(57)【要約】【課題】細胞撮像用の光学システムを提供する。【解決手段】顕微鏡システム（１０、１０’、１０''、１０'''）は、不均一な空間分布を有する光源光を発生するレーザ（１８）または発光ダイオード（１８'''）を含む。光学システムは、視野を画定する対物レンズ（４０）と、光源光を拡大された直径の平行光に変換し、拡大された直径の平行光を空間的に均質化し、さらに均質化された拡大された直径の平行光を対物レンズに結合して、視野の実質的に均一な静的照明を実現するように構成された光学素子列（２２、２２’、２２''、２２'''）とを備える。カメラシステム（５６）は、対物レンズによって視野の少なくとも大部分と静的に光学的に結合されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡視野を撮像する光学システムであって、
上記顕微鏡視野に焦点を合わせた対物レンズと、
１または複数の固定光学部品を含む光学素子列とを備え、
上記１または複数の固定光学部品は、不均一な空間分布を有する光源光を受光するとともに、上記対物レンズによって上記顕微鏡視野に焦点を合わせたときに上記顕微鏡視野のほぼ全域に亘ってほぼ均一な静的照明を与える補正された空間分布を、上記対物レンズに出力することを特徴とする光学システム。
【請求項２】
上記光学素子列は、上記不均一空間分布を拡散して空間的均一性を改善する固定ディフューザを備えることを特徴とする請求項１に記載の光学システム。
【請求項３】
上記固定ディフューザは、約１０°以下のＦＷＨＭを有する低角度ディフューザであることを特徴とする請求項２に記載の光学システム。
【請求項４】
上記固定ディフューザは、上記光学素子列の光路に対して傾斜していることにより、上記視野のスペックル・パターンを実質的に減少させることを特徴とする請求項３に記載の光学システム。
【請求項５】
上記固定ディフューザは、上記光学素子列の光路に対して少なくとも約３０°傾斜していることを特徴とする請求項３に記載の光学システム。
【請求項６】
上記固定ディフューザは、上記光学素子列の光路に対して傾斜していることを特徴とする請求項２に記載の光学システム。
【請求項７】
上記光学素子列は、
上記不均一空間分布を実質的に平坦化して、改善された空間的均一性を有する出力光を生成する固定ビーム・ホモジナイザと、
上記対物レンズによって焦点を合わせたときに上記視野のほぼ均一な静的照明を与える空間分布に、空間不均一性を導入する少なくとも１の他の固定光学部品とを備えることを特徴とする請求項１に記載の光学システム。
【請求項８】
ほぼ均一に静的に照明された上記顕微鏡視野を撮像するカメラシステムをさらに備え、
上記カメラシステムは、少なくとも上記対物レンズによって静的に照明された全顕微鏡視野と、静的に光学的に結合されていることを特徴とする請求項１に記載の光学システム。
【請求項９】
上記光源光を発生するレーザまたは半導体レーザダイオードをさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の光学システム。
【請求項１０】
上記不均一空間分布を有する上記光源光が小径のレーザビームであり、
上記光学素子列は、
上記小径のレーザビームの直径よりも実質的に大きな直径を有する平行光の空間的均一性を改善する大面積固定光学部品と、
上記光学素子列において上記大面積固定光学部品の前に配置された固定ビーム・エキスパンダ（Beam Expander）であって、上記小径のレーザビームを広げて、上記大面積固定光学部品に結合するのに適した実質的により大きな直径を有する平行光を生成する固定ビーム・エキスパンダと、
上記光学素子列において上記大面積固定光学部品の後に配置された固定ビーム・レジューサ（Beam Reducer）であって、上記平行光を上記対物レンズに結合する固定ビーム・レジューサとを備えることを特徴とする請求項１に記載の光学システム。
【請求項１１】
上記大面積固定光学部品は、固定ディフューザを有することを特徴とする請求項１０に記載の光学システム。
【請求項１２】
上記大面積固定光学部品は、固定ビーム・ホモジナイザを有することを特徴とする請求項１０に記載の光学システム。
【請求項１３】
上記光源光を発生する発光ダイオード（ＬＥＤ）をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の光学システム。
【請求項１４】
上記光学素子列は、
平行光の空間的均一性を改善する大面積固定光学部品と、
上記光学素子列において上記大面積固定光学部品の前に配置された固定コリメータであって、上記大面積固定光学部品に結合するのに適した直径を有する平行光に、上記光源光を変換する固定コリメータと、
上記光学素子列において上記大面積固定光学部品の後に配置された１または複数の結合光学部品であって、上記平行光の直径を少なくとも減少させて上記平行光を上記対物レンズに結合させる１または複数の結合光学部品とを備えることを特徴とする請求項１に記載の光学システム。
【請求項１５】
不均一な空間分布を有する光源光を発生するレーザ、半導体レーザダイオードまたは発光ダイオードと、
（i）視野を画定する対物レンズと、（ii）上記光源光を拡大された直径の平行光に変換して、これを空間的に均質化するとともに、この均質化した平行光を上記対物レンズに結合して、上記視野のほぼ均一な静的照明を実現する光学素子列とを含む光学システムと、
上記対物レンズによって上記視野の少なくとも大部分と静的に光学的に結合されたカメラシステムとを備えることを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項１６】
光透過壁を有する試験管と、上記試験管中に配置されたフロートとをさらに備え、上記フロートと上記試験管内壁との間の環状ギャップが、上記視野と一致するように構成されていることを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡システム。
【請求項１７】
上記光学素子列は、上記拡大された直径の平行光を拡散して空間的に均質化するディフューザを備えることを特徴とする請求項１６に記載の顕微鏡システム。
【請求項１８】
上記ディフューザが上記光学素子列の光路に対して傾斜した状態で配置されていることを特徴とする請求項１７に記載の顕微鏡システム。
【請求項１９】
対応する顕微鏡用スライドを支持するｘ−ｙ平行移動ステージをさらに備えることを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡システム。
【請求項２０】
上記光学素子列は、約１０°以下のＦＷＨＭを有する低角度ディフューザを有し、この低角度ディフューザが、上記拡大された直径の平行光を拡散して空間的に均質化することを特徴とする請求項１９に記載の顕微鏡システム。
【請求項２１】
上記ディフューザが上記光学素子列の光路に対して傾斜した状態で配置されていることを特徴とする請求項２０に記載の顕微鏡システム。
【請求項２２】
顕微鏡視野を撮像する光学システムであって、
上記顕微鏡視野に焦点を合わせた対物レンズと、
不均一な空間分布を有する光源光を受光するとともに、上記光源光を拡散して空間的均一性を改善する固定ディフューザとを備え、上記拡散光が、上記対物レンズを通して上記顕微鏡視野の少なくとも大部分に亘ってほぼ均一な静的照明を与えるために使用されることを特徴とする光学システム。
【請求項２３】
上記固定ディフューザは、約１０°以下のＦＷＨＭを有する低角度ディフューザであることを特徴とする請求項２２に記載の光学システム。
【請求項２４】
上記固定ディフューザは、上記光学素子列の光路に対して傾斜していることを特徴とする請求項２２に記載の光学システム。
【請求項２５】
試験管内壁とフロート壁の間の環状ギャップに含まれる生体液層の蛍光染料標識付き希少細胞を識別する方法であって、
顕微鏡システムを使用して、１または複数の焦点深度で１または複数の分析画像を取得するステップと、
取得した各分析画像を画像処理して、候補となる希少細胞の画像を識別するステップと、
選択的に、上記試験管を回転させるステップと、
選択的に、試験管の軸線に沿って上記試験管と上記顕微鏡システムを相対的に平行移動させるステップと、
選択的な回転および相対的な平行移動によって接近した複数の視野について、上記分析画像取得および画像処理を繰り返し、実質的に上記環状ギャップのスパニング（Spanning）を行うステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
ディジタル・プロセッサで実行可能な命令を符号化する不揮発性記憶媒体を備え、１分析画像当たり約１個の染料標識付き細胞数より少ない蛍光染料標識付き細胞密度の生体液層の顕微鏡取得分析画像中の上記染料標識付き細胞を識別する方法を実行する装置であって、
上記方法は、
各分析画像を画像処理して、上記分析画像中の蛍光染料標識付き細胞画像の予想サイズにほぼ対応する特徴サイズの候補の形状を識別するステップを備えることを特徴とする装置。
【請求項２７】
選択可能な焦点深度に視野を有する顕微鏡システムを使用して、生体液層中の蛍光染料標識付き細胞を識別する方法であって、上記顕微鏡視野は上記生体液層の面積よりも実質的に小さいものであり、
上記蛍光染料標識付けによって生じた上記生体液層の背景蛍光に基づいて、上記生体液層の深度を特定するステップと、
特定した上記生体液層の深度またはその近傍の１または複数の焦点深度で、上記顕微鏡システムを使用して、１または複数の分析画像を取得するステップと、
取得した１または複数の分析画像を画像処理して、染料標識付き細胞に対応する可能性のある候補形状を識別するステップと、
上記視野と上記生体液層を相対的に動かすステップと、
上記深度の特定、分析画像の取得、画像処理および相対的移動を繰り返して、上記生体液層の領域に亘って候補形状を識別するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
環状サンプリング領域にサンプルを含む若しくは支持する試験管を操作する試験管操作装置であって、
少なくとも２つのアライメント軸受を備え、上記アライメント軸受の少なくとも１つは上記環状サンプリング領域の第１の側に配置され、上記アライメント軸受の少なくとも１つの他のものは、上記試験管の管軸方向において上記環状サンプリング領域の上記第１の側と反対の上記環状サンプリング領域の第２の側に配置されており、さらに、
上記少なくとも２つのアライメント軸受に押し付ける方向に上記試験管を付勢して、上記環状サンプリング領域の部分を上記少なくとも２つのアライメント軸受に対して位置合わせする機械的付勢手段と、
加えられたトルクに応じて上記管軸を中心に上記試験管を回転させる回転継手とを備えることを特徴とする試験管操作装置。
【請求項２９】
試験管軸を画定し、環状サンプリング領域に対応サンプルを含む若しくは支持する試験管と、
上記試験管軸上において上記環状サンプリング領域と相対する側で、上記試験管と係合する少なくとも２つのアライメント軸受と、
上記少なくとも２つのアライメント軸受から放射状に間隔を開けて配置されるとともに、上記試験管を上記少なくとも２つのアライメント軸受に押し付けて、上記環状サンプリング領域の部分を上記少なくとも２つのアライメント軸受に対して位置合わせする少なくとも１つのバイアス軸受と、
上記試験管と係合して上記試験管を選択的に回転させるモータとを備えることを特徴とするサンプル操作装置。
【請求項３０】
環状サンプリング領域にサンプルを含む若しくは支持する試験管を操作する試験管操作装置であって、
上記環状サンプリング領域の第１の側で上記試験管と係合する固定軸受と、
上記試験管を上記固定軸受に押し付けるバイアス軸受と、
上記試験管と係合し、加えられたトルクを上記試験管に伝達することにより上記試験管を回転させる回転継手とを備えることを特徴とする試験管操作装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年１１月２４日に出願された米国特許仮出願第６０／６３１，０２５号の利益を請求し、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、本出願は、２００４年１１月２４日に出願された米国特許仮出願第６０／６３１，０２６号の利益を請求し、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、本出願は、２００４年１１月２４日に出願された米国特許仮出願第６０／６３１，０２７号の利益を請求し、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
以下に述べることは、撮像技術に関する。遠心分離機にかけられた血液サンプルのバフィーコート（Buffy Coat）の中の上皮細胞などの希少細胞（Rare Cell）を撮像することに関係する実施形態例を特に参照して、本発明は説明される。しかし、以下に述べることは、より一般的には、大きな視野全体にわたって実質的に均一な静的照明を生成する照明システム、および、これを使用する顕微鏡に関する。
【０００３】
定量的なバフィーコート分析の技術では、全血液サンプルが採取され、抗凝血性添加剤や遠心分離等を利用した処理により、白血球を主成分とするバフィーコート成分等の成分に血液が分離される。特定の癌に関連した特定の上皮細胞などの、バフィーコート中に存在する関心のある希少細胞は、適切な蛍光染料を使用して標識付けされ、次に、関心のある蛍光染料標識付き細胞を数えるために、蛍光顕微鏡撮像が使用される。定量的なバフィーコート分析は、特定の癌の選別、癌治療の監視、その他のために有望な非侵襲技術である。
【０００４】
バフィーコート中の蛍光染料標識付き希少細胞の濃度は低い。光学的走査蛍光顕微鏡は、顕微鏡の視野をバフィーコート・サンプルに対して走査して大面積のバフィーコート・サンプルを評価することを可能にする。バフィーコート・サンプルに対して顕微鏡を動かすことによって、または顕微鏡に対してバフィーコート・サンプルを動かすことによって、若しくはこれらのある組合せによって、走査を実現することができる。高強度の均一な光で照明された大きな視野は、バフィーコート・サンプル中の蛍光染料標識付き希少細胞を素早く正確に分析するのに有利である。また、希少細胞の蛍光と散乱照明のスペクトルの区別を容易にするために、照明は、単色光または狭帯域幅光を好ましく使用することができる。
【０００５】
しかし、大きな視野にわたって均一な照明を高強度で実現することは困難である。
【０００６】
白色光光源の場合には、単色光照明または少なくともスペクトルの制限された照明を実現するために、一般に、フィルタ処理が必要である。スペクトル・フィルタ処理は、選ばれたスペクトル範囲以外にある光出力の大部分を遮断する。したがって、白色光光源による照明は、光学的に効率がよくない。また、キセノン・ランプのような高強度白熱白色光光源は、かなりの熱を発生し、この熱は、定量的なバフィーコート分析に悪影響を及ぼすことがある。
【０００７】
レーザ光光源は、スペクトルの狭い光を発生して光学的により効率的である。例えば、アルゴン・レーザは、４８８ｎｍおよび５１４ｎｍで高強度の狭いスペクトル線を出力し、他の波長でより弱い線を出力する。これらの波長は、約５５０ｎｍでルミネセンスを示す特定の標識付け染料の発光を励起するのに適している。
【０００８】
しかし、一般に、レーザは、狭いビーム断面積にわたって非常に不均一なガウス強度プロファイルすなわち分布を有する厳しく平行化されたビームを出力する。さらに、レーザビームは可干渉性であり、一般に、波面間の干渉によるスペックル・パターンを示す。スペックル・パターンは、希少細胞の一般的なサイズと重なる空間周波数を持つことがある。また、スペックル・パターンは、視野が走査されるときに移動するか、変化することがある。レーザ光のこれらの態様は、検出された発光特徴が蛍光染料標識付き希少細胞であるか、または照明の産物であるかの決定を実質的に困難にする。
【０００９】
空間的な均一性は、ビーム・ホモジナイザ（Homogenizer）を使用して改善することができる。ビーム・ホモジナイザの１つの型は、ガウス・ビーム分布を実質的に相殺する逆ガウス吸収プロファイルを実現して、動作する。ビーム・ホモジナイザの他の型は、２以上のレンズ（または、複合レンズ）を使用して、光を平らな空間プロファイルに再分配する方法でガウス・ビームを屈折させる。しかし、顕微鏡蛍光撮像においてビーム・ホモジナイザを使用することには、問題がある。というのは、均質化されたビームを顕微鏡対物レンズで集束させると、他のビーム不均一が発生することがあるからである。さらに、ビーム・ホモジナイザは、一般に、スペックル不均一を実質的に減少させない。
【００１０】
共焦点顕微鏡として知られている他の方法では、視野全体にわたって、レーザビームが高速でラスタ走査されるか、または走査される。視野は、全体として撮像されるのではなく、サンプリングされる。この動的な方法で、時間の任意の瞬間に照明されたサンプルの部分は、視野よりも遥かに小さい。視野にわたって集束レーザビームを高速ラスタ走査することによって、取得したサンプル点から画像を構築することができる。視野の高速サンプリングによって、事実上、均一な照明が動的にシミュレートされる。
【００１１】
共焦点顕微鏡法は、確立された技術である。しかし、ビーム・ラスタ走査は、顕微鏡システムに実質的な複雑さおよびコストを追加する。また、共焦点顕微鏡法は、レンズまたは他の光学部品の小さな欠陥に非常に敏感である。したがって、非常に高品質の光学部品が使用されるべきであり、このことが、さらにまた、システムのコストを高くする。
【００１２】
［参照による援用］
２００２年１０月３日に出願され、２００４年４月８日に米国特許出願公開第２００４／００６７１６２Ａ１号として公開された米国特許出願第１０／２６３，９７４号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２００２年１０月３日に出願され、２００４年４月８日に米国特許出願公開第２００４／００６７５３６Ａ１号として公開された米国特許出願第１０／２６３，９７５号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明者：Albert E. Weller, III、名称「Method and Apparatus for Detection of Rare Cells」で代理人整理番号BATZ 2 00009に対応する、本出願と同時に出願された米国特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明者：Steve Grimes、Thomas D. Haubert、Eric R. Navin、名称「Sample Tube Handling Apparatus」の、代理人整理番号BATZ 2 00010に対応する、本出願と同時に出願された米国特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の開示】
【００１３】
１つの態様によれば、顕微鏡視野を撮像する光学システムが開示される。対物レンズは、顕微鏡視野に焦点を合わせられている。光学素子列は、不均一な空間分布を有する光源光を受け取り、さらに、対物レンズによって顕微鏡視野に焦点を合わされたとき実質的に顕微鏡視野全体にわたって実質的に均一な静的照明を実現する補正された空間分布を、対物レンズに出力するように構成された１または複数の固定光学部品を含む。
【００１４】
他の態様によれば、顕微鏡システムが開示される。レーザ、半導体レーザ・ダイオードまたは発光ダイオードが、不均一な空間分布を有する光源光を発生する。光学システムは、（i）視野を画定する対物レンズと、（ii）光源光を拡大された直径の平行光に変換し、拡大された直径の平行光を空間的に均質化し、さらに均質化された拡大された直径の平行光を対物レンズに結合して、視野の実質的に均一な静的照明を実現するように構成された光学素子列と、を含む。カメラシステムは、対物レンズによって、視野の少なくとも大部分と静的に光学的に結合されている。
【００１５】
他の態様によれば、顕微鏡視野を撮像する光学システムが開示される。対物レンズは、顕微鏡視野に焦点を合わせられている。固定ディフューザ（Diffuser）は、不均一な空間分布を有する光源光を受け取り、空間的均一性を改善するように光源光を拡散する。拡散光は、対物レンズを通して顕微鏡視野の少なくとも大部分にわたって実質的に均一な静的照明を実現するように使用される。
【００１６】
好ましい実施形態についての以下の詳細な説明を読むと、本発明の非常に多くの有利点および利益が当業者に明らかになるであろう。
【００１７】
本発明は、様々な部品および部品の配列で、および様々な処理工程および処理工程の配列で具体化することができる。図面は、好ましい実施形態を例示する目的のためだけのものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
図１に示すように、顕微鏡システム１０は、光透過試験管壁１４と試験管中に配置されたフロートのフロート壁１６との間の環状ギャップ１２のおおむね平面の部分に配置されたバフィーコート・サンプルと一致する顕微鏡視野を撮像する。そのようなバフィーコート・サンプルを取得し準備するための適切な方法および装置は、例えば、米国特許出願公開第２００４／００６７１６２Ａ１号および米国特許出願公開第２００４／００６７５３６Ａ１号に開示されている。
【００１９】
顕微鏡の視野は、試験管およびフロートの湾曲にもかかわらずおおむね平面である。というのは、顕微鏡の視野は、一般に、試験管壁１４およびフロート壁１６の曲率半径よりもサイズが遥かに小さいからである。視野は実質的に平面であるが、光透過試験管壁１４とフロート壁１６の間に配置されたバフィーコート・サンプルは、顕微鏡システム１０の視野深度よりも実質的に大きな厚さであることがある。
【００２０】
試験管は、環状ギャップを横切って顕微鏡視野を走査するのに適した方法で、顕微鏡システム１０に対して固定された位置に取り付けられている。これから述べるように、好ましくは、バフィーコート・サンプルを含む環状ギャップにわたって視野の相対的な回転走査および／または平行移動走査を実現するために適した機構が設けられる。
【００２１】
顕微鏡システム１０は、ガスレーザ、固体レーザ、半導体レーザ・ダイオードなどのレーザ１８を含み、このレーザ１８は、照明波長と、形状が一般にガウス状またはほぼガウス状の不均一空間分布とを有するレーザビームの形態の光源光２０（図１に破線で図示されている）を発生する。上記不均一空間分布は、ビームの中心領域で最高強度を有し、ビームの中心からの距離の増加と共に強度が減少している。光学素子列２２は、空間的に不均一な光源光２０を受け取りかつ補正された空間分布を出力するように構成されている。
【００２２】
ビーム・スプレッダ（Beam Spreader）は、レーザビームをおおむね発散させる凹レンズ２４と、ビーム・ホモジナイザ３０のガウス空間特性の直径に実質的に整合するより大きな直径の広がったビームを平行にするコリメーティング・レンズ２６と、を含む。ビーム・ホモジナイザ３０は、光源光のガウスまたは他の不均一分布を実質的に均質化することによって、広がったレーザビームを平らにして、改善された空間的均一性を有する出力光を生成する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ビーム・ホモジナイザ３０は、逆ガウス・プロファイルに対応する空間的に不均一な吸収プロファイルを有して動作する。そのような実施形態では、ビーム・ホモジナイザは、広がったレーザビームの最高強度の中心領域に対応する中心領域で最大吸収を有し、広がったレーザビームのより低強度の外周領域に対応する周辺でより低い吸収を有するか、または吸収を有しない。
【００２４】
他の実施形態では、ビーム・ホモジナイザ３０は、例えば適切なレンズ対を使用して、広がったレーザビームの面積全体にわたって光強度を均質化するように、屈折により光を再分配する。屈折ビーム・ホモジナイザは、広がったレーザビームの高強度の中心領域からより低強度の周辺領域に光を屈折する。
【００２５】
集束レンズ３４および協働レンズ（Cooperating Lenses）３６は、広がって平らになったレーザビーム或いは均質化されたレーザビームを、焦点を顕微鏡視野に合わされた対物レンズ４０に入力するために望ましいビーム直径まで減少させる。ダイクロイック・ミラー４４は、レーザビームの波長または波長範囲の光を実質的に反射し、かつバフィーコート・サンプル中の希少細胞に標識付けするために使用される蛍光染料の蛍光波長または波長範囲の光を実質的に透過するように選ばれる。
【００２６】
固定光学部品２４、２６、３０、３４、３６を含む光学素子列２２は、対物レンズ４０で顕微鏡視野に焦点を合わされたとき実質的に顕微鏡視野全体にわたって実質的に均一な静的照明を実現する補正された空間分布を、対物レンズ４０に出力するように構成されている。対物レンズ４０は、補正された照明を顕微鏡視野に集束させる。対物レンズ４０は、単一の対物レンズを含んでもよく、または２以上の対物レンズを含んでもよい。顕微鏡システム１０の焦点深度は、例えば、対物レンズ４０と光透過試験管壁１４の間の距離を調整することによって、調整可能である。追加して、または代わりに、対物レンズ４０の中の２以上のレンズまたはレンズ要素を相対的に動かすことによって、焦点深度が調整されてもよい。
【００２７】
ビーム・ホモジナイザ３０は、補正された直径のガウス入力ビームに対して実質的に均一な均質化ビームを出力するように設計されている。しかし、対物レンズ４０は、一般に、いくらかの空間的不均一を生じさせる。したがって、拡大レンズ２４、コリメーティング・レンズ２６、集束レンズ３４、および／または集束レンズ３６などの固定光学部品の１または複数は、場合によっては、対物レンズ４０で焦点を合わせたときビームが顕微鏡視野の実質的に均一な静的照明を実現するように、空間的不均一を空間分布の中に生じさせるように構成される。いくつかの考えられる実施形態では、この補正空間不均一は、その目的のために光学素子列２２に含まれる１または複数の専用光学部品（図示省略）が生じさせる。
【００２８】
顕微鏡視野の実質的に均一な静的照明は、顕微鏡視野内に配置された任意の蛍光染料標識付き上皮細胞の蛍光発光を引き起こす。さらに、蛍光染料は、一般に、バフィーコートに低強度の背景蛍光を与える。この蛍光は、対物レンズ４０で捕らえられ、捕らえられた蛍光５０（図１に点線で図示される）は、ダイクロイック・ミラー４４を通過し、さらに、光源のどんな迷光も除去する光学フィルタ５２を通過して、カメラシステム５６で撮像される。カメラシステム５６は、例えば、後の画像処理のためにコンピュータ、メモリ・カード、または他の不揮発性メモリに格納することができる電子画像を取得する電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラを含んでもよい。
【００２９】
図２および３を参照して、他の適切な顕微鏡システムを説明する。
【００３０】
図２は、図１の固定ビーム・ホモジナイザ３０が固定ディフューザ３０’に置換されて光学素子列２２’が異なっている点を除いて、図１の顕微鏡システム１０と同様の顕微鏡システム１０’を示す。ディフューザ３０’は、例えば、フィジカル・オプティックス社（Physical Optics Corporation：カリフォルニア州、トランス）から入手可能なホログラフィック・ディフューザであってもよい。そのようなホログラフィック・ディフューザは、改善された空間的均一性を与えるように光を拡散するランダム化非周期光学構造を実現するホログラムを使用する。しかし、光の拡散は、いくらかの付随したビーム発散も与える。一般に、光の拡散が強いほど、より多くの空間的均一性を与える傾向があるが、また、より大きなビーム発散を生じさせる傾向がある。ホログラフィック・ディフューザは、発散角の半値全幅（ＦＷＨＭ）に従って適切に分類され、一般に発散角が大きいほど、拡散が大きくなり光均一性が大きくなるが、ビーム発散の増加のために顕微鏡システム１０’の光損失の増加をもたらす。
【００３１】
顕微鏡システム１０’のいくつかの実施形態では、ディフューザ３０’は、約１０°以下のＦＷＨＭを有する低角度ディフューザである。低角度ディフューザは、一般に、比較的少ない発散、したがって照明処理能力の比較的優れた効率を実現するのに好ましい。しかし、発散ＦＷＨＭが小さ過ぎる場合には、ディフューザは、十分なビーム均一性を与えるのに十分な光拡散を実現しない。低拡散は、ガウス分布を均質化するディフューザ３０’の能力を低下させ、また、スペックルを除去するディフューザ３０’の能力を低下させる。
【００３２】
図３に示すように、他の実施形態の顕微鏡システム１０''は、顕微鏡システム１０’と同様のものであり、顕微鏡システム１０’のディフューザ３０’と同様のディフューザ３０''を使用した光学素子列２２''を備える。しかし、ディフューザ３０''は、光源光２０のスペックル・パターンを実質的に減少させるために、光学素子列２２''の光路に対して角度θで傾斜している。どんな特定の動作理論にも限定されることなく、傾斜させることで、スペックル・パターンはより高い空間周波数にシフトし、実際上、スペックル・サイズがより小さくなる。周波数シフトしたスペックルが撮像ピクセル・サイズよりも実質的に小さくなるように傾斜させることで、スペックル・サイズは、空間的にシフトする。
【００３３】
いくつかの実施形態では、光学素子列２２''の光路に対して少なくとも約３０°の傾斜角θが使用され、これによって、約５°程度の低いＦＷＨＭを有するディフューザ３０''のスペックルが実質的に減少することが分かった。他方で、約４５°を超える傾斜角θは、５°のＦＷＨＭを有する低角度ディフューザの場合でも、散乱の増加のために照明処理能力の効率を低下させることが分かった。
【００３４】
図４に示すように、本明細書で開示された顕微鏡システムは、試験管中に含まれた、または試験管で支持されたサンプルの撮像以外に、他の顕微鏡検査の用途にも適している。図４において、顕微鏡システム１０'''は、前の顕微鏡システム１０、１０’、１０''で使用されたレーザ１８ではなく、発光ダイオード（ＬＥＤ）１８'''を光源として含む。ＬＥＤ１８'''は、平行レーザビームではなく発散する光源光２０'''を出力するので、図４に示すように、光学素子列２２'''は、ビームを広げる凹レンズ２４が適切に省略される点で、変更されている。代わりに、レンズ２４の位置にレンズが含まれてもよいが、このレンズは、コリメーティング・レンズ２６によるコリメーションのために適切な発散角調整を行うように選ばれる。光学素子列１０'''は、ディフューザ３０’、３０''に似たディフューザ３０'''を使用する。ＬＥＤ１８'''は、非可干渉光を出力するので、スペックルはおおむね存在しない。しかし、ＬＥＤ１８'''の出力は、一般に、非ガウス分布、例えばランベルト分布を有している。光源光２０'''のこれらの特性を考慮してディフューザ３０'''は傾斜していないが、いくつかの場合には、ディフューザ３０'''は、図２の顕微鏡システム１０’でレーザビーム光源光２０に空間的均一性を与えるために使用される無傾斜ディフューザ３０’よりも小さな発散角ＦＷＨＭを有することができる。
【００３５】
図４の顕微鏡システム１０'''は、顕微鏡システム１０'''が平面スライド６０の上に配置されたサンプルを撮像する点で、顕微鏡システム１０、１０’、１０''とさらに異なっており、この平面スライド６０は、場合によっては、随意のカバー・ガラス６２で覆われる。スライド６０は、サンプル全体にわたった走査を可能にするようにｘ−ｙ平行移動平面ステージ６４の上に配置される。当然ながら、ＬＥＤ１８'''および光学素子列２２'''は、また、図１〜３に示された光透過試験管壁１４とフロート壁１６の間の環状ギャップ１２に配置されたバフィーコート・サンプルを撮像するのにも適している。一方、レーザ１８および光学素子列２２、２２’、２２''は、また、図４に示されたスライド６０の上の平面サンプルを撮像するのにも適している。
【００３６】
光学素子列２２、２２’、２２''、２２'''は、その部品が回転しない、相対的に振動しない、またはそうでなければ相対的に動かないという意味で固定された部品を有している。しかし、サンプルに対する視野の相対的な走査を可能にするように、光学素子列および対物レンズ４０を全体として動かすこと、および／またはビーム・ステアリング要素を含むことなどは考えられる。
【００３７】
試験管中に含まれた、または試験管で支持された環状サンプルを撮像する適切な顕微鏡システムは、説明した通りである。環状ギャップ１２は、一般に、顕微鏡対物レンズ４０の視野深度よりも実質的に大きな厚さである。試験管壁１２およびフロート壁１６は、一般に、試験管またはフロートの全表面にわたって均一でない。顕微鏡対物レンズ４０は、一般に、調整可能な焦点深度を有するが（内部光学部品を動かすことによって、および／または対物レンズ４０を試験管壁１４の方に、または試験管壁１４から離すように動かすことによって調整される）、調整範囲は限定されている。したがって、試験管が回転するときに、および対物レンズ４０または試験管が管軸に沿って平行移動するときに、対物レンズ４０に近い表面が対物レンズ４０から所定距離、離れた位置にあるように、試験管は保持されるべきである。
【００３８】
次に、それを実現するのに適当な試験管ホルダについて説明する。
【００３９】
図５〜図１０に示すように、試験管ホルダ７０は、試験管栓７３で密閉された試験管７２をその中に取り付けている。密閉された試験管７２は、フロート７４と、例えば米国特許出願公開第２００４／００６７１６２Ａ１号および第２００４／００６７５３６Ａ１号に記載されているように、赤血球、血漿、およびバフィーコートを含む成分を分離するように適切に処理され遠心分離機にかけられた血液と、を含む。フロート７４は、濃縮赤血球成分の密度（１．０９０ｇ／ｍｌ）よりも小さく、かつ血漿成分のそれよりも大きな密度（１．０２８ｇ／ｍｌ）を有している。したがって、遠心分離機にかけた後で、フロート７４は、図６に示す試験管軸７５に沿って、濃縮赤血球層と血漿層の間、すなわちバフィーコートと対応する位置に配置される。その結果、バフィーコートは、遠心分離機にかけた後、試験管壁１４とフロート壁１６の間の環状ギャップ１２に配置される（図６の表示を参照されたい）。フロート７４の両端部の環状密閉突出部７６、７８は、試験管が静止しているときに試験管７２の内壁に係合して環状ギャップ１２を密閉している。しかしながら、試験管７２は、遠心分離処理中に拡径して、流体が突出部７６、７８を通過・流通できる状態となり、これにより、バフィーコートを環状ギャップ１２に実質的に集めることができるようになっている。
【００４０】
少なくとも１つの第１のアライメント軸受、すなわち、実施例の試験管ホルダ７０において放射状に間隔を開けて配列された２つの第１のアライメント軸受８０、８１は、環状サンプリング領域１２の第１の側に配置されている。少なくとも１つの第２のアライメント軸受、すなわち、実施例の試験管ホルダ７０において放射状に間隔を開けて配列された２つの第２のアライメント軸受８２、８３は、試験管軸７５に沿って環状サンプリング領域１２の第１の側と反対の第２の側に配置されている。アライメント軸受８０、８１、８２、８３は、止め部材８５（図８にだけ図示されている）によってハウジング８４に固定された固定転がり軸受である。
【００４１】
少なくとも１つのバイアス軸受、すなわち、実施例の試験管ホルダ７０の２つのバイアス軸受８６、８７は、アライメント軸受８０、８１、８２、８３から放射状に間隔を開けて配置され、さらに、バネ９０に付勢されて試験管７２をアライメント軸受８０、８１、８２、８３に押し付けることにより、対物レンズ４０に近い環状サンプリング領域１２の側をアライメント軸受８０、８１、８２、８３に対して位置合わせするようになっている。実施例の試験管ホルダ７０では、２つの第１のアライメント軸受８０、８１および第１のバイアス軸受８６は、放射状に１２０°の間隔を開けて配置され、環状サンプリング領域１２の第１の側の第１の共通平面９２に置かれている。同様に、２つの第２のアライメント軸受８２、８３および第２のバイアス軸受８７は、放射状に１２０°の間隔を開けて配置され、環状サンプリング領域１２の第２の側の第２の共通平面９４に置かれている。バネ９０は、ハウジング８４に固定され、部材９８によってバイアス軸受８６、８７と接続している。
【００４２】
より一般的には、軸受８０、８１、８６および軸受８２、８３、８７は、１２０°以外の放射間隔を有することができる。例えば、バイアス軸受８６は、アライメント軸受８０、８１の各々から等しい放射角の間隔で配置されてもよい。特定の実施例として、バイアス軸受８６は、アライメント軸受８０、８１から１３５°の間隔で配置されてもよく、この特定の実施例では、２つのアライメント軸受８０、８１は、９０°の間隔で配置される。
【００４３】
場合によっては、第１の共通平面９２は、軸受８０、８１、８６が突出部７６のところで試験管７２を押し付けるようにフロート突出部７６を含み、同様に、第２の共通平面９４もまた、場合によっては、軸受８２、８３、８７が突出部７８のところで試験管７２を押し付けるようにフロート突出部７８を含む。この方法によって、環状サンプル領域１２を変形させる可能性が減少する。バイアス軸受８６、８７は、試験管７２をアライメント軸受８０、８１、８２、８３に押し付ける方向に付勢する付勢力９６を与える。
【００４４】
ハウジングは、試験管軸７５に沿って延びる覗き窓１００を含む。対物レンズ４０は、覗き窓１００を通して、対物レンズ４０に近い環状サンプル領域１２の側部を見る。いくつかの実施形態では、平行移動範囲の両方向矢印１０４で示されるように、対物レンズ４０は、試験管軸７５に沿って直線的に平行移動可能である。これは、例えば、試験管ホルダ７０に対して平行移動可能な共通基板に対物レンズ４０および光学素子列２２、２２’、２２''、または２２'''を取り付けることによって、達成することができる。他の方法では、顕微鏡システム１０、１０’、１０''、１０'''は固定され、窓１００を横切って対物レンズ４０を相対的に平行移動させるように、ハウジング８４を含む試験管ホルダ７０がユニットとして平行移動される。さらに他の実施形態では、光学素子列２２、２２’、２２''、または２２'''を固定したままで、対物レンズ４０が移動し、ビームを対物レンズ４０に入力するように適切なビーム・ステアリング部品（図示省略）が設けられる。また、例えば、試験管７２の方に向けて、または試験管７２から遠ざかるように対物レンズ４０を焦点調節範囲１０６にわたって動かすことによって、対物レンズ４０の焦点を合わせることができる（平行移動範囲１０４および焦点調節範囲１０６は、図６のみに示されている）。
【００４５】
環状サンプリング領域１２の走査は、試験管軸に沿った平行移動と、試験管軸７５のまわりの試験管７２の回転との両方を必要とする。回転動作を実現するために、回転継手１１０は、シャフト１１４を介して回転継手１１０と接続されたモータ１１４によって選択的に加えられるトルクに応答して、試験管軸７５のまわりに試験管７２を回転させるように構成されている。実施例の試験管ホルダ７０の回転継手１１０は、試験管７２の一端または底部で試験管と接続している。試験管７２の他端で、バネ荷重キャップ１１６が試験管７２の栓７３を押圧して、上記回転に付随して試験管７２に試験管軸７５に沿った平行移動すべりが生じるのを防止している。
【００４６】
特に図９および１０に示すように、いくつかの実施形態では、回転継手１１０は、試験管７２の凹凸付き底部１２２と噛み合うように構成された凹凸１２０を有する凹凸付き継手である。図９および１０の例示の実施例では、継手１１０の凹凸１２０は、試験管７２の凹凸付き底部１２２の４つの先端部を受け入れる４つのくぼみを含む。他の凹凸形状を使用することもできる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、試験管７２の凹凸付き底部１２２が回転継手１１０の凹凸１２０と噛み合ったときに、継手１１０および試験管底部１２２それぞれの適当な回転非対称な形状部分１２４、１２６（図９および１０に透過表示されている）によって凹凸１２０と凹凸付き底部１２２が結合して、試験管７２の絶対的な回転位置を決定する。このため、試験管７２を試験管ホルダ７０から取り外して、再び取り付けた場合でも、絶対回転位置（例えば、絶対角度値として度の単位で測定される）を維持することができる。
【００４８】
絶対角度位置を実現する他の方法では、試験管は、場合によっては、試験管の絶対回転位置を示す基準の目印、例えば光学的に読取り可能な反射基準目印（図示省略）を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、第２の側のアライメント転がり軸受８２、８３は省略され、回転継手１１０が、試験管軸７５に沿って環状サンプリング領域１２の第１の側と反対の第２の側に配置された少なくとも１つの第２のアライメント軸受を規定する。そのような実施形態では、回転継手は、機械的に駆動されるアライメント軸受として作用して、試験管７２の位置決めと回転の両方を行う。場合によっては、いくつかの実施形態で、第２の側のバイアス軸受８７は、対応する転がり軸受８２、８３と共に省略される。
【００５０】
他方で、いくつかの他の考えられる実施形態では、回転継手１１０が省略され、１または複数の転がり軸受８１、８２、８３、８４、８６、８７は、試験管７２を回転させるように機械的に駆動される。そのような実施形態では、駆動される転がり軸受は、回転継手として作用する。駆動される軸受は、１または複数のアライメント軸受８１、８２、８３、８４であってもよく、または１または複数のバイアス軸受８６、８７であってもよい。
【００５１】
ハウジング８４は、試験管７２を試験管ホルダ７０に取り付けるための開き蓋または開き戸１３０を備える（図５は開いた状態、図６は閉じた状態をそれぞれ示している）。開き蓋または開き戸１３０が開いているとき、バネ荷重キャップ１１６は、試験管７２の栓７３から持ち上げられる。場合によっては、ホルダ７０への試験管７２の取付けまたは取外しを容易にするために、バイアス軸受８６、８７を支える支持部材９８は、バネ９０の付勢力に逆らって試験管７２からバイアス軸受８６、８７を手操作で引き離すための手操作ハンドルまたはレバー（図示省略）を含む。
【００５２】
有利なことには、試験管ホルダ７０は、真っ直ぐな側面を有する例示の試験管７２を位置合わせすることができる。また、試験管ホルダ７０は、僅かに先細りした試験管を収容し位置合わせすることができる。先細の試験管の保持位置は、図６に破線１３４で示され、この破線１３４は、先細の試験管の傾斜した縁部を示している。例示の傾斜１３４によって、回転継手１１０に最も近い試験管の端部が、バネ荷重キャップ１１６に最も近い試験管の端部より小径になっている。図６に示すように、バイアス軸受８６、８７は、試験管をアライメント軸受８１、８２、８３、８４に押し付けて、傾斜１３４にもかかわらず、対物レンズ４０に近い環状サンプル領域１２の部分の位置合わせを維持する。当然のことながら、ホルダ７０は、回転継手１１０に最も近い端部の直径がバネ荷重キャップ１１６に最も近い端部よりも大きい逆の傾斜を有する試験管を同様に収容し位置合わせすることができる。
【００５３】
大きな傾斜がある場合、または非常に偏心した断面または非円形断面を有する試験管の場合には、アライメント軸受８１、８２、８３、８４に押し付ける付勢では、傾斜または断面偏心率または楕円率に完全に対応することはできない。その理由は、第１のアライメント軸受８１と８２の放射間隔および第２のアライメント軸受８３と８４の放射間隔によって、もっと細い管が第１のアライメント軸受８１と８２の間のギャップの中に、また第２のアライメント軸受８３と８４の間のギャップの中にいっそう深くに至ることができるようになるからである。
【００５４】
図１１Ａおよび図１１Ｂに示すように、楕円断面を有する変形試験管７２’は、支持フロート突出部ごとに１組の３個の軸受を使用してより正確に位置合わせされている。この場合に、３個の軸受は、１つのアライメント軸受８１’および２以上のバイアス軸受８６’を含む。アライメント軸受８１’は、対物レンズ４０と同じ放射位置にある（図１１Ａおよび図１１Ｂに透過表示されている）。楕円試験管１２’が回転するときに、撮像される側が楕円試験管７２’の短軸に対応していようと（図１１Ａ）、または撮像される側が楕円試験管７２’の長軸に対応していようと（図１１Ｂ）、アライメント軸受８１’に押し付けるように付勢された撮像される側は、放射方向の一致した対物レンズ４０と正確に位置合わせされた状態にある。
【００５５】
図１２に示すように、他の変形例では、試験管軸７５と平行な力成分を与えて試験管７２を回転継手１１０の中に押し込むように、軸受１４０は、試験管７２の管軸７５に対して傾斜している。この配列では、バネ荷重キャップ１１６は場合によっては省略される。というのは、軸受１４０を傾斜させることにより、回転中の試験管７２の平行移動すべりを妨げるからである。
【００５６】
図１３に示すように、他の変形例では、フロート７４’は螺旋状の突出部７６’を含み、傾斜軸受１４２は、試験管７２の回転に対して密閉突出部７６’に追従するように、試験管軸７５に沿って螺旋ピッチに従った間隔で配置されている。この方法では、傾斜軸受１４２は、試験管７２を管軸７５に沿って平行移動させる力を与え、その結果、対物レンズ４０は、環状ギャップ１２’を走査しながら、平行移動することなしに固定位置に維持されることが可能になる。この方法では、転がり軸受１４２は、試験管７２の回転を生じさせるように適切にモータが取り付けられている。すなわち、転がり軸受１４２は、回転継手としても作用する。
【００５７】
図１４に示すように、他の変形例では、機械的付勢力はバイアス軸受以外の機構によって与えられてもよい。図１４の実施例では、試験管７２はアライメント軸受１８１、１８２、１８３、１８４の上に載って水平に配置され、対物レンズ４０は試験管７２の下に取り付けられている。フロート７４を含んだ試験管７２の重さ１８６（図１４に下向きの矢印１８６で図示された重さ）が、試験管７２をアライメント軸受１８１、１８２、１８３、１８４に押し付ける機械的付勢力として作用する。他の考えられる実施形態では、真空チャック、プラスの空気圧、磁力または他の機械的付勢力が、試験管をアライメント軸受に押し付けるために使用される。アライメント軸受１８１、１８２、１８３、１８４は、アライメント軸受１８１、１８２、１８３、１８４が回転継手として作用するように機械的に回転されてもよく、または別個の回転継手が設けられてもよい。
【００５８】
図１５に示すように、軸受は、転がり軸受以外であってもよい。例えば、ローラ、玉軸受、またはブッシュ面であってもよい。図１５に示される変形試験管ホルダでは、１組の玉軸受２０４を試験管７２に押し付けて、ハウジング２００のブッシュ面で構成されたアライメント軸受２１１、２１２に試験管７２を押し付けるバネ２０２の固定部を、ハウジング２００が実現している。試験管が回転するときに試験管を支えるバイアス軸受および／またはアライメント軸受として、他の型の軸受が使用されてもよい。
【００５９】
図１３の実施形態以外の例示の実施形態では、試験管が試験管ホルダの中で平行移動されないで、代わりに、対物レンズ４０を平行移動させることによって、または、試験管と試験管ホルダをユニットとして平行移動させることによって、走査の平行移動部分が実現されている。他の考えられる実施形態では、例えば、試験管７２を試験管軸７５に沿って平行移動させるために、モータ１１２を回転継手１１２と接続するシャフト１１４に直線平行移動機能を持たせることによって、対物レンズを固定された状態に保ちかつ試験管を試験管ハウジングの中で平行移動させることが考えられる。
【００６０】
試験管中に含まれた、または試験管で支持された環状サンプル領域を撮像するための適切な顕微鏡システムおよび試験管ホルダは、説明した通りである。なお、環状サンプリング領域は、試験管壁１４とフロート壁１６の間のギャップ１２に含まれた例示の流体サンプル以外であってもよい。例えば、環状サンプル領域は、試験管の外面に付着された膜または塗膜であってもよく、或いは試験管の内面に付着された膜または塗膜であってもよい。さらに、「試験管」という用語は、例示の従来の試験管７２以外の他の管状サンプル容器を含むものとして広く解釈されるべきである。例えば、試験管は、関心のある対象のサンプルを円柱状のロッドの外側に塗布するために、含有ボリューム、固体物体、または関心のある他の対象の中に挿入された円柱状のロッドであるかもしれないし、または、試験管は、地質学上の円柱状コア・サンプルなどであってもよい。
【００６１】
環状スライドまたは、試験管中に含まれるか試験管で支持された環状サンプル領域からデータを取得するための適切な顕微鏡システムおよび試験管ホルダは、説明した通りである。以下に、環状生体液層の蛍光染料標識付き細胞を識別または定量化する適切な処理方法を説明する。
【００６２】
図１６には、特定の測定パラメータが図示されている。対物レンズ４０は、視野（ＦＯＶ）にわたって、また焦点深度にある視野深度にわたって像を形成する。図１６において、焦点深度は、対物レンズ４０に対して示されている。しかし、焦点深度は、他の基準に対して示されてもよい。いくつかの実施形態では、対物レンズ４０の焦点深度は約２０ミクロンであり、一方で、試験管壁１４とフロート壁１６の間の環状ギャップ１２は、約５０ミクロンである。しかし、環状ギャップ１２に対応する焦点深度は、試験管および／またはフロートまたは他の要素の不均一のために実質的に変化することがある。予期されることであるが、環状ギャップ１２は、周囲を取り囲む深度範囲（Encompassing Depth Range：以下、包括的深度範囲と称する。）の中のどこかにある。いくつかの実施形態では、３００ミクロンの包括的深度範囲が適切であることが分かった。この寸法は例であって、特定の対物レンズ４０、光透過試験管、フロート、使用される遠心分離の態様または他のサンプル処理などに依存して、特定の実施形態に関して実質的に異なることがある。
【００６３】
図１７には、１つの適切なデータ取得方法３００が図示されている。処理工程３０２で、包括的深度範囲に亘る複数の焦点深度で分析画像が取得される。深度方向にズレが生じないようにするために、工程３０２で取得される分析画像の数は、少なくとも包括的深度範囲を対物レンズ４０の視野深度で割ったものに対応すべきである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、分析画像は、随意の工程３０４で処理され、画像の明るさに基づいて、生体液層（バフィーコート層のような）の深度付近で１または複数の分析画像が特定される。この随意選択は、蛍光染料が一般に背景蛍光を引き起こすという観察結果を利用する。背景蛍光は、取得分析画像で全体的な画像明るさの増加として検出される。画像の明るさは、平均ピクセル強度、二乗平均ピクセル強度などの様々な方法で推定することができる。
【００６５】
画像処理工程３０６で、分析画像、または随意選択工程３０４で選択された１または複数の分析画像は、観察された特徴部分を候補細胞として識別するために、フィルタ処理、閾値化などのような適切な技術を使用して処理される。生体液層の染料標識付き細胞の密度は、一般に、１視野当たりに染料標識付き細胞が約１未満である。したがって、識別される候補細胞の割合は一般に低い。候補細胞が画像処理３０６で識別されたとき、適切な候補細胞標識が１組の候補細胞標識３１０に加えられる。例えば、候補細胞標識は、適切な索引システムおよび候補細胞の特徴部分のｘ−ｙ座標に基づいて画像を識別することができる。希少細胞の密度は一般に低いが、それにもかかわらず、画像処理３０６が、時々、単一の分析画像で２以上の候補細胞を識別することがあることは予想される。他方で、いくつかの分析画像で、候補細胞が識別されない可能性もある。
【００６６】
判断点３１２で、サンプル走査が完了したかどうかが決定される。完了していないときには、工程３１４で視野が動かされる。例えば、試験管７２の回転と試験管軸７５に沿った対物レンズ４０の平行移動との組合せで、環状ギャップ１２の生体液サンプル全体にわたって、視野を相対的に走査することができる。代わりに、図１３の管ホルダを使用して、試験管７２を螺旋状に動かすことによって走査が行われる。新しい視野ごとに、処理工程３０２、３０４、３０６が繰り返される。
【００６７】
サンプル走査が完了したことを判断点３１２が示すと、使用者検証処理３２０が随意に行われ、かかる処理において人間の分析者が各細胞候補を確認または却下することができる。画像処理３０６が十分に正確である場合には、使用者検証処理３２０は省略するようにしてもよい。
【００６８】
人間分析者によって確認された細胞の適切な統計を計算するために、統計分析３２２が行われる。例えば、生体液サンプルの体積または質量が分かっている場合には、単位体積または単位重さ当たりの希少細胞の密度（例えば、細胞／ミリメートルまたは細胞／グラム）を計算することができる。他の統計分析方法では、確認された細胞の数が合計される。標準試験管、標準フロート、標準全血液サンプル量、および標準化された遠心分離処理などの標準バフィーコート・サンプル構成が使用されるとき、これは適切な計量である。また、統計分析３２２は、閾値警報を含むことがある。例えば、細胞数または密度計量が第１の閾値よりも大きい場合、この警報は、さらに進んだ医療検査を必要とする癌の高い可能性を示してもよく、一方で、細胞数または密度が第２のより高い閾値を超えた場合には、この警報は、緊急の医療対応処置を必要とする癌の高い確率を示してもよい。
【００６９】
図１８には、部分的に変更した取得方法３００’が図示されている。処理工程３０４’で、分析画像以外の入力を使用して、最初に、最大背景蛍光強度の焦点深度が決定され、その後に、最大背景蛍光の焦点深度付近で１または数個の分析画像を取得する処理３０２’が行われる。例えば、様々な深度で低分解能画像を取得して、探索処理３０４’が行われてもよい。深度方向にズレが生じないようにするために、工程３０４’で取得される低分解能画像の数は、少なくとも包括的深度範囲を対物レンズ４０の視野深度で割ったものに対応すべきである。他の方法では、大面積の輝度センサ（図示省略）が捕えられた蛍光５０に結合されることがあり（例えば、カメラ５６の部分ミラーを使用して、またはカメラ５６に組み込まれた強度計量器を使用して）、さらに対物レンズ４０の焦点が、包括的深度範囲全体にわたって掃引されることがある。この掃引中のセンサまたは計量器のピーク信号は、最高明るさを与える焦点を示す。
【００７０】
処理工程３０４’で測定された生体液サンプルの深度を用いて、取得処理３０２’は、最高明るさの識別された焦点深度近傍で僅か１つまたは数個の分析画像を取得する。生体液層を完全にカバーすることを保証するために、取得される分析画像の数は、少なくとも環状ギャップ１２の厚さを対物レンズ４０の視野深度で割ったものであるべきである。例えば、環状ギャップ１２が約５０ミクロンの厚さであり、視野深度が約２０ミクロンである場合には、３つの分析画像が適切に取得される。すなわち、最高明るさの焦点深度で１つ、約１５〜２５ミクロンだけ大きい焦点深度で１つ、さらに、約１５〜２５ミクロンだけ小さい焦点深度で１つである。
【００７１】
部分的に変更した取得方法３００’の有利点は、分析画像を取得するより前に焦点深度が決定されるので、取得される高分解能分析画像の数が少なくなることである。決定された焦点深度、僅かに大きな焦点深度および僅かに小さな焦点深度で分析画像を取得して、決定された焦点深度の範囲を確定することは有利である。この方法は、蛍光背景が最大である深度から外れた深度で希少細胞が最適に撮像されることがある可能性を明らかにする。
【００７２】
図１９を参照して、画像処理３０６の適切な実施形態を説明する。この実施形態は、分析画像３３０の任意の細胞候補を識別するために、予想される希少細胞サイズについての演繹的知識（Priori Knowledge）を活用する。照合フィルタ処理３３２で、適切なフィルタカーネル（Filter Kernel）が画像と共に畳み込まれる。照合フィルタ処理３３２は、分析画像３３０中の希少細胞の画像の予想サイズと同等のサイズを有するフィルタカーネルを使用する。
【００７３】
引き続き図１９を参照し、さらに図２０および２１を簡単にさらに参照して、いくつかの実施形態では、正方形フィルタカーネル３３４が使用される。このカーネル３３４は、各々＋１の値を有するピクセルの中心正領域、および各々−１の値を有するピクセルの外側負領域を含む。正領域の面積は、負領域の面積とおおよそ同じ大きさであるべきである。内側領域か外側領域かのどちらか以外の点は、ゼロのピクセル値を有する。フィルタに僅かに正または僅かに負の応答を与えるために、＋１および−１以外の他のピクセル値が、内側および外側領域にそれぞれ使用されてもよい。
【００７４】
さらに図１９に示すように、照合フィルタ処理は、背景照明によって生じたオフセットを除去するか、減少させ、また、希少細胞の信号対雑音比（ＳＮＲ）を改善する。信号は、正照合面積にある点の数だけ増加し、一方で、雑音は、正照合面積と負照合面積の両方にある点の数だけ増加する。ＳＮＲの利得は、信号が直接増すことから生じ、一方で、組み合わされたサンプルの数の二乗平均（ＲＭＳ）値または平方根として増す。Ｎ個の正点およびＮ個の負点を有するフィルタでは、Ｎ／√（２Ｎ）または√（Ｎ／２）の利得が得られる。
【００７５】
正方形フィルタカーネル３３４は、そのエッジ（縁）が分析画像３３０のｘ−ｙ座標方向と並んでいるので、計算上有利である。場合によっては、丸いフィルタカーネル３３４’またはそれ以外の形をしたカーネルが、正方形フィルタカーネル３３４の代わりに使用される。しかし、丸いフィルタカーネル３３４’は、正方形フィルタカーネル３３４よりも計算的に費用がかかる。丸いフィルタカーネル３３４’と比べて正方形フィルタカーネル３３４の他の有利点は、正方形フィルタ３３４のフィルタ・エッジ長さの合計が、検出サイズの２倍から検出サイズの１．４１４倍に減少することである。このことで、エッジ効果が減少し、分析画像３３０のエッジに比較的近いデータを使用することが可能になる。
【００７６】
フィルタカーネルのサイズは、最良のＳＮＲ改善を実現するために、分析画像３３０中の染料標識付き細胞の予想画像サイズに実質的に整合するように選ばれるべきである。例えば、全体に１０個のピクセルがある正（＋１）領域を有する正方形フィルタカーネル３３４は、約１０ピクセルの直径を有する細胞画像に対して最良のＳＮＲ改善を実現すると予想される。このような整合の場合には、信号は、約７８倍に増加すると予想され、一方で、雑音は約１４倍に増加すると予想され、約５．５７：１のＳＮＲ改善が実現される。他方で、同じ正方形フィルタを使用するより小さな８ピクセル直径の細胞の場合のＳＮＲ改善は、約３．５９：１であると予想される。同じ正方形フィルタを使用するより大きな１４ピクセル直径の細胞の場合のＳＮＲ改善は、約３．２９：１であると予想される。
【００７７】
照合フィルタ処理３３２は、様々な方法で実現することができる。１つの方法では、入力画像の各点は、正内側領域にある出力画像の全ての点に合計される。次に、外側の負領域にあるが内側の正領域にない出力画像の全ての点が、減算される。入力画像の各点には一度タッチ（Touch）するだけであるが、出力画像の各点には、外側ボックスのピクセル面積数の回数だけタッチする。
【００７８】
他の適切な方法では、出力画像の点ごとに、正の内側ボックスの中にある入力画像からの全ての点が読み取られ、合計される。次に、正の内側ボックスの外であるが負の外側ボックス内にある全ての点が、減算される。各出力画像ピクセルは僅か一度だけタッチするが、各入力画像ピクセルは、外側ボックスのピクセル数だけタッチする。
【００７９】
他の適切な方法では、入力画像の現在行について２つの内部値、すなわち、負の外側ボックス距離（Negative outer box distance）の行の全ての点の合計値と、内側正ボックス距離（Inner positive box distance）の行の全ての点の合計値が作られる。現在行の全ての出力画像列点は、それらから除かれた外側ボックスの全ての点の入力画像合計を有する。内側正ボックス内の全ての出力画像列点は、内側正ボックス距離の入力画像行点の合計を２回加えられる。行合計は、１つの加算と１つの減算によって、行の次の点のために更新される。これによって、実施コストが減少してフィルタ・ボックスのほぼ高さであるようになる。
【００８０】
照合フィルタ処理３３２においては、様々なエッジ条件を使用することができる。例えば、１つの方法では、分析画像３３０のエッジに重なるフィルタを有するどんな点に対しても出力が生成されない。この方法は、エッジのアーチファクト（Artifacts）を回避するが、有用な面積の減少した出力画像を生成する。他の適切なエッジ条件例では、エッジの全ての点にデフォルト値（例えば、ゼロまたは計算された平均レベルなど）が使用される。
【００８１】
さらに、図１９に示すように、照合フィルタ処理３３２の後でバイナリ（Binary）閾値化処理３３８が適用される。閾値化３３８を行う際の困難さは、適切な閾値の選択である。閾値選択は、いくつかの分析画像が細胞を含まないか、または１つの細胞だけ含むか、または数個すなわち２〜３個の細胞だけを含むか、という可能性によって複雑になる。１つの方法では、閾値は、フィルタ処理されたデータに見られるピーク・ピクセル強度より下の選択されたたパーセント値として選択される。しかし、その場合にピーク・ピクセル値は雑音の中にあるので、この閾値によって、細胞が存在しないとき雑音が検出されるようになる。他の方法は、固定閾値を使用することである。しかし、バックグラウンド強度が分析画像間で実質的に変化する場合、または、照合フィルタ処理がピクセル強度の動的範囲を実質的に変える場合には、固定閾値は、決して最適でない可能性がある。
【００８２】
例示の方法では、閾値は、フィルタ処理されない分析画像３３０のＳＮＲに基づいた処理３４０によって決定される。最初に入力画像の標準偏差を決定することによって、フィルタ出力の予想雑音を計算することができる。雑音は、一般に、合計されたピクセルの数の平方根で大きくなり、このピクセル数は、ピクセル計数の外側ボックス面積である。いくつかの実施形態では、閾値は、この雑音レベルのほぼ７−シグマに設定される。このフィルタは、正確なゼロ直流応答を有しないので、適切な平均レベルが閾値に適切に合計される。
【００８３】
閾値化３３８はバイナリ画像を生成し、このバイナリ画像では、細胞画像の部分であるピクセルが一般に第１の２進値（例えば、「１」）を有し、一方で、細胞画像の部分でないピクセルが一般に第２の２進値（例えば、「０」）を有している。したがって、連結性処理３４４は、ある細胞に対応する第１の２進値のピクセルの連結グループを識別するために行われる。結合性分析３４４は、結合グループの全ての第１の２進値のピクセルを、ユニットとして調査されるべき細胞候補として集めるか、関連付ける。この連結グループまたはユニットの中心は、候補細胞標識の細胞位置座標として決定し、使用することができる。
【００８４】
図２２を参照して、随意のユーザ照合処理３２０の適切な実施形態を説明する。標識は、選択工程３５０で照合のために選ばれる。ディスプレイ工程３５２で、候補細胞標識を含む分析画像の範囲が表示される。また、必要に応じて、候補細胞を含む分析画像に深度方向に隣接した分析画像の対応する範囲と共にディスプレイされる。深度方向に隣接した分析画像をディスプレイすることで、自動化処理３０６で細胞候補が検出された分析画像よりも多くの判別可能な細胞画像を偶然に含む可能性がある追加の視野が、調査する人間分析者に与えられる。人間分析者は、工程３５４で候補を確認するか、却下するかのどちらかである。ループ工程３５６は、全ての候補細胞標識を通して、各候補細胞についての人間分析者による調査を実現するように機能する。統計分析３２２は、人間分析者によって確認されたそれら細胞候補標識に基づいて動作する。
【００８５】
実施例のデータ取得および分析処理は、試験管壁１４とフロート壁１６の間の環状ギャップ１２の環状サンプルを使用する定量的なバフィーコート分析のところで、図１６〜２２を参照して説明した通りである。しかし、本処理は、図４に示した平面サンプル・スライド６０の走査など、他のサンプル走査方法に容易に適用される。
【００８６】
実施例の形態は、基本的に、定量的なバフィーコート分析に関している。しかし、当然のことながら、本明細書で開示された装置および方法は、他の型の生物学的検定に応用可能である。例えば、細胞は、蛍光標識付けされるのではなく、色付けされてもよく、または、細胞は、光学顕微鏡による評価を可能にする固有の光学的特徴（蛍光、コントラストなど）を有するものであってもよい。評価される特徴は、希少細胞以外であってもよい。例えば、評価される特徴は、細胞の破片、バクテリア、または、多細胞構造であってもよい。サンプルは、バフィーコート・サンプル以外の生物学的なサンプルであってもよい。
【００８７】
本発明は、好ましい実施形態を参照して説明された。明らかに、先の詳細な説明を読み理解すると、修正物および変更物が他の人達の心に浮かぶだろう。本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入る限りで全てのそのような修正物および変更物または同等物を含むものとして解釈される意図である。
このように好ましい実施形態を説明したので、今や、本発明は、添付の特許請求の範囲のように特許請求される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】実質的に顕微鏡視野全体にわたって実質的に均一な静的照明を実現する光学システムを含んだ顕微鏡システムを示す図である。
【図２】部分的に変更された光学システムを有する図１の顕微鏡システムを示す図である。
【図３】部分的に変更された他の光学システムを有する図１の顕微鏡システムを示す図である。
【図４】部分的に変更されたさらに他の光学システムを有する図１の顕微鏡システムを示す図である。
【図５】ホルダを示す斜視図であり、そのハウジングは、内部部品が分かるように透過で示されている。
【図６】ホルダを示す側面図であり、そのハウジングは透過で示されている。
【図７】試験管およびアライメント軸受およびバイアス軸受を示す斜視図である。
【図８】試験管ホルダを示す上面図であり、付勢力の表示を含む。
【図９】凹凸付き底部を含む試験管の第２の端部を示す側面図である。
【図１０】図９に示された試験管の凹凸付き底部と噛み合うように構成された凹凸を含む回転カップラを示す上面図である。
【図１１Ａ】他の実施形態の試験管ホルダを示す上面図であり、偏心した断面の試験管が荷重を掛けられている。
【図１１Ｂ】他の実施形態の試験管ホルダを示す上面図であり、偏心した断面の試験管が荷重を掛けられている。
【図１２】傾斜転がり軸受を使用する試験管ホルダの部分を示す側面図である。
【図１３】試験管の螺旋走査を可能にする螺旋状突出部を有するフロートと共に、試験管軸に沿って互い違いに配置された傾斜転がり軸受を使用する試験管ホルダの部分を示す側面図である。
【図１４】試験管を水平に保持し、かつ試験管を付勢に使用する試験管ホルダを示す斜視図である。
【図１５】ブッシュ面をアライメント軸受として、また一組の玉軸受をバイアス軸受として使用する試験管ホルダを示す上面図である。
【図１６】試験管内壁とフロートの外面の間の環状ギャップに捕獲されたバフィーコート・サンプルを使用して、定量的なバフィーコート分析を行う際の関連した特定の測定パラメータを示す図である。
【図１７】適切な定量的バフィーコート測定／分析方法を示す図である。
【図１８】他の適切な定量的バフィーコート測定／分析方法を示す図である。
【図１９】候補細胞に標識付けする適切な画像処理方法を示す図である。
【図２０】照合フィルタ処理で使用するのに適した正方形フィルタカーネルのピクセル配置を示す図である。
【図２１】図２０の正方形フィルタカーネルのピクセル強度断面Ａ−Ａを示す図である。
【図２２】人間の分析者が候補細胞を確認するか、却下することができるようにする適切な使用者照合プロセスを示す図である。
【符号の説明】
【００８９】
１０  顕微鏡システム
２２  光学素子列
４０  対物レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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