(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）：（（Ｘ）ｌ（Ｙ）ｍ）ｎ  （式中、ｌ及びｍは、０から１０の整数であり、ｎは１から１０の整数であり、Ｘ及びＹは、同一でも異なっていてもよく、アルギニン及びリジンから選択される、医薬として用いるためのアミノ酸である）で表されるアミノ酸を含むペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
（（Ｘ）ｌ（Ｙ）ｍ）ｎ        （Ｉ）
（式中、ｌ及びｍは、０から１０の整数であり、ｎは１から１０の整数であり、Ｘ及びＹは、同一でも異なっていてもよく、アルギニン及びリジンから選択される、医薬として用いるためのアミノ酸である）
で表されるアミノ酸を含むペプチド、その変異体、又はその製薬的に許容されうる塩。
【請求項２】
Ｘ及び／又はＹが、Ｄ又はＬ−アミノ酸である、請求項１に記載のペプチド又はペプチド変異体。
【請求項３】
Ｘ及び／又はＹが、交互のアミノ酸である、請求項１に記載のペプチド又はペプチド変異体。
【請求項４】
Ｘ及び／又はＹが同一である、請求項１に記載のペプチド又はペプチド変異体。
【請求項５】
Ｘがリジンであり、Ｙがアルギニンである、請求項１に記載のペプチド又はペプチド変異体。
【請求項６】
ペプチドが３から約２００のアミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチド又はペプチド変異体。
【請求項７】
ペプチドが３から１００のアミノ酸を含む、請求項６に記載のペプチド又はペプチド変異体。
【請求項８】
ペプチドが３から５０のアミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチド又はペプチド変異体。
【請求項９】
ペプチドが３から１５のアミノ酸を含む、請求項８に記載のペプチド又はペプチド変異体。
【請求項１０】
ペプチドが３から７のアミノ酸を含む、請求項９に記載のペプチド又はペプチド変異体。
【請求項１１】
ペプチドが非環式である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチド変異体。
【請求項１２】
医薬的に有効な量の請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド、及び製薬的に許容されうる担体、賦形剤又は希釈剤を含んでなる、組成物。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも２種を含み、それらのペプチドが異なるものである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
賦形剤又は希釈剤が、酸、ジメチルスルホン、Ｎ-(２-メルカプトプロピオニル)グリシン、２-ｎ-ノニル-１,３-ジオキソラン及びエチルアルコールからなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項１５】
賦形剤又は希釈剤が、酢酸、クエン酸、ホウ酸、乳酸、プロピオン酸、リン酸、安息香酸、酪酸、マロン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸又は酒石酸からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
酸が酢酸である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
酢酸が組成物中に、１％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％酢酸未満の濃度で存在する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチド変異体の、細菌感染の治療のための医薬の製造のための使用。
【請求項１９】
細菌感染が、細菌、寄生虫、原虫、ウイルス又は真菌病原によって生じる、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
細菌性病原が、Staphylococcus spp., 例えば Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis; Enterococcus spp., 例えば Enterococcus faecalis; Streptococcus pyogenes; Listeria spp.; Pseudomonas spp.; Mycobacterium spp., 例えば Mycobacterium tuberculosis; Enterobacter spp.; Campylobacter spp.; Salmonella spp.; Streptococcus spp., 例えば Streptococcus Group A or B, Streptoccocus pneumoniae; Helicobacter spp., 例えば Helicobacter pylori; Neisseria spp., 例えば Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis; Borrelia burgdorferi; Shigella spp., 例えば Shigella flexneri; Escherichia coli; Haemophilus spp., 例えば Haemophilus influenzae; Chlamydia spp., 例えば Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci; Francisella tularensis; Bacillus spp., 例えば  Bacillus anthracis; Clostridia spp., 例えば Clostridium botulinum; Yersinia spp., 例えば Yersinia pestis; Treponema spp.; Burkholderia spp.; 例えば Burkholderia mallei and B pseudomallei.からなる群から選択される細菌種からのものである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
ウイルス性病原が、Human Immunodeficiency Virus (HIV1 & 2); Human T Cell Leukaemia Virus (HTLV 1 & 2); Ebola virus; human papilloma virus (e.g. HPV-2, HPV-5, HPV-8  HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-52, HPV-54 and HPV-56); papovavirus; rhinovirus; poliovirus; herpesvirus; adenovirus; Epstein Barr virus; influenza virus, hepatitis B and C viruses, Variola virus, rotavirus or SARS coronavirusからなる群から選択されるウイルスからのものである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
寄生虫病原が、Trypanosoma  spp., (Trypanosoma cruzi, Trypansosoma brucei), Leishmania spp., Giardia spp., Trichomonas spp., Entamoeba spp., Naegleria spp., Acanthamoeba spp., Schistosoma spp., Plasmodium spp., Crytosporidium spp., Isospora spp., Balantidium spp., Loa Loa, Ascaris lumbricoides, Dirofilaria immitis, Toxoplasma ssp., e.g Toxoplasma gondiiからなる群から選択される寄生虫病原からのものである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２３】
真菌性病原が、属Candida spp., (e.g. C.albicans), Epidermophyton spp., Exophiala spp., Microsporum spp., Trichophyton spp., (e.g T.rubrum and T.interdigitale), Tinea spp., Aspergillus spp., Blastomyces spp., Blastoschizomyces spp., Coccidioides spp., Cryptococcus spp., Histoplasma spp., Paracoccidiomyces spp., Sporotrix spp., Absidia spp., Cladophialophora spp., Fonsecaea spp., Phialophora spp., Lacazia spp., Arthrographis spp., Acremonium spp., Actinomadura spp., Apophysomyces spp., Emmonsia spp., Basidiobolus spp., Beauveria spp., Chrysosporium spp., Conidiobolus spp., Cunninghamella spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Graphium spp., Leptosphaeria spp., Malassezia spp., Mucor spp., Neotestudina spp., Nocardia spp., Nocardiopsis spp., Paecilomyces spp., Phoma spp., Piedraia spp., Pneumocystis spp., Pseudallescheria spp., Pyrenochaeta spp., Rhizomucor spp., Rhizopus spp., Rhodotorula spp., Saccharomyces spp., Scedosporium spp., Scopulariopsis spp., Sporobolomyces spp., Syncephalastrum spp., Trichoderma spp., Trichosporon spp., Ulocladium spp., Ustilago spp., Verticillium spp., Wangiella sppからなる群から選択される真菌性病原から誘導される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２４】
病原が、属Trichophyton spp.である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
病原が、Trichophyton interdigitaleである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
病原が、Trichophyton rubrumである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
真菌感染が、爪甲真菌症である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２８】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチド変異体の、粘膜感染の治療のための医薬の製造のための使用。
【請求項２９】
感染が、嚢胞性線維症である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチド変異体又は請求項１２又は１３に記載の組成物が接着又は適用される基体。
【請求項３１】
基体が織物又はコラーゲン材料を含む、請求項３０に記載の基体。
【請求項３２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチド変異体の、創傷の治療のための医薬の製造のための使用。
【請求項３３】
創傷が切り傷又は火傷である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチド変異体の、潰瘍の治療のための医薬の製造のための使用。
【請求項３５】
患者の細菌感染を治療又は予防する方法であって、前記患者に治療的有効量の、請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチド変異体又は請求項１２又は１３に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項３６】
細菌感染が、真菌感染である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ペプチド、ペプチド変異体又は組成物が、患者の皮膚又は爪に局所的に投与される、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
治療的有効量の、請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチド変異体、請求項１２又は１３に記載の組成物又は請求項３０又は３１に記載の基体を、患者に適用することを含む、患者の創傷を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗菌ペプチドを提供する。さらに本発明は抗菌ペプチドを含む医薬組成物及び治療、特に細菌感染の治療におけるペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
内在性抗菌性ペプチドの主要なファミリーの１つであるβ−ディフェンシンは、高等哺乳類の消化管、気道及び泌尿生殖管を裏打ちする上皮細胞から分泌される。それらは皮膚内のケラチン生成細胞によっても作り出される。それらの主たる役割は、これら病原体の感染経路を介した感染に対して、欠くことのできない最初の防御ラインを提供することである。
【０００３】
ディフェンシンは抗菌ペプチドのうち最も研究の進んだクラスの１つである。このクラスは、３つのジスルフィド架橋を持つシステインに富む分子によって構成される。それらは、植物、昆虫及び種々の哺乳類において見出されている。ヒトでは、６個のシステイン残基間の空間的距離及び結合の点で互いに異なる２クラスのディフェンシンが見出されている。これらのうち第１のクラスは、好中球から単離され（ＨＮＰ１−４、ヒト好中球ペプチド）、また、胃腸管のパネート細胞に存在する（α−ディフェンシン５及び６）、α−ディフェンシン（６タイプが存在）である。第２のクラスのβ−ディフェンシンは、より長く、より塩基性に富み、消化管、気道、泌尿生殖管及び皮膚を裏打ちし、及び／又はそれら構成し、及び／又は、それらの中に存在する上皮細胞又はケラチン生成細胞中の粘膜の至る所に存在する。ｈＢＤ１（ヒトβ−ディフェンシン１）は、構成的に分泌され、ヒトβ−ディフェンシン２、３及び４（ｈＢＤ２、ｈＢＤ３及びｈＢＤ４）は感染又は炎症に応答して作り出される。ｈＢＤ２の発現及び分泌は、感染による刺激、特に鞭毛細菌（Ｈａｒｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；３８７：８６１）により、また、ＩＬ１α及びＩＬ１β（インターロイキン１）（Ｌｉｕら，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００２；１１８；２７５−２８１）によって引き起こされる。いくつかの組織部位においては、腫瘍壊死因子１（ＴＮＦ−α）及びリポポリサッカライド（ＬＰＳ）もｈＢＤ２発現を誘導する役割を担っているようである。インビトロにおける実験により、ｈＢＤ２は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのグラム陰性細菌に対してアクティブであり、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などのグラム陽性細菌に対しては、それらに対する程の効果は無いことが明らかとなっている。また、インビトロにおいて、ｈＢＤ２は酵母のカンジダ・アブリカンスに対して殺傷活性を示している。ｈＢＤ３の発現及び分泌は、細菌刺激、ＴＮＦ−α、特に、炎症過程に関与している分子に共通の性質も有しているインターフェロン−γ（ＩＮＦγ）によって誘導される。
【０００４】
β−ディフェンシンが備える強力で、構成的、かつ、制御された広い範囲の元来の抗菌防御に加えて、これらの分子、特に、ｈＢＤ２は、未熟樹状細胞及びメモリＴ−リンパ球に対する化学走化的効果を通じて、免疫応答の順応性の腕を移動させる能力をも有している（Ｙａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９；２８６：５２５−５２８）。
【０００５】
重要なことに、β−ディフェンシンは、病原体の感染を防ぐだけでなく、皮膚や腸管及び泌尿器管内（Ｇａｎｚ，Ｔ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  ３（９）：７１０−２０）などにおける体内の必須の共生微生物生態系の最良の密度及び多様性を制御及び維持するための鍵であるとの証拠が明らかとなりつつある。
【０００６】
β−ディフェンシンの作用形態は、活性を有する濃度において宿主細胞に対し、広く無毒性である。従って、β−ディフェンシンは、広範にわたる感染に対する治療のための潜在的なターゲットとして考えられてきた。しかし、ディフェンシンの天然型を組換体の系で発現させることが技術的に試みられているが、低い収率でしか得られていない。さらに、β−ディフェンシンは化学走化的作用を介した、強力な炎症性化合物であるとの証拠が示唆されつつある（Ｙａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９；２８６：５２５−５２８；Ｖａｎ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇら，Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｒｅｓ．２００２；５１（１）：８−１５；Ｎｉｙｏｎｓａｂａら，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２００３；２（３）：２２４−２３１）。上記を総合すると、これらの要因により、天然型のディフェンシンは治療的適用に対して好ましくないということになる。
また、β−ディフェンシンは極めて塩に対して敏感である（Ｐｏｔｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９７；６５（６）：２３９６−４０１；Ｂａｌｓら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８；１０２（５）：８７４−８０；Ｖａｌｏｒｅら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８；１０１（８）：１６３３−４２；Ｇｏｌｄｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ  １９９７；８８（４）：５５３−６０９；Ｓｉｎｇｈら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄｓ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（２５）：１４９６１−６）。そのため、β−ディフェンシンは、嚢胞性線維症などの状況では抗菌防御を提供することができない。そのような状況では、気道上皮がその状況に伴う持続的な細菌感染に応答して多量のβ−ディフェンシンを作り出すが、カチオンの再吸収や塩素分泌を増大させる軌道上皮膜を通じたイオン輸送の不均衡により、β−ディフェンシンは不活性となってしまう（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ＳＨ及びＢｏｕｃｈｅｒ  ＲＣ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｕｌｍ．Ｍｅｄ．２００３  Ｎｏｖ；９（６）：４８６−９１；Ｄａｖｉｅｓ  ＪＣ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｐｕｌｍｏｎｏｌ  Ｓｕｐｐｌ．２００４；２６：１４７−８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、細菌感染を処置するために使用し得る更なる薬剤が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、驚くべき事に、天然型のディフェンシン以上に抗菌活性が向上したペプチドを同定した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の第一の態様によれば、同一又は異なる３から２００のＤ及び／又はＬアミノ酸が提供され、それらのアミノ酸は、疎水性アミノ酸及び／又はカチオン性アミノ酸からなる群より選択される。該ペプチドは、３から約１００のＤ及び/又はＬアミノ酸、例えば、４から約５０のＤ及び／又はＬ−アミノ酸を含む３から５０アミノ酸Ｄ及び／又はＬアミノ酸を含んでいてよい。
本発明のペプチドは、特に細菌感染の治療又は予防に有用である。
本発明のさらなる態様は、式Ｉ：
((Ｘ)ｌ(Ｙ)ｍ)ｎ            （Ｉ）
（式中、ｌ及びｍは、０から１０の整数、例えば、０から５の整数であり、ｎは１から１０の整数でありＸ及びＹは、同一でも異なっていてもよく、疎水性アミノ酸及び／又はカチオン性アミノ酸からなる群より選択される）
で表されるアミノ酸を含むペプチドである。
本発明のより好ましい態様は、本発明のペプチドが３から２００アミノ酸、例えば、３、４、５、６又は７から１００までのアミノ酸を含み、３、４、５、６又は７から２０、２５、３０、３５、４０又は４２までのアミノ酸を含んでいる。
本発明のペプチドは、１００から２００のアミノ酸、２７から１００のアミノ酸、２８から８６のアミノ酸、７から２７のアミノ酸、又は３から１４のアミノ酸を含んでもよい。
好ましくは、本発明のペプチドは３から１５のアミノ酸、例えば、３から７のアミノ酸を含む。
さらに好ましい態様では、本発明のペプチドはさらに１以上のシステイン残基を含み、例えば、１、２、３、４、５又は６システイン残基のように、６システイン残基までを含む。
【００１０】
本発明のより好ましい態様では、式ＩＩ
Ｃ((Ｘ)ｌ(Ｙ)ｍ)ｎＣ(Ｘ)ｌ(Ｙ)ｍ)ｎ            （ＩＩ）
（式中、Ｃはシステインであり、ｌ及びｍは、０から１０の整数であり、Ｘ及びＹは、同一でも異なっていてもよく、疎水性アミノ酸及び／又はカチオン性アミノ酸からなる群より選択される）で表されるアミノ酸を含むペプチドが提供される。
【００１１】
本発明のさらにより好ましい態様では、本発明のペプチドは、式ＩＩＩ：
Ｃ((Ｘ)ｌ(Ｙ)ｍ)ｎＣ(Ｘ)ｌ(Ｙ)ｍ)ｎＣ((Ｘ)ｌ(Ｙ)ｍ)ｎＣ(Ｘ)ｌ(Ｙ)ｍ)ｎ    （ＩＩＩ）
（式中、Ｃ、Ｘ、Ｙ、ｌ、ｍ及びｎは、本明細書で定義される通りである）
で表されるアミノ酸を含む。
本発明のまたさらにより好ましい態様において、本発明のペプチドは、式ＩＶ：
Ｃ((Ｘ)ｌ(Ｙ)ｍ)ｎＣ(Ｘ)ｌ(Ｙ)ｍ)ｎＣ((Ｘ)ｌ(Ｙ)ｍ)ｎＣ(Ｘ)ｌ(Ｙ)ｍ)ｎＣ      （ＩＶ）
（式中、Ｃ、Ｘ、Ｙ、ｌ、ｍ及びｎは、本明細書で定義される通りである）
で表されるアミノ酸を含む。
【００１２】
本発明のペプチドは天然型のβ−ディフェンシンより簡単な構造であるため、それらを作り出すのは簡単かつ効率的である。また、本発明のペプチドは実質的に塩に反応せず肝毒性もない。さらに、それらの作用形態は、代謝的というよりは物理的であり（すなわち、生命の代謝経路の構成要素のターゲットに対し、直接的な膜破壊である）、仮に完全に除かないにしても、標的となる細菌が抗菌剤に対する抵抗性を獲得する確率を最小限にする。
【００１３】
当業者において知られるように、アミノ酸は、主としてアミノ酸側鎖の化学的及び物理的性質により、異なるクラスに分けることができる。例えば、通常、幾つかのアミノ酸は親水性又は極性アミノ酸であると考えられ、他は疎水性又は非極性アミノ酸と考えられる。ここで用いられるように、「疎水性」又は「カチオン性」という言葉は、Ｆａｕｃｈｅｒｅ及びＰｌｉｓｋａ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０：３９（１９８３）に記載されるように−１．１０以上の疎水性を備え、及び／又は、０以上の総電荷を有するアミノ酸を示してもよい。また、疎水性又は非極性アミノ酸は、生理的なｐＨにおいて荷電しておらず、極性ではなく、通常水溶液にはじかれる側鎖をもつアミノ酸を示してもよい。
【００１４】
本発明のより好ましい態様において、Ｘ及び／又はＹは、グリシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、アラニン、トリプトファン、バリン、イソロイシン、メチオニン、チロシン及びスレオニンからなる疎水性アミノ酸の群、及び／又はオルニチン、ヒスチジン、アルギニン及びリジンからなるカチオン性アミノ酸の群より選択される。Ｘ及び／又はＹは、Ｄ又はＬ−アミノ酸でもよい。さらに、Ｘ及び／又はＹは、交代性のアミノ酸でもよい。
【００１５】
また、本発明は、既知の異性体（構造、立体−、立体配座及び立体配置）、及び前記アミノ酸の構造類似体、及び、限定はしないが、リン酸化、グリコシル化、スルホニル化及び／又はヒドロキシル化を含む、自然に（例えば、翻訳後修飾）又は化学的に修飾されたものも含む。
一般に、本発明のペプチドは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン又はセリンを含まないが、本発明のある種のペプチドは、例えば、これらのアミノ酸が存在していても活性を有することがある。
本発明のペプチドは、式ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの末端システイン残基の一方又は両方に隣接する１以上の付加的なアミノ酸残基を含んでもよく、例えば、本発明のペプチドは、１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）までの付加的なアミノ酸残基を含んでもよい。好ましくは、付加的なアミノ酸は、システイン残基ではない。さらに好ましくは、付加的なアミノ酸残基はＸ及び／又はＹである。
【００１６】
さらに、ペプチドのアミノ酸配列は、本発明のペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸残基と他のアミノ酸残基との置換であって、Ｌ体ではなくＤ体を利用する置換を含む、ペプチド変異体が生じるように修飾されてもよい。
１以上のペプチド残基は、ペプチドの生物学的活性を変化、促進又は保持するように、他の残基と交換することができる。そのような変異体は、例えば、変異体ではないペプチドの少なくとも約１０％の生物学的活性を有する。保存的アミノ酸がしばしば利用される。つまり、上述のような類似の化学的及び物理的性質を持つアミノ酸の置換である。
【００１７】
従って、例えば、保存的アミノ酸置換には、リジンとアルギニン、オルニチン又はヒスチジンとの交換、１の疎水性アミノ酸とその他のアミノ酸との交換が含まれる。置換が導入されたのち、変異体は生物学的な活性によりスクリーニングされる。
【００１８】
本発明のペプチドは、少なくとも４アミノ酸、例えば、４から５０アミノ酸、又は４から５０アミノ酸、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４２又は４５アミノ酸など、２０から４５アミノ酸を含んでもよい。
本発明のより好ましい態様では、Ｘ及びＹは同一でロイシン又はグリシンである。
本発明のさらに好ましい態様では、Ｘはロイシンで、Ｙはグリシンである。
さらに好ましい態様において、Ｘ及びＹは同一で、リジン又はアルギニンである。よって、本発明は、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン及びポリ−Ｄ−アルギニンから選択されるペプチドを提供する。
さらにより好ましい態様では、Ｘはリジンで、Ｙはアルギニンである。
【００１９】
本発明のペプチドにおいて、ｌ及びｍは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
本発明のペプチドにおいて、ｌは１、ｎは１、ｍは４から９、例えば、ｍは３、４、５、６、７、８又は９である。
本発明のペプチドにおいて、ｌ、ｎ及び／又はｍは１から５、例えば、１、２、３、４又は５である。
好ましくは、本発明のペプチドは非環式である。本発明のペプチドは直鎖、すなわち直線状、又は分岐状でもよい。
【００２０】
ここで用いられる「ペプチド」という用語は、一般的な用語として、ペプチド結合により互いに結合された複数のアミノ酸残基を意味する。「ペプチド」は、ポリペプチド及びタンパク質と交換可能に用いられ、同じ意味を表す。
本発明の一実施例において、ペプチドは、
CGGGGGGCGGGGCGGGGGGGGGCGGGGGGCC   (i)
CLLLLLLCLLLLCLLLLLLLLLCLLLLLLCC        (ii)
CLGLGLGCGLGLCLGLGLGLGLCGLGLGLCC     (iii)
CRKRKRRCRKRKCKRKRKRKRKCRKRKRKCC   (iv)
KKK                                         (v)
KKKKKKK                                   (vi)
RRR                                         (vii)
RRRRRRR                                    (viii)
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
本発明のさらなる態様において、ペプチドは少なくとも（ｉ）から（ｖｉｉｉ）のアミノ酸配列の１つ、及び末端のシステイン残基の一方又は両方に隣接する付加的なアミノ酸残基を含む。従って、本発明のさらなる実施例において、図１に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが提供される。
一般に、本発明のペプチドは、合成ペプチドである。ペプチドは、単離され、精製されたペプチド、又はそれらの変異体でもよく、例えば、固相ペプチド合成法、酵素触媒ペプチド合成により、又は組換えＤＮＡ技術を用いて、インビトロにおいて合成することができる。
【００２２】
哺乳類細胞にとって望ましくない毒性がほとんど若しくは全くない活性なペプチドを同定するために、個別のペプチド、又はペプチドライブラリーを作製し、個別のペプチド又は該ペプチドライブラリー由来のペプチドを、限定はしないが、抗真菌性、抗菌性、抗ウイルス性、抗原虫性、抗寄生虫性活性及び毒性を含む、抗菌活性及び毒性に対してスクリーニングすることができる。
本発明のペプチドは、例えば、遊離酸、遊離塩基、エステル及び他のプロドラッグ、塩及び互変体など、異なる形態で存在してもよく、本発明には、化合物の全ての変異体が含まれる。
従って、本発明には、本発明のペプチド又はペプチド変異体の塩又はプロドラッグが包含される。
【００２３】
本発明のペプチドは、製薬的に許容された塩の形態で投与される。本発明の製薬的に許容される塩は、従来の化学的手法により、塩基性又は酸性部分を含む元のペプチドから合成される。通常、そのような塩は、これらペプチドの遊離酸又は塩基形態を、水又は有機溶媒、又はそれらの混合物中で（例えば、通常、エーテル、エチルアセテート、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルなどの非水系媒体が好ましい）、適当な塩基又は酸と化学量論的に反応させることにより調製することができる。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳ，１９８５，ｐ。１４１８中に参照することができるが、その開示内容は、出典としてここに取り込む。また、Ｓｔａｈｌら，Ｅｄｓ，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄＵｓｅ”，Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２も参照のこと。
【００２４】
従って、本発明は、元の化合物が、それらの酸又は塩基塩、例えば、従来の無毒性塩、又は、例えば、無機又は有機酸又は塩基から形成される第４アンモニウム塩とされることによって修飾された、ここに開示されるペプチドの製薬的に許容される塩を含む。そのような酸付加塩の例には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギニン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ブチル酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシルスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモエート(palmoate)、ペクチネート(pectinate)、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシン酸塩、トシル酸塩及びウンデカン酸塩などが含まれる。塩基塩には、アンモニウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルタミン及びアルギニン、リジンなどのアミノ酸塩が含まれる。また、塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピル及びブチル塩化物、臭化物及びヨウ化物などの低級アルキルハロゲン化物、ジメチル、ジエチル、ジブチルなどのジアルキル硫酸塩、及びジアミル硫酸塩、デシル、ラウリル、ミリスチル及びステアリル塩化物、臭化物、ヨウ化物などの長鎖ハロゲン化物、ベンジル及びフェネチル臭化物などのアラルキルハロゲン化物及びその他のような試薬で四級化することができる。
【００２５】
本発明のペプチド又はペプチド変異体のカルボキシル基の塩は、ペプチドを１以上の所望の塩基の等価物、例えば、水酸化ナトリウムなどの金属水酸化物塩基、例えば、炭酸ナトリウム塩又は重炭酸ナトリウム塩などの金属炭酸塩又な重炭酸塩、例えば、トリエチルアミン、トリエタノールアミンなどのアミン塩基などと接触させることにより、通常の方法で調製することができる。
【００２６】
本発明のペプチド又はペプチド変異体のアミノ基のＮ−アシル誘導体は、最終縮合のためにＮ−アシル保護アミノ酸を利用することにより、又は保護した若しくは保護していないアミノ酸をアシル化することにより調製してもよい。Ｏ−アシル誘導体は、例えば、遊離のヒドロキシペプチド又はペプチドレジンのアシル化によって調製してもよい。いずれにしても、アシル化はハロゲン化アシル、無水物、アシルイミダゾールなどの標準的なアシル化試薬を用いて、実施することができる。
【００２７】
本発明は、ここに記載されるペプチドの活性を有する製薬的な化学種、例えば、インビボにおいて遊離酸に変換されるカルボン酸のエステル又はフリーなアミノ基に変換される保護されたアミンなどのように、１以上の官能基が保護又は誘導体化されるが、インビボにて官能基に変換し得るものについてのプロドロッグが含まれる。ここで用いられる「プロドラッグ」という用語は、例えば、血中の加水分解などによって、インビボにて速やかに元のペプチドへ変換される特定の構造を示す。詳細な議論は、Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ及びＶ．Ｓｔｅｌｌａ、Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｖｏｌ．１４  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，ｅｄ．，  Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇｓ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｈ  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｄ，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５；及びＪｕｄｋｉｎｓら，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６（２３），４３５１−４３６７（１９９６）において行われており、これらを出典明示してここに取り込む。
【００２８】
従って、プロドラッグには、互いに変換可能な誘導体に変換された官能基を持つ薬剤が包含される。典型的には、そのようなプロドラッグは加水分解により活性な薬剤に変換される。以下にその例を示す：
2008509980.tif 000002
【００２９】
また、プロドラッグには酸化還元反応によって活性な薬剤へ変換される化合物も含まれる。例として；
酸化的活性化
・Ｎ−及びＯ−脱アルキル化
・酸化的脱アミノ化
・Ｎ−酸化
・エポキシ化
還元的活性化
・アゾ還元
・スルホキシド酸化
・ジスルフィド酸化
・生体内還元的アルキル化
・ニトロ還元
を挙げることができる。
また、ヌクレオチド活性化、リン酸化による活性化及び脱炭酸化による活性化もプロドラッグの代謝的活性化として言及される。
保護基の使用については、ＪＷＦ  ＭｃＯｍｉｅ，編集、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９７３）「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、及び「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＴＷ  Ｇｒｅｅｎｅ及びＰＧＭ  Ｗｕｔｚ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）に詳述されている。
【００３０】
従って、ここに記載されたペプチドの保護された誘導体は、それ自体、薬剤的な活性を保持していないかもしれないが、それらが非経口的又は経口的に投与され、その後、体内において薬剤的な活性を持つ化合物となり得ることは、当業者において十分に理解し得るであろう。従って、そのような誘導体は「プロドラッグ」の例である。ここに記載された化合物の全てのプロドラッグは、本発明の範囲に含まれる。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、本発明の少なくとも１つのペプチド又は１以上の異なるペプチドの製薬的な有効量を含む医薬組成物を提供する。
また、これらのペプチドは製薬的に許容されるキャリアー、賦形剤又は希釈剤も含む。「製薬的に許容される」とは、正常な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、炎症、アレルギー性反応、又はその他の問題若しくは合併症を示すことなく、ヒト、場合によっては動物の組織と接触させるために使用する上で適しており、合理的な損益割合が釣り合ったこれらの化合物、材料、組成物、及び／又は投与量様式を示すためにここでは用いられる。
特に、本発明のペプチドは、例えば、細菌、真菌、酵母、寄生虫、原生動物及びウイルスに対する抗菌ペプチドとして有用である。ここでは、「抗菌ペプチド」とは、殺菌的及び／又は静菌的活性を持つ全てのペプチドを定義するために使用することができ、限定はしないが、抗菌、抗真菌、抗糸状菌、抗寄生虫、抗原生動物、抗ウイルス、抗伝染性、抗感染性、及び／又は、滅菌性、殺藻性、殺アメーバー性、殺菌性、殺真菌性、殺寄生虫性、殺原生動物性、殺原虫性を持つと言われている全てのペプチドを包含する。
【００３２】
従って、本発明はさらに薬剤としての使用するための発明のペプチドを提供する。本発明のペプチドは、インビボ及びエキソビボにおける抗菌薬としての用途を有する。
好ましい態様において、本発明は細菌感染を治療するための薬剤の製造に関するペプチドの使用方法を提供する。「細菌感染」とは、細菌、寄生虫、原生動物、ウイルス又は真菌病原体によって引き起こされる感染を意味する。「病原体」とは、通常、全ての疾病誘導生物として定義される。
【００３３】
細菌性病原体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，例えば、Ｅｎｔｅｒ  ｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．；  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  グループＡ又はＢ，  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．，例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．，例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．，例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．，例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．，例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｆｕｌａｒｅｎｓｉｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．，例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｓｐｐ．，例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．，例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．；例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ及びＢ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉからなる群より選択される細菌種に由来しうる。
【００３４】
ウイルス性病原体は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＴＶｌ及び２）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ１及び２）；エボラウイルス；ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ−２、ＨＰＶ−５、ＨＰＶ−８、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５４及びＨＰＶ−５６）；パポバウイルス；ライノウイルス；ポリオウイルス；ヘルペスウイルス；アデノウイルス；エプスタイン・バーウイルス；インフルエンザウイルス、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス、痘瘡ウイルス、ロタウイルス又はＳＡＲＳコロナウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来しうる。
【００３５】
寄生虫病原体は、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ，Ｔｒｙｐａｎｓｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ），Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．，Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．，Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．，Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｓｐｐ．，Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｓｐｐ．，Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｓｐｐ．，Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｗｎ  ｓｐｐ．，Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．，Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｌｏａ  Ｌｏａ，Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ，Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ，Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｓｓｐ．，例えば、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ  からなる群より選択される寄生虫病原体に由来しうる。
【００３６】
真菌性病原体は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．，（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ），Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．，Ｅｘｏｐｈｉａｌａ  ｓｐｐ．，Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｉｍ  ｓｐｐ．，Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．，（例えば、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ及びＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ），Ｔｉｎｅａ  ｓｐｐ．，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．，Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．，Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．，Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．，Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．，Ｓｐｏｒｏｔｒｉｘ  ｓｐｐ．，Ａｂｓｉｄｉａ  ｓｐｐ．，Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｓｐｐ．，  ｓｐｐ．，Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｓｐｐ．，Ｌａｃａｚｉａ  ｓｐｐ．，Ａｒｔｈｒｏｇｒａｐｈｉｓ  ｓｐｐ．，Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ  ｓｐｐ．，Ａｐｏｐｈｙｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．，Ｅｍｍｏｎｓｉａ  ｓｐｐ．，Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｐ．，Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐｐ．，Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｐ．，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｓｐｐ．，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐｐ．，Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐｐ．，Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｓｐｐ．，Ｍｕｃｏｒ  ｓｐｐ．，Ｎｅｏｔｅｓｔｕｄｉｎａ  ｓｐｐ．，Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．，Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．，Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．，Ｐｈｏｍａ  ｓｐｐ．，Ｐｉｅｄｒａｉａ  ｓｐｐ．，Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．，Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ  ｓｐｐ．，Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐｐ．，Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｓｐｐ．，Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．，Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐｐ．，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．，Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．，Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．，Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｓｐｐ．，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．，Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐｐ．，Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｐｐ．，Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．，Ｗａｎｇｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．の属の真菌性病原体に由来しうる。
【００３７】
本発明のペプチドで治療可能な細菌感染は、表１に示されるヒトの細菌、真菌、エンベロープ型ウイルス病原体のいずれから選択されてもよい。
従って、本発明は、細菌感染が全身性、局所性、皮下性、皮膚性又は粘膜性の真菌感染である細菌感染を治療するための薬剤の製造のための本発明に基づくペプチドの使用を提供する。
【００３８】
真菌感染は、感染が深部に及び、内部器官又は血液由来のものに影響を与えることを意味する全身性、又は感染が表面的で皮膚上で起こることを意味する局所性（皮膚糸状菌性）に分類できる。さらに、酵母感染は体の粘膜に影響を与え得る。また、酵母感染は全身性（例えば、カンジダ血症及び他の頻度の高い致命的状況）でもあり得る。皮膚上の真菌感染は、普通クリーム又は軟膏（局所的抗真菌薬）で治療される。しかし、クリームや軟膏の治療では治癒されない全身的感染、酵母感染又は局所的感染は、全身的抗真菌薬（経口又はＩＶ）で治療される必要がある。これらの薬剤は、例えば、白癬（タムシ）など、皮膚上で生じる一般的な真菌感染、喉、膣又は体の他の部分で生じ得るカンジダ症（酵母感染、鵞口瘡としても知られる）を治療するために使用される。また、全身性抗真菌薬は、ヒストプラズマ症、ブラストミセス症及びアスペルギルス症など、肺及び他の器官に影響を与える他の深部への真菌感染を治療するためにも使用される。それらは、骨髄又は器官を移植した患者、及びＨＩＶ−ＡＩＤＳの人々など、免疫系が弱まった人々への真菌感染を予防又は治療するためにしばしば使用される。
【００３９】
全身性又は皮膚糸状菌性真菌感染は、通常、死亡又は重篤な病気の原因とはならないが、蔓延しており、治療に費用がかかるため経済的にも重要である。局所的又は表面的な真菌感染は、皮膚、ラミナ、角質層、爪及び毛髪への感染を含む。皮膚感染は皮膚、手指の爪及び足指の爪の感染である。
本発明のより好ましい態様において、真菌感染は爪甲真菌症である。爪甲真菌症は、限定はしないが、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．に由来する真菌によって引き起こされ、例えば、その真菌は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ又はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍである。
「爪甲真菌症」には、限定はしないが、ｄｉｓｔａｌ  ｌａｔｅｒａ  ｓｕｂｎｇｕａｌ、ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｗｈｉｔｅ、ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｗｈｉｔｅ  ｓｕｂｕｎｇｕａｌ、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ、ｐｒｉｍａｒｙ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ、ｅｎｄｏｎｙｘ、ｅｎｄｏｎｙｘ、カンジダ性（例えば、爪甲剥離症及び慢性粘膜皮膚性疾患）タイプの爪甲真菌症が含まれる。爪甲真菌症は、腕／足の急性蜂窩織炎及びその他の二次細菌感染症など、より重篤な臨床的合併症に対する重要な危険因子であることが明らかにされてきた。従って、本発明はこれらの感染症の治療を包含する。
【００４０】
本発明のペプチドは広範にわたる病原性生物に対する有効な抗菌ペプチドである。しかし、本発明のペプチドは、限定はしないが、嚢胞性線維症や粘膜感染に伴う他の状態、例えば、胃腸、泌尿生殖器又は呼吸器感染などを含む他の状態の治療にも有用である。
また本発明のペプチドは、特に、創傷、潰瘍及び外傷、例えば、切り傷や火傷などの皮膚創傷、及びそれらに関連する状態の治療又は予防においても有用である。
「治療」とは、（感染性の）疾病に罹患している患者に利益を与えることにおける本明細書に記載されるペプチドの効果を指し、患者の病態の改善又は疾病の進行の遅延を含む。
ここで用いられる「創傷の治療」とは、創傷の回復と関連する状態、及び組織の回復を促進、増大、又は加速化し、術後の傷、火傷、乾癬、美容整形手術及び器官移植後などの組織のリモデリングの加速化を含む療法が含まれる。
従って、本発明のさらなる態様において、本発明のペプチドが適用又は接着される基質が提供される。好ましくは、該基質は創傷への適用又は創傷部位への輸送に適する。好ましくは、抗菌効果を達成するために、基質から創傷ベッドへの本発明のペプチドの運搬が該基質により可能となる。該基質は、例えば、創傷包帯材など、包帯材である。この包帯材は繊維状物質を含むか、又はコラーゲン様物質である。
【００４１】
本発明のペプチドは殺菌剤の用途も見出される。これに関連し、本発明のペプチド又は医薬組成物は、単独又は他の殺菌剤と組み合わせて処理すべき表面へ塗布してもよい。ここで用いられる「処理すべき表面」とは、ここで定義される基質又は医療用具である。
さらなる態様において、本発明は、本発明のペプチドの治療上有効な量を被検対象へ投与することを含む、細菌感染を治療又は予防する方法を提供する。
本発明のより好ましい方法において、細菌感染は真菌感染である。本発明の方法において、ペプチドは該被検対象の皮膚又は爪に適用してもよい。
哺乳動物、鳥類及び他の動物を、本明細書に記載のペプチド、組成物又は方法により治療してもよい。そのような哺乳類、鳥類には、ヒト、イヌ、ネコ及びウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ及び七面鳥などの家畜が含まれる。さらに、本発明のペプチド、組成物又は方法により植物を処置してもよい。
被検対象が動物の場合には、本発明の方法は、限定はしないが、蹄、鉤爪、ヒトの足を含む爪様特徴部に適用される。
【００４２】
本発明の方法には、ペプチド処理の他、爪へのペプチドの透過を促進する処理が含まれる。この方法は化学的又は物理的手段によって促進される。爪のエッチング又は爪の背面層の綴じ込みなどの物理的処理は、本発明のペプチドの透過性を促進し得る。本発明のペプチに対する爪の透過性の化学的な増大は、爪の爪体ケラチン内で物理的又は化学的な結合を破壊することによって達成される。爪の軟化剤には、限定はしないが、尿素、サリチル酸が含まれ、これらが爪の密度を減少させるために爪の水和作用が増大し、その結果、本発明のペプチドに対する透過性が増大させる。メルカプト基を含む化合物は爪のケラチンに存在するジスルフィド結合を切断し、不安定化し、薬剤の透過性を増大させる。限定はしないが、アセチルシステイン及びメルカプトエタノールの誘導体を含む化合物は、本発明のペプチドと組み合わせて使用してもよい。本発明のペプチドと組み合わせて使用できるその他の既知の爪透過性賦形剤／アジュバントには、メチルスルホニルメタン、尿素、ポリエチレングリコール、Ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン、ジメチルスルホン及び２−ｎ−ノニル−１，３−ジオキソランが含まれる。
【００４３】
さらなる態様において、本発明は、本発明のペプチドの治療的有効量、又は基質を創傷に適用することを含む、被検対象の創傷を治療する方法を提供する。
塩を含む本発明のペプチドは、感染、適応症又は疾患に伴う兆候の少なくとも１つを低減し、又は適応症又は疾病に伴う抗体量を低下させることを達成するように投与される。
所望の効果を達成するために、本ペプチド、その変異体又はそれらの組合せが、単独又は分割された投与量にて、例えば、少なくとも体重あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５００〜７５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇから約３００〜５００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００〜３００ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１ｍｇ／ｋｇから約５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は体重当たり少なくとも１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇを投与してもよいが、他の投与量が有益な結果をもたらすこともある。投与総量は、限定はしないが、選択したペプチド及びその臨床的効果、動物の疾病、体重、体調、健康状態、年齢、達成されるべきは予防なのか又は治療なのか、及びペプチドが化学的に修飾されているかどうかなど、種々の要因に応じて変化するであろう。そのような要因は、臨床医が臨床試験の経験的データを調査し、臨床前の動物モデルの結果又は当該技術分野において利用可能な他のテスト系を検討すれば、容易に決定することができる。
【００４４】
本発明による治療剤の投与は、１回の服用であっても、連続的又は断続的な方法による複数回の投与であってもよく、例えば、受容者の体調、投与目的が治療的か又は予防的か、その他当業者に既知のファクターに依存する。本発明のペプチドの投与は、原則として、予め選択された期間連続的であり、又は一連の間隔を開けた投与量であってもよい。局所的及び全身的投与のいずれも意図される。
【００４５】
組成物、ペプチドを調製するために、ペプチドを合成し、又は他から入手し、必要に応じて又は望むならば精製を行い、その後、凍結乾燥及び安定化する。その後、ペプチドは適当な濃度に調整され、必要なら、他の薬剤と組み合わされる。単位投与量に含まれる所定のペプチドの絶対量は、大きく変動する。例えば、少なくとも本発明の１つのペプチド又は特定の細胞型に特異的な複数のペプチドの約０．０１から約２ｇ、又は約０．０１から約５００ｍｇを投与することができる。あるいは、単位投与量は、約０．０１ｇから約５０ｇ、約０．０１ｇから３５ｇ、約０．１がから約２５ｇ、約０．５がから約１２ｇ、約０．５ｇから約８ｇ、約０．５ｇから約４ｇ、又は約０．５ｇから約２ｇの範囲で変動する。
【００４６】
本発明のペプチドの毎日の投与量もまた変動し得る。この毎日の投与量は、例えば、約０．０００１ｇ／日から約１００又は５０ｇ／日、約０．１ｇ／日から約２５ｇ／日、約０．１ｇ／日から約１２ｇ／日、約０．１ｇ／日から約５ｇ／日、約０．１ｇ／日から約２．５ｇ／日、約０．１ｇ／日から約２ｇ／日、約０．５ｇ／日から約８ｇ／日、約０．５ｇ／日から約４ｇ／日、約０．５ｇ／日から約２ｇ／日、約０．５ｇ／日から約１ｇ／日で変動する。
【００４７】
従って、本発明の治療用ペプチドを含む１以上の適切な単位投与形態は、経口、非経口（皮下、静脈内、筋肉内及び腹腔内を含む）、直腸、皮膚、経皮的、胸郭内、肺内、鼻腔内（呼吸器）の諸経路を含む様々な経路によって投与される。治療的ペプチドは、脂質製剤形態又は持続性放出（例えば、マイクロカプセルへの封入を使用、ＷＯ９４／０７５２９、及び米国特許第４，９６２，０９１号を参照のこと）によって製剤化することもできる。剤形は、適切な場合には、個別の単位投与量形態で都合に合わせて提供され、製剤分野において周知のいかなる方法によって調製されてもよい。これらの方法には、治療剤を脂質キャリアー、固体マトリクス、半固体キャリアー、微細分割固体キャリアー又はそれらの組合せと混合し、その後、必要ならば、所望のデリバリーシステムへ製造物を導入し又はシェイピングするステップが含まれる。
【００４８】
本発明の治療用ペプチドが経口投与のために調製される場合、通常、それらは、製剤又は単位投与量の剤形を調製するための製薬的に許容されるキャリアー、希釈剤又は賦形剤と混合される。経口投与に対し、本ペプチドは、パウダー、顆粒状形体、溶液、懸濁液、エマルジョンとして、又は天然若しくは合成ポリマー若しくはチューインガムからの活性成分の摂取用レジン中に包含して提供してもよい。また、活性なペプチドは、ボーラス、舐剤又はペーストとして提供してもよい。本発明の経口投与されるペプチドは、持続性放出のために製剤化することもでき、例えば、該ペプチドをコーティングし、マイクロカプセルに封入し、あるいは、持続性輸送装置内に配置することができる。上記剤形中の総活性成分量は剤形重量の０．１〜９９．９％含まれる。
【００４９】
本発明の治療用ペプチドを含む医薬製剤は、当該技術分野において周知な方法により、容易に入手可能の成分を用いて調製することができる。例えば、該ペプチドは通常の賦形剤、希釈剤、又はキャリアーと共に製剤化することができ、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、パウダー、エアゾールなどに製剤化することができる。そのような製剤化に適する賦形剤、希釈剤及びキャリアーの例には、バッファー、並びに、スターチ、セルロース、糖、マンニトール及びシリカ誘導体などの充填剤及び増量剤が含まれる。カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びその他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、及びポリビニルピロリドンなどの結合剤を包含することもできる。グリセロールなどの保湿剤、炭酸カルシウム及び重炭酸ナトリウムなどの崩壊剤なども含まれる。パラフィンなどの溶解を遅らせるための薬剤も含まれる。４級アンモニウム化合物などの再吸収の促進剤も含まれる。セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールなどの界面活性剤を含んでもよい。カオリン及びベントナイトなどの吸着性キャリアーを添加することができる。タルク、カルシウム及びステアリン酸カルシウム及びステアリン酸マグネシウム、及び固体ポリエチレングリコールなどの潤滑剤も包含することができる。保存剤を添加してもよい。また、本発明の組成物はセルロース及び／又はセルロース誘導体などの増粘剤も含むことができる。また、キサン、グアール又はカルボガム又はアラビアゴムなどのガム、あるいは、ポリエチレングリコール、ベントン及びモンモリロナイトなども含み得る。
【００５０】
本発明のペプチドを含む錠剤又はカプセルは、例えば、炭酸カルシウム、マグネシウム酸化物及び炭酸マグネシウムなどの緩衝剤を含んでもよい。また、適切な緩衝剤には、酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、及びリン酸塩も含まれる。また、カプレット及び錠剤は、セルロース、アルファ化でんぷん、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース、スターチ、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、コーンスターチ、ミネラルオイル、ポリプロピレングリセロール、リン酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛なども含むことができる。少なくとも１つの本発明のペプチドを含む硬質又は軟質のカプセルは、ゼラチン、微結晶性セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、スターチ、タルク、及び二酸化チタンなど、並びに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧｓ）及び植物油などの液体媒体を含むことができる。さらに、本発明の１以上のペプチドを含む腸溶コーティングカプレット又は錠剤は、胃での分解を防ぎ、十二指腸内のより中性からアルカリ性の環境で溶解するようにデザインされる。
【００５１】
また、本発明の治療用ペプチドは、エリキシル剤又は経口投与に都合のよい溶液として、又は例えば、筋肉内、皮下、腹腔内又は静脈内経路などの非径行的投与に適する溶液として製剤化することもできる。また、本発明の治療用ペプチドの製剤形態は、水溶性又は無水溶液又は分散媒、あるいは、エマルジョン、懸濁液又は軟膏の形式をとることもできる。
【００５２】
従って、治療用ペプチドは、非経口投与（例えば、ボーラスインジェクション又は連続的輸液などのインジェクション）のために製剤化してもよく、また、アンプルによる単位投与量形体、充填済みのシリンジ、少量輸液用コンテナー又は複数投与量用コンテナーとして提供してもよい。上述のように、剤形の有効期限を維持するために保存剤を添加してもよい。活性なペプチド及び他の有効成分は、懸濁液、溶液、又は油性若しくは水性媒体中のエマルジョンを形成してもよく、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散化剤などの製剤化剤を含んでもよい。あるいは、活性なペプチド及び他の有効成分は、使用前に、滅菌固体の無菌的単離、又は滅菌水、発熱物質を含まない水などの適切な媒体で構成される溶液からの凍結乾燥により取得された、パウダー状であってもよい。
【００５３】
こられの製剤は、当該技術分野において周知である製薬的に許容なキャリアー、媒体及びアジュバントを含むことができる。例えば、水以外に、生理学的観点から許容され、アセトン、酢酸、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルフォキシド、「Ｄｏｗａｎｏｌ」として市販される製品などのグリコールエーテル、ポリグリコール及びポリエチレングリコール、短鎖酸のＣ１−Ｃ４アルキルエステル、エチル若しくはイソプロピル乳酸塩、「Ｍｉｇｌｙｏｌ」として市場に出ている製品などの脂肪酸トリグリセリド、イソプロピルミトリステート(mytrisate)、動物、ミネラル及び植物オイル、及びポリシロキサンなどの溶媒から選択される１以上の有機溶媒を使用する溶液を調製することが可能である。
【００５４】
好ましくは、本発明の治療用ペプチドの製剤は、ペプチドを含む溶媒又は希釈剤の形体をとることもできる。溶媒又は希釈媒には、酸溶液、ジメチルスルフォン、Ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン、２−ｎ−ノニル−１，３−ジオキソラン及びエチルアルコールが含まれる。好ましくは、溶媒／希釈剤は、酸性溶媒、例えば、酢酸、クエン酸、ホウ酸、乳酸、プロピオン酸、リン酸、安息香酸、ブチル酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸である。
【００５５】
より好ましくは、該溶媒は酢酸溶液である。該溶媒、例えば、酢酸溶液は、１％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％未満の酸（例えば、酢酸）濃度で組成物中に存在する。
さらなる本発明の態様において、細菌感染、特に真菌感染を治療するための薬剤の製造における酸の使用が提供される。真菌感染は、爪甲真菌症である。爪甲真菌症は、限定はしないが、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．属の真菌によって引き起こされ、例えば、真菌は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ又はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ．などである。酸は前述したものなどである。好ましくは、酸は酢酸である。さらに好ましくは、酸は、１％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％未満の酸濃度の溶液として提供される。典型的には、製剤は、例えば、爪の治療のための局所的投与に適合する。
【００５６】
以下で使用されるように、「活性な薬剤」には本発明の単一のペプチド、又はここに記載されるようなペプチドの組合せが含まれる。また、「活性な薬剤」にはここで記載されるような製薬的な有効量の酸も含まれる。活性な薬剤は同時に、連続的に又は別々に投与される。通常、そのような投与は局所的であることが好ましい。
【００５７】
活性な薬剤は相乗的に効果を示す量にて投与される。従って、本発明には、以下の使用が含まれる：本発明のペプチド及びここで記載した製薬的有効量の酸などの相乗的に効果的な量の活性な薬剤の使用、薬剤などの製造物の製造のための使用、細菌感染の治療における該薬剤の同時的、個別的又は連続的な投与のための使用。
【００５８】
必要ならば、酸化防止剤、界面活性剤、他の防腐剤、膜形成剤、角質溶解剤又は面皰溶解剤、香料、香味剤及び着色剤から選択されるアジュバントを添加することができる。ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン及びα−トコフェロール及びその誘導体などの酸化防止剤を添加することができる。
【００５９】
また、本発明の１以上のペプチド、及び、１以上の例えば、アンフォテリシンＢ、アンフォテリシンＢ脂質複合体（ＡＢＣＤ）、リポソーマルアンフォテリシンＢ（Ｌ−ＡＭＢ）及びリポソーマルナイスタチンなどのポリエン、ボリコナゾール、フルコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、ポザコナゾールなどのアゾール及びトリアゾール；ｃａｓｐｏｆｕｎｇｉｎ、ｍｉｃａｆｕｎｇｉｎ（ＦＫ４６３）、及びＶ−ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ（ＬＹ３０３３６６）などのグルカン合成阻害剤；グリセオフルビン；テルビナフィンなどのアリルアミン；フルシトシン又は他の抗真菌剤など、ここに記載されるものを含むその他の抗菌又は抗真菌剤を含む混合産物も考えられる。さらに、本ペプチドは、局所的な抗真菌薬、例えばシクロピロックスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ウンデシレン酸塩、局所的ナイサチン、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン及びその他の局所的薬剤と組み合わされることも考えられる。
【００６０】
さらに、本ペプチドは持続性放出投与形態などとして製剤化するために好適である。剤形は活性なペプチドを、例えば、腸管又は気管の特定の部位に、出来る限り十分な時間放出するように構成することができる。コーティング、エンベロープ及び保護マトリクスは、例えば、ポリ乳酸−グリコール酸、リポソーム、マイクロエマルジョン、微粒子、ナノ粒子、又はワックスなどの重合体基質から製造される。これらのコーティング、エンベロープ、及び保護マトリクスは、例えば、ステント、カテーテル、腹膜透析チューブ、排出装置などの体内埋め込み装置をコートするのに役に立つ。
【００６１】
局所的投与に関し、活性な薬剤は、目的の領域に対し直接適用するために、当該技術分野において既知の方法により製剤化してもよい。局所的適用に対し主として調製される形状は、例えば、クリーム、ミルク、ゲル、パウダー、ディスパージョン又はマイクロエマルジョン、多少増粘されたローション、含浸パッド、軟膏又はスティック、エアゾール製剤（例えば、スプレー又はフォーム）、ソープ、界面活性剤、ローション又は石鹸片の形状をとる。本目的に対する従来の他の形状には、創傷被覆材、被覆包帯、又は他のポリマー被覆材、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゼリー、スプレー及びエアゾールが含まれる。従って、本発明の治療用ペプチドは、皮膚の投与のためのパッチ又は包帯を介して供給される。あるいは、本ペプチドはポリアクリル酸塩又はアクリル酸塩／ビニル酢酸塩の共重合体などの粘着性ポリマーの一部となるように製剤化することができる。長期間にわたる塗布に対しては、皮膚の水和又は浸軟を最小にするように、ミクロ細孔性及び／又は通気性の裏当てラミネート（薄膜）を使用することが望ましい。裏当て層は、望ましい保護及びサポート機能を果たす適切な厚さにする。通常、適当な厚さは、約１０〜２００ミクロンである。
【００６２】
局所的投与は爪のコーティング又はラッカーの形式でよい。例えば、抗真菌ペプチドは局所的投与に対して、エチルアセテート（ＮＦ）、イソプロピルアルコール（ＵＳＰ）、及びイソプロピルアルコール中のポリ［メチルビニルエーテル／マレイン酸］のブチルモノエステルの溶液中に製剤化することができる。
【００６３】
局所投与のための医薬製剤は、例えば、生理学的に許容な、約０．００１ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの治療すべき徴候又は疾患に特異的な１以上の本発明のペプチドを含む生理食塩緩衝液を含んでもよい。
【００６４】
例えば、軟膏及びクリームは、適切な増粘及び／又はゲル化剤の添加して、水溶性又は油性ベースで製剤化される。ローションは水溶性又は油性ベースで処方され、一般に、１以上の乳化剤、安定化剤、分散化剤、懸濁剤、増粘剤、又は着色剤も含む。活性なペプチドは、例えば、米国特許第４，１４０，１２２；４，３８３，５２９；又は４，０５１，８４２号に開示されるイオン泳動を介して供給することもできる。局所的処方における本発明の治療剤の重量パーセンテージは、種々のファクターに依存するが、通常、製剤の総重量の０．０１％〜９５％、及び典型的には０．１〜８５重量％である。
【００６５】
点眼剤又は点鼻薬などの滴下薬(Drops)は、１以上の治療用ペプチドで、１以上の分散化剤、安定化剤又は懸濁剤を含む水溶性若しくは油性ベース中に製剤化してもよい。液体スプレーは、ポンプ又は都合に合わせて加圧パックで供給される。滴下薬は、単純なキャップ付き点滴ボトル、液体内容物を滴状供給するのに適したプラスチックボトル、又は特別な形状をした容器(closure)を介して供給できる。
【００６６】
治療用ペプチドは、さらに、口腔又は喉の局所的投与のために製剤化することができる。例えば、活性成分を、スクロース及びアカシア又はトラガカントなどの味付きのベースをさらに含むトローチ剤として；ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアなどの不活性なベース中に組成物を含む香錠として；及び本発明の組成物を適当な液体キャリアー中に含むうがい薬として製剤化することができる。
【００６７】
本発明の医薬製剤には、任意の成分として、製薬的に許容されるキャリアー、希釈剤、溶解又は乳化剤、及び当技術分野で利用可能なタイプの塩が含まれる。これらの物質の例には、緩衝生理食塩水などの通常の生理食塩水及び水が含まれる。本発明の製剤に有用なキャリアー及び／又は希釈剤の特定の非限定的な例には、水及びｐＨ７．０−８．０リン酸緩衝生理食塩水などの生理的に許容な緩衝生理食塩水が含まれる。
【００６８】
また、本発明のペプチドは、気道に投与することもできる。従って、本発明は、本発明の方法で使用されるエアゾールの製剤及び投与形態も提供される。一般に、そのような投与形態には特定の感染、適応症又は疾病の臨床的徴候を治療又は予防するのに効果的な少なくとも１つの本発明の薬剤が含まれる。本発明の方法に従って治療される１以上の感染、適応症又は疾病の徴候が統計的に有意に減弱されるならば、全て、本発明の範囲に含まれる感染、適応症又は疾病の治療であると考えられる。
【００６９】
あるいは、吸入又は吹き入れによる投与に関し、本組成物は、例えば、治療薬のパウダー混合物及びラクトース又はスターチなどの適当なパウダーベース等、乾燥パウダーの形状をとる。該パウダー組成物は、例えば、カプセル又はカートリッジ、又はゼラチン、又は吸入器、吹き入れ器、若しくはパウダーが定量吸入器によって投与される発泡性ガス中の単位投与量形態で提供される（例えば、加圧性定量吸入器（ＭＤＩ）及び乾燥パウダー吸入器について、Ｎｅｗｉｎｎａ，Ｓ．Ｐ．ｉｎ  Ａｅｒｏｓｏｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌｕｎｇ，Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．Ｗ．及びＤａｖｉａ，Ｄ．ｅｄｓ．，ｐｐ．１９７−２２４，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８４の開示内容を参照のこと）。
【００７０】
また本発明の治療用ペプチドは、エアゾール又は吸入剤の形状で投与される場合、水溶液中に存在する状態で投与することもできる。従って、他のエアゾール製剤は、例えば、治療されるべき徴候又は疾病に特異的な本発明のペプチド、約０．００１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌを含む、製薬的に許容される緩衝生理食塩水を含む。また、液体中に溶解又は懸濁されていない固体ペプチド又は核酸粒子の微細に分割された形状の乾燥エアゾールも、本発明の実施において有用である。本発明のペプチドは粉化パウダーとして製剤化してもよく、また、平均粒子サイズが約１〜５μｍ、あるいは、２〜３μｍの微細に分割された粒子を含んでもよい。微細に分割された粒子は当技術分野において周知の技術を用いた紛状化及びスクリーンフィルトレーションによって調製される。該粒子は、予め決定された量の微細に分割された原料を、パウダー状で吸入することにより投与される。必要な有効量は、複数の投与量単位の投与によって達成されるので、単位量の活性成分又は各投与量形態の個々のエアゾール投与量に含まれる活性成分が、それ自体で、特定の感染、適応症、又は疾病を治療するための有効量を構成する必要がないことは、十分に理解し得るであろう。さらに、有効量は、投与量形態における投与量、個々に応じて、又は一連の投与未満の使用によって達成されてもよい。
【００７１】
吸入による上方（鼻）又は下方の気道への投与に関し、本発明の治療用ペプチドは、ネブライザー又は加圧パック、又はその他のエアゾールスプレーを供給する都合の良い手段により都合良く供給される。
【００７２】
加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適当なガスなどの適当な推進剤を含んでもよい。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、定量を供給するためのバルブ備えることにより決定される。ネブライザーには、限定はしないが、米国特許第４，６２４，２５１；３，７０３，１７３；３，５６１，４４４；及び４，６３５，６２７中に開示されるものが含まれる。ここで開示されるタイプのエアゾール供給システムは、Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ  ＮＪ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍｏｓｅａｌ  Ｃｏ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を含む多数の商業的入手元から入手可能である。鼻腔内投与に関し、本治療剤は、プラスティックボトル性のアトマイザー又は定量吸入器を介して点鼻薬、液体スプレーにより投与してもよい。典型的なアトマイザーはＭｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Ｗｉｎｔｒｏｐ）及びＭｅｄｉｈａｌｅｒ（Ｒｉｋｅｒ）である。
【００７３】
さらに、活性成分は、他の治療剤、例えば、鎮痛剤、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、気管拡張剤などと組み合わせて、ここに記載された病態又は他に記載された病態に対し、使用することができる。
【００７４】
本発明は、正常人又は他の動物細胞に対して低い毒性を持ちながら、所望の抗菌性、例えば、抗真菌性や、所望の特徴（真菌細胞膜を透過し、溶解し、殺傷し、又は真菌の生育を阻害する）を持つペプチドのスクリーニングアッセイ法も提供される。
候補ペプチドは、ここで記載された本発明のペプチドライブラリーから取得することができる。該ペプチドは、特定の構造的特徴を持つように個別に又は合理的にデザインすることもできる。
ここで、本発明を後述の図を参照しながら実施例により記載する。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例を参照することにより、ここで本発明について記載する。
実施例
材料及び方法、試薬
全てのペプチドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｅｖｏｑｕｅｓｔ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡによる規約に基づく固相合成によるか、又はペプチドの供給業者であるＮｅｏＭＰＳ  ＳＡ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ  Ｆｒａｎｃｅ）又はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．（Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）から入手した。真菌へのテストのために、凍結乾燥ペプチドはアッセイバッファー中１，０００μｇ／ｍｌのストック溶液として調製した。図２−８及び図１１の実験中に明記されている場合において、酢酸は最終濃度０．５％で添加された。
【００７６】
病原体
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（ＮＣＰＦ１１７）及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ（ＮＣＰＦ３３５）株はＮｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｈｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｆｕｎｇｉから入手し、Ｓａｂｕｏｒａｕｄアガー及びポテトデキストランアガーの傾斜におよそ１月毎の間隔で稙菌して培養し、３０℃で維持した。Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ株３１７９（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ［ＮＣＴＣ］，Ｃｏｌｉｎｄａｌｅから入手）はＯｘｏｉｄ  Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ中、３７℃で維持した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ株８１９８、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株１０６４２（メチシリン耐性）、及びＥ．ｃｏｌｉ０１５７株１２９００は、ＮＣＴＣ，Ｃｏｌｉｎｄａｌｅから入手し、Ｏｘｏｉｄ  Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ中、３７℃で維持した。
【００７７】
真菌の生育感受性アッセイ
真菌株の各試験ペプチドに対する感受性を決定するために、真菌の生育への影響を以下にように評価した。Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ及びＴ．ｒｕｂｒｕｍの分生子及び菌糸の断片の懸濁液はフレッシュな１０ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｂｒｏｔｈ（ＮＧＢ）（２％ｗ／ｖグルコースを含むＯｘｏｉｄ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ）を傾斜培養に添加し、スパーテルで激しく攪拌して調製した。生じた分生子／菌糸の断片の懸濁液は２層の滅菌した外科用のガーゼを通して大きな分生子のマットとアガーの小片を取り除いた。２０μｌの懸濁液（５４０ｎｍの吸光度約０．１、およそ１０６の栄養繁殖体／ｍｌに対応する）を総体積８０μｌの栄養培地（ＮＧＢ）と適当量のペプチド溶液が予め添加された滅菌９６ウェルマイクロタイタープレート中に稙菌した。ＮＧＢ培地のみに溶媒をくわえ（可能である場合は、ペプチドサンプルと同じ濃度となるように）、最終体積１００μｌとしたものをコントロールウェルとした。プレート中での真菌の生育は、３０℃で２４時間、４日及び７日培養した後、Ｍｉｃｏｒｏｔｅｋ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒを用いて５４０ｎｍの吸光度によりモニターした。
【００７８】
Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの生存アッセイ
真菌株の各テストペプチドに対する感受性を調べるために、Ｃａｎｄｉｄａの生存に対する影響を以下のようにアッセイした。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓカルチャーを１８−２４時間生育させたのち、実験に先立ち４℃で保存した。一晩生育させたフレッシュカルチャーを２０００ｘｇで１０分間遠心したのち、フレッシュなＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈで洗浄し、生細胞の数を５×１０６から１×１０７となるように調整した。アッセイバッファーは１００μｌのＮＧＢ培地を６．９ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．７に添加して調製した。ある濃度のペプチドを含む、又は含まない３５μｌのアッセイバッファーを滅菌したスクリューキャップ付きのポリプロピレンバイアルに添加し、上述のＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの接種菌１５μｌを添加した。バイアルは３７℃の水浴中、２時間インキュベートし、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．の生存数を滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で連続希釈し、Ｏｘｉｄ  Ｓａｂｏｕｒａｕｄアガー（２０ｍｌ）を含む９ｃｍぺトリ皿上にプレートして決定した。計測はプレートを３７℃で１８−２４時間培養した後行った。
【００７９】
細菌の生存アッセイ
Ｓｐｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅ株８１９８、Ｓａｔｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株１０６４２（メチシリン耐性）及びＥ．ｃｏｌｉ０１５７株１２９００（全てＮＣＴＣ，Ｃｏｌｉｎｄａｌｅから入手）を１８−２４時間生育させ、使用前に４℃で保存した。一晩生育させたフレッシュカルチャーを２０００ｘｇで１０分間遠心したのち、フレッシュなＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈで洗浄した。各４つのペプチドに対する感受性は、上述のＣ．ａｌｂｃａｎｓのようにアッセイした。Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳ.  ａｕｒｅｕｓに関し、ペプチド感受性アッセイに対する細胞の初期数は、１０８／ｍｌであり、計数に用いた培地はＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ）であった。Ｓｔｒ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓはＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ上では他の株に比べあまりよく生育したかったため、これらのアッセイについては細胞の初期数を他の株よりも低くし、１０６／ｍｌとした。Ｓｔｒ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓの生存は、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒに代えてＯｘｏｉｄ  Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  Ｓｏｙａ  Ａｇａｒを使用して決定した。
【００８０】
結果
ペプチド１−４によるＴｒｉｃｈｏｐｈｔｙｏｎ  ｓｐｐ．の生育阻害
臨床上関係する２つの皮膚の真菌病原体であるＴ．ｒｕｂｒｕｍ及びＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅは、材料と方法のセクションに記載したように、成長培地のみ（コントロールカルチャー）又は５０μｇ／ｍｌのペプチド１、２、３又は４（図１に示す）を含む成長培地中で培養した。Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ及びＴ．ｒｕｂｒｕｍの生育は、培養４日及び７日後に光学的濃度（５４０ｎｍの吸光度）を測定して評価した。無処理サンプルのコントロールと比較すると、テストされた各ペプチドは、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ（図２）及びＴ．ｒｕｂｒｕｍ（図３）の生育を４及び７日後に有意に阻害した。各テスト株のコントロールカルチャーは、４〜７日の間にＯＤの読みの増加として示されるように、生育し続けた。
【００８１】
ペプチド１−４によるＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．の生育及び生存の阻害
酵母のＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを材料と方法のセクションに上述したように、成長培地のみ（コントロールカルチャー）又は５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ、及び３００μｇ／ｍｌ又は５００μｇ／ｍｌのペプチド１、２、３又は４を含む成長培地中で培養した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの生育は、培養２４時間（図４ａ）及び４８時間（図４ｂ）後に光学的濃度（５４０ｎｍの吸光度）を測定して評価した。無処理サンプルのコントロールと比較すると、テストされた各ペプチドは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの生育を時間及び濃度  依存的に有意に阻害した。生育阻害の濃度依存性は、コントロールの条件（成長培地のみ）又は５０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ濃度のペプチド１の存在下、２４時間培養後に光学的に評価した実験（図５）においてさらに確認された。別の実験で、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの生存を、成長培地のみ（コントロール）又は１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの範囲の濃度のペプチド４を含む培地中で生育させた１８−２４時間カルチャー後評価した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ菌体の生存は、２４時間培養後の生存率の計測により算定したように、濃度依存的に減少した（図６）。
【００８２】
ペプチド４による細菌の生存の阻害
臨床上関係する３つの細菌病原体、Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７株、メチシリン耐性Ｓａｔｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）及びＳｐｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅを、材料及び方法のセクションに上述したように、ある濃度範囲のペプチドに対し暴露した。３時間後、各細菌カルチャーサンプルを適当な固体成長培地プレートに移植し、コントロール（成長培地のみ）及び処理サンプル（ペプチド４を含む成長培地）中の生コロニーの数を１８−２４時間後に算定した。３時間の暴露後、ペプチド４は、無処理のカルチャーであるコントロールと比較して、各細菌株の生存を濃度依存的に有意に阻害した（図７）。
【００８３】
酢酸はペプチド４の抗真菌活性を促進する
図２及び３に示す実験のコントロール（ペプチド無し）及びテスト培地（ペプチド１、２、３又は４を含む）は両方とペプチド溶媒として０．５％の酢酸を含んでおり（詳細は材料及び方法のセクション）、酢酸自体がペプチドの活性及び／又は真菌の生存において役割を演じているかどうか調べるために、別の実験を行った。そのため、成長培地のみ、０．０１％の酢酸のみを含む成長培地、１ｍｇ／ｍｌのペプチド４を含む成長培地、及び１ｍｇ／ｍｌのペプチド４と０．０１％の酢酸を含む成長培地を用いて、方法及び材料のセクションに記載のように、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍの生育実験を行った。真菌の生育は上述のようにして、培養後３時間でＯＤにより測定した。予想通り、ペプチド４はＴ．ｒｕｂｒｕｍの成長を阻害した。０．０１％の酢酸のみの場合、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍに対し、有意な影響を与えなかったが（図８）、ペプチド４を含む培地中に存在する場合、０．０１％の酢酸の存在により、１ｍｇ／ｍｌのペプチド４のみの場合より、有意にＴ．ｒｕｂｒｕｍの生育を阻害した。
【００８４】
ペプチド４によるＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ及びＴ．ｒｕｂｒｕｍの生育阻害
Ｔｒｙｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．の生育に対するペプチド４の阻害効果を材料及び方法に記載した真菌生育アッセイにより測定した。Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ及びＴ．ｒｕｂｒｕｍは、培地のみ、又は３通りの異なる濃度のペプチド４を含む培地中で培養を行った。いずれのサンプル中にも酢酸は存在していなかった。培地のみのコントロールは、培地のバックグラウンドの吸光度を示すために用いた。真菌の生育は上述のように３０℃で９６時間培養後ＯＤにより測定した。図９に示すように、これらのアッセイにより、両方の種の真菌に対し、ペプチド４の阻害効果が立証され、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍよりもＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅは一貫してペプチド４の阻害効果を受けやすかった。Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅの生育は、０．５５ｍｇ／ｍｌのペプチド濃度において阻害された。
【００８５】
Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅに対するペプチド３及び４の効果
Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅに対するペプチド３及び４の潜在的な抗真菌力を評価した。生育阻害アッセイが材料及び方法に記載されるように、酢酸に非存在下において行われた。ペプチド１−３は極めて疎水的であるゆえに不溶性であったため、酢酸溶媒中にてＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．に対して以前テストしたのみであった。Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅカルチャーは、ペプチド３、ペプチド４の存在下、又は酢酸溶媒を含まない培地のみで７日間生育させ、生育をＯＤで測定した場合、ペプチド４は有意に真菌の生育を阻害するが（図１０）、ペプチド３は阻害効果を示さなかった（図１０）。０．５％酢酸非存在下における、疎水性ペプチド３の活性を超えるカチオン性ペプチド４の増強された活性により、以前認められた疎水性ペプチドの活性に対する、酢酸の顕著な影響が示唆された。
【００８６】
Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅの生育に対する酢酸の効果
酢酸によるＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅの生育阻害は、材料及び方法のセクションに記載されるように真菌の生育実験を立証することにより評価された。Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅカルチャーは、無処理又は３つの異なる酢酸濃度で処理し、３０℃、９６時間生育させた（図１１）。この結果により、前にペプチド１−４と共に溶媒として使用された濃度と同じ０．５％酢酸の重要な効果が示された。酢酸非存在下においてペプチド３の活性が欠如するという本実験により、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．に対してペプチド４が最も活性のある化合物であることが示唆される。
【００８７】
Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅの生育に対するポリ−Ｌ−リジンの効果
ペプチド４はリジン及びアルギニン残基を有する非常にカチオン性の高いペプチドであるため、これらのアミノ酸のポリ−Ｌ形態の抗真菌活性をＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅに対し、材料及び方法に詳述される生育阻害アッセイを用いて、酢酸非存在下においてテストした。コントロールである無処理のＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅカルチャーと、長さ２７−１００残基及び１００−２００残基の範囲のポリ−Ｌ−リジンを、１ｍｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌで含むカルチャーを確立した。Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅの各カルチャーの生育を３０℃で９６時間後に評価した。両サイズのポリ−Ｌ−リジン共にＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅの生育を阻害したが（図１２）、より長い分子がテストした全ての濃度で生育を阻害したのに対し、長さ２７−１００アミノ酸の分子については、高濃度においてのみ阻害活性が認められた（図１２）。この結果は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．に対するリジン生育阻害効果がサイズと濃度の両方に依存することを示唆する。
【００８８】
Ｔ．ｒｕｂｒｕｍの生育に対するポリ−Ｌ−アルギニン及びポリ−Ｌ−リジンの効果
次に、ポリ−Ｌ−リジンに対するポリ−Ｌ−アルギニンの抗真菌活性をＴ．ｒｕｂｒｕｍに対してテストした。生育阻害は、材料及び方法に記載されるように、酢酸非存在下において測定された。Ｔ．ｒｕｂｒｕｍは、培地のみ、ポリ−Ｌ−アルギニン（長さ２８−８６アミノ酸）及びポリ−Ｌ−リジン（１００−２００アミノ酸）を含む培地中にて培養した。菌接種していない培地のみのコントロールも設定した。カルチャーは３０℃で９６時間維持され生育がモニターされた。ポリ−Ｌ−アルギニン及びポリ−Ｌ−リジン共にＴ．ｒｕｂｒｕｍの生育を阻害した（図１３）。等しい濃度である１ｍｇ／ｍｌで総阻害生育量をテストした場合、ポリ−Ｌ−リジンよりもポリ−Ｌ−アルギニンの方が、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍに対する阻害効果においてより活性が高かった（図１３）。
【００８９】
Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ及びＴ．ｒｕｂｒｕｍのポリ−Ｌ−アルギニンによる阻害
ポリ−Ｌ−アルギニンによるＴｒｙｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．の生育阻害を材料及び方法のセクションに記載されるよに真菌生育実験をセットアップすることによりテストした。Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ及びＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅカルチャーを、培地のみ又は３つの異なる濃度のポリ−Ｌ−アルギニンを含む培地中にて行った。いずれのサンプルにも酢酸は存在していなかった。培地のみのコントロールは培地の吸光度のバックグラウンドを示すために用いた。真菌の生育は上述のように３０℃で９６時間インキュベーションした後、ＯＤにより測定した（図１４）。ポリアルギニンはいずれの種に対しても０．５５ｍｇ／ｍｌまで活性が認められた（図１４）。
【００９０】
Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ及びＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅに対する低い濃度（１００μｇ／ｍｌ）のポリアルギニンの効果
ポリアルギニンによるＴｒｙｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．の生育阻害は、材料及び方法のセクションに記載されるように真菌生育実験をセットアップすることによりテストされた。Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ及びＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅカルチャーは、無処理又は単一濃度ポリアルギニン（１００μｇ／ｍｌ）で処理し、いずれのサンプルにも酢酸を加えずに生育させた。培地のみのコントロールは培地の吸光度のバックグラウンドを示すために使用した。真菌の生育は、上述のように３０℃で９６時間インキュベーションしたのちＯＤにより測定した（図１５）。濃度を低くすると活性の喪失が生じ、このことは、ポリアルギニンのＴｒｙｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．に対する濃度効果を示すものである。
【００９１】
Ｔ．ｒｕｂｒｕｍの生育に対するペプチド三量体（３アミノ酸）の効果
Ｔ．ｒｕｂｒｕｍの生育に対するに対するポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−ヒスチジン及びポリ−Ｌ−トリプトファンのペプチド三量体の活性をテストした。生育阻害は、材料及び方法に記載のようにセットアップし、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍを無処理のままに置くか、又は２ｍｇ／ｍｌの各三量体に暴露した。カルチャーは３０℃で９６時間維持した。真菌の生育はＯＤにより測定し、その結果は無処理のカルチャーの生育に対するパーセンテージで表した（図１６）。Ｔ．ｒｕｂｒｕｍの生育において有意な減少をもたらすのに必要な３アミノ酸のみのポリペプチドについては、ポリ−Ｌ−アルギニンが最も活性が高かった。
【００９２】
Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅの生育に対するペプチド４（１．２ｍｇ／ｍｌ）及びＮａＣｌの効果
Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅに対するペプチド４の抗真菌活性における種々の塩濃度の影響を調べた。Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅの生育阻害アッセイを材料及び方法に記載のように、酢酸非存在下においてセットアップした。カルチャーは、未処理のまま置くか、又はペプチド４に１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌを加えたものに暴露した。Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅカルチャーを３０℃で９６時間維持し、上述したようにＯＤにより生育を評価した（図１７）。ペプチド４の抗真菌活性は、生理学的状況下において認められる濃度に近い塩濃度又はそれ以上の塩濃度のいずれにも影響されなかった（図１７）。内在性β−ディフェンシンの抗細菌活性は、低い塩濃度であっても阻害されることが広く報告されている。
【００９３】
高塩濃度におけるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに対するペプチド４の効果
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの生存を、ある濃度範囲のペプチド４と共に３７℃で２時間インキュベーションした後、方法及び材料に詳述されるように評価した。生理的又は非常に高い塩条件（内在性β−ディフェンシンペプチド活性を阻害することが知られている）の効果を確かめるため、成長培地を２通りのＮａＣｌ濃度に調整した。ペプチド４の顕著な殺菌活性は、非常に高い塩濃度においても観察された（図１８）。ペプチド４の濃度が増加するに従い、より高い塩濃度の効果は低下することが認められた（図１８）。従って、ペプチド４の殺菌活性は塩によって阻害されない。
【００９４】
Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに対するポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン及びポリ−Ｄ−アルギニンの活性
ポリ−Ｌ−リジンに対するポリ−Ｌ−アルギニン、及びポリ−Ｄ−リジンに対するポリ−Ｌ−リジンの抗真菌性活性について、これらのペプチド変異体のいずれがＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに対する増強された活性を示すのかを調べるために、評価が行われた。Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．は、１００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ及び１０ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｌ−アルギニンの存在下において、材料及び方法のセクションに記載されるように３７℃で２時間インキュベートした。生存については、上述の通り評価を行い、ポリ−Ｌ−アルギニンのポリ−Ｌ−リジンを超える増強された抗真菌活性が示された（図１９）。また、ポリ−Ｄ−リジンはポリ−Ｌ−リジンとよく似た抗真菌活性を持つことも示された。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明の４つのペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２】真菌、Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅの図１のペプチドによる処理後４日（ａ）及び７日（ｂ）の生育を示す棒グラフである。
【図３】真菌、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍの図１のペプチドによる処理後４日（ａ）及び７日（ｂ）の生育を示す棒グラフである。
【図４】真菌、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの図１のペプチドによる処理後２４日（ａ）及び４８日（ｂ）の成長を示す棒グラフである。
【図５】Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの生育に対するペプチド（図１に示す）の２４時間処理後の濃度依存性実験の結果を示す。
【図６】図１に示されるペプチド４の一連の投与量の存在下における２４時間後のＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．の生存状況を示すグラフである。
【図７】図１に示されるペプチド４の一連の投与量の存在下における２４時間後３つの異なる細菌株の生存状況を示すグラフである。
【図８】生育３日目におけるペプチド４（１ｍｇ／ｍｌ）の抗真菌活性（対Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）に対する０．０１％酢酸の相乗効果を示す棒グラフである。
【図９】ペプチド４によるＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ及びＴ．ｒｕｂｒｕｍの阻害効果を示す棒グラフである。
【図１０】ペプチド３及び４のＴ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅに対する効果を示す棒グラフである。
【図１１】Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅの生育に対する酢酸の効果を示す棒グラフである。
【図１２】Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅの生育に対するポリリジンの効果を示す棒グラフである。
【図１３】Ｔ．ｒｕｂｒｕｍの生育に対するポリリジン及びポリアルギニンの効果を示す棒グラフである。
【図１４】Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ及びＴ．ｒｕｂｒｕｍに対するポリ−Ｌ−アルギニンの阻害効果を示す棒グラフである。
【図１５】Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ及びＴ．ｒｕｂｒｕｍに対する低い濃度のポリアルギニンの効果を示す棒グラフである。
【図１６】Ｔ．ｒｕｂｒｕｍの生育に対する三量体の効果を示す棒グラフである。
【図１７】Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅの生育に対するペプチド４及びＮａＣｌの効果を示す棒グラフである。
【図１８】塩濃度の増加におけるペプチド４のＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓへの効果を示す棒グラフである。
【図１９】Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの生存に対するポリリジン及びポリアルギニンの効果を示す棒グラフである。
【図２０−１】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−２】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−３】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−４】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−５】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−６】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−７】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−８】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−９】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−１０】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−１１】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−１２】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−１３】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−１４】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−１５】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−１６】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−１７】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−１８】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−１９】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−２０】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−２１】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−２２】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−２３】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−２４】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−２５】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−２６】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−２７】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−２８】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−２９】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−３０】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−３１】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−３２】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２０−３３】本発明のペプチドにより治療可能なヒトの細菌、真菌、寄生虫及びエンベロープ型ウイルス病原体のリストである。
【図２１】結果及び図に示されるアミノ酸ポリマーコードに対応するペプチドの詳細である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２０−６】
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【図２０−７】
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【図２０−８】
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【図２０−９】
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【図２０−１０】
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【図２０−１１】
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【図２０−１２】
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【図２０−１３】
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【図２０−１４】
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【図２０−１５】
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【図２０−１６】
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【図２０−１７】
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【図２０−１８】
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【図２０−１９】
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【図２０−２０】
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【図２０−２１】
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【図２０−２２】
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【図２０−２３】
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【図２０−２４】
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【図２０−２５】
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【図２０−２６】
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【図２０−２７】
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【図２０−２８】
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【図２０−２９】
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【図２０−３０】
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【図２０−３１】
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【図２０−３２】
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【図２０−３３】
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【図２１】
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【配列表】
2008509980000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月2日(2007.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
（（Ｘ）ｌ（Ｙ）ｍ）ｎ        （Ｉ）
（式中、ｌ及びｍは、０から１０の整数であり、ｎは１から１０の整数であり、Ｘ及びＹは、同一でも異なっていてもよく、疎水性アミノ酸及び／又はカチオン性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である）
で表されるアミノ酸を含むペプチド、その変異体、又はその製薬的に許容されうる塩から選択される、医薬として使用するための化合物。
【請求項２】
Ｘ及びＹが、オルニチン、ヒスチジン、アルギニン及びリジンからなるカチオン性アミノ酸の群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ及びＹが、アルギニン及びリジンから選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ及びＹが同一である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ及びＹがアルギニンである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ペプチドが３から２００のアミノ酸を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
ペプチドが３から１００のアミノ酸を含む、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
ペプチドが３から５０のアミノ酸を含む、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
ペプチドが３から１５のアミノ酸を含む、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
ペプチドが３から７のアミノ酸を含む、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
医薬的に有効な量の請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物、及び製薬的に許容されうる担体、賦形剤又は希釈剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物を含む、細菌感染の治療のための医薬。
【請求項１３】
細菌感染が、細菌、寄生虫、原虫、ウイルス又は真菌性病原によって生じる、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
細菌性病原が、Staphylococcus spp.；Enterococcus spp.；Streptococcus pyogenes；Listeria spp.；Pseudomonas spp.；Mycobacterium spp.；Enterobacter spp.；Campylobacter spp.；Salmonella spp.；Streptococcus spp.；Helicobacter spp.；Neisseria spp.；Borrelia burgdorferi；Shigella spp.；Escherichia coli；Haemophilus spp.；Chlamydia spp.；Francisella tularensis；Bacillus spp.；Clostridia spp.；Yersinia spp.；Treponema spp.； Burkholderia spp.からなる群から選択される細菌種からのものである、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
真菌性病原が、属Candida spp.；Epidermophyton spp.；Exophiala spp.；Microsporum spp.；Trichophyton spp.；Tinea spp.；Aspergillus spp.；Blastomyces spp.；Blastoschizomyces spp.；Coccidioides spp.；Cryptococcus spp.；Histoplasma spp.；Paracoccidiomyces spp.；Sporotrix spp.；Absidia spp.；Cladophialophora spp.；Fonsecaea spp.；Phialophora spp.；Lacazia spp.；Arthrographis spp.；Acremonium spp.；Actinomadura spp.；Apophysomyces spp.；Emmonsia spp.；Basidiobolus spp.；Beauveria spp.；Chrysosporium spp.；Conidiobolus spp.；Cunninghamella spp.；Fusarium spp.；Geotrichum spp.；Graphium spp.；Leptosphaeria spp.；Malassezia spp.；Mucor spp.；Neotestudina spp.；Nocardia spp.；Nocardiopsis spp.；Paecilomyces spp.；Phoma spp.；Piedraia spp.；Pneumocystis spp.；Pseudallescheria spp.；Pyrenochaeta spp.；Rhizomucor spp.；Rhizopus spp.；Rhodotorula spp.；Saccharomyces spp.；Scedosporium spp.；Scopulariopsis spp.；Sporobolomyces spp.；Syncephalastrum spp.；Trichoderma spp.；Trichosporon spp.；Ulocladium spp.；Ustilago spp.；Verticillium spp.；及びWangiella sppからなる群から選択される真菌性病原から誘導される、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１６】
病原が、属Trichophyton spp.である、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
病原が、Trichophyton interdigitaleである、請求項１６に記載の医薬。
【請求項１８】
病原が、Trichophyton rubrumである、請求項１６に記載の医薬。
【請求項１９】
真菌感染が、爪甲真菌症である、請求項１２に記載の医薬。
【請求項２０】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物を含む、粘膜感染の治療のための医薬。
【請求項２１】
感染が、嚢胞性線維症である、請求項２０に記載の医薬。
【請求項２２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物が接着又は適用された基体を含んでなる創傷被覆材。
【請求項２３】
基体が織物又はコラーゲン材料を含む、請求項２２に記載の創傷被覆材。
【請求項２４】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物を含む、創傷の治療のための医薬。
【請求項２５】
創傷が切り傷又は火傷である、請求項２４に記載の医薬。
【請求項２６】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物を含む、潰瘍の治療のための医薬。
【国際調査報告】
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