(57)【要約】  昆虫幼虫からのタンパク質の回収方法が提供される。抽出バッファー中で、少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つを混合する。少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つからバッファーを分離する。分離されたバッファーからタンパク質を単離する。
2008519855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫幼虫からのタンパク質の回収方法であって、
少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つを抽出バッファーと混合し；
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つからバッファーを分離し；および
前記分離されたバッファーから前記タンパク質を単離すること
を含む方法。
【請求項２】
昆虫部分を前記抽出バッファーと混合し、かつ前記昆虫部分が長さ約１ｍｍ〜約１ｃｍである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
凍結昆虫幼虫を長さ約１ｍｍ〜約１ｃｍの断片に破砕または切断することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
デカントすること、篩い分け、スクリーニング、低速度の遠心分離、向流抽出、デカンター遠心分離、中空管や大口径の中空糸やプレート・フレーム・タンジェンシャルフローろ過、またはパーコレーション抽出の少なくとも１つによって前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つから前記バッファーを分離する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が天然型である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が組換え型である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーを転倒回転型ミキサによって混合する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーをオーバーヘッドライトニングミキサによって混合する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抽出バッファーとの混合前に前記幼虫を破砕することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記幼虫をハンマーや小づちを使用した衝撃によって破砕する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
破砕前に前記幼虫を凍結することをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抽出バッファーが、ｐＨ７．８の５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記昆虫幼虫がウェルのウェッブにおいて飼育され、各ウェルは少なくとも１つの幼虫と食餌とを含み、前記方法が前記ウェルのウェッブ、食餌および幼虫を切り刻むことをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質を前記幼虫の血液リンパから回収する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記昆虫幼虫がイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）の幼虫である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が、モノクローナル抗体、細胞表面受容体、膜内輸送タンパク質、サイクリン、サイトカイン、Ｆａｂフラグメント、ウイルス抗原、蛍光タンパク質、融合タンパク質、成長因子、コリンエステラーゼ、ペプチダーゼ、αインターフェロン、マウスＩｇＧ、ブタインターロイキン−１８、ヒトアデノシンデアミナーゼ、ヒトグループＩＩ型ホスホリパーゼＡ２、インターロイキン−２、ウイルス受容体、ホルモン受容体、無脊椎動物免疫タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、ＲＡＳエフェクター、ウイルス抗原、および抗菌ペプチドの少なくとも１つを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つから前記幼虫の血液リンパを単離し、及び前記血液リンパから前記タンパク質を単離する請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーとを約１５分〜約４５分の期間混合する請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーとを約１５秒〜４時間までの期間混合する請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーとを約３０秒〜約１分の期間混合する請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーとを約５分〜約１０分の期間混合する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーとを約１時間〜約２時間の期間混合する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離されたタンパク質を精製することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
昆虫幼虫からのタンパク質の回収用システムであって、
前記幼虫を断片に切断するかまたは前記幼虫を薄片に押しつぶす粉砕装置と；
前記幼虫断片や薄片と抽出バッファーを収容する働きをする混合容器と；
前記幼虫断片や薄片との混合後に抽出バッファーを収容する働きをするコンテナと；
幼虫破片から前記タンパク質を分離する働きをする分離機と
を含むシステム。
【請求項２５】
前記幼虫を凍結する働きをするフリーザーと；
凍結幼虫を破砕する働きをする破砕装置と
さらに含む請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
幼虫の断片や薄片を生成する手段と；
幼虫タンパク質が前記バッファーに抽出されるように前記幼虫断片や薄片と抽出バッファーを組み合わせる手段と；
幼虫タンパク質を前記抽出バッファーから単離するための手段と
を含む昆虫幼虫からのタンパク質の回収用システム。
【請求項２７】
前記幼虫を凍結するための凍結手段と；
凍結幼虫を破砕するための破砕手段と
をさらに含む請求項２６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫の幼虫からのタンパク質の回収のための方法およびシステムに関する。より詳細には、本発明は、大量飼育された昆虫幼虫からのタンパク質の回収に関する。
【背景技術】
【０００２】
昆虫を使用して、天然タンパク質と組換えタンパク質の両方が大量生産されている。昆虫を利用してタンパク質を生産する１つの難点は、昆虫体からタンパク質を単離するときに、特にタンパク質を最初に抽出するときに直面する困難性に関係している。現在、昆虫幼虫からのタンパク質の回収のための方法では、タンパク質を手動で抽出することを行っている。手動抽出は一般に、シリンジを使用して、血液リンパを除去するか、あるいは例えば腹脚を分断して昆虫から血液リンパが流れ出るように昆虫を「出血」させるなど、昆虫体の一部を除去している。手動抽出は非常に手間がかかり、かつ時間がかかる。また、プロセスは工業的規模で行えないので、少数の昆虫にしか適さない。その結果、手動抽出は、大量のタンパク質の大規模生産には役に立たない。
【０００３】
また、昆虫幼虫は完全に均質化される。しかしながら、完全な均質化は、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、腸プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼ、インテグミン（ｉｎｔｅｇｕｍｉｎ）、キチン、器官、および細胞破片の極めて複雑な混合物の生成だけでなく、かなりの量の脂質ミセルとマルチラメラの小胞の形成ももたらす。さらに均質化によって、容積固体の全体の割合を減少させることなく容積固体全体の大きさが減少し、回収がより難しく、しかもその費用がかかるようになる。そこで、この複雑な混合物から所望のタンパク質を単離する必要がある。
【０００４】
別のプロセスにおいては、目的タンパク質とカイコの繭のタンパク質成分を組み合わせた融合タンパク質を利用して、カイコの繭から目的タンパク質の回収を行っている。このプロセスに関連する問題は、融合タンパク質を創造するのに必要な繭のタンパク質からの追加のアミノ酸配列に起因して標的タンパク質を不正確に折り畳むことのほか、目的タンパク質からの、カイコの繭のタンパク質の成分を含むそれらの、同じ余分なアミノ酸配列の除去に関連する問題を含んでいる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、昆虫幼虫からのタンパク質の回収方法を提供する。この方法は、抽出バッファー中で、少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つを混合することを含む。少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つからバッファーを分離する。分離されたバッファーからタンパク質を単離（アイソレート：ｉｓｏｌａｔｅ）する。
【０００６】
本発明はまた昆虫幼虫からのタンパク質の回収用システムを提供する。このシステムは、幼虫を断片に切断するミルと、断片に切断された幼虫と抽出バッファーを収容する働きをする混合容器と、断片に切断された幼虫との混合後の抽出バッファーを収容する働きをするコンテナと、幼虫破片からタンパク質を分離する働きをする分離機とを含む。
【０００７】
本発明の目的と利点は、以下の説明から、図面を併せて参照することにより明瞭に理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の実施形態は、昆虫から血液リンパを抽出するための方法およびシステムを提供する。特に、本発明は、大量の昆虫を工業的規模で処理する場合に適用できる方法を提供する。血液リンパが抽出されたら、血液リンパ中に存在するタンパク質および／または他の所望の成分を単離できる。血液リンパの大規模な回収のための方法を提供することによって、本発明は、昆虫での現実的なタンパク質の生産に役立つ。
【０００９】
本発明は、多くの目的において昆虫を大量飼育するために有用である。例えば本発明は、昆虫の大量飼育において、組換え型または野生型バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）を製造するために有用である。このようなバキュロウイルスは、例えば別のバキュロウイルス、昆虫病原性菌類（エンタマパサジニック・ファンガイ：ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｇｉ）または線虫等のような、生物殺虫剤として利用してもよい。さらに、昆虫を大量飼育して、バキュロウイルスが媒介する発現を使用して組換えタンパク質を製造してもよい。
【００１０】
本発明の方法は、昆虫全体すなわち昆虫のまるごと全体、昆虫幼虫全体すなわち昆虫幼虫のまるごと全体を、昆虫全体を細かく切断しておよび／または昆虫幼虫を細かく切断して、抽出バッファーと混合することを含んでいる。昆虫および／または幼虫を利用する場合には、それらを均質化しないか、または最小限に均質化する。つまり、昆虫および／または幼虫を徹底的には切り刻まないので、得られる断片は識別可能である。昆虫または幼虫を完全に均質化するまで切り刻むと、このプロセスの標的であろうタンパク質が、非分泌タンパク質、各種プロテアーゼ、キチン、インテグミン、細胞全体すなわち細胞のまるごと全体、脂肪体および他の望ましくない昆虫生成物等のような、昆虫の他の望ましくない成分と混合される場合がある。完全な均質化によって創造されまたは増加されたような別の破片から、所望の標的タンパク質を分離しなければならないことは、プロセスを難しくし、しかもその費用が増大するので、幼虫（感染性または非感染性）の完全な均質化に関連した問題に何ら制限されることのない本方法が望ましいものとなる。
【００１１】
本発明を昆虫に関連して説明してきたが、クモ、ダニまたは蠕虫等の他の生物を処理するのに利用してもよい。本発明に従って処理できる昆虫の例としては、限定されないが、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）（キャベジ・シャクトリムシ（cabbage looper））、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）（ビート・アワヤトウ（beet armyworm））、ヨトウガの種（Spodoptera frugiperda）（フォール・アワヨトウ（fall armyworm））、オオタバコガ（Heliothis virescens）（タバコガ（tobacco budworm））、ヤガ科の種（コーンイヤーワーム）（Helicoverpa zea）（ボールウォーム（bollworm））、コナガ（Plutella xylostella）（コナガ（diamondback moth））、ヨーロッパアワノメイガ（Ostrinia nubilalis）（ヨーロピアンアワノメイガ（European corn borer））、アナグラファ・ファルシフェラ（Anagrapha falcifera）（セロリ・シャクトリムシ（celery looper））、ゴドリンガ（Cydia pomonella）（シンクイガ（codling moth））、クリプトフレビア・ロイコトウレタ（Cryptophlebia leucotreta）（フォールス・シンクイガ（false codling moth））、幼虫（larval：ラーバル）段階の他のガ（蛾）種、チョウ（蝶）種、捕食性昆虫、寄生性昆虫、バッタ類（グラスホッパー）（grasshoppers）、コオロギ（クリキト）（crickets）、キリギリス（カイティディドウ）（katydids）（直翅目類昆虫（Orthoptera））、ゴキブリ（cockroaches）（ゴキブリ目（Blattodea））、カマキリ（mantids）、ナナフシ（walking sticks）、ハサミムシ（earwigs）（カマキリ目（Mantodea）、ナナフシ目（Phasmatodea）、ハサミムシ目（Dermaptera））、アザミウマ（thrips）（アザミウマ目（Thysanoptera））、ツルウー・バグ（半翅類の昆虫）（true bugs）、ハナカメムシ（flower bugs）（異翅類（Heteroptera））、アブラムシ（アリマキ）（aphids）、プラントホッパー（planthoppers）、リーフホッパー（leafhoppers）、カイガラムシ（scale insects）（同翅目（Homoptera））、クサカゲロウ（Lacewings）（脈翅目（Neuroptera））、チョウ、ガ（鱗翅目（Lepidoptera））、カブトムシ（beetles）（甲虫類（Coleoptera））、ハエ（Flies）（双翅目（Diptera））、寄生蜂、およびハバチ（sawflies）（膜翅目（Hymenoptera））が挙げられる。
【００１２】
いずれの昆虫を利用して生成されたいずれのタンパク質も回収し得る。回収し得るタンパク質およびタンパク質の種類の例をいくつか挙げると、モノクローナル抗体、細胞表面受容体、膜内輸送タンパク質、サイクリン、サイトカイン、Ｆａｂフラグメント、ウイルス抗原、蛍光タンパク質、融合タンパク質、成長因子、コリンエステラーゼ、ペプチダーゼ、αインターフェロン、マウスＩｇＧ、ブタインターロイキン−１８、ヒトアデノシンデアミナーゼ、ヒトグループＩＩ型ホスホリパーゼＡ２、インターロイキン−２、ウイルス受容体、ホルモン受容体、無脊椎動物免疫タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、ＲＡＳエフェクター、ウイルス抗原、および抗菌ペプチドが挙げられる。
【００１３】
昆虫全体または幼虫全体および／または細かく切られた昆虫を利用してもいいが、本発明は一般に切断され、あるいは全体ではなくされた幼虫で行われる。これは、図１のフローチャートに示されている。図１は、タンパク質を昆虫幼虫から回収するための本発明による方法の実施形態に関係する一般的なステップを示す。始めに、幼虫を変化（ｃｏｍｍｕｔｅ）させるかまたは砕く（ステップ１）。これは、随意に行うステップであり、含まれるタンパク質によることができる。
【００１４】
切断する前に、幼虫を凍結してもよい。凍結により幼虫の均質化を最小限にすることができる。幼虫を切り刻むか、ハンマーや小づち等を使用して衝撃を与えることによって破砕するか、挽くかあるいは断片に砕くか、粉砕する。他の実施形態によれば、昆虫を凍結乾燥する。
【００１５】
幼虫の粉砕は、幼虫を顆粒状の混合物に形成することによって幼虫の流動性を高め、かつ幼虫の表面積を増大させるために行われて、目的タンパク質の拡散に必要な距離を減少させ、幼虫から回収されるタンパク質の収量を増大しおよび／またはその他の利益を提供する。典型的な例として、幼虫を、約１ｍｍ〜約１ｃｍの寸法の断片に砕く。プロセスは、幼虫全体から約５０ミクロンの断片にいたるいずれかの大きさの断片を利用してもよい。好ましい結果は、大まかな直径が約０．５ｍｍ〜約２．５ｍｍの顆粒を使用することで得られるであろう。代替的な実施形態によれば、幼虫を、寸法が典型的に約０．１ｍｍ〜約５ｍｍ、より典型的には約０．５ｍｍ〜約２ｍｍの薄片になるまで押しつぶす工程を含む。特定の一実施形態によれば、幼虫を切り刻んで約２ｍｍ程度の顆粒にする。
【００１６】
昆虫／幼虫を、カバーで覆われた複数のくぼみすなわちウェル（ｗｅｌｌ）が形成された蜘蛛の巣状のものすなわちウェッブ（ｗｅｂ）の中で大量飼育してもよい。各ウェルは、配合された昆虫食餌と少なくとも１つの昆虫卵で満たされている。昆虫は、幼虫かまたはその段階を越えるかあるいはそれ以上にまで育てられ、ウイルスに感染させてもさせなくてもよい。昆虫をこのような方法で大量飼育する場合には、ウェッブと、カバーと、昆虫食餌および昆虫を含めたウェルの内容物とを切り刻んで、抽出バッファーと混合させる。このような場合、切り刻まれた内容物全体を抽出バッファーと混合してもよい。
【００１７】
一実施形態によれば、昆虫幼虫をミリングマシンで粉砕する。使用されるであろう特定のミリングマシンはフィッツミル（Ｆｉｔｚｍｉｌｌ）型のミリングマシンである。一技術によれば、ブレードを順方向に向けて凍結幼虫を顆粒形状にするようにミリングマシンを操作してもよい。ミルを様々な速度で操作して、幼虫を様々な度合いで切断するようにしてもよい。例えば、ミルを約３０００〜約９０００ｒｐｍで操作することもできる。具体的な実施形態では約３０００、約６０００または約９０００ｒｐｍを利用した。粉砕を低い温度で行ってもよい。例えば、粉砕は、約−１００℃〜約３０℃の温度範囲で行われてもよい。特定の一実施形態では約４℃において行った。
【００１８】
別の実施形態によれば、昆虫の幼虫はコニカルミル（ｃｏｎｉｃａｌ  ｍｉｌｌ）で粉砕する。使用されるかもしれない特定のミリングマシンは、クワドロコミル（Ｑｕａｄｒｏ  Ｃｏｍｉｌ）である。幼虫を様々な度合いで切断するように、ミルを様々な速度および様々な構成で操作してもよい。例えば、ミルを約３０００〜約５０００ｒｐｍで操作できる。具体的な実施形態では約３５００ｒｐｍを利用した。スクリーンおよびインペラの様々な構成には、四角と丸、切断と非切断、および約１〜約１５ｍｍの範囲の大きさの孔または開口を含む。具体的な実施形態は、丸と四角のインペラ、切断と非切断のスクリーンおよび約２〜約９ｍｍの範囲の大きさの孔を利用した。例えば、粉砕（comminutation：コミニュテーション）は約−１９６℃〜約３０℃の温度範囲で行ってもよい。特定の一実施形態では約−１９０℃において行った。
【００１９】
コミュニテーション（ｃｏｍｍｕｎｉｔａｔｉｏｎ）のＲＰＭの範囲は、粉砕（comminutation：コミニュテーション）機で使用されるブレードとブレードの向きに依存し得る。別の技術によれば、衝撃によるコミニュテーションは、ブレードを逆向きにすることによって行うこともでき、それにより、極度の低温条件下でブレードの腹側で幼虫を打撃することになる。一実施形態によれば、低温条件を、機器の打撃領域に気相の液体窒素か二酸化炭素を注入することによって作り出す。衝撃によるコミニュテーションは一般的に、打撃アームを長くすることか、平らなブレードの回転速度を増大するかのどちらかによって、打撃力を増大することによって行うことができる。
【００２０】
第３の技術においては、大きさを分けられるべき物質を「篩い分け」装置かまたはスクリーン全体衝撃によってスケーリング（scaling）することを含む。ブレードまたはハンマすなわちストライカ（ｓｔｒｉｋｅｒ）の平らな部分のどちらかを幼虫に向けてもよい。この技術は低い温度および遅めの速度で行ってもよい。スクリーンまたは篩い分けの上方で幼虫をばらばらにしたりまたはドラグで切ったりすることによって、大きさを小さくするための制御を行ってもよい。第４の技術においては、切削面で幼虫を切断する一連の回転するブレードに幼虫を通すことによって幼虫を切り刻む。
【００２１】
次に、幼虫断片、幼虫全体、昆虫全体および／または昆虫断片を抽出バッファーと混合してもよい。これは、図１に示されるフローチャートのステップ２で示す処理である。抽出バッファーは、標的タンパク質が溶解可能ないずれの成分を含んでいてもよい。一実施形態によれば、バッファーは、ｐＨ７．８を有する５０ｍＭ（但し、Ｍはｍｏｌ／ｌを意味する）のトリス（Ｔｒｉｓ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む。バッファーのｐＨは、約５．０〜約８．５とすることができる。標的タンパク質または目的物質の抽出に使用される他のバッファーの含有物は、以下のものを含む：シトレート（１０ｍＭ〜１Ｍ）；トリス（Ｔｒｉｓ）（１０ｍＭ〜１Ｍ）；ホスフェート（１０ｍＭ〜１Ｍ）；グード（Ｇｏｏｄｅ）バッファーシリーズからのバッファー（１０ｍＭ〜１Ｍ）；アセテート（１０ｍＭ〜１Ｍ）；グリセロール（５％〜５０％）；ＰＥＧ（０．１％〜１０％）；硫酸アンモニウム（１００ｍＭ〜１．５Ｍ）；トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０またはトゥイーン８０等の両性界面活性剤（zwittergent:ツバイトタージェント）シリーズ等のイオンおよび非イオン両方の界面活性剤（０．０１％〜１０％）；ＫＣｌ（１０ｍＭ〜２Ｍ）；ＮａＣｌ（１０ｍＭ〜４Ｍ）；硫酸ナトリウム（１０ｍＭ〜１．５Ｍ）；尿素（０．１Ｍ〜８Ｍ）；および／またはグアニジンＨＣｌ（０．１Ｍ〜６Ｍ）。
【００２２】
バッファーを、昆虫または粉砕された昆虫部分のいずれかと様々な比率で混合してもよい。比率は、行われる作業回数に依存してもよい。例えば、作業が多数回行われる場合には、比率はより昆虫に偏っていてもよい。利用されるであろう昆虫対バッファーの比率の例は１：３である。
【００２３】
昆虫／昆虫断片とバッファーを組み合わせたら、これらを混合してもよい。多数の異なる装置を使用した様々な方法で混合を行ってもよい。例えば、転倒回転型ミキサを使用するかまたはオーバーヘッドライトニングミキサ（ｏｖｅｒｈｅａｄ  ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  ｍｉｘｅｒ）を使用して混合を行ってもよい。
【００２４】
昆虫断片の混合後、目的タンパク質を幼虫または幼虫断片から抽出して、目的タンパク質を含むバッファーからこれら断片を分離してもよい。これを、図１のフローチャートに示されるステップ３として示す。抽出および清澄化を別々にあるいは一緒に行うことができる。抽出および分離を多数の異なる方法で行ってもよい。例えば、デカンティング（decanting）すること、篩い分け、スクリーニング、低速度の遠心分離、向流抽出、デカンター遠心分離、中空管や大口径の中空糸やプレート・フレーム・タンジェンシャルフローろ過（プレートおよびフレームの接線方向の流れのろ過）（ｐｌａｔｅ  ａｎｄ  ｆｒａｍｅ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、および／またはパーコレーション抽出を利用できる。２回以上の抽出および／または分離ステップを行ってもよい。また、抽出および分離に１回以上の異なるプロセスを利用してもよい。利用される抽出技術および分離技術の双方とも、少なくとも部分的に、いくつかの要因の中でも特に関係するタンパク質と昆虫断片の大きさで決めればよい。抽出は約１５〜約４５分かかるかもしれない。タンパク質または目的物質の抽出のための時間範囲は、主としてタンパク質か目的物質と抽出プロセスにおいて使用されるバッファーとに依存しており、１５秒から４時間までの範囲となる。いくつかの実施形態では、抽出を約３０秒〜約１分、約５分〜約１０分、または約１時間〜約２時間で行う。いくつかの具体的な実施形態では、５、１０、１５、２０、３０、４５または６０分間利用して、バッファーと幼虫および／または断片を混合した。幼虫および／または断片をバッファーと一回または多数回混合し、それにより得られるバッファーを組み合わせてもよい。
【００２５】
制御されるかもしれない他の抽出パラメータには、温度、遠心分離速度および可能性のあるタンジェンシャルフローろ過・ステップ（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）のための公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）範囲を挙げることができる。典型的には、約４℃〜約４５℃の温度範囲において抽出を行う。２つの特定の実施形態によれば、約４℃または約２０℃の温度において抽出を行う。抽出のための遠心分離を約２，０００×ｇ〜約１５，０００×ｇの速度で行う。抽出のための可能性のあるタンジェンシャルフローろ過・ステップのための公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）範囲は、約１００ｋＤａ  ＮＭＷＣＯ〜約０．２２ミクロンであってよい。
【００２６】
清澄化を約４℃〜約４５℃の温度範囲で行ってよい。特定の一実施形態によれば、清澄化を約４℃の温度で行った。清澄化のために行われるかもしれない遠心分離は、約２，０００×ｇ〜１５，０００×ｇの速度で行ってもよい。さらに、清澄化を約０．０１ｍｍ〜約１ｍｍの網目のスクリーンで行ってもよい。特定の一実施形態は約０．５ｍｍの網目のスクリーンで行った。清澄化のための可能性のあるタンジェンシャルフローろ過・ステップのための公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）は約１００ｋＤａ  ＮＭＷＣＯ〜約０．２２ミクロンの範囲である。
【００２７】
他の昆虫タンパク質からタンパク質含有バッファーを分離後、タンパク質をバッファーから単離してもよい。これは、タンパク質単離のための公知の方法を利用して行ってもよい。例えば、タンジェンシャルフローろ過、液−液抽出、カラムクロマトグラフィ、沈殿、膜結合（メンブレンバインディング：ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、および／または他のいかなる公知のプロセスのいかなる組み合わせによってもタンパク質を単離できる。
【００２８】
単離プロセスを、タンパク質の所望の純度を達成するまで行ってもよい。典型例では、少なくとも約８５％の純度を達成するまでタンパク質を処理する。より一般には、タンパク質は少なくとも約９０％の純度である。いくつかの場合においては、タンパク質は少なくとも約９５％の純度である。一般にタンパク質がその最終用途で有効性を有するのに必要な純度までタンパク質を処理してもよい。
【００２９】
本発明を利用して、関連する生物からいかなるタンパク質生成物または他の所望の物質または成分を単離してもよい。例えば、昆虫幼虫が発現するか発現できるいかなるタンパク質も、天然であろうと組換えであろうと、単離できるであろう。例としては、Ｌ１Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ａ３３Ｒが挙げられ、これらは全て切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）の、分泌形の３つのウイルスタンパク質である。他の例としては、Ｆａｂ（モノクローナル抗体のＦａｂフラグメント、分泌タンパク質）、およびＤｓＲｅｄ（ホモテトラマー（ｈｏｍｏｔｅｔｒａｍｅｒ）でできている非分泌蛍光タンパク質）が挙げられる。他の例はモノクローナル抗体（Ｍａｂ）でもよい。
【００３０】
図２は、本発明によるシステムの実施形態を示す。この実施形態を利用して上述の方法を行ってもよい。システムのこの実施形態は、幼虫全体、幼虫断片、昆虫全体および／または昆虫断片をスクリューコンベヤー５に収容する。スクリューコンベヤーは、幼虫を切り刻むために幼虫をミル７まで運ぶ。ミルを通過後、切り刻まれた幼虫は、スクリューコンベヤー９によって混合容器１１まで運ばれる。リザーバ１３に保管された抽出バッファーをポンプ１５によって混合容器１１に送り出す。切り刻まれた幼虫と抽出バッファーが混合容器で混合される。混合後、切り刻まれた幼虫と抽出バッファーを分離機１７に送って、タンパク質を含有する抽出物を幼虫破片から分離する。リザーバ１９に保管される最終抽出バッファーをポンプ２１によって分離機１７へ送り出してもよい。分離後、バッファーは収容容器２３へ運ばれ、かつ幼虫破片は収容容器２５へ送られる。
【００３１】
本発明により、昆虫幼虫の血液リンパに含まれるタンパク質の非手動の単離が可能となる。分離を、工業的規模（スケーラブル・ファッション：ｓｃａｌａｂｌｅ  ｆａｓｈｉｏｎ）で、残在している望ましくない幼虫破片を残したまま行ってもよい。腸プロテアーゼを、いくつかの非分泌タンパク質の場合、および膜結合型（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｏｕｎｄ）タンパク質か膜関連型（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質の場合に所望の幼虫材料から分離してもよい。
【００３２】
以下に４つの実施例を示すが、それは本発明を説明し、本発明を実施するために利用されるかもしれないパラメータの網羅を意図するものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例１
分泌ウイルスタンパク質である切断型Ｌ１Ｒを発現する幼虫を利用した。幼虫を凍結した。幼虫全体かまたはハンマーや小づちを使用して衝撃によって破砕された幼虫のどちらかを、室温において５０ｍｌ円錐管内で抽出バッファーと転倒回転させて混合した。この場合抽出バッファーは、ｐＨ７．８の５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのβ−メルカプトエタノールの混合液であった。抽出バッファーを５０ｍｌのコニカルチューブからデカンティングすることによって、抽出したＬ１Ｒ含有血液リンパを残りの幼虫破片から分離し、幼虫破片を残した。ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）法によって行われた分析によって、図３および下記の表１に示される結果を示した。これは濃度測定値を提供する。Ｌ１Ｒ特異的ウサギポリクローナルを使用してＬ１Ｒを検出した。コダック１イメージングシステム（Ｋｏｄａｋ  １  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用した濃度測定によってレベルを判定した。タンパク質レベルは、スタンダードとしてＢＳＡを用いるクマシー・プラス・アッセイ(Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  ａｓｓａｙ)によって判定した。図３に示される３列は、１）砕かれた幼虫、２）幼虫全体、および３）すり潰された幼虫である。破砕された幼虫から抽出されたＬ１Ｒのレベルは、全体的に均質化された幼虫から観察されたレベルと類似した。しかしながら、抽出したタンパク質は幼虫の混入物含有が少なく、さらなる処理のための、物質の清澄化をはるかに少ない作業行うことができた。
【００３４】
【表１】
2008519855.tif 000003
【００３５】
実施例２
全て切断型の、分泌形の３つのウイルス抗原である切断型Ｌ１Ｒ、Ｂ５ＲおよびＡ３３Ｒと、ＦＡＢを発現する幼虫を利用した。幼虫を凍結した。幼虫全体かまたはハンマーや小づちを使用した衝撃によって破砕された幼虫のどちらかを、室温において５０ｍｌコニカルチューブ内で抽出バッファーと転倒回転して混合した。この場合、抽出バッファーは、ｐＨ７．８の５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのβ−メルカプトエタノールの混合液であった。抽出バッファーを５０ｍｌコニカルチューブからデカンティングして幼虫破片を後に残すことによって、Ｌ１Ｒを含有する抽出された血液リンパを残りの幼虫破片から分離した。全ての場合において、幼虫全体から様々な程度で４つの標的タンパク質を抽出し、全ての場合において、得られたタンパク質抽出物は適度に透明で、さらなる処理をできる状態であった。１０％ビス−トリスゲル（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ  ｇｅｌ）をＭＥＳ（N-morpholino ethanesulfonic acid）に流し込み、ＰＶＤＦ（Polyvinylidene fluoride）に転写した。抗ｈｉｓ  ＭＡｂを使用して検出を行った。ウエスタンブロット法によって行った分析によって図４に示される結果を生じた。図４に示される１５列は以下の通りである。１）標準（スタンダード）；２−４）１５、４５、および６０分におけるＬ１Ｒ；５−７）１５、４５、および６０分におけるＢ５Ｒ；８−１１）１５、３０、４５、および６０分におけるＦＡＢ；および１２−１５）１５、３０、４５、および６０分におけるＡ３３Ｒ。図４は、幼虫からタンパク質を抽出する能力はタンパク質に依存しないことを示す。
【００３６】
実施例３
切り刻まれた幼虫と幼虫全体の双方を利用して、得られた結果を比較した。Ｌ１ＲおよびＤｓＲｅｄを発現する凍結幼虫全体を、ブレード側を前方にし、篩いスクリーンを取り除いた状態でフィッツミル粉砕装置内で切り刻んだ。幼虫を３０００ｒｐｍ、６０００ｒｐｍ、および９０００ｒｐｍの３つの異なる速度で切り刻んだ。切り刻まれた幼虫を抽出テストおよび分析まで凍結保存した。５０ｍｌコニカルチューブを使用する小規模実験室試験のために記載されているような、幼虫全体および切り刻まれた幼虫の双方を使用して抽出テストを行った。幼虫全体や切り刻まれた幼虫を転倒回転型ミキサを使用して抽出バッファーと混合した。抽出のおおよその割合を判定し、かつ幼虫全体に関して抽出の全体的な水準を判定する分析のために、サンプルを抽出の間に除去した。分析を、半定性的（semi-qualitative）ウエスタンブロット法およびＬ１Ｒ特異的ポリクローナルを使用して行った。この分析は図５および６に示す結果を生じた。帯域の濃度測定はコダック１イメージングシステムを使用して行った。図５に示すように、Ｌ１Ｒの抽出は基本的に１５分以内に完了し、６０００ｒｐｍで刻まれた幼虫と９０００ｒｐｍで刻まれた幼虫との間にほとんど差がなかった。ＤｓＲｅｄは、非分泌タンパク質であり、その存在は、タンパク質の特徴である赤色によって容易に判定できる。幼虫全体や部分的に砕かれた幼虫からのＤｓＲｅｄの抽出の結果を表す図６に示すように、ＤｓＲｅｄの一部抽出が数十分後にもまだ発生しており、９０００ｒｐｍで刻まれた幼虫の抽出は、おそらく幼虫粒子のサイズが小さいために実質的にそれより低い速度のものよりもよい。半定性的ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルかＤｓＲｅｄ特異的ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法を使用してＤｓＲｅｄを検出した。帯域の濃度測定をコダック１イメージングシステムを使用して行った。
【００３７】
実施例４
切り刻まれた幼虫と幼虫全体の両方を利用して、得られた結果を比較した。ＬｌＲを発現する凍結幼虫全体を、ブレード側を前方にし、篩いスクリーンを取り除いた状態でフィッツミル粉砕装置内で切り刻んだ。幼虫を約９０００ｒｐｍで切り刻んだ。切り刻まれた幼虫を抽出テストおよび分析まで凍結保存した。Ｌ１Ｒ発現ウイルスに感染された他の幼虫全体を、抽出バッファー内でＴｕｒｒａｘウルトラホモジナイザーを使用したすり潰しによって実質的に完全に均質化し、続いて遠心分離による清澄化を行った。５０ｍｌコニカルチューブを使用する小規模実験室試験のために記載されているような、幼虫全体および切り刻まれた幼虫の双方を使用して抽出テストを行った。幼虫全体や切り刻まれた幼虫を、転倒回転型ミキサを使用して、抽出バッファーと混合した。抽出のおおよその割合を判定し、かつ幼虫全体に関して抽出の全体的な水準を判定する分析のために、サンプルを抽出の間に除去した。Ｌ１Ｒの検出のための早期進行段階のＥＬＩＳＡによって分析を行い、図７に示される結果を生じた。幼虫からのＬ１Ｒの理論上の最大回収率を、Ｔｕｒｒａｘウルトラホモジナイザーを通して均質化された清澄化された幼虫抽出物の分析によって判定した。図７に示すように、Ｌ１Ｒの抽出量は、約１５分〜約４５分の間に理論上の最大に達した一方で、幼虫全体からのＬ１Ｒの抽出量は約１時間後に理論上の最大に達しなかった。抽出の直線性を仮定して、幼虫全体からの抽出は約９０分〜約１２０分の間に完了したであろう。
【００３８】
実施例５
ヒト化ＭＡｂ発現バキュロウイルスに感染された幼虫を利用した。幼虫は凍結幼虫であり、２つのプレート間での衝撃によって砕かれた。５０ｇの幼虫を４００ｍｌの抽出バッファーと容器内で２０分間混合した。このとき、インペラを有する大きなステンレス鋼容器を使用して数百リットルまで増大可能なオーバーヘッドライトニングスターラー（ｏｖｅｒｈｅａｄ  ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  ｓｔｉｒｒｅｒ）を使用した。幼虫破片をデカンテーションと篩い分けを使用して抽出バッファーから分離して、ウエスタンブロット法によって分析した。１回目の混合中に約９０％のＭＡｂを抽出することによってタンパク質を抽出した。下の表２もまた実施例５の結果を示す。
【００３９】
【表２】
2008519855.tif 000004
【００４０】
実施例６
クワドロ社（Ｑｕａｄｒｏ，Ｉｎｃ．）のコミル（Ｃｏｍｉｌ）等のミル装置を使用して、Ｌ１Ｒ（分泌タンパク質）かＤｓＲｅｄ（非分泌タンパク質）を発現する凍結幼虫を破砕した。スクリーンの孔径、切削面、速度、および温度の変化を含めて様々な条件範囲下で破砕を行った。スクリーンの孔径は約２ｍｍ〜約９ｍｍで変化した。様々な切削面の形状は、四角、丸、星型、平ら、および隆起状を含んでいた。速度は約３２００ｒｐｍ〜約５０００ｒｐｍで変化した。ミリング温度は、約２５℃〜約−１９６℃の範囲であった。この実施例においては、インペラ速度は約３５００であり、衝撃面は液体窒素を使用して冷却されていた。砕いた後、砕かれた幼虫をドライアイス上に保管した。この実施例においては、様々な条件下で砕かれた幼虫を３０分、約２〜８℃においてバッファー（５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／１Ｍ塩化ナトリウム、１５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．７）で抽出した。標的タンパク質抽出物をウエスタンブロット法を使用して決定した。抽出された全タンパク質をクマシー・プラス・ブラッドフォード・アッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ）を使用して決定した。表３は、この実施例の様々な実験から得られた結果を表す。値は、総均質化方法を使用して抽出されたタンパク質に関して抽出されたタンパク質のレベルとして提示される。この実施例においては、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ−２５シヤーホモジナイザー（ｓｈｅａｒ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を使用してバッファー中において幼虫を均質化した。
【００４１】
【表３】
2008519855.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明によるプロセスの実施形態の要素を示すフローチャートである。
【図２】プロセスの流れを説明するための、本発明によるシステムの実施形態の図である。
【図３】実施例１の結果を示す写真である。
【図４】実施例２の結果を示す写真である。
【図５】実施例３の結果を示すグラフである。
【図６】実施例３の結果を示すグラフである。
【図７】実施例４の結果を示すグラフである。
【図１】
2008519855.tif 000006
【図２】
2008519855.tif 000007
【図３】
2008519855.tif 000008
【図４】
2008519855.tif 000009
【図５】
2008519855.tif 000010
【図６】
2008519855.tif 000011
【図７】
2008519855.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月25日(2007.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫幼虫からのタンパク質の回収方法であって、
少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つを抽出バッファーと混合し；
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つから前記抽出バッファーを分離し；および
分離された前記抽出バッファーから前記タンパク質を単離すること
を含む方法。
【請求項２】
昆虫部分を前記抽出バッファーと混合し、かつ前記昆虫部分が長さ約１ｍｍ〜約１ｃｍである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
凍結昆虫幼虫を長さ約１ｍｍ〜約１ｃｍの断片に破砕または切断することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
デカントすること、篩い分け、スクリーニング、低速度の遠心分離、向流抽出、デカンター遠心分離、中空管や大口径の中空糸やプレート・フレーム・タンジェンシャルフローろ過、またはパーコレーション抽出の少なくとも１つによって前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つから前記抽出バッファーを分離する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が天然型である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が組換え型である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーを転倒回転型ミキサによって混合する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーをオーバーヘッドライトニングミキサによって混合する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抽出バッファーとの混合前に前記昆虫幼虫を破砕することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記昆虫幼虫をハンマーや小づちを使用した衝撃によって破砕する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
破砕前に前記昆虫幼虫を凍結することをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抽出バッファーが、ｐＨ７．８の５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記昆虫幼虫がウェルのウェッブにおいて飼育され、各ウェルは少なくとも１つの前記昆虫幼虫と食餌とを含み、前記方法が前記ウェルのウェッブ、前記食餌および前記昆虫幼虫を切り刻むことをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質を前記昆虫幼虫の血液リンパから回収する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記昆虫幼虫がイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）の幼虫である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が、モノクローナル抗体、細胞表面受容体、膜内輸送タンパク質、サイクリン、サイトカイン、Ｆａｂフラグメント、ウイルス抗原、蛍光タンパク質、融合タンパク質、成長因子、コリンエステラーゼ、ペプチダーゼ、αインターフェロン、マウスＩｇＧ、ブタインターロイキン−１８、ヒトアデノシンデアミナーゼ、ヒトグループＩＩ型ホスホリパーゼＡ２、インターロイキン−２、ウイルス受容体、ホルモン受容体、無脊椎動物免疫タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、ＲＡＳエフェクター、ウイルス抗原、および抗菌ペプチドの少なくとも１つを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つから前記昆虫幼虫の血液リンパを単離し、及び前記血液リンパから前記タンパク質を単離する請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーとを約１５分〜約４５分の期間混合する請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーとを約１５秒〜４時間までの期間混合する請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーとを約３０秒〜約１分の期間混合する請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーとを約５分〜約１０分の期間混合する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも昆虫幼虫全体および昆虫幼虫の非均質化部分の１つと前記抽出バッファーとを約１時間〜約２時間の期間混合する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離されたタンパク質を精製することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
昆虫幼虫からのタンパク質の回収用システムであって、
前記昆虫幼虫を断片に切断するかまたは前記昆虫幼虫を薄片に押しつぶす粉砕装置と；
前記昆虫幼虫の断片や薄片と抽出バッファーを収容する働きをする混合容器と；
前記昆虫幼虫の断片や薄片との混合後に抽出バッファーを収容する働きをするコンテナと；
前記昆虫幼虫の断片や薄片から前記タンパク質を分離する働きをする分離機と
を含むシステム。
【請求項２５】
前記昆虫幼虫を凍結する働きをするフリーザーと；
凍結した前記昆虫幼虫を破砕する働きをする破砕装置と
をさらに含む請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
昆虫幼虫の断片や薄片を生成する手段と；
前記昆虫幼虫のタンパク質が抽出バッファーに抽出されるように前記昆虫幼虫の断片や薄片と前記抽出バッファーを組み合わせる手段と；
前記昆虫幼虫のタンパク質を前記抽出バッファーから単離するための手段と
を含む昆虫幼虫からのタンパク質の回収用システム。
【請求項２７】
前記昆虫幼虫を凍結するための凍結手段と；
凍結した前記昆虫幼虫を破砕するための破砕手段と
をさらに含む請求項２６に記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
また、昆虫幼虫は完全に均質化される。しかしながら、完全な均質化は、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、腸プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼ、外皮（ｉｎｔｅｇｕｍｉｎ）、キチン、器官、および細胞破片の極めて複雑な混合物の生成だけでなく、かなりの量の脂質ミセルとマルチラメラの小胞の形成ももたらす。さらに均質化によって、容積固体の全体の割合を減少させることなく容積固体全体の大きさが減少し、回収がより難しく、しかもその費用がかかるようになる。そこで、この複雑な混合物から所望のタンパク質を単離する必要がある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の方法は、昆虫全体すなわち昆虫のまるごと全体、昆虫幼虫全体すなわち昆虫幼虫のまるごと全体を、昆虫全体を細かく切断しておよび／または昆虫幼虫を細かく切断して、抽出バッファーと混合することを含んでいる。昆虫および／または幼虫を利用する場合には、それらを均質化しないか、または最小限に均質化する。つまり、昆虫および／または幼虫を徹底的には切り刻まないので、得られる断片は識別可能である。昆虫または幼虫を完全に均質化するまで切り刻むと、このプロセスの標的であろうタンパク質が、非分泌タンパク質、各種プロテアーゼ、キチン、外皮、細胞全体すなわち細胞のまるごと全体、脂肪体および他の望ましくない昆虫生成物等のような、昆虫の他の望ましくない成分と混合される場合がある。完全な均質化によって創造されまたは増加されたような別の破片から、所望の標的タンパク質を分離しなければならないことは、プロセスを難しくし、しかもその費用が増大するので、幼虫（感染性または非感染性）の完全な均質化に関連した問題に何ら制限されることのない本方法が望ましいものとなる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
昆虫全体または昆虫幼虫全体および／または細かく切られた昆虫を利用してもいいが、本発明は一般に切断され、あるいは全体ではなくされた昆虫幼虫で行われる。これは、図１のフローチャートに示されている。図１は、タンパク質を昆虫幼虫から回収するための本発明による方法の実施形態に関係する一般的なステップを示す。始めに、昆虫幼虫を粉砕するかまたは砕く（ステップ１）。これは、随意に行うステップであり、含まれるタンパク質によることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
一実施形態によれば、昆虫幼虫をミリングマシンで粉砕する。使用されるであろう特定のミリングマシンはフィッツミル（Ｆｉｔｚｍｉｌｌ）（商品名）型のミリングマシンである。一技術によれば、ブレードを順方向に向けて凍結幼虫を顆粒形状にするようにミリングマシンを操作してもよい。ミルを様々な速度で操作して、幼虫を様々な度合いで切断するようにしてもよい。例えば、ミルを約３０００〜約９０００ｒｐｍで操作することもできる。具体的な実施形態では約３０００、約６０００または約９０００ｒｐｍを利用した。粉砕を低い温度で行ってもよい。例えば、粉砕は、約−１００℃〜約３０℃の温度範囲で行われてもよい。特定の一実施形態では約４℃において行った。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
別の実施形態によれば、昆虫の幼虫はコニカルミル（ｃｏｎｉｃａｌ  ｍｉｌｌ）で粉砕する。使用されるかもしれない特定のミリングマシンは、クワドロコミル（Ｑｕａｄｒｏ  Ｃｏｍｉｌ）（商品名）である。幼虫を様々な度合いで切断するように、ミルを様々な速度および様々な構成で操作してもよい。例えば、ミルを約３０００〜約５０００ｒｐｍで操作できる。具体的な実施形態では約３５００ｒｐｍを利用した。スクリーンおよびインペラの様々な構成には、四角と丸、切断と非切断、および約１〜約１５ｍｍの範囲の大きさの孔または開口を含む。具体的な実施形態は、丸と四角のインペラ、切断と非切断のスクリーンおよび約２〜約９ｍｍの範囲の大きさの孔を利用した。例えば、粉砕は約−１９６℃〜約３０℃の温度範囲で行ってもよい。特定の一実施形態では約−１９０℃において行った。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
粉砕のＲＰＭの範囲は、粉砕機で使用されるブレードとブレードの向きに依存し得る。別の技術によれば、衝撃による粉砕は、ブレードを逆向きにすることによって行うこともでき、それにより、極度の低温条件下でブレードの腹側で幼虫を打撃することになる。一実施形態によれば、低温条件を、機器の打撃領域に気相の液体窒素か二酸化炭素を注入することによって作り出す。衝撃による粉砕は一般的に、打撃アームを長くすることか、平らなブレードの回転速度を増大するかのどちらかによって、打撃力を増大することによって行うことができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
バッファーを、昆虫または粉砕された昆虫部分のいずれかと様々な比率で混合してもよい。比率は、行われる作業回数に依存してもよい。例えば、作業が多数回行われる場合には、比率はより昆虫に偏っていてもよい。利用されるであろう昆虫対バッファーの比率の例は１：３である。この昆虫部分を抽出バッファーと混合し、かつ昆虫部分の長さを約１ｍｍ〜約１ｃｍとする。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
以下に６つの実施例を示すが、それは本発明を説明し、本発明を実施するために利用されるかもしれないパラメータの網羅を意図するものではない。  
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
実施例１
分泌ウイルスタンパク質である切断型Ｌ１Ｒを発現する幼虫を利用した。幼虫を凍結した。幼虫全体かまたはハンマーや小づちを使用して衝撃によって破砕された幼虫のどちらかを、室温において５０ｍｌ円錐管内で抽出バッファーと転倒回転させて混合した。この場合抽出バッファーは、ｐＨ７．８の５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのβ−メルカプトエタノールの混合液であった。抽出バッファーを５０ｍｌのコニカルチューブからデカンティングすることによって、抽出したＬ１Ｒ含有血液リンパを残りの幼虫破片から分離し、幼虫破片を残した。ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）法によって行われた分析によって、図３および下記の表１に示される結果を示した。これは濃度測定値を提供する。Ｌ１Ｒ特異的ウサギポリクローナル抗体を使用してＬ１Ｒを検出した。コダック１イメージングシステム（Ｋｏｄａｋ  １  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（商品名）を使用した濃度測定によってレベルを判定した。タンパク質レベルは、スタンダードとしてＢＳＡを用いるクマシー（商標名）・プラス・アッセイ(Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  ａｓｓａｙ)によって判定した。図３に示される３列は、１）砕かれた幼虫、２）幼虫全体、および３）すり潰された幼虫である。破砕された幼虫から抽出されたＬ１Ｒのレベルは、全体的に均質化された幼虫から観察されたレベルと類似した。しかしながら、抽出したタンパク質は幼虫の混入物含有が少なく、さらなる処理のための、物質の清澄化をはるかに少ない作業で行うことができた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
実施例２
全て切断型の、分泌形の３つのウイルス抗原である切断型Ｌ１Ｒ、Ｂ５ＲおよびＡ３３Ｒと、ＦＡＢを発現する幼虫を利用した。幼虫を凍結した。幼虫全体かまたはハンマーや小づちを使用した衝撃によって破砕された幼虫のどちらかを、室温において５０ｍｌコニカルチューブ内で抽出バッファーと転倒回転して混合した。この場合、抽出バッファーは、ｐＨ７．８の５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのβ−メルカプトエタノールの混合液であった。抽出バッファーを５０ｍｌコニカルチューブからデカンティングして幼虫破片を後に残すことによって、Ｌ１Ｒを含有する抽出された血液リンパを残りの幼虫破片から分離した。全ての場合において、幼虫全体から様々な程度で４つの標的タンパク質を抽出し、全ての場合において、得られたタンパク質抽出物は適度に清澄で、さらなる処理をできる状態であった。１０％ビス−トリスゲル（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ  ｇｅｌ）をＭＥＳ（N-morpholino ethanesulfonic acid）に流し込み、ＰＶＤＦ（Polyvinylidene fluoride）に転写した。抗ｈｉｓ  ＭＡｂを使用して検出を行った。ウエスタンブロット法によって行った分析によって図４に示される結果を生じた。図４に示される１５列は以下の通りである。１）標準（スタンダード）；２−４）１５、４５、および６０分におけるＬ１Ｒ；５−７）１５、４５、および６０分におけるＢ５Ｒ；８−１１）１５、３０、４５、および６０分におけるＦＡＢ；および１２−１５）１５、３０、４５、および６０分におけるＡ３３Ｒ。図４は、幼虫からタンパク質を抽出する能力はタンパク質に依存しないことを示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
実施例３
切り刻まれた幼虫と幼虫全体の双方を利用して、得られた結果を比較した。Ｌ１ＲおよびＤｓＲｅｄを発現する凍結幼虫全体を、ブレード側を前方にし、篩いスクリーンを取り除いた状態でフィッツミル粉砕装置内で切り刻んだ。幼虫を３０００ｒｐｍ、６０００ｒｐｍ、および９０００ｒｐｍの３つの異なる速度で切り刻んだ。切り刻まれた幼虫を抽出テストおよび分析まで凍結保存した。５０ｍｌコニカルチューブを使用する小規模実験室試験のために記載されているような、幼虫全体および切り刻まれた幼虫の双方を使用して抽出テストを行った。幼虫全体や切り刻まれた幼虫を転倒回転型ミキサを使用して抽出バッファーと混合した。抽出のおおよその割合を判定し、かつ幼虫全体に関して抽出の全体的な水準を判定する分析のために、サンプルを抽出の間に除去した。分析を、半定性的（semi-qualitative）ウエスタンブロット法およびＬ１Ｒ特異的ポリクローナル抗体を使用して行った。この分析は図５および６に示す結果を生じた。帯域の濃度測定はコダック１イメージングシステムを使用して行った。図５に示すように、Ｌ１Ｒの抽出は基本的に１５分以内に完了し、６０００ｒｐｍで刻まれた幼虫と９０００ｒｐｍで刻まれた幼虫との間にほとんど差がなかった。ＤｓＲｅｄは、非分泌タンパク質であり、その存在は、タンパク質の特徴である赤色によって容易に判定できる。幼虫全体や部分的に砕かれた幼虫からのＤｓＲｅｄの抽出の結果を表す図６に示すように、ＤｓＲｅｄの一部抽出が数十分後にもまだ発生しており、９０００ｒｐｍで刻まれた幼虫の抽出は、おそらく幼虫粒子のサイズが小さいために実質的にそれより低い速度のものよりもよい。半定性的ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー（商標名）染色ゲルかＤｓＲｅｄ特異的ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法を使用してＤｓＲｅｄを検出した。帯域の濃度測定をコダック１イメージングシステムを使用して行った。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
実施例４
切り刻まれた幼虫と幼虫全体の両方を利用して、得られた結果を比較した。ＬｌＲを発現する凍結幼虫全体を、ブレード側を前方にし、篩いスクリーンを取り除いた状態でフィッツミル粉砕装置内で切り刻んだ。幼虫を約９０００ｒｐｍで切り刻んだ。切り刻まれた幼虫を抽出テストおよび分析まで凍結保存した。Ｌ１Ｒ発現ウイルスに感染された他の幼虫全体を、抽出バッファー内でＴｕｒｒａｘウルトラホモジナイザー（商品名）を使用したすり潰しによって実質的に完全に均質化し、続いて遠心分離による清澄化を行った。５０ｍｌコニカルチューブを使用する小規模実験室試験のために記載されているような、幼虫全体および切り刻まれた幼虫の双方を使用して抽出テストを行った。幼虫全体や切り刻まれた幼虫を、転倒回転型ミキサを使用して、抽出バッファーと混合した。抽出のおおよその割合を判定し、かつ幼虫全体に関して抽出の全体的な水準を判定する分析のために、サンプルを抽出の間に除去した。Ｌ１Ｒの検出のための早期進行段階のＥＬＩＳＡによって分析を行い、図７に示される結果を生じた。幼虫からのＬ１Ｒの理論上の最大回収率を、Ｔｕｒｒａｘウルトラホモジナイザーを通して均質化された清澄化された幼虫抽出物の分析によって判定した。図７に示すように、Ｌ１Ｒの抽出量は、約１５分〜約４５分の間に理論上の最大に達した一方で、幼虫全体からのＬ１Ｒの抽出量は約１時間後に理論上の最大に達しなかった。抽出の直線性を仮定して、幼虫全体からの抽出は約９０分〜約１２０分の間に完了したであろう。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
実施例６
クワドロ社（Ｑｕａｄｒｏ，Ｉｎｃ．）のコミル（Ｃｏｍｉｌ）等のミル装置を使用して、Ｌ１Ｒ（分泌タンパク質）かＤｓＲｅｄ（非分泌タンパク質）を発現する凍結幼虫を破砕した。スクリーンの孔径、切削面、速度、および温度の変化を含めて様々な条件範囲下で破砕を行った。スクリーンの孔径は約２ｍｍ〜約９ｍｍで変化した。様々な切削面の形状は、四角、丸、星型、平ら、および隆起状を含んでいた。速度は約３２００ｒｐｍ〜約５０００ｒｐｍで変化した。ミリング温度は、約２５℃〜約−１９６℃の範囲であった。この実施例においては、インペラ速度は約３５００であり、衝撃面は液体窒素を使用して冷却されていた。砕いた後、砕かれた幼虫をドライアイス上に保管した。この実施例においては、様々な条件下で砕かれた幼虫を３０分、約２〜８℃においてバッファー（５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／１Ｍ塩化ナトリウム、１５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．７）で抽出した。標的タンパク質抽出物をウエスタンブロット法を使用して決定した。抽出された全タンパク質をクマシー（商標名）・プラス・ブラッドフォード・アッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ）を使用して決定した。表３は、この実施例の様々な実験から得られた結果を表す。値は、総均質化方法を使用して抽出されたタンパク質に関して抽出されたタンパク質のレベルとして提示される。この実施例においては、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ−２５シヤーホモジナイザー（ｓｈｅａｒ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）（商品名）を使用してバッファー中において幼虫を均質化した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
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【国際調査報告】
2008519855.tif 000015