(57)【要約】本発明は、哺乳動物の疾患の診断、予後、およびモニタリングのための免疫学的測定法の抗原の調製物として使える新規なヒドロキシアパタイト（ＨＡ）−カルシウム結合タンパク質（ＣａＢＰ）複合体（ＣａＢＰ−ＨＡ複合体）の製造並びに使用の方法および組成物に関する。ＣａＢＰ−ＨＡ複合体は血清タンパク質に供された合成ＨＡを使用して、または哺乳動物から石灰化ナノ粒子（ＣＮＰ）とも呼ばれるナノ細菌（ＮＢ）を採取することによって製造できる。ヒドロキシアパタイトは適切なタンパク質とともにインキュベートして調製すると、前記結合タンパク質に構造変化が起こる。前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体をトランスグルタミナーゼなどの酵素に供されると二次的な構造変化が起こり、それによって結合ネオエピトープが共有結合で生成する。
2008519284.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのヒドロキシアパタイト（ＨＡ）と少なくとも１つの結合したカルシウム結合タンパク質および／またはそのフラグメント（ＣａＢＰ）とを含む組成物であって、前記少なくとも１つのヒドロキシアパタイト（ＨＡ）と少なくとも１つの結合したカルシウム結合タンパク質および／またはそのフラグメントとがＣａＢＰ−ＨＡ複合体を含む、組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの結合したカルシウム結合タンパク質および／またはそのフラグメントが、少なくとも１回の構造変化を受ける、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記構造変化が、一次的な構造変化と二次的な構造変化の少なくとも１つである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記構造変化が一次的な構造変化である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記構造変化が二次的な構造変化である、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記構造変化の結果、宿主哺乳動物から免疫応答が生じる、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫応答が前記組成物に対する抗体の生成を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのヒドロキシアパタイト（ＨＡ）と少なくとも１つの結合したカルシウム結合タンパク質および／またはそのフラグメントとが、Ｇｌａ含有ドメインをもつタンパク質、第ＩＩ凝固因子、第ＶＩＩ凝固因子、第ＩＸ凝固因子、第Ｘ／Ｘａ凝固因子、組織因子−凝固因子ＶＩＩａ複合体、プロトロンビナーゼ複合体（第Ｖ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩ因子）、第ＩＩ因子のフラグメント、トロンビン、プロトロンビンフラグメント１、マトリックスＧＬＡタンパク質およびオステオカルシン、オステオポンチン、オステオネクチン、タンパク質第ＸＩＩＩａ因子、フェチュインＡ、カルモジュリン、組織トランスグルタミナーゼＩＩ、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３、ＣＤ  ４２ｂ、ＮＦ−カッパＢ、ＣＤ１４、フェチュインＢ、ＣＤ４０、ミエロペルオキシダーゼ、フィブロネクチン、組織因子、ヒトの補体５ｂ−９、ＣＲＰ、ＣＤ６１、カッパ軽鎖、マクロファージＬ１タンパク質、ｈｓｐ  ６０、フィブリリン−１、ベータ−２−ミクログロブリン、ＣＤ１８、ラミニン、抗トリプシン、ノッチ−１、ＢＳＡ、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）、ＰＴＸ３、補体Ｃ５、フィブリン／フィブリノゲン、Ｄダイマー、第Ｖ因子、抗キモトリプシン、アネキシンＶ、ビトロネクチン、トロンビン、トロポニンＴ、ビメンチン、トロポミオシン、ヒト血清アルブミン、心筋トロポニンＩ、アポリポタンパク質Ａ１、ＭＨＣクラスＩ、アミロイドＰタンパク質、ｓＣＤ４０Ｌ、カリクレイン、ＡＴＩＩＩ、第ＶＩＩＩ因子、硫酸ヘパリン、第ＸＩ因子、ｃ−ｊｕｎ、Ｆｒａ−２、Ｆｒａ−１、Ｊｕｎ  Ｂ、Ｐ−ｃ−Ｊｕｎ、トランスグルタミナーゼ３、アルファ−フェトプロテイン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ｅｒｂＢ２、ＶＥＧＦ、アルファ−シヌクレイン、並びにＬＰＳおよびその成分の脂質Ａなどの複合体と相互作用して結合する他の分子、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、およびトランスグルタミナーゼにより作られるイソペプチド結合などのタンパク質の修飾体のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記構造変化は、前記ヒドロキシアパタイトにより媒介される、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの結合したカルシウム結合タンパク質および／またはそのフラグメントは、哺乳動物の生物学的試料中の二価カチオンの遊離カルシウムが媒介する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１回の構造変化が、トランスグルタミナーゼによって開始される、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１回の構造変化の結果、ネオエピトープの形成が生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が哺乳動物の宿主で感染体として振る舞う、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が哺乳動物の宿主で感染体として振る舞い、該哺乳動物が少なくとも１つの構造変化したカルシウム結合タンパク質および／またはそのフラグメントに対する抗体を産生し、該抗体は標準的な免疫試験法を用いて測定できる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
哺乳動物に由来する生物学的試料内のリン酸カルシウムヒドロキシアパタイト粒子に結合したことに反応して少なくとも１回の構造変化を受けたカルシウム結合タンパク質に対する抗体を検出する方法であって、該方法は、（ｉ）ＣａＢＰ−ＨＡ複合体を提供するステップ、（ｉｉ）抗体−抗原複合体が形成される時間および条件下で、該哺乳動物の生物学的試料を該ＣａＢＰ−ＨＡ複合体に接触させるステップ、次いで、（ｉｉｉ）該抗体と該ＣａＢＰ−ＨＡ複合体との間に複合体が形成されるかどうかを検出するステップ、を含む、方法。
【請求項１６】
前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗原、またはその抗体結合フラグメントがヒト供給源に由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体がウシ供給源に由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体が哺乳動物供給源に由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体と前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体との間に複合体が形成されるかどうかを検出することが、免疫測定法によって決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体と前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体との間に複合体が形成されるかどうかを検出することが、ＥＬＩＳＡ法によって決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体と前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体との間に複合体が形成されるかどうかを検出することが、化学発光測定法によって決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体と前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体との間に複合体が形成されるかどうかを検出することが、免疫比濁分析によって決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体と前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体との間に複合体が形成されるかどうかを検出することが、イムノビーズ法によって決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体と前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体との間に複合体が形成されるかどうかを検出することが、可視バンドを形成する抗体−抗原複合体に基づくラテラルフローファーストアッセイによって決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物学的試料が、血清または血漿、全血、細胞培養試料、脳脊髄液、尿、唾液、精液、羊水、および嚢胞液のうちの少なくとも１つである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記生物学的試料が尿である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的試料が血清である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記生体液が粘液および唾液のうちの少なくとも１つである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物学的試料がヒトの患者から採取される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体が固体表面に結合させることによって固定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体が、市販のヒドロキシアパタイトまたは標準的なプロトコルに従い合成したヒドロキシアパタイトを用いて調製され、その後、哺乳動物の血清に供され、該血清または精製タンパク質または精製タンパク質の混合物中で約１分から約１ヶ月の間インキュベートされ、ここで該ヒドロキシアパタイトが該血清に含有されるカルシウム結合タンパク質、または添加した精製タンパク質と結合して、該ヒドロキシアパタイトに結合して一次的および二次的に構造変化したカルシウム結合タンパク質のコレクションの形成を可能にする、請求項１５に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体が、前記ＣａＢＰ−ＨＡバイオミネラルＮＢ／ＣＮＰ−ＣａＢＰ−ＨＡ複合体から構成される哺乳動物から回収したＮＢ／ＣＮＰに由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つの架橋酵素が添加される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの架橋酵素がトランスグルタミナーゼである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの架橋酵素の添加の結果、ネオエピトープが形成される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つの架橋酵素を添加する請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの架橋酵素がトランスグルタミナーゼである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つの架橋酵素の添加の結果、ネオエピトープの形成が生じる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記精製タンパク質またはタンパク質混合物が、Ｇｌａ含有ドメインをもつタンパク質、第ＩＩ凝固因子、第ＶＩＩ凝固因子、第ＩＸ凝固因子、第Ｘ／Ｘａ凝固因子、組織因子−凝固因子ＶＩＩａ複合体、プロトロンビナーゼ複合体（第Ｖ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩ因子）、第ＩＩ因子のフラグメント、トロンビン、プロトロンビンフラグメント１、マトリックスＧＬＡタンパク質およびオステオカルシン、オステオポンチン、オステオネクチン、タンパク質第ＸＩＩＩａ因子、フェチュインＡ、カルモジュリン、組織トランスグルタミナーゼＩＩ、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３、ＣＤ  ４２ｂ、ＮＦ−カッパＢ、ＣＤ１４、フェチュインＢ、ＣＤ４０、ミエロペルオキシダーゼ、フィブロネクチン、組織因子、ヒトの補体５ｂ−９、ＣＲＰ、ＣＤ６１、カッパ軽鎖、マクロファージＬ１タンパク質、ｈｓｐ  ６０、フィブリリン−１、ベータ−２−ミクログロブリン、ＣＤ１８、ラミニン、抗トリプシン、ノッチ−１、ＢＳＡ、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）、ＰＴＸ３、補体Ｃ５、フィブリン／フィブリノゲン、Ｄダイマー、第Ｖ因子、抗キモトリプシン、アネキシンＶ、ビトロネクチン、トロンビン、トロポニンＴ、ビメンチン、トロポミオシン、ヒト血清アルブミン、心筋トロポニンＩ、アポリポタンパク質Ａ１、ＭＨＣクラスＩ、アミロイドＰタンパク質、ｓＣＤ４０Ｌ、カリクレイン、ＡＴＩＩＩ、第ＶＩＩＩ因子、硫酸ヘパリン、第ＸＩ因子、ｃ−ｊｕｎ、Ｆｒａ−２、Ｆｒａ−１、Ｊｕｎ  Ｂ、Ｐ−ｃ−Ｊｕｎ、トランスグルタミナーゼ３、アルファ−フェトプロテイン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ｅｒｂＢ２、ＶＥＧＦ、アルファ−シヌクレイン、並びにＬＰＳおよびその成分の脂質Ａなどの複合体と相互作用して結合する他の分子、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、およびトランスグルタミナーゼにより作られるイソペプチド結合などのタンパク質の修飾体のうちの少なくとも１つである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記精製タンパク質またはタンパク質混合物が哺乳動物のプロトロンビンまたはその少なくとも１つのフラグメントである、請求項３１の方法。
【請求項４１】
前記精製タンパク質またはタンパク質混合物がヒト供給源に由来する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
前記精製タンパク質またはタンパク質混合物がウシ供給源に由来する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体と前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体との間で複合体が形成されるかどうかの検出が、結合抗体に特異的な二次抗体とともに前記複合体をインキュベートするステップを含み、該二次抗体が、該二次抗体の抗体−固定した抗原複合体への結合を示すために使用されるレポーター分子に連結する、請求項１５に記載の方法。
【請求項４４】
前記二次抗体が、抗ヒト免疫グロブリンまたは特定の動物種に対する免疫グロブリン、またはその特定のサブグループのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ、あるいはそれらの混合物を含み得る、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記レポーター分子が、二次抗体の抗体−固定した抗原複合体への結合の検出を可能にする同定可能なシグナルを提供する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体と前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体との間で複合体が形成されるかどうかを検出することが、病的石灰化に関連する少なくとも１つの疾患の診断、予後、および評価で有用である、請求項１５に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患が、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、慢性心不全、弁石灰化、動脈瘤、石灰性大動脈狭窄症、一過性脳虚血、発作、末梢血管疾患、脈管血栓症、歯苔、歯周病（歯髄結石）、唾液腺結石、慢性疲労症候群などの慢性感染症候群、腎臓結石、膀胱結石、胆石、膵臓病、腸疾患（膵管結石、クローン病、潰瘍性大腸炎など）、肝臓病（肝硬変、肝嚢胞など）、睾丸微石症（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｌｉｔｈ）、慢性前立腺結石、前立腺石灰化、血液透析患者における石灰化、マラコプラキア、自己免疫疾患、狼瘡、エリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、抗リン脂質症候群、結節性動脈炎、血小板減少症、溶血性貧血、脊髄炎、網状皮斑、舞踏病、片頭痛、若年性皮膚筋炎、グレーヴズ病、甲状腺機能低下症、Ｉ型真性糖尿病、アディソン病、下垂体機能低下症、胎盤障害、胎児障害、腎多嚢胞病、糸球体症、目の疾患（角膜石灰化、白内障、黄斑変性および網膜脈管構造誘導性プロセス並びにその他網膜変性、網膜神経変性、網膜炎、虹彩炎など）、耳の疾患（耳硬化症、耳石退化並びに前庭器および内耳に由来する症状（めまいおよび耳鳴））、甲状舌嚢胞、甲状腺嚢胞、卵巣嚢胞、癌（髄膜腫、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、奬液性卵巣腺癌など）、皮膚疾患（皮膚石灰沈着症、カルシフィラキシー、乾癬、湿疹、扁平紅色苔癬など）、慢性関節リウマチ、石灰沈着性腱炎、変形性関節症、線維筋痛症、骨棘、びまん性間質性骨格過骨症、頭蓋内石灰化（変性疾患の進行および認知症など）、貧血、赤血球内ナノ細菌感染、および脾石灰化を伴う赤血球関連の疾患、慢性閉塞性肺疾患、気管支結石、気管支の結石、神経障害、インプラントの石灰化および痂皮形成、混合性の石灰化したバイオフィルム、骨髄変性障害（多発性硬化症、ルー・ゲーリグ病、アルツハイマー病など）、パーキンソン病のうちの少なくとも１つである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも１つのヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、リポ多糖類結合タンパク質（ＬＰＳＢＰ）、および少なくとも１つのカルシウム結合タンパク質（ＣａＢＰ）を含む組成物であって、該少なくとも１つのヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、リポ多糖類結合タンパク質（ＬＰＳＢＰ）、および少なくとも１つのカルシウム結合タンパク質（ＣａＢＰ）が、ＨＡ−ＬＰＳＢＰ−ＣａＢＰ複合体を含む、組成物。
【請求項４９】
前記少なくとも１つのリポ多糖類結合タンパク質と前記少なくとも１つのカルシウム結合タンパク質とが、少なくとも１回の構造変化を受ける、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記構造変化が一次的な構造変化および二次的な構造変化のうちの少なくとも１つである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記構造変化が一次的な構造変化である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記構造変化が二次的な構造変化である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５３】
前記組成物が哺乳動物の宿主で内毒素として振舞う、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５４】
前記組成物に対する抗体が、免疫測定法によって検出され得る、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５５】
少なくとも１つのヒドロキシアパタイトと少なくとも１つの結合したカルシウム結合タンパク質とを含む組成物を使用して、哺乳動物の抗ＣａＢＰ−ＨＡ抗体を検出するプロセスであって、
ａ．少なくとも１つのヒドロキシアパタイトを調製するステップと、
ｂ．少なくとも１つのヒドロキシアパタイトを哺乳動物の血清に供するステップと、
ｃ．該少なくとも１つのヒドロキシアパタイトと血清とを、血清または精製タンパク質または精製タンパク質の混合物中で約１分から約１ヶ月間インキュベートさせるステップと、
ｄ．該少なくとも１つのヒドロキシアパタイトを、該血清または精製タンパク質または精製タンパク質の混合物に含有されるカルシウム結合タンパク質と結合させるステップと、
ｅ．該ヒドロキシアパタイトに結合し一次および二次的に構造変化したカルシウム結合タンパク質のコレクションの形成を可能にするステップと、
を含む、プロセス。
【請求項５６】
生物学的試料中の抗ＣａＢＰ−ＨＡ抗体を検出するための酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）用のキットであって、該キットは、
（ａ）クリアなＣａＢＰ−ＨＡ抗原でコーティングした固体支持体と、
（ｂ）哺乳動物に由来する生物学的試料と、
（ｃ）抗ＣａＢＰ−ＨＡ抗体と反応性のレポーター分子に連結される二次抗体と、
（ｄ）比色剤と、
（ｅ）標準と、
を含む、キット。
【請求項５７】
試料中の抗ＣａＢＰ−ＨＡ抗体を同定する方法であって、
（ａ）単離した抗原および二次抗体と、試薬と、試験試料中の抗体結合反応を検出するための装置とを含む抗ＣａＢＰ−ＨＡ抗体を同定するためのキットを提供し、該単離した抗体と該試料とを混合するステップと、
（ｂ）該試料に抗体結合反応があるかどうかを検出して、抗ＣａＢＰ−ＨＡ抗体の存在を確かめるステップと、
を含む、方法。
【請求項５８】
さらに、前記試薬にカルシウムキレート剤を添加するステップを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＣａＢＰ−ＨＡ複合体が、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、慢性心不全、弁石灰化、動脈瘤、石灰性大動脈狭窄症、一過性脳虚血、発作、末梢血管疾患、脈管血栓症、歯苔、歯周病（歯髄結石）、唾液腺結石、慢性疲労症候群などの慢性感染症候群、腎臓結石、膀胱結石、胆石、膵臓病、腸疾患（膵管結石、クローン病、潰瘍性大腸炎など）、肝臓病（肝硬変、肝嚢胞など）、睾丸微石症、慢性前立腺結石、前立腺石灰化、血液透析患者における石灰化、マラコプラキア、自己免疫疾患、狼瘡、エリテマトーデス、強皮症、皮膚筋炎、抗リン脂質症候群、結節性動脈炎、血小板減少症、溶血性貧血、脊髄炎、網状皮斑、舞踏病、片頭痛、若年性皮膚筋炎、グレーヴズ病、甲状腺機能低下症、Ｉ型真性糖尿病、アディソン病、下垂体機能低下症、胎盤障害、胎児障害、腎多嚢胞病、糸球体症、目の疾患（角膜石灰化、白内障、黄斑変性および網膜脈管構造誘導性プロセス並びにその他網膜変性、網膜神経変性、網膜炎、虹彩炎など）、耳の疾患（耳硬化症、耳石退化並びに前庭器および内耳に由来する症状（めまいおよび耳鳴））、甲状舌嚢胞、甲状腺嚢胞、卵巣嚢胞、癌（髄膜腫、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、奬液性卵巣腺癌など）、皮膚疾患（皮膚石灰沈着症、カルシフィラキシー、乾癬、湿疹、扁平紅色苔癬など）、慢性関節リウマチ、石灰沈着性腱炎、変形性関節症、線維筋痛症、骨棘、びまん性間質性骨格過骨症、頭蓋内石灰化（変性疾患の進行および認知症など）、貧血、赤血球内ナノ細菌感染および脾石灰化を伴う赤血球関連の疾患、慢性閉塞性肺疾患、気管支結石、気管支の結石、神経障害、インプラントの石灰化および痂皮形成、混合性の石灰化したバイオフィルム、骨髄変性障害（多発性硬化症、ルー・ゲーリグ病、アルツハイマー病など）、ならびにパーキンソン病のうちの１つまたはそれ以上と関連する、請求項２８に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体の存在が、石灰化関連の疾患に関連する、請求項２８に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体の存在が、冠動脈石灰化のレベルに関連する、請求項２８に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体の存在が、将来の心臓の事象について最もリスクが高い患者を同定する、請求項２８に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体の存在が、冠動脈石灰化のリスクがある患者を同定する、請求項２８に記載方法。
【請求項６４】
前記抗ＣａＢＰ−ＨＡ抗体の存在が、冠動脈疾患のリスクがある患者を同定する、請求項２８に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体の存在が、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、慢性心不全、弁石灰化、動脈瘤、石灰性大動脈狭窄症、一過性脳虚血、発作、末梢血管疾患、脈管血栓症、歯苔、歯周病（歯髄結石）、唾液腺結石、慢性疲労症候群などの慢性感染症候群、腎臓結石、膀胱結石、胆石、膵臓病、腸疾患（膵管結石、クローン病、潰瘍性大腸炎など）、肝臓病（肝硬変、肝嚢胞など）、睾丸微石症、慢性前立腺結石、前立腺石灰化、血液透析患者における石灰化、マラコプラキア、自己免疫疾患、エリテマトーデス、狼瘡、強皮症、皮膚筋炎、抗リン脂質症候群、結節性動脈炎、血小板減少症、溶血性貧血、脊髄炎、網状皮斑、舞踏病、片頭痛、若年性皮膚筋炎、グレーヴズ病、甲状腺機能低下症、Ｉ型真性糖尿病、アディソン病、下垂体機能低下症、胎盤障害、胎児障害、腎多嚢胞病、糸球体症、目の疾患（角膜石灰化、白内障、黄斑変性および網膜脈管構造誘導性プロセス並びにその他網膜変性、網膜神経変性、網膜炎、虹彩炎など）、耳の疾患（耳硬化症、耳石退化並びに前庭器および内耳に由来する症状（めまいおよび耳鳴））、甲状舌嚢胞、甲状腺嚢胞、卵巣嚢胞、癌（髄膜腫、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、奬液性卵巣腺癌など）、皮膚疾患（皮膚石灰沈着症、カルシフィラキシー、乾癬、湿疹、扁平紅色苔癬など）、慢性関節リウマチ、石灰沈着性腱炎、変形性関節症、線維筋痛症、骨棘、びまん性間質性骨格過骨症、頭蓋内石灰化（変性疾患の進行および認知症など）、貧血、赤血球内ナノ細菌感染、および脾石灰化を伴う赤血球関連の疾患、慢性閉塞性肺疾患、気管支結石、気管支の結石、神経障害、インプラントの石灰化および痂皮形成、混合性の石灰化したバイオフィルム、骨髄変性障害（多発性硬化症、ルー・ゲーリグ病、アルツハイマー病など）、ならびにパーキンソン病のうちの１つまたはそれ以上のリスクがある患者を同定する、請求項２８に記載の方法。
【請求項６６】
ヒドロキシアパタイトと、リポ多糖類結合タンパク質と、ＣａＢＰと（「ＨＡ−ＬＰＳＢＰ−ＣａＢＰ」）を含む内毒素含有粒子の形成により哺乳動物の宿主で感染体として振舞う、粒子。
【請求項６７】
前記粒子の抗ＨＡ−ＬＰＳＢＰ−ＣａＢＰ抗体の検出が免疫測定法による、請求項３５に記載の粒子。
【請求項６８】
抗血清抗体または抗プロトロンビン抗体を検出するために、ヒドロキシアパタイトをヒトまたはウシの血清あるいは精製プロトロンビンもしくはそのフラグメントとともにインキュベートすることによって、ＣａＢＰ−ＨＡ複合体を生成する方法。
【請求項６９】
ヒドロキシアパタイトと会合する血清または精製タンパク質における共有的に修飾したネオエピトープの検出。
【請求項７０】
レシピエントにとって潜在的に有害となりうるＣａＢＰ−ＨＡ複合体に対する抗体の存在についての、血液および組織ドナーのスクリーニング。
【請求項７１】
診断および治療目的のためにドナーのプールおよび抗体の精製のための、抗ＣａＢＰ−ＨＡ抗体の検出。
【請求項７２】
血液試料をＣａＢＰ−ＨＡ複合体の表面に曝露すること、およびその抗体またはＴ細胞レセプタが該複合体を特異的に認識することに起因して表面に結合した細胞を単離することによる、ＣａＢＰ−ＨＡ複合体を認識するＢリンパ球およびＴリンパ球の富化。
【請求項７３】
適した表面に固定した前記複合体に結合させることによる、請求項４３の細胞の除去。
【請求項７４】
ブロッキングおよび治療上の免疫応答を引き起こすための、ＣａＢＰ−ＨＡ複合体によるヒトまたは動物の免疫化または免疫調節。
【請求項７５】
抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体を使用して、感染性ＣａＢＰ−ＨＡ複合体に曝露されたヒトまたは動物の受動的保護。
【請求項７６】
ＣａＢＰ−ＨＡ複合体の非感染性の形態を使用する、感染性ＣＮＰに対するワクチン接種。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６０／６２５，５７２号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的に哺乳動物においてカルシウムを介する構造変化を受けたタンパク質を標的とする抗体を迅速なインビトロの検出に供する方法およびキットに関係する。より具体的には、本発明は、ヒドロキシアパタイトまたは鉱物カルシウム基質に結合する結果として構造変化したタンパク質に対する宿主抗体の検出方法を開示する。リン酸カルシウム鉱物の表面は、カルシウムと相互作用するタンパク質に非常に高い結合能と非常に高い結合親和性を提供する。リン酸カルシウム鉱物（アパタイト）は光を通すため、この基質は本発明の本文に記載する光学的定量化デバイスと一緒に適用できる。これらタンパク質ヒドロキシアパタイトの調製液は固体支持体に固定してもよく、そうすることで診断および予後目的で実験室において、並びに哺乳動物の免疫応答を迅速に検出するキットを利用する方法においてテストキットで日常的に使える。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
高分子の細胞外基質内における不連続に組織化した無機結晶構造の形成は、一般にバイオミネラリゼーションといわれる広範囲にわたる生物学的現象である。バイオミネラリゼーションの一例がリン酸カルシウムの形成である。組織内にリン酸カルシウムが沈着する場合、石灰化として知られる。哺乳動物の骨と歯のエナメル質が石灰化の例である。哺乳動物、特にヒトが罹患する周知の全疾患のうち５０％以上が鉱物カルシウムの沈着が原因である、または鉱物カルシウムの沈着に関連する。リン酸カルシウムからなり、ヒドロキシアパタイトとも呼ばれる鉱物カルシウムは骨や歯を形成する健康な過程ではなく、疾患で見られる。病的石灰化は様々な疾患で見られる。病的石灰化の原因はまだ分かっていないが、研究者たちはこれら疾患の各々に共通のつながりを発見している。すなわち、ナノ細菌または石灰化ナノ粒子（ＮＢ／ＣＮＰ）と呼ばれる極小の鉱物関連細菌様粒子の存在である。
【０００４】
哺乳動物内にヒドロキシアパタイト表面の沈着をもたらす病的石灰化はカルシウム結合タンパク質（ＣａＢＰ）を集める独特な基質を生成する。ＣａＢＰがリン酸カルシウムヒドロキシアパタイトに結合するのは当業者にはよく知られている。現在Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質データベースには３千以上のＣａＢＰとそのフラグメントが掲載されている。血液に曝露するヒドロキシアパタイトはプロトロンビン、Ｃ反応性タンパク質、マトリックスＧＬＡタンパク質などのカルシウム結合タンパク質と結合する。心臓血管医学における臨床実験から、曝露したヒドロキシアパタイト表面に血液が接触すると血栓を引き起こすことが示唆される。最近の冠動脈石灰化スコアデータはその実験を裏付けている。プラスのスコアは、心筋梗塞や発作などの将来のアテローム性動脈硬化症の血栓の事象を予測する良好なバイオマーカーであるからである。多くの研究から、アテローム性動脈硬化症、腎臓病、自己免疫疾患、糖尿病、および癌などの石灰化関連疾患にかかっている患者は多くの場合継続的に異常な血液凝固および血栓症をおこしていることも分かっている。
【０００５】
リン酸カルシウムはそのタンパク質との多重相互作用のためにタンパク質の三次元構造において多くの場合構造変化を媒介できる。かかる構造上の形態は骨や一時的には細胞内で普通に見られ、代謝または生理的な経路および反応を制御する素早いスイッチとして様々な生体調節系で機能する。リン酸カルシウム鉱物は血液または軟組織では正常な構成要素ではなく、骨では骨内膜によって血液および免疫系への直接の曝露から守られる。リン酸カルシウム粒子が血液に曝露すると、免疫系は粒子の表面に安定化された新たなタンパク質構造を「予測」でき、それに反応する。これによって自己抗体の構成体が生成され、自己抗体は自己免疫疾患および新規なタンパク質構造を曝露し免疫学的に認識されるようになる他の疾患の病理学的プロセスを媒介することがよく知られている。自己免疫はアテローム性動脈硬化症でも認知されている。
【０００６】
４つの凝固因子（第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子）はＧｌａドメインおよび他のカルシウム結合部位をもつカルシウム結合タンパク質である。例えば、Ｇｌａドメインは、石灰化防御系の一部として石灰化を調節することが知られるマトリックスＧｌａタンパク質、オステオポンチン、オステオカルシン、オステオネクチンからなる他のＧｌａタンパク質ファミリーと同様にヒドロキシアパタイト／リン酸カルシウムに活性結合する［（非特許文献１）＆非特許文献２］。フィブリン、第ＸＩＩＩａ因子、第ＩＩ因子のフラグメント、トロンビン、プロトロンビンフラグメントＩはすべてＣａＢＰの例である。
【０００７】
ヒドロキシアパタイト表面は哺乳動物の血液または血清においてＣａＢＰの適切な基層および活性化剤として二重の機能を果たす。ヒドロキシアパタイトが血液と接触する状況が数多く存在するため、ヒトの（病態）生理学にとってのこのことの重要性は大きい。すなわち、１）骨折、骨の手術、および歯の手術中に急性に、２）コーティングしていないインプラント、詰め物、アパタイト補助薬の導入により人工的に、３）アテローム硬化性血管におけるリン酸カルシウム沈着物の成長により慢性的に、易破綻性プラークの破裂、細胞の死亡、病的石灰化の曝露（例、ランダル斑、アテローム硬化性プラーク、癌の石灰化）、および結石により破局的に、４）大量の骨の退化を受けた動物の血液におけるリン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト高分子複合体により血液から、および５）ＮＢ／ＣＮＰにより全身に。
【０００８】
ヒドロキシアパタイトに結合するＣａＢＰは血液または血清中の遊離カルシウムの存在によって媒介される。遊離カルシウムは体内の鉱物カルシウムヒドロキシアパタイトとは異なる。遊離カルシウム原子は生理的ｐＨで正味２の陽電荷をもつ。遊離カルシウムは約１ｍＭのヒトの血液中の典型的な濃度で哺乳動物の体内で極めてよく維持される。遊離カルシウムのレベルの上昇は異常活性または疾患を示す。遊離カルシウムが存在すると、ＣａＢＰは利用できればリン酸カルシウム鉱物と結合し、それによって構造変化を起こす。そのため、構造変化したＣａＢＰに対する哺乳動物の体内に存在する抗体の検出は、病的石灰化を伴う疾患の診断および予後または病理において便利であろう。
【０００９】
カルシウムに結合したときのＣａＢＰの構造変化は十分に記録され、当業者には周知である。述べられるようにカルシウムイオンはＣａＢＰの結合特性に直接影響する。様々な親和性をもつＣａＢＰのカルシウム結合により、カルシウムイオンは構造変化をもたらし、その標的タンパク質を安定させ、ＣａＢＰをタンパク質分解から守り、ドメインの相互作用を調節することによってカルシウム依存機能を媒介する。例えば細胞内ＥＦハンドカルシウム結合タンパク質であるカルモジュリンはカルシウム依存の構造変化により１００以上のタンパク質を調節する。構造トポロジーがＣＤ２に似た細胞外非ＥＦハンドカルシウム結合タンパク質であるカドヘリンは、組織の発達および維持を制御する上で重要な役割を果たす。（Ｊｅｎｎｙ  Ｊ  Ｙａｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【００１０】
スクリプス研究所、分子生物学部門のＭ．Ｒ．ＮｅｌｓｏｎおよびＷ．Ｊ．Ｃｈａｚｉｎは「Ｃａ（２＋）センサータンパク質におけるカルシウム誘発構造変化の相互作用に基づく分析（Ａｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｃａ（２＋）ｓｅｎｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という題で、代表的なカルシウムセンサーカルモジュリン（ＣａＭ）およびトロポニンにおけるカルシウム結合誘発の構造変化の詳細な分析を発表し、そこでこれらタンパク質におけるカルシウム誘発の構造変化は各ドメイン内の４つのヘリックスのｐａｃｋｉｎｇの再構築により支配されることと、閉鎖構造と開放構造との比較からカルシウム結合がＥＦハンドの各々内の開放を引き起こすことを確認したと述べている。Ａａｌｉｍ  Ｍ．Ｗｅｌｊｉｅ他の「拡散ＮＭＲ分光法で研究したタンパク質の構造変化：ヘリックス−ループ−ヘリックス型カルシウム結合タンパク質への適用（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」はいくつかのヘリックス−ループ−ヘリックス型調節性Ｃａ２＋結合タンパク質で実施したパルス磁場勾配（ＰＦＧ）拡散ＮＭＲ分光法の研究を利用して、Ｃａ２＋飽和および／または結合する標的に関連付けて構造変化を特徴付けた。
【非特許文献１】Ｒ．Ｗ．Ｒｏｍｂｅｒｇ、Ｐ．Ｇ．Ｗｅｒｎｅｓｓ、Ｂ．Ｌ．Ｒｉｇｇｓ、Ｋ．Ｇ．Ｍａｎｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５、１１７６（１９８６）
【非特許文献２】Ｇ．Ｅ．Ｄｏｎｌｅｙ、Ｌ．Ａ．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．８、１９９（１９９８）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
カルシウム結合タンパク質が構造変化を受けている、ヒドロキシアパタイト基質に結合することによって複合体を形成するカルシウム結合タンパク質（ＣａＢＰ）に対する抗体の有意性を検出および評価する方法および組成物を開示する。開示される方法および組成物は一般的に結合および構造変化したカルシウム結合タンパク質（抗原）またはＣａＢＰ−ＨＡ複合体（以下、ＣａＢＰ−ＨＡ複合体という）を含有するヒドロキシアパタイト基質の製造に関わる。
【００１２】
本発明の開示される方法および組成物は、ヒドロキシアパタイト基質によるタンパク質の結合中に発生する一次および二次変化の測定に利用できる技術を記述する。一次変化はＣａＢＰまたはそのフラグメントがリン酸カルシウムと最初に相互作用するとき、例えば、生理的変化をするときにおこる。二次変化は、Ｃａ結合およびＣａ活性タンパク質である酵素、トランスグルタミナーゼを含むがそれだけに限定されないＣａ結合および／またはＣａ活性酵素である他のタンパク質または酵素により生じる架橋タイプの変化である。二次変化は、例えば、架橋したＣａＢｐ−ＨＡ複合体の形成に十分に長い時間での培養など適切な条件で起こすことができ、前記二次変化は一次結合中に生成されたタンパク質複合体にネオエピトープを生成する。この過程はトランスグルタミナーゼがＮＢ／ＣＮＰで架橋を開始するナノ細菌／石灰化ナノ粒子（ＮＢ／ＣＮＰ）培養株の調製でおこる。参照によりこれに組み込む本発明の譲受人に譲渡された米国特許第５，１３５，８５１号はＮＢ／ＣＮＰの培養株の方法を記述している。
【００１３】
ＣａＢＰタンパク質はヒドロキシアパタイト基質に結合してＣａＢＰ−ＨＡ複合体を形成し、前記ＣａＢＰは、これらタンパク質を抗原性に見せることによって哺乳動物の体内で免疫応答を開始する特異的な構造変化を受ける。この鉱物／タンパク質複合体の形成と宿主哺乳動物によるＣａＢＰ−ＨＡに対して生成された抗体が、前記抗体を、そのため疾患もしくは健康状態のリスクまたは疾患もしくは健康状態の傾向を検出、分析、および評価する手段を提供する。
【００１４】
抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体の検出は、疾患のリスクを判断するとともに患者の「治癒」状態を判断する独特かつ新規な診断および予後ツールを提供する。例えば、Ｋａｊａｎｄｅｒ他が実施した研究では、１３人の患者に４００ｍｇのエチドロネートと５００ｍｇのテトラサイクリンを１週間毎日投与し、その後３ヶ月間投与量を半分にして抗ＣＮＰ療法で治療した。３ヶ月間の療法の間と療法終了後の３ヶ月間、抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体に対する抗体を血清ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。１２人の患者の血清抗体レベルが低下し、平均で４．１５倍低下した。１人の患者の抗体レベルは６ヶ月の間同じままであった。その患者は指示に反してカルシウムサプリメント（すなわち、Ｃａｌｃｉｐｏｓ）を摂取していた。結果によると、抗体レベルは療法終了後の３ヶ月間変化しなかった。胃のヘリコバクターピロリ菌感染により生じる消化性潰瘍などの慢性感染において、抗ヘリコバクターピロリ菌ＩｇＧ力価の低下を観察することによって、根絶を測定および検証する。力価の２５％の低下を前記病原体をうまく根絶した確実な指標と考える。そのため、この類推に基づくと、抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体の定量化はＮＢ／ＣＮＰおよびそれにより引き起こされる数多くの疾患を治癒する療法の便利な指標となれる。
【００１５】
数多くの疾患で病的石灰化、または有害なヒドロキシアパタイトの沈着が見られる。これだけには限定されないが次のような疾患がある。動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、慢性心不全、弁石灰化、動脈瘤、石灰性大動脈狭窄症、一過性脳虚血、発作、末梢血管疾患、脈管血栓症、歯苔、歯周病（歯髄結石）、唾液腺結石、慢性疲労症候群などの慢性感染症候群、腎臓結石、膀胱結石、胆石、膵臓病、腸疾患（膵管結石、クローン病、潰瘍性大腸炎など）、肝臓病（肝硬変、肝嚢胞など）、睾丸微石症、慢性前立腺結石、前立腺石灰化、血液透析患者における石灰化、マラコプラキア、自己免疫疾患、紅斑性狼瘡、強皮症、皮膚筋炎、抗リン脂質症候群、結節性動脈炎、血小板減少症、溶血性貧血、脊髄炎、網状皮斑、舞踏病、片頭痛、若年性皮膚筋炎、グレーヴズ病、甲状腺機能低下症、Ｉ型真性糖尿病、アディソン病、下垂体機能低下症、胎盤障害、胎児障害、腎多嚢胞病、糸球体症、目の疾患（角膜石灰化、白内障、黄斑変性および網膜脈管構造誘導性プロセス並びにその他網膜変性、網膜神経変性、網膜炎、虹彩炎など）、耳の疾患（耳硬化症、耳石退化並びに前庭器および内耳に由来する症状（めまいおよび耳鳴））、甲状舌嚢胞、甲状腺嚢胞、卵巣嚢胞、癌（髄膜腫、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、奬液性卵巣腺癌など）、皮膚疾患（皮膚石灰沈着症、カルシフィラキシー、乾癬、湿疹、扁平紅色苔癬など）、慢性関節リウマチ、石灰沈着性腱炎、変形性関節症、線維筋痛症、骨棘、びまん性間質性骨格過骨症、頭蓋内石灰化（変性疾患の進行および認知症など）、貧血、赤血球内ナノ細菌感染、および脾石灰化を伴う赤血球関連の疾患、慢性閉塞性肺疾患、気管支結石（ｂｒｏｎｃｈｏｌｉｔｈｓ）、気管支の結石（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｓｔｏｎｅ）、神経障害、インプラントの石灰化および痂皮形成、混合性の石灰化したバイオフィルム（ｍｉｘｅｄ  ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  ｂｉｏｆｉｌｍ）、骨髄変性障害（多発性硬化症、ルー・ゲーリグ病、アルツハイマー病など）、パーキンソン病。
【００１６】
開示される方法は、構造変化を受けたＣａＢＰ−ＨＡ複合体タンパク質に対する１つまたはそれ以上の抗体の検出に関わることができる。本発明の方法において、抗体は動物の血清または血漿、哺乳動物の細胞培養標本、脳脊髄液、尿、唾液、精液、羊水、および嚢胞液で検出される。好適な実施形態では、抗体は哺乳動物の血液、血清、または尿で試験する。
【００１７】
従って、血液、血清、または尿を希釈せずに、もしくは適切な希釈液（蒸留水など）で希釈して測定できるが、感度が高まるため希釈が好ましい（特に回収装置を使用する場合）。
【００１８】
ＣａＢＰ−ＨＡ複合体の調製液は便宜的にかつなるべくなら固体支持体に結合する。適する固体支持体はニトロセルロース膜、ガラス、またはポリマーを含む。多数の基質へのヒドロキシアパタイトコーティングおよびその沈着は当業者にはよく知られている。使用に望ましいポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むが、これだけに限定されない。固体支持体は細片、管、ビード、円板、またはマイクロプレートの形態、あるいは免疫測定法を実施するのに適したあらゆる他の表面でよい。
【００１９】
抗原は様々な経路から生産できる。これだけには限定されないが、１）０．０２０から２００μｍの厚さの合成ヒドロキシアパタイトを使用し、適切なＣａＢＰと結合することによってＣａＢＰ−ＨＡ複合体を形成するために適切な条件下で適した期間哺乳動物の血液または血清もしくは精製タンパク質に供する、または２）哺乳動物由来のＮＢ／ＣＮＰを使用し、前記バイオミネラルのＮＢ／ＣＮＰはＣａＢＰ−ＨＡ複合体から構成される。
【００２０】
ＣａＢＰ−ＨＡ複合体タンパク質に対する抗体は、構造変化したＣａＢＰタンパク質および他の分子とのその複合体に対する抗体である。以下に多くのＣａＢＰの代表的なものを列挙するが、本発明の範囲を制限するつもりはない。ＣａＢＰ−ＨＡ複合体の構造変化したタンパク質は、これだけに限定されないが、次のものを含む。Ｇｌａ含有ドメインをもつタンパク質、第ＩＩ凝固因子、第ＶＩＩ凝固因子、第ＩＸ凝固因子、第Ｘ／Ｘａ凝固因子、組織因子−凝固因子ＶＩＩａ複合体、プロトロンビナーゼ複合体（第Ｖ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩ因子）、第ＩＩ因子のフラグメント、トロンビン、プロトロンビンフラグメント１、マトリックスＧＬＡタンパク質およびオステオカルシン、オステオポンチン、オステオネクチン、タンパク質第ＸＩＩＩａ因子、フェチュインＡ、カルモジュリン、組織トランスグルタミナーゼＩＩ、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３、ＣＤ  ４２ｂ、ＮＦ−カッパＢ、ＣＤ１４、フェチュインＢ、ＣＤ４０、ミエロペルオキシダーゼ、フィブロネクチン、組織因子、ヒトの補体５ｂ−９、ＣＲＰ、ＣＤ６１、カッパ軽鎖、マクロファージＬ１タンパク質、ｈｓｐ  ６０、フィブリリン−１、ベータ−２−ミクログロブリン、ＣＤ１８、ラミニン、抗トリプシン、ノッチ−１、ＢＳＡ、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）、ＰＴＸ３、補体Ｃ５、フィブリン／フィブリノゲン、Ｄダイマー、第Ｖ因子、抗キモトリプシン、アネキシンＶ、ビトロネクチン、トロンビン、トロポニンＴ、ビメンチン、トロポミオシン、ヒト血清アルブミン、心筋トロポニンＩ、アポリポタンパク質Ａ１、ＭＨＣクラスＩ、アミロイドＰタンパク質、ｓＣＤ４０Ｌ、カリクレイン、ＡＴＩＩＩ、第ＶＩＩＩ因子、硫酸ヘパリン、第ＸＩ因子、ｃ−ｊｕｎ、Ｆｒａ−２、Ｆｒａ−１、Ｊｕｎ  Ｂ、Ｐ−ｃ−Ｊｕｎ、トランスグルタミナーゼ３、アルファ−フェトプロテイン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ｅｒｂＢ２、ＶＥＧＦ、アルファ−シヌクレイン、並びにＬＰＳおよびその成分の脂質Ａなどの複合体と相互作用して結合する他の分子、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、トランスグルタミナーゼにより作られるイソペプチド結合などのタンパク質の修飾体。
【００２１】
本発明により、哺乳動物の抗体と二次抗体の間で複合体の形成を検出して健康リスクを診断する。抗体は血液、血清、または尿の標本中の抗ヒトまたは抗特異的動物種のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ抗体（またはその混合物）および抗ＣａＢｐ−ＨＡ抗体を含むことができる。そのためある形態の検出手段は抗体−抗原複合体の存在（または必要なら、その量）を同定する必要がある。
【００２２】
検出手段はレポーター分子とコンジュゲートした二次抗体にでき、これは哺乳動物の体液に見られる少なくとも１つのＣａＢＰ−ＨＡ抗体に特異的なものである。「レポーター分子」とは、その化学的な性質により、分析により同定可能な特性をもつ、もしくは抗原に結合する抗体の検出を可能にする分析により同定可能なシグナルを提供する分子または群である。検出は定性的または定量的のいずれでもよい。この種の測定法で最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、蛍光物質または放射性核種含有分子（すなわち、ラジオアイソトープ）のいずれかである。酵素免疫測定法の場合、酵素は、一般的にグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩によって、二次抗体にコンジュゲートする。ただし、容易に分かるように、多様なコンジュゲート技術が存在し、当業者には容易に利用できる。一般に使用される酵素には、特にホースラディシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが含まれる。特異的酵素とともに使われる基質は一般的に、対応する酵素による加水分解の際、検出可能な色の変化を生じさせるために選ばれる。基質は選ぶ用途により可溶性または不溶性にできる。例えば、アルカリホスファターゼコンジュゲートでの使用には、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウムが適する。ペルオキシダーゼコンジュゲートには、１，２−フェニレンジアミン−５−アミノサリチル酸、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン、トリジン、またはジアニシジンが一般に使われる。前述した発色基質ではなく、蛍光生成物を生む蛍光基質を採用することも可能である。蛍光基質の例は、３−ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸（ＨＰＰＡ）およびジヒドロテトラメチロースアミンであり、蛍光標識の例はフルオレセインおよびローダミンである。ある波長の光で照射することによって活性すると、蛍光色素標識のついた抗体は分子の興奮性の状態を誘導しながら光エネルギーを吸収し、その後通常光学顕微鏡で目視によって検出可能な特徴的な色の光を放出する。免疫蛍光検査法およびＥＩＡ技術はともに当分野で十分に定着しており、本方法に特に好ましい。ただし、ラジオアイソトープ、化学発光、生物発光分子および／または染料、および他の発色物質など、他のレポーター分子も採用できる。
【００２３】
抗ＣａＢＰ−ＨＡ抗体の検出および測定は疾患の診断に役立てられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
好適な実施形態の詳細な説明
開示される方法および組成物は、以下の特定の実施形態とそれに含まれる例の詳細な説明並びに図面およびその以上および以下の説明を参照することによりよく理解できる。
【００２５】
ＣａＢＰ−ＨＡ複合体の存在を検出、分析、並びに評価する方法および組成物を開示する。開示される方法および組成物は一般的に哺乳動物の生体液に存在するＣａＢＰ−ＨＡ複合体の１つまたはそれ以上の抗体の検出に関わる。
【００２６】
本発明の一実施形態による免疫測定試験キットは、二次抗体の調製を含めいくつかの成分を組み入れ、抗ヒトまたは抗特異的動物種のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥもしくはその混合物、二次抗体とプローブのコンジュゲート、抗原の調製、抗原をコーティングしたマイクロタイタープレートまたは縦型テストストリップの調製、試薬の調製、および免疫測定を含むことができる。本発明の実施に便利な免疫測定法は、ウエスタンブロット、放射性同位元素標識免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降測定法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、凝集反応測定法、補体結合測定法、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫測定法、タンパク質Ａ免疫測定法、量子ドット測定法、電気化学発光などの技術または当業者に周知の他の技術を用いた系の測定を含むが、これだけに限定されない。そのため、例として、本発明をＥＬＩＳＡに関連して説明していく。ただし、以下の実施形態は本発明の組成物を組み込む免疫測定法に関係するが、特定の種類の免疫測定法に限定されるものでないことは理解されるべきである。
【００２７】
従って、抗ヒトまたは抗特異的動物種のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥもしくはその混合物を含むことのできる二次抗体の調製は、当業者によく知られるあらゆる方法で行うことができる。
【００２８】
抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体を認識する抗ヒトまたは抗特異的動物種のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ抗体は抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体と結合できる。これらは抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体を固定する、もしくは除去、測定、および精製のために生物学的試料から抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体を取り出すのに利用できる。抗ＣａＢＰ−ＨＡ抗体の免疫測定法を構成するのに抗体は多数の方法で使用できる。また、抗体は細胞培養株もしくは動物またはヒトから抗ＣａＢＰ−ＨＡ抗体を除去するときにも使える。さらに、細胞培養株、動物、またはヒト由来の生成物の精製に抗体を使用できる。これらには、血液、血清、およびその生成物、または細胞および器官、あるいは細胞を含むインビトロで培養した生成物が含まれるであろう。
【００２９】
注目すべきことに、ＣａＢＰ−ＨＡ複合体とそこで構造変化したタンパク質の存在は細胞内および細胞外石灰化および石灰化関連の疾患の病因に関与してきたため、抗ヒトまたは抗特異的動物種のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ抗体を使用して、検体内の抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体の存在、実際には抗ＮＢ／ＣＮＰ抗体の存在を検出および定量化できる。この検出および定量化は、翻って、抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体レベルを細胞内および細胞外の石灰化のレベルと関連付けることにより診断および予後の目的に、あるいは治療または療法に対する反応をモニタリングするために使用できる。
【００３０】
抗ヒトまたは抗特異的動物種のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ抗体の調整後、次のステップは抗体とプローブのコンジュゲートに関わる。本発明の一実施形態では、まずｐＨ９．０の約０．０１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液で抗体溶液を一晩透析してこれを行うことができる。次に、当業界に周知の実務に従い、酵素標識プローブを調製するべきである。プローブを調製する一実施形態は、まず個別容器で、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とＮａＩＯ４の溶液を混合するステップを必要とする。例えば、一方の容器で、約１ｍＬの水に約２ｍｇから１０ｍｇのＨＲＰを加える。別の容器で、約１ｍＬの水に約２１．４ｍｇのＮａＩＯ４を加える。さらに、ピペットで約１００マイクロリットルのＮａＩＯ４をＨＲＰ混合物に移すことによって、ＮａＩＯ４溶液とＨＲＰ溶液を化合させることができる。この混合物をさらに室温で約１０分間放置すると、その間に色が深緑色に変わる。その間、抗体コンジュゲートプローブを調製する本実施形態に従い、プローブをｐＨ４．０の５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液に対して一晩透析する。翌日、活性化したＨＲＰを含有する酢酸ナトリウム緩衝液にｐＨ９．５の約０．２Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液を添加する。この緩衝溶液をさらに抗体溶液と混合して、得られた抗体−緩衝液混合物を２回培養する。抗体−緩衝液の混合物の初回の培養は室温で約２時間行う。この２時間の終わりに、０．１ＭのＮａＢＨ４水溶液を約１００マイクロリットル添加した後、２回目の培養を行い、２回目の培養で得られた混合物を４℃でさらに２時間培養する。最後に、得られた混合物を透析チューブに入れて、ＰＢＳに対して一晩透析する。
【００３１】
別の実施形態では、約５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の溶液をｐＨ６．８の０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に入れて、約４℃で一晩透析する。さらに、透析した約０．５ｍｇのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を、約１０ｍＬの１０ｍＭ  ＰＢＳ中の約１．５ｍｇのアルカリホスファターゼ（免疫測定法グレード、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディアナポリス）に添加する。混合物を調製したら、８０マイクロリットルの２５％グルタルアルデヒドを添加して、溶液を静かに混合して化合させる。得られた溶液をさらに室温で約２時間放置する。２時間後、ＰＢＳＬＥ（１００ｍＭのリシンと１００ｍＭのエタノールアミンを含有する１０ｍＭのＰＢＳ）をほぼ等価容量（１０ｍＬ）で添加することによって反応を停止する。次にこの溶液を脱塩しなければならない。本実施形態によると、溶液はＰＢＳＮ（１０ｍＭのＰＢＳに０．０５ＭのＮａＮ３を添加）に入れたセファデックスＧ２５カラムで脱塩する。アルカリホスファターゼ−抗体コンジュゲートを脱塩した後、２０ｍＬのコンジュゲートを４０ｍＬのブロッキング用緩衝液（２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３を含有する０．１７Ｍのホウ酸塩緩衝液）と混合する。最後に、滅菌のために６０ｍＬのコンジュゲートを低タンパク質結合フィルター、Ｍｉｌｌｅｘ  ＨＶ  ０．４５マイクロ−ｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ベッドフォード）で濾過する。濾過して滅菌してしまえば、コンジュゲートは４℃で保管できる。
【００３２】
別の実施形態では、当業者の周知のように、プローブの基質として機能させるためにパサデナのＭＯＳＳ社が製造した基質溶液を利用してもよい。
【００３３】
次のプロセスは、免疫測定法用の抗原の調製に関わる。抗原の調製には２種類の方法と開始組成物がある。１）哺乳動物の体内から回収して超音波処理したナノ細菌／石灰化ナノ粒子の使用、または２）市販または合成のリン酸カルシウム鉱物ヒドロキシアパタイトを哺乳動物の血液または血清あるいは精製タンパク質またはタンパク質の混合物に、一次結合および、望む場合、前記血液または血清、もしくはトランスグルタミナーゼまたは他の適した酵素を添加した溶液に含有されるＣａＢＰの二次的な構造変化ができるのに十分な時間供する。
【００３４】
組織培養株と同様な条件下でＮＢ／ＣＮＰを培養する抗原培養法。本発明の実施において標準的なあらゆる組織培地が役立つ。細胞または組織培地は一般的に哺乳動物の細胞の培養に使われる。培養中、ＮＢ／ＣＮＰはその繁殖、凝集、バイオフィルムの分泌および／またはそのアパタイト細胞外皮の肥厚化のため光学顕微鏡法で見えるようになる。対照として比較のために生育不能なまたは「死んだ」ＮＢ／ＣＮＰを提供することによってその検出を助ける。また、一般細菌よりはるかに少ないが、培養株で汚染物質になりうる、粒子が染色可能な核酸を含むか確認するヘキスト染色法を変更したものが開発されている。この方法は本発明の譲受人に譲渡された、参照によりこれに組み込む米国特許第５，１３５，８５１号に開示される。
【００３５】
本発明の一実施形態は、その成長の必要条件を満たすことによって、ＮＢ／ＣＮＰの複製に適した合成培地に関わる。液体培地はＲＰＭＩ  １６４０またはＤＭＥＭとして知られる標準的な組織培地を含むことができる。この培地はＧｉｂｃｏ社（イギリス、ミドルセックス、アクスブリッジ）から入手できるアミノ酸、塩等の標準化された組成物である。
【００３６】
培地の組成物は基本的に滅菌水に溶かす。水が未同定物質の細胞毒性不純物を含有することがあるため、使用する水質は極めて重要である。水が汚染源とならないように注意しなければならない。例えば、水道水、脱イオン水、または注射用の滅菌水は、その滅菌を事前に点検していればすべて適切であろう。
【００３７】
本発明の抗原としてＮＢ／ＣＮＰの使用を望む場合、培地も寒天培地またはアガロースを使用して凝固できる。ただし、ここでも寒天培地またはアガロースが細胞毒性の不純物を含有することがある。ＬまたはＤ，Ｌ−セレノメチオニンなどのヌクレオチド前駆体および栄養素を添加することによって、成長も任意に刺激する。このように培地はＤ，Ｌ−セレノメチオニン、アデノシン、チミジン、ウラシル、グアニン、シトシンから分離して調製した混合物（５０〜１００倍濃縮）を補うことが好ましく、これら物質はすべてミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手できる。例えば、１００倍濃縮液は溶媒に溶かして、１０ｍＭのＤＬ−セレノメチオニンと、アデノシン、チミジン、ウラシル、グアニン、およびシトシンの化合物をそれぞれ１ｍＭずつ含有する。最終的な培地は、９９ｍＬの基本培地に１ｍＬの１００倍濃縮液を溶かして添加して準備する。基本培地と栄養素の準備には、脱イオン水または蒸留水を利用する。医薬品グレードの成分と生物滅菌装置を利用するときの標準的な手順に従う。
【００３８】
ＮＢ／ＣＮＰ培養株を細胞スクレーパーで静かに掻き取る。培養を遠心分離管に移す。管を超遠心機で約１５０００ｇで４５分間遠心分離する。ペレットを滅菌ＰＢＳで洗浄し、滅菌したエッペンドルフチューブに入れる。容量約５０μＬのコロイド状のナノマテリアル−鉱物複合体を１０ｍＬのＰＢＳで懸濁して、１０秒間２回音波破砕する（１０秒の間隔をあけて）。濁度の値を一定になるまで音波破砕を繰り返す。音波破砕の間、氷で冷却して温度を制御し、最高に達する温度は６０℃とする。懸濁液はＰＢＳで４００ｍＬまで希釈する。溶液の濁度の値は５ＮＴＵから２０ＮＴＵまでが許容できる。コーティング溶液であるこの溶液をさらにＥＬＩＳＡ用マルチウェルプレートにピペットで１００μｌ／ウェル移す。プレートを＋２から＋８℃の間で一晩振動させずに培養する。プレートをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１回洗浄する。次に、Ｔｗｅｅｎを含有するブロッキング用溶液をピペットで３００μｌ／ウェル移してプレートをブロックする。さらにプレートを室温で２時間または＋２℃から＋８℃の間で一晩培養する（振動させない）。プレートを１回ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、適した防止剤（ＮａＮ３）を添加した保存液を１５０μｌ／ウェル添加して、ウェットプレートとして保管するプレートを準備する。プレートをテープで密閉し、湿度調整したボックスで保管する。代わりの方法として、プレートをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１回洗浄してドライプレートを準備する。その後、ショ糖、ソルビトール、または他の適した糖を含有する飽和溶液を１００μｌ／ウェル添加し、プレートシェーカーで５分間培養してプレートを飽和させる。プレートを紙に当てて軽く叩いて乾燥させ、空にする。プレートを＋３０℃の乾燥オーブンにシリカゲルと一緒に入れ（空気を循環させながら）、２時間半（乾燥するまで）培養する。プレートをオーブンから取り出して、室温で安定させる。さらにプレートをアルミニウム製の袋に乾燥剤の袋（Ｄｅｓｉ  Ｐａｋ（Ｒ））（１１ｇ／プレート）と一緒に詰めて、プレートを包んだ袋を加熱密閉する。プレートは＋２℃から＋８℃で保管する。
【００３９】
古い培養（１ヶ月超え）で特に顕著なＮＢ／ＣＮＰの鉱化作用は測定を阻害することが知られている。希釈した試料では、最終濃度３０ｍＭのカルシウムキレート剤を用いてこれを避けられる。本発明の実施形態によると、カルシウムキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコ四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＥＤＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣＤＴＡ）、１，２−Ｂｉｓ（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、その薬剤として許容される塩のうち一または複数を含むことができる。カルシウムキレート剤の添加は利用可能な抗原のすべてを曝露するが、背景に対する影響はもたない。ＮＢ／ＣＮＰの若い（１ヶ月未満）培養からのシグナルは、カルシウムキレート剤の処理により２倍から４倍増加し、無血清培養株からのシグナルはカルシウムキレート剤の処理により１０倍以上増加する。カルシウムキレート剤は非培養ＮＢ／ＣＮＰから得たシグナルに対する影響はもたない。このように、本発明によると、本明細書で開示するキットおよび方法は、培養したＮＢ／ＣＮＰを試験するとき試料を希釈するために使用する測定用緩衝液にカルシウムキレート剤を添加するステップを含むことができる。本発明の一実施形態では、ＮａＯＨを添加してｐＨを約７．５に調整した５００ｍＭのＥＤＴＡ水溶液を使用する。
【００４０】
代わりの方法として、ヒトまたはウシ由来の血清、血清タンパク質、または精製タンパク質は、合成ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）表面をタンパク質溶液に１分から１ヶ月の間曝露することによって当該表面に結合できる。この期間中、タンパク質はＨＡ表面に吸着し、ＨＡ表面との相互作用に典型的なその立体構造を得る。また、血清に自然に存在する、またはタンパク質溶液に添加できる架橋を含む共有的に修飾、例えばトランスグルタミナーゼなどの酵素によりネオエピトープを生成できる。コーティング手順の後、前述した免疫測定法で使用する前に材料を洗浄してブロックしなければならない。方法は飽和カルシウム溶液およびリン酸塩溶液を使用して、実施例４に示すように低温でＥＬＩＳＡプレートまたは他の適したデバイスにアパタイト表面を作ることができる。さらに、合成ＨＡコーティングを準備する他の方法を、当業者によく知られる当該プロセスに適した材料に適用できる。アパタイトコーティングは可視光に透過性で、そのため当業者によく知られる光学読取式および他の光学的な分析器およびプロトコルまたは光散乱分析器およびプロトコルに適合する。
【００４１】
具体的には、ヒドロキシアパタイトに結合し構造変化したタンパク質に対するヒトの自己抗体を、基層として作用する合成アパタイトを用いて測定した。合成アパタイトはいくつかの出版されている手順を用いて作成できる。プラスチック表面をコーティングするために、Ｐｏｓｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｉｃｅ［Ｊ．Ｗ．Ｐｏｓｅｒ、Ｐ．Ａ．Ｐｒｉｃｅ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５４、４３（１９７９）］に従い滅菌溶液を用いて合成アパタイトを準備した。代替法は高温に加熱したリン酸カルシウムのスプレーの使用で、これはそれに適した金属およびセラミックタイプの表面にコーティングするために使える。１００ｍＬ／ウェルのヒドロキシアパタイト溶液を９６ウェルのポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ）にピペットで落とした。プレートを空気循環するオーブンの中で＋３７℃の温度で一晩乾燥させた。精製タンパク質、ヒトのプロトロンビンフラグメント１．２（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をＰＢＳで１０ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、溶液を１００μｌ／アパタイトコーティングしたウェルに加えた。プレートを＋４℃で一晩培養した。翌日、タンパク質溶液を除去し、プレートをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１回洗浄して、Ｔｗｅｅｎ含有溶液を加えて室温で２時間ブロックした。ブロッキング用溶液を除去し、プレートをウェットプレートまたはドライプレートとして保管する準備をした。ウェットプレートは保存液（ＮａＮ３／Ｐｒｏｃｌｉｎ−ＰＢＳ）を添加して準備し、プレートをテープで密閉した。貯蔵寿命を延ばすために、プレートを前述のようにブロックした後乾燥させ、ショ糖または他の糖を含有する溶液で５分間飽和させた。飽和溶液を除去し、プレートを＋３０℃のオーブンで２時間半乾燥させた。乾燥後、プレートをテープで密閉した、または水分量を制御する活性化した乾燥剤の袋と一緒にアルミニウム製の袋に入れた。プレートは使用前にＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。血清または血漿試験試料をＴｗｅｅｎ含有測定用緩衝液で１：５００に希釈し、複製してピペットで１００ｍＬ／ウェル入れた。測定は、陽性対照液から作成した希釈シリーズを用いて定量化できる。試料は適度に振動させながら室温で１時間培養し、培養後プレートをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。二次抗体ＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ）を１：４０００に希釈してＴｗｅｅｎ含有の希釈溶液にし、それを１００ｍＬずつすべてのウェルに添加した。プレートを適度に振動させながら室温で１時間培養した。プレートはＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、１００ｍＬの基質溶液ＴＭＢ（Ｍｏｓｓ社）をすべてのウェルに添加した。さらにプレートを光から保護しながら培養したところ、６３０ｎｍの吸光度を読み取った。必要な場合、反応はＨ２ＳＯ４で停止でき、４０５ｎｍまたは４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
【００４２】
前述したように、ヒドロキシアパタイトはカルシウムとリン酸塩の飽和溶液から沈殿させることができ、それによって適した基質に付着する。ＨＡは、噴霧乾燥または流動層乾燥などの凝結および／または溶媒抽出のメカニズムによって球または同様なものなどの固体粒子にすることもできる。ＨＡの形状または起源は本発明の目的に限られることはなく、どのＨＡ表面もＣａＢＰ−ＨＡ複合体の形成の適切な基質であることが知られる。
【００４３】
次のプロセスは本発明で開示する免疫測定キットと使用する試薬の調製に関わる。本発明の一実施形態では、試薬は９６ウェルのマイクロタイタープレートと使用する試薬を含むことができ、目標値の標準、測定用緩衝液（５０ｍＬ）、二次抗体濃縮液（１．１ｍＬ）、二次抗体希釈液（１２ｍＬ）、洗浄用緩衝液濃縮液（２５倍）（４０ｍＬ）、基質溶液（前述したように、プローブとして使用する）（１３ｍＬ）、反応停止液（１３ｍＬ）、マイクロタイタープレート（上記の通りコーティングした陽性対照を有し、陰性対照として測定用緩衝液を使用する。
【００４４】
試験試料での抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体の検出は多様な方法で行うことができる。一実施形態では、免疫測定を実施して個体から回収した検体中の抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体を同定する。検体を回転して、回収から２時間以内に血清を凝血塊から分離する。検体は２℃から８℃で最長４日間保管でき、−２０℃から−８０℃では少なくとも１年間保管できる。冷凍と解凍を繰り返すのは避けるべきである。
【００４５】
別の実施形態では、免疫測定は蛍光測定法、化学発光測定法、または放射性同位元素標識免疫測定法を用いて実施し、抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体レベルを検出し測定する。本実施形態では、二次抗体は、直接、もしくはラジオアイソトープあるいは検出可能な分子またはタンパク質などの検出可能な標識を使用して間接的に標識するのが好ましい。様々な種類の標識並びにポリペプチドおよび抗体に直接もしくは間接的に標識をコンジュゲートする方法が当業者にはよく知られており、酵素、ラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質、コロイド金、ラテックスビーズなどの着色粒子を含む発色物質が含まれる。以下の例は酵素結合免疫反応吸着法（ＥＬＩＳＡ）および放射性同位元素標識免疫測定法を含む免疫測定法に適する標識である。（１）抗体は、これだけに限定されないが、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、または１３１Ｉなどの放射性同位元素標識にコンジュゲートできる。標識の検出はシンチレーション計数、ガンマ線スペクトロメトリー、またはオートラジオグラフィなどの方法で行える。（２）代わりの方法として、発光性飛翔昆虫のルシフェリンの派生物などの生物発光標識を使用できる。生物発光物質は従来の方法でポリペプチドに共有結合し、ルシフェラーゼなどの酵素が生物発光分子を生じるＡＴＰとの反応を触媒して、光の光子を発するとき、標識されたポリペプチドを検出する。（３）あるいは、発蛍光団も標識として使える。発蛍光団の例は、フルオレセインおよびその派生物、フィコエリトリン、アロ−フィコシアニン、フィコシアニン、ローダミン、テキサスレッドを含む。発蛍光団は一般に蛍光検出器で検出する。（４）さらに別の方法として、ポリペプチドと抗体は色素原で標識して、酵素またはアフィニティ標識を提供できる。例えば、抗体をビオチン−アビジン反応で利用できるようにビオチン標識でき、これは酵素または発蛍光団などの標識にも結合できる。（５）代わりの方法として、抗体はペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または基質を添加すると発色もしくは発蛍光反応をする他の酵素で標識できる。５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（ルミノールＴ．Ｍ．としても知られる）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ミズーリ州セントルイス）などの添加物と、ｐ−ヒドロキシビフェニル（ｐ−フェニルフェノールとしても知られる）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ミズーリ州セントルイス）などの反応速度増強剤を使用して、ホースラディシュペルオキシダーゼなどの酵素を発光反応によって増強でき、酵素基質の発光性または発蛍光性ジオキセタン派生物も使用できる。（６）さらに、二次抗体は当業者によく知られる方法に従う免疫電子顕微鏡法またはラテラルフローファーストアッセイ（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｆａｓｔ  ａｓｓａｙ）で使用するためにコロイド金で標識してもよい。当該標識は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出でき、または分光光度計、屈折計、またはスキャナーを用いて色の変化を検出することによって検出する。抗体とアッセイコンジュゲートを標識する以上の方法並びに他の方法は当業者にはよく知られている。上記標識は単なる例として列���しており、当分野で周知の標識の範囲を制限するものではない。
【００４６】
免疫原性試験は様々な方法で行える。以下の実施例１は、ＥＬＩＳＡ試験を実施できるある方法を記述する。以下の実施例２は、抗ＮＢ／ＣＮＰ抗体の定量化を用いて、患者の冠状動脈疾患の罹患性を判断するある方法を記述する。実施例３は生体ＣａＢＰ−ＨＡ複合体および人工的に作ったＣａＢＰ−ＨＡ複合体に対するヒトの免疫応答を記述する。以上の例は非制限的なものであり、検体中の抗ＮＢ／ＣＮＰ抗体を検出し、免疫原性試験を診断および予後の目的に採用するために免疫原性試験を実施できる多くの方法の単なる例を提供する。
【００４７】
図面において
図１は、これだけには限定されないが、ＮＢ／ＣＮＰ粒子に見られる多数のタンパク質を含むヒストグラムである。ＣＮＰに複数のタンパク質の存在を検出するために表面抗原パターン免疫測定法（ＳＡＰＩＡ）試験を開発した。高結合ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）を抗石灰化タンパク質に対する抗体およびＧｌａ凝固因子および対照抗体でコーティングしてＳＡＰＩＡプレートを作成した。ＳＡＰＩＡは、ヒト血清アルブミン、Ｄダイマー、ＮＦ−κＢ、およびフィブロネクチンに対する抗体を用いて対照とした。これらタンパク質は粒子表面に特異的に結合しないと予想されるためである。モノクローナル抗体をｐＨ７．４の１倍のＰＢＳを１００μＬ／ウェルＥＬＩＳＡプレートに加えて最終濃度１μｇ／ｍｌまで希釈して、＋４℃で一晩培養した。ポリクローナル抗体は１０μｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、プレートを上記のようにコーティングした。コーティング手順の後、プレートをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０を３００μＬ／ウェル添加してブロックし、室温で２時間培養した。その後、ブロッキング用溶液を除去し、保存液０．０５％ＮａＮ３−ＴＢＳを２００μＬ／ウェル添加して、プレートをテープで密閉して冷蔵庫で保管した。使用前に、保存液を除去し、プレートをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１回洗浄した。複製に５０μＬ／ウェルの測定用緩衝液（０．０５Ｍのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、１％マウス血清を加えたｐＨ７．５の０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ３００）を添加し、５０μＬ／ウェルの血清試料を添加した。プレートをテープで密閉し、適度に振動させながら室温で１時間培養した。プレートはＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて４回洗浄し、検出用抗体ＨＲＰ−８Ｄ１０（Ｎａｎｏｂａｃ  Ｏｙ）を１００μＬ／ウェル添加した。プレートを適度に振動させながら室温で１時間培養した。プレートはＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて４回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ．、メリーランド州パサデナ２１１２３）を１００μＬ／ウェル添加した。プレートを密閉し、ホイルで光から保護して、適度に振動させながら室温で２０分培養した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｈｉｔ  ＢＰ  ８０８）で６３０ｎｍの吸光度を読み取った。ブランク値を引いて、ＴａｂｌｅＣｕｒｖｅ２Ｄプログラム（Ｓｙｓｔａｔ、カリフォルニア州ポイント・リッチモンド）を用いてＮａｎｏｃａｐｔｕｒｅ  ＥＬＩＳＡ試験の標準曲線から単位の値を計算した。ピアソンの相関係数（Ｎ＝１６、Ｈ０：ρ＝０の確率＞｜ｒ｜）を計算した。抗石灰化タンパク質と凝固Ｇｌａ因子が他のいくつかのタンパク質とともにＣＮＰに存在することが分かった。
【００４８】
ＳＡＰＩＡ法はまず８人の血漿および血清試料を用いて試験した。ヒトの血漿および血清試料は、まず比較可能な試料であるかどうかを判断するために試験した。図示する陽性試料は凝固因子が例外的に高いことに留意する。これら８試料で得られた結果に基づくと、血清試料および血漿試料はどちらも特異的なパラメータを試験するために使えるであろう。その後、ＳＡＰＩＡ試験のために、ＥＬＩＳＡ結果が０単位から６４０単位の範囲の無作為群（ｎ＝１６、各試料はＣＮＰ単位の値が似ている１から５のヒト血清試料から組み合わせて、複製を行って多くの試験を実施するのに必要な量を作成した）を選択した。
【００４９】
図２はＳＡＰＩＡ試験で得たデータを示し、ＮＢ／ＣＮＰがヒドロキシアパタイトコーティング内もしくはヒドロキシアパタイトコーティング上に構造変化したタンパク質を含有することが示されている。これらタンパク質は、これだけには限定されないが、Ｇｌａ含有ドメインをもつタンパク質、第ＩＩ凝固因子、第ＶＩＩ凝固因子、第ＩＸ凝固因子、第Ｘ／Ｘａ凝固因子、組織因子−第ＶＩＩａ凝固因子複合体、プロトロンビナーゼ複合体（第Ｖ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩ因子）、第ＩＩ因子のフラグメント、トロンビン、プロトロンビンフラグメント１、マトリックスＧＬＡタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、オステオネクチン、タンパク質第ＸＩＩＩａ因子、フェチュインＡ、カルモジュリン、組織トランスグルタミナーゼＩＩ、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３、ＣＤ  ４２ｂ、ＮＦ−カッパＢ、ＣＤ１４、フェチュインＢ、ＣＤ４０、ミエロペルオキシダーゼ、フィブロネクチン、組織因子、ヒト補体５ｂ−９、ＣＲＰ、ＣＤ６１、カッパ軽鎖、マクロファージＬ１タンパク質、ｈｓｐ６０、フィブリリン−１、ベータ−２−ミクログロブリン、ＣＤ１８、ラミニン、抗トリプシン、ノッチ−１、ＢＳＡ、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）、ＰＴＸ３、補体Ｃ５、フィブリン／フィブリノゲン、Ｄダイマー、第Ｖ因子、抗キモトリプシン、アネキシンＶ、ビトロネクチン、トロンビン、トロポニンＴ、ビメンチン、トロポミオシン、ヒト血清アルブミン、心筋トロポニンＩ、アポリポタンパク質Ａ１、ＭＨＣクラスＩ、アミロイドＰタンパク質、ｓＣＤ４０Ｌ、カリクレイン、ＡＴＩＩＩ、第ＶＩＩＩ因子、硫酸ヘパリン、第ＸＩ因子、ｃ−ｊｕｎ、Ｆｒａ−２、Ｆｒａ−１、ＪｕｎＢ、Ｐ−ｃ−Ｊｕｎ、トランスグルタミナーゼ３、アルファフェトプロテイン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ｅｒｂＢ２、ＶＥＧＦ、アルファ−シヌクレイン、ＬＰＳおよびその成分の脂質Ａ、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、並びにトランスグルタミナーゼで作られるイソペプチド結合などのタンパク質の修飾体など、当該複合体と相互作用および結合する他の分子。
【００５０】
図３は、ウシ胎仔血清に短期間曝露したアパタイト粒子上のタンパク質のプロテオーム解析で、培養期間後にヒドロキシアパタイト基質への様々なＣａＢＰの付着が証明されたことを示す表である。ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中の無タンパク質のアパタイト粒子を添加物を加えずに１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに懸濁し、すぐに＋４℃で３０分、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。滅菌ＰＢＳで懸濁してペレットを２回洗浄した後、室温で２０分、１３２００ｒｐｍで遠心分離した。分析前にペレットを冷凍した。プロテオーム解析は、カナダ、モントリオールのＰｒｏｔａｎａ社が行った。ＳＤＳで沸騰処理した試料を還元条件で１Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質バンドをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  染色法で検出し、切除して次の標準手順で処理した。１）ゲルプラグ中のタンパク質をＤＴＴで還元した。２）遊離システイン残基をヨードアセトアミドでアルキル化した。３）タンパク質をエンドプロテアーゼトリプシンで蒸解した。４）生成されたペプチドを中性条件、酸性条件、および塩基性条件で抽出した。
【００５１】
ペプチド混合物はＣ１８逆相クロマトグラフィーで分離して、ナノスプレーインターフェースに連結したＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ社製ＬＴＱ−ＦＴイオントラップ／ＦＴＩＣＲハイブリッド型質量分析計に入れた。質量分析計はデータ依存モードで操作して、クロマトグラフィーカラムから出たときの強度閾値を上回る各ペプチドのタンデム（ｍｓ／ｍｓ）スペクトルを得た。生データファイルをＬＣＱ−ＤＴＡを用いて処理し、タンデムスペクトルのピークリストを作成した。処理したデータをＮＣＢＩ非冗長データベースを用いてＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、イギリス、ロンドン）で調査した。Ｍａｓｃｏｔの結果を質量分析法の科学者に手伝ってもらい、結果を生データに相関させた。
【００５２】
図４は、１３人の患者にエチドロネートとテトラサイクリンを３ヶ月間投与した実施例４の治療プロトコルに従う抗ＮＢ／ＣＮＰ抗体レベルを示す。表は、治療中と追跡調査中の患者の抗体レベルが著しく減少したことを示しており、新規な抗原複合体を用いた抗体価レベルは治療の反応の定量化に便利な診断ツールであることを表している。
【００５３】
図５および６は、追跡検査の６０ヶ月の時点でＮＢ／ＣＮＰの純培養株に曝露した研究所員の抗体レベルを示す線グラフである。曝露の経路は結膜嚢（眼）からとした。図４は６０から６３ヶ月の時点の抗ＮＢ／ＣＮＰ抗体の急激な増加を示す。曝露から７２ヵ月後、治療を試みないで、抗体レベルは安定し、それ以降変わらなかった。図５は抗ヒトＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体を抗ヒトプロトロンビンＦ１−ＨＡ複合体抗体に相関させたＥＬＩＳＡデータを示す。この図は抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体試験法の使用の有効性を示しており、例として、ＮＢ／ＣＮＰ感染したことが分かっている被験者に、抗原としてヒトの生体ＣａＢｐ−ＨＡ複合体と合成的に作成したヒトプロトロンビンフラグメント１−ＨＡ複合体を用いている。抗ヒトＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体の割合は、全希釈液で抗ヒトプロトロンビンＦ１−ＨＡ複合体抗体の割合に従う。
【００５４】
図７は、病的石灰化関連の疾患にかかっている人に存在する抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体を示す。図は実施例５に対応し、６００の血清試料をニューヨーク州ウォーターブリートのＣｌｉｎｏｍｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社から購入した。血清抗体は、クローン病の患者から回収した血清試料を除き、すべての疾患グループで検出可能であった。抗ＮＢ／ＣＮＰ抗体の平均値はすべての疾患グループでクローン病より統計的に大きかった。このデータは、抗ＮＢ／ＣＮＰ抗体のレベルは多数の疾患に関連することを表しており、疾患の早期警告の兆候となりうる。これら疾患は、アルツハイマー、大動脈狭窄症、頚動脈狭窄症、冠動脈疾患、慢性前立腺炎、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓結石疾患、パーキンソン病、多発性嚢胞腎臓結石疾患、慢性関節リウマチ、膵臓炎、胆嚢炎が含まれるが、これだけに限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１：ＥＬＩＳＡ試験
手順：血液または血清を適切かつ当分野で確立したよく知られるプロトコルにより哺乳動物から回収する。冷凍／解凍サイクルは避けるべきである。試験前に、試薬を適切に希釈した後で、室温に戻して、典型的には前記試薬を室温で約１５分間静置して調製しなければならない。試薬は絶対にロット番号の異なる試験キットと交換してはならない。
【００５６】
測定法で使用するマイクロプレートを袋から取り出して、使用前に室温に戻す。必要な数のテストストリップを取り出したら、すぐに袋を再密閉して２から８℃で保管し、プレートの完全性を維持する。
【００５７】
標準および対照液は各バイアルに蒸留水または脱イオン水を１ｍＬ添加して復元する必要がある。Ｒｅｐｌａｃｅ  ｔｈｅ  ｓｔｏｐｐｅｄ、材料を室温で少なくとも１５分間放置する。使用前に標準と対照液のウェルを混合する。復元の後、標準と対照液は室温で一日安定させる。冷凍している場合もあるが、１ヶ月以内に使用しなければならない。冷凍・解凍は２回以上行ってはならない。キットに同梱される洗浄用緩衝液とコンジュゲートは蒸留水または脱イオン水で適切に希釈して混合する。患者の血清を培養用緩衝液で２μＬ／ｍＬに希釈して、室温で少なくとも１５分間静置する。
【００５８】
測定の前に、使用する各テストストリップを洗浄用緩衝液で１回だけ洗浄する。各標準および対照液と希釈した試料を１００μＬずつピペットで適切なウェルに入れる。１００ｒｐｍ±１０のプレートシェーカーに載せて室温（２２±２℃）で６０分間培養する。優良試験所技術を用いて、ウェル間の汚染を避けながら注意して手で洗浄する。容器の上でプレートを逆さにし、元に戻さずに、ウェルの内容物を移し、プレートを吸い取り紙で拭き取る。各ウェルは３００μＬの洗浄用緩衝液で４回洗浄する。最後の洗浄時に、紙に液体の跡が見えなくなるまでプレートを吸い取り紙で軽く叩いて洗浄用緩衝液を完全に拭う。次に、各ウェルに１００μＬの希釈コンジュゲートを添加する。１００ｒｐｍ±１０のプレートシェーカーに載せて室温（２２±２℃）で６０分間培養する。ウェル間の相互汚染を避けるよう注意しながら、もう一度手で洗浄する。容器の上でプレートを逆さにし、元に戻さずに、ウェルの内容物を移し、プレートを吸い取り紙で拭き取る。各ウェルは３００μＬの洗浄用緩衝液で４回洗浄する。最後の洗浄時に、紙に液体の跡が見えなくなるまでプレートを吸い取り紙で軽く叩いて洗浄用緩衝液を完全に拭う。ピペットで各ウェルに１００μＬのＴＭＢ基質を入れる。手順のこの時点では、光から保護する。１００ｒｐｍ±１０のプレートシェーカーに載せて室温（２２±２℃）で２０分間培養する。ピペットで各ウェルに１００μＬの反応停止液を入れる。４５０ｎｍの吸光度を読み取る。吸光度はすぐに読み取る。
【００５９】
計算：品質管理ガイドラインに一致してデータが受け入れられるかを検証する。異常値ははねてもよい。標準ゼロの吸光度の値は０．３を超えてはならない。ただし、これは不注意な洗浄のしるしで、測定を繰り返さなければならない。標準、対照液、未知試料のそれぞれについて、光学密度の値を平均する（複製がある場合）。ゼロ標準の吸光度の値の平均値を、他の標準、対照液、および試料の吸光度の値の平均値から引く。縦座標に光学密度を、横座標に標準濃度（単位／ｍＬ）をとった方眼紙に、滑らかな標準曲線を描く。代わりの方法として、４パラメータ曲線適合プログラムを使用できる。対照液と未知試料の値は標準曲線から直に読み取る。試料の希釈因数（２μＬ／ｍＬまたは１／５００）と試料の容積因数（１００μＬまたは１／１０）を標準曲線の濃度に含める。そのため、未知試料の値は標準曲線から直に読み取り、これら因数を掛けない。
【００６０】
結果の解釈：期待値は＜０．２単位／ｍＬ（陰性結果）である。陽性結果（＞０．２  単位／ｍＬ）はＣａＢＰ−ＨＡ複合体に対する抗体の存在を表す。血清または血漿検体での陽性結果は動脈石灰化または他の形態の病的石灰化を伴う疾患に非常に一般的である。
【００６１】
実施例２：抗ＮＢ／ＣＮＰ抗体と冠動脈疾患の相関関係
冠動脈石灰化が冠動脈疾患（ＣＡＤ）のリスクに関係するという研究が提案されている。本実施例は、ＮＢ／ＣＮＰに対する抗体が症状発現前のＣＡＤを反映していると思われる冠動脈石灰化のレベルに関連しているかどうかを検証した。
【００６２】
電子ビームコンピュータ断層撮影を受けた２０１人の健康な無症状の被験者（男性５２％、平均年齢５６．６歳）から採取した血清検体を用いて、ＮＢ／ＣＮＰの抗体、他の感染症の病原体の抗体、およびＣＲＰの抗体のレベルを測定した。高い石灰化指数には冠動脈石灰化のレベル≧７５パーセンタイルを定義するカットオフ値を定義し、高い抗体レベルにはＮＢ／ＣＮＰ抗体レベル≧第２三分位を定義した。
【００６３】
ＮＢ／ＣＮＰに対する血清抗体は被験者の９４％で検出可能であった。平均抗体値は１．０７単位で、抗体の三分位値はそれぞれ０〜０．２１、０．２２〜０．７３、および０．７４〜１９．２６単位であった。抗体価が高いグループのうち石灰化指数の高い人は３１％で、対して抗体価が最低のグループ（Ｐ−０．０２４）では１６％であった。ＮＢ／ＣＮＰ抗体レベルの高さと冠動脈石灰化指数の高さの関連性は、年齢、男性であること、喫煙、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症、ＣＡＤの家族歴を含めたＣＡＤ危険因子とは無関係であった（９５％の信頼限界１．３９から７．１５で３．１５のオッズ比調整済み）。ただし、冠動脈石灰化とＣＲＰレベルとの関連性も、またはＮＢ／ＣＮＰと他の病原体感染との関連性もみられなかった。このデータは、ナノ細菌ＩｇＧの血清による抗体陽性のレベルが冠動脈石灰化の高い指数と関連していることを示しており、病原体関連のメカニズムが早期アテローム硬化症においてある役割を担っていることを示唆している。
【００６４】
実施例３：生体ＣａＢＰ−ＨＡ複合体および人工的に作成したＣａＢＰ−ＨＡ複合体に対するヒトの免疫応答
ＣａＢＰ−ＨＡ複合体は、参照によりこれに組み込むＫａｊａｎｄｅｒ他の米国特許第５，１３５，８５１号が特許を取得したように、ラビットで、およびラットとマウスで免疫抗原性である。実施例１および２に示すように、ＣａＢＰ−ＨＡ複合体に対する抗体はヒトにも存在する。本実施例では、この複合体が感染性であり、ヒトの体内に取り込まれた後に抗体応答を引き起こす証拠を提供する。図３は、本特許出願を共同執筆した研究者の追跡調査を記述する。彼女を６０ヶ月間追跡調査し、ＥＬＩＳＡ法を用いて陰性の抗体値を得た。その後、彼女の左目をウシ由来のＣＮＰペレットに曝露した。結膜完成経路は関係する特異的な防御系がなく、リンパ管を通らずに静脈系に循環する直接のアクセス経路があるため、一般的に病原体を体内に取り込む効果的な方法だと考えられている。曝露した後、彼女はＣａＢＰ−ＨＡ複合体に対する抗体が非常に高いレベルで陽性になり、何年もの間そのまま変わらなかった。図３を参照。抗ヒトＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体を前述のように測定し、抗ヒトプロトロンビンＦ１−ＨＡ抗体を前述のように測定した。希釈因数は試料の希釈を参照する。希釈が高いと試験結果が高くなっていることから、図４に示すように、生体ヒト由来でも、または合成して作成した場合でも、特異性抗原、この場合、ヒトタンパク質−ＨＡ複合体に対する抗原−抗体反応が強いことが示される。
【００６５】
実施例４：新しい抗炎症・抗感染治療
Ｄｒ．Ｋａｊａｎｄｅｒ（Ｋａｊａｎｄｅｒ他）は、ＦＤＡ認証薬のテトラサイクリンＨＣＬとエチドロネート（ビスフォスフォネート、商標Ｄｉｄｒｏｎａｔｅ（Ｒ））の新規な組み合わせを用いて実験療法を行った。これら２つの薬剤は、それぞれ、細菌感染と骨粗しょう症／パジェット病の治療に処方される投薬量で安全かつ効能の長い歴史がある。
【００６６】
１３人の患者が炎症と潜在的な病原体に関わる慢性病だと同定された。例えば、アテローム性動脈硬化症とその合併症、腎臓結石、胆石、その他の結石；病的石灰化、カルシフィラキシー、骨粗しょう症、パジェット病、自己免疫疾患：慢性関節リウマチ、強皮症乾癬、白斑。患者全員が成人で、妊娠もしくは妊娠の可能性はなく、ＨＩＶまたは他の形態の免疫欠損にかかっていなかった。患者は全員正常な腎臓機能をもっていた。
【００６７】
薬剤処方は１３週間の療法から構成された。第１週目：１日１回Ｄｉｄｒｏｎａｔｅ（Ｒ）４００ｍｇを経口投与、１日１回テトラサイクリン５００ｍｇを経口投与、１日１回ピリドキシン４０〜２００ｍｇを経口投与。第２週目から第１３周目：１日１回Ｄｉｄｒｏｎａｔｅ２００ｍｇを経口投与、テトラサイクリンを１日２回２５０ｍｇ、または１日１回５００ｍｇ経口投与、１日１回ピリドキシン４０〜２００ｍｇ経口投与。ピリドキシンはホモシステイン代謝を助けるために使用した。
【００６８】
療法の追跡検査：２週間ごとに患者から血液と尿の試料を回収した。療法の完了後、さらに２つの試験試料を毎月回収した。症状と全身状態の変化の記録に重点をおいて、患者日記を記録するように依頼した。
【００６９】
１３人の患者を実験に登録した。１２人では抗体の減少がみられた。結果として、平均で４．１５倍の抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体の減少が検出され、これは８０％の減少に相当し、抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体を使用して療法の効能とＣａＢＰ−ＨＡ複合体の根絶に繋げることができることを示している。そのため、抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体を使用して、治療薬に対する反応をモニタリングでき、ＮＢ／ＣＮＰおよびそれにより生じる多数の疾患を治癒できる療法の便利な指標とすることができることが示される。
【００７０】
実施例５：ＣａＢＰ−ＨＡ複合体およびその抗体との疾患の関連性
本実施例は、ＮＢ／ＣＮＰに対する抗体が病的石灰化を伴う様々な疾患に関連するかどうかを検証した。６００の血清試料をニューヨーク州ウォーターブリートのＣｌｉｎｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。血清抗体は、クローン病の患者から回収した血清試料を除き、すべての疾患のグループで検出可能であった。抗ＣＮＰ／ＮＢ抗体の平均値は、全疾患グループでクローン病よりも統計的に高かった。このデータから抗ＣＮＰ／ＮＢ抗体のレベルは多数の疾患に関連することが示され、疾患の早期警告の兆候となりうる。これらの疾患には、アルツハイマー、大動脈狭窄症、頚動脈狭窄症、冠動脈疾患、慢性前立腺炎、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓結石疾患、パーキンソン病、多発性嚢胞腎臓結石疾患、慢性関節リウマチ、膵臓炎、胆嚢炎が含まれる。図５を参照。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
本発明をよりよく理解し、本明細書に組み込み、本明細書の一部をなす添付の図面は、本発明の実施形態を例示し、説明と合わせて本発明の原則を説明するのに役立つ。
【図１】図１は、ＮＢ／ＣＮＰ粒子に見られる多数のタンパク質のヒストグラムを図示する。
【図２−１】図２は、ＮＢ／ＣＮＰが構造変化したタンパク質を含有することを示すＳＡＰＩＡ試験のデータを図示する。
【図２−２】図２は、ＮＢ／ＣＮＰが構造変化したタンパク質を含有することを示すＳＡＰＩＡ試験のデータを図示する。
【図３】図３は、ウシ胎仔血清に短期間曝露したアパタイト粒子のタンパク質のプロテオーム解析を図示する。
【図４】図４は、実施例４の治療プロトコルに従う抗ＮＢ／ＣＮＰ抗体レベルを図示する。
【図５】図５は、抗ヒトプロトロンビンＦ１−ＨＡ複合体抗体に相関させた抗ヒトＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体のＥＬＩＳＡデータを図示する。
【図６】図６は、ＣａＢＰ−ＨＡ複合体に対する抗体反応性を図示する。
【図７】図７は、病的石灰化に関連する疾患をもつ人に存在する抗ＣａＢＰ−ＨＡ複合体抗体を図示する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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