(57)【要約】      （修正有）【課題】複数種類のコーティング溶液の塗り分けを、簡便に行うことができる細胞培養基板を提供すること。【解決手段】複数種類のコーティング溶液（ラミニン溶液等）の塗り分けが可能なように、隔壁５を介して対向配置された複数の凹部形状を有する細胞培養基板１０１。この細胞培養基板１０１に設けられた凹部形状は、コーティング溶液を塗布する区画２１、２２、２３、２４として利用することができる。該凹部形状は、基板と、基盤上に配設された貫通穴を有するフィルム又はシートにより、形成されている。【選択図】図１
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【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
複数種類のコーティング溶液の塗り分けが可能なように、隔壁を介して対向配置された複数の凹部形状を有する、前記コーティング溶液を塗布する区画を備える細胞培養基板。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養基板において、
前記凹部形状は、基板と、当該基板上に配設された貫通穴を有するフィルム又はシートにより形成されていることを特徴とする細胞培養基板。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞培養基板において、
前記コーティング溶液を塗布する区画であって、前記フィルム又はシートに形成された貫通穴の側壁近傍の前記基板上に、前記フィルム又はシートの残渣が付着していることを特徴とする細胞培養基板。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載の培養基板において、
前記隔壁の幅が、０．１ｍｍ以上、１ｍｍ以下であることを特徴とする細胞培養基板。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４に記載の細胞培養基板において、
前記区画の凹部の最大深さが、１０μｍ以上、３００μｍ以下であることを特徴とする細胞培養基板。
【請求項６】
請求項１，２，３、又は４に記載の細胞培養基板において、
前記区画の凹部の最大深さが、５０μｍ以上、１５０μｍ以下であることを特徴とする細胞培養基板。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、細胞培養基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における神経細胞の軸索誘導は、神経回路形成において重要なプロセスである。このプロセスは、時間的、空間的に制御された様々な細胞間の認識機構、細胞内分子間の相互作用によると考えられている。しかしながら、その分子機構の詳細は未だ十分に解明されていないのが現状である。
【０００３】
神経細胞の軸索が、結合対象となる細胞まで適切に誘導されて伸長するのは、軸索ガイダンス分子と呼ばれるネトリン（Netrin）等の誘引分子、又はセマフォリン（Semaphorin）、エフリン（Ephrin）、スリット（Slit）等の反発分子によることがわかりつつある。現在、前記分子の機能解析に加え、これら以外の関与分子の同定、機能解析等が進められている。これらの分子の同定や機能解析には、ポリスチレン等の樹脂製又はガラス製の培養ディッシュ上に、軸索ガイダンス分子又は当該分子と想定される分子を数種類塗り分け、そのディッシュ上で神経細胞を培養し、軸索の伸長等の観察等を実施することにより行っている。
【考案の開示】
【考案が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、上記分子の同定や機能解析に際して、培養ディッシュ上への複数種類の軸索ガイダンス分子等のコーティング溶液の塗り分けは、多大な労力を要していた。塗り分け時に、外部からの振動等の力により、設定した領域からコーティング溶液がはみ出したり、意図しない領域にコーティング溶液が流れだしたりする場合があり、このような場合には、操作を最初からやり直さなければならなかった。また、コーティング溶液の塗布位置が、設定した所望の位置からずれてしまった場合、正確な実験結果が得られないという問題があった。
【０００５】
そこで、容易に軸索ガイダンス分子の塗り分けができる細胞培養基板が望まれていた。なお、上記においては、神経細胞を例にとり説明したが、細胞を培養して、コーティング溶液により解析を行いたい場合全般において同様の課題が生じ得る。
【０００６】
本考案は、上記背景に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、複数種類のコーティング溶液の塗り分けを簡便に行うことができる細胞培養基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本考案に係る細胞培養基板は、複数種類のコーティング溶液の塗り分けが可能なように、隔壁を介して対向配置された複数の凹部形状を有する区画を備えるものである。
【０００８】
本考案に係る細胞培養基板によれば、上記構成の区画を複数備えているので、複数のコーティング溶液を簡便に塗り分けることが可能である。
【考案の効果】
【０００９】
本考案によれば、複数種類のコーティング溶液を簡便に塗り分け可能な細胞培養基板を提供することができるという優れた効果を有する。
【考案を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本考案を適用した実施形態の一例について説明する。なお、本考案の趣旨に合致する限り、他の実施形態も本考案の範疇に属し得ることは言うまでもない。また、以降の図における各部材のサイズや比率は、一例であり、これに限定されるものではない。
[実施形態１]
図１（ａ）は、本実施形態１に係る細胞培養基板の一例を説明するための平面図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）のＩｂ−Ｉｂ切断部断面図である。細胞培養基板１０１は、同図に示すように、ポリエチレン（以下「ＰＥ」と略記する）テープ３とガラス基板４から構成される。ＰＥテープ３には、解析区画となる複数の開口部（貫通穴）が形成されている。そして、このＰＥテープ３がガラス基板４上に貼り付けられている。
【００１１】
ＰＥテープ３には、４つの区画を形成するための開口部が形成されている。具体的には、第１解析区画２１、第２解析区画２２、第３解析区画２３、第４解析区画２４を形成するための開口部である。この開口部はガラス基板４にＰＥテープ３を貼り付けた後、レーザー等により開口部周囲を焼き切り、その後不要となった各解析区画にあるＰＥテープを除去することで、図１（ａ）及び（ｂ）に示すような凹部形状の第１解析区画２１〜第４解析区画２４を形成する。第1解析区画２１〜第４解析区画２４は、本実施形態１においては略同一形状に形成されている。隣接する各解析区画間は、隔壁５により隔てられている。
【００１２】
第1解析区画２１〜第４解析区画２４は、コーティング溶液を塗るための区画である。各解析区画を別個の凹部形状とすることにより、解析区画毎に異なる多種類のコーティング溶液を容易に塗り分けることができる。コーティング溶液とは、細胞に対して解析等を行いたい溶液全般を含む。タンパク質等を含む溶液の他、リファレンスのための溶液等も含む。
【００１３】
本実施形態１に係る細胞培養基板１０１は、特に、神経細胞の機能解析に好適に用いることができる。例えば、第１解析区画２１〜第４解析区画２４には、軸索ガイダンス分子である神経誘引物質、神経反発物質等のタンパク質を含むコーティング溶液等を塗布することにより、神経細胞の機能解析等に好適に利用することができる。なお、本明細書において「神経細胞」とは、単独の神経細胞の他、神経細胞の集団からなる神経節等も含むものとする。
【００１４】
本実施形態１に係る細胞培養基板１０１は、例えば、以下のようにして製造される。まず、縦８ｍｍ、横８ｍｍ、厚み０．１２ｍｍ程度のＰＥフィルムを用意し、ガラス基板に貼り付ける。ガラス基板としては、例えば、顕微鏡用カバーガラスやスライドガラス、市販のガラスボトムディッシュを挙げることができ、その大きさは培養条件や培養方法に応じ変えても問題ない。
【００１５】
まず、開口部を形成させるため各解析区画に該当する形状に合わせて、レーザー光を照射することにより、ＰＥフィルムを焼き切る。その後、各解析区画にピンセットで焼き切ったＰＥフィルムを除去することにより、コーティング溶液を載せる凹部形状を形成する。なお、各解析区画のＰＥフィルムの除去は、レーザー光にてＰＥフィルムを焼き切った直後でも、コーティング溶液を搭載する直前のいずれでもよい。
【００１６】
なお、細胞培養基板として、ガラス基板４とＰＥテープ３により構成される例について説明したが、これに限定されるものではなく、細胞の培養、解析の妨げにならない材料の中から適宜選定することができる。例えば、ガラス基板に代えて、透明な熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、光硬化性樹脂等を利用することができる。例えば、アクリル樹脂、シクロオレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン共重合体、ポリカーボネート系樹脂、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系樹脂、エチレン・ビニルアルコール共重合体、オレフィン系・スチレン系・ウレタン系等の熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、フッ素系樹脂、ポリメチルシロキサン等のシリコーン系樹脂等を用いてもよい。また、ＰＥフィルムに代えて、他のフィルムやシートを用いてもよい。例えば、ポリプロピレンフィルム、アクリルフィルム、ポリエチレンテレフタレートフィルム、塩化ビニルフィルム等を用いてもよい。
【００１７】
隣接する解析区画間を隔てる隔壁５の幅は、０．１ｍｍ以上とすることが好ましい。０．１ｍｍ以上とすることにより、振動等の外部からの力等によって、種類の異なるコーティング溶液が、隣接する解析区画に流出してしまうことをより効果的に防止することができる。また、隔壁５は、細胞の遊走性阻害や神経細胞の軸索伸展阻害の観点から、１ｍｍ以下とすることが好ましい。
【００１８】
ＰＥフィルムの厚さは、１０μｍ以上、３００μｍ以下とすることが好ましく、さらには、５０μｍ以上、１５０μｍ以下とすることがより好ましい。これにより、振動等の外部からの力等によって、種類の異なるコーティング溶液が、隣接する解析区画に流出してしまうことをより効果的に防止することができる。また、レーザー光で焼き切った後、ＰＥフィルムをピンセットで除去する場合、効率よく剥離させることができる。さらに、各解析区画に注入するコーティング溶液の量は、上記流出を効果的に防止する観点から、解析区画を構成する体積の５００％以下とすることが好ましい。
【００１９】
なお、レーザー光でＰＥフィルムを焼き切ることで解析区画に該当するＰＥフィルムを除去した後、ＰＥフィルムの開口部の側壁近傍のガラス表面にＰＥフィルムの焼き残りである残渣（不図示）が発生する。細胞培養においてこの残渣は問題なく、細胞の遊走性や神経細胞の軸索伸展に影響はみられない。しかも、ＰＥフィルムの開口部の側壁近傍のガラス表面にＰＥフィルムの残渣が付着していることにより、後述する細胞の載置後、揺れや振動によって細胞が所望外の位置に移動しにくくなるというメリットを有する。
【００２０】
上記のように構成された細胞培養基板１０１は、解析対象となるコーティング溶液、例えば、タンパク質等からなるコーティング溶液を解析区画毎にそれぞれ塗り分ける。コーティング溶液としては、接着性分子、軸索ガイダンス分子、若しくはこれらの機能を有すると想定される分子等を含む溶液を挙げることができる。具体的には、タンパク質であるコラーゲン、フィブロネクチン等を挙げることができ、また合成高分子であるポリ−L−リシン、ポリ−D−リシン、ポリ−L−オルニチン、ポリエチレンイミン等の細胞接着作用がある分子に加えて、神経突起の伸長にも誘導効果を有するラミニン溶液などを挙げることができる。
【００２１】
コーティング溶液によるコーティングが終了した後、枠を構成しているＰＥテープ３を剥離することにより、異なる複数のコーティング溶液の塗り分けを行った平面状の細胞培養基板を得ることができる。神経細胞等の細胞は、ＰＥテープ３を剥離後に、第1解析区画２１〜第４解析区画２４に囲まれた中央領域であるガラス基板４上に塗布する。これにより、細胞の接着性評価や神経細胞の軸索伸長の誘導効果を調べることができる。なお、ＰＥテープ３を剥離後、前述した残渣がガラス表面上に残る。この残渣により、細胞を載置する領域である、第1解析区画２１〜第４解析区画２４に囲まれた中央領域から、揺れや振動等によって第1解析区画２１〜第４解析区画２４等の所望外の位置に細胞が移動することを抑制することができる。
【００２２】
本実施形態１に係る細胞培養基板よれば、複数の凹部形状の区画を配設しているので、複数のコーティング溶液の塗り分けを簡便にセッティングすることができる。また、残渣を細胞培養基板の開口部の側壁近傍の基板表面に付着させているので、振動や揺れ等によって細胞が所望外の位置に移動することを抑制することができる。
【００２３】
[実施形態２]
次に、上記実施形態１とは異なる細胞培養基板の一例について説明する。なお、以降の説明において、上記実施形態１と同一の要素部材には同一の符号を付し、適宜その説明を省略する。
【００２４】
本実施形態２に係る細胞培養基板は、以下の点を除く基本的な構造は上記実施形態１と同様である。すなわち、上記実施形態１においては、ＰＥテープ３により４つの解析区画（第１解析区画２１〜第４解析区画２４）を配設していたのに対し、本実施形態２においては、４つの解析区画（第１解析区画２１〜第４解析区画２４）の他、これらの解析区画に囲まれる領域に区画１が配設されている点において相違している。
【００２５】
図２（ａ）は、本実施形態２に係る細胞培養基板の一例を説明するための平面図であり、図２（ｂ）は、図２（ａ）のＩＩｂ−ＩＩｂ切断部断面図である。細胞培養基板１０２は、同図に示すように、ＰＥテープ３ａとガラス基板４から構成される。ＰＥテープ３ａには、第1解析区画２１〜第４解析区画２４に加え、これらの解析区画により囲まれる区画１を形成するための開口部が形成されている。そして、このＰＥテープ３ａがガラス基板４上に貼り付けられている。
【００２６】
第1解析区画２１〜第４解析区画２４は、上記実施形態１と同様にコーティング溶液を塗るための区画である。また、本実施形態２においては、区画１にもコーティング溶液を塗ることが可能である。
【００２７】
本実施形態２に係る細胞培養基板１０２は、特に、神経細胞の機能解析に好適に用いることができる。例えば、区画１に神経節を載せ、第1解析区画２１〜第４解析区画２４には、軸策ガイダンス分子である神経誘引物質、神経反発物質等のタンパク質を含むコーティング溶液等を塗布することにより、神経細胞の機能解析等に好適に利用することができる。
【００２８】
本実施形態２に係る細胞培養基板１０２は、実施形態１に準じて製造される。まず、開口部を形成させるため各区画に該当する形状に合わせ、レーザー光を照射することにより、ＰＥフィルムを焼き切る。その後、区画毎にピンセットで焼き切ったＰＥフィルムを個々に除去することにより、コーティング溶液を載せる凹部形状を形成する。なお、各区画のＰＥフィルムの除去は、レーザー光にてＰＥフィルムを焼き切った直後でも、コーティング溶液を搭載する直前のいずれでもよい。
【００２９】
第1解析区画２１〜第４解析区画２４、並びに区画１との間に形成されたＰＥフィルム３ａにより構成される隔壁５ａの幅は、０．１ｍｍ以上とすることが好ましい。０．１ｍｍ以上とすることにより、振動等の外部からの力等によって、種類の異なるコーティング溶液が、隣接する解析区画に流出してしまうことをより効果的に防止することができる。また、隔壁５ａは、細胞の遊走性阻害や神経細胞の軸索伸展阻害の観点から、１ｍｍ以下の幅とすることが好ましい。
【００３０】
上記のように構成された細胞培養基板１０２に対して、解析対象となるコーティング溶液、例えば、タンパク質等からなるコーティング溶液を各区画にそれぞれ塗り分ける。コーティング溶液としては、接着性分子、軸索ガイダンス分子、若しくはこれらの機能を有すると想定される分子等を含む溶液を挙げることができる。これらコーティング溶液によるコーティングが終了した後、枠状のＰＥフィルム３ａを剥離することにより、異なる複数のコーティング溶液の塗り分けた平面状の細胞培養基板を得ることができる。神経節等の神経細胞は、ＰＥテープ３ａを剥離後に、第1解析区画２１〜第４解析区画２４に囲まれた中央領域であるガラス基板４上に塗布する。これにより、細胞の接着性評価や神経細胞の軸索伸長の誘導効果を調べることができる。
【００３１】
本実施形態２に係る細胞培養基板よれば、複数の解析区画と、これらを取り囲む区画を配設しているので、複数のコーティング溶液の塗り分けを簡便にセッティングすることができる。また、残渣を細胞培養基板の開口部の側壁近傍の基板表面に付着させているので、振動や揺れ等によって細胞が所望外の位置に移動することを抑制することができる。
【００３２】
[実施形態３]
次に、上記実施形態１及び２とは異なる細胞培養基板の一例について説明する。本実施形態３に係る細胞培養基板は、以下の点を除く基本的な構造は上記実施形態１及び２と同様である。すなわち、上記実施形態１及び２においては、各区画が独立していたが、本実施形態３においては、４つの解析区画の内、対角に設置される解析区画が連通されて配置される点で相違している。
【００３３】
図３（ａ）は、本実施形態３に係る細胞培養基板の一例を説明するための平面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）のＩＩＩｂ−ＩＩＩｂ切断部断面図である。細胞培養基板１０３は、同図に示すように、ＰＥテープ３ｂとガラス基板４から構成される。ＰＥテープ３ｂには、解析区画となる複数の開口部が形成されている。具体的には、第1解析区画２１ｂ、第２解析区画２２、第３解析区画２３である。第1解析区画２１ｂは、上記実施形態２における第1解析区画２１と区画１を隔てる隔壁を取り除き、さらに第４解析区画２４と区画１を隔てる隔壁を取り除いた構造となっている。換言すると、上記実施形態１における４つの解析区画のうち、対角に設置される２組の解析区画のうちの一つを連通させた構造としている。このような解析区画を有するＰＥテープ３ｂが、ガラス基板４上に貼り付けられている。
【００３４】
第1解析区画２１ｂ、第２解析区画２２、第３解析区画２３は、コーティング溶液を塗るための区画である。本実施形態に係る細胞培養基板１０３は、特に、神経細胞の機能解析に好適に用いることができる。例えば、第1解析区画２１ｂ、第２解析区画２２、及び第３解析区画２３に、軸策ガイダンス分子である神経誘引物質、神経反発物質等のタンパク質を含むコーティング溶液等を塗布し、その後、第１解析区画２１ｂの中央領域（上記実施形態２の区画１に相当する領域）に神経節を載せることにより、神経細胞の機能解析等に好適に行うことができる。
【００３５】
本実施形態３に係る細胞培養基板１０３は、上記施形態１に準じて製造される。まず、開口部を形成させるため各区画に該当する形状に合わせ、レーザー光を照射することにより、ＰＥフィルムを焼き切る。その後、区画毎にピンセットで焼き切ったＰＥフィルムを除去することにより、コーティング溶液を載せる凹部形状を形成する。なお、各区画のＰＥフィルムの除去は、レーザー光にてＰＥフィルムを焼き切った直後でも、コーティング溶液を搭載する直前のいずれでもよい。
【００３６】
第1解析区画２１ｂ、第２解析区画２２、第３解析区画２３の間に形成された隔壁５ｂの幅は、０．１ｍｍ以上とすることが好ましい。０．１ｍｍ以上とすることにより、振動等の外部からの力等によって、種類の異なるコーティング溶液が、隣接する解析区画に流出してしまうことをより効果的に防止することができる。また、隔壁５ｂは、細胞の遊走性阻害や神経細胞の軸索伸展阻害の観点から、１ｍｍ以下の幅とすることが好ましい。
【００３７】
上記のように構成された細胞培養基板１０３に対して、解析対象となるコーティング溶液、例えば、タンパク質等からなるコーティング溶液を各区画にそれぞれ塗り分ける。コーティング溶液としては、接着性分子、軸索ガイダンス分子、若しくはこれらの機能を有すると想定される分子等を含む溶液を挙げることができる。これらコーティング溶液によるコーティングが終了した後、枠状のＰＥフィルム３を剥離することにより、異なる複数のコーティング溶液の塗り分けを行った平面状の細胞培養基板を得ることができる。神経細胞等の細胞は、ＰＥテープ３を剥離後に、第1解析区画２１ｂの中央領域（上記実施形態２における区画１の領域）であるガラス基板４上に塗布する。これにより、細胞の接着性評価や神経細胞の軸索伸長の誘導効果を調べることができる。
【００３８】
本実施形態３に係る細胞培養基板よれば、複数の解析区画を配設しているので、複数のコーティング溶液の塗り分けを簡便にセッティングすることができる。また、残渣を細胞培養基板の開口部の側壁近傍の基板表面に付着させているので、振動や揺れ等によって細胞が所望外の位置に移動することを抑制することができる。
【００３９】
なお、上記実施形態１〜３においては、解析区画を４つ設けた例について説明したが、目的に応じて適宜設定可能であり、形状も、本考案の趣旨を逸脱しない範囲において任意に設定可能である。例えば、複数の同一形状の解析区画を一列に配設する細胞培養基板としてもよい。この場合、例えば、配列方向の一辺端部近傍に細胞を載置すればよい。
【実施例】
【００４０】
次に本考案の実施様態を、神経節を用いた実施例で説明する。実施例に基づいて本考案を具体的に説明するが、本考案はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４１】
コーティング溶液の塗り分けは１００μｇ／ｍｌのポリ-L-リシン臭化水素塩水溶液（和光、分子量３０万以上：以下、PLL溶液）と８μｇ／ｍｌのラミニン溶液（マウスラミニン、BD Bioscience）を使用した。まず、区画毎に１〜２μｌのPLL溶液を載せ、３０分間静置し、その後脱イオン水で洗浄した。これを風乾後、塗り分けしたい区画に１〜２μｌのラミニン溶液を載せ、１時間静置しハンクス緩衝液で洗浄し、培養液を添加して塗り分けした細胞培養基板を得た。
【００４２】
培養は卵胚７〜８目のニワトリ胚から取り出した後根神経節を細胞培養基板の中央に載せ、神経成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ 和光）、ゲンタマイシン（Sigma）、０．６％グルコース、２ｍＭグルタミン、１０％牛胎児血清を含むＬ−１５培地（invitrogen）が入った直径３５ｍｍのポリスチレン製ディッシュの底面に設置し、３７℃、で約２４〜７２時間培養し、後根神経節の状態、軸索の伸長の度合いを観察した。
【００４３】
（実施例１）
図１に示す構造を有する細胞培養基板１０１を作製した。本実施例1に係る細胞培養基板１０１は、ガラス基板４として、顕微鏡用カバーガラス（縦１７ｍｍ×横１７ｍｍ×厚さ０．１５ｍｍ）を用いた。また、第１解析区画２１、第２解析区画２２、第３解析区画２３、第４解析区画２４を構成するためのＰＥテープとして、厚さが０．１２ｍｍのものを用いた。
【００４４】
図４（ａ）に図１（ａ）のＩＶａ−ＩＶａ切断部断面図を、図４（ｂ）に図１のＩＶｂ−ＩＶｂ切断部断面図を、図４（ｃ）に図１のＩＶｃ−ＩＶｃ切断部断面図を示す。細胞培養基板１０１に形成されたＰＥテープ３には、対向配置される第１解析区画２１、第２解析区画２２、第３解析区画２３、第４解析区画２４を構成するための開口部が設けられている。第1解析区画２１〜第４解析区画２４の長辺を２ｍｍとした（図４参照）。これらの区画は、ＰＥテープ３にレーザーを照射して、レーザー光により焼き切ることにより作製した。各解析区画との間隙を構成する隔壁５の幅は０．１ｍｍとした。
【００４５】
このようにして作製された細胞培養基板１０１は、最初に、第1解析区画２１〜第４解析区画２４に、１〜２μｌのＰＬＬ溶液を図５の写真に示すように注入した。ＰＬＬ溶液の注入に際して、隣接する解析区画同士で、ＰＬＬ溶液が接触したり、混合したりすることはなかった。次いで、ＰＬＬ溶液を脱イオン水で洗浄し、風乾した。その後、図６に示すように第1解析区画２１、及び第４解析区画２４の２つの解析区画に１〜２μｌのラミニン溶液を注入した。この際、ラミニン溶液を注入した解析区画から、ラミニン溶液がはみ出したり、隣接する解析区画等に流れ込んだりすることはなかった。
【００４６】
ラミニン溶液を注入後、緩衝液で洗浄し、風乾を行った。風乾後、枠状のＰＥテープ３を剥離し、この細胞培養基板１０１を培地の入ったディッシュの底面に設置した。次いで、後根神経節を第1解析区画２１〜第４解析区画２４によって囲まれる領域（上記実施形態２における区画１に相当する領域）のガラス基板４上に載置した。そして、所定の条件で培養した。約４８時間後、細胞培養基板１０１を観察したところ、図７に示すように、後根神経節が初期に載置した位置からほとんど移動することなく、また軸索がラミニン溶液をコーティングした区画に選択的に伸長していることを確認した。
【００４７】
なお、図７に示す符号６は、ＰＥテープ３の残渣である。同図に示すうように、ＰＥテープ３を剥離した後であっても、ＰＥテープ３のレーザー光照射部に若干の残差が残る場合がある。本実施例１においては、１０〜５０μｍ程度の残渣が残った。残渣によって、神経節の培養（特に軸索伸長）に大きな影響はなかった。
【００４８】
また、本実施例１においては、ラミニン溶液を塗布した例について説明したが、第２解析区画２２、第３解析区画２３に、別の種類のコーティング溶液を同時に塗り分けて、培養を行うことができることは言うまでもない。また、第1解析区画２１と第４解析区画２４に別々のコーティング溶液を塗布してもよい。
【００４９】
（実施例２）
図２に示す構造を有する細胞培養基板１０２を作製した。本実施例２に係る細胞培養基板１０２は、ガラス基板４として、ガラスボトムディッシュ（ガラス面直径２７ｍｍ、ＩＷＡＫＩ）のガラス面を用いた。また、第１解析区画２１、第２解析区画２２、第３解析区画２３、第４解析区画２４、区画１を構成するためのＰＥテープとして、厚さが０．１２ｍｍのものを用いた。
【００５０】
図８（ａ）に図２のＶＩＩＩａ−ＶＩＩＩａ切断部断面図を、図８（ｂ）に図２のＶＩＩＩｂ−ＶＩＩＩｂ切断部断面図を、図８（ｃ）に図２のＶＩＩＩｃ−ＶＩＩＩｃ切断部断面図を示す。細胞培養基板１０２に形成されたＰＥテープ３ａには、対向配置される第１解析区画２１、第２解析区画２２、第３解析区画２３、第４解析区画２４、区画１を構成するための開口部が設けられている。第1解析区画２１〜第４解析区画２４の長辺を２ｍｍとした。区画１は略正方形で一辺を０．７ｍｍとした。これらの区画は、ＰＥテープにレーザーを照射して、レーザー光により焼き切ることにより作製した。各解析区画との間隙を構成する隔壁５ａの幅は０．１ｍｍとした。
【００５１】
このようにして作製された細胞培養基板１０１は、最初に、第1解析区画２１〜第４解析区画２４、並びに区画１に、１〜２μｌのＰＬＬ溶液を注入した。ＰＬＬ溶液の注入に際して、隣接する解析区画同士もしくは解析区画と区画で、ＰＬＬ溶液が接触したり、混合したりすることはなかった。次いで、ＰＬＬ溶液を脱イオン水で洗浄し、風乾した。その後、第1解析区画２１、及び第４解析区画２４に１〜２μｌのラミニン溶液を注入した。ラミニン溶液を注入した解析区画から、ラミニン溶液がはみ出したり、隣接する解析区画等に流れ込んだりすることはなかった。
【００５２】
ラミニン溶液を注入後、緩衝液で洗浄し、風乾を行った。風乾後、枠状のＰＥテープ３を剥離し、次いで、ガラスボトムディッシュに培地を入れ、後根神経節を解析区画によって囲まれる区画１に載置した。そして、所定の条件で培養した。約４８時間後、細胞培養基板１０２を観察したところ、後根神経節が区画１からはみ出すことなく、また軸索がラミニン溶液をコーティングした区画に選択的に伸長していることを確認した。
【００５３】
（実施例３）
図３に示す構造を有する細胞培養基板１０３を作製した。本実施例３に係る細胞培養基板１０３は、ガラス基板４として、ガラスボトムディッシュ（ガラス面直径２７ｍｍ、ＩＷＡＫＩ）のガラス面を用いた。また、第１解析区画２１ｂ、第２解析区画２２、第３解析区画２３を構成するためのＰＥテープ３ｂとして、厚さが０．１２ｍｍのものを用いた。
【００５４】
図９（ａ）に図３のＩＸａ−ＩＸａ切断部断面図を、図９（ｂ）に図３のＩＸｂ−ＩＸｂ切断部断面図を、図９（ｃ）に図３のＩＸｃ−ＩＸｃ切断部断面図を示す。細胞培養基板１０３に形成されたＰＥテープ３には、対向配置される第１解析区画２１ｂ、第２解析区画２２、第３解析区画２３を構成するための開口部が設けられている。なお、第1解析区画２１と第４解析区画２４は幅７ｍｍの通路で連通している。これらの区画は、ＰＥテープにレーザーを照射して、レーザー光により焼き切ることにより作製した。各解析区画との間隙を構成する隔壁５ｂの幅は０．１ｍｍとした。
【００５５】
このようにして作製された細胞培養基板１０３は、最初に、第1解析区画２１〜第４解析区画２４並びに区画１に、１〜２μｌのＰＬＬ溶液を注入した。ＰＬＬ溶液の注入に際して、隣接する解析区画同士もしくは解析区画と区画で、ＰＬＬ溶液が接触したり、混合したりすることはなかった。次いで、ＰＬＬ溶液を脱イオン水で洗浄し、風乾した。その後、第２解析区画２２、及び第３解析区画２３に１〜２μｌのラミニン溶液を注入した。ラミニン溶液を注入した解析区画から、ラミニン溶液がはみ出したり、隣接する解析区画等に流れ込んだりすることはなかった。
【００５６】
ラミニン溶液を注入後、緩衝液で洗浄し、風乾を行った。風乾後、枠状のＰＥテープ３を剥離し、次いで、ガラスボトムディッシュに培地を入れ、後根神経節を基板中央に載置した。そして、所定の条件で培養した。約４８時間後、細胞培養基板１０３を観察したところ、後根神経節は初期に載置した場所からほとんど移動することなく、また軸索がラミニン溶液をコーティングした区画に選択的に伸長していることを確認した。
【００５７】
（比較例1）
顕微鏡用カバーガラス（縦１７ｍｍ×横１７ｍｍ×厚さ０．１５ｍｍ）１０４表面に、図１０の点線で示す領域に２つの解析区画領域（第１解析区画１２１、第２解析区画１２２）を設定した。第１解析区画１２１、及び第２解析区画１２２は、共に長辺５ｍｍ、短辺２ｍｍとし、長辺を介して互いに対向配置させるようにした。第１解析区画１２１と第２解析区画１２２の間隙は、０．１ｍｍに設定した。これらの２つの解析区画に、マイクロシリンジによりPLL溶液を各解析区画に塗り分けた。しかし、０．１ｍｍの間隙を作製することは非常に困難であった。
【００５８】
塗り分けた後、脱イオン水で洗浄し、風乾させた。さらに、第２解析区画１２２にラミニン溶液をマイクロシリンジで塗り、緩衝液で洗浄し、風乾を行った。これらの塗り分けた解析区画が不明になることから、マジックを使用して解析区画の位置を明示した。風乾後、この細胞培養基板を培地の入ったディッシュの底面に設置し、培地を入れ、後根神経節を第1解析区画１２１と第２解析区画１２２の間隙と推定される場所に載置した。そして、所定の条件で培養した。
【００５９】
約４８時間後、細胞培養基板を観察したところ、後根神経節は初期に載置した場所から移動していたり、解析区画間の間隙にうまく載置されていなかったりするケースが散見された。このように、マイクロシリンジで塗り分けを実施した場合、マイクロシリンジでの塗り分けが非常に困難であった。しかも、第２解析区画１２２にラミニン溶液を塗る場合において、第1解析区画１２１に染みだすケースも見られた。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】（ａ）は、実施形態１に係る細胞培養基板の平面図、（ｂ）は、図１（ａ）Ｉｂ−Ｉｂの切断部断面図。
【図２】（ａ）は、実施形態２に係る細胞培養基板の平面図、（ｂ）は、図２（ａ）ＩＩｂ−ＩＩｂの切断部断面図。
【図３】（ａ）は、実施形態３に係る細胞培養基板の平面図、（ｂ）は、図３（ａ）ＩＩＩｂ−ＩＩＩｂの切断部断面図。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、実施例１に係る細胞培養基板の切断部断面図。
【図５】実施例１に係る細胞培養基板の各解析区画にＰＬＬ溶液を載せた時の状態写真。
【図６】実施例１に係る細胞培養基板の対角となる解析区画にラミニン溶液を載せた時の状態写真。
【図７】実施例１に係る細胞培養基板において、ニワトリ胚後根神経節を培養した際の状態写真。
【図８】（ａ）〜（ｃ）は、実施例２に係る細胞培養基板の切断部断面図。
【図９】（ａ）〜（ｃ）は、実施例３に係る細胞培養基板の切断部断面図。
【図１０】比較例１にかかるカバーガラスの平面図。
【符号の説明】
【００６１】
１      区画
３      ポリエチレンテープ
４      ガラス基板
５      隔壁
６      残渣
２１    第1解析区画
２２    第２解析区画
２３    第３解析区画
２４    第４解析区画
１０１、１０２、１０３  細胞培養基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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