(57)【要約】  本発明は、宿主細胞にＲＮＡを導入することにより、核酸配列及び核酸発現産物の機能を調査及び決定する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生命体における核酸および／または核酸発現産物の機能を調査する方法であって、
（ａ）発現産物の一部または全配列の核酸および／またはコードに由来するＲＮＡの宿主細胞への導入、
（ｂ）前記ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査、および
（ｃ）（ｂ）のステップで決定された宿主細胞における効果に基づいた核酸および／または発現産物の一つ以上の機能の同定、
の各ステップを含む方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡがそれをエンコードする核酸をクローニングし、インビトロでの転写によって得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インビトロでの転写は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターによって調節されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸はポリアデニルカセットと組み合わせて存在することを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡが定義された長さのポリアデニル化部分を有すること特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡがＣａｐ構造を有することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡの宿主細胞への導入は、前記ＲＮＡによりエンコードされた発現産物の発現を引き起こすことを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記発現産物が、ペプチド、タンパク質、酵素、ホルモン、抗体からなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞に対する効果の調査が、前記宿主細胞の表現型および／または生化学的特徴の調査を含むことを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞に対する効果の調査が、前記宿主細胞のタンパク質発現プロファイルの調査（プロテオーム解析）を含むことを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞に対する効果の調査が、前記宿主細胞の前記ＲＮＡ発現プロファイルの調査（トランスクリプトーム解析）を含むことを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞に対する効果の調査が、前記宿主細胞の代謝の調査を含むことを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記代謝の調査が、酵素反応の基質または産物の集積の調査を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞に対する効果の調査が、遺伝子調節の調査を含むことを特徴とする請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞に対する効果が、ＲＮＡが導入されていない細胞と比較して調査されることを特徴とする請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞に対する効果の調査が、相補性解析を含むことを特徴とする、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、原生または真核細胞であることを特徴とする、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞へのＲＮＡ導入が、エレクトロポレーション法またはリポソームを用いて、行なわれることを特徴とする、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞に対する効果の調査が、高密度マイクロアレイ処理を用いて行なわれることを特徴とする請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に核酸配列および核酸発現産物の機能を、宿主細胞にＲＮＡを導入することにより、調査または決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの配列決定の最初のドラフトが完了し、次の課題は、記述的ゲノム研究から機能的ゲノム研究に移行することである（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，  ８８２５−８８２６）。
【０００３】
アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）の使用は、近年において、対象とする遺伝子発現のオフ切り替えのための広い用途が見出されている。
【０００４】
アンチセンスＲＮＡは配列特異的に、相補性の規則にしたがって、当然、自然に転写された標的配列のｍＲＮＡに結合する。この方法は原核生物において最初に記述された（Ｇｒｅｅｎ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５，５６９−５９７）。今日では、それにより、非常に多くの型の真核細胞におけるいかなる所望される遺伝子の迅速で、束の間の、転写後サイレンシングを可能にし（Ｉｚａｎｔ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９，３４５−３５２）、広く使用されている。
【０００５】
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）において、標的配列と特異的に相互作用する短い二重鎖ＲＮＡ（〜２１ｂｐ）が細胞内に導入される。結果として、多タンパク質複合体が活性化されることで、転写されたｍＲＮＡが翻訳可能になる前に、ｍＲＮＡの早期分解が引き起こされる  （Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，  ４０４，２９３−２９６）。しかしながら、インターフェロン系の活性化を通じて、または、二重鎖ＲＮＡに依存するタンパク質キナーゼ応答（ＰＫＲ）の誘導を通じて、（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８，９７４２−９７４７）、または、濃度依存的な刺激、または、非標的遺伝子の抑制を通じて（Ｐｅｒｓｅｎｇｉｅｖ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）ＲＮＡ  １０，１２−１８）ｓｉＲＮＡによっても非特異的効果が引き起こされる。
【０００６】
上記方法は、アンチセンスＲＮＡ、または、ＲＮＡｉを用いて、翻訳を阻止し、したがって遺伝子の機能欠損を引き起こす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特定の遺伝子、特に異所的に活性化または過剰発現された遺伝子、たとえば腫瘍において選択的に発現した遺伝子を機能的特徴づけるために、機能獲得の効果をシミュレートすることはより有用である。
【０００８】
数多くの遺伝子転換技術も、このために利用可能である。したがって、一過性の形質転換体および安定して形質転換された細胞クローンの両方が生産される。調査中の遺伝子は、ＤＮＡプラスミド構造体を用いて、または、レトロウイルスベクターあるいはアデノウイルスベクターの助けにより細胞内に挿入することができる。さらに、挿入遺伝子の発現を構成的にすることができ、または、制御可能なプロモーターにより制御することができる。この目的に利用される、全ての遺伝子転移形態は、固有のシステムの欠点を有している。プラスミドやウィルスによる一過性形質転換体は、ほとんどの細胞型に対して非常に非効率であり（特に、初代細胞）、結果として、多様な亜集団の形質転換をもたらし、これらは、発現レベルの十分正確な滴定をできなくしている。しかしながら、ひとつのおよびそれと同一の遺伝子産物が多様な機能を、異なった細胞、または、たとえ同じ細胞でも異なった濃度で、発揮しているため、これらの技術から得られた情報量は、非常に限られている。軽視できない他の問題は、プラスミドを用いた形質転換が、遅延後にしか転写がおきないことである。その転写まで時間は、形質転換された細胞の細胞周期のフェーズに依存し、かつ、細胞集団に応じて非常に多様である。結果、非同期な、転写および発現がおこる。かわりに、安定形質転換細胞を用いることが提案されている。しかしながら、安定形質転換細胞株の生産には、非常に時間がかかり、かつ、効率的に全ての細胞系に対して実行することはできない。したがって、ほとんどの哺乳類生命体の新鮮な単離細胞が安定して形質転換されない。他の短所は、形質転換後の、例えば抗体の使用や物理的措置（例えば細胞分類）による形質転換細胞の濃縮により、遺伝子産物が導入されたにもかかわらず、起源細胞型から多くの点で異なった亜集団の選別を引き起こすことがある。
【０００９】
本発明は、遺伝子産物の機能の特徴づけのための方法に関し、インビトロで転写された長鎖ＲＮＡの転移に基づく。インビトロで転写されたＲＮＡの細胞への転移は確立された方法であり、腫瘍抗原を抗原提示樹上細胞（ＤＣ）に導入するために、現在特に集中して、腫瘍免疫学において試験されている（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，１０２８−１０３４；Ｈｅｉｓｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，２９５３−２９６０；Ｎａｉｒ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，３６４−３６９）。反対に、今までは遺伝子機能の系統的決定のために、インビトロで転写されたＲＮＡの転移が利用されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、一般的に核酸および／または発現産物、特にペプチドやタンパク質の機能の特徴づけのための方法に関する。本発明による方法において、調査中の核酸および／または調査中の発現産物の機能は、完全に未知であってもよく、または、調査中の核酸および／または調査中の発現産物の一つ以上の機能は、既知であってもよく、この態様においては、本発明による方法は、さらなる機能の同定を目的としている。
【００１１】
本発明の一つの特徴は、宿主細胞における核酸の発現の効果を調査する方法であって、（ａ）核酸に由来するＲＮＡを、前記宿主細胞へ導入すること；および、（ｂ）宿主細胞への当該ＲＮＡの導入の結果として生じる、宿主細胞に対する効果の調査、の段階を含む方法に関する。
【００１２】
ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果は、核酸および／または発現産物の機能についての情報を提供することができる。
【００１３】
したがって、本発明のもう一つの特徴は、生命体における核酸および／または核酸発現産物の機能を調査する方法であって（ａ）核酸および／または、発現産物の一部または全配列のコードに由来するＲＮＡの宿主細胞への導入；（ｂ）ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査；（ｃ）（ｂ）のステップで決定された宿主細胞に対する効果に基づいた核酸および／または発現産物の一つ以上の機能の同定、の各ステップを含む方法に関する。
【００１４】
本発明による方法は、特に殆ど時間消費しないこと、反応速度論的解析の可能なことおよび、殆ど全ての細胞系に適用可能なことに関して利点がある。特に、発現には、ＲＮＡが細胞の細胞質に入りさえすれば十分で、細胞核に入る必要はないため、調査中の核酸、たとえば遺伝子の導入は、ＤＮＡ構造体の使用に比べ、ＲＮＡの形を取った方が利点がある。したがって、ＲＮＡ転移は、形質転換される細胞の分裂活性に依存しない。さらに、ＲＮＡを用いて達成可能となる転換率は、比較的高く（Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ，Ｖ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ，９８，４９−５６；Ｓａｅｂｏｅ−Ｌａｒｓｓｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５９，１９１−２０３）、得られるタンパク質量は、生理学的発現におけるその導入率に対応する。翻訳が完了したタンパク質は、数時間以内に検出可能であり、機能的に意味のあるものになるため、反応速度的な研究を非常に良好に行うことができる（Ｖａｎ  Ｍｅｉｒｖｅｎｎｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９，７８７−７９７）。
【００１５】
細胞内へのＲＮＡ転移は、本発明によれば、実施例で実証された以下の特徴に基づいて、その後の機能的特徴づけに対して理想的である。
【００１６】
・ ＲＮＡ転移によって、腫瘍細胞や未転換一次細胞を含む、調査対象の全ての真核細胞型に、遺伝子産物を挿入できる（表１）。
・ 転換率は非常に高く、多くの細胞型に対して９０％より大であり、したがって、選択する必要がない。
・ 発現レベルは、形質転換に用いるＲＮＡ量によって、非常に良好に滴定することができる。このようにして、細胞内の発現レベルの差異の効果をシミュレートすることが可能となる。
・ 形質転換後、同期翻訳が直ちに起こるため、年代順に生物学的余効を感度よく検出できる。
・ ＲＮＡ形質転換は、トランスクリプトームに関して、形質転換細胞の方法依存変動を殆ど示さない。
【００１７】
本発明による方法は、特に細胞および細胞株の転写調節因子、腫瘍遺伝子、潜在腫瘍遺伝子の異所性発現のシミュレーションに好適であり、したがって、それら遺伝子の機能的特徴付けに好適である。このような場合、宿主細胞に挿入されるＲＮＡは、腫瘍遺伝子または、潜在腫瘍遺伝由来である。
【００１８】
本発明による方法のひとつの実施の態様において、宿主細胞に挿入されるＲＮＡは、それをエンコードする核酸をクローニングし、そのクローン核酸の転写によって、好ましくは、インビトロ転写によって得られる。転写調節プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターならどれでも良い。特にＲＮＡポリメラーゼの例としては、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼがある。好ましくは、本発明によるインビトロでの転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターによって調節される。
【００１９】
特定の実施形態において、ＲＮＡをコードする核酸は、ポリアデニルカセットと併せて存在する。これらの実施形態においては、核酸の発現により、好ましくはインビトロの転写により得られるＲＮＡは、定義された長さのポリアデニル化部分を有することが好ましい。ポリＡストレッチは、好ましくは１０から５００長、より好ましくは３０から３００長、さらに好ましくは６５から２００長、特には１００から１５０長のアデノシン残基を有する。特に好ましい実施形態においては、ポリＡストレッチは、およそ１２０長のアデノシン残基を有する。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態において、宿主細胞に挿入するＲＮＡは、その５'末端にてＣａｐ構造または調節配列を有し、これが宿主細胞での翻訳をプロモートする。
【００２１】
本発明に係る方法の特に好ましい実施形態において、ＲＮＡを宿主細胞に導入することにより、ＲＮＡによりエンコードされた発現産物の発現が引き起こされる。本発明の特定の実施形態においては、発現産物はペプチド、タンパク質、酵素、抗体および抗原からなる群より選択することができる。
【００２２】
本発明によれば、機能調査について、宿主細胞に導入されるＲＮＡの量を制御することが可能になり、したがって宿主細胞において発現した発現産物の量を制御することが可能になる。
【００２３】
特定の実施形態において、本発明の宿主細胞に導入されるＲＮＡは、ＲＮＡライブラリーの一部である。本発明のこの態様は、宿主細胞への導入における宿主細胞に対する特定の影響を起こすことを可能にする又は宿主細胞の特定の機能を制御あるいは特定の機能に影響を与えることを可能にするＲＮＡの発生について、異なる核酸または核酸の変異体（定義：ＲＮＡライブラリー）の群をスクリーニングする方法にも関係する。
【００２４】
したがって、本発明のこの態様は、特定の効果または機能を有する核酸および／または核酸発現産物を見つける方法であって、（ａ）宿主細胞へのＲＮＡの導入；（ｂ）ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査；（ｃ）宿主細胞に対する効果を引き起こすＲＮＡの同定の各ステップを含む方法に関する。この方法は、宿主細胞に対する効果を引き起こすＲＮＡのヌクレオチド配列の決定をも含む。前記ヌクレオチド配列の決定は、公知の方法、特にオリジナル核酸のシークエンシングにより行うことができる。
【００２５】
本発明に係る方法は、ＲＮＡの宿主細胞への導入および宿主細胞中のＲＮＡの可能性ある発現の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査および同定を含む。
【００２６】
ＲＮＡの宿主細胞への導入が、当該宿主細胞に対する効果を示すには多くの様式があることは当業者にとって明らかだろう。したがって、本発明に係る方法においては、ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる効果を調査することを可能にする様々な方法がある。このような方法は、特に限定されないが、以下の一つ以上のパラメータ：細胞増殖、細胞死、細胞移動、細胞接着、薬物に対して改変された耐性または改変された感受性、細胞老化、特定分子の生産または生産抑制、ｍＲＮＡの量、タンパク質産物の量、タンパク質活性レベル、タンパク質のリン酸化に対する効果、タンパク質または核酸のプロセッシングに対する効果、ＲＮＡ安定性に対する効果、シグナル伝達または二次メッセンジャーに対する効果、の決定を含む。
【００２７】
ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査は、好ましくは当該宿主細胞の表現型および／または生化学的特徴の調査を含む。
【００２８】
特定の実施形態においては、ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査が、宿主細胞のタンパク質発現プロファイルの調査（プロテオーム解析）および／またはＲＮＡ発現プロファイルの調査（トランスクリプトーム解析）を含む。
【００２９】
さらなる実施形態において、ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査が、宿主細胞の代謝の調査を含む。この代謝の調査は、公知の方法にしたがった酵素反応からの基質または産物の集積調査を含むことが好ましい。
【００３０】
他の実施形態において、ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査が、遺伝子調節の調査を含む。
【００３１】
本発明に係る方法の特に好ましい実施形態において、宿主細胞に対する効果の調査は、ＲＮＡが導入されていない細胞（転移コントロール）との比較、または機能と関係のないＲＮＡを導入した細胞（ネガティブコントロール）、あるいは機能を仲介するＲＮＡを導入した細胞（ポジティブコントロール）との比較で行う。これら細胞は、コントロールまたは基準としての役割を果たす。また、これら細胞は用いられる宿主細胞と一致していることが好ましい。
【００３２】
サブトラクティブハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法は、ＲＮＡの宿主細胞への導入が宿主細胞のＲＮＡ発現プロファイルに対する作用を含むのか否か決定するために用いることができる。この実施形態においては、例えばコントロール細胞に存在するＲＮＡを、着目しているＲＮＡを挿入する宿主細胞により発現されたＲＮＡから「差し引いた（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）」としている。
【００３３】
さらなる実施形態において、ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査は、相補性解析を含む。この実施形態においては、宿主細胞に内在する遺伝子の機能を、ＲＮＡの宿主細胞への導入により置き換え、または増強させる。
【００３４】
さらなる実施形態において、ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査は、宿主細胞の表現型の特徴の調査、例えば形態学的、巨視的または微視的調査などの方法による調査を含む。
【００３５】
また、宿主細胞は、ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査の前に、さらなる処置または状態の変更をすることができる。これにより、ある実施形態においては、細胞の因子に対する効果を一時的に調査する。宿主細胞は、核酸および／または核酸発現産物の機能のさらなる決定のために、特定の生命体におけるインビボの状況下に組み込むこともできる。
【００３６】
ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果の調査は、核酸および／または発現産物が有する、この核酸および／または発現産物が由来する生命体の中の一つ以上の機能を同定することを可能にする。
【００３７】
本発明に係る方法は、着目する核酸および／または着目する発現産物に機能的に関連する一つ以上の細胞因子を同定することも可能にする。このような細胞因子の群には、着目するＲＮＡの宿主細胞への導入に対する増加した発現を表示するものがあるだろう。もう一つのこのような細胞因子の群には、着目するＲＮＡの宿主細胞への導入に対する減少した発現を表示するものがあるだろう。これにより、本発明は、細胞因子および着目する核酸および／または発現産物の間の機能的な関連性を同定する手段をも提供する。
【００３８】
ある実施形態においては、宿主細胞が、調査する核酸および／または調査する発現産物と同様の生命体由来であることが好ましい、すなわち調査する核酸および／または調査する発現産物が宿主細胞と同種であることが好ましい。しかしながら、調査する核酸および／または調査する発現産物は、宿主細胞とは異種であることが可能である。
【００３９】
着目する核酸および／または着目する発現産物は、少なくとも初めに、その核酸および／またはその発現産物を自然に発現することが知られている宿主細胞中で調査することが好ましい。
【００４０】
しかしながら、ある実施形態においては、異種の核酸および／または発現産物を、宿主細胞、特に哺乳類細胞中で試験することが望まれることもある。これにより、例えば特定の配列、例えば真菌由来の配列が哺乳類の配列のための置換産物として機能する可能性があるか否かを決定することも可能である。もしそうである場合、この異種の配列は、例えば哺乳類の配列のための治療上の置換産物として用いることができる。
【００４１】
さらに、本発明に係る方法において、核酸および／または発現産物の誘導体で一つ以上の機能について試験することが望まれることもある。これは、特定の核酸および／または特定の発現産物を改変すること、および改変された核酸および／または改変された発現産物がオリジナルの核酸および／またはオリジナルの発現産物の一つ以上の効果および／または機能を維持するか否かを試験することを可能にする。多くの場合において、オリジナルの核酸および／またはオリジナルの発現産物の一つ以上の効果および／または機能を維持する核酸および／または発現産物の誘導体を製造することが望まれる。一方で、それらはオリジナルの核酸および／またはオリジナルの発現産物の一つ以上の効果および／または機能を持たないものである。
【００４２】
ある実施形態においては、高いスループットのシステムを、本発明に係る方法を行うために用いる。この態様の一つの実施態様において、システムは随意にコンピュータ化またはロボット化することができ、および多数のコンパートメントの使用を含むこともできる。特に好ましい実施形態においては、このコンパートメントをマルチウェルのプレートに配列させて、ＲＮＡおよび宿主細胞を多くのコンパートメントに配置させることが好ましい。
【００４３】
ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果は、公知のマイクロアレイ技術および処理により調査することができる。
【００４４】
（発明の詳細な説明）
本発明によれば、組み換え核酸の産物、細胞の培養、および核酸、特にＲＮＡの細胞への導入、特にエレクトロポレーションおよびリポフェクションについて標準的な方法を使用することができる。酵素反応および精製技術は、製造者の指示または公知の手法により行う。
【００４５】
「生命体」という用語は、本発明によれば、遺伝物質の増幅または伝達する能力を有し、かつ、植物および動物並びに微生物、例えばバクテリア、イースト、真菌およびウィルスを含む生物学上の単位に関する。
【００４６】
「形質転換」という用語は、本発明によれば、一つ以上の核酸の生命体または細胞、または後者由来の細胞への導入に関する。
【００４７】
「宿主細胞」という用語は、本発明によれば、外部の核酸、特にＲＮＡを用いて形質の変換または転換が可能な細胞に関する。核酸は、宿主細胞に一つ以上のコピーにて存在することができ、およびある実施形態においては宿主細胞で発現される。
【００４８】
本発明によれば、「宿主細胞」は、原核および真核細胞、特にヒトおよび動物細胞、植物細胞および微生物細胞を包含する。本発明で使用される特に好ましい宿主細胞は、真核細胞、特に哺乳類細胞、例えばヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギおよび霊長類由来の細胞である。これらの細胞は、多様な組織の型由来であり、および一次細胞および細胞株を包含することができる。
【００４９】
宿主細胞は、ヒトの組織由来であることが好ましく、特に限定されないが、神経細胞、脳細胞、上皮細胞、結合組織細胞（例えば線維芽細胞、骨芽細胞）、血液細胞（例えば白血球、リンパ球、単球および好中球、特に樹状細胞、血小板）、感覚細胞、筋細胞、肺細胞、心臓細胞、肝細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、乳腺細胞、腎臓細胞、腸細胞、胃細胞、結腸細胞、前立腺細胞、卵巣細胞、胚細胞および幹細胞が挙げられ、これらは多様な細胞型に分化する能力を有する。
【００５０】
培養細胞株も使用することができる。本発明のある実施形態においては、例えば着目する核酸および／または着目する発現産物がこれら細胞でしか正常に発現しない場合に、部分的にまたは完全に分化した細胞を用いる。
【００５１】
本発明によれば、「ＲＮＡの宿主細胞への導入の結果として生じる宿主細胞に対する効果」という用語は、ＲＮＡの宿主細胞への導入に起因する可能性のある、宿主細胞に対する知覚可能な効果のいずれも包含し、特に宿主細胞の成長、発達、増幅、遺伝的継承、生物学および／または表現型に対する効果を包含する。
【００５２】
「表現型」または「表現型の特徴」という用語は、生命体または宿主細胞の外観に関する。表現型は、内的および外的な構造および機能の全てを含む。個々の発達の経過において、生命体およびそれに由来する細胞の表現型は変化することができる。生命体およびそれに由来する細胞の外的特徴は、その遺伝的情報（遺伝子型）により決定されるが、表現型はどの遺伝子が実際に発現されるのか（発現）に依存する。
【００５３】
「生化学」または「生化学的特徴」という用語は、生命体またはそれに由来する細胞における基質の代謝および伝達に関する。
【００５４】
本発明によれば、「生命体またはそれに由来する細胞における核酸および／または核酸発現産物の機能」という用語は、生命体またはそれに由来する細胞、好ましくはその核酸および／またはその核酸発現産物が由来する生命体またはそれに由来する細胞における、核酸および／または核酸発現産物の機能的役割に関する。ある実施形態においては、この用語は、発ガン現象における核酸および／または核酸発現産物の機能的役割に関する。核酸に関しては、この用語は、特に生命体またはそれに由来する細胞における核酸の発現または発現の欠如から生じる効果に関する。
【００５５】
本発明によれば、「核酸および／または核酸発現産物の機能」という用語は、核酸および／または核酸発現産物が一つだけまたはいくつかの機能を有することを意味することがあり、後者の場合、一つ以上の機能が本発明に係る方法により調査される。
【００５６】
「遺伝子」という用語は、本発明によれば、特定の核酸配列に関し、この配列は一つ以上の細胞の産物の産生、および／または一つ以上の細胞間または細胞内の機能の獲得に関与する。特にこの用語は、特定のタンパク質、または機能性または構造性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡセグメントに関する。
【００５７】
本発明の核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはＲＮＡの産生に使用することができるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であることが好ましい。本発明によれば、核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組み換え技術により作り出された分子および化学的に合成された分子を包含する。また、本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖、および直鎖状または共有結合的に環状に閉じた分子の形態をとることができる。
【００５８】
また、本発明の核酸、特にＲＮＡは、核酸間でのホモロジー（相同性）がある程度あれば、すなわちこの核酸がヌクレオチド配列において直接的または相補的に十分な一致があれば、この他の核酸から誘導される。さらに、核酸は、一番目の核酸（当該核酸）が二番目の核酸（他の核酸）の誘導体である場合にも、この他の核酸から誘導される。また、「核酸から誘導されたＲＮＡ」という用語は、特にＲＮＡが核酸またはそれから誘導される核酸の転写産物であること、および／または翻訳によって、そのＲＮＡが由来する核酸の転写および翻訳に基づいて生じるタンパク質発現産物と、同様の配列を有するタンパク質発現産物を結果的にもたらす配列を有することを意味する。
【００５９】
本発明によれば、核酸の「誘導体」は、その核酸において一つまたは複数のヌクレオチドの置換、削除および／または追加が存在することを意味する。さらに、「誘導体」という用語は、核酸の核酸塩基、糖またはリン酸に対する化学的誘導体も包含する。また、「誘導体」という用語は、非天然にて発生するヌクレオチドおよびヌクレオチド誘導体を含む核酸をも包含する。
【００６０】
本発明によれば、核酸は単離することができる。本発明によれば、「単離された核酸」は、核酸が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりインビトロで増幅されること、（ｉｉ）クローニングにより組み換えにて作り出されること、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動による分離により精製されること、または（ｉｖ）例えば化学合成により合成されることを意味する。単離された核酸は、組み換えＤＮＡ技術による操作が可能な核酸である。
【００６１】
核酸は、二つの配列が互いにハイブリダイズ可能であり、安定した二重鎖を形成できる場合、他方の核酸と「相補的」となる。なお、このハイブリダイズは、好ましくはポリヌクレオチド間での特定のハイブリダイズを許容する条件（ストリンジェントな条件）下で生じるものである。ストリンジェントな条件は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｂｌ．，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｂｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、および例えば６５℃でハイブリダイゼーションバッファ（３．５×ＳＳＣ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ）でのハイブリダイズに関する。ＳＳＣは、０．１５Ｍの塩化ナトリウム／０．１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイズ後、ＤＮＡが移動してきた膜を、例えば２×ＳＳＣで室温にて洗浄し、その後０．１−０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで６８℃までの温度で洗浄する。
【００６２】
本発明によれば、相補的核酸は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、および好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヌクレオチドの同一性を有する。
【００６３】
本発明の方法により核酸と機能的に連結される発現制御配列または調節配列は、その核酸に対して同種または異種であってもよい。コード配列および調節配列は、それらが共有結合する場合、コード配列の転写または翻訳が調節配列の制御下または影響下にて行われるように、「機能的」に連結する。コード配列が機能的タンパク質に翻訳される場合、調節配列のこのコード配列との機能的連結した状態でのこの調節配列の提示が、コード配列での読み枠移動を引き起こしたり、または所望するタンパク質またはペプチドへのコード配列を翻訳不能としないように、コード配列の転写を導く。
【００６４】
本発明によれば、「発現制御配列」または「調節配列」は、プロモーター、リボソーム結合配列および他の制御要素を包含し、この制御要素は遺伝子の転写または誘導されたＲＮＡの翻訳を制御するものである。本発明のある実施形態においては、発現制御配列は制御され得る。調節配列の正確な構造は、種に依存して、または細胞型に依存して異なるが、転写または翻訳の開始に関与する、一般的に５'−未転写の配列、および５'および３'−未翻訳の配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などを包含する。特に、５'−未翻訳の調節配列は、機能的に結合した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を有するプロモーター領域を包含する。調節配列は、エンハンサー配列または上流のアクチベータ配列も包含し得る。
【００６５】
さらに、本発明の核酸は、この核酸によりエンコードされたタンパク質またはポリペプチドを特定の標的部位にガイドするポリペプチドをコードする他の核酸と連結することができる。特に、本発明の核酸は、エンコードされたタンパク質またはポリペプチドの転座または安定化を宿主細胞の細胞膜またはこの細胞の特定のオルガネラにおいてコンパートメント化された部分の細胞膜の上で引き起こすポリペプチドをコードする他の核酸と連結することができる。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態において、クローン核酸は、この核酸の発現を制御するプロモーターを随意に含むベクター内に存在する。「ベクター」という用語は、その最も一般的な意味において用いられ、例えば核酸を原核および／または真核細胞に挿入して、必要に応じてゲノムに組み込むことを可能にする、核酸のためのいかなる中間的な媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）をも包含する。このようなベクターは、細胞中で複製および／または発現されることが好ましい。中間的な媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）は、例えばエレクトロポレーション、微小粒子衝撃法（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム投与（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、アグロバクテリアを用いた転移、またはＤＮＡまたはＲＮＡウィルスを介した挿入における用途に適応させることができる。
【００６７】
組み換えＲＮＡは、本発明によれば、インビトロでの適切なＤＮＡ鋳型の転写により産生することができる。さらに、組み換えＲＮＡは、配列の安定化、キャッピングおよびポリアデニル化によって修飾することができる。
【００６８】
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味において用いられ、ＲＮＡの産生、またはＲＮＡおよびタンパク質／ポリペプチドの産生を包含する。また、発現は、核酸の部分的な発現も包含する。さらに、発現は過渡的であっても、安定的であってもよい。ＲＮＡに関して、「発現」という用語は、特にタンパク質／ポリペプチドの産生に関する。
【００６９】
発現産物、特にタンパク質あるいはポリペプチド、または本発明の意味におけるアミノ酸配列の「誘導体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸削除変異体、および／またはアミノ酸置換変異体を包含する。
【００７０】
アミノ酸挿入変異体は、アミノ−および／またはカルボキシ−末端融合物、および特定のアミノ酸配列の中での個々のまたはいくつかのアミノ酸の挿入物を包含する。挿入を伴うアミノ酸配列変異体において、一つ以上のアミノ酸残基は、アミノ酸配列の所定の位置で挿入されるが、結果産物の好適なスクリーニングによるランダム挿入も可能である。アミノ酸削除変異体は、配列から一つ以上のアミノ酸を除くことにより特徴付けられる。アミノ酸置換変異体は、配列の少なくとも一つの残基を除き、かつ、その場所にもう一つの残基を挿入することにより特徴付けられる。この修飾は、同種のタンパク質間またはポリペプチド間で保存されていない、アミノ酸配列の位置でなされていることが好ましい。アミノ酸は、同様の特性、例えば疎水性、親水性、電気陰性度、側鎖の容積などを有する他のもので置換すること（同類置換）が好ましい。同類置換は、例えばあるアミノ酸をもう一つのアミノ酸で置換することに関する。以下にその置換対象となるアミノ酸と同じ群に挙げる。
【００７１】
１．小さな脂肪族の、非極性あるいはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）
２．負のチャージを帯びた残基およびそれらのアミド：Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
３．正のチャージを帯びた残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
４．大きな脂肪族の、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
【００７２】
３残基が、タンパク質構造において特定の役割を果たすため、括弧内にて示されている。Ｇｌｙは、側鎖を有さない唯一の残基であり、これにより鎖に柔軟性を付与する。Ｐｒｏは、独特の配置を有しており、これによりポリペプチド構造に大きな変化を導くことができる。Ｃｙｓは、分子内、または他のＣｙｓとの分子間のジスルフィド架橋を形成することができる。
【００７３】
上述したアミノ酸変異体は、組み換えＤＮＡ操作を用いて容易に作り出すことができる。全部公知または部分的に公知の配列を有するＤＮＡの所定部位での置換変異を挿入するための技術は、公知であり、例えばＭ１３突然変異生成が挙げられる。タンパク質産生のための置換、挿入または欠失といったＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に詳細に記載されている。
【００７４】
本発明によれば、タンパク質またはポリペプチドの「誘導体」は、タンパク質またはポリペプチドに関連する糖質、脂質および／またはタンパク質またはポリペプチドに関連する単一のまたは複数の分子の置換、欠失および／または付加も包含する。さらに、「誘導体」は、タンパク質またはポリペプチドの機能的、化学的な等価物の全てに当てはまる。
【００７５】
本発明によれば、発現産物の部分またはフラグメントは、好ましくは、それが由来する発現産物の機能的な特性を有する。この機能的な特性は、抗生物質との相互作用、他のポリペプチドまたはタンパク質との相互作用、核酸の選択的結合および酵素活性を包含する。
【００７６】
本発明によれば、核酸の部分またはフラグメントは、好ましくは上記で定義したような発現産物の部分またはフラグメントをコードする核酸の部分に関する。
【００７７】
本発明によれば、核酸の細胞への導入のために、多様な方法を用いることができる。このような方法は、核酸−ＣａＰＯ４沈殿物の形質転換、ＤＥＡＥに関連する核酸の形質転換、着目する核酸を担持したウィルスを用いた形質転換または感染、エレクトロポレーション、リポソーム媒介の形質転換などを包含する。核酸を特定細胞へ案内することは、ある実施形態においては好ましい。このような実施形態において、核酸を細胞に送達するために用いるキャリア（例えば、レトロウィルスまたはリポソーム）は、結合した案内分子（ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を備える。例えば、抗体のような分子は、標的細胞の表面膜タンパク質に特異的であったり、あるいは標的細胞上のレセプターのためのリガンドであったりするが、核酸キャリアに取り込んだり、または結合させることができる。核酸をリポソームにより導入することが望まれる場合には、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に取り込んで、標的および／または吸収を可能とすることができる。このようなタンパク質は、カプシドタンパク質またはそのフラグメントを包含する。このタンパク質は、特定の細胞型、内在するタンパク質に対する抗体、細胞内部位にガイドするタンパク質などに特異的である。
【００７８】
本発明によれば、「相補性解析」という用語は、特定の遺伝子を削除または変異させて、その遺伝子の役割にてもはや十分に機能しないようにした後に、核酸を生命体または細胞に導入したときにこの生命体または細胞にて得られる効果の調査に関する。相補的な遺伝子またはその発現産物が、欠損遺伝子または変異遺伝子を伴った生命体または細胞に導入されると、好ましくはそれらはその遺伝子の機能を再生する能力を有する。
【００７９】
本発明によれば、「マイクロアレイ」という用語は、生物学上の材料、例えば核酸、ペプチドまたはタンパク質を高密度にて適用し、結合するために用いられるデバイスに関する。マイクロアレイは、多量のサンプルを制御された間隔にて適用することを許容し、それらがパラレルな実験に使用することができる固体キャリア支持体からなり、またはそのような固体キャリア支持体を有する。
【００８０】
本発明によれば、「高密度」という用語は、様々なサンプル、例えば核酸サンプルを高密度で保持し、これにより多くの質問に対して回答を与えることを可能にするアレイに関連して用いられる。
【００８１】
本発明は、以下に示す図面および実施例により詳細に説明されるが、これら図面および実施例は説明としてのみ用いられるのであり、限定として理解されるべきではない。当業者は、本記載および本実施例に基づいてさらなる実施形態に拡げることができるものであり、これらも本発明により保護される。
【実施例】
【００８２】
実施例１：ベクターの生産
【００８３】
ベクターは、それぞれのコード配列を基礎ベクターであるｐＧＥＭ３Ｚベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または、ｐＣＭＶ  Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ）にクローンして、生産した。
【００８４】
ｐＧＥＭ３Ｚベクターは、開始コドンの前にＳＰ６プロモーターを持ち、そこからインビトロで転写可能である。ｐＣＭＶ  Ｓｃｒｉｐｔベクターは同じ部位にＴ７プロモーターを有する。
【００８５】
これらの基礎ベクターから出発し、大幅な組み換えで導入する。これは、ポリアデニル化された、インビトロで転写された（ＩＶＴ）ＲＮＡの生産のために必須である。
【００８６】
１２０塩基のポリＡ伸長部分を、ｐＧＥＭ３ＺベクターにＸｈｏＩ切断部位を解して導入した。ポリＡ伸長直後、制限部位を導入し、これにより、ポリＡ伸長がリニア化する。後述するように、ｐＧＥＭ３Ｚテールベクターをこのベクターにしている（図１ａ）。
【００８７】
１２０塩基対のポリＡ伸長部分をｐＣＭＶ  ＳｃｒｉｐｔベクターにＳａｃＩ切断部位の後ろで導入した。後述するように、ｐＳＴＩテールベクターをこのベクターとしている（図１ｂ）。
【００８８】
ｅＧＦＰまたは、各組織から増幅された遺伝子を、精製および各ベクターによる制限後、連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＦ１-に形質転換した。得られたプラスミドを配列決定し、その配列を分析した。
実施例２：ＩＶＴ  ＲＮＡの生産
【００８９】
ＩＶＴ  ＲＮＡの生産の第一段階は、各プラスミドのリニア化を含む。用いられる制限酵素は、ｐＧＥＭ３Ｚテールベクターについては、ＢｐｉＩであり、ｐＳＴＩテールベクターについてはＳａｐＩだった。両方とも、ベクターの中を一度だけ、つまり挿入テールの後ろが切断された。リニア化後、酵素は、フェノール−クロロホルム沈殿によって不活性化し、除去した。この為に、フェノールおよびクロロホルムの混合物の等容量（ｉｓｏｖｏｌｕｍｅ）が制限チャージに追加され、完全に混合された。１００００×ｇの手短な遠心分離により、下部の有機層およびＤＮＡを含む上部の水層への分離が生じた。後者を新しい反応槽に移した。その後、水層を等容量の純クロロホルムで混合し、全てのフェノール残留物を除去した。遠心分離後、水層を除去し、２倍等容量のエタノールとｐＨ４．５の１０％ｖ／ｖ３Ｍ酢酸ナトリウムと−２０℃にて加えて２時間沈殿させた。
【００９０】
ＤＮＡは、１００００×ｇで、４℃の遠心分離で４５分間沈降し、塩を除去するために７０％エタノールで洗浄し、適量のＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ水中で取っておいた。リニア化が成功かつ完了であることを確かめるために、ゲル電気泳動を行なった。ＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍの光度測定法で、測定した。ＤＮＡ純度の測定のため、さらに２８０ｎｍの吸光度を測定してＯＤ２６０／２８０比を得た。
【００９１】
１０μｇのリニア化ＤＮＡをインビトロ転写に用いた。これについては、４／５のｄＧＴＰにさらにキャップ構造を付与した４０μｌのｄＮＴＰと、ｌ０μｌの１０×バッファと、２０μｌのｄＴＴと、１０μｌのＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼを、３７℃で２時間でインキュベートした。ポリメラーゼは、転写されるＯＲＦから５'方向に位置する、Ｔ７またはＳＰ６認識配列に結合し、相補的ＲＮＡ鎖を合成する。
【００９２】
ＩＶＴ  ＲＮＡは、ＭｅｇａＣｌｅａｒ  Ｋｉｔを用いて精製した。これについては、ＲＮＡをシリカ膜に最適に結合させるために必要な塩を含んだ結合緩衝濃縮物に、そのＲＮＡを取っておいた。エタノールの添加により、ＲＮＡ水和殻から水が除去した。その混合物を、シリカカラムにロードし、１００００×ｇで２分遠心分離させた。ＲＮＡをそのカラムに結合させ、一方不純物、たとえば、酵素残留物を洗い落とした。何度かの洗浄後、精製されたＲＮＡを溶出した。溶出緩衝液を、９５℃まで予熱して効率的に溶出した。
【００９３】
質管理および定量化は、ゲル電気泳動および光度測定によって、行った。
実施例３：細胞へのエレクトロポレーション
【００９４】
エレクトロポレーション法の原理は、短い電流パルスによって、細胞の膜電位を乱すことに基づいている。外部刺激による膜電位の変化は、次の式で表される。
【数１】
2008525043.tif 000002
Ｖｍは膜電位であり、ｆは細胞外の電界分布に対する細胞の影響を表す形状因子である。ｆＥｅｘは適用された電界を表し、ｒは細胞半径を表し、φは外部から適用された電界に対する角度を表す。ｆは、通常１．５として与えられるが、それは他の多くの因子に依存している。適用された電界が、細胞膜の容量を越えるとき、すなわち、ΔＶｍが１Ｖとして与えられる閾値ΔＶｓより大きいとき、細胞へのエレクトロポレーションは成功する（Ｋｉｎｏｓｉｔａ，Ｋ．，Ｊｒ．ａｎｄ  Ｔｓｏｎｇ，Ｔ．Ｙ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ，２６８，４３８−４４１）。二分子膜としての細胞膜の構造は、真核細胞に共通の特徴であるため、この値は異なった細胞株に対して、ほとんど変動を示さない。
【００９５】
絶縁破壊の膜電位になると、一時的に親水性穿孔が形成され、そこを通じて水が細胞内に浸透して、たとえば核酸等の分子の細胞内への移動が生じる（Ｗｅａｖｅｒ，Ｊ．Ｃ．（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５，３−２８；Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．４８，３−１６）。
【００９６】
エレクトロポレーションの前に、用いる接着細胞をセミコンフルエントの状態まで培養し、ＰＢＳで洗浄後、トリプシンを用いて、細胞培養フラスコから取り外した。細胞を１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）添加培地に移し、５００×ｇで８分遠心分離した。ペレットを血清フリー培地Ｘ−Ｖｉｖｏのなかで再懸濁し、再び、５００×ｇで８分遠心分離した。この洗浄操作を続くエレクトロポレーションに影響するＦＣＳの残留物を除去するためにさらに２回行なった。
【００９７】
洗浄後、細胞を２５０μｌにて所望の細胞密度になるように調整し、エレクトロポレーションキュベットに移し、氷上で静置した。適量のインビトロで転写されたＲＮＡを添加し、十分攪拌した後、エレクトロポレーションを、２００Ｖかつ２５０μＦで行った。その後、細胞を速やかに適当な培養液に移し、３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートした。
実施例４：実験条件の確立と実験系の特徴付け
【００９８】
ｅＧＦＰ−ｐＧＥＭ３Ｚテール発現ベクターを、実験条件の確立のために用いた。５'に位置するＲＮＡポリメラーゼプロモーターＳＰ６によって、インビトロでのＲＮＡの発現が可能になる。
【００９９】
インビトロで転写されたｅＧＦＰ  ＲＮＡは、以下のように、多様な細胞型の形質転換効率の試験のために用いた。形質転換効率は、ｅＧＦＰの蛍光強度の測定によりＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒを用いて、測定した。細胞内のＲＮＡ量は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。腫瘍細胞株に９０％より高い効率で形質転換可能であるだけでなく、初代樹状細胞にも７０から８０％の効率で形質転換可能であることが示された（図２および３並びに表１）。
【０１００】
【表１】
2008525043.tif 000003
表１：２０μｇのｅＧＦＰ  ＩＶＴ  ＲＮＡを用いた５×１０６個の細胞の形質転換後に測定した多様な細胞の形質転換効率。形質転換後２４時間にＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒを用いての蛍光強度の測定。
形質転換条件：２００Ｖかつ２５０μＦのエレクトロポレーション。
【０１０１】
さらに、形質転換効率による細胞の影響は２×１０６から２×１０７細胞の範囲において除外することができた（図４）。また、エレクトロポレーション条件は、試験範囲内での形質転換効率に対して決定的な影響を及ぼさない（図５）。
【０１０２】
ＲＮＡの安定性は２４時間にわたって立証された（図６ａ）。一方、その半減期に依存するが４８から７２時間にわたって、細胞内でタンパク質を検出することができる（図６ｂ）。
【０１０３】
転写されたＲＮＡ量および得られるタンパク質量の間には直接的な依存性があることが示すことができた（図７）。
【０１０４】
この方法に因る分子変化は、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて測定された。プロテアソーム関連遺伝子、ヒートショック遺伝子およびアポトーシス関連遺伝子の分子変化は、８時間後および２４時間後に見られただけであった（表２）。
【０１０５】
【表２】
2008525043.tif 000004
表２：非形質転換コントロール細胞と比較して、２０μｇのｅＧＦＰ  ＩＶＴ  ＲＮＡで形質転換した２×１０７個の７８６−０細胞における十分に調節された遺伝子の数。変化は、＞２または＜０．５の調節で有意であるだけである。
【０１０６】
ｓｉＲＮＡの使用の後に記載されてきたような（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８，９７４２−９７４７）インターフェロン系の活性はない。
実施例５：モデル遺伝子のＩＶＴ  ＲＮＡ形質転換
【０１０７】
さらなる、ＩＶＴ  ＲＮＡを用いた細胞の形質転換の可能性および限界の詳細な検討のため、多種のモデル遺伝子を異種発現したＩＶＴ  ＲＮＡとして細胞に導入した。よく特徴づけされた遺伝子ＨＩＦ１−α（低酸素症誘導因子）およびＶＨＬ（ｖｏｎ−Ｈｉｐｐｅｌ  Ｌｉｎｄａｕ）をモデル遺伝子として用いた。これらの遺伝子のコード領域を睾丸組織由来のｃＤＮＡを用いて増幅し、ｅＧＦＰのために記載されたベクター系へクローンした。
【０１０８】
ＨＩＦ１−αやＶＨＬについては、多種な標的遺伝子が記載されており、それらの発現は、不完全細胞株の形質転換後に測定した。ＨＩＦ１−α転写因子の形質転換後、標的遺伝子であるＬＤＨＡ（乳酸脱水素酵素Ａ）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子１α）や、Ｇｌｕｔ−１（グルコーストランスポーター１）の発現増加を検出した（図８）。それらの誘導の程度は、転移ＨＩＦ１−α  ＩＶＴ  ＲＮＡ量に基づいて滴定することができる。ＨＩＦ１−α転写因子の転移によって、その標的遺伝子の強固な調節が可能である。用いられたＩＶＴ  ＲＮＡ量の滴定を通じて、ＨＩＦ１−αにより誘導された遺伝子の転写量を滴定することもできる。
【０１０９】
転写因子の分子効果は、ほとんど直接かつ即座に検出することができる。したがって、ＨＩＦ１はその標的遺伝子のプロモーター領域の共通配列に直接結合し（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．（２０００）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４，１９８３−１９９１；Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．（２０００）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８８，１４７４−１４８０）、速やかにそれらの転写を開始させる。間接的かつ副次的効果もＩＶＴ  ＲＮＡ転移により、明らかにできるか否かを調査するために、ＨＩＦ１−αよりも上位であるｐＶＨＬ（ｖｏｎ−Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｄａｕ）タンパク質を第２モデル遺伝子として選択した。ｐＶＨＬは、ユビキチンリガーゼＥ３複合体に属し、ＨＩＦ１のαサブユニットの分解を引き起こす。したがって、ＶＨＬの発現増加は、細胞内のＨＩＦ１濃度の減少を引き起こし、ＨＩＦ１標的遺伝子の発現の減少に関係している。ＶＥＧＦおよびＬＤＨＡ発現における時間に依存した減少は、ＶＨＬでの細胞の形質転換後、明確に実証された（図９）。
実施例６：例としてＳＹＴ−ＳＳＸ１およびＳＹＴ−ＳＳＸ２を用いた推定発癌転写物の従来未知の機能の同定。
【０１１０】
ＲＮＡ転移技術は、腫瘍生物学に対する遺伝子の関連性の迅速な解読を可能にする。証明のために普遍的に発現する遺伝子である、ＳＹＴ遺伝子およびＣＧ遺伝子であり、睾丸や腫瘍でのみ発現するＳＳＸ１またはＳＳＸ２遺伝子の融合産物を選択した。これらの遺伝子を選択した理由としては、一方においては、滑膜肉腫において９０％を超える（Ｓｒｅｅｋａｎｔａｉａｈ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４４，１１２１−１１３４）転座ｔ（Ｘ；１８）（ｐ１１．２；ｑ１１．２）（Ｃｌａｒｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７，５０２−５０８；Ｃｒｅｗ，Ａ．Ｊ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，２３３３−２３４０）の頻度であり、この転座頻度は、腫瘍生物学の関連性を示唆し、したがって、発癌能を示唆するからである。また、他方では、この融合産物が転写活性化ＱＰＧＹドメインを含有していることから、転座の結果として、直接分子変化が期待されるためである。腫瘍の発達及び体系における、転座の分子効果及びそれらの重要性は未だ大部分が知られていない。ＳＹＴ−ＳＳＸ１及びＳＹＴ−ＳＳＸ２  ＩＶＴ  ＲＮＡの形質転換体により誘導された分子変化をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、解析した。ＳＹＴ−ＳＳＸ１及びＳＹＴ−ＳＳＸ２を用いた細胞に形質転換後、多数の遺伝子発現の増加が検出できた。形質転換後、検出できた調節遺伝子としては、第１成長因子、神経遺伝子、腫瘍遺伝子または腫瘍関連遺伝子が挙げられ、また、これらは、細胞周期の調節またはシグナル伝達に関与する（図１２−１〜１２−１３）。これら遺伝子のいくつかの差次的発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲにより、実証された（図１３；図１０）。滑膜肉腫における、これら遺伝子の機能的関連性を検出するために、さらにそれらの発現を、正常組織と比較して滑膜肉腫において測定した（図１１）。
【０１１１】
実施例としてＳＹＴ−ＳＳＸ１およびＳＹＴ−ＳＳＸ２の形質転換体を用いて、ＲＮＡ転移およびそれに続くＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いた分子変化の測定により、発癌現象における遺伝子の有意性を決定することが可能であることを明らかに示すことができた。形質転換細胞の直接的および間接的な標的遺伝子は、決定され、遺伝子機能の我々の理解に寄与する。
【０１１２】
ＩＶＴ  ＲＮＡの薬物動態的特徴と併せて、ＩＶＴ  ＲＮＡはシグナル伝達カスケードを解読するための良好な基礎を構成する。様々な時点での遺伝子発現プロファイルの構成および適切なソフトウェアを用いたそれらの解析は、定義された遺伝子群の単位を記述することにより、結果として起こる活性化された調節遺伝子のカスケードを発見することを可能にする。このように、ＲＮＡ転位技術を用いて、発癌現象において、今まで殆ど特徴付けられていない遺伝子の機能的有意性を解明することが可能となる。さらに、新規に同定された標的遺伝子の転移により、形質転換遺伝子の直接的および間接的な効果を発見することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】用いられたｅＧＦＰベクターの表示−ａ．ｐＧＥＭ３Ｚ  ｅＧＦＰテール、ｂ．ｐＳＴＩ  ｅＧＦＰテールである。これらのベクターは、続くクローニングのための、開始ベクターとして用いられた。
【図２】７８６−０細胞における、形質転換後２４時間のｅＧＦＰ  ＩＶＴ  ＲＮＡの翻訳を検出するためのウエスタンブロット。ｅＧＦＰ−ｐＧＥＭ３ＺテールＩＶＴ  ＲＮＡの２０μｇが、２００Ｖかつ２５０μＦで形質転換された。一次抗体として、濃度１μｇ／ｍｌのウサギ抗ＧＦＰを用いた。二次抗体として、濃度０．５μｇ／ｍｌのヤギ抗ウサギＨＲＰを用いた。マウス抗ＥＲＫ２抗体を濃度０．２μｇ／ｍｌのローディングコントロールとして用いた。ここで、二次抗体として、ヤギ抗マウスＨＲＰを、１／５０００希釈で用いられた。
【図３】１×１０７個の７８６−０細胞に、ｅＧＦＰ  ＩＶＴ  ＲＮＡの２０μｇが形質転換された後２４時間の、又は、ＲＮＡなしでコントロール形質転換後の、ＦＡＣＳドットブロットの表示。
【図４】ｅＧＦＰの平均蛍光強度を測定して、エレクトロポレーション効率に対する細胞カウントの影響の測定。ｅＧＦＰ−ｐＧＥＭ３ＺテールＩＶＴ  ＲＮＡの２０μｇが、上記数のＫ５６２細胞に形質転換された。細胞は形質転換後２４時間培養された。平均蛍光強度は、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒを使用して測定した。
【図５】エレクトロポレーション効率や平均蛍光強度に対するエレクトロポレーション条件の影響の測定。ＭＣＦ７細胞に、ｅＧＦＰ  ＩＶＴ  ＲＮＡを２０μｇ形質転換した。細胞は形質転換後２４時間培養された。平均蛍光強度は、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒを使用して測定した。
【図６】ｅＧＦＰ  ＩＶＴ  ＲＮＡ又は、２ｄＧＦＰ  ＩＶＴ  ＲＮＡの２０μｇを用いた、２×１０７個の７８６−０細胞の形質転換後、転写およびタンパク質量に対する時間の影響の測定。ａ．定量ＲＴ−ＰＣＲ分析に基づく、相対転写量の測定。正規化は非形質転換細胞に対して行った。ｃＤＮＡ量の違いを考慮するために、１８ｓ特異的ＰＣＲを行い、その値で正規化に用いた。ｂ．ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒを使用したｅＧＦＰの平均蛍光強度の測定。
【図７】ｅＧＦＰ  ＩＶＴ  ＲＮＡを用いた５×１０６個のＭＣＦ−７細胞の形質転換後２４時間のｅＧＦＰタンパク質レベルに対するＲＮＡ量の影響の測定。ａ．非形質転換コントロールと比較したヒストグラムブロットでの蛍光強度の測定の表示。ｂ．平均蛍光強度の表示。
【図８】２×１０７個の７８６−０細胞形質転換後２４時間のＨＩＦ１−α、ＬＤＨＡ、ＶＥＧＦ、および、Ｇｌｕｔ−１の相対転写量のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる定量測定。ｅＧＦＰ形質転換コントロールと比較した相対発現の表示。
【図９】ＶＨＬ  ＩＶＴ  ＲＮＡの２０μｇを用いた２×１０７個の７８６−０細胞の形質転換後、ＶＥＧＦおよびＬＤＨＡの相対転写量の時間に対する変化。非形質転換細胞と比較して、相対転写量を測定した。正規化は１８ｓ  ｒＲＮＡによって行った。
【図１０】ＳＹＴ、ＳＳＸ２、ＳＹＴ−ＳＳＸ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ２、または、コントロールとして、ｅＧＦＰ  ＩＶＴ  ＲＮＡを用いた、１×１０７個のＭＣＦ−７細胞の形質転換後の相対転写量の表示。正規化はＨＰＲＴによって成立した。ｅＧＦＰ  ＩＶＴ  ＲＮＡを用いて形質転換された細胞と比較して、相対転写量を測定した。
【図１１】乳房、肺、腎臓、卵巣、睾丸、肝臓、リンパ節、胸腺、脾臓および副腎の正常組織と比較した、滑膜肉腫における、ＢＭＰ７、ＥＰＨＡ４およびＣＯＬ５Ａ１の相対転写量の表示。正規化はＨＰＲＴによって行った。ＢＭＰ−７およびＣＯＬ５Ａ１の発現の測定のため、試験された肉腫は、骨肉種であった。一方、ＥＰＨＡ４の調査のため、滑膜肉腫を試験し、ＳＹＴ−ＳＳＸ１またはＳＹＴ−ＳＳＸ２に対して、ポジティブではなかった。転位の欠損によって、病理の診断は不確かなものである。
【図１２−１】機能によってグループ化され、かつ、ｅＧＦＰを用いた形質転換コントロールと比較して、ＳＳＸ２、ＳＹＴ−ＳＳＸ１またはＳＹＴ−ＳＳＸ２を用いたＭＣＦ−７細胞の形質転換体に対して、５％の有意性基準で、少なくとも２１倍の差異で発現された、遺伝子一覧表。記載のない値は非有意調節領域に位置する、つまり＜２１の値である。表に示された値は、いずれの場合も、２が基底の指数である。つまり、結果数は差異発現のファクターを表している。
【図１２−２】図１２−１に同じ。
【図１２−３】図１２−１に同じ。
【図１２−４】図１２−１に同じ。
【図１２−５】図１２−１に同じ。
【図１２−６】図１２−１に同じ。
【図１２−７】図１２−１に同じ。
【図１２−８】図１２−１に同じ。
【図１２−９】図１２−１に同じ。
【図１２−１０】図１２−１に同じ。
【図１２−１１】図１２−１に同じ。
【図１２−１２】図１２−１に同じ。
【図１２−１３】図１２−１に同じ。
【図１３】ｅＧＦＰ形質転換細胞と比較して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定された、相対転写量の表示。正規化はＨＰＲＴによって行った。生物学的上のｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）間の標準偏差が記載されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１２−１０】
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【図１２−１１】
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【図１２−１２】
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【図１２−１３】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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