【事件の表示】
　特許第２６７５７２３号「マイコバクテリア属細菌の核酸の検出およびマイコバクテリア属細菌の同定のための試薬および方法」の請求項１ないし２２に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２６７５７２３号の請求項１ないし１５に係る特許を維持する。
【理由】
１．手続の経緯
本件特許第２６７５７２３号は、出願日が平成４年８月１４日（パリ条約による「優先権主張」　１９９２年７月１７日　米国）である特願平４−２５８８１９号の特許出願に係り、平成９年７月１８日に設定登録がなされたもので、その後、石井宏司（以下、申立人という）から特許異議の申立てがなされ、当審において取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１１年５月１２日に訂正請求がなされたものである。
２．訂正の適否
２−１．訂正の概要
　本件訂正の趣旨は、請求項３，４，７，８，１５〜１７を削除すると共に請求項の番号を順に並べ、かつ、それに伴い不明りょうとなった請求項の引用関係を整理したものである。
２−２．訂正の目的、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正は、請求項を削除するものなので、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内の訂正であり、かつ、特許請求の範囲を減縮するものと認められる。
　そして、当該訂正は、実質上特許請求の範囲を拡張又は変更するものとは認められない。
２−３．独立特許要件
　訂正明細書記載の請求項１〜１５に係る発明（以下、訂正発明１〜１５という。）は、その特許請求の範囲請求項１〜１５に記載されたとおりの事項により特定されるものと認める。
［訂正発明１、２、５〜９、１１〜１５］
　これらの発明は、取消理由を発見しえず本件特許出願の際独立して特許を受けることができるものと認められる。
　なお、取消理由の対象となった訂正前の請求項３、４、７、８、１５〜１７は削除され、この点についての取消理由は解消した。
［訂正発明３、４］
　取消理由の対象となった訂正発明３、４は、取消理由で引用した刊行物１　（Ｂｏｒｉｓ　Ｂｏｄｄｉｎｇｈａｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．，２８（８），ｐ．１７５１−１７５９（１９９０））に記載もその示唆もされていない新規なプローブであるＫＹ１６５及びＫＹ１６６を構成要件とするものである。してみると、刊行物１に基づいて、当該プローブを見いだし、訂正発明３、４の如く構成することは、当業者といえども困難であると認められる。
　そして、これらの発明は、かかるプローブを採用することにより訂正明細書（【００４７】）記載の格別な作用効果を奏するものである。
　よって、訂正明細書記載の請求項３、４項に係る発明は、甲第１号証記載の発明から容易に発明できたものといえず、本件特許出願の際独立して特許を受けることができるものといえる。
［訂正発明１０］
　特許異議意見書（第６頁第１６行〜第７頁下から２行）において、「内部対照オリゴヌクレオチド」と「内部陽性対照オリゴヌクレオチド」の学術的な意味が示され、不明瞭な記載は無いことが判明した。よって、特許法第３６条第５項に関する取消理由は解消し、本件特許出願の際独立して特許を受けることができるものといえる。
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法等の一部を改正する法律（平成６年法律第１１６号）附則第６条第１項の規定によりなお従前の例によるとされる、特許法第１２０条の４第２項、同条第３項で準用する１２６条第２〜４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
３．特許異議申立について
３−１．申立理由の概要
　申立人は、以下（１）〜（３）の理由により、訂正前の請求項１〜２２にかかる特許は、取り消されるべきである旨を主張する。
（１）証拠方法として、甲第１号証（上記、当審の取消理由で引用した刊行物１と同じ。）及び甲第２号証（Ｕ．Ｅｄｗａｒｄｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１７（１９）ｐ．７８４３−７８５３（１９８９））を提出し、訂正前の請求項１〜２２にかかる発明は、「甲第１号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものである」又は「甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものである」から、訂正前の請求項１〜２２にかかる特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものである。
（２）訂正前の特許請求の範囲に記載のプローブの種特異性がはっきりと示されておらず、また、これを実証した実施例も記載されていない。
　また、当該プローブが１６ＳリボゾームＲＮＡのどこに存在するのか不明であり、技術的意義が不明である。よって、訂正前の本件特許明細書の記載は、特許法第３６条第４項又は第５項に規定する要件を満たしていない。
（３）ＫＹ７５は、１６ＳリボゾームＲＮＡの塩基配列中に見いだせない配列であり、下流プライマーとして使用してＰＣＲ法により増幅できるとした理由が不明である。また、訂正前の本件特許明細書例５（本件特許明細書【００９３】〜【００９７】。特に、表４）において、Ｍ．ｓｉｍｅａｃを増幅できないので、ＫＹ７５をプライマーとする技術的意義が不明である。よって、訂正前の本件特許明細書の記載は、特許法第３６条第４項又は第５項に規定する要件を満たしていない。
３−２．甲各号証記載の事項
［甲第１号証］
▲１▼第２図
種特異的な配列として、本願発明におけるＫＹ２１（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ左から−も入れて３１番目の塩基から右の配列），ＫＹ２５（Ｍ．ｋａｈｓａｓｉｉ．ＫＹ２１と同様の箇所），ＫＹ２６（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅ１１ｕｌａｒｅ，ＫＹ２１と同様の箇所）及びＫＹ６３（Ｍ．ａｖｉｕｍ，ＫＹ２１と同様の箇所）が記載されている。
▲２▼第３図
属特異的な配列として、本願発明におけるＫＹ１０２及びＫＹ１０１に相当する部分を含む１３塩基配列（２４７領域に相当する第３図Ｂ）が記載されている。
▲３▼第６図
　プライマーとして（Ａ）２４６と逆向き２６４の対、（Ｂ）２４６と逆向き２６０及び（Ｃ）２４６と逆向き２６６＋逆向き２６７の３セットを試験した結果、全てのプライマーの対が他の細菌等由来のＤＮＡには反応せずマイコバクテリアのみを検出できた旨が記載されている。
［甲第２号証］
▲１▼第３図に、ＫＹ１８に相当する配列が記載されている。
▲２▼表１のプライマーＢには、ＫＹ１８に含まれる１３ヌクレオチドが、１９種の他の微生物の同じ部位と比較して、約半数が全く同一で、６種が１塩基のみ相違、１種が２塩基相違であることが記載されている。
３−３．各申立理由に対する検討
３−３−１．申立理由（１）について
［訂正発明１］
　甲第１号証においては、３−２．甲各号証記載の事項▲３▼で摘記したように、２４６等の配列をプライマーと使用した実験はなされているが、これは、訂正発明の構成要件であるＫＹ１８及びＫＹ７５とは異なる配列による実験と認められる。よって、甲第１号証には、訂正発明の構成要件であるＫＹ１８及びＫＹ７５に相当する配列は記載もされていなければ、その示唆もされていない。
　甲第２号証には、ＫＹ１８については記載されているものの、ＫＹ７５については何等記載されていないなければ、示唆もされていない。
　また、甲第１号証及び甲第２号証のいずれにもＫＹ１８がマイコバクテリアを特異的に検出できる領域であることを示唆する記載は在しない。逆に、甲第２号証には、上記▲２▼で摘記したように、ＫＹ１８は他の微生物と非常に相同性の高い部分を含むことが記載されており、ＫＹ１８のみでは他の微生物も検出されてしまいマイコバクテリアの検出ができないことが示唆されていると認められる。
　訂正発明１は、ＫＹ１８のみではなく、ＫＹ１８とＫＹ７５を一対のプライマーとして使用することにより、明細書記載のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの検出が行えるという効果本件訂正明細書【００１５】）を奏するものである。そうすると、ＫＹ７５について何等記載されていない甲第１号証記載の発明に基づいて訂正発明１の如く構成することは、当業者といえども困難である。また、甲第１号証及び甲第２号証記載の発明を組み合わせてみても、これらの刊行物にＫＹ７５について何等記載も示唆もされていないのであるから、訂正発明１の如く構成することは、当業者といえども困難である。
　したがって、訂正発明１に係る特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものとはいえない。
［訂正発明２、５〜１５］
　また、訂正発明２、５〜１５は、すべて請求項１を引用する請求項であって、請求項１をより減縮した発明であるので、訂正発明１にかかる特許を取り消すことができない以上、訂正発明２、５〜１５にかかる特許もまた取り消すことはできない。
［訂正発明３、４］
　甲第１号証、甲第２号証には、訂正発明３，４の構成要件であるＫＹ１６５及びＫＹ１６６が記載されておらず、また、その示唆もされていない。
　してみると、甲第１号証及び甲第２号証に基づいて、当該プローブを見いだし、訂正発明３、４の如く構成することは、当業者といえども困難であると認められる。
　そして、これらの発明は、かかるプローブを採用することにより訂正明細書（【００４７】）記載の格別な作用効果を奏するものである。
　よって、訂正発明３、４にかかる特許を取り消すことはできない。
［申立理由（２）］
　訂正明細書【００４８】の表３に、訂正発明８、９及び１３の構成要件である各プローブが、どのマイコバクテリアと対応するか明記されており、種特異的なプローブとして技術的意義があることは明らかである。また、当該プローブの位置がｌ６Ｓのどこに存在するか記載されて無くとも、前記したように種特異的プローブとしての技術的意義は、明らかであり、申立人の主張は失当である。
［申立理由（３）］
　甲第２号証第３図には、全１６ｓリボゾームＲＮＡ配列が記載されており、ここにＫＹ７５に相当する配列は見いだせないが、訂正明細書【００９５】表４に記載のように１６Ｓの開始領域付近に位置するＫＹ１８と共にＫＹ７５を用いることでＰＣＲ法による１６Ｓリボゾームを含む領域の増幅が可能である具体的データが記載されていることからして、ＫＹ７５は、１６ｓリボゾームＲＮＡの更に下流に存在する配列であると認められる。このように、ＫＹ７５を使用してＰＣＲ法による増幅したデータがある以上、増幅できるとした理由が明記されて無くとも、特許法第３６条第４項又は第５項に規定する要件を満たしていないということはできない。
　また、訂正明細書【００９５】表４においては、申立人の主張するようにＫＹ１８及びＫＹ７５を用いてＭ．ｓｉｍｅａｅを増幅できないデータが示されている。しかしながら、実験されたマイコバクテリアに属する１５種のうち増幅できなかったのはＭ．ｓｉｍｅａｅのみであって、しかも訂正明細書【００９４】に記載されているようにＭ．ｓｉｍｅａｅは、ヒトの病気との関連は殆ど報告されておらず、臨床的に重要なものではない。そうすると、病原性を有する多くのマイコバクテリアに属する種を検出できる点において、その技術的意義は明らかであり、臨床的に重要でないＭ．ｓｉｍｅａｅのみが検出できないとしても訂正発明１〜１５の技術的意義は何等損なわれるものではない。
　よって、申立人の主張は採用できない。
４．むすび
　以上のとおりであるから、申立人の主張する理由及び証拠方法によっては、訂正明細書の請求項１〜１５に係る特許を取り消すことはできない。
　また、他に訂正明細書の請求項１〜１５に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年６月３日（１９９９．６．３）
【訂正の要旨】
請求の要旨
　特許第２６７５７２３号の明細書を請求書に添付した訂正明細書のとおり訂正することを求める。
すなわち、請求項３，４，７，８，１５，１６および１７を削除し、請求項７および８の削除に伴い、請求項２０を以下のごとく訂正する。
　請求項２０において、
　「請求項８に記載の」を『配列ＫＹ２１（配列番号５）、配列ＫＹ２５（配列番号６）、配列ＫＹ２６（配列番号７）、配列ＫＹ６３（配列番号８）、配列ＫＹ１５１（配列番号９）、配列ＫＹ１０６（配列番号１０）、配列ＫＹ１２６（配列番号１１）、配列ＫＹ１３９（配列番号１２）、配列ＫＹ１５７（配列番号１６）、配列ＫＹ１６７（配列番号１７）、配列ＫＹ１６８（配列番号１８）、配列ＫＹ１６９（配列番号１９）、配列ＫＹ１７０（配列番号２０）、配列ＫＹ１７１（配列番号２１）、配列ＫＹ１７２（配列番号２２）および配列ＫＹ１７３（配列番号２３）ならびにこれらの完全に相補的な配列からなる群から選択される少なくとも二つのオリゴヌクレオチドプローブからなる』に訂正する。
（５４）【発明の名称】
マイコバクテリア属細菌の核酸の検出およびマイコバクテリア属細菌の同定のための試薬および方法
（５７）【特許請求の範囲】
　　【請求項１】　マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の標的領域またはそれに相当するＲＮＡを増幅できる一対のオリゴヌクレオチドプライマーで、第一のプライマーはバイブリダイズする配列として配列ＫＹ１８（配列番号１）の少なくとも１４ヌクレオチドからなるサブ配列を含み、第二のプライマーはハイブリダイズする配列として配列ＫＹ７５（配列番号２）の少なくとも１４ヌクレオチドからなるサブ配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
　　【請求項２】　ハイブリダイズする配列として、第一のプライマーが配列ＫＹ１８（配列番号１）を含有し、第二のプライマーが配列ＫＹ７５（配列番号２）を含有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
　　【請求項３】　請求項１に記載の一対のプライマーにより増幅されるマイコバクテリア属種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の標的領域またはそれに相当するＲＮＡ内に保存される領域にハイブリダイズすることができる核酸配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、このプローブとハイブリダイズする配列が検出されるべきマイコバクテリア属種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列とは同一ではなく、かつこのプローブとハイブリダイズする配列が配列ＫＹ１６５（配列番号１３）の少なくとも１４ヌクレオチドからなるサブ配列またはその相補性配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブ。
　　【請求項４】　請求項１に記載の一対のプライマーにより増幅されるマイコバクテリア属種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の標的領域またはそれに相当するＲＮＡ内に保存される領域にハイブリダイズすることができる核酸配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、このプローブとハイブリダイズする配列が検出されるべきマイコバクテリア属種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列とは同一ではなく、かつこのプローブとハイブリダイズする配列が配列ＫＹ１６６（配列番号１４）の少なくとも１４ヌクレオチドからなるサブ配列またはその相補性配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブ。
　　【請求項５】　請求項１に記載の一対のプライマーからなるサンプル中のマイコバクテリア核酸を検出し、場合により同定するキット。
　　【請求項６】　更に、一対のプライマー、ＫＹ１８（配列番号１）およびＫＹ７５（配列番号２）により増幅された１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の領域にハイブリダイズすることができる核酸を含むオリゴヌクレオチドプローブからなる請求項５に記載のキット。
　　【請求項７】　前記プローブ配列が、検出されるマイコバクテリア属種のいずれとも配列において同一ではない請求項６に記載のキット。
　　【請求項８】　更に、配列ＫＹ２１（配列番号５）、配列ＫＹ２５（配列番号６）、配列ＫＹ２６（配列番号７）、配列ＫＹ６３（配列番号８）、配列ＫＹ１５１（配列番号９）、配列ＫＹ１０６（配列番号１０）、配列ＫＹ１２６＜配列番号１１）、配列ＫＹ１３９（配列番号１２）、配列ＫＹ１５７（配列番号１６）、配列ＫＹ１６７（配列番号１７）、配列ＫＹ１６８（配列番号１８）、配列ＫＹ１６９（配列番号１９）、配列ＫＹ１７０（配列番号２０）、配列ＫＹ１７１（配列番号２１）、配列ＫＹ１７２（配列番号２２）および配列ＫＹ１７３（配列番号２３）の少なくとも１４ヌクレオチドからなるサブ配列、並びにこれらの相補的な配列からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプローブからなる請求項５〜７のいずれか一つに記載のキット。
　　【請求項９】　更に、配列ＫＹ２１（配列番号５）、配列ＫＹ２５（配列番号６）、配列ＫＹ２６（配列番号７）、配列ＫＹ６３（配列番号８）、配列ＫＹ１５１（配列番号９）、配列ＫＹ１０６（配列番号１０）、配列ＫＹ１２６＜配列番号１１）、配列ＫＹ１３９（配列番号１２）、配列ＫＹ１５７（配列番号１６）、配列ＫＹ１６７（配列番号１７）、配列ＫＹ１６８（配列番号１８）、配列ＫＹ１６９（配列番号１９）、配列ＫＹ１７０（配列番号２０）、配列ＫＹ１７１（配列番号２１）、配列ＫＹ１７２（配列番号２２）および配列ＫＹ１７３（配列番号２３）の少なくとも１４ヌクレオチドからなるサブ配列、並びにこれらの相補的な配列からなる群から選択される少なくとも二つのオリゴヌクレオチドプローブからなる一群のオリゴヌクレオチドプローブを含んでなる請求項５〜７のいずれか一つに記載のキット。
　　【請求項１０】　プライマーＫＹ１８（配列番号１）およびＫＹ７５（配列番号２）に相補的な上流および下流の配列に隣接した内部対照オリゴヌクレオチド配列を更に含む請求項５〜９のいずれか一つに記載のキット。
　　【請求項１１】　試料中に含まれるマイコバクテリアの核酸を検出する方法であって、
　（ａ）請求項１に記載の一対のプライマーを用いて１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子由来の前記核酸領域を増幅し、
　（ｂ）工程（ａ）にて増幅される前記核酸を、マイコパクテリア属に特異的なプローブと混合し、そして
　（Ｃ）前記核酸および前記プローブの間に形成されたハイブリッドを検出することを含んでなる方法。
　　【請求項１２】　マイコバクテリア属に特異的なプローブが、請求項３および４のいずれかに記載のプローブである請求項１１に記載の方法。
　　【請求項１３】　マイコバクテリアを分類する方法であって、
　（ａ）請求項１に記載の一対のプライマーを用いて１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子由来の核酸領域を増幅し、
　（ｂ）工程（ａ）にて増幅される前記核酸を、配列ＫＹ２１（配列番号５）、配列ＫＹ２５（配列番号６）、配列ＫＹ２６（配列番号７）、配列ＫＹ６３（配列番号８）、配列ＫＹ１５１（配列番号９）、配列ＫＹ１０６（配列番号１０）、配列ＫＹ１２６（配列番号１１）、配列ＫＹ１３９（配列番号１２）、配列ＫＹ１５７（配列番号１６）、配列ＫＹ１６７（配列番号１７）、配列ＫＹ１６８（配列番号１８）、配列ＫＹ１６９（配列番号１９）、配列ＫＹ１７０（配列番号２０）、配列ＫＹ１７１（配列番号２１）、配列ＫＹ１７２（配列番号２２）
および配列ＫＹ１７３（配列番号２３）並びにこれらの完全に相補的な配列からなる群から選択される少なくとも二つのオリゴヌクレオチドプローブからなる一群の配列特異的オリゴヌクレオチドプローブと混合し、そして
　（Ｃ）前記核酸および前記プローブの間に形成されたハイブリッドを検出することを含んでなる方法。
　　【請求項１４】　増幅がポリメラーゼ連鎖反応により行われる請求項１２および１３のいずれか一つに記載の方法。
　　【請求項１５】　ボリメラーゼ連鎖反応が、配列ＫＹ１８（配列番号１）および配列ＫＹ７５（配列番号２）からなる一対のプライマーを用いて行われる請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
　　　【０００１】
　本発明はマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）核酸の存在を検出し、試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸が生じたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ属種を同定するための試薬および方法に関するものである。特に、本発明はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の標的領域または相当するＲＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーに関するもので、前記プライマーはハイブリダイズする配列として配列５′ＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧ３′（ＫＹ１８）または５′ＧＣＣＣＧＴＡＴＣＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＡ３′（ＫＹ７５）を含む。さらに本発明は一対のプライマーを用いた増幅により得られたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ属種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子または相当するＲＮＡの標的領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブに関するもので、ハイブリダイズする配列として、第一ののプライマーは配列ＫＹ１８を含み、第二のプライマーは配列ＫＹ７５を含む。さらに特異的には、本発明はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子または相当するＲＮＡの標的領域を増幅し、プローブと増幅した核酸を混合し、および前記核酸および前記プローブ、ここには特異的プローブが存在するが、との間に形成される雑種を検出または同定することにより、試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸を検出または同定する方法に関するものである。またさらに発明は方法を実施するためのキットに関しても指示する。
　　　【０００２】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａは遅い生育をする、耐酸性好気性バチルスである。小なくとも１９種のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、最も著名なものではＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓおよびＭ．ｌｅｐｒａｅがこれまでヒトのの病気に関連している。Ｍ．ａｖｉｕｍ．Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのようないくつかの種は健康人には通常病原ではないが、ＡＩＤＳウイルスに感染しているような免疫不全者に病気を引き起こす。さらに、いくつかの種が希にヒトに病気を引き起こすが、腐生植物のような臨床試料に生じる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種の検出および同定の方法には細菌の培養、抗体による検出および最近では放射活性標識された核酸プローブを用いたハイブリダイゼーションによるｒＲＮＡの検出が含まれる。これらの方法のそれぞれは重要な問題をもつ。
　　　【０００３】
　バチルスを培養することによる検出は遅く、二カ月まで必要で、典型的には種の同定のためにさらに生化学的試験が必要である。抗体による検出はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種間の交差反応のために特異性を欠いており、また感度も不足している。さらに現在および過去の感染の区別が困難である。小サブユニットリボソームＲＮＡ（１６Ｓ　ｒＲＮＡ）にハイブリダイズするプローブとして放射活性標識したＤＮＡ断片を用いる検出は感度が不足しており、さらに少なくとも数日の培養期間が必要である（ＰＣＴ／ＷＯ８４／０２７２１参照）。
　　　【０００４】
　核酸の特異的な配列を増幅する方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、以前には検出できない程の少量であった細胞に存在する核酸の迅速な検出を可能にした。ＰＣＲ増幅を用いて、一コピーの標的核酸でさえ検出できる。配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによる検出できるレベルにまで増幅された核酸配列の直接的な検出は、配列の単一のヌクレオチドの変化を検出するのに充分な程特異的な診断試験を可能にした。しかし、全てのプライマーの対およびプローブが有効なわけではない。プローブの選択とともに、プライマーおよびそれ故増幅される領域の選択が得られる特異性および感度を大部分決定する。
　　　【０００５】
　ＰＣＲによる増幅はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸のシークエンシング、試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ核酸の検出およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種の同定に用いられた。最近ゲノムの各種の領域が試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ核酸を検出および同定するために用いられた。これらの診断試験のほとんどはたった一つまたは小数の種を検出するためにデザインされており、ある場合には、限定された特異性チェックがＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａではない細菌のＤＮＡに対して行われた。
　　　【０００６】
　６５キロダルトンの抗原を暗号化する遺伝子領域の検出がＣｈｉａらの１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２８巻（第９号）、１８７７から１８８０ページ；Ｂｒｉｓｓｏｎ−Ｎｏｅｌらの１９８９年、Ｌａｎｃｅｔ、第３３４巻、１０６９から１０７１ページ；Ｈａｃｋｅｌらの１９９０年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、第４巻、２０５から２１０ページ；ＷｏｏｄｓおよびＣｏｌｅの１９８９年、ＦＥＭＳ　Ｍｙｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、第６５巻、３０５から３１０ページおよびＨａｎｃｅらの１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第３巻（第７号）、８４３から８４９ページに記述されている。６５キロダルトン抗原遺伝子に基づく一度の試験ではＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種を三種以上区別することはできない。
　　　【０００７】
　繰り返しのＤＮＡ要素であるＩＳ６１１０の増幅について、Ｔｈｉｅｒｒｙらの１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２８巻（第１２号）、２６６８から２６７３ページおよびＥｉｓｅｎａｃｈらの１９９０年、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ、第１６１巻、９７７から９８１ページで報告された。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ，ｂｏｖｉｓはコピー数により区別されるのだが（Ｐｌｉｋａｙｔｉｓらの１９９１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、第５巻、２１５から２１９ページ）、ＩＳ６１１０の増幅は基本的にはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの特定の種の存在を試験するときにのみ用いられる。
　　　【０００８】
　Ｍ．ｌｅｐｒａｅの３６キロダルトン抗原はＨａｒｔｓｋｅｅｒｌらの１９８９年、Ｊ．Ｇｅｎ．．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１３５巻、２３５７から２３６４ページの中で診断試験に用いられた。試験はＭ．ｌｅｐｒａｅに対して特異的であることを意味したが、他のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａからのＤＮＡに対して弱いものから中程度のハイブリダイゼーションが観察された。
　　　【０００９】
　タンパク抗原ｂをコードする遺伝子配列が増幅産物の存在または非存在に基づくＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ｂｏｖｉｓの試験を作り出すためにＳｊｏｂｒｉｎｇらの１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２８巻（第１０号）、２２００から２２０４ページの中で用いられた。
　　　【００１０】
　ＭＰＢ６４タンパク質を暗号化する遺伝子配列に基づくＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの存在の単なる試験がＳｈａｎｋａｒらの１９９０年、Ｌａｎｃｅｔ、第３３５巻、４２３ページに記述された。
　　　【００１１】
　クローニングされたＤＮＡ断片から構築されたプローブがＰａｔｅｌらの１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２８巻（第３号）、５１３から５１８ページおよびＦｒｉｅｓらの１９９０年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、第４巻、８７から１０５ページに記述された。プローブの特異性はプローブのデザインの間の配列解析によるよりはむしろ選択の過程により得られた。
　　　【００１２】
　診断試験に用いるために解析され、標的とされるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのゲノムの領域のーつは、小サブユニットリボソームＲＮＡ（１６Ｓ　ｒＲＮＡ）である。Ｂｏｔｔｇｅｒらの１９８９年、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、第６５巻、１７１から１７６ページで、各種の生物の１６Ｓ　ｒＲＮＡが広範囲の生物の核酸を増幅するようにデザインされた「共通」プライマーを用いて増幅され、その後直接的にシークエンスされた。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種の系統発生学的関係はＲｏｇａｌｌらの１９９０年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏ．、第１３６巻、１９１５から１９２０ページの中で、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子配列を比較することにより研究された。Ｂｏｄｄｉｎｇｈａｕｓらの１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２８巻（第８号）、１７５１から１７５９ページにおいて、同定に関して増幅のための配列特異的オリゴヌクレオチドおよび１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列領域へのハイブリダイゼーションを用いてなされた証拠が示された。１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列の高度に可変的な領域が三種のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａについて研究された。属特異的プライマーが種特異的プローブハイブリダイゼーションに用いられるための可変領域を含む領域を増幅するために用いられた。
　　　【００１３】
　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａに近縁の、および疎遠の多くの生物の小サブユニットｒＲＮＡが研究され、シークエンスされている。多くの生物の小サブユニットｒＲＮＡ配列の編集がＮｅｅｆｓらにより、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、補遺、第１８巻、２２３７から２３１７ページ（１９９０）に用意されている。
　　　【００１４】
　ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡの存在およびＤＮＡが生じた種を同定するために迅速で感度の良い試験が必要である。
　　　【００１５】
　本発明はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの検出および種の同定のための迅速で感度の良いＰＣＲに基づく方法を提供する。１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列に特異的なプライマーおよびプロープが提供される。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの検出は属特異的プライマーを用いた増幅およびそれに続くドットブロットハイブリダイゼーションによる属特異的プローブを用いたスクリーニングにより行われる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａが検出されると、種の同定が増幅されたＤＮＡから、通常リバースドットブロット法による種特異的プローブを用いた同じ増幅反応から決定される。
　　　【００１６】
　１６ＳリボソームＲＮＡ（ＲＮＡ）を暗号化する配列の増幅はいくつかの利点をもつ。本発明は臨床試料に存在する３０以上のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ属種および非常に多くの他の生物を検出し、区別するために用いられる。本発明のプローブおよびプライマーは可能な最大の特異性を提供し、それにより類似配列をもつ関連生物の存在により引き起こされる誤りの陽性の可能性を最小限にする。１６Ｓ　ＲＮＡ遺伝子は高度に保存された領域を含む。本発明の属特異的プライマーおよびプローブはそのような保存された領域にハイブリダイズし、属の中のほとんど全ての種の配列にハイブリダイズできる；プライマーは試験された１５のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種のうち１４の核酸を増幅し、これらの１４の増幅されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡ配列のうち、属特異的プローブは１２にハイブリダイズする。１６Ｓ　ｒＲＮＡはまた増幅される領域内に高度に可変的な領域を含む。本発明の種特異的プローブは目的のそれぞれの種が独特の配列をもつ可変領域にハイブリダイズする。
　　　【００１７】
　１６Ｓ　ｒＲＮＡからプライマーおよびプローブを選択することのさらに有利な点は、ＲＮＡが生細胞中に多くのコピー数（１０３から１０４）で存在することである。与えられた臨床試料中のＲＮＡの形態での遺伝子配列の数はそれ故これに相当するＤＮＡ配列の数の１０４倍にまでなる。さらに検出感度を望むならば、ＲＮＡ自身が増幅標的として用いられる。
　　　【００１８】
　本発明の別の面で、第二の増幅反応が確認試験として行われる。第二の増幅反応は、直接的ではなく第一の標的、即ち１６ＳリボソームＲＮＡ核酸に関連する標的配列の存在をあてにするものである。適当な標的配列が好ましくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種に保存され、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａではない種には関連しない。適当な標的遺伝子は例えば、６５ｋＤａタンパク質遺伝子を暗号化する遺伝子である（Ｐａｏらの１９８９年、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、第６５巻、３０５から３１０ページ；Ｈａｒｔｓｋｅｅｒｌらの１９８９年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏ．、第１３５巻、２３５７から２３６４ページ；およびＨａｃｋｅｌらの１９９０年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、第４巻、２０５から２１０ページ）。第一の増幅反応の結果を確認するために役立つ一方、第二の標的配列の増幅は比較研究、特にＰＣＲおよび培養法の比較から生じた一致しない結果を解析するために特に意味がある。
　　　【００１９】
　さらに本発明は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａを検出するために陽性の対照として用いる新規組成に関するものである。発明は種特異的Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａプローブ同様、属特異的プローブを用いて、試験の結果を確認するための新規組成を提供する。
　　　【００２０】
　本発明の一面は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸の存在を検出し（属特異的プローブ）、核酸を生じる種の同一性を決定できる（種特異的プローブ）プローブに関するものである。
　　　【００２１】
　本発明の別の面は共通プローブに関するものである。好ましい具体例では、発明はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの単離の異種の増幅および検出のための共通オリゴヌクレオチドを提供する。共通オリゴヌクレオチドプローブはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａに近縁の非Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種にはハイブリダイズしない。
　　　【００２２】
　共通プローブは単一のオリゴヌクレオチドプローブを用いた広範囲の標的特異的な検出に適している。ここで用いられているような共通プローブは検出されるべきＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのいずれの核酸配列とも同一でないオリゴヌクレオチドプローブである。共通プローブは非天然核酸配列を含む雑種オリゴヌクレオチド構成物である。本発明で記述されるような共通プローブは検出法において、選択された種を包含すると同時に排除するために用いられる。具体的には、発明は新規配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。これらのプローブは広くＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種を検出するが、例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒのような近縁ではあるが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａではない種を検出しない。
　　　【００２３】
　本発明の別の面は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸の特異的な領域を増幅するためのプライマーに関するものである。この領域はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種間に保存される領域および配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて標的核酸の起源を決定できるような種間の充分な不均一性をもつ可変領域の両者を含む。
　　　【００２４】
　本発明の別の面は、検出および種同定法に関するものである。発明のプライマーを用いたＰＣＲによる標的核酸の増幅は、増幅された核酸を属特異的プローブと混合し、ハイブリダイゼーションが起きるかを検出することにより、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸の検出をさせ、一方種の同定は種特異的プローブとのハイブリダイゼーションのパターンを決定することにより行われる。
　　　【００２５】
　本発明のまた別の面は、キットに関するものである。これらのキットは各種の形態をとり、一つまたはそれ以上のプローブを含み、具体的には種レベルで感染したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの同一性を決定するのに充分な一群のプローブおよびキットの成分を用いるための指示書を含む。キットはまた一つまたはそれ以上の増幅試薬、例えば属特異的プライマー、ポリメラーゼ、緩衝液およびヌクレオシド三リン酸を含むことができる。
　　　【００２６】
　さらに具体的には、キットはまた陽性および陰性の対照を含む。好ましい陽性の対照はこの中で記述される。
　　　【００２７】
　本発明を理解するために、いくつかの用語が下に定義される。
　　　【００２８】
　「オリゴヌクレオチド」なる用語は、検出されるＤＮＡ断片および核酸の対照のような二つまたは通常それ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子を指す。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、多くの因子およびオリゴヌクレオチドの最終的な機能または利用に依存する。オリゴヌクレオチドは、例えば適当な配列のクローニングおよび制限酵素による切断およびＮａｒａｎｇらの１９７９年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第６８巻、９０から９９ページのホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎらの１９７９年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第６８巻、１０９から１５１ページのホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅらの１９８１年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．、第２２巻、１８５９から１８６２ページのジエチルホスホアミダイド法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法のような方法による直接的な化学合成を含む適当な方法により調製される。
　　　【００２９】
　「プライマー」なる用語は、天然または合成の、適当な緩衝液で、適当な温度で、核酸の鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される、即ち四種の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびポリメリゼーションの試薬（即ちＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在条件下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは好ましくは一本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適当な長さは用いようとするプライマーに依存するが、典型的には１５から２５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に鋳型と充分に安定な雑種複合体を形成するのに、より低い温度が必要である。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズし、ＤＮＡ合成を開始できるのに充分相補的でなければならない。
　　　【００３０】
　ここで明らかにされている発明の具体例では、特異的配列のプライマーおよびプローブが提供される。これらの具体例で提供される特異的配列のプライマーおよびプローブは、例えば５′または３′端に標的配列に相補的な、または相補的ではないヌクレオチドを付加することにより修飾されることは技術者には明らかなことである。プライマー組成が標的配列の伸長開始点として作用し、プライマーおよびプローブがこれらの例示される具体例に含まれる少なくとも１４の連続したヌクレオチドからなる限り、そのような組成は発明の範囲内にある。
　　　【００３１】
　「プライマー」は、特に増幅される標的領域の一方または両端の情報に不明瞭さがある場合、一つ以上のプライマーを指す。「保存された」領域が集団中で著しいレベルの多型を示すなら、そのような配列を増幅するプライマーの混合液が調製されるか、またはプライマーがミスマッチの配列さえ増幅するようにデザインされる。もし望むならば、プライマーは分光学的に、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出できる標識を取り込むことにより標識される。例えば、有効な標識には３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、（通常ＥＬＩＳＡで用いられるような）酵素、ビオチン、またはハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体が得られるタンパク質が含まれる。標識はまた、プライマーまたは増幅されたＤＮＡのようなプライマー伸長産物の固体支持体上への固定化を促進するために、プライマーを「捕捉する」のに用いられる。
　　　【００３２】
　「配列特異的オリゴヌクレオチド」および「ＳＳＯ」は、「ハイブリダイズする」領域と呼ばれる検出される配列に相補的な配列をもつ、「配列特異的な緊縮のハイブリダイゼーション条件」下で、正確に相補的な標的配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。ハイブリダイゼーションの条件の緊縮度を緩めることにより、配列のミスマッチが許容される；許容されるミスマッチの程度はハイブリダイゼーション条件の適当な調整によりコントロールされる。「プローブ」および「ＳＳＯプローブ」はＳＳＯと互換的に用いられる。
　　　【００３３】
　「標的領域」は解析される核酸の領域を指す。
　　　【００３４】
　「熱安定性ポリメラーゼ酵素」は、相対的に熱に安定で、標的配列の核酸の鎖の一方に相補的なプライマー伸長産物を形成するためにヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を指す。酵素はプライマーの３′端で合成を開始し、合成が停止するまで、鋳型の５′端へ向かって進む。精製された熱安定性ポリメラーゼ酵素は米国特許第４，８８９，８１８号により充分に記述されている。
　　　【００３５】
　「逆転写酵素」は、リボ核酸の鋳型に相補的なプライマー伸長産物を形成するためにヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を指す。酵素はプライマーの３′端で合成を開始し、合成が停止するまで、鋳型の５′端へ向かって進む。ＲＮＡ標的配列を相補的なコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に変換する適当な重合試薬の例は、トリ骨髄芽腫ウィルス逆転写酵素および逆転写酵素活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼである。
　　　【００３６】
　図１は本発明の属特異的および種特異的プローブ両者を用いたハイブリダイゼーション試験の結果を示している。プローブの特異性はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの異なる１３種のＤＮＡで試験された。
　　　【００３７】
　本発明はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの検出および種の同定に関する迅速かつ感度の良いＰＣＲに基づく方法を提供する。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列に特異的なプライマーおよびプローブが提供される。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの検出は、属特異的プライマーを用いた増幅およびそれに続くドットブロットハイブリダイゼーション法による属特異的プローブを用いたスクリーニングにより行われる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａが検出されると、種の同定がリバースドットブロット法により種特異的プローブを用いて、同じ
増幅反応のＤＮＡから決定される。正逆、両ドットブロット法は非常に簡便にマイクロタイタープレートで行われる。
　　　【００３８】
　属特異的プライマーおよびプローブは１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の保存領域にハイブリダイズし、種特異的プローブは１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の可変領域にハイブリダイズする。合成はプライマーの３′端で始まるので、３′端でのミスマッチはより重大である。チミジンは他の塩基のミスマッチよりも許容される；それでプライマーは３′端にチミジン塩基を付けないようにデザインされた。オリゴヌクレオチドの塩基含量は変性温度に影響を及ぼす。プライマーまたはプローブの結合の緊縮度および特異性は温度上昇を増加する。しかし、全てのプローブがリバースドットブロット法では同時にハイブリダイズされるので、最適なプローブハイブリダイゼーション条件は全てのプローブで類似している。
　　　【００３９】
　本発明のプライマーの対は目的の全てのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子配列の増幅で効果的に機能するが、殆どの他の材料からの相当するＤＮＡを増幅しない。さらに、これらのプライマーの増幅条件および効率は種間でかなり一定で、そのため殆ど全てのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種が一回の試験で検出可能である。表１は本発明のプライマーのハイブリダイズする配列を示している。
　　　【００４０】
　【表１】
　　　【００４１】
　大腸菌番号システムを用いると、上述プライマーＫＹ１８は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基５２から７４に、下流プライマーＫＹ７５は塩基６２４から６４７に広がる。合わせると、これらのプライマーは約５８３塩基対の長さの産物を合成する；正確な大きさは種に依存する。
　　　【００４２】
　ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡの存在に対する最初のスクリーニングは混合液として同時に用いられる二つの属特異的プローブを用いて行われる。
　　　【００４３】
　【表２】
　　　【００４４】
　混合プローブが用いられる理由は、殆どのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種がＫＹ１０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号４）の領域の配列に関して、二つのグループに分けられることである。これらの二つのプローブは試験されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ属の１４種のうち１２種のＤＮＡを検出する。
　　　【００４５】
　別の具体例では、ＫＹ１６５（配列番号１３）がプローブＫＹ１０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号４）に置き換わる。プローブＫＹ１０１（配列番号３）、ＫＹ１０２（配列番号４）、ＫＹ１６５（配列番号１３）およびＫＹ１６６（配列番号１４）は表２に与えられる。ＫＹ１６５（配列番号１３）はＫＹ１０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号４）の両者の配列を含む共通プローブである。ＫＹ１０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号４）は互いに二塩基異なる。ＫＹ１６５（配列番号１３）はＫＹ１０１（配列番号３）またはＫＹ１０２（配列番号４）と同一ではないが、互いに一塩基異なる。この一致は一方のミスマッチの「有利な」ＫＹ１０１（配列番号３）およびもう一方のミスマッチのＫＹ１０２（配列番号４）で達成された。ＫＹ１６５（配列番号１３）は全てのＫＹ１０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号４）特異的なＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種に充分ハイブリダイズできる。ＫＹ１６５（配列番号１３）はさらにミスマッチがあるために、高緊縮条件下でＭ．ｘｅｎｏｐｉ（配列番号１５）にハイブリダイズしない。
　　　【００４６】
　ＫＹ１６６（配列番号１４）は、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ（配列番号１５）を含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種を検出するための境界共通プローブである。ＫＹ１６５（配列番号１３）の配列同様、ＫＹ１６６（配列番号１４）の配列は非Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種に相当しない。プローブはＫＹ１０１（配列番号３）、ＫＹ１０２（配列番号４）、およびＭ．ｘｅｎｏｐｉ（配列番号１５）（ＧｅｎＢａｎｋ取得番号Ｘ５２９２９、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓから入手可能）の相当する配列と同様に異なるようにデザインされる。ＫＹ１６６（配列番号１４）はＫＹ１０１（配列番号３）、ＫＹ１０２（配列番号４）およびＭ．ｘｅｎｏｐｉ（配列番号１５）とそれぞれ二塩基異なる。ＫＹ１６６（配列番号１４）は効果的に全てのＫＹ１０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号４）に特異的な種およびＭ．ｘｅｎｏｐｉ（配列番号１５）にハイブリダイズする。さらにＫＹ１６６（配列番号１４）は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａに近縁の二種の非Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａである、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ　ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍまたはＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅにはハイブリダイズしない。Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ（配列番号１５）の相当する配列は表２に含まれる。表で、ＫＹ１６６（配列番号１４）に対してのミスマッチは下線が引かれている。ＫＹ１６５（配列番号１３）に対するミスマッチは小文字で示される。
　　　【００４７】
　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ核酸が試料に存在するならば、核酸が生じた種が一群の種特異的プローブへのハイブリダイゼーションにより決定される。種の同定の段階で用いられるプローブは表３に示される。
　　　【００４８】
　【表３】
　　　【００４９】
　最も臨床的に興味のある種は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．．Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅおよびＭ．ａｖｉｕｍである。Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅは普通は病気とは関係ないが、頻繁にヒト試料に生じる。したがって、属特異的プローブによるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸の検出は臨床的に重要ではないＭ．ｇｏｒｄｏｎａｅによることが頻繁に予想される。例６は種特異的プローブの特異性に関する追加情報を含む。
　　　【００５０】
　本発明の重要な一面は、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子領域の増幅である。本発明を実施する者は、ポリメラーゼ連鎖反応は好ましい増幅方法であるが、試料中の標的配列の増幅はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅および自己を維持する配列の複製のような、それぞれが充分な増幅をでき、その結果標的配列がＳＳＯプローブへの核酸ハイブリダイゼーションにより検出される既知の方法により行われることに注目すべきである。代わりとして、Ｑβ−レプリカーゼ増幅のような、検出できるレベルまでプローブを増幅する方法が用いられる。「プローブ」は上記の方法に用いられる配列特異的オリゴヌクレオチドを含む；例えば、ＬＣＲで用いられる二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドは、ＬＣＲが配列の存在を示すためにプローブの連結のみを必要とする場合でも本発明の目的の「プローブ」である。
　　　【００５１】
　ＰＣＲの過程は技術的に良く知られているが（米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号、および４，９６５，１８８号を参照せよ）、一般的なＰＣＲの情報は以下のＰＣＲの過程に不慣れな者に発明を明らかにし、充分理解させる目的を提供する。
　　　【００５２】
　ＰＣＲにより試料中の標的核酸配列を増幅するために、配列は増幅システムの成分に入れやすくなければならない。一般に、この入りやすさは試料から核酸を分離することにより保証される。生物試料から核酸を抽出する各種の方法が技術的に知られている。例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉらが１９８９年に「ＰＣＲ工学」（Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）の中で記述していることを参照せよ。代わって、試料がかなり容易に壊れるものならば、核酸はＰＣＲ技術による増幅の前に精製される必要はない、即ち、試料が細胞、特に末梢血リンパ球またはアミニオサイトを含むなら、細胞内成分の溶解および分散は単に低調緩衝液に細胞を懸濁することにより行われる。
　　　【００５３】
　ＰＣＲのそれぞれのサイクルはプライマー伸長により形成される核酸二重鎖の分離を含む。ＰＣＲ過程の好ましい具体例では、鎖の分離は反応液を二重鎖の変性を引き起こすが、ポリメラーゼの非可逆的な変性は引き起こさないような効果的な時間で、充分な高温に熱することにより達成される（米国特許第４，９６５，１８８号を参照せよ）。典型的な熱変性は秒から分の範囲の時間に対して、約８０℃から１０５℃の範囲の温度を含む。しかし、鎖の分離は物理的、化学的または酵素的手段を含むいずれかの適当な変性法により行われる。鎖の分離は例えば、へリカーゼまたはへリカーゼ活性をもつ酵素により誘導される。例えば、酵素ＲｅｃＡはＡＴＰ存在下でヘリカーゼ活性をもつ。へリカーゼによる鎖の分離に適した反応条件は技術的に知られている（Ｋｕｈｎ　Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇの１９７８年、ＣＳＨ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４３巻、６３から６７ページ；およびＲａｄｄｉｎｇの１９８２年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１６巻４０５から４３６ページを参照せよ）。
　　　【００５４】
　しかし例え鎖の分離が達成されても、鎖が一度分離されると、ＰＣＲの次の段階には標的配列に隣接したプライマーを用いて分離された鎖をハイブリダイズすることが含まれる．。プライマーは標的の鎖の相補鎖を形成するために伸長される。好結果のＰＣＲ増幅では、プライマーは、二重鎖配列にハイブリダイズするそれぞれのプライマーが一つのプライマーから合成される伸長産物が鋳型（相補鎖）から分離されると、他のプライマーの伸長の鋳型として作用するような位置になるようにデザインされる。変性、ハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルは望みの量の増幅された核酸を得るために必要な回数繰り返される。
　　　【００５５】
　ＰＣＲにおけるプライマーの鋳型依存性の伸長は、適当な塩、金属陽イオンおよびｐＨ緩衝システムを含む反応系で、適当量の四種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ．ｄＧＴＰ．ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ；以下に記述されるＵＮＧ滅菌システムが取り込まれているならば、ｄＵＴＰがｄＴＴＰに代わって、またはこれに加えて用いられる）存在下で重合試薬により触媒される。適当な重合試薬は鋳型依存性ＤＮＡ合成を触媒することが知られている酵素である。ＤＮＡ鋳型とともに用いるのに適しているポリメラーゼの例には、大腸菌ポリメラーゼＩまたはこの酵素のＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓから分離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼが含まれる。後者の酵素は核酸の増幅およびシークエンシングに広く用いられる。Ｔａｑポリメラーゼを用いる反応条件は技術的に知られており、上述の「ＰＣＲ工学」（１９８９）中でＧｅｌｆａｎｄにより記述されている。ＲＮＡ鋳型から相補的なコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するために適している重合試薬はトリ骨髄芽腫ウイルスＲＴのような逆転写酵素（ＲＴ）または逆転写酵素活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼである。典型的には、ＲＮＡ鋳型は次の増幅のためのＤＮＡ鋳型だけを残して、最初の逆転写の段階後の最初の変性段階の間に熱分解される。
　　　【００５６】
　１６Ｓ　ｒＲＮＡが増幅されるべきならば、このＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を作るために最初の逆転写（ＲＴ）段階が行われる。ＰＣＴ特許公示ＷＯ９１／０９９４４はＰＣＲ増幅でも機能する熱安定性ポリメラーゼによる高温での逆転写について記述している。高温ＲＴはより高いプライマーの特異性および改良された効率を提供する。同一のプライマーおよびポリメラーゼは逆転写およびＰＣＲ増幅段階の両者に充分であり、反応条件は両反応が試薬の変化なしに起きるように最適化される。逆転写酵素として機能できる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼは鋳型に関係なく全てのプライマー伸長段階に用いられる。両過程は試薬を変えるまたは添加するためにチューブを開くことなしに行われる；温度プロフィールのみが最初のサイクル（ＲＮＡ鋳型）および残りの増幅サイクル（ＤＮＡ鋳型）の間で調整される。
　　　【００５７】
　ＰＣＲ法はそれぞれの段階の後、新たな試薬が添加される段階的な様式で、または全ての試薬が同時に添加される様式で、あるいは与えられた数の段階の後、新鮮な、または異なる試薬が添加される、部分的に段階的な様式で行われる。例えば、鎖の分離が熱により誘導され、ポリメラーゼが熱感受性であるなら、ポリメラーゼは鎖分離の回転後に添加されなければならない。しかし、例えばへリカーゼが変性に用いられ、または熱安定性ポリメラーゼが伸長に用いられるならば、全ての試薬が最初に添加され、あるいは代わって、試薬の分子の割合が反応にとって重大であるならば、試薬は合成反応により消費された場合、定期的に補充される。
　　　【００５８】
　ＰＣＲ過程が最も普通に熱安定性酵素を用いて自動的な過程として行われることを技術者は知るであろう。この過程において、反応液の温度は変性領域、プライマーアニーリング領域および反応領域をサイクルする。熱安定性酵素の使用に特異的に適している機械はＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒから購入できる。
　　　【００５９】
　当業者はまた前の反応の増幅された核酸によるＰＣＲの汚染の問題に気づくであろう。この問題を減少する方法は前の反応の増幅されたＤＮＡを酵素的に分解することである。ＰＣＲ増幅はｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰ存在下で行われる。得られた二重鎖ウラシルを含む産物はウラシルーＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）により分解され、一方通常のチミンを含むＤＮＡはＵＮＧにより分解されない。増幅前に増幅反応液にＵＮＧを添加することにより、標的として作用する全てのウラシルを含むＤＮＡの分解が始まる。ウラシルを含むＤＮＡの唯一の材料は前の反応の増幅産物であるので、この方法は効果的に反応液を滅菌し、前の反応からの汚染の問題（持ち越し）を取り除く。ＵＮＧは熱により一時的に不活化され、増幅の変性段階もまだＵＮＧを不活化するように作用する。それ故ウラシルを取り込んだ新たな増幅産物はＵＮＧのない環境で形成され、分解はされない。
　　　【００６０】
　配列特異的プローブハイブリダイゼーションは本方法を旨く実践するための重要な段階である。本発明の配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは特異的にＭ　ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａゲノムの特定の断片とハイブリダイズし、属特異的プローブの場合、他の生物からの、種特異的プローブの場合、他のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種からの配列について不安定化するミスマッチをもつ。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、プローブが特異的に正確に相補的な配列にのみハイブリダイズするように選択される。増幅産物の検出は、正しい増幅産物のみが検出され
、関連生物の相同配列の存在により引き起こされる偽の陽性シグナルの機会を減少させることを保証するためにこの配列特異的ハイブリダイゼーションを用いる。
　　　　【００６１】
　ＳＳＯプローブおよび核酸配列の間に形成される雑種を検出する方法は、ハイブリダイゼーションの領域に加え、プローブがさらに特徴をもつことを必要とする。ドットブロット法では、例えばプローブは典型的に標識される。以下に記述される「リバース」ドットブロット法の場合のように、プローブが最初に固定化されるならば、プローブはまたＰＣＴ特許公示８９／１１５４８により詳細に記述される技術である、照射によりナイロン膜へ固定されるポリ−ｄＴの長い伸長を含むことができる。
　　　　【００６２】
　本発明のプローブは上述のオリゴヌクレオチドを合成する技術を利用して、合成され、標識される。例えば、プローブは３２Ｐ−ＡＴＰおよびキナーゼとともにプローブをインキュベートすることにより、３２Ｐで５′端が標識される。ＳＳＯプローブの適当な非放射活性標識は西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。この標識を含むプローブの調製および検出方法が米国特許第４，９１４，２１０号および４，９６２，０２号に記述されている。そのような標識プローブに関する追加情報は、米国特許第４，７８９，６３０号；Ｓａｉｋｉらの１９８８年、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻、５３７から５４１ページ；およびＢｕｇａｗａｎらの１９８８年、Ｂｉｏ／Ｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、９４３から９４７ページを参照せよ。有効な色素原には赤白色素および３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が含まれる。Ｈｅｌｍｕｔｈは「ＰＣＲプロトコール」（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９９０）の１１９から１２８ページで、ＰＣＲ産物の非アイソトープ検出の方法について記述している。
　　　【００６３】
　本発明のプローブは、核酸配列が試料中に存在しているかをプローブが試料中に存在している配列に結合するかを決定することにより決めるのに用いられる。試料中にプローブ１および核酸配列の間に形成される雑種を検出するための本発明の目的の適当な方法は技術的に知られている。例えば、検出は例４に記述されるようにドットブロット法を用いて行われる。ドットブロット法で、未標識の増幅試料は膜のような固体支持体に結合され、膜は適当なハイブリダイゼーション条件下で標識プローブとインキュベートされ、ハイブリダイズしなかったプローブ
は洗浄により除去され、フィルターは結合プローブの存在をモニターされる。試料が属特異的プローブを用いてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸の存在をスクリーニングされる場合のように、複数試料がいくつかのプローブで解析される場合、ドットブロット法は非常に有効である。
　　　【００６４】
　非常に多くのプローブが用いられる場合別の方法が非常に有効である。この方法は、増幅配列が標識を含み、プローブが固体支持体に結合しているような「リバース」ドットブロットである。この方法で、未標識プローブは膜に結合され、適当な緊縮ハイブリダイゼーション条件下で標識試料にさらされる。ハイブリダイズしない標識試料はその後適当な緊縮条件下で洗浄により除去され、フィルターは結合配列の存在がモニターされる。種の決定にはそれぞれの増幅試料に対する複数の種特異的プローブの使用が必要なので、リバースドットブロット法はこの段階で好ましい試験方法である。
　　　【００６５】
　別法として、多数のプローブハイブリダイゼーション部位またはウェルをもつ検出方法を使用することが望ましい。例えば、マイクロタイタープレートのような固体支持体が発明の方法の大規模な臨床応用に特に有効である。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡのハイブリダイゼーション／捕捉または固体支持体についての方法は知られている。これらの方法の具体例で、増幅された標的ＤＮＡはＰＣＲ反応の増幅の間に（例えばビオチンで）標識される。標識ＤＮＡは、ＰＣＲ産物のマイクロタイタープレートのウェルに結合した標的特異的オリゴヌクレオチド捕捉プローブへのハイブリダイゼーションにより特異的に捕捉される。結合産物は用いられる標識の型にしたがって適当に検出される。例えば、ビオチンが標識として用いられるならば、アビジンＨＲＰ複合体が添加され、（ａ）過酸化水素基質およびＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）色素原、または（ｂ）過酸化水素基質およびテトラメチルベンジジン色素原（ＴＭＢ）のいずれかと反応される。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを定量的に検出させる色素定量シグナルが開発された。
　　　【００６６】
　臨床生物医学研究室で行われる場合、マイクロタイタープレート法を用いた検出方法が広範囲の標的で標準化されている。長さ２５ヌクレオチド以下の検出プローブをもつことが望ましい。より短いプローブは交差反応の機会を最小にし、特に大規模スクリ−ニング法では有効である。したがって、例８はマイクロタイタープレート法によるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種を検出する好ましい方法が記述される。２５ヌクレオチド以上のプローブはマイクロタイタープレート検出法に同様に適しているが、最大の特異性を保証するためにハイブリダイゼーションおよび緊縮条件を個々に決定しなければならないことを技術者は認識せねばならない。
　　　【００６７】
　別の適当な検定システムでは、標識プローブはＰＣＲ増幅過程の間に添加される。それぞれの合成段階の間に標的ＤＮＡにハイブリダイズするプローブはプライマー伸長を触媒するために用いられるポリメラーゼの５′から３′へのエキソヌクレアーゼ活性により分解される。プローブの分解産物はその後検出される。それ故、分解産物の存在はプローブおよび標的ＤＮＡの間にハイブリダイゼーションが起きたことを示す。
　　　【００６８】
　本発明はまた発明のプライマーおよびプローブからなる複数容器単位であるキットに関するものである。有用なキットはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸を検出するためにＳＳＯプローブを含むことができる。いくつかの場合、ＳＳＯプローブは適当な支持膜に固定される。キットはまたＰＣＲ増幅のプライマーを含むことができる。キットの他の付随的な組成には、例えば逆転写酵素またはポリメラーゼ、その基質のヌクレオシド三リン酸、標識に用いられる手段（例えば、標識がビオチンならば、アビジン−酵素コンジュゲートおよび酵素基質および色素原）または検出標識、およびＰＣＲ、逆転写またはハイブリダイゼーション反応のための適当な緩衝液が含まれる。上記成分に加え、キットはまた発明の増幅および検出方法を行うための支持書を含む。
　　　【００６９】
　本発明の好ましい具体例では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａを検出するキットにはまた陽性および陰性の対照が含まれる。好ましくは陽性の対照は試験試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸を増幅するために用いられた同一のプライマーの対を用いて増幅可能な核酸配列を含む。陽性の対照を用いる方法は知られており、ここでは存在するまたはしない標的および陽性の対照は同一のプライマーの対を用いる。好ましくは陽性の対照は産物ＤＮＡが標的の大きさと直ちに区別できる分離した大きさとなるようにデザインされる。
　　　【００７０】
　別の面で、本発明は種特異的Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａプローブ同様、属特異的Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａプローブを検出するためのプローブにハイブリダイズできる陽性の対照を提供する。例９は陽性の対照核酸の構築について記述している。
　　　【００７１】
　ここで記述されているように、特に一致しないＰＣＲおよび培養のデータを解決するために、第二の増幅標的を用いることが望ましい。内部陽性対照ベクターを提供するための本発明の教訓を与えると、さらに内部陽性対照が構築されることを普通の技術者直ちに認識するであろう。例えば、ハイブリダイズし、続いて陽性の対照ＤＮＡの分離した断片を増幅するために、陽性の対照は一次（１６ＳｒＲＮＡ）および二次標的（例えば、６５ｋＤａタンパク質遺伝子）の両者に対するプライマ一部位を取り込む。
　　　【００７２】
　以下に示される本発明の例は例証の目的のみで、発明の範囲を限定するものではない。
　　　【００７３】
　　【実施例】
例１
試料の調製
　核酸はＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅから市販されるＩｓｏＱｕｉｃｋＴＭシステムを用いて唾液試料から分離される。約１０ｍｌの唾液試料は液化／消毒され、遠心により沈澱され、ＢＳＡを含む緩衝液約１ｍｌに再懸濁される。この試料のうち２００から５００μｌが細菌を沈澱させるために遠心される。沈澱は１００μｌの試料緩衝液Ａに再懸濁され、１００μｌの溶菌試薬１で溶菌される。溶菌液は７容の試薬２および４容の試薬３で抽出される（試薬１、２および３は試料緩衝液ＡとともにＩｓｏＱｕｉｃｋシステムで供給される）。試料は遠心され、その後１／３容の１０Ｍ酢酸アンモニウムが水層に添加され、ＤＮＡが等量のイソプロパノールで沈澱される。沈澱したＤＮＡは７０％エタノールで洗浄され、風乾後、１００μｌのＴＥ、ｐＨ８．０に再懸濁される。５０μｌのそれぞれの試料標品が増幅反応に用いられる。
　　　【００７４】
例２
ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡの増幅
　マスター試薬液はそれぞれの反応が次の試薬：それぞれのプライマ−２５ｐｍｏｌ、それぞれのｄＮＴＰ１０ｎｍｏｌ、２×ＰＣＲ緩衝液（１０×緩衝液＝５００ｍＭ　ＫＣｌ、５００ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．９、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）、３単位のＴａｑポリメラーゼ、２単位のＵＮＧ、および反応当り５０μｌの反応液になるようにＨ２０を含むように調製される。このマスター溶液は５０μｌの鉱物油を重層され、ＤＮＡ試料が油層の下で反応液に添加される。
　　　【００７５】
　ＤＮＡはＰａｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒのサーマルサイクラーで増幅される。サーマルサイクラーは変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長の３７サイクル；それぞれ１分当り９８℃、６２℃および７２℃を２サイクル、続いて１分当り９４℃、６２℃および７２℃を３５サイクルとなるようにプログラムされる。Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒサーマルサイクラーは、ＵＮＧ滅菌システムが用いられているなら、最終の伸長を完全にし、ＵＮＧ酵素を不活性化したままにするために、最後のサイクルの後適当な時間７２℃に試料をおくようにプログラムされる。増幅産物はその後ゲル電気泳動および／またはドットブロットハイブリダイゼーションにより解析される。ゲル電気泳動による解析がなされるなら、１０×試料緩衝液（０．２５％キシレンシアノール、０．２５％ブロモフェノールブルー、２５％フィコール）が添加され、１００μｌのクロロホルムで鉱物油が抽出され、Ｔａｑポリメラーゼは不活化される。
　　　【００７６】
例３
ドットブロット法
　増幅試料の最初のスクリーニングにより、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸の存在が検出される。ドットブロット法で、増幅ＤＮＡの少量が変性され、ナイロンフィルターにのせられ、以下に記述されるように固定化される。フィルターはその後標識プローブの一つにハイブリダイゼーションさせるためにプローブ溶液に浸される。それぞれのプローブは放射活性標識されるが、西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共有結合したプローブはまた色素原の、または化学蛍光の基質存在下での非同位元素の検出の手段を提供するために用いられる。固定化された標的ＤＮＡは二つの属に特異的なプローブＫＹ１０１およびＫＹ１０２の混合液にハイブリダイズされる。試験される試料数がプローブ数をはるかに超えると予想されるので、（一つの混合液に二つのプローブ）、ドットブロット法はこの最初のスクリ−ニングには最も便利である。非常に多くの試料が単一の固体支持体の別々の位置でハイブリダイズされ、プローブ溶液に支持体を浸すことによって同時に標識プローブにさらされる。
　　　【００７７】
　増幅は例２のように行われる。ＰＣＲ産物はその後アルカリで処理することにより変性される。ＰＣＲ産物５μｌに対して５μｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、８μｌの５Ｎ水酸化ナトリウムおよび８２μｌが添加される。混合液は室温で１０分間放置される。
　　　【００７８】
　ＢｉｏＤｙｎｅＴＭＢナイロンフィルター（Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐ．、ＧｌｅｎＣｏｖｅ．ＮＹ）はＨ２０に５から１０分間浸され、さらにドットブロットマニフォールド（Ｂｉｏ−ＤｏｔＴＭ、Ｂｉｏ　Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）が設定された後、２００μｌのＨ２０で洗浄されることにより調製される。変性に続き、１００μｌの試料混合液はドットブロット器を用いてナイロン膜へ真空下でのせられる。それぞれのウェルはその後２００μｌの０．４Ｎ水酸化ナトリウムで洗浄され、さらに簡単に２×ＳＳＣで洗浄され、液体が残らなくなるまで乾燥される。ＤＮＡはＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）ＵＶライトボックスを用いて（「オ一トクロスリンク」の設定で）、１２００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線照射によりナイロン膜に固定化されクロスリンクされる。
　　　【００７９】
　フィルターは少なくとも３０分間６０℃（エアシェイカー）で熱シールできる袋の中でハイブリダイゼーション緩衝液（０．５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％　ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌのマス精子ＤＮＡ）に浸されて「プレハイブリダイズ」される。放射活性標識されたプローブが用いられるなら、緩衝液はその後１×１０６ｃｐｍのプローブを含む等量の同一溶液に置き換えられ、フィルターは６０℃で２時間から一晩の間ハイブリダイズされる。
　　　【００８０】
　ハイブリダイゼーション後、フィルターは三回２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで、二回２０分間室温で、さらに一度２０分間振とう水浴中で７１℃の高度の緊縮温度で洗浄される。フィルターは乾燥され、プラスチックラップにくるまれ、一枚または二枚の増感スクリーンとともに−７０℃でＸ線フィルムに露光される。
　　　【００８１】
　視覚化する別の方法は西洋ワサビを結合したオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイズすることで、このオリゴヌクレオチドプローブは「ＰＣＲプロトコール：方法と応用へのガイド」（Ｉｎｎｉｓら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）（１９８９）の９２から１１２ページのＬｅｖｅｎｓｏｎおよびＣｈａｎｇにより、およびＮ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．の第３１９巻、５３７から５４１ページ（１９８８）のＳａｉｋｉらにより記述されたように調製される。ハイブリダイゼーションは５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液当たり２ｐｍｏｌのＨＲＰ−ＳＳＯプローブを用いて行われる。
　　　【００８２】
　洗浄後、色素原の色素基質で現像されるフィルターは１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０で洗浄され、０．１ｍｇ／ｍｌの３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（Ｆｌｕｋａ）および０．００１５％過酸化水素を含む１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０に入れられ、緩やかに攪拌しながら１０から３０分間室温でインキュベートされる。現像されたフィルターは水で洗浄され、直ちに写真撮影される。ＴＭＢ検出システムはＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ　Ｒｏｃｈｅにより開発され製造され、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒから入手できるＡｍｐｌｉＴｙｐｅ　ＤＱａｌｐｈａＤＮＡタイピングキットに記述されているように基本的には調製され用いられる。別の具体例では、フィルターは化学蛍光検出システム（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて現像される。フィルターは５分間ＰＢＳで洗浄され、緩やかに攪拌しながらＥＣＬ溶液に１分間入れられる。フィルターはその後室温で１から５分間Ｘ線フィルムに露光される。
　　　【００８３】
例４
リバースドットブロット法
　種の同定にはそれぞれの試料が各種の種特異的プローブにさらされる必要がある；同一性はプロ−ブが試料ＤＮＡに結合することにより示される。それぞれの試料が複数のプロ−ブにさらされるため、リバースドットブロット法がより便利である。プローブは膜の別々の位置に固定され、その後膜に結合したプローブにハイブリダイズさせるために、膜全体が増幅された標的ＤＮＡを含む溶液に浸される。リバースドットブロットの過程は申請中の出願第１９７，０００号および第３４７，４９５号に；Ｓａｉｋｉらの１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８６巻、６２３０から６２３４ページ；およびＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ　Ｒｏｃｈｅにより開発製造され、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒから市販されるＡｍｐｌｉＴｙｐｅ　ＤＱａｌｐｈａ　ＤＮＡタイピングキットに記述される。増幅プライマーは上述のＬｅｖｅｎｓｏｎおよびＣｈａｎｇ　の１９８９年の報告に記述されたようにビオチン化され、そのため、膜結合プローブにハイブリダイズするいずれの増幅されたＤＮＡも容易に検出される。
　　　【００８４】
　一つの具体例で、検出はストレプトアビジンを結合させた西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を膜に結合したプローブにハイブリダイズしたビオチン化させた（プライマーを介した）増幅ＤＮＡと反応させることにより行われる。それ故ＨＲＰはＳＡ−ビオチン相互作用を介して増幅ＤＮＡに結合し、例えばテトラメチルベンジジンの酸化により色素化合物の生成のような各種の既知の手段によりシグナルを生成するために用いられる（米国特許第４，７８９，６３０号を参照）。
　　　【００８５】
　プローブはいずれかの手段により膜に固定化されるが、好ましい方法はオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイズする領域にポリーｄＴの長い配列を「テーリング」させることを含む。得られたポリ−ｄＴの「テール」はナイロン膜上でプローブを膜に共有結合で固定するためにアミン基と反応させることができる。この反応はＵＶ照射により促進される。
　　　【００８６】
　市販されるＤＮＡ合成機でテールを付けたプローブをまた合成できるが、末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ、Ｒａｔｌｉｆｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；以下の反応に約１２０単位／μｌ（１００ｐｍｏｌｅ／μｌ）の濃度を仮定）がプローブにポリ−ｄＴテールを付けるために用いられる。しかし、テールを付けたプローブを作るためにＤＮＡ合成機を用いる場合、プローブの５′端にテールを配置し、そのために望まない未成熟の鎖の停止が主としてテール領域に生じる。
　　　【００８７】
　ＴｄＴ反応は、１×ＴｄＴ塩、２００ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド、８００μＭ　ＤＴＴおよび６０単位のＴｄＴを含む約１００μｌの容量で行われる。１０×ＴｄＴ塩は１０００ｍＭカコジル酸カリウム、１０ｍＭ塩化コバルト、２ｍＭジチオスレイトール、２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６であり、ここで参考として取り入れられているＲｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙおよびＷｕによるＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第６５巻、４３から６２ページに記述されているように調製される。８ｍＭ　ｄＴＴＰの１０×保存溶液は簡単に調製される（水酸化ナトリウムでｐＨ７に中和される）。
　　　【００８８】
　ＴｄＴ反応は３７℃で二時間行われ、その後１００μｌの１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８を添加することにより停止される。テールを付けたオリゴヌクレオチドの終濃度は１μＭ（ｌｐｍｏｌｅ／μｌ）で、ホモポリマーテールの長さは約４００残基である。テールの長さはｄＴＴＰのオリゴヌクレオチドに対する分子比を調整することにより変えられる。テールを付けたプローブは−２０℃で使用まで保存される。
　　　【００８９】
　リバースドットブロット法に好ましいナイロン膜はＰａｌｌにより製造され、ＢｉｏＴｒａｎｓナイロン膜としてＩＣＮより販売されている、０．４５ミクロのポアサイズのＢｉｏｄｙｎｅ　Ｂナイロン膜である。プローブはＢｉｏＲａｄ製のＢｉｏ−Ｄｏｔブロット器を用いて非常に容易に膜にスポットされる。それぞれのプローブは膜上の単一の独立した位置にスポットされる。それぞれのテールを付けたプローブ２から１０ｐｍｏｌｅはドットブロット器にのせる前に５０から１００μｌのＴＥ緩衝液に予め混合される。ドットブロット後、膜は過剰の液体を取り去るために吸収紙上に一時的におかれる。膜はその後Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒライトボックスのようなＵＶライトボックス内へ入れられ、ナイロン膜へテールを付けたプローブを固定するために２５４ｎｍで５０から６０ｍＪ／ｃｍ２でＵＶにさらされる。未結合のプローブを除去するための簡単な洗浄後（ハイブリダイゼーション溶液で約１５分間）、膜はビオチン化ＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーションに用いられる。
　　　【００９０】
　増幅ＰＣＲ産物は３から１０分間９５℃で熱することにより変性され、４０μｌの変性ＰＣＲ産物がハイブリダイゼーションのためにそれぞれのプローブに添加される。ハイブリダイゼーションは０．５×ＳＳＣ．０．２５％　ＳＤＳ、および５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液からなるハイブリダイゼーション緩衝液中で、振とう水浴で２０分間５７℃で行われる。ハイプリダイゼーション緩衝液は、３．１ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液にＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒから市販される２５μｌのＳＡ−ＨＲＰを含む３ｍｌの溶液に置き換えられ、振とう水浴中で５
７℃、２０分間インキュベートされる。
　　　【００９１】
　洗浄は２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの洗浄緩衝液中で行われる。１０ｍｌの洗浄緩衝液での簡単な膜の洗浄後、１０ｍｌの緩衝液での１２分の厳密な洗浄が５７℃で行われる。さらに５分の室温での洗浄が行われ、続けて１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０による５分間の洗浄が行われる。
　　　【００９２】
　色素原の結合は、５ｍｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム、５μｌの３％過酸化水素および０．２５ｍｌの色素原（Ｐｅｒｋｉｎ　ＥｌｍｅｒのＴＭＢ）からなる５ｍｌの色素原溶液中で２５から３０分間、室温で行われる。蒸留水による１０分間の洗浄が三回室温で行われる。１×ＰＢＳでの室温、３０分間の後洗浄はシグナルの質を増すことができる。色素原が存在する段階の間は、膜はアルミ箔で被うことにより光から遮断されなければならない。現像された膜は永久に記録するために写真撮影される。
　　　【００９３】
例５
ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡの検出
　ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡの検出は上の例２に記述されたプロトコールを用いた、ビオチン化した属特異的プライマーＫＹ１８（配列番号１）およびＫＹ７５（配列番号２）による増幅およびそれに続く上の例３に記述されたドットブロット法を用いた、属特異的プローブＫＹ１０１　（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号４）へのハイブリダイゼーションにより行われる。上流プライマーＫＹ１８（配列番号１）および下流プライマーＫＹ７５（配列番号２）のハイブリダイズする領域の配列は上の表１にあげられている。属特異的プローブＫＹ１０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号４）のハイブリダイズする領域の配列は上の表２にあげられている。
　　　【００９４】
　属特異的プライマーＫＹ１８（配列番号１）およびＫＹ７５（配列番号２）はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの１５種の核酸を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に用いられた。結果が表４に示されている。予想されるように、ＫＹ１８（配列番号１）／ＫＹ７５（配列番号２）は、Ｍ．ｓｉｍｉａｅを除く全てのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種のＤＮＡを増幅した。ＫＹ７５（配列番号２）がＭ．ｓｉｍｉａｅの３′端５塩基のうち４塩基が、Ｍ．ｃｈｉｔａｅの３′端の２塩基が異なっているため、Ｍ．ｓｉｍｉａｅまたはＭ．ｃｈｉｔａｅのＤＮＡの増幅は予想されなかった。しかし、ヒトの病気へのＭ．ｓｉｍｉａｅの関連は殆ど報告されていないので、検出は臨床的には重要ではない。Ｍ．ｘｅｎｏｐｉおよびＭ．ｔｅｒｒａｅのＤＮＡを除いて、ハイブリダイズした全ての増幅したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡは属特異的プローブＫＹ１０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号４）とのハイブリダイゼーションにより検出された。
　　　【００９５】
　【表４】
　　　【００９６】
　これらのプライマーの特異性は２２の異なるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａではない種のＤＮＡを増幅させることにより試験された。増幅産物はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ　ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ　ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｎｉｓｓｅｒｉａ　ｓｉｃｃａおよびＰｒｏｐｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｎｅｓのＤＮＡのみから得られた。しかし、これらの増幅産物は属特異的プローブとはハイブリダイズせず、それ故、誤りの陽性結果は得られなかった。試験された生物は下の表５にあげられている。
　　　【００９７】
　【表５】
　　　【００９８】
例６
種の同定
　ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡが臨床試料に検出されると、核酸を生じる種が例４のリバースドットブロット法を用いて種特異的プローブとのハイブリダイゼーションのパターンにより決定される。現在のシステムにより検出される臨床的に興味のある種はＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。さらに、この種が頻繁に臨床試料に見いだされるため、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅの検出が望まれる。
　　　【００９９】
　図１は表３のプローブから選択された種特異的プローブの特異性の試験の結果を示す。予想された特異性とともに、それぞれのプローブのハイブリダイズする領域の配列が上の表３に示されている。Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉａの異なる１３種の精製ＤＮＡの増幅産物が属特異的および種特異的プローブの特異性を試験するために用いられた。それぞれの種に対して、培養された細菌から精製された１ｐｇのＤＮＡ（約３００の細菌ゲノムに相当）がビオチン化プライマーを用いて、例２のように増幅された。プローブハイブリダイゼーションの検出は例４のリバースドットブロット法を用いて行われた。増幅ＤＮＡの存在の陽性の対照として、属特異的プローブが種特異的プローブとともに試験ストリップに含まれた。
　　　【０１００】
例７
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの１６Ｓ　ｒＲＮＡの増幅
　１６Ｓ　ｒＲＮＡは逆転写により最初にｃＤＮＡを作成し、このｃＤＮＡを増幅することにより増幅される。上述の例２と同一のプライマーが用いられる。この例では、高温での逆転写およびＰＣＲ増幅の両者が熱安定性Ｔｔｈポリメラーゼを用いて行われる。
　　　【０１０１】
　逆転写は次の組成を含む２０μｌの容量で行われる：８μｌのＨ２０、２μｌの１０×ＲＴ反応緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、および９００ｍＭ塩化カリウム）、２μｌの１０ｍＭ塩化マンガン、２μｌのｄＮＴＰ溶液（それぞれＨ２Ｏに溶解した２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、ｐＨ７．０）、２μｌの「下流」プライマー（Ｈ２０に溶解した７．５ｍＭ）、１×保存緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．　５、１００ｍＭ塩化カリウム、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０．２％　Ｔｗｅｅｎ　２０（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール）に溶解した２μｌの０．１８μＭのＴｔｈポリメラーゼおよび２μｌの鋳型ＲＮＡ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解した２５０ｎｇ以下）。Ｔｒｉｓを除く全ての溶液は、Ｍａｎｉａｔｕｓらの１９８２年の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）」の１９０ページに記述されたように混入しリボヌクレアーゼを除去するためにジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理される。逆転写はサーモサイクラーで５分間、７２℃で行われる。反応は氷で４℃まで冷却することにより停止される。
　　　【０１０２】
　ＰＣＲ増幅は次の試薬を添加することにより行われる：２μｌの残りのプライマー（Ｈ２ｏに溶解した７．５ｍＭ）、２μｌのｄＮＴＰ溶液（それぞれＨ２ｏに溶解した１０ｍＭ　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ．ｐＨ７．０）、８μｌの１０×ＰＣＲ反応緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１ｍＭ塩化カリウム、１８．７５ｍＭ塩化マグネシウム、７．５ｍＭ　ＥＧＴＡおよび５０％（ｖ／ｖ）グリセロール）および６８μｌのＤＥＰＣ処理したＨ２ｏ。核酸は例２と同一の熱プローフィールを用いて、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒサーマルサイクラーで増幅される。増幅産物は前述の例のように解析される。
　　　【０１０３】
例８
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの検出のためのマイクロタイタープレートアッセイ
　本発明のこの具体例で、プローブはマイクロタイタープレートのウェルに固定される。増幅された標的ＤＮＡは上述のように結合したプローブにハイブリダイズされる。前例にあるように、増幅プライマーは結合プローブにハイブリダイズした増幅ＤＮＡを検出するためにビオチン化される。
　　　【０１０４】
　ＢＳＡに結合した望みのプローブは最初に個々のウェルのプラスチック表面に吸着された。ウェルはその後ウシ血清アルブミンのようなタンパク質でブロックされた。好ましくはＣｏｒｎｉｎｇ製の９６ウェルプレートが用いられる。
　　　【０１０５】
　増幅が完了すると、ＰＣＲチューブはサーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）から取り出された。１００μｌの変性溶液がそれぞれのＰＣＲチューブに添加された。新しいチップがそれぞれのチューブに用いられる。一つの具体例で、検出は直ちには行われない。その場合、ＰＣＲチューブは２から８℃で一晩保存された。変性された増幅反応液は２から８℃の保存で粘性をもつようになる。チューブは開ける前にピペッテイングを容易にするために２５から３０℃で簡単に温められた。
　　　【０１０６】
　適当な数の８ウェルのマイクロタイタープレートのストリップ（少なくとも二つのストリップ）が取り出され、マイクロタイタープレート枠にセットされた。１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液がマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに入れられた。
　　　【０１０７】
　変性溶液は０．４Ｍ水酸化ナトリウム；８０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．００５％チモールブルーを含む。ハイブリダイゼーション／中和緩衝液は３Ｍチオシアン化ナトリウム；８０ｍＭリン酸一ナトリウム；１０ｍＭリン酸一ナトリウムおよび０．１２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む。使用前にｐＨは５．０＋／−０．２になるようにチェックされる。
　　　【０１０８】
　マルチチャンネルピペッターで充電チップを用いて、トレーのそれぞれのＰＣＲチューブからの２５μｌの変性された増幅反応液がマイクロタイタープレートの相当するウェルの位置に入れられた。プレートはマイクロタイタープレートの蓋で被われ、１０から１５回側面を緩やかにたたかれた。適正な試薬のピペッティングが行われたウェルは黄色に着色する。色の変化がない、または青色への単一の変化が注目されるなら、過剰量のアンプリコンが添加される。陽性のＯＤ値は増加するが、陰性のＯＤ値は影響されなくなるまで試験は続けられる。プレートは６０分間、３７℃でインキュベートされた。３７℃、一時間の最初のハイプリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション／中和緩衝液は除去され、同一緩衝液に置き換えられ、プレートはさらに１５分、３７℃インキュベートされた。
　　　【０１０９】
　インキュベーションに続いて、プレートは五回、洗浄溶液で洗浄された。プレートの洗浄は手動で、または適当にプログラムされた自動マイクロタイタープレート洗浄機を用いて行われる。洗浄には、１×ＰＣＲ洗浄緩衝液が用いられた。１０×濃度のＰＣＲ洗浄緩衝液は次のように調製された：９．９４ｇ／ｌのリン酸二ナトリウム；４．４１ｇ／１のリン酸一ナトリウム；３．７２２ｇ／ｌのＥＤＴＡ；８７．６６ｇ／ｌの塩化ナトリウム；１３．７ｇ／ｌのＴｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ｌのＰｒｏ　Ｃｌｉｎ３００（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ、Ｐｈｉｌａｎｄｅｌｐｈｉａ．ＰＡ）。溶液はｐＨをリン酸で調整される（ｐＨ６．５から７．１が望ましい）。
　　　【０１１０】
　手動洗浄では、プレートの中身は空にされ、乾燥された。３００μ１の洗浄溶液が試験されるプレートのそれぞれのウェルに添加され、プレートは１５から３０秒乾かされた。プレートは再び空にされ、乾燥された。この洗浄の過程はさらに四回繰り返された。その後プレートは乾燥された。
　　　【０１１１】
　自動マイクロプレート洗浄機では、次の手法が用いられた。ウェルの中身は吸引された。洗浄機は試験されるプレートのそれぞれのウェルに３５０μｌの洗浄溶液が添加され、３０秒間浸され、吸引されるようにプログラムされた。この段階がさらに四回繰り返された。プレートはその後乾燥された。
　　　【０１１２】
　１００μｌのコンジュゲートが試験されるプレートのそれぞれのウェルに添加された。アビジン−ＨＲＰコンジュゲートは次のように調製される。希釈液は０．１モル；０．２５％Ｅｍｕｌｓｉｔ２５（ＤＫＳ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）；１．０％Ｋａｔｈｏｎ　ＣＧ（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）；０．１％フェノール；１．０％ウシγ−グロブリンを含む。溶液は濃塩酸でｐＨ７．３に調整された。この希釈液に対して、１０ｎＭの結合したアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）が添加された。プレートはその後カバーされ、５０分間、３７℃でインキュベートされ、再び上述のように洗浄された。作用基質は二つの８ウェルマイクロタイタープレートのストリップ（１６検体）に対し、２．０ｍｌの基質Ａおよび０．５ｍｌの基質Ｂを混合することにより調製された。基質Ａは３ｍＭ過酸化水素、６．５ｍＭクエン酸および０．１％Ｋａｔｈｏｎ　ＣＧを含む。基質Ｂは４．２ｍＭ３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンおよび４０％ジメチルホルムアミドを含む。作用基質は使用三時間以内に調製され、直射日光を避けて保存された。
　　　【０１１３】
　１００μｌの作用基質（基質ＡおよびＢの混合液）が試験されるプレートのそれぞれのウェルに添加された。プレートはカバーされ、１０分間、室温（２０から２５℃）で、暗所にてインキュベートされた。１００μｌの停止試薬（５％硫酸）が試験されるそれぞれのウェルに添加された。それぞれのウェルの４５０ｎｍの吸収が停止試薬を添加後一時間以内に読まれた。吸収値は試料および対照について記録された。
　　　【０１１４】
例９
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸の増幅および検出のための方法に有効な陽性の対照ベクターの構築
　種特異的プローブ結合配列を含むオリゴヌクレオチドがその相補鎖（ＫＹ１７８（配列番号２４）からＫＹ１８１（配列番号２７））とともに合成された。（これらのオリゴはクローニングを容易にするために両端に制限酵素の認識部位を含む。）ＫＹ１７８（配列番号２４）およびＫＹ１７９（配列番号２５）、またはＫＹ１８０（配列番号２６）およびＫＹ１８１（配列番号２７）のそれぞれ１μｇが、相補鎖をアニールさせるために、合わされ、５分間９８℃で熱処理され、一時間７５℃でインキュベートされた。アニール産物は３％Ｎｕｓｉｅｖｅ（ＦＭＣ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）／１％アガロースゲルの電気泳動により、残留した一本鎖のオリゴから分離された。二本鎖の産物のバンドは切り出され、ＤＮＡが溶出された。ＤＮＡ断片はその後適当な制限酵素で切断され、互いに連結された。連結産物は上記のＮｕｓｉｅｖｅ／アガロースゲルから分離された。
　　　【０１１５】
　レシピエントベクターが調製された。レシピエントベクターはプライマーおよびプローブ結合部位を含むＭ．ｔｂの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の断片が挿入されたプラスミドで、次のように調製された。
　　　【０１１６】
　５０ｐｇのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＮＡがプライマーＫＹ７０（配列番号２８）およびＣＲ０１（配列番号２９）を用いて、全反応系１００μｌ中に５０ｐｍｏ１のＣＲ０１（配列番号２９）、８０ｐｍｏ１のＫＹ７０（配列番号２８）、２０ｎｍｏ１のそれぞれのｄＮＴＰ１２．５単位のＴａｑポリメラーゼおよび１×ＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．９；５０ｍＭ塩化カリウム；１．５ｎＩＭ塩化マグネシウム）が存在する状態で増幅された。熱のサイクル条件は例２の概略の通りである。増幅産物は１００μｌのクロロホルムで抽出された。
　　　【０１１７】
　増幅産物およびベクターｐＢＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の両者は制限酵素ＰｓｔＩで消化され、一度フェノール／クロロホルムで抽出され、エタノールで沈澱された。（ＣＲ０１は５′端にＰｓｔＩ部位を含み、増幅産物はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ特異的プライマーおよびプローブの結合部位の下流に内部ＰｓｔＩ部位を含む。）ＰｓｔＩで切断されたベクターは仔ウシの腸のホスファターゼでの処理により脱リン酸化され（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、フェノール／クロロホルムで抽出された後、エタノールで沈澱された。調製された増幅産物は標準条
件下でベクターに連結された（Ｍａｎｉａｔｉｓ）。
　　　【０１１８】
　連結されたＤＮＡは大腸菌のコンピテント細胞に形質転換された。望みの挿入を含むプラスミドをもつコロニーは次のようにｔｂ一特異的プローブＫＹ２１（配列番号５）に対するコロニーブロットハイブリダイゼーションにより同定された。細菌は栄養寒天プレート上に重層されたニトロセルロースフィルターディスクに画線され、一晩培養された。フィルターは取り出され、続いて３ＭＭ漉紙に細菌側を上にして）重層され、１０％ＳＤＳ（３分）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム／１．５Ｍ塩化ナトリウム（５分）、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ８／１
．５Ｍ塩化ナトリウム（５分）および２×ＳＳＣ（５分）に浸された。フィルターは風乾された。ＤＮＡはフィルター上でＵＶ照射によりクロスリンクされ、その後ＫＹ２１（配列番号５）にハイブリダイズされ、例３の概略のように洗浄された。
　　　【０１１９】
　【化１】
　　　【０１２０】
　ｐＫＹ５と命名されたこのベクターは、種特異的プローブ結合部位を含むが、完全なプライマーおよび属特異的プローブ結合部位を取り去った１７４塩基対の断片を除去するために、制限酵素ＳｔｙＩおよびＸｈｏＩで切断されたプラスミドは１．５％低融点アガロースゲル電気泳動により１７４塩基対の断片から分離された。ベクターを含むバンドはゲルから切り出され、ＮＡＣＳカラム（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂ）を用いたクロマトグラフィおよびエタノール沈殿により精製された。種特異的プローブの認識部位を含む挿入断片は調整したベクターに連結される。連結産物はコンピテントの宿主細菌に形質転換される。
　　　【０１２１】
　適当な挿入を含む形質転換体はＰＣＲ増幅により同定される。形質転換体の細菌コロニーは０．５ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁される。５０μｌの細菌懸濁液はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡの増幅に必要な組成を含むＰＣＲ反応チューブに入れられ、増幅が上述のように行われる。望みの挿入を含むプラスミドをもつ細菌はプライマーＫＹ１８（配列番号１）およびＫＹ７５（配列番号２）の対を用いて、６４０塩基対のＰＣＲ産物を生成する。元々のｐＫＹ５プラスミドを含む細菌の増幅は５８４塩基対のＰＣＲ産物を生成する。
　　　【０１２２】
　それ故生成されたアンプリコンは、例に記述されている属特異的および種特異的プローブのハイブリダイゼーション部位の存在を確認するために、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの属特異的および種特異的プローブに例４に概略されるリバースドットブロットハイブリダイゼーションによりハイブリダイズされる。陽性の対照プラスミドは、属プローブおよび種特異的プローブの選択された部分にハイブリダイズするように類似して調製される。キットでは例えば、ＫＹ１７８からＫＹ１８１（配列番号２４から２７）の配列を含む陽性の対照プラスミドを含むことに加え、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを他の種と区別するための陽性の対照プラスミドを含むことが望ましい。
　　　【０１２３】
　【化２】
　　　【０１２４】
例１０
陽性の対照プラスミドの利用
　陽性の対照プラスミドの一つの利用は、特異的な実験における増幅の効率をモニターすることである。そのような応用では、陽性の対照プラスミドの連続的な希釈液が作成される。既知のコピー数のプラスミドが増幅反応の鋳型として用いられる。増幅されるプラスミドＤＮＡの最低数が増幅反応の効率の測定を与える。陽性の対照プラスミドの別の利用は、属および種特異的プローブがＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡを検出する効率をモニターするために用いられる産物を生成することである。上述のように生成された増幅産物はハイブリダイゼーション反応の基質として作用できる。適当なハイプリダイゼーションシグナルの生成はプローブがどの程度良好にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡを検出できるかについての評価を可能にする。
　　　【０１２５】
　【配列表】
配列番号：１：
（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：２３塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：１：
　【化３】
　　ＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧ　ＴＣＧＡＡＣＧＧＡＡ　ＡＧＧ　２３
　　　【０１２６】
配列番号：２：
（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：２４塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎮
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：２：
　【化４】　　　　　
　　ＧＣＣＣＧＴＡＴＣＧ　ＣＣＣＧＣＡＣＧＣＴ　ＣＡＣＡ　２４
　　　【０１２７】
配列番号：３：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：３：
　【化５】　　　
　　ＴＣＧＣＧＴＴＧＴＴ　ＣＧＴＧＡＡＡＴＣＴ　ＣＡＣＧＧＣＴＴ　ＡＡ　３０
　　　【０１２８】
配列番号：４：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：４：
　【化６】
　　ＴＣＧＣＧＴＴＧＴＴ　ＣＧＴＧＡＡＡＡＣＴ　ＣＡＣＡＧＣＴＴＡＡ　３０
　　　【０１２９】
配列番号：５：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ＝３６塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：５：
　【化７】
　　ＡＣＧＧＧＡＴＧＣＡ　ＴＧＴＣＴＴＧＴＧＧ　ＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣ　ＴＴＴＡＧＣ　３６
　　　【０１３０】
配列番号：６：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ＝３０塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：６：
　【化８】
　　ＡＣＴＴＧＧＣＧＣＡ　ＴＧＣＣＴＴＧＴＧＧ　ＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴ　３０
　　　【０１３１】
配列番号：７：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：７：
　【化９】
　　ＴＴＴＡＧＧＣＧＣＡ　ＴＧＴＣＴＴＴＡＧＧ　ＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴ　　　　３０
　　　【０１３２】
配列番号：８：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３４塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：８：
　【化１０】
　　ＴＣＡＡＧＡＣＧＣＡ　ＴＧＴＣＴＴＣＴＧＧ　ＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴ　ＴＴＧＣ　３４
　　　【０１３３】
配列番号：９：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：９：
　【化１１】
　　ＴＣＣＣＧＡＡＧＴＧ　ＣＡＧＧＣＣＡＧＡＴ　ＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧ　３０
　　　【０１３４】
配列番号：１０：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：１０：
　【化１２】
　　ＧＡＡＧＧＣＴＣＡＣ　ＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴ　ＧＡＣＧＧＴＡＧＧＴ　　　３０
　　　【０１３５】
配列番号：１１：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：１１：
　【化１３】
　　ＧＣＡＡＴＣＴＧＣＣ　ＴＧＣＡＣＡＣＣＧＧ　ＧＡＴＡＡＧＣＣＴＧ　　３０
　　　【０１３６】
配列番号：１２：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３４塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：１２：
　【化１４】
　　ＧＧＧＴＣＴＡＡＴＡ　ＣＣＧＡＡＴＡＧＧＡ　ＣＣＡＣＡＧＧＡＣＡ　ＣＡＴＧ　　　　　３４
　　　【０１３７】
配列番号：１３：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ＝：１３：
　【化１５】
　　ＴＣＧＣＧＴＴＧＴＴ　ＣＧＴＧＡＡＡＴＣＴ　ＣＡＣＡＧＣＴＴＡＡ　　　　　　３０
　　　【０１３８】
配列番号：１４：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：１４：
　【化１６】
　　ＴＣＧＣＧＴＴＧＴＴ　ＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴ　ＣＡＣＡＧＣＴＴＡＡ　　　　３０
　　　【０１３９】
配列番号：１５：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ＝：１５：
　【化１７】
　　ＴＣＧＣＧＴＴＧＴＴ　ＣＧＴＧＧＡＡＴＧＣ　ＣＡＣＡＧＣＴＴＡＡ　　　３０
　　　【０１４０】
配列番号：１６：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：１６：
　【化１８】
　　ＡＴＡＧＧＡＣＣＡＴ　ＴＣＴＧＣＧＣＡＴＧ　ＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧ　　　　　３０
　　　【０１４１】
配列番号：１７：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：２４塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：１７：
　【化１９】
　　ＡＣＣＴＣＡＡＧＡＣ　ＧＣＡＴＧＴＣＴＴＣ　ＴＧＧＴ　　　　　　　２４
　　　【０１４２】
配列番号：１８：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：２４塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：１８：
　【化２０】
　　ＣＣＧＡＡＴＡＧＧＡ　ＣＣＡＣＡＧＧＡＣＡ　ＣＡＴＧ　　　　　　　２４
　　　【０１４３】
配列番号：１９：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：２４塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：１９：
　【化２１】
　　ＡＣＣＴＴＴＡＧＧＣ　ＧＣＡＴＧＴＣＴＴＴ　ＡＧＧＴ　　　　　　　２４
　　　【０１４４】
配列番号：２０：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：２４塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：２０：
　【化２２】
　　ＡＡＣＡＣＴＴＧＧＣ　ＧＣＡＴＧＣＣＴＴＧ　ＴＧＧＴ　　　　　　　２４
　　　【０１４５】
配列番号：２１：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：２４塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：２１：
　【化２３】
　　ＧＡＡＧＧＣＴＣＡＣ　ＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴ　ＧＡＣＧ　　　　　　　２４
　　　【０１４６】
配列番号：２２：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：２４塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：２２：
　【化２４】
　　ＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡ　ＡＧＣＧＣＴＴＴＡＧ　ＣＧＧＴ　　　　　　　２４
　　　【０１４７】
配列番号：２３：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：２４塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：２３：
　【化２５】
　　ＡＧＧＡＣＣＡＴＴＣ　ＴＧＣＧＣＡＴＧＴＧ　ＧＴＧＴ　　　　　　　２４
　　　【０１４８】
配列番号：２４：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：１３９塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：２４：
　【化２６】
　　　【０１４９】
配列番号：２５：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：１３９塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：２５：
　【化２７】
　　　【０１５０】
配列番号：２６：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：１２６塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：２６：
　【化２８】
　　　【０１５１】
配列番号：２７：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：１２６塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：２７：
　【化２９】
　　　【０１５２】
配列番号：２８：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：２９塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤ　ＮＯ：２８：
　【化３０】
　　ＧＣＧＧＴＡＣＣＴＧ　ＣＡＣＡＣＡＧＧＣＣ　ＡＣＡＡＧＧＧＡＡ　２９
　　　　【０１５３】
配列番号：２９：
　　　　（ｉ）配列の特徴：
　　　　　　　　　（Ａ）長さ：３１塩基対
　　　　　　　　　（Ｂ）型：核酸
　　　　　　　　　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　　　　　　　　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　　　（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
　　　（ｘｉ）配列の記述：配列ＩＤＮＯ：２９：
　【化３１】
　　ＣＧＣＣＴＧＣＡＧＴ　ＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣ　ＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧ　Ｇ３１
【図面の簡単な説明】
　　【図１】
　表３のプローブから選択されたプローブの特異性の試験の結果を示す図である。