(57)【要約】  ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患の治療方法。この方法は、それを必要とする対象に、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが可能である薬剤の治療有効量を与えることによってもたらされる。
2008525427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患の治療方法であって、それを必要とする対象に、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが可能である薬剤の治療有効量を与え、それによって、該対象におけるＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を治療する工程を包含する方法。
【請求項２】
前記ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を破壊すること、またはその形成を妨害することによってもたらされる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤が前記ＨＣ８またはＮＩＫをコードする内因性核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤が抗体または抗体フラグメントである請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤が、ＮＩＫを結合可能であるＨＣ８由来アミノ酸配列を含むペプチドであり、該ペプチドが少なくとも５アミノ酸でかつ５０アミノ酸以下の長さである請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤が、ＨＣ８を結合可能であるＮＩＫ由来アミノ酸配列を含むペプチドであり、該ペプチドが５アミノ酸でかつ２００アミノ酸以下の長さである請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を安定化すること、またはその形成を増強することによってもたらされる請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、ＮＩＫまたはＨＣ８の少なくとも活性部分を発現することが可能なポリヌクレオチドである請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が、ＮＩＫまたはＨＣ８の少なくとも活性部分を含むポリペプチドである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤がＮＩＫインヒビターである請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を安定化すること、またはその形成を増強することによってもたらされる請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤が、ＮＩＫの少なくとも活性部分を発現することが可能なポリヌクレオチドである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤が、ＮＩＫの少なくとも活性部分のポリペプチドである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患が、免疫疾患、炎症性疾患または癌である請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を破壊すること、またはその形成を妨害することが可能である抗体または抗体フラグメント。
【請求項１６】
前記抗体または抗体フラグメントの抗原認識ドメインが、配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０または６５０〜９４７によって含まれる請求項１５記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１７】
２００アミノ酸以下を含み、配列番号５の座標１〜１８０または６５０〜９４７によって示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を破壊すること、またはその形成を妨害することが可能である単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
２６Ｓプロテアソームの異常な活性と関連する疾患の治療方法であって、それを必要とする対象に、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を減少することが可能な治療有効量の薬剤を与え、それによって、該対象における２６Ｓプロテアソームの異常な活性と関連する疾患を治療する工程を包含する方法。
【請求項１９】
前記薬剤が、ＮＩＫのキナーゼ活性を阻害することが可能な分子、ＨＣ８のリン酸化変異体、およびＮＩＫの非機能的誘導体からなる群より選択される請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＮＦ−κＢ活性または異常なプロテアソーム活性と関連する疾患を治療するために適切な薬物候補を同定する方法であって、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが可能な分子を同定する工程を包含し、該分子が薬物候補である方法。
【請求項２１】
前記分子が、低分子化学物質、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、ペプチドおよび抗体からなる群より選択される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を治療するための医薬の製造のための、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが可能な薬剤の使用。
【請求項２３】
前記ＮＩＫ−ＨＣ８結合が、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を破壊すること、またはその形成を妨害することによってもたらされる請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
前記薬剤が、前記ＨＣ８またはＮＩＫをコードする内因性核酸配列に相補的であるオリゴヌクレオチドである請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
前記薬剤が抗体または抗体フラグメントである請求項２３記載の使用。
【請求項２６】
前記薬剤がＮＩＫを結合可能であるＨＣ８由来のアミノ酸配列を含むペプチドであり、該ペプチドが少なくとも５アミノ酸でかつ５０アミノ酸以下の長さである請求項２３記載の使用。
【請求項２７】
前記薬剤がＨＣ８を結合可能であるＮＩＫ由来のアミノ酸配列を含むペプチドであり、該ペプチドが５アミノ酸でかつ２００アミノ酸以下の長さである請求項２３記載の使用。
【請求項２８】
前記ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を安定化すること、またはその形成を増強することによってもたらされる請求項２２記載の使用。
【請求項２９】
前記薬剤がＮＩＫまたはＨＣ８の少なくとも活性部分を発現することが可能であるポリヌクレオチドである請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
前記薬剤がＮＩＫまたはＨＣ８の少なくとも活性部分を含むポリペプチドである請求項２８記載の使用。
【請求項３１】
前記薬剤がＮＩＫインヒビターである請求項２２記載の使用。
【請求項３２】
ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を安定化すること、またはその形成を増強することによってもたらされる請求項２２記載の使用。
【請求項３３】
前記薬剤がＮＩＫの少なくとも活性部分を発現することが可能であるポリヌクレオチドである請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
前記薬剤がＮＩＫの少なくとも活性部分のポリペプチドである請求項３２記載の使用。
【請求項３５】
ＮＦ−κＢ活性に関連する疾患が免疫疾患、炎症性疾患または癌である請求項２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣ８へのＮＩＫの結合を調節するための薬剤、および癌などのＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を治療するためにこのような薬剤を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物細胞における大部分のタンパク質の分解は、ユビキチン依存性２６Ｓプロテアソームによって実行される。この２６Ｓプロテアソームは、細胞周期の調節から抗原プロセシングまでの範囲にわたる多くの異なる細胞プロセスに関与している［HershkoおよびCiechanover (1998) Annu. Rev. Biochem. 67:425-479］。プロテアソームは、２つの大きな単位：２０Ｓ触媒コア複合体および１９Ｓ調節複合体から構成される［Gerards (1998) Cell. Mol. Life Sci. 54:253-262］。この１９Ｓ複合体は、２０Ｓ複合体の内部で分解されるポリユビキチン化タンパク質基質の認識のために必要である。バレル形状２０Ｓ粒子は４つの環から作られ、それらの各々が７個の異なるサブユニットを含む。２つの内側の環はβ型サブユニットを含み、外部の環はα型サブユニットを含む。
【０００３】
２０Ｓプロテアソームの２つのαサブユニット、ＨＣ８（α７）およびＨＣ９（α３）は、哺乳動物細胞中でリン酸化されることが知られている。２０Ｓプロテアソーム調製物と同時精製されるプロテインキナーゼＣＫ２（カゼインキナーゼＩＩ）は、ＨＣ８サブユニットのＣ末端に位置する２つのセリン残基、Ｓｅｒ２４３およびＳｅｒ２５０においてＨＣ８をリン酸化することが知られてきた［Mason (1996) Eur. J. Biochem. 238:453-462; Castano (1996) Biochemistry 35:3782-3789］。最近、Boseら［Biochem J. (2004) 378:177-84］は、γインターフェロンを用いる細胞の処理が、ＨＣ８サブユニットの脱リン酸化および２６Ｓプロテアソームの不安定化を生じることを明らかにした。
【０００４】
ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌファミリーの転写因子は炎症性および免疫細胞応答、細胞周期調節、分化、およびアポトーシスからの保護に関与する［BaeuerleおよびBaltimore, Cell 87:13-20, (1996); Ghoshら、Annu. Rev. Immunol. 16:225-260, (1998)］。哺乳動物において、このファミリーの転写因子は、５つのメンバー：ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、ＮＦ−κＢ１（これは、前駆体ｐ１０５と、プロセス型ｐ５０の両方で存在する）およびＮＦ−κＢ２（これは、前駆体ｐ１００と、プロセス生成物ｐ５２の両方で存在する）から構成されている。ＮＦ−κＢタンパク質のホモ−およびヘテロダイマーは、ＩκＢファミリーのインヒビターとの複合体で、細胞質中に存在する。ＮＦ−κＢ１およびＮＦ−κＢ２の前駆体型（それぞれｐ１０５およびｐ１００）は、Ｃ末端ＩκＢ相同阻害領域を含む。これらのＮＦ−κＢタンパク質を含むダイマーは、ＩκＢ相同領域の機能によって細胞質に保持される。さらに、ＮＦ−κＢ１／ｐ１０５およびＮＦ−κＢ２／ｐ１００はまた、他のＮＦ−κＢタンパク質のダイマーと結合し、それらに細胞質保持を課すことができる。ＮＦ−κＢ活性化は、主としてＮＦ−κＢ１／ｐ１０５およびＮＦ−κＢ２／ｐ１００におけるＩκＢタンパク質またはＩκＢ相同領域の分解の誘導、および結果的な核へのＮＦ−κＢダイマーの移行を通して起こる［GhoshおよびKarin, (2002) cell S81-96］。
【０００５】
炎症性および免疫細胞応答、細胞周期調節、分化、およびアポトーシスからの保護におけるその役割のために、ＮＦ−κＢの活性化は、関節リウマチ、喘息（astma）および炎症性腸疾患などの炎症性疾患；全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患；または種々の型の癌などの異なる疾患の発生において重要な役割を果たす［RulandおよびMak, Semin.Immunol. 3:177-83, (2003)］。このように、ＮＦ−κＢ関連疾患を治療する際の使用のために、ＮＦ−κＢ活性を調節することが可能である薬剤を明らかにすることに向けたかなりの努力がなされてきた。従って、免疫抑制特性および抗炎症性特性を有する多数の分子が、ＮＦ−κＢのインヒビターとして研究されてきた。これらには、グルココルチコイドおよび他のステロイドホルモン、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ラパマイシン、サリチル酸、および金化合物が含まれる。しかし、これらの化合物の大多数は、重篤な免疫抑制および他の重篤な副作用をしばしば生じる広範な活性を有する。
【０００６】
本発明者らは、ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）が、標準的な経路および代替的な経路を介してＮＦ−κＢ活性化において中心的な役割を果たすことを以前に示した（Ramakrishnanら、Receptor-specific signaling for both the alternative and the canonical NF-κB activation pathways by NF-κB-inducing kinase (NIK), Immunity 21:477-489, 2004)。
【０００７】
本発明を実務まで限定する間に、本発明者らは、ＮＩＫが２６ＳプロテアソームサブユニットＨＣ８を結合し、それによって、後者のリン酸化を活性化することを予想外に明らかにした。従って、本発明者らは、ＮＩＫ−ＨＣ８相互作用を調節することが可能な薬剤が、プロテアソーム活性および／またはＮＩＫ分解を活性または抑制し、その結果、ＮＦ−κＢレベルを調節し、それによってＮＦ−κＢ活性と関連する疾患の治療を容易にすることを提案する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の１つの態様に従って、ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患の治療方法が提供される。この方法は、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが可能である薬剤の治療有効量を、それを必要とする対象に与えることによってもたらされる。
【０００９】
本発明の別の態様に従って、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を破壊すること、またはその形成を妨害することが可能である抗体または抗体フラグメントが提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の態様に従って、２６Ｓプロテアソームの異常な活性と関連する疾患の治療方法が提供される。この方法は、それを必要とする対象に、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を減少することが可能な治療有効量の薬剤を与えることによってもたらされる。
【００１１】
本発明のさらに別の態様に従って、ＮＦ−κＢ活性または異常なプロテアソーム活性と関連する疾患を治療するために適切な薬物候補を同定する方法が提供される。この方法は、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが可能な分子を同定することによってもたらされ、この分子は薬物候補である。
【００１２】
本発明のさらに別の態様に従って、２００アミノ酸以下を含み、配列番号５の座標１〜１８０または６５０〜９４７によって示されるアミノ酸配列を含み、ＮＩＫ−ＨＣ複合体を破壊すること、またはその形成を妨害することが可能である単離されたポリペプチドが提供される。
【００１３】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴に従って、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することは、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を破壊すること、またはその形成を妨害することによってもたらされる。
【００１４】
記載される好ましい実施形態における、なおさらなる特徴に従って、この薬剤は、ＨＣ８またはＮＩＫをコードする内因性核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドである。
【００１５】
記載される好ましい実施形態における、なおさらなる特徴に従って、この薬剤は、抗体または抗体フラグメントである。
【００１６】
記載される好ましい実施形態における、なおさらなる特徴に従って、この抗体または抗体フラグメントは、配列番号５によって示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０または６５０〜９４７によって網羅される。
【００１７】
記載される好ましい実施形態における、なおさらなる特徴に従って、この薬剤は、ＮＩＫを結合可能であるＨＣ８由来アミノ酸配列を含むペプチドであり、このペプチドは少なくとも５アミノ酸でかつ５０アミノ酸以下の長さである。
【００１８】
記載される好ましい実施形態における、なおさらなる特徴に従って、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することは、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を安定化すること、またはその形成を増強することによってもたらされる。
【００１９】
記載される好ましい実施形態における、なおさらなる特徴に従って、この薬剤は、ＮＩＫまたはＨＣ８の少なくとも活性部分を発現することが可能であるポリヌクレオチドである。
【００２０】
記載される好ましい実施形態における、なおさらなる特徴に従って、この薬剤は、ＮＩＫまたはＨＣ８の少なくとも活性部分を含むポリペプチドである。
【００２１】
記載される好ましい実施形態における、なおさらなる特徴に従って、この薬剤はＮＩＫインヒビターである。
【００２２】
記載される好ましい実施形態における、なおさらなる特徴に従って、ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患は、免疫疾患、炎症性疾患、または癌である。
【００２３】
記載される好ましい実施形態における、なおさらなる特徴に従って、この薬剤は、ＮＩＫのキナーゼ活性を阻害することが可能な分子、ＨＣ８のリン酸化変異体、およびＮＩＫの非機能的誘導体からなる群より選択される。
【００２４】
記載される好ましい実施形態における、なおさらなる特徴に従って、この分子は、低分子化学物質、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、ペプチド、および抗体からなる群より選択される。
【００２５】
本発明はまた、ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが可能な薬剤の使用を提供する。
【００２６】
本発明は、ＮＩＫ−ＨＣ８相互作用を調節するための薬剤、および癌などのＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を治療するためにその薬剤を使用する方法を提供することによって、現在知られている構成の欠点に首尾よく対処する。
【００２７】
他に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の一般の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは等価な方法および材料が本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は以下に記載される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示目的のみであり、限定を意図するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、ＮＦ−κＢと関連する疾患の治療方法である。詳細には、本発明は、ＮＩＫ−ＨＣ８相互作用を調節することによってＮＦ−κＢ活性を制御する方法に関する。
【００２９】
本発明の原理および操作は、図面および添付の説明を参照してより良好に理解され得る。
【００３０】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その応用において、以下の説明において示されるか、または図面に図示される要素の構成および配置の詳細に限定されないことが理解される。本発明は、他の実施形態、または種々の方法で実施もしくは実行されるものであることが可能である。また、本明細書で使用される語法および専門用語は説明のみのためであって、限定と見なすべきではないことが理解される。
【００３１】
ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）は、ＮＦ−κＢ活性を刺激することが可能であるセリン／スレオニンキナーゼである（Malininら、Nature 385:540-544, 1997）。初期の研究は、ＮＩＫがＮＦ−κＢ２／ｐ１００のタンパク質分解性プロセシング、それゆえに、ｐ５２；ＲｅｌＢなどのＮＦ−κＢダイマーの精製を誘導することを示した。最近、Ramakrishnanら（Immunity 21:477-489, 2004）は、ＮＦ−κＢダイマーを活性化する特異的インデューサーによって開始される近接するシグナル伝達事象の独特なセットにＮＩＫが関与することを示した。
【００３２】
本発明を実務に限定することはないが、本発明者らは、驚くべきことにかつ予想外に、ＮＩＫが哺乳動物細胞中でヒト２０ＳプロテアソームのＣ８サブユニット（ＨＣ８）を結合することが可能なこと（実施例１）、およびこのような結合がＨＣ８リン酸化の活性化を生じることができること（実施例２）を明らかにした。このようなＨＣ８リン酸化は、２６Ｓプロテアソーム活性と関連しているので（本明細書中上記の序論に記載されているように）、本発明者らは、ＮＩＫ−ＨＣ８相互作用を調節することが、２６プロテアソームを効果的に安定化または脱安定化することができ、結果として、ＮＩＫ（これは、本明細書中上記のようにＮＦ−κＢ活性のために必要である）および／またはＮＦ−κＢ前駆体（例えば、ｐ１００）のプロテアソーム媒介性分解を増加または減少することができることを仮定した。
【００３３】
従って、本明細書の１つの態様に従って、ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患の治療方法が提供される。この方法は、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を調節することが可能である薬剤の治療有効量を、それを必要とする対象に与えることによってもたらされる。
【００３４】
「それを必要とする対象」という語句は、ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を有するか、またはＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を発症するリスクがある（すなわち、素因がある）哺乳動物、好ましくはヒトの対象をいう。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、このような用語が適用される疾患、障害、もしくは状態、またはこのような障害もしくは状態の１つ以上の徴候を逆転し、軽減し、その進行を阻害し、または予防することをいう。「処置」または「治療」という用語は、対象を治療する行為をいう。
【００３６】
ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患は、ＮＦ−κＢ活性によって誘導、増強、または抑制される任意の疾患、障害、または状態であり得る。ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患には、免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、喘息、および炎症性腸疾患）、および癌［Barnes P.J., N Engl J Med. 336:1066-1071, 1997; Brandら、J Clin Invest. 97:1715-1722, 1996; Remick D G. J Crit Care. 10:198-212, 1995; Behlら、J Neural Transm Suppl.49:125-134, 1997; Brandら、Arterioscler Thromb Vasc Biol.17:1901-1909, 1997; Kaltschmidtら、J Neuroimmunol.55:99-106, 1994; Luqueら、Semin Cancer Biol.8:103-111, 1997;およびRulandおよびMak, Semin. Immunol.3:177-183, 2003］が含まれるがこれらに限定されない。
【００３７】
本明細書中上記に言及されるように、本発明は、ＮＦ−κＢ活性の減少または上昇と関連する疾患の治療を可能にする。疾患がＮＦ−κＢ活性の減少と関連する場合（例えば、種々の型の免疫不全）において、対象は、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を解離するか、またはその形成を妨害することが可能な薬剤を用いて治療することができる。このような薬剤を用いる治療は、ＮＩＫ依存性ＨＣ８リン酸化を抑制し、それによって、２６Ｓプロテアソームを不安定化し、ＮＩＫの分解の減少、ＮＦ−κＢの分解の減少、および／またはＮＩＫの活性化の変化を生じる。
【００３８】
このような薬剤は、ＨＣ８またはＮＩＫを結合することが可能な抗体または抗体フラグメントであり得る。好ましくは、この抗体は、ＮＩＫまたはＨＣ８の少なくとも１つのエピトープを特異的に結合する。より好ましくは、この抗体は、ＨＣ８のＮＩＫ結合部位の少なくとも１つのエピトープ、またはＮＩＫのＨＣ８結合部位の少なくとも１つのエピトープを特異的に結合する。最も好ましくは、この抗体は、配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０または６５０〜９４７によって含まれる抗原に特異的に結合し、この配列は好ましくは、２００アミノ酸以下の長さである。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原性決定基をいう。
【００４０】
エピトープ決定基は、アミノ酸または炭化水素の側鎖などの分子の化学的に活性な表面の配置から構成され、通常、三次元的な構造特性ならびに特定の電荷の特性を有する。ＮＩＫまたはＨＣ８の好ましいエピトープは、例えば、実施例２に記載されるＮＩＫ  Ｃ末端またはＮＩＫ  Ｎ末端の結合部位（それぞれアミノ酸６５０〜９４７および１〜１８０中）などのＮＩＫ−ＨＣ８結合部位を含むものである。
【００４１】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなどのインタクトな分子ならびにその機能的フラグメントを含む。これらの機能的抗体フラグメントは以下のように定義される：（１）Ｆａｂ、これは抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメントであり、酵素パパインを用いる全抗体の消化によって産生され、インタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部を生じることができる；（２）Ｆａｂ’、ペプシンを用いて全抗体を処理することによって得ることができる抗体分子のフラグメントであり、還元後にインタクトな軽鎖および重鎖の一部を生じる；抗体分子につき、２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；（３）（Ｆａｂ’）２、酵素ペプシンを用いて全抗体を処理することによって得ることができ、引き続く還元を伴わない；Ｆ（ａｂ’）２は２つのジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；（４）Ｆｖ、２つの鎖として発現される、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；ならびに（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝子で融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子。
【００４２】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそれらのフラグメントを産生する方法は、当該分野において周知である（例えば、参照により本明細書に援用される、HarlowおよびLane,Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照されたい）。
【００４３】
本発明に従う抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解的加水分解またはＥ．ｃｏｌｉもしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞または他のタンパク質発現系）中での発現によって調製することができる。抗体フラグメントは、従来的な方法によって、全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンを用いての抗体の酵素的切断によって産生することができ、Ｆ（ａｂ’）２を示す５Ｓフラグメントを提供する。このフラグメントは、チオール還元剤、および選択的に、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のためのブロッキング基を使用してさらに切断され、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントを産生することができる。代替的には、ペプシンを使用する酵素的切断は、一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントを直接的に産生する。これらの方法は、例えば、Goldenberg，米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号ならびにそこに含まれる引用文献によって記載され、これらの特許は、その全体が参照により本明細書に援用される。Porter, R.R.［Biochem. J. 73:119-126 (1959)］もまた参照されたい。抗体を切断する他の方法、例えば、一価軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝子的技術もまた、インタクトな抗体によって認識される抗原にフラグメントが結合する限り、使用されてもよい。
【００４４】
ＦｖフラグメントはＶＨ鎖およびＶＬ鎖の結合を含む。この結合は、Inbarら、［Proc.  Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (1972)］において記載されたように一価であってもよい。代替的には、可変鎖は、分子内ジスルフィド結合によって連結するか、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって接続されるＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されるＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、これは引き続いて、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞に導入される。
【００４５】
本発明によって利用される抗体は、好ましくは、哺乳動物細胞に送達されるか、またはそこで発現されることが可能である抗体フラグメントである。従って、ｓｃＦｖ  Ａｂコード配列は、好ましくは、哺乳動物細胞中でのＮＩＫまたはＨＣ８  ｓｃＦｖフラグメントの発現のために適切であるベクターに含まれる（発現ベクターの構築についての詳細については本明細書中以下を参照のこと）。適切なｓｃＦｖ発現ベクターは、例えば、ｐＩＧ６［Ge：in Antibody Engineering（Boreback C.A.K ed.）２nd ed.pp 229-261, 1995 Oxford university］、ｐＦａｂ５ｃ、またはKhoshar（PNAS 99:1002-1007, 2002）によって記載されたｐｃＤＮＡ３．１であり得る。
【００４６】
組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを用いて単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖを産生するための方法は、例えば、WhitlowおよびFilpula, Methods 2:97-105(1991); Birdら、Science 242:423-426(1988); Packら、Bio/Technology 11:1271-77(1993);および米国特許第４，９４６，７７８号によって記載されている。
【００４７】
抗体フラグメントの別の型は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。このような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される。例えば、LarrickおよびFry［Methods, 2:106-10(1991)］を参照のこと。
【００４８】
非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化型は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合サブ配列）であり、これらは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基が、所望の特異性、親和性、および収容能力を有する、マウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）からの残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体において見い出されないか、または取り込まれたＣＤＲ配列もしくはフレームワーク配列においても見い出されない残基を含んでもよい。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的には２つのの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここでは、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのそれに一致し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである。ヒト化抗体はまた、最適には、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む［Jonesら、Nature, 321:522-525(1986); Riechmannら、Nature, 332:323-329(1988); およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol， 2:593-596(1992)］。
【００４９】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当該分野において周知である。一般的には、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそこに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、インポート残基とよばれ、これは、インポート可変ドメインから取られる。ヒト化は、Winterおよび共同研究者の方法［Jonesら、.,Nature, 321:522-525(1986); Riechmannら、Nature 332:323-327(1988); Verhoeyenら、Science, 239:1534-1536(1988)］にしたがって、ヒト抗体の対応する配列の代わりに齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによって、本質的に実施することができる。従って、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここでは、実質的にインタクトなヒト可変ドメイン未満のものが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際上、ヒト化抗体は、典型的には、あるＣＤＲ残基およびおそらくあるＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似の部位からの残基によって置き換えられているヒト抗体である。
【００５０】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該分野において公知である種々の技術を使用して産生することができる［HoogenboomおよびWinter, J. MoI. Biol, 227:381(1991); Marksら、J. Mol. Biol., 222:581(1991)］。ColeらおよびBoernerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である［Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77(1985)およびBoernerら、J. Immunol, 147(l):86-95(1991)］。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されているマウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によって作製することができる。チャレンジの際に、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子再構成、アセンブリー、および抗体レパートリーを含むすべての点で、ヒトにおいて見られるものと密接に類似している。このアプローチは、例えば、以下において記載されている：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、以下の科学刊行物：Marksら、Bio/Technology 10,:779-783(1992); Lonbergら、Nature 368:856-859(1994); Morrison, Nature 368 812-13(1994); Fishwildら、Nature Biotechnology 14,845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996);およびLonbergおよびHuszar, Intern. Rev. Immunol.13, 65-93(1995)。
【００５１】
本発明の抗体はまた、本明細書中上記に記載されるように、当該分野において公知である標準的な方法を使用して、ＮＩＫまたはＨＣ８特異的ポリクローナル抗血清を最初に産生することによって生成することができる。次いで、抗血清アリコートは、複数のモノ−特異的ポリクローナル抗体のサブセット（各々が１つまたはいくつかのＮＩＫまたはＨＣ８のエピトープを特異的に認識する）を精製するために、各々がＮＩＫまたはＨＣ８の特異的アミノ酸部分を含む複数のアフィニティー結合カラムを通過させる。次いで、これらのサブセットは、本明細書中以下に記載されるような方法を使用して、哺乳動物細胞中で、ＮＩＫ−ＨＣ８結合を破壊するか、またはＮＩＫ−ＨＣ８複合体を解離する能力についてスクリーニングおよび選択を行う。
【００５２】
ＮＩＫ−ＨＣ８複合体の形成を妨害することが可能である薬剤はまた、ＮＩＫまたはＨＣ８の発現を抑制することが可能である小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子であり得る。ＲＮＡ干渉は２段階プロセスである。開始段階と呼ばれる第１段階では、インプットｄｓＲＮＡは、おそらくＤｉｃｅｒの作用によって、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に消化される。このＤｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡ−特異的リボヌクレアーゼのＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーであり、ｄｓＲＮＡ（直接的にまたは導入遺伝子もしくはウイルスを介して導入される）をＡＴＰ依存的な様式でプロセスする（切断する）。連続的な切断事象は、ＲＮＡを、各々が２−ヌクレオチド３’突出を有する１９〜２１ｂｐ二重鎖（ｓｉＲＮＡ）に分解する［HutvagnerおよびZamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232(2002); およびBernstein Nature 409:363-366(2001)］。
【００５３】
エフェクター段階において、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ヌクレアーゼ複合体に結合して、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡのＡＴＰ依存性の巻き戻しが、ＲＩＳＣの活性化のために必要である。次いで、活性型のＲＩＳＣが、塩基対相互作用によって相同転写物を標的とし、ｍＲＮＡを、ｓｉＲＮＡの３’末端から１２ヌクレオチドフラグメントに切断する［HutvagnerおよびZamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232(2002); Hammondら、(2001) Nat. Rev. Gen. 2:110-119(2001);およびSharp Genes. Dev. 15:485-90(2001)］。切断のメカニズムはまだ説明されるべきものであるが、研究は、各ＲＩＳＣが単一のｓｉＲＮＡおよびＲＮａｓｅを含むことを示している［HutvagnerおよびZamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232(2002)］。
【００５４】
ＲＮＡｉの顕著な効力のために、ＲＮＡｉ経路中の増幅段階が示唆されてきた。増幅は、より多くのｓｉＲＮＡを生成するインプットｄｓＲＮＡのコピーを行うこと、または形成されたｓｉＲＮＡの複製によって起こり得る。代替的に、または加えて、増幅は、ＲＩＳＣの複数のターンオーバー事象によってもたらされることができる［Hammondら、Nat. Rev. Gen. 2:110-119(2001), Sharp Genes. Dev.15:485-90(2001); HutvagnerおよびZamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232(2002)］。ＲＮＡｉに関するさらなる情報については、以下の概説を参照のこと：Tuschl ChemBiochem.２:239-245(2001); Cullen Nat. Immunol. 3:597-599(2002);および Brantl Biochem. Biophys. Act. 1575:15-25(2002)。
【００５５】
本発明を用いる使用のために適切なＲＮＡｉ分子の合成は、以下のように行うことができる。最初に、ＮＩＫまたはＨＣ８のｍＲＮＡ配列を、ＡＡジヌクレオチド配列について、ＡＵＧ開始コドンの下流をスキャンする。各ＡＡおよび３’隣接１９ヌクレオチドの存在を、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位は、オープンリーディングフレームから選択する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、調節タンパク質結合部位が豊富だからである。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合と干渉する可能性がある［Tuschl ChemBiochem.2:239-245］。しかし、５’ＵＴＲに向けられたｓｉＲＮＡが、細胞ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの約９０％の減少を媒介し、かつタンパク質レベルを完全に消滅させたＧＡＰＤＨについて実証されたように（www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html）、非翻訳領域に向けられたｓｉＲＮＡもまた、有効である可能性があることが認められる。
【００５６】
２番目に、潜在的な標的部位は、任意の配列アラインメントソフトウェア、例えば、ＮＣＢＩサーバーから利用可能なＢＬＡＳＴソフトウェア（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を使用して、適切なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較される。他のコード配列に対して有意な相同性を示す推定の標的部位は、フィルターにかけて除去する。
【００５７】
適格である標的配列は、ｓｉＲＮＡ合成のための鋳型として選択される。好ましい配列は、低いＧ／Ｃ含量を含むものである。なぜなら、これらは、５５％よりも高いＧ／Ｃ含量を有するものと比較して、遺伝子サイレンシングを媒介する際により有効であることが判明したからである。いくつかの標的部位は、好ましくは、評価のために標的遺伝子の長さに沿って選択される。選択されたｓｉＲＮＡのより良好な評価のために、好ましくは、ネガティブコントロールが同時に使用される。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡは、好ましくは、ｓｉＲＮＡとしては同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムに対する有意な相同性を欠く。従って、任意の他の遺伝子に対するいかなる有意な相同性も示さないならば、ｓｉＲＮＡのスクランブルヌクレオチド配列が好ましく使用される。例として、本発明の教示に従う、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を破壊するか、またはその形成を妨害するために使用することができるｓｉＲＮＡ配列は、配列番号１−２（センス／アンチセンス）および配列番号３−４（センス／アンチセンス）に示される。
【００５８】
ＮＩＫ−ＨＣ８複合体の形成を妨害することが可能である別の薬剤は、ＮＩＫまたはＨＣ８をコードするｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡ配列を特異的に切断することが可能なＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖と二本鎖の両方の標的配列を切断することが可能である一本鎖ポリヌクレオチドである（Breaker, R.R.およびJoyce, G. Chemistry and Biology 1995; 2:655; Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997; 943:4262）。ＤＮＡザイムについての一般的モデル（「１０〜２３」モデル）が提案されている。「１０〜２３」ＤＮＡザイムは、各々７個から９個のデオキシリボヌクレオチドの２つの基質認識ドメインが隣接する、１５個のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。この型のＤＮＡザイムは、プリン：ピリミジン結合においてその基質ＲＮＡを効率的に切断することができる（Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199；ＤＮＡザイムの概説については、Khachigian, LM［Curr Opin Mol Ther 4:119-21(2002)を参照されたい］）。
【００５９】
合成の、操作された、ＤＮＡザイムが認識する単鎖かつ二本鎖の標的切断部位の構築および増幅の例は、Joyceらへの米国特許第６，３２６，１７４号において開示されている。ヒトウロキナーゼレセプターに対して指向される同様の設計のＤＮＡザイムは、ウロキナーゼレセプター発現を阻害することが最近観察され、インビボで結腸癌細胞の転移を首尾よく阻害する（Itohら、2002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.org）。別の応用において、ｂｃｒ−ａｂｌオンコジーンに相補的なＤＮＡザイムは、白血病細胞におけるオンコジーン発現を阻害すること、ならびに、ＣＭＬおよびＡＬＬの場合において、自系骨髄移植における再発率を減少することに成功した。
【００６０】
ＮＩＫ−ＨＣ８複合体の形成を妨害することはまた、ＮＩＫまたはＨＣ８をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることが可能なアンチセンスポリヌクレオチドを使用することによってもたらすことができる。
【００６１】
このようなアンチセンス分子の設計は、アンチセンスアプローチに対して重要である２つの局面を考慮しながら行わなければならない。第１の局面は、適切な細胞の細胞質へのオリゴヌクレオチドの送達であるのに対して、第２の局面は、細胞中で、その翻訳を阻害するようなやり方で、設計されたｍＲＮＡを特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
【００６２】
先行技術は、広範な種々の細胞型にオリゴヌクレオチドを効率的に送達するために使用することができる多数の送達ストラテジーを教示する［例えば、Luft J Mol Med 76:75-6(1998); Kronenwettら、Blood 91:852-62(1998)；Rajurら、Bioconjug Chem 8:935-40(1997)；Lavigneら、Biochem Biophys Res Commun 237:566-71(1997)およびAokiら、(1997) Biochem Biophys Res Commun 231:540-5(1997)を参照のこと］。
【００６３】
加えて、標的ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドの両方における構造的な変化のエネルギー論を説明する熱力学サイクルに基づいて、それらの標的ｍＲＮＡについての最大予測結合親和性を有する配列を同定するためのアルゴリズムもまた利用可能である［例えば、Waltonら、Biotechnol Bioeng 65:1-9(1999)を参照のこと］。
【００６４】
このようなアルゴリズムは、細胞におけるアンチセンスアプローチを実行するために首尾よく使用されてきた。例えば、Waltonらによって開発されたアルゴリズムは、ウサギβグロビン（ＲＢＧ）およびマウス腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の転写物についてのアンチセンスオリゴヌクレオチドを科学者達が首尾よく設計することを可能にした。同じ研究グループは、３つのヒト標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸脱水素酵素ＡおよびＢならびにラットｇｐ１３０）に対して合理的に選択されたオリゴヌクレオチドの細胞培養中でのアンチセンス活性が、反応速度論的ＰＣＲによって評価されるように、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドケミストリーを用いて、２つの細胞型における３つの異なる標的に対しての試験を含む、ほぼすべての場合において有効であると判明したことを最近報告した。
【００６５】
加えて、インビトロ系を使用して特定のオリゴヌクレオチドの効率を設計および予測するためのいくつかのアプローチもまた公開されている［Matveevaら、Nature Biotechnology 16:1374-1375(1998)］。
【００６６】
いくつかの臨床試験は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実行可能性、および活性を実証してきた。例えば、癌の治療のために適切であるアンチセンスオリゴヌクレオチドが首尾よく使用されてきたのに対して［Holmundら、Curr Opin Mol Ther 1:372-85(1999)］、ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３、およびＢｃｌ−２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを介する血液学的悪性腫瘍の治療は臨床試験に入っており、患者によって許容されることが示されてきた［Gerwitz Curr Opin Mol Ther 1:297-306(1999)］。
【００６７】
より最近では、ヒトへパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介抑制が、マウスモデルにおけるヒト癌細胞の胸膜播種を阻害することが報告されている［Unoら、Cancer Res 61:7855-60(2001)］。
【００６８】
従って、現在のコンセンサスは、上記に記載されるように、アンチセンス技術の分野における最近の発展は、高度に正確なアンチセンス設計アルゴリズムの生成、および広範な種々のオリゴヌクレオチド送達系の生成に導いており、当業者が、過度の試行錯誤実験に頼る必要なしに、既知の配列の発現を下方制御するために適切であるアンチセンスアプローチを設計および実行すること可能にする。
【００６９】
ＮＩＫ−ＨＣ８複合体の形成を妨害することが可能であるさらに別の薬剤は、ＮＩＫまたはＨＣ８をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することが可能なリボザイム分子である。リボザイムは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的阻害のためにますます増加して使用されている［Welchら、Curr Opin Biotechnol.9:486-96(1998)］。任意の特定の標的ＲＮＡを切断するリボザイムを設計する可能性は、基礎研究と治療的適用の両方においてリボザイムを価値のあるツールにする。治療分野において、リボザイムは、感染性疾患におけるウイルスＲＮＡ、癌における優性発癌遺伝子、および遺伝的障害における特定の体細胞変異を標的とするように利用されてきた［Welchら、Clin Diagn Virol.10:163-71(1998)］。最も顕著には、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコールは、すでにフェーズ１臨床試験中である。より最近では、リボザイムは、トランスジェニック動物研究、遺伝子標的確証、および経路の解明のために使用されてきた。いくつかのリボザイムは、臨床試験の種々の段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒトの臨床試験において研究された最初の化学合成されたリボザイムである。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、特に、血管形成経路において鍵となる成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮増殖因子レセプター）の形成を阻害する。リボザイム  ファーマシューティカル社（Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.）および本発明者らの会社は、動物モデルにおける抗血管形成治療剤の重要性を実証してきた。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するように設計されたリボザイムであるＨＥＰＴＡＺＹＭＥは、細胞培養アッセイにおいて、Ｃ型肝炎ウイルスを減少させる際に有効であることが見出された（リボザイム  ファーマシューティカル社−ＷＥＢホームページ）。
【００７０】
本発明を用いる使用のために適切であるオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなど）の合成は当該分野において周知の日常的な方法を使用して行うことができ、例えば、P. Herdewijn, Ed., Oligonucleotide Synthesis, Humana Press, 2004において特定される。
【００７１】
ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を破壊すること、またはその形成を妨害することはまた、ＮＩＫを結合することが可能であるＨＣ８由来のアミノ酸配列、またはＨＣ８を結合することが可能であるＮＩＫ由来のアミノ酸配列を含むペプチドを使用して行うことができる。より好ましくは、このペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸６５０〜９４７または１〜１８０によって含まれるＮＩＫ−由来のアミノ酸配列である。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は交換可能に使用され、ネイティブなペプチド（分解産物、合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）およびペプチド模倣物（典型的には、合成的に合成されたペプチド）、例えば、ペプトイドおよびセミペプトイドを含み、これらは、例えば、身体中にある間、ペプチドをより安定にするかまたはより免疫原性でなくする修飾を有してもよい、ペプチドアナログである。このような修飾には以下が含まれるがこれらに限定されない：環化、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ＣＨ2−ＮＨ、ＣＨ2−Ｓ、ＣＨ2−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ2−Ｏ、ＣＨ2−ＣＨ2、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＦ＝ＣＨを含むがこれらに限定されないペプチド結合修飾、バックボーン修飾、および残基修飾。哺乳動物のＨＣ８（例えば、GeneBank Accession Number XM_０５０９４７）およびＮＩＫ（例えば、GeneBank Accession Number Y１０２５６）のアミノ酸配列は容易にアクセス可能である。本発明を用いる使用のために適切なペプチド分子の合成は、当該分野において周知の日常的な方法を使用して行うことができ、例えば、C.A. Ramsden Ed, Quantitative Drug Design, Chapter 17.2，F. Choplin Pergamon Press, 1992において特定される。
【００７３】
疾患がＮＦ−κＢ活性の増加と関連する場合において（例えば、ホジキンリンパ腫および多くの他の型の癌；慢性炎症性疾患、例えば、クローン病および関節リウマチ）、対象は、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を安定化するか、またはその形成を増強することが可能な薬剤を用いて治療することができる。このような薬剤を用いる治療は、ＮＩＫ依存性ＨＣ８リン酸化を促進し、それによって２６Ｓプロテアソームを安定化し、ＮＩＫおよび／またはＮＦ−κＢの分解の増加を生じる。
【００７４】
ＮＩＫ−ＨＣ８複合体を安定化するか、またはその形成を増強することが可能な適切な薬剤は、ＮＩＫまたはＨＣ８をコードするポリヌクレオチドであり得る。代替的には、この薬剤は、ＮＩＫまたはＨＣ８の少なくとも活性部分、またはその複合体形成部分を含むポリペプチドであり得る。
【００７５】
本明細書中上記に言及されるように、ＮＩＫ−ＨＣ８複合体形成は、ＨＣ８のリン酸化の増加、結果として２６Ｓプロテアソームの安定性および活性をもたらす。
【００７６】
従って、本発明はまた、ＮＩＫ依存性ＨＣ８リン酸化を増加または減少させることによって、２６プロテアソームを安定化または不安定化することを想定する。ＮＩＫ依存性ＨＣ８リン酸化を変化させるために利用されてもよい薬剤には、例えば、キナーゼ活性を欠くＮＩＫ変異体またはＮＩＫ−ＨＣ８標的化キナーゼインヒビターが含まれる。
【００７７】
本発明の薬剤は、それ自体で、または医薬組成物の一部（活性成分）としてＮＦ−κＢ関連疾患の治療において使用することができる。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」とは、生理学的に適切なキャリアおよび賦形剤などの他の化学成分を伴う、本明細書に記載される１種以上の活性成分の調製物をいう。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【００７９】
本明細書中以後では、交換可能に使用されてもよい語句「生理学的に受容可能なキャリア」および「薬学的に受容可能なキャリア」は、生物に対して顕著な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性および特性を無効にしない、キャリアまたは希釈剤をいう。アジュバントは、これらの語句に含まれる。
【００８０】
本明細書では、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に加えられる不活性物質をいう。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種々の型のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００８１】
薬物の製剤化および投与のための技術は、参照により本明細書に援用される、「Remington's Pharmaceutical Sciences」Mack Publishing Co., Easton, PA、最新版において見い出されてもよい。
【００８２】
投与の適切な経路には、例えば、経口、直腸、経粘膜、とりわけ経鼻、腸または非経口的送達が含まれ、筋肉内、皮下および髄内の注射、ならびにくも膜下腔内、直接的脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内の注射が含まれる。
【００８３】
代替的には、全身的な様式であるよりはむしろ局所的に、例えば、患者の骨組織領域への直接的な医薬組成物の注射を介して、医薬組成物を投与してもよい。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、当該分野において周知のプロセスによって、例えば、従来的な混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、すりつぶし、乳化、カプセル化、包接、または凍結乾燥のプロセスによって、製造されてもよい。
【００８５】
従って、本発明に従う使用のための医薬組成物は、薬学的に使用することができる調製物への活性成分の加工を容易にする、賦形剤および補助剤を含む１種以上の薬学的に受容可能なキャリアを使用して従来的な様式で製剤化されてもよい。適切な製剤は、選択された投与の経路に依存する。
【００８６】
注射のために、医薬組成物の活性成分は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンガー液、または生理学的塩緩衝液などの生理学的に適合性である緩衝液中で製剤化されてもよい。本発明の医薬組成物のために適している投与の１つの経路は、Erikksonの米国特許第６，５２５，０３０号に記載されるような、骨膜下注射である。経粘膜投与のために、バリアに対して透過するための適切な浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は、当該分野において一般的に公知である。
【００８７】
経口投与のために、医薬組成物は、当該分野において周知である薬学的に受容可能なキャリアと活性化合物を合わせることによって容易に製剤化することができる。このようなキャリアは、患者による経口摂取のために、医薬組成物が、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、リキッド、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化されることが可能である。経口使用のための薬理学的調製物は、所望される場合、錠剤または糖衣錠コアを得るために、適切な補助剤を加えた後で、固体賦形剤を使用し、選択的に、得られる混合物を粉砕し、および顆粒の混合物を加工して作製することができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、ライススターチ、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に受容可能なポリマーである。所望される場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、もしくはアルギン酸、またはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤が加えられてもよい。本明細書で使用される場合、「経口投与」という用語は、舌、歯茎、口蓋、または他の口腔表面を含む任意の口の表面への薬学的化合物の投与を含む。経口投与のさらなる方法は、口腔表面の組織と適合可能であるミスト、スプレー、または懸濁物中での医薬組成物の供給を含む。
【００８８】
糖衣錠コアは適切なコーティングとともに供給される。この目的のために、濃縮糖溶液が使用されてもよく、これは、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含んでもよい。染料および色素は、活性化合物用量の同定のため、またはその異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠のコーティングに加えられてもよい。
【００８９】
経口的に使用することができる医薬組成物には、ゼラチンで作られた押し込み型カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から作られたソフト密封カプセルが含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意に安定剤と混合した活性成分を含んでもよい。ソフトカプセルにおいては、活性成分は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁されてもよい。加えて、安定剤が加えられてもよい。経口投与のためのすべての製剤は、選択された投与の経路のために適切な投薬量であるべきである。
【００９０】
口腔投与のために、組成物は、従来的な様式で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態を取ってもよい。
【００９１】
鼻吸入による投与のために、本発明に従う使用のための活性成分は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、または二酸化炭素の使用を伴って、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提供の形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合において、投薬量単位は、計量した量を送達するためのバルブを提供することによって決定されてもよい。例えば、ディスペンサー中での使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物、およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含めて製剤化されてもよい。
【００９２】
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化されてもよい。注射のための製剤は、選択的に保存料を加えた単位剤形、例えば、アンプルまたは複数用量容器中で提供されてもよい。この組成物は、油性または水性の媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンであってもよく、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤用薬剤を含んでもよい。
【００９３】
非経口投与のための医薬組成物は、水溶性型の活性調製物の水溶液を含む。加えて、活性成分の懸濁液は、適切な油または水ベースの注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセリド、またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増加する物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含んでもよい。選択的に、この懸濁液はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、適切な安定剤または活性成分の溶解度を増加させる薬剤を含んでもよい。
【００９４】
代替的には、活性成分は、使用前に、適切な媒体、例えば、滅菌した、発熱物質なしの水ベースの溶液を用いる構成のために、粉末型であってもよい。
【００９５】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来的な坐剤ベースを使用して、坐剤または保持浣腸剤などの直腸組成物中で製剤化されてもよい。
【００９６】
本発明の状況における使用のために適切な医薬組成物は、意図された目的を達成するために活性成分が有効量で含まれる組成物を含む。より詳細には、治療有効量とは、障害（例えば、乳房腫瘍の進行）の徴候を予防、軽減もしくは改善するため、または治療される対象の生存を延長するために有効な活性成分（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の量を意味する。
【００９７】
治療有効量の決定は、とりわけ、本明細書に提供される詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００９８】
本発明の方法において使用される任意の調製物のために、治療有効量または用量は、インビトロアッセイまたは細胞培養アッセイから最初に見積もることができる。本明細書に記載される活性成分の毒性および治療的効力は、インビトロ、細胞培養、または実験動物において、標準的な薬学的手順によって決定することができる。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイ、および動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を処方する際に使用することができる。この投薬量は、利用される剤形および利用される投与の経路に依存して変化する可能性がある。正確な処方、投与の経路、および投薬量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択可能である（例えば、Finglら、1975,“The Pharmacological Basis of Therapeutics”Ch.１ p.１」を参照のこと）。
【００９９】
投薬量および間隔は、例えば、芽球性転移の場合においては、腫瘍の進行を遅らせるために十分である活性成分のレベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）に、個々に調整されてもよい。ＭＥＣは各調製物について変化するが、インビトロデータから見積もることができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個体の特性および投与の経路に依存する。検出アッセイは、血漿濃度を決定するために使用することができる。
【０１００】
治療される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回の投与であり得、治療のコースは、数日間から数週間続き、または疾患状態の減少が達成される。
【０１０１】
投与される組成物の量は、当然、治療される対象、苦痛の重篤度、投与の様式、主治医の判断などに依存する。
【０１０２】
本発明の組成物は、所望される場合、活性成分を含む１つ以上の単位剤形を含んでもよい、ＦＤＡ認可キットなどのパックまたはディスペンサーデバイス中で提供されてもよい。このパックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。このパックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随してもよい。このパックまたはディスペンサーはまた、製造を監督する政府機関によって指示された形式で容器に付随する注意書によって適合されてもよく、この注意書は組成物の形態またはヒトもしくは獣医学的な投与の監督機関による認可を反映する。このような注意書は、例えば、処方薬についての米国食品医薬品局によって認可されたラベル、または認可された製品の挿入物であり得る。適合可能な薬学的キャリア中で製剤化された本発明の調製物を含む組成物はまた、上記でさらに詳述されるように、調製され、適切な容器中に配置され、および示された状態の治療について標識されてもよい。
【０１０３】
本明細書中上記に記載される方法の実施、および／または上記の医薬組成物の製造を容易にするために、本発明はさらに、ＮＦ−κＢ活性と関連する疾患を治療するため、および／または異常なプロテアソーム活性と関連する疾患を治療するために、新規な薬物候補を同定する方法を提供する。
【０１０４】
この方法は、哺乳動物細胞おいてＮＩＫ−ＨＣ８複合体を解離するか、またはその形成を妨害する能力について、複数の分子、好ましくは、小分子化学物質、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、または抗体をスクリーニングすることによってもたらされる。スクリーニングは、ＨＣ８およびＮＩＫを同時発現する培養細胞の溶解物中で同時免疫沈殿アッセイを使用して行われてもよい。例示的なスクリーニングアッセイは、本明細書中以下の実施例の節の実施例１に詳細に記載されている。代替的には、薬物候補は、本明細書中以下の実施例の節の実施例２に詳細に記載されているようなインビトロキナーゼアッセイを使用して、ＮＩＫ依存性ＨＣ８リン酸化を調節する能力についてスクリーニングされてもよい。
【０１０５】
一旦、ＮＩＫ依存性ＨＣ８リン酸化を調節することが可能な分子が同定されると、それらの細胞透過能力およびそれらの哺乳動物に対する毒性を決定するために、インビトロのさらなる分析が実施される。必要とされる場合、適切な薬物候補は、その細胞透過を増加させるため、およびＮＩＫ依存性ＨＣ８リン酸化を調節する際にその活性に実質的に影響を与えることなく毒性を減少させるために修飾される。
【０１０６】
本発明のさらなる目的、利点、および新規な特徴は、限定を意図するものではない以下の実施例の精査の際に、当業者に対して明らかになる。加えて、本明細書中以下に描写され、および上記の特許請求の範囲の節において特許請求されるような本発明の種々の実施形態および局面の各々は、以下の実施例において実験的なサポートを見出す。
【実施例】
【０１０７】
ここで、以下の実施例に対する参照がなされ、この実施例は、上記の説明と一緒に、非限定的な様式で本発明を例証する。
【０１０８】
一般的に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験室手順は、分子的、生化学的、微生物学的、および組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は文献中に徹底的に説明されている。例えば、以下を参照のこと：“Molecular Cloning：A laboratory Manual”Sambrookら(1989);“Current Protocols in Molecular Biology”Volumes I-III Ausubel, R.M., ed.(1994); Ausubelら、“Current Protocols in Molecular Biology”John WileyおよびSons, Baltimore, Maryland(1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”John Wiley & Sons, New York(1988); Watsonら、“Recombinant DNA」Scientific American Books,New York；Birren et al.（eds）“Genome Analysis：A Laboratory Manual Series”Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998);米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号；および同第５，２７２，０５７号に示されるような方法論；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994);“Current Protocols in Immunology”Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994); Stites et al.（eds）, “Basic and Clinical Immunology”(8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994); MishellおよびShiigi (eds),“Selected Methods in Cellular Immunology”W. H. Freeman and Co., New York(1980);利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されており、例えば、以下を参照されたい：米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号；および同第５，２８１，５２１号；“Oligonucleotide Synthesis”Gait, M.J., ed. (1984);“Nucleic Acid Hybridization”Hames, B.D., およびHiggins S.J., eds.(1985);“Transcription and Translation”Hames, B.D.,およびHiggins S.J., Eds. (1984);“Animal Cell Culture”Freshney, R.L, ed. (1986);“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press, (1986);“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal, B., (1984)および“Methods in Enzymology”Vol.1-317, Academic Press；“PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications”Academic Press, San Diego, CA(1990); Marshakら、“Strategies for Protein Purification and Characterization−A Laboratory Course Manual”CSHL Press (1996);これらのすべてはあたかも全体が本明細書に示されるように参照により援用される。他の一般的な参考文献はこの文書全体を通して提供される。そこに示される手順は当該分野において周知であると考えられており、読者の便宜のために提供される。そこに含まれるすべての情報は参照により本明細書に援用される。
【０１０９】
実施例１
ＮＩＫは２０ＳプロテアソームのＨＣ８サブユニットと相互作用する
材料および実験手順
構築物：ＮＩＫ−Ｎ末端６ｍｙｃタグを有するｐＣＳ３ＭＴＮＩＫ、ａｌｙ  ＮＩＫ、キナーゼｄｅａｄ  ＮＩＫ、ＮＩＫ  Ｋ６７０Ａ、およびＳｎｉＰ  ＮＩＫ  Ｈ６７４Ｙの構築物を、ｐＣＳ３ＭＴＮＩＫから、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する部位特異的変異誘発によって、製造業者のプロトコール（ストラタジーン）を使用して生成した。
【０１１０】
ＨＣ８は、２ハイブリッドプレイから、Ｎ末端にＨＩＳタグを有するｐＣＤＮＡ３ベクターにサブクローニングし、次いで、Ｃ末端に加えられたｍｙｃタグを有するＰＣＤＮＡ３にサブクローニングした。
【０１１１】
ＨＣ８  ＳＳ  ２４３，２５０ＡＡ変異体は、部位特異的変異誘発によって生成した。すべてのＮＩＫ欠失は、対応する領域の制限消化によって、またはＰＣＲ増幅のいずれかによって作製し、ｐＣＤＮＡ−ＨＩＳベクターにクローニングした。
【０１１２】
酵母２ハイブリッドスクリーニングアッセイ：ＮＩＫまたはその欠失を、ベイトとしてｐＧＢＫＴ７ベクターにクローニングし、酵母株ＳＦＹ５２６におけるアッセイのために、プレイをｐＧＡＤＴ７ベクターに再クローニングした。スクリーニングのために使用した系は、Matchmaker version III（クローンテック）であった。このプレイは、２２〜７０歳の年齢範囲の５１例の男性／女性からプールした、あらかじめ形質転換したヒト骨髄ライブラリー（カタログ番号ＨＹ４０５３ＡＨ）であった。これは、２ハイブリッドライブラリーの新世代に属し、α−ｇａｌアッセイとともに、高ストリンジェント４倍ドロップアウト（ＱＤＯ）選択を提供する。ＬＥＵ、ＴＲＰ、ＨＩＳ、およびＡＤＥを含まないプレート上で増殖したクローンを、α−ｇａｌアッセイによって再確認した。ポジティブクローンのプラスミドを、界面活性剤および機械的ストレス、続いてＤＮＡのフェノール抽出およびエタノール沈殿を用いて、酵母細胞の溶解によって調製した。プラスミドからのコードされるインサートを、ライブラリーベクターｐＡＣＴ２について特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅した。
【０１１３】
細胞：ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞およびＨｅＬａ細胞を使用した。
【０１１４】
トランスフェクション：トランスフェクションは、Sambrookら、(Molecular cloning. A Laboratory Manual.SE.CSH press, 1989）によって記載されるように、リン酸カルシウム沈殿法を使用して行った。手短に述べると、１５０万個の２９３−Ｔ細胞を１０ｃｍプレートに播種した。２４時間のインキュベーション時間後、空のベクターを加えることによってプレートあたり１５μｇの総ＤＮＡ濃度を維持しながら、培養物をそれぞれのプラスミドでトランスフェクトした。
【０１１５】
溶解物の調製および同時免疫沈殿：細胞を、トランスフェクションの２４時間後に収集し、次いで１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶解緩衝液［（１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｃｌ（ｐＨ  ７．６）および１×完全プロテアーゼインヒビター（ロッシュ）］中で溶解した。すべての免疫沈殿を、それぞれの抗体およびプロテインＧセファロースビーズ（アマシャム  ファルマシア）を用いて、４℃で４時間のインキュベーションによって実行した。
【０１１６】
ウェスタンブロッティング：ウェスタンブロットは、ＥＣＬ（ピアス）によって発色させた。
【０１１７】
結果
酵母２ハイブリッドスクリーニングを、プレイとして、インタクトなＮＩＫ  ｃＤＮＡ（GenBank Accession No.Yｌ０２５６；配列番号５）、ＮＩＫ−Ｃ末端（配列番号５のアミノ酸６２４〜９４７）、またはＮＩＫ−Ｎ末端（アミノ酸１〜３６７）を使用して行った。これらのスクリーニングにおいて見出された最も優勢なプレイはα７サブユニット（ＨＣ８）（GenBank Accession No.XM_０５０９４７）であった。これらの相互作用は、異種酵母株、ＳＦＹ５２６において確証され、ここで、ＮＩＫ−Ｃ末端またはＮＩＫ−Ｎ末端とのＨＣ８相互作用は、全長ＮＩＫとのＨＣ８相互作用よりも実質的にはるかに強いことが見出された（以下の表１を参照のこと）。
【０１１８】
【表１】
2008525427.tif 000003
「＋＋＋＋」および「＋＋」は、それぞれ、アッセイ開始後３０分以内、および１時間での強力な色の発色（β−ｇａｌ発現）を意味する；「＋」は、アッセイ開始後３時間後での強力な色の発色を示す；「−」はアッセイ開始後２４時間以内に色の発色がないことを意味する。
【０１１９】
哺乳動物細胞におけるＮＩＫ−ＨＣ８相互作用に取り組むために、同時免疫沈殿アッセイを、ＮＩＫ（Accession No.Y１０２５６；配列番号５）および／またはＨＣ８（Accession No.XM_０５０９４７）を一過性に同時発現する２９３Ｔ細胞の溶解物中で行った。図１ａ〜ｂから明白であるように、同時免疫沈殿実験は、ＮＩＫおよびＨＣ８が二方向性様式で相互作用すること、すなわち、免疫沈殿しているＨＣ８がＮＩＫを同時沈殿させながら（図１ｂ）、免疫沈殿しているＮＩＫがＨＣ８を同時沈殿させた（図１ａ）ことを示す。ＮＩＫにおけるａｌｙ変異［これは、ＮＩＫのＣ末端におけるアミノ酸置換を引き起こす（Shikura (1999) Nat. Genet. 22:74-7）］は、ＨＣ８とのその相互作用を完全に消失した（図１ｂ）。加えて、マウスＮＩＫは、ＨＣ８への結合か可能であることが見出された（図６）。
【０１２０】
ヒトＮＩＫの欠失分析は、少なくとも２つのＨＣ８−結合領域の存在を明らかにした：１つはＮＩＫのＣ末端におけるアミノ酸６５０〜９４７中であり（図３ａ）、もう１つはＮＩＫのＮ末端のアミノ酸１〜１８０中にある（図３ｂおよび図３ｃ、４）。
【０１２１】
ＨｅＬａ細胞中で一過性に同時発現されたＭｙｃ−タグ化ＨＣ８およびＨｉｓタグ化ＮＩＫを使用する同時免疫沈殿実験は、ＮＩＫ−ＨＣ８結合が、プロテアソーム結合ＨＣ８中で起こることを示した（遊離のＨＣ８とは対照的に；図５）。ａｌｙ変異、アラニンによるリジン６７０の置き換え、または天然に存在するＮＩＫの一塩基変異多型（Ｈ６７４Ｙ）は、プロテアソーム結合ＨＣ８へのＮＩＫ結合に影響を与えなかった（図７）。
【０１２２】
実施例２
ＮＩＫはそのＣ末端の２つのセリン残基においてＨＣ８をリン酸化する
ＨＣ８は２つの保存性セリン残基、Ｓ２４３およびＳ２５０を含み、これは、カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）リン酸化の標的である（Castanoら、Biochemistry 35:3782-789, 1996）。ＮＩＫがＨＣ８をリン酸化する能力を試験するために、インビトロキナーゼアッセイを行った。
【０１２３】
材料および実験手順
インビトロキナーゼアッセイおよびウェスタンブロッティングを、本質的にRamakrishnanら、（Immunity 21:477-489, 2004）によって記載されるように実施した。
【０１２４】
結果
図２ａ〜ｂに示されるように、ＨＣ８は、インビトロキナーゼアッセイにおいて、ＮＩＫリン酸化のための基質であることが見出された。ＨＣ８上の２つのセリン残基（アミノ酸２４３および２５０）のアラニンによる置き換えは、ＨＣ８のＮＩＫ誘導性リン酸化を完全に消失させた（図２ａ）。しかし、ＨＣ８変異体はＮＩＫに結合したのに対し（野生型ＨＣ８と類似）、これはａｌｙ  ＮＩＫには結合しなかった（図２ｂ）。
【０１２５】
図８に示されるように、ＨＣ８のセリン残基２４３および２５０の変異は、ＮＩＫ誘導性の代替的なＮＦ−κＢ経路、ならびにＨＣ８およびＮＩＫの核移行を実質的に阻害した。データは、ＮＩＫ−ＨＣ８結合から生じるＨＣ８のＮＩＫ誘導性リン酸化がＮＩＫ分解を増強するように働く可能性があることをさらに示唆する。
【０１２６】
明確化のために別々の実施形態の状況で説明されている本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態の組み合わせにおいて提供されてもよいことが認められる。逆に、簡潔さのために単一の実施形態の状況で説明されている本発明の種々の特徴もまた、別々に、また任意の適切な小結合において提供されてもよい。
【０１２７】
本発明は、その特定の実施形態と組み合わせて説明されてきたが、多くの代替物、修飾、およびバリエーションが当業者に明白であることは明らかである。従って、添付の特許請求の範囲の技術思想および広い範囲に含まれる、すべてのこのような代替物、修飾、およびバリエーションを含むことが意図される。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願、ならびにGenBank Accession番号は、あたかも各々個々の刊行物、特許、もしく特許出願、またはGenBank Accession番号が具体的かつ個別に、参照により本明細書に援用されることが示されるのと同程度に、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。加えて、本願におけるいかなる参考文献の引用または同定も、このような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの認可として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
本発明は、添付の図面を参照して、例示目的のみのためにここで説明される。ここで特定の図面を詳細に参照して、示される特定のものが本発明の特定の実施形態の例として、およびその例示的な議論の目的のためであること、ならびに本発明の原理的および概念的な局面の説明の最も有用でありかつ容易に理解される説明であると考えられているものを提供することのために提示されることが強調される。この点において、本発明の根本的な理解のために必要であるものよりも詳細には本発明の構造的な詳細が示される試みはなされず、図面に付随する説明が、本発明のいくつかの型がいかにして実務上で具体化されるかを当業者に明らかにする。
図面の説明は以下の通りである：
【図１】ａ〜ｂは、ＮＩＫおよびＨＣ８で一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞中でのＮＩＫとＨＣ８の間での相互作用を図示する免疫沈殿アッセイのウェスタンブロット分析を示す。図１ａ−左のパネル−は、ＮＩＫ免疫複合体中でのＨＣ８の存在を示す。下のパネルは、ＮＩＫで同時トランスフェクトした２９３Ｔ細胞中のＨＣ８発現の増加レベルを示す全細胞溶解物である。図１ｂ−右のパネル−は、ＨＣ８免疫複合体中での野生型ＮＩＫの存在およびａｌｙ  ＮＩＫの非存在を示す。下のパネルは、全細胞溶解物におけるＮＩＫおよびａｌｙ  ＮＩＫの発現レベルを示す。
【図２】ａ〜ｂは、ＮＩＫによるＨＣ８のリン酸化を図示する免疫沈殿アッセイのウェスタンブロットを示す。図２ａ−野生型（ＷＴ）ＨＩＳ−タグ化ＨＣ８またはＳＳ２４３、２５０ＡＡ変異ＨＩＳ−タグ化ＨＣ８を、２９３Ｔ細胞中のｍｙｃタグ化ＮＩＫとともに同時発現させた。免疫沈殿は、抗ＨＩＳ抗体を使用して、それに結合したＨＣ８およびＮＩＴを沈殿させた。免疫沈殿物は、キナーゼ反応緩衝液中で、５μｃｉのγ３２Ｐ  ＡＴＰとともに、３０℃で３０分間インキュベートした。サンプルは１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写し、オートラジオグラフィーによって可視化した。その後メンブレンを、抗ＨＩＳ抗体および抗ｍｙｃ抗体でプローブした。下のパネルは、ＮＩＫとともに免疫沈殿した野生型および変異型ＨＣ８の量を示す。図２ｂは、ＨＣ８を伴うＮＩＫの同時免疫沈殿を示すが、ａｌｙ  ＮＩＫの同時免疫沈殿は示さない。全細胞溶解物中のＮＩＫおよびａｌｙ  ＮＩＴの発現レベルは下のパネルに示す。
【図３ａ】ＨＣ８に結合するヒトＮＩＫ領域の欠失分析を示す。Ｈｉｓタグに連結された、全長ＮＩＫおよびその種々の欠失変異体（示されるＮ末端およびＣ末端残基を有する）を、ＨｉｓまたはＭｙｃタグのいずれかに融合されたＨＣ８とともに、ＨｅＬａ細胞中で一過性に同時発現させ、それらの結合を、抗ＮＩＫモノクローナル抗体を使用する細胞溶解物からのＮＩＫの免疫沈殿、続いてウェスタンブロッティングによって評価した。ＮＩＫのＣ末端領域の上流のＣ８結合モチーフの存在を示す。
【図３ｂ】ＨＣ８に結合するヒトＮＩＫ領域の欠失分析を示す。Ｈｉｓタグに連結された、全長ＮＩＫおよびその種々の欠失変異体（示されるＮ末端およびＣ末端残基を有する）を、ＨｉｓまたはＭｙｃタグのいずれかに融合されたＨＣ８とともに、ＨｅＬａ細胞中で一過性に同時発現させ、それらの結合を、抗ＮＩＫモノクローナル抗体を使用する細胞溶解物からのＮＩＫの免疫沈殿、続いてウェスタンブロッティングによって評価した。キナーゼドメインがＨＣ８を結合しないことを図示する。
【図３ｃ】ＨＣ８に結合するヒトＮＩＫ領域の欠失分析を示す。Ｈｉｓタグに連結された、全長ＮＩＫおよびその種々の欠失変異体（示されるＮ末端およびＣ末端残基を有する）を、ＨｉｓまたはＭｙｃタグのいずれかに融合されたＨＣ８とともに、ＨｅＬａ細胞中で一過性に同時発現させ、それらの結合を、抗ＮＩＫモノクローナル抗体を使用する細胞溶解物からのＮＩＫの免疫沈殿、続いてウェスタンブロッティングによって評価した。ＮＩＫのアミノ酸１８７の下流のＮＩＫ−ＨＣ８結合領域を図示する。
【図３ｄ】ＨＣ８に結合するヒトＮＩＫ領域の欠失分析を示す。Ｈｉｓタグに連結された、全長ＮＩＫおよびその種々の欠失変異体（示されるＮ末端およびＣ末端残基を有する）を、ＨｉｓまたはＭｙｃタグのいずれかに融合されたＨＣ８とともに、ＨｅＬａ細胞中で一過性に同時発現させ、それらの結合を、抗ＮＩＫモノクローナル抗体を使用する細胞溶解物からのＮＩＫの免疫沈殿、続いてウェスタンブロッティングによって評価した。ＮＩＫのアミノ酸１８０の下流のＮＩＫ−ＨＣ８結合領域を図示する。
【図３ｅ】ＨＣ８に結合するヒトＮＩＫ領域の欠失分析を示す。Ｈｉｓタグに連結された、全長ＮＩＫおよびその種々の欠失変異体（示されるＮ末端およびＣ末端残基を有する）を、ＨｉｓまたはＭｙｃタグのいずれかに融合されたＨＣ８とともに、ＨｅＬａ細胞中で一過性に同時発現させ、それらの結合を、抗ＮＩＫモノクローナル抗体を使用する細胞溶解物からのＮＩＫの免疫沈殿、続いてウェスタンブロッティングによって評価した。ＮＩＫのアミノ酸１８０の下流のＮＩＫ−ＨＣ８結合領域を図示する。
【図３ｆ】ＨＣ８に結合するヒトＮＩＫ領域の欠失分析を示す。Ｈｉｓタグに連結された、全長ＮＩＫおよびその種々の欠失変異体（示されるＮ末端およびＣ末端残基を有する）を、ＨｉｓまたはＭｙｃタグのいずれかに融合されたＨＣ８とともに、ＨｅＬａ細胞中で一過性に同時発現させ、それらの結合を、抗ＮＩＫモノクローナル抗体を使用する細胞溶解物からのＮＩＫの免疫沈殿、続いてウェスタンブロッティングによって評価した。ＮＩＫのアミノ酸１８０の下流のＮＩＫ−ＨＣ８結合領域を図示する。
【図３ｇ】ＨＣ８に結合するヒトＮＩＫ領域の欠失分析を示す。Ｈｉｓタグに連結された、全長ＮＩＫおよびその種々の欠失変異体（示されるＮ末端およびＣ末端残基を有する）を、ＨｉｓまたはＭｙｃタグのいずれかに融合されたＨＣ８とともに、ＨｅＬａ細胞中で一過性に同時発現させ、それらの結合を、抗ＮＩＫモノクローナル抗体を使用する細胞溶解物からのＮＩＫの免疫沈殿、続いてウェスタンブロッティングによって評価した。ＮＩＫのアミノ酸１８０の下流のＮＩＫ−ＨＣ８結合領域を図示する。
【図４】ＨＣ８に結合することが可能であるＮＩＫ領域の欠失分析を要約するダイアグラムである。このダイアグラムは、ＮＩＫ中のＨＣ８についての少なくとも２つの結合領域を図示する：１つはＮ末端におけるアミノ酸１〜１８０の中の結合領域、もう１つはＣ末端における結合領域（アミノ酸６５０〜９４７）である。このダイアグラムはさらに、結合領域がＮＩＫのキナーゼモチーフ（アミノ酸４００〜６５０）において存在しなかったことを示す。
【図５】ＮＩＫ−ＨＣ８結合が、プロテアソーム結合ＨＣ８とともに（および遊離のＨＣ８とともにではなく）存在することを図示する免疫沈殿アッセイのウェスタンブロット分析を示す。Ｍｙｃタグ化ＨＣ８およびＨｉｓタグ化ＮＩＫは、ＨｅＬａ細胞中で一過性に発現された。プロテアソームは、抗Ｃ２プロテアソーム成分抗体を使用して、細胞溶解物から沈殿された。分析は、タグ化ＨＣ８とＮＩＫ分子の両方のＣ２との同時沈殿を示す。
【図６】マウスＮＩＫもまたヒトＣ８（ＨＣ８）に結合することを図示する免疫沈殿アッセイのウェスタンブロットを示す。ＦＬＡＧタグに連結された全長マウスＮＩＫおよびその種々の欠失変異体（示されるＮ末端残基およびＣ末端残基を有する）は、ＦｌａｇタグまたはＭｙｃタグのいずれかに融合されたＨＣ８とともにＨｅＬａ細胞中で同時発現された。マウスＮＩＫおよびＨＣ８結合は、抗ＮＩＫモノクローナル抗体を使用する細胞溶解物からのＮＩＫの免疫沈殿、続いてウェスタン分析によって評価した。
【図７】アラニンによるリジン６７０の置き換えであるａｌｙ変異、および天然に存在するＮＩＫの一塩基変異多型（Ｈ６７４Ｙ）がプロテアソームへのＮＩＫ結合を妨害しないことを図示する免疫沈殿アッセイのウェスタンブロット分析を示す。Ｍｙｃタグ化ＨＣ８およびＨｉｓタグ化ＮＩＫは、ＨｅＬａ細胞中で一過性に発現された。プロテアソームは、抗Ｃ２プロテアソーム成分抗体を使用して、細胞溶解物から沈殿された。
【図８】ＮＩＫ誘導性の代替的なＮＦ−κＢ経路ならびにＨＣ８およびＮＩＫの核移行に対する、ＨＣ８におけるセリン残基２４３および２５０を変異させることの効果を図示する免疫沈殿アッセイのウェスタンブロット分析を示す。アラニンによって置き換えられたセリン残基２４３および２５０を有するヒトＮＩＫおよびＨＣ８は、ＨｅＬａ細胞においてＮＩＫおよびＮＦ−κＢ（ｐ１００）とともに同時発現された。２５時間のインキュベーション後、細胞の核画分および細胞質画分は単離され、ｐ５２（代替的経路の活性化を経由して誘導されたｐ１００プロセシングを示す）、ＮＦ−κＢ  ｐ６５、ＮＩＫ、およびＨＣ８についてプローブした。この分析は、変異型ＨＣ８を同時発現する細胞中でのｐ５２の実質的な減少を示す。加えて、この分析は、野生型ＨＣ８を同時発現する細胞の核へのＮＩＫおよびＨＣ８の移行を示すが、変異型ＨＣ８を同時発現する細胞の核への移行は示さない。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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