(57)【要約】  本発明は、改善された安定性と長い血漿半減期を有する、ビタミンＫ依存性ポリペプチド、具体的にはヒトVII因子、ヒトVIIａ因子、ヒトIX因子、および、ヒトプロテインＣ、および、それらの誘導体をコードする改変されたｃＤＮＡ配列、このようなｃＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、改変されていない野生型タンパク質の生物活性を有するが、改善された安定性を有する組換えポリペプチドおよび誘導体、ならびに、このような組換えタンパク質およびそれらの誘導体の製造方法に関する。本発明はまた、このような改変されたＤＮＡ配列を含むヒト遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターも包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドを製造する方法であって、該方法は、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドを改変することを含み、それによって、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、活性化ペプチドが改変されていない第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比較して増加した半減期を有するようになる、上記方法。
【請求項２】
改変は、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を付加すること、または、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの類似体を付加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの血漿中半減期は、改変されていない第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの血漿中半減期より大きい、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
改変は、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部で置換することを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも８個の連続したアミノ酸からなる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
改変は、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化の特異性を保存しながら、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドを、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドで置換することを含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
改変は、（ｉ）第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの軽鎖と活性化ペプチドとの間の切断部位を除去すること、または、（ii）第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドと重鎖との間の切断部位を除去することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化された形態は、非改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化された形態と比較して増加した血漿中半減期を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの酵素原の形態は、非改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの酵素原の形態と比較して増加した血漿中半減期を有し、ここにおいて、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの改変された活性化ペプチドは、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドが活性化された際に放出される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化された形態は、非改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化された形態と比較して増加した血漿中半減期を有し、ここにおいて、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドが活性化された際の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの改変された活性化ペプチドは、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの軽鎖または重鎖のいずれかに共有結合したままである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの酵素原の形態は、非改変型ビタミンＫ依存性ポ
リペプチドの酵素原の形態と比較して増加した血漿中半減期を有し、ここにおいて、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドが活性化された際の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの改変された活性化ペプチドは、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの軽鎖または重鎖のいずれかに共有結合したままである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化された形態は、非改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化された形態と比較して増加した血漿中半減期を有し、ここにおいて、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの改変された活性化ペプチドは、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドが活性化された際に放出される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
改変は、活性化ペプチド中の翻訳後修飾部位を改変することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
改変は、活性化ペプチド中の少なくとも１個のＮ型糖鎖付加部位を除去することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、ヒトVIIまたはVIIａ因子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１８および配列番号１９からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、ヒトプロテインＣであり、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１８および配列番号１９からなる群より選択される、請求項２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、ヒトIX因子であり、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドは、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する、請求項２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
改変は、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化の特異性を実質的に改変しない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、活性化ペプチドが改変されていないビタミンＫ依存性ポリペプチドと比較して増加した半減期を有する、改変された活性化ペプチドを含む改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項２１】
改変された活性化ペプチドは、異なるビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部、または、この異なるビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの類似体を含む、請求項２０に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項２２】
異なるビタミンＫ依存性の活性化ペプチドの一部は、異なるビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも８個の連続したアミノ酸からなる、請求項２１に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項２３】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、改変ヒトVII因子、改変ヒトIX因子、および、改変ヒトプロテインＣからなる群より選択される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項２４】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、活性化ペプチドの少なくとも一部が、配列番号１８および配列番号１９からなる群より選択されるアミノ酸配列で置換された改変ヒトVII因子である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項２５】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、活性化ペプチドの少なくとも一部が配列番号１８および配列番号１９からなる群より選択されるアミノ酸配列で置換された改変ヒトプロテインＣである、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項２６】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、活性化ペプチドが配列番号１９で示されるアミノ酸配列で置換された改変IX因子である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項２７】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、その活性化ペプチド中のＮ型糖鎖付加部位を欠失している、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項２８】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの半減期は、それに対応する活性化ペプチドが改変されていないビタミンＫ依存性ポリペプチドと比較して少なくとも５０％増加する、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項２９】
改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、それに対応する活性化ペプチドが改変されていないビタミンＫ依存性ポリペプチドと比較して高い安定性を有する、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項３０】
凝血活性を有する、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項３１】
（ｉ）改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化された形態は、改変された活性化ペプチドを含まないこと、および、（ii）改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの酵素原の形態は、非改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの酵素原の形態と比較して増加した半減期を有することを特徴とする、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項３２】
（ｉ）改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化された形態は、改変された活性化ペプチドを含むこと、および、（ii）改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化された形態は、非改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化された形態と比較して増加した半減期を有することを特徴とする、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド。
【請求項３３】
請求項２０〜３２のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項３３に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクター。
【請求項３５】
発現ベクターである、請求項３４に記載のプラスミドまたはベクター。
【請求項３６】
ヒト遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターである、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
請求項３３に記載のポリヌクレオチド、または、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のプラスミドまたはベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
−改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドが発現するような条件下で請求項３４に記載の宿主細胞を培養すること；および、
−場合により、該宿主細胞または培地から改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドを回収すること、
を含む、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの製造方法。
【請求項３９】
請求項２０〜３２のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド、請求項３３に記載のポリヌクレオチド、または、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のプラスミドまたはベクターを含む医薬組成物。
【請求項４０】
血液凝固障害を治療または予防する医薬品を製造するための、請求項２０〜３２のいずれか一項に記載の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド、請求項３３に記載のポリヌクレオチド、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のプラスミドまたはベクター、または、請求項３７に記載の宿主細胞の使用。
【請求項４１】
血液凝固障害は、血友病Ａである、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
治療は、ヒト遺伝子治療を含む、請求項４０または４１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された安定性と長い血漿中半減期を有するビタミンＫ依存性ポリペプチド、具体的にはヒトVII因子、ヒトVIIａ因子、ヒトIX因子、および、ヒトプロテインＣおよびそれらの誘導体をコードする改変されたｃＤＮＡ配列、このようなｃＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、改変されていない野生型タンパク質の生物活性を有するが、改善された安定性を有する組換えポリペプチドおよび誘導体、および、このような組換えタンパク質およびそれらの誘導体の製造方法に関する。本発明はまた、このような改変されたＤＮＡ配列を含む、ヒト遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターも含む。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＫ依存性タンパク質は、ある種のタイプの血友病を治療するのに用いられる。典型的な血友病または血友病Ａは、遺伝性の出血障害である。これはＸ染色体伴性の血液凝固第VIII因子欠乏症により発症し、ほとんど雄のみが１０,０００人中１〜２人の発生率で影響を受ける。Ｘ染色体異常は、雌のキャリアー（自身は血友病者ではない）によって遺伝する。血友病Ａの臨床症状は、高い出血傾向である。濃縮VIII因子での治療が導入される以前は、重度の血友病に罹った人の平均寿命は、２０歳未満であった。血漿由来の濃縮VIII因子の使用、その後のＦVIIIの組換え型の使用によって、血友病患者を取り巻く状況は顕著に改善され、平均寿命は大幅に伸び、その人々の多くに程度の差はあるが普通の生活を送る可能性を与えた。血友病Ｂ（その罹患率は血友病Ａよりも５倍少ない）は、ＦIXが機能しないか、または、欠失していることによって引き起こされるものであり、血漿由来の濃縮ＦIXまたはＦIXの組換え型で治療される。血友病Ａと血友病Ｂのいずれにおいても、病気の治療における最も重篤な医学的問題は、補充された因子に対する同種異型抗体の生成である。全ての血友病Ａ患者の３０％もが、ＦVIIIに対する抗体を発生させる。それほどではないにせよＦIXに対する抗体も発生し、免疫寛容誘導治療への感度が低くなるにつれてより重度の結果が生じる。
【０００３】
現在の凝固モデルによれば、生理学的な凝固のきかっけは、通常血管系の外側に位置するＴＦ発現細胞の表面での組織因子（ＴＦ）とVIIａ因子（ＦVIIａ）との複合体の形成であると言われている。これによりＦIXの活性化が起こり、最終的にＦＸはいくつかのトロンビンを生産する。正のフィードバックループで、トロンビンは、ＦVIIIおよびＦIXを活性化し（これが、いわゆる血液凝固カスケード「本来の」目的である）、それによって、完全な止血を達成するための完全なトロンビンのバーストを発生させるのに必要なＦＸａの生成を増幅する。通常の生理学的レベルを超える濃度のＦVIIａを投与することによって、ＦVIIIａおよびＦIXａの必要性を迂回して止血が達成されることが示されている。ＦVIIに関するｃＤＮＡのクローニング（ＵＳ４,７８４,９５０）により、その血漿から誘導された凝固因子の組換え代替物を開発することが可能になった。１９８８年に、このＦVIIａの高いタイターのＦVIII阻害抗体を有する患者への投与が初めて成功した。それ以来ＦVIIａの効能（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）の数は徐々に増えており、これは、万能な止血剤になる可能性があるということの現れである（Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎ，２００２）。
【０００４】
ＦVIIは、分子量５０ｋＤａの単鎖糖タンパク質であり、これは、肝細胞によって４０６個のアミノ酸からなる不活性な酵素原として血流に分泌される。ＦVIIは、このタンパク質のＧｌａドメインに位置する１０個のγ−カルボキシ−グルタミン酸残基（６、７、１４、１６、１９、２０、２５、２６、２９および３５位）を含む。Ｇｌａ残基は、それらの生合成のためにビタミンＫを必要とする。Ｃ末端からＧｌａドメインに向かって、２
つの上皮増殖因子ドメイン、続いてトリプシン様セリンプロテアーゼドメインが存在する。ＦVIIのさらなる翻訳後修飾としては、水酸化（Ａｓｐ６３）、Ｎ型（Ａｓｎ１４５、および、Ａｓｎ３２２）、同様に、Ｏ型糖鎖付加（Ｓｅｒ５２およびＳｅｒ６０）が挙げられる。
【０００５】
ＦVIIは、Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３での単一のペプチド結合のタンパク質分解によってその活性化された形態であるＦVIIａに変換され、ここで２個のポリペプチド鎖、Ｎ末端軽鎖（１７ｋＤａ）とＣ末端重鎖（２８ｋＤａ）とが形成され、これらは１個のジスルフィド架橋で連結されている。その他のビタミンＫ依存性ポリペプチドとは対照的に、ＦVIIに関して、活性化の際に切り離される活性化ペプチドは説明されていない。相同性比較によれば、Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３切断部位は、その他のビタミンＫ依存性ポリペプチドのＣ末端の活性化切断部位に相当する。しかしながら、Ａｒｇ１４４もまたプロテアーゼの切断部位を構成する可能性があることから、現在の考えに対して、ＦVIIは、Ａｒｇ１４４〜Ａｒｇ１５２の８個のアミノ酸からなる活性化ペプチドを有するということは排除できない。
【０００６】
ＦVIIａの活性なコンフォメーションを達成するためには、Ｉｌｅ１５３〜Ａｓｐ３４３間の活性化による切断の後の塩架橋の形成が必須である。インビトロで、ＦVIIの活性化は、ＦＸａ、ＦXIIａ、ＦIXａ、ＦVIIａ、ＦＳＡＰおよびトロンビンによって達成できる。Ｍｏｌｌｅｒｕｐ等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９５）４８：５０１〜５０５）は、いくつかの切断が、重鎖のＡｒｇ２９０および／またはＡｒｇ３１５でも起こることを報告している。
【０００７】
ＦVIIは、血漿中に濃度５００ｎｇ／ｍｌで存在する。ＦVIIのうち１％（例えば５ｎｇ／ｍｌ）が、ＦVIIａとして存在する。ＦVIIの血漿中半減期は約４時間であり、ＦVIIａの血漿中半減期は約２時間であることがわかっている。アンチトロンビンIIIのようなセルピンによる回復不能の阻害のために、ＦVIIａの２時間の半減期は、活性化された凝固因子としては比較的長いが（他の場合では分単位であることが多い）、それにもかかわらず、止血を達成するためには複数回の静脈注射または持続点滴が必要になり、患者にとって極めて高い治療コストと不便を強いるために、これはＦVIIａの治療用途に関して深刻な欠点の一つである。一方で、ＦVIIａは、万能な止血剤としての使用可能性があるため、より長い有効半減期を有するＦVIIａの形態を開発するために医療上の高い必要性がある。
【０００８】
ＦVIIを改変するために数々の試みがなされてきた：
Ｎｉｃｏｌａｉｓｅｎ等（ＷＯ８８／１０２９５，１９８７年６月２５日）によれば、以下のアミノ酸を欠失または改変することによって、ＦVIIは、タンパク質分解に対して安定化されることが示唆されている：Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３８、Ｌｙｓ１４３、Ａｒｇ２９０、Ａｒｇ３１５、Ｌｙｓ３１６、Ｌｙｓ３４１、Ａｒｇ３９２、Ａｒｇ３９６、Ａｒｇ４０２、Ｉｌｅ４２およびＴｙｒ４４。
【０００９】
Ｎｉｃｏｌａｉｓｏｎ（ＵＳ５,５８０,５６０，１９８９年１１月１３日）は、ＷＯ８８／１０２９５を発展させて、ＦVII／ＦVIIａのタンパク質分解に対する感受性を低くするために、Ａｒｇ３０４、Ｐｈｅ２７８およびＴｙｒ３３２に突然変異または欠失を入れることも挙げている。
【００１０】
Ｂｈａｒａｄｗａｊ等（ＪＢＣ(１９９６)，４８，３０６８５〜３０６９１頁）は、ＦＸを活性化できないＦVII突然変異体Ｐｈｅ３２８Ｓｅｒを発現させて、アミド分解活性が検出されなかったことを示している。
【００１１】
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ等（ＰＮＡＳ(１９９６)９３，１４３７９〜１４３８４）は、Ｌｙｓ１５７、Ｖａｌ１５８、Ｇｌｕ２９６、Ｍｅｔ２９８、Ａｓｐ３３４、Ｓｅｒ３３６またはＬｙｓ３３７がＡｌａで置換されたＦVIIａ変異体を提唱している。
【００１２】
Ｎｅｌｓｅｓｔｕｅｎ（ＷＯ９９／２９７６７，１９９７年１０月２３日）は、Ｇｌａドメインのリン脂質膜への親和性が強化されるように点突然変異を導入することによってＧｌａドメインを改変し、それによって、特異的活性を強化した改変型ＦVIIａを得ている。提唱されている点突然変異は、Ｐｒｏ１０、Ｇｌｙ１１、Ａｒｇ２８およびＬｙｓ３２での変異である。
【００１３】
Ｎｅｌｓｅｓｔｕｅｎ（ＷＯ００／６６７５３，１９９９年４月２９日）は、Ｇｌａドメインのリン脂質膜への親和性が強化されるように点突然変異を導入することによってＧｌａドメインを改変し、それによって、特異的活性を強化した改変型ＦVIIａを得ている。提唱されている点突然変異は、５、９、１１、１２、２９、３３、３４、３５および／または３６での変異である。
【００１４】
Ｋｏｒｎｆｅｌｔ等（Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ., ３６３，４３〜５４頁）は、Ｍｅｔ２９８およびＭｅｔ３０６の酸化により、野生型ＦVIIａと比較して３０％高いＴＦからのＦVIIａ−ｏｘの解離速度、および、２０％低いＦＸ活性化が得られることを示している。
【００１５】
Ｋｅｍｂａｌｌ−Ｃｏｏｋ等（ＪＢＣ(１９９８)，１４，８５１６〜８５２１頁）は、ＦVII突然変異体Ｇｌｎ１００Ａｒｇを発現させ、これらは、凝固活性が検出されないが、野生型ＦVIIａに匹敵するアミド分解活性を有することを示し、さらにこれは、ＴＦとの結合が損なわれたためである、という仮説を立てている。
【００１６】
Ｉｉｎｏ等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９９８）３５２：１８２〜１９２は、Ｏ型糖鎖付加部位のＳｅｒ−５２およびＳｅｒ−６０を突然変異させることによって、ＦVIIａの凝固活性を減少させ、場合によってはＴＦとの相互作用を妨害することを示している。
【００１７】
Ｒｕｆ等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(１９９９)１６，１９５７〜６６頁）は、突然変異Ａｒｇ３６Ａｌａにより、ＦＸ活性化速度の減少が起こることを示している。
【００１８】
Ｉｗａｎａｇａ等（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．(１９９９年８月増刊号)，４６６，抄録１４７４）は、３１６〜３２０残基が欠失しているか、または、３１１〜３２２残基が、トリプシンからそれに対応する残基に置換されているＦVII変異体に言及している。
【００１９】
Ｓｏｅｊｉｍａ  Ｋｅｎｊｉ等（ＪＰ２００１０６１４７９，１９９９年８月２４日）は、Ｃｙｓ１５９とＣｙｓ１６４との間のジスルフィド基を切断することによって、または、Ｔｈｒ２３３〜Ａｓｐ２４４のループ構造の少なくとも一部を置換、付加または欠失させることによって、または、Ａｒｇ３０４〜Ｃｙｓ３２９の介在配列の少なくとも一部を置換、付加または欠失させることによって、特異的活性を強化した改変型ＦVIIａを作製している。
【００２０】
Ｐｅｄｅｒｓｅｎ等（ＵＳ２００３／００９６３３８，２０００年２月１１日）は、ＦVIIａの半減期を延長させるための、糖類などの非ポリペプチド部分構造を含むＦVIIとＦVIIａとの結合体を特許請求している。また、本件請求項は、新規のＮ型および／またはＯ型糖鎖付加部位の導入、または、インビボで複合糖質を得るための、もとから存在する
Ｎ型および／またはＯ型糖鎖付加部位の除去を用いた新規の組み合わせの導入も包含する。
【００２１】
ＰｅｒｓｓｏｎおよびＯｌｓｅｎ（ＵＳ２００３／０１７０８６３，２０００年５月３日）は、Ｌｅｕ３０５またはＰｈｅ３７４がその他のアミノ酸で置換された改変型ＦVIIａを教示している。上述の突然変異と組み合わせて、プロテアーゼドメイン（１５３〜４０６）中の最大２０個のアミノ酸が置換されている。場合によりＬｅｕ３０５およびＰｈｅ３７４と組み合わせて、２７４位、３００〜３０４位および３０６〜３１２位でその他のアミノ酸を置換したその他の改変型ＦVII分子が開示されている。これらの改変は、ＦVIIａが、通常はＴＦにより誘導されるべきより活性なコンフォメーションを自発的に達成する効果を有する。
【００２２】
ＰｅｒｓｓｏｎおよびＯｌｓｅｎ（ＵＳ２００３／０１０４９７８および２００３／０１００７４０，２０００年９月２９日）はさらに、Ａｌａ置換以外に、Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ３３７、Ａｓｐ３３４、Ｓｅｒ３３６、Ｖａｌ１５８、Ｇｌｕ２９６およびＭｅｔ２９８の位置での点突然変異を有するその他の改変型ＦVIIａ分子を教示している。
【００２３】
ＰｉｎｇｅｌおよびＫｌａｕｓｅｎ（ＵＳ２００２／０１５１４７１およびＵＳ２００２／０１３７６７３，２０００年１０月２日）は、所定の比率の異なるＮ型糖鎖付加を含む複数のＦVIIまたは関連ポリペプチドを含む調製物を特許請求している。
【００２４】
Ｒｕｆ等（ＷＯ０２／３８１６２，２０００年１１月９日）は、ＴＦの非存在下でより高いアミド分解活性と、より高いＴＦへの親和性をもたらす、Ｍｅｔ２９８Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２９６ＩｌｅおよびＶａｌ１５８Ａｓｎの改変、またはそれらの組み合わせの改変を含むＦVII／ＦVIIａ変異体を特許請求している。これらの要素をさらに改変して、Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３８、Ａｒｇ２９０、Ａｒｇ３０４、Ａｒｇ３１５およびＬｙｓ３４１でトリプシン様の切断部位を改変すること、および、Ｉｌｅ４２、Ｔｙｒ４４、Ｐｈｅ２７８、および、Ｔｙｒ３３２でキモトリプシン様の部位を改変することにおけるその安定性を増加させている。
【００２５】
Ｐｅｒｓｓｏｎ（ＷＯ０２／０７７２１８，２００１年３月２２日）は、ＦVII／ＦVIIａの半減期を長くするという目的で、アミノ酸２４７〜２６０、３９３〜４０５およびＰｒｏ４０６、より具体的にはＲ３９６、Ｑ２５０およびＰｒｏ４０６、好ましくは化学基を結合させることができるアミノ酸を突然変異させたＦVII／ＦVIIａ突然変異体を教示している。これは、Ｋ１５７、Ｖ１５８、Ｅ２９６、Ｍ２９８、Ｌ３０５、Ｄ３３４、Ｓ３３６、Ｋ３３７およびＦ３７４でのＦVII／ＦVIIａの活性を高める突然変異と組み合わせることができる。
【００２６】
ＰｅｒｓｓｏｎおよびＯｌｓｅｎ（ＵＳ２００３／０１０００７５，２００１年９月２７日）は、Ｌｅｕ３０５は、活性に重要であると考えられるＦVIIａのＴＦ錯体化型に見出されるα−へリックスの末端に位置することを教示している。遊離のＦVIIａにおいて、このヘリックスは歪んでいるため、場合によっては不安定である。本発明に従ってＬｅｕ３０５をその他のアミノ酸で置換することにより、その他の場合ではＴＦにより誘導される活性なコンフォメーションを達成する変異体が得られる。アミノ酸Ｌｙｓ１５７、Ｌｙｓ３３７、Ａｓｐ３３４、Ｓｅｒ３３６、Ｖａｌ１５８、Ｇｌｕ２９６およびＭｅｔ２９８は、Ｉｌｅ１５３とＡｓｐ３４３との間の塩架橋の形成に影響を与える領域に位置する。本発明に従ってこれらのアミノ酸を置換することによって、プロテアーゼのＮ末端の挿入、例えば活性に必須な塩架橋の生成を容易にすることができる。
【００２７】
ＰｅｒｓｓｏｎおよびＯｌｓｅｎ（ＵＳ２００３／０１３０１９１，２００１年１１月
２日）は、３１３〜３２９、３６４、３６６、３７３および３７６位、同様に３３０〜３３９位がその他のアミノ酸で置換された、高い特異的活性を有するさらなる改変型ＦVII／VIIａ突然変異体を教示している。
【００２８】
Ｈａａｎｉｎｇ等（ＷＯ０３／０９３４６５，２００２年４月３０日）は、Ｎｅｌｓｅｓｔｕｅｎの教示（リン脂質の結合を強化するためのＧｌａドメインの改変）を発展させており、すなわちＰｒｏ１０を好ましくはＧｌｎで、Ｌｙｓ３２を好ましくはＧｌｕで、Ａｓｐ３３を好ましくは疎水性アミノ酸、好ましくはＰｈｅで、Ａｌａ３４を好ましくは負電荷を有するアミノ酸で、好ましくはＧｌｕで置換し、さらに、Ａｌａ３の後にアミノ酸（好ましくはＴｙｒ）を挿入し、さらにＮ型糖鎖付加部位を導入している。
【００２９】
Ｆｏｎｃｕｂｅｒｔａ等（ＷＯ２００４／０１１６７５，２００２年７月２５日）は、論理上より高い発現レベルとＦVIIａの改善された機能が得られる、天然に存在するＦVIIの対立遺伝子変異体を説明している。このような改善された特性のデータは示されていない。４９種のうち２種の変異体はエキソンに存在しており、それにより、アミノ酸置換：Ａ２９４ＶおよびＲ３５３Ｑが起こる。
【００３０】
ＰｅｒｓｓｏｎおよびＯｌｓｅｎ（ＷＯ２００４／０２９０９０，２００２年９月２５日）は、いくつかのその他のアミノ酸と共にＰｈｅ３７４を突然変異させることにより、ＦVIIａの活性から独立したＴＦの増加が得られることを示している。すなわちＬ３０５Ｖ、Ｓ３１４Ｅ、Ｋ３３７ＡおよびＦ３７４Ｙは、ＴＦのアミド分解活性を増加させた。
【００３１】
Ｈａａｎｉｎｇ等（ＷＯ２００４／０２９０９１，２００２年９月３０日）は、ＦVII／ＦVIIａのＴＦ結合部位におけるＬ３９、Ｉ４２、Ｓ４３、Ｋ６２、Ｌ６５、Ｆ７１、Ｅ８２およびＦ２７５でＦVIIを改変しており、ＴＦへの親和性を高めている。
【００３２】
Ａｎｄｅｒｓｅｎ等（ＷＯ２００４／０８３３６１，２００３年３月２０日）は、１９６位（Ｄ１９６Ｎ／Ｋ）、２３７位（Ｇ２３７Ｌ、または、ＧＡＡ  ＧＡＡＡまたはＧＡＡＡＡの挿入）、および、３４１位（Ｋ３４１Ｎ／Ｑ）でＦVII／ＦVIIａを改変しており、ＴＦへの親和性を高めている。
【００３３】
Ｂｌａｊｃｈｍａｎ等（ＷＯ２００４／１０８７６３，２００３年６月５日）は、ウサギVIIａ因子は、ヒトＴＦに対して、ヒトVIIａ因子より高い親和性を有することから、ヒトＥＧＦドメインとウサギＥＧＦドメインとの差の解析に基づいて、ＥＧＦドメイン内でＦVII／ＦVIIａを改変している。５３、６２、７４、７５および８３位での突然変異体が特許請求されており、これらはヒトＴＦに対してより高い親和性を有し、止血薬としての将来性が高いことが示されている。
【００３４】
Ｈａａｎｉｎｇ等（ＷＯ２００４／１１１２４２，２００３年６月１９日）は、４、１０、２８、３２、３３、３４、３６、７４、７７、１１６位でＦVII／ＦVIIａを改変しており、好ましくはＡ３Ｙ、Ｐ１０Ｑ、Ｒ２８Ｆ、Ｋ３２Ｅ、Ｄ３３Ｆ、Ａ３４Ｌ、Ｒ３６Ｅ、Ｋ３８Ｅ、Ｐ７４Ｓ、Ｅ７７Ａ、Ｅ１１６Ｄである。Ｒ３６Ｅ突然変異は、ＴＦ依存性の分析において、ＴＦへの結合の減少とトロンビン生成の減少を引き起こし、同時に、ＰＬ依存性の分析においても同じ活性を維持している。
【００３５】
Ｊｏｈａｎｓｅｎ等（ＷＯ２００５／０３２５８１，２００３年１０月７日）は、場合により充填剤（選択的にはＰＥＧ）と組み合わされた、VII因子活性ドメインにカップリングされた脂質膜結合ドメインからなるハイブリッド分子を教示している。
【００３６】
Ｍａｕｎ等  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．（２００５）１４：１１７１〜８０は、ＦVII
コンフォメーションを、活性なＴＦ＊ＦVIIａ様の状態に固定するために、新しいジスルフィド結合を導入している。アミド分解活性の反応速度論解析により、野生型と比較して、全てのVIIａ因子変異体は、単独で、特異的活性を高めることが明らかになり、変異体１３６：１６０および１３８：１６０について、基質Ｓ−２７６５を用いた場合、最大でそれぞれ６７０倍および３３０倍増加した。アミド分解性の分析において、VIIａ因子のジスルフィドが固定された変異体は、最大限の活性のために補因子としてＴＦを必要としなくなった。可溶性ＴＦの存在下で、野生型と比較して、変異体１３６：１６０および１３８：１６０についてそれぞれ２０倍および１２倍、活性が強化された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３７】
本発明の目的は、より長い有効半減期を有する改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド、例えば改変型ＦVII、および、改変型ＦVIIａを提供することである。
【００３８】
ＦVIIは、その他のＧｌａドメインタンパク質、例えばＦIX、ＦＸ、プロテインＣ、プロテインＺ、プロトロンビン、ＧＡＳ６およびプロテインＳに関する。より密接に関連するのは、ＦVII、ＦIX、ＦＸおよびプロテインＣであり、これらは、Ｎ末端Ｇｌａドメイン、それ続いて２個の上皮増殖因子（ＥＧＦ）ドメイン、それに続いてトリプシン様セリンプロテアーゼドメインからなる。プロテインＺは、類似の構造を有するが、不活性なプロテアーゼドメインである。プロトロンビンは、Ｇｌａドメイン、それに続いて、２個のＥＧＦドメインの代わりに２個のクリングルドメイン、それに続いてトリプシン型プロテアーゼドメインからなる。ＧＡＳ６およびプロテインＳは、Ｇｌａドメイン、それに続いて４個のＥＧＦドメイン、それに続いて、プロテアーゼドメインの代わりに２個のラミニン−Ｇドメインからなる。
【００３９】
特筆すべきは、これらの密接に関連した血漿タンパク質の血漿半減期の大きな差である：
ＦVII：２〜４時間
プロテインＣ：６〜８時間
ＦIX：１８〜３０時間
ＦＸ：２０〜４２時間
プロテインＳ：２４〜５８時間
プロトロンビン：４１〜７２時間。
【００４０】
これらのタンパク質の特に密接に関連したサブグループには、ＦVII、ＦIX、ＦＸ、および、プロテインＣが含まれる。
【００４１】
図１では、ヒト由来、および、その他の種由来のＦVII、プロテインＣ、ＦIXおよびＦＸ間の相同性を比較している。これらの分子は高度に保存されており、最も目立つ差は、活性化ドメイン内にある。ＦVIIに関して、活性化ペプチドは説明されていない。しかしながら、活性化の際に、ＦVIIはＡｒｇ１５２での切断に加えてＡｒｇ１４４でも切断される可能性もある、その場合、保存されたＮ型糖鎖付加部位を含む８個のアミノ酸からなる推定上の活性化ペプチドの放出が起こる。
【００４２】
驚くべきことに、活性化ペプチドの長さと活性化ペプチドの翻訳後修飾は、半減期の増加と相関がある：
【表１】
2008509688.tif 000002
【００４３】
それゆえに、本発明は、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドを製造する方法に関し、本方法は、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドを改変することを含み、それによって、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドが、活性化ペプチドが改変されていない第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比較して増加した半減期を有するようになる。
【００４４】
本発明はさらに、このような改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドを製造する方法に関し、本方法は、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を付加すること、または、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部で置換することによって、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドを改変することを含む。
【００４５】
ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、それらの生合成経路において、それらのタンパク質前駆体のグルタミン酸残基の側鎖をカルボキシ化するのにビタミンＫを必要とするタンパク質群である。ビタミンＫ依存性ポリペプチドとしては、これらに限定されないが、VII因子、VIIａ因子、IX因子、IXａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、II因子（プロトロンビン）、プロテインＣ、活性化プロテインＣ、タンパク質Ｓ、活性化タンパク質Ｓ、ＧＡＳ６、活性化ＧＡＳ６、プロテインＺ、活性化プロテインＺなどが挙げられる。さらに、有用なビタミンＫ依存性ポリペプチドは、野生型であってもよいし、または、突然変異を含んでいてもよい。糖鎖付加またはその他の翻訳後修飾の程度と位置は、選択された宿主細胞や宿主細胞の環境の性質に応じて様々であってよい。特定のアミノ酸配列について言及する場合、このような配列の翻訳後修飾も本願に包含される。
【００４６】
本願で用いられる「VII／VIIａ因子」は、活性化されていない形態（VII因子）、または、活性化された形態（VIIａ因子）のいずれか、または、それらの混合物からなる生成物を意味する。上記の定義に含まれる「VII／VIIａ因子」としては、天然型のヒトVII／VIIａ因子のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、わずかに改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質も挙げられ、例えば、上記タンパク質が実質的にVIIａ因子活性を保持する範囲でのＮ末端のアミノ酸の欠失または付加など、改変されたＮ末端を含むタンパク質である。上記の定義に含まれる「VII因子」としては、個体ごとに存在し、発生する可能性がある天然の対立遺伝子変異も挙げられる。上記の定義に含まれる「VII因子」としてはさらに、ＦVII／ＦVIIａの変異体も挙げられる。このような変異体は、野生型配列とは１またはそれ以上のアミノ酸残基が異なっている。このような差の例としては、Ｎ末端および／またはＣ末端の１またはそれ以上のアミノ酸残基（例えば１〜１０個のアミノ酸残基）によるトランケーション、または、Ｎ末端および／またはＣ末端での１またはそれ以上の余分な残基の付加、例えばＮ末端でのメチオニン残基の付加、加えて、保存的アミノ酸置換、すなわち類似の特徴を有するアミノ酸群、例えば（１）小さいア
ミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、および、（６）芳香族アミノ酸の範囲内で行われる置換が挙げられる。以下の表に、このような保存的置換の例を示す。
【００４７】
【表２】
2008509688.tif 000003
【００４８】
配列表に、様々なビタミンＫ依存性ポリペプチドのアミノ酸配列、および、それらをコードするｃＤＮＡ配列を示す：
【表３】
2008509688.tif 000004
【００４９】
第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、好ましくは、VII因子、VIIａ因子、IX因子、IXａ因子、プロテインＣおよび活性化されたプロテインＣからなる群より選択される。より好ましくは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、ヒトVII因子、ヒトVIIａ因子、ヒトIX因子、ヒトIXａ因子、ヒトプロテインＣおよびヒト活性化されたプロテインＣからなる群より選択される。最も好ましくは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、ヒトVII因子、または、ヒトVIIａ因子である。具体的な実施形態において、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、配列番号３、６および９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５０】
第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドとは異なる。従って、本発明の方法によって得られる改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドに天然に存在しない活性化ペプチドの少なくとも一部を含む。
【００５１】
第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドよりも長い血漿半減期を有する。他の実施形態において、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの長さは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの長さより長い。
【００５２】
好ましくは、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、IX因子、Ｘ因子およびプロトロンビンからなる群より選択される。より好ましくは、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、ヒトIX因子、ヒトＸ因子およびヒトプロトロンビンからなる群より選択される。具体的な実施形態において、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドは、配列番号９、１２および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５３】
付加された第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの活性化ペプチドの一部は、好ましくは、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも８個、より好ましくは少なくとも１２個、さらにより好ましくは少なくとも１５個の連続したアミノ酸からなる。
【００５４】
他の実施形態において、付加された第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも０.１５×Ｎ個の連続したアミノ酸からなっていてもよく、ここにおいてＮは、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸の総数である）。好ましくは、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも０.５×Ｎ、より好ましくは少なくとも０.７５×Ｎ、より好ましくは少なくとも０.９×Ｎ、最も好ましくは少なくとも０.９５×Ｎ個の連続したアミノ酸からなる。
【００５５】
他の実施形態において、付加された第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも（Ｎ−ｘ）個の連続したアミノ酸からなり、ここにおいてＮは、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸の総数であり、ｘは７が可能であり、好ましくはｘは５であり、より好ましくはｘは４であり、より好ましくはｘは３であり、さらにより好ましくはｘは２である。
【００５６】
また、付加された第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、活性化ペプチドの中央部分からなっていてもよく、すなわち、活性化ペプチドの最も端のＣ末端のアミノ酸、または、最も端のＮ末端のアミノ酸を含まない。
【００５７】
最も好ましくは、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化の特異性を保持しながら、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドのアミノ酸配列に付加される。あるいは、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドの変異体を、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドのアミノ酸配列に添加してもよい。変異体は、１〜１０、好ましくは１〜７、より好ましくは１〜５、最も好ましくは１〜３個のアミノ酸が付加、欠失および／または置換された活性化ペプチドを含む。
【００５８】
酵素原の半減期だけを延長させようとする場合、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端活性化の切断部位が、変異体の活性化ペプチド中に保持されることが好ましい。さらにビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化された形態の半減期も延長させようとする場合、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端いずれかの活性化の切断部位が欠失していればよい。好ましくは、Ｎ末端活性化の切断部位が欠失している。ＦVIIａの半減期を延長させようとする場合、Ｎ末端活性化の切断部位を選択的に欠失させればよく、それに対して、Ｃ末端活性化の切断部位を選択的に保持させればよい。
【００５９】
以下の表に、数種のビタミンＫ依存性ポリペプチド由来の活性化ペプチドの配列を要約
する。
【表４】
2008509688.tif 000005
【００６０】
本明細書で用いられる用語「活性化ペプチド」は、既知の活性化ペプチド、および、推定上の活性化ペプチドを含み、例えばVII因子中の活性化ペプチドである。
【００６１】
非限定的な例を挙げれば、以下のアミノ酸配列のいずれか一つを、配列番号３または６のアミノ酸配列に付加することができる：
配列番号１８のアミノ酸１〜３５；
配列番号１８のアミノ酸１〜３４；
配列番号１８のアミノ酸１〜３３；
［……］
配列番号１８のアミノ酸１〜８；
配列番号１８のアミノ酸１〜７；
配列番号１８のアミノ酸１〜６；
配列番号１８のアミノ酸１〜５；
配列番号１８のアミノ酸２〜３５；
配列番号１８のアミノ酸２〜３４；
配列番号１８のアミノ酸２〜３３；
［……］
配列番号１８のアミノ酸２〜９；
配列番号１８のアミノ酸２〜８；
配列番号１８のアミノ酸２〜７；
配列番号１８のアミノ酸２〜６；
配列番号１８のアミノ酸３〜３５；
配列番号１８のアミノ酸３〜３４；
配列番号１８のアミノ酸３〜３３；
［……］
配列番号１８のアミノ酸３〜１０；
配列番号１８のアミノ酸３〜９；
配列番号１８のアミノ酸３〜８；
配列番号１８のアミノ酸３〜７；
など。
【００６２】
非限定的な例を挙げれば、以下のアミノ酸配列のいずれか一つを、配列番号３、６または９のアミノ酸配列に付加することができる：
配列番号１９のアミノ酸１〜５２；
配列番号１９のアミノ酸１〜５１；
配列番号１９のアミノ酸１〜５０；
［……］
配列番号１９のアミノ酸１〜８；
配列番号１９のアミノ酸１〜７；
配列番号１９のアミノ酸１〜６；
配列番号１９のアミノ酸１〜５；
配列番号１９のアミノ酸２〜５２；
配列番号１９のアミノ酸２〜５１；
配列番号１９のアミノ酸２〜５０；
［……］
配列番号１９のアミノ酸２〜９；
配列番号１９のアミノ酸２〜８；
配列番号１９のアミノ酸２〜７；
配列番号１９のアミノ酸２〜６；
配列番号１９のアミノ酸３〜５２；
配列番号１９のアミノ酸３〜５１；
配列番号１９のアミノ酸３〜５０；
［……］
配列番号１９のアミノ酸３〜１０；
配列番号１９のアミノ酸３〜９；
配列番号１９のアミノ酸３〜８；
配列番号１９のアミノ酸３〜７；
など。
【００６３】
第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチド領域の近くに挿入される。これは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドのアミノ酸を欠失させないで、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの２個のアミノ酸の間に挿入されてもよい。例えば、ＦVIIが第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの場合、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、アミノ酸１４４と１４５との間、アミノ酸１４５と１４６との間、アミノ酸１４６と１４７との間、アミノ酸１４７と１４８との間、アミノ酸１４８と１４９との間、アミノ酸１４９と１５０との間、アミノ酸１５０と１５１との間、アミノ酸１５１と１５２との間、または、アミノ酸１５２と１５３との間に挿入されてもよい（番号付けは配列番号３を参考にしている）。好ましくは、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、アミノ酸１４４と１４５との間に挿入される（番号付けは、配列番号３を参考にしている）。好ましくは、上記挿入によっても、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化のＣ末端の切断部位と特異性は保存される。Ｎ末端の切断部位は、上記挿入によって欠失させてもよい。
【００６４】
その他の形態において、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチド中のアミノ酸の伸張を置換する。例えば、ＦVIIが第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの場合、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、配列番号３のアミノ酸１４０〜１５２が置換されていてもよい。好ましくは、上記置換によっても、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化のＣ末端の切断部位と特異性は保存される。Ｎ末端の切断部位は、上記置換によって欠失させてもよい。
【００６５】
Ｎ末端の切断部位は、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの所定のアミノ酸を、第二
のビタミンＫ依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドで置換することによって、欠失させてもよい。従って、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、以下の配列番号３のアミノ酸配列のいずれか一つを置換していてもよい：
アミノ酸１４０〜１４５；
アミノ酸１４１〜１４５；
アミノ酸１４２〜１４５；
アミノ酸１４３〜１４５；
アミノ酸１４４〜１４５；
アミノ酸１４５；
アミノ酸１４０〜１４４；
アミノ酸１４１〜１４４；
アミノ酸１４２〜１４４；
アミノ酸１４３〜１４４；または
アミノ酸１４４。
【００６６】
他の実施形態において、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチド中のタンパク質分解による切断部位は、活性化ペプチド領域に対してＮ末端およびＣ末端であり、これらは改変中に保持される。従って、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化の特異性は保持される。
【００６７】
他の実施形態において、酵素原の血漿中半減期を延長させようとする場合、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端活性化の切断部位が、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端活性化の切断部位を置換するか、または、Ｎ末端活性化の切断部位は、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドから保持されていてもよく、さらに、Ｃ末端活性化の切断部位は、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドから保持されていてもよい（逆もまた同様）。活性化されたビタミンＫ依存性ポリペプチドの血漿中半減期を安定化しようとする場合、Ｎ末端またはＣ末端活性化の切断部位のいずれかが欠失していればよい。安定化されたＦVIIａ変異体の場合、活性化ペプチドは、Ｎ末端の軽鎖と共に保持されなければならない。これは、Ｃ末端活性化の切断部位は保持され、それに対して、ビタミンＫ依存性ポリペプチドから移動させたＮ末端活性化の切断部位は欠失させなければならない、ということを伴う。また、これは、Ａｒｇ１４４で仮定の活性化ペプチドの切断部位を欠失させるのにも必要な場合がある。
【００６８】
改変は、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチド、または、それらの変異体の挿入に加えて、それに付随する第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部の欠失をさらに含んでいてもよく、同時に、選択的に第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化の特異性を保持する。欠失させる部分は、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも２個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも６個、さらにより好ましくは少なくとも８個の連続したアミノ酸からなっていてもよい。
【００６９】
他の実施形態において、欠失させた第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも０.１５×Ｎ個の連続したアミノ酸からなっていてもよく、ここにおいてＮは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸の総数である）。好ましくは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも０.５×Ｎ、より好ましくは少なくとも０.７５×Ｎ、より好ましくは少なくとも０.９×Ｎ、最も好ましくは少なくとも０.９５×Ｎ個の連続したアミノ酸からなる。
【００７０】
他の実施形態において、欠失させた第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも（Ｎ−ｘ）個の連続したアミノ酸からなり、ここにおいてＮは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸の総数であり、ｘは７が可能であり、好ましくはｘは５であり、より好ましくはｘは４であり、より好ましくはｘは３であり、さらにより好ましくはｘは２である。
【００７１】
欠失させた第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、活性化ペプチドの中央部分からなっていてもよく、すなわち、活性化ペプチドの最も端のＣ末端のアミノ酸、または、最も端のＮ末端のアミノ酸を含まない。
【００７２】
具体的な実施形態において、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドは、欠失している。
【００７３】
通常、改変は、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部で置換することを含む。第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部、および、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部の好ましい実施形態は、上述したものに相当する。
【００７４】
具体的な実施形態において、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドは、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化の特異性を保持するのに必要なアミノ酸を保持しながら、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチド、または、第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドの変異体で置換されている。
【００７５】
非限定的な例を挙げれば、本発明は、例えばマウス、イヌ、ウシ、ブタまたはげっ歯類のプロトロンビン因子のような、動物のビタミンＫ依存性ポリペプチド由来の活性化ペプチド配列（図１に、そのうちいくつかを示す）、加えてそれらの組み合わせの導入を包含する。
【００７６】
非限定的な例を挙げれば、本発明は、ＦVIIの活性化部位の近傍に、ＦIXまたはＦＸの活性化ペプチドを導入すること、同様に、プロテインＣの活性化ペプチドをＦIXまたはＦＸの活性化ペプチドで置換すること、同様に、ＦIXの活性化ペプチドをＦＸの活性化ペプチドで置換することを包含する。本発明のこれらの好ましいＦVII分子を用いた広範な形態を説明すれば、単に、８個のアミノ酸からなる推定上の活性化ペプチドを、プロテインＣ、ＦIXまたはＦＸから採取した活性化ペプチドのいずれか１つで完全に置換すること、または、１個のアミノ末端近傍のアミノ酸ないし完全な推定上のＦVIIの活性化ペプチドに、プロテインＣ、ＦIXまたはＦＸから採取した活性化ペプチドを付加して、ハイブリッド活性化ペプチドを作成することによって、ＦVIIの半減期は増加する。
【００７７】
本発明のその他の形態は、これらの移動させた活性化ペプチドの翻訳後修飾の変形形態であり、例えば、非限定的な例を挙げれば、移動させた活性化ペプチド中のＮ型糖鎖付加部位の除去、またあるいは、ＦVIIのＡｒｇ１４４〜Ａｒｇ１５２からなる推定上の活性化ペプチド中のＮ型糖鎖付加部位の除去によって、アシアロタンパク質受容体が介在する凝固因子の除去を少なくすることができる。それゆえに、本発明の一実施形態において、改変は、活性化ペプチド中の翻訳後修飾部位を改変することを含む。好ましくは、改変は、活性化ペプチド中の少なくとも１個のＮ型糖鎖付加部位を除去することを含む。
【００７８】
本発明のその他の形態は、より寿命が長いビタミンＫ依存性タンパク質の活性化ペプチドの類似体を移動させることによる、血漿中半減期の延長である。類似体とは、その最も広義の意味で、より長い寿命の野生型ビタミンＫ依存性タンパク質の活性化ペプチドの８個よりも長い連続したアミノ酸を有する挿入物であるか、または、より長い寿命の野生型ビタミンＫ依存性タンパク質の活性化ペプチドのこれらアミノ酸の保存的置換を有する挿入物であり、第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドの酵素原の半減期を延長させようとする場合、そのＮ末端及びそのＣ末端活性化の切断部位を保存したもの、または、活性化されたビタミンＫ依存性ポリペプチドの半減期も延長させようとする場合、そのＮ末端またはそのＣ末端活性化の切断部位のどちらかを保存したものである。
【００７９】
保存的アミノ酸置換は、類似の特徴を有するアミノ酸群、例えば（１）小さいアミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸および（６）芳香族アミノ酸の範囲内で行われる置換である。表２に、このような保存的置換の例を示す。
【００８０】
本発明のその他の形態は、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの安定性を高める方法であって、本方法は、その活性化ペプチドを改変することを含む。本発明のさらにその他の形態は、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの有効半減期または血漿中半減期を高める方法であって、本方法は、その活性化ペプチドを改変することを含む。これらの方法は、上述の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの製造方法と同じ工程を含んでいてもよい。
【００８１】
本発明はさらに、本発明の方法で得ることができる改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドに関する。改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、改変された活性化ペプチドを含んでいてもよく、ここにおいて、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、活性化ペプチドが改変されていないビタミンＫ依存性ポリペプチドと比較して増加した半減期を有する。
【００８２】
本発明のその他の形態は、改変された活性化ペプチドを含む改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドであり、前記改変された活性化ペプチドは、異なるビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を含む。あるいは、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、異なるビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの類似体または変異体を含んでいてもよい。類似体および変異体は、上記で定義された分子である。
【００８３】
好ましくは、上記ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、上記で定義された第一のビタミンＫ依存性ポリペプチドである。「異なるビタミンＫ依存性ポリペプチド」は、上記で定義された第二のビタミンＫ依存性ポリペプチドである。本発明の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの好ましい実施形態は、上記で本発明の方法に関して説明された好ましい実施形態に対応する。
【００８４】
他の実施形態において、本発明の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの未改変型および／または野生型と比較して、増加した有効半減期を示す。有効半減期は、Ｌｉｎｄｌｅｙ等（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  VIIａ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．１９９４  ５５：６３８〜６４８）で示されるようにしてインビトロで測定することができる。
【００８５】
有効半減期は、通常、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの未改変型および／または野生型と比較して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも２００％、さらにより好ましくは少なくとも５００％増加する。
【００８６】
ヒトVII因子の野生型の有効半減期は、約４時間である。本発明の改変されたVII因子分
子の有効半減期は、通常、少なくとも約６時間、好ましくは少なくとも約１０時間、より好ましくは少なくとも約１５時間、最も好ましくは少なくとも約２４時間である。
【００８７】
ヒトVIIａ因子の野生型の有効半減期は、約２時間である。本発明の改変されたVIIａ因子分子の有効半減期は、通常、少なくとも約３時間、好ましくは少なくとも約５時間、より好ましくは少なくとも約８時間、最も好ましくは少なくとも約１２時間である。
【００８８】
一般的に、上記改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、未改変型と比較して、および／または、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの野生型と比較して、高い安定性を有する。改変されたVII因子分子の安定性の増加は、例えば、これまで機能分析で説明されているようにして測定することができる。
【００８９】
本発明の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、通常、それに対応するビタミンＫ依存性ポリペプチドの野生型および／または未改変型と実質的に同じ活性を有する。「実質的に同じ」活性は、それに対応するビタミンＫ依存性ポリペプチドの野生型および／または未改変型の活性の、少なくとも約１０％、好ましくは約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約１００％を意味する。VII／VIIａ因子の活性は、基質であるＸ因子を、活性なＸａ因子に変換する能力である。VII／VIIａ因子ポリペプチドの活性は、Ｓｈａｗ等，１９９８，ＰＮＡＳ，第９５巻，４２２９〜４２３４頁、または、Ｇａｂｒｉｅｌ等，２００４，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．第４１巻，Ｓｕｐｐｌ．１，２０〜２４頁で説明されている分析を用いて測定することもできる。
【００９０】
本発明はさらに、本願で説明されている改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。用語「ポリヌクレオチド」は、一般的に、あらゆるポリリボヌクレオチド、または、ポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、改変されていないＲＮＡまたはＤＮＡ、または、改変されたＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡでもよいし、一本鎖または二本鎖ＲＮＡでもよい。本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、１またはそれ以上の修飾塩基および／または通常ではない塩基（例えばイノシン）を含むＤＮＡまたはＲＮＡも含む。当然のことながら、当業者既知の多くの有用な目的に役立つ多種多様な改変をＤＮＡおよびＲＮＡに施してもよい。本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、このような化学的、酵素的または代謝的に改変されたポリヌクレオチドの形態、同様に、ウイルスおよび細胞（例えば単細胞および複雑型細胞など）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的な形態を包含する。
【００９１】
当業者であれば当然と思われるが、遺伝子コードの縮重により、所定のポリペプチドは、異なるポリヌクレオチドによってコードされている場合もある。これらの「変異体」も本発明に包含される。
【００９２】
好ましくは、 本発明のポリヌクレオチド は、単離されたポリヌクレオチドである。用語「単離された」ポリヌクレオチドは、その他の核酸配列、例えば、これらに限定されないが、その他の染色体のＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに、 染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡを実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製してもよい。当業者既知の従来の核酸精製方法を用いて、単離されたポリヌクレオチドを得てもよい。このような用語は、組換えポリヌクレオチド、および、 化学合成されたポリヌクレオチドも含む。
【００９３】
本発明のさらにその他の形態は、本発明に係るポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクターである。好ましくは、上記プラスミドまたはベクターは、発現ベクターである。具体的な実施形態において、上記ベクターは、ヒト遺伝子治療に使用するためのトラン
スファーベクターである。
【００９４】
本発明のさらにその他の形態は、本発明のポリヌクレオチド、または、本発明のプラスミドまたはベクターを含む宿主細胞である。
【００９５】
本発明の宿主細胞は、改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの製造方法で用いてもよく、本発明の一部を構成する。本方法は、以下を含む：
（ａ）改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドが発現されるような条件下で本発明の宿主細胞を培養すること；および、
（ｂ）場合により、該宿主細胞または培地から改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドを回収すること。
【００９６】
上述した変異体の発現：
適切な宿主細胞中での組換えタンパク質の大量生産は、当業者既知の方法に従って、上述の改変されたｃＤＮＡを、様々な発現系で増殖が可能な組換え発現ベクター中に、適切な調節因子と共に効率的な転写単位に構築することを必要とする。効率的な転写調節因子は、それらの天然の宿主と同様の動物細胞を有するウイルス、または、動物細胞の染色体ＤＮＡから誘導することができる。好ましくは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、または、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートから誘導されたプロモーター−エンハンサーの組み合わせ、または、ベータ−アクチンまたはＧＲＰ７８のような動物細胞中で強く構成的に転写された遺伝子を含むプロモーター−エンハンサーの組み合わせを用いることができる。ｃＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの安定した高レベルを達成するためには、転写単位は、その３’近位部分に、転写終結のためのポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含むべきである。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス４０初期転写領域、ウサギベータ−グロビン遺伝子、または、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子遺伝子から誘導される。
【００９７】
次に、ｃＤＮＡは、ハイブリッドの改変されたＧｌａドメインタンパク質、好ましくはＦIX、ＦＸ、プロテインＣ、最も好ましくはVII因子タンパク質を発現させるための適切な宿主細胞系のゲノムに統合される。好ましくは、正しいフォールディング、Ｇｌａドメイン合成、ジスルフィド結合結合形成、アスパラギン結合型の糖鎖付加、Ｏ結合型の糖鎖付加、および、その他の翻訳後修飾、同様に、培地への分泌を確実にするために、この細胞系は脊椎動物由来の動物細胞系と予想される。その他の翻訳後修飾の例は、新生ポリペプチド鎖のチロシンのＯ−硫酸化、水酸化、および、タンパク質分解プロセシングである。使用可能な細胞系の例は、サルＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞であり、選択的にはハムスターＣＨＯ細胞である。
【００９８】
対応するｃＤＮＡをコードする組換え発現ベクターは、数種の様々な方法で、動物細胞系に導入することができる。例えば、組換え発現ベクターは、異なる動物ウイルスをベースとしたベクターから作製することができる。これらの例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、および、好ましくはウシパピローマウイルスをベースとしたベクターである。
【００９９】
また、それらのゲノムに組換えＤＮＡが統合された特定の細胞クローンの単離を容易にするために、対応するＤＮＡをコードする転写単位は、これらの細胞中で優勢な選択マーカーとして機能する可能性があるその他の組換え遺伝子と共に動物細胞に導入することもできる。このタイプの優勢な選択マーカー遺伝子の例は、Ｔｎ５アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ（ゲネチシン（Ｇ４１８）耐性を付与する）、ハイグロマイシン  ホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシン耐性を付与する）、および、ピューロマイシンア
セチルトランスフェラーゼ（ピューロマイシン耐性を付与する）である。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、望ましいタンパク質のｃＤＮＡをコードするベクターと同じベクターに含ませてもよいし、または、同時に導入されて宿主細胞のゲノムに統合される別個のベクターにコードされてもよい（これは、異なる転写単位間で堅い物理的な連結を形成することが多い）。
【０１００】
望ましいタンパク質のｃＤＮＡと共に用いることができるその他のタイプの選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする様々な転写単位をベースとしたものである。このタイプの遺伝子を内因性ｄｈｆｒ活性が失われた細胞、選択的にはＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＤＧ−４４）に導入した後、ヌクレオシドを含まない培地中でこれらを増殖させることが可能になると予想される。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジンおよびグリシンを含まないハムＦ１２である。これらのｄｈｆｒ遺伝子は、凝固因子のｃＤＮＡ転写単位と共に、同じベクターまたは異なるベクターのいずれかに連結させて上記のタイプのＣＨＯ細胞に導入することができるため、組換えタンパク質を生産するｄｈｆｒ陽性細胞系を作製することができる。
【０１０１】
上記の細胞系を細胞毒性のｄｈｆｒ阻害剤であるメトトレキセートの存在下で増殖させる場合、メトトレキセート耐性の新しい細胞系が出現すると予想される。これらの細胞系は、連結されたｄｈｆｒと望ましいタンパク質の転写単位の数が増幅されているために、組換えタンパク質を高速で生産する可能性がある。高濃度のメトトレキセート（１〜１００００ｎＭ）中でこれらの細胞系を増殖させると、極めて高速で望ましいタンパク質を生産する新しい細胞系を得ることができる。
【０１０２】
上記の望ましいタンパク質を生産する細胞系は、懸濁培養、または、様々な固体支持体のいずれかでラージスケールで増殖させることができる。これらの支持体の例は、デキストランまたはコラーゲンマトリックスをベースとしたマイクロキャリアー、または、中空糸の形態の固体支持体、または、 様々なセラミック材料である。細胞懸濁培養またはマイクロキャリアーで増殖させる場合、上記の細胞系培養は、槽培養として、または、長期間にわたり調整培地の連続的な供給を伴う潅流培養のどちらかとして行うことができる。従って、 本発明によれば、上記の細胞系 は、望ましい組換えタンパク質の生産のための工業的プロセスの開発によく適している。
【０１０３】
上記のタイプの分泌細胞の培地中に蓄積する組換えタンパク質は、濃縮し、多種多様な生化学的な方法やクロマトグラフィー法によって精製することができ、例えば、細胞培地中での望ましいタンパク質とその他の物質との、大きさ、電荷、疎水性、溶解性、特異的な親和性などの差を利用する方法が挙げられる。
【０１０４】
このような精製の例は、固体支持体に固定したモノクローナル抗体へ組換えタンパク質を吸着させることである。脱離させた後、タンパク質を、上記の特性に基づいて多種多様なクロマトグラフィー技術によってさらに精製してもよい。
【０１０５】
本発明の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、純度８０％以上、より好ましくは純度９５％以上に精製することが好ましく、具体的には、汚染高分子、具体的にはその他のタンパク質や核酸に関して純度が９９.９％より大きい製薬的に純粋な状態であり、さらに感染性の物質や発熱性の物質を含まないことが好ましい。好ましくは、単離された、または、精製された本発明の改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、その他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０１０６】
本発明で説明される組換えタンパク質は、治療用途に応じた医薬配合物に製剤化することができる。精製したタンパク質は、従来の生理学的に適合する水性の緩衝溶液に溶解さ
せてもよく、そこに場合により、医薬配合物を提供するための製薬用賦形剤を添加してもよい。
【０１０７】
本発明の様々な生成物が、医薬品として有用である。従って、本発明は、本明細書で説明されているような改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、または、本発明のプラスミドまたはベクターを含む医薬組成物に関する。
【０１０８】
また、本発明の改変されたＤＮＡは、ヒト遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターに統合されてもよい。
【０１０９】
本発明のその他の形態は、血液凝固障害を治療または予防する医薬品を製造するための、本明細書で説明されているような改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のプラスミドまたはベクター、または、本発明の宿主細胞の使用である。血液凝固障害としては、これらに限定されないが、血友病Ａが挙げられる。好ましくは、上記治療は、ヒト遺伝子治療を含む。
【０１１０】
本発明はまた、血液凝固障害（例えば血友病Ａ）に罹った個体を治療する方法に関する。本方法は、前記個体に、本明細書で説明されているような改変型ビタミンＫ依存性ポリペプチドの有効量を投与することを含む。他の実施形態において、本方法は、前記個体に、本発明のポリヌクレオチド、または、本発明のプラスミドまたはベクターの有効量を投与することを含む。あるいは、本方法は、前記個体に、本明細書で説明されている本発明の宿主細胞の有効量を投与することを含んでいてもよい。
【０１１１】
図面の説明:
図１：ヒト由来、および、その他の種の、ＦVII、プロテインＣ、ＦIXおよびＦＸ間の相同性の比較である。
図２：寿命が長いビタミンＫ依存性ポリペプチドから挿入された活性化ペプチドを含むＦVII変異体の薬物動態である。
【実施例】
【０１１２】
さらに、以下に記載のそれらの実施例で本発明をより詳細に説明する。この本発明の具体的な実施形態の説明は、添付の図とあわせて作製されたものとする。
【０１１３】
実施例１：VII因子コード配列へのIX因子の活性化ペプチド配列の挿入
この実施例において、ＦIX活性化ペプチドの大半が、ＦVII活性化部位を保存しつつＦVIIのｃＤＮＡ中のそれぞれの位置に挿入される。まず、クローニングベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）；ｐＦVII−５３８ｗｔと命名されたプラスミド）に挿入されたＦVIIのｃＤＮＡを、アミノ酸Ａｌａ１４６とＳｅｒ１４７（番号付けは、配列番号３を参考にした）との間に制限部位ＮｈｅＩを導入することによって外来の活性化ペプチド配列を挿入するために製造した。市販の変異誘発キット（例えばストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のクイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）部位特異的変異誘発キット）を製造元の説明書に従って用いて、部位特異的変異誘発を行った。変異誘発に用いられたプライマーを以下に列挙する；突然変異誘発性の塩基は太字で示す。
【０１１４】
【化１】
2008509688.tif 000006
【０１１５】
得られたプラスミドを、ｐＦVII−ＮｈｅＩ１８６と命名した。
次に、ＦIX活性化ペプチドのアミノ酸１６５〜１９４（番号付けは、配列番号９を参考にした）を、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によってＦＩＸのｃＤＮＡコンストラクトで増幅した。
【０１１６】
【化２】
2008509688.tif 000007
【０１１７】
両方のプライマーに、ＮｈｅＩ制限部位（下線で示した）を付加した。増幅産物をＮｈｅＩで消化し、ＮｈｅＩで消化した上述のｐＦVII−ＮｈｅＩ１８６にクローニングした。
【０１１８】
ＤＮＡ配列解析で正しい方向であることを確かめた後、２回の変異誘発を行い、ＮｈｅＩ部位を天然のＦVII／ＦIX配列に復帰突然変異させた。突然変異誘発プライマーを以下に示す：
ＦIX挿入物の５’末端でＮｈｅＩ部位を復帰突然変異させるためのプライマー：
【化３】
2008509688.tif 000008
【０１１９】
ＦIX挿入物の３’末端でＮｈｅＩ部位を復帰突然変異させるためのプライマー：
【化４】
2008509688.tif 000009
【０１２０】
得られた発現プラスミドを、ｐＦVII−５５２と命名した。得られた成熟ＦVII／ＦIXキメラタンパク質配列（配列番号２９）は、以下に示す通りであり、挿入されたＦIXの活性化ペプチド配列は下線で示した。
【０１２１】
【化５】
2008509688.tif 000010
【０１２２】
どのｃＤＮＡ配列がクローニングに用いられるかによって、キメラタンパク質は、ＦIX活性化ペプチド RAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQS（配列番号３０）の多型のような、ＦVIIおよびＦIXの多型を含む場合もある。
【０１２３】
プラスミドｐＦVII−５５２に基づいて、ＦVIIのｃＤＮＡとＦIXの活性化ペプチド配列との間に異なる転位配列によりその他の発現プラスミドを構築した。そのために、２回の変異誘発を上述のようにしてｐＦVII−５５２に施した。第一回目で、配列番号２９のアミノ酸１４５〜１４７を欠失させ、ここで以下のプライマーを用いた：
【化６】
2008509688.tif 000011
【０１２４】
第二回目の変異誘発で、配列番号２９のアミノ酸１７６と１７７との間に４個のアミノ酸を挿入し、ここで以下のプライマーを用いた：
【化７】
2008509688.tif 000012
【０１２５】
得られたプラスミドを、ｐＦVII−６８１と命名した。得られた成熟ＦVII／ＦIXキメラタンパク質配列（配列番号４６）は、以下に示す通りであり、挿入されたＦIXの活性化ペプチド配列は下線で示した。
【０１２６】
【化８】
2008509688.tif 000013
【０１２７】
実施例２：VII因子コード配列へのＸ因子の活性化ペプチド配列の挿入
ＦＸの活性化ペプチドを、ＰＣＲによってクローニングされたＦＸのｃＤＮＡで以下のプライマーを用いて増幅し、ＮｈｅＩ制限部位（下線で示した）を結合させた。
【化９】
2008509688.tif 000014
【０１２８】
次に、ＦＸの活性化ペプチドを含むＰＣＲフラグメントを、ＮｈｅＩで消化し、ＮｈｅＩで消化したプラスミドｐＦVII−ＮｈｅＩ１８６（実施例１）にライゲーションした。
それに続く上記で説明されているような２回の部位特異的変異誘発で、ＦVIIのｃＤＮＡ
配列とＦＸの活性化ペプチドとの転位を修正した。
【０１２９】
第一回目の変異誘発を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて行った：
【化１０】
2008509688.tif 000015
【０１３０】
第二回目の変異誘発を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて行った：
【化１１】
2008509688.tif 000016
【０１３１】
得られたプラスミドを、ｐＦVII−６１１と命名した。得られた成熟ＦVII／ＦＸキメラタンパク質配列（配列番号５３）は、以下に示す通りであり、挿入されたＦＸの活性化ペプチド配列は下線で示した。
【０１３２】
【化１２】
2008509688.tif 000017
【０１３３】
実施例３：IX因子のコード配列へのＸ因子の活性化ペプチド配列の挿入
この実施例において、ＦＸの活性化ペプチドは、ＦIXの活性化部位を保存しているＦIXのｃＤＮＡ中のそれぞれの位置に挿入された。
まず、２個の制限部位：ＸｂａＩ部位（アミノ酸Ｓｅｒ１６１とＬｙｓ１６２との間）、および、ＰｉｎＡＩ部位（Ｔｈｒ１９２とＧｌｎ１９３との間）（番号付けは、配列番号９を参考にした）の導入によって外来の活性化ペプチド配列を挿入するために、クローニングベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（ベクトン・ディッキンソン）中のＦIXのｃＤＮＡを製造した。部位特異的変異誘発を、市販の変異誘発キット（例えばストラタジーンのクイックチェンジ部位特異的変異誘発キット）を製造元の説明書に従って用いて行った。変異誘発に用いられたプライマーを以下に列挙する；突然変異誘発性の塩基は太字で示す。
【０１３４】
ＸｂａＩ部位の導入のための突然変異誘発プライマー：
【化１３】
2008509688.tif 000018
【０１３５】
ＰｉｎＡＩ部位の導入のための突然変異誘発プライマー：
【化１４】
2008509688.tif 000019
【０１３６】
次に、ＦＸの活性化ペプチドのアミノ酸１５９〜２１３（番号付けは、配列番号１２を参考にした）を、ポリメラーゼ連鎖反応によって、以下のプライマーを５’末端のＸｂａＩおよび３’末端のＰｉｎＡＩ部位に付加して用いて増幅した（下線で示した）。
【０１３７】
【化１５】
2008509688.tif 000020
【０１３８】
増幅産物をＸｂａＩとＰｉｎＡＩで消化し、上述のようにして改変されたＸｂａＩとＰｉｎＡＩで消化したＦIXのｃＤＮＡにクローニングした。その後、２回の変異誘発を行い、ＸｂａＩおよびＰｉｎＡＩ部位を天然のＦIXおよびＦＸ配列に復帰突然変異させた。突然変異誘発プライマーを以下に示す：
ＦＸ挿入物の５’末端で、ＸｂａＩ部位を復帰突然変異させるためのプライマー：
【化１６】
2008509688.tif 000021
【０１３９】
ＦＸ挿入物の３’末端で、ＰｉｎＡＩ部位を復帰突然変異させるためのプライマー：
【化１７】
2008509688.tif 000022
【０１４０】
得られた成熟ＦIX／ＦＸキメラタンパク質配列（配列番号４１）は、以下に示す通りであり、挿入されたＦＸの活性化ペプチド配列は下線で示した。
【化１８】
2008509688.tif 000023
【０１４１】
実施例４：改変型ＦVIIおよびＦIXタンパク質のトランスフェクションおよび発現
発現プラスミドをＥ.ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０（インビトロジェン(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)）中で増殖させ、標準的なプロトコールを用いて（キアゲン(Ｑｉａｇｅｎ)）精製した。ＨＥＫ２９３細胞（インビトロジェン）をリポフェクトアミン２０００試薬（インビトロジェン）を用いてトランスフェクションし、無血清培地（インビトロジェン２９３エクスプレス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓ））中で、５０ｎｇ／ｍｌの
ビタミンＫ３、および、４μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下で増殖させた。トランスフェクションされた細胞群をＴ−フラスコを介してローラーボトルに拡散させ、そこから精製のために上清を回収した。
【０１４２】
実施例５：改変型ＦVIIタンパク質の精製
欧州特許第０７７０６２５号で説明されているようにしてＦVIIタンパク質を精製した。簡単に言えば、可溶性の組織因子をシアン化臭素によってセファロースビーズに共有結合させた。ＦVIIを含む細胞培養上清を１０ｍＭカルシウム緩衝液に入れた。同じ緩衝液で未結合のタンパク質を洗浄して除いた。結合したＦVIIタンパク質の溶出を１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を用いて行った。
【０１４３】
実施例６：ＦVII活性および抗原の測定
ＦVII抗原を、当業者に性能が既知のＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に言えば、マイクロプレートを、ウェルあたり１２０μＬのキャプチャー抗体（ヒツジ抗ヒトＦVII  ＩｇＧ，セダレーン（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）ＣＬ２００３０ＡＰ，緩衝液Ａ［シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｃ３０４１］で１：１０００に希釈）と周囲温度で一晩インキュベートした。プレートを緩衝液Ｂ（シグマＰ３５６３）で３回洗浄した後、各ウェルを、緩衝液Ｃ（シグマＰ３６８８）２００μＬと周囲温度で１時間インキュベートした。さらに緩衝液Ｂで３回洗浄工程を行った後、試験サンプルの緩衝液Ｂでの連続希釈液、同様に、標準ヒト血漿（デイド・ベーリング（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）；５０〜０.５ｍＵ／ｍＬ）の緩衝液Ｂ（ウェルあたりの体積：１００μＬ）での連続希釈液を、周囲温度で２時間インキュベートした。緩衝液Ｂでの３回の洗浄工程の後、検出抗体（ヒツジ抗ヒトＦＶＩＩ  ＩｇＧ，セダレーンＣＬ２００３０Ｋ，ペルオキシダーゼで標識された）の緩衝液Ｂでの１：５０００の希釈液１００μＬを各ウェルに添加し、周囲温度でさらに２時間インキュベートした。緩衝液Ｂでの３回の洗浄工程の後、基質溶液（ＴＭＢ，デイド・ベーリング，ＯＵＶＦ）をウェルあたり１００μＬで添加し、暗所で周囲温度で３０分間インキュベートした。希釈していない停止溶液（デイド・ベーリング，ＯＳＦＡ）１００μＬを添加して、適切なマイクロプレートリーダーで波長４５０ｎｍで読み取るためのサンプルを製造した。次に、参照として標準ヒト血漿を用いた標準曲線を用いて、試験サンプルの濃度を計算した。
【０１４４】
実施例７：改変型ＦVIIタンパク質の薬物動態
麻酔したＣＤ／ルイスラット（物質あたりラット６匹）に、野生型および改変型ＦVIIタンパク質を１００μｇ／ｋｇ体重の用量で静脈内投与した。試験物質の投与後、５、３０、６０、１２０および４８０分間で３匹のラットから、さらに、１５、４５、９０、および、２４０分間で残りの３匹のラットから、血液サンプルを頚動脈から採取した。その後、ヒトVII因子に特異的なＥＬＩＳＡ分析（上記参照）によって、ＦVII抗原の含量を定量した。図２に、各群の平均ＦVII抗原濃度を示す。表５は、排除のアルファおよびベータ相に関して計算された半減期を要約したものであり、これから、アルファ相が５〜３０分間、ベータ相が３０分間〜抗原分析の検出限界を超える濃度の最後のタイムポイントと定義された。計算は、式Ｔ1/2＝ｌｎ２／ｋ（式中、ｋは、回帰線の傾きである）に従ってなされた。
【０１４５】
【表５】
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【０１４６】
このデータから明らかに、天然型の推定上のＦVIIの活性化ペプチドを、より長い寿命のプロトロンビン因子からの活性化ペプチドで置換することによって、タンパク質のインビボでの半減期が野生型ＦVIIタンパク質と比較して有意に長くなることが示される。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１ａ】ヒト由来、および、その他の種の、ＦVII、プロテインＣ、ＦIXおよびＦＸ間の相同性の比較である。
【図１ｂ】ヒト由来、および、その他の種の、ＦVII、プロテインＣ、ＦIXおよびＦＸ間の相同性の比較である。
【図２】寿命が長いビタミンＫ依存性ポリペプチドから挿入された活性化ペプチドを含むＦVII変異体の薬物動態である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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