(57)【要約】  本発明は、プロテインチロシンホスファターゼ（「ＰＴＰアーゼ」）阻害剤および癌を治療するための免疫療法におけるＴ細胞活性化剤とのそれらの併用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＴＰアーゼ阻害剤およびＴ細胞活性化剤を含有する、癌の治療のための治療組成物。
【請求項２】
前記癌が、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の治療組成物。
【請求項３】
前記ＰＴＰアーゼ阻害剤が、五価アンチモン化合物、イミダゾール、およびジアミジン化合物、それらの生物学的等価物、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の治療組成物。
【請求項４】
前記ＰＴＰアーゼ阻害剤が五価アンチモン化合物である、請求項３に記載の治療組成物。
【請求項５】
前記五価アンチモン化合物がスチボグルコン酸ナトリウムである、請求項４に記載の治療組成物。
【請求項６】
前記スチボグルコン酸ナトリウムが異なる化合物の混合物を含む、請求項５に記載の治療組成物。
【請求項７】
前記混合物を分別し、１またはそれ以上の分画を除去する、請求項６に記載の治療組成物。
【請求項８】
前記混合物を高速液体クロマトグラフィーによって分別する、請求項７に記載の治療組成物。
【請求項９】
前記Ｔ細胞活性化剤が腫瘍浸潤性マクロファージを誘導する、請求項１に記載の治療組成物。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞活性化剤が、ＩＬ−２およびその機能的変異体である、請求項９に記載の治療組成物。
【請求項１１】
ＰＴＰアーゼ阻害剤とＩＬ−２を含有する、ＩＬ−２の毒性を低下させるための治療組成物。
【請求項１２】
前記ＰＴＰアーゼ阻害剤が、五価アンチモン化合物、イミダゾール、およびジアミジン化合物、それらの生物学的等価物、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１１に記載の治療組成物。
【請求項１３】
前記ＰＴＰアーゼ阻害剤が五価アンチモン化合物である、請求項１２に記載の治療組成物。
【請求項１４】
前記五価アンチモン化合物がスチボグルコン酸ナトリウムである、請求項１３に記載の治療組成物。
【請求項１５】
前記スチボグルコン酸ナトリウムが異なる化合物の混合物を含む、請求項１４に記載の治療組成物。
【請求項１６】
前記混合物を分別し、１またはそれ以上の分画を除去する、請求項１５に記載の治療組成物。
【請求項１７】
前記混合物を高速液体クロマトグラフィーによって分別する、請求項１６に記載の治療組成物。
【請求項１８】
ａ）ＰＴＰアーゼ阻害剤を含む容器；および
ｂ）癌の治療における前記ＰＴＰアーゼ阻害剤とＴ細胞活性化剤の使用のための指示書
を含み、それらと共に包装されたキット。
【請求項１９】
有効量のＰＴＰアーゼ阻害剤およびＴ細胞活性化剤を患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項２０】
前記癌が、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＴＰアーゼ阻害剤が、五価アンチモン化合物、イミダゾール、およびジアミジン化合物、それらの生物学的等価物、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＴＰアーゼ阻害剤が五価アンチモン化合物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記五価アンチモン化合物がスチボグルコン酸ナトリウムである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記スチボグルコン酸ナトリウムが異なる化合物の混合物を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記混合物を分別し、１またはそれ以上の分画を除去する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記混合物を高速液体クロマトグラフィーによって分別する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞活性化剤が腫瘍浸潤性マクロファージを誘導する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞活性化剤が、ＩＬ−２およびその機能的変異体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１１に記載の組成物を被験者に投与することを含む、ＩＬ−２の毒性を低下させる方法。
【請求項３０】
前記ＰＴＰアーゼ阻害剤が、五価アンチモン化合物、イミダゾール、およびジアミジン化合物、それらの生物学的等価物、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＴＰアーゼ阻害剤が五価アンチモン化合物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記五価アンチモン化合物がスチボグルコン酸ナトリウムである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記スチボグルコン酸ナトリウムが異なる化合物の混合物を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記混合物を分別し、１またはそれ以上の分画を除去する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記混合物を高速液体クロマトグラフィーによって分別する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＰＴＰアーゼ阻害剤とＩＬ−２を連続的に投与する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
ＰＴＰアーゼ阻害剤とＩＬ−２を同時に投与する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１１に記載の組成物を被験者に投与することを含む、ＩＬ−２の治療効果を増強する方法。
【請求項３９】
ＩＬ−２治療を受けている被験者にＰＴＰアーゼ阻害剤を投与することを含む、ＩＬ−２の治療効果を増強する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示が参照してここに組み込まれる、２００４年１１月１１日出願の米国特許出願第１０／９８７，２１７号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、および疾患を治療するための、Ｔ細胞活性化剤と組み合わせたプロテインチロシンホスファターゼ阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明が関係する技術分野の水準を説明するために本出願全体を通じて括弧内で様々な公表文献または特許を参照する。これらの公表文献または特許の各々は参照してここに組み込まれる。
【０００４】
細胞内のタンパク質チロシンのリン酸化は、例えばサイトカインによって与えられるような細胞外刺激によって調節される。この調節は、細胞増殖、分化および機能的活性を制御するように働く。ＳＨＰ−１、ＰＴＢ１Ｂ、ＭＫＰ１、ＰＲＬ−１、ＰＲＬ−２およびＰＲＬ−３を含む文字通り数百のプロテインチロシンホスファターゼ（「ＰＴＰアーゼ」）が公知である。細胞内のタンパク質チロシンリン酸化を調節するシグナル伝達機構は、プロテインチロシンキナーゼ（「ＰＴＫ」）（タンパク質基質内のチロシン残基をリン酸化することを通してシグナル伝達カスケードを開始させる）とプロテインチロシンホスファターゼ（基質の脱リン酸化を通してシグナル伝達を終了させる）の相互作用に依存する。プロテインチロシンキナーゼまたはホスファターゼの活性を調節する化合物は、細胞内タンパク質チロシンリン酸化の平衡に影響を及ぼし、シグナル伝達を再指令することを通して細胞変化を誘導することができる。これは、ＰＴＫ阻害剤ＳＴＩ−５７１によるヒト慢性骨髄性白血病および消化管間質腫瘍の治療成功によって良好に例示される（Berman et al., Hum. Pathol. 32, 578 (2001); Druker, et al., N. Engl. J. Med. 344, 1031 (2001); Mauro et al., Curr. Opin. Oncol. 13, 3 (2001)）。ＳＴＩ−５７１は、前記疾患において鍵となる病原分子の役割を果たす異常活性化プロテインキナーゼであるｂｃｒ／ａｂｌまたはｃ−ｋｉｔを標的する。
【０００５】
急性骨髄性白血病（「ＡＭＬ」）は、様々な分化段階で停止し、最終分化することができない骨髄芽球細胞の蓄積によって特徴付けられる。形態学、細胞化学、免疫学的マーカーおよび細胞遺伝学に基づき、ＡＭＬはフランス−アメリカ−イギリス（ＦＡＢ）分類に従って異なるサブクラスに分類できる。ＡＭＬの大部分のサブクラスのための治療が満足し得るものではない。治療は通常、完全な血液学的寛解を誘導するための導入治療および残存疾患を根絶するための強化療法として投与される集中化学療法を含む。化学療法単独または自家幹細胞移植と組み合わせた強化療法は、比較的高い危険度の再発および５０％未満の長期的無病生存率に結びつく。同種移植による強化療法は、再発危険度はより低いが、より高い治療関連死亡率を有する（Lowenberg et al., N. Eng. J. Med. 341, 1051 (1999) (「Lowenberg」)。
【０００６】
ＡＭＬ治療における分化誘導療法の潜在的可能性が、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ、Ｍ３サブクラス）の治療における全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の最近の成功によって注目を集めている(Kogan et al., Oncogene 18, 5261 (1999) (「Kogan」))。ＡＴＲＡは、完全な寛解および７５％を超える高い長期的ＡＰＬ無再発生存率を誘導することが示された(Fenaux et al., Blood 94, 1192 (1999))。ＡＴＲＡのこの治療効果は、キメラタンパク質の分解と変化した転写調節を生じさせる、レチノイン酸受容体α（ＲＡＲ−α）の異常生成キメラタンパク質へのその結合を通してＡＰＬ細胞の末期分化を誘導する上でのその活性に由来する(Kogan)。ＲＡＲ−αのキメラタンパク質の生成はＡＰＬ細胞に限定されるので、ＡＴＲＡによる分化誘導療法は他のＡＭＬサブクラスの治療においては限られた恩恵を示した(Lowenberg)。ＡＴＲＡの治療使用は、重篤な全身毒性(Tallman et al., Blood 95, 90 (1999))およびＡＴＲＡ耐性の誘導によって損なわれる(Melnick et al., Blood 93, 3167 (1999))。それでもやはり、ＡＰＬ症例のサブグループにおけるＡＴＲＡの著明な成功は、ＡＭＬ治療における分化誘導療法の効果を示す証拠を提供し、他の分化誘導療法を特定するための多大の努力を促した。ヒ素誘導体およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む、いくつかの候補物質が最近報告された(He et al., Oncogene 18, 5278 (1999))。
【０００７】
いくつかの系列の証拠が、ＡＭＬ細胞分化はＰＴＫとＰＴＰアーゼの平衡によって調節される細胞タンパク質チロシンリン酸化によって影響されることを示唆した。ＨＬ−６０前骨髄球性白血病細胞の顆粒球成熟は、細胞タンパク質チロシンリン酸化の低下およびチロシンキナーゼとプロテインホスホチロシンホスファターゼの両方の活性上昇を生じさせることが示された（Frank et al., Cancer Res. 48 (1988))。造血プロテインチロシンホスファターゼ（ＨｅＰＴＰ）の増幅および過剰発現がＡＭＬ細胞および細胞系において認められており、異常ＡＭＬ細胞増殖および分化の停止に寄与すると考えられる(Zanke et al., Leukemia 8, 236 (1994))。造血細胞ホスファターゼＳＨＰ−１の関与は、ＨＬ−６０細胞分化の間のその発現上昇(Zhao et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA 91, 5007 (1994))およびＪ２Ｅ白血病細胞のＥｐｏ誘導性分化の阻害によって示された(Bittorf et al., Biol. Chem. 380, 1201 (1999))。興味深いことに、ＰＴＫ阻害剤ＳＴＩ−５７１は、単独では分化誘導活性を持たないが、ＡＰＬ細胞のＡＴＲＡ誘導性分化を増強することが示された(Berman et al., Rev. Infect Dis. 10, 560 (1988))。
【０００８】
ＰＲＬファミリーのチロシンホスファターゼ（例えばＰＲＬ−１、ＰＲＬ−２およびＰＲＬ−３）の過剰発現は、ヒト悪性疾患における潜在的病原の役割を果たす。ＰＲＬ−１（再生肝のホスファターゼ−１）は当初、肝再生の間に発現される遺伝子の１つとして特定された(Diamond, et al., MoI. Cell. Biol. 14, 3752 (1994)（「Diamond」）。ＰＲＬ−２およびＰＲＬ−３は、ＰＲＬ−１とのそれらの相同性に基づいて見出された(Montagna, et al., Hum. Genet. 96, 532 (1995); Zeng, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 244, 421 (1998) (「Zeng-1998」))。ＰＲＬは、少なくとも７５％のアミノ酸配列類似性で密接に関連するホスファターゼである(Zeng-1998)。健常成人組織では、ＰＲＬは主として骨格筋で発現され、脳（ＰＲＬ−１）、肝臓（ＰＲＬ−２）および心臓（ＰＲＬ−３）ではより低い発現レベルで検出可能である(Diamond; Zeng-1998)。増殖へのＰＲＬ−１の関与が再生肝におけるその発現上昇によって示唆されたが(Diamond)、ＰＲＬの生理的機能は現在のところ明らかではない。
【０００９】
分化上皮組織の維持における潜在的役割が、腎臓および肺（ＰＲＬ−１）(Kong, et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 279, G613 (2001)) 並びにマウス腸（ＰＲＬ−３）(Zeng, et al., J. Biol. Chem. 275, 21444 (2000))の末期分化細胞におけるそれらの選択的発現に基づいて提起された。遺伝子増幅または他の欠陥から生じるＰＲＬ−３の過剰発現は、最近の試験でヒト結腸直腸癌の腫瘍転移に結びつくことが認められた(Saha, et al., Science 294, 1343 (2001) (「Saha」))。他のヒト悪性疾患へのＰＲＬ−３過剰発現の潜在的関与は、ヒト８ｑ番染色体におけるＰＲＬ−３遺伝子の局在によって示唆され、この領域の過剰コピーが多くの異なる腫瘍型の進行期においてしばしば認められた(Saha)。癌におけるＰＲＬ過剰発現の腫瘍形成の役割と一致して、ＰＲＬ  ＰＴＰアーゼの異所性発現が細胞増殖を増強し、細胞形質転換を引き起こすおよび／または腫瘍増殖を促進することがヌードマウスにおいて認められた(Cates, et al., Cancer Lett. 110, 49 (1996); Diamond)。ＰＲＬ  ＰＴＰアーゼは、全てのホスファターゼを広く阻害する(Burke et al., Biopolymers 47, 225 (1998))、オルトバナジン酸ナトリウムによって阻害し得るが(Diamond, Matter, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 283, 1061 (2001))、ＰＲＬの臨床的に使用可能な阻害剤は報告されていない。ホスファターゼの腫瘍形成機構およびシグナル伝達事象／分子の調節は不明確なままである。
【００１０】
癌および免疫不全、Ｂ型肝炎および肝炎を含む他の疾患はしばしばサイトカインで治療される。腎細胞癌（ＲＣＣ）は、例えば、米国で毎年約３１，２００の新規症例が特定され、１２，０００名が死亡する悪性疾患である(Greenlee, R. T., M. B. Hill-Harmon, T. Murray, and M. Thun. 2001. Cancer statistics, 2001. Ca Cancer J Clin 51:15)。ＲＣＣ患者の大半が、化学療法および放射線治療を含む従来の治療に対して応答不良の進行した疾患を当初に有するか、または限局性癌の治療後に発現する(Mulders, P., R. Figlin, J. B. deKernion, R. Wiltrout, M. Linehan, D. Parkinson, W. deWolf, and A. Belldegrun. 1997. Renal cell carcinoma: recent progress andfuture directions. Cancer Res 57:5189)。これらの患者は、わずか８ヶ月の平均生存率および１０％未満の５年生存率を有する(Motzer, R. J., and P. Russo. 2000. Systemic therapy for renal cell carcinoma. J Urol 163:408)。サイトカインまたは免疫細胞を用いた抗腫瘍免疫の活性化に基づく免疫療法は、進行したＲＣＣの治療のための選択的な全身的アプローチとして検討されてきた(Rosenberg, S. A. 2001. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature 411:380)。意外にも、インターロイキン−２（ＩＬ−２）は末期ＲＣＣ患者において１０−２０％の応答を誘導することが示され、ＲＣＣ治療に関して承認された(Bleumer, l, E. Oosterwijk, P. De Mulder, and P. F. Mulders. 2003. Immunotherapy for renal cell carcinoma. Eur Urol 44:65)。
【００１１】
ｊａｎｕｓファミリーキナーゼ／シグナル伝達性転写因子（Ｊａｋ／Ｓｔａｔ）経路のシグナル伝達を誘導する(Stark et al., Harvey Lect. 93, 1 (1997)) いくつかのサイトカインが、多くの疾患における臨床使用のために承認されている(D. J. Vestal et al., Pharmacology of Interferons:Induced Protein Cell Activation and Antitumor Activity, In Cancer Chemotherapy Biotherapy (3rd ed. 2001) (「Vestal」)。インターフェロン（ＩＦＮ）は、臨床使用が承認された、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ経路でシグナル伝達するサイトカインの一例である(Vestal)。ＩＦＮ−αは、黒色腫を含むヒト悪性疾患を治療する上で有益なサイトカインの一例である(Borden et al., Semin. Cancer Biol. 10, 125 (2000))。しかし、ＩＦＮ−αの臨床効果は、しばしばサイトカインに対する癌細胞の抵抗性によって制限される。ＩＦＮ−αシグナル伝達分子を標的する薬剤は、抵抗性を克服するためにＩＦＮ−αの抗癌活性を増強させ得るが、これまでのところ報告されている薬剤はない。そして、広い意味で、癌細胞が抵抗性を発現する可能性があるサイトカインは、抵抗性に関与するシグナル伝達分子を標的する薬剤から恩恵を受けることができる。
【００１２】
ＩＬ−２は、Ｔリンパ球および多くの他の免疫細胞の活性化剤である(Rosenberg, S. A. 2000. Interleukin-2 and the development of immunotherapy for the treatment of patients with cancer. Cancer J Sci Am 2000-.S2)。ＩＬ−２は、細胞表面上のその受容体に結合して、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）によるＩＬ−２シグナル伝達分子の脱リン酸化を含むいくつかの機構によって下方調節される細胞内シグナル伝達カスケードの引き金を引く(Rosenberg, S. A. 2000. Interleukin-2 and the development of immunotherapy for the treatment of patients with cancer. Cancer J Sci Am 2000:S2; Ellery, J. M., S. J. Kempshall, and P. J. Nicholls. 2000. Activation of the interleukin 2 receptor: a possible role for tyrosine phosphatases. Cell Signal 12:367)。ＩＬ−２によって媒介される生物学的作用は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）およびＢ細胞の増殖とクローン拡大を含む(Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4th Ed., Saunders 2000, p. 255)。ＩＬ−２は末梢白血球におけるＩＦＮ−γの合成を刺激し、同時に殺腫瘍性サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子の分泌を誘導する。ＩＬ−２治療は、従来の治療に対して不応性の多くの癌に対して有効であることが示されたが、その用量関連毒性により臨床的有用性は限定されている。高用量のＩＬ−２治療は血管漏出、ショック、肺水腫および全身性低血圧に結びつく。それ故、ＩＬ−２毒性を低下させ、その治療効果を増強することが極めて望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、プロテインチロシンホスファターゼ（「ＰＴＰアーゼ」）阻害剤、および癌を治療するためのＴ細胞活性化剤と組み合わせたＰＴＰアーゼ阻害剤の使用に関する。治療し得る被験者は、ヒトを含む哺乳動物、哺乳動物を含む動物を包含するが、これらに限定されない。強力なＰＴＰアーゼ阻害剤として特定された化合物のクラスは、五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物およびジアミジン化合物を含むが、これらに限定されない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の１つの実施形態は、ＰＴＰアーゼ阻害剤とＴ細胞活性化剤を含有する、癌を治療するための治療組成物を提供する。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物から選択される。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。Ｔ細胞活性化剤は、直接または間接的に、Ｔ細胞に、腫瘍浸潤性マクロファージの誘導を含むそれらのエフェクター機能を実施させる上で有効な何らかの作用物質である。Ｔ細胞活性化剤およびＴ細胞エフェクター機能は当分野において周知であり、Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4th Ed. 2000, and in Janeway et al., Immunobiology, 5th Ed., 2001に述べられている。Ｔ細胞活性化剤は、タンパク質、ペプチド、あるいは有機または無機分子であり得る。例えばビスホスホネートおよびリン抗原（phosphoantigens）が強力なＴ細胞活性化剤であることは当分野において周知である。Ｔ細胞活性化剤がタンパク質またはペプチドである場合、本発明はその機能的変異体を包含する。ここで使用する、ペプチドＴ細胞活性化剤の「機能的変異体」または「変異体」は、親タンパク質またはペプチドＴ細胞活性化剤の免疫刺激作用を保持しながら、Ｔ細胞活性化剤ペプチドの一次アミノ酸配列に対する１またはそれ以上の修飾を含むペプチドである。Ｔ細胞活性化剤ペプチドの機能的変異体がアミノ酸置換を含む場合は、典型的には保存的アミノ酸置換、すなわちもとのアミノ酸の性質、例えば電荷、疎水性、立体配座等を保持する置換が好ましい。アミノ酸の保存的置換の例は、以下の群内のアミノ酸の間で起こる置換を含む：（１）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（２）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（３）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（４）Ａ、Ｇ；（５）Ｓ，Ｔ；（６）Ｑ、Ｎ；および（７）Ｅ、Ｄ。変異体ペプチドＴ細胞活性化剤によるＴ細胞の刺激は、その変異体ペプチドが機能的変異体であることを示す。１つの実施形態では、Ｔ細胞活性化剤はＩＬ−２およびその機能的変異体である。
【００１５】
本発明のもう１つの実施形態は、スチボグルコン酸ナトリウムまたはその生物学的等価物およびＴ細胞活性化剤を含有する、癌を治療するための治療組成物を提供する。スチボグルコン酸ナトリウムは、さらに種々の分子量の分画に分離してもよく、一部の分画は廃棄しうる。
【００１６】
本発明のもう１つの実施形態は、ＰＴＰアーゼ阻害剤とＩＬ−２またはその機能的変異体を含有する、癌を治療するための治療組成物を提供する。ＩＬ−２と組み合わせたＰＴＰアーゼ阻害剤の使用は、意外かつ予想外にも、ＩＬ−２の有効性を増強するだけでなく、その毒性を有意に低下させることが発見された。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物から選択され得る。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。
【００１７】
本発明のもう１つの実施形態は、スチボグルコン酸ナトリウムまたはその生物学的等価物およびＩＬ−２を含有する、癌を治療するための治療組成物を提供する。
【００１８】
本発明のもう１つの実施形態は、分別された化合物を含有する、先の実施形態で述べた条件下で癌を治療するための治療組成物を提供する。治療組成物として使用する化合物が異なる化合物の混合物を含むときは、混合物を分別してもよく、１またはそれ以上の分画を除去し得る。１またはそれ以上の分画を、その後、治療組成物を調製するために使用し得る。
【００１９】
本発明のもう１つの実施形態は、ＰＴＰアーゼ阻害剤とＩＬ−２を含有する、ＩＬ−２の毒性を低下させるための組成物を提供する。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、以下のクラス：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物の１つから選択し得る。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。１つの実施形態では、ＰＴＰアーゼ阻害剤はスチボグルコン酸ナトリウムまたはその生物学的等価物である。もう１つの実施形態では、ＰＴＰアーゼ阻害剤はスチボグルコン酸ナトリウムの１またはそれ以上の分画である。
【００２０】
本発明のもう１つの実施形態は、ＰＴＰアーゼ阻害剤を含む容器；および癌の治療のための先に述べたＰＴＰアーゼ阻害剤とＴ細胞活性化剤の使用のための指示書を含むキットを提供する。１つの実施形態では、ＰＴＰアーゼ阻害剤はスチボグルコン酸ナトリウムであり、Ｔ細胞活性化剤はＩＬ−２である。
【００２１】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のＰＴＰアーゼ阻害剤およびＴ細胞活性化剤を被験者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物から選択される。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。１つの実施形態では、ＰＴＰアーゼ阻害剤はスチボグルコン酸ナトリウムである。Ｔ細胞活性化剤は、直接または間接的に、Ｔ細胞に、腫瘍浸潤性マクロファージの誘導を含むそれらのエフェクター機能を実施させる上で有効な何らかの作用物質である。１つの実施形態では、Ｔ細胞活性化剤はＩＬ−２およびその機能的変異体である。
【００２２】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のＰＴＰアーゼ阻害剤とＩＬ−２を被験者に投与することを含む、ＩＬ−２の毒性を低下させる方法を提供する。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物から選択される。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。１つの実施形態では、ＰＴＰアーゼ阻害剤はスチボグルコン酸ナトリウムである。１つの実施形態では、前記方法は、ＰＴＰアーゼ阻害剤とＩＬ−２を連続的に投与することを含む。もう１つの実施形態では、ＰＴＰアーゼ阻害剤とＩＬ−２は同時に投与される。
【００２３】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のＰＴＰアーゼ阻害剤とＩＬ−２を被験者に投与することを含む、ＩＬ−２の治療効果を増強する方法を提供する。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物から選択される。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。１つの実施形態では、ＰＴＰアーゼ阻害剤はスチボグルコン酸ナトリウムである。１つの実施形態では、前記方法は、ＰＴＰアーゼ阻害剤とＩＬ−２を連続的に投与することを含む。もう１つの実施形態では、ＰＴＰアーゼ阻害剤とＩＬ−２を同時に投与する。
【００２４】
本発明のもう１つの実施形態は、ＩＬ−２治療を受けている被験者にＰＴＰアーゼ阻害剤を投与することを含む、ＩＬ−２の治療効果を増強する方法を提供する。
【００２５】
本発明のもう１つの実施形態は、１またはそれ以上の投与化合物を分別することを含む、前記方法の実施形態で述べた条件下で疾患を治療するための方法を提供する。方法において使用する化合物が異なる化合物の混合物を含むときは、混合物を分別してもよく、１またはそれ以上の分画を除去し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
ここで使用するとき、以下の略語は以下の意味を有する：
【００２７】
「ＡＭＬ」は、ここでは急性骨髄性白血病を意味するために使用される；
【００２８】
「ＡＴＲＡ」は、ここでは全トランスレチノイン酸を意味するために使用される；
【００２９】
「ＧＭ−ＣＳＦ」は、ここでは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子を意味するために使用される；
【００３０】
「ＩＦＮ−α」または「ＩＦＮα」は、ここではインターフェロン−アルファを意味するために使用される；
【００３１】
「ＩＦＮ−β」または「ＩＦＮβ」は、ここではインターフェロン−ベータを意味するために使用される；
【００３２】
「ＩＦＮ−γ」または「ＩＦＮγ」は、ここではインターフェロン−ガンマを意味するために使用される；
【００３３】
「ＩＬ−２」は、ここではインターロイキン−２を意味するために使用される；
【００３４】
「ＩＬ−３」は、ここではインターロイキン−３を意味するために使用される；
【００３５】
「Ｊａｋ２」は、ここではｊａｎｕｓファミリーキナーゼ２を意味するために使用される；
【００３６】
「Ｍψ」は、ここではマクロファージを意味するために使用される；
【００３７】
「ＮＢＴ」は、ここではニトロブルーテトラゾリウムを意味するために使用される；
【００３８】
「ＰＴＰアーゼ」は、ここではプロテインチロシンホスファターゼを意味するために使用される；
【００３９】
「ＰＴＫ」は、ここではプロテインチロシンキナーゼを意味するために使用される；
【００４０】
「ＲＣＣ」は、ここでは腎細胞癌を意味するために使用される；
【００４１】
「ＳＨ２」は、ここではＳｒｃ−相同２ドメインを意味するために使用される；
【００４２】
「ＳＨＰ−１」は、ここではＳｒｃ−相同プロテインチロシンホスファターゼを意味するために使用される；
【００４３】
「Ｓｔａｔ１」は、ここではシグナル伝達性転写因子１を意味するために使用される；
【００４４】
「Ｓｔａｔ５」は、ここではシグナル伝達性転写因子５を意味するために使用される；
【００４５】
「ＳＳ」および「ＳＳＧ」は、ここではスチボグルコン酸ナトリウムを意味するために使用される；
【００４６】
「Ｔ細胞活性化剤」は、ここでは腫瘍浸潤性マクロファージの活性化を含む、ここで開示するＴ細胞のエフェクター機能を惹起する上で有効な物質、分子または組成物を意味するために使用される。
【００４７】
ＰＴＰアーゼ活性を阻害する上で有用な組成物および方法をここで開示する。本発明者は、意外かつ予想外にも、リーシュマニア症の治療において有効な薬剤が、異常活性プロテインチロシンホスファターゼに関連する、またはさもなければプロテインチロシンホスファターゼ活性を含む疾患、例えば癌の治療において有効である強力なプロテインチロシンホスファターゼ阻害剤であることを発見した。治療される患者は、ヒトを含む哺乳動物、哺乳動物を含む動物を包含し得るが、これらに限定されない。リーシュマニア症薬という用語は、ここでは「リーシュマニア症の治療において有効な化合物」という語句と交換可能に使用される。リーシュマニア症を治療する上で有効な薬剤のクラスは、五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物およびジアミジン化合物を含むが、これらに限定されない。さらに、リーシュマニア症薬ではない五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物およびジアミジン化合物は、ＰＴＰアーゼ活性を阻害する上で有用であり得る。リーシュマニア症を治療する上で有効な薬剤の総説は、Steck, Prog. Drug Res. 18, 289 (1974)に認められる。リーシュマニア症を治療する上で有効なリーシュマニア症薬または化合物という用語は、当業者には理解されるように、現在リーシュマニア症を治療するために臨床的および／または実験的に使用される薬剤および化合物を包含することが意図されている。リーシュマニア症を治療する上で有効な薬剤の一部の詳細な例は、以下の化合物を含むが、これらに限定されない：アロプリノール（例えばＧｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ／Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  ＫｌｉｎｅからのＺｙｌｏｒｉｃ（登録商標）、ＳａｖａｌからのＴａｌｏｌ（登録商標）、Ｚｙｌｏｐｒｉｍ（登録商標））、アミノシジン（例えばＧａｂｂｒｉｏｍｙｃｉｎ（登録商標））、アンホテリシン／アンホテリシンＢ（例えばＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）、Ａｍｐｈｏｃｉｎ（登録商標）、Ａｍｐｈｏｃｉｌ（登録商標）、Ａｂｅｌｃｅｔ（登録商標））、インターフェロン（例えばＡｃｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標））、イトラコナゾール、ケトコナゾール（例えばＮｉｚｏｒａｌ（登録商標））、レバミゾール（例えばＥｒｇａｍｉｓｏｌ（登録商標））、アンチモン酸メグルミンまたはグルカンタイム（例えばＧｌｕｃａｎｔｉｍｅ（登録商標）、Ｇｌｕｃａｎｔｉｍ（登録商標））、ミルテフォシン（アルキルリン脂質）、パロモマイシン（アミノシジン）（例えばＨｕｍａｔｉｎ（登録商標））、イセチオン酸ペンタミジン（例えばＮｅｂｕＰｅｎｔ（登録商標）、Ｐｅｎｔａｃａｒｉｎａｔ（登録商標）、Ｐｅｎｔａｍ（登録商標））、ペンタミジン（例えばＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ，Ｍａｙ＆ＢａｋｅｒからのＬｏｍｉｄｉｎｅ（登録商標））、シタマキン／ＷＲ６０２６（８−アミノキノリン）、およびスチボグルコン酸ナトリウム（例えばＧｌａｘｏ  ＷｅｌｌｃｏｍｅからのＰｅｎｔｏｓｔａｍ（登録商標））。上記リストからのいずれかの化合物の脱落は、そのような薬剤をリーシュマニア症薬の範囲内に含まないことを意図すると解釈されるべきではない。リーシュマニア症薬という用語はまた、まだリーシュマニア症を治療する上で有効と認められていないが、将来有効と認められる可能性のある薬剤および化合物を包含することが意図されている。
【００４８】
ここで述べる組成物および方法は、将来リーシュマニア症を治療する上で有効であることが認められる可能性のある薬剤、薬剤のクラス、およびそれらの生物学的等価物を含むことが意図されており、それらを包含する。さらにここで述べる組成物および方法は、リーシュマニア症を治療する上で有効と特定された薬剤から将来誘導または開発される可能性のある薬剤、薬剤のクラス、およびそれらの生物学的等価物を含むことが意図されており、それらを包含する。リーシュマニア症を治療する上で有効な薬剤は、細胞内プロテインチロシンリン酸化の平衡に影響を及ぼし、シグナル伝達を再指令することによって細胞変化を誘導することが認められた。リーシュマニア症を治療する上で有効な薬剤が強力なＰＴＰアーゼ阻害剤であるという発見に基づいて予測されたが、本発明はリーシュマニア症を治療する上で有効な化合物に限定されず、特定されるクラス（例えば五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物およびジアミジン化合物）内の他の化合物を含むことが意図されている。
【００４９】
五価アンチモン化合物は、例えばアンチモン酸メグルミン（グルカンタイム）、アンチモンデキストラングルコシド、アンチモンマンナン、エチルスチバミン、尿素スチバミン、およびスチボグルコン酸ナトリウムを含むが、これらに限定されない。五価アンチモン化合物は強力なＰＴＰアーゼ阻害剤であることが認められた。五価アンチモン化合物はＳｂ（Ｖ）を含む。例として、スチボグルコン酸ナトリウムはＳｂ（Ｖ）とグルコン酸の複合体であり、アンチモン酸メグルミンはＳｂ（Ｖ）とｎ−メチル−Ｄ−グルカミンの複合体である。スチボグルコン酸ナトリウムおよびアンチモン酸メグルミンの構造は、これらの組成物がしばしばポリマーとして存在することから、確実には決定されていない。スチボグルコン酸ナトリウムおよびアンチモン酸メグルミンの仮説上の構造をそれぞれ図１Ａおよび１Ｂに示す。スチボグルコン酸ナトリウムは、マクロファージ内に存在する原生動物寄生虫によって引き起こされる疾患、リーシュマニア症の治療において数十年間にわたって使用されてきた。その薬理的機構はよく理解されていないが、この薬剤の治療作用は細胞標的によって媒介され得るという示唆が存在する：細胞内リーシュマニアを死滅させるが、サシチョウバエの腸内に存在し、インビトロで規定培地において増殖できる浮遊型（プロマスティゴート）の原生動物には作用を及ぼさない。スチボグルコン酸ナトリウムはまた、アンチモングルコン酸ナトリウム、Ｓｔｉｂａｎａｔｅ、Ｄｉｂａｎａｔｅ、Ｓｔｉｈｅｋ、Ｓｏｌｕｓｔｉｂｏｓｔａｍ、ＳｏｌｙｕｓｕｒｍｉｎおよびＰｅｎｔｏｓｔａｍ（登録商標）としても知られる。スチボグルコン酸ナトリウムの合成のための方法は当業者に公知である。
【００５０】
イミダゾールおよびジアミジン化合物も強力なＰＴＰアーゼ阻害剤であることが発見された。より詳細には、イミダゾールおよびジアミジン化合物であるレバミゾール、ケトコナゾールおよびペンタミジンが強力なＰＴＰアーゼ阻害剤であると認められたが、これらのクラス内の他の化合物も有用であると考えられる。レバミゾール、ケトコナゾールおよびペンタミジンは、これまでにリーシュマニア症に対して有効と特定された公知構造の有機化合物である。ケトコナゾール、レバミゾールおよびペンタミジンの構造をそれぞれ図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示す。
【００５１】
本発明の１つの実施形態は、抗癌剤を含む、癌を治療するための治療組成物を提供する。抗癌剤は癌の治療において有効な薬剤である。抗癌剤は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物から選択され得る。抗癌剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。治療組成物の五価アンチモン化合物は、スチボグルコン酸ナトリウム、アンチモン酸メグルミンおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。治療組成物のイミダゾール化合物は、ケトコナゾール、レバミゾールおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。ジアミン化合物は、ペンタアミジンおよび生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。抗癌剤はＰＴＰアーゼ阻害剤であり得る。治療される癌は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌であり得るが、これらに限定されない。前記治療組成物は、複数の癌を有する患者を治療するために使用し得る。
【００５２】
本発明のもう１つの実施形態は、リーシュマニア症薬を含有する、癌を治療するための治療組成物を提供する。リーシュマニア症薬という用語は、現在リーシュマニア症を治療するために臨床的および／または実験的に使用される薬剤および化合物を包含することが意図されている。リーシュマニア症薬という用語はまた、まだリーシュマニア症を治療する上で有効と認められていないが、将来有効と認められる可能性のある薬剤および化合物を包含することが意図されている。リーシュマニア症薬は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物であり得るが、これらに限定されない。リーシュマニア症薬の例は、アロプリノール、アミノシジン、アンホテリシン／アンホテリシンＢ、インターフェロン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、レバミゾール、アンチモン酸メグルミン、ミルテフォシン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ペンタミジン、シタマキン／ＷＲ６０２６、スチボグルコン酸ナトリウム、およびそれらの化合物の生物学的等価物を含むが、これらに限定されない。治療される癌は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌であり得るが、これらに限定されない。前記治療組成物は、複数の癌を有する患者を治療するために使用し得る。治療組成物は、リーシュマニア症薬の混合物または組合せを含み得る。
【００５３】
本発明のもう１つの実施形態は、スチボグルコン酸ナトリウムまたはその生物学的等価物を含有する、癌を治療するための治療組成物を提供する。治療される癌は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌であり得るが、これらに限定されない。前記治療組成物は、複数の癌を有する患者を治療するために使用し得る。
【００５４】
本発明のもう１つの実施形態は、サイトカインとＰＴＰアーゼ阻害剤を含有する、サイトカイン治療に応答性の疾患を治療するための治療組成物を提供する。感染症、ＰＴＰアーゼ活性に関連する疾患、免疫不全、癌、感染、ウイルス感染、多発性硬化症、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含むがこれらに限定されない多くの疾患がサイトカインで治療される。サイトカインと共にＰＴＰアーゼ阻害剤を使用することは、意外かつ予想外にもサイトカインの有効性を改善することが発見された。ＰＴＰアーゼは、同時投与したサイトカインの働きに緩衝し、それらを無効にし得る。同時投与したサイトカインの働きを妨げているＰＴＰアーゼを阻害することにより、サイトカインの活性を増強し得る。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物から選択され得る。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。治療組成物の五価アンチモン化合物は、スチボグルコン酸ナトリウム、アンチモン酸メグルミンおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。治療組成物のイミダゾール化合物は、ケトコナゾール、レバミゾールおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。ジアミン化合物は、ペンタアミジンおよび生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。前記治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。サイトカインの例は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γおよび顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明のもう１つの実施形態は、サイトカインとリーシュマニア症薬を含有する、サイトカイン治療に応答性の疾患を治療するための治療組成物を提供する。感染症、ＰＴＰアーゼ活性に関連する疾患、免疫不全、癌、感染、ウイルス感染、多発性硬化症、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含むがこれらに限定されない多くの疾患がサイトカインで治療される。リーシュマニア症薬は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物であり得るが、これらに限定されない。リーシュマニア症薬は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物の生物学的等価物であり得る。リーシュマニア症薬の例は、アロプリノール、アミノシジン、アンホテリシン／アンホテリシンＢ、インターフェロン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、レバミゾール、アンチモン酸メグルミン、ミルテフォシン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ペンタミジン、シタマキン／ＷＲ６０２６、スチボグルコン酸ナトリウム、およびそれらの化合物の生物学的等価物を含むが、これらに限定されない。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。サイトカインの例は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γおよび顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明のもう１つの実施形態は、スチボグルコン酸ナトリウムまたはその生物学的等価物とサイトカインを含有する、サイトカイン治療に応答性の疾患を治療するための治療組成物を提供する。治療される疾患は、感染症、ＰＴＰアーゼ活性に関連する疾患、免疫不全、癌、感染、ウイルス感染、多発性硬化症、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含み得るが、これらに限定されない。前記治療組成物は、複数の疾患を有する患者を治療するために使用し得る。使用されるサイトカインの種類は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γおよび顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子であり得るが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量の抗癌剤を患者に投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。抗癌剤は、以下のクラス：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物の１つから選択される。抗癌剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。抗癌剤は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。治療組成物の五価アンチモン化合物は、スチボグルコン酸ナトリウム、アンチモン酸メグルミンおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。治療組成物のイミダゾール化合物は、ケトコナゾール、レバミゾールおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。ジアミン化合物は、ペンタアミジンおよび生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。抗癌剤はＰＴＰアーゼ阻害剤であり得る。治療される癌は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌であり得るが、これらに限定されない。前記方法は、複数の癌を有する患者を治療するために使用し得る。
【００５８】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のリーシュマニア症薬を患者に投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。リーシュマニア症薬は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物であり得るが、これらに限定されない。リーシュマニア症薬の例は、アロプリノール、アミノシジン、アンホテリシン／アンホテリシンＢ、インターフェロン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、レバミゾール、アンチモン酸メグルミン、ミルテフォシン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ペンタミジン、シタマキン／ＷＲ６０２６、スチボグルコン酸ナトリウム、およびそれらの化合物の生物学的等価物を含むが、これらに限定されない。治療される癌は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌であり得るが、これらに限定されない。前記治療組成物は、複数の癌を有する患者を治療するために使用し得る。治療組成物は、リーシュマニア症薬の混合物または組合せを含み得る。
【００５９】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のスチボグルコン酸ナトリウムまたはその生物学的等価物を患者に投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。治療される癌は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌であり得るが、これらに限定されない。前記方法は、複数の癌を有する患者を治療するために使用し得る。
【００６０】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のサイトカインとＰＴＰアーゼ阻害剤を患者に投与することを含む、サイトカイン治療に応答性の疾患を治療するための方法を提供する。感染症、ＰＴＰアーゼ活性に関連する疾患、免疫不全、癌、感染、ウイルス感染、多発性硬化症、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含むがこれらに限定されない疾患が、この方法を用いて治療され得る。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物から選択される。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。治療組成物の五価アンチモン化合物は、スチボグルコン酸ナトリウム、アンチモン酸メグルミンおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。治療組成物のイミダゾール化合物は、ケトコナゾール、レバミゾールおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。ジアミン化合物は、ペンタアミジンおよび生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。サイトカインの例は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γおよび顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のサイトカインとリーシュマニア症薬を患者に投与することを含む、サイトカイン治療に応答性の疾患を治療するための方法を提供する。感染症、ＰＴＰアーゼ活性に関連する疾患、免疫不全、癌、感染、ウイルス感染、多発性硬化症、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含むがこれらに限定されない疾患が、この方法を用いて治療され得る。リーシュマニア症薬は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物から選択し得る。リーシュマニア症薬は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。この方法による使用に適するリーシュマニア症薬の例は、アロプリノール、アミノシジン、アンホテリシン／アンホテリシンＢ、インターフェロン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、レバミゾール、アンチモン酸メグルミン、ミルテフォシン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ペンタミジン、シタマキン／ＷＲ６０２６、スチボグルコン酸ナトリウム、およびそれらの化合物の生物学的等価物を含むが、これらに限定されない。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。サイトカインの例は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γおよび顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のスチボグルコン酸ナトリウムまたはその生物学的等価物およびサイトカインを患者に投与することを含む、サイトカイン治療に応答性の疾患を治療するための方法を提供する。この方法によって治療される疾患は、感染症、ＰＴＰアーゼ活性に関連する疾患、免疫不全、癌、感染、ウイルス感染、多発性硬化症、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含み得るが、これらに限定されない。前記方法は、複数の疾患を有する患者を治療するために使用し得る。使用されるサイトカインの種類は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γおよび顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子であり得るが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明の１つの実施形態は、化合物の混合物を含有する化合物を分別することに関する。上記実施形態のいずれかにおいて、方法の一部として提供されるまたは使用される化合物が化合物の混合物を含有する場合、その混合物を分別し、１またはそれ以上の分画を除去し得る。化合物の混合物中に存在する化合物は、異なる分子量の化合物（例えばポリマー）、配座異性体、鏡像異性体、異性体、類似体、誘導体、未反応前駆体、副産物、中間体または分解産物を含み得る。一例として、スチボグルコン酸ナトリウムは、１００〜４，０００ａｍｕの範囲の分子量を有する多数の種のポリマーとして存在する。クロマトグラフィーまたは別の適切な方法によるスチボグルコン酸ナトリウムの親混合物の分別は、種々のＰＴＰアーゼ阻害活性を有する分画を提供する。比較的低いＰＴＰアーゼ阻害活性を有するまたはＰＴＰアーゼ阻害活性を持たない分画の除去は、溶液全体のＰＴＰアーゼ阻害活性を上昇させ得る。さらに、最終混合物中により少ない分子種が存在するとき、分解あるいは親化合物内の他の生成物または成分に関連する毒性を低下させ得る。
【００６４】
本発明のもう１つの実施形態は、疾患細胞をＰＲＬホスファターゼの存在または突然変異に関してスクリーニングすることを含む、基質脱リン酸化に依存する疾患を治療するための方法を提供する。一部の場合、単にある種のホスファターゼが疾患細胞内に存在することを判定するだけでは有効なホスファターゼ阻害剤を選択するのに十分な情報が与えられないことがある。例えばホスファターゼが突然変異した場合、同じ種の非突然変異ホスファターゼに対して非常に有効であった特定ホスファターゼ阻害剤に対する抵抗性が突然変異ホスファターゼに付与され得る。例えばシステインがＰＲＬ−１の８６位のアルギニンを置換する場合、その酵素はスチボグルコン酸ナトリウムによる阻害に対する抵抗性が有意に低い。抵抗性を付与された突然変異ホスファターゼが疾患細胞内に存在する場合、その突然変異の知識はその疾患を治療する上で重要であると考えられる。それ故、本発明の実施形態は、突然変異したＰＲＬホスファターゼが疾患細胞内に存在するかどうかを判定するためのスクリーニング方法を提供する。１つの工程は、疾患細胞がＰＲＬホスファターゼを含むかどうかを判定するために疾患細胞の試料をスクリーニングすることを含む。もう１つの工程は、ＰＲＬホスファターゼ阻害剤に対する抵抗性を付与する突然変異に関してＰＲＬホスファターゼをスクリーニングすることを含む。もう１つの工程は、細胞内認められるＰＲＬホスファターゼに対する治療有効量の阻害剤を患者に投与することを含む。ＰＲＬホスファターゼが突然変異していることが認められる場合、その疾患に抗するために選択されるＰＲＬホスファターゼ阻害剤は、非突然変異ＰＲＬホスファターゼのために使用されるＰＲＬホスファターゼ阻害剤とは異なり得る。これらの工程はいかなる順序でも実施し得る。この実施形態の方法を実施するための器具を含むキットが提供され得る。キット器具は、試料がＰＲＬホスファターゼを含むかどうかを当業者に公知の方法によって判定し得る。キット器具は、ＰＲＬホスファターゼが１またはそれ以上の突然変異を含むかどうかを当業者に公知の方法によって判定し得る。
【００６５】
本発明のもう１つの実施形態は、ＰＴＰアーゼ阻害剤とＴ細胞活性化剤を含有する、癌を治療するための治療組成物を提供する。Ｔ細胞活性化剤は、直接または間接的に、Ｔ細胞に、腫瘍浸潤性マクロファージの誘導を含むそれらのエフェクター機能を実施させる上で有効な何らかの作用物質である。Ｔ細胞活性化剤およびＴ細胞エフェクター機能は当分野において周知であり、Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4th Ed. 2000, and in Janeway et al., Immunobiology, 5th Ed., 2001に述べられている。Ｔ細胞活性化剤は、タンパク質、ペプチド、あるいは有機または無機分子であり得る。例えばビスホスホネートおよびリン抗原が強力なＴ細胞活性化剤であることは当分野において周知である。Ｔ細胞活性化剤がタンパク質またはペプチドである場合、本発明はその機能的変異体を包含する。ここで使用する、ペプチドＴ細胞活性化剤の「機能的変異体」または「変異体」は、親タンパク質またはペプチドＴ細胞活性化剤の免疫刺激作用を保持しながら、Ｔ細胞活性化剤ペプチドの一次アミノ酸配列に対する１またはそれ以上の修飾を含むペプチドである。Ｔ細胞活性化剤ペプチドの機能的変異体がアミノ酸置換を含む場合は、典型的には保存的アミノ酸置換、すなわちもとのアミノ酸の性質、例えば電荷、疎水性、立体配座等を保持する置換が好ましい。アミノ酸の保存的置換の例は、以下の群内のアミノ酸の間で起こる置換を含む：（１）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（２）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（３）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（４）Ａ、Ｇ；（５）Ｓ，Ｔ；（６）Ｑ、Ｎ；および（７）Ｅ、Ｄ。変異体ペプチドＴ細胞活性化剤によるＴ細胞の刺激は、その変異体ペプチドが機能的変異体であることを示す。１つの実施形態では、Ｔ細胞活性化剤はＩＬ−２およびその機能的変異体である。ＩＬ−２は、当業者に周知のタンパク質／ペプチドＴ細胞活性化剤である。ＦＤＡによって承認されたＩＬ−２製剤、例えばプロリューキン（Ｃｈｉｒｏｎ）は、市販のものを容易に入手し得る。ここで述べる全ての実施形態において、Ｔ細胞活性化剤はＩＬ−２を明白に包含するが、必ずしもＩＬ−２に限定されないことが了解されるべきである。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物から選択され得る。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。治療組成物の五価アンチモン化合物は、スチボグルコン酸ナトリウム、アンチモン酸メグルミンおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。治療組成物のイミダゾール化合物は、ケトコナゾール、レバミゾールおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。ジアミン化合物は、ペンタアミジンおよび生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。治療される癌は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌であり得るが、これらに限定されない。前記治療組成物は、複数の癌を有する患者を治療するために使用し得る。
【００６６】
本発明のもう１つの実施形態は、リーシュマニア症薬とＴ細胞活性化剤を含有する、癌を治療するための治療組成物を提供する。リーシュマニア症薬という用語は、現在リーシュマニア症を治療するために臨床的および／または実験的に使用される薬剤および化合物を包含することが意図されている。リーシュマニア症薬という用語はまた、まだリーシュマニア症を治療する上で有効と認められていないが、将来有効と認められる可能性のある薬剤および化合物を包含することが意図されている。リーシュマニア症薬は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物であり得るが、これらに限定されない。リーシュマニア症薬の例は、アロプリノール、アミノシジン、アンホテリシン／アンホテリシンＢ、インターフェロン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、レバミゾール、アンチモン酸メグルミン、ミルテフォシン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ペンタミジン、シタマキン／ＷＲ６０２６、スチボグルコン酸ナトリウム、およびそれらの化合物の生物学的等価物を含むが、これらに限定されない。治療される癌は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌であり得るが、これらに限定されない。前記治療組成物は、複数の癌を有する患者を治療するために使用し得る。治療組成物は、リーシュマニア症薬の混合物または組合せを含み得る。
【００６７】
本発明のもう１つの実施形態は、スチボグルコン酸ナトリウムまたはその生物学的等価物およびＴ細胞活性化剤を含有する、癌を治療するための治療組成物を提供する。治療される癌は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌であり得るが、これらに限定されない。前記治療組成物は、複数の癌を有する患者を治療するために使用し得る。
【００６８】
本発明のもう１つの実施形態は、Ｔ細胞活性化剤とＰＴＰアーゼ阻害剤を含有する、サイトカイン治療に応答性の疾患を治療するための治療組成物を提供する。感染症、ＰＴＰアーゼ活性に関連する疾患、免疫不全、癌、感染、ウイルス感染、多発性硬化症、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含むがこれらに限定されない多くの疾患がサイトカインで治療され、本発明の組成物によって治療可能であると考えられる。Ｔ細胞活性化剤と共にＰＴＰアーゼ阻害剤を使用することは、意外かつ予想外にもＴ細胞活性化剤の治療有効性を有意に増強し、その毒性を劇的に低下させることが発見された。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物から選択され得る。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。治療組成物の五価アンチモン化合物は、スチボグルコン酸ナトリウム、アンチモン酸メグルミンおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。治療組成物のイミダゾール化合物は、ケトコナゾール、レバミゾールおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。ジアミン化合物は、ペンタアミジンおよび生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。サイトカインの例は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γおよび顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
本発明のもう１つの実施形態は、リーシュマニア症薬とＴ細胞活性化剤を含有する、サイトカイン治療に応答性の疾患を治療するための治療組成物を提供する。感染症、ＰＴＰアーゼ活性に関連する疾患、免疫不全、癌、感染、ウイルス感染、多発性硬化症、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含むがこれらに限定されない多くの疾患がサイトカインで治療され、本発明の組成物による治療に適すると考えられる。リーシュマニア症薬は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物であり得るが、これらに限定されない。リーシュマニア症薬は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物の生物学的等価物であり得る。リーシュマニア症薬の例は、アロプリノール、アミノシジン、アンホテリシン／アンホテリシンＢ、インターフェロン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、レバミゾール、アンチモン酸メグルミン、ミルテフォシン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ペンタミジン、シタマキン／ＷＲ６０２６、スチボグルコン酸ナトリウム、およびそれらの化合物の生物学的等価物を含むが、これらに限定されない。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。サイトカインの例は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γおよび顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明のもう１つの実施形態は、スチボグルコン酸ナトリウムまたはその生物学的等価物およびＴ細胞活性化剤を含有する、サイトカイン治療に応答性の疾患を治療するための治療組成物を提供する。治療される疾患は、感染症、ＰＴＰアーゼ活性に関連する疾患、免疫不全、癌、感染、ウイルス感染、多発性硬化症、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含み得るが、これらに限定されない。前記治療組成物は、複数の疾患を有する患者を治療するために使用し得る。使用されるＴ細胞活性化剤は、好ましくは腫瘍浸潤性マクロファージを誘導する。好ましい実施形態では、Ｔ細胞活性化剤はＩＬ−２である。
【００７１】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量の抗癌剤とＴ細胞活性化剤を患者に投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。抗癌剤は、以下のクラス：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物の１つから選択される。抗癌剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。抗癌剤は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。治療組成物の五価アンチモン化合物は、スチボグルコン酸ナトリウム、アンチモン酸メグルミンおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。治療組成物のイミダゾール化合物は、ケトコナゾール、レバミゾールおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。ジアミン化合物は、ペンタアミジンおよび生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。抗癌剤はＰＴＰアーゼ阻害剤であり得る。１つの実施形態では、Ｔ細胞活性化剤はＩＬ−２およびその機能的変異体である。治療される癌は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌であり得るが、これらに限定されない。前記方法は、複数の癌を有する患者を治療するために使用し得る。
【００７２】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のリーシュマニア症薬とＴ細胞活性化剤を患者に投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。リーシュマニア症薬は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物であり得るが、これらに限定されない。リーシュマニア症薬の例は、アロプリノール、アミノシジン、アンホテリシン／アンホテリシンＢ、インターフェロン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、レバミゾール、アンチモン酸メグルミン、ミルテフォシン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ペンタミジン、シタマキン／ＷＲ６０２６、スチボグルコン酸ナトリウム、およびそれらの化合物の生物学的等価物を含むが、これらに限定されない。１つの実施形態では、Ｔ細胞活性化剤はＩＬ−２およびその機能的変異体である。治療される癌は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌であり得るが、これらに限定されない。前記治療組成物は、複数の癌を有する患者を治療するために使用し得る。治療組成物は、リーシュマニア症薬の混合物または組合せを含み得る。
【００７３】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のスチボグルコン酸ナトリウムまたはその生物学的等価物およびＴ細胞活性化剤を患者に投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。治療される癌は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌であり得るが、これらに限定されない。１つの実施形態では、Ｔ細胞活性化剤はＩＬ−２またはその機能的変異体である。前記方法は、複数の癌を有する患者を治療するために使用し得る。
【００７４】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のＴ細胞活性化剤とＰＴＰアーゼ阻害剤を患者に投与することを含む、サイトカイン治療に応答性の疾患を治療するための方法を提供する。感染症、ＰＴＰアーゼ活性に関連する疾患、免疫不全、癌、感染、ウイルス感染、多発性硬化症、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含むがこれらに限定されない疾患が、この方法を用いて治療され得る。Ｔ細胞活性化剤は、好ましくは腫瘍浸潤性マクロファージを誘導する。１つの実施形態では、Ｔ細胞活性化剤はＩＬ−２またはその機能的変異体である。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物から選択される。ＰＴＰアーゼ阻害剤は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物のいずれかの生物学的等価物であり得る。治療組成物の五価アンチモン化合物は、スチボグルコン酸ナトリウム、アンチモン酸メグルミンおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。治療組成物のイミダゾール化合物は、ケトコナゾール、レバミゾールおよびそれらの化合物の生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。ジアミン化合物は、ペンタアミジンおよび生物学的等価物を含み得るが、これらに限定されない。治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。サイトカインの例は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン、および顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のＴ細胞活性化剤とリーシュマニア症薬を患者に投与することを含む、サイトカイン治療に応答性の疾患を治療するための方法を提供する。感染症、ＰＴＰアーゼ活性に関連する疾患、免疫不全、癌、感染、ウイルス感染、多発性硬化症、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含むがこれらに限定されない疾患が、この方法を用いて治療され得る。好ましい実施形態では、Ｔ細胞活性化剤はＩＬ−２またはその機能的変異体である。リーシュマニア症薬は、以下のクラスの化合物：五価アンチモン化合物、イミダゾール化合物またはジアミジン化合物であり得るが、これらに限定されない。リーシュマニア症薬は、これらのクラスに存在することが知られるまたは将来発見される化合物の生物学的等価物であり得る。本発明の方法に使用されるのに適したリーシュマニア症薬の例は、アロプリノール、アミノシジン、アンホテリシン／アンホテリシンＢ、インターフェロン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、レバミゾール、アンチモン酸メグルミン、ミルテフォシン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ペンタミジン、シタマキン／ＷＲ６０２６、スチボグルコン酸ナトリウム、およびそれらの化合物の生物学的等価物を含むが、これらに限定されない。前記治療組成物は、それらの化合物の混合物または組合せを含み得る。
【００７６】
本発明のもう１つの実施形態は、有効量のスチボグルコン酸ナトリウムまたはその生物学的等価物およびＴ細胞活性化剤を患者に投与することを含む、サイトカイン治療に応答性の疾患を治療するための方法を提供する。この方法によって治療される疾患は、感染症、ＰＴＰアーゼ活性に関連する疾患、免疫不全、癌、感染、ウイルス感染、多発性硬化症、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含み得るが、これらに限定されない。前記方法は、複数の疾患を有する患者を治療するために使用し得る。Ｔ細胞活性化剤は、ＩＬ−２およびその機能的変異体であり得るが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明のもう１つの実施形態は、化合物の混合物を含有する化合物を分別することに関する。上記実施形態のいずれかにおいて、方法の一部として提供されるまたは使用される化合物が化合物の混合物を含有する場合、その混合物を分別し、１またはそれ以上の分画を除去し得る。化合物の混合物中に存在する化合物は、異なる分子量の化合物（例えばポリマー）、配座異性体、鏡像異性体、異性体、類似体、誘導体、未反応前駆体、副産物、中間体または分解産物を含み得る。一例として、スチボグルコン酸ナトリウムは、１００〜４，０００ａｍｕの範囲の分子量を有する多数の種のポリマーとして存在する。クロマトグラフィーまたは別の適切な方法によるスチボグルコン酸ナトリウムの親混合物の分別は、種々のＰＴＰアーゼ阻害活性を有する分画を提供する。比較的低いＰＴＰアーゼ阻害活性を有するまたはＰＴＰアーゼ阻害活性を持たない分画の除去は、溶液全体のＰＴＰアーゼ阻害活性を上昇させ得る。さらに、最終混合物中により少ない分子種が存在するとき、分解あるいは親化合物内の他の生成物または成分に関連する毒性を低下させ得る。
【００７８】
本発明のもう１つの実施形態は、前記実施形態のいずれかのＰＴＰアーゼ阻害剤およびＩＬ−２またはその機能的変異体を被験者に投与することを含む、ＩＬ−２の毒性を低下させるための方法を提供する。この方法のもう１つの実施形態は、ＩＬ−２治療を受けている被験者にＰＴＰアーゼ阻害剤を投与することを含む。本発明のもう１つの実施形態は、前記実施形態のいずれかのＰＴＰアーゼ阻害剤およびＩＬ−２またはその機能的変異体を被験者に投与することを含む、ＩＬ−２の治療効果を増強する方法を提供する。この方法のもう１つの実施形態は、ＩＬ−２治療を受けている被験者にＰＴＰアーゼ阻害剤を投与することを含む。
【００７９】
上記で提示した本発明の実施形態は、プロテインチロシン活性またはその異常活性に関連する疾患の予防的および治療的処置のための組成物および方法を提供する。「予防的」は、特定疾患または複数の疾患に対する、全体的または部分的な、保護を意味する。「治療的」は、疾患自体の改善、およびさらなる疾患に対する、全体的または部分的な、保護を意味する。前記方法は、予防的または治療的に被験者を処置するために十分な量の、ＰＴＰアーゼの阻害剤の投与を含む。ここで開示する薬剤は、全ての生物学的等価物（すなわち医薬的に許容される塩、前駆体、誘導体および塩基形態）を包含する。ここで使用する、「混合すること」、「混合」または「混合物」は、１）投与前の基質とアゴニストの混合（「インビトロ混合」）、２）「インビボ混合」を生じさせる基質とアゴニスト（血管新生増殖因子）の同時および／または連続的な、しかし別々の（すなわち別々の静脈内系統）投与による混合を意味する。
【００８０】
好ましくは、患者に投与する薬剤は、プロテインチロシンホスファターゼを阻害する上で有効な、ここで開示する化合物の生物学的等価物である。生物学的等価物は、ここで開示する化合物の医薬的に許容される類似体、前駆体、誘導体、または医薬的に許容される塩である。当業者は、プロドラッグと称されることもある前駆体が、治療する部位でまたはその付近で薬剤の活性形態に変換され得るものでなければならないことを認識する。
【００８１】
ここで開示する薬剤、並びにそれらの生物学的等価物または医薬的に許容される塩は、何らかの適切な経路により本発明に従って投与することができる。適切な投与経路は、全身的、例えば経口的または注射によって、局所、眼内、眼周囲、結膜下、網膜下、脈絡膜上および眼球後経路を含む。薬剤を投与する方法は、一部には、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに依存し得る。
【００８２】
当業者は、上記に列挙した実施形態において有用な治療組成物を投与する適切な方法を認識する。特定治療組成物を投与するために２つ以上の経路を使用することができるが、ある特定経路は他の経路よりも迅速で有効な反応を提供することができる。従って、記述した投与経路は単なる例示であり、いかなる意味においても限定ではない。
【００８３】
本発明に従って動物、特にヒトに投与される特定用量は、妥当な時間枠内で動物に所望反応を生じさせるのに十分であるべきである。ここで開示する治療組成物は、ヒトを含む哺乳動物、哺乳動物を含む動物を包含するが、これらに限定されない様々な被験者に投与し得る。当業者は、用量が多種多様な因子、例えば使用する特定治療組成物の強さ、動物の年齢、種、状態または疾患状態および体重に依存することを認識する。用量の大きさはまた、投与の経路、時期および頻度並びに特定治療組成物の投与に付随し得る有害副作用の存在、性質および程度、および所望の生理的作用によっても決定される。様々な状態または疾患状態、特に慢性の状態または疾患状態が、多回の投与を含む長期的な治療を必要とし得ることは当業者に認識される。
【００８４】
適切な用量および投与計画は、当業者に公知の従来の用量設定手法によって決定することができる。一般に、治療は、化合物の最適用量より少ない低用量で開始される。その後、その状況下で最大作用が達成されるまで少しずつ用量を上昇させる。
【００８５】
投与は、皮下および非経口的投与を含むがこれらに限定されない、何らかの適切な手法によって実施し得る。皮下投与の例は、静脈内、動脈内、筋肉内および腹腔内経路を含む。用量および投与計画は、主としてその治療組成物が治療のためまたは予防のために投与されるか、別個にまたは混合物として投与されるか、生物学的損傷および宿主の種類、宿主の病歴、および阻害剤または生物活性物質の種類に依存する。量は、高い治療指数を達成するために有効でなければならない。ヒトは一般に、疾患過程の長さおよび薬剤の有効性に比例した長さで、マウスおよびラットよりも長く治療される。投与は、単回投与または数日間にわたる多回投与であり得る。治療される宿主または患者が、疾患または感染に対する改善、これに限定はされないが、例えば生存率の改善、より迅速な回復、あるいは症状の改善または排除を示すとき、ここで定義する、治療目的が達成される。多回投与が好ましいとして用いられる場合、投与の頻度は、例えば宿主の種類および癌の種類、投与量等に依存する。医師は、いずれの投与経路および投与頻度が特定症例において最も有効であるかを常用実験に基づいて確認する必要があり得る。
【００８６】
上記で開示した実施形態における使用のための組成物は、好ましくは、賦形剤として公知の医薬的に許容される担体、および特定疾患を予防的または治療的に処置するために十分な量の治療組成物を含有する。担体は、慣例的に使用されるもののいずれかであり得、物理化学的配慮、例えば化合物の溶解度および反応性の欠如、および投与経路によってのみ制限される。当業者は、以下で述べる医薬組成物に加えて、治療組成物が、ポリマー組成物、包接複合体、例えばシクロデキストリン包接複合体、リポソーム、ミクロスフェア、マイクロカプセル等として製剤され得ることを理解する（例えば参照してここに組み込まれる、米国特許第４，９９７，６５２号；同第５，１８５，１５２号；および同第５，７１８，９２２号参照）。
【００８７】
治療組成物は、医薬的に許容される酸付加塩として製剤することができる。医薬組成物における使用のための医薬的に許容される酸付加塩の例は、鉱酸、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸、および有機酸、例えば酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸およびアリールスルホン酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸から誘導されるものを含む。
【００８８】
ここで述べる医薬的に許容される賦形剤は、当業者に周知であり、公的に容易に入手し得る。好ましくは、医薬的に許容される賦形剤は治療組成物に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用または毒性を有さない。
【００８９】
上述した実施形態はまた、他の製薬上活性な化合物の同時投与を含み得る。「同時投与」とは、上述した治療組成物の投与の前、投与と同時（例えば同じ製剤中または別々の製剤中で治療組成物と組み合わせて）、または治療組成物の投与後の投与を意味する。例えばコルチコステロイド、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾンまたはトリアムシノロンアセトニド、または非コルチコステロイド系抗炎症化合物、例えばイブプロフェンまたはフルビプロベンを同時投与することができる。同様に、ビタミンおよびミネラル、例えば亜鉛、抗酸化剤、例えばカロテノイド（例えばゼアキサンチンまたはルテインのようなキサントフィルカロテノイド）、および微量養分を同時投与することができる。加えて、プロテインチロシンホスファターゼ経路の他の種類の阻害剤を同時投与することができる。
【００９０】
以下の実施例および考察は、上述した分子および方法の使用のための機能と方法をさらに説明するためのものであり、いかなる意味においても特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
（実施例）
【００９１】
Ｉ．スチボグルコン酸ナトリウムはプロテインチロシンホスファターゼの強力な阻害剤であり、造血細胞系の応答を上昇させる。
【００９２】
ＳＨＰ−１ホスファターゼの阻害剤を特定するために化学試薬をインビトロホスファターゼアッセイによってスクリーニングした。スチボグルコン酸ナトリウムは、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２およびＰＴＰ１Ｂを含むプロテインチロシンホスファターゼの強力なインビトロ阻害剤であるが、二重特異性ホスファターゼＭＫＰ１の阻害剤ではないことが認められる。インビトロでのＳＨＰ−１ホスファターゼ活性は、リーシュマニア症のために治療されているヒトにおいて得られるピーク血清レベルの濃度またはそれ以下の濃度である１０μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウムによってほぼ完全に阻害された。インビボでのＰＴＰアーゼに対するスチボグルコン酸ナトリウムの阻害活性は、Ｂａｆ３細胞内の異なる細胞タンパク質のチロシンリン酸化の増強および造血増殖因子ＩＬ−３によって誘導されるＢａｆ３増殖によって示された。重要な点として、スチボグルコン酸ナトリウムはＴＦ−１細胞増殖に対するＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αの反対の作用を増強させ、様々なサイトカインのシグナル伝達を増強する上でのこの薬剤の広い活性を示唆した。
【００９３】
Ａ．実験材料および方法
【００９４】
１．化学物質および試薬
【００９５】
プロテインチロシンホスファターゼアッセイキットおよびプロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）のＧＳＴ融合タンパク質をＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，Ｎ．Ｙ．）より購入した。スラミンおよび酒石酸アンチモンカリウムはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）より購入した。スチボグルコン酸ナトリウム（そのＳｂ含量は１００μｇ／ｍｌであり、以下スチボグルコン酸ナトリウム濃度を示すために使用した）はＤｒ．Ｘｉａｏｓｕ  Ｈｕ（Ｓｉｃｈｕａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｃｈｉｎａ）から贈呈された。ＳＨＰ−１(Yi et al.,Mol. Cell. Biol. 12, 836 (1992))およびＳＨＰ−２(Frearson et al., Eur. J. Immunol. 26, 1539 (1996)) のＧＳＴ融合タンパク質は、Burshtyn et al., J. Biol. Chem. 272, 13066 (1997)の中で確立されたプロトコールに従って調製した。ＳＨＰ−１のＧＳＴ融合タンパク質ｃａｔａは、マウスＳＨＰ−１  ｃＤＮＡからＰＣＲによって誘導される、マウスＳＨＰ−１のＰＴＰアーゼ触媒ドメインのコード領域（アミノ酸２０２−５５４）を含むｐＧＥＸ構築物で形質転換したＤＨ５ａ細菌から精製した。マイトジェン活性化プロテインキナーゼホスファターゼ１（ＭＫＰ１）のＧＳＴ融合タンパク質は、以下のプライマー：
（ＭＫＰ１／５、５’ｃｔｇｇａｔｃｃｔｇｃｇｇｇｇｇｃｔｇｃｔｇｃａ−ｇｇａｇｃｇｃ（配列番号１）；ＭＫＰｌ／３、５’ａａｇｔｃｇａｃｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｇａｇｇｔｇｇｔｇａｔ）（配列番号２）を用いてＲＴ−ＰＣＲによって誘導されるＭＫＰ１  ｃＤＮＡのコード領域を含むｐＧＥＸ構築物で形質転換したＤＨ５ａ細菌から精製した。
【００９６】
マウスＩＬ−３(Yang et al., Blood 91, 3746 (1998)、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ(Thomassen et al., Clin. Immunol. 95, 85 (2000))および組換えヒトＩＦＮ−α(Uddin et al., Br. J. Haematol. 101, 446 (1998))はこれまでに記述されている。ホスホチロシン（抗ｐｔｙｒ、４Ｇ１０、ＵＢＩ）、β−アクチン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ．）、ホスホチロシンＳｔａｔ５（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ  Ｉｎｃ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびＪａｋ２（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｏｌｄｅｎ，Ｃｏｌｏ．）に対する抗体は市販のソースから購入した。
【００９７】
２．インビトロでのプロテインチロシンホスファターゼアッセイ。
【００９８】
インビトロでのＰＴＰアーゼ活性を、市販のプロテインチロシンホスファターゼアッセイキット（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（「ＵＢＩ」））を用いて当業者に公知の確立された手順に従って測定した。このアッセイは、チロシンがリン酸化されている、配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号３）の合成ホスホチロシンペプチドのインビトロでの脱リン酸化を測定する。簡単に述べると、ＧＳＴ／ＰＴＰアーゼ融合タンパク質０．０１μｇを、種々の濃度の阻害剤または化学物質（０〜１，０００μｇ／ｍｌ）を含むトリス緩衝液（トリス１０ｍＭ、ｐＨ７．４）５０μｌ中、２２℃で１０分間インキュベートし、次にホスホチロシンペプチド０．２ｍＭを添加して、２２℃で１８時間インキュベートした。マラカイトグリーン溶液１００μｌを添加し、５分間インキュベートして、５分後に６６０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００９９】
ＰＴＰアーゼ阻害剤によるＳＨＰ−１の阻害の可逆性を評価するため、グルタチオンビーズに結合したＧＳＴ／ＳＨＰ−１融合タンパク質を低温トリス緩衝液またはＰＴＰアーゼ阻害剤を含むトリス緩衝液中、４℃で３０分間プレインキュベートした。次に、ビーズをインビトロでのＰＴＰアーゼアッセイに供するかまたはトリス緩衝液で３回洗浄した後インビトロＰＴＰアーゼアッセイに供した。
【０１００】
３．細胞、細胞培養および細胞増殖アッセイ。
【０１０１】
マウス造血細胞系Ｂａｆ３を、以前にDamen et al., J. Biol. Chem. 270, 23402 (1995)の中で述べられているように１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）およびマウスＩＬ−３（２０単位／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。ヒト骨髄性細胞系ＴＦ−１を、以前にThomassen et al., Clin. Immunol. 95, 85 (2000)において述べられているように１０％ＦＣＳおよび４０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを添加したＲＰＭＩ１６４０に維持した。細胞増殖アッセイのために、細胞を１０％ＦＣＳ培地中で２回洗い、１０％ＦＣＳ培地に再懸濁して、３７℃で１６時間インキュベートし、次に様々な量のサイトカイン、スチボグルコン酸ナトリウムまたは酒石酸アンチモンカリウムを含む１０％ＦＣＳ培地中３７℃で、指示されているように３〜６日間培養した。増殖アッセイにおける細胞数は、指示されているようにＭＴＴアッセイによってまたは顕微鏡細胞計数によって測定した。
【０１０２】
４．細胞タンパク質リン酸化の誘導およびウエスタンブロット法。
【０１０３】
スチボグルコン酸ナトリウムまたは過バナジン酸による細胞タンパク質リン酸化の誘導のために、Ｂａｆ３細胞を０．１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地中３７℃で１６時間インキュベートした。次に細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中で２回洗い、スチボグルコン酸ナトリウムまたは過バナジン酸（０．１ｍＭ）と共に様々な時間インキュベートした後、低温細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ トリス、ｐＨ ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4；２０ｍｍ ＮａＦ；１％ ノニデットＰ−４０；２ｍＭ ＰＭＳＦ；２０μｇ／ｍｌ アプロチニンおよび１ｍＭ モリブデン酸ナトリウム）に細胞を溶解することによって終了した。ＩＬ−３誘導のＪａｋ／Ｓｔａｔリン酸化へのスチボグルコン酸ナトリウムまたは酒石酸アンチモンカリウムの作用を調べるため、０．１％ ＦＣＳ  ＲＰＭＩ１６４０培地中で１６時間、Ｂａｆ３細胞から増殖因子を除去し、その後スチボグルコン酸ナトリウムまたは酒石酸アンチモンカリウムと共にまたはそれらなしで１０分間インキュベートした。次にＩＬ−３を細胞懸濁液に添加し、様々な時間インキュベートした。その後細胞を採取し、４℃の低温溶解緩衝液に４５分間溶解した。全細胞溶解産物（ＴＣＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）にブロットして、特異抗体でプローブし、増強化学発光キット（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ．）を用いて検出した。
【０１０４】
Ｂ．結果
【０１０５】
１．スチボグルコン酸ナトリウムはインビトロでプロテインチロシンホスファターゼを阻害する。
【０１０６】
様々な化合物をインビトロＰＴＰアーゼアッセイによってスクリーニングすることを通して、スチボグルコン酸ナトリウムをＰＴＰアーゼの阻害剤として特定した。ＧＳＴ／ＳＨＰ−１融合タンパク質による合成ホスホチロシンペプチドの脱リン酸化は、１０μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウムによってほぼ完全にブロックされた（９９％）（図３Ａ）（データは３つの試料の平均±標準偏差値を示す）。スチボグルコン酸ナトリウムはＳＨＰ−２およびＰＴＰ１Ｂも阻害したが（図３Ａ）、同様の程度（約９９％）の阻害を達成するには約１０倍高い薬剤濃度（１００μｇ／ｍｌ）が必要であった（図３Ａ）。公知のＰＴＡアーゼ阻害剤であるスラミンによるＳＨＰ−１の阻害は、匹敵する条件下では効果はより低かった。この薬剤は、ＭＫＰ１、二重特異性プロテインチロシンホスファターゼに対しては明らかな阻害活性を示さなかった（図３Ｃ）。実験条件下で、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＰＴＰ１ＢおよびＭＫＰ１のＧＳＴ融合タンパク質は、阻害剤の不在下でペプチド基質に対して同様のＰＴＰアーゼ活性を示した（バックグラウンド（０．０３）を約０．６上回る６６０ｎｍ吸光度）。
【０１０７】
２．スチボグルコン酸ナトリウムはＳＨＰ−１  ＰＴＰアーゼ触媒ドメインを標的し、インビトロで前記ホスファターゼと安定な複合体を形成する。
【０１０８】
基質脱リン酸化はＰＴＰアーゼ触媒ドメインによって媒介され、その活性はしばしば、隣接するＮ末端およびＣ末端領域によって調節される。スチボグルコン酸ナトリウムが、ＰＴＰアーゼ触媒ドメインを標的することを通してまたは隣接調節領域によってＰＴＰアーゼを阻害したのかどうかを定義するため、ＧＳＴ／ＳＨＰ−１融合タンパク質へのスチボグルコン酸ナトリウムの作用を、ＰＴＰアーゼ触媒ドメインを含むがＳＨ２ドメインを有し、Ｃ末端領域が欠失しているＧＳＴ／ＳＨＰ−１ｃａｔａ融合タンパク質と比較した（図４Ａ）。スチボグルコン酸ナトリウムは、インビトロでのホスホチロシンペプチド基質の脱リン酸化において２つのタンパク質を阻害する上で同様の活性を示し（図４Ｂ）（データは３つの試料の平均±標準偏差値を示す）、スチボグルコン酸ナトリウムによるＳＨＰ−１  ＰＴＰアーゼ活性の阻害がＳＨＰ−１  ＳＨ２ドメインおよびＣ末端領域を必要としないことを明らかにした。これらの結果は、スチボグルコン酸ナトリウムがＳＵＰ−１  ＰＴＰアーゼ触媒ドメインを直接標的することの強力な証拠を提供する。
【０１０９】
スチボグルコン酸ナトリウムによるＳＨＰ−１  ＰＴＰアーゼのインビトロでの阻害が可逆過程であるのかどうかを調べるため、スチボグルコン酸ナトリウムと共にプレインキュベートしたＧＳＴ／ＳＨＰ−１融合タンパク質の洗浄が阻害を取り除き得るかどうかを検討した。スチボグルコン酸ナトリウムによるＧＳＴ／ＳＨＰ−１融合タンパク質の阻害は洗浄によって影響を受けなかった（図５）。これに対し、スラミンによるホスファターゼの阻害は、以前の報告(Zhang et al., J. Biol. Chem. 273, 12281 (1998))と一致して、洗浄工程によってほぼ完全に除去された（図５）。
【０１１０】
３．スチボグルコン酸ナトリウムは細胞タンパク質のチロシンリン酸化を誘導し、Ｂａｆ３細胞におけるＩＬ−３誘導のＪａｋ２／Ｓｔａ５のリン酸化を上昇させる。
【０１１１】
スチボグルコン酸ナトリウムがインビボでＰＴＰアーゼ阻害剤として機能するかどうかを調べるため、マウスＩＬ−３依存性細胞系Ｂａｆ３における細胞タンパク質チロシンリン酸化へのスチボグルコン酸ナトリウムの作用を検討した。スチボグルコン酸ナトリウムによるＢａｆ３細胞の処置は、過バナジン酸（０．１ｍＭ）によって誘導されるもの（図６Ｂ）に比べて軽度で一過性のタンパク質チロシンリン酸化を誘導した（図６Ａ）。約５５および３２ｋＤａの細胞タンパク質のチロシンリン酸化の上昇が、前記薬剤と共に５分間インキュベートした細胞において明らかであった（図６、レーン１〜３）。この細胞タンパク質チロシンリン酸化の誘導は用量依存的であり、薬剤濃度が高いほどより著明な誘導が起こった（図６、レーン２および３）。これらのタンパク質のリン酸化上昇はまた、１０、３０または６０分間の持続的処置でも検出されたが、より控えめなレベルであった（図６、レーン４〜１２）。この細胞タンパク質チロシンリン酸化の上昇は、これらの試料における同様の量のＰ−アクチンタンパク質によって示されたようにタンパク質試料の変動性によるものではなかった（図６、下のパネル）。前記薬剤は、全細胞溶解産物（ＴＣＬ）試料中のいくつかの他のホスホチロシン細胞タンパク質に明らかな作用を及ぼさず（図６）、タンパク質チロシンリン酸化の誘導におけるこの薬剤のある種の特異性を示唆した。５５および３２ｋＤａタンパク質の同一性は測定しなかった。図６のレーン４、７および１０のものと比較してレーン１におけるｐ３２バンドのより弱いリン酸化シグナルは、必ずしも一貫して検出されなかった。
【０１１２】
スチボグルコン酸ナトリウムがインビボでＳＨＰ−１を阻害するかどうかを判定するために、Ｂａｆ３細胞におけるＩＬ−３誘導のＪａｋ２チロシンリン酸化への薬剤の作用を検討した（図７）。ＩＬ−３を除去したＢａｆ３細胞を薬剤と共にまたは薬剤なしで１０分間インキュベートし、次にＩＬ−３で様々な時間刺激した。ＩＬ−３は、薬剤の存在下または不在下でＢａｆ３細胞におけるＪａｋ２およびＳｔａｔ５のチロシンリン酸化を誘導した。しかし、薬剤の存在下でのＪａｋ２およびＳｔａｔ５のホスホチロシンレベルは、デンシトメトリー分析よって測定したとき、薬剤処置なしの細胞におけるレベルの約２倍であった（図７、レーン２〜６とレーン８〜１２を比較する）。
【０１１３】
ＩＬ−３によって刺激しなかった細胞では、２つのタンパク質のチロシンリン酸化は薬剤の存在下または不在下で検出不能であった。（図７、レーン１および７）。薬剤単独との３７℃で１６時間の持続的インキュベーションも、Ｊａｋ２／Ｓｔａｔ５チロシンリン酸化を誘導することができなかった。
【０１１４】
４．スチボグルコン酸ナトリウムはＢａｆ３細胞におけるＩＬ−３誘導の細胞増殖を上昇させる。
【０１１５】
ＳＨＰ−１は、ＳＨＰ−１欠損細胞の、ＩＬ−３を含む様々なサイトカインに対する過応答性によって示されるように、サイトカインのシグナル伝達を下方調節することが知られている。ＳＨＰ−１に対するスチボグルコン酸ナトリウムの阻害活性は、この薬剤がＢａｆ３細胞のＩＬ−３誘導性増殖を上昇させることを予測させた。実際に、ＩＬ−３誘導のＢａｆ３増殖は０．３〜２００μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウムの存在下で上昇し、最大作用濃度は約４０μｇ／ｍｌであった（図８Ａ）。より高い濃度では（１，０００μｇ／ｍｌ）、薬剤はＩＬ−３誘導性Ｂａｆ３増殖を抑制した（図８Ａ）。前記薬剤のこの増殖促進作用は、ＩＬ−３の最適下量（３．３または１０単位／ｍｌ）で明らかであったが、最適量（３０単位／ｍｌ）では明らかでなかった（図８Ｂ）。ＩＬ−３不在下では、スチボグルコン酸ナトリウムは、３日目の培養物において細胞増殖を支持するまたは細胞生存能を維持することができなかった（図８Ｂ）。
【０１１６】
５．スチボグルコン酸ナトリウムはＴＦ−１細胞増殖へのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αの反対の作用を増強する。
【０１１７】
Ｊａｋ／Ｓｔａｔシグナル伝達経路は、しばしば細胞増殖に反対の作用を及ぼすサイトカインによって開始されるシグナルを伝達する。ヒト骨髄性白血病細胞系ＴＦ−１は、増殖を促進するＧＭ−ＣＳＦと細胞増殖を阻害するＩＦＮ−αの両方に応答する。ＰＴＰアーゼ阻害剤の作用がＩＬ−３によって開始されるシグナル伝達事象に固有であるのかまたは他のサイトカインにも影響を及ぼすのかを調べるため、スチボグルコン酸ナトリウムの存在下または不在下でのＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮ−αに対するＴＦ１細胞の増殖応答を検討した。
【０１１８】
ＴＦ−１細胞の増殖は、最適下濃度（５〜４０ｎｇ／ｍｌ）のＧＭ−ＣＳＦによって用量依存的に誘導された（図９Ａ）（データは３つの試料の平均±標準偏差値を示す）。このＴＦ−１細胞の増殖は、５０μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウムの存在下で上昇した（図９Ａ）。前記薬剤の存在下または不在下で、ＧＭ−ＣＳＦを欠く培養物では生存細胞は検出されなかった（図９Ａ）。これらの結果は、スチボグルコン酸ナトリウムはＴＦ−１細胞におけるＧＭ−ＣＳＦの増殖促進活性を上昇させるが、実験条件下で細胞生存能を維持するまたは増殖を促進するために増殖因子の代わりになることはできないことを明らかにした。
【０１１９】
ＩＦＮ−αの存在下で、ＴＦ−１細胞のＧＭ−ＣＳＦ誘導性増殖は抑制された（図９Ｂ）。ＩＦＮ−αとスチボグルコン酸ナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）の両方を含む培養物では、ＧＭ−ＣＳＦ誘導性増殖のさらなる低下が検出され（図９ＢおよびＣ）、ＩＦＮ−αの増殖阻害活性が前記薬剤の存在下で増強されたことを示唆した。薬剤によるＩＦＮ−αの増殖阻害増強がＧＭ−ＣＳＦの存在下で起こったことから、実験条件下でＧＭ−ＣＳＦのマイトジェンシグナル伝達を上昇させる薬剤の作用に比べてＩＦＮ−αと薬剤の間での相乗作用の優位性を指示した。
【０１２０】
図９Ｄに示すように、ＧＭ−ＣＳＦ誘導のＴＦ−１増殖を上昇させる上でのスチボグルコン酸ナトリウムの活性は用量依存的であり、最適活性は５０μｇ／ｍｌであった。他方で、ＩＦＮ−αの存在下でのより劇的な増殖阻害が薬剤のより高い濃度で起こった（図９Ｅ）。低用量の薬剤（１２．５〜５０μｇ／ｍｌ）はＧＭ−ＣＳＦ誘導性細胞増殖に負の作用を示さなかったので、ＩＦＮ−αが誘導する増殖阻害を上昇させる上でのそのような用量の作用は、ＩＦＮ−αシグナル伝達の特異的増強から生じた可能性が高い。他方で、ＩＦＮ−αと組み合わせた高用量の薬剤の非特異的毒性が、より劇的な増殖阻害に寄与したと考えられる。
【０１２１】
６．酒石酸アンチモンカリウムのＳｂ（ＩＩＩ）形態はＰＴＰアーゼに対する阻害活性を持たない。
【０１２２】
スチボグルコン酸ナトリウムはＳｂ（Ｖ）形態であり、細胞内でリーシュマニア増殖に影響を及ぼし得るＳｂ（ＩＩＩ）形態に変換する。インビトロおよびインビボでＰＴＰアーゼを阻害する上でのＳｂ（ＩＩＩ）形態の酒石酸アンチモンカリウムの活性を測定した。
【０１２３】
スチボグルコン酸ナトリウムと異なり、１〜１，０００μｇ／ｍｌの酒石酸アンチモンカリウムはインビトロでＰＴＰアーゼＳＨＰ−１およびＰＴＰ１Ｂの検出可能な阻害を示さなかった（図１０Ａ）。また、ＩＬ−３誘導のＳｔａｔ５リン酸化（図１０Ｂ）またはＢａｆ３細胞のＩＬ−３誘導性増殖（図１０Ｃ）を増強することもできず、インビボでのＰＴＰアーゼに対する阻害活性の欠如を指示した（データは３つの試料の平均±標準偏差値を示す）。興味深いことに、酒石酸アンチモンカリウムはＢａｆ３細胞に対して著明な毒性を示した。上記結果は、合わせて考慮すると、Ｓｂ（Ｖ）形態だけがＰＴＰアーゼ阻害剤として働き、Ｓｂ（ＩＩＩ）形態に変換されたときには不活性化されることを示唆する。
【０１２４】
Ｃ．考察
【０１２５】
これらのデータは、スチボグルコン酸ナトリウムがインビトロおよびインビボでプロテインチロシンホスファターゼの強力な阻害剤であることを明らかにする。スチボグルコン酸ナトリウムは、インビトロでのＰＴＰアーゼアッセイにおいてプロテインチロシンホスファターゼ（ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２およびＰＴＰ１Ｂ）による合成ホスホチロシンペプチド基質の脱リン酸化を阻害した（図３）。インビトロでのこれらのＰＴＰアーゼ阻害剤によるｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｓｉｇｍａ）の脱リン酸化もこの薬剤によって同様に阻害された。インビボでのＰＴＰアーゼに対するこの薬剤の阻害活性は、Ｂａｆ３細胞における５６および３２ｋＤａの２個のまだ特定されていない細胞タンパク質のタンパク質チロシンリン酸化の迅速な誘導によって示された（図６）。興味深いことに、以前の試験で(Yang et al., Blood 91, 3746 (1998)) 、同様の分子量のタンパク質がＳＨＰ−１欠損細胞において過リン酸化されることが認められている。誘導される細胞タンパク質チロシンリン酸化は、長期的な薬剤インキュベーションに関してはそれほど劇的ではなく（図６）、薬剤が実験条件下で不安定であり得ることまたは薬剤が細胞タンパク質のリン酸化に対して反対の作用を有するＰＴＰアーゼを不活性化し得ることを示唆した。これに関して、ＰＴＰアーゼが、細胞内で、ＰＴＰアーゼ阻害活性を示すことができなかったＳｂ（ＩＩ）形態に変換することが知られているスチボグルコン酸ナトリウムのＳｂ（Ｖ）形態によって阻害されたことは興味深い（図１０）。細胞内変換は、それ故、ＰＴＰアーゼ阻害剤の不活性化を生じさせると考えられ、この薬剤のチロシンリン酸化の軽度で一過性の誘導および細胞増殖への控えめな作用を説明し得る。これは、その臨床適用を可能にする、他のＰＴＰアーゼ阻害剤と比較してこの薬剤のより低い毒性に関連すると考えられるので、有益な側面を有すると考えられる。
【０１２６】
インビボでのＰＴＰアーゼに対するスチボグルコン酸ナトリウムの阻害活性は、ＩＬ−３誘導のＪａｋ２／Ｓｔａｔ５リン酸化およびＢａｆ３細胞のＩＬ−３誘導性増殖の上昇によってさらに指示された。以前の実験は、ＳＨＰ−１が、サイトカインによって開始されるシグナル伝達を下方調節するＪａｋファミリーキナーゼを脱リン酸化することを示した(Jiao et al., Exp. Hematol. 25, 592 (1997))。Ｊａｋキナーゼの中で、ＩＬ−３は、遺伝子発現を調節するＳｔａｔ５タンパク質をリン酸化するＪａｋ２キナーゼを活性化する。スチボグルコン酸ナトリウムがＩＬ−３誘導のＪａｋ２／Ｓｔａｔ５チロシンリン酸化およびＢａｆ３細胞のＩＬ−３誘導性増殖を上昇させたという所見は、それ故、インビボでの本剤によるＳＨＰ−１の阻害と一致する。しかし、ＩＬ−３誘導のＪａｋ２／Ｓｔａｔ５リン酸化および細胞増殖への本剤の作用が、Ｊａｋキナーゼの脱リン酸化に関与する付加的なＰＴＰアーゼ（例えばＣＤ４５  ＰＴＰアーゼ）を含む可能性が残る。実際に、スチボグルコン酸ナトリウムはＳＨＰ−１欠損細胞においてＧＭ−ＣＳＦ誘導のＴｙｋ２／Ｓｔａｔ３チロシンリン酸化を上昇させた。この薬剤によるＩＬ−３誘導のＪａｋ２／Ｓｔａｔ５チロシンリン酸化の増強がＩＬ−３刺激後の遅い時点でより劇的であったことは、本剤によるリン酸化の長期間の誘導を示唆した。本剤のそのような作用は、シグナル伝達分子を不活性化するＩＬ−３刺激後の遅い時点でＪａｋ２／Ｓｔａｔ５に集積したＰＴＰアーゼを標的することを示唆する。
【０１２７】
スチボグルコン酸ナトリウムによるインビボでのＰＴＰアーゼの阻害はまた、この薬剤がＴＦ−１細胞増殖に対するＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αの反対の作用を上昇させるという所見とも一致した（図９および１０）。特に、前記所見は、本剤が、ＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮ−αによって利用される共有シグナル伝達分子（例えばＪａｋファミリーキナーゼ）を脱リン酸化するＰＴＰアーゼを標的することを示唆した。そのような推定上の機構は、本剤のサイトカイン依存性作用を説明する；ＰＴＰアーゼのその阻害は、それぞれＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αによって開始される分裂促進および増殖阻止シグナルの両方の増幅を導く。それはまた、スチボグルコン酸ナトリウムが様々なサイトカインのシグナル伝達を上昇させる上で広い活性を有し得ることを示唆する。ＳＨＰ−１が、以前の試験において、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αのシグナル伝達を下方調節することが示されたことは注目に値する。ＳＨＰ−１欠損マウスからのマクロファージは、対照と比較してＧＭ−ＣＳＦ誘導の細胞増殖の約２倍の上昇を示すことが報告された。増殖上昇のこのレベルは、この薬剤によるＳＨＰ−１の阻害と一致して、スチボグルコン酸ナトリウムの存在下でのＧＭ−ＣＳＦ誘導性ＴＦ−１細胞増殖の上昇と類似する。致死的モスイートン表現型におけるＳＨＰ−１欠損単球／マクロファージの病原性作用に照らすと、ＧＭ−ＣＳＦ誘導性細胞増殖への本剤の見かけ上控えめな作用は、インビボでは有意な生物学的影響を有し得ると考えられる。
【０１２８】
これらの結果はまた、Ｊａｋ／Ｓｔａｔリン酸化およびサイトカインに対する細胞応答を上昇させる治療濃度のスチボグルコン酸ナトリウムによるＰＴＰアーゼの阻害が、リーシュマニア症の治療における本剤の薬理的作用の原因となる主要因子であり得ることを示唆する。シグナル伝達のためのＪａｋ／Ｓｔａｔ経路に依存するサイトカインの中で、ＩＦＮ−γは細胞内リーシュマニアを除去する上で重要な役割を果たす。さらに、ＩＦＮ−γシグナル伝達の損傷がリーシュマニア感染マクロファージにおいて検出され、この寄生生物によるＳＨＰ−１の活性化に関連付けられた。それ故、スチボグルコン酸ナトリウムはＳＨＰ−１（および他のＰＴＰアーゼ）を阻害することを通してマクロファージにおけるＩＦＮ−γシグナル伝達を上昇させ、細胞内リーシュマニアのクリアランスに寄与し得ると推定できる。それ故、スチボグルコン酸ナトリウムの抗リーシュマニア活性は、Ｓｂ（Ｖ）による細胞シグナル伝達の上昇および細胞内でＳｂ（Ｖ）から変換したＳｂ（ＩＩＩ）による寄生生物の死滅の両方に由来し得る。そのような機能的機構は、それでもやはり、特異的阻害剤による宿主ＰＴＰアーゼの調節が、マクロファージにおけるサイトカインシグナル伝達を増強することによってリーシュマニア感染の進行を有効に制御できるというこれまでの所見と一致する。抗リーシュマニア症薬であるヒ酸ナトリウムがマクロファージにおけるＬＰＳ誘導のＭＡＰキナーゼシグナル伝達を阻害するという所見に照らすと、細胞シグナル伝達の調節は抗リーシュマニア症薬の共通機構であると考えられる。
【０１２９】
スチボグルコン酸ナトリウムがＰＴＰアーゼを阻害する機構は、おそらくこの酵素のＰＴＰアーゼ触媒ドメインを標的することによると考えられる。前記薬剤は、野生型ＳＨＰ−１、およびＳＨＰ−１活性を調節する隣接Ｎ−末端ＳＨ２ドメインまたはＣ末端領域を持たない、ＰＴＰアーゼドメインを含むＳＨＰ−１突然変異型の両方を阻害する上で有効であった（図４）。この機構はまた、本剤が、そのＰＴＰアーゼ触媒ドメインを除き、ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２と見かけ上の構造類似性を持たないＰＴＰ１Ｂを阻害するという所見と一致する。これに関して、本剤がＭＫＰ１に対して明らかな活性を示さなかったことは意外ではない。二重特異性ホスファターゼの触媒ドメインのアミノ酸配列および構造はチロシン特異的ＰＴＰアーゼのものとは実質的に異なるからである。そのような機構はまた、本剤が、保存されたＰＴＰアーゼ触媒ドメインを有する全てのチロシン特異的ＰＴＰアーゼに対して阻害活性を有し得ることを示唆する。これらの結果は、本剤が、インビトロで洗浄工程に抵抗性であるＳＨＰ−１との安定な複合体を形成することを指示したが、これがＰＴＰアーゼドメインのポケット構造への本剤のドッキングによるものであったのかまたは共有結合の形成を含んでいたのかは現在のところ明らかではない。前者の場合は、ＰＴＰアーゼの推定上のポケット構造の微妙な差異がインビトロでのこの阻害剤に対する酵素の異なる感受性の原因である可能性が高い。加えて、個々のＰＴＰアーゼに対してより特異的で強力な活性を有する本剤の化学的誘導体を開発する可能性も示唆する。
【０１３０】
インビトロで明らかにされた本剤に対するＰＴＰアーゼの異なる感受性は、インビボでのＰＴＰアーゼの同様の区別的感受性を示唆し、それは、ＩＬ−３誘導性細胞増殖への本剤の用量依存的作用およびより高い用量での本剤の公知の臨床副作用を説明し得る。スチボグルコン酸ナトリウムは、治療濃度でＩＬ−３誘導性Ｂａｆ３増殖を上昇させ、より高用量では細胞増殖を抑制した。臨床適用において、治療用量のスチボグルコン酸ナトリウムは良好に耐容されたが、より高用量では可逆性の非特異的ＥＣＧ変化および腎不全を含む副作用を有することが知られている。高用量での本剤の作用は、本剤の高濃度に対してのみ感受性であるＰＴＰアーゼの阻害に関連すると考えられる。
【０１３１】
ＩＩ．インビトロでのヒト骨髄性白血病細胞系の分化および増殖へのスチボグルコン酸ナトリウムの作用
【０１３２】
ＡＭＬの治療における分化誘導療法の薬剤としてのスチボグルコン酸ナトリウムの潜在的可能性を探るため、インビトロでの様々なヒトＡＭＬ細胞系の分化に対するスチボグルコン酸ナトリウムの作用を検討した。データは、スチボグルコン酸ナトリウムがＡＭＬ細胞系ＮＢ−４、ＨＬ−６０およびＵ９３７の分化を用量および時間依存的に誘導することを明らかにした。最適用量で、スチボグルコン酸ナトリウムは、ＮＢ４細胞の不可逆的分化をＡＴＲＡによって誘導されるのと同様のレベルに誘導した。スチボグルコン酸ナトリウムが誘導したＨＬ−６０およびＵ９３７細胞の分化はそれぞれ６０％および５０％であり、これらは、２つの細胞系においてＡＴＲＡによって誘導されるのとほぼ等しいまたはそれより高いレベルまでＧＭ−ＣＳＦによって増強された。これらの結果は、ＡＭＬ治療におけるスチボグルコン酸ナトリウム、およびおそらく他のＰＴＰアーゼ阻害剤の潜在的可能性を示唆する。
【０１３３】
Ａ．実験材料および方法
【０１３４】
１．試薬
【０１３５】
全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール（ＴＰＡ）はＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）より購入した。スチボグルコン酸ナトリウム(Pathak et al., J. Immunol. 167, 3391 (2001))および組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子）(Thomassen et al., Clin. Immunol 95, 85(2000)) は以前に記述されている。
【０１３６】
２．細胞系、細胞培養および細胞増殖アッセイ。
【０１３７】
ＮＢ４細胞系(Lanotte et al., Blood 77, 1080 (1991))はｔｈｅ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎのＤｒ．Ｄａｎ  Ｌｉｎｄｎｅｒより贈呈された。ＩＬ−６０およびＵ９３７細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）より購入した。これらのヒトＡＭ細胞系を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。細胞増殖アッセイのために、様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムを含む１０％ＦＣＳ培地中３７℃で６日間、細胞を培養した。培養物中の細胞数を、先にMosmann, J. Imunol. Methods 65, 55 (1983)の中で述べられているようにＭＴＴアッセイによって測定した。
【０１３８】
３．分化の誘導の試験
【０１３９】
ＡＭＬ細胞系の分化を、ＮＢＴのホルマザンへの還元によって測定される、スーパーオキシドを生産するそれらの能力によっておよびフローサイトメトリーによるＣＤ１１ｂ表面マーカーの発現の分析によって評価した。ＮＢＴ還元のために、各々の細胞懸濁液を、１ｍｇ／ｍｌ ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）および２．５μｇ／ｍｌ ＴＰＡを含む等容量の溶液と３７℃で３０分間混合した。インキュベーション後、各々の試料中の紫色のホルマザン沈積物を含む細胞およびＮＢＴ還元活性を持たない細胞（白色細胞）を、顕微鏡下で２００細胞を計数することによって測定した。データは、以下の比率：紫色細胞／紫色＋白色細胞に基づくパーセンテージとして表わされている。細胞表面抗原の分析のために、細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）複合マウス抗ヒトＣＤ１１ｂ（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ．）に暴露した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）で蛍光の分析を実施した。
【０１４０】
４．細胞溶解産物分析
【０１４１】
細胞溶解産物を、スチボグルコン酸ナトリウム（２５０μｇ／ｍｌ）またはＡＴＲＡ（１μＭ）の不在下または存在下でのＮＢ４細胞の３日間の培養後にフローサイトメトリーによって分析した。簡単に述べると、細胞を低温エタノールに固定し、５０ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、１ｍｇ／ｍｌ ＲＮアーゼおよび０．１％ＮＰ−４０の溶液と共に暗所において４℃で３０分間インキュベートした。ＣＥＬＬＦＩＴプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて染色した後直ちに分析を実施した。
【０１４２】
５．アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウムアッセイによるアポトーシス細胞の検出。
【０１４３】
アネキシンＶアッセイキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）を用いて露出した膜リン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）のアネキシンＶ染色を行った。簡単に述べると、ＮＢ４細胞をスチボグルコン酸ナトリウム（２５０μｇ／ｍｌ）またはＡＴＲＡ（１μＭ）の不在下または存在下で１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ  １６４０培地において３日間培養した。次に細胞をＰＢＳ中で２回洗い、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムを含む結合緩衝液（１０ｍＭヘペス、ｐＨ７．４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；２．５ｍＭ ＣａＣｌ2）中で１５分間染色した。１０容量の結合緩衝液を添加して反応を停止させ、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆａｃｓｖａｎｔａｇｅ）によって分析した。
【０１４４】
Ｂ．結果
【０１４５】
１．スチボグルコン酸ナトリウムはＡＭＬ細胞系ＮＢ４の分化を用量および時間依存的に誘導した。
【０１４６】
ＮＢ４はＡＰＬ患者に由来するヒトＡＭＬ細胞系であり、ＡＴＲＡによって顆粒球へと分化するように誘導され得る。ＡＭＬのための分化誘導療法におけるスチボグルコン酸ナトリウムの潜在的可能性を探るため、薬剤の活性を、最初に、ＮＢＴ還元アッセイおよびＣＤ１１ｂ抗原発現により、ＮＢ４細胞のより成熟した顆粒球様細胞への分化を誘導することによって測定した。
【０１４７】
２．スチボグルコン酸ナトリウムは、本剤の存在下でのＮＢＴ陽性細胞の上昇によって示されるようにＮＢ４細胞分化を用量および時間依存的に誘導した。
【０１４８】
スチボグルコン酸ナトリウムは、３日目または６日目の培養物において試験した全ての用量で（１０〜４００μｇ／ｍｌ）分化誘導活性を有していた（図１１Ａ）。最適用量は、６日間スチボグルコン酸ナトリウムの存在下で培養したＮＢ４細胞の８７％分化を誘導した２５０μｇ／ｍｌであった（図１１Ａ）。この用量で、スチボグルコン酸ナトリウム誘導のＮＢ４細胞分化は、細胞を最初の２４時間薬剤で処置した後検出可能であり、その後の期間中さらに上昇し、６日目までに８７％に達した（図１１Ｂ）。ＡＴＲＡ（１μＭ）で６日間処置したＮＢ４細胞も、同等の条件下で同様の程度の細胞分化に達した（図１１Ｂ）。スチボグルコン酸ナトリウム誘導のＮＢ４細胞分化は、ＣＤ１１ｂ陽性細胞が、対照での１０％から、スチボグルコン酸ナトリウム（２５０ｐｇ／ｍｌ）の存在下で３日間培養したＮＢ４細胞では２４％に上昇したことによってさらに確認された（図１１Ｃ）。
【０１４９】
３．スチボグルコン酸ナトリウム誘導のＮＢ４細胞分化は、Ｓ期での細胞増殖停止および細胞死の増加に結びつく。
【０１５０】
ＭＴＴアッセイによるスチボグルコン酸ナトリウムのＮＢ４細胞増殖への作用を測定した。ＮＢ４細胞の増殖は、検討した全ての用量（１２．５〜４００μｇ／ｍｌ）のスチボグルコン酸ナトリウムの存在下で著明に阻害された（図１２Ａ）。細胞ＤＮＡ含量分析（図１２）は、スチボグルコン酸ナトリウム（２５０μｇ／ｍｌ）で３日間処置したＮＢ４細胞におけるＳ期の細胞の有意の増加を示した（図１２Ｂ）。これに対し、ＡＴＲＡ（１μＭ）の存在下で３日間培養したＮＢ４細胞は、先の報告(Idres et al., Cancer Res. 61, 700 (2001))と一致して、ＧＩ期で停止された（図１２Ｂ）。スチボグルコン酸ナトリウム（２５０μｇ／ｍｌ）の存在下で６日間培養したＮＢ４細胞の実質的な個体群がアネキシンＶによって陽性染色され、細胞がアポトーシスを通して死滅していることを示唆した（図１２Ｃ）。これらの結果は、スチボグルコン酸ナトリウム誘導のＮＢ４細胞増殖がＳ期で停止し、細胞に対して細胞傷害性作用を及ぼすことを明らかにした。
【０１５１】
４．スチボグルコン酸ナトリウム誘導のＮＢ４細胞分化は可逆的であり、最適誘導のためには薬剤への持続的な暴露を必要とする。
【０１５２】
我々は次に、スチボグルコン酸ナトリウム誘導のＮＢ４細胞分化がスチボグルコン酸ナトリウムの不在下で逆転するかどうかを検討した。スチボグルコン酸ナトリウム（１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ）の存在下で６日間培養したＮＢ４細胞を洗浄し、スチボグルコン酸ナトリウムを含まない培地に再懸濁した。その後細胞を６日間培養し、ＮＢＴ陽性細胞の数を毎日測定した。図１３Ａに示すように、ＮＢＴ陽性細胞のパーセンテージは６日の期間中概して一貫したままであり、スチボグルコン酸ナトリウム誘導のＮＢ４細胞分化がスチボグルコン酸ナトリウムの不在下で逆転しなかったことを明らかにした。同等の条件下で、ＡＴＲＡ誘導のＮＢ４分化は、先に報告されているような(Lanotte et al, Blood 95, 85 (1991))同様の特徴を示した。
【０１５３】
ＮＢ４細胞分化の誘導がスチボグルコン酸ナトリウムへの長期的な暴露を必要とするかどうかを調べるため、ＮＢ４細胞をスチボグルコン酸ナトリウム（１００μｇ／ｍｌ）の存在下で０．５〜２４時間培養し、その後洗浄して、スチボグルコン酸ナトリウムを含まない培地で６日間培養した後、ＮＢＴ染色した。０．５〜２４時間スチボグルコン酸ナトリウムに暴露したＮＢ４細胞においてＮＢＴ陽性細胞の線形増加が検出され、２４時間で最大増加（１６％）が認められた（図１３Ｂ）。それ故、ＮＢ４細胞分化はスチボグルコン酸ナトリウムへの短期間の暴露後に誘導可能であった。しかし、スチボグルコン酸ナトリウムへの２４時間の暴露によって誘導された１６％のＮＢＴ陽性細胞は、スチボグルコン酸ナトリウム（１００μｇ／ｍｌ）の存在下で６日間培養したＮＢ４細胞における５２％のレベルを実質的に下回った（図１１Ａ）。培養中の分化細胞のパーセンテージはスチボグルコン酸ナトリウムへの暴露時間の長さと直接関係するので（図１１Ｂ）、合わせた結果は、スチボグルコン酸ナトリウムによるＮＢ４細胞分化の最適誘導には持続的な薬剤暴露を必要とすることを指示した。同様に、ＡＴＲＡへの短期暴露によって誘導されるＮＢ４細胞分化（図１３Ｂ）は、長期暴露のものと比べて控えめであった（図１１Ｂ）。
【０１５４】
５．スチボグルコン酸ナトリウムはＨＬ−６０およびＵ９３７細胞系の分化を誘導する。
【０１５５】
スチボグルコン酸ナトリウムの分化誘導作用がＮＢ４細胞に固有であるかどうかを調べるため、ＡＭＬ細胞系ＨＬ−６０およびＵ９３７におけるスチボグルコン酸ナトリウムの作用を検討した。ＨＬ−６０およびＵ９３７細胞を様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムの不在下または存在下で種々の時間培養した。培養中のＮＢＴ陽性細胞のパーセンテージを細胞分化の指標として測定した。
【０１５６】
スチボグルコン酸ナトリウムはＨＬ−６０およびＵ９３７細胞の分化を用量および時間依存的に誘導した（図１４）。ＨＬ−６０およびＵ９３７細胞の分化を誘導する上でのスチボグルコン酸ナトリウムの最適用量は、６日目の培養物において実験条件下で４００μｇ／ｍｌであった（図１４Ａおよび１４Ｃ）。この用量で、スチボグルコン酸ナトリウム誘導のＨＬ−６０およびＵ９３７細胞の分化（約６０％）は、６日目培養物においてＡＴＲＡによって誘導される分化（ＨＬ６０については９０％およびＵ９３７については６０％）を下回った（図１４Ｂおよび１４Ｄ）。ＮＢ４細胞と同様に、ＨＬ−６０およびＵ９３７の分化細胞のパーセンテージはスチボグルコン酸ナトリウムの存在下での長期的培養に比例して上昇し（図１４Ｂおよび１４Ｄ）、最適分化誘導のための持続的薬剤暴露の必要性を指示した。ＰＴＰアーゼ阻害剤はまた、２つのＡＭＬ細胞系に対する増殖阻害活性を示した。２つの細胞系における分化誘導のための薬剤の最適用量（４００μｇ／ｍｌ）で、スチボグルコン酸ナトリウムは６日目培養物においてＵ９３７細胞の９７％増殖阻害およびＨＬ−６０細胞の６３％阻害を達成した（図１２Ａ）。
【０１５７】
６．スチボグルコン酸ナトリウムが誘導するＨＬ−６０およびＵ９３７の分化はＧＭ−ＣＳＦによって増強される。
【０１５８】
ＨＬ−６０およびＵ９３７細胞の分化を誘導する上でのＧＭ−ＣＳＦと組み合わせたスチボグルコン酸ナトリウムの作用を測定した。ＨＬ−６０およびＵ９３７細胞をスチボグルコン酸ナトリウム（４００μｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）または両方の存在下で１〜６日間培養し、ＮＢＴ陽性細胞のパーセンテージを毎日測定した。
【０１５９】
スチボグルコン酸ナトリウムが誘導するＨＬ−６０およびＵ９３７の分化は、ＡＴＲＡによって誘導されるのとほぼ等しいかまたはそれより高いレベルまでＧＭ−ＣＳＦによって増強された（図１５）。James et al., Leukemia 11, 1017 (1997)において報告されたこれまでの結果と一致して、ＧＭ−ＣＳＦ単独ではＨＬ−６０（図１５Ａ）およびＵ９３７（図１５Ｂ）の分化にわずかな作用しか示さず、ＮＢＴ陽性細胞の最大上昇（８〜１０％）は６日目であった。興味深いことに、ＧＭ−ＣＳＦおよびスチボグルコン酸ナトリウムの両方の存在下で培養したＨＬ−６０におけるＮＢＴ陽性細胞のパーセンテージは、スチボグルコン酸ナトリウム単独での６０％（図１５Ａ）またはＡＴＲＡ単独での９０％（図１４Ｂ）と比較して８３％に上昇した。より劇的に、Ｕ９３７細胞でのＧＭ−ＣＳＦとスチボグルコン酸ナトリウムの組合せは、スチボグルコン酸ナトリウム単独（５５％）（図１５Ｂ）またはＡＴＲＡ単独（７３％）（図１４Ｄ）の場合よりも高い、８０％細胞分化を誘導した。これに対し、ＧＭ−ＣＳＦ単独では、以前の報告と一致して、ＮＢ４細胞分化に検出可能な作用を示さず、同等の条件下でスチボグルコン酸ナトリウム誘導のＮＢ４細胞分化を上昇させなかった。
【０１６０】
Ｃ．考察
【０１６１】
これらのデータは、これまでリーシュマニア症のために使用されており、ＰＴＰアーゼ阻害剤であることが認められた薬剤であるスチボグルコン酸ナトリウムが、インビトロでＡＭＬ細胞系ＮＢ４、ＨＬ−６０およびＵ９３７の分化を誘導することを明らかにする。これらのデータは、スチボグルコン酸ナトリウムが、ＮＢＴ陽性細胞の増加によっておよびＣＤ１１ｂ表面マーカー（ＮＢ４）の発現上昇によって示されたように、ＮＢ４、ＨＬ−６０およびＵ９３７細胞の顆粒球様成熟を誘導することを示した。前記薬剤のこの分化誘導活性は、比較的短期の暴露後に本剤の低用量で検出可能であった。最適用量での長期的暴露により、スチボグルコン酸ナトリウムはＡＴＲＡによって誘導されるものに比肩し得るＮＢ４細胞の分化レベルを誘導する。ＡＴＲＡによって誘導されるのと同様の高いレベルのＨＬ−６０およびＵ９３７細胞の分化は、ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせたスチボグルコン酸ナトリウムの最適用量によっても達成された。データはさらに、スチボグルコン酸ナトリウム誘導の分化が不可逆的であり、増殖停止および、おそらくアポトーシスによる、細胞死に結びつくことを明らかにする。これらの結果は、インビトロでのＡＭＬ細胞系における本剤の著明な分化誘導活性を明らかにし、スチボグルコン酸ナトリウムをＡＭＬ治療における分化誘導療法の候補物質として指示した。
【０１６２】
これらの結果は、スチボグルコン酸ナトリウムが種々のＦＡＢクラスのＡＭＬ細胞の分化を誘導する上で有効であり得ることを示唆した。これは、Ｍ３（ＮＢ４およびＨＬ−６０）およびＭ５（Ｕ９３７）サブクラスを代表するＡＭＬ細胞系でのその分化誘導活性によって示される。Ｍ２サブクラスを代表するヒトＡＭＬ細胞系ＡＭＬ−３の分化を誘導する上でのその作用によって裏付けられる。スチボグルコン酸ナトリウムはＰＴＰアーゼ阻害剤であるので、スチボグルコン酸ナトリウムがＡＭＬ細胞における１またはそれ以上のＰＴＰアーゼを直接標的することによって分化を誘導すると予想される。そのような機構は、見かけ上、ＡＴＲＡで処置したＮＢ４細胞において分解される、ＡＴＲＡの主要標的であるＰＭＬ／ＲＡＲ−αキメラタンパク質とは独立して機能する。これは、スチボグルコン酸ナトリウムがＮＢ４細胞におけるＰＭＬ／ＲＡＲ−αキメラタンパク質の発現レベルに検出可能な作用を及ぼさず、分化誘導においてＡＴＲＡと相乗作用しなかったことから明白である。分化誘導におけるスチボグルコン酸ナトリウムのこの異なる機構は、スチボグルコン酸ナトリウムがＡＴＲＡ治療に対して不応答性であるまたは抵抗性を発現したＡＭＬ症例において特に有用であり得ることを示唆する。
【０１６３】
ＡＭＬ分化において鍵となるスチボグルコン酸ナトリウム標的は、本剤に対して比較的感受性のないＰＴＰアーゼの中にあると考えられる。これは、１０μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウムによる感受性ＰＴＰアーゼ（例えばＳＨＰ−１）の完全な阻害および１００μｇ／ｍｌ超での非感受性ＰＴＰアーゼの同様の阻害を示した、本阻害剤に対する種々の感受性のＰＴＰアーゼについての上記所見に基づく。そしてそれは、ＡＭＬ細胞分化を誘導する上でのスチボグルコン酸ナトリウムの最適用量が１００μｇ／ｍｌより大きいレベルであるというここで提示したデータによって裏付けられる。これに関して、ＡＭＬにおけるＨｅＰＴＰの増幅および過剰発現の関与は興味深く、ＰＴＰアーゼを本剤の候補標的として示唆する。スチボグルコン酸ナトリウム感受性およびスチボグルコン酸ナトリウム抵抗性ＡＭＬ細胞系のＰＴＰアーゼ発現プロフィールの特性決定は、ＡＭＬ分化における推定上のＰＴＰアーゼ標的を特定するのに役立つ。
【０１６４】
ＮＢ４およびＨＬ−６０ＩＵ９３７細胞の分化を誘導するためのスチボグルコン酸ナトリウムの最適用量はそれぞれ２５０μｇ／ｍｌおよび４００μｇ／ｍｌである。リーシュマニア症治療のための標準用量は、１０μｇ／ｍｌまたはそれ以上の血清レベルを生じさせる１０−２０ｍｇ／ｋｇ／日である。しかし、８０〜１４３ｍｇ／ｋｇという高用量がリーシュマニア症治療において使用されたことがあるので、より高い薬剤用量が臨床的に達成可能であり、耐容され得る。それにもかかわらず、標準用量のスチボグルコン酸ナトリウムであっても、より低用量（例えば１０μｇ／ｍｌ）の薬剤がＡＭＬ細胞における分化誘導活性を示したので（図９）、ある種の治療的恩恵を有すると考えられる。
【０１６５】
ＧＭ−ＣＳＦがＨＬ−６０およびＵ９３７のスチボグルコン酸ナトリウム誘導性分化を上昇させるという所見は、ＡＭＬ治療における２つの試薬の組合せの臨床使用の潜在的可能性を示唆した（図１５）。スチボグルコン酸ナトリウムとＧＭ−ＣＳＦの間でのそのような相互作用は、ＧＭ−ＣＳＦのシグナル伝達を上昇させる上での本剤の活性および骨髄性細胞へのサイトカインの生物学的作用を考慮すると予想外ではない。しかし、スチボグルコン酸ナトリウムとＧＭ−ＣＳＦの併用は、分化誘導における２つの試薬間の陽性相互作用が、サイトカインに対して応答性ではないＮＢ４細胞では検出されなかったので、ＡＭＬ症例のサブグループに対してのみ利益になると考えられる。さらに、スチボグルコン酸ナトリウムはまた、ＡＭＬ細胞の分化誘導において他のサイトカインとも相互作用し得る。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮはＡＭＬ細胞の分化を増強することが報告された。ＧＭ−ＣＳＦと同様に、前記２つのサイトカインは、スチボグルコン酸ナトリウムによって増強され得るＪａｋ／Ｓｔａｔ経路を通してシグナル伝達する。
【０１６６】
ＩＩＩ．ＰＴＰアーゼ阻害剤であるスチボグルコン酸ナトリウムは、ＩＦＮと協力してインビトロでヒト癌細胞系の増殖を阻害する。
【０１６７】
抗腫瘍薬としてのスチボグルコン酸ナトリウムの潜在的可能性を探るため、インビトロでの様々なヒト癌細胞系の増殖へのその作用を検討した。データは、単独でまたはＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βと組み合わせて使用したスチボグルコン酸ナトリウムが、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、黒色腫、前立腺癌、乳癌、腎癌および膀胱癌の種々のヒト細胞系のインビトロ増殖を阻害する上で有効であったことを明らかにする。さらに、スチボグルコン酸ナトリウムのこの抗癌作用は、特定細胞タンパク質のチロシンリン酸化の増強および細胞アポトーシスの誘導に関連していた。癌細胞のＩＦＮ抵抗性を克服する上でのスチボグルコン酸ナトリウムの有効性は、サイトカインに応答して部分的増殖阻害だけを示した癌細胞系の、単独またはＩＦＮ−αと組み合わせたスチボグルコン酸ナトリウムによるほぼ完全な死滅によって指示された。スチボグルコン酸ナトリウムの広いインビトロ抗癌活性は、単独薬剤としてまたはＩＦＮ−α／−βと組み合わせた新規抗癌剤としてのその潜在的可能性を示唆する。さらに、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ  ＰＴＰアーゼを標的することによってＪａｋ／Ｓｔａｔシグナル伝達を上昇させる本剤の能力は、本剤がＪａｋ／Ｓｔａｔ経路を通してシグナル伝達する造血増殖因子およびサイトカインの他の治療において有効であることを示唆する。
【０１６８】
Ａ．実験材料および方法
【０１６９】
１．試薬。
【０１７０】
組換えヒトＩＦＮ−α（ＩＦＮ−α−２ｂ、比活性２×１０8単位／ｍｇタンパク質、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）およびスチボグルコン酸ナトリウムは以前に記述されている(Phatak et al., J. Immunol. 167, 3391 (2001))。組換えヒトＩＦＮ−β（比活性２×１０8単位／ｍｇタンパク質）はＡｅｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）より入手した。ホスホチロシン（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，Ｎ．Ｙ．）、ホスホチロシンＳｔａｔ１およびＳｔａｔ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆ．）、およびβ−アクチン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ．）についての抗体は、記載した市販のソースから購入した。
【０１７１】
２．細胞、細胞培養および細胞増殖アッセイ。
【０１７２】
ヒト細胞系を、３７℃の１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０またはＤＭＥＭ培地に維持した。ＤＳおよびＤＲ（Ｆａｎ  Ｄｏｎｇ，ｔｈｅ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＣＣＦ））、Ｕ２６６、ＤＵ１４５およびＣ４２（Ａｌｅｘ  Ａｌｍａｓａｎ，ＣＣＦ）、Ｐｅｅｒ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｎｆｉｅｌｄ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）、Ｈ９（ＡＴＣＣ）、ＷＭ９およびＷＭ３５（Ｅｒｎｅｓｔ  Ｂｏｒｄｅｎ，ＣＣＦ）、ＭＤＡ２３１およびＭＤＡ４３５（Ｇｒａｈａｍ  Ｃａｓｅｙ，ＣＣＦ）、ＷｉＴ４９−Ｎ１（Ｂｒｙａｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＣＣＦ）、ＲＣ４５および５６３７（Ｓ．Ｋ．Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ，ＣＣＦ）を試験において使用した。
【０１７３】
細胞増殖アッセイのために、細胞を、９６穴プレートにおいて様々な量のＩＦＮおよび／またはスチボグルコン酸ナトリウムを含む１０％ＦＣＳ培地で増殖させ、指示されているように３７℃で３または６日間培養した。増殖アッセイにおける生存細胞数を、Phatak et al., J. Immunol. 167, 3391 (2001)に述べられているようにＭＴＴアッセイによって測定した。
【０１７４】
３．薬剤相互作用分析
【０１７５】
薬剤間の相互作用を検討する最も一般的な形態を提供する、半数効果（median effect）分析(Chou et al., Adv. Enzyme Regul. 22, 27 (1984))を、スチボグルコン酸ナトリウムとＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの間の相互作用を分析するために使用した。各々の薬剤単独および併用についても、用量反応曲線を作成した。半数作用プロットを、ＩＦＮ単独、スチボグルコン酸ナトリウム単独および併用について作成した。併用指数（ＣＩ）を決定し、影響を与えた分画（ＦＡ）に対してプロットした。データを、相互に排他的および相互に非排他的の両方のモードで解析した。２つの相互に非排他的な薬剤の間の相互作用は、方程式ＣＩ＝Ｄ1／Ｄx1＋Ｄ2／Ｄx2＋Ｄ1Ｄ2／Ｄx1Ｄx2［式中、Ｄx1およびＤx2は、増殖をｘ％阻害するために必要な薬剤１および薬剤２の用量である］によって表わされる。Ｄ1とＤ2の併用も増殖をｘ％阻害する（すなわち薬剤１と薬剤２は等効果である）。ＣＩ＜１であるとき薬剤は相乗作用性であり、ＣＩ＝１であるとき薬剤は付加的であり、およびＣＩ＞１であるとき薬剤は拮抗的である。
【０１７６】
４．アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウムアッセイによるアポトーシス細胞の検出
【０１７７】
暴露した膜リン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）のアネキシンＶ染色を、アネキシンＶアッセイキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて実施した。簡単に述べると、Ｕ２６６またはＷＭ９細胞を、スチボグルコン酸ナトリウム、ＩＦＮ−αまたはその両方の不在下または存在下で１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ  １６４０培地において３日間培養した。次に細胞をＰＢＳ中で２回洗い、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムを含む結合緩衝液（１０ｍＭヘペス、ｐＨ７．４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；２．５ｍＭ ＣａＣｌ2）中で１５分間染色した。１０容量の結合緩衝液を添加して反応を停止させ、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆａｃｓｖａｎｔａｇｅ）または蛍光顕微鏡によって分析した。
【０１７８】
５．ＩＦＮ−αおよび／またはスチボグルコン酸ナトリウムによるＳｔａｔ１チロシンリン酸化の誘導
【０１７９】
スチボグルコン酸ナトリウムの不在下または存在下でのＩＦＮ−αによるＳｔａｔ１チロシンリン酸化の誘導のために、３７℃の１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ  １６４０培地での細胞増殖をＩＦＮ−α（５０ｕ／ｍｌ）によって様々な時点で刺激し、スチボグルコン酸ナトリウムで５分間処置するかまたは処置しなかった後、細胞を低温溶解緩衝液（１％ＮＰ−４０；５０ｍＭ トリス、ｐＨ ７．４；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ グリセロール、１０ｍＭ モリブデン酸ナトリウムおよび４ｍＭ ＡＥＢＳＦ）に溶解して終了した。
【０１８０】
６．細胞溶解産物の調製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法。
【０１８１】
細胞を低温溶解緩衝液に３０分間溶解して細胞溶解産物を調製し、４℃、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって透明化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、細胞溶解産物を等容量の２ＸＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合し、９０℃で５分間加熱して、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の細胞タンパク質をニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，Ｎ．Ｈ．）に移し、５％ 乳でブロックして、抗体でプローブし、増強化学発光キット（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ．）を用いて検出した。
【０１８２】
Ｂ．結果
【０１８３】
１．スチボグルコン酸ナトリウムは造血系悪性疾患のヒト細胞系のインビトロ増殖を阻害し、ＩＦＮ−α誘導の細胞増殖阻害を上昇させる。
【０１８４】
スチボグルコン酸ナトリウムは、ＩＦＮ−α抵抗性リンパ腫細胞系ＤＲのＩＦＮ−α誘導性増殖阻害を著明に上昇させた。ＤＲおよびＤＳ細胞系は、親ヒトリンパ腫細胞系Ｄａｕｄｉに由来し、それぞれＩＦＮ−αに対して抵抗性または感受性であった。ＩＦＮ−αに対するそれらの感受性と一致して、ＩＦＮ−α（１，０００ｕ／ｍｌ）の存在下で培養したＤＳ細胞は３日目までにほぼ完全に除去された（図１６Ｃ）。これに対し、ＩＦＮ−α処置はＤＲ細胞の１９％の増殖阻害しか生じさせなかった（図１６ＡおよびＢ）。重要な点として、ＩＦＮ−α誘導のＤＲ細胞増殖阻害は、様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムの存在下で４６〜６９％に上昇した（図１６ＡおよびＢ）。スチボグルコン酸ナトリウムによるＩＦＮ−α誘導の増殖阻害の上昇はＤＲ細胞の長期的培養物においても認められ（図１６Ｄ）、３９％のＩＦＮ−α誘導性増殖阻害が、１２．５μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウムの存在下でそれぞれ８０％および９２％に上昇した。興味深いことに、ＰＴＰアーゼ阻害剤自体が、より高い用量でＤＲ細胞に対する著明な活性を示した：単独薬剤として５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌで６日目培養物においてＤＲ細胞の増殖をほぼ完全に排除した（９５〜９９％）（図１６Ｄ）。スチボグルコン酸ナトリウム自体は、ＤＳ細胞に対して控えめな活性を示した（図１６Ｃ）。
【０１８５】
単独またはＩＦＮ−αと組み合わせたスチボグルコン酸ナトリウムによるＤＲ細胞の著明な増殖阻害のこの初期所見は、ヒト造血系悪性疾患の他の細胞系に対するその作用の測定を促した。Ｕ２６６は、現在はＩＦＮ−αで治療される疾患である、ヒト多発性骨髄腫の細胞系である。やはり、Ｕ２６６細胞のＩＦＮ−α誘導性増殖阻害の上昇が、前記薬剤自体の実質的な増殖阻害活性と共に検出された（図１６Ｅ）。スチボグルコン酸ナトリウムによるＩＦＮ−αの増殖阻害活性の様々な程度の上昇が、Ｔ−リンパ腫（Ｈ９）およびＴ−ＡＬＬ（Ｐｅｅｒ）の他の細胞系においても認められた（表１）。
【０１８６】
２．スチボグルコン酸ナトリウムは非造血系悪性疾患のヒト細胞系のインビトロ増殖を阻害し、ＩＦＮ−α誘導の細胞増殖阻害を上昇させる。
【０１８７】
ヒト造血系悪性疾患の細胞系においてＩＦＮ−α誘導の細胞増殖阻害を上昇させるおよび単独で増殖阻害を生じさせるスチボグルコン酸ナトリウムの作用は、本剤が、様々な非造血組織で発現するＰＴＰアーゼ（例えばＰＴＰ１ＢおよびＳＨＰ−２）に対して阻害活性を有するので、非造血系癌細胞に対する本剤の潜在的活性を示唆した。
【０１８８】
いくつかの固形腫瘍細胞系が、単独またはＩＦＮ−αと組み合わせたＰＴＰアーゼ阻害剤に対して感受性であることが認められた。ＷＭ９（黒色腫）、ＭＤＡ２３１（乳癌）およびＤＵ１４５（前立腺癌）のＩＦＮ−α誘導性増殖阻害はスチボグルコン酸ナトリウムによって増強された（図１７Ａ、ＢおよびＣ）。ＤＲリンパ腫細胞系と同様に、これらの腫瘍細胞系は単独薬剤としてのＰＴＰアーゼ阻害剤に感受性であり、単独薬剤としてのＰＴＰアーゼ阻害剤は、５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ用量で６日目培養物において全細胞を死滅させた（図１７）。ウィルムス腫瘍細胞系ＷｉＴ４９−Ｎ１もスチボグルコン酸ナトリウムに対して感受性であったが、その増殖阻害活性はＩＦＮ−αによって増強されなかった（図１７Ｄ）。
【０１８９】
付加的な細胞系における本剤のさらなる試験は、スチボグルコン酸ナトリウムに対する感受性が腫瘍型特異的ではなく、個々の細胞系に固有であることを明らかにした。感受性ＷＭ９黒色細胞系と対照的に、ＷＭ３５黒色細胞系はスチボグルコン酸ナトリウムによってごくわずかしか影響を受けなかった（表１）。ＤＲ１４５前立腺癌細胞系と異なり、Ｃ４２前立腺癌細胞系はこの阻害剤に対して高度抵抗性であった（表１）。ＩＦＮ−αおよびスチボグルコン酸ナトリウムに対するいくつかの他のヒト腫瘍細胞系の増殖応答も測定した（表１）。
【０１９０】
３．スチボグルコン酸ナトリウムはＷＭ９細胞のＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β誘導性増殖阻害を相乗作用的に上昇させる。
【０１９１】
スチボグルコン酸ナトリウムによるＩＦＮ−α誘導性細胞増殖阻害の上昇がこの薬剤の組合せに固有であるかどうかをさらに検討するため、現在はサイトカインによって治療される、ヒト黒色腫のＷＭ９細胞系のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β誘導性増殖阻害への本剤の作用を比較した。
【０１９２】
ＷＭ９細胞の増殖はＩＦＮ−αによって抑制され（図１８Ａ）、ＩＦＮ−βによってより強力に抑制された（図１８Ｂ）。スチボグルコン酸ナトリウムの存在下で、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β誘導の増殖阻害は大きく増強された（図１８）。スチボグルコン酸ナトリウムによるＩＦＮ−α／ＩＦＮ−β誘導の増殖阻害のこの増強は、スチボグルコン酸ナトリウム（１２．５〜５０μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ（１２．５〜５０単位／ｍｌ）の低用量レベルで最も劇的であったが、より高い用量範囲でも検出可能であった（図１８）。それ故、スチボグルコン酸ナトリウムはＷＭ９細胞に対するＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの増殖阻害活性を増強する上で有効であった。
【０１９３】
ＩＦＮ−α／スチボグルコン酸ナトリウムおよびＩＦＮ−β／スチボグルコン酸ナトリウムの組合せの薬剤相互作用の性質を調べるため、図１８に示すデータを、薬剤相互作用を協力的（ＣＩ＜１）、付加的（ＣＩ＝１）または拮抗的（ＣＩ＞１）と規定する併用指数（ＣＩ）値を導くための半数効果分析に供した。相互に排他的および非排他的の両方のモードで算定した結果は、ＩＦＮ−α／スチボグルコン酸ナトリウム（図１９Ａ）およびＩＦＮ−β／スチボグルコン酸ナトリウム（図１９Ｂ）の組合せの薬剤相互作用は、１未満のＣＩ値を特徴として、試験した全ての用量で協力的であった。スチボグルコン酸ナトリウムとＩＦＮ−αの組合せによって達成されたＤＲ、ＤＲ１４５およびＭＤＡ２３１細胞の増殖阻害がＷＭ９細胞の場合と同様であったので（図１７）、結果はやはり、それらの細胞系における２つの薬剤の協力的相互作用を示唆した。
【０１９４】
４．スチボグルコン酸ナトリウムによるヒト癌細胞系の増殖阻害はアポトーシスの誘導に結びつく。
【０１９５】
単独および／またはＩＦＮ−αと組み合わせたスチボグルコン酸ナトリウムによる腫瘍細胞系の著明な増殖阻害は、ＰＴＰアーゼ阻害剤による細胞死の誘導を指示した。それ故、スチボグルコン酸ナトリウム、ＩＦＮ−αまたはその両方の存在下で増殖させたＵ２６６およびＷＭ９細胞系のアポトーシス細胞の数を測定した。
【０１９６】
Ｕ２６６細胞のアポトーシス上昇がスチボグルコン酸ナトリウム単独の存在下で検出され、阻害剤とＩＦＮ−αの両方の存在下では上昇がより劇的であった（図２０）。スチボグルコン酸ナトリウム（１００μｇ／ｍｌ）の存在下で、アポトーシス細胞のパーセンテージは８％（図２０Ａ）から１７％（図２０Ｃ）に上昇した。ＩＦＮ−α（１０００単位／ｍｌ）は１６％のアポトーシスを誘導した（図２０Ｂ）。スチボグルコン酸ナトリウムとＩＦＮ−αの両方が存在するとき、アポトーシス細胞の数は４２％に上昇した（図２０Ｄ）。蛍光顕微鏡で評価したとき、スチボグルコン酸ナトリウム、ＩＦＮ−αまたはその両方の存在下でＷＭ９細胞は、５％（対照）からそれぞれ１１％、１５％または３１％に増加した。それ故、スチボグルコン酸ナトリウムとＩＦＮ−αによるこれらの腫瘍細胞系の増殖阻害は、少なくとも一部には、アポトーシスを誘導することによって媒介された。
【０１９７】
５．スチボグルコン酸ナトリウムによるＩＦＮ−α誘導の細胞増殖阻害の上昇は増強したＳｔａｔ１チロシンリン酸化と相関する。
【０１９８】
ＩＦＮ−α誘導の細胞増殖阻害を上昇させる上でのスチボグルコン酸ナトリウムのシグナル伝達機構を検討するため、明らかにサイトカインの抗細胞作用を媒介する、Ｓｔａｔ１のＩＦＮ−α誘導性チロシンリン酸化へのスチボグルコン酸ナトリウムの作用を測定した。
【０１９９】
ＩＦＮ−α誘導のＳｔａｔ１チロシンリン酸化は、増殖阻害におけるＩＦＮ−αとスチボグルコン酸ナトリウムの相乗作用が検出された細胞系（ＤＲ、ＷＭ９およびＤＵ１４５）（図１６および１７）においてスチボグルコン酸ナトリウムの存在下で増強された。スチボグルコン酸ナトリウムの不在下では、ＤＲ細胞におけるＳｔａｔ１チロシンリン酸化はＩＦＮ−αによって３０分以内に誘導され、刺激後５時間目までに低下した（図２１Ａ、レーン１〜３）。スチボグルコン酸ナトリウム（１０μｇ／ｍｌ）の存在下では、刺激後３０分目のＳｔａｔ１チロシンリン酸化は対照の約２倍であり（図２１Ａ、レーン２および５）、５時間高いままであった（図２１Ａ）。ＩＦＮ−αによる刺激後５時間目のＳｔａｔ１チロシンリン酸化増強は、スチボグルコン酸ナトリウムの存在下で培養したＷＭ９およびＤＵ１４５細胞においても検出された（図２１Ｂ）。これに対し、スチボグルコン酸ナトリウムは、ＩＦＮ−αとスチボグルコン酸ナトリウムの間で抗増殖相乗作用が検出されなかったＷＭ３５およびＷｉＴ４９−Ｎ１細胞系（表１および図１７Ｄ）では、スチボグルコン酸ナトリウムはＩＦＮ−α誘導のＳｔａｔ１チロシンリン酸化を増強することができなかった（図２１Ｂ）。ＩＦＮ−αの不在下では、スチボグルコン酸ナトリウムはＤＲ細胞において単独でＳｔａｔ１チロシンリン酸化を誘導することができなかった（図２１Ａ）。ＷｉＴ４９−Ｎ１細胞におけるＩＦＮ−α誘導のＳｔａｔ１チロシンリン酸化は、スチボグルコン酸ナトリウムの存在下で上昇しなかった（図２１Ｂ）。
【０２００】
造血細胞においてＪａｋ／Ｓｔａｔリン酸化を調節することが知られるＳＨＰ−１の関与を評価するため、腫瘍細胞系におけるＰＴＰアーゼの発現（図２１）を測定した。予想されたように、ＳＨＰ−１タンパク質はＤＲ細胞において容易に検出された（図２１Ａ）。しかし、ＳＨＰ−１タンパク質は、ウィルムス腫瘍細胞系（ＷｉＴ４９−Ｎ１）および前立腺癌細胞系（ＤＵ１４５）には存在したが、２つの黒色腫細胞系では検出不能であった（図２１Ｂ）。それ故、ＷＭ９細胞におけるＩＦＮ−α誘導のＳｔａｔ１チロシンリン酸化の増強はＳＨＰ−１の不在下で起こり、ＰＴＰアーゼ阻害剤に対して感受性の他のＰＴＰアーゼによって媒介されると考えられる。
【０２０１】
Ｃ．考察
【０２０２】
ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βに対する癌細胞の抵抗性は、抗癌治療におけるこれらのサイトカインの臨床適用を制限する主要な問題である。癌細胞のＩＦＮ抵抗性の機構は十分には理解されておらず、ＩＦＮシグナル伝達の低下が癌細胞においてしばしば検出され、重要な因子であると考えられている。ＩＦＮシグナル伝達を上昇させる治療薬は、癌細胞におけるそのような抵抗性を克服するのに役立ち得るが、まだ報告されていない。
【０２０３】
これらのデータは、スチボグルコン酸ナトリウムがＩＦＮシグナル伝達を上昇させ、様々なヒト癌細胞系におけるＩＦＮ抵抗性を克服できることの証拠を提供する。本剤によるＩＦＮ−αシグナル伝達の上昇は、ＷＮ−α誘導のＳｔａｔ１リン酸化の増強によって明らかに示された。この活性は、臨床的に良好に耐容される濃度である、その治療濃度（１０〜２０μｇ／ｍｌ）で検出可能であった。さらに、ＩＦＮ−αシグナル伝達を上昇させる本剤の活性は、ＩＦＮ−αが誘導する様々なヒト癌細胞系の増殖阻害の増強を伴うので、ＩＦＮ抵抗性を克服する上で有効であった。
【０２０４】
２５〜１００μｇ／ｍｌの本剤は、単独薬剤としてのＩＦＮ−αによって部分的にしか阻害されない細胞系のＩＦＮ抵抗性を克服するのに極めて有効であった。これは、本剤とＩＦＮ−αの併用によるＷＭ９黒色腫細胞の完全な除去によって良好に示されたが、前記２つの薬剤個々では、それぞれ７５％および５８％の増殖阻害しか達成されなかった。同様に、ＩＦＮ−αと組み合わせた２５μｇ／ｍｌの本剤は、２つの薬剤個別によるＭＤＡ２３１乳癌細胞の６５％および７９％の増殖阻害に比して、前記細胞のほぼ完全な除去を達成した。単独またはＩＦＮ−αと組み合わせた本剤のこのインビトロでの抗癌活性は、ＷＭ９細胞およびＵ２６６細胞においてアポトーシスの誘導を含むことが示された。リーシュマニア症治療のための標準用量は、１０μｇ／ｍｌまたはそれ以上の血清レベルを生じさせる１０〜２０ｍｇ／ｋｇ／日であるが、それより高い薬剤用量が臨床的に達成可能であり、耐容され得る。８５０ｍｇ／ｋｇ／日の高用量がリーシュマニア症治療において使用されたことがある。
【０２０５】
スチボグルコン酸ナトリウムがＩＦＮ−β誘導の増殖阻害も上昇させるという所見は、本剤が、癌並びに現在このサイトカインで治療されるいくつかの他の疾患（例えばＢ型肝炎および多発性硬化症）の治療においてＩＦＮ−β療法の効果を改善し得ることを示唆した。さらに、ＩＦＮのようにＪａｋ／Ｓｔａｔ経路を通してシグナル伝達するＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦに対する細胞応答の薬剤増強のこれまでの所見に基づく仮説である、ＰＴＰアーゼ阻害剤の標的の中に、Ｊａｋ／Ｓｔａｔタンパク質を脱リン酸化することによってサイトカインシグナル伝達を下方調節するＪａｋ／ＳｔａｔＰＴＰアーゼが存在することの付加的な証拠を提供した。ＰＴＰアーゼＳＨＰ−１およびＣＤ４５は、造血細胞においてＪａｋ／Ｓｔａｔチロシンリン酸化を下方調節することが知られている。ＩＦＮ−α誘導のＳｔａｔ１リン酸化が本剤によって増強されたＷＭ９細胞においてＳＨＰ−１（図２１Ｂ、レーン１〜３）およびＣＤ４５の発現が検出不能であったので、それらの結果は、これらの細胞における薬剤標的として他のＳｔａｔ１調節性ＰＴＰアーゼの存在を指示する。しかしデータは、造血細胞における薬剤標的としてのＳＨＰ−１またはＣＤ４５の関与を排除しない。Ｊａｋ／ＳｔａｔＰＴＰアーゼを標的する薬剤のこの機構は、ＰＴＰアーゼ阻害剤が、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ経路を通してシグナル伝達する他のサイトカインのシグナル伝達を上昇させる同様の活性を有することを予測させる。Ｊａｋ／Ｓｔａｔ経路を通してシグナル伝達する多くのサイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１２）が抗癌治療において使用されており、それらはＰＴＰアーゼ阻害剤と組み合わせて改善され得る。
【０２０６】
ＷＭ９黒色腫細胞系の増殖阻害におけるＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βとスチボグルコン酸ナトリウムの相互作用は明らかに相乗作用的であった。本剤とＩＦＮの間のそのような相乗作用は、ＰＴＰアーゼ阻害剤によるＩＦＮ誘導のＳｔａｔ１リン酸化の増強と一致する。いくつかの他の薬剤がＩＦＮと相乗作用することが示されているが、スチボグルコン酸ナトリウムはＩＦＮシグナル伝達経路内の分子を標的することを通して働く最初のものである。
【０２０７】
データは、スチボグルコン酸ナトリウムがインビトロでヒト癌細胞系に対して著明な増殖阻害活性を有することを明らかにする。この活性は高用量で（２５〜１００μｇ／ｍｌ）で最も劇的であったが、治療濃度で実質的な活性が検出可能であった。例えば１００μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウムは、ＤＲ、ＤＵ１４５、ＭＤＡ２３１およびＷｉＴ４９−Ｎ１細胞系の６日目培養物において細胞の完全なまたはほぼ完全な死滅を達成した。１００μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウムの存在下でのＷＭ９およびＵ２６６細胞のアポトーシス上昇によって示されたように、細胞アポトーシスの誘導が癌細胞の死滅において役割を果たすと考えられる。ＩＦＮ誘導のＪａｋ／Ｓｔａｔリン酸化およびシグナル伝達を上昇させるＪａｋ／ＳｔａｔＰＴＰアーゼを標的することによって媒介される、ＩＦＮと治療濃度の本剤の相乗作用と異なり、スチボグルコン酸ナトリウム単独では、１０ｐｇ／ｍｌ（図２１Ａ、レーン４）またはより高い濃度でＳｔａｔ１リン酸化を誘導することができなかったことに示されるように、この活性はおそらくＪａｋ／Ｓｔａｔ経路とは無関係な他のＰＴＰアーゼによって媒介されると考えられる。
【０２０８】
スチボグルコン酸ナトリウム単独に対するある種のヒト癌細胞系の感受性は、がん治療における単独薬剤としてのスチボグルコン酸ナトリウムの潜在的有効性を示唆する。これに関して、薬剤感受性が腫瘍型特異的ではなく個々の癌細胞系に固有であるという所見は、癌細胞における薬剤感受性および薬剤抵抗性のマーカーの特定の重要性を強調する。薬剤抵抗性は、標的ＰＴＰアーゼまたはＰＴＰアーゼ基質の不在によるものであり、薬剤抵抗性細胞はこれらの分子なしで増殖するように適応したと考えられる。
【０２０９】
ＩＶ．スチボグルコン酸ナトリウムは、ヌードマウスにおいてインビボでヒト黒色腫ＷＭ９腫瘍を根絶し、ヒト前立腺癌ＤＶ１４５腫瘍を著明に抑制するようにＩＦＮ−αと相乗作用する。
【０２１０】
スチボグルコン酸ナトリウムが、臨床的に達成可能であり、耐容される用量で、インビボで抗癌活性を有するかどうかを調べるため、ヌードマウスおけるヒト黒色腫ＷＭ９およびヒト前立腺癌ＤＵ１４５異種移植片に対する、単独薬剤としてまたはＩＦＮ−αとの組合せとしてのスチボグルコン酸ナトリウムの効果を測定した。
【０２１１】
Ａ．実験方法
【０２１２】
以下の配慮に基づき、ＷＭ９およびＤＵ２６６細胞系を試験のために選択した：１）２つの細胞系は、上述した試験において単独薬剤としてまたはＩＦＮ−αとの組合せとしてのスチボグルコン酸ナトリウムに感受性であることが認められた（図１７ＡおよびＢ）；２）どちらの細胞系もヌードマウスにおいて腫瘍形成性であることが知られている；３）これらの細胞系は、有効な治療がない重大の健康上の脅威であるヒト悪性疾患を代表する；４）ＩＦＮ−αは黒色腫および前立腺癌の治療において使用され、控えめな結果を収めているが、このサイトカインと相乗作用するスチボグルコン酸ナトリウムとの併用療法によってその結果が有意に改善されると考えられる。
【０２１３】
ＷＭ９またはＤＵ１４５異種移植片を担持するヌードマウスをＩＦＮ−α（５００，０００Ｕ、皮下、毎日）、スチボグルコン酸ナトリウム（１２ｍｇＳｂ、皮下、毎日）またはその両方で処置した。処置のために使用したＩＦＮ−αの量は、同様の試験で使用された用量と同等である。スチボグルコン酸ナトリウムの用量は、２０ｍｇＳｂ／ｋｇの標準治療用量および重篤な毒性を伴わずに偶発的に臨床で使用された高用量（１４３ｍｇＳｂ／ｋｇ）よりも実質的に高い、約４４０ｍｇＳｂ／ｋｇ体重（平均マウス体重２７ｇ）に相当する。このスチボグルコン酸ナトリウムの用量は、マウスが２０ｍｇＳｂ（約７００〜８００ｍｇＳｂ／ｋｇ）の１日量を耐容できたというパイロット試験での以前の所見に基づいた。インビトロで癌細胞系の増殖を阻害する上でのスチボグルコン酸ナトリウムの作用が用量依存的であり、１００ｐｇＳｂ／ｍｌ（または１００μｇＳｂ／ｋｇ）で癌細胞の完全なまたはほぼ完全な死滅を生じさせたという所見も考慮された。インビボでの本剤の比較的迅速なクリアランス率に照らして、本剤の有効性の検出を確実にするために４４０ｍｇＳｂ／ｋｇ用量をこの初期試験に使用した。
【０２１４】
各々の細胞系について、０日目に１６匹のマウスの各々に、３×１０6細胞／部位（ＷＭ９）または２×１０6細胞／部位（ＤＵ１４５）、２部位／マウスの皮下注射を胸部領域に実施した。処置を行うためにマウスを４匹ずつの４群に分け、２日目から大腿領域に注射した。各々の腫瘍の２つの直交直径を測定するためにカリパスで腫瘍サイズを測った。ＮＣＩの方法（ミリメートルでの長さ×幅２／２＝立方ミリメートルでの容積）を用いて腫瘍容積を算定した。
【０２１５】
Ｂ．結果
【０２１６】
ヌードマウスにおいて単独薬剤としてのスチボグルコン酸ナトリウムはインビボで著明な抗腫瘍活性を有し、ヒト黒色腫ＷＭ９の異種移植片を根絶するようにＩＦＮ−αと相乗作用する。
【０２１７】
インビボでのスチボグルコン酸ナトリウムの抗腫瘍作用およびＩＦＮ−αとのその相乗作用を調べるため、ヌードマウスにおけるヒトＷＭ９黒色腫の異種移植片に対するスチボグルコン酸ナトリウム、ＩＦＮ−αおよびそれらの組合せの作用を測定した。ＷＭ９細胞をヌードマウスに接種し、次にマウスを、処置なし（対照）または接種後２日目から単独薬剤またはそれらの併用による２３日間の処置に供した。処置期間中、処置の効果の指標としてマウスにおけるＷＭ９異種移植片の腫瘍容積を測定した（図２２Ａ）。
【０２１８】
ヌードマウスにおけるＷＭ９細胞は腫瘍を形成し、全く処置を行わない場合、腫瘍は時間依存的に持続的増殖を示した。ＩＦＮ−α単独での処置は、マウスにおけるＷＭ９腫瘍増殖を有意に抑制し、処置期間の終了までに対照群の約４０％の平均腫瘍容積を生じさせた（図２２Ａ、２５日目のデータ）。興味深いことに、スチボグルコン酸ナトリウム単独による処置も、実験条件下でＩＦＮ−α処置を上回る劇的な腫瘍増殖抑制を生じさせた（２５日目に対照の約２０％の腫瘍容積）。最も驚くべきことには、スチボグルコン酸ナトリウムとＩＦＮ−αの併用による処置はＷＩＮＤ腫瘍の段階的縮小を導き、腫瘍は１８日目までに実質的に目に見えなくなった（図２２Ａ）。このマウス群における可視腫瘍の不在は２５日目の処置期間終了時まで続いた。この群の２匹のマウスを処置なしでさらに８週間観察した。この追加観察期間中、これらのマウスにおいて接種部位に目に見える腫瘍は検出されなかった。それ故、併用処置は、ヌードマウスにおいてあらかじめ形成されたＷＭ９腫瘍を根絶した。
【０２１９】
データの統計分析は、２５日目の群間での腫瘍容積の差が極めて有意であることを明らかにした（ｔ検定：対照対スチボグルコン酸ナトリウム、ＩＦＮ−αおよびスチボグルコン酸ナトリウム／ＩＦＮ−α、ｐ＜０．０１；スチボグルコン酸ナトリウム対ＩＦＮ−α、ｐ＜０．０１；スチボグルコン酸ナトリウム対スチボグルコン酸ナトリウム／ＩＦＮ−α、ｐ＜０．０１）。コンビナトリアル分析は、スチボグルコン酸ナトリウムとＩＦＮ−αの相互作用が相乗的であることを指示する。
【０２２０】
２．スチボグルコン酸ナトリウムはヌードマウスにおけるヒト前立腺癌ＤＵ１４５の異種移植片の増殖を著明に抑制する。
【０２２１】
インビボでのスチボグルコン酸ナトリウムの抗腫瘍作用およびＩＦＮ−αとのその相乗作用を調べるため、ヌードマウスにおけるヒトＤＵ１４５黒色腫の異種移植片に対するスチボグルコン酸ナトリウム、ＩＦＮ−αおよびそれらの組合せの作用を測定した。図２２Ｂに示すように、ヌードマウスにおけるＤＵ１４５細胞の接種は腫瘍の形成を生じさせ、腫瘍は、以前の試験と一致して、処置期間中の大部分の間ＩＦＮ−α単独療法によって有意に抑制されなかった。このサイトカインの控えめな抗腫瘍活性が処置期間の終了までに検出され、平均腫瘍容積は２５日目で対照の約７０％であった。これに対し、単独薬剤としてのスチボグルコン酸ナトリウムはＤＵ１４５腫瘍増殖を著明に抑制し、２５日目までに対照の約３０％の平均腫瘍容積を生じさせた。スチボグルコン酸ナトリウムのこの抗腫瘍活性は、本剤をＩＦＮ−αと組み合わせて使用したときさらに上昇した（平均腫瘍容積は２５日目で対照の１８％）。これらの結果は共に、スチボグルコン酸ナトリウムがヌードマウスにおいてＤＵ１４５異種移植片に対する著明な抗腫瘍活性を有することおよび本剤がヌードマウスにおいてＤＵ１４５異種移植片の著しい増殖阻害を達成するようにＩＦＮ−αと相互作用することを明らかにした。
【０２２２】
３．ＷＭ９およびＤＵ１４５異種移植片に対する有効用量のスチボグルコン酸ナトリウムはヌードマウスにおいて良好に耐容される。
【０２２３】
上記で論じたように、ヌードマウスの処置のために使用したスチボグルコン酸ナトリウムの用量は、皮下経路で毎日１２ｍｇＳｂ／マウス（または約４４０ｍｇ／ｋｇ体重）であった。この用量はリーシュマニア症のための標準用量（２０ｍｇＳｂ／ｋｇ、毎日）よりもはるかに高い。ヌードマウスにおけるそのような高用量のスチボグルコン酸ナトリウムの毒性を評価するための初期段階として、２５日の試験期間中のＷＭ９異種移植ヌードマウスの生存率および体重へのスチボグルコン酸ナトリウムの作用を測定した。
【０２２４】
ＷＭ９細胞を接種した１６匹のマウス全てが、それらの処置（対照、スチボグルコン酸ナトリウム、ＩＦＮ−αまたはその両方、４匹のマウス／群）に関わりなく試験の終了時まで生存した。スチボグルコン酸ナトリウムとＩＦＮ−αの併用処置に供したマウスの平均体重は、試験期間中、対照群のマウス（図２３）またはスチボグルコン酸ナトリウムまたはＩＦＮ−α処置群の平均体重と有意差を示さなかった。加えて、全般的外観、摂食または活動において４群のマウスの間で明らかな差は認められなかった。各々の群からの２匹のマウスの解剖は、内部器官の見かけ上の異常を示さなかった。併用処置群の２匹のマウスを処置なしでさらに８週間観察した。これらのマウスは、期間中、目に見える明らかな異常を示さず、処置が重篤な長期的副作用を生じさせなかったことを示唆した。
【０２２５】
Ｃ．考察
【０２２６】
これらの結果は、スチボグルコン酸ナトリウムが、単独薬剤として、インビボで２種類の腫瘍に対してＩＦＮ−αより高い有意の活性を示すことを明らかにする。さらに、スチボグルコン酸ナトリウムは、１６日間の併用処置によりヌードマウスにおいてＷＭ９腫瘍を根絶するようにＩＦＮ−αとの相乗作用を示した。スチボグルコン酸ナトリウムはまた、ＩＦＮ−αと相乗作用して、２剤を単独で使用した場合を上回る、ＤＵ−１４５腫瘍の著しい増殖阻害を達成することが認められた。
【０２２７】
加えて、インビボでのスチボグルコン酸ナトリウムおよび／またはＩＦＮ−αに対する２つの腫瘍細胞系の応答は、インビトロでのそれらの応答と相関した（図１７ＡおよびＢと図２２の結果を比較して）、すなわち上記のインビトロでの結果と同様に、インビボでＷＭ９細胞系はＤＵ１４５細胞系よりもスチボグルコン酸ナトリウムとＩＦＮ−αの併用処置に対して感受性であった。さらに、試験において使用した用量（１２ｍｇＳｂを毎日、または４４０ｍｇＳｂ／ｋｇを毎日）のスチボグルコン酸ナトリウムは重篤な副作用を伴わずに良好に耐容された。
【０２２８】
このデータからいくつかの結論が導かれた：（１）スチボグルコン酸ナトリウムは、臨床的に達成可能であり、耐容され得る用量で単独薬剤としてインビボで著明な広い抗腫瘍活性を有する。（２）インビボでスチボグルコン酸ナトリウムとサイトカイン、特にＩＦＮ−αの間で明らかにされた相乗作用は、スチボグルコン酸ナトリウムの併用が癌治療における現在のＩＦＮ−α療法を有意に改善し得ることを示唆する。（３）スチボグルコン酸ナトリウムはＰＴＰアーゼを標的し、それ故現在の抗癌治療とは異なる機構によって機能するので、本剤は、従来の抗癌治療に対して不応答性または抵抗性の癌についての代替療法として有用であり得る。（４）スチボグルコン酸ナトリウムまたはスチボグルコン酸ナトリウム／ＩＦＮ−αに対する癌細胞系のインビトロとインビボでの応答の相関は、上述した試験によって示されたように、インビトロでこれらの薬剤に対して感受性である他のヒト癌細胞系がインビボでもこれらの薬剤に対して応答性であることを指示する。これはさらに、感受性細胞系（例えばヒト乳癌細胞系ＭＤＡ２３１および多発性骨髄腫細胞系Ｕ２６６）によって示されるヒト悪性疾患が、スチボグルコン酸ナトリウム／ＩＦＮ−α併用療法から恩恵を受け得ることを示唆する。（５）ヌードマウス試験は、インビトロで検出されたスチボグルコン酸ナトリウムとＩＦＮ−αの相乗作用がインビボでも起こることを確認したので、上述した試験で検出されたような、スチボグルコン酸ナトリウムと他のサイトカイン（例えばＩＦＮＰ）のインビトロでの相乗作用が同様にインビボでも存在する可能性がある；それ故スチボグルコン酸ナトリウムは、ウイルス性または自己免疫疾患（例えばＣ型肝炎および多発性硬化症）のためのＩＦＮ−α治療における有用なアジュバントであると考えられる。
【０２２９】
Ｖ．スチボグルコン酸ナトリウムは、腫瘍浸潤性マクロファージの誘導に関するＴ細胞依存性機構により、抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用においてＩＬ−２と相互作用する。
【０２３０】
ＩＬ−２療法は、プロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ−１が鍵となる負の調節因子である免疫細胞を活性化することにより、進行した腎細胞癌において１０〜２０％の応答率を誘導する。スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳＧ）がＳＨＰ−１を阻害するという我々の最近の所見に基づき、ＳＳＧおよびＳＳＧ／ＩＬ−２の抗ＲＣＣ潜在能および作用機構をマウス腎癌モデル（Ｒｅｎｃａ）において検討した。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＳＳＧは、腫瘍浸潤性マクロファージ（Ｍψ）の上昇（２倍）と一致するＲｅｎｃａ腫瘍の６１％の増殖阻害を誘導したが、培養下のＲｅｎｃａ細胞増殖を阻害することはできなかった。ＳＳＧ／ＩＬ−２の併用は、腫瘍増殖を阻害する上で（９１％）および腫瘍浸潤性マクロファージ（Ｍψ）を誘導する上で（４倍）より有効であったが、サイトカイン単独ではほとんど作用を示さなかった。併用処置が胸腺欠損ヌードマウスにおけるＲｅｎｃａ腫瘍増殖に活性を示さなかったことにより、Ｔ細胞の関与が示唆された。ＳＳＧまたはＳＳＧ／ＩＬ−２処置はＢａｌｂ／ｃマウスにおいて腫瘍浸潤性Ｔ細胞を増加させなかったが、ＳＳＧはインビトロで、Ｍψの殺腫瘍作用を活性化することができるＩＦＮ−γのＴ細胞分泌を上昇させた。ＳＳＧ（３倍）またはＳＳＧ／ＩＬ−２の組合せ（６倍）で処置したマウスにおいて脾臓Ｍψの上昇が検出され、遺伝的ＳＨＰ−１欠損を有するマウスにおける顕著な特徴である、全身的Ｍψ増殖を示唆した。ＳＳＧおよびＳＳＧ／ＩＬ−２併用処置はマウスにおいて耐容された。これらの結果は共に、ＩＬ−２との組合せで増強され、Ｍψの増殖／活性化に関するＴ細胞依存性機構によって機能する、ＳＳＧの抗Ｒｅｎｃａ腫瘍活性を明らかにし、ＳＳＧが、抗腫瘍性免疫を増強することによってＩＬ−２治療の抗ＲＣＣ効果を改善し得ることを示唆する。
【０２３１】
Ａ．実験材料および方法
【０２３２】
１．試薬、細胞、細胞培養および細胞増殖阻害アッセイ
【０２３３】
Ｒｅｎｃａ(Murphy, G. P., and W. J. Hrushesky. 1973. A murine renal cell carcinoma. J Natl Cancer Inst 50:1013)、ジャーカット(Gillis, S., and J. Watson. 1980. Biochemical and biological characterization of lymphocyte regulatory molecules. V. Identification of an interleukin 2-producing human leukemia T cell line. J Exp Med 152:1709)およびＷＭ９(Forsberg, K., I. Valyi-Nagy, C. H. Heldin, M. Herlyn, and B. Westermark. 1993. Platelet-derived growth factor (PDGF) in oncogenesis: development of a vascular connective tissue stroma in xenotransplanted human melanoma producing PDGF-BB. Proc Natl Acad Sci U S A 90:393) 細胞系をｔｈｅ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＣＣＦ）の同僚より入手し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。組換えＩＬ−２（プロリューキン、２２００万ＩＵ／１．３ｍｇ、Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）をＣＣＦ薬局より購入した。ＳＳＧは以前に述べられている(Yi, T., M. K. Pathak, D. J. Lindner, M. E. Ketterer, C. Farver, and E. C. Borden. 2002. Anticancer activity of sodium stibogluconate in synergy with IFNs. J Immunol 169:5978)。細胞増殖アッセイのために、様々な量のＳＳＧの不在下または存在下で６日間培養し、生存細胞を別の文献(Pathak, M. K., and T. Yi. 2001. Sodium stibogluconate is a potent inhibitor of protein tyrosine phosphatases and augments cytokine responses in hemopoietic cell lines. J Immunol 167:3391) で述べられているようにＭＴＴアッセイによって定量した。
【０２３４】
２．動物試験
【０２３５】
Ｂａｌｂ／ｃおよび胸腺欠損ヌードＢａｌｂ／ｃマウス（１０週齢、雌性、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）の側腹部にＲｅｎｃａ細胞（１０６細胞／部位）を接種した（皮下）。接種の４日後に、マウスを、処置なし（対照）またはＩＬ−２（１０５ＩＵ／日を５日間、腹腔内）、ＳＳＧ（１２ｍｇ／日、股関節領域に筋肉内）または前記２剤の組合せによる処置に２週間供した。ＩＬ−２用量は、マウスの抗Ｒｅｎｃａ腫瘍免疫を評価するために以前の試験で使用された用量と同等であった(Sonouchi, K., T. A. Hamilton, C. S. Tannenbaum, R. R. Tubbs, R. Bukowski, and J. H. Finke. 1994. Chemokine gene expression in the murine renal cell carcinoma, RENCA, following treatment in vivo with interferon-alpha and interleukin- 2. Am J Pathol 144:747)。ＳＳＧの用量は、マウスリーシュマニア症の治療のための本剤の有効１日用量と同様であった(Murray, H. W., J. D. Berman, and S. D. Wright. 1988. Immunochemotherapy for intracellular Leishmania donovani infection: gamma interferon plus pentavalent antimony. J Infect Dis 157:973)。試験期間中、腫瘍容積を測定し、長球についての式（Ｖ＝４／３×ａ２ｂ）を用いて算定した(Lindner, D. J., E. C. Borden, and D. V. Kalvakolanu. 1997. Synergistic antitumor effects of a combination of interferons and retinoic acid on human tumor cells in vitro and in vivo. Clin Cancer Res 3:931)。異なる処置群の間での腫瘍容積の差の有意性を評価するためにステューデントｔ検定を使用した。試験期間中、マウス生存能（毎日）および体重（週に１回）も記録した。試験終了時に、組織学的および免疫組織化学的分析のためにＲｅｎｃａ腫瘍および主要内部器官（心臓、腎臓、肝臓、肺および脾臓）を採取した。
【０２３６】
３．組織学的および免疫組織化学的検査
【０２３７】
マウスから採取した主要内部器官およびＲｅｎｃａ腫瘍を１０％ホルマリンに固定するかまたは液体窒素中で瞬間凍結した。固定した試料のＨ＆Ｅ染色組織切片を調製し、先に述べられているように(Yi, T., M. K. Pathak, D. J. Lindner, M. E. Ketterer, C. Farver, and E. C. Borden. 2002. Anticancer activity of sodium stibogluconate in synergy with IFNs. J Immunol 169:5978)顕微鏡によって評価した。凍結組織切片の調製および免疫組織化学的検査は確立された手順に従って実施した(Joliat, M. J., P. A. Lang, B. L. Lyons, L. Burzenski, M. A. Lynes, T. Yi, J. P. Sundberg, and L. D. Shultz. 2002. Absence of CD5 dramatically reduces progression of pulmonary inflammatory lesions in SHP-I protein-tyrosine phosphatase-deficient 'viable motheaten' mice. J Autoimmun 18:105)。免疫組織化学的検査のために使用した抗体は、抗ＣＤ４（ラットｍＡｂ、クローンＧＫｌ．５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、抗ＣＤ８（ラットｍＡｂ、クローン５３−６．７．５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、抗Ｆ４／８０（ラットｍＡｂ、クローンＡ３−１、Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）および抗アシアロＧＭｌ（ウサギポリクローナル、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｃａｎａｄａ）であった。顕微鏡検査の前に切片をメイヤーヘマトキシリンで対比染色した。２匹のマウス／群の組織切片を評価した。免疫細胞の数を以下のスキームに基づいて半数量化した：＋、０〜１陽性細胞／４０×視野；＋、２〜５陽性細胞／４０×視野；＋＋、６〜１０陽性細胞／４０×視野等。
【０２３８】
４．インビトロでの免疫細胞へのＳＳＧの作用
【０２３９】
ジャーカット細胞を様々な量のＳＳＧの不在下または存在下で１６時間培養した。細胞と培地上清を遠心分離（１，０００ｇ、１０分間）によって分離した。製造者のプロトコールに従ってＥＬＩＳＡキット（Ｒ．Ｄ．ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して培地上清中のＩＦＮ−γの量を定量した。
【０２４０】
Ｂ．結果
【０２４１】
１．ＳＳＧはＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＲｅｎｃａ腫瘍増殖を阻害するが、培養下のＲｅｎｃａ細胞増殖は阻害しない。
【０２４２】
免疫機構を通して機能するＳＳＧの潜在的抗ＲＣＣ活性を検討するため、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＲｅｎｃａ腫瘍増殖へのＳＳＧの作用を測定した。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける自然発生腎腫瘍に由来するＲｅｎｃａを、この系統の免疫コンピテントマウスにおけるその腫瘍形成性に基づいて選択した(Murphy, G. P., and W. J. Hrushesky. 1973. A murine renal cell carcinoma. J Natl Cancer Inst 50:1013)。
【０２４３】
最初に、ＳＳＧが免疫細胞の不在下で直接Ｒｅｎｃａ細胞増殖を阻害できるかどうかを測定するために、培養下のＲｅｎｃａ細胞増殖へのＳＳＧの作用を検討した。ＳＳＧの不在下または存在下（６．２５〜２００μｇ／ｍｌ）で６日間培養したＲｅｎｃａ細胞は同様の増殖を示した（図２４Ａ）が、ＷＭ９黒色腫細胞の増殖は、以前に報告されたように(Yi, T., M. K. Pathak, D. J. Lindner, M. E. Ketterer, C. Farver, and E. C. Borden. 2002. Anticancer activity of sodium stibogluconate in synergy with IFNs. J Immunol 169:5978) 同等の条件下でＳＳＧによって用量依存的に阻害された（図２４Ｂ）。
【０２４４】
インビボでのＲｅｎｃａ腫瘍増殖へのＳＳＧの作用を、４日目の確立されたＲｅｎｃａ腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスをＳＳＧで処置することによって評価し、ＳＳＧは、マウスリーシュマニア症のための有効用量(Murray, H. W., J. D. Berman, and S. D. Wright. 1988. Immunochemotherapy for intracellular Leishmania donovani infection: gamma interferon plus pentavalent antimony. J Infect Dis 157:973) を毎日２週間にわたって投与した。処置期間の終了時に、ＳＳＧ処置マウスにおけるＲｅｎｃａ腫瘍は未処置対照（１００％）におけるよりも有意に（ｐ＜０．０１）小さかった（３９％）（図２５）。処置は良好に耐容された：処置群の全てのマウスが処置終了時まで生存した（データは示していない）。
【０２４５】
それ故単独薬剤としてのＳＳＧは、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて有意のＲｅｎｃａ細胞増殖阻害を誘導し、良好に耐容された。本薬剤は培養下のＲｅｎｃａ細胞増殖に明らかな作用を及ぼさなかったので、ＳＳＧのこの抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用はおそらくＲｅｎｃａ腫瘍増殖の直接阻害から生じたものではなった。これらの結果は共に、抗腫瘍免疫を含むと考えられる間接的機構によって機能すると思われる、ＳＳＧの抗Ｒｅｎｃａ腫瘍活性を明らかにした。
【０２４６】
２．ＳＳＧ／ＩＬ−２の組合せは単独薬剤よりも有効なＲｅｎｃａ腫瘍増殖阻害を誘導する。
【０２４７】
抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用におけるＳＳＧについての推定上の抗腫瘍免疫機構は、Ｒｅｎｃａ腫瘍増殖が、抗腫瘍免疫細胞を活性化することが知られる(Rosenberg, S. A. 2000. Interleukin-2 and the development of immunotherapy for the treatment of patients with cancer. Cancer J Sci Am 2000:S2)ＩＬ−２と組み合わせたＳＳＧによってより有効に阻害され得ることを示唆する。このサイトカインは進行したＲＣＣにおいて低い応答率を誘導する承認された治療であるので(Margolin, K. A. 2000. Interleukin-2 in the treatment of renal cancer. Semin Oncol 27:194)、ＳＳＧがＲｅｎｃａ腫瘍増殖阻害においてＩＬ−２と相互作用することの証拠は、同時に、ＩＬ−２療法の効果を改善するＳＳＧの潜在的可能性に関する概念の前臨床証明を提供する。それ故Ｒｅｎｃａ腫瘍増殖へのＳＳＧ／ＩＬ−２の作用を測定した。
【０２４８】
４日目の確立されたＲｅｎｃａ腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスを、未処置対照およびＳＳＧ処置に供したマウスと比較して、ＳＳＧ／ＩＬ−２の組合せまたはＩＬ−２単独で処置した。２週間のＳＳＧ／ＩＬ−２併用処置は、ＳＳＧによって誘導された６１％に対し、９０％のＲｅｎｃａ腫瘍増殖阻害を誘導した（ｐ＜０．０１）（図２５）。実験条件下で単独薬剤としてのＩＬ−２は、以前の報告と一致して(Sonouchi, K., T. A. Hamilton, C. S. Tannenbaum, R. R. Tubbs, R. Bukowski, and J. H. Finke. 1994. Chemokine gene expression in the murine renal cell carcinoma, RENCA, following treatment in vivo with interferon-alpha and interleukin-2. Am J Pathol 144:747; Samlowski, W. E., R. Petersen, S. Cuzzocrea, H. Macarthur, D. Burton, J. R. McGregor, and D. Salvemini. 2003. A nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase, M40403, inhibits dose-limiting hypotension associated with interleukin-2 and increases its antitumor effects. Nat Med 9:750)、Ｒｅｎｃａ腫瘍増殖を阻害することができなかった（図２５）。前記併用は、処置期間終了時の全ての処置マウスの生存、および未処置マウスと、主要器官において組織病理学的変化を示さなかった処置マウスの同等の体重によって指示されたように（データは示していない）、耐容された。
【０２４９】
これらの結果は、ＳＳＧの抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用の免疫機構と一致して、ＳＳＧ／ＩＬ−２の組合せが個別の薬剤よりも有効なＲｅｎｃａ腫瘍増殖阻害を誘導することを明らかにした。抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用においてＩＬ−２と相互作用するＳＳＧの能力およびマウスにおける併用治療の耐容性は、進行ＲＣＣのための改善された治療としてのＳＳＧ／ＩＬ−２併用療法の可能性を示唆する。
【０２５０】
３．ＳＳＧおよびＳＳＧ／ＩＬ−２治療は腫瘍浸潤性Ｍψおよび全身的Ｍψ増殖を誘導する。
【０２５１】
Ｒｅｎｃａ腫瘍増殖阻害におけるＳＳＧおよびＳＳＧ／ＩＬ−２併用の作用機構をさらに定義するため、Ｒｅｎｃａ腫瘍浸潤性免疫細胞へのこれらの治療の作用を検討した。Ｔ、ＮＫおよびＭψ系統の細胞は重要な抗腫瘍エフェクターである(Rosenberg, S. A. 2001. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature 411:380)。ＳＳＧ、ＩＬ−２または併用で区別的に処置したマウスからのＲｅｎｃａ腫瘍におけるこれらの免疫細胞の相対数を免疫組織化学的検査によって定量した。
【０２５２】
Ｔリンパ球（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）は、以前に報告されたようにＲｅｎｃａ腫瘍において低い数で存在し、区別的に処置したマウスからの腫瘍の間でほとんど差を示さなかったが（図２６Ａ）、ＮＫ細胞は実験条件下の腫瘍において検出不能であった（データは示していない）。腫瘍浸潤性Ｍψ（Ｆ４／８０＋）は対照とＩＬ−２処置マウスにおいて比肩し得るレベルであったが、興味深いことに、ＳＳＧ処置マウスでは控えめな上昇（〜２倍）およびＳＳＧ／ＩＬ−２処置マウスではより著明な上昇（〜４倍）を示した（図２６Ａ／Ｂ）。
【０２５３】
ＳＳＧおよびＳＳＧ／ＩＬ−２処置マウスからのＲｅｎｃａ腫瘍におけるＭψ上昇が腫瘍特異的事象であるのかまたは全身的Ｍψ増殖の一部であるのかを評価するために、区別的に処置したマウスの脾臓におけるＭψの相対数も免疫組織化学的検査によって定量した。脾臓Ｍψ（Ｆ４／８０＋）数は、対照またはＩＬ−２処置群におけるＭψのバックグラウンドレベルと比較して、ＳＳＧ処置マウスで有意に上昇し（〜３倍）、ＳＳＧ／ＩＬ−２併用によって処置したマウスでは著明に高かった（〜６倍）（図２７Ａ／Ｂ）。区別的に処置したマウスの脾臓は同様のレベルのＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を示した（図２７Ａ）。
【０２５４】
これらの結果は、ＳＳＧ処置が、ＩＬ−２の同時投与によって増幅される、Ｒｅｎｃａ腫瘍におけるＭψ浸潤および見かけ上の全身的Ｍψ増殖を誘導することを明らかにした。これに対し、ＳＳＧまたはＳＳＧ／ＩＬ−２処置は腫瘍浸潤性Ｔ細胞またはＮＫ細胞の数にほとんど影響を及ぼさなかった。ＳＳＧおよびＳＳＧ／ＩＬ−２による腫瘍浸潤性Ｍψおよび全身的Ｍψ増殖のこの選択的誘導は、これらの処置の抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用についての免疫機構を裏付ける組織学的証拠を提供し、Ｍψを潜在的な直接の抗Ｒｅｎｃａ腫瘍エフェクター細胞として関係付ける。
【０２５５】
４．ＳＳＧ／ＩＬ−２の抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用はＴ細胞の存在を必要とする。
【０２５６】
Ｍψが直接の抗Ｒｅｎｃａ腫瘍エフェクター細胞として働く推定上の機構は、Ｍψの殺腫瘍活性を誘導するために必要なサイトカインを分泌するようにＳＳＧまたはＳＳＧ／ＩＬ−２によって活性化され得る、Ｔ細胞の関与を排除しない。実際に、ＳＳＧで処置したジャーカットＴ細胞は、抗腫瘍作用においてＭψを活性化することができる、高い量のＩＦＮ−γを分泌することが認められた(Samlowski, W. E., R. Petersen, S. Cuzzocrea, H. Macarthur, D. Burton, J. R. McGregor, and D. Salvemini. 2003. A nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase, M40403, inhibits dose-limiting hypotension associated with interleukin-2 and increases its antitumor effects. Nat Med 9:750, Qin, Z., J. Schwartzkopff, F. Pradera, T. Kammertoens, B. Seliger, H. Pircher, and T. Blankenstein. 2003. A critical requirement of interferon gamma- mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells. Cancer Res 63:4095)。前記治療の抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用におけるＴ細胞の役割を評価するために、Ｔ細胞を持たない胸腺欠損マウスにおいてＳＳＧ／ＩＬ−２併用の抗Ｒｅｎｃａ腫瘍効果を検討した。
【０２５７】
４日目の確立されたＲｅｎｃａ腫瘍を有する胸腺欠損ヌードＢａｌｂ／ｃマウスを、処置しないかまたはＳＳＧ／ＩＬ−２併用で２週間処置した。Ｒｅｎｃａ腫瘍は、処置期間中両群のマウスにおいて同等に増殖し（図２９）、実験条件下で胸腺欠損マウスにおけるＲｅｎｃａ腫瘍へのＳＳＧ／ＩＬ−２処置の増殖阻害活性の欠如を明らかにした。対照およびＳＳＧ／ＩＬ−２処置マウスからのＲｅｎｃａ腫瘍および脾臓の免疫組織化学的分析は、対照と比較してＳＳＧ／ＩＬ−２処置マウスからの腫瘍（２倍）および脾臓（３倍）におけるＭψの上昇を明らかにした（データは示していない）。
【０２５８】
これらの結果は、ＳＳＧ／ＩＬ−２誘導のＲｅｎｃａ腫瘍増殖阻害がＴ細胞の存在を必要とすることを明らかにし、前記処置の抗腫瘍免疫機構を裏付ける遺伝的証拠を提供する。
【０２５９】
Ｃ．考察
【０２６０】
ここで示す結果は、免疫機構によって媒介され、ＩＬ−２の存在下で上昇するＳＳＧの有意の抗Ｒｅｎｃａ腫瘍活性を初めて明らかにする。
【０２６１】
ＳＳＧの抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用の免疫機構はいくつかの系列の証拠によって裏付けられる。ＳＳＧはＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＲｅｎｃａ腫瘍増殖阻害を誘導するが、培養下のＲｅｎｃａ腫瘍増殖を阻害できなかったという初期所見によって支持され、これはＳＳＧの細胞傷害性による直接の抗Ｒｅｎｃａ腫瘍機構とは相反する。さらに、ＳＳＧが全身的Ｍψ増殖と一致する腫瘍浸潤性Ｍψを誘導したという組織学的証拠によって指示される。ＩＬ−２と組み合わせたＳＳＧの抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用にはＴ細胞が必要であるという遺伝的証拠によって強く裏付けられる。我々は以前の試験で、ＳＳＧが培養下の黒色腫細胞の著明な増殖阻害を誘導し、免疫欠損ヌードマウスにおいて黒色腫増殖を阻害したことから、おそらく黒色腫細胞へのＳＳＧの直接作用から生じると考えられるＳＳＧの抗黒色腫活性を示した(Yi, T., M. K. Pathak, D. J. Lindner, M. E. Ketterer, C. Farver, and E. C. Borden. 2002. Anticancer activity of sodium stibogluconate in synergy with IFNs. J Immunol 169:5978)。マウスモデルでの抗黒色腫作用において組換えヒトＩＦＮ−αと相互作用する、報告されたＳＳＧの能力はまた、免疫細胞不在の培養下の黒色細胞の直接増殖阻害におけるＳＳＧ／ＩＦＮ−αの相乗作用に基づく、免疫非依存性機構によっても説明され得る(Yi, T., M. K. Pathak, D. J. Lindner, M. E. Ketterer, C. Farver, and E. C. Borden. 2002. Anticancer activity of sodium stibogluconate in synergy with IFNs. J Immunol 169:5978)。マウス免疫細胞に対しては不活性であるが、ヒト由来の黒色腫細胞の増殖を阻害する、組換えヒトＩＦＮ−αの種特異性の故に、マウスにおいて報告した抗黒色腫作用へのＩＦＮ活性化免疫の関与は排除することができる(Yi, T., M. K. Pathak, D. J. Lindner, M. E. Ketterer, C. Farver, and E. C. Borden. 2002. Anticancer activity of sodium stibogluconate in synergy with IFNs. J Immunol 169:5978)。我々の今回の試験は、それ故、ＳＳＧに関する新規の免疫媒介性抗腫瘍作用を明らかにした。
【０２６２】
ＳＳＧの免疫媒介性抗腫瘍作用のこの所見は、本剤に関する作用機構への洞察を提供するのに加えて、重要な臨床的意味を有する。ＳＳＧによる直接増殖阻害に対して感受性並びに非感受性の腫瘍を有する患者において有益であると考えられる、潜在的抗癌治療薬としてのより広いＳＳＧ適用を示唆する。さらに、直接の腫瘍増殖阻害と抗腫瘍免疫によるＳＳＧの二元的抗腫瘍作用はまた、ＳＳＧが、直接のＳＳＧ増殖阻害に感受性の腫瘍を有する免疫適格患者において使用するとき最も有効であり得ることを示唆する。この概念は、ＳＳＧに基づく治療の最適効果のための癌患者の選択に役立つと考えられ、将来の前臨床試験において確認できる。加えて、ＳＳＧの免疫媒介性抗腫瘍作用は、ＳＳＧを、今回の試験で検討したＩＬ−２を含む他の免疫活性化剤と組み合わせて使用する潜在的可能性を示唆する。
【０２６３】
ＳＳＧ／ＩＬ−２の組合せは、今回の試験で、単独薬剤と比較して抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用においてより有効であることが明らかにされた。マウスにおけるＳＳＧ／ＩＬ−２併用の優れた抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用および治療の耐容性は、ＳＳＧがＩＬ−２の抗ＲＣＣ治療の効果を改善する潜在的可能性を有し、今後その臨床評価を正当化し得る概念的根拠の前臨床証明を提供する。これに関して、我々の抗Ｒｅｎｃａ腫瘍実験で使用したＩＬ−２の用量が、マウスにおいて報告された最大耐容量（ＭＴＤ）の約２５％であったことは注目に値する(Samlowski, W. E., R. Petersen, S. Cuzzocrea, H. Macarthur, D. Burton, J. R. McGregor, and D. Salvemini. 2003. A nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase, M40403, inhibits dose-limiting hypotension associated with interleukin-2 and increases its antitumor effects. Nat Med 9:750)。マウスにおけるＭＴＤのＩＬ−２とＳＳＧの耐容性は、予備実験でも認められた（未公表データ）。それ故、区別的投与および／または治療スケジュールを通して定義され得る最適化ＳＳＧ／ＩＬ−２併用治療を用いてより著明な抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用が達成され得る可能性がある。毛管漏出症候群を誘導するＩＬ−２活性化Ｔ細胞を通して媒介される、ＩＬ−２の毒性を明らかに上昇させることなくＩＬ−２と相互作用する、実証されたＳＳＧの能力は(Rosenberg, S. A. 2000. Interleukin-2 and the development of immunotherapy for the treatment of patients with cancer. Cancer J Sci Am 2000:S2)、ＳＳＧの抗Ｒｅｎｃａ腫瘍活性が、以下で述べるようにおそらく一部にはＭψを通して媒介され、それ故ＩＬ−２誘導のＴ細胞活性化上昇だけに依存するのではないという我々の所見に関連すると考えられる。
【０２６４】
我々の試験の重要な所見は、ＳＳＧが、ＩＬ−２によって増幅された、腫瘍浸潤性Ｍψおよび著明な全身的Ｍψ増殖を誘導するということである。ＳＳＧの抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用に関する免疫機構を裏付ける組織学的証拠を提供することに加えて、全身的Ｍψ増殖は遺伝的ＳＨＰ−１欠損を有するマウスの重要な特徴であるので、このＳＳＧ活性はまた、ＳＳＧ処置マウスにおけるインビボでのＳＨＰ−１の阻害の潜在的指標である(Green, M. C, and L. D. Shultz. 1975. Motheaten, an immunodeficient mutant of the mouse. I. Genetics and pathology. J Hered 66:250; Shultz, L. D., D. R. Coman, C. L. Bailey, W. G. Beamer, and C. L. Sidman. 1984. "Viable motheaten," a new allele at the motheaten locus. I. Pathology. Am J Pathol 116:179; Shultz, L. D., P. A. Schweitzer, T. V. Rajan, T. Yi, J. N. IhIe, R. J. Matthews, M. L. Thomas, and D. R. Beier. 1993. Mutations at the murine motheaten locus are within the hematopoietic cell protein-tyrosine phosphatase (Hcph) gene. Cell 73:1445)。さらにそれは、Ｍψを本剤の直接ｍｐ抗腫瘍エフェクター細胞として示唆する。Ｍψに関するそのような推定上の役割は、腫瘍浸潤性Ｔ細胞のレベルへのＳＳＧの作用の明らかな欠如と一致し、Ｍψを、殺腫瘍活性を有する重要な免疫細胞とする以前の報告によって裏付けられる(Samlowski, W. E., R. Petersen, S. Cuzzocrea, H. Macarthur, D. Burton, J. R. McGregor, and D. Salvemini. 2003. A nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase, M40403, inhibits dose-limiting hypotension associated with interleukin-2 and increases its antitumor effects. Nat Med 9:750, Masztalerz, A., N. Van Rooijen, W. Den Otter, and L. A. Everse. 2003. Mechanisms of macrophage cytotoxicity in IL-2 and IL- 12 mediated tumour regression. Cancer Immunol Immunother 52:235)。重要な点として、抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用におけるＳＳＧ／ＩＬ−２相互作用についての合理的説明も提供する。ＳＳＧ誘導の腫瘍浸潤性ＭψがＩＬ−２によって上昇したので、ＳＳＧ／ＩＬ−２併用の高い抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用は、腫瘍細胞を直接攻撃するＭψへの２剤の収束作用から生じると考えられる。しかし、ＩＬ−２がどのようにしてＳＳＧ誘導の腫瘍浸潤性Ｍψを上昇させるかは現在のところ明らかではない。ＩＬ−２受容体は、Ｍψへと分化する単球上で発現されるが(Espinoza-Delgado, I, M. C. Bosco, T. Musso, G. L. Gusella, D. L. Longo, and L. Varesio. 1995. Interleukin-2 and human monocyte activation. J Leukoc Biol 57:13)、腫瘍浸潤性ＭψへのＩＬ−２の作用がＴ細胞依存性であったという我々の所見は、ＩＬ−２誘導の単球分化に関する直接の役割と相反する。前記過程におけるＩＬ−２活性化Ｔ細胞からのサイトカインの関与はおそらく選択的機構である。
【０２６５】
ＳＳＧの抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用におけるＭψの推定上の役割を明らかにすることに加えて、我々の結果はまた、抗腫瘍免疫において鍵となる役割を果たすことが知られるＴ細胞の関与を示唆する(Rosenberg, S. A. 2001. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature 411:380)。Ｔ細胞は、腫瘍浸潤性Ｍψおよび全身的Ｍψ増殖のＳＳＧ誘導を上昇させるＩＬ−２の能力ために明らかに必要とされる。これは、ＳＳＧ／ＩＬ−２処置した胸腺欠損マウスにおける腫瘍浸潤性Ｍψおよび脾臓Ｍψ増殖のレベルが、Ｔ細胞コンピテントＢａｌｂ／ｃマウスにおいてＳＳＧ単独で誘導されるものと同様であったという所見によって示される。Ｔ細胞の重要性は、ＳＳＧ／ＩＬ−２処置胸腺欠損マウスにおける腫瘍浸潤性Ｍψの控えめな増加の存在下でＲｅｎｃａ腫瘍増殖阻害が存在しないことによってさらに強調される。少数の腫瘍浸潤性Ｔ細胞およびＭψを活性化することができるＩＦＮ−γのＴ細胞分泌を誘導するＳＳＧの能力を考慮すると(Samlowski, W. E., R. Petersen, S. Cuzzocrea, H. Macarthur, D. Burton, J. R. McGregor, and D. Salvemini. 2003. A nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase, M40403, inhibits dose-limiting hypotension associated with interleukin-2 and increases its antitumor effects. Nat Med 9:750, Qin, Z., J. Schwartzkopff, F. Pradera, T. Kammertoens, B. Seliger, H. Pircher, and T. Blankenstein. 2003. A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells. Cancer Res 63:4095)、前記結果は共に、Ｔ細胞が、腫瘍浸潤性Ｍψを誘導し、活性化するサイトカインを分泌することを通してＳＳＧ／ＩＬ−２の抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用を媒介し得ることを示唆する。
【０２６６】
ＳＳＧが免疫機構を通して抗Ｒｅｎｃａ腫瘍作用を及ぼすという我々の所見はまた、いくつかの他の態様においても重要である。抗リーシュマニア作用におけるＳＳＧの仮定上の免疫機構を強固にする証拠を提供する。特に、ＳＳＧ処置マウスにおいて観察された全身的Ｍψ増殖は、これまで見過ごされてきたと考えられる、ＳＳＧの抗リーシュマニア治療中のそのような薬理作用の存在を示唆する。浮遊型プロマスティゴートおよび細胞内無鞭毛型アマスティゴートに対するＳＳＧの区別的活性を考慮すると(Berman, J. D., and D. J. Wyler. 1980. An in vitro model for investigation of chemotherapeutic agents in leishmaniasis. J. Infect. Dis. 142:83)、類似の抗リーシュマニア特性を有するいくつかの他の化合物(Berman, J. D. 1988. Chemotherapy for leishmaniasis: biochemical mechanisms, clinical efficacy, and future strategies. Rev Infect Dis 10:560)もまた、免疫作用を通して潜在的抗癌活性を有すると考えられ、従って再評価する必要があるという可能性を提起する。ＳＳＧの耐容性およびＳＨＰ−１を阻害することによって免疫細胞を活性化するその明らかな能力を考慮に入れると、ホスファターゼの洗練された阻害剤は、抗癌治療および他の免疫療法のための安全な免疫活性化剤として開発できることが示唆される。
【０２６７】
Ｖ．スチボグルコン酸ナトリウムは抗癌作用においてＰＲＬファミリーのＰＴＰアーゼを阻害する。
【０２６８】
収集されたデータは、スチボグルコン酸ナトリウムが組換えおよび細胞内ＰＲＬの強力な阻害剤であることおよび非毒性用量のスチボグルコン酸ナトリウムがインビトロでおよびマウスモデルにおいて、ＰＲＬを発現する癌細胞系に対して増殖阻害活性を有することを明らかにする。データは、スチボグルコン酸ナトリウム抵抗性癌細胞における突然変異型ＰＲＬ−１がスチボグルコン酸ナトリウム阻害に対して非感受性であり、スチボグルコン酸ナトリウム応答性癌細胞において異所性発現されたときスチボグルコン酸ナトリウム誘導の増殖阻害に対する抵抗性を付与することから、スチボグルコン酸ナトリウムによるＰＲＬの不活性化はその抗癌作用の鍵となる機構の１つであることを示唆した。これらの結果は、抗癌剤としてのスチボグルコン酸ナトリウムの潜在的可能性を示唆し、ＰＴＰアーゼ阻害剤を標的治療として開発するための新規洞察を提供する。
【０２６９】
Ａ．実験材料および方法
【０２７０】
１．試薬
【０２７１】
スチボグルコン酸ナトリウム、スラミン、オルトバナジン酸ナトリウムおよびＳＨＰ−１のＧＳＴ融合タンパク質は以前に記述されている(Pathak et al., J. Imumol. 167, 3391 (2001))。アンチモン酸メグルミンはＡｖｅｎｔｉｓより入手した。ヒトＰＲＬ−１、ＰＲＬ−２およびＰＲＬ−３コード領域のｃＤＮＡは、Ｈ９細胞からＲＴ−ＰＣＲによって誘導し(Safai, et al., Lancet 1, 1438 (1984))、ｐＧＥＸベクターにインフレームで挿入した。ＰＲＬ−１Ｒ８６のｃＤＮＡを、確立された手順に従ってＰＲＬ−１  ｃＤＮＡを鋳型として用いて組換えＤＮＡ手法によって作製した(Jiao, et al., MoI. Cell. Biol. 16, 6985 (1996))。ＰＲＬホスファターゼのＧＳＴ融合タンパク質は、以前に述べられているようにｐＧＥＸ融合タンパク質構築物で形質転換したＤＨ５ａ細菌から作製した(Yi, et al., MoI. Cell. Biol. 12, 836 (1992))。Ｎ末端をＦｌａｇエピトープ(Castrucci, et al., J. Virol. 66, 4647 (1992))で標識したＰＲＬをコードするｃＤＮＡを組換えＤＮＡ手法によって作製し、それらの同一性を確認するために配列決定して、ｐＢａｂｅｐｕｒｏベクター(Yang, et al., Blood 91, 3746 (1998))にクローニングした。抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（Ｍ２，Ｓｉｇｍａ）を市販のソースから購入した。チロシンがリン酸化されている、合成ホスホチロシンペプチド（Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌ−ａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号３）；ＵＢＩ）およびＤｉＦＭＵＰ（６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をＰＴＰアーゼアッセイのための基質として購入した。
【０２７２】
２．インビトロでのＰＴＰアーゼアッセイおよび免疫複合体ＰＴＰアーゼアッセイ
【０２７３】
合成ホスホチロシンペプチドまたはＤｉＦＭＵＰを基質として用いる確立された手順に従って(Pathak et al., J. Imumol. 167, 3391 (2001))、組換えＰＴＰアーゼへの化合物の作用を測定するためにインビトロでのＰＴＰアーゼアッセイを使用した。簡単に述べると、ＰＴＰアーゼ緩衝液（５０ｍＭ トリス、ｐＨ ７，４）５０μＬ中の個々のＰＴＰアーゼ（０．１μｇ／反応）を２２℃で１０分間または指示されているように阻害性化合物の不在下または存在下でインキュベートした。次に基質（０．２ｍＭ ホスホチロシンペプチド）を添加し、２２℃で１８時間反応させた。マラカイトグリーン溶液（ＵＢＩ）１００μｌを添加し、その後分光法（ＯＤ６６０ｎｍ）により、ペプチド基質からＰＴＰアーゼによって切断された遊離リン酸の量を定量することによって個々の反応のＰＴＰアーゼ活性を測定した。ＤｉＦＭＵＰを基質として用いるＰＴＰアーゼアッセイを、以前に述べられている手順に従って実施した(Matter, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 283, 1061 (2001))。以下の式に基づいて相対的ＰＴＰアーゼ活性を算定した：（阻害性化合物の存在下でのＰＴＰアーゼ活性／前記化合物の不在下でのＰＴＰアーゼ活性）×時間×１００％。ＰＴＰアーゼ阻害の可逆性を評価するため、グルタチオンビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合したＰＴＰアーゼのＧＳＴ融合タンパク質を低温トリス緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．０）または阻害剤を含むトリス緩衝液と共に４℃で３０分間プレインキュベートした。次にビーズをトリス緩衝液中で３回洗浄した後または洗浄せずに、インビトロでのＰＴＰアーゼアッセイに供した。
【０２７４】
細胞内ＰＴＰアーゼへのスチボグルコン酸ナトリウムの作用を評価するため、免疫複合体ＰＴＰアーゼアッセイを実施した。細胞を、処置しないかまたはスチボグルコン酸ナトリウムで５分間処置し、新鮮培地で洗って、その後低温溶解緩衝液（５０ｍＭ トリス、ｐＨ ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％ ＮＰ５０；２ｍＭ ＰＭＳＦ；２０μｇ／ｍｌのアプロチニン）に溶解した。溶解産物を免疫沈降アッセイにおいて抗Ｆｌａｇ抗体と共にインキュベートした。免疫複合体をプロテインＧセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で収集し、低温溶解緩衝液中で４回洗った。個々の試料の内容物の約９０％を３つの同等の部分に分割し、各々をＰＴＰアーゼ緩衝液（５０ｍＭ トリス、ｐＨ ７．４；０．２ｍＭ ホスホチロシンペプチド）５０μｌ中２２℃で１８時間インキュベートした。マラカイトグリーン溶液（ＵＢＩ）１００μＬを各々の反応物に添加した後、ペプチド基質からＰＴＰアーゼによって切断された遊離リン酸の量を定量するためにＯＤ６６０の測定に供した(Pathak et al., J. Imumol. 167, 3391 (2001))。個々の試料の残りの１０％の内容物を、ホスファターゼタンパク質の相対量を定量するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法によって分析した。細胞内ＰＴＰアーゼの活性へのスチボグルコン酸ナトリウム作用の期間を評価するため、Ｆｌａｇ−ＰＲＬ−２トランスフェクト細胞を、処置しないかまたはスチボグルコン酸ナトリウムによって３７℃で５分間処置し、無細胞薬剤を除去するために培地で２回洗って、次に新鮮培地中３７℃で２４〜７２時間インキュベートした後、低温溶解緩衝液に細胞を溶解することによって終了した。Ｆｌａｇ−ＰＲＬ−２を溶解産物から免疫沈降させ、ＰＴＰアーゼアッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法に供した。
【０２７５】
３．細胞、細胞培養、細胞増殖アッセイおよびトランスフェクション
【０２７６】
ＮＩＨ３Ｔ３(Yi, et al., Blood 85, 87 (1995))、ＷＭ９(Forsberg, et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 90, 393 (1993))、ＤＵ１４５(Mickey, et al., Cancer Res. 37, 4049 (1977))、ＬｏＶｏ(Drewinko, et al., Cancer Res. 36, 467 (1976))、ＨＥＹ(Buick, et al., Cancer Res. 45, 3668 (1985))、Ｕ２５１(Yoshida, et al., Cancer 50, 410 (1982)), A549 (Giard, et al., J. Natl. Cancer Inst. 51, 1417 (1973))およびＳＫ−Ｎ−ＳＨ(Helson, et al., Cancer Res. 35, 2594 (1975)) 細胞系は記述されており、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。インビトロでの細胞増殖へのスチボグルコン酸ナトリウム作用の測定のために、細胞を様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムの不在下（−）または存在下（＋）で６日間培養し、生存細胞をＭＴＴアッセイ(Mosmann, J. Imunol. Methods 65, 55 (1983))によって定量した。スチボグルコン酸ナトリウムによる増殖阻害のパーセンテージを算定した（±ｘ％）。
【０２７７】
ＮＩＨ３Ｔ３およびＷＭ９トランスフェクタントを用いて細胞内ＰＴＰアーゼへのスチボグルコン酸ナトリウムの作用を評価した。ＮＩＨ３Ｔ３またはＷＭ９細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＢＲＬ）を製造者の指示に従って使用して、ｐＢａｂｅｐｕｒｏベクター（Ｖ）またはＦｌａｇ標識ＰＲＬのｐＢａｂｅｐｕｒｏ発現構築物でトランスフェクトした。トランスフェクタントをピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下で２週間選択し、ピューロマイシンなしの培養で増殖させた後、細胞内Ｆｌａｇ−ＰＲＬのＰＴＰアーゼ活性へのスチボグルコン酸ナトリウムの作用を測定するためまたはスチボグルコン酸ナトリウムの不在下または存在下での培養における細胞増殖を測定するために使用した。
【０２７８】
４．動物試験
【０２７９】
０日目に、４週齢の胸腺欠損ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ、ＮＣＲ）（Ｔａｃｏｎｉｃ）の側腹部にＤＵ１４５細胞（３×１０6細胞／部位）を接種した（皮下）。２日目から、マウスを処置なし（対照）またはスチボグルコン酸ナトリウム（１２ｍｇ、皮下、毎日、股関節領域に筋肉内）による処置に供した。試験で使用したスチボグルコン酸ナトリウムの用量は、マウスリーシュマニア症の治療のためのスチボグルコン酸ナトリウムの有効１日用量と同様であった(Murray, et al. 1988)。腫瘍容積を測定し、長球についての式（Ｖ＝４／３  ７ａ2b）を用いて算定した(Lindner, et al. 1997)。マウスの内部器官および腫瘍接種部位組織のヘマトキシリン＋エオシン（Ｈ．Ｅ．）染色した組織切片を作製し、顕微鏡評価に供した。
【０２８０】
５．スチボグルコン酸ナトリウム抵抗性ＤＵ１４５コロニーの単離と特性決定
【０２８１】
ＤＵ１４５細胞を、４８穴プレートにおいてスチボグルコン酸ナトリウム（１００μｇ／ｍｌ）の存在下で３週間培養した。単一コロー二を含むウエルからの細胞をフラスコに移し、スチボグルコン酸ナトリウム不含培地で３週間培養して、さらなる特性決定のためにＤＵ１４５Ｒ細胞として使用した。６日目の培養物におけるスチボグルコン酸ナトリウムの不在下または存在下でのＤＵ１４５Ｒ細胞の増殖をＭＴＴアッセイによって測定した。ＰＲＬのコード領域のｃＤＮＡをＤＵ１４５およびＤＵ１４５Ｒ細胞からＲＴ−ＰＣＲによって誘導し、以下で述べるプライマーを用いて配列決定した。
【０２８２】
６．ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＰＲＬホスファターゼの発現の検出
【０２８３】
健常志願者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および癌細胞系におけるＰＲＬの転写産物の発現を、以下に列挙する個々のＰＲＬまたはＧＡＰＤＨのための特異的プライマー対でのＲＴ−ＰＣＲによって検出した。ＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色によって視覚化して、制限エンドヌクレアーゼマッピングによってそれらの同一性を確認した。プライマー対の配列は次の通りである：ｈｕＰＲＬ−３／５、５’−ＴＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＧＡＴＧＡ−３’（配列番号４）；  ｈｕＰＲＬ−３／３、５’−ＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＧ−３’（配列番号５）；ｈｕＰＲＬ−２／５、５’−ＴＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＡＡＴＧＡＡＣＣＧＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴ−３’（配列番号６）；ｈｕＰＲＬ−２／３、５’−ＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＴＴＧＧＴ−３’（配列番号７）；ｈｕＰＲＬ−１／５、５’−ＴＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣＴＣＧＡＡＴＧＡＡＣＣＧＣＣＣ−３’（配列番号８）；ｈｕＰＲＬ−１／３、５’−ＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧ−３’（配列番号９）。
【０２８４】
Ｂ．結果
【０２８５】
１．スチボグルコン酸ナトリウムはインビトロで組換えＰＲＬホスファターゼを阻害する。
【０２８６】
スチボグルコン酸ナトリウムがＰＲＬホスファターゼの阻害剤であるかどうかを評価するため、組換えＰＲＬのＰＴＰアーゼ活性へのその作用をインビトロでのＰＴＰアーゼアッセイによって評価した。
【０２８７】
合成ホスホチロシンペプチド基質を脱リン酸化する上での組換えＰＲＬ−１、ＰＲＬ−２およびＰＲＬ−３のＰＴＰアーゼ活性はスチボグルコン酸ナトリウムの存在下で用量依存的に低下し、１００μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウムはＰＴＰアーゼの８０〜９０％の阻害を生じさせた（図３０Ａ）。スチボグルコン酸ナトリウムのこれらの作用は、ＰＲＬを本剤と共に１０分間プレインキュベートした後、反応物に基質を添加してＰＴＰアーゼを開始するという条件下で検出された。３つのホスファターゼはスチボグルコン酸ナトリウムによって同様に阻害され、そのホスファターゼ活性へのスチボグルコン酸ナトリウムとの長期的プレインキュベーションの影響をさらに検討するためにＰＲＬ−３を選択した。スチボグルコン酸ナトリウムとのＰＲＬ−３の３０または６０分間のプレインキュベーションはより劇的な阻害をもたらし、１０μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウム濃度でほぼ完全なＰＲＬ−３の不活性化が起こった（図３０Ｂ）。スチボグルコン酸ナトリウムによるＰＲＬ−３の阻害はまた、選択的基質（ＤｉＦＭＵＰ）を用いても検出されたが、公知のホスファターゼ阻害剤であるオルトバナジン酸ナトリウム(Burke et al., Biopolymers 47, 225 (1998))およびスラミン(Zhang, et al., J. Biol. Chem. 273, 12281 (1998))は、同等の条件下でスチボグルコン酸ナトリウムほど有効ではなかった（図３０Ｃ）。スチボグルコン酸ナトリウムは、組換えＰＲＬ−３および組換えＳＨＰ−１の同様の阻害を誘導した（図３０Ｄ）。スチボグルコン酸ナトリウムによるＰＲＬ−３の阻害は、可逆的阻害剤であるスラミン(Pathak et al., J. hnumol. 167, 3391 (2001))によるＳＨＰ−１の阻害を除去する上で有効な、洗浄工程によって除去されなかった（図３０Ｅ）。
【０２８８】
これらの結果は、スチボグルコン酸ナトリウムがインビトロで組換えＰＲＬホスファターゼの強力かつ不可逆的な阻害剤であることを明らかにした。
【０２８９】
２．スチボグルコン酸ナトリウムはＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクタントにおいて細胞内ＰＲＬを不活性化する。
【０２９０】
次に、スチボグルコン酸ナトリウムがインビボでＰＲＬの阻害剤であるかどうかを調べるため、細胞内ＰＲＬホスファターゼへのスチボグルコン酸ナトリウムの作用を検討した。
【０２９１】
Ｆｌａｇ標識ＰＲＬ−１の発現構築物または対照ベクターをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、次にそれを処置しないかまたはスチボグルコン酸ナトリウムで処置し、モノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈降アッセイのために使用した。免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法およびＰＴＰアーゼアッセイによって分析した。Ｆｌａｇ−ＰＲＬ−１について予想されたように分子量約２２ｋＤａのＦｌａｇ標識タンパク質が未処置またはスチボグルコン酸ナトリウム処置Ｆｌａｇ−ＰＲＬ−１トランスフェクタントからの免疫複合体において検出されたが、対照細胞からの免疫複合体では検出されなかった（図３１Ａ）。未処置Ｆｌａｇ−ＰＲＬ−１トランスフェクタントからの免疫複合体は、対照トランスフェクタントの免疫複合体よりも著明に高いＰＴＰアーゼ活性（約２３倍）を示した（図３１Ｂ）。これに対し、スチボグルコン酸ナトリウム処置Ｆｌａｇ−ＰＲＬ−１トランスフェクタントからの免疫複合体はほとんどＰＴＰアーゼ活性を有さず、対照細胞のものと同様のレベルであった（図３１Ｂ）。そのようなＰＴＰアーゼ活性の欠如はまた、Ｆｌａｇ−ＰＲＬ−２（図３１Ｄ）またはＦｌａｇ−ＰＲＬ−３（図３１Ｆ）のスチボグルコン酸ナトリウム処置したＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクタントからの免疫複合体でも明らかであったが、Ｆｌａｇ標識ＰＲＬは、未処置またはスチボグルコン酸ナトリウム処置細胞からの免疫複合体において同様のレベルで存在した（図３１ＣおよびＥ）。
【０２９２】
これらの結果は、スチボグルコン酸ナトリウム処置がトランスフェクタントにおいて細胞内ＰＲＬを不活性化したことを明らかにし、スチボグルコン酸ナトリウムがインビボでホスファターゼの有効な阻害剤であることを指示した。
【０２９３】
３．スチボグルコン酸ナトリウムはＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクタントにおいて持続的なＰＲＬ−２の不活性化を誘導する。
【０２９４】
スチボグルコン酸ナトリウムが細胞内ＰＲＬを不活性化するという所見に照らして、スチボグルコン酸ナトリウム誘導のＰＲＬの不活性化の期間の問題を検討した。スチボグルコン酸ナトリウムは各々のＰＲＬに対して等しく有効であったので（図３１）、ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクタントにおいてスチボグルコン酸ナトリウムが誘導する単一ＰＲＬの不活性化の期間を測定した。
【０２９５】
Ｆｌａｇ−ＰＲＬ−２トランスフェクタントをスチボグルコン酸ナトリウムで５分間手早く処置し、無細胞薬剤を除去するために洗浄して、次に様々な期間インキュベートした後、細胞溶解によって終了した。細胞からの抗Ｆｌａｇ免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法およびＰＴＰアーゼアッセイによって分析した。免疫複合対中のＦｌａｇ−ＰＲＬ−２タンパク質の量は、抗Ｆｌａｇ抗体でプローブすることによって定量したとき同様のレベルであった（図３２Ｂ）。スチボグルコン酸ナトリウムで処置した細胞からの免疫複合体は、スチボグルコン酸ナトリウム処置によるＰＲＬ−２の不活性化と一致して、対照からのものと比較して（図３２Ａのレーン１と２を比較する）著明に低いＰＴＰアーゼ活性を示した。スチボグルコン酸ナトリウム処置および細胞洗浄後、様々な時間インキュベートした細胞からの免疫複合体は、スチボグルコン酸ナトリウム処置細胞のレベルを上回って、時間依存的にＰＴＰアーゼ活性の段階的上昇を示した（図３２Ａ、レーン３〜９）。２４時間インキュベートした細胞からの免疫複合体のＰＴＰアーゼ活性（図３２Ａ、レーン７）は、未処置細胞の７８％であった。４８〜７２時間インキュベートした細胞からの免疫複合体（図３２Ａ、レーン８および９）は、未処置細胞のものと同様のＰＴＰアーゼ活性を示した。
【０２９６】
これらの結果は、ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクタントにおいて短時間のスチボグルコン酸ナトリウム処置は細胞内ＰＲＬ−２活性に持続的作用を及ぼし、その完全な除去のためには少なくとも２４時間必要であることを明らかにした。
【０２９７】
４．スチボグルコン酸ナトリウムは、ＰＲＬホスファターゼを発現するヒト癌細胞系のインビトロでの増殖を阻害する。
【０２９８】
実証されているＰＲＬホスファターゼの腫瘍形成作用および結腸癌の転移とＰＲＬ−３過剰発現の結びつきを考慮すると、スチボグルコン酸ナトリウムはヒト癌細胞系においてＰＲＬを不活性化し、それ故抗癌作用を有し得ると思われた。ヒト癌細胞系のパネルにおけるＰＲＬの発現レベルおよび細胞系のインビトロ増殖へのスチボグルコン酸ナトリウムの作用を測定した。
【０２９９】
ＰＲＬの発現をヒト肺癌（Ａ５４９）、卵巣癌（Ｈｅｙ）、結腸癌（ＬｏＶｏ）、神経芽細胞種（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）、神経膠種（Ｕ２５１）および前立腺癌（ＤＵ１４５）の細胞系において検出した（図３３）。細胞系のインビトロでの増殖はスチボグルコン酸ナトリウムの存在下で用量依存的に阻害された（図３４）。１００μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウムは実験条件下で細胞系のほぼ完全な細胞死滅を生じさせたが、低用量の薬剤もこれらの細胞系に対して有意の増殖抑制作用を示した（図３４）。細胞系の中で、ＳＫ−Ｎ−ＳＨおよびＵ２５１細胞が本剤に対して最も感受性であり、２５μｇ／ｍｌで約８０％の増殖阻害をもたらした（図３４）。スチボグルコン酸ナトリウムのこの用量は、より感受性の低いＤＵ１４５細胞では約５０％の増殖阻害および残りの細胞系では約６０〜７６％の増殖阻害を生じさせた。
【０３００】
これらの結果は、種々のレベルでＰＲＬホスファターゼを発現する様々なヒト癌細胞系に対するスチボグルコン酸ナトリウムのインビトロでの増殖阻害活性を明らかにした。
【０３０１】
５．非毒性用量のスチボグルコン酸ナトリウムはヌードマウスにおけるＤＵ１４５腫瘍の増殖を阻害する。
【０３０２】
インビボでスチボグルコン酸ナトリウムの抗癌活性をさらに評価するため、ヌードマウスにおけるＤＵ１４５腫瘍の増殖におけるスチボグルコン酸ナトリウムの作用を測定した。
【０３０３】
ヌードマウスに、肩領域で皮下的にＤＵ１４５細胞を接種した。腫瘍が目に見えるようになった接種後２日目に、マウスを処置なし（対照）またはスチボグルコン酸ナトリウム処置（４４０ｍｇ／ｋｇ／日を股関節領域に筋肉内注射）に供した。ＤＵ１４５腫瘍は、以前の報告(Mickey, et al., Cancer Res. 37, 4049 (1977))と一致して、対照マウスにおいて攻撃的増殖を示した（図３５Ａ）（データは平均＋標準誤差（ｎ＝８）を示す）。スチボグルコン酸ナトリウム処置はＤＵ１４５腫瘍の増殖を阻害し、その腫瘍容積は対照マウスにおける腫瘍容積と比較して約３０％であった（図３５Ａ）。処置期間終了時の接種部位の組織学的評価は、スチボグルコン酸ナトリウム処置マウスにおける小さな腫瘍のクラスターの存在を明らかにし（図３５Ｃ）、一方対照マウスでは１個のはるかに大きな腫瘍を示した（図３５Ｂ）。両群の全てのマウスが試験終了時まで生存した。それらの主要器官の組織学的検査には、特に注目すべき点はなかった。
【０３０４】
これらの結果は、明らかな毒性を伴わない、マウスにおけるＤＵ１４５腫瘍に対するスチボグルコン酸ナトリウムの増殖阻害作用を明らかにし、非毒性用量のスチボグルコン酸ナトリウムがインビボで抗腫瘍活性を有することの証拠を提供する。
【０３０５】
６．スチボグルコン酸ナトリウム抵抗性ＤＵ１４５Ｒ細胞は、スチボグルコン酸ナトリウム阻害に対して非感受性の突然変異型ＰＲＬ−１ホスファターゼを発現する。
【０３０６】
培養下のＤＵ１４５細胞がスチボグルコン酸ナトリウムに比較的非感受性であるという所見は（図３４）、ＤＵ１４５細胞が本剤に対して抵抗性の小個体群を含み得る可能性を示唆した。この概念は、スチボグルコン酸ナトリウム処置マウスにおける、そのようなスチボグルコン酸ナトリウム抵抗性細胞の増生から生じると考えられる小さなＤＵ１４５腫瘍のクラスターの存在とも一致した（図３５Ｃ）。ＰＲＬがＤＵ１４５細胞において発現される腫瘍形成性ホスファターゼであること（図３３）およびスチボグルコン酸ナトリウムが組換え（図３０）および細胞内ＰＲＬ（図３１）を阻害することを考慮して、ＤＵ１４５細胞が、スチボグルコン酸ナトリウム非感受性のＰＲＬ突然変異体を発現するスチボグルコン酸ナトリウム抵抗性細胞個体群を含むかどうかをさらに検討した。
【０３０７】
ＤＵ１４５細胞をスチボグルコン酸ナトリウム（１００μｇ／ｍｌ）の存在下で４週間培養した。細胞の大部分がこの期間中に死滅したが、一部の細胞は生存し、別個のクローンを形成した。クローンの１つ（ＤＵ１４５Ｒ）をさらなる特性決定のために単離し、このクローンは、親ＤＵ１４５細胞と比較して培養下のスチボグルコン酸ナトリウムに対する増殖抵抗性を示した（図３６Ａ、データは３つの試料の平均＋標準偏差値を示す）。ＤＵ１４５細胞およびスチボグルコン酸ナトリウム抵抗性コロニーからのＰＲＬのコード領域のｃＤＮＡの配列分析は、ＰＲＬ−２およびＰＲＬ−３のｃＤＮＡが野生型であることを明らかにした。興味深いことに、ＤＵ１４５ＲからのＰＲＬ−１のｃＤＮＡは、２５９位に、野生型ＰＲＬ−１に対応するヌクレオチドＴ、並びにＰＲＬ−１タンパク質のホスファターゼドメイン内でアルギニン残基（Ｒ８６）によるセリン（Ｓ８６）の置換（図３６Ｃ）を生じさせるヌクレオチドＡの存在（図３６Ｂ）を示した。ＤＵ１４５Ｒ細胞からのＰＲＬ−１  ｃＤＮＡの残りの配列は野生型のものであった。親ＤＵ１４５細胞からのＰＲＬ−１  ｃＤＮＡは野生型であった（図３６Ｂ）。
【０３０８】
Ｒ８６を含む組換えＰＲＬ−１タンパク質を作製し、このタンパク質は、野生型ＰＲＬ−１と同様のインビトロでのＰＴＰアーゼ活性を示した（図３６Ｄ；データは３つの試料の平均＋標準偏差値を示す）。しかし、そのＰＴＰアーゼ活性はスチボグルコン酸ナトリウムの存在下で２０％未満しか低下しなかったのに対し、同等の条件下で本剤によって野生型ＰＲＬ−１の９０％阻害が誘導された（図３６Ｅ；データは３つの試料の平均＋標準偏差値を示す）。
【０３０９】
これらの結果は、ＤＵ１４５が、突然変異型ＰＲＬ−１タンパク質が野生型ホスファターゼと同時発現されるスチボグルコン酸ナトリウム抵抗性細胞を含むことを明らかにした。突然変異型ＰＲＬ−１はスチボグルコン酸ナトリウム阻害に対して非感受性の活性ホスファターゼであったので、それが主として本剤に対する癌細胞の抵抗性を媒介するように働くと考えられる。突然変異が親ＤＵ１４５細胞のＰＲＬ−１  ｃＤＮＡの配列分析によって検出不能であったという事実は、それが小さな細胞個体群においてのみ存在することを示唆し、これはスチボグルコン酸ナトリウム処置マウスにおける限られた数の小さなＤＵ１４５腫瘍と一致する概念であった（図３５）。
【０３１０】
７．細胞内ＰＲＬ−１Ｒ８６はスチボグルコン酸ナトリウム阻害に対して非感受性であり、ＷＭ９黒色腫細胞においてスチボグルコン酸ナトリウム誘導の増殖阻害に対する抵抗性を付与する。
【０３１１】
スチボグルコン酸ナトリウムに対する癌細胞抵抗性におけるＰＲＬ−１Ｒ８６の役割を評価するため、Ｆｌａｇ標識ＰＲＬ−１またはＲ８６突然変異型をコードするｃＤＮＡをｐＢａｂｅｐｕｒｏベクターにクローニングし(Yang, et al., Blood 91, 3746 (1998))、ＷＭ９ヒト黒色腫細胞系にトランスフェクトした。前記細胞系において内在性ＰＲＬが発現され、ＲＴ−ＰＣＲおよび配列決定分析によって測定したときそれらのコード領域内に突然変異を有していなかった。安定なトランスフェクト細胞個体群がピューロマイシン選択後に誘導された。
【０３１２】
ＷＭ９細胞におけるＲ８６突然変異型がスチボグルコン酸ナトリウムに対して非感受性の活性ホスファターゼであるかどうかを調べるため、ＷＭ９トランスフェクタントを処置しないかまたはスチボグルコン酸ナトリウムで５分間処置し、無細胞薬剤を除去するために洗浄して、溶解緩衝液に溶解した。細胞溶解産物からの抗Ｆｌａｇ免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法およびＰＴＰアーゼアッセイによって特性決定した。予想されたように、Ｆｌａｇ標識ＰＲＬ−１およびＲ８６突然変異型タンパク質は、対応するトランスフェクタントからの免疫複合体において検出されたが、ベクター対照細胞からは検出されなかった（図３７Ａ）。未処置Ｆｌａｇ−ＰＲＬ−１およびＦｌａｇ−Ｒ８６トランスフェクタントからの免疫複合体は、ベクター対照細胞のバックグラウンド活性を十分に上回るホスファターゼ活性を示し（図３７Ｂ；データは３つの試料の平均＋標準偏差値を示す）、トランスフェクタントにおいて発現されたＰＲＬ−１およびＲ８６がどちらも活性ホスファターゼであったことを明らかにした。興味深いことに、スチボグルコン酸ナトリウム処置Ｒ８６トランスフェクタントからの免疫複合体のホスファターゼ活性は、未処置Ｒ８６細胞と比較して控えめな低下（２０〜３０％）だけを示したのに対し（図３７Ｂ）、スチボグルコン酸ナトリウム処置ＰＲＬ−１トランスフェクタントからの免疫複合体のホスファターゼ活性は、スチボグルコン酸ナトリウム処置用量依存的に５２〜９０％阻害された（図３７Ｂ）。それ故、細胞内ＰＲＬ−１Ｒ８６突然変異型ホスファターゼはスチボグルコン酸ナトリウム阻害に対して非感受性であった。
【０３１３】
ＰＲＬ−１Ｒ８６突然変異型の発現がスチボグルコン酸ナトリウム誘導の増殖阻害に影響を及ぼすかどうかをさらに評価するため、トランスフェクタントをスチボグルコン酸ナトリウムの不在下または存在下で６日間培養し、生存細胞をＭＴＴアッセイによって測定した。トランスフェクタントはスチボグルコン酸ナトリウムの不在下で同様の増殖を示した（図３７Ｃ；データは３つの試料の平均＋標準偏差値を示す）。スチボグルコン酸ナトリウムの存在下では、ＰＲＬ−１およびベクター対照細胞の増殖が用量依存的に阻害された（図３７Ｄ；データは３つの試料の平均＋標準偏差値を示す）。しかし、Ｒ８６トランスフェクタントの増殖は１２．５または２５μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウムによって阻害されず、前記用量のスチボグルコン酸ナトリウムはその他のトランスフェクタントの増殖を２０〜４０％抑制した（図３７Ｄ）。より高用量（５０または１００μｇ／ｍｌ）のスチボグルコン酸ナトリウムは、ＰＲＬ−１細胞へのその作用と比較して、Ｒ８６細胞では控えめな増殖阻害だけを誘導した（図３７Ｄ）。それ故、スチボグルコン酸ナトリウムは、ＰＲＬ−１Ｒ８６トランスフェクタントの増殖を阻害する上であまり有効ではなく、ＷＭ９細胞におけるＰＲＬ−１Ｒ８６の異所性発現がスチボグルコン酸ナトリウムの増殖阻害作用に対する抵抗性を付与したことを明らかにした。
【０３１４】
８．アンチモン酸メグルミン（グルカンタイム）はＳＨＰ−１およびＰＲＬ−３を阻害する。
【０３１５】
他のアンチモンベースの化合物もＰＴＰアーゼ阻害剤として働くかどうかを評価するため、ＳＨＰ−１およびＰＲＬ−３に対するアンチモン酸メグルミン（グルカンタイム）の作用をインビトロでのＰＴＰアーゼアッセイによって分析した。
【０３１６】
合成ホスホチロシンペプチド基質を脱リン酸化する上でのＳＨＰ−１およびＰＲＬ−３のＰＴＰアーゼ活性は、アンチモン酸メグルミンの存在下で用量依存的に低下した（図３８）。１μｇ／ｍｌ以上のアンチモン酸メグルミンレベルは、ＰＴＰアーゼの８５〜９５％阻害を示した（図３８）。１００μｇ／ｍｌのアンチモン酸メグルミンにより、ＳＨＰ−１の約９０％が阻害され、ＰＲＬ−３の約１００％が阻害された（図３８）。
【０３１７】
Ｃ．考察
【０３１８】
これらの結果は、スチボグルコン酸ナトリウムがＰＲＬの阻害剤であることを明らかにした。スチボグルコン酸ナトリウムは、用量依存的に、インビトロでの組換えＰＲＬ（図３０）およびＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクタントにおける細胞内ＰＲＬ（図３１）の活性を阻害した。スチボグルコン酸ナトリウム処置は、以前に特定されたそのＰＴＰアーゼ標的、ＳＨＰ−１(Pathak et al., J. Imumol 167, 3391 (2001))に対するその効力と同様に、１０μｇ／ｍｌでインビトロでの組換えＰＲＬ−３（図３０Ｂ）および細胞内ＰＲＬ（図３１）のほぼ完全な不活性化を生じさせた。これに対し、ＳＨＰ−２はスチボグルコン酸ナトリウムに対してそれほど感受性ではなく、比肩し得るレベルの阻害のために１００μｇ／ｍｌのスチボグルコン酸ナトリウムを必要としたが、本剤は、上述した以前の試験で示されたようにＭＫＰ１ホスファターゼに対してほとんど活性を有していなかった。重要な点として、ＰＲＬに対するスチボグルコン酸ナトリウムの有効用量は、十分に、標準スチボグルコン酸ナトリウム療法において１０〜２０ｍｇ／ｋｇ／日で投与される、本剤の臨床的に達成可能なインビボレベルの範囲内である(Herwaldt et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 46, 296 (1992))。スチボグルコン酸ナトリウムへの短期暴露が２４時間より長い持続的作用で細胞内ＰＲＬの阻害を生じさせた（図３１）ことを考慮すると、インビボでのＰＲＬの不活性化はスチボグルコン酸ナトリウム治療の間に起こり得ると考えられる。インビトロでのスチボグルコン酸ナトリウム誘導のＰＲＬ−３不活性化が洗浄工程によって除去された（図３０Ｅ）という所見は、不可逆的な阻害機構を指示する。そのような作用様式は、スチボグルコン酸ナトリウム誘導の細胞内ＰＲＬ−２の阻害の長期性（図３１）およびホスファターゼとスチボグルコン酸ナトリウムの長期間のプレインキュベーションとＰＲＬ−３のより有効な不活性化の結びつき（図３０Ｂ）と一致する。
【０３１９】
このデータはまた、スチボグルコン酸ナトリウムが抗癌活性を有することを明らかにした。スチボグルコン酸ナトリウムは、前立腺癌細胞系ＤＵ１４５を含む、様々なヒト癌細胞系のインビトロでの増殖を用量依存的に阻害した（図３４）。インビボでのスチボグルコン酸ナトリウムの抗癌作用は、非毒性用量のスチボグルコン酸ナトリウムによるヌードマウスでのＤＵ１４５腫瘍増生の阻害によって明らかにされた（図３５）。その他の癌細胞系がインビトロでスチボグルコン酸ナトリウムに対してＤＵ１４５よりも感受性である（図３４）という事実は、本剤が同等の実験条件下でマウスモデルにおける腫瘍に対してさらに一層有効であり得る可能性を示唆する。これらの結果は、スチボグルコン酸ナトリウムを癌治療のための候補治療薬として示唆し、そのさらなる臨床評価のための前臨床データを提供する。
【０３２０】
重要な点として、これらの結果は、スチボグルコン酸ナトリウムの抗癌作用が、少なくとも一部には、癌細胞におけるＰＲＬの不活性化によって媒介されることを示唆するいくつかの系列の証拠を提供した。スチボグルコン酸ナトリウムがインビトロで増殖阻害活性を示す癌細胞系は（図３４）、全てＰＲＬを発現した（図３３）。これらのホスファターゼは、組換えタンパク質として（図３０）またはそれらの細胞内環境において（図３１および３７）スチボグルコン酸ナトリウムによって阻害された。さらに、我々は、ＤＵ１４５細胞のスチボグルコン酸ナトリウム抵抗性クローンが、スチボグルコン酸ナトリウムによる阻害に対して非感受性の活性ホスファターゼであり（図３６）、ＷＭ９黒色腫細胞において異所性発現されたときスチボグルコン酸ナトリウム誘導の増殖阻害に対する抵抗性を付与する（図３７）、突然変異型のＰＲＬ−１を発現することを示した。これらの結果は、ＰＲＬ−１およびおそらくその他のＰＲＬの不活性化が、癌細胞のスチボグルコン酸ナトリウム誘導性増殖阻害において鍵となる役割を果たすことを示唆する。特にＰＲＬ−１は、ＰＲＬ−ＴＲ８６トランスフェクタントに対して増殖阻害活性を示さないが、ＰＲＬ−１トランスフェクト細胞の増殖を抑制する上で有効であった（図３７Ｄ）、１２．５〜２５μｇ／ｍｌの用量範囲のスチボグルコン酸ナトリウムの増殖阻害活性を媒介する責任を主として担うと考えられる。この概念と一致して、スチボグルコン酸ナトリウムのこれらの用量は、組換えおよび細胞内ＰＲＬを阻害する上で有効であったが（図３０、３１、３６および３７）、ＰＲＬ−１Ｒ８６突然変異型を阻害するには有効でなかった（図３６および３７Ｂ）。スチボグルコン酸ナトリウムはまた、ＳＨＰ−１を阻害する上でも同様の効力を示したが（図３０）、このＰＴＰアーゼは主として造血細胞において発現し(Yi, et al., Blood 78, 2222 (1991); Yi, et al, Molecular & Cellular Biol. 12, 836 (1992))、造血系ではない検討した癌細胞系には存在しないと予想される（図３４）。実際に、ＷＭ９黒色腫細胞におけるＳＨＰ−１発現の不在が、抗ＳＨＰ−１抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認された。それ故、ＷＭ９細胞およびＷＭ９トランスフェクタントに対するスチボグルコン酸ナトリウムの増殖阻害活性はＳＨＰ−１とは独立して機能した。しかし、スチボグルコン酸ナトリウムによるＳＨＰ−１の阻害は造血細胞で起こり、ＰＴＰアーゼによって負に調節されるサイトカインシグナル伝達を上昇させるスチボグルコン酸ナトリウム活性において役割を果たすと考えられる(Pathak et al., J. Imumol. 167, 3391 (2001))。
【０３２１】
おそらく癌細胞におけるＰＲＬの不活性化によって媒介される、インビトロでの癌細胞系およびマウスにおけるＤＵ１４５腫瘍に対するスチボグルコン酸ナトリウムの実証された増殖阻害活性を考慮して、スチボグルコン酸ナトリウムは、腫瘍形成性ホスファターゼが一貫して発現され、病原の役割を果たすヒト悪性疾患において有益であると考えられる。転移性結腸癌におけるＰＲＬ−３の発現上昇だけがこれまでに報告されているが(Bradbury, Lancet 358, 1245 (2001); Saha, et al., Science 294, 1343 (2001))、ＰＲＬが様々なヒト癌細胞系において有意の発現レベルで検出されたという事実は（図３３）、ホスファターゼの発現がヒト悪性疾患において共通し得る可能性を示唆する。ヒト腫瘍試料でのＰＲＬの発現レベルを評価するためのさらなる試験は、臨床評価のための、スチボグルコン酸ナトリウム治療に対して潜在的に感受性であるヒト悪性疾患の種類および病期の特定において決定的に重要な情報を提供する。これに関して、スチボグルコン酸ナトリウム非感受性ＰＲＬ−１突然変異型の特定は、ＰＲＬ−１突然変異がスチボグルコン酸ナトリウム抵抗性マーカーとしての機能を果たし得る、癌患者においてスチボグルコン酸ナトリウム感受性またはスチボグルコン酸ナトリウム抵抗性ヒト腫瘍を特定するためのＰＲＬの配列分析の価値を示唆する。さらに、スチボグルコン酸ナトリウム非感受性ＰＲＬ−１突然変異型は、スチボグルコン酸ナトリウム非感受性ＰＲＬに対する阻害剤を選択的抗癌治療薬として開発するための基礎を提供する。
【０３２２】
抗癌活性を有する初めての臨床的に使用可能なＰＲＬの阻害剤としてのスチボグルコン酸ナトリウムの特定は、ＰＴＰアーゼ阻害剤を標的治療薬として開発する上での重要な突破口であり、さらなる機構検討のための新しい研究領域を切り開く。スチボグルコン酸ナトリウム内のアンチモンがスルフヒドリル基と共有結合を形成する能力(Berman and Grogl. 1988)および全てのチロシンホスファターゼにおける触媒システイン残基の存在(Hooft van Huijsduijnen. 1998)は、潜在的不活性化機構としてスチボグルコン酸ナトリウム内の五価アンチモンによるシステインの修飾を示唆する。この推定上の作用機構は、スチボグルコン酸ナトリウムによる組換えＰＲＬ−３（図３０）およびＳＨＰ−１(Pathak et al., J. Imumol. 167, 3391 (2001))の不可逆的阻害並びにスチボグルコン酸ナトリウム誘導の細胞内ＰＲＬ−２の阻害の長い期間（図３２）と一致する。この推定上の機構はさらに、スチボグルコン酸ナトリウムの有機部分を、アンチモン／システイン相互作用を促進し、それ故阻害剤のＰＴＰアーゼ特異性を定義するためのＰＴＰアーゼ触媒ポケットに相補的な立体配置を提供することに関係付ける。さらに、提案した機構は、スチボグルコン酸ナトリウム阻害に対するＭＫＰ１(Pathak et al., J. Imumol. 167, 3391 (2001))およびＰＲＬ−１Ｒ８６突然変異型の非感受性についての合理的説明を提供する（図３６および３７）。この仮説と一致して、アンチモン酸メグルミン（Ｎ−メチルグルカミンに複合した五価アンチモン）は、ＳＨＰ−１およびＰＲＬ−３（図３８）並びに他のＰＴＰアーゼ（そのうちの一部はスチボグルコン酸ナトリウムによって影響されなかった）に対してＰＴＰアーゼ阻害活性を有することが認められた。それ故、種々の有機部分に複合したアンチモンから成る化合物に基づく新規のより特異的なＰＴＰアーゼ阻害剤を開発することが実現可能であると考えられる。スチボグルコン酸ナトリウムは、それ故、新規治療薬および実験ツールとしてさらに開発し得る新しいクラスのＰＴＰアーゼであると考えられる。
【０３２３】
ＶＩ．ＰＴＰアーゼ阻害活性はスチボグルコン酸ナトリウム内の選択化合物に関連する。
【０３２４】
スチボグルコン酸ナトリウム混合物内の選択化合物または全ての化合物が有効なＰＴＰアーゼ阻害剤であるのかどうかおよびスチボグルコン酸ナトリウムのＰＴＰアーゼ阻害活性がＳｂによってのみ定義されるのかどうかを調べるため、スチボグルコン酸ナトリウムをクロマトグラフィーによって分別した。個々の分画のＳｂ含量およびＰＴＰアーゼ阻害活性を測定した。
【０３２５】
Ａ．実験材料および方法
【０３２６】
スチボグルコン酸ナトリウム混合物をＪｏｒｄｉゲルカラム（Ｊｏｒｄｉ  １００Ａ；Ｊｏｒｄｉ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．）でのＨＰＬＣによって分離し、０．２ｍｌ／分の水で溶出して、溶出の間に分画として収集した。溶出液中の化合物の相対量を質量分析法（フルスキャン）によって観測した。スチボグルコン酸ナトリウムおよびスチボグルコン酸ナトリウム分画のＳｂ含量を、０．８Ｍ ＨＮＯ3および１．２Ｍ ＨＣｌの均一マトリックス中で作製したＳｂ溶液標準品、スチボグルコン酸ナトリウムおよびスチボグルコン酸ナトリウム分画に関して、標準手順に従って誘導結合プラズマ質量分析によって定量した。インジウムを内部標準として用いた。検量線は分析期間を通して安定であった（勾配のドリフト＝０．２９％）。試料のＳｂ含量の値は、全ての系統的およびランダム誤差の算定に基づき約１０％の最大相対誤差を有していた。収集した溶出液中で検出されたＳｂの総量は、クロマトグラフィーのためのスチボグルコン酸ナトリウム投入量の約９０％であった。
【０３２７】
Ｂ．結果および考察
【０３２８】
スチボグルコン酸ナトリウム混合物中の化合物は、クロマトグラフィーの間に時間依存的に溶出され、質量分析走査によって明らかになったように大部分が８〜２５分の間に溶出した（図３９Ａ）。分画１（０〜８分の溶出物）中の化合物の欠如と一致して、誘導結合プラズマ質量分析により、分画中にＳｂは検出されなかった（図３９Ａ）。分画２〜７は様々な量のＳｂ含量を示し、最高レベルは分画４および５で検出され、溶出物中の総Ｓｂの９６％を占めた（図３９Ａ）。
【０３２９】
組換えＳＨＰ−１  ＰＴＰアーゼに対する分画および親スチボグルコン酸ナトリウム混合物の阻害活性をインビトロでのＰＴＰアーゼアッセイによって評価した。１０μｇ／ｍｌのＳｂ濃度のスチボグルコン酸ナトリウムはＳＨＰ−１を不活性化した（図３９Ｂ；（データは３つの試料の平均±標準偏差値を示す）。予想されたように、分画１は検出可能な化合物またはＳｂを含まなかったので（図３９Ｂ）、分画１はＳＨＰ−１に対して活性を示さなかった（図３９Ｂ）。分画６および７は、低レベルのＳｂを有していたが、ＰＴＰアーゼを阻害することができなかった（図３９Ｂ）。興味深いことに、分画６および７と同様のＳｂレベルを有する分画２はＳＨＰ−１に対して活性であった（図３９Ｂ）。これに対し、分画３および４は、それらのＳｂレベルが分画２よりも約１０〜２０倍高かったという事実にも関わらず、ＳＨＰ−１  ＰＴＰアーゼ活性にごくわずかな作用しか示さなかった（図３９Ｂ）。分画５も、そのＳｂレベルは分画２のほぼ１００倍高かったが、ＳＨＰ−１に対して有意の活性を示した（図３９Ｂ）。組換えＳＨＰ−２も分画２および５によって阻害されたが、同等の条件下でその他の分画によっては影響を受けなかった。
【０３３０】
これらの結果は、組換えＳＨＰに対する阻害活性が、Ｓｂ含量だけによって定義されるのではない方法で、スチボグルコン酸ナトリウム混合物中の選択化合物と結びつくことを明らかにした。分画２はスチボグルコン酸ナトリウム中の総化合物の＜１０％を占めるが、その比較的低いＳｂ濃度にもかかわらずＰＴＰアーゼを阻害する上で有効であったという事実は（図３９Ａ）、スチボグルコン酸ナトリウム中の化合物の小さな部分だけが主として本剤のＰＴＰアーゼ阻害活性の原因となることを示唆する。これらの結果は、スチボグルコン酸ナトリウム中の活性化合物が、より強力でより毒性の低いＰＴＰアーゼ標的治療薬として精製され得ることを指示する。最も活性なスチボグルコン酸ナトリウム種をより厳密に特定することはまた、スチボグルコン酸ナトリウムの化学構造および標的ＰＴＰアーゼとの相互作用を定義するための基礎を提供し得る。これらの特定された分子はまた、新規ＰＴＰアーゼ阻害剤の合理的設計のための出発点も提供し得る。
【０３３１】
ＶＩＩ．レバミゾール、ペンタミジンおよびケトコナゾールはインビトロでＰＴＰアーゼ阻害活性を有していた。
【０３３２】
リーシュマニア症に対して有効であることが知られる薬剤、レバミゾール、ペンタミジンおよびケトコナゾールがＰＴＰアーゼ阻害剤として働くかどうかを評価するため、これらの薬剤のインビトロでの作用を検討した。
【０３３３】
Ａ．方法
【０３３４】
上記Ｉ．Ａ．２章で詳述したように合成ホスホチロシンペプチドまたはＤｉＦＭＵＰを基質として使用し、確立された手順に従って(Pathak et al., J. Imumol. 167, 3391 (2001); Pathak et al., Leukemia 16, 2285 (2002), Yi et al., J. Immunol. 169, 5978 (2002))、組換えＰＴＰアーゼへのレバミゾール（Ｓｉｇｍａ）、ペンタミジン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｉｎｃ．）およびケトコナゾール（Ｓｉｇｍａ）の作用を測定するためにインビトロでのＰＴＰアーゼアッセイを使用した。
【０３３５】
Ｂ．結果および考察
【０３３６】
１．レバミゾール、ペンタミジンおよびケトコナゾールはインビトロでＰＴＰアーゼ阻害活性を示す。
【０３３７】
ＳＨＰ−１、ＰＴＰ１ＢおよびＭＬＰ１（図３４および３５）およびＧＳＴｍ８（図４０Ｃ）に対するレバミゾール、ペンタミジンおよびケトコナゾールの活性をインビトロでのＰＴＰアーゼアッセイにおいて測定した。スチボグルコン酸ナトリウムと異なり、レバミゾール、ペンタミジンおよびケトコナゾールは、治療濃度（３〜４μｇ／ｍｌ）またはより高濃度（１０〜１００μｇ／ｍｌ）でＳＨＰ−１（図４１Ａ）またはＧＳＴｍ８（図４０Ｃ）に対して明らかな阻害活性を示さなかった。しかしＰＴＰ１Ｂに関しては、スチボグルコン酸ナトリウムがごく控えめにのみ有効であったのに対し、これらの薬剤は０．１〜１μｇ／ｍｌでＰＴＰ１Ｂ活性の有意の阻害（約８０〜９８％）を達成した（図４０Ｂおよび４１Ｂ）。さらに、３つの薬剤はまた、ＳＳが明らかな作用を及ぼさなかった、ＭＫＰ１の実質的な阻害を示した（図４１Ｃ）。
【０３３８】
ＰＲＬ−１、ＰＲＬ−２およびＰＲＬ−３に対するペンタミジンおよびケトコナゾールの活性も、インビトロでのＰＴＰアーゼアッセイにおいて測定した（図４２）。ペンタミジンは、０．１〜１００μｇ／ｍｌ以上の治療濃度でＰＲＬ−３に対して有効であり、ＰＴＰアーゼ活性を２０〜３０％に低下させた（図４２Ａ）。ペンタミジンはＰＲＬ−１に対してはあまり有効ではなかった；ＰＴＰアーゼは、この薬剤の０．１〜１００μｇ／ｍｌ用量に関してその活性の約７０〜８０％を保持した（図４２Ａ）。ペンタミジンはＰＲＬ−２に対しては有効でなかった（図４２Ａ）。ケトコナゾールは、０．１〜１００μｇ／ｍｌ以上の治療濃度でＰＲＬ−３に対して有効であり、ＰＴＰアーゼ活性を約２５〜４０％に低下させた（図４２Ｂ）。ケトコナゾールはＰＲＬ−１に対してはあまり有効ではなく、ＰＴＰアーゼは、この薬剤の０．１〜１００μｇ／ｍｌ用量に関してその活性の約６０〜７０％を保持した（図４２Ｂ）。ケトコナゾールはＰＲＬ−２に対しては有効でなかった（図４２Ｂ）。
【０３３９】
これらの結果は、ペンタミジンおよびケトコナゾールがある種のＰＴＰアーゼに対して阻害活性を有することおよびＰＴＰアーゼはスチボグルコン酸ナトリウム、ペンタミジンおよびケトコナゾールに対して異なる感受性を有することをインビトロで明らかにした。これらの結果は、ペンタミジンおよびケトコナゾールがそれらの抗リーシュマニア作用の主要機構として細胞ＰＴＰアーゼを標的し得ることおよびそれ故、抗癌活性も有し得ることを示唆した。重要な点として、種々のＰＴＰアーゼを標的する上でのスチボグルコン酸ナトリウム、ペンタミジンおよびケトコナゾールの見かけ上の優先傾向は、これらの阻害剤が、各々がその悪性表現型のために異なるＰＴＰアーゼを必要とすると考えられる、異なる型の癌細胞に対して活性を有し得ることを示唆した。
【０３４０】
２．ペンタミジンはインビトロでＷＭ９細胞の増殖を阻害し、ＩＦＮ−αが誘導するＷＭ９細胞の増殖阻害を上昇させる。
【０３４１】
ペンタミジンおよびケトコナゾールの潜在的抗癌活性を評価するため、単独薬剤としておよびＩＦＮ−αとの組み合わせたペンタミジンおよびケトコナゾールのインビトロでのＷＭ９細胞への作用を測定した（図４３）。
【０３４２】
ペンタミジンは単独薬剤として著しい増殖阻害活性を示した（図４３Ａ）。ペンタミジンは、その治療用量（２〜４ｍｇ／ｋｇ）と同様の濃度である、２．５〜５μｇ／ｍｌで８６〜９７％の阻害を達成した（図４３Ａ）。この薬剤は、０．６２５〜１．２５μｇ／ｍｌの濃度で最も明瞭に、ＩＦＮ−αが誘導する増殖阻害を上昇させた。これらの結果は、ペンタミジンが有意の抗癌活性を有し、ＩＦＮ−αと相互作用することを示唆する。
【０３４３】
０．６２５〜２０μｇ／ｍｌの濃度のケトコナゾールは、単独薬剤としてまたはＩＦＮ−αとの組合せでＷＭ９細胞に対して明らかな活性を有していなかった（図４３Ｂ）。より高濃度では（４０μｇ／ｍｌ）、ケトコナゾールは単独薬剤として６７％の増殖阻害を達成し、ＩＦＮ−α活性にわずかな増強作用を及ぼした（図４３Ｂ）。両剤ともＰＴＰ１ＢおよびＭＫＰ１を阻害する上で類似の活性を示したので（図４１）、ＷＭ９細胞に対するそれらの異なる作用は、おそらく、ＰＴＰ１ＢおよびＭＫＰ１はペンタミジンの抗癌作用の原因となる主要標的ＰＴＰアーゼではないことを示唆する。
【０３４４】
特許請求する本発明の様々な特徴を上記に示したが、これらの特徴は単独でまたはそれらの何らかの組合せとして使用し得ることが了解されるべきである。それ故、特許請求する本発明は、ここで記述した特定の実施形態だけに限定されるべきではない。
【０３４５】
さらに、特許請求する本発明が属する技術分野の当業者には、変法および修正を実施し得ることが了解されるべきである。ここで記載された本実施形態は特許請求された発明の例示である。本開示は、当業者が、特許請求の範囲中で列挙する本発明の要素に同じように対応する選択的要素を有する実施形態を作製し、使用することを可能にし得る。意図する本発明の範囲は、それ故、特許請求の範囲の文言と異ならないまたは実質的に異ならない他の実施形態を包含し得る。本発明の範囲は、従って、付属の特許請求の範囲の中で述べるように定義される。
【表１】
2008519845.tif 000002
【０３４６】
配列ＣＷＵ１
９  １  ３１  ＤＮＡ  ＤＨ５ａ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  １  ｃｔｇｇａｔｃｃｔｇ  ｃｇｇｇｇｇｃｔｇｃ  ｔｇｃａｇｇａｇｃｇ  ｃ  ３１  ２  ２９  ＤＮＡ  ＤＨ５ａ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ２  ａａｇｔｃｇａｃｇｃ  ａｇｃｔｔｇｇｇｇａ  ｇｇｔｇｇｔｇａｔ  ２９  ３  １３  ＰＲＴ  ＰＴＰアーゼ基質として作用するよう作製された未知の人工ペプチド。３  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  １  ５  １０  ４  ３２  ＤＮＡ  Ｈｕｍａｎ  ４  ｔａｇｇａｔｃｃｃｇ  ｇｇａｇｇｃｇｃｃａ  ｔｇｇｃｔｃｇｇａｔ  ｇａ  ３２  ５  ３２  ＤＮＡ  Ｈｕｍａｎ  ５  ｇａｇｔｃｇａｃｃａ  ｔａａｃｇｃａｇｃａ  ｃｃｇｇｇｔｃｔｔｇ  ｔｇ  ３２  ６  ３３  ＤＮＡ  Ｈｕｍａｎ  ６  ｔａｇｇａｔｃｃｃｃ  ａｔａａｔｇａａｃｃ  ｇｔｃｃａｇｃｃｃｃ  ｔｇｔ  ３３  ７  ３２  ＤＮＡ  Ｈｕｍａｎ  ７  ｇａｇｔｃｇａｃｃｔ  ｇａａｃａｃａｇｃａ  ａｔｇｃｃｃａｔｔｇ  ｇｔ  ３２  ８  ３３  ＤＮＡ  Ｈｕｍａｎ  ８  ｔａｇｇａｔｃｃｃｃ  ａａｃａｔｇｇｃｔｃ  ｇａａｔｇａａｃｃｇ  ｃｃｃ  ３３  ９  ３２  ＤＮＡ  Ｈｕｍａｎ  ９  ｇａｇｔｃｇａｃｔｔ  ｇａａｔｇｃａａｃａ  ｇｔｔｇｔｔｔｃｔａ  ｔｇ  ３２
【図面の簡単な説明】
【０３４７】
【図１】スチボグルコン酸ナトリウム（Ａ）およびアンチモン酸メグルミン（Ｂ）の仮説上の構造。
【図２】ケトコナゾール（Ａ）、レバミゾール（Ｂ）およびペンタミジン（Ｃ）の仮説上の構造。
【図３】Ａ．様々な量のスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）の存在下でのＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２およびＰＴＰ１ＢのＧＳＴ融合タンパク質の相対的ＰＴＰアーゼ活性。Ｂ．様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムまたはスラミンの存在下でのＧＳＴ／ＳＨＰ−１融合タンパク質の相対的ＰＴＰアーゼ活性。Ｃ．様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムの存在下でのＰＴＰ１ＢおよびＭＫＰ１のＧＳＴ融合タンパク質の相対的ＰＴＰアーゼ活性。
【図４】Ａ．ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−１触媒ドメイン（ＳＨＰ−１ｃａｔａ）のＧＳＴ融合タンパク質のタンパク質ドメイン構造。Ｂ．様々な量のスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）の存在下でのＳＨＰ−１およびＳＨＰ−１ｃａｔａの融合タンパク質の相対的ＰＴＰアーゼ活性。
【図５】スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）またはスラミンと共にプレインキュベートし、その後洗浄したか（＋）または洗浄していないＳＨＰ−１のＧＳＴ融合タンパク質の相対的ＰＴＰアーゼ活性。
【図６】ＩＬ−３を１６時間除去し、その後スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）（Ａ）または過バナジン酸（Ｂ）と共に様々な時間インキュベートした、Ｂａｆ３細胞の全細胞溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。
【図７】Ｂａｆ３細胞においてスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）がＩＬ−３誘導のＪａｋ２／Ｓｔａｔ５チロシンリン酸化を上昇させることを示す、Ｂａｆ３細胞の全細胞溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。
【図８】Ａ．スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）は、ＩＬ−３の存在下で培養したＢａｆ３細胞の増殖を上昇させる。Ｂ．スチボグルコン酸ナトリウムの存在下または不在下で様々な量のＩＬ−３と共に３日間培養したＢａｆ３細胞についての細胞数。
【図９】Ａ．様々な量のＧＭ−ＣＳＦの存在下でスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）と共にまたはスチボグルコン酸ナトリウムなしで３日間培養したＴＦ−１細胞の増殖。Ｂ．ＧＭ−ＣＳＦおよび様々な量のＩＦＮ−αの存在下でスチボグルコン酸ナトリウムと共にまたはスチボグルコン酸ナトリウムなしで３日間培養したＴＦ−１細胞の増殖。Ｃ．細胞増殖の阻害パーセントで表わしたＢの結果。Ｄ．ＧＭ−ＣＳＦおよび様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムの存在下で６日間培養したＴＦ−１細胞の増殖。Ｅ．ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮ−αおよび様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムの存在下で６日間培養したＴＦ−１細胞の増殖。
【図１０】Ａ．様々な量のスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）または酒石酸アンチモンカリウム（ＰＳｂＴ）の存在下でのＳＨＰ−１、ＰＴＰ１ＢおよびＭＫＰ−１のＧＳＴ融合タンパク質の相対的ＰＴＰアーゼ活性。Ｂ．スチボグルコン酸ナトリウムまたは酒石酸アンチモンカリウムの不在下または存在下に様々な時間ＩＬ−３で刺激したＢａｆ３細胞の全細胞溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｃ．ＩＬ−３（１０単位／ｍｌ）および様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムまたは酒石酸アンチモンカリウムの存在下で３日間培養したＢａｆ３細胞の増殖。
【図１１】Ａ．スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）に３および６日間暴露した後のＮＢ４細胞培養におけるＮＢＴ陽性細胞のパーセンテージ。Ｂ．全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）またはスチボグルコン酸ナトリウムに６日間まで暴露した後のＮＢ４細胞培養におけるＮＢＴ陽性細胞のパーセンテージ。Ｃ．全トランスレチノイン酸またはスチボグルコン酸ナトリウムの存在下で３日間培養したＮＢ４細胞におけるＣＤ１１ｂ陽性細胞のパーセンテージ。
【図１２】Ａ．様々な量のスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）中で６日間培養したＮＢ４、ＨＬ−６０およびＵ９３７細胞についての増殖阻害のパーセンテージ。Ｂ．添加物なしであるいはスチボグルコン酸ナトリウムまたは全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の存在下で培養した後のＧ０／Ｇ１、ＳまたはＧ２／Ｍ期のＮＢ４細胞のパーセンテージ。Ｃ．添加物なしであるいはスチボグルコン酸ナトリウムまたは全トランスレチノイン酸の存在下で３日間培養したＮＢ４細胞についてのフローサイトメトリープロット（Ｘ軸はアネキシンＶ  ＦＩＴＣによる染色を示し、Ｙ軸はヨウ化プロピウムによる染色を示す）。
【図１３】Ａ．スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）または全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の存在下または不在下で６日間培養し、その後洗浄して、さらに６日間培養したＮＢＴ陽性ＮＢ４細胞のパーセンテージ。Ｂ．スチボグルコン酸ナトリウムまたは全トランスレチノイン酸の存在下または不在下で０．５〜２４時間培養し、その後洗浄して、さらに６日間培養したＮＢＴ陽性ＮＢ４細胞のパーセンテージ。
【図１４】Ａ．様々な量のスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）の不在下または存在下で３または６日間培養したＨＬ−６０細胞におけるＮＢＴ陽性細胞のパーセンテージ。Ｂ．様々な量のスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）の不在下または存在下で３または６日間培養したＵ−９３７細胞におけるＮＢＴ陽性細胞のパーセンテージ。Ｃ．全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）またはスチボグルコン酸ナトリウムの存在下または不在下で０〜６日間培養したＨＬ−６０細胞におけるＮＢＴ陽性細胞のパーセンテージ。Ｄ．全トランスレチノイン酸またはスチボグルコン酸ナトリウムの存在下または不在下で０〜６日間培養したＵ９３７におけるＮＢＴ陽性細胞のパーセンテージ。
【図１５】顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）またはその両方の不在下または存在下で様々な時間培養したＮＢＴ要請ＨＬ−６０（Ａ）およびＵ９３７（Ｂ）細胞のパーセンテージ。
【図１６】Ａ．様々な量のスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）および／またはＩＦＮ−αの不在下または存在下で３日間培養したＤＲ細胞への細胞増殖。Ｂ．Ａに示すデータから算定したＤＲ細胞の成長阻害のパーセンテージ。Ｃ．様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムおよび／またはＩＦＮ−αの不在下または存在下で３日間培養したＤＳ細胞への細胞増殖。Ｄ．様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムおよび／またはＩＦＮ−αの不在下または存在下で６日間培養したＤＲ細胞の成長阻害のパーセンテージ。Ｅ．６日目の培養物におけるＩＦＮ−αおよび様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムによるＵ２６６細胞の増殖阻害のパーセンテージ。
【図１７】６日目の培養物における様々な量のスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）および／またはＩＦＮ−αの不在下または存在下でのＷＭ９（Ａ）、ＤＲ１４５（Ｂ）、ＭＤＡ２３１（Ｃ）およびＷｉＴ４９−Ｎ１（Ｄ）の増殖阻害のパーセンテージ。
【図１８】６日目の培養物における様々な量のＳＳ、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの不在下または存在下でのＷＭ９細胞の増殖阻害のパーセンテージ。
【図１９】ＷＭ９細胞におけるスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）とＩＦＮ−α（Ａ）またはＩＦＮ−β（Ｂ）の間の相乗作用を明らかにする制御増殖パーセンテージのプロット。
【図２０】添加物の不在下（Ａ）あるいはＩＦＮ−α（Ｂ）、スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）（Ｃ）またはその両方（Ｄ）の存在下で３日間培養したＵ２６６細胞についてのフローサイトメトリーのプロット（Ｘ軸はアネキシンＶ  ＦＩＴＣによる染色を示し、Ｙ軸はヨウ化プロピウムによる染色を示す）。
【図２１】Ａ．スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）の不在下または存在下に様々な時点でＩＦＮ−αによって刺激したＤＲ細胞の全細胞溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｂ．スチボグルコン酸ナトリウムの不在下または存在下で５時間ＩＦＮ−αによって刺激したヒト癌細胞系ＷＭ９、ＷＭ３５、ＷｉＴ４９−Ｎ１およびＤＲ１４５の全細胞溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。
【図２２】ヌードマウスにおけるＷＭ９およびＤＵ１４５腫瘍の腫瘍容積へのスチボグルコン酸ナトリウム、ＩＦＮ−αまたはその両方の経時的な作用。
【図２３】ＷＭ９異種移植片を担持するヌードマウスと対照群の体重の比較。
【図２４】インビトロでのＳＳＧに対するＲｅｎｃａおよびＷＭ９細胞の区別的増殖応答。Ｒｅｎｃａ（Ａ）およびＷＭ９（Ｂ）細胞を様々な量のＳＳＧの不在下または存在下で６日間培養した。その後、生細胞をＭＴＴアッセイによって定量した。データは３つの試料の平均＋標準偏差を示す。
【図２５】ＳＳＧおよびＳＳＧ／ＩＬ−２併用処置は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてＲｅｎｃａ腫瘍成長を阻害する。Ｒｅｎｃａ細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに接種した（１０６細胞／部位、皮下）。次に、４日で確立されたＲｅｎｃａ腫瘍を有するマウスを、処置しないか（対照）またはＩＬ−２（１０５ＩＵ／日、腹腔内）、ＳＳＧ（１２ｍｇ／日、筋肉内）または２つの薬剤の組合せで処置した。これらのマウスにおけるＲｅｎｃａ腫瘍容積（平均＋標準偏差、ｎ＝８）を表示されているように記録した。薬剤の処置期間を矢印で示す。
【図２６】ＳＳＧおよびＳＳＧ／ＩＬ−２併用処置は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてＲｅｎｃａ腫瘍の浸潤性Ｍψを上昇させる。Ａ．免疫組織化学によって定量した、区別して処置したＢａｌｂ／ｃマウス（図２）からのＲｅｎｃａ腫瘍におけるＴリンパ球およびＭψの相対数。処置終了時にマウスから採取した腫瘍の組織切片を抗ＣＤ４、抗ＣＤ８または抗Ｆ４／８０ｍＡｂによって染色した。処置マウスからの腫瘍におけるＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＦ４／８０＋細胞を、対照マウスの腫瘍での基線レベルと比較することによって採点した（倍数上昇）。Ｂ．区別処置したマウスからのＲｅｎｃａ腫瘍切片におけるＦ４／８０＋細胞の代表的表示（４０×）。
【図２７】ＳＳＧおよびＳＳＧ／ＩＬ−２併用処置は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて脾臓Ｍψを上昇させる。Ａ．免疫組織化学によって定量した、区別して処置したＢａｌｂ／ｃマウス（図２）からの脾臓におけるＴ細胞およびＭψの相対数。処置終了時にマウスから採取した脾臓の組織切片を抗ＣＤ４、抗ＣＤ８または抗Ｆ４／８０ｍＡｂによって染色した。処置マウスからの脾臓におけるＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＦ４／８０＋細胞を、対照マウスの脾臓での基線レベルと比較することによって採点した（倍数）。Ｂ．区別処置したマウスからの脾臓におけるＦ４／８０＋細胞の代表的表示（２０×）。
【図２８】ＳＳＧは、インビトロでジャーカット細胞によるＩＦＮ−γ分泌を上昇させる。ジャーカット細胞を様々な量のＳＳＧの不在下または存在下で１６時間培養した。ジャーカットＴ細胞の培養上清中のＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡによって定量した。データは３つの試料の平均＋標準偏差を示す。
【図２９】胸腺欠損Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＲｅｎｃａ腫瘍成長へのＩＬ−２／ＳＳＧ併用処置の作用。Ｒｅｎｃａ細胞を胸腺欠損Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎｕ／ｎｕ）に接種した（１０６細胞／部位、皮下）。次に、４日で確立されたＲｅｎｃａ腫瘍を有するマウスを、処置しないか（対照）またはＩＬ−２（１０５ＩＵ／日、腹腔内）とＳＳＧ（１２ｍｇ／日、筋肉内）の組合せで処置した。これらのマウスにおけるＲｅｎｃａ腫瘍容積（平均＋標準偏差、ｎ＝８）を表示されているように記録した。薬剤の処置期間を矢印で示す。
【図３０】Ａ．スチボグルコン酸ナトリウムの存在下または不在下にインビトロで合成ホスホチロシンペプチドを脱リン酸化する上での組換えＰＲＬホスファターゼの相対活性。Ｂ．ペプチド基質をリン酸化する上でのＰＲＬ−３活性への組換えＰＲＬ−３とスチボグルコン酸ナトリウムの異なるプレインキュベーション時間の作用。Ｃ．様々な量のＳＳＧ、オルトバナジン酸ナトリウム（ＶＯ）またはスラミンの不在下または存在下でＤｉＦＭＵＰ基質を脱リン酸化する上での組換えＰＲＬ−３の相対活性。Ｄ．ＳＳの不在下または存在下でＤｉＦＭＵＰ基質を脱リン酸化する上での組換えＳＨＰ−１およびＰＲＬ−３の相対活性。Ｅ．ＳＳＧと共に１０分間プレインキュベートし、その後洗浄なし（洗浄−）または洗浄工程（洗浄＋）に供した、グルタチオンビーズに結合したＰＲＬ−３の相対ホスファターゼ活性。
【図３１】Ａ．インビトロでのＰＴＰアーゼアッセイにおける、対照ベクター（Ｖ）またはＦｌａｇ−ＰＲＬ−１発現構築物の未処置（０）またはスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳＧ）で処置した（５分間）ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクタントからの抗Ｆｌａｇ免疫複合体のＰＴＰアーゼ活性。Ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法によって検出した免疫複合体中のＦｌａｇ−ＰＲＬ−１の相対量。Ｃ．Ｆｌａｇ−ＰＲＬ−２の未処置またはスチボグルコン酸ナトリウム処置ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクタントからの抗Ｆｌａｇ免疫複合体のＰＴＰアーゼ活性。Ｄ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法によって測定した免疫複合体中のＦｌａｇ−ＰＲＬ−２の相対量。Ｅ．Ｆｌａｇ−ＰＲＬ−３の未処置またはスチボグルコン酸ナトリウム処置ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクタントからの抗Ｆｌａｇ免疫複合体のＰＴＰアーゼ活性。Ｆ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法によって測定した免疫複合体中のＦｌａｇ−ＰＲＬ−３の相対量。
【図３２】処置しないかまたはスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳＧ）で５分間処置し、無細胞薬剤を除去するために洗浄して、その後様々な時間インキュベートしたＦｌａｇ−ＰＲＬ−２トランスフェクタントからの抗Ｆｌａｇ免疫複合体の相対的ＰＴＰアーゼ活性。Ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法によって測定した免疫複合体中のＦｌａｇ−ＰＲＬ−２の相対量。
【図３３】ＲＴ−ＰＣＲによって測定した、ヒト癌細胞系（Ａ５４９、ＨＥＹ、ＬｏＶｏ、Ｓｋ−Ｎ−ＳＨおよびＤＵ１４５）のパネルおよび健常志願者からのＰＢＭＣにおけるＰＲＬの転写産物の発現。
【図３４】ＳＳＧの存在下または不在下での６日目の培養物におけるヒト癌細胞系Ａ５４９（Ａ）、ＨＥＹ（Ｂ）、ＬＯＶＯ（Ｃ）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（Ｄ）、Ｕ２５１（Ｅ）およびＤＵ１４５（Ｆ）の増殖。
【図３５】Ａ．無処置（対照）またはスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳＧ）による処置に供する２日前にＤＵ１４５細胞を接種したマウスにおける腫瘍容積。Ｂ．２５日目の対照マウスにおけるＤＵ１４５細胞接種部位の組織学的検査。Ｃ．２５日目のＳＳＧ処置マウスにおけるＤＵ１４５細胞接種部位の組織学的検査。（ＤＵ１４５腫瘍を矢印で示す。）
【図３６】Ａ．スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳＧ）の不在下または存在下での６日目の培養物におけるＤＵ１４５およびＤＵ１４５Ｒ細胞の増殖。Ｂ．ＤＵ１４５またはＤＵ１４５Ｒ細胞からのＰＲＬ−１  ｃＤＮＡの配列（コドン８６付近）。Ｃ．ＰＲＬ−１タンパク質におけるＳ８６およびＲ８６の位置。Ｄ．インビトロでのＰＴＰアーゼアッセイにおける、合成ホスホチロシンペプチド基質を脱リン酸化する上でのＰＲＬ−１、ＰＲＬ−１Ｒ８６（Ｒ８６）およびＧＳＴタンパク質（対照）のＧＳＴ融合タンパク質の活性。Ｅ．インビトロでのＰＴＰアーゼアッセイにおいて測定した、スチボグルコン酸ナトリウムの不在下または存在下での組換えＰＲＬ−１およびＰＲＬ−１Ｒ８６（Ｒ８６）の相対的ＰＴＰアーゼ活性。
【図３７】Ａ．対照ベクター（Ｖ）またはＦｌａｇ−ＰＲＬ−１またはＦｌａｇ−ＰＲＬ−１Ｒ８６の発現構築物の未処置またはスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳＧ）処置ＷＭ９細胞トランスフェクタントからの抗Ｆｌａｇ免疫複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット分析。Ｂ．インビトロでのＰＴＰアーゼアッセイによって測定した、抗Ｆｌａｇ免疫複合体の相対的ＰＴＰアーゼ活性（未処置Ｆｌａｇ−ＰＲＬ−１トランスフェクタントからの免疫複合体のＰＴＰアーゼ活性を１００％値とした）。Ｃ．６日目の培養物におけるスチボグルコン酸ナトリウムの不在下でのＷＭ９トランスフェクタントの増殖。Ｄ．様々な量のスチボグルコン酸ナトリウムの存在下でのＷＭ９トランスフェクタントの相対的増殖阻害。
【図３８】インビトロでアンチモン酸メグルミンの存在下での相対的ＳＨＰ−１およびＰＲＬ−３  ＰＴＰアーゼ活性。
【図３９】Ａ．分画および各々の分画中のＳｂ含量を示す、スチボグルコン酸ナトリウム分離のＨＰＬＣクロマトグラフ。Ｂ．各々のスチボグルコン酸ナトリウム分画の存在下での組換えＳＨＰ−１の相対的ＰＴＰアーゼ活性。
【図４０】モデル薬剤として使用したスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）とレバミゾール、ケトコナゾールおよびペンタミジンの存在下でのＭＫＰ（Ａ）、ＰＴＰ１Ｂ（Ｂ）およびＧＳＴｍ８（Ｃ）の相対的ＰＴＰアーゼ活性。
【図４１】モデル薬剤として使用したスチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳ）とケトコナゾールおよびペンタミジンの存在下でのＳＨＰ−１（Ａ）、ＰＴＰ１Ｂ（Ｂ）およびＭＫＰ１（Ｃ）の相対的ＰＴＰアーゼ活性。
【図４２】Ａ．様々な量のペンタミジンの存在下でのＰＲＬ−１、ＰＲＬ−２およびＰＲＬ−３の相対的ＰＴＰアーゼ活性。Ｂ．様々な量のケトコナゾールの存在下でのＰＲＬ−１、ＰＲＬ−２およびＰＲＬ−３の相対的ＰＴＰアーゼ活性。Ｃ．ペンタミジンおよびケトコナゾールの存在下でのＳＨＰ−１の相対的ＰＴＰアーゼ活性。
【図４３】単独薬剤としてまたはＩＦＮ−αと組み合わせたペンタミジン（Ａ）またはケトコナゾール（Ｂ）の存在下で６日間培養したＷＭ９細胞の増殖阻害パーセント。
【図１】
2008519845.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際調査報告】
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