(57)【要約】  本発明は、最適化ＩｇＧ免疫グロブリン変異体、それらの作製、および特に治療目的のそれらの適用のための技術的方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親ポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個の修飾を含む該親ポリペプチドのＦｃ変異体であって、該変異タンパク質は、親ポリペプチドと比較してＦｃＲｎ（胎児性受容体）との変化した結合を示し、該Ｆｃ変異体は、２４６Ｈ、２４６Ｓ、２４７Ｄ、２４７Ｔ、２４８Ｈ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｒ、２４８Ｙ、２４９Ｔ、２４９Ｗ、２５１Ｄ、２５１Ｅ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｋ、２５１Ｍ、２５１Ｎ、２５１Ｔ、２５１Ｖ、２５１Ｙ、２５２Ｆ、２５２Ｌ、２５３Ｌ、２５３Ｔ、２５３Ｖ、２５４Ｈ、２５４Ｌ、２５４Ｎ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、＾２５４Ｎ、２５５Ｅ、２５５Ｆ、２５５Ｈ、２５５Ｋ、２５５Ｓ、２５５Ｖ、２５６Ｅ、２５６Ｈ、２５６Ｖ、２５７Ａ、２５７Ｃ、２５７Ｄ、２５７Ｅ、２５７Ｆ、２５７Ｇ、２５７Ｈ、２５７Ｉ、２５７Ｋ、２５７Ｌ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｑ、２５７Ｒ、２５７Ｓ、２５７Ｔ、２５７Ｖ、２５７Ｗ、２５７Ｙ、２５８Ｒ、２５８Ｖ、２７９Ａ、２７９Ｃ、２７９Ｄ、２７９Ｆ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｌ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｐ、２７９Ｑ、２７９Ｒ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８０Ｅ、２８０Ｈ、＾２８１Ａ、＾２８１Ｄ、＾２８１Ｓ、＾２８１Ｔ、２８２Ｄ、２８２Ｆ、２８２Ｈ、２８２Ｉ、２８２Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｉ、２８３Ｌ、２８３Ｙ、２８４Ｈ、２８４Ｋ、２８４Ｐ、２８４Ｑ、２８４Ｒ、２８４Ｓ、２８４Ｙ、２８５Ｓ、２８５Ｖ、２８６＃、２８６Ｌ、２８７Ｈ、２８７Ｓ、２８７Ｖ、２８７Ｙ、２８８Ｈ、２８８Ｑ、２８８Ｒ、２８８Ｓ、３０５Ｈ、３０５Ｔ、３０６Ｆ、３０６Ｈ、３０６Ｉ、３０６Ｎ、３０６Ｔ、３０６Ｖ、３０６Ｙ、３０７Ｄ、３０７Ｖ、３０７Ｙ、３０８Ａ、３０８Ｃ、３０８Ｄ、３０８Ｅ、３０８Ｆ、３０８Ｇ、３０８Ｈ、３０８Ｉ、３０８Ｋ、３０８Ｌ、３０８Ｍ、３０８Ｎ、３０８Ｐ、３０８Ｑ、３０８Ｒ、３０８Ｓ、３０８Ｔ、３０８Ｗ、３０８Ｙ、３０９Ｆ、３０９Ｈ、３０９Ｉ、３０９Ｎ、３０９Ｐ、３０９Ｑ、３０９Ｖ、３０９Ｙ、３１０Ｋ、３１０Ｎ、３１０Ｔ、３１１Ｈ、３１１Ｌ、３１１Ｓ、３１１Ｔ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１２Ｈ、３１３Ｙ、３１５Ｅ、３１５Ｇ、３１５Ｈ、３１５Ｑ、３１５Ｓ、３１５Ｔ、３１７Ｈ、３１７Ｓ、３３９Ｐ、３４０Ｐ、３４１Ｓ、３７４Ｈ、３７４Ｓ、３７６Ｈ、３７６Ｌ、３７８Ｈ、３７８Ｎ、３８０Ｔ、３８０Ｙ、３８２Ｈ、３８３Ｈ、３８３Ｋ、３８３Ｑ、３８４Ｅ、３８４Ｇ、３８４Ｈ、３８５Ａ、３８５Ｃ、３８５Ｄ、３８５Ｅ、３８５Ｆ、３８５Ｈ、３８５Ｉ、３８５Ｋ、３８５Ｌ、３８５Ｍ、３８５Ｎ、３８５Ｐ、３８５Ｑ、３８５Ｒ、３８５Ｓ、３８５Ｔ、３８５Ｖ、３８５Ｗ、３８５Ｙ、３８６Ｅ、３８６Ｈ、３８６Ｋ、３８７＃、３８７Ａ、３８７Ｈ、３８７Ｋ、３８７Ｑ、３８９Ｅ、３８９Ｈ、４２６Ｅ、４２６Ｈ、４２６Ｌ、４２６Ｎ、４２６Ｒ、４２６Ｖ、４２６Ｙ、４２７Ｉ、４２９Ｄ、４２９Ｆ、４２９Ｋ、４２９Ｎ、４２９Ｑ、４２９Ｓ、４２９Ｔ、４２９Ｙ、４３０Ｄ、４３０Ｈ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｑ、４３０Ｙ、４３１Ｇ、４３１Ｈ、４３１Ｉ、４３１Ｐ、４３１Ｓ、４３２Ｆ、４３２Ｈ、４３２Ｎ、４３２Ｓ、４３２Ｖ、４３３Ｅ、４３３Ｎ、４３３Ｐ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｑ、４３４Ｓ、４３４Ｙ、４３５Ｎ、４３６Ｅ、４３６Ｆ、４３６Ｈ、４３６Ｌ、４３６Ｑ、４３６Ｖ、４３６Ｗ、４３７Ｅ、４３７Ｖ、４３８Ｅ、４３８Ｈおよび４３８Ｋ（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従い、＾は、表示の位置の後ろの挿入であり、そして＃は、その表示の位置の欠失である。）からなる群から選択される少なくとも１個の修飾を含む、Ｆｃ変異体。
【請求項２】
該Ｆｃ変異体が、２４６Ｈ、２４６Ｓ、２４７Ｄ、２４７Ｔ、２４８Ｈ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｒ、２４８Ｙ、２４９Ｔ、２４９Ｗ、２５１Ｄ、２５１Ｅ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｋ、２５１Ｍ、２５１Ｎ、２５１Ｔ、２５１Ｖ、２５１Ｙ、２５２Ｌ、２５３Ｌ、２５３Ｔ、２５３Ｖ、２５４Ｈ、２５４Ｌ、２５４Ｎ、２５４Ｖ、＾２５４Ｎ、２５５Ｅ、２５５Ｆ、２５５Ｈ、２５５Ｋ、２５５Ｓ、２５５Ｖ、２５６Ｈ、２５６Ｖ、２５７Ａ、２５７Ｃ、２５７Ｄ、２５７Ｅ、２５７Ｆ、２５７Ｇ、２５７Ｈ、２５７Ｉ、２５７Ｋ、２５７Ｌ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｑ、２５７Ｒ、２５７Ｓ、２５７Ｔ、２５７Ｖ、２５７Ｗ、２５７Ｙ、２５８Ｒ、２５８Ｖ、２７９Ａ、２７９Ｃ、２７９Ｄ、２７９Ｆ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｐ、２７９Ｑ、２７９Ｒ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８０Ｈ、＾２８１Ａ、＾２８１Ｄ、＾２８１Ｓ、＾２８１Ｔ、２８２Ｄ、２８２Ｆ、２８２Ｈ、２８２Ｉ、２８２Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｉ、２８３Ｌ、２８３Ｙ、２８４Ｈ、２８４Ｋ、２８４Ｐ、２８４Ｑ、２８４Ｒ、２８４Ｓ、２８４Ｙ、２８５Ｓ、２８５Ｖ、２８６＃、２８６Ｌ、２８７Ｈ、２８７Ｓ、２８７Ｖ、２８７Ｙ、２８８Ｈ、２８８Ｑ、２８８Ｓ、３０５Ｈ、３０５Ｔ、３０６Ｆ、３０６Ｈ、３０６Ｉ、３０６Ｎ、３０６Ｔ、３０６Ｖ、３０６Ｙ、３０７Ｄ、３０７Ｖ、３０７Ｙ、３０８Ｃ、３０８Ｅ、３０８Ｆ、３０８Ｇ、３０８Ｈ、３０８Ｉ、３０８Ｋ、３０８Ｌ、３０８Ｍ、３０８Ｎ、３０８Ｐ、３０８Ｑ、３０８Ｒ、３０８Ｓ、３０８Ｗ、３０８Ｙ、３０９Ｆ、３０９Ｈ、３０９Ｎ、３０９Ｑ、３０９Ｖ、３０９Ｙ、３１０Ｋ、３１０Ｎ、３１０Ｔ、３１１Ｌ、３１１Ｔ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１２Ｈ、３１３Ｙ、３１５Ｅ、３１５Ｇ、３１５Ｈ、３１５Ｑ、３１５Ｓ、３１５Ｔ、３１７Ｈ、３１７Ｓ、３３９Ｐ、３４０Ｐ、３４１Ｓ、３７４Ｈ、３７４Ｓ、３７６Ｈ、３７６Ｌ、３７８Ｈ、３７８Ｎ、３８０Ｔ、３８０Ｙ、３８２Ｈ、３８３Ｈ、３８３Ｋ、３８３Ｑ、３８４Ｅ、３８４Ｇ、３８４Ｈ、３８５Ａ、３８５Ｃ、３８５Ｆ、３８５Ｈ、３８５Ｉ、３８５Ｋ、３８５Ｌ、３８５Ｍ、３８５Ｎ、３８５Ｐ、３８５Ｑ、３８５Ｓ、３８５Ｔ、３８５Ｖ、３８５Ｗ、３８５Ｙ、３８６Ｅ、３８６Ｈ、３８６Ｋ、３８７＃、３８７Ａ、３８７Ｈ、３８７Ｋ、３８７Ｑ、３８９Ｅ、３８９Ｈ、４２６Ｅ、４２６Ｈ、４２６Ｌ、４２６Ｎ、４２６Ｒ、４２６Ｖ、４２６Ｙ、４２７Ｉ、４２９Ｄ、４２９Ｆ、４２９Ｋ、４２９Ｎ、４２９Ｑ、４２９Ｓ、４２９Ｔ、４２９Ｙ、４３０Ｄ、４３０Ｈ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｑ、４３０Ｙ、４３１Ｇ、４３１Ｈ、４３１Ｉ、４３１Ｐ、４３１Ｓ、４３２Ｆ、４３２Ｈ、４３２Ｎ、４３２Ｓ、４３２Ｖ、４３３Ｅ、４３３Ｎ、４３３Ｐ、４３３Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｑ、４３４Ｓ、４３５Ｎ、４３６Ｅ、４３６Ｆ、４３６Ｌ、４３６Ｖ、４３６Ｗ、４３７Ｅ、４３７Ｖ、４３８Ｈ、および４３８Ｋからなる群から選択される少なくとも１個の修飾を含む、請求項１に記載のＦｃ変異体。
【請求項３】
該Ｆｃ変異体が、２４６Ｈ、２４６Ｓ、２４７Ｄ、２４７Ｔ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｙ、２４９Ｔ、２４９Ｗ、２５１Ｄ、２５１Ｅ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｔ、２５１Ｖ、２５２Ｌ、２５３Ｌ、２５３Ｔ、２５３Ｖ、２５４Ｈ、２５４Ｌ、２５４Ｎ、２５４Ｖ、＾２５４Ｎ、２５５Ｅ、２５５Ｈ、２５５Ｋ、２５５Ｖ、２５６Ｈ、２５６Ｖ、２５７Ａ、２５７Ｃ、２５７Ｆ、２５７Ｇ、２５７Ｉ、２５７Ｌ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｑ、２５７Ｓ、２５７Ｔ、２５７Ｖ、２５７Ｗ、２５７Ｙ、２５８Ｖ、２７９Ａ、２７９Ｃ、２７９Ｆ、２７９Ｉ、２７９Ｐ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、＾２８１Ａ、＾２８１Ｄ、＾２８１Ｓ、＾２８１Ｔ、２８２Ｆ、２８２Ｉ、２８２Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｉ、２８３Ｌ、２８３Ｙ、２８４Ｐ、２８５Ｖ、２８６＃、２８６Ｌ、２８７Ｖ、２８８Ｑ、２８８Ｓ、３０５Ｔ、３０６Ｆ、３０６Ｈ、３０６Ｉ、３０６Ｎ、３０６Ｔ、３０６Ｖ、３０６Ｙ、３０７Ｖ、３０８Ｃ、３０８Ｆ、３０８Ｇ、３０８Ｌ、３０８Ｍ、３０８Ｎ、３０８Ｐ、３０８Ｑ、３０８Ｓ、３０８Ｗ、３０８Ｙ、３０９Ｆ、３０９Ｎ、３０９Ｑ、３０９Ｖ、３０９Ｙ、３１０Ｔ、３１１Ｌ、３１１Ｔ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１３Ｙ、３１５Ｇ、３１５Ｑ、３１５Ｓ、３１５Ｔ、３３９Ｐ、３４０Ｐ、３４１Ｓ、３７４Ｈ、３７４Ｓ、３７６Ｌ、３７８Ｈ、３７８Ｎ、３８０Ｔ、３８０Ｙ、３８２Ｈ、３８３Ｑ、３８４Ｅ、３８４Ｇ、３８４Ｈ、３８５Ａ、３８５Ｃ、３８５Ｆ、３８５Ｉ、３８５Ｌ、３８５Ｍ、３８５Ｎ、３８５Ｐ、３８５Ｑ、３８５Ｓ、３８５Ｔ、３８５Ｖ、３８５Ｗ、３８５Ｙ、３８６Ｅ、３８６Ｈ、３８６Ｋ、３８７＃、３８７Ａ、３８７Ｈ、３８７Ｋ、３８７Ｑ、３８９Ｈ、４２６Ｌ、４２６Ｎ、４２６Ｖ、４２６Ｙ、４２７Ｉ、４２９Ｄ、４２９Ｆ、４２９Ｋ、４２９Ｎ、４２９Ｑ、４２９Ｓ、４２９Ｔ、４２９Ｙ、４３０Ｌ、４３１Ｇ、４３１Ｉ、４３１Ｐ、４３１Ｓ、４３２Ｆ、４３２Ｈ、４３２Ｖ、４３３Ｅ、４３３Ｎ、４３３Ｐ、４３３Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｑ、４３４Ｓ、４３５Ｎ、４３６Ｆ、４３６Ｌ、４３６Ｖ、４３６Ｗ、４３７Ｅ、および４３７Ｖからなる群から選択される少なくとも１個の修飾を含む、請求項２に記載のＦｃ変異体。
【請求項４】
該Ｆｃ変異体が、２５７Ｃ、２５７Ｍ、２５７Ｌ、２５７Ｎ、２５７Ｙ、２７９Ｑ、２７９Ｙ、３０８Ｆ、および３０８Ｙからなる群から選択される少なくとも１個の置換を含む、請求項１に記載のＦｃ変異体。
【請求項５】
該Ｆｃ変異体が、Ｇ３８５ＨまたはＮ４３４Ｙを含む、請求項１に記載のＦｃ変異体。
該Ｆｃ変異体が、該親ポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも２個の修飾を含む、請求項３または４に記載のＦｃ変異体。
【請求項６】
該Ｆｃ変異体が、２４８Ｄ、２４８Ｅ、２４８Ｋ、２４９Ｈ、２４９Ｋ、２４９Ｒ、２５０Ａ、２５０Ｃ、２５０Ｄ、２５０Ｅ、２５０Ｆ、２５０Ｇ、２５０Ｈ、２５０１、２５０Ｋ、２５０Ｌ、２５０Ｍ、２５０Ｎ、２５０Ｐ、２５０Ｑ、２５０Ｒ、２５０Ｓ、２５０Ｖ、２５０Ｗ、２５０Ｙ、２５１Ｃ、２５１Ｇ、２５１Ｌ、２５１Ｑ、２５１Ｓ、２５２Ａ、２５２Ｃ、２５２Ｇ、２５２Ｎ、２５２Ｑ、２５２Ｓ、２５２Ｔ、２５２Ｖ、２５２Ｗ、２５２Ｙ、２５３Ａ、２５４Ａ、２５４Ｓ、２５５Ｃ、２５５Ｇ、２５５Ｎ、２５５Ｑ、２５５Ｒ、２５５Ｓ、２５５Ｔ、２５５Ｙ、２５６Ａ、２５６Ｄ、２５６Ｆ、２５６Ｋ、２５６Ｑ、２５６Ｒ、２５６Ｓ、２５６Ｔ、２５８Ｃ、２５８Ｄ、２５８Ｅ、２５８Ｇ、２５８Ｈ、２５８Ｋ、２５８Ｎ、２５８Ｑ、２５８Ｓ、２５８Ｔ、２５８Ｙ、２７７Ａ、２７７Ｃ、２７７Ｄ、２７７Ｅ、２７７Ｆ、２７７Ｇ、２７７Ｈ、２７７Ｉ、２７７Ｋ、２７７Ｌ、２７７Ｍ、２７７Ｎ、２７７Ｐ、２７７Ｑ、２７７Ｒ、２７７Ｓ、２７７Ｔ、２７７Ｖ、２７７Ｗ、２７７Ｙ、２７９Ｅ、２７９Ｒ、２８０Ｋ、２８０Ｒ、２８１Ｄ、２８１Ｅ、２８１Ｈ、２８１Ｋ、２８１Ｑ、２８１Ｒ、２８２Ｅ、２８２Ｋ、２８２Ｒ、２８４Ｃ、２８４Ｄ、２８４Ｅ、２８４Ｇ、２８４Ｎ、２８４Ｔ、２８５Ａ、２８５Ｃ、２８５Ｄ、２８５Ｇ、２８５Ｈ、２８５Ｎ、２８５Ｑ、２８５Ｒ、２８５Ｔ、２８５Ｙ、２８６Ｅ、２８６Ｍ、２８６Ｔ、２８７Ｃ、２８７Ｄ、２８７Ｅ、２８７Ｇ、２８７Ｈ、２８７Ｋ、２８７Ｎ、２８７Ｑ、２８８Ｄ、２８８Ｅ、２８８Ｈ、２８８Ｋ、２８８Ｒ、２８７Ｒ、２８７Ｓ、２８７Ｔ、２８８Ａ、２８８Ｃ、２８８Ｄ、２８８Ｅ、２８８Ｆ、２８８Ｇ、２８８Ｈ、２８８Ｋ、２８８Ｌ、２８８Ｍ、２８８Ｎ、２８８Ｐ、２８８Ｔ、２８８Ｖ、２８８Ｗ、２８８Ｙ、３０４Ｃ、３０５Ａ、３０５Ｃ、３０５Ｄ、３０５Ｅ、３０５Ｇ、３０５Ｋ、３０５Ｎ、３０５Ｑ、３０５Ｒ、３０５Ｓ、３０５Ｙ、３０６Ａ、３０６Ｃ、３０６Ｄ、３０６Ｅ、３０６Ｇ、３０６Ｋ、３０６Ｌ、３０６Ｍ、３０６Ｎ、３０６Ｐ、３０６Ｑ、３０６Ｒ、３０６Ｒ、３０６Ｓ、３０６Ｔ、３０６Ｖ、３０６Ｗ、３０６Ｙ、３０９Ｄ、３０９Ｅ、３０９Ｋ、３０９Ｒ、３１０Ａ、３１０Ｃ、３１０Ｄ、３１０Ｅ、３１０Ｇ、３１０Ｈ、３１１Ａ、３１１Ｋ、３１１Ｒ、３１２Ａ、３１２Ｃ、３１２Ｄ、３１２Ｇ、３１２Ｋ、３１２Ｎ、３１２Ｑ、３１２Ｒ、３１２Ｓ、３１２Ｔ、３１２Ｙ、３１３Ｄ、３１３Ｅ、３１３Ｈ、３１３Ｋ、３１３Ｒ、３１４Ａ、３１４Ｃ、３１４Ｄ、３１４Ｅ、３１４Ｆ、３１４Ｇ、３１４Ｈ、３１４Ｉ、３１４Ｌ、３１４Ｍ、３１４Ｎ、３１４Ｐ、３１４Ｑ、３１４Ｒ、３１４Ｓ、３１４Ｔ、３１４Ｖ、３１４Ｗ、３１４Ｙ、３１５Ｄ、３１５Ｋ、３１５Ｒ、３１６Ｈ、３１６Ｋ、３１６Ｒ、３１７Ａ、３１７Ｃ、３１７Ｄ、３１７Ｅ、３１７Ｇ、３１７Ｋ、３１７Ｎ、３１７Ｑ、３１７Ｒ、３１７Ｔ、３１７Ｙ、３４０Ｄ、３４０Ｅ、３４０Ｈ、３４０Ｋ、３４０Ｒ、３４３Ｃ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｙ、３４４Ｌ、３４５Ｃ、３４５Ｄ、３４５Ｅ、３４５Ｇ、３４５Ｈ、３４５Ｋ、３４５Ｎ、３４５Ｑ、３４５Ｒ、３４５Ｓ、３４５Ｔ、３４５Ｙ、３６０Ａ、３６２Ａ、３７６Ｃ、３７６Ｄ、３７６Ｅ、３７６Ｇ、３７６Ｋ、３７６Ｎ、３７６Ｑ、３７６Ｒ、３７６Ｓ、３７６Ｔ、３７６Ｙ、３７８Ｓ、３８０Ａ、３８２Ａ、３８３Ｄ、３８３Ｅ、３８３Ｒ、３８６Ｐ、３８６Ｔ、３８７Ｐ、３８７Ｒ、３８９Ｄ、３８９Ｎ、３８９Ｐ、３８９Ｓ、４１５Ａ、４２４Ａ、４２４Ｄ、４２４Ｅ、４２４Ｈ、４２４Ｋ、４２４Ｒ、４２６Ｄ、４２６Ｋ、４２８Ａ、４２８Ｃ、４２８Ｄ、４２８Ｅ、４２８Ｆ、４２８Ｇ、４２８Ｈ、４２８Ｉ、４２８Ｋ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４２８Ｎ、４２８Ｐ、４２８Ｑ、４２８Ｒ、４２８Ｓ、４２８Ｔ、４２８Ｖ、４２８Ｗ、４２８Ｙ、４３０Ｃ、４３０Ｅ、４３０Ｇ、４３０Ｎ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３１Ｄ、４３１Ｅ、４３１Ｋ、４３１Ｒ、４３２Ｃ、４３２Ｇ、４３２Ｑ、４３２Ｔ、４３２Ｙ、４３３Ａ、４３３Ｋ、４３４Ａ、４３４Ｆ、４３４Ｋ、４３４Ｌ、４３４Ｒ、４３５Ａ、４３６Ａ、４３６Ｄ、４３６Ｒ、４３６Ｔ、４３６Ｙ、４３８Ｄ、４３８Ｅ、および４３８Ｒからなる群から選択される少なくとも１個の置換をさらに含む、請求項３または４に記載のＦｃ変異体。
【請求項７】
親ポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個の修飾を含む該親ポリペプチドのＦｃ変異体であって、該変異タンパク質は、該親ポリペプチドと比較してＦｃＲｎとの変化した結合を示し、該少なくとも１個の修飾は、挿入または欠失を含む、Ｆｃ変異体。
【請求項８】
該修飾がＦｃＲｎとの増加した結合を示す、請求項７に記載のＦｃ変異体。
【請求項９】
該修飾が挿入である、請求項７に記載のＦｃ変異体。
【請求項１０】
該挿入がループ中に位置する、請求項９に記載のＦｃ変異体。
【請求項１１】
該挿入が、２５４または２８１位の後ろに位置する、請求項９に記載のＦｃ変異体。
【請求項１２】
該挿入が＾２８１Ｓである、請求項１１に記載のＦｃ変異体。
【請求項１３】
該修飾が欠失である（ただし、イソ型ＩｇＧ１のＧ２３６位での欠失はない。）、請求項７に記載のＦｃ変異体。
【請求項１４】
少なくとも１個の該欠失がループ内に生じる、請求項１３に記載のＦｃ変異体。
【請求項１５】
少なくとも１個の該欠失が２８６位または３８７位である、請求項１４に記載のＦｃ変異体。
【請求項１６】
親ポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個の修飾を含む該親ポリペプチドのＦｃ変異体であって、該変異タンパク質は、該親ポリペプチドと比較してＦｃＲｎおよびＦｃγＲとの変化した結合を示す、Ｆｃ変異体。
【請求項１７】
該Ｆｃ変異体が、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも２個のアミノ酸修飾を含む、請求項１６に記載のＦｃ変異体。
【請求項１８】
該Ｆｃ変異体が、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも３個のアミノ酸修飾を含む、請求項１６に記載のＦｃ変異体。
【請求項１９】
該Ｆｃ変異体が、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも４個のアミノ酸修飾を含む、請求項１６に記載のＦｃ変異体。
【請求項２０】
該Ｆｃ変異体が、該親ポリペプチドと比較してＦｃＲｎとの増加した結合を示す、請求項１６に記載のＦｃ変異体。
【請求項２１】
該Ｆｃ変異体が、該親ポリペプチドと比較してＦｃＲｎとの減少した結合を示す、請求項１６に記載のＦｃ変異体。
【請求項２２】
該Ｆｃ変異体が、該親ポリペプチドと比較してＦｃγＲとの増加した結合を示す、請求項１６に記載のＦｃ変異体。
【請求項２３】
該Ｆｃ変異体が、ＦｃγＲおよびＦｃＲｎとの増加した結合を示す、請求項１６に記載のＦｃ変異体。
【請求項２４】
該Ｆｃ変異体が、ＦｃγＲおよびＦｃＲｎとの減少した結合を示す、請求項１６に記載のＦｃ変異体。
【請求項２５】
該Ｆｃ変異体が、ＦｃγＲとの減少した結合、およびＦｃＲｎとの増加した結合を示す、請求項１６に記載のＦｃ変異体。
【請求項２６】
該Ｆｃ変異体が、ＦｃγＲとの増加した結合、およびＦｃＲｎとの減少した結合を示す、請求項１６に記載のＦｃ変異体。
【請求項２７】
親ポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む該親ポリペプチドのＦｃ変異体であって、該Ｆｃ変異体は、該親ポリペプチドと比較してＦｃＲｎとの変化した結合を示し、該Ｆｃ変異体は、サイトカイン、可溶性タンパク質因子および癌細胞で発現されるタンパク質からなる群から選択される標的分子に特異性を有するポリペプチドの範囲内に包含される、Ｆｃ変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００４年１１月１２日に出願したＵＳＳＮ６０／６２７，７６３；２００５年１月１１日に出願したＵＳＳＮ６０／６４２，８８６；２００５年２月２日に出願したＵＳＳＮ６０／６４９，５０８；２００５年３月１５日に出願したＵＳＳＮ６０／６６２，４６８；２００５年４月６日に出願したＵＳＳＮ６０／６６９，３１１；２００５年５月１６日に出願したＵＳＳＮ６０／６８１，６０７；２００５年６月１３日に出願したＵＳＳＮ６０／６９０，２００；２００５年７月５日に出願したＵＳＳＮ６０／６９６，６０９；２００５年７月２７日に出願したＵＳＳＮ６０／７０３，０１８；および、２００５年８月１２日に出願したＵＳＳＮ６０／７２６，４５３（全て、参照により本明細書中に包含される。）に対し米国特許法１１９条(e)項の利益を請求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、最適化ＩｇＧ免疫グロブリン変異体、それらの作製のための製造方法、および特に治療目的でのそれらの適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗体は、特定の抗原に結合する免疫学的タンパク質である。ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物において、抗体は、一対の重鎖および軽鎖ポリペプチド鎖から構成させる。各鎖は、個々の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインから成り、故に、一般名である免疫グロブリンが、そのようなタンパク質に用いられる。各鎖は、可変領域（Ｖ領域）および定常領域と称される２個の異なる領域から成る。軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）は、抗体間の著しい配列多様性を示し、標的抗原の結合に関与する。定常領域は、配列多様性をあまり示さず、多くの天然タンパク質の結合に関与して重要な生化学的事象を引き起こす。ヒトでは、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブクラスを含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスを含む）、およびＩｇＭを含む５種の異なるクラスの抗体がある。これらの抗体クラス間の顕著な特徴は、その定常領域であるが、わずかな相違がＶ領域に存在し得る。免疫グロブリンの一般的な構造的特徴を記載する例として本明細書中に用いる図１は、ＩｇＧ１抗体を示す。ＩｇＧ抗体は、２個の重鎖および２個の軽鎖からなる四量体タンパク質である。ＩｇＧ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（それぞれ、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン１、重鎖定常ドメイン２、および重鎖定常ドメイン３を示す。）（また、ＶＨ−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３（それぞれ、重鎖可変ドメイン、定常ガンマ１ドメイン、定常ガンマ２ドメイン、および定常ガンマ３ドメインを示す。）とも称される。）の順で連結する４個の免疫グロブリンドメインからなる。ＩｇＧ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までＶＬ−ＣＬ（それぞれ、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを示す。）の順で連結した２個の免疫グロブリンドメインからなる。
【０００４】
抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定基を含み、故に、その標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。可変領域は、同じクラス内の他の抗体と配列が最も異なるため、そのように称される。大部分の配列多様性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）中に生じる。重鎖および軽鎖あたりそれぞれ３個の、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３で示される、計６個のＣＤＲがある。可変領域のうちＣＤＲ以外は、フレームワーク（ＦＲ）領域と称される。ＣＤＲほど多様ではないが、配列多様性が、異なる抗体間のＦＲ領域中に生じる。概して、抗体のこの特徴的構造は、実質的な抗原結合の多様性（ＣＤＲ）が免疫系により探査され、広範囲の抗原に対する特異性を得ることを可能にする、安定な骨格（ＦＲ領域）を提供する。多くの高分解能構造が、異なる生物由来の多様な可変領域断片（いくつかは抗原と非結合、およびいくつかは抗原との複合体）に利用可能である。抗体可変領域の配列および構造的特徴は、よく特徴付けられており（Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9−16；Morea et al., 2000, Methods 20:267−279、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、抗体の保存的特徴は、多くの抗体作製技術の開発を可能にしている（Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339−376、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。例えば、ある抗体、例えばマウス抗体由来のＣＤＲを、他の抗体、例えばヒト抗体のフレームワーク領域に移植することが可能である。この方法は、当技術分野で“ヒト化”と称され、非ヒト抗体由来の免疫原性の低い抗体治療剤の作製を可能とする。可変領域を含む断片は、抗体の他の領域を欠失して存在することができ、例えばＶＨ−Ｃγ１およびＶＨ−ＣＬを含む抗原結合断片（Ｆａｂ）、ＶＨおよびＶＬを含む可変断片（Ｆｖ）、同じ鎖中で共に連結するＶＨおよびＶＬを含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ならびに多様な他の可変領域断片が含まれる（Little et al., 2000, Immunol Today 21:364−370、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０００５】
抗体のＦｃ領域は、エフェクター機能と称される一連の重要な機能を与える、多くのＦｃ受容体およびリガンドと相互作用する。ＩｇＧに関して、図１および２に示す通り、Ｆｃ領域は、ＩｇドメインＣγ２およびＣγ３、およびＣγ２につながるＮ末端ヒンジを含む。ＩｇＧクラスに関して重要なＦｃ受容体ファミリーは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と細胞性免疫応答とのコミュニケーションを仲介する（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181−220；Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275−290、両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ヒトにおいて、このタンパク質ファミリーには、イソ型ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；イソ型ＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびに、イソ型ＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が含まれる（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。これらの受容体は典型的に、Ｆｃとの結合を仲介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内のいくつかのシグナル伝達事象を仲介し得る細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγγＴ細胞を含む、様々な免疫細胞において発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、これらのエフェクター細胞を抗原結合部位に捕捉し、典型的に、炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性攻撃のような細胞内のシグナル伝達事象ならびにその後の重要な免疫応答をもたらす。細胞傷害性および食作用エフェクター機能を仲介する能力は、抗体が標的細胞を破壊することによる可能性のある機序である。
【０００６】
ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞への抗体の結合を認識し、次いで標的細胞の溶解をもたらす細胞により仲介される反応は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と称される（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181−220；Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739−766；Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275−290、全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞への抗体の結合を認識し、次いで標的細胞の食作用をもたらす細胞により仲介される反応は、抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）と称される。ＦｃγＲＩＩａ（ｐｄｂ受託コード１Ｈ９Ｖ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737−749、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（ｐｄｂ受託コード１ＦＣＧ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Maxwell et al., 1999, Nat Struct Biol 6:437−442、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、ＦｃγＲＩＩｂ（ｐｄｂ受託コード２ＦＣＢ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Sondermann et al., 1999, Embo J 18:1095−1103、参照によりその全体が本明細書中に包含される）；およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｊ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Sondermann et al., 2000, Nature 406:267−273、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を含むヒトＦｃγＲの細胞外ドメインの多くの構造が、解明されている。全てのＦｃγＲは、図１に示す通り、Ｃγ２ドメインおよび前記ヒンジのＮ末端でＦｃ上の同じ領域に結合する。この相互作用は、構造的によく特徴付けられており（Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737−749、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインに結合するヒトＦｃのいくつかの構造は、解明されており（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｋ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Sondermann et al., 2000, Nature 406:267−273、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（ｐｄｂ受託コード１ＩＩＳおよび１ＩＩＸ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469−16477、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、ならびにヒトＩｇＥ Ｆｃ／ＦｃεＲＩα複合体の構造を有する（ｐｄｂ受託コード１Ｆ６Ａ、参照によりその全体が本明細書中に包含される）（Garman et al., 2000, Nature 406:259−266、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０００７】
異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は典型的に、受容体に対してＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に結合する（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。全てのＦｃγＲは、異なる親和性を有するがＩｇＧ Ｆｃの同じ領域に結合する：高親和性結合体であるＦｃγＲＩは、ＩｇＧ１についてＫｄ １０−８Ｍ−１を有するが、一方、低親和性受容体であるＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、一般的に、それぞれ１０−６および１０−５で結合する。ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインは、９６％の同一性を有する；しかしながら、ＦｃγＲＩＩＩｂは、細胞内シグナル伝達ドメインを有さない。さらに、免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することにより特徴付けられるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａは、免疫複合体により誘発される活性化の正の調節因子であるが、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシン依存性阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、故に阻害される。故に、前者は、活性化受容体と称され、ＦｃγＲＩＩｂは、阻害受容体と称される。前記受容体はまた、様々な免疫細胞で発現パターンおよびレベルが異なる。さらに別の複雑度は、ヒトプロテオームにおける多くのＦｃγＲ多型の存在である。臨床的な重要性を有する特に関連する多型は、Ｖ１５８／Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａである。ヒトＩｇＧ１は、Ｆ１５８アロタイプよりもＶ１５８アロタイプにより強い親和性で結合する。この親和性の相違、およびＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰに対する推定されるその効果が、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（リツキサン（登録商標）、BiogenIdec）の効果の重要な決定因子であることが明らかにされている。Ｖ１５８アロタイプを有する患者は、リツキシマブ処置に好ましく応答する；しかしながら、低い親和性のＦ１５８アロタイプを有する患者は、ほとんど応答しない（Cartron et al., 2002, Blood 99:754−758、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ヒトの約１０−２０％が、Ｖ１５８／Ｖ１５８ホモ接合型であり、４５％が、Ｖ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合型であり、そして３５−４５％が、Ｆ１５８／Ｆ１５８ホモ接合型である（Lehrnbecher et al., 1999, Blood 94:4220−4232；Cartron et al., 2002, Blood 99:754−758、全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。故に、ヒトの８０−９０％が、ほとんど応答せず、すなわち、彼らは、Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａの少なくとも１個のアレルを有する。
【０００８】
図１に示す通り、Ｆｃの重複するが分離した部位は、補体タンパク質Ｃ１ｑのための接合部位として機能する。Ｆｃ／ＦｃγＲ結合がＡＤＣＣを仲介するのと同様に、Ｆｃ／Ｃ１ｑ結合は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を仲介する。Ｃ１ｑは、セリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓと複合体を形成し、Ｃ１複合体を形成する。Ｃ１ｑは、６個の抗体を結合し得るが、２個のＩｇＧとの結合が、補体カスケードを活性化するのに十分である。ＦｃのＦｃγＲとの相互作用と同様に、様々なＩｇＧサブクラスは、Ｃ１ｑに対して異なる親和性を有し、典型的に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ＦｃγＲに対してＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に結合する（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０００９】
ＩｇＧにおいて、Ｃｇ２ドメインとＣｇ３ドメインの間のＦｃ上の部位（図１）は、胎児性受容体（neonatal receptor：ＦｃＲｎ）との相互作用を仲介し、その結合は、エンドソームからエンドシトーシスされた抗体を血流に戻して再利用する（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181−220；Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739−766、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。この過程は、大きなサイズの全長分子であるため腎臓ろ過による除去と一緒になって、結果として、１から３週間までの範囲である好ましい抗体の血清半減期となる。ＦｃのＦｃＲｎとの結合はまた、抗体輸送において重要な役割を果たす。ＦｃＲｎのためのＦｃ上の結合部位は、細菌タンパク質ＡおよびＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質による強い結合は、典型的に、タンパク質精製中に、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを用いることにより抗体を精製するための手段として用いられる。故に、Ｆｃ上のこの領域の適合度は、抗体の臨床的特徴およびそれらの精製の両方に重要である。ラットＦｃ／ＦｃＲｎ複合体（Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379−383；Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867−877、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）、およびＦｃとタンパク質ＡおよびＧの複合体（Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20:2361−2370；Sauer−Eriksson et al., 1995, Structure 3:265−278；Tashiro et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471−481、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）の利用可能な構造は、Ｆｃとこれらのタンパク質の相互作用に関する理解を提供する。ＦｃＲｎ受容体はまた、ＩｇＧの、胎児腸へのおよび大人の腸上皮内腔への輸送に関与する（Ghetie and Ward, Annu. Rev. Immunol., 2000, 18:739−766；Yoshida et al., Immunity, 2004, 20(6):769−783、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【００１０】
ラットおよびヒトＦｃγドメインの研究は、ＦｃＲｎの結合のためのいくつかのＦｃ残基の重要性を証明している。ラットおよびヒト配列は、Ｆｃ領域中、約６４％の配列同一性を有する（Kabatらの番号付けで、残基２３７−４４３）。Ｆｃ、ＦｃＲｎ重鎖、およびＦｃＲｎ軽鎖（ベータ−２−ミクログロブリン）のラット／ヒト配列に関しては、図３、４、および５を参照のこと。ヒトＦｃ／ＦｃＲｎ複合体モデルは、ラットＦｃ／ＦｃＲｎ複合体の既存構造から構築されている（Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867−877、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ラットおよびヒト配列は、Ｈ３１０およびＨ４３５のようなＦｃＲｎ結合に重要ないくつかの残基を共有する（Medesan et al., 1997 J. Immunol. 158(5):221−7；Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(9):6591−6604、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。しかしながら、多くの位置において、ヒトおよびラットタンパク質は異なるアミノ酸を有し、ヒト配列中に、ラット配列と異なる環境および可能ならば異なる同一性の残基を供する。この多様性は、ある相同体から他の相同体に特徴を伝達する能力を制限する。
【００１１】
マウスＦｃγにおいて、Ｔ２５２、Ｔ２５４、およびＴ２５６位でのランダム変異およびファージ提示選択は、三重変異体であるＴ２５２Ｌ／Ｔ２５４Ｓ／Ｔ２５６Ｆをもたらし、それは、ＦｃＲｎ親和性の３．５倍増加、および血清半減期の１．５倍増加を有する（Ghetie et al., 1997, Nat. Biotech. 15(7): 637−640、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【００１２】
ラットＦｃ／ＦｃＲｎ複合体の結晶構造は、ＦｃＲｎ結合のための重要なＦｃ残基を同定した（Burmeister et al. Nature. 372:379−383（1994)；Martin et al. Molecular Cell. 7:867−877（2001)、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。最初のＦｃ／ＦｃＲｎ複合体構造は、６Åの解像度で１９９４年に解明された（表２ａ、Burmeister et al. Nature. 372:379−383（1994)、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。より高い解像度の構造が、Marinらにより２００１年に解明され、より詳細な側鎖の位置が示された（Martin et al. Molecular Cell. 7:867−877（2001)、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ラットＦｃＲｎに結合したラットＦｃのこの結晶構造は、変異Ｔ２５２Ｇ／Ｉ２５３Ｇ／Ｔ２５４Ｇ／Ｈ３１０Ｅ／Ｈ４３３Ｅ／Ｈ４３５Ｅ（それらは、ＦｃＲｎ結合を破壊する）を含む１個の単量体、および野生型Ｆｃ単量体を含む１個の単量体を有するＦｃ二量体を用いて解明された。
【００１３】
ヒトＦｃγにおける変異研究は、ＦｃＲｎへの結合に重要な残基のいくつかで起こり、増加した血清半減期を証明している。ヒトＦｃγ１において、Hintonらは、３個の残基を、他の１９個の共通アミノ酸に個々に変異させた。Hintonらは、いくつかの点変異の二重変異が、ＦｃＲｎ結合親和性を増加したことを発見した（Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213−6216、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。２個の変異は、サルにおいて増加した半減期を有した。Shieldsらは、Ａｌａを除くほとんどの残基を変異させ、ＦｃＲｎおよびＦｃγＲの結合について研究した（Shields et al., 2001, J. Biol. Chem., 276(9):6591−6604、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【００１４】
Dall’Acquaらは、増加した親和性でＦｃＲｎを結合するＦｃ変異体を選択するためにファージ提示法を用いた（Dall’ Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171−5180、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。選択されるＤＮＡ配列は、主に二重および三重変異であった。文献は、それらの選択された配列の多くによりコードされるタンパク質を示し、野生型Ｆｃよりも強くＦｃＲｎに結合するものをいくつか発見した。
【００１５】
治療剤としての抗体およびＦｃ融合タンパク質の投与は、そのタンパク質の排除および半減期の特徴に関係して所定の頻度での注射を必要とする。より長時間のインビボ半減期は、より注射頻度を少なくするか、またはより少ない用量を可能にし、それは、明らかに有利である。Ｆｃドメイン中の先の変異は、増加したＦｃＲｎ結合親和性およびインビボ半減期を有するいくつかのタンパク質をもたらすが、これらの変異は、最適変異および増大したインビボ半減期を同定していない。
【００１６】
Ｆｃ領域の１つの特徴は、図１に示す通り、Ｎ２９７に起こる保存されたＮ結合グリコシル化である。よく記載される通り、この炭水化物またはオリゴ糖は、抗体のために重要な構造的かつ機能的役割を果たし、抗体を哺乳動物発現系を用いて製造しなければならない原理的理由の１つである（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176−180；Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288−294；Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539−45547.；Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478−16483；Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591−6604；Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733−26740；Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133−147；Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469−16477；および、Krapp et al., 2003, J Mol Biol 325:979−989、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【００１７】
抗体は、治療的使用のために開発された。かかる治療剤に関係する代表的文献には、Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52−60；Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195−200, Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541−547；Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403−410, McLaughlin et al., 1998, J Clin Oncol 16:2825−2833, and Cobleigh et al., 1999, J Clin Oncol 17:2639−2648（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）が包含される。現在、抗癌治療に関して、死亡率におけるどんな小さな改良も成功を示す。本明細書に記載の任意のＩｇＧ変異体は、さらなる増殖を制限するために抗体の能力を増強するか、または少なくとも部分的に、標的癌細胞を破壊する。
【００１８】
抗体の抗腫瘍効果は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣのような、細胞傷害性エフェクター機能を仲介するそれらの能力を増強することによる。例えば、Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95:652−656；Clynes et al., 2000, Nat Med 6:443−446 and Cartron et al., 2002, Blood 99:754−758（両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）が包含される。
【００１９】
ヒトＩｇＧ１は、治療目的のために最も一般的に使用される抗体であり、工学的研究の大部分は、本明細書中にて構成された。しかしながら、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むＩｇＧクラスの様々なイソ型が、独特の物理的、生物学的、および臨床的特徴を有する。当技術分野において、改良されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４変異体を設計する必要がある。ＦｃＲｎへの結合および／または天然ＩｇＧポリペプチドと比較して増加したインビボ半減期を改善するために、かかる変異体を設計する必要がさらにある。本発明は、これらおよび他の必要性を満たす。
【発明の開示】
【００２０】
発明の概要
本発明は、ＦｃＲｎ受容体との増加した結合およびインビボでのより長時間の血清保持を有する、抗体、Ｆｃ融合体、および免疫接着において発見されたものを含むＦｃドメインの新規変異体の作製を開示する。本発明のさらなる局面は、特に、より低いｐＨ、約ｐＨ６．０での野生型以上のＦｃＲｎ結合の増加であり、エンドソーム中でのＦｃ／ＦｃＲｎ結合を容易にすることである。本発明のさらなる局面は、約ｐＨ７．４での設計した変異体の結合と比較した、約ｐＨ６でのそれらの優先的結合であり、細胞の再利用後の血液へのＦｃの再放出を容易にすることである。
【００２１】
本発明のさらなる局面は、ＦｃＲｎへの減少した結合および減少したインビボ半減期を有するＦｃ変異体の設計に関する。ＦｃＲｎ親和性および／またはインビボ半減期を減少する変異を含むかかるタンパク質は、放射線治療薬の送達およびモニタリングを含む多くの治療法および診断法において有用である（ここで、放射標識の理想的半減期は、そのタンパク質複合体のインビボ半減期とほぼ等しい。）。
【００２２】
本発明のさらなる局面は、Ｆｃドメインと、ＦｃＲ、例えば、ヒトのＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂ、ＦｃｇＲＩＩＩａとの結合の改変に関係する。これらの受容体は、抗体の様々なエフェクター機能の誘導に関与する。それ故に、本発明のさらなる局面は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）のようなＦｃドメインエフェクター機能の改変に関係する。
【００２３】
本発明のさらなる局面は、Ｆｃ含有タンパク質のインビボ半減期およびエフェクター機能の両方に影響を与える変化したＦｃＲｎ結合および変化したＦｃｇ結合の両方を含むＦｃ変異体に関する。例えば、これらの変異体は、増加したインビボ半減期、ならびに改善したＡＤＣＣを有し得る。該変異体は、例えば増加した半減期および減少したＣＤＣを有し得る。
【００２４】
さらなる局面において、本発明は、変異Ｆｃタンパク質をコードする組換え核酸、発現ベクター、および宿主細胞を提供する。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、変異Ｆｃ含有タンパク質を作製する方法であって、本発明の宿主細胞を、該タンパク質を発現するのに適する条件下で培養することを含む方法を提供する。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、本発明の変異Ｆｃタンパク質および医薬的担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
さらなる局面において、本発明は、本発明の変異Ｆｃ含有タンパク質を患者に投与することを含む、疾患を処置するための方法を提供する。
【００２８】
さらなる局面において、本発明は、親ポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも１個の修飾を含む該親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異領域を提供し、ここで、該変異タンパク質は、親ポリペプチドと比較してＦｃＲｎとの変化した結合を示し、該Ｆｃ変異体は、２４６Ｈ、２４６Ｓ、２４７Ｄ、２４７Ｔ、２４８Ｈ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｒ、２４８Ｙ、２４９Ｔ、２４９Ｗ、２５１Ｄ、２５１Ｅ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｋ、２５１Ｍ、２５１Ｎ、２５１Ｔ、２５１Ｖ、２５１Ｙ、２５２Ｆ、２５２Ｌ、２５３Ｌ、２５３Ｔ、２５３Ｖ、２５４Ｈ、２５４Ｌ、２５４Ｎ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、＾２５４Ｎ、２５５Ｅ、２５５Ｆ、２５５Ｈ、２５５Ｋ、２５５Ｓ、２５５Ｖ、２５６Ｅ、２５６Ｈ、２５６Ｖ、２５７Ａ、２５７Ｃ、２５７Ｄ、２５７Ｅ、２５７Ｆ、２５７Ｇ、２５７Ｈ、２５７Ｉ、２５７Ｋ、２５７Ｌ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｑ、２５７Ｒ、２５７Ｓ、２５７Ｔ、２５７Ｖ、２５７Ｗ、２５７Ｙ、２５８Ｒ、２５８Ｖ、２７９Ａ、２７９Ｃ、２７９Ｄ、２７９Ｆ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｌ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｐ、２７９Ｑ、２７９Ｒ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８０Ｅ、２８０Ｈ、＾２８１Ａ、＾２８１Ｄ、＾２８１Ｓ、＾２８１Ｔ、２８２Ｄ、２８２Ｆ、２８２Ｈ、２８２Ｉ、２８２Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｉ、２８３Ｌ、２８３Ｙ、２８４Ｈ、２８４Ｋ、２８４Ｐ、２８４Ｑ、２８４Ｒ、２８４Ｓ、２８４Ｙ、２８５Ｓ、２８５Ｖ、２８６＃、２８６Ｌ、２８７Ｈ、２８７Ｓ、２８７Ｖ、２８７Ｙ、２８８Ｈ、２８８Ｑ、２８８Ｒ、２８８Ｓ、３０５Ｈ、３０５Ｔ、３０６Ｆ、３０６Ｈ、３０６Ｉ、３０６Ｎ、３０６Ｔ、３０６Ｖ、３０６Ｙ、３０７Ｄ、３０７Ｖ、３０７Ｙ、３０８Ａ、３０８Ｃ、３０８Ｄ、３０８Ｅ、３０８Ｆ、３０８Ｇ、３０８Ｈ、３０８Ｉ、３０８Ｋ、３０８Ｌ、３０８Ｍ、３０８Ｎ、３０８Ｐ、３０８Ｑ、３０８Ｒ、３０８Ｓ、３０８Ｔ、３０８Ｗ、３０８Ｙ、３０９Ｆ、３０９Ｈ、３０９Ｉ、３０９Ｎ、３０９Ｐ、３０９Ｑ、３０９Ｖ、３０９Ｙ、３１０Ｋ、３１０Ｎ、３１０Ｔ、３１１Ｈ、３１１Ｌ、３１１Ｓ、３１１Ｔ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１２Ｈ、３１３Ｙ、３１５Ｅ、３１５Ｇ、３１５Ｈ、３１５Ｑ、３１５Ｓ、３１５Ｔ、３１７Ｈ、３１７Ｓ、３３９Ｐ、３４０Ｐ、３４１Ｓ、３７４Ｈ、３７４Ｓ、３７６Ｈ、３７６Ｌ、３７８Ｈ、３７８Ｎ、３８０Ｔ、３８０Ｙ、３８２Ｈ、３８３Ｈ、３８３Ｋ、３８３Ｑ、３８４Ｅ、３８４Ｇ、３８４Ｈ、３８５Ａ、３８５Ｃ、３８５Ｄ、３８５Ｅ、３８５Ｆ、３８５Ｈ、３８５Ｉ、３８５Ｋ、３８５Ｌ、３８５Ｍ、３８５Ｎ、３８５Ｐ、３８５Ｑ、３８５Ｒ、３８５Ｓ、３８５Ｔ、３８５Ｖ、３８５Ｗ、３８５Ｙ、３８６Ｅ、３８６Ｈ、３８６Ｋ、３８７＃、３８７Ａ、３８７Ｈ、３８７Ｋ、３８７Ｑ、３８９Ｅ、３８９Ｈ、４２６Ｅ、４２６Ｈ、４２６Ｌ、４２６Ｎ、４２６Ｒ、４２６Ｖ、４２６Ｙ、４２７Ｉ、４２９Ｄ、４２９Ｆ、４２９Ｋ、４２９Ｎ、４２９Ｑ、４２９Ｓ、４２９Ｔ、４２９Ｙ、４３０Ｄ、４３０Ｈ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｑ、４３０Ｙ、４３１Ｇ、４３１Ｈ、４３１Ｉ、４３１Ｐ、４３１Ｓ、４３２Ｆ、４３２Ｈ、４３２Ｎ、４３２Ｓ、４３２Ｖ、４３３Ｅ、４３３Ｎ、４３３Ｐ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｑ、４３４Ｓ、４３４Ｙ、４３５Ｎ、４３６Ｅ、４３６Ｆ、４３６Ｈ、４３６Ｌ、４３６Ｑ、４３６Ｖ、４３６Ｗ、４３７Ｅ、４３７Ｖ、４３８Ｅ、４３８Ｈおよび４３８Ｋ（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従い、＾は、表示の位置の後ろの挿入であり、そして＃は、その表示の位置の欠失である。）からなる群から選択される少なくとも１個の修飾を含む。
【００２９】
さらなる局面において、本発明は、２４６Ｈ、２４６Ｓ、２４７Ｄ、２４７Ｔ、２４８Ｈ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｒ、２４８Ｙ、２４９Ｔ、２４９Ｗ、２５１Ｄ、２５１Ｅ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｋ、２５１Ｍ、２５１Ｎ、２５１Ｔ、２５１Ｖ、２５１Ｙ、２５２Ｌ、２５３Ｌ、２５３Ｔ、２５３Ｖ、２５４Ｈ、２５４Ｌ、２５４Ｎ、２５４Ｖ、＾２５４Ｎ、２５５Ｅ、２５５Ｆ、２５５Ｈ、２５５Ｋ、２５５Ｓ、２５５Ｖ、２５６Ｈ、２５６Ｖ、２５７Ａ、２５７Ｃ、２５７Ｄ、２５７Ｅ、２５７Ｆ、２５７Ｇ、２５７Ｈ、２５７Ｉ、２５７Ｋ、２５７Ｌ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｑ、２５７Ｒ、２５７Ｓ、２５７Ｔ、２５７Ｖ、２５７Ｗ、２５７Ｙ、２５８Ｒ、２５８Ｖ、２７９Ａ、２７９Ｃ、２７９Ｄ、２７９Ｆ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｐ、２７９Ｑ、２７９Ｒ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８０Ｈ、＾２８１Ａ、＾２８１Ｄ、＾２８１Ｓ、＾２８１Ｔ、２８２Ｄ、２８２Ｆ、２８２Ｈ、２８２Ｉ、２８２Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｉ、２８３Ｌ、２８３Ｙ、２８４Ｈ、２８４Ｋ、２８４Ｐ、２８４Ｑ、２８４Ｒ、２８４Ｓ、２８４Ｙ、２８５Ｓ、２８５Ｖ、２８６＃、２８６Ｌ、２８７Ｈ、２８７Ｓ、２８７Ｖ、２８７Ｙ、２８８Ｈ、２８８Ｑ、２８８Ｓ、３０５Ｈ、３０５Ｔ、３０６Ｆ、３０６Ｈ、３０６Ｉ、３０６Ｎ、３０６Ｔ、３０６Ｖ、３０６Ｙ、３０７Ｄ、３０７Ｖ、３０７Ｙ、３０８Ｃ、３０８Ｅ、３０８Ｆ、３０８Ｇ、３０８Ｈ、３０８Ｉ、３０８Ｋ、３０８Ｌ、３０８Ｍ、３０８Ｎ、３０８Ｐ、３０８Ｑ、３０８Ｒ、３０８Ｓ、３０８Ｗ、３０８Ｙ、３０９Ｆ、３０９Ｈ、３０９Ｎ、３０９Ｑ、３０９Ｖ、３０９Ｙ、３１０Ｋ、３１０Ｎ、３１０Ｔ、３１１Ｌ、３１１Ｔ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１２Ｈ、３１３Ｙ、３１５Ｅ、３１５Ｇ、３１５Ｈ、３１５Ｑ、３１５Ｓ、３１５Ｔ、３１７Ｈ、３１７Ｓ、３３９Ｐ、３４０Ｐ、３４１Ｓ、３７４Ｈ、３７４Ｓ、３７６Ｈ、３７６Ｌ、３７８Ｈ、３７８Ｎ、３８０Ｔ、３８０Ｙ、３８２Ｈ、３８３Ｈ、３８３Ｋ、３８３Ｑ、３８４Ｅ、３８４Ｇ、３８４Ｈ、３８５Ａ、３８５Ｃ、３８５Ｆ、３８５Ｈ、３８５Ｉ、３８５Ｋ、３８５Ｌ、３８５Ｍ、３８５Ｎ、３８５Ｐ、３８５Ｑ、３８５Ｓ、３８５Ｔ、３８５Ｖ、３８５Ｗ、３８５Ｙ、３８６Ｅ、３８６Ｈ、３８６Ｋ、３８７＃、３８７Ａ、３８７Ｈ、３８７Ｋ、３８７Ｑ、３８９Ｅ、３８９Ｈ、４２６Ｅ、４２６Ｈ、４２６Ｌ、４２６Ｎ、４２６Ｒ、４２６Ｖ、４２６Ｙ、４２７Ｉ、４２９Ｄ、４２９Ｆ、４２９Ｋ、４２９Ｎ、４２９Ｑ、４２９Ｓ、４２９Ｔ、４２９Ｙ、４３０Ｄ、４３０Ｈ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｑ、４３０Ｙ、４３１Ｇ、４３１Ｈ、４３１Ｉ、４３１Ｐ、４３１Ｓ、４３２Ｆ、４３２Ｈ、４３２Ｎ、４３２Ｓ、４３２Ｖ、４３３Ｅ、４３３Ｎ、４３３Ｐ、４３３Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｑ、４３４Ｓ、４３５Ｎ、４３６Ｅ、４３６Ｆ、４３６Ｌ、４３６Ｖ、４３６Ｗ、４３７Ｅ、４３７Ｖ、４３８Ｈ、および４３８Ｋからなる群から選択される少なくとも１個の修飾を含むＦｃ変異体を提供する。
【００３０】
さらなる局面において、本発明は、２４６Ｈ、２４６Ｓ、２４７Ｄ、２４７Ｔ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｙ、２４９Ｔ、２４９Ｗ、２５１Ｄ、２５１Ｅ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｔ、２５１Ｖ、２５２Ｌ、２５３Ｌ、２５３Ｔ、２５３Ｖ、２５４Ｈ、２５４Ｌ、２５４Ｎ、２５４Ｖ、＾２５４Ｎ、２５５Ｅ、２５５Ｈ、２５５Ｋ、２５５Ｖ、２５６Ｈ、２５６Ｖ、２５７Ａ、２５７Ｃ、２５７Ｆ、２５７Ｇ、２５７Ｉ、２５７Ｌ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｑ、２５７Ｓ、２５７Ｔ、２５７Ｖ、２５７Ｗ、２５７Ｙ、２５８Ｖ、２７９Ａ、２７９Ｃ、２７９Ｆ、２７９Ｉ、２７９Ｐ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、＾２８１Ａ、＾２８１Ｄ、＾２８１Ｓ、＾２８１Ｔ、２８２Ｆ、２８２Ｉ、２８２Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｉ、２８３Ｌ、２８３Ｙ、２８４Ｐ、２８５Ｖ、２８６＃、２８６Ｌ、２８７Ｖ、２８８Ｑ、２８８Ｓ、３０５Ｔ、３０６Ｆ、３０６Ｈ、３０６Ｉ、３０６Ｎ、３０６Ｔ、３０６Ｖ、３０６Ｙ、３０７Ｖ、３０８Ｃ、３０８Ｆ、３０８Ｇ、３０８Ｌ、３０８Ｍ、３０８Ｎ、３０８Ｐ、３０８Ｑ、３０８Ｓ、３０８Ｗ、３０８Ｙ、３０９Ｆ、３０９Ｎ、３０９Ｑ、３０９Ｖ、３０９Ｙ、３１０Ｔ、３１１Ｌ、３１１Ｔ、３１１Ｖ、３１１Ｗ、３１３Ｙ、３１５Ｇ、３１５Ｑ、３１５Ｓ、３１５Ｔ、３３９Ｐ、３４０Ｐ、３４１Ｓ、３７４Ｈ、３７４Ｓ、３７６Ｌ、３７８Ｈ、３７８Ｎ、３８０Ｔ、３８０Ｙ、３８２Ｈ、３８３Ｑ、３８４Ｅ、３８４Ｇ、３８４Ｈ、３８５Ａ、３８５Ｃ、３８５Ｆ、３８５Ｉ、３８５Ｌ、３８５Ｍ、３８５Ｎ、３８５Ｐ、３８５Ｑ、３８５Ｓ、３８５Ｔ、３８５Ｖ、３８５Ｗ、３８５Ｙ、３８６Ｅ、３８６Ｈ、３８６Ｋ、３８７＃、３８７Ａ、３８７Ｈ、３８７Ｋ、３８７Ｑ、３８９Ｈ、４２６Ｌ、４２６Ｎ、４２６Ｖ、４２６Ｙ、４２７Ｉ、４２９Ｄ、４２９Ｆ、４２９Ｋ、４２９Ｎ、４２９Ｑ、４２９Ｓ、４２９Ｔ、４２９Ｙ、４３０Ｌ、４３１Ｇ、４３１Ｉ、４３１Ｐ、４３１Ｓ、４３２Ｆ、４３２Ｈ、４３２Ｖ、４３３Ｅ、４３３Ｎ、４３３Ｐ、４３３Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｑ、４３４Ｓ、４３５Ｎ、４３６Ｆ、４３６Ｌ、４３６Ｖ、４３６Ｗ、４３７Ｅ、および４３７Ｖからなる群から選択される少なくとも１個の修飾を含むＦｃ変異体を提供する。
【００３１】
図面の簡単な説明
図１。抗体の構造および機能。ｐｄｂ受託コード１ＣＥ１からのヒト化Ｆａｂ構造（James et al., 1999, J Mol Biol 289:293−301、参照によりその全体が本明細書中に包含される）およびｐｄｂ受託コード１ＤＮ２からのヒトＩｇＧ１Ｆｃ構造（DeLano et al., 2000, Science 287:1279−1283、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を用いてモデル化された、全長ヒトＩｇＧ１抗体のモデルを示す。ＦａｂおよびＦｃ領域を連結するフレキシブルヒンジは示さず。ＩｇＧ１は、２個の軽鎖および２個の重鎖からなるヘテロ二量体のホモ二量体である。軽鎖のＶＬおよびＣＬ、ならびに重鎖のＶＨ、Ｃガンマ１（Ｃγ１）、Ｃガンマ２（Ｃγ２）、およびＣガンマ３（Ｃγ３）を含む、抗体を含むＩｇドメインが標識される。Ｆｃ領域は標識される。可変領域中の抗原結合部位、ならびに領域中のＦｃγＲｓ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑおよびタンパク質ＡおよびＧの結合部位を含む、関連タンパク質の結合部位は標識される。
【００３２】
図２。Kabat et alに記載の通りＥＵ番号を付した本発明に用いるヒトＩｇＧ配列。
【００３３】
図３。Kabatに記載の通りＥＵ番号を付した本発明に用いるヒトおよびげっ歯動物ＩｇＧ配列の例。
【００３４】
図４。本発明に用いたヒトおよびげっ歯動物ＦｃＲｎ重鎖配列の例。
【００３５】
図５。本発明に用いたヒトおよびげっ歯動物ベータ−２−ミクログロブリン配列の例。
【００３６】
図６。ラット構造から作製されたヒトＦｃ／ＦｃＲｎ複合体モデル（Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379−383；Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867−877、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。いくつかのヒスチジン残基は、ＦｃＲｎ鎖（淡灰色）およびＦｃポリペプチド（濃灰色）上の空間充填（space-filling）原子で示される。
【００３７】
図７。挿入または欠失を含む変異体の設計に用いるいくつかの概念の説明図。
【００３８】
図８。本発明の変異体。
図９。本発明の変異体。
図１０。本発明の変異体。
【００３９】
図１１。Ｆｃ変異体のコンストラクトに用いられ得るベクターｐｃＤＮＡ３．１ Ｚｅｏ＋の図。
【００４０】
図１２。野生型Ｆｃおよび本発明のＦｃ変異体の競合的ＦｃＲｎ結合データ。各パネルにおいて、本発明のＦｃ変異体は、左（赤色または濃灰色）曲線で示され、野生型トラスツズマブは、右（青色または淡灰色）曲線で示される。
【００４１】
図１３。Ｆｃ変異体のＦｃＲｎ結合特性の概要。右から左の列は、ＦｃＲｎ結合の修飾、使用した免疫グロブリン、他の修飾、野生型と比較したＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ競合分析による相対的ＦｃＲｎ親和性（中央値）、実施した分析数、およびタンパク質の参照数を示す。１．０より大きい相対的ＦｃＲｎ親和性数は、野生型よりも増加した結合を証明する。
【００４２】
図１４。本発明のＦｃ変異体のＦｃＲｎ結合データ。Ｆｃ変異体は、アレムツズマブまたはトラスツズマブである。野生型と比較した結合の増加倍数を示す。
【００４３】
図１５。ＦｃＲｎとの改善した結合を有するＦｃ変異体の表面プラズモン共鳴実験の概要。棒グラフは、野生型Ｆｃドメインと比較した各変異体のＦｃＲｎ結合親和性における増加倍数を示す。
【００４４】
図１６。野生型抗体および本発明の変異体の表面プラズモン共鳴実験。示した線は、ｐＨ６．０での、ＦｃＲｎとのＦｃ変異体抗体の結合および分離である。
【００４５】
図１７。本発明のＦｃ変異体とＦｃＲｎとの結合分析。ｐＨ６．０（ａおよびｂ）およびｐＨ７．０（ｃ）での、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）により測定した直接結合分析を示す。
【００４６】
図１８。本発明のＦｃ変異体とＦｃＲｎとの結合分析。Ｆｃ変異体と表面結合ＦｃＲｎとの結合により作製される表面プラズモン共鳴単位を示す。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は、抗体、Ｆｃ融合体、および免疫接着において発見されるものを含むＦｃドメインの新規な変異体であって、ＦｃＲｎ受容体との増加した結合を有する変異体の作製を開示する。本明細書で記載の通り、ＦｃＲｎとの結合は、インビボでのより長時間の血清保持をもたらす。
【００４８】
インビボでのＦｃタンパク質の保持を増加するためには、結合親和性は、ｐＨ７．４付近での親和性の付随的増加なく、ｐＨ６付近で増加しなければならない。未だ試験中であるが、Ｆｃ領域は、エンドソーム中ｐＨ６でのＦｃＲｎとの結合がＦｃを隠すため、インビボでのより長時間の半減期を有すると考えられる（Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592−598、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。その後、エンドソーム画分は、Ｆｃを細胞表面に再生する。前記画分が細胞外空間（より高いｐＨ〜７．４）に開くと、血中に戻るＦｃの放出を促進する。Dall’ Acquaらは、ｐＨ６およびｐＨ７．４にて増加したＦｃＲｎ結合を有するＦｃ変異体が、実際に、減少した血清濃度および野生型Ｆｃと同じ程度の半減期を有したことを示した（Dall’ Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171−5180、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＦｃの増加した親和性は、血中に戻るＦｃの放出を妨げると考えられる。故に、Ｆｃのインビボでの半減期を増加させ得るＦｃ変異は、理想的には、より高いｐＨでのＦｃの放出を可能にしながら、より低いｐＨでのＦｃＲｎ結合を増加し得る。アミノ酸ヒスチジンは、ｐＨ６．０から７．４の範囲でその荷電状態が変わる。故に、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体中の重要な部位でＨｉｓ残基が発見されることは驚くことではない（図６）。
【００４９】
本発明のさらなる局面は、エンドソーム中Ｆｃ／ＦｃＲｎ結合を促進する、特により低いｐＨ、約ｐＨ６．０での、野生型に対するＦｃＲｎ結合の増加である。また、ＦｃγＲとの異なる結合として、特にＦｃγＲＩＩＩｂとの増加した結合およびＦｃγＲＩＩｂとの減少した結合が、増加した効果をもたらすことが示されている、変化したＦｃＲｎ結合および他のクラスのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との変化した結合を有するＦｃ変異体を記載する。
【００５０】
定義
本発明は、理解をより完全にし得るために、いくつかの定義を以下に記載する。かかる定義は、文法的同等物を包含することを意味する。
【００５１】
本明細書で記載の“ＡＤＣＣ”または“抗体依存性細胞介在性細胞傷害”は、標的細胞上に結合した抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解をもたらすＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞である細胞により仲介される反応を意味する。
【００５２】
本明細書で記載の“ＡＤＣＰ”または抗体依存性細胞介在性食作用は、標的細胞上に結合した抗体を認識し、次いで標的細胞の食作用を誘導するＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞である細胞により仲介される反応を意味する。
【００５３】
本明細書中、“アミノ酸修飾”は、ポリペプチド配列中の、アミノ酸置換、挿入、および／または欠失を意味する。
【００５４】
本明細書中、“アミノ酸置換”または“置換”は、親ポリペプチド配列中、特定の位置での、あるアミノ酸の他のアミノ酸との置換を意味する。例えば、Ｆｃ変異体の場合において、Ｅ２７２Ｙ置換は、２７２位のグルタミン酸をチロシンで置換される変異体ポリペプチドを意味する。
【００５５】
本明細書で用いる“アミノ酸挿入”または“挿入”は、親ポリペプチド配列中、特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、−２３３Ｅまたは＾２３３Ｅは、２３３位後および２３４位前へのグルタミン酸の挿入を意味する。さらに、−２３３ＡＤＥまたは＾２３３ＡＤＥは、２３３位後および２３４位前へのＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を意味する。
【００５６】
本明細書で用いる“アミノ酸欠失”または“欠失”は、親ポリペプチド配列中、特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｅ２３３−またはＥ２３３＃は、２３３位でのグルタミン酸の欠失を意味する。さらに、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、２３３位から始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を意味する。
【００５７】
本明細書で用いる“変異体タンパク質”または“タンパク質変異体”、または“変異体”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親タンパク質と異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、タンパク質自体、該タンパク質またはそれをコードするアミノ配列を含む組成物を意味し得る。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して、少なくとも１個のアミノ酸修飾を有し、例えば、親タンパク質と比較して約１個から約１０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１個から約５個のアミノ酸修飾を有する。本明細書中、タンパク質変異体配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは、少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有し得る。変異体タンパク質は、変異体タンパク質自体、該タンパク質変異体またはそれをコードするアミノ酸配列を含む組成物を意味し得る。従って、本明細書で用いる“抗体変異体”または“変異体抗体”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で用いる“ＩｇＧ変異体”または“変異体ＩｇＧ”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親ＩｇＧとは異なる抗体を意味し、そして本明細書で用いる“免疫グロブリン変異体”または“変異体免疫グロブリン”は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親免疫グロブリン配列とは異なる免疫グロブリン配列を意味する。変異体には、非天然アミノ酸が包含され得る。例えば、ＵＳ６５８６２０７；ＷＯ９８／４８０３２；ＷＯ０３／０７３２３８；ＵＳ２００４−０２１４９８８Ａ１；ＷＯ０５／３５７２７Ａ２；ＷＯ０５／７４５２４Ａ２；J. W. Chin et al.,（2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026−9027；J. W. Chin, & P. G. Schultz,（2002), ChemBioChem 11:1135−1137；J. W. Chin, et al.,（2002), PICAS United States of America 99:11020−11024；and, L. Wang, & P. G. Schultz,（2002), Chem. 1−10（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）が包含される。
【００５８】
本明細書で用いる“タンパク質”は、少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。ペプチジル基は、天然に生じるアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造物、すなわちペプタイドのような“類似体”を含み得る（Simon et al., PNAS USA  89(20):9367（1992）を参照のこと、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。当業者には認識されているように、アミノ酸は、天然に生じ得るか、または天然に生じない。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、およびノルロイシン（noreleucine）は、本発明の目的のアミノ酸と見なされ、Ｄ−およびＬ−（ＲまたはＳ）配置のアミノ酸を用いることができる。本発明の変異体には、例えば、Cropp ＆ Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625−30, Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566−71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371−3, and Chin et al., 2003, Science 301(5635):964−7（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される。）に記載の方法を含むが、それに限定されない、Schultzおよび同僚により開発された技術を用いて挿入された非天然アミノ酸の使用を含む修飾が包含され得る。さらに、ポリペプチドは、１個以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列変異（circular permutation）、環化、他の分子との結合、タンパク質またはタンパク質ドメインとの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加を含み得る。
【００５９】
本明細書で用いる“残基”は、タンパク質中の位置およびそこに関係するアミノ酸の特定を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７、またＮ２９７とも称する）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の残基である。
【００６０】
本明細書で用いる“Ｆａｂ”または“Ｆａｂ領域”は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単独のこの領域、または全長抗体もしくは抗体断片中のこの領域を意味し得る。
【００６１】
本明細書で用いる“ＩｇＧサブクラス修飾”は、１個のＩｇＧイソ型の１個のアミノ酸を、異なる整列したＩｇＧイソ型において対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧ１はＥＵ２９６位にチロシンを含み、ＩｇＧ２はフェニルアラニンを有するため、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス修飾と見なされる。
【００６２】
本明細書で用いる“天然に生じない修飾”は、イソ型（isotypic）ではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧは何れも、３３２位にグルタミン酸を含まないため、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４におけるＩ３３２Ｅ置換は、天然に生じない修飾と見なされる。
【００６３】
本明細書で用いる“アミノ酸”および“アミノ酸同一性”は、特定の定められた位置に存在し得る、２０個の天然に生じるアミノ酸または何らかの天然に生じない類似体のうち１個を意味する。
【００６４】
本明細書で用いる“エフェクター機能”は、抗体のＦｃ領域と、Ｆｃ受容体またはリガンドとの相互作用によりもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣが含まれるが、それらに限定されない。
【００６５】
本明細書で用いる“エフェクター細胞”は、１個以上のＦｃ受容体を発現し、１個以上のエフェクター機能を仲介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞には、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγδＴ細胞が含まれるが、それらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含む何れかの生物を含むが、それらに限定されない生物由来であり得る。
【００６６】
本明細書で記載の“ＩｇＧ Ｆｃリガンド”は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、何れかの生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌タンパク質Ａ、ブドウ球菌タンパク質Ｇ、およびウイルスＦｃγＲが含まれるが、それらに限定されない。Ｆｃリガンドにはまた、ＦｃγＲと相同性のＦｃ受容体ファミリーであるＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）が含まれる（Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123−136、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未知の分子を含み得る。特定のＩｇＧ Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。本明細書で用いる“Ｆｃリガンド”は、抗体のＦｃ領域と結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、何れかの生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
【００６７】
本明細書で用いる“Ｆｃガンマ受容体”または“ＦｃγＲ”は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子によりコードされる何れかのタンパク質ファミリーのメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、イソ型ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；イソ型ＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびに、イソ型ＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57−65、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、ならびに何れかの未知のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲイソ型またはアロタイプが含まれるが、それらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、それらに限定されない何れかの生物由来であり得る。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに何れかの未知のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲイソ型またはアロタイプが含まれるが、それらに限定されない。
【００６８】
本明細書で用いる“ＦｃＲｎ”または“胎児性Ｆｃ受容体”は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃＲｎ遺伝子により少なくともその一部をコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、それらに限定されない何れかの動物由来であり得る。当技術分野で公知の通り、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば、重鎖および軽鎖と称される２個のポリペプチドを含む。軽鎖は、ベータ−２−ミクログロブリンであり、重鎖は、ＦｃＲｎ遺伝子によりコードされる。本明細書中他に特に記載がなければ、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とベータ−２−ミクログロブリンの複合体を意味する。特定の目的のＦｃＲｎの配列、特にヒト種の配列を、図に示す。
【００６９】
本明細書で用いる“親ポリペプチド”は、後に修飾され変異体を作製する未修飾ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に生じるポリペプチド、または天然に生じるポリペプチドの変異体または改変型であり得る。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、該親ポリペプチドまたはそれをコードするアミノ酸配列を含む組成物を意味し得る。従って、本明細書で用いる“親免疫グロブリン”は、修飾されて変異体を作製する未修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で用いる“親抗体”は、修飾されて変異体抗体を作製する未修飾抗体を意味する。“親抗体”には、下記に説明する通り、公知の商業的、組換え的に作製された抗体が含まれることに注目すべきである。
【００７０】
本明細書で用いる“位置”は、タンパク質配列中の位置を意味する。位置は、連続して、または確立された形式、例えばKabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従い、番号付けされ得る。例えば、２９７位は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の位置である。
【００７１】
本明細書で用いる“標的抗原”は、特定の抗体の可変領域により特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であり得る。
【００７２】
本明細書で用いる“標的細胞”は、標的抗原を発現する細胞を意味する。
【００７３】
本明細書で用いる“可変領域”は、カッパ、ラムダ、および重鎖免疫グロブリン遺伝子領域それぞれからなるＶκ、Ｖλ、および／またはＶＨ遺伝子の何れかにより実質的にコードされる１個以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。
【００７４】
本明細書で用いる“野生型またはＷＴ”は、アレル変異体を含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００７５】
本発明は、ＦｃＲｎとの調節された結合を示す抗体を対象とする（調節には、結合の増加ならびに減少が包含される。）。例えば、いくつかの例において、増加した結合は、抗体の細胞再利用をもたらし、故に、例えば治療用抗体に関して増加した半減期をもたらす。あるいは、減少したＦｃＲｎ結合が、例えば放射標識を含む診断用抗体または治療用抗体に関して望ましい。さらに、ＦｃＲｎとの増加した結合、および他のＦｃ受容体、例えばＦｃγＲとの変化した結合を示す抗体は、本発明において利用され得る。従って、本発明は、抗体を提供する。
【００７６】
抗体
本発明は、ＦｃＲｎとの結合を調節するアミノ酸修飾を含む抗体を対象とする。特に興味があるのは、低ｐＨでＦｃＲｎとの増加した結合親和性を示し、高ｐＨで実質的に変化した結合を示さない、最小限にＦｃ領域を含む抗体またはその機能的変異体である。
【００７７】
古典的抗体構造単位には、典型的に、四量体が含まれる。各四量体は、典型的に、ポリペプチド鎖の２個の相同対（各対は、１個の“軽”鎖（典型的に、約２５ｋＤａの分子量を有する。）および１個の“重”鎖（典型的に、約５０−７０ｋＤａの分子量を有する。）を有する。）からなる。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のイソ型を定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、それらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むが、これに限定されないサブクラスを有する。故に、本明細書で用いる“イソ型”は、それらの定常領域の化学特性および抗原特性により定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンイソ型は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤおよびＩｇＥである。
【００７８】
各鎖のアミノ末端部位には、抗原認識に主要な役割を果たす、約１００から１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。可変領域中、３つのループが、重鎖および軽鎖の各Ｖドメインに集合し、抗原結合部位を形成する。各ループは、相補性決定領域（以降、“ＣＤＲ”と称する）と称され、そこでのアミノ酸配列中の変異は、最も重要である。
【００７９】
各鎖のカルボキシ末端部位は、エフェクター機能に主要な役割を果たす定常領域を定義する。Kabatらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の主要配列を集めた。該配列の保存の程度に基づき、彼らは、ＣＤＲおよびフレームワークに個々の主要配列を分類し、そのリストを作成した（SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91−3242, E.A. Kabat et alを参照のこと、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【００８０】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスにおいて、重鎖には、いくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書中、“免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン“とは、異なる三次元構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明において興味があるのは、重鎖定常（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体において、ＩｇＧイソ型はそれぞれ、３個のＣＨ領域を有する。従って、ＩｇＧにおける“ＣＨ”ドメインは、下記である：“ＣＨ１”は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従い、１１８−２２０位を示す。“ＣＨ２”は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従い、２３７−３４０位を示し、“ＣＨ３”は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従い、３４１−４４７位を示す。
【００８１】
重鎖のＩｇドメインの他のタイプは、ヒンジ領域である。本明細書中、“ヒンジ”もしくは“ヒンジ領域”または“抗体ヒンジ領域”もしくは“免疫グロブリンヒンジ領域”は、抗体の第一および第二定常ドメイン間のアミノ酸を含むフレキシブルポリペプチドを意味する。構造的には、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインは、ＥＵ ２２０位で終わり、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、ＥＵ ２３７位の残基で始まる。故に、ＩｇＧに関して、抗体ヒンジは、本明細書中、２２１位（ＩｇＧ１にてＤ２２１）から２３６位（ＩｇＧ１にてＧ２３６）を含むと定義され、ここで、番号は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従う。いくつかの態様において、例えばＦｃ領域において、一般的に２２６位または２３０位に当たる“下流側ヒンジ（lower hinge）”が包含される。
【００８２】
本発明において特に興味があるのは、Ｆｃ領域である。本明細書で用いる“Ｆｃ”または“Ｆｃ領域”は、免疫グロブリンドメインの第一の定常領域、いくつかの場合に、ヒンジの一部を除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。故に、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの残り２個の定常領域、ならびに免疫グロブリンドメインＩｇＥおよびＩｇＭの残り３個の定常領域、ならびにこれらのドメインのＮ末端のフレキシブルヒンジを意味する。ＩｇＡおよびＩｇＭに関して、Ｆｃには、Ｊ鎖が含まれ得る。ＩｇＧに関して、図１に示す通り、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃｇ２およびＣｇ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃｇ１）とＣガンマ２（Ｃｇ２）の間の下流側ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、ここで、番号は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従う。Ｆｃは、下記に記載の通り、単離したこの領域か、またはＦｃポリペプチド中のこの領域を意味し得る。本明細書で記載の“Ｆｃポリペプチド”は、Ｆｃ領域の全てまたは一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合体、単離されたＦｃ、およびＦｃ断片を含む。
【００８３】
いくつかの態様において、抗体は全長である。本明細書中、“全長抗体”とは、本明細書に記載の通り、１個以上の修飾を含む可変および定常領域を含む抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。
【００８４】
あるいは、抗体は、それぞれ、抗体断片、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書中、“抗体模倣体”と称されることもある。）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（本明細書中、“抗体複合体”と称されることもある。）、および各断片を含むが、それらに限定されない、多様な構造であり得る。
【００８５】
抗体断片
１つの態様において、抗体は抗体断片である。特に興味があるのは、Ｆｃ領域、Ｆｃ融合体および重鎖の定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含み、さらにまた、重鎖定常領域融合体を含む、抗体である。
【００８６】
特定の抗体断片には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単一の可変領域からなるｄＡｂ断片（Ward et al., 1989, Nature 341:544−546、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの結合したＦａｂ断片を含む二価断片、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２個のドメインを結合させ、抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーにより連結される（Bird et al., 1988, Science 242:423−426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879−5883、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。）、（ｖｉｉｉ）二重特異的一本鎖Ｆｖ（ＷＯ０３／１１１６１、参照により本明細書中に包含される）、ならびに（ｉｘ）“二重抗体（diabody）”または“三重抗体（triabody）”、遺伝子融合により構築される多価または多特異的断片（Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461−479；WO94/13804；Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444−6448、全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）が含まれるが、それらに限定されない。該抗体断片は、修飾され得る。例えば、分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組込みにより安定化され得る（Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239−1245、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【００８７】
キメラおよびヒト化抗体
いくつかの態様において、骨格成分は、異なる種由来の混合物であり得る。そういうものとして、問題の抗体がそのような抗体であるとき、かかる抗体は、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であり得る。一般的に、“キメラ抗体”および“ヒト化抗体”は両方とも、２種以上由来の領域を組み合わせた抗体を意味する。例えば、“キメラ抗体”には、伝統的に、マウス（またはいくつかの場合に、ラット）由来の可変領域（複数可）およびヒト由来の定常領域（複数可）が含まれる。“ヒト化抗体”は、一般的に、ヒト抗体中に見出される配列に置換した可変ドメインフレームワーク領域を有している非ヒト抗体を意味する。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドにコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いてそのような抗体と同一である。そのいくつかまたは全てが非ヒト生物に由来する核酸によりコードされるＣＤＲは、ヒト抗体可変領域のベータ−シートフレームワークに移植され、抗体を作製し、その特異性は、移植したＣＤＲにより決定される。そのような抗体の作製は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Jones, 1986, Nature 321:522−525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534−1536（全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載される。対応する供与側残基への選択した受容側フレームワーク残基の“復帰突然変異（Backmutation）”は、しばしば、初期の移植したコンストラクトで欠失している親和性を再び得るのに必要である（ＵＳ５５３０１０１；ＵＳ５５８５０８９；ＵＳ５６９３７６１；ＵＳ５６９３７６２；ＵＳ６１８０３７０；ＵＳ５８５９２０５；ＵＳ５８２１３３７；ＵＳ６０５４２９７；ＵＳ６４０７２１３、全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含み、故に、ヒトＦｃ領域を典型的に含むだろう。ヒト化抗体はまた、遺伝子組み換えされた免疫系を有するマウスを用いて作製され得る（Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639−654、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。非ヒト抗体のヒト化および再形成のための様々な技術および方法は、当技術分野でよく知られている（Tsurushita ＆ Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science(USA)およびそこで参照される文献、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ヒト化方法には、Jones et al., 1986, Nature 321:522−525；Riechmann et al.,1988；Nature 332:323−329；Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534−1536；Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029−33；He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029−1035；Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285−9, Presta et al., 1997, Cancer Res.57(20):4593−9；Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181−4185；O’Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321−8（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される。）に記載の方法が含まれるが、それらに限定されない。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を減じるヒト化または他の方法には、例えば、Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969−973（参照によりその全体が本明細書中に包含される。）に記載の表面再形成（resurfacing）方法が含まれ得る。１つの態様において、親抗体は、当技術分野で公知の通り、成熟した親和性を有する。構造に基づく方法は、例えばＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載のヒト化および親和性成熟に用いられ得る。選択に基づく方法は、Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151−162；Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678−10684；Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611−22618；Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910−8915；Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753−759（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される。）に記載の方法を含むが、これらに限定されない、抗体可変領域のヒト化および／または親和性成熟に用いられ得る。他のヒト化方法は、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０；Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119−1125；De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076−3084（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される。）に記載の方法を含むが、これらに限定されない、ＣＤＲの一部のみの移植を伴い得る。
【００８８】
二重特異的抗体
１つの態様において、本発明の多特異的抗体、特に二重特異的抗体はまた、“二重抗体”と称されることもある。これらは、２個（またはそれ以上）の異なる抗原に結合する抗体である。二重抗体は、当技術分野で公知の様々な方法で作製することができ（Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446−449、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、例えば化学的に、またはハイブリッド・ハイブリドーマ（hybrid hybridoma）から作製することができる。
【００８９】
ミニボディ
１つの態様において、抗体はミニボディである。ミニボディは、ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含む最小化抗体様タンパク質である（Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055−3061、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。いくつかの場合に、ｓｃＦｖは、Ｆｃ領域と結合することができ、ヒンジ領域のいくつかまたは全てを包含し得る。
【００９０】
ヒト抗体
１つの態様において、抗体は、本明細書に記載の通り、少なくとも１個の修飾を有する全長ヒト抗体である。“全長ヒト抗体”または“完全ヒト抗体”は、本明細書に記載の修飾を有するヒト染色体に由来する抗体遺伝子配列を有するヒト抗体を意味する。
【００９１】
抗体融合体
１つの態様において、本発明の抗体は、抗体融合タンパク質（本明細書中、“抗体複合体”と称されることもある）である。抗体融合体の１つのタイプは、結合パートナーを有するＦｃ領域を連結するＦｃ融合体を含む。本明細書で用いる“Ｆｃ融合体”は、１個以上のポリペプチドが、作動可能にＦｃ領域に連結されるタンパク質を意味する。本明細書中、Ｆｃ融合体は、従来技術（Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52−60；Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195−200、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）で用いられる通り、用語“免疫アドヘシン（immunoadhesin）”、“Ｉｇ融合体”、“Ｉｇキメラ”、および“受容体グロブリン”（ダッシュを付けることもある）と同義の意味である。Ｆｃ融合体は、一般的に、何れかのタンパク質または小分子であり得る融合パートナーを有する免疫グロブリンのＦｃ領域を結合する。実際、何れかのタンパク質または小分子はＦｃと結合し、Ｆｃ融合体を作製し得る。タンパク質融合パートナーには、いずれかの抗体の可変領域、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、または他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれ得るが、それらに限定されない。小分子融合パートナーは、Ｆｃ融合体を治療標的に向ける何れかの治療剤を含み得る。かかる標的は、何れかの分子、好ましくは疾患に関与する細胞外受容体であり得る。故に、ＩｇＧ変異体は、１個以上の融合パートナーと結合し得る。１つの別の態様において、ＩｇＧ変異体を、他の治療化合物と結合するか、または作動可能に連結する。該治療化合物は、細胞毒性剤、化学療法剤、毒物、放射性同位体、サイトカイン、または他の治療的活性剤であり得る。ＩｇＧは、様々な非タンパク性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマーのうち１つと結合し得る。
【００９２】
Ｆｃ融合体に加えて、抗体融合体は、重鎖の定常領域と、１個以上の融合パートナー（何れかの抗体の可変領域を再び含む）の融合を含むが、一方、他の抗体融合体は、融合パートナーを有する実質的または完全な全長抗体である。１つの態様において、融合パートナーの役割は標的結合を仲介することであり、故に、それは、抗体の可変領域に機能的に類似する（そして、実際抗体可変領域であり得る）。実際、何れかのタンパク質または小分子は、Ｆｃと結合し、Ｆｃ融合体（または抗体融合体）を作製し得る。タンパク質融合パートナーは、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカインまたはいくつかの他のタンパク質またはタンパク質ドメインを含み得るが、それらに限定されない。小分子融合パートナーは、Ｆｃ融合体を治療標的に向ける何れかの治療剤を含み得る。かかる標的は、何れかの分子、好ましくは疾患に関与する細胞外受容体であり得る。
【００９３】
結合パートナーは、タンパク性または非タンパク性であり得る；後者は、一般的に、抗体および結合パートナーの官能基を用いて作製される。例えばリンカーは、当技術分野で公知である；例えば、ホモ−またはヘテロ−二官能性リンカーが、よく知られている（1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross−linkers, pages 155−200を参照のこと、参照により本明細書中に包含される）。
【００９４】
適する複合体には、下記の標識、薬剤、ならびに、細胞毒性剤（例えば、化学療法剤）または毒物またはかかる毒物の活性断片を含むが、これらに限定されない細胞毒性物質が含まれるが、それらに限定されない。適する毒物およびそれらの対応する断片には、ジフテリアＡ鎖、エクゾキトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどが含まれる。細胞毒性物質にはまた、放射性同位体と抗体を結合すること、または放射性核種と抗体に共有結合しているキレート剤を結合することにより作製される放射性化学物質が含まれる。さらなる態様が、カリケミシン、オーリスタチン（auristatin）、ゲルダナマイシン、マイタンシン、ならびにデュオカルマイシンおよび類似体を利用する；後者に関して、Ｕ．Ｓ．２００３／００５０３３１Ａ１を参照のこと、参照によりその全体が本明細書中に包含される。
【００９５】
抗体の共有結合修飾（Covalent modification）
抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲内に包含され、常にではないが一般的に、翻訳後に行われる。例えば、抗体の共有結合修飾のいくつかのタイプは、抗体の特定のアミノ酸残基を、選択した側鎖またはＮ−もしくはＣ−末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることにより分子中に導入される。
【００９６】
システイニル残基は、最も一般的に、α−ハロ酢酸（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾール（imidozoyl））プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル−２−ピリジルジヅルフィオ、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸塩、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールなどと反応することにより誘導され得る。
【００９７】
ヒスチジル残基は、ヒスチジル側鎖と比較的特異的に反応するピロ炭酸ジエチルとのｐＨ５．５−７．０での反応により誘導される。パラ−ブロモフェンアシルブロミドも有用である；反応は、好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中、ｐＨ６．０にて行われる。
【００９８】
リシニル（Lysinyl）およびアミノ末端残基を、無水コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの物質を用いる誘導体化は、リシニル残基の荷電を逆にする効果を有する。他の誘導体化に適する試薬であるアルファ−アミノ含有残基には、メチルピコリンイミダート；ピリドキサルリン酸；ピリドキサール；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオン；および、グリオキシル酸を用いるトランスアミナーゼ触媒反応のようなイミドエステルが含まれる。
【００９９】
アルギニル残基は、１個またはいくつかの常套試薬（とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリン）を用いる反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基が高ｐＫａであるためにアルカリ性条件で行うことが必要である。さらに、これらの試薬は、リシンの複数の基ならびにアルギニン イプシロン−アミノ基と反応し得る。
【０１００】
チロシル残基の特定の修飾を、特に関心を持って、芳香族性ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりチロシル残基中にスペクトル標識を導入することにより作製することができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（acetylimidizole）およびテトラニトロメタンを、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体それぞれを形成するために用いる。チロシル酸基を、ラジオイムノアッセイである適する上記のクロラミンＴ法に用いるための標識タンパク質を調製するために１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化する。
【０１０１】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’Ｎ＝Ｃ＝Ｎ――Ｒ’）（式中、ＲおよびＲ’は、所望により、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのような異なるアルキル基であり得る。）との反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０１０２】
二官能性物質を用いる誘導体化は、下記の方法だけでなく、様々な方法での使用のための不水溶性支持マトリックスまたは表面への抗体を架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）のようなジサクシンイミジルエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドを含むホモ二官能性イミドエステルが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化中間体を生じる。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性不水溶性マトリックスおよび米国特許番号第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；および、同第４，３３０，４４０号（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の反応基質を、タンパク質固定化に用いる。
【０１０３】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基の形態はどちらも、本発明の範囲内である。
【０１０４】
他の修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp. 79−86 [1983]、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに何れかのＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１０５】
グリコシル化
共有結合修飾の他のタイプは、グリコシル化である。他の態様において、本明細書に記載のＩｇＧ変異体は、１個以上の改変された糖鎖（glycoform）を含むように修飾され得る。本明細書で用いる“改変された糖鎖”は、ＩｇＧと共有結合する炭水化物組成物を意味し、ここで該炭水化物組成物は、親ＩｇＧと化学的に異なる。改変された糖鎖は、エフェクター機能を増強するかまたは減少することを含むが、これらに限定されない様々な目的に有用であり得る。改変された糖鎖は、当技術分野で公知の様々な方法により作製され得る（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176−180；Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288−294；Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733−26740；Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466−3473；ＵＳ６，６０２，６８４；ＵＳＳＮ１０／２７７，３７０；ＵＳＳＮ１０／１１３，９２９；ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２４６Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１４０Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される；（PotelligentＴＭ technology [Biowa, Inc., Princeton, NJ］；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）glycosylation engineering technology [Glycart Biotechnology AG, Zuerich, Switzerland]）。多くのこれらの技術は、フコシル化レベルを制御すること、および／またはＦｃ領域に共有結合するオリゴ糖を、例えば、遺伝子組み換えまたは他の様々な生物または細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）でＩｇＧを発現することによるか、またはグリコシル化経路に関与する酵素（例えば、ＦＵＴ８［α１，６−フコシルトランスフェラーゼ］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を調節することによるか、またはＩｇＧが発現された後、炭水化物（複数可）を修飾することにより、２つに切断することに基づく。改変された糖鎖は、典型的に、異なる炭水化物またはオリゴ糖と称される；故に、ＩｇＧ変異体、例えば抗体またはＦｃ融合体は、改変された糖鎖に包含され得る。あるいは、改変された糖鎖は、異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むＩｇＧ変異体と称され得る。当技術分野で公知の通り、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、下記の、特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または不存在）、または該タンパク質を産生する宿主細胞もしくは生物に依存し得る。特定の発現系を以下に記載する。
【０１０６】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン酸基の側鎖への炭水化物部分の付加を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。故に、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、可能性のあるグリコシル化部位をもたらす。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用可能である。）への糖の一種（Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロース）の付加を意味する。
【０１０７】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位のために）１個以上の上記トリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を改変することにより都合よく達成される。該改変はまた、（Ｏ結合グリコシル化部位のために）出発配列への１個以上のセリンまたはトレオニン残基の付加または置換により成され得る。簡単には、抗体のアミノ酸配列を、好ましくはＤＮＡレベルでの変化により、特に、コドンが所望のアミノ酸に翻訳され得るように作製されるように予め選択された塩基にて、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることにより、改変する。
【０１０８】
抗体上の炭水化物部分の数を増加する他の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。これらの方法は、ＮおよびＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で有利である。用いるカップリング法に依存して、糖（糖類）を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインの一部のような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンの一部のような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトランの一部のような芳香族性残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０およびAplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259−306（両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載される。
【０１０９】
出発抗体に存在する炭水化物部分の除去を、化学的または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸化合物、または等価化合物へのタンパク質の暴露を必要とする。この処理により、結果として、架橋している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖鎖が切断されるが、一方、ポリペプチドは無傷のままである。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52、およびEdge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131（両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載される。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の通り、様々なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成され得る。可能性のあるグリコシル化部位でのグリコシル化は、Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の通り、ツニカマイシン化合物の使用により阻止することができる。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を妨げる。
【０１１０】
抗体の共有結合修飾の他のタイプは、例えばNektar Therapeuticsから市販されている2005-2006 PEG Catalog（Nektar websiteで利用可能）、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の方法で、抗体を、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンのような様々なポリオールを含むが、これらに限定されない様々な非タンパク性ポリマーに結合することを含む。さらに、当技術分野で公知の通り、アミノ酸置換を、ＰＥＧのようなポリマーの付加を促進するために抗体内の様々な部位に行うことができる。例えば、米国特許公開番号２００５／０１１４０３７Ａ１（参照によりその全体が本明細書中に包含される）を参照のこと。
【０１１１】
標識抗体
いくつかの態様において、本発明の抗体の共有結合修飾は、１個以上の標識の付加を含む。いくつかの場合において、これらは、抗体融合体と見なされる。用語“標識基”は、何れかの検出可能な標識を意味する。いくつかの態様において、標識基は、可能性のある立体障害を減じるために、多様な長さのスペーサーアームを介して抗体と結合させる。タンパク質を標識するための様々な方法が、当技術分野で公知であり、本発明の実施において用いられ得る。
【０１１２】
一般的に、標識は、それらが検出される分析に依存して様々なクラスに分類される：ａ）放射性同位体または重同位体であり得るアイソトープ標識；ｂ）磁気標識（例えば、磁性粒子）；ｃ）レドックス活性部分；ｄ）光学色素；酵素群（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；ｅ）ビオチン化基；および、ｆ）二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー塩基対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。いくつかの態様において、標識基は、可能性のある立体障害を減じるために、多様な長さのスペーサーアームを介して抗体と結合させる。タンパク質を標識するための様々な方法が、当技術分野で公知であり、本発明の実施において用いられ得る。
【０１１３】
特定の標識は、発色団、蛍光体およびフルオロフォアを含むが、これらに限定されない光学色素が含まれ、多くの例において特に後者である。フルオロフォアは、“小分子”蛍光物質、またはタンパク性蛍光物質のどちらかであり得る。
【０１１４】
“蛍光標識”は、その固有の蛍光特性により検出され得る何れかの分子を意味する。適する蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Malacite green）、スチルベン、黄色蛍光色素（Lucifer Yellow）、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ ＹｅｌｌｏｗおよびＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Molecular Probes, Eugene, OR）、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびテキサスレッド（Pierce, Rockford, IL）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Amersham Life Science, Pittsburgh, PA）が含まれるが、それらに限定されない。適するフルオロフォアを含む光学色素は、Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載される。
【０１１５】
適するタンパク性蛍光標識にはまた、ウミシイタケ（Renilla）種、ウミエラ（Ptilosarcus）種、またはオワンクラゲ（Aequorea）種のＧＦＰを含む緑色蛍光タンパク質（Chalfie et al., 1994, Science 263:802−805）、ＥＧＦＰ（Clontech Laboratories, Inc., Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9；Stauber, 1998, Biotechniques 24:462−471；Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178−182）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Clontech Laboratories, Inc.）、ルシフェラーゼ（Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408−5417）、β−ガラクトシダーゼ（Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603−2607）およびウミシイタケ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許番号第５２９２６５８号、同第５４１８１５５号、同第５６８３８８８号、同第５７４１６６８号、同第５７７７０７９号、同第５８０４３８７号、同第５８７４３０４号、同第５８７６９９５号、同第５９２５５５８号）が含まれるが、それらに限定されない。この段落における上記の参考文献は全て、参照により本明細書中に明示的に包含される。
【０１１６】
ＩｇＧ変異体
１つの態様において、本発明は、ＩｇＧタンパク質変異体を提供する。最小限では、ＩｇＧ変異体は、重鎖のＣＨ２−ＣＨ３領域を含む抗体断片を含む。さらに、適するＩｇＧ変異体は、Ｆｃドメイン（例えば、下流ヒンジ領域を含む）を含み、ならびに重鎖の定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含むＩｇＧ変異体も本発明に有用であり、それらは全て、融合パートナーと融合し得る。
【０１１７】
ＩｇＧ変異体は、親ＩｇＧポリペプチドと比較して、いくつかの場合に野生型ＩｇＧと比較して、１個以上のアミノ酸修飾を含む。ＩｇＧ変異体は、１個以上の最適化特性を有し得る。ＩｇＧ変異体は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により、その親ＩｇＧとアミノ酸配列が異なる。故に、ＩｇＧ変異体は、親と比較して少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する。あるいは、ＩｇＧ変異体は、親と比較して２個以上のアミノ酸修飾、例えば親と比較して約１個から５０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１個から１０個のアミノ酸修飾、最も好ましくは約１個から約５個のアミノ酸修飾を有し得る。
【０１１８】
故に、ＩｇＧ変異体の配列および親Ｆｃポリペプチドの配列は、実質的に相同性である。例えば、本明細書中、変異体ＩｇＧの変異体配列は、親ＩｇＧ変異体配列と約８０％の相同性、好ましくは少なくとも約９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有し得る。修飾は、分子生物学を用いて遺伝子組み換え的にまたは酵素的または化学的に行われ得る。
【０１１９】
抗体のための標的抗原
実質的には、標的抗原の下記のリストに属するタンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフおよび／またはエピトープが含まれるが、それらに限定されない全ての抗原は、ＩｇＧ変異体により標的とされ得る。それらには、サイトカインおよび膜貫通受容体を含む膜結合因子のような両方に可溶性の因子が含まれる：１７−ＩＡ、４−１ＢＢ、４Ｄｃ、６−ケト−ＰＧＦ１ａ、８−イソ−ＰＧＦ２ａ、８−オキソ−ｄＧ、Ａ１ アデノシン受容体、Ａ３３、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＲＩＡ、アクチビンＲＩＡ ＡＬＫ−２、アクチビンＲＩＢ ＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＡ、アクチビンＲＩＩＢ、ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アドレシン、ａＦＧＦ、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−７、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−Ｖ／ベータ−１アンタゴニスト、ＡＮＧ、Ａｎｇ、ＡＰＡＦ−１、ＡＰＥ、ＡＰＪ、ＡＰＰ、ＡＰＲＩＬ、ＡＲ、ＡＲＣ、ＡＲＴ、アルテミン、抗Ｉｄ、ＡＳＰＡＲＴＩＣ、心房性ナトリウム利尿因子、ａｖ／ｂ３インテグリン、Ａｘｌ、ｂ２Ｍ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ、Ｂ−リンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）、ＢＡＣＥ、ＢＡＣＥ−１、Ｂａｄ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ、Ｂａｇ−１、ＢＡＫ、Ｂａｘ、ＢＣＡ−１、ＢＣＡＭ、Ｂｃｌ、ＢＣＭＡ、ＢＤＮＦ、ｂ−ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＩＤ、Ｂｉｋ、ＢＩＭ、ＢＬＣ、ＢＬ−ＣＡＭ、ＢＬＫ、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２ ＢＭＰ−２ａ、ＢＭＰ−３ オステオゲニン（Osteogenin）、ＢＭＰ−４ ＢＭＰ−２ｂ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６ Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＢＭＰ−８ａ、ＯＰ−２）、ＢＭＰＲ、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６）、ＢＲＫ−２、ＲＰＫ−１、ＢＭＰＲ−ＩＩ（ＢＲＫ−３）、ＢＭＰ、ｂ−ＮＧＦ、ＢＯＫ、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ＢＰＤＥ、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ、ＢＴＣ、補体因子３（Ｃ３）、Ｃ３ａ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ１０、ＣＡ１２５、ＣＡＤ−８、カルシトニン、ｃＡＭＰ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌関連抗原、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、ＣＢＬ、ＣＣＩ、ＣＣＫ２、ＣＣＬ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８���ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、
【０１２０】
ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５２、ＣＤ１６４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＦＴＲ、ｃＧＭＰ、ＣＩＮＣ、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、ＣＫｂ８−１、ＣＬＣ、ＣＭＶ、ＣＭＶ ＵＬ、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＮ−１、ＣＯＸ、Ｃ−Ｒｅｔ、ＣＲＧ−２、ＣＴ−１、ＣＴＡＣＫ、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、サイトケラチン腫瘍関連抗原、ＤＡＮ、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＣ−ＳＩＧＮ、補体制御因子（Decay accelerating factor）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−１）、Ｄｈｈ、ジゴキシン、ＤＮＡＭ−１、Ｄｎａｓｅ、Ｄｐｐ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、Ｄｔｋ、ＥＣＡＤ、ＥＤＡ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＥＭＡ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＮＡ、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、ｅＮＯＳ、Ｅｏｔ、エオタキシン１、ＥｐＣＡＭ、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＣＣ、Ｅ−セレクチン、ＥＴ−１、ファクターＩＩａ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩｃ、ファクターＩＸ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆａｓ、ＦｃＲ１、ＦＥＮ−１、フェリチン、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ−８、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ−３、フィブリン、ＦＬ、ＦＬＩＰ、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、Ｇ２５０、Ｇａｓ６、ＧＣＰ−２、ＧＣＳＦ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ−５（ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ−６（ＢＭＰ−１３、ＣＤＭＰ−２）、ＧＤＦ−７（ＢＭＰ−１２、ＣＤＭＰ−３）、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１５（ＭＩＣ−１）、ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＦＡＰ、ＧＦＲａ−１、ＧＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ２、ＧＦＲ−アルファ３、ＧＩＴＲ、グルカゴン、Ｇｌｕｔ４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ１３０、ｇｐ７２、ＧＲＯ、成長ホルモン放出因子、ハプテン（ＮＰ−ｃａｐまたはＮＩＰ−ｃａｐ）、
【０１２１】
ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＣＣ、ＨＣＭＶ ｇＢエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ ｇＨエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ ＵＬ、造血成長因子（ＨＧＦ）、Ｈｅｐ Ｂ ｇｐ１２０、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ） ｇＢ糖タンパク質、ＨＳＶ ｇＤ糖タンパク質、ＨＧＦＡ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ １２０ Ｖ３ループ、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ＨＭＦＧ ＰＥＭ、ＨＲＧ、Ｈｒｋ、ヒト心臓ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＨＶＥＭ、Ｉ−３０９、ＩＡＰ、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＥ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮｇ、Ｉｇ、ＩｇＡ受容体、ＩｇＥ、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インターフェロン（ＩＮＦ）−アルファ、ＩＮＦ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ、インヒビン、ｉＮＯＳ、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、インスリン様増殖因子１、インテグリンアルファ２、インテグリンアルファ３、インテグリンアルファ４、インテグリンアルファ４／ベータ１、インテグリンアルファ４／ベータ７、インテグリンアルファ５（アルファＶ）、インテグリンアルファ５／ベータ１、インテグリンアルファ５／ベータ３、インテグリンアルファ６、インテグリンベータ１、インテグリンベータ２、インターフェロンガンマ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＪＥ、カリクレイン２、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１４、カリクレイン１５、カリクレインＬ１、カリクレインＬ２、カリクレインＬ３、カリクレインＬ４、ＫＣ、ＫＤＲ、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラミニン５、ＬＡＭＰ、ＬＡＰ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−１）、潜在的ＴＧＦ−１、潜在的ＴＧＦ−１ ｂｐ１、ＬＢＰ、ＬＤＧＦ、ＬＥＣＴ２、レフティ、ルイス−Ｙ抗原、ルイス−Ｙ関連抗原、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、Ｌｆｏ、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、リポタンパク質、ＬＩＸ、ＬＫＮ、Ｌｐｔｎ、Ｌ−セレクチン、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＬＴＢ４、ＬＴＢＰ−１、肺表面、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容体、Ｍａｃ−１、ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡＧ、ＭＡＰ２、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＭ、ＭＣＡＭ、ＭＣＫ−２、ＭＣＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ、Ｍｅｒ、ＭＥＴＡＬＬＯＰＲＯＴＥＡＳＥＳ、ＭＧＤＦ受容体、ＭＧＭＴ、ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１−アルファ、ＭＫ、ＭＭＡＣ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、
【０１２２】
ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＰＩＦ、Ｍｐｏ、ＭＳＫ、ＭＳＰ、ムチン（Ｍｕｃ１）、ＭＵＣ１８、ミュラー管抑制物質、Ｍｕｇ、ＭｕＳＫ、ＮＡＩＰ、ＮＡＰ、ＮＣＡＤ、Ｎ−Ｃアドヘリン、ＮＣＡ ９０、ＮＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ネプリライシン、ニューロトロフィン−３，−４、または−６、ニュールツリン、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮＧＦ−ベータ、ｎＮＯＳ、ＮＯ、ＮＯＳ、Ｎｐｎ、ＮＲＧ−３、ＮＴ、ＮＴＮ、ＯＢ、ＯＧＧ１、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｒ、ｐ１５０、ｐ９５、ＰＡＤＰｒ、副甲状腺ホルモン、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＰ、ＰＢＲ、ＰＢＳＦ、ＰＣＡＤ、Ｐ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＫ−１、ＰＥＣＡＭ、ＰＥＭ、ＰＦ４、ＰＧＥ、ＰＧＦ、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＩＮ、ＰＬＡ２、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＰｌＧＦ、ＰＬＰ、ＰＰ１４、プロインスリン、プロレラキシン、プロテインＣ、ＰＳ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＴＥＮ、ＰＴＨｒｐ、Ｐｔｋ、ＰＴＮ、Ｒ５１、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、ＲＳＶ Ｆｇｐ、Ｒｅｔ、リウマイド因子、ＲＬＩＰ７６、ＲＰＡ２、ＲＳＫ、Ｓ１００、ＳＣＦ／ＫＬ、ＳＤＦ−１、ＳＥＲＩＮＥ、血清アルブミン、ｓＦＲＰ−３、Ｓｈｈ、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＫ−１、ＳＬＡＭ、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＣ、ＳＭＤＦ、ＳＭＯＨ、ＳＯＤ、ＳＰＡＲＣ、Ｓｔａｔ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ−ＩＩ、ＴＡＣＥ、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質−７２）、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、Ｔ細胞受容体（例えば、Ｔ細胞受容体アルファ／ベータ）、ＴｄＴ、ＴＥＣＫ、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＴＥＲＴ、睾丸ＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ、ＴｆＲ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ Ｐａｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、ＴＧＦ−ベータＲＩ（ＡＬＫ−５）、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩｂ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩＩ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、ＴＧＦ−ベータ５、トロンビン、胸腺Ｃｋ−１、甲状腺刺激ホルモン、Ｔｉｅ、ＴＩＭＰ、ＴＩＱ、組織因子、ＴＭＥＦＦ２、Ｔｍｐｏ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−アルファベータ、ＴＮＦ−ベータ２、ＴＮＦｃ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬ Ｒ１ Ａｐｏ−２、ＤＲ４）、
【０１２３】
ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ−２Ａ、ＴＲＩＣＫ−Ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬ Ｒ３ ＤｃＲ１、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬ Ｒ４ ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ ＯＤＦ Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧ ＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ｒ ＦＮ１４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ ＡＴＡＲ、ＨｖｅＡ、ＬＩＧＨＴ Ｒ、ＴＲ２）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ ｐ７５ＮＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ ＡＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ ＴＡＪ、ＴＲＡＤＥ）、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ（ＲＥＬＴ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦ ＲＩ ＣＤ１２０ａ、ｐ５５−６０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ ＲＩＩ ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５−８０）、ＴＮＦＲＳＦ２６（ＴＮＦＲＨ３）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴｂＲ ＴＮＦ ＲＩＩＩ、ＴＮＦＣ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０ ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０ ｐ５０）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ Ａｐｏ−１、ＡＰＴ１、ＣＤ９５）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３ Ｍ６８、ＴＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢ ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＴＮＦＲＨ２）、ＴＮＦＲＳＴ２３（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１ ＴＮＦＲＨ１）、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３ Ａｐｏ−３、ＬＡＲＤ、ＴＲ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ Ａｐｏ−２リガンド、ＴＬ２）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンド ＯＤＦ、ＯＰＧリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ａｐｏ−３リガンド、ＤＲ３リガンド）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ ＴＡＬＬ２）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＡＦＦ ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ ＨＶＥＭリガンド、ＬＴｇ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲリガンド ＡＩＴＲリガンド、ＴＬ６）、ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＴＮＦ−ａ コネクチン（Conectin）、ＤＩＦ、ＴＮＦＳＦ２）、ＴＮＦＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ−ｂ ＬＴａ、ＴＮＦＳＦ１）、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂ ＴＮＦＣ、ｐ３３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド ｇｐ３４、ＴＸＧＰ１）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド ＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＨＩＧＭ１、ＩＭＤ３、ＴＲＡＰ）、ＴＮＦＳＦ６（Ｆａｓリガンド Ａｐｏ−１リガンド、ＡＰＴ１リガンド）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド ＣＤ７０）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド ＣＤ１３７リガンド）、ＴＰ−１、ｔ−ＰＡ、Ｔｐｏ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ Ｒ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、トランスフェリン受容体、ＴＲＦ、Ｔｒｋ、ＴＲＯＰ−２、ＴＳＧ、ＴＳＬＰ、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５、腫瘍関連抗原発現ルイスＹ関連炭水化物、ＴＷＥＡＫ、ＴＸＢ２、Ｕｎｇ、ｕＰＡＲ、ｕＰＡＲ−１、ウロキナーゼ、ＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ−��、ＶＥＣＡＤ、ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−２、ＶＥＦＧＲ−１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）、ＶＥＧＩ、ＶＩＭ、ウイルス抗原、ＶＬＡ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、ＶＮＲインテグリン、フォン・ヴィレブランド因子、ＷＩＦ−１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＩＡＰ、ＸＰＤ、ならびにホルモンおよび成長因子のための受容体。
【０１２４】
当業者は、標的の上記リストが、特定のタンパク質および生体分子のみでなく、それらを含む生化学的経路または経路群も意味することを理解するだろう。例えば、標的抗原としてのＣＴＬＡ−４への言及は、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、およびこれらのタンパク質に結合する全ての他の未知のリガンドまたは受容体を含む、Ｔ脂肪共刺激経路を形成するリガンドおよび受容体も標的であることを意味する。故に、本明細書で用いる抗原とは、特定の生体分子のみでなく、該標的と相互作用する一連のタンパク質および該標的が属する生化学的経路のメンバーも意味する。当業者は、上記の標的抗原のいずれか、それらに結合するリガンドもしくは受容体、またはその対応する生化学的経路の他のメンバーを、Ｆｃ融合体を作製するために本発明のＦｃ変異体に作動可能に連結し得ることをさらに理解するだろう。故に、例えば、ＥＧＦＲを標的とするＦｃ融合体を、ＥＧＦＲに結合するＥＧＦ、ＴＧＦ−ｂ、または発見されたもしくは未知の全ての他のリガンドにＦｃ変異体を作動可能に連結することにより構築することができる。従って、本発明のＦｃ変異体は、ＥＧＦＲに結合するＥＧＦ、ＴＧＦ−ｂ、または発見されたもしくは未知の全ての他のリガンドに結合するＦｃ融合体を作製するために、ＥＧＦＲと作動可能に連結され得る。故に、実際、リガンド、受容体であろうといくつかの他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインであろうと、それらの対応する生化学的経路を含む上記の標的およびタンパク質を含むが、それらに限定されない全てのポリペプチドを、Ｆｃ融合体を作製するために本発明のＦｃ変異体に作動可能に連結することができる。
【０１２５】
適する抗原の選択は、所望の適用に依存する。抗癌処置に関して、その発現が癌細胞に限定される標的を有することが望ましい。とりわけ抗体治療に適していることが証明されているいくつかの標的が、シグナル伝達機能を有するものである。他の治療用抗体は、受容体とその同族リガンドとの結合を阻害することにより受容体のシグナル伝達を阻止して、それらの効果を発揮する。治療用抗体の他の作用機序は、受容体の下方制御を引き起こすことである。他の抗体は、それらの標的抗原を介するシグナル伝達により働かない。いくつかの場合において、感染性疾患剤に向けられた抗体が用いられる。
【０１２６】
１つの態様において、本発明のＦｃ変異体は、サイトカインに対する抗体中に組み込まれる。あるいは、Ｆｃ変異体は、サイトカインと融合または結合される。本明細書で用いる“サイトカイン”は、細胞間メディエーターとして他の細胞に作用する、ある細胞集団により放出されるタンパク質の一般名を意味する。例えば、Penichet et al., 2001, J Immunol Methods 248:91−101（参照により明示的に本明細書中に包含される）に記載の通り、サイトカインは、抗体に融合され、一連の望ましい特性を提供する。かかるサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるものは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニル ヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝臓の増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータのような神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータのような形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−アルファ、ベータ、およびガンマのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに、顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータのような腫瘍壊死因子；Ｃ５ａ；ならびに、ＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。本明細書で用いる通り、用語サイトカインには、天然源由来または組換え細胞培養由来のタンパク質、および天然配列の生物学的に活性な同等物が含まれる。
【０１２７】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのようなサイトカインおよび可溶性標的は、本発明の変異体を用いるための好ましい標的である。例えば、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＴＮＦ抗体、またはそれらの断片は、ＦｃＲｎ結合を増加するＦｃ変異体の使用のための特に良好な抗体である。これらの標的に対する治療剤は、しばしば、自己免疫性疾患の処置を伴い、長期間かけての多数回投与を必要とする。それ故、本発明の変異体によりもたらされるより長時間の血清半減期および処置頻度の低下は、特に好ましい。
【０１２８】
臨床試験または開発における使用を承認される多くの抗体およびＦｃ融合体には、本発明のＦｃ変異体により利点がもたらされ得る。本明細書中、これらの抗体およびＦｃ融合体は、“臨床的製品および候補品”と称される。故に、好ましい態様において、本発明のＦｃポリペプチドは、臨床的製品および候補品の範囲で使用され得る。例えば、ＣＤ２０を標的とする多くの抗体は、本発明のＦｃポリペプチドにより利点がもたらされ得る。例えば、本発明のＦｃポリペプチドは、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、IDEC/Genentech/Roche）（例えば、ＵＳ５，７３６，１３７を参照のこと）、非ホジキンリンパ腫の処置に承認されたキメラ抗ＣＤ２０抗体；ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、現在Genmabにより開発されている抗ＣＤ２０、ＵＳ５，５００，３６２に記載の抗ＣＤ２０抗体、ＡＭＥ−１３３（Applied Molecular Evolution）、ｈＡ２０（Immunomedics, Inc.）、ＨｕｍａＬＹＭ（Intracel）、およびＰＲＯ７０７６９（ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０４２６、題名“Immunoglobulin Variants and Uses Thereof”）と実質的に類似する抗体に使用され得る。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む上皮細胞増殖因子受容体ファミリーのメンバーを標的とする多くの抗体は、本発明のＦｃポリペプチドにより利点がもたらされ得る。例えば、本発明のＦｃポリペプチドは、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、Genentech）（例えば、ＵＳ５，６７７，１７１を参照のこと）と実質的に類似する抗体、乳癌の処置に承認されたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体；Genentechにより現在開発されているペルツズマブ（ｒｈｕＭａｂ−２Ｃ４、ＯｍｎｉｔａｒｇＴＭ）；ＵＳ４，７５３，８９４に記載の抗Ｈｅｒ２抗体；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Imclone）（ＵＳ４，９４３，５３３；ＰＣＴ ＷＯ ９６／４０２１０）、様々な癌の臨床試験におけるキメラ抗ＥＧＦＲ抗体；Abgenix-Immunex-Amgenにより現在開発されているＡＢＸ−ＥＧＦ（ＵＳ６，２３５，８８３）；Genmabにより現在開発されているＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ（ＵＳＳＮ１０／１７２，３１７）；４２５、ＥＭＤ５５９００、ＥＭＤ６２０００、およびＥＭＤ７２０００（Merck KGaA）（ＵＳ５，５５８，８６４；Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549−60；Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315−20；Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773−83）；ＩＣＲ６２（Institute of Cancer Research）（ＰＣＴ ＷＯ ９５／２００４５；Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1−3):129−46；Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247−53；Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228−35；Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2):273−80）；ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈＲ３（YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba（ＵＳ５，８９１，９９６；ＵＳ６，５０６，８８３；Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71−81）；ｍＡｂ−８０６（Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering）（Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2):639−44）；ＫＳＢ−１０２（KS Biomedix）；ＭＲ１−１（IVAX, National Cancer Institute）（ＰＣＴ ＷＯ ０１６２９３１Ａ２）；ならびに、ＳＣ１００（Scancell）（ＰＣＴ ＷＯ ０１／８８１３８）に使用され得る。
【０１２９】
他の好ましい態様において、本発明のＦｃポリペプチドは、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病の処置に現在承認されたヒト化モノクローナル抗体であるアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Millenium）に使用され得る。本発明のＦｃポリペプチドは、Ortho Biotech/Johnson ＆ Johnsonにより開発された抗ＣＤ３抗体であるムロモナブ−ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３（登録商標））、IDEC/Schering AGにより開発された抗ＣＤ２０抗体であるイブリツモマブチウキセタン（ibritumomab tiuxetan）（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、Celltech/Wyethにより開発された抗ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体であるゲムツマブ・オゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、Biogenにより開発された抗ＬＦＡ−３ Ｆｃ融合体であるアレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標））、Centocor/Lillyにより開発されたアブシキマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、Novartisにより開発されたバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、MedImmuneにより開発されたパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、Centocorにより開発された抗ＴＮＦアルファ抗体であるインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、Abbottにより開発された抗ＴＮＦアルファ抗体であるアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、Celltechにより開発された抗ＴＮＦアルファ抗体であるＨｕｍｉｃａｄｅＴＭ、Immunex/Amgenにより開発された抗ＴＮＦアルファ Ｆｃ融合体であるエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、Abgenixにより開発されている抗ＣＤ１４７抗体であるＡＢＸ−ＣＢＬ、Abgenixにより開発されている抗ＩＬ８抗体であるＡＢＸ−ＩＬ８、Abgenixにより開発されている抗ＭＵＣ１８抗体であるＡＢＸ−ＭＡ１、Antisomaにより開発中の抗ＭＵＣ１抗体であるＰｅｍｔｕｍｏｍａｂ（Ｒ１５４９、９０Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、Antisomaにより開発されている抗ＭＵＣ１抗体であるＴｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０）、Antisomaにより開発されているＡｎｇｉｏＭａｂ（ＡＳ１４０５）、Antisomaにより開発されているＨｕＢＣ−１、Antisomaにより開発されているＴｈｉｏｐｌａｔｉｎ（ＡＳ１４０７）、Biogenにより開発されている抗アルファ−４−ベータ−１（ＶＬＡ−４）およびアルファ−４−ベータ−７抗体であるアンテグレン（登録商標）（ナタリズマブ）、Biogenにより開発されている抗ＶＬＡ−１インテグリン抗体であるＶＬＡ−１ ｍＡｂ、Biogenにより開発されている抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）抗体であるＬＴＢＲ ｍＡｂ、Cambridge Antibody Technologyにより開発されている抗ＴＧＦ−β２抗体であるＣＡＴ−１５２、Cambridge Antibody TechnologyおよびAbbottにより開発されている抗ＩＬ−１２抗体であるＪ６９５、Cambridge Antibody TechnologyおよびGenzymeにより開発されている抗ＴＧＦβ１抗体であるＣＡＴ−１９２、Cambridge Antibody Technologyにより開発されている抗エオタキシン１抗体であるＣＡＴ−２１３、Cambridge Antibody Technologyおよびhuman Genome Sciences Inc.により開発されている抗Ｂｌｙｓ抗体であるＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−ＢＴＭ、Cambridge Antibody Technologyおよびhuman Genome Sciences, Inc.により開発されている抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体であるＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｍＡｂ、Genentechにより開発されている抗ＶＥＧＦ抗体であるアバスチン（商標）（ベバシツマブ、ｒｈｕＭＡｂ−ＶＥＧＦ）、Genentechにより開発されている抗ＨＥＲ受容体ファミリー抗体、Genentechにより開発されている抗組織因子抗体である抗組織因子（ＡＴＦ）、Genentechにより開発されている抗ＩｇＥ抗体であるＸｏｌａｉｒＴＭ（オマリズマブ）、GenentechおよびXomaにより開発されている抗ＣＤ１１ａ抗体であるＲａｐｔｉｖａＴＭ（エファリズマブ）、GenentechおよびMillenium Pharmaceuticalsにより開発されているＭＬＮ−０２抗体（以前は、ＬＤＰ−０２）、Genmabにより開発されている抗ＣＤ４抗体であるＨｕＭａｘ ＣＤ４、GenmabおよびAmgenにより開発されている抗ＩＬ１５抗体であるＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、
【０１３０】
GenmabおよびMedarexにより開発されているＨｕＭａｘ−Ｉｎｆｌａｍ、GenmabおよびMedarexおよびOxford GcoSciencesにより開発されている抗ヘパラナーゼＩ抗体であるＨｕＭａｘ−Ｃａｎｃｅｒ、GenmabおよびAmgenにより開発されているＨｕＭａｘ−Ｌｙｍｐｈｏｍａ、Genmabにより開発されているＨｕＭａｘ−ＴＡＣ、IDEC Pharmaceuticalsにより開発されているＩＤＥＣ−１３１および抗ＣＤ４０Ｌ抗体、IDEC Pharmaceuticalsにより開発されている抗ＣＤ４抗体であるＩＤＥＣ−１５１（クレノリキシマブ（Clenoliximab））、IDEC Pharmaceuticalsにより開発されている抗ＣＤ８０抗体であるＩＤＥＣ−１１４、IDEC Pharmaceuticalsにより開発されている抗ＣＤ２３であるＩＤＥＣ−１５２、IDEC Pharmaceuticalsにより開発されている抗マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）抗体、Imcloneにより開発されている抗イディオタイプ抗体であるＢＥＣ２、Imcloneにより開発されている抗ＫＤＲ抗体であるＩＭＣ−１Ｃ１１、Imcloneにより開発されている抗ｆｌｋ−１抗体であるＤＣ１０１、Imcloneにより開発されている抗ＶＥカドヘリン抗体、Immunomedicsにより開発されている抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体であるＣＥＡ−ＣｉｄｅＴＭ（ラベツズマブ（labetuzumab））、Immunomedicsにより開発されている抗ＣＤ２２抗体であるＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅＴＭ（エプラツズマブ）、 Immunomedicsにより開発されているＡＦＰ−Ｃｉｄｅ、Immunomedicsにより開発されているＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ、Immunomedicsにより開発されているＬｋｏＣｉｄｅ、Immunomedicsにより開発されているＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ、Medarexにより開発されている抗ＣＴＬＡ４抗体であるＭＤＸ−０１０、Medarexにより開発されている抗ＣＤ３０抗体であるＭＤＸ−０６０、Medarexにより開発されているＭＤＸ−０７０、Medarexにより開発されているＭＤＸ−０１８、MedarexおよびImmuno-Designed Moleculesにより開発されているＯｓｉｄｅｍＴＭ（ＩＤＭ−１）および抗Ｈｅｒ２抗体、MedarexおよびGenmabにより開発されている抗ＣＤ４抗体であるＨｕＭａｘＴＭ−ＣＤ４、MedarexおよびGenmabにより開発されている抗ＩＬ１５抗体であるＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、MedarexおよびCentocor/J＆Jにより開発されている抗ＴＮＦα抗体であるＣＮＴＯ １４８、Centocor/J＆Jにより開発されている抗サイトカイン抗体であるＣＮＴＯ １２７５、MorphoSysにより開発されている抗細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）（ＣＤ５４）抗体であるＭＯＲ１０１およびＭＯＲ１０２、MorphoSysにより開発されている抗線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）抗体であるＭＯＲ２０１、Protein Design Labsにより開発されている抗ＣＤ３抗体であるＮｕｖｉｏｎ（登録商標）（ビシリズマブ）、Protein Design Labsにより開発されている抗ガンマインターフェロン抗体であるＨｕＺＡＦＴＭ、Protein Design Labsにより開発されているＡｎｔｉ−α５β１インテグリン、Protein Design Labsにより開発されている抗ＩＬ−１２、Xomaにより開発されている抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体であるＩＮＧ−１、ならびにXomaにより開発されている抗ベータ２インテグリン抗体であるＭＬＮ０１（本段落中、上記の引用文献は全て、参照により明確に本明細書中に包含される）を含むが、それらに限定されない、他の臨床製品および候補品と実質的に類似する様々な抗体またはＦｃ融合体に使用され得る。
【０１３１】
本発明のＦｃポリペプチドは、上記の臨床候補品および製品中、または実質的にそれらと類似である抗体およびＦｃ融合体中に組み込まれ得る。本発明のＦｃポリペプチドは、いくつかの異なる方法でヒト化、親和性成熟、遺伝子組み換え、または修飾される上記の臨床候補品および製品中に組み込まれ得る。
【０１３２】
１つの態様において、本発明のＦｃポリペプチドは、自己免疫性疾患、炎症性疾患の処置、または移植適用に使用される。かかる疾患に関係のある標的抗原および臨床的製品および候補には、ＬＤＰ−０２のような抗α４β７インテグリン抗体、ＬＤＰ−０１のような抗ベータ２インテグリン抗体、５Ｇ１．１のような抗補体（Ｃ５）抗体、ＢＴＩ−３２２のような抗ＣＤ２抗体、ＭＥＤＩ−５０７、ＯＫＴ３のような抗ＣＤ３抗体、ＳＭＡＲＴ 抗ＣＤ３、ＩＤＥＣ−１５１のような抗ＣＤ４抗体、ＭＤＸ−ＣＤ４、ＯＫＴ４Ａ、抗ＣＤ１１ａ抗体、ＩＣ１４のような抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１８抗体、ＩＤＥＣ１５２のような抗ＣＤ２３抗体、ゼナパックスのような抗ＣＤ２５抗体、５ｃ８のような抗ＣＤ４０Ｌ抗体、Ａｎｔｏｖａ、ＩＤＥＣ−１３１、ＭＤＸ−３３のような抗ＣＤ６４抗体、ＩＤＥＣ−１１４のような抗ＣＤ８０抗体、ＡＢＸ−ＣＢＬのような抗ＣＤ１４７抗体、ＣＤＰ８５０のような抗Ｅセレクチン抗体、ＲｅｏＰｒｏ／Ａｂｃｉｘｉｍａのような抗ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、ＩＣＭ３のような抗ＩＣＡＭ−３抗体、ＶＸ−７４０のような抗ＩＣＥ抗体、ＭＤＸ−３３のような抗ＦｃＲ１抗体、ｒｈｕＭａｂ−Ｅ２５のような抗ＩｇＥ抗体、ＳＢ−２４０６８３のような抗ＩＬ−４抗体、ＳＢ−２４０５６３のような抗ＩＬ−５抗体、ＳＣＨ５５７００、ＡＢＸ−ＩＬ８のような抗ＩＬ−８抗体、抗インターフェロンガンマ抗体、ＣＤＰ５７１のような抗ＴＮＦ（ＴＮＦ、ＴＮＦａ、ＴＮＦａ、ＴＮＦ−アルファ）抗体、ＣＤＰ８７０、Ｄ２Ｅ７、インフリキシマブ、ＭＡＫ−１９５Ｆならびにアンテグレンのような抗ＶＬＡ−４抗体が含まれるが、それらに限定されない。
【０１３３】
ＦｃＲｎに対する増加した結合を有するような本発明のＦｃ変異体を、増大した特性を与えるためにＴＮＦ阻害剤分子に利用可能である。有用なＴＮＦ阻害剤分子には、哺乳動物におけるＴＮＦ−アルファの作用を阻害する何れかの分子が包含される。適する例には、Ｆｃ融合体であるエンブレル（登録商標）（エタネルセプト）ならびに抗体であるヒュミラ（登録商標）（アダリムマブ）およびレミケード（登録商標）（インフリキシマブ）が含まれる。本ＦｃＦｎ結合を増加するために発明のＦｃ変異体を用いて作製されたモノクローナル抗体（レミケードおよびヒュミラのような）は、増加した半減期により、より有効に変換され得る。
【０１３４】
いくつかの態様において、感染症に対する抗体を用いる。真核細胞に対する抗体には、出芽酵母、メタノール資化性酵母（Hansenula polymorpha）、乳糖資化性酵母（Kluyveromyces fragilisおよびK. lactis）、メタノール資化性酵母（Pichia guillerimondiiおよびP. pastoris）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparium）、およびアルカン資化性酵母（Yarrowia lipolytica）を含むが、これらに限定されない酵母細胞を標的とする抗体が含まれる。
【０１３５】
カンジダグラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダクルセイ（C. krusei）、カンジダルシタニアンド（C. lusitaniaeand）、カンジダマルトーサ（C. maltosa）を含むカンジダ株、ならびに特にアスペルギルス、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、コクシジオイデス、ブラストミセスおよびペニシリウム種と関係のある標的抗原を含む、さらなる真菌細胞に対する抗体はまた、有用である。
【０１３６】
原生動物と関係のある標的抗原に向けた抗体には、トリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア（Leishmania donovanii）を含むリーシュマニア種；マラリア原虫（Plasmodium spp.）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、クリプトスポリジウム原虫（Cryptosporidium parvum）、ジアルジア（Giardia lamblia）、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、およびサイクロスポーラ（Cyclospora cayetanensis）と関係のある抗体が含まれるが、それらに限定されない。
【０１３７】
バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）を含むバチルス属；ビブリオ属、例えば、コレラ菌（V. cholerae）；エッシェリキア属（Escherichia）、例えば、毒素性大腸菌（Enterotoxigenic E. coli）；シゲラ属（Shigella）、例えば、赤痢菌（S. dysenteriae）；サルモネラ属、例えば、チフス菌（S. typhi）；マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、例えば、結核菌（M. tuberculosis）、ハンセン菌（M. leprae）；クロストリジウム属、例えば、ボツリヌス菌、破傷風菌（C. tetani）、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）、ウェルシュ菌（C.perfringens）；コリネバクテリウム属（Cornyebacterium）、例えば、ジフテリア菌（C. diphtheriae）；連鎖球菌（Streptococcus）、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）；ブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌；ヘモフィルス属、例えば、インフルエンザキン；ナイセリア属（Neisseria）、例えば、髄膜炎菌（N. meningitidis）、淋菌（N. gonorrhoeae）；エルシニア属（Yersinia）、例えば、エルシニア・ランブル（Y. lamblia）、ペスト菌（Y. pestis）；シュードモナス属、例えば、緑膿菌、シュードモナス・プチダ（P. putida）；クラミジア属、例えば、クラミジアトラコマチス（C. trachomatis）；ボルデテラ属、例えば、百日咳菌（B. pertussis）；トレポネーマ属、例えば、梅毒トレポネーマ（T Palladium）；炭疽菌（B. anthracis）、ペスト菌（Y. pestis）、ブルセラ種、野兎病菌（F. tularensis）、鼻疽菌（B. mallei）、類鼻疽菌（B .pseudomallei）、クロストリジウム・ボツリナム、サルモネラ種、ビブリオ菌毒素Ｂ（SEB V. cholerae toxin B）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、リステア種、トリコスポロン菌（Trichosporon beigelii）、ロドトウラ種（Rhodotorula species）、凝集性酵母（Hansenula anomala）、エンテロバクター種（Enterobacter sp.）、クレブシエラ種（Klebsiella sp.）、リステリア種（Listeria sp.）、マイコプラズマ種（Mycoplasma sp.）などを含むが、これらに限定されない、病原性および非病原性の原核生物のような適する細菌に対する抗体を含む、原核抗原に対する抗体はまた、有用である。
【０１３８】
いくつかの局面において、抗体は、ウイルス感染に向けられる；これらのウイルスには、オルソミクソウイルス（orthomyxoviruse）（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミキソウイルス（paramyxoviruse）（例えば、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば、風疹ウイルス（rubella virus））、パルボウイルス、ポックスウイルス（例えば、痘瘡ウイルス（variola virus）、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、肝炎ウイルス（Ａ、ＢおよびＣを含む）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、水痘瘡ウイルス（varicella zoster virus）、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス）、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス（rabies virus））、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ ＩおよびＩＩを含む）、パポバウイルス（例えば、パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス、ならびにピコルナウイルスなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
最適化ＩｇＧ変異体特性
本発明はまた、様々な治療的に関連のある特性について最適化されるＩｇＧ変異体を提供する。１個以上の最適化特性を示すように組み込まれるまたは予測されるＩｇＧ変異体は、本明細書中、“最適化ＩｇＧ変異体”と称される。最適化され得る最も好ましい特性には、ＦｃＲｎに対する増大または減少した親和性、および増加または減少したインビボ半減期が含まれるが、これらに限定されない。適する態様には、低ｐＨ、例えばエンドソームと関係するｐＨ、例えばｐＨ６．０にてＦｃＲｎに対して増加した結合親和性を示すが、一方、抗ｐＨ、例えば７．４にて対応する増加した結合親和性を示さず、エンドソーム中により取り込まれ得るが、放出速度は通常通りである抗体が含まれる。同様に、修飾されたＦｃＲｎ結合を有するこれらの抗体は、所望によりＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ１１／１７４，２８７、１１／１２４，６４０、１０／８２２，２３１、１０／６７２，２８０、１０／３７９，３９２、および出願番号第＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿号を有する２００５年１０月２１日出願の発明の名称「IgG Immunoglobulin variants with optimized effector function」の特許出願に概略を説明する通り、修飾されたＦｃγＲ結合のような他の所望の特性を有し得る。すなわち、最適化特性にはまた、ＦｃγＲに対する増加または減少した親和性が含まれるが、それに限定されない。１つの任意の態様において、ＩｇＧ変異体は、ＦｃＲｎ結合プロフィールに加えて、ヒト活性化ＦｃγＲ、好ましくはＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した親和性を有するように最適化される。さらに他の任意の別の態様において、ＩｇＧ変異体は、ヒト阻害性受容体 ＦｃγＲＩＩｂに対して減少した親和性を有するように最適化される。すなわち、特定の態様は、ＦｃＲｎに対する増加した結合、およびＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した結合を示す抗体の使用を包含する。他の態様は、ＦｃＲｎに対する増加した結合、およびＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した結合を示す抗体の使用を利用する。これらの態様は、ヒトにおける増大した治療特性、例えば増大したエフェクター機能およびより大きな抗癌効果を有するＩｇＧポリペプチドを提供することが予想される。別の態様において、ＩｇＧ変異体は、ＦｃＲｎに対する増加または減少した親和性、およびＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂを含むが、これらに限定されないヒトＦｃγＲ（それらのアレル変異体を含む）に対する増加または減少した親和性を有するように最適化される。これらの態様は、ヒトにおける増強された治療特性、例えば増加した血清半減期および減少したエフェクター機能を有するＩｇＧポリペプチドを提供することが予定される。他の態様において、ＩｇＧ変異体は、ＦｃＲｎに対して増大した親和性、および１個以上のＦｃγＲに対して増大した親和性を提供するが、１個以上の他のＦｃγＲに対して減少した親和性を提供する。例えば、ＩｇＧ変異体は、ＦｃＲｎおよびＦｃγＲＩＩＩａに対して増大した結合を有し得るが、ＦｃγＲＩＩｂに対して減少した結合を有し得る。あるいは、ＩｇＧ変異体は、ＦｃＲｎおよびＦｃγＲに対して減少した結合を有し得る。他の態様において、ＩｇＧ変異体は、ＦｃＲｎに対して減少した親和性、およびＦｃγＲＩＩｂに対して増大した親和性を有し得るが、１個以上の活性化ＦｃγＲに対して減少した親和性を有し得る。さらに他の態様において、ＩｇＧ変異体は、増加した血清半減期および減少したエフェクター機能を有し得る。
【０１４０】
好ましい態様は、ヒトＦｃＲｎおよびＦｃγＲに対する結合の最適化を含むが、別の態様において、ＩｇＧ変異体は、げっ歯動物および非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されない非ヒト生物由来のＦｃＲｎおよびＦｃγＲに対して増強または減少した親和性を有する。非ヒトＦｃＲｎに対する結合を最適化されるＩｇＧ変異体は、実験で使用され得る。例えば、マウスモデルは、効果、毒性、および特定の薬剤候補についての薬物動態のような特性の検査を可能にする様々な疾患に利用可能である。当技術分野で公知の通り、異種移植と称される過程であるが、癌細胞を、ヒト癌を模倣するためにマウスに移植するかまたは注入し得る。ＦｃＲｎに対して最適化されるＩｇＧ変異体を含むＩｇＧ変異体の試験は、タンパク質の除去特性、その除去機序などに関する有益な情報を提供し得る。ＩｇＧ変異体はまた、グリコシル化形態の機能性および／または溶解特性を増大するために最適化され得る。Ｆｃリガンドには、ＦｃＲｎ、ＦｃγＲｓ、Ｃ１ｑ、ならびにプロテインＡおよびＧが含まれるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギまたはサルを含むが、これらに限定されない何れかの起源、好ましくはヒト由来であり得る。別の好ましい態様において、ＩｇＧ変異体は、親ＩｇＧ変異体のグリコシル化形態よりも安定かつ／または溶解性になるように最適化される。
【０１４１】
ＩｇＧ変異体は、補体タンパク質、およびＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）を含むが、これらに限定されないＦｃＲｎおよびＦｃγＲ以外のＦｃリガンドと相互作用するように調節される修飾を含み得る。ＦｃＲＨには、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２、ＦｃＲＨ３、ＦｃＲＨ４、ＦｃＲＨ５、およびＦｃＲＨ６が含まれるが、これらに限定されない（Davis et al., 2002, Immunol. Reviews 190:123−136、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１４２】
好ましくは、ＩｇＧ変異体のＦｃリガンド特異性は、その治療的有用性を決定し得る。治療目的のための特定のＩｇＧ変異体の有用性は、標的抗原のエピトープまたは形態ならびに処置される疾患または適応症に依存して変わる。標的および適応症のほとんどについて、増強したＦｃＲｎ結合は、増強したＦｃＲｎ結合が、血清半減期の増加をもたらし得るために、好ましいであろう。より長時間の血清半減期は、治療剤のより低頻度の投与またはより低い投与量を可能にする。このことは、治療剤が、反復投与が必要とされる適応症に応じて与えられるとき、特に好ましい。いくつかの標的および適応症に関して、減少したＦｃＲｎ親和性は、好ましいであろう。これは、増加した排除および減少した血清半減期を有する変異体Ｆｃが、例えば造影剤または放射線治療剤として用いられるＦｃポリペプチドにおいて、望ましいとき、特に好ましいであろう。
【０１４３】
使用され得るＩｇＧ変異体には、増大した活性化ＦｃγＲおよび／または抑制性ＦｃγＲに対する減少した親和性を有するＦｃＲｎに対する増大した親和性を提供するＩｇＧ変異体が含まれる。いくつかの標的および適応症について、異なる活性化ＦｃγＲに対する異なる選択性を提供するＩｇＧ変異体を利用することは、さらに効果的であり得る；例えば、いくつかの場合に、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した結合は、望ましいかもしれないが、ＦｃγＲＩには望ましくなく、一方、他の場合に、ＦｃγＲＩＩａのみに対する増加した結合は、好ましいであろう。任意の標的および適応症について、ＦｃＲｎ結合を変化し、ＦｃγＲにより仲介されるおよび補体により仲介されるエフェクター機能の両方を増強するＩｇＧ変異体を利用することは、好ましいかもしれないが、一方、他の場合について、ＦｃＲｎ結合または血清半減期、およびＦｃγＲにより仲介されるまたは補体により仲介されるエフェクター機能のどちらか、を増大するＩｇＧ変異体を利用するのが都合よいかもしれない。いくつかの標的または癌適応症について、１個以上のエフェクター機能を、例えばＣ１ｑ、１個以上のＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、または１個以上の他のＦｃリガンドへの結合をノックアウトすることにより減少または改変することは、都合よいかもしれない。他の標的および適応症について、活性化ＦｃγＲへのＷＴレベル、減少または除去された結合であるが、阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの増大した結合を提供するＩｇＧ変異体を利用することが好ましいかもしれない。このことは、例えば、ＩｇＧ変異体の目的が、炎症疾患または自己免疫性疾患を阻害すること、またはいくつかの方法で免疫を調節することであるとき、特に有用であり得る。自己免疫性疾患が一般的に長期にわたり、処置が反復投与で行われるため、増加した半減期および増加したＦｃＲｎ結合を有するＦｃ変異体でのその処置は、特に好ましい。
【０１４４】
修飾は、ＩｇＧ安定性、溶解性、機能性、または臨床用途を改善するために行われ得る。好ましい態様において、ＩｇＧ変異体は、ヒトにおける免疫原性を減少するための修飾を含み得る。最も好ましい態様において、ＩｇＧ変異体の免疫原性を、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０（参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の方法を用いて減少させる。別の態様において、ＩｇＧ変異体は、ヒト化される（Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１４５】
ＩｇＧ変異体は、免疫原性を減少する修飾を含み得る。免疫原性を減少する修飾には、親配列からＭＨＣタンパク質に誘導された処理ペプチドの結合を減少する修飾が含まれ得る。例えば、アミノ酸修飾は、どんな一般的なＭＨＣアレルにも高親和性で結合することが予測される免疫エピトープがないか、またはそれが最小数となるように、作製されるだろう。タンパク質配列中のＭＨＣ結合エピトープを同定するいくつかの方法が、当技術分野で公知であり、ＩｇＧ変異体中のエピトープを数えるために用い得る。例えば、ＷＯ９８／５２９７６；ＷＯ０２／０７９２３２；ＷＯ００／３３１７；ＵＳＳＮ０９／９０３，３７８；ＵＳＳＮ１０／０３９，１７０；ＵＳＳＮ６０／２２２，６９７；ＵＳＳＮ１０／７５４，２９６；ＰＣＴ ＷＯ ０１／２１８２３；および、ＰＣＴ ＷＯ ０２／００１６５；Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432−439；Mallios, 2001, Bioinformatics 17: 942−948；Sturniolo et al., 1999, Nature Biotech. 17: 555−561；WO 98/59244；WO 02/069232；WO 02/77187；Marshall et al., 1995, J. Immunol. 154: 5927−5933；and Hammer et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 2353−2358（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を参照のこと。配列に基づく情報は、所定のペプチド−ＭＨＣ相互作用の結合スコアを決定するために用い得る（例えば、Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432−439；Mallios, 2001, Bioinformatics 17: p942−948；Sturniolo et. al., 1999, Nature Biotech. 17: 555−561を参照のこと、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１４６】
ＩｇＧ変異体の作製
本発明の変異体を、様々な手段で設計することができる。本明細書に記載の通り、変異とは、挿入、欠失、置換、他の修飾、またはこれらの組み合わせおよび他の変化であり得る。本発明の特定の新しい態様は、ＦｃポリペプチドのＦｃリガンドへの結合を改善または減少する挿入または欠失の設計である。本明細書に記載の通り、挿入または欠失は、ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性を増加または減少するように作製され得る。挿入および欠失は、合理的な方法により、または無作為または半無作為のライブラリー作製またはスクリーニングのような、使用または無作為要素を含む方法により、設計され得る。別の態様において、置換とは、ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎへの親和性を増加または減少することを開示する。
【０１４７】
挿入および欠失
変異体Ｆｃポリペプチドを、Ｆｃポリペプチド中の位置で親アミノ酸の代わりに変異体アミノ酸を置換することにより作製することができる。Ｆｃポリペプチド中の１個以上のアミノ酸を変異体アミノ酸に置換することにより、その位置で側鎖は変えられる。最も有用な置換は、Ｆｃ側鎖を変えることによりＦｃ特性を修飾する。置換された側鎖は、Ｆｃ機能または特性と関係するＦｃ結合パートナーと直接的または間接的に相互作用し得る。少なくとも１個の置換は、親Ｆｃポリペプチドの１個以上の側鎖の共有構造を変える。
【０１４８】
あるいは、変異体Ｆｃポリペプチドを、親Ｆｃポリペプチドの骨格の共有構造を変えることにより作製することができる。タンパク質中の骨格原子は、ペプチド窒素、アルファ炭素、カルボニルまたはペプチド炭素およびカルボニル酸素である。骨格の共有構造の変化は、Ｆｃポリペプチドの特性を変えるさらなる方法を提供する。Ｆｃ骨格の共有構造は、骨格中への原子の付加、例えば１個以上のアミノ酸の挿入により、または骨格からの原子の除去、例えば１個以上のアミノ酸の削除により、変えられ得る。骨格の共有構造はまた、骨格の個々の原子を他の原子に変えることにより変えられ得る（Deechongkit et al., J Am Chem Soc. 2004. 126(51):16762−71、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。当技術分野で公知かつ本明細書に説明する通り、Ｆｃポリペプチドのアミノ酸の挿入または欠失は、ＦｃポリペプチドをコードするＤＮＡ中の対応するヌクレオチドを挿入または欠失することにより行うことができる。あるいは、当技術分野で公知の通り、アミノ酸の挿入または欠失を、Ｆｃポリペプチドの合成中に行うことができる。
【０１４９】
１個以上の結合パートナー（例えば、ＦｃガンマＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ）を有するＦｃポリペプチドの相互作用を変えるアミノ酸の挿入または欠失の設計は、Ｆｃポリペプチドとその結合パートナーの複合体の構造を考慮することにより行うことができる。あまり好ましくない態様において、設計を、Ｆｃポリペプチドの構造、および結合パートナーの結合に関与するＦｃ領域についての情報を考慮することにより行うことができる。この情報は、変異誘発実験、ファージ提示実験、相同性比較、コンピューターモデリングまたは他の手段により得られる。
【０１５０】
アミノ酸配列中、Ｆｃ結合相互作用に影響するが、Ｆｃポリペプチドの全体構造、安定性、発現または使用に影響しない挿入または欠失に好ましい位置は、Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー相互作用に関与するループ中である。ＦｃポリペプチドへのＦｃＲｎ結合を改変するために、２４４−２５７位、２７９−２８４位、３０７−３１７位、３８３−３９０位、および４２８−４３５位が、挿入または欠失のループ位置として好ましい（KabaらのＥＵ ｉｎｄｅｘによる番号、Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379−383；Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867−877、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ＦｃポリペプチドへのＦｃガンマ受容体結合を改変するために、２２９−２３９位、２６６−２７３位、２９４−２９９位、および３２４−３３１位が、挿入または欠失のループ位置として好ましい（KabaらのＥＵ ｉｎｄｅｘによる番号、PDB code 1E4K.pdb Sondermann et al. Nature. 2000 406:267、全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ループは、アルファへリックスまたはベータシート構造に関与しないポリペプチドの領域である。ループ位置は、アルファへリックスまたはベータ構造のどちらでもない位置である（van Holde, Johnson and Ho. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey 1998, Chapter 1 pp2−67、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。ループ位置は、骨格原子が、典型的に、アルファへリックスおよびベータシートの骨格原子と比較して、よりフレキシブルまたは水素結合にあまり関与しないために、好ましい。それ故に、１個以上のアミノ酸の挿入または欠失によるループの伸張または短縮は、安定性、発現または他の問題を含む、Ｆｃポリペプチドの大きな破壊的変化をもたらす可能性は少ない。
【０１５１】
挿入および欠失は、ポリペプチドの長さを変えるために用いることができる。例えば、ループ領域中、ループの長さの変化は、ループの変化したフレキシビリティおよび立体配置エントロピーをもたらす。ループ中の挿入は、一般的に、ループの立体配置エントロピーを増加し得、それは、Ｂｏｌｔｚｍａｎ定数と可能性のある立体配置の数の自然対数を乗じて定義され得る（van Holde, Johnson and Ho. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey 1998, pp78、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。少なくとも１個のアミノ酸のポリペプチドへの挿入により、ポリペプチドが利用可能な立体配置の全体数は増加する。これらのさらなる立体配置は、Ｆｃポリペプチドが、Ｆｃ結合タンパク質を結合するさらなる立体構造の１つを利用し得るため、好ましいＦｃ／Ｆｃ−結合パートナー相互作用を形成するのに有益であり得る。この場合において、挿入は、Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー相互作用の強化をもたらし得る。さらなる立体配置が、結合表面に用いられないとき、挿入は、該さらなる立体配置が、結合に適する立体配置と競合するかもしれないため、Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー相互作用の弱化をもたらし得る。同様に、ポリペプチド断片の欠失はまた、Ｆｃ／Ｆｃ結合−パートナー相互作用の強化または弱化のどちらかをもたらし得る。骨格構造の数の可能性を減少する断片の欠失が、結合に適する立体配置を排除するとき、欠失は、Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー相互作用の弱化をもたらし得る。欠失が、結合に適する立体配置を排除しないとき、欠失は、該欠失が、結合に適する立体配置と競合する立体配置を排除し得るため、Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー相互作用の強化をもたらし得る。
【０１５２】
挿入および欠失を、Ｆｃポリペプチドにおけるアミノ酸の位置および方向の改変に用いることができる。挿入および欠失が、骨格の共有構造中に変化をもたらすため、それらは、必然的に骨格原子の位置の変化をもたらす。図７は、３つの異なる骨格中、いくつかのループ断片での骨格位置（Ｌ１からＬ４と表示する）を比較する。参照骨格構造は、４つのループ断片を含むが、一方、欠失骨格は、断片Ｌ１およびその前の付加的断片、すなわち、Ｎ末端から断片Ｌ１までを含む挿入断片を欠く。欠失および挿入は、挿入または欠失部位の近くで骨格構造中に最大の変化をもたらす。ループのＮ末端近くの断片、例えば断片Ｌ１の欠失によりループが短縮され、残りの断片がループＮ末端近くにその位置を移動する。これは、Ｌ２断片をＬ１断片の従前の位置方向に、かつループＮ末端方向に移動させる効果を有する。このＬ２断片のＬ１断片方向への位置変化は、Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー複合体の結合を強化することができ、Ｌ２中に位置するアミノ酸または複数のアミノ酸が、Ｌ１中に位置するとき、Ｆｃ−結合パートナーと好ましい相互作用を作製することを示唆する先の情報があるとき、好ましい。例えば、Ｌ２が、アラニンおよびチロシンを含み、アラニンおよびチロシンの２個のＬ１アミノ酸の置換が、既に増加した結合を有するＦｃ変異体をもたらすとき、Ｌ１の欠失は、Ｆｃ−結合パートナーに対して増加した親和性を有するＦｃ変異体を作製し得る。
【０１５３】
同様に、ループのＮ末端側でのＦｃポリペプチドへのポリペプチド断片の挿入は、ループのＣ末端側へのループ断片の位置の移動をもたらす。図７において、その前への、すなわち、Ｎ末端から断片Ｌ１までへの１個以上のアミノ酸の挿入は、ループのＣ末端方向へのＬ１断片の移動を含む骨格立体配置を変化させる。このタイプの挿入は、該挿入が、Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー相互作用の強化をもたらし得るため、断片Ｌ１中に位置するアミノ酸が、Ｌ２位置に位置するとき、好ましい相互作用を作製することが公知であるとき、好ましい。Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー相互作用の弱化が望ましいとき、該挿入は、新しい位置への好ましくないアミノ酸の移動に用いることができる。前記挿入、欠失および参照断片（図７中、Ｌ１からＬ４）は、Ｆｃポリペプチド中、１個または２個以上のアミノ酸であり得る。
【０１５４】
あるいは、挿入または欠失は、ループのＮ末端での挿入または欠失と同様の方法を、ループのＣ末端に用いることができる。ループＣ末端への挿入は、ループＮ末端方向への、Ｎ末端の挿入位置の移動を導くかもしれない。ループＣ末端での欠失は、ループＣ末端方向への、Ｎ末端の欠失位置の移動を導くかもしれない。ループのＮ末端またはＣ末端での挿入または欠失の使用の選択は、ループ中に位置するアミノ酸、望まれる増加または減少したＦｃ／Ｆｃ−結合パートナー親和性、および望ましい位置移動に基づく。
【０１５５】
挿入または欠失は、ループ、アルファへリックス、およびベータシート領域を含む、Ｆｃポリペプチドのいずれかの領域で用いることができる。挿入および欠失に好ましい位置には、アルファへリックスまたはベータシート領域ではないループ領域が含まれる。ループは、それらが、一般的に、アルファへリックスまたはベータシートよりも骨格において変更を受けるため、好ましい。タンパク質／タンパク質相互作用の強化をもたらす挿入または欠失に特に好ましい位置は、ループのＮ末端またはＣ末端である。ループ側鎖が、Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー相互作用に関与するとき、末端での挿入または欠失は、結合相互作用における大きな不利益な変化をもたらしにくい。ループの正確な中心内の欠失は、Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー結合部分における重要な残基の除去をもたらしやすく、ループの正確な中心内の挿入は、Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー結合部分における好ましくない相互作用を作製しやすい。欠失または挿入される残基の数は、望まれる骨格変化のサイズにより決定され得、例えば、１５個未満の残基の挿入または欠失が好ましく、１０個未満の残基の挿入または欠失がより好ましく、５個未満の残基の挿入または欠失が最も好ましい。
【０１５６】
Ｆｃ欠失変異体の位置およびサイズが設計されると、ポリペプチド配列全体が、完全に決定され、ポリペプチドが、当技術分野で公知の方法により構築され得る。
【０１５７】
しかしながら、Ｆｃ挿入変異体は、挿入すべき少なくとも１個のアミノ酸の配列を設計するさらなる段階を有する。Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓを含む極性残基の挿入は、Ｆｃポリペプチド中で露出されると予期される位置で好ましい。Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＡｌａを含むより小さいアミノ酸は、小さいサイズが、Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー相互作用の立体的干渉をもたらしにくいため好ましい。ＳｅｒおよびＴｈｒはまた、Ｆｃ−結合パートナー上の原子と水素結合するための能力を有する。
【０１５８】
挿入はまた、挿入されたポリペプチドが、Ｆｃ／Ｆｃ−結合パートナー結合の強化が望ましいとき、望まれ得るため、Ｆｃ−結合パートナーと好ましい相互作用を作製するように設計され得る、別のフレキシビリティを有する。骨格挿入の長さは、挿入すべき単純な一般的配列を有する変異体骨格をモデル化することにより決定することができる。例えば、異なる長さのポリセリン、ポリグリシンまたはポリアラニン挿入が、構築およびモデル化され得る。モデル化は、挿入を含む相同体の公知の三次元構造に基づく相同性モデリングを含む様々な方法により、およびＭＯＤＥＬＬＥＲ（M.A. Marti-Renom et al. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29, 291-325, 2000）およびＲＯＳＥＴＴＡ（Kuhlman et al.(2003). Science 302, 1364-8）（両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を含むコンピューターによるモデリングにより行われ得る。典型的に、様々な骨格構造は、初めに作製され、最終的な骨格構造は、側鎖の同一性が確立された後に決定され得る。側鎖は、ＰＤＡ（登録商標）アルゴリズム（ＵＳ６，１８８，９６５；６，２６９，３１２；６，４０３，３１２；６，８０１，８６１；６，８０４，６１１；６，７９２，３５６、６，９５０，７５４、およびＵＳＳＮ０９／７８２，００４；０９／９２７，７９０；１０／１０１，４９９；１０／６６６，３０７；１０／６６６３１１；１０／２１８，１０２、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）により設計され得る。
【０１５９】
挿入および欠失は、本明細書に記載の方法によりＦｃポリペプチドとは別の何れかのポリペプチド中に設計することができる。例えば、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるＡＰＲＩＬ中の挿入または欠失は、その三次元構造を用いて設計することができる（PDB code 1XU1.pdb, Hymowitz, et al.(2005) J. Biol. Chem. 280:7218、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。挿入または欠失は、その受容体であるＴＡＣＩへのＡＰＲＩＬ結合を増加するように設計され得る。挿入または欠失部位に好ましいループ残基は、残基Ｓｅｒ１１８−Ｖａｌ１２４、Ａｓｐ１６４−Ｐｈｅ１６７、Ｐｒｏ１９２−Ａｌａ１９８、Ｐｒｏ２２１−Ｌｙｓ２２６である。これらのループは、ＡＰＲＩＬ／ＴＡＣＩ複合体中のＴＡＣＩと相互作用し、結合を仲介する。
【０１６０】
変異体を含むポリペプチド
ＩｇＧ変異体は、ヒトＩｇＧ配列に基づいていてよく、故に、ヒトＩｇＧ配列は、他の配列が比較される、他の生物、例えばげっ歯動物および霊長類由来の配列を含むが、それらに限定されない“ベース”配列として用いられる。ＩｇＧ変異体はまた、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭなどのような他の免疫グロブリンクラス由来の配列を含み得る。ＩｇＧ変異体が、ある親ＩｇＧに関して作製されるが、該変異体は、別の、第二の親ＩｇＧに関して作製または“転換”され得ることが考慮される。これは、一般的に、ＩｇＧの配列間の配列または構造同一性に基づき、第一および第二のＩｇＧ間の“等価”または“対応する”残基および置換基を決定することにより行われる。相同性を確立するために、本明細書に概説する第一のＩｇＧのアミノ酸配列を、第二のＩｇＧの配列と直接比較する。アライメントを維持するために必要な挿入および欠失を考慮し（すなわち、任意の欠失および挿入による保存残基の除去を避けて）、当技術分野で公知の１個以上の相同性アライメントプログラムを用いて（例えば、種間で保存された残基を用いて）配列をアライメント後、第一のＩｇＧ変異体の初めの配列において特定のアミノ酸と等価の残基が定義される。保存残基のアライメントは、好ましくはかかる残基の１００％を保存すべきである。しかしながら、保存残基の７５％以上またはわずか５０％程度のアライメントも、等価残基を定義するのに適する。等価残基はまた、構造が決定されているＩｇＧの三次構造レベルで、第一および第二ＩｇＧ間の構造的相同性を決定することにより定義され得る。この場合に、等価残基は、親または前駆体の特定のアミノ酸残基の２個以上の主鎖原子（ＮとＮ、ＣＡとＣＡ、ＣとＣおよびＯとＯ）の原子座標が、アライメント後、０．１３ｎｍ以内、好ましくは０．１ｎｍであると定義される。アライメントは、ベストモデルが、タンパク質の非水素タンパク質原子の原子座標の最大重複を与えるような方向および位置付けされた後、得られる。等価または対応する残基をどのように決定するかに関わらず、かつＩｇＧが作製される親ＩｇＧの同一性に関わらず、伝えられるべきであるとされていることは、見出されたＩｇＧ変異体を、重要な配列またはＩｇＧ変異体と構造的相同性を有する何れかの第二の親ＩｇＧに改変することができることである。故に、例えば、変異体抗体を、上記の方法または等価残基を決定するための他の方法を用いることにより作製するとき（ここで、親抗体はヒトＩｇＧ１である。）、変異体抗体は、異なる抗原と結合する別のＩｇＧ１親抗体、ヒトＩｇＧ２親抗体、ヒトＩｇＡ親抗体、マウスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ親抗体などに改変され得る。さらに、上記の通り、親ＩｇＧ変異体においては、ＩｇＧ変異体を他の親ＩｇＧに転換する能力に影響しない。
【０１６１】
ＩｇＧ変異体を作製、産生およびスクリーニングするための方法を提供する。記載の方法は、何れかの特定の用途または操作理論にとらわれることを意味しない。むしろ、提供される方法は、一般的に、１個以上のＩｇＧ変異体が、最適化されたエフェクター機能を有するＩｇＧ変異体を実験的に得るために、作製、産生、およびスクリーニングされ得ることを説明することを意図する。様々な方法が、抗体の設計、産生、および試験、ならびにタンパク質変異体について、ＵＳＳＮ１０／７５４，２９６、およびＵＳＳＮ１０／６７２，２８０（両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載される。
【０１６２】
様々なタンパク質作製方法が、最適化したエフェクター機能を有するＩｇＧ変異体を設計するために用いられ得る。１つの態様において、構造に基づく作製方法を用いることができ、ここで利用可能な構造情報を、置換、挿入または欠失を誘導するために用いる。好ましい態様において、コンピューターを用いたスクリーニング法を用いることができ、ここで置換を、コンピューターによる計算においてそれらのエネルギー的適合に基づき設計する。例えばＵＳＳＮ１０／７５４，２９６およびＵＳＳＮ１０／６７２，２８０、ならびに本明細書中に引用される文献（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を参照のこと。
【０１６３】
配列のアライメントを、表示の位置での置換を誘導するために用いることができる。当業者は、配列情報の使用が、タンパク質構造に有害な可能性のある置換の導入を阻止し得ることを理解するだろう。配列の源は、様々であってよく、Kabatデータベース（Northwestern University）；Johnson ＆ Wu, 2001, Nucleic Acids Res. 29:205−206；Johnson ＆ Wu, 2000, Nucleic Acids Res. 28:214−218）、ＩＭＧＴデータベース（ＩＭＧＴ、the international ImMunoGeneTics information system（登録商標）；Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27:209−212；Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Res. 28:219−221；Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29:207−209；Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:307−310)、およびＶＢＡＳＥ（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を含むが、これらに限定されない、１個以上の公知のデータベースを含む。抗体配列情報を、哺乳動物を含むが、これに限定されない何れかの生物由来の、生殖細胞系配列または天然に生じる抗体の配列の配列アライメントから得る、蓄積する、および／または作製することができる。当業者は、ヒトまたは実質的にヒトである配列の使用が、ヒトに投与するとき、あまり免疫原性ではないという利点をさらに有し得ることを理解するだろう。より一般的な核酸またはタンパク質データベース、すなわち、特に抗体というわけではない他のデータベースには、SwissProt、GenBank、Entrez、およびEMBLヌクレオチド配列データベースが含まれるが、これらに限定されない。整列配列には、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、および／またはＣＬ配列が含まれ得る。当技術分野で公知の多数の配列に基づくアライメントプログラムおよび方法が存在し、これらは全て、配列アライメントの作製における使用できる。
【０１６４】
あるいは、無作為的または半無作為的変異誘導法を、所望の位置にアミノ酸修飾を作製するために用いることができる。これらの場合において、位置は無作為に選択され、またはアミノ酸変化は、単純な法則を用いて作製される。例えば、全ての残基を、アラニンに変化することができ、それはアラニンスクリーニングと称される。かかる方法は、より高レベルの配列多様性をスクリーニングする選択方法を用いる、より高度な工学的方法と併用され得る。当技術分野で公知の通り、例えば、下記に記載のファージ提示法、リボソーム提示法、細胞表面提示法などのような提示技術を含む、かかる方法に使用することができる多様な選択技術が存在する。
【０１６５】
ＩｇＧ変異体の作製およびスクリーニング方法は、当技術分野で公知である。抗体分子生物学、発現、精製、およびスクリーニングのための一般的方法は、Antibody Engineering、Duebel ＆ Kontermann編集, Springer−Verlag, Heidelberg, 2001；および、Hayhurst ＆ Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683−689；Maynard ＆ Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339−76に記載される。また、ＵＳＳＮ１０／７５４，２９６；ＵＳＳＮ１０／６７２，２８０；および、ＵＳＳＮ１０／８２２，２３１；ならびに、１１／１２４，６２０（全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の方法を参照のこと。
【０１６６】
本発明の好ましい変異体には、図８に見られるものが含まれる。あるいは、本発明の好ましい変異体には、図９に見られるものが含まれる。さらに、あるいは、本発明の好ましい変異体には、図１０に見られるものが含まれる。本発明の特に好ましい変異体には、Ｇ３８５ＨおよびＮ４３４Ｙが含まれる。本発明の最も好ましい変異体には、２５７Ｃ、２５７Ｍ、２５７Ｌ、２５７Ｎ、２５７Ｙ、２７９Ｑ、２７９Ｙ、３０８Ｆおよび３０８Ｙが含まれる。
【０１６７】
ＩｇＧ変異体の作製
ＩｇＧ変異体を、当技術分野で公知の何れかの方法により作製することができる。１つの態様において、ＩｇＧ変異体配列を、メンバー配列をコードし、それ故に、要すれば宿主細胞中にクローニングされ、発現され、そして分析され得る核酸を作製するために用いる。これらの実施を、公知の方法、およびMolecular Cloning−A Laboratory Manual, 3rd Ed.（Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001）、およびCurrent Protocols in Molecular Biology（John Wiley ＆ Sons）（両方とも、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載の、使用され得る様々な方法を用いて行う。ＩｇＧ変異体をコードする核酸を、タンパク質を発現するために、発現ベクター中に挿入することができる。発現ベクターは、典型的に、作動可能に連結した、すなわち、機能的に関係して挿入されたタンパク質を、制御または調節配列、選択可能マーカー、何れかの融合パートナー、および／またはさらなる要素と共に含む。ＩｇＧ変異体は、タンパク質の発現を誘導または引き起こすのに適当な条件下で、ＩｇＧ変異体をコードする核酸を含む、核酸、好ましくは発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養することにより作製され得る。哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞および酵母を含むが、これらに限定されない多様な適当な宿主細胞を、用いることができる。例えば、使用され得る多様な細胞系は、ＡＴＣＣ細胞系カタログ（American Type Culture Collectionにより利用可能、参照によりその全体が本明細書中に包含される）に記載される。宿主細胞中に外来の核酸を導入する方法は、当技術分野で公知であり、用いる宿主細胞により異なり得る。
【０１６８】
好ましい態様において、ＩｇＧ変異体は、発現後に精製および単離される。抗体は、当業者に公知の多様な方法で単離または精製され得る。標準的精製方法には、クロマトグラフ法、電気泳動法、免疫学的方法、沈殿法、透析法、ろ過法、濃縮法およびクロマト分画技術が含まれる。当技術分野で公知の通り、様々な天然タンパク質、例えば細菌タンパク質Ａ、Ｇ、およびＬが抗体に結合し、これらのタンパク質は、精製で使用され得る。しばしば、精製は、特定の融合パートナーにより可能であり得る。例えば、タンパク質を、ＧＳＴ融合が用いられるときグルタチオン樹脂、Ｈｉｓタグが用いられるときＮｉ＋２親和性クロマトグラフィー、またはフラグタグが用いられるとき固定化抗フラグ抗体を用いて精製することができる。適する精製技術における一般的ガイダンスについては、Antibody Purification： Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer−Verlag, NY, 1994（参照によりその全体が本明細書中に包含される）を参照のこと。
【０１６９】
ＩｇＧ変異体のスクリーニング
ＩｇＧ変異体を、インビトロ分析、インビボおよび細胞に基づく分析、および選択技術を用いる方法を含むが、これらに限定されない多様な方法を用いてスクリーニングすることができる。自動化高性能スクリーニング技術を、スクリーニング方法に利用することができる。スクリーニングには、融合パートナーまたは標識、例えば免疫標識、同位体標識、または蛍光もしくは比色色素のような小分子標識の使用を用いることができる。
【０１７０】
好ましい態様において、ＩｇＧ変異体の機能的および／または生物物理的特徴を、インビトロ分析においてスクリーニングする。好ましい態様において、タンパク質を、機能性、例えばその反応を触媒する能力またはその標的に対するその結合親和性についてスクリーニングする。結合分析を、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動法）およびＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動法）に基づく分析、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ（増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ法）、シンチレーション近接分析、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）としても公知）、等温滴定熱量計、示差走査熱量計、ゲル電気泳動法、およびゲルろ過法を含むクロマトグラフィー法を含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の様々な方法を用いて行うことができる。これらおよび他の方法は、いくつかの融合パートナーまたは標識を利用し得る。分析には、発色標識、蛍光標識、発光標識、または同位体標識を含むが、これらに限定されない多様な検出方法を用いることができる。タンパク質の生物物理的特徴、例えば安定性および溶解性は、当技術分野で公知の様々な方法を用いてスクリーニングすることができる。タンパク質の安定性を、折りたたみ状態と非折りたたみ状態の間の熱力学的平衡を測定することにより決定し得る。例えば、ＩｇＧ変異体は、化学的変性剤、熱、またはｐＨを用いて非折りたたみ状態にでき、この遷移を、円偏光二色性分光法、蛍光分光法、吸光度分光法、ＮＭＲ分光法、熱量測定法、およびタンパク質分解法を含むが、これらに限定されない方法を用いて観察することができる。当業者に認められ得る通り、折りたたみおよび非折りたたみ遷移の動力学的パラメーターを、これらおよび他の技術を用いて観察することもできる。ＩｇＧ変異体の溶解性および全体的な構造的完全性を、当技術分野で公知の様々な方法を用いて定量的または定性的に決定することができる。ＩｇＧ変異体の生物物理的性質を特徴付けるための使用され得る方法には、ゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー、質量分析法、紫外吸光度分光法、蛍光分光法、円偏光二色性分光法、等温滴定熱量計、示差走査熱量計、分析的超遠心分離法、動的光散乱、タンパク質分解法、および架橋法、濁度測定法、フィルター遅延分析（filter retardation assay）、免疫分析、蛍光色素結合分析、タンパク質染色分析、顕微鏡法、およびＥＬＩＳＡまたは他の結合分析による会合体の検出が含まれる。Ｘ線結晶学的解析およびＮＭＲ分光法を用いる構造分析も、使用され得る。
【０１７１】
当技術分野で公知の通り、スクリーニング法の一部には、ライブラリーの好ましいメンバーを選択する方法が含まれる。該方法は、本明細書中、“選択方法”と称され、これらの方法は、ＩｇＧ変異体のスクリーニングに使用される。タンパク質ライブラリーを、選択方法を用いてスクリーニングするとき、好ましい、すなわちいくつかの選択基準を満たすライブラリーのメンバーのみが、増殖され、単離され、および／または観察される。認められ得る通り、最も適合する変異体のみが観察されるため、かかる方法は、ライブラリーメンバーの個々の適合性を分析する方法によりスクリーニング可能なものより大きなライブラリーのスクリーニングを可能にする。選択は、何らかの方法、技術、または、共有結合もしくは非共有結合する融合パートナー（その遺伝子型を有するタンパク質の表現型、すなわち、それをコードする核酸を有するタンパク質の機能）により可能である。例えば、選択方法としてのファージ提示法の使用は、ライブラリーメンバーと遺伝子ＩＩＩタンパク質の融合により可能である。この方法において、いくつかの基準、例えばタンパク質の標的との結合親和性を満たす、ＩｇＧ変異体の選択または単離はまた、それをコードする核酸を選択または単離する。単離すると、その後、Ｆｃ変異体をコードする遺伝子または複数の遺伝子を増幅することができる。パニング（panning）とも称されるこの単離および増幅方法を反復し、ライブラリー中での好ましいＩｇＧ変異体の富化を可能にし得る。付着した核酸の核酸配列決定は、最終的に、遺伝子の同定を可能にする。
【０１７２】
タンパク質ライブラリーのスクリーニングにおいて使用され得る様々な選択方法が、当技術分野で公知である。これらには、ファージ提示法（Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, CA, 1996；Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832−10838；Smith, 1985, Science 228:1315−1317）およびファージ感染の選択（Malmborg et al., 1997, J Mol Biol 273:544−551）、感染性ファージの選択（Krebber et al., 1997, J Mol Biol 268:619−630）、および遅延感染性パニング法（Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301:893−904）のようなその誘導法、細菌上（Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol 15:29−34；Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol 11:6−10；Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18:645−648；Jun et al., 1998, Nat Biotechnol 16:576−80）、酵母上（Boder ＆ Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430−44；Boder ＆ Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553−557）、および哺乳動物細胞上（Whitehorn et al., 1995, Bio／technology 13:1215−1219）の提示のような細胞表面提示法（Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395−399）、ならびにポリソーム提示（Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:9022−9026）、リボソーム提示（Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937−4942）、ｍＲＮＡ提示（Roberts ＆ Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297−12302；Nemoto et al., 1997, FEBS Lett 414:405−408）、およびリボソーム不活性化提示システム（Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc 124, 538−543）のようなインビトロ提示技術（Amstutz et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400−405）が含まれるが、これらに限定されない。本段落中の全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書中に包含される。
【０１７３】
使用され得る他の選択方法には、ペリプラズム発現およびサイトメトリースクリーニング（Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19:537−542、参照によりその全体が本明細書中に包含される）、タンパク質断片相補性分析（Johnsson ＆ Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10340−10344；Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:12141−12146、全て参照によりその全体が本明細書中に包含される）、および選択法（Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11723−11728、参照によりその全体が本明細書中に包含される）にて用いる酵母ツーハイブリッドスクリーニング（Fields ＆ Song, 1989, Nature 340:245−246、参照によりその全体が本明細書中に包含される）が含まれるが、それらに限定されないインビボ方法のような、提示に依存しない方法が含まれる。別の態様において、選択は、発現ベクターに特異的な配列に結合する融合パートナーにより可能であり、それ故に、融合パートナーと共有または非共有結合し、Ｆｃ変異体ライブラリーメンバーとそれらをコードする核酸とを関連付ける。例えば、ＵＳＳＮ０９／６４２，５７４；ＵＳＳＮ１０／０８０，３７６；ＵＳＳＮ０９／７９２，６３０；ＵＳＳＮ１０／０２３，２０８；ＵＳＳＮ０９／７９２，６２６；ＵＳＳＮ１０／０８２，６７１；ＵＳＳＮ０９／９５３，３５１；ＵＳＳＮ１０／０９７，１００；ＵＳＳＮ６０／３６６，６５８；ＰＣＴ ＷＯ ００／２２９０６；ＰＣＴ ＷＯ ０１／４９０５８；ＰＣＴ ＷＯ ０２／０４８５２；ＰＣＴ ＷＯ ０２／０４８５３；ＰＣＴ ＷＯ ０２／０８０２３；ＰＣＴ ＷＯ ０１／２８７０２；および、ＰＣＴ ＷＯ ０２／０７４６６(全て、参照によりその全体が本明細書中に包含される）は、そのような融合パートナーおよび使用され得る技術を記載する。別の態様において、インビボ選択は、タンパク質の発現が、いくらかの増殖、複製、または細胞に有利な生存を与えるとき、利用できる。
【０１７４】
“定向進化（directed evolution）”法と称される選択方法の一部は、時折新規の変異の挿入を含む、選択中の好ましい配列のメイティング（mating）またはブレッディング（breading）を含む方法である。当業者により認められる通り、定向進化法は、ライブラリーにおける最も好ましい配列の同定を容易にすることができ、スクリーニングされる配列の多様性を増加し得る。ＤＮＡシャフティング（ＰＣＴ ＷＯ ００／４２５６１ Ａ３；ＰＣＴ ＷＯ ０１／７０９４７ Ａ３）、エキソンシャフティング（ＵＳ６，３６５，３７７；Kolkman ＆ Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423−428）、ファミリーシャフティング（Crameri et al., 1998, Nature 391:288−291；US 6,376,246）、ＲＡＣＨＩＴＴＴＭ（Coco et al., 2001, Nat Biotechnol 19:354− 359；ＰＣＴ ＷＯ ０２／０６４６９）、インビトロ組み換えのＳＴＥＰおよびランダムプライム法（Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol 16:258−261；Shao et al., 1998, Nucleic Acids Res 26:681−683)、エキソヌクレアーゼにより仲介される遺伝子アセンブリー（ＵＳ６，３５２，８４２；ＵＳ６，３６１，９７４）、Ｇｅｎｅ Ｓｉｔｅ Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＴＭ（ＵＳ６，３５８，７０９）、Ｇｅｎｅ ＲｅａｓｓｅｍｂｌｙＴＭ（ＵＳ６，３５８，７０９）、ＳＣＲＡＴＣＨＹ（Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11248−11253)、ＤＮＡ断片化法（Kikuchi et al., Gene 236:159−167）、一本鎖ＤＮＡシャフティング（Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133−137）、およびＡＭＥシステムＴＭ定向進化タンパク質作工学技術（Applied Molecular Evolution）（ＵＳ５，８２４，５１４；ＵＳ５，８１７，４８３；ＵＳ５，８１４，４７６；ＵＳ５，７６３，１９２；ＵＳ５，７２３，３２３）を含むが、それらに限定されない、ＩｇＧ変異体をスクリーニングするための方法において使用され得る多様な定向進化法が、当技術分野で公知である。本段落に引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書中に包含される。
【０１７５】
好ましい態様において、ＩｇＧ変異体を、１個以上の細胞に基づく分析またはインビボ分析を用いてスクリーニングする。そのような分析のためには、精製または非精製タンパク質は典型的に、細胞が個々の変異体またはライブラリーに属する変異体の集合に暴露されるように、細胞外に添加される。これらの分析は、常にではないが一般的に、ＩｇＧの機能に基づく；すなわち、ＩｇＧの能力は、その標的に結合し、いくつかの生化学的事象、例えばエフェクター機能、リガンド／受容体結合阻害、アポトーシスなどを仲介する。かかる分析はしばしば、ＩｇＧに対する細胞の応答、例えば細胞生存、細胞死、細胞形態の変化、または例えば天然遺伝子またはレポーター遺伝子の細胞発現などの転写活性化、を観察することを含む。例えば、かかる分析は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、またはＣＤＣを誘導するＩｇＧ変異体の能力を測定することができる。いくつかの分析に関して、標的細胞に加えて、さらなる細胞または成分、例えば血清補体、または末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、マクロファージなどのエフェクター細胞を、添加する必要があり得る。かかる添加細胞は、何れかの生物、好ましくはヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサル由来であり得る。抗体は、標的を発現する任意の細胞系のアポトーシスを引き起こし得るか、またはその分析に添加される免疫細胞により標的細胞に対する攻撃を仲介し得る。細胞死または細胞生存を観察するための方法は、当技術分野で公知であり、それらには、色素、免疫化学的試薬、細胞化学的試薬、および放射性試薬の使用が包含される。例えば、カスパーゼ染色分析は、アポトーシスの観察を可能にし、放射性基質またはアラマーブルーのような蛍光色素の取り込みまたは放出は、細胞増殖または活性化の観察を可能にする。好ましい態様において、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＥｕＴＤＡに基づく細胞毒性分析（Perkin Elmer, MA）が用いられる。あるいは、標的細胞の死または損傷を、１個以上の天然の細胞内タンパク質、例えば乳酸脱水素酵素の放出を測定することにより観察することができる。転写活性化は、細胞に基づく分析において機能を分析するための方法にもなり得る。この場合、応答を、上方制御され得る天然の遺伝子またはタンパク質の分析により観察することができ、例えば任意のインターロイキンの放出を測定することができるか、あるいは、読み出し（readout）がレポーター構築物により可能となる。細胞に基づく分析はまた、タンパク質の存在に対する応答としての細胞の形態的変化の測定を含み得る。かかる分析のための細胞タイプは、原核または真核であってよく、当技術分野で公知の様々な細胞系を用いることができる。あるいは、細胞に基づくスクリーニングを、変異体をコードする核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトした細胞を用いて行う。すなわち、ＩｇＧ変異体を、細胞に対して細胞外に添加しない。例えば１つの態様において、細胞に基づくスクリーニングは、細胞表面提示法を利用する。細胞の表面上にＩｇＧ変異体の提示を可能にする融合パートナーを、用いることができる（Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395−399、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１７６】
好ましい態様において、ＩｇＧ変異体の免疫原性は、１個以上の細胞に基づく分析法を用いて実験的に決定される。いくつかの方法を、エピトープの実験的確認に用いることができる。好ましい態様において、エクスビボＴ細胞活性化分析を用いて、免疫原性を実験的に定量する。この方法において、適合供与側由来の抗原提示細胞およびナイーブＴ細胞を、１回以上、目的のペプチドまたは全体タンパク質で刺激する。その後、Ｔ細胞活性化を、多くの方法を用いて、例えばサイトカイン産生を測定すること、またはトリチウム化チミジンの取り込みを測定することにより検出することができる。最も好ましい態様において、インターフェロンガンマ産生を、Ｅｌｉｓｐｏｔ分析を用いて測定する（Schmittel et. al., 2000, J. Immunol. Meth. 24: 17−24、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。
【０１７７】
ＩｇＧ変異体の生物学的特徴を、細胞、組織および生物全体の実験により特徴付けることができる。当技術分野で公知の通り、薬剤をしばしば、疾患または疾患モデルに対する処置のための薬剤の効果を測定するため、または薬剤の薬物動態、毒性および他の特性を測定するために、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよびサルを含むが、これらに限定されない動物において試験する。動物は、疾患モデルと称され得る。治療剤をしばしば、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、および遺伝子組み換えマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むが、それらに限定されないマウスにおいて試験する。かかる実験は、治療剤として用いられるタンパク質の可能性を決定するための意味のあるデータを提供することができる。何れかの生物、好ましくは哺乳動物を、試験に用いることができる。例えばヒトに遺伝的に類似するため、サルを適する治療モデルとすることができ、故に、ＩｇＧの効果、毒性、薬物動態、または他の特性を試験するために用いることができる。ヒトにおける試験が、最終的に、薬剤としての承認に必要であり、故に、もちろんこれらの実験が意図される。従って、ＩｇＧをヒトにおいて試験し、その治療効果、毒性、免疫原性、薬物動態、および／または他の臨床特性を決定し得る。
【０１７８】
ＩｇＧ変異体の使用方法
ＩｇＧ変異体は、様々な製品として使用され得る。１つの態様において、ＩｇＧ変異体は、治療剤、診断剤、または実験試薬であり、好ましくは治療剤である。ＩｇＧ変異体は、モノクローナルまたはポリクローナルである抗体組成物において使用され得る。好ましい態様において、ＩｇＧ変異体を、標的抗原を有する標的細胞、例えば癌細胞を殺すために使用する。別の態様において、ＩｇＧ変異体を、標的抗原を阻止、アンタゴナイズまたはアゴナイズするため、例えばサイトカインまたはサイトカイン受容体をアンタゴナイズするために用いる。別の好ましい態様において、ＩｇＧ変異体を、標的抗原を阻止、アンタゴナイズまたはアゴナイズするため、標的抗原を有する標的細胞を殺すために用いる。
【０１７９】
ＩｇＧ変異体を、様々な治療目的に用いることができる。好ましい態様において、ＩｇＧ変異体を含む抗体を、抗体関連疾患を処置するために患者に投与する。本目的に関して“患者”には、ヒトおよび他の動物、好ましくは哺乳動物が含まれ、最も好ましくはヒトである。本明細書中、“抗体関連疾患”または“抗体反応性疾患”または“状態”または“疾患”は、ＩｇＧ変異体を含む医薬組成物の投与により緩和され得る疾患を意味する。抗体関連疾患には、自己免疫疾患、免疫学的疾患、感染症、炎症性疾患、神経疾患、および癌を含む腫瘍性および新生物性疾患が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中、“癌”および“癌性”は、調節されない細胞増殖により典型的に特徴付けられる哺乳動物における生理的状態を意味するか、または記載する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮種、神経鞘腫（schwanoma）、髄膜腫、腺癌、黒色腫、ならびに白血病およびリンパ性悪性腫瘍が含まれるが、それらに限定されない。
【０１８０】
１つの態様において、ＩｇＧ変異体は、患者に投与される唯一の治療的活性剤である。あるいは、ＩｇＧ変異体を、細胞毒性薬、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、血管形成阻害剤、心臓保護剤、または他の治療剤を含むが、それらに限定されない１個以上の他の治療剤と併用投与する。ＩｇＧ変異体を、１個以上の他の治療レジメンと併用して投与し得る。例えば、ＩｇＧ変異体を、化学療法、放射線治療、または化学療法と放射線治療の両方と共に、患者に投与し得る。１つの態様において、ＩｇＧ変異体を、ＩｇＧ変異体であるか、またはＩｇＧ変異体ではない１個以上の抗体と併用投与することができる。他の態様に従い、ＩｇＧ変異体および１個以上の他の抗癌治療剤を、エクスビボで癌細胞の処置に用いる。かかるエクスビボ処置は、骨髄移植および特に、自家骨髄移植に有用であり得ると考えられる。もちろん、ＩｇＧ変異体は、外科手術のような、さらに他の治療技術と組み合わせて用いることができると考えられる。
【０１８１】
様々な他の治療剤が、ＩｇＧ変異体との併用投与のために使用され得る。１つの態様において、ＩｇＧを、血管形成阻害剤と併用投与する。本明細書で用いる“血管形成阻害剤”は、血管の発達を阻止、またはある程度妨げる化合物を意味する。抗血管形成因子は、例えば、血管形成の促進に関与する増殖因子または増殖因子受容体と結合する、小分子またはタンパク質、例えば抗体、Ｆｃ融合体もしくはサイトカインであり得る。本明細書中、好ましい抗血管形成因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と結合する抗体である。別の態様において、ＩｇＧは、適応的免疫応答を誘導または増大する治療剤、例えばＣＴＬＡ−４を標的とする抗体と共に投与される。別の態様において、ＩｇＧを、チロシンキナーゼ阻害剤と共に投与する。本明細書で用いる“チロシンキナーゼ阻害剤”は、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子を意味する。別の態様において、ＩｇＧ変異体を、サイトカインと共に投与する。
【０１８２】
医薬組成物とは、ＩｇＧ変異体および１個以上の治療的活性剤が、製剤されることを意図する。ＩｇＧ変異体の製剤は、所望の純度を有するＩｇＧを、所望により薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980、参照によりその全体が本明細書中に包含される）と共に混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態に保存用に調製される。インビボ投与用に使用される製剤を、好ましくは滅菌する。これは、滅菌ろ過膜を通すろ過または他の方法により容易に達成される。本明細書に記載のＩｇＧ変異体および他の治療的活性剤は、免疫リポソーム、および／またはマイクロカプセル封入としても製剤され得る。
【０１８３】
製剤中の治療的に活性なＩｇＧ変異体の濃度は、約０．１から１００重量％で変化し得る。好ましい態様において、ＩｇＧの濃度は、０．００３から１．０モルの範囲内である。患者を処置するために、ＩｇＧ変異体の治療的有効用量を投与することができる。本明細書中、“治療的有効用量”とは、それが投与されて効果を生じる用量を意味する。正確な用量は、処置の目的に依存して変化し、公知の技術を用いて当業者により確認され得る。投与量は、体重１ｋｇ当たり０．０１から１００ｍｇまたはそれ以上、例えば体重１ｋｇ当たり０．０１、０．１、１．０、１０、または５０ｍｇの範囲であり得、１から１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。当技術分野で公知の通り、タンパク質分解、全身的対局所送達、および新しいタンパク質合成の速度、ならびに年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与の時間、薬剤の相互作用および状態の重症度に関する調整が必要であり、当業者により常套的実験にて確認され得る。
【０１８４】
好ましくは滅菌水溶液の形態でＩｇＧ変異体を含む医薬組成物の投与を、経口、皮下、静脈内、非経腸的、経鼻的、耳内（intraotically）、眼内（intraocularly）、経直腸、経膣的、経皮的、局所的（例えば、ジェル、軟膏、ローション、クリームなど）、腹腔内、筋肉内、肺内（例えば、Aradigmにより市販されるＡＥＲｘ（登録商標）吸入可能技術、またはNektar Therapeuticsにより市販されるＩｎｈａｎｃｅ（登録商標）肺送達システムなど）を含むが、それらに限定されない様々な方法で行うことができる。本明細書に記載の治療剤を、他の治療剤と併用して投与することができ、すなわち、本明細書に記載の治療剤を、例えば小分子、他の生物学的製剤、放射線治療、外科手術などを含む、他の治療または治療剤と併用し得る。
【実施例】
【０１８５】
実施例
本発明を説明するために、以下に実施例を提供する。これらの実施例は、どんな特定の適用または操作理論にも本発明を制限することを意味しない。本発明で検討した全ての位置に関して、番号は、Kabatに記載のＥＵ ｉｎｄｅｘに従う（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。抗体分野の当業者は、この決まりが、免疫グロブリンファミリーの保存された位置を参照して標準化し得る、免疫グロブリン配列の特定領域における不連続的番号からなることを理解するだろう。従って、ＥＵ ｉｎｄｅｘに定義される何れかの特定の免疫グロブリンの位置は、その連続的配列に対応する必要はない。
【０１８６】
実施例１：Ｆｃ変異体のＤＮＡ構築物、発現および精製
Ｆｃ変異体を、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインおよびトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、Genentech）の可変ドメインを用いて構築した。Ｆｃポリペプチドは、アレムツズマブ、トラスツズマブまたはＡＣ１０の一部であった。アレムツズマブ（Campath（登録商標）、Milleniumの登録商標）は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病の処置に現在認可されているヒト化モノクローナル抗体である（Hale et al., 1990, Tissue 抗原 35:118-127、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、Genentechの登録商標）は、転移性乳癌の処置のための抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である。ＡＣ１０は、抗ＣＤ３０モノクローナル抗体である。ハーセプチン可変領域を、リカーシブＰＣＲを用いて組み立てた。その後、この可変領域を、図１１に示すｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクター（Invitrogen）中にヒトＩｇＧ１と共にクローニングした。プラスミドを、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０ 大腸菌細胞（Invitrogen）中で増殖させ、Ｈｉ−Ｓｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Qiagen）を用いて精製した。プラスミドを、クローニングしたインサートの存在を確かめるために配列決定した。
【０１８７】
部位特異的変異誘発を、ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＴＭ方法（Stratagene）を用いて行った。所望の置換、挿入および欠失を含むプラスミドを、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０大腸菌細胞（Invitrogen）中で増殖させ、Ｈｉ−Ｓｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Qiagen）を用いて精製した。ＤＮＡを、配列の適合度を確認するために配列決定した。
【０１８８】
重鎖遺伝子（ＶＨ−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３）（野生型または変異体）を含むプラスミドを、２９３Ｔ細胞中に、軽鎖遺伝子（ＶＬ−Ｃγ）を含むプラスミドと共に共トランスフェクトした。培地を、トランスフェクションの５日後に集め、抗体を、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー（Pierce）を用いて上清から精製した。抗体濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）分析（Pierce）により決定した。
【０１８９】
実施例２：結合親和性測定
ＦｃポリペプチドとＦｃリガンドの結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定で分析した。表面プラズモン共鳴測定を、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置（BIAcore AB）を用いて行った。野生型または変異体抗体を、固定したタンパク質Ｌ（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）を用いて捕捉し、受容体分析物との結合を測定した。タンパク質Ｌを、５ｕｌ／分の流速で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／Ｎ−エチル−Ｎ’−（−３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＮＨＳ／ＥＤＣ）を用いて、ＣＭ５センサーチップ上１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中、１ｕＭのに濃度でＣＭ５センサーチップと共有結合させた。各センサーチップのフローセル１を、結合のネガティブコントロールとしてＮＨＳ／ＥＤＣを用いた。泳動緩衝液は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０（HBS-EP, Biacore, Uppsala, Sweden）であり、チップ再生緩衝液は、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ ｐＨ１．５であった。１２５ｎＭの野生型または変異体トラスツズマブ抗体を、１ｕｌ／分にて５分間、ＨＢＳ−ＥＰ中タンパク質Ｌ ＣＭ５チップに結合させた。１から２５０ｎＭの連続希釈中で、ＦｃＲｎ−Ｈｉｓ−ＧＳＴ分析物であるＨｉｓタグおよびグルタチオンＳトランスフェラーゼと融合したＦｃＲｎを、ＨＢＳ−ＥＰ中、１０ｕｌ／分にて、２０分間の結合、１０分間の解離のために注入した。レゾナンスユニット（ＲＵ）で測定された応答を、ほぼ定常状態の結合を表す、受容体注入の１２００秒後に得た。抗体および緩衝液を用いた１サイクルのみが、ベースライン応答を提供した。ＲＵ対１／ｌｏｇ濃度プロットを作製し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでの非線形回帰を用いてＳ字状の用量応答に合わせる。
【０１９０】
ＦｃポリペプチドとＦｃリガンドの結合をまた、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）を用いて行った。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭは、ビーズに基づく非放射性発光近接分析である。供与側ビーズのレーザー励起は、酸素を励起し、受容側ビーズとの接近が十分なとき、化学発光事象のカスケードを生じ、最終的に５２０−６２０ｎｍで蛍光放出をもたらし得る。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭの主な利点は、その感度である。１つの供与側ビーズが、１秒当たり最大６０，０００までの励起酸素分子を放出するため、シグナル増幅が非常に高く、アトモル濃度（１０−１８）レベルまで下げての検出が可能である。野生型抗体を、ストレプトアビジン供与側ビーズとの結合のための標準的方法によりビオチン化させ、タグ付きＦｃリガンド、例えばＦｃＲｎを、グルタチオンキレート供与側ビーズに結合させた。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭを、Ｆｃ／Ｆｃリガンド相互作用が、供与側および需要側ビーズを結合させる直接的結合分析として用いた。さらに、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭを、目的のＦｃポリペプチドをスクリーニングするための競合分析として用いた。競合するＦｃポリペプチドの不存在において、野生型抗体およびＦｃＲｎが相互作用し、５２０−６２０ｎｍでのシグナルを生じる。タグの付いていないＦｃドメインは、野生型Ｆｃ／ＦｃＲｎ相互作用と競合し、相対的結合親和性の決定を可能にするために蛍光を定量的に減少させる。
【０１９１】
実施例３：Ｆｃ変異体のＦｃＲｎ結合特性。
ＩｇＧ１ ＦｃからＦｃＲｎの結合親和性を、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭを用いて変異体抗体と共に測定した。Ｆｃポリペプチドは、アレムツズマブまたはトラスツズマブの一部であった。アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ilex）は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病の処置のために現在認可されているヒト化モノクローナル抗体である（Hale et al., 1990, Tissue 抗原 35:118−127、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、Genentech）は、転移性乳癌の処置のための抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である。
【０１９２】
競合的ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭデータを、野生型抗体と比較して、ｐＨ６．０でのＦｃ変異体の相対的結合を測定するために収集した。競合的抗体の機能としてのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭシグナルの例を、図１２に示す。Ｐ２５７Ｌ、Ｐ２５７Ｎ、Ｖ２７９Ｅ、Ｖ２７９Ｑ、Ｖ２７９Ｙ、＾２８１Ｓ、Ｅ２８３Ｆ、Ｖ２８４Ｅ、Ｌ３０６Ｙ、Ｔ３０７Ｖ、Ｖ３０８Ｆ、およびＱ３１１Ｖの１２個の変異体の曲線を示し、各変異体曲線が、それらのボックス内で野生型曲線の左に遷移するとき、増加した親和性を証明する。本発明のＦｃ変異体についての競合的ＡｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭデータを、図１３および１４にまとめる。野生型と比較した変異体の相対的ＦｃＲｎ結合を一覧にする。１以上の値は、野生型と比べてＦｃ変異体とＦｃＲｎの改善された結合を証明する。例えば、変異体Ｅ２８３ＬおよびＶ２８４Ｅは、野生型よりもそれぞれ９．５倍および２６倍強力な結合を有する。多くの変異体の表面プラズモン共鳴測定はまた、図１５および１６に示す通り、ＦｃＲｎとの増加した結合を示す。
【０１９３】
２５７位にて、イミノ酸、プロリンを除去し、骨格Ｎを有さない１個のアミノ酸を側鎖共有結合に置換する全ての変異体が、Ｆｃドメインをより自由にし、ＦｃＲｎとのより良好な結合を可能にするより大きなフレキシビリティを骨格に供する。特に、２５７位でのＬおよびＮへの変異体は、ｐＨ６でのＦｃＲｎ結合を強くし、４個の原子側鎖および側鎖のガンマ分岐パターンが、Ｆｃドメインを生産的にする、すなわちＦｃＲｎ相互作用を強くするのを助ける。３０８位は、２５７位と相互作用することを証明する。これらの位置の両方は、Ｆｃ／ＦｃＲｎ相互作用に直接関係するＨ３１０と順に相互作用する（表２、Burmeister et al(1994) Nature 372:379−383、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。Ｆｃ変異体Ｖ３０８ＦおよびＶ０８Ｙは、野生型よりも２．９倍および４．３倍増加したＦｃＲｎ親和性を有する（図１３）。２７９位および３８５位は、変異体Ｖ２７９Ｅ、Ｖ２７９ＱおよびＶ２７９ＹならびにＧ３８５ＨおよびＧ３８５Ｎ（全て、より強いＦｃＲｎ相互作用を有する。）としてＦｃＲｎと相互作用する。これらの変異体は全て、水素結合の可能なアミノ酸である。
【０１９４】
Ｆｃ変異体Ｎ４３４Ｙは、図１３に示す通り、特に、ｐＨ６．０にてＦｃＲｎとの強い結合を有する。単一変異体Ｎ４３４Ｙは、１６倍増加した結合を有する。この変異体と他の修飾の組み合わせは、さらに強い結合をもたらした。例えば、Ｐ２５７Ｌ／Ｎ４３４Ｙ、＾２８１Ｓ／Ｎ４３４Ｙ、およびＶ３０８Ｆ／Ｎ４３４Ｙは、８３０倍、１８０倍、および３５０倍増加したＦｃＲｎ結合を示す。
【０１９５】
実施例４：挿入および欠失を組み込む変異体
Ｆｃ／ＦｃＲｎ相互作用の強さを変える挿入および欠失を構築し、様々なＦｃリガンドとのそれらの結合特性を測定した。残基２８１と２８２（KabatらのＥＵ番号を用いる）の間に挿入したＳｅｒ残基を有するＦｃ変異体を、ＦｃドメインのＦｃＲｎ結合特性を増加するために設計した。この変異体は、特定の位置の後ろへの挿入を意味する“＾”を含む、＾２８１Ｓと称される。２個以上の残基であり得る挿入配列は、位置番号の後ろに供される。このＦｃ変異体を、本明細書に記載の方法を用いて、カッパＩｇＧ１抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、Genetech）が構築された。残基２８１と２８２の間の挿入は、残基２８１のＦｃループ残基Ｃ末端をループのＣ末端方向へ移動させ、側鎖位置を変化させる。２８２位、２８３位、および２８４位での置換を含むＦｃ変異体は、このループのＣ末端への移動が有益であることを示唆する（図１４を参照のこと）。他の変異体であるＮ２８６の欠失（しばしば、Ｎ２８６＃と称される。）をまた、このＦｃＲｎ結合ループの位置を移動させるために構築した。これらの変異体は両方とも、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎに対する増加した結合親和性を示す。
【０１９６】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭデータは、＾２８１Ｓ変異体および他の変異体とＦｃＲｎの結合を示す。このＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭデータは、直接結合分析として集められる。化学発光シグナルのより高レベルが、より強い結合を証明する。変異体の濃度が、該分析で上昇するため、強力なシグナルが生じる。図１７ａおよび１７ｂ中、ｐＨ６．０でのこれらのデータは、＾２８１Ｓ、Ｐ２５７Ｌ、Ｐ２５７Ｌ／＾２８１Ｓ（置換／挿入変異体の組み合わせ）および他の変異体の、野生型Ｆｃよりも増加した親和性を証明する。また、サルにおける増加した血清半減期を有することが以前に示された、二重置換であるＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌが示される（Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216、参照によりその全体が本明細書中に包含される）。挿入である＾２８１Ｓのみが、Ｆｃ／ＦｃＲｎ結合を増加する。さらに、＾２８１Ｓは、２個の修飾が、〜４０ｎＭデータ点に示す通り、変異体Ｐ２５７Ｌ／＾２８１Ｓに組み込まれるとき、Ｐ２５７Ｌの結合がさらに増加する。図１７ｃのデータは、これらの変異体が、ｐＨ７．０での増加したＦｃＲｎ結合を示さないことを証明する。ｐＨ７．０での減少した親和性は、Ｆｃ再利用に重要な工程である、ＦｃＲｎから細胞外空間へのＦｃポリペプチドの放出を可能にするため、増加したインビボ半減期に望ましい。
【０１９７】
表面プラズモン共鳴実験はまた、＾２８１ＳとＦｃＲｎの改善した結合を証明する。図１８は、チップ表面上のＦｃＲｎに結合する様々なＦｃ変異体として作製される応答単位（response unit）を示す。変異体がチップに十分に結合するのを可能にした後、応答単位を記録し、縦座標に示した。挿入＾２８１Ｓは、本明細書に記載の他の変異体と同様の結合特性を示し、野生型よりもＦｃＲｎへの増加した親和性を有する（例えば、図１３、１４および１５を参照のこと）。
【０１９８】
Ｎ２８６の欠失を含む欠失変異体であるＮ２８６＃はまた、野生型よりも、ＦｃＲｎとの増加した親和性を示す。この変異体は、図１３に示す通り、ＦｃＲｎ親和性の２．０倍増加を有する。図中のデータはまた、ｐＨ６．０での競合的実験として集められたＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭデータである。変異体を、供与側ビーズと結合した野生型Ｆｃと、受容側ビーズと結合したＦｃＲｎの結合を阻害するために用いる。２倍少ない遊離のＮ２８６＃は、遊離の野生型Ｆｃより必要であり、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体を介する供与側／受容側ビーズの結合を阻害する。これは、野生型よりも、Ｎ２８６＃の２倍強い結合を証明する。
【０１９９】
挿入または欠失を含む他のＦｃ変異体は、ＦｃＲｎに対して減少した親和性を有する。挿入変異体である＾２５４Ｎは、変異体の性質および位置から予期される通り、大幅に減少したＦｃＲｎ結合を有する。この変異体は、ＦｃＲｎ結合ループの中間に、Ａｓｎの挿入を有する。この挿入は、野生型の結合親和性の結合の１．１％しか有さない（図１３）。
【０２００】
本発明の特定の態様は、説明を目的として上記されるが、多数の変形が、添付の特許請求の範囲に記載の通り、本発明から逸脱しない範囲で作製され得ることは、当業者に認められるだろう。本明細書中に引用された全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書中に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】図１。抗体の構造および機能。ｐｄｂ受託コード１ＣＥ１からのヒト化Ｆａｂ構造（James et al., 1999, J Mol Biol 289:293−301、参照によりその全体が本明細書中に包含される）およびｐｄｂ受託コード１ＤＮ２からのヒトＩｇＧ１Ｆｃ構造（DeLano et al., 2000, Science 287:1279−1283、参照によりその全体が本明細書中に包含される）を用いてモデル化された、全長ヒトＩｇＧ１抗体のモデルを示す。ＦａｂおよびＦｃ領域を連結するフレキシブルヒンジは示さず。ＩｇＧ１は、２個の軽鎖および２個の重鎖からなるヘテロ二量体のホモ二量体である。軽鎖のＶＬおよびＣＬ、ならびに重鎖のＶＨ、Ｃガンマ１（Ｃγ１）、Ｃガンマ２（Ｃγ２）、およびＣガンマ３（Ｃγ３）を含む、抗体を含むＩｇドメインが標識される。Ｆｃ領域は標識される。可変領域中の抗原結合部位、ならびに領域中のＦｃγＲｓ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑおよびタンパク質ＡおよびＧの結合部位を含む、関連タンパク質の結合部位は標識される。
【図２】図２。Kabat et alに記載の通りＥＵ番号を付した本発明に用いるヒトＩｇＧ配列。
【図３】図３。Kabatに記載の通りＥＵ番号を付した本発明に用いるヒトおよびげっ歯動物ＩｇＧ配列の例。
【図４】図４。本発明に用いたヒトおよびげっ歯動物ＦｃＲｎ重鎖配列の例。
【図５】図５。本発明に用いたヒトおよびげっ歯動物ベータ−２−ミクログロブリン配列の例。
【図６】図６。ラット構造から作製されたヒトＦｃ／ＦｃＲｎ複合体モデル（Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379−383；Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867−877、両方とも参照によりその全体が本明細書中に包含される）。いくつかのヒスチジン残基は、ＦｃＲｎ鎖（淡灰色）およびＦｃポリペプチド（濃灰色）上の空間充填（space-filling）原子で示される。
【図７】図７。挿入または欠失を含む変異体の設計に用いるいくつかの概念の説明図。
【図８】図８。本発明の変異体。
【図９】図９。本発明の変異体。
【図１０】図１０。本発明の変異体。
【図１１】図１１。Ｆｃ変異体のコンストラクトに用いられ得るベクターｐｃＤＮＡ３．１ Ｚｅｏ＋の図。
【図１２】図１２。野生型Ｆｃおよび本発明のＦｃ変異体の競合的ＦｃＲｎ結合データ。各パネルにおいて、本発明のＦｃ変異体は、左（赤色または濃灰色）曲線で示され、野生型トラスツズマブは、右（青色または淡灰色）曲線で示される。
【図１３】図１３。Ｆｃ変異体のＦｃＲｎ結合特性の概要。右から左の列は、ＦｃＲｎ結合の修飾、使用した免疫グロブリン、他の修飾、野生型と比較したＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ競合分析による相対的ＦｃＲｎ親和性（中央値）、実施した分析数、およびタンパク質の参照数を示す。１．０より大きい相対的ＦｃＲｎ親和性数は、野生型よりも増加した結合を証明する。
【図１４】図１４。本発明のＦｃ変異体のＦｃＲｎ結合データ。Ｆｃ変異体は、アレムツズマブまたはトラスツズマブである。野生型と比較した結合の増加倍数を示す。
【図１５】図１５。ＦｃＲｎとの改善した結合を有するＦｃ変異体の表面プラズモン共鳴実験の概要。棒グラフは、野生型Ｆｃドメインと比較した各変異体のＦｃＲｎ結合親和性における増加倍数を示す。
【図１６】図１６。野生型抗体および本発明の変異体の表面プラズモン共鳴実験。示した線は、ｐＨ６．０での、ＦｃＲｎとのＦｃ変異体抗体の結合および分離である。
【図１７】図１７。本発明のＦｃ変異体とＦｃＲｎとの結合分析。ｐＨ６．０（ａおよびｂ）およびｐＨ７．０（ｃ）での、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）により測定した直接結合分析を示す。
【図１８】図１８。本発明のＦｃ変異体とＦｃＲｎとの結合分析。Ｆｃ変異体と表面結合ＦｃＲｎとの結合により作製される表面プラズモン共鳴単位を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１３ｅ】
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【図１３ｆ】
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【図１３ｇ】
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【図１３ｈ】
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【図１３ｉ】
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【図１３ｊ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１５】
2008519860.tif 000032
【図１６ａ−１】
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【図１６ａ−２】
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【図１６ｂ−１】
2008519860.tif 000035
【図１６ｂ−２】
2008519860.tif 000036
【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月10日(2007.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親Ｆｃポリペプチドに相当するＦｃ領域中に少なくとも１個の修飾を含む該親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体を含むポリペプチドであって、該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較してＦｃＲｎ（胎児性受容体）との変化した結合を示し、該Ｆｃ変異体は、２４６Ｓ、２５７Ｌ、２５７Ｎ、２５７Ｑ、２５７Ｙ、２７９Ａ、２７９Ｆ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｐ、２７９Ｑ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８４Ｈ、２８４Ｋ、２８４Ｐ、２８４Ｑ、２８４Ｒ、２８４Ｓ、３０８Ｃ、３０８Ｅ、３０８Ｆ、３０８Ｇ、３０８Ｈ、３０８Ｌ、３０８Ｍ、３０８Ｎ、３０８Ｐ、３０８Ｑ、３０８Ｓ、３０８Ｔ、３０８Ｗ、３０８Ｙ、３８５Ｃ、３８５Ｆ、３８５Ｈ、３８５Ｉ、３８５Ｌ、３８５Ｍ、３８５Ｎ、３８５Ｐ、３８５Ｑ、３８５Ｖ、３８５Ｗ、３８５Ｙ、３８７Ｋ、および３８７Ｑ（ここで、番号は、ＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。）からなる群から選択される少なくとも１個の修飾を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
該Ｆｃ変異体が、２５７Ｌ、２５７Ｎ、２５７Ｙ、２７９Ｑ、２７９Ｙ、３０８Ｆ、および３０８Ｙからなる群から選択される少なくとも１個の置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
該Ｆｃ変異体がＧ３８５Ｈを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
該Ｆｃ変異体が、該親ポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも２個の修飾を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
該Ｆｃ変異体が、２４８Ｄ、２４８Ｅ、２４８Ｋ、２４９Ｈ、２４９Ｋ、２４９Ｒ、２５０Ａ、２５０Ｃ、２５０Ｄ、２５０Ｅ、２５０Ｆ、２５０Ｇ、２５０Ｈ、２５０Ｉ、２５０Ｋ、２５０Ｌ、２５０Ｍ、２５０Ｎ、２５０Ｐ、２５０Ｑ、２５０Ｒ、２５０Ｓ、２５０Ｖ、２５０Ｗ、２５０Ｙ、２５１Ｃ、２５１Ｇ、２５１Ｌ、２５１Ｑ、２５１Ｓ、２５２Ａ、２５２Ｃ、２５２Ｇ、２５２Ｎ、２５２Ｑ、２５２Ｓ、２５２Ｔ、２５２Ｖ、２５２Ｗ、２５２Ｙ、２５３Ａ、２５４Ａ、２５４Ｓ、２５５Ｃ、２５５Ｇ、２５５Ｎ、２５５Ｑ、２５５Ｒ、２５５Ｓ、２５５Ｔ、２５５Ｙ、２５６Ａ、２５６Ｄ、２５６Ｆ、２５６Ｋ、２５６Ｑ、２５６Ｒ、２５６Ｓ、２５６Ｔ、２５８Ｃ、２５８Ｄ、２５８Ｅ、２５８Ｇ、２５８Ｈ、２５８Ｋ、２５８Ｎ、２５８Ｑ、２５８Ｓ、２５８Ｔ、２５８Ｙ、２７７Ａ、２７７Ｃ、２７７Ｄ、２７７Ｅ、２７７Ｆ、２７７Ｇ、２７７Ｈ、２７７Ｉ、２７７Ｋ、２７７Ｌ、２７７Ｍ、２７７Ｎ、２７７Ｐ、２７７Ｑ、２７７Ｒ、２７７Ｓ、２７７Ｔ、２７７Ｖ、２７７Ｗ、２７７Ｙ、２７９Ｅ、２７９Ｒ、２８０Ｋ、２８０Ｒ、２８１Ｄ、２８１Ｅ、２８１Ｈ、２８１Ｋ、２８１Ｑ、２８１Ｒ、２８２Ｅ、２８２Ｋ、２８２Ｒ、２８４Ｃ、２８４Ｄ、２８４Ｅ、２８４Ｇ、２８４Ｎ、２８４Ｔ、２８５Ａ、２８５Ｃ、２８５Ｄ、２８５Ｇ、２８５Ｈ、２８５Ｎ、２８５Ｑ、２８５Ｒ、２８５Ｔ、２８５Ｙ、２８６Ｅ、２８６Ｍ、２８６Ｔ、２８７Ｃ、２８７Ｄ、２８７Ｅ、２８７Ｇ、２８７Ｈ、２８７Ｋ、２８７Ｎ、２８７Ｑ、２８８Ｄ、２８８Ｅ、２８８Ｈ、２８８Ｋ、２８８Ｒ、２８７Ｒ、２８７Ｓ、２８７Ｔ、２８８Ａ、２８８Ｃ、２８８Ｄ、２８８Ｅ、２８８Ｆ、２８８Ｇ、２８８Ｈ、２８８Ｋ、２８８Ｌ、２８８Ｍ、２８８Ｎ、２８８Ｐ、２８８Ｔ、２８８Ｖ、２８８Ｗ、２８８Ｙ、３０４Ｃ、３０５Ａ、３０５Ｃ、３０５Ｄ、３０５Ｅ、３０５Ｇ、３０５Ｋ、３０５Ｎ、３０５Ｑ、３０５Ｒ、３０５Ｓ、３０５Ｙ、３０６Ａ、３０６Ｃ、３０６Ｄ、３０６Ｅ、３０６Ｇ、３０６Ｋ、３０６Ｌ、３０６Ｍ、３０６Ｎ、３０６Ｐ、３０６Ｑ、３０６Ｒ、３０６Ｒ、３０６Ｓ、３０６Ｔ、３０６Ｖ、３０６Ｗ、３０６Ｙ、３０９Ｄ、３０９Ｅ、３０９Ｋ、３０９Ｒ、３１０Ａ、３１０Ｃ、３１０Ｄ、３１０Ｅ、３１０Ｇ、３１０Ｈ、３１１Ａ、３１１Ｋ、３１１Ｒ、３１２Ａ、３１２Ｃ、３１２Ｄ、３１２Ｇ、３１２Ｋ、３１２Ｎ、３１２Ｑ、３１２Ｒ、３１２Ｓ、３１２Ｔ、３１２Ｙ、３１３Ｄ、３１３Ｅ、３１３Ｈ、３１３Ｋ、３１３Ｒ、３１４Ａ、３１４Ｃ、３１４Ｄ、３１４Ｅ、３１４Ｆ、３１４Ｇ、３１４Ｈ、３１４Ｉ、３１４Ｌ、３１４Ｍ、３１４Ｎ、３１４Ｐ、３１４Ｑ、３１４Ｒ、３１４Ｓ、３１４Ｔ、３１４Ｖ、３１４Ｗ、３１４Ｙ、３１５Ｄ、３１５Ｋ、３１５Ｒ、３１６Ｈ、３１６Ｋ、３１６Ｒ、３１７Ａ、３１７Ｃ、３１７Ｄ、３１７Ｅ、３１７Ｇ、３１７Ｋ、３１７Ｎ、３１７Ｑ、３１７Ｒ、３１７Ｔ、３１７Ｙ、３４０Ｄ、３４０Ｅ、３４０Ｈ、３４０Ｋ、３４０Ｒ、３４３Ｃ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｋ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｙ、３４４Ｌ、３４５Ｃ、３４５Ｄ、３４５Ｅ、３４５Ｇ、３４５Ｈ、３４５Ｋ、３４５Ｎ、３４５Ｑ、３４５Ｒ、３４５Ｓ、３４５Ｔ、３４５Ｙ、３６０Ａ、３６２Ａ、３７６Ｃ、３７６Ｄ、３７６Ｅ、３７６Ｇ、３７６Ｋ、３７６Ｎ、３７６Ｑ、３７６Ｒ、３７６Ｓ、３７６Ｔ、３７６Ｙ、３７８Ｓ、３８０Ａ、３８２Ａ、３８３Ｄ、３８３Ｅ、３８３Ｒ、３８６Ｐ、３８６Ｔ、３８７Ｐ、３８７Ｒ、３８９Ｄ、３８９Ｎ、３８９Ｐ、３８９Ｓ、４１５Ａ、４２４Ａ、４２４Ｄ、４２４Ｅ、４２４Ｈ、４２４Ｋ、４２４Ｒ、４２６Ｄ、４２６Ｋ、４２８Ａ、４２８Ｃ、４２８Ｄ、４２８Ｅ、４２８Ｆ、４２８Ｇ、４２８Ｈ、４２８Ｉ、４２８Ｋ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４２８Ｎ、４２８Ｐ、４２８Ｑ、４２８Ｒ、４２８Ｓ、４２８Ｔ、４２８Ｖ、４２８Ｗ、４２８Ｙ、４３０Ｃ、４３０Ｅ、４３０Ｇ、４３０Ｎ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３１Ｄ、４３１Ｅ、４３１Ｋ、４３１Ｒ、４３２Ｃ、４３２Ｇ、４３２Ｑ、４３２Ｔ、４３２Ｙ、４３３Ａ、４３３Ｋ、４３４Ａ、４３４Ｆ、４３４Ｋ、４３４Ｌ、４３４Ｒ、４３５Ａ、４３６Ａ、４３６Ｄ、４３６Ｒ、４３６Ｔ、４３６Ｙ、４３８Ｄ、４３８Ｅ、および４３８Ｒからなる群から選択される少なくとも１個の置換をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
該Ｆｃ変異体が、該親Ｆｃポリペプチドと比較してＦｃＲｎおよびＦｃγＲとの変化した結合を示す、請求項１から５の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
該Ｆｃ変異体が、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも２個のアミノ酸修飾を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
該Ｆｃ変異体が、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも３個のアミノ酸修飾を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
該Ｆｃ変異体が、該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域中に少なくとも４個のアミノ酸修飾を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
該Ｆｃ変異体が、該親Ｆｃポリペプチドと比較してＦｃＲｎとの増加した結合を示す、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
該Ｆｃ変異体が、該親Ｆｃポリペプチドと比較してＦｃＲｎとの減少した結合を示す、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
該Ｆｃ変異体が、該親Ｆｃポリペプチドと比較してＦｃγＲとの増加した結合を示す、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
該Ｆｃ変異体が、ＦｃγＲおよびＦｃＲｎとの増加した結合を示す、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
該Ｆｃ変異体が、ＦｃγＲおよびＦｃＲｎとの減少した結合を示す、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
該Ｆｃ変異体が、ＦｃγＲとの減少した結合、およびＦｃＲｎとの増加した結合を示す、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
該Ｆｃ変異体が、ＦｃγＲとの増加した結合、およびＦｃＲｎとの減少した結合を示す、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
該Ｆｃ変異体が、該親Ｆｃポリペプチドと比較してＦｃＲｎとの変化した結合を示し、該Ｆｃ変異体が、サイトカイン、可溶性タンパク質因子および癌細胞で発現されるタンパク質からなる群から選択される標的分子に特異性を有するポリペプチドの範囲内に包含される、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のＦｃ変異体を含む抗体。
【請求項１９】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のＦｃ変異体を含むＦｃ融合。
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月18日(2007.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008519860000001.app
【国際調査報告】
2008519860.tif 000041
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2008519860.tif 000043
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