(57)【要約】  密着結合形成を調節するための方法及び組成が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の密着結合のモジュレータを識別するための方法であって、
（ａ）形質転換された上皮細胞又は形質転換された内皮細胞を試験化合物に接触させることと、
（ｂ）前記試験化合物に接触させられた形質転換された細胞により、機能的な密着結合の構造を決定することと、
（ｃ）前記試験化合物が形質転換された細胞のオクルディン（occludin）の活動を調節することにより密着結合の構造を増加させるところ、対照化合物と比較して密着結合の構造を増加させる前記試験化合物を選択すること
を含む方法。
【請求項２】
選択された化合物が機能性内皮の分裂した表現型特性を誘発する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試験化合物がオクルディンの活動を再現する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記試験化合物がオクルディンの発現を上方に調節する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記試験化合物がポリヌクレオチド又はポリペプチドを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記形質転換された細胞がＰａ４−Ｒａｆ１細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記試験化合物がオクルディンの第二のループと相互作用する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
間葉形質転換への内皮のモジュレータを識別するための方法であって、
（ａ）オクルディン又はその断片を試験化合物に接触させることと、
（ｂ）前記試験化合物がオクルディン又はその断片と直接的又は間接的に相互作用するか否かを決定することと、
（ｃ）オクルディンの第二のループと相互作用して形質転換された細胞内の上皮から間葉への形質転換の表現型の変更を反転させる試験化合物を選択すること
を含む方法。
【請求項９】
選択された化合物が、形質転換された細胞内の機能性内皮の分裂した表現型特性を誘発する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験化合物がポリヌクレオチド、ポリペプチド又は有機小分子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記形質転換された細胞がＲａｆ１により形質転換されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒａｆ１により誘発された形質転換を調節するための方法であって、
Ｒａｆ１により形質転換された細胞を形質転換された細胞内のオクルディンの発現を誘発する組成に接触させることと、
Ｒａｆ１に起因する上皮から間葉への形質転換の表現型の変化を反転させること
を含む方法。
【請求項１３】
上皮細胞又は内皮細胞の形質転換を治療する方法であって、
上皮から間葉への形質転換の表現型の変化を反転させるのに十分な量にて、形質転換された上皮細胞又は内皮細胞をオクルディンモジュレータを含む組成に接触させること
を含む方法。
【請求項１４】
上皮から間葉への形質転換の表現型の変化がＲａｆ１に起因する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
皮膚癌を治療するための組成であって、
Ｒａｆ１に起因する上皮から間葉への形質転換の表現型の変化を反転させるのに十分な量にて、第二のループとオクルディンのカルボキシ末端を含む組み換えオクルディンポリペプチドをコード化するベクターと、
薬学的に受容可能な担体又は賦形剤
を含む組成。
【請求項１６】
上皮細胞又は内皮細胞の形質転換を治療するための組成であって、
宿主内のＲａｆ１に起因する上皮から間葉への形質転換の表現型の変化を反転させるために有効なオクルディンモジュレータの量
を含む組成。
【請求項１７】
前記宿主が哺乳類を含む、請求項１６に記載の組成。
【請求項１８】
前記オクルディンモジュレータがポリヌクレオチド、ポリペプチド、有機小分子又はこれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の組成。
【請求項１９】
第二の治療剤をさらに含む、請求項１６に記載の組成。
【請求項２０】
前記第二の治療剤が化学療法薬である、請求項１９に記載の組成。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、2004年12月28日出願の米国仮特許出願番号60/639,824に関連してその利益を主張し、その完全な開示は参照によりその全体についてここに含まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般に癌を治療し又は予防するための方法及び組成に関し、特に上皮性癌を治療するための方法及び組成に関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術）
上皮細胞の重要な機能は、内部環境を外部環境から分離する選択的かつ調整された障壁の維持にある。上皮の障壁は頂端接合部複合体（ＡＪＣ）を含み、これは上皮細胞の極性及び障壁特性の決定、並びに上皮細胞内の傍細胞透過性及び細胞間接着の調整において重要である。ＡＪＣは、閉鎖結合又は「密着結合」（ＴＪ）及び接着結合（ＡＪ）から構成される。ＴＪは、近接する上皮細胞間の傍細胞経路を通じた溶質の拡散に対する一次障壁を形成し、頂端細胞膜部と側底細胞膜部の間の機能的フェンスを形成する。障壁機能と細胞極性の維持におけるその役割に加えて、ＴＪは細胞成長及び増殖に結び付けられた信号伝達経路に関与する。障壁機能、細胞極性並びに細胞成長及び増殖の破壊は上皮性癌の共通した特徴であるため、ＴＪ蛋白質は上皮発癌性形質転換に関連した事象の研究のための魅力的な候補であるように見える。
【０００４】
ＴＪ複合体は、膜貫通及び細胞質性の（「足場」）蛋白質、調節酵素及び転写因子から構成される。膜貫通蛋白質メンバーは、オクルディン（フルセら、1993年）、クローディン（Claudin）（フルセら、1998年）及び接合接着分子（ＪＡＭ）（Martin-Padumaら、1998年）を含む。小帯オクルディン（ＺＯ‐１、ＺＯ‐２及びＺＯ‐３）のような種々のサイトゾルプラーク蛋白質は、その直接的にオクルディン（イトウら、1997年）、クローディン（イトウら、1999年）並びにアクチン（Wittchenら、1999年）に結合する能力を介して、足場要素として作用することが示された。これらの足場蛋白質に加えて、非定型蛋白質キナーゼＣ（ＰＫＣ）イソタイプ、蛋白質キナーゼＡ及びＲｈｏ様ＧＴＰアーゼのような調節酵素が、ＺＯＮＡＢ及びｈｕＡＳＨ１のような転写因子に沿ったＴＪにおいて発見される（Matter及びBalda、2003年）。この多数の膜貫通蛋白質、足場蛋白質、調節酵素及び転写因子は、障壁機能、細胞極性、成長及び増殖の調節に関与するＴＪにおける動的複合体を共に形成する。
【０００５】
６５ｋＤａまでの分子量を有するオクルディンは、最初に識別され、ニワトリ内（フルセら、1993年）、続いて種々の哺乳類種内（アンドウ・アカツカら、1996年）のＴＪストランドに局在する内在性膜蛋白質として特徴付けられた。水治療法計画分析は、オクルディンが長いＣ終端細胞質尾部とより短いＮ終端細胞質ドメインを有する四つの膜貫通ドメインから構成されることを示唆する。この提案されたトポグラフィーは、二つの細胞外ループと一つの短い細胞内ターンを四つの膜貫通部分に位置付ける。証拠により、オクルディンがＴＪ障壁機能（Baldaら、1996年）、ＴＪフェンス機能及び細胞接着事象（Van Itallie及びAnderson、1997年）に直接的に関与することが示唆される。加えて、我々の以前の研究は、オクルディンが上皮細胞内の発癌性形質転換に関連した表現型の変更の矯正において役割を果たすことを示唆する（Li及びMrsny、2000年）。
【０００６】
種々の研究により、特定のオクルディンドメイン欠失又は置換がそのＴＪにおける局在化及びその障壁機能における役割にどのように影響するかが調査された（Baldaら、1996年、Chenら、1997年、フルセら、1994年）。オクルディンの突然変異型の過剰発現は、例えば培養された上皮細胞内の障壁及びフェンス機能の両方に影響することが示された（Bamforthら、1999年）。オクルディンの細胞外ループに対応する合成ペプチドは、ＴＪを破壊して細胞接着を抑制することが観察された（Lacaz-Vieiraら、1999年、Wong及びGumbiner、1997年）。これらの研究は、オクルディンがＴＪ障壁及びフェンス機能において中心的役割を果たすことと、特定のオクルディンドメインの突然変異が細胞内における機能及びその局所化に影響を与えることに大筋で同意する。
【０００７】
機能的ＴＪ構造の破壊は、多数のヒト上皮性癌の共通した特徴である。特定のＴＪ蛋白質の下方制御は、癌の種々の形態において病期、侵襲性及び転移可能性と相関することが示された（Hooverら、1998年、トビオカら、2004年）。例えば子宮内膜癌において、オクルディンの下方制御は腫瘍悪性度、侵襲性及び転移と相関することが示され、不完全に分化された胃腸腺癌においてオクルディン発現が減少することも観察された（キムラら、1997年）。オクルディンに加えて、クローディン及びＺＯ−１のような他のＴＪ関連蛋白質が、悪性度の重要な指標であることが示された。いくつかの乳癌において、より悪性型においてＺＯ−１発現が減少することが示され（Hooverら、1998年）、クローディン７の発現が組織学的悪性度と相関することが示された（Kominskyら、2003年）。ＴＪ蛋白質が予後指標として働くことに加えて、癌細胞へのＴＪ蛋白質の導入が腫瘍侵襲及び転移を防ぎ得ることを示唆する山のような証拠が存在する。例えば、クローディン４の過剰発現は、生体外において膵臓癌細胞の侵襲性を減少させることと、動物モデルにおいて転移を減少させることが観察された（Michlら、2003年）。
【０００８】
以前の研究（Li及びMrsny、2000年）は、構造的に活性の発癌性Ｒａｆ１の過剰発現が、ＴＪ蛋白質オクルディンの下方制御によりラット上皮Ｐａ４細胞を発癌性表現型に形質転換したことを証明した。一方、Ｒａｆ１形質転換細胞への外因性のオクルディンの導入は、上皮性表現型を救い、機能的ＴＪの再構成を誘発することが観察された。細胞内の発癌性表現型におけるオクルディンの影響を調査し決定するために、さらなる研究が必要とされた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
本開示の局面は、一般に細胞、特に形質転換された細胞において密着結合形成を調節するための組成及び方法を提供する。他の局面は、密着結合構造のモジュレータを識別するための方法を提供する。
【００１０】
一つの局面は、形質転換された上皮細胞又は形質転換された内皮細胞を試験化合物に接触させることにより細胞密着結合のモジュレータを識別し、試験化合物に接触した形質転換された細胞により機能的密着結合の構造を決定し、対照化合物と比較して密着結合の構造を増加させる試験化合物を選択するための方法を提供する。ここで、試験化合物は形質転換された細胞のオクルディン活動を調節することにより、密着結合の構造を増加させる。
【００１１】
別の局面は、オクルディン又はその断片を試験化合物に接触させ、試験化合物がオクルディン又はその断片と直接的又は間接的に相互作用するか否かを決定し、オクルディンの第二ループと相互作用して形質転換された細胞における上皮から間葉への形質転換の表現型変化を反転させる試験化合物を選択することにより、上皮の間葉形質転換のモジュレータを識別するための方法を提供する。
【００１２】
さらに別の局面は、Ｒａｆ１により形質転換された細胞を、形質転換された細胞内におけるオクルディンの発現を強制する組成に接触させ、Ｒａｆ１に起因する上皮から間葉への形質転換の表現型変化を反転させることにより、Ｒａｆ１が導入された形質転換を調節するための方法を提供する。
【００１３】
さらに別の局面は、上皮から間葉への形質転換の表現型変化を反転させるのに十分な量のオクルディンモジュレータを含む組成に、形質転換された上皮又は内皮細胞を接触させることにより、上皮又は内皮細胞の形質転換を治療する方法を提供する。
【００１４】
他の局面は、密着結合を調整するための組成を提供する。一つの局面は、薬学的に受容可能な担体又は賦形剤と、Ｒａｆ１に起因する上皮から間葉への形質転換の表現型変化を反転させるのに十分なオクルディンのカルボキシ末端及び第二のループを含む組み換えオクルディンポリペプチドをコード化するベクターを含む、皮膚癌を治療するための組成を提供する。
【００１５】
別の局面は、Ｒａｆ１に起因する上皮から間葉への形質転換の表現型変化を反転させるのに有効なオクルディンモジュレータを含む上皮又は内皮細胞の形質転換を治療するための組成を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（詳細な説明）
上皮細胞において、ＴＪは傍細胞溶質流動及び細胞極性を調節するために重要である。ＴＪ蛋白質の破壊は上皮性癌において報告されるが、従来、発癌性形質転換の調節におけるＴＪ蛋白質の役割は大部分が未調査のままであった。以前の研究は、ＴＪ蛋白質オクルディンが活性Ｒａｆ１によって形質転換された上皮細胞株（Ｐａ４）の表現型を修正する能力を識別した（Li及びMrsny、2000年）。機能の救済（rescue-of-function）アプローチを使用して、本開示はオクルディンの特定の領域がＲａｆ１媒介性細胞形質転換を修正する自己の能力にどのように影響を与えるかについての、この同一のＰａ４細胞系を使用した調査の結果を示す。本研究からの最も注目すべき発見の一つは、提示されたオクルディンの第二の細胞外ループが、上皮形態（図２）、接合部複合体の組み合わせ（図３及び図４）及びＴＪ障壁機能（図５）の救済において重要であることを示した。加えて、オクルディンの第二のループは、Ｒａｆ１により促進される生体外軟寒天の足場依存性の成長（図６）及び生体内腫瘍成長（図７）を反転させるために重要である。
【００１７】
証拠の蓄積により、オクルディンがＴＪ内の構造及び機能において重要な役割を果たすことが示唆される。オクルディンの突然変異型の過剰発現は、培養された上皮細胞内の障壁及びフェンス機能の両方に影響を与えることが示され（Baldaら、1996年、Bamforthら、1999年）、オクルディンの細胞外ループに対応する合成ペプチドはＴＪを破壊して細胞接着を抑制することが観察された（Lacaz-Vieiraら、1999年、Wong及びGumbiner、1997年）。内皮細胞においては、血液脳関門の内皮細胞が全身の内皮細胞（全身の内皮細胞はより漏れやすい密着結合を有する。）より極めて高いレベルのオクルディンを発現する点において、オクルディン発現はＴＪ機能と相関するように見える（ヒラセら、1997年）。最後に、オクルディン不活性化マウスは、遅延した成長及び種々の組織特有の異常を含む複合表現型を示し、オクルディンの機能が重要であることを示唆する（サイトウら、2000年）。これらの研究は共に、オクルディンが上皮及び内皮細胞機能にとって決定的に重要な、ＴＪのキー構成要素であることの強力な証拠を提供する。
【００１８】
種々の研究は、オクルディン局在化及びＴＪ機能上における特定の突然変異体の効果を調査した。多数の研究が、オクルディン蛋白質がＴＪの重要な構成要素であることに同意するものの、無傷の機能性ＴＪの標的化及び形成に特定のオクルディン領域が必要とされるか否かについて、いくつかの不一致が生じた。例えば、Ｃ‐末端尾の全体を欠くオクルディン構造がＴＪにおいて局在化することが観察され（Baldaら、1996年、Chenら、1997年）、Ｃ‐末端尾単独では局在化のために十分であるように見えない（Matter及びBalda、1998年）。しかしながら、これらの結果はＣ‐末端が切断されたオクルディン構造がＴＪにおいて局在化することに失敗したことを報告する別の研究（フルセら、1994年）と矛盾する。加えて、第一の細胞外ループを欠くオクルディン構造がＴＪにおいて局在化に成功することが観察されたが、第二のループ又は両方の細胞外領域を欠く構造が局在化しなかったことが観察された（Bamforthら、1999年、Medinaら、2000年）。このように、オクルディンの細胞外領域、特に第二のループはＴＪ内におけるオクルディンの局在化のために重要であり、Ｃ‐末端尾の要求は未だ不明確なままである。これらの研究において使用される細胞株の複製起点及び使用されるオクルディン構造における微細な違いが、これらの明白な不一致のいくつかを説明し得る。特に、内在性のオクルディンとその結合パートナーの存在は、導入されたオクルディン構造の局在化とＴＪ機能におけるオクルディン構造の作用に影響を与える。我々の現在の研究の特有の局面は、Ｒａｆ１により形質転換されたＰａ４細胞の使用である。Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞はオクルディンを発現せず又は結合を形成しないが、機能的及び形態論的に無傷のＴＪを形成することが可能な高分化型のＰａ４上皮細胞から派生される。このモデルは、オクルディン蛋白質に対する構造的変更がどのように上皮細胞におけるオクルディン蛋白質の機能に影響を与えるかを調査するために有用であると分かった。
【００１９】
以前の研究は、オクルディンの第二のループに対応するペプチドの管理が上皮を横断する電気抵抗を崩壊させ、細胞結合からのオクルディンの消失の結果をもたらしたことを示した（Wong及びGumbiner、1997年）。このように、オクルディンの第二の細胞外ループはＴＪ複合体内にオクルディン蛋白質を集中させ、かつ／又は安定させるために重要であると思われる。他の研究は、オクルディンの細胞外領域が細胞間接着に直接的に関与することを示し（Van Itallie及びAnderson、1997年）、細胞間の同種親和性オクルディン相互作用がその細胞外領域に依存する可能性が高いことを示した（フルセら、1998年）。第一の細胞外ループを欠くオクルディンはＴＪにおいてＺＯ‐１と共に局在化される一方、第二のループを欠くオクルディンは密着結合に不在であったことが報告された（Medinaら、2000年）。これらのデータは、細胞外領域に関与する相互作用がＴＪ内のオクルディン機能について決定的に重要であり得るとの考えを支援する。これらの報告と一致して、我々はＰａ４‐Ｒａｆ１細胞内の第二の細胞外ループを欠くオクルディン蛋白質の発現が上皮形態を救済せず、あるいはＴＪ構造又は機能を回復しなかったことを観察した。しかしながら、第一のループを欠くオクルディン突然変異体がＴＪにおいて局在化され（図２）、ＴＪ複合体の集合の成長を促進し（図３及び図４）、さらに障壁機能を部分的にのみ救済した（図５）ことは興味深い。これらの結果は、第一のループがＴＪ複合体内へのオクルディンの集合のために第一のループが必要とされない可能性があるが、第一のループはＴＪの傍細胞浸透性特性の確立及び／又は維持において役割を果たし得ることを示唆する。
【００２０】
多重遺伝子族を構成するクローディンは、ＴＪの障壁機能に直接的に関与することが示された（モリタら、1999年、ツキタ及びフルセ、1999年）。クローディン及びオクルディンは、共にＴＪストランドの骨格を構成すると考えられる。最近の研究は、クローディンとオクルディンの間の直接的相互作用がそれらの機能に貢献することを示唆する。例えば、オクルディンはクローディン‐４と協同して選択的傍細胞浸透性を媒介することが証明された（Baldaら、2000年）。オクルディンとクローディンの間の相互作用は、Ｌ‐細胞内のクローディンが導入された膜内ストランドへのオクルディンの補充によっても示唆される（フルセら、1998年）。以前の研究において、完全長のオクルディン発現の範囲は全体のクローディン‐１蛋白質レベルと正に相関したことが示され、オクルディンとクローディンの間の相互作用を強く示唆している。本研究は、オクルディンによるクローディン‐１の上方調節がその第二の細胞外ループを利用することを証明し、これらの蛋白質の細胞外領域が直接的に相互作用し得る概念を支援している。しかしながら、これらの結果の解釈において、ＴＪにおけるクローディン‐１の上方調節及び安定化が、実はＺＯ‐１のような他のＴＪに関連した蛋白質により間接的に媒介され得ることを考慮することが重要であり、ＺＯ‐１のＴＪにおける局在化もまたオクルディン発現により影響を受ける。
【００２１】
オクルディンがＲａｆ１により導入された形質転換を抑制する分子メカニズムは良く理解されていない。本明細書の以下の開示は、Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞内の野生型オクルディンの過剰発現が、遺伝子発現における劇的変化の結果をもたらしたマイクロアレイ実験である。この発見は、オクルディンにより媒介されたＲａｆ１により形質転換された細胞内の上皮表現型の救済が、転写レベルにおける調節を含むことを示唆する。ＴＪ蛋白質と転写因子の間の関係についてはほとんど知られていないが、増加する証拠により、おそらくＺＯ‐１のようなＴＪ関連アダプター蛋白質を通じて、ＴＪ蛋白質が遺伝子発現の抑制において役割を果たすことが示唆される。例えば、ＺＯ‐１によるＥｒｂＢ２の調節は転写因子ＺＯＮＡＢの隔離を含むと考えられ（Balda及びMatter、2000年）、ＺＯ‐１のＺＯＮＡＢとの相互作用は細胞成長及び増殖のＣＤＫ４により媒介された抑制において役割を果たすと思われる（Baldaら、2003年）。最近には、ＺＯ‐２と転写因子Ｆｏｓ、Ｊｕｎ及びＣ／ＥＢＰの間の相互作用が、ＡＰ‐１を介した遺伝子発現を抑制することが証明された（Betanzosら、2004年）。ＴＪと関連付けられた別の転写因子はＡＳＨ‐１であるが（ナカムラら、2000年）、ＴＪ蛋白質がＡＳＨにより抑制された遺伝子発現にどのように影響を与えるかについてはより少なくしか知られていない。Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞内における発癌性表現型を反転させることにおけるオクルディンの劇的な効果を前提とすれば、転写抑制がこの過程において役割を果たす可能性が高い。将来の研究は、ＴＪにおけるオクルディン発現及び局在化が、ＴＪ内において局在化させる、ＡＳＨ及び他のＺＯ‐１及びＺＯ‐２と相互作用することが知られる特定の転写因子にどのように影響を与えるかを考慮するかも知れない。
【００２２】
現在、生体外及び生体内においてＴＪ蛋白質オクルディンの発現が上皮細胞のＲａｆ‐１形質転換を抑制し得る証拠が蓄積されている。本開示は今、オクルディンの第二のループがＲａｆ１の活性化に関連した上皮から間葉への形質転換（ＥＭＴ）表現型変化を反転させるために重要であることを示す直接的証拠を提示する。オクルディンによるＥＭＴ反転は、機能的ＴＪの形成及び極性付けされた機能的上皮の表現型特性の再取得にも関連付けられている。重要なことに、前記の結果はＴＪが上皮性癌の調整において極めて重要な役割を果たすことを証明し、ＴＪ蛋白質オクルディンがＲａｆ１腫瘍遺伝子と共にＥＭＴに関連した事象を制御するための機能的原動力に参加することを示唆する。ＴＪの破壊はヒト上皮性癌における侵襲及び転移の重要な指標と考えられ、オクルディンのようなＴＪ蛋白質はそのような癌の診断及び治療のための価値ある分子標的であると証明され得る。
【００２３】
（スクリーニング）
本開示は、オクルディン活動のモジュレータ、細胞形質転換のモジュレータ及び密着結合形成のモジュレータを識別するための方法をも提供する。ここで使用される「試験化合物」又は「モジュレータ」の語は、密着結合の形成、特にオクルディンにより媒介された密着結合の形成を潜在的に抑制又は促進し得る任意の分子を指す。代表的なモジュレータは、オクルディンのカルボキシ末端を選択的に含むオクルディンの第二のループのようなオクルディンの断片又はオクルディンの活動又は発現を模倣し又は増加させる。試験化合物又はモジュレータは、蛋白質又はその断片、小分子又は核酸分子でさえあり得る。いくつかの試験化合物及びモジュレータは、オクルディンポリペプチドに構造的に関連する化合物であり得る。本開示は、改善された化合物を開発することを支援するために鉛化合物の使用を考慮し、既知の阻害剤及び活性化剤との比較のみならず、オクルディン、特にオクルディンの第二のループのような標的分子の構造に関連した予測をも含む。
【００２４】
一つの実施形態は、試験化合物の存在下において、オクルディンポリペプチド、その同族体又はその断片による密着結合の形成を分析することと、対照化合物と比較してオクルディンにより媒介された密着結合形成を促進又は阻害する試験化合物を選択することを含む密着結合形成のモジュレータを識別するための方法を提供する。
【００２５】
別の実施形態においては、有用な薬剤の基本的基準を満たすと考えられる小分子ライブラリが、有用な化合物を識別するためにスクリーニングされ得る。組み合わせにより生成されたライブラリ（例えば発現ライブラリ）を含むそのようなライブラリのスクリーニングは、活動に関連した（及び関連しない）多数の化合物をスクリーニングするための高速かつ効率的な方法である。組み合わせによるアプローチは、第二、第三及び第四世代化合物モデル化された活性化合物（しかしそうでなければ所望されない化合物）の創造により、そのアプローチ自体を潜在的な薬剤の高速な進化にも役立てる。
【００２６】
試験化合物は自然発生する化合物の断片又は一部を含むことができ、あるいは既知の化合物の活性の組み合わせ（しかしそうでなければ当該組み合わせは不活性である）として発見され得る。動物、微生物、菌類、植物源（葉及び樹皮を含む）及び海水試料のような自然源から単離された化合物は、潜在的に有用な医薬品の存在のための候補として分析され得る。スクリーニングされるべき医薬品は、化学的組成又は人工化合物からも派生又は合成され得ることが理解されるであろう。このように、本開示の実施形態により識別される試験化合物は、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、小分子誘導剤、既知の阻害剤若しくは促進剤に基づいて設計され得る有機若しくは無機又は任意の他の化合物であり得ることが理解される。
【００２７】
他の適切なモジュレータは、アンチセンス分子、リボザイム及び抗体（単鎖抗体を含む）のような触媒核酸を含み、前記のそれぞれはオクルディンについて特有であり、特にオクルディンの第二のループについて特有である。例えば、翻訳若しくは転写開始部位又はスプライス部位に結合するアンチセンス分子は、試験化合物の範囲内である。
【００２８】
モジュレータの構造の重要な部分、例えばオクルディンの第二のループを模倣するために、最初に識別された調節化合物に加えて、他の立体的に類似の化合物が形成される。そのような化合物は、ペプチドモジュレータのペプチド模倣薬を含み、最初のモジュレータと同一の方法により使用され得る。
【００２９】
本開示による阻害剤又は活性化剤は、上流又は下流に、直接的又は間接的に、オクルディンにより媒介される密着結合構造にその阻害又は活性化効果を与えるものであり得る。一つの実施形態において、識別されたモジュレータによる阻害又は活性化は、加えられた試験化合物が存在しない場合に観察されたものと比較して、オクルディンの生物学的活動の調節又は発現を結果として生ずる。
【００３０】
（密着結合形成のモジュレータについてのスクリーニング）
本開示の実施形態は、オクルディンの機能、発現又は生体利用性、特に密着結合の形成におけるオクルディンの機能のモジュレータを識別するための方法を含む。前記モジュレータは、オクルディンにより媒介される密着結合形成を直接的又は間接的に調節し得る。直接的調節は、モジュレータとオクルディン、オクルディン受容体又はオクルディン結合部位の間の物理的相互作用、例えばオクルディンの第二のループのようなオクルディンの領域へのモジュレータの結合を指す。オクルディンにより媒介される密着結合形成の間接的調節は、モジュレータがオクルディンと直接的又は間接的に相互作用する共同因子、第二の蛋白質又は第二の生物学的分子に物理的に関連する時に達成され得る。加えて、間接的調節はＲＮＡコード化オクルディンの発現又は翻訳に影響を与えるモジュレータを含むであろう。
【００３１】
いくつかの実施形態において、分析は試験化合物の大きなライブラリの無作為のスクリーニングを含み得る。代替的に、分析は上皮又は内皮細胞、組織、器官又は系におけるオクルディンの機能又は発現を調節することが疑われる化合物の特定の集合に焦点を絞るために使用され得る。
【００３２】
分析は、オクルディン発現、蛋白質発現、蛋白質活動又は結合活動の決定を含み得る。他の分析は、特に密着結合形成に関与するポリペプチドの核酸転写又は翻訳の決定、例えばｍＲＮＡレベル、ｍＲＮＡ安定性、ｍＲＮＡ劣化、転写率及び翻訳率の決定を含み得る。
【００３３】
一つの実施形態において、密着結合モジュレータの識別は、試験化合物の存在下又は不存在下におけるオクルディンの機能に基づいている。試験化合物又はモジュレータは、オクルディンの機能、特に密着結合の形成におけるオクルディンの機能を変更し又は変更すると考えられる任意の物質であり得る。典型的には、モジュレータはオクルディンにより媒介される密着結合形成を削減、消去又は軽減するように選択されるであろう。しかしながら、治療目的のために、モジュレータは密着結合形成を増加又は減少させるように選択され得る。
【００３４】
一つの例示的方法は、オクルディンを少なくとも第一の試験化合物に接触させることと、オクルディンと第一の試験化合物の間の相互作用について分析することを含む。前記分析は、オクルディンにより媒介される密着結合形成を決定することを含み得る。
【００３５】
開示された実施形態において測定され得る特定の分析の終点又は相互作用は、密着結合形成、イオン透過性、経上皮電気抵抗、オクルディン下方又は上方調整又は代謝回転を含むが、これらに限られない。前記の分析の終点は、ＦＡＣＳ、ＦＡＣＥ、ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロット法及び／又はウエスタンブロット法のような標準的方法を使用して分析され得る。さらに、分析は無細胞系、単離された細胞、遺伝子的に操作された細胞、不死化細胞又は遺伝子組み換え動物を含む器官において行われ得る。
【００３６】
他のスクリーニング方法は、試験化合物を識別するためにラベル付けされたオクルディンを使用することを含む。オクルディンは、良く知られており従来技術において使用される標準ラベル付け手順を使用してラベル付けされ得る。そのようなラベルは、放射性、蛍光、生物学的及び酵素タグを含むが、これらに限られない。
【００３７】
別の実施形態は、試験化合物が皮膚、上皮又は内皮細胞におけるオクルディンの発現において有する効果を決定することにより、オクルディン発現のモジュレータを識別するための方法を提供する。例えば、オクルディンを発現する皮膚細胞が試験化合物と接触させられ得る。オクルディン発現は、オクルディン蛋白質発現又はオクルディンｍＲＮＡ転写若しくは翻訳を検出することにより決定され得る。この分析のために適切な細胞は、不死化細胞株、初代細胞培養又はオクルディンを発現するように操作された細胞、例えばＰＡ４細胞を含むが、これらに限られない。オクルディンの発現を調節する化合物、特にオクルディンの発現又は生体利用性を増加させる化合物が選択され得る。
【００３８】
（生体外分析）
別の実施形態は、オクルディンモジュレータの識別のための生体外分析を提供する。そのような分析は、一般的に単離された分子を使用し、高速にかつ多数実行されることができ、これにより短時間において取得可能な情報の量を増加させる。前記分析を実行するために、試験管、プレート、皿及び計深棒又はビーズのような他の表面を含む種々の容器が使用され得る。
【００３９】
無細胞分析の一つの例は、結合分析である。直接的に機能を解明するのではないが、モジュレータが標的分子、例えば核酸コード化オクルディンに特定の態様により結合する能力は、関連した生物学的効果の強力な証拠である。そのような分子は、オクルディン核酸に結合して、オクルディンの発現を調節、例えばオクルディンの発現を上方調整することができる。分子の標的への結合は、結合自体における又は結合自体の、立体、アロステリック又は電荷間（charge-charge）の相互作用に起因して抑制性であり得て、オクルディンを下方調整又は不活性化し得る。標的は、溶液内において遊離しているか、担体に固定されているか、細胞の表面内又は表面上において発現されているかのいずれかであり得る。標的又は化合物のいずれかはラベル付けされ得て、これにより結合の決定を可能にする。通常、標的がラベル付けされた種類であり、ラベル付けが結合を阻害又は促進する機会を減少させる。一つの物質がラベル付けされた状態において競合する結合形態が実行され、結合についての効果を決定するために遊離ラベル対結合済ラベルの量が測定され得る。
【００４０】
高い処理量の化合物のスクリーニングのための技術は、WO84/03564に記述されている。多数の小ペプチド試験化合物が、プラスチックピン又はいくつかの他の表面のような固体物質上に合成される。結合済ポリペプチドは、種々の方法により検出される。
【００４１】
（細胞分析）
他の実施形態は、細胞内のオクルディンを調節するための化合物の能力について化合物をスクリーニングする方法を含む。この目的のために特に操作された細胞を含む種々の細胞株が、そのようなスクリーニング分析のために利用され得る。適切な細胞は、ＰＡ４細胞、内皮細胞又は上皮細胞を含むが、これらに限られない。細胞もまた、オクルディン若しくはオクルディンのモジュレータ又はオクルディンとオクルディンのモジュレータの両方の組み合わせを発現するために操作され得る。さらに、当業者は、良く知られており従来技術において使用される安定又は一過性トランスフェクションが、開示された実施形態において使用され得ることを理解するであろう。
【００４２】
例えば、発現ベクターの細胞への導入は、発現ベクターを含む遺伝子組み換え細胞を生成し得る。ＤＮＡの細胞又は宿主細胞への導入は、分子生物学の分野において良く知られた技術であり、例えばSambrookら「Molecular Cloning 3rd Ed.」（2001年）に記述されている。細胞のトランスフェクションの方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、電気穿孔法、弾道衝撃等を含む。代替的には、本明細書において与えられた参考文献及び例において記述された従来技術を使用して、細胞に開示された発現ベクターが単に導入され得る。宿主細胞は、原核生物若しくは真核生物の細胞、又はベクターを複製しかつ／又はベクターによりコード化された異種の遺伝子を発現させることが可能である任意の変形可能な器官であり得る。多数の細胞株及び培養物が、宿主細胞として使用するために利用可能であり、これらはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）を通じて取得され得る。ＡＴＣＣは、生きた培養物及び遺伝子材料についての保管庫として働く機関であり、前記機関のウェブサイトはワールドワイドウェブ上の次のアドレスatcc.orgにおいて見付けることが可能である。
【００４３】
宿主細胞は、トランスフェクションベクターの性質及びトランスフェクションの目的に依存して選択され得る。例えば、プラスミド又はコスミッドは、多数のベクターの複製のために原核生物の宿主細胞内に導入され得る。ベクター複製及び／又は発現のための宿主細胞として使用される微生物の細胞は、ＤＨ５α、ＪＭ１０９及びＫＣ８、並びにＳＵＲＥ（登録商標）適格細胞及びＳＯＬＯＰＡＣＫ（商標）ゴールド細胞（STRATAGENE、La Jolla、カリフォルニア）のような多数の商業的に利用可能な微生物宿主を含む。代替的に、大腸菌ＬＥ３９２のような微生物細胞が、ファージウイルスのための宿主細胞として使用され得る。宿主細胞として使用され得る真核生物細胞は、イースト、昆虫及び哺乳類を含むが、これらに限られない。ベクターの複製及び／又は発現のための哺乳類の真核宿主細胞の例は、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ，Ｓａｏｓ及びＰＣ１２を含むが、これらに限られない。種々の細胞型及び器官から多数の宿主細胞が利用可能であり、当業者には知られているであろう。同様に、ウイルス性のベクターが原核又は真核宿主細胞のいずれか、特にベクターの複製又は発現を可能にするものに関係して使用され得る。
【００４４】
分析に依存して、培養が必要とされ得る。細胞は、多数の異なる生理学的分析のいずれかを使用して検査される。代替的には、例えば蛋白質発現、ｍＲＮＡ発現（全体の細胞又はポリ（Ａ）ＲＮＡの差分表示を含む）等を考察することにより、分子分析が実行され得る。
【００４５】
（生体内分析）
生体内分析は、器官内の異なる細胞に到達し若しくは影響を与える試験化合物の能力を測定するために使用され得るマーカーを保持するように、又は特定の欠陥を有するように操作されたヒト以外の遺伝子組み換え動物を含む種々の動物モデルの使用を包含する。マウスは、そのサイズ、取り扱いの容易さ並びにその生理機能及び遺伝子構成の情報により、特に遺伝子組み換え動物として好適な実施例である。しかしながら、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、スナネズミ、ウッドチャック、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ及びサル（チンパンジー、テナガザル及びヒヒを含む）を含むがこれらに限られない他の動物もまた適切である。モジュレータについての分析は、これらの種のいずれかから派生した動物モデルを使用して行われ得る。
【００４６】
そのような分析において、一以上の試験化合物が動物に投与され、試験化合物により処理されていない類似の動物と比較して一以上の特性を変更する試験化合物の能力によって、モジュレータが識別される。前記特性は、特定の化合物（例えば酵素、受容体、ホルモン）若しくは細胞の機能（例えば成長又は再生）、あるいはその代わりにより広い神経細胞再生、軸索成長若しくは再生又は同様のものに関して上述されたもののいずれかであり得る。
【００４７】
他の実施形態は、オクルディンの機能を調節する試験化合物についてのスクリーニングの方法を提供する。前記実施形態において、代表的な方法は一般に試験化合物を動物に投与するステップと、上皮から間葉への形質転換の一以上の特性を削減する試験化合物の能力を決定するステップを含む。
【００４８】
試験化合物によるこれらの動物の処理は、適切な形式による動物への当該化合物の投与を包含するであろう。投与は、経口、経鼻、口腔又は局所さえ含むが、これらに限られない臨床又は非臨床目的のために利用され得る任意の経路である。あるいは、投与は気道内注入、気管支内注入及び皮内、皮下、筋肉、腹腔又は静脈注射によるものであり得る。具体的に考慮された経路は、全身静脈注射、血液若しくはリンパ液供給を介した、又は影響を受ける部位への直接の局所投与である。
【００４９】
生体内における化合物の有効性の決定は、種々の異なる基準を包含し得る。動物内における毒性及び用量反応もまた、生体外又は細胞内分析におけるものよりも有意義な態様において実行され得る。
【００５０】
（薬剤組成）
本開示の薬剤組成及び投薬形態は、開示された組成又は化合物の薬学的に受容可能な塩、又はその薬学的に受容可能な多形体、溶媒和物、水和物、無水物（dehydrate）、共結晶、無水若しくは非晶質形態を含む。開示された化合物の特定の塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム塩及びその水和物を含むが、これらに限られない。
【００５１】
本開示の化合物の薬学的単位投与形態は、患者に対する経口、粘膜（例えば経鼻、舌下、膣、口腔又は直腸）、非経口（例えば筋肉内、皮下、静脈内、動脈内又はボーラス注入法）、局所又は経皮投与に適切である。投与形態の例は、錠剤、カプレット、硬カプセル及び軟カプセルのようなカプセル、カシェ剤、トローチ、ドロップ（lozenge）、散剤、坐剤、軟膏、パップ剤（湿布）、ペースト、粉剤、包帯剤、クリーム、絆創膏、液剤、パッチ、エアロゾル（例えば経鼻スプレー又は吸入剤）、ゲル剤、懸濁液・溶液及びエリキシル剤を含む患者への経口又は粘膜投与に適した液状投与形態（例えば水性又は非水性懸濁液、水中油型乳剤又は水中油型液体乳剤）、患者への非経口投与に適した液状投与形態、並びに患者への非経口投与に適した液状投与形態を提供するために再構成されることが可能な無菌の固体（例えば結晶質又は非晶質固体）を含むが、これらに限られない。
【００５２】
本開示の組成の投与形態の組成、形状及び型は、典型的にはその使用に依存して変化するであろう。非経口投与形態は、同一の疾病及び異常を治療するのに使用される経口投与形態よりも少ない量の活性成分を含み得る。本開示により包含される特定の投与形態が互いに変化するであろう前記及び他の手法は、当業者にとって容易に明白となるであろう。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、18th ed.、Mack Publishing、Easton, Pa.（1990年）を参照されたい。
【００５３】
本開示の薬剤組成及び単位投与形態は、典型的には一以上の薬学的に受容可能な賦形剤又は希釈剤をも含む。本開示の特定の化合物により与えられる、増加した溶解性及び／又は向上した流れ、純度及び安定性（例えば吸湿性）特性のような、しかしこれらに限られない利点は、前記化合物を従来技術よりも薬剤製造及び／又は患者への投与により適するようにし得る。適切な賦形剤は薬学又は医薬の当業者には良く知られており、適切な賦形剤の非制限的な例がここに提供される。特定の賦形剤が薬剤組成又は投与形態への導入に適しているか否かは、投与形態が患者に投与される方法を含むがこれに限られない、従来技術において周知の種々の要因に依存する。例えば、錠剤又はカプセルのような経口投与形態は、非経口投与形態における使用に適しない賦形剤を含み得る。特定の賦形剤の適合性は、当該投与形態内の特定の活性成分にも依存し得る。例えば、いくつかの活性成分の分解は、ラクトースのようないくつかの賦形剤によって、又は水に晒されたときに速められ得る。第一級又は第二級アミンを含む活性成分は、特にそのような加速した分解に影響を受けやすい。
【００５４】
本開示はさらに、活性成分が分解される率を削減する一以上の化合物を含む薬剤組成及び投与形態を包含する。ここで「安定剤」と呼ばれるそのような化合物は、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、ｐＨ緩衝剤又は塩緩衝剤）を含むがこれに限られない。加えて、本開示の薬剤組成又は投与形態は、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カリウム又は有機酸のような一以上の溶解度調整剤を含み得る。特定の溶解度調整剤は、酒石酸である。
【００５５】
賦形剤の量及びタイプと同様に、投与形態における活性成分の量及び特定のタイプは、患者に投与されるべき経路のような、しかしこれに限られない要因に依存して異なり得る。しかしながら、本開示の化合物の典型的な投与形態は、約１０ｍｇから約１０００ｍｇの量の、好適には約２５ｍｇから約７５０ｍｇの量の、より好適には約５０ｍｇから約５００ｍｇの量の、さらに好適には約３０ｍｇから約１００ｍｇの量の、薬学的に許容可能な塩、又は薬学的に許容可能なその多形体、溶媒和物、水和物、無水物、共結晶、無水若しくは非晶質形態を含む。
【００５６】
加えて、化合物及び／又は組成は、脂質又はポリマーを基礎とするナノ粒子を使用して伝達され得る。例えば、ナノ粒子は非経口的に投与される薬の薬理学的かつ治療的特性を改善するように設計され得る（Allen, T.M.、Cullis, P.R.、 Drug delivery systems: entering the mainstream、Science. 303(5665): 1818-22（2004年））。
【００５７】
本開示の局所投与形態は、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、スプレー、エアロゾル、溶液、乳剤及び当業者に知られた他の形態を含むが、これらに限られない。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、18th ed.、Mack Publishing、Easton, Pa.（1990年）及びIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms、4th ed.、Lea & Febiger、Philadelphia, Pa.（1985年）を参照されたい。噴霧可能でない局所投与形態については、局所適用に適合し、好適には水より大きな動的粘性を有する担体又は一以上の賦形剤を含む粘性から半固体又は固体形態が、典型的には使用される。適切な製剤は、限定なしに、溶液、懸濁液、乳剤、クリーム、軟膏、粉剤、塗布剤、膏薬等を含む。前記製剤は、所望された場合、例えば浸透圧のような種々の特性に影響するために殺菌され、あるいは補助剤（例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤又は塩）と混合される。他の適切な局所投与形態は、活性成分が好適には固体又は液体の不活性担体と組み合わされて、加圧された揮発性物質（例えばフロンのような気体の推進剤）と共に混合物として、又は小型容器内に包装される噴霧可能なアエロゾル剤を含む。保湿剤又は湿潤剤もまた、所望された場合に薬剤組成及び投与形態に加えられ得る。そのような追加成分の例は、従来技術において周知である。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、18th ed.、Mack Publishing、Easton, Pa.（1990年）を参照されたい。
【００５８】
本開示の組成の経皮及び粘膜投与形態は、眼科用液剤、パッチ、スプレー、エアロゾル、クリーム、ローション、坐剤、軟膏、ゲル、液剤、乳剤、懸濁液又は当業者に知られた他の形態を含むが、これらに限られない。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、18th ed.、Mack Publishing、Easton, Pa.（1990年）及びIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms、4th ed.、Lea & Febiger、Philadelphia, Pa.（1985年）を参照されたい。口腔内の粘膜組織を治療するために適した投与形態は、マウスウォッシュ、口腔用ゲル又は口腔パッチとして製造され得る。追加の経皮投与形態は「保有タイプ」又は「基質タイプ」パッチを含み、前記パッチは皮膚に適用されて特定の期間貼用されることにより所望の量の活性成分の浸透を可能にし得る。
【００５９】
本開示の活性成分を投与するために使用され得る経皮投与形態及び投与の方法の例は、米国特許番号4,624,665、4,655,767、4,687,481、4,797,284、4,810,499、4,834,978、4,877,618、4,880,633、4,917,895、4,927,687、4,956,171、5,035,894、5,091,186、5,163,899、5,232,702、5,234,690、5,273,755、5,273,756、5,308,625、5,356,632、5,358,715、5,372,579、5,421,816、5,466,465、5,494,680、5,505,958、5,554,381、5,560,922、5,585,111、5,656,285、5,667,798、5,698,217、5,741,511、5,747,783、5,770,219、5,814,599、5,817,332、5,833,647、5,879,322及び5,906,830に開示されたものを含むが、これらに限られない。前記各号はそれらの全体について参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
本開示により包含される経皮及び粘膜投与形態を提供するために使用され得る適切な賦形剤（例えば担体及び希釈剤）及び他の材料は、製薬技術における当業者にとって周知であり、所与の薬剤組成又は投与形態が適用される特定の組織又は器官に依存する。当該事実を考慮して、典型的な賦形剤は、非毒性かつ薬学的に許容可能な投与形態を形成するための水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン‐１，３‐ジオール、イソプロピルミリスチン酸塩、イソプロピルパルミチン酸塩、鉱油及びこれらの混合物を含むが、これらに限られない。
【００６１】
治療されるべき特定の組織に依存して、本開示のオクルディンモジュレータ又は密着結合の薬学的に受容可能な塩による治療の前に、又は治療に関係して、又は治療の後に、追加成分が使用され得る。例えば、浸透促進剤は、活性成分を組織に送達し又は組織を横断して送達することを支援するために使用され得る。適切な浸透促進剤は、アセトン、エタノール・オレイル及びテトラヒドロフリルのような種々のアルコール、ジメチルスルホキシドのようなアルキルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンのようなピロリドン、コリドン（Kollidon）グレード（ポビドン（Povidone）、ポリビドン（Polyvidone））、尿素並びにＴＷＥＥＮ  ８０（ポリソルベート８０）及びＳＰＡＮ  ６０（ソルビタンモノステアレート）のような種々の水溶性又は不溶性の糖エステルを含むが、これらに限られない。
【００６２】
薬剤組成若しくは投与形態のｐＨ、又は薬剤組成若しくは投与形態が適用される組織のｐＨもまた、活性成分の伝達を改善するために調整され得る。同様に、溶剤担体の極性、そのイオン強度又は張度は、伝達を改善するために調節され得る。ステアリン酸塩のような化合物もまた、伝達を改善するために活性成分の親水性又は親油性を有利に変更するために、薬剤組成又は投与形態に加えられ得る。この点において、ステアリン酸塩は製剤の脂質伝達手段として、乳化剤または界面活性剤として、そして伝達向上又は浸透向上剤として働き得る。密着結合モジュレータの薬学的に許容可能な塩の異なる水和物、無水物、共結晶、溶媒和物、多形体、無水又は非晶質形態は、結果として生ずる組成の特性をさらに調整するために使用され得る。
【００６３】
（定義）
「生命体」又は「宿主」の語は、少なくとも一つの細胞から構成される任意の生存する存在を指す。生存する有機体は、例えば単一の真核生物細胞のように単純であり、あるいは人間を含む哺乳類のように複雑であり得る。
【００６４】
「薬学的に受容可能な塩」は、生物学的効果と遊離塩基の特性を保持する塩類を指し、前記塩類は塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ‐トルエンスルホン酸、サリチル酸、リンゴ酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸等のような無機酸又は有機酸の反応により得られる。
【００６５】
「薬剤組成」は、生理学的に受容可能な担体及び賦形剤のような他の化学的成分を伴う、本明細書において記述された一以上の化合物の混合物、又は薬学的に受容可能なその塩を指す。薬剤組成の目的は、生命体への化合物の投与を促進することである。
【００６６】
本明細書において使用されるように、「薬学的に受容可能な担体」は、生命体に重大な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活動及び特性を無効にする担体又は希釈剤を指す。
【００６７】
「賦形剤」は、化合物の投与をさらに促進するために薬剤組成に加えられる不活性物質を指す。賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖及びデンプンのタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油並びにポリエチレングリコールを限定なしに含む。
【００６８】
「プロドラッグ」の語は、核酸とタンパク質を含む薬剤を指し、前記薬剤は生体内において生物学的に活性の形態に変換される。プロドラッグは、いくつかの状況において親化合物より投与が容易であり得るため、しばしば有用である。例えば、プロドラッグは経口投与により生物学的に利用可能であり得る一方、親化合物はそうではない。プロドラッグは、親薬剤を超えた薬剤組成における改善された溶解度をも有し得る。プロドラッグは、酵素処理と代謝加水分解を含む種々の機序により親薬剤に変換され得る（Harper, NJ.（1962年）「Drug Latentiation in Jucker ed. Progress in Drug Research」4,221-294頁、  Morozowich他（1977年）「Application of Physical Organic Principles to Prodrug Design in E. B. Roche編「Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs」米国薬剤師協会（AphA）、Acad. Pharm. 科学引用索引（Sci.）、E. B. Roche編（1977年）「Bioreversible Carriers in Drug in Drug Design, Theory and Application」米国薬剤師協会、H. Bundgaard編（1985年）「Design of Prodrugs, Elsevier」、Wang他（1999年）「Prodrug approaches to the improved delivery of peptide drug」Curr. Pharm. Design. 5(4),265-287頁、Pauletti他（1997年）「Improvement in peptide bioavailability: Peptidomimetics and Prodrug Strategies」Adv. Drug. Delivery Rev. 27,235-256頁、Mizen他（1998年）「The Use of Esters as Prodrugs for Oral Delivery of β-Lactam antibiotics」Pharm. Biotech.11,345-365頁、Gaignault他（1996年）「Designing Prodrugs and Bioprecursors I. Carrier Prodrugs」Pract. Med. Chem.671-696頁、G. L. Amidon, P. I. Lee and E. M. Topp編「Transport Processes in Pharmaceutical Systems」Marcell Dekker、185-218頁内M. Asghamejad（2000年）「Improving Oral Drug Transport Via Prodrugs」、Balant他 （1990年）「Prodrugs for the improvement of drug absorption via different routes of administration」Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet.、15（2）、143-53頁、Balimane and Sinko（1999年）「Involvement of multiple transporters in the oral absorption of nucleoside analogues」Adv. Drug Delivery Rev.39（1-3），183-209頁、Browne（1997年）「Fosphenytoin (Cerebyx), Clin. Neuropharmacol」20（1），1-12頁、Bundgaard （1979年）「Bioreversible derivatization of drugs-principle and applicability to improve the therapeutic effects of drugs」Arch. Pharm. Chemi.86（1）、1-39頁、H. Bundgaard ed. （1985年）「Design of Prodrugs, New York: Elsevier」、Fleisher他（1996年）「Improved oral drug delivery: solubility limitations overcome by the use of prodrugs」 Adv. Drug Delivery Rev. 19（2），115-130頁、Fleisher他（1985年）「Design of prodrugs for improved gastrointestinal absorption by intestinal enzyme targeting」Methods Enzymol  112,360-81頁、Farquhar D他（1983年）「Biologically Reversible Phosphate-Protective Groups」J. Pharm. 科学引用索引72（3），324-325頁、Han, H. K他（2000年）「Targeted prodrug design to optimize drug delivery」製薬科学者協会 Pharm  科学引用索引2（1），Ｅ6Sadzuka Y.（2000年） 「Effective prodrug liposome and conversion to active metabolite」Curr Drug Metab   1（1），31-48頁、D.M. Lambert（2000年）「Rationale and applications of lipids as prodrug carriers」Eur. J. Pharm. 科学引用索引11、追補2、Ｓ15-27頁、Wang, W他（1999年）「Prodrug approaches to the improved delivery of peptide drugs」 Curr. Pharm. Des.5（4）265-87頁）。
【００６９】
「核酸」の語は、少なくとも二つの塩基‐糖‐リン酸塩の組合せの配列を指す技術用語である。裸のＤＮＡを送達するために、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと区別されなければならないため、１２０以上のモノマー単位を含む。しかしながら、一本鎖又は二本鎖いずれかのＲＮＡ、ＲＮＡｉ及びｓｉＲＮＡを伝達する目的のために、ポリヌクレオチドは２以上のモノマー単位を含有する。ヌクレオチドは、核酸ポリマーのモノマー単位である。ヌクレオチドの語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（トランスファーリボ核酸）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子リボ核酸）、ｒＲＮＡ（リボソームリボ核酸）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーリボ核酸）、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ及びリボザイムの形態にあり得る。ヌクレオチドの語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ホスホロチオネート、その他の天然核酸のリン酸骨格変種をも含む。アンチセンスは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの機能を阻害するポリヌクレオチドである。天然の核酸はリン酸骨格を有し、人工的な核酸は他のタイプの骨格を含み得るが、同一の塩基は含まない。
【００７０】
「ポリペプチド」の語は、蛋白質とその断片も含む。ポリペプチドは、アミノ酸残基配列としてここに開示される。前記配列は、アミノからカルボキシ末端の方向に、左から右へと書かれる。正式名称に従えば、アミノ酸残基配列は、以下に示すように３文字又は１文字のコードによって命名される。アラニン(Ala, A)、アルギニン(Arg, R)、アスパラギン(Asn, N)、アスパラギン酸(Asp, D)、システイン(Cys, C)、グルタミン(Gln, Q)、グルタミン酸(Glu, E)、グリシン(Gly, G)、ヒスチジン(His, H)、イソロイシン(Ile, I)、ロイシン(Leu, L)、リジン(Lys, K)、メチオニン(Met, M)、フェニルアラニン(Phe, F)、プロリン (Pro, P)、セリン(Ser, S)、トレオニン(Thr, T)、トリプトファン(Trp,W)、チロシン(Tyr, Y)及びバリン (Val, V)。
【００７１】
「変異体」は、基準のポリペプチド又はポリヌクレオチドから異なるが、本質的特性を維持するポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の基準ポリペプチドからアミノ酸配列が異なる。一般に、基準ポリペプチドと変異体の配列が全体について近く類似し、多数の領域において同一であるように、差異は限定されている。変異体及び基準ポリペプチドは、一以上の変更（例えば代替、追加及び／又は削除）によりアミノ酸配列において異なり得る。代替又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコード化されたものであり得るか、又はそうであり得ない。対立遺伝子変異体のようなポリペプチドの変異体は自然に発生し得て、又は自然に発生すると知られていない変異体であり得る。
【００７２】
変形及び変更は本開示のポリペプチドの構造においてなされ得て、ポリペプチドに類似した特性（例えば、保存アミノ酸置換）を有する分子をさらに得る。例えば、特定のアミノ酸は、相当の活動の損失なしに配列内において他のアミノ酸を置換し得る。ポリペプチドの生物学的機能的活動を定義するのはポリペプチドの相互作用能力及び性質であるため、特定のアミノ酸配列置換はポリペプチド配列内に作成され得て、それでもなお似た性質のポリペプチドを得る。
【００７３】
そのような変更を行う際に、アミノ酸の水治療法指数は考慮され得る。ポリペプチドに相互作用的な生物学的機能を与えることにおける水治療法アミノ酸指数の重要性は、一般に従来技術において理解されている。特定のアミノ酸が類似した水治療法指数又はスコアを有する他のアミノ酸を置換し得て、なお類似の生物学的活動を有するポリペプチドを結果として生ずることが知られている。各アミノ酸は、その疎水性と荷電特性に基づいて水治療法指数を割り当てられた。前記指数は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／システイン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸塩（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸塩（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）である。
【００７４】
アミノ酸の相対的水治療法特性が、結果として生じるポリペプチドの第二の構造を決定すると考えられている。そして、同様に前記第二の構造は、酵素、サブストレート、レセプター、抗体、抗原等のような他の分子とポリペプチドの相互作用を定義する。アミノ酸が類似の水治療法指数を有する他のアミノ酸により置換され得ることは従来技術において知られており、なお機能的に等しいポリペプチドを得る。そのような変更においては、水治療法指数が±２以内のアミノ酸の置換が好適であり、±１以内のアミノ酸の置換が特に好適であり、±０．５以内のアミノ酸の置換がさらにより特に好適である。
【００７５】
同種のアミノ酸の置換は、親水性の基礎上においても作られ得る。特に、そこでは生物学的機能について等しいポリペプチド又はこれによって作られたペプチドが、免疫学的な実施形態における使用を意図されている。以下の親水性の値が、アミノ酸残基に割り当てられた。アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸塩（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、プロリン（−０．５±１）、トレオニン（−０．４）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。アミノ酸が類似した親水性の値を有する別のものを置換し得て、さらに生物学的同等物、特に免疫学的に同等のポリペプチドを獲得し得ることが理解される。そのような変化において、親水性の値が±２以内であるアミノ酸の置換が好適であり、±１以内が特に好適であり、±０．５以内がさらにより特に好適である。
【００７６】
上記に概説したように、アミノ酸の置換は、一般にアミノ酸側鎖置換の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、荷電、サイズ等に基づいている。種々の前述の特性を考慮する典型的な置換は、当業者によく知られ、（Ａｌａ：Ｇｌｙ，Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ，Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ，Ｃｙｓ，Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ，Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ，Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ，Ｖａｌ）（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ，Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ，Ｐｈｅ）及び（Ｖａｌ：Ｉｌｅ，Ｌｅｕ）（元の残基：典型的な置換）を含む。本開示の実施形態は、上記のようなポリペプチドの機能的又は生物学的な同等物を考慮する。特に、ポリペプチドの実施形態は、関心のあるポリペプチドに約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び９５％の配列同一性を有する変異体を含み得る。
【００７７】
従来技術において知られるように、「同一性」とは、配列を比較することによって決定されるように、二以上のポリペプチド配列間の関係である。従来技術において、「同一性」は、そのような配列の鎖間の一致によって決定されるようなポリペプチド間の配列関係の度合いをも意味する。「同一性」及び「類似」は、Lesk, A.M.編（1988年）「Computational Molecular Biology」Oxford University Press、ニューヨーク、Smith, D.W.編（1993年）「Biocomputing: Infomatics and Genome Projects. Academic Press」ニューヨーク、Griffin, A.M.及びGriffin, H.G.編（1994年）「Computer Analysis of Sequence Data: Part 1」Humana Press、ニュージャージー、von Heinje, G.（1987年）「Sequence Analysis in Molecular Biology」Academic Press、Gribskov, M.及びDevereux, J.編（1991年）「Sequence Analysis Primer.」M Stockton Press、ニューヨーク、Carillo, H. and Lipman, D.（1988年）「SIAM J Applied Math.」48, 1073において記述されるものに含まれるが、これらに限られない既知の方法によって容易に計算され得る。
【００７８】
同一性を決定するための好適な方法は、試験済みの配列間において最大の一致を与えるように意図されている。同一性及び類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。二つの配列間における同一性の百分率は、the Needelman and Wunsch（（1970年）J. Mol. Biol., 48, 443-543頁）アルゴリズム（例えばＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴ）を組み込む解析ソフトウェア（例えばSequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Groups, Madison Wis.）を使用することにより決定され得る。
【００７９】
一例として、ポリペプチド配列は基準配列と同一になり得る、すなわち１００％同一であるか、百分率同一性が１００％より小さくなるような、基準配列と比較して特定の整数のアミノ酸変更までを含み得る。そのような変更は、少なくとも一つのアミノ酸欠失、同類及び非同類置換を含む置換、又は挿入から選択され、ここでは前記変更が基準ポリペプチド配列のアミノ−又はカルボキシ−末端位置、又は前記末端位置の間のどこかにおいて発生し得て、基準配列内のアミノ酸の間に個別に、あるいは基準配列内での一以上の連続したグループにおいて散在する。所与の百分率同一性についてのアミノ酸変化の数は、基準ポリペプチドにおけるアミノ酸の合計数に各百分率同一性（１００で割られる）の数値パーセントを乗じ、次に基準ポリペプチドにおけるアミノ酸の前記合計数から生成物を減じることによって決定される。
【００８０】
本明細書において使用されるように、「精製された」の語及び類似の語は、自然環境における分子又は化合物に正常に関連した他の成分から実質的に遊離している（少なくとも６０％遊離、好適には７５％遊離、そして最も好適には９０％遊離）形態の分子又は化合物の単離に関する。
【００８１】
本明細書において使用されるように、「治療（treating）」の語は、特定の異常又は状況に関連した症状を緩和し、及び／又は前記症状を予防又は消去することを含む。
【００８２】
本明細書において使用されるように、「調節する（modulate）」「調節している（modulating）」「変更する（modify）」及び／又は「モジュレータ」の語は、一般に特定の機能又は挙動を直接的に又は間接的に促進／活性化又は阻害／抑制することを指す。例えば、細胞の密着結合のモジュレータは、細胞の障壁機能を活性化し、細胞極性又は細胞成長及び増殖を調節し得る。あるいは、細胞の密着結合のモジュレータは、細胞の障壁機能を抑制し、細胞極性又は細胞成長及び増殖を調節し得る。いくつかの例においては、モジュレータは、特定の活動又は機能を、その自然状態、又は一般に期待され得る活動の平均的レベル、又は現在の活動のレベルに関連して、増加及び／又は減少させ得る。
【００８３】
「操作可能にリンクされた」とは、成分がその通常の機能を実行するように構成された並置を指す。例えば、操作可能にコード配列にリンクされた制御配列又はプロモーターは、コード配列の発現に影響を与えることが可能であり、操作可能に蛋白質にリンクされた細胞小器官局所化配列は、リンクされた蛋白質に特定の細胞小器官において局所化されるように指示する。
【００８４】
本明細書において使用されるように、「外因性ＤＮＡ」又は「外因性核酸配列」又は「外因性ポリヌクレオチド」の語は、外界から細胞又は細胞小器官に導入された核酸配列を指す。典型的には、導入された外因性配列は組み換え配列である。
【００８５】
本明細書において使用されるように、「トランスフェクション」の語は、ミトコンドリア、核又は葉緑体の内部空間と共に細胞の細胞質への核酸配列の導入を含む、生きている細胞の膜により封入された空間の内部への核酸配列の導入を指す。核酸は種々の蛋白質と関連付けられた裸のＤＮＡ又はＲＮＡの形態であり得て、あるいは核酸はベクターに組み込まれ得る。
【００８６】
本明細書において使用されるように、「ベクター」の語は核酸配列を細胞に導入するために使用される媒介物に関して使用される。ウイルスベクターは、組み換えＤＮＡ配列が宿主細胞又は細胞小器官に導入されることを可能にするために変更されたウイルスである。
【００８７】
「異種」の語は、別々の遺伝源、別々の生命体又は別々の種に由来することを意味する。そのため、異種の抗原は、第二の遺伝源によって発現される第一の遺伝源からの抗原である。第二の遺伝源は、典型的にはベクターである。
【００８８】
「組み換え」の語は、一般に非自然に発生している核酸、核酸構造（construct）又はポリペプチドを指す。そのような非自然に発生している核酸は、分子生物学技術を使用して加入される異なる起源のＤＮＡ分子の組み合わせ、又は例えば欠失、置換、反転、挿入等を有する変更された天然の核酸を含む。組み換えもまた、組み換え核酸によりコード化されたポリペプチドを指す。非自然に発生している核酸又はポリペプチドは、人間によって変更された核酸及びポリペプチドを含む。
【００８９】
（材料及び方法）
（オクルディン欠失構造）
オクルディン欠失構造は、テンプレートとしてヒトのオクルディンのために、ｃＤＮＡコード化を使用するＰＣＲを基礎とした突然変異生成によって生成された。ＰＣＲ増幅は、前記校正プラーク形成単位ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Stratagene））を使用することを行い、かつ製品が、ポリメラーゼ連鎖反応ブラント（Blunt）II‐TOPOベクター（インビトロジェン）の中へサブクローニングされた。挿入遺伝子型は、配列分析によって確認され、次にｐｃ‐ＤＮＡ４‐マイク（myc）哺乳類発現ベクター（インビトロジェン（Invitrogen））の中へクローン化された。１０アミノ酸マイクタグは、免疫検出を促進するために、各々のオクルディン欠失構造の前記Ｃ末端において設計された。第一の細胞外ループの切断された形態であるＯｃｃΔＬ１は、二つのＰＣＲ製品を消化し（digest）結紮する（ligate）ことにより構成された。第一のＰＣＲ製品は、二つのプライマー、５´‐ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣ‐３´（配列ＩＤ  ＮＯ：１）及び５´‐ＧＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧ‐３´（配列ＩＤ  ＮＯ：２）を使用して増幅された。結果として生じるＰＣＲ製品は、第一の膜透過領域、及び第一の細胞外ループの最初の４つのアミノ酸を含むオクルディンのＮ末端をコード化し、操作されたＥｃｏＲＶ部位がこれに続いた。第二のＰＣＲ製品は、二つのプライマー、５´‐ＧＧＣＧＡＴＡＴＣＧＧＡＧＧＣＴＡＴＡＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧ‐３´（配列ＩＤ  ＮＯ：３）及び５´‐ＧＧＡＧＧＣＴＡＴＡＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧ‐３´（配列ＩＤ  ＮＯ：４）を使用することによって増幅されることにより、操作されたＥｃｏＲＶ部位により開始するオクルディンのＣ末端を含むＰＣＲ製品を生成し、第二の膜透過領域及びオクルディン蛋白質の残りがこれに続いた。前記二つの製品は、ｐｃＤＮＡ４ベクター（インビトロジェン）内にクローニングされ、操作されたＥｃｏＲＶ部位を使用して二つの挿入が結合された。第一のヒトオクルディンの細胞外ループは、残基Ｄ９０及びＲ１３５を包含する４６残基を含むことが予測される。切断された第一の細胞外ループＯｃｃΔＬ１は、残基９４から１２８までの削除、及び真正のオクルディン配列において見受けられない残基ＤＩの挿入（ＥｃｏＲＶ部位から）から結果として生じた１３のアミノ酸Ｄ９０ＲＧＹＤＩＧＧＹＴＤＰＲ１３５を含んでいた。第二の細胞外ループＯｃｃΔＬ２の切断された形態を含む構造は、同一のアプローチを使用することによって作成された。ヒトオクルディンの第二のループは、Ｇ１９６からＥ２４３までの４８の残基を含むことが予測される。切断された第二の細胞外ループＯｃｃΔＬ２は、残基２００〜２３８の削除、及びオクルディンにおいて見受けられない残基ＫＬの挿入（ＥｃｏＲＶ部位から）から結果として生じたアミノ酸Ｇ１９６ＶＮＰＫＬＶＤＰＱＥ２４３を含んでいた。構造ＯｃｃΔＮは、Ｎ‐末端領域及び細胞外ループ（アミノ酸１〜２６６）を含み、Ｃ‐末端領域を欠く。構造ＯｃｃΔＣは、Ｃ‐末端領域（アミノ酸２４３〜５２２）のみを含む。全てのオクルディンの突然変異体は、上述と同一のアプローチを使用して構成された。
【００９０】
（細胞培養及び安定した細胞株の生成）
正常なラットの耳下腺腺上皮から抽出された高度に分化された上皮細胞株であるＰａ４細胞は、ウシ胎仔血清２．５％、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、上皮細胞増殖因子（２５ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（１．１μＭ）及びグルタミン酸塩（５ｍＭ）が追加されたダルベッコ（Dulbecco）修正イーグルズ（Eagle's）／Ｆ１２（１：１）培地において培養され、３５°Ｃにおいて５％のＣＯ２を含む湿気のある環境において維持された。Ｐａ４‐Ｒａｆ１及びＯｃｃ細胞は、以前に記述されたように（Li及びMrsny, 2000年）確立され、上述した要素とチャコール揮散されたウシ胎仔血清２．５％が追加されたダルベッコ修正イーグルズ／Ｆ１２（１：１、フェノールレッド無し）培地において維持された。Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）及びハイグロマイシン（１００μｇ／ｍｌ）が前記Ｏｃｃ細胞株の二重選択のために使用される一方で、Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）がＰａ４‐Ｒａｆ１細胞の選択のために使用された。チャコール揮散された血清は、前記培地においてエストロゲンレベルを最小限にするためのＰａ４‐Ｒａｆ１及びＯｃｃの安定した細胞株の維持において使用された。
Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞は、リポフェクタミンプラス（Lipofectamin Plus）試薬（Life Technologies）を使用して、種々のオクルディン欠失構造によりトランスフェクトされた。安定した細胞株は、Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）及びゼオシン（Zeocin）（２００μｇ／ｍｌ）において選択された。抵抗性コロニーは、上述した要素とチャコール揮散されたウシ胎仔血清２．５％、Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）、ゼオシン（２００μｇ／ｍｌ）が追加されたダルベッコ修正イーグルズ／Ｆ１２（１：１、フェノールレッド無し）培地において分離され維持された。
【００９１】
Ｐａ４‐Ｒａｆ１‐Ｏｃｃは、前記完全長ヒトオクルディン遺伝子によりトランスフェクトされたＰａ４‐Ｒａｆ１細胞を指す。前記細胞は、上皮の特徴を有する（すなわち、成熟した密着結合及び接着結合を分極、成長させる）。
【００９２】
（免疫蛍光顕微鏡検査法）
０．４μｍの細孔サイズを有するポリカーボネートフィルタ（NK, Costar, Cambridge、マサチューセッツ、アメリカ合衆国）又はガラスカバースリップ上で増殖した細胞は、カルシウム及びマグネシウムを含むＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ＋）により洗浄された。細胞は、−２０°Ｃにおいて２０分間、純メタノール中において、凝固されて透過化された。続いて、細胞は室温において１時間、正常ヤギ血清５％（ブロッキング緩衝液）を含むＨＢＳＳ＋において遮断され、６０分間、ヒトオクルディンに対する一次抗体、クラウディン（claudin）‐１、ＺＯ‐１（Zymed Laboratories, San Francisco, カリフォルニア州）、Ｅ‐カドヘリン（BD Biosciences）と共にブロッキング緩衝液において培養された。次に、細胞は洗浄され、６０分間アレクサ（Alexa）色素共役された二次抗体（Molecular Probes, Eugene, オレゴン州）と共に培養された。続いて、細胞は洗浄されてプロロングアンチフェイド（PROLONG ANTIFADE）培地（Molecular Probes）と共にスライド上に載せられた。結合蛋白質の二重ラベル付けのために、細胞は純メタノールにおいて凝固され透過化され、ブロッキング緩衝液において遮断された。細胞は、二つの一次抗体とともに連続的に染色された。蛍光性の赤色又は緑色アレクサ色素（Molecular Probes）を共役させたロバ抗ヤギ及び抗ウサギ抗体は、前記それぞれの一次抗体の検出のために使用された。染色された細胞は、ツァイス（Zeiss）１００Ｍアキシオバート（axiovert） 及び４０ｘ又は６３ｘパン‐アポクロマート（Pan-Apochromat）オイルレンズに接続されたツァイスＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡（Zeiss Microimaging Inc., Thornwood, ニューヨーク州）を使用して走査された。蛍光色素は、チャネル間のクロストークを排除するために、フレームインタレースモードにおいて連続的に撮像された。示された画像は、各スライドについて撮られた複数の画像により、少なくとも三つの実験を代表する。
【００９３】
（ウェスタンブロット法及び界面活性剤溶解性分析）
トリトン（Triton）Ｘ‐１００‐可溶性及びトリトンＸ‐１００‐不溶性プールを作るために、細胞は、ＰＢＳとともに二度洗浄され、４°ＣにおいてｐＨ８．０のトリス塩酸２０ｍＭ、塩化ナトリウム１３７ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸５ｍＭ、１０％（体積比（vol/vol））のグリセロール、１％（体積比）のトリトンＸ‐１００、ＰＭＳＦ１ｍＭ、アプロチニン１ｍＭ、ロイペプチン１ｍＭ、ペプスタチンＡ１μＭ、オルトバナジウム酸ナトリウム１ｍＭ、ＥＧＴＡ１ｍＭ、ＮａＦ１０ｍＭ、ピロリン酸四ナトリウム１ｍＭ及びβ‐グリセロリン酸塩１００μＭを含む金溶解緩衝液において溶解させられた。溶解物は、１０分間４°Ｃにおいて培養され、次に４°Ｃにおいて３０分間、１５，０００Ｘｇにおいて遠心分離された。この浮遊物は、トリトンＸ‐１００‐可溶性プールと考察された。沈殿物は、１％ＳＤＳにおいて溶解され、トリトンＸ‐１００‐不溶性プールと呼ばれた。蛋白濃度は、ピアス（Pierce）ＢＣＡ分析によって測定された。等量の細胞溶解物の蛋白質（５０μｇ）は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにさらされた。電気泳動の後、蛋白質は、ＰＶＤＦ細胞膜（バイオ‐ラドラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories））の上に電子ブロットされた（electroblotted）。細胞膜は、一次抗体を備えた培養の前に、１時間５％の乳溶液（milk solution）により遮断された。ＨＲＰを共役させた二次抗体及び改良された化学蛍光検出システム（NENTM Life Science Products, Inc.）は、結合抗体を検出するために使用された。
【００９４】
（ＴＥＲの測定及び傍細胞透過性）
経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）測定のために、細胞は、０．４μｍの細孔サイズを有するポリカーボネートフィルタ上にプレート化された（Plated）。ミリセル（Millicell）‐ＥＲＳ電圧抵抗計（ミリポア（Millipore））は、前記ＴＥＲ値を測定するために使用された。全てのＴＥＲ値は、前記フィルタの領域について標準化され、前記フィルタの貢献及び浴液を除外することによって得られた。フルオレセイン化された（fluoresceinated）デキストラン（ＦＤ‐３；ＭＷ３０００）に対する傍細胞透過性が、以前に公開された方法（Sandersら、１９９５）によって分析された。簡潔には、細胞は０．４μｍの細孔サイズを有するポリカーボネートフィルタ上において増殖した。ＴＥＲが測定され、次に細胞がハンクス（Hanks）平衡塩溶液／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＨＢＳＳ＋）において洗浄され、軌道シェーカー上において１０分間３７°Ｃにて平衡を保った。細胞は、時間＝０において１ｍｇ／ｍｌのＦＤ‐３（分子プローブ）により、先端方向に取り付けられた。基底外側のサンプルはｔ＝０，３０，６０，９０及び１２０分に取得され、蛍光強度はサイトフルーア（CytoFluor）２３５０蛍光測定システム（Millipore, Cambridge, MA）上において分析された。輸送されたＦＤ‐３濃度は、標準曲線（蛍光トレーサーの既知の濃度を薄めることによって生成された）から推定され、かつｎｇ（輸送されたＦＤ‐３）／ｃｍ２／時間と表された。個別の実験から数値がプールされ、平均値±（平均値の標準誤差）と表現される。示されたデータは少なくとも三つの実験を代表する。
【００９５】
（軟寒天におけるクローニング効率の測定）
完全長オクルディン又は種々のオクルディン突然変異体を発現するＰａ４細胞、Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞及びＰａ４‐Ｒａｆ１細胞は、完全な溶媒（medium）により希釈された低融点アガロース溶液０．３５％（wt/vol）１ｍｌによる３５ｍｍ培養皿につき、１×１０４細胞の密度によりシード化された（seeded）。皿は、細胞プレート化の前に、低融点アガロース０．７％（wt/vol）１ｍｌによりコートされ、重層溶媒１ｍｌが細胞プレート化の後に加えられた。前記皿は、４週間の間３５°Ｃにおいて５％ＣＣ＞２及び９５％空気において培養された。前記重層溶媒は、３日ごとに変更された。４週間後、前記細胞は３‐[４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル]‐２，５‐臭化ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ；０．０５ｍｇ／ｍｌ）により染色された。染色された皿は撮影され、直径０．４ｍｍより大きいコロニーが数えられて分析された。
【００９６】
（ヌードマウスにおける腫瘍原性）
ヌードマウスは、生体内における腫瘍原性を検査するために使用された。完全長オクルディン又は種々のオクルディン突然変異体を発現するＰａ４細胞、Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞及びＰａ４‐Ｒａｆ１細胞は、対数増殖期を大きくし、収穫され、洗浄され、注入のためにＰＢＳにおいて再懸濁された。それぞれの細胞株（ＰＢＳ２００μｌにおいて１×１０６細胞）は、４匹のオスのヌードマウスの脇腹に皮下注射された。腫瘍形成は日々観察された。全てのヌードマウスは、分離され分析される腫瘍により６週で犠牲となった。
【００９７】
（実施例）
例１：オクルディンは、Ｒａｆ‐１形質転換された細胞において前記上皮表現型を救済する。
構成的に活性なＲａｆ１の導入は、形質転換された表現型の取得と一致するＰａ４細胞における内因性オクルディンの下方調整をもたらす。ウイルス性のプロモーターによって操作されるヒトオクルディン遺伝子の導入は、ヒトオクルディン蛋白質の強制的発現及びＲａｆ１により誘発された癌表現型の反転を促す（Li及びMrsny, 2000年）。このＲａｆ１‐オクルディンの動き（dynamic）上のオクルディン蛋白質内における特定の構造要素の役割を調査するために、実験は最初にＰａ４‐Ｒａｆ１細胞において、この機能救済モデルを有効にするために実行された。Ｐａ４細胞は、生体外のプラスチック表面上において増殖したとき、極性化された上皮の堅固なコロニーを形成し（図１Ａ）、側細胞膜の頸部頂点（apical neck）領域に限定されているオクルディン、クローディン‐１、ＺＯ‐１、及びＥ‐カドヘリンのような結合蛋白質を発現し（図１Ｂ）、ウエスタンブロット法によりすぐに検出された（図１Ｃ）。Ｐａ４細胞は、生体外の半透膜担体上において培養されたときに、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）の高い値を発現させた（図１Ｄ）。しかしながら、構成的に活性なＲａｆ１の安定した発現は、Ｐａ４細胞をもはやプラズマ細胞膜（図１Ｂ）において結合蛋白質を発現しない線維芽細胞様表現型（図１Ａ）に形質転換した。ウエスタンブロット法は、Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞がもはやオクルディンを発現しないことを示し、出現したＥ‐カドヘリンのレベルは影響を受けなかったものの、クローディン‐１及びＺＯ‐１発現のレベルを削減した（図１Ｃ）。加えて、Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞は、半透膜上で培養されたときに、もはや測定可能なＴＥＲ値を発現しなかった（図１Ｄ）。以前の研究（Li及びMrsny、2000年）と一致して、Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞内へのヒトオクルディン蛋白質の強制的発現（Ｏｃｃ）は、上皮形態（図１Ａ）、結合染色パターン（図１Ｂ）及びＰａ４細胞について観察された障壁機能（図１Ｄ）を回復した。同時に、これらの結果は、Ｒａｆ１形質転換された細胞における強制された完全長ヒトオクルディンの発現が、上皮表現型の再取得及びＰａ４細胞内の機能的に損なわれていないＴＪの形成を促進し得ることを再確認する。次に、Ｒａｆ１形質転換されたＰａ４細胞における特定オクルディン領域欠失の影響を調査するために、さらなる実験が行われた。
【００９８】
例２：オクルディンの第二の細胞外ループは、上皮細胞形態の救済のために重要である。
オクルディンは、二つの細胞外ドメイン及び細胞質アミノ及びカルボキシ末端を備えた４つの膜貫通領域を保有すると予測される（フルセら、1993年）。オクルディン欠失構造のパネルは、トランスフェクトされた蛋白質の免疫検出を促進するために、Ｃ‐末端において操作された１０‐アミノ酸マイクタグを全て備えて作られた（図２Ａ）。Ｐａ４細胞内における構成的に活性なＲａｆ１（Ｐａ４‐Ｒａｆ１）の安定した発現は、オクルディンの発現を欠く細胞において、線維芽細胞様生育特性を誘発した。ＺＯ‐１は、細胞間接触の位置において断片的に局在化された（図２Ｂ）。次にオクルディン構造は、Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞内に安定的にトランスフェクトされ、導入遺伝子の発現はマイクタグの免疫検出によって確認された（データ不図示）。生体外のプラスチック上において増殖した細胞の位相差顕微鏡法は、完全長オクルディンの導入又は第一の細胞外ループ（ＯｃｃΔＬ１）を欠いている構造のみに付随している細胞において、高度にクラスター化されたコロニーを明示した。両方の場合において、ＺＯ‐１についての染色及び発現したオクルディン（完全長又はＯｃｃΔＬ１のいずれか）の極性を有する上皮細胞の典型である高度に組織化された「金網」パターンにおいて共に局在化した（図２Ｂ）。Ｎ‐末端及び細胞外ドメイン（ＯｃｃΔＮ）、Ｃ‐末端ドメイン（ＯｃｃΔＣ）又は前記第二の細胞外ループ（ＯｃｃΔＬ２）を欠くオクルディン構造の導入は、上皮細胞形態を救済することに失敗した（図２Ｂ上部パネル）。ＺＯ‐１は、ＯｃｃΔＮを発現しているＰａ４‐Ｒａｆ１細胞において、細胞間接触におけるマイクタグと共に共局在化するために頻繁に観察された。しかしながら、オクルディンのＯｃｃΔＬ２構造を発現しているＰａ４‐Ｒａｆ１細胞は、ＯｃｃΔＮ又はＯｃｃΔＣを発現している前記の細胞より、さらに頻繁にＺＯ‐１及び前記マイクタグの細胞内分布を示した（図２Ｂ下部パネル）。これらの結果は、前記Ｎ‐末端及びオクルディンのＣ‐末端ドメインの両方が、Ｒａｆ１‐形質転換されたＰａ４細胞において上皮細胞形態の救済のために重要であることを示唆する。加えて、オクルディンの細胞外ドメイン内において、第一のループではないが第二のループがこの過程にとって重要であると思われる。
【００９９】
例３：オクルディンの第二のループは、接合部複合体の集合にとって重要である。
透過性担体上において高密度に増殖したＯｃｃΔＬ１及びＯｃｃΔＬ２突然変異体を発現しているＰａ４‐Ｒａｆ１細胞を比較しているより多数の結合蛋白質ラベル付け研究は、クローディン‐１、ＺＯ‐１及びＥ‐カドヘリンがＯｃｃΔＬ１突然変異体細胞の接合部複合体の頂点の領域において局在化されることを明示した（図３Ａ）。重要なことには、これはＯｃｃΔＬ１細胞が異なる接合部複合体（ＺＯ‐１の共局在化及び発現されたオクルディン突然変異体蛋白質の前記マイクタグ）を備えた極性単分子層を形成し得たことを証明する。ＯｃｃΔＬ１細胞における結合蛋白質分布のこのパターンは、完全長オクルディン（Ｏｃｃ）を発現しているＰａ４細胞において観察されたものと類似していた（図３Ｂ）。ＯｃｃΔＬ１突然変異体と対照的に、ＯｃｃΔＬ２突然変異体を発現している細胞は、まとまりのないオクルディン（マイクタグ）、ＺＯ‐１、クローディン‐１及びＥ‐カドヘリンの染色パターンを示した。図３は、前記プラズマ細胞膜におけるこれらの蛋白質の混乱した染色パターン及び細胞内区画におけるそれらの局在性を示す。
【０１００】
非イオン性界面活性剤不溶性は、細胞骨格に関連した接合部複合体の中への蛋白質取り込みの指標と考えられる（サカキバラら、1997年）。形態学及び共焦点データを補足するために（図２及び３）、生化学的特性は、結合蛋白質発現及びＰａ４、Ｐａ４‐Ｒａｆ１、ＯｃｃΔＬ１又はＯｃｃΔＬ２細胞から用意された非イオン性界面活性剤トリトンＸ‐１００（ＴＸ‐１００）細胞ホモジネートの溶解（Ｓ）又は不溶（Ｉ）断片との関連を実行した（図４）。Ｐａ４細胞において発現した高リン酸化型オクルディンは、クローディン‐１、ＺＯ‐１及びＥ‐カドヘリンがＩ及びＳ断片において等しく存在している一方で、これらの細胞のＩ断片と主に関連している。構成的に活性なＲａｆ‐１（Ｐａ‐４Ｒａｆ１）の導入は、発言したオクルディンの全体的な損失、及びこれらの細胞のＩ断片の範囲外へのクローディン‐１、ＺＯ‐１及びＥ‐カドヘリンの転換によって実証された正常な接合部の構成をもたらす（図４）。Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞において発現した第一のループ（ＯｃｃΔＬ１）を欠いているオクルディン蛋白質は、Ｐａ４細胞に関して観察されたものと同様に、ＩとＳ断片の間に分布していることが発見された。重要なことには、前記ＯｃｃΔＬ１細胞におけるクローディン‐１、ＺＯ‐１及びＥ‐カドヘリンについての溶解性分析結果は、母体となっているＰａ４上皮細胞株のものと非常に似ている（図４）。対照的に、ＯｃｃΔＬ２を発現しているＰａ４‐Ｒａｆ１細胞は、界面活性剤不溶性断片において、比例してより少ないクローディン‐１、ＺＯ‐１及びＥ‐カドヘリンを示し、このパターンは、発癌Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞のものと密接に似ていた（図４）。興味深いことに、発現したＯｃｃΔＬＺは、前記Ｓ断片においてほとんど排他的であった。概して、ＯｃｃΔＬ１及びＯｃｃΔＬ２細胞株について観察された溶解性分析結果における違いは、細胞形態及び接合部染色パターンにおける違いと一致する。
【０１０１】
例４：オクルディンの第二のループは、ＴＪ障壁機能にとって重要である。
種々の研究は、オクルディンの細胞外ループが上皮単分子層におけるＴＪ障壁機能の規則にとって重要であることを報告する。野生型ヒトオクルディン（Ｏｃｃ）を発現しているＰａ４‐Ｒａｆ１細胞は、生体外において半透性フィルタ担体上の培養の５日後、＞９００  Ｏ‐ｃｍ２の経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）値を備えた単分子層を形成した（図５Ａ）。ＯｃｃΔＬ２突然変異体を発現しているＰａ４‐Ｒａｆ１細胞がバックグラウンドを上回ってＴＥＲ値を生成しなかった（＜８０Ω‐ｃｍ２）一方、ＯｃｃΔＬ１突然変異体の導入は、培養５日目に＞５００Ω‐ｃｍ２のＴＥＲ値を生成した。これらＯｃｃΔＬ２細胞におけるＴＥＲは、完全長オクルディンによりトランスフェクトされたＰａ４細胞において観察されたものより低い一方、＞５００Ω‐ｃｍ２のＴＥＲ値は機能的なＴＪの発展を支える。上皮細胞の電気的かつ溶質障壁特性は接続を断った（バルダ（Balda）ら、1996）ので、傍細胞透過性の標識として、ＦＤ‐３（３ｋＤａ  ＦＩＴＣ‐デキストラン）溶剤上のＯｃｃΔＬ１及びＯｃｃΔＬ２突然変異体の効果がさらに調査された。Ｐａ４細胞を横切るＦＤ‐３溶剤は、この傍細胞透過性マーカーの高度に制限された動きを示した（図５Ｂ）。完全長ヒトオクルディンの導入により抑制されたＰａ４‐Ｒａｆ１細胞は−１，５００ｎｇ／ｃｍ２／ｈｒのＦＤ‐３流動速度を有する一方、Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞における強制されたＯｃｃΔＬ１の発現は多少より高い流動速度（〜３層より高い）をもたらした。期待された通り、Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞におけるＯｃｃΔＬ２の強制された発現は、ＦＤ‐３溶剤に少しも制限を示さない（データ不図示）。同時にこれらの結果は、オクルディンの第二のループがＴＪ障壁機能に必須であることを意味するが、単なる第二のループ（ＯｃｃΔＬ１）を備えた突然変異体の発現は、ＴＪ障壁機能を完全に救済するために十分ではない。
【０１０２】
例５：オクルディンの第二のループは、軟寒天における足場依存的な増殖に必要である。
軟寒天上の足場依存的な増殖の損失は、発癌性形質転換の標識と考えられる。Ｐａ４細胞の場合において、外因性のオクルディンの過剰発現は足場依存性を回復することが観察されたが（Li及びMrsny、2000年）、構成的に活性なＲａｆ１を備えた形質転換は、足場依存的な増殖のための能力を与えることを示す。特定のオクルディンドメインが足場依存的な増殖を抑圧するために必要であるかどうかを調査するために、様々なヒトオクルディン突然変異体又は完全長ヒトオクルディンを発現するＰａ４‐Ｒａｆ１細胞が、軟寒天において増殖分析を受けた（図６Ａ）。ＯｃｃΔＣ、ＯｃｃΔＮ及びＯｃｃΔＬ２突然変異体を発現しているＰａ４‐Ｒａｆ１細胞は、軟寒天上で多数のコロニー、平均してそれぞれ１０５、１００及び８０のコロニーを形成した。対照的に、完全長オクルディン（Ｏｃｃ）又はＯｃｃΔＬ１突然変異体の発現は、平均してそれぞれ５及び１０のみのコロニーにより、軟寒天上における増殖を極めて抑制した（図６Ｂ）。これらの結果は、オクルディンの第二のループが足場依存的な増殖の抑制、発癌性形質転換の指標に必須であることを示唆する。
【０１０３】
例６：オクルディンの第二のループは、ヌードマウスにおけるＲａｆ１媒介性腫瘍形成の抑圧に必要である。
Ｐａ‐４細胞増殖上でオクルディンの第二ループによって果たされた潜在的な役割をよりよく証明するために、我々は種々のオクルディン突然変異体を発現するＰａ４‐Ｒａｆ１の成長特性を生体内において分析した。完全長ヒトオクルディン又は種々の突然変異体（図２Ａ）を発現しているＰａ４‐Ｒａｆ１細胞が、ヌードマウスの脇腹に皮下注射された。腫瘍形成は外観検査によって分析された。Ｐａ４細胞（データ不図示）又は完全長ヒトオクルディン（Ｏｃｃ）（図７Ａ）若しくはＯｃｃΔＬ１のいずれかを発現しているＰａ４‐Ｒａｆ１細胞（データ不図示）の注入は、６週間ポスト注入により腫瘍を生成することに失敗した（図７Ｂ）。反対に、ＯｃｃΔＬ２（図７Ａ）又はＯｃｃΔＣ又はＯｃｃΔＮを発現しているＰａ４‐Ｒａｆ１細胞又はＰａ４‐Ｒａｆ１細胞（データ不図示）の注入は、目に見える大きな腫瘍を確かに生成した（図７Ｂ）。
【０１０４】
これらの研究が限定された数の動物及び注射部位に遂行されたとはいえ、これらの様々な細胞株の皮下注入がもたらした腫瘍の増殖量において著しい違いは観察されなかった（図７Ｂ）。同時にこれらの結果は、外因性のオクルディン（又は第一の細胞外ループだけ欠乏しているオクルディン）の発現がヌードマウスにおけるＲａｆ１‐誘発性腫瘍増殖を抑圧し得ることと、オクルディンの第二のループが形質転換したＰａ４細胞をＲａｆ１の増殖抑圧のために必要とされることを明示することによって、以前の生体外研究を拡張する。
【０１０５】
例７：活性Ｒａｆ１は、密着結合蛋白質遺伝子発現を下方調整する。
内部精度管理データに基づくと、アジレント（agilent）オリゴヌクレオチドにより得られた１．５より大きい異なる発現値は、重要である可能性がある。この基準を用いることで、我々は安定なトランスフェクション前後のＰａ４細胞から得られた全体のラットのゲノムに関するマイクロアレイデータを、構成的に活性なＲａｆ１（Ｐａ４‐Ｒａｆ１）と比較した。Ｐａ４とＰａ４‐Ｒａｆ１細胞の間のｍＲＮＡ存在度レベルの比較は、多数の遺伝子がＲａｆ１の活動によって上へ又は下へ制御されていることを示した（図８Ａ）。Ｐａ４細胞における活性なＲａｆ１によって影響を与えられた遺伝子は、転写因子、応答要素、調節分子、増殖因子受容体、細胞間接触蛋白質、及びＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰキナーゼ経路活性化と関係のある上皮細胞遺伝子調節を分析している他の研究において確認されたものと一致した細胞骨格要素を含んでいた。最も強いｍＲＮＡ存在度プロファイル移動は、細胞極性、拡散及びアポトーシス刺激に対する感受性に関連する遺伝子において発生した。現在の研究によって確認された多数の遺伝子は、他の癌細胞マイクロアレイ研究において細胞調節の対象になっているとして以前に報告されている。
【０１０６】
特に重要なＴＪ関連蛋白質ｍＲＮＡ存在度レベルは、Ｐａ４を、オクルディン（−１．８層）、クローディン‐７（−１２層）、クローディン‐３（−２．６層）、クローディン‐１（−２．５層）を含むＰａ４‐Ｒａｆ１細胞と比較するとき、著しく減少した。これらの結果は、腫瘍形成に関連した前立腺上皮細胞のｍＲＮＡ存在度レベルにおける変化、及び減少したオクルディンｍＲＮＡ及びＲａｆ１の活性化に従っているＰａ４細胞における発現レベルを示している我々の以前の研究と一致する。Ｐａ４‐Ｒａｆ１を分析しているより最近の研究は、ｍＲＮＡとクローディン‐１に関する蛋白質レベルの両方における減少を確認した。これらの発見は、ＴＪ成分の下方制御が上皮細胞形質転換事象と関連しているという観点から重要である。
【０１０７】
例８：オクルディンは、Ｒａｆ１‐操作された遺伝子発現を抑制する。
Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞（Ｐａ４‐Ｒａｆ１‐Ｏｃｃ細胞を生成すること）において、トランスフェクションアプローチによるオクルディンの強制された発現は、これらの細胞における構造的に活性なＲａｆ１キナーゼ活性に影響を与えない。これらの研究に関して、ヒトオクルディンは、ラットオクルディンよりはむしろ、内部から生じるオクルディン蛋白質の自然発生的な再発現が発生しなかったことを検証する手段として導入された。ヒトオクルディンの強制された発現は、軟寒天における増殖及びヌードマウスへの皮下注射によって評価されたＰａ４‐Ｒａｆ１細胞の癌表現型に反転し得る。Ｐａ４‐Ｒａｆ１におけるｍＲＮＡ多数レベルとＰａ４‐Ｒａｆ１‐Ｏｃｃ細胞との比較は、Ｐａ４細胞の中への活性Ｒａｆ１の導入によって誘発された基本的に全てのゲノム変異の顕著な反転を示した（図８Ｂ）。
【０１０８】
Ｐａ４細胞（活性Ｒａｆ１の導入より前に）についての特定のｍＲＮＡの存在度の変化と、Ｐａ４‐Ｒａｆ１‐Ｏｃｃ（強制されたヒトオクルディン発現後）についての特定のｍＲＮＡの存在度の変化の比較は、この予期されなかったＲａｆ１‐オクルディン力を通じて制御された遺伝子の反転可能な性質を分析する手段として比較された（図９）。ＴＪに関連した蛋白質遺伝子の回復は、これらの研究に特に関係のあるこの力の一つの局面を提供する。さらには、Ｒａｆ１活性化により、ｍＲＮＡ存在度において最大の変化を示す識別された遺伝子の全てが、続くヒトオクルディンの強制された発現を反転させた。
【０１０９】
例９：クローディン‐１は、Ｒａｆ１‐操作された遺伝子発現を抑制しない。
多くの研究は、機能的なＴＪ構造を構築し、かつ維持することにおいて、クローディン蛋白質についての重要な役割を記述した。Ｒａｆ１シグナル伝達事象の活性化は、乳癌発癌を導き得るけれども、一連の乳癌細胞株におけるＭＡＰＫ活性化の抑制は、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫ経路が乳癌細胞においてＴＪ構造の異常調節を含み得ないことを意味する一方、オクルディン及びクローディン‐１のような重大なＴＪ蛋白質の衰えた蛋白質レベルを回復することに失敗した。これらの著者は、クローディン‐１がアポトーシスを導き得ることを示す一方で、クローディン‐１蛋白質発現と関連した非Ｒａｆ調整された事象が乳癌細胞においてオクルディン発現に関連した事象よりもより重大になり得る。クローディン‐１がＰａ４‐Ｒａｆ１細胞（Ｐａ４‐Ｒａｆ１‐クローディン‐１）において発現した以前の研究は、Ｒａｆ１‐誘発性ＥＭＴと関連した事象の抑制の欠乏を示した。Ｐａ４‐Ｒａｆ１‐クローディン１細胞を得たマイクロアレイ分析データと他のアレイセットとの比較は、ＴＪ蛋白質の強制された発現が、Ｐａ‐４細胞においてＲａｆ１の活性化によって、生成された遺伝子組み換えの抑制に影響を与えることに失敗することを示す。組織間（又は細胞間）変動が、Ｒａｆ１活性化及びオクルディン調整への上皮細胞反応において重要な要素になり得ることを可能にする。クローディン‐１以外のクローディン族の一員がさらにＲａｆ１／Ｏｃｃ力をより活発に含み得ることをさらに可能にする。この関連で、クローディン‐３及びクローディン‐７は、前立腺上皮細胞の悪性形質転換によって影響を与えられ、我々は本研究において強力に制御されるためのこれら同様の二つのクローディン蛋白質を観察した。
【０１１０】
例１０：上皮細胞におけるＲａｆ１誘発性発癌効果の抑制。
本研究は、Ｒａｆ１とオクルディン発現間の動的関係を支持し、上皮細胞分化を順に決定する。この経路の異常調節は、上皮細胞の発癌の増殖に関係がある。多くの要素がこの規制プロセスにおいて加わる。増殖因子、抗アポトーシス分子等を含む因子のような以前の研究に基づいている。例えば、腫瘍関連のカルシウムシグナル伝達物質１遺伝子のｍＲＮＡ存在度レベルは、血管癒着分子Ｖｃａｍ１が１７層を抑制し、かつ血管内皮増殖因子Ｃ遺伝子転写が３層に影響を与える一方で、Ｒａｆ／Ｏｃｃ力によって４層変更されている。ＲＥＸ‐３と名付けられた遺伝子についての存在度レベルは、Ｆ９テアト癌腫（teatocarcinoma）細胞（Faria、1998年）においてレチノイン酸によって影響を与えられたことを以前に示したが、Ｒａｆ１によって３７層上方調整され、かつオクルディンによって同等の範囲に下方調整された。
【０１１１】
しかしながら、特に興味深いのは、直接に増殖因子シグナル伝達及び細胞生存経路に影響を与えることを示さないいくつかの遺伝子である。これに関して、約５０のｍＲＮＡ転写物は、癌治療方針について潜在的に標的になり得るように高度に調整された。これらの候補遺伝子のいくつかの実験は、癌細胞生存及び転移におけるそれらの役割の可能性を支持する。例えば、Ｒａｆ１／Ｏｃｃ力がオステオポンチン遺伝子の転写調整を強力に調整する（３０層）。オステオポンチン（又はシアロ蛋白質）は、サイトカイン及び発癌性及び転移性事象によって上方調整され関連していたことを示されている接着蛋白質様の性質とともに糖蛋白質を隠され、リン酸化される（Denhardtら、2003年、Rittlingら、2004年）。オステオポンチンは、さらに腫瘍転移及び血管生成に関わっている（アソウら、2001年、ネモトら、2001年）。さらに、最近の発見は、細胞表面水路アクアポリン‐１が新しい血管の増殖にとって重要であることを示唆する（Saddounら、2005年）。Ｒａｆ１は、アクアポリン‐１ｍＲＮＡレベルにおいて、約４層の増加を誘発し、オクルディン発現によって修正された。Ｒａｆ１／Ｏｃｃ力によって影響を与えられた最も高度に調整された遺伝子の一つは、蛋白質と結合している増殖因子で、Ｒａｆ１によってＰａ‐４細胞３８層において下方調整され、オクルディンによってＰａ‐４Ｒａｆ１細胞において３５層上方調整された。
【０１１２】
Ｈ２．０のようなホメオボックス遺伝子及びＭＡＤＳボックス転写エンハンサー因子２のような一連の特定の転写調節因子は、癌に関するこれらの治療法介入のための潜在的標的を作ることによって、Ｒａｆ１／Ｏｃｃ力によって制御される。予測され得ないＲａｆ１／Ｏｃｃ力において確認された他の潜在的癌標的は、以下の表１を含む。
【表１】
2008525496.tif 000002
【０１１３】
これらの遺伝子組み換えの全ては、オクルディンの導入によって修正された。従って、これらの様々な遺伝子製品及び／又はそれらの機能の導入、調整又は調節は、癌治療にとって、別々に又はオクルディン蛋白質修正を補助して、固有かつ予期しない機会を提供する。これらの標的のいくつかはさらに、消耗、骨吸収等のような癌に関連した病状のいくつかを改善するための可能性のある方法を表す。
【０１１４】
例１１：発癌性Ｒａｆ１は、抑制オクルディンプロモーター及び活性化スラッグ（Slug）によって上皮細胞形質転換を誘発する。
付随する結合蛋白質発現の損失を伴うＡＪＣの分裂は、癌細胞浸潤及び転移の顕著な特徴である。Ｒａｓ‐Ｒａｆシグナル経路の活性化は、癌を生成された上皮のサブグループに関係があるとされる。従って、我々の研究は、発癌性Ｒａｆ‐１が上皮間充織転換（ＥＭＴ）及び発癌性表現型への形質転換を誘発する機序を検査した。ラット唾液腺上皮細胞株（Ｐａ４）を用いることで、我々は、Ｐａ４上皮細胞においてＲａｆ‐１癌遺伝子の構造性の発現が機能的なＴＪを分裂させ、オクルディン発現を下方調整することによって上皮の表現型を癌表現型に形質転換することを証明した。Ｒａｆ‐１活性作用オクルディン発現及びＥＭＴによって構造をより良く特徴付けるために、我々は、オクルディンプロモーター活動上におけるＲａｆ‐１の作用を分析した。オクルディンプロモーターの１８５３‐塩基対（ｂｐ）断片は分離され、欠失構造が生成された。Ｒａｆ‐１形質転換された細胞の中への前記構造のトランスフェクションは、オクルディンプロモーター（−５０／＋２４０）の最小断片がＲａｆ‐１によって抑制されたことを明らかにした。さらに、発癌性Ｒａｆ‐１は、オクルディンの後続の下方調整を伴う転写リプレッサー「スラッグ」（遺伝子を含むジンクフィンガー）の上方調整を誘発した。これらの事象は、上皮細胞形質転換と相関した。興味深いことに、ＥＭＴを分析している他の研究とは対照的に、Ｅ‐カドヘリン発現は変化がないままであった。Ｒａｆ‐１形質転換された細胞におけるスラッグのｓｉＲＮＡ媒介性抑制は、改良されたオクルディン発現及び上皮表現型への遷移と一致する形態変化をもたらす。これらの発見は、Ｒａｆ‐１により誘発されるオクルディンの抑制及び後続のＥＭＴの媒介におけるスラッグの役割を裏付ける。
【０１１５】
上述の実施形態は本発明の完全な開示にする目的のために詳細に記述されている一方、当業者の人々に、多くの変更が本発明の精神及び原理から離れることなしに、そのように詳細になされ得ることを明白にし得る。従って、本開示は以下の特許請求の範囲によってのみ制限されるべきである。
【０１１６】
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【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１Ａ】Ｐａ４及びＰａ４‐Ｒａｆ１及びＯｃｃ細胞のサブ融合性（subconfluent）培養物の位相差顕微鏡写真のパネルである。
【図１Ｂ】Ｐａ４、Ｐａ４−Ｒａｆ１及びＯｃｃ細胞内におけるオクルディン、クローディン‐１、ＺＯ‐１及びＥ‐カドヘリンのラベル付けを示す免疫蛍光顕微鏡写真のパネルである。
【図１Ｃ】Ｒａｆ１形質転換されたＰａ４細胞における結合蛋白質発現における変化を示す免疫ブロット法のパネルである。
【図１Ｄ】透過性のトランスウェル（transwell）フィルタ上において培養されたＰａ４、Ｐａ４‐Ｒａｆ１及びＯｃｃ細胞の経上皮抵抗測定の線グラフである。
【図２Ａ】Ｒａｆ１形質転換されたＰａ４細胞内において発現された特定のオクルディン領域の欠失をコード化する構造に対応する領域を示す完全長のオクルディンの図である。全ての構造は、Ｃ‐末端ｍｙｃタグを含む。Ｏｃｃは、完全長のヒトオクルディンである。ＯｃｃΔＮは、短いＮ‐末端尾と両方の細胞外ループを欠く。ＯｃｃΔＣは、Ｃ‐末端細胞質ドメインを欠く。ＯｃｃΔＬ１は、第一の細胞外ループを欠く。ＯｃｃΔＬ２は、第二の細胞外ループを欠く。
【図２Ｂ】種々のＯｃｃ突然変異を発現する細胞の顕微鏡写真のパネルである。最も上のパネルは、ＯｃｃΔＮ、ＯｃｃΔＣ又はＯｃｃΔＬ２を発現する細胞が線維芽細胞様形態を示す一連の位相差画像である一方、完全長のオクルディン又はＯｃｃΔＬ１を発現する細胞は、親Ｐａ４上皮細胞の典型的な丸石様の外観を得る。最も下のパネルは、ＺＯ‐１及びｍｙｃタグ付けされたオクルディン構造に対する抗体を有するＰａ４‐Ｒａｆ１細胞内の一連の免疫蛍光顕微鏡写真である。ＯｃｃΔＮ、ＯｃｃΔＣ、ＯｃｃΔＬ２を発現するＰａ４‐Ｒａｆ１細胞は、拡散した非組織化されたＺＯ‐１及びｍｙｃ染色を示す一方、完全長のオクルディン又はＯｃｃΔＬ１を発現する細胞は細胞間接合の外側膜における典型的なＺＯ‐１及びｍｙｃタグ付けされたオクルディンの染色を示すことに留意されたい（スケールバーは１０）。
【図３Ａ】第一のループを欠くオクルディン突然変異体（ＯｃｃΔＬ１）を発現する複数の細胞内の細胞間接合におけるオクルディン、クローディン‐１、ＺＯ‐１及びＥ‐カドヘリン染色を示す共焦点免疫蛍光顕微鏡写真のパネルである。対照的に、オクルディン、クローディン‐１、ＺＯ‐１及びＥ‐カドヘリンは、第二のループを欠くオクルディン突然変異体（ＯｃｃΔＬ２）を発現する複数の細胞内において、拡散され非組織化された細胞内染色パターンを示す。
【図３Ｂ】Ｐａ４‐Ｒａｆ１細胞内におけるオクルディンの局所化を示すｘ‐ｚ平面における共焦点画像のパネルである。完全長のオクルディン（Ｏｃｃ）を発現する細胞において、オクルディンは最小の外側膜染色を有する密着結合において集中される。第一のループを欠くオクルディン（ＯｃｃΔＬ１）を発現する細胞内において、オクルディンは密着結合において局在化もするが、僅かにより多くの外側膜染色が観察される。最後に、第二のループを欠くオクルディン（ＯｃｃΔＬ２）を発現する細胞は、識別可能な頂端接合部複合体を有することなく、極性を有する単分子層を形成することに失敗する。
【図４】第一の細胞外ループを欠くオクルディン突然変異体（ＯｃｃΔＬ１）及び第二の細胞外ループを欠くオクルディン突然変異体（ＯｃｃΔＬ２）を発現する細胞から準備され、Ｐａ４細胞及びＲａｆ１‐形質転換されたＰａ４細胞（Ｐａ４‐Ｒａｆ１）からの抽出物と比較されたトリトン（Triton）Ｘ‐１００可溶性（Ｓ）及び不溶性（Ｉ）蛋白質断片を示す免疫ブロットである。蛋白質断片は、結合蛋白質オクルディン、クローディン‐１、ＺＯ‐１又はＥ‐カドヘリンのために免疫ブロットされた。
【図５Ａ】第一の細胞外ループ又は第二の細胞外ループのいずれかを欠く完全長のオクルディン又はオクルディン突然変異体を発現するＰａ４‐Ｒａｆ１細胞内における受動的イオン流出に対する経上皮抵抗を示す線グラフである。
【図５Ｂ】ＦＤ‐３（蛍光デキストラン、３０００Ｄａ）の傍細胞流動を示す棒グラフである。
【図６Ａ】軟寒天中の３５ｍｍディッシュにプレート化された、特定の領域欠失を有するオクルディン構造を発現するＰａ４‐Ｒａｆ１細胞の写真のパネルである（サイズバーは２ｍｍ）。
【図６Ｂ】各細胞株についてのコロニーの平均数を示す棒グラフである。
【図７Ａ】野生型オクルディン（Ｏｃｃ）又は第二のループを欠く突然変異体（ＯｃｃΔＬ２）を発現する細胞を注射されたヌードマウスの代表的写真のパネルである。
【図７Ｂ】各細胞株を注射されたマウスからの平均腫瘍重量を示すテーブルである。
【図８Ａ】Ｐａ４‐Ｒａｆ対Ｐａ４の間のｍＲＮＡ存在度レベルの比較を示す図である。
【図８Ｂ】Ｐａ４‐Ｒａｆ対Ｐａ４‐Ｒａｆ１‐Ｏｃｃの間のｍＲＮＡ存在度レベルの比較を示す図である。
【図９】Ｐａ４‐Ｒａｆ１‐Ｏｃｃ細胞内のｍＲＮＡ存在度レベルに対するＰａ４‐Ｒａｆ１内のｍＲＮＡ存在度レベルの比較を示す図である。
【図１０】Ｐａ４‐クローディン対Ｐａ４‐Ｏｃｃ細胞におけるｍＲＮＡ存在度レベルの比較を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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