【事件の表示】
　特許第２８３７８４７号「トロンビン製剤」の請求項１ないし１１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２８３７８４７号の請求項１ないし１０に係る特許を維持する。
【理　由】
　　　　　理　　　　　　　由
１．手続の経緯
　本件特許第２８３７８４７号発明は、昭和６３年１月２７日（パリ条約による優先権主張１９８７年１月２８日、米国）の出願であって、平成１０年１０月９日にその特許権の設定登録がなされ、その後、吉富製薬株式会社、財団法人　化学及血清療法研究所及び前田哲哉より特許異議の申し立てがなされ、当審により取消しの理由が通知され、その指定期間内である平成１２年６月５日に訂正請求がなされたものである。
２．訂正の適否についての判断
　ア．訂正の内容
  特許権者が求めている訂正の内容は、特許請求の範囲を以下のとおりに訂正するものである。
「1)(a)二段階イオン交換クロマトグラフィー処理により精製された精製トロンビン、
　(b)25〜50重量%のポリオール、および酢酸塩イオンまたは燐酸塩イオンを含有する緩衝剤
を含有しており、PH 5.0〜6.5を有する安定なトロンビン組成物であって、前記精製は、第一段階でDEAEセファロースカラムを用いて大部分の非トロンビンタンパク質を吸着させて除き、第二段階でCMセファロースカラムを用いてトロンピンを吸着させ、残る非トロンビンタンパク質はカラムを通過せしめ、該CMセファロースカラムからトロンビンを 0.45M NaCI中の0.05Mの前記緩衝剤で溶離させることからなるものである前記組成物。
2)前記緩衝剤が燐酸塩イオンを含有しそして前記pHが6.0〜6.5である請求項1記載の組成物。
3)前記緩衝剤が酢酸塩イオンを含有しそして前記pHが5.0〜5.5である請求項1記載の組成物。
4)前記ポリオールがグリセロールである請求項2記載の組成物。
5)前記ポリオールがグリセロールである請求項3記載の組成物。
6)請求項4記載の組成物および支持体からなる、創傷手当に使用するための止血剤。　　　
7)請求項5記載の組成物および支持体からなる、創傷手当に使用するための止血剤。
8)二段階イオン交換クロマトグラフィー処理により精製された精製トロンビンを25〜50重量%のポリオールおよび酢酸塩イオンまたは燐酸塩イオンを含有する緩衝剤と接触させる工程からなる、最終的なpH 5.0〜6.5を有する安定化されたトロンビン組成物の製法であって、前記精製は、第一段階でDEAEセファロースカラムを用いて大部分の非トロンビンタンパク質を吸着させて除き、第二段階でCMセファロースカラムを用いてトロンビンを吸着させ、残る非トロンビンタンパク質はカラムを通過せしめ、該CMセフフロースカラムからトロンビンを 0.45MNaCI中の0.05Mの前記緩衝剤で溶離させることからなるものである前記組成物の製法。
9)前記緩衝剤が燐酸塩緩衝剤でありそして最終的なpHが6.0〜6.5である請求項8記載の製法。
10)前記緩衝剤が酢酸塩緩衝剤でありそして最終的なpHが5.0〜5.5である請求項8記載の製法。」
　イ．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記の訂正事項は、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　そして、上記の訂正事項は、特許明細書に記載された事項の範囲内のものであって、かつ、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものではない。
　ウ．独立特許要件の判断
（引用刊行物）
刊行物１：Thrombos.Haemostas.
39
刊行物２：Methods　in　Enzymology　Volume　XLV　14章(p.161-166）1976年
刊行物３：J.Biol.Chem.,242、p.5252-5259（1967）
刊行物４：特開昭57-39849号公報
刊行物５：Biochemistry、18、p.5191-5196(1979)
刊行物６：特開昭56-39782号公報
刊行物７：J.Biol.Chem.,252、p.3587-3598(1977)
刊行物８：Thrombois　Res.　36、p.377-387(1984)
（引用刊行物の記載内容）
　訂正明細書の請求項１〜１１に係る発明に対して、当審が平成１１年１１月１２日付けで通知した取消理由で引用した刊行物１には、ウシトロンビンをスルフォプロピルーセファデックスＣ−５０でクロマトグラフィー処理したことが記載され、刊行物２には、ウシトロンビンをIRC-50陰イオン交換樹脂、DEAE−Sephadex、ならびにDEAE−cellulose、phospocelluloseとゲル濾過クロマトグラフィーとの組み合わせなどが用いられたこと、またヒトトロンビンの精製については、例えばsulfopropyl-Sephadexカラムを用いてｐＨ6.5の燐酸ナトリウム緩衝液溶液中のヒトトロンビンを精製する方法が記載され、刊行物３には、ウシトロンビンをDEAE-cellulose及びCellulose　phosphateの二段階イオン交換クロマトグラフィーで処理したことが記載され、刊行物４には、トロンビン溶液の安定化のために多価アルコールを配合したものが記載され、刊行物５には、糖及びポリオールが蛋白質の熱による変性を安定化することが記載され、刊行物６には、一価あるいは多価の水溶性有機カルボン酸塩類から選ばれた化合物の一種類または二種類以上を組み合わせて添加することによりトロンビン溶液を安定化する方法が記載され、刊行物７及び８には、トロンビンがｐＨ６で安定であることが記載されている。
（対比・判断）
　訂正明細書の請求項１に係る発明（以下、単に「請求項１に係る発明」という。）と、刊行物１〜６に記載された発明とを対比すると、両者はトロンビンをクロマトグラフィーにより精製する技術に関するものである点で一致するものの、前者はトロンビンを精製するにあたり、「第一段階でＤＥＡＥセファロースカラムを用いて大部分の非トロンビンタンパク質を吸着させて除き、第二段階でＣＭセファロースカラムを用いてトロンビンを吸着させ、残る非トロンビンタンパク質はカラムを通過せしめ、該ＣＭセファロースカラムからトロンビンを０．４５Ｍ　NaCl中の０．０５Ｍの前記緩衝剤（＝酢酸塩イオンまたは燐酸塩イオンを含有する緩衝剤）で溶離させる」ことにより精製されたものに、さらに２５〜５０重量％のポリオールを加え、ｐＨを５．０〜６．５としたトロンビン組成物であるのに対して、後者すなわち各刊行物には、このような特定の二段階精製法により得られた精製トロンビンを２５〜５０重量％のポリオールを加え、さらに特定のｐＨに調製した組成物とすることについては記載されておらず、示唆するところもない。上記各刊行物のうち、とくに刊行物３は、請求項１に係る発明における精製法と類似したクロマトグラフィーを利用した二段階精製法を記載するが、二段階目で使用されるカラムが刊行物３においてはCellulose　phosphateであるのに対して、請求項１においてはＣＭセファロースである点で相違し、また、２５〜５０重量％のポリオールを配合することについて刊行物３には全く言及しておらず、さらに刊行物４はトロンビン「溶液中グリセロールが５０部を越した比率は、きわめて粘度が高くまたは濃厚になる傾向があ」る（公報第６頁左上欄）ことが記載されているが、この系においてはリジンなどの、硫黄を含有しないアミノ酸を共存させることにより充分な安定性を得ているものであって、１０〜５０重量％のグリセロールのような多価アルコールと組み合わせ使用するトロンビンとして、請求項１に記載の特定の精製法により精製されたものを用いることについては全く記載するところがなく、刊行物７及び８は単にトロンビンがｐＨ６で安定であることを記載するにとどまるものであるから、当業者が、刊行物１〜８に記載された発明に基づいて、請求項１に係る発明を容易に想到することはできない。
　そして、請求項１に係る発明はこのような構成を採用することにより、燐酸塩系では１２月後で１００％、酢酸塩系では１２月後で９５％という高い活性をしめすという格別顕著な効果を奏するものである。
　したがって、本件請求項１に係る発明は、当業者が刊行物１〜８に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
　つぎに、訂正明細書の請求項２〜５に係る発明（以下、単に「請求項２〜５に係る発明」という。）について検討すると、請求項２〜５に係る発明は、請求項１に係る発明をさらに技術的に限定するものであるから、請求項１に係る発明についての理由と同様の理由により、刊行物１〜８に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
　さらに、請求項６〜７及び請求項８〜１０はそれぞれ、止血剤及び（トロンビン）組成物の製法に関するものであるところ、いずれも請求項１あるいはそれをさらに技術的に限定したトロンビン製剤を用いるもの、あるいは該トロンビン製剤の製法に関するものであるから、上記と同様の理由により、いずれも、刊行物１〜８に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
　よって、本件発明は特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　エ．むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び第３項で準用する同法第１２６第２〜４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
３．特許異議の申立についての判断
（本件発明）
　請求項１〜１０に係る発明は、訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１〜１０に記載されたとおりのものである。（上記２．ア参照）
　特許異議申立人財団法人　化学及血清療法研究所（以下、「申立人Ａ」という。）は、訂正前の請求項１〜１１に係る発明についての特許に対して、証拠として甲第１〜８号証（それぞれ上記刊行物１〜８に相当）を提出し、訂正前の請求項１〜１１に係る発明は甲第１〜８号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、訂正前の請求項１〜１１に係る発明についての特許は特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものであるから取り消されるべきであり、さらに、請求項１及９においては記載不備があるので本件特許は同法３６条に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであるから取り消されるべき旨主張し、特許異議申立人吉富製薬株式会社（以下、「申立人Ｂ」という。）は、訂正前の請求項１〜１１に係る発明は、明細書の詳細な説明の記載に不備があるので、本件特許は特許法第３６条に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであるから取り消されるべきであり、さらに甲第１号証（特開昭６２−８１３２７号公報）を提出し、訂正前の請求項９に係る発明は、甲第１号証に記載された先願発明と同一の発明であるから、訂正前の請求項９に係る発明の特許は特許法第２９条の２の規定により取り消されるべき旨主張し、特許異議申立人前田哲哉（以下、「申立人Ｃ」という。）は、甲第１号証（特開昭５７−３９８４９号公報；上記刊行物４に相当）、甲第２号証（特開昭５６−３９７８２号公報；上記刊行物６に相当）及び甲第３号証（特開昭６０−１１２７１号公報）を提出し、訂正前の請求項１及び９に係る発明についての特許は、甲第１〜３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、訂正前の請求項１及び９に係る発明についての特許は特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものであるから取り消されるべきであり、さらに、請求項１及び９に係る発明は、明細書の詳細な説明の記載に不備があるので、本件特許は特許法第３６条に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであるから取り消されるべきであると主張する。
（申立人Ａの主張について）
　申立人Ａの提出した甲第１〜８号証は、前記２．ウ．において記載した刊行物１〜８にそれぞれ相当するものであるところ、２．エ．において記載した理由により、請求項１〜１０に係る発明は、甲第１〜８号証に記載された発明から当業者が容易に発明をすることができたものではない。なお、申立人Ａは、とくに甲第４号証について、「甲第４号証の主たる特許請求の範囲の記載の構成要件は多価アルコール（ポリオール）のみであ」（特許異議申立書第１３頁）るとし、さらに「特許権者が固執する多価アルコール（ポリオール）と硫黄を含まないアミノ酸との組み合わせなる要件は、これらが特許請求の範囲の従属項として記載されていることからも明らかなように、甲第４号証の発明の好適な実施態様と捉えられるべきで」ある（同第１４頁第３行〜第６行）と主張するが、甲第４号証の実施例IIIにおいては、「リジンの不存在下において血液凝固時間は実質的に増加し、それによって安定性の著しい低下を示した。」（公報第７頁左上欄）と記載され、また、「１５％マンニトール、または３０％グリセロール、または３０％ソルビトールを伴なうトロンビンの生理食塩水溶液(PEGなし、アミノ酸なし)は、３７℃において４０日にわたり（ソルビトール）そしてある試験では７５日にわたり（グリセリンとマンニトール）トロンビン活性を示し続けた。」（公報第８頁右上欄）という記載もアミノ酸なしでも一定期間「トロンビン活性を示し続けた」というだけで、どの程度の活性かについて記載がなく、上記実施例IIIの「リジンの不存在下において・・・安定性の著しい低下を示した。」という記載と併せ考えれば、この「トロンビン活性を示し続けた。」の記載の意味するところは、それほど高くはないが、失活までは至らない程度のトロンビン活性レベルが持続した、と理解すべきものであって、このトロンビン活性持続結果が請求項１〜１０に係る発明における安定化効果と比肩できるものということはできないものであり、トロンビンを特定のクロマトグラフィー精製方法により精製することにより安定化させることについても何も示唆するところがないので、甲第４号証についての申立人Ａの主張も妥当でない。
　また、請求項１及び９における記載不備の主張については、明細書が訂正されたことにより、その根拠がなくなったものである。
（申立人Ｂの主張について）
　明細書の記載不備に関する主張については、明細書が訂正されたことにより、その根拠がなくなったものである。
　つぎに、訂正前の請求項９に係る発明についての、特願昭６０−２２２４５３号発明と同一である、という主張についても、明細書が訂正されたことにより、両者は互いに区別のできる別異の発明となった。
　したがって、申立人Ｂのいずれの主張も妥当でない。
（申立人Ｃの主張について）
　申立人Ｃが甲第１号証として提示した特開昭５７−３９８４９号公報は、刊行物４及び申立人Ａの提出した甲第４号証と同一のものであり、また、甲第２号証として提示した特開昭５６−３９７８２号公報は、刊行物６及び申立人Ａの提出した甲第６号証と同一のものであり、上記したと同様の理由で、本件請求項１〜１０に係る発明を何ら示唆するものではなく、甲第３号証（特開昭６０−１１２７１号公報）はコラーゲン−トロンビン組成物に関するものであり、同様に本件請求項１〜１０に係る発明を何ら示唆するものではなく、このような甲第１〜３号に記載された発明を組み合わせても本件請求項１〜１０に係る発明を当業者が容易になし得たものではない。
　また、請求項１及び９における記載不備の主張については、明細書が訂正されたことにより、その根拠がなくなったものである。
４．むすび
　したがって、特許異議の申立及び理由によっては、請求項１〜１０に係る発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年５月１５日（２００１．５．１５）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
　特許請求の範囲を以下のとおりに訂正する。
「１）（ａ）二段階イオン交換クロマトグラフィー処理により精製された精製トロンビン、
　（ｂ）２５〜５０重量％のポリオール、および酢酸塩イオンまたは燐酸塩イオンを含有する緩衝剤
を含有しており、ＰＨ５．０〜６．５を有する安定なトロンビン組成物であって、前記精製は、第一段階でＤＥＡＥセファロースカラムを用いて大部分の非トロンビンタンパク質を吸着させて除き、第二段階でＣＭセファロースカラムを用いてトロンビンを吸着させ、残る非トロンビンタンパク質はカラムを通過せしめ、該ＣＭセファロースカラムからトロンビンを０．４５Ｍ　ＮａＣＩ中の０．０５Ｍの前記緩衝剤で溶離させることからなるものである前記組成物。
２）前記緩衝剤が燐酸塩イオンを含有しそして前記ｐＨが６．０〜６．５である請求項１記載の組成物。
３）前記緩衝剤が酢酸塩イオンを含有しそして前記ｐＨが５．０〜５．５である請求項１記載の組成物。
４）前記ポリオールがグリセロールである請求項２記載の組成物。
５）前記ポリオールがグリセロールである請求項３記載の組成物。
６）請求項４記載の組成物および支持体からなる、創傷手当に使用するための止血剤
７）請求項５記載の組成物および支持体からなる、創傷手当に使用するための止血剤。
８）二段階イオン交換クロマトグラフィー処理により精製された精製トロンビンを２５〜５０重量％のポリオールおよび酢酸塩イオンまたは燐酸塩イオンを含有する緩衝剤と接触させる工程からなる、最終的なｐＨ５．０〜６．５を有する安定化されたトロンビン組成物の製法であって、前記精製は、第一段階でＤＥＡＥセファロースカラムを用いて大部分の非トロンビンタンパク質を吸着させて除き、第二段階でＣＭセファロースカラムを用いてトロンビンを吸着させ、残る非トロンビンタンパク質はカラムを通過せしめ、該ＣＭセフフロースカラムからトロンビンを０．４５ＭＮａＣＩ中の０．０５Ｍの前記緩衝剤で溶離させることからなるものである前記組成物の製法。
９）前記緩衝剤が燐酸塩緩衝剤でありそして最終的なｐＨが６．０〜６．５である請求項８記載の製法。
１０）前記緩衝剤が酢酸塩緩衝剤でありそして最終的なｐＨが５．０〜５．５である請求項８記載の製法。」
（５４）【発明の名称】
トロンビン製剤
（５７）【特許請求の範囲】
１）（ａ）二段階イオン交換クロマトグラフィー処理により精製された精製トロンビン、
　（ｂ）２５〜５０重量％のポリオール、および酢酸塩イオンまたは燐酸塩イオンを含有する緩衝剤
を含有しており、ｐＨ５．０〜６．５を有する安定なトロンビン組成物であって、前記精製は、第一段階でＤＥＡＥセファロースカラムを用いて大部分の非トロンビンタンパク質を吸着させて除き、第二段階でＣＭセファロースカラムを用いてトロンビンを吸着させ、残る非トロンビンタンパク質はカラムを通過せしめ、該ＣＭセファロースカラムからトロンビンを０．４５Ｍ　ＮａＣｌ中の０．０５Ｍの前記緩衝剤で溶離させることからなるものである前記組成物。
２）前記緩衝剤が燐酸塩イオンを含有しそして前記ｐＨが６．０〜６．５である請求項１記載の組成物。
３）前記緩衝剤が酢酸塩イオンを含有しそして前記ｐＨが５．０〜５．５である請求項１記載の組成物。
４）前記ポリオールがグリセロールである請求項２記載の組成物。
５）前記ポリオールがグリセロールである請求項３記載の組成物。
６）請求項４記載の組成物および支持体からなる、創傷手当に使用するための止血剤。
７）請求項５記載の組成物および支持体からなる、創傷手当に使用するための止血剤。
８）二段階イオン交換クロマトグラフィー処理により精製された精製トロンビンを２５〜５０重量％のポリオールおよび酢酸塩イオンまたは燐酸塩イオンを含有する緩衝剤と接触させる工程からなる、最終的なｐＨ５．０〜６．５を有する安定化されたトロンビン組成物の製法であって、前記精製は、第一段階でＤＥＡＥセファロースカラムを用いて大部分の非トロンビンタンパク質を吸着させて除き、第二段階でＣＭセファロースカラムを用いてトロンビンを吸着させ、残る非トロンビンタンパク質はカラムを通過せしめ、該ＣＭセファロースカラムからトロンビンを０．４５Ｍ　ＮａＣｌ中の０．０５Ｍの前記緩衝剤で溶離させることからなるものである前記組成物の製法。
９）前記緩衝剤が燐酸塩緩衝剤でありそして最終的なｐＨが６．０〜６．５である請求項８記載の製法。
１０）前記緩衝剤が酢酸塩緩衝剤でありそして最終的なｐＨが５．０〜５．５である請求項８記載の製法。
【発明の詳細な説明】
　タンパク分解酵素であるトロンビンは止血にとって必須物質である。このものはフィブリン生成による凝血塊の形成における主要な試薬である。凝固助剤としてのその有効性ゆえにトロンビンおよびその製剤は外科的処置中の出血を抑制するのに有用である。乾燥トロンビンは入手しうるが、取扱および時間的配慮から液体製剤が一般に好ましい。
　今まで、貯蔵安定性かつ外科手術中すぐ使用できる高度に安定な液体トロンビン製剤は何ら存在していない。これはトロンビンが、水または食塩水に溶解された場合に、トロンビンタンパク質の変性および自己分解ゆえにその活性を速やかに喪失することが原因である。
　今、適当な媒体中における精製トロンビンに安定化量のある種の緩衝剤を添加することにより、無菌で貯蔵安定性のトロンビン製剤が製造されうることが見出された。所望の場合は、食塩水および１種またはそれ以上のポリオール安定剤も使用されうる。
　この発明は１９８５年１０月２８日出願の米国特許出願番号第７９１，８３６号の記載に関連するものである。
　好ましい態様の一つにおいては、５０％（ｖ／ｖ）のグリセロールおよび０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）を含有する０．４５Ｍ　ＮａＣｌ溶液中における２０００Ｕ／ｍｌ（単位／ｍｌ）の精製トロンビンを含有する溶液が調製された。この溶液は、室温（２５℃）で６か月貯蔵した後もそのもとの凝固活性のすべてを保有していた。室温で１２か月貯蔵後でもごの溶液はまだもとの活性の８０％を保持していた。
　もう一つの好ましい態様においては、０．０５Ｍの酢酸塩緩衝液、２．７％（０．４５Ｍ）のＮａＣｌおよび２５％のグリセロールと共に１５００Ｕ／ｍｌの精製トロンビンを含有する組成物はｐＨ５で２５℃で６か月貯蔵後でフィブロメーターの示度によれば８６％の活性を示した。
　これらの好ましい組成物は４℃で貯蔵された場合にはそれより良好な活性さえ示した、すなわち燐酸塩系で１２か月後で１００％そして酢酸塩系で１２か月後で９５％を示した。
　本発明のトロンビン組成物およびその製法は血液凝固を助成するための慣用の製剤およびその製法に比較していくつかの長所を有する。
　粉末製剤と異なり、本発明組成物は使用に先立ち何ら再構成する必要がない。従って、１種またはそれ以上の成分（類）または容器（類）の計測、混合、滅菌等は重要な考慮要件ではない。本発明の製剤は最終使用前に最小限の、すなわちわずかしかまたは何ら調製を行うことなく使用されうる。
　その上、本発明のトロンビン含有物質の安定性ゆえに製品の貯蔵目録および／または回転の必要が大きく排除されることとなる。４℃で約１週間しか安定でない大部分のトロンビンの食塩水溶液または水溶液と異なり、本発明による製剤は通常の冷蔵温度（すなわち、約４℃）および室温（すなわち約２５℃）で６か月またはそれ以上の期間安定である。
　高濃度のグリセロール、スクロース、および他のポリオールが溶液中におけるタンパク質を安定化させうることは知られている。トロンビンの場合、グリセロール濃度６７％で１０００Ｕ／ｍｌのトロンビン溶液を大きく安定化させうることが知られている。しかしながら、高濃度のグリセロールを用いることは無菌トロンビン溶液の大規模製造においては実際的でない、何故ならかかる製剤の粘度が高くなるからである。５０％またはそれ以下のグリセロールを含有する本発明組成物によりこの問題が回避される。
　本発明の他の利点および観点は以下の記載を考察することにより明らかとなろう。
　本発明は最も広義には下記事項に関する。
Ｉ．精製トロンビン、ポリオール、および少くとも１種の緩衝剤を含有するトロンビン組成物好ましくは溶液。
ＩＩ．前記Ｉ項の調製物を含有する、傷手当用止血製剤。
ＩＩＩ．前記Ｉ項のトロンビン組成物の製法。
　本発明により調製された製剤は液体媒体中に実質上精製されたトロンビン、および本発明の緩衝剤の１種またはそれ以上を含有しなければならない。これらは食塩水、およびタンパク質製剤中に慣用に使用される他の物質を含有しうる。
　「製剤」なる用語を用いてはいるが、その中にはトロンビンが実質的に可溶化されるかまたは高度に分散された形態で、本発明におけるポリオールおよび緩衝剤の１種またはそれ以上と組み合わされて存在するすべての種類の配合物が包含されることが意図されることに注意されねばならない。
　液体製剤が一般に好ましい。トロンビンの溶液が大いに好ましい。液体製剤が調製される場合は、使用される溶媒（類）またはその他の希釈剤（類）がトロンビンと適当な混和性を有していて、それゆえ製剤標準、例えばバッチからバッチヘのトロンビン濃度の均一性、に容易に合致しうることが一般的に好ましい。
　用いられるトロンビンは二段階イオン交換クロマトグラフィーにより得られる精製トロンビンである。第一段階で、大部分の非トロンビンタンパク質を吸
では、ＣＭセファロースを用いてトロンビンを吸着させそして残る非トロンビンタンパク質はカラムを通過せしめる。このトロンビンは０．４５Ｍ　ＮａＣｌ中の０．０５Ｍ酢酸塩（ｐＨ５．０）を用いるかまたは０．４５Ｍ　ＮａＣｌ中の０．０５Ｍ燐酸塩（ｐＨ６．０）を用いて溶離させる。次にこのトロンビン溶液を、酢酸塩緩衝液または燐酸塩緩衝液のいずれかおよび食塩水を含有するグリセロールと混合して本発明の安定化された溶液を調製する。
　トロンビンは生理食塩水、すなわち約０．９％のＮａＣｌを含有する水溶液中に溶解しうることが知られている。しかしながら、他の食塩溶液も使用されうる。さらに、かかる溶液中のＮａＣｌの全部または一部を他の適当な塩の１種またはそれ以上で置換することもできる。
　本発明の製剤にとって好ましい媒体は水である。しかしながら、本発明の製剤におけるトロンビンの溶解度および／または安定性に不利な影響を及ぼさない他の希釈剤の１種またはそれ以上を用いることが望ましい。
　かかる希釈剤の一つはグリセロールである。他の有用なポリオールにはマンニトール、ソルビトール、マクロース、グルコース等が包含される。これらの混合物を用いることもできる。グリセロールが使用されるのが非常に好ましい。
　グリセロールまたは他のポリオール成分（類）は組成物の総重量に基づき約１０〜約６０重量％、好ましくは２５〜５０重量％の総濃度で使用されうる。
　もし別に断りなければ、示される量はすべて組成物の総重量に基づく重量％である。
　適当な緩衝系は、その水溶液が最終的なトロンビン溶液のｐＨを約５．０〜約８．０、好ましくはｐＨ約５．０〜約６．０に保持するものである。燐酸塩緩衝液が用いられる場合はその製剤の最終的なｐＨが約６．０〜約６．５でありそして酢酸塩緩衝液が用いられる場合は最終的なｐＨは約５．０であることが大変好都合である。
　ｐＨは組合せ電極を用い通常のｐＨ計で測定される。
　有用な緩衝系には酢酸塩、燐酸塩、コハク酸塩、重炭酸塩、イミダゾール、トリス、およびＮ．Ｅ．Ｇｏｏｄ氏他の
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
２４
Ａｎａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ
１０４
　本発明の緩衝系に使用するのに適当な試薬にはＭＥＳ，ＡＣＥＳ，ＢＥＳ，ＭＯＰＳ，ＴＥＳ，ＨＥＰＥＳ等が包含される。燐酸塩はカルシウムイオンが存在しないかまたはＥＤＴＡの存在下でのみ使用されるべきである。かかる試薬の混合物も使用されうる。もし混合緩衝剤が用いられる場合は、最終的なｐＨは適当に調整されねばならない。
　ホスヘートイオンおよびアセテートイオンを含有する緩衝剤が好ましい。それらの混合物を用いることもできる。
　米国特許出願番号第０６／７９１，８３６号に記載の緩衝系も本発明で使用されうる。
　緩衝剤は水および／または他の適当な希釈剤（類）と共に、緩衝溶液中に総濃度約０．０２Ｍ〜約１Ｍ、好ましくは約０．０５Ｍ〜約０．１０Ｍで存在しよう。
　他の種々の慣用の添加剤、例えば酸化防止剤、着色剤、界面活性剤等を使用することもできる。場合によりグルタチオンも一成分として使用されうる。アミノ酸が場合により使用されうるが、それらは、精製されたトロンビンに及ぼすポリオールおよび緩衝成分の安定化作用を妨害するような量で存在してはならない。一般に、それらはもし存在するとすれば０．５％またはそれ以下の少量でのみ使用されるのが好ましい。
　一般に、これまでに論じられた成分の濃度範囲は第Ｉ表に示される限界内であろう。表中の％は組成物の総重量に基づく。
止血剤
と組み合わせてまたは単独で使用されるコラーゲンは種々の方法を用い、本発明による安定化されたトロンビン製剤と一緒に効果的に使用されうる。好ましくは、安定化された溶液を止血剤上に吸収させそしてパッドを凍結乾燥させ、無菌的に包装する。
　抗菌剤または抗生物質も、特に感染予防が決定的に重要である火傷患者に使用するために前記パッド中に混入されうる。さらに、界面活性剤およびＮａＣｌ以外の塩も使用されうる。かかる添加剤の１種またはそれ以上が存在する場合はそれらの濃度は一般に第ＩＩ表に示される範囲内にある。
　本発明による止血剤の製造に適当な包帯の種類の一つは米国特許第４，３６３，３１９号に記載されている。
トロンビン製剤の製造
　好ましくはウシ起源の粗製トロンビンを前記の２段階イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。この精製トロンビンを０．４５Ｍ　ＮａＣｌ中の０．０５Ｍ燐酸塩（ｐＨ６．０）を添加することによるか、または０．４５Ｍ　ＮａＣｌ中０．０５Ｍ酢酸塩（ｐＨ５．０）を添加することによりＣＭ−セファロースから溶離する。カラムから溶出したトロンビンは高度に濃縮されており、本発明によるトロンビン製剤を製造するためには、希釈されねばならない。これは、例えば燐酸塩緩衝食塩水中における溶出したトロンビンにｐＨ６．０の０．０５Ｍ燐酸塩、０．４５Ｍ　ＮａＣｌ中の５０％（ｗ／ｗ）グリセロールを含有する同量の溶液を添加することにより行われる。得られるトロンビン製剤は２５％グリセロール、０．０５Ｍ燐酸塩、０．４５Ｍ　ＮａＣｌ中に所望濃度の精製トロンビンを含有している。この特定の製剤はｐＨ６．０を有する。
　得られる製剤はＢＢＬフィブロメーターを用いて凝固時間を測定することにより検定する。
　以下の実施例により本発明をより詳しく説明する。
実施例　Ｉ
　燐酸塩緩衝されたトロンビン組成物の調製は前記したとおりである。酢酸塩緩衝された組成物は０．０５Ｍ燐酸塩（ｐＨ６．０）に代えてｐＨ５．０の０．０５Ｍ酢酸塩を用いることにより同様にして調製される。
　本発明のトロンビン組成物は下記操作により検定される。
　トロンビン活性レベルはＢＢＬフィブロメーターで凝固時間を測ることにより測定される。フィブリノゲン源はプールされたヒト血漿を０．９％食塩水で１：１に希釈したものである。トロンビン溶液はイミダゾールにより緩衝された食塩水中の０．５％ポリエチレングリコール８０００を用いて２００倍に希釈する。凝固カップに希釈された血漿０．２ｍｌを加える。これを３７℃に３分間保ち、次にこの溶液に希釈されたトロンビン溶液のこれも３７℃で３分間保持されたもの０．１ｍｌを加える。凝固時間はフィブロメーターの示度から直接測定する。残留するトロンビン単位／ｍｌの数字はトロンビン濃度対凝固時間の標準曲線から測定される。
実施例　ＩＩ
　第ＩＩＩ表に示されるデータにより、ｐＨ６．０のグリセロール燐酸塩系における精製トロンビンの安定性が証明される。
　グリセロールレベルが２５％より低い場合は室温ではトロンビンの安定性が保持されないことに注意すべきである。
実施例　ＩＩＩ
　第ＩＶ表に示されるデータによりｐＨ５．０のグリセロール−酢酸塩系中における精製トロンビンの安定性が証明される。
　同じ配合物中における不純なトロンビンと精製トロンビンの安定性を比較することが有益である。不純なトロンビンの溶液（１５００単位／ｍｌ、２５％（ｗ／ｗ）グリセロール、０．０５Ｍ酢酸塩および０．４５Ｍ　ＮａＣｌ中、（ｐＨ５．０））は２５℃で１か月貯蔵した場合でその当初の凝固活性の６８％を保有していることが判明した。１５００単位／ｍｌの精製トロンビンを含有する同様の配合物は２５℃で１か月経過後でその当初活性の１００％を保持し、そして２５℃で６か月経過後でその活性の８６％を保持していることが判明した。
実施例　ＩＶ
止血剤の製造
　０．４５Ｍ食塩水を含有するｐＨ５．０の０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液中における精製トロ
ッドを凍結乾燥する。かかる乾燥パッド中に含有されるトロンビンは室温においてさえもその安定性を長期間にわたり保持しうる。グリセロール／酢酸塩中に精製トロンビンを飽和しそして湿潤状態で貯蔵されたゲルフォームのパッドは室温で６日後には完全に分解した。
　当業者が考えうるような妥当な変形は本発明の範囲から逸脱することなく行われうることに留意されたい。