(57)【要約】ABCA1依存経路を介した細胞からの脂質流出を促進する、複数の両親媒性αヘリックスドメインを有するペプチドまたはペプチド類似体が本明細書において開示される。異脂肪血症性障害を治療または阻害するためにマルチドメイン両親媒性αヘリックスペプチドまたはペプチド類似体を使用する方法も本明細書において提供される。細胞からのABCA1依存性脂質流出を促進する非細胞傷害性のペプチドを特定するための方法も本明細書において開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
2つまたはそれ以上の両親媒性αヘリックスドメインを含み、ABCA1依存経路による細胞からの脂質流出を促進する単離されたペプチドまたはペプチド類似体であって、第1の両親媒性αヘリックスドメインが第2の両親媒性αヘリックスドメインと比較して高い脂質親和性を示す、単離されたペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項２】
細胞からのABCA1依存性脂質流出を促進し、実質的に非細胞傷害性である、請求項1記載の単離されたペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項３】
第1の両親媒性αヘリックスドメインの疎水性モーメントスコア(Eisenbergスケール;100度αヘリックス)/残基が約0.34〜約0.60であり、第2の両親媒性αヘリックスドメインの疎水性モーメントスコア(Eisenbergスケール;100度αヘリックス)/残基が約0.1〜約0.33であり、第1の両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアと第2の両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアの差が少なくとも0.01である、請求項1または請求項2記載の単離されたペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項４】
少なくとも1つのさらなるペプチドドメインをさらに含む、請求項1または請求項2記載の単離されたペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項５】
さらなるペプチドドメインが、ヘパリン結合部位、インテグリン結合部位、P-セレクチン部位、TAT HIV配列、パニング配列、ペナトラチン(penatratin)配列、SAA C末端配列、SAA N末端配列、LDL受容体配列、改変18A配列、アポA-I Milano配列、6×His配列、ラクトフェリン配列、またはこれらの2つもしくはそれ以上の組み合わせを含む、請求項4記載の単離されたペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項６】
2つの両親媒性αヘリックスドメインを含み、SEQ ID NO:3〜45のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離されたペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項７】
請求項6記載のペプチドまたはペプチド類似体のいずれか1つをコードする、単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項1もしくは請求項2記載の単離されたペプチドまたはペプチド類似体あるいは請求項7記載の単離された核酸分子、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項９】
治療的有効量の請求項8記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体における異脂肪血症性障害または血管障害を治療または阻害する方法。
【請求項１０】
異脂肪血症性障害または血管障害が、高脂血症、高リポタンパク血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、HDL欠損症、アポA-I欠損症、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、血栓塞栓性卒中、末梢血管疾患、再狭窄、急性冠状動脈症候群、灌流後心筋障害、脈管炎、炎症、またはこれらの2つもしくはそれ以上の組み合わせを含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
異脂肪血症性障害または血管障害が高コレステロール血症である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
単離されたペプチドまたはペプチド類似体がSEQ ID NO:3〜45のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
さらなる脂質低下組成物を投与する工程をさらに含む、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
細胞からのABCA1依存性脂質流出を促進する実質的に非細胞傷害性のペプチドを特定するための方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)ペプチドを用いて細胞傷害試験を行う工程;および
(b)ABCA1発現細胞および非ABCA1発現細胞において脂質流出試験を行い、それによって、細胞からのABCA1依存性脂質流出を促進する実質的に非細胞傷害性のペプチドを特定する工程。
【請求項１５】
ペプチドが2つまたはそれ以上の両親媒性αヘリックスドメインを含有する、請求項14記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本開示は、ABCA1依存経路を介して細胞からの脂質流出を促進する、複数の両親媒性αヘリックスドメインを有するペプチドまたはペプチド類似体に関する。さらに、本開示は、細胞からの脂質流出を促進するマルチドメイン両親媒性αヘリックスペプチドを特徴付けるための方法に関する。ABCA1依存経路を介して細胞からの脂質流出を促進するマルチドメイン両親媒性αヘリックスペプチドは、異脂肪血症性障害および血管障害の治療および予防において有用である。
【背景技術】
【０００２】
背景
高密度リポタンパク質(HDL)による細胞からの過剰コレステロールの除去は、HDLアポリポタンパク質と、ABCA1(Oram and Yokoyama, J. Lipid Res. 37:2473-2491, 1996)などの細胞表面結合部位または受容体(Mendez et al., J. Clin. Invest. 94:1698-1705, 1994)との相互作用によって促進される。ABCA1は、ATP結合カセット輸送体ファミリーのメンバーであり(Dean and Chimini., J. Lipid Res. 42:1007-1017, 2001)、多くの細胞タイプによって発現される(Langmann et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:29-33, 1999)。ABCA1輸送体の変異は、過剰な細胞コレステロールの蓄積、低いHDL値、および高い心血管疾患リスクを特徴とするタンジール病につながる(Rust et al., Nat. Genet. 22:352-355, 1999; Bodzioch et al., Nat. Genet. 22:347-351, 1999; Brooks-Wilson et al., Nat. Genet. 22:336-345, 1999; Remaley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:12685-12690, 1999;およびLawn et al., J. Clin. Invest. 104:R25-R31, 1999)。タンジール病患者に由来する線維芽細胞は、コレステロールおよびリン脂質を細胞外アポリポタンパク質に流出させる初期の段階に欠陥がある(Francis et al., J. Clin. Invest. 96:78-87, 1995およびRemaley et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17:1813-1821, 1997)。
【０００３】
研究によって、アテローム性動脈硬化症イベントの発生と、HDLおよびその最も豊富なタンパク質構成成分であるアポリポタンパク質A-I(アポA-I)の値には逆の相関関係があることが証明されている(Panagotopulos et al., J. Biol. Chem. 277:39477-39484, 2002)。アポA-Iは、ABCA1トランスフェクト細胞からの脂質流出を促進することが示されている(Wang et al., J. Biol. Chem. 275:33053-33058, 2000; Hamon et al., Nat. Cell Biol. 2:399-406, 2000;およびRemaley et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 280:818-823, 2001)。しかしながら、アポA-IとABCA1の相互作用がどういったものであるかということは十分に理解されていない。他のいくつかの交換可能なタイプのアポリポタンパク質もABCA1トランスフェクト細胞から脂質を流出させることが示されている(Remaley et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 280:818-823, 2001)。交換可能なタイプのアポリポタンパク質は類似する一次アミノ酸配列を有さないが、これらは全て、タンパク質と脂質の相互作用を促進することが知られている構造モチーフである両親媒性ヘリックスを含有する(Segrest et al., J. Lipid Res. 33:141-166, 1992およびAnantharamaiah et al., J. Biol. Chem. 260:10248-10255, 1985)。動物実験から、アポA-Iまたはその変異体であるアポA-I Milano(位置173のアルギニンがシステインに置換されている)の静脈内注射によってアテローム性動脈硬化症が有意に後退することが分かっている(Rubin et al., Nature 353:265-267, 1991およびNissen et al., JAMA 290:2292-2300, 2003)。これらの結果から、apoA-1またはその誘導体はアテローム性動脈硬化症の治療および予防における潜在的な治療用化合物として魅力的なものとなっている。
【０００４】
アポリポタンパク質の物理的特性および生物学的特性を研究するためのモデルとして、アポリポタンパク質の短い合成ペプチド模倣物が用いられている(例えば、Fukushima et al., J. Am. Chem. Soc. 101:3703-3704, 1980; Kanellis et al., J. Biol. Chem. 255:11464-11472, 1980;ならびに米国特許第4,643,988号および同第6,376,464号を参照されたい)。これらの短い合成ペプチド模倣物には、例えば、ネイティブアポリポタンパク質から取られた単一ヘリックス、合成両親媒αヘリックス(Kanellis et al., J. Biol. Chem. 255: 11464-11472, 1980)、およびその誘導体が含まれる。短い合成両親媒性ヘリックスペプチドの例は、脂質流出を促進し、アテローム性動脈硬化症を阻害することが示されている(Garber et al., J. Lipid Res. 42:545-552, 2001; Navab et al., Circulation 105:290-292, 2002;および米国特許第6,156,727号)。しかしながら、これらのペプチドの中にはアテローム性動脈硬化症の予防に有益な効果を示すものもあるが、潜在的に細胞傷害性でもある(Remaley et al., J. Lipid Res. 44:828-836, 2003)。細胞傷害性は、細胞からの非特異的なABCA1非依存性脂質流出によって引き起こされると考えられている(Remaley et al., J. Lipid Res. 44:828-836, 2003)。従って、アテローム性動脈硬化症などの心血管疾患の治療および予防において使用するために、ABCA1依存経路による細胞からの特異的な脂質流出を促進するアポリポタンパク質の非細胞傷害性の合成ペプチド模倣物が必要とされている。
【発明の開示】
【０００５】
開示の概要
ABCA1依存経路を介して細胞からの脂質流出を促進する複数の両親媒性αヘリックスドメインを有するペプチドを含む単離されたペプチドおよびペプチド類似体が特定され、本明細書において説明される。様々な態様において、同じペプチドにおいて、第1の両親媒性αヘリックスドメインは第2の両親媒性αヘリックスドメインと比べて高い脂質親和性を示す。一例において、このマルチドメインペプチドは2つの両親媒性αヘリックスのドメインを含み、SEQ ID NO:3〜45のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を含む。
【０００６】
治療的有効量の単離されたマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体を被験体に投与する工程を含む、被験体における異脂肪血症性障害および血管障害を治療する方法も本明細書において説明される。本明細書において開示された単離されたマルチドメインペプチドを用いて治療することができる異脂肪血症性障害および血管障害には、高脂血症、高リポタンパク血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、HDL欠損症、アポA-I欠損症、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、血栓塞栓性卒中、末梢血管疾患、再狭窄、急性冠状動脈症候群、再灌流心筋障害、脈管炎、炎症、またはこれらの2もしくはそれ以上の組み合わせが含まれるが、これに限定されない。
【０００７】
細胞からのABCA1依存性脂質流出を促進する実質的に非細胞傷害性のペプチドを特定する方法も説明される。この方法では、ペプチドを用いて1つまたは複数の細胞傷害試験が行われ、ABCA1発現細胞および非ABCA1発現細胞に対して1つまたは複数の脂質流出試験が行われ、それによって、細胞からのABCA1依存性脂質流出を促進する、1つまたは複数の実質的に非細胞傷害性のペプチドが特定される。このような方法において使用するための例示的なペプチドには、2またはそれ以上の両親媒性αヘリックスドメインを含有するペプチドが含まれる。
【０００８】
以下および他の特徴および利点は、いくつかの態様の以下の詳細な説明からさらに明らかになるだろう。詳細な説明は添付の図面を参照して進行する。
【０００９】
詳細な説明
I.略語
ABCA1:ATP結合カセット輸送体A1
アポA-I:アポリポタンパク質A-I
DMPC:ジミリストイルホスファチジルコリン
HDL:高密度リポタンパク質
HPLC:高圧液体クロマトグラフィー
LDL:低密度リポタンパク質
RBC:赤血球
【００１０】
II.用語
特別の定めの無い限り、技術用語は従来の用法に従って用いられる。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII, publishued by Oxford University Press, 2000 (ISBN 019879276X)、Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publishued by Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829)、およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publishued by Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341)、ならびに他の同様の参考文献において見つけることができる。
【００１１】
本明細書で使用する単数形の用語「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り複数の指示物を含む。同様に、語句「または」は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り「および」を含むことが意図される。また、本明細書で使用する用語「含む(comprises)」は「含む(includes)」を意味する。従って、「AまたはBを含む(comprising A or B)」は、「A、B、またはAおよびBを含む(including A, B, or A and B)」を意味する。さらに、核酸またはポリペプチドについて、全ての塩基サイズおよびアミノ酸サイズならびに全ての分子量または分子量値は近似であり、説明のために示されていると理解されるはずである。本発明の実施または試験において、本明細書に記載のものと同様のまたは等価な材料および方法を使用することができるが、適切な材料および方法を下記で説明する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。コンフリクトの場合、用語の説明を含む本明細書は調整する。材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を目的としない。
【００１２】
本開示の様々な態様を検討しやすくするために、特定の用語を以下で説明する。
【００１３】
アルカン:
炭化水素の一種。この分子は最大限可能な数の水素原子を有し、従って、二重結合を有さない(すなわち、飽和している)。脂肪族炭化水素とも知られる非環式アルカンの一般式はCnH2n+2である。可能性のある最も簡単なアルカンはメタン(CH4)である。
【００１４】
アルキル基:
メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどなどの、1〜24個の炭素原子の分枝または非分枝の飽和炭化水素基を指す。「低級アルキル」基は、1〜10個の炭素原子を有する分枝または非分枝の飽和炭化水素である。
【００１５】
両親媒性:
両親媒性分子は、疎水(無極性)基と親水(極性)基の両方を含有する。疎水基は、長い炭素鎖、例えば、式CH3 (CH2)n (式中、nは、一般的に、約4〜約16を上回るか、または約4〜約16である)を有する炭素鎖などのアルキル基でもよい。このような炭素鎖は、任意に、1つまたは複数の分枝も含み、ここで、水素は脂肪族部分(例えば、アルキル基)で置換されている。疎水基はまたアリール基も含んでよい。親水基は、以下:アニオン性分子(例えば、脂肪酸、硫酸、もしくはスルホン酸)またはカチオン性分子などのイオン分子、両性分子(例えば、リン脂質)、あるいは非イオン性分子(例えば、小さなポリマー)の1つまたは複数でもよい。
【００１６】
両親媒性分子の一例は両親媒性ペプチドである。両親媒性ペプチドはまた、ヘリックスの一方の面に親水性アミノ酸残基を有し、反対の面に疎水性アミノ酸残基を有するヘリックスペプチドと説明することもできる。任意に、本明細書に記載のペプチドは、脂質または脂質界面の存在下などの生理学的環境において両親媒性ヘリックスを形成する。
【００１７】
類似体、誘導体、または模倣物:
類似体は、化学構造の点で親化合物と異なる分子、例えば、ホモログ(アルキル鎖の長さが異なるなど化学構造の増加分だけ異なる)、分子の断片、1つまたは複数の官能基だけ異なる構造、イオン化の変化である。構造類似体は、多くの場合、Remington (The Science and Practice of Pharmacology, 19th Edition (1995), chapter 28)に開示される技法などの技法を用いた定量的構造活性相関(QSAR)を用いて見出される。誘導体は、基本構造から誘導された生物学的に活性な分子である。模倣物は、生物学的に活性な分子などの別の分子の活性を模倣する分子である。生物学的に活性な分子は、ある化合物の生物学的活性を模倣する化学構造を含んでもよい。
【００１８】
動物:
生きた多細胞脊椎動物。このカテゴリーには、例えば、哺乳動物および鳥類が含まれる。用語「哺乳動物」は、ヒトおよび非ヒトの哺乳動物を両方とも含む。同様に、用語「被験体」は、ヒトおよび獣医学に関する被験体、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含む。
【００１９】
抗体:
免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされている1つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質(またはタンパク質複合体)。認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらは順に、それぞれ、免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを規定する。
【００２０】
免疫グロブリン(抗体)の基本構造単位は一般的に四量体である。それぞれの四量体は同じ2対のポリペプチド鎖からなり、それぞれの対には1つの「軽鎖」(約25kDa)および1つの「重鎖」(約50〜70kDa)がある。それぞれの鎖のN末端は、主に抗原認識を担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。用語「可変領域軽鎖」(VL)および「可変領域重鎖」(VH)は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００２１】
本明細書で使用する用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンならびに多数の十分に特徴付けられたフラグメントを含む。例えば、標的タンパク質(またはタンパク質もしくは融合タンパク質内のエピトープ)に結合する、Fab、Fv、および短鎖Fv(SCFv)もまた、タンパク質(またはエピトープ)に特異的な結合剤である。これらの抗体フラグメントは以下の通りである。(1)Fab、インタクトな軽鎖および重鎖の一部を生じるように、抗体全体を酵素パパインで消化することによって生成した一価の抗原結合フラグメントを含有する抗体分子フラグメント;(2)Fab'、インタクトな軽鎖および重鎖の一部を生じるように、抗体全体をペプシンで処理し、その後に、還元することによって得られた抗体分子フラグメント、抗体1分子当たり2つのFab'フラグメントが得られる;(3)(Fab') 2 、後で還元を行うことなく、抗体全体を酵素ペプシンで処理することによって得られた抗体フラグメント;(4)F(ab') 2 、2つのジスルフィド結合によって一緒になった、2つのFab'フラグメントの二量体;(5)Fv、2本の鎖として発現された、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含有する遺伝子操作フラグメント;および(6)単鎖抗体、遺伝子融合した単鎖分子として、軽鎖可変領域と重鎖可変領域が適切なポリペプチドリンカーによって結合している遺伝子操作された分子。これらのフラグメントを作成する方法は日常的な方法である(例えば、Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999を参照されたい)。
【００２２】
本開示の方法および組成物において使用するための抗体はモノクローナル抗体でもよく、ポリクローナル抗体でもよい。単なる例として、モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein (Nature 256:495-97, 1975)の古典的な方法またはその派生方法に従ってマウスハイブリドーマから調製することができる。モノクローナル抗体を作成するための詳細な手順は、Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999に記載されている。
【００２３】
ドメイン:
タンパク質のドメインは、共通の構造特性、生理化学特性、および機能特性を有するタンパク質部分、例えば、疎水性ドメイン、極性ドメイン、球状ドメイン、ヘリックスドメイン、または性質を共有するタンパク質部分、例えば、DNA結合ドメイン、ATP結合ドメインなどである。
【００２４】
異脂肪血症性障害:
任意のまたは全ての血中脂質または血中リポタンパク質の量の変化に関連する障害。異脂肪血症性障害には、例えば、高脂血症、高リポタンパク血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、HDL欠損症、アポA-I欠損症、および心血管疾患(すなわち、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、および再狭窄)が含まれる。
【００２５】
流出:
流れ出るプロセス。本明細書に記載の結果に適用される場合、脂質流出は、コレステロールおよびリン脂質などの脂質が、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質ペプチド模倣物などのアクセプターと複合体を形成し、小胞または細胞から除去されるプロセスを指す。「ABCA1依存性脂質流出」(または「ABCA1依存経路」による脂質流出)は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質のペプチド模倣物が細胞に結合し、ABCA1輸送体によって促進されるプロセスによって細胞から脂質を流出させるプロセスを指す。
【００２６】
ヘリックス:
高分子のバックボーン結合の周りに規則正しく回転を繰り返すことによって生じる、らせん状の分子コンホメーション。
【００２７】
疎水性:
疎水(または親油)基は電気的に中性であり、無極性であり、従って、他の中性および無極性の溶媒または分子環境を好む。疎水性分子の例には、アルカン、油、および脂肪が含まれる。
【００２８】
疎水性モーメント(μH):
ペプチドまたは他の分子における両親媒性の程度(すなわち、疎水性の非対称性の程度)の尺度の1つ。これは、ペプチドの全ての疎水性指標のベクトル和を残基数で割ったものである。従って、疎水性モーメントは、アミノ酸1残基当たりの、異なる旋光角について測定されたペプチドの疎水性である。ある特定のペプチド配列のμHを計算する方法は当技術分野において周知であり、例えば、Eisenberg et al., Faraday Symp. Chem. Soc. 17: 109-120, 1982; Eisenberg et al., J. Mol. Biol. 179:125-142, 1984;およびKyte & Doolittle, J. Mol. Biol., 157: 105-132, 1982に記載されている。ある特定のペプチドについて得られる実際のμHは、ペプチドを構成するアミノ酸残基のタイプおよび総数に左右される。
【００２９】
異なる長さのペプチドの両親媒性は、平均疎水性モーメントによって直接比較することができる。平均疎水性モーメントは、μHをヘリックス中の残基数で割ることによって得ることができる。
【００３０】
両親媒性配列の疎水性モーメントを計算するために、ペプチド分析ツールプログラム(インターネットで入手可能なプログラムを含む)を使用することができる。例えば、ワールドワイドウェブ(www)のbbcm.units.it/〜tossi/HydroCalc/HydroMCalc.html#hmeanで入手可能なツールを参照されたい。このツールは、参照により本明細書に組み入れられる、Tossi et al. (「New Consensus hydrophobicity scale extended to non-proteinogenic amino acids」, PEPTIDES 2002, Proc. of 27th European Peptide Symposium, Sorrento, 2002)でも議論されている。当業者であれば、疎水性モーメントおよび両親媒性の他の比較測定値を計算することができる他の方法が分かるだろう。
【００３１】
親水性:
親水(または疎油)基は電気的に極性化しており、H結合が可能であるので、水中では油または他の「無極性」溶媒より容易に溶解することができる。
【００３２】
疾患の阻害または治療:
例えば、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患などの疾患のリスクのある被験体において、疾患、障害、または状態が完全に発生するのを阻害すること。「治療」は、疾患または病的状態が発生し始めた後に、疾患または病的状態の徴候または症状を寛解させる治療的介入を指す。疾患、病的状態、または症状に関して本明細書で使用する用語「寛解させる」は、治療の任意の観察可能で有益な効果を指す。有益な効果は、例えば、感受性のある被験体における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患の一部または全ての臨床症状の重篤度の低下、疾患の進行の遅延、疾患の再発数の減少、被験体の全体的な健康もしくは幸福の改善、または特定の疾患に特有の当技術分野において周知の他のパラメータによって証明することができる。
【００３３】
単離された/精製された:
「単離された」または「精製された」生物学的成分(例えば、核酸、ペプチド、またはタンパク質)は、実質的に、生物学的成分が天然に生じる生物の細胞にある他の生物学的成分、すなわち、他の染色体および染色体外のDNAおよびRNAならびにタンパク質から分離されているか、他の生物学的成分から離れて生成されているか、または他の生物学的成分から離れて精製されている。従って、「単離されている」核酸、ペプチド、およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸、ペプチド、およびタンパク質、ならびに化学合成された核酸またはタンパク質も含む。用語「単離された」または「精製された」は完全な精製を必要とせず、むしろ、相対的な用語と意図される。従って、例えば、単離された生物学的成分は、生物学的成分が天然環境において細胞内にある時より濃縮されているものである。好ましくは、調製物は、生物学的成分が、調製物の全ての生物学的成分内容物の少なくとも50％、例えば、少なくとも70％、少なくとも90％、少なくとも95％、またはそれ以上に相当するように精製されている。
【００３４】
標識:
別の分子の検出を容易にするために、その分子に直接的または間接的に結合している検出可能な化合物または組成物。標識の特定の非限定的な例には、蛍光タグ、酵素的結合、および放射性同位体が含まれる。
【００３５】
リンカー:
2つの他の分子を、共有結合、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、もしくは水素結合によってつなぐ分子。
【００３６】
脂質:
例えば、クロロホルムまたはエーテルなどの無極性溶媒によって細胞および組織から抽出することができる、水不溶性または部分的に水不溶性、油性または脂肪性の有機物質の一種。脂質のタイプには、トリグリセリド(すなわち、グリセリンおよび脂肪酸鎖からなる天然脂肪および油)、リン脂質(例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルイノシトール)、スフィンゴ脂質(例えば、スフィンゴミエリン、セレブロシド、およびガングリオシド)、ならびにステロール(例えば、コレステロール)が含まれる。
【００３７】
脂質親和性:
脂質に対する両親媒性αヘリックスの相対結合親和性の測定値。脂質親和性を求めるために、当業者周知の任意の数の方法を使用することができる。1つの態様において、両親媒性αヘリックスの脂質親和性は、両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアを計算することによって求められる。例えば、比較的高い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコア/残基は、Eisenbergスケール(100度αヘリックス)で約0.34を上回る、または約0.34であるのに対して、比較的低い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコア/残基は、Eisenbergスケールで約0.34未満である(Eisenberg et al., Faraday Symp. Chem. Soc. 17:109-120, 1982)。別の態様では、比較的高い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコア/残基は、Eisenbergコンセンサススケールで約0.40〜約0.60であるのに対して、低脂質親和性ヘリックスの疎水性モーメントスコア/残基は、コンセンサススケールで約0.20〜約0.40である (Eisenberg et al., PNAS 81:140-144, 1984およびEisenberg et al., J. Mol. Biol. 179:125-142, 1984)。複数の両親媒性αヘリックスドメインを有する、いずれか1つのペプチドまたはペプチド類似体では、比較的高い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアと、比較的低い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアの差はコンセンサススケールで少なくとも0.01であると理解されるはずである。ある態様において、この差は、0.02、0.05、0.08、または0.1など0.01を上回る。
【００３８】
他の態様において、両親媒性αヘリックスの脂質親和性は1つまたは複数の機能試験によって求められる。機能試験の特定の非限定的な例には、逆相HPLCにおける保持時間、表面単層排除圧力(surface monolayer exclusion pressure)(Palgunachari et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338, 1996)、リン脂質小胞への結合親和性(Palgunachari et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338, 1996)、およびDMPC小胞可溶化(Remaley et al., J. Lipid Res. 44:828-836, 2003)が含まれる。
【００３９】
両親媒性αヘリックスの脂質親和性を計算する代替法のさらなる非限定的な例には、総疎水性モーメント、総ペプチド疎水性、総ペプチド疎水性/残基、疎水面にあるアミノ酸の疎水性、平均相対疎水性モーメント、疎水面にあるアミノ酸1残基あたりの疎水性、およびリン脂質二重層へのペプチド透過予測値に基づく脂質親和性計算値が含まれる(Palgunachari et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338, 1996)。両親媒性ヘリックスの疎水性モーメントを計算するために、アミノ酸の異なるタイプの疎水性スケールも使用することができ、これから脂質親和性の異なる相対順位を得ることができる(Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982)。
【００４０】
非細胞傷害性:
非細胞傷害性の化合物は、細胞または被験体を治療するために通常用いられる投与量で細胞の生存率または増殖特徴に実質的に影響を及ぼさない化合物である。さらに、非細胞傷害性化合物を用いて処理された細胞では、LDHまたはヘモグロビンなどの細胞内内容物を放出する細胞のパーセントが低い(例えば、約10％またはそれ以下)。非細胞傷害性化合物によって細胞から脂質が流出すると、細胞膜の全体的な完全性を維持し、有意な細胞毒性につながらないプロセスによって細胞から脂質が除去される。
【００４１】
無極性:
無極性化合物は、正電荷または負電荷の集中がない化合物である。無極性化合物、例えば、油は水にあまり溶けない。
【００４２】
ペプチド:
モノマーがアミノ酸残基であり、アミノ酸残基がアミド結合によってつながれているポリマー。アミノ酸がα-アミノ酸である場合、L光学異性体またはD光学異性体を使用することができる。本明細書で使用する用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は任意のアミノ酸配列を含み、糖タンパク質などの改変配列を含むことが意図される。用語「ペプチド」は、具体的には、天然に生じるペプチドならびに組換えまたは合成により生成されたペプチドを含むことが意図される。用語「残基」または「アミノ酸残基」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に組み込まれるアミノ酸への言及を含む。
【００４３】
薬学的に許容される担体:
本開示において有用な薬学的に許容される担体(ビヒクル)は従来の担体である。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)は、1つまたは複数のマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体およびさらなる薬学的薬剤などの1つまたは複数の治療用化合物または分子の薬学的送達に適した組成物および製剤について述べている。
【００４４】
一般的には、担体の種類は、用いられている特定の投与方法に左右される。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどなどの薬学的および生理学的に許容される液体を含む注射用液体を含む。固体組成物(例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル形態)の場合、従来の無毒の固体担体は、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含んでもよい。生物学的に中性の担体に加えて、投与しようとする薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、またはpH緩衝剤などの少量の無毒の補助物質、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有してもよい。
【００４５】
リン脂質:
リン脂質は、水溶性極性頭部が(負に荷電したリン酸基によって)2つの水不溶性無極性尾部に結合したものからなる。尾部は両方とも脂肪酸からなり、それぞれ長さは約14〜約24炭素基である。水性環境に置かれると、リン脂質は二重層またはミセルを形成し、疎水性尾部は互いに尾を付けて並ぶ。これは、両側に親水性頭部を有する膜を形成する。リン脂質は、動物細胞膜の主要成分である脂質である。
【００４６】
極性:
極性分子は、正電荷および負電荷の分布の中心が一点に集まらない分子である。極性分子は、極性の尺度である双極子モーメントによって特徴付けられ、他の極性化合物に溶解し、無極性化合物に実質的に不溶性である。
【００４７】
組換え核酸:
天然に生じない配列、または別の方法で分離された2つの配列セグメントの人為的な組み合わせによって作成された配列を有する配列。この人為的な組み合わせは、多くの場合、化学合成によって達成され、より一般的には、単離された核酸セグメントの人為操作、例えば、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載の技法などの遺伝子工学的技法によって達成される。用語「組換え」は、単に、核酸の一部の付加、置換、または欠失によって変えられた核酸を含む。
【００４８】
治療有効量:
特定の薬剤による治療を受けている被験体において望ましい効果を得るのに十分な、薬剤の量。例えば、これは、被験体における異脂肪血症性障害(例えば、アテローム性動脈硬化症)の予防、寛解、および/または治療において有用なマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体の量でもよい。理想的には、薬剤の治療的有効量は、被験体において実質的な細胞傷害効果(例えば、膜微小可溶化)を引き起こすことなく異脂肪血症性障害(例えば、アテローム性動脈硬化症)を予防、寛解、および/または治療するのに十分な量である。被験体における異脂肪血症性障害(例えば、アテローム性動脈硬化症)を予防、寛解、および/または治療するのに有用な薬剤の有効量は、治療を受けている被験体、障害の重篤度、および治療用組成物の投与方法に左右される。
【００４９】
形質転換された:
「形質転換された」細胞は、分子生物学的技法によって核酸分子が導入されている細胞である。この用語は、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、およびパーティクルガンアクセラレーションによる裸のDNAの導入を含む、このような細胞に核酸分子が導入され得る全ての技法を含む。
【００５０】
III.いくつかの態様の概説
ABCA1依存経路を介して細胞からの脂質流出を促進する複数の両親媒性αヘリックスドメインを有する単離されたペプチドおよびペプチド類似体が本明細書において開示される。1つの態様において、マルチドメインペプチドは複数の両親媒性αヘリックスドメインを含み、第1の両親媒性αヘリックスドメインは第2の両親媒性αヘリックスドメインと比較して高い脂質親和性を示し(脂質親和性は、例えば、疎水性モーメントによって測定される;Eisenberg et al., Faraday Symp. Chem. Soc. 17:109-120, 1982; Eisenberg et al., PNAS 81:140-144, 1984;およびEisenberg et al., J. Mol. Biol. 179: 125-142, 1984を参照されたい)、ペプチドまたはペプチド類似体は、ABCA1依存経路によって細胞からの脂質流出を促進する。
【００５１】
任意に、細胞からのABCA1依存性脂質流出を促進する単離されたペプチドおよびペプチド類似体は、実質的に非細胞傷害性でもある。
【００５２】
特定の非限定的な例において、第1の両親媒性αヘリックスドメインの疎水性モーメントスコア(Eisenbergスケール;100度αヘリックス)/残基は約0.3〜約0.60であり、第2の両親媒性αヘリックスドメインの疎水性モーメントスコア/残基は約0.1〜約0.33であり、第1の両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアと第2の両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアの差は少なくとも0.01である。ある態様において、この差は、0.02、0.05、0.08、または0.1など0.01を上回る。例えば、5Aペプチド(SEQ ID NO:3)は、N末端脂質親和性ヘリックスについては疎水性モーメントスコア(Eisenbergスケール;100度αヘリックス)/残基が0.34であり、C末端の低脂質親和性ヘリックスについては疎水性モーメントスコア/残基が0.28である。別のスケール計算を使用すると、5Aペプチド(SEQ ID NO:3)は、N末端の高脂質親和性ヘリックスについては疎水性モーメントスコアが0.4905であり、C末端の低脂質親和性ヘリックスについては疎水性モーメントスコア/残基が0.3825である。任意に、ペプチド内で、比較的高い両親媒性ヘリックスと比較的低い両親媒性ヘリックスの順序を逆にすることができる。
【００５３】
0.83の最大スコアを有する「パーフェクト」両親媒性ヘリックスに対して標準化された相対平均疎水性モーメントスコアを使用すると、5Aペプチド(SEQ ID NO:3)の2つのヘリックスの値は0.42および0.34である。しかしながら、アミノ酸の疎水性を求めるために異なる物理的性質を使用することができ、その結果、ペプチドの疎水性モーメントを計算するために異なるスケールが得られることがよく認識されているだろう。これらの異なるスケールを用いて計算すると、疎水性スコアの絶対値および両親媒性ヘリックスの脂質親和の相対順位が変化し得る。例えば、Kyte & Doolittleスケール(Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982)を使用すれば、5AペプチドのN末端ヘリックスおよびC末端ヘリックスの疎水性モーメントスコアは1.47および1.26、相対平均疎水性モーメントスコア(パーフェクトヘリックス:2.8)は0.51および0.44になると分かるだろう。いくつかの異なるスコアリングシステムの混成物である複合コンセンサススケールを使用すれば、5AペプチドのN末端ヘリックスおよびC末端ヘリックスの疎水性モーメントスコアは4.01および2.02であり、相対平均疎水性モーメントスコア(パーフェクトヘリックス:6.3)は0.64および0.32になるだろう。このような全てのスケール、計算、および測定値は、当業者により認められているように使用、変換、および交換することができる。
【００５４】
複数の両親媒性αヘリックスドメインを有するペプチドの他の非限定的な代表例を、SEQ ID NO:4〜45に示した。
【００５５】
ABCA1依存経路を介した細胞からの脂質流出を促進し、さらなる機能ドメインまたはペプチドも含む、複数の両親媒性αヘリックスドメインを有する単離されたペプチドおよびペプチド類似体もまた本明細書において開示される。さらなる機能ドメインまたはペプチドの特定の非限定的な例には、ヘパリン結合部位、インテグリン結合部位、P-セレクチン部位、TAT HIV配列、パニング配列、ペナトラチン(penatratin)配列、SAA C末端配列、SAA N末端配列、LDL受容体配列、改変18A配列、アポA-I Milano配列、6×His配列、ラクトフェリン配列、またはこれらの2もしくはそれ以上の組み合わせが含まれる。
【００５６】
ABCA1依存経路を介した細胞からの脂質流出を促進する、複数の両親媒性αヘリックスドメインを有する1つまたは複数の単離されたペプチドまたはペプチド類似体を含む薬学的組成物も開示される。複数の両親媒性αヘリックスドメインを有する代表的なペプチドをSEQ ID NO:3〜45に示した。
【００５７】
別の態様において、被験体における異脂肪血症性障害および血管障害を治療または阻害するための方法が提供される。この方法は、ABCA1依存経路を介した細胞からの脂質流出を促進する、複数の両親媒性αヘリックスドメインを有する1つまたは複数の単離されたペプチドまたはペプチド類似体を含む、治療的有効量の薬学的組成物を被験体に投与する工程を含む。特定の非限定的な例において、異脂肪血症性障害および血管障害には、高脂血症、高リポタンパク血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、HDL欠損症、アポA-I欠損症、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、血栓塞栓性卒中、末梢血管疾患、再狭窄、急性冠状動脈症候群、および再灌流心筋障害が含まれる。提供される方法のさらに別の特定の例において、単離されたペプチドは2つの両親媒性αヘリックスドメインを含み、SEQ ID NO:3〜45に示したアミノ酸配列を有する。
【００５８】
細胞からのABCA1依存性脂質流出を促進する非細胞傷害性のペプチドを特定するための方法も開示される。
【００５９】
IV.マルチドメイン両親媒性ペプチド
HDLの最も優勢なタンパク質構成成分であるアポA-I(Panagotopulos et al., J. Biol. Chem. 277:39477-39484, 2002)は、界面活性剤様抽出プロセスによって細胞からの脂質流出を促進すると考えられている(Remaley et al., J. Lipid Res. 44:828-836, 2003)。ABCA1輸送体は、アポA-Iと細胞との結合を促進し、アポA-Iの界面活性剤様抽出プロセスによる除去を受けやすい脂質ドメインを作り出す脂質ミクロドメインを作り出すことによって、このプロセスを促進すると提案されている。他の交換可能なタイプの天然アポリポタンパク質の大部分と同様に、アポA-Iは脂質流出を促進するためにほぼ完全にABCA1の存在に依存している(Remaley et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 280:818-823, 2001)。さらに、脂質流出がアポA-Iおよび他の交換可能なタイプの天然アポリポタンパク質によって起こる時、非細胞傷害プロセスによって起こり、それによって細胞膜の完全性が維持される(Remaley et al., J. Lipid Res. 44:828-836, 2003)。アポA-Iは、広範囲の脂質親和性を有する少なくとも8個の大きな両親媒性ヘリックスドメインを含有する(Gillote et al., J. Biol. Chem. 274:2021-2028, 1999)。
【００６０】
アポA-Iの各ヘリックスの合成ペプチドが作成されており、比較的高い脂質親和性を有するアポA-Iの8個の大きな両親媒性ヘリックスのうち2個だけが単独で培養下の細胞からの脂質流出を促進できることが示されている(Gillote et al., J. Biol. Chem. 274:2021-2028, 1999およびPalgunachari et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338, 1996)。さらに、アポリポタンパク質の合成ペプチド模倣物は抗炎症性および抗酸化特性を有することが示されている(Van Lenten et al., Trends Cardiovasc. Med. 11 :155-161, 2001; Navab et al., Cur. Opin. Lipidol. 9:449-456, 1998; Barter et al., Cur. Opin. Lipidol. 13:285-288, 2002)。
【００６１】
ペプチドがABCA1輸送体による脂質流出を媒介するために高脂質親和性が必要な特徴であることが示されているために(Remaley et al., J. Lipid Res. 44:828-836, 2003)、あらかじめ、アポリポタンパク質合成ペプチド模倣物は高脂質親和性を有するように設計されている(Remaley et al., J. Lipid Res. 44:828-836, 2003; Segrest et al., J. Lipid Res. 33:141-166, 1992; Anantharamaiah et al., J. Biol. Chem. 260:10248-10255, 1985; Garber et al., J. Lipid Res. 42:545-552, 2001; Navab et al., Circulation 105:290-292, 2002;および米国特許第6,156,727号)。しかしながら、高脂質親和性を有するアポA-Iペプチド模倣物はまたABCA1輸送体とは無関係に脂質流出を促進できることも示されている(Remaley et al., J. Lipid Res. 44:828-836, 2003)。このようなペプチドは、ABCA1輸送体を発現しない細胞、および機能的なABCA1輸送体を含有しないタンジール病細胞からの脂質流出を促進することが示されている(Remaley et al., J. Lipid Res. 44:828-836, 2003)。さらに、高脂質親和性を有するアポA-I合成ペプチド模倣物はまた、パラホルムアルデヒドで固定されている細胞から脂質を除去する能力に基づいて、受動的な物理プロセスによって脂質を抽出することもできる(Remaley et al., J. Lipid Res. 44:828-836, 2003)。このABCA1非依存経路による細胞からの脂質流出は、細胞のLDH放出に基づいて、細胞に対して細胞傷害性であることが示されている(Remaley et al., J. Lipid Res. 44:828-836, 2003)。
【００６２】
細胞への望ましくない細胞傷害効果に加えて、ABCA1非依存性脂質流出は、アテローム硬化プロセスに冒されている細胞から脂質を除去するインビボでの能力を弱めることによって、このようなペプチドの治療利益を下げることもある。例えば、異脂肪血症性障害および血管障害を有する被験体でも、ほとんどの細胞は過剰な細胞コレステロールを有さず、従って、ABCA1輸送体を発現しない。アテローム性動脈硬化巣に存在する、マクロファージ、内皮細胞、および平滑筋細胞などの細胞は全て脂質が蓄積しやすく、過剰なコレステロールでいっぱいになった時にABCA1を発現する。これらの細胞によるABCA1の発現は、細胞のコレステロール含有率によって精巧に調節されることが示されている(Langmann et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:29-33, 1999)。細胞内コレステロールによるABCA1輸送体の誘導は、過剰な細胞内コレステロールに対する細胞の防御機構であり、アテローム性動脈硬化症の発症の予防に重要であることが示されている(Dean and Chimini, J. Lipid Res. 42:1007-1017, 2001)。ABCA1輸送体によるコレステロール除去に特異的でないアポリポタンパク質のペプチド模倣物は、ABCA1発現細胞からのコレステロール除去において治療有効性が低いだろう。なぜなら、これらのペプチドによって、より豊富にある非ABCA1発現細胞から除去されたコレステロールは、これらのペプチドがコレステロールに結合する全体の能力を下げるからである。従って、ABCA1輸送体を発現する細胞だけから脂質を選択的にかつ細胞傷害を起こさずに除去することが、アポリポタンパク質の治療用ペプチド模倣物の望ましい特性である。
【００６３】
本開示は、細胞傷害を起こさずに、ABCA1輸送体によって細胞から脂質を特異的に流出させる単離されたマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体を提供する。1つの態様において、このようなペプチドまたはペプチド類似体は、比較的高い脂質親和性(例えば、約0.3〜約0.60の疎水性モーメントスコア(Eisenbergスケール;100度αヘリックス)/残基) を示す両親媒性αヘリックスドメインおよび比較的低い脂質親和性(例えば、約0.1〜約0.33の疎水性モーメントスコア/残基)を有する第2の両親媒性αヘリックスドメインを含有し、比較的高い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアと比較的低い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアの差は少なくとも0.01である。ある態様において、この差は、0.02、0.05、0.08、または0.10など0.01を上回る。比較的高い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスが比較的低い脂質親和性を有する別のαヘリックスと結合しているペプチドは、ABCA1輸送体による細胞からの脂質の除去に特異的である。
【００６４】
マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体における両親媒性の程度(すなわち、疎水性の非対称性の程度)は、都合よく、両親媒性αヘリックスドメインそれぞれの疎水性モーメント(μH)を計算することによって定量することができる。ある特定のペプチド配列のμHを計算する方法は当技術分野において周知であり、例えば、Eisenberg et al., Faraday Symp. Chem. Soc. 17:109-120, 1982; Eisenberg et al., PNAS 81:140-144, 1984;およびEisenberg et al., J. Mol. Biol. 179:125-142, 1984に記載されている。ある特定のペプチド配列について得られた実際のμHは、ペプチドを構成するアミノ酸残基の総数に左右される。異なる長さのペプチドの両親媒性は、平均疎水性モーメントによって直接比較することができる。平均疎水性モーメントは、μHをペプチド中の残基数で割ることによって得ることができる。
【００６５】
別の態様において、このようなペプチドまたはペプチド類似体は、比較的高い脂質親和性(例えば、約0.30〜約0.60の疎水性モーメントスコア(Eisenbergスケール;100度αヘリックス)/残基)を示す両親媒性αヘリックスドメインおよび中程度の脂質親和性(例えば、約0.29〜約0.33の疎水性モーメントスコア(Eisenbergスケール;100度αヘリックス)/残基)有する第2の両親媒性αヘリックスドメインを含有し、比較的高い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアと比較的中程度の脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアの差は少なくとも0.01である。ある態様において、この差は、0.02、0.05、0.08、または0.1など0.01を上回る。このようなペプチドは、比較的高い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスおよび比較的低い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスを含有するペプチドと比較して、ABCA1輸送体に対する特異性が低いが、比較的高い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスドメインを2つ含有するペプチドより依然として細胞傷害性が低い。
【００６６】
細胞からのABCA1依存性コレステロール流出を媒介する複数の両親媒性αヘリックスドメインを有するマルチドメインペプチドの特定の非限定的な例を表1に示した。
【００６７】
（表１）細胞からのABCA1依存性コレステロール流出を媒介する例示的なマルチドメインペプチド
2008516605.tif 000002
【００６８】
本明細書において開示するマルチドメインペプチドにおいて、アミノ酸残基間の結合は、ペプチド結合またはアミド結合(すなわち、-C-C(O)NH-)でもよい。または、1つまたは複数のアミド結合は、アミド以外の結合、例えば、置換アミドで置換されていてもよい。置換アミドには、一般的には、式-C(O)NR-(式中、Rは、(C1-C6)アルキル、置換(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルケニル、置換(C1-C6)アルケニル、(C1-C6)アルキニル、置換(C1-C6)アルキニル、(C5-C20)アリール、置換(C5-C20)アリール、(C6-C26)アルカリール、置換(C6-C26)アルカリール、5-20員環ヘテロアリール、置換5-20員環ヘテロアリール、6-26員環アルクヘテロアリール(alkheteroaryl)、および置換6-26員環アルクヘテロアリールである)の基が含まれるが、これに限定されない。さらに、1つまたは複数のアミド結合は、ペプチドの構造または活性を著しく妨げないペプチドミメティックまたはアミド模倣物部分で置換されてもよい。適切なアミド模倣物部分は、例えば、Olson et al., J. Med. Chem. 36:3039-3049, 1993に記載されている。
【００６９】
さらに、本明細書において開示する代表的なマルチドメインペプチドにおいて、アミノ末端およびカルボキシ末端は様々な官能基との結合によって改変することができる。アポリポタンパク質の合成ペプチド模倣物の末端電荷の中和は脂質親和性を高めることが示されている(Yancey et al., Biochem. 34:7955-7965, 1995; Venkatachalapathi et al., Protein: Structure, Function and Genetics 15:349-359, 1993)。例えば、両親媒性ペプチドのアミノ末端のアセチル化はペプチドの脂質親和性を高める(Mishra et al., J. Biol. Chem. 269:7185-7191, 1994)。可能性のある他の末端改変は、例えば、Brouillette et al., Biochem. Biophys. Acta 1256: 103-129, 1995: Mishra et al., J. Biol. Chem. 269:7185-7191, 1994;およびMishra et al., J. Biol. Chem. 270:1602-1611, 1995に記載されている。
【００７０】
さらに、本明細書において開示する代表的なマルチドメインペプチドにおいて、アミノ酸Proは、複数の両親媒性αヘリックスを連結するのに用いられる。しかしながら、複数の両親媒性αヘリックスドメインを機能的に分離する、グリシン、セリン、スレオニン、およびアラニンなどの他の適切なアミノ酸を使用することができる。ある態様において、グリシン、セリン、スレオニン、およびアラニンなどの連結用アミノ酸は連結にβターンを付与する能力を有する。さらに、2またはそれ以上のアミノ酸、またはH2N(CH2) nCOOH(式中、nは1〜12の整数である)などの二官能性有機化合物を含有する大きなリンカーも使用することができる。このようなリンカー、ならびにこのようなリンカーおよびこのようなリンカーを取り込んているペプチドを作成する方法の例は当技術分野において周知である(例えば、Huning et al., Chem. Ber. 100:3039-3044, 1974およびBasak et al., Bioconjug. Chem. 5:301-305, 1994を参照されたい)。
【００７１】
ペプチドの1つまたは複数のアミノ酸が別のアミノ酸残基で置換されているマルチドメインペプチドの改変形も本開示に含まれる。最も簡単な改変は、1つまたは複数のアミノ酸を、類似した生理化学的特性および/または構造特性を有するアミノ酸で置換することを伴う。これらのいわゆる保存的置換は、結果として得られるペプチドの活性および/または構造に最小限の影響しか及ぼさない可能性が高い。保存的置換の例を以下に示した。
2008516605.tif 000003
【００７２】
保存的置換は、一般的には、(a)置換領域においてペプチドバックボーンの構造を、例えば、ヘリックスコンホメーションとして維持する、(b)標的部位において分子の電荷もしくは疎水性を維持する、または(c)側鎖の容積を維持する。
【００７３】
アミノ酸は、典型的に、側鎖に従って、極性、疎水性、酸性、塩基性、および芳香族を含む1つまたは複数のカテゴリーに分類される。極性アミノ酸の例には、ヒドロキシル、スルフヒドリル、およびアミドなどの側鎖官能基を有するアミノ酸、ならびに酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸が含まれる。極性アミノ酸には、アスパラギン、システイン、グルタミン、ヒスチジン、セレノシステイン、セリン、スレオニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれるが、それに限定されるわけではない。疎水性アミノ酸または無極性アミノ酸の例には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、プロリン、メチオニン、およびフェニルアラニンなどがあるが、それに限定されるわけではない、無極性脂肪族側鎖を有する残基が含まれる。塩基性アミノ酸残基の例には、アミノ基またはグアニジノ基などの塩基性側鎖を有する残基が含まれる。塩基性アミノ酸残基には、アルギニン、ホモリジン、およびリジンが含まれるが、それに限定されるわけではない。酸性アミノ酸残基の例には、カルボキシ基などの酸性側鎖官能基を有する残基が含まれる。酸性アミノ酸残基には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれるが、それに限定されるわけではない。芳香族アミノ酸には、芳香族側鎖基を有するアミノ酸が含まれる。芳香族アミノ酸の例には、ビフェニルアラニン、ヒスチジン、2-ナフチルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれるが、それに限定されるわけではない。アミノ酸の中には、1つを超えるグループに分類されるものもあることに注意する。例えば、ヒスチジン、トリプトファン、およびチロシンは、極性アミノ酸と芳香族アミノ酸の両方に分類される。前記のグループのそれぞれに分類されるさらなるアミノ酸は当業者に公知である。
【００７４】
一般的に、ペプチドの特性に最大の変化をもたらすと予想される置換、例えば、(a)親水性残基、例えば、セリルまたはスレオニルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルの代わりに(または疎水性残基によって)置換されている変化;(b)システインまたはプロリンが他の任意の残基の代わりに(または他の任意の残基によって)置換されている変化;(c)電気陽性側鎖、例えば、リジル、アルギニル、またはヒスタジルを有する残基が電気陰性残基(例えば、グルタミルもしくはアスパルチル)の代わりに(または電気陰性残基によって)置換されている変化;あるいは(d)嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが側鎖を有さない残基、例えば、グリシンの代わりに(または側鎖を有さない残基によって)置換されている変化は非保存的である。
【００７５】
両親媒性ヘリックスの脂質親和性は、主に、ヘリックスの疎水面にあるアミノ酸残基の疎水性によるものであるので(Eisenberg et al., PNAS 81:140-144, 1984およびEisenberg et al., J. Mol. Biol. 179:125-142, 1984)、両親媒性ヘリックスの全体の脂質親和性は、疎水性アミノ酸を極性の高いアミノ酸で置換することによって下げることができる。1つの態様において、37-pAペプチドの疎水面にある疎水性アミノ酸(例えば、Phe、Leu、またはVal)が、Phe、Leu、およびValより疎水性の低いAlaで置換された(Eisenberg et al., PNAS 81:140-144, 1984およびEisenberg et al., J. Mol. Biol. 179:125-142, 1984)。特定の非限定的な例には、5A-37pAペプチド(SEQ ID NO:3)、1A-37pAペプチド(SEQ ID NO:4)、2A-37pAペプチド(SEQ ID NO:5)、3A-37pAペプチド(SEQ ID NO:6)、および4A-37pAペプチド(SEQ ID NO:7)が含まれる。
【００７６】
別の態様において、37-pAペプチドの疎水面にある疎水性アミノ酸(例えば、Phe、Leu、またはVal)は、Phe、Leu、およびValより疎水性の低いGlyで置換することができる(Eisenberg et al., PNAS 81:140-144, 1984およびEisenberg et al., J. Mol. Biol. 179:125-142, 1984)。特定の非限定的な例には、SEQ ID NO:8〜10に示したペプチドが含まれる。置換のためにAlaまたはGlyの代わりに、他のわずかに疎水性のアミノ酸を使用することができる(Eisenberg et al., PNAS 81:140-144, 1984およびEisenberg et al., J. Mol. Biol. 179:125-142, 1984)。
【００７７】
マルチドメインペプチドのアミノ酸残基は、遺伝子にコードされている天然のアミノ酸に加えて、天然の非コードアミノ酸および合成アミノ酸で置換されてもよい。有用な置換をもたらす、ある特定の一般的に生じるアミノ酸には、β-アラニンおよび3-アミノプロピオン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、4-アミノ酪酸などの他のω-アミノ酸;α-アミノイソ酪酸;ε-アミノヘキサン酸;δ-アミノ吉草酸;N-メチルグリシンまたはサルコシン;オルニチン;シトルリン;t-ブチルアラニン;t-ブチルグリシン;N-メチルイソロイシン;フェニルグリシン;シクロヘキシルアラニン;ノルロイシン;ナフチルアラニン;4-クロロフェニルアラニン;2-フルオロフェニルアラニン;3-フルオロフェニルアラニン;4-フルオロフェニルアラニン;ペニシラミン;1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸;β-2-チエニルアラニン;メチオニンスルホキシド;ホモアルギニン;N-アセチルリジン;2,4-ジアミノ酪酸;2,3-ジアミノ酪酸;p-アミノフェニルアラニン;N-メチルバリン;ホモシステイン;ホモフェニルアラニン;ホモセリン;ヒドロキシプロリン;ホモプロリン;N-メチル化アミノ酸;およびペプトイド(N-置換グリシン)が含まれるが、これに限定されない。
【００７８】
ある特定の態様において、マルチドメインペプチドのアミノ酸はL-アミノ酸で置換されるが、置換はL-アミノ酸に限定されない。従って、マルチドメインペプチドの改変形も本開示に含まれる。ここで、L-アミノ酸は同じD-アミノ酸(例えば、L-Arg→D-Arg)または保存的置換D-アミノ酸(例えば、L-Arg→D-Lys)で置換され、逆もまた同じである。特定の非限定的な例には、SEQ ID NO:27〜30に示したペプチドが含まれる(表1を参照されたい;置換されたアミノ酸に下線を引いた)。
【００７９】
アミノ酸を置換することに加えて、両親媒性αヘリックスドメインの脂質親和性を小さくするために、他の方法を使用することができる。このような方法の例には、ヘリックスドメインの短縮(特定の非限定的な例には、SEQ ID NO:11〜14に示したペプチドが含まれる)、ヘリックスの相を変えるような1つまたは複数のアミノ酸の付加または欠失(特定の非限定的な例には、それぞれSEQ ID NO:19〜22および15〜18に示したペプチドが含まれる)、ならびに正電荷残基の位置と負電荷残基の位置を交換することによる極性面のA型両親媒性ヘリックス電荷分布の変化(特定の非限定的な例には、SEQ ID NO:23〜26に示したペプチドが含まれる; Segrest et al., Adv. Protein Chem. 45:303-369, 1994)が含まれる。さらなる方法には、例えば、天然の高脂質親和性ヘリックスと人為的に設計した低脂質親和性ヘリックスの組み合わせ(特定の非限定的な例には、SEQ ID NO:31〜34に示したペプチドが含まれる)、天然の低脂質親和性ヘリックスと人為的に設計した高脂質親和性ヘリックスの組み合わせ(特定の非限定的な例には、SEQ ID NO:35〜38に示したペプチドが含まれる)、および隣接しない天然の低脂質親和性ヘリックスと天然の高脂質親和性ヘリックスの組み合わせ(特定の非限定的な例には、SEQ ID NO:39〜42に示したペプチドが含まれる)が含まれる。疎水面と親水面の境界にあるLys残基のArg(両親媒性ペプチドがリン脂質二重層に入り込む能力を弱める)への置換(Palgunachari et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338, 1996)は、両親媒性αヘリックスドメインの脂質親和性を下げるさらなる方法である(特定の非限定的な例には、SEQ ID NO:43〜45に示したペプチドが含まれる)。
【００８０】
両親媒性ヘリックスに対するこれらの変化の多くはペプチドの疎水性モーメントの低下に反映される。しかしながら、両親媒性ヘリックスの改変の中には疎水性モーメント計算値を変えない場合があるが、ペプチドの脂質親和性を弱めるものもある(例えば、D-アミノ酸置換、極性面残基の電荷分布に対する変化、およびLys残基からArg残基への置換)。このような場合、ペプチドの脂質親和性に及ぼす変化の影響を評価するために、逆相HPLCにおける保持時間などの脂質親和性の機能試験を使用することができる(例えば、図8を参照されたい)。本明細書において開示するマルチドメインペプチドの脂質親和性を測定するのに使用することができる機能試験のさらなる非限定的な例には、表面単層排除圧力(Palgunachari et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338, 1996)、リン脂質小胞への結合親和性(Palgunachari et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338, 1996)、およびDMPC小胞可溶化(Remaley et al., J. Lipid Res. 44:828-836, 2003)が含まれる。マルチドメインペプチドの脂質親和性予測値を計算する別の方法のさらなる例には、総疎水性モーメント、総ペプチド疎水性、総ペプチド疎水性/残基、疎水面にあるアミノ酸の疎水性、疎水面にあるアミノ酸1残基あたりの疎水性、およびリン脂質二重層へのペプチド透過予測値に基づく脂質親和性計算値が含まれる(Palgunachari et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.16:328-338, 1996)。マルチドメインペプチドの脂質親和性を評価するのに用いられる1つまたは複数のパラメータに関係なく、少なくとも1つのヘリックスが比較的高い脂質親和性を有し、少なくとも1つのヘリックスが比較的低い脂質親和性を有する、少なくとも2またはそれ以上のヘリックスを含有するペプチドは本開示に含まれるとみなされる。脂質親和性を計算するための疎水性モーメント計算の代わりに別の試験または別の計算が用いられる場合、高脂質親和性ヘリックスおよび低脂質親和性ヘリックスの脂質親和性の最適値は、細胞傷害性アッセイ法(例えば、図9を参照されたい)ならびに非ABCA1発現細胞およびABCA1発現細胞における脂質流出アッセイ法(例えば、図10を参照されたい)を行うことによって機能的に求めることができる。
【００８１】
複数の両親媒性αヘリックスドメインが、同じ配列または異なる配列を含む二量体、三量体、四量体、さらに高次のポリマー(すなわち、「多量体」)からなる、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体も本開示に含まれる。このような多量体は縦列反復の形をとってもよい。両親媒性αヘリックスドメインは互いに直接くっついていてもよく、1つまたは複数のリンカーによって隔てられていてもよい。両親媒性αヘリックスドメインは、頭部と尾部(すなわち、N末端とC末端)、頭部と頭部(すなわち、N末端とN末端)、尾部と尾部(すなわち、C末端とC末端)、および/またはこれらの組み合わせでつながれてもよい。1つの態様において、多量体は、2個、3個、4個、および約10個までの両親媒性αヘリックスドメインの縦列反復であるが、低い細胞傷害性でABCA1脂質流出を特異的に促進するという望ましい効果を有する任意の数の両親媒性αヘリックスドメインを使用することができる。
【００８２】
本開示のさらなる局面は、本明細書において開示するマルチドメインペプチドのアミノ酸配列に基づく類似体、変異体、誘導体、および模倣物を含む。典型的に、模倣化合物は、例えば、その選択されたペプチド、構造ドメイン、活性部位、または結合領域(例えば、ホモタイプ結合部位もしくはヘテロタイプ結合部位、触媒活性部位もしくは触媒活性ドメイン、受容体もしくはリガンドが結合する境界面またはドメイン、または構造モチーフ)の一次構造、二次構造、および/もしくは三次構造、ならびに/または電気化学的特徴を模倣する、(模倣化合物の少なくとも一部の)三次元構造を有する合成化合物である。模倣化合物は、多くの場合、本明細書において議論されるようにネイティブペプチドと望ましい生物学的活性(例えば、脂質と相互作用する能力)を共有する。典型的に、模倣化合物の少なくとも1つの生物学的活性は、模倣物のモデルであるネイティブペプチドの活性と比較して実質的に低くなく、多くの場合、ネイティブペプチドの活性と同じであるか、またはネイティブペプチドの活性より大きい。
【００８３】
対応するネイティブペプチドに対して同じ、類似する、高い、または低い生物学的活性を有するペプチド模倣物を構築するために当業者に周知の様々な技法を使用することができる。多くの場合、これらの類似体、変異体、誘導体、および模倣物は、対応するネイティブペプチドとは異なる、または対応するネイティブペプチドから改善した1つまたは複数の望ましい活性、例えば、溶解度、安定性、脂質相互作用、および/または加水分解もしくはタンパク質分解に対する感受性の改善した特徴を示す(例えば、Morgan and Gainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252, 1989を参照されたい)。さらに、本開示の模倣化合物は、高い細胞透過性、結合パートナーに対する大きな親和性および/もしくはアビディティ、ならびに/または長い生物学的半減期などの、治療への応用を促す他の望ましい特徴を有してもよい。本開示の模倣化合物は、部分的または完全にペプチドでないが、模倣化合物のモデルであるペプチドにおいて生じるアミノ酸残基の側鎖と同一の側鎖を有するバックボーンを有してもよい。いくつかのタイプの化学結合、例えば、エステル、チオエステル、チオアミド、レトロアミド、還元カルボニル、ジメチレン、およびケトメチレン結合は、プロテアーゼ耐性模倣化合物の構築におけるペプチド結合の一般的に有用な代用であることが当技術分野において公知である。
【００８４】
1つの態様において、ペプチド模倣物を生成するために、本開示内で有用なマルチドメインペプチドは、遺伝子によりコードされる20種類のアミノ酸(すなわちD-アミノ酸)の1つまたは複数の天然に生じる側鎖を、他の側鎖、例えば、アルキル、低級アルキル、4員環、5員環、6員環〜7員環の環状アルキル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ(低級アルキル)、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびその低級エステル誘導体などの基、ならびに4員環、5員環、6員環〜7員環の複素環で置換することによって改変される。例えば、プロリン残基の環の大きさを5員環から4員環、6員環、または7員環に変えたプロリン類似体を作成することができる。環式基は飽和でも不飽和でもよく、不飽和であれば、芳香族でも非芳香族でもよい。複素環式基は、1つまたは複数の窒素、酸素、および/または硫黄ヘテロ原子を含有してもよい。このような基の例には、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、モルホリニル(例えば、モルホリノ)、オキサゾリル、ピペラジニル(例えば、1-ピペラジニル)、ピペリジル(例えば、1-ピペリジル、ピペリジノ)、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル(例えば、1-ピロリジニル)、ピロリニル、ピロールイル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル(例えば、チオモルホリノ)、およびトリアゾリル基が含まれる。これらの複素環式基は置換されていてもよく、置換されていなくてもよい。基が置換されている場合、置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、または置換フェニルもしくは非置換フェニルでもよい。ペプチドならびにペプチド類似体および模倣物はまた、米国特許第4,640,835号、同第4,496,689号、同第4,301,144号、同第4,670,417号、同第4,791,192号、および同第4,179,337号に記載のように、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルカンのうちの1つまたは複数に共有結合してもよい。
【００８５】
本開示の範囲内にある他のペプチド類似体および模倣物には、グリコシル化変異体、および他の化学部分との共有結合コンジュゲートまたは凝集コンジュゲートが含まれる。共有結合誘導体は、当技術分野において周知の手段によって、官能基と、N末端またはC末端のアミノ酸側鎖に見られる基との連結によって調製することができる。これらの誘導体には、カルボキシル末端またはカルボキシル側鎖含有残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基のO-アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基(例えば、リジンまたはアルギニン)のN-アシル誘導体が含まれ得るが、それに限定されるわけではない。アシル基は、C3〜C18の通常のアルキルを含むアルキル部分の群より選択され、それによって、アルカノイルアロイル種を形成する。リン酸化アミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、もしくはホスホスレオニンを含む他のわずかな改変、またはリボシル基もしくは架橋試薬を含む他の部分を有するバージョンのネイティブ一次アミノ酸配列も包含される。
【００８６】
別の態様では、本明細書において開示するマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体に、検出可能な部分を連結して、ペプチド/ペプチド類似体と検出可能な部分のコンジュゲートを作成することができる。このような使用に適した検出可能な部分には、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が含まれる。本開示に意図される検出可能な部分には、免疫蛍光部分(例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなど)、放射性部分(例えば、3H、32P、125I、35S)、酵素部分(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ)、比色部分(例えば、コロイド金、ビオチン、着色ガラスまたはプラスチックなど)が含まれ得るが、これに限定されない。検出可能な部分は、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体のN末端および/またはC末端に連結することができる。任意に、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体と検出可能な部分の間にリンカーを含めることができる。
【００８７】
このような部分を検出する手段は当業者に周知である。従って、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出されてもよく、蛍光マーカーは、放出された光を検出する光検出器を用いて検出されてもよい。酵素標識は、典型的に、酵素に基質を与え、酵素が基質に作用することによって生じた反応生成物を検出することによって検出され、比色標識は、色の付いた標識を単に視覚化することによって検出される。
【００８８】
別の態様では、本明細書において開示するマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体に、さらなる機能ドメインまたはペプチドを連結して、ペプチド/ペプチド類似体と、さらなる機能ドメイン/ペプチドのコンジュゲートを作成することができる。さらなる機能ドメインまたはペプチドは、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体のN末端および/またはC末端に連結することができる。任意に、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体とさらなる機能ドメインまたはペプチドの間にリンカーを含めることができる。さらなる機能ドメインまたはペプチドは、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体が細胞傷害を起こさずに細胞から脂質を流出させる能力を高めてもよい。例示的なさらなる機能ドメイン/ペプチドには、表2に示したものが含まれる。
【００８９】
（表２）例示的なさらなる機能ドメイン
2008516605.tif 000004
【００９０】
細胞認識配列は、これらの配列を含有するマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体が細胞に結合する能力を高めることができ、細胞との結合は、ABCA1を介したコレステロール流出における必須の第1段階である、(Remaley et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 280:818-823, 2001)。細胞内部移行配列は、ペプチドの初期脂質付加が起こると提案されている細胞内区画へのマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体の細胞取り込みを高め(Neufeld et al., J. Biol. Chem. 279:15571-15578, 2004)、従って、脂質流出を促進することができる。中性コレステロール加水分解酵素を活性化する配列(Kisilevsky et al., J. Lipid Res. 44:2257-2269, 2003)は、細胞から流出する形態のコレステロールである細胞内遊離コレステロールの量を増やすことができる。同様に、ACATの阻害は、コレステロールからコレステリルエステルへのエステル化をブロックし、従って、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体による流出のための遊離コレステロールプールを増やす(Kisilevsky et al., J. Lipid Res. 44:2257-2269, 2003)。マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体を肝臓に標的化する配列は、コレステロールの肝臓の取り込みおよび胆汁への流出であるコレステロール逆転送の最終段階を促進することができる(Collet et al., J. Lipid Res. 40:1185-1193, 1999)。アポA-Iおよび合成ペプチド模倣物の有益な効果の一部は、これらの抗炎症性および抗酸化特性によるものだと考えられている(Van Lenten et al., J. Clin. Invest. 96:2758-2767, 1995)。酸化脂質を隔離するドメイン(Datta et al., J. Biol. Chem. 279:26509-26517, 2004)、抗酸化物質として作用するドメイン(Bielicki et al., Biochem. 41:2089-2096, 2002)、または脂質酸化を促進する重金属をキレート化するドメイン(Wakabayashi et al., Biosci. Biotechnol Biochem. 63:955-957, 1999)を含有する配列は、これらも脂質酸化を阻止することによってマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体の脂質流出特性を引き立たせることができる。
【００９１】
本開示によって意図されるリンカーは、2つのペプチドを互いに共有結合することができる任意の二官能性分子でよい。従って、適切なリンカーは、官能基がペプチドのN末端および/またはC末端と共有結合することができる二官能性分子である。ペプチドのN末端またはC末端に結合するのに適した官能基は当技術分野において周知である、同様に、このような共有結合形成をもたらすのに適した化学反応も当技術分野において周知である。
【００９２】
リンカーは、可撓性、剛性、または半剛性でもよい。適切なリンカーには、例えば、ProもしくはGlyなどのアミノ酸残基または約2〜約5個、10個、15個、20個、もしくはさらに多くのアミノ酸を含有するペプチドセグメント、H2N(CH2) nCOOH(式中、nは1〜12の整数である)などの二官能性有機化合物などが含まれる。このようなリンカーならびにこのようなリンカーおよびこのようなリンカーを取り込んているペプチドを作成する方法の例は当技術分野において周知である(例えば、Hunig et al., Chem. Ber. 100:3039-3044, 1974およびBasak et al., Bioconjug. Chem. 5:301-305, 1994を参照されたい)。
【００９３】
本開示に適用可能なコンジュゲーション方法には、非限定的な例として、還元的アミノ化、ジアゾカップリング、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド化、およびチオカルバモイル化学反応が含まれる。1つの態様において、両親媒性αヘリックスドメインは、コンジュゲーションの前に「活性化」される。活性化によって、コンジュゲーション反応が起こるのに必要な化学基が得られる。特定の非限定的な1つの例において、活性化工程は、アジピン酸ジヒドラジドによる誘導体化を含む。特定の非限定的な別の例において、活性化工程は、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオン酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルによる誘導体化を含む。特定の非限定的なさらに別の例において、活性化工程は、プロピオン酸スクシンイミジル3-(ブロモアセトアミド)による誘導体化を含む。さらに、誘導体化剤の非限定的な例には、ホルミル安息香酸スクシンイミジルおよびレブリン酸スクシンイミジルが含まれる。
【００９４】
V.マルチドメイン両親媒性ペプチドの合成および精製
本開示のマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は、当業者に公知の実質的に任意のペプチド調製法を用いて調製することができる。例えば、マルチドメインペプチドは、段階的な溶液ペプチド合成もしくは固相ペプチド合成、または組換えDNA法、またはその等価物を用いて調製することができる。
【００９５】
A.化学合成
D配置またはL配置を有する本開示のマルチドメインペプチドは、当技術分野において周知の自動固相手順によって容易に合成することができる。適切な合成は、「T-boc」または「F-moc」手順を用いて実施することができる。固相合成のための技法および手順は、Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, E. Atherton and R. C. Sheppard, 出版IRL, Oxford University Press, 1989に記載されている。または、マルチドメインペプチドは、例えば、Liu et al., Tetrahedron Lett. 37:933-936, 1996; Baca et al., J. Am. Chem. Soc. 117:1881-1887, 1995; Tam et al., Int. J. Peptide Protein Res. 45:209-216, 1995; Schnolzer and Kent, Science 256:221-225, 1992; Liu and Tam, J. Am. Chem. Soc. 116:4149-4153, 1994; Liu and Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6584-6588, 1994;およびYamashiro and Li, Int. J. Peptide Protein Res. 31:322-334, 1988)に記載のように、セグメント縮合によって調製することができる。これは、グリシン含有ペプチドに特によくあることである。本開示のマルチドメインペプチドを合成するのに有用な他の方法は、Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092, 1985に記載されている。
【００９６】
ペプチドおよびペプチド類似体合成の当業者に公知のさらなる例示的な技法は、Bodanszky, M. and Bodanszky, A., The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York, 1994;およびJones, J., Amino Acid and Peptide Synthesis, 2nd ed., Oxford University Press, 2002に開示されている。Bodanszky and Jonesの参考文献は、アミノ酸およびアミノ酸誘導体を活性化およびカップリングするためのパラメータおよび技法について詳しく述べている。さらに、この参考文献は、様々な有用な官能基および保護基を選択、使用、および除去する方法を開示している。
【００９７】
D配置またはL配置を有する本開示のマルチドメインペプチドはまた、合成ペプチドの商業的供給業者から容易に購入することもできる。このような供給業者には、例えば、Advanced ChemTech (Louisville, KY)、Applied Biosystems (Foster City, CA)、Anaspec (San Jose, CA)、およびCell Essentials (Boston, MA)が含まれる。
【００９８】
B.組換え合成
マルチドメインペプチド全体が遺伝子によりコードされるアミノ酸から構成されている場合またはマルチドメインペプチドの一部が遺伝子によりコードされるアミノ酸から構成されている場合、マルチドメインペプチドまたはその関連部分は従来の組換え遺伝子工学的技法を用いて合成することもできる。組換え生成のために、マルチドメインペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、適切な発現ビヒクル、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメント、またはRNAウイルスベクターの場合には複製および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入される。次いで、発現ビヒクルは、マルチドメインペプチドを発現する適切な標的細胞にトランスフェクトされる。次いで、発現ペプチドは、使用される発現系に応じて当技術分野において十分に確立された手順によって単離される。組換えタンパク質およびペプチドを生成するための方法は当技術分野において周知である(例えば、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, Ch. 17、およびAusubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999を参照されたい)。
【００９９】
生成効率を高めるために、ポリヌクレオチドは、酵素切断部位によって分けられた複数のマルチドメインペプチド単位をコードするように設計することができる。結果として生じたポリペプチドは、ペプチド単位を回収するために(例えば、適切な酵素による処理によって)切断することができる。これは、1つのプロモーターによって駆動されるペプチドの収率を高めることができる。1つの態様では、複数のペプチドをコードする1つのmRNAが転写され、各コード領域がcap非依存性翻訳制御配列、例えば、配列内リボソーム進入部位(IRES)に機能的に連結されるように、ポリシストロニックポリヌクレオチドを設計することができる。適切なウイルス発現系において用いられた時、mRNAによってコードされる各ペプチドは、例えば、IRESによって、転写物の内部で翻訳される。従って、ポリシストロニック構築物は1つの大きなポリシストロニックmRNAの転写を指示し、次に、ポリシストロニックmRNAは複数の個々のペプチドの翻訳を指示する。このアプローチはポリタンパク質の生成および酵素処理を無くし、1つのプロモーターによって駆動されるペプチドの収率を著しく高めることができる。
【０１００】
本明細書に記載のペプチドを発現するために、様々な宿主-発現ベクター系を使用することができる。これらの宿主-発現ベクター系には、適切なコード配列を含有する組換えバクテリオファージDNAまたはプラスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物;適切なコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターまたは菌類発現ベクターで形質転換された酵母または糸状菌;適切なコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス(baculovirus))に感染させた昆虫細胞系;適切なコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(cauliflower mosaic virus)(CaMV)もしくはタバコモザイクウイルス(tobacco mosaic virus)(TMV))に感染させた植物細胞系または適切なコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系;あるいは動物細胞系が含まれるが、これに限定されない。
【０１０１】
発現系の発現エレメントは強さおよび特異性の点で多種多様である。使用する宿主/ベクター系に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む任意の数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントを発現ベクターにおいて使用することができる。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lacハイブリッドプロモーター)などの誘導性プロモーターを使用することができる。昆虫細胞系におけるクローニングの場合、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを使用することができる。植物細胞系におけるクローニングの場合、植物細胞ゲノムに由来するプロモーター(例えば、熱ショックプロモーター、RUBISCO小サブユニットプロモーター、クロロフィルa/b結合タンパク質プロモーター)または植物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、CaMV 35S RNAプロモーター、TMVコートタンパク質プロモーター)を使用することができる。哺乳動物細胞系におけるクローニングの場合、哺乳動物細胞ゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス(adenovirus)後期プロモーター、ワクシニアウイルス(vaccinia virus)7.5Kプロモーター)を使用することができる。
【０１０２】
C.精製
本開示のマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などなどの当技術分野において周知の多くの技法によって精製することができる。特定のマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体を精製するのに用いられる実際の条件は、部分的に、合成法、および実効電荷、疎水性、親水性などの要因に左右され、当業者に明らかであろう。
【０１０３】
アフィニティクロマトグラフィー精製の場合、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体に特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体産生の場合、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体を注射することによって、 ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、これに限定されない様々な宿主動物を免疫化することができる。マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は、側鎖官能基または側鎖官能基に取り付けられたリンカーによって適切な担体(例えば、BSA)に取り付けることができる。免疫応答を高めるために、宿主種に応じて様々なアジュバントを使用することができる。アジュバントには、フロイントアジュバント(完全および不完全)、無機質ゲル(例えば、水酸化アルミニウム)、界面活性物質(例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、および油エマルジョン)、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG(bacilli Calmette-Guerin)およびコリネバクテリウム-バルバム(Corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒト用アジュバントが含まれるが、これに限定されない。
【０１０４】
追加免疫注射を定期的に与え、例えば、既知濃度の抗原に対する寒天での二重免疫拡散によって半定量的に求められるように、抗体価が低下し始めた時に、抗血清を採取することができる。例えば、Ouchterlony et al., Handbook of Experimental Immunology, Wier, D. (ed.), Chapter 19, Blackwell, 1973を参照されたい。抗体のプラトー濃度は、通常、0.1〜0.2mg/ml血清(約12μM)の範囲内にある。抗原に対する抗血清の親和性は、例えば、Fisher (Manual of Clinical Immunology, Ch. 42, 1980)によって述べられたように競合結合曲線を作成することによって求められる。
【０１０５】
マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体に対するモノクローナル抗体は、培養において連続細胞系によって抗体分子が産生される任意の技法、例えば、Kohler & Milstein (Nature 256:495-97, 1975)の古典的な方法、またはその派生方法を用いて調製することができる。簡単に述べると、マウスに、数マイクログラムの選択されたタンパク質免疫原(例えば、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体)を数週間にわたって繰り返し接種する。次いで、マウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。ポリエチレングリコールによって脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合し、アミノプテリン含有選択培地(HAT培地)において系を増殖させることによって、過剰な非融合細胞を破壊する。首尾よく融合した細胞を希釈し、希釈液のアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに入れ、培養物の増殖を続ける。Engvall (Meth. Enzymol., 70:419-39, 1980)によって最初に述べられた酵素結合免疫測定法(ELISA)またはその派生方法などのイムノアッセイ手順によってウェルの上清液中の抗体を検出することによって、抗体産生クローンを特定する。選択された陽性クローンを増殖させ、そのモノクローナル抗体産物を使用するために採取することができる。詳細なモノクローナル抗体産生手順は、Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999に記載されている。抗体を含有するポリクローナル抗血清は、適切な動物を、免疫原性を高めるために改変されていなくてもよく、改変されていてもよい少なくとも1種類のマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体を含むポリペプチドで免疫化することによって調製することができる。
【０１０６】
抗体全体の代わりに抗体フラグメントを使用することができ、原核生物宿主細胞において容易に発現させることができる。「抗体フラグメント」とも呼ばれる、モノクローナル抗体の免疫学的に有効な部分を作成および使用する方法は周知であり、Better & Horowitz, Methods Enzymol. 178:476-96, 1989; Glockshuber et al., Biochemistry 29:1362-67, 1990;ならびに米国特許第5,648,237号(Expression of Functional Antibody Fragments);同第4,946,778号 (Single Polypeptide Chain Binding Molecules);および同第5,455,030号(Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecules)、ならびにこれらに引用された参考文献に記載されているものを含む。ポリペプチド/結合剤複合体が形成することができる条件、ならびにポリペプチド/結合剤複合体の形成を検出するためのアッセイ法、および結合剤およびポリペプチドの結合親和性を定量するためのアッセイ法は、当技術分野において標準的なものである。このようなアッセイ法には、当業者に周知のウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫蛍光法、免疫細胞化学、免疫組織化学、蛍光標識細胞分取(FACS)、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)、免疫磁気アッセイ法、ELISA、ELISPOT (Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Wiley, NY, 1995)、凝集アッセイ法、綿状反応アッセイ法、細胞パニングなどが含まれ得るが、これに限定されない。
【０１０７】
VI.薬学的組成物およびその使用法
本開示のマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は、脂質流出を促進することが有益な動物、特に、哺乳動物(例えば、ヒト)における任意の障害を治療するのに使用することができる。このような状態には、高脂血症(例えば、高コレステロール血症)、心血管疾患(例えば、アテローム性動脈硬化症)、再狭窄(例えば、アテローム性動脈硬化巣)、末梢血管疾患、急性冠状動脈症候群、再灌流心筋障害などが含まれるが、これに限定されない。本開示のマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体はまた、血栓塞栓性卒中の治療中に、および閉塞冠状動脈疾患の血栓溶解治療中にも使用することができる。
【０１０８】
マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は単独で使用してもよく、前記の状態を治療するのに用いられる他の脂質低下組成物または脂質低下薬物と共に併用療法において使用してもよい。このような療法には、関与する薬物の同時投与または連続投与が含まれるが、これに限定されない。例えば、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化症の治療において、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体の製剤は、現在用いられているコレステロール低下療法、例えば、胆汁酸樹脂、ナイアシン、スタチンのいずれか1つまたは複数と共に投与することができる。
【０１０９】
別の態様において、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は、高脂血症、高コレステロール血症、および/またはアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患を治療するためにスタチンまたはフィブラートと共に使用することができる。さらに別の態様において。本開示のマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は、抗菌剤および/または抗炎症剤と組み合わせて使用することができる。さらなる態様において、マルチドメインペプチドは、利用可能な任意の遺伝子療法アプローチを用いてインビボで発現させることもできる。
【０１１０】
A.ペプチドまたはペプチド類似体の投与
ある態様において、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は様々な供給源から単離し、被験体に直接投与することができる。例えば、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は、当技術分野において周知のように大腸菌発現系などインビトロで発現させ、治療用組成物に有用な量で単離することができる。
【０１１１】
例示的な適用において、治療用組成物は、高脂血症、高リポタンパク血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、HDL欠損症、アポA-I欠損症、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、血栓塞栓性卒中、末梢血管疾患、再狭窄、急性冠状動脈症候群、または再灌流心筋障害などの異脂肪血症性障害または血管障害に罹患している被験体に、異脂肪血症性障害または血管障害を阻害または治療するのに十分な量で投与される。この使用に有効な量は、障害の重篤度および被験体の健康状態の一般状態に左右される。化合物の治療的有効量は、症状の主観的な軽減、または医師もしくは資格のある他の観察者によって認められるような客観的に特定可能な改善のいずれかをもたらす量である。
【０１１２】
マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射などの当業者に公知の任意の手段(例えば、Banga,「Parenteral Controlled Delivery of Therapeutic Peptides and Proteins」, Therapeutic Peptides and Proteins, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1995を参照されたい)によって投与することができるが、経口投与、鼻投与、または肛門投与でさえも意図される。1つの態様において、投与は皮下注射または筋肉内注射によるものである。異脂肪血症性障害または血管障害を阻害または治療するためにマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体を使用することができる時間を延ばすために、マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は、移植片、油性注射、または粒子系として提供されてもよい。粒子系は、微粒子、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノカプセル、または類似の粒子(Banga,「Parenteral Controlled Delivery of Therapeutic Peptides and Proteins」, Therapeutic Peptides and Proteins, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1995)でもよい。
【０１１３】
特定の非限定的な1つの例において、SEQ ID NO:3〜45に示したアミノ酸配列の1つまたは複数を含むマルチドメインペプチドが投与される。
【０１１４】
B.核酸分子の投与
マルチドメインペプチド全体が遺伝子によりコードされるアミノ酸から構成されている態様において、またはマルチドメインペプチドの一部が遺伝子によりコードされるアミノ酸から構成されている態様において、マルチドメインペプチドまたはその関連部分の投与は適切な核酸発現ベクターによって行うことができる。この核酸発現ベクターは、例えば、レトロウイルスベクター(米国特許第4,980,286号を参照されたい)を用いて、または直接注射することによって、またはマイクロパーティクルボンバードメント(例えば、遺伝子銃; Biolistic, DuPont)を用いて、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって、または核に進入することが知られているホメオボックス様ペプチド(例えば、Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:1864-1868,1991を参照されたい)と連結させて投与することによって、細胞内にあるように投与される。または、核酸を細胞内に導入し、発現のために、例えば、相同組換えまたは非相同組換えによって宿主細胞DNA中に組み込むことができる。
【０１１５】
DNA発現ベクター(例えば、ベクターpCDNA)の使用は、発現を駆動する強力なウイルスプロモーター(例えば、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus))の制御下にある外来cDNAを細胞に導入する方法の一例である。しかしながら、他のベクターを使用することができる。他のレトロウイルスベクター(例えば、pRETRO-ON, BD Biosciences, Palo Alto, CA)もこのプロモーターを使用するが、トランスフェクションを全く用いずに細胞に進入するという利点があり、標的細胞が分裂している時だけ標的細胞ゲノムに組み込まれる。これらのプラスミドを使用した時には、テトラサイクリンを投与することによって治療用核酸の発現をオンにすることもできる。従って、細胞を、これらのプラスミドでトランスフェクトし、次いで、発現を調節するために1コースのテトラサイクリンを投与することができる。
【０１１６】
pMAM-neo(BD Biosciences, Palo Alto, CA)またはpMSG(Invitrogen, Carlsbad, CA)などの他のプラスミドベクターは、MMTV-LTRプロモーター(ステロイドによって調節することができる)またはSV10後期プロモーター(pSVL, Invitrogen, Carlsbad, CA)またはメタロチオネイン応答性プロモーター(pBPV, Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用する。他のウイルスベクターにはレトロウイルスが含まれる。他のウイルスベクターの例には、アデノウイルス、AAV(adeno-associated virus)、組換えHSV、ポックスウイルス(poxvirus)(ワクシニア)、および組換えレンチウイルス(lentivirus)(例えば、HIV)が含まれる。これらのベクターは全て、標的細胞にcDNA配列または転写に必要な制御エレメントを送達するという基本的な目標を達成する。
【０１１７】
レトロウイルスは感染効率が高く、組込みおよび発現が安定しており、遺伝子療法に好ましいベクターとみなされてきた(Orkin et al., Prog. Med. Genet. 7:130-142, 1988)。マルチドメインペプチドをコードする核酸をレトロウイルスベクターにクローニングし、その内因性プロモーター(該当する場合)またはレトロウイルスLTR(長末端反復配列)から駆動することができる。このタイプのアプローチのために、アデノウイルス、AAV (McLaughlin et al., J. Virol. 62:1963-1973, 1988)、ワクシニアウイルス(Moss et al., Annu. Rev. Immunol. 5:305-324, 1987)、ウシパピローマウイルス(Bovine Papilloma virus) (Rasmussen et al., Methods Enzymol. 139:642-654, 1987) 、またはエプスタイン-バーウイルス(Epstein-Barr virus)などのヘルペスウイルス(herpesvirus)グループのメンバー (Margolskee et al., Mol. Cell. Biol. 8:2837-2847, 1988)を含む、他のウイルストランスフェクション系も使用することができる。
【０１１８】
ウイルスベクターを用いたマルチドメインペプチドをコードする核酸の細胞への送達に加えて、非感染送達法を使用することができる。例えば、最近、様々遺伝子によるトランスフェクションのために脂質およびリポソームを介した遺伝子送達が首尾よく用いられている(概説については、Templeton and Lasic, Mol. Biotechnol., 11:175-180, 1999; Lee and Huang, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 14:173-206, 1997;およびCooper, Semin. Oncol., 23: 172-187, 1996を参照されたい)。例えば、単球性白血病細胞をトランスフェクトする能力についてカチオン性リポソームが分析されており、ウイルスベクター使用の実行可能な代替であると示されている(de Lima et al., Mol. Membr. Biol., 16:103-109, 1999)。このようなカチオン性リポソームは、例えば、モノクローナル抗体または他の適切な標的化リガンドを含めることによって、特定の細胞に標的化することもできる(Kao et al., Cancer Gene Ther., 3:250-256, 1996)。
【０１１９】
C.代表的な投与方法、製剤、および投与量
提供されたマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体、このようなペプチドをコードする構築物またはベクターは、ヒトまたは動物被験体に投与するために、薬学的に許容される担体(例えば、リン脂質もしくは他のタイプの脂質)またはビヒクルと組み合わせることができる。ある態様において、1種類を超えるマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体を組み合わせて、1つの調製物を形成することができる。マルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は都合よく単位剤形にされ、従来の薬学的技法を用いて調製することができる。このような技法は、活性成分と、薬学的担体または賦形剤を会合させる工程を含む。一般的に、製剤は、均一かつ均質に活性成分と液体担体を会合させることによって調製される。非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を所期のレシピエントの血液と等張にする溶質を含有してもよい水性および非水性の滅菌注射液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。製剤は、1回量容器または複数回用量容器、例えば、密封したアンプルおよびバイアルに入れられてもよく、フリーズドライ(凍結乾燥)した状態で保存されてもよく、これは、滅菌した液体担体、例えば、注射用水の使用直前の添加しか必要としない。即時注射溶液および注射懸濁液は、当業者によって一般的に用いられる滅菌した散剤、顆粒、および錠剤から調製されてもよい。
【０１２０】
ある特定の態様において、単位投与製剤は、1回分の用量もしくは単位またはその適切な部分の投与成分を含有する製剤である。前記で詳細に述べた成分に加えて、本明細書に含まれる製剤は、当業者に一般的に用いられる他の薬剤を含んでもよいことが理解されるはずである。
【０１２１】
異脂肪血症性障害および血管障害の治療に用いられる薬学的組成物を含む本明細書において提供される薬学的組成物は、頬および舌下を含む口、直腸、非経口、エアロゾル、鼻、筋肉内、皮下、皮内、ならびに局所などの様々な経路によって投与することができる。薬学的組成物は、溶液、エマルジョン、および懸濁液、マイクロスフェア、粒子、微粒子、ナノ粒子、およびリポソームを含むが、これに限定されない、様々な形で投与することができる。1つの態様において、ABCA1特異性および低細胞傷害性という適切な特徴を有するマルチドメインペプチドまたはペプチド類似体は、被験体に投与する前にリン脂質または他の脂質と予め複合体を形成して、円盤状または球状の粒子にすることができる。
【０１２２】
別の態様において、薬学的組成物を、治療を必要とする部位に局所投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、外科手術中の局所もしくは局部への注入もしくは灌流、局所適用 (例えば、創傷用包帯)、注射、カテーテル、坐剤、または移植片(例えば、シアラスティック膜などの膜もしくは繊維を含む、多孔性材料、無孔性材料、もしくはゼラチン材料から形成された移植片)などによって達成され得るが、それに限定されるわけではない。1つの態様において、投与は、心臓または末梢脈管構造などの治療しようとする組織の部位(または前の部位)への直接注射によるものでもよい。別の態様において、薬学的組成物は、小胞、特定のリポソームに入れて送達される(例えば、Langer, Science 249:1527-1533, 1990; Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N. Y., pp. 353-365, 1989を参照されたい)。
【０１２３】
さらに別の態様において、薬学的組成物は徐放系に入れて送達することができる。1つの態様において、ポンプを使用することができる(例えば、Langer Science 249:1527-1533, 1990; Sefton Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507-516, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574-579, 1989を参照されたい)。別の態様において、ポリマー材料を使用することができる(例えば、Ranger et al., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61-64, 1983; Levy et al., Science 228:190-192, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25:351-356, 1989;およびHoward et al., J. Neurosurg. 71:105-112, 1989を参照されたい)。Langer (Science 249: 1527-1533, 1990)による総説に記載の徐放系などの他の徐放系も使用することができる。
【０１２４】
薬学的組成物の有効量は、治療しようとする障害または状態の内容ならびに障害または状態の段階に左右される。有効量は標準的な臨床技法によって求めることができる。製剤に使用しようとする正確な用量は投与経路にも左右され、医療従事者の判断および各被験体の状況に従って決定されるはずである。このような投与量範囲の一例は、一回量または分割量で0.1〜200mg/kg体重である。投与量範囲の別の例は、一回量または分割量で1.0〜100mg/kg体重である。
【０１２５】
どの被験体の特定の用量および投与頻度も変更することができ、特定の化合物の活性、化合物の代謝安定性および作用の長さ、治療を受けている被験体の年齢、体重、身体全体の健康、性別、食事、投与方法および投与時間、流出速度、薬物の組み合わせ、ならびに状態の重篤度を含む様々な要因に左右される。
【０１２６】
本開示の薬学的組成物は、治療期間全体を通じてほぼ同じ用量で、漸増投与計画において、または負荷投与計画(例えば、負荷量は維持量の約2倍〜5倍である)において投与することができる。ある態様において、用量は、治療されている被験体の状態、疾患もしくは状態の重篤度、治療に対する見かけ上の応答、および/または当業者によって判断される他の要因に基づいて治療中に変更される。投与体積は投与経路に応じて変わる。一例として、筋肉内注射は約0.1ml〜約1.0mlでもよい。当業者であれば、異なる投与経路に適した体積が分かるだろう。
【０１２７】
本開示の主題は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【０１２８】
実施例
実施例1
合成ペプチドによって媒介される細胞からの脂質流出
本実施例は、両親媒性ヘリックスを含有する合成ペプチドがABCA1発現細胞から脂質を流出させる能力を証明する。
【０１２９】
Remaley et al.(Biochem. Biophys. Res. Commun. 280:818-823, 2001)に記載のように、ヒトABCA1 cDNA(ABCA1細胞)で安定にトランスフェクトしたHeLa細胞、およびハイグロマイシン耐性対照プラスミドのみでトランスフェクトしたHeLa細胞(対照細胞)を作成し、α改変イーグル培地(αMEM)+10％ウシ胎児血清において増殖させた。コレステロールまたはコリンで放射標識した非コレステロール添加細胞において、コレステロールおよびリン脂質の流出を18時間行った(Remaley et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17:1813-1821, 1997)。パーセント流出は、ブランク培地(αMEM+1mg/ml BSA)の放射能カウントを差し引いた後に計算し、総放射能カウントに対する、流出期間中に細胞から除去された放射能カウントのパーセントとして表した。
【０１３０】
細胞固定は、3％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝食塩水(PBS)で10分間処理し、その後に、ブランク培地で3回洗浄することによって行った。細胞から培地への乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出は酵素を用いて測定し(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)、ブランク培地に放出されたLDHを差し引いた後に、総細胞LDHに対するパーセントとして表した。総細胞LDHは、細胞を1％Triton X-100で可溶化した後に求めた。
【０１３１】
37pAペプチド:
2008516605.tif 000005
は、Fmoc/DIC/HOBtプロトコールを用いて、Biosearch 9600ペプチド合成機(Applied Biosystems, Foster City, CA)において固相法によって合成した。L-アミノ酸(L-37pA)鏡像異性体およびD-アミノ酸(D-37pA)鏡像異性体を両方とも合成した。全てのペプチドを、Aquapore RP-300カラムを用いた逆相HPLCによって98％を超える均一性まで精製した。
【０１３２】
アポA-Iおよび合成ペプチドが細胞から脂質を流出させる能力を評価するために、ABCA1細胞を使用した(図1)。以前に述べられたように(Hamon et al., Nat. Cell Biol. 2:399-406, 2000およびRemaley et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 280:818-823, 2001)、対照細胞は、有意な量のコレステロールおよびリン脂質をアポA-Iに流出しないが、ABCA1によるトランスフェクション後には流出させる(図1A,B)。L-アミノ酸を用いて合成され、アポA-Iに存在する10個の両親媒性ヘリックスとは対照的に2個の両親媒性ヘリックスしか有さないL-37pAペプチドは、ABCA1細胞から対照細胞の約2倍〜4倍のコレステロールおよびリン脂質を流出させた(図1C,D)。L-37pAペプチドおよびアポA-Iは両方とも、ほぼ同じタンパク質濃度10μg/mlで脂質流出の飽和を示し始めたが、L-37pAペプチドはアポA-Iより分子量がかなり小さいので、これは、L-37pAについてはモル濃度2μM、アポA-Iについては0.36μMに対応する。全てD-アミノ酸で合成した37pAペプチドであるD-37pAもまた、ABCA1細胞からのコレステロールおよびリン脂質の流出の促進に効果がああった(図1E,F)。D-37pAの用量反応曲線はL-37pAとほぼ同じであった。このことは、脂質流出のために37-pAペプチドとABCA1輸送体は立体選択的に相互作用する必要が無いことを示唆している。L-37pAおよびD-37pAは両方とも一貫して、アポA-I(図1A,B)より多く対照細胞(図1C〜F)からコレステロール(40μg/mlで5％)およびリン脂質(40μg/mlで8％)を除去した。
【０１３３】
実施例2
脂質流出の時間経過
本実施例は、ABCA1発現細胞からアポA-Iおよび両親媒性ヘリックス含有合成ペプチドへのコレステロール流出の時間経過を証明する。
【０１３４】
ABCA1細胞からアポA-Iへのコレステロール流出は2時間後に初めて検出することができ、30時間の流出期間を通じて増加し続けた(図2A)。対照的に、対照細胞からアポA-Iへのコレステロール流出ではバックグラウンドを超える有意な増加は無かった(図2B)。全体的に見て、ABCA1細胞からL-37pAへのコレステロール流出のキネティクスは、コレステロール流出が30分後に初めて検出できたことを除けばapoA-Iとほぼ同じであった(図2A)。L-37pAペプチドはアポA-Iと異なり、対照細胞からのコレステロール流出も促進したが、約半分の速度であった(図2B)。対照細胞からL-37pAへの少量のコレステロール流出は30分で初めて検出することができ、次いで、L-37pAとABCA1細胞について観察されたものと同様に、流出期間を通じてゆっくりと増加し続けた。
【０１３５】
実施例3
両親媒性αヘリックスの重要性
本実施例は、ペプチドの脂質親和性および細胞からの脂質流出を促進するペプチドの能力における両親媒性αヘリックスの重要性を証明する。
【０１３６】
L-アミノ酸を含有するペプチドにD-アミノ酸を導入すると、ペプチドがαヘリックスを形成する能力を妨げることが知られている(Chen et al., J. Pept. Res. 59:18-33, 2002)。ペプチドの脂質親和性および細胞からの脂質流出を促進するペプチドの能力における両親媒性αヘリックスの重要性を試験するために、37pAと同じ配列を有する以下の2種類のペプチド:(1)L2D-37pA、バリンおよびチロシンにD-アミノ酸を使用した以外は全てL-アミノ酸、ならびに(2)L3D-37pA、アラニン、リジン、およびアスパラギン酸にD-アミノ酸を使用した以外は全てL-アミノ酸を、L-アミノ酸およびD-アミノ酸の混合物を用いて作成した。ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)小胞の可溶化において界面活性剤として作用する能力をモニタリングすることによって評価されたように、L2D-37pAおよびL3D-37pAペプチドの脂質親和性は低かった。以前に述べられたように(Jonas, Methods of Enzymology 128:553-581, 1986)、ペプチド(0.4mg/ml)による多重膜DMPC小胞(2mg/ml)の可溶化は8.5％NaBrの存在下で行い、室温で2時間インキュベートした後に350nmでの吸光度を測定した。2時間インキュベートした後に、L-37pAおよびD-37pAペプチドはDMPC小胞をほぼ完全に可溶化したが、L3D-37pAペプチドは濁度低下を最小限にしか引き起こさなかった(図3)。L2D-37pAペプチドおよびアポA-Iは、L-37pAおよびL3D-37pAペプチドと比較して中間レベルのDMPC小胞可溶化を引き起こした。
【０１３７】
L2D-37pAペプチドを脂質流出について試験した時に、バリン残基およびチロシン残基にD-アミノ酸を使用することによって、ABCA1細胞からのコレステロールおよびリン脂質の流出は、全てL-アミノ酸を含有するL-37pAペプチドと比較して75％を超えて低下した(図4と図1C,Dを比較せよ)。ABCA1細胞からL2D-37pAペプチドへの脂質流出はapoA-1と比較して低下したにもかかわらず、このペプチドは依然としてABCA1細胞から脂質を流出させる能力をある程度保持していたが、アポA-Iと同様に対照細胞から脂質流出を促進することができなかった(図1A,B)。対照的に、DMPC小胞可溶化を最小限にしか引き起こさなかったL3D-37pAも(図3)、ABCA1細胞からも対照細胞からも検出可能な量の脂質流出を促進することができなかった(図4)。37pAにあるヘリックスとほぼ同じ長さの2個の非両親媒性αヘリックスを含有する、γ結晶タンパク質に基づくペプチド
2008516605.tif 000006
; Hay et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 146:332-338, 1987)を試験し、これもまた、両細胞株からのコレステロールおよびリン脂質の流出の促進において完全に効果が無いことが見出された。これらの結果は、脂質流出の促進における両親媒性αヘリックスの重要性を証明した以前の研究と一致している(例えば、Gillotte et al., J. Biol. Chem. 274:2021-2028, 1999 および Gillotte et al., J. of Lipid Res. 39:1918-1928, 1998を参照されたい)。しかしながら、2種類の細胞株からの脂質流出の相対値(図1および4)から、両親媒性ヘリックスペプチドはABCA1依存的およびABCA1非依存的に脂質流出を促進できるが、DMPC小胞可溶化によって評価されたように(図3)、アポA-IおよびL2D-37pAなどの脂質親和性が中程度しかないアポリポタンパク質およびペプチドにはABCA1発現が必要であると証明された。
【０１３８】
実施例4
ABCA1非依存性脂質流出経路の評価
本実施例は、高脂質親和性を有する両親媒性ヘリックスペプチドがABCA1非依存的に脂質流出を促進できることを証明する。
【０１３９】
対照細胞からL-37pAおよびD-37pAへの残存脂質流出(図1を参照されたい)が低レベルの内因性ABCA1によるものではないことを確認するために、切断型非機能ABCA1輸送体を有するタンジール病線維芽細胞細胞株(Remaley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:12685-12690, 1999)の脂質流出を評価した(図5)。アポA-I、L-37pA、およびD-37pAは全て正常線維芽細胞からコレステロールを流出したが、アポA-Iは、タンジール病線維芽細胞から有意な量のコレステロールを流出しなかった(Francis et al., J. Clin. Invest. 96:78-87, 1995およびRemaley et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17:1813-1821, 1997も参照されたい)。対照的に、L-37pAおよびD-37pAは両方とも、低レベルであるが、依然としてタンジール病線維芽細胞からコレステロールを流出させることができた。従って、このことは、これらのペプチドがABCA1の非存在下で細胞から脂質を流出させる能力を裏付けている。
【０１４０】
脂質流出のABCA1非依存経路を、アポA-I(A)、L-37pA(L)、およびD-37pA(D)(図6)へのコレステロール流出に及ぼすパラホルムアルデヒド細胞固定の影響を調べることによってさらに評価した。さらに、溶解濃度以下の単純な界面活性剤もまた対照細胞からの脂質流出より大きくABCA1細胞からの脂質流出を促進するかどうか確かめるために、0.02％のタウロデオキシコール酸(T)も1時間後の脂質流出について試験した。ABCA1輸送体がATPを必要とすることに基づいて予想されたように、(Dean et al., J. Lipid Res. 42:1007-1017, 2001; Mendez, J. Lipid Res. 38:1807-1821, 1997)、パラホルムアルデヒドでABCA1細胞を固定すると、アポA-Iがコレステロールを流出させる能力は完全にブロックされた(図6A)。対照的に、ABCA1細胞を細胞固定することによって、L-37pAおよびD-37pAペプチドへのコレステロール流出は部分的にしか低下しなかった。細胞固定後に、ベースラインコレステロール流出の約30％が依然として保持された。非固定対照細胞においてコレステロール流出を試験した時に、L-37pAおよびD-37pAへのコレステロール流出レベルは、固定ABCA1細胞を用いて得られたレベルとほぼ同じであった(図6Bと6Aを比較せよ)。さらに、ABCA1細胞とは異なり、対照細胞を固定しても、2種類のペプチドへのコレステロール流出はこれ以上低下しなかった(図6B)。これらの結果から、ペプチドによるABCA1細胞からの脂質流出はABCA1依存的経路およびABCA1非依存経路によって起こるが、対照細胞からの脂質流出は、生細胞を必要としない受動的なエネルギー非依存的プロセスであるABCA1非依存経路によってのみ起こることが分かる。
【０１４１】
比較的低い濃度(0.02％)のタウロデオキシコール酸を細胞流出培地に1時間添加しても、光学顕微鏡によって評価されたように細胞の形態は変化しなかったが、ABCA1細胞から少量のコレステロールが流出し(図6A)、これは固定後にわずかに増大した。タウロデオキシコール酸処理後の対照細胞からも、ほぼ同じ量のコレステロールが流出した(図6B)。他のいくつかの界面活性剤(TX-100、NP-40、CHAPS)を用いて溶解濃度以下の濃度で試験した時にも、ほぼ同じ結果が得られた。このことから、ABCA1は両親媒性ヘリックスタンパク質への脂質流出を促進するが、細胞が単純な界面活性剤に脂質を流出させる全体的な傾向を強めないことが分かる。
【０１４２】
ペプチドを介した脂質流出を細胞固定によって完全にブロックできないこと(図6)、およびペプチドによるDMPC小胞可溶化と脂質流出に相関関係があること(図1および3)は、対照細胞からの脂質流出が、ペプチドにある両親媒性ヘリックスの界面活性剤様作用による細胞膜脂質の微小可溶化の結果として生じることを示唆している。従って、細胞原形質膜の微小可溶化は潜在的に細胞傷害性であり得るが、流出実験中、ペプチドまたはアポA-Iとインキュベートした後に、細胞に及ぼす形態的な影響は観察されなかった。しかしながら、流出研究に用いられた最大濃度および時間(40μg/ml,18時間)で、細胞をL-37pAおよびD-37pAとインキュベートした時には一貫して、両細胞株から少量のLDHが放出された(対照細胞:L-37pA(6.1％±0.2)、D-37pA(6.6％±0.1);ABCA1細胞:L-37pA(4.3％±0.04)、D-37pA(5.7％±0.1))。対照的に、対照細胞から脂質流出を引き起こさず(図2および3)、従って、ABCA1非依存経路によって脂質を流出できないように見える、L2D-37pA、L3D-37pA、およびアポA-1は、両細胞株からベースライン(<0.5％)を上回って細胞LDHを有意に放出しなかった。
【０１４３】
実施例5
放射標識L-37pAの結合におけるペプチド/アポA-Iの競合
本実施例は、37pAペプチドとABCA1細胞または対照細胞の結合には立体選択性が無いことを証明する。
【０１４４】
L-37pAペプチドを一塩化ヨウ素を用いて125I標識した。12ウェルプレートにおいて増殖させたコンフルエント細胞を、αMEM培地+10mg/ml BSA中で指示した濃度の非標識競合ペプチドと4℃で3時間インキュベートした(図7)。次いで、細胞を3回洗浄し、αMEM培地+10mg/ml BSAに溶解した1μg/ml放射標識L-37pAペプチドと4℃で1時間インキュベートした。細胞を3回洗浄し、0.1N NaOHで可溶化した後に細胞結合カウントを求めた。
【０１４５】
放射標識ペプチドと競合タンパク質の潜在的に干渉する相互作用を阻止するために、2段階連続競合結合アッセイ法を行った(Mendez el al., J. Clin. Invest. 94:1698-1705, 1994)。最初に、細胞を競合タンパク質と3時間インキュベートし、洗浄し、次いで、放射標識L-37ペプチドの細胞結合を測定した。脂質流出研究に使用した最大ペプチドタンパク質濃度40μg/mlに相当する試験最大濃度8μM(図1)で、非標識L-37pAペプチドは、標識L-37pAペプチドの約40％の結合をブロックした(図7A)。D-37pAは、L-37pA結合の競合において同様に有効であった。これは、ペプチドとABCA1細胞の結合には立体選択性が無いことを示している。対照的に、L3D-37pAは、L-37pA結合の競合において完全に効果が無かった。L2D-37pAおよびアポA-Iは中間的な競合物質として作用した。これらはそれぞれ、放射標識L-37pAとABCA1細胞の結合を約30％低下させた(図7A)。対照細胞は比較的高いL-37pA比結合も示したが(図7B)、競合物質の非存在下では、対照細胞が結合した放射標識L-37pAペプチドは、ABCA1細胞が結合した放射標識L-37pAペプチドより23％少なかった(対照細胞27±0.6pmol/mg細胞タンパク質;ABCA1細胞35±2.2pmol/mg細胞タンパク質)。ABCA1細胞と同様に、非標識L-37pAおよびD-37pAは放射標識L-37pAの結合において等しく競合した。対照的に、L2D-37pAおよびアポA-Iは、放射標識L-37pA結合における競合についてはABCA1細胞より対照細胞において効果が低かった。試験最大濃度で両ペプチドは、不活性L3D-37pAペプチドを用いて得られた結果と同様に、5％未満の放射標識L-37pAと対照細胞の結合をブロックした。全体的に見て、これらの結果から、37pAペプチドとABCA1細胞または対照細胞の結合には立体選択性が無く、ペプチドの細胞結合は少なくとも部分的にペプチドの脂質親和性に依存していることが分かる。
【０１４６】
実施例6
脂質流出および細胞傷害性に及ぼすマルチドメイン両親媒性ペプチドの脂質親和性の非対称性の影響
本実施例は、マルチドメイン両親媒性ペプチドの脂質親和性の非対称性が、マルチドメインペプチドによるABCA1依存的コレステロール流出の特異性の重要な構造決定要因であることを証明する。
【０１４７】
C末端ヘリックス(5A)または両ヘリックス(10A)の疎水性残基(F18、L14、L3、V10、F6)に対して5個のAla置換を行うことによって、37pAペプチドを改変した。逆相HPLC保持時間は、改変ペプチドの疎水性モーメントによって計算されたような脂質親和性予測値と密接な相関関係があった(図8)。C末端ヘリックスに1個(L14、1A)、2個(L14,F18、2A)、3個(L14,F18,F6、3A)、および4個(L14,F18,F6,V10、4A)のAla置換を有する4つのさらなるペプチドも合成した。37pAの保持時間が最長であり、それぞれのさらなるAla置換によって、保持時間に基づく脂質親和性が低下した(図8)。
【０１４８】
次いで、赤血球溶血アッセイ法を用いて、37pAペプチドおよび全ての改変ペプチドを細胞傷害性について試験した(図9)。LDH放出のモニタリングを介して以前に観察された結果と同様に、37pAは細胞傷害性であることが見出された。試験最大用量で1時間後に赤血球の約25％が溶解した(図9)。全体的に見て、Ala置換を含有する改変ペプチドは細胞傷害性が低く、細胞傷害性の程度はAla置換数と密接な相関関係があった。4Aおよび5Aペプチドははっきりと分かる赤血球溶血を示さなかったが、1A、2A、および3Aペプチドは、37pAと比較して中程度の溶血を示した(図9)。これらの結果に基づいて、細胞傷害性の低下の点から見ると、比較的低い脂質親和性を有する両親媒性αヘリックスの最適な疎水性モーメントスコア/残基は約0.34未満である(Eisenberg et al., PNAS 81:140-144, 1984およびEisenberg et al., J. Mol. Biol. 179:125-142, 1984)。
【０１４９】
ABCA1輸送体によるコレステロール流出の特異性についても、37pAペプチドおよび改変ペプチドを試験した(図10)。37pAペプチドは、ABCA1を介したコレステロール流出を促進したが、ABCA1輸送体を発現しない対照HeLa細胞株からのコレステロール流出を媒介することもできた。改変ペプチドを用いてコレステロール流出が行われた時に、37pAペプチドとは異なる2つの特徴を有することが観察された。第1に、37pAペプチドと比較してAla置換によって漸進的な右方向の用量反応曲線シフトがあった。最大量のコレステロール流出を得るためには、より高濃度の改変ペプチドが必要であった。さらに、ABCA1輸送体に起因する総コレステロール流出のパーセントは、37pAペプチドにおいてAla置換を行うことによって漸増した。理論に拘束されるつもりはないが、これは、改変ペプチドがABCA1トランスフェクト細胞からコレステロールを除去する能力を依然として保持しているが、非ABCA1コレステロール流出経路を介した対照細胞からのコレステロールの除去に効果が低いことによるものであると考えられる。5Aペプチドは、ABCA1輸送体によるコレステロール流出のみを引き起こすことについて完全に特異的であった。これらの結果に基づいて、コレステロール流出のABCA1特異性の点から見ると、比較的低い脂質親和性を有する両親媒性ヘリックスに最適な疎水性モーメントスコア(Eisenbergスケール;100度αヘリックス)/残基は約0.1〜約0.33である。
【０１５０】
実施例7
ABCA1依存的脂質流出を促進する非細胞傷害性ペプチドの特定
本実施例は、細胞からのABCA1依存的脂質流出を促進する非細胞傷害性ペプチドを特定するための方法を例示する。
【０１５１】
ペプチド設計:
本願に記載の原理および手順に基づいて、1つは比較的高い脂質親和性を有し、1つは比較的低い脂質親和性を有する2またはそれ以上の両親媒性αヘリックスを含有するマルチドメインペプチドのために、アミノ酸配列を設計することができる。
【０１５２】
ペプチド生成:
試験しようとするペプチドは、本願に記載のように合成によって、または組換えDNA法によって生成し、逆相HPLCまたは当業者に周知の他の適切な技法によって精製することができる。
【０１５３】
ペプチド細胞傷害性試験:
ペプチドは、細胞内LDHの放出(実施例4)または赤血球からのヘモグロビンの放出(実施例6)などの当業者に周知の任意の数の方法によって細胞傷害性について試験することができる。このような研究は、本明細書に記載のように、様々な濃度のペプチドを細胞株、小胞または赤血球とインキュベートすることによって行われる。
【０１５４】
脂質流出のペプチドABCA1特異性:
試験しようとするペプチドは、1〜20μMのおおよその濃度範囲で無血清細胞培地に添加し、本明細書に記載したように、ABCA1輸送体を発現しない対照細胞株およびヒトABCA1輸送体cDNAを用いたトランスフェクション後の同じ細胞株とインキュベートすることができる。または、コレステロール含有率ならびに/またはABCA1輸送体を誘導する薬剤(例えば、cAMPおよびLXRアゴニスト)への曝露に応じてABCA1輸送体を発現するまたは発現しない、マクロファージなどの細胞も使用することができる。約4〜24時間の適切な期間の後に、培養上清を細胞から取り出すことができ、本明細書に記載のように、流出したコレステロールまたはリン脂の量を定量することができる。ABCA1輸送体を発現しない細胞から得られた結果から、ABCA1発現細胞株からの総脂質流出を差し引くことによって、ABCA1特異的脂質流出を計算する。
【０１５５】
本明細書に記載の構築物、組成物、および方法の正確な詳細は、説明された本発明の精神から逸脱することなく変更または修正され得ることは明らかであろう。本発明者らは、以下の特許請求の範囲の範囲および精神の中にある、このような修正および変更を全て主張する。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】様々なペプチドで処理したABCA1トランスフェクト細胞および対照細胞による脂質流出を示した一組のグラフである。ABCA1トランスフェクト細胞(黒丸)および対照細胞(白丸)を、10％FCSを含むα-MEM培地において増殖させ、コレステロール(図1A、1C、および1E)ならびにリン脂質(図1B、1D、および1F)を、アポA-I(図1Aおよび1B)、L-37pA(図1Cおよび1D)、ならびにD-37pA(図1Eおよび1F)に流出させる能力について18時間にわたって調べた。結果は三通りの平均±1 SDで表した。
【図２】アポA-IおよびL-37pAで処理したABCA1トランスフェクト細胞および対照細胞による脂質流出の時間経過を示した一対のグラフである。10μg/ml アポA-I(四角)、10μg/ml L-37pAペプチド(三角)、およびブランク培地(丸)(α-MEM+1mg/ml BSA)で処理したABCA1トランスフェクト細胞(図2A)または対照細胞(図2B)からのコレステロール流出を、x軸に指示した時点で求めた。結果は三通りの平均±1 SDで表した。
【図３】合成ペプチドによるDMPC小胞の可溶化を示したグラフである。最終濃度0.4mg/mlの指示したペプチド(L-37pA(L)、D-37pA(D)、L2D-37pA(L2D)、L3D-37pA(L3D)、およびアポA-I(A))を、DMPC小胞(2mg/ml)と2時間インキュベートした。(小胞溶解を示す)濁度の低下を350nmの吸光度でモニタリングした。結果は三通りの平均±1 SDで表した。
【図４】L-アミノ酸およびD-アミノ酸が混合している37pAペプチドで処理したABCA1トランスフェクト細胞および対照細胞による脂質流出を示した一対のグラフである。ABCA1トランスフェクト細胞(黒記号)および対照細胞(白記号)を10μg/ml L2D-37pA(黒丸、白丸)および10μg/ml L3D-37pA(黒四角、白四角)で処理した時に、コレステロール(図4A)およびリン脂質(図4B)を流出させる能力について18時間にわたって調べた。結果は三通りの平均±1 SDで表した。
【図５】タンジール病線維芽細胞からのコレステロールのABCA1非依存性流出を示すグラフである。正常皮膚線維芽細胞(白バー)およびタンジール病皮膚線維芽細胞(黒バー)を10μg/ml アポA-I(A)、10μg/ml L-37pA(L)、および10μg/ml D-37pA(D)で処理した時に、コレステロールを流出させる能力について18時間にわたって調べた。結果は三通りの平均±1 SDで表した。
【図６】ABCA1トランスフェクト細胞および対照細胞からのコレステロール流出に及ぼす細胞固定の影響を示した一対のグラフである。ABCA1トランスフェクト細胞(図6A)および対照細胞(図6B)を、3％パラホルムアルデヒドで固定する前(白バー)および固定した後(黒バー)、アポA-I(A)、L-37pA(L)、D-37pA(D)、および(0.02％)タウロデオキシコール酸(T)で処理した時に、コレステロールを流出させる能力について調べた。合成ペプチドおよびアポA-Iは10μg/mlの濃度で使用し、コレステロール流出を18時間後に測定した。タウロデオキシコール酸処理による流出は1時間後に測定した。結果は三通りの平均±1 SDで表した。
【図７】L-37pAペプチドとABCA1トランスフェクト細胞および対照細胞との競合結合を示した一対のグラフである。ABCA1細胞(図7A)および対照細胞(図7B)を、指示した濃度の競合タンパク質[L-37pA(三角)、D-37pA(白四角)、アポA-I(黒丸)、L2D-37pA(星)、およびL3D-37pA(白丸)]と、4℃で3時間インキュベートし、次いで、洗浄し、1μg/mlの放射標識L-37pAペプチドと4℃で1時間インキュベートした。結果は三通りの平均±1 SDで表した。
【図８】37pAペプチドおよび誘導ペプチド(1A、2A、3A、4A、5A、および10A)の疎水性モーメント計算値と逆相HPLCにおける保持時間をプロットしたグラフである。約1mgの各ペプチドをC-18逆相HPLCカラムに注入し、0.1％TFAを含有する25〜85％勾配アセトニトリルを用いて溶出させた。
【図９】37pAペプチドおよび誘導ペプチド(1A、2A、3A、4A、5A、および10A)による赤血球溶解を示したグラフである。赤血球を、指示した濃度のペプチドと37℃で1時間インキュベートした。結果は三通りの平均±1 SDで表した。
【図１０】37pAペプチドおよび誘導ペプチド(37pA,図10A;1A,図10B;2A,図10C;3A,図10D;4A,図10E;および5A,図10F)で処理した時の、ABCA1トランスフェクト細胞および対照細胞によるコレステロール流出を示した一組のグラフである。ABCA1トランスフェクト細胞(灰色の四角)および対照細胞(黒三角)を指示した濃度のペプチドで処理した後に、コレステロールを流出させる能力について18時間にわたって調べた。ABCA1特異的流出は、ABCA1トランスフェクト細胞からのコレステロール流出結果を対照細胞らのコレステロール流出結果(白ダイヤモンド)から差し引くことによって計算した。結果は三通りの平均±1 SDで表した。
【配列表フリーテキスト】
【０１５７】
添付の配列表に列挙した核酸配列およびアミノ酸配列は、37 C.F.R. 1.822において定義されている標準的なヌクレオチド塩基の文字略語およびアミノ酸の3文字コードを用いて示した。それぞれの核酸配列の一方の鎖のみを示したが、表示した鎖を参照することによって相補鎖が含まれていると理解される。添付の配列表において：
SEQ ID NO:1は、37pAペプチドのアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:2は、γ結晶ペプチドのアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:3〜45は、アポA-I様活性を有する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。これらは表1にも示した。
SEQ ID NO:46〜49は、いくつかの細胞認識配列のアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:50〜53は、いくつかの細胞内部移行配列のアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:54は、中性コレステロールエステラーゼ活性化配列のアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:55は、ACAT阻害配列のアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:56および57は、一対のLDL受容体配列のアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:58〜60は、いくつかの抗酸化配列のアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:61および62は、一対の金属キレート化配列のアミノ酸配列を示す。
【図１】
2008516605.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008516605.tif 000013
【図８】
2008516605.tif 000014
【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2008516605000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月5日(2007.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2つまたはそれ以上の両親媒性αヘリックスドメインを含み、第1の両親媒性αヘリックスドメインが第2の両親媒性αヘリックスドメインと比較して高い脂質親和性を示す、単離されたペプチドまたはペプチド類似体であって、第1の両親媒性αヘリックスドメインの疎水性モーメントスコア(Eisenbergスケール;100度αヘリックス)/残基が約0.34〜約0.60であり、第2の両親媒性αヘリックスドメインの疎水性モーメントスコア(Eisenbergスケール;100度αヘリックス)/残基が約0.1〜約0.33であり、第1の両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアと第2の両親媒性αヘリックスの疎水性モーメントスコアの差が少なくとも0.01であり、ABCA1依存経路による細胞からの脂質流出を促進する、単離されたペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項２】
細胞からのABCA1依存性脂質流出を促進し、実質的に非細胞傷害性である、請求項1記載の単離されたペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項３】
少なくとも1つのさらなるペプチドドメインをさらに含む、請求項1または請求項2記載の単離されたペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項４】
さらなるペプチドドメインが、ヘパリン結合部位、インテグリン結合部位、P-セレクチン部位、TAT HIV配列、パニング配列、ペナトラチン(penatratin)配列、SAA C末端配列、SAA N末端配列、LDL受容体配列、改変18A配列、アポA-I Milano配列、6×His配列、ラクトフェリン配列、またはこれらの2つもしくはそれ以上の組み合わせを含む、請求項3記載の単離されたペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項５】
2つの両親媒性αヘリックスドメインを含み、SEQ ID NO:3〜45のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離されたペプチドまたはペプチド類似体。
【請求項６】
請求項5記載のペプチドまたはペプチド類似体のいずれか1つをコードする、単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項1もしくは請求項2記載の単離されたペプチドまたはペプチド類似体あるいは請求項6記載の単離された核酸分子、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項８】
治療的有効量の請求項7記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体における異脂肪血症性障害または血管障害を治療または阻害する方法。
【請求項９】
異脂肪血症性障害または血管障害が、高脂血症、高リポタンパク血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、HDL欠損症、アポA-I欠損症、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、血栓塞栓性卒中、末梢血管疾患、再狭窄、急性冠状動脈症候群、灌流後心筋障害、脈管炎、炎症、またはこれらの2つもしくはそれ以上の組み合わせを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
異脂肪血症性障害または血管障害が高コレステロール血症である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
単離されたペプチドまたはペプチド類似体がSEQ ID NO:3〜45のいずれか1つに示されたアミノ酸配列を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
さらなる脂質低下組成物を投与する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
細胞からのABCA1依存性脂質流出を促進する実質的に非細胞傷害性のペプチドを特定するための方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)ペプチドを用いて細胞傷害試験を行う工程;および
(b)ABCA1発現細胞および非ABCA1発現細胞において脂質流出試験を行い、それによって、細胞からのABCA1依存性脂質流出を促進する実質的に非細胞傷害性のペプチドを特定する工程。
【請求項１４】
ペプチドが2つまたはそれ以上の両親媒性αヘリックスドメインを含有する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
請求項1〜5のいずれか一項記載のペプチドでコーティングされているインプラント。
【請求項１６】
薬学的組成物がインプラント上に送達される、請求項8〜12のいずれか一項記載の方法。
【国際調査報告】
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