(57)【要約】ドナー細胞を初期胚へ導入することによって改変された胚および哺乳類を生み出す方法が提供され、それにより、そこから生み出された結果である胚および動物は、ドナー細胞由来の全ての組織に対して有意なまたは完全な寄与を有し、ドナー細胞DNAを伝達できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）遺伝的改変についてヘテロ接合性の胚性幹（ES）細胞またはES様細胞である雌真核ドナー細胞を初期宿主胚へ導入する段階と、
（b）（a）の胚を胚盤胞期まで培養する段階と、
（c）雌ドナー細胞由来の少なくとも90％の細胞寄与を有する改変された雌の哺乳類を生み出す妊娠のために、（b）の胚を代理母へ導入する段階と、
（a'）遺伝的改変についてヘテロ接合性の胚性幹（ES）細胞またはES様細胞である雄真核ドナー細胞を初期宿主胚へ導入する段階と、
（b'）（a'）の胚を胚盤胞期まで培養する段階と、
（c'）改変された雄の哺乳類を生み出す妊娠のために、（b'）の胚を代理母へ導入する段階と、
（d）遺伝的改変についてホモ接合性の哺乳類を生み出す、（cおよびc'）の性的に成熟した改変された雄の哺乳類と性的に成熟した改変された雌の哺乳類とを交配させる段階
とを含む、遺伝的改変についてホモ接合性の哺乳類を生み出すための方法。
【請求項２】
段階（a）の雌真核ドナー細胞が段階（a'）の雄真核ドナー細胞の同一細胞系に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（a）の雌真核ドナー細胞がXO細胞であり、および段階（c）の改変された雌の哺乳類がXO哺乳類である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
細胞が近交系またはハイブリッド系由来のマウスES細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
近交系が、129、C57BL/6、またはBalbCからなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ハイブリッド系がC57BL/6x129である、請求項４記載の方法。
【請求項７】
遺伝的に改変された細胞が、
（a）関心対象のDNA配列を含む大きなクローン化ゲノム断片を得る段階と、
（b）真核ドナー細胞（LTVEC）において使用するための大きな標的ベクターを作製するため、（a）の大きなクローン化ゲノム断片を遺伝的に改変するためにバクテリア相同組換えを使用する段階と、
（c）真核ドナー細胞における内因性遺伝子または染色体座を改変するため、（b）のLTVECをこの細胞へ導入する段階と、
（d）内因性遺伝子または染色体座が遺伝的に改変されたこれらの真核ドナー細胞を同定するために、（c）の真核ドナー細胞における対立遺伝子の改変を検出するよう定量的アッセイを使用する段階
によって生み出される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
宿主胚が、C57BL/6系由来の近交系胚またはスイスウェブスター（Swiss Webster）系由来の非近交系胚を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
段階（b）および／または（b'）の培養が成長因子によって調整される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
成長因子がWntファミリーのタンパク質である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Wntファミリーのタンパク質がWnt3aである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
真核ドナー細胞が、透明帯にある開口部を通じて宿主胚へ導入される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
開口部がレーザーによって作製される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
（a）遺伝的改変についてヘテロ接合性である雌真核ドナー細胞を初期宿主胚へ導入する段階と、
（b）（a）の胚を胚盤胞期まで培養する段階と、
（c）雌ドナー細胞由来の少なくとも90％の細胞寄与を有する改変された雌の哺乳類を生み出す妊娠のために、（b）の胚を代理母へ導入する段階と、
（a'）遺伝的改変についてヘテロ接合性である雄真核ドナー細胞を初期宿主胚へ導入する段階と、
（b'）（a）の胚を胚盤胞期まで培養する段階と、
（c'）改変された雄の哺乳類を生み出す妊娠のために、（b'）の胚を代理母へ導入する段階と、
（d）遺伝的改変についてホモ接合性の胚が生み出され、遺伝的改変についてホモ接合性の真核ドナー細胞が、雄ES細胞における遺伝子変換、同一の遺伝子の両対立遺伝子を標的化すること、またはX架橋されるかもしくはY架橋されるかのいずれかの遺伝子を標的化することによって生み出される、（cおよびc'）の性的に成熟した改変された雄の哺乳類と性的に成熟した改変された雌の哺乳類とを交配させる段階
とを含む、遺伝的改変のためのホモ接合性胚を生み出す方法。
【請求項１５】
培地が成長因子を含み、初期胚が前桑実胚期または8細胞期胚であり、成長因子が、Wnt1、Wnt3a、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt4、Wnt5a、Wnt6、Wnt7a、Wnt8a、Wnt9a、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、およびWnt16からなる群より選択されるWntファミリーのタンパク質である、初期胚を維持および／または成長させるための培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子改変についてホモ接合性の動物を生み出すための改良された方法に向けられる。特に、本発明は、望ましい改変をその後の子孫へ伝達できる動物の作出効率性を高めるための、ドナー細胞由来の高い遺伝的材料の寄与を有する動物を生み出すための、および望ましい遺伝的改変を保持するホモ接合性動物を生み出すのに必要な効率性を増大させ、かつ時間を短縮するための方法に指向する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の記載
真核ドナー細胞を改変するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第6,586,251号（特許文献１）を参照されたい。遺伝子導入動物を生み出すための方法も当技術分野において公知である。TT2 ES細胞における望ましい改変を伝達できる動物の作出効率性を向上させるために提唱された方法は、Yagi et al.（1993）Analytical Biochemistry 214: 70-76（非特許文献１）に記載される。
【０００３】
【特許文献１】米国特許第6,586,251号
【非特許文献１】Yagi et al.（1993）Analytical Biochemistry 214: 70-76
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、改変された細胞の初期宿主胚への導入が宿主胚に対するドナー細胞の遺伝的材料および細胞寄与を実質的に増大させ、それにより産出した動物はドナー由来の増大した細胞の画分を有し、したがって生殖系列を通じてその改変が伝達する可能性が増大するという認識に一部基づいている。さらに、本発明の方法によって、先行技術の方法で実用的であったものよりも幅広い範囲のドナー細胞が使用できる。したがって、本発明の方法は、改変についてホモ接合性の動物を生み出すのに必要な動物数および交配数を減少させる。
【０００５】
第一の局面において、本発明は、（a）真核ドナー細胞を初期胚へ導入する段階と、（b）改変された哺乳類を生み出す妊娠のために（a）の胚を代理母へ導入する段階とを含む、改変された哺乳類を生み出すための方法を特徴とする。初期胚は前桑実胚期細胞である。より具体的な態様において、初期胚は8細胞期胚である。初期胚は、いずれかの系統由来でありうる。ある態様において、C57BL/6などの近交系胚が宿主胚として使用される。別の態様において、例えばスイスウェブスターなどの非近交系胚が宿主胚として使用される。
【０００６】
真核ドナー細胞は幹細胞である。特に、その幹細胞は、胚性幹（ES）細胞またはES様細胞である。いずれかの適切なES細胞系由来のES細胞が、本発明の方法において使用できる。ある態様において、ES細胞は、例えば、129、C57BL/6、またはBalbCなどの近交系由来である。別の態様において、ES細胞は、例えば、C57BL/6×129などのハイブリッド系由来である。具体的な態様において、細胞はマウスES細胞である。しかしながら、本発明の方法は、例えば、ラットES細胞またはES様細胞などの他の哺乳類由来の細胞で実施されうる。ある態様において、ES細胞またはES様細胞は、遺伝的改変を含む改変された細胞である。より具体的な態様において、改変は自発的に生じうるか、無作為でありうるか、または例えば外来核酸の導入による実験操作による結果として生じうる。外来核酸は、当技術分野において公知のいずれかの方法によって、例えば相同組換えによって導入されうる。
【０００７】
第二の局面において、本発明は、（a）遺伝的改変についてヘテロ接合性である雌真核ドナー細胞を初期宿主胚へ導入する段階、（b）さらなる発達のために（a）の胚を培養物中で維持する段階、（c）改変された雌の哺乳類を生み出す妊娠のために、（b）の胚を代理母へ導入する段階、（a'）遺伝的改変についてヘテロ接合性である雄真核ドナー細胞を初期宿主胚へ導入する段階、（b'）さらなる発達のために（a'）の胚を培養物中で維持する段階、（c'）改変された雄の哺乳類を生み出す妊娠のために、（b'）の胚を代理母へ導入する段階、および（d）（cおよびc'）の性的に成熟した雌雄の哺乳類を交配させ、遺伝的改変についてホモ接合性である哺乳類を生み出す段階を含む、遺伝的改変についてホモ接合性の哺乳類を生み出すための方法を特徴とする。
【０００８】
ある態様において、段階（a）の雌真核ドナー細胞は、段階（a'）の雄真核ドナー細胞と同一の細胞系に由来する。より具体的な態様において、段階（a）の雌真核ドナー細胞はXO細胞であり、段階（c）の改変された雌の哺乳類はXO哺乳類である。
【０００９】
雄または雌の真核ドナー細胞は幹細胞であり、好ましくはヘテロ接合性のES細胞またはES様細胞である。ある態様において、ヘテロ接合性ES細胞は、（i）関心対象のDNA配列を含有する大きなクローン化ゲノム断片を得る段階、（ii）真核ドナー細胞において使用するための大きな標的化ベクター（LTVECまたは大きな標的化ベクター）を作製するため、（i）の大きなクローン化ゲノム断片を遺伝的に改変するためにバクテリア相同組換えを使用する段階、（iii）真核ドナー細胞における内因性遺伝子または染色体座を改変するため、（ii）のLTVECを真核ドナー細胞へ導入する段階、および（iv）内因性遺伝子または染色体座が遺伝的に改変された真核ドナー細胞を同定するため、（iii）の真核ドナー細胞における対立遺伝子の改変を検出するよう定量的アッセイを使用する段階によって生み出される。
【００１０】
さまざまな態様において、段階（b）および／または段階（b'）の培養条件によって、胚は後桑実胚期以降まで発達できる。ある態様において、段階（b）および／または段階（b'）の培養条件は、成長因子により調整された培地によって提供される。好ましい態様において、成長因子はWntファミリーのタンパク質である。ある態様において、Wntタンパク質は培地へ直接添加される。別の態様において、Wntタンパク質はマウスL細胞により産出される。さらに別の態様において、培地はさらに白血病阻害因子（LIF）を含む。
【００１１】
ある具体的な態様において、（b）および／または（b'）の胚盤胞期胚は、妊娠およびさらなる発達のために代理母へ導入される。
【００１２】
真核ドナー細胞は、当技術分野において公知のいずれかの方法によって初期胚へ導入されうる。ある態様において、真核ドナー細胞は初期胚の透明帯の下に導入される。他の方法論には、透明帯の膜の除去が含まれる。より具体的な態様において、真核ドナー細胞は、注入または、透明帯に開口部を作製する他の方法によって、透明帯の下に導入されうる。ある具体的な態様において、開口部はレーザーによって透明帯に作製される。ある態様において、レーザーは赤外線固体ダイオードレーザーを含む。別の態様において、真核ドナー細胞は、細胞融合法によって宿主胚へ導入される。
【００１３】
ある態様において、90％を超えるドナー細胞由来の細胞を含む改変された哺乳類は段階（d）で交配される。好ましい態様において、改変された哺乳類は95％を超えるドナー細胞由来の細胞を含む。より好ましくは、改変された哺乳類は100％ドナー細胞由来の細胞を含む。
【００１４】
第三の局面において、本発明は、（a）遺伝的改変についてヘテロ接合性である雌真核ドナー細胞を初期宿主胚へ導入する段階、（b）さらなる発達のために（a）の胚を培養物中で維持する段階、（c）改変された雌の哺乳類を生み出す妊娠のために、（b）の胚を代理母へ導入する段階、（a'）遺伝的改変についてヘテロ接合性である雄真核ドナー細胞を初期宿主胚へ導入する段階、（b'）さらなる発達のために（a'）の胚を培養物中で維持する段階、（c'）改変された雄の哺乳類を生み出す妊娠のために、（b'）の胚を代理母へ導入する段階、および（d）（cおよびc'）の改変された雌雄の哺乳類を交配させ、遺伝的改変についてホモ接合性である胚を生み出す段階を含む、遺伝的改変についてホモ接合性の胚を生み出す方法を特徴とする。
【００１５】
第四の局面において、本発明は、（a）遺伝的改変についてホモ接合性である真核ドナー細胞を初期胚へ導入する段階、（b）さらなる発達のために（a）の胚を培養物中で維持する段階、（c）遺伝的改変についてホモ接合性である哺乳類を生み出す妊娠のため、（b）の胚を代理母へ導入する段階を含む、遺伝的改変についてホモ接合性の哺乳類を生み出す方法を特徴とする。
【００１６】
ある態様において、遺伝的改変についてホモ接合性である真核ドナー細胞を生み出すための方法は、雄ES細胞における遺伝子変換、同じ遺伝子について両対立遺伝子を標的化すること、またはX架橋されるかもしくはY架橋されるかのいずれかの遺伝子を標的化することを含む。
【００１７】
第五の局面において、本発明は、（a）遺伝的改変についてホモ接合性である真核ドナー細胞を初期胚へ導入する段階と、（b）段階（a）の初期胚を培養して、遺伝的改変についてホモ接合性である胚を生み出す段階とを含む、遺伝的改変についてホモ接合性の胚を生み出す方法を特徴とする。
【００１８】
第六の局面において、本発明は、（a）真核ドナー細胞を初期胚へ導入する段階と、（b）後桑実期以降まで胚が発達できる条件下で、段階（a）の初期胚を培養する段階とを含む、ドナー真核ドナー細胞から宿主胚へと遺伝的材料の相対的な寄与を増大させる方法を特徴とする。
【００１９】
ある態様において、段階（b）の培養条件によって胚は胚盤胞へと発達できる。別の態様において、段階（b）の培養条件によって胚は原腸胚以降まで発達できる。さまざまな態様において、段階（b）の培養条件によって、胚は後桑実胚期以降まで発達できる。ある態様において、段階（b）の培養条件は、成長因子によって調整される培地によって提供される。好ましい態様において、成長因子はWntファミリーのタンパク質である。ある態様において、Wntタンパク質は培地へ直接添加される。別の態様において、Wntタンパク質はL細胞によって産出される。さらに別の態様において、培地はさらに白血病阻害因子（LIF）を含む。
【００２０】
第七の局面において、本発明は、（a）真核ドナー細胞を初期胚へ導入する段階、（b）胚が後桑実胚期以降まで発達できる条件下で、段階（a）の初期胚を培養する段階、および（c）真核ドナー細胞由来の増大した細胞の画分を有する哺乳類を生み出す妊娠のために（b）の胚を代理母へ導入する段階を含む、ドナー真核ドナー細胞から宿主胚への遺伝的材料の増大した相対的な寄与を有する哺乳類を生み出す方法を特徴とする。
【００２１】
第八の局面において、本発明は、（a）遺伝的改変を保持する真核ドナー細胞を初期胚へ導入する段階、（b）胚が後桑実胚期以降まで発達できる条件下で段階（a）の初期胚を培養する段階、および（c）遺伝的改変を伝達できる哺乳類を生み出す妊娠のために（b）の胚を代理母へ導入する段階を含む、遺伝的改変を伝達できる哺乳類を生み出す方法を特徴とする。
【００２２】
第九の局面において、本発明は、本発明の方法によって生み出される遺伝的に改変された哺乳類を特徴とする。好ましい態様において、哺乳類の細胞の90％以上がドナー細胞由来の細胞であり、より好ましくは哺乳類の細胞の95％以上がドナー細胞由来の細胞であり、さらにより好ましくは哺乳類の細胞の99％以上がドナー細胞由来の細胞である。ある態様において、哺乳類の細胞の100％がドナー細胞由来の細胞である。
【００２３】
第十の局面において、本発明は、本発明の方法によって生み出される遺伝的に改変された胚を特徴とする。好ましい態様において、胚の細胞の90％以上がドナー細胞由来であり、より好ましくは細胞の95％以上がドナー細胞由来の細胞であり、さらにより好ましくは細胞の99％以上がドナー細胞由来の細胞である。ある態様において、胚の細胞の100％がドナー細胞由来の細胞である。
【００２４】
第十一の局面において、本発明は、初期胚を維持しおよび／または成長させるための、成長因子を含む培地を特徴とする。
【００２５】
ある態様において、成長因子はWntファミリーのタンパク質である。Wntファミリータンパク質は、Wnt1、Wnt3a、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt4、Wnt5a、Wnt6、Wnt7a、Wnt8a、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、およびWnt16からなる群より選択される。好ましい態様において、Wntタンパク質はWnt3aである。ある態様において、Wntタンパク質は組換えタンパク質である。別の態様において、培地はWnt産出マウスL細胞により調整される。
【００２６】
ある態様において、培地はさらに維持剤を含む。ある態様において、維持剤は白血病阻害因子（LIF）である。
【００２７】
他の目的および利点は、続く詳細な記述の概説から明らかとなるであろう。
【００２８】
詳細な記述
本発明の方法、コンストラクトおよび遺伝子導入動物が記載される前に、本発明は、このようなもの全てが変動しうるように、記載される特定の方法、コンストラクト、遺伝子導入動物、および実験条件に制限されないことは理解されるべきである。本発明の範囲が、前述される特許請求の範囲によってのみ制限されるであろうことから、本明細書で使用される用語法が特定の態様のみを記載する目的のためのものであり、制限するように企図されるものではないことも理解されるべきである。
【００２９】
本明細書および前述される請求項において使用されるように、単数形の「a」、「an」および「the」は、さもなくば内容に従って明らかにされていない限り、複数形への言及を包含し、例えば、「細胞」は複数の細胞を包含する。したがって、例えば「方法」に対する言及は、一つ以上の方法、および／または本明細書に記載されるタイプの段階、および／または本開示を読む上で、当業者に明らかとなるであろう段階を包含する。
【００３０】
別段の定義がなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価のいずれかの方法および材料が本発明の実施または検査において使用できるが、好ましい方法、コンストラクトおよび材料がいまや記載される。本明細書に記載される全ての刊行物は、その全てが参照として本明細書に組み入れられる。
【００３１】
定義
「胚性幹（ES）様細胞」という用語は、胚へ導入される際に発達していく胚のいずれかの組織へ寄与できる細胞を包含する。
【００３２】
「増大した寄与」、「より高い相対的な割合」およびそれらの類似の用語は、改変された初期宿主胚のさらなる発達から結果として生じる生物体へのドナー真核ドナー細胞の改良された遺伝的材料の寄与を包含する。本発明の方法は、宿主胚へ導入された細胞が、生み出した動物の生殖系列組織を含む、全ての組織へ寄与する確率を増大させる手段を提供する。
【００３３】
本明細書で使用される「遺伝子ノックアウト」によって意味されるのは、染色体座においてコード化される遺伝情報の破壊から結果として生じる遺伝的改変である。本明細書で使用される「遺伝子ノックイン」によって意味されるのは、異なるDNA配列を有する染色体座においてコード化される遺伝情報の置換から、または染色体座における外来遺伝情報の挿入から結果として生じる遺伝的改変である。本明細書で使用される「ノックアウト動物」によって意味されるのは、動物の細胞の有意な割合が遺伝子ノックアウトを内部に有する動物である。本明細書で使用される「ノックイン動物」によって意味されるのは、動物の細胞の有意な割合が遺伝子ノックインを内部に有する動物である。
【００３４】
一般的な記述
遺伝子導入動物研究の望ましい構成要素のひとつは、遺伝的改変を子孫へ伝達できる遺伝的に改変された遺伝子導入動物、つまり、その生殖系列に遺伝的改変を含む遺伝子導入動物を生み出すことである。このような伝達可能な遺伝子導入動物を作製する現在の方法は、資源および時間の消費の点で非効率的である傾向にある。例えば、遺伝的改変を子孫へ伝達できる遺伝的に改変された遺伝子導入動物を生み出すため、望ましい遺伝的改変についてヘテロ接合性である改変されたES細胞がレシピエントの胚盤胞胚へ注入され、遺伝子導入子孫の妊娠および誕生のために、レシピエント胚が代理母へ移植される。結果として生じる遺伝子導入子孫は、その子孫の組織のいくつかが、注入されたES細胞由来である一方で、その子孫のその他の組織はレシピエントの胚細胞由来であるため、キメラである。このキメラ化のため、遺伝的改変を含む注入されたES細胞は、子孫の生殖系列組織を形成するかもしれないし、またはしないかもしれず、遺伝的改変を次世代へ伝達できるかもしれないし、できないかもしれない。キメラが遺伝的改変を伝達できるかどうかを決定するため、望ましい改変が生じる子孫（F1）へ伝達されるかどうかを確立するため、キメラは、同一の遺伝的改変を保持しない別の動物と交配されなければならない。キメラとその他の動物との交配のF1子孫における望ましい遺伝的改変の検出は、キメラがその生殖系列において望ましい遺伝的改変を保持し、その子孫へその改変を伝達できること（生殖系列伝達）を確立する。典型的に、キメラのほぼ50％が生殖系列伝達を示す。毛皮の色は、キメラへのES細胞の寄与の程度およびF1子孫へのES細胞の遺伝的内容の伝達の程度のマーカーとして最も頻繁に使用される。
【００３５】
キメラが遺伝的改変を伝達できるかどうかを決定するためにF1世代を生み出すための現在の需要は、F1子孫を交配しおよび維持する時間と経費の点で非効率的であり高価である。遺伝子導入動物を生み出すための工程の効率性を改良するある方法は、ドナー細胞がより後期の胚、例えば胚盤胞へ導入されるときに得られる結果と比較して、外来性細胞の増大した遺伝的材料の寄与を有する動物を生み出す細胞の前桑実胚へ導入できる本発明によって提供される。結果として、F0動物の非常により高い割合が生殖系列伝達体である。たいていの場合、F0動物は100％生殖系列伝達体であり、したがってこれらのF0動物はES細胞材料をそれらの子孫全てに伝達できる。
【００３６】
ドナー細胞を初期宿主胚、例えば8細胞期胚へ導入することは、より後期の宿主胚、例えば胚盤胞の使用を教示する現在の方法を超えるいくつもの重要な利点を提供する。後述の実施例１に示されるように、ドナー母（例、雌BL/6マウス）から回収された初期胚の数は、より後期の胚から回収された数よりも多い。したがって、ドナーとして必要とされる妊娠した雌のマウスはより少なく、妊娠した雌のマウスを入手し維持する経費を削減する。
【００３７】
さらに、後述に示されるように、ドナー細胞は、キメラ動物を同一数生み出すために、後期の胚よりも初期宿主胚の方がより少ない数で導入でき、ドナー細胞を胚へ導入する時間と経費を削減し、例えば導入が微量注入法による場合、微量注入にかかる時間の量が大きく削減される。
【００３８】
本発明によって、妊娠のために代理母へ導入される前に、後桑実胚期、例えば胚盤胞期または原腸胚期までドナー細胞含有宿主胚を培養することもできる。インビトロ培養条件が宿主胚よりもドナー細胞にとってより好ましいため、結果として生じる胚は、桑実胚期の宿主胚が妊娠のために代理母へ導入される方法と比較して、ドナー細胞由来の細胞量がより多い。
【００３９】
本発明によって提供される重要な改良は、ドナーDNAを伝達できる生み出した動物の個体数が、初期宿主胚の使用で実質的に増大し、それにより交配の世代が完全に排除されることである。このことは、重要な商業的含意を有する有意な実用的改良である。
【００４０】
交配の世代が完全に排除できる当技術分野において公知の方法は、四倍体胚を改変されたドナー細胞のレシピエントとして採用する。レシピエント胚の四倍体細胞が発達中の動物の組織へ寄与できないため、生まれる動物は完全に、改変されたドナー細胞由来である。結果として生じる動物が生殖能力に影響する遺伝的改変を持たない場合、望ましい遺伝的改変を交配に際してその動物の子孫へ伝達できるであろう。この工程は、ハイブリッドES細胞系にのみ由来する生存して生まれた動物が少ない比率で産出されるため、困難かつ非効率的である。前桑実胚期の二倍体胚の透明帯の下への細胞の注入は、完全にまたはほぼ完全にES細胞由来の生存している動物のより多くの数を生存および生み出すことを増大させる。雌雄のいずれも本方法によって得ることができる。
【００４１】
本発明の方法は、微量注入を通じて近交系ES細胞を非近交系レシピエント胚へ導入するために適用できる。
【００４２】
本発明の他の特徴は、本発明の説明のために付与される典型的な態様に関する以下の記載に従って明らかとなるであろうし、それを制限しているよう企図されるものではない。
【００４３】
実施例
以下の実施例は、本発明の方法、組成物および動物をどのように作製および使用するかについて、実施例を用いて当業者に提供するために述べられ、本発明の範囲を制限することを企図しない。使用される数（例: 量、温度等）に関する正確性を確実にする努力がなされているが、いくつかの実験上の偏差は当業者に公知のように予期されるべきである。別段の記載がなければ、部分は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は℃におけるものであり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧にある。
【００４４】
実施例１．生殖系列伝達動物の作出
プラグの朝を0.5日p.c.（交尾後）と指定した、自然交配から注入のためのマウス胚を得た。交尾2.5日後のプラグができた(plugged)雌から卵管を採取し、ダルベッコの培地で洗い流し、8細胞期胚を回収した。培養手段（5％CO2のインキュベーター中で37℃）および微量注入工程のために、胚をこの培地中で維持した。
【００４５】
ES細胞の導入前に製造者の説明書にしたがって、XYクローンレーザーシステムを使用して8細胞期胚の透明帯に孔を作製したことを除けば、標準的な微量注入技術を使用して、8細胞期胚の注入を実施した。この孔を通じて注入針を挿入し、6〜10個のES細胞を囲卵空間へと置かれた。
【００４６】
注入された胚を培養皿KSOM+AAへと移植し、胚盤胞期まで一晩培養した。生存している胚を胚盤胞として、次の日の午後（交尾3.5日後）代理雌へと移植した。
【００４７】
実施例２．ホモ接合性DLL4ノックアウトマウスの作出
ホモ接合性DLL4ノックアウトES細胞を上述のように8細胞期マウス胚へ微量注入した。注入した胚を胚盤胞期まで培養し、妊娠のために代理雌へと移植した。すべてのDLL4ノックアウト胚は妊娠中に死亡した。死亡の原因は、ヘテロ接合性マウスの従来の交配によって産出される胚について観察されるものと同一であった。F0世代においてDLL4のない表現型が観察されたことは、DLL4のないマウスを生み出すのに通常必要とされるであろう2世代交配を回避した。
【００４８】
実施例３．遺伝的改変を有する高度にかつ十分にES細胞由来のF0マウスの作出
遺伝的に改変された雄F1H4ES細胞を8細胞期または胚盤胞期のいずれかのC57BL/6胚へ微量注入した。微量注入した胚盤胞胚を、注入の直後に妊娠のために代理雌へと移植した。微量注入した8細胞期胚をさらに、KSOM+AA培地中で胚盤胞期まで培養した後、妊娠のために代理雌へと移植した。ES細胞寄与の割合を、雄F0マウスの毛皮の色により概算した。結果を表１に要約する。示されるように、遺伝的に改変されたES細胞を8細胞期胚へ微量注入すると、F0マウスは全てES細胞由来である。一方、遺伝的に改変されたES細胞を胚盤胞期胚へ微量注入すると、雄F0マウスのいずれも完全にはES細胞由来ではなく、雄F0マウスの約半分のみ（494B-F5および1218X-E2についてそれぞれ4匹中2匹および7匹中4匹）が90％を超えるES由来の細胞を有した。
【表１】
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【００４９】
より多くのES細胞系を使用して、生じた雄F0マウスにおけるES細胞寄与に及ぼす宿主胚の段階（8細胞期対胚盤胞期）の影響を試験した。同様の結果を得、表2に要約する（*ES細胞寄与の割合をF0マウスの毛皮の色により概算した）。
【表２】
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【００５０】
実施例４．高度にかつ十分にES細胞由来の雌F0マウスの作出
遺伝的に改変されたXO ES細胞（648B-H12クローン）を8細胞期または胚盤胞期のいずれかのC57BL/6胚へ微量注入した。微量注入した胚盤胞胚を、注入の直後に妊娠のために代理雌へと移植した。微量注入した8細胞期胚をさらに、KSOM+AA培地中で胚盤胞期まで培養した後、妊娠のために代理雌へと移植した。雌F0マウスにおけるES細胞寄与の割合を、それらの毛皮の色により概算した。表３に示されるように、遺伝的に改変されたES XO ES細胞を8細胞期胚へ微量注入すると、キメラは全て雌であった。遺伝的に改変されたES細胞を胚盤胞期胚へ微量注入すると、648B-H12マウスについては総数16匹中7匹のみ、648C-H1F0マウスについては16匹中11匹が雌であった（ES細胞寄与の割合をF0マウスの毛皮の色により概算した）。
【表３】
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【００５１】
実施例５．非近交系および近交系の宿主胚を使用する、高度にかつ十分にES細胞由来のF0マウスの作出
改変されていない雄近交系（C57BL/6）またはハイブリッド（F1H4）のES細胞を、8細胞期または胚盤胞期のいずれかのスイスウェブスター（SW）胚へ微量注入した。微量注入した胚盤胞胚を、注入の直後に妊娠のために代理雌へと移植した。微量注入した8細胞期胚をさらに、KSOM+AA培地中で胚盤胞期まで培養した後、妊娠のために代理雌へと移植した。結果を表4に要約する（*ES細胞寄与の割合をF0マウスの毛皮の色により概算した）。
【表４】
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【００５２】
雄近交系129（CJ7）およびBalb/cのES細胞を8細胞期または胚盤胞期のいずれかの近交系C56BL/6宿主胚へ微量注入したとき、同様の結果が得られた。結果を表5に要約する（*ES細胞寄与の割合をF0マウスの毛皮の色により概算した）。    
【表５】
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【００５３】
実施例６．高度にかつ十分にES細胞由来のF0マウスは生殖系列伝達形質転換受容性である
ES細胞由来の90％を超える細胞（90％を超えるES細胞寄与）を有するF1H4由来の雄F0マウスを使用して、生殖系列伝達形質転換受容性を試験した。雄のES細胞を使用して、性的に成熟した雄F0マウスを性的に成熟した雌と交配させた。生殖系列伝達形質転換受容性の評価のためのマーカーとして、子孫の毛皮の色を使用した。結果を表６に要約する。8細胞期胚を宿主胚として使用すると、8細胞期微量注入によって生み出されるF0雄の95％超（53匹中51匹）が、100％生殖系列伝達形質転換受容性を示した。胚盤胞期胚を宿主胚として使用すると、F0雄の約64％（89匹中57匹）のみが100％生殖系列伝達形質転換受容性を示した。さらに、胚盤胞期微量注入によって生み出されたF0雄の約21％（89匹中19匹）は、子孫を持たない8細胞期微量注入によって生み出されたF0雄の4％未満（53匹中2匹）と比較して、子孫を全く生み出さなかった（**生殖系列伝達形質転換受容性の割合を、対応する子孫の毛皮の色により概算した）。
【表６】
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【００５４】
実施例７．F0マウスの性質に及ぼす微量注入後の培地の影響
改変された雄C57BL/6およびF1H4のES細胞を、8細胞期のスイスウェブスター（SW）胚へ微量注入した。微量注入した胚を異なる培地中で胚盤胞期まで培養した後、妊娠のために代理雌へ移植した。三つの異なる培地、（1）マウス胚培地であるKSOM、（2）LIFを含有するES細胞培地であるLIF、（3）Wnt3により調整されるES細胞培地であるWnt3、を使用した。結果を表7に要約する。Wnt3により調整されたES培地を次のように作製した。（i）マウスL細胞を高グルコースDMEM、10％FBS、およびL-グルタミンでできた培地の入ったT75フラスコへと播種し、37℃で5％CO2でインキュベートした。（ii）細胞密度が100％培養密度(confluency)に到達したとき、細胞の10％を別のT75フラスコへと再播種した。（iii）細胞密度が再度培養密度に到達するまで（再播種の約3日後）培地を回収した。および最後に、（iv）回収した培地を、LIFは入っていないが血清と置換したES細胞培地の等量と混合した（*ES細胞寄与の割合をF0マウスの毛皮の色により概算した）。
【表７】
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【００５５】
雄の改変されたF1H4細胞を8細胞期のC57BL/6のES胚へ微量注入すると、同様の結果が得られた。
【００５６】
実施例８．ヘテロ接合性ES細胞からの遺伝的改変についてホモ接合性の動物の作出
望ましい遺伝的改変についてヘテロ接合性である雄ES細胞を、実施例１に記載のとおり、8細胞期のマウス胚へ微量注入する。同一の雄ES細胞系由来であり、同一の遺伝的改変についてヘテロ接合性である雌ES細胞を、上述のとおり別の8細胞期マウス胚へ微量注入した。両者の胚を胚盤胞期まで培養し、妊娠のために代理雌へと移植する。生じた生殖系列を伝達する雌雄のF0マウスを交配して、望ましい遺伝的改変についてホモ接合性である子孫を得た。2対のマウスを交配させた。総数39匹の仔が生まれ、これらの仔のうちの9匹は遺伝的改変についてホモ接合性であった。 
【国際調査報告】
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