(57)【要約】  本発明は、韓国型イシダイイリドウイルスの免疫原性を有する蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子によりコードされる蛋白質、該蛋白質から由来した合成ペプチド、該遺伝子を含む組み換え発現ベクター、該組み換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体を不活性化させて製造した不活性化ワクチン及び該ワクチンを利用して魚類を免疫させる方法である。
2008522584.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１ないし配列番号７のうち何れか１つの塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有し、韓国型イシダイイリドウイルスの免疫原性蛋白質をコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するＯＲＦ Ａ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号２の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するＯＲＦ Ｂ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号３の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するＯＲＦ Ｃ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号４の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するＯＲＦ Ｄ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項６】
配列番号５の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するＯＲＦ Ｅ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項７】
配列番号６の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するＯＲＦ Ｆ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項８】
配列番号７の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するＯＲＦ Ｇ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項９】
配列番号８ないし配列番号１４のうち何れか１つのアミノ酸配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する、アミノ酸配列を有する韓国型イシダイイリドウイルスＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の免疫原性蛋白質であることを特徴とする免疫原性蛋白質。
【請求項１０】
配列番号８のアミノ酸配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、アミノ酸輸送子の機能を有するＯＲＦ Ａ蛋白質であることを特徴とする請求項９に記載の免疫原性蛋白質。
【請求項１１】
配列番号９のアミノ酸配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、主要カプシド蛋白質の機能を有するＯＲＦ Ｂ蛋白質であることを特徴とする請求項９に記載の免疫原性蛋白質。
【請求項１２】
配列番号１０のアミノ酸配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、ＩｇＭ重鎖の機能を有するＯＲＦ Ｃ蛋白質であることを特徴とする請求項９に記載の免疫原性蛋白質。
【請求項１３】
配列番号１１のアミノ酸配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、ラミニン結合蛋白質であるＯＲＦ Ｄ蛋白質であることを特徴とする請求項９に記載の免疫原性蛋白質。
【請求項１４】
配列番号１２のアミノ酸配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミリスチル化された膜蛋白質であるＯＲＦ Ｅ蛋白質であることを特徴とする請求項９に記載の免疫原性蛋白質。
【請求項１５】
配列番号１３のアミノ酸配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する、アミノ酸配列を有するＯＲＦ Ｆ蛋白質であることを特徴とする請求項９に記載の免疫原性蛋白質。
【請求項１６】
配列番号１４のアミノ酸配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、アンキリン反復配列を有するＯＲＦ Ｇ蛋白質であることを特徴とする請求項９に記載の免疫原性蛋白質。
【請求項１７】
配列番号１５及び配列番号１６で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項１８】
配列番号１７及び配列番号１８で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項１９】
配列番号１９及び配列番号２０で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項２０】
配列番号２１及び配列番号２２で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項２１】
配列番号２３及び配列番号２４で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項２２】
配列番号２５及び配列番号２６で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項２３】
配列番号２７及び配列番号２８で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項２４】
韓国型イシダイイリドウイルスＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の全体ゲノムＤＮＡを鋳型として、請求項１７ないし請求項２３のうち何れか１項に記載のオリゴヌクレオチドプライマ対を利用して、ＰＣＲを行って請求項１に記載の遺伝子を増幅させる工程、及び増幅された遺伝子を分離する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子を増幅させて得る方法。
【請求項２５】
原核細胞用の発現ベクター内に挿入された請求項１に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組み換え発現ベクター。
【請求項２６】
原核細胞用の発現ベクターは、ｐＥＴ２８ａであることを特徴とする請求項２５に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２５または請求項２６に記載の組み換え発現ベクターで形質転換されたことを特徴とする原核宿主細胞。
【請求項２８】
宿主細胞は、 Ｅ．ｃｏｌｉであることを特徴とする請求項２７に記載の原核宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２７または請求項２８のうち何れか１項に記載の形質転換された宿主細胞を、適切な栄養培地でＩＰＴＧの存在下で培養する工程を含んで、前記形質転換された宿主細胞から組み換え蛋白質を量産することを特徴とする方法。
【請求項３０】
ＩＰＴＧの濃度は、１ｍＭ〜１０ｍＭ範囲であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＩＰＴＧの処理時間は、２時間以上であることを特徴とする請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＩＰＴＧの処理時間は、４〜６時間であることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２７または請求項２８のうち何れか１項の形質転換宿主細胞の培養により生産されたことを特徴とする組み換え蛋白質。
【請求項３４】
請求項２７または請求項２８のうち何れか１項の形質転換宿主細胞を不活性化剤で処理する工程を含むことを特徴とする組み換え不活性化ワクチンの製造方法。
【請求項３５】
不活性化剤は、ホルマリンであることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ホルマリンの濃度は、０.１％ないし０.７％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ホルマリンの濃度は、０.５％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２７または請求項２８のうち何れか１項の形質転換宿主細胞を不活性化させて製造したことを特徴とする組み換え不活性化ワクチン。
【請求項３９】
前記ワクチンは、配列番号１の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するＯＲＦ Ａ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＡであることを特徴とする請求項３８に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項４０】
前記ワクチンは、配列番号２の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する、塩基配列を有するＯＲＦ Ｂ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された、宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＢであることを特徴とする請求項３８に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項４１】
前記ワクチンは、配列番号３の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する、塩基配列を有するＯＲＦ Ｃ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された、宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＣであることを特徴とする請求項３８に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項４２】
前記ワクチンは、配列番号４の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する、塩基配列を有するＯＲＦ Ｄ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された、宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＤであることを特徴とする請求項３８に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項４３】
前記ワクチンは、配列番号５の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する、塩基配列を有するＯＲＦ Ｅ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された、宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＥであることを特徴とする請求項３８に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項４４】
前記ワクチンは、配列番号６の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する、塩基配列を有するＯＲＦ Ｆ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された、宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＦであることを特徴とする請求項３８に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項４５】
前記ワクチンは、配列番号７の塩基配列、またはこれと８０％以上の配列相同性を有する、塩基配列を有するＯＲＦ Ｇ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された、宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＧであることを特徴とする請求項３８に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項４６】
請求項３９ないし請求項４５のうち何れか１項に記載の組み換え不活性化ワクチンのうち、２以上を含むことを特徴とする組み合わせられた組み換え不活性化ワクチン。
【請求項４７】
不活性化ワクチンＢとＣ、不活性化ワクチンＢとＤ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ及びＥ、または不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含むことを特徴とする請求項４６に記載の組み合わせられた組み換え不活性化ワクチン。
【請求項４８】
不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含むことを特徴とする請求項４７に記載の組み合わせられた組み換え不活性化ワクチン。
【請求項４９】
請求項３８ないし請求項４５のうち何れか１項に記載の組み換え不活性化ワクチン、または請求項４６ないし請求項４８のうち何れか１項に記載の組み合わせられた組み換え不活性化ワクチンを魚類に投与することを含むことを特徴とする魚類の免疫方法。
【請求項５０】
前記不活性化ワクチンを魚類の背筋肉に投与することを特徴とする請求項４９に記載の魚類の免疫方法。
【請求項５１】
ワクチンの投与量は、２００μｇ組み換え蛋白質／ｋｇ体重であることを特徴とする請求項４９または請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項３９ないし請求項４５のうち何れか１項に記載の組み換え不活性化ワクチンのうち、少なくとも１つを含むことを特徴とするキット。
【請求項５３】
不活性化ワクチンＢとＣ、不活性化ワクチンＢとＤ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ及びＥ、または不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含むことを特徴とする請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含むことを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
配列番号２９ないし配列番号３８から構成される群から選択されたアミノ酸配列を有し、イリドウイルスの免疫原性を有することを特徴とするペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タイ類に感染して集団斃死を誘発するイシダイイリドウイルス（Ｒｏｃｋ Ｂｒｅａｍ ＩｒｉｄｏＶｉｒｕｓ；以下、ＲＢＩＶ）であって、韓国型分離株であるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１から分離された遺伝子、前記遺伝子を含む組み換え発現ベクター、前記発現ベクターを含む形質転換体、前記形質転換体で製造された不活性化ワクチン等に関する。
【背景技術】
【０００２】
タイ類は、高級魚種の１つであって、その需要が多くて、日本、韓国、中国などを含むアジア諸国で養殖されている。日本及び韓国の場合、刺身に対する嗜好度が高くて、養殖魚類の消費が増加しつつあり、養殖業は、国家の経済にも大きく寄与し、特に、排他的な保護水域が増えて行くにつれ、その重要性はますます大きくなっている。特に、韓国は、三面が海で囲まれており、東海岸、南海岸、西海岸、済州島一帯は、魚類の養殖に適した水質及び水温を保っており、疾病などの管理が徹底的に行われれば、タイ類の養殖業が発展する可能性は非常に高い。しかし、タイ類の養殖において、ウイルス性の疾病による集団斃死が大きな問題となってきた。
毎年、イリドウイルスの感染によるウイルス性疾病が発生することによって、数千万尾のタイ類が斃死し、また、前記のようなウイルス性疾病が一度発生すれば、治療が非常に難しいだけでなく、経済的な損失が大きく、漁村地域の養殖漁家に莫大な経済的な打撃を与えて、魚族資源の確保にも悪影響を及ぼしている。
イリドウイルスには、イリドウイルス属（ｇｅｎｕｓ  Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、クロルイリドウイルス属（ｇｅｎｕｓ  Ｃｈｌｏｒｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、ラナウイルス属（ｇｅｎｕｓ  Ｒａｎａｖｉｒｕｓ）及びリムフォキスティウイルス属（ｇｅｎｕｓ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｓｔｉｖｉｒｕｓ）などの４種類の属が存在し、魚類に感染するイリドウイルスは、ラナウイルス属及びリムフォキスティウイルス属がある。このうち、魚類の大量斃死を誘発するイリドウイルスは、ラナウイルス属のイリドウイルスである。
タイ類、スズキ、ヒラメ及びブリなどの腎臓、脾臓、神経細胞または魚類免疫関連の細胞を感染させて、それらの感染魚類の大量斃死を誘発するイリドウイルスは、１９９７年までは韓国で発生しなかった疾病であるが、１９９８年の夏期に、南海岸の閉じ込め養殖場のイシダイの大量斃死が発生し始めて（Ｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈ，１３（２）：１２１〜１２７，２０００）、現在まで養殖漁民に相当の経済的な被害を与えている。
魚類イリドウイルスワクチンの開発は、イリドウイルスに感染された魚類の組織を磨砕及び濾過して、ＧＦ（Ｇｒａｎｔ Ｆｉｎ）細胞に接種した後、培養されたウイルスをホルマリンで不活性化させて使用する場合（Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ，ａｌ．，ＤＡＯ，３６（１）：７３〜７５，１９９９）以外には、遺伝子を利用したイリドウイルスワクチンの開発についての報告がいまだにないと確認された。
これにより、本発明者らは、イリドウイルスに対する予防ワクチンの製造のために有効に利用され得る遺伝子及び蛋白質を発見し、前記遺伝子を含む組み換えベクター、及び前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体を製造し、これを不活性化させて組み換え不活性化ワクチンを製造することによって本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、既存の魚類イリドウイルスの不活性化ワクチンの短所である高いウイルス不活性化ワクチンの製造コスト及び、ウイルス継代によるウイルス濃度の減少によるワクチン製造用のイリドウイルス感染魚類組織の確保という問題を解決し、韓国型ＲＢＩＶ分離株であるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１をはじめとする、ＲＢＩＶに対する免疫反応の誘発能力に優れたＲＢＩＶに対する予防ワクチンを提供することを目的とする。
また、本発明は、前記のようなＲＢＩＶに対する予防ワクチンの製造のために利用されうるイリドウイルスの遺伝子及び蛋白質、前記蛋白質から由来したペプチド、前記遺伝子を含む組み換えベクター、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体及びそれから製造されたワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、イリドウイルスの免疫原性蛋白質をコードして、イリドウイルスに対する予防ワクチンの製造のために利用され得る韓国型イシダイイリドウイルスであるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子を提供する。
また、本発明は、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子のそれぞれによりコードされる免疫原性蛋白質ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ蛋白質を提供する。
また、本発明は、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子をクローニングするために利用されるプライマ対を提供する。
また、本発明は、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子を増幅させて得る方法を提供する。
また、本発明は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子のそれぞれを含む組み換え発現ベクターを提供する。
また、本発明は、前記ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子のそれぞれを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
また、本発明は、前記形質転換された宿主細胞から、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子によりそれぞれコードされる組み換え蛋白質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを生産する方法を提供する。さらに具体的に、本発明は、前記形質転換された宿主細胞から前記組み換え蛋白質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧを生産するに当たって、発現誘導剤の濃度及び処理時間などを最適化することによって前記組み換え蛋白質を量産する方法を提供する。
また、本発明は、前記形質転換された宿主細胞から生産された組み換え蛋白質ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧを提供する。
また、本発明は、前述した本発明の形質転換された宿主細胞を不活性化させて、不活性化ワクチンを製造する方法、及びこれにより製造された不活性化ワクチンを提供する。
また、本発明は、前記の形質転換された宿主細胞を不活性化させて製造した、不活性化ワクチンを利用して魚類を免疫させる方法を提供する。
また、本発明は、前記の本発明の不活性化ワクチンを含むキットを提供する。
また、本発明は、イリドウイルスに対する予防ワクチンの製造のために利用され得るポリペプチドの断片を提供する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、は、ＲＢＩＶに対するワクチンの製造に利用され得るＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の免疫原性蛋白質をコードする遺伝子、これによってコードされる免疫原性蛋白質、これから由来したペプチド、前記遺伝子を含む組み換えベクター、前記組み換えベクターを含む形質転換体、前記形質転換体を利用して製造された不活性化ワクチンを提供することによって、イリドウイルスに対するワクチンの効果が優秀であり、かつ安価なイリドウイルスワクチンを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、添付した図面を参照して、本発明を詳細に説明する。
本発明の第１態様によって、本発明は、イリドウイルスの免疫原性蛋白質をコードして、イリドウイルスに対する予防ワクチンの製造のために利用され得る韓国型ＲＢＩＶであるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１から分離したＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子、及びそれらの配列相同体を提供する。
本発明者らは、韓国型ＲＢＩＶであるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の場合、ウイルスを構成する蛋白質数が１１８個以上であり、ゲノムＤＮＡのサイズが１１２,０８０ｂｐであって、現在まで報告された魚類イリドウイルスとは異なるということが確認され、前記ゲノムＤＮＡの配列を決定し、これを、コンピュータプログラムを利用して分析して、１１８個の可能なＯＲＦを確認した。そして、これらのＯＲＦから推論されたアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴプログラムを利用してＧｅｎＢａｎｋのデータベースと比較・分析した結果、機能が公知の蛋白質と高い相同性を有する２９個のＯＲＦ及び、公知の配列と相同性を有していない３１個のＯＲＦを確認した（Ｄｏ ｅｔ，ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２５：３５１〜３６３，２００４：参考として全体が本願に統合される）。これらのの塩基配列の情報は、アクセッション番号第ＡＹ５３２６０６号としてＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録された。
前記のようなＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡの配列及びＯＲＦ情報に基づいて、本発明者らは、イリドウイルスの免疫原性蛋白質をコードして、イリドウイルスに対するワクチンの製造に有効なイリドウイルスの遺伝子を発見するために、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の１１８個のＯＲＦのうち、第一に、ウイルスの外側に存在して、魚類の免疫反応を誘導する可能性の高い構造蛋白質、第二に、細胞の表面に発現される蛋白質であって、ウイルスが増殖して生きている細胞と隣接する正常細胞とを堅く結合させる役割を行う蛋白質、第三に、ウイルスが感染された細胞でイリドウイルス蛋白質が合成されるとき、宿主細胞の外膜に存在する可能性の高いイリドウイルス蛋白質の遺伝子を発見することにした。
このために、前記１１８個のＯＲＦの塩基配列をアミノ酸配列に転写して、現在まで米国生物学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋに登録されたアミノ酸配列と比較・分析して、前記の３つの条件を満足する７個の遺伝子を選別して、ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧと命名し、これらを本発明のイリドウイルスに対するワクチンの製造のために利用した。
前記のような分析を通じて選別された本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ遺伝子は、配列目録の配列番号１の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｂ遺伝子は、配列番号２の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｃ遺伝子は、配列番号３の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｄ遺伝子は、配列番号４の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｅ遺伝子は、配列番号５の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｆ遺伝子は、配列番号６の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｇ遺伝子は、配列番号７の塩基配列を有する。
一方、前記配列番号１、２、３、４、５、６または７の塩基配列で１以上の塩基置換、欠失、挿入及び／または付加されるか、または前記配列番号１、２、３、４、５、６または７の塩基配列と厳しいハイブリッド化の条件下でハイブリッド化する、前記配列番号１、２、３、４、５、６、または７の塩基配列と７０％以上の配列相同性を有する配列相同体も本発明に含まれる。
ハイブリッド化のための条件は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ．Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９））に開示されており、例えば、５×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１％のＳＤＳ，２５℃〜６８℃で数時間ないし一夜などの条件を利用できる。このとき、混成化温度は、さらに好ましくは、４５℃〜６８℃（ホルムアミドなし）、または３０℃〜４２℃（５０％のホルムアミド）が利用され、洗浄条件は、０.２×ＳＳＣ、４６℃〜６８℃を利用できる。
当業者であれば塩の濃度及び温度などの混成化条件を調節して、本発明のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子の塩基配列に対して、一定％以上の配列相同性を有するＤＮＡの 塩基配列を得ることができ、このようにして得られた配列相同体は、本発明の範囲に含まれる。
すなわち、本発明は、前記配列番号１、２、３、４、５、６、または７の塩基配列に対して７０％以上、好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を有するＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子の配列相同体を含む。
本発明の第２態様によって、本発明は、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子によってそれぞれコードされるイリドウイルスの免疫原性蛋白質であるＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ蛋白質及びこれらの配列相同体を提供する。
本発明のＯＲＦ Ａ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ａ蛋白質は、３７８個のアミノ酸からなり、推定分子量は、４０,７３１.４８Ｄａであり、配列番号８のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、マンダリンフィッシュから由来したイリドウイルスであるＩＳＫＮＶのアミノ酸輸送子蛋白質と９５％以上のアミノ酸配列の相同性を有して、アミノ酸輸送子の機能を行うと推定される。
ＯＲＦ Ｂ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｂ蛋白質は、４５３個のアミノ酸からなり、推定分子量は、４９,４７６.７９Ｄａであり、配列番号９のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、ＲＳＩＶ（Ｒｅｄ Ｓｅａ Ｂｒｅａｍ Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）の主要カプシド蛋白質と９９％のアミノ酸配列の相同性を有して、主要カプシド蛋白質と推定される。
ＯＲＦ Ｃ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｃ蛋白質は、５１５個のアミノ酸からなり、推定分子量は、５７,０２６.９６Ｄａであり、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、ＩＳＫＮＶの配列と８５％以上の配列相同性を有して、ＩｇＭ重鎖蛋白質と推定される。
ＯＲＦ Ｄ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｄ蛋白質は、８０５個のアミノ酸からなり、推定分子量は、８７,３３２Ｄａであり、配列番号１１のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、ＲＳＩＶのラミニン結合蛋白質の配列と９０％以上の配列相同性を有して、ラミニン結合蛋白質と推定される。
ＯＲＦ Ｅ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｅ蛋白質は、２７５個のアミノ酸からなり、推定分子量は、３０,３３８.７４Ｄａであり、配列番号１２のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、７０％以上の高い配列相同性を有する配列が発見されず、蛋白質の機能性モチーフの検索結果、ミリスチル化された膜蛋白質と推定される。
ＯＲＦ Ｆ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｆ蛋白質は、２５８個のアミノ酸からなり、推定分子量は、２９,２７２.７０Ｄａであり、配列番号１３のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、相同性を有する配列が発見されなかった。
ＯＲＦ Ｇ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｇ蛋白質は、４５４個のアミノ酸からなり、推定分子量は、４９,９７３.５６Ｄａであり、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、ＩＳＫＮＶの配列と９０％以上の配列相同性を有して、アンキリン反復配列（ＡＮＫＹＲＩＮ  ＲＥＰＥＡＴＳ）と推定される。
また、本発明は、前記配列番号８ないし配列番号１４のアミノ酸配列で、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／または付加されるが、前記配列に７０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、イリドウイルスの免疫原性を有する蛋白質を含む。
好ましくは、本発明は、前記配列番号８ないし配列番号１４のアミノ酸配列に７０％以上、より好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、イリドウイルスの免疫原性を有する蛋白質を含む。
本発明の第３態様によって、本発明は、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧＤＮＡを得るために、これらの遺伝子をＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ（重合酵素の連鎖反応）により増幅させるために利用されるプライマ対を提供する。
前述したように、本発明者らは、イリドウイルスに対するワクチンの製造に利用され得るものとして選択されたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅させるために、各遺伝子のためのプライマ対を考案した。
前記プライマ対は、増幅されたＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子をクローニングさせる発現ベクター内の制限酵素の部位を考慮して、両末端で適切な制限酵素の部位を有するように考案される。
本発明の好ましいプライマ対は、本発明で利用される好ましい発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）内の制限酵素の部位を考慮して、順方向プライマは、Ｎｈｅ Ｉの切断部位を有するように、そして、逆方向プライマは、Ｈｉｎｄ IIIの切断部位を有するように考案される。
しかし、本発明のプライマ対は、前記の切断部位以外に、ベクターｐＥＴ２８ａ内に存在する他の制限酵素の部位に相応する切断部位を有するように考案され、このようなプライマ対も本発明に含まれる。
また、本発明の前記ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子は、ｐＥＴ２８ａ以外の後述するような多様な発現ベクター内へクローニングされ得るので、このような多様なベクター内の制限酵素の切断部位に相応する多様な切断部位を有するように考案され、このようなプライマ対も本発明に含まれる。
ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子のそれぞれのための好ましいプライマ対の塩基配列は、次の通りである：
ＯＲＦ Ａ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＣＧ ＴＧＴ ＧＴＡ ＣＴＡ ＣＡＧ ＴＧＴ ３’（配列番号１５）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＡＴＡ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＡＡ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ３’（配列番号１６）
ＯＲＦ Ｂ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＧＴ Ｇ ３’（配列番号１７）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＴＧＣ ３’（配列番号１８）
ＯＲＦ Ｃ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＣＧＴ ＧＧＧ ＴＡＡ ＧＧＣ ＡＧＧ ＴＡＡ ３’（配列番号１９）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ ＧＣＴ ＡＣＴ ＡＴＧ ３’（配列番号２０）
ＯＲＦ Ｄ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＧ ＧＴＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ３’（配列番号２１）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡＣ ＴＣＧ ＴＴＡ ＣＣＧ ＴＴＧ ＧＧＡ ＣＧＡ ３’（配列番号２２）
ＯＲＦ Ｅ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＣＡ ＡＴＡ ＡＡＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＴＡ ３’（配列番号２３）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＴＴＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＡＣ ＣＴＡ ＴＧＴ ＧＡＡ ３’（配列番号２４）
ＯＲＦ Ｆ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＴＡＣ ＣＧＧ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＡＴＡ ３’（配列番号２５）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＴＴ ＴＡＴ ＣＴＧ ３’（配列番号２６）
ＯＲＦ Ｇ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＣＡＴ ＧＴＡ ＣＡＴ ＧＴＧ ＴＣＴ ＧＴＴ ３’（配列番号２７）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＣＧＴ ＣＴＴ ＡＴＣ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＣＧ ３’（配列番号２８）
また、前記の各遺伝子のためのプライマ対の配列またはその一部を含み、ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子のＰＣＲ増幅に利用され得るプライマ対も本発明に含まれる。
本発明のプライマは、オリゴヌクレオチド合成器により合成して利用でき、このようなオリゴヌクレオチドの合成方法などは、当業界に公知されて利用されており、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）やＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１.５３（１９８９）のような文献に開示されている。
本発明の第４態様によって、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドプライマ対を利用して、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子を得る方法を提供する。
本発明の方法は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の全体ゲノムＤＮＡを鋳型として、前記本発明のオリゴヌクレオチドプライマ対を利用してＰＣＲを行い、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを増幅させる工程、及び増幅された各遺伝子を分離する工程を含む。
本発明の方法に利用されるウイルスゲノムＤＮＡの分離、ＰＣＲ及び増幅された遺伝子の分離方法などは、当業界に公知されて利用されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１.５３（１９８９）のような文献に開示されている。
簡単に要約すると、ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、鋳型としてウイルスの全体ゲノムＤＮＡと適切な重合酵素及びプライマ対でＰＣＲ反応物を形成し、これをＰＣＲ反応器で変性、アニール化及び延長反応させることによって行われる。
本発明の方法で有効な重合酵素は、ＥＸ Ｔａｑ重合酵素であるが、必ずしもこれに制限されるものではなく、変性、アニール化及び延長反応のための適した反応温度及び反応時間は、当業者ならば容易に決定して利用できる。好ましくは、本発明の方法の変性反応は、９４℃で４５秒間行われ、アニール化反応は、６０℃で４５秒間行われ、延長反応は、７２℃で４５秒間行われる。
このように増幅されたＤＮＡを適切な制限酵素、好ましくは、Ｎｈｅ Ｉ及びＨｉｎｄ IIIで処理し、アガロースゲルで電気泳動して増幅されたＤＮＡバンドを確認し、これからＤＮＡを精製することによって、発現ベクターにクローニングされる各遺伝子が得られる。
このような本発明の方法により得られたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子は、組み換えＯＲＦ ＡないしＧ蛋白質の生成に利用される組み換え発現ベクターの製造に利用され得る。
本発明の第５態様によって、本発明は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを含む組み換え発現ベクターを提供する。
本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子を挿入して組み換え発現ベクターを製造するためのベクターは、遺伝子の配列がベクター内に挿入された後、このベクターが宿主内に感染して、宿主細胞内で所望の遺伝子を発現し、所望の蛋白質を生産できる発現用ベクターであれば、何れも利用できる。このような発現ベクターは、１以上の選択性マーカー、プロモータ配列などを含み、発現ベクターの例としては、ｐＥＴ２８ｃ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＥＴ２８ａなどがあるが、必ずしもこれらに限定されるものではなく、このうち、原核細胞用の発現ベクターが本発明に好ましく、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、 米国）が特に好ましい。
プラスミドなどのベクターに本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを挿入する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１.５３（１９８９）に記載されている。
本発明で利用された組み換え発現ベクターの製造を簡単に要約すると、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを、前記の本発明のオリゴヌクレオチドプライマ対を利用してＰＣＲにより増幅させた後、それらの遺伝子及び発現ベクターを同じ制限酵素で分解処理し、前記遺伝子のそれぞれを適切なリガーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを利用して発現ベクターにライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させることによって、ＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれのための組み換え発現ベクターＡないしＧを製造する。
本発明の組み換え発現ベクターの一例として、ＯＲＦ Ｂ遺伝子を含むベクターｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｂが図１に示されている。
このように製造された組み換え発現ベクターＡないしＧを、宿主細胞の形質転換に利用できる。
本発明の第６態様によって、本発明は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを含む組み換え発現ベクターＡないしＧで形質転換された宿主細胞ＡないしＧを提供する。
本発明に利用され得る宿主細胞としては、本発明の組み換え発現ベクターに適しており、形質転換され得る細胞であれば可能であり、当業界で一般的に使用されるＥ．ｃｏｌｉ菌株などが利用され得るが、必ずしもこれに限定されるものではない。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ ２１等）が宿主細胞として本発明に利用される。
本発明の組み換えベクターＡないしＧを宿主細胞に導入する方法は、例えば、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧなどの化学的処理による方法のような当業界に公知された方法を利用でき、これらの方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１.５３（１９８９）などの文献に開示されている。
好ましくは、燐酸カルシウム法が本発明で利用され、簡単に要約すると、宿主細胞と組み換え発現ベクターとを混合して、氷で３０分間反応させた後、４２℃で９０秒間処理して熱衝撃を加え、次いで、氷で９０秒間放置する。次いで、形質転換体を３７℃で約１時間培養した後、抗生剤の入っているプレートに塗抹して培養した後、組み換え発現ベクターを含む形質転換体を選別する。
本発明の第７態様によって、本発明は、前記形質転換された宿主細胞Ａないし宿主細胞Ｇを適切な栄養培地で培養する工程を含んで、前記形質転換された宿主細胞Ａないし宿主細胞Ｇから本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の組み換え蛋白質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを量産する方法を提供する。
形質転換された宿主細胞から組み換え蛋白質の生産は、一般的に、宿主細胞の成長に必要な炭素源などの栄養供給源を含有した栄養培地で、組み換え蛋白質の生産に適した培養条件下で形質転換された宿主細胞を培養することによって行われる。
本発明の方法において、形質転換体の培養のための栄養培地は、Ｅ．ｃｏｌｉのような、本発明に利用された宿主細胞によって選択される。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、ＬＢ培地などが一般的に利用される。
本発明の方法において、形質転換体のための培養条件は、本発明の組み換え蛋白質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧが量産されるように選択されねばならないところ、本発明者らは、発現誘導剤であるＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）の濃度、処理時間及び抗生剤の濃度を異ならせて発現程度を調べ、本発明の組み換え蛋白質の量産のための適した培養条件を確認した。
その結果、本発明の組み換え蛋白質ＡないしＧを量産するための形質転換された宿主細胞ＡないしＧの適した培養条件は、形質転換体の培養物のＯＤ６００値が０.６になったとき、ＩＰＴＧ ０.５ｍＭないし２０ｍＭを処理した後に４時間以上培養すると確認された。好ましくは、最適の培養条件は、ＩＰＴＧの１ｍＭ〜１０ｍＭを処理した後、４〜６時間培養すると確認された。しかし、このような範囲を多少逸脱した培養条件も、本発明の組み換え蛋白質の量産を誘導すれば、本発明に利用可能であり、本発明に含まれる。
本発明の第８態様によって、本発明は、前述したような本発明の形質転換宿主細胞ＡないしＧの培養により生産された組み換え蛋白質ＡないしＧを提供する。
前述したように、形質転換宿主細胞を適した培養条件下で培養した後、その培養物から所望の組み換え蛋白質を分離及び精製することによって、所望の組み換え蛋白質が得られる。
形質転換細胞の培養物から組み換え蛋白質を分離及び精製する方法は、当業界では公知のものであり、簡略に説明すると、細胞培養物の遠心分離により形質転換細胞を集め、これを滅菌ＰＢＳのような適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理のような方法で細胞を破壊し、遠心分離して宿主細胞の内容物を得た後、親和性クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、等電点クロマトグラフィのような公知の方法により所望の蛋白質を分離及び精製できる。
前記のような分離及び精製により得られた本発明の組み換え蛋白質ＡないしＧは、魚類を兔役させるためのワクチンの製造に利用され得る。
本発明の第９態様によって、本発明は、本発明の組み換え発現ベクターＡないしＧでそれぞれ形質転換されて、本発明の組み換え蛋白質ＡないしＧをそれぞれ量産する形質転換宿主細胞ＡないしＧを不活性化させて、不活性化ワクチンＡないしＧを製造する方法、及び前記方法により製造された不活性化ワクチンＡないしＧを提供する。また、本発明は、不活性化ワクチンＡないしＧのうち、少なくとも２つを含むワクチンの組み合わせを提供する。
本発明の不活性化ワクチンの製造方法は、本発明の形質転換宿主細胞ＡないしＧを不活性化剤で処理して、宿主細胞の感染可能性を除去する工程を含む。
不活性化ワクチンの製造方法は、当業界では公知のものであり、好ましくは、本発明方法は、本発明の形質転換宿主細胞を培養して組み換え蛋白質を発現させる工程、及び前記形質転換宿主細胞の培養物を不活性化剤で処理する工程を含む。さらに好ましくは、本発明の方法は、本発明の形質転換宿主細胞を培養して組み換え蛋白質を発現させる工程、宿主細胞培養物の遠心分離により細胞ペレットを得る工程、及び前記ペレットの懸濁液に不活性化剤を処理する工程を含む。
一般的な不活性化剤としては、例えば、ホルマリン、グルタルジアルデヒド、β−プロピオンラクトンなどがあり、ワクチン原液の製造以前または製造以後に添加・混合して使用する。ホルマリンを使用する場合、その添加量は、約０.０００４〜０.７％（ｖ／ｖ）であり、不活性化温度は、約２℃〜３７℃であり、不活性化時間は、約２日〜１８０日である。
本発明の不活性化ワクチンの製造方法のために、前述したような任意の公知の不活性化剤を利用して、本発明の形質転換宿主細胞ＡないしＧを処理でき、好ましくは、ホルマリンを利用する。本発明の方法において好ましいホルマリンの添加量は、０.１％〜０.７％（ｖ／ｖ）であり、さらに好ましくは、０.５％である。本発明の方法において好ましい不活性化剤の処理時間は、３日以上であり、さらに好ましくは、３日である。本発明の方法において好ましい不活性化処理の温度は、４℃である。
前記のような本発明の方法によって、不活性化剤で本発明の形質転換宿主細胞ＡないしＧを処理することによって、本発明の組み換え不活性化ワクチンＡないしＧが得られる。
このようにして得られた本発明の組み換え不活性化ワクチンＡないしＧは、イシダイをはじめとする魚類を兔役させるために、単独で、または多様な組み合わせで利用され得る。
本発明で使用できる不活性化ワクチンの組み合わせは、不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも２つを含み、好ましくは、不活性化ワクチンＢとＣとの組み合わせ、不活性化ワクチンＢとＤとの組み合わせ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ及びＥの組み合わせ、及び不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧの組み合わせが挙げられ、このような組み合わせは、形質転換体により生産される組み換え蛋白質の機能を考慮して、組み換え蛋白質Ｂを基本とし、これに類似した機能を行う蛋白質を添加する方式で組み合わせたものであって、前記例示された４つの組み合わせ以外に、他の多様な組み合わせも本発明のワクチンの組み合わせに含まれる。さらに好ましくは、本発明の不活性化ワクチンの組み合わせは、不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧの組み合わせである。
前記のような本発明の不活性化ワクチンＡないしＧは、魚類を兔役させるための投与量の２倍の濃度でイシダイ稚魚に投与してその斃死率を観察した結果、イシダイ稚魚の斃死が全く発生せず、その安全性が確認された。
本発明の第１０態様によって、本発明は、本発明の不活性化ワクチンＡないしＧ、またはそれらの組み合わせを魚類に投与することを含む、魚類を免疫させる方法を提供する。
本発明の不活性化ワクチンにより兔役させ得る魚類は、タイ類、スズキ、ヒラメ及びブリなどを含み、このうちタイ類が好ましく、特に、イシダイが好ましい。
本発明の不活性化ワクチンを利用して魚類を免疫させる方法は、本発明のワクチンを、腹腔内、筋肉内、または皮下接種または浸透法、敬具投与などを利用して魚類に投与する工程を含む。好ましくは、本発明の不活性化ワクチンは、筋肉内注射により投与される。
本発明の免疫方法に利用され得る本発明の不活性化ワクチンの組み合わせは、不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも何れか１つを含み、好ましくは、不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも２つを含み、さらに好ましくは、不活性化ワクチンＢとＣ、不活性化ワクチンＢとＤ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ及びＥ、または不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含み、最も好ましくは、不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含む。
本発明の不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも２以上を利用して魚類を免疫させる場合、前記２以上の不活性化ワクチンは、混合された後に魚類に投与されることが好ましい。
魚類を兔役させるとき、本発明の不活性化ワクチンの投与量は、組み換え蛋白質量が魚類の重量１ｋｇ当り２００μｇの（２００μｇの組み換え蛋白質／ｋｇ体重）濃度となるように、一回投与当り０.０１ｍｌないし０.５ｍｌを投与することが好ましい。
一方、本発明の第１１態様によって、本発明は、本発明の前記不活性化ワクチンを含むキットを提供する。
本発明のキットは、本発明の不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも何れか１つを含み、好ましくは、２以上の不活性化ワクチンを含む。好ましくは、本発明のキットは、不活性化ワクチンＢとＣ、不活性化ワクチンＢとＤ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ、及びＥ、または不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含み、最も好ましくは、本発明のキットは、不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含む。
本発明のキットには、キットに含まれた不活性化ワクチンの投与についての説明書が含まれ得る。
本発明のキット内に含まれる不活性化ワクチンが２以上である場合、本発明の不活性化ワクチンＡないしＧは、あらかじめ混合された形態でキットに含まれてもよく、または、キット内のそれぞれの容器に個別的に含まれてもよい。不活性化ワクチンがそれぞれ別途の容器に含まれた場合、ユーザは、キット内の使用説明書によってそれぞれの不活性化ワクチンを混合して使用できる。
本発明の第１２態様によって、本発明は、本発明のＯＲＦ ＡないしＧ蛋白質のアミノ酸配列の一部を有し、イリドウイルスの免疫原性を有するペプチドを提供する。
本発明のペプチドは、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＤ、Ｆ及びＧ遺伝子によりコードされる６個のアミノ酸配列を分析して、第一に、抗原性が高く、第二に、表面に露出されており、第三に、親水性などの３つを満足させる部分を選別することによって得られた。
本発明のペプチドは、天然または合成であってもよく、合成ペプチドは、ペプチド合成器などを利用して合成できる。
本発明によって、本発明の各ＯＲＦ蛋白質のために選択されたペプチド配列は、次の通りである：
ＯＲＦ Ａ：ＡＷＰＬＦＤＤＲＭＲＶＤＱＣＲＢＩ（配列番号２９）
ＯＲＦ Ｂ：ＴＬＱＳＨＫＱＬＹＳＤＹＲＴＥＣ（配列番号３０）
ＡＰＰＤＲＤＤＤＲＷＴＶＰＴＧＣＲＢＩＶ（配列番号３１）
ＯＲＦ Ｃ：ＰＴＥＰＥＰＥＥＰＥＥＥＥＤＥＣ（配列番号３２）
ＴＥＰＥＰＥＥＰＥＥＥＥＤＥＹＣ（配列番号３３）
ＯＲＦ Ｄ：ＱＶＤＲＳＧＡＫＶＰＳＥＡＰＣ（配列番号３４）
ＣＡＭＲＳＲＤＰＬＹＤＫＶＫ（配列番号３５）
ＯＲＦ Ｆ：ＹＡＲＡＲＧＳＴＨＩＲＲＱＫＶＣＲＢＩＶ（配列番号３６）
ＯＲＦ Ｇ：ＣＳＰＥＴＲＮＳＮＦＫＨＳＶＴＹ（配列番号３７）
ＤＭＳＨＩＴＫＥＭＡＬＮＴＫＱＨＴＣＲＢＩＶ（配列番号３８）
このような本発明のペプチドは、優れた免疫原性を有して、イリドウイルスに対するワクチンの製造に有効に利用され得る。
以下で、実施例を参考にして、本発明をさらに詳細に説明し、下記の実施例は、単に例示の目的として開示されるものであり、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【実施例】
【０００７】
実施例１：  ＲＢＩＶ−ＴＹのゲノムＤＮＡ配列の決定及び配列の分析
１）ウイルスＤＮＡの分離
本発明に利用されたウイルスサンプルは、韓国の慶尚南道の統營で養殖されたイシダイから得られた。ＧＦ細胞を１０％のウシ胎仔血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充されたＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）培地で成長させた。ＧＦ細胞の感染によりウイルスストックを増幅させた。細胞変性効果を表す感染された細胞を収集して、−２０℃で凍結させた。凍結された細胞を解凍させ、４℃で１０分間３５００ｘｇで遠心分離して細胞カスを除去し、無細胞上澄液を４℃で３０分間３００００ｘｇで遠心分離した。ウイルス沈殿物をＴＮＥ緩衝液（０.０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０，０.１ＭのＮａＣｌ、０.００１ＭのＥＤＴＡ）で懸濁させ、ＤＮａｓｅ Ｉ及びＲＮａｓｅ Ａで３７℃で１５分間恒温処理した。前記ウイルスをＳＷ４０ Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で４℃で２時間、６００００ｘｇで２０〜５０％（ｗ／ｗ）のスクロース勾配で遠心分離して精製した。ウイルスバンドを除去してＰＢＳ緩衝液で希釈し、ビリオンペレットを４℃で６００００ｘｇで１時間遠心分離した後に収集した。ビリオンを０.５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ及び０.５％のＳＤＳで、５５℃で３時間恒温処理してウイルスＤＮＡを抽出した。前記ＤＮＡをフェノールクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ．Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９））。
２）ウイルスＤＮＡのＰＣＲ増幅及びＤＮＡ配列の決定
ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の全体ゲノムＤＮＡを増幅させるために、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲのためのプライマは、ＩＳＫＮＶのＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースのヌクレオヌクレオチド配列から考案した。重複される１２０個以上のＰＣＲプライマ対を考案して、平均ＰＣＲ生成物を１０００ないし１２００ｂｐの長さにした。鋳型は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡであった。遺伝子増幅反応の条件は、次の通りであった：９４℃で５分間１サイクル；９２℃で３０秒、６０℃で１分、及び７２℃で１分間３５サイクル；及び７２℃で５分間１サイクル。ＰＣＲプライマ対によって、アニール化の温度には少しずつの変化があった。増幅されたＰＣＲ生成物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、自動配列分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，米国）で配列を決定した。
３）ＤＮＡの配列分析
前記で得られたゲノムＤＮＡ配列及びこれから推論されたアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴプログラムを利用してＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースと比較した。ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｉｃｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３〜４６８０，１９９４）を利用して配列し、次いで、ＴｒｅｅＶｉｅｗ（Ｐａｇｅ，Ｒ．Ｄ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１２，３５７〜３５８，１９９６）で系統図を構成した。ＯＲＦは、メチオニンコドンから始まって、５０個以上のコドンから構成され、さらに大きなＯＲＦ内に位置しないことを基準として同定した。その結果、１１８個のＯＲＦが同定され、そのうち２９個は、公知の配列と高い相同性を有し、３１個は、相同性を有する配列を確認することができなかった（Ｄｏｅｔ，ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２５：３５１〜３６３，２００４；参考として全体が本願に統合される）。これから得られたヌクレオヌクレオチド配列データは、アクセッション番号ＡＹ５３２６０６としてＧｅｎＢａｎｋに登録された。
【０００８】
実施例２：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ遺伝子の選別
実施例１でＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノム配列の分析結果から得たＯＲＦデータに基づいて、ＯＲＦ分析プログラム（ＤＮＡｓｉｓＭＡＸ、Ｈｉｔａｃｈｉ、日本）を利用して、１１８個のＯＲＦのうち、ワクチン製造に利用可能な７個の遺伝子を選別して、ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧと命名した。
前記のような分析により選別された本発明の前記ＯＲＦ Ａ遺伝子は、配列番号１の塩基配列（１,１３７個の塩基対）を有し、ＯＲＦ Ｂ遺伝子は、配列番号２の塩基配列（１,３６２個の塩基対）を有し、ＯＲＦ Ｃ遺伝子は、配列番号３の塩基配列（１,５４８個の塩基対）を有し、ＯＲＦ Ｄ遺伝子は、配列番号４の塩基配列（２,４１８個の塩基対）を有し、ＯＲＦ Ｅ遺伝子は、配列番号５の塩基配列（８２８個の塩基対）を有し、ＯＲＦ Ｆ遺伝子は、配列番号６の塩基配列（７７７個の塩基対）を有し、ＯＲＦ Ｇ遺伝子は、配列番号７の塩基配列（１,３６５個の塩基対）を有する。
【０００９】
実施例３：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡの分離
実施例２で選択されたＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子を増幅させるために、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡを次の通りに分離した。
ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１に感染したイシダイを収集して解剖した後、脾臓、腎臓及び脳を摘出して、ウシ胎仔血清が添加されていないＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）培地を摘出組織総重量の１０倍にして添加して、組織磨砕器で磨砕した後、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を１Ｘにして添加して、４℃で１０時間放置した後、穴のサイズが０.２２μｍである滅菌された濾過フィルタを利用して、組織磨砕液を無菌的に濾過した。
濾過液をＧＦ細胞に１／５００に希釈して添加し、２５℃で５日間培養して、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１培養液及びウイルスに感染されたＧＦ細胞で、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１ゲノムＤＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ＰＣＲ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）を利用して分離した。また、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１に感染したイシダイの脾臓、腎臓、脳組織で、前記のゲノムＤＮＡ分離キットを利用してＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡを分離した。
【００１０】
実施例４：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子の増幅
選別されたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子を増幅させるために、ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子に対するＰＣＲプライマを製作した。
まず、ＯＲＦ Ａ遺伝子を増幅するために、Ｎｈｅ Ｉの切断部位を有する順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＣＧ ＴＧＴ ＧＴＡ ＣＴＡ ＣＡＧ ＴＧＴ ３’（配列番号１５）とＨｉｎｄ IIIの切断部位を有する逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＡＴＡ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＡＡ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ３’（配列番号１６）とを合成して、ＰＣＲ反応のために使用した。
次いで、実施例３で分離したＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡに０.５ＵのＥＸ Ｔａｑ−重合酵素（Ｔａｋａｒａ、日本）、及び１０ｐｍｏｌｅの前記プライマ（配列番号１５＋配列番号１６）対を添加し、高速熱純化器（Ｆａｓｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ；ＭＪｒｅａｃｈｅｒ、米国）を使用して９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で４５秒の順にＤＮＡ増幅を３０回行った。
前記のように増幅されたＤＮＡ生成物を制限酵素Ｎｈｅ Ｉ及びＨｉｎｄ IIIで処理して、ゲル電気泳動させた後にＤＮＡを分離することによって、次の工程でベクターへのクローニングに利用されるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ遺伝子を得た。
ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子も、下記のようなＰＣＲプライマ対をそれぞれ利用して、前記と同じ実験過程によって増幅させて各遺伝子を得た。各遺伝子のために利用されたプライマ対の塩基配列は、次の通りである：
ＯＲＦ Ｂ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＧＴ Ｇ ３’（配列番号１７）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＡＧ ＧＡＴＡＧＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＴＧＣ ３’（配列番号１８）
ＯＲＦ Ｃ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＣＧＴ ＧＧＧＴＡＡ ＧＧＣ ＡＧＧ ＴＡＡ ３’（配列番号１９）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＣＴＡＣＧ ＧＣＴ ＡＣＴ ＡＴＧ ３’（配列番号２０）
ＯＲＦ Ｄ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＧＧＴＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ３’（配列番号２１）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡＣ ＴＣＧ ＴＴＡＣＣＧ ＴＴＧ ＧＧＡ ＣＧＡ ３’（配列番号２２）
ＯＲＦ Ｅ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＣＡＡＴＡ ＡＡＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＴＡ ３’（配列番号２３）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＴＴＴ ＧＣＡＧＡＡ ＴＡＣ ＣＴＡ ＴＧＴ ＧＡＡ ３’（配列番号２４）
ＯＲＦ Ｆ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＴＡＣ ＣＧＧＧＡＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＡＴＡ ３’（配列番号２５）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡＧ ＧＡＴＣＣＧ ＴＴＴ ＴＡＴ ＣＴＧ ３’（配列番号２６）
ＯＲＦ Ｇ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＣＡＴ ＧＴＡＣＡＴ ＧＴＧ ＴＣＴ ＧＴＴ ３’（配列番号２７）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＣＧＴ ＣＴＴＡＴＣ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＣＧ ３’（配列番号２８）
【００１１】
実施例５：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子を含む組み換え発現ベクターの製作
前記実施例４でＰＣＲ結果から得られたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子を、それぞれ原核細胞発現用ベクターであるｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）にクローニングして組み換え発現ベクターを製造した。製造過程は、次の通りである。
まず、前記実施例４で増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素Ｎｈｅ Ｉ−Ｈｉｎｄ IIIで切断して、各遺伝子生成物を得た。また、本発明の各遺伝子をクローニングする発現ベクターを準備するために、ｐＥＴ２８ａベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞で形質転換した後、カナマイシン５０μｇ／ｍｌが添加されたＬＢブロスに接種して３７℃で培養した後、プラスミドを大量で抽出した。抽出したプラスミド１ｍｇにＮｈｅ Ｉ制限酵素（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）及び反応緩衝溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ）を添加して、３７℃で１時間反応させてプラスミドを切断した。次いで、Ｎｈｅ Ｉで切断したｐＥＴ２８ａベクターにＨｉｎｄ III制限酵素及び反応緩衝溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ）を添加して、３７℃で１時間反応させてプラスミドを切断した。次いで、制限酵素Ｎｈｅ Ｉ及びＨｉｎｄ IIIで切断されたｐＥＴ２８ａベクターと各遺伝子とを１：１の割合で混合した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）１ｕｎｉｔ及び反応緩衝溶液（６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、６.６ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、６６μＭのＡＴＰ）を添加して、３７℃で３０分間反応させて、遺伝子をベクターのＮｈｅ Ｉ−Ｈｉｎｄ IIIの位置に挿入することによって、組み換え発現ベクターを製造した。
このようにして得られたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれが挿入された組み換え発現ベクターＡないしＧを、Ｔ７プロモータープライマを利用して自動塩基配列読取器（Ａｐｐｌｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｉｃｓ、米国）により、挿入されたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子が良好にクローニングされたことが確認することができた。
本実施例により得られた組み換え発現ベクターの一例として、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ｂ遺伝子を含有した組み換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｂが図１に示されている。
組み換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ａ、ｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｃ、ｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｄ、ｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｅ、ｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｆ及びｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｇは、図１のｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−ＢでＯＲＦ Ｂ遺伝子の部分がそれぞれＯＲＦ Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ遺伝子に置換される。
【００１２】
実施例６：組み換え発現ベクターによる宿主細胞の形質転換
実施例５で製作された組み換え発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ＴＡＫＡＲＡ、日本）と混ぜて氷（４℃）で３０分間反応させた後、４２℃で１分３０秒間反応させて再び氷（４℃）で１分３０秒間放置した。
その結果から得られた組み換え発現ベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを安定化させるために、８００μｌのＳＯＣ培地（２％のトリプトン、０.５％の酵母抽出物、０.０５％のＮａＣｌ）を入れて３７℃で１時間反応させた。
安定化された形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが添加されたＬＢプレートに１００μｌを分注して広げた後、３７℃で１５時間培養して、各遺伝子に対する形質転換体を３０個ずつ選別した。
【００１３】
実施例７：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の組み換え蛋白質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ蛋白質の発現
実施例６で得た形質転換された宿主細胞でクローニングされたＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子から、ＯＲＦ ＡないしＧ蛋白質を大量で発現させるための形質転換体の培養条件を最適化するために、発現誘導剤であるＩＰＴＧの濃度、処理時間及び抗生剤の濃度を異ならせて発現程度を調べた。
１）ＩＰＴＧ濃度及び処理経時による発現誘導
実施例６の方法で得られた大腸菌ＢＬ ２１（ＤＥ３）／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ａ形質転換体を、５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンが入っている３ｍＬのＬＢ培地で１０時間培養した後に１／１００に希釈して、５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンが入っているＬＢ培地１００ｍＬに接種して３７℃で培養した。
ＯＤ６００値が０.６になったとき、ＩＰＴＧを多様な濃度で添加して蛋白質の発現を誘導した。添加したＩＰＴＧの濃度は、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭであり、ＩＰＴＧ処理をしてから４時間後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析によって組み換え蛋白質Ａの発現程度を測定した。
一方、ＩＰＴＧ処理経時による組み換え蛋白質の発現様相を調べるために、１ｍＭのＩＰＴＧを添加した培養物及び添加していない培養物で、添加する直前（０時間）、添加後２時間、４時間、６時間、８時間での組み換え蛋白質の発現様相を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって調べた。
誘導された組み換え蛋白質の発現量を調べるために利用されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析方法は、次の通りである。各試料から１ｍＬずつ採取した後、１４,０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した後に上澄液を捨て、５００μｌの滅菌ＰＢＳでペレットを再懸濁させた。懸濁試料が入っている１.５ｍＬのチューブを氷に保管しつつ、超音波処理して細胞を破砕し、このとき、１５秒間超音波処理し、１０秒間冷却する過程を３回繰り返した。破砕した試料を１４,０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄液１００μｌを採取して２Ｘ ＳＤＳ−試料緩衝液（２Ｘ ＳＤＳサンプルバッファー）１００ μｌと混合して、１００℃で１０分間沸かした。これを再び１４,０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、２０μｌを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングした。５０〜１５０Ｖで約２時間分離した後、クマシー染色液（０.１％のクマシーブルーＲ２５０、４２％の酢酸、４２％のメチルアルコール）で３０分間染色し、脱色液Ｉ（５％の酢酸、７.５％のメチルアルコール）で１時間脱色した。その結果から得たポリアクリルアミドゲルの写真が図２及び図３に示されている。
図２に示すように、１ｍＭのＩＰＴＧを処理したレーン２ないし５では、組み換え蛋白質が大量で発現され、処理時間が長くなるほど発現量が多くなることが確認できる。一方、ＩＰＴＧを処理していないレーン６ないし１０では、組み換え蛋白質が大量で発現されていないことが確認できる。
また、図３に示すように、１ｍＭないし２０ｍＭのＩＰＴＧ処理時、組み換え蛋白質が多量で発現され、特に、１０ｍＭのＩＰＴＧ処理時（レーン５）、または１ｍＭのＩＰＴＧ及び１００μｇのカナマイシン処理時（レーン７）にさらに多量で発現されることが確認できる。
【００１４】
実施例８：組み換え不活性化ワクチンの製造
前記実施例６で得た形質転換体を利用してワクチンを製造するために、前記形質転換体を不活性化させた。その不活性化過程は、次の通りである。
ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子をそれぞれ含有した形質転換菌株ＡないしＧを、５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンが入っているＬＢ培地で３７℃で１０時間培養した後に１／１００に希釈して、５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンが入っているＬＢ培地１,０００ｍＬに接種して３７℃で培養した。ＯＤ６００値が０.６になったとき、ＩＰＴＧを１ｍＭの濃度で添加して３７℃で５時間培養した後、５,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後に上澄液を捨て、１００ｍＬの滅菌ＰＢＳでペレットを再懸濁した。懸濁試料にホルマリン（３７％のホルムアルデヒド溶液）を総体積の０.５％にして添加して、形質転換体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを４℃で３日間不活性化させた。
不活性化された懸濁試料を５,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後に上澄液を捨て、ペレットを１００ｍＬの滅菌ＰＢＳで再懸濁し、遠心分離する過程を３回繰り返した。蛋白質の濃度を２０μｇ／ｍＬにして滅菌ＰＢＳを添加し、これに１００ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリンＧ、１００μｇ ／ｍＬのストレプトマイシンを添加して４℃で保管した。
【００１５】
実施例９：組み換え不活性化ワクチンの安全性の試験
前記実施例８で製造した組み換え不活性化ワクチンの安全性実験のために、イシダイ稚魚（体重；９±１ｇ）を３００Ｌの水槽に２０尾ずつ収容した後、各組み換えワクチンを４０μｇ ／ｍＬの濃度に調製して、実際のワクチン処理濃度の２倍の濃度でイシダイ稚魚の背筋肉の付近に注射して自然水温で飼育しつつ、ワクチンによるイシダイ稚魚の斃死如何を１５日間観察した。その結果、本発明の組み換えワクチンの処理による斃死は全く発生せず、組み換えワクチンの安全性を確保した。
【表１】
2008522584.tif 000003
【００１６】
実施例１０：組み換え不活性化ワクチンの効能確認
本発明の組み換え不活性化ワクチンの効能を確認するために、実施例８で製造された組み換え不活性化ワクチンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを４つの組み合わせで混ぜて実験した。
試験区１は、組み換え不活性化ワクチンＡ、Ｂ及びＥを混合し、試験区２は、ＢとＣとを混合し、試験区３は、ＢとＤとを混合し、試験区４は、Ｂ、Ｆ及びＧを混合し、滅菌ＰＢＳと抗生剤とを混合して処理した試験区を対照区として調製した。前記のような４つの組み合わせは、Ｂ蛋白質を基本とし、これに類似した機能を行う蛋白質を添加する方式で組み合わせた。
ワクチンの効能確認の実験は、以下のように実施した。
ＲＢＩＶが感染していないと確認されたイシダイ稚魚を３００ＬのＦＲＰ水槽に収容して、前記で調製した試験用ワクチン４つを０.１ｍｌずつ背筋肉の部位に注射して、１５日間ワクチンの効果が表れるように自然水温で飼育した。ワクチン処理されたイシダイに、ＧＦ細胞で培養したＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１菌株を１０４ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの濃度で感染させた。ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１に感染されたイシダイを飼育しつつ、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１による斃死率を調査及び分析した、
その結果は、図４に示すように、対照区に比べてワクチン試験区１ないし４は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１に対する防御効果を有して、イシダイ斃死を遅延させ、特に、試験区４の場合、蓄積された致死率が、一ケ月後にも３０％に至らず、優れたワクチンの効果を提供することが確認できた。
【００１７】
実施例１１：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ及びＧペプチドの分析及び合成
本発明の６個のＯＲＦ ＡないしＤ及びＦとＧ遺伝子によりコードされるアミノ酸の配列を分析して、第一に、抗原性が高く、第二に、表面に露出されており、第三に、親水性の特性などの３つを満足させる部分を選択して、ワクチン用ペプチドとして合成した。
各ＯＲＦ蛋白質のために合成されたペプチドの配列は次の通りであり、ペプチドの合成は、（株）ペプトロン（韓国）に依頼して行われた。
ＯＲＦ Ａ：ＡＷＰＬＦＤＤＲＭＲＶＤＱＣＲＢＩ（配列番号：２９）
ＯＲＦ Ｂ：ＴＬＱＳＨＫＱＬＹＳＴＥＣ（配列番号：３０）
ＡＰＰＤＲＤＤＤＲＷＴＶＰＴＧＣＲＢＩＶ（配列番号：３１）
ＯＲＦ Ｃ：ＰＴＥＰＥＰＥＥＰＥＥＥＥＤＥＣ（配列番号：３２）
ＴＥＰＥＰＥＥＰＥＥＥＥＤＥＹＣ（配列番号：３３）
ＯＲＦ Ｄ：ＱＶＤＲＳＧＡＫＶＰＳＥＡＰＣ（配列番号：３４）
ＣＡＭＲＳＲＤＰＬＹＤＫＶＫ（配列番号：３５）
ＯＲＦ Ｆ：ＹＡＲＡＲＧＳＴＨＩＲＲＱＫＶＣＲＢＩＶ（配列番号：３６）
ＯＲＦ Ｇ：ＣＳＰＥＴＲＮＳＮＦＫＨＳＶＴＹ（配列番号：３７）
ＤＭＳＨＩＴＫＥＭＡＬＮＴＫＱＨＴＣＲＢＩＶ（配列番号：３８）
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ｂ遺伝子を含む組み換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｂの制限酵素を示す図面である。
【図２】発現誘導剤ＩＰＴＧを１ｍＭ処理時及び未処理時の、経時による組み換え蛋白質の発現程度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。ＬＭは、低分子量サイズのマーカーであり、ＨＭは、高分子量サイズのマーカーであり、レーン１ないし５は、ＩＰＴＧ処理後、０時間、２時間、４時間、６時間、及び１８時間で組み換え蛋白質の発現を示し、レーン６ないし１０は、ＩＰＴＧ未処理後、０時間、２時間、４時間、６時間、及び１８時間で組み換え蛋白質の発現を示す。
【図３】発現誘導剤ＩＰＴＧの処理による組み換え蛋白質の発現様相を示す ＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。レーン１は、高分子量の蛋白質マーカーであり、レーン２は、正常ＢＬ ２１ Ｅ．ｃｏｌｉの蛋白質の発現を示し、レーン３は、ＩＰＴＧを１ｍＭ処理した場合の組み換え蛋白質の発現を示し、レーン４は、ＩＰＴＧを５ｍＭ処理した場合の組み換え蛋白質の発現を示し、レーン５は、ＩＰＴＧを１０ｍＭ処理した場合の組み換え蛋白質の発現を示し、レーン６は、ＩＰＴＧを２０ｍＭ処理した場合の組み換え蛋白質の発現を示し、レーン７は、ＩＰＴＧを１ｍＭ、カナマイシンを１００μｇ処理した場合の組み換え蛋白質の発現を示し、レーン８は、ＩＰＴＧを１ｍＭ、カナマイシンを１００μｇ処理した場合の組み換え蛋白質の発現を示す。
【図４】本発明に係る組み換え不活性化ワクチンの効果を示すグラフである。
【図１】
2008522584.tif 000004
【図２】
2008522584.tif 000005
【図３】
2008522584.tif 000006
【図４】
2008522584.tif 000007
【配列表】
2008522584000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月20日(2007.6.20)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１ないし配列番号７のうち何れか１つの塩基配列を有し、韓国型イシダイイリドウイルスの免疫原性蛋白質をコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列を有するＯＲＦ Ａ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号２の塩基配列を有するＯＲＦ Ｂ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号３の塩基配列を有するＯＲＦ Ｃ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号４の塩基配列を有するＯＲＦ Ｄ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項６】
配列番号５の塩基配列を有するＯＲＦ Ｅ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項７】
配列番号６の塩基配列を有するＯＲＦ Ｆ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項８】
配列番号７の塩基配列を有するＯＲＦ Ｇ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項９】
配列番号１５及び配列番号１６で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項１０】
配列番号１７及び配列番号１８で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項１１】
配列番号１９及び配列番号２０で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項１２】
配列番号２１及び配列番号２２で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項１３】
配列番号２３及び配列番号２４で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項１４】
配列番号２５及び配列番号２６で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項１５】
配列番号２７及び配列番号２８で表示されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマ対。
【請求項１６】
韓国型イシダイイリドウイルスＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の全体ゲノムＤＮＡを鋳型として、請求項９ないし請求項１５のうち何れか１項に記載のオリゴヌクレオチドプライマ対を利用して、ＰＣＲを行って請求項１に記載の遺伝子を増幅させる工程、及び増幅された遺伝子を分離する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子を増幅させて得る方法。
【請求項１７】
原核細胞用の発現ベクター内に挿入された請求項１に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組み換え発現ベクター。
【請求項１８】
原核細胞用の発現ベクターは、ｐＥＴ２８ａであることを特徴とする請求項１７に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１７または請求項１８に記載の組み換え発現ベクターで形質転換されたことを特徴とする原核宿主細胞。
【請求項２０】
宿主細胞は、 Ｅ．ｃｏｌｉであることを特徴とする請求項１９に記載の原核宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１９または請求項２０のうち何れか１項に記載の形質転換された宿主細胞を、適切な栄養培地でＩＰＴＧの存在下で培養する工程を含んで、前記形質転換された宿主細胞から組み換え蛋白質を量産することを特徴とする方法。
【請求項２２】
ＩＰＴＧの濃度は、１ｍＭ〜１０ｍＭ範囲であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＰＴＧの処理時間は、２時間以上であることを特徴とする請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＩＰＴＧの処理時間は、４〜６時間であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９または請求項２０のうち何れか１項の形質転換宿主細胞の培養により生産されたことを特徴とする組み換え蛋白質。
【請求項２６】
請求項１９または請求項２０のうち何れか１項の形質転換宿主細胞を不活性化剤で処理する工程を含むことを特徴とする組み換え不活性化ワクチンの製造方法。
【請求項２７】
不活性化剤は、ホルマリンであることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ホルマリンの濃度は、０.１％ないし０.７％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ホルマリンの濃度は、０.５％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１９または請求項２０のうち何れか１項の形質転換宿主細胞を不活性化させて製造したことを特徴とする組み換え不活性化ワクチン。
【請求項３１】
前記ワクチンは、配列番号１の塩基配列を有するＯＲＦ Ａ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＡであることを特徴とする請求項３０に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項３２】
前記ワクチンは、配列番号２の塩基配列を有するＯＲＦ Ｂ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された、宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＢであることを特徴とする請求項３０に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項３３】
前記ワクチンは、配列番号３の塩基配列を有するＯＲＦ Ｃ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された、宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＣであることを特徴とする請求項３０に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項３４】
前記ワクチンは、配列番号４の塩基配列を有するＯＲＦ Ｄ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された、宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＤであることを特徴とする請求項３０に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項３５】
前記ワクチンは、配列番号５の塩基配列を有するＯＲＦ Ｅ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された、宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＥであることを特徴とする請求項３０に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項３６】
前記ワクチンは、配列番号６の塩基配列を有するＯＲＦ Ｆ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された、宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＦであることを特徴とする請求項３０に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項３７】
前記ワクチンは、配列番号７の塩基配列を有するＯＲＦ Ｇ遺伝子を含む組み換えベクターにより形質転換された、宿主細胞の不活性化により製造された不活性化ワクチンＧであることを特徴とする請求項３０に記載の組み換え不活性化ワクチン。
【請求項３８】
請求項３１ないし請求項３７のうち何れか１項に記載の組み換え不活性化ワクチンのうち、２以上を含むことを特徴とする組み合わせられた組み換え不活性化ワクチン。
【請求項３９】
不活性化ワクチンＢとＣ、不活性化ワクチンＢとＤ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ及びＥ、または不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含むことを特徴とする請求項３８に記載の組み合わせられた組み換え不活性化ワクチン。
【請求項４０】
不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含むことを特徴とする請求項３９に記載の組み合わせられた組み換え不活性化ワクチン。
【請求項４１】
請求項３０ないし請求項３７のうち何れか１項に記載の組み換え不活性化ワクチン、または請求項３８ないし請求項４０のうち何れか１項に記載の組み合わせられた組み換え不活性化ワクチンを魚類に投与することを含むことを特徴とする魚類の免疫方法。
【請求項４２】
前記不活性化ワクチンを魚類の背筋肉に投与することを特徴とする請求項４１に記載の魚類の免疫方法。
【請求項４３】
ワクチンの投与量は、２００μｇ組み換え蛋白質／ｋｇ体重であることを特徴とする請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項３１ないし請求項３７のうち何れか１項に記載の組み換え不活性化ワクチンのうち、少なくとも１つを含むことを特徴とするキット。
【請求項４５】
不活性化ワクチンＢとＣ、不活性化ワクチンＢとＤ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ及びＥ、または不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含むことを特徴とする請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含むことを特徴とする請求項４５に記載のキット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
以下、添付した図面を参照して、本発明を詳細に説明する。
本発明の第１態様によって、本発明は、イリドウイルスの免疫原性蛋白質をコードして、イリドウイルスに対する予防ワクチンの製造のために利用され得る韓国型ＲＢＩＶであるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１から分離したＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子、及びそれらの配列相同体を提供する。
本発明者らは、韓国型ＲＢＩＶであるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の場合、ウイルスを構成する蛋白質数が１１８個以上であり、ゲノムＤＮＡのサイズが１１２,０８０ｂｐであって、現在まで報告された魚類イリドウイルスとは異なるということが確認され、前記ゲノムＤＮＡの配列を決定し、これを、コンピュータプログラムを利用して分析して、１１８個の可能なＯＲＦを確認した。そして、これらのＯＲＦから推論されたアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴプログラムを利用してＧｅｎＢａｎｋのデータベースと比較・分析した結果、機能が公知の蛋白質と高い相同性を有する２９個のＯＲＦ及び、公知の配列と相同性を有していない３１個のＯＲＦを確認した（Ｄｏ ｅｔ，ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２５：３５１〜３６３，２００４：参考として全体が本願に統合される）。これらのの塩基配列の情報は、アクセッション番号第ＡＹ５３２６０６号としてＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録された。
前記のようなＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡの配列及びＯＲＦ情報に基づいて、本発明者らは、イリドウイルスの免疫原性蛋白質をコードして、イリドウイルスに対するワクチンの製造に有効なイリドウイルスの遺伝子を発見するために、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の１１８個のＯＲＦのうち、第一に、ウイルスの外側に存在して、魚類の免疫反応を誘導する可能性の高い構造蛋白質、第二に、細胞の表面に発現される蛋白質であって、ウイルスが増殖して生きている細胞と隣接する正常細胞とを堅く結合させる役割を行う蛋白質、第三に、ウイルスが感染された細胞でイリドウイルス蛋白質が合成されるとき、宿主細胞の外膜に存在する可能性の高いイリドウイルス蛋白質の遺伝子を発見することにした。
このために、前記１１８個のＯＲＦの塩基配列をアミノ酸配列に転写して、現在まで米国生物学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋに登録されたアミノ酸配列と比較・分析して、前記の３つの条件を満足する７個の遺伝子を選別して、ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧと命名し、これらを本発明のイリドウイルスに対するワクチンの製造のために利用した。
前記のような分析を通じて選別された本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ遺伝子は、配列目録の配列番号１の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｂ遺伝子は、配列番号２の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｃ遺伝子は、配列番号３の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｄ遺伝子は、配列番号４の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｅ遺伝子は、配列番号５の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｆ遺伝子は、配列番号６の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｇ遺伝子は、配列番号７の塩基配列を有する。
一方、前記配列番号１、２、３、４、５、６または７の塩基配列で１以上の塩基置換、欠失、挿入及び／または付加されるか、または前記配列番号１、２、３、４、５、６または７の塩基配列と厳しいハイブリッド化の条件下でハイブリッド化する、前記配列番号１、２、３、４、５、６、または７の塩基配列と７０％以上の配列相同性を有する配列相同体も本発明に含まれる。
ハイブリッド化のための条件は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ．Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９））に開示されており、例えば、５×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１％のＳＤＳ，２５℃〜６８℃で数時間ないし一夜などの条件を利用できる。このとき、混成化温度は、さらに好ましくは、４５℃〜６８℃（ホルムアミドなし）、または３０℃〜４２℃（５０％のホルムアミド）が利用され、洗浄条件は、０.２×ＳＳＣ、４６℃〜６８℃を利用できる。
当業者であれば塩の濃度及び温度などの混成化条件を調節して、本発明のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子の塩基配列に対して、一定％以上の配列相同性を有するＤＮＡの 塩基配列を得ることができ、このようにして得られた配列相同体は、本発明の範囲に含まれる。
すなわち、本発明は、前記配列番号１、２、３、４、５、６、または７の塩基配列に対して７０％以上、好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を有するＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子の配列相同体を含む。
本発明の第２態様によって、本発明は、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子によってそれぞれコードされるイリドウイルスの免疫原性蛋白質であるＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ蛋白質及びこれらの配列相同体を提供する。
本発明のＯＲＦ Ａ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ａ蛋白質は、３７８個のアミノ酸からなり、推定分子量は、４０,７３１.４８Ｄａであり、配列番号８のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、マンダリンフィッシュから由来したイリドウイルスであるＩＳＫＮＶのアミノ酸輸送子蛋白質と９５％以上のアミノ酸配列の相同性を有して、アミノ酸輸送子の機能を行うと推定される。
ＯＲＦ Ｂ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｂ蛋白質は、４５３個のアミノ酸からなり、推定分子量は、４９,４７６.７９Ｄａであり、配列番号９のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、ＲＳＩＶ（Ｒｅｄ Ｓｅａ Ｂｒｅａｍ Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）の主要カプシド蛋白質と９９％のアミノ酸配列の相同性を有して、主要カプシド蛋白質と推定される。
ＯＲＦ Ｃ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｃ蛋白質は、５１５個のアミノ酸からなり、推定分子量は、５７,０２６.９６Ｄａであり、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、ＩＳＫＮＶの配列と８５％以上の配列相同性を有して、ＩｇＭ重鎖蛋白質と推定される。
ＯＲＦ Ｄ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｄ蛋白質は、８０５個のアミノ酸からなり、推定分子量は、８７,３３２Ｄａであり、配列番号１１のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、ＲＳＩＶのラミニン結合蛋白質の配列と９０％以上の配列相同性を有して、ラミニン結合蛋白質と推定される。
ＯＲＦ Ｅ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｅ蛋白質は、２７５個のアミノ酸からなり、推定分子量は、３０,３３８.７４Ｄａであり、配列番号１２のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、７０％以上の高い配列相同性を有する配列が発見されず、蛋白質の機能性モチーフの検索結果、ミリスチル化された膜蛋白質と推定される。
ＯＲＦ Ｆ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｆ蛋白質は、２５８個のアミノ酸からなり、推定分子量は、２９,２７２.７０Ｄａであり、配列番号１３のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、相同性を有する配列が発見されなかった。
ＯＲＦ Ｇ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｇ蛋白質は、４５４個のアミノ酸からなり、推定分子量は、４９,９７３.５６Ｄａであり、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、ＩＳＫＮＶの配列と９０％以上の配列相同性を有して、アンキリン反復配列（ＡＮＫＹＲＩＮ  ＲＥＰＥＡＴＳ）と推定される。
また、本発明は、前記配列番号８ないし配列番号１４のアミノ酸配列で、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／または付加されるが、前記配列に７０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、イリドウイルスの免疫原性を有する蛋白質を含む。
好ましくは、本発明は、前記配列番号８ないし配列番号１４のアミノ酸配列に７０％以上、より好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、イリドウイルスの免疫原性を有する蛋白質を含む。
本発明の第３態様によって、本発明は、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧＤＮＡを得るために、これらの遺伝子をＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ（重合酵素の連鎖反応）により増幅させるために利用されるプライマ対を提供する。
前述したように、本発明者らは、イリドウイルスに対するワクチンの製造に利用され得るものとして選択されたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅させるために、各遺伝子のためのプライマ対を考案した。
前記プライマ対は、増幅されたＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子をクローニングさせる発現ベクター内の制限酵素の部位を考慮して、両末端で適切な制限酵素の部位を有するように考案される。
本発明の好ましいプライマ対は、本発明で利用される好ましい発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）内の制限酵素の部位を考慮して、順方向プライマは、Ｎｈｅ Ｉの切断部位を有するように、そして、逆方向プライマは、Ｈｉｎｄ IIIの切断部位を有するように考案される。
しかし、本発明のプライマ対は、前記の切断部位以外に、ベクターｐＥＴ２８ａ内に存在する他の制限酵素の部位に相応する切断部位を有するように考案され、このようなプライマ対も本発明に含まれる。
また、本発明の前記ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子は、ｐＥＴ２８ａ以外の後述するような多様な発現ベクター内へクローニングされ得るので、このような多様なベクター内の制限酵素の切断部位に相応する多様な切断部位を有するように考案され、このようなプライマ対も本発明に含まれる。
ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子のそれぞれのための好ましいプライマ対の塩基配列は、次の通りである：
ＯＲＦ Ａ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＣＧ ＴＧＴ ＧＴＡ ＣＴＡ ＣＡＧ ＴＧＴ ３’（配列番号１５）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＡＴＡ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＡＡ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ３’（配列番号１６）
ＯＲＦ Ｂ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＧＴ Ｇ ３’（配列番号１７）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＴＧＣ ３’（配列番号１８）
ＯＲＦ Ｃ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＣＧＴ ＧＧＧ ＴＡＡ ＧＧＣ ＡＧＧ ＴＡＡ ３’（配列番号１９）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ ＧＣＴ ＡＣＴ ＡＴＧ ３’（配列番号２０）
ＯＲＦ Ｄ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＧ ＧＴＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ３’（配列番号２１）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡＣ ＴＣＧ ＴＴＡ ＣＣＧ ＴＴＧ ＧＧＡ ＣＧＡ ３’（配列番号２２）
ＯＲＦ Ｅ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＣＡ ＡＴＡ ＡＡＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＴＡ ３’（配列番号２３）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＴＴＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＡＣ ＣＴＡ ＴＧＴ ＧＡＡ ３’（配列番号２４）
ＯＲＦ Ｆ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＴＡＣ ＣＧＧ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＡＴＡ ３’（配列番号２５）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＴＴ ＴＡＴ ＣＴＧ ３’（配列番号２６）
ＯＲＦ Ｇ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＣＡＴ ＧＴＡ ＣＡＴ ＧＴＧ ＴＣＴ ＧＴＴ ３’（配列番号２７）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＣＧＴ ＣＴＴ ＡＴＣ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＣＧ ３’（配列番号２８）
また、前記の各遺伝子のためのプライマ対の配列またはその一部を含み、ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子のＰＣＲ増幅に利用され得るプライマ対も本発明に含まれる。
本発明のプライマは、オリゴヌクレオチド合成器により合成して利用でき、このようなオリゴヌクレオチドの合成方法などは、当業界に公知されて利用されており、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）やＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１.５３（１９８９）のような文献に開示されている。
本発明の第４態様によって、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドプライマ対を利用して、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子を得る方法を提供する。
本発明の方法は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の全体ゲノムＤＮＡを鋳型として、前記本発明のオリゴヌクレオチドプライマ対を利用してＰＣＲを行い、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを増幅させる工程、及び増幅された各遺伝子を分離する工程を含む。
本発明の方法に利用されるウイルスゲノムＤＮＡの分離、ＰＣＲ及び増幅された遺伝子の分離方法などは、当業界に公知されて利用されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１.５３（１９８９）のような文献に開示されている。
簡単に要約すると、ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、鋳型としてウイルスの全体ゲノムＤＮＡと適切な重合酵素及びプライマ対でＰＣＲ反応物を形成し、これをＰＣＲ反応器で変性、アニール化及び延長反応させることによって行われる。
本発明の方法で有効な重合酵素は、ＥＸ Ｔａｑ重合酵素であるが、必ずしもこれに制限されるものではなく、変性、アニール化及び延長反応のための適した反応温度及び反応時間は、当業者ならば容易に決定して利用できる。好ましくは、本発明の方法の変性反応は、９４℃で４５秒間行われ、アニール化反応は、６０℃で４５秒間行われ、延長反応は、７２℃で４５秒間行われる。
このように増幅されたＤＮＡを適切な制限酵素、好ましくは、Ｎｈｅ Ｉ及びＨｉｎｄ IIIで処理し、アガロースゲルで電気泳動して増幅されたＤＮＡバンドを確認し、これからＤＮＡを精製することによって、発現ベクターにクローニングされる各遺伝子が得られる。
このような本発明の方法により得られたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子は、組み換えＯＲＦ ＡないしＧ蛋白質の生成に利用される組み換え発現ベクターの製造に利用され得る。
本発明の第５態様によって、本発明は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを含む組み換え発現ベクターを提供する。
本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子を挿入して組み換え発現ベクターを製造するためのベクターは、遺伝子の配列がベクター内に挿入された後、このベクターが宿主内に感染して、宿主細胞内で所望の遺伝子を発現し、所望の蛋白質を生産できる発現用ベクターであれば、何れも利用できる。このような発現ベクターは、１以上の選択性マーカー、プロモータ配列などを含み、発現ベクターの例としては、ｐＥＴ２８ｃ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＥＴ２８ａなどがあるが、必ずしもこれらに限定されるものではなく、このうち、原核細胞用の発現ベクターが本発明に好ましく、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、 米国）が特に好ましい。
プラスミドなどのベクターに本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを挿入する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１.５３（１９８９）に記載されている。
本発明で利用された組み換え発現ベクターの製造を簡単に要約すると、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを、前記の本発明のオリゴヌクレオチドプライマ対を利用してＰＣＲにより増幅させた後、それらの遺伝子及び発現ベクターを同じ制限酵素で分解処理し、前記遺伝子のそれぞれを適切なリガーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを利用して発現ベクターにライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させることによって、ＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれのための組み換え発現ベクターＡないしＧを製造する。
本発明の組み換え発現ベクターの一例として、ＯＲＦ Ｂ遺伝子を含むベクターｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｂが図１に示されている。
このように製造された組み換え発現ベクターＡないしＧを、宿主細胞の形質転換に利用できる。
本発明の第６態様によって、本発明は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを含む組み換え発現ベクターＡないしＧで形質転換された宿主細胞ＡないしＧを提供する。
本発明に利用され得る宿主細胞としては、本発明の組み換え発現ベクターに適しており、形質転換され得る細胞であれば可能であり、当業界で一般的に使用されるＥ．ｃｏｌｉ菌株などが利用され得るが、必ずしもこれに限定されるものではない。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ ２１等）が宿主細胞として本発明に利用される。
本発明の組み換えベクターＡないしＧを宿主細胞に導入する方法は、例えば、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧなどの化学的処理による方法のような当業界に公知された方法を利用でき、これらの方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１.５３（１９８９）などの文献に開示されている。
好ましくは、燐酸カルシウム法が本発明で利用され、簡単に要約すると、宿主細胞と組み換え発現ベクターとを混合して、氷で３０分間反応させた後、４２℃で９０秒間処理して熱衝撃を加え、次いで、氷で９０秒間放置する。次いで、形質転換体を３７℃で約１時間培養した後、抗生剤の入っているプレートに塗抹して培養した後、組み換え発現ベクターを含む形質転換体を選別する。
本発明の第７態様によって、本発明は、前記形質転換された宿主細胞Ａないし宿主細胞Ｇを適切な栄養培地で培養する工程を含んで、前記形質転換された宿主細胞Ａないし宿主細胞Ｇから本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の組み換え蛋白質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを量産する方法を提供する。
形質転換された宿主細胞から組み換え蛋白質の生産は、一般的に、宿主細胞の成長に必要な炭素源などの栄養供給源を含有した栄養培地で、組み換え蛋白質の生産に適した培養条件下で形質転換された宿主細胞を培養することによって行われる。
本発明の方法において、形質転換体の培養のための栄養培地は、Ｅ．ｃｏｌｉのような、本発明に利用された宿主細胞によって選択される。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、ＬＢ培地などが一般的に利用される。
本発明の方法において、形質転換体のための培養条件は、本発明の組み換え蛋白質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧが量産されるように選択されねばならないところ、本発明者らは、発現誘導剤であるＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）の濃度、処理時間及び抗生剤の濃度を異ならせて発現程度を調べ、本発明の組み換え蛋白質の量産のための適した培養条件を確認した。
その結果、本発明の組み換え蛋白質ＡないしＧを量産するための形質転換された宿主細胞ＡないしＧの適した培養条件は、形質転換体の培養物のＯＤ６００値が０.６になったとき、ＩＰＴＧ ０.５ｍＭないし２０ｍＭを処理した後に４時間以上培養すると確認された。好ましくは、最適の培養条件は、ＩＰＴＧの１ｍＭ〜１０ｍＭを処理した後、４〜６時間培養すると確認された。しかし、このような範囲を多少逸脱した培養条件も、本発明の組み換え蛋白質の量産を誘導すれば、本発明に利用可能であり、本発明に含まれる。
本発明の第８態様によって、本発明は、前述したような本発明の形質転換宿主細胞ＡないしＧの培養により生産された組み換え蛋白質ＡないしＧを提供する。
前述したように、形質転換宿主細胞を適した培養条件下で培養した後、その培養物から所望の組み換え蛋白質を分離及び精製することによって、所望の組み換え蛋白質が得られる。
形質転換細胞の培養物から組み換え蛋白質を分離及び精製する方法は、当業界では公知のものであり、簡略に説明すると、細胞培養物の遠心分離により形質転換細胞を集め、これを滅菌ＰＢＳのような適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理のような方法で細胞を破壊し、遠心分離して宿主細胞の内容物を得た後、親和性クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、等電点クロマトグラフィのような公知の方法により所望の蛋白質を分離及び精製できる。
前記のような分離及び精製により得られた本発明の組み換え蛋白質ＡないしＧは、魚類を兔役させるためのワクチンの製造に利用され得る。
本発明の第９態様によって、本発明は、本発明の組み換え発現ベクターＡないしＧでそれぞれ形質転換されて、本発明の組み換え蛋白質ＡないしＧをそれぞれ量産する形質転換宿主細胞ＡないしＧを不活性化させて、不活性化ワクチンＡないしＧを製造する方法、及び前記方法により製造された不活性化ワクチンＡないしＧを提供する。また、本発明は、不活性化ワクチンＡないしＧのうち、少なくとも２つを含むワクチンの組み合わせを提供する。
本発明の不活性化ワクチンの製造方法は、本発明の形質転換宿主細胞ＡないしＧを不活性化剤で処理して、宿主細胞の感染可能性を除去する工程を含む。
不活性化ワクチンの製造方法は、当業界では公知のものであり、好ましくは、本発明方法は、本発明の形質転換宿主細胞を培養して組み換え蛋白質を発現させる工程、及び前記形質転換宿主細胞の培養物を不活性化剤で処理する工程を含む。さらに好ましくは、本発明の方法は、本発明の形質転換宿主細胞を培養して組み換え蛋白質を発現させる工程、宿主細胞培養物の遠心分離により細胞ペレットを得る工程、及び前記ペレットの懸濁液に不活性化剤を処理する工程を含む。
一般的な不活性化剤としては、例えば、ホルマリン、グルタルジアルデヒド、β−プロピオンラクトンなどがあり、ワクチン原液の製造以前または製造以後に添加・混合して使用する。ホルマリンを使用する場合、その添加量は、約０.０００４〜０.７％（ｖ／ｖ）であり、不活性化温度は、約２℃〜３７℃であり、不活性化時間は、約２日〜１８０日である。
本発明の不活性化ワクチンの製造方法のために、前述したような任意の公知の不活性化剤を利用して、本発明の形質転換宿主細胞ＡないしＧを処理でき、好ましくは、ホルマリンを利用する。本発明の方法において好ましいホルマリンの添加量は、０.１％〜０.７％（ｖ／ｖ）であり、さらに好ましくは、０.５％である。本発明の方法において好ましい不活性化剤の処理時間は、３日以上であり、さらに好ましくは、３日である。本発明の方法において好ましい不活性化処理の温度は、４℃である。
前記のような本発明の方法によって、不活性化剤で本発明の形質転換宿主細胞ＡないしＧを処理することによって、本発明の組み換え不活性化ワクチンＡないしＧが得られる。
このようにして得られた本発明の組み換え不活性化ワクチンＡないしＧは、イシダイをはじめとする魚類を兔役させるために、単独で、または多様な組み合わせで利用され得る。
本発明で使用できる不活性化ワクチンの組み合わせは、不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも２つを含み、好ましくは、不活性化ワクチンＢとＣとの組み合わせ、不活性化ワクチンＢとＤとの組み合わせ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ及びＥの組み合わせ、及び不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧの組み合わせが挙げられ、このような組み合わせは、形質転換体により生産される組み換え蛋白質の機能を考慮して、組み換え蛋白質Ｂを基本とし、これに類似した機能を行う蛋白質を添加する方式で組み合わせたものであって、前記例示された４つの組み合わせ以外に、他の多様な組み合わせも本発明のワクチンの組み合わせに含まれる。さらに好ましくは、本発明の不活性化ワクチンの組み合わせは、不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧの組み合わせである。
前記のような本発明の不活性化ワクチンＡないしＧは、魚類を兔役させるための投与量の２倍の濃度でイシダイ稚魚に投与してその斃死率を観察した結果、イシダイ稚魚の斃死が全く発生せず、その安全性が確認された。
本発明の第１０態様によって、本発明は、本発明の不活性化ワクチンＡないしＧ、またはそれらの組み合わせを魚類に投与することを含む、魚類を免疫させる方法を提供する。
本発明の不活性化ワクチンにより兔役させ得る魚類は、タイ類、スズキ、ヒラメ及びブリなどを含み、このうちタイ類が好ましく、特に、イシダイが好ましい。
本発明の不活性化ワクチンを利用して魚類を免疫させる方法は、本発明のワクチンを、腹腔内、筋肉内、または皮下接種または浸透法、敬具投与などを利用して魚類に投与する工程を含む。好ましくは、本発明の不活性化ワクチンは、筋肉内注射により投与される。
本発明の免疫方法に利用され得る本発明の不活性化ワクチンの組み合わせは、不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも何れか１つを含み、好ましくは、不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも２つを含み、さらに好ましくは、不活性化ワクチンＢとＣ、不活性化ワクチンＢとＤ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ及びＥ、または不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含み、最も好ましくは、不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含む。
本発明の不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも２以上を利用して魚類を免疫させる場合、前記２以上の不活性化ワクチンは、混合された後に魚類に投与されることが好ましい。
魚類を兔役させるとき、本発明の不活性化ワクチンの投与量は、組み換え蛋白質量が魚類の重量１ｋｇ当り２００μｇの（２００μｇの組み換え蛋白質／ｋｇ体重）濃度となるように、一回投与当り０.０１ｍｌないし０.５ｍｌを投与することが好ましい。
一方、本発明の第１１態様によって、本発明は、本発明の前記不活性化ワクチンを含むキットを提供する。
本発明のキットは、本発明の不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも何れか１つを含み、好ましくは、２以上の不活性化ワクチンを含む。好ましくは、本発明のキットは、不活性化ワクチンＢとＣ、不活性化ワクチンＢとＤ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ、及びＥ、または不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含み、最も好ましくは、本発明のキットは、不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含む。
本発明のキットには、キットに含まれた不活性化ワクチンの投与についての説明書が含まれ得る。
本発明のキット内に含まれる不活性化ワクチンが２以上である場合、本発明の不活性化ワクチンＡないしＧは、あらかじめ混合された形態でキットに含まれてもよく、または、キット内のそれぞれの容器に個別的に含まれてもよい。不活性化ワクチンがそれぞれ別途の容器に含まれた場合、ユーザは、キット内の使用説明書によってそれぞれの不活性化ワクチンを混合して使用できる。
本発明の第１２態様によって、本発明は、本発明のＯＲＦ ＡないしＧ蛋白質のアミノ酸配列の一部を有し、イリドウイルスの免疫原性を有するペプチドを提供する。
本発明のペプチドは、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ，ＣないしＧ遺伝子によりコードされる６個のアミノ酸配列を分析して、第一に、抗原性が高く、第二に、表面に露出されており、第三に、親水性などの３つを満足させる部分を選別することによって得られた。
本発明のペプチドは、天然または合成であってもよく、合成ペプチドは、ペプチド合成器などを利用して合成できる。
本発明によって、本発明の各ＯＲＦ蛋白質のために選択されたペプチド配列は、次の通りである：
ＯＲＦ Ａ：ＡＷＰＬＦＤＤＲＭＲＶＤＱＣＲＢＩ（配列番号２９）
ＯＲＦ Ｃ：ＴＬＱＳＨＫＱＬＹＳＤＹＲＴＥＣ（配列番号３０）
ＡＰＰＤＲＤＤＤＲＷＴＶＰＴＧＣＲＢＩＶ（配列番号３１）
ＯＲＦ Ｄ：ＰＴＥＰＥＰＥＥＰＥＥＥＥＤＥＣ（配列番号３２）
ＴＥＰＥＰＥＥＰＥＥＥＥＤＥＹＣ（配列番号３３）
ＯＲＦ Ｅ：ＱＶＤＲＳＧＡＫＶＰＳＥＡＰＣ（配列番号３４）
ＣＡＭＲＳＲＤＰＬＹＤＫＶＫ（配列番号３５）
ＯＲＦ Ｆ：ＹＡＲＡＲＧＳＴＨＩＲＲＱＫＶＣＲＢＩＶ（配列番号３６）
ＯＲＦ Ｇ：ＣＳＰＥＴＲＮＳＮＦＫＨＳＶＴＹ（配列番号３７）
ＤＭＳＨＩＴＫＥＭＡＬＮＴＫＱＨＴＣＲＢＩＶ（配列番号３８）
このような本発明のペプチドは、優れた免疫原性を有して、イリドウイルスに対するワクチンの製造に有効に利用され得る。
以下で、実施例を参考にして、本発明をさらに詳細に説明し、下記の実施例は、単に例示の目的として開示されるものであり、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
実施例１１：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧペプチドの分析及び合成
本発明の６個のＯＲＦ Ａ，ＣないしＧ遺伝子によりコードされるアミノ酸の配列を分析して、第一に、抗原性が高く、第二に、表面に露出されており、第三に、親水性の特性などの３つを満足させる部分を選択して、ワクチン用ペプチドとして合成した。
各ＯＲＦ蛋白質のために合成されたペプチドの配列は次の通りであり、ペプチドの合成は、（株）ペプトロン（韓国）に依頼して行われた。
ＯＲＦ Ａ：ＡＷＰＬＦＤＤＲＭＲＶＤＱＣＲＢＩ（配列番号：２９）
ＯＲＦ Ｃ：ＴＬＱＳＨＫＱＬＹＳＴＥＣ（配列番号：３０）
ＡＰＰＤＲＤＤＤＲＷＴＶＰＴＧＣＲＢＩＶ（配列番号：３１）
ＯＲＦ Ｄ：ＰＴＥＰＥＰＥＥＰＥＥＥＥＤＥＣ（配列番号：３２）
ＴＥＰＥＰＥＥＰＥＥＥＥＤＥＹＣ（配列番号：３３）
ＯＲＦ Ｅ：ＱＶＤＲＳＧＡＫＶＰＳＥＡＰＣ（配列番号：３４）
ＣＡＭＲＳＲＤＰＬＹＤＫＶＫ（配列番号：３５）
ＯＲＦ Ｆ：ＹＡＲＡＲＧＳＴＨＩＲＲＱＫＶＣＲＢＩＶ（配列番号：３６）
ＯＲＦ Ｇ：ＣＳＰＥＴＲＮＳＮＦＫＨＳＶＴＹ（配列番号：３７）
ＤＭＳＨＩＴＫＥＭＡＬＮＴＫＱＨＴＣＲＢＩＶ（配列番号：３８）
【国際調査報告】
2008522584.tif 000043
2008522584.tif 000044
2008522584.tif 000045