(57)【要約】  以下の式Ｉのコンジュゲートは、生物医学用途、例えば、薬物の送達又は標識化部分で或いはリポソーム又はミセルの要素として有用である。式Ｉにおいて、Ａは親水性ポリマーであり、Ｌ及びＬ’のそれぞれは、独立にリンカー基であり、Ｂは脂質部分であり、Ｚは、診断用リガンド、生物学的に関連のあるリガンド、又は反応性結合部分であり、これは一般に、Ｚ中の窒素、酸素又は硫黄原子を介してコンジュゲートのリン原子に結合している（ＦＩ）。
2008516056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の化合物
【化１】
2008516056.tif 000009
［式中、
Ａは親水性ポリマーであり、
Ｌ及びＬ’のそれぞれは、独立にリンカー基であり、
Ｂは脂質部分であり、
Ｚは、診断用リガンド、生物学的に関連のあるリガンド、及び反応性結合部分からなる群から選択され、前記反応性結合部分は、ヒドロキシ（−ＯＨ）、酸化物（−Ｏ-）、又は２−アミノエトキシではない］。
【請求項２】
Ｂが、脂肪酸、ステロール、ジエーテル脂質、及びジアシル脂質から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｂがジアシル脂質であって、次式を有する、請求項２に記載の化合物
【化２】
2008516056.tif 000010
［式中、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立に４〜２４個の炭素原子を有するアルキル又はアルケニルである］。
【請求項４】
Ｒ１及びＲ２のそれぞれがＣ１７Ｈ３５である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｚが、Ｚ中の窒素、酸素又は硫黄原子を介してＰに結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｚが、Ｚ中の窒素原子を介してＰに結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｚが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘの形（ｎは２〜８であり、Ｘは、アミノ、メルカプト、ヒドロキシ、ジスルフィド、アルデヒド、ケトン、マレイミド、ヒドラジド、活性化エステル、他のカルボン酸誘導体、及び脱離基から選択される）の反応性結合部分である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
ｎが３であり、Ｘが−ＮＨ２である、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
ｎが３であり、Ｘがスクシンイミジルエステルである、請求項６に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｚが診断用リガンドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｚが、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、及び小分子化合物から選択される生物学的に関連のあるリガンドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ａが、２〜１２０個のエチレングリコール繰返し単位を有するポリエチレングリコールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｌ及びＬ’のそれぞれが、独立に、アルキル、アリール、又はアラルキル部分であり、その一方又は両側に基Ｙが隣接しており、但し、Ｙは、（ｉ）−Ｗ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｑ−、（ｉｉ）−Ｗ−（Ｃ＝Ｏ）−、（ｉｉｉ）−Ｗ−、及び（ｉｖ）ジスルフィド（Ｗ及びＱは、独立に、酸素、ＮＨ、及び直接結合から選択される）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｌ及びＬ’の少なくとも１つが、ｉｎ  ｖｉｖｏで開裂可能である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１に記載の化合物を含むリポソーム。
【請求項１６】
請求項３に記載の化合物を含む、請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項１７】
請求項１に記載の化合物を１〜約５０モルパーセント含む、請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項１８】
薬物用担体の親水親油バランスを調整する方法であって、
次式の担体
【化３】
2008516056.tif 000011
［式中、
Ａは親水性ポリマーであり、
Ｌ及びＬ’のそれぞれは、独立にリンカー基であり、
Ｂは脂質部分であり、
Ｚは、前記薬物であるか、又は前記薬物にコンジュゲートするのに有効な反応性部分であり、前記反応性部分は、ヒドロキシ（−ＯＨ）、酸化物（−Ｏ-）、又は２−アミノエトキシではなく、
ＡとＢの相対的サイズは、前記担体に所望のＨＬＢを与えるのに有効である］
を提供することを含む上記方法。
【請求項１９】
Ｂがジアシル脂質であり、前記化合物が、次式
【化４】
2008516056.tif 000012
［式中、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立に４〜２４個の炭素原子を有するアルキル又はアルケニルである］
を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ａがポリエチレングリコールである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
治療薬を経口送達する方法であって、
式Ｉ
【化５】
2008516056.tif 000013
［式中、
Ａは親水性ポリマーであり、
Ｌ及びＬ’のそれぞれは、独立にリンカー基であり、
Ｂは脂質部分であり、
Ｚは前記治療薬を含む］
のコンジュゲートを対象に経口投与することを含む方法。
【請求項２２】
Ｚが、ｉｎ  ｖｉｖｏで開裂可能な式Ｉのリン原子への結合をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｂがジアシル脂質であり、前記コンジュゲートが、式ＩＩ
【化６】
2008516056.tif 000014
［式中、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立に４〜２４個の炭素原子を有するアルキル又はアルケニルである］
を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
Ａがポリエチレングリコールである、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性ポリマーが、ホスホルアミド酸塩、リン酸トリエステル又はリン酸チオエステル基を介して脂質部分にコンジュゲートされ、これに、リガンド又はこのようなリガンドをコンジュゲーションするための反応性部分がさらにコンジュゲートされているリポポリマーコンジュゲートに関する。このリガンドは治療用分子又は診断上関連のある分子である。
【０００２】
参考文献
Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：７１−７６（１９９０）。
Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．、「アミノデオキシチミジン単位を含むオリゴヌクレオチドの合成及び特性（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｍｉｎｏｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｕｎｉｔｓ）」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２０：３４０３−９（１９９２）。
Ｋｉｒｐｏｔｉｎ，Ｄ．，Ｈｏｎｇ，Ｋ．，Ｍｕｌｌａｈ，Ｎ．，Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｚａｌｉｐｓｋｙ．Ｓ．、「離脱可能なポリマーコーティングを有するリポソーム：表面グラフト化ポリ（エチレングリコール）の開裂によって誘起されるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン小胞体の不安定化及び融合（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｔａｃｈａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏａｔｉｎｇ：ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｏｌｅｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｇｒａｆｔｅｄ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））」，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８８（２−３）：１１５−８（１９９６）。
Ｌｉｎｄｈ，Ｉ．ａｎｄ  Ｓｔａｗｉｎｓｋｉ，Ｊ．、「Ｈ−ホスホン酸塩中間体を介したグリセロリン脂質及びその類似体を合成する一般的な方法（Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｎａｌｏｇｓ  ｖｉａ  Ｈ−ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）」，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：１３３８−４２（１９８９）。
Ｌｕｋｙａｎｏｖ，Ａ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．、「難溶性薬物のための送達系としての水溶性ポリマーの脂質誘導体からのミセル（Ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｌｉｐｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｐｏｏｒｌｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｄｒｕｇｓ）」，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５６：１２７３−８９（２００４）。
Ｍｌｏｔｋｏｗｓｋａ，Ｂ．ａｎｄ  Ｍａｒｋｏｗｓｋａ，Ａ．、「炭素−硫黄−リン結合を有するチオホスファチジルコリンの新規な合成（Ａ  ｎｅｗ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｂｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｂｏｎｄ）」，Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎａｌｅｎ  ｄｅｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  ２：１９１−３（１９８８）。
Ｓｏｌｏｄｉｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．、「リン酸トリエステルカチオン性リン脂質の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）」，Ｓｙｎｌｅｔｔ．４５７−８（１９９６）。
Ｗｏｏｄｌｅ，ＭＣ．、「ポリ（エチレングリコール）グラフト化リポソーム療法（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｇｒａｆｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」，ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｅｄｓ．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ  ６８０、ｐｐ６０−８１、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９７）。
Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．、「ポリマーグラフト化リポソームの製造のための末端基官能化ポリエチレングリコール−脂質コンジュゲートの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｄ−ｇｒｏｕｐ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｇｒａｆｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）」，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．４（４）：２９６−９（１９９３）。
Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，Ｍｕｌｌａｈ，Ｎ．，Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｊ．Ａ．，Ｇｉｔｔｅｌｍａｎ，Ｊ．，Ｇｕｏ，Ｌ．，ａｎｄ  ＤｅＦｒｅｅｓ，Ｓ．Ａ．、「ポリマー鎖の末端に付加されたオリゴペプチド又はオリゴ糖リガンドを有するポリ（エチレングリコール）グラフト化リポソーム（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｇｒａｆｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｒ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｐｐｅｎｄｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｅｒｍｉｎｉ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｈａｉｎｓ）」，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．８（２）：１１１−８（１９９７）。
Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，Ｍｕｌｌａｈ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｑａｚｅｎ，Ｍ．、「ポリマー鎖の末端にリガンドを有するポリ（エチレングリコール）グラフト化リポソームの製造（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｇｒａｆｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒｅｍｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｈａｉｎｓ）」，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３８７：５０−６９（２００４）。
【背景技術】
【０００３】
リポポリマー、特にｍＰＥＧ−ＰＥ（ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン）コンジュゲートは、種々のリポソーム及びミセル薬物送達製剤（例えば、それぞれ、Ｗｏｏｄｌｅら、１９９７、及びＬｕｋｙａｎｏｖら、２００４参照）に広範に使用されている。従来、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、ポリエチレングリコール、例えばｍＰＥＧをジアシルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のアミノ基に結合することによって調製される。いくつかのこのようなｍＰＥＧ−ＰＥコンジュゲートは、市販されており、例えば、ジステアロイルＰＥから誘導されたｍＰＥＧ２Ｋ−ＤＳＰＥは、ＳＴＥＡＬＴＨ（登録商標）リポソーム製剤中の主要な賦形剤として広範に使用されている。リガンドがＰＥＧ鎖の遊離の末端に結合している、リガンド−ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、リポソームの標的化送達に使用するために開発されてきた（Ｚａｌｉｐｓｋｙら、２００４）。
【０００４】
その他のコンジュゲートが、例えば米国特許第５，３５９，０３０号（Ｅｋｗｕｒｉｂｅ、１９９４）に記載されており、これは、ペプチドの非イオン性洗剤（ＰＥＧ−疎水性物質付加物）とのコンジュゲートを主として対象としている。コンジュゲートのこの開示された構造は、上記の脂質−疎水性物質−リガンド構造を含み、この場合、脂質が親水性部分（非イオン性洗剤）に結合し、親水性部分がその他の末端でリガンド（ペプチド）と結合している。或いは、リガンドが脂質及び、２つの疎水性部分（その一方が他の脂質にさらに結合している）に結合したより複雑な構造が開示されている。これらのコンジュゲート中の非イオン性洗剤は、不均一組成物である傾向にある合成材料である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、本発明は、式Ｉの化合物
【化１】
2008516056.tif 000003
［式中、
Ａは親水性ポリマーであり、
Ｌ及びＬ’のそれぞれは、独立にリンカー基であり、
Ｂは脂質部分であり、
Ｚは、診断用リガンド、生物学的に関連のあるリガンド、及び反応性結合部分からなる群から選択され、前記反応性結合部分は、ヒドロキシ（−ＯＨ）、酸化物（−Ｏ-）、又は２−アミノエトキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）ではない］を提供する。
【０００６】
選択された実施形態では、脂質部分Ｂは、脂肪酸、ステロール、ジエーテル脂質、及びジアシル脂質から選択される。Ｂがジアシル脂質の場合は、この化合物は、好ましくは式ＩＩ
【化２】
2008516056.tif 000004
［式中、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立に４〜２４個の炭素原子を有するアルキル又はアルケニルである］である。一実施形態では、Ｒ１及びＲ２のそれぞれはＣ１７Ｈ３５（ジステアロイル脂質）である。
【０００７】
リガンド又は反応性結合部分Ｚは、好ましくは、Ｚ中の窒素、酸素又は硫黄原子を介してリン原子に結合している。上記のように、この反応性結合部分は、ヒドロキシ（−ＯＨ）、酸化物（−Ｏ-）、又は２−アミノエトキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）ではない；好ましくは、アミノアルコキシ基（その一例は、２−アミノエトキシである）ではない。好ましい実施形態では、Ｚは、Ｚ中の窒素原子を介してＰに結合して、ホスホルアミド酸塩結合を形成する。
【０００８】
Ｚが反応性結合部分の場合は、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘの形（ｎは２〜６であり、Ｘは、コンジュゲーションしやすい官能基、例えばアミノ、メルカプト、ヒドロキシ、ジスルフィド、アルデヒド、ケトン、マレイミド、ヒドラジド、スクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルなどの、活性化エステルを含むその他のカルボン酸誘導体、又は脱離基を含む）であり得る。例示的な脱離基としては、塩化物、臭化物、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、及びニトロフェニルカルボン酸塩がある。選択された実施形態では、Ｘは、アミノ、マレイミド、ヒドラジド、及びスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルから選択される。一実施形態では、ｎは３であり、Ｘは−ＮＨ２である。他の実施形態では、ｎは３であり、Ｘはスクシンイミジルエステルである。
【０００９】
Ｚは、診断用リガンド、例えば、フルオレセイン又はクマリンなどの蛍光化合物、或いは生物学的に関連のあるリガンド、例えば、治療薬（薬物）又は標的部分を含んでもよい。構造的には、このリガンドは、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、及び小分子化合物から選択することができる。一実施形態では、このリガンドは、治療用ポリペプチド又はタンパク質であり、他の実施形態では、治療用小分子化合物である。
【００１０】
一実施形態では、親水性ポリマーＡは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、好ましくは２〜約１２０個のエチレングリコール繰返し単位を有する。このＰＥＧポリマーは、代表的には、メトキシなどのアルコキシ基又はＸに対する上記のものなどの反応性基、例えば、ヒドラジド（Ｈ２Ｎ−ＮＨ−（ＣＯ）−）、アミノ、ジスルフィド、マレイミド、ニトロフェニルカルボン酸塩、又はＮＨＳエステルを末端としている。
【００１１】
選択された実施形態では、結合Ｌ及びＬ’のそれぞれは、独立に、アルキル、アリール、又はアラルキル部分であり、その一方又は両側に基Ｙが隣接しており、但し、Ｙは、
（ｉ）−Ｗ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｑ−、（ｉｉ）−Ｗ−（Ｃ＝Ｏ）−、（ｉｉｉ）−Ｗ−、及び（ｉｖ）ジスルフィド（Ｗ及びＱは、独立に、酸素、ＮＨ、及び直接結合から選択される）である。好ましくは、アルキルは低級アルキルであり、アリールは単環式基又は二環式基、より好ましくは単環式基である。
【００１２】
他の態様では、本発明は、上記式Ｉ又はＩＩの化合物を、好ましくはリポソームの総脂質含有量の１〜約５０モルパーセントの量で含むリポソームを提供する。
【００１３】
本発明はまた、Ｚが治療薬を含む、上記の式Ｉ又はＩＩのコンジュゲートを対象に経口投与することによって、治療薬を経口的に送達する方法を提供する。この態様では、部分Ａ及びＢ（親水性ポリマー及び脂質）の相対サイズを、経口的送達に有利なＨＬＢ（親水親油バランス）を得るために調整することができる。好ましくは、Ｚは、ｉｎ  ｖｉｖｏで開裂可能な、コンジュゲートのリン原子への結合をさらに含む。さらに、好ましい実施形態では、Ｂは、コンジュゲートが式ＩＩを有し、Ａがポリエチレングリコールであるようなジアシル脂質である。
【００１４】
本発明の上記及びその他の目的及び特徴は、付随する図面と共に以下の本発明の詳細な説明を読めば十分に理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１．定義
「アルキル」とは、直鎖か又は分枝であってよい、炭素及び水素を含む一価の残基を意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル、及びイソプロピルがある。「シクロアルキル」とは、炭素及び水素を含有し、好ましくは３〜７個、より好ましくは５〜６個の環炭素原子を有する、完全に飽和の環式一価の基を意味し、アルキルでさらに置換されてよい。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、エチルシクロペンチル、及びシクロヘキシルがある。
【００１６】
「低級アルキル」とは、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチル、及びイソペンチルで例示される、１〜６個の炭素原子のアルキル基を意味する。選択された実施形態では、「低級アルキル」基は、１〜４個の炭素原子を有する。
【００１７】
「アシル」基とは、カルボン酸のヒドロキシル基の除去によって、有機酸から誘導された有機基である。例えば、カルボン酸から誘導されたアシル基は、Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−の形（但し、Ｒはアルキル基であり、低級アルキル基であってよい）を有する。他のアシル基には、Ｒ−Ｘ（Ｃ＝Ｏ）−の形（但し、ＸはＯ、Ｓ、又はＮＨである）が含まれる。
【００１８】
「ヒドロカルビル」とは、炭素及び水素からなる基、すなわち、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、及び非複素環式アリールを包含する。
【００１９】
「アリール」とは、単環（例えば、フェニル）、２個の縮合環（例えば、ナフチル）又は３個の縮合環（例えば、アントラシル又はフェナントリル）を有する、置換か又は非置換の一価芳香族基を意味する。一般的には、単環基（単核式とも称される）が好ましい。この用語には、環中に１個又は複数の窒素、酸素、又は硫黄原子を有する芳香環の基、例えばフリル、ピロール、ピリジル、及びインドールであるヘテロアリール基も含まれる。「置換された」とは、アリール基中の１つ又は複数の環水素が、ハロゲン化物、例えば、フッ素、塩素、又は臭素で；１又は２個の炭素原子を含む低級アルキル基で；又はニトロ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、メトキシ、ハロメトキシ、ハロメチル、又はハロエチルで置換されていることを意味する。存在する場合は、好ましい置換基としては、フッ素、塩素、メチル、エチル、及びメトキシがある。
【００２０】
「ＰＥＧ」とは、ポリエチレングリコール、繰返し単位（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（但し、ｎが好ましくは約１０〜約２３００であり、これは分子量約４４０〜約１００，０００ダルトンに対応する）を有するポリマーを意味する。このポリマーは、代表的には、実質的にすべての分子量範囲にわたり水溶性である。ポリペプチドとのコンジュゲーションでは、ＰＥＧ分子量の好ましい範囲は、約２，０００〜約５０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００〜約４０，０００ダルトンである。このＰＥＧは、本明細書に記載のコンジュゲーション反応を妨害しない任意の基、例えば、ヒドロキシル、エステル、アミド、チオエーテル、アルコキシ、又は適当な保護部分でブロックされた種々の反応性基でエンドキャップされてよい。一般的なエンドキャップされたＰＥＧはメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）である。ＰＥＧホモポリマーが好ましいが、この用語は、ＰＥＧと他のモノマーのコポリマーも含んでよい。これは、例えば、プロピレングリコールなどの他のエーテルを形成するモノマーであり得る。
【００２１】
「ホスホルアミド酸塩」結合とは、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲＲ’）−Ｏ−の形（但し、Ｒ及びＲ’のそれぞれは、水素か、又は炭素原子を介してＮに結合した置換基を表す）の結合を意味する。「リン酸チオエステル」結合とは、本明細書では「チオ燐酸塩」とも称され、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＲ）−Ｏ−の形（但し、Ｒは、炭素原子を介してＳに結合する置換基を表す）の結合を意味する。
【００２２】
分子上の「コンジュゲーションしやすい」又は「反応性」官能基とは、合成有機化学の通常の条件下で、他の分子上の官能基と共有結合を形成するのに有効なものである。このような条件とは、例えば、どちらの分子の非反応性部分にも悪影響を及ぼさないものである。
【００２３】
「小胞体形成性脂質」とは、疎水性及び極性の頭部基部分を有する両親媒性脂質を意味し、これは、リン脂質によって例示されるように、水中で自発的に二重層小胞体を形成することができるか、或いは、脂質二重層中に、疎水性部分を二重層膜の内部の疎水性領域に接触させ、且つ、極性頭部基部分を膜の外部の極性表面に向けて配向して安定して取り込まれている。このような小胞体形成性脂質は、代表的には１個又は２個の疎水性アシル炭化水素鎖又はステロイド基を含み、且つ、極性頭部基に化学的に反応性の基、例えば、アミン、酸、エステル、アルデヒド又はアルコールを含むことができる。例としては、リン脂質、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）があり、但し、２個の炭化水素鎖は、代表的には約１４〜２２個の間の炭素原子の長さであり、様々な不飽和度を有する。その他の小胞体形成性脂質としては、セレブロシド及びガングリオシドなどの糖脂質、及びコレステロールなどのステロールがある。
【００２４】
「薬剤として許容される塩」という用語は、例えば、有機又は無機対イオン、例えば、アルカリ又はアルカリ土類金属カチオン（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、バリウム又はカルシウム）；アンモニウム；或いは有機カチオン、例えば、ジベンジルアンモニウム、ベンジルアンモニウム、２−ヒドロキシエチルアンモニウム、ビス（２−ヒドロキシエチル）アンモニウム、フェニルエチルベンジルアンモニウム、等を有するカルボン酸塩を包含する。その他のカチオンとしては、塩基性アミノ酸、例えばグリシン、オルニチン、ヒスチジン、フェニルグリシン、リシン、及びアルギニンのプロトン化の形態がある。
【００２５】
この用語にはまた、有機又は無機酸から誘導された対イオンを有する、アミンなどの塩基性基の塩が含まれる。このような対イオンとしては、塩化物、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、パルミチン酸塩、コール酸塩、グルタミン酸塩、グルタル酸塩、酒石酸塩、ステアリン酸塩、サリチル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ソルビン酸塩、ピクリン酸塩、安息香酸塩、桂皮酸塩等がある。
【００２６】
「薬剤として許容される担体」とは、ヒト対象を含む対象にコンジュゲートを薬剤配合物として投与するのに適した担体である。この担体は、代表的には、生理食塩水溶液などの水性ビヒクル、デキストロース、グリセロール、又はエタノールである。不活性成分、例えば緩衝剤、安定剤、等を製剤中に含めてよい。本明細書では、「水性ビヒクル」とは、その主たる成分として水を含むが、丁度説明した溶質を含めてよい。共溶剤、例えばアルコール又はグリセロールが存在してもよい。
【００２７】
固体製剤も使用してよく、代表的には不活性な賦形剤、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース又はセルロースエーテル、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム、等が含まれる。このコンジュゲートは、当技術分野で既知の方法に従って、脂質又はリン脂質中の懸濁液中、リポソーム製剤中、或いは、経皮製剤又は吸入可能製剤中に配合することもできる。
【００２８】
ＩＩ．リポポリマーコンジュゲート
Ａ．構造及び特性
一態様では、本発明は、構造Ｉの
【化３】
2008516056.tif 000005
［式中、
Ａは親水性ポリマーであり、
Ｌ及びＬ’のそれぞれは、独立にリンカーであり、
Ｂは脂質部分であり、
Ｚは、治療薬、診断薬、及び反応性結合部分からなる群から選択される］リポポリマーコンジュゲートを対象とする。
【００２９】
反応性結合部分が、ヒドロキシ（−ＯＨ）、酸化物（−Ｏ-）、又は２−アミノエトキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）である化合物は含めない。好ましくは、これはアミノアルコキシ基（その一例は２−アミノエトキシである）ではない。
【００３０】
例示的な親水性ポリマー（Ａ）としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミド、上に列挙されたポリマーのコポリマー、及びポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマーがある。体温で完全に水溶性であり、十分に生体適合性のあるポリマーが好ましい。多くのこれらのポリマーの特性及び反応が、米国特許第５，３９５，６１９号及び同第５，６３１，０１８号に記載されている。
【００３１】
好ましい実施形態では、親水性ポリマー（Ａ）は、ポリ（アルキレンオキシド）、より好ましくは上記に定義したＰＥＧ（ポリエチレングリコール）ポリマーである。好ましくは、このＰＥＧポリマーは、２〜約１２０個のエチレングリコール繰返し単位を有する。その離れた末端は、代表的には、アルコキシ基又は反応性基、例えば、基Ｘに対して以下に記載の基などでキャップされている。
【００３２】
脂質部分（Ｂ）は、少なくとも約８個の炭素原子、好ましくは約８〜２４個の炭素原子を含む、少なくとも１つのアルキル鎖又はアシル鎖、或いはステロイド核を有する水不溶性分子である。小胞体形成性脂質が好ましい。例示的な脂質には、単一炭化水素鎖又は、好ましくは２個の炭化水素鎖を有するリン脂質であって、炭化水素鎖は、長さが代表的には約４〜２４、好ましくは約８〜２４、より好ましくは約１２〜２４個の炭素原子であり、様々な不飽和度を有するリン脂質が含まれる。その他の適当な脂質には、糖脂質、例えば、セレブロシド及びガングリオシド、及びステロイド、例えば、コレステロール、又はコレステリルアミンが含まれる。
【００３３】
選択された実施形態では、脂質部分Ｂは、脂肪酸、ステロール、ジエーテルグリセリル脂質（２個のエーテル結合炭化水素鎖を有する）、及びジアシルグリセリル脂質（２個のアシル結合炭化水素鎖を有する）から選択される。一実施形態では、脂質部分Ｂはジアシルグリセリル脂質であり、リポポリマーコンジュゲートが、式ＩＩ
【化４】
2008516056.tif 000006
［式中、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立に、４〜約２４個の炭素原子、好ましくは約６〜２４個の炭素原子、より好ましくは約１２〜２４個の炭素原子を有するアルキル又はアルケニルである］を有している。一実施形態では、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、Ｃ１７Ｈ３５（ジステアロイル）である。
【００３４】
リン原子基に結合した基Ｚには、治療用又は診断用リガンド、例えば、薬物或いは標的部分、結合部分又は標識化部分が含まれる。代表的には、Ｚはまた、例えば、タンパク質、多糖類、核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、又は小分子化合物であり得るリガンド部分をリン原子に結合する短いリンカー基（Ｌ及びＬ’に対して以下に記載のものなど）を含む。
【００３５】
標的部分又は結合部分の例としては、ビオチン、葉酸塩、ピリドキサール、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などの成長因子、サイトカイン、ＣＤ４、及びＤＴＰＡなどのキレート剤がある。その他の標的部分としては、米国特許第６，６６０，５２５号及び同第６，０４３，０９４号に記載のものがあり、これらを参照により本明細書に援用する。好ましい標識化部分としては、蛍光化合物、例えば、クマリン及びその誘導体、フルオレセイン及びその誘導体、及び当技術分野で既知のその他なのものがある。
【００３６】
構造的には、このリガンドは、ポリマー又はオリゴマーの生体分子、例えば、タンパク質、多糖類、核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、又は小分子化合物から選択し得る。「小分子」化合物とは、ポリマー又はオリゴマーでない、有機、無機、又は有機金属化合物として広範に定義することができる。代表的には、このような化合物は、１０００未満、又は一実施形態では５００Ｄａ未満の分子量を有する。
【００３７】
好ましくは、基Ｚは、Ｚ中の窒素、酸素又は硫黄原子を介してリン原子に結合し、それぞれ、ホスホルアミド酸塩、リン酸トリエステル、又はリン酸チオエステル結合を生じる。好ましくは、基Ｚは、Ｚ中の窒素原子を介してリン原子に結合して、ホスホルアミド酸塩結合を生じる。
【００３８】
Ｚが反応性結合部分の場合は、Ｚは好ましくは、反応性基Ｘが末端をなす、短鎖の原子（すなわち、長さ１〜約８個の原子、好ましくは長さ２〜６個の原子）を含み、但し、Ｘは、例えば、治療用部分又は診断用部分上の他の基と反応して共有結合を形成するのに有効な求核基又は求電子基である。一実施形態では、Ｚは、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘの形（但し、ｎは２〜約６、好ましくは２〜４であり、Ｘはコンジュゲーションしやすい官能基、例えば、アミノ、メルカプト、ジスルフィド、アルデヒド、ケトン、マレイミド、ヒドラジド、その他のカルボン酸誘導体、等である）の反応性部分である。基Ｘは、脱離基、例えば、塩化物、臭化物、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、スクシンイミジルエステル、又はニトロフェニルカルボン酸塩を含んでよい。一実施形態では、ｎは３であり、Ｘは−ＮＨ２であって、Ｚは３−アミノプロピルアミンである。
【００３９】
このリガンド又は結合基Ｚは、以下にさらに論じるように、ｉｎ  ｖｉｖｏでコンジュゲートからリガンドを放出するのに有効な、ｉｎ  ｖｉｖｏで開裂可能な部分、例えば、エステル、カルバミン酸塩、炭酸塩、又はジスルフィドを含むことができる。
【００４０】
リンカーＬ及びＬ’（構造ＩＩ参照）は、一般的には、リン酸塩（或いは、場合に応じてホスホルアミド酸塩又はリン酸チオエステル）の酸素原子（複数）と、それぞれ親水性ポリマー及び脂質基の間の貯蔵で安定な結合である。好ましくは、Ｌ及びＬ’のそれぞれは、独立に、アルキル、アリール、又はアラルキル部分であり、その一方又は両側に基Ｙが隣接しており、但し、Ｙは、（ｉ）−Ｗ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｑ−、（ｉｉ）−Ｗ−（Ｃ＝Ｏ）−、（ｉｉｉ）−Ｗ−及び（ｉｖ）ジスルフィド（Ｗ及びＱは、独立に、酸素、ＮＨ、及び直接結合から選択される）である。したがって、Ｌ及び／又はＬ’の種々の実施形態には、直接結合、アルキル基、エーテル、エステル、アミド、カルバミン酸塩、炭酸塩、ジスルフィド、及びこれらの任意のものとアルキル又はアリール基の組合せが含まれる。このアルキル基は、好ましくは低級アルキルであり、このアリール基は、好ましくは単核式又は二核式、より好ましくは単核式である。好ましいリンカーとしては、長さ２〜４個の原子のアルキル基と組み合わせた、エーテル、エステル、アミド、カルバミン酸塩、炭酸塩、又はジスルフィドがある。また、好ましいものには、例えば米国特許第６，３４２，２４４号に記載のジチオベンジルリンカーが含まれる。
【００４１】
選択された実施形態では、Ｌ及びＬ’の少なくとも１つが、ｉｎ  ｖｉｖｏで開裂可能である。このような開裂可能な結合には、酵素的に又は加水分解で開裂可能なエステル及び炭酸塩、並びに還元性化学種、例えばシスティン又はグルタチオンによってｉｎ  ｖｉｖｏで開裂することが可能なジスルフィドが含まれる。
【００４２】
本明細書に記載のリポポリマーコンジュゲートは、結合したリガンド用送達ビヒクルとしてこれらを有用にする種々の特性を有する。このリガンド（例えば、治療薬）は、そのコンジュゲート中の脂質と親水性ポリマー鎖の結合部の近傍に結合しているので、このリガンドは、リガンドが通常ＰＥＧ鎖の末端に結合している従来技術のコンジュゲートに比べて、親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）によってより遮蔽され易い。このような遮蔽の利点としては、循環時間がより長くなり、リガンドの分解が減少することである。
【００４３】
このリガンドが検出可能な基の場合は、リガンドの脂質頭部基近傍への位置決めは、リポソームの脂質挿入の研究に有用な試薬も提供する。
【００４４】
さらに、リポポリマーコンジュゲートの親水親油バランス（ＨＬＢ）は、脂肪酸（脂質）及び／又は親水性ポリマー（例えばＰＥＧ）の鎖長を変えることによって調整可能である。例えば、ＨＬＢは膜浸透を改良するために改変することができ、これは結合した薬物の経口及びＣＮＳ送達に有益である。
【００４５】
したがって、本発明はまた、上記式Ｉ又はＩＩの担体（但し、Ｚは薬物であり、Ａ及びＢの相対サイズは、担体に所望のＨＬＢを与えるのに有効である）を提供することによって、薬物用担体の親水親油バランスを調整する方法を提供する。この担体では、Ａは好ましくはＰＥＧポリマーである。
【００４６】
Ｂ．リポポリマーコンジュゲートの調製
本発明のコンジュゲートは、一般形Ａ−Ｌ−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）ＯＲ−Ｏ−Ｌ’−Ｂ（Ａ、Ｂ、Ｌ、及びＬ’は、上記に定義した通りであり、ＯＲは、酸化物、ヒドロキシ又は低級アルコキシ、例えばメトキシである）の中間体、リン酸ジエステル又はリン酸トリエステルリポポリマー構造から調製することができる。
【００４７】
脂質Ｂがジアシルグリセリル脂質、例えば上記構造ＩＩの場合は、このような中間体は、ジアシルグリセリルリン脂質から調製することができ、その多くは天然起源であるか、市販されているか、及び／又は既知の方法によって容易に調製される。親水性ポリマー、特にＰＥＧポリマーをリン脂質に結合するための種々の方法が、当技術分野で報告されている。例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ、１９９３；Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、１９９６；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９７を参照。このようなＰＥＧ−リン脂質化合物は、市販もされており、例えば、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）などの種々のＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミンが、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、アラバマ州）から入手可能である。
【００４８】
Ｂがリン脂質、リン酸ジエステル（又はＯＲがアルコキシの場合はリン酸トリエステル）由来でない場合は、Ａ−Ｌ−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）ＯＲ−Ｏ−Ｌ’−Ｂは、例えば、オリゴヌクレオチド合成に一般に使用されるホスホアミダイト中間体を使用し得る従来の方法によって調製することができる。したがって、この手順の一実施形態では、部分Ｂ−Ｌ’−ＯＨ（ヒドロキシル官能基を有する脂質部分）を試薬Ｐ（ＮＲ２）（ＯＭｅ）Ｃｌ（但し、Ｒは代表的にはイソプロピルである）と反応させて、ホスホアミダイトＰ（ＮＲ２）（ＯＭｅ）−Ｏ−Ｌ’−Ｂを形成する。次いでこの中間体を部分Ａ−Ｌ−ＯＨ（ヒドロキシル官能基を有する親水性ポリマー）と反応させて、亜リン酸トリエステルＡ−ＬＯ−Ｐ（ＯＭｅ）−Ｏ−Ｌ’−Ｂを形成し、これをリン酸トリエステルに酸化することができる。必要に応じて、塩基又は酸で処理して、それぞれリン酸塩又はリン酸を得る。
【００４９】
一実施形態では、基Ｚは、Ｚ中の窒素原子を介してコンジュゲート中のリン原子に結合して、ホスホルアミド酸塩結合を形成する。下記の実施例１には、一方のアミン末端とリン酸塩頭部基の間のホスホルアミド酸塩結合の形成を介して、ジアミンのｍＰＥＧ−ＤＳＰＥに結合し、さらなる誘導体化又はコンジュゲーションを他のアミン末端が利用可能なようにしておくことが記載されている（図１参照）。この手順では、出発リン酸ジエステルを塩化オキサリルで活性化して、塩化ホスホリル中間体を生成し、これを単離することなしにアミン試薬（この実施例では、１−Ｂｏｃ保護  １，３−ジアミノプロパン）と反応させる。このリン酸ジエステルは、アミンとの反応のために他の試薬、例えばイミダゾールの存在下でカルボジイミドによっても活性化される（Ｇｈｏｓｈら、１９９０）。このアミノ誘導体化リポポリマーコンジュゲートは、Ｂｏｃ保護基を除去することによって生成される。
【００５０】
リン酸ジエステル脂質に他の１級又は２級アミンを結合して、安定なホスホルアミドジエステルコンジュゲートを形成するために同様の手順を使用することができる。このリンカー基Ｚは、その遊離の末端に種々の官能基を有してよい。例えば、実施例２に記載し、図２に示すように、酸分解的脱保護の後に遊離カルボン酸を提供するために、アミノ酸エステル、例えば、β−アラニンｔｅｒｔ−ブチルエステルを使用することができる。次いで、この末端官能基は、当技術分野で既知の合成方法を用いて種々のリガンド、上記のように例えば、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、糖類、標的基、キレート剤等を結合させるために利用することができる。
【００５１】
図１に図示する例示的な手順では、アミノプロパンホスホルアミド酸塩のアミノ基を脱保護し、７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸のスクシンイミジルエステルと結合して、蛍光標識したリポポリマー（ｍＰＥＧ−７ＨＣ−ＤＳＰａｍと呼ばれる）を生じる。図２に図示した手順では、上記のようにβ−アラニンとの反応を介して結合した末端カルボン酸塩は、ＮＨＳエステルとして活性化され、続いてタンパク質のアミノ基にコンジュゲーションされる。
【００５２】
本発明のリン酸トリエステル結合リポポリマーは、例えば、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥなどのリン酸ジエステルをＲ−ＯＨと縮合させることによって得ることができる。この反応は、例えばＳｏｌｏｄｉｎら（１９９６）によって報告されたように、２、６−ルチジン中で塩化メタンスルホニル又は塩化トルエンスルホニルを介在させることができる。Ｒ−ＯＨのＲ残基は、さらに誘導体化が可能なマスキング基を含むことができる。
【００５３】
Ｍｌｏｔｋｏｗｓｋａ及びＭａｒｋｏｗｓｋａ（１９９８）は、メトキシ基を有する亜リン酸トリエステル（すなわち、ＲＯ−Ｐ（ＯＭｅ）−ＯＲ’）とＮ−チオール化スクシンイミド（すなわち、環窒素が−ＳＲ”で置換された）の反応により、チオ燐酸塩、ＲＯ−ＰＯ（ＳＲ”）−ＯＲ’が生成することを報告している。
【００５４】
本発明のコンジュゲートはまた、一般形Ａ−Ｌ−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）Ｈ−Ｏ−Ｌ’−Ｂ（但し、Ａ、Ｂ、Ｌ、及びＬ’は上記に定義した通りである）のＨ−ホスホン酸ジエステル中間体を介して容易に得ることができる。このような中間体は、Ｌｉｎｄｈ及びＳｔａｗｉｎｓｋｉ（１９８９）によって報告された方法を用いて調製することができる。例えば、ジアシルグリセロールを三塩化リン／イミダゾールで処理し、続いて水性後処理により、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸塩が高収率で生成する。このＨ−ホスホン酸塩は、塩化ピバロイルを用いて、親水性ポリマー、例えばｍＰＥＧ−ＯＨに結合して、Ｈ−ホスホン酸塩ジエステル結合ｍＰＥＧ−脂質を生成することができる。
【００５５】
このＨ−ホスホン酸塩基は、ＣＣｌ４／トリエチルアミン中で適当なアミンと結合することによって、ホスホルアミド酸塩に容易に変換することができる（例えば、Ｇｒｙａｚｎｏｖ及びＬｅｔｓｉｎｇｅｒ、１９９２参照）。この反応は、任意のアミノ含有レポーター又は薬物部分を結合するために使用することができる。
【００５６】
Ｈ−ホスホン酸塩基はまた、硫黄による単純な処理によってチオ燐酸塩に容易に変換可能である（Ｌｉｎｄｈ及びＳｔａｗｉｎｓｋｉ、１９９８）。このチオ燐酸塩を、さらに官能化し、直接Ｓ−アルキル化によって種々のレポーター基で標識することが可能である。
【００５７】
上記のように、この分子の脂質−親水性ポリマー部分は、脂質、親水性ポリマー、又は両方が、循環中の一定の時間後に分子から放出されるような、１つ又は複数のｉｎ  ｖｉｖｏで開裂可能な結合（代表的にはＬ又はＬ’部分で）を有して調製し得る。例えば、リポソーム中のＰＥＧ−ＤＳＰＥからＰＥＧのｉｎ  ｖｉｖｏ開裂を記述している、Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、１９９６参照。
【００５８】
この基Ｚは、さらなる結合部分を提供するのに有効な基であってよく、或いは診断薬又は治療薬であってよい。一実施形態では、結合基Ｚは、結合している薬剤が、循環中の一定の時間後、好ましくは標的部位に送達後に分子のリポポリマー部分から放出されるような、ｉｎ  ｖｉｖｏ開裂可能な結合を含むことが可能である。
【００５９】
Ｃ．開裂可能な結合
上記のように、本明細書に記載のリポポリマー−リガンドコンジュゲートは、脂質、親水性ポリマー、及びリガンド（例えば薬物）の１種又は複数が、循環中の一定時間後にコンジュゲートから放出されるようなｉｎ  ｖｉｖｏ開裂可能な１種又は複数の結合を有して調製し得る。このような開裂可能な結合には、酵素的に又は加水分解で開裂可能なエステル及び炭酸塩、並びに還元性化学種、例えばシスティン又はグルタチオンによってｉｎ  ｖｉｖｏで開裂可能なジスルフィドが含まれる。結合は、結合の選択、分子内開裂の使用、及び／又は開裂部位又は近傍における立体的又は電子的特性の変更を含む、当技術分野で既知の方法に従ってより速い開裂又は遅延した開裂のために設計することができる。例えば、開裂部位における立体的効果による開裂速度の調節が記載されている米国特許第６，３４２，２４４号（参照により本明細書に援用する）参照。
【００６０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるコンジュゲートの構造の所望の変化に応じて、コンジュゲートの異なる部分を開裂可能な結合により調製することができる。例えば、リポソーム中のＰＥＧ−ＤＳＰＥからのＰＥＧのｉｎ  ｖｉｖｏ開裂が記載されている、Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、１９９６参照。この場合、ＰＥＧポリマーの開裂により、リポソームの表面上のＰＥＧのコーティングが分断されて、リポソームが不安定化及び破壊され、これによってその含有物を放出する。
【００６１】
本明細書に記載のコンジュゲートからの親水性ポリマー又は脂質の開裂は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのコンジュゲートのＨＬＢの変更にも使用することが可能である。例えば、一般的には、経口又はＣＮＳ送達のため及び膜浸透のためには、より親油性の化合物がはじめに有利である。関門通過後の脂質部分の開裂は、親水性及びこれによる化合物のサイトゾル溶解度を増大するために使用することができる。
【００６２】
このリガンド又は結合基Ｚはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでコンジュゲートからリガンドを放出するのに有効なｉｎ  ｖｉｖｏ開裂可能部分、例えばエステル、カルバミン酸塩、炭酸塩、又はジスルフィドを含んでよい。これは、標的部位における薬物送達に特に有用である。
【００６３】
Ｄ．ミセル又はリポソーム組成物
本明細書に記載のリポポリマーは、非経口送達に有用なミセル又はリポソーム製剤に使用することができる。さらに、これらは血液脳関門透過性、並びに経口送達に潜在的に有用である。
【００６４】
リポソームは、種々の治療目的、特に全身投与によって標的領域又は細胞に治療薬を運ぶために使用される閉鎖された脂質小胞体である。特に、親水性ポリマー鎖、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の表面コーティングを有するリポソームは、ポリマーコーティングのないリポソームより長い血中循環寿命を提供するので、薬物担体として望ましい。このポリマーは、血中タンパク質へのバリアとして作用して、タンパク質の結合、並びにマクロファージ及び細網内皮系の他の細胞が取込み及び除去するためにリポソームを認識するのを阻止する。
【００６５】
脂質成分からリポソームを形成する方法は、当技術分野でよく知られている。本発明のリポポリマーを取り込んだリポソームは、脂質二重層成分（例えば、リン脂質及び／又はその他の小胞体形成性脂質）の混合物中に、約１〜約５０モルパーセント、好ましくは約１〜約２０モルパーセントの、上記式Ｉの脂質−ポリマーコンジュゲート（但し、Ｚは標的部分又は治療用部分である）に含めることによって調製することができる。他の実施形態では、Ｚは標識化部分である。好ましくは、脂質−ポリマーコンジュゲートは、上記式ＩＩ（すなわち、脂質はジアシルグリセリルリン脂質である）である。
【００６６】
このリポソームは、カプセル化された化合物を含むことができる。一実施形態では、このリポポリマーコンジュゲートＩ又はＩＩは、親水性ポリマーが、好ましくは標的部位に到達した後にリポポリマーコンジュゲートから放出されるようにｉｎ  ｖｉｖｏで開裂可能な親水性ポリマー（Ａ）への結合を含んでいる。Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、１９９６に記載されたように、このようなリポソームの脂質組成物は、リポソームが親水性ポリマーを失うことによって不安定化し、これによって、ポリマーがｉｎ  ｖｉｖｏ開裂したときに、その含有物を放出するように設計することができる。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は、本明細書に記載の本発明さらに例示し、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００６８】
（実施例１）
７−ヒドロキシクマリン及びｍＰＥＧ−ＤＳＰＥのホスホルアミド酸塩に結合したコンジュゲートの合成（図１）
Ａ．ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ−Ｎ−１−Ｂｏｃ  １，３−ジアミノプロパンの合成
ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（０．５ｇ、０．１８９ミリモル）をジクロロメタン（５ｍｌ）中に溶解し、窒素雰囲気下で０℃に冷却した。この溶液に無水ＤＭＦ（５０μＬ、０．６４６ミリモル）及び塩化オキサリル（１５０μＬ、１．７２ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。この溶媒を減圧下で蒸発し、生成物をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解し、窒素雰囲気下で０℃に冷却した。トリエチルアミン（２００μＬ、１．４４２ミリモル）及びＮ−１−Ｂｏｃ  １，３−ジアミノプロパン（７６．４５ｍｇ、０．３６２８ミリモル）を０℃の上記の溶液に添加した。この反応を氷浴中で１５分間及び室温で１５分間撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ、９０：１８：２）により、反応が完了まで進行していることを示した（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥのＲｆは０．５３３であり、生成物は０．７３３であった）。溶媒を減圧下で蒸発し、粗製混合物を溶離液としてＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（９５：５）を用いるクロマトグラフィーにかけた。得られた生成物をイソプロパノールを用いてさらに沈殿させ、ろ過し、五酸化リンにより乾燥して、生成物０．４２２ｇ（７６％）を得た。
【００６９】
【化５】
2008516056.tif 000007
Ｍａｌｄｉ（使用マトリックス：２，５−ジヒドロキシベンジル酸＋ＴＦＡ（０．１％）＋５メトキシサリチル酸（１ｍｇ／ｍｌ）：ｍ／ｚ２９５８に分布。
【００７０】
Ｂ．ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ−７−ヒドロキシクマリン−１，３−ジアミノプロパンの合成
上記に調製したｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ−Ｎ−１−Ｂｏｃ−１，３−ジアミノプロパン（０．１ｇ、０．０３３７ミリモル）を冷却したジオキサン（３ｍｌ）中の４Ｎ  ＨＣｌに溶解し、混合物を室温で５０分間撹拌した。次いで、ジオキサンを凍結乾燥によって除去した。脱保護された生成物の形成が、ＴＬＣによって（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ−Ｎ−１−Ｂｏｃ  １，３−ジアミノプロパンのＲｆは０．７３３であり、脱保護された生成物は０．５３３であった）、及び３１Ｐ−ＮＭＲ（１３．２８ｐｐｍ）によって確認された。脱保護された生成物をジクロロメタン（２ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。この溶液に最小量のＤＭＦ中のＮ−スクシンイミジル−７−ヒドロキシクマリニルアセテート（２１．９９ｍｇ、０．０６９ミリモル）及びトリエチルアミン（２３．９９μＬ、０．１７２ミリモル）を添加した、反応混合物を窒素雰囲気下室温で３時間撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ、９０：１８：２）により、出発材料と共に非極性生成物スポット（Ｒｆ：０．７３３）の存在が示された。溶媒を減圧下で蒸発し、粗生成物を溶離液としてＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（９５：５）を用いるクロマトグラフィーにかけた。所望の生成物をｔ−ブタノールを用いて凍結乾燥して、収率４０％を得た。
【００７１】
【化６】
2008516056.tif 000008
Ｍａｌｄｉ（使用マトリックス：２，５−ジヒドロキシベンジル酸＋ＴＦＡ（０．１％）＋５メトキシサリチル酸（１ｍｇ／ｍｌ）：ｍ／ｚ３０６０に分布、スプレー（ｅｐｒａｙ）１０８２（３＋）、Ｉ４８０（２＋）。１Ｈ及びＣＯＳＹスペクトルは、図１に示した提案された構造と一致した。
【００７２】
（実施例２）
ホスホルアミド酸塩に結合したｍＰＥＧ−タンパク質−リン脂質コンジュゲートの合成（図２）
ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥのジクロロメタン溶液を塩化オキサリル及び触媒量のＤＭＦで処理した。この溶液を蒸発によって濃縮し、残渣をジクロロメタン中に再溶解し、氷により冷却し、トリエチルアミン及びβ−アラニンｔｅｒｔ−ブチルエステルで処理した。１５分後に反応が完了した。溶液を蒸発によって濃縮し、β−Ａｌａ−ＯｔＢｕホスホルアミド酸塩生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール９５：５）によって精製した。
【００７３】
ｔｅｒｔ−ブチルエステル基の除去をジオキサン中で４Ｍ  ＨＣｌで６時間処理することによって実施した。この溶媒及びＨＣｌを真空下で除去し、次いで、得られたｍＰＥＧ−ＤＳＰＥのカルボキシル含有ホスホルアミド酸塩をジクロロメタン中に溶解し、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）及びＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）との反応によって、そのスクシンイミジルエステルに変換した。形成されたジシクロヘキシル尿素をろ過し、溶液を濃縮した。この生成物、ｍＰＥＧ−（β−Ａｌａ−ＯＳｕ）ＤＳＰａｍをイソプロパノール中に沈殿させ、ＮＭＲ及びＭＳによって特性決定した。ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥからの全体的収率はほぼ５０％であった。
【００７４】
リン酸塩緩衝剤（ｐＨ７．５）中のリゾチーム（２ｍｇ／ｍｌ）を５倍モル過剰なｍＰＥＧ−（β−Ａｌａ−ＯＳｕ）ＤＳＰａｍと１時間反応させた。この修飾されたタンパク質をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩによって特性決定し、リゾチームとリポポリマーの１：１及び１：２コンジュゲートの存在を確認した。１：１コンジュゲートをカチオン交換クロマトグラフィーによって単離した。
【００７５】
本発明を特定の実施形態に関して説明してきたが、当業者であれば、本発明から逸脱することなく種々の変更形態及び修正形態を加えることができることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の一実施形態による、検出可能なリガンド、７−ヒドロキシクマリンを含む、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥから誘導されたリポポリマーコンジュゲートの調製を示す合成スキームである。
【図２】本発明の他の実施形態による、タンパク質リガンドを含むリポポリマーコンジュゲートの調製を示す合成スキームである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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