(57)【要約】本発明は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）I-2219菌株のバクテリアによって生産される巨大分子の製造方法、ならびに、炎症性のリウマチ性疾患の予防および治療のための薬物を製造するための当該巨大分子の使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）I-2219菌株のバクテリアによって生産される巨大分子の製造方法であって、次の工程を含むことを特徴とする製造方法。
i）約３０℃〜４０℃の間の温度範囲にある有気性のまたは無気性の条件下で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）I-2219菌株を、調節されたまたは調節されていないｐＨを有するとともに、天然の（変性していない）ラクトアルブミンおよびラクトースに富む乳糖血清タンパク質画分を成分として含有する培養液に、接種し、培養する；
ii）１６〜４８時間の培養期間の後、前記培養液から前記バクテリアを分離する；
iii）２キロダルトン〜５０キロダルトンの切り離し閾値を有する濾過膜で限外濾過することにより、凝縮残留画分を得る；
iv）前記凝縮残留画分の体積量の５〜２５倍に相当する体積量で洗浄することにより、巨大分子を濃縮する；
v）濃縮された前記凝縮残留画分を脱水する；
vi）陰イオン交換樹脂を通過させることにより前記巨大分子を精製する；
vii）０．１５〜０．６Ｍの塩化ナトリウム、好ましくは０．３Ｍの塩化ナトリウム、により溶出される、前記バクテリア性の巨大分子を含有する前記画分、を集める。
【請求項２】
前記培養液における前記ビフィドバクテリアの前記接種を、凍結凝縮物または１６〜２４時間の前培養物を用いて実施する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バクテリアを、前記培養液に、培養液１ミリリットル当たり１０5〜１０10コロニー形成単位の密度で接種する、ことを特徴とする請求項１および２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養液の前記成分が次の量で存在する、ことを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
−  天然の（変性していない）ラクトアルブミンに富む乳糖血清タンパク質の画分：培養液１リットル当たり０．０１〜１ｇ；
−  ラクトース：培養液１リットル当たり３０〜７０ｇ。
【請求項５】
前記培養液のｐＨが調節されていない、ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記培養液のｐＨが約４〜６の間に保持されている、ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の方法を実施することにより得られた前記バクテリア性の巨大分子に基づく、腸内細菌叢およびそのトランスロケーションを制御するように設計された生成物を得るための、製造。
【請求項８】
請求項１〜６に記載の方法を実施することにより得られた前記バクテリア性の巨大分子に基づく、リウマチ性多発関節炎の治療用に設計された薬剤組成物を得るための、製造。
【請求項９】
請求項１〜６に記載の方法を実施することにより得られたバクテリア由来の前記巨大分子の、炎症性のリウマチ性疾患の治療薬または予防薬の製造のための、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリア由来の巨大分子の製造方法、それにより得られる巨大分子、ならびに、炎症性のリウマチ性疾患の予防および治療における当該分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リウマチ性多発関節炎、強直性脊椎炎または感染後リウマチなどの多くの炎症性のリウマチ性疾患に共通する特徴は、バクテリアまたはバクテリア性のシグナル（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドグリカン・ポリサッカライド）が滑液中に存在することである（“RT-PCR Analysis of Bacterial rRNA for Detection and Characterization of Bacterial Species in Arthritis Synovial Tissue” - Kempsell K.E., Cox C.J., Hurle M., Wong A., Wilkie S., Zanders E.D., Gaston J.S., Crowe J.S. In Infect. Immun. 2000, 68(10): 6012-26; “Investigation of Infectious Agents Associated with Arthritis by RT-PCR of Bacterial rRNA”, Cox C.J., Kempsell K.E., Gaston J.S. in Arthritis Res. Ther. 2003, 5(1):R1-8）。これらのバクテリアは、大部分が消化管に由来する。これらは、腸管のバリアーを超え（バクテリアル・トランスロケーション）、マクロファージおよび樹状細胞により滑膜へと輸送される。健康な関節は、通常、無菌およびバクテリアの残渣が全くない状態にあるため、炎症性の滑膜におけるバクテリアおよびその成分の存在は、リウマチ性疾患の要因になると考えられている。
【０００３】
現在の治療は、炎症誘発性サイトカインを阻害したり（インフリキシマブ、エンブレル、アナキンラ）、炎症誘発性サイトカインが生産される原因である免疫細胞の再生を減らしたりする（レフルノミド）ことにより、リウマチ性疾患の症状に対処するとともに、炎症反応を減少させることを目指している。しかし、このような治療には、感染症（日和見感染、結核）、抗ＤＮＡ抗体ならびに狼瘡、中枢神経系の脱髄、好中球減少症および鬱血性心不全の危険性、のような望ましくない副作用がある。
【０００４】
リウマチ性疾患の症状を有する患者に適用する反生物学的療法は、腸内細菌叢の特定のバクテリアの量を減少させるとともに、炎症の減少に寄与する。しかし、この治療方法は、バクテリアに抵抗力が生じる危険性を考慮すると、長期的には使用できない。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、炎症性のリウマチ性疾患の治療のための上記の現在の方法の欠点を減らすことを可能にする。本発明の目的は、炎症性のリウマチ性疾患の治療において、腸内細菌叢およびバクテリアル・トランスロケーションの制御を可能とし、これにより炎症性のリウマチ性疾患に付随した炎症反応を減少させる、バクテリア由来の巨大分子、の使用に基づいた、別のアプローチの提案である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
第１の側面によれば、本発明は、ブタペスト条約に基づき、パリ、ドクター・ルー通り、２５、パストゥール研究所に設置されている、ラ  コレクスィヨン  ナスィョナル  ドゥ  キュルテュール  ドゥ  ミクロオルガニスム（la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)（ＣＮＣＭ）に１９９９年５月３１日付けで寄託された、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）I-2219菌株のバクテリアによって生産される、巨大分子の製造方法に関する。
【０００７】
この方法は、次の工程を含むことを特徴とする：
i）約３０℃〜４０℃の間の温度範囲にある有気性のまたは無気性の条件下で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）I-2219菌株を、調節されたまたは調節されていないｐＨを有するとともに、天然の（変性していない）ラクトアルブミンおよびラクトースに富む乳糖血清タンパク質画分を成分として含有する培養液に、接種し、培養する；
ii）１６〜４８時間の培養期間の後、培養液からバクテリアを分離する；
iii）２キロダルトン〜５０キロダルトンの切り離し閾値を有する濾過膜で限外濾過することにより、凝縮残留画分を得る；
iv）凝縮残留画分の体積量の５〜２５倍に相当する体積量で洗浄することにより、巨大分子を濃縮する；
v）濃縮された凝縮残留画分を脱水する；
vi）陰イオン交換樹脂を通過させることにより巨大分子を精製する；
vii）０．１５〜０．６Ｍの塩化ナトリウム、好ましくは０．３Ｍの塩化ナトリウム、により溶出される、バクテリア性の巨大分子を含有する画分、を集める。
【０００８】
種々の実施形態によれば、バクテリア由来の巨大分子の製造方法は、場合によって組み合わせることができる、次の特徴を有する：
−  培養液におけるビフィドバクテリアの接種を、バクテリアの増殖を可能にする、凍結凝縮物または１６〜２４時間の前培養物を用いて実施する；
−  バクテリアを、培養液に、培養液１ミリリットル当たり１０5〜１０10コロニー形成単位の密度で接種する；
−  培養液の成分が次の量で存在する：
−  天然の（変性していない）ラクトアルブミンに富む乳糖血清タンパク質の画分：
培養液１リットル当たり０．０１〜１ｇ；
−  ラクトース：培養液１リットル当たり３０〜７０ｇ；
−  培養液のｐＨが調節されていない；
−  培養液のｐＨが約４〜６の間に保持されている。
【０００９】
第２の側面によれば、本発明は、本発明の方法の実施によって製造される、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）I-2219菌株のバクテリアによって生産される、バクテリア由来の巨大分子に関する。当該分子は、出願人が実施した試験により、コラーゲンにより誘導された関節炎のモデルマウスにおいて、抗関節炎活性を有することが証明されている。この抗関節炎活性は、以下を含む種々のパラメータにより評価される：
−  マウスにおけるコラーゲンIIによる関節炎の誘導作用からの防護；
−  腸内細菌叢およびバクテリアル・トランスロケーションを制御する性質。
【００１０】
第３の側面によれば、本発明は、炎症性のリウマチ性疾患の予防または治療のために設計された薬物を製造するために、バクテリア由来の巨大分子を使用するものである。巨大分子を含有する薬物は、炎症性のリウマチ性疾患の治療のために現在使用されている治療薬（レフルノミド、モノクローナル抗体、抗炎症剤）に対する補助薬として、または副作用がよく知られているこれらの薬に代えて、使用できる。
【００１１】
巨大分子を含有する薬物は、経口的に、または皮下注射により、投与できる。当該薬物は、腸内細菌叢およびバクテリアル・トランスロケーションの制御作用を有し、これにより炎症性のリウマチ性疾患に付随する炎症反応を減少させる。こうした作用は、（罹患率の高い家系から出た患者のための）リウマチ性疾患の予防、ならびに、リウマチ性多発関節炎および強直性脊椎炎を含む種々の炎症性のリウマチ性疾患の治療のいずれにおいても、強く求められている。
【００１２】
本発明により製造されるバクテリア由来の上記分子を含有する薬物は、液状では−３５℃〜＋４℃、乾燥状態の場合は＋４０℃まで、の温度範囲において、３年間保存することが可能である。当該薬物は、副作用を引き起こさない。
【００１３】
以下の実施例を参照しつつ明細書を読むことにより、本発明をより理解できるであろう。
【００１４】
実施例１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの培養物により得た巨大分子の調製
次の成分を含有する培養液を準備する：
−  用意された培養液１リットル当たり０．０１〜０．０５ｇのラクトアルブミンに相当する、濃縮ラクトアルブミン調合物；
−  ０．３ｇ／リットルのシステイン・クロロハイドレート；
−  ２．１５ｇ／リットルのリン酸二水素カリウム；
−  ６２．５ｇ／リットルのラクトース。
【００１５】
濃縮ラクトアルブミン調合物は、溶液（例えば、ARMOR PROTEINESが供給するVitalarmor alpha 607）を、ｐH４．１の状態で、６０℃のウォーターバス中に１５分間浸けて、乳血清タンパク質を凝結させることにより得る。そして、遠心沈殿の後、上清を採集する。
【００１６】
ラクトースのみを加えることにより第１の溶液を再調製する。残りの成分を加えることにより第２の溶液を再調製する。これら２種類の溶液を、１１５℃で３０分間、オートクレーブで処理する。
【００１７】
ｐＨを制御した状態での連続培養
培養液のｐＨを、培養器に培養液を注入する際に、５．８に調節する。培養液１ミリリットル当たり１×１０6〜２×１０8コロニー形成単位（ＣＦＵｓ）の範囲でビフィドバクテリアを含有する２４時間接種原を、６．６７％（ｖ／ｖ）（培養液１５００ミリリットルに対して接種原１００ミリリットル）の割合で培養液に接種する。ビフィドバクテリアは、培養液を、振盪させつつ、曝気させずに、３７℃の温度で培養する。ｐＨは、３Ｎの水酸化ナトリウムを添加することにより５．８に保持する。培養は約２０時間持続させる。最終的なバクテリア培養物におけるビフィドバクテリウム・ブレーベの密度は、培養液１ミリリットル当たり１×１０9〜１×１０10ＣＦＵｓの範囲にある。バクテリアの当該増殖は、平均して、バクテリアの母集団の１０倍に相当する増殖である。
【００１８】
ｐＨを制御していない状態での非連続培養
培養液のｐＨを、培養器に培養液を注入する際に調節しない。培養液１ミリリットル当たり１×１０6〜２×１０8コロニー形成単位（ＣＦＵｓ）の範囲でビフィドバクテリアを含有する２４時間接種原を、６．６７％（ｖ／ｖ）（培養液１５００ミリリットルに対して接種原１００ミリリットル）の割合で培養液に接種する。ビフィドバクテリアは、培養液を、振盪させず、曝気させずに、３７℃の温度で培養する。培養は約２０時間持続させる。
【００１９】
別の実施形態では、培養液に対するビフィドバクテリアの接種を、凝縮物１ｇ当たりビフィドバクテリアを１０8〜１０12ＣＦＵｓ含有する凍結凝縮物を用いて実施する。
【００２０】
量的側面
ｐＨを制御した状態での培養において限外濾過後に回収される生産物の収量は、培養液１リットル当たり乾燥粉末７００〜１０００ミリグラムである。ローリー法によって規定されるタンパク質の量は、乾燥粉末１グラム当たり２７５ミリグラムである。デュボイス法（Dubois methods）によって規定される糖質の量は、乾燥粉末１グラム当たり２２０ミリグラムである。
【００２１】
ｐＨを制御していない状態での培養において限外濾過後に回収される生産物の収量は、培養液１リットル当たり乾燥粉末７０〜１７０ミリグラムのオーダーである。ローリー法によって規定されるタンパク質の量は、乾燥粉末１グラム当たり７１ミリグラムである。デュボイス法によって規定される糖質の量は、乾燥粉末１グラム当たり６１５ミリグラムである。
【００２２】
バクテリア培養の終盤において、８０００ｇ、３０分間の遠心分離により、バクテリアを除去する。
【００２３】
１０キロダルトンの切り離し閾値を有するAMICON spiral S10Y10型カートリッジを備えたAMICON Proflux M12装置により、室温下で、上清を限外濾過する。まず、上清を、１０倍以下に凝縮した後、１５リットルの浸透水を用いて連続的に洗浄する。残留画分は、当該洗浄工程の終盤において５００ミリリットルの体積になるまで凝縮し、凍結状態または凍結乾燥状態で保存する。
【００２４】
そして、残留画分の濃縮溶液または再調製した残留画分の溶液を、陰イオン交換樹脂の表面を通過させることにより、残留画分に含有された巨大分子を精製する（Amersham Biosciencesが供給するfast-flow DEAEセルロース樹脂、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ５０ｍＭを用いて平衡化する；濃度が０〜１Ｍになるように塩化ナトリウムを添加した状態にある同じバッファを用いて溶出させる）。
【００２５】
０．１５−０．６Ｍの塩化ナトリウム（好ましくは０．３Ｍの塩化ナトリウム）により溶出される画分から、バクテリア性の巨大分子を集める。画分は、塩類を除去した後、凍結乾燥させる。こうして製造された巨大分子は、５〜３０キロダルトンの範囲の分子量を有するオリゴ糖、および５０〜７０キロダルトンの範囲の分子量を有するバクテリア由来のタンパク質、により構成された状態にある。
【００２６】
実施例２．ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）I-2219菌株に由来する巨大分子の抗リウマチ作用の測定
本発明により製造されるバクテリア由来の巨大分子（実施例１に記載の手順によって得た精製画分により構成されている）の抗リウマチ作用を、慢性関節リウマチの実験モデル、すなわちコラーゲンＩＩにより関節炎を誘導したオスのＤＢＡ／１マウス、において評価した。
【００２７】
２．１  オスのＤＢＡ／１マウスにおけるコラーゲンIIによる関節炎の誘導作用に対する予防
使用するマウスを２つの群に分けた：
−  １５匹のマウスからなるコントロール群（コラーゲンＩＩで免疫化）；
−  ５匹のマウスからなるテスト群（コラーゲンＩＩで免疫化）。
【００２８】
オスのＤＢＡ／１マウスの尻尾の根本に、コラーゲンＩＩの注射を２回した。最初の注射は、４〜５週齢の動物に対して行った。追加投与は３週間後に行った。その翌週には、動物の関節が腫れ上がった。動物毎に関節炎のスコアを確立し、週に２〜３度記録を取った。
【００２９】
テストする動物への生成物の投与：
・コントロール：コントロール群の動物には、飲用水に代えて、バクテリア由来の巨大分子を製造する条件と同様に１０キロダルトンの限外濾過によって処理した、培養していない培養液を与えた；
・巨大分子：
１）負荷投与量：実験開始時に、そして、免疫化から１０日、１６日、２８日、３８日および５６日後に、１匹のマウス当たり１００〜１５０マイクロリットル（生成物の乾燥重量で表示して、溶液１リットル当たり１０ｇ）、
２）維持投与量：飲用水に代えて、溶液１リットル当たり０．５〜１．３ｇ（生成物の乾燥重量で表示）を、随意的に動物に与える。
【００３０】
明細書の付属書類における図１は、コントロール群のマウスおよびテスト群のマウスを比較するための、時間関数としての関節炎スコアの変遷について説明するものであり；巨大分子の投与によって関節炎の徴候の発生が予防されることを示す。当該２群間における相違（アノーバ検定による計算）には有意差がある（p<0.001）。
【００３１】
２．２  腸内細菌叢およびバクテリアル・トランスロケーションの制御作用の測定
コラーゲンＩＩにより免疫化された上記の２群の動物に加えて、培養液を与えた動物（１０匹のオスのＤＢＡ／１マウス）や巨大分子を与えた動物（６匹のオスのＤＢＡ／１マウス）についても検討した。これらの動物は、コラーゲンＩＩによる免疫化をせずに、免疫化動物のケージ内に入れた。これらの動物には関節炎が発症しなかった。
【００３２】
実験の終盤（すなわち、コラーゲンの最初の注射の５８〜６８日後）において、盲嚢、パイエル板、心臓内の血液、腎臓、脾臓、肝臓および肺中の、無気性細菌叢および条件的無気性−有気性細菌叢を数えた。動物は、最後の摂餌から２時間以降に犠牲にした。
【００３３】
表１は、糞便物１グラム当たりのＣＦＵｓ数量の対数の平均および標準偏差として表示した、腸内細菌叢の総計に関する結果を提示し、ｎは、それぞれの糞便物を検査したマウスの数量である（２群間のアノーバ比較）。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
関節炎が発症した状態にあるマウス（免疫化コントロール群）では、非免疫化動物（非免疫化コントロール群）よりも、盲嚢細菌叢が多い（p<0.0469）。こうしたバクテリアの増殖は、巨大分子を与えた、免疫化動物（免疫化テスト群）においては観察されない。このように、巨大分子は、腸内細菌叢を制御する。
【００３６】
バクテリアル・トランスロケーション
腸からのバクテリアル・トランスロケーションを、パイエル板において分析した。その結果を表２に提示する。関節炎が発症しているマウス（免疫化コントロール群）では、細菌叢の総計は増加していないものの、バクテリアの組成が変化している。グラム陽性菌による高度な汚染が、免疫化コントロールマウスにおいて観測される（アノーバ、p=0.05）。こうしたグラム陽性菌の増殖は、巨大分子で治療された免疫化群においては観察されない。このように、巨大分子は、特にコラーゲンによる免疫化によって誘導されるバクテリアル・トランスロケーションを、より確実に制御することに寄与する。
【００３７】
さらに、巨大分子は、非免疫化動物におけるバクテリアの移動を減少させる。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
バクテリアの転移
腸管のバリアーを超えた状態にあるバクテリアは、マクロファージおよび血中の多核細胞、マクロファージおよび内臓（肺、肝臓、脾臓、腎臓）の樹状細胞、によって除去される。バクテリアの転移に関する結果を表３に提示する。この結果は、免疫化の有無にかかわらず、コントロールマウスの大半において、肝臓および腎臓にバクテリアが寄生していることを示す。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
巨大分子を用いて処置した、免疫化動物では、生きたバクテリアが肝臓から単離されることはほとんどない（ｐ＝０．０２９）。
【００４２】
このように、巨大分子は、肝臓におけるバクテリア汚染を、より確実に制御することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、関節炎スコアの変遷を説明する図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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