(57)【要約】  本発明は、流体試料内の粒子を検出し、同定し、分類し、特性評価する方法及びデバイスを提供する。回転及び／又は移動する試料コンテナを有する光学アナライザであって、非常に低い濃度で存在する蛍光粒子の濃度を測定し、サイズ、形状、拡散定数、及び／又は組成に基づいて、蛍光粒子を特性評価する光学アナライザを提供する。パターン認識データ分析技法及び多チャネル検出を使用する走査型光学アナライザを提供する。【選択図】  図１
2008536093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の粒子を分析するためのデバイスであって、
前記粒子を含む前記試料を保持する少なくとも半透明なコンテナと、
前記試料に供給される励起光を生成することによって、前記粒子の少なくとも一部に蛍光を生成させる光源と、
前記コンテナ内に位置する観察体積から蛍光を集める手段と、
前記コンテナを移動させることによって、前記粒子の少なくとも一部を前記観察体積を通して移動させる手段と、
蛍光を集める前記手段と光学的に接続する光検出器であって、前記観察体積からの前記蛍光の少なくとも一部を受けて、その強度を測定することによって、前記蛍光の時間プロファイルを生成する、該光検出器と、
を備えるデバイス。
【請求項２】
前記コンテナを移動させる前記手段は、前記コンテナの中心を通る回転軸線の回りに前記コンテナを回転させる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記コンテナを移動させる前記手段は、毎秒約０．１回転から毎秒約１０回転までの範囲において選択される速度で前記コンテナを回転させる、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記コンテナを移動させる前記手段は、垂直方向に前記コンテナを移動させる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記コンテナを移動させる前記手段は、毎秒約０．０１センチメートルから毎秒約５センチメートルまでの範囲において選択される速度で前記コンテナを垂直に反転させる、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記コンテナを移動させる前記手段は、同時に、前記コンテナを回転させ、垂直に反転させる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記コンテナを移動させる前記手段は、モーター、スイッチングエレクトロニクス、又は偏心回転板デバイスである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記観察体積から蛍光を集める前記手段は、共焦点顕微鏡である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記光源は、空間的にコリメートされた励起光を生成する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記観察体積は、前記コンテナの壁からの距離であって、約１００μから約２０００μまでの範囲から選択される距離に設けられる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記観察体積は、約１×１０２μｍ３から約１×１０８μｍ３までの範囲から選択される体積を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記コンテナを移動させる前記手段は、一時に１粒子ずつ、粒子に前記観察体積を通らせる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記光検出器によって生成された前記時間プロファイルを受け取り、分析するパターン認識アルゴリズムを有するプロセッサを更に備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記パターン認識アルゴリズムは、前記時間プロファイル内の特徴と所定のパターンとの整合をとり、前記所定のパターンは、前記観察体積を通過する粒子の時間依存蛍光強度に対応する、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記所定のパターンは、経験的に決定される、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
所定のパターンは、前記所定のパターン及び前記時間プロファイルの時間の関数としての強度が互いに約２０％以内である場合に、前記時間プロファイルの特徴と整合される、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１７】
所定のパターンは、前記所定のパターンの幅が前記観察体積を通過する粒子の飛行時間に相関する場合に、前記時間プロファイルの特徴と整合される、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記パターン認識アルゴリズムは、前記時間プロファイルの特徴と前記所定のパターンとの間の整合の個数を数える、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記時間プロファイルの特徴と前記所定のパターンとの間の整合の前記個数は、前記試料内の前記粒子の濃度に比例する、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記パターン認識アルゴリズムは、前記時間プロファイル内の特徴と所定のパターンとの整合をとり、前記所定のパターンは、前記観察体積を通過する粒子の時間依存の蛍光強度に対応し、前記時間プロファイル内の前記特徴と整合される前記所定のパターンの幅は、前記粒子のサイズに比例する、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記パターン認識アルゴリズムは、異なる総積分強度を有する整合した特徴のヒストグラムを含む出力を生成する、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記粒子は、蛍光標識付けされた粒子、元来的に蛍光性の粒子、又は蛍光標識付けされた粒子と元来的に蛍光性の粒子の双方である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記粒子は、細胞、ウィルス、細菌、タンパク質、ペプチド、タンパク質凝集体、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＲＮＡ、ＲＮＡ−タンパク質複合体、球、金属粒子、磁性粒子、及び抗体コーティングされたビーズからなる群から選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記コンテナは、円筒形キュベットである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２５】
追加の光検出器を備え、前記光検出器は、第１の波長分布を有する前記観察領域からの蛍光を選択的に検出し、前記追加の光検出器は、第２の波長分布を有する光を選択的に検出し、前記第１の波長分布は、前記第２の波長分布と異なる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２６】
試料内の粒子を分析するデバイスであって、
前記粒子を含む前記試料を保持する少なくとも半透明なコンテナと、
前記試料に供給される励起光を生成することによって、前記粒子の少なくとも一部に蛍光を生成させる光源と、
蛍光を集める手段であって、第１共焦点開口及び第２共焦点開口と光学的に接続する光収集部品を有しており、前記第１共焦点開口は、前記第２共焦点開口と異なる断面積を有する、該手段と、
前記コンテナ内に配置された第１観察体積からの蛍光を検出する第１光検出器であって、前記第１共焦点開口を通過する蛍光を検出するように位置決めされて、前記蛍光の第１時間プロファイルを生成する、該第１光検出器と、
前記コンテナ内に配置された第２観察体積からの蛍光を検出する第２光検出器であって、前記第２共焦点開口を通過する蛍光を検出するように位置決めされて、前記蛍光の第２時間プロファイルを生成する、該第２光検出器と、
前記コンテナを移動させることによって、前記粒子の少なくとも一部を前記第１観察体積及び前記第２観察体積を通して移動させる手段と、
を備えるデバイス。
【請求項２７】
前記第１共焦点開口は、前記第２共焦点開口よりも小さい断面積を有し、前記第１観察体積は、前記第２観察体積内に配置されている、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記観察体積から蛍光を集める前記手段は、共焦点顕微鏡である、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記第１及び第２の光検出器によって生成される前記第１及び第２の時間プロファイルを受け取り、該第１及び第２の時間プロファイルを分析するパターン認識アルゴリズムを有するプロセッサを更に備える、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記パターン認識アルゴリズムによる前記第１及び第２の時間プロファイルの分析は、前記粒子の粒度分布を決定する、請求項２９に記載のデバイス。
【請求項３１】
粒子を、該粒子を含む試料内において分析する方法であって、
少なくとも半透明なコンテナ内に粒子を含む前記試料を提供するステップと、
前記試料に励起光を向けるステップであって、前記試料内の前記粒子の少なくとも一部に蛍光を生成させる、該ステップと、
前記試料内の観察体積から蛍光を集め、前記観察体積からの前記蛍光を光検出器に向けるステップと、
前記コンテナを移動させるステップであって、前記試料内の粒子に前記観察体積を通過させる、該ステップと、
前記光検出器を使用して時間の関数として前記観察体積からの前記蛍光の強度を測定するステップであって、前記観察体積からの前記蛍光の時間プロファイルを生成する、該ステップと、
を含む方法。
【請求項３２】
パターン認識アルゴリズムを使用して前記時間プロファイルを分析するステップが、前記試料内の粒子の濃度、前記試料内の前記粒子の粒度分布、又はその双方を決定する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料内の前記粒子に蛍光標識付けするステップを更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
共焦点顕微鏡を前記試料と光学的に接続するように設けるステップを更に含み、前記共焦点顕微鏡は、前記試料に前記励起光を向ける前記ステップと、観察体積から前記蛍光を集め、前記観察体積からの前記蛍光を光検出器に向ける前記ステップとを実行するのに使用される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
パターン認識アルゴリズムを使用して前記時間プロファイルを分析するステップを更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記パターン認識アルゴリズムを使用して前記時間プロファイルを分析する前記ステップは、前記時間プロファイル内の特徴と所定のパターンとの整合をとるステップを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記パターン認識アルゴリズムを使用して前記時間プロファイルを分析する前記ステップは、前記時間プロファイル内の特徴と前記所定のパターンとの間の整合の個数を数えることによって、前記検出時間間隔中に検出される粒子の正味個数を決定するステップを更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記パターン認識アルゴリズムを使用して前記時間プロファイルを分析する前記ステップは、前記検出時間間隔中に走査された試料の全体積によって前記検出時間間隔中に検出された粒子の正味個数を割るステップを更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記コンテナは、円筒形であり、前記コンテナを移動させる前記ステップは、前記コンテナを同時に回転させて垂直に反転させることを含み、前記パターン認識アルゴリズムを使用して前記時間プロファイルを分析する前記ステップは、式
Ｌ＝π（ｄ）（Ｖｒ）（ｔ）
を使用して前記試料内の前記観察体積の軌跡の全長を決定するステップを更に含み、ここで、ｄは、前記コンテナの直径であり、Ｖｒは、前記コンテナの回転速度であり、ｔは、選択された検出時間間隔である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記検出時間間隔中に走査される試料の前記全体積（Ｖ）は、式
Ｖ＝（Ｌ）×（Ｃｒｏｓｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ）
を使用して提供され、ここで、Ｌは、前記選択された軌跡の長さであり、Ｃｒｏｓｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎは、前記励起光の伝搬軸に平行な軸に沿った前記観察体積の断面積である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記観察体積からの前記蛍光の前記強度は、約０．５秒から約１０分までの範囲から選択される検出期間において時間の関数として検出される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
試料内の粒子を分析するデバイスであって、
前記粒子を含む前記試料を保持する少なくとも半透明なコンテナと、
前記試料に供給される励起光を生成することによって、前記粒子の少なくとも一部に蛍光を生成させる光源と、
前記コンテナ内に配置された観察体積から蛍光を集める手段と、
前記コンテナを移動させることによって、前記粒子の少なくとも一部を前記観察体積を通して移動させる手段と、
蛍光を集める前記手段と光学的に接続する光検出器であって、前記観察体積からの前記蛍光の少なくとも一部を受け取り、その強度を測定することによって、前記蛍光の時間プロファイルを生成する、該光検出器と、
前記試料と前記光検出器との間に位置決めされた複数スリット共焦点開口であって、蛍光が、該複数スリット共焦点開口を通過し、前記光検出器によって受け取られるようにする、該複数スリット共焦点開口と、
を備えるデバイス。
【請求項４３】
蛍光を集める前記手段及び前記複数スリット共焦点開口は、共焦点顕微鏡の構成部品である、請求項４２に記載のデバイス。
【請求項４４】
前記複数スリット共焦点開口は、二重スリット共焦点開口である、請求項４２に記載のデバイス。
【請求項４５】
前記光検出器によって生成された前記時間プロファイルを受け取り、分析するパターン認識アルゴリズムを有するプロセッサを更に備える、請求項４２に記載のデバイス。
【請求項４６】
前記パターン認識アルゴリズムは、前記観察内の前記粒子の位置を決定する、請求項４５に記載のデバイス。
【請求項４７】
試料内の粒子を分析する統合粒子測定システムであって、
前記粒子を含む前記試料を保持する少なくとも半透明なコンテナと、
前記試料に供給される励起光を生成することによって、前記粒子の少なくとも一部に蛍光を生成させる光源と、
前記コンテナ内に配置された観察体積から蛍光を集める手段と、
前記コンテナを移動させることによって、前記粒子の少なくとも一部を前記観察体積を通して移動させる手段と、
蛍光を集める前記手段と光学的に接続する光検出器であって、前記観察体積からの前記蛍光の少なくとも一部を受け取り、その強度を測定することによって、前記蛍光の時間プロファイルを生成する、該光検出器と、
前記試料に粒子を導入する手段であって、粒子が前記試料に供給されるように、前記少なくとも半透明なコンテナに動作可能に接続された、該手段と
を備える統合粒子測定システム。
【請求項４８】
粒子を導入する前記手段は、粒子を含む液体又は粒子を含む気体を前記試料に供給できる供給口である、請求項４７に記載のデバイス。
【請求項４９】
前記試料に粒子を導入する前記手段は、粒子を含む液体を連続的に又は滴状で前記試料に供給する供給口である、請求項４７に記載のデバイス。
【請求項５０】
前記試料に粒子を導入する前記手段は、前記試料を通して、粒子を含む気体を泡立たせることができるチューブである、請求項４７に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[001]本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下での優先権を、２００５年１月３１日に出願の米国特許仮出願第６０／６４８５１３号について主張するものであり、当該名国特許仮出願を、その全体を参照することによって、本明細書における開示と矛盾しない範囲で、援用する。
【連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載】
【０００２】
[002]本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された契約番号第ＰＨＳ５Ｐ４１−ＲＲ０３１５５号の下で、政府支援を得て成されたものである。米国政府は、本発明においてある種の権利を有している。
【発明の背景】
【０００３】
[003]過去数十年において、光学的分析法が、多様な媒質内の微量成分を検出し、特性評価するために有用で幅広く適用可能な分析ツールとして現れてきた。光学的分析法では、電磁放射が、試料に与えられて、試料の成分と相互作用する。入射電磁放射と試料との間の相互作用は、散乱、透過、及び／又は、放出電磁放射を生成し、この電磁放射が、収集され、検出される。検出された光の強度、波長分布、偏光状態、散乱角、又はこれらの特質の任意の組合せが、試料成分の組成、濃度、物理的状態、及び／又は化学的環境に関する情報を提供する。微量成分を特性評価するのに特に有用であることが実証されている光学的分析法には、吸収分光学技法、発光分光学技法、ラマン散乱分析法、ミー散乱分析法、磁気共鳴分光学法、及び多次元光学分光学技法がある。
【０００４】
[004]光学的分析法は、生物系の細胞成分及び非細胞成分の特性評価に特に有利な複数の利益をもたらす。第１に、光学的分析法は、広範囲の生物系及び生物物質に適用可能である。これは、ペプチド、オリゴヌクレオチド、及び脂質のような生物学的に重要な分子及びその凝集体が、紫外領域、可視領域、及び赤外領域の電磁放射を吸収し、散乱し、及び／又はその偏光状態に影響するからである。第２に、多くの光学的分析法、特に蛍光標識付け又は赤外標識付け等の選択的光学標識付け技法を使用する方法は、生物物質を同定し、特性評価する選択的で高感度の手段を提供する。第３に、光学的方法は、しばしば、非破壊特性評価方法を構成し、これによって、生物活性、組成、又は物理的状態に大きく影響することなく、生物試料の成分を分析することを可能にする。第４に、光学的分析法は、静的な系及び流動系において、インサイチュのリアルタイム検出を可能にする。最後に、近年、電磁スペクトルの紫外領域、可視領域、及び赤外領域で動作する安価で高感度の光検出器及び安定した光源が入手可能性であることにより、光学的方法を使用する高スループット分析が、商業的にも技術的にも実用的になっている。
【０００５】
[005]これらの利益の結果として、光学的分析法は、生物物質の同定、分類、及び選別に幅広く使用されている。例えば、光学フローサイトメトリは、免疫表現型検査（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）での応用、ＤＮＡ分析、機能検査法（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓａｙ）、細胞選別（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｏｒｔｉｎｇ）、細胞粒子及び非細胞粒子（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｎｏｎｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の定量分析、並びに臨床診断及び治療を含む、種々多様な実験設定で有用であることが実証されている。フローサイトメトリでは、注目する細胞粒子及び／又は非細胞粒子を含む懸濁液が、流体の高速流動内に注入され、これが、粒子の周囲にシースをもたらし、これによって、層流が作られる。シース流体は、流体力学的絞り込み（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）として知られるプロセスで試料よりはるかに高速にポンピングされ、これが、詰まりを最小にし、粒子の試料流れを小さい分析体積内に正確にセンタリングする。粒子の連続的層流は、粒子を空間的に分離し、これら粒子が、光学検出領域を通過するようにする。この光学検出領域は、粒子が特性評価される領域である。光学検出領域では、粒子は、好ましくは一時に一つずつ、選択された波長分布を有するレーザー光といった電磁放射の一以上の入射ビームと相互作用し、これによって、散乱、透過、及び／又は放出電磁放射を生成し、当該電放射が、時間の関数として検出される。細胞物質を特性評価するために従来の光学フローサイトメトリシステムで通常使用される光学測定は、細胞直径を特性評価するための低角度前方散乱光強度と、細胞内の粒状組織の量を判定するための直交散乱光強度とを含む。
【０００６】
[006]蛍光検出法は、従来の光学フローサイトメトリシステムで、特に選択的蛍光標識技法と組み合わせて幅広く使用され、この場合に、複数の波長分布に対応する蛍光強度が、光学検出領域を通過する粒子ごとに同時に検出される。標識付けされたプローブと、大量の蛍光染料、着色剤、及びインターカレータが、さまざまな細胞タイプ及び細胞成分の検出を促進する。いくつかの方法では、蛍光抗体を使用して、細胞検体の特定の表面受容体の密度を測定し、したがって区別された細胞タイプの部分母集団を区別する。総細胞内ＤＮＡ、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ内の特定のヌクレオチド配列、選択されたペプチド及びタンパク質、並びに遊離脂肪酸を含む細胞内成分も、光学フローサイトメトリと組み合わされた蛍光プローブを使用して、日常的に検出され、定量化されている。
【０００７】
[007]したがって、光学フローサイトメトリ技法は、粒状組織の流体流れ内での位置、サイズ、量、並びに、検出可能なマーカーの存在及び存在率等の多数のパラメータに基づいて、個々のセルを区別することを可能にする。この能力の結果、光学フローサイトメータは、しばしば、生物試料内の粒子の母集団の特徴的なプロファイルを生成するのに使用される。例えば、フローサイトメトリは、ＨＩＶ感染に関する治療の過程中に免疫細胞の減退又は維持を測定し、がん患者の予後及び診断のために腫瘍細胞の存在又は不在を判定するのに効果的に使用されてきた。
【０００８】
[008]光学フローサイトメトリは、生物試料の成分を同定し、特性評価するための強力で多彩な技法ではあるが、多数の重要な制限及び短所を有する。第１に、分析される粒子のサイズに関する従来の光学フローサイトメータのダイナミックレンジが、狭い。この制限の結果、多数の異なるフローサイトメータが、しばしば、異なるサイズを有する細胞の分布を含む生物系の研究に必要になる。第２に、フローサイトメータの正しい動作は、細胞又は他の破片の凝集塊が、分析にかけられる試料に存在しないことを必要とする。というのは、これらが、フローセルの層流条件を阻止するか、これに有害に影響する可能性があるからである。したがって、試料及びシース流体は、流れを妨害しないようにするために、注意深く濾過される必要がある。必要な濾過は、しばしば、有害な形でフロー条件に影響せずに効果的に実行することが困難である。第３に、従来のフローサイトメータは、複雑な計装を含み、正しい動作のために高度な訓練を受けたオペレータを必要とする。フローサイトメータのアラインメント及び較正は、単純な作業ではなく、正確で良好に分解された光学的分類を頻繁に達成するように実行される必要がある。第４に、フローサイトメータの正しい動作には、フローセルを頻繁に洗浄し、チュービングを洗い流し、殺菌して、生物膜（ｂｉｏ−ｆｉｌｍ）の堆積、及び汚染を防ぐことが必要となる。洗浄及び殺菌は、これらの方法を使用して微生物を含む試料を特性評価する場合に、特に重要である。第５に、調査中の試料は、多くのフローサイトメータシステムでは分析の後に失われ、したがって、補完的な技法を使用する追加分析にかけることができない。これは、微量でのみ入手可能な試料又は入手が困難な試料を分析する場合に、重大な短所となる。最後に、市販フローサイトメータの実質的なコストは、細胞選別が可能でないシステムであっても、その可搬性における重大な制限に加えて、短所となっており、大規模な研究機関及び臨床機関の外でのこのテクノロジの広範な使用を妨げてきた。
【０００９】
[009]前述したことから、当技術分野では、極端に少量に存在する試料の成分、具体的には生物試料の微量成分を同定し、特性評価するための光学的方法及び光学デバイスが現在必要とされていることが理解されよう。分析される粒子の粒度分布、組成、及び物理的状態に関して大きなダイナミックレンジを提供する光学的分析法及び光学的分析デバイスが必要である。さらに、従来の光学フローサイトメータより生物膜の堆積及び汚染を受けにくく、分析を受ける試料の面倒な事前濾過を必要としない、光学的分析法及び光学的分析デバイスが必要である。最後に、生物試料を分析する安価で単純で可搬性を有する光学的分析デバイスであって、長い訓練なしで技術者が操作できる光学的分析デバイスが必要である。
【発明の概要】
【００１０】
[010]本発明は、試料内の粒子、特に低い存在率で存在する蛍光粒子を分析する光学的方法、デバイス、及びデバイス構成部品を提供する。本発明は、透明な媒質、散乱性媒質、及び／又は光学的に不透明な媒質内の細胞、微生物、生物学的に重要な分子、並びにその凝集体及び複合体を含む粒子を検出し、その濃度を測定し、分類するための走査型共焦点顕微鏡デバイス及び分析方法を提供する。本発明の方法及びデバイスは、短い（例えば約１分未満の）試料走査期間を使用して、広い範囲のサイズを有する粒子を検出し、同定し、分類することができる。本発明の目的は、ａｔｔｏｍｏｌａｒ以下の濃度のような極端に低い濃度で試料に存在する粒子を検出し、物理的特性、化学的特性、及び／又は光学的特性に関してこれら粒子を正確に分類することができる光学的分析デバイス及び分析方法を提供することである。本発明の別の目的は、試料濾過を必要とせず、分析中の試料の消失又は劣化をもたらさない光学的分析システム及び方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、機械的に単純であり、機械的に堅牢であり、安価であり、可搬性の高い光学的分析デバイスであって、長い訓練なしで技術者が簡単に操作できる光学的分析デバイスを提供することである。
【００１１】
[011]一態様においては、本発明は、試料に存在する蛍光粒子といった粒子を分析する光学アナライザ及び方法を提供する。本発明のこの態様に係る実施形態では、光学アナライザは、粒子を含む試料を保持する少なくとも半透明なコンテナと、励起光を生成する光源と、蛍光を集める手段と、コンテナを移動させる手段と、光検出器とを備える。粒子を含む試料を保持する少なくとも半透明なコンテナとしての円筒形キュベットといった光学キュベットの使用は、本発明のこの態様のいくつかの応用に有益である。一実施形態では、レーザー又はランプといった光源によって生成された平行励起光が、試料に供給される。励起光と試料との相互作用は、試料内の粒子の少なくとも一部に蛍光を生成させる。
【００１２】
[012]レンズ、反射器光ファイバ部品、共焦点顕微鏡、又は導波管といった蛍光を集める手段が、試料に光学的に接続され、試料の内側にあり、且つ、コンテナ内に設けられた観察体積から蛍光を選択的に集めるように構成される。懸濁媒質内の粒子の分析に有用な実施形態では、観察体積は、試料を保持する少なくとも半透明なコンテナの壁のすぐ近く（例えば、約５００μ以内、又は、いくつかの応用例では約２００μ以内）に設けられる。コンテナを移動させる手段は、動作可能にコンテナに接続されており、試料内の粒子の少なくとも一部を観察体積を通して移動させるように、コンテナを移動させることができる。コンテナを移動する例示的手段であって、いくつかの実施形態で有用な手段は、所与の試料走査期間において統計的に独立した観察体積をもたらすようにコンテナを回転及び／又は変位させる（例えば、垂直変位、水平変位、又は双方）ことができ、オプションとして、観察体積を通して粒子を、一時に１粒子ずつ移動させる手段を提供する。光検出器は、蛍光を集める手段と光学的に接続されており、観察体積から蛍光を受け、観察体積からの蛍光の強度を測定し、蛍光の時間プロファイルを生成することができる。オプションとして、一つ又は複数のスリットといった一以上の開口が、試料と光検出器との間に設けられて、観察体積から発する蛍光が光検出器によって検出され、他の領域からの蛍光が検出されないことを保証する。オプションとして、励起光フィルタが、光源と試料との間に設けられ、及び／又は発光光フィルタが、試料と光検出器との間に設けられる。いくつかの実施形態では、光検出器によって生成された時間プロファイルの分析が、試料内の粒子の濃度、粒度分布、及び／又は輝度分布の測定をもたらす。
【００１３】
[013]一実施形態では、本発明は、新規の走査型共焦点顕微鏡と、流体試料内に低濃度で存在する蛍光粒子を検出し、カウントし、及び／又は分類することができるパターン認識アルゴリズムを有するプロセッサとを組み合わせた光学的分析デバイスを提供する。この態様の実施形態では、本発明は、試料内の粒子の濃度を決定する光学的分析デバイスを提供し、当該デバイスは、流体試料を保持する少なくとも半透明なコンテナと、励起光を生成する光源と、共焦点顕微鏡と、試料を保持するコンテナを移動させる手段と、光検出器と、パターン認識アルゴリズムを有するプロセッサとを備える。本発明の本実施形態では、共焦点顕微鏡は、励起光を受けるように、光源と光学的に接続される。共焦点顕微鏡は、励起光を、少なくとも半透明なコンテナ内に保持された試料に集束させ、これによって、試料内の粒子に蛍光を生成させ、また、試料内の観察体積から蛍光を集める。光検出器は、共焦点顕微鏡と光学的に接続され、観察体積からの蛍光の少なくとも一部を受け取り、その強度を時間関数として測定し、これによって、観察体積からの蛍光の時間プロファイルを生成する。一実施形態では、共焦点開口が、光検出器の前に設けられ、約１×１０２μｍ３から約１×１０８μｍ３までの範囲から選択される体積を有する観察体積をもたらすスリット又はピンホール領域を有する。一実施形態で、共焦点開口は、約１μから約１００μまでの範囲から選択される幅を有するスリットである。
【００１４】
[014]コンテナを移動させる手段は、コンテナに動作可能に接続されており、光学的分析中にコンテナを移動させることができる。一実施形態では、コンテナを移動させる手段は、光学的分析中に、選択された軌跡に沿って、コンテナを回転し、及び／又は移動させる。当該手段は、例えばコンテナの回転、並びに／若しくは、垂直方向及び／又は水平方向での変位をもたらすことによって、粒子を含む試料を選択された試料走査期間中に観察体積中で移動させる（又は走査する）。オプションとして、コンテナを移動させる手段は、光学的分析中にコンテナを回転させ、これによって、励起光の伝搬軸について分析を受ける粒子の方向を、当該粒子が観察体積を通って移動するように、系統的に変更する。コンテナを移動させる手段は、コンテナに周期的又は非周期的な任意の運動をもたらすことができ、粒子を含む試料を観察体積を通して効果的に移動させ、コンテナを回転させ、或いは、並進運動と回転運動の双方の組合せをもたらす。一実施形態では、コンテナを移動させる手段は、流体試料を保持するコンテナを回転し、垂直に変位させ、及び／又は水平に変位させることができるモーター、スイッチングエレクトロニクス、及び／又は偏心回転板機構である。いくつかの応用例に好適なコンテナを移動させる手段は、選択的に調整可能な回転速度で回転運動をもたらし、選択的に調整可能な軌跡及び変位の速度を有する垂直変位をもたらし、及び／又は選択的に調整可能な軌跡及び変位の速度を有する水平変位をもたらす。一実施形態では、コンテナの垂直変位速度は、毎秒約０．０１センチメートルから毎秒約５センチメートルの範囲において選択され、及び／又はコンテナの回転速度は、毎秒約０．１回転から毎秒約１０回転の範囲から選択される。
【００１５】
[015]パターン認識アルゴリズムを有するプロセッサ、例えばコンピュータ又は他の同等なハードウェアは、光検出器によって生成された時間プロファイルに対応する出力信号を受け取るために、光検出器と少なくとも片方向通信するように設けられる。パターン認識アルゴリズムのオペレーションは、時間プロファイルを分析し、これによって、試料内の粒子の濃度を決定する。一実施形態では、パターン認識アルゴリズムは、時間プロファイル内の特徴と、観察体積を通過する粒子の時間依存蛍光強度に対応する所定のパターンとの整合をとる。本発明で有用な所定のパターンは、時間関数としての強度分布を含み、経験的に決定でき（例えば、蛍光粒子を含む明確に特性評価された試料（例えば、蛍光標識付けされたビーズを含む試料）に対応する蛍光時間プロファイルを測定することによって）、又は予め（ab initio）計算することができる。本発明のパターン認識アルゴリズムは、より大きいデータフィルタリングアルゴリズムの構成要素であってもよく、当該フィルタリングアルゴリズムは、観察体積を通過する粒子に対応する時間プロファイル内の特徴を識別することができる。いくつかの実施形態では、本発明のパターン認識アルゴリズム及びデータフィルタリングアルゴリズムは、蛍光相関分光学技法及び光子カウントヒストグラム分析を介して時間プロファイルを分析することもできる。
【００１６】
[016]離散的な粒子検出事象は、時間プロファイル内の特徴と所定のパターンとの振幅及び形状の間の整合をとることによって特定される。粒子の濃度は、所与の試料走査期間における時間プロファイル内の特徴と整合する所定のパターンの個数を計算することによって決定される。一実施形態では、これは、大きいベクトルをもつ各点で最小二乗計算を実行するフィルタアルゴリズムのオペレーションによって実行される。このアルゴリズムは、局所χ二乗を最小化するフィルタの最大の振幅を計算する。ここで、振幅は、フィルタ強度の乗数である。χ二乗は、雑音ウィンドウ内の指定された雑音レベルと大きいベクトルをもつ特定の点でのカウント数の平方根を考慮した標準偏差の推定値との合計による所定のパターンへのフィット（近似）と生データとの間の差に重みを付けることによって計算される。濃度は、整合した個数を選択された試料走査期間中に分析された試料の体積で割ることにより、分析された時間プロファイルから抽出される。この試料の体積は、観察体積のサイズ、コンテナの移動の速度（例えば、垂直変位及び水平変位の速度）、及び試料走査期間の持続時間の知識を用いて正確に計算することができる。
【００１７】
[017]パターン認識を使用する本発明のデータ分析の重要な機能的特性は、分析を受ける試料を保持するキュベットを移動する（例えば、回転する、並進させる、又は変位させる）ことによって、蛍光及び励起光の透過、吸収、及び／又は散乱の変化について正確に訂正できることである。いくつかの実施形態で、この訂正は、観察体積からの背景蛍光及び／又は散乱された励起光の時間の関数としての変化について補正することと実質上等しい。したがって、本発明のパターン認識分析は、走査型光学計装を使用し試料コンテナを照明及び光学的分析中に移動させて実行される測定の精度及び再現性を向上する。
【００１８】
[018]オプションとして、パターン認識アルゴリズムのオペレーションは、サイズ、形状、及び拡散速度のような一以上の物理的特性、輝度等の光学的特質、並びに／若しくは、注目する蛍光及び／又は蛍光標識付けされた生体分子（例えば、ペプチド、タンパク質、脂質、ｍ−ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、又はこれらの凝集体及び複合体）の存在及び／又は存在率等の化学的特質に基づいて、試料内の粒子を分類する。粒子粒度分布及び粒子輝度分布等の粒子の集合の特性は、時間プロファイル内の特徴と整合する所定のパターンの強度分布の振幅及び形状の分析によって決定される。時間プロファイル内の特徴と整合する所定のパターンの幅、例えば半値全幅は、観察体積内の粒子の滞留時間に正の相関を有し得る。或いは、観察体積を通過する粒子のサイズは、事前に選択されたパターンの幅を変更し、時間プロファイル内の特徴に対して量的に整合をとることによって、判定することができる。別の実施形態では、時間プロファイル内の特徴及び／又は時間プロファイル内の特徴に整合する所定のパターンの輝度積分が、観察領域内の粒子のサイズ及び形状等、粒子の物理的特性、光学的特性、及び／又は化学的特性の測定値を提供する。
【００１９】
[019]蛍光データの分析にパターン認識アルゴリズムを使用することは、本光学的分析の方法及びデバイスの感度を高め、機能的能力を拡張するので、有益である。第１に、パターン認識アルゴリズムの使用は、１分未満の試料走査期間を使用して１ミリリットルあたり１０粒子もの低い濃度で低い輝度を有する粒子を検出することを可能にする。これは、従来の走査型共焦点顕微鏡法と比較して、約１０８倍の感度の改善をもたらす。第２に、本発明のパターン認識アルゴリズムは、約１０％の任意の正確さで、サイズに基づいて、粒子を分類することを可能にする。さらに、パターン認識アルゴリズムを有するプロセッサの使用は、粒子を、サイズに基づいて、約２５０ナノメートルから数十μまでの範囲といったサイズの広いダイナミックレンジで分類可能とするサイズ分析法を提供する。最後に、パターン認識アルゴリズムは、拡散定数、形状、輝度、及び組成といった他の重要な粒子の特性に基づいて、正確な粒子の分類をもたらす。
【００２０】
[020]このデータ分析手法の別の利益は、パターン認識を介する分析に有用な所定のパターン及びかかる分析アルゴリズムでのそれらパターンの使用が、粒子の組成又は粒子が分散される媒質の組成に強くは依存しないことである。本発明では、濃度測定は、粒子検出事象の回数の特定と、試料走査期間中に走査された試料の正味体積の判定とを伴う。粒子検出事象は、所定のパターンと、観察体積からの蛍光の観察した時間プロファイル内の特徴との整合をとることによって特定される。本発明の所定のパターンは、試料に存在する粒子のタイプと、粒子を含む媒質の密度及びイオン強度といった物理的特性との知識を用いて理論的に又は経験的に、試料内の粒子の拡散速度及び移動速度の差を考慮するよう、スケーリングし、正規化し、及び／又は訂正することができる。したがって、本技法は、分析を受ける系の正確な性質に強く依存する入念な較正手順なしで、粒子の濃度の判定を可能にする。粒子を分類する場合には、本方法及び本デバイスは、時間プロファイル内の特徴に所定のパターンの振幅及び形状を整合させる較正手順を使用する。例えば、粒子のサイズは、その粒子が共焦点体積（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）を通過するのに要する時間によって推定することができる。原理上は、スリットのサイズ、光学拡大率、及び回転速度を与えれば、先験的較正なしに、サイズを得ることができる。しかし、既知のサイズの粒子を用いる較正を、本発明で使用することもできる。
【００２１】
[021]共焦点顕微鏡と、試料を保持する少なくとも半透明なコンテナを移動させる手段との組合せは、観察体積を通る流体試料の実質的な体積（例えば、数ミリメートル）を、流動系の使用を必要とせず、移動させる効果的な手段をもたらす。この説明においては、「走査」とのは、粒子が光学的に検出され、及び／又は特性評価されることができるように、粒子を含む試料を共焦点顕微鏡の観察体積を通って運ぶこと又は移動させることを指す。さらに、この説明での走査は、観察体積内での粒子の位置が、例えば試料コンテナの回転によって、励起光の光軸に対して変更されるようにする透明コンテナの移動をも指す場合がある。本発明の一実施形態では、コンテナは、同時に回転されて垂直に変位され、分析を受ける試料の走査をもたらす。コンテナの垂直変位は、コンテナの軌跡を生成し、当該軌跡は、観察体積中に粒子を通し、走査される試料についての試料走査中に分析される体積が統計的に独立であることを保証する。この説明において、本デバイス及び本方法によって分析される観察体積についての「統計的に独立」とは、後続の走査中に同一構成で同一の粒子を見る確率が、極端に低く（例えば、０．０１％未満）、いくつかの場合に無視できる（例えば、０．０００１％未満）という事実を指す。観察体積中に粒子を移動させることに加えて、コンテナの回転は、励起光の光軸に対する粒子の位置を系統的に変更し、これによって、光学検出中の粒子の位置を走査する手段をもたらす。したがって、光学的分析中のコンテナの回転は、励起光の伝搬軸に対する観察領域内の回転位置の関数として粒子を特性評価する手段をもたらす。特に、コンテナの回転は、複数の光学的観点（すなわち、粒子を通る軸）から粒子を特性評価することを可能にし、このことによって、粒子のサイズ、形状、及び組成に関する追加情報を提供する。円筒形キュベットの回転（毎秒約５回転から毎秒約１０回転）と、より低速の垂直反転（毎秒約２．５センチメートルから毎秒約５センチメートル）との組合せは、ｓｕｂ−ａｔｔｏｍｏｌａｒ濃度の試料内の粒子の濃度を測定し、サイズに関してこれらを分析するのに有用なコンテナ軌跡をもたらす。
【００２２】
[022]光学的分析中に観察体積を通って移動される（例えば、回転、垂直変位、及び／又は水平変位によって）流体試料の正味体積は、走査期間の長さと、試料を保持するコンテナの移動の速度と、観察体積のサイズとに依存する。観察体積のサイズは、共焦点顕微鏡で使用される共焦点開口のサイズ、具体的には試料と光検出器との間に位置決めされる共焦点開口のサイズによって制御される。より小さい観察体積は、バックグラウンドに対する信号強度比を高め、観察体積を通過する粒子が一時に一つずつ検出されることを確実にするのに有益である。しかし、より小さい観察体積の使用は、より大きい観察体積を使用するシステムで分析されるのと同等の正味試料体積を分析するために、より長い試料走査期間を必要とする。したがって、観察体積及び試料走査時間の選択は、これらのデバイス性能属性におけるトレードオフである。いくつかの応用例では、最適の妥協は、注目する粒子の正確な検出及び特性評価をもたらす最大の共焦点開口を使用することである。観察体積を増やす（より広い共焦点開口を使用する）ことによって、所与の実行時間に走査される全体積が、より大きくなる。或いは、光学的分析を受ける試料を、分析の前に希釈して、粒子が一時に一つずつ検出体積中を移動することを保証する濃度を達成してもよい。試料希釈は、高散乱性の媒質又は高吸収性の媒質に分散された粒子を特性評価する場合にも有用なことがある。
【００２３】
[023]光学的分析中に試料を走査するデバイス構成部品のこの組合せは、本発明のこの態様の方法及びデバイスにおける複数の具体的な利益をもたらす。第１に、試料コンテナを移動させる手段と組み合わされた共焦点顕微鏡の使用は、観察領域を通って粒子を移動させる手段をもたらし、流体の流れを生成する必要をなくす。その結果、分析を受ける試料は、光学フローサイトメトリシステムのように試料の流れ及び詰まりに関連する問題を防ぐための徹底的な事前濾過を必要としない。さらに、試料は、デバイスの内部構造には絶対に入らず、これによって、本分析システムは、汚染、細菌増殖、及びバイオ−フィルムの形成に関連する問題をより受け難くなる。さらに、試料は、光学的分析中に失われず、損傷を受けず、或いは劣化せず、これによって、本方法によって検出され、特性評価された後に、試料を追加の補完的な分析にかけることが可能になる。第２に、共焦点顕微鏡の使用は、ピコリットルほどの非常に小さい観察体積の使用を可能にし、これは、粒子が一時に一つずつ観察領域を通過するようにし、信号対雑音比を改善するのに有用となる。しかし、コンテナの垂直変位及び回転によって、約１秒から約１００秒に等しい走査期間といった比較的短い試料走査期間を使用して、約１ミリリットルから約１０ミリリットルに等しい試料体積といったより大きい試料の体積の特性評価を可能にする。第３に、共焦点顕微鏡の使用は、観察領域が試料を保持するコンテナの壁の比較的近く（例えば、約５０ミクロンから約５００ミクロンまで）に位置するように、照明焦点を選択することを可能にする。この特徴は、半透明な媒質及び／又は非常に散乱性の媒質、例えば懸濁媒質の成分を、本デバイス及び本方法を使用して効果的に分析することを可能にする。第４に、試料コンテナを移動させる手段と組み合わされた共焦点顕微鏡の使用は、移動する光源、光検出器、又は二色性ミラー等の可動光学部品を備える複雑な光学系を必要とせずに、粒子を含む試料を観察領域中で移動させる手段をもたらす。本発明のこの態様は、単純で機械的に堅牢な実験システムであって、走査の間に繰り返される光学的アラインメントを必要としない実験システムを提供するので、有益である。
【００２４】
[024]別の態様では、本発明は、流体試料内の粒子を選択的に検出し、その濃度を測定する方法及びデバイスと、異なる物理的特質及び／又は化学的特質を有する粒子を区別することができる光学的分析方法及び光学的分析デバイスを提供する。本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、検出の特異度は、蛍光染料、染料、共有結合標識、及び／又はインターカレータのような一以上の蛍光プローブであって、表面結合のタンパク質、細胞間のタンパク質、又は細胞内のタンパク質、ペプチド、脂質、オリゴヌクレオチド、若しくは、これらの凝集体又は複合体といった試料の特定の成分に選択的に会合する（共有結合によって又は共有結合によらずに）蛍光プローブを用いて試料を処理することによって実現される。例えば、本方法及び本デバイスは、試料の異なる成分と選択的に会合する核酸蛍光体及び蛍光抗体といった複数の異なる蛍光プローブを用いて処理される流体試料の分析によく適する。この実施形態では、異なる波長分布の光による同時励起又は順次励起と、複数の異なる波長での蛍光の検出とが、一以上の蛍光プローブと選択的に会合する試料内の粒子の弁別的検出及び定量化を可能にする。或いは、検出の特異度は、本発明のいくつかの方法及びデバイスでは、観察体積を通過する粒子の拡散定数に基づいて実現される。本発明のこれらの実施形態では、観察による蛍光の時間プロファイル内の特徴の強度分布を分析して、検出された粒子に関連する拡散定数を決定する。例えば、いくつかの例では、時間プロファイル内の特徴の幅、又は時間プロファイル内の特徴と整合する所定のパターンの幅は、観察体積内の粒子の拡散定数又は滞留時間に正の相関を有する。異なるサイズ、形状、又は電荷を有する粒子といった異なるタイプの粒子は、異なる拡散定数を有するので、本発明のこの機能的能力は、試料内の異なる粒子タイプを区別する手段をもたらす。或いは、検出の特異度は、本発明のいくつかの方法及びデバイスで、測定された粒子輝度に基づいて実現される。これらの実施形態では、時間プロファイル内の特徴の総積分強度が、決定され、粒子の異なるタイプを区別するのに使用される。例えば、いくつかの例で、本発明のこの態様は、細胞又は微生物等の粒子を、試料に投与された一以上の蛍光プローブに選択的に結合するタンパク質、ペプチド、脂質、及びオリゴヌクレオチドといった特定の生体分子の存在及び存在率に基づいて、区別する手段をもたらす。
【００２５】
[025]別の態様では、本発明は、観察領域を通って移動される粒子と会合した複数の異なる蛍光プローブからの蛍光を同時に独立に監視することのできる多チャネル光学アナライザを提供する。一実施形態では、複数の光検出器、波長区別要素、及び対応する共焦点開口が、共焦点顕微鏡と光学的接続され、異なる励起波長及び／又は発光波長を有する複数の蛍光プローブが、分析を受ける流体試料に供給される。各蛍光プローブの組成は、例えば、異なる表面結合の又は細胞内のタンパク質又はペプチドに選択的に結合する複数の異なる核酸蛍光体又は蛍光抗体を使用することによって、試料内の注目する物質に選択的に会合するように選択される。一つ以上の光源からの光による励起は、一つ以上のプローブによって標識付けされた粒子に蛍光を放たせる。この蛍光の強度及び波長分布は、その粒子に会合した蛍光プローブの存在率及び素性に依存し、したがって、組成に基づいて粒子を分類するのに使用することができる。複数の光検出器は、光フィルタ、格子、プリズム、モノクロメータ、又は二色性反射器といった波長弁別部品を備えており、各光検出器は、選択された蛍光プローブから発する蛍光を検出できるが、粒子と会合した他の蛍光プローブから発する蛍光を検出しないようになっている。したがって、この光学的構成の各光検出器は、選択された蛍光プローブに対応する観察体積からの蛍光の時間プロファイルを独立に生成する。本発明のこの構成は、優れた検出特異度をもたらすので有益である。というのは、注目する粒子に、電磁スペクトルの異なる領域で発光する複数の蛍光プローブを用いて標識を付けることができるからである。同時発生検出事象のための複数の光検出器の出力を分析することによって、注目する粒子の弁別的検出及び定量化が可能になる。
【００２６】
[026]別の態様では、本発明は、多チャネル光学アナライザを提供し、当該アナライザでは、共焦点顕微鏡と光学的に接続し、異なるサイズを有する共焦点開口（例えばスリット）をそれぞれが有する複数の光検出器が設けられている。この実施形態では、光検出器は、異なる有効焦点体積を有する観察体積からの光を検出する。本発明で同時に分析される観察体積は、オーバーラップするように配置することができ、いくつかの実施形態では、同心に配置される。異なる有効焦点体積に対応する観察体積の蛍光時間プロファイルの同時分析は、試料内の粒子の粒度分布をより正確に決定することを支援する。これは、粒子のサイズが共焦点スリットを通る走行時間を変化させるからである。異なる共焦点開口を使用して、粒子のサイズ及び／又は輝度をより正確に決定することができる。さらに、光軸の方向に沿った粒子の位置を、この実施形態の多チャネルシステムを使用して決定することができる。
【００２７】
[027]本発明は、パターン認識分析技法に加えて又はそれ以外の統計分析法を使用する方法及びデバイスをも含む。一実施形態では、例えば、本発明は、観察された時間プロファイルが、検出された光子のヒストグラムを生成する光子ヒストグラム分析アルゴリズムのオペレーションによって分析されるデバイス及び方法を提供する。この分析法を使用して獲得された光子カウントヒストグラムは、観察体積から発する蛍光の光の揺らぎの振幅分布を特性評価し、サンプリング時間あたりに所与の個数の光子を検出する確率分布に関係付ける。単一の種の蛍光粒子の場合には、光子カウントヒストグラムの特徴は、二つのパラメータ、すなわち、観察体積内の粒子の平均個数と、粒子輝度とによって表すことができる。この粒子輝度は、サンプリング時間あたりに粒子一つにつき検出される光子の平均個数と定義される。さらに、試料に存在する異なる蛍光を発する種が、十分な間隔をおかれた輝度の大きさを有する場合に、これらの種を区別するのに光子カウントヒストグラム分析を使用することが可能である。或いは、本発明は、観察された時間プロファイルが、蛍光相関分析アルゴリズムのオペレーションによって分析されるデバイス及び方法を提供する。本発明の例示的な蛍光相関分析アルゴリズムは、蛍光の揺らぎの時間的自己相関を求める。この自己相関は、時間の関数としての蛍光の揺らぎの時間的持続時間の測定値を提供する。この分析は、観察体積内の分子の個数に関する情報と、観察された蛍光の揺らぎ、例えば、検出された粒子の拡散定数及び拡散速度を求めるプロセス及びパラメータと、を提供する。
【００２８】
[028]別の態様では、本発明の光学的分析デバイス及び光学的分析方法は、観察体積を通過する粒子の蛍光強度プロファイルから導出される制御信号に基づき、閉ループフィードバック制御が可能である。本発明のこの態様は、流体試料内の選択された粒子を複数回検出し特性評価することができる光学的分析方法デバイスを提供する。本発明のこの態様の実施形態では、粒子を含む試料は、試料を保持するコンテナの選択されたコンテナ軌跡に沿った移動によって、観察体積を通して移動される。観察領域内の粒子からの蛍光が、集められ、これによって、時間プロファイルが生成され、この時間プロファイルが、プロセッサによってリアルタイムで分析される。プロセッサは、時間プロファイルを分析するパターン認識アルゴリズムを有し、移動するコンテナの軌跡を選択的に調整できるコントローラと少なくとも片方向通信するように設けられる。粒子の特性は、時間プロファイルの分析を介してリアルタイムに決定され、コントローラに供給される一以上の制御信号の基礎とされる。一実施形態では、試料走査期間中に選択された粒子を、観察領域を通して複数回移動させることができる新しいコンテナ軌跡を指示する制御信号が、コントローラに供給される。例えば、検出された粒子の物理的特性又は化学的特性が、その粒子を適当に分類するために更なる光学的分析が必要であることを示す場合があり、したがって、プロセッサは、注目する粒子を観察体積を通して移動させることのできる変更版のコンテナ軌跡を開始する制御信号を生成し、これによって、一以上の追加の粒子検出事象をもたらす。
【００２９】
[029]本発明は、光学的分析を受ける流体試料に導入された粒子の濃度の統合された測定を提供することができる統合粒子測定システムをも提供する。本発明のこの態様では、試料を保持するコンテナは、試料に粒子を導入する手段に動作可能に接続される。例えば、一実施形態では、光学的分析の前に及び／又は光学的分析中に、試料を通して気体を泡立たせるか、連続的に又は滴状で液体を導入するために、コンテナへのチューブが設けられている。粒子を含む液滴を試料に供給できる流体導入システムを、コンテナに接続することができる。これらの実施形態では、粒子は、連続的に又は離散的な時刻に、コンテナに系統的に供給される。本発明の光学的分析デバイスは、試料を周期的に又は連続的に探測し、これによって、時間の関数としての試料内の粒子の特性評価を実現する。例えば、一実施形態では、本発明の統合粒子測定システムは、流体試料に蓄積する粒子の濃度、粒度分布、組成、輝度、又はこれらの特性の組合せの測定を実現する。本発明のこの態様は、室内の空気等の環境試料又は水試料内の病原体及び／又は汚染物の検出に特に有用である。
【００３０】
[030]本発明の方法及びデバイスは、共焦点顕微鏡の観察体積内の光ルミネセンス過程、化学発光過程、又は電界発光過程を介する発光を経る粒子の光学的分析に幅広く適用可能である。例えば、本デバイス及び本方法は、化学発光及び／又は生物発光を経ることのできる粒子を同定し、分類し、及び／又はその濃度を決定するのに有用である。本発明のこれらの態様では、共焦点顕微鏡の観察体積を通過する粒子からの発光が、試料に励起光を供給する必要なしに、集められ、検出され、分析される。本方法での蛍光は、単一光子吸収過程又は多光子吸収過程によって励起することができる。２光子励起スキームといった本方法における多光子励起を使用することによってもたらされる利益は、測定可能な多光子吸収を生成するのに十分に高い励起光強度を有する非常に小さい観察体積からの蛍光を集め、検出し、分析することができることである。
【００３１】
[031]本方法及び本デバイスは、さまざまな物質を含む試料の特性評価に有用である。これら物質には、液体、コロイド、分散懸濁液、乳濁液、コロイド溶液、及び混合物があるが、これらに限定されない。本方法及び本デバイスは、透明度の高い媒質内、半透明な媒質内、及び散乱性の高い媒質内にある天然に蛍光を発する成分及び蛍光標識付けされた成分を検出するのに有用である。本発明は、体液、組織懸濁液、食物飲料、組換え発現系等の発現系から生成された流体、及びこれらから導出される試料といった生物試料の分析に特によく適する非破壊光学的分析法を提供する。本方法は、低い濃度の生物物質を検出し、分類することができる。生物物質としては、原核細胞と、真核細胞と、細菌と、ウィルスと、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、脂質等の生体分子と、これらのすべての凝集体及び複合体と、を挙げることができるが、これらに限定されない。本デバイス及び本技法によって分析される物質の組成に関する多彩性は、本デバイス及び本技法を、広範囲の応用に適切なものにする。これら応用には、細胞物質及び微生物の特性評価、生物試料に存在する生体分子の同定、食料品に存在する物質の検定、試料内の病原体の検出、臨床診断及び治療応用のための生物試料の検定、試料の高スループット定量分析、並びにタンパク発現レート（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒａｔｅ）を監視する機能検定法があるが、これらには限定されない。
【００３２】
[032]別の実施形態では、本発明は、試料内の粒子を分析する方法を提供し、当該方法は、（ｉ）少なくとも半透明なコンテナ内で粒子を含む試料を提供するステップと、（ｉｉ）試料に励起光を向けるステップであって、これによって試料内の粒子の少なくとも一部に蛍光を生成させる、当該ステップと、（ｉｉｉ）試料内の観察体積から蛍光を集め、観察体積からの蛍光を光検出器に向けるステップと、（ｉｖ）コンテナを移動するステップであって、これによって試料内の粒子を観察体積中に通過させる、当該ステップと、（ｖ）光検出器を使用して時間の関数として観察体積からの蛍光の強度を測定するステップであって、これによって観察体積からの対応する蛍光の時間プロファイルを生成する、当該ステップと、を含む。本発明のこの態様のオプションの方法は、パターン認識アルゴリズムを使用して時間プロファイルを分析するステップを更に含み得る。
【００３３】
[033]別の態様では、本発明は、粒子を含む試料内の粒子の濃度を判定する方法を提供する。この方法は、（１）少なくとも半透明なコンテナ内で粒子を含む試料を提供するステップと、（２）粒子を含む試料と光学的に接続された共焦点顕微鏡に励起光を向けるステップと、（３）共焦点顕微鏡を使用して試料に励起光を集束させ、これによって粒子に蛍光を生成させるステップと、（４）共焦点顕微鏡を使用して試料内の観察体積からの蛍光を集めるステップと、（５）コンテナを移動させるステップであって、これによって試料内の粒子を観察体積中に通過させる、当該ステップと、（６）共焦点顕微鏡と光学的に通じて位置決めされた光検出器を使用して、時間の関数として観察体積からの蛍光の強度を測定するステップであって、これによって観察体積からの対応する蛍光の時間プロファイルを生成する、当該ステップと、（７）パターン認識アルゴリズムを使用して時間プロファイルを分析するステップであって、これによって時間プロファイルから試料内の粒子の濃度及びサイズを決定する、当該ステップと、を含む。
【発明の詳細な説明】
【００３４】
[050]以下、図面を参照する。図面においては、同様の符号は、同様の要素を示し、複数の図面に現れる同一の符号は、同一の要素を指す。さらに、以下では、次の定義が当て嵌まる。
【００３５】
[051]「流体」及び「流体試料」は、同義に使用され、保持されるコンテナの形状に従うことができるすべての物質を指す。本発明の方法と共に使用可能な流体は、液体、複数の液体の混合物、発泡体等のコロイド、乳濁液、コロイド溶液、粒子の分散系、粒子の懸濁液、及びこれらの任意の組合せを含むが、これらに限定はされない。この説明における流体は、尿、血液、脊髄液、血漿を含む細胞及び非細胞の血液成分、血小板を含む試料、赤血球細胞を含む試料、白血球細胞を含む試料、組織エキス及び組織懸濁液、食料品、遺伝子組換え法から生成された発酵媒質、治療物質及び診断物質を含む組換え技法によって作られた物質、治療物質及び診断物質を含む遺伝子導入動物及び遺伝子導入植物から作られた物質、牛乳及び乳製品、水、飲料、化学製品及び医薬品、並びにワクチン等の生物学的流体を含む。
【００３６】
[052]「粒子」は、試料に存在する可溶性及び不溶性の物質を指す。この説明における粒子は、分子、イオン、高分子、生体分子、真核細胞及び原核細胞等の細胞、細胞の成分、細菌及びウィルス等の微生物、病原体、並びにこれらのすべての成分、複合体、及び凝集体を含むが、これらに限定はされない。「生体分子」は、有機体によって作られるか生きている有機体にとって重要な分子を指し、タンパク質、ペプチド、ペプチドホルモン、脂質、ＤＮＡ分子、ＲＡＮ分子、オリゴヌクレオチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質、砂糖、並びにこれらの派生物、変種、凝集体、及び複合体（一つ又は複数の蛍光標識を有する、これらの標識付けされた類似化合物を含む）を含むが、これらに限定されない。「蛍光粒子」は、励起光によって励起された時に蛍光を生成できる粒子を指し、元来的な蛍光粒子と、一以上の蛍光体との会合（共有結合又は非共有結合）によって蛍光性となった粒子とを含み、蛍光体には、蛍光標識付けされた粒子、染められた粒子、蛍光タグ付けされた粒子、及びインターカレータ又は染料と会合した粒子がある。蛍光粒子は、単一の蛍光体又は複数の蛍光体と会合する場合がある。蛍光粒子は、蛍光体を用いて選択的に標識付けし又はタグ付けすることができる。蛍光体は、特定のタイプの粒子又は、タンパク質及び／又はオリゴヌクレオチドのような粒子の特定の要素と選択的に会合する
【００３７】
[053]「蛍光時間プロファイル」は、時間の関数としての蛍光強度の分布を指す。蛍光時間プロファイル内の「特徴」は、時間の関数としての強度の変化によって特徴付けられる時間プロファイルの一部を指し、いくつかの応用例に関して好ましくは、時間の関数としての強度の統計的に有意な変化によって特徴特徴付けられる時間プロファイルの一部を指す。蛍光時間プロファイルの特徴は、本デバイス及び本方法の観察体積を通る一以上の粒子の存在及び／又は通過から生じ得る。
【００３８】
[054]「光学的に接続され」及び「光学的に結合され」は、本説明では同義に使用されるものであり、光がある要素から別の要素に伝搬することができる複数のデバイス部品の構成を指す。これらデバイス部品は、デバイス構成部品を使用して、直接に又は間接に光学的に結合することができる。デバイス部品には、導波管、光ファイバ要素、反射器、フィルタ、プリズム、レンズ、格子、及びこれらのデバイス構成部品の任意の組合せがある。
【００３９】
[055]「強度」との用語は、励起光又は蛍光等の光の電場ベクトル又は磁場ベクトルの振幅を指す。「強度」との用語は、その代わりに、光を検出した時に光検出器によって生成される信号の振幅、例えば、光ダイオード又は光電子増倍管によって生成される電流の振幅を指す場合がある。
【００４０】
[056]「電磁放射」及び「光」との用語は、本出願では同義に使用され、電場及び磁場の波を指す。本発明のデバイス及び方法で蛍光粒子を励起するのに有用な電磁放射は、紫外光、可視光、近赤外線、遠赤外線、又はこれらの組合せを含む。
【００４１】
[057]「半透明」は、物質、デバイス、又はデバイス構成部品の、それに入射する電磁放射の少なくとも一部を透過させることができる特質を指す。
【００４２】
[058]「移動」は、分析を受ける試料を保持する少なくとも半透明なコンテナの運動等、デバイス又はデバイス構成部品の変位を指す。移動は、あらゆるタイプの運動を含み得るものであり、垂直変位、水平変位、円形軌道運動、楕円軌道運動、放物線運動、直線運動、及びこれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない。移動は、周期運動又は非周期運動をもたらすことができる。
【００４３】
[059]「所定のパターン」は、時間の関数としての関数形式の強度の分布を指し、時間プロファイル内の特徴に対して整合されるか、これにあてはめられる。特徴の整合に使用される所定のパターンは、適当にスケーリングされ又は正規化されたガウス関数又はローレンツ関数を使用するといったように、アブイニシオ法によって導出することができ、或いは、例えば既知のサイズ、形状、及び輝度を有する粒子の観察体積を通る通過に対応する強度分布を測定することによるように、経験的に導出することができる。所定のパターンをスケーリングし、正規化し、又は調整して、蛍光時間プロファイル内の特徴に対する所定のパターンの整合を最適化することができる。本発明で有用な関数形式の所定のパターンは、光学検出特性評価システムの特徴を表す複数の実験パラメータに依存し、当該パラメータとしては、励起光学部品及び検出光学部品のアラインメントと、光検出器の前に位置決めされた開口の幅とを挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、本発明で有用な関数形式の所定のパターンは、共焦点顕微鏡の点像分布関数の体積に対する粒子のサイズ、粒子の形状、及び粒子の輝度等、検出及び／又は特性評価を受ける粒子の特性にも依存し得る。
【００４４】
[060]以下の説明では、本発明の正確な性質の完全な説明を提供するために、本発明のデバイス、デバイス構成部品、及び方法の多数の具体的な詳細を示す。しかし、本発明をこれらの具体的な詳細なしで実践できることは、当業者にとって明白であろう。
【００４５】
[061]本発明は、流体試料内の粒子を検出し、同定し、分類し、特性評価する方法及びデバイスを提供する。具体的には、本発明は、パターン認識データ分析技法を使用する走査型共焦点顕微鏡デバイスであって、非常に低い濃度で存在する蛍光粒子の濃度を測定し、サイズ、形状、拡散定数、及び／又は組成に基づいて、蛍光粒子の特性を評価する走査型共焦点顕微鏡デバイスを提供する。
【００４６】
[062]図１Ａに、本発明の光学的分析デバイスであって、流体試料内の蛍光粒子の濃度を測定する光学的分析デバイスの平面図の概略図を示す。光学的分析デバイス１００は、光源１１０、共焦点顕微鏡１２０、粒子を含む流体試料１３５を保持する光学キュベットのような少なくとも半透明なコンテナ１３０、コンテナを移動させる手段１４０、光検出器１５０、及びパターン認識アルゴリズムを有するプロセッサ１６０を備える。図１Ａに示す実施形態では、共焦点顕微鏡１２０は、コリメーション部品（例えば、ピンホール又はスリット）１７０、二色性反射器１８０、第１対物レンズ１９０、第２対物レンズ２００、及び共焦点開口２１０（例えば、ピンホール又はスリット）を有する。オプションとして、光学的分析デバイス１００は、発光フィルタ２１２、励起フィルタ２１４、アナログ−ディジタル変換器２２０、ディスプレイ２３０、及びデバイスコントローラ２４０を更に備えていてもよい。
【００４７】
[063]光源１１０は、励起光（概略的に点線３００によって示す）を生成し、この励起光は、共焦点顕微鏡１２０に供給される。励起光は、オプションとしてコリメーション部品１７０を通過し、これによって、コリメートされた励起光が生成され、この励起光が二色性ミラー１８０に向けられる。コリメートされた励起光の少なくとも一部は、第１対物レンズ１９０を通過し、第１対物レンズ１９０は、励起光を試料１３５に集束させる。集束された励起光は、コンテナ１３０の壁を通って少なくとも部分的に透過され、試料１３５内に設けられた小さな観察体積２７０に集束される。試料に供給された励起光３００は、蛍光粒子を励起し、蛍光を生成する。観察体積２７０からの蛍光の一部（概略的に破線３１０によって表される）は、共焦点顕微鏡１２０によって集められ、光検出器１５０に供給され、当該光検出器１５０が、時間の関数として蛍光３１０の強度を測定する。蛍光３１０は、通常は励起光３００の伝搬軸と一致する伝搬軸に沿って伝搬するが、図１Ａでは（及び図５でも）、これらの図を説明するために、蛍光から励起光を区別する手段を提供するよう、励起光３００からわずかにずれて図示されている。図１Ａに示す実施形態では、観察体積２７０からの蛍光３１０は、二色性反射器１８０によって反射され、第２対物レンズ２００及び共焦点開口２１０を通過し、光検出器１５０の検出面（例えば、光電陰極又は光ダイオード）に結像される。共焦点開口２１０を使用することによって、第１対物レンズの焦点面から発するものではない蛍光による光が、光検出器１５０の検出面に達することが防止される。本発明は、光源１１０が、更なるコリメーションを必要とせず空間的にコリメートされた励起光のビームをもたらすレーザーを含む場合には、コリメーション部品１７０を有しない実施形態を含む。
【００４８】
[064]光学的分析中に、コンテナを移動させる手段１４０は、選択された軌跡に沿ってコンテナ１３０を移動し、これによって、粒子を含む試料を、観察体積２７０を通して移動させる。好適にはいくつかの応用例の場合に、粒子は、一時に一つずつ、観察体積に入り、観察体積から出るように移動される。図１Ａに示す実施形態では、コンテナを移動させる手段１４０は、コンテナの中心を通り、励起光の伝搬軸と交差する回転軸の回りでコンテナ１３０を回転すると同時に、ある軸、例えばコンテナ１４０の回転軸に実質的に平行な又はこれと一致する軸に沿ってコンテナ１３０を垂直に変位させる。コンテナ１３０の回転は、概略的に矢印３５０によって示されており、コンテナ１３０の垂直変位は、概略的に矢印３６０（図１Ｂを参照されたい）によって示されている。
【００４９】
[065]図１Ｂは、円筒形キュベットを含むコンテナ１３０の拡大側面図を示す。図１Ｂは、試料１３５内の観察体積２７０も示している。また、図１Ｂは、回転−垂直変位軸３８５及び励起光の伝搬軸３８４も示している。矢印３５０及び３６０によって概略的に示されているように、コンテナ１３０は、回転−垂直変位軸３８５の回りで回転されると同時に、回転−垂直変位軸３８５に沿って垂直に変位される。コンテナ１３０のこの回転と垂直並進との組合せによって、粒子を含む試料を観察体積２７０を通して移動させ、励起光の伝搬軸３８４に対する観察体積２７０内の粒子の位置を系統的に変更する。測定される蛍光強度に対応する信号対雑音比を最適化するのに有用な実施形態では、回転及び／又は垂直変位の速度が、選択的に調整可能である。本発明は、回転と垂直変位との組合せ以外の方法でコンテナ１３０が移動される実施形態も含み、この移動には、水平変位に、回転、垂直変位、又は回転と垂直変位の双方を組み合わせた移動がある。
【００５０】
[066]オプションとして、励起光３００は、光源１１０の前に配置された励起フィルタ２１４に通される。この励起フィルタ２１４は、試料内の粒子を励起できる光の波長を透過することができ、蛍光粒子の励起時に生成される蛍光３１０に対応する光の波長の透過を実質的に防ぐことができる。オプションとして、蛍光３１０は、光検出器１５０の前に配置された発光フィルタ２１２に通される。この発光フィルタ２１２は、蛍光３１０に対応する光の波長を透過することができ、試料内の蛍光粒子の励起波長に対応する光の波長の透過を実質的に防ぐことができる。オプションとして、二色性反射器１８０は、例えば優先的に励起光３００を透過し、優先的に蛍光３１０を反射することによって、波長弁別を行うことができる。励起フィルタ２１４、発光フィルタ２１２、二色性反射器１８０、又はこれらの光学部品の任意の組合せによってもたらされる波長弁別は、粒子の検出、粒子の濃度の測定、及び粒子の分析に関する光学的分析デバイス１００の総合感度を高める。
【００５１】
[067]蛍光３１０の強度は、時間の関数として光検出器１５０によって検出され、これによって、観察体積２７０からの蛍光の時間プロファイルが生成される。図１に示す実施形態では、光検出器１５０の光電流に対応する出力信号は、アナログ−ディジタル変換器２２０によってアナログ信号からディジタル信号に変換され、出力信号は、パターン認識アルゴリズムを有するマイクロコンピュータ等のプロセッサ１６０に向けられる。図１に示す矢印は、光検出器１５０から発生する出力信号の通信を示す。パターン認識アルゴリズムのオペレーションは、所定のパターンと時間プロファイル内の特徴との整合をとり、所与の試料走査時間中における整合の個数をカウントする。特徴の整合に使用される所定のパターンは、適当にスケーリングされ又は正規化されたガウス関数又はローレンツ関数を使用するといったように、アブイニシオ法によって導出することができ、或いは、例えば既知のサイズ、形状、及び輝度を有する粒子の観察体積を通る通過に対応する強度分布を測定することによるといったように、経験的に導出することができる。所定のパターンとの整合をとる特徴は、試料内で検出される粒子に対応するので、粒子の濃度の測定値は、所与の試料走査期間において観察体積を通過した試料の正味体積の知識を用いて抽出することができる。一実施形態では、所与の試料走査期間において観察体積を通過した試料の正味体積は、所与の試料走査期間におけるコンテナ１３０の軌跡の正味長さに、共焦点顕微鏡１２０の点像強度分布関数の体積をかけることによって決定される。約１×１０６μｍ３と等しい点像強度分布関数の体積を有する共焦点顕微鏡及び１分程度の試料走査時間を使用することによって、正味体積を、数ミリリットルオーダーで観察領域中に通過させることが可能になる。いくつかの応用例では、約１×１０５μｍ３から約５×１０７μｍ３までの範囲にわたって選択される点像強度分布関数の体積を有する観察体積の使用が好ましい。本発明のパターン認識アルゴリズムは、データフィルタリングアルゴリズムをもつ構成要素とすることができ、観察体積を通る粒子の通過に対応する時間プロファイル内の特徴を特定し、カウントすることができる。
【００５２】
[068]オプションとして、パターン認識アルゴリズムのオペレーションはまた、サイズ及び／又は形状に基づいて、観察の際に粒子を分類する。一実施形態で、分類は、時間プロファイル内の特徴と整合する所定のパターンの振幅及び形状を評価することによって達成される。例えば、時間プロファイル内の特徴と整合する所定のパターンの幅は、観察体積内の粒子の滞留時間、粒子のサイズ、粒子の形状、又は粒子の拡散定数に相関する。オプションとして、パターン認識アルゴリズムのオペレーションはまた、粒子輝度に基づいて、時間プロファイル内の特徴と整合する所定のパターンの総積分強度を決定することによって、観察体積内の粒子を分類する。いくつかの例では、輝度に基づく粒子の区別は、蛍光抗体標識又は蛍光ＤＮＡプローブ等の選択的蛍光標識に結合された分子の素性及び存在率に関する情報を提供する。
【００５３】
[069]オプションとして、パターン認識アルゴリズムのオペレーションは、各々の整合された特徴の統計的有意性を示すパラメータ、例えばχ二乗値を提供することによって、観察された時間プロファイルへの所定のパターンのフィッティングの品質の示す一以上の統計指標をも生成する。一実施形態では、本発明のパターン認識アルゴリズムは、特徴とその特徴と整合した所定のパターンとの間の差に各測定の標準偏差の推定値によって重み付けすることによって、各整合についてのχ二乗を計算する。オプションとして、パターン認識アルゴリズムのオペレーションは、粒子の濃度、粒子の粒度分布、及び／又は粒子の輝度分布のような処理されたデータ及び結果を表す出力を、オペレータによって簡単に評価される形式で生成する。例えば、一実施形態では、パターン認識アルゴリズムは、整合した特徴の最大強度又は総積分強度に対応する整合した特徴の個数を示すヒストグラムを生成する。
【００５４】
[070]図１Ａを再び参照する。光学的分析デバイス１００は、オプションとして、デバイスコントローラ２４０及び／又はディスプレイ２３０を更に備える。デバイスコントローラ２４０は、コンテナを移動させる手段１４０に動作可能に接続され、プロセッサ１６０と少なくとも片方向通信するように設けられる。一実施形態では、デバイスコントローラは、プロセッサ１６０から出力信号を受け取り（概略的に矢印として図示する）、選択された変位速度を有するコンテナ１３０の選択された軌跡、例えば、注目している選択された粒子に観察体積２７０を繰り返して通らせる軌跡を生成することができる。ディスプレイ２３０は、プロセッサ１６０と少なくとも片方向通信するように設けられ、未処理の蛍光データ、所定のパターンとの整合をとった時間プロファイル等の処理済みデータ、並びに、所定のパターンと整合した特徴の個数、粒子の濃度、粒子の粒度分布、粒子の輝度分布、及び観察された時間プロファイルへのフィッティングの品質を示す統計指標といったパターン認識アルゴリズムのオペレーションの他の結果を表示することができる。
【００５５】
[071]図２は、パターン認識アルゴリズムを有するプロセッサと組み合わされた走査型共焦点顕微鏡を備える本発明の光学的分析デバイスの写真を示している。図２に示す装置は、水平の配置を有する小さな共焦点顕微鏡と、回転運動（約５回転／秒）及びより低速の垂直反転（約２．５センチメートル毎秒）をもたらす二つのモーターを有し、円筒形キュベット（直径約１ｃｍ）を保持する機械的機器と、を備えている。低速垂直走査は、後続の垂直走査で探査される観察体積の統計的独立を確保するのに有用である。照明焦点は、試料の内側でキュベットの壁から約２００μｍにセンタリングされる。
【００５６】
[072]励起光を生成するために、６０ｎｍのＦＷＨＭを有する５２５ｎｍ帯域フィルタに結合されたハロゲンランプを含む光源、５１５ｎｍ励起光を供給するアルゴンイオンレーザー（Ｓｔａｂｉｌｉｔｅ  ２０１７、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）、又は５３２ｎｍ励起光を供給するネオジム−イットリウムレーザーが設けられる。この実験的構成で粒子を検出するために必要な光源の放射強度は、１ｍＷ未満である。設けられた対物レンズは、Ｋｙｏｗａ  ２０ｘ（開口数０．４０）である。ロングパス発光光フィルタが、光検出器の前に設けられて、二色性ミラーによって反射されたすべての励起光の検出を防ぐ。蛍光検出は、光電子増倍管（ＰＭＴ）ＨＣ１２０（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を含む光検出器を使用して達成される。ＰＭＴからの信号は、デュアル−チャネル１２ビットＡ／Ｄ収集カードに供給される。光電流は、可変時間分解能（１／４０ｋＨｚ＝０．０２５ｍｓ以下）で標本化される。時間の関数としての時間ビンあたりの光電流を与える信号の時間トレースは、コンピュータに格納され、ｓｉｍＦＣＳと称する包括的分析ソフトウェアを使用して分析される。多数の他の機能の中でも、ｓｉｍＦＣＳは、自己相関関数及び光子カウントヒストグラムを計算する。粒子通過パターン認識アルゴリズムを有する相関フィルタプログラムも、ｓｉｍＦＣＳに含まれている。このフィルタの機能は、所定のパターンと時間プロファイル内の特徴との整合をとることである。時間プロファイル内の特徴と整合するパターンの幅は、照明体積を通る粒子の通過の時間と相関する。このシステムは、陽性事象のヒストグラムが入手され、個々の整合を見ることができるように構成される。粒子通過パターン認識に基づく相関フィルタプログラムは、１分未満の走査時間における低輝度の粒子のｓｕｂ−ａｔｔｏｍｏｌａｒ検出を可能にする。
【００５７】
[073]本発明では、光学的分析中に分析される全体積は、総試料走査期間（又は検出時間）に比例する。共焦点顕微鏡内の点像強度分布関数の推定体積（ＶＰＳＦ）は、次式によって定義される。
ＶＰＳＦ＝（Ｌｘ）×（Ｌｙ）×（Ｌｚ）      （Ｉ）
ここで、Ｌｘは、Ｘ方向に沿った観察の長さであり、Ｌｙは、Ｙ方向での観察の長さであり、Ｌｚは、Ｚ方向での観察の長さである。長方形スリットが光検出器の前に設けられる場合には、Ｌｘ及びＬｙは、励起光の伝搬軸に直交する軸に対応し、スリットの物理的寸法及び共焦点顕微鏡の拡大率を使用して計算され、Ｌｚは、励起光の伝搬軸に平行な軸に対応し、このシステムの物理光学部品を使用して計算される。Ｌｘ、Ｌｙ、及びＬｚがそれぞれ７０μ、５００μ、及び１５０μと等しい実施形態では、式Ｉは、５×１０６μ３と等しい点像強度分布関数の体積をもたらす。
ＶＰＳＦ＝（７０μｍ）×（５００μｍ）×（１５０μｍ）
＝５×１０６（μｍ）３
【００５８】
[074]回転及び垂直反転を伴う移動方式の場合に試料を保持する少なくとも半透明なコンテナの軌跡の全長（Ｌ）は、次式を使用して計算される。
Ｌ＝π（ｄｃｕｖｅｔｔｅ）（Ｖｒ）（ｔ）      （ＩＩ）
ここで、ｄｃｕｖｅｔｔｅは、キュベットの直径である。Ｖｒは、キュベットの回転速度であり、ｔは、試料走査期間（又は検出時間）である。１００秒と等しい試料走査期間、１センチメートルに等しいキュベット直径、及び５回転毎秒に等しい回転速度の場合には、式ＩＩは、１．６×１０７μｍに等しい軌跡の全長の値をもたらす。
Ｌ＝π(１ｃｍ)(５／秒)(１００秒)（(１×１０４μｍ)／１ｃｍ）
＝１．６×１０７μｍ
【００５９】
[075]試料走査期間中に探査される全体積（Ｖ）は、次式によって与えられる。
Ｖ＝（Ｌ）×（Ｃｒｏｓｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ）      （ＩＩＩ）
ここで、Ｌは、軌跡の全長であり、Ｃｒｏｓｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎは、観察領域の断面積であり、例えば、励起光の伝搬軸に平行な及び／又は励起光の伝搬軸と一致する軸に沿った観察領域の断面積である。Ｌｙ及びＬｚが、それぞれ５００μ及び１５０μに等しい一実施形態では、Ｃｒｏｓｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎは、次式によって与えられる。
Ｃｒｏｓｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ＝（Ｌｙ）×（Ｌｚ）＝（５００μｍ）×（１５０μｍ）
＝７．５×１０４μｍ２
【００６０】
[076]７．５×１０４μ２のＣｒｏｓｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ及び１．６×１０７μｍの軌跡の全長（Ｌ）（上の計算を参照されたい）を式ＩＩＩに代入すると、１．２ｍｌに等しい、走査中に探査される全体積（Ｖ）がもたらされる。
Ｖ＝(１．６×１０７μｍ)×(７．５×１０４μｍ２)×（１ｃｍ／(１×１０４μｍ)）３
＝１．２ｃｍ３＝１．２ｍｌ
【００６１】
[077]したがって、この実験的構成では、１ｍｌを超える体積が、１００秒の測定時間中に探査される。この計算は、適度に短い走査時間で非常に低い濃度（１ミリメートルあたり２〜３個）を検出する本発明のデバイス及び方法の能力を示す。
【００６２】
[078]試料流体が、デバイスの内部構造に絶対に「入ら」ないことに留意することが重要である。詰まりを防ぐための注意深い濾過は、不要である。汚染又は細菌増殖を防ぐための頻繁な洗浄は、不要である。また、試料は、フローサイトメトリのようには失われない。試料は、キュベット内に留まり、したがって、必要な場合に他の試験にかけることができる。本発明のこの属性は、入手し難い試料を扱う場合に非常に有利である。
【００６３】
[079]図３は、本光学アナライザを使用して生成された、観察体積を通って移動する粒子の例示的蛍光時間プロファイルを示している。ｙ軸は、任意の単位の強度に対応し、ｘ軸は、任意の単位の時間に対応する。図３に示す時間プロファイルは、約３００回転毎分（５回転／秒）に等しい回転速度での試料を保持するコンテナの回転と、約１センチメートル毎秒の速度での試料を保持するコンテナの垂直反転との組合せを使用して獲得されたものである。約９２３０及び９５２０と等しい時間での時間プロファイル内の特徴は、観察体積を通る粒子の通過に対応する。図４の（ａ）に、光学アナライザによって生成された時間プロファイル（上のプロット）と、時間プロファイル内の特徴との整合をとる対応の所定のパターン（中のプロット）とを示す。図４の（ａ）には、時間プロファイルとの照合をとった各パターンに関連するχ二乗値（下のプロット）も示してある。図４の（ｂ）に、時間プロファイル内で観察される特徴（曲線Ａ）と、その特徴と一致するようにフィッティングされた所定のパターン（曲線Ｂ）とを示すオーバーラッププロットを示す。特徴との整合をとる所定のパターンの形状は、ガウス関数によって定義される。ガウス関数を使用することによって、観察体積を通る粒子の移動の第１近似がもたらされる。本発明の方法は、システム及び応用例に応じて、より複雑な機能を有する所定のパターンの使用をも含む。図４の（ｃ）に、拡大されたスケールでの単一パターンの強度分布を示し、図４の（ｄ）に、異種試料の分析のために入手された粒度分布を示す。
【００６４】
[080]図５は、本発明の多チャネル光学アナライザの概略図を示している。多チャネルアナライザ６００は、ビーム分割器６０１、追加の対物レンズ６１０、追加の共焦点開口６２０、追加の発光光フィルタ６３０、及び追加光の検出器６４０を更に備えている。ビーム分割器６０１は、観察体積２７０からの蛍光を反射するように位置決めされている。図５に示すように、この反射された光は、追加の対物レンズ６１０及び追加の共焦点開口６２０に通され、蛍光強度を時間の関数として測定できる追加の光検出器６４０に結像される。観察領域内の粒子と会合した複数の異なる蛍光プローブからの蛍光を同時に且つ独立に監視するのに有用な本発明の実施形態では、光検出器１５０及び追加の光検出器６４０のそれぞれは、選択された波長分布を有する光を透過させる異なる発光光フィルタ６３０を備えている。したがって、本発明のこの実施形態は、複数の蛍光時間プロファイルを生成し、当該複数の蛍光時間プロファイルは、異なる蛍光プローブからの信号に対応しており、これら異なる蛍光プローブは、粒子の分類に有用な情報を組成に基づいて提供するために分析され得るものである。或いは、本発明の他の実施形態では、光検出器１５０及び追加光検出器６４０のそれぞれが、異なるサイズの共焦点開口を備える。したがって、本発明のこの実施形態は、サイズ及び／又は形状を基礎とする粒子の分類に有用な情報を提供するために分析できる異なるサイズの観察体積に対応する複数の蛍光時間プロファイルを生成する。
【００６５】
[081]図６は、本発明の例示的なパターン認識アルゴリズムのステップを示す機能流れ図を示している。この図に示すように、ガウス関数といった関数タイプが、時間プロファイル内の特徴にフィッティングするために使用される所定のパターンの基礎とするために、まず選択される。次に、パターンの長さに略等しい長さといった選択された長さを有する蛍光時間プロファイルの区間にフィルタを適用する。所定のパターンの強度を変更し、最小二乗フィットを、設定されたパラメータ限度内で得る。整合が得られた場合には、特徴を粒子検出事象として記録し、強度を保存する。粒度分布も必要な場合には、パターン幅を、設定された最大幅と最小幅との間で走査し、最良のフィッティングに対応する幅を保存する。その後、この処理を、時間プロファイルの次の時間間隔について繰り返す。
【００６６】
[082]本発明の方法及びデバイスは、広範な光学デバイス構成部品、電気デバイス構成部品、及び機械的デバイス構成部品を使用することができる。本方法に有用な光源は、レーザー、狭帯域ランプ源（ｎａｒｒｏｗ  ｂａｎｄ  ｌａｍｐ  ｓｏｕｒｃｅ）等の狭帯域コヒーレント源を含み得る。或いは、光学干渉フィルタ、回折格子、又はモノクロメータといった波長フィルタリング部品が、十分に狭い波長分布を有する励起放射を達成し、観察領域内の粒子からの発光の高感度の検出を可能にするよう設けられているならば、広帯域ランプを本発明で光源として使用することができる。光源には、レーザー、狭帯域ランプ（例えば、水銀アークランプ）、広帯域ランプ（例えば、重水素ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、又は蛍光灯、一以上の発光ダイオード（ＬＥＤ）があるが、これらに限定はされない。
【００６７】
[083]本発明は、光源と光学的に接続するコリメーション部品（例えば、ピンホール又はスリット）、二色性反射器、対物レンズ、及び光検出器と光学的に接続する共焦点開口（例えば、ピンホール又はスリット）を備える従来の共焦点光学顕微鏡との互換性を有する。光源と光学的に接続するコリメーション部品（例えば、ピンホール又はスリット）の使用は、本発明では、特に、光源がレーザー源のような小さいスポットサイズを有する空間的にコヒーレントな光源である実施形態の場合に、オプションである。固定された位置を有する焦点体積をもたらす共焦点顕微鏡は、例えば二色性反射器の回転によって選択的に可変の位置を有する焦点体積をもたらす共焦点顕微鏡と同様に、本発明に有用である。本発明での共焦点顕微鏡は、一定のサイズ又は選択的に可変のサイズを有する共焦点開口を有することができ、水平又は垂直の光学的配置で提供することができる。
【００６８】
[084]本方法及び本デバイスで有用なコンテナは、励起光及び粒子からの発光を少なくとも部分的に透過する任意の形状を有するコンテナを含む。高い検出感度を必要とする光学的分析の応用例に有用なコンテナは、励起光及び放出される光について高透過性のものである。円筒形キュベット又は光学セルのようなコンテナであって、回転位置の関数として実質的に一定（例えば、約１０％以内で一定又は、いくつかの応用例について好ましくは約５％以内で一定）である、励起光及び粒子からの発光の透過率を有するコンテナの使用は、コンテナが光学的分析中に回転される粒子分類測定に特に有用である。
【００６９】
[085]試料コンテナを保持するコンテナを移動する手段であって、コンテナの並進、回転、又はその双方を実現する任意の手段を、本発明で使用することができ、当該手段には、モーター、スイッチングエレクトロニクス、及び／又は偏心回転板機構がある。試料を保持するコンテナを移動させる手段であって、機械的な揺らぎ及び／又は振動を受け難い手段の使用は、いくつかの応用例に好適である。しかし、本発明の光学的分析方法及び光学的分析デバイスは、観察体積中の粒子の通過の時間スケールより相当に長い（すなわち、少なくとも３倍）時間スケールで発生する機械的な揺らぎ及び／又は振動によってもたらされる誤差を受けやすいものではない。
【００７０】
[086]任意の光検出デバイスが、本発明で使用可能であり、当該デバイスには、光電子増倍管、アバランシェフォトダイオードといった光ダイオード、及び光導電検出器があるが、これらに限定されない。本発明で有用な光検出器は、信号増幅器、終端器、アナログ−ディジタル変換システム、電子フィルタリングシステム、又は当技術分野で既知の任意の同等物を備えることができる。本発明の光検出器は、光子を数えるように構成することができる。
【００７１】
[087]本方法及び本発明のデバイスは、コンピュータ支援オートメーションに適しており、したがって、多数の試料の高スループット光学的分析に非常に適している。本発明で有用なプロセッサには、マイクロコンピュータ、汎用コンピュータ、又はアプリケーションソフトウェアを実行できる処理システムがある。本方法で使用可能な例示的コンピュータには、ＩＢＭ社のパーソナルコンピュータ又は適切なその同等物といったマイクロコンピュータ、及び、ワークステーションコンピュータがある。好ましくは、本発明のパターン認識アルゴリズムは、コンピュータコンパクトディスク（ＣＤ  ＲＯＭ）、フラッシュメモリデバイス、又はフロッピディスク等のコンピュータ可読媒体に埋め込まれる。さらに、コンピュータ可読媒体は、ハードディスク又はランダムアクセスメモリ、若しくは読取専用メモリといったメモリチップの形態をとってもよい。
【００７２】
[088]当業者には理解されるように、本発明のデータ分析方法及びパターン認識アルゴリズムを実施するコンピュータソフトウェアコードは、任意の適切なプログラミング言語を使用して記述することができる。例示的な言語には、Ｃ又はＣの任意のバージョン、Ｐｅｒｌ、Ｊａｖａ、Ｐａｓｃａｌ、若しくは、これら全ての同等物があるが、これらに限定はされない。本発明のいくつかの応用例では、コンピュータを使用して本方法の全てのステップを達成することが好ましいが、コンピュータを使用して本方法のあるステップ又は選択された一連のステップだけを実行することも企図されている。
【００７３】
[089]本明細書で採用した用語及び表現は、説明のための用語として使用しており、限定するものではない。そのような用語及び表現の使用に、図示され説明される特徴又はその諸部分のすべての同等物を除外する意図はなく、特許請求される発明の範囲内で種々の変更が想定されるものと認められる。したがって、本発明を、好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示してきたが、当業者は、本明細書で開示される概念の修正形態及び変形形態を用いることができ、そのような修正形態及び変形形態は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあるものと考えられることを理解すべきである。本明細書で提供される特定の実施形態は、本発明の有用な実施形態の例であり、当業者には、本発明を、本説明で示したデバイス、デバイス構成要素、方法ステップの多数な変形形態を使用して実行できることが、明白であろう。本発明に有用な方法及びデバイスは、多数の任意選択のデバイス部品及び構成部品を備えることができ、これら部品には、光ファイバ部品、温度コントローラ、ＦＰエタロン、高域カットオフフィルタ及び低域カットオフフィルタといった光学フィルタ、コリメートするレンズ及び反射器等のコリメーション部品、トリガパルスジェネレータ、レーザー、モノクロメータ、プリズム、回折格子、集束するレンズ反射器といった集束素子、反射器、偏光子、光ファイバカプラ及び光ファイバ送信器、温度コントローラ、温度センサ、広帯域光源、並びに狭帯域光源があるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
[090]以下の参考文献は、全般的にディジタル信号処理及びパターン認識に関するものである。（１）Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊｏｈｎ  Ｇ．Ｐｒｏａｋｉｓ、Ｄｉｍｉｔｒｉｓ  Ｇ．Ｍａｎｏｌａｋｉｓ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９５年、（２）Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  Ｔｉｍｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、Ｒ．Ｓｃｈａｆｅｒ、及びＪ．Ｂｕｃｋ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、１９９９年、（３）Ｄｉｓｃｒｅｔｅ−Ｔｉｍｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｐｅｅｃｈ  Ｓｉｇｎａｌｓ、Ｊ．Ｒ．Ｄｅｌｌｅｒ，Ｊｒ．、Ｊ．Ｈ．Ｌ．Ｈａｎｓｅｎ、及びＪ．Ｇ．Ｐｒｏａｋｉｓ、ＩＥＥＥ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年、及び（４）Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（２００１年）Ｄｕｄａ、Ｈａｒｔ、及びＳｔｏｒｋ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ。以下の参考文献は、光子カウントヒストグラム分析及び揺らぎ相関分光学分析を使用して蛍光データを解釈する分析方法に関するものである。（１）「Ｔｈｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｈｉｓｔｏｇｒａｍ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｙ．Ｃｈｅｎ、Ｊ．Ｄ．Ｍｕｌｌｅｒ、Ｐ．Ｔ．Ｃ．Ｓｏ、及びＥ．Ｇｒａｔｔｏｎ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、１９９９年７月、５５３〜５６７頁、Ｖｏｌ．７７、Ｎｏ．１、（２）米国特許第６７９４６５９号、（３）「Ｔｗｏ  ｐｈｏｔｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ」、Ｋ．Ｍ．Ｂｅｒｌａｎｄ、Ｐ．Ｔ．Ｃ．Ｓｏ、及びＥ．Ｇｒａｔｔｏｎ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、１９９５年、Ｖｏｌ  ６８、６９４〜７０１頁、（４）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｉ．Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  Ｂａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ」、Ｅ．Ｌ．Ｅｌｓｏｎ及びＤ．Ｍａｇｄｅ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９７４年、Ｖｏｌ  １３、１〜２７頁、（５）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．ＩＩ．Ａｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｒｅａｌｉｚａｔｉｏｎ」、Ｄ．Ｍａｇｄｅ、Ｅ．Ｌ．Ｅｌｓｏｎ、及びＷ．Ｗ．Ｗｅｂｂ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９７４年、Ｖｏｌ  １３、２９〜６１頁、（６）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ｉｎｃｅｐｔｉｏｎ，ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｕｓ」、Ｗ．Ｗ．Ｗｅｂｂ、Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．、２００１年、Ｖｏｌ  ４０、３９６９〜３９８３頁、及び（７）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｐ．Ｋａｓｋ、Ｋ．Ｐａｌｏ、Ｄ．Ｕｌｌｍａｎｎ、及びＫ．Ｇａｌｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．���１９９９年、ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９６、１３７５６〜１３７６１頁。
【参照による援用及び変形形態に関する陳述】
【００７５】
[091]本願全体を通じて引用されるすべての参考文献、例えば、発行された特許又は許可された特許及びこれらの同等物を含む特許文書、特許出願公開、並びに非特許文献文書又は他の原資料を、各参考文献が少なくとも部分的に本願の開示と矛盾しない範囲において個別に参照することによって援用されたかのように、それらの全体を参照することによって、本明細書に援用する（例えば、部分的に矛盾する参考文献は、その参考文献の部分的に矛盾する部分を除いて参照することによって援用する）。
【００７６】
[092]本明細書で説明し又は例示する全ての成分の調合又は組合せは、別途述べない限り、本発明を実施するのに使用することができる。
【００７７】
[093]範囲、例えば温度範囲、時間範囲、又は、組成、若しくは濃度の範囲が、本明細書に与えられる場合には、必ず、すべての中間範囲及び部分範囲、並びに与えられた範囲に含まれるすべての個々の値が、本開示に含まれることが意図されている。本明細書の説明に含まれるすべての部分範囲又は範囲、若しくは部分範囲内の個々の値が、添付の特許請求の範囲から除外され得ることを理解されたい。
【００７８】
[094]本明細書に言及する全ての特許及び出版物は、本発明が関係する当業者の水準を示す。本明細書で引用した参考文献を、その全体を参照することによって本明細書に援用し、その出版又は出願の日の技術的現状を示す。この情報を、必要な場合に、従来技術に含まれる特定の実施形態を除外するために本明細書で使用できることが意図されている。
【００７９】
[095]本明細書で使用するように、「備える」との語は、「含む」又は「特徴とする」と同義であり、包含的又は非限定的であって、追加の列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。本明細書で使用するように、「からなる」との語は、請求項の要素に指定されない全ての要素、ステップ、又は成分を除外する。本明細書で使用するように、「本質的に〜からなる」は、請求項の基本的かつ新規の特性に本質的に影響しない物質又はステップを除外しない。本明細書の各例では、「備える」、「本質的に〜からなる」、及び「からなる」のいずれの語も、他の三つの語のいずれかと交換することができる。本明細書で例示的に説明した本発明は、本明細書に具体的には開示していない任意の一つ又は複数の要素、若しくは一つ又は複数の限定がなくとも、適切に実践することができる。
【００８０】
[096]当業者は、出発物質、物質、試薬、合成方法、精製方法、分析方法、検定方法、及び具体的に例示したもの以外の方法を、過度の実験に頼らずに本発明の実施に使用できることを理解するであろう。全てのそのような物質及び方法についての全ての技術的に既知の機能的同等物が、本発明に含まれることが意図されている。採用した用語及び表現は、説明のための用語として使用しており、限定するものではなく、そのような用語及び表現の使用に、図示し説明した特徴又はその諸部分の全ての同等物を除外する意図はなく、特許請求される発明の範囲内で種々の変更が想定されることが認められる。したがって、本発明を、好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示してきたが、当業者は、本明細書で開示した概念の修正形態及び変形形態を用いることができ、そのような修正形態及び変形形態は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲に含まれるものと考えられることを理解されたい。
【００８１】
（実施例１：透明媒質及び懸濁媒質内の蛍光球の分析）
[097]試料内の粒子の濃度を正確に測定する能力を実証するために、本発明の光学的分析デバイスを使用して、散乱性の試料を含む透明な緩衝液とＬｙｐｏｓｉｎ溶液（２０％重量希釈１：８０）の双方において、直径１．０μｍの橙色蛍光球（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｆ−８８２０）の濃度を決定した。緑色フィルタ（５２５±６０ｎｍ）と組み合わされた小さなハロゲンランプを、これらの測定で励起光を供給する光源として使用した。１ミリメートルあたり２〜３百球もの低さのこれらの試料内の橙色蛍光球の濃度が、本光学的分析デバイスを使用し１分の試料走査時間を使用して、測定可能であった。
【００８２】
[098]図７に、例示的な光子電流ヒストグラムを示し、図８に、本方法及び本デバイスを使用して生成された粒子濃度の関数としての総カウント（蛍光時間プロファイル内のピーク）のプロットを示す。図８に示すように、検査した広範囲の濃度において、非常に良好な線形フィットが存在する。この調査の結果は、本方法及び本デバイスが、光学的に透明な試料内及び散乱性の試料内の蛍光粒子の濃度の決定に良好に適することを実証するものである。
【００８３】
[099]より低い濃度、例えば１ミリリットルあたり２〜３粒子の低い濃度であっても、再現可能に検出し、測定するために、パターン認識アルゴリズムを有する相関フィルタプログラムを使用して、本方法を使用して生成された蛍光時間プロファイルを分析した。光子カウントヒストグラムは、注目する粒子からの信号の他に、背景及び機械的回転の影響からの寄与を含む。単純なデータフィルタリング（低域データフィルタリング等）は、特に散乱性媒質内の僅かな粒子を扱う場合に、目標とする検出感度を達成するのに十分なものではない。パターン認識アルゴリズムを有する相関フィルタプログラムは、走査中の照明体積内の注目する粒子の通過を認識し、強度振幅及びオプションとしてその総積分強度と共に、その事象をヒットとして記録する。
【００８４】
[0100]パターン認識アルゴリズムの有効性を評価するために、機器較正を、蛍光性の蛍光球を使用して実行した。図１１に、パターン認識データ分析を採用する本光学的分析デバイスを使用した濃縮−希釈調査の結果を示す。図１１は、濃度が高まるにつれて検出される事象（粒子）の数の飽和を示している。これは、期待された結果である。というのは、高濃度では、観察体積内に複数の粒子が同時に存在する確率が高まるからである。しかし、この飽和効果について訂正することは、発光側のピンホールを変更することによって観察体積を減らし、パイルアップ確率を考慮に入れた曲線の線形近似を実行することによって、又は光学的分析の前に単純に試料を希釈することによって、容易である。しかし、この曲線の低濃度部分では、飽和効果に関する訂正は、不要である。このレジームでは、線形性は、図１１の挿入図によって示されるように、非常に低い濃度（１ｍｌあたり２〜３個）まで優れている。これらの測定では、約１分の走査時間が使用された。
【００８５】
（実施例２：牛乳内の体細胞カウントの分析）
[0101]乳腺炎は、乳牛の最もコストのかかる病気である。米国内でのこの病気に起因する全損失の推定値は、毎年１５億ドルから３０億ドルの範囲内である。牛乳内の細胞カウントは、乳腺の健康と密接に関連するので、体細胞カウント（ＳＣＣ）は、牛乳品質の国際標準測定値として受け入れられている。その結果、牛乳内の体細胞カウントを測定する安価で信頼性があり可搬性ある方法及びデバイスが、現在必要とされている。
【００８６】
[0102]牛乳内の体細胞の濃度を決定する本発明の光学的分析デバイスの能力を、実験によって実証した。これらの測定では、新鮮な牛乳を、イリノイ大学の乳牛研究部門から入手した。乳試料を、分析の前にトリス緩衝液内で１／４に希釈した。当初に、実験を、乳腺炎の治療を受けている牛からの牛乳を含む試料に対して実行した。このソースからの牛乳に対応する体細胞カウントは、１ミリメートルあたり約１００００００細胞と決定された。これらの実験では、１０回の希釈を実行して、１ｍＬあたり約１０５細胞から１ｍＬあたり約１０６細胞までの範囲の体細胞カウントを有する希釈試料の分析を可能にした。界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を、細胞膜を破裂させるために光学的分析の前に試料に加えた。さらに、臭化エチジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅ−１３０５）を、１０マイクロモルの濃度で加えて、体細胞に蛍光標識付けした。加えた臭化エチジウムは、細胞内のＤＮＡと会合し、その蛍光は、遊離型の蛍光の約２０倍に強化される。
【００８７】
[0103]図９に、体細胞を含む乳試料について本方法によって生成された例示的な光子電流ヒストグラムを示す。図９のヒストグラムの広がりは、明らかに、試料内の蛍光粒子の濃度に依存する。このシステムについて有用な較正曲線を生成するために、蛍光時間プロファイル内のどの特徴が体細胞の陽性検出として識別されるのかを確立する蛍光強度閾値を、設定した。図１０に、本方法及び本デバイスを使用して生成した体細胞濃度の関数としての総カウント（蛍光時間プロファイル内の、閾値を超えるピーク）のプロットを示す。図１０に示すように、検査された濃度の有用な範囲において非常に良好な線形フィットが存在する。さらに、生データの繰り返し分析は、この較正曲線の線形性が、蛍光強度閾値の選択に影響され易いものではないことを示した。
【００８８】
（実施例３：大腸菌の光学的分析）
[0104]細菌等の微生物の濃度を測定する本発明の能力を、実験によって実証した。これらの実験では、大腸菌を、振とう培養機（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ２４）内において３７℃の温度及び毎分３００回転の攪拌、且つ、Ｌ培地内で数時間増殖させた。次に、ＭＯＰＳ緩衝液を、試料希釈に使用した。細菌に、Ｓｙｔｏｘ  Ｏｒａｎｇｅ、すなわちＤＮＡプローブを用いて標識付けした。図１２に、細菌の相当に暗い蛍光に対応する蛍光時間プロファイルから生成された較正を示す。図１２に示すように、１ミリリットルあたり１００個を相当に下回る濃度を、１分の走査時間を使用して測定することができる。さらに、データ分析に使用するソフトウェアが、強度分析をも実行した。図１３に、強度分布に基づいて粒子を分類する本発明の能力を実証する振幅ヒストグラム（すなわち、強度分布）を示す。
【００８９】
（実施例４：Ａβタンパク質凝集体の光学的検出）
[0105]本発明の目標は、体液等の生物試料内のタンパク質の凝集体を検出し、その濃度を測定することである。本発明のこの応用を評価するために、アミロイドβオリゴマの凝集体の低濃度を測定する本光学的分析デバイス及び本光学的分析方法の能力を、実験によって実証した。
【００９０】
[0106]、アルツハイマー病及び一致する年齢の対照被験者からの脳脊髄液試料であって、解剖で得られた（ｎ＝１９  ＡＤ、ｎ＝２１  Ｃ平均死後期間＜３．５時間）試料を、フルオレセイン−ヒトＡβ（１−４２）（ＦＬ４２）（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｉｎｃ．）を用いて標識付けし、Ｐｉｔｓｃｈｋｅから変更された方法によるＦＣＳによって検定した。２光子励起（７８０ｎｍ、Ｔｉ：サファイヤレーザー、モード−ロック、１５０ｆｓパルス、試料で６〜９ｍＷ）を使用して、プローブへのフォトダメージ（ｐｈｏｔｏｄａｍａｇｅ）を減らし、標本体積をより良好に画成した。検出には、光子カウントモードで動作するＥＧ＆ＧモデルＳＰＣＭ−ＡＱＲ−１５アバランシェフォトダイオードを用いた。レーザー照明を、４０Ｘ  ＮＡ＝１．４  ｏｉｌ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅを介して８室スライド（ＬａｂＴｅｃｈ  ｃａｔ．１５５４１）内の１０μｌ試料液滴に集束させた。フルオレセイン及びフルオレセイン−リゾチームの単一分子検出及び相関分析を使用して、機器を較正した。１６ビットデータ標本化レートを、単一分子事象を識別するために１６〜３２ｋＨｚの範囲にわたらせた。
【００９１】
[0107]１０ｍＭ  ＮａＰｉ  −  ０．２％  ｗ／ｖ  ＳＤＳ、ｐＨ７．５内のＦＬ−４２を、ＣＳＦ試料内で１００ｎＭ及び０．０２％  ＳＤＳに希釈して、内因性オリゴマ複合体に標識付けした。大きく明るい粒子が、ＡＤ試料内で遊離蛍光ペプチド背景の上で観察された。標識付けされていないＣＳＦ試料及び１０ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．５内の１００ｎＭ  ＦＬ−４２の何れもが、標識付けされたＣＳＦ試料内で観察される大きく明るいオリゴマを測定の時間にわたって生成しなかった。
【００９２】
[0108]大きく明るいオリゴマは、希な事象、すなわち推定個数濃度＜１ｐＭとして検出された。これらの大きいオリゴマは、低速で拡散し、大半の標本時間は、事象の間で待つものであった。本発明人は、オリゴマの低い濃度と遅い拡散の組合せが、十分な統計を有する単一の判定に数日を要するものと予測される。
【００９３】
[0109]最小限の時間で意味のある比較を行うのに十分な事象を収集するために、複数ビーム走査パラダイムを試験して、個々の分子を区別する分解能を維持しながら標本抽出する体積を増やした。走査なしで、共焦点画像によって、〜１ｆｌの体積を継続的に監視した。４ミリ秒の期間での２０μｍ直径の円内の焦点の走査は、〜０．５ｐｌの体積を標本抽出した。３μｍ増分でのＸ−Ｙ軸の４５×４５μｍ及びＺ軸の６０μｍのラスタ走査は、〜１２０ｐｌを標本抽出した。
【００９４】
[0110]図１４Ａ及び１４Ｂに、それぞれ、２光子励起モードで動作する従来の走査型共焦点顕微鏡を使用して得られた比較対象試料及びＡＤ試料の蛍光時間プロファイルを示す。図１４Ａは、静的な比較対象及びＡＤ（２０分）に対応し、図１４Ｂは、３Ｄ  ＡＤ試料ビーム走査に対応する（ＸＹラスタ走査＋ｚステップ、９０秒）。図１４Ａの強いスパイクは、測定されたピーク幅によって示されるように、その遅い拡散に基づいて、大きなオリゴマＡβ複合体と解釈された。解剖ＣＳＦ試料のこの小さな試料では、比較対象群（ｎ＝２２、平均３．１０５±０．６４８ピーク標準偏差）を、ｐ＝０．００３４６で被験者のＡＤ群（ｎ＝１８、平均６．０５３±０．８００ピーク標準偏差）から区別することができる。これらの群は分離可能であるが、母集団は、部分的に観察された事象の数の少なさに起因して、オーバーラップしている。図１４Ｂに示す３Ｄ走査を、擬似３Ｄ画像に変換した。図１４Ｃは、３Ｄ走査から生成された擬似３Ｄ画像を示し、複数の大きな蛍光オリゴマ（細長い白い点）を示す。
【００９５】
[0111]パターン認識アルゴリズムを有する相関フィルタプログラムを使用して、本方法及び本デバイスを使用して獲得された蛍光時間プロファイルを分析し、アミロイドβ重合体及び凝集体等の細長い粒子のサイズの分布を決定した。図１５に、比較対象試料及びＡＤ試料の凝集体濃度及びサイズの相関プロットを示す。
【００９６】
[0112]（実施例５：より良い局所化及び固有の輝度判定のための複数スリット共焦点開口を有する光学アナライザ）
【００９７】
[0113]オプションとして、本発明の光学アナライザ及び分析方法は、複数スリットの共焦点開口光学構成を利用する。本発明のこの態様のアナライザは、粒子濃度、粒子輝度、及び／又はサイズ特性評価の測定を提供することに加えて、観察体積内の粒子の位置及び／又は軌跡を測定することができる。本発明のこの機能的態様は、大きな観察体積を使用する正確な光学的分析を可能にし、これによって、光学走査中の大きい試料体積の分析を可能にする。これらの実施形態での粒子位置及び／又は軌跡の決定は、粒子の検出及び輝度に関する粒子の特性評価の感度を向上する。これは、分析中に獲得される位置情報が、検出される粒子の絶対強度又は絶対輝度に関する不確実性を除去し、及び／又は最小にするからである。
【００９８】
[0114]本発明のこの実施形態では、複数スリットの共焦点開口が、試料と光検出器との間に設けられ、観察体積からの蛍光の少なくとも一部が、光検出器によって検出される前に複数スリットの共焦点開口を通過するようになっている。本明細書で使用する用語「複数スリットの共焦点開口」は、光検出器の前で対称に又は非対称に空間的に分配され、入射蛍光の少なくとも部分的な透過を可能にする複数のスリット及び／又はピンホールを含むデバイス構成要素を指す。複数スリット共焦点開口は、粒子の正確な光学検出及び／又は特性評価をもたらす任意の個数のスリット及び／又はピンホールを有することができ、設けられるスリット又はピンホールは、同一の面積又は異なる面積を有することができる。実質的に同一のスリット面積（例えば、約１０％以内）を有する二つの共焦点スリットを含む二重スリット共焦点開口（すなわち、二つのスリットを有する）の使用は、いくつかの光学的分析応用例に有益である。この態様の実施形態では、本発明の複数スリット共焦点開口は、共焦点顕微鏡の構成部品であってもよい。本発明のいくつかの応用例に関する有用な複数スリット共焦点開口は、約５μから約１００μまでの範囲において選択された幅を有する複数のスリットを含んでおり、これらスリットは、約５μから約５００μまでの範囲において選択される距離だけ互いに等しく離間している。本発明のいくつかの応用例に関する有用な複数スリット共焦点開口は、光検出器の前に対称に分配された複数のスリットを含む。
【００９９】
[0115]本アナライザ及び本分析方法では、複数スリット共焦点開口を使用して、照明プロファイルの中心に対する蛍光粒子の位置及び／又は軌跡の決定の質を向上する。本複数スリット構成は、単一の検出器の前に位置決めされた単一のスリットではなく、単一の検出器の前の複数のスリットを使用する。図１６に、観察体積内の粒子位置及び／又は粒子軌跡を判定するための本発明における単一スリット共焦点開口及び複数スリット共焦点開口の使用を概略的に示し、比較する。図１６の（ａ）及び（ｂ）は、単一スリット共焦点開口を使用する本発明の実施形態を示し、図１６の（ｃ）及び（ｄ）は、二重スリット共焦点開口を使用する本発明の実施形態を示す。
【０１００】
[0116]図１６の（ａ）及び（ｂ）に、正確に共焦点体積の中心を通る第１の粒子軌跡（図１６の（ａ））と、共焦点体積の中心を離れて通る第２の粒子軌跡（図１６の（ｂ））とを示す。図１６の（ａ）及び（ｂ）（これらのパネルの上部）に、各単一スリット共焦点開口構成について予測された蛍光時間プロファイルをも示す。図１６の（ａ）及び（ｂ）の比較は、粒子が観察体積の中心から離れて通過するにつれて、蛍光時間プロファイルの幅が増えることを示す。したがって、時間プロファイルの特徴の幅の測定は、粒子位置及び／又は粒子軌跡を決定する手段をもたらす。
【０１０１】
[0117]複数スリット共焦点開口を組み込むことによって、測定される粒子位置及び／又は粒子軌跡の精度及び正確さが実質的に高まる。図１６の（ｃ）及び（ｄ）に、正確に観察体積の中心を通る第１の粒子軌跡（図１６の（ｃ））と、観察体積の中心から離れて通る第２の粒子軌跡（図１６の（ｄ））とを示す。図１６の（ｃ）及び（ｄ）（これらのパネルの上部）に、各二重スリット共焦点開口構成について予測された蛍光時間プロファイルをも示す。図１６の（ｃ）は、粒子が正確に観察体積（すなわち、共焦点体積）の中心を通過する場合に、時間プロファイルが、二つの同一の形状のピークで特徴付けられることを示す。しかし、図１６の（ｄ）に示すように、この二つのピークは、粒子軌跡が観察体積の中心から離れて移動するにつれて、幅広となり、最終的に、蛍光時間プロファイル内で単一の幅広のピークに合併する（図１６の（ｄ））。蛍光時間プロファイル内のこの二つのピークから単一のピークへの遷移は、粒子位置及び／又は粒子軌跡を特性評価する有用な手段をもたらす。例えば、一実施形態で、所与の検出事象に対応する観察された時間プロファイル内のピーク間の時間における分離が、観察体積内の粒子の位置（例えば、図１６の（ａ）〜（ｄ）に示すようにＺ軸に沿った粒子の位置）の量的特性評価に使用される。複数スリット共焦点開口の光学配置を使用して獲得された時間プロファイル内の二つの極大値を分離する時間は、向上した精度で粒子位置、粒子軌跡、及び／又は輝度強度を測定するのに有用な重要な情報をもたらす。複数スリット共焦点開口の光学配置を使用して観察されたピーク形状及び間隔の変化も、本発明で粒子形状を判定するのに使用することができる。
【０１０２】
[0118]粒子が観察体積を通過する時に、測定される蛍光は、粒子の固有の輝度（又は強度）及び照明プロファイル内の軌跡の特定の位置に依存し、輝度は、共焦点体積の中心に近いほど高い。一実施形態では、本システムは、複数スリット構成を使用して生成される異なる蛍光時間プロファイルを分析し（例えば、観察された時間プロファイル内の複数のピークの時間における分離を測定することによって）、Ｚ軸に沿った粒子の位置を正しく割り当てる（図１６の（ａ）〜（ｄ）で特定されるように）ことができる。Ｚ軸に沿った粒子位置（図１６の（ａ）〜（ｄ）で特定されるように）がわかったならば、粒子強度／輝度を、向上した精度で計算することができる。この新しい手法を使用しても、まだ不確定性、すなわち、焦点面に関する反射対称性があるが、これは、照明強度の計算には影響しない。複数スリット共焦点開口の光学配置を使用して生成された時間プロファイルの分析は、種々の方法を使用して分析することができ、これら方法には、パターン認識データ分析技法、光子カウントヒストグラム分析、及び揺らぎ相関分光学法があるが、これらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ】流体試料内の蛍光粒子の濃度を測定する、本発明の光学的分析デバイスの平面図を示す概略図である。
【図１Ｂ】円筒形キュベットを含むコンテナを示す拡大側面図であり、本発明のいくつかの方法で有用な同時に発生する回転及び垂直変位の軸も示す図である。
【図２】パターン認識アルゴリズムを有するプロセッサと組み合わされた走査型共焦点顕微鏡を含む、本発明の光学的分析デバイスを示す写真である。
【図３】観察体積を通って移動する粒子の例示的蛍光時間プロファイルであって、光学アナライザを使用して生成されたプロファイルを示す図である。
【図４】（ａ）に光学アナライザによって生成された時間プロファイル（上のプロット）と、時間プロファイル内の特徴と整合される対応する所定のパターン（中のプロット）とを示し、時間プロファイルと整合される各パターンに関連するχ二乗値（下のプロット）も示しており、（ｂ）に時間プロファイル内で観察される特徴（曲線Ａ）と、その特徴と一致するようにあてはめられた所定のパターン（曲線Ｂ）とを示すオーバーラッププロットを示し、（ｃ）に拡大スケールで単一パターンの強度分布を示し、（ｄ）に異種試料の分析のために入手された粒度分布を示す図である。
【図５】本発明の多チャネル光学アナライザを示す概略図である。
【図６】本発明の例示的パターン認識アルゴリズムのステップを示す機能流れ図である。
【図７】蛍光球を含む試料について本発明のデバイス及び方法によって生成された例示的な光子電流ヒストグラムを示す図である。
【図８】蛍光球を含む試料について本発明のデバイス及び方法によって生成された、粒子濃度の関数としての総カウント（蛍光時間プロファイル内のピーク）のプロットを示す図である。
【図９】体細胞を含む乳試料について本方法によって生成された例示的な光子電流ヒストグラムを示す図である。
【図１０】本方法及び本デバイスを使用して生成された、体細胞濃度の関数としての総カウント（蛍光時間プロファイル内の、閾値を超えるピーク）のプロットを示す図である。
【図１１】パターン認識データ分析を使用する本光学的分析デバイスを使用する濃縮−希釈調査の結果を示す図である。
【図１２】細菌の相当に暗い蛍光に対応する蛍光時間プロファイルから生成された較正を示す図である。
【図１３】強度分布に基づいて粒子を分類する本発明の能力を実証する振幅ヒストグラム（すなわち、強度分布）を示す図である。
【図１４Ａ】比較参照試料及びＡＤ試料の蛍光時間プロファイルを示す図である。
【図１４Ｂ】比較参照試料及びＡＤ試料の蛍光時間プロファイルを示す図である。
【図１４Ｃ】３Ｄ走査から生成された擬似３Ｄ画像を示し、複数の大きい蛍光オリゴマ（細長い白い点）を示す図である。
【図１５】比較参照試料及びＡＤ試料の凝集体濃度及びサイズの相関プロットを示す図である。
【図１６】観察体積内の粒子位置を決定する、本発明における複数スリット共焦点開口の使用を概略的に示す図であり、（ａ）に単一スリット共焦点開口を使用する本発明の実施形態を概略的に示し、（ｂ）に単一スリット共焦点開口を使用する本発明の実施形態を概略的に示し、（ｃ）に二重スリット共焦点開口を使用する本発明の実施形態を示し、（ｄ）に二重スリット共焦点開口を使用する本発明の実施形態を示す図である。
【図１Ａ】
2008536093.tif 000003
【図１Ｂ】
2008536093.tif 000004
【図２】
2008536093.tif 000005
【図３】
2008536093.tif 000006
【図４】
2008536093.tif 000007
【図５】
2008536093.tif 000008
【図６】
2008536093.tif 000009
【図７】
2008536093.tif 000010
【図８】
2008536093.tif 000011
【図９】
2008536093.tif 000012
【図１０】
2008536093.tif 000013
【図１１】
2008536093.tif 000014
【図１２】
2008536093.tif 000015
【図１３】
2008536093.tif 000016
【図１４Ａ】
2008536093.tif 000017
【図１４Ｂ】
2008536093.tif 000018
【図１４Ｃ】
2008536093.tif 000019
【図１５】
2008536093.tif 000020
【図１６】
2008536093.tif 000021
【国際調査報告】
2008536093.tif 000022