(57)【要約】  ユニバーサル抗体ライブラリーについて記載しており、該ライブラリーは、合成したものであり、特定の規準に従って選択された発現ヒト抗体配列に由来し、該規準は、例えば、その配列がある種の抗原クラス（例えば、低分子、多糖類、ペプチドまたはタンパク質）に反応して発現した天然抗体に由来し、最適な多様性のために操作して作製したＣＤＲ領域を有していることである。疾患の治療に適した治療薬を単離するために、このようなライブラリーを作製し、スクリーニングする方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）次の規準：
ｉ）各フレームワーク領域は、所定の抗原クラスに対する発現抗体において規定した閾値頻度以上で生殖細胞系配列を含むこと
に従って選択された、１個または複数のフレームワーク領域、および場合により
ｂ）１個または複数のＣＤＲ領域
を含む、抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドのライブラリー。
【請求項２】
抗体結合領域が、抗体、抗体軽鎖（ＶＬ）、抗体重鎖（ＶＨ）および１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
１個または複数のＣＤＲ領域を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項４】
１個または複数の前記ＣＤＲ領域が、次の規準：
ｉ）前記ＣＤＲ領域は、ａ）の選択フレームワーク領域（複数も）の正準クラスにより決定される長さを備えること、および
ｉｉ）前記ＣＤＲ領域は、前記ＣＤＲ領域内の各位置または位置のサブセットに、相当する天然ＣＤＲ領域（複数も）中の相当位置に見出される、ある閾値頻度以上で出現するアミノ酸のセットから選択されるアミノ酸残基を含むこと、
によって選択され、ａ）のフレームワーク領域およびｂ）のＣＤＲ領域が共同で抗体結合領域を形成する、
請求項３に記載のライブラリー。
【請求項５】
１個または複数の前記ＣＤＲ領域が、次の規準：
ｉ）前記ＣＤＲ領域は、ａ）の選択フレームワーク領域（複数も）の正準クラスにより決定される長さを備えること、および
ｉｉ）前記ＣＤＲ領域は、前記ＣＤＲ領域内の各位置に、
生殖細胞系ＣＤＲ、発現ＣＤＲ領域の両方に出現する保存アミノ酸、
生殖細胞系では保存されているが、発現ＣＤＲ領域では可変性である半保存アミノ酸、および
生殖細胞系で可変性であり、発現ＣＤＲ領域で可変性である非保存アミノ酸
からなる群から選択されるアミノ酸残基によって表わされる、アミノ酸残基を含むこと、
によって選択され、ａ）のフレームワーク領域およびｂ）のＣＤＲ領域が共同で抗体結合領域を形成する、
請求項３に記載のライブラリー。
【請求項６】
前記フレームワーク領域が、軽鎖フレームワーク領域および重鎖フレームワーク領域からなる群から選択される、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項７】
前記軽鎖フレームワーク領域が、ＶκＩ−Ｌ１、ＶκＩ−Ｌ５、ＶκＩＩＩ−Ａ２７、ＶκＩＩＩ−Ｌ６、ＶκＩＩＩ−Ｌ２０、Ｖλ１−１ｂ、Ｖλ１−１ｃ、Ｖλ２−２ａ２、およびＶλ３−３１、Ｖλ３−３ｒからなる群から選択される、ヒト軽鎖フレームワーククローンに由来する請求項６に記載のライブラリー。
【請求項８】
前記重鎖フレームワーク領域が、１−ｅ、３−０７、３−１１、３−２１、３−２３、３−３０．５、３−３３、３−４８および３−７４からなる群から選択される、ヒト重鎖フレームワーククローンに由来する請求項６に記載のライブラリー。
【請求項９】
重鎖フレームワークが、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５およびＪＨ６からなる群から選択されるＪセグメント配列を含む、請求項６に記載のライブラリー。
【請求項１０】
フレームワーク領域が、約１０％から約１００％の閾値出現頻度を有する、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記所定の抗原クラスが、タンパク質、ペプチド、低分子、多糖類およびポリヌクレオチドからなる群から選択される抗原のクラスである、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１２】
ＣＤＲ領域が、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３からなる群から選択される、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１３】
所与の正準構造に関連して選択されたＣＤＲの画定により決定されるＣＤＲ−Ｈ１の長さが、長さ５、６、７および８からなる群から選択される、請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項１４】
ＣＤＲ−Ｈ１領域が、Ｋａｂａｔに基づくＣＤＲの画定に従うと長さが５である、請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項１５】
ＣＤＲ−Ｈ１がアミノ酸配列ＳＹＸ１ＭＸ２を含み、式中Ｘ１の配列はＡ、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、ＮまたはＧであり、Ｘ２はＡ、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、ＷまたはＧである、請求項１４に記載のライブラリー。
【請求項１６】
ＣＤＲ−Ｈ１領域が、接触決定に基づくＣＤＲの画定に従うと長さが６である、請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項１７】
ＶＨ１  ＣＤＲ−Ｈ１がアミノ酸配列Ｔ／ＳＳＹＸ１Ｉ／ＭＸ２を含み、式中Ｘ１はＡ、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｈ、ＮまたはＧであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、ＨまたはＮである、請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項１８】
ＶＨ３  ＣＤＲ−Ｈ１がアミノ酸配列ＳＸ１ＹＸ２ＭＸ３を含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＴであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＷまたはＧであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎである、請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項１９】
所与の正準構造に関連して選択されたＣＤＲの画定により決定されるＣＤＲ−Ｈ２の長さが、長さ１７、１２および１３からなる群から選択される、請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項２０】
ＣＤＲ−Ｈ２領域が、Ｋａｂａｔに基づくＣＤＲ画定に従うと長さ１７である、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２１】
ＣＤＲ−Ｈ２がアミノ酸配列Ｘ１ＩＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＧＸ４Ｘ６ＹＹＡＤＳＶＫＧを含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＧまたはＷであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、ＨまたはＮであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、ＨまたはＮであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＧであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、ＨまたはＮであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＴである、請求項２０に記載のライブラリー。
【請求項２２】
ＣＤＲ−Ｈ２領域が、接触決定に基づくＣＤＲ画定に従うと長さ１３である、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２３】
ＶＨ１  ＣＤＲ−Ｈ２がＷＭＧＸ１ＩＸ２ＰＸ３Ｘ４ＧＸ５Ｔ／ＡＮのアミノ酸配列を含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＧまたはＷであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、ＨまたはＮであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＧまたはＭであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＦまたはＧであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＴである、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２４】
ＶＨ３  ＣＤＲ−Ｈ２がＷＶＳ／ＡＸ１ＩＳＸ２Ｘ３ＧＸ４Ｘ５Ｘ６Ｙのアミノ酸配列を含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｖ、ＧまたはＴであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、ＷまたはＦであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、ＨまたはＮであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＧまたはＴであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＴまたはＫであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＦである、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２５】
ＣＤＲ−Ｈ３鎖長が、長さ９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択される、請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項２６】
ＣＤＲ−Ｈ３領域が長さ９である、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項２７】
ＣＤＲ−Ｈ３がＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＦＤのアミノ酸配列を含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｅ、ＬまたはＶであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＬまたはＱであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｔ、ＬまたはＱであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＷまたはＬであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、ＴまたはＶである、請求項２６に記載のライブラリー。
【請求項２８】
ＣＤＲ−Ｈ３領域が長さ１０である、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項２９】
ＣＤＲ−Ｈ３がアミノ酸配列ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＦＤを含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｅ、Ｌ、ＶまたはＭであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、ＫまたはＱであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｅ、Ｌ、Ｖ、ＱまたはＷであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、ＷまたはＱであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｅ、ＷまたはＬであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＬまたはＦである、請求項２８に記載のライブラリー。
【請求項３０】
ＣＤＲ−Ｈ３領域が長さ１１である、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項３１】
ＣＤＲ−Ｈ３がアミノ酸配列ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＦＤを含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｋ、Ｇ、ＥまたはＬであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、Ｇ、Ｆ、ＬまたはＶであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＶまたはＴであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＴまたはＷであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＴまたはＬであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＧまたはＷであり、Ｘ７はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｗ、ＦまたはＬである、請求項３０に記載のライブラリー。
【請求項３２】
ＣＤＲ−Ｈ３領域が長さ１２である、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項３３】
ＣＤＲ−Ｈ３がＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＦＤのアミノ酸配列を含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＥまたはＶであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、ＱまたはＴであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、ＶまたはＷであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｗ、ＬまたはＶであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、ＴまたはＬであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、ＴまたはＥであり、Ｘ７はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、ＷまたはＦであり、Ｘ８はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｆ、ＴまたはＷである、請求項３２に記載のライブラリー。
【請求項３４】
ＣＤＲ−Ｈ３領域が長さ１３である、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項３５】
ＣＤＲ−Ｈ３がＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＦＤのアミノ酸配列を含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｅ、Ｖ、ＬまたはＫであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、ＱまたはＫであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、ＫまたはＭであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、ＬまたはＶであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、ＬまたはＱであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、ＥまたはＴであり、Ｘ７はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＷまたはＧであり、Ｘ８はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＧまたはＦであり、Ｘ９はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｆ、ＷまたはＴである、請求項３４に記載のライブラリー。
【請求項３６】
ＣＤＲ−Ｈ３領域が長さ１４である、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項３７】
ＣＤＲ−Ｈ３がＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＦＤのアミノ酸配列を含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＥまたはＶであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、ＱまたはＫであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、ＴまたはＥであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、Ｆ、ＴまたはＱであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、ＴまたはＬであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、ＬまたはＶであり、Ｘ７はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｌ、ＥまたはＶであり、Ｘ８はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｆ、ＥまたはＬであり、Ｘ９はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＷまたはＴであり、Ｘ１０はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｆ、ＷまたはＬである、請求項３６に記載のライブラリー。
【請求項３８】
ＣＤＲ−Ｈ３領域が長さ１５である、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項３９】
ＣＤＲ−Ｈ３がアミノ酸配列ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＦＤを含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｅ、ＶまたはＴであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｗ、Ｌ、ＴまたはＶであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｅ、Ｔ、Ｆ、ＬまたはＷであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｅ、Ｃ、ＴまたはＦであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、ＷまたはＬであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＴまたはＥであり、Ｘ７はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、ＶまたはＷであり、Ｘ８はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、ＭまたはＷであり、Ｘ９はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、ＣまたはＫであり、Ｘ１０はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＷまたはＱであり、Ｘ１１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｗ、ＦまたはＬである、請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４０】
ＣＤＲ−Ｈ３領域が長さ１６である、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項４１】
ＣＤＲ−Ｈ３がアミノ酸配列ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＦＤを含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、ＶまたはＥであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、ＶまたはＥであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＴまたはＬであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、ＴまたはＥであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、ＴまたはＭであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、ＦまたはＷであり、Ｘ７はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、ＬまたはＥであり、Ｘ８はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、ＥまたはＷであり、Ｘ９はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、ＦまたはＷであり、Ｘ１０はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、ＴまたはＦであり、Ｘ１１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＷまたはＴであり、Ｘ１２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＷまたはＦである、請求項４０に記載のライブラリー。
【請求項４２】
ＣＤＲ−Ｈ３領域が長さ１７である、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項４３】
ＣＤＲ−Ｈ３がアミノ酸配列ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＦＤを含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、ＥまたはＬであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＬまたはＱであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、ＶまたはＭであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＶまたはＣであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＶまたはＴであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｆ、ＶまたはＴであり、Ｘ７はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｗ、Ｔ、ＶまたはＦであり、Ｘ８はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＬまたはＶであり、Ｘ９はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、ＬまたはＣであり、Ｘ１０はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＦまたはＬであり、Ｘ１１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｌ、ＶまたはＣであり、Ｘ１２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＧであり、Ｘ１３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＧまたはＷである、請求項４２に記載のライブラリー。
【請求項４４】
ＣＤＲ−Ｈ３領域が長さ１８である、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項４５】
ＣＤＲ−Ｈ３がアミノ酸配列ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＦＤを含み、式中Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｅ、ＶまたはＬであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＬまたはＫであり、Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、ＬまたはＦであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＶまたはＴであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｆ、Ｋ、ＬまたはＭであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｔ、ＷまたはＣであり、Ｘ７はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、ＷまたはＦであり、Ｘ８はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｗ、ＶまたはＦであり、Ｘ９はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＬまたはＶであり、Ｘ１０はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、ＬまたはＦであり、Ｘ１１はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｆ、ＧまたはＷであり、Ｘ１２はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、ＬまたはＦであり、Ｘ１３はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＧまたはＷであり、Ｘ１４はＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＷまたはＴである、請求項４４に記載のライブラリー。
【請求項４６】
所与の正準構造に関連して選択されたＣＤＲの画定により決定されるＶＬ（κ）ＣＤＲ−Ｌ１の長さが、長さ７および８からなる群から選択される、請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項４７】
ＶＫ−Ｉ  ＣＤＲ−Ｌ１領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ７である、請求項４６に記載のライブラリー。
【請求項４８】
ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列ＳＸ１Ｘ２ＬＡ／ＮＷＹを含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＴまたはＫであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＷである、請求項４７に記載のライブラリー。
【請求項４９】
ＶＫ−ＩＩＩ  ＣＤＲ−Ｌ１領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ７である、請求項４６に記載のライブラリー。
【請求項５０】
ＣＤＲ−Ｌ１が、ＳＳＮ／ＹＬＡＷＹのアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載のライブラリー。
【請求項５１】
ＶＫ−ＩＩＩ  ＣＤＲ−Ｌ１領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ８である、請求項４６に記載のライブラリー。
【請求項５２】
ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列ＳＳ／ＮＸ１ＹＬＡＷＹを含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＴである、請求項５１に記載のライブラリー。
【請求項５３】
所与の正準構造に関連して選択されたＣＤＲの画定により決定されるＶＬ（κ）ＣＤＲ−Ｌ２の長さが、長さ１０からなる群から選択される、請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項５４】
ＶＫ−Ｉ  ＣＤＲ−Ｌ２領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ１０である、請求項５３に記載のライブラリー。
【請求項５５】
ＣＤＲ−Ｌ２が、ＬＬＩＹＸ１ＡＳＸ２ＬＱ／Ｅのアミノ酸配列を含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＫまたはＧであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＴである、請求項５４に記載のライブラリー。
【請求項５６】
ＶＫ−ＩＩＩ  ＣＤＲ−Ｌ２領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ１０である、請求項５３に記載のライブラリー。
【請求項５７】
ＣＤＲ−Ｌ２が、アミノ酸配列ＬＬＩＹＧ／ＤＡＳＸ１ＲＡを含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＴである、請求項５６に記載のライブラリー。
【請求項５８】
ＣＤＲの画定により決定されるＶＬ（κ）ＣＤＲ−Ｌ３鎖長が、長さ８および９からなる群から選択される、請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項５９】
ＣＤＲ−Ｌ３領域が、接触によるＣＤＲ画定に従って長さ８である、請求項５８に記載のライブラリー。
【請求項６０】
ＣＤＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＸ４を含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＴまたはＬであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、ＱまたはＧであり、Ｘ３がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、Ｌ、ＷまたはＦであり、Ｘ４がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｌ、ＷまたはＦである、請求項５９に記載のライブラリー。
【請求項６１】
ＣＤＲ−Ｌ３領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ９である、請求項５８に記載のライブラリー。
【請求項６２】
ＣＤＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＰＸ４を含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＧであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｘ３がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＷまたはＴであり、Ｘ４がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｗ、ＬまたはＴである、請求項６１に記載のライブラリー。
【請求項６３】
所与の正準構造に関連して選択されたＣＤＲの画定により決定されるＶ１（λ）ＣＤＲ−Ｌ１鎖長が、長さ７、９および１０からなる群から選択される、請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項６４】
Ｖλ−１  ＣＤＲ−Ｌ１領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ９である、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６５】
ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列ＩＧＸ１ＮＸ２ＶＸ３ＷＹを含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＴまたはＦであり、Ｘ３がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、ＨまたはＮである、請求項６４に記載のライブラリー。
【請求項６６】
Ｖλ−２  ＣＤＲ−Ｌ１領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ１０である、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６７】
ＣＤＲ−Ｌ１が、ＶＧＸ１ＹＮＹＶＳＷＹのアミノ酸配列を含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＧである、請求項６６に記載のライブラリー。
【請求項６８】
Ｖλ−３  ＣＤＲ−Ｌ１領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ７である、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６９】
ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ａ／ＶＸ４ＷＹを含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＫまたはＴであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｋ、ＱまたはＥであり、Ｘ３がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＦであり、Ｘ４がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＣである、請求項６８に記載のライブラリー。
【請求項７０】
所与の正準構造に関連して選択されたＣＤＲの画定により決定されるＶＬ（λ）ＣＤＲ−Ｌ２の長さが、長さ１０からなる群から選択される、請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項７１】
Ｖλ−１  ＣＤＲ−Ｌ２領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ１０である、請求項７０に記載のライブラリー。
【請求項７２】
ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列ＬＬＩＹＸ１ＮＮ／ＳＸ２ＲＰを含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＧまたはＥであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＱまたはＫである、請求項７１に記載のライブラリー。
【請求項７３】
Ｖλ−２  ＣＤＲ−Ｌ２領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ１０である、請求項７０に記載のライブラリー。
【請求項７４】
ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列ＬＭ／ＩＩＹＥ／ＤＶＸ１Ｘ２ＲＰを含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＴであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＫである、請求項７３に記載のライブラリー。
【請求項７５】
Ｖλ−３  ＣＤＲ−Ｌ２領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ１０である、請求項７０に記載のライブラリー。
【請求項７６】
ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列ＬＶＩ／ＶＹＸ１ＤＸ２Ｘ３ＲＰを含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、ＫまたはＧであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＴであり、Ｘ３がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＫまたはＥである、請求項７５に記載のライブラリー。
【請求項７７】
ＣＤＲの画定により決定されるＶＬ（λ）ＣＤＲ−Ｌ３鎖長が、長さ８、９、１０および１１からなる群から選択される、請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項７８】
ＣＤＲ−Ｌ３領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ８である、請求項７７に記載のライブラリー。
【請求項７９】
ＣＤＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＳ／ＡＷＤＸ１ＳＸ２Ｘ３を含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＧであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｔ、ＬまたはＧであり、Ｘ３がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｖ、Ｗ、ＱまたはＬである、請求項７８に記載のライブラリー。
【請求項８０】
ＣＤＲ−Ｌ３領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ９である、請求項７７に記載のライブラリー。
【請求項８１】
ＣＤＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＳ／ＡＹＤ／ＡＸ１ＳＸ２Ｘ３Ｘ４を含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＧまたはＴであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＬまたはＴであり、Ｘ３がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＴまたはＬであり、Ｘ４がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｖ、Ｗ、Ｌ、ＦまたはＧである、請求項８０に記載のライブラリー。
【請求項８２】
ＣＤＲ−Ｌ３領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ１０である、請求項７７に記載のライブラリー。
【請求項８３】
ＣＤＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＳ／ＡＷＤＸ１ＳＬ／ＳＸ２Ｘ３Ｘ４を含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＴであり、Ｘ３がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、ＬまたはＶであり、Ｘ４がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｖ、ＷまたはＧである、請求項８２に記載のライブラリー。
【請求項８４】
ＣＤＲ−Ｌ３領域が、接触によるＣＤＲ画定に従うと長さ１１である、請求項７７に記載のライブラリー。
【請求項８５】
ＣＤＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＳ／ＡＷＤＸ１ＳＬ／ＳＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５を含み、式中Ｘ１がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＧであり、Ｘ２がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＴであり、Ｘ３がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、ＮまたはＬであり、Ｘ４がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｖ、ＬまたはＦであり、Ｘ５がＡ、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、Ｖ、ＷまたはＧである、請求項８４に記載のライブラリー。
【請求項８６】
ＣＤＲ領域が、約１０％から約１００％の閾値頻度で天然に出現するアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項８７】
ＣＤＲ領域は、ＣＤＲ内の残基１個がＬＴＭ（ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）を用いて改変されている多様性を有する、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項８８】
ＣＤＲ領域は、ＣＤＲ内の複数の残基がＷＴＭ（ｗａｌｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）を用いて改変されている多様性を有する、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項８９】
抗体結合領域が、天然体細胞変異に相当する１個または複数のアミノ酸置換を更に含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項９０】
発現ライブラリーである、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項９１】
請求項９０に記載のライブラリー、ここで発現ライブラリーが、リボソームディスプレイライブラリー、ポリソームディスプレイライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、細菌発現ライブラリー、および酵母ディスプレイライブラリーからなる群から選択される、ライブラリー。
【請求項９２】
少なくとも約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２および１０１３からなる群から選択される抗体結合領域の多様性を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項９３】
１個または複数のフレームワーク領域および１個または複数のＣＤＲ領域をコードし、予め決定されたポリヌクレオチドを合成することによって生成する、請求項１に記載のライブラリーであって、前記領域をコードする該ポリヌクレオチドは十分な重複配列を更に含み、それによりポリヌクレオチド配列が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件下で、完全な抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドに構築できるライブラリー。
【請求項９４】
画定したＣＤＲ領域をコードする前記ポリヌクレオチドが、ＷＴＭ（ｗａｌｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）、拡張ＷＴＭ、ＬＴＭ（ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）、およびそれらの組合せからなる群から選択される変異誘発法を用いて変異誘発されている、請求項９３に記載のライブラリー。
【請求項９５】
次の規準：
ｉ）各フレームワーク領域は、所定の抗原クラスに対する発現抗体において、ある閾値頻度以上で出現すること、および場合により、
ｉｉ）各フレームワーク領域は、生殖細胞系抗体配列において、ある閾値頻度以上で出現すること
に従って選択された、１個または複数のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、所定の多様性を有する１個または複数の画定されたＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、
を含む、請求項１に記載のライブラリーを生成する方法であって、前記領域をコードする該ポリヌクレオチドは十分な重複ポリヌクレオチド配列を更に含み、それによりポリヌクレオチド配列が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件下で、完全な抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドに構築できる方法。
【請求項９６】
画定されたＣＤＲの前記所定の多様性が、次の規準：
ｉ）ＣＤＲ領域の長さは、選択されたフレームワーク領域の生成した正準構造により決定されること、および
ｉｉ）ＣＤＲ領域は、画定されたＣＤＲ領域内で天然に起こることが判明している閾値出現頻度で、アミノ酸残基の多様性を含むこと、
に従って設計される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記所定の多様性が、ＷＴＭ（ｗａｌｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）、拡張ＷＴＭ、ＬＴＭ（ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）、およびそれらの組合せからなる群から選択される変異誘発を用いて導入される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
請求項８７に記載の発現ライブラリーを発現させることにより、抗体結合領域を産生するステップ、および
該抗体結合領域をスクリーニングすることにより、所望の結合親和性を有する抗体結合領域を選択するステップ
を含む、所望の結合親和性を有するポリペプチドを特定する方法。
【請求項９９】
請求項９８に記載の方法、
ここで前記スクリーニングが、抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドと結び付いた状態で、該抗体結合領域を標的物質と接触させることを含む、方法。
【請求項１００】
選択した抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドを特定するステップを更に含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
請求項９９に記載の方法、
ここで前記ポリヌクレオチドが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイおよび酵母ディスプレイからなる群から選択される発現ディスプレイを用いて、抗体結合領域と結び付けられる、方法。
【請求項１０２】
請求項９９または１００に記載の方法により特定した抗体結合領域。
【請求項１０３】
１つまたは複数のステップがコンピュータ支援される請求項９５または９８に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項１０３の方法の１つまたは複数のステップを実行するための指示を有する、電子装置での使用に適した媒体。
【請求項１０５】
請求項１０４の方法の１つまたは複数のステップを実行するための装置。
【請求項１０６】
ａ）図または表のいずれかに示した配列を有する１個または複数のフレームワーク領域、および
ｂ）図または表のいずれかに示した配列を有する１個または複数のＣＤＲ領域
を含み、
ここでａ）のフレームワーク領域およびｂ）のＣＤＲ領域が、所定の抗原クラスに対する抗体結合領域を共同で形成する、
抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドのライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連情報
本願は、その全内容を本明細書に参照により組み込んでいる、２００４年７月６日に出願した米国仮特許出願第６０／５８５９３１号に対する優先権を請求している。本明細書全体で引用するすべての特許、特許出願および参考文献の内容は、その全体を参照によりここに組み込んでいる。
【０００２】
抗体は、研究手段として、また診断・治療用途において多大な適合性を有している。しかし、このような有用な抗体の特定は困難で、そのためには、特に治療用途を想定した場合、抗体を投与のために適正化する前に、相当程度の再設計または「ヒト化」が必要となることが頻繁である。
【背景技術】
【０００３】
望ましい抗体を特定する以前の方法では、代表的抗体、例えばヒトライブラリーまたは合成ライブラリーのファージディスプレイが通常実施されてきたが、このような手法には限界がある。例えば、大部分のヒトライブラリーは、供給源組織から実験的に捕捉またはクローニングできる抗体配列の多様性しか含んでいない。したがって、ヒトライブラリーは、他の貴重な抗体配列を欠いているか、または過少に示している恐れがある。合成またはコンセンサスライブラリーには、免疫原性の潜在性を有する非天然配列をコードする可能性などの他の制約がある。その上、合成ライブラリーを包括的にしようとすると、多様性が増え過ぎて、スクリーニングするのが困難となることが頻繁である。更に、特定の標的に結合する候補抗体を特定するために用いる際、これらのライブラリーは、候補分子の結合性を改良するための合理的な親和性成熟追跡法に不向きである。例えば、後続の抗体改良法では、ランダム変異誘発、飽和変異誘発、変異性ＰＣＲ、遺伝子シャフリング、抗体連鎖シャフリングなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発がしばしば行われる。このような戦略は元来確率論的であり、何らかの意味ある配列多様性を探索するために、厖大なライブラリーの構築を要することが多い。所与の抗体中で変異を起こすべき位置数が増加するにつれ、生成するライブラリーの規模も妥当なスクリーニング規模より大きくなる。
【０００４】
したがって、非免疫原性で、所望の特性、例えば容易にスクリーニングできる代表的多様性を有する候補抗体を、系統的に代表するユニバーサル抗体ライブラリーの必要性が存在する。
【０００５】
本発明は、所与の抗原クラスに対する望ましい全候補抗体を表すユニバーサル抗体ライブラリー（ＵＡＬ）、ならびにそのような抗体ライブラリーを作製し、スクリーニングする方法を提供することによって、上記問題を解決する。更に、ユニバーサル抗体ライブラリーの抗体は、ヒト配列に由来し、そのため非免疫原性であり、したがって治療用途、例えば、ヒトの障害や疾患を予防または治療するためにヒト患者に投与することに適している。
【０００６】
本発明のライブラリーは、多重の残基多様性または単一の残基多様性を所与の部位、例えば１個または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に導入する必要があるか否かに応じて、ＷＴＭ（ｗａｌｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）またはＬＴＭ（ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）（各々例えば、米国特許第６６４９３４０号、第５８３０６５０号、第５７９８２０８号、および米国特許出願第６０／４８３２８２号を参照されたい）などの例えば変異誘発技術を用いて効率的に導入される多様性を有している。重要なことは、このような技術により、生産的多様性の量を最大限に高め、非生産的多様性、即ち単なるノイズや偶発事象の量を最小限に減らすことが可能である。したがって、本発明のユニバーサル抗体ライブラリーは、既存の抗体ライブラリーより小規模となり得るが、しかし、より合理的な多様性を備えることにより、抗体結合性候補分子をより効率的に特定することができる。
【０００７】
一実施形態では、本発明のユニバーサル抗体ライブラリーは、軽鎖および／または重鎖の１個または複数のＣＤＲ中に所望の多様性を示す完全合成のライブラリーを創製するために、ＷＴＭまたはＬＴＭ技術を応用したものである。その抗体配列、例えばフレームワークおよびＣＤＲは、特定の規準に従って選択される。例えば、その１つの規準は、該抗体配列が、発現（再編成）抗体配列内、例えばヒト抗体配列内で、更に、好ましくは抗原の特定クラスに反応した際に、最小限の出現閾値頻度（例えば、約１０％以上）を示さねばならないことである。場合により、更に別の規準は、該発現（再編成）抗体配列が、最小限の閾値頻度（例えば、約１０％以上）を維持しながら生殖細胞系配列から生じる（誘導される）ことである。更にまた別の規準（１つ／複数）は、所与の長さ、正準構造および／またはＣＤＲ相互依存性（例えば、ＣＤＲ１のＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３に対する）を有するＣＤＲ（例えば、発現ＣＤＲ）同士の比較をすることである。その多様性を特定した後、オリゴヌクレオチドを用いた操作により、それを従来の遺伝子形態、例えば１本鎖抗体形態（ｓｃＦｖ）中に組み込むが、その場合のオリゴヌクレオチドにより、遺伝子操作（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＳＯＥ（ｓｉｎｇｌｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）および／またはＫｕｎｋｅｌ介在変異誘発）によってフレームワークおよびＣＤＲ配列の完全な構築が系統的に可能となる。
【０００８】
混合プローブを用いたとき通常起こる不適当な変異を回避することによって、非機能性タンパク質を生じる恐れのある任意の変異が、本発明により最小限に抑えられることは重要である。その上、ＷＴＭを用いたときに可能な精度は、ランダム変異誘発および／または遺伝子シャフリング技術と対照的である。更に、フレームワーク選択と、位置およびアミノ酸種に関する配列多様性の程度とを制御することによって、ライブラリーによる「抗原」クラスの認識が最適化される。更にまた、このｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、自己抗原の免疫学的ネガティブ選択と、微生物の環境曝露による遺伝子の任意の偏りとを回避している。
【０００９】
したがって、本発明は、不必要に大きくせずに情報提供可能な規模のスクリーニングライブラリーから開始できる利点を提供する。最初の１セットのクローンを特定した後、後続の親和性成熟ライブラリーは、ＬＴＭおよび／またはＷＴＭオリゴヌクレオチドの共通セットを共有し、時間および試薬経費を節約できる。更にまた、ユニバーサル抗体ライブラリーは、多様な抗原、特に例えば自己抗原に対するもので、他の任意の方法では得るのが困難である、非常に特異的な抗体を迅速・有効に産生することができる。
【００１０】
ユニバーサル抗体ライブラリーは、ある抗体の画定した１個または複数の領域をコードし、本明細書に記載の規準に従って考え得るすべての変異抗体を一括して表現する、個々のポリヌクレオチドを最初に合成することによって、生成し、スクリーニングされる。該変異抗体は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写・翻訳を用いて、および／またはリボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイなどのディスプレイを用いて発現する。
【００１１】
次いで、発現した抗体は、結合アッセイなどの機能アッセイを用いてスクリーニングし、選択する。一実施形態では、そのポリペプチドは、抗体結合性分子、例えば１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードするポリヌクレオチドと結合して発現し、その結果、抗体結合性分子（例えば、ｓｃＦｖ）をコードする該ポリヌクレオチド配列の特定が可能となる。関連する一実施形態では、該抗体は、例えばＵＳ２００４００７２７４０Ａ１、ＵＳ２００３００３６０９２Ａ１およびＵＳ２００３０１０００２３Ａ１に記載の技術を例えば用いて、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物の膜上に分泌され、ディスプレイされる。
【００１２】
本法は、ヒト抗体配列を特定することにより、新規抗体もしくは改良抗体またはその断片、例えば１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を開発するために使用できる。その上、本法は、いずれ多様化することになる開始時の１サブセットの配列を選択するために使用できる先験的情報の補助により、例えばコンピュータモデリングや電子データベースのバイオマイニングにより、例えば本明細書に記載の規準に従い、例えばＷＴＭまたはＬＴＭ変異誘発を用いて、実施することができる。
【００１３】
本発明の他の利点および態様は、以下の説明および実施例から容易に明らかとなろう。
【発明の開示】
【００１４】
本明細書および請求の範囲を明確に理解するために、次の定義を以下に示す。
【００１５】
定義
本明細書で使用する場合、「抗体結合領域」との用語は、抗原（複数も）を結合できる、免疫グロブリンまたは抗体の可変領域の１個または複数の部分を指す。抗体結合領域は、通常、例えば抗体軽鎖（ＶＬ）（またはその可変領域）、抗体重鎖（ＶＨ）（またはその可変領域）、重鎖Ｆｄ領域、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体複合重軽鎖（またはその可変領域）、あるいは完全長抗体、例えばＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体である。
【００１６】
「フレームワーク領域」との用語は、多様性が相対的に高いＣＤＲ領域同士の間に存在する、当技術分野認知の抗体可変領域中の部分を指す。このようなフレームワーク領域は、フレームワーク１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）と通常呼称し、ＣＤＲが抗原結合表面を形成できるように、重鎖または軽鎖抗体可変領域中に見出される３個のＣＤＲを三次元空間中に保持するための足場を提供する。
【００１７】
「閾値出現頻度」との用語は、免疫細胞が例えば特定クラスの抗原に反応するときに、発現するのに有利な配列であると判定した配列から、ユニバーサル抗体ライブラリーに使用するための選択配列を誘導することを要求する、本発明の規準を指す。閾値出現頻度を満たすと判定されたこのような発現（再編成）配列は、通常、約１０％以上の出現率（％）で発現する配列である。
【００１８】
「生殖細胞系閾値頻度」との用語は、免疫細胞が例えば特定クラスの抗原に反応するときに、発現するのに有利な生殖細胞系配列であると判定した配列から、ユニバーサル抗体ライブラリーに使用するための選択配列（即ち、発現または再編成配列）を誘導することを要求する、本発明の規準を指す。生殖細胞系閾値頻度を満たすと判定された配列は、通常、約１０％以上の出現率（％）で生殖細胞系配列から誘導されるか、またはそれを起源とする配列である。
【００１９】
「所定の抗原クラス」、または「抗原のクラス」、または「抗原クラス」との用語は、基本組成から見て構造的／化学的に似ている抗原類を指す。典型的な抗原クラスは、タンパク質（ポリペプチド）類、ペプチド類、多糖類、ポリヌクレオチド類、および低分子類である。
【００２０】
「正準構造」との用語には、例えばＫａｂａｔデータベースの目録に収載する際の当該抗体の直鎖配列に関する検討項目が挙げられる。Ｋａｂａｔ付番方式は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基に一貫した付番をするための広範に採用されている基準である。追加の構造的検討項目、例えば、Ｋａｂａｔ付番法では十分に反映されておらず、例えばＣｈｏｔｈｉａ等が記載し、例えば結晶構造解析および三次元モデリングにより明らかとなるような差異が、抗体の正準構造を決定するために使用できる。したがって、所与の抗体配列は、とりわけ、適当なアクセプター配列の特定を可能にする正準クラスに分類してもよい。抗体アミノ酸配列のＫａｂａｔ付番法、および例えばＣｈｏｔｈｉａ等が記載する構造的検討項目、ならびに所与の抗体の正準態様の解釈に対するその関わりは、文献中に記載されている（後述の例えば材料および方法も参照されたい）。「正準構造」との用語は、抗原結合ループの１つが取る主鎖コンホメーションも指す。構造の比較により、抗原結合ループ６個中の５個では、利用可能なコンホメーションの範囲が制限されている。各正準構造の特徴は、ポリペプチド骨格のねじれ角により決定できる。したがって、抗体間の対応ループは、ループの大部分のアミノ酸配列に高い可変性があるにも関わらず、非常に類似した三次元構造を取り得る（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，８７７−８８３；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，１９９６  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３，８００−８１５）。更にまた、採用されているループ構造とその周りのアミノ酸配列との間には関係がある。特定の正準クラスのコンホメーションは、ループの長さと、重要位置にあり、ループと相互作用をしており、外部の保存されたフレームワーク中にあるアミノ酸残基とによって決定される。このような重要なアミノ酸は、水素結合を介して相互作用をしていることが多い。したがって、特定の正準クラスへの指定は、このような重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行うことができる。
【００２１】
「画定したＣＤＲ領域」との用語は、結合性分子の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の結合性を３個で構成する相補性決定領域（ＣＤＲ）を指す。可変重鎖配列および可変軽鎖配列の各々には、各可変配列に対してＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称する３個のＣＤＲがある。画定したＣＤＲ領域は抗体分子の機能活性に寄与し、足場領域またはフレームワーク領域に過ぎないアミノ酸配列がそれらを隔離できる。正確な画定上のＣＤＲの境界および長さは分類体系によって異なる。したがって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａによって接触画定域または他の任意の境界画定域と呼ばれる場合がある。境界が異なるにも関わらず、すべてのＣＤＲは、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分に幾つかの重複残基を有している。したがって、ＣＤＲのこれらの画定域は、隣接フレームワーク領域に対して長さおよび境界区域が異なるものとなろう。例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａおよび／またはＭａｃＣａｌｌｕｍ等を参照されたい（例えば、その内容全体を本明細書に組み込んである以下のものを参照されたい。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７；ａｎｄ  ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））。
【００２２】
「保存アミノ酸残基」との用語は、生殖細胞系配列およびＣＤＲ配列の間で、あるいは所与の正準クラスおよび／または長さのＣＤＲ同士の間で、所与の残基位置に対し通常５０％以上（例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより高い）の高い頻度で出現すると決定されたアミノ酸残基を指す。所与の残基がこのように高い頻度で出現すると決定された場合、それは保存されていると判定され、したがって、分析しているＣＤＲ領域中の少なくともそのアミノ酸残基位置に対して、本発明のライブラリーにおいては「固定」残基または「定常」残基として表現される。通常は、保存アミノ酸（コドン）位置に対し核酸の変異誘発／可変性は導入されず、該残基が固定され、予め決定されている。
【００２３】
「半保存アミノ酸残基」との用語は、生殖細胞系配列およびＣＤＲ配列の間で、あるいは所与の正準クラスおよび／または長さのＣＤＲ同士の間で、所与の残基位置に対する２〜３個の残基について、高い頻度で出現すると決定されたアミノ酸残基を指す。２〜３個の残基、好ましくは２個の残基が、合計でその時の約４０％以上（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより高い）の頻度で発現する場合、該残基は半保存されていると判定され、したがって、分析しているＣＤＲ領域中の少なくともそのアミノ酸残基位置に対して、本発明のライブラリーにおいては「半固定」残基として表現される。通常は、適性水準の核酸の変異誘発／可変性が、半保存アミノ酸（コドン）位置に対し、２〜３個の残基が適切に発現するように導入される。したがって、２〜３個の該残基は各々、この位置に対して「半固定」されていると言うことができる。
【００２４】
「可変アミノ酸残基」との用語は、生殖細胞系配列およびＣＤＲ配列の間で、あるいは所与の正準クラスおよび／または長さのＣＤＲ同士の間で、所与の残基位置に対し、可変頻度で出現すると決定されたアミノ酸残基を指す。多数の残基が所与の位置に出現する場合、該残基位置は可変であると判定され、したがって、分析しているＣＤＲ領域中の少なくともそのアミノ酸残基位置に対して、本発明のライブラリーにおいては「可変」であると表現される。通常は、適性水準の核酸の変異誘発／可変性が、可変アミノ酸（コドン）位置に対し、正確な残基スペクトルが適切に発現するように導入される。当然ながら、任意のアミノ酸残基位置の結果または可変性、即ち保存、半保存、可変のいずれかは、適当な場合、本明細書に開示した変異誘発法、例えばＬＴＭ、ＷＴＭ、ドーピングＷＴＭ、および／または拡張ＷＴＭのいずれかを用いて、所望であれば発現、探索または変更できることは理解される。
【００２５】
「可変性プロファイル」との用語は、アミノ酸、および特定のＣＤＲ位置に存在する出現のそれらの頻度率を指す。該ＣＤＲ位置は、所望の特性に従って群別された整列ＣＤＲデータセットから誘導される。各ＣＤＲ位置では、アミノ酸頻度の合計が所定の「高い」閾値に達するまで、順位別アミノ酸頻度をその位置の可変性プロファイルに追加する。
【００２６】
「アミノ酸」または「アミノ酸残基」との用語は、当技術分野認知の定義を有するアミノ酸を通常指しており、該アミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、およびバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択されるアミノ酸などであるが、修飾、合成または希少アミノ酸も所望であれば使用してもよい。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えばＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）、負荷電側鎖（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ）、正荷電側鎖（例えばＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）、または非荷電側鎖（例えばＡｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）を有するものに群別できる。
【００２７】
「ライブラリー」との用語は、本明細書に記載するような多様性を有し、本発明の方法により変異誘発された２種以上の抗体分子（またはその断片）を指す。ライブラリーの抗体は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチドとポリペプチド、無細胞抽出物中のポリヌクレオチドとポリペプチドの形態を取るか、あるいは、ファージ、原核細胞に関するか、真核細胞中にあるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドとなっていることもできる。
【００２８】
「ポリヌクレオチド」との用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子、ならびにその類縁体（例えば、ヌクレオチド類縁体を用い、または核酸化学を用いて生成したＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。所望であれば、合成によって、例えば、当技術分野認知の核酸化学を用いて、または酵素的に例えばポリメラーゼを用いて、該ポリヌクレオチドを作製してもよいし、所望であれば修飾してもよい。典型的な修飾には、メチル化、ビオチニル化、および当技術分野公知の修飾が挙げられる。その上、核酸分子は１本鎖、２本鎖のいずれでもよく、所望であれば被検出部に連結してもよい。
【００２９】
「変異誘発」との用語は、別途指定しない限り、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を変化させるための当技術分野認知の任意技術を指す。好ましい変異誘発方式には、ＷＴＭ（ｗａｌｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）、有益ＷＴＭ、ＬＴＭ（ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）、ＬＴＭ２（改良ＬＴＭ）、コドンを偏らせるためにドープヌクレオチドを用いるＷＴＭ、多様性のより高い領域内に短い配列領域を定常的または固定的に保持するための拡張ＷＴＭ、あるいはそれらの組合せが挙げられる。
【００３０】
「組合せ有益変異誘発」との用語は、ＬＴＭアミノ酸変異誘発の所定スクリーニングで可測特性に変更ありと最初に特定された、ＶＬおよび／またはＶＨＣＤＲアミノ酸配列変異体の縮重混合物をコードする、コード配列の組合せライブラリーを指す。組合せ有益変異手法では、ＬＴＭによって特定されたこれらの有益変異体の組合せを発現するオリゴヌクレオチドコード配列が生成する。このような組合せは、単一ＣＤＲ内の異なる有益変異体、単一抗体鎖中にある２個以上のＣＤＲ内の変異体、または異なる抗体鎖のＣＤＲ内変異体の組合せであってもよい。
【００３１】
詳細な説明
概説
抗体は強力な診断・治療手段である。標的に対して容易にスクリーニングできる候補結合性分子を含んだ抗体ライブラリーは、望ましい。包括的なユニバーサル抗体ライブラリーの十分な展望は、これまでのところ幻想であった。合成ライブラリーには、ノイズや、自然には出現しない過剰な多様性が伴う。純粋なヒトライブラリーには、ある種の抗原クラスに対して偏りがあり、その多様性は捕捉技術次第に過ぎない。本発明は、包括的であり、例えばハイスループット法を用いて容易にスクリーニングすることにより、新規な治療薬を得ることのできるユニバーサル抗体ライブラリーを提供する。
【００３２】
とりわけ、ユニバーサル抗体ライブラリー（ＵＡＬ）は任意の抗原を認識する可能性を有している。該ライブラリーの他の重要な利点には、例えば、自己反応性抗体はドナーの免疫系によるネガティブ選択により除去されるため、ヒト発現ライブラリーでは普通認められない自己抗原に対する多様性の増加が含まれる。別の特徴は、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）によるクローンのポジティブ選択を用いるユニバーサル抗体ライブラリー（ＵＡＬ）のスクリーニングによって、ハイブリドーマライブラリーの生成および上清スクリーニングを行う標準的で面倒な手順が回避されることである。更にまた、他の所望標的に対する追加の抗体を発見するために、ＵＡＬライブラリーを再スクリーニングすることもできる。
【００３３】
１．１  バイオインフォマティクスを用いるユニバーサル抗体成分の特定および選択
本発明のユニバーサル抗体ライブラリー（ＵＡＬ）を構築する第１ステップは、所定のある種の規準を満たす配列の選択である。例えば、非冗長再編成抗体配列を含んだ電子データベースのＫａｂａｔデータベースから、特に特定の抗原クラスに対して極めて高頻度に発現される配列を探すことができる。該抗原クラスは、例えばタンパク質、ペプチド抗原を含むが、低分子、多糖類およびポリヌクレオチドも含むことができる。このような抗体のフレームワーク配列のクラスタリング分析を行った後、生殖細胞系配列（Ｖ  ＢＡＳＥデータベース）との比較（ＢＬＡＳＴ探索アルゴリズムを用いて）により、所与の抗原クラス、例えばタンパク質性の抗原または標的を認識する機能抗体を生成するために後に再編成する、最も使用頻度の高い生殖細胞系ファミリーが決定される。
【００３４】
次いで、機能抗体の最大で構造多様性が最も高い群を表わす候補フレームワーク配列を選択し、更にＣＤＲ１およびＣＤＲ２の正準構造を決定することにより、該ＣＤＲの長さ、したがってフレームワーク内に収容できる多様性を決定する。ＣＤＲ３に関しては、再編成抗体配列の頻度分析結果を特定するために、長さのサイズ分布を行う。
【００３５】
ＣＤＲのアミノ酸配列を誘導する方法には、存在する再編成抗体配列の頻度分析および相当する可変性プロファイル（ＶＰ）の生成が含まれる。不変位置を固定する一方で、最高頻度のアミノ酸を他の位置における野生型として選択する。次いで、変異誘発、例えばＷＴＭ（ｗａｌｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）を用いて、このような野生型アミノ酸を系統的に変化させることにより、ユニバーサル抗体ライブラリーを生成する。
【００３６】
ユニバーサルライブラリーの構築戦略には、フレームワーク配列の選択と、その後の超可変ＣＤＲループの設計が必要となる。フレームワーク配列の選択に関しては、特定抗原に反応して発現したと判定される利用可能なフレームワーク足場すべてのサブセットをアレイ化する。所与の抗原クラスに反応して自然界で最も高頻度に発現するフレームワークの決定によって、適当なフレームワークアクセプターを選択する。例えば、タンパク質系抗原に反応して発現する好ましいアクセプターフレームワークを決定するために、Ｋａｂａｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍで利用可能）から「タンパク質指向性」フレームワークを探す。好ましいアクセプター配列が異なる抗原クラスに対してＣＤＲを提示するために必要であれば、および／または特定種のアクセプター配列が必要であれば、それに応じてＫａｂａｔタンパク質配列フィルターを設定する。例えば、タンパク質系標的に対するヒト用治療薬に使用する配列を決定するためには、タンパク質／ペプチド抗原を認識するヒト抗体配列（マウス、ラット、ニワトリなどのいずれの配列でもない）だけに絞るように該フィルターを設定する。これにより、結果を偏向させる恐れのある、データセットおよび配列情報における冗長が著しく減少する。
【００３７】
前記ステップによって、多数の各種合成フレームワーク足場を生成する必要性が最小限となり、約６００配列以下の潜在的アクセプターのデータセットが通常得られる。したがって、生成配列数は、抗原クラスによって選択される再編成遺伝子配列を生じる生殖細胞系前駆体配列を決定する更なる分析のために、容易に扱える。生殖細胞系に関するこの第２の決定によって、抗原クラスによって選択された抗体配列の選択は、過剰に提示される最適な（または高頻度）生殖細胞系フレームワーク配列の有無が特定されるので、精度が向上する。多数の再編成抗体配列を産生する、ある種の抗原に対する幾つかのポリクローナル反応では、少数のアクセプターフレームワーク配列が使用されるに過ぎないことが、実際に認められてきた。このような事例では、抗体の抗原に対する配列および結合の多様性は、フレームワークではなく、主にＣＤＲに局在化している。上記のバイオインフォマティクス分析は説明上ＶＨ遺伝子に集中しているが、Ｖλ、Ｖκのいずれの遺伝子も同様に評価されることは理解されよう。
【００３８】
１．２  ＣＤＲ多様性を最大化するための設計戦略
本発明の規準に基づく候補フレームワークの選択によって、導入すべきＣＤＲサイズおよび初期アミノ酸配列多様性が左右される。抗体配列の１）ある抗原クラスに対する出現頻度および２）生殖細胞系頻度を特定すると、該配列をその正準クラスに従って配列できる。正準クラスは、Ｃｌｏｔｈｉａにより記載された約束事項（後述の、材料および方法を参照されたい）を用いて決定する。抗体配列の所与のセットについては、該抗体配列の大多数はある一定の正準クラスに入り得る。次いで、該正準クラスにより、ＣＤＲ内に収容できるアミノ酸残基の個数が決まる。例えば、該正準クラスが１−３であれば、ＣＤＲ１はアミノ酸６個のループを有し、ＣＤＲ２はアミノ酸１３個のループを有することになろう。重鎖可変配列に関しては、Ｊセグメントの配列分担は、ほんの６配列のサブセット由来の最適合配列だけを通常検討しさえすればよい程度に、かなり良好に保存されている。Ｋａｂａｔ、Ｖ  ＢＡＳＥの各データベースに関するＣＤＲアミノ酸の頻度分析により、２種の区分、例えば１）保存すべき位置、および２）多様性生成に適する位置に属するＣＤＲアミノ酸残基位置の特定が可能となる。
【００３９】
ＶＨ−ＣＤＲ２の設計では、Ｖ  ＢＡＳＥ、Ｋａｂａｔの各データベースにおける多様性分析は、上記ＶＨ−ＣＤＲ１に対して行ったのと同様に行う。
【００４０】
ＶＨＣＤＲ３の多様性の設計では、Ｋａｂａｔデータベースからの抗体のＣＤＲ３配列は、サイズおよび抗原クラスに従って整列させる。非タンパク質抗原およびタンパク質／ヘプチド抗原を認識する各抗体のＣＤＲ３の長さを比較し、頻度分析を行い、１０％の閾値頻度を用いて、ＣＤＲ３多様性の設計に使用すべき最も有利な配列を特定する。ＣＤＲ３のサイズおよびアミノ酸残基頻度の分析は、例えば免疫グロブリン（Ｄ）およびＪ遺伝子再編成配列を用いて行うので、フィルター処理済みのＫａｂａｔおよびＶ  ＢＡＳＥを直接比較するための「ＣＤＲ３」生殖細胞系相当配列はない。しかし、フィルター処理済みＫａｂａｔの頻度分析または可変性プロファイル（ＶＰ）は、再編成ＣＤＲ３の各サイズに対して生成することができ（図１１および１２）、その結果、各サイズ分類に対して、全ＣＤＲ３位置を通して最も高頻度のアミノ酸が明らかとなり、コンセンサス「野生型」配列が得られる。意外にも、この「コンセンサス」または「頻度」手法によって、高い選択圧を受けている特定のアミノ酸が特定される。したがって、これらの残基位置は通常固定されており、多様性はその他のアミノ酸位置に導入される（特定のアミノ酸がこれらの位置に存在する場合の特定された選択性を考慮すると）。
【００４１】
前記ＣＤＲのいずれかに対して多様性を設計する場合、修飾アミノ酸残基、例えば大部分のポリペプチドに使用されている従来のアミノ酸２０種以外の残基、例えばホモシステインを所望であれば導入できる。これは、修飾アミノ酸残基を所望するポリヌクレオチドに終止コドンを通常導入する当分野認知の技術を用いて実行される。次いで、該技術により、導入すべき修飾アミノ酸に連結した修飾ｔＲＮＡ（例えば終止コドンのアンバー、オパールまたはオーカーのいわゆるサプレッサーｔＲＮＡ）を当該ポリペプチドに入れる（例えば、Ｋｏｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｏｃｈｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｔＲＮＡｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＰＮＡＳ，９８，１４３１０−１４３１５（２００１））。
【００４２】
２．コンピュータ支援ユニバーサル抗体ライブラリー（ＵＡＬ）の構築
本発明のユニバーサル抗体ライブラリーおよびその構築は、生成すべき抗体多様性に関する配列・構造情報の便宜を得て、改良抗体を生成する可能性が高まるように行う。画定領域、例えばＣＤＲに導入すべきアミノ酸多様性を選択する指針とするために、モデリング情報も使用できる。更にまた、本発明の抗体について得られた実際の結果も、繰り返し作製し、スクリーニングすべきそれ以後の抗体の選択（または排除）、例えば親和性成熟の指針とすることができる。
【００４３】
特定の一実施形態では、不十分または不要な構造および／または機能を有すると予測される任意の抗体の産生を省くために、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリングを使用する。このようにして、産生すべき抗体数を顕著に減らすことにより、その後のスクリーニングアッセイにおいてシグナルノイズ比を高めることができる。別の特定の実施形態では、任意の関連情報源、例えば遺伝子・タンパク質配列および三次元のデータベース、ならびに／あるいは試験済み抗体の結果から得られる追加のモデリング情報で、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリングを継続的に更新することにより、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏデータベースの予測能を一層精密にする（図１）。
【００４４】
更に別の実施形態では、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏデータベースは、アッセイ結果、例えば試験済み抗体の結合親和性／アビディティーを備えており、１種または複数のアッセイ規準に基づいて、該抗体が、反応抗体または非反応抗体として、例えば良好に結合するか、さほど結合しない抗体として区分される。このようにして、本発明の親和性成熟により、ある範囲の機能的反応を特定の配列・構造情報と同等に扱い、このような情報を用いて今後試験すべき抗体の製造の指針とすることができる。本法は、標的抗原に対する特定の結合親和性について、例えばＢｉａｃｏｒｅアッセイを用いて抗体または抗体断片をスクリーニングするのに特に適している。
【００４５】
したがって、ある領域内の特定の残基が所望の機能に関わらないと予測されることが、例えばｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリングを介して分かれば、その領域内の非隣接残基の変異誘発が望ましいこともある。画定領域間の等位構造および空間的相関関係、例えば抗体の画定領域中の機能性アミノ酸残基、例えば導入したその多様性を検討し、モデル化することができる。このようなモデリング規準には、例えばアミノ酸残基側鎖基の化学的性質、原子間距離、結晶構造解析データなどが挙げられる。したがって、産生すべき抗体数は賢明に最小限とすることができる。
【００４６】
好ましい一実施形態では、前記ステップの１つまたは複数がコンピュータで支援される。特定の一実施形態では、該コンピュータ支援ステップは、例えば、Ｋａｂａｔデータベースをマイニングし、場合によりＶｂａｓｅと結果を相互参照することを含み、それによって本発明の特定の規準を決定し、所望のＣＤＲ多様性を設計するために使用する（図１〜２）。本法は、装置、例えばコンピュータ駆動装置によって部分的または完全に実行する場合にも適している。例えば、データベースマイニングによる抗体配列の選択、多様性設計、オリゴヌクレオチド合成、前記操作のＰＣＲ介在集積、および所与の標的を結合する候補抗体の発現・選択は、組み合わせた装置類によって部分的または完全に実行することができる。その上、本法を部分的または完全に実行するための指示は、この指示を実行するための電子装置で使用するのに適した媒体に賦与できる。要約すると、本発明の方法は、ソフトウェア（例えば、コンピュータ可読性指示）およびハードウェア（例えば、コンピュータ、ロボット装置およびチップ）を含むハイスループット手法に合わせて修正可能である。
【００４７】
３．ユニバーサル抗体ライブラリーの合成
一実施形態では、本発明のユニバーサル抗体ライブラリー（ＵＡＬ）は、ポリペプチドの画定領域をコードし、所定のアミノ酸に対してコドンを１個だけ有する個々のオリゴヌクレオチドを合成することによって、スクリーニングのために生成される。これは、オリゴヌクレオチド内の各コドン位置に、野生型ポリペプチドの合成に必要なコドン、所定のアミノ酸用コドンのいずれかを導入することによって実現され、ＬＴＭ（ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）と称する（例えば、米国特許出願第６０／４８３２８２号を参照されたい）。
【００４８】
別の実施形態では、多数のアミノ酸位置における多様性が必要な場合、ＷＴＭ（ｗａｌｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ変異誘発）を使用できる（例えば、米国特許第６６４９３４０号、第５８３０６５０号および第５７９８２０８号、ならびに米国特許出願第６０／４８３２８２号を参照されたい）。ＷＴＭにより、最小限のオリゴヌクレオチド数で多重変異を起こすことが可能である。オリゴヌクレオチドは、例えばドーピング技法を用いて、回分で個別に作製でき、次いで所望であれば混合またはプールすることができる。
【００４９】
ライブラリーを生成するためのオリゴヌクレオチドの混合物は、既知のＤＮＡ合成法により容易に合成できる。好ましい方法では、β−シアノエチルホスホロアミダイトの固相化学法の使用を必要とする（例えば、米国特許第４７２５６７７号を参照されたい）。便宜上、指定のヌクレオチド試薬容器を収容している自動ＤＮＡ合成装置を使用できる。例えば画定領域を表わすポリヌクレオチドをより大きな遺伝子サイズ配列中に導入または構築することを促進するために、制限酵素部位またはプライマーハイブリッド形成部位を含有するように、ポリヌクレオチドも合成してもよい。
【００５０】
合成したポリヌクレオチドは、標準的遺伝子工学技法を用いてより大きな遺伝子サイズ配列、例えば１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）中に挿入できる。例えば、制限酵素のための隣接認識部位を含有するように、ポリヌクレオチドを作製することができる（例えば、米国特許第４８８８２８６号を参照されたい）。認識部位は、その領域をコードするＤＮＡに隣接する遺伝子中に天然に存在するか、または導入されている認識部位に相当するように、設計することができる。２本鎖形に変換した後、ポリヌクレオチドは、標準的技法によって該遺伝子または遺伝子ベクター中に連結される。適当なベクター（例えばファージベクター、プラスミドを含めて）によって、該遺伝子は、抗体の発現に適当な無細胞抽出物、ファージ、原核細胞または真核細胞中に導入できる。
【００５１】
あるいは、通常長さが約２０〜６０ヌクレオチドの部分重複ポリヌクレオチドが、設計される。次いで、その内部ポリヌクレオチドを相補パートナーにアニーリングして、更にアニーリングするのに有用な１本鎖伸長部を有する２本鎖ＤＮＡを得る。次いで、そのアニーリング対を一緒に混合し、伸長させ、連結することにより、ＰＣＲを用いて完全長２本鎖分子を形成することができる（例えば、実施例３を参照されたい）。適当なベクター中にクローニングするために、その合成遺伝子の末端近傍に都合良い制限酵素部位を設計できる。次いで、その完全長分子を適当なベクター中に連結することができる。
【００５２】
部分重複ポリヌクレオチドを遺伝子構築に使用する場合、そのポリヌクレオチドの１種の代わりに、縮重ヌクレオチドの１組を直接導入することもできる。適当な相補鎖は、部分相補ポリヌクレオチドからの伸長反応中に、ポリメラーゼによる酵素的伸長によって他方の鎖から合成される。合成段階における縮重ポリヌクレオチドの導入によっても、遺伝子の複数のドメインまたは画定領域に変異を誘発し、または多様性を有するようにそれを操作するクローニングが簡易化される。
【００５３】
別の手法においては、抗体が１本鎖プラスミド上に存在している。例えば、ファージベクター中、またはヘルパーファージを用いて１本鎖分子の増殖を可能とする複製源が繊維状ファージのベクター中に、その遺伝子をクローニングできる。この１本鎖鋳型は、所望の変異を表わす１組の縮重ポリヌクレオチドでアニーリングし、伸長させ、連結し、こうして各類縁鎖を適当な宿主中に導入できる分子集団中に組み込むことができる（例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：７９１−８０２（１９８８）を参照されたい）。この手法により、変異誘発のために多重ドメインを選択する多重クローニングステップを回避できる。
【００５４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法も、ポリヌクレオチドを遺伝子中、例えばＣＤＲ多様性をフレームワーク領域中に導入するために使用できる。例えば、ポリヌクレオチド自体を伸長用のプライマーとして使用できる。この手法では、画定領域（またはその一部）に相当する変異原カセットをコードするポリヌクレオチドは、相互に少なくとも部分的に相補性であり、ポリメラーゼ、例えばＰＣＲ増幅を用いて大きな遺伝子カセット（例えばｓｃＦｖ）を形成するために、伸長させることができる。
【００５５】
ライブラリーの大きさは、ＣＤＲ鎖長と、例えばＷＴＭまたはＬＴＭを用いて発現する必要のあるＣＤＲ多様性の量に応じて変化するであろう。好ましくは、ライブラリーは、１０１５、１０１４、１０１３、１０１２、１０１１、１０１０、１０９、１０８、１０７未満、より好ましくは１０６未満の抗体を含むように設計されよう。
【００５６】
上記説明は、対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを変化させることにより、抗体多様性を発現させることを中心としていた。しかし、本発明の範囲が、タンパク質化学を用いて所望のポリペプチドを直接合成することによって、本明細書に開示する抗体多様性を発現させる方法も包含することは理解される。この手法の実施では、生成するポリペプチドは、ポリヌクレオチド中間体の使用を除けることを別とすれば、本発明の特徴を依然として取り込んでいる。
【００５７】
上記のライブラリーに関しては、ポリヌクレオチドおよび／または対応ポリペプチドの形態を問わず、当分野認知の技術を用いて、ライブラリーをマイクロチップなどの固体支持体に結合してもよいし、好ましくはアレイ状にしてもよい。
【００５８】
本発明の方法は、親和性成熟を介して候補抗体分子を修飾するのに特に有用である。改変は、抗体の可変領域および／またはフレームワーク（定常）領域中に導入できる。可変領域の修飾により、抗原結合性および所望であれば触媒特性が向上した抗体が産生できる。フレームワーク領域の修飾によっても、溶解性や安定性などの物理化学的性質を改良できるが、このような性質は、例えば商業的生産、生体利用率、および抗原に対する親和性に特に有用である。変異誘発の標的は、通常抗体分子のＦｖ領域、即ち重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）から各１本の連鎖２本の可変領域で構成される、抗原結合活性の分担構造となろう。所望の抗原結合特性が特定されると、可変領域（複数も）を操作してＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの適当な抗体クラスにすることができる。好ましい一実施形態では、特定された候補結合性分子に親和性成熟を施すことにより、標的／抗原に対する該結合性分子の親和性／アビディティーを高める。
【００５９】
４．発現系およびスクリーニング系
前記技術または他の適切な技術のいずれかによって生成するポリヌクレオチドのライブラリーは、発現させ、スクリーニングすることにより、所望の構造および／または活性を有する抗体を特定することができる。該抗体の発現は、無細胞抽出物（および、例えばリボソームディスプレイ）、ファージディスプレイ、原核細胞、または真核細胞（例えば、酵母）を用いて実行できる。
【００６０】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、無細胞抽出物中で発現できる鋳型として働くように操作される。例えば米国特許第５３２４６３７号、第５４９２８１７号および第５６６５５６３号に記載のベクターおよび抽出物が使用でき、その多数のものは商業的に入手できる。ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子型）をポリペプチド（例えば、表現型）に連結するためのリボソームディスプレイおよび他の無細胞技術が使用でき、例えばＰｒｏｆｕｓｉｏｎ（商標）（例えば、米国特許第６３４８３１５号、第６２６１８０４号、第６２５８５５８号および第６２１４５５３号を参照されたい）。
【００６１】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰｌｕｃｋｔｈｕｎおよびＳｋｅｒｒａが記載する系などの便利なＥ．ｃｏｌｉ発現系中で発現することができる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６−５１５（１９８９）；Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２７３−２７８（１９９１））。Ｍ．Ｂｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６（１９８９）に記載のように、変異タンパク質は、培地中および／または細菌の細胞質中に分泌するように発現させることができる。一実施形態では、ＶＨおよびＶＬをコードする単一ドメインは各々、ｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、ｐｅｌＢシグナル配列などのシグナル配列をコードする配列の３’末端に結合される（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４３７９（１９８７））。このような遺伝子融合体は２シストロン性構築体に作製され、それにより単一ベクターから発現され、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間中に分泌されることができるが、その場では再度折り畳まれ、活性型に回復できる（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２７３−２７８（１９９１））。例えば、抗体重鎖遺伝子は、抗体軽鎖遺伝子と同時に発現することにより、抗体または抗体断片を産生することができる。
【００６２】
別の実施形態では、抗体配列は、分泌シグナルおよび脂質化部分を用いて原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉの膜表面上に発現され、これについては、例えばＵＳ２００４００７２７４０Ａ１、ＵＳ２００３０１０００２３Ａ１およびＵＳ２００３００３６０９２Ａ１に記載されている。
【００６３】
更に別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば酵母ディスプレイを用いて酵母などの真核細胞中に発現でき、これについては、例えば米国特許第６４２３５３８号、第６３３１３９１号および第６３０００６５号に記載されている。この手法では、ライブラリーの抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、酵母の表面上に発現され、ディスプレイされているポリペプチドに融合している。
【００６４】
本発明の抗体を発現するためのより高等な真核細胞、例えば骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０細胞）、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞も使用できる。哺乳類細胞中に発現する場合、抗体は、培地中に発現するか、または該細胞の表面上に発現するように、通常設計される。抗体または抗体断片は、例えば、完全な抗体分子として、または個々のＶＨおよびＶＬ断片、Ｆａｂ断片、単一ドメインとして、または１本鎖（ｓＦｖ）として産生できる（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）を参照されたい）。
【００６５】
発現抗体（または直接合成により生成した抗体）のスクリーニングは、適当な任意の手段によって行うことができる。例えば、結合活性は、標準的な免疫アッセイおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーにより評価できる。本発明の抗体の触媒機能、例えばタンパク質分解機能のスクリーニングは、例えば米国特許第５７９８２０８号に記載のように、標準的なヘモグロビンプラークアッセイを用いて実現できる。候補抗体の治療標的結合能の決定は、例えば、所与の標的または抗原に対する抗体の結合率を測定するＢｉａｃｏｒｅ装置を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイできる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、幾種もの動物モデルのいずれかを用いて行い、その後適切であればヒトにおいて試験できる。
【実施例】
【００６６】
実施例全体にわたって、別途指示のない限り以下の材料および方法を使用した。
【００６７】
材料および方法
本発明の実施は、別途指示のない限り、化学、分子生物学、組み換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ技術、免疫学（特に、例えば抗体技術）、発現系（例えば、無細胞発現、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよびＰｒｏｆｕｓｉｏｎ（商標））、ならびに必要な任意の細胞培養に関する従来技法は、当分野の技術に含まれ、文献中で説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．１  ａｎｄ  ２，（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．１９８４）；ＰＣＲ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９）（Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎｅｉｄｌｅ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；ＰＣＲ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｂｕｒｋｅ，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ  Ｌｔｄ（１９９６）；Ｔｈｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ＲＴ−ＰＣＲ，Ｓｉｅｂｅｒｔ，Ｅｄ．，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．（１９９８）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）；Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｂｉｎｉｅｃｋｉ，Ａ．，Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｐｕｂ．，（１９９０）．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃ．Ｂａｒｂａｓ（Ｅｄ．），ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，（２００１）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｐ  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ（Ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｂｏｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ��ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５（６）：５５３−７（１９９７）；Ｂｏｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２８：４３０−４４（２０００）；米国特許第６３４８３１５号にてＰｌｕｃｋｔｈｕｎ  他が記載したリボソームディスプレイと、米国特許第６２５８５５８号、第６２６１８０４号および第６２１４５５３号にてＳｚｏｓｔａｋ他が記載したＰｒｏｆｕｓｉｏｎ（商標）；ならびにＵＳ２００４００５８４０３Ａ１に記載の細菌ペリプラズム発現を参照されたい。
【００６８】
Ｋａｂａｔの約束事項を用いた抗体配列分析に関する更なる詳細説明は、例えば以下の文献に見出すことができる：Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｋａｂａｔ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ａ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｅｘａｍｐｌｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；２４８：１１−２５；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ＣＤＲＨ３  ｌｅｎｇｔｈｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，Ｄｅｃ；１０（１２）：１８０１−５；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＨＵＮＴ．Ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  ｓｃｒｅｅｎ  ａｌｉｇｎｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５；５１：１−１５．ａｎｄ  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｎｇｔｈ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤＲＨ３  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．１９９３  Ｍａｙ；１６（１）：１−７．Ｒｅｖｉｅｗ。
【００６９】
Ｃｈｏｔｈｉａの約束事項を用いた抗体配列分析に関する更なる詳細説明は、例えば以下の文献に見出すことができる：Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８  Ｍａｙ  １；２７８（２）：４５７−７９；Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｅｓｉｇｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ．１９９７  Ｏｃｔ；６８（１−３）：９−１６．；Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８  Ｊａｎ  １６；２７５（２）：２６９−９４；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７  Ｎｏｖ  ７；２７３（４）：９２７−４８．Ｂａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．１９９４  Ｄｅｃ；１（１２）：９１５−２０；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２  Ｏｃｔ  ５；２２７（３）：７９９−８１７  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ．１９８９  Ｄｅｃ  ２１−２８；３４２（６２５２）：８７７−８３；ａｎｄ  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９８７  Ａｕｇ  ２０；１９６（４）：９０１−１７）。
【００７０】
Ｃｈｏｔｈｉａ分析に関する更なる詳細説明は、例えば以下の文献に記載されている：Ｍｏｒｅａ  Ｖ，Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  Ａ，Ｒｕｓｔｉｃｉ  Ｍ，Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８  Ｊａｎ  １６；２７５（２）：２６９−９４；Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ，Ｇｈｅｒａｒｄｉ  Ｅ，Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＩＭ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｇ，Ｍａｒｋｓ  ＪＤ，Ｌｌｅｗｅｌｙｎ  ＭＢ，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２  Ｏｃｔ  ５；２２７（３）：７９９−８１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ，Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  Ａ，Ｌｅｖｉｔｔ  Ｍ，Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ  ＳＪ，Ａｉｒ  Ｇ，Ｓｈｅｒｉｆｆ  Ｓ，Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ，Ｄａｖｉｅｓ  Ｄ，Ｔｕｌｉｐ  ＷＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８９  Ｄｅｃ  ２１−２８；３４２（６２５２）：８７７−８３；Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ．Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９８７  Ａｕｇ  ２０；１９６（４）：９０１−１７；ａｎｄ  Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ．Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．１９８７；５２：３９９−４０５。
【００７１】
ＣＤＲ接触の検討に関する更なる詳細説明は、例えばＭａｃＣａｌｌｕｍ  ＲＭ，Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣ，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＭ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６  Ｏｃｔ  １１；２６２（５）：７３２−４５に記載されている。
【００７２】
本明細書で言及した抗体の配列およびデータベースに関する更なる詳細説明は、例えば以下の文献に見出される：Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＩＭ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｇ，Ｍａｒｋｓ  ＪＤ，Ｌｌｅｗｅｌｙｎ  ＭＢ，
Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｔｈｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  ｆｉｆｔｙ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２  Ｏｃｔ  ５；２２７（３）：７７６−９８；Ｌｉ  Ｗ，Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ  Ｌ，Ｇｏｄｚｉｋ  Ａ．Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅ  ｔｈｅ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００１  Ｍａｒ；１７（３）：２８２−３；［ＶＢＤＢ］ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ−ｏｋ．ｐｈｐ？ｍｅｎｕ＝９０１；［ＫＢＴＤＢ］ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ；［ＢＬＳＴ］ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／［ＣＤＨＩＴ］ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｌｊｃｒｆ．ｅｄｕ／ｃｄ−ｈｉ／；［ＥＭＢＯＳＳ］ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／；［ＰＨＹＬＩＰ］ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｙｌｉｐ．ｈｔｍｌ；ａｎｄ  ［ＦＡＳＴＡ］ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ。
【００７３】
細菌発現ライブラリーは、通常以下のように構築した。Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １０１（２５）：９１９３．（２００４）に記載のＡＰＥｘ発現ディスプレイ系などの適当な発現ディスプレイベクター中に、鋳型配列（図１８）をクローニングする。ＡＰＥｘベクター中に導入した配列で調製した構築体のＫｕｎｋｅｌ変異誘発によって、ウォークスルー（ｗａｌｋｔｈｒｏｕｇｈ）および拡張ウォークスルーライブラリーを調製する。Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発用の１本鎖鋳型は、標準処方を用いて調製した（Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：３３３−６３）。鋳型のＫｕｎｋｅｌ変異誘発は、例えば以下の文献に詳述されるような標準的方法に従って実行した：Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−９２；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−８２；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００；Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−８０；ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８９）ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ。
【００７４】
図２６は、ＣＤＲライブラリー収集オリゴヌクレオチド類を鋳型抗体コード配列中に導入するＫｕｎｋｅｌ変異誘発法における一般的ステップを示す。先ず、１本鎖ウラシル化鋳型を、ＣＤＲＬ３用に選択されたコドン置換部を有するＬ３オリゴヌクレオチド集合体（緑色断片）と反応させる。ＳＥＱＩＤ−１を利用する鋳型に関しては、サイズ２種のＣＤＲＬ３、サイズ８および９がある。その各サイズに対して、ウォークスルーアミノ酸の各々により、単一のオリゴヌクレオチド混合物が生成すると思われる。ウォークスルーオリゴヌクレオチド混合物９種をサイズ８（ＶＫＩＩＩ＿３＿８＊）に対して示し、ウォークスルー混合物９種をサイズ９（ＶＫＩＩＩ＿３＿９＊）に対して示す。オリゴヌクレオチド混合物全１８種を等モルずつ混合し、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発を前記のように行う（ＳＴＥＰ１）（Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：３３３−６３）。通常１本鎖鋳型の１０μｇ反応で、１０８〜１０９個規模の形質転換体ライブラリーが得られよう。この変異誘発反応はＤＨ５α細胞中に形質転換され、ＣＤＲＬ３ライブラリー集合体上でマキシプレップ（ｍａｘｉｐｒｅｐ）を行う。
【００７５】
Ｌ３ライブラリー１本鎖鋳型を調製するために、Ｌ３ライブラリーＤＮＡのこの集合体をＣＪ２３６細胞中に形質転換する（ＳＴＥＰ２）。これにより、追加のＣＤＲ変異誘発を導入するための１本鎖鋳型が生成する。変異誘発したＨ３ライブラリーオリゴヌクレオチド（ＳＴＥＰ３）をＣＤＲＬ３ライブラリー鋳型にアニーリングする。図１８に示した配列を利用する鋳型に関しては、ＣＤＲＨ３の鎖長１０種、サイズ９〜１８を初期設計で使用する。ＣＤＲＨ３の各サイズについては、別々の反応を行う。したがって、ステップ３では、各反応に対し１本鎖鋳型２０μｇを利用して１０種の反応を別々に行う。ＣＤＲＨ３の各サイズ内では、ウォークスルーアミノ酸９種を利用する。したがって、サイズ９（ＶＨ＿３＿９＊）の各反応に対して縮重オリゴヌクレオチド９種が一緒にプールされ、サイズ１０（ＶＨ＿３＿１０＊）に対しても類似数がプールされるなどである。１本鎖鋳型各２０μｇの反応で、１０９個を超える形質転換体が得られる。したがって、ＣＤＲのサイズ１０種を含んだこのライブラリーに関しては、ＣＤＲＬ３／ＣＤＲＨ３の全ライブラリーは、全形質転換体が１０１０個を超える。各変異誘発反応をＤＨ５α細胞中に形質転換し、プラスミドＤＮＡのマキシ調製後、該ＤＮＡを、ＡＰＥｘディスプレイおよびスクリーニング（Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １０１（２５）：９１９３（２００４）に記載のように）用のＤＨ１２Ｓ細胞などの適当な発現・ディスプレイ細胞系中に形質転換できるか、またはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２などの他のＣＤＲ中に変異を更に導入するために、ＣＪ２３６細胞中に該プラスミドを更に形質転換できる（ＳＴＥＰ４）。
【００７６】
（実施例１）
バイオインフォマティクス主導のユニバーサル抗体ライブラリー配列の特定方法
この実施例では、バイオインフォマティクスと本発明の判定規準とを用いて、ユニバーサル抗体ライブラリーの配列を特定および選択する。
【００７７】
簡潔には、発現された免疫グロブリン、即ち再編成された免疫グロブリンの配列を含有するＫａｂａｔ電子データベースの検索を、特定のフィルターアルゴリズムを用いて行う。詳細には、特定の抗原クラスに応答して発現されたヒト配列のみが特定されるようにフィルターアルゴリズムを設計した。選択された抗原クラスはタンパク質ベースの抗原／標的であった。それは、この抗原クラスが、ヒト治療薬を開発するために扱いやすい標的のセットであるためである。しかし、このデータベースは、他の抗原クラス、例えば、ペプチド、多糖類、ポリヌクレオチド、および低分子の照会、ならびに、例えば獣医学用途の治療薬を開発するための、霊長類、マウス、ラット、またはニワトリ配列などの他の種に由来する抗体配列の照会にも全く同じく容易に受け入れると理解されている。５９７１のＶＨ配列からなる初期セットに、以上の判断規準を適用した（しかし、このセットの配列は、追加の配列がクローニングされ、データベースに入力されるのに従って、数が増加しうることに留意されたい）。
【００７８】
上記検索およびフィルター分析から、タンパク質抗原を認識する非重複の再編成ヒト抗体クローンを代表する約３８０のＶＨ遺伝子配列からなるデータセットが返答された。次のステップでは、これらの再編成された遺伝子配列を産生した生殖系列前駆体の指定を行い、それに続いて、これらの生殖系列候補配列の頻度分析を行う。換言すれば、タンパク質抗原用に最適または高頻度な生殖系列フレームワーク配列が存在するかどうかに関する判定を行う。フィルターを通ったＶＨ配列（Ｋａｂａｔから）の中の再編成された遺伝子によって用いられている生殖系列配列を決定するために、Ｖ  ＢＡＳＥを用いた。Ｖ  ＢＡＳＥは、ＧｅｎｂａｎｋおよびＥＭＢＬデータライブラリー（それぞれ、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｇｉｓｈ，Ｗ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．、およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０年）、「Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、ならびに、ＭＲＣタンパク質工学センター（Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｈｉｌｌｓ  Ｒｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，ＣＢ２  ２ＱＨ）によって運営されている一般に利用可能なデータベースを参照のこと）の現在の最新版にあるものを含めた、公表されている１０００の配列から収録されたヒト生殖系列可変領域配列の包括的な総覧である。現在、７つのファミリー（即ちＶＨ１−７）に分類されている５１の機能的ＶＨセグメント、７つのファミリー（即ちＶκＩ−ＶＩＩ）に分類されている４０の機能的なＶκセグメント、および１０のファミリー（即ちＶλ１−１０）に分類されている３１の機能的なＶλセグメントが存在する。発現された（再配列された）配列に最も高頻度に寄与するＶＨ生殖系列遺伝子（およびファミリー）を特定するために、フィルターを通ったＫａｂａｔ配列（約３８０ＶＨ）に対する、Ｖ  ＢＡＳＥ生殖系列配列のＢａｔｃｈ  ＢＬＡＳＴを行った。この分析は、例えば、最も高頻度で現れる８つのフレームワークのうちの６つ（フレームワーク１、２、および３）がＶＨ３生殖系列ファミリーに属すること、ならびに、ＶＨ１およびＶＨ４ファミリーのメンバーが中程度に現れるグループを形成したことを特定した。フィルターを通ったＫａｂａｔデータベースに現れた生殖系列ＶＨフレームワーク（１、２、および３）の配列に関して頻度分析を行った（図３および４）。この分析では、再編成された配列の分類の際、生殖系列遺伝子に最大４つまでの体細胞変異（点入り棒グラフ）を許した。フィルターを通ったＫａｂａｔと生殖系列遺伝子との間の一致は、中空の棒グラフで示す。閾値ラインは、タンパク質／ペプチド抗原を認識する抗体の再編成された配列で最も高頻度で現れる生殖系列遺伝子を特定するように設定されている（図３および４）。
【００７９】
最も高頻度のＶＨ３フレームワークの特定は、重要な結果をもたらす。ＶＨ３初期フレームワーク配列の選択は、対応するＣＤＲ配列の多様性および標準的な正準構造によって規定されるサイズ制限を決定する（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ」、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９９２年、２２７（３）、７９９〜８１７頁、およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．ら、「Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｖ  ｋａｐｐａ  ｄｏｍａｉｎ」、Ｅｍｂｏ  Ｊ、１９９５年、１４（１８）、４６２８〜３８頁参照）。また、Ｖ  ＢＡＳＥによるフィルターを通ったＫａｂａｔのＢＬＡＳＴ検索は、候補分子の親和性成熟中に変異導入できる、体細胞超変異のいわゆる「ホットスポット」である位置も特定する。予備的なＫａｂａｔ−Ｖ  ＢＡＳＥ結果は、高頻度で使用されている４つのＶＨ３フレームワーク、即ち３−０７、３−１１、３−２３、および３−３３と、ＶＨ１フレームワークである１−ｅと、ＶＨ４フレームワークである４−３４および４−３０．４とを特定した（図５）。複数の開始フレームワークを選択する際に、潜在的抗原結合のためのＣＤＲの外で、構造的多様性が追加して生成された。６つのＪＨ配列（フレームワーク４をコードする）すべての比較分析は、これらの４つの配列が同一であり、他の２つの配列でも、相違は２アミノ酸のみであることを示す。この配列保存は、７つのフレームワークファミリーすべてに、一般的なフレームワーク４を使用するのを可能にし、多様性によって機能しないものが産生されるのを最小限にする（図５）。
【００８０】
したがって、本発明の判定規準を使用し、かつ、バイオインフォマティクス手法および既存の抗体データベースを使用して、抗体アクセプター配列の、操作しやすいセットを合理的に特定できることが実証された。更に、これらの配列の特定は、以下に論じる通り、ユニバーサル抗体ライブラリー内における賢明なＣＤＲ多様性を最大にする基礎を提供する。
【００８１】
（実施例２）
ユニバーサル抗体ライブラリーのためのＣＤＲ多様性を設計する方法
この実施例では、ユニバーサル抗体ライブラリーのＣＤＲ多様性を最適化する方法を示す。
【００８２】
候補フレームワーク選択は、前述の通り、導入されるＣＤＲのサイズおよび初期アミノ酸配列選択の両方を決定する。選択された６つのＶＨ３遺伝子ファミリーすべてが、同じ正準構造１−３を有する。正準構造１−３は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２がそれぞれ、５アミノ酸および１７アミノ酸のループを有することを要求する。ＫａｂａｔおよびＶ  ＢＡＳＥデータベースのＣＤＲアミノ酸頻度分析は、１）絶対配列保存、２）第１回の多様性生成、および３）それに続く、体細胞超変異の模倣による親和性成熟のためのＣＤＲアミノ酸の特定を可能にする。重鎖および軽鎖可変領域における各ＣＤＲの設計については、以下に配列と共に論じる。
【００８３】
重鎖の第１ＣＤＲ、即ち、以下では「ＶＨ−ＣＤＲ１」を設計するには、上記の判断規準を以下の通りに考慮する。即ち、生殖系列および再編成された遺伝子の両方で保存されているＣＤＲ位置は固定する。生殖系列では保存されているが、再編成された遺伝子では可変的なＣＤＲ位置は、初期のライブラリー構築では固定するが、親和性成熟中では変異導入を可能にする。そして、生殖系列および再編成配列で多様性を示すＣＤＲ位置が、変異誘発、例えばウォークスルー変異導入（ＷＴＭ（商標））を用いて多様性を導入する位置である。特定された６つのＶＨ３遺伝子ファミリー（即ち、３−０７、３−２１、３−２３、３−３０．５、３−４８、および３−７４）から初めて、生殖系列の５アミノ酸ＣＤＲ１配列の比較Ｖ  ＢＡＳＥ分析によって、これら６つの遺伝子の間でＳ３１、Ｙ３２、およびＭ３４が保存されていることが明らかになる（図６、左パネル）。フィルターを通ったＫａｂａｔデータセットにおける、再編成された５アミノ酸ＣＤＲ１配列すべての頻度分析（図６、右のパネル）は、３つの重要な発見を明示する。第１に、Ｙ３２は高度に保存されている。第２に、生殖系列で保存されている位置Ｓ３１およびＭ３４は、後の体細胞変異の対象となる。そして、第３に、ＣＤＲ１位置３３および３５は、生殖系列でも再編成された抗体配列でも保存されていない。
【００８４】
したがって、ＶＨ−ＣＤＲ１では、Ｙ３２の厳密な保存は、それを保存するための強い選択圧を示すため、Ｙ３２が固定され、いかなる改変も受けない。ＣＤＲ１位置３３および３５は、変異誘発、例えばＷＴＭ（商標）による初期のＣＤＲ１配列多様性を生成させる部位である。位置Ｓ３１およびＭ３４は、最初は「固定される」が、任意のｓｃＦｖ候補クローンにおける親和性成熟の際に変異導入を行う部位として特定されている。全部位で多様性を生成させない理由は、そのライブラリーの初期多様性を限定して、発現およびディスプレイを促進させることである。
【００８５】
上記Ｋａｂａｔの頻度分析から、ＣＤＲ１は、ＳＹＡＭＨという「野生型」の保存配列を有する。残基Ａ３３およびＨ３５は、図６で最も高い頻度であるため、野生型配列として選択される。アミノ酸多様性を導入する際に、ＣＤＲ１配列はＳＹＸＭＸであろう。式中、Ｘは、変異導入、例えばＷＴＭを行う位置を示す。例えば、ＣＤＲ１位置３３および３５のチロシン残基で変異導入、例えばＷＴＭを行う場合、その結果得られる望ましいＣＤＲ１配列は、ＳＹＹＭＨ、ＳＹＡＭＹ、ＳＹＹＭＹである。この場合には、芳香族側鎖を導入することの効果が探索される。Ａ３３位置の野生型のオリゴヌクレオチドコドン配列はＧＣＸである。Ｙ３３で置換する場合、これに対応する必要なオリゴヌクレオチド配列はＴＡＹであろう。したがって、Ａ３３→Ｙ３３オリゴヌクレオチド混合物には、その結果のコドン配列は（Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｃ）Ｃであろう。この場合、生成されたＡ３３→Ｙ３３オリゴヌクレオチドは、グリシン（ＧＣＣ）、アスパラギン酸（ＧＡＣ）、およびセリン（ＴＣＣ）をコードするコドン変更も有しうる。これらの追加「副産物」は、位置３３に多様性を追加するのに寄与する。次のＷＴＭ（商標）位置３５に関しては、Ｈ３５の野生型のコドン配列はＣＡＹであろう。そして、Ｙ３５に置換される場合、必要なオリゴヌクレオチド配列はＴＡＹであろう。したがって、Ｈ３５→Ｙ３５混合物には、その結果のコドン配列が（Ｃ／Ｔ）ＡＣである。この場合、いかなる追加アミノ酸「副産物」も形成されないであろう。
【００８６】
別の手法では、ルックスルー変異導入（ＬＴＭ）を利用することによって、副産物を回避する。これは、通常、所望の変化それぞれについてオリゴヌクレオチドの合成を必要とするが、いかなる副産物（ノイズ）も排除する。
【００８７】
重鎖の第２ＣＤＲ、即ち、以下では「ＶＨ−ＣＤＲ２」を設計するには、Ｖ  ＢＡＳＥおよびＫａｂａｔデータベースにおける上記配列分析は、ＶＨ−ＣＤＲ１に関する場合と同様の方法で行われる。ＶＨ−ＣＤＲ２配列の頻度分析を行い、６種の候補フレームワークからの生殖系列ＣＤＲ２配列のアラインメントを構築し、閾値頻度を１０％に選択した（図８）。
【００８８】
同じＶＨ３遺伝子ファミリー（３−０７、３−２１、３−２３、３−３０．５、３−４８、および３−７４）から開始して、Ｖ  ＢＡＳＥ（図８、左パネル）およびフィルターを通過したＫａｂａｔ（図８、右パネル）の頻度分析は、ＣＤＲ２位置Ｉ５１、Ｙ５９、Ａ６０、およびＧ６５がすべての生殖系列およびほとんどの再編成された遺伝子で保存されており、したがって、合成ＣＤＲ２で不変でなければならないことを示す。上記のＫａｂａｔ頻度分析は、ＶＨ−ＣＤＲ２が、ＧＩＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧという「野生型」のコンセンサス配列を有するであろうことを示す。ＶＨ−ＣＤＲ２位置５４、５５、５８、６１、６２、６３、６４は生殖系列で配列保存を示すが、後の体細胞変異の対象となり、したがって、「固定」されるが、親和性成熟の際の変異導入は容認される。最初のＣＤＲ２多様性に関しては、試験アミノ酸（下線）を、位置５０、５２、５２ａ、５３、５６、および５７（ＸＩＸＸＸＧＧＸＸＹＹＡＤＳＶＫＧ）に変異誘発、例えばＷＴＭ（商標）によって導入する。
【００８９】
ＷＴＭは、無作為変異導入とは異なり、特定のアミノ酸による所定の置換を可能にする。例えば、位置５０、５２、５３、５６、および５７（下線）のチロシン（Ｙ）残基でＣＤＲ２のＷＴＭ（商標）を行うには、その結果の所望のＷＴＭ（商標）ＣＤＲ２配列は、以下の置換、即ち、単一置換（ＹＩＸＸＸＧＧＸＸＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＸＩＹＸＸＧＧＸＸＹＹＡＤＳＶＫＧなど）二重置換（ＹＩＹＸＸＧＧＸＸＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＹＩＸＸＹＧＧＸＸＹＹＡＤＳＶＫＧなど）、三重置換（ＹＩＸＸＹＧＧＹＸＹＹＡＤＳＶＫＧなど）、四重置換（ＹＩＹＹＹＧＧＸＸＹＹＡＤＳＶＫＧまたはＹＩＸＹＹＧＧＹＸＹＹＡＤＳＶＫＧ）、五重置換（ＹＩＸＹＹＧＧＹＹＹＹＡＤＳＶＫＧ）、六重置換（ＹＩＹＹＹＧＧＹＹＹＹＡＤＳＶＫＧ）を含有する（改変は下線部）。通常、１ＣＤＲあたりの２〜３置換が好ましく、これは、オリゴヌクレオチド合成における薬物使用によって容易に実現できる（技術上の詳細に関しては、例えば、米国特許出願公開第２００４００３３５６９号を参照のこと）。
【００９０】
予め選択された９つのＷＴＭ（商標）アミノ酸を用いた、ＣＤＲ２のＷＴＭ（商標）によって、９×２６即ち５７６メンバーのライブラリー多様性が生じる。比較のために、全２０アミノ酸による６箇所のＣＤＲ２飽和変異は、２０６即ち６．４×１０７であろう。したがって、ＣＤＲ２における「非固定」の１２箇所で飽和変異を行うのみで、ライブラリーの多様性は、２０１２即ち４×１０１５となるであろう。これは、現在のライブラリーのディスプレイ・スクリーニング技術の能力を超えたものである。これは本発明の利点を明示するものである。本発明は、それとは対照的に、それより小型であるが、より代表性の高いライブラリーの構築を可能にする。実際、本発明の方法は、第一世代の結合分子を特定するための、数箇所のＣＤＲ位置における操作が容易なライブラリーを提供する。それに続く、他のＣＤＲ位置での親和性成熟変異導入によって、特定されたそれらの結合分子を最適化する。
【００９１】
ＶＨＣＤＲ３の多様性の設計を行うために、Ｋａｂａｔデータベースから得た抗体ＣＤＲ３配列のアラインメントを、それらのサイズおよび抗原クラスに従って行った。非タンパク質性抗原（影つけされた棒グラフ）およびタンパク質／ペプチド抗原（中空の棒グラフ）を認識する抗体のＣＤＲ３の長さを示し、傾向線に適合させた（前者は実線、後者は点線）（図１１）。フィルターを通ったＫａｂａｔデータセットからの１３アミノ酸ＣＤＲ３配列の頻度分析を行い、１０％の閾値頻度を選択した（図１１）。ＣＤＲ３のサイズおよびアミノ酸残基頻度の分析は、例えば、免疫グロブリンＤおよびＪ遺伝子の再編成された配列を用いて行われるので、直接フィルター処理されたＫａｂａｔおよびＶ  ＢＡＳＥ比較に相当するいかなるＣＤＲ３生殖系列等価物も存在しない。それにもかかわらず、フィルター処理されたＫａｂａｔデータベースを検査したところ、検索結果は、ＣＤＲ３ループサイズに関して、約１３〜１６アミノ酸に頂点を有する６〜２４アミノ酸の範囲の正規分布曲線が存在することを示した（図１０）。
【００９２】
ＣＤＲ３位置に関するＶＢＡＳＥ対Ｋａｂａｔの平行比較分析を行わずに、再編成されたＣＤＲ３の各サイズについてフィルター処理されたＫａｂａｔの頻度分析を行った（図１１）。各サイズ内で、そのＣＤＲ３位置で最も高頻度なアミノ酸を計測する分類によって、コンセンサス「野生型」配列が得られる。驚いたことに、この「コンセンサス」手法は、高選択圧下にある特定のアミノ酸を特定する。例えば、サイズが１３アミノ酸のＣＤＲ３では、位置１０１でアスパラギン酸が高度に保存されていた（図１１）。したがって、上記の通り、ＶＨ−ＣＤＲ１およびＶＨ−ＣＤＲ２の多様性を設計する際に、Ｄ１０１が合成１３アミノ酸ＶＨ−ＣＤＲ３の「固定」された残基位置として維持される。しかし、ＶＨ−ＣＤＲ３位置９６、９８、１００ｃ、および１０２は、一部のアミノ酸を好む傾向が高く、したがって、予備的に「固定」されるが、後に親和性成熟の際に変異導入される。頻度分布は、ＣＤＲ３位置９５、９７、９９、１００、１００ａ、１００ｂ、１００ｄ、および１００ｅがいかなるアミノ酸への傾向も示さなかったことを示す。したがって、１３アミノ酸のＣＤＲ３配列では、式、ＸＧＸＳＸＸＸＸＹＸＸＤＹが、例えばＷＴＭなどの変異誘発などを用いた多様性の部位である位置（下線）を表す。サイズが８〜２０アミノ酸の間にあるすべてのＣＤＲ３配列に関して、同様の分析を行うことができる。図１０は、このサイズ範囲が、タンパク質性標的／抗原を認識する抗体のＣＤＲ３で見出される鎖長多様性の大部分を包含することを図示する。
【００９３】
（実施例３）
バイオインフォマティクスを用いた、抗体ＣＤＲの位置可変性プロファイル（ＶＰ）を作成する方法
別の手法では、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現されているＣＤＲの位置可変性プロファイル（ＶＰ）を決定することによって、ユニバーサル抗体ライブラリー（ＵＡＬ）を設計した。位置可変性プロファイルは、自然に発現される抗体のアラインメントされた配列のデータセットにおける特定の位置に存在する様々なアミノ酸およびそれらそれぞれの出現率のカタログ登録を表す。
【００９４】
したがって、ＶＰの決定は２ステップを伴い、例えば、ステップ１）は、データセットを生成するための、対象の１つまたは複数の特定の特性を共有するアラインメントされたアミノ酸配列（のデータセット）の収集および選択である。ＶＨまたはＶＬ由来の別々にアラインメントされたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が、通常の目的の初期データセットを形成する。対応するＶＰ結果を伴うＣＤＲデータセットを得るための方法が幾つか利用可能である。通常、ステップ（２）を実施するためには、アミノ酸可変性およびアラインメントされた各位置におけるそれらの相対頻度に関する（ＣＤＲ）データセットを列挙する（図４３）。次に、各ＣＤＲデータセットのＶＰは、多様性の現出を更に導入するために、所与のＣＤＲ位置の望ましい特徴を特定する。
【００９５】
ステップ１を実施するには、アラインメントされた配列のデータベースを組み立てる。対象である特定の１つまたは複数の特徴を共有する配列を選択する。例えば、タンパク質は、特定可能なモチーフ、ドメインを有し、かつ／または進化的に近縁なファミリーメンバーであって、それによって、それらの間で全体または部分配列アラインメントを可能にする可能性がある。開始入力データセットは、内因的に発現された成熟抗体のＫａｂａｔデータベースなど、予め特徴付けされ、分類された配列の以前の収録から取得できる。
【００９６】
Ｋａｂａｔデータベースから、ヒト免疫グロブリン、特にＶＨ配列を開始基礎データセット用に選択的に収集した。通常、再編成されたヒトＶＨ配列それぞれのルート生殖系列出自を比較分析によって決定する。対応する生殖系列の基礎を、「起因サブファミリー」と呼ぶ（図４１のステップ１）。この開始「基礎データセット」内の接触画定に記載のパラメータを用いたＶＨ配列の追加ＣＤＲを特定および描写できる。ＣＤＲおよびそれらが含むアミノ酸の指定は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、または他のいかなる適当な画定によって記載することもできる（図４１のステップ２）。
【００９７】
開始ヒトＶＨ配列「基礎データセット」内で、収録されたＶＨ配列は、依然として大きく異なった特徴を有する可能性が高い。ＶＨフレームワーク配列は、中でも、１−ファミリー分割（ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４など）、２−「起因するサブファミリー」、３−ＣＤＲの長さ、４−ＣＤＲ正準構造、５−抗原特異性の点において異なるであろう。「基礎データセット」メンバー間の配列多様性により、一貫した分析を得るには、選出された対象の特性の１つまたは複数を共有するデータセットを特定できるように開始「基礎データセット」からのさらなる選択が必要でありうる。それらそれぞれの特性を共有する構成員は、サブセット内で意味のある比較分析を行うための、より「標準化された」セットの配列を産生することができる。この過程を反復して、その結果より高程度に相関し、かつより小さなデータセットを産生することができる。図４３にそのようなものを例示する。
【００９８】
ＣＤＲは以下の通りに分類することができる。全ヒトＶＨ配列の重複していない「基礎データセット」から開始して、ＶＨ１配列を生成する配列のみを更に選択した（図４３）。非重複性フィルターは、同じ抗原に対して重複して登録された抗体配列を排除する。同じ抗原に対して産生された異なった抗体が存在する場合、これらの配列はデータベースに保持される。ＶＨ１サブセット内では、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を特定し、更に、ＣＤＲ１またはＣＤＲ２サブセットに分割する。ＶＨファミリー内でのＣＤＲ分割では、ＣＤＲ１またはＣＤＲ２サブセットは、依然として異なった長さのＣＤＲと共に分類されている可能性があることに留意するべきである。ＶＨ１  ＣＤＲ２は、長さが１３アミノ酸のものおよび１５アミノ酸のもの両方が存在する。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２には、長さ６アミノ酸および１３アミノ酸がそれぞれ選択され、生成したデータセットをそれぞれＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６およびＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３と命名する（図４３）。
【００９９】
正準構造は以下の通りに分類する。ＶＨ１  ＣＤＲ２配列内で、正準構造２（ＣＳ２）であるか、あるいは正準構造（ＣＳ３）であるものの間での分別を更に行う別のサブセット分割を行う。正準構造は、主要残基におけるシグネチャー残基を識別することによって画定できる。アミノ酸残基および位置は、ＣＤＲのどの画定が利用されるかによる。この実施例では、アミノ酸位置７１にＶ、Ａ、Ｌ、またはＴを導入したＶＨ１  ＣＤＲ２配列を正準構造２と表示し、一方、同じアミノ酸位置のＲは、正準構造３を表す。これらの操作は、それぞれ、ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ２およびＶＨ−１ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ３と命名されたデータセットを生成した（図４３）。
【０１００】
ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ２およびＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ３（図４９）に細分することによって、それらと、更に多くのＶＨ１＿ＣＤＲ２＿１３の全般的集合体（図４８）とのわずかに異なった可変性プロファイルが明らかとなる。例えば、ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ２では、「Ａ」は位置５２ａのより好ましいアミノ酸の１つでない。ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ３では、位置５１に「Ｍ」が好んで導入されることが判明しているが、ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ２およびＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３ではそうではない。ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ２とＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ３との間での、より劇的な例としては、前者において、ＡおよびＴの双方が位置５７でほぼ等しく好まれることである。
【０１０１】
ＶＨ１  ＣＤＲ１は、６残基のアミノ酸を要する正準クラス１（ＣＳ１）を有し、サブセットＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６を生成する（図４４）。この場合、ＣＤＲ１  ＣＳ１を識別する主要アミノ酸シグネチャーには、例えば、位置２４のＴ、Ａ、Ｖ、Ｇ、またはＳ、アミノ酸位置２６のＧ、および位置２９のＩ、Ｆ、Ｌ、Ｖ、またはＳが含まれる。したがって、一部の６アミノ酸ＣＤＲ変種が必要なシグネチャー配列を有しないという点でＣＳ１に属さない配列をＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６データセットが含有することも可能である。ユニバーサル抗体ライブラリーの主目的は、ＣＤＲ正準構造を有するフレームワーク配列と、その中のそれらの可変配列とを最もよく一致させ、それによって最も安定的かつ機能的な配置を得ることである。したがって、これらの非ＣＳ１配列は、自然にはＣＳ１の安定性および機能性に最適化されていないアミノ酸を導入して、データセットの配列における「ノイズ」に寄与しうる。したがって、ＣＳ１シグネチャーに一致した配列のみを分割して、データセットＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１（図４５）を作成して、さらなる精密化を行うことができる。
【０１０２】
交差ＣＤＲ対合を以下の通りに行った。上記のサブセットは、ＶＨ生殖系列サブファミリー、ＣＤＲ長、および正準構造に関してフィルターおよび標準化された配列集合体の例である。ＣＤＲ構造の直接的制約以外にも、ｉｎ  ｖｉｖｏでの内因性ＣＤＲ配列に直接的に影響を与えうる他のパラメータが存在する。実際、ＣＤＲ正準構造がその内部のＣＤＲ配列に影響を与えることのできる現象を実証することができる。１つのＣＤＲ正準構造を有することによって、正準構造および別のＣＤＲの配列の両方に影響を与えられることができる可能性がある。このＣＤＲ相互依存性を明らかにするために、ＣＤＲ正準構造間の対合に基づいてサブセット分割する際にＣＤＲ配列分析を行った。例えば、ＣＤＲサブセットを収集し、それによって、ＣＤＲ１（この場合ＣＳ１のみ）を、それらから構成されている元の抗体配列におけるＣＤＲ２  ＣＳ２またはＣＳ３のいずれかに群別した。
【０１０３】
この原理に従って、ＶＨ−１ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１を、ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１−２（図４６）およびＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１−３（図４７）に分割した。これらはそれぞれ、ＣＤＲ２−ＣＳ２およびＣＤＲ２−ＣＳ３とのＣＤＲ１−ＣＳ１の「対合」を表す。全般的に、可変性プロファイルは、ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６の全集合体と類似しているが、特定のＣＤＲ位置では個々のＣＳ優先性がある。ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１−２（図４６）の位置３１では、ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１またはＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１−３のいずれかと比較して、「Ｇ」および「Ｄ」は可変性プロファイルに現れないだろう。ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１−２とＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１−３との間では、位置３３も外部に何らかの可変性を示す。ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１−２対合では、「Ａ」が、優勢に現れるアミノ酸であり、「Ｇ」、「Ｔ」および「Ｗ」が独特に関連している。一方、ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１−３対合では、優性なアミノ酸が「Ｙ」であり、その変種として好まれているアミノ酸が「Ｄ」である。分析されていないが、ＶＨ−１＿ＣＤＲ２にも、それらの内因性ＣＤＲ１配列に選択的に対合できる、「Ｕ」を有する長さ１５アミノ酸の正準構造が存在する。結果として得られるＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１−Ｕ可変性プロファイルは、上記のＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１−３およびＣＳ１−２可変性プロファイルとは異なっている可能性があると予測される。
【０１０４】
逆に、ＣＤＲ１正準構造１との関連におけるＣＤＲ２配列間の相互依存性を、同様に分析した。図５０は、ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ２−１およびＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ３−１の可変性プロファイルを図示する。もっともこの場合、ＣＤＲ２可変性プロファイルはほぼ同一であった。これは、この点において、ＣＤＲ２設計がＣＤＲ１から独立して機能できることを実証している。しかし、ＶＨ４ファミリーなどの他のフレームワークに関しては、ＶＨ４  ＣＤＲ２は、ＣＤＲ２の長さが１２アミノ酸の正準構造（ＣＳ−１）１つだけ有している。３つの正準構造ＣＳ−１、ＣＳ−２、およびＣＳ−３と関与するのは、ＶＨ４  ＣＤＲ１である。この場合、結果として生じるＶＨ−４＿ＣＤＲ２＿１２＿ＣＳ１−１、ＶＨ−４＿ＣＤＲ２＿１２＿ＣＳ１−２、およびＶＨ−４＿ＣＤＲ２＿１２＿ＣＳ１−１可変性プロファイルから、ＣＤＲ位置における独特のアミノ酸優先性が予期される。
【０１０５】
上記のこれらの結果は、アクセプターとして使用されるのに選択されたＣＤＲ１およびＣＤＲ２両方の正準構造、ならびに、様々なＣＤＲアミノ酸位置にどのアミノ酸が導入されているかに応じて、採用された天然の多様性を模写するために、例えば、交差ＣＤＲ安定化が存在する場合に、他の配列と見出される可能性が最も高い配列を一致させることによって、アミノ酸を「微調整」することができる。
【０１０６】
ＣＤＲ抗原の分類は以下の通りに行った。構造分類に基づいた群別が行われたならば、抗原特異性に基づいて収集されたメンバーを分類することができる（図４３）。所与の抗原クラスに関して、ＣＤＲ内で好まれているアミノ酸の相関関係が存在しうる。そして、これは、特定のフレームワークの抗原クラス優先性に関して観測された。したがって、ＣＤＲ配列の分割に、追加のパラメータとして抗原特異性を追加することが可能である。
【０１０７】
ＣＤＲ配列集合体の拡張は以下の通り行った。上記の分析は、対象のサブセットを生成するための、複数のパラメータのスクリーニングの組合せの追加を示した。これには、選択されたＣＤＲ配列の可変性プロファイルを「狭くする」効果がある。しかし、この逆を行う、即ち、均質性または共有された特性の度合いがより低いより大きなデータセットを得る機会が存在しうる。事実上、これは異なったデータセットを結合することによって、実現される（図４３）。この例では、ＣＤＲ２が、いかなるＶＨファミリーに起因するかに関わらず、正準構造２（ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ２）を有する長さ１２のＣＤＲ２すべての可変性プロファイルを列挙する。これによって、ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ２の多様性に寄与するすべてのアミノ酸のより広範な調査が効果的に得られる。
【０１０８】
ＣＤＲ１およびＣＤＲ２サブセットデータセットに選択する選択的過程を図４３に記載する。発明者らの方法の重要な利点は、多くの異なった「選択」経路が可能であり、それらのそれぞれが、異なったデータセット、したがって、異なった可変性プロファイル（ＶＰ）を生成することである。
【０１０９】
これは、下記の図に例示されており、図中、ＣＤＲ１の可変性プロファイルが、ＶＨ１、ＶＨ３、およびＶＨ４の間で比較される。ある程度類似しているが、１つの重要な相違が位置３４に存在する。ＣＤＲ設計用に、ＶＨ１では、「Ｉ」を固定することができ、ＶＨ３では、「Ｍ」を固定することができ、ＶＨ４では、「Ｗ」を固定することができる。別の相違は、５０％から８０％の頻度要件の使用の下に関連するだろう。ＶＨ４に関しては、位置３５に最も高頻度で見出される２つのアミノ酸が「Ｓ」および「Ｈ」である。集合的に、これらの２つのアミノ酸の集積頻度は８０％を超えるであろう。したがって、位置３５は、「固定された」位置として特徴付けでき、強制同時産物として「Ｓ」および「Ｈ」の両方をその位置に導入することができる。対照的に、ＶＨ１およびＶＨ３の両方に関して、位置３５で最も高頻度で見出される２つのアミノ酸は、それらの出現頻度が併せても８０％を超えず、「可変的」な位置として特徴付けられ、その位置への変異導入（例えばＷＴＭ）が行われるであろう。
【０１１０】
（実施例４）
ユニバーサル抗体ライブラリーを遺伝子操作する方法
この実施例では、遺伝子工学技法を用いてユニバーサル抗体ライブラリーを作製し、組み立てるステップを記述する。
【０１１１】
簡潔には、抗体のＶＬおよびＶＨ断片は、標準的な分子生物学技術を用いてクローニングする。可変領域のフレームワークおよびＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって組み立てる。次に、これらのＶＬおよびＶＨ断片をポリ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（通常ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を用いて連結し、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を生成させる。その後、発現提示ベクターへのクローニングを容易にする制限部位を含有している、５’および３’隣接プライマーを用いて完全長分子を増幅する。生成されたライブラリーの全体的多様性は、フレームワーク配列の数と、例えばＷＴＭを用いた変異導入に選択されたＣＤＲの位置の数に依存する。
【０１１２】
ＷＴＭ（商標）の実施に９アミノ酸を用いた場合、ＶＨライブラリーの平均した多様性は、通常、３．５ｘ１０６（６フレームワークｘ９アミノ酸ｘ（ＣＤＲ１用に２２ｘＣＤＲ２用に２６ｘ１３アミノ酸のＣＤＲ３用に２８））である。ＶＨライブラリーの多様性は上限にあり、ＶλおよびＶκライブラリーの多様性は有意に小さい。したがって、完全なｓｃＦｖライブラリーの併せた多様性は、１０１０から１０１１に限定され、これは、細菌システムの形質転換効率の範囲内にある。
【０１１３】
したがって、リンカー領域をコードする２つのオリゴヌクレオチド、ならびにそれぞれＮ末端およびＣ末端のＨｉｓおよびＭｙｃ免疫タグをコードする２つのオリゴヌクレオチドに加えて、ＶＨ、Ｖλ、Ｖκライブラリーのフレームワークを包含させるために９０のオリゴヌクレオチドを合成する。加えて、３種のライブラリーのＣＤＲ１、２、および３のそれぞれにおいて多様性を表す縮重オリゴヌクレオチド３０〜６０種のサブセットを合成する（合計９０〜１８０）。これらのオリゴヌクレオチドを、単一重複伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲ法で組み立て、必要なＶＨ−ＶλおよびＶＨ−Ｖκの組合せを含んだライブラリーを生成させる。その後、配列検定およびライブラリー品質の評価用に、各ライブラリーからランダムクローンを選択する。
【０１１４】
ＣＤＲの多様性に関しては、ＬＴＭを用いて、抗体ＣＤＲループ内での小さな摂動（例えば１ループあたり１つの変化）を探索する。一層の改良には、それに続いてＷＴＭを用いて、ＣＤＲの化学景観を徹底的にスクリーニングする。ＷＴＭは、１つのＣＤＲ内への複数の置換の取込みを可能にする。ＷＴＭを用いて、野生型アミノ酸および所望のアミノ酸変種を、オリゴヌクレオチド合成を操作することによって、標的のＣＤＲ位置で探索する。オリゴヌクレオチドのサブセットが野生型をコードし、別のサブセットが特定の位置における標的変異をコードする、オリゴヌクレオチドの混合プールを合成する。このＷＴＭ手順では、合成の各ステップで、成長中のオリゴヌクレオチド鎖が、２塩基のうちの１塩基によって伸長する。ある塩基は野生型コドンをコードし、もう一方の塩基は、所望の変異のコドンに属する。
【０１１５】
（実施例５）
ユニバーサル抗体ライブラリーの発現および提示方法
この実施例では、標的に対してスクリーニングするためのユニバーサル抗体ライブラリーを発現および提示する方法を記述する。
【０１１６】
簡潔には、ライブラリーからｓｃＦｖ分子を発現するための信頼性が実証されている細菌発現系およびディスプレイ系を使用する。このｓｃＦｖフォーマットは、リンカーペプチドによって結合される機能的抗原結合ユニット（ＶＨおよびＶＬ領域）からなる（図１４）。本発明のそのようなライブラリーは、天然レパートリーの多様性を増大させ、構築されたならば、他の抗原に関して繰り返しスクリーニングすることができる。
【０１１７】
ｓｃＦｖライブラリーは、標準的な技法を用いて、受容細菌宿主に形質移入する。発現された融合ｓｃＦｖタンパク質は、蛍光標識された抗原の結合を可能にする外表面位置に発現される。候補タンパク質は、ＦＩＴＣで個々に標識する（直接的、またはビオチン−ストレプトアビジン連結を介して間接的に）。その後、標識抗原に効率的に結合する適当なｓｃＦｖクローンを発現するライブラリーのこれらのメンバーをＦＡＣＳを用いて濃縮する。その後、この細胞集団を再度増殖させ、より高い特異性および親和性で標的を認識するクローンの更に小さなサブセットを単離するために、増強されたストリンジェンシーレベルを用いて、後の選択操作を行う。これらのライブラリーは、迅速な特定および確認のために、例えばＦＩＴＣ標識された抗Ｍｙｃタグ抗体およびＦＡＣＳ分析を用いて容易にハイスループットフォーマットに適合させることができる。
【０１１８】
その後、候補クローンを単離し、ｓｃＦｖの配列情報を得るためにプラスミド調製を行う。この手法は、抗体のＶＨおよびＶＬ領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸機能性を決定および最適化するのに必要な仮説主導の合理的コドン置換を可能にする。その後、比較配列解析および個々のクローンの親和性／特異性プロファイルによって、どのクローンで親和性成熟（実施例６を参照）を行うか決定する。
【０１１９】
（実施例６）
ユニバーサル抗体ライブラリーから得た候補のハイスループット親和性成熟を行う方法
この実施例では、ユニバーサル抗体ライブラリーから候補抗体を特定して、親和性成熟を用いてそれを改善するステップを記載する。
【０１２０】
簡潔には、候補抗体分子を取得し、その分子の結合特性を向上させる、ユニバーサル抗体ライブラリーの力および能力を評価するために、市販の抗体を試験抗体として指定し、本発明の方法に従って、変異導入（例えばＷＴＭ（商標）／ＬＴＭＴＭ（商標）技法を用いる）、発現、提示、および改善した。
【０１２１】
簡潔には、試験抗体をｓｃＦｖフォーマットで変異導入し、その後、酵母ディスプレイを用いて、発現および提示を行った。但し、上述した細菌ディスプレイ系ならばいずれも使用することができる。酵母にディスプレイされたｓｃＦｖライブラリーの速度論的選択では、ビオチン化抗原によって細胞の初期標識を行い、大過剰の非ビオチン化抗原の存在下で経時的追跡を行う。追跡期間の後に、ＳＡ−ＰＥ標識によって、解離速度が遅いクローンを特定し、高速ＦＡＣＳ分取器を用いて分別する。図２９の左パネルは、野生型対照および分別ゲートのその結果生じたドットプロットと、分別ゲートにおけるライブラリーおよびクローン数を示すドットプロットと、分別後のライブラリーから単離されたクローンのドットプロットとを示す。図２９の右パネルでは、親和性成熟した２つのクローンの解離アッセイのデータを、野生型タンパク質と比較して、単一指数曲線に適合させて、解離速度定数（ｋｏｆｆ）を決定した。クローン１および２は、親分子より５．２倍および４．３倍遅いｋｏｆｆ速度を示す。
【０１２２】
無作為に選択されたクローンのＤＮＡ配列検定によって、ライブラリーが、所望の変異多様性、意図されていない点変異、欠失、および挿入に関して高品質のものであることが示された。この効率は、様々な塩基の制御されていない導入によって、高レベルの望ましくない塩基変化の影響があり、好ましくないアミノ酸の使用および意図されていない終止コドンによる発現または抗体機能の低下を導くランダム／確率論的な変異誘発戦略とは対照的である。
【０１２３】
更に、表にされた、試験抗体のＬＴＭ分析からの配列データは、ノイズが非常に小さい生産的多様性を示している。図２９の底部パネルは、野生型配列と、６つのＣＤＲすべてで見出された、親分子の親和性を１．５倍以上増強させる２９の別々な変異とを示す。これらの変化のうち幾つかは、複数回単離された。例えば、ＣＤＲ３では、３つの別々な、ＳからＫへの変化と、２つの、ＳからＱへの変化が見出されている。対照的に、影付きの棒グラフは、その変化によって抗原親和性の増強が全く見出されなかったＣＤＲ位置を示す。次に、発見されたすべてのＬＴＭ単一突然変異の組合せを１ライブラリーに導入することによって、これらの高親和性変異中で結合活性が向上しているクローンの単離を容易にする。
【０１２４】
（実施例７）
ヒト疾患を治療するための治療薬抗体候補を特定するためにユニバーサル抗体ライブラリーをスクリーニングする方法
この実施例では、治療薬候補を特定するために、本発明のユニバーサル抗体ライブラリーをスクリーニングする方法を記述する。
【０１２５】
簡潔には、以前の治療に対して不応性であった慢性かつ破壊的な腎疾患を、本発明のユニバーサル抗体ライブラリーに対するスクリーニングの標的として選択した。詳細には、慢性腎疾患（ＣＫＤ）は、２０００万人を超える個体が患っており、米国における公的保健医療の主要問題として認識されている。腎形成過程を理解する際の主要な障害は、１）関与している様々な細胞型、および２）これらの細胞で分化に影響を与える関与分子を特定する腎特異的なバイオマーカーを認識する適当な試薬が存在しないことである。これらの腎マーカーを認識する抗体は、腎臓器官形成および疾患診断を調査するのに必要な現在の試薬類プールを著しく増大させると思われる。
【０１２６】
腎の生物学を理解するために、６つの腎臓特異的ヒト治療薬抗体候補、即ち、１）Ｎａ−Ｈイオン交換体（アイソフォームＮＨＥ３、ＮＨＥ８）（１４、１５）、陰イオン交換体（アイソフォームＳＬＣ２６Ａ６、ＳＬＣ２７Ａ７）、接着性分子Ｋｓｐ−カドヘリン（１６）およびリポカリンを、ユニバーサル抗体ライブラリーに対するスクリーニング用に特定した。
【０１２７】
血液学者は、長期にわたって「分化クラスター」（ＣＤ）細胞表面マーカーを認識するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）試薬の利益を享受してきた。造血作用は、リンパ球様および骨髄系統を生成する過程であり、モデル発生システムとしての多数の利点をしばしば示している。その成功の理由の多くは、造血細胞がＭａｂによって容易に特定、単離、および操作できることにある。
【０１２８】
上記スクリーニングで特定された治療薬候補をアッセイするには、診断用疾患バイオマーカー、例えば、初期急性腎不全（ＡＲＦ）を検出するバイオマーカーである好中球関連ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）を用いることができる。加えて、治療処置の疾患標的、例えば糸球体腎炎を、α３（ＩＶ）コラーゲンタンパク質でモニターすることができる。ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）を用いた、ＦＡＣＳによる可視化を容易にする既存のプロトコールを用いて、これらのタンパク質をビオチン化し、その後、ユニバーサル抗体ライブラリーから、第１回の抗原結合剤質を特定するために、３〜５回の選択を行う。その後、最初の治療薬抗体候補の配列決定を行い、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを用いて、精製された可溶性タンパク質に対する親和性を試験する。その後、望ましい場合には、実施例６に記載の通り、治療薬抗体候補の親和性成熟を行う。
【０１２９】
その後、抗原標的を認識する際のそれらの機能性を決定するために、免疫組織化学、免疫ブロットバイオマーカー診断、ならびに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの抗体ブロッキング実験など、当技術分野で認知されている技法を用いて実験室的実験を行う。
【０１３０】
（実施例８）
遺伝子配列のフィルターおよびクラスター分析を用いたユニバーサル抗体ライブラリー配列のバイオインフォマティクス主導的特定法
この実施例では、データベース分析を用いて、ユニバーサル抗体ライブラリー配列を特定する方法を記述する。
【０１３１】
簡潔には、最適な構造的かつ機能的多様性を有するユニバーサル抗体ライブラリーを設計する目的で、データの主要源として、ＶＢＡＳＥおよびＫＡＢＡＴを選択した。ＶＢＡＳＥは、Ｃｈｏｔｈｉａに基づいた（Ｃｈｏｔｈｉａら）付番方式を有し、ＫａｂａｔのＣＤＲ画定（Ｋａｂａｔら）に従ってアラインメントおよびアノテーションされた全ヒト生殖系列セグメントのＤＮＡおよびポリペプチド配列を含有するデータベースである。ＫＡＢＡＴは、異種の再編成された抗体配列の最も包括的なデータベースである。軽鎖および重鎖の両方におけるすべてのＣＤＲに多様性を導入することによって抗体親和性を改善するために、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら）およびＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａら）が主導する手法に対する代替方式として、ＣＤＲの接触画定方式（ＭａｃＣａｌｌｕｍら）を選択した。接触画定手法は、有意な構造的多様性の導入を可能にし、抗体の構造安定性に影響を与えずに結合を改善する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ付番法は、接触画定手法と共に用いるのに最適な方式なので使用する。図３０に、最もよく使用されているこれら３つのＣＤＲ画定の比較を示す。発明者らの選択に従って、フレームワークのアミノ酸に番号付けした。
【０１３２】
【表１】
2008536473.tif 000002
【０１３３】
ダウンロードしたすべての生殖系列Ｖセグメント（５１ＶＨ、４０ＶＫ、および３１ＶＬ）についてＶＢＡＳＥ分析を行い、上記の画定に従って解析し、例えば、図３１に示すＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３と記載されるフォーマットで３つの異なったファイルに局所保存をした。ここで、ＦＲはフレームワーク領域を指す。
【０１３４】
これらのデータセットから、各ＦＲまたはＣＤＲの個々のデータを抽出することができる。詳細には、配列は、ＦＲ１ｘＦＲ２ｘＦＲ３（ＦＲ１２３と呼ばれる）として構築した。ここで、「ｘ」は、ＣＤＲ１および２のためのプレースホルダとして使用される。この結果生じるデータセットは、ＦＡＳＴＡなど、好都合で小型な形態で保存される（図３２）。
【０１３５】
３つの生殖系列ファミリーのそれぞれについて、フレームワーク空間におけるそれらの相関を分析するため、距離マトリックスを作成するのにＦＲ１２３の配列を用いた。同一な配列はすべて一括し、類似性が高いすべての配列は共にクラスタリングした。各クラスターは、類似した構造特性を表す。ＦＲ１２３配列の階層クラスタリングおよび対応する系統樹は、ＰＨＹＬＩＰパッケージ［ＰＨＹＬ］にあるＵＰＧＭＡ法を用いて計算した。最初に、距離マトリックスを、ＰＲＯＴＤＩＳＴ［ＰＨＹＬ］および簡単なＫｉｍｕｒａ式を用いて計算した。その後、ＵＰＭＧＡアルゴリズムを用いて、ＮＥＩＧＨＢＯＲ［ＰＹＨＬ］を実施した（添付の図を参照）。
【０１３６】
Ｋａｂａｔデータベース［ＫＢＴＤＢ］から、ヒトＶＨ、ＶＫ、およびＶＬ配列の完全なデータセット（表２を参照）を、ＳｅｑｈｕｎｔＩＩ［Ｊｏｈｎｓｏｎら］を用いて、ＡＳＣＩＩフォーマットでダウンロードし、３種のファイル（生データ）に局所保存をした。その後、これらのファイルを解析し、各ｋａｂａｔ記載事項を、局所ＤＢＭＳに保存した。上記のデータセットを解析および分析するべきクラスを含有するｊａｖａパッケージ（ｃｏｍ．ｂｉｏｒｅｎｉｎｃ．ｋａｂａｔＤＢ）が開発されている。また、パッケージは、特定の領域の単離および分析を可能にする、入力配列の様々な集合を改変および記録する多数の方法も提供する。パッケージ設計は柔軟であり、付番方式および／またはＣＤＲ画定相互の容易な切り替えを可能にするものである。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の正準クラスを特定する方法を実施した。
【０１３７】
【表２】
2008536473.tif 000003
【０１３８】
Ｋａｂａｔ分析フィルターは、ｊａｖａパッケージ（ｃｏｍ．ｂｉｏｒｅｎｉｎｃ．ｕｎｉｌｉｂ）および幾つかの外部ツール（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＰＥＣＩＦＩＣＩＴＹ（ｃｏｍ．ｂｉｏｒｅｎｉｎｃ．ｕｎｉｌｉｂ））を用いた幾つかの逐次ステップで、元のデータセットのフィルターが行えるように構成されていた。保存されている、タンパク質抗原のみを認識する再編成された免疫グロブリン配列のサブセットを分析するために、適切なフィルター（以後ＰＡフィルターと呼ぶ）を選択した。ＫａｂａｔＤＢに保存されている、抗原アノテーションがない配列は除外した（表３）。
【０１３９】
【表３】
2008536473.tif 000004
【０１４０】
【表４】
2008536473.tif 000005
【０１４１】
データベースの重複によって引き起こされる偏りを避けるために、ＣＤ−ＨＩＴおよびｊａｖａツール（結果を再確認するため）を用いて、一部の配列のフィルターを行った。このアルゴリズムは、選択された閾値（９５％）を超えた同一性を有する配列クラスターを作成し、その後、各クラスターから代表的な配列を選択することに基づいている。類似性検索は、完全長配列（即ち、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）で行った。
【０１４２】
大部分のライブラリー設計は、フレームワーク領域１、２、および３の微調整された分析に依存しているので、誤分類および／または間違った仮定を避けるために、完全配列データを得ることが非常に重要であった（表５）。
【０１４３】
【表５】
2008536473.tif 000006
【０１４４】
ライブラリーの設計は、連動した２つのサブプロジェクト、即ちフレームワークおよびＣＤＲに分割された。ヒトレパートリーから選択されたフレームワークは、再編成された免疫グロブリン配列におけるそれらの使用を代表する生殖系列フレームワークセグメント１、２、および３であった。このために、フィルターを通ったデータセットを、最初に解析し、ＦＲ１２３フォーマットに書き直した。フレームワーク選択の全過程を通して、この特定のフォーマットを使用し、最も一般的なファミリーが特定されるように、生殖系列フレームワークの使用が、入力データセットにどのように分布しているかを決定した。このために、再編成されたデータセットの各配列について分類を行い、各Ｋａｂａｔ−ＦＲ１２３データセットに関して、関連ＶＢＡＳＥ−ＦＲ１２３に対するＢＬＡＳＴＰ［ＢＬＳＴ］を用いた類似性分析を行い、解析した。最も高い類似性スコアを示すヒットを明らかにする結果を選択した。各ファミリークラスターの基数を比較し、最も一般的なものを、フレームワーク選択の標的として選択した。
【０１４５】
【表６】
2008536473.tif 000007
【０１４６】
【表７】
2008536473.tif 000008
【０１４７】
ＦＲ１２３−Ｋａｂａｔデータセットから生じたクラスターを可視化するために、ＰＨＹＬＩＰパッケージ［ＰＨＹＬ］を用いた（図３６、３７、および３８を参照）。系統樹は、距離法（ＵＰＭＧＡ）を用いて得た。距離マトリックスは、Ｋｉｍｕｒａの式を用いて計算した。その結果得られた系統樹の配置は、それ以前のＢＬＡＳＴ分析と一致した。
【０１４８】
対象の生殖系列ファミリーを選択した後で、使用頻度の高いフレームワークセグメントおよびそれらの相対的正準構造の調査によって、分析の微調整を行った。それぞれのＶＢＡＳＥデータセットは、選択された関連のＫａｂａｔデータセットに対してＢＬＡＳＴ分析し、高い類似性を有する配列のみを産生するその出力データを解析した。その後、各ＶＢＡＳＥフレームワークセグメントを、計算された高類似性ヒットの数に従って順位をつけた。最後に、最も好ましいＶＢＡＳＥクラスター（選択されたファミリー内で）については、クラスターを構成する最高順位の配列から代表を選択した。所望に応じて、選択されたクラスターの中で最も代表的なセグメント（即ち、クラスター内における他のすべてのセグメントから最短距離にあるセグメント；表８を参照）を用いるために、最も順位が高い配列を除外することもができる。
【０１４９】
【表８】
2008536473.tif 000009
【０１５０】
（実施例９）
ＣＤＲ分析を使用したユニバーサル抗体ライブラリーのためのＣＤＲ多様性を設計するための方法
この実施例では、ユニバーサル抗体ライブラリーのためのＣＤＲを設計するための方法を記載する。
【０１５１】
手短に言えば、選択されたフレームワーク（上記）を使用して、ＣＤＲの選択および設計が導かれる。即ち、ＣＤＲの長さおよび配列の両方を、完全な適合性および最適の多様性が得られるように、選択された各フレームワークファミリーに特異的に設計した。選択された生殖系列フレームワーク（ＶＨ−１、ＶＨ−３、ＶＫ−Ｉなど）の正準構造に従ってＣＤＲ１およびＣＤＲ２の長さを選択する。この基準から開始して、完全な分析を実行して、続いてＣＤＲ１およびＣＤＲ２を設計した。オリジナルＫａｂａｔデータセットを、フレームワーク１、２および３の完全性および重複性（９５％類似性閾値）についてのみフィルターした（表９参照）。フレームワーク−ＣＤＲ適合性には、特異性フィルターを使用しなかった。
【０１５２】
【表９】
2008536473.tif 000010
【０１５３】
各鎖クラス（ＶＨ、ＶＫ、ＶＬ）について、入力配列を、選択された生殖系列ファミリーに従って分類し、異なるデータセットにビニングした（表９参照）。ＢＬＡＳＴソフトウェア［ＢＬＳＴ］を使用し、上記のようにその結果を構文解析して、このような結果が得られた。
【０１５４】
選択された各サブファミリー内で、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の両方の長さ分布を正準構造の分類に従って分析する。この分析についてのさらなる詳細は、採用された設計戦略と一緒に以下の項で検討する。この結果の概要を表１０で表す。
【０１５５】
【表１０】
2008536473.tif 000011
【０１５６】
ＣＤＲ１およびＣＤＲ２長さを以下の通り決定した。ＶＨ生殖系列ファミリーは、６および８のＣＤＲ１長さを有し、後者は、使用しないＶＨ−２中にしか存在しない。ＣＤＲ２長さは１２から１５まで様々であり、１３が最も一般的であり、選択されたフレームワークに必要なものである。
【０１５７】
生殖系列ＶＨ−１は常に、６アミノ酸のＣＤＲ１および１３アミノ酸のＣＤＲ２を有する（正準構造１−３、１−２）。再編成されたデータセットでは、ＶＨ−１と特定された配列の約９７％がこれらの長さのＣＤＲを有していた。典型的なフレームワーク基準は、１−ｅ  ＣＤＲ１長さ：６、ＣＤＲ２長さ：１３であり、期待されたクラス適用範囲は＞９７％である。
【０１５８】
生殖系列ＶＨ−３は常に、６アミノ酸のＣＤＲ１ならびに１３および１５アミノ酸ＣＤＲ２を有する。選択されたフレームワークは、それぞれ６および１３のＣＤＲ長さを有し、したがって長さ１５はＣＤＲ２に使用されなかった。ここでデータから、再編成された配列の９９％で、ＣＤＲ１は期待通り長さ６を有し、８１％でＣＤＲ２は長さ１３を有することが示された。ＣＤＲ２の残りの使用空間は、長さ１５を有する正準構造１−Ｕおよび１−４によって包含される可能性が最も高い（特に、３〜１５には、使用されることが多いものがある）。典型的なフレームワーク基準は、３−０７、３−１１、３−２３、３−３０＊  ＣＤＲ１長さ：６、ＣＤＲ２長さ：１３であり、期待されたクラス適用範囲は約８１％である。ＶＫ生殖系列ファミリーのＣＤＲ１は、７から１３まで様々な多数のアミノ酸を有し、最も多いのは７および８アミノ酸である。ＣＤＲ２は常に１０アミノ酸を有する。
【０１５９】
生殖系列ＶＫ−Ｉは常に、７アミノ酸のＣＤＲ１および１０アミノ酸のＣＤＲ２を有する。再編成された配列における使用は、生殖系列情報との完全一致が示す。典型的なフレームワーク基準は、Ｉ−Ｌ１  ＣＤＲ１長さ：７、ＣＤＲ２長さ：１０であり、期待されたクラス適用範囲は９７％超である。
【０１６０】
生殖系列ＶＫ−ＩＩＩは、７および８アミノ酸のＣＤＲ１を有し、常に１０アミノ酸のＣＤＲ２を有する。ここでデータから、配列の５０％がＣＤＲ１長さ７、約４８％が長さ８を有することが示される。２つの異なる極めて一般的な正準構造が存在するので、このような結果が得られた。ＣＤＲ２長さは配列の９８％超で１０である。選択されたフレームワーク内で、ＣＤＲ１の長さは、期待された適用範囲がサブファミリーに関する使用空間の９８％であるように提供される。典型的なフレームワーク基準は、ＩＩＩ−Ａ２７、ＩＩＩ−Ｌ６  ＣＤＲ１長さ：７および８、ＣＤＲ２長さ：１０であり、期待されたクラス適用範囲は９８％超である。
【０１６１】
ＶＬ生殖系列ファミリーＣＤＲ１は、７から１０までの様々な多数のアミノ酸を有し、ここで、８は一般的でなく、したがって選択的に除外される。長さ７、９および１０はすべて、ファミリーにおいて非常に頻度が高い。
【０１６２】
生殖系列ＶＬ−１は、９および１０アミノ酸のＣＤＲ１および１０アミノ酸のＣＤＲ２を有する。再編成された配列に関するデータから、約７４％が長さ９のＣＤＲ１を有し、その約９９％が長さ１０のＣＤＲ２を有することが示される。ＣＤＲ１の長さ１０は、より十分に適合させるために除外され、典型的な選択されたフレームワークは１ｂ  ＣＤＲ１長さ：９、ＣＤＲ２長さ：１０であり、期待されたクラス適用範囲は約７５％であった。
【０１６３】
生殖系列ＶＢＡＳＥ：ＶＬ−２は、１０アミノ酸のＣＤＲ１およびＣＤＲ２を有する。典型的なフレームワーク基準は、２ａ２  ＣＤＲ１長さ：１０、ＣＤＲ２長さ：１０であり、期待されたクラス適用範囲は約９５％である。
【０１６４】
生殖系列ＶＬ−３は常に、９アミノ酸のＣＤＲ１および１０アミノ酸のＣＤＲ２を有する。このサブファミリーをＶＬで最も使用するので、このサブファミリーから選択された２つのフレームワークを選んで、より構造的な適用範囲が得られた。典型的なフレームワーク基準は、３ｒ，３１  ＣＤＲ１長さ：９、ＣＤＲ２長さ：１０であり、期待されたクラス適用範囲は約９９％である。
【０１６５】
【表１１】
2008536473.tif 000012
【０１６６】
１５の選択されたＣＤＲのそれぞれについて（表１１）、別々に頻度分析を実行して、選択されたフレームワークとの関連からアミノ酸の使用位置を決定する。主要な目的は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２内のそれぞれの中での各位置を２つの異なる範疇、即ち１つまたは２つの優勢なアミノ酸を示す固定位置と、初期構造多様性、つまり変異誘発の位置とに分類することであった。
【０１６７】
ＥＭＢＯＳＳ／ｐｒｏｐｈｅｃｙ［ＥＭＢ］を使用した簡単な頻度分析を、アミノ酸の使用位置を表す行列を作成して実行した。次いで、各位置の相対度数データを有するように出力行列を構文解析しフィルターした。パーサは、２つの閾値（低および高）に基づく非常に簡単なフィルターを提供する。各位置について、パーサは、累積度数が高閾値に達するまで、相対度数が低閾値を超えるアミノ酸だけを処理する。また、高閾値に達しない場合、パーサは相対度数が低閾値より低いアミノ酸を評価する。低閾値と高閾値の妥当な組合せは、位置分類に優れた精度を提供するので、１０と８０であった。パーサ出力を度数分布図として視覚化し、その結果を以下の図で示す。
【０１６８】
量的ＣＤＲ分類
１つまたは２つのアミノ酸が他方に対して明らかに優勢である場合、位置を固定として分類する。通常、パラメータ調整に優れたパーサは、こうした位置で、異常なアミノ酸をフィルターによって除外することが可能である。優勢な１つ（複数）のアミノ酸をＣＤＲ配列における野生型として使用する。２つのアミノ酸が優勢である場合、混合したコドンを合成して両方のアミノ酸が得られることを意味する「縮重」野生型を使用する。可変性の高い位置（ＷＴＭ位置）を特定するための選ばれたパラメータは非常に精度が高い。こうした位置で、明らかに優勢のアミノ酸は存在しないが、多くは中頻度から低頻度で異なる。ここで、多様性は、最も頻度の高いアミノ酸が野生型である変異誘発、例えば、ＬＴＭまたはＷＴＭを使用して表すことができる。
【０１６９】
下記の図で、ユニバーサルライブラリーのために開発されたＣＤＲ１およびＣＤＲ２に関するすべての頻度分布図およびアミノ酸配列を報告する。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の名称を以下の通り構築する：ＣＨＡＩＮＴＹＰＥ−ＧＥＲＭＬＩＮＥＦＡＭＩＬＹ＿ＣＤＲＴＹＰＥ−ＣＤＲＬＥＮＧＴＨ。例えば、ＶＨ−１＿ＣＤＲ１−６という名称は、重鎖、ファミリーＶＨ−１、６アミノ酸を有するＣＤＲ１を指す。ＣＤＲ３の名称は類似しており、生殖系列ファミリー分類を含まない。
【０１７０】
ＣＤＲの設計
重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲ３は、長さおよび配列がどちらも最も可変性の高い領域であり、抗体結合部位の構造多様性の大部分が得られる。したがって、完全なデータセットおよびタンパク質特異的鎖の両方に関する長さ分析を各鎖型について実行した。２つのデータセットの長さ分布は有意差が認められ、タンパク質抗原が、わずかに長いＣＤＲ３を好むことが示された。ＶＨ  ＣＤＲ３は非常に広い分布を有し、したがって９から１８の長さ（使用したものの約７５％）を選択した（図１０参照）。Ｖκ  ＣＤＲ３は、非常に狭い分布を有し、使用されたほとんどの長さは８および９である（図２０参照）。Ｖλ  ＣＤＲ３は、わずかに広い分布を有し、この場合、長さ８、９、１０および１１（図２４参照）をライブラリー用に選択した。
【０１７１】
選択された各長さについて、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の設計で記載したものに類似する頻度分析を実行した。すべての長さについて、この分析から、ＣＤＲの中間の位置、およびフレームワーク領域との境界に隣接する少数の保存された位置で多様性が高いことが示された。
【０１７２】
ＣＤＲ１およびＣＤＲ２に関して、ＣＤＲ３の多様性領域を、変異誘発、例えばＷＴＭの標的としての最も可変性の高い位置として選択した。野生型として選んだ残基は、それぞれの位置で最も頻度の高いアミノ酸であった。幾つかのＷＴＭ位置で、野生型アミノ酸を選び、通常、Ｇｌｙの存在を望ましいものであると決定した。ＷＴＭ戦略を修正方法で設計した。即ち、標的および野生型アミノ酸が得られる、塩基の「最小距離」の組合せを選ぶ代わりに、混合コドンを、標的、野生型、およびＧｌｙアミノ酸が得られるように設計した（即ち、Ｇｌｙは必要とされる副産物である）。下記の図は、ユニバーサル抗体ライブラリーのために選ばれたＣＤＲのすべての度数分布図および配列を示す。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の名称は以下の通り構築した：ＣＨＡＩＮＴＹＰＥ−ＧＥＲＭＬＩＮＥＦＡＭＩＬＹ＿ＣＤＲＴＹＰＥ−ＣＤＲＩＥＮＧＴＨ。例えば、ＶＨ−１＿ＣＤＲ１−６という名称は、重鎖、ファミリーＶＨ−１のＣＤＲ１の６残基位置を表す。ＣＤＲ３の名称は類似しているが、生殖系列ファミリー分類を含まない。
【０１７３】
ＣＤＲ３のさらなる設計の条件は以下の通りである。グリシンは、ＣＤＲ３の機能的ループ構造にとって必須である。グリシンは、ＣＤＲ３のＶＨ  ＣＤＲ３ループ全体のおよそ１０〜２０％で認められる。したがって、ＣＤＲ３領域を、多数のグリシンをループ全体に収容するように設計した。したがって、野生型アミノ酸に加えて、グリシンは、多数のＶＨ  ＣＤＲ３位置で必要とされる副産物であった。位置９５では、Ａｓｐが、タンパク質およびペプチド対する抗体に関する度数分布表で非常に多くみられ、したがって、Ａｓｐを野生型アミノ酸として使用し、グリシンをＷＴＭの必要とされる副産物として使用した（Ｄ／Ｇ）。位置９６でも同様に、Ａｒｇが非常に頻度が高く、したがって、Ａｒｇを野生型アミノ酸として使用し、Ｇｌｙを必要とされる副産物として使用した（Ｒ／Ｇ）。位置９７〜９９では、セリンがＣＤＲループでかなり多くみられるアミノ酸であり、したがって許容性が高いので、Ｓｅｒを使用し、Ｇｌｙをベースとして使用した（Ｓ／Ｇ）。位置１０１ではＡｓｐを使用し（一定に維持した）、ＡｓｐのＮ末端側に直結している位置（Ｐｈｅ（Ｄ−１））も同様に維持した。
【０１７４】
ＶＨ  ＣＤＲ３長さ１０以上では、ＡｓｐのＮ末端側に２残基の位置（Ｄ−２）（例えば、ＶＨ  ＣＤＲ３−１０の位置１００）で、Ｔｙｒをベースアミノ酸として使用した。Ｔｙｒも抗体のＣＤＲループで許容性が高い。ＡｓｐのＮ末端側にあるＴｙｒの優勢は、ＣＤＲ３ループの長さと共に増大する。したがって、表１２に示す通り、Ｔｙｒをベースアミノ酸として更に追加した。表１２に示す通り、位置９９でＳｅｒを野生型として使用しＧｌｙを必要とされる副産物として使用するまで、残りは、Ａｓｐ１０１のＮ末端側に位置する。ウォークスルー変異誘発を実行する場合、グリシンがループ構造に存在し（通常１０〜２５％）、許容性が高いアミノ酸がループに存在するので、各ＣＤＲ３ループを構築して、機能性抗体を作製することができる。ウォークスルーアミノ酸および機能性副産物を介して、さらなる機能性結合相互作用を得た。
【０１７５】
本発明のユニバーサル抗体ライブラリーに使用するために特定されたＣＤＲ配列の概要を以下の表１２に記載する。ＣＤＲの名称を標準化する。即ち、名称の第１フィールドは生殖系列ファミリーであり、第２フィールドはＣＤＲ型であり、第３フィールドはＣＤＲの長さである（例えば、ＶＨ１＿ＣＤＲ１−６は、長さ６を有するＶＨ１生殖系列ファミリーのＣＤＲ１である）。単一文字の位置は、固定位置であり、２文字の位置は、２つの標的アミノ酸のみを有するように合成を混合物で実施した組合せの位置（例えば、Ｔ−Ｓ）であり、最初の文字が「Ｘ」である位置の２文字はＷＴＭ位置である。Ｘの次のアミノ酸は野生型である（例えば、Ｘ−Ｖ）。最初の文字が「Ｘ」である３文字の位置は、「副産物最適化」ＷＴＭ位置である。「Ｘ」の次のアミノ酸文字は野生型である。最後のアミノ酸（「／」の後の文字）は必要とされる副産物である。
【０１７６】
【表１２−１】
2008536473.tif 000013
【０１７７】
【表１２−２】
2008536473.tif 000014
【０１７８】
【表１２−３】
2008536473.tif 000015
【０１７９】
ＣＤＲ３の追加の設計では、幾つかのＣＤＲ３位置内に、特にＣ末端領域により大きな多様性を導入している。このより大きな多様性は、Ｋａｂａｔデータベースに認められる多様性をより密接に反映している。これは、ＣＤＲ設計２および３に反映されている（以下の表参照）。
【０１８０】
ＣＤＲ３の代替の設計では、チロシンをＣＤＲ３ループ全体により広範に導入したチロシンリッチ設計を導入する。ＣＤＲ３ループ全体に広範にチロシンがみられるが、グリシンコドンをチロシンコドンと混合すると、システインコドンならびにアンバー終止コドンが生じる。アンバー終止コドンおよび広範なシステインの導入は、非生産的な抗体配列をもたらすはずである。したがって、Ｋａｂａｔ度数分布表ではシステインが認められる重要な位置にグリシンを副産物として含める。システインは、ジスルフィド架橋を形成して長いＣＤＲ３ループを安定化し、したがってこうした重要な位置にシステインを含めることはＣＤＲ３の機能性にとって有用であり得る。ＣＤＲ３のサイズの増大は内部の位置の複雑性の増大をも含み、これは設計の原理に導入される。
【０１８１】
理想的には、チロシンおよびグリシンをあらゆる位置に導入することができる。アンバー終止コドンなど望ましくない副産物を産生することなく、こうした残基をあらゆる位置に導入するために、代替のオリゴヌクレオチド合成操作を利用するが、ここで、コドンのプールを別々に合成し、次いで組み合わせ、次回の合成のために分割する（Ｅ  Ａ  Ｐｅｔｅｒｓ，Ｐ  Ｊ  Ｓｃｈａｔｚ，Ｓ  Ｓ  ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷ  Ｊ  Ｄｏｗｅｒ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９４  Ｊｕｌｙ；１７６（１４）：４２９６〜４３０５）。このプロセスでは２つのプールを使用し、第１のプールは、ＹおよびＳをコードしているコドンＴＭＣを利用し、第２のプールは、Ｈ、Ｓ、Ｒ、ＮおよびＤをコードしているコドンＶＲＣを利用する。したがって、こうしたプールは、チロシンによる疎水性への寄与、および第２のプールによる多数の極性寄与を可能にする。以下で緑で示すすべての多様性位置は、こうしたコドンの分割プールを使用して生成する。
【０１８２】
ＣＤＲのこれらすべての多数の設計により、ユニバーサルライブラリーの多数のサブライブラリーが得られる。各設計を多数の抗原に対する全体的な適合性および性能について実験によって試験する。
【０１８３】
【表１３】
2008536473.tif 000016
【０１８４】
【表１４】
2008536473.tif 000017
【０１８５】
（実施例１０）
ＷＴＭおよび拡張ＷＴＭを使用してＣＤＲ多様性を導入するためのオリゴヌクレオチドの設計
表１２に記載の配列を使用してオリゴ構築を実行することができる。表１２で影付きの、Ｘで表した配列に示す適切な位置でウォークスルーおよび拡張ウォークスルー（ＣＤＲＨ３のための）を実行した。Ｘはウォークスルーアミノ酸を指し、―（ダッシュ）の次の１つ（複数）のアミノ酸はベースアミノ酸を指し、必要とされる任意の副産物は／（スラッシュ）の後に示す。記載した多数のアミノ酸を有する白の位置は、これらのアミノ酸と最小数の副産物との同じ割合の混合物を示す。この混合物は、可変性プロファイルに存在するこうしたアミノ酸の優勢の混合物を反映する。
【０１８６】
例えば、ＶＨ１＿ＣＤＲ１−６は以下の通り記載する。
【０１８７】
【表１５】
2008536473.tif 000018
【０１８８】
ウォークスルーアミノ酸としてアラニンを選ぶ場合、上記の設計のために以下のコドンを使用する。
【０１８９】
【表１６】
2008536473.tif 000019
【０１９０】
位置３０（Ｃｈｏｔｈｉａ付番法）では、ＴＣＣはセリンをコードし、ＡＣＣはスレオニンをコードし、したがって最も効率的な混合物はＷＣＣである。
【０１９１】
位置３１では、ＴＣＣはＳをコードする。
【０１９２】
位置３２では、ＴＡＣはＹをコードする。
【０１９３】
位置３３では、ウォークスルーアミノ酸はベースアミノ酸と同一であり、したがってＡをコードするベースアミノ酸コドンＧＣＣを使用する。
【０１９４】
位置３４では、ＡＴＳはＩおよびＭをコードし、ここで、ＡＴＣはＩをコードし、ＡＴＧはＭをコードする。
【０１９５】
位置３５では、標準的なウォークスルー操作を使用する。ＴＣＣはセリンであり、ＧＣＣはアラニンと一致する。したがって、ＧおよびＴはどちらも第１の位置で必要とされ、Ｃは第２の位置で必要とされ、Ｃは第３の位置で必要とされる。したがって、ＡおよびＳをコードするＫＣＣを使用する。
【０１９６】
実際には、オリゴヌクレオチドを抗体の可変領域と相補的である隣接領域と共に合成する。したがって、以下の配列を使用する。
【０１９７】
【表１７】
2008536473.tif 000020
【０１９８】
２０のすべてのアミノ酸およびアンバーコドンを利用した非天然アミノ酸を、青／緑の影付きで示した適切な位置で潜在的にウォークスルーすることができる。例証するために、９つのウォークスルーアミノ酸を以下に示す。
【０１９９】
【表１８】
2008536473.tif 000021
【０２００】
名称を理解するために、ＶＨ１はフレームワークであり、ＶＨ１＿１はＶＨ１  ＣＤＲ１を指し、ＶＨ１＿１＿６はＣＤＲサイズ６を指し、Ｗはウォークスルーを指し、最後の文字はウォークスルーアミノ酸である。上記の配列は、Ａ（アラニン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｓ（セリン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｐ（プロリン）、Ｒ（アルギニン）、Ｙ（チロシン）、Ｈ（ヒスチジン）、およびＮ（アスパラギン）を用いたウォークスルーを例証する。
【０２０１】
表１２を使用したオリゴ構築は、拡張ウォークスルーを使用し、以下の通りドーピングして実行した。
【０２０２】
ウォークスルーおよび拡張ウォークスルー（ＣＤＲＨ３のための）は、表１２で青または緑の影付きの、Ｘで表した配列に示す適切な位置で実行した。Ｘはウォークスルーアミノ酸を指し、―（ダッシュ）の次の１つ（複数）のアミノ酸はベースアミノ酸を指し、必要とされる任意の副産物は／（スラッシュ）の後に示す。記載した多数のアミノ酸を有する白の位置は、これらのアミノ酸と最小数の副産物との同じ割合の混合物を示す。この混合物は、可変性プロファイルに存在するこうしたアミノ酸の優勢の混合物を反映する。
【０２０３】
【表１９】
2008536473.tif 000022
【０２０４】
必要とされる副産物を用いた拡張ウォークスルー変異誘発の使用を例証するためにこの第２実施例を行う。表１２に示すＶＨ−ＣＤＲ３サイズ１０の設計を上記に示す。アラニンウォークスルーのために合成されたオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
【０２０５】
位置９５では、ベースアミノ酸はアスパラギン酸ＧＡＣである。アラニンはＧＣＣであり、グリシンは必要とされる副産物ＧＧＣである。したがって、Ｇは第１の位置にあり、Ａ、ＧおよびＣは第２の位置にあり、Ｃは第３の位置にある。
【０２０６】
位置９６では、ベースアミノ酸はアルギニンＣＧＣである。アラニンはＧＣＣであり、グリシンは必要とされる副産物ＧＧＣである。したがって、この位置の第１ヌクレオチドはＣまたはＧであり、第２ヌクレオチドはＧまたはＣであり、第３ヌクレオチドはＣを含む。
【０２０７】
位置９７では、ベースアミノ酸はセリンであり、ＴＣＣまたはＡＧＣとしてコードされ得る。アラニンをＧＣＣでウォークスルーし、グリシンはＧＧＣとしてコードされる。ＧＧＣと組み合わせたＴＣＣはシステイン副産物（ＴＧＣ）を産生するので、セリンについてはＡＧＣが選ばれるが、これは、望ましくないジスルフィド結合形成が起こり得るのでＣＤＲでは通常所望のものではない。したがって、ＡＧＣコドンが選ばれる。したがって、第１のヌクレオチド位置はＡまたはＧを含み、第２の位置はＣまたはＧを含み、第３のコード位置はＣを含む。
【０２０８】
位置９８および９９は、位置９７と同じベースアミノ酸および必要とされる副産物アミノ酸を利用するので、位置９７と同一である。
【０２０９】
位置１００は、チロシンをベースアミノ酸ＴＡＣとして利用し、アラニンはＧＣＣである。したがって、第１のコード位置はＴおよびＧの混合物を含み、第２のコード位置はＡおよびＣを含み、第３のコード位置はＣを含む。
【０２１０】
これらの結果を以下に要約する。
【０２１１】
【表２０】
2008536473.tif 000023
【０２１２】
好ましい使用では、抗体配列中への導入を容易にするために、隣接領域を５’および３’領域に付加する。更に、グリシンはＣＤＲＨ３のアミノ酸組成物の１５〜２５％を示すので、グリシンの導入率がこれに近似するようにドーピングを実行することができる。
【０２１３】
一実施例では、位置９５でのグリシンの使用は、第２のコード位置で利用したＧの百分率によって限定される。したがって、グリシンの導入２０％に達するように、混合物に対するＧの百分率は２０％であった。同様に、位置９６〜９９でのグリシンの導入率を、グリシンの導入率が約２５％に達するように調整したが、副産物の導入率は低下した。
【０２１４】
【表２１】
2008536473.tif 000024
【０２１５】
２０のすべてのアミノ酸およびアンバーコドンを利用した非天然アミノ酸を、青／緑の影付きで示した適切な位置で潜在的にウォークスルーすることができる。例証するために、サイズ１０のＶＩＩ  ＣＤＲ３に関する９つのウォークスルーアミノ酸を以下に示す。
【０２１６】
【表２２】
2008536473.tif 000025
【０２１７】
ＣＤＲＨ３の設計２、３および４を使用したオリゴ構築は、拡張ウォークスルーを利用し、以下の通りドーピングして実行した。
【０２１８】
ウォークスルーおよび拡張ウォークスルー（ＣＤＲＨ３のための）は、表１２で青または緑の影付きの、Ｘで表した配列に示す適切な位置で実行した。Ｘはウォークスルーアミノ酸を指し、―（ダッシュ）の次の１つ（複数）のアミノ酸はベースアミノ酸を指し、必要とされる任意の副産物は／（スラッシュ）の後に示す。
【０２１９】
【表２３】
2008536473.tif 000026
【０２２０】
ＣＤＲＨ３のさらなる設計の場合でのウォークスルー操作を更に例証するために、この第３実施例を行う。
【０２２１】
２０のすべてのアミノ酸およびアンバーコドンを利用した非天然アミノ酸を、緑の影付きで示した適切な位置で潜在的にウォークスルーすることができる。この実施例では、設計２を使用してヒスチジンをウォークスルーし、設計３を使用してプロリンをウォークスルーし、設計４を使用してセリンをウォークスルーする。この配列表は、９〜１８の設計長さでウォークスルーされたこれらのアミノ酸を有する。長さ１１の分析をここで示す。
【０２２２】
設計２では、ヒスチジンが、例示的なウォークスルー／拡張ウォークスルーアミノ酸である。位置９５では、ベースアミノ酸はセリンであり、グリシンを副産物として添加した場合のシステインの形成を回避するために、ＴＣＣよりもＡＧＣを選ぶ。グリシンは必要とされる副産物であり、ＧＧＣである。ヒスチジンはＣＡＣとしてコードされる。したがって、Ａ、ＧおよびＣは第１の位置にあり、ＧおよびＡは第２の位置にあり、Ｃは第３の位置にある。この混合物の濃縮物を、約１５〜２５％グリシンおよび好ましいベースアミノ酸セリンを産生するようにドーピングした。
【０２２３】
位置９６、９７、９８および９９では位置９５と同じ設計を利用する。
【０２２４】
位置１００では、ベースアミノ酸ＴＡＣとしてチロシンを利用し、アラニンＧＣＣおよびアスパラギンＡＡＣは副産物として必要とされる。ヒスチジン（ＣＡＣ）は拡張ウォークスルーアミノ酸である。したがって、第１の位置はＴ、Ｇ、ＡおよびＣを含み、第２の位置はＡおよびＣを含み、最後の位置はＣを含む。ベースアミノ酸チロシンが得られるようにドーピングを実行する。
【０２２５】
位置１００ａでは、位置１００と同じ設計原理を利用する。
【０２２６】
隣接領域をプライマーに付加した後、ヒスチジンをウォークスルーするＣＤＲＨ３長さ１１設計２のためのオリゴヌクレオチドの設計を以下および配列表で示す。
【０２２７】
【表２４】
2008536473.tif 000027
【０２２８】
【表２５】
2008536473.tif 000028
【０２２９】
設計３では、プロリンをウォークスルー／拡張ウォークスルーアミノ酸としてこの実施例に使用する。
【０２３０】
位置９５では、Ａｓｐ（ＧＡＣ）がベースアミノ酸であり、Ｇｌｙ（ＧＧＣ）が必要とされる副産物である。プロリン（ＣＣＣ）のウォークスルーにより、第１の位置でＧおよびＣ、第２の位置でＡ、ＧおよびＣ、第３の位置でＣがもたらされる。前記実施例の通り、グリシンを１５〜２５％の頻度に達するようにドーピングする。
【０２３１】
位置９６では、位置９５と同じ設計を利用する。
【０２３２】
位置９７では、ウォークスルーアミノ酸は第３の位置でＣまたはＴを必要としないので、プロリンのウォークスルーのためにセリンＴＣＧを利用する。ＣまたはＴを必要とするウォークスルーアミノ酸のためには、システイン副産物を回避するために、ＡＧＣをセリンコドンに利用することができる。ＡＧＧとしてコードされるもの（アルギニン）よりもトリプトファンＴＧＧのほうが有益な副産物であるので、ＴＣＧはＡＧＣよりも好ましい。アルギニンは、望ましいが、ＣＧＣは最終混合物ですでにコードされており、したがってアルギニンが重複する。
【０２３３】
したがって、ＴＣＧをセリンに使用し、ＧＧＧを、必要とされるグリシン副産物に使用され、ＣＣＧをプロリンに使用する。したがって、Ｔ、ＧおよびＣを第１の位置で使用し、ＧおよびＣを第２の位置で使用し、Ｇを最後の位置で使用する。
【０２３４】
位置９８および９９では、位置９７と同じ設計を利用する。
【０２３５】
位置１００および１００ａでは、ベースアミノ酸（ＴＡＣ）であるチロシン、必要とされる副産物Ａｌａ（ＧＣＣ）、および拡張ウォークスルーアミノ酸Ｐｒｏ（ＣＣＣ）を使用する同じ設計を利用する。したがって、第１の位置はＴ、ＣおよびＧを含み、第２の位置はＡおよびＣを含み、第３の位置はＣを含む。ベースアミノ酸チロシンが得られるようにドーピングを実行する。
【０２３６】
付加された隣接領域と共に、プロリンのウォークスルーによる設計３のためのオリゴヌクレオチドを以下に示す。
【０２３７】
【表２６】
2008536473.tif 000029
【０２３８】
【表２７】
2008536473.tif 000030
【０２３９】
設計４では、セリンをウォークスルー／拡張ウォークスルーアミノ酸として使用する。
【０２４０】
位置９５および９６では、グリシン（ＧＧＣ）がベースアミノ酸であり、ヒスチジン（ＣＡＣ）が、必要とされる副産物であり、セリン（ＡＧＣ）はウォークスルーコドンである。したがって、Ａ、ＧおよびＣを第１の位置に使用し、Ｇを第２の位置に使用し、Ｃを第３の位置に使用する。
【０２４１】
位置９７、９８、１００および１００ａでは、チロシンＴＡＣがベースアミノ酸であり、ＴＣＣはウォークスルーコドンであり、第１の位置でＴ、第２の位置でＡおよびＣ、最後の位置でＣが得られる。
【０２４２】
位置９９では、チロシン（ＴＡＣ）がベースアミノ酸であり、ヒスチジン（ＣＡＣ）、アスパラギン酸（ＧＡＣ）およびアスパラギン（ＡＡＣ）が、必要とされる副産物である。ＴＣＣをセリンコドンに利用する。したがって、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴを第１の位置で使用し、ＡおよびＣを第２の位置で使用し、Ｃを第３の位置で使用する。
【０２４３】
ベースアミノ酸が得られるようにドーピングを実行し、以下のオリゴヌクレオチド混合物が得られるように隣接領域を付加する。
【０２４４】
【表２８】
2008536473.tif 000031
【０２４５】
（実施例１１）
分割プール設計変異誘発／オリゴヌクレオチド合成
興味深い抗原結合領域／抗原接触を特定するために、チロシンおよびグリシンを所望のあらゆる残基位置に導入することができる。アンバー終止コドンなど望ましくない副産物を産生することなく、こうした残基をあらゆる位置に導入するために、代替のオリゴヌクレオチド合成操作を利用することができるが、ここで、コドンのプールを別々に合成し、次いで組み合わせ、次回の合成のために分割する（Ｅ  Ａ  Ｐｅｔｅｒｓ，Ｐ  Ｊ  Ｓｃｈａｔｚ，Ｓ  Ｓ  ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷ  Ｊ  Ｄｏｗｅｒ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４  Ｊｕｌｙ；１７６（１４）：４２９６〜４３０５）。このプロセスでは２つのプールを使用し、第１のプールは、ＹおよびＳをコードしているコドンＴＭＣを利用し、第２のプールは、Ｈ、Ｓ、Ｒ、ＮおよびＤをコードしているコドンＶＲＣを利用する。したがって、こうしたプールは、チロシンによる疎水性への寄与、および第２のプールによる多数の極性寄与を可能にする。この分割プール設計では、ＣＤＲＨ３多様性表（図１２）においてＸで示すすべての多様性位置はこうしたコドンの分割プールを含み得る。この実施例は、以下で示すＶＨ３  ＣＤＲ長さ９に利用したコドンセットを示す。
【０２４６】
【表２９】
2008536473.tif 000032
【０２４７】
第１のプールは、ＹおよびＳを５０：５０比でコードしている。しかし、プールした後グリシンの導入が１５％にまで増大するように第２のプールをドーピングする。より均衡のとれたアミノ酸の比が得られるように、チロシンプールはヒスチジンプールのサイズの１／３でコードされる。
【０２４８】
アミノ酸の限定された混合物を産生するために、４つのオリゴヌクレオチドカラムを利用する。先ず、上記で示したＣＤＲＨ３の隣接領域および固定部分によって画定した通り、４つすべてのカラムにオリゴヌクレオチドの固定３’部分を合成する。上記の実施例配列の位置９９では、第１のカラムはコドンＴＭＣを合成する（３’−５’ＤＮＡ合成におけるＣＭＴ）。残りの３つのカラムは、上記で概説したヌクレオチド比を利用してコドンＶＲＣを合成する（３’−５’ＤＮＡ合成におけるＣＲＶ）。３ヌクレオチドを結合させた後、４つすべてのカラムを開き、アセトニトリルで洗浄することにより合成支持体を除去し、樹脂をプールする。混合後、この樹脂を等しい分量で４つのカラムに入れる。この時点で、次の位置、位置９８を合成する。１つのカラムで上記の通りコドンＴＭＣを合成し、３つのカラムでＶＲＣ混合物を合成する。位置９９のために、この樹脂をプールし、混合し、記載の通り再配分する。このプロセスを位置９７、９６および９５について反復する。この時点で、５’固定および隣接領域を４つすべてのカラムに付加し、４つすべてのカラムの生じたオリゴヌクレオチド混合物を一緒にプールし、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発などの変異誘発法を利用して抗体鋳型中に導入することができる。
【０２４９】
均等物
当分野の技術者であれば、通常の実験を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態との多くの均等物を認識し、または確認できるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】コンピュータ援用データベースバイオマイニングを用いて、本発明のユニバーサル抗体ライブラリーの構築を実施するための模式図である。
【図２】ユニバーサル抗体ライブラリーの合成に使用するためのＣＤＲおよびフレームワーク構成要素を特定および選択するステップの例（およびデータベースの様々な統計）を示す図である。
【図３】出現頻度分析、即ち、所与の抗原クラスに対するヒト抗体免疫応答で使用されている最も使用頻度の高い生殖細胞系フレームワークの特定における閾値頻度の例を示す図である。
【図４】再編成された抗体に寄与する生殖系列の相対頻度を、各ＶＨ生殖系列ファミリーについて表にしたものである。
【図５】所与の抗原クラス（例えばタンパク質系抗原）に対する応答で使用され、合成ＣＤＲ領域のアクセプターとして機能する、７つの高頻度重鎖フレームワーク配列およびそれらの配置を示す図である。ＣＤＲは、接触画定（ＭａｃＣａｌｌｕｍら）によるものである。ＶＨ１、ＶＨ３、およびＶＨ４由来の生殖系列Ｖセグメントを列挙して、図示する。
【図６】例示的合成重鎖ＣＤＲ１の配列多様性を、ＣＤＲ可変性プロファイル（頻度分布）の形態で示す。ＣＤＲ１長さは、ＫａｂａｔのＣＤＲ画定に従って５である。
【図７】生成した、ＣＤＲ可変性プロファイル形態にある例示的合成重鎖ＣＤＲ１の配列多様性と、残基位置および潜在的多様性を示すマトリックスとを示す図である。ＣＤＲ１長さは、ＣＤＲの接触画定に従って６である。
【図８】例示的合成重鎖ＣＤＲ２の配列多様性を、ＣＤＲ可変性プロファイル（頻度分布）の形態で示す。ＣＤＲ２長さは、ＫａｂａｔのＣＤＲ画定に従って１７である。
【図９】生成した、ＣＤＲ可変性プロファイル形態にある例示的合成重鎖ＶＨ１およびＶＨ３のＣＤＲ２の配列多様性と、残基位置および潜在的多様性を示すマトリックスとを示す図である。ＣＤＲ２長さは、ＣＤＲの接触画定に従って１３である。
【図１０】利用可能なＣＤＲ空間のおよそ７５％を占める、サイズが９から１８アミノ酸のＶＨ  ＣＤＲ３の鎖長分布を示す図である。各鎖長に関して別々の分析を行った（図１２を参照）。ＶＨ  ＣＤＲ３のサイズは、ＣＤＲの接触画定に従った。
【図１１】例示的合成重鎖ＣＤＲ３の配列多様性を、ＣＤＲ可変性プロファイル（頻度分布）の形態で示す。ＣＤＲ３長さは、ＫａｂａｔのＣＤＲ画定に従って１３である。
【図１２】生成した、ＣＤＲ可変性プロファイル形態にある例示的合成重鎖ＣＤＲ３の配列多様性と、残基位置および潜在的多様性を示すマトリックスとを示す図である。ＣＤＲ３長さは、ＣＤＲの接触画定に従って９〜１８である。
【図１３】各重鎖ＣＤＲの配列多様性および混合重鎖ライブラリーの多様性を示す図である。可変的な位置の番号およびＣＤＲのサイズはＫａｂａｔの画定に従った。
【図１４】２本鎖核酸に変換できる、非縮重および縮重重複オリゴヌクレオチドを併用し、単一重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ−ＰＣＲ）を用いた重鎖ライブラリーの構築を示す図である。
【図１５】ユニバーサル抗体ライブラリーの重鎖ライブラリーと、κおよび／またはλ軽鎖ライブラリーとの、多様性の追加を目的とした混合を示す図である。
【図１６】所与の抗原クラス（例えばタンパク質）に対する応答で使用され、合成ＣＤＲ領域のアクセプターとして機能する、７つの高頻度軽鎖フレームワーク（即ち、３つのκおよび４つのλ軽鎖フレームワーク）配列およびそれらの配置を示す図である。ＣＤＲ領域は、接触画定に従って特定される。ＶκＩ−Ｌ１、ＶκＩＩＩ−Ａ２７、ＶκＩＩＩ−Ｌ６、Ｖλ１−１ｂ、Ｖλ２−２ａ２、Ｖλ３−３１、およびＶλ３−３ｒ由来の生殖系列Ｖセグメントを列挙して、図示する。
【図１７】生成した、ＣＤＲ可変性プロファイル（頻度分布）形態にある例示的合成ＶκＩおよびＶκＩＩＩ軽鎖ＣＤＲ１の配列多様性と、置換マトリックスとを示す図である。ＣＤＲ１の長さは、ＣＤＲの接触画定に従って７および８である。
【図１８】本発明の例示的１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１９】生成した、可変性プロファイル（頻度分布）形態にある例示的合成ＶκＩおよびＶκＩＩＩ軽鎖ＣＤＲ２の配列多様性と、残基位置および潜在的多様性を示すマトリックスとを示す図である。ＣＤＲ２長さは、ＣＤＲの接触画定に従って１０である。
【図２０】利用可能なＣＤＲ空間のおよそ８０％を占める、サイズが８および９アミノ酸のＶκＣＤＲ３の鎖長分布を示す図である。各鎖長に関して別々の分析を行った（図２１を参照）。ＶＨ  ＣＤＲ３のサイズは、ＣＤＲの接触画定に従った。
【図２１】生成した、可変性プロファイル（頻度分布）形態にある例示的合成軽鎖（Ｖκ）ＣＤＲ３の配列多様性と、残基位置および潜在的多様性を示すマトリックスとを示す図である。ＶκＣＤＲ３の長さは、ＣＤＲの接触画定に従って８〜９である。
【図２２】生成した、可変性プロファイル（頻度分布）形態にある例示的合成軽鎖（Ｖλ）ＣＤＲ１の配列多様性と、残基位置および潜在的多様性を示すマトリックスとを示す図である。ＶλＣＤＲ１の長さは、ＣＤＲの接触画定に従って９、１０、および７である。
【図２３】生成した、可変性プロファイル（頻度分布）形態にある、例示的合成重鎖Ｖλ１、Ｖλ２、およびＶλ３軽鎖ＣＤＲ２の配列多様性と、残基位置および潜在的多様性を示すマトリックスとを示す図である。Ｖλ１、Ｖλ２、およびＶλ３ＣＤＲ２の長さは、ＣＤＲの接触画定に従って１０である。
【図２４】利用可能なＣＤＲ空間のおよそ９０％を占める、サイズが８から１１アミノ酸のＶλＣＤＲ３の鎖長分布を示す図である。各鎖長に関して別々の分析を行った（図２５を参照）。ＶＨ  ＣＤＲ３のサイズは、ＣＤＲの接触画定に従った。
【図２５】生成した、可変性プロファイル（頻度分布）形態にある例示的合成軽鎖ＶλＣＤＲ３の配列多様性と、残基位置および潜在的多様性を示すマトリックスとを示す図である。ＶλＣＤＲ３の長さは、ＣＤＲの接触画定に従って８、９、１０、および１１である。
【図２６】Ｋｕｎｋｅｌ法変異誘発を用いた発現鋳型へのＣＤＲ多様性の導入を示す図である。
【図２７】各軽鎖ＣＤＲの配列多様性および混合軽鎖ライブラリーの多様性を示す図である。可変的な位置の番号およびＣＤＲのサイズはＫａｂａｔの画定に従った。
【図２８】２本鎖核酸に変換できる、非縮重および縮重重複オリゴヌクレオチドを併用し、単一重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ−ＰＣＲ）を用いた軽鎖ライブラリーの構築を示す図である。
【図２９】試験抗体の親和性成熟（左パネル）と、その結果得られた多様性（底部パネル）と、代表的な数クローンの結合の改善（右パネル）とを示す図である。
【図３０】ＶＨ鎖（Ａ）およびＶＬ鎖（Ｂ）に関する３つのＣＤＲ画定、即ちＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔら）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａら）、および接触要件（ＭａｃＣａｌｌｕｍら）の比較を示す図である。ＣＤＲセグメント上の小三角形は、挿入が起こる位置を示す。２つのグラフの下に、各ＣＤＲのアミノ酸数（即ちＣＤＲの長さ）を示す。
【図３１】ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３の形態で解析および保存されたＶＢＡＳＥセグメントの試料を示す図である。ＣＤＲの位置は接触画定（ＭａｃＣａｌｌｕｍら）によるものであり、付番方式はＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａら）によるものである。これらのデータセットから、各ＦＲまたはＣＤＲの個々のデータを抽出することができる。
【図３２】ＦＲ１２３としてＦＡＳＴＡフォーマットで保存された、ＶＢＡＳＥのＶＨ生殖系列配列を示す図である。フレームワークの長さは、ＣＤＲの接触画定を指す。
【図３３】ＦＲ１２３フォーマットのＶＢＡＳＥ  ＶＨセグメントから得た階層的系統樹である。ｐ−距離（ミスマッチの割合）を用いて計算された距離マトリックスと共にＵＰＧＭＡクラスタリングアルゴリズムを用いた。
【図３４】ＦＲ１２３フォーマットのＶＢＡＳＥ  Ｖκセグメントから得た階層的系統樹である。ｐ−距離（ミスマッチの割合）を用いて計算された距離マトリックスと共にＵＰＧＭＡクラスタリングアルゴリズムを用いた。
【図３５】ＦＲ１２３フォーマットのＶＢＡＳＥ  Ｖλセグメントから得た階層的系統樹である。ｐ−距離（ミスマッチの割合）を用いて計算された距離マトリックスと共にＵＰＧＭＡクラスタリングアルゴリズムを用いた。
【図３６】階層的系統木（ＵＰＧＭＡ）として可視化した、既知の抗タンパク質抗体に関するＫａｂａｔ  ＶＨ入力データセット（ＦＲ１２３フォーマット）を示す図である。
【図３７】階層的系統木（ＵＰＧＭＡ）として可視化した、既知の抗タンパク質抗体に関するＫａｂａｔ  Ｖκ入力データセット（ＦＲ１２３フォーマット）を示す図である。
【図３８】階層的系統木（ＵＰＧＭＡ）として可視化した、既知の抗タンパク質抗体に関するＫａｂａｔ  Ｖλ入力データセット（ＦＲ１２３フォーマット）を示す図である。
【図３９】選択された１２の生殖系列セグメントのアミノ酸配列を示す図である。この図には、生殖系列ＣＤＲの配列も含まれている。これらは、以下の項に記載の変異配列で置換されている。
【図４０】多糖類の抗原クラスに適したフレームワークの系統樹を示す図である。
【図４１】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２可変性プロファイル選択を表すフローチャートを示す［実施例３を参照］。
【図４２】ＣＤＲ３可変性プロファイル選択を表すフローチャートを示す［実施例３を参照］。
【図４３】重鎖配列のサブセットプールの選択過程、サブセット配列のサブクラス分割、および正準構造に基づいたサブクラスのさらなる分割を示す図である。
【図４４】ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６集団内の各位置におけるアミノ酸残基普及率のヒストグラムを示す図である。
【図４５】ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１（正準構造２）集団内の各位置におけるアミノ酸残基普及率のヒストグラムである。
【図４６】ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１−２集団内の各位置におけるアミノ酸残基普及率のヒストグラムである。
【図４７】ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１−３集団内の各位置におけるアミノ酸残基普及率のヒストグラムである。
【図４８】ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３集団内の各位置におけるアミノ酸残基普及率のヒストグラムである。
【図４９】それぞれ、ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ２集団およびＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ３集団内の各位置におけるアミノ酸残基普及率のヒストグラムである。
【図５０】それぞれ、ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ２−１集団およびＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ３−１集団内の各位置におけるアミノ酸残基普及率のヒストグラムである。
【図５１】それぞれ、ＶＨ＿ＣＤＲ３−９集団、ＶＨ＿ＣＤＲ３−１５集団、およびＶＨ＿ＣＤＲ３−１８集団内の各位置におけるアミノ酸残基普及率のヒストグラムである。
【図１】
2008536473.tif 000033
【図２】
2008536473.tif 000034
【図３】
2008536473.tif 000035
【図４】
2008536473.tif 000036
【図５】
2008536473.tif 000037
【図６】
2008536473.tif 000038
【図７】
2008536473.tif 000039
【図８】
2008536473.tif 000040
【図９】
2008536473.tif 000041
【図１０】
2008536473.tif 000042
【図１１】
2008536473.tif 000043
【図１２−１】
2008536473.tif 000044
【図１２−２】
2008536473.tif 000045
【図１２−３】
2008536473.tif 000046
【図１２−４】
2008536473.tif 000047
【図１３】
2008536473.tif 000048
【図１４】
2008536473.tif 000049
【図１５】
2008536473.tif 000050
【図１６】
2008536473.tif 000051
【図１７−１】
2008536473.tif 000052
【図１７−２】
2008536473.tif 000053
【図１８】
2008536473.tif 000054
【図１９】
2008536473.tif 000055
【図２０】
2008536473.tif 000056
【図２１】
2008536473.tif 000057
【図２２−１】
2008536473.tif 000058
【図２２−２】
2008536473.tif 000059
【図２３−１】
2008536473.tif 000060
【図２３−２】
2008536473.tif 000061
【図２４】
2008536473.tif 000062
【図２５−１】
2008536473.tif 000063
【図２５−２】
2008536473.tif 000064
【図２６】
2008536473.tif 000065
【図２７】
2008536473.tif 000066
【図２８】
2008536473.tif 000067
【図２９】
2008536473.tif 000068
【図３０】
2008536473.tif 000069
【図３１】
2008536473.tif 000070
【図３２】
2008536473.tif 000071
【図３３】
2008536473.tif 000072
【図３４】
2008536473.tif 000073
【図３５】
2008536473.tif 000074
【図３６】
2008536473.tif 000075
【図３７】
2008536473.tif 000076
【図３８】
2008536473.tif 000077
【図３９】
2008536473.tif 000078
【図４０】
2008536473.tif 000079
【図４１】
2008536473.tif 000080
【図４２】
2008536473.tif 000081
【図４３】
2008536473.tif 000082
【図４４】
2008536473.tif 000083
【図４５】
2008536473.tif 000084
【図４６】
2008536473.tif 000085
【図４７】
2008536473.tif 000086
【図４８】
2008536473.tif 000087
【図４９】
2008536473.tif 000088
【図５０】
2008536473.tif 000089
【図５１】
2008536473.tif 000090
【国際調査報告】
2008536473.tif 000091
2008536473.tif 000092
2008536473.tif 000093
2008536473.tif 000094
2008536473.tif 000095