(57)【要約】本発明は、単離された抗血管新生ペプチドまたはその抗血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質を含む、ペプチドが長さ１１ないし４０アミノ酸でありおよび抗血管新生活性を有し、ペプチドがアミノ酸配列：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４を含み、Ｘ１はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；Ｘ２はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；Ｘ３はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒのうちのアミノ酸残基である；Ｘ４はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；Ｘ５はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；Ｘ６はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；Ｘ７はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒのうちのアミノ酸残基である；Ｘ８はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；Ｘ９はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；Ｘ１０はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎのうちのアミノ酸残基である；Ｘ１１はＳｅｒ、Ｔｈｒのうちのアミノ酸残基である；Ｘ１２はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅのうちのアミノ酸残基である；Ｘ１３はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎのうちのアミノ酸残基である；Ｘ１４はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎのうちのアミノ酸残基である、医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗血管新生ペプチドまたはその抗血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質を含む、ペプチドが長さ１１ないし４０アミノ酸でありおよび抗血管新生活性を有し、前記ペプチドがアミノ酸配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４を含み、
Ｘ１はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；
Ｘ２はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ３はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ４はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ５はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；
Ｘ６はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ７はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ８はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；
Ｘ９はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；
Ｘ１０はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１１はＳｅｒ、Ｔｈｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１２はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１３はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１４はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎのうちのアミノ酸残基である、
医薬組成物。
【請求項２】
Ｘ１はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基、好ましくはＰｈｅ、Ｌｅｕである；
Ｘ２はＬｅｕのアミノ酸残基である；
Ｘ３はＡｒｇ、Ｓｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ４はＩｌｅ、Ｌｅｕのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ５はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基、好ましくはＩｌｅ、Ｓｅｒである；
Ｘ６はＬｅｕ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ７はＬｅｕ、Ｓｅｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ８はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基、好ましくはＩｌｅ、Ｌｅｕである；
Ｘ９はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基、好ましくはＬｅｕ、Ｉｌｅである；
Ｘ１０はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１１はＳｅｒのアミノ酸残基である；
Ｘ１２はＴｒｐのアミノ酸残基である
Ｘ１３はＬｅｕ、Ａｓｎのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１４はＧｌｕのアミノ酸残基である、
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｘ１はＬｅｕ、Ｐｈｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ２はＬｅｕのアミノ酸残基である；
Ｘ３はＡｒｇ、Ｓｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ４はＩｌｅ、Ｌｅｕのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ５はＳｅｒ、Ｉｌｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ６はＬｅｕ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ７はＬｅｕ、Ｓｅｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ８はＬｅｕ、Ｉｌｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ９はＩｌｅ、Ｌｅｕのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１０はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１１はＳｅｒのアミノ酸残基である；
Ｘ１２はＴｒｐのアミノ酸残基である
Ｘ１３はＬｅｕ、Ａｓｎのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１４はＧｌｕのアミノ酸残基である、
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ペプチドのアミノ酸配列Ｘ１〜Ｘ１４が下記の配列のうちの一つに対して少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも８５％および非常に好ましくは少なくとも９２％同一性を有する、請求項１から３のいずれか一つに記載の医薬組成物：
ａ）Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号１）；
ｂ）Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号２）；
ｃ）Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号３）；置換されたアミノ酸残基は相同なアミノ酸残基によって置換されている。
【請求項５】
ペプチドのアミノ酸配列Ｘ１〜Ｘ１４が傾斜ペプチドを表す、請求項１から４のうちいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項６】
傾斜ペプチドの計算平均疎水性が０．１より高く、および傾斜ペプチドが、ペプチドの三次元構造がアルファ−へリックスとして配置されるならばペプチドの計算疎水性アイソポテンシャルが非対称でありおよび計算最小エネルギー立体配座が疎水性／親水性界面方向でありおよび、へリックス軸と、疎水性相と親水性相との間の界面平面との間の計算角度が３０°ないし７０°であるという特徴によって定義される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
傾斜ペプチドの計算平均疎水性が０．２より高く、好ましくは０．３より高く、より好ましくは０．５より高く、より好ましくは０．８より高くおよび非常に好ましくは０．９より高い、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
傾斜ペプチドのへリックス軸と、疎水性相と親水性相との間の界面平面との間の計算角度が３５°ないし６５°、好ましくは４０°ないし６０°、および非常に好ましくは４０°ないし５０°である、請求項５から７のうちいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項９】
下記の物質のうち一つ以上を含む医薬組成物：
ａ）配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号１）（ｈＧＨ、ｈＧＨ−ｖ）を有するペプチド；
ｂ）配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号２）（ｈＰＬ）を有するペプチド；
ｃ）配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号３）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｄ）配列 Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ （配列番号８）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｅ）ａ）からｄ）のペプチドに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％および非常に好ましくは少なくとも９０％同一性を有し、置換アミノ酸残基が好ましくは相同なアミノ酸残基で置換されているペプチド；
ｆ）ａ）からｅ）のペプチド配列のうちいずれか一つを含む組み換えタンパク質；
ｇ）ａ）からｅ）のうちいずれか一つの抗血管新生ペプチドをコードするかまたはｆ）の組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号３および配列番号８の配列をそれぞれ有する二種類のペプチド；または
前記ペプチドに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％および非常に好ましくは少なくとも９０％同一性を有し、置換アミノ酸残基が好ましくは相同なアミノ酸残基によって置換されているペプチド；または
前記ペプチド配列を別個にまたは組み合わせて含む組み換えタンパク質；または
前記抗血管新生ペプチドをコードするかまたは前記組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む医薬組成物。
【請求項１１】
ペプチドが傾斜ペプチドに相当する、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
アミノ酸配列Ｘ１〜Ｘ１４、ペプチドまたは組み換えタンパク質がそれぞれ、三量体構造を形成する、請求項１から１１のうちいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ａ）配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号３）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｂ）配列 Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ （配列番号８）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｃ）ａ）またはｂ）のペプチドに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％および非常に好ましくは少なくとも９０％同一性を有し、置換アミノ酸残基が好ましくは相同なアミノ酸残基によって置換されているペプチド；
ｄ）ａ）からｃ）のペプチド配列を含む組み換えタンパク質；
ｅ）ａ）からｃ）の抗血管新生ペプチドをコードするかまたはｄ）の組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド
：の群から選択されるペプチド。
【請求項１４】
配列番号３および配列番号８の配列をそれぞれ有する二種類のペプチド、または
前記ペプチドに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％および非常に好ましくは少なくとも９０％同一性を有し、置換アミノ酸残基が好ましくは相同なアミノ酸残基によって置換されているペプチド；または
前記ペプチド配列を別個にまたは組み合わせて含む組み換えタンパク質；または
前記抗血管新生ペプチドをコードするかまたは前記組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む組成物。
【請求項１５】
ペプチドまたは組み換えタンパク質がそれぞれ、三量体構造を形成する、請求項１３に記載のペプチドまたは請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１３から１５に記載のペプチドまたは組み換えタンパク質またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項１７】
血管新生関連疾患の予防および／または治療処置のための薬剤の製造のための、請求項１から１６のうちいずれか一つで定義される抗血管新生ペプチドの、または請求項１から１６のうちいずれか一つで定義される抗血管新生ペプチドをコードするかまたは抗血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項１８】
血管新生関連疾患の予防および／または治療処置のための薬剤の製造のための、下記の物質のうち一つ以上の使用：
ａ）配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号１）（ｈＧＨ、ｈＧＨ−ｖ）を有するペプチド；
ｂ）配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号２）（ｈＰＬ）を有するペプチド；
ｃ）配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号３）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｄ）配列 Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ （配列番号８）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｅ）配列 Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ （配列番号５）（プリオン）を有するペプチド；
ｆ）配列 Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ （配列番号６）（β−アミロイド）を有するペプチド；
ｇ）配列 Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｌａ （配列番号７）（ＳＩＶ融合タンパク質）を有するペプチド；
ｈ）下記の配列のうちいずれか一つを有するペプチド：
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ （配列番号２４）（β−アミロイド）、
Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ （配列番号２５）（ＨＩＶ）、
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ （配列番号２６）（Ｐｒｐ１０６−１２６（プリオン））、
Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ （配列番号２７）（麻疹ウイルス）、
Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ （配列番号２８）（ＮＤＶ）、
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ （配列番号２９）（ラウス肉腫ウイルス）、
Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ （配列番号３０）（センダイウイルス）、
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ （配列番号３１）（ＢＬＶ）、
Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇｌｙ （配列番号３２）（ＭＬＶ）、
Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ （配列番号３３）（エボラ）、
Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｌａ （配列番号３４）（酵母インベルターゼＳＰ）、
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ （配列番号３５）（アポＢ１００ＳＰ）、
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ （配列番号３６）（１ｂｃｔ １７７）、
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ （配列番号３７）（１ｂｃｔ １９５）、
Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ （配列番号３８）（アポＡ−ＩＩ）、
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｔｈｒ （配列番号３９）（アポＣ−ＩＩＩ）、
Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ （配列番号４０）（ＣＥＴＰ）、
Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｅｕ （配列番号４１）（ＬＣＡＴ）、
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｐｈｅ （配列番号４２）（ＨＬＰ）、
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ （配列番号４３）（ＬＰＬ）、
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ （配列番号４４）（インフルエンザＨＡ−２）、
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ （配列番号４５）（Ｂ型肝炎、Ｓタンパク質）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ （配列番号 ４６） （ヒト・アポＡ−ＩＩ サカシンＰ）、
Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ （配列番号４７）（メルトリン）、
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ （配列番号 ４） （フェルチリン(Ｆｅｒｔｉｌｉｎｅ)）、
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｔｈｒ （配列番号１３）（アポＣ−ＩＩＩ）、
ｉ）ａ）からｈ）のペプチドに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％および非常に好ましくは少なくとも９０％同一性を有し、置換アミノ酸残基が好ましくは相同なアミノ酸残基によって置換されているペプチド；
ｊ）ａ）からｉ）のペプチド配列のうちいずれか一つを含む組み換えタンパク質；
ｋ）ａ）からｉ）のうちいずれか一つの抗血管新生ペプチドをコードするかまたはｊ）の組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号３および配列番号８の配列をそれぞれ有する二種類のペプチド、または
前記ペプチドに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％および非常に好ましくは少なくとも９０％同一性を有し、置換アミノ酸残基が好ましくは相同なアミノ酸残基によって置換されているペプチド；または
前記ペプチド配列を別個にまたは組み合わせて含む組み換えタンパク質；または
前記抗血管新生ペプチドをコードするかまたはまたは前記組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
を含む組成物の、血管新生関連疾患の予防および／または治療処置のための薬剤の製造のための使用。
【請求項２０】
ペプチドまたは組み換えタンパク質がそれぞれ、三量体構造を形成する、請求項１７から１９のうちいずれか一つに記載の使用。
【請求項２１】
請求項１から１６のうちいずれか一つに記載のペプチドまたは組み換えタンパク質またはポリヌクレオチドの治療上有効な用量が患者に投与される、血管新生関連疾患の予防および／または治療処置のための方法。
【請求項２２】
ａ）抗血管新生性を有しおよび１１〜２０アミノ酸の長さを有する傾斜ペプチド；
ｂ）ａ）のペプチドを含む組み換えタンパク質；
ｃ）ａ）のペプチドまたはｂ）の組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド
：の群から選択される物質を含む医薬組成物。
【請求項２３】
ペプチドの計算平均疎水性が０．１より高く、および傾斜ペプチドが、ペプチドの三次元構造がアルファ−へリックスとして配置されるならばペプチドの計算疎水性アイソポテンシャルが非対称でありおよび計算最小エネルギー立体配座が疎水性／親水性界面方向でありおよび、へリックス軸と、疎水性相と親水性相との間の界面平面との間の計算角度が３０°ないし７０°であるという特徴によって定義される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ペプチドの計算平均疎水性が０．２より高く、好ましくは０．３より高く、より好ましくは０．５より高く、より好ましくは０．８より高くおよび非常に好ましくは０．９より高い、請求項２２または２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ペプチドのへリックス軸と、疎水性相および親水性相の界面平面との間の計算角度が３５°ないし６５°、好ましくは４０°ないし６０°、および非常に好ましくは４０°ないし５０°である、請求項２２から２４のうちいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項２６】
単離された抗血管新生ペプチド、または抗血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質を含み、前記ペプチドが傾斜ペプチドでありおよびプロラクチン（ＰＲＬ）−成長ホルモンファミリー（ＧＨ）のタンパク質に由来する、医薬組成物。
【請求項２７】
単離された抗血管新生ペプチド、または抗血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質を含み、抗血管新生ペプチドがプロラクチン（ＰＲＬ）−成長ホルモンファミリー（ＧＨ）のタンパク質に由来しおよび下記の配列のうちいずれか一つを有する、医薬組成物：
ａ）配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号１）（ｈＧＨ、ｈＧＨ−ｖ）を有するペプチド；
ｂ）配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号２）（ｈＰＬ）を有するペプチド；
ｃ）配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号３）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｄ）配列 Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ （配列番号８）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド。
【請求項２８】
単離された抗血管新生ペプチド、または抗血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質を含み、抗血管新生ペプチドがプロラクチン（ＰＲＬ）タンパク質に由来し、抗血管新生ペプチドまたはその配列がそれぞれ、下記の配列のうちいずれか一つを有する、医薬組成物：
ａ）配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号 ３） （ｈＰＲＬ） を有するペプチド；
ｂ）配列 Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ （配列番号 ８） （ｈＰＲＬ）を有するペプチド。
【請求項２９】
二種類の単離された抗血管新生ペプチド、または前記抗血管新生ペプチドを別々にまたは組み合わせて含む組み換えタンパク質を含み、抗血管新生ペプチドがプロラクチン（ＰＲＬ）タンパク質に由来しおよび下記の配列を有する、医薬組成物：
ａ）配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号３）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｂ）配列 Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ （配列番号８）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド。
【請求項３０】
抗血管新生ペプチドをコードするかまたは請求項２２から２９のうちいずれか一つの抗血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血管新生ペプチド、特に抗血管新生性を有する傾斜ペプチド、および抗血管新生性を有するプロラクチン／成長ホルモンファミリーに由来するペプチドに関する。
【０００２】
血管新生は、既存のものからの毛細血管形成の過程であり、正常な増殖および組織修復に必須である。しかし、過剰な血管新生は関節リウマチ、糖尿病性網膜症、またはがん（血管新生関連疾患）といった多数の疾患に関与していることが示されており、および血管新生の阻害剤の使用はこれらの場合での有望な治療処置と思われる（いわゆる抗血管新生療法）。先端技術では、プロラクチンの１６ｋＤａ Ｎ末端断片（１６Ｋ ＰＲＬ）が、腫瘍増殖に必須である新たに形成された血管の破壊を目指す抗腫瘍療法のための強力な薬剤であることが示された。ヒトプロラクチン／成長ホルモンファミリーの他のメンバーのＮ末端１６Ｋ断片、すなわち１６Ｋ成長ホルモン（１６Ｋ ｈＧＨ）、１６Ｋ成長ホルモン変異体（１６Ｋ ｈＧＨ−Ｖ）および１６Ｋ胎盤ラクトゲン（１６Ｋ ｈＰＬ）もまた血管新生を阻害する一方、対照的に、完全長ホルモンは毛細血管形成を刺激する（ストルマン（Ｓｔｒｕｍａｎ），Ｉ．，他 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ（ストルマン（Ｓｔｒｕｍａｎ），Ｉ．，他 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９６：１２４６−５１ （１９９９））。
【背景技術】
【０００３】
血管新生は、増殖および組織修復といった正常な過程の必須な要素である（コンウェイ（Ｃｏｎｗａｙ），Ｅ．Ｍ．，他 Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ４９：５０７−２１．（２００１））（フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ），Ｊ．Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２８：５３６−４２．（２００１））。血管新生はまた、一般に血管新生疾患と呼ばれる多数の病理状態の発生に関与する。血管新生疾患に繋がる病理状態の例は、特に、関節炎、糖尿病性網膜症、乾癬、肥満および がん である（カーメリエト（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ），Ｐ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ９：６５３−６０ （２００３））。後者の場合には、新しい毛細血管の形成は、原発腫瘍の増殖にだけでなく、転移の拡散にも必須である（フィドラー（Ｆｉｄｌｅｒ），Ｉ．Ｊ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３：４５３−８ （２００３））。
【０００４】
近年、血管新生阻害剤の探索が活発に行われている。現在、トロンボスポンジン、血小板第４因子、アンジオスタチン、エンドスタチン、フマギリンおよびサリドマイドを含むいくつかの血管新生阻害剤が研究されている。これらのうちいくつか、たとえばフマギリンおよびサリドマイドは、臨床試験中である。
【０００５】
また近年、新規の抗血管新生因子の、プロラクチンの１６ｋＤａ Ｎ末端断片（ヒト１６Ｋプロラクチンまたは１６ＫｈＰＲＬ）が同定されている。１６Ｋ ｈＰＲＬはｉｎ ｖｉｔｒｏ および ｉｎ ｖｉｖｏの両方で抗血管新生性を示すことが明らかにされた（フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ），Ｎ．，他 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２９：８９６−９００ （１９９１）、クラップ（Ｃｌａｐｐ），Ｃ．，他 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：１２９２−９．（１９９３）、リー（Ｌｅｅ），Ｈ．，他 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９：３６９６−７０３ （１９９８））。１６Ｋ ｈＰＲＬは内皮細胞増殖を阻害し、およびそれらのアポトーシスを誘導する（ダンジェロ（Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ），Ｇ．，他 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２：６３７４−８ （１９９５）、ダンジェロ（Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ），Ｇ．，他 Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １３：６９２−７０４ （１９９９）、マーティニ（Ｍａｒｔｉｎｉ），Ｊ．Ｆ．，他 Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １４：１５３６−４９．（２０００））。実際、ＢＥＣ（脳内皮細胞）の組み換え１６Ｋプロラクチンでの処理は、ＢＥＣにおけるＤＮＡ断片化を、時間および用量に依存的な形で増加させる（Ｍａｒｔｉｎｉ，Ｊ．Ｆ．，他 Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １４：１５３６−４９．（２０００））。１６Ｋプロラクチンに誘導されるアポトーシスは、カスパーゼ１および３の迅速な活性化、およびＢｃｌ−Ｘのアポトーシス促進形への変換の増加と相関する。さらに、ＮＦ−(Ｂシグナル伝達経路が１６ＫｈＰＲＬのＢＥＣにおけるアポトーシス作用の媒介に関与することが割り出された。用量依存的な形で、１６ＫｈＰＲＬでの処理はＩｋＢ−ａ分解を誘導し、ＮＦ−ｋＢの核への移行およびレポーター遺伝子活性化を可能にする。分解不能なＩ(Ｂ−(変異体の過剰発現またはＮＦ−(Ｂ阻害剤での処理によるＮＦ−(Ｂ活性化の阻害は、１６ＫｈＰＲＬ誘導性アポトーシスを阻害する。１６ＫｈＰＲＬでの処理は、イニシエーターのカスパーゼ８および９およびエフェクターのカスパーゼ３を活性化し、そのすべてが内皮細胞アポトーシスを誘導するのに必須である。カスパーゼカスケードの１６ＫｈＰＲＬによる活性化はまた、ＮＦ−(Ｂ依存性である（タブリュン（Ｔａｂｒｕｙｎ）、Ｓ．Ｐ．、他Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １７：１８１５−２３（２００３））。１６Ｋ ｈＰＲＬは、Ｇ１−Ｓ および Ｇ２−Ｍ 相の両方で細胞周期停止を誘導することによって増殖を阻害することが示された（タブリュン（Ｔａｂｒｕｙｎ）他，Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１９，１９３２−１９４２ （２００５））。
【０００６】
近年の文献では、１６ＫｈＰＲＬによる血管新生の阻害は、皮下に移植されたヒト結腸腫瘍の増殖をマウスにおいて防げることが開示された（ベンツィエン（Ｂｅｎｔｚｉｅｎ），Ｆ．，他 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：７３５６−６２．（２００１））。より近年、１６Ｋ ｈＰＲＬの発現をｉｎ ｓｉｔｕで可能にするアデノウイルスベクターが作製された。さらに、１６Ｋ ｈＰＲＬが血管新生を網膜症のマウスモデルにおいて防ぐ能力が評価された（レイスラー（Ｒａｉｓｌｅｒ），Ｂ．Ｊ．，他 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９：８９０９−１４．（２００２））。結果は、アデノウイルス媒介遺伝子導入によってｉｎ ｓｉｔｕで産生された１６Ｋ ｈＰＲＬがマウス網膜において血管増殖を阻害することを示す（パン（Ｐａｎ）他，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４５（７）： ２４１３−２４１９ （２００４）。総合すると、これらの結果は、１６Ｋ ｈＰＲＬは腫瘍増殖に必須の新たに形成された血管の破壊を通じて作用を行う抗腫瘍療法のための薬剤として使用されうることを示唆した。
【０００７】
ヒトプロラクチン／成長ホルモンファミリー（ＰＲＬ／ＧＨファミリー）の他のメンバーのＮ末端１６Ｋ断片、すなわち１６Ｋ成長ホルモン（１６ＫｈＧＨ）、１６Ｋ成長ホルモン変異体（１６ＫｈＧＨ−Ｖ）および１６Ｋ胎盤ラクトゲン（１６ＫｈＰＬ）もまた血管新生を阻害する一方、対照的に、完全長ホルモンは毛細血管形成を刺激することが示された（ストルマン（Ｓｔｒｕｍａｎ），Ｉ．，他 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９６：１２４６−５１ （１９９９））。したがって、１６Ｋ断片の中で，抗血管新生活性を担う領域を特定すること、およびこれらの領域が完全長タンパク質の中に含まれている際には何故不活性であるのかを理解することが重要と思われた。
【０００８】
最先端のポリペプチドの不利益は、より長いポリペプチドは製造が困難でありおよび精製が困難である点であった。さらなる問題は、不安定性および医薬組成物への導入に関する問題によるものであった。
【０００９】
本発明の目的は、製造、精製および取り扱いがより容易である、抗血管新生活性を有する有効なペプチドを同定および提供することであった。さらなる目的は、抗血管新生活性を有するそのようなペプチドを含む医薬組成物を提供することであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、単離された抗血管新生ペプチドまたはその抗血管新生ペプチド組み換えタン  パク質を含む、ペプチドが長さ１１ないし４０アミノ酸でありおよび抗血管新生活性を有し、  前記ペプチドがアミノ酸配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３  −Ｘ１４
Ｘ１はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；
Ｘ２はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ３はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ４はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ５はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；
Ｘ６はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ７はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ８はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；
Ｘ９はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；
Ｘ１０はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎのうちのアミノ酸残基で  ある；
Ｘ１１はＳｅｒ、Ｔｈｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１２はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１３はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１４はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎのうちのアミノ酸残基である、
（配列番号２１）
を含む医薬組成物によって解決された。
【００１１】
好ましい一実施形態では、抗血管新生ペプチドは、好ましくは長さ１１ないし２０アミノ酸であり、１１ないし１６がより好ましく、および１１ないし１４が非常に好ましい。抗血管新生ペプチドは、１１、１２または１３アミノ酸残基の短さでありうる。驚くべきことに、発明者らは、そのような低分子ペプチドがなお強力な抗血管新生活性を有することを見出している。これらのペプチドの利点は、それらが抗血管新生活性を有する有効な、また製造、精製および取り扱いがより容易なペプチドである点である。本発明はまた、前記抗血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質を提供する。この場合、組み換えタンパク質の抗血管新生ペプチドの範囲でない部分は、抗血管新生ペプチドのキャリヤーの役割を果たす。抗血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質の例としては、抗血管新生ペプチドが遺伝子組み換え法によってい融合されたマルトース結合タンパク質ＭＢＰを挙げることができる。
【００１２】
本発明はしたがって、単離された抗血管新生ペプチドまたはその抗血管新生ペプチド組み換えタンパク質を含む、ペプチドが長さ１１ないし４０アミノ酸でありおよび抗血管新生活性を有し、ペプチドが下記の アミノ酸 配列の１１ないし１４の連続する アミノ酸残基を含む：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４
Ｘ１はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；
Ｘ２はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ３はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ４はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ５はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；
Ｘ６はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ７はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ８はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；
Ｘ９はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基である；
Ｘ１０はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎのうちのアミノ酸残基で  ある；
Ｘ１１はＳｅｒ、Ｔｈｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１２はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１３はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１４はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎのうちのアミノ酸残基である （配列番号 ２１）  
医薬組成物を提供する。
【００１３】
このことは、抗血管新生ペプチドが１４アミノ酸残基よりも短い場合は、ペプチドは、Ｘ１−Ｘ１１、Ｘ１−Ｘ１２、Ｘ１−Ｘ１３、Ｘ２−Ｘ１２、Ｘ２−Ｘ１３、Ｘ２−Ｘ１４、Ｘ３−Ｘ１３、Ｘ３−Ｘ１４およびＸ４−Ｘ１４由来の上記の範囲を対象とすることを意味する。
【００１４】
別の好ましい実施形態では、ペプチドは下記の通り定義される：
Ｘ１はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基、好ましくはＰｈｅ、Ｌｅｕである；
Ｘ２はＬｅｕのアミノ酸残基である；
Ｘ３はＡｒｇ、Ｓｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ４はＩｌｅ、Ｌｅｕのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ５はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基、好ましくはＩｌｅ、Ｓｅｒである；
Ｘ６はＬｅｕ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ７はＬｅｕ、Ｓｅｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ８はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基、好ましくはＩｌｅ、Ｌｅｕである；
Ｘ９はへリックスの形成に適合する任意のアミノ酸残基、好ましくはＬｅｕ、Ｉｌｅである；
Ｘ１０はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１１はＳｅｒのアミノ酸残基である；
Ｘ１２はＴｒｐのアミノ酸残基である
Ｘ１３はＬｅｕ、Ａｓｎのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１４はＧｌｕのアミノ酸残基である
（配列番号２２）。
【００１５】
さらに別の好ましい実施形態では、ペプチドは下記の通り定義される：
Ｘ１はＬｅｕ、Ｐｈｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ２はＬｅｕのアミノ酸残基である；
Ｘ３はＡｒｇ、Ｓｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ４はＩｌｅ、Ｌｅｕのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ５はＳｅｒ、Ｉｌｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ６はＬｅｕ、Ｖａｌのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ７はＬｅｕ、Ｓｅｒのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ８はＬｅｕ、Ｉｌｅのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ９はＩｌｅ、Ｌｅｕのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１０はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１１はＳｅｒのアミノ酸残基である；
Ｘ１２はＴｒｐのアミノ酸残基である
Ｘ１３はＬｅｕ、Ａｓｎのうちのアミノ酸残基である；
Ｘ１４はＧｌｕのアミノ酸残基である
（配列番号２３）。
【００１６】
これらの配列は、プロラクチン／成長ホルモンファミリーの傾斜ペプチドの配列およびその相同誘導体を含む。好ましくは、ペプチドのアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ１４は、少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも８５％および非常に好ましくは少なくとも９２％同一性を、下記の配列のうち一つに対して有し：
ａ）Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号１）；
ｂ）Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号２）；
ｃ）Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号３）；置換されたアミノ酸残基は相同なアミノ酸残基によって置換される。これらの配列は、プロラクチン／成長ホルモンファミリーの傾斜ペプチドの配列およびその相同誘導体を含む。相同なアミノ酸残基とは、疎水性、極性、電荷、立体構造特性に関して類似の性質を有するアミノ酸残基である。好ましくはペプチドは傾斜ペプチドである。「相同性」の語は下記でさらに説明および定義される。
【００１７】
別の好ましい一実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ１４は、傾斜ペプチドを表す。好ましくは、傾斜ペプチドの計算平均疎水性が０．１より高く、および傾斜ペプチドが、ペプチドの三次元構造がアルファ−へリックスとして配置されるならばペプチドの計算疎水性アイソポテンシャルが非対称でありおよび計算最小エネルギー立体配座が疎水性／親水性界面方向でありおよび、へリックス軸と、疎水性相と親水性相との間の界面平面との間の計算角度が３０°ないし７０°であるという特徴によって定義される。好ましい一実施形態では、傾斜ペプチドの計算平均疎水性が０．２より高く、好ましくは０．３より高く、より好ましくは０．５より高く、より好ましくは０．８より高く、および非常に好ましくは０．９より高い。
【００１８】
さらに、傾斜ペプチドのへリックス軸と、疎水性相と親水性相との間の界面平面との間の計算角度が３５°ないし６５°、好ましくは４０°ないし６０°、および非常に好ましくは４０°ないし５０°であることが好ましい。より近いペプチドのヘリックス軸と、疎水性相と親水性相との間の界面平面との間の角度が４５°に向けてより近づく傾向がある、ペプチドの抗血管新生活性がより高くなる。
【００１９】
目的はまた、上記に定義される血管新生ペプチドを含むか、または抗血管新生ペプチドをコードするかまたは該血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物によっても解決される。
【００２０】
本発明の目的はまた、下記の物質のうち一つ以上を含む医薬組成物によっても解決される：
ａ）配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号１）（ｈＧＨ，ｈＧＨ−ｖ） を有するペプチド；
ｂ）配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号２）（ｈＰＬ）を有するペプチド；
ｃ）配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号３）（ｈＰＲＬ） を有するペプチド；
ｄ）配列 Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ （配列番号８）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｅ）ａ）からｄ）のペプチドに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％および非常に好ましくは少なくとも９０％同一性を有し、置換アミノ酸残基が好ましくは相同なアミノ酸残基で置換されているペプチド；
ｆ）ａ）からｅ）のペプチド配列のうちいずれか一つを含む組み換えタンパク質；
ｇ）ａ）からｅ）のうちいずれか一つの抗血管新生ペプチドをコードするかまたはｆ）の組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
ａ）からｄ）において配列同一性番号の後の略語はペプチドの起源を示す。
【００２１】
目的はまた、上記に定義されるペプチドまたは組み換えタンパク質またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物によっても解決される。
【００２２】
さらに本発明は、配列番号３および配列番号８の配列をそれぞれ有する二種類のペプチド；または
前記ペプチドに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％および非常に好ましくは少なくとも９０％同一性を有し、置換アミノ酸残基が好ましくは相同なアミノ酸残基によって置換されているペプチド；または
前記ペプチド配列を別個にまたは組み合わせて含む組み換えタンパク質；または
前記抗血管新生ペプチドをコードするかまたは前記組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む医薬組成物を提供する。驚くべきことに、配列番号３および配列番号８の配列をそれぞれ有するペプチドは、組み合わせると、ペプチドが単独で用いられた場合よりも強い抗血管新生作用を有したことが示された。好ましくは、ペプチドは、前記ペプチド配列を含む組み換えタンパク質であるキャリヤータンパク質と融合される。二つの選択肢が可能である：一種類のペプチドを有する組み換えタンパク質が提供するか、または両方の抗血管新生ペプチドを有する組み換えタンパク質がある。後者の場合では、抗血管新生ペプチドは直接隣接して融合されているかまたはリンカー配列によって分離されている。
【００２３】
好ましい実施形態では、上記のアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ１４、またはペプチド（抗血管新生ペプチド）またはペプチドを含む組み換えタンパク質は、それぞれ三量体構造を形成する。ペプチドまたはペプチドを含む組み換えタンパク質の三量体組織は、それぞれ抗血管新生活性を維持するのに重要である。
【００２４】
本発明の目的はまた、
ａ）配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号３）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｂ）配列 Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ （配列番号８）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｃ）ａ）またはｂ）のペプチドに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％、および非常に好ましくは少なくとも９０％同一性を有し、置換アミノ酸残基が好ましくは相同なアミノ酸残基によって置換されているペプチド；
ｄ）ａ）からｃ）のペプチド配列を含む組み換えタンパク質；
ｅ）ａ）からｃ）の抗血管新生ペプチドをコードするかまたはｄ）の組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド
：の群から選択されるペプチドによっても解決される。
【００２５】
ｈＰＲＬ配列では、二種類の傾斜ペプチドが同定されてきた（配列番号３および８）。実施例８．３および８．４に示す通り、１６Ｋ ｈＰＲＬの第２の傾斜ペプチド領域も、１６Ｋ ｈＰＲＬの抗血管新生活性において役割を果たす。１６Ｋ ＰＲＬは、その二種類の傾斜ペプチド領域中で変異し、およびＭＢＰとの融合中に産生される。このタンパク質は、ＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔ ＰＯ １＋２と呼ばれる。カスパーゼ３の活性化を誘導するＭＢＰ−１６Ｋ ｈＰＲＬおよびＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔ ＰＯ ＋２の能力が、図１７のパネルＢに示される。ＡＢＡＥ細胞をＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔ ＰＯ １＋２で処理した場合、ＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬとの比較で、カスパーゼ３の活性化は無くなる。これらの結果は、両方の傾斜ペプチド領域が１６Ｋ ｈＰＲＬの抗血管新生活性に必要であることを示す。
【００２６】
本発明は、配列番号３および配列番号８の配列をそれぞれ有する二種類のペプチド、または前記ペプチドに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％および非常に好ましくは少なくとも９０％同一性を有し、置換アミノ酸残基が好ましくは相同なアミノ酸残基によって置換されているペプチド；または
前記ペプチド配列を別個にまたは組み合わせて含む組み換えタンパク質；または
前記抗血管新生ペプチドをコードするかまたは前記組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む組成物をさらに提供する。
【００２７】
さらに目的は、血管新生関連疾患の予防および／または治療処置のための薬剤の製造のための、上記のペプチドまたは組み換えタンパク質またはポリヌクレオチドの使用によって解決される。
【００２８】
目的は、血管新生関連疾患の予防および／または治療処置のための薬剤の製造のための、下記の物質のうち一つ以上の使用によって解決される：
ａ）配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号１）（ｈＧＨ、ｈＧＨ−ｖ）を有するペプチド；
ｂ）配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号２）（ｈＰＬ）を有するペプチド；
ｃ）配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号３）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｄ）配列 Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ （配列番号８）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｅ）配列 Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ （配列番号５）（プリオン）を有するペプチド；
ｆ）配列 Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ （配列番号６）（β−アミロイド）を有するペプチド；
ｇ）配列 Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｌａ （配列番号７）（ＳＩＶ融合タンパク質）を有するペプチド；
ｈ）下記の配列のうちいずれか一つを有するペプチド：
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ （配列番号２４）（β−アミロイド）、
Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ （配列番号２５）（ＨＩＶ）、
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ （配列番号２６）（Ｐｒｐ１０６−１２６（プリオン））、
Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ （配列番号２７）（麻疹ウイルス）、
Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ （配列番号２８）（ＮＤＶ）、
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ （配列番号２９）（ラウス肉腫ウイルス）、
Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ （配列番号３０）（センダイウイルス）、
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ （配列番号３１）（ＢＬＶ）、
Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇｌｙ （配列番号３２）（ＭＬＶ）、
Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ （配列番号３３）（エボラ）、
Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｌａ （配列番号３４）（酵母インベルターゼＳＰ）、
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ （配列番号３５）（アポＢ１００ＳＰ）、
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ （配列番号３６）（１ｂｃｔ １７７）、
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ （配列番号３７）（１ｂｃｔ １９５）、
Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ （配列番号３８）（アポＡ−ＩＩ）、
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｔｈｒ （配列番号３９）（アポＣ−ＩＩＩ）、
Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ （配列番号４０）（ＣＥＴＰ）、
Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｅｕ （配列番号４１）（ＬＣＡＴ）、
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｐｈｅ （配列番号４２）（ＨＬＰ）、
Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ （配列番号４３）（ＬＰＬ）、
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ （配列番号４４）（インフルエンザＨＡ−２）、
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ （配列番号４５）（Ｂ型肝炎、Ｓタンパク質）、
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ （配列番号 ４６） （ヒト・アポＡ−ＩＩ サカシンＰ）、
Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ （配列番号４７）（メルトリン）、
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ （配列番号 ４） （Ｆｅｒｔｉｌｉｎｅ）、
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｔｈｒ （配列番号１３）（アポＣ−ＩＩＩ）、
ｉ）ａ）からｈ）のペプチドに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％および非常に好ましくは少なくとも９０％同一性を有し、置換アミノ酸残基が好ましくは相同なアミノ酸残基によって置換されているペプチド；
ｊ）ａ）からｉ）のペプチド配列のうちいずれか一つを含む組み換えタンパク質；
ｋ）ａ）からｉ）のうちいずれか一つの抗血管新生ペプチドをコードするかまたはｊ）の組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
ａ）からｈ）での配列識別番号に続く略語は、ペプチドの起源を示す。ペプチドは、下記の従来技術に記載されてきた：配列番号５ないし７、２４、２５、２７ないし４３、リンス（Ｌｉｎｓ），Ｌ．他， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４４， ４３５−４４７ （２００１）； 配列番号１３、リンス（Ｌｉｎｓ），Ｌ．他， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｎｇ． １５， ５１３−５２０ （２００２）； 配列番号２６、デュピエルー（Ｄｕｐｉｅｒｅｕｘ），Ｉ．他， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ３３１， ８９４−９０１ （２００５）； 配列番号４、４４ないし４７、ブラッスール（Ｂｒａｓｓｅｕｒ）， Ｒ． Ｍｏｌ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ． １７， ３１−４０ （２０００）。「血管新生関連疾患」の語は、たとえば関節リウマチ、糖尿病性網膜症またはがんといった疾患のことをいう。
【００２９】
本発明は、配列番号３および配列番号８の配列をそれぞれ有する二種類のペプチド、または前記ペプチドに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％および非常に好ましくは少なくとも９０％同一性を有し、置換アミノ酸残基が好ましくは相同なアミノ酸残基によって置換されているペプチド；または
前記ペプチド配列を別個にまたは組み合わせて含む組み換えタンパク質；または
前記抗血管新生ペプチドをコードするかまたはまたは前記組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
を含む組成物を提供する。
【００３０】
目的はまた、上記に記載のペプチドまたは組み換えタンパク質またはポリヌクレオチドの治療上有効な用量が患者に投与される、血管新生関連疾患の予防および／または治療処置のための方法によっても解決される。
【００３１】
目的はまた、
ａ）抗血管新生性を有しおよび１１〜２０アミノ酸の長さを有する傾斜ペプチド；
ｂ）ａ）のペプチドを含む組み換えタンパク質；
ｃ）ａ）のペプチドまたはｂ）の組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド
：の群から選択される物質を含む医薬組成物によっても解決される。
【００３２】
好ましい一実施形態では、ペプチドの計算平均疎水性が０．１より高く、および傾斜ペプチドが、ペプチドの三次元構造がアルファ−へリックスとして配置されるならばペプチドの計算疎水性アイソポテンシャルが非対称でありおよび計算最小エネルギー立体配座が疎水性／親水性界面方向でありおよび、へリックス軸と、疎水性相と親水性相との間の界面平面との間の計算角度が３０°ないし７０°であるという特徴によって定義される。
【００３３】
別の好ましい一実施形態では、ペプチドの計算平均疎水性が０．２より高く、好ましくは０．３より高く、より好ましくは０．５より高く、さらにより好ましくは０．８より高くおよび非常に好ましくは０．９より高い。
【００３４】
さらに、ペプチドのへリックス軸と、疎水性相および親水性相の界面平面との間の計算角度が３５°ないし６５°、好ましくは４０°ないし６０°、および非常に好ましくは４０°ないし５０°であることが好ましい。
【００３５】
目的はまた、単離された抗血管新生ペプチドまたは抗血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質を含み、ペプチドが傾斜ペプチドでありおよびプロラクチン（ＰＲＬ）−成長ホルモンファミリー（ＧＨ）のタンパク質に由来する医薬組成物によっても解決される。傾斜ペプチドを定義する特性は、上記に定義されている。代替的な実施形態では、前記抗血管新生ペプチドをコードするかまたは前記抗血管新生を含む組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ペプチドが傾斜ペプチドでありおよびプロラクチン（ＰＲＬ）−成長ホルモンファミリー（ＧＨ）のタンパク質に由来する、医薬組成物が提供されている。
【００３６】
別の一実施形態では、単離された抗血管新生ペプチドまたは抗血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質を含み、抗血管新生ペプチドがプロラクチン（ＰＲＬ）−成長ホルモンファミリー（ＧＨ）のタンパク質に由来しおよび下記の配列のうちいずれか一つを有する、医薬組成物が提供されている：
ａ）配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号１）（ｈＧＨ、ｈＧＨ−ｖ）を有するペプチド；
ｂ）配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ （配列番号２）（ｈＰＬ）を有するペプチド；
ｃ）配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号３）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｄ）配列 Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ （配列番号８）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド。
【００３７】
特に好ましい実施形態では、単離された抗血管新生ペプチドまたは抗血管新生ペプチドを含む組み換えタンパク質を含み、抗血管新生ペプチドがプロラクチン（ＰＲＬ）タンパク質に由来し、抗血管新生ペプチドまたはその配列がそれぞれ、下記の配列のうちいずれか一つを有する、医薬組成物が提供されている：
ａ）配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号 ３） （ｈＰＲＬ） を有するペプチド；
ｂ）配列 Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ （配列番号 ８） （ｈＰＲＬ）を有するペプチド。
【００３８】
本発明は、二種類の単離された抗血管新生ペプチドまたは前記抗血管新生ペプチドを別々にまたは組み合わせて含む組み換えタンパク質を含み、抗血管新生ペプチドがプロラクチン（ＰＲＬ）タンパク質に由来しおよび下記の配列を有する、医薬組成物をさらに提供する：
ａ）配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ （配列番号３）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド；
ｂ）配列 Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ （配列番号８）（ｈＰＲＬ）を有するペプチド。
【００３９】
好ましい一実施形態では、上記のペプチドは医薬組成物中に含まれる。そのような医薬組成物は、血管新生関連疾患の予防および／または治療処置のために用いられる。さらに、血管新生関連疾患の予防および／または治療処置のための薬剤の製造のための前記ペプチドまたは前記組み換えタンパク質または前記ポリヌクレオチドの使用が提供されている。本発明はまた、ペプチドまたは組み換えタンパク質またはポリヌクレオチドの治療上有効な用量が患者に投与されることを特徴とする血管新生関連疾患の予防および／または治療処置方法も提供する。「血管新生関連疾患」の語は、たとえば関節リウマチ、糖尿病性網膜症またはがんといった疾患をいう。
【００４０】
本発明は、ＰＲＬ／ＧＨ１６Ｋ断片活性を模倣する抗血管新生ペプチドの探索によって達成された。ペプチドの設計は、新規生物活性分子の開発のための強力な手法にあたる。血管新生の分野では、多数の阻害剤が実際自身は抗血管新生性でない内因性分子の、意味不明の断片である；これは、特に、１６Ｋ ｈＰＲＬ、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断片）（オライリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ），Ｍ．Ｓ．，他 Ｃｅｌｌ ８８：２７７−８５．（１９９７））、アンジオスタチン（プラスミノーゲン断片）（ オライリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ），Ｍ．Ｓ．，他 Ｃｅｌｌ ７９：３１５−２８．（１９９４））について当てはまる。近年、血管新生を阻害するいくつかの合成ペプチドが同定されている。これらのペプチドは、任意に分子をより短いペプチドへ分解することによって（マエシマ（Ｍａｅｓｈｉｍａ），Ｙ．，他 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：３１９５９−６８ （２００１））、またはファージディスプレイスクリーニングによって（ヘチアン（Ｈｅｔｉａｎ），Ｌ．，他 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４３１３７−４２ （２００２））得られている。より低頻度に、より理論的な構造的手法が用いられた（セブチ（Ｓｅｂｔｉ），Ｓ．Ｍ．およびハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ），Ａ．Ｄ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：６５６６−７３ （２０００））。この手法を用いて、アンジネックス（Ａｎｇｉｎｅｘ）ペプチドが、いくつかの抗血管新生因子：ＰＦ４（血小板第４因子）、ＩＬ−８（インターロイキン−８）およびＢＰＩ（殺菌性透過性増大タンパク質）について実施された比較構造分析に基づいて設計された（グリフェン（Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎ），Ａ．Ｗ．，他 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３５４：２３３−４２ （２００１））。
【００４１】
治療上の観点から、ペプチドを用いる利点はむしろ低いと思われる：ペプチドは、より短い半減期およびより弱い活性を示す。しかし血管新生の分野では、いくつかのペプチドの活性は、親分子の活性と類似しおよびより高くさえもあることが示された（グリフェン（Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎ），Ａ．Ｗ．，他 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３５４：２３３−４２ （２００１））（セブチ（Ｓｅｂｔｉ），Ｓ．Ｍ．およびハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ），Ａ．Ｄ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：６５６６−７３ （２０００））。さらに、ペプチドは、より容易に作製されるという利点を示す。アンジオスタチン、エンドスタチンまたは１６Ｋ ｈＰＲＬ様の多数の抗血管新生タンパク質断片が通常作製するのが非常に困難なため、これは重要な問題である。
【００４２】
傾斜ペプチド（または斜め方向ペプチド[ＰＯ］）は、分子モデリングによって約１５年前に発見された（ブラッスール（Ｂｒａｓｓｅｕｒ），Ｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：１６１２０−７ （１９９１））。それらは疎水性残基の非対称な分布を有するらせん構造を取る短いタンパク質断片（１０から２０アミノ酸）である。それらの疎水性勾配を満足するために、これらのペプチドは、脂質／水界面のような疎水性／親水性界面と相互作用する際には斜め方向を取る（ブラッスール（Ｂｒａｓｓｅｕｒ），Ｒ．Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ １７：３１−４０ （２０００））。この斜角は、それらが入れられた系を不安定化するのを可能にし、およびそれらが属するタンパク質の機能に潜在的な役割を示す（リンス（Ｌｉｎｓ），Ｌ．，他 Ｐｒｏｔｅｉｎ ４４：４３５−４７ （２００１））。一方、この不安定化活性を通じて、これらのペプチドの大部分はリポソーム 融合をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導する（マーティン（Ｍａｒｔｉｎ），Ｉ．，他 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １７５：８７２−９ （１９９１）、ピロット（Ｐｉｌｌｏｔ），Ｔ．，他 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：２８７５７−６５ （１９９６）、ピロット（Ｐｉｌｌｏｔ），Ｔ．，他 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７４：３８１−９３ （１９９７）、リンス（Ｌｉｎｓ），Ｌ．，他 Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｎｇ １５：５１３−２０ （２００２））。疎水性分布およびしたがってペプチドの斜め方向を改変する変異は、ペプチドの融合誘発能力を改変する。これらのペプチドのうち一部については、融合誘発が完全長タンパク質について実施されている；結果は、ペプチドの活性およびタンパク質の機能における疎水性勾配の重要性を確認した（ホース（Ｈｏｒｔｈ），Ｍ．，他 Ｅｍｂｏ Ｊ １０：２７４７−５５ （１９９１）、タルムド（Ｔａｌｍｕｄ），Ｐ．，他Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９：３１７−２１ （１９９６）、 Ｌｉｎｓ，Ｌ．，他Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １５：５１３−２０ （２００２））。
【００４３】
傾斜ペプチドは、さまざまな機能を示す多数の異なるタンパク質に発見されている。たとえば、傾斜ペプチドは、ウイルス融合タンパク質に（ホース（Ｈｏｒｔｈ），Ｍ．，他 Ｅｍｂｏ Ｊ １０：２７４７−５５ （１９９１）、ボネチェ（Ｖｏｎｅｃｈｅ），Ｖ．，他 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１５１９３−７ （１９９２）、エパンド（Ｅｐａｎｄ），Ｒ．Ｆ．，他 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０５：１９３８−４３ （１９９４））、β−アミロイドペプチドに（ピロット（Ｐｉｌｌｏｔ），Ｔ．，他 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：２８７５７−６５ （１９９６））、シグナルペプチド、脂質輸送タンパク質に（ブラッスール（Ｂｒａｓｓｅｕｒ），Ｒ．，他 Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２２：１６７−７１ （１９９７））、およびプリオンタンパク質に（ピロット（Ｐｉｌｌｏｔ），Ｔ．，他 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７４：３８１−９３ （１９９７））に見出されている。近年、脂質二重層における傾斜ペプチドの存在が、中性子回折によって実証されている（ブラッドショー（Ｂｒａｄｓｈａｗ），Ｊ．Ｐ．，他 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：６５８１−５ （２０００））。
【００４４】
本発明は、抗血管新生療法に使用されうる、１６Ｋ断片に由来するペプチドを提供する。本発明者らは、傾斜ペプチドの特徴を有する領域が、ＰＲＬ／ＧＨ構造に埋め込まれていて、１６Ｋ断片では露出され、および１６Ｋ断片の活性を担うと仮定した。さらに、発明者らは、この領域は活性になるためには適当な方法で提示されなければならないと提案する。そのような方法は、１６Ｋ ｈＰＲＬによって達成されうる。この場合には、１６Ｋ ｈＰＲＬは完全長ｈＰＲＬとは異なりおよび三量体構成によって特徴付けられる新しい三次元構造を取る。この構造は、傾斜ペプチド領域の露出を可能にする。別の方法は、この領域をマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と融合することである。ＭＢＰは、傾斜ペプチド領域の適当な提示を可能にする。いかなる理論にも縛られず、１６Ｋ ｈＰＲＬタンパク質断片中の三量体構成はまた、本発明に記載のペプチドにも当てはまる。
【００４５】
分子モデリングを用いて、本発明者らはＰＲＬ／ＧＨ１６Ｋ断片内に、露出されやすくおよび「傾斜ペプチド」構造を取りやすい領域を同定した。傾斜ペプチド（または斜め方向ペプチド）は、脂質／水界面のような疎水性／親水性界面と相互作用する際に斜め方向を取る短いタンパク質断片（長さ１０から２０アミノ酸）である。本発明者らは、１６Ｋプロラクチンの傾斜領域を含む合成ペプチドを得て、およびこのペプチドが傾斜ペプチドの性質であるリポソーム融合をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導することを示した。発明者らは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と融合された１６Ｋ ｈＰＲＬの傾斜ペプチドすなわちＭＰＢ−ＰＯ−ＰＲＬをコードする発現ベクターを構築し、およびこの融合タンパク質が１６ＫｈＰＲＬの活性と同様の活性で内皮細胞のアポトーシスを誘導することを実証した。対照として、発明者らは未変化のＭＢＰタンパク質、および疎水性分布およびしたがってペプチドの傾き方向を改変すると予測される変異を含む１６ＫｈＰＲＬの変異傾斜ペプチドと融合されたＭＢＰすなわちＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬを作製した。両方の対照は内皮細胞のアポトーシスの誘導においては不活性であった。同様の結果が、ｈＧＨの傾斜ペプチドと融合されたＭＢＰについて得られた。
【００４６】
これらの結果に基づいて、発明者らは、傾斜ペプチドは、１６Ｋ断片内にあり抗血管新生活性を担いうる領域であることを提案する；この領域は完全長ホルモン中に隠れている（およびしたがって不活性である）が、１６Ｋ断片中では接近できると仮定される。同様の領域は、タンパク質断片でもある血管新生の他の阻害剤の活性を担うことがさらに提案される。発明者らは、ＭＢＰおよび機能が血管新生に関係ないタンパク質の公知の傾斜ペプチドβ−アミロイドＢタンパク質およびＳＩＶウイルスの融合タンパク質も作製した。これらのうち後者は血管新生も阻害するが、１６Ｋ断片といった抗血管新生分子由来の傾斜ペプチドから成る融合よりも高濃度で阻害する。
【００４７】
本発明は、血管新生を阻害でき、およびがん、網膜症および乾癬といった血管新生関連疾患の処置のために用いられうるペプチドを設計しおよび作製する方法を提供する。治療上の観点から本発明者らは、ここでは、さもなければ作製が困難な抗血管新生断片、すなわちエンドスタチンまたは１６Ｋ ｈＰＲＬの活性立体配座における作製のための方法を実証する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明は、血管新生を阻害する能力を有する新規の種類の分子を提供する。これらの分子をここでは「抗血管新生傾斜ペプチド」という。
【００４９】
「抗血管新生傾斜ペプチド」の語は好ましくは、ＰＲＬ／ＧＨファミリーの傾斜領域のアミノ酸で構成されるペプチドをいう。「ＰＲＬ／ＧＨファミリーの傾斜領域」の語は、ｈＰＲＬ中のＰｈｅ８０からＧｌｕ９３までの配列およびｈＧＨ、ｈＧＨ−ＶおよびｈＰＬ中のＬｅｕ７５からＧｌｕ８８までの配列をいう。より好ましくは「抗血管新生傾斜ペプチド」の語は図１に示されるペプチドをいう。
【００５０】
「抗血管新生ペプチド」の語は、血管新生を阻害できるペプチドをいう（フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ），Ｊ．Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ １３：１５９−６７ （２００３））。ペプチドは、内皮細胞アポトーシスを誘導および／または内皮細胞増殖を阻害および／または内皮細胞移動を阻害できるならば抗血管新生性と考えられる。
【００５１】
「傾斜ペプチド」の語は、傾斜していると考えられるペプチドをいう。傾斜ペプチドは、（ブラッスール（Ｂｒａｓｓｅｕｒ），Ｒ．Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ １７：３１−４０ （２０００））に記載された分子モデリングの手順を用いて検出されうる。要約すると、ペプチドは下記の性質を示すならば傾斜していると考えられる：ペプチドが長さ１０から２０アミノ酸である；平均疎水性（アイセンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）共通尺度によって計算される）が０．１より高い。配列に沿った疎水性はイエーニッヒ（Ｊaｈｎｉｇ）および疎水性クラスター分析法（ガボリアード（Ｇａｂｏｒｉａｕｄ），Ｃ．，他 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２２４：１４９−５５ （１９８７）、ヤーニッヒ（Ｊａｈｎｉｇ），Ｆ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５：９３−５ （１９９０））といった異なる方法を用いて計算される。ペプチドが(へリックスとして構築される場合、へリックス軸と界面平面との間の角度は３０°ないし７０°である。最小エネルギー立体配座は疎水性／親水性界面方向である。分子疎水ポテンシャルが計算されおよび疎水性アイソポテンシャルエンベロープは非対称である。傾斜ペプチドの特性は、リポソーム融合をｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において誘導することである。
【００５２】
「抗血管新生傾斜ペプチド」の語も、ＰＲＬ／ＧＨファミリーの傾斜領域のアミノ酸配列から成るより短いか、より長いか、または改変されたペプチドであるが、傾斜していると考えられる改変されたペプチドも含む。「抗血管新生傾斜ペプチド」という語はまた、傾斜特性が維持される限り、自然発生型および非自然発生型アミノ酸を含むがそれに限らない天然アミノ酸の他の分子との置換を含む、任意のアミノ酸の置換を伴うペプチド下記を含む。
【００５３】
本発明は、組み換え技術手法を用いた抗血管新生傾斜ペプチドの作製のための方法をを提供する。１ｎＭないし１μＭ、より好ましくは２０ないし２００ｎＭの範囲の濃度で用いられるペプチドは、内皮細胞のアポトーシスを誘発できる。この方法は、たとえば「マルトース結合タンパク質」（ＭＢＰ）といったキャリヤーポリペプチド／タンパク質と融合される傾斜ペプチドの作製に存在する。
【００５４】
血管新生、血管新生条件および血管新生疾患。血管新生を阻害できる本発明のペプチドおよびそれらの医薬組成物および調製物それぞれは、血管新生に関連するか結果として生じるかまたは由来する任意の疾患または状態を予防するかまたは処置するために有用である。そのような疾患は、特に、悪性腫瘍の形成、血管線維腫、動静脈奇形、関節リウマチといった関節炎、アテローム動脈硬化性斑、角膜移植片新血管形成、遅延した損傷治癒、糖尿病性網膜症といった増殖的網膜症、黄斑変性、血友病関節で発生する粒状化といった粒状化、肥大した瘢痕またはケロイド瘢痕といった損傷治癒における不適切な血管新生、血管新生緑内障、眼腫瘍、ブドウ膜炎、癒着不能骨折、Ｏｓｉｅｒ−Ｗｅｂｅｒ症候群、乾癬、化膿性緑内障、水晶体後繊維増殖症、硬皮症、固形がん、カポジ肉腫、トラコーマ、血管癒着、慢性静脈瘤性潰瘍、白血病、および小胞および黄体嚢胞および絨毛膜がん腫といった生殖障害を含む。
【００５５】
それらの抗血管新生活性を考えれば、本発明のペプチドは、腫瘍の血管新生の選択的阻害、腫瘍の大きさの減少および腫瘍の除去を含む、哺乳類の細胞増殖および血管新生に依存する組織を阻害する方法における使用にも適している。血管新生を受けた腫瘍の例は、血管線維腫、動静脈奇形、眼腫瘍、すべての固形がん、カポジ肉腫、トラコーマおよび絨毛膜がん腫を含むがそれらに限定されない
【００５６】
本発明のペプチドは、胎盤の脈管構造の発生を評価しおよび／または調節するのに用いてもよい。妊娠の二種類の障害、子癇前症および子宮内成長遅滞は、脈管発生の障害と関係しているため、胎盤血管新生の調節は重要な臨床的意味を有する。妊娠が深刻に危くなる前にこれら障害の発生を予測する臨床試験は存在しない。本発明のペプチドは、避妊薬としても用いられうる。
【００５７】
本発明のペプチドの製造
本発明のペプチドは、たとえば、合成でき、精製された完全長ホルモンから調製でき、または組み換え法および本分野で公知である方法を用いて製造されうる。それらの調製のための具体的方法がここで記載されるが、これらのペプチドの製造に適したすべての適当な方法が本発明の範囲内に入ることが意図されることが理解される。
【００５８】
一般的に、これらの方法は、本発明のペプチドのそれぞれをコードおよび発現する原核および真核ベクターの構築を可能にする、ＤＮＡおよびタンパク質配列決定、クローニング、発現および他の組み換え工学法を含む。
【００５９】
一形態では、本発明のペプチドは、ヒト下垂体または血漿からの未変化の成長ホルモンのおよび胎盤ラクトゲンおよび成長ホルモン変異体ｈＧＨ−Ｖの単離によって便利に得られる。単離された未変化のホルモンは、さまざまな程度にグリコシル化および切断されうる。
【００６０】
別の形態では、ペプチドはＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２：４３６ （１９９０）に記載の方法にしたがってまたは『分子生物学最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）他編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）ニューヨーク（１９８７）に記載の方法によって、ペプチド合成によって調製されうる。
【００６１】
本発明のペプチドは、目的のペプチドをコードする核酸の発現によって、または、核酸によってコードされたより長さの長いポリペプチド切断によって、作製されうる。コードされたポリペプチドの発現は、細菌、酵母、植物、昆虫または哺乳類宿主中において本分野で公知の方法によって行われうる。たとえば１６Ｋ ｈＰＲＬは、真核ＨＣＴ １１６細胞中で作製されてきた。１６Ｋ ｈＰＲＬ（停止１４０）のためのｃＤＮＡコーディングは、哺乳類の発現ベクターｐＲＣ ＣＭＶへとクローン化されてきた。構築物はＨＣＴ１１６ヒト大腸がん細胞へと転写され、および、１６Ｋ ｈＰＲＬ（停止１４０）を発現する安定して形質転換された細胞が得られた。調整された媒体またはこれらの細胞由来の精製された１６Ｋ ｈＰＲＬ（停止１４０）は、ｂＦＧＦ誘導ウシ内皮細胞増殖を阻害できた。
【００６２】
一実施形態では、本発明で目的のペプチドは、目的の抗血管新生傾斜ペプチド配列の第一のＤＮＡコドンの５位の上流へと挿入されたメチオニンのためのＤＮＡコドンより開始してＤＮＡ配列をベクターへとクローン化し、および目的の抗血管新生傾斜ペプチドの最後のアミノ酸に対応するＤＮＡコドンを本分野で公知である融合誘発方法によって停止コドンに改変することによって得られる。宿主細胞は、改変された核酸によってコードされたペプチドの発現を可能にする変換される。別の実施形態では、クローン化されたホルモンＤＮＡは、ホルモンポリペプチドの範囲内でタンパク質分解切断部位を作成するために設計される。次いでポリペプチドは、産生後に宿主中で切断され、目的のペプチドを生成する。融合誘発方法の例は、たとえば、『プロメガ手順および応用ガイド』（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ＧＷｄｅ）， プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）， マディソン， ＷＩ， ｐ． ９８ （１８９１）に記載の、または、『分子生物学最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）に記載の方法を含む。
【００６３】
ペプチドが原核ベクターを介して合成される場合、好ましくは、抗血管新生傾斜ペプチドをコードするＤＮＡ配列はシグナルペプチド配列を含まない。加えて、メチオニン（Ｍｅｔ）のためのＤＮＡコドンは、典型的には、コード配列の第一のＤＮＡコドンの５位の上流へと挿入される。
【００６４】
本発明のペプチドは、タンパク質および抗血管新生ペプチドとのハイブリッドまたは融合タンパク質として作製されうる。たとえば、１６Ｋ ｈＰＲＬの抗血管新生傾斜ペプチドは、マルトース結合タンパク質との融合として作製されてきた。マルトース結合タンパク質と１６Ｋ ｈＰＲＬの抗血管新生傾斜ペプチドとの間のフレーム内タンパク質融合が産生されるよう、１６Ｋ ｈＰＲＬの抗血管新生傾斜ペプチドをコードするＤＮＡ断片がｐＭＡＬ−Ｃ２ｘプラスミドへとクローン化されてきた。この融合タンパク質は、内皮細胞のアポトーシスを誘導できる。
【００６５】
ＤＮＡをベクターへとクローン化し、およびポリヌクレオチドを挿入、削除および改変するための、および部位を指示された融合誘発のための方法が、たとえば、上記のプロメガ手順および応用ガイド（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ）に記載されている。細胞またはバクテリアは、特に、熱ショック、電気泳動、リン酸カルシウム沈殿およびリポフェクションを含む公知の方法によって、目的のＤＮＡ配列を付加したベクター好ましくは発現ベクターで形質転換されうる。末端のペプチドまたは他のアナログまたは断片は、次いで、たとえば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル透過クロマトグラフィーによって抽出されおよび精製される。しかし、本発明のペプチドを誘導するのに必要な異なる手順、またはこれら手順の組合せ、または等価な手順を行う、本分野で公知の方法および技術が本発明の範囲内にあると考えられる。
【００６６】
下記の語は、二つ以上の核酸またはポリヌクレオチドの配列関係を記載するために用いる：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」および「相当な同一性」。「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる定義された配列である；参照配列は、たとえば、配列リスト中に与えられた完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列の部分としてのより大きな配列の部分であってもよく、またはあるいは完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含んでもよい。
【００６７】
比較ウィンドウを整列させる配列の最適な配列は、たとえば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２ （１９８１）のローカル相同性アルゴリズムによって、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびウンスク（Ｗｕｎｓｃｈ） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３ （１９７０）の相同性配置アルゴリズムによって、またはこれらアルゴリズムのコンピュータ化された実装（ウィスコンシンジェネティクスゼネチックスソフトウェアパッケージ第７版（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０）， ジェネティクスコンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， マディソン， ウィスコンシンのＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＡ）によって実施してもよい。
【００６８】
ポリペプチドに用いられる場合、「実質的な同一性」または「実質的な配列同一性」の語句は、二つのペプチド配列が、最適に整列された場合、たとえばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムによってデフォルトのギャップ重みを用いて、少なくとも８０パーセント配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセント配列同一性以上を共有することを意味する。「百分率アミノ酸同一性」または「百分率アミノ酸配列同一性」とは、最適に整列された場合、同一のアミノ酸のほぼ指定の百分率を有する、二つのポリペプチドのアミノ酸の比較をいう。たとえば、「９５％アミノ酸同一性」とは、最適に整列された場合、９５％アミノ酸同一性を有する、二つのポリペプチドのアミノ酸の比較をいう。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換で異なる。たとえば、電荷または極性といった類似の化学特性を有するアミノ酸の置換は、タンパク質の性質に作用する可能性は低い。例は、アスパラギンに対するグルタミン、またはアスパラギン酸に対するグルタミン酸を含む。
【００６９】
ペプチドまたはタンパク質をいう場合、「実質的に精製された」または「単離された」の語句は、本質的に他の細胞成分を含まない化学組成物を意味する。それは乾燥または水溶液でありうるが、好ましくは均一状態である。純度および均一性は典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーといった分析化学法を用いて測定される。調製物中で主な種であるタンパク質は実質的に精製されている。一般的に、実質的に精製または単離されたタンパク質は、調製物中に存在するすべての巨大分子の８０％より大を占める。好ましくは、タンパク質は存在するすべての巨大分子の９０％より大を占めるように精製される。より好ましくはタンパク質は９５％より大へ精製され、および非常に好ましくはタンパク質は本質的な均一性へ精製され、他の巨大分子種は従来の方法によって検出されない。
【００７０】
本発明の核酸
ここでまた提供されるのは、本発明のペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列（ポリヌクレオチド）を含む、単離された核酸である。本発明の核酸は、本発明のペプチドの発現のためのベクターをさらに含みうる。一部の実施形態では、ＤＮＡは抗血管新生傾斜ペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を含みうる。遺伝子コードの縮重のため、コードされたアミノ酸配列に変化を結果として生じないヌクレオチド配列における置換を行いうることが当業者に理解される。したがって、ここで定義される「実質的に同一な」配列は本発明の範囲に入りうる。ここに記載の任意のＤＮＡ分子の相補鎖の両方が本発明の範囲に含まれることがさらに当業者に理解される。
【００７１】
核酸配列について適用されるおよび本文書で用いられる「実質的な同一性」または「実質的な配列同一性」の語句は、ポリヌクレオチドが、少なくとも２０個のヌクレオチド位置の比較範囲にわたって、しばしば少なくとも２５〜５０個のヌクレオチドの範囲にわたって、参照配列と比較して少なくとも８５パーセント配列同一性、好ましくは少なくとも９０ないし９５パーセント配列同一性、およびより好ましくは少なくとも９９パーセント配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド配列の特徴を意味し、配列同一性のパーセンテージは比較範囲にわたって参照配列の合計２０％未満である欠失または付加を含みうるポリヌクレオチド配列と参照配列を比較することによって計算される。
【００７２】
作用薬
本発明の一部の実施形態では、抗血管新生ペプチドに対する受容体の作用薬が提供される。そのような作用薬は、本発明のペプチドの変異体および本発明のペプチドのペプチド、非ペプチド、およびペプチドミメティックアナログを含むがそれらに限定されない。
【００７３】
治療手順
血管新生疾患の治療方法のための方法は、本発明のペプチドの一種類以上の血管新生阻害量を患者へ投与することを含む。ここでは、「治療」の語は、血管新生の症状の重症度における防止、改善、または低減をいうことが意図される。同様に、本発明のペプチドの血管新生阻害有効用量は、血管新生の症状の重症度を防止、改善、または低減するのに十分な用量である。
【００７４】
本発明のペプチドは、単独で、または互いにまたは他の血管新生阻害剤と組み合わせて投与されうる。典型的には、本発明のペプチドは、一日当たり約８マイクログラムから３，０００μｇ／ｋｇ、およびより好ましくは一日当たり約２０から１，５００μｇ／ｋｇの量で、好ましくは一日一回または二回投与される。しかし、実質的により低いまたはより高い量を含む他の量もまた投与されうる。本発明のペプチドは、抗血管新生治療を必要とするヒト対象で、筋肉内、皮下、静脈内、腫瘍内、任意の他の許容される投与経路によって投与されうる。眼血管新生疾患の場合には、ペプチドはまた局所的に眼へ投与されうる。
【００７５】
網膜の血管新生によって生じる視力の低下を回避するための糖尿病患者の予防および／または治療、避妊用途、および、手術または化学療法の後、悪性腫瘍の再形成を回避するためといったがん患者の長期治療といった、予防または治療の使用の両方が意図されている。
【００７６】
一部の患者たとえば糖尿病患者が長年にわたり視力喪失に苦しむことが公知であるため、本ペプチドはこの過程の抑制または遅滞のために適切に利用されうる。この用途に利用されるためには、投与されるべき発明の組成物は一日当たり約１２から３，５００μｇ／ｋｇ、および好ましくは一日当たり約２５から２，７００μｇ／ｋｇの量のペプチドを含みうる。しかし、特定の症例に対して開業医が適するとみなした異なるペプチドの量が投与されうる。より少量が、前眼房への注射によって投与されうる。
【００７７】
この用途または任意の他の用途のために、本発明のペプチドは、約１０から３，７５０μｇ／ｋｇ、およびより好ましくは約１５から１，６００μｇ／ｋｇの量で投与されうる。任意の投与手段が適している。
【００７８】
抗血管新生傾斜ペプチドは、疾患の治療のための他の組成物および手順と組み合わせて用いられうる。たとえば、腫瘍は、従来は、手術、放射線または化学療法で抗血管新生傾斜ペプチドと組み合わせて治療してもよく、および次いで抗血管新生傾斜ペプチドは、微小転移巣の休止状態を延長するためにおよび任意の残存腫瘍を安定させるために、引き続き患者に投与されうる。
【００７９】
遺伝子治療
本発明のペプチドをコードする核酸を患者細胞へ、または患者へ遺伝子産物を供給するベクターをｉｎ ｖｉｖｏで送る、組み換えＤＮＡ法を利用する遺伝子治療もまた本発明の範囲内と考えられる。
【００８０】
遺伝子治療法は、ポリペプチドといた遺伝子産物への対象の曝露を、骨格筋、心筋、血管内皮または平滑筋、または固形または循環腫瘍細胞といった目的の組織へ治療遺伝子の発現をターゲッティングすることによって限定する可能性を有する。たとえば、ＷＩＰＯ特許出願公開番号ＷＯ９３／１５６０９は、カテーテル系を用いて血管壁傷害の範囲への遺伝子の投与による血管組織へのインターフェロン遺伝子の運搬を開示する。別の一例では、プロドラッグを酵素的に変換できるタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、「自殺遺伝子」、およびサイトカインをコードする遺伝子が固形腫瘍へ直接に投与される。
【００８１】
治療遺伝子を目的の組織へターゲッティングする他の方法は、形質導入ターゲッティング、位置ターゲッティング、および転写ターゲッティングの三つの範疇を含む（総説はたとえば、ミラーＭｉｌｌｅｒ 他 ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１９０−１９９ （１９９５）を参照）。形質導入ターゲッティングとは、主に受容体リガンドの選択によって達成される、特定の細胞への選択的進入をいう。ゲノム内の位置ターゲッティングとは、たとえばクロマチンの活性領域といった目的の遺伝子座への、または標的遺伝子といった内因性ヌクレオチド配列との相同組み換えによる組み込みをいう。転写ターゲッティングとは、目的の細胞に合わせた遺伝子発現の高度に特異的な調節を伴う、転写プロモーターの組み込みによって達成される選択的発現をいう。
【００８２】
組織特異的プロモーターの例は、肝臓特異的プロモーター（ゾー（Ｚｏｕ）他，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８：１７７１−１７７４ （１９９７））；小腸特異的プロモーター（オリベイラ（Ｏｌｉｖｅｉｒａ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１８３１−３１８３８ （１９９６））；筋および心臓組織におけるジストロフィンｃＤＮＡ発現を導くのに用いられているクレアチンキナーゼに対するプロモーター（コックス（Ｃｏｘ）他，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：７２５−７２９ （１９９３））；およびＢ細胞における自殺遺伝子の発現に対する免疫グロブリン重鎖または軽鎖プロモーター（マクスウェル（Ｍａｘｗｅｌｌ）他，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：４２９９−４３０４ （１９９１））を含む。内皮細胞特異的調節領域もまた特徴づけられている（ヤーロウディ（Ｊａｈｒｏｕｄｉ）他，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．１４：９９９−１００８ （１９９４））。それぞれ肝臓系譜の細胞および肝細胞腫細胞を標的にする、アルブミンまたはアルファフェトプロテインプロモーターの調節下にある単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を有する広宿主性レトロウイルスベクターが構築されている（フーバー（Ｈｕｂｅｒ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：８０３９−８０４３ （１９９１））。そのような組織特異的プロモーターは、レトロウイルスベクター（ハーツォグロー（Ｈａｒｔｚｏｇｌｏｕ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７２８５−１７２９３ （１９９０））およびアデノウイルスベクター（フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）他，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：３７９１−３７９７ （１９８６））に使用でき、およびなお組織特性を維持できる。
【００８３】
目的の組織における発現の特異性を助ける他の要素は、分泌リーダー配列、エンハンサー、核局在化シグナル、内浸透圧破壊ペプチド、などを含みうる。好ましくは、これらの要素は、特異性を助ける目的の組織に由来する。
【００８４】
本発明の実施に有用なウイルスベクター系は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ＨＩＶ、シンドビスウイルス、およびラウス肉腫ウイルスおよびＭｏＭＬＶといったレトロウイルスを含むがそれらに限定されない。典型的には、目的の治療用ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸は、典型的には随伴するウイルスＤＮＡと共に核酸のパッケージング、感受性宿主細胞の感染、および目的のポリペプチドまたはペプチドの発現を可能にするようなベクターへ挿入される。
【００８５】
たとえば、本発明のＤＮＡ構築物は、肝細胞のアシアロ糖タンパク受容体に対するリガンドであるアシアロオロムコイドにポリリシン部分で連結されうる（Ｃｈｅｍ． ２６３：１４６２１ １４６２４ （１９８８）； ＷＯ ９２／０６１８０）。
【００８６】
同様に、本発明の組み換え構築物をパッケージするのに用いられるウィルスエンベロープは、特異細胞への受容体媒介エンドサイトーシスを可能にする受容体に特異的な受容体リガンドまたは抗体の付加によって改変されうる（たとえば、ＷＯ ９３／２０２２１， ＷＯ ９３／１４１８８； ＷＯ ９４／０６９２３）。本発明の一部の実施形態では、本発明のＤＮＡ構築物は、アデノウイルス粒子といったウイルスタンパク質にエンドサイトーシスを容易にするためにリンクされる（クリエル（Ｃｕｒｉｅｌ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｌ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８：８８５０ ８８５４ （１９９１））。他の実施形態では、本発明の分子複合体は、微小管阻害剤（ＷＯ ９４／０６９２２）、インフルエンザウイルス血球凝集素を模倣する合成ペプチド（プランク（Ｐｌａｎｋ）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１２９１８ １２９２４ （１９９４））;およびＳＶ４０ Ｔ抗原（ＷＯ ９３／１９７６８）といった核局在化シグナルを含みうる。
【００８７】
核酸は、さまざまな方法によってｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで目的の組織に導入することができる。本発明の一部の実施形態では、核酸は、顕微鏡下注射、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム融合または微粒子銃といった方法によって細胞に導入される。別の実施形態では、核酸は目的の組織によって直接的に利用される。他の実施形態では、核酸は、細胞への導入を容易にするためにウイルスベクター系にパッケージされる。
【００８８】
本発明の一部の実施形態では、本発明の組成物は患者から外植された細胞または組織にｅｘ ｖｉｖｏで投与され、次いで患者に戻される。遺伝子治療構築物のｅｘ ｖｉｖｏ投与の例は、アクスティアガ（Ａｘｔｅａｇａ）他， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６（５）： １０９８−１１０３ （１９９６）； ノルタ（Ｎｏｌｔａ）他， Ｐｒｏｃ Ｎａｄ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３（６）：２４１４ ９ （１９９６）； コック（Ｋｏｃ）他， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２３ （１）：４６ ６５ （１９９６）； レーパー（Ｒａｐｅｒ）他， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２２３（２）：１１６ ２６ （１９９６）； ダレスアンドロ（Ｄａｌｅｓａｎｄｒｏ）他， Ｊ Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉ．Ｓｕｒｇ．１１（２）：４１６ ２２ （１９９６）；およびマカロブ（Ｍａｋａｒｏｖ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｄ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３（１）：４０２ ６ （１９９６）を含む。
【００８９】
処方および医薬組成物
本発明のペプチドは、たとえば、合成でき、精製された完全長ホルモンから調製でき、または組み換え法および本分野で公知である方法を用いて製造されうる。好ましい一実施形態では、傾斜ペプチドは、組み換え法を用いて、たとえば「マルトース結合タンパク質」（ＭＢＰ）といったキャリヤーポリペプチド／タンパク質へ融合および作製されうる。たとえば、サソリ毒のペプチドおよびＭＢＰから作製された融合タンパク質が抗原として用いられ、ウサギにおいて抗体の産生に成功した（レグロス（Ｌｅｇｒｏｓ），Ｃ．，他 Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：９３４−４２ （２００１））。これは、これらの融合タンパク質が、Ａ．アウストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）毒に対する効率的な免疫保護を提供するワクチンとして使用に成功しうることを示す。代替的に、傾斜ペプチドは、効率を改善するために、合成されおよびその後にキャリヤー分子と融合されうる。代替的な一実施形態では、本発明のペプチドまたは前記ペプチドを含む組み換えタンパク質はＰＥＧ化されている。ＰＥＧ化とはペプチドまたはポリペプチドとポリエチレングリコールとの複合体化である。ＰＥＧ化アルファインターフェロンは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に感染したマウスの治療として用いられている。ＰＥＧ化インターフェロンの使用は、ＶＥＥＶへの感染に対して大幅に高まった生存を結果として生じる（ルカツェウスキー（Ｌｕｋａｓｚｅｗｓｋｉ），Ｒ．Ａ．およびブルックス（Ｂｒｏｏｋｓ），Ｔ．Ｊ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：５００６−１５ （２０００））。ヒト治療では、ＰＥＧ化インターフェロンは現在、Ｃ型肝炎ウイルスによる慢性感染の効果的な治療法である（ポイナール（Ｐｏｙｎａｒｄ），Ｔ．，他 Ｌａｎｃｅｔ ３６２：２０９５−１００ （２００３））。
【００９０】
ペプチドが傾斜しているかどうか実験的に決定する方法に関して：傾斜ペプチドの特徴は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験においてリポソーム融合を誘導することである。この方法は、（マーティン（Ｍａｒｔｉｎ），Ｉ．，他 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １７５：８７２−９ （１９９１）），（ピロット（Ｐｉｌｌｏｔ），Ｔ．，他 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：２８７５７−６５ （１９９６）） ，（ピロット（Ｐｉｌｌｏｔ），Ｔ．，他 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７４：３８１−９３ （１９９７）），（リンス（Ｌｉｎｓ），Ｌ．，他 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １５：５１３−２０ （２００２））に記載されている。
【００９１】
本発明の組成物は、哺乳類対象、好ましくはヒトへの投与のために許容される本分野で公知の方法による投与のために処方される。本発明の一部の実施形態では、本発明の組成物は、注射によって組織へ直接、または目的の組織へ供給する血管へ、投与されうる。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は「局所領域的に」、すなわち、膀胱内に、病変内に、および／または局所に投与される。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は注射、吸入、坐剤、経皮運搬などによって全身的に投与される。本発明の別の実施形態では、組成物は、臓器といった目的の遠隔性の組織への接近を可能にする、カテーテルまたは他の器具を通じて投与される。本発明の組成物はまた、組成物の遅放または徐放を可能にする、デポ型器具、インプラント、またはカプセル化処方で投与されうる。
【００９２】
本発明に基づくまたは由来の治療薬を投与するために、適切なキャリヤー、賦形剤および他の薬剤が、改良された移送、運搬、認容などを提供するべく処方に組み込まれうることが理解される。
【００９３】
多数の適切な処方が、すべての薬剤師に公知の処方集において見い出されうる：『レミントンの薬学』（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）， 
（第１５版， マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）， イーストン， ペンシルバニア（１９７５））、特シブラウグ（Ｂｌａｕｇ），セイモア（Ｓｅｙｍｏｕｒ）によるその第８７章。これら処方はたとえば、粉薬、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、無水吸収塩基、水中油または油中水乳液類、乳液カーボワックス（さまざまな分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル類、およびカーボワックスを含む半固体混合物を含む。
【００９４】
前記の任意の処方は、処方中の活性薬剤が処方によって不活性化されずおよび処方が生理的に適合する場合、本発明の処置および治療において適当でありえる、
【００９５】
有効な治療のために必要な活性成分の量は、投与手段、目的部位、患者の生理的状態、および投与される他の薬剤を含む多くの異なる要因に依存する。したがって、処理用量は安全性および有効性を最適化するために滴定されるべきである。典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏで用いられる用量は、活性成分のｉｎ ｓｉｔｕ投与に有用な量の有用な指針を提供しうる。特定の障害の治療のための有効用量の動物実験は、ヒト用量の別の予測的な指標を提供するであろう。さまざまな考慮事項は、たとえば、グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）およびギルマン（Ｇｉｌｍａｎ）の治療の薬理学的基礎（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）， 第７版（１９８５）， マクミラン出版社（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）， ニューヨーク、および『レミントンの薬学』（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），第１８版， （１９９０）マッ
ク出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ）， イーストン ペンシルバニアに記載されている。投与のための方法はこれらの中で論じられ、経口、静脈内、腹膜内、筋肉内、経皮、経鼻、イオン導入投与などを含む。
【００９６】
本発明の組成物は、投与方法に応じてさまざまな単位用量形態で投与されうる。経口投与に適した単位用量形態は、粉薬、錠剤、ピル、カプセルおよび糖衣剤といった固体剤型、および、たとえばエリキシル、シロップおよび懸濁液といった液体剤型を含む。活性成分は、非経口的に無菌の液体剤型で投与されることもありうる。ゼラチンカプセルは、活性成分、および不活性成分として、たとえばブドウ糖、ラクトース、蔗糖、マンニトール、澱粉、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどといった粉末状のキャリヤーを含む。目的の色、味、安定性、緩衝能力、分散または他の公知の目的の性質を提供するために付加されうる追加的な不活性成分の例は、ベンガラ、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白インクなどである。類似の希釈剤は、圧縮錠剤を作るのに用いることができる。錠剤およびカプセルの両方は、長時間にわたって薬剤の連続放出を提供する徐放産物として製造されうる。圧縮錠剤は、任意の不快な味を被覆しおよび錠剤を雰囲気から保護するための糖衣またはフィルムコート、または消化管の選択的分解のための腸溶性コートであってもよい。経口投与のための液体剤型は、患者による認容を高めるために着色剤および調味料を含みうる。
【００９７】
本発明の組成物の医薬組成物中の濃度は、広範に、すなわち重量比で約０．１％未満から、通常は少なくとも約２％以上から２０％ないし５０％、またはそれ以上まで変化しうり、および選択される特定の投与様式にしたがって流体容積、粘度、他によって主に選択される。
【００９８】
本発明の組成物はまた、リポソームを介して投与されうる。リポソームは、乳液、泡、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などを含む。これらの調製物では、運搬すべき本発明の組成物は、単独で、またはたとえば抗体といった目的の標的と結合する分子と、または他の治療用または免疫原性組成物と組み合わせて、リポソームの一部として組み込まれる。このように、本発明の目的の組成物で満たされたかまたは装飾されたリポソームは全身的に運搬でき、または目的の組織へ導くことができ、そこでリポソームを次いで選択された治療用／免疫原性ペプチド組成物を運搬できる。
【００９９】
本発明での使用のためのリポソームは、一般に中性および負に荷電するリン脂質およびコレステロールといったステロールを含む標準的な小嚢形成脂質から形成される。脂質の選択は、たとえばリポソームの大きさ、酸不安定および血流中のリポソームの安定性などの考慮事項によって一般に導かれる。たとえば、ショーカ（Ｓｚｏｋａ）他， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９：４６７ （１９８０）， 米国特許第４，２３５，８７１号， 第４，５０１，７２８号， 第４，８３７，０２８号および第５，０１９，３６９号中のさまざまなものが、参照により本開示に組み入れられる。
【０１００】
本発明の組成物を含むリポソーム懸濁液は、静脈内、局所的、局部になど、とりわけ、投与の方法、運搬中の本発明の組成物、および処置中の疾患の段階にしたがって異なる用量で投与されうる。
【０１０１】
固体組成物の場合、たとえば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、ブドウ糖、蔗糖、炭酸マグネシウムなどを含む従来の非毒性の固体キャリヤーが用いられうる。経口投与の場合、薬学的に許容可能な非毒性組成物が、以前に記載したそれらキャリヤーといった任意の通常使用される賦形剤、および一般に１０ないし９５％の活性成分、すなわち本発明の一つ以上の組成物、およびより好ましくは２５％ないし７５％の濃度で組み入れることによって形成される。
【０１０２】
エアゾール投与の場合、本発明の組成物は好ましくは、界面活性剤および推進剤とともに細かく分けて供給される。本発明の組成物の典型的な百分率は、重量比で０．０１％ないし２０％、好ましくは１％ないし１０％である。界面活性剤はもちろん非毒性でなければならず、および好ましくは推進剤に可溶性でなければならない。そのような薬剤の代表は、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物を有するカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック酸およびオレイン酸といった６ないし２２個の炭素原子を含む脂肪酸のエステルまたは部分的エステルである。混合または天然グリセリドといった混合エステル類が使用されうる。界面活性剤は、組成物の重量比０．１％ないし２０％、好ましくは０．２５ないし５％を構成しうる。組成物の残りは通常は推進剤である。キャリヤーも所望の通りたとえば鼻腔内運搬のためのレシチンとともに含まれうる。
【０１０３】
本発明の組成物は追加的に、本分野で公知の方法によって、デポ型装置、カプセル化された剤型またはインプラント中で運搬されうる。同様に組成物はポンプを介して目的の組織に運搬されうる。
【０１０４】
本発明の組成物は典型的には症状の発現後に投与されるが、一部の実施形態では処置は予防的でもありうる。典型的には、ポリペプチドの直接的な投与による処置は、症状を低減、予防または改善するのに十分な期間にわたって、毎日、毎週、または、毎月行われる。本発明の核酸による処置は、典型的には数カ月の間隔で行われる。一部の実施形態では、本発明の組成物の投与は子宮内で行われる。
【０１０５】
本発明の組成物は、上記の通りの包装または容器中での、スポンジ、皮膚用パッチ、皮下用インプラントとして提供された、日、週、月単位といった徐放組成物としてキットで提供されうる。この場合、患者は、組成物の一単位を容器から自由に開放してもよく、キット取り扱い説明書に示すように一単位を塗布する。組成物は、新しい単位などによって、指定された期間の終わりに置換されうる。
【０１０６】
上記のように、本組成物は注射によって投与されうる。典型的には、ペプチドは、それ自体によって、またはたとえば糖尿病患者の場合インシュリンを含む組成物中で投与されうる。同じことが、組成物の徐放剤型にあてはまる。同様に、本発明のペプチドは、他の薬剤も含む組成物中で投与されうる。そのような症例の一つは、特に、化学療法剤といった異なる制がん剤または造影剤と標的特異的抗体とが、本発明のペプチドも含む組成物中に提供されることがありうるがんの症例である。したがって、他の薬剤およびキャリヤーに対するペプチドの比率は調整されうる。
【０１０７】
患者に対して運搬されたペプチドのレベルは、免疫測定法によって監視されうる。投与、たとえば筋肉内または皮下投与の後の、本発明のペプチドの血液中のレベルを決定するために、本分野で公知の任意の手順によって、ペプチド配列に特異的な抗体によるプロトコル抗体検定法が実施されうる。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体または１６Ｋ Ｎ末端断片受容体が利用されうる。次いで、血中のペプチドのレベルを患者の罹患する任意の疾患の阻害の進行と相関付ける。
【０１０８】
下記の実施例は説明を意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１０９】
実施例１．ＰＲＬ／ＧＨ１６Ｋ断片中の傾斜ペプチド領域の同定
所与のタンパク質配列中の傾斜ペプチドの検出を可能にする、分子モデリングの一般的手順が設定された（ブラッスール（Ｂｒａｓｓｅｕｒ）、Ｒ．Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ １７：３１−４０（２０００））。要約すると、下記の判定基準を用いて傾斜ペプチドがタンパク質配列中に検出される：ａ）ペプチドが長さ１０〜２０アミノ酸である、ｂ）ペプチドの平均疎水性（アイセンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ），Ｄ，ワイス（Ｗｅｉｓｓ），Ｒ，テルウィリンジャー（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒ），Ｔ １９８２，Ｎａｔｕｒｅ，２９９，３７１−３７４のアイセンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）尺度共通尺度によって計算される）が０．１より高い；ｃ）配列に沿った疎水性がイエーニッヒ（Ｊaｈｎｉｇ）および疎水性クラスター分析法（ガボリアード（Ｇａｂｏｒｉａｕｄ），Ｃ．，他 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２２４：１４９−５５ （１９８７）、ヤーニッヒ（Ｊａｈｎｉｇ），Ｆ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５：９３−５ （１９９０））といった異なる方法を用いて計算される；ｄ）ペプチドが(へリックスとして構築される場合、へリックス軸と界面平面との間の角度が３０°ないし７０°である；ｅ）最小エネルギー立体配座は疎水性／親水性界面方向である。ｆ）分子疎水ポテンシャルが計算されおよび疎水性アイソポテンシャルエンベロープは非対称である。
【０１１０】
この手順を用いて、潜在的な傾斜ペプチドがヒトＰＲＬ／ＧＨ１６Ｋ断片配列のそれぞれに検出された。このドメインは、斜角特性に関して、４つの１６Ｋ断片の配列の間で保存されている。
【０１１１】
図１はＡで、ｈＰＲＬのタンパク質配列を示す。傾斜ペプチド構造を取る可能性の高い領域は太字で強調されている。アルファへリックス領域は長方形の中に示される（キーラー（Ｋｅｅｌｅｒ），Ｃ．，他 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２８：１１０５−２１ （２００３））。矢印は、１６Ｋ断片切断部位の局在を示す。ＢはＰＲＬ／ＧＨファミリーの１６Ｋ断片中の傾斜ペプチド領域の整列を示す。
【０１１２】
実施例２：ペプチドの化学合成
２．１．ＰＯ−ＰＲＬ ペプチドの合成
【０１１３】
１６Ｋ ｈＰＲＬの傾斜ペプチド領域に相当するＰＯ−ＰＲＬというペプチドが化学的に合成された。その配列はＦＬＳＬＩＶＳＩＬＲＳＷＮＥ（配列番号３）である。このペプチドは民営バイオ会社のユーロジェンテック社（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ Ｓ．Ａ．）によって合成された。そのペプチドはＮ末端がアセチル化およびＣ末端がアミド化されている。
【０１１４】
２．２．傾斜ペプチドの生物物理学的特徴づけ：脂質相融合
【０１１５】
脂質相融合は、脂溶性マーカーＲ１８の蛍光を追跡することによって測定した。リポソームに高い表面密度で組み込まれた場合、Ｒ１８蛍光は減弱した。標識化および非標識化リポソームの膜融合によるマーカーの希釈に際して、減弱は軽減されおよびＲ１８蛍光が増加する。標識化リポソームはＲ１８を脂質フィルムに混合することによって調製された（表１参照）。標識化および非標識化リポソームは１：４比（ｗ／ｗ）で混合されおよび濃度５０μＭへ希釈された。蛍光は室温にて（励起λ：５６０ｎｍ、発光λ：５９０ｎｍ）パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）ＬＳ−５０Ｂ蛍光測定機で測定される。ＰＯ−ＰＲＬがリポソーム融合を誘導する能力が、二種類の異なるリポソーム調製物において異なるｐＨにて分析された（表１）。
【０１１６】
表１：ＬＵＶ（大きな一枚膜リポソーム）の組成および調製。ＬＵＶは押出によって調製された。要約すると、脂質フィルムを１時間３７℃にて水和した。懸濁液を５回の凍結融解サイクルに供し、次いで２０バール窒素圧下で２つのポリカーボネートフィルター（孔直径０．０８μｍ）を１０回連続通過させた。リン脂質濃度はリン酸量によって測定した（バーレット（Ｂａｒｌｅｔｔ）法）。
【０１１７】
【表１】
2008509968.tif 000002
【０１１８】
下記の緩衝液を使用した：ｐＨ８緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８；１５０ｍＭ ＮａＣｌ； ０．０１％ＥＤＴＡ； １ ｍＭ ＮａＮ3）、ｐＨ６緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ＝６；１５０ｍＭ ＮａＣｌ； ０．０１％ＥＤＴＡ； １ ｍＭ ＮａＮ3）、ｐＨ４緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ＝４；５７ｍＭ酢酸）
【０１１９】
下記の濃度のペプチドを使用した：
６００μＭ、ペプチド／脂質モル比（Ｒ）０．２に相当
３００μＭ、ペプチド／脂質比（Ｒ）０．１に相当
１５０μＭ、ペプチド／脂質比（Ｒ）０．０５に相当
６０μＭ、ペプチド／脂質比（Ｒ）０．０２に相当
３０μＭ、ペプチド／脂質比（Ｒ）０．０１に相当。
【０１２０】
どの実験条件を使用しても（荷電または非荷電リポソーム、ｐＨ＝４、６または８）、ＰＯペプチドはリポソーム融合を脂質相において誘導する。リポソーム融合の誘導は用量依存的である。表２は異なる実験条件における両方のペプチドについての相対融合（１５分後）の割合を示す。
【０１２１】
表２：１５分後にＰＯペプチドによって誘導される相対リポソーム融合。Ｒ＝ペプチド／脂質比、Ｃ＝荷電およびＵＣ＝非荷電リポソーム。ＰＯペプチドによって誘導されたリポソーム融合Ｒ＝０．２；ｐＨ＝８、ＵＣ）を任意に１００％に設定した：
【０１２２】
【表２】
2008509968.tif 000003
【０１２３】
２．３．ペプチドの立体配座
【０１２４】
溶液中のペプチドの立体配座はフーリエ変換赤外スペクトル法（ＡＴＲ−ＦＴＩＲ）によって分析される。試料（２０μｇ）をゲルマニウムプレート上に塗布し、および１８００ないし１０００ｃｍ−１でスペクトルを記録する。アミドＩバンドに対応する１７００−１６００ｃｍ−１範囲の逆重畳は、ペプチドの二次構造の決定を可能にする（グールマグティグ（Ｇｏｏｒｍａｇｈｔｉｇｈ），Ｅ．，他 Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４２２：１０５−８５ （１９９９））。ペプチドの二次構造を表３に示す。傾斜ペプチドは溶液中ではしばしば(構造である一方、脂質の存在下ではヘリックスである（マーティン（Ｍａｒｔｉｎ），Ｉ．，他 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １７５：８７２−９ （１９９１））。
【０１２５】
【表３】
2008509968.tif 000004
【０１２６】
実施例３．ＭＢＰタンパク質と融合された１６ＫｈＰＲＬの傾斜ペプチドの抗血管新生活性の測定
３．１．ＭＢＯ−ＰＯ−ＰＲＬおよびＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ組み換え融合タンパク質の発現
【０１２７】
「マルトース結合タンパク質」（ＭＢＰ）と融合された傾斜ペプチドが組み換えＤＮＡ工学手法によって作製された。１６Ｋ ｈＰＲＬの傾斜ペプチドを伴うＭＢＰでできた融合タンパク質をコードする遺伝子が下記の通り構築され、およびＭＰＢ−ＰＯ−ＰＲＬと命名された。対照として、疎水性分布を改変する変異が１６Ｋ ｈＰＲＬの傾斜ペプチドに導入された。これらの変異は、脂質水界面方向である際のペプチドの斜め方向を改変する。ＰＯ配列の改変は、Ｌｅｕ２およびＡｓｎ１３の、およびＶａｌ６およびＳｅｒ１１の順列に存在する。１６ＫｈＰＲＬの変異傾斜ペプチドを伴うＭＢＰでできた融合タンパク質をコードする遺伝子が下記の通り構築され、およびＭＰＢ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬと命名された。ペプチドの配列は：
１６ＫｈＰＲＬのＰＯ：ＦＬＳＬＩＶＳＩＬＲＳＷＮＥ（配列番号３）
１６ＫｈＰＲＬのＰＯｍｕｔ：ＦＮＳＬＩＳＳＩＬＲＶＷＬＥ（配列番号１０）である。
【０１２８】
３．２．ｐＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬおよびｐＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ発現ベクターの構築
【０１２９】
目的のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド（ユーロジェンテック社（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ｓ．ａ．）） が、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘプラスミド（ニューイングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．））のＭＢＰコード配列のＣ末端に挿入された。オリゴヌクレオチドはＢａｍＨ Ｉ および Ｘｍｎ Ｉ 制限部位をそれぞれペプチドコード配列の上流および下流に含むように設計されている。これらの部位は、ＢａｍＨ ＩおよびＸｍｎ Ｉによって予め消化されたｐＭＡＬ−ｃ２ｘ プラスミドへペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを挿入することを可能にした。各構造について一つのクローンが選択され、およびそれぞれｐＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬおよびｐＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬと命名された。配列は配列決定によって検証された。
【０１３０】
ｐＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬおよびｐＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬプラスミドを構築するのに用いられるオリゴヌクレオチド配列を下記に示す。変異は太字で示す。オリゴヌクレオチドが有するＸｍｎＩ制限部位の部分は斜体で示す。オリゴヌクレオチドが有するＢａｍＨＩ制限部位の部分は下線で示す：
ＰＯ−ＰＲＬ順方向
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴＡＧＴＣＡＧＣＡＴＡＴＴＧＣＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧ−３’，配列番号 １７；
ＰＯ−ＰＲＬ逆方向
３’−ＴＡＡＡＧＴＡＡＡＧＡＣＴＣＧＧＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＧＴＡＴＡＡＣＧＣＴＡＧＧＡＣＣＴＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＡＧ５’ 配列番号 １８；
ＰＯ ｍｕｔ−ＰＲＬ順方向
５’−ＡＴＴＴＣＡＴＴＴＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＣＡＴＡＴＴＧＣＧＡＧＴＣＴＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＡＧ−３’
配列番号 １９；
ＰＯ ｍｕｔ−ＰＲＬ逆方向
３’−ＴＡＡＡＧＴＡＡＡＴＴＧＴＣＧＧＡＣＴＡＴＡＧＧＴＣＧＴＡＴＡＡＣＧＣＴＣＡＧＡＣＣＧＡＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＡＧ５’
配列番号２０；
【０１３１】
３．３．ＭＢＰ発現を可能にするベクターの構築
【０１３２】
ＭＢＰ対照タンパク質（融合ペプチドを有しない）を作製するために、終止コドンが、ＭＢＰコード配列の下流およびペプチド挿入部位の上流に導入された。ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ プラスミドをＢａｍＨＩおよびＸｍｎＩによって消化し、およびアニーリングした「終止順方向」（５’−ＡＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧ−３’、配列番号１５）および「終止逆方向」（３’−ＴＡＡＡＧＴＡＣＴＡＣＴＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＣＣＣＴＡＧ−５’、配列番号１６）オリゴヌクレオチドとライゲーションした。これらのオリゴヌクレオチドは、終止コドンおよびＸｈｏＩ制限部位を含む。一つのクローンが、ＸｈｏＩ消化によって選択され、およびｐＭＢＰと命名された。配列は配列決定によって検証された。ｐＭＢＰプラスミドを構築するのに用いられるオリゴヌクレオチド配列中で、ＸｈｏＩを太字で示す。オリゴヌクレオチドが有するＸｍｎＩ制限部位の部分は斜体で示す。オリゴヌクレオチドが有するＢａｍＨＩ制限部位の部分は下線で示す。
【０１３３】
３．４．ＭＢＰおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ、ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ融合タンパク質の発現
【０１３４】
ｐＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ、ｐＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬおよびｐＭＢＰの構造で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’細胞を形質転換した。培養はグルコース含有ＬＢ培地で実施し、および発現をＩＰＴＧの添加によって誘導した。試料をさまざまなインキュベート時間で回収し、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ、ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬおよびＭＢＰタンパク質の溶解度を分析するために、細胞をＩＰＴＧ誘導の５時間後に回収し、およびフレンチプレスで破壊した。溶解物を遠心分離し、および沈澱および上清を１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図２に示す通り、ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬおよびＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬタンパク質は可溶性画分中でほぼ９０％まで存在する。記号「Ｆ」は融合タンパク質のバンドを示す。産生はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって培養４５ｍｇ／ｌ付近で推定した。同様の結果がＭＢＰについて得られた。図２は、ＩＰＴＧ誘導の５時間後のＭＢＰ−ＰＯおよびＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ溶解度の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。：
ＭＭ：分子量マーカー。
レーン１〜２：ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ細胞溶解物上清．
レーン３〜４：ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ細胞溶解物上清
レーン５〜６：ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ細胞溶解物沈澱
レーン７〜８：ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ細胞溶解物沈澱
１、３、５、７：培養のＯ．Ｄ．＝１の１５０μｌ相当物が負荷された。２、４、６、８：培養のＯ．Ｄ．＝１の３００μｌ相当物が負荷された。
【０１３５】
３．５．ＭＢＰおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ、ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬタンパク質の精製
【０１３６】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ、ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬおよびＭＢＰをまずアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。可溶性タンパク質をアミロースアフィニティ樹脂（ニューイングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．））に負荷し、洗浄しおよびマルトースで溶出した。目的のタンパク質を含む画分を回収し、トリス−ＨＣｌ２０ｍＭ、ｐＨ＝７．５に対して透析した。三つの試料を次いで陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【０１３７】
３．６．ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ、ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬおよびＭＢＰタンパク質の生物活性
【０１３８】
３．６．１．ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬはアポトーシスを内皮細胞において誘導する
【０１３９】
ＭＰＢ−ＰＯ−ＰＲＬの内皮細胞アポトーシスに対する作用を測定するため、発明者らＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ処理細胞のＤＮＡ含量を、フローサイトメトリーによって分析している。この目的で、ＤＮＡをヨウ化プロピジウムで標識化した。ウシ副腎皮質内皮（ＢＡＣＥ）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）およびｍｌ当たり１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含む低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（１０％ＦＣＳ培地）に、細胞５Ｘ１０5／１００ｍｍプレートの密度で平板播種した。平板播種の２４時間後、細胞を目的のタンパク質で１８時間処理した。細胞をその後採取し、および固定しおよび氷冷エタノール中で２時間透過処理し、その後遠心分離、およびＲＮアーゼ（５μｇ／ｍｌ）およびヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）含有ＰＢＳ中でインキュベート（３７℃にて３０分間）した。細胞をコールター・エピックス（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ）ＸＬフローサイトメーターを用いて分析した。
【０１４０】
結果を図３に示す。未処理細胞について得られたグラフは、Ｇ１、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ細胞部分集団を示す非同調細胞培養に典型的である。Ｇ１部分集団の位置は棒で示す。Ｇ１部分集団の存在は、アポトーシスの顕著な特徴であるアポトーシス体の存在に対応する。Ｇ１細胞部分集団の百分率をパネルＦに示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の産生した１６Ｋ ｈＰＲＬを対照として用いた。結果は、ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬおよび１６ＫｈＰＲＬでの細胞の１８時間処理の結果、Ｇ１細胞部分集団の百分率がそれぞれ３２、９および５５、９となり、一方で未処理細胞のＧ１部分集団の百分率は１％だけであった。ＭＢＰまたはＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬｍｕｔ処理細胞の値は未処理細胞値と有意差が無い。
【０１４１】
３．６．２．ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬはカスパーゼ３活性化を内皮細胞において誘導する
【０１４２】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬがアポトーシスをＢＡＣＥ細胞において誘導することを確認するため、発明者らはカスパーゼカスケードの活性化を研究した。エフェクタープロテアーゼのカスパーゼ−３の活性化は、アポトーシスシグナル伝達経路の最も一般的な現象の一つである。ウシ副腎皮質内皮（ＢＡＣＥ）細胞を、被験タンパク質の漸増濃度で処理した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の産生した１６ＫｈＰＲＬを対照として用いた。処理の１８時間後、細胞を溶解し、およびカスパーゼ３活性を測定した（カスペース（Ｃａｓｐａｃｅ）アッセイシステム、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）。図４に示す結果は、ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬはカスパーゼ３活性を用量依存的な形で誘導する一方、ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬおよびＭＢＰは全く不活性であったことを示す。濃度４０ｎＭでは、ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬは１０ｎＭの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生１６ＫｈＰＲＬと同等の活性を示した。これらの結果は、ＭＢＰと融合された１６ＫｈＰＲＬ由来傾斜ペプチドはカスパーゼ３活性化を内皮細胞において特異的に誘導できることを明瞭に示す。疎水性残基の分布に影響する変異はこの活性を無くす。
【０１４３】
３．６．３．ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬは内皮細胞の増殖を阻害する
【０１４４】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬがＡＢＡＥ（成ウシ大動脈内皮細胞）細胞増殖を阻害する能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。同調ＡＢＡＥ細胞を１０％ＦＢＳ培地ありまたは無しで平板播種し、および１６Ｋ ｈＰＲＬまたはＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬの漸増濃度と共に１８時間処理した。最後の３時間、細胞を５００，０００ｃｐｍの[3Ｈ］チミジンとインキュベートし、５％トリクロロ酢酸で洗浄し、ＮａＯＨ中で可溶化し、および計数した。結果はｃｐｍで表し、および棒のそれぞれは平均値±ＳＤを表し、ｎ＝３である。増殖は細胞をｂＦＧＦ５０ｐＭおよび１％ＦＣＳで処理することによって誘導した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生１６Ｋ ｈＰＲＬを対照として用いた。
【０１４５】
図５に示す通り、ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬはＡＢＡＥ細胞増殖に対して用量依存性の阻害作用を有する。濃度４０ｎＭで、ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬは１０ｎＭの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生１６ＫｈＰＲＬと同等の活性を示した。ＭＢＰまたはＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ処理細胞値は、未処理細胞値と有意差が無かった。これらの結果は、ＭＢＰと融合された１６ＫｈＰＲＬ由来傾斜ペプチドは内皮細胞増殖を特異的に阻害できることを明瞭に示す。疎水性残基の分布に影響する変異はこの活性を無くす。
【０１４６】
３．６．４．ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬはｉｎ ｖｉｔｒｏ毛細血管形成を妨げる
【０１４７】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬが血管新生をｉｎ ｖｉｔｒｏで妨げる能力をさらに分析するため、毛細血管形成を妨げる能力をコラーゲンゲル検定法で分析した。この検定法は下記の通り実施した：細胞２００００個を２つのコラーゲンゲル（５容のラット尾コラーゲン、１容の１０Ｘ Ｍ１９９培地、５０ ｍＭ ＮａＨＣＯ3）の間に平板播種した。ゲルに目的の組み換えタンパク質を含むかまたは含まない１０％ＦＢＳ培地を重層した。図９に示す通り、コラーゲンゲルに含まれる場合、ＢＡＣＥ細胞は毛細血管様構造を形成する（パネルＡ）一方、１０ｎＭ １６Ｋ ｈＰＲＬの添加は毛細血管形成を妨げる（パネルＢ）。４０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ（パネルＣ）は毛細血管構造を形成するＢＡＣＥ細胞の能力を阻害できる一方、８０ ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ（パネルＤ）は作用を有しない。
【０１４８】
３．６．５．ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬはｉｎ ｖｉｖｏ毛細血管形成を妨げる
【０１４９】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬの抗血管新生活性を、初期ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）検定で試験した。ニワトリＣＡＭ検定法は、血管新生をｉｎ ｖｉｖｏで試験するための幅広いおよび相対的に迅速な方法である。発生の３日目、ニワトリ受精胚を殻から取り出してペトリ皿に入れ、および３７℃にてインキュベートした。７日目に、４０μｇの組み換えタンパク質および４μｇのＢＳＡを含むメチルセルロース（０．５％、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））のディスク（５ｍｍ）をニワトリＣＡＭ上に置いた。４８時間後、白墨汁を絨毛尿膜嚢に注射し、および無血管の範囲を決定した。定量化は、少なくとも７個の卵について無血管範囲を測定することによって実施した。図１０に示す通り、無血管範囲は４０μｇのＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬを含むメチルセルロースディスク周囲の範囲に存在する一方、対照ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬは有意な作用を有しない。これらの結果は、ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬが血管新生をｉｎ ｖｉｖｏで妨げることができることを示す。
【０１５０】
実施例４．ＭＢＰタンパク質と融合された１６ＫｈＧＨの傾斜ペプチドの抗血管新生活性の測定
４．１．ＭＢＯ−ＰＯ−ＧＨ および ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＧＨ 組み換え 融合 タンパク質の作製
【０１５１】
上記と同一の手順を用いて、本発明者らは、ＭＢＰおよび１６ＫｈＧＨの傾斜ペプチドから成る融合タンパク質を作製した。対照として、疎水性分布を改変する変異を１６ＫｈＧＨの傾斜ペプチドに導入した。タンパク質名およびペプチド配列を表４に示す。発明者らは、ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨ、ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＧＨがアポトーシスを誘導および内皮細胞の増殖を阻害する能力を上記の通り評価した。結果は、ＭＢＰと融合された１６ＫｈＧＨ由来傾斜ペプチドは内皮細胞においてアポトーシスを特異的に誘導できることを明瞭に示す。疎水性残基の分布に影響する変異はこの活性を無くした。
【０１５２】
表４：ＭＢＰタンパク質と融合された１６ＫｈＧＨの傾斜ペプチドの配列。斜体で、疎水性分布を改変するように設計されている変異ペプチドを示す。
【０１５３】
【表４】
2008509968.tif 000005
【０１５４】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨ、ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＧＨおよびＭＢＰタンパク質の生物活性
【０１５５】
４．２．１．ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨはカスパーゼ３活性化を内皮細胞において誘導する
【０１５６】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨがアポトーシスをＢＡＣＥ細胞において誘導する能力を試験するために、発明者らはカスパーゼカスケードの活性化を研究した。ＢＡＣＥ細胞を漸増濃度の被験タンパク質で処理した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生１６ＫｈＰＲＬを対象として用いた。処理の１８時間後、細胞を溶解しおよびカスパーゼ３活性を測定した（カスペース（Ｃａｓｐａｃｅ）アッセイシステム、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））。図６に示す結果は、ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨはカスパーゼ３活性を誘導する一方、ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＧＨおよびＭＢＰは全く不活性であったことを示す。これらの結果は、ＭＢＰと融合された１６ＫｈＧＨ由来傾斜ペプチドはカスパーゼ３活性化を内皮細胞において特異的に誘導できることを明瞭に示す。疎水性残基の分布に影響する変異はこの活性を無くした。
【０１５７】
４．２．２．ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨは内皮細胞の増殖を阻害する
【０１５８】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨがＡＢＡＥ細胞増殖を阻害する能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。同調ＡＢＡＥ細胞を１０％ＦＢＳ培地有りまたは無しで平板播種し、および漸増濃度の１６ＫｈＰＲＬまたはＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨで１８時間処理した。最後の３時間、細胞を５００，０００ｃｐｍの[3Ｈ］チミジンとインキュベートし、５％トリクロロ酢酸で洗浄し、ＮａＯＨ中で可溶化し、および計数した。結果はｃｐｍで表し、および棒のそれぞれは平均値± ＳＤを表し、ｎ＝３である。増殖は細胞をｂＦＧＦ５０ｐＭおよび１％ＦＣＳで処理することによって誘導した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生１６Ｋ ｈＰＲＬを対照として用いた。
【０１５９】
図７に示す通り、ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨはＡＢＡＥ細胞増殖を阻害する。ＭＢＰまたはＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＧＨ処理細胞値は、未処理細胞値と有意差が無い。これらの結果は、ＭＢＰと融合された１６ＫｈＧＨ由来傾斜ペプチドは内皮細胞増殖を特異的に阻害できることを明瞭に示す。疎水性残基の分布に影響する変異はこの活性を無くした。
【０１６０】
４．２．３．ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨはｉｎ ｖｉｔｒｏ毛細血管形成を妨げる
【０１６１】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨが血管新生をｉｎ ｖｉｔｒｏで妨げる能力をさらに分析するため、毛細血管形成を妨げる能力をコラーゲンゲル検定法で上記の通り分析した。図１１に示す通り、コラーゲンゲルに含まれる場合、ＢＡＣＥ細胞は毛細血管様構造を形成する（パネルＡ）一方、１０ｎＭ １６Ｋ ｈＰＲＬの添加は毛細血管形成を妨げる（パネルＢ）。 １６０ ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨ（パネルＣ）は毛細血管構造を形成するＢＡＣＥ 細胞の能力を阻害できる一方、３２０ ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＧＨは作用を有しない（パネル Ｄ）。
【０１６２】
４．２．４．ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨはｉｎ ｖｉｖｏ毛細血管形成を妨げる
【０１６３】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨの抗血管新生活性を、 ｉｎ ｖｉｖｏでＣＡＭ検定法で上記の通り試験した。図１２に示す通り、４０μｇのＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨを含むメチルセルロースディスクの周囲の範囲に無血管範囲が存在する一方、対照ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＧＨは有意な作用を有しない。これらの結果は、ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨが血管新生をｉｎ ｖｉｖｏで妨げることができることを示す。
【０１６４】
実施例５．ＭＢＰタンパク質と融合された１６ＫｈＰＬの傾斜ペプチドの抗血管新生活性の測定
上記と同一の手順を用いて、ＭＢＰおよび１６Ｋ ｈＰＬの傾斜ペプチドから成る融合タンパク質を作製した。対照として、疎水性分布を改変する変異を１６Ｋ ｈＰＬの傾斜ペプチドに導入した。タンパク質名およびペプチド配列を表５に示す。ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＬ、ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＬが内皮細胞においてアポトーシスを誘導する能力を上記の通り評価した。結果は、ＭＢＰと融合された１６ＫｈＰＬ由来傾斜ペプチドは内皮細胞においてアポトーシスを特異的に誘導できることを明瞭に示す。疎水性残基の分布に影響する変異はこの活性を無くした。
【０１６５】
表５：ＭＢＰタンパク質と融合された１６ＫｈＰＬの傾斜ペプチドの配列。斜体で、疎水性分布を改変するように設計されている変異ペプチドを示す。
【０１６６】
【表５】
2008509968.tif 000006
【０１６７】
実施例６．ＭＢＰと公知の傾斜ペプチドとの間の融合タンパク質の発現および生物活性
６．１．  ＭＢＯ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡ組み換え融合タンパク質の作製
【０１６８】
発明者らは、ＭＢＰと、機能が血管新生と関係しない二種類の公知のタンパク質の傾斜ペプチド、すなわちβ−アミロイドタンパク質（ピロット（Ｐｉｌｌｏｔ）， Ｔ．他， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１： ２８７５７−６５（１９９６））およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ウイルス（ホース（Ｈｏｒｔｈ）， Ｍ．他， Ｅｍｂｏ Ｊ １０： ２７４７−５５ （１９９１））との融合タンパク質も作製した。上記と同じ戦略を用いて、ＭＢＰおよび傾斜ペプチドから成る融合タンパク質を産生した。タンパク質名およびペプチド配列を表７に示す。融合タンパク質を上記の通り発現および精製した。これらペプチドの内皮細胞においてアポトーシスを誘導する能力を上記の通り評価した。結果は、ＭＢＰと融合されたβ−アミロイドタンパク質アミロイドおよびＳＩＶ融合タンパク質由来の傾斜ペプチドはアポトーシスを特異的に誘導し内皮細胞の増殖を阻害できることを明瞭に示す。疎水性残基の分布に影響する変異はこの活性を無くした。
【０１６９】
【表６】
2008509968.tif 000007
【０１７０】
６．２．ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡ組み換えタンパク質の生物活性
【０１７１】
６．２．１．ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡは内皮細胞中のカスパーゼ３活性化を誘導する
【０１７２】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡがＢＡＣＥ細胞においてアポトーシスを誘導する能力を研究するために、発明者らは、カスパーゼカスケードの活性化を研究した。ＢＡＣＥ細胞を漸増濃度の被験タンパク質で処理した。大腸菌産生１６ＫｈＰＲＬを対照として用いた。処理の１８時間後、細胞を溶解しおよびカスパーゼ３活性を測定した（カスペース（Ｃａｓｐａｃｅ）アッセイシステム、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））。図８に示す結果は、ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡがカスパーゼ３活性を誘導することを示す。これらの結果は、ＭＢＰと融合された、サル免疫不全ウイルスの融合タンパク質由来の傾斜ペプチドおよびβ−アミロイドタンパク質由来の傾斜ペプチドが、内皮細胞中のカスパーゼ３活性化を特異的に誘導できることを明瞭に示す。
【０１７３】
６．２．２．ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡは内皮細胞増殖を阻害する
【０１７４】
ＡＢＡＥ細胞増殖を阻害するＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡの能力を上記の通り研究した。図１３に示す結果は、ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡがＡＢＡＥ細胞増殖に対して用量依存性阻害作用を発揮することを示す。濃度１６０ｎＭで、ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡは、１０ｎＭ大腸菌産生１６ＫｈＰＲＬと同等の活性を示す。これらの結果は、ＭＢＰと融合された、サル免疫不全ウイルスの融合タンパク質由来の傾斜ペプチドおよびβ−アミロイドＢタンパク質由来の傾斜ペプチドが、内皮細胞中のカスパーゼ３活性化を特異的に誘導できることを明瞭に示す。
【０１７５】
６．２．３．ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡはｉｎ ｖｉｔｒｏの毛細血管形成を妨げる
【０１７６】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡがＢＡＣＥ毛細血管形成をｉｎｖｉｔｒｏで阻害する能力を上記の通り研究した。図１４に示す通り、コラーゲンゲルに含まれる場合、毛細血管様構造由来のＢＡＣＥ（パネルＡ）、１６０ ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶ（パネルＢ）およびＭＢＰ-ＰＯ−ＢＡ（パネルＣ）は、毛細血管構造形成を阻害できる。これらの結果は、ＭＢＰと融合された、サル免疫不全ウイルスの融合タンパク質由来の傾斜ペプチドおよびβ−アミロイドＢタンパク質由来の傾斜ペプチドが、毛細血管ゲル形成を妨げることができることを示す。
【０１７７】
６．２．４．ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡはｉｎ ｖｉｖｏの毛細血管形成を妨げる
【０１７８】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡが毛細血管形成をｉｎ ｖｉｖｏで阻害する能力を上記の通り研究した。図１５に示す通り、無血管範囲は４０μｇのＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶまたはＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡを含むメチルセルロースディスク周囲の範囲に存在する。これらの結果は、ＭＢＰと融合された、サル免疫不全ウイルスの融合タンパク質由来の傾斜ペプチドおよびβ−アミロイドＢタンパク質由来の傾斜ペプチドが、毛細血管新生をｉｎ ｖｉｖｏで妨げることができることを示す。
【０１７９】
実施例７．ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ、ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨが内皮細胞の生存度を低減する能力は内皮細胞に特異的である
傾斜ペプチドの内皮細胞への作用が細胞特異的かどうかを決定するため、生存度検定を、ＢＡＣＥおよびＡＢＡＥ内皮細胞、および二種類の腫瘍細胞系、Ｂ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳がん細胞に対して実施した。生細胞を、細胞内エステラーゼの存在下で検出し、非蛍光カルセインＡＭ（エステル誘導体）の蛍光カルセインへの酵素的変換によって測定する。
【０１８０】
２５０００個のＢＡＣＥまたはＡＢＡＥ細胞を、１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地０．５ｍｌ中の２４−ウェルプレートに載せ、および組み換えタンパク質で２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１μＭカルセイン−ＡＭで３０分間インキュベートした。次いで蛍光度を５３５ｎｍにて蛍光測定器で測定した。生存度は蛍光の任意単位として表される。図１６に示す通り、４０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬおよび３２０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨはともに内皮細胞型を減少させる一方、８０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ、６４０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＧＨまたは６４０ｎＭ ＭＢＰは作用を示さない。陽性対照として、内皮細胞を１０ｎＭ １６ＫｈＰＲＬでインキュベートした。
【０１８１】
ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨの活性が内皮細胞に特異的であるかどうかを決定するため、Ｂ１６−Ｆ１０およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系細胞系およびＢ１６−Ｆ１０細胞を、それぞれ０．５ｍｌの１０％のＦＣＳ／ＲＰＭＩ培地および１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ４５００培地中の２４ウェルプレートに載せた。細胞を組み換えタンパク質またはカンプトテシンで７２時間処理した。細胞を洗浄し、カルセイン−ＡＭでインキュベートし、および蛍光を上記の通り決定した。図１６に示す通り、１０ｎｍの１６Ｋ ｈＰＲＬ、４０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ、３２０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨまたは６４０ｎＭ ＭＢＰは、Ｂ１６−Ｆ１０またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞生存度に影響を及ぼさない一方、カンプトテシンは影響する。これらの結果は、傾斜ペプチドの細胞生存度を低減する能力が内皮細胞に特異的であることを示す。同様の結果がＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡでも得られた。
【０１８２】
実施例８．１６ＫｈＰＲＬの傾斜ペプチドの斜角を破壊する変異はその抗血管新生活性を阻害する
８．１．ＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬおよびＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔ組み換え融合タンパク質の作製
【０１８３】
１６ＫｈＰＲＬの傾斜ペプチド領域が抗血管新生活性を担うかどうかを決定するため、１６ＫｈＰＲＬに変異を導入した。傾斜ペプチド配列ＦＬＳＬＩＶＳＩＬＲＳＷＮＥ（配列番号３）を配列ＦＮＳＬＩＳＳＩＬＲＶＷＬＥ（配列番号１０）で置換した。傾斜ペプチド領域で変異した１６ＫｈＰＲＬおよび１６ＫｈＰＲＬをＭＢＰと融合させて作製した。傾斜ペプチド領域で変異した１６ＫｈＰＲＬをＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔと呼んだ。対照として、我々はＭＢＰと融合した１６ＫｈＰＲＬを作製しおよびそれをＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬと呼んだ。
【０１８４】
１６ＫｈＰＲＬおよび変異１６ＫｈＰＲＬコード配列はＰＣＲによる増幅によって得られた。ＰＣＲに使用したオリゴヌクレオチドは、ＸｍｎＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ１６ＫｈＰＲＬまたは１６ＫｈＰＲＬコード配列の上流および下流に含むように設計された。各構造の一つのクローンを選択し、および配列が配列決定によって検証された。組み換えタンパク質を上記の通り作製しおよび精製した。
【０１８５】
８．２．ＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬおよびＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔの生物活性
【０１８６】
ＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬおよびＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔがカスパーゼ３活性化を誘導する能力を上記の通り測定した。図１７に示す通り、ＡＢＡＥ細胞をＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔで処理した場合、ＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬとの比較で、カスパーゼ３の活性化は用量依存的な形で４０〜５０％低減された。これらの結果は、傾斜ペプチド領域が１６ＫｈＰＲＬの活性に必須であることを示す。
【０１８７】
８．３．第二の傾斜ペプチド領域で変異したＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬの作製
【０１８８】
上記と同一の手順を用いて、第二の傾斜ペプチドがｈＰＲＬ配列中で同定された。この第二の傾斜ペプチドはＰＬＹＨＬＶＴＥＶＲＧＭＱＥＡ（配列番号８）である。
【０１８９】
１６ＫｈＰＲＬのこの第二の傾斜ペプチド領域が１６ＫｈＰＲＬ抗血管新生活性に関与するかどうかを決定するため、１６ＫｈＰＲＬのこの領域に変異を導入した。傾斜ペプチド配列ＰＬＹＨＬＶＴＥＶＲＧＭＱＥＡ（配列番号８）を配列ＰＱＨＹＬＥＴＶＶＲＧＭＬＥＡ（配列番号９）で置換した。二つの傾斜ペプチド領域で変異した１６ＫｈＰＲＬをと融合させて作製した。このタンパク質をＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔＰＯ１＋２と呼んだ。
【０１９０】
ＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔＰＯ１＋２コード配列は、ＰＣＲによる増幅によって得られた。ＰＣＲに使用したオリゴヌクレオチドは、ＸｍｎＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ１６ＫｈＰＲＬまたは１６ＫｈＰＲＬコード配列の上流および下流に含むように設計された。各構造の一つのクローンを選択し、および配列が配列決定によって検証された。組み換えタンパク質を上記の通り作製しおよび精製した。
【０１９１】
８．４．ＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬおよびＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔＰＯ１＋２の生物活性
【０１９２】
ＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬおよびＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔＰＯ１＋２がカスパーゼ３活性化を誘導する能力を上記の通り測定した。図１７パネルＢに示す通り、カスパーゼ３の活性化は、ＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬとの比較でＡＢＡＥ細胞がＭＢＰ−１６ＫｈＰＲＬｍｕｔＰＯ１＋２で処理された場合失われた。これらの結果は、両方の傾斜ペプチド領域が１６ＫｈＰＲＬの抗血管新生活性に必要であることを示す。
【０１９３】
実施例９：１６ＫｈＲＰＬは未変性条件で三量体である。
１６ＫｈＰＲＬの見かけの分子量（ａｐｐ．Ｍ．Ｍ．）を未変性および変性条件下で測定した。１６ＫｈＰＲＬをタブリュン（Ｔａｂｒｕｙｎ），Ｓ．Ｐ．，他 Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １７：１８１５−２３ （２００３）に記載の通り作製した。図１８に示す通り、変性条件下では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの泳動プロファイルから推論した１６ＫｈＰＲＬの見かけの分子量は約１６０００である。還元剤（s−メルカプトエタノール）の添加は泳動を変化させない。未変性条件での１６ＫｈＰＲＬの見かけの分子量を測定するため、スーパーロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。１６ＫｈＰＲＬは、我々のカラム較正によると、見かけの分子量４６７００に相当する主要ピークに溶出する。この１６ＫｈＰＲＬの計算分子量は１５９００であるため、このピークに溶出する１６ＫｈＰＲＬはおそらく三量体形である。β−ＭＥの添加はＳＤＳ−ＰＡＧＥ実施中の泳動プロファイルを変化させないため、これらの三量体は共有結合していない。イオン性界面活性剤または尿素のような変性剤の使用がこれらの多量体を分離する唯一の方法であるので、多量体が疎水性相互作用によって形成されることを示唆する。結果は１６ＫｈＰＲＬが未変性条件で三量体であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】図１は、Ａ．ｈＰＲＬのタンパク質配列（配列番号１４）を示す。ｈＰＲＬタンパク質は二つの傾斜ペプチドを含む：傾斜ペプチド構造を取る可能性が高い領域は太字（１番傾斜ペプチド配列番号３）および斜体（２番傾斜ペプチド配列番号８）で強調されている。アルファへリックス領域は下線で示される（キーラー（Ｋｅｅｌｅｒ），Ｃ．，他 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２８：１１０５−２１ （２００３））。Ｂ．ＰＲＬ／ＧＨファミリーの１６Ｋ断片中の傾斜ペプチド領域の整列。
【図２】図２は、実施例３．４に記載の、ＩＰＴＧ誘導の５時間後のＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬおよびＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ溶解度の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＭＭ：分子量マーカー；レーン１〜２：ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ細胞溶解物上清；レーン３〜４：ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ細胞溶解物上清；レーン５〜６：ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ細胞溶解物沈澱；レーン７〜８：ＭＢＰ−Ｐｏｍｕｔ−ＰＲＬ細胞溶解物沈澱；１、３、５、７：培養のＯ．Ｄ．＝１の１５０μｌ相当物が負荷された。２、４、６、８：培養のＯ．Ｄ．＝１の３００μｌ相当物が負荷された。矢印はＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬまたはＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬタンパク質を示す。
【図３】図３は、実施例３．６．１に記載の、アポトーシスの誘導のフローサイトメトリーによる分析を示す。ＢＡＣＥ細胞は、未処理のまま（Ａ）、または１０ｎＭＥ．ｃｏｌｉ産生１６Ｋ ｈＰＲＬ（Ｂ）、４０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ（Ｃ）、８０ｎＭ ＭＢＰ（Ｄ）または８０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ（Ｅ）で処理された。
【図４】図４は、実施例３．６．２に記載の、ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ、ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬおよびＭＢＰタンパク質によるカスパーゼ３の活性化を示す。基礎：未処理のＢＡＣＥ細胞。Ｅ．ｃｏｌｉ １６Ｋ ｈＰＲＬ：陽性対照。
【図５】図５は、実施例３．６．３に記載の、ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬによるＡＢＡＥ細胞増殖の阻害を示す。
【図６】図６は、実施例４．２．１により、ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨがＢＡＣＥ細胞のカスパーゼ３の活性化を誘導することを示す。
【図７】図７は、実施例４．２．２に記載の、ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨによるＡＢＡＥ細胞増殖の阻害を示す。
【図８】図８は、実施例６．２．１により、ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡがＢＡＣＥ細胞のカスパーゼ３の活性化を誘導することを示す。
【図９】図９は、ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬが、実施例３．６．４に記載のコラーゲンゲル検定法において、毛細血管形成をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することを示す。パネルＡ：未処理の細胞、パネルＢ：１０ｎＭ １６Ｋ ｈＰＲＬ、パネルＣ：４０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ、パネルＤ：８０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ。
【図１０】図１０は、ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬが、実施例３．６．５に記載のニワトリ絨毛尿膜検定法において、毛細血管形成をｉｎ ｖｉｖｏで阻害することを示す。
【図１１】図１１は、実施例４．２．３に記載により、ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨが、コラーゲンゲル検定法において、毛細血管形成をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することを示す。パネルＡ：未処理の細胞、パネルＢ：１０ｎＭ １６Ｋ ｈＰＲＬ、パネルＣ：８０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬ、パネルＤ：１６０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯｍｕｔ−ＰＲＬ。
【図１２】図１２は、実施例４．２．４により、ＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨが、ニワトリ絨毛尿膜検定法において、毛細血管形成をｉｎ ｖｉｖｏで阻害することを示す。
【図１３】図１３は、実施例６．２．２に記載の、ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡによる内皮細胞増殖の阻害を示す。
【図１４】図１４は、実施例６．２．３により、ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡが、コラーゲンゲル検定法において、毛細血管形成をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することを示す。パネルＡ：未処理の細胞、パネルＢ：１６０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶ、パネルＣ：１６０ｎＭ ＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡ。
【図１５】図１５は、実施例６．２．４により、ＭＢＰ−ＰＯ−ＳＩＶおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＢＡが、コラーゲンゲル検定法において、毛細血管形成をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することを示す。
【図１６】図１６は、実施例７により、ＭＢＰ−ＰＯ−ＰＲＬおよびＭＢＰ−ＰＯ−ＧＨが、内皮細胞（ＢＡＣＥおよびＡＢＡＥ細胞）の生存度を低減するが、腫瘍状（Ｂ１６−Ｆ１０およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）細胞は低減しないことを示す。
【図１７】図１７は、実施例８により、ＭＢＰと融合されおよび傾斜ペプチド領域で変異した１６Ｋ ｈＰＲＬ （ＭＢＰ−１６Ｋ ｈＰＲＬｍｕｔ）（パネルＡ）は、ＭＢＰと融合された非変異１６Ｋ ｈＰＲＬ（ＭＢＰ−１６Ｋ ｈＰＲＬ）よりも、内皮細胞においてカスパーゼ ３ 活性化を誘導する能力が低かった。１６Ｋ ｈＰＲＬの両方の傾斜ペプチドの変異は、１６ Ｋ ｈＰＲＬ活性を完全に廃する（パネルＢ）（実施例８．３および８．４）。
【図１８】図１８は、実施例９により、１６Ｋ ｈＰＲＬは変性条件では単量体であるが未変性条件では三量体であることを示す。パネルＡ：１６Ｋ ｈＰＲＬの１７％ ポリアクリルアミド ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１〜３：(−ＭＥの存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１：精製１６ＫｈＰＲＬ。レーン２：分子量マーカー。レーン３：この主題とは無関係のタンパク質。レーン４：(−ＭＥの非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ：精製１６ＫｈＰＲＬ。右側に、マーカーの分子量が示される（ｋＤａで）。パネルＢ：１６ＫｈＰＲＬのスーパーロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２分子篩での分析サイズ排除クロマトグラフィー。Ａ：デキストランブルー（ピーク１）、二量体（ピーク２）および単量体ＢＳＡ（ピーク３）、オボアルブミン（ピーク４）およびミオグロビン（ピーク５）を用いたカラムの較正；Ｂ：１６ＫｈＰＲＬ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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