(57)【要約】熱安定性ωアミノ基転移酵素、特に高い反応速度を有し、高濃度のドナーアミンに耐性である熱安定性ωアミノ基転移酵素を用いて、キラルアミンの混合物を鏡像異性的に濃縮するか、またはアミノ基が非末端のキラル置換された炭素原子に結合する一対のキラルアミンの1つを立体選択的に合成することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を有することによってSEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、単離された熱安定性ωアミノ基転移酵素：
(a)Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択される242位のアミノ酸置換；
(b)Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、およびGluからなる群より選択される245位のアミノ酸置換；
(c)Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、およびMetからなる群より選択される255位のアミノ酸置換；ならびに
(d)Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、およびGluからなる群より選択される268位のアミノ酸置換。
【請求項２】
242位のVal、245位のThr、255位のIle、および268位のSerを含む、請求項2記載の単離された熱安定性ωアミノ基転移酵素。
【請求項３】
以下からなる群より選択される、1つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項1記載の単離された熱安定性ωアミノ基転移酵素：
(a)Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、およびTrpからなる群より選択される46位のアミノ酸置換；
(b)Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、およびGluからなる群より選択される48位のアミノ酸置換；
(c)Gly、Ser、Thr、Cys、Asp、およびGluからなる群より選択される60位のアミノ酸置換；
(d)Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択される164位のアミノ酸置換；
(e)Gly、Ser、Thr、Cys、Asp、およびGluからなる群より選択される185位のアミノ酸置換；
(f)Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、およびGluからなる群より選択される186位のアミノ酸置換；
(g)Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択される195位のアミノ酸置換；
(h)Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、およびTrpからなる群より選択される197位のアミノ酸置換；
(i)Tyr、Gly、Ser、Thr、Asp、およびGluからなる群より選択される205位のアミノ酸置換；
(j)Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択される242位のアミノ酸置換；
(k)Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、およびGluからなる群より選択される245位のアミノ酸置換；
(1)Ala、Val、Leu、Pro、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択される252位のアミノ酸置換；
(m)Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、およびMetからなる群より選択される255位のアミノ酸置換；
(n)Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、およびGluからなる群より選択される268位のアミノ酸置換；
(0)Tyr、Gly、Ser、Thr、Cys、Asp、およびGluからなる群より選択される323位のアミノ酸置換；
(p)Lys、Arg、およびHisからなる群より選択される409位のアミノ酸置換；
(q)Glu、Asp、Arg、およびHisからなる群より選択される424位のアミノ酸置換；ならびに
(r)Ala、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択される436位のアミノ酸置換。
【請求項４】
以下からなる群より選択される一組の位置のアミノ酸置換をさらに含む、請求項2記載の単離された熱安定性ωアミノ基転移酵素であって：
(a)48、195、および197位；
(b)60、164、186、252、409、および436位；
(c)46位；
(d)185位；
(e)48、60、164、186、195、197、252、409、および436位；
(f)48、60、164、186、195、197、252、409、424、および436位；
(g)46、48、195、および197位；ならびに
(h)60、164、186、242、245、252、268、409、および426位；
ここで
(1)46位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、およびTrpからなる群より選択され；
(2)48位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、およびGluからなる群より選択され；
(3)60位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Asp、およびGluからなる群より選択され；
(4)164位のアミノ酸置換は、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択され；
(5)185位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Asp、およびGluからなる群より選択され；
(6)186位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、およびGluからなる群より選択され；
(7)195位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択され；
(8)197位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、およびTrpからなる群より選択され；
(9)252位のアミノ酸置換は、Ala、Val、Leu、Pro、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択され；
(10)409位のアミノ酸置換は、Lys、Arg、およびHisからなる群より選択され；
(11)424位のアミノ酸置換は、Glu、Asp、Arg、およびHisからなる群より選択され；ならびに
(12)436位のアミノ酸置換は、Ala、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択される、単離された熱安定性ωアミノ基転移酵素。
【請求項５】
60、164、186、242、245、252、268、409、および426位でそれぞれアミノ酸置換をさらに含む、請求項1記載の単離された熱安定性ωアミノ基転移酵素であって：
(a)60位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、およびGluからなる群より選択され；
(b)164位のアミノ酸置換は、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択され；
(c)186位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、およびGluからなる群より選択され；
(d)242位のアミノ酸置換は、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択され；
(e)245位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、およびGluからなる群より選択され；
(f)252位のアミノ酸置換は、Ala、Val、Leu、Pro、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択され；
(g)255位のアミノ酸置換は、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、およびMetからなる群より選択され；
(h)268位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、およびGluからなる群より選択され；
(i)409位のアミノ酸置換は、Lys、Arg、およびHisからなる群より選択され；ならびに
(j)436位のアミノ酸置換は、Ala、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択される、単離された熱安定性ωアミノ基転移酵素。
【請求項６】
46、48、195、197、および424位の1つまたは複数でアミノ酸置換をさらに含む、請求項5記載の単離された熱安定性ωアミノ基転移酵素であって：
(a)46位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、およびTrpからなる群より選択され；
(b)48位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、およびGluからなる群より選択され；
(c)195位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、およびMetからなる群より選択され；
(d)197位のアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、およびTrpからなる群より選択され；ならびに
(e)424位のアミノ酸置換は、Glu、Asp、Arg、およびHisからなる群より選択される、単離された熱安定性ωアミノ基転移酵素。
【請求項７】
SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、およびSEQ ID NO: 18からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された熱安定性ωアミノ基転移酵素。
【請求項８】
SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、およびSEQ ID NO: 18からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、またはSEQ ID NO: 17に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項8記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
発現構築物である、請求項8記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
混合物中の第二のキラルアミンの量が、第一のキラルアミンの量に対して少なくとも約90％であるように、第一のキラルアミンをケトンに変換するのに十分な時間、以下を接触させる段階を含む、2つの鏡像異性的キラルアミンの混合物の鏡像異性的濃縮のための方法：
(a)第一のキラルアミンと、第一のキラルアミンの鏡像異性体である第二のキラルアミンとを含む混合物；
(b)請求項1記載の熱安定性ωアミノ基転移酵素；ならびに
(c)アミノ受容体。
【請求項１２】
少なくとも混合物中の第二のキラルアミンの量が、第一のキラルアミンの量に対して少なくとも約99％であるまで、接触が維持される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
アミンの第二のキラル型の量より実質的により多くの量のアミンの第一のキラル型を形成するのに十分な時間、以下を接触させる段階を含む、アミンの2つのキラル型のうち1つの立体選択的合成のための方法：
(a)ケトン；
(b)請求項1記載の熱安定性ωアミノ基転移酵素；および
(c)アミンドナー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はωアミノ基転移酵素、ならびに鏡像異性的濃縮および立体選択的合成におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
本出願は、2004年12月10日に出願された同時係属中の仮出願第60/634,526号の優先権を主張し、かつ参照により組み入れるものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
単一鏡像体薬物のようなキラル分子を、生体内変換、キラルの触媒または試薬を用いる不斉合成、分解または分離技術などによって産生することができる。当技術分野において、キラル分子を調製する改良された効率的な方法に対して継続した必要がある。
【発明の開示】
【０００４】
発明の詳細な説明
アミノトランスアミナーゼとも呼ばれるアミノ基転移酵素は、ドナーアミンからアミン受容体分子へのアミノ基の転移を触媒する。オメガ-アミノ基転移酵素(ωアミノ基転移酵素)は、カルボキシル基から少なくとも1つのメチレン挿入によって分離されるアミン基を転移する。本発明は、熱安定性ωアミノ基転移酵素、特に高い反応速度を有し、高濃度のドナーアミンに耐性である熱安定性ωアミノ基転移酵素を提供する。本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素を用いて、キラルアミンの混合物を鏡像異性的に濃縮するか、またはアミノ基が非末端のキラル置換された炭素原子に結合する一対のキラルアミンの1つを立体選択的に合成することができる。本発明の方法は、キラル分子を産生するための費用効果が優れた特異的手段を提供する。
【０００５】
熱安定性ωアミノ基転移酵素
アルスロバクター・シトレウス(Arthrobacter citreus)由来の野生型ωアミノ基転移酵素のアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 2に示す。本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素は、SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列とはそれぞれ242、245、255、および268位で異なり、46、48、60、164、185、186、195、197、205、252、323、409、424、および436位で1つまたは複数のさらなるアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【０００６】
例えば、いくつかの熱安定性アミノ基転移酵素は、46位(例えばSEQ ID NO: 12、14、16、および18)または185位(例えばSEQ ID NO: 16および18)でさらなるアミノ酸置換を有する。48、195、および197(例えばSEQ ID NO: 8、10、12、14、16、および18)；46、48、195、および197位(例えばSEQ ID NO: 16および18)；60、164、186、252、409、および426位(例えばSEQ ID NO: 6、8、10、12、16、および18)；48、60、164、186、195、197、252、409、および436位(例えばSEQ ID NO: 8および12)；48、60、164、186、195、197、252、409、424、および436位(SEQ ID NO: 8、10、および12)；または46、48、60、164、185、186、195、197、409、424、および436位(例えばSEQ ID NO: 16および18)でさらなるアミノ酸置換を有するものもある。
【０００７】
本発明の特定の熱安定性ωアミノ基転移酵素は、SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列とはそれぞれ60、164、186、242、245、252、255、268、409、および436位で異なるアミノ酸配列を含み；これらのアミノ基転移酵素において、1つまたは複数の置換は、46、48、195、197、および424位でも起こり得る。
【０００８】
本発明の他の熱安定性ωアミノ基転移酵素は、SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列とはそれぞれ46、48、195、197、242、245、および255位で異なるアミノ酸配列を含み；これらのアミノ基転移酵素において、1つまたは複数の置換は、60、164、185、186、205、252、323、409、424、および436位でも起こり得る。
【０００９】
好ましい置換は表1に提供され、示される可能な置換の全ての可能な組み合わせを含む。最も好ましい置換は、太字体および下線で示される。
【００１０】
（表１）SEQ ID NO: 2に対する好ましいアミノ酸置換
2008522627.tif 000002
【００１１】
表1に記載される置換を有するωアミノ基転移酵素は、熱安定性である。「熱安定性」は、少なくとも40℃まで、好ましくは少なくとも50〜60℃まで(例えば少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、または60℃)、さらにより好ましくは少なくとも55〜63℃まで(例えば少なくとも55、56、57、58、59、60、61、62、または63℃)、酵素が活性であり(生成物の連続した形成によって示されるように、立体選択的合成または鏡像異性的濃縮のいずれかの反応が可能である)、かつ安定である(少なくとも10時間は活性である)ことを意味する。活性は、反応における時間の関数として生成物の形成をモニタリングすることにより測定する。典型的な立体選択的合成および鏡像異性的濃縮反応を、実施例1に記載する。
【００１２】
そのような熱安定性ωアミノ基転移酵素はまた、高濃度のアミンの存在下での野生型酵素(すなわち、それらは活性かつ安定性である)よりも、高いドナーアミン濃度に対してより耐性である。好ましい熱安定性ωアミノ基転移酵素は、＞500mMアミンの存在下で少なくとも10時間は活性かつ安定である。46、48、195、197、および424位で任意のさらなる置換を有するωアミノ基転移酵素はまた、野生型酵素より高い反応速度を有する。これらのより高い反応速度は典型的に、生成物の生成速度によって測定されるように、野生型酵素の反応速度より1.2〜3倍高い(実施例1を参照されたい)。
【００１３】
いくつかの熱安定性ωアミノ基転移酵素のアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 6(「Chir9867」)、8(「CNB03-01」)、10(「CNB03-02」)、12(「CNB03-03」)、14(「CNB04-01」)、16(「CNB05-01」)、および18(「CNB05-02」)、ならびに下記表2に示す。表2において、野生型配列に対するアミノ酸置換を、太字体で示す。本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素は、SEQ ID NO: 4に示され、かつSEQ ID NO: 3に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有さず；SEQ ID NO: 4は高いドナーアミン濃度に耐性であるが、熱安定性ではないωアミノ基転移酵素のアミノ酸配列である。
【００１４】
（表２）熱安定性ωアミノ基転移酵素におけるアミノ酸置換
2008522627.tif 000003
【００１５】
熱安定性ωアミノ基転移酵素の調製
本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素は、当技術分野において公知の任意の適切な手段によって(例えば、宿主細胞内での組換えによって、または化学合成によって)生成することができる。好ましくは、酵素は、組換え大腸菌(E. coli)による高い細胞密度発酵を用いて生成される。
【００１６】
熱安定性ωアミノ基転移酵素の組換え産生
核酸分子
配列表は、本発明の好ましい熱安定性ωアミノ基転移酵素に対するコード配列を提供する(SEQ ID NO: 5、7、9、11、13、15、および17は、それぞれSEQ ID NO: 6、8、10、12、14、16、および18をコードする)。特定の熱安定性ωアミノ基転移酵素をコードする任意のヌクレオチド配列は、しかしながら、その酵素を組換えによって生成するために用いることができる。例えば、熱安定性ωアミノ基転移酵素をコードする配列は、当技術分野で周知の化学法を用いて、全体的にあるいは部分的に合成することができる(Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Horn et al. Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980を参照されたい)。または、SEQ ID NO: 2の野生型ωアミノ基転移酵素をコードする核酸分子(例えばSEQ ID NO: 1)は、本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素をコードするように改変することができる。必要に応じて、そのような分子は、標準核酸精製技術を用いてアルスロバクター・シトレウス細菌から単離することができ、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような増幅技術または自動合成装置を用いて合成することができる。核酸を単離する方法は、ルーチン的であり、当技術分野において公知である。核酸分子を得るための任意のそのような技術は、野生型ωアミノ基転移酵素をコードする核酸分子を得るために用いることができる。
【００１７】
本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素をコードするcDNA分子は、標準分子生物学技術により鋳型としてmRNAを用いて作製することができる。その後cDNA分子は、当技術分野で周知の分子生物学技術を用いて複製することができる。PCRのような増幅技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドのさらなるコピーを得ることができる。
【００１８】
必要に応じて、本明細書に開示されるヌクレオチド配列は、当技術分野において一般に公知の方法を用いて、様々な理由に対して本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素に対するコード配列を変更するように操作することができ、ポリペプチドもしくはmRNA産物のクローニング、プロセッシング、および/または発現を変更する改変を含むがそれらに制限されない。精製タグ配列の付加またはコドン最適化のような配列改変を用いて、発現を促進することができる。これらの方法は、当技術分野で周知であり、かつ例えばPCT/US04/024868においてさらに記載される。
【００１９】
発現ベクター
本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素をコードする核酸分子は、挿入されたコード配列の転写および翻訳に対して必要な要素を含む発現ベクターに挿入することができる。当業者に周知の方法を用いて、本発明の酵素をコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御要素を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、合成技術と同様に、インビトロ組換えDNA技術を含む。
【００２０】
宿主細胞
宿主細胞は、原核または真核であり得る。有用な宿主細胞には、アルスロバクター・シトレウス自体、大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、チフス菌(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)、マイコバクテリア(Mycobacteria)(例えばM.ツベルクローシス(M. tuberculosis))、酵母などが含まれる。宿主細胞の多くのタイプは、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC；10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)から入手可能であり、かつ外来タンパク質の正確な改変およびプロセッシングを確実にするよう選択することができる。例えば、WO 01/98340を参照されたい。
【００２１】
発現構築物は、確立した技術を用いて宿主細胞に導入することができる。そのような技術は、トランスフェリン-ポリカチオンによるDNA転移、裸のまたは封入された核酸によるトランスフェクション、リポソームによる細胞融合、DNA被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」、およびDEAEまたはリン酸カルシウムによるトランスフェクションを含むが、これらに限定されない。
【００２２】
発現ベクターによって形質転換された宿主細胞は、酵素の発現および細胞培養物からの酵素の回収に適した条件下で、培養することができる。形質転換細胞によって生成される酵素は、用いられるヌクレオチド配列および/もしくは発現ベクターに応じて、分泌されるかまたは細胞内に含まれ得る。
【００２３】
熱安定性ωアミノ基転移酵素の精製
組換えにより産生された熱安定性ωアミノ基転移酵素は、酵素を産生するように操作された宿主細胞から単離することができる。精製された熱安定性ωアミノ基転移酵素は、タンパク質、炭水化物、または脂質のような細胞内の他の成分から、当技術分野において周知の方法を用いて分離される。そのような方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および分離用ゲル電気泳動を含むが、これらに限定されない。精製された熱安定性ωアミノ基転移酵素の調製物は、少なくとも80％の純度；好ましくは、調製物は90％、95％、または99％の純度である。調製物の純度は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動のような当技術分野において公知の任意の手段によって評価することができる。
【００２４】
熱安定性ωアミノ基転移酵素の化学合成
本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素は、例えば固相法を用いて合成することができる。例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-54, 1963; Roberge et al., Science 269, 202-04, 1995を参照されたい。タンパク質合成は、マニュアル技術を用いてまたは自動操作によって実施することができる。自動化された合成は、例えばApplied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)を用いて達成することができる。任意で、熱安定性ωトランスフェラーゼの断片は、別々に合成され、化学的方法を用いて全長分子を産生するよう組み合わせることができる。
【００２５】
キラル分子を調製する方法
本発明は、鏡像異性的にキラルアミンの混合物を濃縮すること、または立体選択的に一対のキラルアミンの1つを合成することのいずれかによって、熱安定性ωアミノ基転移酵素を用いてキラル分子を調製する方法を提供する。
【００２６】
ωアミノ基転移酵素が関与する酵素の平衡反応を以下に図示する：
2008522627.tif 000004
式中、R1およびR2はそれぞれ、独立している場合、非置換もしくは酵素によって阻害されない1つもしくは複数の基で置換されたアルキルまたはアリール基であり、かつR1は構造もしくはキラリティにおいてR2とは異なるか、またはR1およびR2は共にキラリティの中心を含む4つ以上の炭素原子の炭化水素鎖である。
【００２７】
アミノ受容体
「アミノ受容体」は、ドナーアミン由来のアミノ基を受容するカルボニル化合物である。アミノ受容体は、ケトカルボン酸およびアルカノンを含む。典型的なケトカルボン酸は、グリオキサル酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸などのようなα-ケトカルボン酸、およびこれらの酸の塩類である。アミノ受容体はまた、他の酵素または全細胞過程によってアミノ受容体に変換される物質、例えばフマル酸(オキサロ酢酸に変換され得る)、グルコース(ピルバートに変換され得る)、ラクタート、マレイン酸などを含む。
【００２８】
アミノドナー
「アミノドナー」はアミノ受容体にアミノ基を提供し、それによってカルボニル種になるアミノ化合物である。典型的なアミノドナーは、L-アラニンまたはL-アスパラギン酸のようなS-構造を有する非キラルアミノ酸グリシンおよびキラルアミノ酸を含む；しかしながら、アミノドナーはアミノ酸である必要はない。例えばS-2-アミノブタン、プロピルアミン、ベンジルアミンなどのようなアミンもまた、アミノドナーとして用いることができる。
【００２９】
キラルアミン
キラルアミンは以下の式を有し：
2008522627.tif 000005
式中、R1およびR2はそれぞれ上記で定義した通りである。R1が構造またはキラリティにおいてR2とは異なるため、式IAおよびIBの化合物は鏡像体(または、R1もしくはR2のいずれかが第二のキラル中心を含む場合はジアステレオマー)であり、かつキラルである。
【００３０】
式IAおよびIBのキラルアミンにおいて、アミノ基は第一級アミンであり、かつ第二級炭素原子、すなわち1つの水素原子および水素以外の2つの置換基(R1およびR2)を有する炭素原子に結合する。さらに、R1およびR2が同じタイプの構造より選択される場合、これらの基は分子キラルを与えなければならない；例えばR1は構造もしくはキラリティにおいてR2とは異なるか、またはR1およびR2は共にキラル基である。一般に、独立している場合、R1およびR2は、アルキル、アラルキル、またはアリール基であり、好ましくは1〜6個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基、7〜12個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝状のフェニルアルキル基、またはフェニルもしくはナフチル基である。例には、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、i-ブチル、s-ブチル、フェニル、ベンジル、フェネチル、2-フェニルプロピルなどが含まれる。
【００３１】
R1およびR2基はそれぞれ、それらの基がωアミノ基転移酵素の作用に有意に影響を及ぼさないかまたは競合しない条件で、1つまたは複数の基によって任意で置換することができる。これは、簡単な阻害アッセイ法により容易に決定することができる。阻害が検出される場合、その反応物のより低い濃度で反応を実行することによって、多くの場合阻害は最小化することができる。典型的な置換基は、限定されはないが、クロロ、フルオロ、ブロモ、およびヨードのようなハロ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、シクロアルキル、カルバモイル、モノ-およびジ-(低級アルキル)置換カルバモイル、トリフルオロメチル、フェニル、ニトロ、アミノ、モノ-およびジ-(低級アルキル)置換アミノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルカルボキサミド、アリールカルボキサミドなどを含む。R1およびR2を合わせた場合、典型的な基は、2-メチルブタン-1,4-ジイル、ペンタン-1,4-ジイル、ヘキサン-1,4-ジイル、ヘキサン-1,5-ジイル、および2-メチルペンタン-1,5-ジイルである。
【００３２】
存在するプロセスが適している典型的なアミンは、限定されないが、2-アミノブタン、2-アミノ-1ブタノール、1-アミノ-1-フェニルエタン、1-アミノ-1-(2-メトキシ-5-フルオロフェニル)エタン、1-アミノ-1-フェニルプロパン、1-アミノ-1-(4ヒドロキシフェニル)プロパン、1-アミノ-1-(4-ブロモフェニル)プロパン、1-アミノ-1-(4-ニトロフェニル)プロパン、1-フェニル-2-アミノプロパン、1-(3-トリフルオロメチルフェニル)-2-アミノプロパン、2-アミノプロパノール、1-アミノ-1-フェニルブタン、1-フェニル-2-アミノブタン、1-(2,5-ジ-メトキシ-4-メチルフェニル)-2-アミノブタン、1-フェニル-3-アミノブタン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-アミノブタン、1-アミノ-2-メチルシクロペンタン、1-アミノ-3-メチルシクロペンタン、1-アミノ-2-メチルシクロヘキサン、1-アミノ-1-(2-ナフチル)エタン、3-メチルシクロペンチルアミン、2-メチルシクロペンチルアミン、2-エチルシクロペンチルアミン、2-メチルシクロヘキシルアミン、および3-メチルシクロヘキシルアミン、1-アミノテトラリン、2-アミノテトラリン、2-アミノ-5-メトキシテトラリン、および1-アミノインダンを含む。
【００３３】
熱安定性ωアミノ基転移酵素
上記の熱安定性ωアミノ基転移酵素のいずれかを用いて、キラル化合物を生成することができる。熱安定性ωアミノ基転移酵素は、遊離型で(例えば精製された酵素として、または無細胞抽出物中で)用いられる。酵素は、架橋デキストランもしくはアガロース、シリカ、ポリアミドもしくはセルロースなどの適した支持体またはマトリックスに、任意で固定することができる。酵素はまた、ポリアクリルアミド、アルギン酸、繊維などに封入することができる。そのような固定のための方法は、文献(例えば、Methods in Enzymology 44, 1976を参照されたい)に記載される。後者の態様は、例えば、一旦固定化酵素が調製されれば、当業者は単に、望ましい濃縮をもたらし、次いで形成されたケトンを除去するために、固定化酵素にアミノ受容体およびキラルアミンの混合物を与えることができるため、特に有用である。米国特許第4,950,606号；5,300,437号；および5,346,828号を参照されたい。
【００３４】
キラルアミンの鏡像異性的濃縮
いくつかの態様において、本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素は、キラルアミンの混合物の鏡像異性的濃縮のための方法に用いられる。「鏡像異性的濃縮」とは、他と比較した場合の、1つのキラル型の量の増加である。この濃縮には、(i)他と比較した場合の、1つのキラル型の量の減少、(ii)他と比較した場合の、1つのキラル型の量の増加、または(iii)1つのキラル型の量の減少、および他のキラル型の量の増加が含まれ得る。鏡像異性的濃縮は、以下の式に従って、典型的に「鏡像体過剰率」または「ee」として表される：
2008522627.tif 000006
式中、E1はアミンの第一のキラル型の量、およびE2は同じアミンの第二のキラル型の量である。例えば、2つのキラル型の最初の比率が50:50であり、かつ50:30の最終比率を生成するのに十分な鏡像異性的濃縮が達成される場合、第一のキラル型に関するeeは25％であるが、最終比率が70:30である場合、第一のキラル型に関するeeは40％である。典型的に本発明の方法に関して、90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99％またはそれ以上のeeが達成され得る。鏡像異性的濃縮は、当技術分野において公知の任意の手段によって測定することができる。例えば、与えられた生成物のeeは、(-)α-(トリ-フルオロメチルフェニル)メトキシアセチルクロライドとの反応(Gal, J. Pharm. Sci. 66, 169, 1977; Mosher et al., J. Org. Chem. 34, 25430, 1969)、およびその後のChrompack溶融シリカカラム上の誘導体化された生成物のキャピラリーガスクロマトグラフィーによって測定することができる。
【００３５】
概して、鏡像異性的濃縮の方法は、アミノ受容体の存在下で、本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素の作用にキラルアミンの混合物を供する段階を含む。
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式中、R1およびR2は上記で定義した通りであり、式IIIにおいて、R4がR2である場合R3はR1であるか、R4がR1である場合R3はR2であるかのいずれかである。
【００３６】
一般に、酵素による過程は、1つのキラル型のみに機能するか、または他のものよりはるかに大きな程度1つのキラル型に機能する。反応が平衡であるので、さらなる出発物質の添加または反応生成物の除去によって、正反応または逆反応のいずれかが支持され得る。したがって、鏡像異性的濃縮反応において、さらなる量のアミノ受容体を添加することができ(飽和状態まで)、および/または形成されるケトンを反応混合物から連続的に除去することができる。逆に、下記のように当業者が立体選択的にアミンの1つのキラル型を合成する場合、さらなるケトンを添加することができ(飽和状態まで)、および/または形成されるアミンを除去することができる。
【００３７】
アミンの望ましくないキラル型はケトンに変換され、望ましいキラル型は変換されない場合、後者は従来の技術によって容易に単離することができる。部分的な分離は、酸性化、ケトンを除去するためのヘプタンのような炭化水素による抽出、水相を塩基性にする段階、およびヘプタンのような炭化水素による再抽出によって遂行される。一方で、アミンのキラル型の両方が望ましい場合、ケトンに変換される型は、反応混合物から(または二相混合物においては水相から)除去することができ、アミノドナーの存在下でωアミノ基転移酵素の作用に独立に供することで、ケトンに最初に変換された同じキラル型を生成することができる。
【００３８】
キラル型の立体選択的合成
本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素は、すなわち式IAまたはIBのアミンの1つのキラル型を実質的に他のものより多くの量において優先的に合成する、立体選択的合成の方法にもまた用いることができる。これらの方法は典型的に、式中のR1およびR2が上記で定義した通りである下記式のケトンを、アミノドナーの存在下で、相当量のキラルアミンの1つが形成されるまで、本発明の熱安定性ωアミノ基転移酵素に供する段階を含む。
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本明細書において用いられる「実質的により大きい」は、少なくとも約51％の両方のキラル型の合わせた量の割合を指す(例えば、少なくとも51、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％)。
【００３９】
本開示に引用された全ての特許、特許出願、および参考文献は、参照により明確に本明細書に組み入れられる。上記の開示は、本発明を概説するものである。以下の具体的な実施例の参照によってより完全な理解を得ることができるが、これらは説明の目的のみに提供されるものであって、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００４０】
実施例1
立体選択的合成および鏡像異性的濃縮反応
立体選択的合成反応において熱安定性ωアミノ基転移酵素の活性を評価するために、108.8 gのリン酸カリウムを反応器内の水に添加する。1 Lの濃HClを添加し、次いでイソプロピルアミンを添加する。pHを7〜7.4に調整し、容量は8 Lに調整する(すなわち100 mMリン酸カリウムおよび1.0 Mのイソプロピルアミン)。ピリドキサール-5-フォスフェートを最終濃度2 mMまで添加し、次いで1〜5 gの噴霧乾燥粗製熱安定性ωアミノ基転移酵素を添加する。好ましくは、酸素がないかまたはほとんどない状態で反応させるため、窒素流は酸素の反応混合物をパージし始める。酵素を、窒素雰囲気下7〜7.2に調整されたpHで1時間混合し、反応は、ケトン7-メトキシ-2-テトラロンを最終濃度100 mMまで添加することによって開始する。試料は規則的な間隔で採取される。安定性および活性は、少なくとも10時間アミン生成物の形成をモニターすることにより測定される。図1は、酵素CNB03-03を用いた合成反応の典型的な進行を示す。
【００４１】
鏡像異性的濃縮反応において熱安定性ωアミノ基転移酵素の活性を評価するために、ラセミのメチルベンジルアミンはアミンドナーとして用いられ、ピルビン酸ナトリウムはアミン受容体として用いられる；残りの成分は同様である。
【００４２】
実施例2
熱安定性アミノ基転移酵素の同定
「CHIR-9867」(SEQ ID NO:6)は変異熱安定性アミノ基転移酵素である。CHIR-9867の変異体を、エラープローンPCR(Leung et al., J. Methods Cell. Mol. Biol. 1, 11-15, 1989)を用いて生成し、S-7-メトキシ-2-アミノテトラリン(S7MAT)の合成のため、プレートスクリーン上でCHIR-9867と比較した60〜68℃におけるそれらの活性についてスクリーニングを行った。プレートスクリーニングは、アミンが、酸素の存在下で有色になるケトンに変換される反応に変異体を供することによって実施される。色が生じる速度は、酵素の活性の指標として用いられる。
【００４３】
38の潜在的な候補は、第一のプレートスクリーンから同定された。全ての同定された変異体はプレート上でさらにスクリーニングされ、13の変異体が潜在的な改良された変異体として同定された。これらの38の変異体は、野生型酵素より良好な速度を有するように見えた。これらの13の変異体は、3 mLスケール(反応容量は3 mLであった)、約65℃でスクリーニングされた。3つの最良の変異体が同定され、CNB03-01、CNB03-02、CNB03-03と名付けられた。これら3つの同定された変異体は、最良の反応速度を有する変異体を選択するために、窒素雰囲気下40 mLスケールで、異なる温度および酵素濃度でさらにスクリーニングされた。CHIR-9867の反応速度は、対照として用いられた。40 mLスケールのスクリーニングから得られた結果を表3に示す。
【００４４】
（表３）
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【００４５】
全ての変異体は高い選択性を示し、アミンはee＞99％で合成された。キラルの純度は、キラルのカラムによりHPLCを用いて測定された。
【００４６】
CNB 03-01、CNB 03-02、およびCNB 03-03を配列決定した。それらのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO: 8、10、および12に示される。予想通り、これらの変異アミノ基転移酵素は全て、それらが生成されたCHIR-9867(SEQ ID NO: 6)のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列が変化していた。CNB 03-01、CNB 03-02、CNB 03-03、およびCHIR-9867間のアミノ酸配列の変化を表2に示す。
【００４７】
実施例3
化学的分析およびキラル分析に用いられるHPLC分析法の概要
化学的分析のためのHPLC法
カラム：Waters, Nova-Pak Phenyl RCM 0.8 cm×10 cm×4μm
移動相：0.15％ H3PO4および10 mMオクタンスルホン酸ナトリウムを含む25/75(v/v-予混合)イソプロパノール/水
流速：1.5 ml/分
注入容量：10μL 
温度：周囲温度
ランタイム：20分 
検出：254 nmのUV
典型的な保持時間：ケトン、9〜10分；アミン13〜14分
キラル分析のためのHPLC法
カラム：Diacel Crownpak CR (+) 15 cm×0.40 cm×5μm
移動相：水中15/85(v/v-予混合)メタノール/1％HClO4
流速：1.25 ml/分
注入容量：15μL
温度：40℃
ランタイム：50分
検出：220 nmのUV
典型的な保持時間：R-アミン、20〜21分；S-アミン24〜25分 
【００４８】
実施例4
拡大された熱安定性を有する新規酵素であるCNB04-01の生成
「CNB03-03」(SEQ ID NO: 10)は、変異熱安定性アミノ基転移酵素である。CNB03-03の変異体を、エラープローンPCR(Leung et al., J. Methods Cell. Mol. Biol. 1, 11-15, 1989)を用いて生成し、S-7-メトキシ-2-アミノテトラリン(S7MAT)の合成のため、プレートスクリーン上でCNB03-03と比較した60〜68℃における24時間より後のそれらの活性についてスクリーニングを行った。プレートスクリーニングは、アミンが、酸素の存在下で有色になるケトンに変換される反応に変異体を供することによって実施された。色が生じる速度は、酵素の活性の指標として用いられた。
【００４９】
CNB04-01の熱安定性は、次のように試験された：酵素は、100 mM塩化カルシウム、100 mM酢酸ナトリウム、1 mMピリドキサール-5-フォスフェートの溶液中にpH 8.5で、50℃に保たれた(0.1 gの酵素を溶液10 ml中に溶解した)。定期的に、1 mlの試料を回収し、pH 8.5の反応混合物20 mlに添加し、50℃でインキューベートした。(S)-アミノ基転移酵素活性の変化を時間の関数として測定した。結果は、酵素の活性が、〜36 mM/時間の時間ゼロでの初速度および150時間後の〜25 mM/時間の初速度で、150時間にわたり比較的安定であることを示した。
【００５０】
実施例5
CNB05-01(SEQ ID NO: 16)およびCNB05-02(SEQ ID NO: 18)の活性の初速度
熱安定性アミノ基転移酵素CNB05-01(SEQ ID NO: 16)およびCNB05-02(SEQ ID NO: 18)の活性の初速度を、以下の反応条件下で試験した：V＝50 ml[2 mM PLP、0.5 IPA、200 mM酢酸ナトリウム]、酵素：5 g/l；(pH)0＝7、ケトン＝130 mM、55℃。
【００５１】
結果を図2に示す。図2から、CNB05-01およびCNB05-02の初速度がCNB03-03より大きいことは明らかである。CNB05-01の初速度は、試験した全ての酵素より良好であり、試験した条件下で0.39 mM/分であった(CNB03-03は0.21 mM/分の初速度を有した)。
【００５２】
実施例6
CNBO5-01(SEQ ID NO: 16)およびCNB03-03(SEQ ID NO: 12)の酵素活性の比較
熱安定性アミノ基転移酵素CNB05-01(SEQ ID NO: 16)およびCNB03-03(SEQ ID NO: 12)の酵素活性は、以下の条件下で試験した：55℃、pH 7(0〜5時間)、100 ml/分 N2、0.75 M IPA、2 mM PLP、200 mM酢酸ナトリウム、2 mlケトン(130 mM)、V＝100 ml、窒素流表面100 ml/分。
【００５３】
結果を図3Aおよび3Bに示す。図3Aは、0.41 mM/分のCNB05-01および0.25 mM/分のCNB03-03の初速度を伴う本実施例で記載される結果の再現性を示す。図3Bは、より高い初速度を有することによって、より短い期間でより高い変換を達成しているCNB05-01による反応の過程で得られる結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】立体選択的合成に対して5g/Lおよび2.5g/Lの酵素CNB03-03(SEQ ID NO: 12)を58〜60℃で用いた、生成物アミンの形成に従う典型的な反応曲線を示す。
【図２】変異CNB05-01(SEQ ID NO: 16)およびCNB05-02(SEQ ID NO: 18)の活性の初速度を示すグラフである。
【図３】図3Aおよび3Bは、CNB05-01(SEQ ID NO: 16)およびCNBO3-O3(SEQ ID NO: 12)の相対的な酵素活性を示すグラフである。図3A；初速度の値。図3B；経時的な速度。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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