(57)【要約】複数の系列の抗生物質を同時に分析する分析用キットであって、少なくともサンプル中の各抗生物質のそれぞれを特異的に認識する生物学的分子と、コロイド金に付着した化合物とを含有する反応性混合物と、固形担体の既知の位置に反応性混合物中の生物学的分子を特異的に捕捉するリガンドが配置された捕捉システムとを含んで構成される分析用キットと、この分析用キットにより複数の系列の抗生物質を同時に分析する方法。【選択図】図１
2008536130.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる系列の抗生物質、少なくともβ−ラクタム系およびテトラサイクリン系抗生物質を同時に分析するための分析用キットであって、
少なくとも、β−ラクタム系抗生物質を特異的に認識する第１の受容体と、
テトラサイクリン系抗生物質およびビオチン化された核酸断片を競合的かつ特異的に認識する第２の受容体とを含有し、
前記両受容体が、コロイド金の粒子によって直接的に、または抗体及びプロテインＡが付着した抗体のいずれかを介して間接的にマーキングされて成る単一の反応性混合物と、
ニトロセルロース膜の所定の位置に区画された２つの試験ゾーンに、それぞれβ−ラクタム環を有する抗生物質及びアビジン、またはこの逆、が沈着された固体担体から成る捕捉システムとを備え、
前記捕捉システムの両試験ゾーンで検出される各々のマーキング強度が、マーキングされた各受容体が各抗生物質を競合的に認識する結果に基づくように構成されることを特徴とする分析用キット。
【請求項２】
ニトロセルロース膜に結合したβ−ラクタム環を有する前記抗生物質がペニシリンまたはセファロスポリン、好ましくはβ−ラクトグロブリンに固定したアンピシリンであり、前記アビジンが、卵白アビジンであることを特徴とする請求項１に記載の分析用キット。
【請求項３】
異なる系列の抗生物質、少なくともβ−ラクタム系抗生物質およびスルファミド系抗生物質を同時に分析するための分析用キットであって、
少なくともコロイド金の粒子によって直接または間接的にマーキングされβ−ラクタムを特異的に認識する第１の受容体と、ビオチン化された抗スルファミド抗体と、コロイド金の粒子によって直接または間接的にマーキングされたスルファミドの類似体とを含んで成る単一の反応性混合物と、
ニトロセルロース膜の所定の位置に区画された２つの試験ゾーンに、それぞれβ−ラクタム環を有する抗生物質及びアビジン、またはこの逆、が沈着された固体担体から成る捕捉システムとを備え、
前記捕捉システムの両試験ゾーンで検出される各々のマーキング強度が、各抗生物質を競合的に認識する結果に基づくように構成されることを特徴とする分析用キット。
【請求項４】
異なる系列の抗生物質、少なくともテトラサイクリン系およびスルファミド系の抗生物質を同時に分析するための分析用キットであって、
少なくともテトラサイクリン系抗生物質およびビオチン化された核酸断片を競合的かつ特異的に認識する受容体を含有し、
前記受容体が、コロイド金の粒子によって直接、または抗体を介して間接的にマーキングされており、
さらに、抗スルファミド抗体と、
コロイド金で直接または間接的にマーキングされたスルファミド類似体とを含んで成る単一の反応性混合物と、
ニトロセルロース膜の所定の位置に区画された２つの試験ゾーンに、それぞれテトラサイクリン受容体またはテトラサイクリン受容体の特異的抗体のいずれかを特異的な標的とする抗体、および抗スルファミド抗体を特異的な標的とする抗体、またはこの逆、が沈着された固体担体から成る捕捉システムとを備えることを特徴とする分析用キット。
【請求項５】
前記反応性混合物に添加された特異的抗受容体抗体が、化学的にまたは組換えによって修飾または非修飾され、精製または非精製であり、マーキング粒子、好ましくは、コロイド金の粒子に直接または間接的に付着または非付着しているモノクローナルまたはポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析用キット。
【請求項６】
前記ニトロセルロース膜が沈着されたディップスティック担体の一端が膜に、他端が吸収紙に接触するとともに、
液体の流れ方向に沿って配置された前記試験ゾーンと、
２つの試験ゾーンを区画する対照ゾーンとを有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の分析用キット。
【請求項７】
前記対照ゾーンが、好ましくは、コロイド金の粒子によってマーキングされたタンパク質調製物によって、より好ましくは、コロイド金の粒子に付着したウシ血清アルブミンもしくはＢＳＡによって得られることを特徴とする請求項６に記載の分析用キット。
【請求項８】
β−ラクタム系、テトラサイクリン系、およびスルファミド系抗生物質を同時に分析するための分析用キットであって、
前記反応性混合物が、さらに、コロイド金の粒子で直接または間接的にマーキングされ、スルファミド系抗生物質を特異的に認識する抗体を含み、
前記捕捉システムが、さらに、スルファミドとコンジュゲートしたタンパク質の調製物が前記ニトロセルロース膜に固定されて成ることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の分析用キット。
【請求項９】
前記ニトロセルロース膜が沈着されたディップスティック担体の一端が膜に、他端が吸収紙に接触するとともに、
液体の流れ方向に沿って配置された３つの前記試験ゾーンと１つの対照ゾーンとを有するか、または、
液体の流れ方向に沿って配置された３つの前記試験ゾーンを有し、２つの前記試験ゾーンの間に配置された２つの前記対照ゾーンとを有することを特徴とする請求項８に記載の分析用キット。
【請求項１０】
異なる系列の抗生物質に相当する分析物、少なくともβ−ラクタム系、テトラサイクリン系、およびスルファミド系抗生物質を同時に分析するための分析用キットであって、
少なくとも、β−ラクタム系を特異的に認識する第１の受容体と、
テトラサイクリンおよび核酸のビオチン化断片を競合的かつ特異的に認識する第２の受容体を含有し、
両方の前記受容体が、コロイド金で直接、または抗体若しくはプロテインＡに付着した抗体を介して間接的にマーキングされ、
さらに、抗スルファミド抗体と、
直接または間接的にコロイド金の粒子でマーキングされ遊離スルファミドの類似体とを含有して成る単一の反応性混合物と、
ニトロセルロース膜の所定の位置に区画された３つの試験ゾーンに、それぞれβ−ラクタム環を有する抗生物質、アビジン、および抗スルファミド抗体を標的する抗体が沈着された固体担体から成る捕捉システムとを備え、
前記捕捉システムの３つの前記試験ゾーンで検出される各々のマーキング強度が、各抗生物質を競合的に認識する結果に基づくように構成されることを特徴とする分析用キット。
【請求項１１】
分析試料が実質的に液体であり、牛乳、蜂蜜、肉、卵、または生物由来の液体のいずれかであることを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の分析用キット。
【請求項１２】
前記β−ラクタム系及びテトラサイクリン系抗生物質の分析に使用される受容体がＢｌａＲ受容体及びＴｅｔＲ受容体であり、既知の系統の微生物、好ましくは、ＢｌａＲについては黄色ブドウ菌、ＴｅｔＲについては大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ  ６００）のプラスミドｐＳＣ１０１から単離されることを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の分析用キット。
【請求項１３】
請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の分析用キットを用いた分析方法であって、
前記反応性混合物と、系列を判定する試料とを接触させて溶液を調製し、前記溶液を３０℃〜５０℃の温度で３〜１５分間インキュベートする段階と、
前記捕捉システムを有するディップスティックを得られた溶液に浸漬し、３〜１５分間インキュベートする段階と、
前記ディップスティック上に現れた結果を裸眼によって視覚的に、または光学的ディップスティックリーダーによって判定する段階と
を含むことを特徴とする分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的に認識される分子を捕捉して１つの混合体中にある複数の異なる抗生物質を高感度で検出すると同時に、各抗生物質が属する系列を特定することができる方法に関し、ある系列に属する抗生物質を特定するための分析機序が、別の系列に属する抗生物質を特定するための分析機序を妨害しないという条件の下で行なわれる。
【０００２】
本発明は、この方法を実行するための分析用キットにも関する。
【背景技術】
【０００３】
食品の監視とチェックの基本原則は、食品の製造過程のできるだけ上流で分析を行い、汚染の疑いがある食品を迅速に特定し取り除くことである。
【０００４】
一般な分析試験として行なわれる、「スクリーニング」とよばれる分析試験の場合、最初の分析で陽性とされたサンプルは、実際に陽性であると見なされ、「確認」試験と呼ばれる次の試験にかける必要がある。他方、最初の分析結果が陰性の場合には、これは十分であり、さらなる分析で結果を再確認する必要はない（１）。
【０００５】
この分析試験で重要な点は、第１に、最初の分析で極力多数の抗生物質の検出が可能でなければならない。したがって、分析またはスクリーニング試験は、一つのサンプルについて複数の抗生物質を検出可能な複数試料分析試験でなければならない。
【０００６】
第２に、確認試験は、対象とする抗生物質を単離および特定しておくことが必要な極めて特異的な確認方法であるため、スクリーニング試験から確認試験に直ちに切り替えることができるように、スクリーニング試験で陽性とされたサンプルに含まれる抗生物質の系列が分かることが重要である。
【０００７】
第３に、スクリーニング試験は「誤った陰性」を示してはいけないということである。これは、その後の確認試験が行なわれないためである。
【０００８】
以下に示すように、抗生物質の検出方法が種々知られている。
その一つは、試料の細菌株の増殖に対する阻害力を測定する微生物学的試験である。
この種類の試験では、結果が得られるまでに比較的長いインキュベーション時間（３〜１６時間）が必要とされる。一般に、これらの試験（デルボテスト（Ｄｅｌｖｏｔｅｓｔ  ＳＰ）（登録商標）、ＢＲＴ試験、コパン（Ｃｏｐａｎ）（商標）、エクリプス（Ｅｃｌｉｐｓｅ）（商標）、バリオ（Ｖａｌｉｏ）（商標））では、使用される細菌株がしばしば種々の系列の抗生物質に敏感であるため、種々の系列の抗生物質を同時に認識し得る。
しかし、この種の試験では、分析対象の各抗生物質が属する系列を正確に特定することができない。
また、サンプル中の対象とする抗生物質と、単一認識サイトとして受容体または抗体のいずれかを有するマーキング競合化合物との競争反応を利用して抗生物質を検出するインビトロ試験が行なわれている。エリザ（ＥＬＩＳＡ）（酵素免疫蛍光測定法）またはＲＩＡ（放射性免疫測定法）／ＲＲＡ（放射線受容体測定法）において、分析のために必要とされる時間は約２〜６時間である。これらの方法、特にＲＲＡ実験法は、種々の系列の抗生物質のいくつかを同時に検出し得る。しかしこの場合、この方法では陽性を示す各抗生物質の系列を特定することはできない。
また、最近まで、対象とする抗生物質を単離し特定することが可能な物理化学的方法は、主にクロマトグラフ分離システムと質量分析検出システム（ＧＣ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳ）とを組み合わせる方法であった。この方法では、対象とする各抗生物質に応じて、適切な条件を設定する必要がある。この方法では、単一の抗生物質、または同じ系列の複数の抗生物質を同時に分析することが可能であり、また同じ系列の抗生物質のすべてを検出することは可能であるが、複数の系列の抗生物質ではけっして可能ではない。クロマトグラフ分離の原理は、所定の抗生物質の物理化学的特性の特徴を利用しているが、これらの特性はしばしば抗生物質の系列ごとに異なる。分析しようとする抗生物質の種類が分からない場合、存在する全ての抗生物質の系列についての方法を考慮しなければならない。
【０００９】
近年、はるかに迅速な方法が開発されている。これらの方法は、「迅速（ＲＡＰＩＤ）試験」と呼ばれ、多数のサンプルについて迅速なスクリーニング試験を行うために使用される。一般に、これらの方法では、生体分子化合物の競争反応を利用して抗生物質の特定を行なう。分析を迅速かつ容易にするために、これらの種類の試験には、側方流動を有する膜デバイス（テトラセンサー（Ｔｅｔｒａｓｅｎｓｏｒ）（商標）、ＳＮＡＰ（登録商標）、ベータ−スター（Ｂｅｔａ−ＳＴＡＲ）（商標）、ＲＯＳＡ）が用いられる。これらの試験は抗生物質の系列に従って分類されるが、今まで単一の操作で種々の系列に属する抗生物質を検出できるものはない。
【００１０】
農業食品業界に一次スクリーニング分析を課すことは妥当だとしても、できるだけ多数の疑わしい抗生物質を特定することが可能な完成度の高い分析方法が要求されるであろう。各々の抗生物質毎に特定の試験を行うのではなく、複数試料分析試験を一回行うことがより実用的かつ経済的である。この業務には、多大な時間、試料管理、および費用を必要とする。これは食品の効率的管理の障害となる。
【００１１】
例えば１０分未満程度でいくつかの系列の抗生物質のすべてを検出することが可能な複数試料分析試験が存在しないことによって、チェックの効率が大きく制限される。
【００１２】
特に、農業食品産業は、一回の操作で少なくとも２つの系列に属する抗生物質の分析を可能にする新しい方法に関心がある。
【００１３】
動物に投与される抗生物質の種類は、適用が治療目的または予防目的であるか、あるいは、動物種、対抗する細菌、獣医学診療、適用される法律、利用可能な手段、さらに地理的地域によって変動しうる。一部の特定の治療の場合、薬剤の混合物が使用される。原則として、医師は、有効であると評価するすべての市販抗生物質の中から選択される抗生物質製剤を使用する。
【００１４】
使用される抗菌剤および抗生物質の主な系列は、ペニシリンおよびセファロスポリン、テトラサイクリン、スルファミド、アミノグリコシドおよび
アミノサイクリトール、マクロライド、クロラムフェニコールまたは他のペプチド、イオノフォア、ニトロフラン、キノロン、カルバドックス等である。これらの系列は、化学的に異なるきわめて広範囲の化合物に及ぶ。
【００１５】
獣医薬および農業生産における抗生物質の集中的な使用は、抗生物質に対して耐性となった細菌株の出現をもたらすと考えられている。ヒトの健康を保護し、かつこの分野において法律を制定するために、多くの国々（欧州連合、米国、カナダ等）は食品の抗生物質の残留物に対する最大限の許容限界（ＭＲＬ−許容残留量）を設定した（２）。ある程度、これらのＭＲＬにより、陽性試料と陰性試料、すなわち、不合格試料と合格試料との間の境界が設定される。
【００１６】
同時に、２００２年８月１２日の委員会決定では、試料を検査するために使用される分析方法に適用可能な必要最低限性能限界（ＭＲＰＬ）が確立され、結果の判定の一般基準が規定された（３）。
【００１７】
指令９６／２３／ＥＣの規定を満足するスクリーニング試験は、立証可能な証拠に基づき、エラー率５％未満の基準に一致することを認証できる分析方法であるとされている。
【００１８】
１９９５年には、抗生物質の含量を分析した全試料の平均１パーセントがＭＲＬよりも高いレベルを有し、陽性を示した。これらの陽性が確認された場合、最も検出頻度の高い抗生物質はペニシリンおよびテトラサイクリンであった（４）。
【００１９】
テトラサイクリンを検出するためのシステムが、出願人の「遺伝子調節機序および対応する分析キットを使用するインビトロ分析を実行するための方法」という名称の特許出願ＷＯ−Ａ−０３／０４８７７０号に記載されている。この方法では、テトラサイクリン以外のものを検出することはできない。好ましい処方では、試薬は、テトラサイクリンに対する耐性を生じる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子制御機序から単離されたＴｅｔＲ受容体と、受容体およびコロイド金とコンジュゲートしたプロテインＡ調製物を認識することができる抗体と、を含んで成る。また、回収(捕捉）システムは、ニトロセルロース膜に固定されたアビジン分子に付着可能な、ビオチン化された特異的ＤＮＡの断片である。インキュベーション中に、試料の存在下で受容体とＤＮＡの断片との相互作用が生じるのは、テトラサイクリンが存在しないときのみであり、ＤＮＡの断片と受容体とが錯体を形成したとき、受容体に付着した金粒子が発色信号を生じる。一方、受容体がテトラサイクリンを認識した場合はＤＮＡの断片と錯体を形成することができず、その結果、発色信号は生じない。
【００２０】
β−ラクタムを認識するシステムが、「生体液体におけるβ−ラクタム環を有する抗生物質を判定するための方法」という名称の特許ＷＯ−Ａ−９９／６７４１６号に記載されている。この方法によれば、β−ラクタム以外のものを検出することは不可能である。発明者は好ましい処方において、精製されビオチン化学的されたリケニホルミス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の単離受容体と、この受容体に会合するコロイド金でコンジュゲートした抗ビオチン抗体調製物を開示し、さらに、ヒト免疫グロブリンに結合したセファロスポリンがニトロセルロース膜に固定された結合体を開示している。試料中にβ−ラクタムが無い場合、ビオチン受容体は膜に固定された抗生物質に付着し、ビオチン受容体に付着した金粒子によって生じる発色信号が検出される。一方、予備インキュベーション中にサンプル中の抗生物質にビオチン受容体が結合した場合は、ビオチン受容体は固定された抗生物質とは結合することができず、発色信号は生じない。
【００２１】
迅速スルファミド認識システムが、Ｒ．ヘルハイエン（Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ）らによって記載され（５）、かつ「サルファジミジン残留物の検出のための一段階ストリップ試験の開発」という名称としても知られている。このシステムでは上記のβ−ラクタムの検出のものと同様の原理が用いられている。一例を挙げると、スルファジミジンに特異性を有する抗体がコロイド金とコンジュゲートされ、スルファジミジンがオボアルブミンにコンジュゲートされてニトロセルロース膜に固定される。試料が抗体によって認識されるスルファジミジン系抗生物質を含む場合、コロイド金とコンジュゲートした抗体と錯体を形成し、膜に固定されたスルファジミジンと抗体の錯体形成を不能にする結果、膜への付着が不能になる。一方、試料にスルファジミジン系抗生物質が存在しないとき、金粒子がコンジュゲートされた抗体は、膜に固定されたスルファジミジンを認識し、発色信号を生じる。この文献はこの試験の特異性を記載していない。
【００２２】
今まで周知の側方流動による迅速方法および工程は、全て単一の系列の抗生物質の検出にのみ適用され、また、今まで少なくとも２種類の系列に属する抗生物質のすべてを単一の操作で検出する方法はない。この主な理由は、一回の分析操作で各系列の抗生物質の検出に必要とされる薬剤のすべてを独立し、かつ互いに妨害することなく用いることが技術的に困難なことにある。第２の問題は、検出された抗生物質が属する系列を特定することが困難なことにある。
【００２３】
以上をまとめると、小分子（ＭＷ＜２，０００）を検出するための周知の迅速システムは、細菌由来の受容体または免疫グロブリン（抗体）等の検出対象の抗生物質を特異的に認識することができる分子と、抗生物質を特異的に認識する部位に対する競合化合物との２つの構成要素を必要とする、競争反応を利用して行なわれる。選択される方法により、構成要素の１つが不溶性の担体に固定され、他の要素はマーキングされる。ある場合には（フォーマット１、下記参照）、マーキングされるのは認識分子で、固定されるのは抗生物質の類似体であり、また別の場合には（フォーマット２、下記参照）、マーキングされるのは抗生物質の類似体で、不溶性物に付着するのは認識分子である。
【００２４】
テトラサイクリン検出システムの独創性は、受容体が２つの相互依存した認識サイトを含んで成る結果、競合化合物が検出対象である抗生物質の類似体ではなく、同じ受容体の第２の認識部位に結合することができるＤＮＡの断片である点にある。
【００２５】
すべての「迅速試験」と呼ばれる方法では、評価は「試験」ゾーン、すなわち、受容体の捕捉要素が固定された部分で生じる発色信号の強度と、「対照」ゾーン、すなわち、他の試薬（または過剰な試薬）が捕捉された部分で得られる別の発色信号の強度を比較することによって行われる。一般に、「試験」ゾーンにおける強度が「対照」ゾーンにおける強度よりも強いとき、検出対象の抗生物質は陰性と判断される。
【００２６】
すべてのβ−ラクタム系抗生物質の分析では、認識分子はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）調製物から得られ、すべての場合、この認識分子は精製後にマーキングされる。マーキングを行なうために、表面に化学修飾を施す。例えば、ペルオキダーゼまたはビオチンによるステアロサーモフィラス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）受容体の例や、ビオチンによるリケニホルミス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）受容体の例（Ｕ．Ｃ．Ｂ．  Ｓ．Ａ．によるＷＯ−Ａ−９９／６７４１６およびＵＳ−Ａ−６，５２４、８０４）、またはさらにコロイド金と直接コンジュゲートしたステアロサーモフィラス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）受容体の例（チャーム社（Ｃｈａｒｍ  Ｉｎｃ．）によるＵＳ−Ａ−６，４７５，８０５）などである。テトラセンサー（Ｔｅｔｒａｓｅｎｓｏｒ）（商標）法を除き、今まで知られている限り、認識分子を化学的に修飾して発色錯体を得ることが必要である。このために、認識分子を精製しその表面の置換基を修飾することが必要であるが、これには認識分子の主要な機能または安定性の特性を変化させるリスクを伴う。
【００２７】
したがって、今まで知られている限り、未精製の原料、または化学修飾されていない受容体による分析は一般に不可能である。
【００２８】
また、「テトラサイクリン」の分析において使用されるタイプのマーキングは、β−ラクタムの分析と互換性はない。これは、すべての報告された場合において「対照」ゾーンに免疫グロブリンを固定することが不可避であるためである。ＷＯ−９９／６７４１６の場合、競合化合物の「試験」ゾーンへの固定に用いられるタンパク質も免疫グロブリンである。テトラサイクリンの分析におけるようなプロテインＡの使用は、必然的にβ−ラクタム系抗生物質の検出に必要とされる一方または両方の捕捉ライン上に非特異的マーキングを生じさせる。
【００２９】
別の方法としてマーキングまたは担体への固定にアビジン−ビオチンの組合せを使用する場合、アビジン−ビオチンの組合せは、一種類の抗生物質を特定するための方法においてのみ使用されうる。アビジンが固定部分に用いられる場合は、すべてのビオチン化された分子がそこに付着することは可能である。かかる場合、例えば文献ＷＯ−Ａ−９９／６７４１６および文献ＷＯ−Ａ−０３／０４８７７０に記載された２つの分析機序の組合せに基づいて、β−ラクタムとテトラサイクリンをともに検出することが可能とは考えられない。第１のケースでは、受容体はビオチン化され、次いでビオチン抗体−金の錯体によってマーキングされ、第２のケースでは、アビジンは固定され、ＤＮＡのビオチン化断片を捕捉する。これら２つの分析機序の組合せは、アビジン−ビオチンの組合せを使用する２つの独立した系でさらなる問題をもたらすことになる。２つの既存の系の組合せにおいて、ビオチン化されたβ−ラクタム系の受容体は、テトラサイクリン系のＤＮＡを捕捉するために必要なアビジンにも結合する結果、試料におけるテトラサイクリンのレベルとは無関係に非特異的マーキングをもたらす。さらに、移動相におけるビオチン抗体−金錯体の存在は、ビオチン化されたＤＮＡを妨害し、その捕捉に必要とされるアビジンを認識できないようにし、これはさらに別の問題をもたらすことになる。
【００３０】
また別のアプローチとして、２つの独立した認識システムを組合せる場合、各々のマーカーの内部基準に対する発色強度によって結果を評価するとき、結果の読取りと判定がきわめて複雑な認識システムとなる。この場合、２つの「試験」バンド（「β−ラクタム」および「テトラサイクリン」）および２つの「対照」バンドが存在することになる。この方法は、分析を簡単にも実用的にもしない。２つの試験の組合せに照らして、互いに比較することによって各々の試験の強度を評価するほうがよい。かかる手順において、分析物(検体）番号１の「試験」ゾーンは分析物(検体）番号２の「対照」ゾーンとなり、分析物(検体）番号２の「試験」ゾーンは分析物(検体）番号１の「対照」ゾーンとなる。
２つの系列の抗生物質が同じ試料中に含まれている場合には、この方法では発色信号はまったく、またはほとんど生じない。これは稀なケースであるが、可能であれば、β−ラクタムとテトラサイクリンが含まれる場合、結果の判定の問題を回避するために両方の発色信号の相対強度をより容易に評価することを可能にする単一の対照線を呈する単一の対照を用いることが推奨される。明らかに、この単一の対照線は、２つ以上の試験を組み合わせて一つの方法にする場合に必要となる。
【００３１】
さらに別のアプローチとして、分析用キットのディップスティックを形成するために選択される材料は、２つの系列の抗生物質を同時に分析するために適していなければならない。ＷＯ９９／６７４１６に記載された好ましい実施形態において、「ロイコソルブ（Ｌｕｅｋｏｓｏｒｂ）（登録商標）」膜の使用が推奨されているが、これはわれわれがテトラサイクリン試験に推奨した方法に適さず、かつ複数試料分析試験に適さない。きわめて不思議なことに、両方の受容体がそのそれぞれの抗体によってマーキングされる場合、試薬が捕捉点に到達する前にロイコソルブ（Ｌｕｅｋｏｓｏｒｂ）（登録商標）と接触すると、β−ラクタムの明確なカットオフ点を得ることは不可能である。この膜は、その効果が牛乳の精製および側方流動における使用で示されたが、この膜はマーキングがコロイド金とコンジュゲートした抗体およびプロテインＡによって行なわれる場合に非特異的認識信号の発生原因となる。
【００３２】
また別のアプローチにおいて、各系列に属するすべての抗生物質を認識する受容体の選択が重要である。この選択は、受容体が抗生物質を認識する性能によってだけではなく、安定性、構造、抗原反応性、アミノ酸組成等によっても決定される。
【００３３】
結論として、周知の方法に基づく限り、２つ以上の独立した分析方法を単一の分析方法にまとめることは先験的に不可能である。例えば、β−ラクタム系およびテトラサイクリン系抗生物質を認識する各受容体を、一方を認識する分析機序が他方を認識する分析機序に確実に干渉しないようにしながら化学修飾し、組み合わせることができるとは考えられない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
［発明の目的］
本発明は、少なくとも２つの異なる系列に属する抗生物質が（理論上無制限に）組み合わされた混合物中の抗生物質の検出と、検出された抗生物質が属する系列の特定を同時に行なうことができる新しい分析方法を提供することを目的とする。
【００３５】
特に、本発明は、少なくとも２つの分析機序を、一つの分析機序が他の分析機序を妨害することなく単一の分析方法に組み合わせることが、技術的および実用的に実現可能であることを明らかにすることを目的とする。
【００３６】
本発明の別の目的は、複数の検体の分析を、単一の試料につき一回の分析操作で、例えば３０分未満のように迅速に行なえることを技術的に明らかにすることである。
【００３７】
本発明の別の目的は、少なくとも２つの系列の抗生物質の検出および特定を同時に行なえる方法、およびインビトロ分析用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
本発明の第１の目的は、請求項１、３、４、および１０のように、種々の系列の抗生物質、すなわちβ−ラクタム系、テトラサイクリン系、およびスルファミド系からの少なくとも２つの系列に属する少なくとも２種の検出物の検出と定量を同時に行なう分析用キットに関し、これは例えば、好ましくは、溶液または凍結乾燥物の形態の少なくとも２種類の生物学的分子を含んで成り、各生物学的分子が前記種々の系列に属する検出物を含むサンプル中の所定の各検出物を同時かつ特異的に認識することが可能な、単一の反応性混合物と、単一の固形担体の形態の捕捉システムであって、固形担体の既知の位置に前記反応性混合物中の前記生物学的分子を特異的、選択的、排他的に捕捉するリガンドが配置され、
前記担体上の捕捉位置でサンプル中の抗生物質の属する系列を特定することが可能な捕捉システムとを備えることを特徴とする。
【００３９】
場合により、捕捉システムに、対象とする抗生物質と類似の競合化合物を用い、溶液中の受容体をマーキングしてもよく、あるいは溶液中の競合類似体をマーキングし、捕捉システムに受容体を用いてもよい。本発明によれば両者を併用してもよい。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態は、従属請求項２、５、および９、および１１−１２に記載されている。
【００４１】
本発明の第２の目的は、請求項１３のように、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の分析用キットによる分析方法に関し、以下の段階を有することを特徴とする。
上記の反応性混合物と、系列を決める試料とを接触させて溶液を調製し、この溶液を３０℃〜５０℃の温度で３〜１５分間インキュベートする段階。
捕捉システムを有するディップスティックを、得られた溶液に浸漬し、３〜１５分間インキュベートする段階。
ディップスティック上に現れた結果を裸眼によって視覚的に、または光学的ディップスティックリーダーによって判定する段階。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、受容体の精製を回避することが好ましい。また、受容体を、例えばコロイド金で直接マーキングした抗受容体抗体、あるいは、好ましくはコロイド金を付着させたプロテインＡでマーキングした受容体抗体により、化学修飾することを回避することが好ましい。
他方、複数試料分析試験の観点からは、コロイド金でマーキングされたプロテインＡは、溶液中のすべての抗体の一般的なマーカーとして作用する。
【００４３】
本発明において使用される受容体と抗体の機能を最大に保つための原則は、化学修飾によるマーキングを生起させないことである。この結果、本発明ではできるだけ自然な状態の細菌由来受容体を使用する。これらの受容体は、コロイド金とコンジュゲートしたプロテインＡを認識する抗体を介してマーキングされる。したがって、金に付着するのはマーキングタンパク質のみであり、分析対象の抗生物質を認識する認識分子ではない。
【００４４】
この方法により、認識分子のすべての官能基は保護される。この利点は、例えばリジン残基の特定の側鎖に基づく認識機能を利用しようとする場合に十分活かされる。化学修飾が起こる場合、報告されているほとんどの場合において、リジン側鎖のＮＨ３＋残基の化学修飾が生じることは重要である。結論として、リジンの化学修飾はリジンの活性部位の劣化をもたらし、調製された薬剤が部分的に不活性になりうる。
【００４５】
抗体によるマーキングは、非固定マーキングであるため柔軟性がある。化学的マーキングは不可逆的共有結合を意味するが、抗体の付着は可逆的であり、作用する力によって平衡がシフトしうる。別の利点は、前記の２番目の段階におけるマーキングを調節できることである。本発明の第２の方式において、抗体が受容体を認識するのは、抗生物質が試料中に遊離しているか、捕捉のために固定されているかに関係なく、受容体が抗生物質を認識した後の段階である。
【００４６】
費用や安定性等の理由だけでなく、複数試料分析試験にうまく適用するためにも、本発明では、黄色ブドウ球菌から単離されたβ−ラクタム受容体（６）を使用することが好ましい。
【００４７】
このβ−ラクタム受容体は、抗生物質、特にβ−ラクタム系抗生物質に抗する能力に関して最も有効な細菌由来受容体であり、インビトロで使用されたときこの受容体は、ペニシン系およびセファロスポリン系のすべてのβ−ラクタム系抗生物質に対し格別の認識能力を示す（文献（６）および実施例に示した結果を参照）。
【００４８】
この受容体の別の利点は、アルカリ性の等電点（ｐＩ）を有することである。これにより細胞の抽出物から抗体を得るとき、極めて容易に精製することができる。
【００４９】
また、われわれの選択は、きわめて特異的であり、複数試料分析試験に関係する残りのすべての試薬との非特異的応答を生じないことが、ウサギによる免疫応答の所見によっても確認されている。
【００５０】
本発明によれば、完全に異なる分析機序を使用して、異なる系列のいくつかの抗生物質の検出に必要なすべての要素を単一の操作に組み合わせた方法が成功裏に構築された。
【００５１】
本発明は、また、確実かつ経済的な複数試料分析試験を提供する。受容体や調製された抗体を精製する必要はなく、さらに、受容体を化学修飾しないので、受容体の反応性および安定性が完全に保護される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
背景技術で述べたように、本発明の競合試験は、２種類のフォーマットが考えられる。第１の場合（フォーマット１）では、受容体はコロイド金とコンジュゲートされ、分析対象の抗生物質の類似体である競合物質は、特定の捕捉点に固定されることによって捕捉システムとして作用する。
第２の場合（フォーマット２）、分析対象の抗生物質に類似する競合物質は、コロイド金とコンジュゲートされ、受容体は特定の捕捉点に固定されることによって捕捉システムとして作用する。
場合によっては、混合システム（上記のフォーマット１および２）の複数試料分析試験も可能である。
【００５３】
＜実施例１：特異的受容体によるテトラサイクリン系およびβ−ラクタム系の同時分析（両者の検出にフォーマット１を用いる）＞
この方法では、β−ラクタム系とテトラサイクリン系抗生物質の各受容体および各受容体に対する各種試薬を含有する反応性混合物と、各受容体の特異的リガンドが正確に区画された場所に固定された捕捉システムとが使用される。
【００５４】
［反応性混合物の調製］
β−ラクタム系抗生物質を検出するために、反応性混合物には、β−ラクタムを認識するための特異的受容体、この受容体の特異的抗体、およびコロイド金とコンジュゲートしたプロテインＡの調製物が含まれる。また、テトラサイクリン系抗生物質を検出するために、反応性混合物には、テトラサイクリンの受容体、この受容体の特異的抗体、ビオチンとコンジュゲートしたＤＮＡの特異的断片、およびコロイド金とコンジュゲートしたプロテインＡの調製物が含まれる。
【００５５】
β−ラクタム受容体は、ゴレミ・コトラ（Ｇｏｌｅｍｉ−Ｋｏｔｒａ）ら（６）の方法によって得られる。未精製受容体は、ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＨＶ膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）、米国）でろ過され、４℃で５０％ｖ／ｖのグリセロールの存在下に保存される。テトラサイクリン受容体は、特許出願ＷＯ−Ａ−０３／０４８７７０号に記載された方法によって得られる。
【００５６】
両受容体の抗体調製物は、カチャブ（Ｋａｃｈａｂ）ら（７）の方法によって得られる。これらの抗体調製物は、β−ラクタム受容体についてはゴレミ・コトラ（Ｇｏｌｅｍｉ−Ｋｏｔｒａ）ら（６）に記載の、テトラサイクリン受容体については出願ＷＯ−Ａ−０３／０４８７７０号に記載されたタンパク質の均質性まで精製受容体の調製物を撹拌することによって得られた。両方の抗体は、好ましくは、未精製で使用される。すなわち、反応性混合物に直接添加されるのは未精製血清である。第２の好ましい実施形態によれば、ポリクローナルまたはモノクローナル型の特異的抗体は、当業者に周知の方法によって精製され、次いでフレンス（Ｆｒｅｎｓ）法（８）のコロイド金粒子に直接または間接的に結合される。
【００５７】
ＤＮＡ断片は、特許出願ＷＯ−Ａ−０３／０４８７７０号に記載された配列および調製に従い、ユーロゲンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）ＳＡ社（ベルギー）で購入できる。この実施例では、ＤＮＡ断片はニトロセルロース膜上の捕捉点に固定されず、反応性混合物に直接混入される。このＤＮＡ断片のビオチン化された末端が、捕捉点に固定されたアビジンによって捕捉される。（下記参照）
【００５８】
用いられるすべての試薬は、反応性および安定性のすべての特性を保存するために化学修飾または置換なしに導入される。これらの分子は精製または非精製であり、これは明らかな経済的利点を有する。
【００５９】
実施例において、より詳しくは、反応性混合物は以下を含んで成る。
−  濃度３６０ｎＭ（ナノモル）のβ−ラクタム受容体（ＲＳＡ）  ５部
−  濃度４．２μＭ(マイクロモル)のテトラサイクリン受容体（ＴｅｔＲ）  ５部
−  ＮａＣｌ  １５０ｍＭを含む５０ｍＭ(ミリモル)ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．８）で４倍に希釈した抗ＲＳＡ血清  １部
−  ＮａＣｌ  １５０ｍＭを含む５０ｍＭ(ミリモル)ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．８）で４倍に希釈した抗ＴｅｔＲ血清  １部
−  ＮａＣｌ  ６９０ｍＭ中の濃度が２５μＭの核酸の溶液  １部
−  ５２０ｎｍの光学密度（ＯＤ）＝１０のプロテインＡ−金（粒径４０ｎｍ）  １５部
−  ＢＳＡ２％、デキストラン１％、ショ糖５％を含む１２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ８）  ２２部
この反応性混合物は必要に応じて調製され、または２０時間凍結乾燥して調製される。
【００６０】
［捕捉システム］
捕捉システムは、反応性混合物中の認識分子と錯体を形成することができる化合物が所定の場所に固定されたニトロセルロース膜を含んで成る。これらの化合物は、「ベータ」信号に対して（β−ラクタムに対して）は、抗生物質、好ましくはペニシリンまたはセファロスポリン型の抗生物質であり、プロテインＡ、ビオチン、またはアビジンに対して特定の反応性を有さない分子に固定される。本発明の好ましい実施形態において、β−ラクトグロブリンに固定したアンピシリンが使用される。
また、「テトラ」信号に対して（テトラサイクリンに対して）は、ＤＮＡ断片の末端のビオチンを認識することができるアビジンである。卵白アビジンが好ましく使用される。
【００６１】
「ベータ」および「テトラ」捕捉ゾーンは、それらの位置が区画され所定の位置にある限り、一方を他方の前にするか、またはその逆にするかは特に指定なく、連続的に配置される。
分析される溶液中に存在する抗生物質の種類の特定を可能にするのは、この区画の位置である。両方の捕捉システムが同じ場所に配置された場合は、分析には影響ないが、どの種類の抗生物質が実際に存在するか判定するのは不可能であろう。
【００６２】
［アンピシリンがコンジュゲートされたβ−ラクトグロブリンの調製］
β−ラクトグロブリンは、多くのリジン残基（１０％）を含んで成る牛乳タンパク質であることから選択され、大部分のリジンは、タンパク質の外側にＮＨ２末端が面する三次元構造を有する（Ｐｕｂｍｅｄ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１ＧＸＡ）。
【００６３】
１００ｍｇのβ−ラクトグロブリンと１５ｍｇの２−イミノチオレンを、１００ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ８．５）４ｍｌの反応液中で、６０分間、２５℃でインキュベートする。次いで、この混合物を、５ｍＭ  ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７）で予め平衡状態にしたＰＤ１０カラム（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、英国（ＵＫ））上に沈着させ、同じ組成の緩衝液で溶出させる。分画されたタンパク質を公知の方法によって収集する。
【００６４】
さらに、１００ｍｇのＳＩＣＣを含む２ｍｌのＤＭＳＯを、２５ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ８）の中にアンピシリンナトリウムを５０ｍｇ／ｍｌ含む２ｍｌの溶液とともにインキュベートし、次に、５０ｍｇのタンパク質溶液の存在下に４時間、４℃でインキュベートする。最後にこの溶液を、２５ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．５）の１００倍容量を透析外液として、６時間、２回、透析する。
【００６５】
［中和アビジンの溶液の調製］
ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｃ．）（米国（ＵＳＡ））で入手可能な５ｍｇ／ｍｌの卵白アビジンの溶液を５０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．５）の中で調製する。
【００６６】
［ＢＳＡ−金の対照溶液の調製］
本発明では、試験前後で一定の強度で可視的な対照ラインを使用することが好ましい。この対照ラインは、好ましくは、「試験」ラインで発生した色と同様の色を示し、次のように合成される。
【００６７】
１０ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）の中で、フレンス（Ｆｒｅｎｓ）（８）法によって得られたコロイド金（粒径４０ｎｍ、光学密度ＯＤλｍａｘ＝３）の調製物２７ｍｌに、１０％ＢＳＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））溶液３ｍｌを添加する。混合物を２０℃で６０分間インキュベートし、次に、ＳＳ３４ローター（ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ））で４５分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離する。次いで、残留物をＮａＣｌ  １５０ｍＭを含む５０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液中に回収し、光学密度ＯＤλｍａｘ４５を得る。さらに、ニトロセルロース膜上に沈着させる溶液を同じ緩衝液で１５倍に希釈し、最終的に光学密度ＯＤを３にする。
【００６８】
［免疫クロマトグラフ法］
免疫クロマトグラフ法は周知であり、文献（免疫クロマトグラフ試験ストリップの開発：簡潔な指針（Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｔｅｓｔ  Ｓｔｒｉｐｓ：Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｇｕｉｄｅ）、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、米国（ＵＳＡ）１１／９６印刷文献番号ＴＢ５００、９６−２０４頁）に記載されている。
本発明において、上記で得られた調製物は、ニトロセルロース膜上の所定の区画された位置に、かつ好ましくは、液体の移動方向に沿って連続して個別に沈着される。
次いで、ニトロセルロース膜の一方の面に、例えば、アールストローム社（Ａｈｌｓｔｒｏｍ，Ｉｎｃ．）（米国（ＵＳＡ））で入手可能な１４２型またはワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）（英国（ＵＫ））で入手可能なＧＦＤＶＡ型のものであるが、パル（Ｐａｌｌ）（英国（ＵＫ））で入手可能なロイコソルブ（Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ）（登録商標）型のものではない膜を接触させ、他方の面には、例えばワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）（英国（ＵＫ））で入手可能な１７ＣＨＲ型の吸収紙を接触させる。
【００６９】
［ニトロセルロース担体への捕捉化合物の沈着］
試料中に存在する抗生物質の種類を特定することを可能にするのが捕捉システム上の位置である。溶液は、１μＬ／ｃｍの流量でＱｕａｎｔｉ−３０００型のバイオドット（Ｂｉｏｄｏｔ）（英国（ＵＫ））「ディスペンサー」によって沈着される。
【００７０】
２つのパラメータ（抗生物質）の検出の場合、β−ラクトグロブリンとアビジンの調製物が、対照ラインの両側にそれぞれ沈着される。例えば、調製されたβ−ラクトグロブリンコンジュゲートは対照ラインより下に沈着され、中和されたアビジン溶液は対照ラインより上に沈着される（図１）。結果として、β−ラクタム系抗生物質の存在は、β−ラクトグロブリン、すなわち、対照ラインより下に位置した試験ラインにマーキングが生じないことによって特徴づけられ、また、テトラサイクリン系抗生物質の存在は、対照ラインより上の試験ラインにマーキングが生じないことによって特徴づけられる。両方の抗生物質が十分な量存在する場合、対照ラインの両側には２つの信号のいずれも出現しない（図１参照）。
【００７１】
［牛乳のサンプル中のβ−ラクタムおよびテトラサイクリンの同時分析］
冷たい牛乳２００μＬを、上記により調製および／または凍結乾燥された５０μＬの試薬の存在下に、５０℃でインキュベートする。５０℃で３分インキュベーションした後、上記の捕捉システムを溶液中に浸漬する。最終判定は、３分のインキュベーション後に、マテスト社（Ｍａｔｅｓｔ）（ドイツ）で入手可能な光学ディップスティックリーダーによって行われる。
【００７２】
結果は表１に記載されている。この方法では、アンピシリン４ｐｐｂおよび／またはテトラサイクリン７５ｐｐｂの牛乳の試料を陽性と判断する。
【００７３】
表２は、言及したβ−ラクタム系およびテトラサイクリン系のさまざまな抗生物質について本方法の検出限界を示す。原則として、対照発色信号に対する試験発色信号の強度比が１以下である場合、試料は対象とするパラメータ（抗生物質）について陽性と判定される。
【００７４】
【表１】
2008536130.tif 000003
【００７５】
【表２】
2008536130.tif 000004
＜実施例２：テトラサイクリン系、β−ラクタム系、およびスルファミド系抗生物質の同時分析（フォーマット１による３種の検出）＞
この好ましい実施形態では、テトラサイクリン系およびβ−ラクタム系受容体に加え、スルファジメトキシン系抗生物質を認識する特異的抗体を用いる。
【００７６】
［反応性混合物の調製］
次の調合に従って、抗スルファジメトキシン抗体をさらに上記の混合物に添加する。
−  濃度３６０ｎＭのβ−ラクタム受容体（ＲＳＡ）  ５部
−  濃度４．２μＭのテトラサイクリン受容体（ＴｅｔＲ）  ５部
−  ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む５０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．８）で４倍に希釈した抗ＲＳＡ血清  １部
−  上記組成のＮａＰｉ緩衝液で４倍に希釈した抗−ＴｅｔＲ血清  １部
−  上記組成のＮａＰｉ緩衝液で２倍に希釈した抗スルファジメトキシン  １部
−  濃度５０μＭの核酸  １部
−  ５２０ｎｍの光学密度（ＯＤ）＝１０のプロテインＡ−金（粒径４０ｎｍ）  ２０部
−  ＢＳＡ２％、デキストラン１％、ショ糖５％を含有する１２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ８）  ２２部
この混合物は必要に応じて調製され、または２０時間凍結乾燥して調製される。
【００７７】
［捕捉システム］
捕捉システムは実施例１のものと同様であり、ここに抗スルファジメトキシン抗体分子を特異的に捕捉する第４のラインが組込まれる（第３の試験ライン）。その他の捕捉ゾーンは前記と同様であるが、図２のように、さまざまに配置される。
【００７８】
［スルファジメトキシンとコンジュゲートしたＢＳＡの調製］
ジクソン・ホランド（Ｄｉｘｏｎ−Ｈｏｌｌａｎｄ）およびカッツ（Ｋａｔｚ）（９）らの方法によって調製される。スルファジメトキシン１００ｍｇとＢＳＡ２００ｍｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２部とジオキサン１部を含んで成る２５ｍｌの混合物中に溶解し、２５％グルタルアルデヒド１２０μＬの存在下に、２５℃で３時間攪拌しながらインキュベートする。次いで、５０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．２）１００容量を透析外液として、４℃で６日間、１２時間ごとに緩衝液を交換しながら透析する。
【００７９】
［ニトロセルロース担体上への捕捉化合物の沈着］
３つのパラメータ（抗生物質）の検出の場合、捕捉ラインはニトロセルロース膜上の所定の区画された位置に、好ましくは液体の移動方向に沿って連続して個別に沈着される。好ましい実施形態によれば、β−ラクタム系、テトラサイクリン系、およびスルファジメトキシン系の捕捉ゾーン、および対照ゾーンは、それぞれ、液体の移動方向に沿って、第１、第２、第３、および最後に第４位置の順で配置される（図２）。単一の対照ゾーンが３つのマーカーの対照となる。別の実施形態として、前記実施例と同様、２つの対照ゾーンを各々の試験ゾーン間に組込むこともできる。
【００８０】
原則として、注意することは、本発明によれば、試験ラインおよび対照ラインは、必ずしも液体の移動方向に沿って配置される必要はない。したがって、分析キットは、配置の順序が「ベータ」−「テトラ」または「テトラ」−「ベータ」、「ベータ」−「スルファ」、または「スルファ」−「ベータ」（以下の実施例を参照）、「ベータ」−「テトラ」−「スルファ」または「スルファ」−「テトラ」−「ベータ」等であっても同等に十分に機能する。
【００８１】
［牛乳の試料におけるβ−ラクタム系、テトラサイクリン系、およびスルファジメトキシン系の同時分析］
冷たい牛乳２００μＬを上記のように調製および／または凍結乾燥した試薬５０μＬの存在下に５０℃でインキュベートする。５０℃で３分インキュベーションした後、上記の捕捉システムを溶液中に浸漬する。最終判定は、３分のインキュベーション後に、マテスト（Ｍａｔｅｓｔ）（ドイツ）で入手可能な光学ディップスティックリーダーによって行なう。
【００８２】
結果を表３に示す。この分析方法では、アンピシリン４ｐｐｂ、および／またはテトラサイクリン７５ｐｐｂ、およびスルファジメトキシン１００ｐｐｂの牛乳の試料を陽性と判断する。
【００８３】
表４は、言及したβ−ラクタム系、テトラサイクリン系、およびスルファジメトキシン系のさまざまな抗生物質についての、本方法の検出限界を示す。原則として、対照発色信号に対する試験発色信号の強度比が１以下である場合、試料は対象とするパラメータ（抗生物質）について陽性と判定される。
【００８４】
【表３】
2008536130.tif 000005
【００８５】
【表４】
2008536130.tif 000006
実施例３：β−ラクタム系およびスルファミド系の同時分析（β−ラクタムはフォーマット１、スルファミドはフォーマット２で検出）
【００８６】
［反応性混合物の調製］
反応性混合物は以下を含んで成る。
−  濃度３６０ｎＭのβ−ラクタム受容体（ＲＳＡ）が５部
−  ５２０ｎｍの光学密度（ＯＤ）＝１０のコロイド金が付着したモノクローナル抗ＲＳＡ抗体が１０部
−  ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む５０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．８）で希釈されたビオチン化抗スルファジメトキシン抗体  １部
−  ＢＳＡ−スルファジメトキシン−金（粒径４０ｎｍ）の希釈液  １０部
−  ＢＳＡ２％、デキストラン１％、ショ糖５％を含む１２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ８）  ２４部
この混合物は必要に応じて調製され、または２０時間凍結乾燥して調製される。
【００８７】
［抗スルファジメトキシン抗体のビオチン化］
１００ｍＭ、ｐＨ９．２の炭酸塩緩衝液で透析した抗−スルファジメトキシン抗体５ｍｇ／ｍｌを含む溶液８２５μＬを、１．５ｍｇ／ｍｌでビオチン−ＬＣ−ＮＨＣの溶液（ペルビオ社（Ｐｅｒｂｉｏ，Ｉｎｃ．）で入手可能）１６５μＬの存在下に、光を避けて２５℃で２時間インキュベートする。１Ｍ，トリス緩衝液（ｐＨ８）を１０μＬ添加し３０分間静置して反応を止め、次いで、ＮａＣｌ  １５０ｍＭを含む５０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．８）に対して１０時間の透析を２回行なう。
【００８８】
［金粒子とコンジュゲートしたＢＳＡ−スルファジメトキシンの調製］
対照ＢＳＡ−金溶液は、実施例２に記載されたＢＳＡ−スルファジメトキシンの調合液を用いて、実施例１と同様の方法でコロイド金を固定して調合する。
【００８９】
［捕捉システム］
捕捉システムは実施例１のものと同様である。しかし、この実施例では、対照ゾーンの上にある第２の捕捉部位に固定されたアビジンに、ビオチン化抗スルファミド抗体が捕捉される。
【００９０】
［牛乳の試料におけるβ−ラクタム系およびスルファジメトキシン系の同時分析］
冷たい牛乳２００μＬを、上記の調製試薬５０μＬの存在下に３０℃で１５分間インキュベートする。この第１のインキュベーション後、上記の捕捉システムを溶液中に浸漬する。最終判定を１５分間の第２のインキュベーション後に行う。結果を表５に示す。
【００９１】
【表５】
2008536130.tif 000007
実施例４：テトラサイクリン系およびスルファミド系の同時分析（フォーマット２により両方を検出）
【００９２】
［反応性混合物の調製］
反応性混合物は以下を含んで成る。
―  濃度４．２μＭのテトラサイクリン受容体（ＴｅｔＲ）  ５部
−  ５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１５０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．８）で希釈したモノクローナル抗ＴｅｔＲマウス抗体  １部
−  上記の組成のＮａＰｉ緩衝液で希釈した抗スルファミドウサギ抗体  １部
―  ＢＳＡ−スルファジメトキシン−金（粒径４０ｎｍ）の希釈液  １０部
−  濃度５０μＭのビオチン化された核酸  １部
―  ５２０ｎｍの光学密度（ＯＤ）＝１０の抗ビオチン−金（粒径４０ｎｍ）抗体  １０部
−  ＢＳＡ２％、デキストラン１％、ショ糖５％を含む１２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ８）  ２２部
この混合物は必要に応じて調製され、または２０時間凍結乾燥して調製される。
【００９３】
［捕捉システム］
捕捉システムは実施例１のものと同様である。しかし、この場合には、モノクローナル抗ＴｅｔＲ抗体が捕捉される第１の捕捉部位を形成するのは、抗ＴｅｔＲマウス抗体であり、また、抗スルファミド抗体が捕捉される第２の捕捉部位を形成するのはニワトリ抗スルファミドウサギ抗体である。
【００９４】
［肉の試料におけるテトラサイクリン系およびスルファミド系の同時分析］
ブタの筋肉１０ｇに  ５０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ８）３０ｍｌを添加し、ミニミックス（ＭｉｎｉｍｉＸ）（インターサイエンス社（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｆ）型の混合機で２分間混合する。次いで、エッペンドルフ（登録商標）チューブ中に収集した溶液を１分間、６，０００ｒｐｍで遠心分離し、それから上清を回収する。上清２００μＬを上記の調製試薬５０μＬの存在下に２５℃で１５分間インキュベートする。この第１のインキュベーション後、上記の捕捉システムを溶液中に浸漬する。最終判定を１５分間の第２のインキュベーション後に行う。結果を表６に示す。
【００９５】
【表６】
2008536130.tif 000008
＜実施例５：β−ラクタム系、テトラサイクリン系、およびスルファミド系の同時分析（β−ラクタム／テトラサイクリンはフォーマット１、スルファミド系はフォーマット２）．
【００９６】
［反応性混合物の調製］
反応性混合物は以下を含んで成る。
−  濃度３６０ｎＭのβ−ラクタムー受容体（ＲＳＡ）  ５部
−  ＮａＣｌ  １５０ｍＭを含む５０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．８）で希釈したモノクローナル抗ＲＳＡマウス抗体  １部
−  濃度４．２μＭのテトラサイクリン受容体（ＴｅｔＲ）  ５部
−  ＮａＣｌ  １５０ｍＭを含む５０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．８）で希釈したモノクローナル抗ＴｅｔＲマウス抗体  １部
−  濃度５０μＭのビオチン化された核酸  １部
−  ＮａＣｌ  １５０ｍＭを含む５０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．８）で希釈したポリクローナル抗スルファミドウサギ抗体  １部
−  ＢＳＡ−スルファジメトキシン−金（粒径４０ｎｍ）の希釈液  ７部
−  ５２０ｎｍの光学密度（ＯＤ）＝１０のコロイド金（粒径４０ｎｍ）が付着した抗マウス抗体  １３部
−  ＢＳＡ２％、デキストラン１％、ショ糖５％を含む１２０ｍＭ，ｐＨ８のヘペス緩衝液  １６部
この混合物は必要に応じて調製され、または２０時間凍結乾燥して調製される。
【００９７】
別の好ましい方法では、モノクローナル抗ＲＳＡ抗体および抗ＴｅｔＲ抗体は、直接コロイド金の粒子とコンジュゲートされる。
【００９８】
［捕捉システム］
捕捉システムは実施例１のものと同様である。しかし、この場合には、ＲＳＡ受容体を捕捉する第１の捕捉部位を形成するのはラクトグロブリン−アンピシリンであり、ＴｅｔＲ受容体を捕捉する第２の捕捉部位を形成するのはアビジンであり、抗スルファミドウサギ抗体を捕捉する第３の捕捉部位を形成するのは抗ウサギニワトリ抗体である。
【００９９】
［牛乳の試料におけるβ−ラクタム系、テトラサイクリン系、およびスルファミド系の同時分析］
冷たい牛乳２００μＬを、上記の調製試薬５０μＬの存在下に３０℃で１５分間インキュベートする。この第１のインキュベーション後、上記の回収(捕捉）要素を溶液中に浸漬する。最終判定を１５分間の第２のインキュベーション後に行う。結果を表７に示す。
【０１００】
【表７】
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（文献）
（１）生きた動物および動物性食品における特定の物質およびそれの残留物を監視する手段に関する１９９６年４月２９日の理事会指令９６／２３／ＣＥおよび廃止指令８５／３５８／ＣＥＥおよび８６／４６０／ＣＥＥおよび決定８９／１８７／ＣＥＥおよび９１／６６４／ＣＥＥ．
（２）動物起源の食品における動物用医薬品の最大限の残留物限界の確立のための委員会手順を規定する１９９０年６月２６日の理事会規則（ＥＥＣ）第２３７７／９０号。
（３）Ｏｆｆ．Ｊ．Ｅｕｒ．Ｃｏｍｍ．２００２年、Ｌ２２１／８  −  ２００２／６５７／ＣＥ。
（４）ヒサオ・オカ（Ｈｉｓａｏ  Ｏｋａ）、農業において使用される抗生物質の化学的分析、ＡＯＡＣ
ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、１９９５年、ＩＳＢＮ０−９３５５８４−５７−９。
（５）ロン  フェアハイジェン（Ｒｏｎ  Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ）ら、Ａｎａｌｙｓｔ  １２３（１９９８年）、２４３７−２４４１頁。
（６）ゴレミ・コルタ（Ｇｏｌｅｍｉ−Ｋｏｔｒａ），Ｄら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７８巻、第２０号（２００３年５月）、１８４１９−１８４２５頁。
（７）カチャブ（Ｋａｃｈａｂ），Ｅ．Ｈ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１４７巻、第１号（１９９２年）、３３−４１頁。
（８）フレンス（Ｆｒｅｎｓ），Ｇ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．、２４１（１９７３年）、２０頁。
（９）ディクソン・ホール（Ｄｉｘｏｎ−Ｈｏｌｌａｎｄ）Ｄ．Ｅ．、およびカッツ（Ｋａｔｚ）、Ｓ．Ｅ．、（１９８８年）、Ｊ．  Ａｓｓｏｃ．Ｏｆｆ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８年）７１（６）、１１３７−４０頁。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】２系列の抗生物質を同時分析する場合の、ニトロセルロース担体上の捕捉ゾーンと対照ゾーンの配置例を示す模式図である。
【図２】固定対照ゾーンも提供されている、テトラサイクリン系、β−ラクタム系、およびスルファミド系を同時分析する場合のニトロセルロース担体上の捕捉ゾーンと対照ゾーンの配置例を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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