(57)【要約】本発明は、細胞増殖性疾患を治療するための化合物および薬学的組成物、このような化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ法、ならびに、このような疾患の治療法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの活性を特異的に阻害可能な化合物が患者に投与される段階を含む、患者の細胞増殖性疾患を治療する方法。
【請求項２】
化学療法剤が患者に投与される段階をさらに含み、化合物および化学療法剤を患者の細胞増殖性疾患を治療するために十分な量で投与し、ならびに化学療法剤が化合物の投与と同時に、または投与から28日以内に実施される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第2の化学療法剤が、アレムツズマブ、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ビカルタミド、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコクシブ、クロランブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、リン酸エストラムスチン、エトドラク、エトポシド、エキセメスタン、フロキシウリジン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、フルタミド、フォルメスタン、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、ゴセレリン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、ヒペリシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、レトロゾール、リュープレリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ロフェコキシブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、6-チオグアニン、トポテカン、トレモファイン（toremofine）、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンからなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
放射線療法をさらに含み、化合物および放射線療法が、患者の細胞増殖性疾患を治療するために十分な量で投与・実施され、ならびに放射線療法が化合物の投与と同時に、または投与から28日以内に実施される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
細胞増殖性疾患が新生物である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
新生物が癌である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
癌が、聴神経腫、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性単球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性赤白血病、腺癌、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、慢性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌(colon cancer)、結腸癌(colon carcinoma)、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、胚性癌腫、内皮肉腫(endotheliosarcoma)、上衣細胞腫、上皮癌、ユーイング腫瘍、神経膠腫、重鎖病、血管芽腫、肝臓癌、ホジキン病、大細胞癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肺癌(lung cancer)、肺悪性腫瘍(lung carcinoma)、リンパ管内皮腫(lymphangioendotheliosarcoma)、リンパ管肉腫、マクログロブリン血症、髄様癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、粘液肉腫、神経芽腫、非ホジキン病、乏突起細胞腫、骨原性肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腺癌、乳頭癌、松果体腫、真性多血症、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎細胞癌、網膜芽腫、シュワン細胞腫、脂腺癌、精上皮腫、小細胞肺癌、扁平上皮癌、汗腺癌、滑膜腫、睾丸癌、子宮癌、ワルデンストレーム線維肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
化合物が、生体膜を越えて移行可能な、共有結合で連結された部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
部分が、ペネトラチン(penetratin)ペプチドまたはTATペプチドを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
活性が基質との結合である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
化合物がプロドラッグの形状で患者に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
以下である化合物が、MAPKAPキナーゼ-2のRNAの切断をRNA干渉を介して誘導可能な2本鎖の低分子干渉核酸(siNA)分子を含む、請求項1記載の方法：
(a)siNA分子の各鎖の長さが、約18〜23ヌクレオチドであり；および
(b)MAPKAPキナーゼ-2のRNAの切断をRNA干渉を介して誘導可能なsiNA分子の1本の鎖が、MAPKAPキナーゼ-2のRNA配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【請求項１３】
siNA分子がRNAを含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
siNA分子の1本の鎖の配列が、SEQ ID NO: 29〜32の任意の1つを含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
化合物が、核酸塩基(nucleobase)のオリゴマーを含み、該オリゴマーの配列が、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の少なくとも10個の連続残基と相補的である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
化合物がペプチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
ペプチドがアミノ酸配列[L/F/I]XR[Q/S/T]L[S/T][疎水性残基](SEQ ID NO: 17)を含み、該ペプチドがせいぜい50アミノ酸を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
ペプチドがアミノ酸配列LQRQLSI(SEQ ID NO: 16)を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
細胞増殖性疾患が1種類もしくは複数の腫瘍を含み、および化合物が直接的な注射によって1種類もしくは複数の腫瘍に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
以下の段階を含む、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドに対する基質結合の阻害剤となる可能性のある化合物を同定する方法：
(a)MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドもしくはこの基質結合断片と、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドもしくはこの基質結合断片と結合可能な化合物を、化合物とMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチド間、もしくはこの基質結合断片間の複合体の形成を可能とする条件で接触させる段階；
(b)段階(a)の複合体を候補化合物に接触させる段階；ならびに
(c)MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドもしくはこの基質結合断片に由来する段階(a)の化合物の置換を測定する段階であって、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドもしくはこの基質結合断片に由来する段階(a)の化合物との置換によって、候補化合物が、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドに対する基質結合の阻害剤である可能性のある化合物であると同定される段階。
【請求項２１】
MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドと結合可能な化合物がペプチドを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
ペプチドがアミノ酸配列[L/F/I]XR[Q/S/T]L[S/T][疎水性残基](SEQ ID NO: 17)を含み、該ペプチドがせいぜい50アミノ酸を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
ペプチドがアミノ酸配列LQRQLSI(SEQ ID NO: 16)を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
以下の段階を含む、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドに対する基質結合の阻害剤である可能性のある、化合物を同定する方法：
(a)表1から、Ile74、Glu145、Lys188、Glu190、Phe210、Cys224、Tyr225、Thr226、Pro227、Tyr228、Tyr229、およびAsp345の残基の少なくとも3つに関して、少なくとも1つの原子座標、もしくはこの代理座標（surrogate）、または座標の平均二乗偏差が3Å未満である原子座標を有するMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの3次元モデルを提供する段階；ならびに
(b)水溶液中で、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドと結合する、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドに相補的である十分な表面を有する分子を決定する候補化合物の構造を作る段階であって、候補化合物が、基質とMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの結合の阻害剤である可能性のある化合物であると同定される段階。
【請求項２５】
アミノ酸配列[L/F/I]XR[Q/S/T]L[S/T][疎水性残基](SEQ ID NO: 17)を含むペプチドを含み、該ペプチドがせいぜい50アミノ酸を含む化合物。
【請求項２６】
ペプチドがアミノ酸配列LQRQLSI(SEQ ID NO: 16)を含む、請求項25記載の化合物。
【請求項２７】
請求項25記載の化合物のプロドラッグ。
【請求項２８】
ペプチドが、生体膜を越えて移行可能な、共有結合で連結された部分をさらに含む、請求項25記載の化合物。
【請求項２９】
部分がペネトラチンペプチドまたはTATペプチドを含む、請求項28記載の化合物。
【請求項３０】
以下を含む、患者の細胞増殖性疾患を治療するための薬学的組成物：
(a)MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの活性を阻害可能な化合物；および
(b)組成物が、患者の細胞増殖性疾患を治療するために十分な量で製剤化される化学療法剤。
【請求項３１】
化学療法剤が、アレムツズマブ、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ビカルタミド、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコクシブ、クロランブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、リン酸エストラムスチン、エトドラク、エトポシド、エキセメスタン、フロキシウリジン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、フルタミド、フォルメスタン、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、ゴセレリン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、ヒペリシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、レトロゾール、リュープレリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ロフェコキシブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、6-チオグアニン、トポテカン、トレモファイン、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンからなる群より選択される、請求項30記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
化合物がプロドラッグの形状である、請求項30記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
以下である化合物が、MAPKAPキナーゼ-2のRNAの切断をRNA干渉を介して誘導可能な2本鎖の低分子干渉核酸(siNA)分子を含む、請求項30記載の薬学的組成物：
(a)siNA分子の各鎖の長さが、約18〜23ヌクレオチドであり；および
(b)MAPKAPキナーゼ-2のRNAの切断をRNA干渉を介して誘導可能なsiNA分子の1本の鎖が、MAPKAPキナーゼ-2のRNAの配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【請求項３４】
siNA分子がRNAを含む、請求項33記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
siRNA分子の1本の鎖の配列が、SEQ ID NO: 29〜32の1つを含む、請求項33記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
化合物が、核酸塩基のオリゴマーを含み、該オリゴマーの配列が、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の少なくとも10個の連続残基と相補的である、請求項30記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
化合物がペプチドを含む、請求項30記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
ペプチドがアミノ酸配列[L/F/I]XR[Q/S/T]L[S/T][疎水性残基](SEQ ID NO: 17)を含み、該ペプチドがせいぜい50アミノ酸を含む、請求項37記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
ペプチドがアミノ酸配列LQRQLSI(SEQ ID NO: 16)を含む、請求項38記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
化合物が、生体膜を越えて移行可能な、共有結合で連結された部分を含む、請求項30記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
部分がペネトラチンペプチドまたはTATペプチドを含む、請求項40記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
連邦政府資金による研究に関する記載
本研究は、米国立衛生研究所から助成金による支援を受けた(助成金番号GM60594および同CA112967)。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
ゲノムの完全性の維持は、多細胞生物の健康に不可欠である。DNA損傷チェックポイントは、細胞分裂が遅れることで、損傷DNAの修復を可能とする機構、またはDNA損傷の程度が修復不能な場合はアポトーシスを誘導する機構を含む。DNA損傷応答性の3つの主要な細胞周期チェックポイントは、G1/Sチェックポイント、S期内チェックポイント、およびG2/Mチェックポイントである。
【０００３】
DNA損傷応答を制御する情報伝達事象には、進化的に保存されたSer/Thrキナーゼ、およびホスホセリン/スレオニン結合ドメインが関与する。さまざまなタイプの遺伝毒性ストレスが集まることで、おそらくさまざまなタイプのDNA損傷を認識する特異的なタンパク質複合体を、少数の共通経路に集めることによって、限定されたレパートリーのDNA損傷チェックポイント応答が引き起こされる。例えば、電離放射線照射(IR)および紫外光(UV)によって一般に引き起こされる損傷は、上流のキナーゼである毛細血管拡張性運動失調症原因因子（ataxia-telangiectasia mutated）(ATM)、および毛細血管拡張性運動失調症およびRAD3関連因子（ataxia-telangiectasia- and RAD3-related）(ATR)の活性化を惹起する。これらのキナーゼは、DNA損傷チェックポイントに直接作用するシグナルを伝達を誘導する。
【０００４】
ATMおよびATRは、部分的に重複した機能を有すると考えられている。というのは、両キナーゼに、いくつかの共通のSer/Thr-Gln含有基質が同定されているからである。ATMは主に2本鎖切断に反応し、ATRは、UVが引き起こす、大きい(bulky)DNA損傷を含む多くのタイプのDNA損傷に応答する。活性化したATMは下流のエフェクターキナーゼChk2をThr68でリン酸化し、ならびにATRは下流のエフェクターキナーゼChk1をSer317およびSer345でリン酸化する。加えて、ツメガエル属(Xenopus)の卵抽出物、および哺乳類細胞の両方を対象とした研究では、ATR/Chk1およびATM/Chk2に依存しないチェックポイント経路の存在が指摘されている。
【０００５】
Chk1およびChk2がDNA損傷応答を制御する主な機構は、サイクリン/Cdk複合体の正の調節因子である、Cdc25ファミリーのホスファターゼの成員のリン酸化依存性の不活性化を介する。Cdc25ファミリーは、3種類の異なるイソ型：Cdc25A、Cdc25B(異型1、2、および3)、ならびにCdc25Cからなる。Cdc25AおよびCdc25Bは癌遺伝子と考えられている。というのは、ヒトの多くの癌で発現が促進されるからである。Cdc25Aは、S期の進行、ならびに有糸分裂への進行および維持の両方を制御する。DNA損傷に応答してCdc25Aは、Ser78およびSer123を含む複数の部位がリン酸化され、ユビキチンによる分解の標的となる。一方、Cdc25BとCdc25Cは、これらによるサイクリン依存性キナーゼCdc2/サイクリンBの活性化を介する、有糸分裂への進行の調節に主に関与する。DNA損傷に応答して、Cdc25B1/Cdc25B2およびCdc25Cは、それぞれSer309/Ser323およびSer216におけるリン酸化によって、Cdc2/サイクリンBの核内プールから離れて隔離され、14-3-3との結合および細胞質内における保持につながる。しかしながら、このG2/Mチェックポイントの確立における、Cdc25ファミリーのさまざまな成員の正確な役割については活発な議論がある。
【０００６】
IRによって誘導されるDNA損傷チェックポイントとは対照的に、UV応答性のチェックポイントについてはよくわかっていない。このチェックポイントに関する深い理解と、理解の深まりに基づく疾患の治療法の開発が求められている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明者らはここで、MAPKAPキナーゼ-2が、化学療法剤に起因するDNA損傷に応答して、ATRおよび/またはATMに依存して特異的に活性化されること、ならびにMAPKAPキナーゼ-2が、このような薬剤曝露後における、G1、S期、およびG2/Mのチェックポイントの活性化に重要な役割を果たすことを報告する。RNA干渉によるMAPKAPキナーゼ-2の下方制御は、インビトロでは腫瘍細胞に対する、およびインビボではマウスの腫瘍モデルにおける、シスプラチンおよびドキソルビシンの抗増殖作用および細胞毒性作用を顕著に高める。システムレベルでは、DNA損傷に応答して、Chk1およびMAPKAPキナーゼ-2は、MAPKAPキナーゼ-2枯渇後のチェックポイントの停止（abrogation）が、Chk1の過剰発現によって救済可能され得るように収束して類似の分子標的をリン酸化する、平行した独立の経路で機能するようである。
【０００８】
以上の結果を元に本発明者らは、MAPKAPキナーゼ-2の発現を阻害することで細胞増殖性疾患を治療する新たな方法を発明した。本発明者らは、MAPKAPキナーゼ-2阻害剤、細胞増殖性疾患の治療に有用な、このような阻害剤を含む薬学的化合物、および他の阻害剤を同定するスクリーニング法も発見した。本発明の方法および化合物は例えば、癌を治療するために、または他の抗癌療法の開発を促すために使用することができる。
【０００９】
したがって1つの局面では、本発明は、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの活性を阻害可能な化合物を患者に投与する段階を含む、患者の細胞増殖性疾患を治療する方法を特徴とする。阻害される活性は例えば、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの発現、または基質との結合を含む場合がある。同方法は、化学療法剤や放射線療法などの、化合物および化学療法剤、または放射線療法が患者の細胞増殖性疾患を治療するために十分な量で投与・実施されるように、追加的な治療を患者に対して実施する段階を含む場合もある。追加的な治療は、阻害性化合物の投与に対して同時に、または例えば最長28日の間隔を設けて実施される場合がある。当技術分野で周知の任意の化学療法剤または放射線療法は、本発明の方法に有用な可能性がある。例示的な化学療法剤は、微小管阻害剤(例えばノコダゾール)；2本鎖DNA切断を生じる化合物(例えばドキソルビシンおよびダウノルビシン)；1本鎖DNA切断を誘導する化合物(例えばカンプトテシン)；ならびに架橋剤(例えばシスプラチンで)ある。例示的な細胞増殖性疾患は、新生物、例えば既知の任意の形状の癌を含む。1つの態様では、固形腫瘍は、MAPKAPキナーゼ-2阻害剤を単独で、または他の治療薬と組み合わせて、腫瘍内に直接注入されることによって、または全身投与によって治療される場合がある。単独療法として投与される場合は、このような化合物は、患者の細胞増殖性疾患を治療するために十分な量が投与され；併用療法の場合は、化合物の組み合わせが、患者の細胞増殖性疾患を治療するために十分な量で、まとめて投与される。
【００１０】
前記の方法で使用される阻害性化合物は、ペネトラチンペプチドまたはTATペプチドなどの、生体膜を越えて移行可能な、共有結合で連結された部分を含む場合がある。または、このような化合物は、プロドラッグの形状で投与される場合がある。適切な化合物は、MAPKAPキナーゼ-2の生物学的活性の低分子阻害剤、RNA干渉療法に有用なRNA分子、アンチセンス療法に有用なRNA分子、およびMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドを阻害可能なペプチドを含む。例えば本発明の方法に有用なRNA分子は、MAPKAPキナーゼ-2のRNAの切断をRNA干渉を介して誘導可能な、2本鎖の低分子干渉核酸(siNA)分子を含む(siNA分子の各鎖は、約18〜23ヌクレオチドの長さであり、およびsiNA分子の1本の鎖は、MAPKAPキナーゼ-2のRNAの配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む)。1つの態様では、siNA分子は、配列が例えばSEQ ID NO: 29〜32の任意の1つを含むRNAを含む。低分子ヘアピン核酸(shNA)分子も本発明の方法に使用される場合がある。または、核酸塩基のオリゴマーを投与することで、アンチセンス療法を実施することができる(このようなオリゴマーの配列は、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の少なくとも10個の連続残基と相補的である)。治療法は、ペプチドまたはペプチド模倣物(peptidomimetic)を含む化合物、例えば、Xは任意のアミノ酸であり、ペプチドもしくはペプチド模倣物はせいぜい50アミノ酸を含むアミノ酸配列[L/F/I]XR[Q/S/T]L[S/T][疎水性残基](SEQ ID NO: 17)を含む化合物を使用することで実施することもできる。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される。1つの態様では、ペプチドまたはペプチド模倣物はアミノ酸配列LQRQLSI(SEQ ID NO: 16)を含む。
【００１１】
本発明はさらに、以下の段階を含む、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドに対する基質結合の阻害剤の可能性がある化合物を同定する方法を特徴とする：MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドを、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドと結合可能な化合物と、同化合物とMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチド間の複合体の形成を可能とする条件で接触させる段階；同複合体に候補化合物を接触させる段階；ならびにMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドから、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドと結合可能な化合物の置換を測定する段階。結合可能な化合物の置換によって、候補化合物が、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドに対する基質結合の阻害剤である可能性のある化合物であることがわかる。1つの態様では、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドと結合可能な化合物は、ペプチドまたはペプチド模倣物、例えばアミノ酸配列[L/F/I]XR[Q/S/T]L[S/T][疎水性残基](SEQ ID NO: 17)を含むペプチドまたはペプチド模倣物を含む(ペプチドまたはペプチド模倣物はせいぜい50アミノ酸を含む)。例えば、ペプチドまたはペプチド模倣物はアミノ酸配列LQRQLSI(SEQ ID NO: 16)を含む場合がある。前記の方法では、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの基質結合断片を完全長のMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドに代えて使用することができる。
【００１２】
前記の局面の変形例も、本発明の方法で可能である。MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドまたはこの基質結合断片と、同ポリペプチドと結合可能な化合物を、候補化合物の存在下で接触させることが可能であり、ならびにMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドと結合可能な化合物の結合を測定する任意の手段を本発明の方法で使用することができる。一般に、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドと結合可能な化合物の結合の量が、候補化合物の非存在下で測定される結合の量と比較して、候補化合物の存在下で低下すれば、候補化合物は、本発明の方法によって基質結合の阻害剤であると判定される。
【００１３】
別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドまたはこの基質結合断片に対する基質結合の阻害剤である可能性のある化合物を同定する方法を特徴とする：Ile74、Glu145、Lys188、Glu190、Phe210、Cys224、Tyr225、Thr226、Pro227、Tyr228、Tyr229、およびAsp345の少なくとも3つの残基に関して、表1から、少なくとも1つの原子座標、またはこの代理座標(surrogate)、または座標の平均二乗偏差が3Å未満である原子座標を有するMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの3次元モデルを提供する段階；ならびに水溶液中でMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドと結合するMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドに相補的である十分な表面を有する分子を決定する、候補化合物の構造を明らかにする段階。
【００１４】
本発明はさらに、ペプチドまたはペプチド模倣物を含む化合物、例えばアミノ酸配列[L/F/I]XR[Q/S/T]L[S/T][疎水性残基](SEQ ID NO: 17)を含む化合物を特徴とする(ペプチドまたはペプチド模倣物はせいぜい50アミノ酸を含む)。1つの態様では、ペプチドまたはペプチド模倣物はアミノ酸配列LQRQLSI(SEQ ID NO: 16)を含む。本発明の阻害性化合物は、ペネトラチンペプチドまたはTATペプチドなどの、生体膜を移行可能な、共有結合で連結された部分を含む場合がある。または、このような化合物は、プロドラッグの形状で投与することが可能である。
【００１５】
別の局面では、本発明は、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの活性を阻害可能な化合物；および化学療法剤を含む、患者の細胞増殖性疾患を治療するための薬学的組成物を特徴とし、ここで薬学的組成物は、細胞増殖性疾患を治療するために十分な量で製剤化される。当技術分野で周知の任意の化学療法剤は、本発明の組成物中で有用な場合がある。薬学的組成物に有用な阻害性化合物は、ペネトラチンペプチドまたはTATペプチドなどの、生体膜を移行可能な、共有結合で連結された部分を含む場合がある。または、このような化合物は、プロドラッグの形状で投与することが可能である。低分子阻害剤、siNA分子、アンチセンスRNA分子、またはペプチドを含む化合物を含む、上記の任意の局面で記載された任意の化合物は、本発明の薬学的組成物中で有用な可能性がある。
【００１６】
本発明の任意の前記の局面では、阻害性化合物が、MAPKAPキナーゼ-2の特異的阻害剤であること、例えばChk1、Chk2、およびp38 SAPKなどの関連キナーゼを実質的に阻害することなくMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドを阻害する化合物であることが望ましいが、低い選択性で、または非選択的にMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドを阻害する化合物も本発明の方法に有用である。
【００１７】
本明細書および添付の請求項で使用されるように、以下の用語・表現には特別の意味がある。
【００１８】
「アミノ酸断片」は、ペプチド鎖に、そのα側のカルボキシル、そのα窒素、またはこの両方を介して組み入れられたアミノ酸残基を意味する。
【００１９】
末端のアミノ酸は、アミノ末端またはカルボキシ末端における、任意の天然の、または非天然のアミノ酸残基である。内部のアミノ酸は、末端のアミノ酸ではない任意の天然または非天然のアミノ酸残基である。
【００２０】
「類似体」は、同一ではないが類似の特性を有する分子を意味する。例えばポリペプチドの類似体は、天然のポリペプチドに対して類似体の機能を高める、ある程度の生化学的修飾を有しながら、対応する天然のポリペプチドの生物学的活性を保持する。このような生化学的修飾は、例えばリガンドとの結合を変化させることなく、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、または半減期を高めたり延長したりする場合がある。類似体は、非天然のアミノ酸を含む場合がある。
【００２１】
核酸に関して本明細書で用いる「アンチセンス」は、長さとは無関係に、遺伝子のコード鎖に相補的な核酸配列を意味する。
【００２２】
「原子座標」は、結晶材料の原子(X線散乱中心)によるX線の回折によって得られるパターンに関して数学的方程式で導かれる、結晶材料中の原子の3次元座標を意味する。回折データを使用して、結晶の単位格子の電子密度マップが計算される。このような電子密度マップを使用して、結晶の単位格子内の個々の原子の位置が決定される。原子座標は、当業者に既知の手順で、別の座標系(すなわち代理座標系(surrogate system))に、原子の相対位置に影響を及ぼすことなく変換することができる。
【００２３】
分子に「〜に結合する」という表現は、対象分子に対する物理化学的な親和性を有することを意味する。結合は、本発明の任意の方法で、例えばインビトロ翻訳結合アッセイ法で測定することができる。
【００２４】
ポリペプチドまたは他の化合物の「生物学的活性」は、天然の分子の構造、調節、または生化学的側面に関する機能を有することを意味する。例えば、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの1つの生物学的活性は、インビボまたはインビトロにおける結合アッセイ法で測定可能な基質結合、例えばペプチド結合である。
【００２５】
「ケージ化化合物(caged compound)」は、切断可能な部分と結合した、生物学的に活性を有する分子を意味する(結果として生じる結合化合物は、同部分が結合した状態にある限りにおいて生物学的活性を欠く)。このような部分は、対象分子の1つもしくは複数の官能基を立体的に遮蔽することで生理活性を妨げる。このような部分は、酵素的手段、化学的手段、または光分解的手段を含む任意の手段で除去することが可能であり；このような部分が除去されると、分子の生物学的活性が回復する。
【００２６】
「候補化合物」は、本明細書に記載されたアッセイ法の1つを使用することで、遺伝子もしくはタンパク質の発現レベル、または遺伝子もしくはタンパク質の生物学的活性を変化させるその能力が、アッセイ法の対象となる、任意の核酸分子、ポリペプチド、または他の低分子を意味する。候補化合物は例えば、ペプチド、ポリペプチド、合成有機分子、天然有機分子、核酸分子、およびこれらの成分を含む。
【００２７】
「細胞増殖性疾患」は、細胞増殖に異常な増加または減少が見られる任意の病的条件を意味する。例示的な細胞増殖性疾患は、癌もしくは新生物、炎症性疾患、または過形成を含む(例えば、いくつかの状態の高血圧、前立腺過形成)。
【００２８】
「化学療法剤」は、癌を含む増殖性疾患の治療または制御に使用される1種類もしくは複数の化合物を意味する。化学療法剤は、細胞毒性剤および細胞増殖抑制剤を含む。
【００２９】
「複合体」は、2個またはこれ以上の分子の化学的会合物(chemical association)を意味する。複合体は、分子間の結合を維持する、弱い静電結合のネットワークを含む場合がある。共有結合、イオン結合、水素結合、疎水結合、またはファン・デル・ワールス相互作用などの他のタイプの相互作用が、複合体の成員間の静電結合に代えて、または静電結合に加えて存在する場合がある。
【００３０】
「コンピューターモデリング」は、以下の1つもしくは複数を決定するためのコンピュータープログラムの応用を意味する：結合部分に対するリガンドの位置および結合近接性(binding proximity)、結合状態のリガンドが占める空間、結合部分とリガンド間の相補的な接触面の量、任意のリガンドと結合部分の結合の変形エネルギー、ならびにリガンドと結合部分間における水素結合の強度、ファン・デル・ワールス相互作用、疎水性相互作用、および/または静電相互作用のエネルギーのある程度の推定値。コンピューターモデリングは、モデル系と候補化合物の特性の比較も可能である。例えば、コンピューターモデリング実験で、本発明の薬理作用団(pharmacophore)モデルを候補化合物と比較して、候補化合物のモデルに対する適合性を評価することができる。上記の評価に有用な手法の例には、量子力学的な方法、分子力学的な方法、分子動力学的な方法、モンテカルロ・サンプリングによる方法、系統的検索、および距離幾何学法などがある。コンピューターモデリングプログラムに関する詳細については、本明細書の別の項で扱う。
【００３１】
「検出目的で標識する」は、分子、例えばMAPKAPキナーゼ-2ドメインと相互作用するペプチドまたはペプチド模倣性の低分子の存在を標識および同定する任意の手段を意味する。分子を検出目的で標識する方法は当技術分野で周知であり、放射性核種(例えば32P、33P、125I、または35Sなどの同位体)、非放射性標識(例えば化学発光標識またはフルオレセイン標識)、およびエピトープタグを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
必要であれば分子を、多種多様な分子の存在を識別可能なマーカーを使用して、さまざまに標識することができる。例えば、MAPKAPキナーゼ-2のドメインと相互作用するペプチドをフルオレセインで標識することが可能であり、およびMAPKAPキナーゼ-2のドメインをテキサスレッド(Texas Red)で標識することが可能である。このようなペプチドの存在は、MAPKAPキナーゼ-2ドメインの存在と同時にモニタリングすることが可能である。
【００３３】
「断片」は、標準となるタンパク質または核酸の部分と実質的に同一の領域を有するポリペプチドまたは核酸の一部分を意味し、および標準となるタンパク質または核酸の少なくとも1つの生物学的活性の少なくとも50%、75%、80%、90%、95%、もしくはさらには99%を保持する。
【００３４】
アミノ酸に関する「疎水性」は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、またはバリンの任意のアミノ酸を意味する。
【００３５】
「MAPKAPキナーゼ-2の生物学的活性」は、インビボまたはインビトロでMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドによって引き起こされることが知られている任意の活性を意味する。例えば、このような活性は、DNA損傷応答経路、細胞周期の制御、転写調節、クロマチンリモデリング、または基質結合の機能の少なくとも1つによって引き起こされる場合がある。MAPKAPキナーゼ-2の生物学的活性の1つのアッセイ法では、MAPKAPキナーゼ-2、または基質結合ドメインを含む、この断片もしくは変異体が基質と結合する能力が測定される。
【００３６】
「MAPKAPキナーゼ-2の核酸」は、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの全体または一部分をコードするか、またはGenbankアクセッション番号NM_004759 (SEQ ID NO: 1)もしくはNM_032960 (SEQ ID NO: 2)、またはこれらの類似体の核酸配列の全体または一部分と実質的に同一である核酸を意味する。
【００３７】
「MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチド」は、Genbankアクセッション番号NP_004750 (SEQ ID NO: 3)もしくはP49137 (SEQ ID NO: 4)、またはこれらの類似体のポリペプチド配列の全体または一部分と実質的に同一であるポリペプチド、およびMAPKAPキナーゼ-2の生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。
【００３８】
「新形成(neoplasia)」または「新生物(neoplasm)」は、細胞または組織の病的な増殖、およびこれに続く、他の組織または器官への移動または浸潤を特徴とする疾患を意味する。新形成の増殖は典型的には、制御不能かつ進行的であり、正常細胞の増殖を誘導しない可能性があるか、または停止させる可能性のある条件で生じる。新形成は、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、輸尿管、尿道、子宮、および膣、またはこれらの組織もしくは細胞のタイプからなる群より選択される器官を含むが、これらに限定されない、さまざまな細胞のタイプ、組織、または器官に影響を及ぼす場合がある。新形成は、聴神経腫、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性単球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性赤白血病、腺癌、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、慢性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌(colon cancer)、結腸癌(colon carcinoma)、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、胚性癌腫、内皮肉腫(endotheliosarcoma)、上衣細胞腫、上皮癌、ユーイング腫瘍、神経膠腫、重鎖病、血管芽腫、肝臓癌、ホジキン病、大細胞癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肺癌(lung cancer)、肺悪性腫瘍(lung carcinoma)、リンパ管内皮腫(lymphangioendotheliosarcoma)、リンパ管肉腫、マクログロブリン血症、髄様癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、粘液肉腫、神経芽腫、非ホジキン病、乏突起細胞腫、骨原性肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腺癌、乳頭癌、松果体腫、真性多血症、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎細胞癌、網膜芽腫、シュワン細胞腫、脂腺癌、精上皮腫、小細胞肺癌、扁平上皮癌、汗腺癌、滑膜腫、睾丸癌、子宮癌、ワルデンストレーム線維肉腫、およびウィルムス腫瘍などの癌を含む。
【００３９】
「核酸」は、リボ核酸もしくはデオキシリボ核酸、またはこれらの類似体のオリゴマーまたはポリマーを意味する。この表現は、天然の塩基、糖、および糖鎖間(バックボーン)の結合からなるオリゴマー、ならびに同様に機能する非天然の部分を有するオリゴマーを含む。このような修飾型または置換型のオリゴヌクレオチドは、例えば細胞内への取り込みの促進、およびヌクレアーゼの存在下における安定性の亢進などの特性のために、天然型よりも好ましい場合がある。
【００４０】
いくつかの好ましい核酸の特異的な例は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖鎖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環の糖鎖間結合を含む場合がある。最も好ましい例は、CH2-NH-O-CH2、CH2-N(CH3)-O-CH2、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2、およびO-N(CH3)-CH2-CH2のバックボーンを有するものである(リン酸ジエステルはO-P-O-CH2である)。モルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい(Summerton, J.E. and Weller, D.D.、米国特許第5,034,506号)。タンパク質-核酸(PNA)バックボーンなどの他の好ましい態様では、オリゴヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンが、ポリアミドバックボーンと置換され、塩基が、ポリアミドバックボーンのアザ窒素原子と直接または間接的に結合した状態にある場合がある(P.E. Nielsen et al. Science 199: 254, 1997)。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下の1つを含む、アルキルおよびハロゲン置換型の糖部分を含む場合がある：OH、SH、SCH3、F、OCN、O(CH2)nNH2、もしくはO(CH2)n CH3(nは約1〜約10)；C1〜C10の低級アルキル、置換型の低級アルキル、アルカリル、もしくはアラルキル；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-アルキル、S-アルキル、もしくはN-アルキル；O-アルケニル、S-アルケニル、もしくはN-アルケニル；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換型シリル；RNA切断基；コンジュゲート；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する官能基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する官能基、および類似の特性を有する他の置換基。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣物を有する場合もある。
【００４１】
他の好ましい態様は、少なくとも1個の修飾塩基型を含む場合がある。このような修飾塩基の、いくつかの特異的な例は、2-(アミノ)アデニン、2-(メチルアミノ)アデニン、2-(イミダゾリルアルキル)アデニン、2-(アミノアルキルアミノ)アデニン、または他のヘテロ置換型アルキルアデニンを含む。
【００４２】
「ペプチド模倣物(peptidomimetic)」は、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣または拮抗することが可能な化合物を意味する。ペプチド模倣物は、非ペプチド性の構造エレメント、非天然のペプチド、合成有機分子、天然有機分子、核酸分子、およびこれらの成分を含む場合がある。ペプチド模倣物の同定は、結合対を組み入れて、結合対を置換する化合物を同定するスクリーニング法で達成することができる。または、ペプチド模倣物を、既知のタンパク質-タンパク質相互作用、例えば、本発明のペプチドとMAPKAPキナーゼ-2ドメインの相互作用の分子モデリングによってコンピュータで設計することができる。1つの態様では、ペプチド模倣物は、同じ結合面を占めることで、結合対の1つの成員と置換される。ペプチド模倣物は、結合面に対して、より高い結合親和性を有することが望ましい。
【００４３】
「薬学的に許容される賦形剤」は、投与対象に対して生理学的に許容される担体、および、ともに投与される化合物の治療特性を保持する担体を意味する。1つの例示的な薬学的に許容される賦形剤は生理食塩水である。生理学的に許容される他の添加剤、およびその組成は当業者に既知であり、例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(第20版、A.R. Gennaro編、2000, Lippincott Williams & Wilkins)に記載されている。
【００４４】
「リンペプチド」は、1つもしくは複数のリン酸部分が、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、ヒスチジンの各アミノ酸残基、またはアミノ酸類似体に共有結合で連結されているペプチドを意味する。ペプチドは、存在するセリンアミノ酸残基、スレオニンアミノ酸残基、チロシンアミノ酸残基、またはヒスチジンアミノ酸残基の数の程度までリン酸化され得る。リンペプチドは、4つの独立したSer/Thr/Tyr残基において、3つの独立したSer/Thr/Tyr残基において、または2つの独立したSer/Thr/Tyr残基においてリン酸化され得る。望ましくはリンペプチドは、複数のSer残基、Thr残基、またはTyr残基の存在に関わらず、1つのSer/Thr/Tyr残基でリン酸化される。
【００４５】
典型的には、リンペプチドは、適切な条件で原核細胞もしくは真核細胞における発現によって、またはペプチドがその後に単離され、かつ適切なキナーゼを使用することでリン酸化される翻訳抽出物における発現によって生成される。またはリンペプチドは、例えばN-α-FMOC-保護アミノ酸(適切なリン酸化アミノ酸を含む)を使用して、標準的な化学的な方法で合成可能である。望ましい態様では、非加水分解性のリン酸類似体の使用が組み入れられることで、非加水分解性のリンペプチドの作製が可能となる(参照により本明細書に組み入れられる、Jenkins et al., J. Am. Chem. Soc., 124:6584-6593, 2002)。このようなタンパク質合成法は一般に使用されており、分子生物学およびタンパク質生化学の標準的な方法で実施される(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1994, J. Sambrook and D. Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury NY, 2000)。1つの態様では、リンペプチドは一般に最長100アミノ酸残基である。より短いリンペプチド、例えば50残基未満、25残基未満、20残基未満、または15残基未満も可能である。リンペプチドは、わずか2アミノ酸残基、3アミノ酸残基、4アミノ酸残基、5アミノ酸残基、6アミノ酸残基、7アミノ酸残基、8アミノ酸残基、9アミノ酸残基、または10アミノ酸残基の長さの場合がある。
【００４６】
「タンパク質」または「ポリペプチド」または「ペプチド」は、本明細書に記載されているように、天然もしくは非天然のポリペプチドもしくはペプチドの全体または一部を含む、翻訳後修飾(例えばグリコシル化もしくはリン酸化)に関わらず、3個以上の天然または非天然のアミノ酸の任意の鎖を意味する。
【００４７】
本明細書で用いるように、天然のアミノ酸は、天然のタンパク質中に通常存在するようなL型配置の天然のα-アミノ酸である。非天然のアミノ酸は、タンパク質中に通常存在しないアミノ酸、例えばL配置を有する天然のα-アミノ酸のエピマー、すなわち非天然のD配置を有するアミノ酸；または、この(D,L型)同位体混合物；または、このようなアミノ酸の相同体、例えばβ-アミノ酸、α,α-2置換型アミノ酸もしくはα-アミノ酸を意味し、このようなアミノ酸の側鎖は、1つもしくは2つのメチレン基によって短縮化されているか、または5個〜最大10個の炭素原子を直鎖中に有するα-アミノアルカン酸、非置換型または置換型の芳香族(α-アリールもしくはα-アリールの低級アルキル)、例えば置換型のフェニルアラニンもしくはフェニルグリシンなどの、最大10個の炭素原子まで長くなっている。ポリペプチド中に組み入れられる可能性もある他のアミノ酸には、オルニチン(OまたはOrn)やヒドロキシプロリン(Hyp)などがある。
【００４８】
ポリペプチドまたはこの誘導体は、別のタンパク質またはペプチドと、例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合ポリペプチドとして融合または結合が可能である。他の一般に使用されている融合ポリペプチドは、マルトース結合タンパク質、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のプロテインA、Flag-Tag、HA-tag、緑色蛍光タンパク質(例えばeGFP、eYFP、eCFP、GFP、YFP、CFP)、赤色蛍光タンパク質、ポリヒスチジン(6xHis)、およびセルロース結合タンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
「プロドラッグ」は、インビボで修飾されて、例えば血液中における加水分解によって、生物学的に活性のある薬剤化合物の形成につながる化合物を意味する。プロドラッグの修飾に関する詳細については、参照により本明細書に組み入れられる、T. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, Edward B. Roche編、Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987、およびJudkins et al., Synthetic Communications 26(23):4351-4367, 1996に記載されている。
【００５０】
「精製された」という表現は、天然の状態で共存する他の成分から分離されることを意味する。典型的には、ある要素は、天然の状態で共在するタンパク質、抗体、および天然有機分子を重量比で少なくとも50%含まない場合に実質的に純粋である。このような要素は、重量比で少なくとも75%、90%、またはさらには99%、純粋である場合がある。実質的に純粋な要素は、化学合成、天然の供給源からの対象要素の分離、または天然の状態では対象要素を産生しない組換え宿主細胞における対象要素の産生によって得られる場合がある。当業者であれば、Coligan et al.(Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, New York, 2000)に記載された手法などの標準的な手法で、タンパク質、小胞、およびオルガネラを精製することができる。要素は望ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはカラムクロマトグラフィー(HPLCを含む)解析(Coligan et al., 前掲)による測定時に、出発材料に対して少なくとも2倍、5倍、または10倍、純粋である。例示的な精製法は、(i)塩析、すなわち(NH4)2SO4による沈殿；(ii)従来のクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、または逆相クロマトグラフィー；(iii)アフィニティクロマトグラフィー、例えばイムノアフィニティクロマトグラフィー、活性部位アフィニティクロマトグラフィー、色素親和性クロマトグラフィー、または固定化金属アフィニティクロマトグラフィー；および(iv)調製目的の電気泳動(preparative electrophoresis)、例えば等電点電気泳動やネイティブPAGEを含む。
【００５１】
「MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの活性を特異的に阻害する」という表現は、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの1つもしくは複数の生物学的活性を、関連キナーゼ、例えばChk1、Chk2、およびp38 SAPKを実質的に阻害することなく低下させることを意味する。望ましくは、特異的な阻害は、対照活性に対する、例えば天然のMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの発現能力または基質結合能力に対する、生物学的活性の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%の低下である。特異的な阻害の例示的な手段は、RNA干渉の使用によって行われる。MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドを阻害するが、それほど特異的に阻害するわけではない化合物の例がUCN-01である。
【００５２】
「実質的に同一である」という表現は、ポリペプチドまたは核酸が、標準となるアミノ酸または核酸の配列に対して、少なくとも75%、85%、90%、95%、またはさらには99%の同一性を示すことを意味する。ポリペプチドの場合、比較配列の長さは一般に、少なくとも35アミノ酸、45アミノ酸、55アミノ酸、またはさらには70アミノ酸である。核酸の場合は、比較配列の長さは一般に、少なくとも60ヌクレオチド、90ヌクレオチド、またはさらには120ヌクレオチドである。
【００５３】
配列同一性は典型的には、公的に利用可能なコンピュータープログラムで測定される。2つの配列間の同一性を決定するコンピュータープログラムの方法は、GCGプログラムパッケージ(Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 387, 1984)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 :403 (1990))を含むが、これらに限定されない。よく知られたスミス-ウォーターマン(Smith-Waterman)アルゴリズムで同一性を決定することもできる。BLASTプログラムは、NCBIおよび他の供給者から公開されている(例えば、BLAST Manual, Altschul et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894)。これらのソフトウェアプログラムは相同性の程度を、さまざまな置換、欠失、および他の修飾に割り当てることで、類似の配列をマッチさせる。アミノ酸の比較に関する、保存的置換は典型的には、以下のグループ内における置換を含む：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００５４】
「実質的に阻害する」という表現は、対照活性値と比較して、阻害される分子の1つもしくは複数の活性を少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、またはさらには98%、低下させることを意味する。
【００５５】
MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドに関する「基質結合断片」は、ペプチドまたはペプチド模倣物の基質と結合可能なポリペプチドの部分を意味する。例えば(SEQ ID NO: 3に関して)、領域Phe46〜Asp345を含むMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの断片は基質結合断片である。
【００５６】
原子座標と関連する「代理座標(surrogate)」は、座標間の相対的な関係を保持する座標の任意の修飾(例えば数学的な修飾または拡大・縮小)を意味する。
【００５７】
「3次元モデル」は、分子の構造の3次元表現を意味する。コンピューターモデリングにより、構造データと併せて、このようなモデルを作ることができる。このようなデータは、x線結晶学的データ、核磁気共鳴データ、電子顕微鏡データ、または分子もしくは分子の複合体のモデル構築に有用な実験データもしくは理論データの他の任意の供給源を含む場合がある。
【００５８】
疾患、障害、もしくは条件を「治療する」という表現は、疾患、障害、もしくは条件の当初の、または後の発生を予防する、または遅らせること；条件の消失から再発までの間の、無病生存期間を延長すること；条件に関連する有害な症状を安定化もしくは低減させること；または条件の進行を阻害するか、遅延させるか、もしくは安定化させることを意味する。望ましくは、治療対象の少なくとも20%、40%、60%、80%、90%、または95%が、疾患の全ての証拠が消失する完全な寛解を示す。別の望ましい態様では、患者が、ある条件であると診断され、および本発明の化合物で治療された後に生存する時間の長さは、以下より少なくとも20%、40%、60%、80%、100%、200%、もしくは、さらには500%長い：(i)非治療患者が生存する平均期間、または(ii)別の治療法で治療された患者が生存する平均期間。
【００５９】
「非天然のアミノ酸」は、構造および反応性が天然のアミノ酸と似た、天然のアミノ酸に類似の構造を有する有機化合物を意味する。本明細書で定義される非天然のアミノ酸は一般に、非天然のアミノ酸が天然のアミノ酸と置換されるか、またはペプチドに組み入れられる、いずれかの場合に、ペプチドの特性(例えば選択性、安定性、結合親和性)を高めるか、または低める。このようなアミノ酸を含む非天然のアミノ酸およびペプチドは例えば、米国特許第6,566,330号および同第6,555,522号に記載されている。
【００６０】
本発明の他の特性および利点は、本発明の望ましい態様に関する以下の記載から、ならびに特許請求の範囲から明らかになると思われる。
【００６１】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞増殖性疾患の治療に有用な方法および化合物を特徴とする。この治療法は、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドまたはこの基質結合断片の活性を阻害可能な化合物の投与を特徴とする。このような化合物は、ペプチド、ペプチド模倣物、または核酸分子を含む化合物を含むが、これらに限定されない。本発明はさらに、MAPKAPキナーゼ-2の阻害剤を同定するスクリーニングアッセイ法を特徴とする。加えて本発明は、MAPKAPキナーゼ-2の基質結合部位を標的とすることで、これを阻害する薬学的組成物および化合物、例えばペプチドおよびペプチド模倣物を含む。
【００６２】
最近、ATR-Chk1経路に加えて、p38 SAPK経路も、UV照射後のDNA損傷応答の完全な活性化に必要であることが報告された。本発明者らは本明細書で、p38 SAPKのすぐ下流の標的であるMAPKAPキナーゼ-2が、UVによって誘導されるDNA損傷に応答したCdc25BおよびCdc25Cのリン酸化、ならびにG1チェックポイント、Sチェックポイント、およびG2/Mチェックポイントの維持に直接関与することを報告する。したがってMAPKAPキナーゼ-2は、Chk1およびChk2に加えて、より高等の真核細胞のDNA損傷応答の協調に関与する第3のチェックポイントキナーゼを含む。
【００６３】
この第3のDNA損傷応答経路に関する、いくつかの重要な疑問は未だ解決されていない。DNA損傷後のp38 MAPK/MAPKAPキナーゼ-2の活性化はATRまたはATMに依存するのだろうか。p38 MAPK/MAPKAPキナーゼ-2カスケードは、UV以外の他のタイプの遺伝毒性ストレスに対するDNA損傷チェックポイントに重要な役割を果たしているのだろうか。Chk1経路およびMAPKAPキナーゼ-2経路に由来するシグナルは、システムレベルでどのように統合されているのだろうか。本発明者らは特に、MAPKAPキナーゼ-2/Chk3が、従来の抗癌化学療法剤に曝露された細胞の遺伝毒性ストレス応答に関与するか否かを調べることに関心を抱いた。MAPKAPキナーゼ-2が、化学療法によって誘導されるDNA損傷を受けた細胞の細胞周期の進行を妨げる際に重要な役割を果たしていることが証明されれば、MAPKAPキナーゼ-2は、抗癌剤の設計において臨床的に重要な標的であるということになる。
【００６４】
p38 SAPKに対する最適なリン酸化モチーフの決定
DNA損傷応答に関与するp38 SAPKシグナル伝達経路の基質および標的を同定するために、本発明者らは、p38α SAPKに対する最適な基質リン酸化モチーフを、指向性ペプチドライブラリーのスクリーニング(oriented peptide library screening)で決定した。p38 SAPKによる効率的なペプチドのリン酸化には、Ser+1位に固定されたPro残基が必要であることが判明し、p38 SAPKがPro誘導性のMAPキナーゼであるという既知の知見と矛盾しなかった。縮重配列XXXXSPXXXX(SEQ ID NO: 8)(XはCys、Ser、Thr、およびTyrを除く全てのアミノ酸)を含むライブラリーを対象としたスクリーニングで、Ser-2位のProが最も強く選択され、他の脂肪族残基は弱く選択されることが判明した(図1A)。他の選択はSer-3位、Ser-1位、およびSer+2位でも認められた。
【００６５】
最適なリン酸化モチーフをさらに明らかにするために、初回のスクリーニングで得られた結果を元に、Ser-2位とSer+1位の両方にProが固定され、ならびにSer、Thr、およびTyrがX位に含まれるライブラリーを使用して第2のスクリーニングを実施した。その結果、Ser-1位におけるGln、Met、およびGlyが選択され、Pro、Ser、およびThrが、わずかに弱く選択されることが判明した(図1A)。Glyが、Ile、Val、およびTyrとともに、Ser-3位における好ましい残基であった。疎水性残基、特に芳香族アミノ酸およびβ-分枝アミノ酸がSer+2位で選択された。指向性ペプチドライブラリーのスクリーニングで決定された、p38α SAPKに対する、結果として得られた最適なモチーフは、既知の基質上に、全てとは言わないまでも大半にマップされたp38 MAPKのリン酸化部位の配列と極めてぴったりマッチしている(図1A)。
【００６６】
最適なp38 SAPKのコンセンサスリン酸化モチーフGPQSPI(SEQ ID NO: 9)を含むペプチド「p38チド」を、動態解析用に合成した。このペプチドはp38 SAPKによって、インビトロで容易にリン酸化されたが；飽和型のミカエリス-メンテン型の動態は示さなかった(図1B)。むしろ初期速度は、最大1400μMまでのp38チド濃度の増加に伴って直線的に上昇した。この結果は、MAPキナーゼのドッキング部位などの、最適なリン酸化モチーフ以外の他の相互作用がp38 SAPK-基質結合の最適化に関与している可能性の高いことを示唆している。
【００６７】
潜在的なp38 SAPKの基質、特にDNA損傷のシグナル伝達に関連する基質を探すために、Swiss-Protデータベースを、Scansiteを使用して、p38 SAPKのコンセンサスリン酸化モチーフについて検索した。p38 SAPKの既知の基質であるGADD153以外に、本発明者らは、トップの250ヒット中にDNA損傷応答タンパク質を1つも同定できなかった。しかしながらデータベースの検索では、NADPHオキシダーゼ酵素の細胞質成分であるp47phox中に2つのタンデムの、ほぼ最適な（near-optimal）、p38 SAPKによるリン酸化部位(Ser345およびSer348)が明らかとなった。この配列PGPQSPGSPL(SEQ ID NO: 10)を含むペプチド「p47チド」は、p38 SAPKによって強くリン酸化されたが、p38チドと同様に、単離されたペプチドは直線的な非飽和型の動態を示した(図1B)。
【００６８】
次に、単離されたペプチドではなく、野生型および変異型のGST標識された完全長のp47phoxタンパク質を、インビトロにおけるリン酸化反応の基質として使用した。野生型の完全長のp47phoxタンパク質は、p38α SAPKによって速やかにリン酸化された(図1Cおよび図1D)。Ser345→Alaの変異は、p47phoxのリン酸化に対して、Ser348→Alaの変異より顕著な作用を有しており、Ser345部位が、最適なp38 SAPKコンセンサスモチーフに対してSer348部位より良好にマッチするという観察と非常によく一致していた。Ser345→AlaかつSer348→Alaの同時変異では、p38 SAPKによるp47phoxのリン酸化は完全に認められなくなった。動態解析の結果、p38 SAPKによる野生型p47phoxのリン酸化の古典的なミカエリス-メンテン挙動のKmが6.0μMであり、およびVmaxが36.6 nmol/分/μgであることが判明した。Ser345のAlaへの変異がKmを高め、かつVmaxを減じた一方で、Ser348からAlaへの変異は主にKmを高めた(図1E)。
【００６９】
単離されたペプチド、および完全なタンパク質から得られた、これらのデータは、p38 SAPKによる効率的な基質リン酸化が、指向性ペプチドライブラリーのスクリーニングによって決定された最適な基質モチーフに対して妥当なマッチを有する配列を必要とすること、ならびにMAPKドッキング部位が関与する追加的な相互作用が、強力なキナーゼ-基質間相互作用に重要な可能性が高いということを示す。複数のドッキングモチーフがp38 SAPKに関して、特に疎水性アミノ酸に挟まれることの多い、正に帯電したアミノ酸残基の短いクラスターに関して同定されている。このタイプのドッキングモチーフに対応する、IHQRSRKRLSQ(SEQ ID NO: 11)およびVRFLQQRRRQA(SEQ ID NO: 12)の2つの配列は、p47phox中のp38 SAPKリン酸化部位の近傍に存在する。後者の配列のモチーフ中のRRRからLLLへの変異は、p38α SAPKによるp47phoxのリン酸化の速度を70%以上、低下させた。
【００７０】
Bulavin et al. (Nature, 411:102-107, 2001)は、p38 SAPKとDNA損傷応答経路の関連を指摘しており、およびUV-Cによって誘導されるDNA損傷に応答して、p38 SAPKが、Cdc25B(Cdc25B2の場合はSer323；Cdc25B1の場合はSer309)上における14-3-3結合部位の発生に直接関与することを報告している。p47phoxと同様に、Cdc25Bは、潜在的なp38 SAPKドッキングモチーフであるPVQNKRRRSV(SEQ ID NO: 13)を含むが；Ser323を挟む配列LXRSPSMP(SEQ ID NO: 14)は、Ser+1位にProを欠き、図1Aに示した最適なp38 SAPKモチーフとは似ていない。図2Aに示すように、組換え型のp38 SAPKは、細菌で産生されたCdc25Bをインビトロで容易にリン酸化した。しかしながら、このリン酸化は14-3-3結合を誘導せず、およびCdc25BのSer323→Ala変異型は、p38 SAPKによって、野生型Cdc25Bタンパク質と同程度にリン酸化された。これらのデータは、Cdc25Bがp38 SAPKの基質である可能性がある一方で、このリン酸化が、G2/Mチェックポイントを生じる14-3-3結合に関与しないということに反する。
【００７１】
MAPKAPキナーゼ-2に対する最適なリン酸化モチーフの決定
MAPKAPキナーゼ-2およびMAPKAPキナーゼ-3、MNK1およびMNK2、MSK1およびMSK2、ならびにPRAKを含むいくつかのSer/Thrキナーゼがp38 SAPKの下流で活性化される。She et al.(Oncogene, 21:1580-1589, 2002)は、UV-Bによって誘導されるDNA損傷に応答して、MAPKAPキナーゼ-2がp53を、2つのよく知られたチェックポイントキナーゼであるChk1およびChk2によってリン酸化される同じ部位であるSer20でリン酸化する可能性があることを報告している。Chk1もChk2も、Cdc25ファミリーの成員をリン酸化して、14-3-3結合部位を作り出すことが可能であり、MAPKAPキナーゼ-2が類似のモチーフを有する可能性があることが示唆される。したがって、MAPKAPキナーゼ-2に対する最適な基質リン酸化モチーフを指向性ペプチドライブラリーのスクリーニングで調べた。
【００７２】
MAPKAPキナーゼ-2による効率的なペプチドのリン酸化は、Ser-3位に固定されたArgを含むライブラリー(XXXXRXXSXXXX (SEQ ID NO: 15)；XはCys、Ser、Thr、またはTyrを除く全てのアミノ酸)についてのみ認められた。ペプチドライブラリーのスクリーニングによってタンパク質キナーゼによるリン酸化モチーフを決定する重要な段階は、非リン酸化ペプチドのバックグラウンドからの、リン酸化されたペプチドの精製を含む。MAPKAPキナーゼ-2の場合、これは金属アフィニティクロマトグラフィーおよび配列決定に先立つ、全てのGlu残基およびAsp残基の、個々のメチルエステルへの変換によって劇的に改善された。この結果として生じるモチーフは、ほぼ全ての縮重位置において明瞭なアミノ酸の選択を示した(図3A)。MAPKAPキナーゼ-2は、Ser-5位およびSer+1位における疎水性残基Leu、Phe、Ile、およびValに対して強い選択を示した。強い選択はSer-2位におけるGlnでも認められ、および中程度の選択がSer-1位におけるLeuで認められた。指向性ペプチドライブラリーのスクリーニングで、MAPKAPキナーゼ-2に対するモチーフであると決定されたことは、Ser-5位におけるLeu、Ile、またはPhe；Ser-3位におけるArg；Ser-2位におけるGln、Ser、またはThr；Ser-1位におけるLeu、Val、またはPro；およびSer+1位におけるGluのほか疎水性残基を主に含む、既知の基質上にマップされたMAPKAPキナーゼ-2のリン酸化部位(図3A、下)の配列と極めて一致する。既知のMAPKAPキナーゼ-2基質中で、Ser-2位においてGlnに加えて、極性残基のSerおよびThrが選択されるということは、指向性ペプチドライブラリーのスクリーニングでは検出されなかった可能性がある。というのは、SerおよびThrはライブラリー中に存在しなかったからである。
【００７３】
ペプチドライブラリーのスクリーニングの結果を検証するために、最適なMAPKAPキナーゼ-2のコンセンサスモチーフLQRQLSI(SEQ ID NO: 16)、または同モチーフ内の各位置でAlaが置換された変異体バージョンを含む個々のペプチド(MK2チド)を合成して動態解析に使用した(図3Bおよび図3C)。最適なMK2チドは、これまで知られている限り最高のMAPKAPキナーゼ-2ペプチド基質である、HSP27由来の配列より2倍低いKm値を示した。モチーフ内の各位置におけるAlaへの置換はKmおよびVmaxに異なって影響し、いくつかの位置(Ser-3位におけるArg)は主にKmに作用し、他の位置(Ser-5位におけるLeu)(図3C)は主にVmaxに作用した。鍵となる残基の重要な順は、Arg-3>Leu-5≒Ile+1>Gln-3である。最適なMK2チドは、最低のKmも最高のVmaxも有していなかったが、最高のVmax/Km比を有していた。これは、ペプチドライブラリーのスクリーニング法が、低いKmまたは高いVmaxを単独としてではなく最適なVmax/Kmを基礎として基質を選択するという事実と矛盾しない。指向性ペプチドライブラリーのスクリーニングで得られたデータ、既知の基質配列、および本発明者らの実施した動態研究を総合すると、最適なMAPKAPキナーゼ-2のリン酸化モチーフは、[L/F/I]XR[Q/S/T]L[S/T][疎水性残基](SEQ ID NO: 17)となる。
【００７４】
最適なMAPKAPキナーゼ-2基質モチーフは、Cdc25B中の既知のSer323リン酸化/14-3-3結合モチーフ、ならびにCdc25C中のSer216リン酸化/14-3-3結合部位に非常によくマッチする(図3A)。初期の実験ではCdc25Bに焦点が当てられていた。というのは、Cdc25Cとは異なりCdc25Bは、細菌において中程度の量で産生可能であり、およびCdc25BのSer323部位は過去に、明白な（direct）p38 SAPK部位であると報告されていたからである。組換え型のCdc25Bを、精製MAPKAPキナーゼ-2とインキュベートしたところ、有意なCdc25Bのリン酸化、およびリン酸化型タンパク質と14-3-3の強力な結合が生じた(図2A)。Ser323→Alaの変異は、MAPKAPキナーゼ-2がCdc25Bをリン酸化する能力を実質的に減じ、およびCdc25Bが14-3-3に結合する能力を完全に除去した(図2A)。これらのインビトロで得られた結果は、MAPKAPキナーゼ-2が、p38 SAPK経路によって伝達されるDNA損傷シグナルの下流における重要なCdc25/14-3-3チェックポイントキナーゼであることを強く示唆している。
【００７５】
MAPKAPキナーゼ-2は、UVによって誘導されるDNA損傷後のG2/Mチェックポイントに重要な役割を果たす
DNA損傷チェックポイントの機能におけるMAPKAPキナーゼ-2の重要性をU2OS細胞を対象に調べた。UV-C照射によって誘導されるDNA損傷に応答したMAPKAPキナーゼ-2の活性化(図4A)を、SDS-PAGEゲル上における移動度の低下によって、ならびにp38によってリン酸化され、およびMAPKAPキナーゼ-2の活性化に必要な部位であるpThr344に対するリン酸化型特異的抗体を使用するイムノブロッティングでモニタリングした。図2Bに示すように、MAPKAPキナーゼ-2は、照射開始から1時間以内に活性化され、および活性化状態が実験の8時間にわたって維持された。MAPKAPキナーゼ-2の活性化の動態は、これらの細胞に由来するCdc25Bが14-3-3と結合する能力に対応していた。これらのデータを元に、2時間の時点を後の研究で使用することとした。
【００７６】
UVによって誘導されるDNA損傷応答に、内因性のMAPKAPキナーゼ-2が直接的な役割を果たすことを確認するためにRNA干渉を使用した。U2OS細胞を、MAPKAPキナーゼ-2に特異的なsiRNAオリゴヌクレオチドで処理したところ、MAPKAPキナーゼ-2は、トランスフェクションの48時間後までに、ほぼ検出不能なレベルまで実質的に減じたが、対照GFPのsiRNAオリゴヌクレオチドによる処理では低減は認められなかった(図2C)。p38 SAPK、Chk1、またはChk2のレベルの低下、またはUV-Cによって誘導される活性化の低下は、これらの細胞では認められなかった。このような他の活性キナーゼの存在にもかかわらず、siRNAによるMAPKAPキナーゼ-2のノックダウンは、UV-C曝露後におけるCdc25Bと14-3-3の結合、およびCdc25Cと14-3-3の結合の両方の喪失を引き起こした(図2C)。
【００７７】
本発明者らは、UV-C照射後における、GFPがノックダウンされた対照細胞、およびMAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞の細胞周期の進行をFACSで調べた(図4A〜4K)。この実験では、細胞に20 J/m2のUV-Cを照射し、2時間かけて回復させた後に、ノコダゾールを含む培地に移してさらに16時間維持して、細胞周期を進行させて有糸分裂で停止する任意の細胞を生じさせた。このような細胞は、有糸分裂マーカーであるリン酸化ヒストンH3で染色される。このような条件では、GFPのsiRNAをトランスフェクトした非同期性の細胞の非照射培養物は、4N-DNAを含むピークに蓄積し、リン酸化ヒストンH3の染色が顕著なレベルで認められ(図4Bおよび図4C)、ノコダゾールによるM期の停止と矛盾がなかった。UV照射に反応して対照細胞は、G1、S、およびG2の顕著な分布を示し、リン酸化ヒストンH3の染色は、ほぼ完全に失われており、G1、S、およびG2のチェックポイントが完全であることがわかった(図4Dおよび図4E)。
【００７８】
MAPKAPキナーゼ-2のsiRNAをトランスフェクトした細胞の挙動は非常に大きく異なっていた。UV非照射時に、MAPKAPキナーゼ-2のsiRNAをトランスフェクトした細胞は、対照となるGFPのsiRNAをトランスフェクトした細胞と同様に、4N DNAを含むピーク中に蓄積し、高レベルのリン酸化ヒストンH3の染色が認められた(図4Fおよび図4G)。しかしながら、UVによって誘導されるDNA損傷後には、MAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞は、細胞周期の進行を停止できなかった。むしろ、非照射細胞で観察される場合と、相対的な4N-DNAピークが同等であること、およびリン酸化ヒストンH3の染色のレベルが同等であることからわかるように、これらの細胞は細胞周期を進行して、非照射細胞と同程度に有糸分裂へと進んだ(図4Hおよび図4I)。Cdc25B/C:14-3-3に関して得られた、図2Cに示す結果と総合すると、これらのFACSデータから、MAPKAPキナーゼ-2が、UV照射に反応時の、UVによって誘導されるG2/Mチェックポイントに重要な役割を果たすことがわかる。図4Jに要約されたUV反応とは対照的に、MAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞における電離放射線照射に対するG2/Mチェックポイント応答は完全である(図4K)。
【００７９】
MAPKAPキナーゼ-2は、UVによって誘導されるDNA損傷後におけるS期チェックポイントおよびG1停止に重要な役割を果たす
図4A〜4Kに示すMAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞は、DNA損傷後にG1期およびS期のチェックポイントの喪失も示した。というのは、非同期性培養物へのUV照射が、細胞をノコダゾール含有培地に移した際に、4N DNAを含むピークにおける細胞の蓄積を生じたからである。S期チェックポイントの機能におけるMAPKAPキナーゼ-2の直接的な役割を調べるために、U2OS細胞がノックダウンされた対照細胞、またはMAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされたU2OS細胞にUVを照射し、30分間かけて回復させた後に、BrdUで、さまざまな時間標識した。非照射時は、対照siRNAをトランスフェクトした細胞の42%が、MAPKAPキナーゼ-2のsiRNAをトランスフェクトした細胞の場合の53%と比較して、12時間後の時点で実質的なBrdUの取り込みを示した(図5Aおよび図5B)。細胞に20 J/m2のUV光を照射後にBrdU標識を行ったところ、対照siRNAをトランスフェクトした細胞のわずか3.5%が、12時間後の時点でBrdUの取り込みを示したに留まった。これと著しく対照的に、MAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞の48%が、かなりの量のBrdUを取り込みを継続した。対照siRNAで処理された細胞と、MAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞との間における、BrdUの取り込みに関する類似の差は、照射後のより短い時間でも認められた(図5B)。
【００８０】
UV照射の12時間後にFACSプロファイルを調べたところ、MAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞のG1集団が、対照となるGFPのsiRNAで形質転換された細胞と比較して劇的に減少することが判明した(図5A、右上および下方のFACSプロファイル)。G1ピークのこの喪失と、これに伴う、標識の2時間に対して、12時間の時点でBrdUの取り込みを示す細胞のパーセンテージの上昇は、内因性のMAPKAPキナーゼ-2が、損傷後のDNA合成阻害(S期チェックポイントの機能)と、損傷によって誘導される細胞のG1からS期移行の停止(G1/Sチェックポイントの機能)の両方に重要な役割を果たすことを意味する。MAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞におけるG1/S期チェックポイントおよびS期チェックポイントの喪失は、対照siRNAで処理された細胞と比較して、UV照射後における、より高いレベルのCdc25A、p53のレベルの低下、およびp53のSer20におけるリン酸化の減少と関連していた(図2C)。
【００８１】
UV-Cによって誘導されるDNA損傷に応答した、S期の対照細胞、またはMAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理された細胞の運命をFACSで調べた。この実験では、非同期性の細胞を擬似処理するか、または20 J/m2のUV-C照射後にBrdUによるパルス標識を行った。BrdUの取り込みを示した細胞は、10時間後と20時間後に解析を行った(図5C)。非照射の対照細胞もMAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞のいずれも、BrdUパルス標識集団は、10時間後の時点で後期S期およびG2/M期の分布を示し、ならびに20時間後の時点でG1ピークが再出現し、細胞周期に完全に移行したことがわかる。UV-C照射に応答して、対照siRNAで処理された細胞は、FACS解析のためにゲート制御するBrdUの有意な取り込みを示さなかった(図5C、左下のパネル)。これとは対照的に、S期チェックポイントおよびBrdUの取り込みを失った、MAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理された細胞の大集団は、20時間の時点で大きく減じたG1ピークを示し続け、多くの細胞は、4Nを上回るDNA染色を示しており(図5C、右下のパネルの囲み)、有糸分裂死および細胞周期からの脱出と一致する。
【００８２】
MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞は、DNA損傷によって誘導される細胞死に対する感受性がより高い
図4および図5A〜5Cに示した実験から、MAPKAPキナーゼ-2が、UVによって誘導されるDNA損傷によって引き起こされる個々の細胞周期チェックポイントに関与することがわかる。MAPKAPキナーゼ-2の枯渇が、細胞の生存に及ぼす作用を見極めるために、本発明者らは細胞に対照siRNAまたはMAPKAPキナーゼ-2のsiRNAを48時間かけてトランスフェクトし、トリプシン処理を行い、再プレーティングし、および再プレーティングの12時間における、さまざまな線量のUV-Cの照射に反応したコロニー形成を解析した。図5Dおよび図5Eからわかるように、MAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞は、対照処理細胞と比較して、検討した全ての線量のUV-C照射時にコロニー形成の有意な減少を示した。UV-C曝露後における生存に見られる、この差は、低線量〜中線量のUVで最も顕著であった。
【００８３】
MAPKAPキナーゼ-2の基質選択性の構造モデル
MAPKAPキナーゼ-2に関して決定された最適なリン酸化モチーフは、他の2種類のチェックポイントキナーゼ、Chk1およびChk2に関して決定されたモチーフと酷似していた(図6A)。MAPKAPキナーゼ-2、Chk1、およびChk2の全3種類の、これらのCAMKスーパーファミリーの成員は、Ser-5位における脂肪族残基、Ser-3位におけるArg、およびSer+1位における芳香族/脂肪族残基を強く選択し、他の位置の特定のアミノ酸に対しては、追加的な弱いストリンジェンシーの選択を示す(図6A)。これとは対照的に、Akt/PKBなどのAGCキナーゼスーパーファミリーの成員、および従来のタンパク質キナーゼCスーパーファミリーの成員などは、Ser-5位とSer-3位の両方にArg残基を含む配列を優先的にリン酸化し、ならびに細胞周期の制御に重要な役割を果たすというよりも、分化済みの細胞の機能に固有の抗アポトーシスシグナル伝達および他のシグナル伝達に重要な役割を果たす。
【００８４】
基質モチーフの選択の構造的基礎を調べるために、本発明者らは、公開されたMAPKAPキナーゼ-2:ADP共結晶構造(Underwood et al., Structure, 11 : 627-636, 2003)を基礎モデルとして使用して、活性化型MAPKAPキナーゼ-2を対象に分子モデリング試験を行った。最適な基質ペプチドであるLQRQLSIA(SEQ ID NO: 6)を、伸長配座(extended conformation)中のキナーゼ活性部位にモデル化し(図6D)、ならびにキナーゼ:基質複合体を、Akt/PKB:AMP-PNP:GSK3-ペプチド3元複合体の構造(Yang et al., Nat. Struct. Biol., 9:940-944, 2002)(図6C)と、およびモデル化されたCdc25Cペプチドを含むChk1の結晶構造と比較した(Chen et al., Cell, 100:681-692, 2000)(図6E)。MAPKAPキナーゼ-2、Akt/PKB、およびChk1に見られる、Ser-3位のArgに対する強い選択は、全3種類のキナーゼの類似の位置(MAPKAPキナーゼ-2のGlu145、Akt/PKBのGlu236、およびChk1のGlu91)、Akt/PKBではGSK3-ペプチド上のSer-3位のアルギニンのグアニジノ基と二座の塩橋が形成されるが、この類似の位置における保存されたグルタミン酸残基の存在によって理論的に説明される。同様に、Ser+1位における疎水性残基に対する選択は、全3種類のキナーゼについて同位置に保存されている疎水性ポケットによって説明される。このポケットは、Akt/PKBの場合はPhe310、Pro314、Leu317、およびPhe359によって囲まれており、ならびにChk1の場合はMet167、Leu171、Val174、Leu178、およびLeu179によって囲まれている。MAPKAPキナーゼ-2中の、対応するSer+1ポケットはPro223、Pro227、Val234、およびLeu235によって囲まれている。この領域内で、Akt/PKBのGly312、およびChk1のGly169は、MAPKAPキナーゼ-2ではTyr225となっており、これはMAPKAPキナーゼ-2の疎水性ポケットの深さを減じている可能性があり、ならびにAkt/PKBおよびChk1によるPheの選択と比較して、同位置における分枝脂肪族残基に対する選択を説明する可能性がある。
【００８５】
Akt/PKBのSer-5位におけるArgの選択と、MAPKAPキナーゼ-2およびChk1による同位置における疎水性残基に対する対応する選択の間に見られる顕著なコントラストは、Ser-5ポケットの基部におけるAkt/PKBのGlu342の存在によって説明できる。この残基は、MAPKAPキナーゼ-2およびChk1では保存されておらず、MAPKAPキナーゼ-2ではIle255と置換されており、およびChk1ではAla200と置換されている。MAPKAPキナーゼ-2中の他の残基、特にPhe147、Pro189、Pro261、およびLeu342、ならびに同様にChk1中のPhe93、Ile96、Pro98、Pro133、およびLeu206は、同領域に見られる重要な疎水性に寄与する。
【００８６】
MAPKAPキナーゼ-2は、DNAを損傷する化学療法剤で処理されると活性化される
p38 MAPK-MAPKAPキナーゼ-2経路が、臨床的に重要な化学療法剤の曝露後における細胞のDNA損傷応答に関与したかを調べるために、本発明者らはヒトのU2OS骨肉腫細胞を、DNA架橋剤であるシス-白金(シスプラチン)、トポイソメラーゼI阻害剤であるカンプトテシン、またはトポイソメラーゼII阻害剤であるドキソルビシンで処理した(図12A〜12F)。細胞溶解物を調製し、キナーゼの活性化をSDS-PAGEおよびイムノブロッティングでモニタリングした。MAPKAPキナーゼ-2の活性化を、SDS-PAGE上におけるその移動度の変化によって、およびp38 SAPKによるリン酸化でMAPKAPキナーゼ-2活性を劇的に上昇させる、自己阻害性ドメイン中の部位であるpThr344に対するリン酸特異的抗体を使用するイムノブロッティングでモニタリングした。p38 MAPKによる活性化は、Thr180/Tyr182の2か所がリン酸化された活性化型のキナーゼに特異的な抗体を使用したイムノブロッティングで評価した。
【００８７】
DNA損傷剤に曝露前の細胞(図12A〜12C、ゼロ時間のレーン)、またはDMSO(溶媒)のみで処理した細胞(図12D)では、MAPKAPキナーゼ-2は、抗pThr344抗体と交差反応しない1本のバンドとして流れた。細胞をシスプラチンおよびドキソルビシンに曝露した1時間以内に、またはカンプトテシンで処理した4時間以内に、MAPKAPキナーゼ-2は、その電気泳動移動度に有意な減少が見られた。上へ移動したMAPKAPキナーゼ-2のバンドは、MAPKAPキナーゼ-2のpThr344の免疫反応性バンドと、p38 SAPKのpThr180/pTyr182のバンドの両方と同じ動態で現われた。MAPKAPキナーゼ-2の活性化はp38 MAPKに完全に依存していた。というのは、DNA損傷剤添加の30分前における、p38 MAPK選択的阻害剤SB203580の成長培地への添加は、p38 MAPKの活性化を保持しながら、MAPKAPキナーゼ-2の活性化を完全に消失させたからである(図12E)。シスプラチン、カンプトテシン、およびドキソルビシンに対するMAPKAPキナーゼ-2の活性化に関する同様の結果は、HeLa子宮頚癌細胞およびU87MGヒト膠芽腫細胞でも認められた。これらの個々の薬剤による処理時の、MAPKAPキナーゼ-2の活性化の経時変化(図12A〜12D)は、γH2AX核内点状構造(nuclear foci)の出現率とマッチしていた(図12F)。これらのデータは、使用した化学療法剤による細胞の処理が、おそらく化学療法によって誘導されたDNA損傷の直接の結果として、MAPKAPキナーゼ-2の活性化をもたらすことを意味する。
【００８８】
上流の活性化型PIKKであるATMおよびATRは、化学療法によって誘導されるDNA損傷後におけるMAPKAPキナーゼ-2の活性化に必要である
ATMおよび/またはATRが、DNA損傷によって誘導されるMAPKAPキナーゼ-2の活性化に必要か否かを調べるために、本発明者らは、毛細血管拡張運動失調症(Ataxia-Telangiectasia)の患者に由来するATM欠損線維芽細胞、およびゼッケル症候群の患者に由来するATR欠損細胞におけるMAPKAPキナーゼ-2の活性化プロファイルを解析した。この実験では、細胞をシスプラチン、ドキソルビシン、カンプトテシン、またはUV照射で処理し、2時間後および8時間後に回収し、ならびに上記の手順でMAPKAPキナーゼ-2の活性化をモニタリングした(図13A〜13Bおよび図23A〜23B)。本発明者らは、カフェインの添加による、これらのキナーゼの薬理的阻害の作用も調べた(図13C)。シスプラチン、カンプトテシン、またはUVに反応したMAPKAPキナーゼ-2の活性化は、ATM欠損線維芽細胞では損なわれなかったが、ドキソルビシン処理はMAPKAPキナーゼ-2を、これらの細胞で活性化できなかった(図13Aおよび図23A〜23B)。一方、ATRを欠くゼッケル症候群の線維芽細胞は、シスプラチン、ドキソルビシン、またはカンプトテシンのいずれかの曝露後にMAPKAPキナーゼ-2を活性化できなかったが、UVによって誘導されるMAPKAPキナーゼ-2の活性化は認められた(図13Aおよび図23A〜23B)。同様にU2OS細胞を20 mMのカフェインで30分間処理後に、シスプラチンおよびドキソルビシンに曝露したところ、MAPKAPキナーゼ-2反応は完全に消失したが、UVによるMAPKAPキナーゼ-2の活性化は、これらの条件で通常通りに認められた。総合すると、これらのデータは、シスプラチン、カンプトテシン、およびドキソルビシンが、MAPKAPキナーゼ-2の活性化にATRを必要とすること、ドキソルビシンもATM活性を必要とすること、ならびにUV照射が、MAPKAPキナーゼ-2をATMまたはATRとは独立に活性化可能なことを意味する。
【００８９】
MAPKAPキナーゼ-2は、ドキソルビシン処理後のG2/Mチェックポイントに必要である
U2OS細胞をドキソルビシンで処理すると、DNAの2本鎖切断が生じる(図12F)、かつ処理後の18〜30時間に顕著なG2/M期の停止が誘導された(図24A〜24B)。この大きなG2/M集団に加えて、G1期およびS期における少量の細胞蓄積も認められた。MAPKAPキナーゼ-2の活性化がチェックポイント応答に関与するか否かを調べるために、RNA干渉を使用して、MAPKAPキナーゼ-2タンパク質のレベルが安定に抑制されたU2OS細胞を作製した(図14A〜14C)。MAPKAPキナーゼ-2に特異的なshRNAの導入は、トランスフェクトされた細胞集団全体の解析時に、MAPKAPキナーゼ-2タンパク質の強いノックダウンをもたらしたが、ルシフェラーゼのshRNAの導入時には、これは認められなかった(図14A)。
【００９０】
MAPKAPキナーゼ-2またはルシフェラーゼのshRNAでノックダウンされた非同期性の細胞を擬似処理するか、またはドキソルビシンに30時間曝露し、細胞周期の進行をFACSでモニタリングした。1つの一連の実験で、紡錘体毒素であるノコダゾールを培地に、ドキソルビシン添加の3時間後に添加し、任意の細胞に細胞周期の進行を引き起こさせて、有糸分裂で停止させた。DNA含量をPI染色でモニタリングし；リン酸化ヒストン-H3の染色を、有糸分裂への移行の指標として用いた。図14Aの左側のパネルに示すように、ルシフェラーゼshRNAでノックダウンされた対照細胞をドキソルビシンで処理したところ、4N DNAを含む細胞の蓄積が誘導され、およびノコダゾールの非存在下または存在下では、リン酸化ヒストン-H3の染色は見られなかった。ルシフェラーゼshRNAを発現する細胞の挙動は、トランスフェクトされなかったドキソルビシン処理された対照U2OS細胞集団と全く同じであり(図24B)、顕著な4N DNA成分、およびG2/Mチェックポイントが完全なことを示すリン酸化ヒストン-H3の染色の不在が認められた。ところが全く対照的に、ドキソルビシンで処理したMAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞は、非処理細胞と本質的に同一の細胞周期プロファイルを示した(図14A、最も右側の上段および中段のパネル)。MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞に、ドキソルビシン処理後にノコダゾールを添加したところ、4N DNAを含むピークの蓄積が見られ、36.3%の細胞の染色が、リン酸化ヒストンH3に関して陽性であった(図14A、右下のパネル)。この値は、ノコダゾールによって有糸分裂でブロックされた非処理U2OS細胞と同等の値(42%)であった(図24D)。MAPKAPキナーゼ-2に対する第2の無関係のRNAi配列の使用時に同じ結果が得られ、これらの結果が、RNAiによるオフターゲット(off-target)効果から生じたのではないことがわかる。MAPKAPキナーゼ-2の枯渇は、DNA損傷後に全Chk1レベルを変化させないか、またはChk1の活性化を減じなかった(図14B)。これらの結果から、MAPKAPキナーゼ-2の喪失が、ドキソルビシンによって誘導されるDNA損傷後に、細胞が機能性のG2/Mチェックポイントを確立することを、活性化Chk1の存在に関わらず妨げることがわかる。
【００９１】
MAPKAPキナーゼ-2は、トポイソメラーゼ阻害剤によって誘導されるDNA損傷に応答してCdc25Bと14-3-3の結合を誘導する
Cdc25ファミリーの2つの成員であるCdc25BおよびCdc25Cは、正常細胞における有糸分裂への移行の開始および維持に重要な役割を果たし、G2/Mチェックポイントの顕著な標的である。Cdc25Bは初期有糸分裂の阻害因子として、G2後期に中心体においてCdk1/サイクリンBを活性化することで機能すると考えられているが、Cdc25Cは、有糸分裂の開始後は、核の自己増幅ループ内でCdk1/サイクリンB活性をさらに増幅するように機能する。γ照射またはUV照射によって誘導されるDNA損傷に応答して、チェックポイントキナーゼは、Cdc25BおよびCdc25Cを、それぞれSer323とSer216においてリン酸化し、これは、触媒活性の中程度の低下に伴って、14-3-3タンパク質との結合を誘導し、それらを核内のサイクリン/Cdk基質から引き離して細胞質内に隔離する。最近の研究では、Cdc25Bが、正常な細胞周期におけるG2/Mチェックポイント応答の開始および維持に特に非常に重要な役割を果たしていることが示唆されている。というのはCdc25Bの再活性化が、DNA損傷細胞の細胞周期への再進入に極めて重要であるからである。本発明者らは既に、MAPKAPキナーゼ-2が、Cdc25BをSer323で直接リン酸化して、14-3-3結合部位を作ることが可能なことを示した。したがって本発明者らは、MAPKAPキナーゼ-2のシグナル伝達が、化学療法剤によるDNA損傷に応答時のCdc25Bと14-3-3の結合に必要か否かを調べた。ルシフェラーゼがノックダウンされた対照細胞およびMAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞を擬似処理するか、またはシスプラチン、カンプトテシン、もしくはドキソルビシンとインキュベートした。細胞溶解物を8時間後に調製し、組換え型のGST-14-3-3β/ζとインキュベートした。内因性のCdc25Bと14-3-3の結合は、イムノブロッティングで検出した。図14Cに示すように、ドキソルビシン処理もカンプトテシン処理も、ルシフェラーゼshRNA対照細胞において、Cdc25B上に安定な14-3-3結合部位の発生を誘導したが、シスプラチン曝露では誘導されなかった。しかしながら、14-3-3とCdc25Bの結合は、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞に由来する溶解物中には検出されなかった(図14C、下のパネル)。この結果は、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞において、トポイソメラーゼ阻害剤であるドキソルビシンによる処理後にG2/Mチェックポイントが喪失したことを示すパネルAの細胞周期試験とよく一致する。これらのデータは、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞における、化学療法によって誘導されるG2/Mチェックポイントの喪失が、少なくとも部分的には、Cdc25Bと14-3-3タンパク質の結合の喪失に起因する可能性が高いことを示している。
【００９２】
MAPKAPキナーゼ-2は、シスプラチン処理後のG1/Sチェックポイントの停止に必要である
ドキソルビシン処理細胞で見られるG2/Mチェックポイント応答とは対照的に、DNAの鎖内架橋剤であるシスプラチンによる処理によってU2OS細胞は、それ以後30時間を超える時間にわたって、細胞周期のG1期およびS期に顕著に蓄積した(図24C)。RNA干渉を使用して、この過程におけるMAPKAPキナーゼ-2の役割を調べた。ルシフェラーゼがノックダウンされた対照細胞は、shRNAを欠くU2OS細胞と同様に、シスプラチン曝露後に、G1およびSにおける同一の蓄積を示した(図15A、左のパネル)。シスプラチン処理の3時間後にルシフェラーゼノックダウン細胞にノコダゾールを添加しても、リン酸化ヒストンH3の染色によるモニタリングにより、有糸分裂細胞の出現はその後27時間を超える時間にわたって認められず(図15A、左下のパネル)、G1/Sチェックポイントが機能的に損なわれていないことがわかる。シスプラチン曝露前におけるMAPKAPキナーゼ-2の枯渇は、極めて大きく異なる結果を招いた。図15Aの右側のパネルからわかるように、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞は、シスプラチン処理後に、S期の細胞の総数が極めてわずかに増加した以外は、非処理細胞と類似の細胞周期プロファイルを示した。特に、シスプラチン添加の3時間後にノコダゾールを添加したところ、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞は、4N DNAを含むピークに蓄積し、約42%の細胞がリン酸化ヒストンH3に関して強く染色された。MAPKAPキナーゼ-2に対する第2の無関係のsiRNA配列で処理した細胞では同じ結果が得られた。MAPKAPキナーゼ-2の枯渇は、シスプラチン曝露後におけるChk1の活性化を損なわなかった(図15B)。これらのデータは、MAPKAPキナーゼ-2が、シスプラチンによって誘導されるG1/S停止に不可欠なこと、およびMAPKAPキナーゼ-2の喪失によってU2OS細胞が、シスプラチンによって誘導されるG1/Sチェックポイントの無効化を、活性化型のChk1の有無に関わらず可能として、有糸分裂に移行することを意味している。
【００９３】
MAPKAPキナーゼ-2は、シスプラチンによって誘導されるDNA損傷に応答時のCdc25Aの分解に必要である
G2/Mチェックポイント応答に関与するCdc25BおよびCdc25Cの、14-3-3が関与する隔離とは対照的に、G1期およびS期のチェックポイントは、Cdc25の別のイソ型であるCdc25Aのリン酸化依存性の分解によって大きく制御される。MAPKAPキナーゼ-2の枯渇が、G1/Sチェックポイント応答の喪失を招くという、本発明者らが得た観察を元に、本発明者らは、MAPKAPキナーゼ-2が、シスプラチンによって誘導されるDNA損傷後のCdc25Aの分解に必要か否かを調べた。ルシフェラーゼshRNA対照細胞、およびMAPKAPキナーゼ-2を枯渇した細胞をシスプラチンで処理し、および細胞溶解物を対象に、処理の8時間後および12時間後に、Cdc25Aに対するイムノブロッティングを行った(図15B)。Cdc25Aのレベルは、ルシフェラーゼがノックダウンされた対照細胞では、シスプラチン処理後に劇的に低下した。これとは対照的に、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞では、シスプラチン曝露後のCdc25Aのレベルは、わずかに低下しただけであり、非損傷細胞で見られるレベルと同等で変わらなかった。これらのデータは、MAPKAPキナーゼ-2の非存在下では、U2OS細胞が、シスプラチンによって誘導されるDNA損傷に応答時にCdc25Aを分解へ導く能力を欠くということを意味する。MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞がCdc25Aを分解できないという事実によって、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞がシスプラチン曝露後に持続的なG1/Sチェックポイントを確立できないことを説明できる可能性は高い。
【００９４】
DNA損傷に応答したCdc25Aの分解には、チェックポイントキナーゼによるCdc25Aの直接的なリン酸化が関与する。例えば、UV照射およびγ照射に反応して、Chk1はCdc25Aを、後のプロテオソームによるユビキチンが介在する分解を促す複数の部位においてリン酸化する。しかしながらChk1は通常は、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞でシスプラチン処理後に活性化される(図15B)。Chk1以外のChk2などの他のキナーゼは最近、Cdc25Aを、特定の条件でChk1と少なくとも複数の同じ部位をリン酸化可能なことが報告されている。さらに本発明者らは、MAPKAPキナーゼ-2によってリン酸化されるペプチドおよびタンパク質上の最適なアミノ酸配列モチーフが、Chk1およびChk2によってリン酸化された最適な配列モチーフと、ほぼ同一であることを明らかにした。したがって本発明者らは、Cdc25AがMAPKAPキナーゼ-2の直接の基質である可能性を調べた。組換え型のCdc25Aを、精製されたMAPKAPキナーゼ-2またはChk1とインビトロで32P-γ-ATPの存在下でインキュベートし、リン酸化をSDS-PAGE/オートラジオグラフィーでモニタリングした。図15Cに示すように、MAPKAPキナーゼ-2はCdc25Aをインビトロで、Chk1と同程度に効率的にリン酸化した。総合すると、これらの知見は、シスプラチン処理に応じたCdc25Aの分解が、MAPKAPキナーゼ-2によるCdc25Aの直接的なリン酸化を必要とすること、またはMAPKAPキナーゼ-2活性が、インビボでChk1をCdc25Aに標的輸送するために必要であることを示唆している。
【００９５】
MAPKAPキナーゼ-2の下方制御は、腫瘍細胞の化学療法に対する感受性を高める
図15A〜15Cおよび図16A〜16Dに示す実験は、MAPKAPキナーゼ-2が、シスプラチンおよびドキソルビシンに起因するG1/S停止およびG2/M停止に重要な役割を果たすことを示している。MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞における、これらのチェックポイントの欠損によって、これらの細胞の、化学療法の抗増殖作用および細胞毒性作用に対する感受性は高まる可能性がある。この可能性を探るために、対照U2OS細胞、またはMAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされたU2OS細胞を擬似処理するか、またはシスプラチンもしくはドキソルビシンと、これらの用量を増やしながら8時間インキュベートし、洗浄し、トリプシン処理を行い、および再プレーティングし、ならびに8日後にコロニー形成を調べた(図16A〜16B)。対照shRNAで処理された細胞と比較すると、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞は、シスプラチン処理およびドキソルビシン処理の両方に対して、特に比較的低い薬剤用量で劇的に高い感受性を示した(図16C〜16D)。例えば、10μMのシスプラチンまたは1μMのドキソルビシンのいずれかで処理したルシフェラーゼshRNA細胞は、非処理細胞で形成された数の約40%のコロニーを形成したが、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞では、同じシスプラチン処理およびドキソルビシン処理は、コロニーの数を、非処理細胞に見られる場合の、それぞれわずか4%および2%に減じた。
【００９６】
MAPKAPキナーゼ-2の不在も、インビボにおけるシスプラチンもしくはドキソルビシンの抗腫瘍原性作用を高める可能性があるか否かを明らかにするために、本発明者らは、対照siRNAもしくはMAPKAPキナーゼ-2のsiRNAを、H-Ras-V12によって形質転換されたp53-/- MEFに導入し、これを溶媒のみ、1μMのシスプラチン、または0.1μMのドキソルビシンのいずれかで処理後にヌードマウスに移植した。各個体には、MAPKAPキナーゼ-2のsiRNAをトランスフェクトした細胞の2回の注射(左脇腹)、および対照siRNAをトランスフェクトした細胞の2回の注射(右脇腹)を行い、腫瘍形成を15日目に評価した。図17Aの左側のパネルは、DNA損傷剤による処理を行わないと、全4回の注射が、15日後に固形の線維性腫瘍の形成を招くことを示す。一般に、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞の注射の結果として生じる腫瘍のサイズは、対照siRNAをトランスフェクトした細胞に由来する腫瘍のサイズより大きかった(図17A、図17B、および図17D)。対照siRNAをトランスフェクトした細胞を、移植前にシスプラチンまたはドキソルビシンのいずれかで前処理しても腫瘍形成は防げなかった。しかしながら、結果として生じた腫瘍は、非処理細胞によって形成された腫瘍のサイズおよび重量の約35%に減じていた(図17Aおよび図17D)。シスプラチンまたはドキソルビシンのいずれかによる処理前におけるMAPKAPキナーゼ-2の枯渇は、腫瘍の形成を完全に除去し(図17A、図17C、および図17D)、培養物に見られる、これらの細胞の化学療法剤に対する感受性の増大が、細胞が正常組織の微小環境内で成長させた場合にも維持されていたことがわかる。
【００９７】
最後に本発明者らは、MAPKAPキナーゼ-2の枯渇の化学感受性作用が、既存の腫瘍を後に化学療法剤で処理した場合にも観察されるか否かを調べた。この実験では、H-Ras-V12によって形質転換されたp53-/- MEFに、レンチウイルス輸送系を使用して、マウスのU6プロモーターから発現される対照ルシフェラーゼshRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2に特異的なshRNAを安定にトランスフェクトした(図18A)。レンチウイルスの輸送ベクターは、CMVプロモーターの制御下でGFPもコードするので、shRNA発現細胞のFACSベースの初期の選択、ならびにインサイチューにおける、このような遺伝的に改変された細胞から生じる腫瘍の蛍光検出が可能となる。腫瘍は、106個の細胞をヌードマウスの脇腹に注射することで誘導した。12日後に直径が約1 cmの腫瘍が全ての注射部位に形成され、シスプラチン、ドキソルビシン、または溶媒による処理を開始した(図18B)。DNA損傷剤による処理を行わない場合には、これらの動物の右脇腹におけるMAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞から生じる腫瘍は、左脇腹におけるルシフェラーゼshRNA対照細胞に由来する腫瘍より大きく成長した(図18B〜18C)。シスプラチンもしくはドキソルビシンによる処理後に、対照腫瘍はサイズの極めてわずかな縮小か、または緩やかな継続的な成長のいずれかを示した(図18B)。これとは対照的に、MAPKAPキナーゼ-2を欠く腫瘍には、重量および直径の両方について劇的な減少・短縮が見られた(図18Bおよび図18D)。MAPKAPキナーゼ-2を欠く腫瘍は、シスプラチン処理時には、それ以後14日間で1.3 cm〜0.4 cm縮小し、ドキソルビシン処理時には1.4〜0.5 cm縮小した。
【００９８】
FACS解析で観察されたG1/SチェックポイントおよびG2/Mチェックポイントの喪失、ならびに有糸分裂関連ホスファターゼであるCdc25AおよびCdc25Bの調節異常を総合すると(図14A〜14Cおよび図15A〜15C)、これらのデータは、MAPKAPキナーゼ-2活性の抑制が、インビトロおよびインビボにおける遺伝毒性ストレスに対する細胞の感受性の増大をもたらすことの強力な証拠となる。この結果には、潜在的な治療的重要性がある。というのは、低分子阻害剤でMAPKAPキナーゼ-2を標的とすれば、従来の化学療法剤に対する腫瘍細胞の感受性の増大がもたらされるはずであることを示唆しているからである。
【００９９】
MAPKAPキナーゼ-2およびChk1は独立に活性化される
本発明者らが観察した、シスプラチン、カンプトテシン、ドキソルビシン、およびUV照射によるMAPKAPキナーゼ-2の活性化は、Chk1に関して報告された活性化プロファイルに酷似している。同様に、これらのDNA損傷性刺激後に、MAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞で見られる、損なわれたG1/SチェックポイントおよびG2/Mチェックポイントは、Chk1欠損細胞に関して報告された結果と、ある程度の類似性がある。このような表現型上の類似性を受けて、本発明者らは、Chk1およびMAPKAPキナーゼ-2の活性化が総合に独立であるか否かを、さらに調べることにした。図14Bおよび図15Bに示すように、シスプラチンおよびドキソルビシンに応じたChk1の活性化は、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞では損なわれなかった。したがって本発明者らは、逆の可能性、すなわちDNA損傷後のMAPKAPキナーゼ-2の活性化がChk1に依存するか否かを調べた。U2OS細胞から、siRNAを使用してChk1を除去し、シスプラチンおよびドキソルビシンに曝露し、MAPKAPキナーゼ-2の活性化を解析した。図19に示すように、MAPKAPキナーゼ-2のリン酸化/活性化は、これらのDNA損傷剤による処理後に、Chk1の有無に関わらず、通常通りに生じた。したがって、遺伝毒性ストレス後のMAPKAPキナーゼ-2およびChk1の活性化は相互に独立に生じるようである。
【０１００】
MAPKAPキナーゼ-2によるDNA損傷チェックポイント表現型はChk1の過剰発現によって人工的に救済できる
Chk1およびMAPKAPキナーゼ-2が同じ最適な配列モチーフをリン酸化し、一連の重複する基質を標的とし、および相互に独立に活性化されるという観察から、本発明者らは、MAPKAPキナーゼ-2の喪失が、哺乳類細胞におけるChk1の過剰発現によって救済されるか否かを調べるための遺伝学的実験を行うことにした(図20A〜20E)。この実験では、ルシフェラーゼのshRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2のshRNAを発現する細胞に、哺乳類のChk1発現コンストラクトを、または空のベクター対照を一過的にトランスフェクトした(図25)。トランスフェクションの30時間後に細胞をシスプラチン、ドキソルビシン、またはUV照射に曝露し、さらに30時間後に回収し、および細胞周期の進行をFACSで解析した。1つの一連の実験では、任意の細胞について細胞周期を進行させて有糸分裂において停止させるために、化学療法剤の添加またはUV照射の3時間後に培地にノコダゾールを添加した。
【０１０１】
本発明者らが過去に観察した結果と矛盾することなく、空のベクターDNAをトランスフェクトしたルシフェラーゼshRNA対照細胞は、シスプラチン(図20A)およびUV照射(図26)の曝露後にG1/S停止を生じ、ならびにドキソルビシンに反応して顕著なG2停止を示した(図20B)。このような細胞周期プロファイルには、ルシフェラーゼshRNA細胞にChk1をトランスフェクトしても変化は認められなかった。空のベクターDNAをトランスフェクトしたMAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞は、ノコダゾールを培地に添加時に両チェックポイントを突破して有糸分裂期で蓄積した(図20A〜20B)。しかしながら、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞におけるChk1の過剰発現は、遺伝毒性ストレス後に機能性チェックポイントを確立する能力を完全に回復させた。こうして細胞は、シスプラチンおよびUV照射に反応してG1/Sで停止し、ならびにドキソルビシン処理後はG2で停止した(図20Aおよび図20B、ならびに図26の最も右側のパネル)。これらのMAPKAPキナーゼ-2を枯渇させた、Chk1を過剰発現する細胞の成長培地へのノコダゾールの添加は、リン酸化ヒストンH3陽性細胞の数を増加させなかった。したがってChk1の過剰発現は、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞が、遺伝毒性ストレス後に細胞周期を進行することを妨げた。
【０１０２】
本発明者らは、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞における、Chk1によるG1/SチェックポイントおよびG2/Mチェックポイントの人工的救済(synthetic rescue)が、化学療法剤処理に対する感受性の低下にも十分か否かを調べた。Chk1またはベクターのみをトランスフェクトした、ルシフェラーゼおよびMAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞を擬似処理するか、もしくはシスプラチンおよびドキソルビシンの用量を増加させながら8時間インキュベートするか、または20 J/m2のUV光を照射した。細胞を洗浄し、トリプシン処理を行い、再プレーティングし、8日後に、既に説明した手順でコロニー形成を調べた(図27〜28)。図20C〜20Eに要約したように、空の対照ベクターをトランスフェクトしたMAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞は、シスプラチン、ドキソルビシン、およびUVによる抗増殖作用に対して感受性の増大を示した。これらのMAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞におけるChk1の過剰発現は、クローン原性生存を、野生型レベルのMAPKAPキナーゼ-2を含む対照細胞に関して見られるレベルと区別できないレベルまで回復させた。
【０１０３】
UCN-01はChk1およびMAPKAPキナーゼ-2の両方の強力な阻害剤である
スタウロスポリン誘導体である7-ヒドロキシスタウロスポリン/UCN-01はChk1を、Chk2と比較して約1000倍低いIC50で阻害するので、Chk1特異的阻害剤として実験で使用されている。しかしながら、強力な状況的証拠から、UCN-01が、細胞周期の制御に関与する他のキナーゼを、Chk1阻害試験に使用時と同等の濃度で阻害することが示唆されている。例えばChk1枯渇細胞は、Ser-216におけるCdc25Cのリン酸化を、非同期性の成長中でもγ照射後でも維持する。同部位におけるリン酸化は、細胞を低用量のUCN-01(約300 nM)で処理すると失われることから、Chk1以外の、UCN-01が阻害可能なキナーゼがCdc25Cのリン酸化に関与することがわかる。MAPKAPキナーゼ-2が重要なチェックポイント調節因子であるという本発明者らが得た知見を元に、UCN-01がMAPKAPキナーゼ-2を、Chk1阻害実験で典型的に使用される用量で阻害するか否かを本発明者らは調べた。インビトロキナーゼアッセイ法を、Cdc25BおよびCdc25C中の14-3-3結合配列と類似したコアコンセンサス配列LQRQLSI(SEQ ID NO: 16)を有する最適なペプチド基質を使用して、Chk1およびMAPKAPキナーゼ-2を対象に、さまざまな濃度のUCN-01の存在下で実施した。図21Aに示すように、UCN-01は両キナーゼを、Chk1については約35 nMのIC50値で、およびMAPKAPキナーゼ-2については約95 nMのIC50値で強力に阻害した。Chk1について本発明者らが測定したIC50値は、過去に公開されたデータとよく一致している。重要な点は、MAPKAPキナーゼ-2について本発明者らが測定したIC50値が、「Chk1特異的な」チェックポイント抑止アッセイ法(checkpoint abrogation assay)に使用されるUCN-01の濃度より有意に低いことであり、このような試験で用いられる条件では、Chk1とMAPKAPキナーゼ-2の両方が阻害されることが示唆される。
【０１０４】
UCN-01によるMAPKAPキナーゼ-2の阻害の構造的基礎を調べるために、MAPKAPキナーゼ-2:UCN-01複合体の構造を、公開されたMAPKAPキナーゼ-2:スタウロスポリン構造から得られる座標を使用してモデル化し、得られた結果を、Chk1:UCN-01の共結晶構造と比較した(図21B)。図21Bのパネル2、パネル3、およびパネル5からわかるように、UCN-01の7-ヒドロキシ部分は、MAPKAPキナーゼ-2:スタウロスポリン構造中に容易に納まることが可能であり、その最も近い近傍の残基は、Val118(Cγ2まで2.8Å)、Leu141(Cδ1まで3.2Å)、およびThr206(Cγ2まで3.6Å)となる。立体障害がないこと、およびモデル化されたMAPKAPキナーゼ-2:UCN-01の構造がChk1:UCN-01構造に対して全体的に似ていること(図21Bのパネル1およびパネル4)は、生化学的に観察された緊密な結合が構造的に妥当である論拠となる。
【０１０５】
MAPKAPキナーゼ-2が、細胞内におけるUCN-01の直接の標的であることを検証するために、本発明者らは、p38 MAPK/MAPKAPキナーゼ-2経路を活性化する刺激の1つである熱ショックの後に、MAPKAPキナーゼ-2に特異的な基質であるhsp-27のリン酸化を測定した。ルシフェラーゼのshRNAを発現する対照U2OS細胞、またはMAPKAPキナーゼ-2のshRNAを発現するU2OS細胞を、250 nMのUCN-01の存在もしくは非存在下で42℃または37℃で2時間インキュベートし、およびhsp-27のリン酸化を、よく知られたMAPKAPキナーゼ-2のリン酸化部位であるpSer82に対する抗体を使用したイムノブロッティングでモニタリングした。図21Cは、対照ルシフェラーゼshRNA細胞を42℃で維持した時のhsp-27のリン酸化を示す(レーン1)。このリン酸化は、UCN-01処理によって完全に消失した(レーン2)。42℃で維持された、MAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞では、UCN-01の有無に関わらずリン酸化は認められなかった(レーン3、4)。同様に、UCN-01処理を実施または非実施の条件で37℃で維持された対照ノックダウン細胞とMAPKAPキナーゼ-2ノックダウン細胞のいずれにおいてもシグナルは認められなかった(レーン5〜8)。さらに熱ショックは、hsp-27のSer-82におけるリン酸化の促進に同等に有効であり、およびUCN-01は、Chk1を枯渇させた細胞における、Ser-82におけるリン酸化のブロッキングに同等に有効であった(図21D、レーン1〜4)。したがって、インビボにおけるMAPKAPキナーゼ-2のUCN-01による阻害はChk1の機能に依存しない。この知見は、UCN-01が、細胞内におけるMAPKAPキナーゼ-2の直接の阻害剤であることの強力な証拠となり、およびUCN-01が、おそらくChk1およびMAPKAPキナーゼ-2を含む2つの平行してはいるが重複していないチェックポイント経路の同時阻害によって、癌の治療に臨床的に有効であることが示唆される。
【０１０６】
MAPKAPキナーゼ-2のシグナルの伝達経路が破壊されると、機能性のChk1応答の存在下であっても、化学療法に対する応答が促進されることから、およびMAPKAPキナーゼ-2ノックアウトマウスが、Chk1ノックアウトマウスとは対照的に生存可能なことから、本発明者らの得た結果は、MAPKAPキナーゼ-2に特異的な阻害剤が、望ましくない副作用のほとんどない重要な臨床上の利益をもたらす可能性があることが示唆される。いずれの場合も、本発明者らが今回得たデータは、臨床に使用可能なMAPKAPキナーゼ-2阻害剤を有用な抗癌剤として開発することを強く支持する。p53欠損細胞がS期内チェックポイントおよびG2/Mチェックポイントの経路に依存することを考えれば、MAPKAPキナーゼ-2を標的とすることは、このようなタイプのヒト癌を治療する際に特に有効な方法であると考えられる。
【０１０７】
MAPKAPキナーゼ-2が果たす役割のモデル
本発明者らが得たデータは、UVによって誘導されるDNA損傷に応答してp38 SAPKが果たす重要な役割が、14-3-3結合と、それ以後の細胞周期の停止を誘導する、Cdc25ファミリーの成員のMAPKAPキナーゼ-2によって誘導されるリン酸化に至る、MAPKAPキナーゼ-2のリン酸化および活性化であることを示している。このようにMAPKAPキナーゼ-2は、細胞の電離放射線照射の曝露後にChk1およびChk2が果たす役割と同様に、UV-Cによって誘導されるDNA損傷後に類似の機能を果たす。
【０１０８】
MAPKAPキナーゼ-2は、核内で最初の活性化を受けた後に、活性キナーゼが細胞質へ輸送される。したがってMAPKAPキナーゼ-2は、DNA損傷に応じたCdc25B/Cのリン酸化の核内開始因子として、かつCdc25B/Cを細胞質内で阻害された状態で保つ維持キナーゼとして機能するために好位置にある。キナーゼ依存性のDNA損傷チェックポイントに関する統合モデルを図7に示す。電離放射線照射に応答して、ATMによるChk2の活性化、およびATRによるChk1の活性化は、チェックポイントキナーゼのコアモチーフLXRXX[S/T][疎水性残基](SEQ ID NO: 18)に対応する関連配列上における、Cdc25ファミリーの成員のリン酸化に至る。同様に、UVによって誘導されるDNA損傷に応答して、ATRはChk1を活性化し、およびp38 SAPKはMAPKAPキナーゼ-2を活性化し、Cdc25ファミリーの成員上の同じコアモチーフのリン酸化に至る。Chk1の果たす主な役割は、IR後のCdc25Aのリン酸化に関与するようである。一方でChk2は、Cdc25ファミリーの全3種類の成員をリン酸化するようである。Chk2の非存在下では、Chk1は、この機能の少なくとも一部を包含することが可能なようである。本発明者らが今回得たデータは、MAPKAPキナーゼ-2が、UV-C曝露後にCdc25B/Cを標的とする主要なエフェクターキナーゼであることを意味する。MAPKAPキナーゼ-2はCdc25Aのリン酸化に関与する可能性もある。というのは、G1チェックポイントおよびS期チェックポイントが、MAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされた細胞では除去されることを本発明者らが観察したからである。
【０１０９】
本明細書に示した結果は、Chk1およびMAPKAPキナーゼ-2の両方の活性が、DNA損傷性の化学療法およびUV照射に応じたG1/SおよびG2/Mにおける細胞周期の停止に必要であることを意味する(図22)。システムレベルでは、これらの結果は、正常なDNA損傷チェックポイント応答が、専用のDNA損傷応答経路(すなわちChk1)、および潜在的に、より全体的なストレス応答経路(MAPKAPキナーゼ-2)の協調した作用を含むことを示唆している。これらの個々の経路から生じる個々のキナーゼ活性は、組み合わされて損傷後に細胞周期を停止させるのにちょうど十分であり、おそらくDNA損傷が修復されると速やかなチェックポイントの開放を促すレベルにあると測定されている（titered）ようである。この仮説と矛盾することなく、Chk1の過剰発現は、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞で観察される、G2/MおよびG1/Sの両方の細胞周期チェックポイントの欠損を救済した。
【０１１０】
実験手順
化合物、抗体、および薬剤
UCN-01は、R. Schultz, Drug Synthesis and Chemistry Branch, Developmental Therapeutics Program, Division of Cancer Treatment and Diagnosis, NationalCancer Institute (Bethesda, MD)から供与を受けた。シスプラチン、ドキソルビシン、およびカンプトテシン、ピューロマイシン、およびグルタチオンビーズはSigma-Aldrichから購入した。ヨウ化プロピジウムはCalbiochemから購入した。全MAPKAPキナーゼ-2およびこのリン酸化型、p38 MAPK、Chk1、Chk2、ATM/ATR基質、hsp-27、およびp53(pS20)に対する抗体はCell Signaling Technology (Beverly, MA)から購入した。β-アクチンおよび5-ブロモ-2-デオキシウリジン(BrdU)に対する抗体はSigma-Aldrichから購入し；抗Cdc25A抗体(MS-640-P1、カクテル)はNeoMarker(Fremont, CA)から；抗Cdc25B抗体はTransduction Labsから、抗GST抗体はAmersham/GE Healthcareから、および抗リン酸化ヒストンH3抗体はUpstateからそれぞれ購入した。活性型MAPKAPキナーゼ-2はUpstateから購入した。ヨウ化プロピジウム(PI)はCalbiochemから購入し、アミロースビーズはNew England Biolabsから購入し、Ni-NTAアガロースはQIAGENから購入し、ならびにグルタチオンビーズおよびBrdUはSigma-Aldrichから購入した。
【０１１１】
細胞培養
U2OS細胞、HeLa細胞、U87MG細胞、およびH-Ras-V12によって形質転換されたp53-/- MEFは、10% FCSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEMで37℃で、5% CO2循環の加湿インキュベーター内で培養した。GM05849 A-T線維芽細胞、および対応する対照GM00637線維芽細胞、ならびにGM18366 ATRを欠く、ゼッケル症候群の線維芽細胞、および対応する対照GM00023線維芽細胞は、Coriell細胞バンクから入手し、ならびにEagleの塩類、10% FCS、およびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したMEMで培養した。
【０１１２】
組換えタンパク質の精製
GST融合タンパク質およびMBP融合タンパク質をコードするコンストラクトで、大腸菌のDH5α株またはBL21(DE3)株を形質転換し、および組換えタンパク質を、0.4 mMのIPTGで37℃で3〜5時間処理することで、対数増殖期後期の細胞を誘導することで得た。細胞を、50 mM Tris-HCl, pH 7.5、250 mM NaCl、1 mM DTT、8μg/mLペプスタチン、8μg/mLアプロチニン、および8μg/mLロイペプチンを含む溶解緩衝液中で超音波処理して溶解した。融合タンパク質を細胞溶解物から、アミロースビーズまたはグルタチオンビーズを使用して精製した。0.5% NP-40を含むPBSで十分に洗浄し、PBSで最終洗浄後に、融合タンパク質を、40 mMマルトースまたは20 mMグルタチオンを含むHEPES, pH 7.2でビーズから溶出後に、2つの（duplicate）Sephadex G-25カラム(NAP-10カラム、Pharmacia)を使用してPBSに交換した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸アッセイ法(Pierce)により、製造業者の推奨する手順で、BSAを標準として使用することで決定した。pFASTBAC上の完全長のChk1-GSTまたは完全長のChk2-His6をSf9昆虫細胞で発現させた。Chk1を発現する細胞を、50 mM Tris-HCl, pH 7.5、250 mM NaCl、1 mM DTT、1.0% NP-40、8μg/mLペプスタチン、8μg/mLアプロチニン、8μg/mLロイペプチン、2 mM Na3VO4、10 mM NaF、および1μMマイクロシスチンを含む緩衝液中で溶解し、ならびにChk1をグルタチオンビーズを使用して精製した。Chk1を、50 mM Tris-HCl, pH 8.0中の10 mMグルタチオンでビーズから溶出し、キナーゼ緩衝液で透析を行った。Chk2を発現する細胞を、50 mM Tris-HCl, pH 7.5、250 mM NaCl、1 mM DTT、1.0% NP-40、8μg/mLペプスタチン、8μg/mLアプロチニン、8μg/mLロイペプチン、2 mM Na3VO4、10 mM NaF、および1μMマイクロシスチンを含む緩衝液中で溶解し、ならびにChk2をNi-NTAアガロースビーズを使用して精製した。40 mMイミダゾールを含む溶解緩衝液で十分に洗浄した後に、Chk2を50 mM Tris-HCl, pH 8.0中の100 mMイミダゾールでビーズから溶出し、キナーゼ緩衝液で透析を行った。
【０１１３】
点突然変異を、Stratagene Quick Change Mutagenesis Kitを使用して導入し、コード領域全体の配列を決定して確認した。
【０１１４】
指向性ペプチドライブラリーおよびインビトロキナーゼアッセイ法によるキナーゼモチーフのスクリーニング
当業者であれば本発明の方法で、ペプチドライブラリーのスクリーニングを使用して、p38 SAPKポリペプチド、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチド、または他の生物学的に重要な標的と結合するペプチドを同定できると考えられる。このようなスクリーニングで同定されたペプチド、または関連化合物は、例えばMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの生物学的活性を阻害する能力のために、治療上の利益を有する可能性があると考えられる。
【０１１５】
コンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニングを、組換え型の精製済みのp38α SAPK、MK2、Chk1、およびChk2を使用して、一部改変した文献記載の手順で実施した(Songyang and Cantley, Methods Mol. Biol., 87:87-98, 1998)。簡単に説明すると、5.0μgの組換え型のp38α SAPK、3.0μgのMK2、2.0μgのChk1、および2.0μgのChk2を、1 mgの各ペプチドライブラリーと、20 mM HEPES, pH 7.5、10 mM MgCl2、3 mM 2-メルカプトエタノール、および2.5μCiの32P-γ-ATPを含む100μM ATPを含む300μlの反応容量中で30℃で120分間インキュベートした。この条件で、約1%のペプチド混合物がリン酸化された。同反応混合物を、300μlの30%酢酸を添加して希釈し、およびリン酸化されたペプチドを、取り込まれなかった32P-γ-ATPから、30%酢酸を含むアイソクラティック溶離で、DEAEカラムクロマトグラフィー(ベッド容量1 ml)によって分離した。ペプチド混合物(リン酸化型と非リン酸化型の両方を含むがATPは含まない)は、カラムの600μlの空隙容量に続く最初の1 ml以内で溶出された。試料をSpeed-Vac装置内で乾燥した。
【０１１６】
p38α SAPKのペプチドライブラリーの実験では、試料を、1 M NaClを含む200μlの50 mM MES, pH 5.5に再懸濁した。リン酸化されたペプチドと非リン酸化ペプチドは、鉄(ferric)-イミノ二酢酸ビーズを使用したIMACで分離した。0.5 mlのイミノ二酢酸カラムに、2.5 mlの20 mM FeCl3を充填し、H2Oで十分に洗浄後に、3 mlの500 mM NH4HCO3, pH 8.0、3 mlのH2O、および3 mlの50 mM MES(pH 5.5)/1 M NaClで洗浄した。ペプチド混合物をアプライし、カラムを3 mlの50 mM MES, pH 5.5、1 M NaClと、これに続く4 mlのH2Oで展開して（develop）、非リン酸化ペプチドを除去した。次に、リン酸化されたペプチドを、2 mlの500 mM NH4HCO3, pH 8.0で溶出し、Speed-Vac装置内で乾燥して80μlのH2Oに再懸濁した。
【０１１７】
好塩基性キナーゼ指向ライブラリーを使用したペプチドライブラリーのスクリーニングは、ペプチド配列決定に先立つ、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)段階中にリン酸化ペプチドと同時に精製される非リン酸化型のAsp/Gluに富むペプチドの高いバックグラウンドのために複雑であり、解析を極めて込み入ったものとする。この問題を克服するために本発明者らは、最初にペプチドライブラリーを対象キナーゼでリン酸化し、次に塩酸メタノールで処理して、Asp残基およびGlu残基を無荷電性のメチルエステルに変換する新たな方法を開発した。この方法によって、IMACカラムに吸着する非リン酸化ペプチドのバックグラウンドは、有意でないレベルまで減じた。さらにAspおよびGluのメチルエステルは配列決定反応中に、それらの遊離の酸に再び変換されたので、これらの残基が、リン酸化モチーフ中に存在するならば、これらの残基の選択が可能となり、正確な測定が可能となった。
【０１１８】
MAPKAPキナーゼ-2、Chk1、およびChk2のペプチドライブラリー実験では、40μlの塩化チオニルをフード内で1 mlの乾燥メタノールに滴下して添加した。次に同溶液を使用して、個々の乾燥ペプチドライブラリーを溶解した後に、室温で1時間、攪拌した。ペプチドライブラリーを一晩かけて乾燥し、メタノール/アセトニトリル/水の1:1:1混合液(100μl)に再懸濁した。0.5 mlのイミノ二酢酸カラムに2.5 mlの20 mM FeCl3を充填し、H2Oで十分に洗浄後、3 mlの500 mM NH4HCO3(pH 8.0)、3 mlのH2O、および3 mlの50 mM MES, pH 5.5、1 M NaClで洗浄した。ペプチド混合物をアプライし、カラムを4 mlのH2Oと、これに続く3 mlのNH4HCO3, pH 8.0で展開して非リン酸化ペプチドを除去した。リン酸化ペプチドを、2 mlの500 mM NH4HCO3, pH 11.0で溶出し、Speed-Vac装置内で乾燥して40〜80μlのH2Oに再懸濁した。
【０１１９】
IMACによる精製後に、ライブラリー(0.5〜1.5 nmole)を対象に自動エドマン配列決定を、Applied Biosystemsのモデル477Aペプチドシーケンサーを使用して行った。データの解析は、リン酸化ペプチド混合物中の各アミノ酸の量(mol-%)を、開始時のライブラリー中に存在する量に対して標準化することで実施した。最終的な優先比(preference ratio)の合計を、特定のアミノ酸が特定の位置における選択性がない場合では1の優先値を有するように、ペプチドライブラリー内の縮重位置にあるアミノ酸の総数に対して標準化した。p38 MAPキナーゼ、MK2、Chk1、およびChk2による、インビトロにおけるキナーゼスクリーニングに使用した縮重ペプチドライブラリーは、XはCys、Ser、Thr、およびTyrを除く全てのアミノ酸である配列GAXXXXSPXXXXAKKK[SPライブラリー](SEQ ID NO: 19)；XはCysを除く全てのアミノ酸であるGAXXXXPXSPXXXXXAKKK[PxSPライブラリー](SEQ ID NO: 20)；またはXはCys、Ser、Thr、およびTyrを除く全てのアミノ酸であるGAXXXXRXXSXXXXAKKK[RxxSライブラリー](SEQ ID NO: 21)からなる。全てのライブラリーにおいて、SはSerを示し、PはProを示し、およびRはArgを示す。
【０１２０】
2.0μgの組換え型のp47もしくはCdc25B基質タンパク質、または特定の量のペプチド、および0.10μgの組換え型p38α SAPK、もしくは0.03μgの組換え型MAPKAPキナーゼ-2を含む、30μlのキナーゼ反応緩衝液(20 mM HEPES, pH 7.5、10 mM MgCl2、3 mM 2-メルカプトエタノール、100μg/ml BSA、50μM ATP、10μCi 32P-γ-ATP)を対象としたキナーゼ反応を30℃で所定の時間行った。p38の最適なペプチド、およびp47phoxペプチドの配列はそれぞれ、KKAZGPQGPQSPIE (SEQ ID NO: 22)とKKAZGPQSPGSPLE(SEQ ID NO: 23)である。p38またはMAPKAPキナーゼ-2によるインビトロにおけるリン酸化後の、Cdc25Bの14-3-3プルダウンでは、2.0μgのCdc25Bを10倍過剰の14-3-3-MBPとインキュベートし、オートラジオグラフィーで解析した。動態測定では、反応を、等量の0.5パーセントリン酸を添加することで停止させ、5μlをp81ペーパー上にスポットした。このp81ペーパーを0.5パーセントのリン酸で5回洗浄し、シンチレーション計数用のシンチレーション液に添加した。インビトロにおけるリン酸化反応では、等容積の試料緩衝液を添加して反応を停止させた後に、95℃で3分間、加熱した。試料をSDS-PAGEで解析後にニトロセルロースに転写し、オートラジオグラフィーおよびイムノブロッティングを行った。p38αによる、単離されたペプチド、および完全長のp47phoxタンパク質のリン酸化の速度を、100μM、400μM、および1400μMのペプチド濃度、ならびに1μM、5μM、10μM、および15μMのタンパク質濃度を使用して、シンチレーションの計数によって、5分、10分、および20分の時点で決定した。MAPKAPキナーゼ-2によるMK2チドのリン酸化は、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM、500μM、および1000μMのペプチド濃度を使用して、3分、6分、9分、および12分の時点で実施した。これらの酵素学的試験から、次にKm、Vmax、およびVmax/Kmの値を確認した。全ての動態実験は、最低3回実施した。Km値およびVmax値を決定する各実験条件では、本発明者らは、反応速度が、全基質濃度について時間に関して直線的であること、ならびに10%未満の基質がリン酸化されていたことを検証した。
【０１２１】
UCN-01のIC50を決定するインビトロキナーゼアッセイ法を、20 mM HEPES(pH 7.5)、10 mM MgCl2、3 mM 2-メルカプトエタノール、100μg/ml BSA、50 mM ATP、10μCi 32P-γ-ATP、および50μM MK2チド基質を含む30μlの反応物を対象に30℃で20分間かけて実施した。Chk1は0.3μMの濃度で使用し；MAPKAPキナーゼ-2は0.1μMの濃度で使用した。反応を、等容積の0.5%リン酸を反応物に添加して停止させ、5μlをP81ペーパー上にスポットした。0.5%リン酸で5回洗浄後に、試料を対象に、シンチレーションの計数を行った。Cdc25Aのリン酸化試験は、W. Harper博士(Harvard Medical School)から供与されたpCMV GST-Cdc25AをトランスフェクトしたHEK293T細胞から免疫沈殿させたGST-Cdc25Aを使用して実施した。簡単に説明すると、HEK293T細胞に、既に説明したリン酸カルシウム法で、pCMV GST-Cdc25Aコンストラクトをトランスフェクトした。36時間後に細胞を回収し、50 mM Tris-HCl, pH 7.8、150 mM NaCl、1.0% NP-40、5 mM EDTA、2 mM DTT、8μg/mlペプスタチン、8μg/mlアプロチニン、8μg/mlロイペプチン、2 mM Na3VO4、10 mM NaF、および1μMマイクロシスチンを含む緩衝液で溶解し、遠心分離して清澄化した。上清は、プロテインGビーズで1時間かけて予備的に清澄化した。GST-Cdc25Aを、50μlのGSHビーズ(Sigma-Aldrich)を使用して沈殿させた。ビーズをキナーゼ緩衝液で5回洗浄後に、キナーゼ反応に使用した。キナーゼ反応は、0.3μM Chk1および0.1μM MAPKAPキナーゼ-2を使用して、50μlのキナーゼ反応緩衝液中で実施した。反応を30℃で20分間行い、50μlの2x試料緩衝液を添加して反応を停止させた。試料を95℃で3分間、加熱し、12.5% SDS-PAGEで分離し、ホスホイメージャー(Molecular Dynamics)を使用して可視化した。
【０１２２】
14-3-3プルダウンアッセイ法、イムノブロッティング、および免疫蛍光
U2OS細胞を、溶解緩衝液(50 mM Tris/HCl, pH 7.8、150 mM NaCl、1.0% NP-40、5 mM EDTA、2 mM DTT、8μg/mLペプスタチン、8μg/mLアプロチニン、8μg/mLロイペプチン、2 mM Na3VO4、10 mM NaF、1μMマイクロシスチン)で4℃で20分間かけて溶解した。清澄化済みの溶解物(0.5〜2 mgのタンパク質)を、それぞれ10〜20μgの14-3-3-GSTまたは14-3-3-MBPを含む20μlのグルタチオンビーズまたはアミロースビーズと4℃で120分間インキュベートした。洗浄後に、溶解物、およびビーズに結合した状態のタンパク質をSDS-PAGEで解析し、続いてPVDF膜に転写し、所定の抗体によるイムノブロッティングを行った。免疫蛍光実験では、U2OS細胞を18 mm2のカバースリップ上に播き、照射するか、または擬似処理を行い、固定し、抽出し、および文献に記載された手順で免疫染色を行った(Clapperton et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 11:512-518, 2004)。
【０１２３】
FACS解析
UV照射を、Stratalinker 2400 (Stratagene)を使用して254 nm (UV-C)で行った。U2OS細胞を70%エタノールで-20℃で一晩かけて固定し、0.2% Triton X-100を含むPBSで4℃で20分間かけて透過処理を行い、PBS中の2% FBSでブロッキング処理を行い、および106個の細胞あたり1μgの抗リン酸化ヒストンH3と氷上で60分間インキュベートした。洗浄後に細胞を、FITC結合ヤギ抗ウサギ抗体(希釈率1:500)と氷上で30分間インキュベートし、洗浄し、50μg/mlのPIを含むPBSに20分間かけて再懸濁後に、直ちにFACS解析を行った。解析は、Becton DickinsonのFACS装置をCellQuestソフトウェアとともに使用して実施した。
【０１２４】
BrdU取り込み実験では、細胞を30μMのBrdUと所定の時間インキュベートした後に固定し、上記の手順で透過処理を行った。細胞を2 N HClで室温で20分間かけて変性させ、0.1 MのNa2B4O7(pH 8.5)で中和し、PBS中の2% FBSでブロッキングし、およびマウス抗BrdU抗体と氷上で60分間インキュベートした。洗浄後の細胞を上記の手順で、FITC結合ヤギ抗マウス抗体およびPIとインキュベートした。解析は、Becton DickinsonのFACS装置をCellQuestソフトウェアとともに使用して行った。
【０１２５】
クローン原性生存アッセイ法
細胞を擬似処理するか、またはドキソルビシンもしくはシスプラチンと、これらの用量を増加させながら処理した。処理を開始してから8時間後に、細胞を成長培地で3回、およびPBSで3回洗浄し、トリプシン処理を行い、および5000細胞/10 cm2ディッシュの濃度となるように再プレーティングした。8日後に細胞を固定し、0.1%クリスタルバイオレット(Sigma-Aldrich)で染色した。50個を上回る細胞を含むコロニーを数え、生存フラクションを非処理細胞に対して標準化することで判定した。実験は3回行い、平均値と、エラーバーで示す標準偏差をプロットした。
【０１２６】
マウスの腫瘍モデル
インビボ腫瘍形成アッセイ法には、H-Ras-V12によって形質転換されたp53-/- MEFを使用した。細胞に、GFPまたはマウスのMAPKAPキナーゼ-2に対するsiRNAオリゴヌクレオチドを48時間かけてトランスフェクトした後に擬似処理するか、または0.1μMのドキソルビシン、もしくは1μMのシスプラチンと8時間とインキュベートし、成長培地で3回、PBSで3回洗浄し、トリプシン処理を行い、およびPBS中107細胞/mlの濃度となるように再懸濁した。106個の細胞をヌードマウス(Ncr nu/nu, Taconic)の脇腹の皮下に注射した。
【０１２７】
腫瘍退縮アッセイ法では、H-Ras-V12によって形質転換されたp53-/- MEFに、MAPKAPキナーゼ-2またはルシフェラーゼのいずれかを標的とするshRNAをコードするレンチウイルス輸送ベクターを安定にトランスフェクトした。106個の細胞を、上記と同様にヌードマウスの脇腹に注射し、腫瘍を12日間かけて形成させた。次にマウスを、シスプラチン(2 mg/kg、腹腔内投与、週3回)、またはドキソルビシン(4 mg/kg、腹腔内投与、週3回)のいずれかで処理し、計26日間のモニタリング後に殺した。腫瘍の直径を、成長中に定期的に測定し、エンドポイントにおいて腫瘍を秤量した。実験は4回行い、データは試料の平均と、エラーバーで示す標準偏差をプロットした。
【０１２８】
構造モデリング
活性化型MAPKAPキナーゼ-2(Thr222がリン酸化)は、ADP複合体の結晶構造(Underwood et al., Structure, 11:627-636, 2003)を元に、活性化ループ(残基213〜241)を欠失させ、ならびにAMP-PNPペプチドおよびGSK3ペプチド(Yang et al., Nat. Struct. Biol., 9:940-944, 2002)と複合体を形成した活性化型Akt/PKBの構造に由来する対応領域(残基299〜328)をテンプレートとして使用して再構築することでモデル化した。最適なペプチドLQRQLSIA(SEQ ID NO: 6)を、GSK3ペプチドを元に活性部位にモデル化した。活性化型のMAPKAPキナーゼ-2/ペプチド複合体の座標を、標準的なタンパク質データバンク(PDB)のフォーマットで表1に示す(タンパク質データバンクと、関連する座標のフォーマットの詳細は、Berman et al., Nuc. Acids Res., 28:235-242, 2000に記載されている)。表2に、最も近接するタンパク質-ペプチド接触面を形成し、および活性部位に結合する他の分子の設計または同定に有用な、複合体中の原子の対を列挙する。Chk1の活性部位内における基質ペプチドLYRSPSMPL(ヒトのCdc25Cの残基211〜219)(SEQ ID NO: 7)を、GSK3ペプチドをテンプレートとして使用して同様にモデル化し、および公開されたモデル(Chen et al., Cell, 100:681-692, 2000)と似るようにマニュアルで調整した。構造を、ALIGNおよびSUPERIMPOSEを使用して重ねて表示した。マニュアルによるモデルの調整は、XtalView suiteのXFITを使用して行った。
【０１２９】
UCN-01と結合した状態のMAPKAPキナーゼ-2の構造を、PyMOLを使用して、スタウロスポリンと結合した状態のMAPKAPキナーゼ-2の構造(PDB ID 1NXK)を基礎モデルとしてモデル化した。
【０１３０】
（表１）活性化型MAPKAPキナーゼ-2/ペプチド複合体の座標
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【０１３１】
（表２）MAPKAPキナーゼ-2/ペプチド複合体中で接触する原子の対
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【０１３２】
RNA干渉(RNAi)および組換えDNA
2塩基のデオキシヌクレオチドのオーバーハングを有する、21塩基対からなるsiRNAの2本鎖はDharmacon Researchから購入した。細胞に、オリゴフェクタミン(oligofectamine)(Invitrogen)を製造業者の指示書通りに使用してsiRNAをトランスフェクトした。細胞は典型的には48時間後に回収して後の実験に使用した。shRNAコンストラクトを安定に発現するU2OS細胞を、レンチウイルスの遺伝子輸送によって作製した。RNAiのヘアピンをレンチウイルスの輸送ベクターpLentiLox-3.7puroまたはpLentiLox-3.7GFPのマルチクローニングサイトにクローニングした。広宿主性のVSV-Gシュードタイプ(pseudotyped)レンチウイルスをBL2+施設における全ての感染に使用した。全ての輸送用およびパッケージング用のコンストラクトはCP. Dillon(MIT)から供与された。標的となる細胞は、8μg/mlのピューロマイシンで4日間かけて選択した。以下の配列をRNAiに使用した：ルシフェラーゼ(shRNA)、
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；hMAPKAPキナーゼ-2(shRNA)、
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；mMAPKAPキナーゼ-2(shRNA)、
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；GFP(siRNA)のセンス鎖
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、およびアンチセンス鎖
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；mMAPKAPキナーゼ-2(siRNA)のセンス鎖
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、およびアンチセンス鎖
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；hMAPKAPキナーゼ-2(siRNA)のセンス鎖
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、およびアンチセンス鎖
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；Chk1(siRNA)
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、およびアンチセンス鎖
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。
【０１３３】
過剰発現試験では、FLAG-6xHis標識ヒトChk1のcDNAをPCRで増幅し、CMVプロモーターの下流に位置する、pHURRAのMlu-1部位およびNot-1部位にサブクローニングした。pHURRAは、H. Pavenstadt博士(Munster大学)から供与された。
【０１３４】
治療
本発明による治療は単独で実施可能なほか、別の治療法と併せて実施可能であり、および家庭、医院、診療所、病院の外来部門、または病院で施行され得る。治療は一般に、医師が治療の効果を詳細に観察可能で、かつ必要な任意の調整が可能な病院において開始される。治療の期間は、患者の年齢および状態、患者の疾患もしくは障害の段階、ならびに治療に対する患者の反応の内容によって変わる。加えて、本発明の方法で治療される可能性のある疾患もしくは障害を発生するリスクの大きい人(例えば遺伝的素因のある人)は、疾患の症状を抑えるか、または遅らせるための予防的な治療を受ける場合がある。薬剤の投与は、異なる間隔を設けて(例えば毎日、毎週、または毎月)実施される場合がある。治療は、健康な新しい細胞を作らせて、その強度を回復させる機会を患者の身体に与えるために、休息期間を含むオンとオフの周期で行われる場合がある。治療は、患者の寿命を延ばすために使用される場合がある。
【０１３５】
癌の治療では、癌のタイプ、およびその発生の段階に依存して、癌の拡散を遅らせるために、癌の成長を遅らせるために、原発腫瘍から身体の他の部位へ拡散する恐れのある癌細胞を死滅または停止させるために、癌に起因する症状を緩和させるために、またはそもそも癌を予防するために治療を行うことができる。
【０１３６】
治療用化合物の投与
化合物と、その天然のパートナーとの結合を、その結合部位を介して選択的に破壊することで、または妨げることで、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの生物学的活性または生物学的機能を阻害することができる。本発明の方法は、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの発現を低下させること(例えばRNAiもしくはアンチセンス療法)によって、またはMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドに直接に結合させて、その基質結合活性を阻害することのいずれかによって、同ポリペプチドの活性を阻害する化合物の使用を特徴とする。このような阻害性化合物について以下に詳細に記載する。
【０１３７】
不適当な細胞周期調節を特徴とする疾患または障害は、新形成などの細胞増殖性疾患を含む。新形成の例には、聴神経腫、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性単球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性赤白血病、腺癌、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、慢性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌(colon cancer)、結腸癌(colon carcinoma)、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、胚性癌腫、内皮肉腫、上衣細胞腫、上皮癌、ユーイング腫瘍、神経膠腫、重鎖病、血管芽腫、肝臓癌、ホジキン病、大細胞癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肺癌(lung cancer)、肺悪性腫瘍(lung carcinoma)、リンパ管内皮腫、リンパ管肉腫、マクログロブリン血症、髄様癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、粘液肉腫、神経芽腫、非ホジキン病、乏突起細胞腫、骨原性肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腺癌、乳頭癌、松果体腫、真性多血症、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎細胞癌、網膜芽腫、シュワン細胞腫、脂腺癌、精上皮腫、小細胞肺癌、扁平上皮癌、汗腺癌、滑膜腫、睾丸癌、子宮癌、ワルデンストレーム線維肉腫、およびウィルムス腫瘍などがあるが、これらに限定されない。
【０１３８】
MAPKAPキナーゼ-2結合ペプチド、低分子、または他の化合物を、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤に含めて、単位投与剤形で投与することができる。過剰な細胞増殖に起因する疾患の患者に化合物を投与するための適切な製剤もしくは組成物を提供するためには、従来の薬務を使用することができる。投与は、患者が徴候を発現する前に開始することができる。任意の適切な投与経路を使用することができる。例えば投与は、非経口投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、眼窩内投与、眼内投与、脳室内投与、関節内投与、髄腔内投与、大槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアロゾル投与、座剤投与、または経口投与とすることができる。例えば治療用製剤は、溶液または懸濁物の形状とすることが可能であり；経口投与時は、製剤を錠剤またはカプセル剤の形状とすることが可能であり；および鼻腔内製剤の場合は、粉末剤、点鼻剤、またはエアロゾル剤の形状とすることができる。
【０１３９】
併用療法
上記したように、必要に応じて、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドを阻害する化合物による治療を、放射線療法、外科手術、または化学療法などの、増殖性疾患の治療法と組み合わせることができる。MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドと相互作用する化合物とともに投与可能な化学療法剤は、アレムツズマブ、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ビカルタミド、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコクシブ、クロランブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、リン酸エストラムスチン、エトドラク、エトポシド、エキセメスタン、フロキシウリジン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、フルタミド、フォルメスタン、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、ゴセレリン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、ヒペリシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、レトロゾール、リュープレリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ロフェコキシブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、6-チオグアニン、トポテカン、トレモファイン（toremofine）、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンを含むが、これらに限定されない。1種類または複数の化学療法剤を、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドを阻害する1種類または複数の化合物と組み合わせて投与することができる。
【０１４０】
本発明の併用療法では、治療法の成分は同時に投与されるか、または相互に28日以内に、対象新生物の成長を阻害するために十分な量で投与される。
【０１４１】
癌のタイプ、および癌の発生段階に依存して、本発明の併用療法で癌を治療することが可能であり、癌の拡散を遅らせることが可能であり、癌の成長を遅らせることが可能であり、原発腫瘍から他の身体部位へ拡散する恐れのある癌細胞を死滅もしくは停止させることが可能であり、癌に起因する症状を緩和させることが可能であるほか、またはそもそも癌を予防することが可能である。併用療法は、痛みや不快感を引き起こす癌細胞を除去することで、人々を、より快適に生活させるためにも役立つ場合がある。
【０１４２】
本発明を組み合わせて投与することで、低用量の各化合物の投与が可能となり、個々の化合物の単独の投与と比較して、同等の有効性、およびより低毒性がもたらされる。または、このような組み合わせは、毒性が同等か、もしくは低い新生物の治療に関して、有効性の改善につながる。
【０１４３】
RNA干渉療法
本発明は、MAPKAPキナーゼ-2の発現を低下させるRNA干渉(RNAi)の使用が、化学療法剤に対する細胞の感受性を高めるという、新しく、かつ治療的に重要な発見を特徴とする。したがって、本発明の方法によって、核酸塩基オリゴマーを、RNAiによるMAPKAPキナーゼ-2発現のノックダウンのために2本鎖RNAの状態で使用することができる。RNAiは、対象となる特定のタンパク質の細胞内発現を低下させる1つの方法である(Tuschl, Chembiochem 2:239-245, 2001；Sharp, Genes & Devel. 15:485-490, 2000；Hutvagner and Zamore, Curr. Opin. Genet. Devel. 12:225-232, 2002；およびHannon, Nature 418:244-251, 2002に概説される)。RNAiでは、遺伝子のサイレンシングは典型的には、細胞内における2本鎖RNA(dsRNA)の存在によって転写後に引き起こされる。このようなdsRNAは細胞内でプロセシングを受けて、低分子干渉RNA(siRNA)と喚ばれる、より短い断片となる。dsRNAのトランスフェクションによる、またはプラスミドベースの発現系を使用するsiRNAの発現のいずれかによる細胞内へのsiRNAの導入は、哺乳類細胞の機能喪失型の表現型を作製するために、ますます多く使用されつつある。
【０１４４】
本発明の1つの態様では、2本鎖RNA(dsRNA)分子が作製される。dsRNAは、2重鎖を形成したRNAの2本の異なる鎖、または自己2重鎖化した(self-duplexed)1本のRNA鎖(低分子ヘアピン(sh)RNA)の場合がある。典型的にはdsRNAは約21〜22塩基対であるが、必要に応じて、これより短い場合も長い場合もある(最長で約29残基の核酸塩基)。dsRNAは、標準的な手法(例えば化学合成またはインビトロ転写)で作製することができる。キットは例えば、Ambion(Austin, TX)およびEpicentre(Madison, WI)から入手することができる。dsRNAを哺乳類細胞で発現させる方法は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002；Paddison et al. Genes & Devel. 16:948-958, 2002. Paul et al. Nature Biotechnol. 20:505-508, 2002；Sui et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-5520, 2002；Yu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052, 2002；Miyagishi et al. Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002；およびLee et al. Nature Biotechnol. 20:500-505, 2002に記載されている。
【０１４５】
低分子ヘアピンRNAは、任意で3'UUオーバーハングを有するステム-ループ構造からなる。種類は多様である可能性があるが、ステムは21〜31塩基対(望ましくは25〜29塩基対)の範囲であり、およびループは4〜30塩基対(望ましくは4〜23塩基対)の場合がある。細胞内におけるshRNAの発現に関しては、例えば、ポリメラーゼIII H1-RNAまたはU6プロモーター、ステム-ループ型のRNA挿入物用のクローニング部位、および4-5チミジン転写終結シグナルを含むプラスミドベクターを使用することができる。ポリメラーゼIIIプロモーターは一般に、詳細の明らかな開始部位および停止部位を有し、ならびに転写物は、ポリ(A)テールを欠く。これらのプロモーターの終結シグナルは、ポリチミジンの連続の存在によって定義され、および転写物は典型的には第2のウリジンの後で切断される。この位置で切断されると、発現されるshRNA中に、合成siRNAの3'オーバーハングと似た3'UUオーバーハングが生じる。哺乳類細胞におけるshRNAの他の発現法は、先に引用した参考文献に記載されている。
【０１４６】
オリゴの合理的な設計を使用するコンピュータープログラムは、RNAiの標的となる可能性のあるMAPKAPキナーゼ-2配列の領域を推定するために有用である。DharmaconのsiDESIGNツールの内容に関しては例えば、Reynolds et al., Nat. Biotechnol., 22:326-330, 2004を参照されたい。表3に、RNA干渉で標的となる可能性のあるMAPKAPキナーゼ-2内の、複数の例示的なヌクレオチド配列を列挙する。siRNAまたはshRNAのオリゴは、表に記載された配列に対応するように、ならびにオーバーハング、例えば3'dTdTオーバーハングおよび/またはループを含むように作製することができる。
【０１４７】
（表３）MAPKAPキナーゼ-2のRNAi標的配列
2008519861.tif 000046
【０１４８】
アンチセンス療法
RNAiベースの方法に代わる方法として、MAPKAPキナーゼ-2のアンチセンス核酸を使用する治療的戦略を本発明の方法に使用できる。この手法は、遺伝子発現の配列特異的な抑制が、mRNAと相補的なアンチセンス分子種間の細胞内におけるハイブリダイゼーションによって達成可能であるという原理に基づく。ハイブリッド2本鎖RNAの形成は後に、標的となるMAPKAPキナーゼ-2のmRNAのプロセシング/輸送/翻訳、および/または安定性に干渉する可能性がある。アンチセンス戦略には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、およびアンチセンスRNAの注射を含む、さまざまな方法を使用することができる。例示的な方法の1つは、アンチセンスRNA発現ベクターの標的細胞へのトランスフェクションを特徴とする。アンチセンス効果は、対照(センス)配列によって誘導することができる。しかしながら、表現型の変化の程度は極めて多様である。アンチセンス効果によって誘導される表現型効果は、タンパク質のレベル、タンパク質活性の程度、および標的mRNAレベルなどの基準の変化に基づく。
【０１４９】
OLIGO(過去にNational Biosciences Inc.によって販売)などのコンピュータープログラムを使用して、以下の基準を元に、アンチセンス療法用の候補核酸塩基オリゴマーを選択することができる：
(1)GC含量が75%を越えないこと、およびAT含量が75%を越えないこと；
(2)好ましくは4残基またはこれ以上の連続G残基を有する核酸塩基オリゴマーではないこと(毒性対照として選択されたことがあるが、毒性作用の報告があるため)；
(3)安定なダイマー構造またはヘアピン構造を形成する能力を有する核酸塩基オリゴマーでないこと；ならびに
(4)翻訳開始部位の周囲の配列が好ましい領域であること。
加えて、標的mRNAの接近可能な領域はRNA二次構造フォールディングプログラムMFOLD(M. Zuker, D.H. Mathews および D.H. Turner, Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide., RNA Biochemistry and Biotechnology, J. Barciszewski および B.F.C. Clark編、NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, (1999))を援用して推定可能である。最も安定であると推定されるmRNAの折りたたみの5%以内の自由エネルギー値を有する準最適な折りたたみは、相補的な塩基を見つけることで塩基対結合を形成可能な残基が含まれる200塩基のウィンドウを使用して推定することができる。塩基対を形成しないオープン領域（open region）は、個々の準最適の折りたたみと統合される可能性があり、およびオープンである（open）と一貫して推定される領域は、核酸塩基オリゴマーとの結合に対する接近可能性が高いと見なされる場合がある。上記のいくつかの選択基準を部分的にのみ満たす、他の核酸塩基オリゴマーも、標的mRNAの推定オープン領域を認識する可能な限りにおいて、可能性のある候補として選択される場合がある。
【０１５０】
治療的に有用な化合物および薬学的組成物
MAPKAPキナーゼ-2の活性を阻害する任意の化合物または薬学的組成物は、本発明の方法に有用な場合がある。上記の活性化型MAPKAPキナーゼ-2/ペプチド複合体のモデル(表1)から、ペプチド、またはペプチド様化合物、例えばペプチド模倣物が、MAPKAPキナーゼ-2を阻害するために有用な可能性があることがわかる。このような化合物は、こうした作用を、MAPKAPキナーゼ-2の天然のペプチド基質を模倣することで、およびMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドが、その天然の基質とインビボで結合可能な規模もしくは速度を低く、または遅くすることで達成する。したがって、ペプチドおよびペプチド様化合物の合成法または修飾法について以下に説明する。
【０１５１】
ペプチドの合成および結合(conjugation)
ペプチドを含む本発明の化合物は、既に詳細に記載した手順で作製される。またはペプチドは、2-クロロトリチル塩化物樹脂上で、標準的なFMOC化学反応で作製できる(Int. J. Pept. Prot. Res. 38, 1991, 555-61)。樹脂からの切断は、ジクロロメタン(DCM)中の20%酢酸を使用して、側鎖がブロックされた状態で残すように行われる。次に、自由端のカルボキシレートペプチドを、4'(アミノメチル)-フルオレセイン(Molecular Probes, A-1351；Eugene, OR)に、ジメチルホルムアミド(DMF)中の過剰なジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を使用して室温で結合させる。蛍光性のN-C保護ペプチドを、シリカゲルクロマトグラフィー(DCM中の10%メタノール)で精製する。次にN末端のFMOC基を、DMF中のピペリジン(20%)を使用して除去し、およびN末遊離のペプチドをシリカゲルクロマトグラフィー(DCM中の20%メタノール、0.5% HOAc)で精製する。最後に任意のt-ブチル側鎖の保護基を、2.5%の水および2.5%のトリイソプロピルシランを含む95%トリフルオロ酢酸を使用して除去する。このようにして得られたペプチドは、HPLCで1本のピークを示すはずであり、および以下のアッセイ法を実施するために十分純粋である。
【０１５２】
ペプチドの修飾および非天然のアミノ酸
本発明の化合物の治療効果および/または生物学的利用能を高めたり持続させたりするために、本発明のペプチド含有化合物のアミノ酸残基には修飾を施せると理解されている。したがって、以下の一般式(I)を有するα-アミノ酸は、さまざまな修飾を受けることが可能である。
2008519861.tif 000047
ここで、Rは、特定のアミノ酸残基を示す。α-アミノ酸の例示的な修飾は、以下の式(II)を含むが、これに限定されない。
2008519861.tif 000048
上式で、R1、R2、R3、R4、およびR5は独立に、水素、ヒドロキシ、ニトロ、ハロ、C1-5分枝アルキルもしくはC1-5直鎖アルキル、C1-5アルカリル、ヘテロアリール、およびアリールであり；アルキル、アルカリル、ヘテロアリール、およびアリールは、C1-5アルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、C1-5アルコキシ、C1-5アルキルチオ、トリハロメチル、C1-5アシル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ニトリル、C1-5アルコキシカルボニル、オキソ、アリールアルキル(アルキル基は1〜5個の炭素原子を有する)、およびヘテロアリールアルキル(アルキル基は1〜5個の炭素原子を有する)からなる群より選択される1種類もしくは複数の置換基によって置換されない場合もあれば置換される場合もあり；またはR1およびR2は連結されて、任意で酸素、硫黄、もしくは水素を含むC3-8環、または任意でヒドロキシルと置換されるC1-5アルキルを形成するか；またはR2およびR3は連結されて、任意でヒドロキシルと置換され、および任意で酸素、硫黄、C1-5アミノアルキル、もしくはC1-5アルキルを含むC3-8環を形成する。
【０１５３】
ペプチドを含む本発明の化合物は、以下の式(III)で表される非天然のN末端のアミノ酸を含むが、これらに限定されない。
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上式でA1は、α-アミノ基を介して連結されたアミノ酸またはペプチド鎖であり；R1およびR3は独立に、水素、C1-5分枝もしくは直鎖のC1-5アルキル、C1-5アルカリル、ヘテロアリール、およびアリールであり、これらのそれぞれは、1〜3個のC1-5アルキル、1〜3個のハロゲン、1〜2個の-OR5、N(R5)(R6)、SR5、N-C(NR5)NR6R7、メチレンジオキシ、-S(O)mR5、1〜2個の-CF3、-OCF3、ニトロ、-N(R5)C(O)(R6)、-C(O)OR5、-C(O)N(R5)(R6)、-1H-テトラゾール-5-イル、-SO2N(R5)(R6)、-N(R5)SO2アリール、もしくは-N(R5)SO2R6からなる群より選択される置換基と置換されないか、または置換され；R5、R6、およびR7は独立に、水素、C1-5直鎖アルキルもしくはC1-5分枝アルキル、C1-5アルカリル、アリール、ヘテロアリール、およびC3-7シクロアルキルから選択され、ならびに2個のC1-5アルキル基が1個の原子上に存在する場合は、これらは任意で連結されて、任意で酸素、硫黄、またはR7が任意でヒドロキシルと置換される水素もしくはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成し；R2は、水素、F、C1-5直鎖アルキルもしくはC1-5分枝アルキル、C1-5アルカリルであるか；またはR2およびR1は連結されて、任意で酸素、硫黄、またはR7が任意でヒドロキシルと置換される水素もしくはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成するか；またはR2およびR3は連結されて、任意でヒドロキシルと置換され、および任意で酸素、硫黄、またはR7は水素もしくはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成し；R2は、水素、F、C1-5直鎖アルキルもしくはC1-5分枝アルキル、C1-5アルカリルであり；ならびにR4は、それぞれが、1〜3個のC1-5アルキル、1〜3個のハロゲン、1〜2個の-OR5、N(R5)(R6)、N-C(NR5)NR6R7、メチレンジオキシ、-S(O)mR5(mは0〜2)、1〜2個の-CF3、-OCF3、ニトロ、-N(R5)C(O)(R6)、-N(R5)C(O)(OR6)、-C(O)OR5、-C(O)N(R5)(R6)、-1H-テトラゾール-5-イル、-SO2N(R5)(R6)、-N(R5)SO2アリール、もしくは-N(R5)SO2R6からなる群より選択される置換基と置換されないか、もしくは置換される水素、C1-5分枝または直鎖のC1-5アルキル、C1-5アルカリル、ヘテロアリール、およびアリールであり；R5、R6、およびR7は独立に、水素、C1-5直鎖アルキルもしくはC1-5分枝アルキル、C1-5アルカリル、アリール、ヘテロアリール、およびC3-7シクロアルキルから独立に選択され、ならびに2個のC1-5アルキル基が1個の原子上に存在する場合は、これらは任意で連結されて、任意で酸素、硫黄、またはR7が任意でヒドロキシルと置換される水素もしくはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成する。
【０１５４】
本発明の化合物は、以下の式で表される、非天然の内部アミノ酸を含む場合もある。
2008519861.tif 000050
上式でA2は、α-カルボキシ基を介して連結されたアミノ酸またはペプチド鎖であり；A1は、α-アミノ基を介して連結されたアミノ酸またはペプチド鎖であり；R1およびR3は独立に、それぞれが1〜3個のC1-5アルキル、1〜3個のハロゲン、1〜2個の-OR5、N(R5)(R6)、SR5、N-C(NR5)NR6R7、メチレンジオキシ、-S(O)mR5(mは1〜2)、1〜2個の-CF3、-OCF3、ニトロ、-N(R5)C(O)(R6)、-C(O)OR5、-C(O)N(R5)(R6)、-1H-テトラゾール-5-イル、-SO2N(R5)(R6)、-N(R5)SO2アリール、もしくは-N(R5)SO2R6からなる群より選択される置換基と置換されないか、または置換される水素、C1-5分枝アルキルもしくは直鎖アルキル、C1-5アルカリル、ヘテロアリール、ならびにアリールであり；R5、R6、およびR7は独立に、水素、C1-5直鎖アルキルもしくはC1-5分枝アルキル、C1-5アルカリル、アリール、ヘテロアリール、およびC3-7シクロアルキルから選択され、ならびに2個のC1-5アルキル基が1個の原子上に存在する場合は、これらは任意で連結されて、任意で酸素、硫黄、またはR7が任意でヒドロキシルと置換される水素またはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成し；ならびにR2は、水素、F、C1-5直鎖アルキルもしくはC1-5分枝アルキル、C1-5アルカリルであるか；またはR2およびR1は連結されて、任意で酸素、硫黄、またはR7が任意でヒドロキシルと置換される水素もしくはC1-5アルキルであるNR7、を含むC3-8環を形成するか、またはR2およびR3は連結されて、任意でヒドロキシルと置換され、および任意で酸素、硫黄、またはR7は水素もしくはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成する。
【０１５５】
本発明は、以下の式で表される、非天然の内部アミノ酸が存在する、本発明のペプチド含有化合物の修飾も含む。
2008519861.tif 000051
上式でA2は、α-カルボキシ基を介して連結されたアミノ酸またはペプチド鎖であり；A1は、α-アミノ基を介して連結されたアミノ酸またはペプチド鎖であり；R1およびR3は独立に、水素、C1-5分枝または直鎖のC1-5アルキル、およびC1-5アルカリルであり；R2は、水素、F、C1-5直鎖アルキルもしくはC1-5分枝アルキル、C1-5アルカリルであるか；またはR2およびR1は連結されて、任意で酸素、硫黄、またはR7が任意でヒドロキシルと置換される水素もしくはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成し；XはOもしくはSであり；ならびにR5およびR6は独立に、水素、C1-5直鎖アルキルもしくはC1-5分枝アルキル、C1-5アルカリル、アリール、ヘテロアリール、およびC3-7シクロアルキルから選択され、ならびに2個のC1-5アルキル基が1個の原子上に存在する場合は、これらは任意で連結されて、任意で酸素、硫黄、またはR7が任意でヒドロキシルと置換される水素もしくはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成するか；またはR5およびR6は連結されて、任意で酸素、硫黄、またはR7が任意でヒドロキシルと置換される水素もしくはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成する。
【０１５６】
本発明の化合物は、以下の式である、C末端非天然内部アミノ酸を含む場合もある。
2008519861.tif 000052
上式でA2は、α-カルボキシ基を介して連結されたアミノ酸またはペプチド鎖であり；R1およびR3は独立に、それぞれが1〜3個のC1-5アルキル、1〜3個のハロゲン、1〜2個の-OR5、N(R5)(R6)、SR5、N-C(NR5)NR6R7、メチレンジオキシ、-S(O)mR5、1〜2個の-CF3、-OCF3、ニトロ、-N(R5)C(O)(R6)、-C(O)OR5、-C(O)N(R5)(R6)、-1H-テトラゾール-5-イル、-SO2N(R5)(R6)、-N(R5)SO2アリール、もしくは-N(R5)SO2R6からなる群より選択される置換基と置換されないか、または置換される水素、C1-5分枝または直鎖のC1-5アルキル、C1-5アルカリル、ヘテロアリール、およびアリールであり；R5、R6、およびR7は独立に、水素、C1-5直鎖アルキルもしくはC1-5分枝アルキル、C1-5アルカリル、アリール、ヘテロアリール、およびC3-7シクロアルキルから選択され、ならびに2個のC1-5アルキル基が1個の原子上に存在する場合は、これらは任意で連結されて、任意で酸素、硫黄、またはR7が任意でヒドロキシルと置換される水素もしくはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成し；R2は、水素、F、C1-5直鎖アルキルもしくはC1-5分枝アルキル、C1-5アルカリルであるか；またはR2およびR1は連結されて、任意で酸素、硫黄、またはR7が任意でヒドロキシルと置換される水素もしくはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成するか；またはR2およびR3は連結されて、任意でヒドロキシルと置換され、ならびに任意で酸素、硫黄、またはR7が水素もしくはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成し；R2は、水素、F、C1-5直鎖アルキルもしくはC1-5分枝アルキル、C1-5アルカリルであり；ならびにQは、R5、R6が独立に、水素、C1-5直鎖アルキルもしくはC1-5分枝アルキル、C1-5アルカリル、アリール、ヘテロアリール、およびC3-7シクロアルキルから独立に選択される、OH、OR5、またはNR5R6であり、ならびに2個のC1-5アルキル基が1個の原子上に存在する場合は、これらは任意で連結されて、任意で酸素、硫黄、またはR7が、任意でヒドロキシルと置換される水素もしくはC1-5アルキルであるNR7を含むC3-8環を形成する。当技術分野で周知のペプチド修飾法は例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(第20版、A.R. Gennaro編、2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia)に記載されている。
【０１５７】
ペプチド模倣物
ペプチド誘導体(例えばペプチド模倣物)は、環状ペプチド、天然のアミノ酸残基と、対応するD型の立体異性体との置換、または非天然のアミノ酸残基との置換によって得られるペプチド、ペプチドの化学誘導体、二重ペプチド(dual peptide)、ペプチドの多量体、および他のタンパク質もしくは担体と融合したペプチドを含む。本発明のペプチドの環状誘導体は、環状化に適した2個もしくはこれ以上の追加のアミノ酸残基を有する誘導体である。このような残基はしばしば、カルボキシル末端に、およびアミノ末端に追加される。ペプチド誘導体は、対応するD型アミノ酸残基と置換される1個または複数のアミノ酸残基を有する場合がある。1つの例では、本発明のペプチドもしくはペプチド誘導体は、全L型、全D型、または混合型のD,L型のペプチドである。別の例では、アミノ酸残基は、非天然のアミノ酸残基と置換される。非天然のアミノ酸、または誘導体化された非天然のアミノ酸の例は、Nα-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、およびβ-メチルアミノ酸を含む。
【０１５８】
本発明のペプチドの化学誘導体は、通常は対象ペプチドの一部ではない追加的な官能基部分を含む誘導体を含むが、これらに限らない。このような誘導体の例は、(a)アミノ末端、または別の遊離アミノ基のN-アシル誘導体(アシル基は、アルカノイル基、例えばアセチル基、ヘキサノイル基、オクタノイル基、アロイル基、例えばベンゾイル基、もしくはFmoc基(フルオレニルメチル-O--CO--)、カルボベンゾキシ基(ベンジル-O--CO--)、モノメトキシスクシニル基、ナフチル-NH--CO--、アセチルアミノ-カプロイル、アダマンチル-NH--CO--などの保護基のいずれかの場合がある)；(b)カルボキシル末端のエステル、または別の遊離のカルボキシル基もしくはヒドロキシ基のエステル；(c)アンモニアとの、もしくは適切なアミンとの反応によって生じるカルボキシル末端のアミド、または別の遊離のカルボキシル基のアミド；(d)グリコシル化誘導体；(e)リン酸化誘導体；(f)親油性部分、例えばカプロイル、ラウリル、ステアロイルに結合した誘導体；ならびに(g)抗体または他の生物学的リガンドと結合した誘導体を含む。化学誘導体には、ペプチド結合--CO--NH--の修飾、例えば(a)--CH2--NH--への還元；(b)--CO--N(アルキル)--へのアルキル化；および(c)--NH--CO--への変換によって得られる誘導体も含まれる。ペプチド模倣物は、ホスホン酸部分またはスルホン酸部分を含む場合もある。
【０１５９】
本発明の二重ペプチドは、直接連結された、またはスペーサーを介して相互に共有結合で連結された、2つの同じか、または2つの異なる本発明のペプチドからなる。
【０１６０】
本発明の多量体は、いくつかの同じか、または異なるペプチドもしくはこの誘導体から形成されるポリマー分子からなる。
【０１６１】
1つの例では、ペプチド誘導体は、タンパク質分解に対する耐性が、対応する非誘導体化ペプチドより大きい。例えば、1残基もしくは複数のL型アミノ酸残基の代わりにD型アミノ酸置換を有するペプチド誘導体は、タンパク質分解性の切断に耐性を示す。
【０１６２】
別の例では、ペプチド誘導体は、対応する非誘導体化ペプチドと比較して細胞膜透過性が高い。例えばペプチド誘導体は、アミノ末端および/またはカルボキシル末端において、および/または内部部位において結合された親油性部分を有する場合がある。このような誘導体は、所望の機能活性を保持するのであれば、細胞内におけるタンパク質-タンパク質相互作用を標的とする場合に非常に好ましい。
【０１６３】
別の例では、ペプチド誘導体は、リガンド(例えばMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチド)と高い親和性で結合する。
【０１６４】
本発明のペプチドまたはペプチド誘導体は、合成的および組換え的な手法を含む、当業者に既知の任意のペプチド合成法で得られる。例えば本発明のペプチドまたはペプチド誘導体は、簡単に説明するとC末端のアミノ酸のカルボキシル基の樹脂とのカップリングと、N-α保護アミノ酸の連続的な追加からなる固相ペプチド合成によって得られる場合がある。保護基は、当技術分野で既知の任意の保護基の場合がある。個々の新しいアミノ酸が、成長途上の鎖に追加される前に、対象となる鎖に追加された既存のアミノ酸の保護基が除去される。適切な樹脂へのアミノ酸のカップリングについては、Rivier et al.(米国特許第4,244,946号)に記載されている。このような固相合成は例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1964；Vale et al., Science 213:1394-1397, 1984；Marki et al., J. Am. Chem. Soc. 10:3178, 1981に、ならびに米国特許第4,305,872号および同第4,316,891号に記載されている。望ましくは、自動ペプチド合成装置が使用される。
【０１６５】
合成されたペプチドもしくはペプチド誘導体の精製は、クロマトグラフィー(例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、およびサイズ排除（sizing）カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、差次的溶解性(differential solubility)、疎水性を含む標準的な方法で、またはタンパク質精製の他の任意の標準的な手法で実施される。1つの態様では、薄層クロマトグラフィーが使用される。別の態様では、逆相HPLC(高速液体クロマトグラフィー)が使用される。
【０１６６】
最後に、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、および他の低分子から決定される構造と機能の関係を利用して、類似の特性を有する類似の分子構造を作製することができる。したがって本発明は、本明細書に明示的に開示された分子に加えて、本明細書に例示された特定の態様の構造、疎水性、荷電性、および側鎖特性を共有する分子を含むことが想定される。
【０１６７】
1つの例では、所望の結合活性を有する、このような誘導体もしくは類似体は、任意のMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドなどの他の対象の分子または標的との結合に使用することができる。所望の対象特性を保持するか、または欠くか、もしくは阻害する(例えばMAPKAPキナーゼ-2と天然のリガンドの結合を阻害する)誘導体もしくは類似体を、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの生物学的活性を阻害するために使用することができる。
【０１６８】
特にペプチド誘導体は、機能的に等価な分子を提供するか、または必要に応じて、機能が高められたか、もしくは低められた分子を提供する、置換、付加、もしくは欠失によってアミノ酸配列を改変することで作られる。遺伝暗号の縮重のために、実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の核酸配列を、組換えペプチドの作製に使用することができる。これには、配列内の機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって改変される、したがってサイレントな変化が生じる、本発明のペプチドの全体または一部を含むヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。本発明の誘導体および類似体は、当技術分野で既知のさまざまな方法で作製することができる。作製を可能とする操作は、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで可能である。例えば、クローニングされた核酸の配列は、当技術分野で既知の数多くの任意の戦略で修飾することができる(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。配列は、制限エンドヌクレアーゼによる適切な部位における切断後に、必要に応じて、酵素による、さらなる修飾を施し、インビトロで単離して連結することができる。
【０１６９】
MAPKAPキナーゼ-2の阻害剤
RNAiによるMAPKAPキナーゼ-2の発現のノックダウンが、細胞を化学療法剤に対して敏感にさせるという今回の発見を元にすると、MAPKAPキナーゼ-2を特異的または非特異的に阻害する任意の化合物が抗新生物療法に有用な可能性がある。本発明の方法および組成物に使用可能な、適切なMAPKAPキナーゼ-2阻害剤は、2-(3-アミノプロピル)-8-(メチルチオ)-2,4,5,6-テトラヒドロピラゾロ[3,4-e]インダゾール-3-カルボン酸ジヒドロクロライド、2-(3-アミノプロピル)-2,4,5,6-テトラヒドロピラゾロ[3,4-e]インダゾール-3-カルボン酸ヒドロクロライド、2-(3-{[2-(4-ブロモフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-2,4,5,6-テトラヒドロピラゾロ[3,4-e]インダゾール-3-カルボン酸ヒドロクロライド、2-(2-アミノエチル)-2,4,5,6-テトラヒドロピラゾロ[3,4-e]インダゾール-3-カルボン酸ヒドロクロライド、8-(アリルチオ)-2-(3-アミノプロピル)-2,4,5,6-テトラヒドロピラゾロ[3,4-e]インダゾール-3-カルボン酸ジヒドロクロライド、2-(3-アミノプロピル)-8-(ベンジルチオ)-2,4,5,6-テトラヒドロピラゾロ[3,4-e]インダゾール-3-カルボン酸ジヒドロクロライド、2-{3-[(2-チエン-2-イルエチル)アミノ]プロピル}-2,4,5,6-テトラヒドロピラゾロ[3,4-e]インダゾール-3-カルボン酸、2-{3-[(2-チエン-3-イルエチル)アミノ]プロピル}-2,4,5,6-テトラヒドロピラゾロ[3,4-e]インダゾール-3-カルボン酸ヒドロクロライド、エチル2-(3-{[2-(4-ブロモフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-2,4,5,6-テトラヒドロピラゾロ[3,4-e]インダゾール-3-カルボキシレート、2-(3-アミノプロピル)-8-キノリン-3-イル-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-h]キナゾリン-3-カルボン酸ジヒドロクロライド、2-(3-アミノプロピル)-8-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-h]キナゾリン-3-カルボン酸ヒドロクロリド、2-(3-アミノプロピル)-8-フェニル-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-h]キナゾリン-3-カルボン酸ヒドロクロリド、2-キノリン-3-イル-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[4,3-h]キナゾリン-7-オン、2-ピリジン-3-イル-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[4,3-h]キナゾリン-7-オン、8-キノリン-3-イル-2-[3-(トリチルアミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[4,3-h]キナゾリン-3-カルボン酸ヒドロクロライド、2-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[4,3-h]キナゾリン-7-オン、2-(4-メトキシフェニル)-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[4,3-h]キナゾリン-7-オン、2-ピリジン-4-イル-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[4,3-h]キナゾリン-7-オンヒドロクロライド、2-(3-アミノプロピル)-8-キノリン-3-イル-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-(3-ニトロフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-(4-ヒドロキシフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸ヒドロブロミド、2-(3-アミノプロピル)-8-(3-ヒドロキシフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸ヒドロブロミド、2-(3-アミノプロピル)-8-(2-ナフチル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-(3,5-ジフルオロフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-q]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-(3-シアノフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-q]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、9-(ヒドロキシメチル)-2-キノリン-3-イル-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-(4-メトキシフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-q]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-[3-(メチル-スルホニル)フェニル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-q]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-q]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(1H-イミダゾール-1-イル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-q]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-(3-メトキシフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-アニリノ-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸、2-(3-アミノプロピル)-8-(3,4-ジフルオロフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(4'-カルボキシ-1,1'-ビフェニル-4-イル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(4-ヒドロキシフェニル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロアセテート、2-プロピル-8-キノリン-3-イル-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸、2-[3-({2-[3'-(トリフルオロメチル)-1,1'-ビフェニル-4-イル]エチル}アミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-(4-tert-ブチルフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[3-({2-[4-(3-フリル)フェニル]エチル}アミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(3'-クロロ-1,1'-ビフェニル-4-イル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(4-メトキシフェニル)-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、2-[3-({2-[4'-(トリフルオロメチル)-1,1'-ビフェニル-4-イル]エチル}アミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-ヒドロキシフェニル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2'-:1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-(3-アミノプロピル)-N-ヒドロキシ-8-キノリン-3-イル-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f-]イソキノリン-3-カルボキサミドヒドロクロライド、2-[(E)-2-(4-ヒドロキシフェニル)エテニル]-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロ���セテート、2-キノリン-3-イル-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、2-(4-ヒドロキシフェニル)-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、2-(3-{[2-(2'-クロロ-1,1'-ビフェニル-4-イル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(4'-tert-ブチル-1,1'-ビフェニル-4-イル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(3,4-ジクロロフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[3-(3-クロロフェニル)プロピル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[(E)-2-フェニルエテニル]-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(4-ピリジン-4-イルフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[3-(4-ブロモフェニル)プロピル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[3-(4-tert-ブチルフェニル)プロピル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(3'-イソプロピル-1,1'-ビフェニル-4-イル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-{3-[(2-チエン-2-イルエチル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-(3-{[2-(1,1'-ビフェニル-4-イル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-メトキシフェニル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]-イソキノリン-7(8H)-オン、2-(3-{[2-(4-ブロモフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(2,4-ジクロロフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-{3-[(ベンジルスルホニル)アミノ]プロピル}-8-キノリン-3-イル-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸、9-(アミノメチル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロアセテート、2-(3-ニトロフェニル)-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、2-(3-アミノプロピル)-8-キノリン-3-イル-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボキサミドヒドロクロライド、2-(3-{[3-(4-クロロフェニル)プロピル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[3-(ジメチルアミノ)フェニル]-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、2-(3-{[(4-クロロベンジル)スルホニル]アミノ}プロピル)-8-キノリン-3-イル-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸、2-(3-{[2-(4-ピリジン-3-イルフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(4-クロロフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(5-クロロチエン-2-イル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[3-(4-シアノフェニル)プロピル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[3-(5-メチル-2-フリル)ブチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[3-({2-[4-(1-ベンゾチエン-3-イル)フェニル]エチル}アミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アンモニオプロピル)-3-カルボキシ-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-イウム二塩化物、2-(4-メトキシフェニル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-(3-{[3-(4-アセチルフェニル)プロピル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-
2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[3-({3-[4-(メチルスルホニル)フェニル]プロピル}アミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-(2-メトキシフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[3-({2-[3'-(アミノメチル)-1,1'-ビフェニル-4-イル]エチル}アミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(2-アミノエチル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸ジヒドロクロライド、2-(3-{[2-(4-ニトロフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[3-({2-[2'-(トリフルオロメチル)-1,1'-ビフェニル-4-イル]エチル}アミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、9-(ヒドロキシメチル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-(3-{[2-(4-メチルフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、9-{[(2-チエン-2-イルエチル)アミノ]メチル}-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-(3-{[2-(4-エトキシフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、2-(3-{[2-(4-メトキシフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、3-[3-(1H-テトラアゾール-5-イル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-2-イル]プロパン-1-アミンヒドロクロライド、2-(3-アミノプロピル)-8-クロロ-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-q]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[(1R,2S)-2-フェニルシクロプロピル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-{3-[(3,3-ジフェニルプロピル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(3-ブロモ-4-メトキシフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-{3-[(4-フェニルブチル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[3-(2,3-ジヒドロ-1H-インデン-2-イルアミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(2-ナフチル)-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、2-{3-[(3-フェニルプロピル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(4-フルオロフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-{3-[(2-チエン-3-イルエチル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸ジヒドロクロライド、5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-[3-(グリコロイルアミノ)プロピル]-8-キノリン-3-イル-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸ヒドロクロライド、8-キノリン-3-イル-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸、2-(3-{[2-(4-エチルフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(2-クロロフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-{3-[(2-エチルブチル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、8-キノリン-3-イル-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボキサミド、2-{3-[(2-ピリジン-4-イルエチル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(4-クロロフェニル)プロピル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(3-クロロフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[3-(グリコロイルアミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-{[2-(3,4-ジメトキシフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(1-ベンゾフラン-2-イル)-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、2-(3-{[4-(2-アミノエチル)フェニル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(1-ナフチル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、8-(3-アミノプロピル)-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オンジヒドロクロライド、2-アニリノ-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-(3-アミノプロピル)-8-[2-(トリフルオロメチル)フェニル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、9-(アジドメチル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、9-({[2-(4-クロロフェニル)エチル]アミノ}メチル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-フェニル-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、2-[3-(ペンチルアミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、10-(2-アミノエチル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-[3-(アリルアミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(4-アミノブチル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸ジヒドロクロライド、2-(3-{[2-(4-アミノフェニル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[(1E)-3,3-ジメチルブタ-1-エニル]-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2:1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-(8H)-オン-トリフルオロアセテート、10-(ニトロメチル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、3-カルボキシ-2-[3-(メチルアンモニオ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-イウム二塩化物、2-[3-({[(4-ブトキシフェニル)アミノ]カルボニル}アミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸、2-{3-[(2-ピリジン-3-イルエチル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-{3-[(2-ピリジン-2-イルエチル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-{3-[(シクロプロピルメチル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-{3-[(2-チエン-2-イルプロピル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-メトキシ-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-[3-(ジメチルアミノ)フェニル]-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-q]イソキノリン-7(8H)-オン、2-(3-{[2-(1H-ピロール-1-イル)エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[3-(ベンジルオキシ)プロピル]-8-キノリン-3-イル-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸、2-{3-[(4-ブトキシベンジル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2:1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-[(E)-2-(2-フルオロフェニル)エテニル]-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-q]イソキノリン-7(8H)-オン、2-[(1E)-ヘキサ-1-エニル]-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロアセテート、2-アニリノ-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、2-クロロ-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-[(E)-2-(4-メトキシフェニル)エテニル]-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-(メチルチオ)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-{3-[(2-フリルメチル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-アゼパン-1-イル-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロアセテート、2-(3,6-ジヒドロピリジン-1(2H)-イル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロアセテート、9-メチル-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-(ピペリジン-3-イルメチル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸ヒドロクロライド、9-(クロロメチル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、2-[(4-メトキシベンジル)アミノ]-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロアセテート、2-(3-([2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]アミノ}プロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(ベンジルアミノ)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロアセテート、2-(メチルチオ)-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1'2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、2-{3-[(2-クロロベンジル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-[3-(ベンジルアミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート；2-[3-({[(4-メトキシフェニル)アミノ]カルボニル}アミノ)プロピル]-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸、2-{3-[(2-フェニルエチル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-{3-[(チエン-2-イルメチル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-ベンジル-5,6,9,10-テ
トラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オン、5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-[1,4]ジアゼピノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7-オン、2-{3-[(4-クロロベンジル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-{3-[(2-フェニルプロピル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、7-オキソ-5,6,7,8,9,10-ヘキサヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-9-カルボキサミドトリフルオロアセテート、2-(3-ヒドロキシプロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸、2-(1,3-ジヒドロ-2H-イソインドール-2-イル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロアセテート、2-{3-[(4-アミノフェニル)アミノ]プロピル}-4,5-ジヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(4-ヒドロキシピペリジン-1-イル)-5,6,9,10-テトラヒドロピラジノ[1',2':1,5]ピラゾロ[3,4-f]イソキノリン-7(8H)-オントリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-7-ヒドロキシ-8-(3-ニトロフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ベンゾ[g]インダゾール-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(2-アミノエチル)-7-ヒドロキシ-8-(3-ニトロフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ベンゾ[g]インダゾール-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、3-ヒドロキシ-2-(3-ニトロフェニル)-5,6,8,9,10,11-ヘキサヒドロ-7H-ベンゾ[g][1,4]ジアゼピノ[1,2-b]インダゾール-7-オントリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-7-ヒドロキシ-4,5-ジヒドロ-2H-ベンゾ[g]インダゾール-3-カルボン酸ジヒドロクロライド、2-(2-アミノエチル)-8-ブロモ-7-ヒドロキシ-4,5-ジヒドロ-2H-ベンゾ[g]インダゾール-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-[2-(4-クロロフェニル)エチル]-7-ヒドロキシ-4,5-ジヒドロ-2H-ベンゾ[g]インダゾール-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、3-ヒドロキシ-2-(3-ニトロフェニル)-5,6,9,10-テトラヒドロベンゾ[g]ピラジノ[1,2-b]インダゾール-7(8H)-オンヒドロブロミド、2-(3-アミノプロピル)-8-ブロモ-7-ヒドロキシ-4,5-ジヒドロ-2H-ベンゾ[g]インダゾール-3-カルボン酸ヒドロブロミド、2-(3-アミノプロピル)-7-ヒドロキシ-8-(4-ニトロフェニル)-4,5-ジヒドロ-2H-ベンゾ[g]インダゾール-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-8-(3-シアノフェニル)-7-ヒドロキシ-4,5-ジヒドロ-2H-ベンゾ[g]インダゾール-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、2-(3-アミノプロピル)-7-ヒドロキシ-8-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-4,5-ジヒドロ-2H-ベンゾ[g]インダゾール-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、および2-(3-アミノプロピル)-7-ヒドロキシ-8-(3,3,3-トリフルオロプロピル)-4,5-ジヒドロ-2H-ベンゾ[g]インダゾール-3-カルボン酸トリフルオロアセテート、7-ヒドロキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、2,3,8,10,11,12-ヘキサヒドロ-1H,7H-9,12-メタノアゼピノ[3,4-b]ピラノ[3,2-e]インドール-8-カルボン酸、7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、7-(メチルチオ)-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、7-(ベンジルオキシ)-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、7-(メチルチオ)-3,4,5,10-テトラヒド���-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、2,2,2-トリフルオロエチル-7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボキシレート、2,3-ジヒドロキシプロピル-7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボキシレート、ピリジン-4-イルメチル-7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボキシレート、2-フルオロエチル-7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボキシレート、アリル-7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボキシレート、ベンジル-7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボキシレート、2-(メチルチオ)エチル-7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボキシレート、2-メトキシエチル-7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボキシレート、7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、7-ヒドロキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、2,3,8,10,11,12-ヘキサヒドロ-1H,7H-9,12-メタノアゼピノ[3,4-b]ピラノ[3,2-e]インドール-8-カルボン酸、7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、7-(メチルチオ)-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、7-(ベンジルオキシ)-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、7-(メチルチオ)-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-カルボン酸、6-(2-オキソ-2-フェニルエトキシ)-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-カルボン酸、6-メトキシ-2-メチル-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-カルボン酸、2,2,2-トリフルオロエチル-7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボキシレート、6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-カルボン酸、7-ヒドロキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、6-ヒドロキシ-2-メチル-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-カルボン酸、7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボン酸、6-メトキシ-2-メチル-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-カルボン酸、2,3-ジヒドロキシプロピル-7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロ-1H-2,5-メタノアゼピノ[3,4-b]インドール-1-カルボキシレート、4-エチル-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-カルボン酸、6-メトキシ-4-メチル-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-カルボン酸、8,9,10,11-テトラヒドロ-7H-ピリド[3',4':4,5]ピロロ[2,3-f]イソキノリン-7-オントリフルオロアセテート、3-(アミノメチル)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オントリフルオロアセテート、3-(アミノメチル)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オンヒドロクロライド、7-メトキシ-3,4,5,10-テトラヒドロアゼピノ[3,4-b]インドール-1(2H)-オン、6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、6-メトキシ-2,9-ジヒド��-1H-β-カルボリン-1-オン、6-ヒドロキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、8,9,10,11-テトラヒドロ-7H-ピリド[3',4':4,5]ピロロ[2,3-f]イソキノリン-7-オン、3-(アミノメチル)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、3-(アミノメチル)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、6-メトキシ-3-{3-[(2-フェニルエチル)アミノ]プロピル}-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、(1E)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-カルバゾール-1-オンオキシム、(1Z)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-カルバゾール-1-オンオキシム、6-メトキシ-3-{3-[(3-フェニルプロピル)アミノ]プロピル}-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、メチル1-オキソ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドール-6-カルボキシレート、3-(ヒドロキシメチル)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、3-(3-アミノプロピル)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、3-(2-アミノエチル)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、エチル1-(ヒドロキシイミノ)-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-カルバゾール-6-カルボキシレート、2-メトキシ-7,8,9,10-テトラヒドロシクロヘプタ[b]インドール-6(5H)-オンオキシム、3-(ヒドロキシメチル)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、3-(3-アミノプロピル)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、3-(2-アミノエチル)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、エチル1-(ヒドロキシイミノ)-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-カルバゾール-6-カルボキシレート、2-メトキシ-7,8,9,10-テトラヒドロシクロヘプタ[b]インドール-6(5H)-オンオキシム、3-[3-(ベンジルアミノ)プロピル]-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-カルバゾール-1-オンオキシム、6-ヨード-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-カルバゾール-1-オンオキシム、6-メトキシ-2-メチル-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-カルバゾール-1-オンオキシム、3-(3-ヒドロキシプロピル)-6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-オン、エチル1-オキソ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1H-ピリド[4,3-b]インドール-6-カルボキシレート、6-メトキシ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-β-カルボリン-1-チオン、メチル4-オキソ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-カルバゾール-8-カルボキシレート、ならびに2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-カルバゾール-1-オンオキシムを含む。他の化合物は、米国特許出願第2004-0127492号、同第2005-0101623号、同第2005-0137220号、および同第2005-0143371号に記載されている。
【０１７０】
プロドラッグおよび他の修飾型化合物
分子、例えば薬剤とMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドの相互作用を利用して、化学療法または放射線療法に対する細胞の感受性を高めることができる。MAPKAPキナーゼ-2が関与する疾患もしくは障害の治療、安定化、または予防は、化合物、ペプチド、または核酸分子を投与することで影響を受ける場合がある。しかしながら、場合によっては、インビトロにおいてMAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドと天然基質の相互作用の破壊に有効な化合物は、インビボでは有効な治療薬ではない。例えば、この原因は、化合物の低い生物学的利用能にあると考えられる。こうした問題を迂回する1つの方法は、投与後に当初の化合物に天然の状態で変換する、生物学的利用能が改善された修飾型薬剤、すなわちプロドラッグを投与することである。このようなプロドラッグは、変換を受けると、その完全な薬理作用を示す可能性がある。プロドラッグは、親分子の望ましくない特性を変化させたり、または除去したりするように特異的に設計された1種類もしくは複数の特化した保護基を含む。1つの態様では、プロドラッグは、親分子の1つもしくは複数の荷電性または疎水性の官能基をマスクする。投与後、プロドラッグはインビボで活性化合物に代謝される。
【０１７１】
プロドラッグは、薬剤の以下の1つもしくは複数の特徴を改善するために有用な可能性がある：溶解性、吸収、分布、代謝、排出、部位特異性、安定性、患者による受入れやすさ、毒性の軽減、または製剤上の問題。例えば、活性化合物は、経口生物学的利用能が低いことがあるが、体内で代謝され得る適切に選択された共有結合を結合させることによって、経口生物学的利用能は、体内における親化合物の活性に有害な作用を及ぼすことなくプロドラッグの経口投与を可能とするために十分に改善する可能性がある。
【０１７２】
プロドラッグは、担体に結合した状態の場合もある。つまり、酵素処理によって除去可能なエステルなどの官能基を含む。最適には、追加される官能基は、薬理作用をほとんど有さないか、または全く有さず、およびこのような基を親化合物につなげる結合は、インビボにおける効率的な活性化を可能とするように不安定である。このような担体基は、親化合物に直接結合させることができる(バイパーテート（bipartate)）ほか、リンカー領域を介して結合させることができる(トリパーテート（tripartate)）。プロドラッグを形成させるために親化合物に結合される官能基の一般的な例は、エステル、メチルエステル、サルフェート、スルホネート、ホスフェート、アルコール、アミド、イミン、フェニルカルバメート、およびカルボニルを含む。
【０１７３】
一例として、メチルプレドニゾロンは、水溶性の低いコルチコステロイド薬剤である。注射液または眼内投与に有用なものとするために、同薬剤は、溶解性の高いプロドラッグに変換しなければならない。メチルプレドニゾロンナトリウムのコハク酸エステルは、親化合物より可溶性がかなり高く、およびインビボでコリンエステラーゼによって速やかに、かつ十分に、遊離のメチルプレドニゾロンに加水分解される。
【０１７４】
ケージ化化合物をプロドラッグとして使用することもできる。ケージ化化合物は例えば、対象化合物を生物学的に不活性にする、結合された1つもしくは複数の光分解可能な官能基を有する場合がある。この例では、閃光分解がケージ基を、空間的または時間的に制御された様式で放出する(かつ化合物を活性化する)。ケージ化化合物は、当業者に既知の任意の方法で作製または設計可能である。
【０１７５】
プロドラッグの設計および使用に関する、さらなる記載に関しては、Testa and Mayer, Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism: Chemistry, Biochemistry and Enzymology, Vch. Verlagsgesellschaft Mbh. (2003)を参照されたい。他の修飾型化合物も、本発明の方法における候補となる。例えば、ある修飾型化合物は、代謝されて親分子を生成する必要はない。むしろ、いくつかの態様では、化合物は例えば、親分子の活性を実質的に減じることなく生物学的利用能を高める除去不能な部分を含む場合がある。このような部分は例えば、共有結合によって親分子に連結可能であり、および細胞による取り込みを高めるために、細胞膜などの生体膜を越えて移行可能とすることができる。例示的な部分はペプチド、例えばペネトラチンまたはTATを含む。本発明の例示的なペネトラチン含有化合物は例えば、アンテナペディア(Antennapedia)タンパク質(Derossi et al., J. Biol. Chem. 269:10444-10450, 1994)のホメオドメインに由来する16アミノ酸の配列を含むペプチド、特にアミノ酸配列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO: 50)を有するペプチドであるか、またはLin et al.(J. Biol. Chem. 270:14255-14258, 1995)に開示されたペプチド配列を含む。米国特許出願第2004-0209797号、ならびに米国特許第5,804,604号、同第5,747,641号、同第5,674,980号、同第5,670,617号、および同第5,652,122号に記載された部分もある。さらに本発明の化合物は、例えば固体支持体に結合させることができる。
【０１７６】
スクリーニングアッセイ法
蛍光偏光アッセイ法を、本発明の方法に有用な低分子ペプチド模倣物または他の化合物を同定するための置換アッセイ法に使用することができる。以下に、蛍光偏光を使用する例示的な方法につい説明するが、どのような形であれ制限する意図はないと見なされたい。スクリーニングに関しては、全ての試薬は、適切な濃度に希釈し、および使用溶液(working solution)を氷上で維持する。GST融合タンパク質およびGST融合タンパク質用の使用ストック溶液(working stock)の濃度は約4 ng/μlであり、フルオレセイン標識ペプチドは1.56 fmol/μlの濃度で使用可能であり、コールドのペプチドは25 pmol/μlの濃度で使用可能である。試料を、1ウェルあたり200μlの総容量で、黒色平底プレート、Biocoat、#359135(低結合用)(BD BioSciences; Bedford, MA)上でインキュベートする。アッセイ法は、Labsystem Multi-Drop 96/384装置(Labsystem；Franklin, MA)を使用して、10% DMSO(平均濃度28μM)に希釈した50μlの試験化合物、50μlの50 mM MES-pH 6.5、50μlのフルオレセイン-ペプチド、50μlのGST-MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドを連続的に添加することで開始するほか、50μlの非標識ポリペプチドを負の対照として使用することができる。添加後に、全てのプレートを4℃で静置する。4℃で一晩のインキュベーション後に、蛍光偏光をPolarionプレートリーダー(Tecan, Research Triangle Park, NC)で測定する。キセノンフラッシュランプには、485 nmの励起フィルターおよび535 nmの発光フィルターを装着する。フラッシュの数は30とする。次に生データを、全相互作用に対するパーセンテージに変換することができる。続く全ての解析は、SPOTFIREデータ解析ソフトウェア(SPOTFIRE, Somerville, MA)を使用して実施することができる。
【０１７７】
活性化合物の選択後に、ヒットの自己蛍光、ならびに蛍光消光効果を測定する。測定値が2,000単位を越える場合は自己蛍光であることを意味し、測定値が50単位の場合は、クエンチング効果を意味する。確認されたヒットを次に用量反応曲線(IC50)で解析して再確認することができる。次に、用量反応曲線上における最高のヒットを、GST-MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチド融合体を使用する等温滴定熱量計で評価することができる。
【０１７８】
候補化合物のアッセイ法は、MAPKAPキナーゼ-2と結合することが既知の化合物の存在下で実施可能であり、および結合することが既知の化合物の存在下と非存在下で結合に差が見られれば、候補化合物のMAPKAPキナーゼ-2との結合能力の有用な尺度となる可能性がある。このアッセイ法は、当業者に既知の任意のフォーマットで、例えば置換アッセイ法として実施可能である。
【０１７９】
他の結合アッセイ法および置換アッセイ法
蛍光偏光アッセイ法は、スクリーニング戦略における化合物-タンパク質相互作用を測定する手段の1つに過ぎない。化合物-タンパク質相互作用の別の測定法が当業者に知られている。このような方法は、質量分析(Nelson and Krone, J. Mol. Recognit, 12:77-93, 1999)、表面プラズモン共鳴(Spiga et al., FEBS Lett., 511:33-35, 2002；Rich and Mizka, J. Mol. Recognit, 14:223-8, 2001；Abrantes et al., Anal. Chem., 73:2828-35, 2001)、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)(Bader et al., J. Biomol. Screen, 6:255-64, 2001；Song et al., Anal. Biochem. 291:133-41, 2001；Brockhoff et al., Cytometry, 44:338-48, 2001)、生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)(Angers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:3684-9, 2000；Xu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:151-6, 1999)、蛍光消光(Engelborghs, Spectrochim. Acta A. Mol. Biomol. Spectrosc, 57:2255-70, 70；Geoghegan et al., Bioconjug. Chem. 11:71-7, 2000)、蛍光活性化細胞スキャニング/ソーティング(Barth et al., J. Mol. Biol., 301:751-7, 2000)、ELISA、およびラジオイムノアッセイ法(RIA)を含むが、これらに限定されない。
【０１８０】
薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、それ自体公知の方法で、例えば従来の溶解過程、凍結乾燥過程、混合過程、顆粒化過程、または調合過程の手段で調製される。組成物および製剤を作製する、当技術分野で周知の方法は例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(第20版、A.R. Gennaro編、2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia)に記載されている。
【０１８１】
活性成分の溶液、さらには懸濁液、および特に等張性の水溶液もしくは懸濁液が好ましくは、可能であれば、使用直前に調製されるこのような溶液または懸濁液のために、例えば活性成分のみを含むか、または併せて担体、例えばマンニトールを含む凍結乾燥組成物の場合に使用される。薬学的組成物は、無菌化することが可能であり、および/または添加剤、例えば保存剤、安定剤、湿潤剤および/または乳化剤、可溶化剤、浸透圧調節用の塩類、および/または緩衝液を含むことが可能であり、ならびにそれ自体公知の方法で、例えば、従来の溶解過程もしくは凍結乾燥過程の手段で調製される。以上の溶液もしくは懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、またはゼラチンなどの、粘性を高める物質を含む場合がある。
【０１８２】
油中懸濁液は、油成分として、注射目的で使用されることの多い植物油、合成油、または半合成油を含む。したがって特に、抗酸化剤、例えばビタミンE、β-カロテン、または3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシトルエンが必要に応じて添加される、酸成分として8〜22個、特に12〜22個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸、例えばラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、または対応する不飽和酸、例えばオレイン酸、エライジン酸、エルカ酸、ブラシジン酸、またはリノール酸を含むこのような液体脂肪酸エステルを挙げることができる。これらの脂肪酸エステルのアルコール成分は、最大6個の炭素原子を有し、およびモノヒドロキシまたはポリヒドロキシ、例えばモノヒドロキシ、ジヒドロキシ、もしくはトリヒドロキシのアルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、もしくはペンタノール、またはこれらの異性体、特にグリコールおよびグリセロールである。したがって、脂肪酸エステルの以下の例を挙げることができる：オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、「Labrafil M 2375」(トリオレイン酸ポリオキシエチレングリセロール、Gattefoss, Paris)、「Miglyol 812」(鎖長がC8〜C12の飽和脂肪酸のトリグリセリド、Huls AG, Germany)、特に、綿実油、アーモンドオイル、オリーブオイル、ヒマシ油、ゴマ油、ダイズ油などの植物油、および特にラッカセイ油。
【０１８３】
注射用組成物は、無菌条件で一般的な様式で調製される。これは、組成物をアンプルまたはバイアルに充填して、容器を密封する場合についても同様である。
【０１８４】
経口投与用の薬学的組成物は、活性成分を固体担体と混合し、必要に応じて、結果として得られた混合物を顆粒化し、および同混合物を、必要に応じて、もしくは必要ならば適切な添加剤の添加後に、錠剤、糖衣錠コア(drage core)、またはカプセル剤として加工することで得られる。活性成分の正確に測定された量の分散または放出を可能とするプラスチック製の担体中に組み入れることも可能である。
【０１８５】
適切な担体は特に、糖類、例えば乳糖、サッカロース、マンニトール、もしくはソルビトール、セルロース調製物、および/またはリン酸カルシウム、例えば三リン酸カルシウムもしくはリン酸水素カルシウムなどの賦形剤、ならびに例えばトウモロコシ、コムギ、イネ、またはジャガイモのデンプンを使用したデンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドンなどの結合剤、および/または必要に応じて、上記のデンプンなどの崩壊剤、さらにはカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどの塩である。賦形剤は特に、流動剤および潤滑剤、例えばケイ酸、タルク、ステアリン酸、またはマグネシウムもしくはカルシウムのステアリン酸塩などの塩、および/またはポリエチレングリコールである。糖衣錠コアは、適切な、任意で腸溶性のコーティングが施され、それはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、または適切な有機溶媒中のコーティング溶液、または腸溶コーティング剤の調製には、フタル酸エチルセルロースもしくはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの適切なセルロース調製物の溶液を含む場合のある濃縮糖溶液として特に使用される。カプセル剤は、ゼラチンから作られる乾燥充填カプセル剤、およびゼラチンから作られる密封軟カプセル剤（soft sealed capsule）、ならびにグリセロールやソルビトールなどの可塑剤である。乾燥充填カプセル剤は、顆粒状態の活性成分を例えば、乳糖などの充填剤、デンプンなどの結合剤、および/またはタルクやステアリン酸マグネシウムなどの流動促進剤と、および必要に応じて安定剤とともに含む場合がある。軟カプセル剤中には、好ましくは活性成分が、脂肪油、パラフィン油、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な油性賦形剤中に溶解されるか、または懸濁され、安定剤および/または抗菌剤も添加することも可能である。色素または着色料を、錠剤または糖衣錠コーティング剤に、またはカプセル包装材に、例えば視認目的で、もしくは活性成分の異なる量を示すために添加することができる。
【０１８６】
薬学的組成物は、約1%〜約95%、好ましくは約20%〜約90%の活性成分を含む。本発明の薬学的組成物は例えば、アンプル、バイアル、坐剤、糖衣錠、錠剤、またはカプセル剤の形状などの単位投与剤形の場合がある。
【０１８７】
製剤はヒト患者に、治療的有効量(例えば真核宿主生物における疾患、障害、または感染の発生もしくは進行を低下させる量、抑制する量、弱める量、減少させる量、停止させる量、または安定化させる量)を投与することができる。治療薬の好ましい投与量は、疾患のタイプおよび程度、患者の全体的な健康状態、配合される添加剤の剤形、およびその投与経路などの変数に依存する可能性が高い。
【０１８８】
上記の任意の投与法に関しては、MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドと相互作用する化合物を、治療的事象が必要とされる部位に(例えば注射、例えば1つもしくは複数の腫瘍への直接の注射)によって、または治療的事象が推定される近傍の組織に、または強化療法が必要であると推定される細胞が供給される血管に投与することができる。
【０１８９】
MAPKAPキナーゼ-2ポリペプチドと相互作用する化合物の投与量は、個々の患者の大きさ、および健康状態を含む、いくつかの因子に依存するが、一般に成人には1日あたり0.1 mg〜1000 mg(両端を含む)が、任意の薬学的に許容される剤形で投与される。加えて、本明細書に記載された任意の方法による処置を従来の治療法と組み合わせることができる。
【０１９０】
他の態様
本明細書で言及された、全ての出版物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。加えて、米国特許出願第2005-0196808号および、2005年5月9日に出願された米国特許出願第11/126,022号が参照により本明細書に組み入れられる。本発明の、記載された方法および系に、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、さまざまな修正や変更がなされることは当業者に明らかであると思われる。本発明は、特定の態様について記載されているが、請求する発明が、そのような特定の態様に過度に制限されるべきではないと理解されるべきである。実際に、当業者に周知の本発明の実施に関して記載された様式のさまざまな修正は、本発明の範囲に含まれることを意図している。
【０１９１】
他の態様は、請求項に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】p38α SAPKによる基質のリン酸化の基質特異性および動態解析。図1Aは、指向性ペプチドライブラリーのスクリーニングで決定されたp38の基質特異性を示す表。最高の選択性を示す残基を示し；選択値が1.7を上回る残基を太字で示す。省略形は以下の通り：MEF2A、筋細胞エンハンサー因子2；ATF2＝活性化転写因子2；3PK1＝MAPキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ-3。図1Bは、最適なp38ペプチド(p38チド)、およびp47phoxに由来するペプチド(p47チド)のインビトロにおけるp38αキナーゼによるリン酸化の動態を示すグラフ。図1Cは、野生型のGST-p47phox、Ser345→Ala変異体、およびSer348→Ala変異体のインビトロにおけるリン酸化の動態を示すグラフ。n=3の実験で得られた典型的なデータを示す。図1Dは、完全長の野生型または変異体のp47phoxタンパク質のインビトロにおけるリン酸化を示す。試料はSDS-PAGE/オートラジオグラフィーで解析された。図1Eは、図1Cに示した反応の動態パラメータの表。
【図２】DNA損傷後のCdc25BおよびCdc25Cのリン酸化におけるMAPKAPキナーゼ-2の関与を示す。図2Aは、p38α SAPKまたはMAPKAPキナーゼ-2による、完全長の野生型Cdc25BまたはSer-323→Ala変異体のリン酸化を示す。リン酸化後に、Cdc25B上における14-3-3結合部位の発生が、14-3-3-MBPプルダウンと、続くSDS-PAGE/オートラジオグラフィーによって判定された。図2Bでは、MAPKAPキナーゼ-2によるリン酸化の動態、およびCdc25B上における14-3-3結合部位の発生が、20 J/m2のUV照射によってU2OS細胞で測定された。図2Cでは、G2/M期、G1期、およびS期のチェックポイント応答におけるシグナル伝達が、GFPのsiRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理したU2OS細胞を対象に、UVによって誘導されるDNA損傷の前および2時間後に解析された。ローディング量が等しいことは、β-アクチンに対するウェスタンブロッティングで判定された。
【図３】MAPKAPキナーゼ-2による基質のリン酸化の基質特異性および動態解析を示す。図3Aは、指向性ペプチドライブラリーのスクリーニングで決定されたMAPKAPキナーゼ-2の基質特異性を示す表。省略形は以下の通り：HSP27、熱ショックタンパク質27；5-LO、5-リポキシゲナーゼ；LSP1、リンパ球特異的タンパク質；SRF、血清応答因子；GS、グリコーゲン合成酵素；TH、チロシンヒドロキシラーゼ。図3Bは、MAPKAPキナーゼ-2による、最適なMAPKAPキナーゼ-2ペプチド(MK2チド)のインビトロにおけるリン酸化の動態を示すグラフ。図3Cは、MAPKAPキナーゼ-2による野生型および変異体のMK2チドのリン酸化の動態パラメータの表。
【図４】MAPKAPキナーゼ-2が、DNA損傷後のG2/M停止に必要なことを示す。図4Aは、UV-C照射が、核内点状構造の形成によって明らかとなるDNA損傷を誘導することを示す。U2OS細胞を擬似照射するか、または20 J/m2のUV-C照射に曝露し、2時間後に抗リン酸化(Ser/Thr)ATM/ATR基質抗体を使用して免疫染色した。図4Bは、50 ng/mlのノコダゾールを含む培地中に16時間置かれた、GFPのsiRNAで処理された非照射U2OS細胞のFACS解析を示すグラフ。細胞のDNA含量をPI染色で解析した。図4Cは、50 ng/mlのノコダゾールを含む培地中に16時間置かれた、GFPのsiRNAで処理された非照射U2OS細胞のFACS解析を示すグラフ。細胞のリン酸化ヒストンH3の染色を、有糸分裂移行のマーカーとして解析した。図4Dは、図4Aと同様に照射後に、50 ng/mlのノコダゾールを含む培地中にさらに16時間置かれた、GFPのsiRNAで処理したU2OS細胞のFACS解析を示すグラフ。細胞のDNA含量をPI染色で解析した。図4Eは、図4Aと同様に照射後に、50 ng/mlのノコダゾールを含む培地中にさらに16時間置かれた、GFPのsiRNAで処理されたU2OS細胞のFACS解析を示すグラフ。細胞のリン酸化ヒストンH3の染色を、有糸分裂移行のマーカーとして解析した。図4Fは、50 ng/mlのノコダゾールを含む培地中に16時間置かれた、MAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理された非照射U2OS細胞のFACS解析を示すグラフ。細胞のDNA含量をPI染色で解析した。図4Gは、50 ng/mlのノコダゾールを含む培地中に16時間置かれた、MAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理された非照射U2OS細胞のFACS解析を示すグラフ。細胞のリン酸化ヒストンH3の染色を、有糸分裂移行のマーカーとして解析した。図4Hは、図4Aに記載された手順で照射後に、50 ng/mlのノコダゾールを含む培地中に16時間置かれた、MAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理されたU2OS細胞のFACS解析を示すグラフである。細胞のDNA含量をPI染色で解析した。図4Iは、図4Aに記載された手順で照射後に、50 ng/mlのノコダゾールを含む培地中に16時間置かれた、MAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理されたU2OS細胞のFACS解析を示すグラフ。細胞のリン酸化ヒストンH3の染色を有糸分裂移行のマーカーとして解析した。図4Jは、GFPのsiRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理したU2OS細胞を擬似処理するか、または20 J/m2のUV-C照射に曝露し、および図4B〜4Iに記載された手順で解析された実験の結果を示すグラフ。各実験の代表的な結果を示す。図4Kは、GFPのsiRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理されたU2OS細胞を擬似処理するか、または10 Gyの電離放射線照射に曝露させ、および図4B〜4Iに記載された手順で解析した実験の結果を示すグラフ。各実験の代表的な結果を示す。
【図５】MAPKAPキナーゼ-2が、DNA損傷後のS期停止および細胞生存に必要なことを示す。図5Aでは、GFPのsiRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理されたU2OS細胞を擬似処理するか、または同細胞にUVを照射し、および30分間かけて回復させた。BrdUを添加して細胞を固定し、およびDNA含量およびBrdUの取り込みを12時間後にFACSで解析した。図5Bは、BrdU添加の2時間後および12時間後における、BrdUの取り込みを示す図5Aの細胞のパーセンテージを示すグラフ。図5Cでは、GFPのsiRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理されたU2OS細胞を、擬似処理するか、または同細胞にUVを照射し、30分間かけて回復させた後に、BrdUで30分間、パルス標識を行った。照射後の所定の時間に、DNA含量の分布をBrdU陽性集団を対象に解析した。図5Dでは、GFPのsiRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理したU2OS細胞を擬似処理するか、または同細胞に所定の線量のUV-Cを照射した。48時間後に細胞をクリスタルバイオレットで染色して可視化した。挿入図は拡大図を示す。図5Eは、細胞を35 mm2のディッシュあたり約100個の密度でプレーティングして行われた定量的コロニー形成アッセイ法の結果を示すグラフ。細胞を図5Dと同様に処理し、およびアッセイ法を各条件について3回実施した。
【図６】MAPKAPキナーゼ-2、Akt、およびChk1の基質結合間隙に対する、活性部位の静電ポテンシャルおよび疎水性の比較を示す。図6Aは、Akt/PKB、Chk1、Chk2、およびMAPKAPキナーゼ-2に対する最適な基質リン酸化モチーフを示す表。図6Bは、図6C〜6E(上)と同様の方向から見たMAPKAPキナーゼ-2のキナーゼドメインのリボン表示、および活性部位中の基質ペプチドを棒表示で示す、直交方向(下)から見た同ドメインである。同図は、MolscriptおよびRaster3Dを使用して作製された。図6Cは、GRASPを使用した、Akt/PKBの活性部位の分子表面表示(PDBコード1O6K)。静電ポテンシャル(左)および疎水性(右)に影をつけて示す。リン酸化受容部位を太字で表示したGSK3基質ペプチドGRPRTTSFAE(SEQ ID NO: 5)を棒表示で示す。図6Dは、MAPKAPキナーゼ-2の活性部位の分子表面表示(PDBコード1NY3)。静電ポテンシャルおよび疎水ポテンシャルには、図6Cと同様に影をつけてある。最適な基質ペプチドLQRQLSIA(SEQ ID NO: 6)を棒表示で示す。図6Eは、Chk1の活性部位の分子表面表示(PDBコード1IA8)。静電ポテンシャルおよび疎水ポテンシャルには、図6Cと同様に影をつけてある。モデル化されたCdc25Cの基質ペプチド(LYRSPSMPL)(SEQ ID NO: 7)の棒表示を示す。図6C、図6D、および図6Eにおける基質ペプチドのSer-5位、Ser-3位、およびSer+1位に対応する領域を点線の円で示す。
【図７】キナーゼ依存性のDNA損傷チェックポイントの統合モデル。このモデルでは、DNA損傷チェックポイントの情報伝達ネットワークの平行する経路が、類似のリン酸化モチーフ特異性を有する下流のキナーゼへのシグナル伝達によって共通の基質に収束する。Φは疎水性残基を意味する。Chk1からCdc25B/Cに至る点線は、このリン酸化が、電離放射線照射に反応して未だ議論があることを示す。
【図８Ａ】HeLa細胞を、さまざまな化学療法剤と、記載のさまざまな時間インキュベートした。溶解物を、図に示すように、MAPKAPキナーゼ-2、リン酸化T334 MAPKAPキナーゼ-2、およびβ-アクチンに関してプローブを用いて調べた。
【図８Ｂ】U2OS細胞を、さまざまな化学療法剤と、記載のさまざまな時間インキュベートした。溶解物を、図に示すように、MAPKAPキナーゼ-2、リン酸化T334 MAPKAPキナーゼ-2、およびβ-アクチンに関してプローブを用いて調べた。
【図８Ｃ】U87MG細胞を、さまざまな化学療法剤と、記載のさまざまな時間インキュベートした。溶解物を、図に示すように、MAPKAPキナーゼ-2、リン酸化T334 MAPKAPキナーゼ-2、およびβ-アクチンに関してプローブを用いて調べた。
【図９Ａ】U2OS細胞に、レンチウイルスのトランスフェクション系で安定にトランスフェクトした。次に細胞を、図に示すようにシスプラチンおよびノコダゾールで処理した。インキュベーション後に細胞を回収し、および後のFACS解析用に、ヨウ化プロピジウムおよびリン酸化ヒストンH3抗体で標識した。
【図９Ｂ】U2OS細胞に、レンチウイルスのトランスフェクション系で安定にトランスフェクトした。次に細胞を、図に示すように、ドキソルビシンおよびノコダゾールで処理した。インキュベーション後に細胞を回収し、および後のFACS解析用にヨウ化プロピジウムおよびリン酸化ヒストンH3抗体で標識した。
【図１０】U2OS細胞に、図に示すように、GFPまたはMAPKAPキナーゼ-2を標的とするsiRNAを一過的にトランスフェクトした。シスプラチンとの所定の時間のインキュベーション後に、細胞を回収し、および溶解物を、図に示すように、CDC25A、MAPKAPキナーゼ-2、およびβ-アクチンに関してブロッティングした。
【図１１Ａ】2つの独立したプレーティングアッセイ法の結果を要約したグラフ。一過的にトランスフェクトされた細胞をシスプラチンで8時間処理した。インキュベーション後に、細胞を1:20に分け、および新しいディッシュに再び播いた。1週間後に細胞をメタノールで固定し、および改変Giemsa(商標)染色液で2分間かけて染色した。次にコロニーを数えた。
【図１１Ｂ】2つの独立したプレーティングアッセイ法の結果をまとめたグラフ。一過的にトランスフェクトされた細胞をドキソルビシンで8時間処理した。インキュベーション後に、細胞を1:20に分け、および新しいディッシュに再び播いた。1週間後に細胞をメタノールで固定し、および改変Giemsa(商標)染色液で2分間かけて染色した。次にコロニーを数えた。
【図１１Ｃ】図11Aに対応するオリジナルプレートの写真。挿入図は、1個のコロニーの拡大図を示す。
【図１１Ｄ】図11Bに対応するオリジナルプレートの写真。挿入図は、1個のコロニーの拡大図を示す。
【図１２】MAPKAPキナーゼ-2経路が、DNA損傷性の化学療法後に活性化されることを示す。図12A〜12Dには、MAPKAPキナーゼ-2およびp38 MAPKの活性化の動態を示す。U2OS細胞を10μMのシスプラチン(図12A)、10μMのカンプトテシン(図12B)、10μMのドキソルビシン(図12C)、またはDMSO対照(図12D)で、所定の時間処理した。細胞溶解物を、MAPKAPキナーゼ-2(MK-2)およびリン酸化/活性化型のMK-2、およびp38 MAPKを対象に、ウェスタンブロッティングでプローブを用いて調べた。β-アクチンの染色をローディング対照とした。図12Eは、MAPKAPキナーゼ-2の活性化がp38 MAPKに依存することを示す。U2OS細胞を、p38 MAPKの特異的阻害剤SB203580(10μM)、またはDMSO溶媒で30分間処理した後に、図12A〜12Dに示すように、化学療法剤に曝露した。全p38およびリン酸化/活性化型のp38を、上記と同様の手順でイムノブロッティングで判定した。図12Fは、MAPKAPキナーゼ-2の活性化が、γH2AX核内点状構造(nuclear foci)の形成と対応することを示す。U2OS細胞を擬似処理するか、またはシスプラチン(10μM)、カンプトテシン(10μM)、もしくはドキソルビシン(10μM)とインキュベートした。1時間および4時間後に細胞を、γ-H2AXに対する抗体を使用して免疫染色し、ならびにDAPIで対比染色した。
【図１３】ATM/ATRが、DNA損傷剤によるMAPKAPキナーゼ-2の活性化に必要なことを示す。図13Aは、ドキソルビシンによるMAPKAPキナーゼ-2の活性化にはATMが関与するが、シスプラチンまたはUVによる活性化には関与しないことを示す。GM05849 A-T線維芽細胞、および対応する対照GM00637線維芽細胞を、シスプラチン(10μM)、ドキソルビシン(10μM)、UV照射(20J/m2)、またはDMSO(対照)で2時間または8時間処理した。細胞溶解物を、全MAPKAPキナーゼ-2および活性化型のMAPKAPキナーゼ-2に対して、図12に示す手順でイムノブロッティングでプローブを用いて調べた(ローディング対照としてβ-アクチンを使用)。図13Bは、シスプラチンとドキソルビシンの両方によるMAPKAPキナーゼ-2の活性化がATRに依存することを示す。ゼッケル症候群の患者に由来するGM18366 ATR欠損細胞、または対応する対照GM00023線維芽細胞を処理し、および図13Aと同様に解析した。シスプラチンおよびドキソルビシンとは対照的に、UV照射後のMAPKAPキナーゼ-2の活性化はATRを必要としなかった。図13Cは、カフェインが、シスプラチンおよびドキソルビシンによるMAPKAPキナーゼ-2の活性化を阻害するが、UVによる活性化を阻害しないことを示す。U2OS細胞を20 mMのカフェイン、または溶媒のみで30分間処理した後に、図13Aに示すDNA損傷剤に曝露した。細胞溶解物を上記の手順で、MAPKAPキナーゼ-2の活性化に関して解析した。
【図１４】MAPKAPキナーゼ2が、ドキソルビシン処理後のG2/M停止に関与することを示す。図14Aは、RNAiによるMAPKAPキナーゼ-2の下方制御が、ドキソルビシンによって誘導されるG2/Mチェックポイントを除去することを示す。ルシフェラーゼのshRNAを安定に発現する対照U2OS細胞、またはMAPKAPキナーゼ-2のshRNAを安定に発現するU2OS細胞を、10μMのドキソルビシンの非存在下もしくは存在下で培養し、30時間後に細胞周期プロファイルを、DNA含量に関してはPIを使用したFACSで解析し、および有糸分裂の指標としてリン酸化ヒストンH3の染色を行った。下の一連のパネルでは、ノコダゾール(100 nM)をドキソルビシンを添加した3時間後に添加した。顕著なG2/Mチェックポイントの喪失に加えて、G1期およびS期の成分も、ドキソルビシン＋ノコダゾール処理後のMK2枯渇細胞で除去されていることに注目されたい。MK2枯渇の効率を、全細胞溶解物を対象としたイムノブロッティングで解析した(左下)。図14Bは、MAPKAPキナーゼ-2の下方制御がChk1の活性化を損なわないことを示す。ルシフェラーゼのshRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2のshRNAを発現するU2OS細胞を擬似処理するか、または同細胞を10μMのドキソルビシンに30時間曝露した。全細胞溶解物を対象に、MAPKAPキナーゼ-2、ならびに全Chk1および活性化型のChk1の存在に関してイムノブロッティングを行った。図14Cは、ドキソルビシンおよびカンプトテシンによって誘導された、Cdc25Bと14-3-3の結合が、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞では失われることを示す。U2OS細胞を擬似処理するか、または10μMのシスプラチン、10μMのカンプトテシン、もしくは10μMのドキソルビシンで8時間処理した。Cdc25B上の14-3-3結合部位の存在を、溶解物を、ビーズに結合させたGST-14-3-3とインキュベート後に、プルダウン材料のイムノブロッティングを行うことでモニタリングした。
【図１５】MAPKAPキナーゼ-2が、シスプラチン処理に反応してG1/Sチェックポイントを制御していることを示す。図15Aは、RNAiによるMAPKAPキナーゼ-2の下方制御が、シスプラチンによって誘導されるG1/Sチェックポイントを除去することを示す。ルシフェラーゼのshRNAを安定に発現する対照U2OS細胞、またはMAPKAPキナーゼ-2のshRNAを安定に発現するU2OS細胞を、10μMのシスプラチンの非存在下または存在下で培養し、および細胞周期プロファイルを30時間後に、DNA含量に関してPIを使用し、および有糸分裂の指標としてリン酸化ヒストンH3の染色を使用するFACSで解析した。下の一連のパネルでは、ノコダゾール(100 nM)を、シスプラチンを添加した3時間に添加した。図15Bは、シスプラチンによって誘導された、Cdc25Aレベルの低下が、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞では、Chk1の活性化に関わらず損なわれることを示す。ルシフェラーゼのshRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2のshRNAを発現するU2OS細胞を擬似処理するか、または10μMのシスプラチンに8時間および12時間曝露した。全細胞溶解物のイムノブロッティングを、Cdc25A、全MAPKAPキナーゼ-2および活性化型Chk1を対象に行った。β-アクチンをローディング対照として使用した。図15Cは、MAPKAPキナーゼ-2がCdc25Aをインビトロでリン酸化することを示す。GSTタグを付けられたCdc25Aは、0.3μMのChk1、または0.1μMのMAPKAPキナーゼ-2のいずれかを含む30μlのキナーゼ反応物中で30℃で20分間リン酸化された。試料をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーで解析した。基質のローディング量が等しいことは、GSTを対象としたイムノブロッティングで評価された。
【図１６】MAPKAPキナーゼ-2の枯渇が、U2OS細胞を、シスプラチンおよびドキソルビシンの抗増殖作用に対して敏感にさせることを示す。ルシフェラーゼのshRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2のshRNAを発現するU2OS細胞を擬似処理するか、またはシスプラチン(図16A)もしくはドキソルビシン(図16B)の用量を増加させながら8時間、クローン原性生存アッセイ法で処理した。細胞を洗浄し、トリプシン処理を行い、および5000細胞/10 cm2ディッシュの密度で再プレーティングした。8日後にコロニーをクリスタルバイオレット染色によって可視化して数えた。挿入図は拡大図を示す。図16Cおよび図16Dは、図16Aおよび図16Bに示した結果の量的変化を示すグラフ。アッセイ法を各条件で3回行い、擬似処理細胞に対して標準化した。
【図１７】MAPKAPキナーゼ-2の枯渇が、化学療法で処理された癌細胞の移植後に、腫瘍形成をインビボで抑制することを示す。H-Ras-V12によって形質転換されたp53-/- MEFに、GFPまたはMAPKAPキナーゼ-2に対するsiRNAオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間に、細胞をシスプラチン(1μm)、ドキソルビシン(0.1μm)、または溶媒のみのいずれかで8時間処理した。各106個の細胞の2回の個々の注射を、NCRヌード非近交系マウスの脇腹の皮下組織に行った。図17Aは、所定の各処理の15日後に、結果として生じた腫瘍を背側から見た図である。対照siRNAをトランスフェクトした細胞は右側の脇腹にあり、およびMAPKAPキナーゼ-2のsiRNAで処理した細胞は左側の脇腹にある。図17Bは、DNA損傷性の化学療法剤による前処理の非実施時に形成された、結果として生じた腫瘍の拡大図である。図17Cでは、siRNAによるマウスのMAPKAPキナーゼ-2のノックダウンの効率を、腫瘍移植前の、MEFに由来する溶解物のイムノブロッティングで評価した。図17Dは、15日後のエンドポイントにおける腫瘍重量の解析を示すグラフ。
【図１８】MAPKAPキナーゼ-2の枯渇がマウスモデルで、DNA損傷性の化学療法後に、確立した腫瘍の退縮を促進させることを示す。図18Aでは、H-Ras-V12によって形質転換されたp53-/- MEFに、U6プロモーター作動性のルシフェラーゼのshRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2のshRNA、およびCMVプロモーター作動性のGFPをコードするレンチウイルスを感染させた。感染の3日後に、GFP発現細胞をFACSで選択し、さらに7日間培養した。次にGFP陽性集団の全体におけるMAPKAPキナーゼ-2のノックダウンの効率を、全細胞溶解物のイムノブロッティングで評価した。図18Bでは、図17と同様に、106個の細胞の、NCR非近交系ヌードマウスの脇腹への皮下注射後に、腫瘍の成長を2日毎に測定した。矢印は、12日目におけるDMSO、シスプラチン、またはドキソルビシンの腹腔内投与の開始点を示す。DNA損傷性の化学療法の非実施時には、MAPKAPキナーゼ-2枯渇腫瘍は、13日目に始まる各時点において、対照の腫瘍より統計学的に有意に大きかった(スチューデントのt検定、両側、p<0.02)。これとは対照的に、シスプラチンまたはドキソルビシンの処理後には、MAPKAPキナーゼ-2枯渇腫瘍は、それぞれ21日目および23日目に始まる時点において、対照となる腫瘍より統計学的に小さかった(p<0.02)。図18Cの上段のパネルは、腫瘍細胞の移植の26日後に対応する、所定の処理の開始から14日後における、インサイチューの腫瘍の背側からの観察である。中段のパネルは、対応する蛍光像である。下段のパネルは、切除後の腫瘍の拡大図である。図18Dは、26日目のエンドポイントにおける腫瘍重量の解析を示すグラフ。
【図１９】シスプラチンおよびドキソルビシンが、Chk1とは独立にMAPKAPキナーゼ-2を活性化することを示す。U2OS細胞に、GFPまたはChk1を標的とするsiRNAオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞を10μMのシスプラチン、または10μMのドキソルビシンで12時間処理し、溶解し、ならびにプローブを用いて全MAPKAPキナーゼ-2およびリン酸化/活性化型MAPKAPキナーゼ-2のレベルを調べた。ノックダウンの効率を、Chk1に対するイムノブロッティングで評価した。
【図２０】Chk1の過剰発現が、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞において、G1/SチェックポイントおよびG2/Mチェックポイントの喪失を救済し、ならびに遺伝毒性ストレスに対する耐性を高めることを示す。図20A〜20Bでは、ルシフェラーゼおよびMAPKAPキナーゼ-2のshRNAを発現するU2OS細胞に、ヒトChk1または空のベクターのみを一過的にトランスフェクトした。次に細胞を、10μMのシスプラチン(図20A)、または10μMのドキソルビシン(図20B)に曝露した。細胞周期を進行中の細胞を有糸分裂で停止させるために、指示される場合には処理の3時間後に、培地に100 nMのノコダゾールを添加した。処理の30時間後に、細胞周期プロファイルを、DNA含量についてPIを使用したFACS、およびリン酸化ヒストンH3の染色によって解析した。図20C〜20Eでは、図20Aおよび図20Bに示した細胞のタイプを、図17と同様にクローン原性生存アッセイ法に使用した。細胞を、用量を増加させながらシスプラチン(図20C)、もしくはドキソルビシン(図20D)と8時間処理するか、または擬似照射を行うか、もしくはUVを照射し(20J/m2)(図20E)、洗浄し、トリプシン処理を行い、および5000細胞/10 cm2ディッシュの密度で播いた。生存コロニー数を8日後に数えた。アッセイ法は各条件で3回実施し、擬似処理細胞に対して標準化した。
【図２１】UCN-01がMAPKAPキナーゼ-2を強力に阻害することを示す。図21Aでは、UCN-01の用量を次第に増加させるインビトロキナーゼアッセイ法を、MK-2チドを基質として使用して、Chk1およびMAPKAPキナーゼ-2を対象に行った。図21Bは、UCN-01によるMAPKAPキナーゼ-2の阻害の構造的基礎を示す。UCN-01を添加した、Chk1:UCN-01複合体(パネル1、4)、およびMAPKAPキナーゼ-2:スタウロスポリン複合体についてのリボンダイアグラムおよび分子表面を、スタウロスポリン(パネル2、3、5)にモデル化する。パネル3は、パネル2の画像を90度開店させたもの。矢印は、点で示されたファン・デル・ワールス半径を有するUCN-01の固有の7-ヒドロキシ基を示す。図21Cは、UCN-01が、U2OS細胞中でMAPKAPキナーゼ-2を阻害することを示す。ルシフェラーゼのshRNA、またはMAPKAPキナーゼ-2のshRNAを発現する細胞を200 nMのUCN-01の非存在下または存在下で、37℃または42℃で2時間インキュベートした。細胞を溶解し、全hsp-27、hsp-27 pS82、およびMAPKAPキナーゼ-2を対象にイムノブロッティングでプローブを用いて調べた。図21Dは、UCN-01によるhsp-27の阻害がChk1に依存しないことを示す。GFPまたはChk1のsiRNAをトランスフェクトした細胞を、200 nMのUCN-01の非存在下または存在下で、42℃または37℃で2時間インキュベートした。次に細胞を溶解し、全hsp-27、hsp-27 pS82、およびChk1を対象にイムノブロッティングでプローブを用いて調べた。
【図２２】DNA損傷性の化学療法剤に反応した、MAPKAPキナーゼ-2チェックポイントのシグナル伝達のモデル。DNA損傷剤に反応するチェックポイント機能は通常、Chk1とMAPKAPキナーゼ-2の両経路の共同作用を必要とし、および両経路とも、インドールカルバゾール（indolcarbazole）薬剤であるUCN-01によって同時に阻害される。
【図２３】カンプトテシンがMAPKAPキナーゼ-2を、ATR依存的およびATM非依存的に活性化することを示す。図23Aでは、ゼッケル症候群の患者に由来するGM18366 ATR欠損細胞、または対応する対照GM00023線維芽細胞をカンプトテシン(10μM)で2時間または8時間で処理した。細胞溶解物を、全MAPKAPキナーゼ-2および活性化型MAPKAPキナーゼ-2に関するイムノブロッティングでプローブを用いて調べ、抗β-アクチン抗体をローディング対照として使用した。図23Bでは、GM05849 A-T線維芽細胞、および対応する対照GM00637線維芽細胞を図23Aと同様に処理して解析した。
【図２４】シスプラチンおよびドキソルビシンによる処理が、異なる細胞周期チェックポイントを選択的に誘導することを示す。図24Aでは、非同期性の対照U2OS細胞の細胞周期プロファイルを、DNA含量を調べるためのPI、およびリン酸化ヒストンH3の染色を使用するFACSで解析した。図24Bは、ドキソルビシン(10μM)で18時間処理された細胞が、G2/M境界に選択的に蓄積し、G1期およびS期の成分が少ないことを示す。図24Cは、シスプラチン(10μM)で18時間処理された細胞がG1/Sに選択的に蓄積し、G2/Mにおける成分が少ないことを示す。図24Dは、ノコダゾール(100 nM)で18時間処理された細胞がM期に蓄積し、リン酸化ヒストンH3の染色が約42%と強かったことを示す。
【図２５】対照U2OS細胞およびMAPKAPキナーゼ-2がノックダウンされたU2OS細胞における、Chk1の過剰発現の作用を示す。ルシフェラーゼまたはMAPKAPキナーゼ-2のshRNAを安定に発現するU2OS細胞に、FLAG標識Chk1を含む発現ベクターpHURRAを、またはベクターのみを一過的にトランスフェクトした。細胞溶解物を、全MAPKAPキナーゼ-2およびChk1のレベルを調べるために、β-アクチンをローディング対照としてプローブを用いて調べた。
【図２６】Chk1の過剰発現が、UVによって誘導されるG1/Sチェックポイントの喪失を救済することを示す。ルシフェラーゼおよびMAPKAPキナーゼ-2のshRNAを発現するU2OS細胞に、ヒトChk1または空のベクターのみを一過的にトランスフェクトした。次に細胞に、20 J/m2のUV光を照射した。細胞周期を有糸分裂で停止させるために、指示される場合には、処理の3時間後に、100 nMのノコダゾールを培地に添加した。細胞周期プロファイルを、処理の30時間後に、DNA含量についてPIを使用するFACS、およびリン酸化ヒストンH3の染色によって解析した。照射後に、明瞭なG1/Sチェックポイントに加えて、マイナーなG2/Mチェックポイントも対照細胞で認められたが、MAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞では認められず、同チェックポイントは、Chk1の過剰発現によっても回復していた。
【図２７】Chk1の過剰発現が、シスプラチンで処理されたMAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞のクローン原性生存を救済することを示す。ルシフェラーゼまたはMAPKAPキナーゼ-2のshRNAを安定に発現するU2OS細胞に、FLAG標識Chk1を含む発現ベクターpHURRAを、またはベクターのみを一過的にトランスフェクトした。細胞を、シスプラチンの用量を増加させながら8時間処理し、洗浄し、トリプシン処理を行い、および5000細胞/10 cm2ディッシュの密度で播いた。生存コロニーをクリスタルバイオレットで染色し、8日後に数えた。
【図２８】Chk1の過剰発現が、ドキソルビシンで処理されたMAPKAPキナーゼ-2枯渇細胞のクローン原性生存を救済することを示す。図27に示したU2OS細胞を、ドキソルビシンの用量を増加させながら処理し、上記の手順で解析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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