【事件の表示】
　特許第３０１６３９８号「喘息治療剤」の請求項１ないし４に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０１６３９８号の請求項１ないし４に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　特許第３０１６３９８号に係る発明についての出願は、平成３年５月１７日（パリ条約による優先権主張、平成２年５月１８日、日本）を国際出願日とする特許出願であって、平成１１年１２月２４日にその発明について特許の設定登録がなされ、その後、その特許について、ブリタニア　ファマシュウティカルス　リミテッドより特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１３年２月６日に訂正請求がなされたものである。
　　　
２．訂正の適否についての判断
(ａ)訂正の内容
　特許請求の範囲の請求項１の
「肺表面活性物質（ＰＳＦ）を有効成分とする喘息治療剤。」を
「人の喘息治療のため喘息発作の発現後に使用する肺表面活性物質（ＰＳＦ）を有効成分とする喘息治療剤。」
と訂正するものである。
　　　　
(ｂ)訂正の目的の適否、拡張・変更の存否、及び新規事項の追加の有無　　
　上記訂正は、願書に添付した明細書（以下、特許明細書という。）の［用法・用量］の項に「喘息の発現前後気道内に注入または噴霧させる」と記載されているように、請求項１の「喘息治療剤」の用途は喘息の発現の前後での投与、つまり、喘息発作の予防及び治療を包含するのに対して、「人の喘息治療のため喘息発作の発現後に使用する……喘息治療剤」と喘息発作の治療に限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当し、特許明細書に記載された範囲内のものである。
　また、この訂正は実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものでもない。
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する第１２６条第２〜３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　　　　
３．特許異議申立についての判断　
イ、本件特許発明
　本件請求項１〜４に係る発明（以下、本件発明という。）は、訂正された特許明細書の記載からみて、特許請求の範囲に記載されたとおりの
「１．人の喘息治療のため喘息発作の発現後に使用する肺表面活性物質(ＰＳＦ)を有効成分とする喘息治療剤。
２．肺表面活性物質（ＰＳＦ）が全体としてリン脂質を４０重量％以上含有する肺表面活性物質（ＰＳＦ）である請求項１の喘息治療剤。
３．リン脂質の主要成分がホスファチジルコリン又はコリンホスホグリセリドである請求項２の喘息治療剤。
４．肺表面活性物質（ＰＳＦ）がサーファクタントＴＡ、サーファクタントＣＬ、合成サーファクタントＸ１、合成サーファクタントＸ２、サーファクタントＣＫ、アルビオファクト、アレック又は１０ml中に１０８mgのジパルミトイルフォスファチジルコリン（dipalmitoylphosphatidylcholine）、１２mgのセチルアルコール（cetyl alcohol）、８mgのチロキサポール（tyloxapol）及び４７mgの塩化ナトリウムが含まれている合成肺表面活性物質のいずれかである請求項１の喘息治療剤。」
と認められる。
　　　　
ロ、異議申立の概要
　異議申立人は、甲第１号証(Biomed. Biochim. Acta 44(1985) 9, K 57-K 61)、甲第２号証（Colloids and Surfaces, 10 (1984) 337-341）、甲第３号証（ヨーロッパ特許出願公開第0119056号明細書(1984)）、甲第４号証（L. Ekelund, et al,゛Surfactant and the Respiratory Tract″ Elsevier Science Publishers,(1989), p273−281）、甲第５号証（米国特許第4,828,844号明細書(1989)）及び甲第６号証（ヨーロッパ特許出願公開第0110498号明細書 (1984)）を提出して、本件請求項１〜３に係る発明は甲第１号証又は甲第４号証に記載された発明であり、また、甲第１〜６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることできたものであり、請求項４に係る発明は甲第１〜４号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第１項第３号又は同法第２９条第２項の規定に違反してされたものであるので、特許法第１１３条第１項第２号の規定により取り消されるべきであると主張している。
　　　　　　
ハ、証拠記載の発明  
　甲第１号証は、吸入されたアレルゲンによる気管支内のマスト細胞及び大食細胞の刺激はアレルギー性気管支喘息に重要な役割を演じていること、天然の表面活性物質が、気管内卵白アルブミン投与後の人工的に換気された卵白アルブミン感作モルモットにおける気管支収縮を減少させることが見出された（K 57の要約の項）こと、モルモットを、0.5mlの食塩水中100μgの卵白アルブミン及び100mgの水酸化アルミニウムの腹腔内注射により実験の３週間前に感作させ、実験の当日に動物のランダムなグループを、天然肺表面活性物質或いは溶媒のいずれかで気管の点滴注入により前処理し、前処理５分後、動物に卵白アルブミンを気管内に施すと、全ての表面処理物質前処理動物は気管支収縮から回復したが、コントロールの動物では９匹中３匹が死んだこと(K 58の10行〜K 59の18行)、及び、天然表面活性物質のような表面活性物質は、肺および気管支におけるレセプター媒介アレルギー反応に対して保護的であり、この機構は気管支のマスト細胞及び大食細胞の細胞表面レセプターが表面活性物質で被覆されることである（K 59の20〜22行）ことが記載されている。
　甲第４号証には、表面活性物質欠乏は多くの呼吸気管支の収縮の原因であると推測できること（278頁)、喘息に対して典型的ないくつかの兆候および症候群は表面活性物質の欠乏によるものと推測できること、及び良好な喘息動物モデルでは、アレルゲンの露出に先立って気道に表面活性物質を投与することによって攻撃を防ぐことが可能であるかどうかが分かるだろう(第280頁下から4行乃至末行)と記載されている。
　甲第２号証、甲第３号証甲第５号証又は甲第６号証には、天然又は合成の表面活性物質（肺表面活性物質）は、殆ど全部がリン脂質からなり、DPPCが特にリッチな成分であること、肺表面活性物質は、肺表面活性物質の分散液を気管および肺に投与することによって呼吸窮迫症候群の治療に用いられることが記載されている。
　　　　
ニ、対比・判断
　甲第１号証に記載されている事項を総合すると、アレルギー性気管支喘息はアレルギー反応により気管支が収縮する疾患であるから、アレルギー性気管支喘息のような抗原により誘発される直接的な気管支応答において、抗原である卵白アルブミンを気管内に施す前に天然肺表面活性物質により予め気管内に点滴注入処理しておくと、天然肺表面活性物質のような表面活性物質は、気管支のマスト細胞及び大食細胞の細胞表面レセプターが表面活性物質で被覆されて肺および気管支におけるレセプター媒介アレルギー反応に対して保護的であることが記載されているものと認められる。
　また、甲第４号証には、喘息は表面活性物質の欠乏によるものと推測でき、アレルゲンの露出に先立って気道に表面活性物質を投与することによって攻撃を防ぐことができるであろうということが記載されているものと認められる。
　甲第１号証の抗原である卵白アルブミンを気管内に施す前に予め気管内に注入していること、及び甲第４号証のアレルゲンの露出に先立って気道に表面活性物質を投与することは、喘息の発作の発現前に使用して喘息の発作を起こらないようにするいわゆる予防剤である。すなわち、甲第１号証及び甲第４号証には、肺表面活性物質を喘息発作の発現後に使用する治療剤は記載されていない。
　したがって、本件請求項１に係る発明は、表面活性物質を喘息発作の発現後に使用する治療剤であるから、肺表面活性物質を喘息に対して用いる予防剤である甲第１及び４号証に記載されたものではない。
　次に、肺表面活性物質を喘息発作の発現後に使用することについて検討する。
　甲第１号証及び甲第４号証には、表面活性物質は肺及び気管支におけるレセプター媒介アレルギー反応に対して保護的であるとか、アレルゲンの露出に先立って気道に表面活性物質を投与することことによって攻撃を防ぐことができるであろうというように、肺表面活性物質は気管におけるアレルギー反応自体を抑制するものとして記載されているから、アレルギー反応が生じた後の治療効果については記載されていないし、示唆もない。そして、甲第２〜３及び５〜６号証には、天然又は合成の肺表面活性物質が呼吸窮迫症候群の治療に用いることが記載されているものの、喘息の治療については何ら記載されていない。
　そうすると、甲第１〜６号証に記載された事項からは、肺表面活性物質を喘息発作の発現後に使用して喘息を治療することは当業者が容易に想到できるものではない。
　したがって、請求項１に係る発明は、甲第１〜６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものではない。
　請求項２〜４に係る発明は、請求項１に係る発明を更に技術的に限定したものであるから、甲第１号証又は甲第４号証に記載されたものではないし、かつ、甲第１〜６号証に記載された発明に基づいて当業者容易に発明をすることができたものでもない。
　　　　
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件特許が特許法第２９条第１項第３号又は同法第２９条第２項に違反して特許されたものではない。
　また、本件特許については、他に取消理由を発見しない。
【異議決定日】
平成１３年３月１日（２００１．３．１）
【訂正の要旨】
　特許請求の範囲の減縮を目的として、特許請求の範囲の請求項１の
「肺表面活性物質（ＰＳＦ）を有効成分とする喘息治療剤。」を
「人の喘息治療のため喘息発作の発現後に使用する肺表面活性物質（ＰＳＦ）を有効成分とする喘息治療剤。」
と訂正するものである。
（５４）【発明の名称】
喘息治療剤
【発明の詳細な説明】
技術分野
　本発明は、肺表面活性物質（以下ＰＳＦという）を有効成分とする喘息治療剤に関する。
背景技術
　気管支喘息は非常に複雑な症候群であり、原因が多様で、主たる臨床症状が一定していないと一般に認められている。
　ところで、ＰＳＦは、現在、死亡率の高い呼吸窮迫症候群の治療剤として格別の評価を受けている。ＰＳＦの主な機能は気−液界面の表面張力の機能（即ち、単位面積当りの表面自由エネルギー）を低下させることにより、肺胞単位を安定化することにある。ＰＳＦは肺胞だけでなく気道にも存在し気管支を安定化していることから、肺気量に伴った径の変化から気管支を保護している。また、ＰＳＦは、呼吸運動の減少及び肺浮腫の発症から肺を保護する液体浸出のコントロールを含めて、肺機能に対して重要な役割を果たしている。事実、肺胞表面張力を人為的に高めることにより誘発させた浮腫に対して、外因性ＰＳＦを投与すると未熟子羊の肺胞の蛋白透過性を減少させることができる。喘息発作によって粘液分泌が増大し、粘膜繊毛クリアランスが損なわれる。粘液分泌と蛋白性液体の浸出が増加すると、細気道及び肺胞内でＰＳＦの活性を抑制することがある。表面張力が増し、かつ液体の浸出が増すと、肺胞に最も近い気道で呼気中に浸出した液体により閉塞を引き起こす。喘息発作において、表面活性が抹消気道と関係があるならば、ＰＳＦの投与は、喘息発作に何らかの治療効果があるのだろうと考えられる。しかしながら、実際には気管支喘息におけるＰＳＦの役割については、未だ知られていない。
　本発明者は、喘息治療剤として有用な薬剤を鋭意研究してきたところ、気管支喘息モデルである抗原誘発気管支収縮モルモットにおいて、また実際に喘息患者に対しＰＳＦが顕著な治療効果を有することを知り、本発明に到達した。
発明の開示
　本発明によれば、ＰＳＦを有効成分とする喘息治療剤が提供される。
　本発明喘息治療剤に使用するＰＳＦは、全体としてリン脂質を４０重量％以上含有し、その主要成分がホスファチジルコリン又はコリンホスホグリセリドである種々の公知の物質が使用できる。具体的には、▲１▼哺乳動物の肺臓組織に存在するリン脂質、中性脂質、総コレステロール、炭水化物及び蛋白質を含有し、かつ乾燥した最終製品の総重量に対するこれら各成分の重量の百分率が、リン脂質は７５．０〜９５．５％、中性脂質は１．８〜１４０％、総コレステロールは３．０％以下、炭水化物は０．１〜１．５％およびタンパク質は５．０％以下である表面活性物質（特公昭６１−９９２５号公報）、▲２▼主としてジパルミトイルホスファチジルコリン及び脂肪アルコールからなる肺表面活性薬組成物（特開昭５７−９９５２４号公報）、▲３▼哺乳動物の肺臓組織に存在するリン脂質、中性脂質、総コレステロール、遊離脂肪酸、炭水化物及び蛋白質を含有する表面活性物質であって、当該物質の乾燥総重量に対する各成分の重量百分率が、リン脂質は６８．６〜９０．７％、中性脂質は０．３〜１３．０％、総コレステロールは０．０〜８．０％、遊離脂肪酸は、１．０〜２７．７％、炭水化物は０．１〜２．０％及び蛋白質は０．０〜３．５％である表面活性物質（以下サーファクタントＴＡという；特公昭６１−９９２４号公報）、▲４▼リン脂質ホスファチジルコリンと不飽和脂肪酸またはそのエステルを主成分とし、該ホスファチジルコリンが全体の５５〜８０重量％を占める合成肺表面活性物質（特開昭５８−１３５８１３号公報）、▲５▼全体の８０重量％以上がリン脂質からなり、実質的に蛋白質を含まない肺表面活性物質（特開昭５８−１６４５１３号公報）、▲６▼哺乳動物の肺臓から抽出されたリン脂質、中性脂質、コレステロール及び炭水化物を含有し、かつ乾燥後の組成がリン脂質７０〜９５重量％、中性脂質１〜１０重量％、総コレステロール３．０重量％以下及び炭水化物０．３重量％以下であって、蛋白質を実質的に含まない肺表面活性物質（特開昭５８−１８３６２０号公報）、▲７▼リン脂質ホスファチジルコリンとカルジオリピンを主成分とし、該ホスファチジルコリンが全体の５５〜８０重量％を占める合成肺表面活性物質（特公平１−２９１７１号公報）、▲８▼ジパルミトイルホスファチジルコリン４０〜４５重量％、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン５〜１０重量％及び糖５０重量％の含量を有する肺用界面活性剤（特公平１−１３６９０号公報）、▲９▼リン脂質であるホスファチジルコリンとカルジオリピン及び／又はホスファチジルグリセロールが全体の８０〜９５重量％、中性脂質が全体の５〜２０重量％、かつ脂肪酸が全体の０〜１０重量％を占めるところの合成肺表面活性物質（以下サーファクタントＣＬという；特開昭５９−９５２１９号公報、日本界面医学会雑誌１４巻１号　５９頁１９８３年）、▲１０▼コリンホスホグリセリド、酸性リン脂質、脂肪酸類及び哺乳動物の肺臓由来のリボ蛋白質を主に含有し、総重量に対するこれらの含量が、コリンホスホグリセリドは５０．６〜８５．０％（Ｗ／Ｗ）、酸性リン脂質は４．５〜３７．６％（Ｗ／Ｗ）、脂肪酸類は４．６〜２４．６％（Ｗ／Ｗ）、リボ蛋白質は０．１〜１０．０％（Ｗ／Ｗ）であるサーファクタント（以下合成サーファクタントＸ１という；特開昭５９−１６４７２４号公報）、▲１１▼飽和の直鎖脂肪酸残基を２個有するホスファチジルコリンが全体の５５〜８０重量％、飽和の直鎖脂肪酸残基を２個有するホスファチジルグリセロールが全体の１０〜３５重量％、中性脂質が全体の５〜２０重量％含まれるところの合成肺表面活性物質（特閑昭５９−１８１２１６号公報）、▲１２▼リン脂質含量４０〜７０％、タンパク量含量１．５％未満、コレステロール含量１０〜４０％、中性脂質含量５〜３０％である作用物質混合物（特開昭６０−２３７０２３号公報）、▲１３▼コリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類を主に含有し、総重量に対するこれらの含量がコリンホスホグリセリドは５３．９〜８７．８％（Ｗ／Ｗ）、酸性リン脂質は４．８〜３８．２％（Ｗ／Ｗ）、脂肪酸類は７．０〜２６．２％（Ｗ／Ｗ）である合成サーファクタント（以下合成サーファクタントＸ２という；特公平２−８７６８号公報）、▲１４▼ブタの肺胞洗浄液から抽出した脂質に塩化カルシウムを添加した物質（以下サーファクタントＣＫという；日本界面医学会雑誌１２巻１号１頁１９８１年、同１４巻　２号２１２頁１９８３年）、▲１５▼ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン及び大豆レシチンの三成分系混合物を含有する合成肺表面活性物質（特公昭６４−９２９２号公報）、▲１６▼極性脂質画分と蛋白質画分とからなる動物源の肺動脈界面活性剤において、該極性脂質画分を少なくとも９８．５重量％の割合で存在させると共に、主に少なくとも９５％の割合のリン脂質混合物で構成した肺動脈界面活性剤（特開昭６４−６３５２６号公報）、▲１７▼特表昭６２−５０１１２２号、特表昭６２−５０１７９２号、特表昭６３−５０３２２２号、特表平１−５０１２８２号、特開平２−４２４号公報、特開平２−６４０５号公報、特開平２−５３７９８号　特開平２−２７９６２８号、特表平２−５０２９１７号、特開平３−４４３３２号、特開平３−９００３３号公報記載の肺表面活性物質蛋白質若しくはその他遺伝子組替えにより製造した肺表面活性物質蛋白質を含有した合成肺表面活性物質又は▲１８▼牛肺から得られ、リン脂質、コレステロール、疎水性表面活性蛋白質、遊離脂肪酸、トリグリセリド及びカルシウムからなるアルビオファクト（Ａｌｖｅｏｆａｃｔ；商品名、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｅｄｉａｔｒ（１９９０）１４９：２８０−２８３；ＬＩＰＩＤＳ　及び　Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．８（１９８３）５２２−５２９参照）、インファサーフ（Ｉｎｆａｓｕｒｆ；商品名）、キューロサーフ（Ｃｕｒｏｓｕｒｆ；商品名）、ヒト羊水から得られるヒューマンサーフ（ＨｕｍａｎＳｕｒｆ；商品名）などの天然ＰＳＦ又はその調整品、▲１９▼サーファクタントＣＫ，ジパルミトイルホスファチジルコリン、ヘキサデカノール、チロキサポール（Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ：ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ　ｐｌｙｍｅｒ　ｗｉｔｈ　ｏｘｉｒａｎｅ　ａｎｄ　４−（１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ）及び塩化ナトリウムからなるエキソサーフ（Ｅｘｏｓｕｒｆ；商品名）、ジパルミトイルホスファチジルコリン７部、ホスファジルグリセロール３部からなるアレック（ＡＬＥＣ；商品名）、ドライサーファクタント（Ｄｒｙ　Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）若しくはリポゾーマルフォーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｌ　ｆｏｒｍ）などの合成ＰＳＦなどが挙げられる。
　なお、ＰＳＦの分散濃度としては、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは２〜４０ｍｇ／ｍｌが適当である。
図面の簡単な説明
　図１は、モルモットのボディ・プレシスモグラフ（ｂｏｄｙ　ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈ）のために用いられた装置の略図である。
　図２はＣｄｙｎおよびＲＬの計算を示す図である。
　図３は、サーファクタントＴＡに関する、３群の実験動物における抗原感作の後の気道開口時圧力（Ｐａｏ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図４は、サーファクタントＴＡに関する、肺の動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図５は、サーファクタントＴＡに関する、肺抵抗（ＲＬ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図６は、ヒスタミン誘発気管支収縮に対するサーファクタントＴＡの９０秒間吸入の影響を示す図である。
　図７は、アレックに関する、３群の実験動物における抗原感作の後の気道開口時圧力（Ｐａｏ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図８は、アレックに関する、肺の動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図９は、アレックに関する、肺抵抗（ＲＬ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図１０は、エキソサーフに関する、３群の実験動物における抗原感作の後の気道開口時圧力（Ｐａｏ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図１１は、エキソサーフに関する、肺の動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図１２は、エキソサーフに関する、肺抵抗（ＲＬ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図１３は、アルビオファクトに関する、３群の実験動物における抗原感作の後の気道開口時圧力（Ｐａｏ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図１４は、アルビオファクトに関する、肺の動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図１５は、アルビオファクトに関する、肺抵抗（ＲＬ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図１６は、サーファクタントＣＫに関する、３群の実験動物における抗原感作の後の気道開口時圧力（Ｐａｏ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図１７は、サーファクタントＣＫに関する、肺の動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図１８は、サーファクタントＣＫに関する、肺抵抗（ＲＬ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図１９は、ヒューマンサーフに関する、３群の実験動物における抗原感作の後の気道開口時圧力（Ｐａｏ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図２０は、ヒューマンサーフに関する、肺の動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
　図２１は、ヒューマンサーフに関する、肺抵抗（ＲＬ）のベースラインからのパーセント変化を示す図である。
〔気管支実験モデルに対する作用〕
　喘息モデルの準備
　高力価抗一卵白アルブミン抗血清の調製
　モルモットの同種細胞親和性抗血清を、サンタイブズら（ＳａｎｔｉｖｅｓＴ，ＲｏｓｋａＡＫ・ＨｅｎｌｙＧ，Ｍｏｏｒｅ　ＶＬ，Ｆｉｎｋ　ＪＮ，ＡｂｒａｍｏｆｆＰ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｕｎｇｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ：Ｊ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ＣｌｉｎＩ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１９７６；５７：５８２−５９４）の方法の変法により調製した。用量５００μｇの卵白アルブミン（ＯＡ）をフロイントの完全アジュヴァント中に乳化させ、モルモット毎に５カ所の異なる部位、即ち、両側腋窩、両側鼠径部及び頸部、に皮内投与した。同じ方法で、２週間後に追加投与を行った。追加投与から２週間後に血清を採取しプールした後、使用時まで凍結保存した。
実験喘息の誘発
　上述の抗血清１ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与して、モルモットに受動感作を起こした。受動感作の１２−２４時間後、モルモットをペントバルビタールナトリウム７５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注入で麻酔した。モルモットを仰臥させ、気管にポリエレンチューブのカニューレを挿入し（外径２．５ｍｍ、内径２．１ｍｍ）、一方の頸静脈に薬物投与のためのカニューレを挿入した。１回換気量１０ｍｌ／ｋｇ、呼吸率６０回／分に調節した小動物用換気装置（１６８０型、Ｈａｒｖａｒｄ，Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｓｏｕｔｈ　Ｎａｔｉｋ，ＮＡ）で人工換気を行なった。この装置のデッドスペースは、０．５ｍであった。上記の全処置を完了した時、ヒスタミン作用を完全に遮断するためにジフェンヒドラミン塩酸塩６０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した後、換気装置の出口をクランピングし、２回の呼吸について、１回換気量の２倍で過剰膨張させた。１０分後、人工換気を中断させずに、生理的食塩水（１ｍｇ／ｍｌ）に溶解した噴霧型卵白アルブミン（抗原）で感作した。卵白アルブミン吸入剤を、実験動物用に開発した超音波ネブライザー付器具で、３０秒間放出させた。
肺表面活性剤
　サーファクタントＴＡ（サーファクテン、東京田辺製薬株式会社、東京、１バイアル当り、凍結乾燥肺表面活性剤脂質１２０ｍｇ）を、加温（３７℃）生理的食塩水に懸濁し、脂質濃度を１０及び２０ｍｇ／ｍｌとした。
　使用した他の薬物は、次の通りである：卵白アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、フロイントの完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ジフェンヒドラミン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｕｉｓ，Ｍｏ）、ペントバルビタールナトリウム溶液（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ヒスタミン２塩酸塩（和光純薬、大阪、日本）。
測定
　図１に示すように、気道開口時圧力（Ｐａｏ）、気管チューブの外側圧力を、示差圧力変換器ＴＰ−６０３型、日本光電、東京、日本）を使って測定した。さらに、食道圧（Ｐｅｓｏ）を、食道に挿入し、低圧変換器（ＭＰＵ−０．１Ａ　日本光電）に接続した水充填ポリエチレンカテーテル（外径：１．４ｍｍ、内径：１．０ｍｍ）によって測定した。その後、モルモットを小さな気密プラスチックボックス内に入れ、空気の速度（Ｖ）をリリー型（Ｌｉｌｌｙ−ｔｙｐｅ）呼吸気流計（ＴＶ２４１Ｔ型、日本光電）と、ボックスの小窓に配した低圧変換器（ＴＰ−６０２Ｔ、日本光電）で測定した。流速をコンピュータで積分し、換気量（Ｖ）を測定した。これらのパラメータ、Ｖ、Ｖ、Ｐａｏ、Ｐｅｓｏを連続的にマルチチャンネルレコーダ（Ｐ−０７７０ｃ、日本光電）に記録した。アムダーとミード（Ａｍｄｕｒ　ＭＯ，Ｍｅａｄ　Ｊ：Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ　ｏｆ　ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ　ｉｎｕｎａｎｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇｓ；Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１９５８；１９２：３６４−３６８）が述べた方法によって、肺の動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）及び肺抵抗（ＲＬ）は、図２に示す数字について計算した。
　Ｃｄｙｎは、体重（ｋｇ）で除し、また、使用したＲＬは、体重を掛けた数値であった。末梢気道の変化と主気管支の変化を比較するため、ベースライン値に対するＣｄｙｎ及びＲしの逆数（１／ＲＬ）を計算した。
　Ｐａｏは、連続測定し、ＣｄｙｎとＲＬは、抗原吸入のすぐ前（ベースライン）、ピーク時、抗原感作１８、２３分後に測定した。これらの各時間の数値の変化は、ベースライン値のパーセント変化として表した。即ち、それぞれ、％Ｐａｏ、％Ｃｄｙｎ、％１／ＲＬである。回復率は、１８分の数値に対する２３分の数値のパーセント変化として決定した。
プロトコール
　以下のプロトコールに従って、合計２７匹のモルモットを検討した。ジフェンヒドラミン塩酸塩の投与後、呼吸機能を測定した（ベースライン）。次に、モルモットを噴霧型卵白アルブミンで感作した。Ｐａｏが最大値に達する約１４分後２回目の呼吸機能測定を行なった。気管支収縮が持続期に入った（Ｐａｏの減少速度が遅くなった）１８分目に、３回目の呼吸機能測定を行なった（ＰＳＦ投与前）。２０分後、サーファクタントＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ（ＰＳＦ１０ｍｇ／ｍｌ投与群、ｎ＝９）、２０ｍｇ／ｍｌ（ＰＳＦ投与群、ｎ＝９）、又は、生理的食塩水（対照群、ｎ＝９）のいずれかの吸入を９０分間実施した。吸入剤は、上述の超音波ネブライザー装置で発生させた。ネブライザーが生じる生理的食塩水、ＰＳＦ１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＳＦ２０ｍｇ／ｍｌの粒子の空気力学的直径の中央値は、それぞれ、３．５９±１．９６μｍ（平均値±標準偏差）、３．６４±１．８７μｍ及び３．６３±１．９８μｍであった。４回目の呼吸機能の測定は、卵白アルブミン感作の２３分後に実施した（ＰＳＦもしくは食塩水吸入終了後１．５分後）。
ヒスタミン誘発気管支収縮
　別のモルモットを、上述の通りに、麻酔し、人工換気した後、換気を中断させずに５分間隔で、ヒスタミンを増量しながら静脈内投与した。５匹のモルモットでは、サーファクタントＴＡ　２０　ｍｇ／ｍｌの吸入剤を、ヒスタミン誘発の１０分前に９０秒間吸入させた。他の５匹には、対照として生理的食塩水の吸収剤を同じ方法で投与した。
統計解析
データは、平均値±標準誤差で示す。統計的な差は、マンーホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定で決定し、Ｐ＜０．０５を有意と見なした。
結果
喘息モデルにおけるＰＳＦ吸入の効果
　全実験動物のＰａｏ、Ｃｄｙｎ、ＲＬのベースライン値は、それぞれ、１０．５±０．２７ｃｍＨ２Ｏ、１．３３±０．０７ｍｌ／ｃｍＨ２Ｏ・ｋｇ、６．９１±０．２７ｃｍＨ２Ｏ・秒・ｋｇ１０−２／ｍｌであった。群間で、これらの数値に有意差は認められなかった。
　図３に示すように、Ｐａｏ増加％は、対照群（ｎ＝９）で、吸入後１３分目に、２６７±３９％の最大値に対して、これらは、その後１８分目に２４５±３２％まで、２３分目に２２２±２５％まで減少した。ＰＳＦ　１０ｍｇ／ｍｌ投与群では、Ｐａｏ増加％は、１５分目に２６９±２３％の最大値に達し、その後１８分目に２５３±２３％、２３分目に２１０±２２％まで減少した。ＰＳＦ　２０ｍｇ／ｍｌ投与群では、Ｐａｏの増加％は、１４分目に２７２±３２％の最大値に達し、その後、１８分目に２５２±２９％まで、２３分目に１９６±３１％まで減少した。Ｐａｏの回復率（１８分目から２３分目への数値の変化％）は、対照群が５．９±２．４％、ＰＳＦ１０ｍｇ／ｍｌ投与群が２０．７±２．２％（ｐ＜０．０１）、ＰＳＦ２０ｍｇ／ｍｌ投与群が２３．４±４．７％（ｐ＜０．０１）であった。
　本実験の％Ｃｄｙｎの変化を図４に示す。全モルモットにおける％Ｃｄｙｎの最小値は、１０．３±０．３％で、抗原感作後１４．３±０．５分目に見られた。３群間で、最小値と発現時間に有意差がなかった。一方、Ｃｄｙｎの回復率は、対照群が１４．６±１．９％、ＰＳＦ１０ｍｇ／ｍｌ投与群が４３．５±１０．３％（ｐ＜０．０２）、ＰＳＦ２０ｍｇ／ｍｌ投与群が５２．０±９．５％（ｐ＜０．０１）であった。従って、ＰＳＦ投与群では、Ｃｄｙｎが、より速やかに回復した。
　％１／ＲＬの変化を図５に示す。全実験動物の％１／ＲＬ最小値は、１３．７±０．９％であった。これらの群間で、最小値に有意差は認められなかった。１／ＲＬの回復率は対照群が３４．５±１５．７％、ＰＳＦ１０ｍｇ／ｍｌ投与群が３９．５±５．５％（ＮＳ）、ＰＳＦ２０ｍｇ／ｍｌ投与群が１０２．４±１５．７％であった（ｐ＜０．０１）。従って、１／ＲＬ変化に関しては、対照群とＰＳＦ１０ｍｇ／ｍｌ投与群の間には有意差は見られなかったが、回復率は、ＰＳＦ２０ｍｇ／ｍｌ投与群が他の群よりも有意に高かった。
ヒスタミン誘発気管支収縮に対するＰＳＦ吸入の影響
　図６はヒスタミン誘発気管支収縮に対するＰＳＦ　２０ｍｇ／ｍｌの９０秒間吸入の影響を示す。この実験では、ＰＳＦの直接的な気管支拡張作用は認められなかった。
考察
　この実験に使用したモルモットは、明確な特徴のある気管支喘息用実験モデルの１種である。モルモットを同種細胞親和性抗血清で受動感作し、内在ヒスタミンの介在する気管支収縮を完全に遮断するため、高用量ジフェンヒドラミン塩酸塩で前処理した。ヒスタミンの作用を遮断することによって、用量−反応と再現性が得られ、エアゾール化した抗原で感作した時、過敏性反応が起こる。発明者の以前の研究では、この種のアレルギー性気管支収縮は、大部分が、アナフイラキシーの遅反応物質（ＳＲＳ−Ａ）の選択的阻害剤であるＦＰＬ５５７１２の持続注入や、ロイコトリエンレセプター括抗剤のＡＳ−３５の吸入による前処理によって抑制された。これらのことから、本実験に見られる卵白アルブミン吸入後の気管支収縮は、主としてＳＲＳ−Ａが介在するアレルギー性のものであろう。
　ＰＳＦのエアゾール化の問題点は、肺の中に限られた量の液体しか沈着できないことである。ウサギ（２．５ｍｇ／ｇ、又は、１０ｍｇ／ｋｇ体重）の肺洗浄で回収した総リン脂質に関するオヤーザンとクレメンツ（Ｏｙａｒｚｕｎ　Ｍ，Ｃｌｅｍｅｎｔｓ　ＪＡ：　Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆ　ｌｕｎｇ　ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　ｂｙ　ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ，　ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ　ｍｅｄｉａｔｏｒｓ，　ａｎｄ　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔ；Ａｍ　Ｒｅｖ　Ｒｅｓｐｉｒ　Ｄｉｓ　１９７８；１１７：８７９−９１）のデータに基づいて、正常な４００ｇのモルモットの肺に存在するＰＳＦの量が４ｍｇであると推定した。本実験で吸入させたエアゾール型サーファクタントＴＡの合計量は、およそ１−２ｍｇで、肺及び肺気管支へのサーファクタントＴＡの沈着量は、約４６％であるから、肺及び肺気管支への沈着量は、肺に正常に存在する量のおよそ１／８−１／４である。呼吸器内に吸入したエアゾール粒子の沈着は、慣性の法則、ブラウン拡散、重力沈降のメカニズムに起因し、その粒子径から気管支および肺胞への沈着量を推定できる。閉塞性疾患の場合には、衝突による沈着量が増加する。ＰＳＦ溶液の平均粒子径は、約３．６μｍで、ＰＳＦ、生理的食塩水、及びアルブミン溶液の間で、粒子径に差がなかったので、これらの溶液の沈着部位は等しくなり、気管支収縮後に、主として、上部気道に沈著する、と推定できる。
　本実験では、エアゾール型外因性ＰＳＦ（サーファクタントＴＡ）の投与によって、内因性ＳＲＳ−Ａ介在の気管支収縮に伴う異常動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）と肺抵抗（ＲＬ）が回復した。低用量では、ＰＳＦは、Ｃｄｙｎの回復に対してのみ、有効であったが、高用量では、ＣｄｙｎとＲＬの両方の回復に有効であった。ＣｄｙｎとＲＬは、それぞれ、下部気道と上部気道を応答させるパラメータであるので、吸入したＰＳＦが、上部気道よりも末梢気道に対して有効なことが結果から示唆される。一方、ＰＳＦの前投与は、注入ヒスタミン誘先の気管支収縮に影響を与えておらず、これは、ＰＳＦが直接的な気管支拡張作用も、非特異的気管支収縮能も持たないことを表している。
　一方、表面張力が肺胞に最も近い気道で高いと、肺胞の液体が呼気開始時に、気道に移動する、と考えることもできる。液体は、空気の通路を狭め、さらに多くの液体を気道に移動させ、肺胞の虚脱が発生する。ＰＳＦを投与することにより、この虚脱を防止することができる。
　上述の結果から、アレルギー性気管支収縮に対して外因性ＰＳＦ（サーファクタントＴＡ）投与が有効であるということができる。
　サーファクタントＴＡは、主に、疎水性アポ蛋白からなる蛋白質を１％含有する。これらの蛋白質は、構造、表面活性、表面皮膜形成のために重要であることから、ＰＳＦは蛋白質を含有していることが望ましい。しかしながら、アポ蛋白を持たないエキソサーフのような合成ＰＳＦでも弱いながら活性を有している。アレック、エキソサーフ、アルビオファクト、サーファクタントＣＫ及びヒューマンサーフについて、サーファクタントＴＡと同様の方法で試験を行なった結果を図７〜図２１に示す。
〔喘息患者に対する作用〕
　呼吸機能試験を、ＦＶＣ（努力肺活量）、ＦＥＶ１．０（１秒量）、ＭＭＦ（中間呼気流量）、△Ｎ２、ＴＬＣ（全肺気量）、ＲＶ（残気量）、ＰａＯ２（動脈血酸素分圧）及びＰａＣＯ２（動脈血二酸化炭素分圧）の項目（臨床検査技術全書、第９巻、生理機能検査　３６７−３９３ページ、医学書院）について行なった。測定装置は、ドライスパイロメータ（ＦＵＤＡＣ−６０、福田電子、東京、日本）及び血液ガスシステム２７８（Ｃｉｂａ　ＣｏｒｎｉｎｇＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＣｏ．，Ｍｅｄｆｉｅｌｄ，ＵＳＡ）を使用した。
　ＦＶＣ、ＦＥＶ１．０、ＭＭＦは呼気を最大まで行なわせ、できるだけ速やかに放出させて得る最大呼気流量により得た。△Ｎ２を示す肺胞プラトー（ａｌｖｅｏｌａｒ　ｐｌａｔｅａｕ）の傾きは、一回肺窒素洗出し法により窒素濃度曲線から得られる。ＴＬＣはヘリウム希釈閉鎖回路法により得た。ＲＶ／ＴＬＣ値は残気率を表す。試験は９０分以内に完結するようにし、検査はＰＳＦ投与前とＰＳＦ投与２０分後に行なった。
　喘息発作を持つアレルギー性喘息患者１１人をＰＳＦ投与群６人と対照群５人とに分け、ＰＳＦ投与群には、１０ｍｇのサーファクタントＴＡを懸濁した１ｍｌ生理的食塩水をジェットネブライザ（タイプ９５−Ｂネブライザシステム、日立、東京）で１００％Ｏ２を用い吸入した。ネブライザは、３．５ｋｇｆ／ｃｍ２に圧縮された空気５１１／ｍｉｎジェットフローで操作した。
　測定結果を表１及び表２に示す。
　呼吸機能検査及び血液ガス検査において、ＰＦＳ投与の効果を次式のパーセンテージとして表し、その結果を表３に示す。
（ＰＦは、呼吸機能データを表す）
　対照群ではＦＶＣ、ＦＥＶ１．０、ＭＭＦ、ＰａＯ２の値はほとんど変化しなかったが、△Ｎ２値は有意に増加した。ＰＳＦ投与群では全患者のＦＶＣ、ＦＥＶ１．０、ＭＭＦ、ＰａＯ２及び△Ｎ２値が著明に改善された。
　また、ＴＬＣ及びＲＶの平均値は、対照群では有意の変化はなかったが、ＰＳＦ群では吸入後有意に減少した。ＲＶ／ＴＬＣもまた、ＰＳＦ群では減少した。
このことは、ＰＳＦが細気管支を安定化し、末梢肺胞での最大換気を引き起こし、空気とらえこみ（ａｉｒ　ｔｒａｐｐｉｎｇ）を防御するという作用により、収縮した細気管支に対し気管支拡張作用を示し、喘息症状を抑えるということを意味する。
　血液ガス分析試験中ＰａＣＯ２値は、両者で有意の相違がなかった。また、ＰＳＦ群のＰａＯ２は処置後有意に増加したが、対照群では変化がなかった。これは、ＰＳＦが肺胞での酸素の取り込みを改善していることを示す。
　ＰＳＦ群の全患者は、吸入後発作及び喘息の症状が軽減した。一方、対照群とされた５人の患者は発作及び喘息鳴が変わらないか悪化した。
　以上のように、ＰＳＦを有効成分とする薬剤は有用な喘息治療剤であるということができる。
〔急性毒性試験〕
　５週令の雄性ＩＣＲマウス及び５週令の雄性ウィスター系ラットに、サーファクタントＴＡを経口及び腹腔内の２形態で投与しＬＤ５０値を求めた。ＬＤ５０値はマウスでは経口で３ｇ／ｋｇ以上、腹腔内で２ｇ／ｋｇ以上であった。同じくラットでは経口で４ｇ／ｋｇ以上、腹腔内で２．５ｇ／ｋｇ以上であった。
〔亜急性毒性試験〕
　成熟したウィスター系ラットに、１月間サーファクタントＴＡを５００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。１月後のラットの体重増減並びに肺臓及び他の主要臓器における肉眼的観察及び組織学的観察には何ら異常が認められなかった。また、異種蛋白に起因する生体異常もなかった。
〔用法・用量〕
　本発明により提供される喘息治療剤は、成人に対しては１ｍｇ〜５０ｍｇのＰＳＦを１回投与量として含有する。用法は、上述の用量を水又は生理的食塩水のような電解質溶液に懸濁し、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、喘息の発現前後気道内に注入又は噴霧させる。投与回数は１〜１０回が適当である。患者の症状又は併用療法に応じて、上述の用量、用法及び回数を適宜変更してもよい。
　本発明喘息治療剤は必要に応じて安定剤、保存剤、等張剤、緩衝剤若しくは懸濁化剤等の医薬品添加物又は殺菌剤を含有してもよい。剤型は液剤又は用時に懸濁して用いる粉末剤が適当であり、バイアル瓶又はアンプル瓶等の密封容器内に充填され、無菌製剤として保存される。
（５７）【特許請求の範囲】
１．人の喘息治療のため喘息発作の発現後に使用する肺表面活性物質（ＰＳＦ）を有効成分とする喘息治療剤。
２．肺表面活性物質（ＰＳＦ）が全体としてリン脂質を４０重量％以上含有する肺表面活性物質（ＰＳＦ）である請求項１の喘息治療剤。
３．リン脂質の主要成分がホスファチジルコリン又はコリンホスホグリセリドである請求項２の喘息治療剤。
４．肺表面活性物質（ＰＳＦ）がサーファクタントＴＡ、サーファクタントＣＬ、合成サーファクタントＸ１、合成サーファクタントＸ２、サーファクタントＣＫ、アルビオファクト、アレック又は１０ｍｌ中に１０８ｍｇのジパルミトイルフォスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、１２ｍｇのセチルアルコール（ｃｅｔｙｌ　ａｌｃｈｏｌ）、８ｍｇのチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐｏｌ）及び４７ｍｇの塩化ナトリウムが含まれている合成肺表面活性物質のいずれかである請求項１の喘息治療剤。