(57)【要約】乾癬の治療および/または緩和用医薬の製造のための、プロスタグランジンA2誘導体および該化合物のプロドラッグの使用、並びに前記プロスタグランジンの局所適用を含む治療方法提供する。また、適当な賦形剤中、治療効果があり生理学的に許容しうる量の上記化合物またはその誘導体を、前記またはプロドラッグの構造として含む組成について言及する。重要な点は、治療効果のある量の該誘導体を、充血、炎症または痛みのような副作用は無く、または僅かしか無く、使用できることである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療効果があり生理学的に許容しうる量の該プロスタグランジンを含む、乾癬の治療および/または緩和用医薬品を製造するための17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2またはその誘導体の使用。
【請求項２】
該プロスタグランジンがエステルプロドラッグであることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
該プロスタグランジンがアミドプロドラッグであることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
【請求項４】
該プロスタグランジンが17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2-イソプロピルエステルであることを特徴とする、請求項2に記載の使用。
【請求項５】
充血、炎症または痛みのような副作用が無く、または僅かしか無く、乾癬の治療および/または緩和が達成される、請求項1-4のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
治療効果があり生理学的に許容しうる量の17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2またはその誘導体を含む、乾癬の治療および/または緩和用の局所適用組成物。
【請求項７】
該プロスタグランジンがエステルプロドラッグであることを特徴とする、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
該プロスタグランジンがアミドプロドラッグであることを特徴とする、請求項6に記載の組成物
【請求項９】
該プロスタグランジンが17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2-イソプロピルエステルであることを特徴とする、請求項7に記載の組成物。
【請求項１０】
治療効果のある量の該組成物を局所適用したとき、充血、炎症または痛みのような副作用が無く、または僅かしか無いことを特徴とする、請求項6-9のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
治療効果があり生理学的に許容しうる量のプロスタグランジンを患者の乾癬性病変の皮膚に局所適用する方法において、該プロスタグランジンが17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2 または誘導体またはそのプロドラッグであることを特徴とする、ヒトの患者における乾癬の治療および/または緩和方法。
【請求項１２】
該プロスタグランジンがエステルプロドラッグであることを特徴とする請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
該プロスタグランジンがアミドプロドラッグであることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
該プロスタグランジンが17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2-イソプロピルエステルであることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
充血、炎症または痛みのような副作用が無く、または僅かしかなく、乾癬の治療および/または緩和することを特徴とする、請求項11-14のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾癬の治療および/または緩和のための組成物および方法、同目的のための、プロスタグランジンA2(PGA2)誘導体の使用、並びに乾癬治療および/または緩和用医薬品の製造のための前記誘導体およびその医薬的に許容しうるプロドラッグの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬はヨーロッパおよびアメリカ合衆国の人口の1-2%が患っている一般的な皮膚病である。この病気は遺伝性であり、通常、10-40歳で発症するが、いずれの世代にでもみられる。乾癬には多くのサブタイプがあるが、該病気の最も一般的な形態では、発症患者に癒着性銀白色鱗屑に覆われた角化性紅斑病変が見られる。頻繁では無いが、該病変は、肘、膝、殿部、および頭皮に局部的に発症する。一般的に皮膚への圧迫や摩擦のような物理的接触が、該病変を誘発するとされている。
【０００３】
乾癬の発症機序は、主としてケラチン生成細胞である表皮の細胞の増殖を促進する炎症と考えられている。従って、表皮は厚く角化性である。腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)のような炎症性メディエーターが、該疾患発症の重要な要因と考えられている。また、乾癬は、全身化して発症し、および、該疾患により、特に四肢に関節炎が起こる。該疾患の経過は変動するが、一般に永久的な完治はない。
【０００４】
乾癬は通常、様々な薬物で治療する。角質剥離性の単純症状には、潤滑油、および局所コルチコステロイドが使用される。サリチル酸、タール含有薬剤、並びにアントラリンおよびビタミンD製剤もまた使用される。より広範囲の乾癬には、PUVA-治療が用いられる。この治療は、ソラレン、例えば8-メトキシソラレンを全身または局所投与するとともに、肌へ紫外線光(UVA)照射することに基づく。この治療法は効果的だが、皮膚癌になりやすくなる。またメトトレキサートのような細胞分裂阻害剤は、重症の乾癬に使用される。最近では、抗体またはT-リンパ球への融合タンパク質が重症の乾癬に効果的であることが明らかとなったが、該薬物は静脈注射により投与されなければならないという不利点がある。全身投与は常に望ましくない副作用のリスクを増す。また、レチノイドが乾癬の治療に使用される。現在、多くの乾癬の治療法はあるが、更に効果的で副作用の少ない薬物が強く望まれる。
【０００５】
多くの患者が乾癬の治療にプロスタグランジンAを含むプロスタグランジンを使用しており、例えば、DE 2460285にタイプA、EおよびFの特定のトランス-デルタ-2 プロスタグランジン誘導体が、それらの合成方法および医薬的使用とともに開示されている。これらのトランス-デルタ-2 プロスタグランジン誘導体の、乾癬を含む様々な自己免疫疾患の治療が示唆されている。
【０００６】
US 4,254,145に、PGAタイプのプロスタグランジンを含む様々なプロスタグランジンが乾癬の治療に有用であるとの記載が開示されている。該効果の考えられるメカニズムは末梢血液循環が増加するためと言及されていた。
【０００７】
更に最近の特許US 6,031,001 (Stjernschantz and Resul)に、AおよびJタイプのプロスタグランジンがそれらのヒトケラチン生成細胞の増殖抑制効果に基づき、乾癬の治療に有用であることが開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
開示された従来技術の概略を考慮すると、乾癬の治療に特効あるプロスタグランジンの開発は以前望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の概要
本発明は、乾癬の治療および/または緩和のための、治療効果があり生理学的に許容しうる量の17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2またはその誘導体を含む局所用組成物を提供する。
【００１０】
本発明のもう一つの態様は、乾癬の治療および/または緩和のための、治療効果があり生理学的に許容しうる量の該プロスタグランジンを含む、医薬品製造のための17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2またはその誘導体の使用に関する。
【００１１】
第３の態様は、治療効果があり生理学的に許容しうる量のプロスタグランジンを患者の皮膚の乾癬皮膚病変に局所適用し、前記プロスタグランジンが17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2または誘導体またはそのプロドラッグである、ヒト患者の乾癬の治療および/または緩和のための方法に関する。
【００１２】
これら３つの態様のすべてにおいて、充血、炎症または痛みのような望ましくない副作用がなく増殖抑制およびアポトーシス効果の両方が達成されることは大変重要である。
【００１３】
以下の説明、実施例および図面で、本発明を更に詳細に言及する。
【００１４】
説明
語句”プロドラッグ”は薬理活性代謝物を生じるが、それ自体に活性はない、または部分的に活性を有する物質(すなわち薬理活性化合物の前駆体)を意味する。
【００１５】
語句”誘導体”および”機能的に同等の誘導体”は、別の物質から派生または生成され、親化合物と、例えば、効力、安定性、耐性などが同一、同様、改良した特性を有するいずれの化合物または物質を包む。機能的に同等な薬剤の誘導体は、該薬剤分子の一般構造を保持するが、該薬剤の治療機能に影響しない原子または基を付加または除去した構造を有する。
【００１６】
プロスタグランジンは酸化を含む代謝段階を経て不飽和脂肪酸前駆体から生成された脂肪酸である。最も重要で一般的な前駆体はアラキドン酸またはエイコサテトラエン酸であり、この前駆体から生成されたプロスタグランジンは2-シリーズである。プロスタグランジンの一般構造は、二つの炭素鎖が結合したシクロペンタン環を含み、上方は通常アルファ鎖と呼ばれ、下方はオメガ鎖と呼ばれる。アルファ鎖は7炭素カルボキシ-末端脂肪族鎖であり、オメガ鎖は8炭素メチル-末端脂肪族鎖である。これらの鎖の二重結合の数に依存して、1-3の下付数字が付けられる。2シリーズのプロスタグランジン中、アルファ鎖は炭素5および6間にシス-配置の二重結合を有し、オメガ鎖は炭素13および14間にトランス-配置の二重結合を有す。プロスタグランジンはオメガ鎖中の炭素15にヒドロキシル基を有し、これは生物活性に重要である。
【００１７】
プロスタグランジンはさらに、シクロペンタン環の構造および置換基に依存して、A、B、C、D、E、F、およびJのサブグループに分類される。炭素9にカルボニル基を有するAタイプのプロスタグランジンにおいて、炭素10および11間に二重結合があり、従って、該環状構造をシクロペンテノンと呼ぶ。
【００１８】
本発明は17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2、PGA2の特異的誘導体、並びにプロドラッグおよびその誘導体に関する。Aタイプのプロスタグランジンは酸性環境でEタイププロスタグランジンから生成され、本発明はまた、合成的、または対応するPGE2アナログからの生化学的手法による特異的PGA2アナログの生成に関する。17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2-イソプロピルエステル、17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2プロドラッグ構造の化学構造は以下に示される(化合物1)。
【化１】
2008509994.tif 000002
【発明の効果】
【００１９】
本発明者は今回、特異的PGA2誘導体の一つ、すなわち17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2およびこの化合物のプロドラッグが乾癬の治療に非常に適していることを明らかにした。このプロスタグランジン誘導体はオメガ鎖環置換PGA2アナログであり、概して乾癬の治療に有用であると既に開示されたプロスタグランジンアナログの一群には該当しない(WO 96/09055; US 6,031,001)。
【００２０】
本発明者は今回、当該PGA2誘導体の実に全てがヒトケラチン生成細胞の増殖抑制効果を示すことを明らかにした(本明細書の実施例は17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2、13,14-ジヒドロ-17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2および16-フェノキシ-(3-トリフルオロメチル)-17,18,19,20-テトラノール-PGA2を含む)。 
【００２１】
しかしながら、実験した化合物のうち17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2は優れた特性を示した。事実、驚くべきことにこの化合物は、PGA2自体以上の増殖抑制効果を示した。加えて、17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2は、乾癬のケラチン生成細胞の過剰増殖の阻止に非常に有益な効果である、ヒトケラチン生成細胞のアポトーシスを引き起こした。
【００２２】
さらに、本発明者は、充血/炎症のすぐれたモデルであるヒト眼試験を行った結果、17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2はPGA2とは対照的に、充血作用または刺激性作用のいずれもなく、非常に有利な化合物であることを明らかにした。充血は血管径が拡大して組織を赤くする、乾癬の典型的で望ましくない症状の一つである。
【００２３】
これまでに本発明者が試験をしたプロスタグランジンの全て(オメガ鎖環置換プロスタグランジンを含む。US 5,422,368参照)は、ある程度の血流量の増加(血管径の拡大)を引き起こす。加えて、多くのプロスタグランジンはまた、それらを適用した組織で炎症または痛みを引き起こす。PGA2は顕著にこれらの不都合な両副作用を引き起こす。しかしながら、17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2はこれらの副作用は全くない一方、PGA2に比べ高い増殖抑制効果を示す。
【００２４】
該化合物に関してまた、13,14-ジヒドロ-17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2は、イソプロピルエステルプロドラッグ構造において試験をしたとき、目に幾分の充血を引き起こすことがUS 5,422,368に開示されている。また、本明細書で実施した一連の試験のうち、増殖抑制効果の試験をしたところ、前記化合物は17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2と比較して増殖抑制効果は非常に低いことが明らかとなった。従って、17-フェニル-18,19,20-トリノルは乾癬の局所治療に非常に適している。この特異的化合物のプロドラッグ、例えばカルボン酸エステルは当然に、同様に乾癬の治療に適しているということとなる。
【００２５】
要約すれば、本発明者は17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2は、著しく高い増殖抑制効果を有し、充血、炎症または痛みを伴わないことを示す。比較され得る、13,14-ジヒドロ-17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2および16-フェノキシ-(3-トリフルオロメチル)-17,18,19,20-テトラノル-PGA2のようなオメガ鎖環置換PGA2アナログに比べて優れていることを示す。重要な点は、17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2アナログは、さらにケラチン生成細胞にプログラム細胞死、アポトーシスを引き起こし、該薬剤の増殖抑制効果の要因となることが示された。
【００２６】
従って、本発明は乾癬の治療および/または緩和のための組成物を提供する。17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2または機能的誘導体、並びにそれらのプロドラッグ（例えばカルボン酸エステルやアミド）を含む組成物を、液剤、ジェル、ローション、クリーム、軟膏、シャンプー、または皮膚または髪(頭皮)に局所使用できる他の形状として処方する。
【００２７】
所望の化合物17-フェニル-18,19,20-トリノル PGA2、その機能的に同等の誘導体およびこの化合物のプロドラッグは、皮膚の局所適用に適した賦形剤中で使用する必要がある。適当な賦形剤は、シクロデキストリンのような可溶化剤および安定剤を含みまたは含まない水性賦形剤、オイル、軟膏、クリーム、ジェル、ミセル系、ナノ粒子、およびあらゆる低速放出製剤が含まれる。適当な賦形剤には、保存剤を含みまたは含まない。単独使用か複数使用かその意図によって、賦形剤に防腐剤を含んでもよく、含まなくても良い。防腐剤としては、例えば塩化ベンザルコニウム、クロルヘキシジン、チオマーサル、パラ安息香酸、アルコール、および十分な抗菌効果有する他の薬剤が含まれる。
【００２８】
相乗効果のため、化粧品、医薬、または他の局所薬を、溶解または混合して上記組成物に組み込み、組合せ配合物を調製する。当該化粧品、医薬または他の成分の例には、軟化剤、保湿剤、必須脂肪酸、抗炎症薬、日焼け防止剤、香料、着色剤などが含まれるが、これらに限られない。
【００２９】
17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2化合物または化合物類の他の局所送達の組成物の剤型は、当業者により直ちに調製または処方される。
【００３０】
望ましい化合物を含む処方例が表1に示される。 
【表１】
2008509994.tif 000003
【００３１】
更に、本発明は乾癬の治療および/または緩和のための方法を提供する。従って、17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2またはその機能的誘導体、または例えばイソプロピルエステルとしてのプロドラッグの構造を使用して、17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2またはその機能的誘導体を、乾癬性病変の治療のため、一日に一回または数回、時間を区切って、病変した皮膚に局所的に塗布する。当該治療は数週間のみ行い、または臨床症状によっては更に継続する。推奨使用量は一塗布あたり0.01から100μgである。通常、面積1dm2に、一塗布あたり投与量1-100μgが使用される。該医薬を臨床症状および剤型により、一日あたり一または数回染み込ませる。乾癬性病変が退行した場合は、治療を断続的に継続するか、または終了する。
【００３２】
本発明はまた、乾癬治療の組成物調製のための、上記の17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2、および/またはそのプロドラッグの使用に関する。また、上記の投与量、濃度、組成物およびその成分は、この使用に準用できる。
【００３３】
本発明を実施例により説明するが、これに限られない。
【実施例】
【００３４】
本発明の実施例に使用するプロスタグランジンアナログは、以下のパラグラフの説明のように合成される。公表された方法(Resul et al. (1993), Phenyl-susbstituted prostaglandins: potent and selective antiglaucoma agents. J Med Chem 36: 243-248)に従い、下記の合成の説明から明らかなように若干修正して、化合物1、2および3を調製した。
【００３５】
PGA2アナログの一般的合成方法
【００３６】
化合物1の調製方法A(スキームII)
【００３７】
化合物1をコーリーラクトン4から合成した。ラクトン4の一級アルコールをDME中、DCC、DMSOおよびH3PO4でアルデヒド5に酸化した。粗アルデヒド5を、塩化リチウムおよびジイソプロピルエチルアミンの存在下、ホスホン酸ジメチル(2-オキソ-4-フェニルブチル)と反応させ、収率70%で6を得た。THF中-78℃で水素化S-アルピン（S-Alphine hydride）でエノン6を立体選択的還元し、(15R)-7異性体より多い、70-75%の(15S)-7異性体を得た。別法としてMeOH/CH2Cl2中、NaBH4.CeCl4(H2O)7で該還元を行ったが、これは選択性が低い。エピ異性体をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで溶離液にトルエン:酢酸エチル 2:1を使用して、直ちに分離し、純粋な(15-S)-7を得た。p-フェニルベンゾイル(PPB)保護基をMeOH中K2CO3で除去し、80%収率のジオール8を得た。生成物8をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで、溶離液に酢酸エチルを使用して精製した。8のフリーヒドロキシル基をテトラヒドロ-ピラニル(THP)基で保護し、定量値の収率で9を得た。化合物9を無水THF中、水素化ジイソブチルアルミニウム(DIBAL-H)で処理し、ラクトール10を得た。生成物10を無水THF中、4-カルボキシブチル-トリフェニルホスホニウムブロミド、t-BuOK、とウィッティヒ反応させ、酸11を得た。これを単離せずに、アセトン中DBUの存在下ヨウ化イソプロピルとさらに反応させ、対応するエステル12が得られ、シリカゲルのカラムクロマトグラフィーで酢酸エチル:ヘキサン 1:1を用いて単離した。化合物12をジクロロメタン中、酸化アルミニウム処理したクロロクロム酸ピリジニウム(PCC/Al2O3)で酸化し、化合物13を得た。保護基11、15-ビステトラヒドロ-ピラニルオキシ基をアセトニトリル中1N HClを加えて除去した。反応混合物を室温で約3 時間攪拌し、14を得た。これを単離せずに過剰の1N HClを加えて反応させた。該混合物をさらに40 時間攪拌し、定量的な変換をさせて、対応するPGA2エステルアナログ(1)を得た。
【００３８】
化合物2の調製方法B(スキームIII)
【００３９】
化合物2をスキームIIIに示されるように合成した。亜硝酸ナトリウムの存在下、触媒としてPd-Cを使用して、水素雰囲気で化合物7(スキームI)のトランスアリル二重結合を還元し、15を得た。化合物15単離し、その後、上記方法Aに従って反応させ、所望の生成物2を得た。
【００４０】
化合物3の調製方法C(スキームIV)
【００４１】
上述の化合物2の合成手法(方法B)に若干修正を加えた方法を使用して、化合物3をスキームIVに示されるように合成した。アルデヒド5をアシルホスホン酸(2-オキソ-3-フェノキシプロピル)ホスホン酸ジメチル23 (スキームIV)と反応させて、エノン24を得た。これを単離し、その後、方法Bに従って反応させ所望の生成物3を得た。
【化２】
2008509994.tif 000004
【００４２】
試薬: a. DCC、DMSO、H3PO4/DME; b. LiCl、(CH3O)2POCH2-CO-(CH2)2C6H5、DIPEA/CH3CN-15℃; c. 水素化S-アルピン/THF; d. K2CO3/ メタノール; e. DHP、PPTS / CH2Cl2; f. DIBAL-H / THF、-78℃; g. 4-カルボキシブチル-トリフェニルホスホニウムブロミド、KOtBu / THF; h. iPrI、DBU / CH3CN; i. PCC、Al2O3/ CH2Cl2; j、k. 1N HCl / CH3CN
【化３】
2008509994.tif 000005
【００４３】
試薬: a. Pd-C/H2、NaNO2、EtOH; b. K2CO3/ メタノール; c. DHP、PPTS / CH2Cl2; d. DIBAL-H / THF; e. 4-カルボキシブチル-トリフェニルホスホニウムブロミド、KOtBu / THF; f. iPrI、DBU / CH3CN; g. PCC、Al2O3/ CH2Cl2; h、i. 1N HCl / CH3CN
【化４】
2008509994.tif 000006
【００４４】
試薬: a. NaH、DME; b. 水素化S-アルピン/THF; c. Pd-C/H2、NaNO2、EtOH; d. K2CO3/ メタノール; e. DHP、PPTS / CH2Cl2; f. DIBAL-H / THF; g. 4-カルボキシブチル-トリフェニルホスホニウムブロミド、KOtBu / THF; h. iPrI、DBU / CH3CN; i. PCC、Al2O3/ CH2Cl2; j、k. 1N HCl / CH3CN
【００４５】
PGA2酸1a、2aおよび3aの調製(スキームV)
【００４６】
PGA2アナログのin vitro活性を評価するため、該イソプロピルエステルプロドラッグ(スキームI)をリン酸緩衝液(pH7.4):アセトン(1:0.2)中、リパーゼタイプVII(シグマ)で加水分解した。該混合液を室温で3日間、磁石で攪拌し(TLC（酢酸エチル）で確認しながら)、該反応混合物をエーテルで洗浄した。水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を真空で除去して、油状物として1a、2aおよび3aが得られ、それぞれ、コード名BR280、BR278およびBR277とした。
【化５】
2008509994.tif 000007
【００４７】
テスト化合物の増殖抑制効果
【００４８】
正常ヒト上皮ケラチン生成細胞、および ケラチン生成細胞成長培地(Clonetics, USAのKGMR-2 Bulletkit; CC-3107)をGoeteborgs Termometerfabrik AB (Vaestra Froelunda, Sweden)より購入した。該細胞を標準的な方法に従い、5% CO2加湿空気中37℃で培養した。３代継代の細胞を実験に使用した。48-ウェルプレートを培養に使用した。各ウェルに約3000細胞を植種した。プロスタグランジンアナログの各濃度につき、2ウェルを使用した。培養完了後、該ウェルをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄した。その後、該細胞を、PBS中1%グルタルアルデヒドを用いて+4℃で15分間固定した。その後、ウェルを再びPBSで2回洗浄し、その後、0.1%クリスタルバイオレット溶液(500μl/ウェル)で処理した。その後、該ウェルを蒸留水で15秒間のリンスを3回し、残留物を十分に乾燥した。吸着した着色物を蒸留水中2.5%ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)500μlに3時間可溶化した。ウェル中の流体の吸光度を、マイクロタイターウェル分光光度計(Multiscan RC V1.3-0)を使用して595nmで測定した。前記試験を2点(2ウェル)につき行った。培養時間は7日間で、培養培地は3-4日後に入れ変えた。プロスタグランジンアナログを培養培地に直接溶解した。適当な培養の後、ウェル中のセル濃度を上述のクリスタルバイオレット法を用いて測定した。
【００４９】
試験結果は図1-4に示される。BR280 (17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2)のEC50値は10-5Mと3x10-6Mの間であり、PGA2よりさらに効果的であった。BR277はPGA2アナログ中、２番目に効果的であり、BR278は最も効果が低かった。濃度10-6Mおよびそれ以下では、該化合物の効果はなかった。PGA2および試験をしたいずれの該アナログも、試験した最高濃度であっても、完全な細胞死を引き起こすことはできなかった。最大効果は約95%であった。従って、BR280は、他の2オメガ鎖環置換PGA2アナログ、BR277およびBR278に比べ、著しく優れた増殖抑制効果を有し、PGA2よりもさらに有効であることが明らかになった。
【００５０】
17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2のアポトーシス効果
【００５１】
一連の実験で、プロアポトーシスBAX遺伝子の発現が、ヒトケラチン生成細胞の免疫細胞化学により説明された。基本的に前記のように培養した細胞を、トリプシン処理し、該溶液を遠心分離し、ペレットを再び懸濁し、カバースリップのついた顕微鏡スライドガラスに移した。免疫細胞化学を標準的な方法に従い行った。BAX (N-20)-親和性ウサギ精製ポリクローナル抗体を、Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California)より購入し、1:200に希釈して使用した。Dako (Carpinteria, California, USA)より入手したホースラディッシュペルオキシターゼ (Dako Envision+TM)に接合した２次ヤギ-抗ウサギ抗体を一次抗体の検出に使用した。適当にリンスし、調合液をホースラディッシュペルオキシターゼの発色性基質として2,2-ジアミノベンジジンとともに室温で10分間インキュベートした。内因性ペルオキシターゼを過酸化水素でクエンチした。また、 免疫細胞化学的方法に適当なコントロールも含めた。最終的に、調合液をカメラ装備のNikon FTX 蛍光顕微鏡で観察し、代表的な細胞のカラー写真を撮影した。
【００５２】
別の一連の実験では、上記のように培養したケラチン生成細胞の、BR280 (17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2)を含むか否かによる、アポトーシス/ネクローシスの検出のため、ヨウ化プロピジウム/Hoechst 33342 (ビスベンズイミド)をSigma Chemical Company (St. Louis, Missouri)より購入し、使用して生体染色を行った。ヨウ化プロピジウム (10 μg/ml)とHoechst 33342 (5 μg/ml)の混合液を培地に加えた。該培地中、細胞を37℃で10分間インキュベートした。該培地のフリー浮揚細胞を集菌し、一方、付着細胞をCa++/Mg++不含ハンクス溶液(Sigma Chemical Company)またはPBSで１回洗浄した。その後、 0.5%トリプシン/EDTA溶液(Ca++/Mg++不含ハンクス溶液、またはPBS) 1.5 mlを加え、37℃で5分間インキュベーションをした。その後該懸濁液を1分間(500g)遠心分離した。ペレットをPBS 0.5 mlに再懸濁し、該懸濁液を上述のように遠心分離した。その後ペレットをPBS 20μlに懸濁し、細胞を含む該懸濁液をカバースリップのついた顕微鏡スライドガラスに設置した。 該細胞をUV-2Aフィルタ−およびカメラ装着Nikon FTX 蛍光顕微鏡で観察した。代表的な細胞のカラー写真を撮影した。プロスタグランジンアナログ(BR280)は直接培地で薄めた。インキュベーション時間は、免疫細胞化学的実験(BAX)では2日、細胞生体染色を伴う実験では7日であった。長期の方の実験では、BR280含有培地をインキュベーション3-4日後に入れ替えた。
【００５３】
プロスタグランジン処理なしのコントロールケラチン生成細胞培養物では免疫染色は若干または全く無かったのに対し、様々な濃度のBR280処理されたヒトケラチン生成細胞ではBAX遺伝子発現(BAX-タンパク)が認められた。10-5Mより低い濃度では、効果は弱いまたは無かった。BR280処理を7日間したケラチン生成細胞に、アポトーシスに特有の細胞核の濃縮および断片化並びにアポトーシス小体が、生体染色によって顕著に示された。これらの実験から、17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2がin vitroでヒトケラチン生成細胞のアポトーシスの機構によって細胞死を誘発することが示唆された。
【００５４】
従って、17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2および機能的に同等の誘導体、並びにそのプロドラッグは、該治療に有効と考えられるケラチン生成細胞の増殖を阻害のみならずアポトーシスを誘発し、乾癬の治療および/または緩和のための有望な選択肢である。
【００５５】
優先権年内に実施した比較試験
【００５６】
副作用に関して17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2はPGA2より優れている。 
【００５７】
上述のように合成したPGA2および17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2を、モデルとしてヒト眼を使用した充血/炎症試験に適した賦形剤に処方した。検体の投与前、投与15、30、60および120分後に、眼表面の発赤をカラー写真で記録した。一方の眼にプロスタグランジンアナログを処理し、他方の眼に賦形剤のみを処理した。同一時点での眼球の炎症または痛みを記録した。濃度26μg/ml(約10-4 M)の2検体を、数日間おいて、3健常人の同一の眼で試験をした。約１週間後、再び、それぞれの化合物をより高濃度として、PGA284 μg/mlおよび17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA296 μg/ml (両濃度は約3x10-4Mに対応)について、同一人の同一の眼で数日間おいて試験した。使用した濃度は、乾癬の治療の薬剤はおおよそこの濃度域で使用されるので適切である。充血を、0(充血なし)から3(最大充血)、0.5毎のスケールで評価した。同様のスケール範囲で眼球の炎症または痛みを評価した。
【００５８】
本質的な薬理活性の固有の特性を示すのに、本発明者はエステルプロドラッグでないプロスタグランジンの酸を使用した。皮膚中、プロドラッグは対応する酸に加水分解され、その後、所望のおよび有害な両薬理活性を呈する。しかしながら、皮膚中の血流を直接測定することは難しい。それ故、本発明者は組織の充血および炎症の研究にするため、適当な一般モデルとして、眼を用いることを選択する。
【００５９】
結果は表2に示される。
【００６０】
表2
PGA2および17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2 (JB991酸)を処理した眼の、眼表面の充血および炎症または痛みの差。濃度26 μg/mlのPGA2およびJB991酸を３人の被験者の目に、期間をおいて局所投与した。約１週間後に、より高濃度(84 μg/ml) (17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2は、実際は96 μg/mlを投与して試験した)を投与して同一の方法を再び行った。いずれの被験者にも、JB991酸の投与後に充血または眼球炎症または痛みは無かった(平均±標準誤差; n=3).
【表２】
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【００６１】
結論として、17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2は、以下の理由により、乾癬の治療薬として新規で優れた特性を示した。:
1.  プロスタグランジンアナログはPGA2と比較して、ヒトケラチン生成細胞に対して優れた増殖抑制効果を有することが明らかとなった。
2.  PGA2とは対照的に、それは感受性充血/炎症モデルで試験したいずれの場合にも完全に副作用は無かった。
3.  試験したオメガ鎖環置換アナログのうち、それは非常に最も優れたヒトケラチン生成細胞増殖抑制効果を示した。
4.  17-フェニル-18,19,20-トリノル PGA2は、ヒトケラチン生成細胞に対し、乾癬皮膚プラークの皮膚肥厚を防ぐのに重要な機構である著しいアポトーシス効果を有することが明らかとなった。
【００６２】
本発明ではその望ましい態様に関して言及したが、それは本発明者が現在知りうる最良の態様を構成するものであり、当該技術分野の通常の技術を有する者に明らかなあらゆる変更および修正を行うことは、本明細書に添付の特許請求の範囲に説明する本発明の範囲内と理解される。 
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】分光光度分析における正常ヒト上皮ケラチン生成細胞へのPGA2の効果を示す。該化合物を次の濃度で加えた。: A1= 10-4M; A2= 3x10-5M; A3= 10-5M; A4= 3x10-6M; A5= 10-6M;およびA6= 10-7M.
【図２】図2は、BR277 (16-フェノキシ-(3-トリフルオロメチル)-17,18,19,20-テトラノル-PGA2 )の効果を示す。該化合物を次の濃度で加えた。: B1= 10-4M; B2= 3x10-5M; B3= 10-5M; B4= 3x10-6M; B5= 10-6M; およびB6= 10-7M.
【図３】図3は、BR278 (13,14-ジヒドロ-17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2 )の効果を示す。該化合物を次の濃度で加えた。: C1= 10-4M; C2= 3x10-5M; C3= 10-5M; C4= 3x10-6M; C5= 10-6M; およびC6= 10-7M.
【図４】図4は、BR280 (17-フェニル-18,19,20-トリノル-PGA2)の効果を示す。該化合物を次の濃度で加えた。: D1= 10-4M; D2= 3x10-5M; D3= 10-5M; およびD4= 3x10-6M; D5= 10-6M; D6= 10-7M
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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