合物と同等の用量レベルで投与される使用。
【請求項３】
インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含む治療に使用するための組成物であって、前記アンチセンス化合物が、治療される動物の体重１ｋｇ当たり０．００１から１０００μｇのレベルで投与される組成物。
【請求項４】
呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための方法であって、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含有する組成物を当該動物に局所投与することを含む方法。
【請求項５】
インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物の、呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための医薬の製造における使用であって、前記医薬が局所投与される使用。
【請求項６】
インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含む治療に使用するための組成物であって、前記アンチセンス化合物が局所投与される組成物。
【請求項７】
呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための方法であって、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含有する組成物を、当該動物に１日に１回以下しか投与されないことを含む方法。
【請求項８】
インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物の、呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための医薬の製造における使用であって、前記医薬が１日に１回以下しか投与されない使用。
【請求項９】
インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含む治療に使用するための組成物であって、前記アンチセンス化合物が１日に１回以下しか投与されない組成物。
【請求項１０】
前記アンチセンス化合物が、前記個々の動物の体重１ｋｇ当たり０．００５から２００μｇのレベルで当該動物に投与される、請求項１、４及び７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アンチセンス化合物が、前記個々の動物の体重１ｋｇ当たり０．５から５０μｇのレベルで当該動物に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アンチセンス化合物が、前記個々の動物の体重１ｋｇ当たり５μｇ以下の用量で投与される、請求項１、４、７、１０及び１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンチセンス化合物が、前記個々の動物の体重１ｋｇ当たり１μｇ以下の用量で投与される、請求項１、４、７、１０及び１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンチセンス化合物が、前記個々の動物の体重１ｋｇ当たり０．００５から２００μｇのレベルで当該動物に投与される、請求項２、５及び８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記アンチセンス化合物が、前記個々の動物の体重１ｋｇ当たり０．５から５０μｇのレベルで当該動物に投与される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記アンチセンス化合物が、前記個々の動物の体重１ｋｇ当たり５μｇ以下の用量で投与される、請求項２、５、８、１４及び１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記アンチセンス化合物が、前記個々の動物の体重１ｋｇ当たり１μｇ以下の用量で投与される、請求項２、５、８、１４及び１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記アンチセンス化合物が、前記個々の動物の体重１ｋｇ当たり０．００５から２００μｇのレベルで当該動物に投与される、請求項３、６及び９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記アンチセンス化合物が、前記個々の動物の体重１ｋｇ当たり０．５から５０μｇのレベルで当該動物に投与される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記アンチセンス化合物が、前記個々の動物の体重１ｋｇ当たり５μｇ以下の用量で投与される、請求項３、６、９、１８及び１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記アンチセンス化合物が、前記個々の動物の体重１ｋｇ当たり１μｇ以下の用量で投与される、請求項３、６、９、１８及び１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記化合物が、吸入又は吹送を介して局所投与される、請求項１、４、７及び１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物が、吸入又は吹送を介して局所投与される、請求項２、５、８及び１４〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
前記化合物が、吸入又は吹送を介して局所投与される、請求項３、６、９及び１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、肺内、鼻内又は気管内に投与される、請求項１、４、７、１０〜１３及び２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物が、肺内、鼻内又は気管内に投与される、請求項２、５、８、１４〜１７及び２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
前記化合物が、肺内、鼻内又は気管内に投与される、請求項３、６、９、１８〜２１及び２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、定量吸入器（ＭＤＩ）、噴霧器、又は粉末吸入器（ＤＰＩ）を介して投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が、定量吸入器（ＭＤＩ）、噴霧器、又は粉末吸入器（ＤＰＩ）を介して投与される、請求項２６に記載の使用。
【請求項３０】
前記組成物が、定量吸入器（ＭＤＩ）、噴霧器、又は粉末吸入器（ＤＰＩ）を介して投与される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記疾患又は病態が、喘息、嚢胞性線維症、アルファ１−アンチトリプシン欠損症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎及び鼻炎から選択される、請求項１、４、７、１０〜１３、２２、２５及び２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患又は病態が、喘息、嚢胞性線維症、アルファ１−アンチトリプシン欠損症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎及び鼻炎から選択される、請求項２、５、８、１４〜１７、２３、２６及び２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
前記疾患又は病態が、喘息、嚢胞性線維症、アルファ１−アンチトリプシン欠損症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎及び鼻炎から選択される、請求項３、６、９、１８〜２１、２４、２７及び３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記疾患又は病態が喘息である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患又は病態が喘息である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３６】
前記疾患又は病態が喘息である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含む組成物、及び、動物の体重１ｋｇ当たり０．００１から１０００μｇの前記アンチセンス化合物という用量レベルで前記組成物を吸入又は吹送によって投与することのできる装置を含むキット。
【請求項３８】
インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含む組成物、及び、治療される動物の体重１ｋｇ当たり０．００１から１０００μｇの前記アンチセンス化合物という用量範囲で前記組成物を投与する指示書及び任意に前記組成物が吸入又は吹送により及び／又は１日に１回以下投与される指示書を含むキット。
【請求項３９】
前記アンチセンス化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１、４、７、１０〜１３、２２、２５、２８、３１及び３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記アンチセンス化合物が、配列番号８１、１１７、１２０、１２１、１２２、１２８、１３０、１３１、１３２、１３６、１３７、１３８、１４１、１４９、１５０、１５９、１６０、１６１、１６７及び１６８から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記アンチセンス化合物が、配列番号８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アンチセンス化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項２、５、８、１４〜１７、２３、２６、２９、３２及び３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４３】
前記アンチセンス化合物が、配列番号８１、１１７、１２０、１２１、１２２、１２８、１３０、１３１、１３２、１３６、１３７、１３８、１４１、１４９、１５０、１５９、１６０、１６１、１６７及び１６８から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
前記アンチセンス化合物が、配列番号８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記アンチセンス化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項３、６、９、１８〜２１、２４、２７、３０、３３及び３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記アンチセンス化合物が、配列番号８１、１１７、１２０、１２１、１２２、１２８、１３０、１３１、１３２、１３６、１３７、１３８、１４１、１４９、１５０、１５９、１６０、１６１、１６７及び１６８から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記アンチセンス化合物が、配列番号８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記アンチセンス化合物が、インテグリンα４の発現を少なくとも５０％阻害する、請求項１、４、７、１０〜１３、２２、２５、２８、３１、３４及び３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記アンチセンス化合物が、インテグリンα４の発現を少なくとも５０％阻害する、請求項２、５、８、１４〜１７、２３、２６、２９、３２、３５及び４２〜４４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５０】
前記アンチセンス化合物が、インテグリンα４の発現を少なくとも５０％阻害する、請求項３、６、９、１８〜２１、２４、２７、３０、３３、３６及び４５〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、呼吸状態を治療するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、特にアンチセンスの、ヒトインテグリンα４をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド化合物に関する。
【０００２】
（背景技術）
炎症は、損傷、感染、又は感染性又は損傷性要因の破壊及び損傷組織の隔離をもたらす組織破壊に対して組織によって誘導される局所的な保護反応である。典型的な炎症反応は次のように進行する：外来物としての抗原の認識又は組織損傷の認識、可溶性炎症メディエータの合成及び放出、炎症細胞の感染又は組織損傷部位へのリクルート、侵襲器官又は損傷組織の破壊及び除去、及び侵襲器官又は損傷組織が消散したシステムの再活性化。炎症性の要素を持つ多くのヒト疾患においては、炎症反応を弱める正常な恒常性維持機構が欠損し、正常組織が損傷及び破壊される。
【０００３】
細胞−細胞相互作用は、上記の各段階において免疫反応の活性化に関与する。正常な炎症反応において初期に検出される事象の一つは、白血球の血管内皮への接着、それに次ぐ、白血球の血管から感染又は損傷部位への遊走である。これらの白血球の血管内皮への接着は、血管からの遊走における強制的な過程である(Harlan, J. M., Blood 1985, 65, 513-525)。この反応は、白血球の細胞表面に発現される接着分子及び血管内皮細胞の相互作用によって媒介される。
【０００４】
非常に遅く活性化する抗原−４（VLA-4, α4βl 又はCD49d/CD29)は、リンパ球、単球、マクロファージ、肥満細胞、好塩基球及び好酸球の表面で発現されるインテグリンである。それはヘテロダイマー接着レセプターであり、非共有結合で連結されたα4及びβl サブユニットからなり、サイトカイン-刺激内皮細胞上に発現される血管細胞接着分子−１(VCAM-I)への接着を媒介するために供される。このVCAM-IとVLA-4との相互作用は、多発性硬化症（MS)、関節リウマチ、喘息、乾癬及びアレルギーを含む急性及び慢性の炎症状態における白血球管外遊出に寄与する。
【０００５】
また、α4 インテグリンサブユニットは、β7インテグリン鎖とも異種二量化して、インテグリンα4β7を形成し、その主要なリガンドが粘膜血管接着分子MadCAM-1であることから、それれは粘膜ホーミングレセプターとして知られている。インテグリンα4β7は、腸管向性を持つ記憶Ｔ細胞のサブユニットを同定する一方、インテグリンα4βl (VLA-4)は、殆どの単核白血球上で構成的に発現されるが循環している好中球上では発現されない。 VCAM-IとVLA-4との相互作用は、例えば、喘息及び気管支炎を包含する多くの呼吸器病態を含む炎症性疾患の潜在的な治療標的であることを示唆している(Kassner, P. D., et al, Adv. Exp. Med. Biol. 1992, 323, 163-170)。
【０００６】
喘息は、好酸球の肺への浸潤を伴う炎症性疾患である。VLA-4は好酸球上に発現される。Metzger, W. J. (Springer Semin. Immunopathol. 1995, 16, 467-478)は、抗-VLA-４抗体及びCS-Iペプチドの両方が好酸球の肺への浸潤を減少させ、喘息の進行を遅らせることを示すために、喘息のウサギモデルを使用した。
ステロイド及び多の抗炎症薬は炎症性疾患及び病態の治療に有効であるが、長期間使用すると、食細胞の白血球遊走及び機能の欠陥によって生ずる感染の危険性を高める等の副作用を導くことがある。ウサギにおけるβl (CD 18とも呼ばれる)モノクローナル抗体によって示されているように(Foster, C. A., 1996, J. Allergy Clin. Immunol., 98, 270-277)、β1インテグリン鎖の機能阻害が、感染の受け易さの増加を伴うという幾分の懸念がある。α4鎖の選択的阻害が、より望ましい方法であろうと思われる。α4鎖の阻害は、VLA-4ヘテロダイマー並びにα4β7ヘテロダイマーのレベルを低下させるであろうと考えられる。
【０００７】
VLA-4を標的とする潜在的な治療介入物は、モノクローナル抗体及びペプチドアンタゴニストを含む。VLA-4に特異的な抗体は、マウスを含む幾つかの喘息実験モデルにおいてアレルゲン-誘発性の気道炎症及び過敏反応を軽減するのに有効であった。Leger, O. J. P. et al. (Human Antibodies, 1997, 8, 3-16) は、多発性硬化症に関するＩＩＩ相臨床実験におけるVLA-4に対するモノクローナル抗体を記載している。CS-Iペプチドアンタゴニストは、Jackson, D. Y., et al. (J. Med. Ghem. 1997, 40, 3359-3369)によって記載された。Hayashi et al. (Cell Struct. Funct. 1991, 16, 241-249)は、インテグリンβ1発現を低下させるためにチキンインテグリンβ1に相補的なRNAを発現するベクターを使用し、細胞接着及び形状の変化を得た。
【０００８】
種々のインテグリンを標的とする安置センスオリゴヌクレオチド（「ASOs」）が、複雑な設定におけるインテグリンの機能的な相互作用を分析する道具として使用されてきた。Lallier 及び Bronner-Fraser (Science, 1993, 259, 692-695) は、チキンβ１、ヒトα4、ラットα1及びヒトβ5インテグリンの保存及び非保存領域を標的とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、これらのインテグリンの細胞接着に対する効果を決定するために使用した。同じオリゴヌクレオチドは、鳥類の胚における神経堤細胞移動経路にも注入され、インビトロで細胞接着を阻害したオリゴヌクレオチドは、インビボにおいて神経堤及び／又は神経管の異常も生ずることが示された(KiI et al., Devel. Biol. 1996, 179,91-101)。
【０００９】
欧州特許出願688 784(Caroms et al.) は、VLA-4のβ1サブユニットを標的とする一つの配列を含む、3' 誘導されたオリゴヌクレオチド類似物を開示している。
米国特許5,968,826 及び 6,258,790 (Bennett et al.)は、インテグリンα4をコードする核酸を標的とする安置センスオリゴヌクレオチドの使用を通して、インテグリンα4発現 を調節することを記載している。米国特許5,968,826は、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドが、喘息を含む、VLA-4発現に関連する多くの炎症性疾患の治療に使用できることを開示している。この文献によると、一般的に、体重１ｋｇ当たり0.01μgから100 g のアンチセンスオリゴヌクレオチドという用量は、１日、１週間、１月、１年、又は２〜２０年に一度又はそれ以上与えられてもよいが、炎症性疾患の治療に使用できる。様々な炎症性疾患に対する例示的な用量範囲は、体重１ｋｇ当たりに0.01 mg から20 mgのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。実施例３０は、喘息のマウスモデルにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの予言的使用を記載しており、そこでは、1 mg/kg から 5 mg/kgの用量のインテグリンα4に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドがマウスに静脈内注入される。
【００１０】
（発明の概要）
ここに我々は、呼吸疾患及び気道過敏症(airway hyperresponsiveness)、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態が、極めて低用量のインテグリンα4をコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物を用いることによって有効に治療又は予防できることを見いだした。
【００１１】
即ち、本発明は、呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための方法であって、前記動物の体重１ｋｇ当たり０．００１から１０００μｇの、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含有する組成物を当該動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
さらに本発明は、呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための方法であって、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含有する組成物を、前記動物の体重１ｋｇ当たり０．００１から１０００μｇの前記アンチセンス化合物という用量レベルで当該動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
さらに本発明は、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物の、呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための医薬の製造における使用であって、前記医薬が、前記動物の体重１ｋｇ当たり０．００１から１０００μｇのアンチセンス化合物という用量レベルで投与される使用を提供する。
【００１４】
さらに本発明は、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含有する、治療で使用するための組成物であって、前記アンチセンス化合物が、治療される動物の体重１ｋｇ当たり０．００１から１０００μｇのアンチセンス化合物という用量レベルで投与される組成物を提供する。
【００１５】
そのような低用量で使用することにより、望ましくない副作用の可能性を有意に低減させること、及び単位用量当たりの製造コストの点から相当なコスト削減をもたらすことを含む、かなりの利益が得られる。さらに、投与に使用しうる装置に、より大きな柔軟性を与えることになる。
【００１６】
好適には、アンチセンス化合物は、個々の動物の体重1kg当たりに、少なくとも0.005、好ましくは少なくとも0.01、より好ましくは少なくとも0.05、より好ましくは少なくとも0.1、より好ましくは少なくとも0.5、更により好ましくは少なくとも1、更により好ましくは少なくとも2 μg のレベルである。アンチセンス化合物は、より高い用量、例えば、個々の動物の体重1kg当たり少なくとも5 μg で投与してもよい。
【００１７】
好適には、アンチセンス化合物は、個々の動物の体重1kg当たりに、1000未満、好ましくは500未満、より好ましくは200未満、より好ましくは150未満、より好ましくは100未満、より好ましくは75未満、より好ましくは50未満、より好ましくは20未満、更により好ましくは10 μg未満のレベルで投与される。アンチセンス化合物は、より低いレベル、例えば、個々の動物の体重1kg当たりに、7未満、5未満、2未満又は1 μg未満のレベルで投与してもよい。
【００１８】
好適には、アンチセンス化合物は、個々の動物の体重1kg当たりに、1000以下、好ましくは500以下、より好ましくは200以下、より好ましくは150以下、より好ましくは100以下、より好ましくは75以下、より好ましくは50以下、より好ましくは20以下、更により好ましくは10 μg以下のレベルで投与される。アンチセンス化合物は、より低いレベル、例えば、個々の動物の体重1kg当たりに、7以下、5以下、2以下又は1 μg以下のレベルで投与してもよい。
【００１９】
さらに、我々は、インテグリンα４をコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物が、局所的に送達された場合に特に有効であることを見いだした。血液から器官への白血球の接着及び移動を調節するためのアンチセンスの薬物動態学及び／又はインテグリンα4の作用の優勢なメカニズムに鑑みると、局所投与が特に有効であるという発見は、驚くべきことである。
【００２０】
よって、本発明は、呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための方法であって、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含有する組成物を当該動物に局所投与することを含む方法を更に提供する。
【００２１】
さらに本発明は、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物の、呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための医薬の製造における使用であって、前記医薬が局所投与される使用を提供する。
【００２２】
さらに本発明は、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含む治療に使用するための組成物であって、前記アンチセンス化合物が局所投与される組成物を提供する。
【００２３】
呼吸器系又は気道への局所投与の任意の方法が使用でき、経口又は経鼻を含む。局所投与は、鼻、喉、咽喉、気管、気管支及び肺を含む呼吸器系の任意の部分、又は口及び鼻腔を含む気道であってよい。吸入又は吹送が特に好ましい。好ましい経路は、肺、鼻内及び気管内投与である。
【００２４】
よって本発明は、インテグリンα4をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含み、吸入又は吹送に適した製剤とされた組成物も提供する。
【００２５】
さらに本発明は、インテグリンα4をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含み、鼻内、肺内又は気管内投与に適した製剤とされた組成物を提供する。
【００２６】
好ましくは、アンチセンス化合物を含む組成物は、粉末状又はエアロゾル化され、個人によって吸入される。好ましくは、組成物は、定量吸入器（ＭＤＩ）、噴霧器、又は乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、鼻吸入器を介して、又は点鼻剤として投与される。このことは、使用の簡潔さ及び単純さの点で極めて有利である。装置の選択により、呼吸器系の別の部分への送達も可能になる。点鼻又は鼻吸入は、鼻炎などの鼻の病態の治療のために上部呼吸管への送達に使用されることが多いのに対し、MDI及びDPIは、喘息などの病態の治療のために下部呼吸管への送達に使用されることが多い。
【００２７】
局所的に投与したときに低容量のオリゴヌクレオチドが作用する可能性は、主に局所的な部分的レベルでは１又はそれ以上のメカニズムの影響があることを示唆している。メカニズムと結びつけることは望まないが、インテグリンα４の作用の優勢なメカニズムは、血液から器官への白血球の接着及び移動を調節することであると提唱される。インテグリンα４に対するアンチセンス薬の白血球への送達のための血管内、腹膜内、又は皮下経路は、主にα４陽性白血球の血管内皮に接着することにより、インテグリンα４陽性白血球の血管から呼吸器系、喘息の部位である肺への遊走が阻害されることにより妨害される。肺の経路を使用することにより、かなりの利点が得られ、肺で発現されるインテグリンα４に対する特異性の向上、又は脳、膝、及び皮膚などの肺以外の他の器官の正常な監視に関与する白血球におけるα４の調節に関連する望まない全身性副作用の可能性を有意に低減させることを含む。明らかに、局所効果を達成する可能性は、極めて有益であり、望まない副作用を生ずる可能性のある全身反応である。
【００２８】
従来技術に記載された以前のインテグリンα４阻害剤は、典型的に1日に1回以上の投与を必要とする用量処方に依拠していた。さらに、典型的には、本発明よりかなり高い用量単位によっていた。例えば、Koo G.C. et al..(Am. J Respiratory Crit Care Med, Vol. 167, pp 1400-1409, 2003)は、1日に2回の局所組成物を用い、1及び3 mg/kgの用量のときにオキュパンシー(occupancy)が良好であったと報告している。
【００２９】
我々は、本発明が、1日に1回及び更に2日に1回の用量のときに、呼吸疾患又は病態の有効な治療をもたらすことを見いだした。研究により、1日に2回又はそれ以上（おそらく5回まで）吸入される薬剤、例えばコルチコステロイドの場合に、非常に低い適合率(compliance rate)（およそ30-70%)であることを示していることから、前記のことは重要である。
【００３０】
よって本発明は、呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための方法であって、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含有する組成物を、当該動物に１日に１回以下しか投与されないことを含む方法を更に提供する。
【００３１】
さらに本発明は、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物の、呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を有する動物を治療及び／又は予防するための医薬の製造における使用であって、前記医薬が１日に１回以下しか投与されない使用を提供する。
【００３２】
さらに本発明は、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含む治療に使用するための組成物であって、前記アンチセンス化合物が１日に１回以下しか投与されない組成物を提供する。
【００３３】
さらに本発明は、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含む組成物、及び、動物の体重１ｋｇ当たり０．００１から１０００μｇの前記アンチセンス化合物という用量レベルで前記組成物を吸入又は吹送によって投与することのできる装置を含むキットを提供する。
【００３４】
さらに本発明は、インテグリンα４をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物を含む組成物、及び、治療される動物の体重１ｋｇ当たり０．００１から１０００μｇの前記アンチセンス化合物という用量範囲で前記組成物を投与する指示書及び任意に前記組成物が吸入又は吹送により及び／又は１日に１回以下投与される指示書を含むキットを提供する。
【００３５】
また本発明は、インテグリンα４をコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドも提供する。即ち、本発明は、インテグリンα４をコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを更に提供し、当該アンチセンス化合物は、配列番号１０３から１７８の少なくとも８核塩基部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０３から１７８のいずれか１つからの、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１３、更により好ましくは少なくとも１５核塩基部分を含む。
【００３６】
理論によって限定されることなく、VLA-4 (α4βl)は、疾患喘息及び他の呼吸器系病態の根底にある幾つかの病態生理学的プロセスに関係しており、α4β7 も、それらの病態における役割を有していると考えられる。インテグリンα４お作用の優勢なメカニズムは、白血球（white blood cells）、即ち白血球（leukocytes）の血液から肺などの器官への接着及び移動を調節することである。VLA-4は、サイトカイン刺激された内皮細胞上のVCAMに結合し、それは白血球、特に好酸球の肺及び鼻腔への移動において重要である。肺又は鼻腔においては、インテグリンα４の役割は明らかになっていない。VLA-4活性化及び/又はα4β7は、局所炎症プロセス、気管支収縮、及び粘液生成、多くの潜在的なメカニズムによる増悪症状に寄与しうる（図１０参照）。肥満細胞(α4βl/α4βl)及び好塩基球(α4βl)は、気管支収縮及び好中球活性化及び好酸球活性化に関係する薬剤を放出し(α4βl/ α4βl7)、それは気道の炎症を導く。マクロファージ(α4βl)、B細胞(α4βl)、及びTh2陽性白血球(α4βl/ α4β7)並びに好酸球を含むT細胞も、気道上皮細胞(α4βl)と同様に気道炎症に関係する。白血球は、肺内でVLA-4を介して局所平滑筋細胞に結合するとも考えられ、それは気管支痙攣に寄与しうる。最後に、VLA-4は血管新生に関与し、血管形成は、肺及び鼻腔の疾患の幾つかにおいて起こる肺改造において重要である。
【００３７】
本発明の方法及び組成物は、呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を治療するために使用してよい。それらの疾患又は病態は、当業者には明らかであろう。粘液の過剰生産に関係することが既に知られた呼吸病態又は疾患であって、本発明の方法及び組成物で治療できるものの例は、例えば、喘息、嚢胞性線維症、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、慢性閉塞性肺疾患及び慢性気管支炎等の慢性呼吸器病態を含む。本明細書において呼吸器とは、鼻、喉、咽頭、気管、気管支及び肺又は口及び鼻孔を含むそれらの気道を空気で満たす経路を含むと解され、本発明の組成物は前記の任意のものに関係する疾患及び病態を治療することができる。例えば、組成物は、上部呼吸器管における疾患の兆候自体が効果である鼻炎などの病態の治療、副鼻腔炎の治療、及び白血球、好中球、好酸球に関連した、又は気道過敏症（AHR)）に依存する疾患又は病態の治療に潜在的に有用である。
【００３８】
本明細書に記載された組成物、化合物、成分、要素などに関しては、特定の組成物、化合物、成分、要素などに関して記載した範囲の下限は、同じ組成物、化合物、成分、ヨウ素などに関して記載した範囲の上限と組み合わせて、当該特定の組成物、化合物、成分、要素などの好適な範囲を特定してもよいと解される。
【００３９】
本明細書を通して、「含む」という単語、又はその変形、例えば、「含む」又は「含んでいる」などは、記載した要素、整数又は工程の内包、あるいは要素、整数又は工程の群を含むが、任意の他の要素、整数又は工程、あるいは要素、整数又は工程の群を排除しないと解される。
【００４０】
本出願に含まれる文献、行為、材料、装置、記事などの議論は、単に本発明の内容を提示するためだけの目的である。これらの事項の全部又は一部が、本出願の各請求項の優先日前に存在したとして、従来技術の基盤を形成し、本発明に関する分野の共通一般知識であったということを受け入れるものではない。
【００４１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、インテグリンα４をコードする核酸分子の機能を調節する、究極的には生産されるインテグリンα４の量を調節するための用途のために、オリゴマーのアンチセンス化合物、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを採用する。これは、インテグリンα４をコードする１間それ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。本明細書において使用する用語「標的核酸」及び「インテグリンα４をコードする核酸」は、インテグリンα４をコードするDNA、そのようなDNAから転写されるRNA（プレ−mRNA及びmRNAを含む）、さらにまた、そのようなRNAから誘導されるcDNAも含む。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的ハイブリダイズは、核酸の正常な機能を阻害する。この標的核酸の機能を、それに特異的にハイブリダイズする化合物によって調節することを、一般に「アンチセンス」と呼んでいる。阻害されるDNAの機能は、複製及び転写を含む。阻害されるRNAの機能は、すべての生命維持機能、例えば、RNAのタンパク質翻訳部位への移動、RNAからのタンパク質の翻訳、１又はそれ以上のmRNA種を生じるRNAのスプライシング、及びRNAに関連する又はそれによって促進される酵素活性を含む。そのような標的核酸機能の阻害全体の効果は、インテグリンα４の発現の調節である。本発明の内容において、「調節」とは、遺伝子の発現における増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の内容において、阻害は、遺伝子発現の調節の好ましい形態であり、mRNAは好ましい標的である。
【００４２】
特異的な核酸をアンチセンスで標的とするのが好ましい。アンチセンス化合物が特定の核酸を「標的とする」のは、本発明の内容においては、多段階プロセスである。プロセスは通常、機能を調節される核酸配列を同定することから始まる。これは、例えば、その発現が特定の疾患又は疾病状態と関連する細胞性遺伝子（又は遺伝子から転写されたmRNA）、あるいは病原菌からの核酸分子である。本発明において、標的はインテグリンα４をコードする核酸分子である。また、標的とするプロセスは、望まれる効果、例えば、タンパク質発現の検出又は調節をもたらすようなアンチセンス相互作用が起こる部位の特定を含む。本発明の内容においては、好ましい遺伝子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF)）の翻訳開始又は停止コドンを含む領域である。当該分野で知られているように、翻訳開始コドンは典型的には5'-AUG (転写されたmRNAにおいて；対応するDNA分子では5'-ATG)であるので、翻訳開始コドンは 「AUGコドン」「開始コドン」又は「AUG開始コドン」とも呼ばれる。わずかな遺伝子は、 RNA配列5'-GUG, 5'-UUG 又は5'-CUGを持つ翻訳開始コドンを有し、5'-AUA, 5'-ACG 及び5'-CUG のインビボでの機能が示された。よって、用語「翻訳開始コドン」及び「開始コドン」は、各例での開始アミノ酸は典型的にはメチオニン（真核生物）又はホルミルメチオニン（原核生物）ではあるが、多くのコドン配列を包含する。当該分野でも知られているように、真核生物及び原核生物の遺伝子が、２間それ以上の代わりうる開始コドンを持ち、特定の細胞型又は組織で又は特定の条件の組み合わせにおける翻訳開始に、そのうちの１つが主に使用される。本発明の内容において、「開始コドン」及び「翻訳開始コドン」は、それらのコドンの配列にかかわらず、インテグリンα４をコードする遺伝子から転写されたmRNA分子の翻訳を開始させるのにインビボで用いられるコドンを意味する。
【００４３】
当該分野で知られているように、遺伝子の翻訳停止コドン（又は「ストップコドン」）は、３つの配列、即ち5'-UAA、5'-UAG 及び5'-UGA (対応するDNA配列は、各々5'-TAA、 5'-TAG 及び5'-TGAである)のうちの１つを有している。用語「開始コドン」及び「翻訳開始コドン」は、翻訳開始コドンから両方向（即ち、5'又は3'）のいずれかに約25から約50連続するヌクレオチドを含むmRNA又は遺伝子を意味する。同様に、用語「停止コドン」及び「翻訳停止コドン」は、翻訳停止コドンから両方向（即ち、5'又は3'）のいずれかに約25から約50連続するヌクレオチドを含むmRNA又は遺伝子を意味する。
【００４４】
オープンリーディングフレーム（ORF)）又は「コード領域」は、当該分野において翻訳開始コドンから翻訳停止コドンの間の領域を指すと知られているが、有効に標的とされうる領域でもある。他の標的領域は、当該分野で翻訳開始コドンから5'方向のmRNAの一部を指すと知られており、よってmRNA又は遺伝子の対応するヌクレオチドの5'キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドを含む5' 非翻訳領域(5'UTR)、及び、当該分野で翻訳停止コドンから3'方向のmRNAの一部を指すと知られており、よってmRNA又は遺伝子の対応するヌクレオチドの3'末端と翻訳停止コドンとの間のヌクレオチドを含む3' 非翻訳領域(3'UTR)を含む。mRNAの5' キャップは、mRNAの5'-最大残基と5-5'オリホスフェート結合を介して結合したN7-メチレン化グアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップは、5'キャップ構造自体と、キャップに隣接する最初の50ヌクレオチドを含むと考えられている。5'キャップ領域は、好ましい標的領域も含む。
【００４５】
幾つかの真核生物mRNA転写物は直接に転写されるが、多くは「イントロン」として知られる１又はそれ以上の領域を含み、それは翻訳される前に転写物から切除される。残された（従って翻訳される）領域は「エクソン」として知られ、スプライスされて連続するmRNAを形成する。mRNAスプライス部位、即ちイントロン-エクソン連結部も好ましい標的領域であり、異常なスプライシングが疾患に関連する状況又は特定のmRNAスプライス産物の過剰生産が疾患に関連する状況において特に有用である。再配列又は欠失による異常な融合連結も好ましい標的である。また、例えばDNA又はプレ-mRNAを標的とするアンチセンス化合物にとって、イントロンも有効で、従って好ましい標的領域になりうることも見いだされた。
【００４６】
１又はそれ以上の標的部位が同定されると、標的に十分に相補的な、即ち十分良好に十分なスプライス性でハイブリダイズして望まれる効果を与えるオリゴヌクレオチドが選択される。
【００４７】
本発明の内容において、「ハイブリダイゼーション」は、相補的なヌクレオチド又はヌクレオチド塩基間の水素結合を意味し、それは、ワトソン−クリック、フーグスティン又は逆フーグスティン水素結合であってもよい。例えば、アデニン及びチミンは相補的核塩基であり、水素結合の形成を介して対となる。本明細書で使用する「相補的」は、2つのヌクレオチド間に正確な対を形成する能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドの或る位置におけるヌクレオチドがDNA又はRNA分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合できる場合、そのオリゴヌクレオチドとDNA又はRNAは当該位置で互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドとDNA又はRNA は、各々の分子の十分な数の対応する部分が互いに水素結合できるヌクレオチドで占められている場合に、互いに相補的である。よって、「特異的に水素結合可能な」及び「相補的な」とは、オリゴヌクレオチドとDNA又はRNA標的との間に安定で特異的な結合が起こるような、十分な程度の相補性又は正確な対を示す。当該分野では、アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズする標的核酸と100%相補的である必要はないと理解されている。アンチセンス化合物は、化合物の標的DNA又はRNAへの結合が標的DNA又はRNAの正常な機能を阻害して利用性を低下させ、特異的結合が望まれる条件下、即ちインビボアッセイ又は治療的処理の場合の生理的条件、あるいはインビトロアッセイの場合、アッセイが実施される条件下で、非標的配列へのアンチセンス化合物の非特異的な結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００４８】
アンチセンス化合物は、研究試薬及び診断薬として共通に使用される。例えば、精密な特異性をもって遺伝子発現を阻害することのできるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者によって、特定の遺伝子の機能を解明するために多く用いられる。アンチセンス化合物は、例えば、生物学的経路の様々なメンバーの機能を区別するのにも使用される。従ってアンチセンス調節は研究用途のために使用されている。
【００４９】
アンチセンスの特異性及び感受性は、当業者によって、治療用途にも用いられている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物及びヒトの疾患病態の治療において治療部分として採用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに安全かつ有効に投与され、多くの臨床的試験が現在も進行している。よって、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織及び動物、特にヒトの治療のための治療方法に有用に構成されうる有用な治療的手段でありうることが確認されている。
【００５０】
本発明の内容では、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（RNA ）又はデオキシリボ核酸（DNA)又はそれらの類似物のオリゴマー又はポリマーを意味する。この用語は、天然由来の核塩基(nucleobases)及び共有ヌクレオシド間（骨格）結合並びに同様に機能する非天然由来部分を有するオリゴヌクレオチドからなる。そのような修飾された又は置換されたオリゴヌクレオチドは、望まれる特性、例えば、向上した細胞取り込み、核酸標的への向上した親和性及びヌクレアーゼ存在下での向上した安定性により、天然形態より好ましいことも多い。従って、本明細書で特定される配列及び/又は配列番号は、特定される配列及び/又は配列番号に対応する天然由来の核塩基、糖及び共有結合ヌクレオシド間(骨格）、並びに特定される配列及び/又は配列番号に基づく非天然由来部分を有し同様に機能するオリゴヌクレオチドからなる。好ましい非天然由来部分は、本明細書に記載され、当業者には明らかになり、核塩基、糖及び/又は共有バックボーン結合が何らかの方法で修飾又は置換された修飾又は置換したオリゴヌクレオチドを含む。
【００５１】
本発明によるアンチセンス化合物は、好ましくは少なくとも5、より好ましくは8、より好ましくは10、更により好ましくは13の核塩基、更により好ましくは15核塩基、更により好ましくは18核塩基を含む。アンチセンス化合物は、このましくは約50まで、より好ましくは約40、より好ましくは、約30までの核塩基、更により好ましくは約25までの核塩基を含む。好ましくは、本発明のアンチセンス化合物は、約8から約30核塩基、より好ましくは約10から約30核塩基、更により好ましくは約15から約25核塩基を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含し、限定されないが、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド類似物を含む。特に好ましいのは、約8から約30核塩基、より好ましくは約15から約25核塩基（即ち、約8〜約30、より好ましくは約15から約25の結合したヌクレオシド）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。当該分野で知られているように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常ヘテロ環塩基である。そのようなヘテロ環塩基の2つの最も通常のクラスは、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むようなヌクレオシドでは、リン酸基は糖の2'、3'又は5'の水酸基部分のいずれかに結合しうる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は互いに隣接するヌクレオシドに共有結合して線形のポリマー化合物を形成する。一方、この線形ポリマー構造の対応する末端は、さらに結合して環状構造を形成するが、線形構造が一般に好ましい。オリゴヌクレオチド構造の中で、リン酸基は通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するとされている。RNA及びDNAの正常な結合又はバックボーンは、3'から5'へのリン酸ジエステル結合である。
【００５２】
アンチセンス化合物の好ましい形態は一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであるが、多くの種で二本鎖構造、例えば二本鎖RNA (dsRNA)分子の導入が、遺伝子又はその関連する遺伝子産物の機能の強力かつ特異的なアンチセンス調節低下を誘発することが示された。この現象は、動物でも植物でも起こり、ウイルス防御及びトランスポゾンサイレンシングと進化的に関係すると考えられる。
【００５３】
dsRNAが動物において遺伝子サイレンシングを導くことの最初の証拠は、1995年に線虫類、シノラブディス・エレガンスの研究によってもたらされた(Guo and Kempheus, Cell, 1995, 81, 611-620)。Montgomery 等は、dsRNAの主要な阻害効果が翻訳後であることを示した(Montgomery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507)。よって、二本鎖RNA (dsRNA)への曝露によりシノラブディス・エレガンスにおいて同定された翻訳後アンチセンスメカニズムは RNAインターフェレンス(RNAi)と呼ばれる。この用語は、アンチセンスに媒介される遺伝子サイレンシングを意味するように一般化され、内部標的化mRNAレベルの配列特異的低下を導くdsRNAの導入を含む(Fire et al, Nature, 1998, 391, 806-811)。近年、それは実際に、RNAiの強力なインデューサであるdsRNAのアンチセンス極性の一本鎖RNAオリゴマーであることが示された(Tijsterman et al., Science, 2002, 295, 694-697)。インテグリンα４発現、特にヒトインテグリンα４発現の一本鎖及び二本鎖RNA(RNAi)阻害も、本発明の範囲内である。
【００５４】
本発明で有用な好ましいアンチセンス化合物の例は、修飾バックボーン又は非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で定義されるように、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドは、バックボーンにリン原子を保持するもの、及びバックボーンにリン原子を持たないものを含む。本明細書の目的のために、そして当該分野における参考として、ヌクレオシド間骨格にリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオチドであると考えられる。
【００５５】
好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えば、オスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば3'-アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、例えば3'-アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び正常3'-5'結合を持つボラノホスフェート、2'-5'-結合したその類似物、及びヌクレオシド単にの隣接部分が3'-5'から5'-3'又は2'-5'から5'-2'に結合した反転極性を持つものを含む。種々の塩、混合塩及び遊離形態も含まれる。
【００５６】
前記のリン-含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、これらに限られないが、米国特許番号3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233;' 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 及び5,625,050を含み、これら各々を参考として本明細書に取り入れるものとする。
【００５７】
リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格の好ましいものは、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１又はそれ以上の短鎖ヘテロ芳香族又はヘテロ脂肪族ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）モルホリノ結合を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合N、O、S及びCH2成分部分を有する他のものを含む。
【００５８】
前記のオリゴヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許は、これらに限られないが、米国特許番号5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 及び5,677,439を含み、これら各々を参考として本明細書に取り入れるものとする。
【００５９】
他の好ましいオリゴヌクレオチド類似物は、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合、即ち骨格が両方とも新規な基で置換されている。適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために基本となる単位は維持されている。そのようなオリゴマー化合物の一つ、優れたハイブリダイゼーション特性を持つことが示されたオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（PNA)）と呼ばれる。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖-骨格がアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換されている。核塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、これらに限られないが、米国特許番号5,539,082; 5,714,331; 及び5,719,262を含み、これら各々を参考として本明細書に取り入れるものとする。PNA化合物の更なる教示は Nielsen et al., (Science, 1991, 254, 1497-1500)に見いだすことができる。
【００６０】
本発明の最も好ましい実施態様は、ホスホチオエート骨格を持つオリゴヌクレオチド、及びヘテロ原子骨格を持つオリゴヌクレオチドであり、特に、-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2 -[メチレン（メチルイミノ）又はMMI骨格として知られる]、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)- N(CH3)-CH2- 及び-O-N(CH3)-CH2-CH2-  前記米国特許番号5,489,677の[天然のホスホジエステル骨格は-O-P-O-CH2-で表される]、及び前記米国特許番号5,602,240のアミド骨格である。また好ましいのは、前記米国特許番号5,034,506のモルホリノ骨格を有するオリゴヌクレオチドである。
【００６１】
修飾オリゴヌクレオチドは、１又はそれ以上の置換糖部分を含んでもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のものの1つを2'位に含む：OH; F; O-, S-, 又はN-アルキル; O-, S-, 又はN-アルケニル; O-, S- 又はN-アルキニル; 又はO-アルキル-O-アルキル,ここで、アルキル、アルケニル及び アルキニルは置換又は非置換のC1からC10アルキル又はC2からC10アルケニル及びアルキニルである。特に好ましいのは、O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 及びO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2であり、ここでn 及びmは１から約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のものの1つを2'位に含む：C1からC10 低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を向上させる基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させる基、及び類似する特性を持つ他の置換基である。好ましい修飾は、2'-メトキシえときし(2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-(2-メトキシエチル)又は2'-MOEとしても知られる) (Martin et al., HeIv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) 即ち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらなる好ましい修飾は、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、O(CH2)2ON(CH3)2基を含み、1998年1月30日に出願された米国特許出願番号09/016,520に記載されているように2'-DMAOEとしても知られ、当該特許出願は本願出願人に共有され、その内容を参考として本明細書に取り入れるものとする。
【００６２】
他の好ましい修飾は、2'-メトキシ(2'-O-CH3)、2'-アミノプロポキシ(2'-OCH2CH2CH2NH2)及び2'-フルオロ(2'-F)を含む。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の部分、特に3'末端ヌクレオチドの糖の3'末端、又は2'-5'結合オリゴヌクレオチド及び5'末端ヌクレオチドの5'末端で施してもよい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖に換えてシクロブチル部分などの糖模倣物を有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、これらに限られないが、米国特許番号4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,0531 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 及び5,700,920を含み、これら各々を参考として本明細書に取り入れるものとする。また、1995年6月5日に出願され本願出願人に共有される許可された特許出願番号08/468,037も、参考として本明細書に取り入れる。
【００６３】
またオリゴヌクレオチドは、核塩基（当該分野では単に「塩基」とよれることが多い）の修飾又は置換を含んでもよい。本明細書で使用する「非修飾」又は「天然」核塩基は、プリンベースのアデニン(A)及びグアニン(G)、及びピリミジンベースのチミン（T)）、シトシン（C)及びウラシル(U)を含む。修飾された核塩基は、他の合成及び天然核塩基、例えば、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピルウラシル及びシトシン、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオ、8-チオアルキル、8-ヒドロキシ及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン及び3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンを含む。更なる核塩基は、米国特許番号3,687,808に記載のもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, 858-859に記載のもの、Englisch et al., (Angewandte Chemie, IE, 1991, 30, 613)に記載のもの、及びSanghvi, Y. S., (Antisense Research and Applications, 15,289-302)及びCrooke, S. T. and Lebleu, B., ed., (CRC Press, 1993)に記載のものを含む。これらの核塩基の或るものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を向上させるのに特に有用である。これらは、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン及びN-2、N-6及びO6置換プリン、例えば2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル及び5-プロピニルシトシンを含む。5-メチルシトシン置換は、0.6-1.2℃で核酸複製安定性を向上させることが示されており(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications 1993, 276-278)、現在のところ好ましい塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせると特にそうである。
【００６４】
上記の修飾核塩基並びに他の修飾核塩基の或るものの調製を教示する代表的な米国特許は、これらに限られないが、上記の米国特許番号3,687,808並びに米国特許番号: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,6.81,941; 及び5,750,692を含み、これらを参考として本明細書に取り入れるものとする。
【００６５】
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させるオリゴヌクレオチドの１間それ以上の部分の化学結合又は複合を含む。そのような部分は、限定されないが、脂質部分、例えばコレステロール部分 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let, 1994, 4, 1053-1060)、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let.,1 1993, 3, 2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res. 1992, 20, 533-538)、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111- 1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 59, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54)、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール又はトリエチルアンモニウム、2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973)、又はアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）を含む。
【００６６】
そのようなオリゴヌクレオチド複合の調製を教示する代表的な米国特許は、これらに限られないが、米国特許番号: 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,0.13; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203; 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928; 及び5,688,941を含み、それらを参考として本明細書に取り入れるものとする。
【００６７】
与えられた化合物のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に、上記の修飾の１以上が単一の化合物又はオリゴヌクレオチドの単一のヌクレオチドに導入されてよい。また本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も包含する。本発明の内容における「キメラ」アンチセンス化合物又は「キメラ」は、２間それ以上の化学的に区別される領域を含む特別のオリゴヌクレオチドであり、各領域は少なくとも1つのモノマー単位、即ちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する耐性の向上、細胞取り込みの向上、及び/又は標的核酸への親和性の向上を付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾された少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドの更なる領域は、RNA:DNA又はRNA:RNAハイブリッドを切断することのできる酵素の基質として供される。例として、RNase H は、RNA:DNA複合体のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。従って、RNase Hの活性化はRNA標的の切断をもたらし、それにより、オリゴヌクレオチドの遺伝子発現の阻害の効率を大きく促進する。従って、キメラオリゴヌクレオチドを使用した場合により短いオリゴヌクレオチドで、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドに比較して匹敵する結果が得られることが多い。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動及び必要ならば当該分野で知られて関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって日常的に検出できる。
【００６８】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２又はそれ以上の、前記したオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び/又はオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成されうる。そのような化合物は、当該分野で、ハイブリッド又はギャップマー(gapmers)とも呼ばれる。そのようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許は、これらに限られないが、米国特許番号: 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 及び5,700,922を含み、それらを参考として本明細書に取り入れる。また、1995年6月6日に出願され、本願出願人に共有される許可された米国特許出願番号08/465,880も参考として本明細書に取り入れるものとする。
【００６９】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、良く知られた固相合成の技術を通して便利かつ日常的に作成される。そのような合成のための装置は、幾つかの供給元、例えば、Applied Biosystems (Foster City, Calif.)によって販売されている。そのような合成のために当該分野で知られた他の手段を更に又はそれに換えて採用してもよい。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製する類似の技術が知られている。
【００７０】
本発明のアンチセンス化合物は、インビトロで合成され、生物学的起源のアンチセンス成分又はアンチセンス分子のインビボ合成を指向して設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
【００７１】
また本発明は、新規なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを提供し、それらはインテグリンα４をコードする核酸を標的とする。特に、本発明はインテグリンα４をコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物を提供し、当該アンチセンス化合物は、配列番号103から178の少なくとも8ヌクレオチド部分を含む。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号103から178の少なくとも10、より好ましくは少なくとも13、更により好ましくは少なくとも15核塩基部分を含む。好ましい実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号103から178の一つを含む。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号103, 104, 107, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 177 及び178又はそれらの一部から選択される。好ましくは、アンチセンス化合物は、配列番号107, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 128, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 163, .164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 177 及び178又はその一部からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。より好ましくは、アンチセンス化合物は、配列番号111, 112, 113, 117, 119, 120, 121, 122, 130, 131, 132, 136, 138, 141, 144, 146, 147, 150, 151, 153, 154, 155, 156, 159, 160, 167, 169, 172 及び177又はその一部からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。更により好ましくは、アンチセンス化合物は、配列番号117, 120, 121, 122, 128, 130, 131, 132, 136, 138, 141, 150, 159, 160, 167 及び169又はその一部からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００７２】
記載した新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドに加えて、本発明の組成物及び方法で使用するための他の好適なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の例は、米国特許番号968,826及び6,258,790に見られ、それらの内容を参考として本明細書に取り入れるものとする。特に、前記米国特許の表1, 2, 3, 5, 7, 10, 15 及び 24に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明において特に有用である。米国特許6,258,790から特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ISIS 107248 (CTGAGTCTGTTTTCCATTCT : SEQ ID NO: 81)である。
【００７３】
好ましい実施態様では、アンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトのインテグリンα４をコードする核酸を標的にする。これは、ヒトのインテグリンα４をコードする核酸と交差反応するアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。交差反応する好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、配列番号117, 120, 121, 122, 128, 130, 131, 132, 136, 137, 138, 141, 149, 150, 159, 160, 161, 167, 168 及び81から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００７４】
好ましい実施態様では、アンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インテグリンα４、好ましくはヒトのインテグリンα４の発現を、少なくとも20、好ましくは少なくとも30、より好ましくは少なくとも40、更により好ましくは少なくとも50%阻害する。特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、ISIS 348592(GCAGCATATTTGTCACTTCC: SEQ ID NO: 136) 及び ISIS 107248 (CTGAGTCTGTTTTCCATTCT : SEQ ID NO: 81)である。
【００７５】
本発明の化合物は、他の分子、分子構造又は化合物の混合物と混合、カプセル化、複合又はその他関係づけられてもよく、例えば、取り込み、分布及び/又は吸収を助けるためのリポソーム及び分子を標的とするレセプターなどである。そのような取り込み、分布及び/又は吸収を助ける製剤の調製を教示する代表的な米国特許は、これらに限られないが、米国特許番号: 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; 及び 5,595,756を含み、それらを参考として本明細書に取り入れるものとする。
【００７６】
本発明のアンチセンス化合物は、任意の製薬上許容される塩、エステル、又はそのエステルの塩、又は、ヒトを含む動物に投与され、（直接的又は間接的に）生物学的に活性な代謝物又は残基を供給する任意の他の化合物を含む。従って、この開示は、本発明の化合物のプロドラッグ及び製薬上許容される塩、それらのプロドラッグの製薬上許容される塩、及び他の生物学的等価物にも及ぶ。
【００７７】
用語「プロドラッグ」は、不活性な形態で調製され、身体又は細胞内で内因性酵素又は他の化学種及び/又は条件によって活性な形態（即ち薬剤）に変換される治療薬を示す。特に、本は爪印及びオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、1993年12月9日に発行されたGosselin等のWO93/24510又はImbach等のWO94/26764に開示された方法に従って、SATE [(S-アセチル-2-チオエチル)ホスフェート]誘導体として調製される。
【００７８】
用語「製薬上許容される塩」は、本発明の化合物の生理学的及び製薬的に許容されうる塩、即ち、親化合物の所望の生物学的活性を維持するが望まれない毒性効果を与えない塩を意味する。
【００７９】
製薬上許容される塩基付加塩は、金属又はアミン、例えばアルカリ及びアルカリ土類金属、又は勇気アミンで形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。好ましいアミンの例は、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、及びプロカインである(例えば、Berge et al. J. of Pharma ScL, 1977, 66, 1-19を参照)。前記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸形態を十分な量の所望の塩基と接触させて従来の手法で塩を生成させることにより調製される。遊離酸形態は、塩形態を酸と接触させ、遊離酸を従来の手法で単離することにより再生できる。遊離酸形態は、対応する塩形態と若干-或る物理的特性、例えば極性溶媒での溶解性が異なるが、その他は、塩は本発明の目的に関して対応する遊離酸と等価である。本明細書で使用する「製薬的付加塩」は、本発明の組成物の一成分の酸形態の製薬上許容される塩を含む。これらは、アミンの有機又は無機酸の塩を含む。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩及びリン酸塩である。他の好ましい製薬上許容される塩は当業者には良く知られており、種々の無機及び有機酸の塩基塩、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸又はリン酸などの無機酸、有機カルボン酸、硫酸、スルホン酸又はホスホン酸、又はN-置換スルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルコロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェのキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、エンボニック酸(embonic acid）、ニコチン酸又はイソニコチン酸、及びアミノ酸、例えば、自然界でのタンパク質合成に関与する20アルファ-アミノ酸、例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸、及びまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-又は3-ホスホグリセラート、グルコース-6-ホスフェート、N-シクロヘキシルスルファミン酸（チクロの形成を伴う）、又は他の酸有機化合物、例えば、アスコルビン酸を含む。化合物の製薬上許容される塩も、製薬上許容されるカチオンから調製できる。好ましい製薬上許容されるカチオンは、当業者に知られており、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム及び第四級アンモニウムカチオンを含む。炭酸又は重炭酸も可能である。
【００８０】
オリゴヌクレオチドについて、製薬上許容される塩は、限定されないが、(a)カチオン、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えばスペルミン及びスペルミジンなどと形成される塩、(b)無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などと形成される酸付加塩、(c)有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸、などと形成される塩、及び(d)元素アニオン、例えば塩素、臭素、及びヨウ素と形成される塩を含む。
【００８１】
本発明のアンチセンス化合物は、治療薬、予防薬、緩和薬として利用できる。治療薬については、気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現を抑制することによって、好ましくはインテグリンアルファ４の発現を調節することによって治療できる疾患又は病態を有すると疑われる動物、好ましくはヒトが、本発明のアンチセンス化合物を投与することにより治療される。本は爪印及び化合物は、有効量のアンチセンス化合物を適切な製薬上許容される希釈剤又はキャリアに添加することにより製薬組成物で利用できる。本発明の化合物及び方法を使用することは、予防的、例えば、感染、炎症又は腫瘍形成を防止又は遅延させるのにも有用である。
【００８２】
本発明の方法及び組成物は、呼吸疾患又は気道過敏症、好酸球増加症、好中球増加症、白血球又は粘液の過剰生産及び／又はインテグリンα４の発現に関連する病態を治療するために使用されうる。そのような疾患又は病態は、当業者には明らかであり、例えば、炎症、免疫、粘液、及び血管由来、気道過敏症疾患又は病態を含む。本発明の方法及び組成物で治療される粘液の過剰生産に関連する呼吸疾患又は病態は、例えば、慢性呼吸器病態、例えば喘息、嚢胞性線維症、アルファ１−アンチトリプシン欠損症、慢性閉塞性肺疾患及び慢性気管支炎を含む。組成物は、上部呼吸管、例えば鼻孔及び鼻腔に関連する疾患又は病態の治療にも使用されうる。例えば、疾患の効果が上部呼吸管で現れる鼻炎、及び副鼻腔炎などの病態が治療される。さらに、組成物は、好酸球増加症に関連する又は気道過敏症（AHR)に依存する疾患又は病態の治療に使用できる。
【００８３】
好ましい一実施態様では、インテグリンα４を標的とするアンチセンス化合物は、気道過敏症に関連する呼吸器系又は気道の病態又は疾患の予防、緩和及び／又は治療に使用できる。例えば、アンチセンスは、喘息の予防、緩和及び／又は治療に使用できる。
他の実施態様では、インテグリンα４を標的とするアンチセンス化合物は、アレルギー性炎症に関連する呼吸器系の病態又は疾患の予防、緩和及び／又は治療に使用できる。
他の実施態様では、インテグリンα４を標的とするアンチセンス化合物は、細胞浸潤に関連する呼吸器系又は気道の病態又は疾患の予防、緩和及び／又は治療に使用できる。例えば、アンチセンス化合物は、好酸球浸潤、好中球及び／又は白血球浸潤の予防、緩和及び／又は治療に使用できる。
他の好ましい実施態様では、インテグリンα４を標的とするアンチセンス化合物は、粘液の過剰生産に関連する呼吸器系又は気道の病態又は疾患の予防、緩和及び／又は治療に使用できる。
【００８４】
また、本発明は、本発明のアンチセンス化合物を含む製薬組成物及び製剤も包含する。本発明の製薬組成物は、多くの方法で投与してよいが、局所投与するのが特に好ましい。投与は経口でも非経口でもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹膜内又は筋肉内注射又は吸入、又は頭蓋内、例えば、鞘内、脳室内の投与を含む。少なくとも１つの2'-O-メトキシエチル修飾を持つオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【００８５】
局所投与のための製薬組成物及び製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、リキッド及びパウダーを含む。従来の製薬キャリア、水性、粉末、又は油性基剤、増粘剤などが必要又は好ましい場合もある。
【００８６】
呼吸器系又は気道への局所投与のための投薬法は、一般的に傾向又は吸入をとる。好ましくは、本発明の組成物は、適切な投与装置を用いて吸入又は吹送される。組成物は、好ましくは粉末状又はエアロゾル形態である。適切な投与装置は当業者には明らかであり、例えば、定量吸入器(MDIs)、噴霧器、粉末吸入器(DPIs)、鼻吸入器、又は点鼻器を含む。従来の鼻スプレー装置を使用してもよい。装置の選択は、呼吸器系のいずれの部分が意図されるかによる。点鼻又は鼻吸入器は、鼻炎なのの鼻の病態を治療するために鼻などの上部呼吸管へお送達に多く使用され、MDI及びDPIは喘息などの病態のために下部呼吸管に送達するために多く使用される。
【００８７】
経口送達は、主に局所又は全身効果のためである。好ましくは、本発明の組成物は、局所効果のために経口で取り込まれる。経口投与のための組成物及び製剤は、粉末又は顆粒、懸濁物又は水あるいは非水媒体中の溶液、カプセル、小袋又は錠剤である。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合材が望ましい場合もある。
【００８８】
非経口、鞘内又は脳室内投与のための組成物及び製剤は、無菌水性溶液を含み、緩衝剤、希釈剤、及び他の適切な添加剤、例えば、、限定されないが、透過促進剤、キャリア化合物及び他の製薬上許容されるキャリア又は賦形剤を含んでもよい。
好ましくは、投与は、呼吸疾患又は病態の影響を受けている領域に局所的である。好ましくは、投与は、噴霧器を含む、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送による肺、気管支内、鼻内、表皮及び経皮である。
【００８９】
本発明のアンチセンス化合物を含む製薬組成物及び／又は製剤は、アンチセンス化合物の消化器送達を促進するために透過促進剤を含んでもよい。透過促進剤は、5つの広いカテゴリー、即ち、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、界面活性剤及び非界面活性剤の1つに属すると分類される(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33)。これらの広いカテゴリーの1又はそれ以上からの透過促進剤が含まれうる。透過促進剤は、1997年7月1日に出願され係属中の米国出願番号08/886,829, filed on JuI. 1, 1997及び1997年10月31日に出願され係属中の米国出願番号 08/961,469に記載されており、これらの出願は共に本願出願人に共有され、両方を参考として本明細書に取り入れるものとする。
【００９０】
透過促進剤として作用する種々の脂肪酸及びそれらの誘導体は、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレイン酸、ジカプレート、トリカプレート、レシノエート、モノオレイン(a.k.a. 1-モノオレオイル-rac-グリセロール)、ジラウリン、カプリン酸、アラキドン酸、グリセリル-1-モノカプレート、l-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ- 及びジ-グリセリド及びそれらの生理学的に許容される塩(即ち、オレエート、ラウレート、カプレート、イリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど)を含む(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654)。幾つかの本発明で好ましい脂肪酸の例は、ナトリウムカプレート及びナトリウムラウレートであり、0.5 から5%の濃度で単独又は組み合わせて使用される。
【００９１】
好ましい透過促進剤は、1997年7月1日に出願され係属中の米国出願番号08/886,829に記載されており、その出願は本願出願人によって共有され、参考として本明細書に取り入れるものとする。
胆汁の生理学的役割は、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収を促進することを含む(Brunton, Chapter 38 In: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, N.Y. 1996, pages 934-935)。種々の天然胆汁塩及びそれらの合成誘導体は、透過促進剤として作用する。従って、用語「胆汁塩」は。胆汁の任意の天然由来成分並びにそれらの合成誘導体を含む。好ましい胆汁塩は、1997年7月1日に出願され係属中の米国出願番号08/886,829に記載されており、その出願は本願出願人によって共有され、参考として本明細書に取り入れるものとする。本発明で好ましい胆汁塩は、ケノデオキシコール酸(CDCA)(Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.)であり、一般に0.5 から2%の濃度で使用される。
【００９２】
１又はそれ以上の透過促進剤を含有する複合製剤を使用してもよい。例えば、胆汁塩を脂肪酸と組み合わせて使用して複合製剤としてもよい。好ましい組み合わせは、ナトリウムカプレート又はナトリウムラウレート（一般に0.5から5%）と組み合わせたCDCAを含む。
キレート剤は、限定されないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)、クエン酸、サリチル酸塩(例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチル酸塩及びホモバニリン酸塩)、コラーゲンのN-アシル誘導体、ベータ-ジケトン（エンアミン）のラウレス-9及びN-アミノアシル誘導体を含む(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 92-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control ReL, 1990, 14, 43-51)。キレート剤は、DAase阻害剤も提供するという付加的な利点を有する。
【００９３】
界面活性剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン-20-セチルエーテル(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drag Carrier Systems, 1991, 8, 92-191);及びパーフルオロケミカルエマルジョン、例えばFC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252-257)を含む。
非界面活性剤は、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル- 及び 1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drag Carrier Systems, 1991, 8, 92-191); 及び非ステロイド抗-炎症剤、例えば、ナトリウムジクロフェナク、インドメタシン、及びフェニルブタゾン(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)を含む。
【００９４】
本明細書で使用する「キャリア化合物」は、核酸、又はその類似物を指し、それは不活性であるが（即ち、生物学的活性自体を持たないが）、例えば、生物学的に活性な核酸の分解又はその環境からの除去によって生物学的活性を持つ核酸の生物学的利用能を低下させるインビボプロセスによって核酸として認識されるものを言う。核酸と挙アリア化合物との共投与は、典型的に後者の物質が過剰であるが、おそらく共通のレセプターに対するキャリア化合物と核酸の間の競合により、肝臓、腎臓又は他の体外循環リザーバにおいて回収される核酸の量をかなり減少させる。例えば、部分的にホスホロチオ化されたオリゴヌクレオチドの肝臓組織における回収は、ポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジル酸又は4-アセタミド-4'-イソチオシアノ-スチル弁-2,2-ジスルホン酸と共投与したときに減少する(Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drag Dev., 1996, 6, 177-183)。
【００９５】
キャリア化合物に対して「製薬上許容されるキャリア」（賦形剤）は、１又はそれ以上の核酸を動物に送達するための、製薬上許容される溶媒、懸濁剤又は他の製薬的に不活性な媒体である。製薬上許容されるキャリアは、液体でも固体でもよく、心に意図する投与方法に応じて、与えられた製薬組成物の核酸及び他の成分と組み合わせたときに望ましいバルク、粘性等を提供するように選択される。典型的な製薬上許容されるキャリアは、限定されないが、結合剤(例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニル-ピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど); フィラー(例えば、ラクトース及び他の糖類、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど); 潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイダル二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど); 崩壊剤(例えば、スターチ、グリコール酸スターチナトリウムなど); 又は湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)を含む。持続放出経口送達システム及び／又は経口投与される投与形態の腸溶性コーティングは、米国特許番号4,704,295; 4,556,552; 4,309,406; 及び4,309,404に記載されている。
【００９６】
本発明の組成物は、製薬組成物で従来から見られる他の補助的成分を、その確立された使用量で更に含有してもよい。従って、例えば、組成物は、付加的な適合性の製薬的活性剤、例えば止痒薬、収斂薬、局所麻酔薬又は抗炎症薬を含んでもよく、あるいは本発明の組成物の種々の投与形態を物理的に製剤するのに有用な付加的材料、例えば、染料、香料、防腐剤、酸化防止剤、不透明化剤、増粘剤及び安定剤を含んでもよい。しかしながら、そのような材料は、添加する場合は、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に阻害してはならない。
【００９７】
本発明のアンチセンス化合物が患者に導入される方法によらず、化合物のインビボ安定性を向上させる及び／又は化合物を特定の器官、組織又は細胞型に標的化するためのコロイド分散系は送達媒体として使用できる。コロイド分散系は、限定されないが、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ及び水中油型エマルジョンを含む脂質ベースの系、ミセル、混合ミセル、リポソーム及び構造が特定されない脂質：オリゴヌクレオチド複合体を含む。好ましいコロイド分散系は、複数のリポソームである。リポソームは、二層構造で配列した脂質からなる１間それ以上の外層に取り囲まれた水性コアを有する微視的球体である(一般に、Chonn et al., Current Op. Biotech., 1995, 6, 698-708を参照のこと)。
リポソームの調製は、1997年10月31日に出願され係属中の米国出願番号08/961,469に記載されており、その出願は本願出願人によって共有され、参考として本明細書に取り入れるものとする。
【００９８】
本発明の或る実施態様は、(a)１又はそれ以上のアンチセンス化合物、及び(b)１又はそれ以上の非アンチセンスメカニズムによって作用する他の化学治療薬を含有するリポソーム及び他の組成物を提供する。そのような化学治療薬の例は、限定されないが、抗ガン剤、例えば、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ミトマイシン、ナイトロジェン・マスタード、 クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン（CA)、5-フルオロウラシル(5-FU)、フロクスウリジン(5-FUdR)、メトトレキセート(MTX)、コルチシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストロール(DES)を含む。一般に、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 1987, Berkow et al., eds., Rahway, N.J., 1206-1228を参照のこと。抗炎症薬、例えば限定されないが、非ステロイド薬及びコルチコステロイド、及び抗ウイルス薬、例えば限定されないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル及びガンシクロビルは、本発明の組成物に加えてもよい。一般に、各々、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 1987, Berkow et al., eds., Rahway, N.J., pages 2499-2506 及び46-49を参照のこと。他の非アンチセンスの化学治療薬も本発明の範囲内である。２又はそれ以上の組み合わせた化合物を一緒に又は連続して使用してもよい。
【００９９】
他の関連する実施態様では、本発明の組成物は、第一の核酸を標的とする１又はそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、及び第二の核酸標的を標的とする１又はそれ以上の付加的アンチセンス化合物を含んでよい。２又はそれ以上の組み合わせた化合物を一緒に又は連続して使用してもよい。
【０１００】
治療用組成物の製剤及びそれに続くそれらの投与は、当業者の熟練の範囲内であると考えられる。用量は、治療すべき疾患状態の重篤さ及び反応性に依存し、治療の過程は数日から数ヶ月、あるいは治療が有効になる又は疾患状態の緩解が達成されるまで続く。最適な用量スケジュールは、患者の体内での薬剤蓄積の測定から計算できる。当業者は、容易に最適用量、投与方法及び反復頻度を決定できる。最適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効能に依存し、一般にインビトロ及びインビボ動物モデルにおいて有効なEC50に基づいて見積もられる。
【０１０１】
好ましくは、用量は体重1kg当たりに、0.005 から200 μg、より好ましくは0.01 から200 μg、より好ましくは0.1 から5 μg、更により好ましくは0.5 から1 μgの範囲である。用量は1日、1週間、1月又は1年に1回又はそれ以上、さらには2から20年に1回与えられる。好ましくは、用量は1日1回より多くあたえられず、より好ましくは2日に1回より頻繁ではない。
【０１０２】
本発明を、好ましい実施態様に従って特別に説明してきたが、以下の実施例は、本発明を例示するためだけに提供され、何ら限定を意図するものではない。
(実施例）
インテグリンα４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASOs)が、マウス肺における抗原チャレンジに対するアレルギー性炎症を阻害する能力を評価した。
【０１０３】
インテグリンα４mRNAの発現を抑制する能力に関するオリゴヌクレオチドのスクリーニング
インテグリンα４を標的とする一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、マウスbEND細胞において、インテグリンα４のRNAレベルを低下させる能力（「％阻害」）についてスクリーニングした。アンチセンス化合物の設計、調節、合成及び試験は従来技術、例えば米国特許番号6,743,909に記載されており、その全体を参考として本明細書に取り入れる。
簡潔に言えば、細胞をリポフェクチンでトランスフェクトした。オリゴヌクレオチド濃度は30 nMであった。示されたすべての化合物は5-10-5 MOE gapmers (即ち、分子の一方の末端における隣接する5ヌクレオチド上の2'-O-メトキシエチル糖及び10中心ヌクレオチド上の2'デオキシヌクレオシド) w/ホスホロチオエート骨格及び各Cについて5-メチルシトシン。
【０１０４】
使用したプライマー／プローブのセットはRTS2137 (プローブ上のラベル以外はすべてが変更なし)であった：
・Forward: ISIS 348635 GAAAGGTAAAAAGCTTGGCTCATACT (デオキシ、ジエステル骨格)(SEQ ID NO: 100)
・Reverse: ISIS 348636 TCTGAGAAGCCATCTGCATTGA (SEQ ID NO:101)
・Probe: ISIS 348637 5'FAM-TGGAGCTTCTGTCTGCGCTGTGGATAMRA3' (SEQ ID NO: 102)
結果を表１に示す。
【０１０５】
表１：インテグリンα４RNAレベルの阻害
2008516991.tif 000002
2008516991.tif 000003
2008516991.tif 000004
【０１０６】
表１に示すように、多くのオリゴヌクレオチドは交差種化合物であり、ラット及び／又はヒトインテグリンα４並びにマウス配列と完全に相同である。表１から、多くの化合物がインテフ林α４のRNAレベルを５０％又はそれ以上阻害したことは明らかである。
【０１０７】
以下の2つの非重複インテグリンα４アンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる評価のために選択した。
ISIS 348592 (GCAGCATATTTGTCACTTCC: SEQ ID NO: 136)、5-10-5 MOE gapmer (即ち、分子の一方の末端における隣接する5ヌクレオチド上の2'-O-メトキシエチル糖及び10中心ヌクレオチド上の2'デオキシヌクレオシドi.e. ) w/ホスホロチオエート骨格及び各Cについて5-メチルシトシン、これは、ヒト、マウス及びラットのインテグリンα４と完全に相同である。
ISIS 348574 (ATATTTTTCCACCTGTGCCC: SEQ ID NO: 119)、5-10-5 MOE gapmer w/ホスホロチオエート骨格及び各Cについて5-メチルシトシン、これは、マウス及びラットのインテグリンα４と完全に相同である。
ISIS 348574 の8塩基対不一致オリゴヌクレオチドも走らせた。これは、ISIS 358342 (ACAGTGTACCTCCTTTTCTC: SEQ ID NO: 179)、a 5-10-5 MOE gapmer w/ホスホロチオエート骨格であった。
【０１０８】
実施例１：エアロゾル投与したASOsがアレルゲンチャレンジしたマウスにおいて発現されるインテグリンα４のレベルを低下させる能力のインビボ実験
アレルギー性喘息を持つ患者において気道炎症が観察される。この実験は、アレルギー性喘息のマウスモデルのインビボにおいてISIS 348592 及び ISIS 348574 の有効性を評価した。オブアルブミン誘導肺炎症及び気道過敏症（AHR)のモデルは従来技術に記載されている。例えば、それらは米国特許番号6,136,603に記載されており、その内容を参考として本明細書に取り入れる。好ましいモデルはHessel 等によって開発されたものである(J Immunol. 1998, 160, 2998-3005)。オボアルブミンでのBALB/cマウスの感作は血清中にオボアルブミン特異的なIgEを高レベルで誘発した。マウスにおけるオボアルブミンの吸入は、即座に気管支収縮反応を起こした。感作動物におけるオボアルブミン吸入の繰り返しは、インビボで非特異的な気道過敏症を、気道組織で白血球の浸潤を生じさせた。
【０１０９】
簡潔に言えば、雄BALB/cマウスは、0及び14日に、水酸化アルミニウムアジュバント中の20 μg のオボアルブミンのIP注入によって活性感作された。最後の注入の10日後に、マウスをオボアルブミンエアロゾル(1% OVA 食塩水中)に、3日間に渡り1日に1回 曝露した(24, 25 及び26日)。エアロゾルは、噴霧器、例えばMedix 8001 (Sussex, UK)で生成させた。動物をエアロゾルチャレンジごとに30分間曝露した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、チャレンジ期間の間にマウスに与えた。17, 19, 21, 24 及び26日に、感作マウスに、0.01, 1 又は100 μg/kg のISIS 348592 又はISIS 348574をエアロゾル投与で与えた。
【０１１０】
処理群は以下の通りである。
2008516991.tif 000005
【０１１１】
各処理群は10匹の動物であり、すべての動物は28日に犠牲にした。2つのコントロール群があり、一方はエアロゾルの媒体のみを与えられ（7群）、他方は未処理のコントロールである(8群）。
メタコリンに対する気道反応性を、空気オーバーフロー圧力法を用いて最後のエアロゾル曝露の48時間後にインビボで測定し、膨張に対する気管支の耐性を測定した。ベースラインの噴霧メタコリン用量反応曲線を0日に作成し、その後すべての群の動物に高原感作をした。Buxco BioSystem Plethysmograph (Buxco, Troy N. Y.)を用いて肺機能を監視し、測定した気道耐性と関連する強制休止(Penh)として表した(Hamelmann et al., Am. J.Respir. Crit. Care Med., 1997, 156, 766- 775)。
【０１１２】
マウスをウレタンのIP注入によって麻酔し、加熱ブランケット上に配置した。気管にカニューレ挿入し、静脈内投与のために小型のポリエチレンカテーテルを頚静脈に配置した。塩化ツボクラリンの静脈内注入により自発呼吸を抑制した。それが停止したとき、気管カニューレを呼吸ポンプに繋いだ。各投与でのメタコリンに対する気道反応を測定することにより、抗原チャレンジの48時間後に気道反応性を測定した。各群についてチャレンジ後の記録をベースラインの記録と比較して、Penh刺激指数を作成した。結果を図１から４に示す。
【０１１３】
図１は、メタコリン濃度を増加させたときの各群における平均Penh刺激指数をプロットしている((1) -◆- は348592 の0.01 μg/kg; (2) -■- は 348592 の1 μg/kg; (3)-▲-は348592の100 μg/kg; (4) -ｘ- は348574 の0.01 μg/kg; (5) -＊- は348574 の1 μg/kg; (6) -●- は348574 の100 μg/kg; (7) -｜-は媒体; (8) −は未処理である）。
全部の曲線を比較するためにJMP Statistical packageを用いると、テューキーHSDは、媒体群は他のすべての群と相違すること、未処理群はASO ISIS 348574 (0.01, 1 及び100 μg/kg)(即ち、群4 (-ｘ-), 5 (-＊-) 及び6 (-●-))を受けた動物群と類似していること、及び未処理群はASO ISIS 348592 (0.01, 1 及び100 μg/kg)(即ち、群1 (-◆- ), 2 (-■-) 及び3 (-▲-))を受けた動物群と相違することを示している。スチューデントT解析はテューキーHSDと同様の結果を示した。
【０１１４】
図２は、100mg/mlのメタコリン濃度での各群のPenh刺激指数を示すグラフである。再度、ISIS 348574群(4, 5 及び6)について、Penh刺激指数の有意な低下が見られた(P < 0.05 対媒体群)。図３は、100mg/mlのメタコリン濃度での各群における個々の動物についてのPenh刺激指数を示す。図４は、各処理群についてのベースライン図を示す。
【０１１５】
これらの結果は、ASOsがメタコリン誘導アレルギー性気道過敏症を阻害することを明らかに示しており、ピークのPrnh指数は、およそ7.5 (オリゴヌクレオチドなし)から約4.5 (ISIS 348574 の0.01 and 1 μg/kg)、約4 (ISIS 348574 の100 μg/kg)、約5.5 (ISIS 348592 の0.01 μg/kg)、約5.0 (ISIS 348592 の1 μg/kg) 及び約6.25 (ISIS 348592の100 μg/kg)まで低下した。この実験は、喘息のマウスモデルにおけるインテグリンα４アンチセンス化合物の活性の概念の証拠であり、AHRの阻害において、極めて低用量(例えば、0.01 μg/kg)は高度に有効であることを示している。さらにエアロゾル投与は、そのような呼吸器病態の治療のためのアンチセンス化合物の非常に有効な経路であることも示された。
【０１１６】
気道組織の細胞浸潤を測定するために気管支肺胞洗浄(BAL)を使用した。最後のエアロゾルの48時間後、マウスを麻酔し、気管カニューレ挿入を実施し、洗浄食塩水を回収した。マウスを1mlの発熱物質を含まない食塩水のアリコートで5回洗浄した。各洗浄液から誘導された細胞をプールし、冷PBSで洗浄し、200 μl の冷PBSに再懸濁した。細胞の合計数を数えて分類した。結果を図５から示す。
【０１１７】
図５は、各処理群について、気道の細胞のパーセントとしてのマクロファージ(「Mac」)、リンパ球(「Lym」)、好酸球(「Eos」)及び好中球(「Neu」)細胞の平均数をプロットした棒グラフである。アンチセンス化合物で処理したすべての群で好酸球リクルートの有意な低下が観察された。さらに、すべてのアンチセンス処理群でリンパ球及び好中球リクルートの減少が明らかになった。
【０１１８】
図６は、各群についての好酸球の平均数を示す棒グラフである。ASOsで処理したすべての群（即ち、各々0.01, 1 及び100 μg/kg ISIS 348592で処理した群1-3、及び各々0.01, 1 及び100 μg/kg ISIS 348574で処理した群4-6)について、好酸球リクルートにおける有意な減少がある(P < 0.05 対媒体群)。図７は、各群の個々の動物についての好酸球の数を示す。
図８a及び８bは、処理群1-8の各々についての、オボアルブミン特異的IgE及びIgG1のレベルを示す。
【０１１９】
実施例２：エアロゾル投与されたASOsがアレルゲンチャレンジされたマウスにおけるPAS-陽性気道の数を減少させる能力のインビボ実験
この実験は、ISIS 348574が、アレルギー性喘息のマウスモデルにおいて生産される粘液のレベルを低下させる能力を評価した、それを8不一致コントロールASO ISIS 358342と比較した。粘液のレベルは、過ヨウ素酸-シッフ(PAS)試薬での染色を介して測定した。
実施例１と全く同様にして、マウスを感作し、チャレンジしてASOsで処理した。処理群は以下の通りである。
【０１２０】
2008516991.tif 000006
【０１２１】
各処理群は15の動物を含む。2つのコントロール群があり、一方はエアロゾル媒体のみを受け（群7）、他方は未処理群（群8）であった。27日に、各群の5匹の動物にFACSを受けさせた。28日に、各郡残りの10匹を犠牲にした。
【０１２２】
肺を膨張させ、ホルマリンに固定し、側矢状断面を切って実装し、スライドをPASで染色して画像を収集した（各マウス毎に2画像）。媒体及び1 μg/kg群を比較した。結果を図９に示す。
【０１２３】
図９は、各処理群についてPAS陽性気道の平均数を示す棒グラフである。処理群1-3、即ちASO ISIS 348574を受けた群においてPAS陽性気道の明らかな減少が見られ、その減少は0.01 及び1 μg/kg の用量レベルで有意であった(P < 0.05 対媒体群)。このことは、アンチセンス処理の後に気道粘液が減少したことを示す。
【０１２４】
実施例３：喘息のマウスモデルにおけるエアロゾル投与されたASOの標的媒介薬理学的活性に関するインビボ実験
E-カドへリン陽性細胞は上皮細胞であり、その約25%は粘液生産性の杯細胞である。この実験は、ISIS 348574が、E-カドヘリン陽性細胞においてインテグリンα４生産を標的化する能力を評価し、それを8不一致(MM)コントロールASO ISIS 358342と比較する。
実施例１と全く同様にして、マウスを感作し、チャレンジしてASOsで処理した。処理群は以下の通りである。
【０１２５】
2008516991.tif 000007
【０１２６】
各処理群は15の動物を含む。2つのコントロール群があり、一方はエアロゾル媒体のみを受け（群5）、他方は未処理群（群6）であった。27日に、各群の5匹の動物にFACSを受けさせた。28日に、各郡残りの10匹を犠牲にした。肺を回収してコラゲナーゼで消化した。回収した肺細胞における細胞組成及びVLA-4タンパク質発現を、特異的なモノクローナル抗体で免疫染色し、次いでフローサイトメトリ分析(FACS)により決定した。
【０１２７】
細胞をE-カドヘリン及びインテグリンα４に対するラベルした抗体に曝露した。結果を図１１に示す。E-カドヘリン陽性細胞集団は、0.01 及び1 μg/kg の両方のアンチセンス用量で、インテグリンα４にも陽性な細胞のパーセントにおいて統計的に有意な減少を示した(* P<0.05 対媒体)。
よって、低用量のASOは、E-カドヘリン陽性細胞集団においてインテグリンα４レベルを特異的に低下させることがわかった。
【０１２８】
要するに、インテグリンα４ASOをオボアルブミン感作マウスに局所的アレルゲンチャレンジの前にエアロゾル投与すると、肺細胞表面上に発現されるインテグリンα４タンパク質のレベルが低下し、AHRが阻害され（図１−４）、気道のアレルゲン誘発性好酸球及びリンパ球浸潤が抑制され(図５−７）、PAS陽性気道の数が減少し（図９）、このことは、粘液の減少によって示される。8塩基不一致コントロールオリゴヌクレオチド配列は効果がなかった。
【０１２９】
インテグリンα４が、炎症において重要な役割を果たす複数のプロセスを阻害する能力は、インテグリンα４アンチセンス化合物が、低用量で送達されると、喘息などの呼吸器病態の治療で有効な治療薬となりうることを示唆している。さらに、我々の結果は、局所的、特にエアロゾルの送達が、投与の高度に有効な手段であることを示している。また我々の結果は、インテグリンα４がAHR及びマウス喘息モデルの気道への好酸球リクルートにおいて致命的な役割を果たしていることを確認した。
【０１３０】
当業者は、特別な実施態様によって示した本発明に、広く記載したような本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、多くの変更及び/又は修正を加えてもよいことを理解するであろう。従って、本実施態様は、あらゆる意味で例示的であり限定的ではないと考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】喘息のOVAモデルにおける種々のメタコリン用量でのPenHに対する0.01、1 及び100 μg/kg 用量のエアロゾル投与されたインテグリンα４ASOs (ISIS 348592 又は348574)の効果を示すグラフである。ASO処理は、(1) -◆- は0.01 μg/kgの348592; (2) -■- は1 μg/kgの348592; (3) -▲- は100 μg/kgの348592; (4) -ｘ- は0.01 μg/kgの348574; (5) -＊- は1 μg/kgの348574; (6) -●- は100 μg/kgの348574; (7) -｜-は媒体; (8) −は未処理である。
【図２】喘息のOVAモデルにおける100mg/mlメタコリンでのPenHに対する0.01、1 及び100 μg/kg 用量のエアロゾル投与されたインテグリンα４ASOs (ISIS 348592 又は348574)の効果を示すグラフである。
【図３】図２に示した実験の個々のマウスについて、100mg/mlメタコリンでのPenHに対する0.01、1 及び100 μg/kg 用量のエアロゾル投与されたインテグリンα４ASOs (ISIS 348592 又は348574)の効果を示すグラフである。
【図４】喘息のOVAモデルにおけるベースラインPenH反応に関して、媒体コントロールに対するエアロゾル投与されたインテグリンα４ASOs (ISIS 348592 又は348574)の効果を示すグラフである。
【図５】喘息のOVAモデルにおけるBAL細胞リクルートに対する0.01、1 及び100 μg/kg 用量のエアロゾル投与されたインテグリンα４ASOs (ISIS 348592 又は348574)の効果を示すグラフである。気道肺（気管支気道洗浄）における細胞のパーセント（マクロファージ、リンパ球、好酸球及び好中球）を示す。4本の棒の各セットで、左から右に、第1の棒がマクロファージ、第2の棒がリンパ球、第3の棒が好酸球、及び第4の棒が好中球である。
【図６】喘息のOVAモデルにおける好酸球リクルートに対する0.01、1 及び100 μg/kg 用量のエアロゾル投与されたインテグリンα４ASOs (ISIS 348592 又は348574)の効果を示すグラフである。気道肺における好酸球のパーセントを示す。
【図７】図６に示した実験の個々のマウスについて、気道肺の好酸球リクルートに対する0.01、1 及び100 μg/kg 用量のエアロゾル投与されたインテグリンα４ASOs (ISIS 348592 又は348574)の効果を示すグラフである。
【図８】OVA  IgE反応に対する0.01、1 及び100 μg/kg 用量のエアロゾル投与されたインテグリンα４ASOs (ISIS 348592 又は348574)の効果を示すグラフである。
【図９】喘息のOVAモデルにおけるPAS陽性気道の数に関して、コントロールオリゴヌクレオチドISIS 358342に対する0.01、1 及び100 μg/kg 用量のエアロゾル投与されたインテグリンα４ASO (ISIS 348574)の効果を示すグラフである。
【図１０】気道炎症に関連する可能な細胞性反応及び種々の細胞におけるインテグリンα４発現プロフィールを示す模式図である。
【図１１】インテグリンα４も発現する気道肺におけるEカドヘリン陽性細胞（上皮細胞）のパーセントに対する、0.01及び1μg/kg 用量のエアロゾル投与されたインテグリンα４ASO (ISIS 348574)及び不一致ネガティブコントロールオリゴヌクレオチド(ISIS 358342)の効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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