(57)【要約】  ワクチン使用のための２型の単純ヘルペスウイルス等のヘルペスウイルスを調製する方法が開示される。このようなウイルスを無血清培地又は血清含有培地上で培養することができ、またウイルス含有培養上清又はウイルス含有細胞から調製することができる。硫酸含有結合基又はスルホン酸含有結合基を含む固相アフィニティー試薬による処理を含み得る方法によって、続く薬剤処方物のためにこのウイルスを調製する。硫酸ヘパリン又は硫酸デキストラン等のこのような硫酸化多糖類群を使用し、塩溶液で溶出させることができる。この方法を他の培養工程、集菌工程、及び形成工程と組み合わせることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン又は治療のためにヘルペスウイルスを調製する方法であって、
（ａ）前記ウイルスで感染した宿主細胞を培養すること、
（ｂ）前記感染した細胞から培地を単離すること、及び
（ｃ）動物の免疫療法又はワクチン接種に好適なウイルス製剤を与えるために、その上清を使用すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記ヘルペスウイルスが、ＰＫドメインを欠失させたＨＳＶ−２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヘルペスウイルスがＩＣＰ１０ΔＰＫである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培養が、無血清培地で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記培養が、低レベルのタンパク質を含む培地で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記培養が、添加された上皮成長因子を含む培地で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培養が、添加されたインスリンを含む培地で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
（ｄ）精製すべき前記ヘルペスウイルス含有製剤を、ヘパリンに対するアフィニティーで物質を結合することができる硫酸含有結合基又はスルホン酸含有結合基を有する固相を含有するアフィニティー結合試薬と接触させ、それにより該ヘルペスウイルスと該アフィニティー結合試薬とを結合させること、及び
（ｅ）前記ヘルペスウイルスを前記アフィニティー結合試薬から溶出させること
をさらに含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
（ｄ）薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤によって、前記ヘルペスウイルスを製剤化(formulating)する工程
をさらに含む方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
（ｅ）前記製剤を滅菌すると共に、凍結又は凍結乾燥する工程
をさらに含む方法。
【請求項１１】
前記ヘルペスウイルスが感染性ヘルペスウイルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
得られる薬剤処方物が、免疫療法として使用するためのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アフィニティー結合試薬が硫酸含有結合基及び非イオン極性基を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記アフィニティー結合試薬が硫酸ヘパリン又は硫酸デキストランを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記アフィニティー結合試薬が硫酸化多糖類群を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記アフィニティー結合試薬が、スルホイソブチル基によって置換される張り出した(pendent)ポリアクリルアミド鎖を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
ヘルペスウイルスを成長させる方法であって、
（ａ）無血清培地において、前記ウイルスで感染した宿主細胞を培養する工程
を含む方法。
【請求項１８】
前記ヘルペスウイルスがＰＫドメインを欠失させたＨＳＶ−２である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、例えば、実験目的及び治療目的のために（例えば、予防接種又は治療接種等の薬剤処方物の製造のために）、ウイルス感染した細胞培養物からのウイルスの製造、集菌、及び精製に関する。特定の態様では、本発明は、ヘルペスウイルス製剤を製造する方法及び構成(arrangements)に関する。本発明の他の態様は、以下の記載から明らかであろう。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
該当なし。
【０００３】
［邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載］
該当なし。
【０００４】
［コンパクトディスクで提出される資料の参照による援用］
該当なし。
【背景技術】
【０００５】
［発明の背景］
米国特許法施行規則１．９７条及び米国特許法施行規則１．９８条に基づき開示される情報を含む関連技術の記載
生ウイルス製剤を製造する幾つかの方法が知られており、これらの方法は全て、ワクチン及び治療等の目的のために、ウイルス感染した細胞、例えば特にＶｅｒｏ細胞又はＭＲＣ５細胞からウイルスを抽出することを含む。
【０００６】
米国特許第３，９８５，６１５号（Osaka Research Foundation: T Kubo他）によって、テンジクネズミの初期胚組織細胞における経路を含む培養による、ワクチン使用のための生きている弱毒化した水痘ウイルスの製造が示される。
【０００７】
米国特許第５，０２４，８３６号（Merck: W J McAleer他）は、これに基づく凍結乾燥したワクチン製剤の製造に関する。また、生ウイルスワクチンの水溶液は、貯蔵中、不安定であることが知られているという事実も開示している。
【０００８】
ＤＤ−２０９７３８(Cent Cerc Bioprep: IV Patrascu)によって、マレク病に対するワクチンとして使用するための別の型のヘルペスウイルスの製造が示される。このヘルペスウイルスは、（ａ）デキストランミクロスフェアにおいて、特定病原体未感染(specific-pathogen-free)のニワトリの胚細胞を培養すること、（ｂ）ターキーのヘルペスウイルス株ＦＣ−１２６（クローンＩ、ＩＩＩｂ）を、８０％の集密度(confluence)でこの培養物に接種すること、（ｃ）細胞変性効果が８０％のときに、ＳＰＧＡ培地（スクロース、ホスフェート、グルタメート、ウシのアルブミン分画Ｖ）において感染した細胞を集菌すること、（ｄ）この懸濁液を、２分間隔で１分間の超音波パルスを３回にかけると共に、第１のワクチン群を回収するために、この懸濁液を遠心分離すること、（ｅ）ＳＰＣＡ培地で沈殿物を再懸濁すると共に、第２のワクチン群を得るために（およそ２％、ワクチンの収率を増加させるため）、工程（ｄ）を繰り返すこと、（ｆ）ウイルス力価を測定する前に、−１００℃で混合したワクチンを凍結させること、及び（ｇ）ＳＰＣＡ培地を希釈すると共に凍結乾燥することによって、製造される。
【０００９】
例えば、特開平０６−２３４６５９(Z H Handai Biseibutsubyo Kenkyukai)によって、ＭＲＣ−５細胞へ０．０３のＭＯＩで水痘ウイルスのＯｋａ株の種ウイルスを接種すること、及び３７℃で２日間培養することを含む、３７℃でＭＥＭ培地において培養したヒトの２倍体繊維芽細胞であるＭＲＣ−５細胞におけるヘルペスウイルスワクチンの製造が記載されている。したがって、１Ｌ当たり、ＮａＣｌ６．４ｇ、ＫＣｌ０．１６ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ２．３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4０．１６ｇ、スクロース５０．０ｇ、Ｌ−グルタミン酸Ｎａ１．０ｇ、ゼラチン２．０ｇ、ゼラチン加水分解物２５．０ｇ、及びＥＤＡ−３Ｎａ０．１ｇを含む溶液でウイルスを懸濁する。
【００１０】
欧州特許第０５７３１０７号、米国特許第５，３６０，７３６号、及び米国特許第５，６０７，８５２号(Merck: P A Friedman他)によって、生きている弱毒化した無細胞水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）ワクチンのための方法を含む、弱毒化した水痘瘡ウイルスワクチンの製造のための方法が記載されていて、この方法は、（ａ）高度な細胞複製を達成するために、十分に高い栄養条件下で、ヒトの２倍体細胞から選択されるＶＺＶに感染しやすい細胞を単層培養物における高密集度まで(to confluency)培養させると共に、非代謝性の二糖類を供給すること、（ｂ）ＶＺＶ感染した細胞の感染の多重度が実施できる限り高く、集密度のできる限り近くで、工程（ａ）に従って培養した細胞を感染させること、（ｃ）約２２〜９６時間、高い栄養状態でＶＺＶ感染した培養物を維持させると共に、ピーク時に感染性ＶＺＶ産物を集菌すること、（ｄ）ＶＺＶ感染した細胞を集菌する前に、適宜、塩化アンモニウム又はクロロキン等のリソソーム作用(lysosomotropic)剤を含有する生理溶液で、ＶＺＶ感染した培養物を洗浄すること、（ｅ）ＶＺＶ感染した細胞を最小量の安定化溶液に集菌すると共に、すぐに細胞を破壊させること、又は後述の破壊のために細胞を凍結させること、（ｌ）細胞結合型のＶＺＶを適宜、放出するために、ＶＺＶ感染した細胞を破壊すると共に、細胞残屑を除去し、それにより無細胞ＶＺＶ製剤を得ることを含む。この方法は、生ワクチンの大量製造のために、提案されている。その点について、単層培養において細胞を成長させるのに適切な栄養培地は、０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．４ｍｇ／ｍＬのダイズ液及び１０％のウシ胎仔血清で補充したＳＲＦＥ−２培地から本質的に成るように記載され、この細胞は、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、及びＶｅｒｏ細胞から選択される。
【００１１】
米国特許第５，６６５，３６２号(Cantab Pharmaceuticals Research: S C Inglis他)及び米国特許第５，８３７，２６１号(Cantab Pharmaceuticals Research: SC Inglis他)によって、ワクチン目的のために、単純ヘルペスウイルス等の遺伝子的に機能していないヘルペスウイルスを製造するための組み換え細胞及び培養方法が開示されていて、このウイルスは相補的な細胞上で成長させる。
【００１２】
米国特許第６，２６７，９６７号(Cantab: M D Johnston他)において、単純ヘルペスウイルスの精製のための方法が記載されている。それから、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば２型ＨＳＶ（ＨＳＶ−２））等のヒトのヘルペスウイルスの感染性製剤（これは培養物及びウイルスを有するアフィニティー試薬で成長させる場合、細胞結合性を強く維持する傾向があり、塩（例えば約０．４Ｍを超える塩化ナトリウム又は他の薬学的に許容可能な塩）又はヘパリン、別の硫酸多糖類、若しくはスルホン酸多糖類（例えば約５０μｇ／ｍＬ等の約１０〜２５０μｇ／ｍＬ程度）を含有する担体液から適用することができる）は、好適に洗浄され、例えば高濃度塩溶液又は硫酸多糖類若しくはスルホン酸多糖類による溶出によって、このウイルスを感染活性のある形態で回収することができる。任意の様々な方法において、このような細胞培養物からウイルスを初めに集菌することができる。この方法の例としては、例えば、凍結融解サイクル法、又は例えば低張食塩水又はグリセロール溶液を用いた浸透ストレス法；超音波処理；硫酸ヘパリン、硫酸デキストラン、若しくはその同等物による溶出；又は食塩溶液による溶出を利用することによる細胞破裂が挙げられる。
【００１３】
米国特許第６，０１３，２６５号(UMB: L Aurelian)（参照により本明細書中に援用される）又は米国特許第６，０５４，１３１号(UMB: L Aurelian) （参照により本明細書中に援用される）によって、成長が阻害された単純ヘルペス組み換えウイルス（例えばＨＳＶ−２）が開示されており、このＰＫドメインは欠失している。野生型のＨＳＶ−２ウイルスにおいて、複製が感染後２時間で始まり、感染後３６時間で最大レベルに達した。ＰＫ欠失ＨＳＶ−２において、１０％の血清及び０．５％の血清を補充したＶｅｒｏ細胞の両方において感染後１５時間までに複製の開始は見られなかった。複製が再開すると、この変異体は、１０％の血清の存在下において、感染後３６時間で、ＨＳＶ−２の力価と同程度の力価に達したが、この培地中の０．５％の血清で補充した細胞では達しなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
良好な収率及び純度における感染性ウイルス製剤の製造に寄与することが可能なヘルペスウイルス含有製剤（例えばワクチンにおいて、又は治療として使用されるもの）を製造する方法を提供することが、依然として望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
［発明の簡単な概要］
本発明の実施の態様としては、ワクチン又は治療のためにヘルペスウイルスを調製する方法が挙げられ、これには（ａ）このウイルスで感染した宿主細胞を培養すること、（ｂ）感染した細胞から培地を単離すること、及び（３）動物の免疫療法又はワクチン接種に好適なウイルス製剤を与えるために、上清を使用することが含まれる。
【００１６】
したがって、本発明の実施の形態の目的は、ワクチン又は治療に使用するためのヘルペスワクチンを単離する方法を提供することである。
【００１７】
本発明の実施の形態の別の目的は、単純で、安価で、且つ実施することが容易な、ヘルペスウイルスを単離する方法を提供すことである。
【００１８】
本発明の実施の形態の別の目的は、精製時に補助するための添加剤の添加を伴わない、ヘルペスウイルスを単離する方法を提供することである。
【００１９】
本発明の実施の形態の別の目的は、ヘルペスウイルスを製造するのに使用される細胞の破裂を必要としない、ヘルペスウイルスを単離する方法を提供することである。
【００２０】
本発明の実施の形態の別の目的は、安価な構成成分のみを用いる、ヘルペスウイルスを単離する方法を提供することである。
【００２１】
本発明の実施の形態の別の目的は、血清の非存在下で行われる、ヘルペスウイルスを成長させる方法を提供することである。
【００２２】
本発明の実施の形態の別の目的は、血清の非存在下で行われる、ヘルペスウイルスを単離する方法を提供することである。
【００２３】
本発明の実施の形態の最終的な目的は、得ることが容易で、且つ安価な試薬を伴い、環境に対する悪影響がない、ヘルペスウイルスを単離する方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
［発明の詳細な説明］
最も驚くべきことに、本発明者等は、ＰＫドメインを欠失させたＨＳＶ−２が、細胞の細胞壁を超えて容易に移動することを見出していて、このＨＳＶ−２は成長し、培養液並びに細胞で大量に見出される。各領域のウイルスレベルが他の領域のウイルスレベルの１対数内に見出され、この上清が、細胞集団よりもおよそ３０〜３００倍の容量を含むので、このウイルスの有効レベルは、細胞よりも上清で大幅に高い。このことは、感染した細胞内で通常見出されるウイルス粒子を遊離させるための細胞破壊の必要性を取り除く。細胞破壊は、細胞構成成分及び細胞破壊に影響を及ぼすために与えられる試薬から成る不純物の広範囲にわたる精製を要求するという欠点がある。
【００２５】
また、最も驚くべきことに、本発明者等は、ＰＫドメインを欠失させたＨＳＶ−２の変異体が、これまでに１０％のウシ胎仔血清を含む培地で成長阻害され、且つ０．５％のウシ胎仔血清を含む培地で再生されないことが示されたとしても、無血清細胞培地は、ＰＫドメインで欠失されるＨＳＶ−２の成長に適合することを見出している。
【００２６】
本発明の実施形態において、ウイルスの製造に適した培地としては、例えば１０％の血清含有ＥＭＥＭ、又は例えば非常に低いタンパク質濃度（５Фｇ／ｍＬで、動物若しくはヒト由来のタンパク質又はペプチドを含まない）を有するが、例えばＲｅｎＣｙｔｅ(InVitro Services and Systems, Goettingen, Germany)として、ヒトの組み換え上皮成長因子（ＥＧＦ）及び組み換えヒトインスリンを含むＶＰ−ＳＦＭ(Invitrogen, Bethesda, MD)が挙げられ、これはタンパク質又は血清を含まない。使用することができる他の市販の培地としては、例えばインスリンが付与されているＰＣ−１又はＨＬ−１(Cambrex Bioscience, Walkersville, MD)が挙げられる。
【００２７】
本発明の実施形態において、成長が限定されたＰＫ欠失組み換えＨＳＶ−２を支持する細胞株としては、米国特許第６，０１３，２６５号(UMB: L Aurelian)又は米国特許第６，０５４，１３１号(UMB: L Aurelian)で言及される細胞が挙げられ、最も好ましくはＶｅｒｏ細胞又はＭＲＣ−５細胞である。
【００２８】
本発明の実施形態においては、夾雑タンパク質が細胞内に維持されることから、細胞が破裂するのとは対照的に、細胞上清の使用によってより高純度で得られ、ＩＣＰ１０ΔＰＫによって、細胞成長培地においてウイルス粒子を非常に高濃度（例えば最大１０9ｐｆｕ／ｍＬ）にすることが可能になる。
【００２９】
本発明の実施形態において、一般的に、Ｖｅｒｏ細胞又はＭＲＣ−５等の好適に感染した宿主細胞の培養物から得られたウイルス上清において、アフィニティー精製を行うことが可能である。アフィニティー精製前に、例えば約５μｍ以下の膜フィルター等の膜フィルターに最初に集菌したウイルス製剤等を通過させ、それにより浄化した(clarified)ウイルス懸濁液を得ることは好都合であり得る。例えば、下記のように本発明の実施例を使用して、ウイルス力価に対して有用に低減したレベルのＤＮＡ及びタンパク質を含むウイルス分画を調製することが可能である。必要に応じて、アフィニティー精製のウイルス産物を任意のさらなる選択された精製工程にかけることができる。アフィニティー精製前（又はあまり好ましくはないが、アフィニティー精製後）に、この方法で集菌したウイルス製剤をヌクレアーゼ酵素で処理し、それにより許容可能なレベルまで、夾雑核酸の任意の含量を低減させることができる。本明細書に記載のように、処理工程を使用することによって得られたウイルス製剤はさらに処理され、また、例えばヘルペスウイルス(herpevirus)を安定化するのに有用であるウイルスワクチン又は他の薬学的に許容可能な薬剤の従来の構成成分自体によって、薬剤組成物の一部を構成することができる。本発明は、以下の非限定的な実施例によって、さらに記載及び例示される。
【実施例】
【００３０】
［実施例１］
ウイルス粒子を集菌及び精製するための本発明の実施例による方法は、ＨＳＶ−２に感染したＶｅｒｏ細胞の培養物（例えばワクチン用途のために、米国特許第６，０１３，２６５号(UMB: L Aurelian)又は米国特許第６，０５４，１３１号(UMB: L Aurelian)に記載されるようなＨＳＶ−２のＰＫ欠失変異体）を利用し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び抗生物質で補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）によって、１０％の血清における既知の方法で本質的に成長させることができる。約０．０１の感染の多重度でＨＳＶ−２であるＩＣＰ１０ΔＰＫ（ＣＳ）で密集したＶｅｒｏ細胞を感染させ、約３４℃で培養した。例えば感染後２４〜７２時間後に、細胞変性効果が８０〜１００％で観察される場合、ウイルス集菌は容易であるため、この培養物を処理することができる。
【００３１】
代替的には、ＨＳＶ−２でＶｅｒｏ細胞を感染させ、ＶＰ  ＳＦＭ(Invitrogen, Bethesda)、ＭＤ、又はＲｅｎＣｙｔｅ(In Vitro Services and Systems, Goettingen, Germany)等の無血清培地において、指示の通り成長させることができる。
【００３２】
ウイルスを集菌するために、培養培地をデカントし、直接使用するか、又はさらに精製する。ＲｅｎＣｙｔｅ又はＶＰ−ＳＦＭを使用するウイルスレベルも使用に適している。それから、安定化剤で安定化させながら、ウイルス含有培地を使用して、薬学的用途のために直接免疫付与することができ、又はさらに精製してもよい。
【００３３】
例えば、さらなるアフィニティー精製の前に、０．４〜５μｍ（臨界的ではない）の範囲の孔径を有するフィルターで、前濾過を行い、浄化したウイルス懸濁液を得ることができる。遠心分離から上清液を希釈、又は逆方向に濾過して(diafiltered)、それにより好適なイオン濃度を得ることができる。
【００３４】
適宜、例えば約４℃〜室温の温度で、最大約１時間、約２〜１０ｍＭのマグネシウムイオンの存在下、最大約５０ユニット／ｍＬで、ヌクレアーゼ酵素（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）、ＤＮａｓｅ活性及びＲＮａｓｅ活性を有する））によって培養培地を処理することができる。しかし、培養培地が、単離ＤＮａｓｅ処理工程が不要な程度に十分に低い含有量のＤＮＡを有することを頻繁に見出すことができる。
【００３５】
ＨｉＴｒａｐ（商標）調製カラムの形態で、Pharmacia Biotechから手に入れることができる（高い架橋性のアガロースゲルに基づく）（例えば直径が約３４μｍの）ＰｈａｒｍａｃｉａヘパリンＨＰカラムクロマトグラフィ物質上で、ウイルスを含有した液体をさらに精製することができる。代替的には、このアフィニティー試薬は、一般的に同様に使用される、上記のような、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＦＭＤ  ＳＯ5  ６５０Ｍ(Merck(Darmstadt)製)のビーズであり得る。
【００３６】
この工程のさらなる例において、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄することにより調製したヘパリンカラムにＨＳＶ−２ウイルス培養上清を適用させることができる。１０8ｐｆｕ／ｍＬも含有する約１００ｍＬのウイルス製剤をこのカラム上に充填することができる。このウイルスを部分的に溶出することができ、濃縮したウイルスを含有する分画を回収することができる。
【００３７】
必要に応じて、例えばＦｉｌｔｒｏｎ（商標）又は他の接線クロスフロー装置における５００ｋＤの排除限界を有するフィルター／膜を使用して、任意のさらなる精製工程として、介在性ウイルスを含有するカラムからの溶出液を接線クロスフロー濾過（逆方向濾過）にかけることができる。
【００３８】
必要に応じて適宜、クエン酸／生理食塩水緩衝液に対する逆方向濾過によって、このク
ロスフロー限外濾過工程からの保持液を処理することができ、最終的に、再び同じ緩衝液を使用して、約０．４５μｍ〜５μｍのフィルターによる濾過により任意に先行される０．２μｍ（滅菌）濾過にこの保持液をかけた。
【００３９】
必要に応じて、この工程を使用して、約２０ｍｇ／ｍＬで安定化タンパク質（例えばヒト血清アルブミン）等の好適な安定化剤において最大約２０ｍｇ／ｍＬのウイルス製剤を含有する液体を製造することができる。ウイルス製剤を処理するフィルターを使用する前に、同じ緩衝液において同じ安定化剤を含有する液体でこのフィルターを前洗浄することが有用であり得る場合もある。
【００４０】
安定化剤におけるウイルス粒子の懸濁液として、最終産物を得ることができる。残りのＤＮＡのレベルは、十分低くできる。
【００４１】
本発明は、例えばワクチン用途のための組み換えＨＳＶ−２ウイルスの培養及び集菌に有用に適用することができ、このウイルスはＰＫ遺伝子に対して欠失を有し、Ｖｅｒｏ細胞又はＭＲＣ−５細胞の細胞株で培養されたものである。
【００４２】
本発明及び本開示は、本明細書で記載の方法、組成物、及び最終産物、並びに本明細書及び特許請求の範囲で言及、及び記載した工程及び特徴の変更形態及び変形形態（例えばこの工程及び特徴の全ての組み合わせ及び下位の組み合わせ（工程の順番及び選択における変更を含む））に及んで、また本明細書中で言及される文献は、全ての目的のために、本明細書に参照により完全に援用される。
【国際調査報告】
2008525023.tif 000002
2008525023.tif 000003