(57)【要約】  式(I)による化合物であって、【化７６】2008516621.tif 000078GHが、N末端アミノ基から水素原子１つを除去した成長ホルモン化合物を由来とする遊離基を表し；Ｘが、酸素、または２つの水素原子を表し；Zが、結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、-CH2-O-(CH2)1-10-、-CH2-O-(C6H4)-、またはそれらの組み合わせを表し；および、Yが、【化７７】2008516621.tif 000079から選択される遊離基を表す化合物が、該化合物の作製方法とともに提供される。該化合物は、治療に有用である。【選択図】なし
2008516621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)による化合物、ならびに、その医薬的に許容可能な塩、プロドラッグおよび溶媒和化合物：
【化１】
2008516621.tif 000051
ここにおいて、GHは、成長ホルモン化合物のN末端アミノ基から１つの水素原子を除去することで誘導される遊離基を意味し；
Xは、酸素原子または２つの水素原子を意味し；
Zは、結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、-CH2-O-(CH2)1-10-、-CH2-O-(C6H4)-またはそれらの何れかの組み合わせを意味し；
Yは、
【化２】
2008516621.tif 000052
から選択される遊離基を意味し、
ここにおいて、
R1およびR4は、独立に、MeO-(CH2CH2O)100-1000-E-、[MeO-(CH2CH2O)100-1000]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)100-1000-C(=O)NH]E-、Me-(CH2)10-30-E-、Me-(CH2)10-30-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)2-10-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-30-E-、(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)1-30-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-30-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)2-10-E-、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-O-(CH2)1-30、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-(C6H4)-O-(CH2)1-30-、HO2C-(CH2)10-30-E-、シバクロニル(cibacronyl)-E-、GH-C(=O)-CH=N-O-(CH2)2-30-、GH-C(=O)-CH=N-(OCH2CH2)1-10-、GH-(C=O)-CH=N-NH-(CH2)2-30-、GH-(C=O)-CH=N-NH-(CH2CH2O)1-30-(CH2)0-30-、
【化３】
2008516621.tif 000053
を表し；
R2、R3、R5およびR6は独立に、
H、C1-6アルキル、MeO-(CH2CH2O)1-1000-E-、[MeO-(CH2CH2O)1-1000]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)1-1000-C(=O)NH]E-、Me-(CH2)1-30-E-、Me-(CH2)10-30-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)2-10-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-30-E-、(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)1-30-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-30-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)2-10-E-、HO2C-(CH2)10-30-E-、シバクロニル-E-、GH-C(=O)-CH=N-O-(CH2)2-30-、GH-C(=O)-CH=N-O-(OCH2CH2)1-10-、GH-(C=O)-CH=N-NH-(CH2)2-30-、GH-(C=O)-CH=N-NH-(CH2CH2O)1-30-(CH2)0-30-、
【化４】
2008516621.tif 000054
を意味し；
ただし、R2およびR3の少なくとも１つ、またはR5およびR6の少なくとも１つは、HまたはC1-6アルキルでなく；
Eは、結合、または、
-C(=O)NH(CH2)2-30-、-(CH2)1-30C(=O)NH(CH2)2-30-、-(CH2)0-30C(=O)NH-(CH2CH2O)1-10-(CH2)1-5-C(=O)-、-C(=O)NH-[(CH2CH2O)1-10-(CH2)1-5-C(=O)]1-5NH(CH2)2-30-、-C(=O)-、-NHC(=O)-、-C(=O)NH-、-(CH2)1-30NHC(=O)-、-(CH2)1-30C(=O)-、-NHC(=O)NH(CH2)2-30-、-(CH2)1-30NHC(=O)NH(CH2)2-30-、
【化５】
2008516621.tif 000055
-(CH2)0-30C(=O)NH(CH2)2-30-NHC(=O)-(CH2)0-30-、-(CH2)0-30C(=O)NH(CH2CH2O)1-30-CH2CH2NHC(=O)-(CH2)0-30-、-NH(CH2)2-30-、-NH-、-O-、-S-
から選択されるジラジカルを意味し；および
R7、R8およびR9は、独立に、H、C1-6アルキル、アリール、またはヘテロアリールを意味する。
【請求項２】
Xが２つの水素を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Yが以下の構造である、請求項２に記載の化合物。
【化６】
2008516621.tif 000056
【請求項４】
R9が水素を表す、請求項２または請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
請求項２から請求項４の何れか１項に記載の化合物であって、R1が、MeO-(CH2CH2O)100-1000-E-または[MeO-(CH2CH2O)100-1000]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)100-1000-C(=O)NH]E-を表す化合物。
【請求項６】
請求項５に記載の化合物であって、R1が、MeO-(CH2CH2O)400-1000-E-または[MeO-(CH2CH2O)300-600]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)300-600-C(=O)NH]E-を表す化合物。
【請求項７】
請求項５に記載の化合物であって、R1が、MeO-(CH2CH2O)400-500-E-、MeO-(CH2CH2O)600-700-E-もしくはMeO-(CH2CH2O)850-950-E-；または[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]E-を表す化合物。
【請求項８】
請求項２から請求項７の何れか１項に記載の化合物であって、Eが、-C(=O)NH(CH2)2-30-または-(CH2)1-30C(=O)NH(CH2)2-30-を表す化合物。
【請求項９】
請求項８に記載の化合物であって、Eが、-C(=O)NH(CH2)2-10または-(CH2)1-10C(=O)NH(CH2)2-10-を表す化合物。
【請求項１０】
請求項８に記載の化合物であって、Eが、-C(=O)NH(CH2)4または-(CH2)3C(=O)NH(CH2)4-を表す化合物。
【請求項１１】
請求項２から請求項１０の何れか１項に記載の化合物であって、R1が、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-、および
MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-、
【化７】
2008516621.tif 000057
【化８】
2008516621.tif 000058
から選択される化合物。
【請求項１２】
請求項２から請求項１１の何れか１項に記載の化合物であって、Zが、-CH2-O-(CH2)1-5または-CH-O-(C6H4)-を表す化合物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の化合物であって、Zが、-CH2-O-(CH2)3、-CH2-O-(CH2)4、-CH2-O-(CH2)5、-CH2-O-(1,4-C6H4)-、または-CH2-O-(1,3-C6H4)-を表す化合物。
【請求項１４】
請求項１に記載の化合物であって、XがOを表し、および、Zが結合を表す化合物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の化合物であって、Yが以下の構造を表す化合物。
【化９】
2008516621.tif 000059
【請求項１６】
R9が水素を表す、請求項１４または請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
請求項１４から請求項１６の何れか１項に記載の化合物であって、R1が、
【化１０】
2008516621.tif 000060
を表す化合物。
【請求項１８】
請求項１４から請求項１７の何れか１項に記載の化合物であって、R1が、
【化１１】
2008516621.tif 000061
を表す化合物。
【請求項１９】
請求項１４から請求項１６の何れか１項に記載の化合物であって、R1が、MeO-(CH2CH2O)100-1000-E-、[MeO-(CH2CH2O)100-1000]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)100-1000-C(=O)NH]E-、Me-(CH2)10-30-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-30-E-、(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)1-30-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-30-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)1-10、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-O-(CH2)1-30、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-(C6H4)-O-(CH2)1-30、GH-C(=O)-CH=N-(OCH2CH2)1-10-、またはシバクロニル-E-を表す化合物。
【請求項２０】
請求項１４から請求項１６および請求項１９の何れか１項に記載の化合物であって、R1が、MeO-(CH2CH2O)400-1000-E-、[MeO-(CH2CH2O)400-800]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-800-C(=O)NH]E-、Me-(CH2)10-20-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-20-E-、(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)1-20-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-20-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)1-5、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-O-(CH2)1-20、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-(C6H4)-O-(CH2)1-20-、GH-C(=O)-CH=N-(OCH2CH2)1-8-、またはシバクロニル-E-を表す化合物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の化合物であって、R1が、MeO-(CH2CH2O)400-500-E-、MeO-(CH2CH2O)600-700-E-、MeO-(CH2CH2O)850-950-E-、[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]E-、[MeO-(CH2CH2O)600-700]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)600-700-C(=O)NH]E-、Me-(CH2)12-E-、Me-(CH2)10-20-E-、Me-(CH2)14-E-、Me-(CH2)16-E-、Me-(CH2)18-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)15-E-、(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)14-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)4、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-O-(CH2)15、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-(C6H4)-O-(CH2)15-、またはシバクロニル-E-を表す化合物。
【請求項２２】
請求項１４から請求項１６および請求項１９から請求項２１の何れか１項に記載の化合物であって、Eが、-C(=O)NH(CH2)2-30-、-(CH2)1-30C(=O)NH(CH2)2-30-、
【化１２】
2008516621.tif 000062
、-C(=O)NH-[(CH2CH2O)1-10-(CH2)1-5-C(=O)]1-5NH(CH2)2-30-、または結合を表す化合物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の化合物であって、Eが、-C(=O)NH(CH2)2-10-、-(CH2)1-10C(=O)NH(CH2)2-10-、
【化１３】
2008516621.tif 000063
、-C(=O)NH-[(CH2CH2O)1-5-(CH2)1-C(=O)]1-4NH(CH2)2-10-、または結合を表す化合物。
【請求項２４】
請求項２２に記載の化合物であって、Eが、-C(=O)NH(CH2)4-、-(CH2)3C(=O)NH(CH2)4、
【化１４】
2008516621.tif 000064
、-C(=O)NH-[(CH2CH2O)2-(CH2)1-C(=O)]1NH(CH2)4-、-C(=O)NH-[(CH2CH2O)2-(CH2)1-C(=O)]2NH(CH2)4-、-C(=O)NH-[(CH2CH2O)2-(CH2)1-C(=O)]3NH(CH2)4-、および結合を表す化合物。
【請求項２５】
請求項１４から請求項２２に記載の化合物であって、R1が、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-、
MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-、
MeO-(CH2CH2O)600-700-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)600-700-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-、
【化１５】
2008516621.tif 000065
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)3-C(=O)-NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2CH2-O)2-CH2-C(=O)NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-[NH-(CH2CH2-O)2-CH2-C(=O)]2NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-[NH-(CH2CH2-O)2-CH2-C(=O)]3NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)14-C(=O)-NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)(1,4-C6H4)-O-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)(1,4-C6H4)2-O-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2)4-、
GH-C(=O)-CH2-CH=N-(O-CH2CH2)2-、
GH-C(=O)-CH2-CH=N-(O-CH2CH2)3-、
GH-C(=O)-CH2-CH=N-(O-CH2CH2)4-、
GH-C(=O)-CH2-CH=N-(O-CH2CH2)5-、
GH-C(=O)-CH2-CH=N-(O-CH2CH2)6-、
シバクロニル-NH-(CH2)4-、
【化１６】
2008516621.tif 000066
【化１７】
2008516621.tif 000067
を表す化合物。
【請求項２６】
請求項１に記載の化合物であって、
[MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2-NH-C(=O)-O-CH2]2CH-O-(CH2)3-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
[MeO-(CH2CH2O)600-750](CH2)3-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)600-750-(CH2)3C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
[MeO-(CH2CH2O)600-700]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)600-700-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
【化１８】
2008516621.tif 000068
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)3-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2CH2-O)2-CH2-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-[NH-(CH2CH2-O)2-CH2-C(=O)]2NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-[NH-(CH2CH2-O)2-CH2-C(=O)]3NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)14-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリル)(1,4-C6H4)-O-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリル)(1,4-C6H4)2-O-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
GH-C(=O)-CH=N-(O-CH2CH2)2-O-N=CH-C(=O)-GH、
GH-C(=O)-CH=N-(O-CH2CH2)3-O-N=CH-C(=O)-GH、
GH-C(=O)-CH=N-(O-CH2CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
GH-C(=O)-CH=N-(O-CH2CH2)5-O-N=CH-C(=O)-GH、
GH-C(=O)-CH=N-(O-CH2CH2)6-O-N=CH-C(=O)-GH、
シバクロニル-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)4-GH、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)4-GH、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)4-GH、
[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)4-GH、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)5-GH、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)5-GH、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)5-GH、
[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)5-GH、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)6-GH、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)6-GH、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)6-GH、
[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)6-GH、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,4-C6H4)CH2-GH、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,4-C6H4)CH2-GH、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,4-C6H4)CH2-GH、
[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,4-C6H4)CH2-GH、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,3-C6H4)CH2-GH、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,3-C6H4)CH2-GH、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,3-C6H4)CH2-GH、
[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,3-C6H4)CH2-GH、
【化１９】
2008516621.tif 000069
【化２０】
2008516621.tif 000070
【化２１】
2008516621.tif 000071
から選択される化合物。
【請求項２７】
請求項１または請求項２に記載の化合物の作製のための方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)  式Q-Z-CH=Oの化合物との、GHのN末端アミノ基の還元的アルキル化、ここにおいて、Qは、適した薬剤によってアルデヒドまたはケトンに変換されうる官能基であり、この結果式ＩＩの化合物が得られる；および
【化２２】
2008516621.tif 000072
(b)  式(II)による化合物の官能基Qを、アルデヒドまたはケトンへ変換し、式(III’)の化合物を得る、
【化２３】
2008516621.tif 000073
ここにおいて、Aは、アルデヒドまたはケトン部分を表す；および
(c)  式(III’)の化合物と、R1-O-NH2、R2R3N-NH2、R4NH(CH2)2-3SHまたはR5CH(NR6H)(CR7R8)1-2SHから選択される化合物との縮合、ここにおいて、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、請求項１に定義されるとおりである。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、Qが、
【化２４】
2008516621.tif 000074
から選択され、
ここにおいて、R9はH、C1-6アルキル、アリール、またはヘテロアリールを表し、および、式(III’)による化合物が式(III)の形態をとる方法。
【化２５】
2008516621.tif 000075
【請求項２９】
請求項１または請求項３に記載の化合物の作製のための方法であって、以下の段階を含む方法：
(a’)  式(IV)による、N末端がセリンにより延長したGHを酸化し、
Ser-GH  (IV)
式(V)による、グリオキシル酸誘導体とする
O=CH-C(=O)-GH (V);
(b’)  式Vによる該誘導体と、R1-O-NH2、R2R3N-NH2、R4NH(CH2)2-3SHまたはR5CH(NR6H)(CR7R8)1-2SHから選択される化合物との縮合、ここにおいて、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、請求項１に定義される通りである。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、(a’)における前記酸化が、過ヨウ素酸塩によって達成される方法。
【請求項３１】
式(II)または(III)による化合物：
【化２６】
2008516621.tif 000076
ここにおいて、Zは、結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、またはそれらの組み合わせを表し；および
Qは、
【化２７】
2008516621.tif 000077
から選択される、適した試薬で処理することにより、アルデヒドまたはケトンに変換され得る官能基であり、ここにおいて、R9は、H、C1-6アルキル、アリール、またはヘテロアリールである。
【請求項３２】
R9が水素である、請求項３１に記載の化合物。
【請求項３３】
Zが、-CH2-O-(CH2)1-5または-CH-O-(C6H4)-である、請求項３１または請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の化合物であって、Zが、-CH2-O-(CH2)3、-CH2-O-(CH2)4、-CH2-O-(CH2)5、-CH2-O-(1,4-C6H4)-または-CH2-O-(1,3-C6H4)-である化合物。
【請求項３５】
請求項３１から請求項３４の何れか１項に記載の化合物であって、GHが、hGHからN末端アミノ基を除去することにより得られる遊離基である化合物。
【請求項３６】
式IVによる化合物；
Ser-GH (IV)
ここにおいて、GHは、N末端アミノ基から１つの水素原子を除去することで成長ホルモン化合物から誘導される遊離基を表すが、前記化合物はSer-hGHではない。
【請求項３７】
式Vによる化合物；
O=CH-C(=O)-GH (V)
ここにおいて、GHは、N末端アミノ基から１つの水素原子を除去することで成長ホルモン化合物から誘導される遊離基を表す。
【請求項３８】
元のGHと比較して薬理学的性質が改善された結合型GHの作製における、請求項３１に記載の化合物の使用。
【請求項３９】
元のGHと比較して薬理学的性質が改善された結合型GHの作製における、請求項３６または請求項３７に記載の化合物の使用。
【請求項４０】
請求項３８および請求項３９の何れか１項に記載の使用であって、前記薬理学的性質の改善が、in vivo半減期の増大である使用。
【請求項４１】
請求項３６に記載の化合物をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、ただし前記構築物は、Ser-hGHをコードしない核酸構築物。
【請求項４２】
請求項４１に記載の構築物を含むベクター。
【請求項４３】
請求項４２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４４】
治療における使用のための、請求項１から請求項２６の何れか１項に記載の化合物。
【請求項４５】
請求項１から請求項２６の何れか１項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項４６】
成長ホルモンの循環レベルの増大により利益を得る疾病を治療する方法であって、請求項１から請求項２６の何れか１項に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記投与が、１日おきに、またはそれより長い間隔をおいて行われる方法。
【請求項４８】
成長ホルモンの循環レベルの増大により利益を得る疾病の治療のための薬剤の製造における、請求項１から請求項２６の何れか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬理的な性質が改善した成長ホルモンの結合体(conjugates)に関し、および治療における前記ホルモンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の性質および特性を、前記タンパク質に化学基を結合させ適切に性質を変えることによって修飾することは周知のことである。そのような結合は、一般に、結合する基の官能基と反応する官能基がタンパク質中に存在することが必要である。典型的に、N末端アミノ基、リジンのε-アミノ基またはシステインのチオール基といったアミノ基が、適したアシル化試薬と組み合わせることで使用されてきた。
【０００３】
しばしば、特定の部位で結合することが、望まれまたさらには要求されることがあり、このことは、位置選択性結合(regioselective conjugation)と呼ばれる。しかしながら、ヒト成長ホルモン(hGH)といった成長ホルモンの位置選択性アシル化は困難である。というのも、このタンパク質が、同様の反応性を示すリジン残基を９つ含んでおり、通常生成物の混合物が得られるためである。これらの混合物の単一の構成成分は単離するのが難しく、通常、低い収率および純度でしか得られないだろう。
【０００４】
Gaertnerらは、文献(Bioconjugate Chem., 7, 38-44, 1996)にて、PEGをIL-8、G-CFSおよびIKL-1raに結合させる方法を開示している。その方法では、N末端にアルデヒドを作り、アルコキシアミンで官能性をもたせたPEGと反応させている。N末端アミノ酸残基がセリンの場合は過ヨウ素酸塩を用いた酸化によって、N末端アミノ酸残基がセリンではない場合は金属触媒によるアミノ基転移によって、N末端にアルデヒドが作られる。
【０００５】
N末端セリンで延長されたヒト成長ホルモン、Ser-hGHが、WO 04/007687にて、SEQ ID No. 66として開示されている。この応用は、例えば性質の改善されたhGHの多量体に関する。
【０００６】
ヒト成長ホルモンは、選択的にN末端アミノ基のアルデヒドにて、還元的にアルキル化されることも知られている(US 20040127417)。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、元の成長ホルモン化合物と比較して薬理学的性質が改善されるように、選択的にN末端にて結合された成長ホルモン化合物(GH)に関する。
【０００８】
従って、一実施態様において、本発明は、式(I)による化合物、ならびにその医薬的に許容可能な塩、プロドラッグおよび溶媒和化合物を提供する：
【化２８】
2008516621.tif 000003
【０００９】
ここにおいて、GHは、成長ホルモン化合物のN末端アミノ基から１つの水素原子を除去することで誘導される遊離基を意味し；
Xは、酸素原子または２つの水素原子を意味し；
Zは、結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、-CH2-O-(CH2)1-10-、-CH2-O-(C6H4)-またはそれらの組み合わせを意味し；
Yは、
【化２９】
2008516621.tif 000004
【００１０】
から選択される遊離基を意味し、
ここにおいて、
R1および R4は、独立に、MeO-(CH2CH2O)100-1000-E-、[MeO-(CH2CH2O)100-1000]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)100-1000-C(=O)NH]E-、Me-(CH2)10-30-E-、Me-(CH2)10-30-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)2-10-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-30-E-、(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)1-30-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-30-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)2-10-E-、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-O-(CH2)1-30、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-(C6H4)-O-(CH2)1-30-、HO2C-(CH2)10-30-E-、シバクロニル(cibacronyl)-E-、
GH-C(=O)-CH=N-O-(CH2)2-30-、GH-C(=O)-CH=N-(OCH2CH2)1-10-、GH-(C=O)-CH=N-NH-(CH2)2-30-、GH-(C=O)-CH=N-NH-(CH2CH2O)1-30-(CH2)0-30-、
【化３０】
2008516621.tif 000005
【００１１】
を意味し；
R2、R3、R5およびR6は独立に、
H、C1-6アルキル、MeO-(CH2CH2O)1-1000-E-、[MeO-(CH2CH2O)1-1000]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)1-1000-C(=O)NH]E-、Me-(CH2)1-30-E-、Me-(CH2)10-30-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)2-10-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-30-E-、(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)1-30-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-30-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)2-10-E-、HO2C-(CH2)10-30-E-、シバクロニル-E-、GH-C(=O)-CH=N-O-(CH2)2-30-、GH-C(=O)-CH=N-O-(OCH2CH2)1-10-、GH-(C=O)-CH=N-NH-(CH2)2-30-、GH-(C=O)-CH=N-NH-(CH2CH2O)1-30-(CH2)0-30-、
【化３１】
2008516621.tif 000006
【００１２】
を意味し；
ただし、R2およびR3の少なくとも１つ、またはR5およびR6の少なくとも１つは、HまたはC1-6アルキルでなく；
Eは、結合、または、
-C(=O)NH(CH2)2-30-、-(CH2)1-30C(=O)NH(CH2)2-30-、-(CH2)0-30C(=O)NH-(CH2CH2O)1-10-(CH2)1-5-C(=O)-、-C(=O)NH-[(CH2CH2O)1-10-(CH2)1-5-C(=O)]1-5NH(CH2)2-30-、-C(=O)-、-NHC(=O)-、-C(=O)NH-、-(CH2)1-30NHC(=O)-、-(CH2)1-30C(=O)-、-NHC(=O)NH(CH2)2-30-、-(CH2)1-30NHC(=O)NH(CH2)2-30-、
【化３２】
2008516621.tif 000007
【００１３】
-(CH2)0-30C(=O)NH(CH2)2-30-NHC(=O)-(CH2)0-30-、-(CH2)0-30C(=O)NH(CH2CH2O)1-30-CH2CH2NHC(=O)-(CH2)0-30-、-NH(CH2)2-30-、-NH-、-O-、-S-
から選択されるジラジカルを意味し；
R7、R8およびR9は、独立に、H、C1-6アルキル、アリール、またはヘテロアリールを意味する。
【００１４】
一実施態様において、本発明は、式Iの化合物を作製する方法であって、以下の段階を含む方法に関する：
(a)  式Q-Z-CH=Oの化合物との、GHのN末端アミノ基の還元的アルキル化、ここにおいて、Qは、適した薬剤によってアルデヒドまたはケトンに変換されうる官能基であり、この結果式ＩＩの化合物が得られる；
【化３３】
2008516621.tif 000008
【００１５】
(b)  式(II)による化合物の官能基Qの、式(III’)によるアルデヒドまたはケトンへの変換、
【化３４】
2008516621.tif 000009
【００１６】
ここにおいて、Aは、アルデヒドまたはケトン部分を意味する；および
(c)  式(III’)の化合物と、R1-O-NH2、R2R3N-NH2、R4NH(CH2)2-3SHまたはR5CH(NR6H)(CR7R8)1-2SHから選択される化合物との縮合。
【００１７】
一実施態様において、本発明は、式(I)による化合物の作製する方法に関し、該方法は、以下の段階を含む：
(a’)  式(IV)によるN末端がセリンにより延長したGHを酸化し、
Ser-GH  (IV)
式(V)によるグリオキシル酸誘導体とし、
O=CH-C(=O)-GH (V);および
(b’)  式Vによる該誘導体と、R1-O-NH2、R2R3N-NH2、R4NH(CH2)2-3SHまたはR5CH(NR6H)(CR7R8)1-2SHから選択される化合物とを縮合させる。
【００１８】
一実施態様において、本発明は、式(II)または(III)による化合物に関する。
【化３５】
2008516621.tif 000010
【００１９】
一実施態様において、本発明は、式IVまたはVによる化合物を提供するが、ただし該化合物はSer-hGHでない；
Ser-GH  (IV)        O=CH-C(=O)-GH (V)。
【００２０】
一実施態様において、本発明は、元のGHと比較して薬理学的性質が改善された結合型GHの作製における、式(II)または式(III)による化合物の使用を提供する。
【００２１】
一実施態様において、本発明は、元のGHと比較して薬理学的性質が改善された結合型GHの作製における、式(IV)または式(V)による化合物の使用を提供する。
【００２２】
一実施態様において、本発明は、式Vによる化合物をコードする核酸配列を含む核酸構築物に関し、ただし該構築物はSer-hGHをコードせず、該構築物を含むベクターに関し、および該ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００２３】
一実施態様において、本発明は、治療における使用のための式(I)による化合物に関する。
【００２４】
一実施態様において、本発明は、式(I)による化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
一実施態様において、本発明は、成長ホルモンの循環レベルの増加により利益を得る疾病の治療の方法であって、式(I)による化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
一実施態様において、本発明は、成長ホルモンの循環レベルの増加により利益を得る疾病の治療のための薬物の製造における、式(I)による化合物の使用に関する。
【定義】
【００２７】
本願の文脈において、「成長ホルモン」（GH）は、本出願の試験Ｉで決定されるような成長ホルモン活性を示すタンパク質を表すよう意図される。前記試験において、hGHの活性に対して、２０％超、例えば４０％超、例えば６０％超、例えば８０％超の活性を示すタンパク質が、成長ホルモン化合物として定義される。
【００２８】
本願の文脈において、タンパク質は、ペプチド結合でつながる２以上のアミノ酸配列を表すよう意図され、該アミノ酸は、天然または非天然のアミノ酸であってよい。この用語は、例えば、親油基、PEGまたは補欠分子族の付加によって誘導体化されたタンパク質をも含むと意図されることが理解されるべきである。
【００２９】
本願の文脈において、「アルキル」という用語は、１から６の炭素原子を有した、直鎖、分枝鎖および/または環状飽和一価炭化水素遊離基を表すよう意図され、C1-6-アルキルとも示される。C1-6-アルキル基には、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、4-メチルブチル、n-ヘキシル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル(ネオペンチル)および1,2,2-トリメチルプロピルが含まれる。「アルキレン」という用語は、対応する二端遊離基(bi-radical)を表す。
【００３０】
本願で使用される「アリール」という用語は、１以上の環を含む炭素環式芳香環系を意味し、例えば、フェニル、ビフェニリル(biphenylyl)、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インデニル、ペンタレニル(pentalenyl)およびアズレニルを意味するよう意図される。アリールはまた、上に列挙された多環炭素環系の部分的に水素付加された誘導体であって、少なくとも１つの環が芳香族である誘導体を含むよう意図される。そのような部分的に水素付加された誘導体には、1,2,3,4-テトラヒドロナフチルおよび1,4-ジヒドロナフチルが含まれる。「アリーレン」という用語は、対応する二端遊離基を表し、例えば、1,2-フェニレン、1,3-フェニレン、1,4-フェニレン、1,2-ナフチレン、1,4-ナフチレン、4,4'-ビフェニレン、4,4''-テルフェニレンおよび4,4'''-クアテルフェニレンを含む。
【００３１】
本出願で使用される「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素および硫黄から選択される１以上のヘテロ原子を含む、複素環式芳香環系の遊離基を表し、例えば、フリル、チエニル、ピローリル(pyrrolyl)、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、ピラニル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、1,2,3-トリアジニル、1,2,4-トリアジニル、1,3,5-トリアジニル、1,2,3-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、1,2,3-チアジアゾリル、1,2,4-チアジアゾリル、1,2,5-チアジアゾリル、1,3,4-チアジアゾリル、テトラゾリル、チアジアジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンズイソキサゾリル、プリニル、キナゾリニル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、プテリジニル、カルバゾリル、アゼピニル、ジアゼピニル、アクリジニル等を表すよう意図される。この用語はまた、上に列挙された多環複素環系の部分的に水素付加された誘導体であって、ヘテロ原子を含む少なくとも１つの環が、芳香族である誘導体を含むよう意図される。そのような部分的に水素付加された誘導体の例は、2,3-ジヒドロベンゾフラニル、ピロリニル、ピラゾリニル、インドリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリニルおよびオキサゼピニルを含む。「ヘテロアリーレン」という用語は、対応する二端遊離基を表すよう意図され、例えば、1,2,4-ピラゾール-2,5-ジイル、イミダゾール-1,2-ジイル、チアゾール-2,4-ジイル、(4-フェニルイミダゾール)-4,1'-ジイルおよび(3,5-ジフェニル-1,2,4-オキサジアゾール)-4,4''-ジイルが含まれる。
【００３２】
「シバクロニル(cibacronyl)」という用語は、以下に図示される遊離基、またはその何れかの塩もしくは溶媒和化合物を意味する。
【化３６】
2008516621.tif 000011
【００３３】
本出願にて使用される「溶媒和化合物」という用語は、溶質および溶媒から形成される、明確な化学量論の複合体である。溶媒は、例として、水、エタノール、または酢酸であってよい。
【００３４】
「双極性(dipolar)溶媒和化合物」という用語は、比誘電率が6.0より大きい溶媒和化合物を表す。
【００３５】
「Peg」という用語は、以下の構造の、多分散または単分散のジラジカルを意味し、
【化３７】
2008516621.tif 000012
【００３６】
ここにおいて、nは１より大きい整数であり、その分子量は、約100から約1,000,000 Daの間である。
【００３７】
「mPEG」または「mPeg」という用語は、以下の構造の、多分散または単分散のラジカルを意味し、
【化３８】
2008516621.tif 000013
【００３８】
ここにおいて、mは１より大きい整数である。従って、mが90であるmPEGは、3991 Daの分子量、すなわち約4 kDaの分子量を有する。同様に、平均分子量20 kDaのmPEGは、mの平均が454である。mPEGを作製の過程により、これらの分子はしばしば、分子量の分布を有す。この分布は、多分散指数(polydispersity index)により記述される。
【００３９】
mのこの分布によって、20 kDaの分子量を有すmPEGは、MeO-(CH2CH2O)400-500としても表してよく、30 kDaの分子量を有すmPEGは、MeO-(CH2CH2O)600-700としても表してよく、および40 kDaの分子量を有すmPEGは、MeO-(CH2CH2O)850-950としても表してよい。より重いmPEG鎖は、一本鎖分子として作製することが困難である可能性があり、従って、分枝mPEGとして作られる。特に、40 kDaの分子量を有するmPEGは、それぞれ20 kDaのアームを含む分枝mPEGとして達成されてよい。
【００４０】
本出願にて使用される「多分散指数(polydispersity index)」という用語は、重量平均分子量と数平均分子量の比を意味し、ポリマー化学の分野において既知である（例えば、“Polymer Synthesis and Characterization”, J.A. Nairn, University of Utah, 2003参照）。多分散指数は、1以上の数であり、ゲル透過クロマトグラフィーのデータから推定してよい。多分散指数が１の場合、生成物は、単分散であり、従って単一の分子量の化合物からできている。多分散指数が１より大きい場合、これは、そのポリマーの多分散の尺度となり、すなわち、異なる分子量を有するポリマーの分布がどれだけ広いかが表される。
【００４１】
式、化合物名にて、または分子構造にて例えば「mPEG20000」を使用した場合、mPEGが多分散であり約20 kDaの分子量を有すmPEG残基であることを表す。
【００４２】
多分散指数は、典型的に、PEGまたはmPEGの分子量に伴い増大する。20 kDa PEGおよび特に20 kDa mPEGと言及された場合、これは、多分散指数が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02から1.03の間の値をとる化合物（または実際には、化合物の混合物）を表すよう意図される。30 kDa PEGおよび特に30 kDa mPEGと言及された場合、これは、多分散指数が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02から1.03の間の値をとる化合物（または実際には、化合物の混合物）を表すよう意図される。40 kDa PEGおよび特に40 kDa mPEGと言及された場合、これは、多分散指数が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02から1.03の間の値をとる化合物（または実際には、化合物の混合物）を表すよう意図される。
【００４３】
本出願で使用されるような、「プロドラッグ」という用語は、生物加水分解性(biohydrolyzable)アミドおよび生物加水分解性エステルを含み、および、a)そのようなプロドラッグの生物加水分解性の官能性が本発明による化合物に包含されている化合物、およびb)所定の官能基が酸化または還元されることで本発明による薬剤物質が得られる化合物を包含する。これらの官能基の例は、1,4-ジヒドロピリジン、N-アルキルカルボニル-1,4-ジヒドロピリジン、1,4-シクロヘキサジエン、tert-ブチル等を含む。
【００４４】
本出願で使用されるような、「生物加水分解性エステル」という用語は、原体(drug substance)（この場合、本発明による化合物）のエステルであって、a)元の物質の生物活性を妨害しないものの、その物質に、作用期間、作用の開始等といったin vivoにおける有利な性質を付与するエステル、またはb)生物学的に不活性であるものの、患者によりin vivoで容易に生物学的な有効成分に変換されるエステルのどちらかである。この利点は、例えば可溶性が増大すること、または、生物加水分解性エステルが、経口投与で腸から吸収され、血漿中で本発明による化合物に変換されるということである。そういった多くの例は、当該技術において知られており、例えば、低級アルキルエステル（例えば、C1-C4）、低級アシルオキシアルキルエステル、低級アルコキシアシルオキシアルキルエステル、アルコキシアシルオキシエステル、アルキルアシルアミノアルキルエステルまたはクロリンエステルが含まれる。
【００４５】
本出願で使用されるような、「生物加水分解性アミド」という用語は、原体（この場合、本発明による化合物）のアミドであって、a)元の物質の生物活性を妨害しないものの、その物質に、作用期間、作用の開始等といったin vivoにおける有利な性質を付与するエステル、またはb)生物学的に不活性であるものの、患者によりin vivoで容易に生物学的な有効成分に変換されるエステルのどちらかである。この利点は、例えば可溶性が増大すること、または、生物加水分解性エステルが、経口投与で腸から吸収され、血漿中で本発明による化合物に変換されるということである。そういった多くの例が、当該技術において知られており、例えば、低級アルキルアミド、α-アミノ酸アミド、アルコキシアシルアミド、およびアルキルアミノアルキルカルボニルアミドが含まれる。
【００４６】
本願の文脈において、「医薬的に許容可能な塩」という用語は、患者に対して有害でない塩を表すよう意図される。そのような塩には、医薬的に許容可能な酸付加塩、医薬的に許容可能な金属塩、アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩を含む。酸付加塩は、無機酸ならびに有機酸の塩を含む。適した無機酸の典型例は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸等を含む。適した有機酸の典型例は、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、ケイ皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモ酸(pamoic acid)、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、EDTA、グリコール酸、p-アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸等を含む。医薬的に許容可能な無機または有機酸付加塩の更なる例は、J. Pharm. Sci. 1977, 66, 2に列挙される医薬的に許容可能な塩を含み、該文献は本出願に援用される。金属塩の例には、リチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩等が含まれる。アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩の例には、アンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、エチルアンモニウム塩、ヒドロキシエチルアンモニウム塩、ジエチルアンモニウム塩、ブチルアンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等が含まれる。
【００４７】
本出願にて使用される、化合物の「治療的有効量」とは、所定の疾病およびその合併症の臨床症状を、治癒、緩和、または部分的に阻止するのに十分な量を意味する。これを達成するために適した量が「治療的有効量」として定義される。それぞれの目的に応じた有効量は、例えば、疾病または傷害の重症度、ならびに患者の体重、性別、年齢および一般的な状態に依存するだろう。適切な投与量の決定は、評価の行列(matrix of values)を構築し、行列中の様々な点で試験をすることによる、日常的な実験を用いて達成してよく、そのような実験は、全て、経験を積んだ医師または獣医師の通常の技術に含まれる。
【００４８】
本出願で使用される「治療」または「治療する」とう用語は、疾病または障害といった症状と闘う目的のために、患者を管理しケアすることを意味する。この用語は、患者が患う所定の症状に対する、十分な範囲の治療を含むよう意図され、例えば、病徴または合併症を緩和するために、疾病、障害または症状の進行を鈍化するために、病徴および合併症を緩和または軽減するために、および/または、疾病、障害または症状を治癒または除くために、ならびに、症状を予防するために（ここにおいて予防は、疾病、症状、または障害と闘う目的で患者を管理およびケアすることと解されるべきである）活性化合物を投与することが含まれ、および、病徴または合併症の発症を予防するために、活性化合物を投与することを含む。治療される患者は、好ましくは、哺乳類、特にヒトであり、しかし、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジおよびブタといった動物を含んでもよい。
【発明の詳細な説明】
【００４９】
一実施態様において、本発明は、N末端に化学基が結合したGH、すなわち化学式(I)による化合物に関する。
【化３９】
2008516621.tif 000014
【００５０】
前記化合物は、元の(parent)GHとも呼ばれる対応する非結合型GHと比較して、薬理学的性質が改善されている。そのような薬理学的性質の例は、機能的in vivo半減期(functional in vivo half-life)、免疫原性、腎臓でのろ過、プロテアーゼに対する保護作用およびアルブミン結合を含む。
【００５１】
「機能的in vivo半減期」という用語は、通常の意味で使用され、すなわち、GHまたは結合型GHの５０％の生物活性が、なお体内/標的組織に存在している時間であり、またはGHもしくはGH結合体(conjugates)の活性が、その最初の値の５０％となった時間を意味する。機能的in vivo半減期を決定するかわりに、「in vivo血漿半減期(in vivo plasma half-life)」が決定されてよく、すなわち、これは、GHまたはGH結合体の５０％が、排除される前に、血漿または血流中で循環している時間である。血漿半減期の決定は、しばしば、機能的半減期の決定より単純であり、血漿半減期の大きさは、通常、機能的in vivo半減期の大きさの良い指標である。血漿半減期の別称には、血清半減期(serum half-life)、循環半減期(circulating half-life)、循環性半減期(circulatory half-life)、血清排除(serum clearance)、血漿排除(plasma clearance)、および排除半減期(clearance half-life)が含まれる。
【００５２】
機能的in vivo半減期または血漿半減期と関連して使用される「増加する」という用語は、GH結合体の関連した半減期が、同等の条件下で、もとのGHと比較して、統計的に有意に増加していることを表すように使用される。例えば、関連した半減期は、少なくとも約25％まで、例えば少なくとも約50％まで、例えば少なくとも100％、150％、200％、250％、または500％まで増加してよい。一実施態様において、本発明による化合物は、元のGHの半減期と比較して、少なくとも5時間、好ましくは少なくとも約24時間、より好ましくは少なくとも約72時間、および最も好ましくは少なくとも約7日間の半減期の増大を示す。
【００５３】
in vivo血漿半減期の測定は、文献に記載されるような多数の方法にて行うことができる。in vivo血漿半減期における増大は、排除(CL)の減少として、または平均滞留時間(MRT)の増加として定量してよい。本発明による結合型GHが、元のGHのＣＬの70％未満、例えば50％未満、例えば20％未満、例えば10％未満に減少していると適当な試験にて決定された場合、in vivo血漿半減期が増加したといえる。適当な試験にて、本発明による結合型GHのMRTが、元のGHのMRTの130％超、例えば150％超、例えば200％超、例えば500％超まで増加した場合、in vivo血漿半減期は増加したといえる。排除および平均滞留時間は、適当な実験動物を用いて、標準的な薬物動態学的実験にて評価することができる。所定のタンパク質に適した実験動物を選択することは、当業者の能力の範囲内である。ヒトにおける試験は、もちろん、究極的な試験を意味する。適当な実験動物には、正常な、オスのスプラーグ-ドーリー(Sprague-Dawley)ラット、マウスおよびカニクイザルが含まれる。典型的に、マウスおよびラットは、皮下による単一の大量瞬時投与(bolus)で注射され、一方サルは、皮下による単一の大量瞬時投与(bolus)、または単一の静脈による投与で注射してよい。注射する量は実験動物に依存する。続いて、CLおよびMRTの評価に適すように、１から5日間にわたって、血液サンプルが採取される。血液サンプルは、ELISA技術によって都合よく分析される。
【００５４】
化合物の「免疫原性」という用語は、ヒトに投与されたときに、体液性、細胞性またはその両方による、有害な免疫反応を誘発する化合物の能力を表す。何れかのヒトの部分母集団において、特定の投与されたタンパク質に感受性を示す個人が存在してよい。免疫原性は、当該分野において既知の通常の技術を用いて、感受性を示す個人において、成長ホルモンに対する抗体および/または成長ホルモンに応答するT細胞の存在を定量して測定してよい。一実施態様において、本発明による結合型GHは、感受性を示す個人において、元のGHの免疫原性と比較して、少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約40％および最も好ましくは少なくとも約50％の免疫原性の減少を示す。
【００５５】
本出願で使用される「プロテアーゼに対する保護作用(protease protection)」または「プロテアーゼ保護性(protease protected)」という用語は、本発明による結合型GHが、血漿ペプチダーゼまたはプロテアーゼに対して、元のGHより抵抗性を示すことを表すよう意図される。血漿中に存在するプロテアーゼおよびペプチダーゼ酵素は、循環するタンパク質、例えば、成長ホルモンといった循環するペプチドホルモンの分解に関与する。
【００５６】
例えば、ジペプチジルアミノペプチダーゼIV (DPPIV)による分解に対する、タンパク質の抵抗性は、以下の分解試験によって決定される：タンパク質の一定分量(5 nmol)を、0.1 Mトリエチルアミン-HCl緩衝液(pH 7.4)100μL中で、酵素活性が5 mUに相当する精製ジペプチジルアミノペプチダーゼIV 1μLとともに、37℃で10-180分間インキュベートする。酵素反応を、5μLの10％トリフルオロ酢酸を添加して停止し、タンパク質分解産物を、HPLC分析を用いて分離し定量する。この分析を行うための、別の方法は次の通りである：Siegelら(Regul. Pept. 1999;79:93-102)およびMentleinら(Eur. J. Biochem. 1993;214:829-35)の方法に従い、混合物を、Vydac C18 widepore (30 nm 細孔、5 μm 粒子) 250 x 4.6 mm カラムに供し、0.1%トリフルオロ酢酸において、アセトニトリルの直線的な段階的勾配を作って（0％アセトニトリルで3分、0-24％のアセトニトリルで17分、24−48％アセトニトリルで1分）、1 ml/分の流速で溶出する。タンパク質およびその分解生成物を、220 nm(ペプチド結合)または280 nm(芳香族アミノ酸)で吸光度を測定し、そのピーク面積を、標準のそれを基準に積分して定量する。ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによるタンパク質の加水分解の速度は、加水分解によりペプチドが10％未満となったときのインキュベーション時間で推定する。一実施態様において、GH結合体の加水分解速度は、元のGHの70％未満、例えば40％未満、例えば10％未満である。
【００５７】
哺乳類種の循環血液において、最も豊富なタンパク質成分は、血清アルブミンであり、正常な状態で、血液全体の100 mL当り約3から4.5グラムの濃度で存在している。血清アルブミンは、約70,000ダルトンの血液タンパク質であり、循環系において幾つかの重要な機能を有している。これは、血液中にみられる様々な有機分子のトランスポーターとして機能し、脂肪酸およびビリルビンといった様々な代謝産物の主要なトランスポーターであり、および、その存在量のために循環血液の浸透圧調節因子として機能する。血清アルブミンは、1週間を越える半減期を有しており、タンパク質の血漿半減期を増加させる1つの方法は、血清アルブミンに結合する化学基をタンパク質に結合させることである。アルブミン結合特性は、J.Med.Chem, 43, 2000, 1986-1992に記載されるとおりに決定してよく、該文献は本出願に援用される。
【００５８】
一実施態様において、GHは、SEQ ID NO 1にて示されるアミノ酸配列を有するヒト成長ホルモン(hGH)である。
【００５９】
一実施態様において、GHは、hGHの変種(variant)であり、該変種は、hGH配列の1以上のアミノ酸残基を別の天然または非天然アミノ酸に置換することによって；および/または、1以上の天然または非天然アミノ酸をhGH配列に付加することによって；および/またはhGH配列から1以上のアミノ酸を欠失させることによって得られる化合物であると理解され、何れかのこれらの工程は、任意に、さらに1以上のアミノ酸の誘導体化を行ってよい。特に、1つのアミノ酸は、同じグループの別のアミノ酸残基によって、すなわち、同様の性質を有した別のアミノ酸残基によって置換されるという意味で、そのような置換は保存的である。アミノ酸は、都合よく、その性質に基づいて以下の群に分けてよい：塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（たとえば、グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えば、グルタミン、システインおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）および小アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、セリンおよびスレオニン）。
【００６０】
一実施態様において、GHは、hGHと少なくとも80％、例えば少なくとも85％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有する。一実施態様において、そのようなhGHとの同一性は、本出願による試験Ｉで決定される、hGHの少なくとも20％、例えば少なくとも40％、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも80％の成長ホルモン活性に連関する。
【００６１】
当該分野において知られる「同一性」という用語は、配列の比較から決定される、2以上のタンパク質間の関係を指す。当該分野において、「同一性」とはまた、2以上のアミノ酸の紐(string)間の一致数にて決定される、タンパク質間の配列の関連性の度合いを意味する。「同一性」は、（必要あれば）特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって処理されるギャップ・アラインメントで、2以上の配列の、より小さな部分間の一致のパーセントが測定される。関係のあるタンパク質の同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法には、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991；およびCarillo et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)に記載される方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
同一性を決定する好ましい方法は、試験する配列間で最大の一致が得られるように設計される。同一性を決定する方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムに記載されている。2つの配列間の同一性を決定するための、好ましいコンピュータープログラム法には、GAPを含むGCGプログラムパッケージ(Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)) が含まれる。BLASTXプログラムは、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)およびその他の供給元から提供され(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra)、公に利用可能である。周知のスミス・ウォーターマン(Smith Waterman)アルゴリズムもまた、同一性の決定のために使用してよい。
【００６３】
例えば、コンピューターアルゴリズムGAP(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)を使用する場合、配列の同一性のパーセントを決定しようとする2つのタンパク質は、それぞれのアミノ酸が最適に一致するよう並べられる（アルゴリズムによって決定される「一致全長(matched span)」）。ギャップ開始ペナルティ(gap opening penalty)（３×平均対角(average diagonal)によって計算される；「平均対角」とは、使用される比較行列(comparison matrix)の対角の平均である；「対角」とは、特定の比較行列により、それぞれのアミノ酸完全一致に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ(gap opening penalty)（通常、{割合(fraction)(1/10)}×ギャップ開始ペナルティ）、ならびにPAM 250またはBLOSUM 62といった比較行列は、アルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列（PAM 250比較行列については、Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978)；BLOSUM 62比較行列についてはHenikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992)を参照）もまた、アルゴリズムに使用される。
【００６４】
タンパク質配列比較に好ましいパラメーターは、以下を含む：
アルゴリズム：Needleman et al., J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970)；比較行列：BLOSUM 62 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992))；ギャップペナルティ：12、ギャップ長ペナルティ(Gap Length Penalty)：4、類似性の閾値：0。
【００６５】
GAPプログラムは、上記のパラメーターを用いた場合に有用である。上記のパラメーターは、GAPアルゴリズムを用いたタンパク質比較（終了ギャップに対してペナルティを伴わない）におけるデフォルトパラメーターである。
【００６６】
一実施態様において、GHは、N末端において100アミノ酸残基まで伸長されたhGHである。特に、当該伸長は、50アミノ酸残基まで、例えば40アミノ酸残基まで、例えば20アミノ酸残基まで、例えば10アミノ酸残基まで、例えば5アミノ酸残基まで、例えば１、２または３アミノ酸残基の伸長である。
【００６７】
一実施態様、実施態様i)において、式(I)の化合物が式(I’)の形態をとる場合、Xは2つの水素を表す。
【化４０】
2008516621.tif 000015
【００６８】
実施態様i)のさらなる実施態様において、Yは以下の構造を表す。
【化４１】
2008516621.tif 000016
【００６９】
実施態様i)のさらなる実施態様において、R9は、水素を表す。
【００７０】
実施態様i)のさらなる実施態様において、R1は、MeO-(CH2CH2O)100-1000-E-または[MeO-(CH2CH2O)100-1000]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)100-1000-C(=O)NH]E-を表す。
【００７１】
実施態様i)のさらなる実施態様において、R1は、MeO-(CH2CH2O)400-1000-E-または[MeO-(CH2CH2O)300-600]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)300-600-C(=O)NH]E-を表す。特に、R1は、MeO-(CH2CH2O)400-500-E-、MeO-(CH2CH2O)600-700-E-またはMeO-(CH2CH2O)850-950-E-；または[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]Eを表してよい。
【００７２】
実施態様i)のさらなる実施態様において、Eは、-C(=O)NH(CH2)2-30-または-(CH2)1-30C(=O)NH(CH2)2-30-を表す。
【００７３】
実施態様i)のさらなる実施態様において、Eは、-C(=O)NH(CH2)2-10または-(CH2)1-10C(=O)NH(CH2)2-10-を表す。特に、Eは、-C(=O)NH(CH2)4または-(CH2)3C(=O)NH(CH2)4-を表してよい。
【００７４】
実施態様i)のさらなる実施態様において、R1は、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-、および
MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-から選択される。
【００７５】
実施態様i)のさらなる実施態様において、Zは、-CH2-O-(CH2)1-5または-CH-O-(C6H4)-を表す。特に、Zは、-CH2-O-(CH2)3、-CH2-O-(CH2)4、-CH2-O-(CH2)5、-CH2-O-(1,4-C6H4)-または-CH2-O-(1,3-C6H4)-を表してよい。
【００７６】
一実施態様、実施態様ii)において、式(I)の化合物が式(I’’)の形態をとる場合、XはOを表し、Zは結合を表す。
【化４２】
2008516621.tif 000017
【００７７】
実施態様ii)の実施態様において、Yは以下の構造を表す。
【化４３】
2008516621.tif 000018
【００７８】
実施態様ii)の実施態様において、R9は、水素を表す。
【００７９】
実施態様ii)の実施態様において、R1は、MeO-(CH2CH2O)100-1000-E-、[MeO-(CH2CH2O)100-1000]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)100-1000-C(=O)NH]E-、Me-(CH2)10-30-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-30-E-、(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)1-30-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-30-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)2-10-E-、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-O-(CH2)1-30、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-(C6H4)-O-(CH2)1-30, GH-C(=O)-CH=N-(OCH2CH2)1-10-、またはシバクロニル-E-を表す。
【００８０】
実施態様ii)の実施態様において、R1は、MeO-(CH2CH2O)400-1000-E-、[MeO-(CH2CH2O)400-800]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-800-C(=O)NH]E-、Me-(CH2)10-20-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-20-E-、(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)1-20-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)1-20-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)2-5-E-、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-O-(CH2)1-20、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-(C6H4)-O-(CH2)1-20-、GH-C(=O)-CH=N-(OCH2CH2)1-8-、またはシバクロニル-E-を表す。
【００８１】
一実施態様において、R1は、MeO-(CH2CH2O)400-500-E-、MeO-(CH2CH2O)600-700-E-、MeO-(CH2CH2O)850-950-E-、[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]E-、[MeO-(CH2CH2O)600-700]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)600-700-C(=O)NH]E-、Me-(CH2)12-E-, Me-(CH2)10-20-E-、Me-(CH2)14-E-、Me-(CH2)16-E-、Me-(CH2)18-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)15-E-、(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)14-E-、(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)4-E-、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-O-(CH2)15、(5-テトラゾリル)-(C6H4)-(C6H4)-O-(CH2)15-、またはシバクロニル-E-を表す。
【００８２】
一実施態様において、R1は以下の構造を表す。
【化４４】
2008516621.tif 000019
【００８３】
一実施態様において、R1は以下の構造を表す。
【化４５】
2008516621.tif 000020
【化４６】
2008516621.tif 000021
【００８４】
実施態様ii)の実施態様において、Yは以下の構造を表す。
【化４７】
2008516621.tif 000022
【００８５】
一実施態様において、R6およびR9は水素を表し、R7およびR8は独立に水素またはメチルを表し、およびR5は以下の構造を表し、
【化４８】
2008516621.tif 000023
【００８６】
ここにおいて、mPeg(10-30k) = mPeg(10k)、mPeg(20k)、およびmPeg(30k)は、別々であり、それぞれのmPeg(10-30k)に対して特定の実施態様であり、およびそれらの何れかの特定の組み合わせである。
【００８７】
一実施態様において、R6およびR9は水素を表し、R7およびR8は独立に水素またはメチルを表し、およびR5は以下の構造である。
【化４９】
2008516621.tif 000024
【００８８】
実施態様ii)のさらなる実施態様において、Eは-C(=O)NH(CH2)2-30-、-(CH2)1-30C(=O)NH(CH2)2-30-、
【化５０】
2008516621.tif 000025
【００８９】
-C(=O)NH-[(CH2CH2O)1-10-(CH2)1-5-C(=O)]1-5NH(CH2)2-30-、または結合を表す。
【００９０】
実施態様ii)のさらなる実施態様において、Eは、-C(=O)NH(CH2)2-10-、-(CH2)1-10C(=O)NH(CH2)2-10-、
【化５１】
2008516621.tif 000026
【００９１】
-C(=O)NH-[(CH2CH2O)1-5-(CH2)1-C(=O)]1-4NH(CH2)2-10-、または結合を表す。Eの特定の例には、-C(=O)NH(CH2)4-、-(CH2)3C(=O)NH(CH2)4、
【化５２】
2008516621.tif 000027
【００９２】
-C(=O)NH-[(CH2CH2O)2-(CH2)1-C(=O)]1NH(CH2)4-、-C(=O)NH-[(CH2CH2O)2-(CH2)1-C(=O)]2NH(CH2)4-、-C(=O)NH-[(CH2CH2O)2-(CH2)1-C(=O)]3NH(CH2)4-、および結合が含まれる。
【００９３】
実施態様ii)のさらなる実施態様において、R1は以下の構造を表す。
【化５３】
2008516621.tif 000028
【００９４】
実施態様ii)のさらなる実施態様において、R1は、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-、
MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-、
MeO-(CH2CH2O)600-700-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)600-700-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-、
【化５４】
2008516621.tif 000029
【００９５】
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)3-C(=O)-NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2CH2-O)2-CH2-C(=O)NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-[NH-(CH2CH2-O)2-CH2-C(=O)]2NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)-(CH2)15-C(=O)-[NH-(CH2CH2-O)2-CH2-C(=O)]3NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)2CH-(CH2)14-C(=O)-NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)(1,4-C6H4)-O-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2)4-、
(5-テトラゾリル)(1,4-C6H4)2-O-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2)4-、
GH-C(=O)-CH2-CH=N-(O-CH2CH2)2-、
GH-C(=O)-CH2-CH=N-(O-CH2CH2)3-、
GH-C(=O)-CH2-CH=N-(O-CH2CH2)4-、
GH-C(=O)-CH2-CH=N-(O-CH2CH2)5-、
GH-C(=O)-CH2-CH=N-(O-CH2CH2)6-、 
シバクロニル-NH-(CH2)4-、
【化５５】
2008516621.tif 000030
【化５６】
2008516621.tif 000031
【００９６】
を表す。
【００９７】
式Ｉによる化合物の特定の例には、
[MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2-NH-C(=O)-O-CH2]2CH-O-(CH2)3-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
[MeO-(CH2CH2O)600-750](CH2)3-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)600-750-(CH2)3C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
[MeO-(CH2CH2O)600-700]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)600-700-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
【化５７】
2008516621.tif 000032
【００９８】
(5-テトラゾリルl)-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリルl)-(CH2)15-C(=O)-NH-S(=O)2-(CH2)3-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリルl)-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2CH2-O)2-CH2-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリルl)-(CH2)15-C(=O)-[NH-(CH2CH2-O)2-CH2-C(=O)]2NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリルl)-(CH2)15-C(=O)-[NH-(CH2CH2-O)2-CH2-C(=O)]3NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリルl)2CH-(CH2)14-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリルl)(1、4-C6H4)-O-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
(5-テトラゾリルl)(1、4-C6H4)2-O-(CH2)15-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
GH-C(=O)-CH=N-(O-CH2CH2)2-O-N=CH-C(=O)-GH、
GH-C(=O)-CH=N-(O-CH2CH2)3-O-N=CH-C(=O)-GH、
GH-C(=O)-CH=N-(O-CH2CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
GH-C(=O)-CH=N-(O-CH2CH2)5-O-N=CH-C(=O)-GH、
GH-C(=O)-CH=N-(O-CH2CH2)6-O-N=CH-C(=O)-GH、
シバクロニル-NH-(CH2)4-O-N=CH-C(=O)-GH、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)4-GH、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)4-GH、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)4-GH、
[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)4-GH、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)5-GH、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)5-GH、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)5-GH、
[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)5-GH、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)6-GH、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)6-GH、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)6-GH、
[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(CH2)6-GH、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,4-C6H4)CH2-GH、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,4-C6H4)CH2-GH、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,4-C6H4)CH2-GH、
[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,4-C6H4)CH2-GH、
MeO-(CH2CH2O)400-500-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,3-C6H4)CH2-GH、
MeO-(CH2CH2O)600-700-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,3-C6H4)CH2-GH、
MeO-(CH2CH2O)850-950-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,3-C6H4)CH2-GH、 
[MeO-(CH2CH2O)400-500]-C(=O)NH-(CH2)4CH[MeO-(CH2CH2O)400-500-C(=O)NH]-C(=O)NH-(CH2)4-O-N=CH-CH2-O-(1,3-C6H4)CH2-GH、
【化５８】
2008516621.tif 000033
【化５９】
2008516621.tif 000034
【化６０】
2008516621.tif 000035
【００９９】
が含まれる。
【０１００】
一実施態様において、上記化合物においてGHは、hGHである。
【０１０１】
付加的なまたは代替の実施態様において、本発明は、本出願にて記載される方法および化合物を提供し、ここにおいて、それぞれの「mPEG」の例は、アルコキシ-PEGまたは「aPEG」という次式の化合物によって置換され、
【化６１】
2008516621.tif 000036
【０１０２】
ここにおいて、mは1より大きい整数である。それぞれのR1は、何れかの適したC1-10アルキル基、分枝鎖または（C3-10に対して）非分枝鎖であり、メチル、エチル、およびプロピル、およびブチルを含みこれらに限定されない基をとることができる。
【０１０３】
一実施態様において、本発明は、式(I)または(I’)の化合物の作製の方法に関し、該方法は、以下の工程を含む：
(a) 式Q-Z-CH=Oの化合物との、GHのN末端アミノ基の還元的アルキル化、ここにおいて、Qは適した薬剤によってアルデヒドまたはケトンに変換されうる官能基であり、この結果式ＩＩの化合物が得られる；および
【化６２】
2008516621.tif 000037
【０１０４】
(b)  式(II)の化合物の官能基Qの、式(III’)のアルデヒドまたはケトンへの変換、
【化６３】
2008516621.tif 000038
【０１０５】
ここにおいて、Aは、アルデヒドまたはケトン部分を意味する；および
(c)  式(III’)の化合物と、R1-O-NH2、R2R3N-NH2、R4NH(CH2)2-3SHまたはR5CH(NR6H)(CR7R8)1-2SHから選択される化合物との縮合。
【０１０６】
一実施態様において、Qは、以下の構造から選択され、
【化６４】
2008516621.tif 000039
【０１０７】
ここにおいて、R9は、H、C1-6アルキル、アリールまたはヘテロアリールを表し、式(III’)の化合物は、式(III)の形態をとる。
【化６５】
2008516621.tif 000040
【０１０８】
一実施態様において、工程(a)の還元的アルキル化は、GHの緩衝溶液(pH 4-8)と、水または水および両性溶液の混合物にG-Z-C(=O)Hを溶解した溶液とを混合し、その後NaCNBH4の水溶液を付加することで、生じる。DMFは、両性溶液の一例である。
【０１０９】
式(II)または(III)の化合物の特定の例には、
HO-CH2CH(OH)-CH2-O-(CH2)4-GH、
HO-CH2CH(OH)-CH2-O-(CH2)5-GH、
HO-CH2CH(OH)-CH2-O-(CH2)6-GH、
HO-CH2CH(OH)-CH2-O-(1,4-C6H4)CH2-GH、
HO-CH2CH(OH)-CH2-O-(1,3-C6H4)CH2-GH、
O=CH-CH2-O-(CH2)4-GH、
O=CH-CH2-O-(CH2)5-GH、
O=CH-CH2-O-(CH2)6-GH、
O=CH-CH2-O-(1,4-C6H4)CH2-GH、および
O=CH-CH2-O-(1,3-C6H4)CH2-GHが含まれる。
【０１１０】
一実施態様において、本発明は、式(I)または(I”)による化合物の作製の方法に関し、該方法は、以下の工程を含む：
(a’)  式(IV)による、N末端がセリンにより延長したGHを酸化し、
Ser-GH  (IV)
式(V)による、グリオキシル酸誘導体とし、
O=CH-C(=O)-GH (V);および
(b’)  式Vによる該誘導体と、R1-O-NH2、R2R3N-NH2、R4NH(CH2)2-3SHまたはR5CH(NR6H)(CR7R8)1-2SHから選択される化合物とを縮合させる。
【０１１１】
一実施態様において、工程(a’)における酸化は、GHの緩衝溶液(pH 7-9)と、メチオニンの溶液（30-300当量）とを混合し、NaIO4 (5-20当量)といった過ヨウ素酸塩を加えることで、生じる。得られるグリオキシル酸誘導体は、以下に図示するように、アルデヒド形態と相当する水和物との間で平衡状態にて存在し、
【化６６】
2008516621.tif 000041
【０１１２】
および、式(V)の化合物に言及された場合、その言及は、上記の平衡状態にある両化合物に対してされていると解される。
【０１１３】
式(IV)または(V)の化合物の特定の例には、
Ser-hGH、および
O=CH-C(=O)-hGHが含まれる。
【０１１４】
一実施態様において、本発明は、GHの薬理学的性質を改善する方法であって、上記方法に記載されるように結合型GHの作製を含む方法に関する。特に、薬理学的性質の改善は、機能的in vivo半減期(functional in vivo half-life)、血漿in vivo半減期(the plasma in vivo half-life)、平均滞留時間における増大、または排除の低下を意味するよう意図される。
【０１１５】
式(I)の化合物は、成長ホルモン活性を発揮し、および、それ自体で、循環する成長ホルモンの量の増加によって利益を得るであろう疾病または状態の治療に使用してよい。特に、本発明は、成長ホルモン欠乏症(GHD)；ターナー症候群；プラーダー-ヴィリ症候群(PWS)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、HAART治療を受けた小児におけるHIV感染(HIV/HALS小児)；在胎期間に比して体重が小さい小児(short children born short for gestational age)(SGA)；超低出生時体重(VLBW)であるがSGAでない小児における低身長；骨格形成異常；低軟骨形成症；軟骨形成不全；特発性低身長(ISS)；成人におけるGHD；脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨(matacarpea)、中足骨(matatarsea)、および指といった長い骨の骨折またはその内部での骨折；頭蓋骨(scull)、手の基部(base of hand)、および脚の基部(base of food)といった海綿状骨(spongious bones)の骨折またはその内部での骨折；例えば手、膝、または肩における、腱または靭帯の手術後の患者；骨延長法(distraction oteogenesis)を行っているまたは経験している患者；臀部もしくは円盤置換術、半月板修復、脊椎固定術、または、膝、臀部、肩、肘、手首または顎における人工関節固定後の患者；釘(nails)、ねじおよびプレートといった骨接合材料が固定された患者；骨折が非癒合または変形癒合の状態の患者；例えば、脛骨または第一足指(1st toe)からのオステアトミア(osteatomia)後の患者；移植片移植後の患者；外傷または関節炎によって生じる膝における、関節軟骨変性症；ターナー症候群の患者における骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症；長期的に透析が必要な成人患者(adult patients in chronic dialysis)(APCD)；APCDにおける栄養失調関連循環器病；APCDにおける悪液質の逆転(reversal of cachexia); APCDにおける慢性閉塞性肺疾患(chronic abstractive pulmonal disease)；APCDの高齢者；APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；HIV感染した男性；短腸症候群(short bowel syndrome)；中心性肥満；HIV関連性脂肪異栄養症候群(HALS)；男性不妊症；選択的大手術(major elective surgery)、アルコール/薬物解毒または神経学的外傷後の患者；加齢；虚弱な高齢者；骨関節炎；外傷的に損傷した軟骨；勃起障害；線維筋痛；記憶障害；うつ病；外傷性脳損傷；外傷性脊椎損傷；クモ膜下出血；超低出生時体重；代謝症候群；グルココルチコイド筋障害；または小児におけるグルココルチコイド治療が原因の低身長の治療のための方法であって、それを必要とする患者に対し式(I)による化合物の治療的有効量を投与する方法に関する。
【０１１６】
一側面において、本発明は、筋組織、神経組織または傷の治癒の促進；損傷を受けた組織への血流の促進または改善；または損傷を受けた組織における感染率の低下のための方法であって、それを必要とする患者に対し式Iの化合物の治療的有効量を投与することを含む方法を提供する。
【０１１７】
一実施態様において、本発明は、上述した疾病といった、成長ホルモンの血漿中レベルが増加することで利益を得る疾病の製造における式Iによる化合物の使用に関する。
【０１１８】
典型的な非経口による投与量は、1度の投与当り10-9 mg/kg体重から約100 mg/kg体重の範囲である。典型的な投与量は、1度の投与当り約0.0000001 mg/kg体重から約10 mg/kg体重の範囲である。正確な投与量は、例えば、徴候、薬物、投与の頻度および様式、治療する患者の性別、年齢および一般的体調、治療する疾病または症状の性質および重症度、治療の望ましい効果および当業者にとって明らかなその他の因子に依存するだろう。
【０１１９】
典型的な投与頻度は、1日2回、1日1回、２日おき、週に2回、週に1回またはより長い投与間隔である。本発明による融合タンパク質の延長された半減期により、週に2回、週に1回またはより長い投与間隔といった、長い投与間隔による投与計画が、本発明の特別な実施態様である。
【０１２０】
多くの疾病は、その治療において、同時に投与されるまたは連続的に投与される1より多い薬剤を用いて治療される。それゆえ、上記の疾病の1つの治療のための治療学的方法において、式(I)の化合物を、前記疾病の治療にて通常使用される1以上のその他の治療的活性を有する化合物と組み合わせて使用することは、本発明の範囲内である。同様に、式(I)の化合物を、上記の疾病の1つの治療において通常使用されるその他の治療的活性を有する化合物と組み合わせて、前記疾病のための薬物の製造に使用することも本発明の範囲内である。
【０１２１】
GHおよび特にSer-GHは、例えば標準的なタンパク質合成技術を用いた合成といった、多くの様々な方法にて作製してよい。特別な実施態様において、しかしながら、GHまたはSer-GHは、適切な宿主中で、該宿主に適した核酸構築物の取り込み後に発現される。
【０１２２】
本出願で使用される「核酸構築物(nucleic acid construct)」という用語は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAまたはRNA由来の何れかの核酸分子を表すよう意図される。「構築物」という用語は、一本鎖または二本鎖であってよく、関心のあるタンパク質をコードする完全または部分的核酸配列に基づいてよい核酸部分(nucleic acid segment)を表すよう意図される。構築物は、任意にその他の核酸部分を含んでよい。
【０１２３】
本発明によるタンパク質をコードする本発明の核酸構築物は、適切にゲノムまたはcDNA由来であってよく、例えば、ゲノムまたはcDNAライブラリーを作製し、標準的技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションすることによりタンパク質の全長または部分をコードするDNA配列をスクリーニングすることで得られるものであってよい(J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York参照)。本願目的において、GHをコードするDNA配列は、好ましくは、ヒト由来であり、例えば、ヒトゲノムDNAまたはcDNAライブラリー由来である。特に、DNA配列は、ヒト由来であってよく、例えば、特定の臓器もしくは細胞種からのcDNA、またはヒトゲノムDNA由来の遺伝子であってよい。
【０１２４】
GHまたはSer-GHをコードする本発明による核酸構築物はまた、確立された標準的方法、例えば、BeaucageおよびCaruthersによって記述されるホスホアミド法(Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 - 1869)、またはMatthesらによって記述される方法(EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805)により、合成的に作製してよい。ホスホアミド法に従って、オリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成機にて合成され、精製され、アニールされ、連結され(ligated)および適切なベクターにクローン化される。
【０１２５】
そのうえ、核酸構築物は、標準的技術によって、合成DNA、ゲノムDNAまたはcDNA由来（適切に）の断片を連結して作製される、合成DNAおよびゲノムDNAの混合、合成DNAおよびcDNAの混合、またはゲノムDNAおよびcDANの混合であってよく、前記断片は、完全長の核酸構築物の様々な部分に相当する。
【０１２６】
核酸構築物はまた、例えばUS 4,683,202またはSaikiら(Science 239 (1988), 487 - 491)によって記載されるように、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法によって作製してよい。
【０１２７】
一実施態様において、核酸構築物は、DNA構築物であり、この用語は、もっぱら以下の場合にて使用されるであろう。
【０１２８】
一実施態様において、本発明は、本発明によるDNA構築物を含む組み換えベクターに関する。本発明によるDNA構築物が挿入された組み換えベクターは、組み換えDNA法に都合よく供され得る何れかのベクターであってよく、ベクターの選択は、しばしば、それを導入する宿主細胞に依存するだろう。従って、ベクターは、自己複製ベクターであってよく、すなわち、染色体外の実体として存在し、複製が染色体の複製とは独立しているベクターであってよく、例えばプラスミドであってよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた先の染色体とともに複製されるものであってよい。
【０１２９】
ベクターは、好ましくは、本発明によるタンパク質をコードするDNA配列が、DNAの転写に必要とされる付加的な部分に実施可能につながった、発現ベクターである。一般に、発現ベクターは、プラスミドもしくはウイルス性DNA由来であり、または両方の要素を含んでよい。「実施可能につながった」という用語は、部分が、それらの意図される目的に従って機能するように配列されている状態であることを表し、該意図される目的とは、例えば、転写がプロモーターから開始され、タンパク質をコードするDNA配列に沿って進行するといったことである。
【０１３０】
プロモーターは、選択した宿主細胞中にて転写活性を示す何れかのDNA配列であってよく、宿主細胞と同種または異種のどちらかであるタンパク質をコードする遺伝子を由来としてよい。
【０１３１】
哺乳類細胞にてGHをコードするDNAの転写を調節するのに適したプロモーターの例は、SV40プロモーター(Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864)、MT-1（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター(Palmiter et al., Science 222 (1983), 809 - 814)またはアデノウイルス2主用後期プロモーター(the adenovirus 2 major late promoter)である。
【０１３２】
昆虫細胞での使用のための適したプロモーターの例は、ポリヘドリン(polyhedrin)プロモーター(US 4,745,051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11)、P10プロモーター(J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776)、Autographa californica ポリヘドロシスウイルス塩基性タンパク質プロモーター(the Autographa californica polyhedrosis virus basic protein promoter) (EP 397 485)、バキュロウイルス即初期遺伝子1プロモーター(the baculovirus immediate early gene 1 promoter) (US 5,155,037; US 5,162,222)、またはバキュロウイルス39K遅発性初期遺伝子プロモーター(the baculovirus 39K delayed-early gene promoter) (US 5,155,037; US 5,162,222)である。
【０１３３】
酵母細胞での使用のための適したプロモーターの例は、酵母解糖遺伝子(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073 - 12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419 - 434)もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, eds.), Plenum Press, New York, 1982)由来のプロモーター、またはTPI1(US 4,599,311)もしくはADH2-4c (Russell et al., Nature 304 (1983), 652 - 654)プロモーターを含む。
【０１３４】
糸状菌宿主細胞での使用のための適したプロモーターの例は、例えば、ADH3プロモーター(McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093 - 2099) またはtpiAプロモーターである。その他の有用なプロモーターの例は、A. oryzaeタカアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、A. niger中性α-アミラーゼ、A. nigerもしくはA. awamoriグルコアミラーゼ(gluA)、Rhizomucor mieheiリパーゼ、A. oryzaeアルカリプロテアーゼ、A. oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼまたはA. nidulansアセトアミダーゼをコードする遺伝子を由来とするものである。タカ-アミラーゼおよびgluAプロモーターが好ましい。
【０１３５】
細菌宿主細胞での使用のための適したプロモーターの例は、Bacillus stearothermophilusマルトジェニックアミラーゼ遺伝子(maltogenic amylase gene)、Bacillus licheniformis アルファ-アミラーゼ遺伝子、Bacillus amyloliquefaciens BANアミラーゼ遺伝子、Bacillus subtilisアルカリプロテアーゼ遺伝子、またはBacillus pumilusキシロース遺伝子のプロモーター、またはファージによるラムダPRもしくはPLプロモーター、またはE. coli lac、trpまたはtacプロモーターを含む。
【０１３６】
GHまたはSer-GHをコードするDNA配列はまた、必要な場合は、適したターミネーターに実施可能につなげられてよく、そのようなターミネーターとは、例えば、ヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter et al., op. cit.)または（菌宿主に対して）TPI1 (Alber and Kawasaki, op. cit.)もしくはADH3 (McKnight et al., op. cit.)ターミネーターである。ベクターはさらに、ポリアデニル化シグナル（例えば、SV40またはアデノウイルス5 Elb領域由来）、転写性エンハンサー配列（例えばSV40エンハンサー）および転写性エンハンサー配列（例えば、アデノウイルスVA RNAsをコードするもの）といった要素を含んでよい。
【０１３７】
本発明による組み換えベクターはさらに、ベクターが問題の宿主細胞中で複製できるようにするDNA配列を含んでよい。そのような配列の例は、（宿主細胞が哺乳類細胞である場合）SV40複製開始点である。
【０１３８】
宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターが複製できるようにするのに適した配列は、酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1-3および複製開始点である。
【０１３９】
宿主細胞が細菌細胞である場合、ベクターが複製できるようにする配列は、DNAポリメラーゼIII複合体をコードする遺伝子および複製開始点である。
【０１４０】
ベクターはまた、選択マーカーを含んでよく、例えば、宿主細胞の欠損を補う生成物の遺伝子、例えばジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードする遺伝子もしくはSchizosaccharomyces pombe TPI遺伝子(P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130に記述される)といった遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシンもしくはメトトレキセートといった薬剤への耐性を付与する遺伝子を含んでよい。糸状菌では、選択マーカーには、amdS、pyrG、argB、niaDおよびsCが含まれる。
【０１４１】
GHを宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる）が、組み換えベクターに与えられてよい。分泌シグナル配列は、正しい読み枠でタンパク質をコードするDNA配列につなげられる。分泌シグナル配列は、通常、タンパク質をコードするDNA配列の5’側に位置する。分泌シグナル配列は、GHと正常に関連するものであってよく、または、別の分泌タンパク質をコードする遺伝子由来であってよい。
【０１４２】
酵母細胞からの分泌のため、分泌シグナル配列は、発現したタンパク質が細胞の分泌経路へ効果的に導入されるのを促進する何れかのシグナルペプチドをコードしてよい。シグナルペプチドは、天然のシグナルペプチドもしくはその機能的な部分であってよく、または合成ペプチドであってよい。適したシグナルペプチドは、α-ファクターシグナル配列(US 4,870,008参照)、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド (O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646参照)、改変カルボキシペプチダーゼシグナル配列(L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897参照)、酵母BAR1シグナル配列(WO 87/02670参照)、または酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3 (YAP3)シグナル配列(M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137参照)であることがわかっている。
【０１４３】
酵母の効率的な分泌のため、リーダーペプチドをコードする配列はまた、シグナル配列の下流およびタンパク質をコードするDNA配列の上流に挿入してよい。リーダーペプチドの機能は、発現したタンパク質を、小胞体からゴルジ体へと導き、さらに培地への分泌（すなわち、細胞壁の向うへ、または少なくとも細胞膜を通って酵母細胞の細胞膜周辺腔にタンパク質を移出）のために分泌小胞に導くことである。リーダーペプチドは、酵母α-ファクターリーダーである（その使用について、例えばUS 4,546,082、EP 16 201、EP 123 294、EP 123 544およびEP 163 529に記載されている）。あるいは、リーダーペプチドは、合成リーダーペプチド、すなわち天然に発見されないリーダーペプチドであってよい。合成リーダーペプチドは、例えば、WO 89/02463またはWO 92/11378に記載されるように構築されてよい。
【０１４４】
糸状菌での使用には、シグナルペプチドは、都合よく、Aspergillus種アミラーゼまたはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、Rhizomucor mieheiリパーゼまたはプロテアーゼをコードする遺伝子、またはHumicola lanuginosaリパーゼをコードする遺伝子を由来としてよい。シグナルペプチドは、好ましくは、A. oryzaeタカアミラーゼ、A. niger天然α-アミラーゼ、A. niger酸安定性アミラーゼ、またはA. nigerグルコアミラーゼをコードする遺伝子を由来とする。
【０１４５】
昆虫細胞での使用には、シグナルペプチドは、都合よく、昆虫遺伝子(WO 90/05783参照)、例えば、鱗翅目Manduca sextaアジポキニンホルモン前駆体シグナル配列(US 5,023,328参照)を由来としてよい。当該タンパク質をコードするDNA配列、プロモーターおよび任意にターミネーターおよび/または分泌シグナル配列をそれぞれ連結するために使用する方法、およびそれらを複製に必要な情報を含む、適したベクターに挿入するために使用する方法は、当業者に周知である(例えば、Sambrook et al., op.cit.参照)
本発明によるDNA構築物または組み換えベクターを導入する宿主細胞は、当該タンパク質を作製することができる何れかの細胞であってよく、細菌、酵母、菌類および高等真核細胞を含む。
【０１４６】
培養にてGHの作製が可能な細菌宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えば、Bacillus例えばB. subtilis、B. licheniformis、B. lentus、B. brevis、B. stearothermophilus、B. alkalophilus、B. amyloliquefaciens、B. coagulans、B. circulans、B. lautus、B. megatherium、もしくはB. thuringiensisといった株、またはStreptomyces例えばS. lividansまたはS. murinusといった株、またはグラム陰性細菌、例えばEcherichia coliである。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換によって、それ自体既知の様式によるコンピテントセルを用いて(Sambrook et al., supra参照)、達成してよい。
【０１４７】
E. coliといった細菌でタンパク質を発現させる場合、タンパク質は、典型的に不溶性顆粒（封入体として知られる）として細胞質中に保持されてよく、または細菌の分泌配列によって細胞膜周辺腔に導かれてよい。前者の場合、細胞は溶菌され、顆粒は回収されおよび変性され、その後、変性用薬剤を希釈してタンパク質をリフォールディングする。後者の場合、タンパク質は、例えば、超音波処理または浸透圧ショックにて細胞を破壊し細胞膜周辺腔から内容物を放出させタンパク質を回収することで、回収してよい。
【０１４８】
適した哺乳類細胞株の例は、COS (ATCC CRL 1650)、BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10)、CHL (ATCC CCL39)またはCHO (ATCC CCL 61)細胞株である。哺乳類細胞を形質移入し、細胞に導入されたDNA配列から発現させる方法は、例えば、KaufmanおよびSharp(J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341)；Loyterら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 - 426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725)；CorsaroおよびPearson(Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603)、Grahamおよびvan der Eb(Virology 52 (1973), 456)；およびNeumannら(EMBO J. 1 (1982), 841 - 845)によって記述されている。
【０１４９】
適した酵母細胞の例には、Saccharomyces種またはSchizosaccharomyces種の細胞、特にSaccharomyces cerevisiaeまたはSaccharomyces kluyveriの株を含む。酵母細胞に異種性DNAを形質転換し、そこから異種性タンパク質を作製する方法は、例えばUS 4,599,311、US 4,931,373、US 4,870,008、US 5,037,743、およびUS 4,845,075に記載されており、これらは全て本出願い援用される。形質転換細胞は、選択マーカー、通常は薬剤耐性、または、例えばロイシンといった特定の栄養を欠いた環境でも成長する能力によって決定される表現型により選択される。酵母での使用において好ましいベクターは、US 4,931,373に記載されるPOT1ベクターである。本発明によるタンパク質をコードするDNA配列は、シグナル配列および任意に例えば上述したようなリーダー配列に先行していてよい。適した酵母細胞の更なる例は、K. lactisといったKluyveromycesの株、Hansenula例えばH. polymorpha、またはPichia例えばP. pastoris (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp. 3459-3465; US 4,882,279参照)である。
【０１５０】
その他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばAspergillus種、Neurospora種、 Fusarium種、またはTrichoderma種、特にA. oryzae、A. nidulansまたはA. nigerの株の細胞である。Aspergillus種のタンパク質の発現のための使用は、例えばEP 272 277およびEP 230 023に記載されている。F. oxysporumの形質転換は、例えば、Malardierらが記載する通りに行ってよい (1989, Gene 78: 147-156) 。
【０１５１】
糸状菌を宿主細胞として使用する場合、都合よく、DNA構築物を宿主の染色体に組み込み、組み換え宿主細胞を得ることで、本発明によるDAN構築物を形質転換してよい。この組み込みは、DNA配列が、より安定的に細胞に維持され得るという利点を有すると一般に考えられている。DNA構築物の宿主染色体への組み込みは、例えば同種性または異種性組み換えによって、通常の方法に従って行ってよい。
【０１５２】
昆虫細胞の形質転換およびそこでの異種性タンパク質の作製は、US 4,745,051；US 4,879,236；US 5,155,037；5,162,222；EP 397,485に記載されるように行ってよく、これら全ては本出願に援用される。宿主として使用される昆虫細胞株は、適切に、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia ni細胞といった、Lepidoptera細胞株(US 5,077,214参照)であってよい。培養条件は、適切に、例えばWO 89/01029もしくはWO 89/01028、または上記の何れか参照文献に記載される通りであってよい。
【０１５３】
上記の形質転換または形質移入された宿主細胞は、次に、適した栄養培地中にて、当該タンパク質の発現が許される条件で培養し、その後生成されるタンパク質を培地から回収する。
【０１５４】
細胞を培養するために使用する培地は、宿主細胞を生育するのに適した何れかの通常の培地であってよく、例えば、適した栄養補給物(supplements)を含む最小または複合培地であってよい。適した培地は、商業的供給源から利用でき、または公開されている処方(例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションのカタログにある処方)に従って作製してよい。細胞により作製されるタンパク質は、次に、遠心またはろ過により宿主細胞を培地から分離し、上清からタンパク質性成分を沈殿させ、例えば硫酸アンモニウムを用いてろ過し、様々なクロマトグラフィー法、例えば、問題の特定のタンパク質に依存して、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー等により精製することを含む通常の方法によって、培地から回収してよい。
【０１５５】
[医薬組成物]
別の目的は、本発明による結合型GHを含む医薬組成物を提供することであり、該結合型GHは、10-15 mg/mlから200 mg/ml、例えば10-10 mg/mlから5 mg/mlの濃度で存在し、前記組成物は、2.0から10.0のpHを有している。組成物はさらに、緩衝系、防腐剤、緊張剤(tonicity agent)、キレート剤、安定剤および界面活性剤を含んでよい。本発明による一実施態様において、医薬組成物は、水性組成物、すなわち水を含む組成物である。そのような組成物は、典型的に溶液または懸濁液である。本発明の更なる実施態様において、医薬組成物は水溶液である。「水性組成物」という用語は、少なくとも50％w/wの水を含む組成物として定義される。同様に、「水溶液」とは、少なくとも50％w/wの水を含む溶液と定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも50％w/wの水を含む懸濁液と定義される。
【０１５６】
さらなる実施態様において、医薬組成物は、使用に先立ち医師または患者が溶剤および/または希釈剤を加える、凍結乾燥組成物である。
【０１５７】
別の実施態様において、医薬組成物は、あらかじめ溶解する必要のない、すぐ使用できる乾燥組成物(例えば凍結乾燥または噴霧乾燥されたもの)である。
【０１５８】
さらなる側面において、本発明は、GH結合体(conjugate)の水溶液および緩衝剤を含む医薬組成物に関し、該GH結合体は、0.1-100 mg/mlまたはそれを超える濃度で存在し、該組成物は、約2.0から約10.0のpHを有する。
【０１５９】
本発明の別の実施態様において、組成物のpHは、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9および10.0から成るリストから選択される。
【０１６０】
本発明のさらなる実施態様において、緩衝剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、またはそれらの混合物から成る群から選択される。これらの特定の緩衝剤の一つは、本発明の代替の実施態様を構成する。
【０１６１】
本発明による更なる実施態様は、さらに、医薬的に許容可能な防腐剤を含む。本発明によるさらなる実施態様において、防腐剤は、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、メチルp-ヒドロキシ安息香酸塩、プロピルp-ヒドロキシ安息香酸、2-フェノキシエタノール、ブチルp-ヒドロキシ安息香酸塩、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、およびチオメルサール、ブロノポール、安息香酸、イミドウレア(imidurea)、クロルヘキシジン(chlorohexidine)、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、エチルp-ヒドロキシ安息香酸塩、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(3p-クロルフェノキシプロパン-1,2-ジオール) またはそれらの混合物を含む群から選択される。本発明によるさらなる実施態様において、防腐剤は、0.1 mg/mlから20 mg/mlの濃度で存在する。本発明によるさらなる実施態様において、防腐剤は、0.1 mg/mlから5 mg/mlの濃度で存在する。本発明によるさらなる実施態様において、防腐剤は、5 mg/mlから10 mg/mlの濃度で存在する。本発明によるさらなる実施態様において、防腐剤は、10 mg/mlから20 mg/mlの濃度で存在する。これらの特定の防腐剤のそれぞれが、本発明の代替の実施態様を構成する。医薬組成物における防腐剤の使用は、当業者に周知である。適宜、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000が参照される。
【０１６２】
本発明のさらなる実施態様において、組成物はさらに等張剤(isotonic agent)を含む。本発明によるさらなる実施態様において、等張剤は塩(例えば、塩化ナトリウム)、糖もしくは糖アルコール、アミノ酸(例えば、L-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えば、グリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)、またはそれらの混合物を含む群から選択される。例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース-Naを含む、モノ-、ジ-、またはポリサッカライド、または水溶性グルカンといった何れかの糖を使用してよい。一実施態様において、糖添加物は、スクロースである。糖アルコールは、少なくとも1つの-OH基を有するC4-C8炭水化物と定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールを含む。一実施態様において、糖アルコール添加物はマンニトールである。上述した糖または糖アルコールは、別々に、または組み合わせて使用してよい。糖または糖アルコールが、液体製剤に可溶であり、本発明による方法を用いて得られる安定化効果に有害な効果をもたらさない限り、使用する量に決まった制限はない。一実施態様において、糖または糖アルコール濃度は、約1 mg/mlおよび約150 mg/mlの間である。本発明のさらなる実施態様において、等張剤は、1 mg/mlから50 mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様において、等張剤は、1 mg/mlから7 mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様において、等張剤は、8 mg/mlから24 mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様において、等張剤は、25 mg/mlから50 mg/mlの濃度で存在する。これらの特定の等張剤のそれぞれが、本発明の代替の実施態様を構
成する。医薬組成物における等張剤の使用は、当業者に周知である。適宜、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000が参照される。
【０１６３】
本発明のさらなる実施態様において、組成物はさらにキレート剤を含む。本発明によるさらなる実施態様において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸、およびアスパラギン酸の塩、ならびにそれらの混合物から選択される。本発明のさらなる実施態様において、キレート剤は、0.1mg/mlから5mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様において、キレート剤は、0.1mg/mlから2mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様において、キレート剤は、2mg/mlから5mg/mlの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤のそれぞれが、本発明の代替の実施態様を構成する。医薬組成物におけるキレート剤の使用は、当業者に周知である。適宜、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000が参照される。
【０１６４】
本発明のさらなる実施態様において、組成物はさらに、安定剤を含む。医薬組成物における安定剤の使用は、当業者に周知である。適宜、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000が参照される。
【０１６５】
より特に、本発明による組成物は、安定化液体医薬組成物であって、その治療的な活性成分は、保存期間に液体医薬組成物中で凝集形成をおそらく示すタンパク質を含む。「凝集形成」とは、可溶性が維持されうるオリゴマーの形成、または溶液中に沈殿する、大きく視認可能な凝集体の形成をもたらす、タンパク質分子間の物理的相互作用であると意図される。「保存期間」とは、液体医薬組成物または一旦作製した組成物が、患者にすぐに投与されない状態であると意図される。むしろそれは、作製後、液体形態、凍結状態、または、後に患者への投与に適した液体形態またはその他の形態へと再構築するための乾燥形態の何れかで、保存のために包装される。「乾燥形態」とは、液体医薬組成物または組成物が、凍結乾燥(freeze drying)(例えば、凍結乾燥(lyophilisation);例えば、Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59参照)、噴霧乾燥(Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206；およびMumenthaler らの(1994) Pharm. Res. 11:12-20参照)、または風乾(Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadheadら(1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; and Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20参照) の何れかによって乾燥されることと意図される。液体医薬組成物の保存期間におけるタンパク質による凝集形成は、そのタンパク質の生物活性に対して有害な効果を及ぼす可能性があり、医薬組成物の治療効果の損失をもたらす。さらに、凝集形成は、タンパク質含有医薬組成物が注入システム(infusion system)を用いて投与された場合に、管、膜、またはポンプの障害となるといったその他の問題を引き起こす可能性がある。
【０１６６】
本発明による医薬組成物は、さらに、組成物の保存期間におけるタンパク質の凝集形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基(amino acid base)を含んでよい。「アミノ酸塩基」とは、何れかの所定のアミノ酸が、その遊離塩基の形態またはその塩の形態のどちらかで存在する、アミノ酸またはアミノ酸の組み合わせであると意図される。アミノ酸の組み合わせが使用される場合、全てのアミノ酸がその遊離塩基の形態で存在してよく、全てがその塩の形態で存在してよく、または幾つかがその塩基の形態で存在し、その他がその塩の形態で存在してよい。一実施態様において、本発明による組成物の作製に使用するためのアミノ酸は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸といった、電荷を有した側鎖を持つものである。特定のアミノ酸または有機塩基が、その遊離塩基の形態またはその塩の形態のどちらかで存在する限り、特定のアミノ酸（メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンおよびそれらの混合物）の何れかの立体異性体（すなわち、LもしくはD異性体、またはそれらの混合物）もしくはこれらの立体異性体の組み合わせ、またはグリシン、またはイミダゾールといった（しかしそれに限定されない）有機塩基が、本発明の医薬組成物中に存在してよい。一実施態様において、アミノ酸のL-立体異性体が使用される。一実施態様において、L-立体異性体が使用される。本発明による組成物は、また、これらのアミノ酸類似体(amino acid analogue)とともに処方されてよい。「アミノ酸類似体」とは、本発明による液体医薬組成物の保存期間においてタンパク質の凝集形成を減少させる所望の効果をもたらす、天然のアミノ酸の誘導体であると意図される。適したアルギニン類似体には、例えば、アミノグアニジン、オルニチン、およびN-モノエチルL-アルギニンが含まれ、適したメチオニン類似体には、エチオニンおよびブチオニンが含まれ、および適したシステイン類似体には、S-メチル-Lシステインが含まれる。その他のアミノ酸の場合、アミノ酸類似体は、その遊離塩基の形態またはその塩の形態のどちらかで組成物に取り込まれる。本発明のさらなる実施態様において、アミノ酸またはアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を予防または遅延させるのに十分な濃度で使用される。
【０１６７】
本発明によるさらなる実施態様において、治療的薬剤として作用するタンパク質が、メチオニンスルホキシドへの酸化を受けやすいメチオニン残基を少なくとも1つ含むタンパク質である場合、メチオニン（またはその他の硫黄を含むアミノ酸もしくはアミノ酸類似体）を、そのような酸化を阻害するために加えてよい。「阻害する」とは、メチオニン酸化種の一定期間における蓄積が最小であることと意図される。メチオニンの酸化の阻害によって、タンパク質が適切な分子形態により維持されることになる。メチオニンの何れかの立体異性体（LまたはD異性体）または何れかのその組み合わせが、使用可能である。添加すべき量は、メチオニン残基の酸化が阻害され、メチオニンスルホキシドの量が調節作用(regulatory agencies)にとって許容できる量となるのに十分な量であるべきである。典型的に、このことは、組成物が、約10％から約30％より多くメチオニンスルホキシドを含まないことを意味する。一般に、これは、添加したメチオニンとメチオニン残基の比が、約1：1から約1000：1、例えば10：1から約100：1となるように、メチオニンを添加することで達成することができる。
【０１６８】
本発明によるさらなる実施態様において、組成物はさらに、高分子量ポリマーまたは低分子量化合物の群から選択される安定剤を含む。本発明によるさらなる実施態様において、安定剤は、ポリエチレングリコール(例えば、PEG 3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロースまたはそれらの誘導体(例えば、HPC、HPC-SL、HPC-LおよびHPMC)、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノールといった含硫黄物質、ならびに様々な塩(例えば、塩化ナトリウム)から選択される。これらの特定の安定剤のそれぞれが、本発明の代替の実施態様を構成する。
【０１６９】
医薬組成物はまた、その中の治療的活性タンパク質の安定性をさらに強める、付加的安定化剤(additional stabilizing agents)を含んでよい。本発明に特に関係する安定化薬剤には、タンパク質をメチオニン酸化から守るメチオニンおよびEDTAを含むが、それらに限定されず、および、タンパク質を凍結解凍または機械的剪断に関係する凝集から守る非イオン性界面活性剤を含む。
【０１７０】
本発明のさらなる実施態様において、組成物はさらに界面活性剤を含む。本発明のさらなる実施態様において、界面活性剤は、エトキシ化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマー(例えば、プルロニック(Pluronic)（登録商標）F68といったポロキサマー、ポロキサマー188および407、トリトンX-100 )、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アルキル化およびアルコキシル化誘導体といったポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体(ツイーン(Tween)、例えばツイーン-20、ツイーン-40、ツイーン-80およびブリジ(Brij)-35)、モノグリセリドまたはそのエトキシ化誘導体、ジグリセリドまたはそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチンおよびリン脂質(例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロールおよびスフィンゴミエリン)、リン脂質の誘導体(例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸)およびリゾリン脂質(例えば、パルミトイルリゾホスファチジル-L-セリンおよびエタノールアミン、コリン、セリンまたはスレオニンの1-アシル-sn-グリセロ-3-リン酸エステル)およびリゾホスファチジルおよびホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル（アルキルエステル）、アルコキシ（アルキルエステル）-誘導体、例えばリゾホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンのラウロイルおよびミリストイル誘導体、およびコリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトールといった極性ヘッドグループの修飾体(modifications)、および陽性に帯電したDODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルスレオニン、およびグリセロリン脂質(例えば、ケファリン)、グリセロ糖脂質(例えば、ガラクトピラノシド)、スフィンゴ糖脂質(例えば、セラミド、ガングリオシド)、ドデシルホスホコリン、鶏卵(hen egg)リゾレシチン、フシジン酸誘導体(例えば、タウロ-ジヒドロフシジン酸ナトリウム等)、長鎖脂肪
酸およびその塩C6-C12 (例えば、オレイン酸およびカプリル酸)、アシルカルニチンおよび誘導体、リジン、アルギニンまたはヒスチジンのNα-アシル化誘導体、リジンまたはヒスチジンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニンまたはヒスチジンおよび中性もしくは酸性アミノ酸の何れかの組み合わせを含むジペプチドのNα-アシル化誘導体、中性アミノ酸および２つの荷電アミノ酸の何れかの組み合わせを含むトリペプチドのNα-アシル化誘導体、DSS (ドクセートナトリウム(docusate sodium)、CAS登録番号[577-11-7])、ドクセートカルシウム、CAS登録番号[128-49-4])、ドクセートカリウム、CAS登録番号[7491-09-0])、SDS (ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム)、カプリル酸ナトリウム、コール酸またはその誘導体、胆汁酸およびその塩およびグリシンまたはタウリン結合体(conjugates)、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸塩、陰イオン性(アルキル-アリール-スルホン酸塩)一価界面活性剤、双性イオン界面活性剤(例えば、N-アルキル-N,N-ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホン酸塩、3-コールアミド-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホン酸、陽イオン性界面活性剤(四級アンモニウム塩基) (例えば、セチル-トリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロライド)、非イオン性界面活性剤(例えば、ドデシルβ-D-グルコピラノシド)、エチレンジアミンにプロピレンオキシドおよびエチレンオキシドを連続的に付加してできる四官能性ブロックコポリマーである、ポロキサマー(例えば、テトロン酸)、から選択され、または、界面活性剤は、イミダゾリン誘導体、もしくはその混合物の群から選択されてよい。これらの特定の界面活性剤のそれぞれが、本発明の代替の実施態様を構成する。
【０１７１】
医薬組成物における界面活性剤の使用は、当業者に周知である。適宜に、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000が参照される。
【０１７２】
その他の成分を、本発明による医薬組成物に含めることが可能である。そのような付加的成分には、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、充填剤、張力改質剤(tonicity modifiers)、キレート剤、金属イオン、油性溶媒(oleaginous vehicles)、タンパク質(例えば、ヒト血漿アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質)および双性イオン(例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンおよびヒスチジンといったアミノ酸)を含めてよい。そのような付加的成分は、もちろん、本発明による医薬組成物の全体の安定性に悪影響を与えてはならない。
【０１７３】
本発明によるGH結合体を含む医薬組成物は、様々な部位にそのような治療を必要とする患者に対し投与してよく、そのような部位とは、例えば、局所的部位、例えば、皮膚および粘膜部位、吸収を迂回する部位、例えば、動脈、静脈、心臓への投与、および吸収に関与する部位、例えば、皮膚、皮下、筋肉または腹部への投与である。
【０１７４】
本発明による医薬組成物の投与は、そのような治療を必要とする患者に対し、様々な投与経路を通して行われてよく、例えば、舌、舌下、頬、口内、経口、胃および腸内、経鼻、肺、例えば、気管支梢および肺胞またはそれらの組み合わせを通して、上皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼球、例えば結膜を通して、輸尿管、および非経口的な経路で行われて良い。
【０１７５】
本発明の組成物は、様々な投与形態で投与してよく、例えば、溶剤、懸濁剤、乳濁剤、ミクロ乳濁剤(microemulsions)、マルチプル乳濁剤(multiple emulsion)、泡、軟膏(salves)、ペースト剤、硬膏剤、軟膏剤(ointments)、錠剤、被覆(coated)錠剤、リンス(rinses)、カプセル、例えば、ハードゼラチンカプセルおよびソフトゼラチンカプセル、坐薬、直腸カプセル、ドロップ、ゲル、噴霧剤、散剤、煙霧剤、吸入剤、点眼剤、眼軟膏剤、眼用リンス、腟坐薬、膣用リング、膣用軟膏剤、注射溶液、インシチュ形質転換溶剤(in situ transforming solutions)、例えば、インシチュゲル化、インシチュ硬化、インシチュ沈殿、インシチュ結晶化、注入溶液、および移植片の形態である。
【０１７６】
本発明による組成物はさらに、GH結合体の安定性をさらに強化し、生物学的利用能を増大させ、可溶性を増加させ、有害効果を低下させ、当該分野の当業者に周知の時間治療を達成し、および患者の服薬遵守を増加させるために、またはそれらの何れかの組み合わせのために、薬剤担体、薬剤送達システムおよび高度薬剤送達システム(advanced drug delivery system)と混ぜ合わせ、または、例えば、共有結合的、疎水的および静電気的相互作用によって、それらに結合させてよい。担体、薬剤送達システムおよび高度薬剤送達システムの例には、ポリマー、例えばセルロースおよび誘導体、多糖類、例えばデキストランおよび誘導体、デンプンおよび誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリル酸およびメタクリル酸ポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびそれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば、熱ゲル化(thermogelling)システム、例えば 当業者に周知のブロックコポリマー、ミセル、リポソーム、ミクロスフェア、ナノ微粒子、液晶およびその分散液、脂質-水系の相挙動(phase behaviour)の分野の当業者に周知のL2相(L2 phase)およびその分散液、重合ミセル、マルチプル乳剤(multiple emulsions)、自己乳化(self-emulsifying)、自己ミクロ乳化(self-microemulsifying)、シクロデキストリンおよびその誘導体、およびデンドリマー(dendrimers)が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
本発明による組成物は、例えば定量噴霧式吸入器(metered dose inhaler)、ドライパウダー吸入器(dry powder inhaler)および噴霧器（これらは全て当該分野の当業者に周知の装置である）を用いたGH結合体の肺への投与において、固体、半固体、粉末および溶液の組成物が有用である。
【０１７８】
本発明による組成物は、調節性、持続性、延長性(protracting)、遅延性(retarded)、および徐放性薬剤送達システムの組成物が特に有用である。より特に、しかし限定を意味せず、組成物は、当業者に周知の非経口的調節性放出および持続性放出システム（両システムとも、投与の回数を何倍も低減させる）の組成物が有用である。さらにより好ましくは、皮下投与される調節性放出および持続性放出システムが有用である。本発明の範囲を限定することなく、有用な放出性システムおよび組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、重合ミセル、ミクロスフェア、ナノ微粒子である。
【０１７９】
本発明による組成物に有用な調節性放出システムを作製する方法は、結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧力均質化、封入、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフェアの作製のための溶媒蒸発、押し出し加工(extrusion)および超臨界抽出法を含むが、これらに限定されない。一般に、Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)およびDrug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Composition and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)が参照される。
【０１８０】
非経口投与は、注射器、任意にペン型注射器を用いて、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射により行ってよい。あるいは、非経口投与は、注入ポンプを用いて行うことができる。さらなる選択肢は、鼻用または肺用スプレーの形態におけるGH結合体の投与のための溶剤または懸濁剤であってよい、組成物である。またさらなる選択肢として、本発明によるGH結合体を含む医薬組成物は、例えば、針のない注射による、もしくはパッチ(patch)による経皮投与、または経粘膜、例えば頬からの投与に適応させることも可能である。
【０１８１】
「安定化組成物」という用語は、物理的安定性が増大した、化学的安定性が増大した、または物理的および化学的安定性が増大した組成物を指す。
【０１８２】
本出願で使用されるタンパク質組成物の「物理的安定性」という用語は、タンパク質が熱-機械的ストレスに曝された結果および/または疎水的表面および界面といった不安定化させる界面および表面と相互作用した結果、生物化学的に不活性でおよび/または不溶性のタンパク質の凝集を形成しようとするタンパク質の傾向を表す。水性タンパク質組成物の物理的安定性は、適した容器(例えば、カートリッジまたはバイアル)に満たした組成物を、機械的/物理的ストレス（例えば、撹拌）に異なる温度で様々な期間さらした後、目視検査および/または濁度測定によって評価される。組成物の目視検査は、暗い背景で、鋭く集光した光にて行われる。組成物の濁度は、濁度の視覚的スコアランキングで特徴付けられ、例えば、0から3（全く濁りを示さない組成物は視覚的スコア0、および昼光で視覚的濁りを示す組成物は視覚的スコア3に相当）のスケールで行われる。組成物は、昼光で視覚的濁りを示す場合、タンパク質凝集に関して物理的に不安定であると分類される。あるいは、組成物の濁度は、当業者に周知の簡単な濁度計で評価することができる。水性タンパク質組成物の物理的安定性はまた、分光学的薬剤またはタンパク質の高次構造状態のプローブを用いて評価することができる。プローブは、好ましくは、タンパク質の非-未変性配座異性体に優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光学的プローブの１つの例は、チオフラビンTである。チオフラビンTは、アミロイド原繊維の検出に広く使用されてきた蛍光色素である。原繊維が存在する場合、およびおそらくその他のタンパク質立体配置が存在する場合でも同様に、チオフラビンTは、原繊維タンパク質形態と結合すると、最大約450 nmの新たな励起を生じおよび約482 nmの発光を増強する。非結合型チオフラビンTは、本質的に、そのような波長において、非蛍光性である。
【０１８３】
その他の小分子は、タンパク質の構造の未変性状態から非-未変性状態への変化のプローブとして使用することができる。例えば、「疎水性パッチ(hydrophobic patch)」プローブは、タンパク質の露出した疎水性パッチに優先的に結合する。疎水性パッチは、一般に、未変性状態においてタンパク質の三次構造中に埋まっているが、タンパク質が展開または変性した特に露出される。これらの小分子、分光学的プローブの例は、芳香族性、疎水性色素、例えば、アントラセン、アクリジン、フェナントロリン等である。その他の分光学的プローブは、金属-アミノ酸複合体、例えば、疎水性アミノ酸のコバルト金属複合体であり、該疎水性アミノ酸とは、例えば、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリン等である。
【０１８４】
本出願で使用されるタンパク質組成物の「化学的安定性」という用語は、未変性タンパク質構造と比較して生物学的有効性が潜在的に低くおよび/または免疫原性が潜在的に増強した化学的分解生成物の形成をもたらす、タンパク質構造の化学的共有結合の変化を指す。様々な化学的分解生成物が、未変性タンパク質の種類および性質に依存して、ならびにタンパク質が露出される環境に依存して形成されうる。化学的分解の排除は、間違いなく、完全に避けることはできず、化学的分解生成物の量の増大は、当業者にとって周知なように、タンパク質組成物の保存および使用の間にしばしば見られる。ほとんどのタンパク質が、脱アミドを起こしやすい。脱アミドとは、グルタミニルまたはアスパラギニル残基の側鎖アミド基が加水分解され、遊離カルボン酸を形成する過程である。その他の分解経路は、高分子量形質転換生成物の形成に関する。そのような形成において、２以上のタンパク質が、アミド基転移および/またはジスルフィド相互作用によって互いに結合し、共有結合性ダイマー、オリゴマーおよびポリマー分解産物の形成がもたらされる(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。酸化（例えば、メチオニン残基の酸化）を、化学的分解の別の変種として言及することができる。タンパク質組成物の化学的安定性は、異なる環境条件（分解生成物の形成は、例えば温度の増加によって、しばしば促進される）にさらした後、様々な時点での化学的分解生成物の量を測定することで評価することができる。個々の分解生成物の量は、様々なクロマトグラフィー技術（例えば、SEC-HPLCおよび/またはRP-HPLC）を用いて、分子サイズおよび/または電荷に依存して分解生成物を分離することで、しばしば決定される。
【０１８５】
それゆえ、上に概要を述べたように、「安定化組成物」は、物理的安定性、化学的安定性、または物理的および化学的安定性が増大した組成物を指す。一般に、組成物は、有効期限に達するまで、使用および保管（推奨される使用および保管条件に従って）の間、安定的でなければならない。
【０１８６】
本発明による一実施態様において、GH結合体を含む医薬組成物は、使用の際６週間を越えて、および保管の際３年間を越えて安定している。
【０１８７】
本発明の別の実施態様において、GH結合体を含む医薬組成物は、使用の際４週間を越えて、および保管の際３年間を越えて安定している。
【０１８８】
本発明の別の実施態様において、GH結合体を含む医薬組成物は、使用の際４週間を越えて、および保管の際２年間を越えて安定している。
【０１８９】
本発明のさらに別の実施態様において、GH結合体を含む医薬組成物は、使用の際２週間を越えて、および保管の際２年間を越えて安定している。
【０１９０】
本出願に引用される、文献、特許出願および特許を含む全ての参考文献は、それぞれの参考文献が、参照により取り込まれることが独立におよび明確に示され、およびその全体が本出願にて説明されるかのように、同じ範囲で本出願に援用される。
【０１９１】
全ての表題および副題は、本出願において、便宜的にのみ使用されており、何れかの方法に本発明を限定して解釈されるべきでない。
【０１９２】
上述の要素の、全てのありうる変種における、何れかの組み合わせは、本出願中に記載がない限り、または前後関係から明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【０１９３】
本発明を記載する文中にて使用される、「a」および「an」および「the」という用語は、本出願中に記載がない限り、または前後関係から明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を包含するよう解釈されるべきである。
【０１９４】
本出願における、値の範囲の列挙は、本出願中に記載がない限り、単にその範囲に入るそれぞれの値を独立に指す速記法(shorthand method)として役立つよう意図されており、それぞれの値は、独立に本出願に引用されるかのように明細書中に取り込まれる。言及がない限り、本出願で提供される全ての正確な値は、相当するおよその値を意味する（例えば、特定の因子または測定に関して提供される全ての正確な代表的値はまた、適切な場合に、「約」と修飾されて、相当するおよその測定値を提供するとみなすことができる）。
【０１９５】
本出願に記載される全ての方法は、本出願中に記載がない限り、または前後関係から明らかに矛盾しない限り、何れかの適した順番で行うことができる。
【０１９６】
本出願で提供される、何れかおよび全ての例、または例証的語句（たとえば「〜といった」）は、単に本発明をより明らかにするよう意図されており、記載がない限り本発明の範囲の限定を示さない。明細書中の何れの語句も、明示的にそう表されていない限り、何れの要素も本発明の実施に不可欠であることを示していると解釈されるべきでない。
【０１９７】
本出願中の、特許文献の引用および取り込みは、便宜的にのみ行われ、そのような特許文献の、有効性、特許性および/または実施可能性の何れの観点も反映しない。
【０１９８】
要素または要素群に関して、「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」または「含む(containing)」といった用語の使用による、本発明の何れかの側面または実施態様の本出願における記述は、本出願中に記載がない限り、または前後関係から明らかに矛盾しない限り、特定の要素または要素群「から成る」、それら「から、本質的に成る」、またはそれら「を実質的に含む」、本発明の同様な側面または実施態様の支持を提供するよう意図される（例えば、特定の要素を含むと本出願に記載される組成物は、本出願中に記載がない限り、または前後関係から明らかに矛盾しない限り、その要素から成る組成物を記載しているとも理解されるべきである）。
【０１９９】
本発明は、適用される法律により許される最大限の範囲で、本出願に示される側面または請求項に列挙される主題の、全ての修飾物および均等物を含む。
【実施例】
【０２００】
以下の略語が使用される：
Boc:    tert-ブチルオキシカルボニル
Bt:    1-ベンゾトリアゾリル
DBU:    1,8-ジアゾビシクロ[5.4.0]ウンデク(undec)-7-エン
DCM:    ジクロロメタン、メチレンクロリド
Dde:    1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DIC:    ジイソプロピルカルボジイミド
DMA:    N,N-ジメチルアセトアミド
DMF:    N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO:    ジメチルスルホキシド
DMAP:    4-ジメチルアミノピリジン
DMPU:    1,3-ジメチルテトラヒドロピリミジン-2-オン
EDC:    N-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドハイドロクロライド
Fmoc:    9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HBTU:    2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
HOAt:    3-ヒドロキシ-3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-b]ピリジン、4-アザ-3-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HOBt:    N-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HONSu:    N-ヒドロキシスクシンイミド
NMP:    N-メチルピロリドン
HPLC:    高圧液体クロマトグラフィー
Pmc:    2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル
r.t.:    室温
Su:    スクシンイミジル
TFA:    トリフルオロ酢酸
TIS:    トリイソプロピルシラン
Trt:    トリチル、トリフェニルメチル
Ts:    トルエンスルホニル
TSTU:    O-(1-スクシンイミジル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩。
【０２０１】
NMRスペクトルは、Bruker 300 MHzおよび400 MHz機器にて計測した。HPLC-MSは、Perkin Elmer機器(API 100)で行った。
【０２０２】
Merck-Hitachi (Hibar(商標) RT 250-4, Lichrosorb(商標) RP 18, 5.0μm, 4.0 x 250 mm, 勾配溶出, ３０分間で水に20%から80%のアセトニトリル, 1.0 ml/min, 254 nmで検出)およびWaters (Symmetry(商標), C18, 3.5μm, 3.0 x 150 mm, 勾配溶出, １５分間で水に5%から90%のアセトニトリル, 1.0 ml/min, 214 nmで検出)によるHPLCシステムを使用した。
【０２０３】
[一般的方法(A)]
本発明による式(II)および(III)の化合物を、以下のように作製してよい。
【化６７】
2008516621.tif 000042
【０２０４】
緩衝液(pH 4-8)にGHの入った溶液に、水に、または水および双極性溶媒の混合液にアルデヒドQ-Z-CHOが溶解した溶液を加え、続いて、NaCNBH4の水溶液を加える。生成された混合液を、室温で１から２４時間室温で振盪する。緩衝液(pH≧7)の添加後、標準的な精製により、式(II)の化合物が得られる。上述の通り、Qは、アルデヒドまたはケトンへの変換が可能な官能基である。式(II)の化合物を式(III)の化合物に変換するのに必要な条件は、基Qの構造に依存する。Qがヒドロキシル(OH)または一級アミノ基(NH2)を含む場合、一般的方法(B)に記載される過ヨウ素酸酸化で、該変換を行うことができる。式(II)の化合物が、アセタール、アミナール、ヘミアミナール、チオアセタール、ジチオアセタール、または何れかのその他の種のアセタールである場合、変換は、式(II)の化合物の酸または酸化体による処置が必要となる可能性がある。あるいは、式(I)または(I’)の化合物を得るための濃縮反応はまた、文献に記載される通り(Tumelty et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 14238-14239)、酸または銀の塩または水銀の塩の存在下で、Qがアセタール種の構造である式(II)の化合物と、適したアルコキシルアミン、ヒドラジン、またはアミノチオールとを混合することで、直接行ってよい。
【０２０５】
[一般的方法(B)]
本発明による式(V)の化合物は、以下のように作製してよい。
【化６８】
2008516621.tif 000043
【０２０６】
適した緩衝液(pH = 7-9)にSer-GHが溶解した溶液に、水にメチオニン（30-300等量）を溶解した溶液を加え、続いて、水に過ヨウ素酸ナトリウム（5-20等量）を溶解した溶液を加える。生成される溶液を、慎重に5-30分間振盪し、アルデヒドおよびその水和物の混合物が含まれる溶液を得る。この生成混合物は、さらに精製することなく使用することができる。
【０２０７】
[一般的方法(C)]
一般式(III)または一般式(V)の化合物と、アルコキシルアミン、ヒドラジン、またはアミノチオールとの濃縮は、水、または水および双極性溶媒の混合液、またはDMFといった双極性溶媒単独に、適したアルコキシルアミン、ヒドラジン、またはアミノチオールを溶解した溶液を、式(III)または(V)の溶液に加えることで行われる。生成される混合液のpHは、2.0から12.0の範囲であってよく、任意に、所定の値、例えば、3.6、4.0、6.0、6.5、10.0または10.5に調整してよい。生成される混合液を、慎重に1-200時間振盪し、その反応後、HPLCまたはその他の何れかの通常の分析手段に供す。反応が終了したとき、混合液を水で希釈し、生成物を標準的なクロマトグラフィー技術で精製する。
【０２０８】
実施例１  Ser-hGHの作製
Ser-hGH類似体発現プラスミドを、pNNC13をベースに作製した(Zbasic2mt-D4K-hGH)。該プラスミドは、野生型hGHにZbasicドメイン(mvdnkfnkerrrarreirhlpnlnreqrrapirslrddpsqsanllaeakklnraqapkyrggsddddksfptiplsrlfdnamlrahrlhqlafdtyqefeeayipkeqkysflqnpqtslcfsesiptpsnreetqqksnlellrisllliqswlepvqflrsvfanslvygasdsnvydllkdleegiqtlmgrledgsprtgqifkqtyskfdtnshnddallknygllycfrkdmdkvetflrivqcrsvegscgf)が融合したものを発現する。付加的なSerを、QuikChange(登録商標) XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用い、プライマーのセット: 
5’ end: pNNC13 Ser-F
5’-GGATCAGACGACGACGACAAAagcTTCCCAACCATTCCCTTATCC-3’および、
3’end: pNNC13 Ser-R
5’-GGATAAGGGAATGGTTGGGAAgctTTTGTCGTCGTCGTCTGATCC-3’
を使用して、成熟型hGHの最初のアミノ酸であるPheの前に挿入した。
【０２０９】
E. coli BL21(DE3)に、pET11a-Zbasic2mt-D4K-Ser-hGHを形質転換した。シングルコロニーを、100μg/ml Ampを含む100 ml LB培地に接種し、37℃で培養した。OD600が0.6に達したとき、細胞培養温度を30℃まで下げ、細胞を、1 mM IPTGにより30℃で4時間誘導した。細菌細胞を、3000 gで15分間遠心(Eppendorf centrifuge 5810R)して回収した。細胞ペレットを、細胞溶解緩衝液(25 mM Na2HPO4  25 mM NaH2PO4 pH 7、5 mM EDTA、 0.1%トリトンX-100)に再懸濁し、細胞を、30 kpsiの細胞破壊(cell disruption) (Constant Cell Disruption Systems)によって破壊した。ライゼートを、10000 gで30分間遠心して、不純物を除いた。ペレットを処分し、上清は、保存し精製に使用した。
【０２１０】
Zbasic2mt-D4K-Ser-hGHを、段階的勾配溶出(緩衝液A: 25 mM Na2HPO4  25 mM NaH2PO4 pH 7; 緩衝液B: 25 mM Na2HPO4  25 mM NaH2PO4 pH 7、1 M NaCl)を用いて、SP-セファロースで精製した。続いて、タンパク質を、エンテロペプチダーゼで切断し、Ser-hGHを放出させた。Ser-hGHをさらに、ブチルセファロース4FFカラムで精製し、Zbasic2mt-D4Kドメインおよびエンテロペプチダーゼから分離した(緩衝液A: 100 mM Hepes pH 7.5；緩衝液B: 100 mM Hepes pH 7.5、 2 M NaCl、直線的勾配を使用した)。Ser-hGHの最終生成物を、緩衝液を交換し、50 mM NH4HCO3, pH 7.8から凍結乾燥した。
【０２１１】
実施例２  1-[2-(O-(2-(N-ヘキサデカノイルピペリジン-4-イル)エチル)オキシミノ)アセチル]-hGH
【化６９】
2008516621.tif 000044
【０２１２】
以下の溶液を作製した：
緩衝液: 水(10 ml)に25 μl (188μmol)トリエタノールアミン(Mwt: 149.21, d: 1.12) 
メチオニン(Mwt: 149.21): 水(10 ml)に20 mg (134μmol)
NaIO4 (Mwt: 213.89): 水(10 ml)に5 mg (23.3μmol)
1-ヘキサデカノイル-4-(2-アミノキシ-1-エチレン)ピペリジン(Mwt: 382.6): DMF (0.2 ml)に3.6 mg
AcOH (Mwt: 60, d: 1): 水(1.0 ml)に17μl (283μmol)。
【０２１３】
Ser-hGH (Mwt: 22211;約1 mg, 45 nmol)を、緩衝液(110μl)に溶解した。この溶液に、メチオニン溶液(10μl、約30等量)を加え、次に、NaIO4溶液(10μl、約5等量)を加えた。透明な溶液を室温に15分間置いた。ヒドロキシルアミンの溶液(10μl；約10等量)を加え、生成される若干濁った混合液を、室温で15分間置いた。次に、AcOHの溶液(10μl；約60等量)を加え、約1分後、水(0.5 ml)および上記のトリエタノールアミン緩衝液(0.5 ml)を加えた。HPLCおよびMaldiによる分析から、少なくとも80％が所望のオキシムに変換したことがわかった。
【０２１４】
実施例３  1-[2-(O-(4-(4-(メトキシ-PEG(30K)-オキシ)ブチリルアミノ)ブチル)オキシミノ)アセチル]-hGH
(a) N-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシブチル) フタルイミド
【化７０】
2008516621.tif 000045
【０２１５】
N-(4-ブロモブチル)フタルイミド(18.9 g、67.0 mmol)、MeCN (14 ml)、およびN-Boc-ヒドロキシルアミン(12.7 g、95.4 mmol)の混合液に、撹拌しながら、DBU (15.0 ml、101 mmol)を少しずつ(in portions)加えた。生成される混合液を、50℃で24時間撹拌した。水(300 ml)および12 M HCl(10 ml)を加え、および生成物を、AcOEtで3回抽出した。抽出液をまとめ、ブラインで洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。生成される油(28 g)を、クロマトグラフィーで精製した(140 g SiO2、ヘプタン/AcOEtによる勾配溶出)。17.9 g (80%)の表題の化合物を、油として得た。1H NMR (DMSO-d6) δ 1.36 (s, 9H), 1.50 (m, 2H), 1.67 (m, 2H), 3.58 (t, J = 7 Hz, 2H), 3.68 (t, J = 7 Hz, 2H), 7.85 (m, 4H), 9.90 (s, 1H)。
【０２１６】
(b) 4-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシ)ブチルアミン
【化７１】
2008516621.tif 000046
【０２１７】
EtOH (10 ml)に(a)で得られたN-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシブチル) フタルイミド(8.35 g, 25.0 mmol)を溶解した溶液に、ヒドラジン水和物(20 ml)を加え、混合液を80℃で38時間撹拌した。混合液を濃縮し、残留物をEtOHおよびPhMeで共蒸発(coevaporated)した。残留物に、EtOH (50 ml)を加え、沈殿したフタルヒドラジドをろ過して除き(filtered off)およびEtOH (50 ml)で洗浄した。まとめたろ液を濃縮し、5.08 gの油を得た。この油を、水中(20 ml)にK2CO3 (10 g)を溶解した溶液と混合し、生成物をCH2Cl2で抽出した。乾燥(MgSO4)し濃縮して2.28 g(45%)の表題の化合物を油として得た。これは、それ以上精製することなく使用した。1H NMR (DMSO-d6) δ 1.38 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.51 (m, 2H), 2.51 (t, J = 7 Hz, 2H), 3.66 (t, J = 7 Hz, 2H)。
【０２１８】
(c) Peg(30k)-O-(CH2)3-C(=O)-NH-(CH2)4-O-NH2
【化７２】
2008516621.tif 000047
【０２１９】
CH2Cl2 (40 ml)に(b)で得られた4-(N-ブチルオキシカルボニル-アミノキシ)ブチルアミン(0.43 g, 2.10 mmol)を溶解した溶液に、mPEG-SBA(30K) (Nektar Therapeutics, 5.0 g, 0.17 mmol)を加えた。生成された混合液を室温で5時間撹拌した。混合液を濃縮し、残留物を減圧下で乾燥させた。iPrOH (4 x 80 ml)で再結晶し、4.14 gのBoc-保護 Peg(30K)-アルコキシルアミンを得た。
【０２２０】
この生成物(21 mg、約0.7μmol)に、CH2Cl2 (2.5 ml)およびTFA (2.5 ml)を加えた。0.5時間後、混合液を濃縮し、残留物をCH2Cl2 (2.5 ml)およびトルエン(10 ml)に再溶解し、再び濃縮した。その残留物を、CH2Cl2 (3 ml)の入ったより小さなバイアルに移し、N2を流して濃縮し、次に減圧下で濃縮した。残留物を、水(0.21 ml)に2-メチルピリジン(約5μl)とともに溶解し、pHを6.0に調整した。
【０２２１】
(d) 酸化型Ser-hGHのPEG化(Pegylation)
【化７３】
2008516621.tif 000048
【０２２２】
以下の溶液を作製した：
緩衝液: 水(100 ml)に240 mg (1.61 mmol)のトリエタノールアミン(Mwt: 149.21); pH = 8.5.
メチオニン(Mwt: 149.21): 水(1.0 ml)に26 mg (0.174 mmol)
NaIO4 (Mwt: 213.89): 水(1.0 ml)に5 mg (24μmol)。
【０２２３】
Ser-hGH (1 mg, 45 nmol)に、緩衝液(0.10 ml)およびメチオニン溶液(0.030 ml)を加え、過ヨウ素酸溶液(15μl)を加えた。15分後、DMF(60μl)を加え、混合液全体を、(c)で得られたPeg溶液に加えた。生成された混合液は、pH 6.5であった。混合液を20時間静置させ、その後SDS-PAGEで分析した。PEG化したhGHが、約30％の収率で得られた。
【０２２４】
実施例４  2,3-ビス(メチルポリオキシエチレンオキシ)-1-({3-[(1,5-ジオキソ-5-(4-boc-アミノオキシブチルアミノ)ペンチル)アミノ]プロピル}ポリオキシエチレンオキシ)プロパン
【化７４】
2008516621.tif 000049
【０２２５】
DCM (20 ml)に4-(N-Boc-アミノキシ)-1-ブチルアミン(0.3 g, 1.5 mmol)を溶解した溶液に、Peg-OSuエステル(5 g、0.125 mmol; Sunbright GL3-400GS2、NOF Corp.から供給)を加え、その後DIPEA (0.5 ml)を加えた。混合液を5日間室温で撹拌した。生成物を、ジエチルエーテルを加えることで沈殿させ、ろ過により単離し、DCMに再溶解し、さらに3回沈殿の操作を繰り返した。生成物を、次に、DCMおよびMeOHの混合液に溶解し、酸性イオン交換樹脂(Amberlyst 15, 10 g, DCM + MeOHで洗浄)を加えた。混合液を1時間撹拌し、ろ過し、濃縮した。残留物を、さらに3回ジエチルエーテルで沈殿させて精製した。Boc-基の量を、内部標準(4-シアノ-4'-ヒドロキシビフェニル)を用いた1H NMR分光法で決定した結果、12.8μmol/gであった。
【０２２６】
実施例５  酸化型SerhGHのPEG化: 1-(N-{4-(5-[3-(オメガ-(3-(2,3-ビス(メチルポリオキシエチレンオキシ)プロピルオキシ)プロピル)ポリオキシエチレンオキシ)プロピルアミノ]-1,5-ジオキソペンチルアミノ)ブトキシ}イミノアセチル)hGH
【化７５】
2008516621.tif 000050
【０２２７】
以下の溶液を作製した：
緩衝液A: トリエタノールアミン(270 mg, 1.8 mmol)、3-メチルチオプロパノール(580 mg, 5.46 mmol)、水(40 ml)、
緩衝液E: MES-水和物(4.27 g, 20 mmol) + 水(50 ml) + 1N NaOH (12.5 ml, 12.5 mmol)、pH = 6.5、
緩衝液F: L-メチオニン(2.0 g) + 水(80 ml)、
過ヨウ素酸溶液: NaIO4 (48.1 mg, 0.225 mmol) + 水(1.0 ml)。
【０２２８】
Peg-脱保護：
実施例２で作製した生成物(200 mg, 2.5μmol)を、DCM (15 ml)およびTFA (15 ml)と混合し、0.5時間後、混合液を濃縮した。残留物を、EtOHとともに１度共蒸発(coevaporated)させ、減圧下で一晩乾燥させた。残留物を、緩衝液E(4.0 ml)に溶解した。
【０２２９】
酸化：
緩衝液A(6 ml)にSerhGH (60 mg, 2.7μmol)を溶解した溶液に、過ヨウ素酸溶液(0.6 ml)を加えた。１５分後、混合液を緩衝液Fで希釈し、緩衝液Fで５回透析した(Amicon Ultra, cut-off 5000 Da, 10 °C)。残留物を緩衝液Fで希釈し1.5 mlとし、この溶液に、氷冷(0℃)したNMP(0.5 ml)を加えた。
【０２３０】
オキシム化(Oximation)
生成されたアルデヒド溶液を、ただちにPeg溶液に加えた。若干濁った混合液を、室温下、暗所に１週間置いた。Peg化されたタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーで精製した。
【０２３１】
[薬理学的方法]
試験(I)  成長ホルモン活性を決定するためのBAF-3GHR試験
BAF-3細胞（骨髄由来のマウスプロ-Bリンパ細胞株）は、本来、生育および生存においてIL-3依存性であった。IL-3は、JAK-2およびSTATを活性化するが、これらは、GHにより刺激を受けて活性化される、同様の介在物質である。ヒト成長ホルモン受容体の形質移入の後、細胞株は、成長ホルモン依存型の細胞株となった。このクローンは、様々な成長ホルモンサンプルのBAF-3GHRの生存における効果を評価するために使用することができる。
【０２３２】
BAF-3GHR細胞株を、37℃、５％CO2下、飢餓培地(starvation medium)（成長ホルモンを含まない培地）で２４時間培養した。
【０２３３】
細胞を洗浄し、飢餓培地に再懸濁し、プレートにまいた。10μlの様々な濃度の成長ホルモン化合物もしくはヒト成長ホルモンまたは対照物を細胞に添加し、プレートを、37℃、５％CO2下で68時間培養した。
【０２３４】
AlamarBlue(登録商標)をそれぞれのウェルに加え、次に細胞をさらに4時間培養した。AlamarBlue(登録商標)は、酸化還元の指標であり、生得的な細胞性代謝によって減少する。それゆえ、生存細胞数の間接的な尺度となる。
【０２３５】
最後に、細胞の代謝活性を、蛍光プレート測定器で測定した。サンプルの吸光度は、成長ホルモン化合物または対照物で刺激していない細胞を基準とした％で表した。濃度-応答曲線から、活性（50％を示した、細胞を刺激した化合物の量）を算出することができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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