【事件の表示】
　特許第２９９６６９０号「免疫学的凝集反応試薬」の請求項１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２９９６６９０号の請求項１に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第２９９６６９０号の請求項１に係る発明は、平成２年（１９９０年）５月１５日に出願され、平成１１年（１９９９年）１０月２９日に設定登録された。
　本件特許について、申立人熊澤　一、申立人池野耕司、申立人高良尚志、及び申立人佐伯憲生、より特許異議の申立があり、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１２年１２月２５日に訂正請求（後日取り下げ）がなされた後、再度の取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１３年５月２３日に訂正請求がなされた。
　
２．　訂正請求の適否の検討
　平成１３年５月２３日付訂正請求書による訂正請求（以下、本件訂正請求という）の適否について以下検討する。
（１）　訂正事項
　本件訂正請求は、つぎの訂正事項からなる。
　
訂正事項ａ：
　本件明細書の下記の個所の「使用時に」を、『使用直前に』訂正する。
（ａ１）  請求項１
（ａ２）　平成１０年８月１７日付け手続補正書２頁（３）（本件特許公報２頁左欄２２行目）
（ａ３）　同手続補正書２頁（４）（本件特許公報２頁左欄２８行目）
（ａ４）　同手続補正書３頁〜４頁（５）（本件特許公報２頁左欄３４行目）
　
訂正事項ｂ：
　本件明細書の下記の個所の「調整」を、『調製』に訂正する。
（ｂ１）  請求項１
（ｂ２）　平成１０年８月１７日付け手続補正書２頁（２）（特許第２９９６６９０号公報２頁左欄１３行）
（ｂ３）　同手続補正書２頁（３）（本件特許公報２頁左欄２３行）
（ｂ４）　同手続補正書２頁（４）（本件特許公報２頁左欄３０行）
（ｂ５）　同手続補正書２頁（５）（本件特許公報２頁左欄３６行及び右欄５行）
（ｂ６）　同手続補正書３頁〜５頁（６）（本件特許公報６右欄３６行、６頁右欄最終行〜７頁左欄１行、７頁左欄４行及び７頁左欄５行）、及び
（ｂ７）　明細書１２頁１５行目（本件特許公報３頁右欄４３行）
　
(２)　訂正事項ａについて
　訂正事項ａは、特許請求の範囲に記載された、ポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製される時期を、限定的に明確にしたものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　そして、訂正事項ａは、願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内である。また、訂正事項ａは、実質上特許請求の範囲を拡張するものでもなく、又は、変更するものでもない。
　
(３)　訂正事項ｂについて
　訂正事項ｂは、誤記の訂正を目的とするものである。
　訂正事項ｂは、願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内である。また、訂正事項ｂは、実質上特許請求の範囲を拡張するものでもなく、又は、変更するものでもない。
　
(４)　訂正事項の検討結果
　以上検討したところによれば、本件訂正請求は、特許法１２０条の４第２項及び第３項の規定に適合している。
　
３．　本件発明
  本件訂正明細書の請求項１に係る発明（以下、「本件発明」という。）は、その特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により構成されるつぎのとおりのものである。
「　【請求項１】
　少なくとも、抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子、ポリビニルピロリドン及び緩衝液の３成分よりなる試薬であって、使用直前にポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製されることを特徴とする免疫学的凝集反応試薬。」
　
４．　特許異議申立の概要
　特許異議申立の概要は以下のとおりである。
（Ａ）　申立人熊澤一の申立の概要
刊行物Ａ１
　松沢茂隆、榊輝美子、伊藤幸夫「血球凝集反応用合成高分子メジウムの研究（１）分子量の異なる２種以上のＰＶＰ（ポリビニールピロリドン）を主成分とするメジウムについて」日本法医学雑誌、第２５巻、第１号、１頁〜１４頁（１９７１）
刊行物Ａ２
　「臨床検査技術全書第４巻　免疫血清検査」、（株）医学書院、１２６〜１３７頁（１９７３）
　本件発明は、上記刊行物Ａ１〜刊行物Ａ２に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
（Ｂ）　申立人池野耕司の申立の概要
刊行物Ｂ１
　特開昭４７−１７２９０号公報
刊行物Ｂ２      
　松沢茂隆、吉川智子「血球凝集反応用合成高分子メジウムの研究（２）ＰＶＰ（ポリビニールピロリドン）とフィコールの混合メジウムについて」日本法医学雑誌、第２５巻、第１号、１５頁〜２６頁（１９７１）
刊行物Ｂ３
　「検査と技術」ｖｏｌ．１６　ｎｏ．７８（免疫化学検査法），５９３−５９６，医学書院、１９８８
刊行物Ｂ４
　「日本臨床」第４２巻・春季臨時増刊号（臨床免疫handbook）、１２１４−１２２０、１９８４
刊行物Ｂ５
　「臨床検査」第３２巻第３号、３４６〜３４７頁、１９８８
　本件発明は、上記刊行物Ｂ１に記載された発明と同一であるか、あるいは、上記刊行物Ｂ１〜刊行物Ｂ５に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
（Ｃ）　申立人高良尚志の申立の概要
刊行物Ｃ１
　特開昭６２−２２０８６６号公報
刊行物Ｃ２
　特開昭５８−５８４６８号公報
　本件発明は、上記刊行物Ｃ１〜刊行物Ｃ２に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
（Ｄ）　申立人佐伯憲生の申立の概要
刊行物Ｄ１      
　特開昭４７−１７２９０号公報　（刊行物Ｂ１に同じ）
刊行物Ｄ２
　特開昭５７−４９８６１号公報
刊行物Ｄ３
　特開昭５７−４４８４５号公報
　本件発明は、上記刊行物Ｄ１〜刊行物Ｄ３に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
５．　申立人熊澤一の申立についての検討
５．１　引用刊行物の記載事項
　前記刊行物Ａ１〜刊行物Ａ２には、下記の事項が記載されている。
（Ａ１）　刊行物Ａ１の記載事項
（Ａ１ａ）血球凝集反応用メジウム（緒言、２頁左欄１行〜右欄１行）
「　血球凝集反応は，食塩水，グルコース溶液，血清およびプラズマなどのメジウムを用いて観察されることが多い．アラビアゴム，プソイドムチン性卵巣嚢腫内容液，1）ゼラチン2）などのほか，デキストラン，3）−5）メチルセルロース，6）7）カルボキシメチルセルロール，6）ポリビニールピロドリン（ＰＶＰ）［審判官註、「ポリビニールピロリドン」の誤記である］，7）−10）ポリビニールアルコール，6）フィコール11）などの高分子物質溶液が用いられることもあるが，それらの溶液中では不完全血球凝集素の作用が促進されることが知られている．合成ないし半合成高分子物質のうち，分子量が比較的均一な製品を利用できるのはＰＶＰ　デキストランおよびフィコールであるが，それらの溶液は血球凝集反作用メジウム［審判官註、「血球凝集反応用メジウム」の誤記である］として優れた性質を示すものとされている．すなわち，ＰＶＰ は McNEIL3）9）らにより開発され，その他の研究者とくにHUMMEL7）により有用性が主張されている．デキストランはGRUBB3）により有効なことが発見され，デキストラン・血清混合液はMUNK−ANDERSEN溶液と呼ばれ，不完全血球凝集素検出のためのメジウムとして優れているという報告11）がある．また，フィコール溶液はPOLLACKにより，非物異的凝集［審判官註、「非特異的凝集」の誤記である］をほとんど起さず，保存による沈澱物形成がない点に特長のあるメジウムであると述べられている．」
（Ａ１ｂ）  合成ないし半合成高分子物質を２種以上配合するタイプのメジウム（緒言、２頁右欄２行〜６行）
「　従来使用された合成ないし半合成高分子メジウムは、それぞれの物質を単独で溶液としたものが多く、例外的にヒト血清を混合したものはあるが、合成ないし半合成高分子物質を２種以上配合するタイプのメジウムはまだ用いられていない．」
（Ａ１ｃ）　分子量の異なる２種以上のＰＶＰ（緒言、２頁右欄６行〜１０行）
「　私たちはＰＶＰの血球凝集反応におよぼす影響を検討した結果、分子量の異なる２種以上のＰＶＰを配合した溶液は、不完全血球凝集素の促進効果に比べて非特異的血球凝集作用が極めて弱いことを見出した。」
（Ａ１ｄ）　非特異的凝集作用の強さ（実験成績、４頁右欄７行〜末行、６頁左欄１行〜１２行）
「（２）　ＰＶＰによる血球凝集素促進効果と非特異的血球凝集作用の強さの比に影響を与える因子について
（１）ＰＶＰの分子量による差
　ＰＶＰをｐＨ７．８イミダゾール−塩酸緩衝液（０．２５％）（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムを加えて等張に調整）に溶解して作製した液で、不完全抗Ｐ凝集素血清（ＯＭＮｐＬｅ（ａ−ｂ＋）型ヒト血清）を希釈し、その促進効果を比較した成績を表６ に示す。ＰＶＰ−k30 および−k25 によるＰ血球の非特異的凝集は６〜１５分後から出現し次第に強くなるが、それまでの時間帯ではＰ血球だけが特異的に凝集された。・・・
その成績は表 ７ に示すようになり、次のように要約できる。
　１）ＰＶＰ−k30および−k25には、２０％ＢＳＡより強い血液型凝集素促進作用がある。　
　２）・・・
　３）ＰＶＰ−k15には促進作用がない。表には示さないが、ＰＶＰ−k30と−k25の促進効果を比較すると、ＰＶＰ−k30は−k25の約１／２ の濃度でほぼ等しい促進力を示す。なお、分子量160，000以上のＰＶＰを用いた実験も試みたが、０．５％程度でもかなり強い促進効果がみられた。しかし、非特異的血球凝集作用が強く、研究の目的上、以後の実験では分子量30，000（−k30）以下のＰＶＰを用いることにした．」
（Ａ１ｅ）　表１０（８頁）
　表１０には「複合ＰＶＰメジウム３種の組成とそれぞれの特長」が示されている。メジウム３種の略称が、ＰＰ１、ＰＰ２、ＰＰＢＳＡであることが示されている。これら３種のメジウムには、ＰＶＰ−k30、ＰＶＰ−k25及びＰＶＰ−k15が含まれていることが示されている。　
（Ａ１ｆ）　複合ＰＶＰメジウム（実験成績　、８頁右欄３行〜末行）
「　（３）２種以上の分子量のＰＶＰを主剤にする血清反応用メジウム作製法と実用性の検討
（１）組成
　前述の実験成績を基礎にして、それぞれ組成のことなる２８種のＰＶＰメジウムを作製し、種々の血球凝集素に対する促進効果を比較した。一連の実験成績により比較的使いやすいと判断されたメジウム３種の組成を表１０に示す。
　・・・・・・・・・・
（３）複合ＰＶＰ メジウムの保存性
　ＰＶＰは，テキストランと同様に水溶液中で重合し，沈澱を形成するが，表１２に示すように，ＰＶＰ−k15ではほとんと表われない．複合ＰＶＰメジウムにおいては，３０日後から ＰＰ１メジウムが，また，４０日後から ＰＰ２メジウムが僅かな沈殿を形成したが，ＰＰＢＳＡメジウムは ２４０日後でも完全に透明であるなど，いずれもかなり安定した保存性を示した．なお，POLLACKのフィコールメジウムに用いられているフィコールは２１０日後も全く沈殿を生じなかった．複合ＰＶＰメジウムとヒト血清を混合して保存すると、徐々に白濁ないし沈殿物の形成を見ることがあった．フィコールメジウムでも同様の現象を認めたが，複合ＰＶＰメジウムのほうがいくらかその傾向が強く，とくに抗血清混合比率が高い時（例えば１：１）には混合後直ちにかなり強い混濁が生ずることがあった．血清の混合比が低い溶液（例えば複合ＰＶＰメジウムの１／１０〜１／３０量）は透明になり、保存性も良かった．混濁ないし沈殿の発生は、血清の混濁に関係し，乳ビの混入のある血清では早期に強くあらわれた．血清を高速遠沈した後に、孔径０．４μ以下のセルロースアセテート膜で濾過した場合は複合ＰＶＰメジウムと混合して保存した後の混濁ないし沈殿の程度が極めて少なくなった．」
（Ａ１ｇ）　表１１（９頁）
　表１１は、「作製法の差がＰＰ１メジウムの不完全抗Ｄ凝集素血清の促進作用および非特異的血球凝集作用に及ぼす影響」を示したものである。
（Ａ１ｈ）　非特異凝集作用（考察、１１頁右欄下から１２行〜左欄７行）
「　ＰＶＰが血球凝集反応に及ぼす影響は，一般には「促進効果」だけしか知られていないが，私たちの検討した結果では，平均分子量22，000（k25）以上の ＰＶＰ だけがその効果を示すもので，平均分子量12，000（k15）のＰＶＰには凝集反応を阻止する作用が認められた．さらにk25以上の ＰＶＰ とＰＶＰ-k15を適当な範囲の比率で混合すると，k25以上の ＰＶＰ が持つ非特異的凝集作用が著しく弱くなり，不完全凝集素促進作用は（いくらか低下するが）かなり強いまま残されることが見出された．このような ＰＶＰ の性質を利用して血球凝集反応用メジウムを作製するための基礎実験を行なったが，Ｔｗｅｅｎ８０，ラウリル硫酸ソーダなとの界面活性剤の添加などの手段がかなり有効であることが分った．緩衝液の選択，ｐＨ値、ＰＶＰ製剤の種類などについての実験結果をも参考にして，数１０種の複合ＰＶＰメジウムを試製して検討した結果、用途が広く，使いやすいメジウムを３種類選んだが，これらは非特異的血球凝集作用が弱く，不完全血球凝集素に対する促進作用は極めて強いので前述の目的に合った「凝集反応用メジウム」であると考えられる．」
　
（Ａ２）　刊行物Ａ２の記載事項
（Ａ２ａ）  凝集反応（１２６頁右欄下から第８行〜５行）
「　光学顕微鏡で観察できる程度の大きさの粒子性の抗原、たとえば細菌、赤血球などが、それに対応する抗体と反応して顕微鏡あるいは肉眼で見えるくらいの大きな塊を作る現象を凝集反応とよんでいる。」
（Ａ２ｂ）  血液型（１２７頁左欄１１行〜１７行）
「　LANDSTEINER（１９００）は、ヒトの血清と赤血球を混ぜ合わせると、組み合わせによっては凝集反応が起こることから、今日のＡ、Ｂ、Ｏ型の血液型を発見し、その翌年DECASTELLO＆STURLIがＡＢ型を見つけ、加えた。こうして、血清学的反応の一形式である凝集反応が種々の細菌による伝染性疾患の血清学的診断法やいろいろな実験的研究に用いられるようになった。」
（Ａ２ｃ）  不完全抗体（１２７頁左欄１８行〜３４行）
「　LEVINE（1939），WIENER ＆LANDSTEINER（1940）らによりＲｈ型が発見され，ヒトの同種免疫に重要な役割を演じていることが明らかになるにつれ，抗Ｒｈ抗体が含まれていることが推定できる血清に，生理食塩水中でＲｈ陽性赤血球と凝集できないものがあることが気づかれてきた。DIAMOND らにより，このような抗体も高濃度のウシ血清アルブミン溶液中では凝集か起こることがわかり，やがて COOMBS（1945）らは，抗体の属するグロブリンに対応する抗グロブリン抗体を加えると凝集反応が起こることから，生理食塩水中で凝集反応が起こらない血液型抗体の存在を証明した。そして，RACEにより，生理食塩水中で凝集を起こす抗体は完全抗体，起こさない抗体は不完全抗体と名づけられた。日本では，緒方富雄により前者が在来の定型的な血清学的反応を起こすことから定型抗体，後者は非定型的な条件でのみ血清学的反応を起こすことから非定型抗体と名づけられた。」
（Ａ２ｄ）  赤血球、ポリスチロール粒子などに吸着（１２７頁左欄３５行〜３９行）
「　凝集反応は沈降反応と本質的には変わりないので、沈降反応を示すような抗原を、赤血球、ポリスチロール粒子などに吸着させ、対応する抗体との反応を凝集反応の形とし、感度をあげるとともに観察しやすくすることが試みられた。」
（Ａ２ｅ）  凝集反応の機序（１２７頁右欄９行〜２３行）
「２）凝集反応の機序
　・・・。MARRACKらの研究により、抗原と抗原を抗体が橋渡しするために凝集が起こることが証明されるに及んで特異説が有力になった。その後、電子顕微鏡的にも抗体が抗原の橋渡しをすることが証明されている。しかし、・・・赤血球の膜表面の荷電（電気二重層）が変わるというような物理化学的変化も微妙に影響していることが考えられる。」
　
５．２　本件発明と刊行物Ａ１発明との対比
　本件発明と刊行物Ａ１に記載された発明（以下、「刊行物Ａ１発明」という。）とを対比する。
　刊行物Ａ１の「不完全血球凝集素の作用」による「血球凝集反応」は、「免疫学的凝集反応」の一種である（前記（Ａ２ｃ）参照）。
  刊行物Ａ１の「血球」は、「血球凝集素」の作用を測定するのに使用する「試薬」ということができる。
  刊行物Ａ１の「血球」は、「血球」の担体部分の表面に「抗原（凝集原）」を担持しているものということはでき、「不溶性担体粒子」ということはできるが、「血球」の担体部分の表面にもともと「抗原（凝集原）」を有しているものであるので、「抗原」を「固定化」したものということはできない。
　刊行物Ａ１の「分子量の異なる２種以上のＰＶＰ」（前記（Ａ１ｃ）参照）は、「ポリビニルピロリドン」である。
　刊行物Ａ１の「ｐＨ７．８イミダゾール−塩酸緩衝液」（前記（Ａ１ｄ）参照）は、「緩衝液」である。
　
５．３　一致点
 　そうすると、本件発明と刊行物Ａ１発明とは、次の点で一致している。
　（一致点）
　少なくとも、抗原を担持した不溶性担体粒子、ポリビニルピロリドン及び緩衝液の３成分よりなる試薬であって、ポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製されることを特徴とする免疫学的凝集反応試薬、である点
　
５．４　相違点
　そして、本件発明と刊行物Ａ１発明とは、次の点で相違している。
　（相違点Ａ１）
  本件発明では、「免疫凝集反応」の種類が限定されていないのに対し、刊行物Ａ１発明では、「不完全血球凝集素の作用」による「血球凝集反応」に限定されている点。そして、本件明細書には、「免疫凝集反応」の種類として、「血球凝集反応」や「不完全抗体の作用による凝集反応」について例示されていない。
　（相違点Ａ２）
  本件発明では、「抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子」を試薬として使用するのに対し、刊行物Ａ１発明では「血球」を使用するものである点。
　（相違点Ａ３）
  本件発明では、「ポリビニルピロリドン」を試薬として使用するのに対し、刊行物Ａ１発明では「分子量の異なる２種以上のＰＶＰ」を使用するものである点。そして、本件発明では、「ポリビニルピロリドン」を２種以上混合することは、必須の構成となっていない。また、「ポリビニルピロリドン」を２種以上混合することは、本件明細書には、記載されていない。
　（相違点Ａ４）
  本件発明では、「ポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製される」のが「使用直前に」行われるのに対し、刊行物Ａ１発明では「使用直前に」行われることに限定されていない点。
　
５．５　相違点についての検討
　そこで、これらの相違点について以下検討する。
　（１）  ポリビニルピロリドン
  本件発明で使用する「ポリビニルピロリドン」は、「工業的に合成されている分子量１万から３６万程度のものが限定されずに使用できるが、ポリビニルピロリドンの粘度の指標であるフィケンチャーの粘度式におけるＫ価で２０以上のものは感度の向上効果が高く好適であり、Ｋ価で５０以上のものがさらに好適である。」とされている（本件特許公報２頁右欄９行〜１４行）。
  これに対して、刊行物Ａ１では、「ポリビニルピロリドン」は、「k25以上の ＰＶＰ とＰＶＰ−k15を適当な範囲の比率で混合すると，k25以上の ＰＶＰ が持つ非特異的凝集作用が著しく弱くなり，不完全凝集素促進作用は（いくらか低下するが）かなり強いまま残されることが見出された」というもので、「ＰＶＰ−k15を適当な範囲の比率で混合する」ということが、刊行物Ａ１発明において、「非特異的凝集作用」を弱めるために必須の構成である。
　（２）　本件発明の効果
  本件発明細書各実施例及び比較例において、特異性試験の評価を、担体に固定化した抗体（抗Candidaalbicans抗体）に対する抗原（Candidaalbicans）とは異なる多数の抗原（上記菌とは異なる属の真菌６種及び常在菌１４種）に対して凝集反応が生じるか否かで判定して、非特異凝集反応が起こらないことが確認されている（本件特許公報４頁左欄以下、及び、第１表、参照）。これに対して、刊行物Ａ１には、異なる抗原の下での非特異凝集性は、確認されていない。
　本件明細書、特に実施例および比較例の結果によれば、この非特異凝集反応が起こらない（０／２０）という、本件発明の顕著な効果は、「ポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製される」のが「使用直前に」行われること（上記相違点Ａ４の構成要素）により奏されるものと、認められる。
　（３）　刊行物Ａ１発明における「非特異的凝集作用」
  刊行物Ａ１において、「非特異的凝集作用」が奏されるのには、「分子量の異なる２種以上のＰＶＰ」の使用が必須であり、本件発明では、「分子量の異なる２種以上のＰＶＰ」の使用は必須ではない。
  刊行物Ａ１には、上記相違点Ａ４の構成要素と本件発明の顕著な効果との対応関係を示唆する記載はない。
　（４）　保存性
　なお、刊行物Ａ１には、「複合ＰＶＰメジウムとヒト血清を混合して保存すると、徐々に白濁ないし沈殿物の形成を見ることがあった。」と記載されていて、保存性について言及があるが、この言及は、「血球」の存在下における保存性を示しているものでないので、この言及が、「ポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に血球が懸濁した状態に調製される」のが「使用直前に」行われたほうが、好ましいことを示唆しているものということはできない。
　（５）  刊行物Ａ２
  刊行物Ａ２にも、上記相違点Ａ４の構成要素と本件発明の顕著な効果との対応関係を示唆する記載はない。
　（６）　検討結果
　そうすると、本件発明は、上記刊行物Ａ１〜刊行物Ａ２に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということはできない。
　
６．　申立人池野耕司の申立についての検討
６．１　刊行物Ｂ１〜刊行物Ｂ２の記載事項
　前記刊行物Ｂ１〜刊行物Ｂ２には、下記の事項が記載されている。
（Ｂ１）　刊行物Ｂ１の記載事項
（Ｂ１ａ）  血清学的資料を得る自動的方法（請求項１）
「　血清学的に決定力のある物質として、０．０５から０．９ミクロンの粒子大をもつ血清学的に不活性なラテックス粒子と物理的にそして（もしくは）化学的に結合している抗体もしくは抗原を利用し、エアセグメンテーション方式における吸光度の測定により血清学的資料を得る自動的方法。」
 （Ｂ１ｂ）第一の方法（第１図、４頁右下欄下から５行〜５頁右上欄３行）
「　第１図に図解で示した第一の方法では、ラテックス懸濁液を三方フイツテイング（three−way fitting）中へ比例ポンプ（proportining pump）で連続的に注入するが、ここへは分析試料も分析板から連続的に注入される。次にラテツクス−試料混合物を第２の三方フイツテイングでやはりこの系の中へポンプで注入した水溶性荷電中和性重合体と混合する。得られた混合物を次に第３の三方フイツテイングにエアセグメントする。セグメントした試料を次に小さな混合コイル中で混合し、エアセグメントされた試料が混合コイルから出てくるときに希釈剤を添加する。得られた混合物はもう一つの混合コイルを通過して２．５回巻固定コイル中へ入る。得られた凝集ラテツクスは混合物がコイル中を移動する際に沈でんする。・・・次に本懸濁液は消抱され、フローセルキュベットを通過させるがここでは吸光度を光電池セルで測定し、その結果を光学密度単位もしくは光伝導百分率で適当な記録器に記録させる。試料の陽性反応はＴ−トラップにおける廃棄物の除去によるラテツクス濃度の減少を示唆する。」
　（Ｂ１ｃ）  水性緩衝溶液中で結合（３頁右上欄１８行〜左下欄７行）
「　担体粒子は多くの異なった方法で血清学的に決定力のある物質を被覆することができる。たとえばモンサント化学会社から入手できる「リトロン６１５」のような重合スチレンラテツクスの重合体粒子を使用することができる。ポリスチレンラテツクスの分散層における重合体粒子と適当な血清学的に決定力のある物質とは、およそｐＨ８．２の水性緩衝溶液中で結合している。好ましい緩衝溶液はグリシンおよびサラインを含む。最終的には、この反応混合物を適当な希釈度に希釈する。」
　（Ｂ１ｄ）  例１（５頁右下欄８行〜６頁右上欄１５行）
  例１では、「ラテツクス懸濁液」として、「ヒト血清アルブミン」で被覆した「カルボキシル化ブタジエン−スチレン共重合体粒子」からなる「ラテツクス懸濁液」が使用されている。「分析試料」として、「希釈やぎ抗ヒトアルブミン血清試料」が使用されている。「水溶性荷電中和性重合体」として、「水性ポリビニルピロリドン溶液」が使用されている。
　（Ｂ１ｅ）　例４（７頁右下欄２行〜８頁左上欄２行）
  例４では、「ラテツクス懸濁液」として、「ポリスチレン共重合体粒子」に被覆した「人体ガンマグロブリン」を「ｐＨ８．２のトリス−塩酸緩衝液」に懸濁させたものを使用することが記載されている。
　（Ｂ１ｆ）　重合体荷電中和剤（４頁右上欄１５行〜左下欄１行）
「　重合体荷電中和剤は被覆粒子間の反綬する電気的負荷を部分的に中和する目的で本方式に存在している。これは最大凝集反応を確実にする為に要求される。利用する重合体は水可溶性で反応体の負荷を部分的に中和する能力を持たねばならず、また本方式の不均一な流れもしくは妨げを生じさせるほどその濃度が粘性であったはならない。
　代表的な好ましい水可溶性重合体は、分子量360，000のポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等である。
　本発明において使用するに好ましいものはポリビニルピロリドンである。本発明の方式において有用であるためには、重量でこの好ましい重合体をおよそ１％からおよそ８％使用する。この量は他の水可溶性重合体とは異なってよい。」
（Ｂ１ｇ）　重合体の濃度調整（４頁左下欄１５行〜右下欄１行）
「　もしも不完全に被覆された担体を使用した場合には二次的干渉反応の可能性があるため、本方式は単に主要な反応が起こりおよび（もしくは）測定されるだけのように調整すればよい。これにはたとえば電気的に中和重合体の濃度を下げ、こうして弱い二次的反応が生じないようにおよび主要な反応のみが起こるようにすればよい。」
　
（Ｂ２）　刊行物Ｂ２の記載事項
　刊行物Ｂ２には、免疫学的凝集反応の一態様である血液型凝集素血清を用いた血液凝集反応における、血清反応用メジウムの研究結果が記載されている。　ポリビニルピロリドンとフィコールを適当に混合すると、「非特異的凝集反応が弱く、不完全血球凝集素に対する促進作用はかなり強い」ことが記載されている（１６頁左欄１０行〜１４行）。
　また、１９頁表４には、ポリビニルピロリドン単独、又はポリビニルピロリドンとフィコールの混合物の血液凝集に対する促進効果が示されている。
　
（Ｂ３）　刊行物Ｂ３の記載事項
　刊行物Ｂ３には、免疫比濁法について記載されている。非イオン性重合体の抗原抗体反応増強効果が、説明されているそして、抗原抗体反応を増強する重合体として、ポリビニルピロリドンが例示されている（５９５頁右欄７行〜５９６頁右欄４行）。
　
（Ｂ４）　刊行物Ｂ４の記載事項
　刊行物Ｂ４には、受身凝集反応による免疫比濁法に使用する、全自動免疫化学分析装置用の試薬が記載されている（１２１８頁右欄下から４行〜１２２０頁左欄１２行）。同試薬としては、専用のキットが市販されており、「緩衝液」、「標準液」、及び「抗体吸着ポリスチレンラテツクス懸濁液」からなることが記載されている。
　
（Ｂ５）　刊行物Ｂ５の記載事項
　刊行物Ｂ５には、ラテツクス凝集反応に用いる分散煤としてポリビニルピロリドンが、非特異的凝集を抑える物質の一つであると記載されている（３４６頁右欄下から３行〜３４７頁左欄１行）。
　さらに、ラテツクス試薬の特性を決めているのは分散媒の組成によるところがもっとも大きいことが記載されている（３４７頁左欄４行〜６行）が、具体的な分散媒の組成と関連付けた記載はない。
　
６．２　本件発明と刊行物Ｂ１発明との対比
　本件発明と刊行物Ｂ１に記載された発明（以下、「刊行物Ｂ１発明」という。）とを対比する。
  刊行物Ｂ１の例１の「ラテツクス懸濁液」は、「抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子」の懸濁液であり（前記（Ｂ１ｄ）参照）、「試薬」である。刊行物Ｂ１の「ラテツクス懸濁液」は、「緩衝液」を分散媒としているものである（前記（Ｂ１ｃ）参照）。
　刊行物Ｂ１には、「ポリビニルピロリドン」を、「重合体荷電中和剤」として使用することが記載されており、これは最大凝集反応を確実にする為に使用される「試薬」である。
  刊行物Ｂ１発明は、「エアセグメンテーション方式における吸光度の測定」に係るもので、「免疫学的凝集反応」によるものである。
　本件発明では、「試薬」は、「使用直前」に「ポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態」に調製される。すなわち、試料と混合する直前に三成分の試薬が混合される。これに対し、刊行物Ｂ１発明では、「ラテツクス懸濁液」と「分析試料」とを混合した後で「水溶性荷電中和性重合体」と混合し、「エアセグメンテーション方式」により凝集物を沈殿除去した後に、吸光度を測定するもの、すなわち、試料との混合直前に三成分の試薬が混合されてはいないものである。
　
６．３　一致点
　そうすると、本件発明と刊行物Ｂ１発明とは、次の点で一致している。
　（一致点）
　少なくとも、抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子、ポリビニルピロリドン及び緩衝液の３成分よりなる試薬であって、ポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態で使用される、免疫学的凝集反応試薬、である点。
　
６．４　相違点
　そして、本件発明と刊行物Ｂ１発明とは、次の点で相違している。
　（相違点Ｂ１）
  本件発明では、「使用直前」に「ポリビニルピロリドン」が溶存する「緩衝液」に「不溶性担体粒子」が「懸濁した状態」に「調製」される、すなわち、すなわち、試料と混合する直前に三成分の試薬が混合される、のに対し、刊行物Ｂ１発明では、「ラテツクス懸濁液」と「分析試料」とを混合した後で「水溶性荷電中和性重合体」と混合するもので、すなわち、試料との混合直前に三成分の試薬が混合されているものでない点。
　（相違点Ｂ２）
  本件発明の「免疫学的凝集反応試薬」は、免疫学的の凝集反応に基づくもので、方式が限定されていないのにたいし、刊行物Ｂ１発明の「試薬」は、「エアセグメンテーション方式における吸光度の測定」に限定されている点。
　
６．５　相違点についての検討
　そこで、これらの相違点について以下検討する。
（１）　本件発明の効果
  本件発明細書各実施例及び比較例において、特異性試験の評価を、担体に固定化した抗体（抗Candidaalbicans抗体）に対する抗原（Candidaalbicans）とは異なる多数の抗原（上記菌とは異なる属の真菌６種及び常在菌１４種）に対して凝集反応が生じるか否かで判定して、非特異凝集反応が起こらないことが確認されている（本件特許公報４頁左欄以下、及び、第１表、参照）。
　本件明細書、特に実施例および比較例の結果によれば、この非特異凝集反応が起こらない（０／２０）という、本件発明の顕著な効果は、「ポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製される」のが「使用直前に」行われることにより奏されるもの、すなわち、試料と混合する直前に三成分の試薬が混合されることにより奏されるもの、と認められる。
　
（２）  引用刊行物における示唆
  これに対して、刊行物Ｂ１には、試料と混合する直前に三成分の試薬が混合されることによりこのような顕著な効果を奏することが示唆されていない。
  また、刊行物Ｂ２〜刊行物Ｂ５にも、試料と混合する直前に三成分の試薬が混合されることによりこのような顕著な効果を奏することが示唆されていない。
　
（３）　検討結果
　そうすると、本件発明は、上記刊行物Ｂ１に記載された発明と同一ということはできず、そして、上記刊行物Ｂ１〜刊行物Ｂ５に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということもできない。
　
７．  申立人高良尚志の申立についての検討
７．１　刊行物Ｃ１〜刊行物Ｃ２の記載事項
　前記刊行物Ｃ１〜刊行物Ｃ２には、下記の事項が記載されている。
（Ｃ１）　刊行物Ｃ１の記載事項
（Ｃ１ａ）　リウマチ因子定量用試薬（請求項１）
「　ヒトγ−グロブリンが感作された不溶性担体、ポリエチレングリコール並びにトリアルキルアミン、その塩及び第４級アンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも一種の水溶性化合物を組み合わせてなる，リウマチ因子定量用試薬。」
（Ｃ１ｂ）  検量線の作成（発明が解決しようとする問題点）
「  免疫ラテツクス凝集法はレーザー光を用いるので高感度ではあるが，ＲＦをこの方法を利用して定量する場合，ヒトγ‐グロブリンが感作された不溶性担体を用いて免疫反応（抗原−抗体反応）を速やかに行なわせるためにポリエチレングリコールの存在下に該反応を行なわせるのが好ましい。しかし，この場合，良好な直線性を有する検量線が得られず，従って，定量に際し，検量線の作成が煩雑になり，また，定量の精度が低下する問題があり，従来知られている試薬では，この問題を解決することができない。」
（Ｃ１ｃ）  試薬（３頁左下欄７行〜１０行）
「  本発明において，前記の感作された不溶性担体，ポリエチレングリコール及び水溶性化合物は，媒体に分散及び溶解し，試薬として使用されるのが好ましい。」
（Ｃ１ｄ）  試薬としての形態（３頁左下欄１１行〜右下欄１４行）
「　この場合，試薬としては，次の形態がある。
（１）　感作された不溶性担体，ポリエチレングリコール及び水溶性化合物を共に同一の媒体に分散又は溶解させた試薬（１液のラテツクス試薬）。
（２）　感作された不溶性担体を媒体に分散させた試薬（ラテツクス試薬）と
ポリエチレングリコールと水溶性化合物を同時に媒体に溶解した試薬からなる２液型の試薬。
（３）　感作された不溶性担体と水溶性化合物を共に同一の媒体に分散又は溶解した試薬（ラテツクス試薬）と、ポリエチレングリコールを溶解した試薬と，ポリエチレングリコールを溶解した試薬からなる２液型の試薬。
（４）　感作された不溶性担体を媒体に分散した試薬（ラテツクス試薬），ポリエチレングリコールを媒体に溶解した試薬と水溶性化合物を媒体に溶解した試薬からなる３液型の試薬。
　これらのうち，（２）及び（３）の形態が好ましい。なお，（１）の形態は，用時に調整されるのが好ましい。」
（Ｃ１ｅ）  緩衝液（３頁右下欄１５行〜１８行）
「　前記において、媒体としては，緩衝液が主に使用され，リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が好ましく、ｐＨを６〜１０に調整したものが好ましい。」
　
（Ｃ２）　刊行物Ｃ２の記載事項
（Ｃ２ａ）  β２−ミクログロブリンの測定方法（請求項１）
「　一次元免疫拡散法に於いて、ゲルプレート中に抗β２−ミクログロブリン及び鮮明な沈降輪を与える不溶性沈降物生成物質を含有させてその存在下に免疫反応させることを特徴とするβ２−ミクログロブリンの測定方法。」
 （Ｃ２ｂ）  一次元免疫拡散法（２頁左上欄９行〜１８行）
「　既に、β２−ミクログロブリンの測定法としては抗ヒトβ２−ミクログロブリンを含むゲルプレートに細孔を設けて検体を満たし、β２−ミクログロブリンの浸透拡散に伴って生ずる抗原抗体反応沈降輪から測定する一次元免疫拡散法がある。（木村正巳．臨床化学，３ ．３０５（１９・７ ４））しかしこの方法ては沈降輪を読みとる為にクンニン酸処理やアミドブラック１０Ｂ染色等の後処理が必要であり、また反応時間も４８時間という長時間を要するという欠点がある。」
（Ｃ２ｃ）  不溶性沈降物生成物質（２頁右下欄２行〜１３行）
「　本発明者らの知見によると、当該不溶性沈降物生成物質は　β２−ミクログロブリンの抗原抗体反応生成物を不溶化し不溶性沈降物を生成させると共に鮮明を沈降輪を与える性質を有する。
　当該不溶性沈降物生成物質が存在しない場合は不溶性の沈降物が生成し難い為、一般的に行われている一次元免疫拡散法では先に述べた後処理無しでは定量出来ない。
　不溶性沈降物生成物質として抗原抗体反応促進剤を用いる場合は鮮明な沈降輪が得られるだけでなく、免疫反応時間も飛躍的に短縮されるので極めて好ましい。」
（Ｃ２ｄ）  抗原抗体反応促進剤（３頁右上欄4行〜１３行）
「　解明な沈降輪を与える不落性沈降物生成物質としては抗原抗体反応促進剤が好ましく、抗原抗体反応促進剤としては、ポリエチレングリコール、ポリビニールアルコール、ポリビニールピロリドン、デキストランなとの水溶性高分子化合物てあって窒素、酸素などのヘテロ原子を有するものが使用できるが、これらのうちでは単位重量あたりのローンペア存在数が大であるものほど好ましい傾向にある。なお、これらは単独でも混合しても使用することができる。」
　
７．２　本件発明と刊行物Ｃ１発明との対比
　本件発明と刊行物Ｃ１に記載された発明（以下、「刊行物Ｃ１発明」という。）とを対比する。
　刊行物Ｃ１発明の「ヒトγ−グロブリンが感作された不溶性担体」は、「抗体を固定化した不溶性担体粒子」である。
  刊行物Ｃ１発明の「ポリエチレングリコール」は、「抗原抗体反応促進剤」である（前記（Ｃ１ｂ）、（Ｃ２ｄ）参照）。本件発明で使用されている「ポリビニルピロリドン」も、「抗原抗体反応促進剤」として知られているものである（前記（Ｃ２ｄ）参照）。
　刊行物Ｃ１発明の「試薬」において使用されている「媒体」は、主に「緩衝液」である（前記（Ｃ１ｅ）参照）。
  刊行物Ｃ１発明の「試薬」は「免疫学的凝集反応試薬」であるが、「リウマチ因子定量用試薬」に限定されている。
　刊行物Ｃ１発明の「試薬」は、検量線の直線性の改善剤として「トリアルキルアミン、その塩及び第４級アンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも一種の水溶性化合物」を必須成分としているのに対し、本件発明の「免疫学的凝集反応試薬」は、そのような水溶性化合物は必須成分としていない。
  刊行物Ｃ１発明では、「用時」に「抗原抗体反応促進剤（ポリエチレングリコール）」が溶存する「緩衝液」に「不溶性担体粒子」が懸濁した状態に調製されることが好ましいことが記載されている（前記（Ｃ１ｄ）参照）。
　
７．３　一致点
　そうすると、本件発明と刊行物Ｃ１発明とは、次の点で一致している。
　（一致点）
　少なくとも、抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子、「抗原抗体反応促進剤」及び緩衝液の３成分よりなる試薬であって、使用直前に「抗原抗体反応促進剤」が溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製されることを特徴とする免疫学的凝集反応試薬、である点。
　
７．４　相違点
　そして、本件発明と刊行物Ｃ１発明とは、次の点で相違している。
　（相違点Ｃ１）
　本件発明では、試薬成分として「ポリビニルピロリドン」を使用するものに限定されているのに対し、刊行物Ｃ１発明では、「ポリエチレングリコール」を使用するものに限定されている点。
　（相違点Ｃ２）
　本件発明では、前記「３成分」よりなる試薬であるのに対し、刊行物Ｃ１発明では、「トリアルキルアミン、その塩及び第４級アンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも一種の水溶性化合物」を必須成分とする４成分よりなるものである点。
　（相違点Ｃ３）
  本件発明の「免疫学的凝集反応試薬」は、使用目的が限定されていないのに対し、刊行物Ｃ１発明のものは、「リウマチ因子定量用試薬」に限定されている点。
　
７．５　相違点についての検討
　そこで、これらの相違点について以下検討する。
（１）　本件発明の効果
  本件発明細書各実施例及び比較例において、特異性試験の評価を、担体に固定化した抗体（抗Candidaalbicans抗体）に対する抗原（Candidaalbicans）とは異なる多数の抗原（上記菌とは異なる属の真菌６種及び常在菌１４種）に対して凝集反応が生じるか否かで判定して、非特異凝集反応が起こらないことが確認されている（本件特許公報４頁左欄以下、及び、第１表、参照）。
　本件明細書、特に実施例および比較例の効果によれば、この非特異凝集反応が起こらない（０／２０）という、本件発明の顕著な効果は、「ポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製される」のが「使用直前に」行われることにより奏されるもの、すなわち、試料と混合する直前に三成分の試薬が混合されることにより奏されるもの、と認められる。
　
（２）  引用刊行物における示唆
  これに対して、前述したように、刊行物Ｃ１には、「ポリエチレングリコール」を含む試薬が「用時」に、すなわち試料と混合する直前に試薬が混合されることが好ましいと記載されているが、本件明細書の比較例２〜比較例４によれば、「ポリエチレングリコール」を使用したものは、非特異的凝集が発生してしまうものである。そして、刊行物Ｃ１には、試料と混合する直前に「ポリビニルピロリドン」を含む三成分の試薬を混合することによりこのような顕著な効果を奏することが示唆されているということができない。
  また、刊行物Ｃ２にも、試料と混合する直前に「ポリビニルピロリドン」を含む三成分の試薬が混合されることによりこのような顕著な効果を奏することが示唆されていない。
　
（３）　検討結果
　そうすると、本件発明は、上記刊行物Ｃ１〜刊行物Ｃ２に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということはできない。
　
８．  申立人佐伯憲生の申立についての検討
８．１　刊行物Ｄ１〜刊行物Ｄ３の記載事項
　前記刊行物Ｄ１〜刊行物Ｄ３には、下記の事項が記載されている。
（Ｄ１）　刊行物Ｄ１の記載事項
　刊行物Ｄ１は、刊行物Ｂ１と同じものである。
  刊行物Ｄ１には、前記（Ｂ１ａ）〜（Ｂ１ｇ）の事項が記載されている。
　
（Ｄ２）　刊行物Ｄ２の記載事項
（Ｄ２ａ）競争的放射線免疫検定（請求項１）
「　１）　競争的放射線免疫検定を用いて体液中の抗体濃度を測定するために、水溶液中で第１の抗体に特異的に結合している抗原を結合させそして結合してない抗原からこの結合している抗原を分離する方法に際し、一方では黄色ブドウ球菌細胞に結合しておりそして他方では第１の抗体を特異的に結合する第２の抗体により、特典的に結合している抗原も有する第１の抗体を水溶液中に溶解されている遊離の抗原から分離する方法において、第２の抗体による第１の抗体の特異的な結合を促進させる反応促進剤が水溶液に添加されることを特徴とする方法。」
（Ｄ２ｂ）  試薬（請求項３）
「　３）　競争的な放射線免疫検定による抗原の測定に際して第１の抗体に結合している抗原から遊離の抗原を分離させるための、水性緩衝液、反応促進剤および第２の抗体が特異的に結合している黄色葡萄球菌細胞からなる試薬。」
（Ｄ２ｃ）  反応促進剤（５頁左上欄１０行〜末行）
「　本発明による反応促進剤は、第２の抗体による第１の抗体の特異的な結合反応を促進する物資であり、その際これらは免疫グロブリン、特にガンマ‐グロブリンの空間的なポリペプチド構造を実質上変化させずそしてそれによって抗体の特異的な反応性を破壊しない．かかる物質の例はデキストランあるいはポリビニルピロリドンのような親水性重合体でもある。」
　
（Ｄ３）  刊行物３の記載事項
　刊行物Ｄ３は、本件特許の審査過程で引用された刊行物であり、分散媒として、緩衝液の使用が記載されている。
　
８．２　本件発明と刊行物Ｄ１発明との対比
　本件発明と刊行物Ｄ１に記載された発明（以下、「刊行物Ｄ１発明」という。）とを対比する。
  刊行物Ｄ１の例１の「ラテツクス懸濁液」は、「抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子」の懸濁液であり（前記（Ｂ１ｄ）参照）、「試薬」である。刊行物Ｄ１の「ラテツクス懸濁液」は、「緩衝液」を分散媒としているものである（前記（Ｂ１ｃ）参照）。
　刊行物Ｄ１には、「ポリビニルピロリドン」を、「重合体荷電中和剤」として使用することが記載されており、これは最大凝集反応を確実にする為に使用される「試薬」である。
  刊行物Ｄ１発明は、「エアセグメンテーション方式における吸光度の測定」に係るもので、「免疫学的凝集反応」によるものである。
　本件発明では、「試薬」は、「使用直前」に「ポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態」に調製される。すなわち、試料と混合する直前に三成分の試薬が混合される。これに対し、刊行物Ｄ１発明では、「ラテツクス懸濁液」と「分析試料」とを混合した後で「水溶性荷電中和性重合体」と混合し、「エアセグメンテーション方式」により凝集物を沈殿除去した後に、吸光度を測定するもの、すなわち、試料との混合直前に三成分の試薬が混合されてはいないものである。
　
８．３　一致点
　そうすると、本件発明と刊行物Ｄ１発明とは、次の点で一致している。
　（一致点）
　少なくとも、抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子、ポリビニルピロリドン及び緩衝液の３成分よりなる試薬であって、ポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態で使用される、免疫学的凝集反応試薬、である点。
　
８．４　相違点
　そして、本件発明と刊行物Ｄ１発明とは、次の点で相違している。
　（相違点Ｄ１）
  本件発明では、「使用直前」に「ポリビニルピロリドン」が溶存する「緩衝液」に「不溶性担体粒子」が「懸濁した状態」に「調製」される、すなわち、すなわち、試料と混合する直前に三成分の試薬が混合される、のに対し、刊行物Ｄ１発明では、「ラテツクス懸濁液」と「分析試料」とを混合した後で「水溶性荷電中和性重合体」と混合するもので、すなわち、試料との混合直前に三成分の試薬が混合されているものでない点。
　（相違点Ｄ２）
  本件発明の「免疫学的凝集反応試薬」は、免疫学的の凝集反応に基づくもので、方式が限定されていないのにたいし、刊行物Ｄ１発明の「試薬」は、「エアセグメンテーション方式における吸光度の測定」に限定されている点。
　
８．５　相違点についての検討
　そこで、これらの相違点について以下検討する。
（１）　本件発明の効果
  本件発明細書各実施例及び比較例において、特異性試験の評価を、担体に固定化した抗体（抗Candidaalbicans抗体）に対する抗原（Candidaalbicans）とは異なる多数の抗原（上記菌とは異なる属の真菌６種及び常在菌１４種）に対して凝集反応が生じるか否かで判定して、非特異凝集反応が起こらないことが確認されている（本件特許公報４頁左欄以下、及び、第１表、参照）。
　本件明細書、特に実施例および比較例の効果によれば、この非特異凝集反応が起こらない（０／２０）という、本件発明の顕著な効果は、「ポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製される」のが「使用直前に」行われることにより奏されるもの、すなわち、試料と混合する直前に三成分の試薬が混合されることにより奏されるもの、と認められる。
　
（２）  引用刊行物における示唆
  これに対して、前述したように、刊行物Ｄ１には、試料と混合する直前に三成分の試薬が混合されることによりこのような顕著な効果を奏することが示唆されていない。
  また、刊行物Ｄ２〜刊行物Ｄ３にも、試料と混合する直前に三成分の試薬が混合されることによりこのような顕著な効果を奏することが示唆されていない。
　
（３）　検討結果
　そうすると、本件発明は、上記刊行物Ｄ１〜刊行物Ｄ３に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということはできない。
　
９．　むすび
  本件特許異議の申立（Ａ）〜申立（Ｄ）は、いずれも理由がない。
　したがって、本件特許異議の申立の理由によっては、本件請求項１の発明に係る特許を取り消すことができない。
　また、他に本件請求項１に係る発明の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年６月４日（２００１．６．４）
【訂正の要旨】
　訂正の要旨
訂正事項ａ：
　本件明細書の下記の個所の「使用時に」を、『使用直前に』訂正する。
（ａ１）　請求項１
（ａ２）　平成１０年８月１７日付け手続補正書２頁（３）（本件特許公報２頁左欄２２行目）
（ａ３）　同手続補正書２頁（４）（本件特許公報２頁左欄２８行目）
（ａ４）　同手続補正書３頁〜４頁（５）（本件特許公報２頁左欄３４行目）
訂正事項ｂ：
　本件明細書の下記の個所の「調整を、『調製』に訂正する。
（ｂ１）　請求項１
（ｂ２）　平成１０年８月１７日付け手続補正書２頁（２）（特許第２９９６６９０号公報２頁左欄１３行）
（ｂ３）　同手続補正書２頁（３）（本件特許公報２頁左欄２３行）
（ｂ４）　同手続補正書２頁（４）（本件特許公報２頁左欄３０行）
（ｂ５）　同手続補正書２頁（５）（本件特許公報２頁左欄３６行及び右欄５行）
（ｂ６）　同手続補正書３頁〜５頁（６）（本件特許公報６右欄３６行、６頁右欄最終行〜７頁左欄１行、７頁左欄４行及び７頁左欄５行）、及び
（ｂ７）　明細書１２頁１５行目（本件特許公報３頁右欄４３行）
（５４）【発明の名称】
免疫学的凝集反応試薬
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】少なくとも、抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子、ポリビニルピロリドン及び緩衝液の３成分よりなる試薬であって、使用直前にポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製されることを特徴とする免疫学的凝集反応試薬。
【発明の詳細な説明】
　［産業上の利用分野］
　本発明は免疫学的な凝集反応に基づく測定試薬に関する。
　［従来の技術及びその問題点］
　従来、不溶性担体粒子に物理吸着あるいは共有結合の形成により抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子（以下、固定化担体粒子と略す）と血清や尿などの検体中の対応する抗体又は抗原との間における抗原抗体反応に基づく凝集反応あるいは凝集阻止反応を観察することにより、検体中の対応する抗体又は抗原を測定する免疫学的な測定試薬が知られている。そして、この固定化担体粒子を用いる測定方法は検体中に含まれる比較的微量の抗体又は抗原を迅速に、高精度でかつ簡便に測定でき、数分の内に測定をしうるためにその場合での診断が可能であり、広く利用されている。
　しかしながら、免疫学的凝集反応試薬を使用する医療の現場からは、より早期に診断して早期の治療を実現するために、従来に増してより微量の抗体又は抗原を測定することが求められている。
　従来免疫学的凝集反応の試薬の中にポリエチレングリコールを添加すると、試薬の測定感度が向上することが知られている（特開昭５８−４７２５６）が、ポリエチレングリコールと検体とが反応したり、ポリエチレングリコールと固定化担体粒子とが反応したりして測定の特異性が劣る欠点があった。また不溶性担体粒子を使用しない、一次元免疫拡散法においてポリビニルピロリドンを添加する技術がすでに公知（特開昭５８−５８４６８）であるが、この技術は、沈降輪が不鮮明な低分子の抗原に対して、ポリビニルピロリドンの添加により沈降輪を鮮明にするものであり、感度の向上効果については何ら言及していない。
　さらに、試薬の保存中における固定化担体粒子の沈降や凝集を防止するために、固定化担体粒子が分散された試薬に、予めポリビニルピロリドン等の安定化剤を溶解させることが知られていますが（特開昭５７−４４８５４号公報）、このように試薬の調製当初から液中にポリビニルピロリドンを溶存させても、固定化担体粒子にゆっくりとポリビニルピロリドンが作用し、やはり測定の特異性は経時的に損なわれていく問題が生じていました。
　［問題を解決するための手段］
　本発明者らは、上記目的を達成し得る免疫学的凝集反応試薬を得るため鋭意研究してきた結果、少なくとも、抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子、ポリビニルピロリドン及び緩衝液の３成分よりなる試薬であって、使用直前にポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製される場合には、臨床的な診断において特異性を損なわず、且つ感度が向上することを見出だし、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、少なくとも、抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子、ポリビニルピロリドン及び緩衝液の３成分よりなる試薬であって、使用直前にポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製されることを特徴とする免疫学的凝集反応試薬である。
　本発明の測定試薬は、抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子、ポリビニルピロリドン及び緩衝液を成分としている。該測定試薬は、上記各成分が、使用直前にポリビニルピロリドンが溶存する緩衝液に不溶性担体粒子が懸濁した状態に調製されるように、複数の液及び固形物で構成される。これらの複数の液及び固形物は、一定の操作手順に従って試薬の各構成部品と検体とを混合して使用する。即ち、試薬のうち、固形物部品がそれぞれ固定化担体粒子とポリビニルピロリドンに分離されている場合には、これらをそれぞれ液体部品である緩衝液に溶解及び懸濁させればよい。無論、その順番は特に限定されない。
　また、あらかじめ固定化担体粒子とポリビニルピロリドンとをドライ混合した後、緩衝液と混合することもできる。
　また、別の態様として、あらかじめポリビニルビロリドンを溶解した緩衝液と固定化担体粒子とに分離されている場合には、該緩衝液に固定化担体粒子を混合して使用すればよい。
　更に、固定化担体粒子を懸濁した緩衝液とポリビニルピロリドンとに分かれている場合には、該緩衝液にポリビニルピロリドンを溶解して使用すればよい。
　特に、固定化担体粒子を分散した液とポリビニルピロリドンを添加した緩衝液を調製し、使用直前に１液に混合して使用すれば、保存中の固定化担体粒子とポリビニルピロリドンの非特異的な反応が完全に防止できて好適である。
　本発明で使用するポリビニルピロリドンは、工業的に合成されている分子量１万から３６万程度のものが限定されずに使用できるが、ポリビニルピロリドンの粘度の指標であるフィケンチャーの粘度式におけるＫ価で２０以上のものは感度の向上効果が高く好適であり、Ｋ価で５０以上のものがさらに好適である。
　本発明において、ポリビニルピロリドンを固体のまま試薬の構成部品とすることもできるが、測定操作を簡便に行うために、あらかじめ緩衝液に溶解して使用する態様が好ましい。本発明において使用する緩衝液は種々の緩衝液が限定されずに使用できるが、リン酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液、などの緩衝液が好適に使用される。
　ポリビニルピロリドンの使用量は、感度が向上する効果と、固定化担体粒子が非特異的に凝集して特異性が低下する現象と、さらには試薬粘度が増加して攪拌が困難になる現象とを勘案して定めれば良いが、測定時の全液量に対するポリビニルピロリドンの濃度が０．０１〜５％の範囲にある場合が特に好適である。
　本発明において固定化担体粒子は抗原又は抗体を不溶性担体粒子に固定化して調製する。
　不溶性担体粒子としては、固定化、保存及び測定を行う時に用いられる液体媒体に実質的に不溶性の不溶性担体粒子であり、詳しくは後述するが平均粒子径１０μｍ程度以下の微粒子が好適に用いられる。
　これらの粒子としては、すでに抗原抗体反応に使用されるものが種々知られており、本発明においてもこれらの公知の微粒子が特に限定されず使用できる、特に好適に使用されるものを例示すると例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重体の様な乳化重合法により得られる有機高分子ラテックス粒子などの有機高分子物質の微粒子、あるいはシリカ、シリカ−アルミナ、アルミナの様な無機酸化物または該無機酸化物などにシランカップリング処理などの操作で官能基を導入した無機粒子さらにはヒトＯ型赤血球、ヒツジ赤血球などの生物由来の粒子などである。
　上記不溶性担体粒子の粒子径については、粒子径が大きい場合、凝集にともなう粒子径の変化量は大きいが凝集反応速度が遅く、粒子径が小さいとブラウン運動が活発で凝集反応速度は速いが一次粒子径が小さいために凝集反応にともなう粒子径の変化量が小さい。このために凝集反応に用いられる不溶性担体粒子の平均粒子径は１０μｍ程度以下、好ましくは０．０５〜５．０μｍの不溶性担体粒子が好適に用いられる。
　本発明において、不溶性担体粒子に固定化する抗原又は抗体としては、特に限定的でなく公知のものが使用できる。代表的なものを例示すれば、例えば、ヒトＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）・抗ＣＲＰ抗体、ストレプトリジンＯ・抗ストレプトリジンＯ抗体、変性ガンマグロブリン・リウマチ因子、アルブミン・抗アルブミン抗体、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）・抗ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ・抗ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ・抗ＩｇＭ抗体、補体第三成分（Ｃ３）・抗Ｃ３抗体、Ｃ４・抗Ｃ４抗体、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）・抗ＡＦＰ抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）・抗ＣＥＡ抗体、ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）・抗ｈＰＬ抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）・抗ｈＣＧ抗体、インシュリン・抗インシュリン抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）・抗ＨＢｓ抗体、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ・抗Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ抗体、梅毒トレポネマ抗原、風疹抗原、抗ロタウイルス抗体、抗アデノウイルス抗体、等の公知の抗原又は抗体をあげることができる。
　本発明において、不溶性担体粒子に抗原又は抗体を固定化する方法は、物理的吸着、化学的共有結合の形成のいずれでも良い。化学的共有結合の形成についてはすでに多くの方法が提案されており、固定化する抗体の特性に合わせ公知の方法から固定化方法を選択すれば良い。一般には分散媒中で抗体を必要に応じて架橋剤の存在下に不溶性担体粒子と混合すれば良い。架橋剤としてはグルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの公知のものが使用できる。
　不溶性担体粒子に抗原又は抗体を固定化する際の分散媒は特に限定的ではなく公知のものが使用されるが、上記の架橋剤を使用する場合には分散媒中の成分が架橋剤と反応しない分散媒を用いる必要がある。固定化する際の不溶性担体粒子の分散媒中の濃度は特に限定されるものではないが、一般には抗原又は抗体と混合した時点で０．０５重量％以上、好ましくは０．２〜２．０重量％となる様に選ぶのが好適である。抗原又は抗体の濃度も特に限定されるものではないが、一般には不溶性担体粒子と混合した時点で０．０００５重量％以上、好ましくは０．００２〜０．２重量％となる様に選ぶのが好適である。
　本発明において、固定化担体粒子を用いた免疫学的測定方法即ち、抗体固定化担体粒子上の抗原又は抗体と被検体中の対応する抗体又は抗原などとの間における抗原抗体反応に基づく凝集反応あるいは凝集阻止反応を観察する方法は、目視、光学的測定方法など公知の方法が特に限定されず使用できる。
　［作用及び効果］
　ポリビニルピロリドンの化学的特性として、種々の無機、有機化合物を吸着したり、錯体を形成し、例えばヨウ素や染料の溶解度を著しく増したり、ポリアクリル酸などの高分子電解質および蛋白質と相互作用をすることが知られている。
　本発明においては、不溶性担体粒子の表面に重合開始剤の切片などのアニオンが存在し、不溶性担体粒子が一種のポリアニオンと考えられる。また固定化した抗原又は抗体が存在しており、検体中の抗体又は抗原との間でポリビニルピロリドンが相互に作用して凝集反応の仲立ちとなっているものと考えられる。このため蛋白質間の距離が接近し、相互作用が起こり易くなり、抗原抗体の反応が促進され、測定感度が向上したものと考えられる。一方ヨウ素や染料の溶解度を著しく増すことから推察して固定化担体粒子の分散安定化にも寄与しているものと考えられる。
　［実施例］
　以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説明するが本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１〜３
（１）固定化担体粒子の調製
　膣カンジダ症の原因となる真菌のＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓに対する抗Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ抗体を常法に従いアフィニティー精製した後、精製抗体を１／６０モルのリン酸緩衝液（以下ＰＢと略す、ｐＨ６．３）で透析し、ＰＢを加え濃度０．２５ｍｇ／ｍｌの抗体液を調製した。実施例１として、平均粒子径０．７２８μｍのポリスチレンラテックス粒子（担体粒子）をＰＢで希釈し、ラテックス濃度が１重量％の分散液を調製し、上記抗体液に等容量添加し直ちに攪拌混合した。２時間静置後、ウシ血清アルブミン（凍結乾燥品）を０．１重量部加えさらに２時間静置した。次いで、遠心分離し、得られた沈渣（固定化担体粒子）に上記抗体液の２倍容量のＰＢを加えて懸濁（粒子濃度：約０．５重量％）し、抗Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓアフィニティー精製抗体を固定化した抗体固定化担体粒子の分散液すなわちカンジダ試薬を得た。
（２）凝集反応試験
　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ｃ−ａ−１１１（千葉大真核微生物センターより入手）を菌濃度１０８個／ｍｌに調製した抗原の原液をＰＢで希釈して１ｍｌ当たりの菌濃度が２５×１０５個、１２．５×１０５個、６．３×１０５個、３．２×１０５個、１．６×１０５個、０．８×１０５個、０．４×１０５個、０．２×１０５個、の抗原液を調製した。一方ポリビニルピロリドンＫ６０（分子量１６万）をＰＢに溶解して濃度を１０％に調製した液を原液として、ポリビニルピロリドンＫ６０の濃度が１０％、１．０％、０．１０％のＰＢ溶液を調製し、上記の抗原液とそれぞれ等量混合して、ポリビニルピロリドンＫ６０を５．０％、０．５０％、０．０５０％の濃度で含み、菌濃度が１２．５×１０５個から０．１×１０５個、の抗原希釈液を調製し、それぞれ実施例１、２、３とした。また、陰性像を評価するためポリビニルピロリドンＫ６０を５．０％、０．５０％、０．０５０％の濃度で含み、抗原を含まない液を調製した。（１）で得たカンジダ試薬をガラス平板上に１滴ずつ滴下し、各１滴のカンジダ試薬に上記Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓの抗原希釈液１滴を加え、爪楊枝で混合し、直ちに平沢制作所（株）製テーハー式攪拌機によりガラス平板を１分間に１２０回転の速度で２分間水平回転し攪拌した。攪拌後の凝集状態を肉眼で判定し、凝集が明らかに認められた抗原の抗原希釈液中の最小濃度をもってカンジダ試薬の抗原に対する感度として、結果を第１表に示した。
（３）特異性試験
　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ｃ−ａ−１１１にかえて、他の属の真菌６種（千葉大真核微生物センターより入手）、さらにカンジダ試薬を使用する際に検体中に存在する常在菌１４種（理化学研究所より入手）をそれぞれＰＢで希釈して１ｍｌ当たりの菌濃度が１００×１０５個となるように菌体液を調製した。感度試験と同様に凝集試験を行った。凝集状態を肉眼で判定し、凝集が認められない場合（−）、凝集の有無が判定しがたい場合（±）、明らかに凝集が認められた場合（＋）と判定して、上記２０種の内（＋）の発生した割合を第１表に示した。
比較例１〜７
　実施例１において、ポリビニルピロリドンＫ６０の希釈液を混合し、抗原希釈液として使用した代わりに抗原希釈液をＰＢのみとした場合を比較例１とした。ポリビニルピロリドンＫ６０の希釈液の代わりにポリエチレングリコール６０００の希釈液を混合して、ポリエチレングリコール６０００を５．０％、０．５０％、０．０５０％の濃度で含み、菌濃度が１２．５×１０５個から０．１×１０５個、の抗原希釈液を調製し、それぞれ比較例２、３、４とした。同様にデキストラン（分子量６〜９万）を５．０％、０．５０％、０．０５０％の濃度で含み、菌濃度が１２．５×１０５個から０．１×１０５個、の抗原希釈液を調製し、それぞれ比較例５、６、７とした。実施例１〜３と同様に感度試験及び特異性試験を行い、得られた結
果を第１表に示した。
　第１表に示したとおり、ポリビニルピロリドンＫ６０を添加した実施例１〜３は添加物を含まない比較例１に比べ、感度が２〜１６倍向上し、陰性像並びに特異性の低下が無く良好な試薬特性を示した。これに対して、ポリエチレングリコール６０００又はデキストランを添加した比較例２〜７は、添加濃度が低い場合には感度が向上したが陰性像及び特異性が実施例１〜３及び添加物を含むまない比較例１に比べ劣った。さらに添加量が増すと陰性像並びに陽性像ともに非特異的に凝集し測定が不能となった。
実施例４〜６
　実施例１のポリビニルピロリドンＫ６０に代えて、ポリビニルピロリドンＫ９０（分子量３６万）を測定時に２％となる様に抗原希釈液を調製した場合（実施例４）、ポリビニルピロリドンＫ２５（分子量２４５００）を測定時に４％となる様に抗原希釈液を調製した場合（実施例５）、ポリビニルピロリドンＫ１５（分子量１００００）を測定時に８％となる様に抗原希釈液を調製した場合（実施例６）につき、実施例１と同様に操作して感度及び特異性を評価した。結果を第２表に示した。
　第２表に示したとおり、実施例４及び実施例５では添加物を含まない比較例１に比べ、明らかに試薬感度が向上したが、Ｋ価が１５の実施例６
の場合は抗原濃度が３．２×１０５個／ｍｌの抗原濃度の検体に対し凝集を示す場合と凝集の有無が判定しがたい場合とがあり、わずかの感度の増加にとどまった。実施例４の添加濃度を４％に、実施例５の添加濃度を８％に各々増した場合は、試薬が粘稠となり試薬と検体とを強力に混合する必要があった。
実施例７と比較例８
　アルファフェトプロテイン（以下ＡＦＰ）に対する抗ＡＦＰ抗体を常法に従いアフィニティー精製した後、精製抗体を０．１モルの塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液（以下ＡＢと略す、ｐＨ８．２）で透析し、ＡＢを加え濃度０．２５ｍｇ／ｍｌの抗体液を調製した。平均粒子径０．２３２μｍのポリスチレンラテックス粒子（担体粒子）をＡＢで希釈し、ラテックス濃度が１重量％の分散液を調製し、上記抗体液に等容量添加し直ちに攪拌混合した。２時間静置後、ウシ血清アルブミン（凍結乾燥品）を０．１重量部加えさらに２時間静置した。次いで、遠心分離し、得られた沈渣（固定化担体粒子）に上記抗体液の４倍容量のＡＢを加えて懸濁（粒子濃度：約０．２５重量％）し、抗ＡＦＰアフィニティー精製抗体を固定化した抗体固定化担体粒子の分散液を得た。
　実施例７として、ＡＢにポリビニルピロリドンＫ６０を０．４％添加して血清希釈液を調製した。
　日立７０５０形生化学多項目自動分析機に上記の試薬を適応して以下の測定条件でＡＦＰを測定した。まず、血清２０μｌを光学セル中にサンプリングし、血清希釈液３００μｌを加え攪拌する。血清希釈液を加えて約５分後に、抗体固定化担体粒子の分散液１００μｌを加え攪拌する。抗体固定化担体粒子を加えて約１分後と５分後との間の約４分間における波長６００ｎｍの吸光度の変化量を自動的に計測した。
　実施例７の血清希釈液に代えて、血清希釈液がポリビニルピロリドンＫ６０を含まないＡＢのみの場合（比較例８）は、ＡＦＰ濃度が２０００ｎｇ／ｍｌの検体に対して上記吸光度変化量は０．０２１Ａｂｓ．であったが、実施例７の試薬は、同一検体に対し上記の吸光度変化量が０．１５２Ａｂｓ．と約７倍高感度を示した。なお、ＡＦＰ濃度が１０ｎｇ／ｍｌ以下の検体に対して、実施例７及び比較例８ともに上記の吸光度変化量は０．００１Ａｂｓ．以下であった。
比較例９，１０
　実施例１〜３の（１）固定化担体粒子の調製において、固定化担体粒子に抗体液の２倍容量のＰＢを加えて懸濁させる代わりに、抗体液の２倍容量の１０％ポリビニルピロリドンＫ６０（分子量１６万）ＰＢ溶液を加えて懸濁させる以外、同様に実施してポリビニルピロリドン含有カンジダ試薬を得た。そして、これを１０℃下で３ヶ月及び６ヶ月保存した。次いで、実施例１〜３の（２）凝集反応試験において、抗原液をＰＢのみで希釈した抗原希釈液を使用し、これを上記保存後のポリビニルピロリドン含有カンジダ試薬と混合する以外、同様に操作して凝集反応試験を実施した。さらに、Ｃａｎｄｉａ　ａｌｂｉｃａｎｓにかえて（３）特異性試験に用いたものと同様の他の菌体液を調製し、上記と同様に凝集反応試験を行って特異性試験を実施した。結果を第２表にそれぞれ示した。
　また、第２表には対照試験として、実施例１〜３の（１）固定化担体粒子の調製と同様にしてカンジダ試薬を調製後、１０℃下で３ヶ月及び６ヶ月保存し、次いで、これにポリビニルピロリドンＫ６０を２．５％になるように溶解させたポリビニルピロリドン含有カンジダ試薬を用い、ポリビニルピロリドンＫ６０を溶解させてから一日以内に、上記比較例と同様にして（２）凝集反応試験及び（３）特異性試験を実施した結果も併記した。
　第２表に示したとおり、カンジタ試薬をポリビニルピロリドンＫ６０が含有された状態で長期保存した比較例９，１０は、使用直前に該カンジタ試薬にポリビニルピロリドンＫ６０を含有させた対照試験に比較して、測定の特異性が大きく低下した。