(57)【要約】  本発明は、本明細書で細胞表面糖タンパク質として同定された新規なタンパク質（INSP201と称される）並びに疾患の診断、予防及び治療における前記タンパク質及びそのコード遺伝子に由来する核酸の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28及び/又は配列番号:30に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ii）細胞表面糖タンパク質ファミリーのメンバーの断片であるか、又は（i）記載のポリペプチドと共通の抗原決定基を有するポリペプチド；又は
（iii）（i）又は（ii）記載のポリペプチドの機能的等価物。
【請求項２】
配列番号:8、配列番号:12、配列番号:24及び/又は配列番号:30に示すアミノ酸配列を含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号:2、配列番号:10、配列番号:14、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:26及び/又は配列番号:28に示すアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列から成る、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26配列番号:28及び/又は配列番号:30に示すアミノ酸配列から成る、請求項1又は2記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16又は配列番号:18に示すアミノ酸配列と相同であり、さらに細胞表面糖タンパク質ファミリーのメンバーであることを特徴とする、請求項1から4のいずれか１項の（iii）記載の機能的等価物。
【請求項６】
請求項１〜３の何れか１項記載のポリペプチドの機能的等価物であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８記載のアミノ酸配列と80％、好ましくは85％、90％、95％若しくは99％を超える配列同一性を有するポリペプチド、または、それらの活性な断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペプチドの機能的等価物であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８記載のアミノ酸配列と有意な構造的相同性を示すポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８または配列番号３０からの７個以上のアミノ酸残基からなる共通の抗原決定基を有する、請求項１〜３のいずれか１項の(i)記載のポリペプチドの断片であるポリペプチド。
【請求項９】
請求項1から8のいずれか1項記載のポリペプチドをコードする、精製核酸分子。
【請求項１０】
配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27又は配列番号:29に示す核酸配列を含むか、又はその重複等価物若しくは断片である、請求項9記載の精製核酸分子。
【請求項１１】
配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27又は配列番号:29に示す核酸配列から成る請求項10記載の精製核酸分子、又はその重複等価物若しくは断片。
【請求項１２】
請求項9から11のいずれか1項記載の核酸分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、精製核酸分子。
【請求項１３】
請求項9から12のいずれか1項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１４】
請求項13記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項１５】
請求項1から8のいずれか1項記載の細胞表面糖タンパク質と特異的に結合するリガンド。
【請求項１６】
抗体である、請求項5記載のリガンド。
【請求項１７】
請求項1から8のいずれか1項記載のポリペプチドの発現レベル又は活性を増加若しくは減少させる化合物。
【請求項１８】
請求項1から8のいずれか1項記載のポリペプチドの生物学的作用のいずれも誘導することなく前記ポリペプチドと結合する、請求項17に記載の化合物。
【請求項１９】
天然又は改変された基質、リガンド、酵素、レセプター又は構造的若しくは機能的模倣物である、請求項18記載の化合物。
【請求項２０】
異種アミノ酸配列と融合した請求項1から8のいずれか1項記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項２１】
異種アミノ酸配列がIgG定常ドメイン若しくはその断片、又はhCGドメイン若しくはその断片である、請求項20記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
疾患の治療又は診断に使用される、請求項1から8のいずれか1項記載のポリペプチド、請求項9から12のいずれかに記載の核酸分子、請求項13記載のベクター、請求項15若しくは16記載のリガンド、請求項17から19のいずれか1項記載の化合物、又は請求項20若しくは21記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
患者からの組織において請求項１〜８のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現レベルを評価すること、または、請求項１〜８のいずれか１項記載のポリペプチドの活性を評価すること、および、前記発現レベルまたは活性をコントロールレベルと比較することを含み、前記コントロールレベルと相違するレベルを疾患の指標とする、患者の疾患の診断方法。
【請求項２４】
in vitroで実施される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程を含む、請求項23又は24に記載の方法：
（a）請求項15又は16に記載のリガンドを生物学的サンプルとリガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で接触させる工程；及び
（b）前記複合体を検出する工程。
【請求項２６】
（ａ）患者の組織のサンプルと核酸プローブとを、請求項９〜１２のいずれか１項記載の核酸分子と前記プローブとの間のハイブリッド複合体の形成が可能な条件下で接触させること；
（ｂ）コントロールサンプルと前記プローブとを、工程（ａ）使用したのと同じ条件下で接触させること；および、
（ｃ）前記サンプル中の前記ハイブリッド複合体の存在を検出すること、
を含み、
コントロールサンプル中のハイブリッド複合体のレベルと異なるハイブリダイゼーション複合体のレベルが患者サンプル中に検出されることを疾患の指標とする、請求項２３または２４記載の方法。
【請求項２７】
ａ）患者の組織からの核酸サンプルと核酸プライマーとを、請求項９〜１２のいずれか１項記載の核酸分子と前記プライマーとの間にハイブリッド複合体の形成が可能な条件下で接触させること；
ｂ）コントロールサンプルと前記プライマーとを、工程（ａ）使用したのと同じ条件下で接触させること；および、
ｃ）前記サンプル核酸を増幅させること；
ｄ）患者およびコントロールサンプルについて増幅された核酸のレベルを検出すること、
を含み、
コントロールサンプルにおける増幅された核酸のレベルと有意に異なる増幅された核酸のレベルが患者サンプルにおいて検出されることを疾患の指標とする、請求項２３または２４記載の方法。
【請求項２８】
以下の工程を含む、請求項23又は24記載の方法：
（a）疾患について検査される患者から組織サンプルを入手する工程；
（b）前記組織サンプルから請求項9から12のいずれか1項記載の核酸分子を単離する工程； 
（c）疾患に付随する変異の存在を前記疾患の指標として前記核酸分子で検出することにより、疾患について患者を診断する工程。
【請求項２９】
さらに核酸分子を増幅させて増幅生成物を形成する工程及び前記増幅生成物中に変異の有無を検出する工程を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
患者における変異の有無が、前記核酸分子を前記核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブとストリンジェントな条件下で接触させて、疾患と関連する変異に対応するいずれかの部分において前記核酸プローブの非ハイブリダイズ部分を有するハイブリッド二本鎖分子を形成させること；および、前記プローブ鎖の非ハイブリダイズ部分の有無を疾患に関連する変異の有無の指標として検出することを含む、請求項28又は29記載の方法。
【請求項３１】
疾患が炎症、癌、結腸癌、炎症性腸疾患、膵臓異常及び/又はIL-2関連疾患を含む（ただしこれらに限定されない）、請求項23から30のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
疾患が、リンパ球抗原が関与する疾患である、請求項23から30のいずれか1項記載の方法。
【請求項３３】
細胞表面糖タンパク質としての請求項1から8のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項３４】
請求項1から8のいずれか１項記載のポリペプチド、請求項9から12のいずれか1項記載の核酸分子、請求項13記載のベクター、請求項14記載の宿主細胞、請求項15若しくは16記載のリガンド、請求項17から19のいずれか1項記載の化合物、又は請求項20若しくは21記載の融合ポリペプチド、を含む医薬組成物。
【請求項３５】
請求項1から7のいずれか1項記載のポリペプチド、請求項9から12のいずれか１項記載の核酸分子、を含むワクチン組成物。
【請求項３６】
炎症、癌、炎症性腸疾患、膵臓異常及び/又はIL-2関連疾患の治療用医薬の製造で使用される、請求項1から8のいずれか１項記載のポリペプチド、請求項9から12のいずれか1項記載の核酸分子、請求項13記載のベクター、請求項14記載の宿主細胞、請求項15若しくは16記載のリガンド、請求項17から19のいずれか1項記載の化合物、請求項20若しくは21記載の融合ポリペプチド、又は請求項34記載の医薬組成物。
【請求項３７】
リンパ球抗原が関与する疾患の治療用医薬の製造で使用される、請求項1から8のいずれか１項記載のポリペプチド、請求項9から12のいずれか1項記載の核酸分子、請求項13記載のベクター、請求項14記載の宿主細胞、請求項15若しくは16記載のリガンド、請求項17から19のいずれか1項記載の化合物、請求項20若しくは21記載の融合ポリペプチド、又は請求項34記載の医薬組成物。
【請求項３８】
請求項1から8のいずれか1項記載のポリペプチド、請求項9から12のいずれか1項記載の核酸分子、請求項13記載のベクター、請求項14記載の宿主細胞、請求項15若しくは16記載のリガンド、請求項17から19のいずれか1項記載の化合物、請求項20若しくは21記載の融合ポリペプチド、又は請求項34記載の医薬組成物、を患者に投与することを含む、患者の疾患を治療する方法。
【請求項３９】
健常な者における天然の遺伝子の発現又はポリペプチドの活性と比較した場合に、症状を有する患者において前記遺伝子の発現又はポリペプチドの活性が低い疾患について、前記患者に投与されるポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物又は組成物がアゴニストである、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
健常な者における天然の遺伝子の発現又はポリペプチドの活性と比較した場合に、症状を有する患者において前記遺伝子の発現又はポリペプチドの活性が高い疾患について、前記患者に投与されるポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物又は組成物がアンタゴニストである、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
患者からの組織における請求項１〜８のいずれか１項記載のポリペプチドの発現レベル若しくは活性を一定期間モニターすること、または患者からの組織における請求項９〜１２のいずれか１項記載の核酸分子の発現レベルを一定期間モニターすること、を含み、前記一定期間にわたる前記発現レベルもしくは活性のコントロールレベルへ向かう変化を疾患の緩解の指標とする、患者の疾患の治療処置をモニターする方法。
【請求項４２】
疾患の治療及び/又は診断に有効な化合物を同定する方法であって、請求項1から8のいずれか1項記載のポリペプチド又は請求項9から12のいずれか1項記載の核酸分子を、前記ポリペプチド又は核酸分子に対して結合アフィニティーを有すると考えられる1以上の化合物と接触させる工程、及び前記核酸分子又はポリペプチドと特異的に結合する化合物を選択する工程を含む、前記方法。
【請求項４３】
以下を含む疾患の診断に有用なキット：
ストリンジェントな条件下で請求項9から12のいずれか1項記載の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含む第一の容器；
前記核酸分子を増幅させるために有用なプライマーを含む第二の容器；及び
疾患の診断を容易にするために、前記プローブ及びプライマーを使用するための指示書。
【請求項４４】
ハイブリダイズしないRNAを消化するための試薬を含む第三の容器をさらに含む、請求項41記載のキット。
【請求項４５】
核酸分子のアレイを含むキットであって、前記核酸分子の少なくとも1つが請求項9から12のいずれか1項記載の核酸分子である、前記キット。
【請求項４６】
請求項1から8のいずれか1項記載のポリペプチドと結合する1以上の抗体、及び、前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬を含むキット。
【請求項４７】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリペプチドをより高いレベル、より低いレベル、または発現しないように形質転換された、非ヒトトランスジェニック若しくはノックアウト動物。
【請求項４８】
請求項47記載の非ヒトトランスジェニック動物を候補化合物と接触させ、前記動物の疾患に対する前記化合物の影響を決定すること、を含む、疾患を治療するために有効な化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４９】
IVFで使用されるか、又は避妊薬として使用される、請求項1から8のいずれか1項記載のポリペプチド、請求項9から12のいずれか1項記載の核酸分子、請求項13記載のベクター、請求項14に記載の宿主細胞、請求項15若しくは16記載のリガンド、請求項17から19のいずれか1項記載の化合物、請求項20若しくは21記載の融合ポリペプチド、又は請求項34に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
避妊薬の製造で使用される、請求項1から8のいずれか1項記載のポリペプチド、請求項9から12のいずれか1項記載の核酸分子、請求項13記載のベクター、請求項14記載の宿主細胞、請求項15若しくは16記載のリガンド、請求項17から19のいずれか1項記載の化合物、請求項20若しくは21記載の融合ポリペプチド、又は請求項34記載の医薬組成物。
【請求項５１】
細胞表面糖タンパク質関連疾患の治療又は予防を目的とする候補薬剤のスクリーニングの標的としてのINSP201ポリペプチドの使用。
【請求項５２】
以下の工程を含む、生物学的に活性な化合物を選択する方法：
（i）候補化合物とINSP201ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞とを接触させる工程；
（ii）前記細胞の表面で前記INSP201ポリペプチドと結合する、及び/又は、INSP201ポリペプチドの活性を調節する化合物を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本明細書で細胞表面糖タンパク質と同定された新規なタンパク質（INSP201と称される）、並びに疾患の診断及び治療における前記タンパク質及びコード遺伝子に由来する核酸配列の使用に関する。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は参照により完全に本明細書に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
薬剤発見のプロセスは、機能ゲノミクスの時代が到来したために目下のところ重大な改革を受けている。“機能ゲノミクス”という用語は、機能を対象となっているタンパク質の配列に帰するためにバイオインフォマティクスツールを利用するアプローチに適用される。そのようなツールは、配列データの生産速度が、機能をこれらタンパク質配列に割り当てる研究室の能力を急速に凌駕しつつあるためにますます必要となっている。
バイオインフォマティクスツールの有効性及び正確さが増加しているので、これらのツールによって生化学的に性状を決定する通常技術は急速に置き換えられつつある。実際に、本発明の同定に用いられた高度なバイオインフォマティクスツールは、今や高度な信頼を置き得る結果を生産することができる。
配列データが利用可能になるにつれ、種々の機関及び商業的機構がそれらを調査し、重大な発見が継続的に達成されている。しかしながら、研究及び薬剤発見のための標的として、更なる遺伝子及びそれらがコードするポリペプチドの同定及び性状決定を求める持続的な要求がなお存在する。
序論
分泌タンパク質
細胞が細胞外タンパク質を生成する能力は多くの生物学的プロセスにとって主要なものである。酵素、増殖因子、細胞外マトリックスタンパク質及びシグナリング分子は全て細胞によって分泌される。これは分泌小胞と形質膜との融合を介する。ほとんどの事例では（全てというわけではないが）、タンパク質は小胞体へ、さらに分泌小胞へシグナルペプチドによって誘導される。シグナルペプチドはcis-作動性配列であり、前記配列はポリペプチド鎖の細胞質から膜結合小区画（例えば分泌小胞）への輸送に影響を与える。分泌小胞を標的とするポリペプチドは細胞外マトリックスに分泌されるか、又は形質膜に保持される。形質膜に保持されるポリペプチドは、1つ又は2つ以上の膜貫通ドメインを有するであろう。細胞の機能で中心的な役割を果たす分泌タンパク質の例はサイトカイン、ホルモン、細胞外マトリックスタンパク質（粘着分子）、プロテアーゼ、並びに増殖及び分化因子である。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、INSP201ポリペプチドは細胞表面糖タンパク質であるという発見に基づいている。
本発明の第一の特徴のある実施態様では、以下のポリペプチドが提供される：
（i）配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16及び/又は配列番号:18に示すアミノ酸配列を含む；
（ii）細胞表面糖タンパク質ファミリーのメンバーの断片であるか、又は（i）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する；または、
（iii）（i）又は（ii）との機能的等価物である。
好ましくは、本発明のこの第一の特徴のポリペプチドは、配列番号:12に示すアミノ酸配列を含む。好ましいそのようなタンパク質は配列番号:8に示すアミノ酸配列を含む。
本発明のこの第一の特徴の第二の実施態様にしたがえば、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16及び/又は配列番号:18に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドが提供される。
好ましくは、本発明の範囲から排除される断片は、配列番号:8の最初の79アミノ酸から成る断片である。この断片は、NCBI GenPeptエントリーAX884746及びGensetの名称で以下の特許書類（US20050106595、US6822072、JP2001269182、JP2002511259、EP1033401、WO9953051、US6783961）に開示されている。配列番号:2に示す配列を有するポリペプチドは、以下では“INSP201エクソン1ポリペプチド”と称される。配列番号:4に示す配列を有するポリペプチドは、以下では“INSP201エクソン2ポリペプチド”と称される。配列番号:6に示す配列を有するポリペプチドは、以下では“INSP201エクソン3ポリペプチド”と称される。配列番号:8に示す配列を有するポリペプチドは、以下では“完全長INSP201ポリペプチド”と称される。
出願人は理論に拘束されることを望まないが、INSP201ポリペプチドの最初の21アミノ酸はシグナルペプチドを形成すると仮定される。
この仮定のシグナル配列をもたないINSP201エクソンポリペプチドは配列番号:10に示されている。この仮定のシグナル配列をもたない完全長のINSP201ポリペプチドは配列番号:12に示されている。
【０００４】
配列番号:10に示す配列を有するポリペプチドは、以下では“INSP201エクソン1成熟ポリペプチド”と称される。配列番号:12に示す配列を有するポリペプチドは、以下では“INSP201成熟ポリペプチド”と称される。
INSP201ポリペプチドは多数の可能なN-グリコシル化部位を含むと本明細書では予測される。したがって、配列番号:8のAsn124、Asn156、Asn188、Asn204、Asn220、Asn250及びAsn268に対応する位置の1、2、3、4、5、6又は７つでN-グリコシル化によって改変されたINSP201ポリペプチドを含む、又は前記から成る糖タンパク質は本発明の特徴として含まれる。
INSP201ポリペプチドは、配列番号:8の残基406−427（406及び427を含む）に膜貫通領域を含むと本明細書では予測される。したがって、INSP201ポリペプチドの細胞外変種は本発明の特徴として含まれる。好ましいそのような変種は、配列番号:8のアミノ酸残基1−405、又は配列番号:8の22−405（22及び405を含む）を含む、又は前記から成る細胞外形態を、本明細書に記載するようにそれらのアポ及びN-グリコシル化型において含む。配列番号:14に示す配列を有するポリペプチドは、以下では“INSP201細胞外ポリペプチド”と称される。配列番号:18に示す配列を有するポリペプチドは以下では“INSP201成熟細胞外ポリペプチド”と称され、INSP201ポリペプチドのシグナルペプチドを形成すると予想されるアミノ酸を除外する。
このタイプのポリペプチド変種は、リガンド、例えばINSP201ポリペプチド及びこのタイプの他のタンパク質と結合する分泌されるリガンドのスクリーニングアッセイで特に有用である。そのような変種はまた、そのようなリガンドの定量のために、例えばこれらのリガンド及びこのポリペプチドが役割を演じる疾患の診断で用いることができる。
INSP201ポリペプチドの細胞内変種もまた本発明の特徴として含まれる。この変種は、配列番号:8のアミノ酸残基428−518（428及び518を含む）から成るポリペプチドである。配列番号:16に示す配列を有するポリペプチドは、以下では“INSP201細胞内ポリペプチド”と称される。
【０００５】
本明細書で用いられる“INSP201ポリペプチド”という用語には、INSP201エクソン1ポリペプチド、INSP201エクソン2ポリペプチド、INSP201エクソン3ポリペプチド、完全長INSP201ポリペプチド、INSP201エクソン1成熟ポリペプチド、INSP201成熟ポリペプチド、INSP201細胞外ポリペプチド、INSP201成熟細胞外ポリペプチド及びINSP201細胞内ポリペプチドを含むポリペプチドが含まれる。これら全てのポリペプチドは本発明の特徴を構成する。
好ましくは、本発明の第一の特徴の上記の態様にしたがうポリペプチドは、分泌タンパク質、特に細胞表面糖タンパク質ファミリーのメンバーとして機能する。
細胞表面糖タンパク質は人間の生物学、したがって生理学及び健康にとって極めて重要な問題である。もちろんのこと、細胞膜の外側表面はアッセンブリー及び組織の完全性の維持に主要な役割を果たす。発生時の細胞及び分化細胞の外側表面は、系統的シグナル、リガンド又はホルモンを認識するレセプター分子を含む。リガンドの結合又は解離は細胞の分化機能のいくつかを制御して、全体の系の要求に細胞を協調させる。外側表面はまた糖タンパク質及びプロテオグリカンで被覆される。これらのタンパク質と多糖類の大きな複合体は組織特異的マトリックスを提供し、その中で類似の機能をもつ細胞は、互いに緊密に結びついた組織として一緒に作動することができる。胚発生では、細胞表面の糖タンパク質及びプロテオグリカンの分子的特異性により、共通の機能をもつ細胞の分離及び結合が促進され、おそらくは制御される。
【０００６】
炭水化物鎖は、糖タンパク質とN-及びO-グリコシジル結合しており、複雑な構造を形成する。実際、N-及びO-グリカン鎖は、グリコシルトランスフェラーゼの制御配列によって小胞体及びゴルジ内で組み立てられ、グリコシダーゼプロセッシング反応が、（例えば遺伝子発現レベルで又は酵素の局在化レベルとして）特異的な調節事象にゆだねられる。この複雑な調節は数百の多くの構造をもたらし、その範囲は、細胞/組織タイプ又は発生/分化状態で変動する。
欠陥のあるグリコシル化によって引き起こされる疾患、及び組換えDNA技術により生成される治療用糖タンパク質に関してはますます重要性が高まっている。特に、病的細胞では、正常とはしばしば性状的に異なり、疾患の病期の判定及び診断に役立ち得る、これらの構造における相対的割合を有する。疾患に特異的な糖タンパク質の構造及びそれらの機能に関する知識を、免疫療法で、細胞粘着の阻止又は他の結合若しくは生物学的過程の阻害で治療的に用いることができる（I. Brockhausen et al. Acta Anat. 1998, 16(1-4):36-78；P.K. Bhatia and A. Mukhopadhyay, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1999, 64:155-201）。
例えば、グリコシル化/糖タンパク質の発現と癌の進行/悪性度（JW Dennis et al. Biochim Biophys Acta. 1999 Dec.6, 1473(1):21-34）又は遺伝的疾患（JW Dennei et al. Bioassays 1999 May, 21(5)412-21）との間の関係が調査された。
糖タンパク質は典型的には糖型の混合物として発現されると仮定して、糖タンパク質の生物学的研究に関する実験のために均質な糖ペプチド及び糖タンパク質物質を得るための種々の技術が開発されてきた（MJ Grogan et al. Annu Rev Biochem. 2002, 71:593-634）。
【０００７】
多くの細胞表面糖タンパク質が細胞のプロテアーゼによる限定的なタンパク質分解に委ねられる。この切断メカニズムは細胞外ドメインの分泌を可能にする。細胞外ドメインは、これら領域によって認識される他の循環タンパク質の結合活性に影響を与えることができる。実際に、細胞外ドメインの切断は、サイトカイン/サイトカインレセプター系で重点的に研究されたように、外因性刺激に対する細胞の応答を変化させることによって、多数の病理生理学的過程（例えば炎症、細胞変性及びアポトーシス）及び発癌に必要とされる（J. Mullberg et al. Eur Cytokine Netw. 2000 Mar, 11(1):27-38；J. Arribas and A. Merlos-Suarez, Curr Top Dev Biol. 2003, 54:125-44；P. Dello Sbarba and E. Rovida, Biol. Chem. 2002 Jan, 383(1):69-83）。
本発明の第一のポリペプチドはさらにヒスチジンタグを含むことができる。好ましくは、ヒスチジンタグは前記ポリペプチドのC-末端に見出される。好ましくは、ヒスチジンタグは1−10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10残基）のヒスチジン残基を含む。より好ましくは、前記ヒスチジンタグは6ヒスチジン残基を含む。
本発明の“抗原決定基”は本発明のポリペプチドの一部分であり得る。抗原決定基は抗体の結合部位又はT細胞レセプター（TCR）と結合する。また別には、“抗原決定基”はただ1つの抗体分子が結合する本発明のポリペプチドの表面上の部位でもありえる。一般的には、抗原はいくつかの又は多くの異なる抗原決定基を有し、多くの異なる特異性を有する抗体と反応する。好ましくは、抗体は本発明のポリペプチドと免疫特異的である。好ましくは、抗体は本発明のポリペプチドと免疫特異的であり、前記は融合タンパク質の部分ではない。好ましくは、抗体はINSP201又はその断片と免疫特異的である。抗原決定基は、通常化学的に活性な表面の分子（例えばアミノ酸又は糖側鎖）群から成り、特異的な三次元の構造的特徴を特異的な荷電的特徴と同様に有する。好ましくは、“抗原決定基”は、抗原性を有する（すなわち特異的免疫応答を誘引する）本発明のポリペプチド上の特定の化学基を指す。
【０００８】
第二の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする精製核酸分子を提供する。
“精製核酸分子”という用語は、好ましくは以下の本発明の核酸分子を指す：（1）全核酸が供給細胞から単離されたときに、天然の状態で一緒に見出されるタンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質の少なくとも50%から分離された核酸分子、（2）前記“精製核酸分子”が天然の状態で結合されているポリヌクレオチドの全体又は一部分と結合していない核酸分子、（3）天然の状態では結合していないポリヌクレオチドと機能的に連結されている核酸分子、又は（4）天然の状態ではより大きなポリヌクレオチド配列の部分として存在しない核酸分子。好ましくは、本発明の単離核酸分子は、実質的に、他のいずれの夾雑核酸分子、又はその天然の環境で見出される他の夾雑物質を含まない（前記夾雑物はポリペプチド製造におけるその使用又はその治療的、診断的、予防的若しくは研究的使用に関して妨げとなるであろう）。好ましい実施態様では、ゲノムDNA分子は本発明の範囲から特別に排除される。好ましくは、10kb（キロ塩基対）、50kb、100kb、150kb、200kb、250kb又は300kbより大きいゲノムDNAは、特に本発明の範囲から排除される。好ましくは、“精製核酸分子”はcDNAのみから成る。
好ましくは、前記精製核酸分子は、配列番号:1（INSP201エクソン1ポリペプチドをコードする）、配列番号:3（INSP201エクソン2ポリペプチドをコードする）、配列番号:5（INSP201エクソン3ポリペプチドをコードする）、配列番号:7（INSP201ポリペプチドをコードする）、配列番号:9（INSP201エクソン1成熟ポリペプチドをコードする）、配列番号:11（INSP201成熟ポリペプチドをコードする）、配列番号:13（INSP201細胞外ポリペプチドをコードする）、配列番号:15（INSP201細胞内ポリペプチドをコードする）、又は配列番号:17（INSP201成熟細胞外ポリペプチドをコードする）に示される核酸配列を含むか、又はこれら配列のいずれかの重複等価物若しくは断片である。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号:1（INSP201エクソン1ポリペプチドをコードする）、配列番号:3（INSP201エクソン2ポリペプチドをコードする）、配列番号:5（INSP201エクソン3ポリペプチドをコードする）、配列番号:7（INSP201ポリペプチドをコードする）、配列番号:9（INSP201エクソン1成熟ポリペプチドをコードする）、配列番号:11（INSP201成熟ポリペプチドをコードする）、配列番号:13（INSP201細胞外ポリペプチドをコードする）、配列番号:15（INSP201細胞内ポリペプチドをコードする）、又は配列番号:17（INSP201成熟細胞外ポリペプチドをコードする）に示される核酸配列から成る精製核酸分子、又はこれら配列のいずれかの重複等価物若しくは断片である精製核酸分子を提供する。
第三の特徴では、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で本発明の第二の特徴の核酸分子とハイブリダイズする精製核酸分子を提供する。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は以下のように規定される：50%ホルムアミド、5ｘのSSC（150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5ｘデンハルト溶液、10%硫酸デキストラン及び20μg/mLの変性せん断サケ精子DNAを含む溶液で42℃での一晩のインキュベーション、続いて0.1ｘのSSCで約65℃でフィルターを洗浄。
本明細書で用いられる、“機能的等価物”は、本発明のポリペプチド又は核酸分子と実質的に類似する機能的又は構造的特徴を有するタンパク質又は核酸を指す。タンパク質の機能的等価物は、特定の機能の実施のために改変が必要とされるような改変を含むことができる。“機能的等価物”という用語は、分子の断片、変異体、ハイブリッド、変種、類似体又は化学的誘導体を含むことを意図する。
好ましくは、“機能的等価物”は、本発明のポリペプチドの任意の1つ又は2つ以上の機能的活性を示すタンパク質又は核酸分子であってもよい。
【００１０】
好ましくは、“機能的等価物”は、生物学的活性又は機能の測定のための適切なアッセイでINSP201又はその断片と比較して、実質的に類似の活性を示すタンパク質又は核酸であり得る。好ましくは、“機能的等価物”は、生物学的活性又は機能の測定のための適切なアッセイでINSP201又はその断片と比較して、同一又はより高い活性を示すタンパク質又は核酸であり得る。好ましくは、“機能的等価物”は、生物学的活性又は機能の測定のための適切なアッセイでINSP201又はその断片と比較して、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%又はそれより高い活性を示すタンパク質又は核酸であり得る。
好ましくは、“機能的等価物”は、本発明のポリペプチドと実質的に類似するin vivo又はin vitro活性を示すことができるタンパク質又は核酸であり得る。好ましくは、“機能的等価物”は、本発明のポリペプチドの対応する部分が他の細胞内又は細胞外分子と相互作用する態様と実質的に類似の態様でそれら分子と相互作用することができるタンパク質又は核酸であり得る。例えば、 “機能的等価物”は、免疫アッセイにおいて、本発明のポリペプチドの対応するペプチド（すなわち“機能的等価物”を達成するためにそのアミノ酸配列が改変されたペプチド）又は本発明のペプチドそのものと抗体との結合を低下させることができよう（ここで前記抗体は本発明のポリペプチドの対応するペプチドに対して生成されてあった）。等モル濃度の機能的等価物は、前述の対応するペプチドの結合を少なくとも約5%、好ましくは約5%から10%、より好ましくは約10%から25%、さらに好ましくは約25%から50%、もっとも好ましくは約40%から50%低下させるであろう。
【００１１】
例えば、機能的等価物は完全に機能的であってもよいが、また1つ又は2つ以上の活性を欠いていてもよい。したがって、本発明では、変種は、例えば細胞表面糖タンパク質としてその実体を反映するポリペプチドの活性の機能に影響を与えることができる。第四の特徴では、本発明は、ベクター（例えば発現ベクター）を提供し、前記ベクターは本発明の第二又は第三の特徴の核酸分子を含む。
第五の特徴では、本発明は、本発明の第四の特徴のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
第六の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴の細胞表面糖タンパク質ファミリーのメンバーと特異的に結合するリガンドを提供する。好ましくは、前記リガンドは、細胞表面糖タンパク質ファミリーのメンバーである本発明の第一の特徴のポリペプチドの機能を阻害する。本発明のポリペプチドに対するリガンドは種々の形態でもたらされ得る。前記形態には天然又は改変基質、酵素、レセプター、有機小分子（例えば2000Daまで、好ましくは800Da又はそれより小さい天然又は合成小有機分子）、ペプチド模倣物、無機分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、上述の構造的又は機能的模倣物が含まれる。
第七の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現を変化させるために有効であるか、又は本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性を調節するために有効な化合物を提供する。
そのような化合物は、本明細書に開示するアッセイ及びスクリーニング方法を用いて同定することができる。
本発明の第七の特徴の化合物は、前記遺伝子の発現レベル又は前記ポリペプチドの活性を増加させるか（アゴニスト）又は低下させる（アンタゴニスト）ことができる。
重要なことには、INSP201ポリペプチドの機能を同定することによって、疾患の治療及び/又は診断に有効な化合物を同定することができるスクリーニング方法の設計が可能になることである。INSP201ポリペプチドの細胞外型及び細胞内型は、このような性質のスクリーニングで特に有用であろう。本発明の第六及び第七の特徴のリガンド及び化合物はそのような方法を用いて同定することができる。これらの方法は本発明の特徴として含まれる。
【００１２】
本発明のまた別の特徴は、候補薬調整物質、特に細胞表面糖タンパク質関連疾患に対して活性を有する候補薬のスクリーニングの標的としてINSP210遺伝子又はポリペプチドの使用にある。
本発明のさらに別の特徴は、細胞表面糖タンパク質関連疾患の治療用化合物をスクリーニングする方法にある。前記方法は、INSP210遺伝子又はポリペプチド若しくは前記の断片と結合する化合物の能力を決定することを含む。
本発明のさらに別の特徴は、細胞表面糖タンパク質関連疾患の治療用化合物をスクリーニングする方法にある。前記方法は、INSP210遺伝子又はポリペプチド若しくは前記の断片の活性の調節をテストすることを含む。
第八の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチド、又は本発明の第二若しくは第三の特徴の核酸分子、又は本発明の第四の特徴のベクター、又は本発明の第五の特徴の宿主細胞、又は本発明の第六の特徴のリガンド、又は本発明の第七の特徴の化合物を、細胞表面糖タンパク質ファミリーのメンバーが関与する疾患の治療又は診断で使用するために提供する。そのような疾患には、細胞増殖性異常（新形成、メラノーマ、肺、結腸直腸、乳房、膵臓、頭部頸部の腫瘍、及び他の固形腫瘍を含む）、骨髄増殖性異常（例えば白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、血管増殖性異常、カポジ肉腫）、自己免疫疾患/炎症性疾患（アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬及び気道の炎症、喘息、及び器官移植拒絶を含む）、心脈管系異常（高血圧、浮腫、狭心症、アテローム性硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再灌流損傷及び虚血を含む）、神経学的異常（中枢神経系疾患、アルツハイマー症、脳損傷、筋萎縮性側索硬化症及び疼痛を含む）、気道の異常（慢性閉塞性肺疾患及び嚢胞性線維症を含む）、発育異常、代謝異常（真性糖尿病、骨粗しょう症、肥満、エイズ及び腎疾患を含む）、感染（ウイルス感染、細菌感染、真菌感染及び寄生虫感染を含む）並びに他の病的状態が含まれる。好ましくは、前記疾患は、細胞表面糖タンパク質が関与するものである。これらの分子はまた、そのような疾患の治療用医薬の製造で用いることができる。これらの分子はまた、避妊又は不妊を含む生殖異常の治療に用いることができる。
【００１３】
本発明の部分（すなわち本発明の第一の特徴のポリペプチド、本発明の第二若しくは第三の特徴の核酸分子、本発明の第四の特徴のベクター、本発明の第五の特徴の宿主細胞、本発明の第六の特徴のリガンド、本発明の第七の特徴の化合物）は、炎症、細胞変性及びアポトーシス並びに発癌を含む疾患/異常（本明細書では前記2つの用語は相互に用いられる）の治療又は診断で特に有用であり得る。
第九の特徴では、本発明は患者で疾患を治療する方法を提供する。前記方法は、本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現レベル、又は本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性を前記患者由来の組織で判定し、前記発現又は活性のレベルをコントロールレベルと比較することを含み、前記コントロールレベルと異なるレベルを疾患の指標とする。そのような方法は、好ましくはin vitroで実施されるであろう。同様な方法を患者における疾患の治療をモニターするために用いることができ、ポリペプチド又は核酸分子の発現又は活性のレベルがある期間にわたってコントロールレベルへ向かって変化すれば疾患の緩解の指標となる。
本発明の第一の特徴のポリペプチドを検出する好ましい方法は以下の工程を含む：（a）本発明の第六の特徴のリガンド（例えば抗体）を生物学的サンプルとリガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で接触させる工程；及び（b）前記複合体を検出する工程。
当業者には明らかなように、本発明の第九の特徴にしたがう多数の種々の方法が存在する。前記は、例えば短いプローブによる核酸のハイブリダイゼーション、点変異解析、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅方法、及び異常なタンパク質レベルを検出するために抗体を用いる方法である。同様な方法を短期又は長期にわたって用いて、疾患の治療を患者でモニターすることができる。本発明はまた疾患を診断するこれらの方法で有用なキットを提供する。
【００１４】
十番目の特徴では、本発明は、細胞表面糖タンパク質として本発明の第一の特徴のポリペプチドの使用を提供する。細胞表面糖タンパク質としての本発明のポリペプチドの適切な使用には、細胞増殖、代謝又は分化の調節物質としての使用、レセプター/リガンドの部分としての使用、及び生理学的又は病理学的状態の診断マーカーとしての使用が含まれる。
十一番目の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチド、又は本発明の第二若しくは第三の特徴の核酸分子、又は本発明の第四の特徴のベクター、又は本発明の第五の特徴の宿主細胞、又は本発明の第六の特徴のリガンド、又は本発明の第七の特徴の化合物を、医薬的に許容できる担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
十二番目の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチド、又は本発明の第二若しくは第三の特徴の核酸分子、又は本発明の第四の特徴のベクター、又は本発明の第五の特徴の宿主細胞、又は本発明の第六の特徴のリガンド、又は本発明の第七の特徴の化合物を、疾患の診断又は治療のための医薬の製造で使用するために提供する。前記疾患には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：骨髄増殖性異常（例えば白血病、リンパ腫、骨髄形成異常症候群、及び癌、新形成、メラノーマ、肺、結腸直腸、乳房、膵臓、頭部及び頸部の腫瘍、並びに他の固形腫瘍）、血液異常（例えばマクログロブリン血症）、自己免疫疾患/炎症性疾患（アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬、多発性硬化症及び気道の炎症、喘息、及び器官移植拒絶を含む）、B-細胞異常、心脈管系異常、神経学的異常、発育異常、受胎異常、代謝異常、エイズ、腎疾患、感染、及び他の病的状態。
【００１５】
十三番目の特徴では、本発明は患者で疾患を治療する方法を提供する。前記方法は、本発明の第一の特徴のポリペプチド、又は本発明の第二若しくは第三の核酸分子、又は本発明の第四の特徴のベクター、又は本発明の第五の特徴の宿主細胞、又は本発明の第六の特徴のリガンド、又は本発明の第七の特徴の化合物を患者に投与することを含む。
症状を有する患者において本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現、又は本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性が、健常な者での前記発現又は活性レベルと比較して低い疾患について、患者に投与されるポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物はアゴニストであるべきである。逆に、症状を有する患者において前記ポリペプチドの天然の遺伝子の発現又は活性が、健常な者での前記発現又は活性レベルと比較して高い疾患について、患者に投与されるポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物はアンタゴニストであるべきである。そのようなアンタゴニストの例にはアンチセンス核酸分子、リボザイム及びリガンド（例えば抗体）が含まれる。
INSP201ポリペプチドは細胞表面糖タンパク質であり、したがって多くの症状で役割を有する。INSP201ポリペプチドのアンタゴニストは、それらがこれら症状を調節する方法を提供するので特に重要である。
十四番目の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチドを高レベルで又は低レベルで発現するか、又は前記が発現されないように形質転換されたトランスジェニック、又はノックアウト非ヒト動物を提供する。そのようなトランスジェニック動物は、疾患の研究のための非常に有用なモデルであり、さらにまた、そのような疾患の治療又は診断に有効な化合物の同定のためのスクリーニング計画でも用いることができる。
本発明を利用するために用いることができる標準的な技術及び方法の要旨は下記に提供される。本発明は、記載した特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクター及び試薬に限定されないことは理解されよう。本明細書で用いられる用語は単に具体的な実施態様を記載する目的のためであり、この用語が本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲の語句によってのみ制限される。
ヌクレオチド及びアミノ酸の標準的な略語が本明細書では用いられる。
【００１６】
本発明を利用するために用いることができる標準的な技術及び方法の要旨は以下で提供される。本発明は、記載した特定の方法論、プロトコル、細胞株、ベクター及び試薬に限定されないことは理解されよう。さらにまた、本明細書で用いられる用語は、具体的な実施態様を記載することを単に目的としており、この用語によって本発明の範囲を限定すべきではないこともまた理解されよう。本発明の範囲は添付の語句によってのみ限定される。
別に指定がなければ、本発明の実施には、通常の分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び免疫学の技術が用いられ、前記技術は当業者の技量の範囲内である。
そのような技術は文献で完全に説明されている。参考のための特に適切な成書には以下が含まれる：Sambrook Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989)；DNA Clonig, Vokumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)；Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)；Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986)；Immoblized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.)、特に154及び155巻；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, Lomdon)；Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.)；及びHandbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV（D.M. Weir and C.C. Blackwell eds. 1986）。
【００１７】
本明細書で用いられる、“ポリペプチド”という用語には、2つ又は3つ以上のアミノ酸が互いにペプチド結合又は改変ペプチド結合（すなわちペプチドイソステア）によって結合されたものを含む、任意のペプチド又はタンパク質が含まれる。この用語は、短い鎖（ペプチド及びオリゴペプチド）及び長い鎖（タンパク質）の両者を指す。
本発明のポリペプチドは成熟タンパク質型であっても、プレ-、プロ-又はプレプロ-タンパク質であってもよい。後者は、プレ-、プロ-又はプレプロ-部分の切断によって活性化され、活性を有する成熟ポリペプチドを生成する。そのようなポリペプチドでは、前記プレ-、プロ-又はプレプロ-配列はリーダー配列又は分泌配列でもよく、又は成熟ポリペプチド配列の精製のために用いられる配列でもよい。
本発明の第一の特徴のポリペプチドは融合タンパク質の部分を形成することができる。例えば、1つ又は2つ以上の付加されたアミノ酸配列を含むことはしばしば有利である。前記付加される配列は、分泌配列若しくはリーダー配列、プロ-配列、生成を促進する配列、又はより高い安定性を例えば組換え体の生成中に付与する配列を含むことができる。また別には、又は前記に加えて、成熟ポリペプチドは別の化合物、例えば前記ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合させることができる。
【００１８】
本発明の第一の特徴のポリペプチドの融合タンパク質は、例えば免疫グロブリン融合物（すなわち免疫グロブリンの全部又は一部分と融合した細胞外INSP201（例えばINSP201-EC）の全部又は断片を含む融合タンパク質）を含むことができる。免疫グロブリン融合タンパク質の製造方法は当分野では周知であり、例えばWO01/03737に記載されている方法である。生成された本発明の融合タンパク質は、本発明の第一の特徴のポリペプチドの生物学的活性（例えばIL-2阻害）を実質的に保持していることは当業者には理解されよう。前記生物学的活性は、実施例6に記載されているようにin vitroアッセイで、又は実施例7に記載されているように癌アッセイで、又は実施例8に記載されているように炎症性腸疾患の動物モデルで測定することができる。前記融合は直接的であっても短いリンカーペプチドを介していてもよい。前記リンカーペプチドは、長さが1から3アミノ酸残基又はそれより長く、例えば5、7、9、11又は13アミノ酸の長さでもよい。前記リンカーは、例えば、配列E-F-M（Glu-Phe-Met）のトリペプチド、又はGlu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Metを含む13-アミノ酸リンカー配列でもよい。前記リンカー配列は、本発明の第一の特徴のポリペプチドと免疫グロブリン配列との間に導入される。生成された融合タンパク質は特性が改善され、前記は例えば体液中での残留時間（半減期）の延長、特異的活性の増加、発現レベルの増加、又は融合タンパク質の精製の促進である。
【００１９】
好ましい実施態様では、本発明の第一の特徴のポリペプチドは、Ig分子の定常領域、例えば免疫グロブリンのFc部分に融合される。好ましくは、前記は重鎖領域（例えばCH2及びCH3ドメイン）に、場合によっては例えばヒトIgG1のヒンジ領域と一緒に融合される。Fc部分は、例えば望ましくない活性（例えば補体結合、Fcレセプターへの結合など）を防ぐために変異させることができる。
本発明の第一の特徴のポリペプチド及び免疫グロブリンの一部分を含む具体的な融合タンパク質の生成は、例えばWO99/09063の実施例11に記載されている。Ig分子の他のアイソフォーム（例えばアイソフォームIgG2若しくはIgG4、又は他のIgクラス、例えばIgMもしくはIgA）もまた、本発明の融合たんぱく質の生成に適している。融合タンパク質はモノマーでもマルチマーでも、ヘテロ-若しくはホモ-マルチマーでもよい。
本発明の第一の特徴のポリペプチドのさらに別の融合タンパク質は、ダイマー、トリマーなどの形成を可能にする、他のタンパク質から単離されたドメインを融合させることによって調製することができる。例えば、本発明のポリペプチドの重合化を可能にするタンパク質配列の例は、例えばhCG（WO97/30161）、コラーゲンX（WO04/33486）、C4BP（WO04/20639）、Erbタンパク質（WO98/02540）又はコイルが形成されたコイルペプチド（WO01/00814）のようなタンパク質から単離されたドメインである。ペプチドは、20個の遺伝暗号のアミノ酸以外の、天然のプロセス（例えば翻訳後プロセッシング）又は化学的改変技術（当分野で公知である）によって改変されたアミノ酸を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドに一般的に存在することができる公知の改変にはグリコシル化、脂質付加、硫酸化、例えばグルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、ヒドロキシル化、及びADPリボシル化がある。他の潜在的な改変には、アセチル化、アシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、GPIアンカー形成、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、タンパク質へのトランスファー-RNA仲介アミノ酸添加（例えばアルギニル化）、及びユビキチン化が含まれる。
【００２０】
改変は、ポリペプチドのいずれの場所（ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシ末端）に生じていてもよい。実際、ポリペプチドのアミノ又はカルボキシ末端又はその両端の共有結合的改変によるブロッキングは、天然に存在するポリペプチド及び合成ポリペプチドで一般的であり、そのような改変は本発明のポリペプチドで存在し得る。
ポリペプチドで生じる改変は、しばしばどのように前記ポリペプチドが生成されるかの相関的要素であろう。組換えによって生成されるポリペプチドの場合、改変の性質及び程度は、大きな比率で、個々の宿主細胞の翻訳後修飾能力及び注目するポリペプチドのアミノ酸配列に存在する改変シグナルによって決定されるであろう。例えば、グリコシル化パターンは宿主細胞の種々のタイプ間で変動する。
本発明のポリペプチドは任意の適切な態様で調製することができる。そのようなポリペプチドには単離された天然に存在するポリペプチド（例えば細胞培養由来の精製形）、組換え生成ポリペプチド（融合タンパク質を含む）、合成により生成されたポリペプチド、又は前記方法の組合せにより生成されたポリペプチドが含まれる（例えば以下を参照されたい：Bray 2003, Nat. Rev. Drug Discov. 2(7):587-93；Casi & Hilvert 2003, Curr. Opin. Struc. Biol. 13(5):589-94）。
【００２１】
本発明の第一の特徴の機能的に等価のポリペプチドは、INSP201ポリペプチドと相同なポリペプチドであり得る。ポリペプチドの一方の配列が他方のポリペプチドの配列と十分に高度な同一性又は類似性を有する場合、これらの2つのポリペプチドは、本明細書で当該用語が用いられるように“相同”である。“同一性”とは、アラインメントを実施した複数の配列の個々の任意の位置においてアミノ酸残基が前記配列間で同一であることを示す。“類似性”とは、アラインメントを実施した配列の個々の任意の位置においてアミノ酸残基が前記配列間で類似のタイプであることを示す。同一性及び類似性の程度は容易に計算することができる（Computational Molecular Biology, Ａ．Ｍ .Lesk,ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing. Infomatics and Genome Projects, D.W. Smith ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, A.M. Griffin and H.G. Griffin eds., Humana Press, New Jersy, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heinje Academic Press, 1987；及びSequence Analysis Primer, M. Gribskov and J. Devereux eds., M. Stockton Press, New York, 1991）。
したがって相同なポリペプチドには、INSP201ポリペプチドの天然の生物学的変種（例えば前記ポリペプチドが由来する種の中での対立遺伝子座変種、又は地理的変種）及び変異体（例えばアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む変異体）が含まれる。そのような変異体には、1つ又は2つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されているポリペプチドが含まれ得る。そのような置換アミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされるものであってもなくてもよい。典型的な前記置換は、Ala、Val、Leu及びIle間で；Ser及びThr間で；酸性残基Asp及びGlu間で；Asn及びGln間で；塩基性残基Lys及びArg間で；又は芳香族残基Phe及びTyr間で生じる。特に好ましいものは、いくつかアミノ酸、すなわち5から10、1から5、1から3、1から2、又は1つだけのアミノ酸が、任意の組合せで置換、欠失又は添加されてある。特に好ましいものは、前記タンパク質の特性及び活性を変化させないサイレント置換、付加及び欠失である。これに関してまた特に好ましいものは保存的置換である。そのような変異体には、1つ又は2つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチドが含まれる。
【００２２】
本発明にしたがえば、いずれの置換も好ましくは“保存的”又は“安全な”置換であるべきで、前記は、一般的には、十分に類似する化学的特性（例えば塩基性、陽性荷電アミノ酸がまた別の塩基性、陽性荷電アミノ酸で置き換えられるべきである）を有するアミノ酸を導入し、分子の構造及び生物学的機能を保存する置換と定義される。
文献には、タンパク質の配列及び/又は構造における統計的及び物理化学的研究をもとにして保存的アミノ酸置換の選択を実施することができる多くのモデルが提供されている（S.I. Rogov and A.N. Nekrasov, 2001）。タンパク質設計実験によって、アミノ酸の特定のサブセットの使用が折りたたみ可能で活性を有するタンパク質を生成することができることが示され、タンパク質構造で容易に収容することができ、機能的及び構造的ホモローグ並びにパラローグの検出に用いることができるアミノ酸の“同義”置換物の分類に役立った（L.R. Murphy et al. 2000）。同義アミノ酸のグループ及びより好ましい同義アミノ酸のグループは表1に示されている。
特定の非保存的変異もまた、種々の目的をもつ本発明のポリペプチドに導入することができる。細胞表面糖タンパク質のアフィニティーが低下した変異は、再使用されリサイクルされるその能力を高め、潜在的にその治療能力を高めることができる（C.R. Robinson, 2002）。本発明のポリペプチドに最終的に存在する免疫原性エピトープはワクチンの開発に利用することができ（S. Stevanovic, 2002）、または、タンパク質の安定性を高めるために変異を選択する公知の方法に従って改変し、さらにそれらを修正することによって除去することができる（B. van den Burg and V. Eijsink, 2002；WO02/05146, WO00/34317, WO98/52976）。
【００２３】
ペプチド模倣物に含まれるアミノ酸誘導体の好ましいまた別の同義グループは表2に定義されているものである。アミノ酸誘導体の非包括的リストにはまた以下が含まれる：アミノイソ酪酸（Aib）、ヒドロキシプロリン（Hyp）、1,2,3,4-テトラヒドロ-イソキノリン-3-COOH、インドリン-2カルボン酸、4-ジフルオロ-プロリン、L-チアゾリジン-4-カルボン酸、L-ホモプロリン、3,4-ジヒドロ-プロリン、3,4-ジヒドロキシ-フェニルアラニン、シクロヘキシル-グリシン及びフェニルグリシン。
“アミノ酸誘導体”とは、20の遺伝的にコードされた天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸又はアミノ酸様化学物質を指す。特に、アミノ酸誘導体は、置換又は非置換、直鎖、分枝若しくは環式アルキル部分を含むことができ、さらに1つ又は2つ以上のへテロ原子を含むことができる。アミノ酸誘導体はde novoに生成するか、又は市販の供給源（Calbiochem-Novabiochem AG, Switzerland; Bachem, USA）から入手することができる。
タンパク質の構造及び機能を調べ及び/又はこれを改善するために、in vitro及びin vivo翻訳系を用いる、非天然アミノ酸誘導体をタンパク質に取り込むための種々の方法が文献に開示されている（D.A. Dougherty, 2000）。非ペプチド模倣物と同様にペプチド模倣物の合成及び開発もまた当分野では周知である（A. Golebiowski et al. 2001；V.J. Hruby and P.M. Balse 2000；T.K. Sawyer, in "Structure Based Drug Design", edited by P. Veerapandia, Marcel Dekker Inc., pg.557-663, 1997）。
典型的には、2つのポリペプチド間の30%を超える同一性は、機能的等価性を示していると考えられる。好ましくは、本発明の第一の特徴の機能的に等価なポリペプチドは、INSP201ポリペプチド又はその活性な断片と80%を超える配列同一性の程度を有する。より好ましいポリペプチドは、それぞれ85%、90%、95%、98%又は99%を超える同一性の程度を有する。
【００２４】
本発明の第一の特徴の機能的に等価のポリペプチドはまた、構造的アラインメントの1つ又は2つ以上の技術を用いて同定されたポリペプチドであろう。例えば、バイオペンジウム（Biopendium(商標)）検索データベースを作成するために用いられた検索ツールの1つの特徴を構成するインファーマティカ・ゲノムスレッダー（Inpharmatica Genome Threader）技術を用いて（PCT出願WO01/69507を参照されたい）、現時点では未知の機能をもつ、INSP201ポリペプチドと比較して低い配列同一性を有するが、INSP201ポリペプチド配列と有意な構造相同性を共有するために細胞表面糖タンパク質ファミリーのメンバーであると予想されるポリペプチドを同定することができる。 “有意な構造相同性”とは、インファーマティカ・ゲノムスレッダーが、2つのタンパク質は10%以上の確実性で構造的相同性を共有すると予想することを意味する。
本発明の第一の特徴のポリペプチドはまた、INSP201ポリペプチドの断片及びINSP201ポリペプチドの機能的等価物の断片を含むが、ただし、これら断片が細胞表面糖タンパク質ファミリーのメンバーであるか、又はINSP201ポリペプチドと共通の抗原決定基を有することを条件とする。
本明細書で用いられる、“断片”という用語は、INSP201ポリペプチド、又はその機能的等価物のアミノ酸配列の部分（全体ではない）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。前記断片は、前記配列から少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含むべきであり、さらに、個々の配列に応じてｎは好ましくは7以上（例えば8、10、12、14、16、18、20またはそれより多い）である。小さな断片が抗原決定基を形成することができる。
好ましくは、本発明の断片の最小の長さは6、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450又は500アミノ酸である。
【００２５】
好ましくは、本発明の断片の最大の長さは517、515、510、500、475、450、400、350、300、250、200、150、100又は50アミノ酸である。
好ましくは、本発明の断片をコードする核酸分子の最小の長さは18、30、75、150、300、450、600、750、900、1050、1200、1350又は1500核酸である。
好ましくは、本発明の断片をコードする核酸分子の最大の長さは1551、1545、1530、1500、1425、1350、1200、1050、900、750、600、450、300又は150核酸である。
好ましくは、本発明のポリペプチドの最大の長さは518、520、550、600、650、700、800、900、1000、1250、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500又は5000アミノ酸である。
好ましくは、本発明のポリペプチドをコードする核酸の最大の長さは1554、1560、1750、1800、1950、2100、2400、2700、3000、5000、7500、10000、20000、30000、50000、75000又は100000核酸である。
完全長INSP201ポリペプチドの断片は、INSP201ポリペプチド中のそれぞれ2つ、又は3つ全ての隣接するエクソン配列の組合せから成ることができる。
そのような断片は“独立して”あり、すなわちそれらは他のアミノ酸又はポリペプチドの部分ではなく、前記と融合もしていなくてよく、また、それらはより大きなポリペプチド内に含まれていてもよい（それら断片は、より大きなポリペプチドの部分又は領域を形成する。）。より大きなポリペプチド内に含まれているとき、本発明の断片はもっとも好ましくはただ1つの連続する領域を形成する。例えば、ある種の好ましい実施態様は、断片のアミノ末端に融合されたプレ-及び/又はプロ-ポリペプチド領域を有する断片、及び/又は断片のカルボキシ末端に融合された付加領域を有する断片に関する。しかしながら、いくつかの断片がただ1つのより大きなポリペプチド内に含まれていてもよい+。
【００２６】
本発明のポリペプチド又はそれらの免疫原性断片（少なくとも1つの抗原決定基を含む）を用いて、リガンド（例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体、それらは前記ポリペプチドに対して免疫特異的である）を作成することができる。そのような抗体を利用して、本発明のポリペプチドを発現するクローンを単離又は同定するか、又は本発明のポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。前記抗体はまた、当業者には明白なように、他の適用の中でとりわけ診断又は治療促進物質として利用することができる。
“免疫特異的”という用語は、本発明のポリペプチドに対して、従来技術の他の関連するポリペプチドに対するアフィニティーよりも実質的により強いアフィニティーを有する抗体を意味する。本明細書で用いられる、“抗体”という用語は、完全な分子と同様にその断片、例えばFab、F(ab')及びFvを指し、前記断片は注目する抗原決定基と結合することができる。そのような抗体は、したがって本発明の第一の特徴のポリペプチドと結合する。
“実質的により強い”とは、公知の分泌タンパク質と比較した時、本発明のポリペプチドに対するアフィニティーにおいて測定可能な増加が存在することを意味する。
好ましくは、前記アフィニティーは、公知の分泌タンパク質（例えば細胞表面糖タンパク質ファミリーのメンバー）に対するよりも、本発明のポリペプチドに対して少なくとも1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍又はそれより強い。
好ましくは、公知の細胞表面糖タンパク質と比較した時、本発明のポリペプチドに対するアフィニティーにおいて測定可能な増加が存在する。
【００２７】
ポリクローナル抗体が望ましい場合は、選択した哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ヤギ又はウマを本発明の第一の特徴のポリペプチドで免疫することができる。前記動物の免疫に用いられるポリペプチドは、組換えDNA技術によって誘導しても、又は化学的に合成してもよい。所望の場合は、前記ポリペプチドは担体タンパク質と結合させることができる。ポリペプチドを化学的に結合させることができる一般的に用いられる担体には、ウシ血清アルブミン、タイログロブリン及びキーホールリンペットヘモシアニンが含まれる。続いて前記結合させたポリペプチドを用いて、動物を免疫することができる。前記免疫動物の血清を採集し、公知の方法にしたがって、例えば免疫アフィニティークロマトグラフィーによって処理する。
本発明の第一の特徴のポリペプチドに対するモノクローナル抗体もまた当業者は容易に作成することができる。ハイブリドーマ技術を用いるモノクローナル抗体を作成する一般的な方法は周知である（例えば以下を参照されたい：G. Koehler and C. Milstein, 1975,Nature 256:495-497；Kozbor et al. 1983, Immunology Today 4:72；Cole et al. 1985, 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.）。
【００２８】
本発明の第一の特徴のポリペプチドに対して生成されたモノクローナル抗体のパネルを種々の特性、すなわちアイソタイプ、エピトープ、アフィニティーなどについてスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体は、それらを誘導した個々のポリペプチドの精製で特に有用である。また別には、注目するモノクローナル抗体をコードする遺伝子を、例えば当分野で公知のPCR技術によってハイブリドーマから単離し、適切なベクターでクローニングし発現させることができる。
キメラ抗体（前記では非ヒト可変領域がヒトの定常領域に結合又は融合されている）（例えば以下を参照されたい：Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84:3439）もまた有用であり得る。
前記抗体を改変し（例えばヒト化によって）、個体での免疫原性を低下させることができる（例えば以下を参照されたい：Jones et al. Nature 1986, 321:522；Verhoeyen et al. Science 1988, 239, 1534；Kabat et al. J. Immunol. 1991, 147:1709；Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:10029；Gorman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88:34181；及びHodgson et al. Bio/Technology 1991, 9:421）。本明細書で用いられる、“ヒト化抗体”という用語は、非ヒトドナー抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメイン中のCDRアミノ酸及び選択した他のアミノ酸が、ヒト抗体中の同等のアミノ酸の代わりに代用された抗体分子を指す。したがってヒト化抗体はヒト抗体に極めて類似するが、ドナー抗体の結合能力を有する。
さらに別の態様では、前記抗体は“二重特異的”抗体であってもよい。すなわち抗体は2つの異なる抗原結合ドメインを有し、各ドメインは異なるエピトープに向けられている。
【００２９】
ファージディスプレー技術を用いて、関連抗体の保持についてスクリーニングしたヒトのリンパ球のPCR増幅V-遺伝子レパートリーから、又はナイーブライブラリーから、本発明のポリペプチドに対して結合活性を有する抗体をコードする遺伝子を選別することができる（J. McCafferty et al. 1990, Nature 348:552-554；J. Marks et al. 1992, Biotechnology 10:779-783）。これら抗体のアフィニティーは、チェーンシャッフリングによっても改善することができる（T. Clackson et al. 1991, Nature 352:624-628）。
上記技術によって生成された抗体は、ポリクローナルであれモノクローナルであれ、それらは免疫アッセイ、放射性免疫アッセイ（RIA）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）における試薬として用いることができるという点で更なる有用性を有する。これらの適用では、抗体は、解析により検出可能な試薬（例えば放射性同位体、蛍光分子又は酵素）で標識することができる。
本発明のポリペプチドに対して作成されるポリクローナル抗体は、一般的に動物（例えばウサギ又はマウス）において、INSP201ポリペプチドの複数回の皮下又は腹腔内注射の手段によって産生される。免疫される種で免疫誘発性である担体タンパク質（例えばカサガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はダイズトリプシンインヒビター）と本発明のポリペプチドを結合させることは有用であろう。さらにまた、免疫応答を強化するために凝集剤（例えばミョウバン）が用いられる。免疫後に、動物を採血し、抗INSP201抗体力価について血清をアッセイする。
本発明のポリペプチドに対して作成されるモノクローナル抗体は、持続的細胞株培養によって抗体分子の生成を提供する任意の方法を用いて製造される。モノクローナル抗体の適切な製造方法の例には、ハイブリドーマ法およびB-細胞ハイブリドーマ法が含まれる。さらにまた、本発明によって提供されるものは、INSP201ポリペプチドと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。
【００３０】
本発明のモノクローナル抗体は治療薬として使用するために改変することができる。ある実施態様は“キメラ”抗体であり、前記抗体では、重鎖（H）及び/又は軽鎖（L）の一部分は、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、一方、前記鎖の残りの部分は、別の種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である。さらにまた含まれるものはそのような抗体の断片であるが、ただしそれら断片が所望される生物学的活性を示す場合に限られる。
別の実施態様では、本発明のモノクローナル抗体は“ヒト化”抗体である。一般的には、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から前記抗体に導入された1つ又は2つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば当分野で記載された方法を用い、げっ歯類の相補性決定領域の少なくとも一部分をヒト抗体の対応する領域で置換することによって実施することができる。
“抗体”又は“免疫グロブリン”という用語は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を含むことを意図する。好ましい抗体は前記抗原と反応するモノクローナル抗体である。“抗体”という用語はまた、抗原と反応する2つ以上の抗体混合物をも含むことを意図する（例えば抗原と反応する種々のタイプのモノクローナル抗体のカクテル）。“抗体”という用語はさらに全抗体、生物学的に機能的なその断片、単鎖抗体、及び遺伝的に変化した抗体（例えば2種以上の部分を含むキメラ抗体）、二官能性抗体、抗体結合物、ヒト化抗体及びヒト抗体を含むことをも意図する。さらに用いることができる、生物学的に機能的な抗体断片は、抗原との結合のために十分である、抗体由来ペプチド断片である。本明細書で用いられる抗体は、完全な抗体と同様に、エピトープ、抗原又は注目する抗原決定基と結合することができる任意の抗体断片（例えばF(ab')2、Fab'、Fab、Fv）を含むことが意図される。
【００３１】
“精製抗体”とは、前記に天然に付随する他のタンパク質、炭水化物及び脂質をほとんど含まないことを意味する。そのような抗体は、本発明のINSP201ポリペプチド（又はその抗原性断片）と“優先的に結合する”（すなわち他の抗原的に無関係の分子を実質的に認識せずこれと結合しない）。本発明の精製抗体は、好ましくは、特定の種のINSP201と免疫反応性を有し、これと免疫特異的であり、より好ましくは天然のヒトINSP201に対して免疫特異的である。
“特異的に結合する”とは、特異的なポリペプチド（すなわちINSP201）に対する抗体の高いアビディティー及び/又は高いアフィニティー結合を意味する。この特異的ポリペプチド上のそのエピトープとの抗体結合は、好ましくはこの同じ抗体と他の任意のエピトープとの結合よりも強い。特異的にINSP201と結合する抗体は、他のポリペプチドと弱いがなお検出可能なレベルで（例えば注目するポリペプチドに対して示された結合の10%未満）結合することができる。そのような弱い結合（又はバックグラウンド結合）は、注目する化合物又はポリペプチドとの特異的な抗体結合とは区別することができる。
好ましくは、前記アフィニティーは、INSP201ファミリーの公知の他のメンバーに対するよりも、本発明のポリペプチドに対して少なくとも1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍又は106倍強い。
“遺伝的に変化した抗体”とは、アミノ酸配列が天然の抗体のアミノ酸配列とは変化した抗体を指す。組換えDNA技術と本発明との関連のために、天然の抗体で見出されるアミノ酸配列に制限される必要はなく、抗体は再設計して所望の特徴を得ることができる。可能な変形は多数あり、例えば可変又は定常領域のただ１つ若しくは数個のアミノ酸変化から完全な再設計まで範囲がある。定常領域の変化は、一般的には、特徴（例えば補体の固定、膜との相互作用及び他のエフェクター機能）を改善又は変化させるために実施されるであろう。可変領域の変化は、抗原結合の特徴を改善するために実施されるであろう。
【００３２】
用語“ヒト化抗体”又は“ヒト化免疫グロブリン”は、ヒトのフレームワーク、非ヒト抗体由来の少なくとも1つ及び好ましくは全ての相補性決定領域（CDR）を含む免疫グロブリンを指し、前記抗体においては、存在する任意の定常領域はヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一（すなわち少なくとも約85−90%、好ましくは少なくとも95%同一）である。したがって、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、おそらくCDRを除いて、1つ又は2つ以上の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば以下を参照されたい：Queenらの米国特許5,5301,101号、5,585,089号、5,693,762号及び6,180,370号（前記文献の各々は参照により本明細書に含まれる）。
“完全にヒト化された抗体”はヒト免疫グロブリンの可変及び定常領域の両方を含む分子である。完全にヒト化された抗体は、慢性及び再発性疾患（例えば自己免疫疾患）のために反復治療が要求される治療的な使用に用いることができる潜在的能力を有する。完全にヒト化された抗体を調製するある方法は、マウスの液性免疫系の“ヒト化”、すなわちヒトIgを産生することができるマウス株（ゼノマウス）の作成から成り、内因性Ig遺伝子を不活化したマウスにヒト免疫グロブリン（Ig）遺伝子座を導入することによって達成される。Ig遺伝子座は、その物理的構造並びに最終的に広い免疫応答をもたらすために要求される遺伝子再編成及び発現過程の両方の意味で極めて複雑である。抗体の多様性は、Ig遺伝子座に存在する種々のV、D及びJ遺伝子間での順列組合せ的再編成によって主として生成される。これらの遺伝子座はまた点在する調節エレメントを含み、前記エレメントは抗体の発現、対立遺伝子座の排除、クラススイッチング及びアフィニティー成熟を制御する。再編成されていないヒトIgトランスジーンのマウスへの導入によって、マウスの組換え機構はヒト遺伝子に適合し得ることが示された。さらにまた種々のアイソタイプの抗原特異的hu-mAbを分泌するハイブリドーマを抗原で免疫したゼノマウスによって得ることができる。
完全にヒト化した抗体及びそれらの調製方法は当分野で公知である（Mendez et al. 1997, Nature Genetics 15:146-156；Buggemenn et al. 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-1326；Tomizuka et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727；WO98/24893。
【００３３】
“キメラ抗体”という用語は、定常領域が1つの種の抗体に由来し（典型的にはヒト）、可変領域は別の種（典型的にはげっ歯類）の抗体に由来する抗体を指す。したがって、キメラ抗体は、異なる部分が別個の動物種に由来する分子（例えばネズミMabに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの）である。キメラ抗体は、適用に際して免疫原性を減少させ、生産収量を増加させるために主として用いられる。例えば、ネズミのMabはハイブリドーマからより高収量で得られるがヒトでの免疫原性が高い場合に、ヒト/ネズミキメラMabが用いられる。キメラ抗体及びそれらの製造方法は当分野で公知である（Cabilly et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277；Morrison et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855；Boulianne et al. 1984, Nature 312:643-646；Cabilly et al. 欧州特許出願125023号（1984年11月14日出願公開）；Neuberger et al. 1985, Nature 314:268-270；Taniguchi et al. 欧州特許出願171496号（1985年2月19日出願公開）；Morrison et al. 欧州特許出願173494号（1986年3月5日出願公開）；Neuberger et al. PCT出願WO8601533（1986年3月13日出願公開）；Kudo et al. 欧州特許出願184187号（1986年6月11日出願公開）；Sahagan et al. 1986, J. Immunol. 138:1066-1074；Robinson et al. 国際特許出願WO8702671号（1987年5月7日出願公開）；Liu et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443；Sun et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218；Better et al. 1988, Science 240:1041-1043；Riechmann et al. Nature 332:323-327；及びHarlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL（上掲書））。これらの文献は参照により完全に本明細書に含まれる。
本明細書で用いられる、“抗体断片”という語句は、特異的に抗原、抗原決定基又はエピトープと結合することができる抗体の部分を含む分子を指す。完全な抗体分子の代わりに、本明細書に開示する方法にしたがってそれらの抗原の検出及び定量のためにFab及びF(ab')2並びに本発明で有用な抗体の他の断片を用いることができることは理解されよう。そのような断片は、例えばパパイン（Fab断片を生じる）又はペプシン（F(ab')2断片を生じる）のような酵素を用い典型的にはタンパク質分解切断によって生成される。
【００３４】
本明細書を通して記載されている抗体に関しては、“モノクローナル抗体”という用語は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、完全にヒト化された抗体、抗イディオタイプ抗体に対する抗体（抗-抗Id抗体）（可溶型又は結合型で標識することができる）を、任意の公知の技術（例えば酵素切断、ペプチド合成又は組換え技術であるが、ただしこれらに限定されない）によって提供されるその断片と同様に含むことが意図される。モノクローナル抗体は、抗原に対して特異的な抗体の実質的に均質な集団を含み、前記集団は実質的に同様なエピトープ結合部位を含む。Mabは当業者に公知の方法によって得ることができる。例えば以下を参照されたい：Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497；米国特許4,376,110号；Ausubel et al. eds., Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)；及びColligan et al. eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y. (1992-1996)：前記文献の内容は参照により本明細書に含まれる。そのような抗体はいずれの免疫グロブリンクラス（IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及びその任意のサブクラスを含む）であってもよい。本発明のmAbを産生するハイブリドーマはin vitro、in situ又はin vivoで培養することができる。in vivo又はin situでの高力価のMabの産生は、現時点で好ましい産生方法である。“モノクローナル抗体”という用語は、無傷の分子と同様にその断片、例えばFab及びF(ab')2（前記は抗原と結合することができる）を含むことを意図する。Fab及びF(ab')2は、無傷の抗体のFc断片を欠き、いっそう迅速に血液循環から除去され、無傷の抗体よりも組織との非特異的結合を減少させ得る（Wahl et al. 1983, J. Nucl. Med. 24:316-325）。
モノクローナル抗体が分子と特異的に反応し、それによって分子が抗体と結合する場合、モノクローナル抗体は分子と“結合することができる”と称される。
【００３５】
“抗原”は、抗体によって結合され得る分子又は分子の部分である。抗原はさらに、そのエピトープと結合することができる抗体を動物に誘導することができる。抗原は1つ又は2つ以上のエピトープを有することができる。上記に言及した特異的反応は、抗原が高度に選択的な態様でその対応する抗体上のエピトープと反応し、他の抗原によって惹起され得る他の多くの抗体とは反応しないことを示している。
本発明で有用な抗体（抗体の断片を含む）は、サンプル中のそれらの抗原を定量的に又は定性的に検出するために又はそれらの抗原を発現する細胞の存在を検出するために用いることができる。これは、蛍光により標識した抗体（下記参照）を蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー又は蛍光測定検出と一緒に用いる免疫蛍光技術によって達成することができる。
本発明で有用な抗体（又はその断片）は、それらの抗原のin situ検出のために免疫蛍光顕微鏡法又は免疫電子顕微鏡法の場合のように組織学的に用いることができる。in situ検出は、患者から組織学的標本を取り出し、本発明の標識された抗体をそのような標本に提供することによって達成することができる。抗体（又は断片）は、好ましくは、標識抗体を生物学的サンプルに塗布することによって、又は重層することによって提供される。そのような方法を使用することにより、抗原の存在だけでなく調査組織上での抗原の分布もまた決定することができる。本発明を用い、そのようなin situ検出を達成するために、多様な任意の組織学的方法（例えば染色方法）を改変できることは当業者には容易に理解されよう。
抗原のためのそのようなアッセイは、典型的には生物学的サンプル（例えば生物学的液体、組織抽出物、新しく採集した細胞（例えばリンパ球又は白血球）、又は組織培養でインキュベートした細胞）を、前記抗原を同定することができる標識抗体の存在下でインキュベートし、さらに当分野で周知の多数の技術のいずれかによって前記抗体を検出することを含む。
【００３６】
生物学的サンプルは、固相支持体若しくは担体（例えばニトロセルロース）、又は細胞、細胞粒子若しくは可溶性タンパク質を固定することができる他の固相又は担体に結合させることができる。続いて、前記支持体又は担体を適切な緩衝液で洗浄し、続いて本発明の標識抗体で上記のように処理することができる。その後、前記固相支持体又は担体を二回目の緩衝液で洗浄し、未結合抗体を除去することができる。続いて、前記固相又は担体上の結合標識の量を通常の手段によって検出することができる。
本発明の抗体分子は、“2-サイト”又は“サンドイッチ”アッセイとしてもまた知られている免疫測定アッセイで利用するために順応させることができる。典型的な免疫測定アッセイでは、ある量の非標識抗体（又は抗体断片）が固相又は担体に結合され、固相抗体、抗原及び標識抗体間で形成された三重複合体の検出及び/又は定量を可能にするために、検出できるように標識した可溶性抗体のある量が添加される。
本発明の抗体は、免疫アフィニティークロマトグラフィー技術と一緒に用いることができる。より具体的には、前記抗体をクロマトグラフィーカラム内の物質の表面に静置することができる。その後、精製されるべき組成物をカラムに通す。精製されるべきサンプルがいくらかのINSP201ポリペプチド（前記ポリペプチドは前記抗体と結合する）を含む場合、前記INSP201ポリペプチドはサンプルから取り除かれ、それによって精製される。
したがって要約すれば、診断方法は、哺乳動物由来の細胞サンプル（例えば血液サンプル、リンパ節生検又は組織）を用いてin vitroで実施するか、又はin vivo画像化によって実施することができる。
本発明の抗体を含む組成物を用いて、INSP201の存在を、例えば放射性免疫アッセイ、ELISA、FACSなどによって検出することができる。1つ又は2つ以上の標識部分をヒト化免疫グロブリンに結合させることができる。例示的標識部分には、放射線不透過性色素、造影剤、蛍光分子、スピン標識分子、酵素、又は、特に放射性又は磁気共鳴画像化技術において診断価値をもつ他の標識部分が含まれる。
【００３７】
本発明のIgG抗体調製物は、タンパク質-Gアフィニティー精製、好ましくはタンパク質-G免疫沈澱による精製を用いて、本発明の抗血清から都合よく精製することができる。免疫動物に由来する抗血清は、免疫ブロット解析、免疫沈澱及びELISAにより最適感度でINSP201ポリペプチドを検出するために用いることができる。
一般的には、最適な再現性、標準化、又は正確さによる利益を得る適用のために、標的抗原と特異的に結合することができる本発明の精製抗体又は抗体断片は、本発明の非精製調製物に比べて最適であろう。
同族抗原に対して10-2までの解離定数を特徴とするアフィニティーを有する抗体又は抗体断片は通常の技術を用いて得ることができることは当業者には理解されよう。
上記で述べたように、前記調製物は有利には、種々のタイプの任意の検出可能な分子に結合させた抗体又は抗体断片を含む。
抗体断片は、それが由来した親抗体よりも小さいという利点を有し、一方、親抗体と実質的に同一の標的抗原結合特異性又は結合特異性と結合アフィニティーの両方を保持する。したがって、親抗体よりも小さいために、抗体断片は、一般的に後者より優れた生体分布及び拡散特性（例えば全身的、in vivo、又は単離組織において）を有するであろう。実質的にFc領域を欠く抗体断片（例えば単鎖Fv、Fab'、F(ab')2又はCDR）は、そのようなFc領域と特異的に結合する能力をもつ分子と調製物を暴露することを含むが、そのような結合が所望されない場合の適用において有利である。典型的には、同族Fcレセプター又はFc-結合補体成分（例えば血清中に存在する補体成分C1q）に暴露されたFc領域の所望されない結合を含むであろう。Fcレセプターは多くの免疫細胞タイプの表面に提示され、前記免疫細胞には以下が含まれる：専門のAPC（例えば樹状突起細胞）；Bリンパ球；及び顆粒球（例えば好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ及びマスト細胞）。したがって、抗体断片のFc領域の欠如は、望ましくないFcレセプター仲介免疫細胞活性化又は補体成分仲介補体カスケードを回避するために、特に前記調製物をin vivoで個体に投与するときに特に有利である。
【００３８】
F(ab')2は、抗体分子の中に二価の抗原結合部分を含む抗体分子の断片である。
本発明のF(ab')2調製物は、便利には、本発明の抗体調製物（例えば本発明の抗血清）を酵素ペプシンで処理することによって標準的な方法を用いて得ることができる。得られたF(ab')2生成物は5S粒子である。
Fab又はFab'は、抗体分子の中に一価の抗原結合部分を含む抗体分子の断片である。
CDRは、例えばEP0585939又はStrandbergら（Protein Eng. 2001 Jan, 14(1):67-74）に開示されているように作成することができる。本発明のCDRは改変CDRでもよく、前記はINSP201ポリペプチドの調節に対して強化された作用を有する。活性なペプチドの改変方法の例は、Sawaら（J. Med. Chem. 1999, 42:3289-3299）によって記載されている。
本発明のFab'調製物は、便利には、本発明の抗体調製物（例えば本発明の抗血清）を酵素ペプシンで処理し、続いて得られたF(ab')2を還元することによって標準的な方法を用いて得ることができる。そのような還元はチオール還元剤を用い、さらにジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のためのブロッキング基を用いて達成することができる。そのような処理によって、2つの一価3.5S Fab'、Fc断片が生成される。
Fab調製物は、便利には、本発明の抗体調製物（例えば本発明の抗血清）を酵素ペプシンで処理し、無傷軽鎖及び重鎖の一部（可変及びCH1ドメインを含む）を生成することによって標準的な方法を用いて得ることができる。
抗体の酵素処理によって抗体断片を生成するための多数の手引きが当分野の文献に提供されている（例えば以下を参照されたい：Goldenberg, 米国特許4,036,945号及び4,331,647号；R.R. Porter, Biochem J. 73:119-126）。
【００３９】
単鎖Fv（当分野ではまた“scFv”と称される）は、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が適切なポリペプチドリンカーで連結されたものを含む単鎖分子である。
本発明のF(ab')2、Fab'、Fab又は単鎖Fv又はCDR調製物は組換え技術を用いて得ることができる。
組換え抗体断片の入手は、標的抗原で免疫した動物のBリンパ球のmRNAを単離し、前記mRNAからRT-PCRによりcDNAを生成し、前記cDNAを用いて抗体断片のファージディスプレーライブラリーを構築することによって達成される。Bリンパ球は便利には脾臓から単離するか、また別には免疫動物の血液、骨髄又はリンパ節から単離してもよい。
上記に記載の方法を用いて、所望される本質的に任意の標的抗原結合アフィニティー及び/又は特異性を有する本発明のモノクローナル抗体断片調製物を得ることができる。そのような調製物は、そのような特定標的抗原と結合する特徴を有する、標的抗原と結合することができる試薬により利益を得る種々の適用で利用し得る。
Fab'はFabと構造が本質的に類似するので、Fab'を含む本発明の調製物は、Fabを含む調製物と本質的に互換的に用いることができる（この場合、そのようなFab'及びFabは本質的に同じ重鎖及び軽鎖可変領域を含む）。最大の親和性で標的抗原と結合することができる抗体断片を含む本発明の調製物による利益を受ける適用の場合（前記が通常このような事例であろうが）、本発明のF(ab')2調製物は、本発明のFab、Fab'又はscFv調製物が一価の結合であるに対してF(ab')2が二価の標的抗原結合であるために、そのような一価抗体断片より優れていよう。
上記に記載したように、適用及び目的応じて、抗体又は抗体断片調製物は任意の種々の哺乳動物種から由来することができる。
所望の種に由来する本発明の抗体及び抗体断片調製物は、標的抗原で免疫したそのような種の動物の血清から得ることができる。
【００４０】
ヒト抗体若しくはヒト化抗体又は抗体断片の本発明の調製物は、個体への前記調製物の投与を含む適用で好ましいであろう。例えば、ヒト抗体若しくはヒト化抗体又は抗体断片は、一般的には最適に免疫寛容される傾向を有し、したがって、ヒトで最適なin vivo半減期を示し、それによって最適な有効性を示すであろう。ヒト抗体又はヒト化抗体の製造及び発現に関する更なる手引きは以下で提供される。
前記調製物はそれだけで用いることができるが、また医薬組成物中の活性な成分として処方することができる。
したがって、本発明により医薬的に許容できる担体及び活性成分として本発明の抗体又は抗体断片を含む医薬組成物が提供される。
本発明の抗体又は抗体断片を活性な成分として医薬組成物中で処方する方法及びそのような医薬組成物を利用する方法は下記で述べる。
好ましくは、前記抗体又は抗体断片の投与は、本発明の抗体又は抗体断片を活性化成分として含む、本発明の医薬組成物を投与することによって達成される。
抗体又は抗体断片は、好ましくは、生化学的活性の所望される調節を達成するために標的抗原と結合した断片の十分なレベルを達成させるために投与される。
当業者、例えば医師（より好ましくは前記疾患を専門とする医師）は、本発明の教示にしたがって疾患を効果的に治療するために、適切な治療プロトコル（適切な投与経路及び抗体又は抗体断片の適切な用量を含む）の決定に必要な専門的知識を有するであろう。
上記に記載したように、ポリペプチドである標的抗原（すなわちINSP201）は多様な方法で入手することができる。
好ましくは、標的抗原は標準的な化学的合成方法により得られる。
標的抗原は、例えば標準的な固相技術を用いて化学的に合成することができる。そのような技術には完全固相合成、部分的固相合成法、断片縮合、古典的溶液合成が含まれる。固相ポリペプチド合成法は当分野で周知である（例えば以下を参照されたい：Stewart et al. in "Solid Phase Peptide Synthesis", 2nd ed., Pierce Chemical Company, (1984)）。
【００４１】
合成ポリペプチドは、例えばT. Creighton（Proteins, syructures and molecular principles, 1983, W.H. Freeman and Co. N.Y.）が記載したように調製用高速液体クロマトグラフィーによる方法によって精製することができ、そのアミノ酸配列は標準的なアミノ酸配列決定法により確認できる。
上記に記載したように、前記調製物は好ましくは標的抗原で動物を免疫することによって得ることができる。
調製物のin vivo製造は、有利にはアジュバントの存在下で、血清中の抗体の産生を支援するスケジュールにしたがって、標的抗原を哺乳動物に繰り返し注射することによって達成することができる。標的抗原が小さすぎて（当分野では“ハプテン”と称される）適切な免疫応答を誘引することができない場合には、前記ハプテンは、抗原的に中性の担体（例えばキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）又は血清アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（BSA）担体）と結合させることができる（例えば米国特許5,189,178号及び5,239,078号を参照されたい）。ハプテンの担体へのカップリングは、当分野で周知の多様な方法を用いて実施することができる。例えば、アミノ基への直接カップリングを実施し、さらに場合によっては形成されたイミノ結合の還元を実施する。また別には、前記担体は、縮合剤（例えばジシクロヘキシルカルボジイミド又は他のカルボジイミド脱水剤）を用いて結合させることができる。リンカー化合物もまた前記結合の実施に用いることができる。ホモ二官能性及びヘテロ二官能性リンカーの両方をピアースケミカル社（Pierce Chemical Company, Rockford, Ill）から入手できる。得られた免疫原性複合体を続いて適切な哺乳動物対象（例えばウシ、ヒツジ、マウス、ウサギなど）に注射することができる。抗体のin vivo産生に続いて、当分野で周知の免疫アッセイ手順を用いて、宿主動物におけるその血清力価を容易に測定することができる。
【００４２】
上記に記載したように、前記調製物は有利にはヒト化抗体又は抗体断片を含む。
ヒト化抗体又はヒト化抗体断片は、遺伝学的に操作されたキメラ抗体又は抗体断片であり、（好ましくは最小の）非ヒト抗体由来部分を有する。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、所望される機能性を有する非ヒト種（例えばマウス、ラット又はウサギ）の相補性決定領域（ドナー抗体）由来の残基によって置き換えられている抗体が含まれる。いくつかの事例では、ヒト抗体のFvフレームワーク残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエントにおいても又は移入される相補性決定領域若しくはフレームワーク配列においても見出されない残基を含むことができる。一般的に、ヒト化抗体は少なくとも1つ及び典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、前記において、相補性決定領域の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体に一致し、さらにフレームワーク領域の全て又は実質的に全てが対応するヒトコンセンサス配列の配列と一致する。ヒト化抗体はまた最適には、典型的にはヒト抗体に由来する抗体定常領域（例えばFc領域）の少なくとも一部分を含む（例えば以下を参照されたい：Jones et al. 1986, Nature 321:522-525；Riechmann et al. 1988, Nature 332:323-329；及びPresta 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596）。非ヒト抗体又は抗体断片をヒト化する方法は当分野では周知である。一般的には、ヒト化抗体は、ヒトではない供給源からその中に導入された1つ又は2つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば移入残基と称され、前記は典型的には移入される可変ドメインから採用される。ヒト化は、本質的には文献記載のように（例えば以下を参照されたい：Jones et al. 1986, Nature 321:522-525；Riechmann et al. 1988, Nature 332:323-327；Verhoeyen et al. 1988, Science 239:1534-1536；米国特許4,816,567号）、ヒト相補性決定領域を対応するげっ歯類の相補性決定領域で置き換えることによって実施することができる。したがって、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体であり、この場合、完全なヒト可変ドメインよりも実質的に小さいものが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際、ヒト化抗体は、典型的には、いくらかの相補性決定領域残基及びおそらくいくらかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体の同様部位に由来する残基によって置き換えられたヒト抗体である。ヒト抗体又はヒト抗体断片はまた当分野で公知の種々の技術を用いて製造することができ、前記技術はファージディスプレーライブラリーを含む（例えば以下を参照されたい：Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381；Marks et al. 1991, J. Mol. Biol. 222:581；Cole et al. "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, pp.77(1985)；Boener et al. 1991, J. Immunol. 147:86-95）。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン対立遺伝子座をコードする配列をトランスジェニック動物（例えばマウス）に導入することによって産生することができる。前記動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子は部分的に又は完全に不活化されてある。抗原チャレンジに際して、ヒト抗体の産生がそのような動物で観察され、前記の抗体は、遺伝子の再編成、チェーンアッセンブリ及び抗体レパートリーを含む全ての点においてヒトで認められるものと密接に類似する。そのようなアプローチを実施するための豊富な手引きが当分野��文献に提供されている（例えば以下を参照されたい：米国特許5,545,807号、5,545,806号、5,569,825号、5,625,126号、5,633,425号及び5,661,016号；Marks et al. 1992, Bio/Technology 10:779-783；Lonberg et al. 1994, Nature 368:856-859；Morrison, 1994, Nature 368:812-13；Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14:845-51；Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14:826；Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93）。
【００４３】
膜結合INSP201を標的とするアンタゴニスト抗体は、炎症及び/又は自己免疫疾患の治療に有用である。
膜結合INSP201を標的とするアゴニスト抗体は、癌、HIV及び/又はEGV並びにB型肝炎感染の治療に有用である。
INSP201を標的とする抗体の活性は、実施例6から8に記載するアッセイ及び/又は動物モデルによって示すことができる。
本発明の第二及び第三の特徴の好ましい核酸分子は、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、及び配列番号:18に示すポリペプチド配列のポリペプチドまたはそれらの機能的等価物をコードする核酸分子である。本発明の核酸分子は好ましくは、本明細書に開示する配列に由来する少なくともｎの連続するヌクレオチドを含み、ここでｎは個々の配列に応じて10又はそれより大きい（例えば12、14、15、18、20、25、30、35、40又はそれより大きい）。
本発明の核酸分子はまた、上記に記載した核酸分子に対して相補的である配列を含む（例えばアンチセンス又はプローブの目的のため）。
本発明の核酸分子はRNAの形態（例えばmRNA）であってもよく、又はDNAの形態（例えばcDNA、合成DNA又はゲノムDNAを含む）であってもよい。そのような核酸分子は、クローニングによって、化学的合成技術によって、又は前記の組合せによって入手することができる。前記核酸分子は、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成を用いて化学的な合成によって、ゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーから、又は生物から分離することによって調製することができる。RNA分子は一般的にはDNA配列にin vitro又はin vivo転写によって生成することができる。
【００４４】
核酸分子は二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖DNAはコード鎖（センス鎖としても知られている）でもよいが、また前記は非コード鎖（アンチセンス鎖とも称される）であってもよい。
“核酸分子”という用語にはまたDNA及びRNAの類似体、例えば改変骨格を含むもの及びペプチド核酸（PNA）が含まれる。本明細書で用いられる、“PNA”という用語は、アンチセンス分子又はアンチ遺伝子因子を指し、前記は、複数のアミノ酸残基のペプチド骨格（好ましくはリジンで終わる）に連結された長さが少なくとも5ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む。末端のリジンは組成物に可溶性を付与する。PNAはペジル化させて細胞内でのその寿命を延長することができる。細胞内で、PNAは相補的な一本鎖DNA及びRNAと優先的に結合し、転写物の伸長を停止させる（P. E. Nielsen 1993, Anticancer Drug Des. 8:53-63）。
本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、本明細書に開示する核酸分子の1つ又は2つ以上のコード配列と同一であり得る。
これらの分子はまた、遺伝暗号の縮退の結果として、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16又は配列番号:18のいずれかに示されるポリペプチドをコードする種々の配列を有することができる。そのような核酸分子には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：成熟ポリペプチドのみのためのコード配列；成熟ポリペプチド及び付加コード配列（例えばリーダー配列又は分泌配列（例えばプロ-、プレ-、又はプレプロ-ポリペプチド配列）をコードする）のためのコード配列；前述の付加コード配列を含むか、又は含まない成熟ポリペプチドのコード配列であって、更なる付加的な非コード配列を一緒に有する前記コード配列（前記更なる付加的非コード配列は非コード5'及び3'配列を含み、前記は例えば転写されるが、翻訳されない配列であり、転写（終了シグナルを含む）、リボソーム結合及びmRNAの安定性で役割を果たす）。前記核酸分子はまた、付加的なアミノ酸（例えば付加的な機能を提供するもの）をコードする付加的な配列を含むことができる。
【００４５】
本発明の第二及び第三の特徴の核酸分子はまた、本発明の第一の特徴のポリペプチド及び断片の断片又は機能的等価物をコードすることができる。そのような核酸分子は、天然に存在する変種、例えば天然に存在する対立遺伝子座変種でもよいが、又は前記分子は天然に存在することが知られていない変種であってもよい。前記核酸分子の天然に存在しないそのような変種は変異導入技術（核酸分子、細胞又は生物に応用できる変異導入技術を含む）によって作成することができる。
この点に関する変種では、ヌクレオチド置換、欠失又は挿入によって前述の核酸分子とは異なる変種が存在する。前記置換、欠失又は挿入は2つ以上のヌクレオチドを含むことができる。前記変種は、コード領域又は非コード領域又はその両方で変異を有することができる。コード領域における変異は、保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失又は挿入を生じることができる。
本発明の核酸分子はまた、多様な理由のために、当分野で一般的に知られている方法（クローニング、プロセッシング及び/又は遺伝子生成物（ポリペプチド）の発現の改変を含む）を用いて操作することができる。ランダムな断片化並びに遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのPCRによる再アッセンブリーによるDNAシャッフリングは、前記ヌクレオチド配列の操作に用いることができる技術として含まれる。位置特異的変異導入を用いて新規な制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを改変し、コドン優先性を変化させ、スプライス変種を生成し、変異を導入することができる、云々。
【００４６】
本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする核酸分子を異種配列に連結し、その結果、一体となった核酸分子は融合たんぱく質をコードすることができる。そのような結合核酸分子は本発明の第二又は第三の特徴に含まれる。例えば、前記ポリペプチドの活性の阻害物質についてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、そのような結合核酸分子を用いて、市販の抗体によって認識することができる融合タンパク質を発現させることは有用であろう。融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチド配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作することができ、それによって、前記ポリペプチドを異種タンパク質から切断して別個に精製することができる。
本発明の核酸分子はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子と部分的に相補的であり、したがって前記コード核酸分子とハイブリダイズする（ハイブリダイゼーション）アンチセンス分子を含む。当業者には公知のように、そのようなアンチセンス分子（例えばオリゴヌクレオチド）を設計して、本発明のポリペプチドをコードする標的核酸を認識し、これと特異的に結合して転写を妨げることができる（例えば以下を参照されたい：J.S. Cohen 1989, Trends in Pharm. Sci. 10:435；Okano 1991, J. Neurochem. 56:560；O'Connor J. Neurochem. 56:560(1991)；Lee et al. Nucleic Acids Res. 6:3073(1979)；Cooney et al. 1998, Science 241:456；Dervan et al. 1991, Science 251:1360）。
本明細書で用いられる、“ハイブリダイゼーション”という用語は、互いに水素結合することによる2つの核酸分子の会合を指す。典型的には、１つの分子が固相に固定され、他方は溶液中で遊離しているであろう。続いて、この2つの分子は、水素結合に適した条件下で互いに接触できるように配置される。この結合に影響を与える因子には以下が含まれる：溶媒のタイプ及び体積；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；攪拌；液相分子の固相との非特異的結合を阻止する薬剤（デンハルト試薬又はBLOTTO）；前記分子の濃度；分子の結合速度を高める化合物の使用（硫酸デキストラン又はポリエチレングリコール）；及びハイブリダイゼーションの後の洗浄条件のストリンジェンシー（上掲書（Sambrook et al.）を参照されたい）。
【００４７】
標的分子と完全に相補的な分子のハイブリダイゼーションの阻害は、当分野で公知のように（例えば上掲書（Sambrook et al.）を参照されたい）ハイブリダイゼーションアッセイを用いて調べることができる。実質的に相同な分子は、種々のストリンジェンシー条件下で完全に相同な分子の標的分子との結合に競合し、これを阻害するであろう（G.M. Wahl and S.L. Berger, 1987, Methods Enzymol. 152:399-407；A.R. Kimmel, 1987, Methods Enzymol. 152:507-511）。
“ストリンジェンシー”とは、異なる分子の結合よりも非常に類似する分子の結合に有利なハイブリダイゼーション反応の条件を指す。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、50%のホルムアミド、5ｘのSSC（150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5ｘのデンハルト溶液、10%硫酸デキストラン及び20μg/mLの変性せん断サケ精子DNAを含む溶液中で42℃で一晩のインキュベーション、続いて0.1ｘのSSC、約65℃でのフィルターの洗浄と規定される。低ストリンジェンシー条件は、35℃でのハイブリダイゼーション反応の実施を含む（上掲書（Sambrook et al.）を参照されたい）。好ましくは、ハイブリダイゼーションのために使用される条件は高ストリンジェンシー条件である。
本発明のこの特徴の好ましい実施態様は、INSP201ポリペプチドをコードする核酸分子とそれらの全長にわたって少なくとも70%同一である核酸分子、及びそのような核酸分子と実質的に相補的な核酸分子である。好ましくは、本発明のこの特徴の核酸分子は、そのようなコード配列に対してその全長にわたって少なくとも80%同一である領域を含むか、又は前記と相補的な核酸分子である。これに関しては、前記のような核酸分子に対してそれらの全長にわたって、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、99%又はそれ以上同一である核酸分子が特に好ましい。この特徴で好ましい実施態様は、INSP201ポリペプチドと同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドをコードする核酸分子である。
【００４８】
本発明はまた、以下の工程を含む、本発明の核酸分子を検出す方法を提供する：（a）本発明の核酸プローブをハイブリダイズする条件下で生物学的サンプルと接触させて二重鎖複合体を形成する工程；及び（ｂ）形成されたそのような二重鎖複合体のいずれかを検出する工程。
本発明にしたがって利用することができるアッセイとの関係でさらに下記で考察するように、上記に記載した核酸分子は、RNA、cDNA又はゲノムDNAのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用し、完全長cDNA及びINSP201ポリペプチドをコードするゲノムクローンを単離することができ、さらにcDNA及び前記ポリペプチドをコードする遺伝子と高い配列類似性を有する相同遺伝子又はオルソロガス遺伝子のゲノムクローンを単離することができる。
これに関しては、当分野で公知の他の技術の中でとりわけ下記の技術を利用することができ、これらは例示のために下記で考察する。DNAの配列決定および解析のための方法は周知であり、当分野で一般的に利用可能である。実際、それらは本明細書で考察する本発明の実施態様の多くを実施するために用いることができる。そのような方法では、DNAポリメラーゼIのクレノー断片、シークェナーゼ（US Biochemical Corp. Cleveland, OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱耐性T7ポリメラーゼ（Amersham, Chicago, IL）、又はポリメラーゼ及びプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ（例えばGibco/BRL（Gaithersburg, MD）が市販するELONGASE増幅系で見出されるもの）の組合せのような酵素を用いることができる。好ましくは、配列決定プロセスは以下のような機械を用いて自動化することができる：Hamilton Micro Lab2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Thermal Cycler（PTC200; MJ Research, Watertown, MA）並びにABI Catalyst 及び373及び377DNA Sequencers（Perkin Elmer）。
【００４９】
INSP201ポリペプチドの機能と等価な機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子を単離するある方法は、当分野で公知の標準的方法を用いて、天然のプローブ又は人工的に設計したプローブによりゲノムDNA又はcDNAを探索することである（例えば以下を参照されたい：”Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel et al.(eds). Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992）。適切なコード遺伝子（配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15及び配列番号:17）由来の核酸配列に一致するか、又は前記と相補的な、少なくとも15、好ましくは少なくとも30、より好ましくは少なくとも50の連続する塩基を含むプローブが特に有用なプローブである。そのようなプローブは、解析によって検出することができる試薬で標識され、それらの同定を促進することができる。有用な試薬には、放射性同位元素、蛍光色素及び検出可能な生成物の形成を触媒することができる酵素が含まれるが、ただしこれらに限定されない。これらのプローブを用いて、当業者は、ゲノムDNAの相補的なコピー、cDNA又はRNAポリヌクレオチド（前記はヒト、哺乳動物又は他の動物由来の注目するタンパク質をコードする）を単離し、関連する配列（例えば前記ファミリー、タイプ及び/又はサブタイプのさらに別のメンバー）について、前記のような供給源をスクリーニングすることができる。
【００５０】
多くの事例で、単離されたcDNAは、ポリペプチドをコードする領域が短く切断されている（通常は5'末端で）という点で不完全であろう。完全長のcDNAを得るために、又は短いcDNAを伸長させるためにいくつかの方法が利用可能である。前記のような配列は、部分的なヌクレオチド配列を利用し、さらに上流の配列（例えばプロモーター及び調節エレメント）を検出するために当分野で公知の種々の方法を用いて伸長させることができる。例えば、利用することができるある方法は、cDNA末端迅速増幅法Rapid Amplification of cDNA: RACE）を基にしている（例えば以下を参照されたい：Frohman et al. 1988,PNAS USA 85:8998-9002）。マラソン（Marathon(商標)）テクノロジー（Clontech Laboratories Inc.）によって実施されるこの技術の最近の改変により、例えばより長いcDNAの検索が顕著に単純化された。わずかに異なる技術（“制限部位”PCRと称される）はユニバーサルプライマーを用い、既知の遺伝子座に隣接する未知の核酸配列を回収する（G. Sarkar, 1993, PCR Methods Applic. 2:318-322）。逆PCRもまた、公知領域を土台にした分岐プライマーを用いて配列を増幅又は伸長させるために用いることができる（T. Triglia et al. 1988, Nucleic Acids Res. 16:8186）。利用できるまた別の方法は捕捉PCRであり、前記はヒト及び酵母人工染色体DNA中の公知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅を含む（M. Lagerstrom et al. 1991, PCR Methods Applic., 1:111-119）。未知の配列を回収するために利用できるまた別の方法は、Parkerらの方法である（J.D. Parker et al. 1991, Nucleic Acids Res. 19:3055-3060）。さらにまた、PCR、ネストプライマー及びプロモーターファインダー（PromoterFinder(商標)）ライブラリーをゲノムDNAウォーキングのために用いてもよい（Clontech, Palo Alto, CA）。この工程ではライブラリーをスクリーニングする必要がなく、イントロン/エクソン接合部の発見に有用である。
完全長cDNAをスクリーニングするとき、より大きなcDNAを含むためにサイズ選別したライブラリーを使用することが好ましい。さらにまた、ランダムプライミングされたライブラリーが、それらは遺伝子の5'領域を含む配列をより多く含むという点で好ましい。ランダムにプライミングされたライブラリーの使用が、オリごd(T)ライブラリーは完全長cDNAをもたらさないという状況のために特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、5'非転写調節領域への配列の伸張のために有用であろう。
【００５１】
本発明のある実施態様では、本発明の核酸分子を染色体位置決定のために用いることができる。この技術では、核酸分子は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的とし、これとハイブリダイズすることができる。本発明にしたがって、染色体に対して関連する配列をマッピングすることは、それら配列と遺伝子関連疾患との相関性確認で重要な工程である。いったん配列が染色体上の正確な位置に対してマッピングされたら、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝子地図データと相関させることができる。そのようなデータは、例えば以下で見出される（V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man、ジョーンズホプキンス大学ウェルヒメディカルライブラリーからオンラインで入手できる）。同じ染色体の領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係は、続いてリンケージ解析により識別される（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）。前記は、ポジショナルクローニング又は他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子について探索を行っている研究者に貴重な情報を提供する。いったん遺伝的リンケージによって特定のゲノム領域に疾患又は症状が大雑把に位置決めされたら、前記領域にマッピングされる任意の配列が更なる調査のための関連遺伝子又は調節遺伝子となる。前記核酸分子はまた、転座、倒置などによる染色体上の位置の相違を正常個体、キャリア個体又は罹患個体間で検出するために用いることができる。
本発明の核酸分子はまた組織内分布のために貴重である。そのような技術は、それらをコードするmRNAを検出することによって組織内での前記ポリペプチドの発現パターンの決定を可能にする。これらの技術には、in situハイブリダイゼーション技術及びヌクレオチド増幅技術（例えばPCR）が含まれる。これらの研究から得られる結果は、生物体内での前記ポリペプチドの正常機能の指標を提供する。さらにまた、mRNAの正常な発現パターンと変異遺伝子によってコードされるmRNAの発現パターンとの比較研究は、疾患における変異遺伝子の役割についての貴重な洞察を提供する。そのような不適切な発現は時間的、空間的又は定量的性質を有し得る。
【００５２】
遺伝子サイレンシングアプローチもまた、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の内因性発現をダウンレギュレートするために行うことができる。RNA干渉（RNAi）（S.M. Elbashir et al. 2001, Nature 411:494-498）は、用いることができる配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの一方法である。短いdsRNAオリゴヌクレオチドが、in vitroで合成され、細胞内に導入される。これらdsRNAオリゴヌクレオチドの配列特異的結合は、標的mRNAの分解、標的タンパク質発現の低下又は除去の引き金となる。
上記で評価した遺伝子サイレンシングアプローチの有効性はポリペプチド発現の測定により（例えばウェスタンブロッティングによる）判定することができ、さらにRNAレベルではタックマン（TaqMan）による方法を用いることができる。
本発明のベクターは本発明の核酸分子を含み、前記はクローニングベクター又は発現ベクターであり得る。本発明の宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい（前記は本発明のベクターで形質転換、トランスフェクト又は形質導入されている）。
本発明のポリペプチドは、宿主細胞内に含まれるベクター中で前記ポリペプチドのコード核酸分子の発現によって組換え形態で調製され得る。そのような発現方法は、当業者に周知であり、例えば以下に詳細に記載されている：Sambrook et al.（上掲書）及びFernandez & Hoeffler（1998, eds. “Gene expression systems. Using nature for the art of expression”. Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto）。
一般的には、要求される宿主でポリペプチドを調製するために核酸分子の維持、増殖又は発現に適した任意の系を用いることができる。多様な周知で公知の技術、例えば上掲書（Sambrook et al.）に記載されたようなもののいずれかによって、適切なヌクレオチド配列を発現系に挿入することができる。一般的には、コード遺伝子は、コントロールエレメント（例えばプロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現の場合）及び場合によってオペレーター）の制御下に置かれ、それによって所望のポリペプチドをコードするDNA配列が形質転換宿主細胞内でRNAに転写される。
【００５３】
適切な発現系の例は、例えば染色体系、エピソーム系及びウイルス由来系を含み、例えば以下に由来するベクターが含まれる：細菌性プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス（例えばSV40）、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、擬似狂犬病ウイルス及びレトロウイルス）又は前記の組合せ、例えばプラスミドとバクテリオファージ遺伝エレメント（コスミド及びファージミドを含む）に由来するもの。ヒト人工染色体（HAC）もまた、プラスミド中に含まれ発現され得るDNAよりも大型の断片DNAのデリバーに用いることができる。以下のベクター、pCR4-TOPO、pCR4-TOPO-INSP201、pENTR、pENTR_INSP201EC-6HIS、pEAK12d-PAC、pDEST12.2、pEAK12d-PAC_INSP201EC-HIS及びpDEST12.2_INSP201EC-6HISが、INSP201に関連して本発明の特徴にしたがって使用される適切なベクターの好ましい例である。
特に好ましい発現系には微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、タバコモザイクウイルス（TMV））又は細菌発現ベクター（例えばTi又はpBR322プラスミド）で形質転換感染させた植物細胞系；又は動物細胞系が含まれる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸分子の宿主細胞への導入は、多くの標準的な実験室用マニュアル（例えばDavis et al. 1986, Basic Methods in Molecular Biology；及びSambrook et al. 上掲書）に記載されている方法によって実施することができる。特に適切な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、弾道導入又は感染が含まれる（以下を参照されたい：Sambrook et al. 1989（上掲書）；Ausubel et al. 1991（上掲書）；Spector, Goldman & Leinwald, 1998）。真核細胞では、発現系は系の要求に応じて一過性でも（例えばエピソーム系）又は永久性（染色体組込み）であってもよい。
【００５４】
コード核酸分子は、例えば翻訳されたポリペプチドの小胞体腔への又は細胞周囲間隙への又は細胞外環境への分泌のために、制御配列をコードする配列、例えばシグナルペプチド又はリーダー配列を含んでいても、又は含んでなくてもよい。これらのシグナルはポリペプチドにとって内在性であってもよいが、またそれらは異種シグナル配列であってもよい。リーダー配列は細菌宿主により翻訳後プロセッシングで除去され得る。
制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することが所望され得る。調節配列の例は、化学的又は物理的刺激（調節性化合物の存在を含む）、種々の温度又は代謝条件に応答して遺伝子の発現を増減させる配列である。調節配列は、ベクターの非翻訳領域にあるもの、例えばエンハンサー、プロモーター並びに5'及び3'非翻訳領域である。これらは宿主細胞タンパク質と相互作用し、転写及び翻訳を遂行することができる。そのような調節配列はそれらの強度及び特異性において変動し得る。利用されるベクター系及び宿主に応じて、多数の適切な転写及び翻訳エレメント（構成性、誘導性プロモーターを含む）を用いることができる。例えば、細菌系でクローニングするときは、誘導性プロモーター（例えばブルースクリプトファージミド（Stratagene, LaJolla, CA）又はpSport(商標)プラスミド（Gibco BRL）の）ハイブリッドlacZプロモーターなどを用いることができる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターを昆虫細胞で用いることができる。植物細胞（例えば熱ショック、RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）又は植物ウイルス（例えばウイルスプロモーター又はリーダー配列）に由来するプロモーター又はエンハンサーをベクターにクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来のプロモーター又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。多数の配列コピーを含む細胞株を作成する必要がある場合は、SV40又はEBVを土台にしたベクターを適切な選択性マーカーとともに用いることができる。
【００５５】
発現ベクターは、個々の核酸コード配列が適切な調節配列とともにベクター内に配置されるように構築される。調節配列に対するコード配列の配置及び方位は、コード配列が前記調節配列の“制御”下で転写されることができるようなものである。すなわち、前記制御配列でDNA分子と結合するRNAポリメラーゼが前記コード配列を転写する。いくつかの事例では、適切な向きで制御配列に前記配列を結合させることができるように（すなわちリーディングフレームを維持するために）、前記配列を改変する必要があるかもしれない。
上記制御配列及び他の調節配列は、ベクターに挿入する前に核酸コード配列と連結することができる。また別には、前記コード配列は、既に制御配列及び適切な制限部位を含む発現ベクターに直接クローニングすることができる。
組換えポリペプチドの長期的な高収量産生のためには安定な発現が好ましい。例えば、注目するポリペプチドを安定的に発現する細胞株を、ウイルス起源の複製及び/又は内因性発現エレメント及び選別可能マーカー遺伝子を同じ又は別個のベクターに含み得る発現ベクターを用いて形質転換することができる。前記ベクターの導入に続いて、前記細胞を選択培養液に切り替える前に、細胞を1−2日間富裕培養液で増殖させることができる。選別可能マーカーの目的は選択に対する耐性を付与するためであり、前記マーカーの存在は、導入された配列を発現させることができる細胞の増殖及び回収を可能にする。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンを前記細胞タイプに適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【００５６】
発現のために宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当分野では公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から入手できる、以下を含む（ただしこれらに限定されない）多くの哺乳動物細胞株が含まれる：チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa、ベビーハムスター腎（BHK）細胞、サル腎（COS）細胞、C127、3T3、BHK、HEK293、ボウズメラノーマ細胞及びヒト肝細胞癌（例えばHep G2）細胞並びに多数の他の細胞株。
バキュロウイルス系では、バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のための材料がキットの形（“MaxBac”キット）でとりわけインビトロジェン（Invitrogen, San Diego, CA）から市販されている。これらの技術は一般的に当業者には公知であり、以下に完全に記載されている：Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)。この系で使用される特に適切な宿主細胞には、例えばショウジョウバエS2及びスポドプテラSf9細胞が含まれる。
当分野で公知の多くの植物細胞培養および完全な植物遺伝子発現系が存在する。適切な植物細胞遺伝子発現系の例にはUS5,693,506；US5,659,122及びUS5,608,143に記載されたものが含まれる。植物細胞培養での遺伝子発現の更なる例は以下に記載されている：Zenk, 1991, Phytochemistry 30:3861-3863。
特に、プロトプラストを単離し、これを培養して完全な再生植物を得て、それによって移入された遺伝子を含む完全な植物が得られる全ての植物を利用することができる。特に、サトウキビ、サトウダイコン、綿花、果実及び他の樹木、豆類及び野菜の全ての主要な種を含む（ただしこれらに限定されない）培養細胞又は組織から全ての植物を再生することができる。
【００５７】
特に好ましい細菌宿主細胞の例には連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌（E. coli）、ストレプトミセス属及び枯草菌（Bacillus subtilis）細胞が含まれる。
真菌類での発現のために特に適切な宿主細胞の例には酵母細胞（例えばS.セレビシアエ）及びアスペルギルス細胞が含まれる。
形質転換細胞を回収するために用いることができる多数の選別系が当分野で公知である。前記の例には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（M. Wigler et al. 1977, Cell 11:223-32）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（L. Lowy et al. 1980, Cell 22:817-23）遺伝子が含まれ、前記はそれぞれtk-又はaprt+/-細胞を利用することができる。
さらにまた、選別のための基準として例えば以下のように抗代謝薬、抗生物質又は除草剤耐性を用いることができる：メトトレキセート耐性を付与するジヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR）（M. Wigler et al. 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70）；npt、アミノグリコシド系のネオマイシン及びG-418に対する耐性を付与する（F. Colbere-Garapin et al. 1981, J. Mol. Biol. 150:1-14）；及びals又はpat、それぞれクロロスルフロン及びホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する。さらに別の選別可能な遺伝子が文献に記載されてあり、前記の例は当業者には明白であろう。
マーカー遺伝子発現の有無は注目の遺伝子もまた存在することを示唆するが、その存在及び発現は確認する必要がある。例えば、注目する配列がマーカー遺伝子配列内に挿入されるならば、前記適切な配列を含む形質転換細胞はマーカー遺伝子機能が存在しないことによって識別することができる。また別には、マーカー遺伝子をただ1つのプロモーターの存在下で本発明のポリペプチドとタンデムに配置することができる。誘導又は選別に応答するマーカー遺伝子の発現は通常、前記タンデム遺伝子の発現も同様に示す。
【００５８】
また別には、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、前記ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に公知の多様な方法によって同定することができる。これらの方法には、DNA-DNA又はDNA-RNAハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ、例えば蛍光活性化細胞分類（FACS）又は免疫アッセイ技術（例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）及び放射性免疫アッセイ（RIA））が含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記方法は、核酸又はタンパク質の検出及び/又は定量のために膜系、溶液系、チップ系技術を含む（以下を参照されたい：R. Hampton et al. 1990, Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN；及びD.E. Maddox et al. 1983, J. Exp. Med. 158:1211-1216）。
多様な標識及び結合技術が当業者には公知であり、種々の核酸アッセイ及びアミノ酸アッセイで用いることができる。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関連する配列の検出のために標識されたハイブリダイゼーションプローブ又はPCRプローブを生成する手段には、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識又は標識ポリヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。また別には、本発明のポリペプチドをコードする配列はmRNAプローブの産生のためにベクターにクローニングしてもよい。そのようなベクターは当分野で公知であり、市販されている。前記は、適切なRNAポリメラーゼ（例えばT7、T3又はSP6）及び標識ヌクレオチドを添加することによって、in vitroでのRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、多様な市販キット（Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI；Prommega, Madison, WI；及びU.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH）を用いて実施することができる。
【００５９】
検出を容易にするために用いることができる適切なレポーター分子又は標識には、放射性核種、酵素並びに蛍光性、化学発光性薬剤又は発色剤が、基質、補助因子、阻害剤、磁性粒子などと同様に含まれる。
本発明の核酸分子もまた、トランスジェニック動物、特にげっ歯類動物の作成に用いることができる。そのようなトランスジェニック動物は本発明の更なる特徴を構成する。前記は、体細胞の改変によって局所的に実施するか、又は生殖系列療法によって実施し遺伝可能な改変を取り込ませることができる。そのようなトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドの調節物質として有効な薬剤分子のための動物モデルの作成で特に有用であり得る。
前記ポリペプチドは、組換え細胞培養から以下を含む周知の方法によって回収することができる：硫安又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレシチンクロマトグラフィー。高速液体クロマトグラフィーは精製に特に有用である。ポリペプチドが単離及び精製の間に変性したときは、タンパク質をリフォールディングさせるための周知の技術を用いて、活性な構造を再生することができる。
所望にしたがってタンパク質の精製を促進するために特殊化したベクター構築物を用いることもできる。前記は、本発明のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させることによって実施される。そのような精製促進ドメインの例には、金属キレートペプチド（例えば固定金属上での精製を可能にするヒスチジン-トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Aドメイン、及びFLAGS伸長/アフィニティ精製系で利用されるドメイン（Immunex Corp., Seattle, WA）が含まれる。切断可能なリンカー配列（例えばXA因子又はエンテロキナーゼに対して特異的なもの）（Invitrogen, San Diego, CA）を精製ドメインと本発明のポリペプチドとの間に含有させることによって精製を促進してもよい。そのような発現ベクターは、チオレドキシン又はエンテロキナーゼ切断部位に先行するいくつかのヒスチジン残基と融合した本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。前記ヒスチジン残基はIMAC（Porathら（J. Porath et al. 1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281）が記載した固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）による精製を促進し、一方、チオレドキシン又はエンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質から本発明のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターに関する考察は以下に提供されている：D.J. Kroll et al. 1993, DNA Cell Biol. 12:441-453。
【００６０】
前記ポリペプチドをスクリーニングアッセイで使用するために発現させる場合は、一般的には、前記が発現される宿主細胞の表面で前記ポリペプチドを産生させるのが好ましい。この場合には、宿主細胞は、例えば蛍光活性化細胞分類（FACS）又は免疫アフィニティー技術のような技術を用いるスクリーニングアッセイでの使用の前に採集することができる。前記ポリペプチドが培養液中に分泌される場合は、前記培養液は、発現ポリペプチドの回収及び精製のために回収することができる。ポリペプチドが細胞内で産生される場合は、細胞は、ポリペプチドを回収する前に先ず溶解させねばならない。
上記に示したように、本発明はまた、新規な標的及び薬剤候補物質又は先導物質のスクリーニングのための方法を提供する。これらのスクリーニング方法には結合アッセイ及び/又は機能的アッセイが含まれ、これらはin vitroで、細胞系で、又は動物で実施することができる。
これに関しては、本発明の具体的な目的は、細胞表面糖タンパク質関連疾患の治療又は予防用の候補薬剤をスクリーニングするための標的としてINSP201ポリペプチドを使用することにある。
本発明のまた別の目的は、生物学的に活性な化合物を選別する方法にあり、前記方法は、候補化合物をINSP201遺伝子又はポリペプチドと接触させる工程及び前記遺伝子又はポリペプチドと結合する化合物を選別する工程を含む。
本発明のさらに他の目的は、生物学的に活性な化合物を選別する方法にあり、前記方法は、INSP201ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞と候補化合物を接触させる工程及び前記INSPポリペプチドと前記細胞の表面で結合し、及び/又はINSP201ポリペプチドの活性を調節する化合物を選別する工程を含む。
“生物学的に活性な”化合物とは、対象で生物学的な活性、好ましくは治療的活性を有する任意の化合物、より好ましくは細胞表面糖タンパク質活性を有する化合物、さらに好ましくはINSP201関連疾患を治療するために使用できる化合物、又は細胞表面糖タンパク質関連疾患を治療する薬剤を開発するための先導物質として使用できる化合物を指す。“生物学的に活性な”化合物は、好ましくはINSP201の活性を調節する化合物である。
【００６１】
上記の方法は、種々の装置及び条件（固定化試薬を含む）を用いて実施することができ、さらに細胞表面糖タンパク質関連疾患のモデル（例えば動物モデル）で前記選別された化合物の活性をアッセイする追加の工程を含むことができる。
好ましい選別化合物は、INSP201のアゴニスト、すなわちINSP201と結合しその内在性リガンドの活性を模倣することができる化合物である。
本発明の更なる目的は、生物学的に活性な化合物を選別する方法にあり、前記方法は、テスト化合物を本発明のINSP201ポリペプチドとin vitroで接触させる工程、及び前記INSP201ポリペプチドの活性を調節する前記テスト化合物の能力を決定する工程を含む。
本発明の更なる目的は、生物学的に活性な化合物を選別する方法にあり、前記方法は、テスト化合物を本発明のINSP201遺伝子とin vitroで接触させる工程、及び前記INSP201遺伝子の発現を調節する、好ましくはその発現を刺激する前記テスト化合物の能力を決定する工程を含む。
また別の実施態様では、本発明は、活性な化合物、特に炎症、細胞変性及びアポトーシス、並びに発癌の調節に活性を有する化合物をスクリーニング、選別又は同定する方法に関する。前記方法は、レポーター構築物を含む組換え宿主細胞とテスト化合物を接触させる工程（前記レポーター構築物はINSP201遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含む）、及び前記レポーター遺伝子の発現を調節する（例えば刺激また低下、好ましくは低下させる）テスト化合物を選別する工程を含む。
本発明のポリペプチドは、多様な薬剤スクリーニング技術のいずれかにおいて化合物ライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。そのような化合物は、本発明の遺伝子の発現レベル、又は本発明のポリペプチドの活性を活性化（作動）し、又は阻害（拮抗）して、更なる本発明の特徴を構成することができる。好ましい化合物は、本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現を変化させるか、本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性を調節するために有効である。
【００６２】
アゴニスト又はアンタゴニスト化合物は、例えば細胞、無細胞調製物、キメラライブラリー又は天然生成物の混合物から単離することができる。これらのアゴニスト又はアンタゴニストは、天然又は改変された基質、リガンド、酵素、レセプター又は構造的若しくは機能的模倣物であり得る。そのようなスクリーニング技術の適切な概覧のためには以下の文献を参照されたい：Coligan et al. Current Protocols in Immunology (1991) 1(2):Chapter5。
標的遺伝子又はポリペプチドとの結合は、前記標的の活性を調節する、したがって対象者で細胞表面糖タンパク質関連疾患に至る経路に影響を与える化合物の能力に関する指標を提供する。結合の決定は多様な技術によって、例えば候補化合物の標識によって、標識したリファレンスリガンドとの競合などによって実施することができる。in vitro結合アッセイのためには、前記ポリペプチドは、本質的に純粋な形態で、懸濁状態で、支持体に固定されて、又は膜（無傷の細胞、膜調製物、リポソームなど）で発現された状態で用いることができる。
活性の調節には、INSP201レセプターの表面発現の刺激、前記レセプターのマルチマー形成の調節（例えば他のサブユニットとのマルチマー複合体の形成）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。アッセイで用いられる細胞は、任意の組換え細胞（すなわちINSP201ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む任意の細胞）又は、内因性INSP201ポリペプチドを発現する任意の細胞であろう。そのような細胞の例には原核細胞（例えば細菌）及び真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。具体的な例には、大腸菌、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）又はサッカロミセス（Saccharomyces）属の酵母、哺乳動物細胞株（例えばVero細胞、CHO細胞、3T3細胞、COS細胞など）および、哺乳動物細胞の初代又は樹立培養が含まれる（例えば線維芽細胞、胎児細胞、上皮細胞、神経系細胞及び脂肪細胞などにより作製される）。
【００６３】
良好なアンタゴニストである可能性が極めて高い化合物は、その結合に際して本発明のポリペプチドの生物学的作用を誘発することなく、前記ポリペプチドと結合する分子である。潜在的なアンタゴニストには、本発明のポリペプチドと結合し、それによってその活性を阻害又は消滅させる小有機分子、ペプチド、ポリペプチド及び抗体が含まれる。この態様では、正常な細胞結合分子と前記ポリペプチドとの結合が阻害され、その結果前記ポリペプチドの正常な生物学的活性が妨げられる得る。
そのようなスクリーニング技術で用いられる本発明のポリペプチドは、溶液中で遊離していても、固相に固定されていても、細胞表面に保持されていても、又は細胞内に存在していてもよい。一般的には、そのようなスクリーニング方法は、前記ポリペプチドを発現し、結合又は機能的応答の刺激若しくは阻害を観察するためにテスト化合物と接触させる適切な細胞又は細胞膜の使用を含むことができる。続いてテスト化合物と接触させた細胞の機能的応答を、テスト化合物と接触させなかったコントロール細胞と比較する。そのようなアッセイによって、前記ポリペプチドの活性化によって生じるシグナルを前記テスト化合物がもたらすか否かを適切な検出系を用いて判定することができる。活性化の阻害因子は一般的には公知のアゴニストの存在下でアッセイし、さらにテスト化合物の存在下における前記アゴニストによる活性化に対する影響を観察する。
【００６４】
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト化合物を同定する好ましい方法は以下の工程を含む：
（a）本発明の第一の特徴のポリペプチドを発現する細胞（場合によってその表面で発現する細胞）を、前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下でスクリーニングされるべき化合物と接触させる工程であって、前記ポリペプチドは、化合物と前記ポリペプチドとの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる第二の成分と結合されているポリペプチドである、前記工程；および
（b）前記化合物と前記ポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルのレベルを測定することによって、前記化合物が前記ポリペプチドと結合してこれを活性化又は阻害するか否かを決定する工程。
本明細書に記載するアッセイタイプで検出可能なシグナルを発生させる方法は当業者には公知であろう。具体的な例は、本発明のポリペプチド又は断片（例えばLBD）をGAL4 DNA結合ドメインと融合された状態で発現する構築物を、レポータープラスミド（前記の例はpFR-Luc（Stratagene Europe, Amsterdam, The Netherlands）である）とともに同時トランスフェクトすることである。このプラスミドはGAL4結合部位の5つのタンデムリピートをもつ合成プロモーターを含む（ルシフェラーゼ遺伝子の発現を制御する）。潜在的なリガンドが細胞に添加されると、前記リガンドはGAL4-ポリペプチド融合物と結合し、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘導する。ルミネッセンスリーダーを用いて、ルシフェラーゼ発現レベルをその活性によってモニターすることができる（例えば以下を参照されたい：Lehman et al. 1995, JBC 270:12953；Pawar et al. 2002, JBC 277:39243）。
【００６５】
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するさらに好ましい方法は以下の工程を含む：
（a）標識化合物又は未標識化合物を、任意の固相（例えばビーズ、プレート、マトリックス支持体、チップ）に固定した前記ポリペプチドと接触させ、前記標識を測定することによって又は化合物それ自体の存在によって前記化合物を検出する工程；又は
（b）細胞膜に前記ポリペプチドを人工的に係留する手段によって、又は化合物と前記ポリペプチドとの結合に応答し検出可能なシグナルを提供することができる第二の成分と結合させたキメラレセプターを構築することによって、細胞表面に前記ポリペプチドを発現する細胞を、前記ポリペプチドとの結合が許容される条件下でスクリーニングされるべき化合物と接触させる工程；及び
（c）化合物とポリペプチドとの相互作用から生じたシグナルのレベルを前記化合物の非存在下におけるシグナルのレベルと比較することによって、前記化合物が前記ポリペプチドと結合し、これを活性化又は阻害したか否かを決定する工程。
例えば、ペプチドコアクチベーターの存在下で前記ポリペプチドと結合したリガンドのFRET検出のような方法を用いることができる（Norris et al. Science, 1999, 285:744）。
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するさらに好ましい方法は以下の工程を含む：
（a）前記ポリペプチドを発現する細胞（場合によってその表面で発現する細胞）を、前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下でスクリーニングされるべき化合物と接触させる工程であって、前記ポリペプチドは、化合物と前記ポリペプチドとの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる第二の成分と結合されたペプチドである、前記工程；および、
（b）前記化合物と前記ポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルのレベルを前記化合物の非存在下におけるシグナルのレベルと比較することによって、前記化合物が前記ポリペプチドと結合してこれを活性化又は阻害するか否かを決定する工程。
更に別の好ましい実施態様では、上記記載の一般的な方法は、さらに前記ポリペプチドのための標識又は未標識リガンドの存在下でアゴニスト又はアンタゴニストの同定を実施する工程をさらに含むことができる。
【００６６】
また別の実施態様では、本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法は以下の工程を含む：候補化合物と前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下で、本発明のポリペプチドを発現する細胞（及び場合によって本発明のポリペプチドをその表面に有する細胞）又はそのようなポリペプチドを含む膜とリガンドの結合の阻害を前記候補化合物の存在下で決定する工程、及び前記ポリペプチドと結合したリガンドの量を決定する工程。リガンドの結合を低下させることができる化合物はアゴニスト又はアンタゴニストであると考えられる。好ましくはリガンドは標識される。
より具体的には、ポリペプチドのアンタゴニスト又はアゴニスト化合物についてスクリーニングする方法は以下の工程を含む：
（a）本発明のポリペプチドを発現する（まるごとの）細胞全体（場合によって細胞表面に発現する細胞）、又は本発明のポリペプチドを含む細胞膜と標識リガンドをインキュベートする工程；
（b）前記細胞全体又は細胞膜と結合した標識リガンドの量を測定する工程；
（c）標識リガンド及び工程（a）の前記細胞全体又は細胞膜の混合物に候補化合物を添加し、前記混合物を平衡化させる工程；
（d）工程（c）の後で細胞全体又は細胞膜に結合した標識リガンドの量を測定する工程；及び
（e）工程（b）及び（d）で結合した標識リガンドの相違を比較する工程であって、工程（d）で結合を減少させる化合物をアゴニスト又はアンタゴニストであると考える、前記工程。
同様に、以下の工程を含む、ポリペプチドのアンタゴニスト又はアゴニスト化合物についてスクリーニングする方法が提供される：
（a）任意の固相若しくは細胞表面上の本発明のポリペプチド、又は本発明のポリペプチドを含む細胞膜と標識リガンドをインキュベートする工程；
（b）前記固相、全細胞又は細胞膜上のポリペプチドと結合した標識リガンドの量を測定する工程；
（c）標識リガンド及び工程（a）の固相、全細胞又は細胞膜上のポリペプチドの混合物に候補化合物を添加し、前記混合物を平衡化させる工程；
（d）工程（c）の後で固定ポリペプチド又は全細胞若しくは細胞膜に結合した標識リガンドの量を測定する工程；及び
（e）工程（b）及び（d）で結合した標識リガンドの相違を比較する工程であって、工程（d）で結合を減少させる化合物をアゴニスト又はアンタゴニストであると考える、前記工程。
【００６７】
本発明のINSP201ポリペプチドは細胞の増殖及び分化を調節することができる。したがって、INSP201ポリペプチドの生物学的活性は、細胞の増殖及び分化の研究を可能にする系、例えば器官培養アッセイ又はアガロース培養におけるコロニーアッセイ系で調べることができる。細胞増殖の刺激又は阻害は多様なアッセイによって測定することができる。
例えば、細胞の増殖阻害を観察するために、固体培地又は液体培地を用いることができる。固体培地では、増殖阻害を受けている細胞は、形成されたコロニーのサイズを比較することによって対象細胞群から容易に選別することができる。液体培地では、増殖阻害は、培養液の濁度又は標識チミジンのDNAへの取り込みを測定することによってスクリーニングすることができる。典型的には、ヌクレオシド類似体の新規合成DNAへの取り込みを用いて、細胞集団における増殖（すなわち活性な細胞の増殖）を測定することができる。例えば、ブロモデオキシウリジン（BrdU）をDNA標識試薬として用い、抗BrdUマウスモノクローナル抗体を検出試薬として用いることができる。この抗体は、ブロモデオキシウリジンを取り込んだDNAを含む細胞とのみ結合する。多数の検出方法をこのアッセイと併用して用いることができる。前記には免疫蛍光法、免疫組織化学法、ELISA及び比色法が含まれる。ブロモデオキシウリジン及び抗BrdUマウスモノクローナル抗体を含むキットがベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）から市販されている。
細胞の分化に対するINSP201ポリペプチドの作用は、幹細胞又は胚性細胞を種々の量のINSP201ポリペプチドと接触させ、幹細胞又は胚性細胞の分化に対する影響を観察することによって測定することができる。生じた細胞を組織特異的抗体及び顕微鏡検査を用いて識別することができる。
【００６８】
INSP201ポリペプチドはまた、用量依存態様で免疫系及び/又は神経系細胞の分裂及び分化を調節することが上記に記載したアッセイで見出すことができる。したがって、INSP201ポリペプチドの“機能的等価物”には、上記記載のアッセイで同じ細胞増殖及び分化調節活性を用量依存態様で示すポリペプチドが含まれる。用量依存活性の程度はINSP201ポリペプチドのそれと同一である必要はないが、好ましくは、与えられた活性アッセイにおいて、前記“機能的等価物”はINSP201ポリペプチドと比較して同様な用量依存性を示すであろう。
上記に記載のある種の実施態様では、単純な結合アッセイを用いることができる。前記アッセイでは、ポリペプチドを保持している表面へのテスト化合物の粘着はテスト化合物に直接的又は間接的に結合させた標識の手段によって検出するか、又は標識競合物との競合を必要とする。また別の実施態様では、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。前記アッセイでは、ポリペプチドと結合することができる中和抗体はテスト化合物と結合について特異的に競合する。この態様で、前記ポリペプチドに対して特異的な結合アフィニティーを有するいずれのテスト化合物の存在の検出にも前記抗体を用いることができる。
前記ポリペプチドをコードするmRNAの細胞内での産生に対する添加テスト化合物の影響を検出するためのアッセイもまた設計することができる。例えば、モノクローナル又はポリクローナル抗体を用い当分野で公知の標準的な方法によって、分泌又は細胞結合ポリペプチドレベルを測定するELISAを構築することができ、適切に操作した細胞又は組織の前記ポリペプチド産生を阻害又は強化することができる化合物についての探索のために用いることができる。続いてポリペプチドと被検化合物間での結合複合体の形成を測定することができる。
【００６９】
用いることができる薬剤スクリーニングのためのまた別の技術は、注目のポリペプチドに対して適切な結合アフィニティーを有する化合物の高処理スクリーニングを提供することができる（国際特許出願WO84/03564を参照されたい）。この方法では、大量の小さな種々のテスト化合物を固体の基質上で合成し、続いて前記を本発明のポリペプチドと反応させ洗浄する。ペプチドを固定する方法は、非中和抗体を用いることである。続いて結合を当分野で周知の方法を用いて検出することができる。上述の薬剤スクリーニング技術で使用するために、精製ポリペプチドはまたプレート上に直接被覆され得る。
この種のさらにまた別の技術は当業者には明白であろう。例えば以下を参照されたい：C. Adessi & C. Soto 2002, Curr. Med. Chem. 9(9):963-78；F.L. Strand 2003, Prog. Drug Res. 61(1-37)；V.J. Hruby 2002, J. Nat. Rev. Drug Discov. 1(11):847-58。
本発明のポリペプチドを用い、当分野で公知の標準的なレセプター結合技術、例えばリガンド結合アッセイ及び架橋アッセイを介して膜結合又は可溶性レセプターを同定することができる。前記アッセイでは、ポリペプチドは放射活性同位体で標識されるか、化学的に改変されるか、又はその検出若しくは精製を促進するペプチド配列と融合され、さらに仮想的レセプターの供給源（例えば細胞組成物、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、又は体液）とインキュベートされる。結合効率は、生物物理学的技術（例えば表面プラズモン共鳴及び分光解析）を用いて測定することができる。結合アッセイはレセプターの精製又はクローニングのために用いることができるが、また、前記ポリペプチドとそのレセプターとの結合と競合するアゴニスト及びアンタゴニストを同定することもできる。スクリーニングアッセイを実施する標準的な方法は当分野では周知である。
【００７０】
また別の実施態様では、本発明は、免疫関連疾患治療用INSP201ポリペプチドアゴニスト又は刺激物質を単離又は精製するために、INSP201ポリペプチド又はその断片（したがって前記断片は好ましくはINSP201遺伝子特異的断片である）を使用することに関する。ここで前記アゴニスト又は刺激物質は以下から成る群から選択される：
１．特異的抗体又はその断片（以下を含む）：a）キメラ抗体、b）ヒト化抗体、又は完全にヒトの抗体、および、
２．二重特異性又は多重特異性抗体、
３．単鎖（例えばscFv）抗体、
４．単一ドメイン抗体、
５．前記抗体に由来するペプチド-又は非ペプチド-模倣物、又は
６．抗体模倣物、例えばa）アンチカリン又はb）フィブロネクチン系結合分子（例えばトリネクチン又はアドネクチン）。
抗体からペプチド-又は非ペプチド-模倣物を作成することが当分野で公知である（Sarabovi et al. 1991；及びSaragovi et al. 1992）。
アンチカリンもまた当分野で公知である（Vogt et al. 2004）。フィブロネクチン系結合分子はUS6818418及びWO2004029224に記載されている。
さらにまた、テスト化合物は、多様な起源、性質及び組成物であり得る。前記は例えば任意の小分子、核酸、脂質、ペプチド、ポリペプチドであり、前記ポリペプチドには抗体（例えばキメラ抗体、ヒト化抗体又は完全にヒトの抗体又は抗体断片を含む）、それらに由来するペプチド-又は非ペプチド-模倣物と同様に二重特異性若しくは多重特異性抗体、単鎖（例えばscFv）若しくは単一ドメイン抗体又は抗体模倣物（例えばアンチカリン又はフィブロネクチン系結合分子（例えばトリネクチン又はアドネクチン））などが含まれ、前記は単離形又は混合物又はその組合せである。
【００７１】
本発明はまた、上記に記載したアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、レセプター、基質、酵素を同定する方法で有用なスクリーニングキットを含む。
本発明は、上記に記載する方法によって発見された本発明のポリペプチドの活性又は抗原性を調節する、アゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、レセプター、基質及び酵素、並びに他の化合物を含む。
上記で述べたように、本発明の多様な構成部分（すなわち、本発明の第一の特徴のポリペプチド、本発明の第二若しくは第三の特徴の核酸分子、本発明の第四の特徴のベクター、又は本発明の第五の特徴の宿主細胞、又は本発明の第六の特徴のリガンド、又は本発明の第七の特徴の化合物）が、疾患の治療又は診断で有用であり得ることが意図される。疾患の治療又は診断についての本発明の成分の有用性を判定するために、1つ又は2つ以上の以下のアッセイを実施することができる。以下のアッセイのいくつかはテスト化合物がタンパク質/ペプチドであるとして言及、当業者は以下のアッセイを容易に改変して本発明の他の成分もまた“テスト化合物”として用いることができることに留意されたい。
本発明はまた、本発明のポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物を適切な医薬担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。これらの組成物は、下記で詳しく述べるように、治療薬若しくは診断薬として、ワクチンとして、又は他の免疫原性組成物として適切であり得る。
本明細書で用いられる用語にしたがえば、ポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物［X］は、組成物中のX＋Y（Ｙは不純物）の合計の少なくとも85重量％がXであるときに、不純物［Y］が“実質的に除かれている”。好ましくは、Xは、組成物中のX＋Yの合計の少なくとも約90重量％を構成し、より好ましくは、少なくとも約95重量％、98重量%又は99重量%ですらある。
【００７２】
前記医薬組成物は、好ましくは治療的に有効な量の本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンド又は化合物を含む。本明細書で用いられる、“治療的に有効な量”という用語は、標的の疾患又は症状を治療、軽減若しくは予防するために、又は検出可能な治療的若しくは予防的効果を示すために必要な治療薬剤の量を指す。いずれの化合物についても、先ず初めに治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイ（例えば新形成細胞の細胞培養アッセイ）で、又は動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌ又はブタ）で評価することができる。前記動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与ルートを決定するために用いることができる。続いて、そのような情報を用いて、ヒトでの投与のために有用な用量及びルートを決定する。
ヒト対象者のための厳密な有効用量は、症状の重篤度、対象者の一般的な健康状態、年齢、体重及び性別、食事、投与の時期及び頻度、薬剤の組合せ、反応の鋭敏性、並びに治療に対する耐性/応答に左右される。前記用量は日常的な検査によって決定することができ、臨床医の裁量の範囲内である。一般的には、有効用量は、0.01mg/kgから50mg/kg、好ましくは0.05mg/kgから10mg/kgであろう。組成物は患者に個々に投与してもよいが、また他の物質、薬剤又はホルモンと組み合わせて投与してもよい。
医薬組成物はまた、治療用物質の投与のために医薬的に許容できる担体を含むことができる。そのような担体には抗体及び他のポリペプチド、遺伝子および他の治療用物質（例えばリポソーム）が含まれるが、ただし前記担体はそれ自体、前記組成物を受容する固体に有害な抗体の産生を誘発せず、さらに不適切な毒性を生じることなく投与され得ることを条件とする。適切な担体は大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー及び不活性なウイルス粒子であり得る。
【００７３】
医薬的に許容できる塩、例えば鉱酸塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）；有機酸の塩（例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）をここでは用いることができる。医薬的に許容できる担体についての完全な考察は以下の成書で入手できる：Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co., N.J. 1991）。
治療用組成物中の医薬的に許容できる担体にはさらに液体（例えば水、食塩水、グリセロール及びエタノール）が含まれ得る。さらにまた、補助物質（例えば湿潤剤、乳化剤、pH緩衝物質など）もそのような組成物中に存在することができる。そのような担体は、前記医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー懸濁剤などに処方することを可能にする。
いったん処方されたら、本発明の組成物は患者に直接投与することができる。治療されるべき対象者は動物であり、特に人間が治療され得る。
本発明で利用される医薬組成物は多数の経路によって投与することができる。前記経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、腱鞘内、脳室内、経皮又は皮膚貫通適用（例えばWO98/20734を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸投与が含まれるが、ただしこれらに限定されない。遺伝子銃又はヒポスプレーもまた本発明の医薬組成物の投与に用いることができる。典型的には、治療用組成物は、注射可能剤として（液体溶液又は懸濁物として）；注射前に液体ベヒクル中の溶液又は懸濁液として調製するために適切な固体形として調製され得る。
前記組成物の直接的デリバリーは、一般的には、皮下、腹腔内、静脈内、又は筋肉内に注射することによって達成されるか、又は組織間隙腔にデリバーすることができる。前記組成物はまた病巣に投与することもできる。投薬処置は1回投薬スケジュールでも複数回投薬スケジュールでもよい。
【００７４】
個々の症状において、本発明のポリペプチドの活性が過剰な場合は、いくつかのアプローチが利用可能である。あるアプローチは、対象者に上記に記載した阻害化合物（アンタゴニスト）を、本発明のポリペプチドの機能を抑制するために有効な量で医薬的に許容できる担体と一緒に投与することを含む（前記ポリペプチドの機能の抑制は、例えばリガンド、基質、酵素、レセプターの結合を阻止し、又は第二のシグナルを阻害しそれによって異常な症状を軽減することによって達成される）。好ましくは、そのようなアンタゴニストは抗体である。もっとも好ましくは、そのような抗体は、それらの免疫原性を最小限にするために、上記で考察したようにキメラ化及び/又はヒト化されている。
また別のアプローチでは、注目のリガンド、基質、酵素、レセプターに対する結合アフィニティーを保持するポリペプチドの可溶形を投与することができる。典型的には、前記ポリペプチドは注目の部分を保有する断片の形態で投与することができる。
更に別のアプローチでは、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、発現ブロッキング技術を用いて（例えば上記に記載したようなアンチセンス核酸モジュールの使用（内部で生成させるか、又は別個に投与される））抑制することができる。遺伝子発現の改変は、ポリペプチドをコードする遺伝子の制御5'領域、調節領域（シグナル配列、プロモーター、エンハンサー及びイントロン）の相補性配列又はアンチセンス分子（DNA、RNA又はPNA）を設計することによって達成することができる。同様に、抑制は“トリプルヘリックス”塩基対法を用いて達成することができる。トリプルヘリックスペアリングは、ポリメラーゼ、転写因子又は調節分子の結合のために十分に開き得るというダブルヘリックスの能力の阻害を惹起するので有用である。トリプレックスDNAを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（J.E. Gee et al. 1994, In: B.E. Huber and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY）。相補性配列又はアンチセンス分子はまた、転写物のリボソームへの結合を妨げることによってmRNAの翻訳を阻止するように設計することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは投与するか、又はin vivo発現からin situで生成させてもよい。
【００７５】
さらにまた、本発明のポリペプチドの発現は、そのコードmRNA配列に特異的なリボザイムを用いることによって妨げることができる。リボザイムは触媒活性を有するRNAであり、天然又は合成であり得る（例えば以下を参照されたい：N. Usman et al. Curr. Opin. Struc. Biol. 1996, 6(4):527-33）。合成リボザイムは、mRNAを選択した位置で特異的切断し、それによってmRNAの機能的ポリペプチドへの翻訳を防げることができるように設計することができる。リボザイムは、通常RNA分子で見出されるように、天然のリン酸リボース骨格及び天然の塩基を用いて合成することができる。また別には、リボザイムは、非天然骨格（例えば2'-O-メチルRNA）を用いて合成しリボヌクレアーゼによる分解から保護することができ、さらに改変塩基を含むことができる。
RNA分子を改変して、細胞内安定性及び半減期を高めることができる。可能な改変には、前記分子の5'及び/又は3'末端におけるフランキング配列の付加、又は前記分子の骨格内でのホスホジエステル結合以外のホスホロチオエート又は2'-O-メチルの使用が含まれるが、ただしこれらに限定されない。この概念はPNAの作成で固有であり、非慣用的塩基（例えばイノシン、ケオシン及びブトシン）と同様に、アセチル-、メチル-、チオ-並びにアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様な改変型（内在性エンドヌクレアーゼはこれらを容易に認識しない）を含有させることによって、これらの分子の全てに広く適用することができる。
本発明のポリペプチド及びその活性の過小発現に関連する異常状態を治療するために、いくつかのアプローチがまた利用可能である。あるアプローチは、対象者に前記ポリペプチドを活性化する化合物（すなわち上記に記載したアゴニスト）の治療的に有効な量を投与し、前記異常な症状を軽減することを含む。また別には、前記ポリペプチドの治療量を適切な医薬担体と一緒に投与して、ポリペプチドの注目する生理学的バランスを回復させることができる。
【００７６】
遺伝子療法を用い、対象者で注目する細胞による前記ポリペプチドの内在性産生を達成することができる。遺伝子療法は、修正した治療用遺伝子で欠損遺伝子を置換することによって前記ポリペプチドの不適切な産生を永久的に治療するために用いられる。
本発明の遺伝子療法はin vivo又はex vivoで実施することができる。ex vivo遺伝子療法は、患者細胞の単離及び精製、治療遺伝子の導入、及び遺伝的に変化させた細胞を前記患者に戻すことを必要とする。対照的に、in vivo遺伝子療法は患者の細胞の単離及び精製を必要としない。
前記治療用遺伝子は患者への投与のために典型的には“パッケージングされている”。遺伝子デリバリーベヒクルは、非ウイルス性（例えばリポソーム）、又は複製欠損ウイルス（例えばK.L. Berkner（Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1992, 158:30-66）記載のアデノウイルス、又はN. Muzyczka（Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1992, 158:97-129；及び米国特許5,252,479号）記載のアデノ関連ウイルス（AAV））であり得る。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、複製欠損レトロウイルスベクターで発現について操作することができる。続いてこの発現構築物を単離し、さらに、前記ポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージング細胞に導入することができる。その結果、前記パッケージング細胞は注目の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生することができる。in vivoで細胞を操作し、さらにin vivoで前記ポリペプチドを、発現するために、これらのプロデューサー細胞を対象者に投与することができる（以下の成書の20章を参照されたい：Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches in Human Molecular Genetics (1996), T. Strachan and A.P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd.（及びその中に引用された参考文献））。
また別のアプローチは“裸のDNA”の投与であり、前記アプローチでは治療用遺伝子は血流又は筋肉組織に直接注射される。
【００７７】
本発明のポリペプチド又は核酸が疾患惹起因子である状況では、本発明は、前記ポリペプチド又は核酸をワクチンとして用いて前記疾患惹起因子に対する抗体の生成を提供する。
本発明のワクチンは、予防的（すなわち感染を防ぐ）又は治療的（すなわち感染後の疾患を治療する）であり得る。そのようなワクチンは免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質又は核酸を含み、前記は通常は上記に記載したように医薬的に許容できる担体と組み合わされている。前記担体には、前記組成物を受容する個体において有害な抗体をそれ自体誘発しない任意の担体が含まれる。さらにまた、これらの担体は免疫刺激物質（“アジュバント”）として機能することができる。さらにまた、前記抗原又は免疫原は、細菌の類毒素（例えばジフテリア、破傷風、コレラ、H.ピロリ及び他の病原体由来の類毒素）と結合させることができる。
ポリペプチドは胃で分解され得るので、ポリペプチドを含むワクチンは好ましくは非経口的に（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、又は皮内注射）投与される。非経口投与に適した処方物には、水性及び非水性無菌的注射溶液（抗酸化剤、緩衝物質、制菌剤、及び処方物をレシピエントの血液と等張にさせる溶質を含むことができる）、及び水性及び非水性無菌的懸濁物（懸濁剤又は膨張剤を含むことができる）が含まれる。
本発明のワクチン処方物はユニットドース又はマルチドース容器で提供することができる。例えば、封入アンプル及びバイアルは、使用直前に無菌的液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。投与量は、ワクチンの具体的な活性に左右され、日常的な実験によって容易に決定することができる。
本発明のポリペプチドと結合する抗体の遺伝的デリバリーはまた、例えば国際特許出願WO98/55607に記載されているように実施することができる。
ジェットインジェクション（例えば以下を参照されたい：www.powderject.com）と称される技術もまたワクチン組成物の処方で有用である。
ワクチン接種及びワクチンデリバリー系のために多数の適切な方法が国際特許出願WO00/29428に記載されている
【００７８】
本発明はまた、診断試薬としての本発明の核酸分子の使用に関する。本発明の核酸分子の特徴を有する遺伝子の変異型（前記は機能不全を伴う）の検出は、疾患の診断又は疾患に対する感受性（前記遺伝子の過少発現、過剰発現又は空間的若しくは時間的発現の変異により生じる）の診断に付け加えることができるか、又は前記を限定することができる診断的ツールを提供する。
診断用核酸分子は、対象者の細胞（例えば血液、尿、唾液、組織生検又は剖検材料）から入手できる。ゲノムDNAは直接検出に用いてもよいが、又は、解析の前にPCR、リガーゼ連鎖反応（LCR）、鎖の置換増幅（SDA）又は他の増幅技術によって酵素的に増幅してもよい（例えば以下を参照されたい：Saiki et al. Nature 1986, 324:163-166；Bej et al. Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 1991, 26:301-334；Birkenmeyer et al. J. Virol. Meth. 1991, 35:117-126；J. Van Brunt Bio/Technology 1990, 8:291-294）。
ある実施態様では、本発明のこの特徴は患者で疾患を診断する方法を提供し、前記方法は、本発明のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現レベルを判定し、さらに前記発現レベルをコントロールレベルと比較することを含み、前記コントロールレベルと相違するレベルが疾患の指標となる。前記方法は、
（a）患者の組織サンプルと核酸プローブとを、本発明の核酸分子と前記プローブとの間でのハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で接触させる工程；
（b）コントロールサンプルを前記プローブと工程（a）で用いた条件と同じ条件下で接触させる工程；及び
（c）前記サンプルにおいてハイブリッド複合体の存在を検出する工程、
を含み、コントロールサンプル中のハイブリッド複合体レベルと異なる患者サンプル中のハイブリッド複合体レベルが検出されることを疾患の指標とする。
本発明の更なる特徴は以下の工程を含む診断方法を含む：
（a）疾患について検査される患者から組織サンプルを入手する工程；
（b）前記組織サンプルから本発明の核酸分子を単離する工程； 
（c）疾患と関連した核酸分子の変異の存在を検出することにより、疾患について患者を診断する工程。
【００７９】
上記の方法で核酸分子の検出を促進するために、例えばPCRを用いる増幅工程を含むことができる。
欠失及び挿入は、正常な遺伝子型と比較して増幅生成物のサイズの変化によって検出することができる。点変異は、本発明の標識RNA或いは本発明の標識アンチセンスDNA配列に対して増幅DNAをハイブリダイズさせることによって識別することができる。完全にマッチした配列は、RNase消化によるか又は融解温度における相違を判定することによってミスマッチ二重鎖と区別することができる。患者における変異の有無は、ストリンジェントな条件下でDNAとハイブリダイズしてハイブリッド二本鎖分子を形成する核酸プローブとDNAを接触させることによって検出することができる。前記ハイブリッド二本鎖分子は、疾患に関連する変異に対応する任意の部分において核酸プローブがハイブリダイズしない部分を有しており、前記プローブがハイブリダイズしない部分の有無が、DNA鎖の対応する部分における疾患関連変異の有無の指標として検出される。
このような診断は出生前および出生後検査として特に有用である。
点変異及びリファレンス遺伝子と“変異体”遺伝子との間の他の配列の相違は他の周知の技術、例えば直接的DNA配列決定又は一本鎖コンフォメーション多形性によって特定することができる（以下を参照されたい：Orita et al. Genomics 1989, 5:874-879）。例えば、改変PCRによって生成された二本鎖PCR生成物又は一本鎖鋳型分子とともに配列決定プライマーを用いることができる。前記配列決定は、放射能標識ヌクレオチドを用いる通常の工程によって、又は蛍光タグを用いる自動配列決定工程によって実施される。クローン化DNAセグメントもまたプローブとして用いて、特定のDNAセグメントを検出することができる。この方法の感度は、PCRと併用されたときに極めて強化される。さらに、点変異及び他の配列変種（例えば多形性）は、上記のように、例えばただ1つのヌクレオチドが異なる配列のPCR増幅のために対立遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを用いることにより検出することができる。
【００８０】
DNAの配列相違はまた、変性剤含有又は非含有ゲルにおけるDNA断片の電気泳動移動度の変化によって、又は直接DNA配列決定によって検出することができる（例えば、Meyers et al. Science 1985, 230:1242）。特定の位置における配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えばRNase）及びS1保護又は化学的切断方法によって示すことができる（Cotton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 85:4397-4401）。
通常のゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、ミクロ欠失、異数体、転座、倒置のような変異はまたin situ解析によっても検出することができる（例えば以下を参照されたい：Keller et al. DNA Probes, 2nd Ed. (1993) Stockton Press, New York, N.Y. USA）。すなわち、細胞内のDNA又はRNA配列は、それらを単離及び/又は膜上に固定する必要なしに変異について解析することができる。フルオレッセンスin situハイブリダイゼーション（FISH）は現在のところもっとも一般的に用いられる方法であり、FISHに関しては多数の概説が存在する（例えば以下を参照されたい：Trachuck et al. Science 1990, 250:559-562：Trask et al. Trends. Genet. 1991, 7:149-154）。
本発明の別の実施態様では、本発明の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築し、遺伝的変種、変異及び多形性の効率的なスクリーニングを実施することができる。アレイテクノロジーの方法は周知であり、普遍的な応用性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖及び遺伝的変動性を含む分子遺伝学における多様な疑問に答えるために用いることができる（例えば以下を参照されたい：M. Chee et al. Science 1966, 274:610-613）。
【００８１】
ある実施態様では、前記アレイは、文献（PCT出願WO95/11995（Chee et al.）；D.J. Lockhart et al. 1996, Nat. Biotech. 14:1675-1680；M. Schena 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619）に記載された方法にしたがって調製され、使用された。オリゴヌクレオチド対は2つから100万を超える範囲であり得る。オリゴマーは、光誘導化学反応を用いて基質上の指定の領域で合成される。前記基質は紙、ナイロン若しくは他のタイプのメンブレン、フィルター、チップ、ガラススライド又は任意の他の適切な固相であろう。別の特徴では、オリゴヌクレオチドは、化学的結合方法及びインクジェット適用装置をPCT出願WO95/25116（Baldeschweiler et al）に記載されたように用いて、基質の表面で合成することができる。別の特徴では、真空系、熱、UV、機械的又は化学的結合方法によって、ドット（又はスロット）ブロットに類似する“グリッド形成（gridded）”アレイを用い、基質の表面にcDNA断片又はオリゴヌクレオチドを配列し、結合させることができる。アレイ（例えば上記に記載のもの）は手動で作成するか、又は利用可能な装置（スロットブロット又はドットブロット装置）、材料（任意の適切な固相）及び機械（自動装置を含む）を用いて製作することができ、8、24、96、384、1536又は6144のオリゴヌクレオチド、又は2から100万を超える他の任意の数（前記100万を超える数は市販の装置の効率的な使用に役立つ）のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
上記に考察した方法に加えて、対象者に由来するサンプルから異常に低下又は増加したレベルのポリペプチド又はmRNAを測定することを含む方法によって疾患を診断することができる。発現の低下又は増加は、ポリヌクレオチドの定量について当分野で周知の方法のいずれか（例えば核酸増幅、例えばPCR、RT-PCR、RNase保護、ノザンブロッティング及び他のハイブリダイゼーション方法）を用いて、RNAレベルで測定することができる。
【００８２】
宿主由来のサンプルで本発明のポリペプチドレベルを決定するために用いることができるアッセイ技術は当業者には周知であり、ある程度詳細に上記で考察されている（放射能免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット解析及びELISAアッセイ）。本発明のこの特徴は以下の工程を含む診断方法を提供する：（a）上記に記載のリガンドを生物学的サンプルと、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で接触させる工程；及び（b）前記複合体を検出する工程。
ポリペプチドレベルを測定するためのプロトコル、例えばELISA、RIA及びFACSはさらにまた、変化した又は異常なポリペプチド発現レベルの診断の根拠を提供する。ポリペプチド発現の正常又は標準値は、正常な哺乳動物対象、好ましくはヒトから採取した体液又は細胞抽出物を、前記ポリペプチドに対する抗体と複合体形成に適した条件下で一緒にすることによって確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法（例えば光測定手段）によって定量することができる。
本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を、前記ポリペプチドの発現を特徴とする症状又は疾患の診断に用いるか、又は本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンド及び他の化合物で処置される患者をモニターするアッセイで用いることができる。治療薬について上記で述べた態様と同じ態様で診断のために有用な抗体を調製することができる。前記ポリペプチドのための診断アッセイには、前記抗体及びヒトの体液又は細胞若しくは組織の抽出物中で前記ポリペプチドを検出するための標識を利用する方法が含まれる。前記抗体は改変して又は改変せずに用いることができる。さらに前記抗体は、共有結合又は非共有結合によりそれらをレポーター分子と結合させることによって標識することができる。当分野で公知の極めて多様なレポーター分子を使用することができ、それらのいくつかは上記に記載されている。
【００８３】
対象者、生検組織由来のコントロールサンプル及び疾患サンプルで発現されるポリペプチドの量を標準値と比較する。標準値及び対象の値との間の偏差によって疾患を診断するためのパラメーターが確立される。診断アッセイは、ポリペプチド発現の有る、無し、及び過剰を識別し、さらに、治療的介入時のポリペプチドレベルの調節をモニターするために用いることができる。そのようなアッセイはまた、具体的な治療的レジーメンの有効性を判定するために動物実験、臨床試験又は個々の患者の治療のモニターで用いることができる。
本発明の診断キットは以下を含むことができる：
（a）本発明の核酸分子；
（b）本発明のポリペプチド；
（c）本発明のリガンド。
本発明のある特徴では、診断キットは以下を含むことができる：ストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含む第一の容器；前記核酸分子を増幅させるために有用なプライマーを含む第二の容器；及び疾患の診断を容易にするために前記プローブ及びプライマーを使用するための指示書。前記キットはさらにハイブリダイズしないRNAを消化するための試薬を保持する第三の容器を含むことができる。
本発明のまた別の特徴では、診断キットは核酸分子のアレーを含むことができ、前記分子の少なくとも1つは本発明の核酸分子である。
本発明のポリペプチドを検出するために、診断キットは、本発明のポリペプチドと結合する1つ又は2つ以上の抗体；及び前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬を含むことができる。
【００８４】
そのようなキットは、細胞表面糖タンパク質ファミリーのメンバーが関係する疾患又は前記疾患に対する感受性の診断で有用であろう。そのような疾患には以下が含まれ得る：細胞増殖性異常（新形成、メラノーマ、肺、結腸直腸、乳房、膵臓、頭部及び頸部の腫瘍、並びに他の固形腫瘍を含む）；骨髄増殖性異常（例えば白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、血管増殖性異常、カポジ肉腫）；自己免疫疾患/炎症性疾患（アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬及び気道の炎症、喘息、及び器官移植拒絶を含む）；心脈管系異常（高血圧、浮腫、狭心症、アテローム性硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再灌流損傷及び虚血を含む）；神経学的異常（中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、筋萎縮性側索硬化症及び疼痛を含む）；気道の異常（慢性閉塞性肺疾患及び嚢胞性線維症を含む）；発育異常；代謝異常（真性糖尿病、骨粗しょう症、肥満、エイズ及び腎疾患を含む）；感染（ウイルス感染、細菌感染、真菌感染及び寄生虫感染を含む）；並びに他の病的状態。好ましくは、前記疾患は、リンパ球抗原が関係する疾患である。そのようなキットはまた、生殖異常（不妊を含む）の検出のために用いることができる。
本発明の種々の特徴及び実施態様を、INSP201ポリペプチドに具体的に言及しながらこれから実施例によってより詳細に述べる。
細部の改変は本発明の範囲から逸脱することなく実施され得ることは理解されよう。
本発明にしたがえば、可溶性INSP201（例えばINSP201-EC）のアンタゴニスト又は膜結合INSP201のアゴニスト（例えばアゴニスト抗体）は、単独又はいくつかの他の治療的レジーメンまたは抗癌剤と併用して投与し（例えば例えばマルチ薬剤レジーメン）、癌、HIV及び/又はEBV及びB型肝炎感染の治療及び/又は予防のための付加的又は協調的効果を得ることができる。
抗癌剤は、白金化合物（例えばシスプラチン及びカルボプラチン）、ビンカアルカロイド（例えばビノレルビン、ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキシン（例えばドセタキセル及びパクリタキセル）、種々のトポイソメラーゼ阻害剤、IL-2並びのインターフェロンαから選択される。
本発明にしたがえば、可溶性INSP201（例えばINSP201-EC）のアゴニスト又は膜結合INSP201のアンタゴニスト（例えばアンタゴニスト抗体）は、単独又はいくつかの他の療法または薬剤と併用して投与し（例えば例えばマルチ薬剤療法）、炎症及び/又は自己免疫疾患の治療及び/又は予防のための付加的又は協調的効果を得ることができる。
抗炎症剤は、インターフェロン-ベータ、シクロスポリンA、タクロリムス及びシロリムスから選択される。
【００８５】
表１
2008509659.tif 000002
【００８６】
表２
2008509659.tif 000003
【００８７】
実施例
実施例１:INSP201の同定およびin silico解析
上述したように、INSP201ポリペプチドは細胞表面糖タンパク質として機能すると予測される。INSP201についてのSignalP-NN出力はこのタンパク質が配列上位置21と22の間で切断されると考えられるリーダー配列を含むことを示している（Nielsen, H. et al. 1997, Protein Engineering, 10, 1-6; Nielsen, H., and Krogh, A.: Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model. In Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, pp. 122-130 (1998)）。リーダー配列の存在はINSP201タンパク質が分泌タンパク質として機能することと矛盾しない。
INSP201に関するTMHMMの結果はこのポリペプチドが残基406-428（端を含む）に膜貫通ドメインを含むことを示している。TMHMMは既知の二次構造に基づいて膜貫通ドメインを予測するデータベースである。図１はINSP201に関するNetNGlyc (version 1.0)(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)の結果を示している。NetNGlycはニューラルネットワークアルゴリズムに基づいて、アクセプターおよび非-アクセプターの区別を試みて、N-結合グリコシル化に関するコンセンサス配列、Asn-Xaa-Ser/Thr（XaaはProでない）および周辺配列環境を同定するためのプログラムである。グリコシル化は重要な翻訳後修飾であり、タンパク質フォールディング、局在化および輸送、タンパク質可溶性、抗原性、生物学的活性および半減期、および細胞-細胞相互作用に影響を与えることが知られている。
本明細書で提供するこれらの実験およびINSP201の配列情報に基づいて、広範囲のヒト組織型にわたってINSP201転写物の存在を検出してその組織発現を決定するための実験を計画することが可能になった。さらに、病的環境におけるINSP201の関連性をより具体的に立証するために、広範な正常および疾患組織にわたってINSP201転写物の存在を検出するための実験を設計することも可能であろう。
同時に、ヒトゲノムDNAからINSP201遺伝子をクローニングすることは原核又は真核発現系におけるINSP201タンパク質を高レベル発現させることを可能とし、続いてその精製および特性解析を可能とするであろう。例えば、INSP201の更なる生物学的特徴付けに使用できるかもしれないINSP201特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体を精製するために組換えINSP201が使用できる。
【００８８】
実施例２
INSP201ポリペプチドをコードする遺伝子のクローン化の作業が進行中である。これには、ヒトcDNA鋳型の調製、例えば、種々の正常ヒト組織総RNAサンプル（Clontech、Stratagene、Ambion、Biochain Instituteから購入することも自前で調製することもできる）からSuperscriptII RNase H、逆転写酵素（Invitrogen）のような酵素を用いてcDNA鋳型を調製することが含まれる。ヒトcDNAライブラリー（バクテリオファージλベクター中）はClontech、Invitrogenから購入することもでき、λ GT10ベクター中に作製することもできる。特異的なPCRプライマー対はPrimer Designer Software（Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA）などのソフトウエアを用いて仮想的cDNAの完全なコード配列を増幅するために設計することができる。特異的なPCRプライマー対は同じソフトウエアを用いて予測される各エクソンのDNA配列を増幅するように設計することもできる。これらの単離したDNA断片はクローニングベクター、PCR反応および／またはDNA制限／連結反応を用いて所望の順序にアッセンブルすることができる。PCRプライマーは55 + 100CのTmおよび40-60％のGC含量を有するように最適化した。非特異的プライミングが僅かまたは全くないように標的配列（INSP201）に対して高い選択性を有するプライマーを選択しなければならない。次にPCRを用いて注目する遺伝子配列増幅することができる。この配列をクローニングするために必要な手順、たとえば、PCR産物のサブクローニング、コロニーPCR、プラスミドDNA調製およびシーケンシング、および最後に哺乳動物発現ベクターの構築はこの分野で知られたものである（例えば、WO 03/055913 を参照されたし）。
【００８９】
さらなる実験を行い、INSP201ポリペプチドの組織分布およびin vivo発現レベルを、本明細書に開示したヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づいて決定することができる。
例えば、INSP201の転写物の存在は種々のヒト組織からのcDNAのPCRによって調べることができる。INSP201転写物はテストするサンプル中に非常に低いレベルで存在するかもしれない。従って、RNA調製物中の僅かな量のゲノム夾雑物が擬陽性を生じさせるので、種々のヒト組織中の転写物の存在を立証するための実験を計画するには細心の注意が必要である。従って、全てのRNAは逆転写に使用する前にDNaseで処理しなければならない。加えて、各組織について、逆転写を行わないコントロール反応（-ve RTコントロール）を設定することができる。
例えば、各組織からの１μgの総RNAを用い、Multiscript逆転写酵素（ABI）およびランダムヘキサマープライマーを用いてcDNAを生成することができる。各組織について、逆転写酵素以外の全ての成分を加えたコントロール(-ve RTコントロール)を設定する。各組織について逆転写RNAサンプルおよびマイナスRTコントロールに対してPCR反応を行う。INSP201特異的プライマーは本明細書で提供する配列情報に基づいて容易に設計することができる。逆転写サンプル中に正しい分子量の産物が存在し、マイナスRTコントロール中に産物が存在しないことはその組織中に転写物が存在することの証拠とすることことができる。上述したように精製したものに限らず、どのような適切なcDNAライブラリーもINSP201転写物をスクリーニングするために使用することができる。
INSP201ポリペプチドの組織分布パターンはこれらのポリペプチドの機能に関してさらに有用な情報を提供するであろう。
さらに、細胞株におけるこのポリペプチドの過剰発現またはノックダウンを用いて宿主細胞ゲノムの転写活性化に対する影響を決定することができる。INSP201ポリペプチドの二量体化パートナー、共活性化因子、共リプレッサーはウエスタンブロッティングと組み合わせた免疫沈降および質量分析と組み合わせた免疫沈降によって同定することができる。
【００９０】
実施例３−INSP201細胞外ドメインのクローニング
INSP201は単一回膜貫通タンパク質であると予想され、未注釈の細胞外ドメイン（N末端）と保存された細胞内ドメイン（おそらくシグナル伝達に関与する）を有すると予測されている。このタンパク質は３つのエクソンにコードされた全長518個のアミノ酸のタンパク質（1554bp）と予測されている。予測される細胞外ドメインは最初の405アミノ酸（1215bp）によってコードされる。最も3'側32bpを除いて細胞外ドメインは予測されるエクソン１にコードされている。
予測される細胞外ドメインの全体を含む1215bp産物を増幅するためにPCRプライマー対(INSP201-CP1/INSP201-CP2) (図2)を設計した。INSP201-CP2リバースPCRプライマーは51bp長でありエクソン１の3'端と19bpの重複を含み、エクソン２にコードされる細胞外ドメインの32bpを含む。これらのプライマーをゲノムDNAを鋳型としてPCRに使用した。INSP201-CP2プライマーはエクソン１を増幅し、同時にそのPCR産物にエクソン２の32bpを付加する。このPCR産物をゲル上で視覚化し、予測されるサイズのバンドを精製し、PCR4-TOPOクローニングベクターへクローン化した。
配列解析により、INSP201細胞外ドメイン配列を含むクローンを同定した。このクローンはプラスミドpCR4-TOPO-INSP201ECである。
【００９１】
3.1  PCRのための遺伝子特異的プライマー
仮想的cDNAの予測されるコード配列を含む1215bp産物を増幅するために、Primer  Designer Software（Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA）を用いてPCRプライマー対（INSP201-CP1 および INSP201-CP2,表３）を設計した。標的配列（INSP201）に対して高い選択性を有するプライマーを選択した。
【００９２】
3.2  ゲノムDNAからのINSP201細胞外ドメインのPCR
INSP201の予測される細胞外ドメインの大部分は単一エクソンからなっており、従って、ゲノムDNAから増幅することができた。エクソン２にコードされる細胞外ドメインの32bはINSP201-CP2リバースPCRプライマーに含まれており、このプライマーはまたエクソン１の3'端と19bpの重複を含んでいる。遺伝子特異的クローニングプライマーINSP201-CP1/INSP201-CP2および鋳型としてゲノムDNAを用い、１xPlatinum（登録商標）Taq High Fidelity(HiFi)バッファー、2mM MgSO4、200μM ｄNTPs、0.2μMの各クローニングプライマー、１ユニットのPlatinum（登録商標）Taq DNAポリメラーゼHigh Fidelity（Hifi）（Invitrogen）、100ngのゲノムDNA（Novagen Inc.）および、0x、1xまたは2x  PCRx エンハンサー溶液（Invitrogen）を含む最終体積50μlにてPCRを行った。サイクルはMJ Research DNA Engineを用いて、以下のプログラムで行った：94℃にて２分；94℃、30秒、68℃、１分30秒、を35サイクル；続いて68℃にて78分間を１サイクル、および４℃の保持サイクル。
増幅産物は0.8％のアガロースゲル、１x TAEバッファー（Invitrogen）上で視覚化した。予想される分子量（1215bp）のPCR産物を、MinElute DNA精製システム（Qiagen）を用いてゲルから精製し、10μlのEBバッファー（10mM Tris-Cl、pH8.5）中に溶出し直接サブクローニングした。
【００９３】
3.3  PCR産物のサブクローニング
Invitrogen社から購入したTAクローニングキットを用いて、業者指定の条件でPCR産物をトポイソメラーゼI改変クローニングベクター(pCR4-TOPO)にサブクローニングした。簡単に言えば、４μlのゲル精製PCR産物を15分間１μlのTOPOベクターおよび１μlの塩溶液と室温にてインキュベーションした。次に、この反応混合物で大腸菌株TOP10（Invitrogen）を以下のように形質転換した：小分けした50μlのOne Shot TOP10細胞を氷上で溶解し、２μlのTOPO反応物を添加した。この混合物を氷上で１５分間インキュベーションし、次に42℃にて正確に30秒間インキュベーションすることによって熱ショックをかけた。サンプルを氷上に戻し、250μlの加温した（室温）SOC培地を添加した。サンプルを振盪しながら（220rpm）37℃にて１時間インキュベーションした。この形質転換混合物の全量をアンピシリン（100μg/ml）を含むL-ブロス（LB）プレート上にプレーティングし、37℃にて一晩インキュベーションした。
【００９４】
3.4  コロニーPCR
滅菌ようじを用いてコロー二を50μlの滅菌水に接種した。接種物の10μlを、１ｘAmpliTaqTMバッファー、200μM dNTPs、20pmolのT7プライマー、20pmolのT3プライマーおよび１ユニットのAmpliTaqTM（Applied Biosystems）を用い、総反応体積20μlでMJ Research DNA Engineを用いてPCRにかけた。サイクル条件は以下の通りとした：94℃、２分；94℃、30秒、48℃、30秒、および72℃、１分30秒、を30サイクル。更なる解析までサンプルを４℃に保持した（保持サイクル）。
PCR産物を１％アガロースゲル上１x TAEバッファーで解析した。ほぼ予測される分子量（1215bp＋マルチクローニング部位（MCS）による105bp）のPCR産物を示したコローを37℃にてアンピシリンを含む（100μg/ml）５mlのL-ブロス（LB）中で220rpmで振盪しながら一晩増殖させた。
【００９５】
3.5  プラスミドDNA調製およびシーケンシング
ミニプレッププラスミドDNAを５ml培養物からBiorobot 8000ロボットシステム（Qiagen）またはWizard Plus SV Miniprepsキット（Promega、カタログ番号1460）を用い、業者の指示に従って調製した。プラスミドDNAは80μlの滅菌水中に溶出した。DNA濃度はSpectramax 190光度計（Molecular Devices）を用いて測定した。プラスミドDNA（200-500ng）をT7およびT3プライマーおよび遺伝子特異的プライマーINSP201-SP1およびINSP201-SP2を用い、BigDye Terminatorシステム（Applied Biosystems、カタログ番号4390246）を用いて業者の指定に従ってDNAシーケンシングにかけた。プライマー配列は表３に示した。シーケンシング反応物はDye-Exカラム（Qiagen）またはMontage SEQ 96クリーンナッププレート（Milliporeカタログ番号LSKS09624）を用いて精製し、次にApplied Biosystems 3700シーケンサーで解析した。
配列解析によりアミノ酸レベルで予測されるINSP201細胞外ドメインと100％マッチングするクローンが同定された。クローン化されたcDNA断片の配列を図３に示した。クローン化したPCR産物はpCR4-TOPO-INSP201-EC中にある。
【００９６】
3.6  INSP201-ECのための哺乳動物発現ベクターの構築
プラスミドpCR4-TOPO-INSP201-ECをPCR鋳型として用いて、6HISタグをコードする3'配列を有するINSP201-EC ORF配列を含むpEAK12dおよびpDEST12.2発現クローンを、GatewayTMをクローニング法（Invitrogen）を用いて作製した。
【００９７】
3.7  インフレームで6HISタグ配列に融合したゲートウェイ（Gateway）適合INSP201-EC ORFの作製
Gatewayクローニング法の第一段階には、5'末端側がattB1組換え部位およびコザック配列によりフランキングされ、3'末端側がインフレーム６ヒスチジン（6HIS）タグをコードする配列、ストップコドンおよびattB2組換え部位にフランキングされたINSP201-ECのORFを作製することが含まれる。
最初のPCR反応（50μlの最終体積）にはそれぞれ以下が含まれる：１μl（30ng）のプラスミドpCR4-TOPO-INSP201-EC、1.5μl dNTPs(10mM)、10μlの10x Pfxポリメラーゼバッファー、１μl MgSO4(50mM)、0.5μlの各遺伝子特異的プライマー（100μM）(INSP201EC-EX1およびINSP201EC-EX2)、および0.5μl Platinum Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）。PCRは95℃、２分間の初期変性工程に続いて、１２サイクルの94℃、15秒、55℃、30秒、68℃、２分間、および、4℃の保持サイクルで行った。増幅産物を業者の指示に従ってWizard PCR Preps DNA Purification System（Promega）を用いて直接精製し、50μlの滅菌水中に回収した。
【００９８】
第2のPCR反応（最終体積50μl）には、10μl精製PCR1産物、1.5μl dNTPs（10mM）、５μlの10x Pfxポリメラーゼバッファー、１μl MgSO4(50mM)、0.5μlの各Gateway変換プライマー（100μM）（GCPフォワードおよびGCPリバース）および0.5μlのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼを含んでいた。この第2のPCR反応の条件は以下の通り：95℃にて１分間、94℃、15秒、50℃、30秒、68℃、２分間を４サイクル、94℃、15秒、55℃、30秒、68℃、２分間、を25サイクル、続いて、４℃の保持サイクル。産物が予測する分子量（1215+70=1285bp）であることを確認するため、10μlを0.8％アガロースゲル上１x TAEバッファー（Invitrogen）を用いて視覚化した。残りの40μlを１x TAEバッファー中、0.8％アガロースゲル上に装荷し、業者の指示に従ってバンドをWizard PCR Preps DNA精製システム（Promega）を用いて精製し、50μl滅菌水中に回収した。
【００９９】
3.8  Gateway適合INSP201-EC ORFのGatewayエントリーベクターpDONR221、並びに、発現ベクターpEAK12d-PACおよびpDEST12.2へのサブクローニング
Gatewayクローニング法の第２段階には、以下のようなGateway改変PCR産物のGatewayエントリーベクターpDONR221（Invitrogen）へのサブクローニングが含まれる：５μlのPCR2による精製産物を1.5μl pDONR221ベクター（0.1μg/μl）、２μl BPバッファーおよび1.5μl BPクロナーゼ酵素ミックス（Invitrogen）と共に最終体積10μlにて室温にて１時間インキュベーションした。プロテイナーゼK １μl（２μg/μl）の添加により反応を停止さて、37℃にて更に10分間インキュベーションした。この反応物の一部（１μl）を用いて大腸菌DH10B細胞を以下のようにエレクトロポレーションにより形質転換した：DH10Bエレクトロコンピテント細胞（Invitrogen）25μlを氷上で溶解し、１μlのBP反応ミックスを添加した。この混合物を冷却した0.1cmエレクトロポレーションキュベットに移し、BioRad  Gene-Pulser（登録商標）を用いて業者の指定に従って細胞をエレクトロポレーションした。室温まで加温しておいたSOC培地（0.5ml）をエレクトロポレーション後直ちに添加した。この混合物を15ml スナップキャップチューブに移し、振盪しながら(220rpm)37℃にて１時間インキュベーションした。この形質転換混合物の一部（10μlおよび50μl）をカナマイシン（40μg/ml）を含むL-ブロス（LB）プレート上にプレーティングし、37℃にて一晩インキュベーションした。
【０１００】
得られたコロニーの８個について５mlの培養物からQiaprep BioRobot 8000システム（Qiagen）を用いてミニプレッププラスミドDNAを調製した。プラスミドDNA（150-200ng）を21M13およびM13Revプライマー並びに遺伝子特異的INSP201-319F-SP1およびINSP201-570F-SP1シーケンシングプライマーを用いて、BigDyeTerminatorシステム（Applied Biosystemsカタログ番号4336919）を用いて業者の指定に従ってDNAシーケンシングにかけた。プライマーは表３に示した。シーケンシング反応物はMontage SEQ 96クリーンナッププレート（Millipore、カタログ番号LSKS09624）を用いて精製し、Applied Biosystems 3700シーケンサーで解析した。
【０１０１】
次に、INSP201-EX-6HISインサートを含んでいたクローンからのプラスミド（pENTR_INSP201-EC-6HIS）溶出物（２μlまたはおよそ150ng）を、1.5μlのpEAK12d-PACベクターまたはpDEST12.2ベクター（0.1μg/μl）、２μl LRバッファーおよび1.5μlのLRクロナーゼ（Invitrogen）を含む最終体積10μlの組換え反応に用いた。この混合物を室温にて1時間インキュベーションし、プロテイナーゼK １μl（２μg/μl）の添加により停止させ、37℃にてさらに10分間インキュベーションした。この反応物の一部（１μl）を用いて大腸菌DH10B細胞を以下のようにエレクトロポレーションにより形質転換した：DH10Bエレクトロコンピテント細胞（Invitrogen）25μlを氷上で溶解し、１μlのLR反応ミックスを添加した。この混合物を冷却した0.1cmエレクトロポレーションキュベットに移し、BioRad  Gene-Pulser（登録商標）を用いて業者の指定に従って細胞をエレクトロポレーションした。室温まで加温しておいたSOC培地（0.5ml）をエレクトロポレーション後直ちに添加した。この混合物を15ml スナップキャップチューブに移し、振盪しながら(220rpm)37℃にて１時間インキュベーションした。この形質転換混合物の一部（10μlおよび50μl）をアンピシリン（100μg/ml）を含むL-ブロス（LB）プレート上にプレーティングし、37℃にて一晩インキュベーションした。
【０１０２】
得られたコロニーの６個について５mlの培養物からQiaprep BioRobot 8000システム（Qiagen）を用いてミニプレッププラスミドDNAを調製した。pEAK12d-PAC中のプラスミドDNA(200-500ng)を、pEAK12FおよびpEAK12Rプライマー並びに遺伝子特異的INSP201-319F-SP1およびINSP201-570-SP1シーケンシングプライマーを用いて上述したようにDNAシーケンシングにかけた。pDEST12.2ベクター中のプラスミドDNA(200-500ng)を、21M13およびM13Revプライマー並びに上述した遺伝子特異的シーケンシングプライマーを用いてDNAシーケンシングにかけた。プライマー配列を表３に示した。
【０１０３】
配列を確認したクローン（pEAK12d-PAC_INSP201-EC-6HIS）の500ml培養物から、Sambrook J.ら,1989（Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press））の方法を用いてCsCl勾配精製大量調製DNAを調製し、このプラスミドDNAを滅菌水（または10mM Tris-HCl pH8.5）中で１μg/μlの濃度に再懸濁し、-20℃に保存した。
配列を確認したクローン（pDEST12.2_INSP201-EC-6HIS）の500ml培養物から、EndoFree Plasmid Megaキット（Qiagen）を用い、業者の指定に従って無エンドトキシン大量調製DNAを調製した。精製DNAを無エンドトキシンTEバッファーに最終濃度が少なくとも３μg/μlで再懸濁し、-20℃に保存した。
【０１０４】
表３: INSP201 クローニングおよびシーケンシングプライマー
2008509659.tif 000004
下線部配列 = コザック配列
太字 = 停止コドン
二重線配列= Hisタグ
【０１０５】
実施例４−哺乳動物細胞における機能的ゲノム発現およびクローニングしたHis-タグ付きプラスミドpEAK12d-PAC_INSP201-EC-6HISの精製
エプスタイン-バールウイルス核抗原を発現するヒト胚性腎臓細胞293細胞（HEK293-EBNA、Invitrogen）を懸濁物としてEx-細胞VPPRO無血清培地中で維持した（種ストック、維持培地、JRH）。細胞を１x106細胞/mlにて１％FCSを添加した250ml FEME（DMEM/Ham's F12 1:1  19mM HEPES、5g/lグルコース、7.5mM L-グルタミン、4ml/l ITS-X）（全てInvitrogen-Life Technologies）培地に接種する。トランスフェクションミックスのために、500μg DNA（pEAK12d-PAC_INSP201-EC-6HIS）＋10μgレポーター遺伝子DNAを50ml FEME １％FCSで希釈する。これに１ml PEI（１mg/l Polysciences、USA）を添加する。この混合物を室温にて10分間インキュベーションする。10分後、このトランスフェクションミックスを細胞に加え、37℃にて90分間インキュベーター中でインキュベーションする。最後に、DNAが未滅菌であることによりコンタミネーションを防ぐため、2.5ml Pen-Strepを含む残りの200ml FEME １％FSCを補給する。陽性トランスフェクションの確認は第６日の定性的蛍光試験（Axiovert 10 Zeiss）によって行った。第6日（収集日）に、上清（500ml）を遠心し（４℃、400g）固有のアイデンティファイアーを備えたポットに移した。
【０１０６】
4.1  精製工程
C-末端6HISタグを有する組換えタンパク質を含む500ml培地サンプルを１体積の冷却したバッファーA（50mM NaH2PO4;600mM NaCl；8.7％(w/v)グリセロール、pH7.5）で最終体積1000mlに希釈した。このサンプルを0.22μm滅菌フィルター（Millipore,500mlフィルターユニット）を通して滅菌し、１リットル滅菌角形培地ボトル中で４℃にて保存した。
精製は４℃にて自動サンプルローダー（Latomatic）に接続したVISION ワークステーション（Applied Biosystems）で行った。精製手順は、Niイオンを装荷したPoros 20 MC（Applied Biosystems）カラム（10 x 50 mm、3.93ml）による金属アフィニティークロマトグラフィー、およびそれに続くSephadex G-25（Amersham Pharmacia）ゲルろ過カラム（1.0 x 15 cm）によるバッファー交換という連続する2つの工程からなる。
【０１０７】
最初のクロマトグラフィー工程について、金属アフィニティーカラムは30カラム体積のEDTA溶液（100mM EDTA；１M NaCl；pH8.0）で再生し、15カラム体積の100mM NiSO4溶液で洗浄してNiイオンを再装荷し、10カラム体積のバッファーAで洗浄し、続いて７カラム体積のバッファーB（50mM NaH2PO4；600mM NaCl；8.7％ (w/v)グリセロール、400mMイミダゾール、pH7.5）で洗浄し、最後に15mM イミダゾールを含む15カラム体積のバッファーAで平衡化した。サンプルを、Labomaticサンプルローダーによって200mlサンプルループに移し、続いてNi金属アフィニティーカラムに流速20ml/分で装荷した。全てのサンプル（1000ml）をNiカラムに移すため、この装荷工程を５回繰り返した。続いて、このカラムを12カラム体積のバッファーAで洗浄し、次に20mMイミダゾールを含む28カラム体積のバッファーAで洗浄した。20mMイミダゾール洗浄の間に、緩く付着した夾雑タンパク質がカラムから溶出された。組換えHis-タグ付きタンパク質は最後に流速２ml/分の10カラム体積のバッファーBにより溶出し、溶出タンパク質を2.7mlの画分として集めた。
【０１０８】
2番目のクロマトグラフィー工程について、Sephadex G-25ゲルろ過カラムは、２mlのバッファーD（1.137M NaCl；2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4;8mM Na2HPO4；pH7.2）で再生し、続いて、４カラム体積のバッファーB（137mM NaCl；2.7mM KCl；1.5mM KH2PO4;8mM Na2HPO4；20％(w/v)グリセロール；pH7.4）で平衡化した。Ni-カラムから溶出されたピーク画分は自動的にVISIONに備えられたサンプルローダーを通してSephadex G-25カラムに装荷され、タンパク質は流速２ml/分でバッファーCによって溶出された。脱塩したサンプルを2.7ml画分として回収した。この画分を0.22μm滅菌遠心フィルター（Millipore）を通して滅菌し、小分けし、凍結して-80℃にて保存した。このサンプルの一部をSDS-PAGE（4-12％NuPAGEゲル；Novex）上でクマシーブルー染色および抗-His抗体を用いたウエスタンブロットによって解析した。
【０１０９】
4.2  クマシーブルー染色
NuPAGEゲルを0.1％クマシーブルーR250染色液（30％メタノール、10％酢酸）中で室温にて1時間染色し、続いて20%メタノール、7.5％酢酸中でバックグラウンドがクリアになりタンパク質バンドが明瞭に見えるまで脱染色した。
【０１１０】
4.3  ウエスタンブロット
電気泳動後、290mAで4℃にて１時間タンパク質をゲルからニトロセルロース膜へ電気転写した。この膜をバッファーE（137mM NaCl；2.7mM KCl；1.5mM KH2PO4；8mM Na2HPO4；0.1％ Tween 20、pH7.4）中の５％粉末乳で室温にて１時間ブロッキングし、続いて2.5％粉末乳を含むバッファーE中で２つのウサギ抗-Hisポリクローナル抗体混合物（G-18およびH-15、それぞれ0.2μg/ml；Santa Cruz）と４℃にて一晩インキュベーションした。さらに、１時間室温にてインキュベーションした後、この膜をバッファーEで洗浄し（３x10分間）、次に2.5％粉末乳を含むバッファーE中で１/3000に希釈したHRP-結合抗ウサギ二次抗体（DAKOTA、HRP 0399）とインキュベーションした。バッファーE（３x10分間）で洗浄後、この膜をECLキット（Amersham）で１分間現像した。次にこの膜をHyperfilm（Amersham）に曝露し、このフィルムを現像し、ウエスタンブロット像を視覚的に解析した。
【０１１１】
実施例５−TaqMan解析によるINSP201遺伝子発現レベルの解析
リアルタイムPCRをSYBRグリーン化学法を用いてABI PRISM 7700 Sequence Detectionシステムで行った。PCRプライマー対は、産物が解析する配列のイントロンにわたるように設計した。産物の発現レベルはランダムプライマーを用いてRNAサンプルから作製したRT-PCR産物パネルで決定した。
RT-PCRのためのSuperscript III First-Strand Sysnthesisシステム（Invitregen、カタログ番号18080-51）を用いて、最終体積20μlで各サンプルからの総RNAを逆転写した。２μgの総RNAを50ngのランダムヘキサマープライマー、10mMの各dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP、DEPC-処理水と合わせて10μlとした。この混合物を65℃にて５分間インキュベーションし、氷上で１分間冷却した。次に10μl cDNA合成ミックスを別のチューブに調製した：２μl 10x RTバッファー；４μl 25mM MgCl2、２μl 0.1M DTT、１μl RnaseOUTTM（40ユニット/μl）および１μl SuperscirptTM III 逆転写酵素（200ユニット/μl）。このcDNA合成ミックスをRNA/プライマー混合物に添加し、緩やかに混合し、25℃にて10分間インキュベーションし、次に50℃にて50分間インキュベーションした。次に、逆転写酵素を85℃にて５分間インキュベーションすることによって不活化した。この混合物を氷上で冷却し、１μlの大腸菌RNase H（２ユニット/μl）を添加し、37℃にて20分間インキュベーションした。この混合物を氷上で冷却し、滅菌水で1/250に希釈した。この逆転写酵素反応物の希釈物をTaqMan装置（PE Biosystems 7700）でリアルタイムPCR解析にかけた。
【０１１２】
PE Biosystems社のPrimer Expressソフトウエアを用いて以下の配列に従ってヒトINSP201-ECおよびグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼGAPDH（ハウスキーピングコントロール）用のSYBRグリーンリアルタイムPCRプライマーを設計した：INSP201-EC（エクソン１および２の間の境界にわたるプライマー対）、リバース 5'-TCGCCCCACCAGAGTCAC-3'；フォワード 5'- CCGAGGTGAGGGAGTCAACA -3'；GAPDH、リバース 5'- GATGGGATTTCCATTGATGACA -3'；フォワード 5'- CCACCCATGGCAAATTCC -3'；イントロン-GAPDH、リバース 5'- CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT -3'；フォワード 5'- CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC -3'。特異性および最適プライマー濃度をプラスミドpCR4-TOPO-INSP201-ECに対してテストした。特異的GAPDHイントロンプライマーによるPCRを行うことにより可能性のあるゲノムDNA混入を排除した。非特異的増幅がないことは3.5％アガロースゲル電気泳動上でPCR産物を解析し、予想する分子量の単一バンドが生成されていることを保証することによって確認した。
【０１１３】
SYBRグリーンリアルタイムPCRを５μl／ウエルのRT-PCR、25μl/ウエルのSYBRグリーンPCRマスターミックス（PE Biosystems）で、AmpErase ウラシル N-グリコシラーゼ（UNG）（0.5ユニット/ウエル）および20μlのプライマー（300nM）を用いて行った。PCRは50℃にて２分間（cDNAに取りこまれたウラシルを除去するためのAmpErase UNGインキュベーション）、続いて、95℃にて10分間（AmpliTaq Gold活性化のため）、次に95℃、15分間、60℃、２分間を40サイクル、ABI PRISM 7700 Detectionシステムで行った。逆転写されたcDNAサンプルをこのように増幅し、そのCt値（サイクル閾値）を決定した。全てのCt値をハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して正規化した。ゲル電気泳動解析により、INSP201-ECおよびGAPDHに対する単一の特異的なDNAバンドが観察された。SYBRグリーンPCRマスターミックスを用いたリアルタイム検出の原理は、二本鎖DNAへのSYBRグリーン色素の結合によって生じる傾向の増加を測定することによってPCR産物を直接検することに基づいている。各cDNAサンプルにおけるGAPDHとINSP201-EC間の発現レベルの相違はCt値の相違として表した。すなわち、デルタ（δ）Ct=Ct(GAPDH) - Ct(INSP201-EC)。各サンプルについての結果は、以下の式に従って、検出可能なGAPDH発現に必要なサイクル数に対する検出可能なINSP201-EC発現に必要なサイクル数の相違（倍数）として表した：相違倍数＝２(-δCt)。最後に、各cDNAサンプルにおけるINSP201-ECの発現レベルはGAPDH遺伝子発現レベルを100％とし、INSP201-ECについての相違倍数を100で割ることによってGAPDH遺伝子発現レベルに対して相対的に示した。結果を表４〜９に示す。
【０１１４】
表４
2008509659.tif 000005
【０１１５】
表５
2008509659.tif 000006
【０１１６】
表６．
2008509659.tif 000007
【０１１７】
表７
2008509659.tif 000008
【０１１８】
表８
2008509659.tif 000009
【０１１９】
表９
2008509659.tif 000010
【０１２０】
2008509659.tif 000011
【０１２１】
GAPDH発現レベルに対するINSP201-EC発現レベルの閾値を0.3と定義すると、TaqMan発現結果は、INSP163が予想外に、一つの膵臓組織（表４および図４）、一つの肺腫瘍組織（表５および図５）、および種々の炎症性腸疾患組織（表９および図６）に限定され、種々の炎症性腸疾患組織では高いレベルで発現していることを示している。正常な肺組織ではINSP201-ECの発現は見られない（INSP201-ECのGAPDHに対する発現レベルは0.03より下である）。この肺腫瘍は気管支原性癌、より具体的には扁平上皮癌である。
【０１２２】
この特異的な発現パターンから、INSP201-ECが肺癌および炎症性腸疾患に関与しているという結論が導かれる。本発明のポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドを特徴付けるこの驚くべき特性により、これらは薬剤または医薬組成物の調製に特に適したものとなる。従って、本発明のポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、一つの膵臓組織、一つの肺腫瘍組織および種々の炎症性腸疾患組織における限定された発現という予想外の発見を提供する。
【０１２３】
実施例６-サイトメトリービーズアレイ（CBA）を用いたConA刺激したヒトPBMCによって産生されるサイトカインレベルの決定
6.1  概要
この研究の目的は有糸分裂促進物質コンカナバリンA（ConA）で刺激したヒト末梢単核球細胞を用いて、サイトカイン分泌の新たな調節因子を発見することである。
タンパク質INSP201-ECは、ConA刺激したヒトPBMCからのIL-2分泌をEmax＝80％かつEC50=８μg/mlで阻害し、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5またはIL-10のレベルに対しては全く効果が見られなかった。
【０１２４】
6.2  装置およびソフトウエア
96穴マイクロタイタープレート光度計EX（Labsytem）
Graph Pad Prismソフトウエア
Excel  ソフトウエア
フローサイトメトリー Becton-Dickinson
CBA  解析ソフトウエア
細胞培養用のフード
細胞培養用のインキュベーター
遠心機
ピペット
【０１２５】
6.3  材料および試薬
バフィーコート
DMEM GIBCO  Ref:21331-020
ヒト血清AB型  SIGMA  Ref:H1513
L-グルタミン GIBCO Ref:250 030-020
ペニシリン-ストレプトマイシン GIBCO Ref:150 070-063
フィコール PHARMACIA ref:17-1440-03
細胞培養用96穴マイクロタイタープレート  COSTAR Ref:3596
コンカナバリンA SIGMA  Ref: C0412
水溶性デキサメタゾン SIGMA Ref:D2915
ヒトTh1/Th2サイトカインCBAキット  Becton-Dickison Ref:550749
PBS GIBCO Ref:14190-094
滅菌FALCON 50ml  Becton-Dickinson  Ref:2070
グリセロール MERCK Ref:1-04092-2500
96穴マイクロタイタープレート円錐底  NUNC Ref:249570
【０１２６】
6.4  方法
バッフィーコートからのヒトPBMCの精製
DMEMでバッフィーコートを１〜２に希釈
50mlFalconチューブ内の15mlフィコール層上に希釈した血液25mlをゆっくり加える
チューブを遠心（2000rpm、20分間、室温、ブレーキ無し）
中間層（環）を集め、細胞を25mlのDMEMで洗浄し、遠心(1200rpm、５分間)。３回繰り返す。バッフィーコートは総数約600 x 106細胞を与えるであろう。
【０１２７】
活性試験
80μl のDMEM+2.5％ヒト血清+１％ L-グルタミン+１％ペニシリン-ストレプトマイシンで希釈した1.25 x 106 細胞/mlを96穴マイクロタイタープレートに添加
各ウエルに以下を10μl（各ウエル１条件）添加： PBS+20％グリセロール中のINSP201-EC（50μg/mlの濃度から開始）
各ウエルに以下を10μl添加： ConA 50μg/ml（ConAの最終濃度は５μg/ml）
48時間後、細胞懸濁物を集め、ヒトTh1/Th2サイトカインCBAキットBecton−Dickisonによりヒトサイトカインを測定
【０１２８】
CBA  解析
ヒトTh1/Th2捕捉ビーズ混合物を業者の指定に従って調製した（CBA Kit  Becton-Dickinson Ref:550749）、簡単には以下の通り：
−実験に必要なアッセイチューブの数を決定する
−混合前に各捕捉ビーズ懸濁物を激しく撹拌する
−各アッセイにつき各捕捉ビーズ10μlを「混合捕捉ビーズ」と標識した単一のチューブに添加する
−ビーズ混合物を激しく撹拌する
【０１２９】
サンプルの調製
−アッセイ希釈液を用いて上清を1:5に希釈する（20μlの上清＋60μlのアッセイ希釈液）
−サンプル希釈物を混合し、そのサンプルを96穴円錐底マイクロタイタープレート（Nunc）に移す
【０１３０】
ヒトTh1/Th2サイトカインCBAアッセイ手順
−希釈した上清50μlを円錐底マイクロタイタープレート（Nunc）に添加する
−混合捕捉ビーズ50μlを添加する
−50μlのヒトTh1/Th2検出試薬を添加する
−上記プレートを室温にて３時間インキュベーションし、光への直接曝露から保護する
−1500rpmにて５分間遠心する
−上清を注意深く捨てる
−各ウエルに200μlの洗浄バッファーを添加し、1500rpmにて５分間遠心する
−上清を注意深く捨てる
−各ウエルに200μlの洗浄バッファーを添加し、1500rpmにて５分間遠心する
−上清を注意深く捨てる
−各ウエルに130μlの洗浄バッファーを添加してビーズペレットを再懸濁する
−フローサイトメトリーでサンプルを解析する
−データをCBA Application Software、Activity Base、およびMicrosoft Excelを用いて解析する。
−結果はConA刺激した細胞（100％）対非刺激細胞（０％）とするサイトカインの分泌レベルの百分率として得られる。
【０１３１】
6.5：結果−ConA刺激ヒトPBMCへのINSP201-EC投与の影響
結果は、INSP201−ECの存在下における用量応答態様でのIL-2分泌阻害を示している。達成された最大阻害（Emax）は80%である（EC50は8μg/mL）。IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5又はIL-10のレベルには影響は認められなかった。したがって前記阻害はIL-2に特異的である。
炎症性腸疾患、癌および膵組織におけるヒト末梢単核球由来IL-2及びINSP201-EC発現のダウンレギュレーションを考えると、この結果は炎症、IL−2関連疾患、癌、炎症性腸疾患及び/又は膵臓疾患におけるINSP201-ECの関与を示している。
IL-2のアゴニストは公知である。例えば、アボットは、新形成の治療のためにIL-2融合タンパク質を開発した。アムゲンは癌の治療のためにIL-2アゴニストを開発した。アンチキャンサー社は、肺腫瘍の治療のためにIL-2アゴニスト（AC-9401）を開発した。アルアプラゲン社（AplaGen GmbH）は、癌の治療のためにIL-2アゴニスト（IL−2模倣ペプチド）を開発した。アベクチンは、乳房腫瘍の治療のためにIL-2アゴニスト（アベクチン）を開発した。アベンチスファーマは、癌の治療のためにIL-2アゴニストを開発した。バイエル社（Bayer Corp）は、HIV感染、腎細胞癌及びメラノーマの治療のためにIL-2アゴニスト（BAY−50-4798）を開発した。ベイラー医科大学（Baylor College of Medicine）は、慢性リンパ球性白血病の治療のためにIL-2アゴニスト（IL-2/CD40L-発現白血病ワクチン）を開発した。バイオゲンは、肉腫、後天的免疫不全症候群、癌、結腸腫瘍及び腎腫瘍の治療のためにIL-2調節物質（テセロイキン）を開発した。バイオミラUSAは、非小細胞肺癌、HIV感染、肺腫瘍及び腎腫瘍の治療のためにIL-2アゴニスト（リポソーム製剤、ペプチド）を開発した。ベーリンガーインゲルハイムは、メラノーマ、新形成の治療のためにBIWB-2（ワクチン）を開発した。カイロン社（Chiron Corp.）は、HIV感染、腎細胞癌、白血病、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、癌、肺腫瘍、卵巣腫瘍の治療のためにアルデシューキンを開発した。カイロン社は、同様にHIV感染並びに頭部及び頸部の腫瘍の治療のためにPEG-インターロイキン-2を開発した。EMDレキシゲンリサーチは、メラノーマ及び神経系腫瘍の治療のためにEMD-273063（モノクローナル抗体-融合タンパク質）を開発した。EMDレキシゲンリサーチは、癌の治療のためにNHS-IL-2（D20T）（免疫グロブリンとの結合物）を開発した。フラメルテクノロジーは、癌の治療のためにIL-2アゴニストを開発した。イムネックスは、B型肝炎ウイルス感染、メラノーマ及び癌の治療のために組換えペプチドを開発した。癌研究所は、癌の治療のためにワクチンを開発した。マックマスター大学は、メラノーマ、乳房腫瘍及び癌の治療のためにワクチン（アデノウイルスによる遺伝子療法）を開発した。サウスカロライナ・メディカルユニバーシティは、癌の治療のためにペプチド-GN_CSF/IL-2ワクチン接種療法を開発した。米国立衛生院は、腎細胞癌、マラノーマ及び結腸腫瘍の治療のためにIL-2遺伝子療法を開発した。ピボタルバイオサイエンスは、癌の治療のためにIL-2アゴニスト（PB-1）を開発した。スクリプス研究所は、非小細胞肺癌、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、癌、脳腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍及び腎腫瘍の治療のためにKS-IL-2（モノクローナル抗体結合融合タンパク質）を開発した。セラーゲンは、HIV感染、新形成、慢性関節リウマチ及びインスリン依存糖尿病の治療のためにDAB-486-IL-2を開発した。セラーゲンは、同様に非小細胞肺癌、脱毛症、HIV感染、慢性リンパ性白血病、皮膚T細胞リンパ腫、リンパ腫、乾癬、慢性関節リウマチ、非ホジキンリンパ腫、対宿主性移植片病、頭部及び頸部腫瘍、肺腫瘍並びに皮膚炎の治療のためにデニロイキンジフチオックス（タンパク質融合毒素）を開発した。スカイファーマは、感染の治療のためにIL-2アゴニスト（ペプチド）を開発した。聖ユダ小児病院（St Jude Children Research Hospital）は、神経系腫瘍���治療のためにIL-2アゴニスト（ワクチン）を開発した。州立ウイルスリサーチセンター（State Research Center of Virology）及びバイオテクノロジーVECTORは、癌の治療のためにIL-2アゴニスト（ペプチド）を開発した。武田薬品は、B型肝炎ウイルス感染及び癌の治療のためにセルモロイキンを開発した。トランスジーンSAは、メラノーマ及び固形腫瘍の治療のためにTG-1024（アデノウイルスによる遺伝子療法）を開発した。トランスジーンSAは、非小細胞肺癌、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍及び卵巣腫瘍の治療のためにTG-4010（天然痘ウイルスによる遺伝子療法）を開発した。セルテラピーは、中皮腫、腎細胞癌、肉腫、メラノーマ及び乳房腫瘍癌の治療のためにTG-2001を開発した。トランスカリオティックテラピーは、腎細胞癌の治療のためにIL-2、TKTを開発した。カリフォルニア大学は、メラノーマ、前立腺腫瘍及び結腸腫瘍の治療のためにUCLAを開発した。シンシナチー大学は、頭部及び頸部の腫瘍並びに癌の治療のためにワクチニアウイルス療法を開発した。ピッツバーグ大学は、新形成の治療のためにIL-2アゴニスト（ペプチド）を開発した。テキサス大学は、HIV感染の治療のためにINGN-301を開発した。ヴァレンチス/ロシュは、頭部及び頸部腫瘍の治療のためにIL-2/スーパー抗原-B、c脂質遺伝子療法を開発した。バレンチスは同様に、肺腫瘍の治療のためにVLTS-587を開発した。ヴァイカルは、メラノーマの治療のためにIL-2アゴニスト（遺伝子療法−プラスミド）を開発した。ヴァイカルは、腎細胞癌、肉腫、リンパ腫、メラノーマ及び前立腺腫瘍の治療のためにロイベクチンを開発した。ヴィロジネティクス社は、癌の治療のためにALVAC-hIL-2（天然痘ウイルスによる遺伝子療法）を開発した。イードリサーチは、神経変性疾患の治療のためにIL-2アゴニスト（ペプチド）を開発した。
【０１３２】
IL-2のアンタゴニストは公知である。例えば、アフィマックス/アベンチスは、慢性関節リウマチ、自己免疫疾患及び心脈管系疾患の治療のために免疫抑制IL-2アンタゴニストを開発した。ハオブリテク社は、癌の治療のためにモノクローナル抗体を開発した。イムノテクは、対宿主性移植片拒絶症の治療のためにモノクローナル抗体を開発した。スネシス・ファーマシューティカルは、対宿主性移植片病の治療のためにIL-2アンタゴニストを開発した。
インターロイキン-2の機能、製造及び臨床適用は文献に概説されている（Graffen and Liu Cytokine 2004, 28:109-123）。
したがって、IL-2関連疾患は以下の疾患である：新形成、肺腫瘍、癌、乳房腫瘍、HIV感染、腎細胞癌、メラノーマ、慢性リンパ球性白血病、肉腫、後天的免疫不全症候群、結腸腫瘍、腎腫瘍、非小細胞肺癌、白血病、非ホジキンリンパ腫、卵巣腫瘍、頭部及び頸部の腫瘍、神経系腫瘍、B型肝炎ウイルス感染、前立腺腫瘍、脳腫瘍、結腸直腸腫瘍、腎腫瘍、脱毛症、皮膚T細胞リンパ腫、リンパ腫、神経系腫瘍、固形腫瘍、膵臓腫瘍、中皮腫、貧血、潰瘍性大腸炎、胃癌、皮膚硬化症、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、慢性B型肝炎ウイルス感染、高ガンマグロブリン血症、エプスタイン-バールウイルス仲介リンパ球増殖性疾患、急性骨髄性白血病、転移性メラノーマ、関節炎、白血球減少症、血小板減少症、血管形成異常、カポジ肉腫、膵臓疾患又は多発性硬化症。
好ましくは、“癌”は以下に由来する癌から選択される：血液及びリンパ系、皮膚の癌、消化系の癌、泌尿系の癌、乳癌、卵巣癌、婦人科の癌、絨毛癌、肺癌、脳腫瘍、骨腫瘍、類癌腫瘍、鼻咽頭癌、腹膜後腔肉腫、軟組織肉腫、甲状腺癌、又は未知の原発部位の癌。
好ましくは、“肺腫瘍”又は“肺癌”は本明細書では相互に用いられ、良性若しくは悪性原発腫瘍、又は他の多くの器官及び組織の原発癌からの転移に由来するものから選択される。
好ましくは、肺癌は以下を含む原発性肺腫瘍から選択される：気管支原発性癌、気管支類癌、軟骨腫様過誤腫（良性）、単発リンパ腫、肉腫（悪性）又は多病巣性リンパ腫。
好ましくは、気管支原発性癌は、扁平上皮癌、未分化小細胞癌、未分化大細胞癌、腺癌又は気管支肺胞癌から選択される。
好ましくは、気管支原発性癌は扁平上皮癌又は非小細胞肺癌である。
好ましくは、肺癌は、皮膚、乳房、結腸、前立腺、腎、甲状腺、胃、子宮頸、直腸、精巣及び骨の原発癌からの転移又はメラノーマから選択される。
“気管支類癌”又は“気管支腺癌”は互換的に用いることができる用語である、良性であることも悪性であることもあり、両方の性別で等しく発生する。その経過は長い。気管支内の腫瘍部分では主要気管支の管腔が閉塞し得る。重層粘膜からの気泡を含む出血がしばしば発生する、同じ一帯の肺の再発性肺炎及び重層部分の局所的な肺の疼痛が一般的である。転移は一般的ではないが、局所的リンパ節には生じ得る。
好ましくは、膵臓の疾患は、急性膵炎、慢性膵炎、膵臓癌（腺房細胞癌又は混合細胞集団膵臓癌を含む）である。
好ましくは、炎症性腸疾患はクローン病又は潰瘍性結腸炎である。
好ましくは、膜結合INSP201の細胞外部分（グリコシル化されていてもいなくても）、その断片、そのアゴニスト又は膜結合INSP201のアンタゴニストは、炎症、IL-2関連疾患及び/又は炎症性腸疾患の治療、並びに実質器官及び骨髄の移植で有用である。シクロスポリンA、タクロリムス又はシロリムスとの併用を実質器官及び骨髄移植に用いることができる。
好ましくは、膜結合INSP201のアンタゴニストは中和抗体である。
好ましくは、膜貫通ドメインを欠くINSP201ポリペプチドは、炎症、IL-2関連疾患及び/又は炎症性腸疾患の治療に用いられる。
好ましくは、膜貫通ドメインは配列番号:8又は配列番号:24のアミノ酸406から428にわたる。
好ましくは、膜結合INSP201のアゴニストは、癌（例えば肺癌、RCC又はメラノーマ）及び/又はIL-2関連疾患（例えばHIV、EBV又はB型肝炎感染）の治療に用いられる。
好ましくは、膜結合INSP201のアゴニストはアゴニスト抗体である。
好ましくは、膜結合INSP201の細胞外部分は、配列番号:14、配列番号:18、配列番号:22又は配列番号:28から成るか、又は前記を含む。好ましくは、膜結合INSP201の細胞外部分の断片は、配列番号:2、配列番号:10、配列番号:20又は配列番号:26から成るか、又は前記を含む。
好ましくは、膜結合INSP201は配列番号:8、配列番号:12、配列番号:24、配列番号:30、又はエクソン1及びエクソン2の組合せ（すなわち、配列番号:4と組合された配列番号:2、配列番号:10、配列番号:20又は配列番号:2）から成るか、又は前記を含む。
【０１３３】
実施例７：非小細胞肺癌細胞（A549）におけるIKK2活性を決定するアッセイ
腫瘍壊死因子α（TNFα）は、細胞の活性化、分化及びアポトーシスを含む多数の機能を有する多面発現性サイトカインである。TNFαは、細胞のタイプに特異的な態様でアポトーシス作用及びアンチアポトーシス作用の両作用を示す。TNFαアンチアポトーシス作用は、NF-κB活性のアップレギュレーションによって媒介されるようである。NF-κBのTNFα誘発活性化は、細胞死から細胞を保護する、いくつかのアンチアポトーシスタンパク質の発現を増加させる。この経路が阻害されると、TNFαは強力に細胞死を誘発しえる。NF-κBの活性化IKK複合体によって媒介される。INSP201-EC、その融合物又はINSP201を標的とする抗体の活性は、A549細胞（ヒト肺癌細胞）におけるIKK2活性の活性化を測定することができる以下のアッセイによって示すことができる。TNFαは、プロアポトーシス及びアンチアポトーシス経路の両経路を誘導することができるので、シクロヘキシミドによるアンチアポトーシス遺伝子発現の阻止は細胞死をもたらすことができる。細胞がいったんアポトーシスを受けたら、それらは培養表面からはがれる。細胞をクリスタルバイオレットで固定し、続いて洗浄したとき、生細胞のみが染色され、これは450nmで読みとることができる。したがって、この測定はA549細胞における細胞死を決定するために用いることができる。A549細胞をシクロヘキシミドの存在下でTNFαで処理すると、アポトーシスがもたらされる。IKK経路を誘発し、したがってアンチアポトーシス遺伝子をアップレギュレートするために細胞をIL-1β又はTNFαで予備処理すると、TNFα＋シクロヘキシミド処理によって誘導される細胞死から細胞を保護することができる。IL-1βによる予備処理工程の間に、特異的な阻害因子でIKK活性を阻止することによって、TNFα＋シクロヘキシミド媒介細胞死に対するIL1βの保護作用が無効にされ得る。したがって、TNFαシグナル伝達のこの特性を用いて、A549細胞でIKK活性をモニターすることができる。IKK阻害因子は、用量依存的にIL1β媒介保護作用をA549細胞で阻止するが、EGFでは保護作用は存在しない。IKK活性をモニターするために用いた手順は以下のとおりである：
1）A549細胞を播種し（50,000細胞/ウェル）、さらに一晩培養する；
2）化合物（すなわちINSP201-EC、その融合物又はISNP201を標的とする抗体）の存在下又は非存在下で、無血清倍中でIL-1β（1ng/mL）又はTNFαにより細胞を一晩予備処理する。前記化合物はIKK活性の特異的な阻害因子である；
3）前記細胞をTNFα及びシクロヘキシミドで8時間処理する；さらに
4）細胞死をクリスタルバイオレットでモニターする。
【０１３４】
実施例８：動物モデル
INSP201-EC、その融合物又はISNP201を標的とする抗体の活性は、文献に概説（Kamb and Lassota, Drug Discovery Today: Disease Models; vol.1, No.1, 2004, pp.31-36）されているように癌モデル、肺癌モデル（Lahm and Fischer, Drug Discovery Today: Disease Models; vol.1, No.1, 2004, pp.25-30）、又は炎症性腸疾患モデル（Borm et Bouma, Drug Discovery Today: Disease Models; vol.1, No.1, 2004, pp.437 -443）において示すことができる。
さらにまた、本発明のポリペプチドの活性は以下のアッセイの少なくとも１つで確認することができる：
ａ．INSP201-EC、その融合物又はISNP201を標的とする抗体は、正常細胞又は癌細胞の増殖又は生存を調節することができる。
ｂ．INSP201-EC、その融合物又はISNP201を標的とする抗体は、ConAアッセイにおいてIL-2分泌を調節することができる（実施例6）。
ｃ．INSP201-EC、その融合物又はISNP201を標的とする抗体、A549細胞（ヒト肺癌細胞）においてIKK2活性を調節することができる（実施例7）。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１−１】NetNGlyc 1.0.を用いた、INSP201のグリコシル化部位の予想を示す。
【図１−２】図１−１のつづき
【図２−１】INSP201のcDNA及びタンパク質配列を示す。クローニングに用いたPCRプライマーの位置は矢印で示されている。予想される細胞外ドメインは灰色で強調されている。
【図２−２】図２−１の続き
【図２−３】図２−２の続き
【図３−１】INSP201ECのPCR生成物の翻訳によるヌクレオチド配列を示す解析を示す。
【図３−２】図３−１の続き
【図４】主要組織収集物（表２）ついてのINSP201-ECのTaqman解析を示す。
【図５】比較用組織（表3）についてのINSP201-ECのTaqman解析を示す。
【図６】種々の炎症性腸疾患（IBD）生検（表7）についてのINSP201-ECのTaqman解析を示す。
【図７】ConA-刺激PBMCのIL-2分泌のINSP201-ECによる阻害を示す。X-軸はAS902132/2濃度（μg/mL）を示す。Y-軸はサイトカイン分泌（IL-2）の百分率を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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