(57)【要約】  本発明は、組み換え法により製造することができそしてさらなる化学誘導体化の準備が整ったＮ末端遊離チオールを有する新規な修飾タンパク質に関する。特に、本発明は改変された生化学的、物理化学的および薬物動態学的特性を有するエリスロポエチンコンジュゲート化合物に関する。さらに特に、本発明の１つの態様は、式：（Ｍ）ｎ−Ｘ−Ａ−ｃｙｓ−ＥＰＯ（Ｉ）［式中、ＥＰＯは、エリスロポエチンもしくは野生型ヒトＥＰＯと異なる少なくとも１個のアミノ酸を有するエリスロポエチンバリアント、または骨髄細胞に赤血球の生成を増加させる生物学的特性を有するその任意の製薬学的に許容しうる誘導体から選択されるエリスロポエチン部分であり；ｃｙｓはアミノ酸システインを表し、そしてエリスロポエチン部分のアミノ酸配列に対して位置−１に存在し；Ａは−１Ｃｙｓのチオール基にＸを化学的に結合するために用いられる残基部分の構造を示し；Ｘはポリアルキレングリコールもしくは他のポリマーのような水溶性ポリマーであり；Ｍは構築物の循環半減期を増加する有機分子（ペプチドおよびタンパク質を包含する）であり；そしてＮは０〜１５の整数である］のエリスロポエチンコンジュゲート化合物に関する。
2008500275.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質のＮ末端のシステインに結合したポリマーを有する治療用タンパク質コンジュゲートを製造する方法であって、ここで、該システイン残基のチオールが：
ａ）該治療用タンパク質の核酸配列を得ること、
ｂ）細胞における該タンパク質の発現のためのシグナル配列を選択することおよび該シグナル配列のための核酸配列を得ること、
ｃ）（ａ）のタンパク質配列に（ｂ）のシグナル配列を該シグナル配列がコドンＴＧＴの上流であるようにそれらの間にコドンＴＧＴを介挿して設計することにより構築物の形成を導くこと、
ｄ）該構築物が細胞において発現されるようにすること、
ｅ）該構築物によりコードされるポリペプチドを回収すること、ならびに
ｆ）該ポリペプチドをＮ末端のシステインでポリマーに結合すること
を含んでなる該コンジュゲートの共有結合の形成に関与する方法。
【請求項２】
導く段階がオリゴヌクレオチド特異的（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発である請求項１の方法。
【請求項３】
選択する段階が公的に利用可能なコンピューター法の使用を包含する請求項１の方法。
【請求項４】
可能なシグナル配列がヒト成長ホルモンリーダー（配列番号：２）、抗体重鎖リーダー配列（配列番号：３）、抗体軽鎖リーダー配列（配列番号：４）、ヒトインターフェロンデルタ１リーダー配列（配列番号：１２）およびヒトインターフェロンオメガ１配列（配列番号：１３）よりなる群から選択される請求項３の方法。
【請求項５】
式
（Ｍ）ｎ−Ｘ−Ａ−ｃｙｓ−ＥＰＯ  （Ｉ）
［式中、ＥＰＯはエリスロポエチンもしくは野生型ヒトＥＰＯと異なる少なくとも１個のアミノ酸を有するエリスロポエチンバリアント、または骨髄細胞に赤血球の産生を増加させる生物学的特性を有するその任意の製薬学的に許容しうる誘導体から選択されるエリスロポエチン部分であり；ｃｙｓはアミノ酸システインを表し且つエリスロポエチン部分のアミノ酸配列に対して位置−１に存在し；Ａはチオール反応性部分の残基であり；Ｘは親水性ポリマーであり且つ任意であり；Ｍは該部分の循環半減期を増加することができる有機分子であり；そしてｎは０〜１５の整数である］
の部分を含んでなる、骨髄細胞に赤血球の生成を増加させる生物学的特性を有するエリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ）コンジュゲート。
【請求項６】
骨髄細胞に赤血球の産生を増加させ、そして該増加が非結合エリスロポエチンの投与後に見られるものよりも長い期間にわたって該エリスロポエチンコンジュゲートの投与後に持続される請求項３のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項７】
持続効果が非修飾哺乳類エリスロポエチンよりも増加した血清半減期によるものである請求項４のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項８】
部分Ｍが脂肪酸基、脂肪酸エステル基、脂質もしくはリン脂質から各々独立して選択される１〜約６個の有機部分を含んでなる請求項３のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項９】
親水性ポリマーがポリアルキレンオキシドである請求項４のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項１０】
該エリスロポエチンもしくはエリスロポエチン部分が組み換えおよび非組み換え哺乳類エリスロポエチンから選択される請求項３のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項１１】
ポリアルキレンオキシドが置換されたポリエチレンオキシドである請求項７のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項１２】
ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、アルキル−ポリエチレンオキシド、ビスポリエチレンオキシドおよびポリアルキレンオキシドのコポリマーもしくはブロックコポリマーから選択される請求項７のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項１３】
該ポリアルキレンオキシドが約２００〜約１００，０００の間の分子量を有するポリエチレングリコールホモポリマーである請求項７のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項１４】
該親水性ポリマーが線状もしくは分岐状ポリアルカングリコール鎖、炭水化物鎖、アミノ酸鎖またはポリビニルピロリドン鎖であり、そして該親水性ポリマーが約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有する請求項３のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項１５】
該親水性ポリマーが２，０００ダルトンより大きい分子量を有する線状もしくは分岐状ポリアルカングリコール鎖である請求項１２のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項１６】
該親水性ポリマーが線状もしくは分岐状ポリエチレングリコール鎖または線状もしくは分岐状の置換されたポリエチレングリコール鎖であり、そして有機部分Ｍがアルキル基、Ｃ６〜Ｃ４０脂肪酸基、Ｃ６〜Ｃ４０脂肪酸エステル基、脂質基およびリン脂質基から選択される請求項１２のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項１７】
該親水性ポリマーがアルキル基、Ｃ６〜Ｃ４０脂肪酸基、Ｃ６〜Ｃ４０脂肪酸エステル基、脂質基もしくはリン脂質基から選択される有機部分で末端が置換される線状もしくは分岐状ポリエチレングリコール鎖である請求項１４のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項１８】
該有機部分がパルミトイルである請求項１５のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項１９】
有機部分がジステロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である請求項１５のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項２０】
Ａがエチルであり、ＸがＰＥＧもしくは他のポリマーであり且つ任意であり、そしてＭがビオチン、ダンシル、または研究、診断もしくは治療目的のために有用である生物物理学的特性をＥＰＯに与える他の部分である請求項３のコンジュゲート。
【請求項２１】
Ａがエチルである請求項３のコンジュゲート。
【請求項２２】
ＥＰＯがａ）位置２８から少なくとも位置１６５の配列番号：１、ｂ）配列番号：１と異なる少なくとも１個のアミノ酸を有するエリスロポエチンバリアント、またはｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の任意の製薬学的に許容しうる誘導体よりなる群から選択されるエリスロポエチン部分であり；そしてｃｙｓがアミノ酸システインを表し且つ配列番号：１もしくはバリアントのアミノ酸番号２８に対してＮ末端の位置に存在し；Ａがチオール反応性部分の残基を示し；Ｘが親水性ポリマーであり；そしてＭがアルキル基、Ｃ６〜Ｃ４０脂肪酸基、Ｃ６〜Ｃ４０脂肪酸エステル基、脂質基もしくはリン脂質基であり；そしてｎが０〜１５の整数である請求項３のエリスロポエチンコンジュゲート。
【請求項２３】
Ｎ末端にシステイン残基を有するｃｙｓ−ＥＰＯ部分を式Ｙ−Ｘ−（Ｍ）ｎ（式中、Ｙはチオール反応性部分であり、このチオール反応性部分は、残基Ａを含有するかもしくはＥＰＯ−ｃｙｓ−ポリマーコンジュゲートが形成されるような条件下で残基Ａになる）の事前に構築した親水性ポリマー−有機部分複合体と接触させることを含んでなる請求項３のエリスロポエチンコンジュゲートを製造する方法。
【請求項２４】
該ポリマーがポリアルキレンオキシドである請求項２１の方法。
【請求項２５】
該ポリアルキレンオキシドがアルファ置換されたポリアルキレンオキシドである請求項２２の方法
【請求項２６】
該ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールである請求項２３の方法。
【請求項２７】
チオール反応性部分がスルホンである請求項２１の方法。
【請求項２８】
チオール反応性部分がエチルスルホンである請求項２５の方法。
【請求項２９】
チオール反応性部分がジスルフィドである請求項２１の方法。
【請求項３０】
チオール反応性部分がマレイミドである請求項２１の方法。
【請求項３１】
Ｘがペプチドもしくはタンパク質であり、そしてＡがＣｙｓ−１とチオエステルもしくはエステル部分との反応生成物である請求項２１の方法。
【請求項３２】
チオール反応性部分がヨードアセトアミドである請求項２１の方法。
【請求項３３】
Ａがエチルであり、ＸがＰＥＧもしくは他の水溶性ポリマーであり且つ任意であり、そしてＭがビオチン、ダンシル、または研究、診断もしくは治療目的のために有用である生物物理学的特性をＥＰＯに与える他の部分である請求項２１の方法。
【請求項３４】
請求項３のコンジュゲートの治療的に有効な量を投与することを含んでなる貧血の処置方法。
【請求項３５】
該コンジュゲートが、非結合エリスロポエチンと比較して増加した血清半減期を特徴とする請求項３２の方法。
【請求項３６】
遊離アルファアミンを有するシステイン残基が、反応性遊離チオールを提供するために組み換え、酵素的もしくは化学的手段により付加されており、そして該反応性遊離チオールがタンパク質フォールディング、分泌もしくは生物活性を妨げず、そして該チオールが誘導体化されることができそれにより該エリスロポエチンタンパク質の循環半減期を増加させるかもしくはそうでなければ生物活性を改善する組み換えもしくは非組み換え哺乳類エリスロポエチンを含有するエリスロポエチンタンパク質もしくはタンパク質コンジュゲート。
【請求項３７】
式：Ｚ−ｃｙｓ−ＥＰＯ［式中、ＥＰＯはエリスロポエチンもしくは野生型ヒトＥＰＯと異なる少なくとも１個のアミノ酸を有するエリスロポエチンバリアント、または骨髄細胞に赤血球の産生を増加させる生物学的特性を有するその任意の製薬学的に許容しうる誘導体から選択されるエリスロポエチン部分であり、ｃｙｓはアミノ酸システインを表し且つエリスロポエチン部分のアミノ酸配列に対して位置−１に存在し；そしてＺは異種シグナル配列である］の部分。
【請求項３８】
異種シグナル配列がヒト成長ホルモンリーダー配列（配列番号２）である請求項３５の部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換え法により製造することができそしてさらなる化学誘導体化の準備が整った新規な修飾タンパク質に関する。特に、本発明は、改変された生化学的、物理化学的および薬物動態学的特性を有するエリスロポエチンコンジュゲート化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、コロニー刺激因子として機能しそして赤血球合成の調節に関与する主要因子として働く天然で形成される糖タンパク質である。エリスロポエチンは、骨髄における前駆細胞を刺激してそれらを分裂させそして成熟赤血球に分化させることにより作用する。この過程は、循環からの赤血球の破壊もしくは除去が新たな細胞形成の速度により調和がとれるように体内で厳重に制御される。天然に存在するＥＰＯは、腎臓において生産される糖タンパク質である（非特許文献１）。従って、骨髄における前駆体による低いかもしくは不十分な赤芽球生成の症状に加えて、末期の腎臓病のような、腎臓機能が障害を起こすかもしくは破壊される任意の症状は、エリスロポエチン応答性症状に相当する。
【０００３】
多様な細胞タイプがＥＰＯを生産することが示されており、そして毛細管内皮細胞および脳内を包含する、赤血球前駆細胞に加えて多数の細胞がＥＰＯ受容体を発現する。星状細胞は低酸素状態に応答してＥＰＯを生産し（非特許文献２）、そして外因性ＥＰＯは動物モデルにおいて虚血性障害から近くのニューロン細胞を防御することができ（非特許文献３）、従って、ＥＰＯは神経学的障害もしくは疾患からの防御および回復において役割を有し得る。さらに最近では、エリスロポエチンは、急性虚血−再灌流障害から網膜ニューロンを防御し（非特許文献４）、そして実験的脊髄損傷からの神経学的回復を高める（非特許文献５）ことが見出されている。神経系におけるニューロン細胞もしくはグリア細胞を冒す病的神経症状は、虚血、アポトーシス、壊死、酸化的もしくはフリーラジカル損傷および興奮毒性に起因し得る。神経学的病状には、例えば、脳および脊髄虚血、急性脳損傷、脊髄損傷、網膜疾患、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病およびＡＬＳのような神経変性疾患が包含される。従って、外因性ＥＰＯは、現在、これらの症状のいくつかもしくは全てにおいて防御するかもしくは予防すると考えられている。
【０００４】
実際に、ＥＰＯは心筋組織（非特許文献６）および胃腸組織（非特許文献７）を包含する様々な細胞および組織タイプにおいて内分泌（ホルモンの）、自己分泌および傍分泌機能（自己および隣接する細胞タイプへの活性化もしくは刺激作用）を示す（概説には非特許文献８を参照）。従って、投与されるＥＰＯの潜在的治療適応症は、腎不全および貧血をはるかに越えて拡大している。
【０００５】
エリスロポエチンは、ＥＰＯ遺伝子のクローニングおよびチャイニーズハムスター卵巣細胞における発現によって組み換えＤＮＡ技術を用いて製造されている（特許文献１）。組み換えで製造されたＥＰＯは、慢性腎不全と関連する貧血を包含する様々な形態の貧血、ジドブジン処置したＨＩＶ感染患者および骨髄抑制化学療法を受けている癌患者の処置において有効な治療薬として或る間（ｆｏｒ  ｓｏｍｅ  ｔｉｍｅ）市販されている。ＥＰＯ糖タンパク質は、担体としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する通常の緩衝水溶液における静脈内（ＩＶ）もしくは皮下（ＳＣ）注射のいずれかとして、非経口投与される。そのような製剤は、米国においてエポゲン（ＥＰＯＧＥＮ）（Ｒ）およびプロクリット（ＰＲＯＣＲＩＴ）（Ｒ）の商品名で販売される。これらの製品は、防腐剤の入っていない１ｍｌの単回用量もしくは２ｍｌの複数回用量保存バイアルにおいてエリスロポエチンを含有する。
【０００６】
これらの製剤は非常にうまくいくことが証明されているが、ある種の不都合がこれらの製品と関連する。現在、エリスロポエチンのようなタンパク質治療法の生物活性の期間は、短い血漿半減期およびプロテアーゼ分解を受けやすいことにより限定される。ＥＰＯのような治療用タンパク質の短い半減期（４時間）は、最大臨床効能のために頻繁な投与を必要とする。これは、慢性症状の処置には不都合であり、そして低い患者のコンプライアンスをもたらす可能性があり、それ故に最適な結果とはいえない。従って、ＥＰＯの血漿半減期を増加しようと試みられている。
【０００７】
最近では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非抗原性の水溶性ポリマーが治療的および診断的に重要なポリペプチドの共有結合修飾に使用されている。例えば、インターロイキン（非特許文献９；非特許文献１０）、インターフェロン（非特許文献１１）、カタラーゼ（非特許文献１２）、スーパーオキシドジスムターゼ（非特許文献１３）およびアデノシンデアミナーゼ（非特許文献１４）のような治療用ポリペプチドへのＰＥＧの共有結合は、インビボでそれらの半減期を延ばし、そして／もしくはそれらの免疫原性および抗原性を減少することが報告されている。
【０００８】
誘導体化ＰＥＧ化合物は、以前に開示されている（特許文献２）。翻訳後誘導体化のこの方法はまた、ＥＰＯにも適用されている。例えば、特許文献３は、ＰＥＧが酸化された炭水化物を介して連結されるエリスロポエチン活性を有する炭水化物修飾ポリマーコンジュゲートを開示する。特許文献４は、ＥＰＯを包含する、リシン欠失（ｌｙｓｉｎｅ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ポリペプチドバリアントのポリアルキレンオキシド結合を開示する。特許文献５はモノメトキシ−ＰＥＧ−ＥＰＯ（ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）の製造を記述し、ここで、ＥＰＯは遺伝子工学により導入されたシステイン残基を含有し、それに特定のＰＥＧ試薬が共有結合される。他のＰＥＧ−ＥＰＯ組成物は、特許文献６、特許文献７、特許文献８および特許文献９に開示される。
【０００９】
出願人の同時係属出願（特許文献１０）は、ＰＥＧでの抗体および抗体フラグメントの修飾を開示し、そしてＰＥＧがマウスおよび霊長類における循環半減期を増加できることを示す。誘導体化ＰＥＧは、抗体ｃ７Ｅ３のＦａｂフラグメントの修飾に使用された。循環半減期は、ＰＥＧの分子量に直接比例して増加される。ＰＥＧの分子量が増加するにつれて、インビトロでＡＤＰにより誘発される血小板凝集を阻害する化合物の能力は減少され、一方、精製されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合は、ＢＩＡｃｏｒｅにより測定した場合、影響を受けない。ＰＥＧへの脂肪酸もしくは脂質の付加（ＰＥＧ３．４Ｋ−ＤＳＰＥ［ジステロイルホスファチジルエタノールアミン］）は、ＰＥＧ５Ｋより大きい循環半減期をもたらした。ｃ７Ｅ３Ｆａｂに対してｃ７Ｅ３Ｆａｂ’（ＰＥＧ５Ｋ）２のインビトロ活性の減少があるが、ｃ７Ｅ３Ｆａｂ’−（ＰＥＧ３．４Ｋ−ＤＳＰＥ）２の活性はｃ７Ｅ３Ｆａｂと同等である。
【００１０】
出願人の別の同時係属出願（特許文献１１）は、親水性ポリマーのみの付加により達成できるものよりも組成物の循環血清半減期を増加する有機分子に共有結合された非抗原性親水性ポリマーにＥＰＯが共有結合されるＥＰＯを修飾する方法を開示する。該方法は、糖タンパク質にポリマーを結合するための連結基を有する実質的に非抗原性の官能化親水性ポリマーと赤血球生成活性を有するタンパク質もしくは糖タンパク質を反応させる段階を含む。製造方法は、ＥＰＯ上の官能基と反応するポリアルキレンオキシドの活性型とＥＰＯを反応させることを含む。これには、活性エステル、ヒドラジド、ヒドラジン、セミカルバジド、チオセミカルバジド、マレイミドもしくはハロアセチルポリアルキレンオキシドのような活性化ポリアルキレンオキシドが包含される。
【００１１】
純粋に化学的方法を用いてＰＥＧへの結合（「ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）」）によりタンパク質を修飾する多数の方法の多くの場合に制限する特性は、到達可能なリシン残基上に存在し得るアミン基および／もしくはタンパク質のＮ末端のアミンとの無差別なそして不完全であることが多い反応である。他の化学的方法は、修飾戦略の一部として炭水化物基の酸化を必要とし、同様に不完全なもしくは一貫性のない反応および定義されない生成物組成をもたらす。従って、利用可能な現在の選択肢を考慮すると、穏やかな部位特異的な方法でＥＰＯのような治療用タンパク質を修飾する方法は有利である。
【００１２】
天然に存在する分子へのモチーフの修飾もしくは付加は、治療用タンパク質の提供および製造方法の目的のために遺伝子工学を当該技術に実施する者に周知である多数の危険を伴う。これらの影響のうち最も明らかであるのは、生物活性の喪失もしくは部分的喪失である。別の場合では、構築された発現ベクターからの発現レベルは、生産細胞系から受け入れ難いほど低い。別の潜在的な不都合は、天然に存在するタンパク質からでも異種配列のカップリングもしくは融合が、抗原性エピトープを生み出しそして被験体において好ましくない免疫反応を引き起こす可能性があり、それは治療用タンパク質の長期の効能を最終的に限定することである。さらに、最も反応性の官能基、リシンを攻撃する化学的方法を用いるタンパク質の修飾はまた、タンパク質の構造および活性に影響を与え得るタンパク質の等電点およびｐＫａも変える。従って、活性の、安全なそして経済的に製造される製品を提供することが目的である場合、これらの制限を理解することは重要である。
【００１３】
システイン残基の導入は、部位特異的修飾のためにタンパク質上に独特な部位を導入する有効な手段であることが示されている（非特許文献１５）。Ｎ末端のシステインは、特に独特な生化学的特性を有する。アルファ−アミンおよび側鎖チオールの近接近のために、Ｎ末端のシステイン残基はエステル部分と反応して安定なアミド結合を形成する（非特許文献１６）。これは、非常に選択的なそして安定した方法でタンパク質のＮ末端へのペプチド、タンパク質および他の分子の結合を可能にする。システイン上の遊離アルファ−アミンの存在はまた、局所ｐＨをよりアルカリ性にし、内部のシステイン上に存在するチオールに対してＮ末端のチオールのより高い反応性ももたらす。結果として、別の利点は、結合反応がより低いｐＨで行われることができ、タンパク質の非特異性が低い誘導体化をもたらすことである。チオエステルへのシステインのチオール基の転化のさらなる利点は、それがそのシステインの等電点もしくは電荷の変化をもたらさないことである。
【００１４】
しかしながら、分泌タンパク質において、システイン残基は一般にジスルフィドシステインとして存在し、そしてタンパク質の三次構造の安定化に寄与する。追加のシステイン残基を付加することは、タンパク質の安定性を損なう危険性がある。例えば、ＥＰＯは全てジスルフィド架橋に関与する４個のシステイン残基を含有する。従って、Ｎ末端での５番目のシステイン残基の導入は、適切なフォールディング、従って受容体認識を妨げ得る可能性がある。
【００１５】
成熟Ｎ末端でのアミノ酸の導入は、分泌タンパク質を修飾する場合に興味深い挑戦、すなわち、シグナル配列切断部位の破壊を与える。分泌タンパク質の大部分は、生合成が始まるＮ末端に追加領域（シグナルもしくはリーダー配列と呼ばれる）を有して翻訳され、それはタンパク質を小胞体（ＥＲ）にターゲッティングする。シグナル配列は、ある種の特徴を共有し；それらは通常約２０〜２５アミノ酸であり、Ｎ末端で塩基性であり、中央で非常に疎水性であり、そしてシグナルペプチダーゼによる切断の部位の前に小さい非荷電残基を有する。疎水性領域は、ＥＲ受容体複合体との相互作用に必須であり、そして酸化環境における翻訳およびフォールディングを促進する。膜からの分泌の際に、シグナル配列は、タンパク質における唯一の遊離アルファアミンになるタンパク質の機能性成熟Ｎ末端アミノ酸で酵素的に切断される。シグナル部分は保持され、そして細胞の内部で分解される。従って、新しいＮ末端アミノ酸になる前駆体タンパク質配列へのアミノ酸の付加
は、シグナル配列と通常の成熟Ｎ末端の間に追加の残基を置くこと、それにより切断および分泌の効率への未知の影響を有して生来の切断部位を変えることを必要とする。ヒトＥＰＯ前駆体ポリペプチドは、２７アミノ酸のシグナル配列を有する。いったん細胞のＥＲコンパートメントに入ると、シグナルペプチドはシグナルペプチドのグリシン２７と成熟ＥＰＯ鎖のアラニン２８の間で切断される。
【００１６】
遺伝子工学法は、核酸コーディング配列を付加することもしくは変えることによりタンパク質にアミノ酸を付加するかもしくは変えるために使用することができる。従って、当業者は、標準的な技術を用いてコーディング配列もしくはｃＤＮＡを操作することにより天然に存在するＮ末端アミノ酸残基のＮ末端にシステイン残基を有する新規な治療用タンパク質配列を作り出す可能性を認識する。設計されたタンパク質のＮ末端がシステインである確率を上げるために、一般に、内因性シグナル配列は、タンパク質をＥＲにターゲッティングするのに効率がよい上に適当な切断部位をもたらすことが既知であるもので置換されなければならない。
【００１７】
異種シグナル配列は、例えば、酵母（特許文献１２および非特許文献１７）および哺乳類細胞（非特許文献１８）におけるＥＰＯ発現のために代わりのシグナル配列を用いて、タンパク質の成熟Ｎ末端を設計するために成功裡に使用されている。しかしながら、治療用タンパク質のＮ末端設計形態を分泌するために使用されている異種シグナル配列の報告はない。
【特許文献１】Ｌｉｎ，ＵＳ５６１８６９８明細書
【特許文献２】ＵＳ５４３８０４０明細書
【特許文献３】ＷＯ９４／２８０２４明細書
【特許文献４】ＵＳ４９０４５８４明細書
【特許文献５】ＷＯ９０／１２８７４明細書
【特許文献６】ＥＰ６０５６９３明細書
【特許文献７】ＵＳ６，０７７，９３９明細書
【特許文献８】ＷＯ０１／０２０１７明細書
【特許文献９】ＥＰ５３９１６７明細書
【特許文献１０】ＵＳＳＮ０９／４３１，８６１明細書
【特許文献１１】Ｕ．Ｓ．第６０／３７７，９４６号明細書
【特許文献１２】ＵＳ４７７５６２２明細書
【非特許文献１】Ｊａｃｏｂｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１３（６００５），８０６−８１０（１９８５）
【非特許文献２】Ｍａｓｕｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１９４８８−１９４９３
【非特許文献３】Ｓａｋａｎａｋａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：４６３５−４６４０
【非特許文献４】Ｊｕｎｋ，ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０６５９−１０６６４
【非特許文献５】Ｇｏｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：９４５０−９４５５
【非特許文献６】Ｐａｒｓａ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１１２（７）：９９９−１００７
【非特許文献７】Ｆａｔｏｕｒｏｓ，Ｍ．Ｓ．，２００３，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １６５（１０）：９８６−９９２
【非特許文献８】Ｌａｐｐｉｎ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：４８５−４９２
【非特許文献９】Ｋｎａｕｆ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８，２６３，１５，０６４
【非特許文献１０】Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９５，３３，４４７
【非特許文献１１】Ｋｉｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  １９９０，６，１５７
【非特許文献１２】Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９７７，２５２，３，５８２
【非特許文献１３】Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，Ｃ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３，１３１，２５
【非特許文献１４】Ｃｈｅｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９８１，６６０，２９３
【非特許文献１５】Ｋｕａｎ，Ｃｈｉｅｎ  Ｔｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９，７６１０−７６１６（１９９４）
【非特許文献１６】Ｔａｍ，Ｊａｍｅｓ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５１，３１１−３３２（２０００）
【非特許文献１７】Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ７９，１６７−１８０
【非特許文献１８】Ｋｉｍ，Ｃｈａｎｇ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅ  １９９，２９３−３０１
【発明の開示】
【００１８】
［発明の要約］
本発明は、生物活性ポリペプチドコンジュゲート組成物を提供し、ここで、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｎ末端のシステインを有する結合パートナーペプチドをもたらすように修飾され、そしてこのパートナーは、有機分子に共有結合されることもできる非抗原性親水性ポリマーに共有結合的にそして部位特異的に結合され、その修飾のいずれも組成物の循環血清半減期を増加する。
【００１９】
さらに特に、本発明の１つの態様は、従って、式
（Ｍ）ｎ−Ｘ−Ａ−ｃｙｓ−ＥＰＯ  （Ｉ）
［式中、ＥＰＯは、エリスロポエチンもしくは野生型ヒトＥＰＯと異なる少なくとも１個のアミノ酸を有するエリスロポエチンバリアント、または骨髄細胞に赤血球の産生を増加させる生物学的特性を有するその任意の製薬学的に許容しうる誘導体から選択されるエリスロポエチン部分であり；ｃｙｓはアミノ酸システインを表し且つエリスロポエチン部分のアミノ酸配列に対して位置−１に存在し；Ａは−１Ｃｙｓのチオール基にＸを化学的に結合するために用いられる残基部分の構造を示し；Ｘはポリアルキレングリコールもしくは他のポリマーのような水溶性ポリマーであり；Ｍは構築物の循環半減期を増加する有機分子（ペプチドおよびタンパク質を包含する）であり；そしてＮは０〜１５の整数である］
により記述されるＥＰＯ誘導体に関する。カップリングもしくは価数に適切な官能基を与えるために他の分子がＡとＸの間もしくはＸとＭの間に含まれ得る。有機分子Ｍは任意である。Ｘは好ましくはポリエチレングリコールのようなポリアルキレンオキシドであり且つ同様に任意である。
【００２０】
本発明は、また、貧血または減少した内因性エリスロポエチンもしくは赤血球生成と関連する他の症状または赤血球の増加が所望される症状を処置する方法も提供する。本発明の方法には、また、赤血球生成欠損に直接関係していないが筋肉、粘膜組織、生殖腺機能および認知機能の維持もしくは増大と関連するＥＰＯの抗アポトーシス効果に関係し得る症状を処置するための本発明の組成物の使用も包含される。本発明の方法には、さらに、神経組織もしくは他の組織を虚血性、化学的もしくは物理的損傷から防御するか、維持す
るか、もしくは処置するための本発明の組成物の使用が包含される。本発明のこの態様として、処置には、そのような治療を必要とする哺乳類に本明細書に記述されるコンジュゲートの有効量を投与することが包含される。本発明の結果として、インビボで実質的に長期の赤血球生成活性を有するコンジュゲートおよび該コンジュゲートを製造する方法が提供される。
【００２１】
本明細書に開示される技術の利点は、Ｎ末端システイン残基を含有するＥＰＯバリアントの発現によって得られる実質的に定義された最終生成物組成およびＥＰＯの増加した半減期である。
【００２２】
［詳細な記述］
本発明のタンパク質は、治療用タンパク質のＮ−ｃｙｓバリアントであり、そして特異的で且つ安定な化学修飾を受けることを可能にするＮ末端の遊離チオールすなわち「ＮＴＦＴ」を有する。天然に存在するかもしくは組み換えで製造されるタンパク質は、システイン残基が分子の成熟Ｎ末端にあるようにプロセシングされることはほとんどない。本発明の方法は、治療的に有益な成熟した天然に存在するヒトタンパク質もしくは設計したタンパク質のＮ末端で付加されたシステインの提示を「強いる」ために異種シグナル配列を使用する。異種シグナル配列の使用は、内因性リーダーがそのような変化を受け入れることができない場合に起こり得る所望のＮ末端システイン残基の不正確なもしくは誤ったプロセシングの可能性を防ぐ。不十分なプロセシングもしくは不正確なプロセシングは、ａ）不十分な発現率をもたらすシグナル配列の不十分な切断効率あるいはｂ）システインを全く残さないかまたはそれを＋２、＋３もしくは＋ｎの位置で残すＮ末端での不適切な切断をもたらす。後者の場合、タンパク質の化学修飾の特異性および容易さは、システインが成熟タンパク質における＋１の位置にある場合ほど最適ではない。
【００２３】
特定のタンパク質を細胞外分泌にターゲッティングするプロセシングもしくは「シグナル」ペプチドを含んでなる前駆体タンパク質は、免疫グロブリンタンパク質について早くも１９７２年に記載され、そしてさらに最近ではこれらの配列の部分構造ならびに関連するプロセシング段階および酵素がより詳細に研究されている（概説には、Ｄａｌｂｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６：１１２９−１１３８を参照）。
【００２４】
１つの特に好ましいシグナル配列は、ヒト成長ホルモンリーダー配列（配列番号：２）であるが、しかしながら、理論的には、必要とされるＮ末端を生成することにおいて効率よくそして正確に働き得る多数の哺乳類異種リーダー配列がある。成熟Ｎ末端システインタンパク質をもたらすシグナルペプチドを含んでなる他の哺乳類前駆体ポリペプチドは、インターフェロンアルファ遺伝子ファミリーと関連するものである。タンパク質がシグナルペプチドとして含んでなる確率および最も可能性が高い切断部位を予測するために加重マトリックス法（ＥＭＢＯＳＳ）であるＳｉｇＣｌｅａｖｅおよび隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づくＳｉｇＰｆａｍのような、インシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）予測アルゴリズムが開発されている。ヒト前駆体タンパク質からの様々なシグナル配列をＳｉｇｎａｌＰバージョン３．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／；Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０：７８３−７９５，２００４）を用いて所望の成熟タンパク質としてＮ−Ｃｙｓ−ＥＰＯにカップリングした場合に予測される切断部位と一緒に表１に示す。ＳｉｇｎａｌＰ  ｖ３．０は、実験的に確かめられた切断部位のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースからの真核生物タンパク質に対して訓練されたニューラルネットワーク（ＮＮ）およびＨＭＭの両方を与える。これらの予測に基づいて、（表１）は、天然のＥＰＯリーダー配列がＮ−Ｃｙｓ−ＥＰＯのリーダーとして不適当であると予測され、一方、ｈＧＨリーダーおよびインターフェロン（ＩＦＮ）タンパク質シグナルペプチドの全てではないがいくつかはＮ末端ｃｙｓを有するタンパク質をもたらすと予測されることを示す。
【００２５】
【表１】
2008500275.tif 000003
【００２６】
【表２】
2008500275.tif 000004
【００２７】
様々な哺乳類発現ベクターが、組み換えタンパク質を発現するために成功して使用されている。本発明の方法により製造される典型的な組成物は、強力なウイルスプロモーター、共通コザック配列、興味のあるタンパク質の前駆体をコードするＤＮＡ（ｈＨＧシグナルペプチド：ＥＰＯ）、ヘキサＨｉｓタグ、終止コドンおよび例えばＳＶ４０（シミアンウイルス）ポリアデニル化シグナルもしくはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル由来のポリアデニル化シグナルを利用する単純な発現ベクターを含んでなる。
【００２８】
本発明の組成物を含有する発現ベクターがいったん構築されると、新規なタンパク質は、宿主細胞をトランスフェクションする常法を用いて発現される。一過性トランスフェクションもしくは安定なトランスフェクション方法を用いることができ、そして哺乳類シグナル配列をプロセシングすることができる任意の宿主細胞（哺乳類が好ましい）を用いることができる。有用な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、Ｗ１３８、２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞系である。細胞培養物からのタンパク質の回収および精製の方法は当業者に周知であり、そしてヘキサ−ヒスチジンもしくはＦＬＡＧのような精製「タグ」（“ｔａｇｓ”）と呼ばれる有用なアミノ酸モチーフの追加コーディング領域の付加を含む。
【００２９】
原核生物により発現される場合、ポリペプチドは典型的にＮ末端メチオニンもしくはホルミルメチオニンを含有し、そしてグリコシル化されず、従って好ましくない。しかしながら、本発明は、特にグリコシル化されたタンパク質を製造することが目的ではない場合に上記の哺乳類シグナルペプチド含有ベクターおよび哺乳類宿主細胞の使用に限定されないことを当業者は認識する。タンパク質の発現および分泌のための細菌システムは既知であり、そして使用される。例えば、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ヌクレアーゼシグナルペプチドコーディング配列は、バシラスにおけるプロインシュリンの製造のための構築物において使用されている、例えばＥＰ０１７６３２０Ａ１を参照。様々な分泌シグナルペプチド配列は、バシラスにおいて有用であり、そして操作を受けることができ、本発明のＮ末端システインポリペプチドを製造することができる。そのような分泌コーディング配列には、バシラス・アミロリキファシ
エンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）のアルファ−アミラーゼシグナルペプチド配列、バシラス・セレウス（Ｂ  ｃｅｒｅｕｓ）の０−ラクタマーゼＩ型シグナルペプチド配列、バシラス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼシグナルペプチド配列およびバシラス・アミロリケファシエンス（Ｂ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）サブチリシンシグナルペプチド配列が包含されるが、これらに限定されるものではない。上記の分泌コーディング配列は、ベクターの転写および翻訳活性化配列と機能性Ｎ末端システインポリペプチドをコードする配列との間に適切に連結されることができる。
【００３０】
ＥＰＯ
ＥＰＯは、肝臓において主に生産され、そして前駆細胞上の受容体ダイマーへの結合によって機能し、赤血球への分化およびその後の増殖をもたらす（Ｌｉｖｎａｈ，Ｏ．ｅｔ
ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９，２８３，９８７−９９０）。ＥＰＯは２つの結合面を介して受容体に結合し、その一方はもう一方より受容体に対する高い親和性を有する。ＥＰＯの結晶構造は、解明されている（Ｓｙｅｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９５（６７０１），５１１−５１６（１９９８）；Ｃｈｅｅｔｈａｍ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＮＭＲ  ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ  ａｖｅｒａｇｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．８−Ｓｅｐ−１９９８．タンパク質データベースＩＤ  １ＢＵＹ）。その受容体に結合するＥＰＯの結晶構造もまた記述されている（Ｓｔｒｏｕｄ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ｒｅｉｄ，Ｓ．Ｗ．，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．タンパク質データベースＩＤ  １ＣＮ４を参照）。
【００３１】
エリスロポエチン遺伝子は、１９３アミノ酸のプロ−ポリペプチド（配列番号：１）をコードする５個のエキソンを有する。２７アミノ酸のリーダー配列は、プロ−ポリペプチドのアミノ末端から切断して除かれ、機能性の１６６アミノ酸ポリペプチドをもたらす。しかしながら、チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現された組み換えヒトエリスロポエチンは１６５アミノ酸のみを含有し、ａｒｇ１６６を喪失していた。このメカニズムは定義されておらず、そして血漿中を循環するエリスロポエチンもまたａｒｇ１６６を欠くかどうかもしくはさらなるＣ末端のトランケーションは不明である。エリスロポエチンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は両方とも、哺乳類間で非常に保存されている。
【００３２】
本発明のＥＰＯの生物活性型への修飾のための出発材料は、好ましくは、ヒトエリスロポエチン（配列番号１）もしくはｄｅｓ−１６６Ａｒｇ配列番号：１、または生物活性を有することが既知である他のバリアント、または骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の生成を増加させる生物学的特性を有するその他の誘導体である。ＥＰＯ糖タンパク質は、自然源から得られるかもしくは引用することにより本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．４，７０３，００８；５，４４１，８６８；５，５４７，９３３；５，６１８，６９８および５，６２１，０８０に開示されるような既知の方法を用いて組み換えで製造されることができる。野生型ヒトＥＰＯにおいて、位置２４、３８および８３のＡｓｎ残基は、３個の天然に存在するＮ結合型グリコシル化部位に相当する。これら３個の位置および１個のＯ結合型部位（Ｓｅｒ１２３）でのグリコシル化は、天然のおよび哺乳類細胞培養物において生産される組み換えＥＰＯの両方の重量の約４０％を占める。遺伝子操作されたバリアントは、より多いか、より少ないかもしくは異なるグリコシル化部位を有して作製されている。所望の生物活性を有するエリスロポエチンタンパク質の非グリコシル化形態、低グリコシル化もしくは高グリコシル化形態もまた、本発明の組成物において用いることができる。非グリコシル化タンパク質は原核生物により製造され、従って、エシェリキア・コリのような原核細胞を用いる発現系における哺乳類タンパク質のコドン適合した核酸配列の使用は、非グリコシル化タンパク質産物を製造する能力をもたらす。そのような方法は、ＷＯ００／３２７７２に教示される。生物活性を有する位置２４、３８もしくは８３のＡｓｎ残基のいずれかのアミノ酸交換により製造される改変されたグリコシル化パターンを有する他のバリアントもまた、記述されている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２０４３４−２０４３９）。
【００３３】
高グリコシル化ＥＰＯを製造する方法は、ＷＯ０２４９６７３およびＥＰ６４０６１９に教示される。追加のＮ結合型炭水化物鎖をｒＨｕＥＰＯ分子に付加することができる。哺乳類細胞において、Ｎ結合型炭水化物は、炭水化物付加の共通配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）（ここで、ＸはＰｒｏもしくはＡｓｐ以外のアミノ酸である）でポリペプチド骨格に付けられる。このプロセスは、細胞の小胞体において起こり、そして膜結合型オリゴ糖転移酵素により触媒される。認識共通配列の知識は、クローン化されるＤＮＡの配列において必要な変更を行うことによりポリペプチド骨格に新たな炭水化物結合部位を導入するために遺伝子工学者により利用されている。もちろん、共通配列は、炭水化物付加と適合する位置、例えば、受容体結合を妨げないかまたは分子のフォールディング、構造もしくは安定性を危うくしない位置で知的に付加されなければならない。エリスロポエチンアナログ、ＮＥＳＰは、２つの成功裡にグリコシル化された４鎖アナログの炭水化物付加部位を１つの分子に合わせることにより作製された。ＮＥＳＰのアミノ酸配列は、５つの位置でヒトエリスロポエチンのものと異なり（Ａｌａ３０Ａｓｎ、Ｈｉｓ３２Ｔｈｒ、Ｐｒｏ８７Ｖａｌ、Ｔｒｐ８８ＡｓｎおよびＰｒｏ９０Ｔｈｒ）、位置３０および８８のアスパラギン残基で追加のオリゴ糖結合を可能にする（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９６：８２ａ（２０００））。特許出願公開ＷＯ０１８１４０５に開示される高グリコシル化バリアントは、３０、５３および８８；３０、５５および１１４；もしくは３０、８８および１１４で３個の追加のＮ結合型グリコシル化部位を有するものである。
【００３４】
改変されたグリコシル化を有するＰＥＧ付加ＥＰＯバリアントもまた記述されており（ＵＳ６５８３２７２およびＵＳ６３４０７４２）、ここで、付加されるグリコシル化共通配列は、主に位置３０、５７、５９、６７、８８、８９、１３６および１３８にある。
【００３５】
タンパク質を設計し直す方法
本発明のポリペプチドバリアントもしくはその機能性フラグメントは、当該技術分野において既知であるいくつかの方法のいずれかを用いて作製することができる。オリゴヌクレオチド特異的（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発は、突然変異をそれらの表現型に関係なく体系的に導入するための周知のそして効率のよい方法であり、そしてそれ故にタンパク質工学への定方向進化方法に適している。該方法論は柔軟性があり、正確な突然変異が制限酵素の使用なしに導入されることを可能にし、そして比較的安価である。ポリメラーゼ連鎖反応および他の増幅方法論を包含する、組み換えおよび酵素合成は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）に、そしてＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）に記述されていることが見出されることができる。
【００３６】
オリゴヌクレオチド選択的突然変異誘発を用いて合成される突然変異ポリペプチドの効率のよい合成および発現の方法を行うことができ、そして引用することにより本明細書に組み込まれるＡｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）ＤＮＡ，２：１８３およびＫｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−４９２（１９８５）により記述されるように当該技術分野において周知である。
【００３７】
また、例えば、単一もしくは複数アミノ酸突然変異をＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＴＭ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において利用されるような突然変異アミノ酸（１つもしくは複数）をコードするオリゴヌクレオチドを用いて作製することができる。野生型もしくは親タンパク質をコードするｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発もまた、引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｈｉｇｕｃｈｉ
ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７３５１−７３６７（１９８８）により記述される技術を用いて成し遂げることができる。一般に、この方法は２組のプライマー：突然変異させるタンパク質の全ｃＤＮＡに隣接しそしてそれ故にＰＣＲ増幅の際にｃＤＮＡの全長コピーを生成する第一の対、および相互に相補的でありそして所望の突然変異を含有する第二の対の使用を必要とする。これらのプライマーは最初に２組の生成物、３’末端の近くに導入された突然変異を有するもの、および５’末端の近くに導入された突然変異を有するものを生成する。しかしながら、これら２つの生成物は相互にならびにＰＣＲプライマーにも相補的であるので、これら２つの生成物は両方向に伸長される重複する二本鎖を形成することができる。従って、２つのプライマー組の存在下でのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を用いて図１に示されるような所望の構築物をコードする全長ｃＤＮＡ（配列番号：１４）を作製することができる。
【００３８】
遺伝子もしくは遺伝子フラグメントを製造する合成のもしくは最低でも無細胞の方法もまた、既知の当該技術分野の十分に範囲内である。オリゴヌクレオチドの順次アニーリングにより大きい核酸ポリマーを合成する方法は、例えば、両方ともＥｖａｎｓへのＰＣＴ出願第ＷＯ９９／１４３１８号にそして米国特許第６，５２１，４２７号に記述されていることが見出されることができる。インビトロ法を用いて改変された遺伝子もしくは完全なコーディング配列を合成する方法は、以前にヒトＥＰＯに適用されている：例えば；ＵＳ６１５９６８７およびＵＳ６５３７７４６を参照。改変された特性を有するＥＰＯおよび他のタンパク質を製造するためにインビボで突然変異を導く方法は、ＥＰ０８４３７２５およびＵＳ６４４４４４１に教示される。
【００３９】
ＥＰＯもしくはＥＰＯバリアントポリペプチドのような活性タンパク質のＮ末端でシステインを付加する本発明の方法は、所望の生物活性を有するタンパク質のバリアントもしくは突然変異体型のいずれかを用いて実施することができる。該方法は、真核細胞系を用いて発現される糖タンパク質、特にＥＰＯに実施することができ、またはアシアル化（ａｓｉａｌａｔｅｄ）もしくは完全にアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）タンパク質もしくはＥＰＯに実施することができる。
【００４０】
水溶性ポリマー
特に好ましい水溶性ポリマーは、ＰＥＧの数種の１つである。ＰＥＧは塩基性炭素単位、ＨＯ−（ＣＨ２）２−ＯＨからなり、そして名称：ポリエチレングリコール（様々な分子量）；ＰＥＧ２００；ＰＥＧ（様々な分子量）；ポリエチレンオキシド；カーボワックス；アルファ−ヒドロ−オメガ−ヒドロキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）；エトキシル化１，２−エタンジオール；ポリオキシエチレンエーテル；エムカポール（Ｅｍｋａｐｏｌ）２００；ガファノール（Ｇａｆａｎｏｌ）ｅ２００：プルリオールｅ２００；ポリジオール２００；ポリオックスＷＳＲ−３０１；マクロゴール；およびポリオキシエトレンイン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｌｅｎｅＩｎ）の下で様々な形態で販売される。ＰＥＧに基づくポリマーが使用される本発明の態様として、それらは約２００〜約１００，０００ダルトンの間、そして好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの間の平均分子量を有することが好ましい。２，０００〜１２，０００ダルトンの分子量が最も好ましい。
【００４１】
代わりの水溶性ポリマー物質には、デキストラン、ポリビニルピロリドン、多糖、澱粉、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドもしくは他の同様の非免疫原性ポリマーのような物質が包含される。当業者は、前述のものが単に実例であり、そして本発明における使用に適当な非抗原性ポリマーのタイプを限定するものではないことを認識する。
【００４２】
インビボにおける延長された薬物動態学的半減期を与える有機分子
半減期を増加するために親水性ポリマーに結合することができる有機分子には、脂肪酸、ジカルボン酸、ジカルボン酸のモノエステルもしくはモノアミド、飽和脂肪酸を含有する脂質、不飽和脂肪酸を含有する脂質、飽和および不飽和脂肪酸の混合物を含有する脂質、単純炭水化物、複合炭水化物、炭素環（ステロイドのような）複素環（アルカロイドのような）、アミノ酸鎖、タンパク質、酵素、酵素補因子またはビタミンが包含される。
【００４３】
１つの態様として、親水性ポリマー基は１〜約６個のアルキル、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂質もしくはリン脂質基で置換される（本明細書、例えば式Ｉに記述されるように）。好ましくは、置換された親水性ポリマー基は線状もしくは分岐状ＰＥＧである。好ましくは、置換された親水性ポリマー基は、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂質もしくはリン脂質基または炭化水素で末端置換される線状ＰＥＧ（例えばＰＥＧジアミン）である。アルキル、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂質もしくはリン脂質基で置換される親水性ポリマーは、適当な方法を用いて製造することができる。例えば、修飾剤は、単一保護された（ｍｏｎｏｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）ＰＥＧジアミンを活性化脂肪酸（例えば、塩化パルミトイル）と反応させることにより製造することができる。得られる生成物は、脂肪酸基で置換されるＰＥＧを含んでなる修飾されたＥＰＯを製造するために用いることができる。様々な他の適当な合成スキームを用いることができる。例えば、アミン含有ポリマーを本明細書に記述されるような脂肪酸もしくは脂肪酸エステルにカップリングすることができ、そして脂肪酸もしくは脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート（例えば、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールで活性化される）をポリマー上のヒドロキシル基にカップリングすることができる。このようにして、所望の特定を有する多数の適当な直鎖状および分枝鎖状マルチマー構造を構築し、そして最終的にトランスグルタミナーゼアミンドナーとして働く第一級アミンを含有するように連結するかもしくは修飾することができる。
【００４４】
本発明における使用に適当な脂肪酸および脂肪酸エステルは飽和していることができ、または１個もしくはそれ以上の不飽和単位を含有することができる。好ましい態様として、脂肪酸および脂肪酸エステルは、約６〜約４０個の炭素原子もしくは約８〜約４０個の炭素原子を含んでなる。本発明の方法においてＥＰＯを修飾するのに適当なＥＰＯには、例えば、ｎ−ドデカノエート（Ｃ１２、ラウレート）、ｎ−テトラデカノエート（Ｃ１４、ミリステート）、ｎ−ヘキサデカノエート（Ｃ１６、パルミテート）、ｎ−オクタデカノエート（Ｃ１８、ステアレート）、ｎ−エイコサノエート（Ｃ２０、アラキデート）、ｎ−ドコサノエート（Ｃ２２、ベヘネート）、ｎ−トリアコンタノエート（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタノエート（Ｃ４０）、シス−Δ９−オクタデカノエート（Ｃ１８、オレエート）、全てシス−Δ５，８，１１，１４−エイコサテトラエノエート（Ｃ２０、アラキドネート）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが包含される。適当な脂肪酸エステルには、線状もしくは分岐状低級アルキル基を含んでなるジカルボン酸のモノエステルが包含される。低級アルキル基は、１〜約１２個、好ましくは１〜約６個の炭素原子を含んでなることができる。本発明のタンパク質を修飾するのに適当な脂肪酸エステルには、例えば、オクタデカン酸メチル、オクタデカン酸エチル、オクタデカン酸プロピル、ドデカン酸ブチル、ドデカン酸ｓｅｃ−ブチル、ドデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル、テトラデカン酸ネオペンチル、テトラデカン酸ヘキシル、シス−Δ９−オクタデカン酸メチルなどが包含される。
【００４５】
Ｎ末端Ｃｙｓポリペプチドへの転移のための基質の製造
求電子試薬に連結された２もしくは３成分またはそれ以上を含んでなる組成物は、本発明の方法における適当な結合基質として機能することができる。
【００４６】
基質の製造は、好ましくは段階的に行われ、そして最終段階において単一のチオール反応性化合物をもたらす。ＤＴＴのような還元剤により切断されるジスルフィド結合およびチオエステル結合、ならびに還元条件下で切断可能でないチオエーテル結合は、本発明の組成物において用いることができる。
【００４７】
ジスルフィド結合の形成は、チオール含有基質もしくは活性化ジスルフィド、すなわち、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィドを用いて行われる（Ｃ．Ｗｏｇｈｉｒｅｎ，Ｂ．Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｓｔｅｉｎ，Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｔｈｉｏｌ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ａ  ｎｅｗ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｏｒ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ４（１９９３）３１４）。チオエーテル結合は、マレイミド活性化基質を用いてもしくはＰＥＧ−ヨードアセトアミドで都合よく形成される。ＰＥＧ−ビニルスルホン二重結合へのチオール付加に基づく、比較的新しい試薬もまた示されている（Ｍ．Ｍｏｒｐｕｒｇｏ，Ｏ．Ｓｃｈｉａｖｏｎ，Ｐ．Ｃａｌｉｃｅｔｉ，Ｆ．Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｍｐｈｉｐｈｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５６（１９９６）５９−７２）。ポリマーに有機分子を結合する他の方法は周知であり、そしてチオールと反応する薬剤、例えば、アクリロイル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などの使用が包含される。
【００４８】
反応基は、親水性ポリマー、コンジュゲート複合体に直接もしくはリンカー部分、例えばＣ１〜Ｃ１２ヒドロカルビル基を介して結合することができる。本明細書において用いる場合、「ヒドロカルビル基」は、１個もしくはそれ以上の炭素原子が場合により酸素、窒素もしくは硫黄のようなヘテロ原子で置換されていてもよい炭化水素鎖をさす。適当なリンカー部分には、例えば、テトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−および−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−が包含される。
【００４９】
水溶性ポリマーＸと親油性薬剤Ｍの連結は、タンパク質のＮ末端システインへの最終基質の結合の前に行われ、そして当該技術分野において既知である任意の化学的もしくは酵素的方法を用いることができる。従って、例えば、アミン反応基がトシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）、置換されたフェニルエステル、ハロゲン化アシルなどのような求電子性基を含み、水溶性ポリマーと有機分子をカップリングするために使用される場合、大部分の場合において第一級アミンは保護されなければならない。ポリマーに有機分子を結合する他の方法は周知であり、そしてチオールと反応することができる薬剤、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロイル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などの使用が包含される。アルデヒドもしくはケトン官能基は、アミンもしくはヒドラジド含有分子にカップリングすることができ、そしてアジド基は３価のリン基と反応してホスホルアミデートもしくはホスホルイミド結合を形成することができる。そのようなチオール反応基を分子に導入するために適当な方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）を参照）。反応基は、親水性ポリマー、コンジュゲート複合体に直接もしくはリンカー部分、例えばＣ１〜Ｃ１２ヒドロカルビル基を介して結合することができる。本明細書において用いる場合、「ヒドロカルビル基」は、１個もしくはそれ以上の炭素原子が場合により酸素、窒素もしくは硫黄のようなヘテロ原子で置換されていてもよい炭化水素鎖をさす。システインと基質との間に使用されるような適当なリンカー部分はまた、基質組成物の成分の間でも使用されることができ、そして例えば、テトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−および−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−が包含される。
【００５０】
リンカー部分を含んでなる修飾剤は、例えば、モノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えば、モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノヘキサン）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で脂肪酸と反応させて遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間でアミド結合を形成することにより製造することができる。Ｂｏｃ保護基をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理により生成物から除いて第一級アミンを露出させることができ、それを記述されているように別のカルボキシレートにカップリングすることができ、もしくは無水マレイン酸と反応させることができ、そして得られる生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成せしめることができる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／１６２２１を参照、その全教示は引用することにより本明細書に組み込まれる）。
【００５１】
ポリペプチドのＮ末端Ｃｙｓへの基質の結合
いったんポリマー部分がポリペプチドのＮ末端ｃｙｓへの結合用に選択され、そして合成で製造されると、まだ活性化されていない場合、ポリマー基質は、ポリペプチドのＮ末端に連結されることが所望される位置でチオール反応基で活性化されなければならない。
【００５２】
スルホン
ポリ（エチレングリコール）および関連ポリマーの活性スルホンを製造するために用いられる合成経路は、引用することによりその全部が本明細書に組み込まれるＵＳ５４４６０９０（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）に教示される。該特許における教示によれば、該方法は、硫黄がポリマー分子に結合され、そして次に一連の反応によって活性スルホン官能基に転化される少なくとも４つの段階を含んでなる。さらなる反応（５）は、塩基性条件下でのビニルスルホンへのハロアルキルスルホンの転化である。各段階における使用に特に好ましい試薬を以下に本明細書に示すが、他の試薬もまた用いることができる：
（１）ＰＥＧ−ＯＨ＋ＣＨ３ＳＯ２Ｃｌ→ＰＥＧ−ＯＳＯ２ＣＨ３
（２）ＰＥＧ−ＯＳＯ２ＣＨ３＋ＨＳＣＨ２ＣＨ２ＯＨ→ＰＥＧ−ＳＣＨ２ＣＨ２ＯＨ
（３）ＰＥＧ−ＳＣＨ２ＣＨ２ＯＨ＋Ｈ２Ｏ２→ＰＥＧ−ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ
（４）ＰＥＧ−ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ＋ＳＯＣｌ２→ＰＥＧ−ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ        ｌ
（５）ＰＥＧ−ＳＯ２−ＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ＋ＮａＯＨ→ＰＥＧ−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２        ＋ＨＣｌ
【００５３】
段階１は、親水性ポリマー上の利用可能なヒドロキシルの「活性化」である。ヒドロキシル部分は、当業者に明らかなはずであるように他の方法が利用可能であるが、典型的には２つの経路、ヒドロキシルエステル化もしくは置換の一方により活性化される。ヒドロキシルエステル化は、酸もしくは酸ハロゲン化物のような酸誘導体をＰＥＧと反応させて反応性エステルを生成せしめることにより成し遂げられる。典型的なエステルは、スルホン酸エステル、カルボン酸エステルおよびリン酸エステルである。本発明を実施することにおける使用に適当なスルホニル酸ハロゲン化物には、塩化メタンスルホニルおよび塩化ｐ−トルエンスルホニルが包含される。
【００５４】
置換において、親水性ポリマーの−ＯＨ基は、より反応性の部分、典型的にはハロゲン化物で置換される。例えば、ＳＯＣｌ２として構造的に表される塩化チオニルをＰＥＧと反応させてより反応性の塩素置換されたＰＥＧを生成せしめることができる。
【００５５】
段階２は、ポリマーにおける炭素原子に直接硫黄を連結しそして同様の反応特性を有するエチルスルホンもしくはエチルスルホン誘導体を生成せしめることである。スルホン基から離れている鎖における第二の炭素原子がスルホンとチオール部分との連結の反応部位を与えるように２炭素「エチル」部分が必要とされる。
【００５６】
段階３は、炭素に結合している硫黄のスルホン基−ＳＯ２への限定酸化を伴う。過酸化水素および過ホウ酸ナトリウムを包含する、多数のそのような酸化剤がある。タングステン酸のような触媒は、有用であることができる。
【００５７】
段階４として、第二段階において付加されたヒドロキシル部分を反応順序における第一段階と同様に、ヒドロキシル基の活性化によってもしくはより反応性の基でのヒドロキシル基の置換によって、より反応性の形態に転化する。
【００５８】
得られるポリマー活性化エチルスルホンは、安定で、単離可能であり、そしてチオール選択的カップリング反応に適している。例えば、ＰＥＧクロロエチルスルホンは、約７以下のｐＨで水において安定であるが、それにもかかわらず少なくとも約ｐＨ９までの塩基性ｐＨの条件でチオール選択的カップリング反応に都合よく用いることができる。ＰＥＧビニルスルホンもまた安定で且つ単離可能であり、そしてチオール選択的な、加水分解に安定な結合を形成することができる。
【００５９】
段階５は、チオール選択的カップリング反応において使用するビニルスルホンもしくはその活性誘導体の１つに活性化エチルスルホンを転化するために、合成に加えることができる。ポリマービニルスルホンは、そのエチルスルホン対応物よりチオールと迅速に反応し、そして約１１未満のｐＨの水において加水分解に対して少なくとも数日間安定である。
【００６０】
反応は、エチルもしくはビニル炭素が最終コンジュゲートの一部として残る生成物を生成すると予想される。ＵＳ５４４６０９０およびその中の教示は、任意の分子量の、そして線状もしくは分岐状状であることができ、置換されるかもしくは非置換であることができる活性ＰＥＧスルホンを提供する。加水分解に対するスルホン部分の安定性は、それを二官能性もしくはヘテロ二官能性用途に特に有用にする。
【００６１】
ポリマービニルスルホンならびにその前駆体および誘導体は、チオール部分を有する表面および分子への直接結合に用いることができる。しかしながら、より典型的には、一方の位置、典型的にはポリマーの末端近くでエチルスルホン部分、そして反対側末端で異なる官能性部分の両方を有するＰＥＧのようなヘテロ二官能性親水性ポリマー。一方の末端でスルホン部分そしてもう一方の末端でアミン特異的部分を有するヘテロ二官能性ＰＥＧは、例えば、同じもしくは異なるタンパク質のシステインおよびリシン部分の両方に結合することができる。あるいはまた、ヘテロ二官能化分子は、安定なアミン結合が未反応のスルホン部分の反応の前に形成されることができる限り、本明細書に記述されるような第二の有機部分を導入するために用いることができる。
【００６２】
ヘテロ二官能性活性化ＰＥＧの他の活性基は、多種多様な化合物の中から選択することができる。生物学的および生物工学的用途には、置換基は、典型的に、アルデヒド、トレシレートと呼ばれることもあるトリフルオロエチルスルホネート、ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドエステル、塩化シアヌル、フッ化シアヌル、アジ化アシル、スクシネート、ｐ−ジアゾベンジル基、３−（ｐ−ジアゾフェニルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ基、マレイミドなどのようなＰＥＧを活性化するためにＰＥＧ化学において典型的に使用される反応性部分から選択される。
【００６３】
Ｎ末端システインを含有するＥＰＯへのペプチド、タンパク質、ＰＥＧおよび他のポリマーの結合はまた、エステル化学によって成し遂げられることもできる。ペプチドおよびタンパク質の場合には、両方ともそれらのＣ末端でエステル部分（好ましくはチオエステル）を含有するように合成されるかもしくは発現されることができる。穏やかな水性条件下でチオエステル化合物を次にＮ末端システインを含有するＥＰＯと反応させることができ、最終生成物は、システイン残基のａ−アミノ基と該チオエステルのカルボキシル炭素の間で形成されるアミド結合によって該チオエステル化合物に結合されたＥＰＯからなる（Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２，１２４８５−１２４８９（１９９５））。
【００６４】
本発明の誘導体化エリスロポエチン化合物の例は、次のとおりである：
Ｍ−ＰＥＧ−Ａ−Ｃｙｓ−ＥＰＯ（ここで、Ｃｙｓは生物活性エリスロポエチンアミノ酸配列に対してＣｙｓ−１を表し；Ｍは脂質、炭水化物、多糖、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコールもしくはタンパク質であり；そしてＡは担体もしくは求電子性チオール反応基、好ましくはマレイミドの反応生成物を表す）。
【００６５】
（Ｍ−ＰＥＧ）２−Ａ−Ｃｙｓ−ＥＰＯ（ここで、Ｃｙｓは生物活性エリスロポエチンアミノ酸配列に対してＣｙｓ−１を表し；Ｍ−ＰＥＧはＡ上の２つの異なるカルボキシル基にエステル化され、そしてＡは担体もしくは求電子性チオール反応基、好ましくはマレイミドの反応生成物を表す部分をさらに含んでなり；そしてＭは脂質、炭水化物、多糖、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコールもしくはタンパク質である）。高級マルチプル（ｈｉｇｈｅｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ）も同様に包含される。
【００６６】
（Ｍ−ＰＥＧ）２−Ｒ−Ａ−Ｃｙｓ−ＥＰＯ（ここで、Ｃｙｓは生物活性エリスロポエチンアミノ酸配列に対してＣｙｓ−１を表し；Ａは担体もしくは求電子性チオール反応基、好ましくはマレイミドの反応生成物を表し；（Ｍ−ＰＥＧ）２−Ｒは、Ａ上の２つの異なるカルボキシル基に結合しており；Ｍは脂質、炭水化物、多糖、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコールもしくはタンパク質であり、そしてＲは価数増大構築物である）。高級マルチプルも同様に包含される。
【００６７】
Ｍ−Ａ−Ｃｙｓ−ＥＰＯ（ここで、Ｃｙｓは生物活性エリスロポエチンアミノ酸配列に対してＣｙｓ−１を表し；Ｍはタンパク質もしくはペプチドであり、そしてＡは該タンパク質もしくはペプチド上の遊離システイン側鎖である）。
【００６８】
Ｍ−Ａ−Ｃｙｓ−ＥＰＯ（ここで、Ｃｙｓは生物活性エリスロポエチンアミノ酸配列に対してＣｙｓ−１を表し；Ｍは脂質であり、そしてＡは担体もしくは求電子性チオール反応基、好ましくはマレイミドの反応生成物を表す）。
【００６９】
Ｍ−Ａ−Ｃｙｓ−ＥＰＯ（ここで、Ｃｙｓは生物活性エリスロポエチンアミノ酸配列に対してＣｙｓ−１を表し；Ｍはビオチン、ダンシル、または研究、診断もしくは治療目的のために有用な生物物理学的特性をＥＰＯに与える他の部分であり；そしてＡは担体もしくは求電子性チオール反応基、好ましくはマレイミドの反応生成物を表す）。ビオチンもしくは既知の結合パートナーを有する別の部分がコンジュゲートに導入される場合、該コンジュゲートは、ビオチン−アビジン複合体におけるようなその既知の結合パートナーとの複合体で研究、診断もしくは治療において用いることができると予想される。
【００７０】
Ｍ−Ａ−Ｃｙｓ−ＥＰＯ（ここで、Ｃｙｓは生物活性エリスロポエチンアミノ酸配列に対してＣｙｓ−１を表し；Ｍはタンパク質、ペプチド、または研究、診断もしくは治療目的のために有用な独特な特性をＥＰＯに与える他の部分であり；そしてＡはエステルもし
くはチオエステル基とＣｙｓ−１との間の反応の生成物を表す）。
【００７１】
治療的投与
本発明のＮＴＦＴエリスロポエチンコンジュゲートは、、慢性腎不全と関連する貧血を包含する様々な形態の貧血、ジドブジン処置したＨＩＶ感染患者および化学療法を受けている癌患者のような低いかもしくは障害のある赤血球生成を特徴とする血液疾患を処置することにおける非経口製剤として有用である。それはまた、鎌状赤血球病、ベータ−サラセミア、嚢胞性線維症、妊娠および生理不順、未熟児の初期貧血、脊髄損傷、宇宙飛行、急性失血、老化などのような様々な病状、疾患および血液学的異常の状態の処置において用途を有することもできる。それはまた、手術前の患者におけるような赤血球の増加が所望される状況において用途を有することもできる。好ましくは、本発明のＮＴＦＴエリスロポエチンコンジュゲート組成物は、非経口（例えば、ＩＶ、ＩＭ、ＳＣもしくはＩＰ）投与される。
【００７２】
有効投薬量は、処置する症状および投与の経路によりかなり異なると予想されるが、０．１〜１００μｇ／ｋｇ体重（約７〜７０００Ｕ）の活性物質の範囲であると予想される。貧血症状の処置の好ましい用量は、週に３回約５０〜約３００ユニット／ｋｇである。
【００７３】
本発明のＮＴＦＴエリスロポエチンコンジュゲート製剤は、神経学的病状、特に脳および脊髄虚血、急性脳損傷、脊髄損傷、網膜疾患、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病およびＡＬＳのような神経変性疾患が包含されるがこれらに限定されるものではない中枢神経系のものを処置することにおいて有用である。神経学的病状に加えて、本発明のＥＰＯ製剤は、梗塞心臓（ｉｎｆｒａｃｔｅｄ  ｈｅａｒｔ）のような虚血性もしくは低酸素ストレスの結果として損傷を受けた他の組織、結合組織および臓器損傷を包含する外科的介入の結果としての軟組織損傷、ならびに外傷もしくは免疫媒介性炎症の結果としての組織損傷の疾患を処置するかもしくはその治癒を高めることにおいて有用である。
【００７４】
製薬学的組成物
本発明に従って製造される治療用ＮＴＦＴタンパク質コンジュゲートは、当該技術分野において既知である方法により製薬学的に許容しうる担体もしくは賦形剤とともに注射に適当な製薬学的組成物において製造することができる。例えば、適切な組成物は、ＷＯ９７／０９９９６、ＷＯ９７／４０８５０、ＷＯ９８／５８６６０およびＷＯ９９／０７４０１に記述されている。本発明の生成物を調合するための好ましい製薬学的に許容しうる担体の中には、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質などがある。本発明の化合物は、等張化剤、例えば１３２ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７の１０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウムバッファーにおいて調合することができる。場合により製薬学的組成物は、防腐剤を含有することができる。製薬学的組成物は、異なる量のエリスロポエチン生成物、例えば１０〜２０００μｇ／ｍｌ、例えば５０μｇもしくは４００μｇを含有することができる。
【００７５】
組成物の安定性は、トコフェロール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、パルミチン酸アスコルビル、もしくは例えばエデト酸二ナトリウムのようなエデト酸塩のような酸化防止剤の添加によりさらに高めることができ、エデト酸塩はさらに場合により存在する重金属を結合する。安定性は、安息香酸ならびにパラベン、例えばメチルパラベンおよび／もしくはプロピルパラベンのような防腐剤の添加によりさらに高めることができる。
【００７６】
低いかもしくは障害のある赤血球生成を特徴とする血液疾患を処置すること
本発明の１つの態様として、本発明のＮＴＦＴエリスロポエチンコンジュゲートの投与
は、ヒトにおける増加した赤血球形成をもたらすことに関する。従って、ＮＴＦＴエリスロポエチンコンジュゲートの投与は、赤血球の生成において重要な天然に存在するＥＰＯタンパク質の機能を補充するかもしくはその代わりをする。ＮＴＦＴエリスロポエチンコンジュゲートを含有する製薬学的組成物は、単独でまたは症状もしくは疾患の一部として、低いかもしくは障害のある赤血球生成を特徴とする血液疾患に悩むヒト患者への様々な手段による投与に有効な強度で調合されることができる。製薬学的組成物は、皮下、静脈内もしくは筋肉内注射によるような注射により投与することができる。ＮＴＦＴエリスロポエチンコンジュゲートの平均量は異なることができ、そして特に有資格医師の推奨および処方に基づくべきである。コンジュゲートの正確な量は、処置する症状の正確なタイプ、処置する患者の症状、ならびに組成物における他の成分のような因子に従う好みの問題である。例えば、０．０１〜１０μｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１０μｇ／ｋｇ体重を例えば週に１回投与することができる。
【００７７】
本発明の別の態様として、本発明のＮＴＦＴエリスロポエチンコンジュゲート製剤の使用は、脳および脊髄虚血、急性脳損傷、脊髄損傷、網膜疾患、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病およびＡＬＳのような神経変性疾患のために低下するか、障害が起きるかもしくは失われた神経組織、特に中枢神経系のもの、および機能を防御するか、回復させるか、もしくは増強するために介入を必要とするヒト患者を処置することに関する。本発明のＮＴＦＴエリスロポエチンコンジュゲート製剤の使用はまた、梗塞心臓のような虚血性もしくは低酸素ストレスの結果として損傷を受けた他の組織、結合組織および臓器損傷を包含する外科的介入の結果としての軟組織損傷、ならびに外傷もしくは免疫媒介性炎症の結果としての組織損傷を防御するか、回復させるか、もしくはその治癒を高めるために介入を必要とするヒト患者を処置することにも関することができる。
【００７８】
本願の全体にわたって、様々な公開が参考文献として記載されている。これらの公開における開示は、最新技術をさらに十分に記述するために引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００７９】
本発明は、本発明の化合物および組成物の製造を示すが限定しない目的のために提示される以下の実施例によりさらに説明される。
【実施例１】
【００８０】
ｃｙｓ−ＥＰＯのクローニング
ＥＰＯのＮ末端は受容体結合に関与せず、そしてＥＰＯ−受容体複合体から離れて向くように位置する。このために、ＥＰＯのＮ末端は、受容体結合にそしてそれ故に生物活性にも最小の立体効果を有するはずである化学修飾を導入するための理想的な位置を提供する。従って、Ｎ末端でのシステイン残基の導入は、受容体結合を破壊せずにＥＰＯの部位特異的修飾を可能にする。
【００８１】
従って、ＥＰＯ遺伝子配列もしくはｃＤＮＡを操作することによりアラニン残基のＮ末端にシステイン残基を有するｈＥＰＯ配列の作製を行った。しかしながら、インシリコ分析により、ＥＰＯ前駆体コーディング配列にシステインコドンを単に付加することは、推定切断部位をシグナルペプチドにおけるプロリン２４とバリン２５の間の上流にシフトして新たなＮ末端残基としてｖａｌ２５を残すかもしくはｃｙｓ（−１）とａｌａ１との間の切断を引き起こして付加されたシステインを完全に効率よく取り除き得ることが示唆される（ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０；ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）。設計したＥＰＯのＮ末端がシステインである確率を上げるために、ＥＲにタンパク質をターゲッティングするのに効率がよいことが既知であるもの、例えばヒト成長ホルモンの最初の２６アミノ酸で内因性ｈＥＰＯシグナルペプチドを置換することが提示された（Ｍｏｒｒｉｓ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７４，４１８−４２３）。コンピューターモデルにより分析した場合に、この異種タンパク質（図１、配列番号：３）は、Ｎ末端システインを有する成熟タンパク質をもたらすと予測された。
【００８２】
Ｎ末端に追加のシステインを有するヒトＥＰＯを発現するために用いることができる構築物の製造を成し遂げるために、ヒト成長ホルモンリーダー配列を、新規なタンパク質の発現用のベクターにシステインコドンと一緒に設計した。
【００８３】
ＥＰＯの核酸配列は、ｐＥＧ１５から増幅した。ｈＧＨシグナル配列の核酸配列は、ｐＸＧＨ５（Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）に由来するベクターから増幅した。ｈＧＨ−ＥＰＯ構築物をｐＳＵＥプラスミドと称するプラスミドに連結した。配列番号：３（図１）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製するために用いる方法を以下に記述する。
【００８４】
プライマー設計
第一のＰＣＲプライマー対（配列番号：１５および１６）を用いてＨｉｎｄＩＩＩ−コザック−ｈＧＨ−ＣＹＳ−ＡｐａＬＩを含有する１０７ｂｐフラグメントを生成せしめた。
【００８５】
【表３】
2008500275.tif 000005
【００８６】
第二のＰＣＲプライマー対（配列番号：１７および１８）を用いてＣＹＳ−ＡｐａＬＩ−ＥＰＯ−ＢａｍＨＩを含有する５１８ｂｐフラグメントを生成せしめた。
【００８７】
【表４】
2008500275.tif 000006
【００８８】
クローニング
第一のプライマー対を用いて最終構築物のｈＧＨシグナル配列フラグメント（配列番号：２）を生成せしめた。ＰＣＲ勾配条件は、９５℃ｘ２分、続いて９５℃ｘ２分、５０℃〜６０℃３０秒間、７２℃３０秒間の３０サイクル、続いて７２℃で３分間の最終伸長、そして次に４℃保持であった。第二のプライマー対を用いて最終構築物のＥＰＯフラグメントを生成せしめた。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間、次に９４℃ｘ３０秒、６０℃ｘ３０秒、７２℃ｘ３分の３０サイクル、７２℃で７分間の最終伸長で終わり、そして４℃保持であった。増幅後に、１０μＬの各ＰＣＲ反応物を１μＬの１０Ｘローディング色素と合わせ、そして１％のＳｅａＫｅｍゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で１Ｋｂラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とともに泳動した。ｈＧＨ  ＰＣＲ反応により各温度で約１００ｂｐの位置に移動するバンドが生成され；これらのバンドを切り出し、一緒にプールし、そしてＱＩＡＱｕｉｃｋゲル抽出カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の説明書に従って抽出し、そして３０μＬのｄＨ２Ｏにおいて溶出した。約５００ｂｐの位置に移動するＥＰＯバンドを同様に切り出し、抽出した。
【００８９】
ＥＰＯフラグメントをＢａｍＨＩおよびＡｐａＬＩで消化し、ｈＧＨフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＬＩで消化し、そしてベクターｐＳＵＥをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した。１０μＬのｐＳＵＥ消化物を上記のように１％のＳｅａＫｅｍゲル上で泳動した。〜１０ｋｂのベクターバンドを切り出し、上記のように抽出した。全３０μＬの溶出液を仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理し、次にＱＩＡＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）の説明書に従って精製し、そして３０μＬのｄＨ２Ｏにおいて溶出した。フラグメント消化物をＱＩＡＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラムで精製し、そして３０μＬのｄＨ２Ｏにおいて溶出した。
【００９０】
個々のフラグメントおよびベクターのライゲーションは、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて行った。ライゲーション反応物をＴＯＰ１０  ＯｎｅＳｈｏｔ化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、そして１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ）を含有するルリア−ベルターニ（ＬＢ）プレート上で平板培養した。個々のコロニーを選択液体ＬＢ培地に取り、そして２２５ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩培養した。プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、そして７５μＬのｄＨ２Ｏに溶出した。全てのクローンを制限酵素で消化してインサートについてスクリーニングした。陽性クローンは、ベクターの内部のプライマーで蛍光色素−ターミネーターおよびＡＢＩ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてシーケンスした。２個の陽性クローンがシーケンシングにより同定され；しかしながら、両方ともｈＧＨシグナル配列に突然変異を含有する（Ｑ２２Ｒ）。この突然変異は、Ｃ末端システインでの予測される切断に影響を及ぼさない。最終プラスミドをｐＳＵＥｃｙｓＥＰＯと称した。
【００９１】
本研究では、強力なウイルスプロモーター、共通コザック配列、興味のある遺伝子（ＥＰＯ）、ヘキサＨｉｓタグ、終止コドンおよびウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化シグナルを利用する単純な発現ベクターを使用している。あるいはまた、ｃｙｓ−ＥＰＯを発現する安定な哺乳類細胞系が、遺伝子産物を発現するために作製されている。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を使用したが、しかしながら、哺乳類シグナル配列をプロセシングすることができる任意の宿主細胞（哺乳類が好ましいが、必須ではない）を使用することができる。
【実施例２】
【００９２】
ｃｙｓ−ＥＰＯの発現
ＤＮＡが哺乳類細胞により取り込まれ、核に運ばれ、そして転写される一過性トランスフェクションを用いて新規なＥＰＯタンパク質を発現させた。この技術を用いて、タンパク質発現のパルス（ｐｕｌｓｅ）が迅速な方法で達成された。トランスフェクションの５日後にならし培地から生成物、ｃｙｓ−ＥＰＯを集め、そしてタンパク質のＣ末端に位置するヘキサＨｉｓタグを用いて精製した。
【００９３】
陽イオン性脂質試薬（ＬＦ２Ｋ）を用いてｃｙｃ−ＥＰＯをコードするＤＮＡ（ｐＳＵＥｃｙｓＥＰＯ）をＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクションした。次に、細胞を１０段（１０−ｔｉｅｒ）セルファクトリーにおいて無血清培地（２９３−ＳＦＭＩＩ）中で培養し、そして４日後にならし培地を回収し、そしてＴＡＬＯＮ  ＩＭＡＣを用いてｃｙ
ｓ−ＥＰＯを精製した。透析および濃縮後に、精製された生成物を純度についてＳＤＳ  ＰＡＧＥ（図２）、Ｎ末端シーケンシングおよびＵＴ−７バイオアッセイ（図３）により分析した。
【００９４】
バイオアッセイでは、ＵＴ−７細胞をアッセイの前に２４．５時間ＥＰＯなしにＬ−ｇｌｕおよび５％ＦＢＳを有するＩＭＤＭにおいて飢餓状態にした。細胞を洗浄し、そしてウェル当たり３０，０００細胞で平板培養した。ＥＰＯ（２．５〜０．００２４ｎｇ／ｍＬ）およびｃｙｓ−ＥＰＯ（２０〜０．０１９５２ｎｇ／ｍＬ）を二重反復で加えた。３７℃で４７．２時間後にウェル当たりの細胞数をＰｒｏｍｅｇａのＭＴＳ溶液を用いて測定し、ＯＤの読み取りを１、２および３時間間隔で行った。値をＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏでバックグラウンド補正し、そして平均バックグラウンドは０．３２７ＯＤユニットであった（図３）。
【００９５】
ｃｙｓ−ＥＰＯが上清から回収されたことは、細胞にトランスフェクションした核酸からのタンパク質の成功した発現を裏づけ、そして該タンパク質がヒト成長ホルモンシグナル配列によりＥＲにターゲッティングされ、正しくフォールディングされ、そして分泌されることを示した。
【００９６】
物質のクーマシー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥ（図２）は、ヒトにおいてそして哺乳類細胞により生産される天然のグリコシル化生成物によって生じる３４ｋＤａとよくマッチする約３１ｋＤａの主要なバンドを示す。対照的に、グリコシル化されていないＥＰＯは、約１８ｋＤａである。
【００９７】
Ｎ末端シーケンシングは、通常の成熟アラニン１残基の上流の単一アミノ酸の存在を裏付けた。このバンドから取り除いた物質のＮ末端配列が示され、そして＊は下記のように説明される：システイン残基はＮ末端シーケンシング法により容易に認識されないので、タンパク質がなんらかの方法で誘導体化されない限り、Ｎ末端のアミノ酸（括弧中のＮ）は存在するとして表される、すなわち、シーケンサーにより「コールされる」ことができるだけであり、従って、該タンパク質が、ブロックされたＮ末端を有さないことを示す。さらに、ｈＧＨシグナル配列のＣ末端由来のアミノ酸は、シーケンシング法により同定することができるアラニン（Ａ）であるので（Ｎ）はそれではないと決定することができる。さらに、最初のコール（Ｎ）の後の一連のアミノ酸は、成熟ヒトＥＰＯ遺伝子（ＡＰＰなど）に対応する。
【００９８】
該構築物をコードする核酸配列を配列番号：１９に示す。
【実施例３】
【００９９】
Ｃｙｓ−ＥＰＯの化学修飾
【０１００】
実験１
１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を有するｐＨ７．０のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対してバッファー交換をＣｙｓ−ＥＰＯに行った。Ｃｙｓ−ＥＰＯ（ＰＢＳ＋１００ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．８中０．７ｍｇ／ｍｌ）およびＥＰＯ（ＰＢＳ＋１００ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．８中０．７ｍｇ／ｍｌ）を０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭおよび２５ｍＭのｂ−メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と３７℃で２時間インキュベーションした。次に、製造業者の説明書に従ってリン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．８）で平衡化したＢｉｏｓｐｉｎ−６脱塩カラム（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でサンプルからＭＥＡを除いた。次に、サンプルを０．７５ｍＭのマレイミド−ＰＥＧ（平均分子量：５９６０）（Ｎｅｋｔａｒ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）と周囲温度で１時間インキュベーションした。１時間後に、システインを０．７５ｍＭの濃度になるように加え、そして周囲温度で２０分間インキュベーションした。次に、サンプルを４〜１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せ、泳動した。サンプルはまた、シナピン酸（ｓｉｎｎａｐｉｃ  ａｃｉｄ）のマトリックスを用いてそして製造業者の推奨に従って製造したＨ−４逆相チップ上でＳＥＬＤＩ質量分析（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ，Ｆｕｌｔｏｎ，ＣＡ）によっても分析した。野性型ＥＰＯを同様に処理した。
【０１０１】
ＥＰＯサンプルのゲル（図４）は、調べた条件のいずれでもＥＰＯの認識可能なＰＥＧ付加が起こらなかったことを示す。これは、非修飾のＥＰＯ標準に対する分子量シフトを表す任意のバンドの欠如により示される。サンプルのＳＥＬＤＩ−ＭＳ（図６）もまた、分子量の違いがないことを示し、これらの条件下でＰＥＧ付加が起こらなかったことを同様に示す。
【０１０２】
ｃｙｓ−ＥＰＯサンプルのゲル（図５）は、調べた条件の各々でｃｙｓ−ＥＰＯの認識可能なＰＥＧ付加が起こったことを示す。これは、非修飾のｃｙｓ−ＥＰＯ標準に対する分子量シフトを表すバンド（白い矢印で示される）により示される（ｃｙｓ−ＥＰＯ標準は、不純物の存在をよりよく示すためにより高い濃度で載せられたこと、および記述される分子量シフトは、標準について認められる主要バンドに関してであることに留意すべきである）。
【０１０３】
サンプルのＳＥＬＤＩ質量スペクトル分析（図６および７）において、約２８，０００のピークは非修飾のＥＰＯもしくはｃｙｓ−ＥＰＯに対応する。ＰＥＧ付加生成物に予想されるものに比例する分子量の違い、図７における５，９６０ＭＷ  ＰＥＧの付加に対応するピークの存在に留意すべきである。ＥＰＯ上のＰＥＧおよびグリコシル化の不均一性のために、これらのピークはかなり幅広く、そして分子量は概算と見なされなければならない。しかしながら、相対分子量は、還元されていないおよび還元されたＣｙｓ−ＥＰＯの両方へのＰＥＧの結合を示し、ｃｙｓ−ＥＰＯのＰＥＧ付加がこれらの条件下で起こることを同様に示す。また、ＰＥＧ付加の程度は、還元に使用するＭＥＡの濃度に対して増加するようである。これは、ｃｙｓ−ＥＰＯ上のＮ末端システインの少なくともいくらかがシステインもしくはグルタチオンのような別のチオールにジスルフィド架橋されることおよびこのジスルフィドを本明細書に記述される条件を用いて選択的に還元できることを示す。総合すると、これらのデータは、ｃｙｓ−ＥＰＯ上のＮ末端チオールが到達可能であり、そしてマレイミド−ＰＥＧのようなチオール特異的試薬により修飾できることを示す。
【０１０４】
実験２
１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を有するｐＨ７．０のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対してバッファー交換をＣｙｓ−ＥＰＯに行う。この溶液にマレイミドと脂質との間に分子量１４〜２０，０００のポリマーリンカー（ＰＥＧのような）を含有する３倍モル過剰のマレイミド活性化ジステロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）を加える。反応混合物を２０〜２５℃の間で１時間インキュベーションする。次に、反応混合物をｚｏｒｂａｘ  ＧＦ−２５０ＸＬサイズ排除ＨＰＬＣカラム上に載せ、そして２ｍｌ／分の流速でＰＢＳで溶出する。次に、得られる修飾タンパク質ピークを含有する画分をプールし、そして生物活性について試験する。
【０１０５】
実験３
２８．７ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中０．５ＭのＨＯＢｔ／ＨＢＴＵ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール／２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸）に１４．３５ｍｌの２Ｍジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、続いて５ｇ（１４．３５ｍｍｏｌ）の３−（Ｓ
，トリチル）−メルカプトプロピオン酸（Ｂａｃｈｅｍ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を加える。溶液を５ｇのＭＢＨＡ樹脂（０．８ｍｍｏｌ／ｇ）（Ｂａｃｈｅｍ）に加え、そして３０分間攪拌する。樹脂を数容量のＤＭＦ、ＤＣＭおよびメタノールで連続して洗浄し、そして真空中で乾燥させる。得られる樹脂を標準的なＢｏｃ化学でペプチド合成に使用する。２〜５０残基の長さのペプチドを標準的なＢｏｃ化学を用いて合成し、そして切断を９０％のＨＦ、１０％のｐ−クレゾール、−５℃、１．５時間において行う。ペプチドをエーテルにおいて沈殿させ、凍結乾燥させ、そして分取逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製する。次に、ペプチドをＰＢＳ（ｐＨ７．０）＋１ｍＭ  ＥＤＴＡにおいてＣｙｓ−ＥＰＯと１２〜４８時間インキュベーションする。反応を分析サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、ＳＤＳゲル電気泳動および／もしくはＳＥＬＤＩ質量分析でモニターする。次に、最終コンジュゲートをＺｏｒｂａｘ  ＧＦ−２５０  ＸＬサイズ排除ＨＰＬＣカラム上に載せ、そして２ｍｌ／分の流速でＰＢＳで溶出する。次に、得られる修飾タンパク質ピークを含有する画分をプールし、そして生物活性について試験する。
【実施例４】
【０１０６】
ＵＴ７細胞増殖アッセイ
ＵＴ７は、ＥＰＯ依存性になるように適応されているヒト白血病細胞系である（Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８２（２），４５６−４６４，１９９３）。ＵＴ７細胞をＰＢＳにおいて３回洗浄し、そしてアッセイの前に２４時間ＥＰＯに関して飢餓状態にする。Ｌ−グルタミンおよび５％でＦＢＳを添加したＩＭＤＭ培地（Ｉ５Ｑ）においてＵＴ−７細胞を飢餓状態にした。細胞を５０ｍＬのＤＰＢＳにおいて１回洗浄し、そしてＤＰＢＳに懸濁したままで計数し、そして適切な培地に６ｘ１０５細胞／ｍＬ（ウェル当たり３０，０００細胞の最終濃度をもたらす）の最終濃度になるように懸濁する。ＥＰＯ標準は、ＥＰＯストック（１．７ｍｇ／ｍＬ）を０．８５μｇ／ｍＬ（４ｍＬの培地中２μＬ）に希釈することにより調製する。ストック溶液をＩ５Ｑ培地において５ｎｇ／ｍＬまで２：３４０希釈し、続いて０．００９８ｎｇ／ｍＬの濃度まで１：２連続希釈する。得られる希釈物は、２．５ｎｇ／ｍＬ〜０．００２４ｎｇ／ｍＬの濃度の標準を与える。試験サンプルを同様に希釈する。ＵＴ−７細胞懸濁液の５０μＬのアリコートを対応するウェルに移し、そしてプレートを３７℃で４８時間インキュベーションした。細胞増殖は、ウェル当たり２０μＬを加えて、ＰｒｏｍｅｇａのＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて評価する。読み取りは、ＭＴＳ添加後１時間で始まる。
【０１０７】
図３は、修飾されていないおよびＮ末端ｃｙｓで修飾されたＥＰＯに対して行ったＵＴ７細胞アッセイにおけるＥＰＯ物質の濃度依存性のグラフを示す。修飾されていないＥＰＯのデータから計算されるＥＣ５０は１．７９５ｘ１０−１１Ｍであり、そして修飾されたＥＰＯのは２．９４８ｘ１０−１１Ｍである。これらのデータは、分泌された物質が活性であることを示す。
【実施例５】
【０１０８】
マウスにおける造血の刺激
約１８〜２０グラムの重さがある、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）から入手したＢＤＦ１メスマウスをフィルタートッププラスチックケージにおいてグループ飼育する（ケージ当たり１０匹）。
【０１０９】
研究の−５日目に、動物を各グループに１５匹の動物で３処置グループ（ＰＢＳコントロール、ＥＰＯおよびＭ−ＰＥＧ−Ａ−Ｃｙｓ−ＥＰＯ）の１つに割り当てる。動物をＣＯ２で麻酔し、そしてベースラインレベルを定めるために血液サンプルを０．０５ｍＬ／サンプルの目標血液容量で後眼窩洞を介してＥＤＴＡ被覆ガラスチューブに採取する。血
液を市販されているＥＤＴＡ調合微小遠心管に入れる。アリコートをヘマトクリット管に入れ、そしてチューブを粘土で密封し、そして５分間遠心分離する。赤血球沈殿容積（ＰＣＶ／ヘマトクリット）は、市販されているヘマトクリット測定カード（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃａｒｄ）上でヘマトクリット管を読み取ることから得られる。ヘモグロビンレベルは、１０μｌの血液を使用して、ＣｏｕｌｔｅｒＴＭカウンターを用いて決定する。０および２日目に、動物にＰＢＳにおける実施例４）のＵＴ−７アッセイにより調整されるような生物活性において同等である量の０．９４ｍＬ（１１２．８ｍＬ／ｋｇ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）、ＥＰＯ（ＰＢＳ中０．３３３μｇ／ｍＬ）もしくは本発明のＭ−ＰＥＧ−Ａ−Ｃｙｓ−ＥＰＯ組成物のいずれかの腹腔内注射を与える。４、７、１０、１４、１７および２１日目に血液サンプルを採取し、そしてヘマトクリット管に等分し、粘土で密封し、そして５分間遠心分離する。赤血球沈殿容積（ＰＣＶ／ヘマトクリット）は、市販されているヘマトクリット決定カード上でヘマトクリット管を読み取ることにより得られる。ヘモグロビンレベルは、１０μｌのサンプルを使用してＣｏｕｌｔｅｒＴＭカウンターを用いて決定する。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】１６６アミノ酸のヒト型に基づきそして−１ｃｙｓ残基をボックス中に示しそしてシグナル配列をボールド体で示す設計し直した前駆体エリスロポエチン分子のアミノ酸配列を示す。
【図２】精製されたｃｙｓ−ＥＰＯの染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析および化学的方法により決定した場合の精製されたｃｙｓ−ＥＰＯのＮ末端配列を示し、（Ｎ）はプレースホルダーを示す。
【図３】ｃｙｓ−ＥＰＯをＥＰＯと比較するＵＴ−７細胞増殖アッセイの結果を示すグラフである。
【図４】レーン：（１）分子量マーカー；（２）ＥＰＯ＋０ｍＭ  ＭＥＡ；（３）ＥＰＯ＋０ｍＭ  ＭＥＡ＋マレイミド−ＰＥＧ；（４）ＥＰＯ＋１５ｍＭ  ＭＥＡ；（５）ＥＰＯ＋１５ｍＭ  ＭＥＡ＋マレイミド−ＰＥＧ；（６）ＥＰＯ＋２０ｍＭ  ＭＥＡ；（７）ＥＰＯ＋２０ｍＭ  ＭＥＡ＋マレイミド−ＰＥＧ；（８）ＥＰＯ＋２５ｍＭ  ＭＥＡ；（９）ＥＰＯ＋２５ｍＭ  ＭＥＡ＋マレイミド−ＰＥＧ；（１０）ＥＰＯ標準に示されるようなサンプルの４〜１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図５】レーン：（１）分子量マーカー；（２）Ｃｙｓ−ＥＰＯ＋０ｍＭ  ＭＥＡ；（３）Ｃｙｓ−ＥＰＯ＋０ｍＭ  ＭＥＡ＋マレイミド−ＰＥＧ；（４）Ｃｙｓ−ＥＰＯ＋１５ｍＭ  ＭＥＡ；（５）Ｃｙｓ−ＥＰＯ＋１５ｍＭ  ＭＥＡ＋マレイミド−ＰＥＧ；（６）Ｃｙｓ−ＥＰＯ＋２０ｍＭ  ＭＥＡ；（７）Ｃｙｓ−ＥＰＯ＋２０ｍＭ  ＭＥＡ＋マレイミド−ＰＥＧ；（８）Ｃｙｓ−ＥＰＯ＋２５ｍＭ  ＭＥＡ；（９）Ｃｙｓ−ＥＰＯ＋２５ｍＭ  ＭＥＡ＋マレイミド−ＰＥＧ；（１０）Ｃｙｓ−ＥＰＯ標準に示されるようなサンプルの４〜１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ＰＥＧに結合されたＣｙｓ−ＥＰＯに対応するバンドは、白い矢印で示されることに留意すべきである。
【図６】ＥＰＯ、ＥＰＯ＋０ｍＭ  ＭＥＡ＋マレイミド−ＰＥＧおよびＥＰＯ＋２５ｍＭ  ＭＥＡ＋マレイミド−ＰＥＧのＳＥＬＤＩ質量スペクトルである。約２８，０００のピークは、修飾されていないＥＰＯに対応する。
【図７】Ｃｙｓ−ＥＰＯ、Ｃｙｓ−ＥＰＯ＋０ｍＭ  ＭＥＡ＋マレイミド−ＰＥＧおよびＣｙｓ−ＥＰＯ＋２５ｍＭ  ＭＥＡ＋マレイミド−ＰＥＧのＳＥＬＤＩ質量スペクトルである。約２８，０００のピークは、修飾されていないｃｙｓ−ＥＰＯに対応し、５，９６０ＭＷ  ＰＥＧの付加に対応するピークが存在する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008500275.tif 000013
【配列表】
2008500275000001.xml
【国際調査報告】
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