(57)【要約】  内皮細胞のＶＥＧＦ媒介性活性化または増殖を阻害する抗血管新生ペプチドが開示される。かかるペプチドを用いて、ＶＥＧＦＲ２受容体（キナーゼドメイン受容体またはＫＤＲとしても知られる）へのＶＥＧＦの結合を阻害し得る。かかるペプチドを用いて、癌、炎症性疾患、眼疾患および皮膚障害等の血管新生関連疾患における、内皮細胞のＶＥＧＦ媒介性活性化も阻害し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＬＰＰＨＳＳまたはその保存的置換を含む、抗血管新生ペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列ＳＬＰＰＨＳＳまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列ＬＰＰＨＳＳＱまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列ＳＬＰＰＨＳＳＱまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列ＴＳＬＰＰＨＳＳまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列ＬＰＰＨＳＳＱＳまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列ＴＳＬＰＰＨＳＳＱまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列ＳＬＰＰＨＳＳＱＳまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列ＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１３】
アミノ酸配列ＬＰＰＨＳＳＱＳＰまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
アミノ酸配列ＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列ＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１６】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰまたはその保存的置換を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１７】
アミノ酸配列ＳＬＰＰＨＳＳＱを含む、単離されたペプチド。
【請求項１８】
アミノ酸配列ＴＳＬＰＰＨＳＳを含む、単離されたペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列ＬＰＰＨＳＳＱＳを含む、単離されたペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸配列ＴＳＬＰＰＨＳＳＱを含む、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸配列ＳＬＰＰＨＳＳＱＳを含む、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２２】
アミノ酸配列ＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳを含む、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳを含む、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２４】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱを含む、請求項２３に記載のペプチド。
【請求項２５】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳを含む、請求項２４に記載のペプチド。
【請求項２６】
アミノ酸配列ＬＰＰＨＳＳＱＳＰを含む、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２７】
アミノ酸配列ＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰを含む、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２８】
アミノ酸配列ＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰを含む、請求項２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰを含む、請求項２８に記載のペプチド。
【請求項３０】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＬＱＴを含む、請求項２３に記載のペプチド。
【請求項３１】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰＬを含む、請求項２９に記載のペプチド。
【請求項３２】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰＲＡＬを含む、請求項２９に記載のペプチド。
【請求項３３】
アミノ酸配列ＳＬＰＰＲＡＬＱを含む、単離されたペプチド。
【請求項３４】
アミノ酸配列ＴＳＬＰＰＲＡＬを含む、単離されたペプチド。
【請求項３５】
アミノ酸配列ＬＰＰＲＡＬＱＳを含む、単離されたペプチド。
【請求項３６】
アミノ酸配列ＴＳＬＰＰＲＡＬＱを含む、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３７】
アミノ酸配列ＳＬＰＰＲＡＬＱＳを含む、請求項３２に記載のペプチド。
【請求項３８】
アミノ酸配列ＴＳＬＰＰＲＡＬＱＳを含む、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３９】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＲＡＬを含む、請求項３１に記載のペプチド。
【請求項４０】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＲＡＬＱを含む、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項４１】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＲＡＬＱＳを含む、請求項３７に記載のペプチド。
【請求項４２】
アミノ酸配列ＬＰＰＲＡＬＱＳＰを含む、請求項３２に記載のペプチド。
【請求項４３】
アミノ酸配列ＳＬＰＰＲＡＬＱＳＰを含む、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４４】
アミノ酸配列ＴＳＬＰＰＲＡＬＱＳＰを含む、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４５】
アミノ酸配列ＡＴＳＬＰＰＲＡＬＱＳＰを含む、請求項４１に記載のペプチド。
【請求項４６】
アミノ酸配列ＷＬＰＰＨＳＳを含む、単離されたペプチド。
【請求項４７】
アミノ酸配列ＡＴＷＬＰＰＨＳＳＱＳＰを含む、請求項４３に記載のペプチド。
【請求項４８】
アミノ酸配列ＷＬＰＰＲＡＬを含む、単離されたペプチド。
【請求項４９】
アミノ酸配列ＡＴＷＬＰＰＲＡＬＱＳＰを含む、請求項４５に記載のペプチド。
【請求項５０】
前記ペプチドが、Ｌ−アミノ酸を含む、請求項１〜４９いずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５１】
前記ペプチドが、Ｄ−アミノ酸を含む、請求項１〜４９いずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５２】
１つ以上のペプチド結合が減少した、請求項１〜４９いずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５３】
請求項５１に記載のペプチドの逆転したアミノ酸配列を含む、レトロインベルソペプチド。
【請求項５４】
アミノ酸配列ＰＳＱＳＳＨＰＰＬＳＴＡを含む、単離されたペプチド。
【請求項５５】
前記ペプチドが、アセチル化アミノ末端を含む、請求項１〜４９および５４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５６】
前記ペプチドが、アミド化したカルボキシ末端を含む、請求項１〜４９および５４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５７】
前記ペプチドが、血清中安定性を促進する部分に結合した、請求項１〜４９および５４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５８】
前記部分が、アルブミン、免疫グロブリンおよびその断片、トランスフェリン、リポタンパク質、リポソーム、α−２−マクログロブリンおよびα−１−糖タンパク質、ポリエチレングリコールおよびデキストランからなる群より選択される、請求項５７に記載のペプチド。
【請求項５９】
請求項１〜４９および５４のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項６０】
薬学的に許容され得る担体をさらに含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記担体がリポソーム形成脂質である、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記組成物がリポソーム送達ビヒクル中で投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ペプチドの放出制御を可能にするポリマー担体をさらに含み、前記ポリマー担体が放出制御ナノ粒子および微粒子からなる群より選択される、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６４】
前記微粒子がマイクロビーズまたは生分解性ミクロスフェアである、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記生分解性ミクロスフェアがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）共重合体を含む、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記組成物が、エアロゾル送達用に製剤化された、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６７】
前記組成物が、経鼻スプレーとして製剤化された、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６８】
前記組成物が、経口投与用に製剤化された、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６９】
前記組成物が、錠剤、丸剤またはカプセルとして製剤化された、請求項６０に記載の組成物。
【請求項７０】
前記組成物が、持続性薬剤または座薬として製剤化された、請求項６０に記載の組成物。
【請求項７１】
さらに、１つ以上のさらなる抗血管新生化合物または抗癌化合物を含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項７２】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）媒介性血管新生を減少させる方法であって、
キナーゼドメイン受容体（ＫＤＲ）を発現する細胞を、ＶＥＧＦ媒介性血管新生が減少するように請求項１〜４９および５４のいずれか一項に記載のペプチドに接触させる工程を含む、方法。
【請求項７３】
ＫＤＲまたはＫＤＲペプチドへのＶＥＧＦの結合をブロックする方法であって、
前記ＫＤＲまたは前記ＫＤＲペプチドを、ＶＥＧＦの結合がブロックされるように請求項１〜４９および５４のいずれか一項に記載のペプチドに接触させる工程を含む、方法。
【請求項７４】
前記ＫＤＲまたはＫＤＲペプチドが細胞の表面に発現されている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞が、原核細胞および真核細胞の群より選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞が、癌と診断された被験体中にある、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＫＤＲまたはＫＤＲペプチドが表面に提示される、請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＫＤＲまたはＫＤＲペプチドが表面上のペプチドアレイに提示される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８１】
癌と診断された患者を、治療有効量の、請求項１〜４９および５４のいずれか一項に記載のペプチドで治療する方法であって、前記癌の拡散が減少または阻害されるように前記ペプチドを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項８２】
前記癌が、腎臓、結腸、卵巣、前立腺、膵臓、肺、脳、胸部および皮膚からなる群より選択される固形腫瘍である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
血管新生関連眼疾患と診断された患者を、治療有効量の、請求項１〜４９および５４のいずれか一項に記載のペプチドで治療する方法であって、前記眼疾患が減少または阻害されるように前記ペプチドを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項８４】
前記眼疾患が、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、網膜血管閉塞、黄斑変性、および角膜損傷または移植に関連する新血管形成からなる群より選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
血管新生関連疾患と診断された患者を、治療有効量の、請求項１〜４９および５４のいずれか一項に記載のペプチドで治療する方法であって、前記血管新生関連疾患が減少または阻害されるように前記ペプチドを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項８６】
前記血管新生関連疾患が、血管腫、関節リウマチ、アテローム硬化症、突発性肺線維症、血管再狭窄、動静脈奇形、髄膜腫、血管新生緑内障、乾癬、血管線維症、血友病関節、過形成瘢痕、オースラー−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管癒着病変、滑膜炎、皮膚炎、子宮内膜症、翼状片、創傷、びらんおよび潰瘍（皮膚、胃および十二指腸）からなる群より選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＫＤＲがＶＥＧＦ存在下で前記ペプチドに接触させられる、請求項７３に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＫＤＲが、ＶＥＧＦに暴露される前に前記ペプチドに接触させられる、請求項７３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本願は、血管新生関連疾患の治療および特徴付けのための治療用ペプチド、特に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が、その受容体であるキナーゼドメイン受容体またはキナーゼインサートドメイン含有受容体（ＫＤＲ）としても知られるＶＥＧＦＲ２に結合することをブロックする抗血管新生ペプチドの、同定および設計に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血管新生は、既存の血管から発生することによって新しい血管が形成される過程である。この多段階過程は内皮細胞へのシグナル伝達を伴い、結果として（１）起源となる血管の膜の溶解、（２）内皮細胞の遊走および増殖、ならびに（３）遊走細胞による新しい血管の形成を生じる（アルバーツ（Ａｌｂｅｒｔｓ）ら、１９９４年、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）のガーランド・パブリッシング・インク（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，）、１２９４頁）。この過程は、創傷治癒および心筋梗塞修復等の有益な生理学的事象において身体に利用されているが、腫瘍細胞等の望まれない細胞によっても利用され、アテローム硬化症、皮膚炎、乾癬および関節リウマチ等の炎症状態、ならびに糖尿病性網膜症および黄斑変性等の眼疾患等の望ましくない状態においても利用される。
【０００３】
血管新生は、固形腫瘍の増殖および転移に必要である。研究によって、血管新生がない場合、腫瘍が直径数ミリメートルを超えて発達する能力を有することはまれであることが確認されている（イサアエヴァ（Ｉｓａｙａｖａ）ら、２００４年、インターナショナル・ジャーナル・オブ・オンコロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．）２５（２）、３３５−４３頁）。血管新生はまた、血液循環への腫瘍細胞の侵入を容易にし、転移部位での腫瘍増殖のための栄養分および酸素を供給する新しい血管を提供することによる、転移形成にも必要である（タケダ（Ｔａｋｅｄａ）ら、２００２年、アナルズ・オブ・サージカル・オンコロジー（Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．）９（７）、６１０−１６頁）。
【０００４】
内皮細胞はまた、慢性炎症性疾患に活発に関与し、血管新生、増殖および組織変性に関与する種々のサイトカイン、サイトカイン受容体およびプロテアーゼを発現する。例えば、関節リウマチの際、内皮細胞は活性化され、接着分子およびケモカインを発現し、血液から組織への白血球遊走につながる。内皮細胞透過性が増大し、水腫形成および関節の膨張につながる（ミドルトン（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ）ら、２００４年、アースリティス・リサーチ・アンド・セラピー（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．）６（２），６０−７２頁）。
【０００５】
異常な新血管形成はまた、種々の眼疾患においても見られ、眼の出血および機能障害につながり、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞および加齢黄斑変性等の疾患に関連する視力の喪失の一因となる（ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）ら、１９９９年、ヒストロジカル・ヒストパソロジー（Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．）１４（４）、１２８７−９４頁）。これらの状態は、乳児、労働年齢および高齢の者たちの間の失明の主要な原因である（アイエロ（Ａｉｅｌｌｏ）、１９９７年、オフサルミック・リサーチ（Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓ．）２９（５），３５４−６２頁）。
【０００６】
血管新生を理解することはまた、乾癬、いぼ、皮膚悪性腫瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、化膿性肉芽腫、血管腫、カポジ肉腫、ならびに恐らくはスピッツ母斑、過形成性瘢痕およびケロイド等の病的皮膚科学的過程の重要な一因であるので、皮膚疾患の治療に非常に重要である（アービサー（Ａｒｂｉｓｅｒ）、１９９６年、ジャーナル・オブ・アメリカン・アカデミー・オブ・ダーマトロジー（Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．）３４（３）、４８６−９７頁）。このように、血管新生の理解における最近の発展は、皮膚癌、乾癬および他の皮膚疾患の治療の進歩、ならびにより迅速な創傷の治癒につながるであろう。
【０００７】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生の間に内皮細胞特異的マイトジェンとして作用する、特に有効な血管新生因子である（ビネトゥリー−トゥールネール（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎｉｅｒｅ）ら、２０００年、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）１９（７）、１５２５−３３頁）。ＶＥＧＦは、腫瘍関連血管新生の刺激による固形腫瘍増殖および転移の促進への関与が示唆されている（ルー（Ｌｕ）ら、２００３年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２７８（４４）、４３４９６−４３５０７）。ＶＥＧＦは、関節リウマチ（ＲＡ）の患者の滑液および血清で見られており、その発現は疾患の重症度と相関性がある（クラベル（Ｃｌａｖｅｌ）ら、ジョイント・ボーン・スパイン（Ｊｏｉｎｔ  Ｂｏｎｅ  Ｓｐｉｎｅ）２００３年  ７０（５）、３２１−６頁）。ＶＥＧＦはまた、眼内新血管形成および透過性の主要なメディエーターに関係があると示唆されている。ＶＥＧＦを過剰発現するトランスジェニックマウスは、臨床的な網膜内および網膜下新血管形成を示し、血管造影によって検出可能な漏出性の眼内血管を形成し、ヒト疾患へのそれらの類似性を示す（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、１９９７年、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）１５１（１）、１３−２３頁）。
【０００８】
そのように広範な障害および疾患への病的血管新生の関与を考慮すれば、血管新生、特にＶＥＧＦシグナル伝達の阻害は、望ましい治療上の目的である。ＶＥＧＦは、２つの高親和性チロシンキナーゼ受容体、ＶＥＧＦＲ１（またはｆｍｓ様チロシンキナーゼ、Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ２（キナーゼドメイン受容体またはキナーゼインサートドメイン含有受容体、ＫＤＲとしても公知）を介して作用する。ＶＥＧＦＲ１はＫＤＲより５０倍高い親和性でＶＥＧＦに結合するが、ＫＤＲは、ＶＥＧＦ血管新生効果、すなわち分裂促進性、走化性および管形成の誘導の、主要なトランスデューサーと思われる（ビネトゥリー−トゥールネール（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎｉｅｒｅ）ら、上掲）。したがって、ＶＥＧＦによるＫＤＲ媒介性シグナルトランスダクションの阻害は、抗血管新生干渉のための優れたアプローチを意味する。
【０００９】
これに関して、血管新生の阻害および腫瘍阻害は、ＶＥＧＦに対する抗体（キム（Ｋｉｍ）ら、１９９３年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３６２、８４１−８４４頁、カナイ（Ｋａｎａｉ）ら、１９９８年、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）７７、９３３−９３６頁、マーゴリン（Ｍａｒｇｏｌｉｎ）ら、２００１年、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．）１９、８５１−８５６頁）、ＫＤＲに対する抗体（ルー（Ｌｕ）ら、上掲、チュー（Ｚｈｕ）ら、１９９８年、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５８、３２０９−３２１４頁、チュー（Ｚｈｕ）ら、２００３年、リューキミア（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）１７、６０４−６１１、プルウェット（Ｐｒｅｗｅｔｔ）ら、１９９９年、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５９、５２０９−５２１８頁）、抗ＶＥＧＦ免疫毒素（オルソン（Ｏｌｓｏｎ）ら、１９９７年、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）７３、８６５−８７０頁）、リボザイム（パヴコ（Ｐａｖｃｏ）ら、２０００年、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．）６、２０９４−２１０３頁）、可溶性受容体（ホラッシュ（Ｈｏｌａｓｈ）ら、２００２年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９９、１１３９３−１１３９８頁、クラベル（Ｃｌａｖｅｌ）ら、上掲）、チロシンキナーゼ阻害剤（フォング（Ｆｏｎｇ）ら、１９９９年、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５９、９９−１０６頁、ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、２０００年、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）６０、２１７８−２１８９頁、グロシオス（Ｇｒｏｓｉｏｓ）ら、２００４年、インフラメーション・リサーチ（Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｒｅｓ．）５３（４）１３３−４２頁）、アンチセンス媒介性ＶＥＧＦ抑制（フォースター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）ら、２００４年、キャンサー・レターズ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．）２０，２１２（１）、９５−１０３頁）、およびＲＮＡ干渉（タケイ（Ｔａｋｅｉ）ら、２００４年、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）６４（１０）、３３６５−７０頁、ライヒ（Ｒｅｉｃｈ）ら、２００３年、モレキュラー・ビジョン（Ｍｏｌ  Ｖｉｓ．）９、２１０−６頁）を含む、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ相互作用の中断および／またはＫＤＲシグナルトランスダクション経路のブロックのいずれかをする薬剤を使用することによって、達成されている。ＫＤＲへのＶＥＧＦの結合をブロックするペプチドもまた記載されており、ウサギ角膜モデルにおいてＶＥＧＦ誘導血管新生を阻害することが示された（ビネトゥリー−トゥールネール（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎｉｅｒｅ）ら、２０００年、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）１９（７）、１５２５−３３頁）。さらに、効果的な抗血管新生治療の開発からの恩恵を受ける立場である様々な患者を考慮すれば、新規の抗血管新生薬剤化合物のさらなる同定および特徴付けの必要性が残る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
最近、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｅｃｈ）が、組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（ベバシズマブ）を市場に導入した。この抗体は、結腸癌の治療において有効性を示し、他の腫瘍細胞型でも試験されている。コスト分析から、この抗体を用いた治療は、進行した結腸癌のケアのコストに患者一人あたり４２，８００ドルから５５，０００ドル、または米国で年間１５億ドルを加算し得ることが示唆される。従って、製造がより安価で、著しく低いコストで治療に用い得る、小ペプチド等の代替薬物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ミニペプチドディスプレイ技術を用いて、内皮細胞活性化または増殖のＶＥＧＦ誘導刺激をブロックまたは減少させる新規の抗血管新生ペプチドを同定した。本発明のペプチドによって、従来技術に対する改良が提供され、ここで、本発明のペプチドの少なくともいくつかは、これまでに既知のペプチドと比較して相当に低いＩＣ５０を示す。したがって、本発明のペプチドは、腫瘍ならびに新形成、関節リウマチおよび乾癬等の炎症性疾患、アテローム硬化症、血管再狭窄、動静脈奇形および血管癒着病変を含む血管障害、ならびに糖尿病性網膜症および黄斑変性を含む眼疾患の治療を含む、血管新生関連疾患の治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
ペプチド
本発明者らは、新規の抗血管新生ペプチドを同定した。用語「抗血管新生」は、本発明のペプチドが、血管新生の過程、または既存の血管から発生することによって新しい血管の形成プロセスを、ブロック、阻害または減少させることを意味する。かかるペプチドは、（１）起源となる血管の膜の溶解の段階、（２）内皮細胞の遊走および増殖の段階、ならびに（３）遊走細胞による新しい血管の形成の段階を含む、血管新生に関与する任意の段階をブロックまたは減少させることによって、血管新生をブロックし得る。
【００１３】
具体的には、本発明のペプチドは、本明細書中または利用可能な文献に記載される任意の１つ以上のアッセイを用いて検出または測定され得るように、内皮細胞活性化または増殖のＶＥＧＦ誘導刺激をブロック、阻害または減少させる。例えば、開示されるペプチドがＶＥＧＦ誘導刺激を阻害または減少させる能力は、本明細書中に記載されるように、開示されるペプチドをＶＥＧＦ存在下でインキュベートし、ウシ網膜内皮細胞（ＢＲＥ）またはヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖または生存における任意の減少をモニタリングすることによって測定され得る。Ｂｃｌ−２またはＡ１等の１つ以上の抗アポトーシスタンパク質の発現に対するペプチドの効果（ガーバー（Ｇｅｒｂｅｒ）ら、１９９８、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２７３（２１）、１３３３１３−１６参照）、またはＡｋｔ等のＶＥＧＦシグナル伝達タンパク質のリン酸化もしくは脱リン酸化に対するペプチドの効果（ガーバー（Ｇｅｒｂｅｒ）ら、１９９８、２７３（４６）、３０３３−４３参照）を検出することを含む内皮細胞刺激の他の測定もまた用いられ得る。
【００１４】
本発明のペプチドはまた、開示されるミニペプチドディスプレイ技術または任意の公知の競合的もしくは非競合的ＫＤＲ結合アッセイを用いて検出または測定されるように、ＫＤＲへのＶＥＧＦの結合を、ブロック、阻害または減少させる。これに関して、本発明のペプチドを発現する、標識されたミニセルまたは任意の他の細胞を用いて、開示されるペプチドの、ＫＤＲへの結合を検出または測定し得る。本発明はまた、本明細書中に開示される任意のペプチドの標識されたペプチド誘導体を包含し、ここでペプチドは、放射性、蛍光、発光、タンパク新生、免疫原性または任意の他の適した分子等の検出可能な標識に、結合または複合体化される。
【００１５】
用語「ペプチド」は、本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」と同等であり、少なくとも６個のアミノ酸の配列を含む分子をいうが、全体、天然または自然のタンパク質のポリペプチド配列をいわない。このように、本発明のペプチドは、少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは１００、７５、５０、４０、３０、２５、２０または１５個までのアミノ酸を有する。本発明の最も好ましいペプチドは、少なくとも約６個で約１２個以下のアミノ酸を有するであろう。
【００１６】
従来技術のＫＤＲブロッキングペプチドでのミニペプチドディスプレイ技術を用いて同定されたペプチドの相同性アラインメントに基づいて、本発明者らは、実質的に改良された抗血管新生特性を有するペプチドの新規のファミリーにコア配列を提供するＬＰＰＨＳＳ（配列番号１）のコンセンサセス配列を同定した。このコアコンセンサセス配列は、相同性アラインメントによって、Ｎ末端アミノ酸ＡＴＳの少なくとも１つ以上および／またはＣ末端アミノ酸ＱＳＰの少なくとも１つ以上を含むようにさらに拡張され、ＡＴＳＬＰＰＨＳＳ（配列番号１０）、ＬＰＰＨＳＳＱＳＰ（配列番号１３）およびＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰ（配列番号１６）の、拡張されたコンセンサセス配列を生じた。
【００１７】
配列番号１６のアミノ酸配列を含むペプチドは、具体的に、これまでに既知のペプチドと比較して約４０ミクロモル対約２００ミクロモルの、有意に低いＩＣ５０を示すことが証明されている。したがって、本発明のペプチドは、抗血管新生活性の機能的特質を示し、約２００ミクロモル未満の濃度、より好ましくは約１７５、１５０、１２５、１００または７５ミクロモル未満の濃度、最も好ましくは約５０ミクロモル未満の濃度で、ＫＤＲへのＶＥＧＦの結合をさらにブロックまたは減少させ得る。
【００１８】
本発明の好ましいペプチドとしては、以下のペプチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
ＬＰＰＨＳＳ（配列番号１）
ＳＬＰＰＨＳＳ（配列番号２）
ＬＰＰＨＳＳＱ（配列番号３）
ＳＬＰＰＨＳＳＱ（配列番号４）
ＴＳＬＰＰＨＳＳ（配列番号５）
ＬＰＰＨＳＳＱＳ（配列番号６）
ＴＳＬＰＰＨＳＳＱ（配列番号７）
ＳＬＰＰＨＳＳＱＳ（配列番号８）
ＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳ（配列番号９）
ＡＴＳＬＰＰＨＳＳ（配列番号１０）
ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱ（配列番号１１）
ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳ（配列番号１２）
ＬＰＰＨＳＳＱＳＰ（配列番号１３）
ＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰ（配列番号１４）
ＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰ（配列番号１５）
ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰ（配列番号１６）
ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＬＱＴ（配列番号１７）
ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰＬ（配列番号１８）
ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰＲＡＬ（配列番号１９）
ＳＬＰＰＲＡＬＱ（配列番号２０）
ＴＳＬＰＰＲＡＬ（配列番号２１）
ＬＰＰＲＡＬＱＳ（配列番号２２）
ＴＳＬＰＰＲＡＬＱ（配列番号２３）
ＳＬＰＰＲＡＬＱＳ（配列番号２４）
ＴＳＬＰＰＲＡＬＱＳ（配列番号２５）
ＡＴＳＬＰＰＲＡＬ（配列番号２６）
ＡＴＳＬＰＰＲＡＬＱ（配列番号２７）
ＡＴＳＬＰＰＲＡＬＱＳ（配列番号２８）
ＬＰＰＲＡＬＱＳＰ（配列番号２９）
ＳＬＰＰＲＡＬＱＳＰ（配列番号３０）
ＴＳＬＰＰＲＡＬＱＳＰ（配列番号３１）
ＡＴＳＬＰＰＲＡＬＱＳＰ（配列番号３２）
ＷＬＰＰＨＳＳ（配列番号３３）
ＡＴＷＬＰＰＨＳＳＱＳＰ（配列番号３４）
ＷＬＰＰＲＡＬ（配列番号３５）
ＡＴＷＬＰＰＲＡＬＱＳＰ（配列番号３６）
ＰＳＱＳＳＨＰＰＬＳＴＡ（配列番号３７）
【００１９】
本発明のペプチドは、開示される配列を「含み」得、すなわち、開示される配列は、開示されるペプチドに、促進された溶解性および／または安定性、ペプチド活性または結合をモニタリングまたは測定するためのマーカータンパク質、免疫原性または抗原性ペプチド等を含むより大きいペプチド等への融合等のさらなる機能的特質を提供し得るまたはし得ない、より大きいペプチド配列の一部である。本発明の好ましいペプチドは、ペプチドの抗血管新生活性および機能的結合特性に影響しない無関係な配列に加えて、開示される配列から「本質的になる」配列を含むとして記載され得る。あるいは、本発明のペプチドは、開示されるペプチド配列のみからなり得る。
【００２０】
コアペプチドの配列は、抗血管新生活性およびＫＤＲへの結合を維持する一方で、可溶性、血清中または血漿中安定性等のパラメータを促進するために、保存的置換および／または化学的修飾もしくは他の分子への結合によって修飾され得る。具体的には、本発明のペプチドは、Ｎ末端でアセチル化および／またはＣ末端でアミド化、または、アルブミン、免疫グロブリンおよびそれらの断片、トランスフェリン、リポタンパク質、リポソーム、α−２−マクログロブリンおよびα−１−糖タンパク質、ポリエチレングリコールおよびデキストランを含むがこれらに限定されない血清中安定性を促進する分子に結合、複合体化もしくは融合され得る。かかる分子は、その全体が参照によって本明細書中に援用される米国特許第６，７６２，１６９号明細書に詳細に記載されている。Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれかを有するペプチドおよび機能的な保存的バリアント、特に、前掲のアミノ酸配列番号３７を有するペプチド等の、逆転したコア配列を有するＤ−アミノ酸ペプチド（レトロインベルソペプチド（ｒｅｔｒｏ  ｉｎｖｅｒｓｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ
））が含まれる。レトロインベルソペプチドは、生物学的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を保持しており、血清プロテアーゼ耐性でもあるが、医薬開発により適しており、結果として、促進されたｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的活性を生じることが示されている。また、このペプチドは、ペプチド結合の１つ以上を減少させることによって修飾されて安定性を促進し得る（Ｍ．Ｗ．ペニントン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）およびＢ．Ｍ．ダン（Ｄｕｎｎ）編、モレキュラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）３５（１９９４年）、ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）のヒューマナ・プレス（Ｈｕｍｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，）２４１−２４７頁中のペニントン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）「ＣＨ２ＮＨで減少した結合代用物を含むペプチドの固相合成（ｓｏｌｉｄ-ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＨ２ＮＨ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｂａｎｄ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）」）。
【００２１】
保存的アミノ酸置換は、天然または非天然のアミノ酸のいずれかを用いて生じ得る。適切な保存的置換は、任意の公知のスコアマトリックスまたは標準的相同性比較を用いて決定され得、以下に記載される置換を含むが、これらに限定されない。ボルド（Ｂｏｒｄｏ）およびアルゴス（Ａｒｇｏｓ）、「部位特異的変異誘発における「安全な」残基置換の提案（Ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ’Ｓａｆｅ’  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｅｇｎｓｉｓ）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２１７（１９９１年）７２１−７２９頁、テーラー（Ｔａｙｌｏｒ）、「アミノ酸保存の分類（Ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」、ジャーナル・オブ・セオレティカル・バイオロジー（Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．）１１９（１９８６年）２０５−２１８頁、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）およびロブソン（Ｒｏｂｓｏｎ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・エボリューション（Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １９（１９８３年）１７１、Ｒ．ドゥーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｅｌ）編、「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」（ＩＳＢＮ  ０−１２−１８２０８４−Ｘ、サンディエゴのアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）１８３（１９９０）、６３−９８頁中のピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡを用いた迅速かつ高感度な配列比較（Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＦＡＳＴＰ  ａｎｄ  ＦＡＳＴＡ）」、ならびにジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）およびオーバリントン（Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ）「配列比較の構造的基盤：スコアリング方法の評価（Ａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ａｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）（１９９３年）２３３、１６−７３８頁、ならびに米国特許第５，９９４，１２５号明細書、これらの各々は、その全体が参照によって本明細書中に援用される。化学的特性に基づくいくつかの例示的な保存的置換が、下の表１に含まれる。
【００２２】
【表１】
2008509157.tif 000002
【００２３】
本発明はまた、本明細書中に開示されるペプチドに特異的に結合する抗体を包含する。例示的な抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、完全ヒト、キメラ、二重特異性およびヘテロ結合抗体が挙げられる。モノクローナル抗体は、参照によって本明細書中に援用されるケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５６、４９５（１９７５年）によって記載されるもの等のハイブリドーマ法を用いて調製され得る。あるいは、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化し得る。免疫化剤は、典型的には、ペプチド、またはその融合タンパク質を含み、さらに担体またはアジュバントタンパク質をさらに含む。
【００２４】
抗イディオタイプ抗体もまた、本明細書中に記載されるようなペプチドと実質的に同様な特性を示す、標準的手順を用いて調製され得る。したがって、かかる抗体を用いて、開示されるペプチドと同様に、内皮細胞のＶＥＧＦ媒介性刺激を阻害または減少させ得る。開示されるペプチドに特異的な抗体は、標識され得、例えば本明細書中に記載される受容体結合アッセイのいずれかにおいて、ペプチドを検出するよう用いられ得る。あるいは、かかる抗体を用いて、組み換えによって合成されたペプチドを精製し得る。
【００２５】
核酸
本発明はまた、本明細書中に記載されるペプチドをコードする単離された核酸、ならびにかかる核酸を含む、クローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のためのベクターを包含する。種々のベクターが、公的に入手可能である。例えば、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得る。かかる核酸を用いて、例えば宿主細胞において核酸を発現させることによって、ペプチド基質を生成し得る。トリプレットコードの縮重のために種々の核酸配列が同じアミノ酸配列をコードし得ること、および本発明が本明細書中に記載されるペプチドをコードする全ての可能性のある核酸配列を包含することは、当業者に理解されよう。かかる核酸は、当該分野で周知の方法を用いて、合成によって調製され得、任意の適したベクターにクローニングされ得る。
【００２６】
周知のクローニング技術を用いて、ペプチドをコードする配列をシグナル配列にインフレームで融合させて、宿主細胞による分泌を可能にし得る。あるいは、かかるペプチドを、別のタンパク質への融合として生成し得、その後部位特異的プロテアーゼの使用によって分離および単離し得る。ペプチドおよびタンパク質を生成するかかるシステムは、市販されている。被験細胞によるＫＤＲの発現を検出する方法において、または試料中のＶＥＧＦ活性を検出する方法において、例えば被験細胞または試料を本発明のペプチドを発現する宿主細胞と混合し、該宿主細胞または該ペプチドの結合を検出することによって、またはＶＥＧＦの阻害を検出することによって、かかる宿主細胞を使用することも実行できよう。適した宿主細胞としては、真核細胞および原核細胞が挙げられる。目的の特定の宿主細胞においてタンパク質発現のためのプロモーターを含むベクターは、公知であり、公的に入手可能である。
【００２７】
本発明のペプチドをコードする核酸および発現ベクターを、本明細書中に記載される治療方法に、例えば遺伝子療法のビヒクルとして用いて、発現されるペプチドを疾患部位に送達することもできる。適したベクターは、典型的には、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスおよびレトロウイルスを含むウイルスベクターである（最近の評論については、その全体が本明細書中に参照によって援用される、スキャンロン（Ｓｃａｎｌｏｎ）、２００４年、アンチキャンサー・リサーチ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）２４（２Ａ）、５０１−４頁参照）。天然および合成のポリマーから組み立てられた放出制御系もまた、ベクターの局所的送達に利用可能であり、これは離れた組織への分布を避け、非標的細胞に対する毒性を減少させ、ベクターに対する免疫応答を低下させる（パニエ（Ｐａｎｎｉｅｒ）およびシェイ（Ｓｈｅａ）、２００４年、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）１０（１）、１９−２６頁）。
【００２８】
使用方法
本発明のペプチドは、ＫＤＲ発現を検出する方法ならびにＶＥＧＦ／受容体相互作用を検出および／または阻害する方法を含むがこれらに限定されない色々な方法に用い得る。例えば、本発明のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＫＤＲ発現細胞の検出のために、放射性または蛍光画像化マーカーに結合させ得る。異常な、または増加したＫＤＲ発現の検出は、進行中の疾患の指標であり得、悪性腫瘍の位置決定または過剰な眼内新血管形成に関連する眼疾患の診断に用いられ得る。
【００２９】
本発明はまた、本明細書中に開示されるペプチドを用いて、開示されるペプチドを模倣する化合物（アゴニスト）をスクリーニングするか、またはこのペプチド（アンタゴニスト）の効果を防ぐ方法を包含する。アンタゴニスト薬候補のスクリーニングアッセイは、ＫＤＲに結合する化合物を同定するよう設計されるか、またはそうでなければ、開示されるペプチドとＫＤＲとの相互作用を妨げるように設計される。かかるスクリーニングアッセイは、小分子薬候補の同定に特に適するようになる、化学ライブラリーの高スループットスクリーニングに基づいて分析できるアッセイを含むであろう。このアッセイは、当該分野で十分特徴付けられている、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞ベースのアッセイを含む、色々な形式で行われ得る。
【００３０】
具体的には、アンタゴニストは、本発明のペプチドと、膜結合もしくは表面結合ＫＤＲまたは組み換え受容体を有する可能性のあるアンタゴニストとを、競合的阻害アッセイに適切な条件下で組み合わせることによって検出され得る。本発明のペプチドは、放射活性または蛍光等によって、受容体に結合したペプチド分子の数を用いて可能性のあるアンタゴニストの有効性を測定し得るように、標識され得る。
【００３１】
本発明はまた、ＶＥＧＦ媒介性血管新生またはＶＥＧＦの結合のそれぞれが減少するように、キナーゼドメイン受容体（ＫＤＲ）を発現する細胞を本明細書中に記載されるペプチドに接触させる工程を含む、ＶＥＧＦ媒介性血管新生を減少させ、ＫＤＲまたはＫＤＲペプチドへのＶＥＧＦの結合をブロックする方法を包含する。かかる方法において、ＫＤＲまたは受容体ペプチドを、ＶＥＧＦに供する前にまたはＶＥＧＦ存在下で本発明のペプチドと接触させ得る。ＫＤＲまたは本発明のペプチドのいずれかを、タンパク質またはペプチドアレイ等の合成表面上に提示し得る。あるいは、ＫＤＲまたはＫＤＲペプチドを、細胞の表面上で発現させ得る。本発明の方法によって標的化されるＫＤＲ発現細胞としては、原核細胞および真核細胞のいずれかまたは両方を挙げることができる。かかる細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持し得るか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば癌または別の血管新生関連疾患と診断された患者または被験体において、存在し得る。
【００３２】
本発明はまた、治療有効量の本明細書中に記載されるいずれかのペプチドで、血管新生関連疾患と診断された患者を治療する方法であって、該血管新生関連疾患が減少または阻害されるように該ペプチドを該患者に投与する工程を含む、方法を含む。例示的な血管新生関連疾患は、本出願のいたるところに記載されており、腫瘍および新形成、血管腫、関節リウマチ、アテローム硬化症、突発性肺線維症、血管再狭窄、動静脈奇形、髄膜腫、血管新生緑内障、乾癬、血管線維腫、血友病性関節、過形成性瘢痕、オースラー−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管癒着病変、滑膜炎、皮膚炎、子宮内膜症、翼状片、糖尿病性網膜症、角膜損傷または移植、創傷、びらんおよび潰瘍（皮膚、胃および十二指腸）に関連する新血管形成からなる群より選択される疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
具体的には、本発明は、治療有効量の本明細書中に記載されるいずれかのペプチドで、癌と診断された患者を治療する方法であって、該癌の拡散が減少または阻害されるように該ペプチドを該患者に投与する工程を含む、方法を含む。本発明の方法によって治療可能な癌としては、腎臓、結腸、卵巣、前立腺、膵臓、肺、脳および皮膚癌からなる群より選択されるものを含むがこれらに限定されない、全ての固形腫瘍および転移癌が挙げられる。
【００３４】
本発明はまた、治療有効量の本明細書中に記載されるいずれかのペプチドで、血管新生関連眼疾患と診断された患者を治療する方法であって、該眼疾患が減少または阻害されるように該ペプチドを該患者に投与する工程を含む、方法を含む。かかる眼疾患としては、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞および黄斑変性を含むがこれらに限定されない、異常な眼内新血管形成に関連する任意の眼疾患が挙げられる。
【００３５】
本発明はまた、治療有効量の本明細書中に記載されるいずれかのペプチドで、血管新生関連炎症状態と診断された患者を治療し、該炎症状態が減少または阻害されるように該ペプチドを該患者に投与する工程を含む、方法を含む。かかる炎症状態または疾患としては、全ての型の関節炎ならびに特に関節リウマチおよび変形性関節症、喘息、肺線維症および皮膚炎を含むがこれらに限定されない、ＶＥＧＦの発現およびＶＥＧＦによる細胞の活性化に関連する任意の炎症性障害が挙げられる。
【００３６】
医薬製剤
医薬用途のために、本発明の化合物は、薬学的に許容され得る担体と組み合わせて使用され得、任意に薬学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含み得る。そのため、本発明はまた、被験体への投与に適した医薬組成物を提供する。担体は、組成物が非経口投与に適応するように液体であり得、または経口投与のために製剤化された固体、すなわち錠剤または丸剤であり得る。さらに、担体は、組成物が吸入に適応するように、噴霧化可能な液体または固体の形態であり得る。非経口投与される場合、組成物は、発熱物質を含まないべきであり、許容され得る非経口担体中にあるべきである。あるいは、活性のある化合物は、公知の方法を用いて、リポソーム中に製剤化またはカプセル化され得る。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、有効量の１つ以上の本発明のペプチドを、薬学的に許容され得る担体と組み合わせて含有する。この組成物は、標的である特定の疾患の治療に適した他の公知の薬物をさらに含有し得る。本発明の化合物の有効量は、化合物がない場合に起こるものと比較して内皮細胞のＶＥＧＦ刺激をブロック、阻害または減少させる量である。言い換えれば、化合物がない場合に起こるものと比較して内皮の血管新生活性を減少させる量である。有効量（および投与の様式）は、個別の基準に基づいて決定され、使用される特定の治療用分子および被験体の考慮（大きさ、年齢、全般的な健康）、治療される状態（癌、関節炎、眼疾患等）、治療される症状の重症度、求められる結果、使用される特定の担体または医薬製剤、投与の経路、および当業者に理解されるであろう他の要因に基づくであろう。有効量は、当該分野で公知の技術を用いて、当業者によって決定され得る。本明細書中に記載される化合物の治療有効量は、当該分野で公知のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験、動物モデルまたは他の用量反応の研究を用いて決定され得る。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、口腔内、眼、鞘内、または別の投与の経路に適した製剤に調製、包装、または販売され得る。他の考えられる製剤としては、放出されたナノ粒子、リポソーム調製物および免疫学に基づいた製剤が挙げられる。
【００３９】
リポソームは、閉じ込められた水性の容積を含む、完全に閉鎖した脂質二分子層膜である。リポソームは、単層（単一の膜）または多層（各々が隣りのものと水性の層によって分離された多重の膜二分子層によって特徴付けられる、タマネギ様構造）であり得るベシクルである。二分子層は、疎水性「尾」領域および親水性「頭」領域を有する２つの脂質単分子層で構成される。膜二分子層において、脂質単分子層の疎水性（非極性）「尾」は二分子層の中心に向いているが、親水性（極性）「頭」は水相に向いている。
【００４０】
本発明のリポソームは、当該分野で公知の任意の方法によって形成され得る。いくつかの方法を用いて、本発明のリポソームを形成し得る。例えば、多層ベシクル（ＭＬＶ）、安定性多層ベシクル（ＳＰＬＶ）、小型単層ベシクル（ＳＵＶ）、または逆相蒸発ベシクル（ＲＥＶ）を用い得る。しかしながら、好ましくは、ＭＬＶがフィルターを通って押し出され、利用されるフィルターサイズに依存した大きさの大型単層ベシクル（ＬＵＶ）を形成する。一般に、３０、５０、６０、１００、２００または８００ｎｍの孔のポリカーボネートフィルターが用いられ得る。関連性のある部分が参照によって本明細書中に援用されるカリス（Ｃｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第５，００８，０５０号明細書に開示されているこの方法において、リポソーム懸濁液が押出装置に繰り返し通され、結果として均一なサイズ分布のリポソームの集団が生じる。
【００４１】
例えば、このろ過は、直線状の膜フィルター（ヌクレオポア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）ポリカーボネートフィルター）もしくは蛇行した経路のフィルター（例えば、０．１μｍサイズのヌクレオポア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）メンブラフィル（Ｍｅｍｂｒａｆｉｌ）フィルター（混合セルロースエステル））を介して、またはホモジナイゼーション等の代替的サイズリダクション技術によって、行われ得る。リポソームの大きさは、直径約０．０３から約２ミクロン、好ましくは約０．０５から０．３ミクロン、最も好ましくは約０．１から約０．２ミクロンで異なり得る。大きさの範囲は、ＭＬＶ、ＳＰＬＶまたはＬＵＶであるリポソームを含む。
【００４２】
本発明のリポソーム製剤に使用され得る脂質としては、合成または天然のリン脂質が挙げられ、中でも、単独または組み合わせのいずれかで、およびコレステロールと組み合わせて、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）およびカルジオリピンを挙げることができる。本発明において有用なリン脂質としては、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）を挙げることができる。他の実施形態において、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、または水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）もまた、使用し得る。ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびジアラキドノイルホスファチジルコリン（ＤＡＣＰ）もまた、同様に用いられ得る。
【００４３】
リポソームの調製の間、有機溶媒を用いて脂質を懸濁することもできる。本発明での使用に適した有機溶媒としては、脂質を溶解させる、色々な極性および誘電特性を有するもの、例えば、中でもクロロホルム、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、塩化メチレン、およびベンゼン：メタノール（７０：３０）等の溶媒混合物が挙げられる。その結果、脂質を含有する溶液（脂質および他の成分が全体に均一に分布している混合物）が形成される。溶媒は、一般に、その生物適合性、低毒性、および可溶化能に基づいて選択される。
【００４４】
本発明のペプチドをリポソーム中にカプセル化するために、関連のある部分が参照によって本明細書中に援用されるチャクラバルティ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｉ）ら、米国特許第５，３８０，５３１号明細書に記載される方法を、本発明のペプチドを用いた使用のために改変し得る。
【００４５】
本発明のアミノ酸およびペプチド製剤を含有するリポソームを、哺乳動物、特にヒトにおいて、徐放性製剤ならびに反復投与を必要とする多くの病態または薬理学的状態の治療に治療的に用い得る。本発明の薬剤を含有するリポソームの投与の様式は、ペプチドが送達され得る生物の部位および細胞を決定し得る。
【００４６】
本発明のリポソームは、単独で投与され得るが、一般に、意図される投与の経路および標準的医薬的実務に関して選択される医薬担体と混合して投与されるであろう。調製物は、非経口的に、例えば静脈内に注射され得る。非経口投与のために、それらは例えば、他の溶質、例えば、等張性が必要または所望される場合、溶液を等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有し得る無菌水溶液の形態で用いられ得る。本発明のリポソームはまた、皮下または筋肉内に使用され得る。他の使用は、調製物の特定の特性に依存して、当業者によって想定され得る。
【００４７】
経口の投与の様式のために、本発明のリポソーム製剤は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、散剤、シロップ、エリキシル、水溶液および懸濁液等の形態で用いられ得る。錠剤の場合、使用され得る担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウムおよびリン酸の塩が挙げられる。デンプン、潤滑剤および滑石等の種々の崩壊剤が、錠剤において一般に使用される。カプセル形態での経口投与のために、有用な希釈剤は、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。水性懸濁液が経口使用のために必要な場合、有効成分は、乳化剤および懸濁剤と組み合わされる。必要に応じて、ある種の甘味および／または矯味矯臭剤が添加され得る。
【００４８】
局所的な投与の様式のために、本発明のリポソーム製剤は、ゲル、油、エマルジョン等の投薬形態に組み込まれ得る。これらの製剤は、クリーム、ペースト、軟膏、ゲル、ローション等の直接の塗布によって投与され得る。病態または薬理学的状態の治療におけるヒトへの投与のために、処方する医師は、所定のヒト被験体に適切な薬剤の投薬を最終的に決定し、これは個体の年齢、体重および反応ならびに使用される薬剤の薬物動態によって異なると予想され得る。
【００４９】
また、患者の病態または状態の性質および重症度は、投薬計画に影響を及ぼすであろう。一般にリポソーム形態での薬物の投薬は遊離した薬物に使用されるものと殆ど同じであると予想されるが、いくつかの場合では、これらの制限の範囲外の用量を投与する必要があり得る。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、生分解性ミクロスフェア等のバイオポリマーの貯蔵製剤をさらに含む。生分解性ミクロスフェアを用いて、薬物放出速度が制御され、薬物が体内の特定の部位に標的化され、それによって、それらの治療効果が最適化され、毒性副作用が減少し、反復投与の不都合が排除される。生分解性ミクロスフェアは、移植および除去のための外科的手順を必要としない点で、大きいポリマーインプラントよりも有利である。
【００５１】
本発明との関連で使用される生分解性ミクロスフェアは、ペプチドの放出を遅らせ、長期間にわたって治療有効濃度を作用の部位で維持するポリマーで形成される。
【００５２】
ポリマーは、エチルセルロース、ポリスチレン、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（乳酸）およびポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）から選択され得る。ＰＬＧＡ共重合体は、再現性および緩効性の特徴を有する合成生分解性および生物適合性ポリマーの１つである。ＰＬＧＡ共重合体の利点は、それらの分解速度が数ヶ月から数年の範囲で、ポリマー分子量とポリ乳酸のポリグリコール酸残基に対する比の関数である点である。非経口用途のための、ＰＬＧＡを使用したいくつかの製品が現在販売されており、米国のルプロン・デポ（Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ）およびゾラデックス（Ｚｏｌａｄｅｘ）ならびに欧州のエナントン・デポ（Ｅｎａｎｔｏｎｅ  Ｄｅｐｏｔ）、デカペプチル（Ｄｅｃａｐｅｐｔｉｌ）およびパーロデル（Ｐａｒｉｏｄｅｌ）ＬＡが含まれる（評論についてはヨンセイ（Ｙｏｎｓｅｉ）、メディカル・ジャーナル（Ｍｅｄ  Ｊ．）２０００年１２月、４１（６）、７２０−３４頁参照）。
【００５３】
鼻上皮の接着結合を介して透過性の増大が証明されているので（ピエトロ（Ｐｉｅｔｒｏ）およびウリー（Ｗｏｏｌｌｅｙ）、「ナステック（Ｎａｓｔｅｃｈ）の鼻腔内薬物送達技術の背後にある科学（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｂｅｈｉｎｄ  Ｎａｓｔｅｃｈ’ｓ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．）」マニュファクチャリング・ケミスト（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔ）、２００３年８月）、本発明の医薬組成物はさらに、経鼻投与に適した製剤で調製、包装および販売され得る。かかる製剤は、有効成分を含み約０．５から約７ナノメートル、好ましくは約１から６ナノメートルの範囲の直径を有する、乾燥粒子を含有し得る。かかる組成物は、粉末を分散させるよう噴霧剤流が向けられ得る乾燥粉末レザバーを含む装置を用いた投与または密閉容器中の低沸点噴霧剤に溶解もしくは懸濁された有効成分を含む装置等の自己噴霧性溶媒／粉末分取容器を用いた投与のために、簡便に乾燥粉末の形態である。好ましくは、かかる粉末は、少なくとも９８重量％の粒子が０．５ナノメートルより大きい直径を有し、少なくとも９５数量％の粒子が７ナノメートル未満の直径を有する、粒子を含む。より好ましくは、少なくとも９５重量％の粒子が１ナノメートルより大きい直径を有し、少なくとも９０数量％の粒子が６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは、ショ糖等の固体微小粉末希釈剤を含み、単位用量の形態で簡便に提供される。
【００５４】
低沸点噴霧剤は、一般に、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴霧剤を含む。一般に、噴霧剤は、組成物の５０から９９．９％（ｗ／ｗ）を構成し得、有効成分は、組成物の０．１から２０％（ｗ／ｗ）を構成し得る。噴霧剤はさらに、液体非イオン性または固体陰イオン性界面活性剤または固体希釈剤（好ましくは有効成分を含む粒子と同位の粒子径を有する）等のさらなる成分を含み得る。
【００５５】
経鼻送達のために製剤化された本発明の医薬組成物はまた、溶液または懸濁液の小滴の形態で有効成分を提供し得る。かかる製剤は、任意に無菌の、有効成分を含む水溶液または希アルコール溶液または懸濁液として、調製、包装または販売され得、任意の噴霧化または微粒化装置を用いて、簡便に投与され得る。かかる製剤は、サッカリンナトリウム等の矯味矯臭剤、揮発油、緩衝剤、界面活性剤またはヒドロキシ安息香酸メチル等の防腐剤を含むがこれらに限定されない１つ以上のさらなる成分をさらに含み得る。この投与の経路によって提供される小滴は、好ましくは、約０．１から約２００ナノメートルの範囲の平均直径を有する。
【００５６】
鼻腔内投与に適した別の製剤は、有効成分を含み約０．２から５００マイクロメートルの平均粒子を有する粗粉末である。かかる製剤は、鼻から吸引される様式で、すなわち鼻腔の近くに保持された粉末を含む容器からの、鼻の通過を介した迅速な吸引によって、投与される。
【００５７】
経鼻投与に適した製剤は、例えば、わずか０．１％（ｗ／ｗ）から１００％（ｗ／ｗ）もの有効成分を含み得、本明細書中に記載される１つ以上のさらなる成分をさらに含み得る。
【００５８】
本発明の化合物は、急性に（すなわち、開始の間または炎症につながる事象の直後）投与されるか、または変性疾患の過程において投与されて、そうしなければ起こるであろう症状の進行を減少または改善し得る。投与のタイミングおよび間隔は被験体の症状によって異なり、当業者によって決定されるように、数時間、数日、数週間またはそれ以上の時間経過にわたって、数時間から数日の間隔で投与され得る。典型的な毎日の投与計画は、１日あたり約０．０１μｇ／ｋｇ体重から、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇ体重から、１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇ体重から、１日あたり約１００ｍｇ／ｋｇ体重からであり得る。
【００５９】
本発明の化合物は、静脈内、経口、鼻腔内、眼内、筋肉内、鞘内に投与されるか、またはペプチド、ペプチド製剤および治療される疾患に関して任意の適した経路で投与され得る。炎症性関節炎の治療のためのペプチドを、滑液に直接注射し得る。固形腫瘍の治療のためのペプチドを、腫瘍に直接注射し得る。皮膚疾患の治療のためのペプチドを、局所的に、例えばローションまたはスプレーの形態で塗布し得る。鞘内投与は、すなわち脳腫瘍の治療のために、脳への直接の注射を含み得る。あるいは、ペプチドを、血液脳関門へ侵入して血液脳関門を横切って有効成分を輸送する能力に関して選択されたペプチドまたは非タンパク質性部分である第二の分子（［担体」）に共役または結合させ得る。適した担体の例は、その全体が参照によって本明細書中に援用される米国特許第４，９０２，５０５号明細書、米国特許第５，６０４，１９８号明細書および米国特許第５，０１７，５６６号明細書に開示されている。
【００６０】
本発明のペプチドを投与する代替的方法は、ベクターがペプチドの発現および分泌を指示できる場合、ペプチドをコードする核酸配列を担持するベクターを被験体に投与することによって行われる。適したベクターは、典型的には、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスおよびレトロウイルスを含む、ウイルスベクターである。ベクター送達系を利用し、遺伝子療法を行う技術は、当該分野で公知である（最近の評論については、ランドストローム（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ）、２００３年、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）２１（３）、１１７−２２頁参照）。
【００６１】
以下の実施例は、本発明を説明および例示するために提供される。このように、これらは本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態もまた、本明細書中の上記および特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内に包含されることを、十分理解するであろう。
【実施例】
【００６２】
実施例１．ミニセルの選択による、新規のヒトＶＥＧＦ受容体ＫＤＲ結合ペプチドの同定
方法
ベクターｐＢＳ（ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ））におけるリケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）の１７Ｋ抗原をコードする遺伝子に遺伝学的に融合されたランダム３０マーオリゴヌクレオチドを含むミニセルディスプレイライブラリーを、本質的に、その全体が参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００３０１０５３１０号明細書に記載されるように、構築した。このライブラリーを大腸菌ＤＳ４１０に形質転換し、形質転換した細胞を、富栄養培養液（テリフィック・ブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ））中、２５０ｍＬ培養で一晩増殖させた。９．３Ｋｒｐｍの勾配遠心分離によって、ミニセルを精製した。
【００６３】
ミニセルのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡベースの結合アッセイを、以下のように行った。
１．コスター（Ｃｏｓｔａｒ）高結合プレート３３６１を、１００ｍＭ重炭酸ナトリウム３０ｍＭ炭酸ナトリウムｐＨ９．５コーティングバッファーで希釈した５μｇ／ｍｌのＫＤＲ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、３５７−ＫＤ）で、５０μｌ／ウェルで被覆した。陰性対照として、コーティングバッファーのみを２つのウェルに加えた。
２．プレートを、わずかに回転させながら４℃で週末にわたってインキュベートした。
３．翌朝、ミニセルランダムライブラリーのアリコート（ペレットの１０％）を、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。１μｌのボデピー（Ｂｏｄｉｐｙ）を加え、ミニセルを、室温で回転させながら１０分間染色した。試料を１３０００ｒｐｍで１分間回転させ、ペレットを、９００μｌのＰＢＳで５分間、室温で回転させて、３回洗浄した。試料を１３０００ｒｐｍで１分間回転させ、アッセイのためにペレットを５６０μｌのＰＢＳに再懸濁した。
４．高結合プレートから新しいプレートへ未結合ＫＤＲを移し、物質を保存した。
５．プレートを、２００μｌのＰＢＳで１回、簡単に洗浄した。
６．標識したミニセルを添加した。ミニセルを、最終的な洗浄条件の濃度の２倍（すなわち、ＰＢＳ、５００ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ、１ＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ、ＰＢＳ＋０．２％ＮＰ−４０、ＰＢＳ＋０．０２％ＳＤＳ）で調製した適切なＰＢＳバッファーで１：１希釈し、０．１％ＢＳＡおよび２５μｇ／ｍｌカナマイシンとともに、５０μｌ／ウェルで添加した。
７．プレートを密閉し、上述のように４℃で一晩インキュベートした（総インキュベーション＝１８時間）。
８．未結合ミニセルを新しいプレートに移し、取っておいた。
９．プレートを、２００μｌの適切なバッファー（ＰＢＳ、２５０ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ、５００ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ、ＰＢＳ＋０．１％ＮＰ−４０、ＰＢＳ＋０．０１％ＳＤＳ）で１分間、３回洗浄した。５０μｌのＰＢＳ／ウェルを加え、プレートを４℃で３時間インキュベートした。
１０．プレートを、２０×および４０×の倍率で、標識されたミニセルに関して顕微鏡下で調べた。
１１．フェノール−クロロホルムによってミニセルＤＮＡを陽性のウェルから抽出し、コンピテントＤＨ５α細胞に形質転換した。
１２．コロニーを単離し、５ｍＬのＬＢ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン中で一晩、３７℃で培養した。
１３．キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）法によって１．５ｍＬの培養物からＤＮＡをミニプレップし、配列決定のために処理した。
１４．有意な相同性を有する配列に関して、配列を文献と比較した。
【００６４】
相同性解析
６つのクローンを得て、それらの配列を、以下の論文に開示されている配列と比較した。
ビネトゥリー−トゥールネール（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ）Ｒ、デマンジェル（Ｄｅｍａｎｇｅｌ）Ｃ、マラヴォー（Ｍａｌａｖａｕｄ）Ｂ、ヴァッシー（Ｖａｓｓｙ）Ｒ、ロイエ（Ｒｏｕｙｒｅ）Ｓ、クレーマー（Ｋｒａｅｍｅｒ）Ｍ，、プルエー（Ｐｌｏｕｅｔ）Ｊ、ダービン（Ｄｅｒｂｉｎ）Ｃ、ペレ（Ｐｅｒｒｅｔ）Ｇ、メイジー（Ｍａｚｉｅ）ＪＣ．、２０００年、「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）媒介性血管新生をブロックするペプチドの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＶＥＧＦ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」、ザ・ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）１９（７）、１５２５−３３頁。ルー（Ｌｕ）Ｄ、シェン（Ｓｈｅｎ）Ｊ、ヴィル（Ｖｉｌ）ＭＤ、チャン（Ｚｈａｎｇ）Ｈ、ヒメネス（Ｊｉｍｅｎｅｚ）Ｘ、ボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）Ｐ、ヴィッテ（Ｗｉｔｔｅ）Ｌ、チュー（Ｚｈｕ）Ｚ．、２００３年、「中和活性の促進のための、血管内皮増殖因子受容体２に対して惹起したピコモル親和性ヒト抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択の調整（Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａ  ｐｉｃｏｍｏｌａｒ  ａｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２７８（４４）、４３４９６−５０７頁。
【００６５】
ビネトゥリー−トゥールネール（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ）らは、固定したＫＤＲを用いて、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングした。ルー（Ｌｕ）らは、ファージディスプレイライブラリーを用いて、２つの完全ヒト中和ＫＤＲ特異的抗体の細かい結合特異性をさらに定義した。図１に示されるように、ミニセルディスプレイスクリーニングによって同定されたクローンを上で参照した２つの論文に開示されるペプチドと比較することによって、一連のサブグループが同定された（図１、ベクターＮＴＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ）を用いたクラスタルＷ（ｃｕｓｔａｌＷ）によって生じた系統樹参照）。ビネトゥリー−トゥールネール（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ）らの論文からのＥｍｂｏＫ４（配列番号３８）、ＥｍｂｏＫ５（配列番号３９）およびＥｍｂｏＶ４（配列番号４０）のペプチド、ルー（Ｌｕ）らの論文からの２つのペプチド１Ａ１１および２Ｄ５（同じ配列（配列番号４１）を有し、そのため１つのものと見なす）、ならびにミニセルディスプレイ技術によって得られたクローンＫ３（配列番号４２）を含む、アラインメントツリーの頂点にあるサブグループが特に興味深い。これらのペプチドのアラインメントを、図２に示す。
【００６６】
図２におけるペプチド配列の間の高レベルの配列相同性から、Ｋ３ペプチドまたはこのペプチドの部分断片が抗血管新生特性を有するであろうことが示唆される。このペプチドの配列を用いたさらなる相同性検索によって、Ｋ３と、ビネトゥリー−トゥールネール（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ）らによって開示された２つのペプチドＥｍｂｏＶ１（配列番号４３）およびＥｍｂｏＫ３（配列番号４４）との間の、別のまとまりの相同性が明らかになった。これらのペプチドの全ての最終的なアラインメントを、図３に示す。このアラインメントによって、ペプチドの全ての間で高度に保存されたコンセンサス配列、ＬＰＰＨＳＳの存在が明らかになった。ビネトゥリー−トゥールネール（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ）らは生物学的活性へのＬＰＰ配列の関連性を論じ、単離されたペプチドのうち２つにおけるＨＳＳ配列の存在について触れたが、単一のペプチドにおけるこれらの部分配列両方の組み合わせは開示されなかった。それにもかかわらず、配列のアラインメント、およびミニセルディスプレイ技術を用いて同定されたＫ３ペプチドとの比較を考慮して、本発明者らは、配列ＬＰＰＨＳＳ（配列番号１）を有するペプチドは、２つの単離された配列そのもののどちらとも実質的に異りより有用な抗血管新生特性を有するであろうと予想した。
【００６７】
また、相同性アラインメントによって、コンセンサスの２つのさらなる領域が明らかになった。ペプチド１Ａ１１のアミノ末端部分に存在する領域ＡＴＳは、ＥｍｂｏＶ１において部分的に保存されている（図２参照）。さらに、ＥｍｂｏＫ４のアラインメントにセリン残基が存在する。したがって、本発明者らはまた、この領域が、抗血管新生特性に寄与するであろうこと、および配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳ（配列番号１０）を有するペプチドが、３つの単離された配列のみのいずれとも実質的に異なりより有用な抗血管新生特性を有するであろうことを予想した。相同な他の領域は、ペプチド１Ａ１１のＣ末端領域およびペプチドＫ３に存在する部分配列ＱＳＰを包含する。また、セリンは、ペプチドＥｍｂｏＫ３において保存されている。したがって、本発明者らはまた、この領域が抗血管新生特性に寄与するであろうこと、および配列ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰ（配列番号１６）を有するペプチドが、４つの単離された配列のみのいずれとも実質的に異なりより有用な抗血管新生特性を有するであろうことを予想した。
【００６８】
実施例２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＫＤＲ結合ペプチドの抗血管新生活性の特徴付け
方法
以下のペプチドを合成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの抗血管新生活性に関して試験した。
ＳＴ１００，０３７  ＬＰＰＨＳＳ（配列番号１）
ＳＴ１００，０３８  ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰ（配列番号１６）
ＳＴ１００，０３９  ＬＰＰＨＳＳＱＳＰ（配列番号１３）
ＳＴ１００，０４０  ビオチン−ＬＰＰＨＳＳＱＳＰ（配列番号１３）
【００６９】
また、ＳＴ１００，０３８の以下のバリアントを、Ｌ−アミノ酸とは異なってＤ−アミノ酸を用いて合成し、活性および血清中安定性に対する修飾の効果を試験した。
ＳＴ１００，０４５  ＡＴＳＬＰＰＨＳＳＱＳＰ（配列番号１６）
ＳＴ１００，０５９  ＰＳＱＳＳＨＰＰＬＳＴＡ（レトロインベルソペプチド）（配列番号３７）
【００７０】
抗血管新生化合物を試験するのに用いられる標準的細胞株であるウシ網膜内皮細胞（ＢＲＥ）のＶＥＧＦ媒介性生存／増殖の阻害のレベルを測定することによって、ペプチドの抗血管新生活性を試験した。細胞をキャンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）ＥＧＭ−２ＭＶ培地中で維持した。１日目に、細胞を６時間または一晩のいずれかの間飢餓状態にし、その後トリプシン処理し、１００μｌのｉｎ  ｖｉｔｒｏジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）オプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）＋１％ウシ胎仔血清中で９６ウェルプレートに平板培養した。次いで、適切な場合には、終濃度２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦならびに終濃度１２．５、２５、５０および１００μｇ／ｍｌの種々のペプチドに加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）オプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）＋１％ウシ胎仔血清の１００μｌのアリコートをさらにウェルに加えた。７２時間のインキュベーションの後、各ウェルの生細胞の数を、ＷＳＴ−１アッセイ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて測定した。
【００７１】
表２は、４４０ｎｍで測定した、ＷＳＴ−１誘導比色変化の量を報告する。各処理のデータポイントを平均し、ペプチド名の下に示す。ＶＥＧＦ＋／−ウェルを平均し、対応する定義の隣に示す。ペプチド処理したウェルとＶＥＧＦのみのウェルとの間のスチューデントｔ検定値を、平均の隣の縦列で計算する。
【００７２】
各データポイントの３つのウェルの平均を図４にグラフで示し、ペプチドの濃度の増大によってどのようにＷＳＴ−１の量、ひいては生細胞の数が減少するかを示す。データのスチューデントｔ検定解析から、これらの減少が、ＳＴ１００，０３８の２つの最も高い濃度で統計的に有意であることが明らかであり、仮定されたように最も活性のあるペプチドと思われる。２５μｇ／ｍｌより高い濃度は、ＷＳＴ−１値における統計的に有意なＶＥＧＦ誘導の増加を完全に廃し、実際に、結果としてＶＥＧＦ刺激のない細胞で見られるよりもさらに低い値を生じた。最も可能性のある説明は、培地中に存在する増殖因子（ＶＥＧＦ）による細胞の刺激をペプチドが阻害するというものである。
【００７３】
図５は、種々の処理に供された数および形態の例を示す顕微鏡写真を表す。非常に少数の細胞しか含まない、１００μｇ／ｍｌのＳＴ１００，０３８で処理したウェルを、特に注目すべきである。存在する、数少ない細胞は、アポトーシス（細胞死）の兆候を示す。これは、陽性対照（ＶＥＧＦで処理した細胞）と対照的であり、ＶＥＧＦを施していない細胞と同様である。
【００７４】
【表２】
2008509157.tif 000003
【００７５】
最大濃度２００μｇ／ｍｌまで、より高い濃度のペプチドを用いて実験を繰り返した。これは、相当量の水の添加を必要とした（ペプチドは水に可溶性であり、２ｍｇ／ｍｌのストック溶液として維持される）。したがって、水の添加自体が何らかの阻害効果を有するかどうかを試験した。前述同様に、キャンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）ＥＧＭ−２ＭＶ培地中でＢＲＥを維持した。１日目に、６時間または一晩のいずれかの間細胞を飢餓状態にし、その後トリプシン処理し、１００μｌのオプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）＋１％ウシ胎仔血清中で９６ウェルプレートに平板培養した。次いで、適切な場合には、終濃度２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦならびに終濃度２５、５０、１００および２００μｇ／ｍｌの種々のペプチドをさらに含むウェルに、オプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）＋１％ウシ胎仔血清の１００μｌのアリコートを加えた。７２時間のインキュベーションの後、各ウェルの生細胞の数を、ＷＳＴ−１アッセイ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて測定した。
【００７６】
表３は、４４０ｎｍで測定した、ＷＳＴ−１誘導比色変化の量を報告する。各処理のデータポイントを平均し、ペプチド名の下に示す。ＶＥＧＦ＋／−ウェルを平均し、対応する定義の隣に示す。ペプチド処理したウェルとＶＥＧＦのみのウェルとの間のスチューデントｔ検定値を、平均の隣の縦列で計算する。
【００７７】
各データポイントの３つのウェルの平均を図６にグラフで示す。データのスチューデントｔ検定解析から、ＷＳＴ−１の減少が、これまでに示されているように最も活性の高いペプチドであるＳＴ１００，０３８の全ての濃度で統計的に有意であることが明らかである。２５μｇ／ｍｌより高い濃度は、ここでも結果として、ＶＥＧＦ刺激なしで見られるよりも低い値を生じた。
【００７８】
【表３】
2008509157.tif 000004
【００７９】
実施例３．１％または１０％血清中でのペプチドの安定性研究
試料調製
水に溶解した１ｍＭペプチドのストック溶液を作製した。次いでストックを、オプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）培地＋１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン＋１％ウシ胎仔血清中またはオプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋１０％ウシ胎仔血清中のいずれかに、１００μＭに希釈した。希釈した試料を、３７度のインキュベーター中の２４ウェル組織培養プレートに入れた。４、６、１８、２４、４８および７２時間目に５０〜１００μｌのアリコートを取り除き、分析まで−７０℃で凍結した。
【００８０】
ＶＣ／ＭＳによる分析
２０μｌの試料を、Ｃ１８逆相カラム（４．８×２５０ｍｍ）上で、アセトニトリル／水０．１％ＴＦＡのグラジエントで分離し、シングルクワッド質量分析計を用いて分析した。ペプチドの質量に依存して、一価または多価のピークを検出した。質量分析計を検出器として用いて生じたクロマトグラムにおけるピーク領域の消失、およびピークの同時の出現による、破壊産物からの質量分析における主要ピークの消失の２つの方法で、ペプチドの分解を測定した。
【００８１】
結果
１％血清において、ＳＴ１００，０３８の２５％が１８時間目で、３３％が２４時間目で、６０％が４８時間目で、および８５％が７２時間目で失われていた。１０％血清において、ペプチドの５０％が４時間目で、６５％が６時間目で分解され、１８時間目では残っているものがなかった。全ての切断は、セリンのＮ末端のようであった。１％血清において、ペプチドは、７２時間の時点を通して存続し続ける、より小さいペプチドに分解した。１０％血清においては、より小さいこれらのペプチドであっても、４８時間目までには殆ど検出されなくなっていた。
【００８２】
ＳＴ１００，０３の、血清中での比較的限定された安定性を考慮して、ＳＴ１００，０４５およびＳＴ１００，０５９を合成した。ＳＴ１００，０４５は、ＳＴ１００，０３８の同じ配列を有するが、Ｄ−アミノ酸でできている。ＳＴ１００，０５９は、逆転した配列を有するＤ−アミノ酸ペプチド（レトロインベルソペプチド）である。これらを、上述のプロトコールを用いて血清中での安定性に関して試験すると、試験したいずれの条件下でも分解しなかった。
【００８３】
Ｄ−アミノ酸ペプチドは血清中でより安定性が高いと当該分野で一般に理解されているが、Ｄ−アミノ酸ペプチドでのＬ−アミノ酸ペプチドの置換は、活性があって安定なペプチドを、自動的には生じない。ＳＴ１００，０３８、ＳＴ１００，０４５およびＳＴ１００，０５９系列での下記の独自のデータによって、Ｄ−アミノ酸を含むＳＴ１００，０３８と同じ配列であるＳＴ１００，０４５はＬ−アミノ酸の相当物よりも生物学的活性がいくらか低いが、レトロインベルソＳＴ１００，０５９のみが依然として生物学的に活性があり、血清中安定性があることが明らかになった。
【００８４】
実施例４．Ｄ−アミノ酸ペプチド誘導体の抗血管新生活性の特徴付け
次いで、ＳＴ１００，０４５の活性を、ＳＴ１００，０３８のものと比較した。前述同様に、ＢＲＥをキャンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）ＥＧＭ−２ＭＶ培地中で維持した。１日目に、細胞を６時間または一晩のいずれかの間飢餓状態にし、その後トリプシン処理し、１００μｌのオプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）＋１％ウシ胎仔血清中で９６ウェルプレートに平板培養した。次いで、適切な場合には、終濃度２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦならびに終濃度５、１２．５、２５および５０μｇ／ｍｌの種々のペプチドに加えて、１００μｌのオプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）＋１％ウシ胎仔血清をさらにウェルに加えた。７２時間のインキュベーションの後、各ウェルの生細胞の数を、ＷＳＴ−１アッセイ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて測定した。
【００８５】
表４は、４４０ｎｍで測定した、ＷＳＴ−１誘導比色変化の量を報告する。各処理（それぞれ５０、２５、１２．５および５マイクログラム／ｍｌ）のデータポイントを平均し、ペプチド名の下に示す。ＶＥＧＦ＋／−ウェルを平均し、対応する定義の隣に示す。ペプチド処理したウェルとＶＥＧＦのみのウェルとの間のスチューデントｔ検定値を、平均の隣の縦列で計算する。
【００８６】
各データポイントの３つのウェルの平均を図７にグラフで示す。データのスチューデントｔ検定解析から、ＷＳＴ−１の減少が、ＳＴ１００，０３８およびＳＴ１００，０４５の最も高い濃度で統計的に有意であることが明らかである。２５μｇ／ｍｌより高い濃度は、ここでも、結果としてＶＥＧＦ刺激なしよりも低い値を生じた。
【００８７】
図８の写真は、種々の処理に供された数および形態の例を示す。非常に少数の細胞しか含まない、５０μｇ／ｍｌのＳＴ１００，０３８またはＳＴ１００，０４５のいずれかで処理したウェルが、特に注目に値する。さらに、存在する、少ししかない細胞は、アポトーシス（細胞死）の兆候を示す。これは、陽性対照（ＶＥＧＦで処理した細胞）と対照的であり、ＶＥＧＦを施していない細胞と同様である。
【００８８】
【表４】
2008509157.tif 000005
【００８９】
実施例５．接着細胞に対するペプチドの抗血管新生活性の特徴付け
この実験において、細胞が一晩接着した後、ペプチドをウェルに加えた。１日目に、細胞を６時間飢餓状態にし、次いでトリプシン処理し、１００μｌのオプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）＋１％ウシ胎仔血清中で９６ウェルプレートに平板培養した。翌朝、細胞はすでに接着しており、適切な場合には、終濃度２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦならびに終濃度１０、３０、５０および７５μｇ／ｍｌの種々のペプチドに加えて、１００μｌのオプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）＋１％ウシ胎仔血清をウェルに加えた。７２時間のインキュベーションの後、各ウェルの生細胞の量を、ＷＳＴ−１アッセイ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて測定した。
【００９０】
表５は、４４０ｎｍで測定した、ＷＳＴ−１誘導比色変化の量を報告する。各処理のデータポイント（それぞれ７５、５０、３０または１０μｇ／ｍｌ）を平均し、ペプチド名の下に示す。ＶＥＧＦ＋／−ウェルを平均し、対応する定義の隣に示す。ペプチド処理したウェルとＶＥＧＦのみのウェルとの間のスチューデントｔ検定値を、平均の隣の縦列で計算する。
【００９１】
各データポイントの３つのウェルの平均を図９にグラフで示す。データのスチューデントｔ検定解析から、ＷＳＴ−１の減少が、ＳＴ１００，０３８の２つの最も高い濃度で統計的に有意であることが明らかである。２５μｇ／ｍｌより高い濃度は、ここでも結果として、ＶＥＧＦ刺激なしで見られるよりも低い値を生じた。しかしながら、ＳＴ１００，０４５では効果が見られなかった。これは、ＳＴ１００，０３８のみが、プレートに接着した後にＢＲＥの増殖を阻害できる、ＳＴ１００，０３８とＳＴ１００，０４５との活性における興味深い違いを表す。以下の実験によって、この違いが確認された。
【００９２】
表６は、ＢＲＥへの、接着前および後のＳＴ１００，０３８およびＳＴ１００，０４５の添加の繰り返しを報告する。各処理のデータポイントを平均し、ペプチド名の下に示す。ＶＥＧＦ＋／−ウェルを平均し、対応する定義の隣に示す。ペプチド処理したウェルとＶＥＧＦのみのウェルとの間のスチューデントｔ検定値を、平均の隣の縦列で計算する。
【００９３】
これまでに見られたように、両方のペプチドはＢＲＥ増殖および生存を阻害した（図１０参照）。また、オプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）＋１０％ウシ胎仔血清中で増殖させた細胞の処理においてＳＴ１００，０３８を試験したところ、これらの条件下でも、ＢＲＥ増殖および生存が阻害された（表６、縦列８〜１１、横行Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ）（図１１）。
【００９４】
表７は、ＢＲＥへの、接着した後のＳＴ１００，０３８およびＳＴ１００，０４５の添加の反復実験を報告する。希釈剤に調節するために、示される対照ウェルに、１０％水もしくは５％水を添加するか、または水を添加しなかった。ＶＥＧＦ＋／−ウェルを平均し、対応する定義の隣に示す。ペプチド処理したウェルとＶＥＧＦのみのウェルとの間のスチューデントｔ検定値を、平均したものの隣の縦列で計算する。これまでに見られたように、ＳＴ１００，０３８のみが、細胞が接着した後に加えた場合に、実質的にＢＲＥ増殖および生存を阻害した（図１２参照）。
【００９５】
【表５】
2008509157.tif 000006
【００９６】
【表６】
2008509157.tif 000007
【００９７】
【表７】
2008509157.tif 000008
【００９８】
実施例６．レトロインベルソペプチド誘導体の抗血管新生活性の特徴付け
上記の結果から、ＳＴ１００，０３８およびＳＴ１００，０４５の両方がＶＥＧＦ媒介性ＢＲＥ増殖および生存を阻害し得、ＳＴ１００，０３８はより広範な条件で効果的であることが示された。したがって、ＳＴ１００，０３８の逆転した配列を有するＤ−アミノ酸ペプチドであるＳＴ１００，０５９を作製することにした。このペプチドは、０３８の「レトロインベルソ」バージョンを表す。かかるペプチドが、より安定である一方で、受容体における同じ結合部位に正確に適合する証拠が、文献の中にある。
【００９９】
この実験において、ＳＴ１００，０５９の活性を、ＳＴ１００，０３８のものと比較して試験した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、キャンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）ＥＧＭ−２ＭＶ培地中で維持した。１日目に細胞をトリプシン処理し、１００μｌのオプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）＋２％ウシ胎仔血清中、９６ウェルプレートに平板培養した。あるいは、次いで、適切な場合には、終濃度１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦならびに終濃度１０、３０または１００μｇ／ｍｌの種々のペプチドに加えて、１００μｌのオプティＭｅｍ（ＯｐｔｉＭｅｍ）をウェルに加えた。７２時間のインキュベーションの後、各ウェルの生細胞の数を、ＷＳＴ−１アッセイ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて測定した。
【０１００】
表８は、４４０ｎｍで測定した、ＷＳＴ−１誘導比色変化の量を報告する。ＶＥＧＦ＋／−ウェルを平均し、対応する定義の隣に示す。ペプチド処理したウェルとＶＥＧＦのみのウェルとの間のスチューデントｔ検定値を、平均の隣の縦列で計算する。標準偏差（ＳＴＤ）を、スチューデントｔ検定の隣の縦列で計算する。
【０１０１】
各データポイントの４つのウェルの平均をグラフで示す（図１３）。データのスチューデントｔ検定解析から、ＷＳＴ−１の減少が、ＳＴ１００，０３８の２つの最も高い濃度およびＳＴ１００，０５９の最も高い濃度で統計的に有意であることが明らかである。したがって、ＳＴ１００，０５９は、ＳＴ１００，０３８と同様の阻害活性を有する。
【０１０２】
【表８】
2008509157.tif 000009
【０１０３】
実施例７．ｉｎ  ｖｉｖｏでのＫＤＲ結合ペプチドの抗血管新生活性の特徴付け
本発明のペプチドを、抗血管新生活性のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいても試験した。このモデルは、ＶＥＧＦ誘導血管新生を、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスにおいてマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を充填したアンジオリアクターで起こるとして、解析する（ゲデズ（Ｇｕｅｄｅｚ）ら、２００３年、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）１６２、１４３１−１４３９頁）
【０１０４】
方法
１．アンジオリアクターの調製
プレキシグラス鋳型および片刃かみそりを用いて、無菌のポリエチレンチューブ（内径０．１４ｃｍ）を標準的な１ｃｍの長さに切断する。これらのチューブの一端をマニキュア液で密閉する。チューブの中に、示されるペプチドありまたはなしで、５００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含有する２０μｌのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から入手し、増殖因子を含まない）を注入する。マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を室温で１時間重合させた後、野生型ＦＶＢ／Ｎ雌マウス（８〜１０週齢）の両側腹にアンジオリアクターを皮下移植する。
２．血管新生の測定
１０日後、アンジオリアクターにおける血管新生を測定する。アンジオリアクターの回収の２０分前に、マウスに、１００μｌの、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストランの、尾静脈を介した注射を施す。血管機能の定量化を、アンジオリアクターからのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の除去によって行い、フルオスターギャラクシー（ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙ）マイクロプレートリーダー（励起４８５ｎｍ、放出５２０ｎｍ、ドイツ連邦共和国のＢＭＧラブテクノロジーズ・ゲーエムベーハー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて、蛍光を測定する。１０個のアンジオリアクターの平均相対蛍光±標準偏差を測定し、統計解析を行う。
３．実験１の概略説明
研究の結果の統計解析が可能であるためには、異なる群の実験が、５匹のマウスに１０個のアンジオリアクターを含まなければならない。動物の種々の群を、以下で表９に列挙する。
【０１０５】
【表９】
2008509157.tif 000010
【０１０６】
ＶＥＧＦ濃度：５００ｎｇ／ｍｌマトリゲル（３０μｌ／アンジオリアクター）
トロンボスポンジンペプチド６１６：ＳＰＷＳＳＣＳＶＴＣＧＤＧＶＩＴＲＩＲ（配列番号４５）（イルエラ−アリスペ（Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅ）ら、１９９９年、サーキュレーション（Ｃｉｒｃ．）１００、１４２３−１４３１頁）。
【０１０７】
実験の定量的結果を表１０に表す。図１４の写真は、マウスからの除去の後のアンジオリアクターを示し、血管新生のレベルの定性的評価を表す。陽性対照群の１０個のアンジオリアクター（ＶＥＧＦのみで処理したもの）のうち、６個のみが解析できた。これらの６個のうち、３個だけがＶＥＧＦの応答していることがわかった（以前の実験および上記の非刺激ＰＢＳ対照と同程度の値）。これらの３個のみが解析に用いられた場合、より低い用量、すなわち５０マイクログラム／ｍｌに相当する４０ミクロモルのＳＴ１００，０３８およびＳＴ１００，０４５がＶＥＧＦ媒介性血管新生を明らかに阻害し、ＳＴ１００，０３８がＳＴ１００，０４５より活性が高く、非刺激ＰＢＳ対照までおよびＴＳＰ６１６ペプチドを用いて得られたレベルと同様までレベルを下げることは明らかである（図１５）。これらの結果がＢＲＥ細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られたものを反映することは注目に値する。このように、５０μｇ／ｍｌのＳＴ１００，０３８は、ＶＥＧＦ刺激生存／増殖を完全に阻害することができた。
【０１０８】
【表１０】
2008509157.tif 000011
【０１０９】
【表１１】
2008509157.tif 000012
【０１１０】
４．実験２の概略説明
試験した動物の種々の群を以下で表１１に列挙する。
【０１１１】
【表１２】
2008509157.tif 000013
【０１１２】
ＶＥＧＦ濃度：５００ｎｇ／ｍｌマトリゲル（３０μｌ／アンジオリアクター）
トロンボスポンジンペプチド６１６：ＳＰＷＳＳＣＳＶＴＣＧＤＧＶＩＴＲＩＲ（配列番号４５）（イルエラ−アリスペ（Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅ）ら、１９９９年、サーキュレーション（Ｃｉｒｃ．）１００、１４２３−１４３１頁）。
【０１１３】
実験の定量的結果を表１２に示す。
【０１１４】
【表１３】
2008509157.tif 000014
【０１１５】
以下は、種々の群のボンフェローニ多重複数比較統計検定を含む。
【０１１６】
【表１４】
2008509157.tif 000015
【０１１７】
図１６のグラフは、値の中央値を報告することによって結果を要約しており、ＳＴ１００，０３８およびＳＴ１００，０５９ペプチドがＶＥＧＦ媒介性血管新生を明らかに阻害することを示す。ＳＴ１００，０５９はＳＴ１００，０３８より活性が高く、血管新生のレベルを非刺激ＰＢＳ対照までおよびＴＳＰ６１６ペプチドを用いて得られたレベルと同様まで下げる。これらの結果がＢＲＥ細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られたものを反映することは注目に値する。また、実験１と２との比較から、レトロインベルソペプチドＳＴ１００，０５９は、Ｌ−アミノ酸をＤ−アミノ酸と単に置換することによって生じるペプチドであるＳＴ１００，０４５より活性が高いことが明らかである。
【０１１８】
実施例８．ｉｎ  ｖｉｖｏでのＫＤＲ結合ペプチドの抗腫瘍活性の特徴付け
本発明のペプチドを、抗腫瘍活性のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて試験した。このモデルは、未処理、または毎日腹腔内に２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ用量のいずれかのＳＴ１００，０５９で処理した皮下Ｂ１６黒色腫腫瘍の増殖を比較する。
【０１１９】
方法
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２０±２ｇの平均体重で得た。マウスＢ１６−Ｆ１黒色腫細胞を皮下移植した（動物１匹あたり５×１０５細胞）。細胞の注射の翌日から開始して、ペプチド（水中に製剤化した）を毎日腹腔内投与した。腫瘍は、細胞の注射の９日後頃に蝕知可能になった。次いで、腫瘍を２日ごとに測定した。
【０１２０】
実験の定量的結果を、表１４に示す。
【０１２１】
【表１５】
2008509157.tif 000016
【０１２２】
【表１６】
2008509157.tif 000017
【０１２３】
図１７は、毎日腹腔内に２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのＳＴ１００，０５９で処理したｉｎ  ｖｉｖｏでの皮下Ｂ１６黒色腫腫瘍の増殖の阻害を、未処理対照と比べて比較するグラフである。ＳＴ１００，０５９は、皮下Ｂ１６黒色腫腫瘍の増殖を、統計的に有意に、用量反応的に阻害することができる。このモデルでのＳＴ１００，０５９の試験を２回繰り返すと、同様の結果になった。
【０１２４】
実施例９．ｉｎ  ｖｉｖｏでのＫＤＲ結合ペプチドの抗転移活性の特徴付け
本発明のペプチドを、ｉｎ  ｖｉｖｏの黒色腫肺転移モデルにおいても試験した。このモデルは、未処理または毎日腹腔内に１００ｍｇ／ｋｇのＳＴ１００，０５９で処理したかのいずれかのマウスＢ１６黒色腫腫瘍肺転移の数および大きさを比較する。
【０１２５】
方法
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、平均体重２０±２ｇで得た。マウスＢ１６−Ｆ１黒色腫細胞を培養物中で増殖させ、８５％のコンフルエンスで採取し、外側尾静脈を介して１００μｌの生理食塩水に接種した（５×１０５細胞／マウス）。
【０１２６】
１４日目にマウスを麻酔下で屠殺し、ブワン固定液中で肺を一晩固定した。肺の全ての葉で、肺転移を同定し、数えた。
【０１２７】
実験の概略説明
動物の種々の群を、以下で表１５に列挙する。
【０１２８】
【表１７】
2008509157.tif 000018
【０１２９】
実験の定量的結果を表１６に示す。
【０１３０】
【表１８】
2008509157.tif 000019
【０１３１】
結果を要約した図１８のグラフは、ＳＴ１００，０５９が肺転移の数を明らかに減少させ、値が３０の単一の異常値が検定値に含まれない場合に多重比較にダネット検定を用いたＡＮＯＶＡ解析Ｐ＜０．０５で、毎日腹腔内に１００ｍｇ／ｋｇ／マウスのＳＴ１００，０５９が統計的に有意であることを示す。このモデルでＳＴ１００，０５９の試験を繰り返すと、同様の結果になった。
【０１３２】
実施例１０．ｉｎ  ｖｉｖｏでのＫＤＲ結合ペプチドの抗腫瘍活性の特徴付け
本発明のペプチドを、抗腫瘍活性のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて試験した。このモデルは、毎日腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのＳＴ１００，０５９、ドセタキセルまたは生理食塩水で処理したヌードマウスにおけるヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍異種移植の増殖を比較する。
【０１３３】
方法
５から６週齢の間の、体重およそ２０ｇの雌ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を、ハーラム・インク（Ｈａｒｌａｍ，  Ｉｎｃ．）から得た。トロカールによって、動物に、ヌードマウスホストにおいて皮下で増殖した腫瘍から採取したヒト腫瘍の断片を皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍の大きさがおよそ６０〜７５ｍｇのとき（移植後約１０〜１５日）に、処理群および対照群に、動物を対にした。各群は８〜１０匹のマウスを含み、そのぞれぞれの耳にタグを付け、実験を通して個別に追跡した。
【０１３４】
薬物または対照の投与は、約７０ｍｇの腫瘍サイズで動物を対にした日に開始した（１日目）。１日目から始めて週２回、マウスを計量し、カリパスを用いて腫瘍の寸法を得た。標準式（Ｗ２×Ｌ）／２によって、これらの腫瘍寸法を腫瘍重量（ｍｇ）に換算した。実験終了時に、マウスを計量し、屠殺し、その腫瘍を摘出した。腫瘍を計量し、群あたりの平均および中央値の腫瘍重量を計算した。
【０１３５】
動物の種々の群を、以下で表１７に示す。
【０１３６】
【表１９】
2008509157.tif 000020
【０１３７】
実験の定量的結果を表１９に示す。各群について、表は、上述のように得たカリパス測定および実際の腫瘍重量を報告する。また、表は、表１８に示される以下の指数に基づいて計算した壊死スコアを報告する。
【０１３８】
【表２０】
2008509157.tif 000021
【０１３９】
腫瘍重量に関する図１９ならびに壊死スコアおよび壊死のあった動物の数に関する図２０のグラフによって、２組のデータを要約する。処理した腫瘍が、カリパス評価した重量対実際の測定した重量で大きな違いを有することが明らかに観察できる。また、処理した腫瘍における中間の実際の重量は、２０ｍｇ／ｋｇ＜１０ｍｇ／ｋｇ＜対照で用量依存的に、対照におけるよりも小さい。最後に、壊死のあった動物の数および壊死の全体のレベルの両方とも、用量依存的に、処理した動物でより高い。
【０１４０】
重量の違いの理由は、壊死スコア、および壊死のあった動物の数の両方によって測定される、処理した腫瘍に存在する壊死の量が、かなり多いことよる。抗血管新生剤による腫瘍壊死の誘導は、文献において十分特徴付けられており、その抗腫瘍作用機序の一部である。したがって、ＳＴ１００，０５９は、免疫無防備状態マウスで増殖したヒト乳癌腫瘍の増殖および血管新生を阻害し得ると結論付ける。
【０１４１】
【表２１】
2008509157.tif 000022
【０１４２】
実施例１１．ＶＥＧＦ誘導細胞内シグナル伝達のＳＴ１００，０５９阻害
抗血管新生化合物を試験するのに用いられる標準的細胞株であるヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＶＥＧＦ誘導細胞内シグナル伝達の阻害のレベルを測定することによって、ペプチドの抗血管新生活性を試験した。内皮細胞におけるＫＤＲのＶＥＧＦ刺激は、結果として、リン酸化ＭＡＰＫに特異的だが全ＭＡＰＫに特異的でない抗体を用いて検出されるＭＡＰＫのリン酸化を生じる。
【０１４３】
キャンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）ＥＧＭ−２ＭＶ培地中で細胞を維持した。１日目に、Ｍ２００培地（カスケード・バイオロジカルス（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））中の１％ＦＢＳ中で細胞を一晩飢餓状態にした。その後、培地を血清不含培地±ペプチドと交換し、２時間インキュベートした。
【０１４４】
次いで、培地を、２５ｎｇ／ｍｌのヒトＶＥＧＦ１６５を含有する血清不含培地と交換し、１０分間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ中２ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウムで細胞を洗浄し、２ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウムおよび１ｍＭのＰＭＳＦを含むＮＰ４０溶解バッファー中に採取し、次いでウエスタンブロットによって解析した。
【０１４５】
図２１のグラフは、ＶＥＧＦの結合ひいてはその受容体であるＫＤＲの活性化をブロックする化合物に期待されるように、ＳＴ１００，０５９の濃度の増大によってどのようにＭＰＫリン酸化のレベルが減少したかを示す。
【０１４６】
実施例１２．ＶＥＧＦ誘導遺伝子発現変化のＳＴ１００，０５９阻害
ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ誘導遺伝子発現変化の阻害のレベルを測定することによって、ペプチドの抗血管新生活性を試験した。内皮細胞におけるＫＤＲのＶＥＧＦ刺激は、結果として、これまでに特徴付けられている遺伝子発現の実質的な変化を生じる（特許出願第２００２０１３２９７８号明細書、ガーバー（Ｇｅｒｂｅｒ）ら参照）。
【０１４７】
細胞をＭ２００培地（カスケード・バイオロジカルス（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））中で維持した。１日目に、Ｍ２００培地（カスケード・バイオロジカルス（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））中１％のＦＢＳ中で一晩細胞を飢餓状態にした。翌朝、培地を血清不含培地（対照）または２５ｎｇ／ｍｌのヒトＶＥＧＦ１６５＋／−２００マイクログラム／ｍｌのＳＴ１００，０５９ペプチドを含有する培地と交換し、２４時間インキュベートした。
【０１４８】
次いで培地を吸引し、製造業者によって記載されているように、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））で細胞を溶解し、全ＲＮＡを生じるよう処理した。
【０１４９】
次いで、全ＲＮＡの１０マイクログラムのアリコートを処理し、製造業者によって記載されているように、アフィメトリックス・ヒューマンＵ１３３プラス２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０）アレイ上で加水分解した。アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ＧＣＯＳソフトウエアを用いて、得られたデータを解析した。これは、アレイ上の各転写産物に関して、統計的アルゴリズムを使用して定量的値（シグナル強度）および定性的値（有無）を計算する。次いで、３つの試料からのデータを比較し、対照と比較したＶＥＧＦによって、修飾、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかをされた遺伝子を同定し、次いでそのレベルを、ＳＴ１００，０５９での処理の後に対照と同様のレベルに戻した。
【０１５０】
図２２および２３は、結果を図表で表している。これらの結果から、ＳＴ１００，０５９が、これまでに文献に記載されている多くの遺伝子に関してＶＥＧＦ誘導遺伝子発現変化を阻害できることが示される。０５９がＫＤＲへのＶＥＧＦの結合をブロックするだけで、もう一方の受容体であるＦＬＴ−１への結合を阻害しないと考えれば、ＶＥＧＦのＫＤＲ選択性変異体によって特異的にアップレギュレーションされている、ヤン（Ｙａｎｇ）らに記載されている遺伝子が興味深い。これらの遺伝子のうち、いくつかはまた、本実験においてアップレギュレーションされており、次いで、ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ７ｘ上昇、スタニオカルシン１、２．４ｘ上昇、インスリン様増殖因子結合タンパク質５、４．５ｘ上昇、γシヌクレイン２ｘ上昇およびｅｔｓ２、２，５倍上昇を含む、０５９によって完全に阻害される。遺伝子ダウン症候群重要領域遺伝子１および遺伝子ペプチジルアルギニンデイミナーゼタイプ１を、例として用いる。
【０１５１】
本明細書中で論じられる全ての出版物、特許および特許出願は、参照によって本明細書中に援用される。前述の詳述において、本発明を、その特定の好ましい実施形態に関して説明し、多くの詳細を実例の目的で述べてきたが、本発明がさらなる実施形態を許容することおよび本明細書中に記載される特定の詳細が本発明の基本的原理を逸脱することなく相当に変化し得ることは、当業者に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、ベクターＮＴＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ）を用いたクラスタルＷ（ｃｕｓｔａｌＷ）多重配列アラインメントアルゴリズムによって生じた系統樹を示し、ミニペプチドディスプレイ技術を用いて同定されたペプチドと、ビネトゥリー−トゥールネール（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ）Ｒ、デマンジェル（Ｄｅｍａｎｇｅｌ）Ｃ、マラヴォー（Ｍａｌａｖａｕｄ）Ｂ、ヴァッシー（Ｖａｓｓｙ）Ｒ、ロイエ（Ｒｏｕｙｒｅ）Ｓ、クレーマー（Ｋｒａｅｍｅｒ）Ｍ、プルエー（Ｐｌｏｕｅｔ）Ｊ、ダービン（Ｄｅｒｂｉｎ）Ｃ、ペレ（Ｐｅｒｒｅｔ）Ｇ、メイジー（Ｍａｚｉｅ）ＪＣ、ザ・ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）２０００年４月３日、１９（７）、１５２５−３３およびルー（Ｌｕ）Ｄ、シェン（Ｓｈｅｎ）Ｊ、ヴィル（Ｖｉｌ）ＭＤ、チャン（Ｚｈａｎｇ）Ｈ、ヒメネス（Ｊｉｍｅｎｅｚ）Ｘ、ボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）Ｐ、ヴィッテ（Ｗｉｔｔｅ）Ｌ、チュー（Ｚｈｕ）Ｚ．ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．）２００３年１０月３１日、２７８（４４）、４３４９６−５０７に開示されたペプチドとの間の関係を比較する。
【図２】図２は、以下のペプチドの間の相同性アラインメントを示す。ビネトゥリー−トゥールネール（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ）らの論文よりＥｍｂｏＫ４（配列番号３８）、ＥｍｂｏＫ５（配列番号３９）およびＥｍｂｏＶ４（配列番号４０）、ルー（Ｌｕ）らの論文より２つのペプチド、１Ａ１１および２Ｄ５（同じ配列（配列番号４１）を有し、そのため１つと見なす）、ならびにミニペプチドディスプレイ技術によって得られたクローンＫ３（配列番号４２）。
【図３】図３は、Ｋ３、ならびにビネトゥリー−トゥールネール（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ）らによって開示されたペプチドのうちの２つ、ＥｍｂｏＶ１（配列番号４３）およびＥｍｂｏＫ３（配列番号４４）を含む、さらなる相同性アラインメントを示す。
【図４】図４は、種々のペプチド存在下でのウシ網膜内皮細胞（ＢＲＥ細胞）のＶＥＧＦ媒介性生存／増殖を示すグラフである。
【図５】図５は、（Ａ）ＶＥＧＦなし、（Ｂ）ＶＥＧＦ、（Ｃ）ＶＥＧＦに１００マイクログラム／ｍｌのＳＴ１００，０３８を追加、（Ｄ）ＶＥＧＦに５０マイクログラム／ｍｌのＳＴ１００，０３８を追加、および（Ｅ）ＶＥＧＦに１００マイクログラム／ｍｌのＳＴ１００，０３９を追加、を含む種々の処理に供されたＢＲＥ細胞の数および形態の顕微鏡写真を示す。
【図６】図６は、種々のペプチド存在下でのＢＲＥ細胞のＶＥＧＦ媒介性生存／増殖を示すグラフであり、ここでペプチドの最大濃度は２００マイクログラム／ｍｌまで増加させた。
【図７】図７は、Ｄアミノ酸を含む同じ配列（ペプチドＳＴ１００，０４５）に対する、Ｌアミノ酸を含むＳＴ１００，０３８ペプチド存在下でのＢＲＥ細胞のＶＥＧＦ媒介性生存／増殖を示すグラフである。
【図８】図８は、（Ａ）ＶＥＧＦなし、（Ｂ）ＶＥＧＦ、（Ｃ）ＶＥＧＦに５０マイクログラム／ｍｌのＳＴ１００，０３８を追加、（Ｄ）ＶＥＧＦに５０マイクログラム／ｍｌのＳＴ１００，０４５を追加、を含む種々の処理に供されたＢＲＥ細胞の数および形態の顕微鏡写真を示す。
【図９】図９は、細胞が接着した後の、ペプチドＳＴ１００，０３８およびＳＴ１００，０４５存在下でのＢＲＥ細胞のＶＥＧＦ媒介性生存／増殖を示すグラフである。
【図１０】図１０は、細胞が接着する前の、ペプチドＳＴ１００，０３８およびＳＴ１００，０４５存在下でのＢＲＥ細胞のＶＥＧＦ媒介性生存／増殖を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ペプチドＳＴ１００，０３８および１０％ウシ胎仔血清存在下でのＢＲＥ細胞のＶＥＧＦ媒介性生存／増殖を示すグラフである。
【図１２】図１２は、細胞が接着した後の、ペプチドＳＴ１００，０３８およびＳＴ１００，０４５存在下でのＢＲＥ細胞のＶＥＧＦ媒介性生存／増殖を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ＶＥＧＦ媒介性ＨＵＶＥＣ生存に対するペプチドＳＴ１００，０３８およびレトロインベルソペプチドＳＴ１００，０５９の効果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、種々のペプチドで処理したマウスから除去した後のアンジオリアクターの写真を示し、血管新生のレベルの定性的評価を表す。写真（Ａ）は、ＶＥＧＦに１６０μＭのペプチドＳＴ１００，０３８を追加で処理したマウス由来のアンジオリアクターを示す。写真（Ｂ）は、ＶＥＧＦに４０μＭのペプチドＳＴ１００，０３８を追加で処理したマウス由来のアンジオリアクターを示す。写真（Ｃ）は、ＶＥＧＦに１６０μＭのペプチドＳＴ１００，０４５を追加で処理したマウス由来のアンジオリアクターを示す。写真（Ｄ）は、ＶＥＧＦに４０μＭのペプチドＳＴ１００，０４５を追加で処理したマウス由来のアンジリアクターを示す。写真（Ｅ）は、ＰＢＳのみで処理したマウス由来のアンジオリアクターを示す。写真（Ｆ）は、ＶＥＧＦのみで処理したマウス由来のアンジオリアクターを示す。写真（Ｇ）は、ＶＥＧＦにペプチドＴＳＰ６１６を追加で処理したマウス由来のアンジオリアクターを示す。
【図１５】図１５は、ＳＴ１００，０３８およびＳＴ１００，０４５を用いたｉｎ  ｖｉｖｏでのＶＥＧＦ媒介性血管新生の阻害を、非刺激ＰＢＳおよびＴＳＰ６１６対照と比べて比較する棒グラフである。
【図１６】図１６は、ＳＴ１００，０３８およびＳＴ１００，０５９を用いたｉｎ  ｖｉｖｏでのＶＥＧＦ媒介性血管新生の阻害を、非刺激ＰＢＳおよびＴＳＰ６１６対照と比べて比較するグラフである。また、各群の下に、種々のペプチドで処理したマウスから除去した後のアンジオリアクターの写真があり、血管新生のレベルの定性的評価を表す。
【図１７】図１７は、毎日腹腔内に２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇのＳＴ１００，０５９で処理したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける皮下Ｂ１６黒色腫腫瘍の増殖の阻害を、未処理対照と比較するグラフである。
【図１８】図１８は、腹腔内に毎日１００ｍｇ／ｋｇまたは２日毎に１００ｍｇ／ｋｇのいずれかで投与したＳＴ１００，０５９で処理したマウスにおけるＢ１６黒色腫肺転移の数を、未処理対照と比較するグラフである。
【図１９】図１９は、ベシクル、ドセタキセル、毎日１０ｍｇ／ｋｇまたは毎日２０ｍｇ／ｋｇのＳＴ１００，０５９で処理したマウスにおけるヒト乳癌腫瘍株ＭＤＡ−ＭＢ２３１のカリパス測定および実際の腫瘍重量を比較するグラフである。
【図２０】図２０は、ベシクル、毎日１０ｍｇ／ｋｇまたは毎日２０ｍｇ／ｋｇのＳＴ１００，０５９で処理したマウスにおける各ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌腫瘍の、腫瘍壊死のあった動物の数および壊死の程度を比較するグラフである。
【図２１】図２１は、ペプチドＳＴ１００，０５９の濃度の増大によってＨＵＶＥＣにおけるタンパク質キナーゼＭＰＫリン酸化のレベルが低下することを示すグラフである。
【図２２】図２２は、ダウン症候群重要領域遺伝子１を例として用いた、ペプチドＳＴ１００，０５９がＶＥＧＦ誘導遺伝子発現変化を制御することを示す像である。
【図２３】図２３は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼタイプ１遺伝子を例として用いた、ペプチドＳＴ１００，０５９がＶＥＧＦ誘導遺伝子発現変化を制御することを示す像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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