(57)【要約】  本発明は、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのバベシアタンパク質及びそのようなタンパク質の免疫フラグメント、そのようなタンパク質又はフラグメントをコードする核酸、ｃＤＮＡフラグメント、組み換えＤＮＡ分子、そのような核酸を含有する、生きている組み換え担体もしくは宿主細胞、ワクチン、そのようなワクチン調製のための方法、バベシア科の生物によって引き起こされる感染又はその臨床的徴候の予防又は治療処置のための、そのようなタンパク質又はフラグメントの使用、及びバベシア科の生物の核酸、抗体又は抗原の検出のための診断テストに関する。
2008500802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸位置１７から位置１８０までのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つアミノ酸配列を含有することを特徴とする、バベシアタンパク質、又は該タンパク質の免疫フラグメント。
【請求項２】
配列番号２で示される通りのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つアミノ酸配列を含有することを特徴とする、請求項１に記載のバベシアタンパク質、又は該タンパク質の免疫フラグメント。
【請求項３】
配列番号４で示される通りのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つアミノ酸配列を含有することを特徴とする、請求項１に記載のバベシアタンパク質、又は該タンパク質の免疫フラグメント。
【請求項４】
請求項１から請求項３に記載のタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントをコードすることを特徴とする、核酸。
【請求項５】
配列番号１の核酸を含有することを特徴とする、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
配列番号３の核酸を含有することを特徴とする、請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
請求項４から請求項６に記載の核酸を含有する、ｃＤＮＡフラグメント。
【請求項８】
機能的に連結されたプロモーターの制御下で、請求項４から請求項６に記載の核酸又は請求項７に記載のｃＤＮＡフラグメントを含有する、組み換えＤＮＡ分子。
【請求項９】
請求項４から請求項６に記載の核酸、請求項７に記載のｃＤＮＡフラグメント又は請求項８に記載の組み換えＤＮＡ分子を含有する、生きている組み換え担体。
【請求項１０】
請求項４から請求項６に記載の核酸、請求項７に記載のｃＤＮＡフラグメント、請求項８に記載の組み換えＤＮＡ分子又は請求項９に記載の生きている組み換え担体を含有する、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１から請求項３に記載のタンパク質もしくは該タンパク質の免疫フラグメント、請求項４から請求項６に記載の核酸、請求項７に記載のｃＤＮＡフラグメント、請求項８に記載の組み換えＤＮＡ分子、請求項９に記載の生きている組み換え担体又は請求項１０に記載の宿主細胞、又はそれらの組み合わせ、及び医薬適合性の担体を含有するワクチン。
【請求項１２】
アジュバントを含有することを特徴とする、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
さらなる免疫活性成分又は該さらなる免疫活性成分をコードする核酸を含有することを特徴とする、請求項１１から請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記さらなる免疫活性成分又は前記さらなる免疫活性成分をコードする核酸が、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ（エーリキア  キャニス）、Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ（バベシア  ギブソニ）、Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ（Ｂ．ボゲリ）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ（リーシュマニア  ドノバン）−複合体、Ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ（イヌ  パルボウイルス）、Ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓ（イヌ  ジステンパーウイルス）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  （レプトスピラ  インテロガンス）  血清型ｃａｎｉｃｏｌａ（カニコーラ）、ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ（イクテロヘモラジ）、ｐｏｍｏｎａ（ポモナ）、ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ（グリポティフォーサ）、ｂｒａｔｉｓｌａｖａ（ブラチスラバ）、Ｃａｎｉｎｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ（イヌ肝炎ウイルス）、Ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ（イヌパラインフルエンザウイルス）、ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ（狂犬病ウイルス）、Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ  ｃａｎｉｓ（ヘパトゾーン  キャニス）及びＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（ボレリア  ブルグドルフェリ）からなる群から選択される生物から得られることを特徴とする、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
請求項１から請求項３に記載のタンパク質に対する抗体又は該タンパク質の免疫フラグメントに対する抗体、又はそれらの組み合わせと、医薬適合性の担体と、を含有することを特徴とする、ワクチン。
【請求項１６】
請求項１から請求項３に記載のタンパク質もしくは該タンパク質の免疫フラグメント、請求項４から請求項６に記載の核酸、請求項７に記載のｃＤＮＡフラグメント、請求項８に記載の組み換えＤＮＡ分子、請求項９に記載の生きている組み換え担体又は請求項１０に記載の宿主細胞、又はそれらの組み合わせと、医薬適合性の担体と、を混合することを含む、請求項１１から請求項１４に記載のワクチンの調製のための方法。
【請求項１７】
請求項１から請求項３に記載のタンパク質に対する抗体又は該タンパク質の免疫フラグメントに対する抗体と、医薬適合性の担体と、を混合することを含む、請求項１５に記載のワクチンの調製のための方法。
【請求項１８】
バベシア科の生物により引き起こされる感染又はその臨床的徴候の予防又は治療処置用のワクチンの製造のための、請求項１から請求項３に記載のタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントの使用。
【請求項１９】
配列番号１又は３で示される核酸配列と少なくとも７０％の相同性を有する核酸、又は該核酸と相補的な核酸を含有し、該核酸の両者とも少なくとも１２、好ましくは１５、より好ましくは１８ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする、バベシア科の生物に関連する核酸検出のための診断テスト。
【請求項２０】
請求項１から請求項３に記載のタンパク質もしくは該タンパク質の免疫フラグメント、又はそれらの組み合わせを含有することを特徴とする、バベシア科の生物に対する抗体検出のための診断テスト。
【請求項２１】
請求項１から請求項３に記載のタンパク質に対する抗体もしくは該タンパク質の免疫フラグメントに対する抗体、又はその組み合わせを含有することを特徴とする、バベシア科の生物由来の抗原物質検出のための診断テスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのバベシアタンパク質及びその免疫フラグメント、そのようなタンパク質をコードする核酸、ｃＤＮＡフラグメント、組み換えＤＮＡ分子、生きている組み換え担体及び宿主細胞、ワクチン、そのようなワクチン調製のための方法、そのようなタンパク質又はフラグメントの使用、及び診断テストに関する。
【０００２】
バベシア症は、マラリアのように、地理的に局限して起こる疾患である。この理由は、病原体が、脊椎動物群に存在する寄生虫のある特定の病原体保有生物から餌を摂取するダニにより伝染されることによる。ダニが存在する場合のみ、バベシア症が発生しうる。すべてを考慮して、特に、土地固有の動物において、寄生虫は顕著な疾患を起こさずに宿主と共存する。多くの場合、遺伝形質の近親交配及び／又はバベシア症が風土病である不慣れな環境へと動物を輸送することを介した人間の活動があるために、バベシア症は問題となる（“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐａｒａｓｉｔｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ（寄生虫感染の免疫学）”，Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．及びＷａｒｒｅｎ，Ｋ．Ｓ．編、ｐ．４７５−５２６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにおける、Ｃａｌｌｏｗ，Ｌ．Ｌ．及びＤａｌｇｌｉｅｓｈ，Ｒ．Ｊ．，１９８２）。
【背景技術】
【０００３】
バベシア症はまた、免疫不全のヒトに対してのみならず、人畜共通感染症としての脅威を内包している（Ｇｒａｙら、２００２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２９１，ｐ．１０８−１１１）。
【０００４】
自然獲得されたバベシア症における疾患の徴候は、通常、感染から７−２１日後に始まる。これらの症候には、発熱、食欲不振、抑うつ、貧血、ヘモグロビン尿症及び急激な衰弱が含まれる。涙液分泌、唾液分泌の増加及び筋肉振戦が起こることが多い。神経的徴候は、末期感染において進行し得、この疾患を治療せず放置した場合、致死となり得る。凝血障害により、赤血球粘性が高まる。血栓症はそれ程見られないが、巨核球と結合した小さな硝子質トロンビンの所見が報告されている。その結果、微小血管系の血液の流れが妨害され、それにより、内臓の鬱血が起こり、血中血球容積（ＰＣＶ）が低下する。これにより、ある一定の組織への酸素供給が低下し得、続いて、酸素欠乏症の結果として組織損傷が起こり得る。
【０００５】
バベシア科の種は、現在、獣医学的に重要な哺乳動物種のほとんどに感染することが分かっている（Ｍ．Ｒｉｓｔｉｃ編：“Ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ  ｏｆ  ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  ｍａｎ（家畜及びヒトのバベシア症）”．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８８における、Ｋｕｔｔｌｅｒ，Ｋ．Ｌ．，）：ウシ（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ（Ｂ．ディバージェンス）、Ｂ．ｂｏｖｉｓ（Ｂ．ボビス）、Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ（Ｂ．ビゲミナ））、ブタ（Ｂ．ｔｒａｕｔｍａｎｎｉ（Ｂ．トラウトマンニ）、Ｂ．ｐｅｒｒｏｎｃｉｔｏｉ（Ｂ．ペロンキトイ））、ヒツジ（Ｂ．ｏｖｉｓ（Ｂ．オビス）、Ｂ．ｍｏｔａｓｉ（Ｂ．モタシ））、ウマ（Ｂ．ｅｑｕｉ（Ｂ．エクイ）、Ｂ．ｃａｂａｌａｉ（Ｂ．キャバリ）、イヌ（Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）（Ｂ．キャニス）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）、Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ（Ｂ．ボゲリ））及びネコ（Ｂ．ｆｅｌｉｓ（Ｂ．フェリス）、Ｂ．ｃａｔｉ（Ｂ．キャティ））。これら全ての種において、死亡又は程度の差はあるが甚大な経済的損失（肉、乳、羊毛又は子孫の質又は量的低下）又は健康状態の著しい低下が、直接、バベシア感染の結果として、又は二次感染の進行を介して起こる。
【０００６】
投薬治療は、既に起こっているバベシア感染を治療することを目的として存在し、例えば、ジプロピオン酸イミドカルブを用いてイヌを治療することができる（Ｃａｒｂｅｓｉａ（Ｒ）として市販されている。）（Ｂｒａｎｄａｏら、２００３，Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓ．ｖｏｌ．１１４，ｐ．２５３−２６５）。しかし、そのような注射は、組織炎症のため痛みを伴う。さらに、このような駆虫薬でよく見られる欠点を有する：すなわち、免疫記憶蓄積の妨害、潜在毒性及び耐性獲得である。
【０００７】
生ワクチンを用いたワクチン接種によりバベシア症がコントロールできることが明らかになっている（Ｐｉｐａｎｏ，１９９５、Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓ．，ｖｏｌ．５７，ｐ．２１３−２３１）。このようなワクチンは、感染動物由来の赤血球を回収することにより生成される。全てではないが一部のバベシア種に対して、寄生虫数を増やすために、インビトロの赤血球培養が開発されてきた。次に、感染動物由来の感染赤血球又はその培養物を、動物へのワクチン接種に使用する。
【０００８】
このような生の寄生虫ワクチンの一般的な欠点は、接種物質が概して制御不能で、その組成が非常に多様であり、生物学的に安全でなくそのプロセス全体において、多数の実験動物を使用するので非倫理的であるという点である。さらに、バベシア寄生虫は、絶対嫌気性であり、酸素を避けないとすぐに死滅してしまうため、非常に不安定である。
【０００９】
あるいは、寄生虫感染性赤血球そのものではなく、周囲の血清又は培養上清をワクチン接種に使用する。赤血球の周囲にあるこのような液体は、可溶性寄生虫抗原（ＳＰＡ）と呼ばれるものを含有する。これらの調製物の組成についてはほとんど知られていない。保護活性が血清又は培地中のメロゾイト表面層（赤血球への侵入プロセス中に残される構造）の抗原の免疫能力よるものであることが示唆されてきた（“Ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｏｍｅｓｔｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｎ（家畜及びヒトのバベシア症）”，Ｒｉｓｔｉｃ，Ｍ．編、ｐ．１６３−１９０，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ中の、Ｒｉｓｔｉｃ，Ｍ．及びＭｏｎｔｅｎｅｇｒｏ−Ｊａｍｅｓ，Ｓ．，１９８８）。さらに、インビトロ培養中、多数の寄生虫が死に、それにより（内部の）寄生虫抗原が培養液中に放出される。
【００１０】
このようなＳＰＡ調製物は、寄生虫に感染する必要がないにもかかわらず、感染の臨床症状を十分に緩和させる、免疫反応を誘発することができる（Ｓｃｈｅｔｔｅｒｓ及びＭｏｎｔｅｎｅｇｒｏ−Ｊａｍｅｓ，Ｓ．，１９９５，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ｔｏｄａｙ，ｖｏｌ．１１，ｐ．４５６−４６２）。例えば、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）寄生虫感染赤血球のインビトロ培養の培養上清由来のＳＰＡは、同族の攻撃感染に対する保護的免疫を誘導する。
【００１１】
Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）に対するＳＰＡワクチンは、Ｐｉｒｏｄｏｇ（Ｒ）として市販されており、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）株の培養物の上清から調製されている（米国特許第４，７７７，０３６号に記載）。しかし、そのようなワクチンは、（野生型）Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）による感染に対して一般にほとんど保護効果がない（Ｌｅｐｅｔｉｔ，Ｃ．，１９８８，“Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｏｓｅ  ｃａｎｉｎｅ  ｅｔ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ｐｉｒｏｄｏｇ”，Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｎａｎｔｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）。
【００１２】
一般に、ＳＰＡを基にしたワクチンは、生の寄生虫ワクチンと同様の欠点を有しており、特徴がほとんど不明であり、非常に多様で、生物学的に安全に用いるために多くの注意を要する。さらに、そのようなワクチンの製造は、寄生虫、赤血球及び／又は血清を得るために実験動物の感染、飼育及び回収が必要であり、規模拡大が非常に困難である。
【００１３】
本発明の目的は、バベシア科による感染に対する、明確で、安全、安定で、製造規模拡大が容易な、効果的なサブユニットワクチンとして作用し得るタンパク質又はそのフラグメントを提供することである。
【００１４】
驚くべきことに、新規バベシアタンパク質ファミリー（２８ｋＤａタンパク質ファミリー）のメンバーならびにその免疫フラグメントを含有するサブユニットワクチンがこれらの有利な特徴全てを有していることを今回発見した。
【００１５】
今回、発現系において産生されるタンパク質サブユニットワクチンにおいて、この新規タンパク質ファミリーのメンバー又はその免疫フラグメントを使用することにより、生の寄生虫及びＳＰＡワクチンの多くの欠点を克服することができた。すなわち、それらのタンパク質は明確に定義されており、生物学的に安全で、その生成物は生きている丸ごとの寄生虫よりも大幅に安定性に優れ、その製造規模を容易に拡大できる。
【００１６】
新規２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質は、その全てが、このファミリーの様々なメンバー間で非常に良く保存されている特異的アミノ酸配列を共通して有していることを特徴とする。
【００１７】
このよく保存されたアミノ酸配列が存在するにもかかわらず、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質の全長は、バベシア科の各メンバーにより様々であり得る。２８ｋＤａタンパク質ファミリーのメンバーの例は、下は２６ｋＤａから４０ｋＤａ超までの範囲の長さを有することが分かっている。
【００１８】
しかし、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのメンバーは全て、配列番号２のアミノ酸位置１７から位置１８０までのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性レベルを有する一続きのアミノ酸を含有する。
【００１９】
例に過ぎないが、フランスにおいて、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）分離株Ａ、本発明による２８ｋＤａファミリーのメンバー及び、さらにＢｃ２８．１又はＢｃ２８．２と呼ばれるものが、それぞれ配列番号２又は４で示すとおりのアミノ酸配列を有することが分かった。
【００２０】
２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質は、バベシア科由来の２８ｋＤａ多重遺伝子族のメンバーであり、核酸レベルでの配列同一性が高い、それらの個別のコード配列から発現される。
【００２１】
特異的抗血清により、感染した赤血球において２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質を検出することができる。これらの血清は、ウェスタンブロッティング及び免疫沈降実験においても寄生虫のこれらの特異的タンパク質を認識する。両タンパク質とも、発現系で発現させることができる。サブユニットワクチンを処方するために、このようにして発現させたタンパク質又はそれらのフラグメントを使用することができ、このワクチンは、バベシア科の種による感染における疾患（の徴候）から哺乳動物を守る。
【００２２】
Ｂｃ２８．１タンパク質は、２種類の形態、すなわち、遊離２６ｋＤａ  ＳＰＡ型（バベシア感染赤血球及びその周囲の液体中に存在する。）ならびに、ＧＰＩアンカーを有し、バベシアメロゾイトの膜と、及び感染赤血球の外膜と会合している２８ｋＤａ結合タンパク質型で存在する。
【００２３】
バベシア寄生虫はその一生のほとんどを赤血球内部に隠れて過ごすので、従って、免疫系により「見られる」ことができる抗原に収束した場合に、免疫反応が最も効果的である。Ｂｃ２８．１の２８ｋＤａ型は、外部に提示されるような抗原であり、感染した赤血球に特異的に向けられる免疫攻撃を可能にする。Ｂｃ２８．１タンパク質の２８ｋＤａ型は、赤血球に結合する。これは、赤血球の凝集における役割を示す。このプロセスが病変の主要な原因であり、寄生虫が新しい赤血球に感染する方法であるので、このレベルでの妨害によってもまた、疾患進行における効果的な免疫介入がもたらされる。
【発明の開示】
【００２４】
従って、本発明のある局面は、配列番号２のアミノ酸位置１７から位置１８０のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つアミノ酸配列を含有することを特徴とするバベシアタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントに関連する。
【００２５】
好ましい実施形態において、本発明によるバベシアタンパク質は、配列番号２で示される通りのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つアミノ酸配列を含有することを特徴とするか、又は該タンパク質の免疫フラグメントである。
【００２６】
別の好ましい実施形態において、本発明によるバベシアタンパク質は、配列番号４で示される通りのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つアミノ酸配列を含有することを特徴とするか、又は該タンパク質の免疫フラグメントである。
【００２７】
より好ましい実施形態において、本発明によるバベシアタンパク質は、好ましくは２６ｋＤａ型又は２８ｋＤａ型である、Ｂｃ２８．１タンパク質であることを特徴とする。
【００２８】
別のより好ましい実施形態において、本発明によるバベシアタンパク質は、Ｂｃ２８．２タンパク質であることを特徴とする。
【００２９】
「タンパク質」という用語は、アミノ酸の分子鎖を組み込むものとする。タンパク質は、ある特定長の産物を指すものではなく、また、必要であれば、インビトロ又はインビボで、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化によって、修飾することのできるものである。従って、特に、ペプチド類、オリゴペプチド類及びポリペプチド類がその定義に含まれる。タンパク質又はペプチドは、生体及び／又は合成起源のものであり得る。
【００３０】
本発明による「バベシアタンパク質」は、バベシア科の生物において対応物を有するタンパク質である。
【００３１】
好ましくは、バベシア科の生物は、Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ（バベシア  ディバージェンス）、Ｂ．ｂｏｖｉｓ（Ｂ．ボビス）、Ｂ．ｍｏｔａｓｉ（Ｂ．モタシ）、Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ（Ｂ．キャバリ）、Ｂ．ｅｑｕｉ（Ｂ．エクイ）、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）、Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ（Ｂ．ボゲリ）、Ｂ．ｆｅｌｉｓ（Ｂ．フェリス）、Ｂ．ｃａｔｉ（Ｂ．キャティ）、Ｂ．ｏｖｉｓ（Ｂ．オビス）、Ｂ．ｔｒａｕｔｍａｎｎｉ（Ｂ．トラウトマンニ）、Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ（Ｂ．ビゲミナ）、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ（Ｂ．ミクロティ）及びＢ．ｇｉｂｓｏｎｉ（Ｂ．ギブソニ）の種からなる群から選択される生物である。
【００３２】
より好ましくは、バベシア科の生物は、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）、Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ（Ｂ．キャバリ）、Ｂ．ｅｑｕｉ（Ｂ．エクイ）、Ｂ．ｂｏｖｉｓ（Ｂ．ボビス）及びＢ．ｂｉｇｅｍｉｎａ（Ｂ．ビゲミナ）の種からなる群から選択される。
【００３３】
「免疫フラグメント」は、そのような２８ｋＤａバベシアタンパク質に対して向けられる抗体を誘導する能力を保持している２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質のフラグメントであると理解される。
【００３４】
好ましくは、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質の免疫フラグメントは、配列番号２又は４のアミノ酸配列から抜粋される少なくとも８アミノ酸を含有する。より好ましくは、そのようなフラグメントは、配列番号２又は４のアミノ酸配列から抜粋される、１１、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０又は２００アミノ酸（望ましい順）を含有する。
【００３５】
好ましくは、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質の免疫フラグメントは、そのようなタンパク質のエピトープを含有する。例えば、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質の免疫フラグメントは、Ｎ−末端シグナル配列及び／又はＣ−末端のＧＰＩアンカー配列を欠失しているタンパク質の一部により形成される。他のフラグメントは、例えば、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質由来の特異的なエピトープを含有するものである。そのようなエピトープは、下記に概説した方法により決定され得る。これらの免疫フラグメントは全て本発明に包含される。
【００３６】
エピトープは、Ｔ細胞受容体が反応する、又はＢ細胞が抗体を産生する抗原性分子の一部であると理解される。従って、本発明によるエピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞などの細胞又は抗体が感染又は疾患の経過を阻害する免疫反応を生じるように、特異的Ｔ細胞を誘導する、又は特異的抗体を産生するようＢ細胞を活性化する。このように、このようなエピトープを介して、免疫反応が生じ得る。
【００３７】
抗原性であるために、アミノ酸フラグメントは、ある一定の長さのものである必要がある。従って、エピトープは、ＭＨＣＩ受容体結合のための少なくとも８個から１１個のアミノ酸、又はＭＨＣＩＩ受容体結合のための、１１個から１５個のアミノ酸からなる（“Ｔｈｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ（抗原プロセシング及び提示の生化学及び細胞生物学）”中の、Ｒ．Ｎ．Ｇｅｒｍａｉｎ及びＤ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，１９９３，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１１，ｐ．４０３−４５０により概説されている。）。これより短いアミノ酸フラグメントは抗原性となり得ず、本分野で公知の技術を用いてＫＬＨ、ＢＳＡ等の担体とカップリングさせる必要がある。カップリングさせた場合、このような短いフラグメントが、本発明の目的の範囲内である免疫反応を誘導できるようになる。
【００３８】
本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質の免疫フラグメント又はエピトープの同定は、例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ法と呼ばれるもの、又は既知のエピトープと比較を行うコンピューターアルゴリズムを介した方法など、様々な簡単な技術により容易に行い得る。
【００３９】
ＰＥＰＳＣＡＮ法（ＷＯ８４／０３５６４及びＷＯ８６／０６４８７、及びＨ．Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８４，ｖｏｌ．８１，ｐ．３９９８−４００２、及びＪ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．ｍｅｔｈ．，１９８７，ｖｏｌ．１０２，ｐ．２５９−２７４）は、タンパク質の免疫性決定因子を検出するための、行いやすく、迅速でよく確立された方法である。これは、調べるタンパク質を漸次重複する一連のペプチドフラグメントを合成すること、及びそれに続く、そのタンパク質に対する特異的抗体を用いたこれらのポリペプチドの試験を含む。本発明によるタンパク質に対するこのような抗体は、本分野で周知の技術を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体を作製することにより得ることができる。
【００４０】
既知であるエピトープとの配列及び／又は構造的一致に基づいた免疫学的に重要なエピトープとしての特異的タンパク質フラグメントの指定におけるコンピューターアルゴリズムの使用もまた周知の技術である。これらの領域の決定は、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ（１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７８，ｐ．３８２４−３８２８）に従う親水性の基準及びＣｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ（１９８７、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４７，ｐ．４５−１４８、及び米国特許第４，５５４，１０１号）による二次構造の局面に基づいたものであり得る。免疫原性エピトープは、同様に、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準（１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２３５，ｐ．１０５９−１０６２及び米国特許出願ＮＴＩＳ  ＵＳ  ０７／００５，８８５）を活用してコンピューターによりタンパク質のアミノ酸配列から予想され得る。これらの方法の使用についての要約概説は、Ｓｈａｎ  Ｌｕ（一般的原則；１９９１、Ｔｉｂｔｅｃｈ，ｖｏｌ．９，ｐ．２３８−２４２）、Ｇｏｏｄら（Ｍａｌａｒｉａ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ；１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ．ｖｏｌ．２３５，ｐ．１０５９−１０６２）、Ｌｕ（概説；１９９２、Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１０，ｐ．３−７）及びＢｅｒｚｏｆｓｋｙ（ＨＩＶ−ｅｐｉｔｏｐｅｓ；１９９１、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．５，ｐ．２４１２−２４１８）で見ることができる。
【００４１】
これらの方法を使用することの効果については、このような方法を使用したＴ細胞エピトープの予想において成功率が７５％であったことを述べている、Ｈ．Ｍａｒｇａｌｉｔら（１９８７、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１３８，ｐ．２２１３−２２２９）で公表されている。
【００４２】
本発明によるタンパク質間の相同性のパーセンテージは、サブプログラム：「ＢｌａｓｔＰ」を選択することにより、コンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」で決定する（Ｔ．Ｔａｔｕｓｏｖａ＆Ｔ．Ｍａｄｄｅｎ，１９９９，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１７４，ｐ．２４７−２５０）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで見出すことができる。）。使用する比較マトリクスは、「ｂｌｏｓｕｍ６２」であり、デフォルトパラメーターは、ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ（開始ギャップペナルティ）：１１；ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ（伸長ギャップペナルティ）：１及びｇａｐ  ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ：５０とする。
【００４３】
このプログラムは、「同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）」として全く相等しいアミノ酸のパーセンテージ及び「ポジティブ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）」として相同であるアミノ酸のパーセンテージを挙げている。
【００４４】
例えば、Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２のアミノ酸配列を図１でアライメントしている。この２つのタンパク質の間、特に、Ｎ−末端  ３／４ｒｓに、高いパーセンテージの相同性が存在する。パーセンテージ相同性（ＢｌａｓｔＰプログラムからの「ポジティブ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）」のパーセンテージ）を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2008500802.tif 000003
【００４６】
２８ｋＤａタンパク質ファミリーの特定のタンパク質に対して、バベシア科の個々の株又は種に関連するタンパク質の間で自然変動が存在することは理解されるであろう。これらの変動は、全体配列におけるアミノ酸の違い、又は前記配列におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位又は付加により示され得る。基本的に生物学的及び免疫学的活性を変化させないアミノ酸置換は、例えば、Ｎｕｅｒａｔｈら、１９７９（“Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（タンパク質）”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）により述べられている。関連アミノ酸間のアミノ酸置換又は進化において頻繁に起こってきた置換は、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，１９７８，”Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（タンパク質配列及び構造アトラス）“，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３を参照のこと。）である。他の一般的なアミノ酸置換には、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。この情報に基づき、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは、迅速かつ感度の高いタンパク質比較（１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２２７．ｐ．１４３５−１４４１）及び相同のタンパク質間の機能的類似性決定方法を開発した。本発明の例としての実施形態のこのようなアミノ酸置換、ならびに欠失及び／又は挿入を有する変動は、得られるタンパク質が免疫反応性を維持している限り、本発明の範囲内である。バベシア科の生物に対する免疫反応を誘導することができるタンパク質を依然として提供する、本発明によるある一定のタンパク質のアミノ酸配列におけるこれらの変動は、「基本的に免疫活性に影響を与えず」、本発明の実施形態であると考えられる。
【００４７】
これにより、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質が、様々な種から単離された場合に、配列番号２又は４のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し得、同時に、同様の免疫学的性質、つまり、バベシア属の生物に対する免疫反応を誘導する能力を有する、同様のタンパク質を依然として表す理由が説明される。
【００４８】
本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質は、バベシア科ファミリーのメンバーである種から得ることができる。
【００４９】
しかし、さらにより好ましい実施形態において、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又はそれらの免疫フラグメントは、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ（Ｂ．ディバージェンス）、Ｂ．ｂｏｖｉｓ（Ｂ．ボビス）、Ｂ．ｍｏｔａｓｉ（Ｂ．モタシ）、Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ（Ｂ．キャバリ）、Ｂ．ｅｑｕｉ（Ｂ．エクイ）、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）、Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ（Ｂ．ボゲリ）、Ｂ．ｆｅｌｉｓ（Ｂ．フェリス）、Ｂ．ｃａｔｉ（Ｂ．キャティ）、Ｂ．ｏｖｉｓ（Ｂ．オビス）、Ｂ．ｔｒａｕｔｍａｎｎｉ（Ｂ．トラウトマンニ）、Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ（Ｂ．ビゲミナ）、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ（Ｂ．ミクロティ）又はＢ．ｇｉｂｓｏｎｉ（Ｂ．ギブソニ）から得られることを特徴とする。
【００５０】
さらにより好ましくは、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又はそれらの免疫フラグメントは、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）、Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ（Ｂ．キャバリ）、Ｂ．ｅｑｕｉ（Ｂ．エクイ）、Ｂ．ｂｏｖｉｓ（Ｂ．ボビス）又はＢ．ｂｉｇｅｍｉｎａ（Ｂ．ビゲミナ）から得られることを特徴とする。
【００５１】
現行の分類学的な分類に関して、当業者は、新しい知見により新しい群への再分類、又は既存の群への追加が行われ得るにつれて、これが時とともに変化し得ることを認識するであろう。しかし、これは、その分類だけで、関連する生物のタンパク質のレパートリーを変化させないので、そのように再分類された生物は、本発明により包含されると考えられる。例えば、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）及びＢ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）は、以前はＢ．ｃａｎｉｓ  ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス  キャニス）及びＢ．ｃａｎｉｓ  ｒｏｓｓｉ（Ｂ．キャニス  ロッシ）の亜種として分類されていた。
【００５２】
Ｓｉｂｉｎｏｖｉｃ  Ｋ．ら（１９６７、Ｊ．ｏｆ  Ｐａｒａｓ．，ｖｏｌ．５３，ｐ．９１９−９２３）は、Ｂａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉ（バベシア  エクイ）及びＢ．ｃａｂａｌｌｉ（Ｂ．キャバリ）に感染したウマの血清由来及びＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）に感染したイヌ由来の単離バベシア抗原を研究した。これらの種由来の抗原の生化学的特性において、特筆すべき顕著な類似性があった。従って、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）から得られたものとしての本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのバベシアタンパク質はまた、Ｂ．ｅｑｕｉ（Ｂ．エクイ）、Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ（Ｂ．キャバリ）及びバベシア科ファミリーの他の種において存在するであろう。
【００５３】
実施例２、セクション２．２．５及び図１１において、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）に対する抗血清により、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来のＢｃ２８．１タンパク質の２６及び２８ｋＤａ型が特異的に認識されることが開示されている。ここでは、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）に存在する２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質が免疫学的にＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のそれと関連することが述べられている。
【００５４】
Ｂｃ２８．１コード配列は、地理的かつ遺伝的に離れているＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）野生分離株から得られた。これらの分離株のいくつかの例の推定アミノ酸を図２でアライメントする。ＢｌａｓｔＰプログラムを用いてペアワイズアライメントにより決定したパーセンテージ相同性（「ポジティブ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ」）を表２に示す。
【００５５】
【表２】
2008500802.tif 000004
【００５６】
従って、最も好ましい実施形態において、本発明は、Ａ８、Ｂ、３４．０１、Ａ、Ｒｏｂｉｎ及びＣａｓｔｒｅｓからなる群から選択されるＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）分離株から得られることを特徴とする、Ｂｃ２８．１もしくはＢｃ２８．２タンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントに関する。
【００５７】
Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ（バベシア  ディバージェンス）由来のＢｄ３７と呼ばれるタンパク質が既に（ＥＰ  １０５０５４１  Ａ１）記載されている。最初、Ｂｄ３７は、タンパク質Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２と類似していると思われる。しかし、Ｂｄ３７及びこの２つのＢｃ２８タンパク質は、全く関連がない：
Ｂｄ３７タンパク質又はそのコード配列と、この２つのＢｃ２８タンパク質又はそれらのコード配列のいずれかとの間に有意な配列の類似性はない。
【００５８】
Ｂｄ３７に対する抗血清は、ウェスタンブロッティングにおいても、免疫沈降実験においても、Ｂｃ２８．１及び２８．２それぞれに対する抗体により認識されるＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の２６／２８及び４５ｋＤａタンパク質を認識しない；例えば、Ｂｄ３７Ｈｉｓタンパク質に対する抗血清は、ＧＳＴ−Ｂｃ２８．２タンパク質を認識しない（図１０Ｂ、レーン６）。
【００５９】
Ｂｄ３７及びＢｃ２８．１の両方が赤血球の外膜に結合するが、Ｂｄ３７は、０．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出することができ、一方、Ｂｃ２８．１は、２Ｍ  ＮａＣｌで溶出しても会合し続ける（実施例２、セクション２．１．５．１．及び２．２．６．１．）。本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質を生成する好ましい方法は、遺伝子工学技術及び組み換え発現系を使用することによるものである。これらは、核酸、ｃＤＮＡフラグメント、組み換えＤＮＡ分子、生きている組み換え単体及び／又は宿主細胞を使用することを含み得る。
【００６０】
従って、本発明の別の局面は、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントをコードすることを特徴とする、核酸に関する。
【００６１】
好ましい実施形態において、本発明による核酸は、配列番号１の核酸を含有する。
【００６２】
別の好ましい実施形態において、本発明による核酸は、配列番号３の核酸を含有する。
【００６３】
「核酸」という用語は、デオキシ−又はリボ核酸の分子鎖を組み入れることを意図する。核酸は、特定の長さではなく、従って、その定義中に、ポリヌクレオチド、遺伝子、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ’ｓ）、プローブ、プライマー、リンカー、スペーサー及びアダプターが含まれる。核酸は、生物及び／又は合成起源であり得る。この核酸は、１本鎖又は２本鎖の形態であり得る。この１本鎖は、センス又はアンチセンス方向であり得る。修飾ＲＮＡ又はＤＮＡもまた定義内に含まれる。核酸の塩基における修飾を行い得、イノシンなどの塩基が組み込まれ得る。他の修飾には、例えば、バックボーンの修飾が含まれ得る。
【００６４】
「コードする」という用語は、とりわけ、正しい状況に組み込まれた場合に転写及び／又は翻訳を介して、タンパク質発現の可能性を提供することを包含することを意図する。
【００６５】
本発明による核酸は、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質をコードするか、又は該タンパク質の免疫フラグメントをコードする。
【００６６】
本発明による核酸は、配列番号１又は３の核酸配列から抜粋された、最短でも２４核酸の長さを有するが、好ましくは、本発明による核酸は、配列番号１又は３の核酸配列から抜粋された、５０、１００、２５０又は５００ヌクレオチド（好ましい順）を含有する。
【００６７】
例えば、本発明による核酸は、シグナル配列及び／又はＧＰＩアンカーのない、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質をコードする核酸である。他の核酸は、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質の特異的エピトープをコードする配列を含有し得る。このような核酸は、全て、本発明中に包含される。
【００６８】
本発明による核酸間の同一性のパーセンテージは、サブプログラム：「ＢｌａｓｔＮ」を選択することにより、コンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を用いて決定する（Ｔ．Ｔａｔｕｓｏｖａ＆Ｔ．Ｍａｄｄｅｎ，１９９９，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１７４，ｐ．２４７−２５０）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで見出すことができる。）。使用パラメーターは、デフォルトパラメーター：ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ａ  ｍａｔｃｈ：＋１；ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ａ  ｍｉｓｍａｔｃｈ：−２；ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ（開始ギャップペナルティ）：５；ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ（伸長ギャップペナルティ）：２；及びｇａｐ  ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ：５０である。
【００６９】
上述のＢｌａｓｔＰプログラムの出力とは異なり、ＢｌａｓｔＮプログラムは、相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ）を挙げないが、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）；同一であるヌクレオチドのパーセンテージを、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）」として示す。
【００７０】
多くの様々な核酸が１つの同じタンパク質をコードすることができることは本分野で周知である。これは、分子生物学において「ウォッブル（ゆらぎ）」、又は「遺伝暗号の縮重」として知られているものの結果であり、いくつかのコドン、又はｍＲＮＡのトリプレットが、翻訳中にリボソームで成長するアミノ酸鎖に結合するための同じアミノ酸を生じる場合である。これは、アミノ酸をコードする各トリプレットの第二及び特に第三の塩基において最もよく見られる。この現象の結果、２種類の異なる核酸に対して約３０％の異種構造があるが、同じタンパク質をコードしているということが起こり得る。従って、約７０％が同一であるヌクレオチド配列を有する２つの核酸は、１つの同じタンパク質をコードし得る。
【００７１】
例えば、本発明によるＢｃ２８．１及びＢｃ２８．２タンパク質をコードする核酸を、図３でアライメントしている。２つのコード配列間、特に、コード配列の５’３／４ｒｓにおいて、高いパーセンテージの同一性が存在する。ＢｌａｓｔＮプログラムからのパーセンテージ同一性を表３に示す。
【００７２】
【表３】
2008500802.tif 000005
【００７３】
本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質をコードする核酸は、バベシア科ファミリーのメンバーの種から得ることができる。
【００７４】
しかし、より好ましい実施形態において、本発明による、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又はそれらの免疫フラグメントをコードする核酸は、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ（Ｂ．ディバージェンス）、Ｂ．ｂｏｖｉｓ（Ｂ．ボビス）、Ｂ．ｍｏｔａｓｉ（Ｂ．モタシ）、Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ（Ｂ．キャバリ）、Ｂ．ｅｑｕｉ（Ｂ．エクイ）、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）、Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ（Ｂ．ボゲリ）、Ｂ．ｆｅｌｉｓ（Ｂ．フェリス）、Ｂ．ｃａｔｉ（Ｂ．キャティ）、Ｂ．ｏｖｉｓ（Ｂ．オビス）、Ｂ．ｔｒａｕｔｍａｎｎｉ（Ｂ．トラウトマンニ）、Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ（Ｂ．ビゲミナ）、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ（Ｂ．ミクロティ）又はＢ．ｇｉｂｓｏｎｉ（Ｂ．ギブソニ）から得られることを特徴とする。
【００７５】
さらにより好ましい実施形態において、２８ｋＤａタンパク質ファミリーによるタンパク質又はそれらの免疫フラグメントをコードする核酸は、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）、Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ（Ｂ．キャバリ）、Ｂ．ｅｑｕｉ（Ｂ．エクイ）、Ｂ．ｂｏｖｉｓ（Ｂ  ボビス）又はＢ．ｂｉｇｅｍｉｎａ（Ｂ．ビゲミナ）から得られることを特徴とする。
【００７６】
分類学的に再分類される種の可能性については前記で考察している。これは生物のゲノムを変更しないので、このような再分類生物もまた、本発明に包含される。
【００７７】
非哺乳動物バベシア科由来の２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質及びそれらをコードする核酸もまた本発明に包含される；このようなタンパク質又は遺伝子は、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質、それらのコード配列、それらの遺伝子及び遺伝子ファミリーの保存性が高いために存在する。
【００７８】
Ｂｃ２８．１タンパク質をコードする核酸は、地理的かつ遺伝的に離れているＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）野生分離株から得られた。このような分離株のいくつかの例のヌクレオチド配列を図４でアライメントしている。ペアワイズＢｌａｓｔＮアライメントのパーセンテージ同一性を表４に示す。
【００７９】
【表４】
2008500802.tif 000006
【００８０】
本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質をコードする核酸は、当業者にとって公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）”（２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）のような標準的な教科書で詳述されている標準的分子生物学的技術により、生成、操作及び発現が可能である。このような種類のうちある操作は、ＲＮＡから、好ましくは、本分野で公知の技術により寄生虫又は寄生虫感染細胞もしくは生物から単離することができるｍＲＮＡからの、ｃＤＮＡフラグメントの合成である。
【００８１】
従って、別の好ましい実施形態において、本発明は、本発明によるｃＤＮＡフラグメントに関する。
【００８２】
逆転写によりｃＤＮＡフラグメントを得るための好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術による。ＰＣＲ実施のための標準的技術及びプロトコールは、例えば、Ｃ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｇ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ：“ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル）”（１９９５、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ８７９６９４４７３）で詳述されている。
【００８３】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、機能的に連結されたプロモーター制御下で本発明による核酸又は本発明によるｃＤＮＡフラグメントを含有する組み換えＤＮＡ分子に関する。
【００８４】
本発明による組み換えＤＮＡ分子を構築するために、好ましくはＤＮＡプラスミドを使用する。このようなプラスミドは、例えば、ＤＮＡインサートの量を増やすために、プローブとして、及びさらなる操作のツールとして有用である。クローニングのためのこのようなプラスミドの例は、ｐＢＲ、ｐＵＣ及びｐＧＥＭシリーズのプラスミドであるが、これらは全て、いくつかの市販業者から入手可能である。
【００８５】
本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントをコードする核酸は、別個のプラスミドにクローニングし、当業者にとって周知の技術を用いて所望するコンフォメーションを得るために改変することができる。しかし、これらはまた、クローニングの改善又は発現目的のために、あるコンストラクトに結合させ得る。
【００８６】
本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質をコードするコード配列に対する改変は、例えば、制限酵素消化を用いることにより、部位特異的突然変異により、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により、行い得る。
【００８７】
タンパク質精製もしくは検出、又は発現レベルを上げる目的のために、さらなる核酸を付加し得る。これにより、ｃＤＮＡフラグメント又は組み換えＤＮＡ分子に含有される最終的な核酸が、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質をコードするために必要な配列よりも大きいことになり得る。このような追加的要素がインフレームで挿入される場合、これらは、発現される２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質の一体部分となる。このような融合タンパク質もまた、本発明に包含される。
【００８８】
核酸、ｃＤＮＡフラグメント又は組み換えＤＮＡ分子にとって必須の条件は、核酸、ｃＤＮＡフラグメント又は組み換えＤＮＡ分子の転写を転写制御配列が制御可能なように、転写制御配列にこれらが作動可能に連結されていることである。転写制御配列は、本分野で周知であり、とりわけ、プロモーター及びエンハンサーが含まれる。プロモーターの選択が、使用する発現系においてそのプロモーターが機能的であるならば、遺伝子転写を支配可能なあらゆる真核、原核又はウイルスプロモーターにまで及ぶことは、当業者にとって明らかである。
【００８９】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、本発明による核酸、本発明によるｃＤＮＡフラグメント又は本発明による組み換えＤＮＡ分子を含有する生きている組み換え担体に関する。
【００９０】
このような生きている組み換え担体（ＬＲＣ’ｓ）は、例えば、さらなる遺伝情報、この場合は本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又はそれらの免疫フラグメントをコードする核酸、ｃＤＮＡ又は組み換えＤＮＡ分子、がクローニングされている、細菌、寄生虫及びウイルスなどの微生物である。このようなＬＲＣｓを接種した標的哺乳動物は、その担体の免疫原に対してだけでなく、ＬＲＣに遺伝暗号がさらにクローニングされている（例えば、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又はその免疫フラグメントをコードする配列など）、異種のタンパク質又は免疫フラグメントに対しても免疫反応を起こすであろう。
【００９１】
細菌性ＬＲＣｓの例として、本分野で公知の弱毒化したサルモネラ株の使用は魅力的であり得る。
【００９２】
あるいは、生きている組み換え担体寄生虫は、とりわけ、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（１９８８、Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，ｖｏｌ．２８，Ｐ．１１２１−１１３０）により述べられている。
【００９３】
ＬＲＣウイルスは、核酸を標的細胞に運ぶ方法として使用し得る。生きている組み換え担体ウイルスはまた、ベクターウイルスとも呼ばれる。ベクターとしてよく使用されるウイルスは、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（Ｐａｎｉｃａｌｉら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７９，ｐ．４９２７）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ）（ＥＰ  ０４７３２１０−Ａ２）及びレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）（Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．及びＰｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．（編）、“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｔｏｄａｙ（今日の実験血液学）”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ｐｐ．９２−９９中の、Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄ．ら、１９８９）である。
【００９４】
宿主細胞において、挿入した本発明による核酸、ｃＤＮＡ又は組み換えＤＮＡの発現を誘導することが可能である、選択したＬＲＣ細菌、寄生虫又はウイルスのゲノムに本発明による組み換え核酸を導入するために、本分野で周知のインビボ相同組み換えの技術を使用することができる。
【００９５】
発現目的のために、細菌、酵母、真菌、昆虫及び脊椎動物細胞発現系が宿主細胞として使用されることが多い。このような発現系は、本分野において周知であり、通常、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を通じて購入できる。
【００９６】
従って、さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、本発明による核酸、本発明によるｃＤＮＡフラグメント、本発明による組み換えＤＮＡ分子又は本発明による生きている組み換え担体を含有する宿主細胞に関する。
【００９７】
本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質の発現のために使用する宿主細胞は、Ｂｃ２８タンパク質をコードする配列を発現させるための細菌由来プラスミド又はバクテリオファージと組み合わせた、細菌起源の細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エシェリヒア  コリ、大腸菌）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バチルス  サブチリス、枯草菌）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（ラクトバチルス菌）又はＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ（カウロバクター  クレセンタス）など、であり得る。宿主細胞はまた、真核生物起源、例えば、酵母特異的ベクター分子と組み合わせた酵母細胞、又は、ベクター又は組み換えバキュロウイルスと組み合わせた、昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏｗら、１９８８、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６，ｐ．４７−５５）のような高等真核細胞；例えばＴｉ−プラスミドを基にしたベクター又は植物ウイルスベクターと組み合わせた植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら、１９８３、Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．３２，ｐ．１０３３）；又は、適切なベクター又は組み換えウイルスとともに使用する、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞又はＣｒａｎｄｅｌｌ−Ｒｅｓｓ  ｆｅｌｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ−ｃｅｌｌｓ（クランデル−レス  ネコ腎臓細胞）のような哺乳動物細胞であり得る。
【００９８】
これらの発現系の次に、植物細胞又は寄生虫を基にした発現系が好ましい発現系である。寄生虫発現系は、例えば、フランス特許出願、公開番号第２７１４０７４号及びＵＳ  ＮＴＩＳ  公開番号ＵＳ  ０８／０４３１０９（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．＆Ｒｏｇｅｒｓ，Ｗ．，１９９３）に記載されている。生物学的応用のためのポリペプチドに対する植物細胞発現系は、例えば、Ｒ．Ｆｉｓｃｈｅｒら（１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６２，ｐ．８１０−８１６）及びＪ．Ｌａｒｒｉｃｋら（２００１、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎ．，ｖｏｌ．１８，ｐ．８７−９４）で考察されている。
【００９９】
無細胞発現系と呼ばれるものにおいても発現を行い得る。このような系は、特定の系において機能するプロモーターに操作可能に連結された適切な組み換え核酸の発現に必要不可欠な因子全てを含有している。例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．コリ）細胞溶解液系（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）又はウサギ網状赤血球細胞溶解液系（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）がある。
【０１００】
本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントは、タンパク質サブユニットワクチンの生成に非常に適している。このようなタンパク質又はフラグメントは、寄生虫又はバベシア科寄生虫が感染した動物もしくは細胞から得ることができる。しかし、発現系において、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントをコードする核酸の使用は、さらに好都合ある。この後、産生されたタンパク質又はフラグメントを回収し、例えば、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントと医薬適合性の担体とを混合することにより、これらをタンパク質サブユニットワクチン中へと処方する。
【０１０１】
従って、本発明のさらに別の局面は、本発明によるタンパク質もしくは該タンパク質の免疫フラグメント、本発明による、核酸、ｃＤＮＡフラグメント、組み換えＤＮＡ分子、生きている組み換え担体又は宿主細胞、又はこれらの組み合わせ、及び医薬適合性の担体を含有するワクチンに関する。
【０１０２】
上述のように、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントを、ワクチン接種に有利に使用することができる。このようなタンパク質又はフラグメントがそれら自身において免疫反応を生じない場合、それらをＫＬＨ、ＢＳＡなどの担体と連結させることができる。
【０１０３】
タンパク質又はそのフラグメントの連結はまた、誘導する免疫反応を増強又は改変するためにも行い得る。例えば、Ｔ細胞の反応を促進するためにタンパク質（−フラグメント）をＴｅｔａｎｕｓトキソイドと連結させるのは一般的な方法である。標的細胞を破壊するために、毒素など、特異的なエフェクター分子を添加することもできる。このような連結は、次のように行うことができる。
【０１０４】
化学的に、直接又は中間体構造を介してのいずれかで、アミノ酸配列の脱水、エステル化などを介して、連結、複合化又は架橋させることによる。
物理的に、巨大分子構造中又は巨大分子構造上での捕捉を介して、連結させることによる。又は、好ましくは、
１つの連続した発現産物が最終的に産生されるような、２つのものをそれぞれコードすることができる核酸のフラグメントを含有する組み換え核酸分子の連結を介した、生物学的融合による。分子工学的技術が好ましい。
【０１０５】
ワクチン接種の代替的かつ効率的な方法は、関連のある抗原又はエピトープをコードするＤＮＡの直接的なワクチン接種によるものである。タンパク質をコードするＤＮＡの直接的なワクチン接種は、例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９３、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，ｖｏｌ．２，ｐ．２０−２６）で概説されているように、多くの様々なタンパク質で成功している。例えば、抗寄生虫ワクチンの分野において、例えばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ（プラスモジウム  ヨエリ、ネズミマラリア原虫）に対する防御が、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイト周囲遺伝子を用いたＤＮＡワクチン接種により成功しており（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．ら、１９９４、Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１２，ｐ．１５２９−１５３３）、及び、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ（リーシュマニア  メジャー）に対する防御が、Ｌ．ｍａｊｏｒ  表面糖タンパク質  ｇｐ６３遺伝子を用いたＤＮＡワクチン接種により成功している（Ｘｕ＆Ｌｉｅｗ，１９９４，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１２．ｐ．１５３４−１５３６）。
【０１０６】
このようなＤＮＡワクチン接種は、本発明による、核酸、ｃＤＮＡフラグメント又は好ましくは組み換えＤＮＡ分子を用いて行うことができる。
【０１０７】
従って、ある好ましい実施形態は、本発明による、核酸、ｃＤＮＡフラグメント又は組み換えＤＮＡ分子を含有することを特徴とする、本発明によるワクチンに関する。
【０１０８】
あるいは、本発明によるワクチンは、上述のように、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントを発現することができる、生きている組み換え担体を含有し得る。
【０１０９】
例えば、細菌、寄生虫又はウイルス担体又はベクターを基にした、このようなワクチンは、それらがバベシア科による感染の自然な形をよりうまく模倣するというサブユニットワクチンより優れた長所を有する。この担体で感染させた細胞による抗原提示もまた、自然感染において２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又はその免疫フラグメントが免疫系に対して提示される経路と類似している。さらに、免疫付与に必要であるのは組み換え担体のうち少量のみであることから、それらの自己増殖は有利である。
【０１１０】
このように、別の好ましい実施形態は、生きている組み換え担体及び医薬適合性の担体を含有する本発明によるワクチンに関する。
【０１１１】
上述の宿主細胞は、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントを発現させるために発現系として使用することができる。発現後、タンパク性産物を回収し得、あるいは、培地又は完全な宿主細胞そのものをワクチン中で使用し得る。これは、精製段階を省略できるという点で利点を有するが、勿論、培地成分及び／又は宿主細胞の成分に対する標的哺乳動物によるある程度の耐性が必要である。
【０１１２】
本発明による、タンパク質又はその免疫フラグメント、核酸、ｃＤＮＡ、組み換え分子、生きている組み換え担体及び宿主細胞のうち２種類以上の分子の組み合わせから編み出された本発明によるワクチンもまた本発明に包含される。単回投与において、又は別個の投与で、これらを組み合わせることができ、同時又は連続的に投与し得る。例えば、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質のコード配列を担う組み換えＤＮＡプラスミドを用いて初回刺激を行い、ある程度の時間経過後に２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質で免疫促進ワクチン接種を行うという、組み合わせワクチン接種を有利に使用し得る。
【０１１３】
哺乳動物標的１個体に対し本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメント  ０．１μｇから１０００μｇを含有する量で本発明によるワクチンを投与することができる。それより低い又は高い用量を基本的に使用することができる。好ましくは、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又はその免疫フラグメント  ５０μｇから２００μｇの間の用量を使用する。
【０１１４】
生きているウイルスベクターワクチンに対して、動物１個体あたりの用量率は、１ｐｆｕから１０１０ｐｆｕの範囲であり得るが、好ましくは、１０−１０５ｐｆｕを使用する。
【０１１５】
医薬適合性の担体は、ワクチン接種を受ける動物の健康に副作用をもたらさない、少なくとも、その副作用が動物がワクチン接種されない場合に見られる影響よりも悪いということがない化合物であると理解される。医薬適合性の担体は、例えば、滅菌水又は滅菌した生理食塩水であり得る。さらに複雑な形態において、担体は、例えば緩衝液であり得る。
【０１１６】
例えば、崩壊しやすい成分を崩壊から保護するために、ワクチンの有効期限を延長するために、又は凍結乾燥効率を向上させるために、ワクチンを安定剤と混合することが多い。有用な安定剤は、とりわけ、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら、１９５０、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．５９，ｐ．５０９）、スキムミルク、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、炭水化物、例えば、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストラン又はグルコース、タンパク質、例えばアルブミン又はカゼインなど、又はそれらの崩壊産物及びリン酸化アルカリ金属などの緩衝液である。
【０１１７】
本発明によるワクチンは、さらに、「ビヒクル」と呼ばれるものを含有し得る。ビヒクルは、本発明による、タンパク質、タンパク質フラグメント、核酸又はその一部、ｃＤＮＡ、組み換え分子、生きている組み換え担体及び／又は宿主細胞が、共有結合されることなく、接着する化合物である。このようなビヒクルは、とりわけ、本分野で公知の、バイオマイクロカプセル、マイクロアルギン酸塩、リポソーム、マクロソル、水酸化アルミニウム、リン酸、硫酸又は酸化アルミニウム、シリカ、Ｋａｏｌｉｎ（Ｒ）（カオリン）及びＢｅｎｔｏｎｉｔｅ（Ｒ）（ベントナイト）である。
【０１１８】
例としては、ＩＳＣＯＭ（Ｒ）と呼ばれる、抗原が部分的に免疫刺激複合体に埋め込まれているビヒクルがある（ＥＰ  １０９．９４２、ＥＰ  １８０．５６４、ＥＰ  ２４２．３８０）。
【０１１９】
さらに、本発明によるワクチンは、１又は複数の適切な界面活性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ（Ｒ）又はＴｗｅｅｎ（Ｒ）を含有し得る。
【０１２０】
例えば安定性又は経済性の理由のために、本発明による、タンパク質、その免疫フラグメント、核酸、ｃＤＮＡ、組み換え分子、生きている組み換え担体、宿主細胞及びワクチンを凍結乾燥し得る。一般に、これにより、０℃を超える、例えば４℃の温度における保存期間を延長させることができる。
【０１２１】
凍結乾燥の方法は、当業者にとって公知であり、様々な規模の凍結乾燥用装置が市販されている。
【０１２２】
従って、より好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、凍結乾燥形態であることを特徴とする。
【０１２３】
凍結乾燥ワクチンを再構成するために、生理学的に許容可能な希釈剤でそれを懸濁し得る。このような希釈剤は、例えば、滅菌水又は生理食塩水のように単純なものであり得る。より複雑な形態において、ＰＣＴ／ＥＰ９９／１０１７８で概説されているような乳剤中でそれを懸濁し得る。
【０１２４】
本発明によるワクチンに対する標的対象は、好ましくは、ヒト又は獣医学的に重要な哺乳動物などの哺乳動物である。このような標的は、健康体又は疾患に罹患しているものであり得、バベシア科寄生虫又はバベシア科寄生虫に対する抗体に対して血清反応陽性又は陰性であり得る。この標的対象は、ワクチン接種及び／又はワクチン接種がそれから保護するために行われる感染もしくは臨床疾患を受け入れ得るあらゆる年齢のものであり得る。
【０１２５】
本発明によるワクチンに対するより好ましい標的哺乳動物は、ウシ、ウマ、イヌ及びネコである。
【０１２６】
本発明によるワクチンは、予防的処置及び治療上の処置として同様に使用することができ、感染又はその疾患の臨床的疾患症候の確立及び／又は進行を妨げることができる。
【０１２７】
本発明によるワクチンは、所望する、標的への適用方法に依存して、いくつかの形態、例えば、液体、ゲル、軟膏、粉末、錠剤又はカプセル、であり得る。
【０１２８】
好ましくは、本ワクチンは、注射可能な液体の形態である。
【０１２９】
本発明によるワクチンは、本分野で公知の方法に従い、哺乳動物標的に投与することができる。例えば、皮膚への、又は皮膚を介した注射の全ての経路を介するなど、例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜下又は皮下など、非経口適用による。実行可能である適用の代替的経路は、眼、鼻、口腔、肛門又は膣の粘膜上皮もしくは、身体のいずれかの部位の外皮の表皮に対するドロップ、スプレー、ゲル又は、軟膏によるもの；エアロゾル又は粉末としてのスプレーのような、局所適用によるものである。あるいは、消化管経路を介して、例えば、粉末、液体又は錠剤として、食物、餌又は飲用水と組み合わせることにより、又は、液体、ゲル、錠剤もしくはカプセルとして口腔に直接投与することにより、又は、坐薬として肛門に直接投与することにより、適用を行い得る。
【０１３０】
好ましい適用経路は、筋肉内注射によるもの、又は皮下注射によるものである。
【０１３１】
適用の最適経路が、予防又は改善されるべき寄生虫感染又は臨床疾患の詳細及び使用するワクチン処方物の性質に依存するものであることは言うまでもない。
【０１３２】
標的哺乳動物への本発明によるワクチンの適用スキームは、単回投与又は複数回投与であり得、それは、用量及び処方と適合する方式で、及び免疫学的に効果的であるような量で、同時又は連続して行い得る。
【０１３３】
好ましくは、本ワクチンは、少なくとも１年間、十分な免疫学的保護効果をもたらす１回の単回投与で適用する。
【０１３４】
さらにより好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、アジュバントを含有することを特徴とする。
【０１３５】
一般に、アジュバントは、非特異的に標的の免疫反応を増強する物質である。多くの様々なアジュバントが本分野で周知である。アジュバントの例は、Ｆｒｅｕｎｄ（フロイント）の完全又は不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロック重合体及びポリアミン、例えば、硫酸デキストラン、カルボポール及びピランなど、である。サポニンもまた非常に適切であり、好ましいアジュバントである。サポニンは、好ましくは、１０μｇ／ｍｌから１０．０００μｇ／ｍｌの間の範囲でワクチンに添加する。サポニン類の中で、サポニン  Ｑｕｉｌ  Ａ（Ｒ）はより好ましいアジュバントである。サポニンとワクチン成分とを、ＩＳＣＯＭＳＯ（Ｒ）（ＥＰ  １０９．９４２、ＥＰ  １８０．５６４、ＥＰ  ２４２．３８０）中で組み合わせ得る。
【０１３６】
さらに、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン又はタフトシンなどのペプチドをアジュバントとして使用することが多く、例えばＢａｙｏｌ（Ｒ）又はＭａｒｋｏｌ（Ｒ）などのミネラルオイル；植物油又はそれらの乳化液及びＤｉｌｕｖａｃＦｏｒｔｅ（Ｒ）を有利に使用することができる。
【０１３７】
アジュバント付加、ビヒクル化合物又は希釈剤の添加、ワクチンの乳化又は安定化の他の方法もまた本発明に包含されることは言うまでもない。このような添加は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ（レミントン：製薬学の科学と実際）”（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）及び“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ（獣医科ワクチン学）”，Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔら編、１９９７、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ  ０４４４８１９６８１など、周知のハンドブックに記載されている。
【０１３８】
本発明によるワクチンは、別の抗原又は免疫活性成分と有利に組み合わせることができる。これもまた、そのコード核酸の形態で添加し得る。
【０１３９】
従って、さらにより好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、さらなる免疫活性成分又は該さらなる免疫活性成分をコードする核酸を含有することを特徴とする。
【０１４０】
さらなる免疫活性成分は、抗原、免疫促進物質及び／又はワクチンであり得、これらのいずれもアジュバントを含有し得る。
【０１４１】
抗原の形態である場合、さらなる免疫活性成分は、ヒト又は獣医学的に重要な動物の何らかの抗原性成分から構成され得る。例えば、それは、タンパク質、炭水化物、リポ多糖類、タンパク性抗原をコードする核酸、又は、転写制御配列と操作可能に連結されたそのような核酸を含有する組み換え核酸分子など、生体分子又は合成分子を含有し得る。そのような核酸、組み換え核酸分子を含有する宿主細胞、又はそのような核酸を含有するＬＲＣもまた、核酸又はさらなる免疫活性成分を送達する手段であり得る。あるいは、それは、断片化した、又は死滅させた微生物、例えば寄生虫、細菌又はウイルスなどを含有し得る。
【０１４２】
さらなる免疫活性成分は、免疫増強物質、例えば、ケモカイン又は免疫刺激核酸（例えばＣｐＧモチーフ）の形態であり得る。あるいは、本発明によるワクチンそのものをワクチンに添加し得る。
【０１４３】
例えば、バベシア科の感染又は関連疾患の臨床徴候に対する組み合わせサブユニットワクチンを形成するために、本発明によるワクチンを、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質ではない、バベシアサブユニットワクチンタンパク質の調製物と組み合わせることができる。
【０１４４】
さらにより好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、前記さらなる免疫活性成分又は該さらなる免疫活性成分をコードする核酸を、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ（エーリキア  キャニス）、Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ（バベシア  ギブソニ）、Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ（Ｂ．ボゲリ）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ（リーシュマニア  ドノバン）−複合体、Ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ（イヌパルボウイルス）、Ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓ（イヌジステンバーウイルス）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（レプトスピラ  インテロガンス）  血清型ｃａｎｉｃｏｌａ（カニコラ）、ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ（イクテロヘモラジ）、ｐｏｍｏｎａ（ポモナ）、ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ（グリポティフォーサ）、ｂｒａｔｉｓｌａｖａ（ブラチスラバ）、Ｃａｎｉｎｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ（イヌ肝炎ウイルス）、Ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ（イヌパラインフルエンザウイルス）、ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ（狂犬病ウイルス）、Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ  ｃａｎｉｓ（ヘパトゾーン  キャニス）及びＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（ボレリア  ブルグドルフェリ）からなる群から選択される生物から得ることを特徴とする。
【０１４５】
初回に対する、本発明による２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメント、本発明による、核酸、ｃＤＮＡ、組み換え分子、生きている組み換え担体及び／又は宿主細胞により、２８ｋＤａタンパク質ファミリーのタンパク質又はその免疫フラグメントに対する特異的抗体の生成が可能となる。本分野で公知の方法を介して、これにより、寄生虫を感染させた哺乳動物標的とワクチン接種した哺乳動物標的との間の鑑別が可能になるような、マーカーワクチンとして適している本発明によるワクチンが作られる。
【０１４６】
あるいは、いわゆる「受動ワクチン接種」のために、ワクチンそのものとしてこれらの特異的抗体を使用し得る。
【０１４７】
従って、さらに別の好ましい実施形態は、本発明によるタンパク質に対する抗体又は該タンパク質の免疫フラグメントに対する抗体、又はそれらの組み合わせ及び医薬適合性の担体を含有することを特徴とするワクチンに関する。
【０１４８】
その抗原に対する抗体を「負荷した」抗原のワクチンにおける組み合わせは、「複合」ワクチンとして本分野で公知である。
【０１４９】
本発明のさらに別の局面は、本発明によるタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメント、本発明による、核酸、ｃＤＮＡ、組み換えＤＮＡ分子、生きている組み換え担体もしくは宿主細胞、又はそれらの組み合わせ、及び医薬適合性の担体を混合することを含む、本発明によるワクチンを調製するための方法に関する。
【０１５０】
本発明のさらに別の局面は、本発明によるタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントに対する抗体、及び医薬適合性の担体を混合することを含む、本発明によるワクチンの調製のための方法に関する。
【０１５１】
上記のように、本発明による方法により得られるワクチンは、予防的処置及び治療上の処置として同様に使用することができ、感染又はその疾患の臨床症候の確立及び／又は進行の両方を妨げることができる。
【０１５２】
従って、本発明のさらなる局面は、バベシア科の生物により引き起こされる感染又はその臨床的徴候に対する予防又は治療上の処置用のワクチンの製造のための、本発明によるタンパク質又は該タンパク質の免疫フラグメントの使用に関する。
【０１５３】
さらにまた、本発明のさらなる局面は、配列番号１又は３で示される核酸配列と少なくとも７０％の相同性を有する核酸、又は該核酸と相補的な核酸を含有し、前記両核酸とも少なくとも１２、好ましくは１５、より好ましくは１８ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする、バベシア科の生物に関連する核酸検出のための診断テストに関する。
【０１５４】
本発明のまたさらなる局面は、本発明によるタンパク質もしくは該タンパク質の免疫フラグメント、又はそれらの組み合わせを含有することを特徴とする、バベシア科の生物に対する抗体検出のための診断テストに関する。
【０１５５】
例えば、Ｂｃ２８．１及び／又はＢｃ２８．２タンパク質もしくはそのいずれかの免疫フラグメンを固相担体に連結させ、これを試験する試料とインキュベーションし、洗浄し、結合した抗体の存在を検出する。
【０１５６】
本発明のまたさらなる局面は、本発明によるタンパク質もしくは該タンパク質の免疫フラグメントに対する抗体、又はその組み合わせを含有することを特徴とする、バベシア科の生物由来の抗原物質検出のための診断テストに関する。
【０１５７】
例えば、Ｂｃ２８．１及び／又はＢｃ２８．２タンパク質もしくはそのいずれかの免疫フラグメントに対する抗体を固相担体に連結させ、これを試験する試料とインキュベーションし、洗浄し、結合した抗体の存在を検出する。
【０１５８】
ここで、次の非限定的な実施例を参照しながら本発明をさらに説明する。
【０１５９】
実施例
【実施例１】
【０１６０】
Ｂｃ２８多重遺伝子族の同定と、Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列の分子特性決定
１．１  使用技術
１．１．１．  全体的技術
１．１．１．１．  Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）の培養
Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）の分離株（Ａ、Ｂ、Ｃａｓｔｒｅｓ、Ｇｉｇｎａｃ、３４．０１及びＲｏｂｉｎと称する。）を、フランスの様々な部門からの自然感染したイヌから得た。Ｓｃｈｅｔｔｅｒｓら（１９９７、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１１５，ｐ．４８５−４９３）の方法に従い、これらをインビトロ培養で維持した。
【０１６１】
Ａ８生物学的クローンは、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来の分離株Ａの生物学的クローンに対応しており、マラリア寄生虫に対して記載されているクローニング−希釈手段（Ｗａｌｌｉｋｅｒ＆Ｂｅａｌｅ，１９９３，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐ．５７−６６）を適応させた手段に従い得た。
【０１６２】
１．１．１．２．  ＤＮＡ配列決定
Ｔ３及びＴ７ユニバーサルプライマー及び既に確立された各鎖の配列由来の様々なオリゴヌクレオチドを用いて、選択したプラスミドの両鎖において、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓ．Ａ．（Ｚｏｎｅ  Ａｓｔｅｃ，Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）により、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ／Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７４，ｐ．５４６３−５４６７）の方法に従い、アルカリ変性させた２本鎖鋳型からのジデオキシチェーンターミネーション法を用いてヌクレオチド配列決定を行った。
【０１６３】
１．１．１．３．  ＤＮＡプライマー
ゲノムフラグメントの単離、プローブの生成及びＰＣＲ反応に使用したＤＮＡプライマーを、個別の配列番号とともに表５に開示する。プライマーは全て、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）により合成された。
【０１６４】
【表５】
2008500802.tif 000007
【０１６５】
１．１．１．４．  ゲノムＤＮＡ抽出、サザンブロット及び染色体分析
製造者（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）に従い、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（Ｒ）カラムを用いて血液２００μｌに対して、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）インビトロ培養物又は感染したイヌ血液の野外試料からのゲノムＤＮＡ抽出を行った。サザンブロット実験は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）の標準的手順を用いて行った。
【０１６６】
インタクトな（完全な）、又はＮｏｔＩ消化したＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の染色体を含有するアガロースプラグの調製及びパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によるそれらの分離は、Ｄｅｐｏｉｘら（２００２，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１２５，ｐ．３１３−３２１）で記載されているようにして行った。
【０１６７】
ＤＮＡハイブリダイゼーション実験に使用したＢｃ２８プローブは、ＤＮＡテンプレートとしてＢｃ２８．１ｃＤＮＡを担うプラスミドを使用し、プライマー、Ｆｓｐｅ３及びＲｓｐｅ４を組み合わせてＰＣＲを行うことにより得た。Ｂｃ２８プローブは、製造者の使用説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に従い、かつ、Ｄｅｐｏｉｘら（前出）で述べられているようにして、Ｎｉｃｋ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎキットを用いて標識した。
【０１６８】
１．１．１．５．  ＲＮＡ抽出及びノーザンブロット分析
トータルＲＮＡ抽出、ｍＲＮＡ精製及びＲＮＡハイブリダイゼーションは、Ｄｒａｋｕｌｏｖｓｋｉら（２００３、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，ｖｏｌ．７１，ｐ．１０５６−１０６７）で述べられているようにして行った。ディゴキシジェニン（ＤＩＧ）−１１−ＵＴＰ−標識Ｂｃ２８アンチセンスリボプローブ（プライマー、Ｆｓｐｅ３及びＲｓｐｅ４を使用して得た相補的ｍＲＮＡ配列）は、ＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（Ｒ）ＤＮＡ標識キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に従い、合成した。
【０１６９】
１．１．１．６．  ＰＣＲ増幅
Ｄｅｐｏｉｘら（前出）で述べられているようにして、Ａｃｃｕ  Ｔａｑ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＰＴＣ−１００（Ｒ）Ｐｒｏｇｒａｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）で増幅を行った。
【０１７０】
１．１．２．  Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ（Ｂ．ディバージェンス）のＢｄ３７  ｃＤＮＡ由来のプライマーを用いたＰＣＲによるＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）からのＢｃ２８．２ゲノムフラグメントの同定、
Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株ＡからのゲノムＤＮＡにおけるＰＣＲ設定に、２種類のプライマー、ｐｒ３及びＥ４を使用した。アニーリング条件は、以下の通り：アニーリング温度を４５℃から５５℃まで、１サイクルごとに２℃ずつ上昇させ、次に、５５℃にて増幅を２５サイクル行った。これらの条件により、５００ｂｐのゲノムフラグメントが増幅され、これをＢｃ２８．２とした。次に、製造者の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、このＰＣＲフラグメントをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｒ）クローニングベクターにクローニングし、配列決定を行った。
【０１７１】
１．１．３．  Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の完全なＢｃ２８．１  ｃＤＮＡ配列のクローニング
最初の逆転写段階に対して、Ｂｃ２８．２  ゲノムフラグメントの配列由来のプライマーを用いて、ｃＤＮＡ  Ｂｃ２８．１からの完全配列をＲＴ−ＰＣＲにより調べた。ＲＴ−ＰＣＲ実験に対して、製造者の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）からのインタクトな（完全な）ｍＲＮＡに対して、ＧｅｎｅＲａｃｅ（Ｒ）プロトコールを適用した。最初の逆転写段階に対して、リバースプライマー  ＲＴ１を使用して、ｃＤＮＡの５’末端配列（クローン５’−Ｂｃ２８．１、５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物）を調べた。プロトコールの最初の逆転写段階において、クローン５’−Ｂｃ２８．１の配列由来の、フォワードプライマー、Ｉｎｖ５を使用して、ｃＤＮＡ  Ｂｃ２８．１の３’末端（クローン３’−Ｂｃ２８．１、３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物）を得た。次に、各逆転写段階で最初に使用したものに対応するプライマーカップルを使用して、及び、ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で与えられているフォワードＧｅｎｅＲａｃｅｒ（Ｒ）５’プライマー（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’）又はリバースＧｅｎｅＲａｃｅｒ（Ｒ）３’プライマー（５’−ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧ−３’）（表５）を用いて、ｃＤＮＡ  Ｂｃ２８．１の５’及び３’末端をＰＣＲにより増幅した。両ケースにおいて、Ａｃｃｕ  Ｔａｑ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、１種類のＰＣＲ産物が得られた。これらのフラグメントをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングし、配列決定を行った。クローン、５’−Ｂｃ２８．１及び３’−Ｂｃ２８．１からの配列を集めて、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来のＢｃ２８．１  ｃＤＮＡの完全配列を形成した。
【０１７２】
１．１．４．  Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来のＢｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列からのコード領域のクローニング
Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２ヌクレオチド配列の対応するゲノムコピーの配列を決定するために、Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２ヌクレオチド配列からの特異的なリバースプライマーを設計した。Ｂｃ２８．１  ｃＤＮＡ配列の５’末端由来のフォワード５’ＵＴＲプライマー及びＢｃ２８．２のゲノム配列の３’末端に特異的にハイブリダイズするリバースＲｓｐｅ３Ｇプライマーを用いて、コード配列  Ｂｃ２８．２からの完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＰＣＲにより増幅した。５’ＵＴＲプライマー及びＢｃ２８．１  ｃＤＮＡ配列の３’末端に特異的にハイブリダイズするリバースＲｓｐｅ３Ｃプライマーを用いて、Ｂｃ２８．１コード配列からの完全なＯＲＦの配列をＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡテンプレートとして、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来の生物学的クローン  Ａ８からのゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。次の条件：９４℃にて３分間の変性ステップ、９４℃にて１分間の変性、５５℃にて１分間のアニーリング及び７２℃にて１分間の伸長から構成される３段階のサイクルプログラム、次に、７２℃にて５分間のステップで増幅を行った。次に、そのＰＣＲフラグメントをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングし、配列決定を行った。
【０１７３】
１．１．５．  Ｂｃ２８．１及び潜在的なＢｃ２８．２コード配列の多型性の分析
フランスの研究所  Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）分離株Ｂ、Ｒｏｂｉｎ、Ｃａｓｔｒｅｓ、Ｇｉｇｎａｃ及び３４．０１からのＢｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列を、プライマーカップル、Ｆｓｐｅ３／Ｒｓｐｅ３Ｃ又はＦｓｐｅ３／Ｒｓｐｅ３Ｇを用いてＰＣＲにより増幅し、５種類の制限酵素（ＡｌｕＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｆＩ、ＭｂｏＩ及びＭｓｐＩ）に基づいた制限マップを両遺伝子に対して予測した。Ｂｃ２８．１コード配列からの推定制限マップに基づき、プライマーカップル、５’ＵＴＲ／Ｒｓｐｅ３Ｃを用いて、フランスの研究所  Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）分離株Ｂ、Ｒｏｂｉｎ、Ｃａｓｔｒｅｓ及び３４．０１からのＢｃ２８．１のコード領域全体をＰＣＲにより増幅し、上述のようにクローニングして配列決定を行った（セクション１．１．２）。
【０１７４】
１．２．結果：
１．２．１．  ＰＣＲによるＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来ゲノムフラグメントの同定
Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来ゲノムＤＮＡにおいて、４５℃から５５℃までアニーリング温度を上昇させるＰＣＲ設定に対して、２種類のプライマー、ｐｒ３及びＥ４を用いた（図５）。
【０１７５】
それにより、約５００ｂｐのフラグメントが増幅された（図５、レーン２；点で示す。）。対照増幅において別個にしたプライマーの各試験がネガティブであったので、この増幅は特異的であった（図５、レーン５及び６）。
【０１７６】
ＧＳＴ融合タンパク質を発現できるようにするために、このクローン、Ｂｃ２８．２（以後、Ｂｃ２８．２と呼ぶ）（下記参照）をｐＧＥＸ（Ｒ）ベクターにクローニングした。
【０１７７】
１．２．２．  Ｂｃ２８多重遺伝子族の同定及びＢｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列のクローニング
１．２．２．１．  完全なＢｃ２８．１  ｃＤＮＡのクローニング
Ｂｃ２８．２のゲノムフラグメントに対応する完全なｃＤＮＡ配列を見つけるために、ＧｅｎｅＲａｃｅｒプロトコールを用いて、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来のインタクトなｍＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。最初に、ゲノムクローン  Ｂｃ２８．２の配列由来のリバースプライマー  ＲＴ１を用いて最初の逆転写段階を行い、続いて、同じＲＴ１プライマー及びＧｅｎｅ  Ｒａｃｅｒキットで提供されるフォワードＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、１個の５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物を得た。次に、プロトコールの最初の逆転写段階において、５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物の推定配列由来のフォワードプライマー、Ｉｎｖ５を用いて、続いて、同じプライマー及びキットで提供されるＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’プライマーを用いてＰＣＲを行い、１個の３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物を得た。５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物からの配列を集め、Ｂｃ２８．１  ｃＤＮＡの完全配列を構成した。このｃＤＮＡには、ポリ（Ａ）２０テール及び７５３ヌクレオチドＯＲＦとともに１０３９ｂｐ配列が含有されていた。ｃＤＮＡのセグメント  ５’ＵＴＲ／Ｒｓｐｅ３Ｃ内で、このＯＲＦは、ヌクレオチド（ｎｔ）位置５０（又はｃＤＮＡ全体からのｎｔ位置７１）でＡＴＧ開始コドンにより開始し、ヌクレオチド位置８２０（又はｃＤＮＡ全体からのｎｔ位置８４１）ＴＡＡ終止コドンで終わる。
【０１７８】
推定ｃＤＮＡの完全配列を用いたＢｃ２８．２  ゲノムフラグメント配列のアライメントにより、プライマーＲＴ１及びＩｎｖ５の領域において（つまり、Ｂｃ２８．２配列の５’末端において）２つの配列間に顕著な同一性があることが明らかになった。しかし、それらの３’末端は、非常にかけ離れていることが分かり、このことから、この遺伝子に対するＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のゲノムにおいて少なくとも２個の関連するゲノムコピーが存在することが示唆された。ｃＤＮＡ配列は２８ｋＤａ前後のポリペプチドをコードし、かつ、その３’末端が関連するゲノムクローンからかけ離れているので、それをＢｃ２８．１とし、一方、その関連ゲノムクローンをＢｃ２８．２とした。
【０１７９】
１．２．２．２．  Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列の特異的ＰＣＲ増幅のためのプライマー設計
ｃＤＮＡ  Ｂｃ２８．１及びゲノムクローン  Ｂｃ２８．２からのヌクレオチド配列の比較から、本寄生虫のゲノムにおける２つの関連するゲノムコピーが示唆されたので、それら各コピーを増幅できる特異的プライマーを設計した。従って、Ｂｃ２８．２及びＢｃ２８．１コード配列を増幅するためにそれぞれ設計した、その３’末端において最もかけ離れた２つの配列、プライマー、Ｒｓｐｅ３Ｇ及びＲｓｐｅ３Ｃを、この領域から選択した（図３）。各コード配列に対するそれらの特異性を明らかにするために、Ｂｃ２８．２配列の５’末端に位置し、２つの配列の保存領域でハイブリダイズするプライマー、Ｃｏｎｓ３．１（図３）と組み合わせて、ＰＣＲによりそれらを試験した。さらに、関連コード配列の２つのコピーが、分離株ＡにおけるＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の２つの亜種由来のものでないことを確認するために、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の生物学的クローン、クローンＡ８からのゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。
【０１８０】
プライマー、Ｃｏｎｓ３．１／Ｒｓｐｅ３Ｇ及びＣｏｎｓ３．１／Ｒｓｐｅ３Ｃの組み合わせにより、プライマーの両組み合わせに対して３００ｂｐ前後のゲノムフラグメントが増幅された（図６、Ａ、Ｉ及びＩＩ、レーン  ＰＣＲ）。プライマー、Ｒｓｐｅ３Ｇ及びＲｓｐｅ３ＣがそれぞれＢｃ２８．２及びＢｃ２８．１コード配列特異的にハイブリダイズすることを確認するために、増幅したフラグメントを制限酵素  ＨｉｎｆＩ又はＭｓｔＩにより消化した（図６、Ａ、Ｉ及びＩＩ、レーンＨ及びＭ）。２つの配列の制限マップの比較により、Ｂｃ２８．２配列の３’末端において、２個のＨｉｎｆＩ制限部位（Ｂｃ２８．１配列の位置７１３及び７７７に位置する。）及び１個のＭｓｐＩ部位（Ｂｃ２８．１配列の位置７９０に位置する。）がないことが明らかになった（図６、Ｃ、；Ｂｃ２８．１コード配列からの制限マップとＢｃ２８．２  ゲノムフラグメントとを比較）。予想されるように、アンプリマー  Ｃｏｎｓ３．１／Ｒｓｐｅ３ＣのＨｉｎｆＩ及びＭｓｐＩ消化から、３及び２個のフラグメントへの増幅フラグメントの消化が示された（図６、Ａ、Ｉ、それぞれレーンＨ及びＭ）。一方、これらの２種類の酵素により、Ｃｏｎｓ３．１／Ｒｓｐｅ３Ｇ  ＰＣＲフラグメントは消化されず（図６、Ａ、ＩＩ、レーンＨ及びＭ）、このことから、プライマー  Ｒｓｐｅ３Ｇ及びＲｓｐｅ３Ｃが、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来の生物学的クローンＡ８からのＢｃ２８．２及びＢｃ２８．１コード配列に特異的にハイブリダイズすることが分かった。
【０１８１】
Ｂｃ２８．２  コード配列の５’末端を分析するために、プライマー、Ｆｓｐｅ３／Ｒｓｐｅ３Ｇ及びＦｓｐｅ３／Ｒｓｐｅ３Ｃの組み合わせを使用することにより、同様のＰＣＲ−ＲＦＬＰを行った（図６、Ｂ、Ｉ及びＩＩ）。両ケースにおいて、そのアンプリマーは、前記２種類の酵素により消化され、その消化の結果得られるフラグメントのサイズから、Ｂｃ２８．２及びＢｃ２８．１コード配列の５’末端が保存されていることが示された（図６、Ｃ；Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２  コード配列からの制限マップの比較）。実際に、Ｂｃ２８．２コード配列の５’末端は、保存位置において、Ｂｃ２８．１コード配列からの、１個のＨｉｎｆＩ部位（Ｂｃ２８．１コード配列の位置３０８に位置する。）及び２個のＭｓｐＩ部位（Ｂｃ２８．１コード配列の位置３６７及び４１２に位置する。）を含有していた。
【０１８２】
結論として：Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のゲノムに２個の関連するＢｃ２８コード配列が存在する。２つのコピーそれぞれを分析できる特異的なプライマーを開示する。制限マップ比較により、両コピーが、５’末端はよく保存されているが、一方で３’末端は非常にかけ離れているがことが分かった。
【０１８３】
１．２．２．３．  Ｂｃ２８．１プローブを用いたハイブリダイゼーション実験
ハイブリダイゼーション実験（サザンブロット、ノーザンブロット及びＰＦＧＥ分析）に用いたプローブ（図７）は、プライマー  Ｆｓｐｅ３及びＲｓｐｅ４の間に位置するＢｃ２８．１  ｃＤＮＡのコード領域に対応していた（図３）。
【０１８４】
１．２．２．３．１．  Ｂｃ２８．１コード配列は、多重遺伝子族に属する。
【０１８５】
最初に、サザンブロット実験の結果において、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のゲノムＤＮＡをＲｓａＩ酵素で消化したところ、１２２０及び１４００ｂｐ前後の２つのハイブリダイズしたフラグメントが検出された（図７、Ａ、ＩＩ、レーン３、矢印で示す。）。Ｂｃ２８．１  ｃＤＮＡの制限マップにはＲｓａＩ部位が存在しないので、そのことから、Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２の関連配列の同定と一致して、少なくとも２つの関連するゲノムコピーが存在することが分かった。
【０１８６】
次に、ＰＦＧＥにより分離された、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）分離株Ａ（図７、Ｃ及びＤ、ＩＩ−Ａ）及びＢ（図７、Ｃ及びＤ、ＩＩ−Ｂ）からの全体（図７、Ｃ、ＩＩ）又はＮｏｔＩ−消化した（図７、Ｄ、ＩＩ）染色体において、Ｂｃ２８．１プローブを用いてハイブリダイゼーション実験を行った。この実験から、関連するＢｃ２８コード配列の少なくとも１０ゲノムコピーがＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のゲノムに存在すること（図７、Ｄ、ＩＩ）、及び、両分離株において、これらのコピーが本寄生虫からの５個の染色体に位置することが分かった（図７、Ｃ、ＩＩ）。分離株Ａ及びＢ両方に対するハイブリダイゼーションシグナルの感受性の違いから、そのファミリーのある分離株に対する様々な関連Ｂｃ２８配列間の配列多型性が示される。
【０１８７】
１．２．２．３．２．  ノーザンブロット分析
既に述べたデータからＢｃ２８．１  ｃＤＮＡに関連する少なくとも１０個のメンバーがあることが示されている一方で、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来のトータルＲＮＡにおけるプローブのハイブリダイゼーションから、１．１ｋｂ前後のｍＲＮＡの１個のバンドが明らかになったが、これは、Ｂｃ２８．１  ｃＤＮＡ配列の大きさと一致する（図７、Ｂ、ＩＩ）。さらに、２つの関連するコード配列、Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２が異なる産物をコードする（２８及び４５ｋＤａ、実施例２、セクション２．２．１参照）ことが発明者らのデータから示されている一方、４５ｋＤａをコードする、より大きいｍＲＮＡは検出されなかった。
【０１８８】
結論として：Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列は、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の５個の染色体に位置する少なくとも１０個のメンバーからなる多重遺伝子族に属する。１個のｍＲＮＡが、Ｂｃ２８．１コピーに対応する２８ｋＤａタンパク質をコードすることが検出された。α−ＧＳＴ−Ｂｃ２８．２抗血清により認識されるバンドに対応する４５ｋＤａタンパク質をコードするより大きいｍＲＮＡは検出することができなかった；免疫沈降実験において検出された少量のタンパク質から、このｍＲＮＡの転写レベルが非常に低いことが示され、さらに、Ｂｃ２８ファミリーのメンバーの転写が制御されていることが示された。
【０１８９】
１．２．２．４．  Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来生物学的クローン  Ａ８内のＢｃ２８．２コード配列のクローニング及びＢｃ２８．１コード配列とのその配列の比較
ＤＮＡテンプレートとしてＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来生物学的クローン  Ａ８からのゲノムＤＮＡを用い、プライマーの組み合わせ、５’ＵＴＲ／Ｒｓｐｅ３Ｇを用いて、ＰＣＲにより、Ｂｃ２８．２  コード配列からの特異的ゲノムフラグメントを増幅した。そのゲノムフラグメントをクローニングし、配列決定を行った。ゲノム配列  Ｂｃ２８．２をアライメントし、プライマーの組み合わせ、５’ＵＴＲ／Ｒｓｐｅ３Ｃを用いて増幅した、相当するＢｃ２８．１コード配列と、ヌクレオチド（図３）及びアミノ酸（図１）の両レベルで比較した。
【０１９０】
１．２．２．４．１．  ヌクレオチドレベルでの比較
このようなＰＣＲにより、それぞれＢｃ２８．２及びＢｃ２８．１ゲノム配列に対する８４５及び８５２ヌクレオチド長の配列が増幅された（図３）。Ｂｃ２８．１  ｃＤＮＡ及びゲノムの相当する配列の比較から、Ｂｃ２８．１コード配列においてイントロン配列が見出されないことが示された。上述のようにＢｌａｓｔＮプログラムを用いて決定した、ヌクレオチドレベルにおけるＢｃ２８．１とＢｃ２８．２配列との間の同一性のパーセンテージは、この２つの配列からの全８４５ヌクレオチドで比較を行った場合、９４％であった（表３）。しかし、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ実験を用いた、既に述べた比較のための制限マップ分析により示唆されたように（図６、Ｃ）、この２つのヌクレオチド配列の比較から、５’末端において強い保存性があり、一方でそれらの３’末端が多型であることが明らかになった（図３）。実際に、ヌクレオチドレベルにおける同一性のパーセンテージは、この２つの配列からの最初の６５２ヌクレオチドを用いて比較を行った場合、９７％である一方、それらの３’末端からの残り１９３ヌクレオチドの比較から、同一性は８１％しかないことが明らかになった（表３）。
【０１９１】
１．２．２．４．２．  Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列の制限マップの比較
ＤＮＡテンプレートとしてＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）由来の生物学的クローン  Ａ８からのゲノムＤＮＡを使用して、プライマー、Ｆｓｐｅ３及びＲｓｐｅ３Ｃ又はＲｓｐｅ３Ｇ間のＢｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列のコード領域に対応する特異的ゲノムフラグメントをＰＣＲにより増幅した。Ａ８生物学的クローン内で、Ｂｃ２８．１コード配列及びＢｃ２８．２コード配列の制限マップを比較するために（図８、Ａ）、生物学的クローン  Ａ８からの２つのコピーに対応するこれらのゲノムフラグメントを様々な制限酵素により消化した。
【０１９２】
既に示したように、このようなＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析により、特にそれらの５’末端において、両コピーが共通するいくつかの制限部位を有することが明らかになった。この２つのコピーの主な違いは、Ｂｃ２８．２  コード配列の３’末端において２個のＨｉｎｆＩ及び１個のＭｓｐＩ制限部位が欠失していることである。この２つのコピーの５’末端においては、２８．２コード配列の５’末端でＥｃｏＲＩ制限部位が欠失していることのみが異なる（図８、Ａ）。
【０１９３】
１．２．２．４．３．  アミノ酸レベルでの比較
Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２のコード配列によりコードされる産物の比較分析を行った（図１）。Ｂｃ２８．２及びＢｃ２８．１  ゲノム配列に対して、２４４及び２５６アミノ酸のＯＲＦがそれぞれ予想された（図１）。それらのヌクレオチド配列で、両方が同じヌクレオチド位置（位置５０）で始まっている一方で、Ｂｃ２８．２  ＯＲＦは位置７８４のＴＧＡ終止コドンで終わっており、Ｂｃ２８．１  ＯＲＦは位置８２０のＴＡＡ終止コドンで終わっているため、２つのＯＲＦはサイズが異なっていた（図３）。既に述べたように、ＢａｌｓｔＰプログラムを用いて、完全配列又はそのタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端を用いて、この２つの予想されるタンパク質間のパーセンテージ相同性を決定した（表１）。この２つの完全タンパク質（２４４残基における。）の比較から、９１％の全体的相同性が明らかになった。既に述べたように、この２つのタンパク質のＮ−末端部分が非常に良く保存されている（この２つのタンパク質の最初の１８０アミノ酸の間で９７％相同性）ことが分かったが、一方、それらのＣ−末端部分は、より多型であり、最後の６４アミノ酸において相同性は７３％であることが分かった。
【０１９４】
１．２．２．４．４．  Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２にコードされる産物の予測解析
Ｂｃ２８ｃＤＮＡ．１によりコードされるタンパク質の予想分子量が２８．３ｋＤａ（及び６．２４のｐＩ）である一方、Ｂｃ２８．２コード配列にコードされるタンパク質の予想分子量は２７．５ｋＤａ（及び９．３０のｐＩ）である。
【０１９５】
疎水性プロファイルの分析（図９）から、両タンパク質に対して内部疎水性配列は明らかとならなかった。しかし、両タンパク質とも、シグナルペプチドに対応するＮ−末端疎水性セグメントを有していた。切断部位は、Ａ１６とＶ１７残基との間に存在する。Ｂｃ２８．２タンパク質とは異なり、Ｂｃ２８．１タンパク質は、そのタンパク質のＣ−末端側終端に位置する別の疎水性セグメントを含有していた（図９）。このＧ２３６−Ｖ２５６疎水性セグメントは、ＧＰＩアンカーである。
【０１９６】
結論として：この多重遺伝子族からのこの２つのゲノムコピー、Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２は、２８ｋＤａ前後の産物をコードすると予想される。両タンパク質とも、そのＮ−末端部分に切断可能なシグナルペプチドを含有する。Ｂｃ２８．１タンパク質のＣ−末端部分にＧＰＩアンカーが存在するが、Ｂｃ２８．２タンパク質のＣ−末端部分にはない。それらの推定アミノ酸配列のように、この２つの関連するＢｃ２８．１及びＢｃ２８．２ヌクレオチド配列は、それらの５’部分でよく保存されているが、３’部分ではより多型である。
【０１９７】
１．２．３．  地理的かつ遺伝的に離れたＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）野生分離株間のＢｃ２８．１及びＢｃ２８．２  コード配列の多型性
１．２．３．１．  ＰＣＲ−ＲＦＬＰによるＢｃ２８．１及びＢｃ２８．２  コード配列の制限マップの比較
ＤＮＡテンプレートとして、フランスのＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）分離株  Ａ８、Ｂ、Ｃａｓｔｒｅｓ、Ｇｉｇｎａｃ、３４．０１及びＲｏｂｉｎからのゲノムＤＮＡを用いて、プライマー、Ｆｓｐｅ３及びＲｓｐｅ３Ｃ又はＲｓｐｅ３Ｇの間の、Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列のコード領域に対応する特異的ゲノムフラグメントをＰＣＲにより増幅した。分離株間で、Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列の制限マップと比較するために、分離株Ａ８、Ｂ、Ｃａｓｔｒｅｓ、Ｇｉｇｎａｃ及び３４．０１からの２つのコピーに対応するこれらのゲノムフラグメントを様々な制限酵素により消化した（それぞれ図８、Ｂ、Ｃ）。
【０１９８】
１．２．３．１．１．  Ｂｃ２８．１コード配列制限マップの比較
プライマーの組み合わせ、Ｆｓｐｅ３／Ｒｓｐｅ３Ｃにより増幅されたＰＣＲフラグメントのこのＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析から、様々な入手可能な分離株からのＢｃ２８．１コード配列間の制限マップの重要な保存が明らかになった（図８、Ｂ）。
【０１９９】
１．２．３．１．２．  Ｂｃ２８．２コード配列の制限マップの比較
Ｂｃ２８．１コード配列に対するもののように、プライマーの組み合わせ、Ｆｓｐｅ３／Ｒｓｐｅ３Ｇを用いて増幅されたＰＣＲフラグメントのＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析から、様々な分離株からの潜在的Ｂｃ２８．２コード配列間で制限マップにおいて重要な保存があることが明らかになった（図８、Ｃ）。
【０２００】
１．２．３．２．  Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の様々な分離株からのＢｃ２８．１コード配列の配列決定
地理的かつ遺伝的に離れているＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）野生分離株間のＢｃ２８．１コード配列の保存性を確認するために、分離株Ａ８、Ｒｏｂｉｎ、Ｃａｓｔｒｅｓ、Ｂ及び３４．０１からのＢｃ２８．１コード配列のコード領域（つまり、プライマー５’ＵＴＲ／とＲｓｐｅ３Ｃとの間）を、ＰＣＲにより増幅し、クローニングし、配列決定を行い、アライメントし、ヌクレオチド（図４）及びアミノ酸（図２）の両レベルで比較した。
【０２０１】
１．２．３．２．１．  ヌクレオチドレベルでの比較
プライマーカップル、５’ＵＴＲ／Ｒｓｐｅ３Ｃを用いたＰＣＲにより、分離株Ｂ、Ｒｏｂｉｎ及びＡに対する８５２ヌクレオチド長のゲノムＢｃ２８．１配列及び分離株３４．０１及びＣａｓｔｒｅｓに対する８４９ヌクレオチド長のゲノムＢｃ２８．１配列が増幅された（図４）。Ｂｌａｓｔプログラムを用いたペアワイズアライメントにおける、ヌクレオチドレベルでの、これらのＢｃ２８．１配列間の同一性のパーセンテージは、１００％（Ａ８及びＲｏｂｉｎが最も近い。）と９７％の間に含まれており（図４）、このことから、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株間のコード配列の強い保存性が示される。
【０２０２】
１．２．３．２．２．  アミノ酸レベルでの比較
これらの様々な分離株からのＢｃ２８．１コード配列によりコードされるタンパク質の比較解析を行った（図２、表２）。分離株Ｂ、Ａ及びＲｏｂｉｎに対して２５６アミノ酸のＯＲＦを得たが、一方、分離株３４．０１及びＣａｓｔｒｅｓに対しては、このＯＲＦは２５５アミノ酸であった（図２）。既に述べたように、ＢｌａｓｔＰプログラムを用いたペアワイズアライメントにおいて決定した様々なＢｃ２８．１タンパク質間の相同性は非常に強く、１００％（ＡとＲｏｂｉｎ）と９７％との間であった（表２）。
【０２０３】
結論として：Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）からのＢｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列からの制限マップの解析により、様々な分離株間の各配列の強い保存性が示される。これら分離株は全てフランスで回収されたので、この保存は、これらの分離株が、異なる地域が起源であったとしても、全て同じ国からのものであるという事実によるものであり得る。しかし、これらの分離株が遺伝的に離れたＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）野生分離株であることが証拠により示唆された。実際に、それらの染色体の内容の分析により、これらの分離株全てが特異的な染色体プロファイルを有することが明らかとなった。さらに、フランス全土及び他のヨーロッパ諸国（ドイツ及びハンガリー）において感染したイヌから回収した６０検体前後の試料に対して、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ実験によるＢｃ２８．１コード配列の多型性の解析を行った。地理的かつ遺伝的に離れているＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）野生分離株間のこのコード配列が良く保存されていることと一致して、野外試料を用いたこのような解析により、この報告で述べたもの以外、他の制限パターンは確認されなかった。
【０２０４】
配列決定により、Ｂｃ２８．１コード配列間のこの保存性及び様々な分離株に対する推定タンパク質が確認された。このことから、９６％を越える、様々なコード配列間の相同性（同一性）及びコードされたタンパク質間の相同性が明らかになった。
【実施例２】
【０２０５】
Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２タンパク質の生化学的特性の決定
２．１．  使用技術
２．１．１．  Ｅ．コリにおけるＧＳＴ−Ｂｃ２８．２及びＨｉｓ−Ｂｃ２８．１組み換えタンパク質の発現及び精製
２．１．１．１．  Ｈｉｓタグ付加Ｂｃ２８．１組み換えタンパク質の産生
Ｂｃ２８．１のＮ−末端部分がなく、Ｃ−末端部分にＧＰＩアンカーがある、又はない、２つの組み換えヒスチジンタグ付加Ｂｃ２８．１タンパク質を、それぞれＨｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ（Ｖ１６−Ｖ２５６）及びＨｉｓ−Ｂｃ２８．１（Ｖ１６−Ｋ２３３）と名付けた。Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃタンパク質の場合は変性条件下で、又は、Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１タンパク質の場合は非変性条件下で、製造者の使用説明書（Ｑｉａｇｅｎ）に従い、これらのタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡビーズでアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０２０６】
２．１．１．１．１．  Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ
ＤＮＡテンプレートとしてＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）（分離株Ａ）からのｃＤＮＡライブラリを用いて、Ｎ−末端部分がないＢｃ２８．１Ｃ  ｃＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ全体からのｎｔ  １０４−８６５又は５’ＵＴＲ／Ｒｓｐｅ３ｃセグメントからのｎｔ８３−８４４）をＰＣＲにより増幅した。Ｃａｒｒｅｔら（１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．，２６５，ｐ．１０１５−１０２１）で述べられているようにして、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｒ）ｃＤＮＡ  Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩ（Ｒ）Ｇｏｌｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、このｃＤＮＡライブラリーを構築した。内部で改変したプライマー、３．１ｅｘｐｆｏｒ及び３．１ｅｘｐｒｅｖＣを用いてＰＣＲを行った。これらのプライマーは、それぞれ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有しており、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＱＥ−３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）に、そのプラスミドに存在するＨｉｓタグとインフレームになるように、増幅した配列をクローニングすることができる。次に、０．８％アガロースゲル（電気泳動グレード、Ｅｕｒｏｂｉｏ，Ｆｒａｎｃｅ）に添加して、０．５ｘＴＡＥ（２５ｘＴＡＥ保存溶液、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ、から調製）中、１００Ｖでアガロースゲル電気泳動を行って、ＰＣＲ産物を精製した。所望する産物に対応するバンドをそのゲルから切り出し、ｇｅｌ−ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ゲル抽出）Ｓｐｉｎ  ｋｉｔ（Ｒ）（Ｑ−Ｂｉｏ−Ｇｅｎｅ）を用いて、ゲルのスライスからＤＮＡを単離した。次に、それをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化し、ゲルを再び精製した。室温において、２ｍＭ  ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を添加した１ｘライゲーション緩衝液（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）中でＴ４ＤＮＡライゲース（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて３時間、ライゲーションを行うことにより、脱リン酸化したＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＱＥ−３０ベクターに、得られたフラグメントをライゲーションした。ベクター：インサートの比は、通常は１：３であり、使用した消化済みベクターの量は、０．５μｇから１μｇであった。
【０２０７】
ライゲーション混合液をＪＭ１０９  ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ（Ｒ）Ｅ．コリ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）にトランスフォーメーションした。アンピシリン含有寒天プレートにこれらの細胞を播種し、タンパク質の小規模発現によりＢｃ２８．１Ｃタンパク質の発現についてコロニーを調べ、その組み換えタンパク質（Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ；  ｃＤＮＡ全体からのｎｔ１１８−８３８又は５’ＵＴＲ／Ｒｓｐｅ３Ｃセグメントからのｎｔ  ９８−８１７；Ｖ１６−Ｖ２５６）を変性条件下でのＮｉ−ＮＴＡビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。簡潔に述べると、一晩培養した培養物の１０倍希釈物により、ＬＢ培地中での小規模（５ｍｌ）の細菌培養を開始した。３７℃で振盪させながら２時間インキュベーションした後、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）を添加することにより、組み換えタンパク質発現を誘導した。誘導から３時間後、遠心（１５分間、４０００ｘｇ）により細胞を回収し、変性緩衝液（８Ｍ尿素、１％  ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８）  １ｍｌ中で細胞溶解した。細胞溶解液を、氷上で、２秒間のパルス休止サイクルで、２分間超音波破砕し、遠心（１０分間、１５０００ｘｇ）した。透明化した細胞溶解液を、時折振盪しながら、５０μｌ  Ｎｉ−ＮＴＡアガロースレジン（Ｑｉａｇｅｎ）存在下で、氷上において２０分間インキュベーションした。添加したレジンを洗浄緩衝液（８Ｍ尿素、１％  ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．３）１ｍｌで３回洗浄し、溶出緩衝液（８Ｍ尿素、１％  ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ４．５）でタンパク質を溶出した。１２％  ポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）により染色すること、及び、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたウェスタンブロットを行うことにより、組み換えタンパク質の存否を調べた。
【０２０８】
Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃタンパク質を大規模産生させる前に、Ｂｃ２８．１Ｃ発現について陽性のコロニーを１個選択し、Ｂｃ２８．１Ｃコアが６ｘＨｉｓリンカーと正しくインフレーム融合していることを確認した。
【０２０９】
結論として：振盪させながら３７℃においてＬＢ培地  ２ｍｌ中で一晩インキュベーションすることにより細菌培養物を得て、ＪｅｔＱｕｉｃｋ（Ｒ）ミニプレップキット（Ｑ−Ｂｉｏ−Ｇｅｎｅ）を用いてプラスミドｐＱＥ−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃを単離した。配列決定により、Ｂｃ２８．１Ｃコアが６ｘＨｉｓリンカーと正しくインフレーム融合していることを確かめた。確認後、同じプロトコールを用いて、大規模でＢｃ２８．１Ｃタンパク質を産生させた。
【０２１０】
２．１．１．１．２．  Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１
Ｎ及びＣ末端部分からの欠失があるＢｃ２８．１  ｃＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ全体からのｎｔ  １０４−７８７又は５’ＵＴＲ／Ｒｓｐｅ３Ｃセグメントからのｎｔ８３−７６６）を上述のようにして、内部で改変したプライマー、３．１ｅｘｐｆｏｒ及び３．１ｅｘｐｒｅｖを用いてＰＣＲにより増幅した。これらのプライマーは、それぞれ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有しており、これにより、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＱＥ−３０ベクターに、Ｈｉｓタグとインフレームになるように、増幅配列をクローニングすることができる。
【０２１１】
上述のように、ライゲーション混合液をＥ．コリ細胞にトランスフォーメーションし、細胞を播種し、タンパク質の小規模発現によりＢｃ２８．１タンパク質の発現についてコロニーを調べた。その組み換えタンパク質（Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１；ｃＤＮＡ全体からのｎｔ１１８−７６９又は５’ＵＴＲ／Ｒｓｐｅ３Ｃセグメントからのｎｔ  ８３−７６６；Ｖ１６−Ｖ２３３）を非変性条件下でのＮｉ−ＮＴＡビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。簡潔に述べると、一晩培養した培養物の１０倍希釈物により、ＬＢ培地中での小規模（５ｍｌ）の細菌培養を開始し、３７℃で振盪させながら２時間インキュベーションした後、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）を添加することにより、組み換えタンパク質発現を誘導した。誘導から３時間後、遠心（１５分間、４０００ｘｇ）により細胞を回収し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍｇ/ｍｌ  リゾチーム及び１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＨｉｓｔａｇ細胞溶解緩衝液で再懸濁した。使用するまで細胞溶解液を−８０℃で保存した。凍結融解後、５００Ｕ  ＤＮＡｓｅＩ酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、２０分間氷上でインキュベーションし、次に、その懸濁液を、氷上で、２秒間のパルス休止サイクルで、２分間超音波破砕した。超音波破砕試料を遠心（２０分間、９０００ｘｇ）し、１．２、０．４５及び最後に０．２２μｍフィルター（Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を介して上清を連続的に濾過した。最後に、濾過液をＦＰＬＣ  Ｎｉ２＋  ＨｉＴｒａｐ（Ｒ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分離した。２０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）を添加したＨｉｓｔａｇ細胞溶解緩衝液で添加カラムを洗浄した。２００ｍＭ  イミダゾールを含有するＨｉｓｔａｇ細胞溶解緩衝液で組み換えＢｃ２８．１タンパク質を最終的に溶出した。
【０２１２】
ポリクローナル血清（α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ）（セクション２．１．２．）を作製するために、変性条件下でＨｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃタンパク質を精製し、ウサギに注射し、侵入低下アッセイのためにその抗血清を使用した（実施例４）。
【０２１３】
非変性条件下でＨｉｓ−Ｂｃ２８．１タンパク質を精製し、赤血球結合アッセイに使用した（セクション２．１．４．）。
【０２１４】
２．１．１．２．  ＧＳＴ−タグ付加Ｂｃ２８．２組み換えタンパク質の生成
ＧＳＴとインフレームのＢｃ２８．２コード配列の３’末端部分をサブクローニングすることにより、ＧＳＴ−Ｂｃ２８．２組み換タンパク質を作製した。最初に、部分的なＢｃ２８．２配列を担った組み換えＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクターを制限酵素、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化した（５’ＢａｍＨＩ部位は、ベクター由来であり、３’ＥｃｏＲＩは、プライマー、Ｅ４由来である。）。既に述べたようにして、このＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製し、ゲルから切り出し、ｇｅｌ−ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ゲル抽出）Ｓｐｉｎ  ｋｉｔ（Ｒ）（Ｑ−Ｂｉｏ−Ｇｅｎｅ）を用いて、ゲルのスライスからＤＮＡを単離した。室温において、２ｍＭ  ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を添加した１ｘライゲーション緩衝液（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）中でＴ４ＤＮＡライゲース（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて３時間のライゲーションを行うことにより、脱リン酸化したＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に得られたフラグメントをライゲーションした。ライゲーション混合液をＥ．コリ（大腸菌）ＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）にトランスフォーメーションし、アンピシリン含有寒天プレートにこれらの細胞を播種し、一晩置いた。プライマー、ｐｒ  ３／Ｅ４を用いてＰＣＲにより陽性のコロニーを選択し、ＧＳＴ−Ｂｃ２８．２タンパク質の発現を調べるために、それに対してＩＰＴＧにより誘導を行った。このように、陽性細菌培養物を一晩増殖させ、アンピシリン  ５０μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地で１：１０に希釈した。その培養物を３７℃にて１時間インキュベーションし、次に、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧとともに３時間インキュベーションした。遠心（１５分間、４０００ｘｇ）により細胞を回収し、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＭＴＰＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）中で超音波破砕により溶解した。この組み換えタンパク質を、グルタチオン−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、還元グルタチオンとの競合により、つまり、４５ｍＭ  グルタチオンとともに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を含有する緩衝液中で、溶出した（Ｓｍｉｔｈ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９８８、Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．６７，ｐ．３１−４０）。
【０２１５】
２．１．２．  免疫付与
Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ＆Ｄ．Ｌａｎｅ（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（抗体：実験室マニュアル）“，ＩＳＢＮ  ２９０７５１６１５９）に従い、ＧＳＴ−Ｂｃ２８．２又はＨｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃタンパク質に対して惹起させたポリクローナル抗血清を、マウス又はウサギにおいてそれぞれ作製した。最初の注射では、ウサギ（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ）に対して、Ｆｒｅｕｎｄ（フロイント）の完全アジュバント（ＦＣＡ）（Ｓｉｇｍａ）で乳化した精製Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ組み換えタンパク質  ５０μｇを皮下に免疫付与し、その後の２回の注射では、Ｆｒｅｕｎｄ（フロイント）不完全アジュバント（ＦＩＡ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて筋肉内注射を行った。Ｂａｌｂ／Ｃマウスに対して、最初の注射では、ＦＣＡで乳化させたＧＳＴ−Ｂｃ２８．２  １５μｇを腹腔内に免疫付与し、その後の２回の注射では、ＦＩＡで乳化させたものを用いた。動物の注射は、３週間間隔で行い、各免疫付与から８日後に採血を行った。
【０２１６】
赤血球へのバベシア寄生虫の侵入を低下させるために、ウサギα−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ抗血清を使用した（実施例４参照）。
【０２１７】
２．１．３．  免疫学的方法
２．１．３．１．  イムノブロッティング
Ｄｒａｋｕｌｏｖｓｋｉら（２００３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，ｖｏｌ．７１，ｐ．１０５６−１０６７）で述べられているようにして調製した精製Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）メロゾイトを用いて、イムノブロッティングを行った。次に、電気泳動用にメロゾイトを処理し、１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそのタンパク質を分離した。ポリクローナル血清  α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃの１：１００希釈液を用いて、イムノブロッティングを行った。
【０２１８】
２．１．３．２．  間接的免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）
Ｄｒａｋｕｌｏｖｓｋｉら（前出）で述べられているようにして、ポリクローナル血清  α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃの１：１００希釈液を用いて、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）寄生赤血球（５％  寄生虫血症レベル）においてＩＦＡを行った。蛍光の減衰を抑えるために、Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ（Ｒ）溶液（Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ  Ｌｔｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）でスライドを封入し、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ，Ｚｅｉｓｓ）を用いて蛍光を検出した。
【０２１９】
２．１．３．３．  Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）培養物の［３５Ｓ］−メチオニン又は［３Ｈ］−エタノールアミン放射性標識及び免疫沈降
Ｄｒａｋｕｌｏｖｓｋｉら（前出）で述べられているようにして、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のインビトロ培養物の［３５Ｓ］−メチオニン放射性標識及び免疫沈降実験を行った。簡潔に述べると、５０μＣｉ／ｍｌ（１２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び５％の開始時寄生虫血症レベルで、［３５Ｓ］−メチオニン放射性標識を行った。Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）からの免疫沈降用の使用画分は：放射性標識抗原（１０６ｃｐｍ）のソースとして、トータル、培養上清（ＳＰＡ）、感染赤血球支質、精製メロゾイト、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４水性（可溶性及び親水性抗原）及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４界面活性（不溶性及び疎水性抗原）画分であった。放射性標識成分  ５０μＣｉ／ｍｌ（２５μＣｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び５％の開始時寄生虫血症レベルでＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）からのインビトロ培養物の［３Ｈ］−エタノールアミン放射性標識を行い、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）からの［３Ｈ］−エタノールアミン放射性標識抗原（１０６ｃｐｍ）のソースとして、トータル及びＳＰＡ画分を用いて、免疫沈降実験を行った。
【０２２０】
２．１．３．４．  ＴＸ−１１４処理によるタンパク質相分離
［３５Ｓ］−メチオニン放射性標識メロゾイト及び感染赤血球支質画分からのＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のタンパク質を、Ｐｒｅｃｉｇｏｕｔら（１９９１、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，ｖｏｌ．５９，ｐ．２７９９−２８０５）で述べられているように、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（Ｓｉｇｍａ）中で分相した。
【０２２１】
２．１．４．  赤血球結合アッセイ
非変性条件下で、製造者の使用説明書に従い（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１タンパク質又はＨｉｓ−ＧＳＴ（対照として）１００μｇを精製した。次に、ＰＢＳ  １ｍｌ中のイヌ  赤血球細胞  ５０μｌとともに、室温にて１時間、これらをインキュベーションした。遠心（２分間、２００ｘｇ）により赤血球を回収し、ＰＢＳ  ２００μｌ中で再懸濁した。次に、４００μｌ  シリコーン油クッション（Ａｌｄｒｉｃｈ）上にその懸濁液を重層した。遠心（４分間、３０００ｘｇ）後、その上清及びシリコーン油を捨て、０．５Ｍ  ＰＯ４ＮａＣｌ  ７５μｌで赤血球に結合したタンパク質を溶出した。溶出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、製造者の使用説明書（Ｐｉｅｒｃｅ）に従い、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔを用いて、ウェスタンブロットにおいて、１／２０．０００希釈の抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ）により検出した。
【０２２２】
２．１．５．  Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）感染赤血球の表面に局在する寄生虫性抗原の分析
最初に、既に述べたように、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のインビトロ培養物を［３５Ｓ］−メチオニンで放射性標識した。次に、赤血球を回収し、ＥＺ  ｌｉｎｋ（Ｒ）ｓｕｌｆｏＬＣ  ＮＨＳビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．２中で１Ｍ）の溶液中で、室温にて３０分間、ビオチン化した。次に、ＰＢＳで赤血球を３回洗浄し、ビオチン化した抽出物をシリコーン油クッション（Ａｌｄｒｉｃｈ）上に移し、細胞溶解した赤血球を除去した。遠心（２０分間、７００ｘｇ）後、ペレットからの無傷の赤血球をＰＢＳで洗浄し、細胞溶解し、Ｄｒａｋｕｌｏｖｓｋｉら（前出）で述べられているようにして、免疫沈降実験用に処理した。既に述べたように、α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ抗血清を用いて、又はワクチン接種／攻撃感染血清を用いて、免疫沈降を行った。ＳＰＡでイヌに３回のワクチン接種を行い、次に同種攻撃感染を行うことにより、これらのワクチン接種／攻撃感染血清を生成させた。Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）分離株Ａ（α−Ａ）、分離株Ｂ（α−Ｂ）及びＢ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）分離株Ｆ（α−Ｆ）寄生虫に対して、このような血清を生成させた。対応する免疫前のイヌ血清もまた、ネガティブコントロールとして試験に供した。次に、免疫沈降実験の検出のために処理するのではなく、免疫沈降させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そのゲルをニトロセルロース膜にブロットした。次に、１／２０００希釈のストレプトアビジン−ＰＯＤコンポーネント（Ｒｏｃｈｅ）とともにその膜をインキュベーションし、製造者の使用説明書に従い（Ｐｉｅｒｃｅ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（Ｒ）  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔを用いることにより、赤血球表面からのビオチン化タンパク質を検出した。赤血球表面からの全体のビオチン化タンパク質を明らかにした後、ビオチン化タンパク質の寄生虫起源を確認するために、ウェスタンブロットに対して、Ｂｉｏｍａｘ  ＭＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ）上でオートラジオグラフィーを行った。
【０２２３】
２．１．５．１．  赤血球−膜結合の強さの測定
α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ抗血清により免疫沈降させたＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）からの潜在的な表面抗原が、真の表面に統合された抗原であるというのではなく、赤血球表面に接着して離れられないだけであるかどうかを分析するための試験において、感染した赤血球表面とのそれらの相互作用の強さを評価した。既に述べたように、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のインビトロ培養からの赤血球を放射性標識し、ビオチン化し、シリコーン油クッションを通過させた。無傷の赤血球を回収し、０．５Ｍから２Ｍの様々な濃度のＮａＣｌ  等量と室温にて２分間インキュベーションした。次に、α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ又は対照としての免疫前ウサギ血清を用いて、溶出物をウェスタンブロットにおいて分析した。
【０２２４】
２．２．  結果
２．２．１．  Ｂｃ２８．２タンパク質の生化学的特性の決定
５０４ｂｐ  Ｂｃ２８．２クローンをｐＧＥＸベクターにクローニングし、３５ｋＤａ前後の精製ＧＳＴ−Ｂｃ２８．２組み換えタンパク質（図１０、Ａ）を得て、マウスにおいてポリクローナル抗体を産生させるために使用した。このα−ＧＳＴ−Ｂｃ２８．２血清は、免疫沈降において、トータル画分の４５ｋＤａタンパク質と弱いが特異的に反応する（図１０、Ｂ、レーン３、星印で示す。）。この４５ｋＤａタンパク質はまた、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のメロゾイト画分において血清により検出されるが、支質及びＳＰＡ画分においては検出されない（データを示さず。）。対照として、無関係の抗−ＧＳＴＢｉｃｖｉｒ１５は、その１５ｋＤａタンパク質とのみ反応性があったが（図１０、Ｂ、レーン１）、免疫前血清はネガティブであった（図１０、Ｂ、レーン２及び５）。α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃにより免疫沈降された２８／２６ｋＤａの２つのタンパク質は、α−ＧＳＴ−Ｂｃ２８．２血清では全く免疫沈降されなかった。Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株Ｂで同様の結果が得られた。
【０２２５】
結論として：α−ＧＳＴ−Ｂｃ２８．２血清は、４５ｋＤａタンパク質とは反応するが、α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清で認識される２８／２６ｋＤａの２つのタンパク質とは反応しない。
【０２２６】
２．２．２．  Ｂｃ２８．１タンパク質の生化学的特性の決定
それぞれＨｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ（Ｖ１６−Ｖ２５６）及びＨｉｓ−Ｂｃ２８．１（Ｖ１６−Ｋ２３３）と名付けた、Ｂｃ２８．１のＮ−末端部分がなく、Ｃ−末端部分のＧＰＩアンカーがある、又はない、２つの組み換えヒスチジンタグ付加Ｂｃ２８．１タンパク質を精製した（図１２）。Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃタンパク質を変性条件下で精製し、ポリクローナル血清（α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ）を産生させるために、ウサギに注射した。Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１タンパク質を非変性条件下で精製し、赤血球結合アッセイに使用した（セクション２．１．４．）。
【０２２７】
２．２．２．１．  Ｂｃ２８．１タンパク質は、ＧＰＩアンカータンパク質である。
【０２２８】
２８ｋＤａの１個の３Ｈ標識タンパク質がα−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清で特異的に免疫沈降されたので、［３Ｈ］−エタノールアミンを用いたＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）細胞溶解液の代謝標識により、Ｂｃ２８．１産物の疎水性Ｃ−末端ペプチドのＧＰＩの性質が確認された（図１３、Ｃ、レーン２）。免疫前血清は反応性がなかった（図１３、Ｃ、レーン１）。
【０２２９】
２．２．３．  免疫沈降アッセイにおけるα−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清の反応性
２．２．３．１．  トータル抗原及び可溶性寄生虫抗原（ＳＰＡ）における反応性
α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清により、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のトータル画分において、２８／２６ｋＤａの２つのタンパク質が認識されたが、上清、つまりＳＰＡ画分においては２６ｋＤａタンパク質のみが検出された（図１２、Ａ、レーン２）。さらに、この２８／２６ｋＤａの２つのタンパク質は、抗−Ａワクチン接種／攻撃感染血清により特異的に認識されたタンパク質と対応した（図１３、Ａ、レーン３）。ウサギ又はイヌの免疫前血清は反応性がなかった（図１３、Ａ、それぞれレーン１及び４）。
【０２３０】
２．２．３．２．  分画化した抗原の反応性
［３５Ｓ］−メチオニン放射性標識した寄生赤血球細胞をストレプトリジンで細胞溶解した。その試料を遠心し、上清（赤血球支質画分）を回収した。ペレット（ゴーストと混ざったメロゾイト）をＰｅｒｃｏｌｌ勾配を介して処理し、精製放射性標識メロゾイト濃度が高い画分（メロゾイト画分）を回収した。メロゾイト及び感染赤血球支質画分の１部をＴＸ−１１４におけるタンパク質の相分離に使用した。Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の放射性標識抗原のソースとして、赤血球支質及びメロゾイト画分、及び、それらの対応するＴＸ−１１４水性（可溶性抗原、Ａｑで示す。）及び界面活性（不溶性抗原、Ｄｅｔ．で示す。）画分を用いて、α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清による免疫沈降実験を行った（図１３、Ｂ）。
【０２３１】
これにより、α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清（図１３、Ｂ、レーン２）がメロゾイト画分の２８ｋＤａ抗原を検出すること、及びこのタンパク質が界面活性相に存在することが示され、このことから、それが不溶性抗原であることが示唆される（図１３、Ｂ、レーンＤｅｔ．）。一方、２６ｋＤａ抗原は、感染赤血球の支質で検出され、このタンパク質が水相に存在することから、それが可溶性タンパク質であることが示唆される（図１３、Ｂ、レーンＡｑ．）。
【０２３２】
分離株Ｂを用いて同様の結果が得られた（データを示さず。）。
【０２３３】
２．２．４．  免疫蛍光アッセイによるＢｃ２８．１タンパク質の位置決定
Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株Ａからの、固定した感染赤血球におけるα−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清の蛍光パターン（図１３、Ｄ）から、メロゾイト表面の標識が示される（写真ＩＩ、矢印で示す。）。さらに、感染赤血球の支質に存在する小胞の強い標識も得られた（写真Ｉ、４個が集まった形において矢印で示す。）。
【０２３４】
２．２．５．  Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）抗血清によるＢｃ２８．１の認識
最初にＴＸ−１１４で疎水性（界面活性剤：Ｄｅｔ．）相及び親水性（水性：Ａｑ．）相に分離しておいた、［３５Ｓ］標識Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）分離株Ｂのトータル抗原の免疫沈降において、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）分離株Ｆに対するワクチン接種／攻撃感染血清を使用した。この異種抗血清により、疎水性相においてＢｃ２８．１の２８ｋＤａ型が沈降し、親水性相において２６及び２８ｋＤａ型の両方が沈降し（図１１、レーン３及び７）、見えるものは全て、３０ｋＤａを示すマーカーバンド位置のすぐ下であった。ポジティブ及びネガティブ対照抗血清を含む。
【０２３５】
２．２．６．  Ｂｃ２８．１タンパク質は赤血球に結合する。
【０２３６】
赤血球結合アッセイを行うことにより、感染赤血球表面へのＢｃ２８．１タンパク質の結合能を調べた（図１４、Ａ）。図１４（Ａ、レーン２）で示すように、抗−Ｈｉｓモノクローナル抗体によりウェスタンブロットにおいてＨｉｓ−Ｂｃ２８．１タンパク質が検出され、そのことから、このタンパク質がイヌ赤血球に結合可能であることが示された。対照として、無関係のＨｉｓ−ＧＳＴを用いて試験を行った場合、反応性は見られなかった（図１４、Ａ、レーン１）。
【０２３７】
２．２．７．  Ｂｃ２８．１タンパク質は赤血球表面抗原である。
【０２３８】
Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）（分離株Ａ）のインビトロ培養の［３５Ｓ］−メチオニン放射線標識から得られたビオチン化した無傷の赤血球を細胞溶解し、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株Ａに対するワクチン接種／攻撃感染血清（α−Ａ）、又はα−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ抗血清、及びそれらの対応する免疫前血清を用いた免疫沈降実験用に処理した。免疫沈降させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そのゲルをニトロセルロース膜にブロットし、赤血球表面からのビオチン化タンパク質を検出した（図１４、Ｂ、ＩＩ）。赤血球細胞表面からの全体のビオチン化タンパク質を検出した後、ビオチン化タンパク質の寄生虫起源を確かめるためにウェスタンブロットをオートラジオグラフィーに供した（図１４、Ｂ、Ｉ）。α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ抗血清が２８／２６ｋＤａの２つのタンパク質を免疫沈降させた（図１４、Ｂ、Ｉ、レーン２）一方で、この実験では、２８ｋＤａタンパク質のみがビオチン化されたことが示され（図１４、Ｂ、ＩＩ、レーン２）、このことから、２つのタンパク質のうち２８ｋＤａタンパク質がＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の組み込まれた表面赤血球抗原であることが示される。このビオチン化２８ｋＤａタンパク質はまた、α−Ａ血清により免疫沈降された（図１４、Ｂ、ＩＩ、レーン３）。免疫前血清は陰性であった（図１４、Ｂ、レーン１及び４）。
【０２３９】
２．２．７．１．  赤血球−膜結合の強さの測定
α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ抗血清により免疫沈降されたＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）からの２８．１表面抗原が、それと会合しているというより、赤血球表面に接着しているだけであるかどうかを分析するための試験において、感染した赤血球表面とのそれらの相互作用の強さを評価した。
【０２４０】
放射性標識及びビオチン化した無傷の赤血球を、０．５Ｍから２Ｍの様々な濃度のＮａＣｌ溶液で処理した。これにより、２Ｍ濃度のＮａＣｌの場合でさえも、２８ｋＤａタンパク質が赤血球表面から溶出されないことが示された。このことから、それがＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の真の表面に組み込まれた抗原であることが証明される。
【０２４１】
結論として：Ｂｃ２８．１タンパク質の生化学的特性の決定により、α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清が２８／２６ｋＤの２つのタンパク質を認識することが明らかとなった。
【０２４２】
２８及び２６ｋＤａタンパク質両方が、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）に感染したイヌの免疫血清により認識され、このことから、それらが、バベシア科感染に対する組み換えワクチンの優れた候補であることが示唆される。
【０２４３】
このデータは、２８ｋＤａがＧＰＩアンカーの付いた不溶性タンパク質であることを示唆する。このタンパク質は、メロゾイト及び感染赤血球の表面に会合する。２６ｋＤａタンパク質は、感染赤血球及び上清画分で同定された可溶性寄生虫抗原（ＳＰＡ）である。分泌タンパク質としての２６ｋＤａタンパク質の特性は、Ｂｃ２８．１タンパク質のＮ−末端部分に切断ペプチドシグナルが存在すること、及び、ＩＦＡで検出されたように、赤血球支質中の小胞において存在することと一致する。
【０２４４】
第一に、このデータから、Ｂｃ２８．１タンパク質が赤血球に結合することが示唆され、これにより、赤血球表面からのリガンドとこのタンパク質が相互作用することが示唆される。２８ｋＤａ産物がメロゾイト表面と会合することが示されたので、その赤血球の感染にこの２８ｋＤａタンパク質が関与することが示唆される。
【０２４５】
第二に、このデータから、２８ｋＤａ型が表面局在抗原であるということも示される。この分析はまた、感染赤血球の表面に付着した可溶性抗原も検出し得る。しかし、無傷の赤血球をＮａＣｌの２Ｍ溶液で処理することによりＢｃ２８．１タンパク質を溶出することができないこと、及び検出されたビオチン化表面抗原が２８ｋＤａタンパク質（つまり、可溶性抗原ではない型）であることから、この２８ｋＤａタンパク質が感染赤血球の外膜に強く会合していることが証明される。これは、（感染）赤血球の結合及び凝集におけるこのタンパク質の機能を示す。実際に、感染赤血球の凝集は、既に、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）について記載されている（Ｓｃｈｅｔｔｅｒｓら、１９９７、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１１５，ｐ．４８５−４９３）。このように、生物の免疫系にさらされることなく、寄生虫が新しい赤血球に感染することを可能にする凝集体を形成するために、感染赤血球の表面に存在する２８ｋＤａタンパク質は（感染）赤血球成分と結合する。
【０２４６】
これらのデータから推定されるＢｃ２８．１タンパク質の２８ｋＤａ型の２つの機能（つまり、侵入及び凝集）から、このタンパク質が寄生虫の生存に非常に重要な役割を果たすことが示唆される。実際に、これらの２つのメカニズムは、寄生虫にとって宿主の免疫系から逃れるために不可欠である。
【実施例３】
【０２４７】
Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２タンパク質サブユニットワクチンを用いたワクチン接種
３．１．  使用技術
３．１．１．  動物
雄及び雌のイヌ、例えば６ヶ月齢のビーグル、を適切な施設で飼育する。無作為割り当てに基づき、適切な大きさのいくつかの群に分ける。開始前、実験中数回、血液試料を採取する。これらの動物の全般的健康を定期的に調べる。
【０２４８】
３．１．２．  ワクチン
例えば、バキュロウイルス発現ベクター系又はＲｏｃｈｅインビトロ発現系において、Ｂｃ２８．１及び／又はＢｃ２８．２タンパク質を産生させる。ウェスタンブロットによりタンパク質の特性を調べ、好ましくはＥｌｉｓａにより定量し、好ましくはＱｕｉｌ  Ａを用いて処方する。
【０２４９】
３．１．３．  ワクチン接種
約３週間の間隔で、２回、イヌに、ワクチンの単回投与を行う。注射は皮下に行う。
【０２５０】
１週間間隔で血液試料を採取し、好ましくはＥｌｉｓａにより血液分析を行うために、血清を調製する。
【０２５１】
２回目のワクチン接種から約２週間後に、生きているＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）寄生虫の適量を用いて攻撃感染を行う。
【０２５２】
攻撃感染から１４日間、感染の臨床徴候について動物を監視する。行動、脾臓の大きさ、リンパ節の大きさ、口腔及び眼瞼の粘膜の色及び毛細血管再充満時間に特に注意を払う。Ｓｃｈｅｔｔｅｒｓら、１９９４（Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，ｖｏｌ．５２，ｐ．２１９−２３３）に記載されているように数値として臨床スコアを表す。
【０２５３】
攻撃感染の観察期間中、クエン酸処理血液から毎日血液塗抹標本を調製し、これらを染色し、寄生虫感染赤血球数を数える。ヘマトクリット測定も毎日行う。
【０２５４】
攻撃感染から１４日後に、感染を治療するために、イヌに対してＣａｒｂｅｓｉａ（Ｒ）による化学療法治療を行う。
【実施例４】
【０２５５】
特異的抗体を用いた、バベシア寄生虫による赤血球への侵入の低下
Ｂｃ２８．１タンパク質に特異的な抗体がバベシア寄生虫の赤血球への侵入を顕著に低下させる能力を証明するために、ウサギポリクローナル抗血清を使用した。
【０２５６】
４．１  使用技術
（Ｓｃｈｅｔｔｅｒｓら、１９９４、前出）で述べられているようにして、イヌ赤血球における標準的バベシア培養を行った。α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ抗血清は、上述のようにして作製した（セクション２．１．２．）。その同じ実験において、Ｂｃ２８．１タンパク質と反応しないウサギ免疫前血清を得た（図１３参照）。これらの血清を、次のスキームで、純粋なまま、又は１：１に混合して、バベシア寄生虫培養物に添加した：
血清試料ｎｒ  １：純粋なα−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ抗血清
血清試料ｎｒ  ２：α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ抗血清と免疫前血清とを１：１混合
血清試料ｎｒ  ３：純粋な免疫前血清。
【０２５７】
懸濁培養物には、その１％がＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシア  キャニス）寄生虫に感染している、１％（ｖ／ｖ）イヌ赤血球細胞が含有されていた。
【０２５８】
このような懸濁培養物の三重測定検体に対して、血清試料１：１０体積を添加し（培養物１．４４ｍｌに１６０μｌ血清（−ｍｉｘ））、その結果、培養物中の特異的α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ抗血清の最終量が１０、５又は０％  ｖ／ｖとなった。
【０２５９】
血清が入った培養物を一晩インキュベーションし、その後、血液塗抹標本を調製し、顕微鏡により寄生虫が感染した赤血球を数えて、寄生虫血症レベルを測定した。
【０２６０】
４．２．  結果
寄生虫侵入低下アッセイの結果を表６に示し、図１５のグラフに表す。この結果から、非特異的（免疫前）ウサギ血清のみが添加された培養物と比較して、α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ抗血清を含有する赤血球−培養物における寄生虫血症レベルが顕著に低下したことが明らかである。侵入低下は、２５％に達し、寄生虫感染赤血球のレベルは、２８％から２１％に低下した。
【０２６１】
α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清の１：１希釈試料でさえも、同じレベルの侵入低下が効果的に達成された（表６参照）。
【０２６２】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０２６３】
【図１】Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２タンパク質のアミノ酸アライメント。  星印でこの２つの配列間の同一性を、１個の点又は２個の点で相同性を示す。Ｂｃ２８．２について、Ｎ−末端部分に位置するシグナルペプチド、及びＢｃ２８．１に対して、Ｃ−末端部分に位置するシグナルペプチド及びＧＰＩアンカーを太字で示す。それらの切断部位は、縦の矢印で示す。
【図２】地理的かつ遺伝的に離れているＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）野生分離株からのＢｃ２８．１タンパク質のアミノ酸アライメント。  星印で様々な配列間の同一性を、１個の点又は２個の点で相同性を示す。Ｂｃ２８．１タンパク質のＮ−末端部分に位置するシグナルペプチド、及びＣ−末端部分に位置するＧＰＩアンカーを太字で示す。
【図３−１】本発明によるＢｃ２８．１及びＢｃ２８．２タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列アライメント。  星印でこの２つの配列間の同一性を示す。Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２配列に対する開始及び終止コドンの位置を示す；対応するヌクレオチドを太字で示す。Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２配列由来のプライマーの位置及び５’−３’方向は、矢印及び太字で示す；ｐｒ３に対しては、短い部分しか一致していない。
【図３−２】本発明によるＢｃ２８．１及びＢｃ２８．２タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列アライメント。  星印でこの２つの配列間の同一性を示す。Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２配列に対する開始及び終止コドンの位置を示す；対応するヌクレオチドを太字で示す。Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２配列由来のプライマーの位置及び５’−３’方向は、矢印及び太字で示す；ｐｒ３に対しては、短い部分しか一致していない。
【図４−１】地理的かつ遺伝的に離れているＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）野生分離株からのＢｃ２８．１タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列アライメント。  星印でこの２つの配列間の同一性を示す。Ｂｃ２８．１配列のそれぞれに対する開始及び終止コドンの位置を示し、太字で記す。プライマーの位置及び５’−３’方向は、矢印で示す。
【図４−２】地理的かつ遺伝的に離れているＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）野生分離株からのＢｃ２８．１タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列アライメント。  星印でこの２つの配列間の同一性を示す。Ｂｃ２８．１配列のそれぞれに対する開始及び終止コドンの位置を示し、太字で記す。プライマーの位置及び５’−３’方向は、矢印で示す。
【図４−３】地理的かつ遺伝的に離れているＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）野生分離株からのＢｃ２８．１タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列アライメント。  星印でこの２つの配列間の同一性を示す。Ｂｃ２８．１配列のそれぞれに対する開始及び終止コドンの位置を示し、太字で記す。プライマーの位置及び５’−３’方向は、矢印で示す。
【図５】Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）からの部分的Ｂｃ２８．２ゲノムＤＮＡフラグメントの同定。  Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株ＡからのゲノムＤＮＡにおいてプライマーカップル  ｐｒ３及びＥ４を用いて、ＰＣＲにより、Ｂｃ２８．２ゲノムＤＮＡフラグメントを単離した（レーン１）。ネガティブ対照として、プライマーｐｒ３及びＥ４のそれぞれも試験した（それぞれレーン２及び３）。
【図６】Ｂｃ２８．１及び潜在的な２８．２コード配列それぞれに対する、リバースプライマー、Ｒｓｐｅ３Ｃ及びＲｓｐｅ３Ｇの特異性の分析。  ＤＮＡテンプレートとしてＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のＡ８  生物学的クローンを用いて、ＰＣＲを行った。フォワードプライマー  Ｃｏｎｓ３．１（Ａ）又はフォワードプライマー  Ｆｓｐｅ３（Ｂ）を用いたＰＣＲ反応においてそれらを使用することにより、Ｂｃ２８．１コード配列に対するリバースプライマーＲｓｐｅ３Ｃ（Ｉ）の特異性及び潜在的Ｂｃ２８．２コード配列に対するリバースプライマーＲｓｐｅ３Ｇ（ＩＩ）の特異性を試験した。次に、これらのＰＣＲ反応から得られたアンプリマー（レーンＰＣＲ）を制限酵素  ＨｉｎｆＩ（Ｈ）又はＭｓｔＩ（Ｍ）で消化した。（Ｃ）Ｂｃ２８．１コード配列、部分的ゲノムフラグメント  Ｂｃ２８．２及びＢｃ２８．２のコード配列の推定制限マップの概略スキーム。
【図７】ハイブリダイゼーション実験によるＢｃ２８多重遺伝子族の分子同定。  Ｂｃ２８．１  ｃＤＮＡ配列からのＰＣＲフラグメント  ＦＳｐｅ３/Ｒｓｐｅ４をハイブリダイゼーション実験のプローブとして使用した。（Ａ）制限酵素ＸｂａＩ（レーン１）、ＸｈｏＩ（レーン２）、ＲｓａＩ（レーン３）、ＮｏｔＩ（レーン４）及びＥｃｏＲＩ（レーン５）で消化した、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株ＡからのゲノムＤＮＡのサザンブロット。（Ｂ）Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株ＡからのトータルＲＮＡのノーザンブロット。（Ｃ及びＤ）Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株Ａ及びＢの全体（Ｃ）又はＮｏｔＩ消化（Ｄ）染色体のＰＦＧＥ分離。（Ｉ）ゲルの臭化エチジウム染色。（ＩＩ）Ｂｃ２８．１プローブとハイブリダイゼーションさせた対応するゲル。
【図８】Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列の比較制限マップの概略スキーム。  （Ａ）Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）からの生物学的クローンＡ８内のＢｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列自身の間の、Ｂｃ２８．１及びＢｃ２８．２コード配列の比較制限マップ。（Ｂ）地理的かつ遺伝的に離れているＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）野生分離株間のＢｃ２８．１コード配列の比較制限マップ。（Ｃ）地理的かつ遺伝的に離れているＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）野生分離株からの潜在的Ｂｃ２８．２コード配列の比較制限マップ。これらの制限マップは、ＡｌｕＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｆＩ、ＭｂｏＩ及びＭｓｐＩによるＤＮＡ消化に基づき作成した。
【図９】Ｂｃ２８．１タンパク質の予想疎水性プロファイル。  予想Ｎ−末端シグナルペプチド及びＣ−末端ＧＰＩアンカーをボックスで囲う。
【図１０】Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）のＢｃ２８．２コード配列によりコードされるタンパク質の同定。  （Ａ）精製したＧＳＴ−Ｂｃ２８．２組み換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）（分離株Ａ）のインビトロ培養の［３５Ｓ］−メチオニン放射性標識のトータル画分からのタンパク質抽出物におけるα−ＧＳＴ−Ｂｃ２８．２の反応性。免疫α−ＧＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５（レーン１）、免疫前α−ＧＳＴ−Ｂｃ２８．２（レーン２）、免疫α−ＧＳＴ−Ｂｃ２８．２（レーン３）、免疫α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ（レーン４）、免疫前α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ（レーン５）及び免疫α−Ｈｉｓ−Ｂｄ３７（レーン６）血清を用いて免疫沈降を行った。
【図１１】Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の親水性及び疎水性タンパク質の免疫沈降。  Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）分離株Ｂのトータル、標識（Ａｑ．）及び界面活性分離（Ｄｅｔ．）抗原を、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）分離株Ａに対するワクチン接種／攻撃感染血清（α−Ａ、レーン１及び５）、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）分離株Ｂに対する免疫血清（α−Ｂ、レーン２及び６）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（Ｂ．ロッシ）分離株Ｆに対するワクチン接種／攻撃感染血清（α−Ｆ、レーン３及び７）又は非感染イヌ血清（Ｎ、レーン４及び８）を用いて免疫沈降させた。
【図１２】組み換えＨｉｓ−Ｂｃ２８．１タンパク質の精製。  精製組み換えＨｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ及びＨｉｓ−Ｂｃ２８．１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃタンパク質を変性条件下で精製し、一方、Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１タンパク質を非変性条件下で精製した。
【図１３−１】Ｂｃ２８．１タンパク質の生化学的特性決定。  Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）（分離株Ａ）からの、［３５Ｓ］−メチオニン（Ａ及びＢ）又は［３Ｈ］−エタノールアミン（Ｃ）放射性標識抗原の免疫沈降実験。免疫前α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清（レーン１）、免疫α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清（レーン２）、免疫α−Ａ（Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株Ａを用いてワクチン接種／攻撃感染を行ったイヌ由来。）血清（レーン３）及び免疫前α−Ａ血清（レーン４）を用いて、免疫沈降を行った。免疫α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清を用いて、メロゾイト及び支質画分からの、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１１４不溶性（Ｄｅｔ．）及び可溶性（Ａｑ．）抗原を免疫沈降させた。（Ｄ）免疫蛍光アッセイによるＢｃ２８．１タンパク質の位置。矢印はそれぞれ、感染赤血球の支質内（写真Ｉ）及びメロゾイトの表面（写真ＩＩ）の小胞の標識を示す。
【図１３−２】Ｂｃ２８．１タンパク質の生化学的特性決定。  Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）（分離株Ａ）からの、［３５Ｓ］−メチオニン（Ａ及びＢ）又は［３Ｈ］−エタノールアミン（Ｃ）放射性標識抗原の免疫沈降実験。免疫前α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清（レーン１）、免疫α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清（レーン２）、免疫α−Ａ（Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株Ａを用いてワクチン接種／攻撃感染を行ったイヌ由来。）血清（レーン３）及び免疫前α−Ａ血清（レーン４）を用いて、免疫沈降を行った。免疫α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清を用いて、メロゾイト及び支質画分からの、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１１４不溶性（Ｄｅｔ．）及び可溶性（Ａｑ．）抗原を免疫沈降させた。（Ｄ）免疫蛍光アッセイによるＢｃ２８．１タンパク質の位置。矢印はそれぞれ、感染赤血球の支質内（写真Ｉ）及びメロゾイトの表面（写真ＩＩ）の小胞の標識を示す。
【図１４】Ｂｃ２８．１タンパク質の赤血球結合特性及びＢ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の表面赤血球局在抗原の分析  精製Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１タンパク質（レーン２）又はＨｉｓ−ＧＳＴ（レーン１）  １００μｇを用いて、これらをイヌ赤血球とインキュベーションし、赤血球結合アッセイを行った。ウェスタンブロットにおいて、１／２０．０００希釈した抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ）により、各タンパク質の赤血球成分への結合能を明らかにした。（Ｂ）α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清（レーン１）、免疫α−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ血清（レーン２）、免疫α−Ａ（Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株Ａを用いてワクチン接種／攻撃感染を行ったイヌ由来。）血清（レーン３）及び免疫前α−Ａ血清（レーン４）を用いて、免疫沈降実験により、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）感染赤血球の表面上に局在する寄生虫抗原を分析した。簡潔に述べると、ビオチン化及び［３５Ｓ］−メチオニン放射性標識した無傷の赤血球を細胞溶解し、Ｂ．ｃａｎｉｓ（Ｂ．キャニス）の分離株Ａに対するワクチン接種／攻撃感染血清（α−Ａ）又はα−Ｈｉｓ−Ｂｃ２８．１Ｃ抗血清及びそれらの対応する免疫前血清を用いた免疫沈降実験を行うために処理した。免疫沈降させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そのゲルをニトロセルロース膜にブロットし、赤血球表面からのビオチン化タンパク質を明らかにした（ＩＩ）。赤血球細胞表面からの全体のビオチン化タンパク質を明らかにした後、ビオチン化タンパク質の寄生虫起源を確認するために、ウェスタンブロットをオートラジオグラフィーに供した（Ｉ）。
【図１５】寄生虫侵入低下アッセイの結果  赤血球におけるＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（バベシアキャニス）寄生虫の培養物を、タンパク質Ｈｉｓ−２８．１Ｃに対して特異的なポリクローナルウサギ抗血清の様々な量とともに、インキュベーションを行うか、又は行わなかった。顕微鏡により寄生虫感染赤血球の相対数を数えることにより寄生虫血症に対して得られた効果を調べた。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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