(57)【要約】  本発明は、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨポリペプチド、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨペプチド、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ又はイヌ科動物の成熟ＧＨＲＨをコードしている単離したポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、脊椎動物、特にイヌにおいて、遺伝子治療によって疾患及び成長ホルモン欠損症を処置するために使用することができる、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ又はイヌ科動物のＧＨＲＨをコードしており且つそれを発現するベクターも包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列を有するアミノ酸残基から本質的になる、単離したイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２の配列を有するアミノ酸残基から本質的になる、単離したイヌ科動物の成熟ＧＨＲＨペプチド。
【請求項３】
配列番号３の配列を有するイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨから本質的になる、単離したポリヌクレオチド、又はそれに完全に相補的なアンチセンス鎖。
【請求項４】
配列番号４の配列を有するイヌ科動物の成熟ＧＨＲＨから本質的になる、単離したポリヌクレオチド、又はそれに完全に相補的なアンチセンス鎖。
【請求項５】
ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である、請求項３又は４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドがＲＮＡ分子である、請求項３又は４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨをコードしており、配列番号３のヌクレオチド塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨをコードしており、配列番号４のヌクレオチド塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
ヌクレオチド塩基配列がエンハンサー及び／又はプロモーターに作動可能に連結している、請求項７又は８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載のベクター及び製薬上又は獣医学上許容される担体、ビヒクル又は賦形剤を含む、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨを細胞中に送達して発現させるための配合物。
【請求項１１】
請求項８に記載のベクター及び製薬上又は獣医学上許容される担体、ビヒクル又は賦形剤を含む、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨを細胞中に送達して発現させるための配合物。
【請求項１２】
担体、ビヒクル又は賦形剤が形質移入を促進する及び／又はベクター若しくはタンパク質の保存性を向上させる、請求項１０又は１１に記載の配合物。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載の配合物を脊椎動物に注射することを含む、ＧＨＲＨを脊椎動物に送達する方法。
【請求項１４】
脊椎動物がイヌである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１０又は１１に記載の配合物を有効量で脊椎動物の細胞に投与し、細胞中でＧＨＲＨを発現させることを含む、脊椎動物において貧血、骨折治癒、悪液質、肥満症、骨粗鬆症又は創傷治癒を処置する方法。
【請求項１６】
脊椎動物がイヌである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１０又は１１に記載の配合物を有効量で脊椎動物の細胞に投与し、細胞中でＧＨＲＨを発現させることを含む、脊椎動物において免疫応答を刺激する方法。
【請求項１８】
脊椎動物がイヌである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、「CANINE GHRH GENE, POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE」と題された、２００３年５月１日出願の米国仮特許出願第６０／４６７，４０５号の優先権を主張する。前述の出願、並びにそれ中に又はそれを遂行する間に引用されたすべての文書（「出願に引用された文書」）及び出願に引用された文書中で引用又は参照されたすべての文書、並びに本明細書中で引用又は参照したすべての文書（「本明細書中で引用した文書」）、並びに本明細書中で引用した文書中で引用又は参照されたすべての文書と共に、本明細書中又は本明細書中に参照により援用されている任意の文献中で言及したすべての製品のすべての製造者の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品情報シートが、本明細書中に参照により援用されており、本発明の実行に用い得る。
【０００２】
本発明は、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨポリペプチド、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨペプチド、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ又はイヌ科動物の成熟ＧＨＲＨをコードしている単離したポリヌクレオチドに関する。
【０００３】
一実施形態では、本発明は、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ又はイヌ科動物のＧＨＲＨをコードしており且つそれを発現するベクターに関する。このようなベクターは、脊椎動物、特にイヌにおいて、遺伝子治療によって疾患及び成長ホルモン欠損症を処置するために使用することができる。
【０００４】
別の実施形態では、本発明は、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ又はイヌ科動物のＧＨＲＨをｉｎ  ｖｉｖｏで発現するベクターを動物宿主に注射することを含む、ペプチドＧＨＲＨを脊椎動物、特にイヌに送達する方法に関する。
【０００５】
本発明は、脊椎動物、特にイヌにおける貧血、悪液質、創傷治癒、骨折治癒、骨粗鬆症、肥満症を処置する方法にも関する。
【背景技術】
【０００６】
成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）とは、下垂体前葉による成長ホルモン（ＧＨ）の合成及び分泌を制御するために重要な役割を果たす視床下部ペプチドである。ヒトＧＨＲＨは、Ｃ末端がアミド化された４４個のアミノ酸のペプチドである。対照的に、ラットＧＨＲＨは長さが４３個のアミノ酸のアミド化されていないペプチドであり、ヒトＧＨＲＨと６７％しか相同性がない。ＧＨＲＨは、Ｃ末端領域におけるシグナルペプチドの除去及びタンパク質分解的切断によって成熟ＧＨＲＨへとプロセッシングされる前駆体（プリプロＧＨＲＨ）から派生することが確立されている。前駆体のアミノ酸配列は、２つの可能性のあるスプライシング−アクセプター部位の示差的な使用法に応じて１０７個又は１０８個の残基を含む。
【０００７】
ヒトとラットＧＨＲＨの遺伝子は、４個のイントロンによって隔てられた５個の小さなエクソンを含み、ゲノムＤＮＡ上で１０キロを超える塩基にわたるが、イントロンの位置及び大きさが異なる。
【０００８】
特許出願ＥＰ１０５２２８６号は、ゲノムライブラリからイヌ科動物のＧＨＲＨ遺伝子をクローニングする非特異的な方法を例示しているが、その説明には遺伝子のヌクレオチド配列が開示されておらず、どのようにイントロンを除去し、どのようにエクソン配列を構築して完全なコード配列を得るかについての指導もまったく提供されていない。
【０００９】
家畜では、ＧＨＲＨは、主に除脂肪体重の増加によって、乳の組成を変化させずに乳汁分泌を促進し、乳変換への供給を増加させ、成長を維持する。ＧＨの分泌を刺激することにより、ＧＨＲＨは動物において免疫機能を亢進する。ＧＨＲＨは、成長ホルモン産生異常による癌などの慢性疾患における悪液質の処置（Bartlett et al Cancer 1994, 73, 1499-1504及びSurgery 1995, 117, 260-267）、創傷治癒、骨折治癒、老化過程の遅延、骨粗鬆症及び貧血（Sohmiya et al J. Endocrinol. Invest. 2000, 23, 31-36及びClin. Endocrinl. 2001, 55, 749-754）において、治療上の大きな有用性を有する。
【特許文献１】特許出願ＥＰ１０５２２８６号
【非特許文献１】Bartlett et al Cancer 1994, 73, 1499-1504
【非特許文献２】Surgery 1995, 117, 260-267
【非特許文献３】Sohmiya et al J. Endocrinol. Invest. 2000, 23, 31-36
【非特許文献４】Clin. Endocrinl. 2001, 55, 749-754
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
研究により、ＧＨの産生及び分泌を刺激するためには比較的少量のＧＨＲＨしか必要ないことが示されている。しかし、異なる動物種由来の異種ＧＨＲＨを用いることにより、ＧＨの放出に対してより弱い刺激がもたらされ得る。また、異種ＧＨＲＨペプチドの治療上の投与により、宿主において抗体応答が誘発され得る。イヌ科動物のＧＨＲＨをコードしているＤＮＡは本発明以前に知られておらず、イヌ又は他の動物種を処置するのに十分な量でイヌ科動物のＧＨＲＨを利用可能にする必要性があった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本出願中で文書を引用又は特定した場合はいずれも、このような文献が本発明の従来技術として利用可能であることの承認ではない。
【００１２】
本発明は部分的に、本出願者らによる、新規のイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ及びイヌ科動物の成熟ＧＨＲＨポリヌクレオチド並びにポリペプチド配列の同定に基づいている。
【００１３】
本発明は、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨポリペプチド、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨペプチド及びイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ又はイヌ科動物の成熟ＧＨＲＨをコードしている単離したポリヌクレオチドに関する。有利な実施形態では、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨポリペプチドは、本質的に配列番号１のアミノ酸残基からなる。別の有利な実施形態では、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨペプチドは、本質的に配列番号２のアミノ酸残基からなる。
【００１４】
本発明はまた、配列番号３の配列を有するイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨから本質的になる単離したポリヌクレオチド、又はそれに完全に相補的なアンチセンス鎖、並びに配列番号４の配列を有するイヌ科動物の成熟ＧＨＲＨから本質的になる単離したポリヌクレオチド、又はそれに完全に相補的なアンチセンス鎖も包含する。ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡ分子であることができる。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ又はイヌ科動物のＧＨＲＨをコードしており且つそれを発現するベクターに関する。このようなベクターは、脊椎動物において、遺伝子治療によって疾患及び成長ホルモン欠損症を処置するために使用することができる。有利な実施形態では、発現ベクターは、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨをコードしており、配列番号３のヌクレオチド塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。別の有利な実施形態では、発現ベクターは、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨをコードしており、配列番号４のヌクレオチド塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。有利な実施形態では、ヌクレオチド塩基配列は、プロモーター及び任意選択でエンハンサーに作動可能に連結している。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ又はイヌ科動物のＧＨＲＨをｉｎ  ｖｉｖｏで発現するベクターを動物宿主に注射することを含む、ペプチドＧＨＲＨを脊椎動物、特にイヌに送達する方法に関する。有利な実施形態では、動物宿主はイヌである。有利な実施形態では、イヌ科動物のＧＨＲＨ又はイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨを発現するベクターと、製薬上又は獣医学上許容される担体又はビヒクル、或いは細胞中でのイヌ科動物のＧＨＲＨ若しくはイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨの送達及び発現を促進する又はベクターの安定性を向上させる賦形剤とを含む配合物。有利には、送達は動物、有利には脊椎動物、より有利にはイヌに、ｉｎ  ｖｉｖｏで行う。より有利な実施形態では、配合物中のベクターは、本質的に配列番号３からなるイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ配列又は本質的に配列番号４からなるイヌ科動物の成熟ＧＨＲＨ配列を含む。
【００１７】
本発明はまた、ＧＨＲＨ配合物を動物に注射することを含む、動物、有利には脊椎動物、より有利にはイヌにＧＨＲＨを送達する方法を提供する。有利な実施形態では、配合物は、イヌ科動物のＧＨＲＨを発現するベクターと製薬上又は獣医学上許容される担体若しくはビヒクル又は賦形剤とを含む。
【００１８】
本発明はまた、脊椎動物において貧血、悪液質、創傷治癒、骨折治癒、骨粗鬆症及び肥満症を処置する方法に関する。本発明はまた、脊椎動物の免疫応答を刺激する方法に関する。
【００１９】
本開示及び特に特許請求の範囲及び／又は段落中では、「含む」、「含んだ」、「含んでいる」などの用語は、米国特許法でそれらに帰するとされた意味を有することができることを留意されたい。例えば、これらは「含む」、「含まれた」、「含めた」などを意味することができ、「本質的に〜からなる」及び「から本質的になる」などの用語は、米国特許法でそれらに帰するとされた意味をもつ。例えば、これらは明白に列挙していない要素を許容するが、従来技術に見つかる要素又は本発明の基本的な若しくは新規の特徴に影響を与える要素を排除する。本明細書中で使用する「一貫して本質的に」とは、明白に非イヌ科動物のＧＨＲＨ配列を排除する意味をもつ。
【００２０】
これら及び他の実施形態は、以下の詳細な説明に開示されている又はそれから明らかであり、またそれに包含されている。
【００２１】
例として示すが、本発明を記載した具体的な実施例だけに限定することを意図しない以下の詳細な説明は、添付の図面と併せることで最もよく理解され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は部分的に、本出願者らによる、新規のイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ及びイヌ科動物の成熟ＧＨＲＨポリヌクレオチド並びにポリペプチド配列の同定に基づいている。本発明以前に、マウス、ラット、ブタ及びウシなどの様々な動物種由来の利用可能なＧＨＲＨペプチド及びコード配列が存在していた。イヌに異種ＧＨＲＨを用いることにより、ＧＨの放出に対してより弱い刺激がもたらされ、繰り返して注射したあとに宿主において抗体応答が誘発され得る。イヌ科動物のＧＨＲＨをコードしているＤＮＡは本発明以前に知られておらず、イヌを処置するのに十分な量でイヌ科動物のＧＨＲＨを利用可能にする必要性があった。
【００２３】
本発明は、以下のアミノ酸配列を有するイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨポリペプチドに関する：H-MPLWVFFLVILTLSSGSHSSPPSLPIRIPRYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNREQGAKVRLGRQVDSLWASQKQMALENILASLLQKRRNSQG-OH（配列番号１）。ペプチドシグナル（プレペプチド）配列はＭｅｔ（１）からＳｅｒ（２０）にわたる。Ｓｅｒ（１９）の後ろでシグナルペプチドの切断も起こることができる。括弧内の数字はプリプロＧＨＲＨ配列中のアミノ酸の位置を意味する。Ｈ−Ｍ及びＧ−ＯＨは、プリプロペプチドのＮ末端でのＭｅｔアミノ酸及びカルボキシ末端でのＧｌｙアミノ酸が修飾されていないことを意味する。ｐｒｅＧＨＲＨペプチドの切断後、Ａｒｇ（３０）の後ろ及びＬｅｕ（７４）の後ろでプロＧＨＲＨペプチドが切断され、成熟ＧＨＲＨペプチドがもたらされる。
【００２４】
イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨポリペプチドの変異体は、位置２のアミノ酸Ｐｒｏがアミノ酸Ｌｅｕによって置換されている。
【００２５】
本発明はまた、以下のアミノ酸配列を有するイヌ科動物の成熟ＧＨＲＨペプチドに関する：R1-YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNREQGAKVRL-R2（配列番号２）（Ｒ１は水素又はＨ−Ｍｅｔであり、Ｒ２はＯＨ又はＮＨ２である）。Ｎ末端でのＨ−Ｍｅｔ又はＨ−Ｙは、メチオニン又はチロシンが修飾されていないことを意味する。成熟ペプチドのカルボキシ末端でのＬ−ＯＨ又はＬ−ＮＨ２は、ロイシンアミノ酸が修飾されていないかアミド化されているかのどちらかであることを意味する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、安定性が向上したイヌ科動物の成熟ＧＨＲＨの類似体を含む。この類似体は、Ｔｙｒ（１）からＨｉｓ（１）、Ａｌａ（２）からＶａｌ（２）、Ｇｌｙ（１５）からＡｌａ（１５）、Ｍｅｔ（２７）からＬｅｕ（２７）又はＳｅｒ（２８）からＡｓｎ（２８）からなる群から選択された、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。括弧内の数字は成熟ＧＨＲＨ配列中のアミノ酸の位置を意味する。これらのアミノ酸置換はイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨポリペプチド内に導入することができる。当業者には、このような特異的アミノ酸置換を行うことは日常的な実験である。例えばそれだけには限定されないが、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨポリヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発を実施して、上述アミノ酸置換のうち１つ又は複数を有するイヌ科動物の成熟ＧＨＲＨペプチドの突然変異体を得ることができる。当分野で知られている方法を用いて遺伝子も化学合成することができる。
【００２７】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「ポリペプチド断片」は、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーをいうために、本明細書中で互換性があるように使用される。ポリマーは、直鎖状又は分枝鎖状であることができ、修飾アミノ酸又はアミノ酸の類似体を含んでいてよく、アミノ酸以外の化学基（chemical moiety）によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然に又は介入することによって、例えばジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識化成分や生物活性成分との結合など任意の他の操作若しくは修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
【００２８】
本発明は、以下の配列及び断片を有する、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨをコードしている単離したポリヌクレオチドを包含する：5'-ATGCCACTCTGGGTGTTCTTCCTGGTGATCCTCACCCTCAGCAGTGGCTCCCACTCTTCCCCGCCATCCCTGCCCATCAGAATCCCTCGGTATGCAGACGCCATCTTCACCAACAGCTACCGGAAGGTGCTGGGCCAGCTGTCCGCCCGCAAGCTCCTGCAGGACATCATGAGCCGGCAGCAGGGAGAGAGAAACCGGGAGCAAGGAGCAAAGGTACGACTCGGCCGTCAGGTGGACAGTCTGTGGGCAAGCCAAAAGCAGATGGCATTGGAGAACATCCTGGCATCCCTGTTACAGAAACGCAGGAACTCCCAAGGATGA-3'（配列番号３）。
【００２９】
本発明はまた、位置５及び６のヌクレオチドＣ及びＡがそれぞれＴ及びＧによって置換されている、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨをコードしているポリヌクレオチドの変異体を提供する。
【００３０】
本発明はまた、以下の配列を有する、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨをコードしている単離したポリヌクレオチドを含む：5'-TATGCAGACGCCATCTTCACCAACAGCTACCGGAAGGTGCTGGGCCAGCTGTCCGCCCGCAAGCTCCTGCAGGACATCATGAGCCGGCAGCAGGGAGAGAGAAACCGGGAGCAAGGAGCAAAGGTACGACTC-3'（配列番号４）。
【００３１】
「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さのヌクレオチドの高分子形態であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び類似体を任意の組合せで含む。ポリヌクレオチドは三次元構造を有していてよく、既知又は未知の任意の機能を行ってよい。用語「ポリヌクレオチド」には二本鎖、一本鎖、及び三重らせん分子が含まれる。別段に指定しない又は必要としない限りは、ポリヌクレオチドである本明細書中に記載の本発明の任意の実施形態は、二本鎖の形態、及びＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはハイブリッド分子のいずれかの二本鎖の形態を構成することが知られている又は予想されている２つの相補的な形態のそれぞれを包含する。
【００３２】
ポリヌクレオチドの非限定的な例は、遺伝子又は遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離したＤＮＡ、任意の配列の単離したＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーである。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチドの類似体などの修飾されたヌクレオチド、ウラシル（ｕｒａｃｙｌ）、フルオロリボースやチオレートなどの他の糖及び結合基、並びにヌクレオチド分枝を含み得る。ヌクレオチドの配列は重合後に、標識化成分を用いたコンジュゲーションなどによってさらに修飾されてもよい。この定義に含まれる他の種類の修飾は、ｃａｐ、１つ又は複数の天然に存在するヌクレオチドを類似体で置換すること、及びポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識化成分、他のポリヌクレオチド又は固体担体に結合させる手段の導入である。
【００３３】
「単離した」ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは、それがそのネイティブ環境中で付随している物質を実質的に含まないものをいう。実質的に含まないとは、これらの物質を少なくとも５０％、有利には少なくとも７０％、より有利には少なくとも８０％、さらにより有利には少なくとも９０％含まないことをいう。
【００３４】
本発明は、ＧＨＲＨポリヌクレオチドの相補鎖をさらに含む。
【００３５】
相補鎖は任意の長さの高分子であることができ、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び類似体を任意の組合せで含むことができる。
【００３６】
ハイブリダイゼーション反応は、様々な「ストリンジェンシー」条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は周知である。例えば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al. 1989)を参照されたい。関連する条件の例には（ストリンジェンシーが低い順で）以下が含まれる：インキュベーション温度は２５℃、３７℃、５０℃、及び６８℃；緩衝液の濃度は１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌと１５ｍＭのクエン酸緩衝液である）及び他の緩衝液系を用いたそれと等価な濃度；ホルムアミドの濃度は０％、２５％、５０％、及び７５％；インキュベーション時間は５分間〜２４時間；１、２又は複数回の洗浄ステップ；洗浄インキュベーション時間は１、２、又は１５分間；並びに洗浄液は６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、又は脱イオン水。
【００３７】
本発明は、イヌ科動物のＧＨＲＨポリペプチドの機能的に等価な変異体及び誘導体並びに機能的に等価なその断片をコードしているポリヌクレオチドをさらに包含し、これは、それがコードしているポリペプチドの特性を増強させるか、低下させるか、又は有意に影響を与えない場合がある。これらの機能的に等価な変異体、誘導体、及び断片は、イヌ科動物のＧＨＲＨの活性を保持する能力を示す。例えば、コードされているアミノ酸配列に変化を与えないＤＮＡ配列の変化、並びにアミノ酸残基の保存的置換、１つ若しくはいくつかのアミノ酸の欠失又は付加、及びアミノ酸の類似体によるアミノ酸残基の置換をもたらすＤＮＡ配列の変化は、コードされているポリペプチドの特性に有意に影響を与えない変化である。保存的アミノ酸置換は、グリシン／アラニン、バリン／イソロイシン／ロイシン、アスパラギン／グルタミン、アスパラギン酸／グルタミン酸、セリン／スレオニン／メチオニン、リシン／アルギニン、及びフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、配列番号１に対して少なくとも少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性又は同一性を有する、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨポリペプチドの変異体を含む。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２に対して少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、又は少なくとも９９％の相同性又は同一性を有する、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨポリペプチドの変異体を含む。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、配列番号３に対して少なくとも８６．５％、少なくとも８７％、少なくとも８７．５％、少なくとも８８％、少なくとも８８．５％、少なくとも８９％、少なくとも８９．５％、少なくとも９０％、少なくとも９０．５％、少なくとも９１％、少なくとも９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも９２．５％、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％、少なくとも９４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の相同性又は同一性を有する、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨをコードしているポリヌクレオチドの変異体を含む。本発明は、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨの類似体をコードしているポリヌクレオチドも包含する。有利な実施形態では、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨの類似体は、配列番号１に対して少なくとも８６．５％、少なくとも８７％、少なくとも８７．５％、少なくとも８８％、少なくとも８８．５％、少なくとも８９％、少なくとも８９．５％、少なくとも９０％、少なくとも９０．５％、少なくとも９１％、少なくとも９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも９２．５％、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％、少なくとも９４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％少なくとも９８．５％、又は少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の相同性又は同一性を有する。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、配列番号４に対して９０．５％、少なくとも９１％、少なくとも９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも９２．５％、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％、少なくとも９４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の相同性又は同一性を有する、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨをコードしているポリヌクレオチドの変異体を含む。本発明は、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨの類似体をコードしているポリヌクレオチドも包含する。有利な実施形態では、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨの類似体は、配列番号２に対して９７．５％、少なくとも９８％少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の相同性又は同一性を有する。
【００４２】
本発明の目的のために、配列の同一性又は相同性は、重なり及び同一性が最大となる一方で配列ギャップが最小限となるようにアラインメントを行った場合の配列を比較することによって決定される。具体的には、いくつかの数学アルゴリズムのうち任意のものを用いて配列同一性を決定し得る。２つの配列を比較するために用いる数学アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 5873-5877に記載のように修正したKarlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2264-2268のアルゴリズムである。
【００４３】
配列の比較に用いる数学アルゴリズムの別の例は、Myers & Miller, CABIOS 1988; 4: 11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムであるＰＡＭ１２０重量残基表を利用する場合は、ギャップ長ペナルティは１２を、及びギャップペナルティは４を用いることができる。局所的な配列類似性領域及びアラインメントを同定するためのさらに別の有用なアルゴリズムは、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 2444-2448に記載のＦＡＳＴＡアルゴリズムである。
【００４４】
本発明による使用が有利であるのはＷＵ−ＢＬＡＳＴ（ワシントン大学のＢＬＡＳＴ）バージョン２．０ソフトウェアである。いくつかのＵＮＩＸプラットフォーム用のＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン２．０の実行可能なプログラムは、ｆｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓからダウンロードすることができる。このプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づいており、これは同様にパブリックドメインＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づいている（すべて本明細書中に参考として組み込まれているAltschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480；Altschul et al Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403-410；Gish & States, 1993; Nature Genetics 3: 266-272；Karlin & Altschul, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877）。
【００４５】
一般に、アミノ酸配列の比較は既知の構造のポリペプチドのアミノ酸配列と未知の構造のポリペプチドのアミノ酸配列とのアラインメントを行うことによって達成する。その後、配列中のアミノ酸を比較し、相同性のあるアミノ酸のグループをグループ化する。この方法によりポリペプチドの保存領域が検出され、アミノ酸の挿入及び欠失が説明される。アミノ酸配列間の相同性は、市販されているアルゴリズムを用いて決定することができる（上記の相同性の説明も参照）。本明細書中他の箇所で言及したものに加えて、米バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ（gapped BLAST）、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴのプログラムにも言及する。これらのプログラムはこの目的のために当分野において幅広く使用されており、２つのアミノ酸配列の相同領域のアラインメントを行うことができる。
【００４６】
プログラムの組の中のすべての検索プログラムのうち、ギャップアラインメントルーチンがデータベース検索自体に不可欠である。所望する場合はギャッピングをオフにすることができる。長さ１のギャップのペナルティ（Ｑ）の初期設定は、タンパク質及びＢＬＡＳＴＰではＱ＝９であり、ＢＬＡＳＴＮではＱ＝１０であるが、任意の整数に変更し得る。ギャップを伸長するための１残基あたりのペナルティ（Ｒ）の初期設定は、タンパク質及びＢＬＡＳＴＰではＲ＝２であり、ＢＬＡＳＴＮではＲ＝１０であるが、任意の整数に変更し得る。重なり及び同一性が最大となる一方で配列ギャップが最小限となるように配列のアラインメントを行うために、Ｑ及びＲの値の任意の組合せを用いることができる。アミノ酸比較マトリックスの初期設定はＢＬＯＳＵＭ６２であるが、ＰＡＭなどの他のアミノ酸比較マトリックスを利用することができる。
【００４７】
或いは又はそれに加えて、例えばヌクレオチド又はアミノ酸配列に関して、用語「相同性」又は「同一性」とは、２つの配列間の相同性の定量的測度を示すことができる。パーセント配列相同性は、（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）＊１００／Ｎｒｅｆ（式中、Ｎｄｉｆはアラインメントを行った際の２つの配列中の同一でない残基の合計数であり、Ｎｒｅｆは一方の配列中の残異数である）として計算することができる。したがって、ＤＮＡ配列AGTCAGTCは配列AATCAATCと７５％の配列同一性を有する（Ｎｒｅｆ＝８；Ｎｄｉｆ＝２）。
【００４８】
或いは又はそれに加えて、配列に関して、「相同性」又は「同一性」とは、同一のヌクレオチド又はアミノ酸を有する位置の数を２つの配列のうち短い方のヌクレオチド又はアミノ酸の数で割算したものをいうことができ、ここで、２つの配列のアラインメントはＷｉｌｂｕｒ及びＬｉｐｍａｎのアルゴリズム（本明細書中に参照により援用されているWilbur & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80: 726）に従って、例えばウィンドウサイズは２０個のヌクレオチド、ワード長は４個のヌクレオチド、及びギャップペナルティは４を用いて決定することができ、アラインメントを含めた配列データのコンピュータ支援解析及び解釈は市販されているプログラム（例えばIntelligenetics（商標）Suite、Intelligenetics Inc.カリフォルニア州）を用いて便利に行うことができる。ＲＮＡ配列が類似していると考えられる場合、又はＤＮＡ配列と一定割合の配列の同一性若しくは相同性を有する場合は、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等価と見なされている。したがって、ＲＮＡ配列は本発明の範囲内にあり、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）をＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等価と見なすことによって、ＤＮＡ配列に由来することができる。
【００４９】
さらに、必要以上の実験を行わずに、当業者は、パーセント相同性を決定するために多くの他のプログラム又は参考文献を調べることができる。
【００５０】
本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクター内に含まれており、且つプロモーター要素及び任意選択でエンハンサーに作動可能に連結しているイヌ科動物のＧＨＲＨポリヌクレオチドを包含する。
【００５１】
有利な実施形態では、プロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子のプロモーターである。別の有利な実施形態では、プロモーター及び／又はエンハンサー要素は酸素誘導性である。本発明の方法で用いることができる酸素誘導性プロモーター及び／又はエンハンサーの例には、それだけには限定されないが、初期成長応答−１（Ｅｇｒ１）プロモーター（例えばPark et al., J Clin Invest. 2002 Aug; 110 (3): 403-1参照）、低酸素症誘導性因子（ＨＩＦ）誘導エンハンサー（例えばCuevas et al., Cancer Res. 2003 Oct 15; 63 (20): 6877-84参照）及びＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｍｎ−ＳＯＤ）プロモーター（例えばGao et al., Gene. 1996 Oct 17; 176 (1-2): 269-70参照）が含まれる。
【００５２】
別の実施形態では、エンハンサー並びに／又はプロモーターには、様々な細胞又は組織に特異的なプロモーター（例えば、筋肉、内皮細胞、肝臓、体性細胞若しくは幹細胞）、様々なウイルスプロモーター及びエンハンサー並びに各動物種に同質遺伝子的に特異的な様々なＧＨＲＨ  ＤＮＡ配列が含まれる。例えば、イヌ科動物筋肉細胞中でイヌ科動物のＧＨＲＨが発現される場合は、イヌ科動物のＧＨＲＨの発現を最適化するためにエンハンサー及び／又はプロモーターはイヌ科動物筋肉細胞に特異的であることができる。筋肉に特異的なプロモーター及びエンハンサーの例は記載されており、当業者に知られている（例えば、その開示が全体で参考として組み込まれているLi et al., Gene Ther. 1999 Dec; 6 (12): 2005-11；Li et al., Nat Biotechnol. 1999 Mar; 17 (3): 241-5及びLoirat et al., Virology. 1999 Jul 20; 260 (1): 74-83参照）。
【００５３】
本発明で使用し得るプロモーター及びエンハンサーには、それだけには限定されないが、ＬＴＲ又はラウス肉腫ウイルス、ＨＳＶ−１のＴＫ、ＳＶ４０の初期又は後期プロモーター、アデノウイルス主要後期（ＭＬＰ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ、メタロチオネイン、α−１抗トリプシン、アルブミン、コラゲネーゼ（collagenese）、エラスターゼＩ、β−アクチン、β−グロビン、γ−グロビン、α−胎児性タンパク質、筋肉クレアチンキナーゼが含まれる。「ベクター」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのどちらかで標的細胞に送達する異種ポリヌクレオチドを含む組換え、ＤＮＡ若しくはＲＮＡプラスミド又はウイルスをいう。異種ポリヌクレオチドは治療を目的として目的配列を含んでいてよく、任意選択で発現カセットの形態であってよい。本明細書中で使用する場合、ベクターは最終的な標的細胞又は対象中で複製が可能である必要はない。この用語にはクローニングベクターが含まれ、ウイルスベクターも含まれる。
【００５４】
用語「組換え」とは、ポリヌクレオチドが、自然に存在しない、又は自然には見つからない配置で別のポリヌクレオチドに連結している、半合成又は合成起源であることを意味する。
【００５５】
「異種」とは、比較する残りのエンティティとは遺伝的に明確に異なるエンティティ由来であることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドを、遺伝子操作技術によって異なる源由来のプラスミド又はベクター内に配置してもよく、これは異種ポリヌクレオチドである。そのネイティブコード配列から取り出し、ネイティブ配列以外のコード配列に作動可能に連結させたプロモーターは異種プロモーターである。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、同一転写単位内のさらなるコード配列、プロモーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位などの制御要素、同一の又は異なるプロモーターの制御下にあるさらなる転写単位、宿主細胞のクローニング、発現、相同組換え、及び形質転換を可能にする配列、並びに本発明の実施形態を提供するために望ましい場合がある任意のこのような構築体などの、さらなる配列を含み得る。
【００５７】
本発明は、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨ、イヌ科動物のプロＧＨＲＨ或いは変異体若しくは類似体又は断片を発現するベクターを包含する。成熟ＧＨＲＨ又はプロＧＨＲＨでは、ＧＨＲＨを細胞外培地に分泌させるために、ペプチドをコードしているヌクレオチド配列の直前にペプチドシグナルをコードしているフレーム内のヌクレオチド配列が存在することが好ましい。シグナル配列は、プリプロＧＨＲＨ由来の天然配列であるか、又は分泌されたタンパク質由来のペプチドシグナル、例えば組織プラスミノーゲンアクチベータータンパク質（ｔＰＡ）、特にヒトｔＰＡ由来のシグナルペプチドであることができる（S. Friezner Degen et al J. Biol. Chem. 1996, 261, 6972-6985；R. Rickles et al J. Biol. Chem. 1988, 263, 1563-1569；D. Berg. et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 179, 1289-1296）。成熟ＧＨＲＨでは、アミド化を得るために、コードポリヌクレオチド配列中のペプチドのＣ末端にＧｌｙ及びＡｒｇを追加することができる。
【００５８】
イヌ科動物のＧＨＲＨの発現のための要素が本発明のベクター中に存在することが有利である。最小限の様式では、これは、開始コドン（ＡＴＧ）、ストップコドン及びプロモーター、並びに任意選択でプラスミドなどの特定のベクター及び特定のウイルスベクター、例えばポックスウイルス以外のウイルスベクターのポリアデニル化配列も含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。ポリヌクレオチドがポリタンパク質断片、例えばイヌ科動物のＧＨＲＨをコードしている場合は、ベクター中においてＡＴＧが読み枠の５’に配置され、ストップコドンが３’に配置されることが有利である。エンハンサー配列、イントロンなどの安定化配列、及びタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列などの、発現を制御するための要素が存在していてもよい。
【００５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのどちらかで本発明の遺伝子の遺伝子産物を発現させるためにベクター若しくは組換え体若しくはプラスミドを作製及び／又は投与する方法は、任意の所望する方法、例えば：米国特許第４，６０３，１１２号；同第４，７６９，３３０号；同第４，３９４，４４８号；同第４，７２２，８４８号；同第４，７４５，０５１号；同第４，７６９，３３１号；同第４，９４５，０５０号；同第５，４９４，８０７号；同第５，５１４，３７５号；同第５，７４４，１４０号；同第５，７４４，１４１号；同第５，７５６，１０３号；同第５，７６２，９３８号；同第５，７６６，５９９号；同第５，９９０，０９１号；同第５，１７４，９９３号；同第５，５０５，９４１号；同第５，３３８，６８３号；同第５，４９４，８０７号；同第５，５９１，６３９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，６７７，１７８号；同第５，５９１，４３９号；同第５，５５２，１４３号；同第５，５８０，８５９号；同第６，１３０，０６６号；同第６，００４，７７７号；同第６，１３０，０６６号；同第６，４９７，８８３号；同第６，４６４，９８４号；同第６，４５１，７７０号；同第６，３９１，３１４号；同第６，３８７，３７６号；同第６，３７６，４７３号；同第６，３６８，６０３号；同第６，３４８，１９６号；同第６，３０６，４００号；同第６，２２８，８４６号；同第６，２２１，３６２号；同第６，２１７，８８３号；同第６，２０７，１６６号；同第６，２０７，１６５号；同第６，１５９，４７７号；同第６，１５３，１９９号；同第６，０９０，３９３号；同第６，０７４，６４９号；同第６，０４５，８０３号；同第６，０３３，６７０号；同第６，４８５，７２９号；同第６，１０３，５２６号；同第６，２２４，８８２号；同第６，３１２，６８２号；同第６，３４８，４５０号及び同第６，３１２，６８３号；１９８６年１０月１６日出願の米国特許出願第９２０，１９７号；国際公開公報ＷＯ９０／０１５４３号；国際公開公報ＷＯ９１／１１５２５号；国際公開公報ＷＯ９４／１６７１６号；国際公開公報ＷＯ９６／３９４９１号；国際公開公報ＷＯ９８／３３５１０号；欧州特許ＥＰ２６５７８５号；欧州特許ＥＰ０３７０５７３号；Andreansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11313-11318；Ballay et al., EMBO J. 1993; 4: 3861-65；Felgner et al., J. Biol. Chem. 1994; 269: 2550-2561；Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11371-11377；Graham, Tibtech 1990; 8: 85-87；Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992; 3: 237-52；Ju et al., Diabetologia 1998; 41: 736-739；Kitson et al., J. Virol. 1991; 65: 3068-3075；McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11414-11420；Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11341-11348；Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11349-11353；Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984; 4: 399-406；Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995; 39, "Baculovirus Expression Protocols," Humana Press Inc.；Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983; 3: 2156-2165；Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11334-11340；Robinson et al., Sem. Immunol. 1997; 9: 271；及びRoizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 11307-11312に開示されている方法に従う若しくは類似している方法、又はそれらに引用された文書中に開示されている方法であることができる。したがって、本発明のベクターは、ポックスウイルス���例えば、ワクシニアウイルス、アビポックス（avipox）ウイルス、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、ラクーン痘（raccoonpox）ウイルス、豚痘ウイルスなど）、アデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス、イヌ科動物アデノウイルス）、ヘルペスウイルス（例えばイヌ科動物ヘルペスウイルス）、バキュロウイルス、レトロウイルスなど（本明細書中に参照により援用されている文書に記載）の、任意の適切な組換えウイルス又はウイルスベクターであることができ、又は、ベクターはプラスミドであることができる。本明細書中で引用した文書及び本明細書中に参照により援用されている文書は、本発明の実施に有用なベクターの例を提供することに加えて、本発明の組成物中の、又はそれに含まれるベクター若しくは複数のベクターによって発現される非イヌ科動物のＧＨＲＨペプチド又はその断片の源、例えば、非イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨペプチド、非イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨペプチド、非イヌ科動物のｐｒｅＧＨＲＨペプチド、非イヌ科動物のプロＧＨＲＨペプチド又はその断片、サイトカインなども提供することができる。
【００６０】
本発明はまた、発現ベクターなどのベクターを含む調製物、例えば、治療用組成物に関する。調製物は、ＧＨＲＨポリヌクレオチドのうち１つ若しくは複数を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる（且つ有利にはそれを発現する）１つ若しくは複数のベクター、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ発現ベクターなどの発現ベクターを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。有利には、ベクターは、製薬上又は獣医学上許容される担体、賦形剤又はビヒクル中で、イヌ科動物のＧＨＲＨをコードしているコード領域を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるポリヌクレオチドを含み、且つそれを発現する。したがって、本発明の一実施形態によれば、調製物中の他のベクター若しくは複数のベクターは、コードしているポリヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、妥当な状況下では、ベクターはイヌ科動物のＧＨＲＨの１つ若しくは複数の他のタンパク質又はその断片を発現する。
【００６１】
別の実施形態によれば、調製物中のベクター若しくは複数のベクターは、イヌ科動物のＧＨＲＨの１つ若しくは複数のタンパク質又はその断片（若しくは複数の断片）をコードしているポリヌクレオチド（若しくは複数のポリヌクレオチド）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、ベクター若しくは複数のベクターはポリヌクレオチド（若しくは複数のポリヌクレオチド）を発現する。本発明の調製物は、有利には妥当な条件下若しくは適切な条件下においてｉｎ  ｖｉｖｏで、又は適切な宿主細胞中で、同一のタンパク質及び／又は異なるタンパク質をコードしているが有利には同一のタンパク質をコードしている、様々なイヌ科動物のＧＨＲＨの単離したもの由来のポリヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、且つ有利に発現もしている少なくとも２つのベクターを含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなることが有利である。有利にはｉｎ  ｖｉｖｏで、イヌ科動物のＧＨＲＨペプチド、融合タンパク質又はそのエピトープをコードしているポリヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなり、且つ有利にはそれを発現する１つ若しくは複数のベクターを含む調製物。本発明はまた、様々なＧＨＲＨ、例えば、それだけには限定されないが、イヌに加えてネコ、ウシ、ヤギ、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット及びヒツジなどの様々な種由来のＧＨＲＨのコードを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、且つそれを発現するベクターの混合物にも向けられている。
【００６２】
本発明の一実施形態によれば、発現ベクターはウイルスベクター、具体的にはｉｎ  ｖｉｖｏ発現ベクターである。有利な実施形態では、発現ベクターはアデノウイルスベクターである。有利には、アデノウイルスは、ヒトＡｄ５ベクター、Ｅ１欠失及び／又はＥ３欠失アデノウイルスである。
【００６３】
１つの特定の実施形態では、ウイルスベクターはポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス又は弱毒化ワクシニアウイルス（例えば、ＭＶＡ、即ちニワトリ胚繊維芽細胞上でアンカラ（Ankara）ワクチン株を５７０以上継代したあと得られた改変アンカラ株；Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153；Sutter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851を参照；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５０８として利用可能；又はＮＹＶＡＣ、米国特許第５，４９４，８０７号の例えば実施例１〜６、並びにＮＹＶＡＣの構築、及びコペンハーゲン株ワクシニアウイルスゲノムからさらなるＯＲＦが欠失しているＮＹＶＡＣの変異体、及びこの組換え体の部位内に異種コード核酸分子を挿入すること、及びマッチしたプロモーターの使用について記載している米国特許第５，４９４，８０７号のｅｔ  ｓｅｑを参照；国際公開公報ＷＯ９６／４０２４１号も参照）、アビポックスウイルス又は弱毒化アビポックスウイルス（例えば、カナリア痘、鶏痘、鳩痘（dovepox）、鳩痘（pigeonpox）、鶉痘（quailpox）、ＡＬＶＡＣ若しくはＴＲＯＶＡＣ；例えば米国特許第５，５０５，９４１号、第５，４９４，８０７号参照）、豚痘、ラクーン痘、ラクダ痘、或いは粘液腫症ウイルスである。
【００６４】
本発明の別の実施形態によれば、ポックスウイルスベクターはカナリア痘ウイルス又は鶏痘ウイルスベクター、有利には弱毒化カナリア痘ウイルス又は鶏痘ウイルスである。この観点から、ＡＴＣＣからアクセス番号ＶＲ−１１１の下で利用可能なカナリア痘。弱毒化カナリア痘ウイルスは米国特許第５，７５６，１０３号（ＡＬＶＡＣ）及び国際公開公報ＷＯ０１／０５９３４号に記載されている。数々の鶏痘ウイルスワクチン株、例えばＭＥＲＩＡＬから販売されているＤＩＦＴＯＳＥＣ  ＣＴ株及びＩＮＴＥＲＶＥＴから販売されているＮＯＢＩＬＩＳ  ＶＡＲＩＯＬＥワクチンも利用可能であり、弱毒化鶏痘株ＴＲＯＶＡＣに関する米国特許第５，７６６，５９９号も参照されたい。
【００６５】
それらの組換え体を作製する方法及びそれらの組換え体をどのように投与するかについての情報に関して、当業者は、本明細書中で引用した文書及び国際公開公報ＷＯ９０／１２８８２号を参照することができ、例えば、ワクシニアウイルスについてはとりわけ米国特許第４，７６９，３３０号、第４，７２２，８４８号、第４，６０３，１１２号、第５，１１０，５８７号、第５，４９４，８０７号、及び第５，７６２，９３８号に言及されており、鶏痘についてはとりわけ米国特許第５，１７４，９９３号、第５，５０５，９４１号及び米国特許ＵＳ−５，７６６，５９９号に言及されており、カナリア痘についてはとりわけ米国特許第５，７５６，１０３号に言及されており、豚痘についてはとりわけ米国特許第５，３８２，４２５号に言及されており、ラクーン痘についてはとりわけ国際公開公報ＷＯ００／０３０３０号に言及されている。
【００６６】
発現ベクターがワクシニアウイルスである場合、発現させるポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドの挿入部位又は複数の部位は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子又は挿入部位、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子又は挿入部位、Ａ型の封入体をコードしている領域（ＡＴＩ）であることが有利である。本明細書中で引用した文書、特にワクシニアウイルスに関するものも参照されたい。カナリア痘の場合には、挿入部位又は複数の部位はＯＲＦ（若しくは複数のＯＲＦ）Ｃ３、Ｃ５及び／又はＣ６であることが有利である。本明細書中で引用した文書、特にカナリア痘ウイルスに関するものも参照されたい。鶏痘の場合には、挿入部位又は複数の部位はＯＲＦＦ７及び／又はＦ８であることが有利である。本明細書中で引用した文書、特に鶏痘ウイルスに関するものも参照されたい。ＭＶＡウイルス領域の挿入部位又は複数の部位は、有利には、Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394；Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74 (9), 4236-4243；Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040を含めた様々な出版物に記載のとおりである。この観点から、当業者が他の挿入部位又は他のプロモーターを用いることを可能にする完全なＭＶＡゲノムがAntoine G., Virology, 1998, 244, 365-396に記載されていることにも注目されたい。
【００６７】
有利には、発現させるポリヌクレオチドを特定のポックスウイルスプロモーター、例えばとりわけワクシニアプロモーター７．５ｋＤａ（Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35）、ワクシニアプロモーターＩ３Ｌ（Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434）、ワクシニアプロモーターＨＡ（Shida, Virology, 1986, 150, 451-457）、牛痘プロモーターＡＴＩ（Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47）、ワクシニアプロモーターＨ６（Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508；Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198；Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836）の制御下に挿入する。
【００６８】
特定の実施形態では、ウイルスベクターはヒトアデノウイルス（ＨＡＶ）又はイヌ科動物アデノウイルス（ＣＡＶ）などのアデノウイルスである。
【００６９】
一実施形態では、ウイルスベクターはヒトアデノウイルス、具体的には、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号Ｍ７３２６０の下で開示されており、且つ参照文献J. Chroboczek et al Virol. 1992, 186, 280-285に開示されているｈＡｄ５の配列を参照することによって、ウイルスゲノムのＥ１領域中の具体的にはヌクレオチド４５９付近からヌクレオチド３５１０付近を欠失させることによって複製能力をなくさせた血清型５アデノウイルスである。欠失させたアデノウイルスを、Ｅ１を発現する２９３（F. Graham et al J. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72）又はＰＥＲ細胞、具体的にはＰＥＲ．Ｃ６（F. Falloux et al Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917）中で増殖させる。ヒトアデノウイルスは、Ｅ３領域中の具体的にはヌクレオチド２８５９２付近からヌクレオチド３０４７０付近が欠失していることができる。Ｅ１領域中の欠失は、Ｅ３領域中の欠失と組み合わせて行うことができる（例えば、J. Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335、F. Graham et al Methods in Molecular Biology Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols Edited by E. Murray, The Human Press Inc, 1991, p 109-128；Y. Ilan et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 2587-2592；米国特許ＵＳ６，１３３，０２８号；米国特許ＵＳ６，６９２，９５６号；S. Tripathy et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 11557-11561；B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev. 1993, 12, 185-199；X. Danthinne et al Gene Thrapy 2000, 7, 1707-1714；K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629；K. Berkner et al Nucl. Acid Res. 1983, 11, 6003-6020；C. Chavier et al J. Virol. 1996, 70, 4805-4810参照）。挿入部位は、最終的にＥ１及び／若しくはＥ３領域の部分的又は完全な欠失のあとのＥ１及び／若しくはＥ３座位（領域）であることができる。有利には、発現ベクターがアデノウイルスである場合は、発現させるポリヌクレオチドを、強力なプロモーターなどの真核細胞中で機能するプロモーター、好ましくはサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）、具体的にはM. Boshart et al Cell 1985, 41, 521-530に記載のヌクレオチド−７３４付近からヌクレオチド＋７付近のエンハンサー／プロモーター領域又はPromega Corp.のｐＣＩベクターのエンハンサー／プロモーター領域の制御下に挿入する。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、ネズミ又はヒト由来であることが有利である。伸長因子１αのプロモーターも使用することができる。１つの特定の実施形態では、低酸素症によって調節されるプロモーター、例えばK. Boast et al Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208）に記載のプロモーターＨＲＥを使用することができる。筋肉に特異的なプロモーターも使用することができる（X. Li et al Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245）。強力なプロモーターも、プラスミドベクターに関連して本明細書中に記載されている。一実施形態では、スプライシング配列をエンハンサー／プロモーター領域の下流に配置することができる。例えば、ＣＭＶ−ＩＥ遺伝子から単離したイントロンＩ（R. Stenberg et al J. Virol. 1984, 49, 190）、ウサギ若しくはヒトβ−グロビン遺伝子から単離したイントロン、具体的にはｂ−グロビン遺伝子由来のイントロン２、免疫グロブリン遺伝子から単離したイントロン、ＳＶ４０初期遺伝子由来のスプライシング配列、又はマウス免疫グロブリンアクセプター配列と融合させたヒトβ−グロビンドナー配列を含むPromege Corp.のｐＣＩベクターから単離したキメライントロン配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＶＵ４７１２０のヌクレオチド８９０付近からヌクレオチド１０２２付近）である。ポリ（Ａ）配列及びターミネーター配列を、発現させるポリヌクレオチド、例えばウシ成長ホルモン遺伝子、具体的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＯＶＧＨＲＨのヌクレオチド２３３９付近からヌクレオチド２５５０付近、ウサギβ−グロビン遺伝子又はＳＶ４０後期遺伝子ポリアデニル化シグナルの下流に挿入することができる。
【００７０】
別の実施形態では、ウイルスベクターはイヌ科動物アデノウイルス、具体的にはＣＡＶ−２である（例えば、L. Fischer et al. Vaccine, 2002, 20, 3485-3497；米国特許第５，５２９，７８０号；米国特許第５，６８８，９２０号；ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１４１０２号参照）。ＣＡＶでは、挿入部位はＥ３領域中及び／又はＥ４領域と右のＩＴＲ領域との間に位置する領域中であることができる（米国特許第６，０９０，３９３号；米国特許第６，１５６，５６７号参照）。一実施形態では、挿入はサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）又はヒトアデノウイルスベクターについて既に記載したプロモーターなどのプロモーターの制御下で行う。ポリ（Ａ）配列及びターミネーター配列は、発現させるポリヌクレオチド、例えばウシ成長ホルモン遺伝子又はウサギβ−グロビン遺伝子ポリアデニル化シグナルの下流に挿入することができる。
【００７１】
別の特定の実施形態では、ウイルスベクターはイヌ科動物ヘルペスウイルス（ＣＨＶ）又はネコ科動物ヘルペスウイルス（ＦＨＶ）などのヘルペスウイルスである。ＣＨＶでは、挿入部位は特にチミジンキナーゼ遺伝子中、ＯＲＦ３中、又はＵＬ４３ＯＲＦ中であってもよい（米国特許第６，１５９，４７７号参照）。一実施形態では、発現させるポリヌクレオチドは真核細胞中で機能するプロモーター、有利にはＣＭＶ−ＩＥプロモーター（ネズミ又はヒト）の制御下で挿入する。１つの特定の実施形態では、低酸素症によって調節されるプロモーター、例えばK. Boast et al Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208）に記載のプロモーターＨＲＥを使用することができる。ポリ（Ａ）配列及びターミネーター配列は、発現させるポリヌクレオチド、例えばウシ成長ホルモン又はウサギβ−グロビン遺伝子ポリアデニル化シグナルの下流に挿入することができる。
【００７２】
本発明のさらなる実施形態によれば、発現ベクターはプラスミドベクター又はＤＮＡプラスミドベクター、具体的にはｉｎ  ｖｉｖｏ発現ベクターである。具体的な非限定的な例では、ポリヌクレオチド配列を挿入するためのベクターとしてｐＶＲ１０２０又は１０１２プラスミド（VICAL Inc.；Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97；Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217）を利用することができる。ｐＶＲ１０２０プラスミドはｐＶＲ１０１２由来であり、ヒトｔＰＡシグナル配列を含む。一実施形態では、ヒトｔＰＡシグナルは、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＨＵＭＴＰＡ１４のアミノ酸Ｍ（１）からアミノ酸Ｓ（２３）を含む。
【００７３】
用語プラスミドは、本発明によるポリヌクレオチド及び所望の宿主又は標的の細胞若しくは複数の細胞中でそれがｉｎ  ｖｉｖｏで発現されるために必要な要素を含む任意のＤＮＡ転写単位にわたる。この観点から、スーパーコイル又は非スーパーコイルの環状プラスミド、並びに直鎖状の形態が本発明の範囲内にあることが意図されることに注意されたい。
【００７４】
各プラスミドは、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨをコードしているポリヌクレオチドに加えて、プロモーターに作動可能に連結しているか、プロモーターの制御下にあるか、又はプロモーターに依存しているイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ、イヌ科動物のプロＧＨＲＨ、変異体、類似体又は断片を含む（comprise）か、含む（contain）か、又は本質的にそれからなる。一般に、真核細胞中で機能するプロモーターを用いることが有利である。好ましい強力なプロモーターはヒト若しくはネズミ由来、又は任意選択でラット若しくはモルモットなどの別の起源である前初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）である。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは実際のプロモーター部分を含むことができ、これはエンハンサー部分に結合していてもしていなくてもよい。欧州特許ＥＰ−Ａ−２６０１４８号、欧州特許ＥＰ−Ａ−３２３５９７号、米国特許第５，１６８，０６２号、第５，３８５，８３９号、及び第４，９６８，６１５号、並びにＰＣＴ出願ＷＯ８７／０３９０５号を参照することができる。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利にはヒトＣＭＶ−ＩＥ（Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530）又はネズミＣＭＶ−ＩＥである。
【００７５】
より一般的には、プロモーターはウイルス又は細胞起源である。本発明の実施において有用に用い得るＣＭＶ−ＩＥ以外の強力なウイルスプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの初期／後期プロモーター又はラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターである。本発明の実施において有用に用い得る強力な細胞性プロモーターは、例えばデスミンプロモーター（Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344）又はアクチンプロモーター（Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277）などの細胞骨格の遺伝子のプロモーターである。
【００７６】
これらプロモーターの機能的な細断片、即ち十分な促進活性を維持しているこれらプロモーターの一部分が本発明内に含まれ、例えばＰＣＴ出願ＷＯ９８／００１６６号又は米国特許第６，１５６，５６７号による切断ＣＭＶ−ＩＥプロモーターを本発明の実施において使用することができる。したがって、本発明の実施におけるプロモーターには、完全長のプロモーターの誘導体及び細断片であって、十分な促進活性、好ましくは誘導体又は細断片が由来する実際の又は完全長のプロモーターの促進活性に実質的に類似した促進活性、例えば米国特許第６，１５６，５６７号の切断ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性及び完全長のＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性と同種の活性を維持しており、その結果プロモーターとして機能する誘導体及び細断片が含まれる。したがって、本発明の実施におけるＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、完全長のプロモーターのプロモーター部分及び／又は完全長のプロモーターのエンハンサー、並びに誘導体及び細断片を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。
【００７７】
好ましくは、プラスミドは、他の発現制御要素を含むか、又は本質的にそれからなる。安定化配列（又は複数の安定化配列）、例えばイントロン配列（又は複数のイントロン配列）、好ましくはｈＣＭＶ−ＩＥの第１イントロン（ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０１０３６号）、ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩ（van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344）を組み込むことが特に有利である。
【００７８】
プラスミド及びポックスウイルス以外のウイルスベクターのポリアデニル化シグナル（ポリＡ）に関しては、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子のポリ（Ａ）シグナル（米国特許第５，１２２，４５８号参照）、又はウサギβグロビン遺伝子のポリ（Ａ）シグナル若しくはＳＶ４０ウイルスのポリ（Ａ）シグナルをより用いることができる。
【００７９】
本発明の別の実施形態によれば、発現ベクターは、妥当な細胞系中でのタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現に用いられる発現ベクターである。分泌のあと、又は分泌が起こらない場合も（分泌が存在しない場合は、典型的には細胞溶解が起こる又は細胞溶解を行う）、発現されたタンパク質を培養上清中又はそれから収集することができ、任意選択で限外濾過などの濃縮方法によって濃縮するか、及び／又は親和性、イオン交換若しくはゲル濾過型クロマトグラフィー方法などの精製手段によって精製する。
【００８０】
本発明で使用することができる宿主細胞には、それだけには限定されないが、筋肉細胞、ケラチノサイト、筋芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ベロ細胞、ＢＨＫ２１、ｓｆ９細胞などが含まれる。宿主細胞を培養する条件は特定の遺伝子に応じて変動し、宿主細胞に応じてイヌ科動物のＧＨＲＨを培養するために最適な条件を決定するために、時によっては日常的な実験が必要であることは当業者に理解されよう。例えば、イヌ科動物のＧＨＲＨをコードしているベクターを筋芽細胞（処置を必要としている動物由来の筋肉組織から得ることができる）に形質転換させ、形質転換した筋芽細胞を動物へと移植することができる。その結果、組換えイヌ科動物のＧＨＲＨを発現するよう遺伝子操作した筋芽細胞は、ホルモンを動物の血液中に分泌することができる。別の例では、ケラチノサイトもＧＨＲＨをコードしているベクターで形質転換させ、動物内に移植することができ、その結果循環内にイヌ科動物のＧＨＲＨが分泌される。
【００８１】
「宿主細胞」とは、遺伝子改変を行ったか、又は組換えプラスミド若しくはベクターの外来ポリヌクレオチドを投与することによって遺伝子改変を行うことが可能である原核細胞或いは真核細胞を示す。遺伝子改変を行った細胞に言及する場合、この用語は最初に改変を行った細胞及びその子孫のどちらもいう。
【００８２】
所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なクローニング又は発現ベクター内に挿入し、次いでベクターを適切な宿主細胞内に導入して複製及び増幅することができる。当分野で知られている任意の手段によってポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することができる。目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、直接の取り込み、エンドサイトーシス、形質移入、ｆ接合、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、又は他の物質を用いた形質移入、微粒子銃、リポフェクション、及び感染（ベクターが感染性、例えばレトロウイルスベクターである場合）を含めたいくつかの妥当な手段のうち任意のものによって、宿主細胞内に導入することができる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は多くの場合宿主細胞の特徴に依存する。
【００８３】
有利な実施形態では、本発明は、標的細胞中におけるイヌ科動物のＧＨＲＨの送達及び発現のために配合物を治療上有効な量で投与することを提供する。治療上有効な量の決定は当業者には日常的な実験である。一実施形態では、配合物は、イヌ科動物のＧＨＲＨを発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び製薬上又は獣医学上許容される担体、ビヒクル又は賦形剤を含む。有利な実施形態では、製薬上又は獣医学上許容される担体、ビヒクル又は賦形剤は、形質移入を促進する及び／又はベクター若しくはタンパク質の保存性を向上させる。
【００８４】
製薬上又は獣医学上許容される担体若しくはビヒクル又は賦形剤は、当業者に周知である。例えば、製薬上又は獣医学上許容される担体若しくはビヒクル又は賦形剤は、０．９％のＮａＣｌ溶液（例えば生理食塩水）又はリン酸緩衝液であることができる。本発明の方法で使用することができる他の製薬上又は獣医学上許容される担体若しくはビヒクル又は賦形剤には、それだけには限定されないが、ポリ−（Ｌ−グルタミン酸塩）又はポリビニルピロリドンが含まれる。製薬上又は獣医学上許容される担体若しくはビヒクル又は賦形剤は、ベクター（若しくは本発明のベクターからｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現されるタンパク質）の投与を容易にする任意の化合物又は化合物の組合せであり得る。有利には、担体、ビヒクル又は賦形剤は、形質移入を促進する及び／又はベクター（若しくはタンパク質）の保存性を向上させ得る。用量及び用量体積は本明細書中の一般的な説明に記載されており、また、必要以上の実験を行わずに、本開示を当分野の知識と組み合わせて読むことによって当業者が決定することができる。
【００８５】
プラスミド用に有利に適切であるが排他的でない第四級アンモニウム塩を含むカチオン性脂質は、以下の式を有することが有利であり：
【００８６】
【化１】
2008500010.tif 000002
【００８７】
（式中、Ｒ１は１２〜１８個の炭素原子を有する飽和又は不飽和の直鎖脂肪族基であり、Ｒ２は２又は３個の炭素原子を含む別の脂肪族基であり、Ｘはアミン又はヒドロキシル基である）、例えばＤＭＲＩＥである。別の実施形態では、カチオン性脂質は中性脂質、例えばＤＯＰＥと会合していることができる。
【００８８】
これらカチオン性脂質のうち、有利には中性脂質、有利にはＤＯＰＥ（ジオレオイル−ホスファチジル−エタノールアミン；Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389）と会合したＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアンモニウム；国際公開公報ＷＯ９６／３４１０９号）が好ましく、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥが形成される。
【００８９】
有利には、プラスミドとアジュバントとの混合物を即席且つ有利には調製物の投与と同時に又は調製物の投与のすぐ前に形成させる。例えば、投与のすぐ前に又は前に、有利には投与の前に混合物が複合体を形成するのに十分な時間を与えるために、例えば、投与の約３０分前など投与の約１０分〜約６０分前に、プラスミド−アジュバント混合物を形成させる。
【００９０】
ＤＯＰＥが存在する場合は、ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥのモル比は、有利には約９５：約５〜約５：約９５、より有利には約１：約１、例えば１：１である。
【００９１】
ＤＭＲＩＥ又はＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥのアジュバント：プラスミド重量比は、約１０：約１〜約１：約５など約５０：約１〜約１：約１０、有利には約１：約１〜約１：約２、例えば１：１〜１：２であることができる。
【００９２】
具体的な実施形態では、薬剤組成物をｉｎ  ｖｉｖｏで直接投与し、コードされている産物が宿主内でベクターによって発現される。ＧＨＲＨをコードしているベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ送達方法（例えば、その開示が全体で参照により援用されている米国特許第６，４２３，６９３号；欧州特許公開ＥＰ１０５２２８６号、欧州特許公開ＥＰ１２０５５５１号、米国特許公開第２００４００５７９４１号、国際公開公報ＷＯ９９０５３００号及びDraghia-Akli et al., Mol Ther. 2002 Dec; 6 (6): 830-6参照）を改変して、本発明のイヌ科動物のＧＨＲＨをイヌに送達することができる。上述の参照文献の教示を考慮して、当業者は、本明細書中に記載のイヌ科動物のＧＨＲＨをコードしているベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ送達を行うことができる。
【００９３】
有利には、本発明による薬剤組成物及び／若しくは治療用組成物並びに／又は配合物は、本明細書中に記載の１つ若しくは複数の発現ベクター及び／又はポリペプチドの治療反応を誘発させるために有効な量を含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなり、有効な量は、必要以上の実験なしに、本明細書中に組み込まれている文書を含めた本開示及び当分野の知識から決定することができる。
【００９４】
プラスミドベクターに基づいた治療用組成物及び／又は薬剤組成物の場合、用量は、一般的に、約１μｇ〜約２０００μｇ、有利には約５０μｇ〜約１０００μｇ、より有利には約１００μｇ〜約８００μｇの、ＧＨＲＨを発現するプラスミドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。電気穿孔を用いてプラスミドベクターに基づいた治療用組成物及び／又は薬剤組成物を投与する場合は、プラスミドの用量は一般に約０．１μｇ〜１ｍｇ、有利には約１μｇ〜１００μｇ、有利には約２μｇ〜５０μｇである。用量体積は、約０．１〜約２ｍｌ、有利には約０．２〜約１ｍｌであることができる。これらの用量及び用量体積は、イヌ科動物並びにウマ科動物及びネコ科動物などの他の哺乳動物の標的種の処置に適切である。
【００９５】
治療用組成物及び／又は薬剤組成物は、用量あたり約１０４〜約１０１１、有利には約１０５〜約１０１０、より有利には約１０６〜約１０９個の、ＧＨＲＨを発現する組換えアデノウイルスのウイルス粒子を含む。ポックスウイルスに基づいた治療用組成物及び／又は薬剤組成物の場合、用量は約１０２ｐｆｕ〜約１０９ｐｆｕであることができる。薬剤組成物は、用量あたり約１０５〜１０９、有利には約１０６〜１０８ｐｆｕの、ＧＨＲＨを発現するポックスウイルス又はヘルペスウイルス組換えを含む。
【００９６】
哺乳動物である標的種用の組成物の用量体積、例えばイヌ科動物用の組成物の用量体積は、ウイルスベクター、例えば非ポックスウイルス−ウイルスベクターに基づいた組成物に基づいて、一般に約０．１〜約２．０ｍｌ、好ましくは約０．１〜約１．０ｍｌ、より好ましくは約０．５ｍｌ〜約１．０ｍｌである。
【００９７】
当業者には、本明細書中の開示は例として提供し、本発明はそれらに限定されないことを理解されよう。本明細書中の開示及び当分野の知識から、当業者は、必要以上の実験を行わずに投与数、投与経路、及び各注射プロトコルで用いる用量を決定することができる。
【００９８】
本発明は、本発明に従って作製した治療用組成物を有効な量で動物に少なくとも１回投与することを企図する。動物は雄、雌、妊娠した雌及び新生仔であってよい。投与は、それだけには限定されないが、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）若しくは皮下（ＳＣ）注射、又は鼻腔内若しくは経口投与を含めた様々な経路によるものでよい。本発明による治療用組成物は、無針装置によっても投与することができる（例えば、Pigjet、Biojector又はVitajet装置（Bioject、米国オレゴン州）を用いる）。プラスミド組成物を投与するための別の手法は、電気穿孔を用いることである（例えば、S. Tollefsen et al. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378；S. Tollefsen et al. Scand. J. Immunol., 2003, 57, 229-238；S. Babiuk et al., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408；ＰＣＴ出願ＷＯ９９／０１１５８号参照）。別の実施形態では、遺伝子銃又は金微粒子銃によってプラスミドを動物に送達する。有利な実施形態では、動物は脊椎動物である。より有利な実施形態では、脊椎動物はイヌである。
【００９９】
本発明は、病状を処置する薬剤組成物を生成するための、イヌ科動物のＧＨＲＨ、イヌ科動物の成熟ＧＨＲＨ、イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ、イヌ科動物プロＧＨＲＨ、変異体、類似体又は断片をコードしており且つそれを発現するウイルスベクターの使用に関する。例えば、本発明によるＧＨＲＨを投与することによって刺激されたＧＨの分泌は、貧血の動物の赤血球細胞に直接的な刺激効果を有する場合がある。しかし、ＧＨＲＨ組成物の投与から利益を受け得る他の病状には、それだけには限定されないが、脊椎動物における悪液質、特に癌から生じる悪液質、創傷治癒、骨折治癒、骨粗鬆症、肥満症などが含まれる。本発明のイヌ科動物のＧＨＲＨを発現するベクターは、成長ホルモン産生異常による癌などの慢性疾患における悪液質の処置（Bartlett et al Cancer 1994, 73, 1499-1504及びSurgery 1995, 117, 260-267）、創傷治癒、骨折治癒、老化過程の遅延、骨粗鬆症及び貧血（Sohmiya et al J. Endocrinol. Invest. 2000, 23, 31-36及びClin. Endocrinl. 2001, 55, 749-754）において、治療上の有用性を有する。
【０１００】
ブタＧＨＲＨをコードしているプラスミドの筋肉内送達は、イヌにおいて成長ホルモン及びＩＧＦ−Ｉの放出を刺激し、貧血及び悪液質を処置することが実証されている（例えばDraghia-Akli et al., Mol Ther. 2002 Dec; 6 (6): 830-6参照）。ＧＨＲＨの慢性投与はイヌにおいて骨折治癒を促進することが実証されている（例えばDubreuil et al., Can J Vet Res. 1996 Jan; 60 (1): 7-13参照）。本発明の治療用イヌ科動物のＧＨＲＨベクターをDubreuil他のポリエチレンロッド外科用インプラント（Can J Vet Res. 1996 Jan; 60 (1): 7-13）の代わりに投与して動物の骨成長を促進することが有利となろう。同様に、ＧＨＲＨの慢性投与はラットにおいて創傷治癒を促進することが実証されている（例えばGarrel et al., Surg Res. 1991 Oct; 51 (4): 297-302参照）。ここでも、本発明の治療用イヌ科動物のＧＨＲＨベクターをGarrel他の徐放性ペレットインプラントインプラント（Surg Res. 1991 Oct; 51 (4): 297-302）の代わりに投与して動物の創傷治癒を促進することが有利となろう。
【０１０１】
本発明はまた、脊椎動物の免疫応答を刺激する方法に関する。一実施形態では、脊椎動物はトリ、ネコ、ウシ、イヌ、サカナ、ヤギ、ウマ、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット又はヒツジである。より有利な実施形態では、脊椎動物はイヌである。
【０１０２】
リンパ球はＧＨ−ＩＧＦ−Ｉ、ＧＨＲＨ及びそのそれぞれの受容体を発現するので、ＧＨＲＨを投与することが免疫細胞の機能を亢進させると仮説されていた（例えばKhorram et al., J Clin Endocrinol Metab. 1997 Nov; 82 (11): 3590-6参照）。ヒトでは、ＧＨＲＨの類似体を健康な高齢者に投与することにより、著しい免疫亢進効果がもたらされ、免疫機能の無防備状態に対する治療上の利点が与えられ得る（例えばKhorram et al., J Clin Endocrinol Metab. 1997 Nov; 82 (11): 3590-6参照）。トランスジェニックマウスにおけるＧＨＲＨの過剰発現により、免疫機能の一部のパラメータの有意な刺激がもたらされた（例えばDialynas et al., J Clin Endocrinol Metab. 1997 Nov; 82 (11): 3590-6参照）。別のマウス研究では、ＧＨＲＨが実験的自己免疫脳脊髄炎の発生に重要な役割を果たし、自己免疫疾患から保護する治療手法の基盤を提供し得る（例えばIkushima et al., J Immunol. 2003 Sep 15; 171 (6): 2769-72参照）。上述の研究はＧＨＲＨが免疫細胞の機能を亢進することを示唆しているので、本発明の治療用イヌ科動物のＧＨＲＨベクターを投与することは脊椎動物における免疫応答の刺激に有利となるであろう。
【０１０３】
次に、以下の非限定的な例によって本発明をさらに説明する。
[実施例]
【実施例１】
【０１０４】
視床下部をイヌから採取し、直ちに液体窒素中で凍結させた。ＱＩＡＧＥＮ（全ＲＮＡ単離用のRneasy Miniプロトコル、カタログ番号７４１０４）のキットを用いて組織から全ＲＮＡを抽出した。Potter Dounceを用いて、キットの変性溶液６００μｌ中で視床下部由来の細胞を解離させた。この溶液はグアニジンイソチオシアネート及びβ−メルカプトエタノールを含んでいた。組織のホモジネートを５分間１４０００ＲＰＭ（毎分の回転数）で遠心分離して細片を除去した。６００μｌの７０％エタノール溶液を加え、混合物をRneasyカラム（colomn）に載せ、１５秒間１００００ＲＰＭで遠心分離した。キットと共に提供されたＲＷ１緩衝液でカラムを２回洗浄した。１分間１４０００ＲＰＭで遠心分離したあと、ＲＮＡを５０μｌのＲＮＡｓｅを含まない緩衝液で溶出させた。
【０１０５】
ｃＤＮＡを、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８．３、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２０単位のＲＮＡｓｅ阻害剤、５０単位のモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素、２．５μＭのランダムヘキサヌクレオチドプライマー及び２μｌの全視床下部ＲＮＡを含む２０μｌの反応混合物中で合成した。逆転写ステップは、２３℃で５分間、４２℃で２０分間、９９℃で５分間及び１０℃で５分間のサイクルで行った。
【０１０６】
ｃＤＮＡのプールは、反応に以下のオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した：
NB151（18量体）5'-ATGCYRCTCTGGGTGYTC-3'（配列番号５）
NB152（17量体）5'-TCATCCYTGGGAGTTCC-3'（配列番号６）
NB153（21量体）5'-GCTACCGGAAGGTKCTGGGCC-3'（配列番号７）
NB154（21量体）5'-GGCCCAGMACCTTCCGGTAGC-3'（配列番号８）
（ＹはＣ又はＴであり、ＲはＡ又はＧであり、ＫはＧ又はＴであり、ＭはＡ又はＣである）。
【０１０７】
オリゴヌクレオチドＮＢ１５１及びＮＢ１５４を用いて、ＧＨＲＨ遺伝子の５’末端に対応する１３６塩基対（ｂｐ）の断片を増幅した。ＮＢ１５２及びＮＢ１５３オリゴヌクレオチドを用いて、ＧＨＲＨ遺伝子の３’末端に対応する重複する２０６ｂｐの断片を増幅した。
【０１０８】
１００μｌの反応混合物は、２０μｌのｃＤＮＡ混合物、２．５単位のＤＮＡポリメラーゼ（J. Cline et al. Nucl. Acid Res. 1996, 24, 3546-3551及びH. Hogrefe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2002, 99, 596-601）、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．２、０．５μｇの各オリゴヌクレオチド（ＮＢ１５１／ＮＢ１５４又はＮＢ１５２／ＮＢ１５３）を含む。増幅は、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の３５サイクル、次いで最後に７２℃で１０分間の伸長を行って実施した。
【０１０９】
ＧＨＲＨｍＲＮＡの５’及び３’末端のヌクレオチド配列を得るために、ｃＤＮＡの５’及び３’末端をＲＡＣＥプロトコルに従って増幅した。５’末端には、３μｌの全視床下部ＲＮＡ、２μＭのプライマーオリゴｄＴ５’−ＣＤＳ、２μＭのＳｍｔオリゴヌクレオチドを含む５μｌの混合物を７０℃で加熱し、変性させるために氷上で冷却した。５μｌのオリゴヌクレオチドを有する変性ＲＮＡ、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、１００単位の逆転写酵素を含む１０μｌの混合物反応を９０分間４２℃でインキュベーションし、その後、１０ｍＭのトリシン−ＫＯＨ、ｐＨ８．５、１ｍＭのＥＤＴＡの緩衝液で１：１０に希釈した。２．５μｌのアリコートを、０．０４μＭのユニバーサルプライマー、０．２μＭのＮＢ１５４オリゴヌクレオチド、４０ｍＭのトリシン−ＫＯＨ、ｐＨ８．７、１５ｍＭのＫＯＡｃ、３．５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、３．７５μｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．００５％のTweem20（登録商標）、０．００５％のノニデット−Ｐ４０、０．２μＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼも含む５０μｌの反応混合物中での増幅に用いた。増幅は、５回のサイクル（cyclation）を５回のサイクルで３分間、及び９４℃で３０秒間、６５℃で３分間、７２℃で３分間の３０サイクルを用いて実施した。２３９ｂｐの断片が得られた。
【０１１０】
Ｓｍｔ（３０量体）5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'（配列番号９）
オリゴｄＴ5'-CDS5'-(T)25N_1N-3'（Ｎ−１はＡ、Ｃ又はＧであり、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）。
ユニバーサルプライマー5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'（配列番号１０）
【０１１１】
３’末端には、手順は、５μｌの混合物は３μｌの全視床下部ＲＮＡ、２μＭのＳＭＡＲＴ（Clontech Laboratories、カリフォルニア州Palo Alto）オリゴヌクレオチドのみを含み、５０μｌのＰＣＲ用反応混合物は２．５μｌの希釈ｃＤＮＡのアリコート、０．０４μＭのユニバーサルプライマー混合物、０．２μＭのＮＢ１５３オリゴヌクレオチド、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ２、３．７５μｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．００５％のTween20（登録商標）、０．００５％のノノデット（Nonodet）−Ｐ４０、０．２μＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む以外は上述のものと同じである。３８６ｂｐの断片が得られた。
【０１１２】
ＳＭＡＲＴ（５７量体）5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3'（配列番号１１）（Ｎ−１はＡ、Ｃ又はＧであり、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである）。
【０１１３】
ＰＣＲ増幅した断片は妥当なプラスミド内に直接クローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーをコロニーリフトハイブリデーテョンによってスクリーニングした。プラスミドｐＣＲＩＩ  ＮＢ１５１／１５４及びｐＣＲＩＩ  ＮＢ１５２／１５３に対応する、ＧＨＲＨのｃＤＮＡを有するプラスミドを、アルカリホスファターゼで標識したＮＢ１５５プローブを用いて同定した。
【０１１４】
ＮＢ１５５（５０量体）5'-GCCATCTTCACYAACARCTACCGGAAGGTBCTGGGCCAGCTVTCYGCCCG-3'（配列番号１２）（ＹはＣ又はＴであり、ＲはＡ又はＧであり、ＢはＣ又はＧ又はＴであり、ＶはＡ又はＣ又はＧである）。
【０１１５】
クローンの配列決定を行った。３２１ｂｐを含むイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨをコードしているヌクレオチド配列は以下のとおりである：5'-ATGCCACTCT GGGTGTTCTT CCTGGTGATC CTCACCCTCA GCAGTGGCTC CCACTCTTCC CCGCCATCCC TGCCCATCAG AATCCCTCGG TATGCAGACG CCATCTTCAC CAACAGCTAC CGGAAGGTGC TGGGCCAGCT GTCCGCCCGC AAGCTCCTGC AGGACATCAT GAGCCGGCAG CAGGGAGAGA GAAACCGGGA GCAAGGAGCA AAGGTACGAC TCGGCCGTCA GGTGGACAGT CTGTGGGCAA GCCAAAAGCA GATGGCATTG GAGAACATCC TGGCATCCCT GTTACAGAAA CGCAGGAACT CCCAAGGATG A-3'（配列番号３）。
【０１１６】
対応するアミノ酸配列は以下のとおりである：H-MPLWVFFLVI LTLSSGSHSS PPSLPIRIPR YADAIFTNSY RKVLGQLSAR KLLQDIMSRQ QGERNREQGA KVRLGRQVDS LWASQKQMAL ENILASLLQK RRNSQG-OH（配列番号１）。シグナルペプチドはアミノ酸１〜アミノ酸２０にわたり、成熟ＧＨＲＨはアミノ酸３１〜アミノ酸７４にわたる。
【実施例２】
【０１１７】
イヌ科動物のＧＨＲＨをコードしているポリヌクレオチドは、ＮＢ１８４及びＮＢ１８５オリゴヌクレオチド並びにＤＮＡポリメラーゼを用いて全視床下部ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって得られる（J. Cline et al. 1996及びH. Hogrefe et al. 2002）。
【０１１８】
ＮＢ１８４（３３量体）：5'-TTTCGCGGATCCTATGCAGACGCCATCTTCACC-3'（配列番号１３）（その５’末端にＢａｍＨ  Ｉ部位を含む）
ＮＢ１８５（３５量体）：5'-AAAGCTCTAGATCAACGGCCGAGTCGTACCTTTGC-3'（配列番号１４）（その５’末端にＸｂａ  Ｉ部位を含む）。
【０１１９】
増幅は、４２℃で１５分間、９５℃で５分間、４℃で５分間の逆転写ステップを１サイクル及び９５℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で１分間のＰＣＲステップを３０サイクルで用いて実施した。
【０１２０】
ＰＣＲ産物（１６４ｐｂ）をフェノール−クロロホルム抽出によって抽出し、次いでＢａｍＨ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉによって消化して１４７ｂｐのＢａｍＨ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ（断片Ａ）を作製した。
【０１２１】
プラスミドｐＡＢ１１０はｐＶＲ１０２０プラスミド（Vical Inc）に由来し、プラスミドのＢａｍＨ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩ消化のあとＰＢ３２６及びＰＢ３２９オリゴヌクレオチドに対応するポリリンカー（ＢａｍＨ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｖ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｐｍｌ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｂｇｌ  ＩＩ）を挿入する。
【０１２２】
ＰＢ３２６（４０量体）5'-GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC-3'（配列番号１５）
ＰＢ３２９（４０量体）5'-GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT-3'（配列番号１６）
【０１２３】
プラスミドｐＡＢ１１０をＢａｍＨ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ消化によって直線化して断片Ｂ（５０５５ｂｐ）を作製した。
【０１２４】
次いで断片Ａ及びＢを精製し、ライゲーションしてプラスミドｐＮＢ１７９（５２０２ｂｐ）（図１）を作製した。
【実施例３】
【０１２５】
プラスミドｐＣＲＩＩ  ＮＢ１５１／１５４をまずＥｃｏＲＩによって消化した。ＥｃｏＲＩ断片（１６７ｂｐ）を精製し、最後にＢｓａＷＩによって消化してＥｃｏＲＩ−ＢｓａＷＩ断片（１４３ｂｐ）を作製した。プラスミドｐＣＲＩＩ  ＮＢ１５２／１５３をまずＥｃｏＲＩによって消化した。ＥｃｏＲＩ断片（２３５ｂｐ）を精製し、最後にＢｓａＷＩによって消化してＢｓａＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２２０ｂｐ）を作製した。
【０１２６】
次いでこれら２つの断片を精製し、ＥｃｏＲＩによって直線化したプラスミドｐＣＲＩＩ  ＮＢ１５１／１５４内にクローニングして最終プラスミドｐＣＲＩＩ  ＮＢ１５１／１５２（４２９５ｂｐ）を作製した。
【実施例４】
【０１２７】
ｐＮＢ２０９の構築は、イヌ科動物のＧＨＲＨ前駆体（１０６個のアミノ酸のポリペプチド）をコードしているｐＶＲ１０１２プラスミド（Ｖｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）に基づいている。
【０１２８】
さらなるＳａｌＩ及びＸｂａｌ部位をそれぞれ５’及び３’末端に有するｃＧＨＲＨ遺伝子に対応するＤＮＡ断片を、プライマーＮＢ３６１及びＮＢ３６０、鋳型としてプラスミドｐＣＲＩＩＮＢ１５１／１５２、並びにＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって増幅した。
【０１２９】
ＮＢ３６０（３０量体）：5'-AAAGCTCTAGATCATCCTTGGGAGTTCCTG-3'（配列番号１７）（その５’末端にＸｂａｌ部位を含む）
ＮＢ３６１（３１量体）：5'-TTTACGCGTCGACATGCTGCTCTGGGTGTTC-3'（配列番号１８）（その５’末端にＳａｌＩ部位を含む）
【０１３０】
ＰＣＲ断片（３４５ｂｐ）をフェノール−クロロホルム抽出によって精製し、次いでＳａｌＩ及びＸｂａｌによって消化して断片Ａ（３２７ｂｐ）を作製した。
【０１３１】
プラスミドｐＶＲ１０１２をＳａｌＩ／Ｘｂａｌ消化によって直線化して断片Ｂ（４８８０ｂｐ）を作製した。
【０１３２】
次いで断片Ａ及びＢを精製し、ライゲーションしてプラスミドｐＮＢ２０９（５２０７ｂｐ）を作製した。図２は、ｐＮＢ２０９のラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す。
【実施例５】
【０１３３】
プラスミドｐＮＢ２１０／ｐＮＢ２１１／ｐＮＢ２１２／ｐＮＢ２１３の構築：ＧＨＲＨプロペプチドに融合した真核ｔＰＡリーダーペプチドを含むハイブリッドタンパク質をコードしている改変ＧＨＲＨ遺伝子を含むｐＡＢ１１０由来のプラスミド。
【０１３４】
さらなるＳａｌＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ部位をそれぞれ５’及び３’末端に有するｔＰＡ（アミノ酸１〜２３）に対応するＤＮＡ断片を、プライマーＮＢ３５５及びＮＢ３５６、鋳型としてプラスミドｐＡＢ１１０、並びにＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって得た（J. Cline et al. 1996及びH. Hogrefe et al. 2002）。
【０１３５】
ＮＢ３５５（２０量体）：5'-CCGTCGTCGACAGAGCTGAG-3'（配列番号１９）（その５’末端にＳａｌＩ部位を含む）
ＮＢ３５６（２４量体）：5'-AAAAGCGCTGGGCGAAACGAAGAC-3'（配列番号２０）（その５’末端にＥｃｏ４７ＩＩＩ部位を含む）
【０１３６】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（１８４ｂｐ）を精製し、次いでＳａｌＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩによって消化して断片Ａ（１７２ｂｐ）を作製した。
【０１３７】
さらなるＳａｌＩ及びＮａｅＩ部位をそれぞれ５’及び３’末端に有するｔＰＡ（アミノ酸１〜２８）に対応するＤＮＡ断片を、プライマーＮＢ３５５及びＮＢ３５７、鋳型としてプラスミドｐＡＢ１１０、並びにＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって得た。
【０１３８】
ＮＢ３５５（２０量体）：5'-CCGTCGTCGACAGAGCTGAG-3'（配列番号１９）（その５’末端にＳａｌＩ部位を含む）
ＮＢ３５７（４２量体）：5'-AAAGCCGGCATGGATTTCCTGGCTGGGCGAAACGAAGAC TGC-3'（配列番号２１）（その５’末端にｔＰＡリーダーペプチドの５個のアミノ酸の付加及びＮａｅＩ部位を含む）。
【０１３９】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（１９９ｂｐ）を精製し、次いでＳａｌＩ及びＮａｅＩによって消化して断片Ｂ（１８７ｂｐ）を作製した。
【０１４０】
さらなるＮｌａＩＶ及びＸｂａｌ部位をそれぞれ５’及び３’末端に有する欠失（アミノ酸１〜１９）ＧＨＲＨに対応するＤＮＡ断片を、プライマーＮＢ３５８及びＮＢ３６０、鋳型としてプラスミドｐＣＲＩＩ  ＮＢ１５１／１５２、並びにＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって得た。
【０１４１】
ＮＢ３５８（２１量体）：5'-TTTGGTTCCCCGCCATCCCTG-3'（配列番号２２）（その５’末端にＮｌａＩＶ部位を含む）
ＮＢ３６０（３０量体）：5'-AAAGCTCTAGATCATCCTTGGGAGTTCCTG-3'（配列番号１７）（その５’末端にＸｂａｌ部位を含む）。
【０１４２】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（２８１ｂｐ）を精製し、次いでＮｌａＩＶ及びＸｂａｌによって消化して断片Ｃ（２６５ｂｐ）を作製した。
【０１４３】
さらなるＳｔｕＩ及びＸｂａｌＩ部位をそれぞれ５’及び３’末端に有する欠失（アミノ酸１〜２０）ＧＨＲＨに対応するＤＮＡ断片を、プライマーＮＢ３５９及びＮＢ３６０、鋳型としてプラスミドｐＣＲＩＩ  ＮＢ１５１／１５２、並びにＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって得た。
【０１４４】
ＮＢ３５９（２４量体）：5'-TTTAGGCCTCCATCCCTGCCCATC-3'（配列番号２３）（その５’末端にＳｔｕＩ部位を含む）
ＮＢ３６０（３０量体）：5'-AAAGCTCTAGATCATCCTTGGGAGTTCCTG-3'（配列番号１７）（その５’末端にＸｂａＩ部位を含む）
【０１４５】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（２７８ｂｐ）を精製し、次いでＳｔｕＩ及びＸｂａｌによって消化して断片Ｄ（２６２ｂｐ）を作製した。
【０１４６】
プラスミドｐＶＲ１０１２をＳａｌＩ／ＸｂａＩ消化によって直線化して断片Ｅ（４８８０ｂｐ）を作製した。
【０１４７】
次いで断片Ｅ、Ａ及びＣを精製し、ライゲーションしてプラスミドｐＮＢ２１０（５３１３ｂｐ）を作製した。図３は、ｐＮＢ２１０のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す。
【０１４８】
次いで断片Ｅ、Ａ及びＤを精製し、ライゲーションしてプラスミドｐＮＢ２１１（５３１０ｂｐ）を作製した。図４は、ｐＮＢ２１１のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す。
【０１４９】
次いで断片Ｅ、Ｂ及びＣを精製し、ライゲーションしてプラスミドｐＮＢ２１２（５３３１ｂｐ）を作製した。図５は、ｐＮＢ２１２のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す。
【０１５０】
次いで断片Ｅ、Ｂ及びＤを精製し、ライゲーションしてプラスミドｐＮＢ２１３（５３２８ｂｐ）を作製した。図６は、ｐＮＢ２１３のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す。
【実施例６】
【０１５１】
プラスミドｐＮＢ２１４／ｐＮＢ２１５の構築
プラスミドｐＮＢ２１４／ｐＮＢ２１５の構築：イヌ科動物のＧＨＲＨ成熟ペプチドに融合したヒトｔＰＡを含むハイブリッドタンパク質をコードしている改変ＧＨＲＨ遺伝子を含む、ｐＡＢ１１０由来のプラスミド。
【０１５２】
さらなるＢｓｔ１１０７Ｉ及びＸｂａｌＩ部位をそれぞれ５’及び３’末端に有する、ペプチド（アミノ酸３１〜７４）ＧＨＲＨに対応するＤＮＡ断片を、プライマーＮＢ３６２及びＮＢ３６３、鋳型としてプラスミドｐＣＲＩＩ  ＮＢ１５１／１５２、並びにＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって得た（J. Cline et al. 1966及びH. Hogrefe et al. 2002）。
【０１５３】
ＮＢ３６２（２７量体）：5'-TTTGTATACGCAGACGCCATCTTCACC-3'（配列番号２４）（その５’末端にＢｓｔ１１０７Ｉ部位を含む）
ＮＢ３６３（３２量体）：5'-AAAGCTCTAGATCAGAGTCGTACCTTTGCTCG-3'（配列番号２５）（その５’末端にＸｂａＩ部位を含む）
【０１５４】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（１５２ｂｐ）を精製し、次いでＢｓｔ１１０７１Ｉ及びＸｂａＩによって消化して断片Ｆ（１３６ｂｐ）を作製した。
【０１５５】
次いで断片Ｅ、Ａ及びＦを精製し、ライゲーションしてプラスミドｐＮＢ２１４（５１８４ｂｐ）を作製した。図７は、ｐＮＢ２１４のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す。
【０１５６】
次いで断片Ｅ、Ｂ及びＦを精製し、ライゲーションしてプラスミドｐＮＢ２１５（５２０２ｂｐ）を作製した。図８は、ｐＮＢ２１５のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す。
【０１５７】
断片Ｅ、Ａ及びＢは実施例５に記載されている。
【実施例７】
【０１５８】
イヌ科動物のプリプロＧＨＲＨのヌクレオチド配列は、発現を向上させるためにコザックコンセンサス配列を導入することによってコドン使用頻度をカニスファミリアリス（Canis familiaris）の１種に適応させることにより、潜在スプライシング部位を除去することによって最適化される。このような改変遺伝子は合成によって得られる：配列番号４０。
【０１５９】
ｐＮＢ２１６の構築：これは、イヌ科動物のＧＨＲＨ最適化前駆体（１０６個のアミノ酸のポリペプチド）配列番号４０をコードしているｐＶＲ１０１２プラスミド（Vical Inc.）に基づいている。
【０１６０】
最適化したイヌ科動物のプリプロＧＨＲＨ遺伝子を挿入するプラスミドｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ−ＧＨＲＨ（Stratagene、米国カリフォルニア州Lajolla）をＳａｌＩ及びＸｂａｌで消化してＳａｌＩ−−Ｘｂａｌ断片（３３６ｂｐ）を作製し、プラスミドｐＶＲ１０１２をＳａｌＩ／ＸｂａＩ消化によって直線化して断片Ｅ（４８８０ｂｐ）を作製した。次いでこれら２つの断片精製し、ライゲーションして最終プラスミドｐＮＢ２１６（５２１６ｂｐ）を作製した。
【実施例８】
【０１６１】
プラスミドｐＮＢ２１７／ｐＮＢ２１８の構築：最適化したＧＨＲＨプロペプチドに融合した真核ｔＰＡリーダーペプチドを含むハイブリッドタンパク質をコードしている改変ＧＨＲＨ遺伝子を含む、ｐＡＢ１１０由来のプラスミド。
【０１６２】
５’及び３’末端をそれぞれさらなるＮｌａＩＶ及びＸｂａｌ部位で最適化した、欠失（アミノ酸１〜２０）ＧＨＲＨに対応するＤＮＡ断片を、プライマーＮＢ３６４及びＮＢ３６５、鋳型としてｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ−ＧＨＲＨプラスミド、並びにＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって得た。
【０１６３】
ＮＢ３６４（２４量体）：5'-TTTGGCCCCCCCAGCCTGCCCATC-3'（配列番号４５）（その５’末端にＮｌａＩＶ部位を含む）
ＮＢ３６５（３３量体）：5'-AAAGCTCTAGATTATCAGCCCTGGCTGTTCCGC-3'（配列番号４６）（その５’末端にＸｂａＩ部位を含む）
【０１６４】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（２８１ｂｐ）を精製し、次いでＮｌａＩＶ及びＸｂａｌによって消化して断片Ｇ（２６５ｂｐ）を作製した。
【０１６５】
プラスミドｐＶＲ１０１２をＳａｌＩ／Ｘｂａｌ消化によって直線化して断片Ｅ（４８８０ｂｐ）を作製した。
【０１６６】
次いで断片Ｅ、Ａ及びＧを精製し、ライゲーションしてプラスミドｐＮＢ２１７（５３１３ｂｐ）を作製した。図１０は、ｐＮＢ２１７のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す。
【０１６７】
次いで断片Ｅ、Ｂ及びＧを精製し、ライゲーションしてプラスミドｐＮＢ２１８（５３２８ｂｐ）を作製した。図１１は、ｐＮＢ２１８のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す。
【０１６８】
断片Ａ及びＢは実施例５に記載されている。
【実施例９】
【０１６９】
プラスミドｐＮＢ２１９／ｐＮＢ２２０の構築：最適化したイヌ科動物のＧＨＲＨ成熟ペプチドに融合したヒトｔＰＡを含むハイブリッドタンパク質をコードしている改変ＧＨＲＨ遺伝子を含む、ｐＡＢ１１０由来のプラスミド。
【０１７０】
５’及び３’末端をそれぞれさらなるＢｓｔ１１０７Ｉ及びＸｂａｌ部位で最適化したペプチド（アミノ酸３１〜７４）ＧＨＲＨに対応するＤＮＡ断片を、プライマーＮＢ３６６及びＮＢ３６７、鋳型としてプラスミドｐＣＲＩＩ  ＮＢ１５１／１５２、並びにＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって得た（J. Cline et al. 1996及びH. Hogrefe et al. 2002）。
【０１７１】
ＮＢ３６６（２７量体）：5'-TTTGTATACGCCGACGCCATCTTCACC-3'（配列番号４７）（その５’末端にＢｓｔ１１０７Ｉ部位を含む）
ＮＢ３６７（３２量体）：5'-AAAGCTCTAGATCACAGCCGCACTTTGGCGCC-3'（配列番号４８）（その５’末端にＸｂａｌ部位を含む）
【０１７２】
フェノール−クロロホルム抽出によってＰＣＲ断片（１５２ｂｐ）を精製し、次いでＢｓｔ１１０７Ｉ及びＸｂａｌによって消化して断片Ｈ（１３６ｂｐ）を作製した。
【０１７３】
次いで断片Ｅ、Ａ及びＨを精製し、ライゲーションしてプラスミドｐＮＢ２１９（５１８４ｂｐ）を作製した。図１２は、ｐＮＢ２１９のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す。
【０１７４】
次いで断片Ｅ、Ｂ及びＨを精製し、ライゲーションしてプラスミドｐＮＢ２２０（５１９９ｂｐ）を作製した。図１３は、ｐＮＢ２２０のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す。
【０１７５】
断片Ａ及びＢは実施例５に記載されている。
【実施例１０】
【０１７６】
ＤＮＡを取り込ませるための低電圧電気穿孔及び動物中で発現させる方法は、その開示がその全体で参照により援用されている米国特許公開２００４００５７９４１号の実施例２から適応させることができる。本発明のプラスミドを送達するために、必要以上の実験なしに本明細書中に記載の方法を改変することができる。
【０１７７】
筋肉内へのプラスミドＤＮＡの直接の注射、次いで電気穿孔は、プラスミドＤＮＡを骨格筋内へ局所的且つ制御された送達を行うための方法である。これは、受動的送達様式で通常用いられる多い量ではなく、少ないプラスミド量（０．１ｍｇほどまで低い）を用いるという利点を有する。理論に縛られることを望まずに、電気穿孔によるプラスミドの取り込みの増加の機構は、恐らく、タンパク質の能動輸送があってもなくても新しく作製された膜孔によって起こる。理論に縛られることを望まないが、筋肉細胞の透過化処理の度合いは、電界強度、パルスの長さ、電極の形状及び種類（Bureau et al., Biochim Biophys Acta. 2000 May 1; 1474 (3): 353-9及びGilbert et al., Biochim Biophys Acta. 1997 Feb 11; 1334 (1): 9-14.）、並びに細胞の大きさ（Somiari et al., Mol Ther. 2000 Sep; 2 (3): 178-87）に依存する。標準的な電極の配置、即ちプレート又はワイヤー電極の対を４ｍｍ間隔で配置することは、げっ歯類において有効であることが示されたが、ブタやヒトなどの大きな哺乳動物では、皮膚の抵抗力の増大、皮下脂肪組織の厚さ、及び電界を比例的に増加させた場合の組織損傷への懸念によりこのような種類の電極が非実用的となる。ブタやイヌの筋線維は相当大きく、したがって電気的透過化処理にげっ歯類の筋肉よりも適している。この報告では、大きな哺乳動物において、様々な用量のＧＨＲＨ又は類似体核酸配列を１回注射し、次いで筋肉内アプリケーターを用いて電気穿孔を行うことが、治療的血漿ホルモンレベルを生じ、また貧血を処置し、るいそうを逆転させ、対象の重量を増やすことを可能にし、且つ慢性的に病気の対象の推定寿命を延長させることができる生物学的に有意な効果を生じるために十分であることを示す。
【０１７８】
ｐＳＰ−ＨＶ−ＧＨＲＨ系（ブタＧＨＲＨを発現するベクター）を、ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔によって健康なイヌの左前脛骨筋に送達した。４匹のイヌ（２匹の雄及び２匹の雌）のグループ１つを対照として用い、８匹のイヌ（４匹の雄及び４匹の雌）のグループ３つにｐＳＰ−ＨＶ−ＧＨＲＨ系を注射した。イヌに、ビヒクルのみ（対照）、又は２００ｍｃｇ、若しくは６００ｍｃｇ若しくは１０００ｍｃｇのｐＳＰ−ＨＶ−ＧＨＲＨを注射し、次いで針電気穿孔を行った。ＧＨＲＨ及びＧＨの全身性レベルの増加の指標は、血清ＩＧＦ−Ｉの濃度の増加である。したがって、注射の２８日後、ビヒクルのみ（対照）、又は２００ｍｃｇ、若しくは６００ｍｃｇ若しくは１０００ｍｃｇのｐＳＰ−ＨＶ−ＧＨＲＨを注射したイヌから血清を採取し、ＩＧＦ−Ｉレベルを決定した。６００ｍｃｇを注射したイヌのＩＧＦ−Ｉレベルは、対照（ビヒクルのみ）の処置動物よりも３倍高かった（図２）。ＩＧＦ−Ｉレベルの増加は統計的に有意であった（ｐ＜０．０４６）。２００ｍｃｇ及び１０００ｍｃｇのプラスミドを注射した動物は対照よりも高いＩＧＦ−Ｉレベルを示したが、ＩＧＦ−Ｉレベルは６００ｍｃｇを注射した動物よりも低かった。より高いＧＨＲＨレベルに対応したＩＧＦ−Ｉレベルの増加は、イヌにおいて組換えブタＧＨ（「ｐＧＨ」）を利用した他の研究と矛盾がない。例えば、ｐＧＨで処置したイヌにおける血清ＧＨレベルの増加に相関する、用量依存性の血清ＩＧＦ−Ｉレベルの増加（約２〜１０倍）があった。
【０１７９】
理論に縛られることを望まないが、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）は、成長ホルモン（ＧＨ）の下垂体前葉からの産生及び放出を刺激し、次いでこれが肝臓及び他の標的器官からのＩＧＦ−Ｉの産生を刺激する。したがって、ＧＨＲＨ及びＧＨの全身性レベルの増加の指標は、血清ＩＧＦ−Ｉ濃度の増加である。２００、６００及び１０００ｍｃｇのｐＳＰ−ＨＶ−ＧＨＲＨを注射した健康なイヌにおける血清ＩＧＦ−Ｉのレベルは、注射前の値と比較して注射の２８日後ですべて高かった。６００ｍｃｇのｐＳＰ−ＨＶ−ＧＨＲＨを注射したイヌは、最も高い統計的に有意なＩＧＦ−Ｉレベルの増加（例えば９０％を超える、ｐ＜０．０４６）を示し、これは、６００ｍｃｇが健康なイヌの最適な濃度であり得ることを示している。
【０１８０】
本発明の有利な実施形態を詳細に説明したが、本発明の精神又は範囲を逸脱せずに多くのその明らかな変形が可能であるので、上述の文章によって定義した本発明は、上述の説明中に記述した特定の詳細に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】ｐＮＢ１７９のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号４９であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号５０である。
【図２】ｐＮＢ２０９のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号２６であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号２７である。
【図３】ｐＮＢ２１０のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号２８であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号２９である。
【図４】ｐＮＢ２１１のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号３０であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３１である。
【図５】ｐＮＢ２１２のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号３２であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３３である。
【図６】ｐＮＢ２１３のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号３４であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３５である。
【図７】ｐＮＢ２１４のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号３６であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３７である。
【図８】ｐＮＢ２１５のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号３８であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３９である。
【図９】ｐＮＢ２１６のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号４０であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号２７である。
【図１０】ｐＮＢ２１７のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号４１であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３１である。
【図１１】ｐＮＢ２１８のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号４２であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３５である。
【図１２】ｐＮＢ２１９のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号４３であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３７である。
【図１３】ｐＮＢ２２０のプラスミド地図及びコードされているＯＲＦを示す図である。コードされているＯＲＦのヌクレオチド配列は配列番号４４であり、コードされているＯＲＦのアミノ酸配列は配列番号３９である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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