(57)【要約】  本発明は、ウイルス性疾患の治療のための、アミノ酸配列ＮＨ２−ＶＣＶＬＡＨＨＦＧＫＥＦＴＰＰＶＱＡＡＹＱＫＷＡＧＶＡＮＡＬＡＨＫＹＨ−ＣＯＯＨを有するペプチド並びに該ペプチドの変異体、誘導体及び断片の使用に関する。
2008509969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス性疾患の治療のための、アミノ酸配列
ＮＨ２−ＶＣＶＬＡＨＨＦＧＫＥＦＴＰＰＶＱＡＡＹＱＫＶＶＡＧＶＡＮＡＬＡＨＫＹＨ−ＣＯＯＨ
を有するペプチドの使用。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドの誘導体、変異体及び断片、特に、アミド化、アセチル化、硫酸化、リン酸、グリコシル化、酸化又はポリエチレングリコール修飾誘導体、特にアミノ酸の保存的な交換及び／又は欠失により得られた変異体及び断片、及び／又は該ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端において１から１０までの付加アミノ酸を含有する異性体の、請求項１に記載の使用（前記誘導体、断片及び異性体は請求項１に記載の前記ペプチドと、少なくとも８０％、特に９０％の配列同一性を有し、且つ細胞感染アッセイにおいて、ＨＳＶ−２に対する阻害活性を有する。）。
【請求項３】
前記ウイルス性疾患がヘルペスである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記ウイルス性疾患が単純ヘルペスウイルスを伴う感染により引き起こされた、請求項１から３の少なくとも一項に記載の使用。
【請求項５】
前記ウイルス性疾患が細菌の不定着化を引き起こさない、請求項１から４の少なくとも一項に記載の使用。
【請求項６】
注入、軟膏、錠剤、スプレー、「持続放出」カプセル及び類似調製物のために調合された生薬製剤中での、及び／又は他の抗ウイルス治療剤との組み合わせによる、請求項１から５の少なくとも一項に記載の使用。
【請求項７】
断片が、
ＮＨ２−ＶＣＶＬＡＨＨＦＧＫＥＦ−ＣＯＯＨ、又は、
ＮＨ２−ＣＶＬＡＨＨＦＧＫＥＦＴＰＰＶＱＡＡＹＱＫＶＶＡＧＶＡＮＡＬＡＨＫＹＨ−ＣＯＯＨである、
請求項２から６の少なくとも一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス性疾患の治療のための、配列番号１を有するペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌により引き起こされる病気の治療に対して、多数の有効な抗生物質の使用をすることが可能であるが、多くの場合、ウイルス性疾患の治療は、困難である。多くの症例では、仮にあるとしても、予防接種法のみが使用可能で、有効な治療剤は存在しない。ウイルス感染後に投与可能な治療的活性物質を提供することは、非常に重要である。
【０００３】
単純ヘルペスウイルスが原因の疾患は、最も頻繁に起こる皮膚の感染症であり、大部分の感染は顔及び陰部で起こる。該疾患は、単純ヘルペスウイルスの感染により引き起こされる。その異変体として頻繁に発生するのが、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）及び単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）である。ＨＳＶ−２は、一般的に、陰部ヘルペスに関連しており、ＨＳＶ−１は、口唇ヘルペスに関連する。
【０００４】
多数の人々は、幼年期に、ヘルペスウイルスにすでに感染している。青年期にヘルペスが出現する場合、他人からの再発された感染が生じた可能性があり、又は自身に存在する「潜在的な」ウイルスの活性化を起こした可能性がある。最初のヘルペス感染は、主に、口腔の小さな水疱の形成（歯肉口内炎）を伴う。また、膣に生じた場合には、その感染症は外陰膣炎と呼ばれ、尿道で起きた場合には、尿道炎と呼ばれる。第２又はそれ以降の疾患は、口唇ヘルペス（単純疱疹）を発生させる。特に重症型のヘルペス感染（アトピー性皮膚炎）は、神経皮膚炎で苦しむ人々に発生する可能性がある。
【０００５】
ヘルペスの発現を完治しても、免疫を引き起こさない。たいていの場合、本疾病が頻繁に再発し、ヘルペス感染症の十分に満足できる治療は現在のところ知られていない。また、今のところ、身体に潜むウイルスを破壊することはできない。こうした理由により、ヘルペス感染症では、疼痛、発熱及び炎症などの症状が治療される。アシクロビル等の抗ウイルス活性成分を含む軟膏剤は、疾病期間を短くするだけである。しかしながら、抗ウイルス活性成分を含む軟膏剤は、ヘルペス感染症の症状進行に対して、限られた影響力しか有しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ウイルス性疾患、特にヘルペスに対して活性物質効果を提供することである。とりわけ、前記活性物質は、単に症状の緩和、又は、例えば、細菌の定着化を伴う側副現象に対して作用するのではなく、ウイルス及びウイルス感染に対して直接的に作用する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、請求項１〜６のいずれかに係る、抗ウイルス薬治療のための、配列番号１を有するペプチドの使用により達成される。前記ペプチドは、以下において、Ｈｅｒｖｉｐと表記される。
【０００８】
該ペプチド自体は、すでに公知であり、細菌放射拡散阻害試験（Ｌｉｅｐｋｅその他、２００３、ＷＯ０１／９４３８６）の方法で、ヒト胎盤から単離された。Ｈｅｒｖｉｐは、ヒトβ−ヘモグロビンのアミノ酸１１２−１４７を含む。
【０００９】
該ペプチドは、前記方法によって、ヒト胎盤抽出物から取得することができ、質量分析法（電子スプレー法、ＥＳＩ−ＭＳ）及びＮ末端配列決定（エドマン分解法）により、生化学的に特徴を決定することが可能である。電子スプレー質量分析法による分子量の決定は、分子量３９０２Ｄａをもたらす。
【００１０】
このペプチドは、すでに公知の抗菌活性に加え、特にＨＳＶ−２及びＨＳＶ−１に対し、非常に特異的な抗ウイルス活性を有することが見出された。（ヘルペス）ウイルスは、その構造及び作用機序が、糸状菌並びに細菌といった病原菌とは異なるので、この発見は驚くべきものであるといえる。従って、細菌と異なり、（ヘルペス）ウイルスは、細胞侵入及び細胞感染において、その表面及びその標的細胞の表面上の特異的な分子構造を使用し、その標的細胞の細胞転写及び翻訳装置を用いてそれらを増殖する。
【００１１】
抗細菌ペプチドは、主に、細菌膜への結合を通じて作用し、これがこのような膜の浸透化を引き起こし、従って、微生物の死（Ｖａａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）をもたらす。この点において、前述の抗菌活性物質の作用機序は、基本的に、抗ウイルス阻害物質の作用機序とは極めて異なるが、それは後者が、感染又は複製に必要な全く異なる分子構造を攻撃するためである。
【００１２】
Ｈｅｒｖｉｐは、ヒトβ−ヘモグロビン（系統番号：４３７８８０４）の配列領域１１２−１４７に対応する、ヒトヘモグロビンのβ鎖からのアミノ酸配列を有するペプチドである。この配列領域を有するペプチドは、意外にも、特異的な抗ウイルス活性を有する。ヒトヘモグロビンであるＨｅｒｖｉｐの前駆タンパク質は、α鎖及びβ鎖という２つの異なるタンパク質鎖からなり、生物の酸素担体としての基本的に重要な役割に加え、その配列［Ｉｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７］に由来する生物活性ヘモグロビン断片に対する親分子としての機能も有する。驚くべきことに、これらの断片は、ヘモグロビンの実際の酸素担体機能と全く関連していないが、非常に異なる生物学的機能を果たす。このため、α鎖及びβ鎖の両方から生じるヘモグロビンの断片は、例えば、増殖因子の放出［Ｓｃｈａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１］、鎮痛［Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９、Ｆｕｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３］又はオピオイドのような［Ｂｒａｎｔｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６］効果を有することが確認されている。
【００１３】
ごく最近、ヘモグロビンの断片が、例えば、ダニから単離されたα鎖のウシヘモグロビンの断片［Ｆｏｇａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９］が、抗菌活性を有することが発見されている。
【００１４】
胎盤から精製され、及び合成的に調製されたペプチドＨｅｒｖｉｐは、インビトロで培養されたＨＳＶ−２に対して用量依存的効果を示す。
【００１５】
本発明に係る物質Ｈｅｒｖｉｐは、ウイルス感染症に治療において、ヘルペスウイルスの複製、伝播及び感染の阻害に対し使用可能である。治療上の使用としては、特に、皮膚並びに粘膜、とりわけ陰部の感染に伴う局所使用が適応症である。しかしながら、ヘルペスウイルスによって引き起こされる感染症の治療のための全身投与も可能である。
【００１６】
本発明のＨｅｒｖｉｐの使用は、ヘルペスウイルスによる感染によって引き起こされる疾患の治療を含む。
【００１７】
本発明によると、Ｈｅｒｖｉｐは、随伴する細菌の不定着化に対する、単なる間接的な効果というよりは、即時の直接的な抗ウイルス効果を有する。好ましくは、細菌、真菌等による実質的な細菌の不定着化を伴わないウイルス性疾患が治療される。
【００１８】
更に、Ｈｅｒｖｉｐの誘導体、変異体及び断片が、本発明の前記抗ウイルス治療に対して適切である。前記誘導体、変異体及び断片は、アミノ酸の欠失、置換及び挿入という慣用的な方法によって得られる。特に、アミド化誘導体、アセチル化誘導体、硫酸化誘導体、リン酸誘導体、グリコシル化誘導体、酸化誘導体、又はポリエチレングリコール修飾誘導体が、適切である。
【００１９】
好ましい態様は、アミノ酸の保存的交換、挿入及び／又は欠失により得た変異体及び断片、及び／又はペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、１〜１０、特に１〜５又は１、２若しくは３個の付加アミノ酸を含有する変異体に関する。
【００２０】
Ｃ末端で末端切断され、最初の１２のアミノ酸のみからなるＨｅｒｖｉｐの断片は、細胞感染アッセイにおいて、高活性を示すことがわかった。従って、好ましい態様において、Ｈｅｒｖｉｐの断片は、少なくとも１２個のＮ末端アミノ酸を含む。別の好ましい態様において、Ｈｅｒｖｉｐの断片は、Ｎ−末端アミノ酸であるバリンが欠如している。
【００２１】
前記誘導体、断片及び変異体は、Ｈｅｒｖｉｐと、少なくとも８０％、特に９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有し、抗ウイルス的に有効である。好ましくは、それらの抗ウイルス活性は、少なくともＨｅｒｖｉｐの活性と同程度に強いが、その強度がより低い場合もあり得、その場合には、少なくともＨｅｒｖｉｐの抗ウイルス活性の１０％、２５％又は５０％であるべきである。このような抗ウイルス活性は、ヒドロゲナーゼ／ホルマザンアッセイで確立されるのが好ましく、又は実施例中に記載のとおりである。
【００２２】
その使用は、好ましくは、軟膏、錠剤、スプレー、注入、軟膏、錠剤、スプレー、「持続放出」カプセル及び類似調製物のために調合された生薬製剤中で、及び／又は他の抗ウイルス治療剤と組み合わせて行われるのが望ましい。
【００２３】
次の実施例を用いて、本発明をさらに解説する：
【実施例】
【００２４】
Ｈｅｒｖｉｐを単離するために、公知の方法（Ｌｉｅｐｋｅその他、２００３、ＷＯ０１／９４３８６）に従い、陽イオン交換及び逆相クロマトグラフィーを使用して、胎盤ペプチド抽出物の濃縮及び分画を行った。ＨＳＶ−２の阻害性（下記の「Ｈｅｒｖｉｐの生化学的活性の決定」を参照）に関して、対応する画分を検査した。活性ペプチドを単離し、ヒトヘモグロビンのβ鎖の断片、アミノ酸１１２−１４７（系統番号４３７８８０４）と決定された。
【００２５】
（ｉ）タンパク質断片ヘモグロビン分子β鎖１１２−１４７のアミノ酸の３９０２．５という理論質量は、測定質量３９０２．５Ｄａと同一である。
【００２６】
（ｉｉ）更に、公知の方法により、Ｈｅｒｖｉｐ配列の化学合成を実行し、次いで分子の質量及び配列決定による検査を行なった。合成Ｈｅｒｖｉｐは、天然ペプチドと比較した場合、クロマトグラフ分析において、同様の特性を有する。
【００２７】
ヒトヘモグロビンのβ鎖の断片、アミノ酸１１２−１４７（系統番号４３７８８０４）は、本明細書において、Ｈｅｒｖｉｐ（ヘルペスウイルス阻害ペプチド）と称される。
【００２８】
Ｈｅｒｖｉｐの生化学的活性の決定
細胞アッセイを用いて、単純ヘルペスウイルスの感染率を決定する。ＨＳＶ−２の阻害剤は、このアッセイにおいて感染率を低下させる。
【００２９】
細胞培養培地１００μｌ中の１０００ＥＬＶＩＳ細胞（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｅｓ、ＵＳＡ）を、９６ウェル細胞培養プレートの反応空間中に植え付けた。ＥＬＶＩＳ細胞は、遺伝的に改変された仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞系で、そのゲノムは、誘導性ＨＳＶプロモーターＩＣＰ６の制御下にある大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を安定的に含有する。ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２による感染成功後、ウイルス性リボヌクレオチド還元酵素ＩＣＰ６を発現し、次いでＩＣＰ６プロモーターを介してＬａｃＺ遺伝子の発現を誘導する。前記植え付けから２４時間後、クロマト画分を精製し、又は合成ペプチドを細胞培養培地中に溶解し、５０μｌの容量で前記細胞に加えた。前記細胞を、３７℃で試料とインキュベーションしてから２時間後、ＨＳＶ−２又はＨＳＶ−１５０μｌ（総量２００μｌ）で感染を行った。検査方法に応じて、０．０１〜１０の異なるＭＯＩ（感染多重度）を、前記感染に対して使用した。Ｇａｌ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｄ  Ｋｉｔ（Ｔｒｏｐｉｘ、＃ＡＢＧＳ１００Ｍ）において、ｌａｃＺコードされたβ−ガラクトシダーゼを検出することによって、ＨＳＶ複製が、感染から２日後に検出された。
【００３０】
単離及び合成調製されたＨｅｒｖｉｐの、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する用量依存性阻害活性を、図１及び図２に示す。
【００３１】
得られたＩＣ５０値は、天然及び合成のＨｅｒｖｉｐに対し、３００−４００μｇ／ｍｌであった。Ｎ端末のバリン残基が欠如した合成Ｈｅｒｖｉｐのペプチドは、対応する抗ウイルス活性を有した。ＶＣＶＬＡＨＨＦＧＫＥＦの配列を有する合成Ｎ末端Ｈｅｒｖｉｐの断片は、６８−２００μｇ／ｍｌの範囲のＩＣ５０値を有した。
【００３２】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１ａ：胎盤から精製された抗ウイルス活性のＨｅｒｖｉｐ及びＨＳＶ−２における合成Ｈｅｒｖｉｐ。植え付け１日後、１０００ＥＬＶＩＳ細胞を、一定量のＨｅｒｖｉｐと、２時間インキュベートし、次いで、ＨＳＶ−２と感染させた。感染２日後、β−ガラクトシダーゼを検出することにより、前記ＨＳＶ−２の感染が検出された。合計３つの異なる臨床的ＨＳＶ−２で、３つ組みで実行された６回の各検査の平均値を示す。そのデータを、半対数プロットの図１ａ、ｂ、ｃ及び対数プロットの図２ａ、ｂ、ｃに示す。  図１ｂ：胎盤から単離されたＨｅｒｖｉｐ及びＨＳＶ−２に対する合成Ｈｅｒｖｉｐ（Ｅｒｌａｎｇｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ２０００を単離）の用量依存曲線。３つ組みで実行された１回の検査から得た平均値を示す。前記検査の説明については、図１ａ／２ａを参照。  図１ｃ：胎盤から単離されたＨｅｒｖｉｐ及びＨＳＶ−１に対する合成Ｈｅｒｖｉｐ（Ｅｒｌａｎｇｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ２０００を単離）の用量依存曲線。２つ組み又は３つ組みで実行された３回の検査から得た平均値を示す。前記検査の説明については、図１ａ／２ａを参照。
【図２】図２ａ：胎盤から精製された抗ウイルス活性のＨｅｒｖｉｐ及びＨＳＶ−２における合成Ｈｅｒｖｉｐ。植え付け１日後、１０００ＥＬＶＩＳ細胞を、一定量のＨｅｒｖｉｐと、２時間インキュベートし、次いで、ＨＳＶ−２と感染させた。感染２日後、β−ガラクトシダーゼを検出することにより、前記ＨＳＶ−２の感染が検出された。合計３つの異なる臨床的ＨＳＶ−２で、３つ組みで実行された６回の各検査の平均値を示す。そのデータを、半対数プロットの図１ａ、ｂ、ｃ及び対数プロットの図２ａ、ｂ、ｃに示す。  図２ｂ：胎盤から単離されたＨｅｒｖｉｐ及びＨＳＶ−２に対する合成Ｈｅｒｖｉｐ（Ｅｒｌａｎｇｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ２０００を単離）の用量依存曲線。３つ組みで実行された１回の検査から得た平均値を示す。前記検査の説明については、図１ａ／２ａを参照。  図２ｃ：胎盤から単離されたＨｅｒｖｉｐ及びＨＳＶ−１に対する合成Ｈｅｒｖｉｐ（Ｅｒｌａｎｇｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ２０００を単離）の用量依存曲線。２つ組み又は３つ組みで実行された３回の検査から得た平均値を示す。前記検査の説明については、図１ａ／２ａを参照。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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