(57)【要約】  本発明は、ＩＬ‐１７Ｆ、ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方のポリペプチド分子の活性の遮断、抑制、低減、拮抗または中和に関する。ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆは、炎症過程およびヒト疾患に関与するサイトカインである。ＺｃｙｔｏＲ１４は、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆに関する共通の受容体である。本発明は、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４および抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体および結合相手、ならびにこのような可溶性受容体、抗体および結合相手を用いたＩＬ‐１７Ｆ、ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方の拮抗方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つのＺｃｙｔｏＲ１４サブユニットを含む単離可溶性受容体であって、ＺｃｙｔｏＲ１４サブユニットが配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む単離可溶性受容体。
【請求項２】
少なくとも1つのＺｃｙｔｏＲ１４サブユニットを含む単離可溶性受容体であって、ＺｃｙｔｏＲ１４サブユニットが配列番号２４のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基４２７を含む単離可溶性受容体。
【請求項３】
2つのＺｃｙｔｏＲ１４サブユニットを含む、請求項１または請求項２記載の可溶性受容体であって、前記サブユニットがポリペプチドリンカーにより一緒に連結される可溶性受容体。
【請求項４】
ポリペプチドリンカーが約100〜240アミノ酸残基を有する、請求項３記載の可溶性受容体。
【請求項５】
ＺｃｙｔｏＲ１４を含む単離可溶性受容体であって、ＺｃｙｔｏＲ１４が配列番号３で示されるようなアミノ酸残基の配列を有するポリペプチドを含み、そして前記可溶性受容体がＩＬ‐１７Ａ（配列番号１４）またはＩＬ‐１７Ｆ（配列番号１６）の前炎症活性を低減する単離可溶性受容体。
【請求項６】
ＩＬ‐１７Ａ（配列番号１４）またはＩＬ‐１７Ｆ（配列番号１６）の前炎症活性を低減する、請求項５記載の可溶性受容体。
【請求項７】
配列番号２で示されるようなアミノ酸残基の配列を含むポリペプチドと結合する抗体または抗体断片であって、ＩＬ‐１７Ａ（配列番号１４）またはＩＬ‐１７Ｆ（配列番号１６）の前炎症活性を低減する抗体または抗体断片。
【請求項８】
ＩＬ‐１７Ａ（配列番号１４）およびＩＬ‐１７Ｆ（配列番号１６）の両方の前炎症活性を低減する、請求項７記載の抗体または抗体断片。
【請求項９】
（ａ）ポリクローナル抗体、（ｂ）ネズミモノクローナル抗体、（ｃ）（ｂ）由来のヒト化抗体、（ｄ）抗体断片、または（ｅ）ヒトモノクローナル抗体である、請求項８記載の抗体または抗体断片。
【請求項１０】
抗体が放射性核種、酵素、基質、補因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁気粒子、薬剤または毒素をさらに含む、請求項８記載の抗体または抗体断片。
【請求項１１】
ＰＥＧ付加をさらに含む、請求項９記載の抗体。
【請求項１２】
（ａ）ポリクローナル抗体、（ｂ）ネズミモノクローナル抗体、（ｃ）（ｂ）由来のヒト化抗体、（ｄ）抗体断片、または（ｅ）ヒトモノクローナル抗体である、請求項８記載の抗体または抗体断片。
【請求項１３】
抗体が放射性核種、酵素、基質、補因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁気粒子、薬剤または毒素をさらに含む、請求項８記載の抗体または抗体断片。
【請求項１４】
ＰＥＧ付加をさらに含む、請求項１２記載の抗体。
【請求項１５】
ＩＬ‐１７Ａ誘導性またはＩＬ‐１７Ｆ誘導性炎症の低減方法であって、炎症を低減するのに十分な量の請求項７記載の抗体の組成物を炎症を有する哺乳類に投与することを包含する方法。
【請求項１６】
ＩＬ‐１７Ａ誘導性またはＩＬ‐１７Ｆ誘導性炎症の低減方法であって、炎症を低減するのに十分な量の請求項１記載のＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体の組成物を炎症を有する哺乳類に投与することを包含する方法。
【請求項１７】
ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆが一役を演じる炎症性疾患に罹患した哺乳類の治療方法であって、以下の：
炎症が低減されるよう哺乳類にＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆのアンタゴニストを投与することを包含する方法であり、この場合、アンタゴニストは（ｉ）ＺｃｙｔｏＲ１４のポリペプチドまたはポリペプチド断片と特異的に結合する抗体、抗体断片または結合ポリペプチド（配列番号２）、あるいは（ｉｉ）ＺｃｙｔｏＲ１４のポリペプチドまたはポリペプチド断片（配列番号３）を含み；そして
ＩＬ‐１７Ａ（配列番号１４）またはＩＬ‐１７Ｆ（配列番号１６）の炎症活性が低減される
方法。
【請求項１８】
疾患が喘息である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
疾患が慢性炎症性疾患である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
疾患が炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、クローン病、関節炎、アトピー性皮膚炎または乾癬を含む慢性炎症性疾患である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
疾患が急性炎症性疾患である、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
疾患が内毒素血症、敗血症、毒物ショック症候群または感染性疾患を含む急性炎症性疾患である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
抗体、抗体断片または結合ポリペプチドが放射性核種、酵素、基質、補因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁気粒子、薬剤または毒素をさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆが一役を演じる炎症性疾患に罹患した哺乳類の治療方法であって、以下の：
炎症が低減されるよう哺乳類にＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆの両方のアンタゴニストを投与することを包含する方法であり、この場合、アンタゴニストは（ｉ）ＺｃｙｔｏＲ１４のポリペプチドまたはポリペプチド断片と特異的に結合する抗体、抗体断片または結合ポリペプチド（配列番号２）、あるいは（ｉｉ）ＺｃｙｔｏＲ１４のポリペプチドまたはポリペプチド断片（配列番号３）を含み；そして
ＩＬ‐１７Ａ（配列番号１４）またはＩＬ‐１７Ｆ（配列番号１６）の両方の炎症活性が低減される
方法。
【請求項２５】
疾患が喘息である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
疾患が慢性炎症性疾患である、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
疾患が炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、クローン病、関節炎、アトピー性皮膚炎または乾癬を含む慢性炎症性疾患である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
疾患が急性炎症性疾患である、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
疾患が内毒素血症、敗血症、毒物ショック症候群または感染性疾患を含む急性炎症性疾患である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
抗体、抗体断片または結合ポリペプチドが放射性核種、酵素、基質、補因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁気粒子、薬剤または毒素をさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
ＺｃｙｔｏＲ１４活性に関連した被験者における病理学的状態の治療方法であって、有効量の請求項１記載の可溶性受容体を投与し、それにより前記病理学的状態を治療することを包含する方法。
【請求項３２】
前記病理学的状態が喘息である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記病理学的状態が慢性炎症性状態である、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記慢性炎症性状態が炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、クローン病、関節炎、アトピー性皮膚炎または乾癬を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記病理学的状態が急性炎症性状態である、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
前記急性炎症性状態が内毒素血症、敗血症、毒物ショック症候群または感染性疾患を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ＺｃｙｔｏＲ１４が一役を演じる炎症性疾患に罹患した哺乳類の治療方法であって、以下の：
炎症が低減されるよう哺乳類にＺｃｙｔｏＲ１４のアンタゴニストを投与することを包含する方法であり、この場合、アンタゴニストはＺｃｙｔｏＲ１４のポリペプチドまたはポリペプチド断片と特異的に結合する抗体、抗体断片、ＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体または結合ポリペプチド（配列番号２）を含み；そして
炎症活性が低減される
方法。
【請求項３８】
疾患が喘息である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
疾患が慢性炎症性疾患である、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
疾患が炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、クローン病、関節炎、アトピー性皮膚炎または乾癬を含む慢性炎症性疾患である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
疾患が急性炎症性疾患である、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
疾患が内毒素血症、敗血症、毒物ショック症候群または感染性疾患を含む急性炎症性疾患である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
抗体、抗体断片または結合ポリペプチドが放射性核種、酵素、基質、補因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁気粒子、薬剤または毒素をさらに含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
抗体、抗体断片または結合ポリペプチドがＰＥＧ付加をさらに含む、請求項３７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連発明の参照
本出願は、米国特許仮出願第60/578,805号（2004年6月10日提出）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
サイトカインは、多数の細胞型の増殖および分化の調節を含めた種々の生物学的作用を媒介する可溶性小タンパク質である（例えばArai et al., Annu. Rev. Biochem. 59: 783(1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3: 311(1991); Paul and Seder, Cell 76: 241(1994)参照）。サイトカイン群を構成するタンパク質としては、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子およびその他の調節分子が挙げられる。例えばヒトインターロイキン‐１７は、インターロイキン‐６、細胞内接着分子１、インターロイキン‐８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびプロスタグランジンＥ２の発現を刺激し、ＣＤ３４＋造血性前駆体の好中球への選択的成熟に一役を演じるサイトカインである（Yao et al., J. Immunol. 155: 5483(1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183: 2593(1996)）。
【０００３】
サイトカインと結合する受容体は、典型的には高親和性でサイトカインと結合する1つまたは複数の内在性膜タンパク質からなり、そしてある種の受容体サブユニットの細胞質部分を通して細胞にこの結合事象を形質導入する。サイトカイン受容体は、それらの細胞外リガンド結合ドメインにおける類似性に基づいて、数個のクラスにグループ分けされている。
【０００４】
サイトカインおよびそれらの受容体の実証されたin vivo活性は、他のサイトカイン、サイトカイン受容体、サイトカインアゴニストおよびサイトカインアンタゴニストの臨床的能力、ならびにそれらの必要性を例証する。例えば前炎症性サイトカインファミリーの実証されたin vivo活性は、前炎症性分子のアンタゴニストの桁外れの臨床的能力、ならびにそれらの必要性を例証する。
【発明の開示】
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明は、前炎症性サイトカインＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆに対するアンタゴニストを提供することにより、これらの必要性を取り扱う。特定的には、前炎症性サイトカインＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆは高度の配列類似性を有し、多数の生物学的特性を共有し、そしてともに活性化Ｔ細胞により産生される。それらは、種々の自己免疫および炎症性疾患、例えば慢性関節リウマチおよび喘息の進行に関与する因子としてともに関連付けられてきた。実際、ＩＬ‐１７Ａ機能を無効にする試薬は、ヒト疾患のいくつかのマウスモデルにおける疾患発生率および重症度を有意に改善する。ＩＬ‐１７Ａは、そのコグネイト受容体、ＩＬ‐１７受容体（ＩＬ‐１７Ｒ）との相互作用によりその作用を媒介するが、しかしＩＬ‐１７Ｆに関する受容体は未だ同定されていない。ＩＬ‐１７Ｆに関する受容体としてＩＬ‐１７Ｒ関連分子、ＺｃｙｔｏＲ１４を同定した、ということをここにわれわれは報告する。しかしながら、この受容体が、類似の高親和性でＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方と結合する、ということにもわれわれは留意した。他方でＩＬ‐１７Ｒは高親和性でＩＬ‐１７Ａと結合するが、しかしＩＬ‐１７Ｆとは極低親和性で結合する。これと一致して、可溶性形態のＩＬ‐１７Ｒは、いずれかの受容体を発現する細胞中でのＩＬ‐１７Ａ結合およびシグナル伝達を遮断するが、しかしＺｃｙｔｏＲ１４とのＩＬ‐１７Ｆの結合または機能を妨害しない、ということをわれわれは示した。それに反して、可溶性形態のＺｃｙｔｏＲ１４は、いずれかの受容体を発現する細胞中でのＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆを、単独でまたは一緒に、拮抗する。ＩＬ‐１７Ａ介入はいくつかの自己免疫疾患のための有効な療法として提唱されてきたため、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体を含み、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体を中和するＩＬ‐１７Ａ、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方の活性を遮断し、抑制し、低減し、拮抗するかまたは中和し得る本発明のアンタゴニストの使用は、これら2つのサイトカインのうちの1つだけをターゲッティングする療法を上回る利点を有する。本発明はさらに、炎症性疾患におけるそのための使用、ならびに関連組成物および方法を提供する。
【０００６】
Ａ）概要
免疫関連および炎症性疾患は、正常生理学では、傷害または損傷に対して応答し、傷害または損傷からの修復を開始し、異質生物体に対する生得的および後天的防御を装備するために重要である、かなり複雑な、しばしば多重相互連絡生物学的経路の顕示または結果である。これらの正常生理学経路が、応答の強度に直接関連するとして、異常調節または過剰刺激の結果として、自己に対する反応として、あるいはこれらの組合せとして、付加的傷害または損傷を引き起こす場合に、疾患または病理学は起きる。
【０００７】
これらの疾患の起源はしばしば、マルチステップ経路を、そしてしばしば多数の異なる生物学的系／経路を包含するが、しかし1つまたは複数のこれらの経路における臨界点での介入は改善または治療作用を有し得る。療法的介入は、有害なプロセス／経路の拮抗作用または有益なプロセス／経路の刺激により起こり得る。
【０００８】
多数の免疫関連疾患が既知であり、広範に研究されてきた。このような疾患としては、免疫媒介性炎症性疾患（例えば慢性関節リウマチ、免疫媒介性腎疾患、肝胆道疾患、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、感染および喘息）、非免疫媒介性炎症性疾患、感染性疾患、免疫不全症、新生物等が挙げられる。
【０００９】
リンパ球（Ｔ細胞）は、哺乳類免疫応答の重要な構成成分である。Ｔ細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）内の遺伝子によりコードされる自己分子と関連する抗原を認識する。抗原は、抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片等の表面でＭＨＣ分子と一緒に表示され得る。細胞系は、宿主哺乳類に対する健康脅威を有するこれらの変異細胞を排除する。Ｔ細胞としては、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞が挙げられる。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞上での抗原‐ＭＨＣ複合体の認識後に、広範に増殖する。ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞および免疫応答に参加する種々の他の細胞の活性化において中心的役割を演じる種々のサイトカイン、即ちリンフォカインも分泌する。
【００１０】
体液性および細胞媒介性免疫応答における中心的事象は、ヘルパーＴ細胞の活性化およびクローン拡大である。ヘルパーＴ細胞活性化は、抗原提示細胞の表面でのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）‐ＣＤ３複合体と抗原‐ＭＨＣの相互作用により開始される。この相互作用は、休止中のヘルパー細胞を細胞周期に入るよう誘導する（Ｇ０→Ｇ１遷移）生化学的事象のカスケードを媒介し、ＩＬ‐２、そして時としてＩＬ‐４に関する高親和性受容体の発現を生じる。活性化Ｔ細胞は、周期を通して進行して、記憶細胞またはエフェクター細胞に増殖し、分化する。
【００１１】
ＴＣＲにより媒介されるシグナルのほかに、Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞により、あるいは抗原提示細胞上の膜結合分子都Ｔ細胞との相互作用により放出されるサイトカインにより誘導される付加的同時刺激を包含する。サイトカインＩＬ‐１およびＩＬ‐６は、同時刺激シグナルを提供することが示されている。さらにまた抗原提示細胞の表面で発現されるＢ７分子とＴ細胞表面で発現されるＣＤ２８およびＣＴＬＡ‐４分子との間の相互作用は、Ｔ細胞活性化をもたらす。活性化Ｔ細胞は、増大数の細胞接着分子、例えばＩＣＡＭ‐１、インテグリン、ＶＬＡ‐４、ＬＦＡ‐１、ＣＤ５６等を発現する。
【００１２】
混合リンパ球培養または混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＴ細胞増殖は、免疫系を刺激する化合物の能力の確立された指標である。多数の免疫応答において、炎症細胞は損傷または感染の部位に浸潤する。移動細胞は、罹患組織の組織学的検査により確定され得るように、好中球、好酸球、単球またはリンパ球であり得る（Current Protocols in Immunology, ed. John E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc.）。
【００１３】
免疫関連疾患は、免疫応答を抑制することにより治療され得る。可溶性受容体および／または免疫刺激活性を有する分子を抑制する中和抗体の使用は、免疫媒介性および炎症性疾患の治療に有益である。免疫応答を抑制する分子は、免疫応答を抑制するために利用され（直接的にまたは抗体アゴニストの使用によるタンパク質）、したがって免疫関連疾患を改善し得る。
【００１４】
インターロイキン‐１７（ＩＬ‐１７Ａ）は、Ｔリンパ指向性ヘルペスウイルス・サイミリ（ＨＳＶ）によりコードされるタンパク質の細胞オーソログとして同定されている［Rouvier et al., J. Immunol., 150(12): 5445-5456 (1993); Yao et al., J. Immunol., 122(12): 5483-5486 (1995)およびYao et al., Immunity, 3(6): 811-821 (1995)参照］。その後の特性化は、このタンパク質が広範囲の末梢組織中の前炎症性応答を誘導するよう作用する強力なサイトカインである、ということを示した。ＩＬ‐１７Ａは、ＣＤ４＋活性化記憶Ｔ細胞によってのみ合成され、分泌される約32 kDaのジスルフィド結合ホモ二量体サイトカインである（Fossiez et al., Int. Rev. Immunol., 16: 541-551 [1998]で再検討されている）。特定的には、ＩＬ‐１７は、19〜23残基のＮ末端シグナル配列を有する155アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、ジスルフィド結合ホモ二量体糖タンパク質として分泌される。ＩＬ‐１７Ａは、WO9518826（1995）、WO9715320（1997）およびWO9704097（1997）、ならびに米国特許第6,063,372号に開示されている。
【００１５】
その制限組織分布にもかかわらず、ＩＬ‐１７Ａは種々の型の細胞上で多面的生物学的活性を示す。ＩＬ‐１７Ａは、多数のサイトカインの産生を刺激することが見出されている。それは、繊維芽細胞、ケラチノサイト、上皮および内皮細胞のような接着細胞によるＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、プロスタグランジンＥ２、ＭＣＰ‐１およびＧＣＳＦの分泌を誘導する。ＩＬ‐１７Ａは、ＩＣＡＭ‐１表面発現、Ｔ細胞の増殖、ならびにＣＤ３４．sup.＋ヒト始原細胞の好中球への分化を誘導する能力も有する。ＩＬ‐１７Ａは骨代謝にも関連づけられており、そして活性化Ｔ細胞およびＴＮＦ‐アルファ産生の存在により特性化される病理学的状態、例えば慢性関節リウマチおよび骨移植片のルースニングにおいて重要な役割を演じることが示唆されている（Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res. 14: 1513-1521 [1999]）。慢性関節リウマチ患者由来の滑膜組織の活性化Ｔ細胞は、正常個体または骨関節炎患者由来のものより多い量のＩＬ‐１７Ａを分泌することが見出された（Chabaud et al., Arthritis Rheum. 42: 963-970 [1999]）。この前炎症性サイトカインは、慢性関節リウマチにおける滑膜炎症に能動的に関与する、ということが示唆された。その前炎症性役割は別として、ＩＬ‐１７Ａは、さらに別のメカニズムにより慢性関節リウマチの病理学に関与すると思われる。例えばＩＬ‐１７Ａは、骨芽細胞中の破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）ｍＲＮＡの発現を誘導することが示されている（Kotake et al., J. Clin. Invest., 103: 1345-1352 [1999]）。ＯＤＦは、骨再吸収に関与する細胞である破骨細胞への始原細胞の分化を刺激する。
【００１６】
ＩＬ‐１７Ａのレベルは慢性関節リウマチ患者の滑膜中で有意に増大されるため、ＩＬ‐１７Ａ誘導性破骨細胞形成は慢性関節リウマチにおける骨再吸収にきわめて重要な役割を演じると思われる。ＩＬ‐１７Ａは、ある種の他の自己免疫障害、例えば多発性硬化症において重要な役割を演じるとも考えられる（Matusevicius et al., Mult. Scler., 5: 101-104 [1999]）。ＩＬ‐１７Ａはさらに、細胞内シグナル伝達により、ヒトマクロファージにおけるＣａ．Sup.２＋流入および［ｃＡＭＰ］の低減を刺激することが示されている（Jovanovic et al., J. Immunol., 160: 3513 [1998]）。ＩＬ‐１７Ａで処理される繊維芽細胞はＮＦ‐カッパＢの活性化を誘導する［Yao et al., Immunity, 3: 811 (1995), Jovanovic et al., 上記］が、一方、それで処理されたマクロファージはＮＦ‐カッパＢおよび有糸分裂促進因子活性化プロテインキナーゼを活性化する（Shalom-Barek et al., J. Biol. Chem. 273: 27467 [1998]）。
【００１７】
さらにＩＬ‐１７Ａはまた、骨および軟骨成長に関与する哺乳類サイトカイン様因子７との配列類似性を共有する。ＩＬ‐１７Ａポリペプチドが配列類似性を共有するその他のタンパク質は、ヒト胚由来インターロイキン関連因子（ＥＤＩＲＦ）およびインターロイキン‐２０である。
【００１８】
ＩＬ‐１７Ａ野広範囲の作用と一致して、ＩＬ‐１７Ａに関する細胞表面因子は、多数の組織および細胞型において広範に発現されることが見出されている（Yao et al., Cytokine, 9: 794 [1997]）。ヒトＩＬ‐１７Ａ受容体（ＩＬ‐１７Ｒ）のアミノ酸配列（866アミノ酸）は単一膜貫通ドメインおよび長い525アミノ酸細胞内ドメインを有するタンパク質を予測するが、しかし受容体配列は独特であり、そしてサイトカインからの受容体／成長因子受容体ファミリーのいずれかのものと類似しない。これは、その他の既知のタンパク質とのＩＬ‐１７Ａそれ自体の類似性の欠如と結び付けられて、ＩＬ‐１７Ａおよびその受容体がシグナル伝達タンパク質および受容体の新規のファミリーの一部であり得る、ということを示す。ＩＬ‐１７Ａ活性はその独特の細胞表面受容体との結合により媒介される、ということが実証されているが、この場合、従来の研究は、Ｔ細胞と可溶性形態のＩＬ‐１７Ａ受容体ポリペプチドとの接触が、ＰＨＡ、コンカナバリンＡおよび抗ＴＣＲモノクローナル抗体により誘導されるＴ細胞増殖およびＩＬ‐２産生を抑制する、ということを示している（Yao et al., J. Immunol., 155: 5483-5486 [1995]）。このようなものとして、既知のサイトカイン受容体、特にＩＬ‐１７Ａ受容体との相同性を有する新規のポリペプチドを同定し、特性化することに、有意の関心が存在する。
【００１９】
ＩＬ‐１７Ｆの発現パターンは、それが活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞および単球のみを含むよう、ＩＬ‐１７Ａのパターンと類似する、と思われる（Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]）。ＩＬ‐１７Ｆは、繊維芽細胞においてＧ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐６およびＩＬ‐８（Hymowitz et al., EMBO J. 20: 5322-5341 [2001]）を、そして内皮細胞ではＴＧＦ‐ｂ（Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]）を誘導することが実証されている。樹状細胞により産生されるサイトカインであるＩＬ‐２３は、主に記憶Ｔ細胞において、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方の産生を媒介し得る、ということが近年報告されている（Aggarwal et al. J. Biol. Chem. 278: 1910-1914 [2003]）。
【００２０】
さらに、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐Ｆの両方の過剰発現または上向き調節は、関節炎および喘息個体で示されている（Moseley et al. Cytokine Growth Factor Rev 14: 155-174 [2003]で再検討）。関節炎に関して、これらのサイトカインは慢性関節リウマチおよび骨関節炎に関連する軟骨および関節破壊に特徴的な方法で作用する。例えばＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆは、新規のプロテオグリカンおよびコラーゲンの合成を抑制しながら、軟骨プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよびコラーゲン断片の放出により関節軟骨外植片中のマトリックス分解を増強することが実証されている（Cai et al. Cytokine 16: 10-21 [2001]; Attur et al Arthritis Rheum 44: 2078-2083 [2001]）。
【００２１】
ＩＬ‐１７Ａと同様に、マウスにおけるＩＬ‐１７Ｆの過剰発現も、肺好中球動員を増大し、肺におけるＴｈ１関連サイトカイン、例えばＩＬ‐６、ＩＦＮ‐ガンマ、ＩＰハイフン１０およびＭＩＧの発現増大を生じる（Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]）。ＩＬ‐１７Ｆはまた、アレルゲン攻撃誘発性喘息患者からのＴ細胞において上向き調節され（Kawaguchi et al J. Immunol 167: 4430-4435 [2001]）、ＮＨＢＥにおけるＩＬ‐６およびＩＬ‐８産生を誘導することが判明した。ＩＬ‐１７Ａに対比して、ＩＬ‐１７Ｆは、in vitroでの血管新生を抑制すると思われる（Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]）。
【００２２】
ＩＬ‐１７Ｆ  ｍＲＮＡは、種々のヒト組織中でノーザンブロットにより検出されなかったが、しかしＣＤ４＋Ｔ細胞および単球の活性化時に劇的に誘導された（同上）。マウスにおいて、Ｔｈ２細胞および肥満細胞は、活性化時にＩＬ‐１７Ｆを発現することが判明した（Dumont, Expert Opin. Ther. Patents 13(3) (2003)参照）。ＩＬ‐１７Ａと同様、ＩＬ‐１７Ｆの発現もマウスにおいてＩＬ‐２３により上向き調節されることが判明した。
【００２３】
ＩＬ‐１７サイトカイン／受容体ファミリーは、免疫および炎症応答の操作に対する革新的アプローチを提供するサイトカインネットワーク内で独特のシグナル伝達系を表わすと思われる。したがって本発明は、新規のＩＬ‐１７ファミリー受容体、ＺｃｙｔｏＲ１４の発見、ならびにＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方と結合するその能力に基づいている。
【００２４】
したがって、ＩＬ‐１７ＦおよびＩＬ‐１７Ａ活性に対するアンタゴニスト、例えばＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体およびそれに対する抗体、例えば本発明の抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナルおよび中和抗体は、特にＩＬ‐１７ＦおよびＩＬ‐１７Ａの両方に対するアンタゴニストとして、炎症性疾患の治療的処置において、単独で、または乾癬の治療においてもともに、有用である。さらに、ＩＬ‐１７Ｆ活性に対するアンタゴニスト、例えばＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体およびそれに対する抗体、例えば本発明の抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナルおよび中和抗体は、例えばアトピー性および接触性皮膚炎、ＩＢＤ、結腸炎、内毒素血症、関節炎、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、成人性呼吸器疾患（ＡＲＤ）、敗血症性ショック、多発性臓器不全、炎症性肺損傷、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気道反応性亢進，慢性気管支炎、アレルギー性喘息、細菌性肺炎、乾癬、湿疹、ならびに炎症性腸疾患、例えば潰瘍性結腸炎およびクローン病、ヘリコバクター・ピロリ感染、腹膜炎症の結果としての腹腔内癒着および／または膿瘍（即ち感染、損傷等からの）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、全身性硬化症、ネフローゼ症候群、臓器同種異系移植片拒絶、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、腎臓、肺、心臓等の移植片拒絶、連鎖球菌細胞壁（ＳＣＷ）誘導性関節炎、骨関節炎、歯肉炎／歯周炎、ヘルペス性間質性角膜炎、癌、例えば前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、卵巣癌、子宮頚部癌、白血病、血管新生、再狭窄および川崎病の治療において、ＩＬ‐１７ＦおよびＩＬ‐１７Ａ（個別にまたは一緒に）を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和する場合、その他の炎症性疾患の療法的処置に有用である。
【００２５】
サイトカイン受容体サブユニットは、リガンド結合ドメイン、ならびに典型的にはシグナル伝達に関与するエフェクタードメインを含む多ドメイン構造により特性化される。多量体サイトカイン受容体としては、単量体、ホモ二量体（例えばＰＤＧＦ受容体ααおよびββアイソフォーム、エリスロポイエチン受容体、ＭＰＬ［トロンボポイエチン受容体］、およびＧ‐ＣＳＦ受容体）、そのサブユニットが各々リガンド結合およびエフェクタードメインを有するヘテロ二量体（例えばＰＤＧＦ受容体αβアイソフォーム）、ならびに本質的に異なる機能を有する構成成分サブユニットを有する多量体（例えばＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７およびＧＭ‐ＣＳＦ受容体）が挙げられる。いくつかの受容体サブユニットは、複数の受容体に共通である。例えばそれ自体の上でリガンドを結合できないが、しかし細胞内シグナル伝達ドメインを含むＡＩＣ２Ｂサブユニットは、ＩＬ‐３およびＧＭ‐ＣＳＦ受容体の一構成成分である。多数のサイトカイン受容体は、それらの構造および機能に基づいて、4つの関連ファミリーのうちの1つに置かれ得る。例えばクラスＩ造血性受容体は、保存システイン残基およびＷＳＸＷＳモチーフ（配列番号１０）を含有するドメインの存在により特性化される。付加的ドメイン、例えばプロテインキナーゼドメイン；フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン；および免疫グロブリンドメイン（ジスルフィド結合ループにより特性化される）が、ある種の造血性受容体中に存在する。サイトカイン受容体構造は、Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26: 221-228, 1991およびCosman, Cytokine 5: 95-106, 1993により再検討されている。一般に、生物体が新規の生物学的機能を獲得するための選択的圧力下で、新規の受容体ファミリー成員は現存する受容体遺伝子の重複から生じて、多遺伝子ファミリーを存在させる、と考えられる。したがってファミリー成員は先祖遺伝子の痕跡を含有し、そしてこれらの特質的特徴は、付加的ファミリー成員の単離および同定において利用され得る。
【００２６】
本発明の中でも特に、本発明は、「ＺｃｙｔｏＲ１４」または「可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４」または「ｓＺｃｙｔｏＲ１４」（これらはすべて、本明細書中で互換的に用いられ得る）と呼ばれる可溶性受容体、あるいはＺｃｙｔｏＲ１４サイトカイン受容体に対する中和抗体に関する新規の使用を提供する。本発明は、ヒト炎症性および自己免疫疾患において用いるための、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド断片および融合タンパク質も提供する。本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体および可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体、例えば本発明の中和抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、炎症および炎症性疾患、例えば乾癬、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ、内毒素血症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、結腸炎、喘息、同種異系移植片拒絶、免疫媒介性腎疾患、肝胆道疾患、多発性硬化症、アテローム硬化症、腫瘍増殖の促進または変形性関節疾患、ならびに本明細書中に開示されるその他の炎症性症状の治療において、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７ＡあるいはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方の活性を遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和するために用いられ得る。
【００２７】
ヒトＺｃｙｔｏＲ１４をコードする例示的ヌクレオチド配列は、配列番号１により提示される；コード化ポリペプチドは、配列番号２で示される。ＺｃｙｔｏＲ１４は、ＩＬ‐１７Ａ（配列番号１３＆１４）およびＩＬ‐１７Ｆ（配列番号１５＆１６）の両方に関する受容体として機能する。ＺｃｙｔｏＲ１４は、単量体、ホモ二量体またはヘテロ二量体として作用し得る。好ましくはＺｃｙｔｏＲ１４は、ＩＬ‐１７Ａおよび／またはＩＬ‐１７Ｆの両方に関するホモ二量体受容体として作用する。ＺｃｙｔｏＲ１４は、ＩＬ‐１７関連サイトカインに関するヘテロ二量体受容体としても作用する。ＺｃｙｔｏＲ１４は、共同所有米国特許出願第10/458,647号および共同所有WIPO公告WO 01/04304（これらはともに、参照により本明細書中で援用される）に開示されている。ＺｃｙｔｏＲ１４（配列番号１）をコードするヒトｃＤＮＡクローンの分析は、約20アミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸残基１〜２０）の推定シグナル配列、約431アミノ酸残基（配列番号２；配列番号３のアミノ酸残基２１〜４５２）の細胞外リガンド結合ドメイン、約20アミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸残基４５３〜４７３）の膜貫通ドメイン、および約203アミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸残基４７４〜６７７）の細胞内ドメインを含む692アミノ酸（配列番号２）をコードするオープンリーディングフレームを明示した。さらにリガンド結合ドメインは、配列番号２２により表わされる。
【００２８】
「ＺｃｙｔｏＲ１４‐１」と呼ばれる変異体ヒトＺｃｙｔｏＲ１４をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は、配列番号４により提供され、コード化ポリペプチドは配列番号５で示される。ＺｃｙｔｏＲ１４‐１は、共同所有米国特許出願第10/458,647号および共同所有WIPO公告WO 01/04304（これらはともに、参照により本明細書中で援用される）に開示されている。配列分析は、ＺｃｙｔｏＲ１４‐１が受容体ポリペプチドの切頭型であることを明示した。即ち、ＺｃｙｔｏＲ１４‐１は、配列番号２のアミノ酸残基１〜１１３を欠く。配列番号１０は、ＺｃｙｔｏＲ１４のＮ末端部分を含むＺｃｙｔｏＲ１４‐１ポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【００２９】
ＺｃｙｔｏＲ１４およびＺｃｙｔｏＲ１４‐１アミノ酸配列の比較は、2つのポリペプチドが代替的スプライス化変異体を表わす、ということも示した。ＺｃｙｔｏＲ１４のアミノ酸配列は、ＺｃｙｔｏＲ１４‐１が欠いている17アミノ酸セグメント（配列番号２のアミノ酸残基３３９〜３５５）を含み、一方、ＺｃｙｔｏＲ１４は、アミノ酸４７９の後ろで、ＺｃｙｔｏＲ１４‐１において見出される13アミノ酸セグメント（配列番号５のアミノ酸残基３５０〜３６２）を欠く。両方のアミノ酸セグメントを含有するポリペプチドは配列番号１１により提供され、一方、配列番号１２は、13および17アミノ酸セグメントの両方を欠くポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【００３０】
「ＺｃｙｔｏＲ１４‐６」と呼ばれる変異体ヒトＺｃｙｔｏＲ１４をコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列は、配列番号２３により提供され、コード化ポリペプチドは配列番号２４で示される。ＺｃｙｔｏＲ１４‐６は、配列番号２で例示されるようなＺｃｙｔｏＲ１４と比較して、25アミノ酸残基欠失を含有する。特定的にはＺｃｙｔｏＲ１４‐６は、配列番号２のアミノ酸残基９４〜アミノ酸残基１１８を含有しない。ＺｃｙｔｏＲ１４‐６（配列番号２３）をコードするヒトｃＤＮＡクローンの分析は、約427アミノ酸残基（配列番号２４のアミノ酸残基１〜４２７）の細胞外リガンド結合ドメイン、約20アミノ酸残基（配列番号２４のアミノ酸残基４２８〜４４８）の膜貫通ドメイン、および約218アミノ酸残基（配列番号２４のアミノ酸残基４４９〜６６７）の細胞内ドメインを明示した。
【００３１】
変異体ネズミＺｃｙｔｏＲ１４をコードする例証的ヌクレオチド配列は、配列番号２５により提供される；コードポリペプチドは配列番号２６で示される。ネズミＺｃｙｔｏＲ１４は、ネズミＩＬ‐１７Ａ（配列番号１７＆１８）およびネズミＩＬ‐１７Ｆ（配列番号１９＆２０）の両方に関する受容体として機能する。ＺｃｙｔｏＲ１４（配列番号１）をコードするネズミｃＤＮＡクローンの分析は、約449アミノ酸残基（配列番号２７）の細胞外リガンド結合ドメインを明示した。さらにリガンド結合ドメインは、配列番号２８により表わされる。
【００３２】
変異体ネズミＺｃｙｔｏＲ１４をコードするさらに別の例証的ヌクレオチド配列は、配列番号２９により提供される；コード化ポリペプチドは、配列番号３０で示される。
ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子は、染色体３ｐ２５‐３ｐ２４に存在する。下記のように、この領域は種々の障害および疾患と関連する。
【００３３】
ノーザン分析は、甲状腺、副腎、前立腺および肝臓組織中にＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子の強い発現が、そして心臓、小腸、胃および気管組織中では低発現が認められる、ということを示す。これに反して、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、結腸、末梢血白血球、脊髄、リンパ節および骨髄中では発現はほとんどまたは全く存在しない。これらの観察は、ＺｃｙｔｏＲ１４配列が種々の組織間を区別するために用いられ得ることを示す。
【００３４】
下記のように、本発明は、配列番号２の参照アミノ酸配列と少なくとも70％、少なくとも80％または少なくとも90％、あるいは95％より多く、例えば96％、97％、98％、または99％より多く、あるいはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供し、この場合、単離ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。本発明は、以下の：（ａ）配列番号２のアミノ酸残基２１〜４５２、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸残基２１〜４３５、（ｃ）配列番号２のアミノ酸残基２１〜６７７、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基１〜６９２から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号１０のアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する単離ポリペプチドも提供する。例示的ポリペプチドとしては、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【００３５】
本発明は、細胞外ドメインを含む単離ポリペプチドであって、細胞外止め因果配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基２１〜４５２、または配列番号１０のアミノ酸配列のアミノ酸残基２１〜４３５を含む単離ポリペプチドも提供する。このようなポリペプチドは、細胞外ドメインに関してカルボキシル末端位置に存在する膜貫通ドメインをさらに含み得るが、この場合、膜貫通ドメインは配列番号２のアミノ酸残基４５３〜４７３を含む。これらのポリペプチドは、膜貫通ドメインに関してカルボキシル末端位置に存在する細胞内ドメインも含み得るが、この場合、細胞内ドメインは、配列番号２のアミノ酸残基４７４〜６７７、配列番号１０のアミノ酸残基４５７〜６７３を、そして任意に細胞外ドメインに関してアミノ末端位置に存在するシグナル分泌配列（ここで、シグナル分泌配列は配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜２０を含む）を含む。
【００３６】
本発明は、変異体ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドも包含するが、この場合、変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも70％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも95％の同一性、または95％より大きい同一性からなる群から選択される配列番号２のアミノ酸配列との同一性を共有し、そして変異体ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列との間の任意の差は、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換によるものである。
【００３７】
さらに本発明は、ＩＬ‐１７Ｆと結合する上記のような単離ポリペプチドも提供する（例えば配列番号１６で示されるようなヒトＩＬ‐１７Ｆポリペプチド配列）。ヒトＩＬ‐１７Ｆポリヌクレオチド配列は、配列番号１５で示される。マウスＩＬ‐１７Ｆポリヌクレオチド配列は配列番号１９で示され、そして対応するポリペプチドは配列番号２０で示される。本発明は、ＩＬ‐１７Ａと結合する上記のような単離ポリペプチドも提供する（例えば配列番号１４で示されるようなヒトＩＬ‐１７Ａポリペプチド配列）。ヒトＩＬ‐１７Ａポリヌクレオチド配列は、配列番号１３で示される。マウスＩＬ‐１７Ａポリヌクレオチド配列は配列番号１７で示され、そして対応するポリペプチドは配列番号１８で示される。
【００３８】
本発明は、配列番号２または３のアミノ酸配列の少なくとも15連続アミノ酸残基を含む単離ポリペプチドおよびエピトープも提供する。例証的ポリペプチドとしては、配列番号２または３を含むかまたはそれらから成るポリペプチド、その抗原エピトープ、またはその機能性ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆ結合断片が挙げられる。さらに本発明は、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａの活性を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和する上記のような単離ポリペプチドも提供する。
【００３９】
本発明は、変異体ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドも包含するが、この場合、変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも70％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも95％の同一性、または95％より大きい同一性、例えば96％、97％、98％または99％より多い同一性からなる群から選択される配列番号２のアミノ酸配列との同一性を共有し、そして変異体ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列との間の任意の差は、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換によるものである。このような保存的アミノ酸置換は、本明細書中に記載されている。さらに本発明は、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａの活性を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和する上記のような単離ポリペプチドも提供する。
【００４０】
本発明はさらに、このようなポリペプチドと特異的に結合する抗体および抗体断片を提供する。例示的抗体としては、中和抗体、ポリクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体由来のヒト化抗体およびヒトモノクローナル抗体が挙げられる。例証的抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよび最小認識単位が挙げられる。中和抗体は、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７ＦとＺｃｙｔｏＲ１４との相互作用が遮断され、抑制され、低減され、拮抗されまたは中和されるよう、好ましくはＺｃｙｔｏＲ１４と結合し；ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７ＦとＺｃｙｔｏＲ１４との結合が遮断され、抑制され、低減され、拮抗されまたは中和されるような抗ＺｃｙｔｏＲ１４中和抗体も本発明により包含される。即ち本発明の中和抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆの各々を単独で結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和し得るし、あるいはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆを一緒に結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗し、または中和し得る。本発明はさらに、本明細書中に記載される担体およびペプチド、ポリペプチドまたは抗体を含む組成物を包含する。
【００４１】
さらに本発明は、製薬上許容可能な担体および少なくとも1つのこのような発現ベクターまたはこのようなベクターを含む組換えウイルスを含む製剤組成物を提供する。本発明はさらに、製薬上許容可能な担体および本明細書中に記載されるポリペプチドまたは抗体を含む製剤組成物を包含する。
【００４２】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片と特異的に結合する抗体または抗体断片と特異的に結合する抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプ抗体断片も意図する。例示的抗イディオタイプ抗体は、配列番号２から成るポリペプチドと特異的に結合する抗体と結合する。
【００４３】
本発明は、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドおよび免疫グロブリン部分を含む融合タンパク質も提供する。このような融合タンパク質では、免疫グロブリン部分は、免疫グロブリン重鎖定常部、例えばヒトＦｃ断片であり得る。本発明はさらに、このような融合タンパク質をコードする単離核酸分子を包含する。
【００４４】
本発明は、可溶性受容体を含めた単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体および多量体受容体のようなＺｃｙｔｏＲ１４細胞外ドメインを含むポリペプチドと結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体も提供する。さらにこのような抗体は、ＺｃｙｔｏＲ１４リガンド、ＩＬ‐１７Ｆ（配列番号１６）およびＩＬ‐１７Ａ（配列番号１４）の、個別のまたは一緒の、ＺｃｙｔｏＲ１４受容体との結合を拮抗するために用いられ得る。
【００４５】
本発明のこれらのおよびその他の態様は、以下の詳細な説明を参照すれば明白になる。さらに種々の参考文献が以下で確認され、そしてそれらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される。
【００４６】
Ｂ）定義
以下の説明では、多数の用語が広範囲に用いられる。以下の定義は、本発明の理解を促すために提供される。
本明細書中で用いる場合、「核酸」または「核酸分子」とは、ポリヌクレオチド、例えばでオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成される断片、ならびに結紮、分割、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成される断片をさす。核酸分子は、天然ヌクレオチド（例えばＤＮＡおよびＲＮＡ）または天然ヌクレオチドの類似体（例えばα‐エナンチオマー形態の天然ヌクレオチド）あるいは両方の組合せである単量体で構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分に、および／またはピリミジンまたはプリン塩基部分に変異を有し得る。糖修飾としては、例えば1つまたは複数のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による置換が挙げられ、あるいは糖はエーテルまたはエステルとして官能化され得る。さらに全糖部分は、立体的および電子的類似構造物、例えばアザ‐糖およびカルボン酸糖類似物で置き換えられ得る。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、あるいはその他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはこのような結合の類似物により連結され得る。ホスホジエステル結合の類似物としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート等が挙げられる。「核酸分子」という用語は、いわゆる「ペプチド核酸」も含み、これは、ポリアミド主鎖に結合される天然または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。
【００４７】
「核酸分子の相補体」という用語は、参照ヌクレオチド配列と比較して相補的ヌクレオチド配列および逆方向を有する核酸分子を指す。例えば配列5’ ATGCACGGG 3’は、5' CCCGTGCAT 3'と相補的である。
【００４８】
「縮重ヌクレオチド配列」という用語は、一ポリペプチドをコードする参照核酸分子と比較して1つまたは複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの一配列を意味する。縮重コドンはヌクレオチドの異なる三つ組を含有するが、しかし同一アミノ酸残基をコードする（即ち、ＧＡＵおよびＧＡＣ三つ組は各々、Ａｓｐをコードする）。
【００４９】
「構造遺伝子」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、これが次に特定ポリペプチドに特有のアミノ酸の一配列に翻訳される核酸分子を指す。
【００５０】
「単離核酸分子」とは、生物体のゲノムＤＮＡに組み込まれない核酸分子である。例えば細胞のゲノムＤＮＡから分離された成長因子をコードするＤＮＡ分子は、単離ＤＮＡ分子である。単離核酸分子の別の例は、生物体のゲノム中に組み込まれない化学合成核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全ＤＮＡ分子より小さい。
【００５１】
「核酸分子構築物」は、現実に存在しない整列で組合されるかまたは並置される核酸のセグメントを含有するよう人が介入して修飾された、一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
【００５２】
「線状ＤＮＡ」とは、自由５’および３’末端を有する非環状ＤＮＡ分子を意味する。線状ＤＮＡは、酵素消化または物理的破壊により閉環ＤＮＡ分子、例えばプラスミドから調製され得る。
【００５３】
「相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、酵素逆転写酵素によりｍＲＮＡ鋳型から生成される一本鎖ＤＮＡである。典型的には、ｍＲＮＡの一部分と相補的なプライマーが、逆転写の開始のために用いられる。このような一本鎖ＤＮＡ分子およびその相補的ＤＮＡ鎖から成る二本鎖ＤＮＡを指すためにも、当業者は「ｃＤＮＡ」という用語を用いる。「ｃＤＮＡ」という用語は、ＲＮＡ鋳型から合成されるｃＤＮＡ分子のクローンも指す。
【００５４】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指図するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近位の遺伝子の５’非コード領域に置かれる。転写の開始に際して機能するプロモーター内の配列要素は、しばしばコンセンサスヌクレオチド配列により特性かされる。これらのプロモーター素子としては、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的要素（ＤＳＥ；McGehee et al.,  Mol. Endocrinol. 7: 551 (1993)）、環状ＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）、血清応答要素（ＳＲＥ；Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1: 47 (1990)）、糖質コルチコイド応答要素（ＧＲＥ）、ならびにその他の転写因子、例えばＣＲＥ／ＡＴＦ（O’Reilly et al., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)）、ＡＰ２（Ye et al., J. Biol. Chem. 269: 25728 (1994)）、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答素子結合タンパク質（ＣＲＥＢ；Loeken, Gene Expr. 3: 253 (1993)）および八量体因子（概して、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)およびLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303: 1 (1994)参照）に関する結合部位が挙げられる。プロモーターが誘導性プロモーターである場合には、転写速度は誘導作因に応答して増大する。逆に、プロモーターが構成性プロモーターである場合、転写速度は誘導作因により調節されない。抑制性プロモーターも既知である。
【００５５】
「コアプロモーター」は、ＴＡＴＡボックスおよび転写の開始を含めたプロモーター機能に関する必須ヌクレオチド配列を含有する。この定義により、コアプロモーターは、活性を増強するかまたは組織特異的活性を付与し得る特定配列の非存在下で検出可能な活性を有することも有さないこともあり得る。
【００５６】
「調節要素」とは、コアプロモーターの活性を調整するヌクレオチド配列である。例えば調節素子は、特定の細胞、組織または細胞小器官中で、専らまたは選択的に、転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含有し得る。これらの型の調節素子は、普通は、「細胞特異的」、「組織特異的」または「細胞小器官特異的」方法で発現される遺伝子と関連する。
【００５７】
「エンハンサー」は、転写の開始部位に関するエンハンサーの距離または配向とは関係なく、転写の効率を増大し得る調節要素の一型である。
【００５８】
「非相同ＤＮＡ」とは、所定の宿主細胞内に天然では存在しないＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の集団を指す。特定宿主細胞と非相同性であるＤＮＡ分子は、その宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ（即ち外因性ＤＮＡ）と組合される限り、宿主細胞種由来のＤＮＡ（即ち内因性ＤＮＡ）を含有し得る。例えば転写プロモーターを含む宿主ＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含有するＤＮＡ分子は、非相同ＤＮＡ分子であるとみなされる。逆に、非相同ＤＮＡ分子は、外因性プロモーターと操作可能的に連結される内因性遺伝子を含み得る。別の例証として、野生型細胞由来の遺伝子を含むＤＮＡ分子は、そのＤＮＡ分子が野生型遺伝子を欠く突然変異体細胞中に導入される場合、非相同ＤＮＡとみなされる。
【００５９】
「ポリペプチド」とは、天然で産生されようと、合成的に産生されようと、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約10未満のアミノ酸残基のポリペプチドは、一般的に「ペプチド」と呼ばれる。
【００６０】
「タンパク質」は、1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質は、非ペプチド構成成分、例えば炭水化物基も含み得る。炭水化物およびその他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生される細胞によりタンパク質に付加され、そして細胞の型に伴って変わる。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖構造に関して、本明細書中で定義される；置換基、例えば炭水化物基は一般に特定されないが、しかしそれにもかかわらず存在し得る。
【００６１】
非宿主ＤＮＡ分子によりコードされるペプチドまたはポリペプチドは、「非相同的」ペプチドまたはポリペプチドである。
「クローンベクター」は、宿主細胞中で自律的に複製する能力を有する核酸分子、例えばプラスミド、コスミドまたはバクテリオファージである。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの不可欠な生物学的機能の損失を伴わずに確定可能方式での核酸分子の、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択に用いるのに適したマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列の挿入を可能にする1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有する。マーカー遺伝子は、典型的にはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子を包含する。
【００６２】
「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常はプロモーターの制御下に置かれ、そしてこのような遺伝子は、プロモーターと「操作可能的に連結される」といわれる。同様に、調節素子およびコアプロモーターは、調節素子がコアプロモーターの活性を調整する場合、操作可能的に連結される。
【００６３】
「組換え宿主」とは、非相同的核酸分子、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターを含有する細胞である。本発明の状況では、組換え宿主の一例は、発現ベクターからのＺｃｙｔｏＲ１４を産生する細胞である。逆に言えば、ＺｃｙｔｏＲ１４は、ＺｃｙｔｏＲ１４の「天然供給源」である、そして発現ベクターを欠く細胞により産生され得る。
【００６４】
「組込みタンパク質」は、少なくとも2つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子により発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば融合タンパク質は、親和性マトリックスと結合するポリペプチドと融合されるＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドの少なくとも一部を含み得る。このような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーを用いて大量のＺｃｙｔｏＲ１４を単離するための一手段を提供する。
【００６５】
「受容体」という用語は、「リガンド」と呼ばれる生物活性分子と結合する細胞関連タンパク質を意味する。この相互作用は、細胞に及ぼすリガンドの作用を媒介する。受容体は、膜結合性受容体、サイトゾル受容体または核受容体；単量体受容体（例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β‐アドレナリン作動性受容体）または多量体受容体（例えばＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ‐３受容体、ＧＭ‐ＣＳＦ受容体、Ｇ‐ＣＳＦ受容体、エリスロポイエチン受容体およびＩＬ‐６受容体）であり得る。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、ならびに典型的にはシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインを含む多ドメイン構造により特性化される。ある種の膜結合受容体では、細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインは、完全機能性受容体を含む別個のポリペプチド中に置かれる。
【００６６】
概して、リガンドと受容体との結合は、細胞中のエフェクタードメインおよびその他の分子（単数または複数）間の相互作用を引き起こす受容体における立体配座変化を生じ、これは次に細胞の代謝における変化をもたらす。受容体‐リガンド相互作用にしばしば結び付けられる代謝事象としては、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、環状ＡＭＰ産生の増大、細胞カルシウムの可動化、膜脂質の可動化、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解が挙げられる。
【００６７】
「可溶性受容体」は、細胞膜に結合されない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、最も一般的には、膜貫通および細胞質ドメイン、ならびに細胞膜とのその他の連結、例えばグリコホスホイノシトール（ｇｐｉ）による連結を欠くリガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、付加的アミノ酸残基、例えばポリペプチドの精製を提供するかまたは基質へのポリペプチドの結合のための部位を提供する親和性タグ、または免疫グロブリン定常部配列を含み得る。多数の細胞表面受容体は、タンパク質分解により産生されるかまたは代替的スプライス化ｍＲＮＡから翻訳される天然の可溶性同等物を有する。可溶性受容体は、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体性であり、多量体受容体は一般に9より多いサブユニットを含まず、好ましくは6より多いサブユニットを含まず、最も好ましくは3より多いサブユニットを含まない。受容体ポリペプチドは、それらがそれぞれ膜固定またはシグナル伝達を提供するのに十分なこれらセグメントの部分を欠く場合、膜貫通および細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さないといわれている。サイトカイン受容体の可溶性受容体は一般に、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含有しない細胞外サイトカイン結合ドメインを含む。例えば代表的可溶性受容体としては、配列番号２１で示されるようなＩＬ‐１７Ｒに関する可溶性受容体が挙げられる。既知のサイトカイン受容体配列のうちのどの配列が、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含有しない細胞外サイトカイン結合ドメインを含むかを概説することは、十分に当業者のレベル内である。さらに、遺伝子コードを使用する当業者は、このような可溶性受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを容易に確定し得る。
【００６８】
「分泌シグナル配列」という用語は、より大きいポリペプチドの一構成成分として、それが合成される細胞の分泌経路を通してより大きいポリペプチドを指図するペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするＤＮＡ配列を意味する。より大きいポリペプチドは一般に、分泌経路を通して輸送中に分泌ペプチドを取り出すために切断される。
【００６９】
「単離ポリペプチド」とは、夾雑細胞構成成分、例えば実際にポリペプチドと関連した炭水化物、脂質またはその他のタンパク質様不純物を本質的に含有しないポリペプチドである。典型的には、単離ポリペプチドの製剤は、高精製形態で、即ち少なくとも約80％の純度、少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、95％より高い純度、例えば96％、97％または98％、あるいはそれより高い純度、または99％より高い純度でポリペプチドを含有する。特定タンパク質製剤が単離ポリペプチドを含有することを示す一方法は、タンパク質製剤のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色後の単一帯域の出現によるものである。しかしながら「単離」という用語は、代替的物理学的形態、例えば二量体の、あるいは代替的グリコシル化または誘導形態の同一ポリペプチドの存在を排除しない。
【００７０】
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という用語は、ポリペプチド内の位置を意味するために本明細書中で用いられる。状況が許す場合、これらの用語は、近接または相対位置を意味するために、ポリペプチドの特定配列または部分に関連して用いられる。例えばポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端に位置するある種の配列は、参照配列のカルボキシル末端に近位に置かれるが、しかし必ずしも完全ポリペプチドのカルボキシル末端に存在しない。
【００７１】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写、ならびに1つまたは複数のポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を包含する。
【００７２】
「スプライス変異体」という用語は、遺伝子から転写されるＲＮＡの代替的形態を意味するために本明細書中で用いられる。スプライス変異は、転写ＲＮＡ分子内の、あるいはあまり一般的ではないが別個に転写されたＲＮＡ分子間の代替的スプライシング部位の使用により、天然に生じ、そして同一遺伝子から転写されるいくつかのｍＲＮＡを生じ得る。スプライス変異体は、変異アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。スプライス変異体という用語は、一遺伝子から転写されるｍＲＮＡのスプライス変異体によりコードされるポリペプチドを意味するためにも、本明細書中で用いられる。
【００７３】
本明細書中で用いる場合、「免疫調節物質」という用語は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンフォトキシン、共刺激分子、造血因子、ｄｔｈｅ様、およびこれらの分子の合成類似体を包含する。
【００７４】
「相補体／抗相補体対」という用語は、適切な条件下で非共有結合安定対を形成する非同一部分を意味する。例えばビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）は、相補体／抗相補体対の原型成員である。その他の例示的相補体／抗相補体としては、受容体／リガンド対、抗体／抗原（あるいはハプテンまたはエピトープ）対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対等が挙げられる。相補体／抗相補体対のその後の解離が望ましい場合、相補体／抗相補体対は好ましくは109 M-1未満の結合親和性を有する。
【００７５】
「抗イディオタイプ抗体」は、免疫グロブリンの可変部ドメインと結合する抗体である。本発明の状況では、抗イディオタイプ抗体は抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体の可変部と結合し、したがって抗イディオタイプ抗体はＺｃｙｔｏＲ１４のエピトープを模倣する。
【００７６】
「抗体断片」は、抗体の一部分、例えばＦ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等である。構造と関係なく、抗体断片は、無傷抗体により認識される同一抗原と結合する。例えば抗ＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナル抗体断片は、ＺｃｙｔｏＲ１４のエピトープと結合する。
【００７７】
「抗体断片」という用語は、特異的抗原と結合する合成または遺伝子工学処理ポリペプチド、例えば軽鎖可変部から成るポリペプチド、重および軽鎖の可変部から成る「Ｆｖ」断片、軽および重鎖可変部がペプチドリンカーにより連結される組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、ならびに超可変部を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位も包含する。
【００７８】
「キメラ抗体」は、齧歯類抗体由来の可変ドメインおよび相補性決定領域を含有する組換えタンパク質であり、抗体分子の残部はヒト抗体に由来する。
【００７９】
「ヒト化抗体」とは、モノクローナル抗体のネズミ相補性決定領域がネズミ免疫グロブリンの重および軽可変鎖からヒト可変ドメインに移入された組換えタンパク質である。ネズミ抗体由来であるヒトにおける治療的使用のためのヒト化抗体、例えばヒトタンパク質と結合するかまたはそれを中和するものの構築は、当業者の技術内である。
【００８０】
本明細書中で用いる場合、「治療剤」とは、治療に有用な接合体を産生するために抗体部分に接合される分子または原子である。治療剤の例としては、毒素、免疫調節剤、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性剤または染料、および放射性同位体が挙げられる。
【００８１】
「検出可能標識」とは、診断に有用な分子を産生するために抗体部分に接合され得る分子または原子である。検出可能標識の例としては、キレート化剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオンまたはその他のマーカー部分が挙げられる。
【００８２】
「親和性タグ」という用語は、二次ポリペプチドの精製または検出を提供するかあるいは基質への二次ポリペプチドの結合のための部位を提供する二次ポリペプチドと結合し得るポリペプチドセグメントを意味するために本明細書中で用いられる。原則的に、抗体またはその他の特異的結合剤が利用可能である任意のペプチドまたはタンパク質は、親和性タグとして用いられ得る。親和性タグとしては、ポリヒスチジン路、プロテインＡ（Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3 (1991)）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Smith and Johnson, Gene 67: 31 (1988)）、Ｇｌｕ‐Ｇｌｕ親和性タグ（Grussenmeyer et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952 (1985)）、サブスタンスＰ、ＦＬＡＧペプチド（Hopp et al., Biotechnology 6: 1204 (1988)）、ストレプトアビジン結合ペプチド、またはその他の抗原エピトープまたは結合ドメインが挙げられる（概して、Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95 (1991)参照）。親和性タグをコードするＤＮＡ分子は、市販供給元（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ）から入手可能である。
【００８３】
「裸抗体」とは、抗体断片とは対照的に、治療剤と接合されない完全抗体である。裸抗体としては、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体、ならびにある種の組換え抗体、例えばキメラおよびヒト化抗体が挙げられる。
【００８４】
本明細書中で用いる場合、「抗体構成成分」という用語は、完全抗体および抗体断片の両方を含む。
【００８５】
「免疫複合体」とは、抗体構成成分と治療剤または検出可能標識との複合体である。
本明細書中で用いる場合、「抗体融合タンパク質」という用語は、抗体構成成分およびＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド構成成分を含む組換え分子を指す。抗体融合タンパク質の例としては、ＺｃｙｔｏＲ１４細胞外ドメインならびにＦｃドメインまたは抗原結合領域を含むタンパク質が挙げられる。
【００８６】
「標的ポリペプチド」または「標的ペプチド」とは、少なくとも1つのエピトープを含身、そして標的細胞、例えば腫瘍細胞または感染性作因抗原を保有する細胞上で発現されるアミノ酸配列である。Ｔ細胞は、標的ポリペプチドまたは標的ペプチドに対する主要組織適合性複合体分子により提示されるペプチドエピトープを認識し、典型的には標的細胞を溶解するかまたは他の免疫細胞を標的細胞の部位に動員し、それにより標的細胞を殺害する。
【００８７】
「抗原ペプチド」とは、主要組織適合性複合体分子と結合して、Ｔ細胞により認識されるＭＨＣ‐ペプチド複合体を形成し、それによりＴ細胞への提示時に細胞傷害性リンパ球応答を誘導するペプチドである。したがって抗原ペプチドは、適切な主要組織適合性複合体分子と結合して、細胞傷害性Ｔ細胞応答、例えば細胞溶解、あるいは抗原を結合するかまたは発現する標的細胞に対する特異的サイトカイン放出を誘導し得る。抗原ペプチドは、クラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子の状況では、抗原提示細胞上で、または標的細胞上で結合され得る。
【００８８】
真核生物では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、ｍＲＮＡを産生するための構造遺伝子の転写を触媒する。核酸分子は、ＲＮＡ転写体が特定ｍＲＮＡの配列と相補的である配列を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩ鋳型を含有するよう設計され得る。ＲＮＡ転写体は「アンチセンスＲＮＡ」と呼ばれ、そしてアンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は「アンチセンス遺伝子」と呼ばれる。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子と結合して、ｍＲＮＡ翻訳の抑制を生じ得る。
【００８９】
「ＺｃｙｔｏＲ１４に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＺｃｙｔｏＲ１４アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、（ａ）ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子の一部分と安定三重鎖を形成し得る、または（ｂ）ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子のｍＲＮＡ転写体の一部分と安定二重鎖を形成し得る配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００９０】
「リボザイム」とは、触媒中心を含有する核酸分子である。本用語は、ＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ、自己切断ＲＮＡ、およびこれらの触媒機能を実施する核酸分子を包含する。リボザイムをコードする核酸分子は、「リボザイム遺伝子」と呼ばれる。
【００９１】
「外部ガイド配列」とは、内因性リボザイム、ＲＮアーゼＰを特定種の細胞内ｍＲＮＡに向けて、ＲＮアーゼによるｍＲＮＡの切断を生じる核酸分子である。外部ガイド配列をコードする核酸分子は、「外部ガイド配列遺伝子」と呼ばれる。
【００９２】
「変異体ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子」という用語は、配列番号２の修飾であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を指す。このような変異体としては、ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子の天然多型物、ならびに配列番号２のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含有する合成遺伝子が挙げられる。付加的変異体形態のＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子は、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列の挿入または欠失を含有する核酸分子である。変異体ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子は、例えば緊縮条件下で遺伝子が配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列を有する核酸分子あるいはその相補体とハイブリダイズするか否かを確定することにより同定され得る。
【００９３】
あるいは変異体ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子は、配列比較により同定され得る。最大対応に関して整列されたときに2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が同一である場合、2つのアミノ酸配列は「100％アミノ酸配列同一性」を有する。配列比較は、DNASTAR（Madison, Wisconsin）により製造されるLASERGENE bioinformatics computing suiteに含まれるもののような標準ソフトウエアプログラムを用いて実施され得る。最適アラインメントを確定することにより2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するためのその他の方法は、当業者に周知である（例えばPeruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (eds.), “Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins,” in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997)およびBishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)参照）。配列同一性を確定するための特定方法は、以下に記載される。
【００９４】
変異体ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子または変異体ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドを同定するために用いられる特定方法とは関係なく、変異体遺伝子または変異体遺伝子によりコードされるポリペプチドは、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体と特異的に結合する能力を機能的に特性化され得る。変異体ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子または変異体ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドは、本明細書中に記載される生物学的または生化学的検定を用いて、そのリガンド、例えばＩＬ‐１７Ａおよび／またはＩＬ‐１７Ｆと結合する能力も機能的に特性化され得る。
【００９５】
「対立遺伝子変異体」という用語は、同一染色体遺伝子座を占める遺伝子の2またはそれより多い代替的形態のうちのいずれかを意味するために本明細書中で用いられる。対立遺伝子変異は突然変異により天然に起こり、そして集団内に表現型多型を生じ得る。遺伝子突然変異はサイレント（コード化ポリペプチドに変化なし）であり得るし、あるいは変異アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。対立遺伝子変異体という用語は、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を意味するためにも、本明細書中で用いられる。
【００９６】
「オーソログ」という用語は、異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能的同等物である1つの種から得られるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。オーソログ間の配列差は、特殊化の結果である。
【００９７】
「パラログ」とは、生物体により作られる別個の、しかし構造的に関連するタンパク質である。パラログは、遺伝子重複により生じると考えられる。例えばα‐グロビン、β‐グロビンおよびミオグロビン葉、互いにパラログである。
【００９８】
本発明は、ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子の機能的断片を包含する。本発明の状況内では、ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子の「機能性断片」は、本明細書中に記載されるドメインであるかまたは抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体と少なくとも特異的に結合するＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドの一部をコードする核酸分子を指す。
【００９９】
標準分析方法の不正確さのために、ポリマーの分子量および長さはおよその値であると理解される。このような値が「約」Ｘまたは「およそ」Ｘとして表わされる場合、Ｘの記述値は±１０％の精度であると理解される。
【０１００】
Ｃ）ＺｃｙｔｏＲ１４ポリヌクレオチドまたは遺伝子の産生
ヒトＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号１または配列番号４に基づいたポリヌクレオチドプローブを用いてヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。これらの技法は標準で且つ十分に確立されており、そして商業的供給元により入手可能なクローニングキットを用いて成し遂げられ得る（例えばAusubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons 1995; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997; Aviv and Leder, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 69: 1408 (1972); Huynh et al., “Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11,” in DNA Cloning: : A Practical Approach Vol. 1, Glover (ed.), page 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) at pages 47-52参照）。
【０１０１】
ヒトＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子をコードする核酸分子は、ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子またはｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいているヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いても得られ得る。ＰＣＲを用いてライブラリーをスクリーニングするための一般的方法は、例えばYu et al., “Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc., 1993により提供される。さらに関連遺伝子を単離するためにＰＣＲを用いる技法は、例えばPreston, “Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc., 1993に記載されている。代替的方法として、ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子は、相互プライミング長オリゴヌクレオチドおよび本明細書中に記載されるヌクレオチド配列を用いて核酸分子を合成することにより得られる（例えばAusubel (1995)参照）。ポリメラーゼ連鎖反応を用いて確立された技法は、少なくとも2キロベース長のＤＮＡ分子を合成する能力を提供する（Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993)、Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993)、Dillon et al., “Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), (Humana Press, Inc., 1993)およびHolowachuk et al., PCR Methods Appl. 4: 299 (1995)）。ポリヌクレオチドに関する再検討のためには、例えばGlick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994)、Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53: 323 (1984)およびClimie et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87: 633 (1990)を参照されたい。
【０１０２】
Ｄ）ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子変異体の産生
本発明は、本明細書中に開示されるＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドをコードする種々の核酸分子、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ分子を提供する。遺伝子コードの縮重にかんがみて、これらのポリヌクレオチド分子間でかなりの配列変異が考え得る、ということを当業者は容易に認識する。さらに本発明は、配列番号２の受容体ポリペプチドと実質的に相同である少なくとも1つのＺｃｙｔｏＲ１４受容体サブユニットを含む単離可溶性単離体、ホモ二量体、ヘテロ二量体および多量体受容体ポリペプチドも提供する。したがって本発明は、配列番号１または配列番号４の縮重ヌクレオチドを含むＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドコード核酸分子およびそれらのＲＮＡ等価物を意図する。
【０１０３】
遺伝子コードの縮重にかんがみて、これらのポリヌクレオチド分子間でかなりの配列変異が考え得る、ということを当業者は容易に認識する。配列番号７は、配列番号２のＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドをコードするすべての核酸分子を包含する縮重ヌクレオチド配列である。配列番号７の縮重配列は、Ｔの代わりにＵを置換することにより、配列番号２をコードするすべてのＲＮＡ配列も提供する、と当業者は認識する。したがって本発明は、配列番号１のヌクレオチド１５４〜ヌクレオチド２２２９を含むＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドコード核酸分子およびそれらのＲＮＡ等価物を意図する。同様に、配列番号６のＺｃｙｔｏＲ１４‐１縮重配列も、Ｔの代わりにＵを置換することにより、配列番号５をコードするすべてのＲＮＡ配列を提供する。
【０１０４】
表１は、縮重ヌクレオチド位置を意味するための一文字コードを記述する。「解」は、コード文字により意味されるヌクレオチドである。「相補」は、相補的ヌクレオチド（単数または複数）に関するコードを示す。例えばコードＹはＣまたはＴを意味し、そしてその相補ＲはＡまたはＧを意味する。ＡはＴと相補的であり、そしてＧはＣと相補的である。
【０１０５】
【表１】
2008509227.tif 000002
【０１０６】
所定のアミノ酸に関するすべての考え得るコドンを包含する縮重コドンを、表２に記述する。
【０１０７】
【表２】
2008509227.tif 000003
【０１０８】
アミノ酸をコードするすべての考え得るコドンを代表する縮重コドンを確定するに際して、何らかの多義性が導入される、と当業者は理解する。例えばセリンに関する縮重コドン（ＷＳＮ）は、いくつかの環境ではアルギニン（ＡＧＲ）をコードし、そしてアルギニンに関する縮重コドン（ＭＧＮ）は、いくつかの環境では、セリン（ＡＧＹ）をコードする。同様の関係は、フェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドン間に存在する。したがって縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは変異体アミノ酸配列をコードし得るが、しかし配列番号３のアミノ酸配列を参照することにより、当業者はこのような変異体配列を容易に同定し得る。変異体配列は、本明細書中に記載されるように機能性に関して容易に試験され得る。
【０１０９】
異なる種は、「選択的コドン使用」を示し得る（概して、Grantham et al., Nucl. Acids Res. 8: 1893 (1980)、Haas et al. Curr. Biol. 6: 315 (1996)、Wain-Hobson et al., Gene 13: 355 (1981)、Grosjean and Fiers, Gene 18: 199 (1982)、Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075 (1986)、Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573 (1982)、Sharp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 851 (1994)、Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 494 (1995)およびMakrides, Microbiol. Rev. 60: 512 (1996)参照）。本明細書中で用いる場合、「選択的コドン使用」または「選択的コドン」という用語は、ある種の細胞で最も頻繁に用いられ、したがって各アミノ酸をコードする潜在的コドンの1または2〜3つの代表物を選ぶタンパク質翻訳コドンを指す技術分野の用語である（表２参照）。例えばアミノ酸トレオニン（Ｔｈｒ）はＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＴによりコードされ得るが、しかし哺乳類細胞では、ＡＣＣは最も一般的に用いられるコドンである；他の種では、例えば昆虫細胞、酵母、ウイルスまたは細菌では、異なるＴｈｒコドンが優先的であり得る。特定の種に関する優先的コドンは、当該技術分野で既知の種々の方法により本発明のポリヌクレオチドに導入され得る。優先的コドン配列の組換えＤＮＡへの導入は、例えば特定細胞型または種内でのタンパク質翻訳をより効率的にすることにより、タンパク質の産生を増強する。したがって本明細書中に開示される縮重コドン配列は、当該技術分野で一般的に用いられそして本明細書中に開示される種々の細胞型および種におけるポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として役立つ。優先的コドンを含有する配列は、種々の種における発現のために試験され、最適化されて、本明細書中に開示されるように機能性に関して試験され得る。
【０１１０】
ＺｃｙｔｏＲ１４コードｃＤＮＡは、種々の方法により、例えば完全または部分的ヒトｃＤＮＡを用いて、あるいは開示配列に基づいた1つまたは複数組の縮重プローブを用いてプローブすることにより、単離され得る。ｃＤＮＡは、本明細書中に開示される代表的ヒトＺｃｙｔｏＲ１４配列から設計されるプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてもクローン化され得る。さらに、ｃＤＮＡライブラリーは宿主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクトするために用いられ得るし、当該ｃＤＮＡの発現は、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドに対する抗体を用いて検出され得る。
【０１１１】
配列番号１で開示される配列はヒトＺｃｙｔｏＲ１４の単一対立遺伝子を表わし、そして対立遺伝子変異および代替的スプライシングが起こると予測される、と当業者は認識する。この配列の対立遺伝子変異体は、標準手法に従って異なる個体からｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをプローブすることによりクローン化され得る。本明細書中に開示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含有するもの、ならびに突然変異がアミノ酸配列変化を生じるものは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体であるタンパク質である場合と同様に、本発明の範囲内である。ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドの特性を保持する代替的スプライス化ｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡ分子は、このようなｃＤＮＡおよびｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドである場合と同様に、本発明の範囲内に含まれる。これらの配列の対立遺伝子変異体およびスプライス変異体は、当該技術分野で既知の標準手法に従って異なる個体または組織からのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをプローブすることによりクローン化され得る。
【０１１２】
上記の方法を用いて、配列番号１または配列番号４と実質的に相同であるか、あるいは配列番号２または配列番号５のアミノ酸をコードする可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体サブユニット、またはその対立遺伝子変異体を含み、そして野生型ＺｃｙｔｏＲ１４受容体のリガンド結合特性を保持する種々のポリペプチドを、当業者は調製し得る。このようなポリペプチドは、一般的に本明細書中に開示されるような付加的ポリペプチドセグメントも含み得る。
【０１１３】
本発明のある種の実施形態内では、単離核酸分子は、緊縮条件下で、本明細書中に開示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズし得る。例えばこのような核酸分子は、緊縮条件下で、配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列を含む核酸分子と、または配列番号１または配列番号４と相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子、あるいはその断片とハイブリダイズし得る。
【０１１４】
概して、緊縮（ストリンジェント）条件は、限定イオン強度およびｐＨで、特定配列に関する熱融点（Ｔｍ）より約5℃低いよう選択される。Ｔｍは、標的配列の50％が完全整合プローブとハイブリダイズする温度（限定イオン強度およびｐＨ下）である。ハイブリダイゼーション後、核酸分子は、緊縮条件下で、または高緊縮条件下で、非ハイブリダイズ化核酸分子を除去するために洗浄され得る（例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989)；Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987)；Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987)；およびWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227 (1990)参照）。配列分析ソフトウエア、例えばＯＬＩＧＯ 6.0（LSR; Long Lake, MN）およびPrimer Premier 4.0（Premier Biosoft International; Palo Alto, CA）、ならびにインターネット上のサイトは、所定の配列を分析し、ユーザー限定判定基準に基づいてＴｍを算定するための利用可能なツールである。特定のポリヌクレオチドハイブリッドを使用するためのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件に適合させることは、十分に当業者の能力内である。
【０１１５】
本発明は、配列番号２のポリペプチドまたはそれらのオーソログと実質的に類似の配列同一性を有する単離ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドも提供する。「実質的に類似の配列同一性」という用語は、配列番号２で示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、例えば96％、97％、98％、または95％より高い配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらのオーソログを意味するために、本明細書中で用いられる。例えば変異体およびオーソログＺｃｙｔｏＲ１４受容体は、免疫応答を生成し、そしてヒトＺｃｙｔｏＲ１４に対する交差反応性抗体を生じるために用いられ得る。このような抗体はヒト化され、本明細書中に記載されるように修飾され、そして乾癬、乾癬性関節炎、ＩＢＤ、結腸炎、内毒素血症を治療するために、ならびに本明細書中に記載されるその他の治療的用途において、療法的に用いられ得る。
【０１１６】
本発明は、2つの判定基準：即ち、配列番号２のアミノ酸配列を有するコード化ポリペプチド間の類似性の確定、ならびにハイブリダイゼーション検定の2つを用いて同定され得るＺｃｙｔｏＲ１４変異体核酸分子も意図する。このようなＺｃｙｔｏＲ１４変異体としては、（１）洗浄緊縮が55〜65℃で0.1％ＳＤＳを含有する0.5×〜2×ＳＳＣと等価である緊縮洗浄条件下で、配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）とハイブリダイズしたままである、そして（２）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％より以上、例えば96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられる。あるいはＺｃｙｔｏＲ１４変異体は、（１）洗浄緊縮が50〜65℃で0.1％ＳＤＳを含有する0.1×〜0.2×ＳＳＣと等価である高緊縮洗浄条件下で、配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）とハイブリダイズしたままである、そして（２）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％より以上、例えば96％、97％、98％、または99％またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特性化され得る。
【０１１７】
配列同一性％は、慣用的方法により確定される（例えばAltshul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603 (1986)およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992)参照）。要するに、2つのアミノ酸配列は、10のギャップ開始ペナルティー、1のギャップ伸長ペナルティー、および表３に示されるようなHenikoff and Henikoff（同上）の「BLOSUM62」スコアリングマトリックスを用いて、アラインメントスコアを最適化するよう整列される（アミノ酸は、標準一文字コードにより同定される）。次に同一性％が、以下のように算定される：（［同一整合の総数］／［長い方の配列の長さ＋2つの配列を整列するために、長い方の配列中に導入されるギャップの数］）（100）。
【０１１８】
【表３】
2008509227.tif 000004
【０１１９】
2つのアミノ酸配列を整列するために利用可能な多数の確立されたアルゴリズムが存在する、と当業者は理解する。PearsonとLipmanの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列および推定ＺｃｙｔｏＲ１４変異体のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを検査するための適切なタンパク質アラインメント法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)により、そしてPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990)により記載されている。要するに、ＦＡＳＴＡは、先ず、保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を考慮せずに、問合わせ配列（例えば配列番号２または配列番号３）および同一性のうちの最高同一性（ktup変数が1である場合）または同一性の対（ktup＝2である場合）を有する試験配列により共有される領域を同定することにより、配列類似性を特性化する。次に、アミノ酸置換マトリックスを用いてすべての対合アミノ酸の類似性を比較することにより、最高密度の同一性を有する10領域が再スコアされ、そしてその領域の末端は、最高スコアに関与する残基のみを含むよう「刈り込まれる」。「カットオフ」値（配列の長さおよびktup値に基づいて予定式により算定）より大きいスコアを有するいくつかの領域が存在する場合には、その領域がギャップを有するおよそのアラインメントを形成するよう連結され得るか否かを確定するために、刈り込み初期領域が検査される。最後に、2つのアミノ酸配列の最高スコアリング領域はNeedleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444 (1970)；Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787 (1974)）の変法を用いて整列され、これが、アミノ酸挿入および欠失を可能にする。ＦＡＳＴＡ分析のための例証的パラメーターを以下に示す：ktup＝1、ギャップ開始ペナルティー＝10、ギャップ伸長ペナルティー＝1および置換マトリックス＝BLOSUM62。これらのパラメーターは、Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990)の付録２に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を修正することにより、ＦＡＳＴＡプログラムに導入され得る。
【０１２０】
ＦＡＳＴＡは、上記のような比率を用いて核酸分子の配列同一性を確定するためにも用いられ得る。ヌクレオチド配列比較に関しては、ktup値は、1〜6、好ましくは3〜6の範囲、最も好ましくは３であり、上記のようなその他のパラメーター組を伴う。
【０１２１】
本発明は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。例えば、一アルキルアミノ酸がＺｃｙｔｏＲ１４アミノ酸配列中の一アルキルアミノ酸の代わりに置換され、一芳香族アミノ酸がＺｃｙｔｏＲ１４アミノ酸配列中の一芳香族アミノ酸の代わりに置換され、一イオウ含有アミノ酸がＺｃｙｔｏＲ１４アミノ酸配列中の一イオウ含有アミノ酸の代わりに置換され、一ヒドロキシ含有アミノ酸がＺｃｙｔｏＲ１４アミノ酸配列中の一ヒドロキシ含有アミノ酸の代わりに置換され、一酸性アミノ酸がＺｃｙｔｏＲ１４アミノ酸配列中の一酸性アミノ酸の代わりに置換され、一塩基性アミノ酸がＺｃｙｔｏＲ１４アミノ酸配列中の一塩基性アミノ酸の代わりに置換され、1つの二塩基性一カルボン酸性アミノ酸がＺｃｙｔｏＲ１４アミノ酸配列中の1つの二塩基性一カルボン酸性アミノ酸の代わりに置換される配列番号２の1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する変異体が得られる。例えば共通アミノ酸の間で、「保存的アミノ酸置換」は、以下の群の各々の中のアミノ酸間の置換により例証される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、（３）セリンおよびトレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（６）リシン、アルギニンおよびヒスチジン。BLOSUM62表は、タンパク質配列セグメントの約2,000の局所的多アラインメントに由来するアミノ酸置換マトリックスであって、関連タンパク質の500より多い群の高保存領域を表わす（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992)）。したがってBLOSUM62置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存的アミノ酸置換を限定し得る。単に化学的特性（上記のような）に基づいたアミノ酸置換を設計することはできるが、しかし、「保存的アミノ酸置換」という用語は、好ましくは−1より大きいBLOSUM62により表わされる置換を指す。例えばアミノ酸置換は、0、1、2または3のBLOSUM62値により置換が特性化される場合、保存的である。この系によれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも1（例えば、1、2または3）のBLOSUM62値により特性化され、一方、さらに好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも2（例えば、2または3）のBLOSUM62値により特性化される。ＺｃｙｔｏＲ１４の特定変異体は、対応するアミノ酸配列（例えば配列番号２）と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％より以上、例えば96％、97％、98％、または99％またはそれより高い配列同一性を有することにより特性化され得るが、この場合、アミノ酸配列における変異は、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換のためである。
【０１２２】
ＺｃｙｔｏＲ１４中の保存的アミノ酸変化は、例えば配列番号１または配列番号４中に列挙されるヌクレオチドの代わりにヌクレオチドを置換することにより、導入され得る。このような「保存的アミノ酸」変異体は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、リンカー‐スキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた突然変異誘発等により得られる（Ausubel (1995)；およびMcPerson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)参照）。変異体ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドは、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体と得的に結合する能力により同定され得る。
【０１２３】
本発明のタンパク質は、非天然アミノ酸残基も含み得る。非天然アミノ酸残基としては、トランス‐３‐メチルプロリン、２，４‐メタノプロリン、シス‐４‐ヒドロキシプロリン、トランス‐４‐ヒドロキシプロリン、Ｎ‐メチルグリシン、アロ‐トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３‐および４‐メチルプロリン、３，３‐ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ‐ロイシン、ノバリン、２‐アザフェニルアラニン、３‐アザフェニルアラニン、４‐アザフェニルアラニンおよび４‐フルオロフェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質中に非天然アミノ酸残基を組み入れるためのいくつかの方法が当該技術分野で既知である。例えば、化学的アミノアシル化サプレッサーｔＲＮＡを用いてナンセンス突然変異が抑制されるin vitro系が用いられ得る。アミノ酸およびアミノアシル化ｔＲＮＡを合成するための方法は、当該技術分野で既知である。ナンセンス突然変異を含有するプラスミドの転写および翻訳は、典型的には、大腸菌Ｓ３０抽出物および市販の酵素およびその他の試薬を含む無細胞系で実行される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される（例えばRobertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722 (1991)、Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301 (1991)、Chung et al., Science 259: 806 (1993)およびChung et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 90: 10145 (1993)参照）。
【０１２４】
第二の方法では、翻訳は、突然変異化ｍＲＮＡおよび化学的アミノアシル化サプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションにより、アフリカツメガエル卵細胞で実行される（Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991 (1996)）。第三の方法内では、大腸菌細胞は、置き換えられるべきである天然アミノ酸（例えばフェニルアラニン）の非存在下で、そして所望の非天然アミノ酸（単数または複数）（例えば２‐アザフェニルアラニン、３‐アザフェニルアラニン、４‐アザフェニルアラニンまたは４‐フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。非天然アミノ酸は、その天然同等物の代わりにタンパク質中に組み入れられる（Koide et al., Biochem. 33: 7470 (1994)参照）。天然アミノ酸残基は、in vitro化学修飾により、非天然種に転化され得る。化学修飾は、置換の範囲をさらに拡大するために、部位特異的突然変異誘発と組合され得る（Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395 (1993)）。
【０１２５】
限定数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、非天然アミノ酸、ならびに人為的アミノ酸が、ＺｃｙｔｏＲ１４アミノ酸残基の代わりに置換され得る。
【０１２６】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、当該技術分野で既知の手法、例えば部位特異的突然変異誘発またはアラニン・スキャニング突然変異誘発に従って同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081 (1989)、Bass et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 88: 4498 (1991)、Coombs and Corey, “Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering,” in Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998）。後者の技法では、単一アラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、そしてその結果生じる突然変異分子が生物学的活性に関して試験されて、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する（Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699 (1996)も参照）。
【０１２７】
配列分析を用いてＺｃｙｔｏＲ１４リガンド結合領域をさらに限定し得るが、しかし核磁気共鳴、結晶学、電子回析または光親和性標識を、推定接触部位アミノ酸の突然変異と一緒に用いることにより、ＺｃｙｔｏＲ１４結合活性（例えばＺｃｙｔｏＲ１４とＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆとの、あるいは抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体との結合）において一役を演じるアミノ酸も確定され得る（例えばde Vos et al., Science 255: 306 (1992)、Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899 (1992)およびWlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59 (1992)参照）。
【０１２８】
突然変異誘発およびスクリーニングの既知の方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer（Science 241: 53 (1988)）またはBowie and Sauer（Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 86: 2152 (1989)）により開示された方法を用いて、多アミノ酸置換が作製され、試験され得る。要するにこれらの著者は、ポリペプチド中の2またはそれより多い位置を同時に無作為化し、機能的ポリペプチドを選択し、次に突然変異化ポリペプチドをシーケンシングして、各位置での許容可能な置換の範囲を確定する。用いられ得るその他の方法としては、ファージ・ディスプレイが（例えばLowman et al., Biochem. 30: 10832 (1991)、 米国特許第5,223,409号（Ladner等）、国際公告WO 92/06204（Huse））、および領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46: 145 (1986)およびNer et al., DNA 7: 127 (1988)）。さらに、ビオチンまたはＦＩＴＣで標識されるＺｃｙｔｏＲ１４は、ＺｃｙｔｏＲ１４リガンドの発現クローニングのために用いられ得る。
【０１２９】
開示ＺｃｙｔｏＲ１４ヌクレオチドおよびポリペプチド配列の変異体は、Stemmer, Nature 370: 389 (1994)、Stemmer, Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 91: 10747 (1994)および国際公開WO 97/20078により開示されているようにＤＮＡシャッフリングによっても生成され得る。要するに、変異体ＤＮＡ分子は、親ＤＮＡの無作為断片化と、その後のＰＣＲを用いた再構築によるin vitro相同組換えにより生成されて、無作為導入点突然変異を生じる。この技法は、親ＤＮＡ分子の一ファミリー、例えば対立遺伝子変異体または異なる種からのＤＮＡ分子を用いることにより修飾されて、当該プロセスに付加的変異性を導入する。所望の活性に関する選択またはスクリーニングと、その後の突然変異誘発および検定の付加的反復は、有害変化に対して同時的に選択しながら、望ましい突然変異に関して選択することにより配列の迅速な「進化」を提供する。
【０１３０】
本明細書中に開示されるような突然変異誘発方法は、高処理量自動スクリーニング法と組合されて、宿主細胞中のクローン化突然変異化ポリペプチドの活性を検出し得る。生物学的活性ポリペプチドまたは抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体と結合するポリペプチドをコードする突然変異化ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収され、最新装置を用いて迅速にシーケンシングされる。これらの方法は、当該ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速確定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【０１３１】
本発明は、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドの「機能性断片」、ならびにこのような機能性断片をコードする核酸分子も包含する。核酸分子のルーチン欠失分析は、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドをコードする核酸分子の機能性断片を獲得するために実施され得る。例証として、配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子は、一連の入れ子式欠失を得るためにＢａｌ３１ヌクレアーゼで消化される。次に断片は適切なリーディングフレーム中の発現ベクターに挿入され、そして発現ポリペプチドが単離され、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体と結合する能力に関して試験される。エキソヌクレアーゼ消化の一代替物は、欠失を導入するためのオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発または所望の断片の産生を特定するための停止コドンを使用することである。あるいはＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子の特定断片は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて合成され得る。
【０１３２】
この一般的アプローチは、インターフェロンの一端または両端での切頭化に関する試験により例示される（Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66: 507 (1995)により要約されている）。さらに、タンパク質の機能分析に関する標準技法は、例えばTreuter et al., Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993)、Content et al., “Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon,” in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), pages 65-72 (Nijhoff 1987)、Herschman, “The EGF Receptor,” in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985), Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270: 29270 (1995)、Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270: 25291 (1995)、Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995)およびMeisel et al., Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996)により記載されている。
【０１３３】
本発明は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列と比較して、アミノ酸変化を有するＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子の機能性断片も意図する。変異体ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子は、上記のように開示ヌクレオチドおよびアミノ酸配列との同一性レベルを確定することにより、構造に基づいて同定され得る。構造に基づいて変異体遺伝子を同定するための代替的アプローチは、潜在的変異体ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子をコードする核酸分子が配列番号１または配列番号４のようなヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズし得るか否かを確定することである。
【０１３４】
本発明は、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドの機能性断片、抗原エピトープ、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドのエピトープ保有部分、ならびにこのような機能性断片、抗原エピトープ、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドのエピトープ保有部分をコードする核酸分子の使用も包含する。このような断片を用いて、ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆ、あるいはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方の活性を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗し、または中和する抗体および結合相手を生成するに際して用いるためのポリペプチドを生成する。本明細書中で定義されるような「機能性」ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドまたはその断片は、ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆ炎症、増殖または分化活性を遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和するその能力により、特殊化細胞機能を誘導するかまたは抑制するその能力により、あるいは抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体、細胞、ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆと特異的に結合するその能力により、特性化される。本明細書中で前に記載されたように、ＺｃｙｔｏＲ１４は、本明細書中に記載されるような独特のサイトカイン受容体構造およびドメインにより特性化される。したがって本発明はさらに、以下の：（ａ）上記の1つまたは複数のドメインを含むポリペプチド分子；ならびに（ｂ）1つまたは複数のこれらのドメインを含む機能性断片を包含する融合タンパク質の使用を意図する。融合タンパク質のその他のポリペプチド部分は、別のサイトカイン受容体、例えばＩＬ‐１０Ｒ、ＩＬ‐１３Ｒ、ＩＬ‐１７Ｒ、ＩＬ‐１０ＲＢ（ＣＲＦ２‐４）により、あるいは融合タンパク質の分泌を促す非ネイティブおよび／または非関連分泌シグナルペプチドにより寄与され得る。
【０１３５】
本発明は、本明細書中に記載されるＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドのエピトープ保有部分を含むポリペプチド断片またはペプチドも提供する。このような断片またはペプチドは、完全タンパク質が免疫原として用いられる場合に抗体応答を引き出すタンパク質の一部である「免疫原性エピトープ」を含み得る。免疫原性エピトープ保有ペプチドは、標準方法を用いて同定され得る（例えばGeysen et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 81: 3998 (1983)参照）。
【０１３６】
逆に、ポリペプチド断片またはペプチドは、抗体が特異的に結合し得るタンパク質分子の一領域である「抗原エピトープ」を含み得る。ある種のエピトープはアミノ酸の線状または連続ストレッチからなり、そしてこのようなエピトープの抗原性は変性剤により崩壊されない。タンパク質のエピトープを模倣し得る相対的に短い合成ペプチドを用いてタンパク質に対する抗体の産生を刺激し得る、ということは当該技術分野で既知である（例えばSutcliffe et al., Science 219: 660 (1983)参照）。したがって本発明の抗原エピトープ保有ペプチド、抗原ペプチド、エピトープおよびポリペプチドは、本明細書中に記載されるポリペプチドと結合する抗体を生じるために、ならびに中和されつつある、そしてＩＬ‐１７ＦおよびＩＬ‐１７Ａ（個別にまたは一緒に）の活性を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和し得る抗ＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナル抗体を同定し、スクリーニングするために有用である。本発明のこのような中和モノクローナル抗体は、ＺｃｙｔｏＲ１４抗原エピトープと結合し得る。Hopp/Woods親水性プロフィールは、配列番号２または４内のほとんどの抗原性能力を有する領域を確定するために用いられ得る（Hopp et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. 78: 3824-3828, 1981；Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986およびTriquier et al., Protein Engineering 11: 153-169, 1998）。プロフィールは、スライディング6残基ウインドウに基づいている。埋没Ｇ、ＳおよびＴ残基ならびに露出Ｈ、ＹおよびＷ残基は無視された。ＺｃｙｔｏＲ１４では、これらの領域は当業者により確定され得る。さらに、例えばDNASTAR Proteanプログラム（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を用いて、Jameson-Wolfプロットにより予測されたような配列番号２または４内のＺｃｙｔｏＲ１４抗原エピトープは好ましい抗原エピトープとして役立ち、そして当業者により確定され得る。この分析の結果は、配列番号２の以下のアミノ酸配列が適切な抗原ペプチドを提供する、ということを示した：アミノ酸２６〜３３（「抗原ペプチド１」）、アミノ酸４１〜４６（「抗原ペプチド２」）、７４〜８１（「抗原ペプチド３」）、アミノ酸９５〜１０５（「抗原ペプチド４」）、アミノ酸１０９〜１１９（「抗原ペプチド５」）、アミノ酸９５〜１１９（「抗原ペプチド６」）、アミノ酸１７８〜１８５（「抗原ペプチド７」）、アミノ酸２００〜２０６（「抗原ペプチド８」）、アミノ酸２３１〜２３８（「抗原ペプチド９」）、アミノ酸２３１〜２４１（「抗原ペプチド１０」）、アミノ酸２６４〜２７０（「抗原ペプチド１１」）、アミノ酸２７４〜２８１（「抗原ペプチド１２」）、アミノ酸３１７〜３２４（「抗原ペプチド１３」）、アミノ酸３５７〜３６３（「抗原ペプチド１４」）、アミノ酸３８４〜３９２（「抗原ペプチド１５」）、アミノ酸３９８〜４１１（「抗原ペプチド１６」）、アミノ酸４０５〜４１１（「抗原ペプチド１７」）、アミノ酸４２３〜４２９（「抗原ペプチド１８」）およびアミノ酸４３４〜４３９（「抗原ペプチド１９」）。本発明は、ＺｃｙｔｏＲ１４に対する抗体を生成するための抗原ペプチド１〜１９のいずれか1つの使用を意図する。本発明は、抗原ペプチド１〜１９のうちの少なくとも1つを含むポリペプチドも意図する。
【０１３７】
好ましい実施形態では、本発明の中和抗体が結合する抗原エピトープは、例えばＺｃｙｔｏＲ１４およびＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆ（個別にまたは一緒に）を用いるリガンド‐受容体結合に重要である配列番号２（および配列番号３の対応する残基）または配列番号５の残基を含有する。
【０１３８】
抗原エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列の少なくとも4〜10のアミノ酸、少なくとも10〜15のアミノ酸、または約15〜約30のアミノ酸を含有し得る。このようなエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドを断片化することにより、または化学的ペプチド合成により産生され得る。さらに、エピトープは、無作為ペプチドライブラリーのファージ・ディスプレーにより選択され得る（例えばLane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5: 268 (1993)およびCortese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616 (1996)参照）。エピトープを同定し、エピトープを含む小ペプチドから抗体を産生するための標準方法は、例えばMole, “Epitope Mapping,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), pages105-116 (The Humana Press, Inc. 1992)、Price,  “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), pages60-84 (Cambridge University Press 1995)およびColigan et al., (eds.), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 and pages 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997)により記載されている。
【０１３９】
任意のＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド（変異体および融合タンパク質を含めて）に関して、上記の表１および２に記述された情報を用いて、その変異体をコードする完全縮重ポリヌクレオチド配列を、当業者は容易に生成され得る。さらに、本明細書中に記載されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づいてＺｃｙｔｏＲ１４変異体を考案するために、当業者は標準ソフトウエアを用い得る。
【０１４０】
Ｅ）ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドの産生
本発明のポリペプチド、例えば全長ポリペプチド；可溶性単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体および多量体受容体；全長受容体；受容体断片（例えばリガンド結合断片および抗原エピトープ）、機能性断片、ならびに融合タンパク質は、慣用的技法に従って、組換え宿主細胞中で産生され得る。ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子を発現するために、ポリペプチドをコードする核酸分子は、発現ベクター中での転写発現を制御する調節配列と操作可能的に連結され、次に、宿主細胞中に導入されなければならない。転写調節配列、例えばプロモーターおよびエンハンサーのほかに、発現ベクターは、翻訳調節配列、ならびに発現ベクターを保有する細胞の選択に適したマーカー遺伝子を含み得る。
【０１４１】
真核生物細胞中の外来タンパク質の産生に適した発現ベクターは、典型的には、（１）細菌複製開始点をコードする原核生物ＤＮＡ素子、および細菌宿主中の発現ベクターの増殖および選択を提供するための抗生物質耐性マーカー；（２）転写の開始を制御する真核生物ＤＮＡ素子、例えばプロモーター；ならびに（３）転写物のプロセッシングを制御するＤＮＡ素子、例えば転写終結／ポリアデニル化配列を含有する。上記のように、発現ベクターは、宿主細胞の分泌経路中に異種ポリペプチドを向ける分泌配列をコードするヌクレオチド配列も包含し得る。例えばＺｃｙｔｏＲ１４発現ベクターは、ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子、および任意の分泌遺伝子に由来する分泌配列を含み得る。
【０１４２】
本発明のＺｃｙｔｏＲ１４タンパク質は、哺乳類細胞中で発現され得る。適切な哺乳類宿主細胞の例としては、アフリカミドリザル腎細胞（ベロ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ1587）、ヒト胚性腎細胞（２９３‐ＨＥＫ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ1573）、ハムスター乳仔腎細胞（ＢＨＫ‐２１、ＢＨＫ‐５７０；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ8544、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ10314）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ34）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ‐Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ61；ＣＨＯ  ＤＧ４４（Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555, 1986））、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ82）、HeLaＳ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ2.2）、ラット肝細胞癌（Ｈ‐４‐ＩＩ‐Ｅ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ1548）、ＳＶ４０‐形質転換化サル腎細胞（ＣＯＳ‐１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ1650）およびネズミ胚細胞（ＮＩＨ‐３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ1658）が挙げられる。
【０１４３】
哺乳類宿主に関しては、転写および翻訳調節シグナルは、哺乳類ウイルス源、例えばアデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サルウイルス等に由来し、この場合、調節シグナルは高レベルの発現を有する特定遺伝子と関連する。適切な転写および翻訳調節配列は、哺乳類遺伝子、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシンおよびメタロチオネイン遺伝子からも得られる。
【０１４４】
転写調節配列は、ＲＮＡ合成の開始を指図するのに十分なプロモーター領域を包含する。適切な真核生物プロモーターとしては、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1: 273 (1982)）、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（McKnight, Cell 31: 355 (1982)）、ＳＶ４０初期プロモーター（Benoist et al., Nature 290: 304 (1981)）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（Gorman et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982)）、サイトメガロウイルスプロモーター（Foecking et al., Gene 45: 101 (1980)）、およびマウス乳癌ウイルスプロモーター（一般的にEtcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al., (eds.), pages 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996参照）が挙げられる。
【０１４５】
あるいは原核生物プロモーター、例えばバクテリオファージＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、原核生物プロモーターが真核生物プロモーターにより調節される場合、哺乳類細胞中でのＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子発現を制御するために用いられ得る（Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10: 4529 (1990)およびKaufman et al., Nucl. Acids Res. 19: 4485 (1991)）。
【０１４６】
ある種の実施形態では、ＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体ポリペプチドまたはＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドの断片をコードするＤＮＡ配列は、発現ベクター内の、転写プロモーターおよびターミネーターを含めたその発現のために必要とされるその他の遺伝子素子と操作可能的に連結される。ベクターは一般に、1つまたは複数の選択マーカーおよび1つまたは複数の複製開始点も含有するが、しかしある種の系内では、選択マーカーは別個のベクター上に提供され、そして外因性ＤＮＡの複製は宿主細胞ゲノム中への組込みにより提供され得る、と当業者は認識する。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクターおよびその他の素子の選択は、当業者のレベル内のルーチン設計の問題である。多数のこのような素子は文献に記載されており、商業的供給元を通して入手可能である。可溶性受容体複合体の多構成成分は、個々の発現ベクター上で同時トランスフェクトされ得るし、あるいは単一発現ベクター中に含有され得る。タンパク質複合体の多構成成分を発現するこのような技法は、当該技術分野で周知である。
【０１４７】
発現ベクターは、種々の標準技法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、マイクロプロジェクタイル媒介性送達、電気穿孔等を用いて、宿主細胞中に導入され得る。トランスフェクト化細胞が選択され、増殖されて、宿主細胞ゲノム中に安定的に組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。真核生物細胞中にベクターを導入するための技法、ならびに優性選択マーカーを用いてこのような安定形質転換体を選択するための技法は、例えばAusubel (1995)により、ならびにMurray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991)により記載されている。
【０１４８】
例えば適切な一選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を提供する遺伝子である。この場合、選択は、ネオマイシン型薬剤、例えばＧ‐４１８等の存在下で実行される。選択系は、「増幅」と呼ばれるプロセスである当該遺伝子の発現レベルを増大するためにも用いられ得る。増幅は、低レベルの選択作用物質の存在下でトランスフェクト体を培養し、次に導入遺伝子の高レベルの産物を産生する細胞に関して選択するために選択作用物質の量を増大することにより実行される。適切な増幅可能選択マーカーは、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）であり、これは、メトトレキセートに対する耐性を付与する。その他の薬剤耐性遺伝子（例えばヒグロマイシン耐性、多剤耐性、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も用いられ得る。あるいは変異表現型を導入するマーカー、例えばグリーン蛍光タンパク質、または表面タンパク質、例えばＣＤ４、ＣＤ８、クラスＩ  ＭＨＣ、胎盤アルカリ性ホスファターゼは、ＦＡＣＳ選別または磁気ビーズ分離技法のような手段により非トランスフェクト化細胞からトランスフェクト化細胞を選別するために用いられ得る。
【０１４９】
ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドは、ウイルス送達系を用いて、培養哺乳類細胞によっても産生され得る。この目的のための例示的ウイルスとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が挙げられる。二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスは、非相同核酸の送達に関して一般的に最も良く研究された遺伝子移入ベクターである（再検討のためには、Becker et al., Meth. Cell Biol. 43: 161 (1994)およびDouglas and Curiel, Science & Medicine 4: 44 (1997)参照）。アデノウイルス系の利点としては、相対的に大型のＤＮＡ挿入物の収容、高力価に増殖する能力、広範囲の哺乳類細胞型に感染する能力、ならびに異なるプロモーターを含有する多数の利用可能なベクターを伴う使用を可能にする柔軟性が挙げられる。
【０１５０】
アデノウイルスゲノムの一部を欠失することにより、非相同ＤＮＡのより大きな挿入物（7 kbまで）が収容され得る。これらの挿入物は、直接結紮により、あるいは同時トランスフェクト化プラスミドとの相同的組換えにより、ウイルスＤＮＡ中に組み入れられ得る。選択肢は、ウイルスベクターから不可欠なＥ１遺伝子を欠失することであり、これはＥ１遺伝子が宿主細胞により提供されない限り、複製不能を生じる。例えばアデノウイルスベクター感染ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ‐1573、45504、45505）は、接着細胞として、あるいは相対的に高い細胞密度での懸濁液培養中で増殖されて、有意量のタンパク質を産生し得る（Garnier et al., Cytotechnol. 15: 145 (1994)参照）。
【０１５１】
ＺｃｙｔｏＲ１４は、他の高等真核生物細胞、例えば鳥類、真菌、昆虫、酵母または植物細胞中でも発現され得る。バキュロウイルス系は、昆虫細胞中にクローン化ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子を導入するための効率的手段を提供する。適切な発現ベクターはキンウワバ（Autographa californica）多核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に基づいており、周知のプロモーター、例えばショウジョウバエ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）７０プロモーター、キンウワバ（Autographa californica）核多角体病ウイルス即時性初期遺伝子プロモーター（ｉｅ‐１）および遅延性初期３９Ｋプロモーター、バキュロウイルスｐ１０プロモーター、およびショウジョウバエメタロチオネインプロモーターを含有する。組換えバキュロウイルスを作製するための第二の方法は、Luckow （Lockow, et al., J. Virol. 67: 4566 (1993)）により記載されたトランスポゾンベースの系を利用する。移入ベクターを利用するこの系は、ＢＡＣ‐ｔｏ‐ＢＡＣキット（Life Technologies, Rockville, MD）で販売されている。この系は、Ｔｎ７トランスポゾンを含有する移入ベクターＰＦＡＳＴＢＡＣ（Life Technologies）を利用して、「バクミド」と呼ばれる大型プラスミドとして大腸菌中に保持されるバキュロウイルスゲノム中にＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドをコードするＤＮＡを移動する（Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71: 971 (1990)、Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75: 1551 (1994)およびChazenbalk, and Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543 (1995)参照）。さらに、移入ベクターは、発現ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドのＣ‐またはＮ末端にエピトープタグ、例えばＧｌｕ‐ＧｌｕエピトープタグをコードするＤＮＡを伴うインフレーム融合体を含み得る（Grussenmeyer et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. 82: 7952 (1985)）。当該技術分野で既知の技法を用いて、ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子を含有する移入ベクターは大腸菌中で形質転換され、組換えバキュロウイルスを示す分断化ｌａｃＺ遺伝子を含有するバクミドに関してスクリーニングされる。組換えバキュロウイルスゲノムを含有するバクミドＤＮＡは次に、一般技法を用いて単離される。
【０１５２】
例証的ＰＦＡＳＴＢＡＣベクターは、相当程度まで修飾され得る。例えば多角体プロモーターは除去され、バキュロウイルス塩基性タンパク質プロモーター（Ｐｃｏｒ、ｐ６．９またはＭＰプロモーターとしても既知）で置換されるが、これは、バキュロウイルス感染の早期に発現され、そして分泌タンパク質を発現するために有益であることが示されている（例えばHill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71: 971 (1990)、Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75: 1551 (1994)およびChazenbalk, and Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543 (1995)参照）。このような移入ベクター構築物では、塩基性タンパク質プロモーターの短いまたは長いバージョンが用いられ得る。さらに、ネイティブＺｃｙｔｏＲ１４分泌シグナル配列を昆虫タンパク質由来の分泌シグナル配列に置き換える移入ベクターが構築され得る。例えばエクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）、ミツバチメリチン（Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA）またはバキュロウイルスｇｐ６７（PharMingen: San Diego, CA）からの分泌シグナル配列が構築物中に用いられて、ネイティブＺｃｙｔｏＲ１４分泌シグナル配列に取って代わる。
【０１５３】
組換えウイルスまたはバクミドは、トランスフェクト化宿主細胞に用いられる。適切な昆虫宿主細胞としては、ＩＰＬＢ‐Ｓｆ‐２１由来の細胞株、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）蛹卵巣細胞株、例えばＳｆ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ1711）、Ｓｆ２１ＡＥおよびＳｆ２１（Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA）、ならびにショウジョウバエ・シュナイダー‐２細胞、およびイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）（米国特許第5,300,435号）由来のＨＩＧＨ  ＦＩＶＥＯ細胞株（Invitrogen）が挙げられる。市販の無血清培地は、細胞を増殖し、保持するために用いられ得る。適切な培地は、Ｓｆ９細胞に関してはＳｆ９００ＩＩTM（Life Technologies）またはＥＳＦ  ９２ＩTM（Expression Systems）；そしてイラクサギンウワバ細胞に関してはＥｘ細胞Ｏ４０５TM（JRH Biosciences, Lenexa, KS）またはExpress FiveＯTM（Life Technologies）である。組換えウイルスが用いられる場合、細胞は典型的には、約2〜5×105細胞の接種密度から約1〜2×106細胞の密度に増殖され、この時点で、組換えウイルスストックが0.1〜10、さらに典型的にはほぼ3の感染多重度（ＭＯＩ）で付加される。
【０１５４】
バキュロウイルス系で組換えタンパク質を産生するための確立された技法は、Bailey et al., “Manipulationof Baculovirus Vectors,” Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), pages 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991)により、Patel et al., “The baculovirus expression system,” in DNA Cloning 2: Expresson Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 205-244 (Oxford University Press 1995)により、Ausubel (1995) at pages 16-57により、Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)により、およびLucknow, “Insect Cell Expression Technology,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)により提供される。
【０１５５】
真菌細胞、例えば酵母細胞も、本明細書中に記載される遺伝子を発現するために用いられ得る。この点で特に興味深い酵母種としては、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア酵母ピキアパストリス（Pichia pastoris）およびメチロトローフ酵母（Pichia methanolica）が挙げられる。酵母における発現のための適切なプロモーターとしては、ＧＡＬ１（ガラクトース）、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）、ＨＩＳ４（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）等からのプロモーターが挙げられる。多数の酵母クローニングベクターが意図され、容易に入手可能である。これらのベクターとしては、ＹＩｐベースのベクター、例えばＹＩｐ５、ＹＲｐベクター、例えばＹＲｐ１７、ＹＥｐベクター、例えばＹＥｐ１３、およびＹＣｐベクター、例えばＹＣｐ１９が挙げられる。外因性ＤＮＡで出芽酵母細胞を形質転換し、それから組換えポリペプチドを産生するための方法は、例えば米国特許第4,599,311号（Kawasaki）、米国特許第4,931,373号（Kawasaki等）、米国特許第4,870,008号（Brake）、米国特許第5,037,743号（Welch等）および米国特許第4,845,075号（Murray等）により開示されている。形質転換化細胞は、選択マーカーにより確定される表現型、一般に薬剤耐性または特定栄養素（例えばロイシン）の非存在下で増殖する能力により選択される。出芽酵母において用いるための適切なベクター系は、Kawasaki等（米国特許第4,931,373号）により開示されるＰＯＴ１ベクター系であり、これはグルコース含有培地中での増殖により形質転換化細胞を選択させる。酵母で用いるための付加的な適切なプロモーターおよびターミネーターとしては、解糖酵素遺伝子からのもの（例えば米国特許第4,599,311号（Kawasaki）、米国特許第4,615,974号（Kingsman等）および米国特許第4,977,092号（Bitter）参照）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が挙げられる（米国特許第4,990,446号、第5,063,154号、第5,139,936号および第4,661,454号も参照）。
【０１５６】
他の酵母、例えばメタノール資化性酵母（Hansenula polymorpha）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、キラー酵母クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、植物病原菌ウスチラゴ・マイディス（Ustilago maydis）、ピキア酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、メチロトローフ酵母（Pichia methanolica）、ピキア・グイレルモンディ（Pichia guillermondii）およびカンジダ・マルトサ（Candida maltosa）に関する形質転換は、当該技術分野で既知である（例えばGleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459 (1986)および米国特許第4,882,279号（Cregg）参照）。アスペルギルス細胞は、米国特許第4,935,349号（McKnight等）の方法に従って利用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための方法は、米国特許第5,162,228号（Sumino等）により開示されている。アカパンカビ（Neurospora）を形質転換するための方法は、米国特許第4,486,533号（Lambowitz）により開示されている。
【０１５７】
例えば組換えタンパク質の産生のための宿主としてのメチロトローフ酵母（Pichia methanolica）の使用は、米国特許第5,716,808号（Raymond）、米国特許第5,736,383号（Raymond）、Raymond et al., Yeast 14: 11-23 (1998)および国際公開WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536およびWO 98/02565に開示されている。メチロトローフ酵母（Pichia methanolica）を形質転換するに際して用いるためのＤＮＡ分子は一般に、二本鎖、環状プラスミドとして調製されるが、これは好ましくは形質転換前に線状化される。メチロトローフ酵母（Pichia methanolica）におけるポリペプチド産生のためには、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターはメチロトローフ酵母（Pichia methanolica）遺伝子、例えばメチロトローフ酵母（Pichia methanolica）アルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１またはＡＵＧ２）のものであり得る。その他の有用なプロモーターとしては、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、フォルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のものが挙げられる。宿主染色体中へのＤＮＡの組込みを促すためには、宿主ＤＮＡ配列が両端で側面を接するプラスミドの完全発現セグメントを有するのが好ましい。メチロトローフ酵母（Pichia methanolica）で用いるための適切な選択マーカーはメチロトローフ酵母（Pichia methanolica）ＡＤＥ２遺伝子であり、これはホスホリボシル‐５‐アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（ＡＩＲＣ；ＥＣ4.1.1.21）をコードし、そしてアデニンの非存在下でａｄｅ２宿主細胞を増殖させる。メタノールの使用を最小限にするのが望ましい大規模な産業的プロセスに関しては、両メタノール利用遺伝子（ＡＵＧ１およびＡＵＧ２）が欠失された宿主細胞が用いられ得る。分泌タンパク質の産生のために、宿主細胞は、液胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４およびＰＲＢ１）を欠き得る。電気穿孔は、メチロトローフ酵母（Pichia methanolica）細胞中への当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するプラスミドの導入を促すために用いられる。メチロトローフ酵母（Pichia methanolica）細胞は、2.5〜4.5 kV/cm、好ましくは約3.75 kV/cmの電場強度、ならびに1〜40ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ秒の時間定数（ｔ）を有する指数関数的減衰パルス化電場を用いて、電気穿孔により形質転換され得る。
【０１５８】
発現ベクターは、植物原形質体、無傷植物組織または単離植物細胞中にも導入され得る。植物組織中への発現ベクターの導入方法としては、直接感染、あるいはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）との植物組織の同時培養、マイクロプロジェクタイル媒介性送達、ＤＮＡ注射、電気穿孔等が挙げられる（例えばHorsch et al., Science 227: 1229 (1985)、Klein et al., Biotechnology 10: 268 (1992)およびMiki et al., “Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants,” in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), pages 67-88 (CRC Press, 1993)参照）。
【０１５９】
あるいはＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子は、原核生物宿主細胞中で発現され得る。原核生物宿主中でＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドを発現するために用いられ得る適切なプロモーターは当業者に周知であり、例としてはＴ４、Ｔ３、Ｓｐ６およびＴ７ポリメラーゼを認識し得るプロモーター、バクテリオファージλのＰRおよびＰLプロモーター、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｌｐｐ‐ｌａｃＳｐｒ、ｐｈｏＡおよびｌａｃＺプロモーター、枯草菌のプロモーター、バシラス属のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトミセス属プロモーター、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のｂｌａプロモーター、ならびにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターが挙げられる。原核生物プロモーターは、Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277 (1987)、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987)およびAusubel et al. (1995)により再検討されている。
【０１６０】
適切な原核生物宿主としては、大腸菌および枯草菌が挙げられる。大腸菌の適切な菌株としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＤＨ１、ＤＨ４Ｉ、ＤＨ５、ＤＨ５Ｉ、ＤＨ５ＩＦ、ＤＨ５ＩＭＣＲ、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ１０Ｂ／ｐ３、ＤＨ１１Ｓ、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、Ｋ３８、ＲＲ１、Ｙ１０８８、Ｙ１０８９、ＣＳＨ１８、ＥＲ１４５１およびＥＲ１６４７が挙げられる（例えばBrown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)参照）。枯草菌の適切な菌株としては、ＢＲ１５１、ＹＢ８８６、ＭＩ１１９、ＭＩ１２０およびＢ１７０が挙げられる（例えばHardy, “Bacillus Cloning Methods,” in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.)(IRL Press 1985)参照）。
【０１６１】
細菌、例えば大腸菌中でＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドを発現する場合、ポリペプチドは、細胞質中に、典型的には不溶性顆粒として保持され得るし、または細菌分泌配列により細胞膜周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒が回収され、そして、例えばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いて変性される。変性ポリペプチドは次に、変性体を希釈することにより、例えば尿素の溶液、ならびに還元および酸化グルタチオンの組合せに対する透析とその後の緩衝化生理食塩溶液に対する透析により、リフォールディングされ、二量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞を崩壊して（例えば音波処理または浸透圧衝撃により）、細胞膜周辺腔の内容物を放出し、そしてタンパク質を回収し、それにより変性およびリフォールディングに対する必要性を不要にすることにより、可溶性および機能性形態で細胞膜周辺腔から回収され得る。
原核生物宿主中でタンパク質を発現する方法は、当業者に周知である（例えばWilliams et al., “Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995)、Ward et al., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)およびGeorgiou, “Expression of Proteins in Bacteria,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), page 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)参照）。
【０１６２】
細菌、酵母、昆虫および植物細胞中に発現ベクターを導入するための標準方法は、例えばAusubel (1995)により提供される。
哺乳類細胞系により産生される外来タンパク質を発現し、回収するための一般的方法は、例えばEtcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al., (eds.), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996)により提供される。細菌系により産生されるタンパク質を回収するための標準技法は、例えばGrisshammer et al., “Purification of over-produced proteins freom E. coli cells,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (ess.), pages 59-92 (Oxford University Press 1995)により提供される。バキュロウイルス系から組換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Richardson (es.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)に記載されている。
【０１６３】
代替物として、本発明のポリペプチドは、排他的固相合成、部分的固相法、断片縮合または古典的溶液合成により合成され得る。これらの合成方法は、当業者に周知である（例えばMerrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963)、Stewart et al., “Solid Phase Peptide Synthesis” (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984)、Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3: 3 (1986)、Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989)、Fields and Colowick, “Solid Phase Peptide Synthesis,” Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997)およびLloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptide and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)参照）。全体的化学合成戦略における変異、例えば「ネイティブ化学結紮」および「発現タンパク質結紮」も標準的である（例えばDawson et al., Science 266: 776 (1994)、Hackeng et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 94: 7845 (1997)、Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997)、Muir et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. USA95: 6705 (1998)およびSeverinov and Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998)参照）。
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、配列番号２または５の少なくとも6、少なくとも9、または少なくとも15連続アミノ酸残基を含む。例証として、ポリペプチドは、配列番号２または５の少なくとも6、少なくとも9、または少なくとも15連続アミノ酸残基を含む。本発明のある種の実施形態内では、ポリペプチドは、これらのアミノ酸配列の20、30、40、50、100またはそれより多い連続残基を含む。このようなペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブとして有用である。
【０１６４】
さらに、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドおよびその断片は、高等真核生物細胞内で単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体として発現され得る。このような細胞は、少なくとも1つのＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドを含むＺｃｙｔｏＲ１４単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体および多量体受容体ポリペプチド（「ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体」または「ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体ポリペプチド」）を産生するために用いられ得るし、あるいはスクリーニング系における検定細胞として用いられ得る。本発明の一態様内では、ＺｃｙｔｏＲ１４細胞外ドメインを含む本発明のポリペプチドは培養細胞により産生され、そしてその細胞は、受容体のためのリガンド、例えば天然リガンド、ＩＬ‐１７Ｆ、ならびにＩＬ‐１７Ａに関して、あるいは天然リガンドのアゴニストおよびアンタゴニストに関してさえ、スクリーニングするために用いられる。このアプローチを要約するために、当該受容体をコードするｃＤＮＡまたは遺伝子が、その発現に必要とされるその他の遺伝子素子（例えば転写プロモーター）と組合され、その結果生じた発現ベクターが宿主細胞中に挿入される。ＤＮＡを発現し、機能性受容体を産生する細胞は、種々のスクリーニング系内で選択され、用いられる。単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体および多量体受容体複合体の各構成成分は、同一細胞中で発現され得る。さらに、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体および多量体受容体複合体の構成成分はまた、膜貫通ドメインまたはその他の膜融合部分と融合されて、上記のようなトランスフェクト体の複合アセンブリーおよびスクリーニングを可能にする。
【０１６５】
本発明のＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆアンタゴニストポリペプチドおよび抗体を検定するために、ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体あるいはＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆを結合することが既知のその他の受容体を発現し、受容体媒介性シグナルを形質導入するに際して用いるのに適した哺乳類細胞（例えばＩＬ‐１７Ｒを発現する細胞）としては、ＺｃｙｔｏＲ１４と機能的複合体を形成し得るその他の受容体サブユニットを発現する細胞が挙げられる。発現されるべき受容体と同一種からの細胞を用いるのも好ましい。好ましい実施形態内では、細胞は、その増殖のために外因的に供給される造血成長因子によっている。この型の好ましい細胞株は、ヒトＴＦ‐１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ‐2003）およびＡＭＬ‐１９３細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ‐9589）であり、これらはＧＭ‐ＣＳＦ依存性ヒト白血球細胞株、ならびにＩＬ‐３依存性ネズミ前‐Ｂ細胞株であるＢａＦ３（Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734 (1985)）である。その他の細胞株としては、ＢＨＫ、ＣＯＳ‐１およびＣＨＯ細胞が挙げられる。適切な宿主細胞は、工学処理されて、必要な受容体サブユニットまたは所望の細胞応答に必要とされるその他の細胞構成成分を産生し得る。このアプローチは、細胞株が工学処理されて任意の種からの受容体サブユニットを発現し、それにより種特異性に起因する潜在的制限を克服する。ヒト受容体ｃＤＮＡの種オーソログはクローン化され、同一種からの細胞株内で用いられ得る（例えばＢａＦ３細胞株中のネズミｃＤＮＡ）。したがって、ＧＭ‐ＣＳＦまたはＩＬ‐３のような一造血性成長因子によって細胞株は、工学処理されて、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７ＡのようなＺｃｙｔｏＲ１４受容体により作用する別のサイトカイン依存性になり得る。
【０１６６】
機能性受容体を発現する細胞は、スクリーニング検定内で用いられる。種々の適切な検定が、当該技術分野で既知である。これらの検定は、標的細胞中の生物学的応答の検出に基づいている。このような一検定は、細胞増殖検定である。細胞は、試験化合物の存在下または非存在下で培養され、そして例えばトリチウム化チミジンの取り込みを測定することにより、または臭化３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）の代謝的分解に基づいた比色検定により細胞増殖が検出される（Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63 (1983)）。代替的検定フォーマットは、レポーター遺伝子を発現するようさらに工学処理される細胞を用いる。レポーター遺伝子は、受容体連結経路に応答性であるプロモーター素子と連結され、そして検定は、レポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。この点での好ましいプロモーター素子は、血清応答素子またはＳＲＥである（例えばShaw et al., Cell 56: 563-572, (1989)参照）。好ましいこのようなレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である（de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987)）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当該技術分野で既知の方法を用いて発光により検出される（例えばBaumgartner et al., J. Biol. Chem. 269: 29094-29101, (1994)； Schenborn and Goiffin, Promega Notes 41: 11, 1993）。ルシフェラーゼ活性検定キットは、例えばPromega Corp., Madison, WIから市販されている。この型の標的細胞株は、化学物質、細胞状態調節培地、真菌ブロス、土壌試料、水試料等のライブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。例えば細胞状態調節培地試料のバンクは、リガンドを産生する細胞を同定するために標的細胞で検定され得る。次に陽性細胞を用いて、哺乳類発現ベクター中にｃＤＮＡライブラリーを産生し、これを分けてプールし、宿主細胞中にトランスフェクトして、発現させる。次にトランスフェクト化細胞からの培地試料が検定され、その後、分けられてプールされ、再トランスフェクトされて、二次培養され、陽性細胞が再検定されて、リガンドをコードするクローン化ｃＤＮＡが単離される。
【０１６７】
本発明により提供される付加的スクリーニングアプローチは、ハイブリッド受容体ポリペプチドの使用を包含する。これらのハイブリッドポリペプチドは、2つの一般的クラスに分けられる。第一のクラスでは、ＺｃｙｔｏＲ１４の細胞内ドメインは、第二受容体のリガンド結合ドメインに接合される。第二クラスのハイブリッド受容体ポリペプチドは、第二受容体、好ましくは造血性サイトカイン受容体の細胞内ドメイン、ならびに膜貫通ドメインを伴うＺｃｙｔｏＲ１４の細胞外（リガンド結合）ドメイン（配列番号３）を含む。この第二クラスの本発明受容体のハイブリッドＺｃｙｔｏＲ１４単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体および多量体は、第二受容体により形質導入されるシグナルに応答し得ることが既知である細胞中で発現される。同時に、これら2つのクラスのハイブリッド受容体は、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａを検出するための検定の開発のための応答性細胞型の同定を可能にする。さらに、このような細胞は、競合型検定において本発明の可溶性受容体アンタゴニストを検定するために、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａの存在下で用いられる。このような検定では、本発明の可溶性受容体の存在下でのＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａの増殖またはシグナル伝達の低減は、拮抗活性を実証する。さらに、細胞ベースの検定であるＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体結合検定も、可溶性受容体がＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａ活性を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和するか否かを査定するために用いられ得る。
【０１６８】
Ｆ）ＺｃｙｔｏＲ１４融合タンパク質および接合体の産生
ＺｃｙｔｏＲ１４類似体の一般的一クラスは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列の一突然変異であるアミノ酸配列を有する変異体である。ＺｃｙｔｏＲ１４類似体の別の一般的クラスは、下記のような抗イディオタイプ抗体およびその断片により提供される。さらに、抗イディオタイプ可変ドメインを含む組換え抗体は、類似体として用いられ得る（例えばMonfardini et al., Proc. Assoc. Am. Physicians 108: 420 (1996)参照）。抗イディオタイプＺｃｙｔｏＲ１４抗体の可変ドメインはＺｃｙｔｏＲ１４を模倣するため、これらのドメインはＺｃｙｔｏＲ１４結合活性を提供し得る。抗イディオタイプ触媒性抗体の産生方法は、当業者に既知である（例えばJoron et al., Ann. N Y Acad. Sci. 672: 216 (1992)、Friboulet et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47: 229 (1994)およびAvalle et al., Ann. N Y Acad. Sci. 864: 118 (1998)参照）。
【０１６９】
ＺｃｙｔｏＲ１４類似体を同定するための別のアプローチは、コンビナトリウムリアル・ライブラリーの使用により提供される。ファージ・ディスプレーおよびその他のコンビナトリウムリアル・ライブラリーを構築し、スクリーニングするための方法は、例えばKay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996)、米国特許第5,783,384号（Verdine）、米国特許第5,747,334号（Kay等）および米国特許第5,723,323号（Kauffman等）により提供される。
【０１７０】
ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドは、in vivoおよびin vitroの両方の用途を有する。例証として、培養細胞により産生されるＺｃｙｔｏＲ１４リガンド（即ちＩＬ‐１７Ｆ、ＩＬ‐１７Ａまたはその両方）の作用を抑制するために、可溶性形態のＺｃｙｔｏＲ１４が細胞培地に付加され得る。
【０１７１】
ＺｃｙｔｏＲ１４の融合タンパク質は、組換え宿主中でＺｃｙｔｏＲ１４を発現するために、そして産生ＺｃｙｔｏＲ１４を単離するために、用いられ得る。下記のように、特定のＺｃｙｔｏＲ１４融合タンパク質は、診断および治療における用途も有する。一型の融合タンパク質は、組換え宿主細胞からのＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドを先導するペプチドを含む。真核生物宿主細胞の分泌経路にＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドを向けるために、分泌シグナル配列（シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても既知）がＺｃｙｔｏＲ１４発現ベクター中に提供される。分泌シグナル配列はＺｃｙｔｏＲ１４に由来し得るが、しかし適切なシグナル配列は別の分泌タンパク質由来でもあり得るし、あるいはde novoで合成され得る。分泌シグナル配列は、2つの配列が的確なリーディングフレーム内で接合され、宿主細胞の分泌経路に新輝合成ポリペプチドを向けるよう配置されるように、ＺｃｙｔｏＲ１４コード配列と操作可能的に連結される。分泌シグナル配列は一般に当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して５’に配置されるが、しかしある種の分泌シグナル配列は当該ヌクレオチド配列中の別の箇所に配置され得る（例えば米国特許第5,037,743号（Welch等）；米国特許第5,143,830号（Holland等）参照）。
【０１７２】
哺乳類細胞により産生されるＺｃｙｔｏＲ１４または別のタンパク質の分泌シグナル配列（例えば米国特許第5,641,655号に記載されているような組織型プラスミノーゲン活性剤シグナル配列）は組換え哺乳類宿主中でのＺｃｙｔｏＲ１４の発現のために有用であるが、しかし酵母シグナル配列が酵母細胞中での発現のために選択される。適切な酵母シグナル配列の例は、酵母交配フェルモンα因子（ＭＦα１遺伝子によりコードされる）、インベルターゼ（ＳＵＣ２遺伝子によりコードされる）または酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５遺伝子によりコードされる）由来のものである（例えばRomanos et al., “Expression of Cloned Genes in Yeast,” in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (eds.), pages 123-167 (Oxford University Press 1995参照）。
ＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体ポリペプチドは、細胞外ドメイン、例えば配列番号３を含有するポリペプチドまたは非ヒト受容体の対応する領域をコードする切頭化ＤＮＡを発現することにより、調製され得る。細胞外ドメインポリペプチドは、膜貫通および細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に含有しない形態で調製される、というのが好ましい。宿主細胞からの受容体ドメインの輸出を指図するために、受容体ＤＮＡは、分泌ペプチド、例えばｔ‐ＰＡ分泌ペプチドをコードする第二ＤＮＡセグメントと連結される。分泌受容体ドメインの精製を促すために、Ｃ末端伸長、例えばポリヒスチジンタグ、サブスタントＰ、ＦｌａｇTMペプチド（Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-1210, (1998)；Eastman Kodak Co., New Haven, CTから入手可能）、あるいは抗体またはその他の特異的結合剤が利用可能な別のポリペプチドまたはタンパク質が、受容体ポリペプチドと融合され得る。さらに、細胞外サイトカイン結合ドメインからのＺｃｙｔｏＲ１４抗原エピトープも、上記のように調製される。
【０１７３】
代替的アプローチでは、ＺｃｙｔｏＲ１４またはその他のサイトカイン受容体構成成分の受容体細胞外ドメインは、免疫グロブリン重鎖定常部、典型的にはＦｃ断片との融合体として発現され得るが、これは、2つの定常部ドメインおよびヒンジ領域を含有するしかし可変部を欠く（米国特許第6,018,026号および第5,750,375号（Sledziewski,AZ等）参照）。本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドは、このような融合体を包含する。このような一融合体は、配列番号６４で示される。このような融合体は、典型的には、Ｆｃ部分が互いにジスルフィド結合され、そして2つの受容体ポリペプチドが互いに密接して整列される多量体分子として分泌される。この型の融合体は、リガンドを特異的にて規定することによりin vitroでシグナルを遮断し、抑制しまたは低減するためのin vitro検定ツールとして、そして循環リガンドを結合し、循環からそれを取り除くためにそれらを非経口投与することにより、in vivoでのアンタゴニストとして、溶液からコグネイトリガンドをアフィニティー精製するために用いられ得る。リガンドを精製するために、受容体‐リガンド結合を促す条件（典型的にはほぼ生理学的温度、ｐＨおよびイオン強度）下で、リガンドを含有する試料（例えば細胞条件調節培地または組織抽出物）に、ＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｉｇキメラが付加される。次にキメラ‐リガンド複合体はプロテインＡを用いた混合物により分離され、これは、固体支持体（例えば不溶性樹脂ビーズ）上に固定される。次に、慣用的化学的技法を用いて、例えば塩またはｐＨ勾配を用いて、リガンドが溶離される。代替的方法では、キメラそれ自体が固体支持体と結合され、結合および溶離は上記と同様に実行される。キメラは、炎症性応答、例えば急性期応答、例えば血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、Ｃ‐反応性タンパク質（ＣＲＰ）等を調節するためにin vivoで用いられ得る。高結合親和性を有するキメラは、非経口投与される（例えば筋肉内、皮下または静脈内注射により）。循環分子はリガンドと結合し、そして正常生理学的プロセスにより循環から取り除かれる。検定に用いるために、キメラは、Ｆｃ領域を介して支持体に結合され、そしてＥＬＩＳＡフォーマットで用いられる。
【０１７４】
本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ１４および結合相手を単離するのを手助けするために、リガンド結合受容体（または抗体、補体／抗補体対の一成員）またはその結合断片、市販のバイオセンサー計器（BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ）を使用する検定系が有益に用いられ得る。このような受容体、抗体、補体／抗補体対の成員、あるいは断片は、受容体チップの表面に固定される。この計器の使用は、Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991およびCunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993に開示されている。受容体、抗体、成員または断片は、アミンまたはスルフヒドリル化学を用いて、フローセル内の金フィルムに付着されたデキストラン繊維と共有結合される。試験試料は、セルを通過する。リガンド、エピトープまたは補体／抗補体対の反対成員が試料中に存在する場合、それはそれぞれ固定受容体、抗体または成員と結合して、媒質の屈折率の変化を引き起こし、これが金フィルムの表面プラズモン共鳴の変化として検出される。この系は、オン‐およびオフ‐レートの確定（これから結合親和性が算定され得る）、ならびに結合の化学量論の査定を可能にする。あるいはリガンド／受容体結合は、ＳＥＬＤＩ（ＴＭ）技法（Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA）を用いて分析され得る。さらにまた、上記のＢＩＡＣＯＲＥ技法は、異なるモノクローナル抗体がＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド上の同一のまたは異なるエピトープと結合するか否かを確定するために競合実験に用いられ得るし、このようなものとして、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和する本発明の中和抗体のエピトープマッピングを手助けするために用いられ得る。
【０１７５】
リガンド結合受容体ポリペプチドは、当該技術分野で既知のその他の検定系内でも用いられ得る。このような系としては、結合親和性の確定のためのScatchard分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949参照）、ならびに比色検定（Cunningham et al., Science 253: 545-48, 1991；Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991）が挙げられる。
【０１７６】
本発明はさらに、種々のその他のポリペプチド融合体ならびに1つまたは複数のポリペプチド融合体を含む関連多量体タンパク質を提供する。例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体は、米国特許第5,155,027号および第5,567,584号に開示されるような二量化タンパク質との融合体として調製され得る。この点での好ましい二量化タンパク質は、免疫グロブリン定常部ドメイン、例えばＩｇＧγ１およびヒトκ軽鎖を包含する。免疫グロブリン‐可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４融合体は、遺伝子工学処理細胞中で発現されて、種々の多量体ＺｃｙｔｏＲ１４受容体類似体を産生し得る。補助ドメインは、それらを特定の細胞、組織または高分子（例えばコラーゲン、あるいはＺｃｙｔｏＲ１４リガンドＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａを発現する細胞）にターゲッティングするために、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体に融合され得る。ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドは、2またはそれより多い部分、例えば精製のためのアフィニティー・タグ、ならびにターゲッティングドメインと融合され得る。ポリペプチド融合体は、特にドメイン間に、1つまたは複数の切断部位も含み得る（Tuan et al., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996参照）。
【０１７７】
細菌細胞では、毒性を低減し、安定性を増大し、そして発現タンパク質の回収を増強するための融合タンパク質として、異種タンパク質を発現するのがしばしば望ましい。例えばＺｃｙｔｏＲ１４は、グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼポリペプチドを含む融合タンパク質として発現され得る。グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ融合タンパク質は、典型的には可溶性であり、そして固定化グルタチオンカラム上で大腸菌溶解物から容易に精製可能である。類似のアプローチにおいて、マルトース結合タンパク質ポリペプチドを含むＺｃｙｔｏＲ１４融合タンパク質は、アミロース樹脂カラムを用いて単離され得るが、一方、切頭化プロテインＡ遺伝子のＣ末端を含む融合タンパク質は、ＩｇＧ‐セファロースを用いて精製され得る。細菌細胞中で融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現するための確立された技法は、例えばWilliams et al., “Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies,” in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (Eds.), page 15-58 (Oxford University Press 1995)により記載されている。さらに、市販の発現系が利用可能である。例えばＰＩＮＰＯＩＮＴ  Ｘａタンパク質精製系（Promega Corporation; Madison, WI）は、アビジンを含む樹脂を用いて発現中にビオチニル化されるようになるポリペプチドを含む融合タンパク質の単離方法を提供する。
【０１７８】
原核生物または真核生物細胞により発現される異種ポリペプチドを単離するために有用であるペプチドタグとしては、ポリヒスチジンタグ（ニッケルキレート樹脂に対する親和性を有する）、ｃ‐ｍｙｃタグ、カルモジュリン結合タンパク質（カルモジュリンアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離される）、サブスタンスＰ、ＲＹＩＲＳタグ（抗ＲＹＩＲＳ抗体と結合する）、Ｇｌｕ‐Ｇｌｕタグ、およびＦＬＡＧタグ（抗ＦＬＡＧ抗体と結合する）が挙げられる（例えばLuo et al., Arch. Biochem. Biophys. 329: 215 (1996)、Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23: 67 (1996)およびZheng et al., Gene 186: 55 (1997)参照）。このようなペプチドタグをコードする核酸分子は、例えばSigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO)から入手可能である。
【０１７９】
別の形態の融合タンパク質は、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドおよび免疫グロブリン重鎖定常部、典型的にはＦｃ断片を含み、これは、2または3つの定常部ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、しかし可変部を欠く。例証として、米国特許第5,723,125号（Chang等）は、ヒトインターフェロンおよびヒト免疫グロブリンＦｃ断片を含む融合タンパク質を記載する。インターフェロンのＣ末端は、ペプチドリンカー部分によりＦｃ断片のＮ末端に連結される。ペプチドリンカーの一例は、主としてＴ細胞挿入配列を含むペプチドであり、これは免疫学的に不活性である。例示的ペプチドリンカーは、アミノ酸配列：GGSGG SGGGG SGGGG S（配列番号９）を有する。この融合タンパク質では、例証的Ｆｃ部分はヒトγ４鎖であり、これは溶液中で安定で、そして補体活性化活性をほとんどまたは全く有さない。したがって本発明は、ＺｃｙｔｏＲ１４部分およびヒトＦｃ断片を含むＺｃｙｔｏＲ１４融合タンパク質を意図するが、この場合、ＺｃｙｔｏＲ１４部分のＣ末端は、ペプチドリンカー、例えば配列番号２または５のアミノ酸配列を含むペプチドを介してＦｃ断片のＮ末端に結合される。ＺｃｙｔｏＲ１４部分は、ＺｃｙｔｏＲ１４分子またはその断片であり得る。例えば融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸およびＦｃ断片（例えばヒトＦｃ断片）（配列番号６４）を含み得る。
【０１８０】
別の変異では、ＺｃｙｔｏＲ１４融合タンパク質は、ＩｇＧ配列、ＩｇＧ配列のアミノ末端と共有結合されるＺｃｙｔｏＲ１４部分、ならびにＺｃｙｔｏＲ１４部分のアミノ末端と共有結合されるシグナルペプチドを含み、この場合、ＩｇＧ配列は、以下の順序での以下の要素からなる：ヒンジ領域、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメイン。したがってＩｇＧ配列は、ＣＨ1ドメインを欠く。ＺｃｙｔｏＲ１４部分は、本明細書中に記載されるようなＺｃｙｔｏＲ１４活性、例えばＺｃｙｔｏＲ１４リガンドと結合する能力を表示する。抗体および非抗体部分の両方を含む融合タンパク質産生へのこの一般的アプローチは、EP 742830（WO 95/21258）（LaRochelle等）により記載されている。
【０１８１】
ＺｃｙｔｏＲ１４部分およびＦｃ部分を含む融合タンパク質は、例えばin vitro検定ツールとして用いられ得る。例えば生物学的試料中のＺｃｙｔｏＲ１４リガンドの存在は、ＺｃｙｔｏＲ１４‐免疫グロブリン融合タンパク質を用いて検出され得るが、この場合、ＺｃｙｔｏＲ１４部分はリガンドを結合するために持ちられ、そして高分子、例えばプロテインＡまたは抗Ｆｃ抗体は、融合タンパク質を固体支持体に結合するために用いられる。このような系を用いて、ＺｃｙｔｏＲ１４リガンド、例えばＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方とそれらの受容体との結合を妨害するアゴニストおよびアンタゴニストを同定し得る。
【０１８２】
抗体融合タンパク質のその他の例としては、抗原結合ドメインを含むポリペプチド、ならびにＺｃｙｔｏＲ１４細胞外ドメインを含有するＺｃｙｔｏＲ１４断片が挙げられる。このような分子は、ＺｃｙｔｏＲ１４結合活性の利益のために特定組織をターゲッティングするために用いられ得る。
【０１８３】
本発明はさらに、種々のその他のポリペプチド融合体を提供する。例えば生物学的機能を付与するドメイン（単数または複数）の一部または全部が、本発明のＺｃｙｔｏＲ１４間で、サイトカイン受容体ファミリーの別の成員からの機能的に等価なドメイン（単数または複数）と交換され得る。ポリペプチド融合体は、組換え宿主細胞中で発現されて、種々のＺｃｙｔｏＲ１４融合類似体を産生し得る。ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドは、2またはそれより多い部分またはドメイン、例えば精製のためのアフィニティー・タグ、およびターゲッティングドメインと融合され得る。ポリペプチド融合体は、特にドメイン間に、1つまたは複数の切断部位も含み得る（例えばTuan et al., Connective Tissue Research 34: 1 (1996)参照）。
【０１８４】
融合タンパク質は、融合タンパク質の各構成成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することにより、当業者に既知の方法により調製され得る。あるいは適正リーディングフレーム中の融合タンパク質の両構成成分をコードするポリヌクレオチドが、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書中に記載される方法により発現され得る。融合タンパク質の酵素的および化学的切断のための一般的方法は、例えばAusubel (1995) at pages 16-19〜16-25により記載されている。
【０１８５】
ＺｃｙｔｏＲ１４結合ドメインは、核磁気共鳴、結晶学、電子回析または光親和性標識のような技法を、ＺｃｙｔｏＲ１４リガンドアゴニストの推定接触部位アミノ酸の突然変異とともに用いて確定した場合の、構造の物理学的分析により、さらに特性化され得る（例えばde Vos et al., Science 255: 306 (1992)、Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899 (1992)およびWlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59 (1992)参照）。
【０１８６】
本発明は、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドがポリマーと連結される化学修飾ＺｃｙｔｏＲ１４組成物も意図する。例証的ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドは、機能性膜貫通ドメインを欠く可溶性ポリペプチド、例えばアミノ酸残基配列番号３から成るポリペプチドである。典型的にはポリマーは、ＺｃｙｔｏＲ１４接合体が水性環境、例えば生理学的環境中で沈殿しないよう、水溶性である。適切なポリマーの一例は、単一反応基、例えばアシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドを有するよう修飾されたものである。このようにして、重合の程度が制御され得る。反応性アルデヒドの一例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドあるいはそのモノ‐（Ｃ1〜Ｃ10）アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である（例えば米国特許第5,252,714号（Harris等）参照）。ポリマーは、分枝鎖であるかまたは非分枝鎖であり得る。さらにポリマーの混合物は、ＺｃｙｔｏＲ１４接合体を産生するために用いられ得る。
【０１８７】
治療のために用いられるＺｃｙｔｏＲ１４接合体は、製薬上許容可能な水溶性ポリマー部分を含み得る。適切な水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ‐ＰＥＧ、モノ‐（Ｃ1〜Ｃ10）アルコキシ‐ＰＥＧ、アリールオキシ‐ＰＥＧ、ポリ‐（Ｎ‐ビニルピロリドン）ＰＥＧ、トレシルモノメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス‐スクシンイミジルカルボネートＰＥＧ、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド・コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロースまたはその他の炭水化物ベースのポリマーが挙げられる。適切なＰＥＧは、約600〜約60,000、例えば5,000、12,000、20,000および25,000の分子量を有し得る。ＺｃｙｔｏＲ１４接合体は、このような水溶性ポリマーの混合物も含み得る。
【０１８８】
ＺｃｙｔｏＲ１４接合体の一例は、ＺｃｙｔｏＲ１４部分、ならびにＺｃｙｔｏＲ１４部分のＮ末端に結合されるポリアルキルオキシド部分を含む。ＰＥＧは、適切な一ポリアルキルオキシドである。一例証として、ＺｃｙｔｏＲ１４は、ＰＥＧで修飾され得る、即ち、「ＰＥＧ化」として既知のプロセスである。ＺｃｙｔｏＲ１４のＰＥＧ化は、当該技術分野で既知のＰＥＧ化反応のいずれかにより実行され得る（例えばEP 0 154 316、Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992)、Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290 (1994)およびFrancis et al., Int J Hematol 68: 1 (1998)参照）。例えばＰＥＧ化は、アシル化反応により、または反応性ポリエチレングリコール分子とのアルキル化反応により、実施され得る。代替的アプローチでは、ＺｃｙｔｏＲ１４接合体は、活性化ＰＥＧを縮合することにより形成されるが、この場合、ＰＥＧの末端ヒドロキシまたはアミノ基は、活性化リンカーにより置き換えられている（例えば米国特許第5,382,657号（Karasiewicz等）参照）。
【０１８９】
アシル化によるＰＥＧ化は、典型的には、ＰＥＧの活性得るテル誘導体をＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドと反応させることを要する。活性化ＰＥＧエステルの一例は、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドにエステル化されるＰＥＧである。本明細書中で用いる場合、「アシル化」という用語は、ＺｃｙｔｏＲ１４と水溶性ポリマーとの間の、以下の型の結合を含む：アミド、カルバメート、ウレタン等。アシル化によるＰＥＧ化ＺｃｙｔｏＲ１４の調製方法は、典型的には、（ａ）1つまたは複数のＰＥＧ基がＺｃｙｔｏＲ１４と結合する条件下で、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドをＰＥＧ（例えばＰＥＧのアルデヒド誘導体の反応性エステル）と反応させ、そして（ｂ）反応産物（単数または複数）を得る、というステップを含む。一般的に、アシル化反応のための最適反応条件は、既知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて確定される。例えばＰＥＧ：ＺｃｙｔｏＲ１４の比が大きいほど、ポリＰＥＧ化ＺｃｙｔｏＲ１４産物のパーセンテージは大きい。
【０１９０】
アシル化によるＰＥＧ化の産物は、典型的にはポリＰＥＧ化ＺｃｙｔｏＲ１４産物であり、この場合、リシンε‐アミノ基はアシル連結基を介してＰＥＧ化される。接続結合の一例は、アミドである。典型的には、その結果生じるＺｃｙｔｏＲ１４は少なくとも95％モノ‐、ジ‐またはトリ‐ペギル化されるが、しかし高度のＰＥＧ化を有するいくつかの種が、反応条件によって形成され得る。ＰＥＧ化種は、標準精製方法、例えば透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて、非接合ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドから分離され得る。
【０１９１】
アルキル化によるＰＥＧ化は一般的に、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体を、還元剤の存在下でＺｃｙｔｏＲ１４と反応させることを包含する。ＰＥＧ基は、‐ＣＨ2‐ＮＨ基を介してポリペプチドと結合され得る。
【０１９２】
さらに、本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または抗体断片は、当該技術分野のそして本明細書中に記載される方法を用いて、ＰＥＧ化され得る。
【０１９３】
モノＰＥＧ化産物を産生するための還元的アルキル化による誘導化は、誘導化のために利用可能な異なる型の第一アミノ基の異なる反応性を利用する。典型的には反応は、リシン残基のε‐アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα‐アミノ基との間のpKa差を利用可能にする。このような選択的誘導化により、アルデヒドのような反応性基を含有する水溶性ポリマーのタンパク質への結合が制御される。ポリマーとの接合は、その他の反応性基、例えばリシン側鎖アミノ基の有意の修飾を伴わずに、タンパク質のＮ末端で優先的に起こる。本発明は、ＺｃｙｔｏＲ１４モノポリマー接合体の実質的に同質の調製を提供する。
【０１９４】
モノポリマーＺｃｙｔｏＲ１４接合体分子の実質的に同質の集団を産生するための還元的アルキル化は、（ａ）ＺｃｙｔｏＲ１４のアミノ末端のα‐アミノ基の選択的修飾を可能にするのに適したｐＨでの還元的アルキル化条件下で、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドを反応性ＰＥＧと反応させ、そして（ｂ）反応産物（単数または複数）を得る、というステップを含み得る。還元的アルキル化のために用いられる還元剤は、水溶液中で安定であり、そして還元的アルキル化の最初のプロセスで形成されるシッフ塩基のみを還元し得るべきである。例証的還元剤としては、ホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボランおよびピリジンボランが挙げられる。
【０１９５】
モノポリマーＺｃｙｔｏＲ１４接合体の実質的同質集団に関しては、還元的アルキル化反応条件は、水溶性ポリマー部分とＺｃｙｔｏＲ１４のＮ末端との選択的結合を可能にするものである。このような反応条件は一般に、Ｎ末端でのリシンアミノ基とα‐アミノ基との間のpKa差を提供する。ｐＨも、用いられるべきポリマー対タンパク質比に影響を及ぼす。概して、ｐＨが低い場合、Ｎ末端α‐基が低反応性であるため、より過度のポリマー対タンパク質比が望ましく、最適条件を達成するためにはより多くのポリマーが必要とされる。ｐＨが高い場合、より多くの反応基が利用可能であるため、ポリマー：ＺｃｙｔｏＲ１４は同じくらい大きい必要はない。典型的には、ｐＨは3〜9または3〜6の範囲内に入る。この方法は、ＺｃｙｔｏＲ１４含有ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体可溶性受容体接合体を作製するために用いられ得る。
【０１９６】
考慮する別の因子は、水溶性ポリマーの分子量である。一般的に、ポリマーの分子量が大きいほど、タンパク質に結合され得るポリマー分子の数は少ない。ＰＥＧ化反応に関しては、典型的分子量は約2 kDa〜約100 kDa、約5 kDa〜約50 kDa、または約12 kDa〜約25 kDaである。水溶性ポリマー対ＺｃｙｔｏＲ１４のモル比は、一般的に1:1〜100:1の範囲である。典型的には、水溶性ポリマー対ＺｃｙｔｏＲ１４のモル比は、ＰＥＧ化に関しては1:1〜20:1、そしてモノＰＥＧ化に関しては1:1〜5:1である。
【０１９７】
ポリペプチドおよび水溶性ポリマー部分を含む接合体を産生するための一般方法は、当該技術分野で既知である（例えば米国特許第5,382,657号（Karasiewicz等）、米国特許第5,738,846号（Greenwald等）、Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59: 636 (1996)、Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247: 434 (1997)参照）。この方法は、ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体可溶性受容体接合体を作製するために用いられ得る。
本発明は、ペプチドまたはポリペプチド、例えば本明細書中に記載される可溶性受容体または抗体を含む組成物を意図する。このような組成物は、担体をさらに含み得る。担体は、慣用的有機または無機担体であり得る。担体の例としては、水、緩衝溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が挙げられる。
【０１９８】
Ｇ）ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、夾雑高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して、少なくとも約80％の純度に、少なくとも約90％の純度に、少なくとも約95％の純度に、または95％より高い、例えば96％、97％、98％、または99％より高い純度に精製され、そして感染性および発熱性作因を含有しない。本発明のポリペプチドは、99.9％より高い純度である薬学的純粋状態にも精製され得る。ある種の調製物では、精製ポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを含有しない。
【０１９９】
分別および／または慣用的精製方法を用いて、天然供給源（例えばヒト組織源）から精製されるＺｃｙｔｏＲ１４の調製物、合成ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド、ならびに組換えＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド、および組換え宿主細胞から精製される融合ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドを生成し得る。概して、硫酸アンモニウム沈降および産生またはカオトロープ抽出は、試料の分別のために用いられ得る。例示的精製ステップとしては、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣおよび逆相高速液体クロマトグラフィーが挙げられ得る。適切なクロマトグラフィー媒質としては、誘導化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特製スライド等が挙げられる。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥおよびＱ誘導体が適している。例示的クロマトグラフィー媒質としては、フェニル、ブチルまたはオクチル基で誘導される媒質、例えばフェニル‐セファロースＦＦ（Pharmacia）、Toyopearlブチル650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル‐セファロース（Pharmacia）等；あるいはポリアクリル樹脂、例えばアンバークロムＣＧ７１（Toso Haas）等が挙げられる。適切な固体支持体としては、それらが用いられるべきである条件下で不溶性であるガラスビーズ、シリカベースの樹脂、セルロース性樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂等が挙げられる。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基および／または炭水化物部分によりタンパク質の結合を可能にする反応基で修飾され得る。
【０２００】
カップリング化学の例としては、臭化シアン活性化、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびにカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシルおよびアミノ誘導体が挙げられる。これらのおよびその他の固体媒体は周知であり、当該技術分野で広範に用いられ、そして商業的供給元から入手可能である。ポリペプチド単離および精製のための特定の方法の選択は、ルーチン設計の問題であり、一部は選択支持体の特性により確定される（例えばAffinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988)およびDoonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)参照）。
【０２０１】
ＺｃｙｔｏＲ１４単離および精製における付加的変異は、当業者により考案され得る。例えば下記のように得られる抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、イムノアフィニティー精製により大量のタンパク質を単離するために用いられ得る。
【０２０２】
本発明のポリペプチドは、特別な特質の開発によっても単離され得る。例えば固定化金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーは、富ヒスチジンタンパク質、例えばポリヒスチジンタグを含むものを精製するために用いられ得る。要するに、ゲルに先ず二価金属イオンが負荷されて、キレート化合物が形成される（Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1 (1985)）。富ヒスチジンタンパク質は、用いられる金属イオンによって、異なる親和性でこのマトリックスに吸着され、競合的溶離、ｐＨ低下、または強キレート化剤の使用により溶離される。その他の精製方法としては、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製が挙げられる（M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182: 529 (1990)）。本発明の付加的実施形態内では、当該ポリペプチドとアフィニティー・タグ（例えばマルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）の融合は、精製を促すために構築される。さらにＺｃｙｔｏＲ１４細胞外ドメインのリガンド結合特性は、例えばアフィニティークロマトグラフィーを用いて、例えばＺｃｙｔｏＲ１４含有可溶性受容体の精製のために開発されるが、この場合、ＩＬ‐１７Ｆリガンドがカラムに結合され、そしてＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体が結合され、その後、標準クロマトグラフィー法を用いて溶離される。
【０２０３】
ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドまたはその断片は、上記のように化学合成によっても調製され得る。ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドは、単量体または多量体で；グリコシル化または非グリコシル化され；ＰＥＧ化または非ＰＥＧ化され得るし；そして最初のメチオニンアミノ酸残基を含むことも含まないこともあり得る。
【０２０４】
Ｈ）ＺｃｙｔｏＲ１４タンパク質に対する抗体の産生
ＺｃｙｔｏＲ１４に対する抗体は、例えばＺｃｙｔｏＲ１４発現ベクターの産物、あるいは抗原として天然供給源から単離されるＺｃｙｔｏＲ１４を用いて得られる。特に有用な抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、ＺｃｙｔｏＲ１４と「特異的に結合する」。抗体は、抗体が以下の2つの特性のうちの少なくとも1つを示す場合、特異的に結合しているとみなされる：（１）抗体が閾値レベルの結合活性でＺｃｙｔｏＲ１４と結合する、ならびに（２）抗体がＺｃｙｔｏＲ１４に関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。
【０２０５】
第一の特質に関して、抗体は、それらがＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド、ペプチドまたはエピトープと106 M-1またはそれより大きい、好ましくは107 M-1またはそれより大きい、さらに好ましくは108 M-1またはそれより大きい、最も好ましくは109 M-1またはそれより大きい結合親和性（Ka）で特異的に結合する場合、特異的に結合する。抗体の結合親和性は、例えばスカチャード分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660 (1949)）により、当業者に容易に確定され得る。第二の特質に関しては、抗体は、例えばそれらが標準ウエスタンブロット分析を用いてＺｃｙｔｏＲ１４を検出するが、しかし目下既知のポリペプチドを検出しない場合、関連ポリペプチド分子と有意に交差反応しない。既知の関連ポリペプチドの例としては、既知のサイトカイン受容体が挙げられる。
【０２０６】
抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、抗原性ＺｃｙｔｏＲ１４エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドを用いて産生され得る。本発明の抗原エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書中に開示される配列番号２、配列番号３、配列番号５または別のアミノ酸配列内に含有される少なくとも9または15〜約30のアミノ酸の配列を含有する。しかしながら30〜50アミノ酸、または本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列以下の任意数を含有する本発明のアミノ酸配列の大部分を含むペプチドまたはポリペプチドも、ＺｃｙｔｏＲ１４と結合する抗体を誘導するために有用である。エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的可溶性を提供するよう選択されるのが望ましい（即ち、配列は相対的に親水性の残基を含み、一方、疎水性残基は典型的には回避される）。さらに、プロリン残基を含有するアミノ酸配列も、抗体産生のために望ましいことがある。
【０２０７】
例証として、ＺｃｙｔｏＲ１４中の潜在的抗原部位は、LASERGENE（DNASTAR; Madison, WI）のＰＲＯＴＥＡＮプログラム（バージョン3.14）により実行される場合、ジェイムソン・ウォルフ法（Jameson and Wolf, CABIOS 4: 181, (1988)）を用いて同定された。デフォルトパラメーターが、この分析では用いられた。
【０２０８】
ジェイムソン・ウォルフ法は、タンパク質構造予測のために6主要サブルーチンを組合せることにより潜在的抗原決定基を予測する。要するに、ホップ・ウッズ法（Hopp et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 78: 3824 (1981)）を先ず用いて、最大局所親水性の領域を示すアミノ酸配列を同定した（パラメーター：平均7残基）。第二ステップでは、エミニ法（Emini et al., J. Virology 55: 836 (1985)）を用いて、表面確率を算定した（パラメーター：表面決定閾値（0.6）＝1）。三番目に、カルプラス・シュルツ法（Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72: 212 (1985)）を用いて、主鎖柔軟性を予測した（パラメーター：柔軟性閾値（0.2）＝1）。分析の第四および第五ステップでは、チョウ・ファスマン法（Chou, “Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition,” in Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), pages 549-586 (Plenum Press 1990)）およりガルニエル・ロブソン法（Garnier et al., J. Mol. Biol. 120: 97 (1978)）を用いて、二次構造予測をデータに適用した（チョウ・ファスマンパラメーター：配座表＝64タンパク質；α領域閾値＝103；β領域閾値＝105；ガルニエル・ロブソンパラメーター：αおよびβ決定定数＝0）。第六サブルーチンでは、柔軟性パラメーターおよびヒドロパシー／溶媒接触可能性因子が組合されて、「抗原指標」と呼ばれる表面輪郭値を確定した。最後に、ピーク拡大関数を抗原指数に適用したが、これは、内部領域と比較した表面領域の移動度から得られる付加的自由エネルギーを説明するためにそれぞれのピーク値の20、40、60または80％を付加することにより、主要表面ピークを拡大する。しかしながらこの計算は、らせん領域は低柔軟性傾向があるため、らせん領域に存在する任意の主要ピークに適用されなかった。ホップ／ウッズ親水性プロフィールを用いて、配列番号３内の最抗原性能力を有する領域を確定し得る（Hopp et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. 78: 3824-3828, 1981；Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986およびTriquier et al., Protein Engineering 11: 153-169, 1998）。プロフィールは、スライディング6‐残基ウインドウに基づいている。埋没Ｇ、ＳおよびＴ残基ならびに露出Ｈ、ＹおよびＷ残基は無視された。さらに、例えばDNASTAR Proteanプログラム（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を用いて、Jameson-Wolfプロットにより予測されたような配列番号３内のＺｃｙｔｏＲ１４抗原エピトープは好ましい抗原エピトープとして役立ち、そして当業者により確定され得る。このような抗原エピトープとしては、（１）配列番号３のアミノ酸残基７３〜アミノ酸残基８２；（２）配列番号３のアミノ酸残基９５〜アミノ酸残基１０４；（３）配列番号３のアミノ酸残基１１１〜アミノ酸残基１１９；（４）配列番号３のアミノ酸残基１７９〜アミノ酸残基１８６；（５）配列番号３のアミノ酸残基２００〜アミノ酸残基２０５；（６）配列番号３のアミノ酸残基２２９〜アミノ酸残基２３６；（７）配列番号３のアミノ酸残基２６４〜アミノ酸残基２６８；ならびに（８）配列番号３のアミノ酸残基２７５〜アミノ酸残基２８１が挙げられる。本発明は、ＺｃｙｔｏＲ１４に対する抗体を生成するために、または本発明の中和モノクローナル抗体をスクリーニングまたは同定するためのツールとして、抗原性ペプチドＸ〜Ｙのいずれか1つを使用することを意図する。本発明は、抗原性ペプチドＸ〜Ｙの少なくとも1つを含むポリペプチドも意図する。本発明は、ＺｃｙｔｏＲ１４に対する抗体を生成するための、ならびに中性にする、そしてＩＬ‐１７ＦおよびＩＬ‐１７Ａ（個別にまたは一緒に）の活性を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和し得る抗ＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナル抗体を同定するかまたはスクリーニングするための、本明細書中に記載される任意の抗原性ペプチドまたはエピトープの使用も意図する。
【０２０９】
さらに、適切な抗原としては、上記のＺｃｙｔｏＲ１４サイトカイン結合または細胞外ドメインを別のサイトカイン細胞外ドメイン、例えばクラスＩまたはＩＩサイトカイン受容体ドメイン、例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４へテロ二量体または多量体ポリペプチド等と組合せて含むＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドも挙げられる。
【０２１０】
組換えＺｃｙｔｏＲ１４タンパク質に対する、または天然源から単離されるＺｃｙｔｏＲ１４に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて調製され得る（例えばGreen et al., “Production of Polyclonal Antisera,” in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992)およびWilliams et al., “Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995)参照）。ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えば明礬（水酸化アルミニウム）またはフロイント完全または不完全アジュバントの使用により、増大され得る。免疫感作のために有用なポリペプチドとしては、融合ポリペプチド、例えばＺｃｙｔｏＲ１４またはその一部分と免疫グロブリンポリペプチドとの、またはマルトース結合タンパク質との融合体も挙げられる。ポリペプチド免疫原は、全長分子またはその一部分であり得る。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合、このような部分は、免疫感作のために高分子担体（例えばカギアナカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風トキソイド）と有益に接合または連結され得る。
【０２１１】
ポリクローナル抗体は典型的には動物、例えばウマ、ウシ、イヌ、鶏、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギまたはヒツジで産生されるが、しかし本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、類人種霊長類抗体由来でもあり得る。ヒヒ属において診断的および治療的に有用な抗体を産生するための一般的技法は、例えば国際特許公告WO 91/11465（Goldenberg等）およびLosman et al., Int. J. Cancer 46: 310 (1990)に見出され得る。
【０２１２】
あるいはモノクローナル抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体が生成され得る。特異的抗原に対する齧歯類モノクローナル抗体は、当業者に既知の方法により得られる（例えばKohler et al., Nature 256: 495 (1975)、Coligan et al., (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)[“Coligan”]、Picksley et al., “Priduction of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)参照）。
【０２１３】
要するに、ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子産物を含む組成物をマウスに注射し、血清試料を採取し、脾臓を取り出してＢ‐リンパ球を採取して、Ｂリンパ球を黒色腫細胞と融合してハイブリドーマを産生し、ハイブリドーマをクローニング氏、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、そしてハイブリドーマ培養から抗体を単離することにより抗体産生の存在を立証することにより、モノクローナル抗体が得られる。
【０２１４】
さらに、本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、ヒトモノクローナル抗体に由来する。ヒトモノクローナル抗体は、抗原攻撃誘発に応答して特異的ヒト抗体を産生するよう工学処理されたトランスジェニックマウスから得られる。この技法では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の素子は、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的化崩壊を含有する胚性幹細胞株由来のマウスの系統に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成し、そしてマウスは、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生するために用いられ得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えばGreen et al., Nature Genet. 7: 13 (1994)、Lonberg et al., Nature 368: 856 (1994)およびTaylor et al., Int. Immun. 6: 579 (1994)により記載されている。
【０２１５】
モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技法により、ハイブリドーマ培養から単離され、精製され得る。このような単離技法としては、プロテインＡセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる（例えばColigan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3；Baines et al., “Purification of Immunoglobulin G(IgG),” in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)参照）。
【０２１６】
特別な用途に関しては、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体の断片を調製するのが望ましい。このような抗体断片は、例えば抗体のタンパク質分解的加水分解により得られる。抗体断片は、慣用的方法により、全抗体のペプシンまたはパパイン消化により得られる。例証として、抗体断片は、ペプシンを用いた抗体の酵素的切断し、Ｆ（ａｂ’）2と呼ばれる５Ｓ断片を提供することにより、産生される。この断片は、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を産生するために、チオール還元剤を用いてさらに切断され得る。任意に、切断反応は、ジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基のために遮断基を用いて、実施され得る。代替物として、ペプシンを用いる酵素的切断は、2つの二価Ｆａｂ断片およびＦｃ断片を直接産生する。これらの方法は、例えば米国特許第4,331,647号（Goldenberg）、Nisonoff et al., Arch Biochem, Biophys. 89: 230 (1960)、Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959)、Edelman et al., in Methods in Enzymology Vol. 1, page 422 (Academic Press 1967)により、ならびにColigan at pages 2.8.1-2.8.10 and 2.10.-2.10.4により記載されている。
【０２１７】
断片が無傷抗体により認識される抗原と結合する限り、抗体を切断するその他の方法、例えば一価軽鎖断片を生成するための重鎖の単離、断片のさらなる切断、あるいはその他の酵素的、化学的または遺伝子的技法も用いられ得る。
【０２１８】
例えばＦｖ断片は、ＶHおよびＶL鎖の会合を含む。この会合は、Inbar et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 69: 2659 (1972)に記載されるように、非共有的であり得る。あるいは、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合により連結され得るし、またはグルタルアルデヒドのような化学物質により架橋され得る（例えばSandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992)参照）。
【０２１９】
Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーにより接続されるＶHおよびＶL鎖を含み得る。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドにより接続されるＶHおよびＶLドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製される。構造遺伝子は、発現ベクター中に挿入され、これはその後、宿主細胞、例えば大腸菌中に導入される。組換え宿主細胞は、2つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを用いて単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖの産生方法は、例えばWhitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97 (1991)（Bird et al., Science 242: 423 (1988)も参照）、米国特許第4,946,778号（Ladner等）、Pack et al., Bio/Technology 11: 1271 (1993)およびSandhu（上記）により記載されている。
【０２２０】
例証として、ｓｃＦｖは、in vivoでＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドにリンパ球を曝露し、そしてファージまたは類似のベクター中の抗体表示ライブラリーを選択する（例えば固定化または標識化ＺｃｙｔｏＲ１４タンパク質またはペプチドの使用により）ことにより得られる。潜在的ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ・ディスプレイ）上に、または細菌、例えば大腸菌上に表示される無作為ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法で、例えば無作為突然変異誘発および無作為ポリヌクレオチド合成により、得られる。これらの無作為ペプチド表示ライブラリーは、リガンドまたは受容体のようなタンパク質またはポリペプチド、生物学的または合成高分子、あるいは有機または無機物質であり得る既知の標的と相互作用するペプチドに関してスクリーニングするために用いられ得る。このような無作為ペプチド表示ライブラリーを作製し、スクリーニングするための技法は、当該技術分野で既知であり（米国特許第5,223,409号（Ladner等）、米国特許第4,946,778号（Ladner等）、米国特許第5,403,484号（Ladner等）、米国特許第5,571,698号（Ladner等）およびKay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996)）、そして無作為ペプチド表示ライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばCLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto,CA)、Invitrogen Inc. (San Diego, CA)、New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA)およびPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ)から入手可能である。無作為ペプチド表示ライブラリーは、本明細書中に開示されるＺｃｙｔｏＲ１４配列を用いてスクリーニングされて、ＺｃｙｔｏＲ１４と結合するタンパク質を同定し得る。
【０２２１】
抗体断片の別の形態は、単一相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、当該抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得られる。このような遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いることにより調製されて、抗体産生細胞のＲＮＡからの可変部を合成する（例えばLarrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991)、Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application、Ritter et al., (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995)およびWard et al., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)参照）。
【０２２２】
あるいは抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、「ヒト化」モノクローナル抗体に由来し得る。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖殻のマウス相補性決定領域をヒト可変ドメイン中に移入することにより産生される。次にヒト抗体の典型的残基は、ネズミ同等物のフレームワーク領域で置換される。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体構成成分の使用は、ネズミ定常部の免疫原性に関連した潜在的問題を未然に回避する。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的技法は、例えばOrlandi et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989)により記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を産生するための技法は、例えばJones et al., Nature 321: 522 (1986)、Carter et al., Pro. Nat‘l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992)、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992)、Singer et al., J. Immun. 150: 2844 (1993)、Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995)、Kelley, “Engineering Therapeutic Antibodies,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)により、および米国特許第5,693,762号（Qeen等）（1997）により記載されている。
【０２２３】
さらに、本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または抗体断片は、当該技術分野におけるそして本明細書中に記載される方法を用いて、ＰＥＧ化され得る。
【０２２４】
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、標準技法を用いて、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または抗体断片で動物を免疫感作することにより、調製され得る（例えばGreen et al., “Production of Polyclonal Antisera,” in Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), pages 1-12 (Humana Press 1992)参照）（Coligan at pages 2.4.1-2.4.7も参照）。あるいはモノクローナル抗イディオタイプ抗体は、上記の技法とともに、免疫原として抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または抗体断片を用いて調製され得る。別の代替物として、ヒト化抗イディオタイプ抗体または類人種霊長類抗イディオタイプ抗体が、上記の技法を用いて調製され得る。抗イディオタイプ抗体の産生方法は、例えば米国特許第5,208,146号（Irie）、米国特許第5,637,677号（Greene等）およびVarthakavi and Minocha, J. Gen. Virol. 77: 1875 (1996)により記載されている。
【０２２５】
抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は検出可能標識と接合されて、抗ＺｃｙｔｏＲ１４免疫複合体を形成し得る。適切な検出可能標識としては、例えば放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識またはコロイド金が挙げられる。このような検出可能的に標識された免疫複合体の作製および検出方法は当業者に周知であり、以下でさらに詳細に説明される。
【０２２６】
検出可能標識は、オートラジオグラフィーにより検出される放射性同位体であり得る。本発明の目的のために特に有用である同位体は、3Ｈ、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓおよび14Ｃである。
【０２２７】
抗ＺｃｙｔｏＲ１４免疫複合体は、蛍光化合物でも標識され得る。蛍光的標識化抗体の存在は、適正波長の光に免疫複合体を曝露して、その結果生じる蛍光を検出することにより確定される。蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ‐フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンが挙げられる。
【０２２８】
あるいは抗ＺｃｙｔｏＲ１４免疫複合体は、抗体構成成分を化学発光化合物とカップリングすることにより、検出可能的に標識され得る。化学発光標識化免疫複合体の存在は、化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することにより確定される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。
【０２２９】
同様に、生物発光化合物は、本発明の抗ＺｃｙｔｏＲ１４免疫複合体を標識するために用いられ得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大する生物学的系中で見出される化学発光の一型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより確定される。標識するために有用である生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。
【０２３０】
あるいは抗ＺｃｙｔｏＲ１４免疫複合体は、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体構成成分を酵素と連結することにより、検出可能的に標識され得る。抗ＺｃｙｔｏＲ１４‐酵素接合体が適切な基質の存在下でインキュベートされる場合、酵素部分は基質と反応して、化学物質部分を産生し、これは、例えば分光分析的、蛍光測光的または視覚的手段により、検出され得る。多特異的免疫複合体を検出可能的に標識するために用いられ得る酵素の例としては、β‐ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。
【０２３１】
当業者は、本発明に従って用いられ得るその他の適切な標識を理解する。マーカー部分と抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体との結合は、当該技術分野で既知の標準技法を用いて成し遂げられ得る。この点で典型的な方法は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70: 1 (1976)、Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81: 1 (1977)、Shih et al., Int’l J. Cancer 46: 1101 (1990)、Stein et al., Cancer Res. 50: 1330 (1990)およびColigan（上記）に記載されている。
【０２３２】
さらに、免疫化学的検出の便益および可変性は、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチンと接合された抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体を用いることにより、増強され得る（例えばWilchek et al., (eds.), “Avidin-Biotin Technology,” Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990)およびBayer et al., “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,” in Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), pages 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992)参照）。
【０２３３】
免疫学的検定の実施方法は、十分に確立されている（例えばCook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), pages 180-208, (Cambridge University Press, 1995)、Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch and Lennox (eds.), pages 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995)およびDiamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996)参照）。
【０２３４】
本発明は、ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子発現に関する免疫学的診断検定を実施するためのキットも意図する。このようなキットは、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または抗体断片を含む少なくとも1つの容器を包含する。キットは、ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または抗体断片の存在を示し得る1つまたは複数の試薬を含む第二容器も包含する。このような指標試薬の例としては、検出可能標識、例えば放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、コロイド金等が挙げられる。キットは、ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または抗体断片がＺｃｙｔｏＲ１４タンパク質を検出するために用いられる使用者への運搬のための一手段も包含し得る。例えば使用説明書は、同封された抗体または抗体断片がＺｃｙｔｏＲ１４を検出するために用いられ得る、ということを記述し得る。書かれた物質は、容器に直接適用され得るし、あるいは書かれた物質は包装挿入物の形態で提供され得る。
【０２３５】
Ｉ）ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方と結合するＺｃｙｔｏＲ１４を拮抗するための抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体の使用
本明細書中で有用な抗体を生成しまたは選択するための代替的技法としては、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体ポリペプチドまたはその断片、例えば抗原エピトープへのリンパ球の曝露、ならびにファージまたは類似のベクター中の抗体表示ライブラリーの選択（例えば固定化または標識化可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体ポリペプチドまたはその断片、例えば抗原エピトープの使用による）が挙げられる。潜在的結合ドメインを有するポリペプチド、例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体ポリペプチドまたはその断片、例えば抗原エピトープをコードする遺伝子は、ファージ（ファージディスプレイ）上に、または細菌、例えば大腸菌上に表示される無作為ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法で、例えば無作為突然変異誘発および無作為ポリヌクレオチド合成により、得られる。これらの無作為ペプチド表示ライブラリーは、リガンドまたは受容体のようなタンパク質またはポリペプチド、生物学的または合成高分子、あるいは有機または無機物質であり得る既知の標的と相互作用するペプチドに関してスクリーニングするために用いられ得る。このような無作為ペプチド表示ライブラリーを作製し、スクリーニングするための技法は、当該技術分野で既知であり（米国特許第5,223,409号（Ladner等）、米国特許第4,946,778号（Ladner等）、米国特許第5,403,484号（Ladner等）および米国特許第5,571,698号（Ladner等））、そして無作為ペプチド表示ライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばCLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto,CA)、Invitrogen Inc. (San Diego, CA)、New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA)およびPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ)から入手可能である。無作為ペプチド表示ライブラリーは、本明細書中に開示される可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体ポリペプチドまたはその断片、例えば抗原エピトープポリペプチド配列を用いてスクリーニングされて、ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体ポリペプチドと結合するタンパク質を同定し得る。可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体ポリペプチドと相互作用するこれらの「結合ポリペプチド」は、細胞をターゲッティングするために；アフィニティー精製により相同ポリペプチドを単離するために用いられ得る；それらは、薬剤、毒素、放射核種等と直接または間接的に接合され得る。これらの結合ポリペプチドは、分析的方法に、例えば発現ライブラリーをスクリーニングし、活性を中和するために、例えばＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆ（個別にまたは一緒に）およびＺｃｙｔｏＲ１４間の相互作用、あるいは受容体とのウイルス結合を、結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和するためにも用いられ得る。結合ポリペプチドは、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体ポリペプチド循環レベルを確定するための；根元的病態または疾患のマーカーとしての可溶性または非可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体を検出するかまたは定量するための診断検定にも用いられ得る。これらの結合ポリペプチドは、「アンタゴニスト」としても作用して、可溶性または膜結合ＺｃｙｔｏＲ１４単量体受容体あるいはＺｃｙｔｏＲ１４ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体ポリペプチ���結合（例えばリガンドとの）およびシグナル伝達を、in vitroおよびin vivoで、遮断するかまたは抑制し得る。さらにまたこれらの結合ポリペプチドは、抗ＺｃｙｔｏＲ１４単量体受容体または抗ＺｃｙｔｏＲ１４ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体ポリペプチドとして役立ち、そしてＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方の活性、ならびに受容体活性またはタンパク質結合を抑制するために有用である。本発明の天然受容体複合体に対して産生される抗体、ならびにＺｃｙｔｏＲ１４‐エピトープ結合抗体および抗ＺｃｙｔｏＲ１４中和モノクローナル抗体は、それらがＺｃｙｔｏＲ１４に対してより特異的に作用し得るし、そしてＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方を抑制し得るので、好ましい実施形態であり得る。さらに本発明の抗体の拮抗および結合活性は、それぞれＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆの存在下でのＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆ増殖、シグナルトラップ、ルシフェラーゼまたは結合検定で、そして本明細書中に記載されるＺｃｙｔｏＲ１４含有可溶性受容体およびその他の生物学的または生化学的検定で、検定され得る。
【０２３６】
可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体ポリペプチドに対する抗体（例えば配列番号３に対する抗体）またはその断片、例えば抗原エピトープは、in vivoでのＩＬ‐１７Ａ、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方の炎症作用を抑制するために、炎症および炎症性疾患、例えば乾癬、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ、内毒素血症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、結腸炎、喘息、同種異系移植片拒絶、免疫媒介性腎疾患、肝胆道疾患、多発性硬化症、アテローム硬化症、腫瘍増殖の促進または変形性関節疾患、ならびに本明細書中に開示されるその他の炎症性症状に対する治療的使用のために；ＺｃｙｔｏＲ１４受容体を発現する細胞を標識するために；アフィニティー精製により可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体ポリペプチドを単離するために；可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体ポリペプチドの循環レベルを確定するための診断的検定のために；根元的病態または疾患のマーカーとしての可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体を検出するかまたは定量するために；ＦＡＣＳを用いる分析方法に；発現ライブラリーをスクリーニングするために；ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａアゴニストとして作用し得る抗イディオタイプ抗体を生成するために；そしてＺｃｙｔｏＲ１４受容体機能を結合し、遮断し、抑制し、低減し、または拮抗するための、あるいはin vitroおよびin vivoでのＩＬ‐１７Ｆおよび／またはＩＬ‐１７Ａ活性（個別にまたは一緒に）を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和するための、中和抗体として、またはアンタゴニストとして、用いられ得る。適切な直接タグまたは標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、ビオチン、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子等が挙げられる；間接的タグまたは標識は、中間体としてのビオチン‐アビジンまたはその他の補体／抗補体対の使用を特徴づけ得る。本明細書中の抗体は、薬剤、毒素、放射性核種等と直接または間接的に接合され得るし、これらの接合体はin vivo診断または治療用とのために用いられる。さらに、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体ポリペプチドまたはその断片に対する抗体は、検定における、例えばウエスタンブロットまたは当該技術分野で既知のその他の検定における変性または非変性ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体ポリペプチドまたはその断片を検出するために、in vitroで用いられ得る。
【０２３７】
可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体、あるいは可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体受容体ポリペプチドに対する抗体は、対応する受容体を発現する細胞に標識をつけ、そしてそれらの発現レベルを検定するために、アフィニティー精製のために、受容体ポリペプチドの循環レベルを確定するための診断的検定内で、蛍光活性化細胞選別を用いる分析的方法のために有用である。さらに、二価抗体および抗イディオタイプ抗体は、ＺｃｙｔｏＲ１４リガンドＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａの作用を模倣するためのアゴニストとして用いられ得る。
【０２３８】
本明細書中の抗体はまた、薬剤、毒素、放射性核種等と直接または間接的に接合され得るし、そしてこれらの複合体はin vivo診断または治療用途のために用いられる。例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体または可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体受容体ポリペプチドを認識する抗体または結合ポリペプチドは、対応する抗相補的分子（即ちＺｃｙｔｏＲ１４含有可溶性または膜結合受容体）を発現する組織または器官を同定するかまたは治療するために用いられ得る。さらに特定的には、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体ポリペプチドあるいはその生物活性断片または一部に対する抗体は、検出可能または細胞傷害性分子と結合されて、ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体を発現する細胞、組織または器官、例えばＺｃｙｔｏＲ１４発現癌を有する哺乳類に送達され得る。
【０２３９】
適切な検出可能分子は、ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体ポリペプチドを結合するポリペプチド、例えば「結合ポリペプチド」（上記の結合ペプチドを含めて）、抗体、あるいはその生物活性断片または一部分と結合するポリペプチドと、直接または間接的に結合され得る。適切な検出可能分子としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子等が挙げられる。適切な細胞傷害性分子は、ポリペプチドまたは抗体に直接または間接的に結合され、そして例としては、細菌または植物毒素（例えば破傷風毒素、シュードモナス内毒素、リシン、アブリン等）、ならびに治療用放射性核種例えばヨウ素‐１３１、レニウム‐１８８またはイットリウム‐９０（ポリペプチドまたは抗体に直接結合されるか、あるいは例えばキレート部分の手段を介して間接的に結合される）が挙げられる。結合ポリペプチドまたは抗体はまた、細胞傷害性薬、例えばアドリアマイシンと接合され得る。検出可能または細胞傷害性分子の間接的結合に関しては、検出可能または細胞傷害性分子は、補体／抗補体対の一成員と接合され得るが、この場合、その他の成員は結合ポリペプチドまたは抗体部分と結合される。これらの目的のために、ビオチン／ストレプトアビジンは、例示的補体／抗補体対である。
【０２４０】
別の実施形態では、結合ポリペプチド‐毒素融合タンパク質または抗体‐毒素融合タンパク質、標的化細胞または組織抑制または切除のために（例えば癌細胞または組織を治療するために）用いられ得る。アル芭結合ポリペプチドが多機能性ドメイン（即ち活性化ドメインまたはリガンド結合ドメイン＋ターゲッティングドメイン）を有する場合、ターゲッティングドメインのみを含む融合タンパク質は、検出可能分子、細胞傷害性分子または補体分子を当該細胞または組織型に向けるために適切であり得る。単一ドメインのみを含む融合タンパク質が補体分子を含む場合には、抗補体分子は検出可能または細胞傷害性分子と接合され得る。したがってこのようなドメイン‐補体分子融合タンパク質は、総称的抗補体‐検出可能／細胞傷害性分子複合体の細胞／組織特異的送達のための総称的ターゲッティングビヒクルを表わす。
【０２４１】
別の実施形態では、ＺｃｙｔｏＲ１４結合ポリペプチド‐サイトカインまたは抗体‐サイトカイン融合タンパク質は、結合ポリペプチド‐サイトカインまたは抗ＺｃｙｔｏＲ１４受容体抗体が過増殖性細胞をターゲッティングする場合、標的組織（例えば脾臓、膵臓、血液、リンパ系、結腸および骨髄癌）のin vivo殺害を増強するために用いられ得る（一般的にHornick et al., Blood 89: 4437-47, 1997参照）。記載された融合タンパク質は、所望の作用部位へのサイトカインのターゲッティングを可能にし、それによりサイトカインの局所濃度上昇を提供する。適切な抗ＺｃｙｔｏＲ１４単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体抗体は、望ましくない細胞または組織（即ち腫瘍または白血病）を標的にして、融合サイトカインがエフェクター細胞による標的細胞溶解改善を媒介する。この目的のための適切なサイトカインとしては、例えばインターロイキン２および顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）が挙げられる。
【０２４２】
あるいは本明細書中に記載されるＺｃｙｔｏＲ１４受容体結合ポリペプチドまたは抗体融合タンパク質は、ＺｃｙｔｏＲ１４受容体調整アポトーシス経路を直接的に刺激して、ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体を発現する過増殖性細胞の細胞死を生じることにより、標的組織のin vivo殺害を増強するために用いられ得る。
【０２４３】
Ｊ）ＺｃｙｔｏＲ１４活性を有するポリペプチドまたはＺｃｙｔｏＲ１４に対する抗体の治療的使用
可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４活性を有するアミノ酸配列は、ＺｃｙｔｏＲ１４リガンドＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆ（単一でまたは一緒に）を結合し、したがってＺｃｙｔｏＲ１４リガンドと内因性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体との結合を阻止することにより、免疫系を調整するために用いられ得る。ＺｃｙｔｏＲ１４アンタゴニスト、例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体も、ＺｃｙｔｏＲ１４リガンドと内因性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体との結合を抑制することにより免疫系を調整するために用いられ得る。したがって本発明は、適量のこのポリペプチドを欠くか、または過剰のＺｃｙｔｏＲ１４リガンドを産生する被験者に対する、ＺｃｙｔｏＲ１４活性を有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド（例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド断片、ＺｃｙｔｏＲ１４類似体（例えば抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗イディオタイプ抗体）、およびＺｃｙｔｏＲ１４融合タンパク質）の使用を包含する。ＺｃｙｔｏＲ１４アンタゴニスト（例えば抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体）も、過剰のＺｃｙｔｏＲ１４リガンドまたはＺｃｙｔｏＲ１４を産生する被験者を治療するために用いられ得る。適切な被験者としては、哺乳類、例えばヒトが挙げられる。例えばこのようなＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドおよび抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、炎症ならびに炎症性疾患、例えば乾癬、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ、内毒素血症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、結腸炎、喘息、同種異系移植片拒絶、免疫媒介性腎疾患、肝胆道疾患、多発性硬化症、アテローム硬化症、腫瘍増殖の促進または変形性関節疾患、ならびに本明細書中に開示されるその他の炎症性症状の治療において、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆ（単独でまたは一緒に）を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗し、または中和するのに有用である。
【０２４４】
好ましい実施形態内では、可溶性受容体形態のＺｃｙｔｏＲ１４（配列番号３）は、in vivoでＩＬ‐１７ＦおよびＩＬ‐１７Ａ（個別にまたは一緒に）を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗し、または中和する単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体である。このようなＺｃｙｔｏＲ１４単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体に対する抗体および結合ポリペプチドも、本明細書中に記載されるように、ＺｃｙｔｏＲ１４活性のアンタゴニストとして、そしてＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆアンタゴニスト（単一でまたは一緒に）として役立つ。
【０２４５】
さらに、ポリクローナルおよびモノクローナル中和抗ＩＬ‐１７Ｆ抗体はともに、細胞ベースの中和検定において、ＩＬ‐１７ＦおよびＩＬ‐１７Ａ活性を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗し、または中和する、とわれわれは本明細書中で記載した。ＺｃｙｔｏＲ１４  ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの組織分布の分析は、ｍＲＮＡ  ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子は、甲状腺、副腎、前立腺および肝臓組織中で強く発現され、そして心臓、小腸、胃および気管組織中でより低い程度に発現される、ということを示した。特にＺｃｙｔｏＲ１４は、非Ｔ細胞末梢血細胞系、例えば単球、Ｂ細胞、および骨髄系統の細胞中で一貫して発現される。さらにまた、ＺｃｙｔｏＲ１４  ｍＲＮＡは、皮膚由来の細胞株中で確実に発現される。ＺｃｙｔｏＲ１４を発現するその他の細胞株は、アレイ上に存在した全部で5つの大腸細胞株である。逆に、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、結腸、末梢血白血球、脊髄、リンパ節および骨髄中での発現はほとんどまたは全く認められなかった。ＺｃｙｔｏＲ１４が結合するリガンド（ＩＬ‐１７Ｆおよび／またはＩＬ‐１７Ａ）は、炎症応答の誘導に関連し、炎症性媒介物質、例えばＩＬ‐１ｂ、ＩＬ‐６およびＴＮＦ‐ａ、ならびに好中球野増殖、成熟および走化性に関与する媒介物質の産生を増強するその能力を主に介して、炎症性疾患に関与する（Witowski et al., Cell. Mol. Life Sci. 61: 567-579 [2004]で再検討）。
【０２４６】
したがって本発明の特定の実施形態は、炎症性および免疫疾患または症状、例えば乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚症状、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、憩室症、喘息、膵炎、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）、膵臓癌、膵炎、グレーブス病、結腸および腸管癌、自己免疫疾患、敗血症、臓器および骨髄移植辺；内毒素血症による炎症、外傷、外科手術または感染；アミロイドーシス；巨脾腫；移植片対宿主疾患；ならびに炎症の抑制、免疫抑制、造血性、免疫、炎症性またはリンパ系細胞、マクロファージ、Ｔ細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を含む）の増殖の低減、病原体または抗原に対する免疫応答の抑制の場合、あるいはＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａサイトカインの抑制が望ましいその他の場合におけるアンタゴニストとしての可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４および抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体の使用に向けられる。
【０２４７】
さらに、本明細書中に記載されるＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドと結合する抗体または結合ポリペプチド、およびＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドそれ自体は、以下のために有用である：
１）急性炎症、外傷、組織損傷、外科手術、敗血症または感染の結果としての炎症、ならびに慢性炎症性疾患、例えば喘息、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、慢性結腸炎、巨脾腫、慢性関節リウマチ、再発性急性炎症性症状出現（例えば結核）の治療、ならびにアミロイドーシスおよびアテローム硬化症、キャッスルマン病、喘息および急性応答の誘導に関連したその他の疾患の治療におけるＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆ受容体を介したシグナル伝達を遮断し、抑制し、低減し、拮抗し、または中和するために。
【０２４８】
２）ＺｃｙｔｏＲ１４を介して免疫細胞（例えばリンパ球、単球、白血球）におけるシグナル伝達を阻止するかまたは抑制するために、自己免疫疾患、例えばＩＤＤＭ、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、慢性関節リウマチおよびＩＢＤの治療におけるＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆ受容体を介したシグナル伝達を遮断し、抑制し、低減し、拮抗し、または中和するために。あるいは、ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体に対する抗体、例えばモノクローナル抗体（ＭＡｂ）も、自己免疫疾患を治療するために望ましくない免疫細胞を枯渇させるためのアンタゴニストとして用いられ得る。喘息、アレルギーおよびその他のアトピー性疾患は、例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体に対するＭＡｂで治療されて、免疫応答を抑制するか、または障害細胞を枯渇し得る。本発明のポリペプチドおよび抗体を用いるＺｃｙｔｏＲ１４を介したシグナル伝達の遮断、抑制、低減または拮抗も、膵臓、腎臓、下垂体およびニューロン細胞の疾患に有益であり得る。ＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、膵炎および膵臓癌に有益であり得る。ＺｃｙｔｏＲ１４は、拮抗性ＭＡｂが癌増殖を抑制し、免疫媒介性殺害を標的かする癌のＭＡｂ両方のための標的として役立ち得る（Hollinger P, and Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998）。可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４に対するＭａｂは、腎症、例えば糸球体硬化症、膜性腎症、アミロイドーシス（他の組織の中でも腎臓に影響を及ぼす）、腎性アテローム硬化症、種々の起源の糸球体腎炎、腎臓の繊維増殖性疾患、ならびにＳＬＥ、ＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、腎腫瘍およびその他の疾患に関連した腎不全を治療するためにも有用であり得る。
【０２４９】
３）ＩＤＤＭ、ＭＳ、ＳＬＥ、重症筋無力症、慢性関節リウマチおよびＩＢＤのような自己免疫疾患の治療におけるＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆ受容体によるシグナル伝達の作動、増強、増大または開始。抗ＺｃｙｔｏＲ１４中和およびモノクローナル抗体は、分化し、増殖を変更し、あるいは自己免疫性を改善するサイトカインまたは細胞表面タンパク質の産生を変えるよう、リンパ球またはその他の免疫細胞に信号を送り得る。特定的には、サイトカイン分泌の代替パターンに対するＴ‐ヘルパー細胞応答の調整は、疾患を改善するよう自己免疫応答を偏向し得る（Smith JA et al., J. Immunol. 160: 4841-4849, 1998）。同様に、作動性抗可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体および多量体モノクローナル抗体は、喘息、アレルギーおよびアトピー性疾患に関与する免疫細胞をシグナル伝達し、枯渇させ、そして偏向させるために用いられ得る。ＺｃｙｔｏＲ１４によるシグナル伝達も、膵臓、腎臓、下垂体およびニューロン細胞の疾患に有益であり得る。ＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、膵炎および膵臓癌にも有益である。ＺｃｙｔｏＲ１４は、シグナリングＭＡｂが癌増殖を抑制し、そして免疫媒介性殺害を標的かする膵臓癌のＭＡｂ療法のための標的として役立ち得る（Tutt, AL et al., J Immunol. 161: 3175-3185, 1998）。同様に、腎細胞癌は、本発明のＺｃｙｔｏＲ１４含有可溶性受容体に対するモノクローナル抗体を用いて治療され得る。
【０２５０】
本明細書中に記載される可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドは、上記のように自己免疫疾患、アトピー性疾患、ＮＩＤＤＭ、膵炎および腎不全の治療において、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａ活性を、単一でまたは一緒に、結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗し、または中和するために用いられ得る。可溶性形態のＺｃｙｔｏＲ１４は、Ｔｈ細胞により媒介される抗体応答を促進するためにおよび／またはリンパ球またはその他の免疫細胞によるＩＬ‐４またはその他のサイトカインの産生を促進するために用いられ得る。
【０２５１】
本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有受容体は、ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆのアンタゴニストとして有用である。このようなアンタゴニストは、ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆの直接的中和または結合により達成され得る。アンタゴニスト的使用のほかに、本発明の可溶性受容体は、ＩＬ‐１７Ｆと結合して、身体内の異なる組織、器官および細胞にリガンドを輸送するために、ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆサイトカインのための担体タンパク質として作用する。このようなものとして、本発明の可溶性受容体は、可溶性受容体‐リガンド複合体を特定部位、例えば組織、特定免疫細胞または腫瘍に向ける分子、ポリペプチドまたは化学物質部分と融合または結合され得る。例えば急性感染またはいくつかの癌においては、利益は、ＩＬ‐１７Ｆの作用による炎症および局所急性期応答タンパク質の誘導に起因し得る（Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993；およびFernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9: 497-53, 2000参照）。
【０２５２】
さらに、本発明の可溶性受容体は、分解またはクリアランスからリガンドを安定化することにより、あるいは身体内の作用部位にリガンドを標的化することにより、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａを安定化し、生物学的利用能、治療寿命および／またはリガンドの効力を増大するために用いられ得る。例えば天然ＩＬ‐６／可溶製ＩＬ‐６Ｒ複合体はＩＬ‐６を安定化し、そしてｇｐ１３０受容体を介してシグナル伝達し得る（Cosman, D.（上記）およびFernandez-Botran, R.（上記）参照）。さらに、ＺｃｙｔｏＲ１４はコグネイトリガンド、例えばＩＬ‐１７Ｆと組合されて、リガンド／可溶性受容体複合体を構成し得る。このような複合体は、例えばｐＤＩＲＳ１（ＩＬ‐１７ＡＲＢ）またはＣＲＦ２‐４（ＩＬ‐１０ＲＢ）のようなコンパニオン受容体サブユニットを提示する細胞からの応答を刺激するために用いられ得る。ＺｃｙｔｏＲ１４／リガンド複合体の細胞特異性は、投与されるリガンド単独に関して観察されるものとは異なる。さらに、複合体は、別個の薬物動態特性、例えば半減期に及ぼす作用、用量／応答、ならびに器官または組織特異性を有し得る。したがってＺｃｙｔｏＲ１４／ＩＬ‐１７ＦまたはＺｃｙｔｏＲ１４／ＩＬ‐１７Ａ複合体は、アゴニスト活性を有して、免疫応答を増強し、あるいはメサンギウム細胞を刺激し、あるいは肝細胞を刺激し得る。あるいは複合体とヘテロ二量体化するシグナル伝達サブユニットを発現する組織のみが、ＩＬ‐６／ＩＬ‐６Ｒ複合体に対する応答と同様に影響を及ぼされ得る（Hirota H. et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. 92: 4862-4866, 1995; Hirano, T. in Thomason, A. (Ed.) “The Cytokine Handbook”, 3rd Ed., p. 208-209）。ＩＬ‐１２およびＣＮＴＦに関する可溶性受容体／サイトカイン複合体は、類似の活性を表示する。
【０２５３】
さらに、炎症は、侵襲作因を寄せ付けないための生物体による防御的応答である。炎症は、多数の細胞性および体液性媒介物質を包含するカスケード事象である。一方、炎症性応答の抑制は、宿主免疫無防備状態のままである。しかしながら検査されないままである場合、炎症は重篤な合併症、例えば慢性炎症性疾患（例えば乾癬、関節炎、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患等）、敗血症性ショックおよび多臓器不全を引き起こし得る。重要なことには、これら多様な疾患状態は、共通の炎症性媒介物質を共有する。炎症により特性化される集合的疾患は、ヒトの罹患率および死亡率に及ぼす大きな衝撃を有する。したがって、抗炎症性タンパク質、例えばＺｃｙｔｏＲ１４および抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体が、喘息およびアレルギーから自己免疫および敗血症性ショックまでの、膨大な数のヒトおよび動物疾患に関する極めて重大な治療的可能性を有する、ということは明らかである。
【０２５４】
１．関節炎
関節炎、例えば骨関節炎、慢性関節リウマチ、損傷の結果としての関節炎関節等は、一般的炎症性症状であり、これらは、抗炎症性タンパク質、例えば本発明のＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドの治療的使用により利益を得る。例えば慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、全身に影響を及ぼす全身性疾患であり、そして関節炎の最も一般的な形態の1つである。それは、関節を裏打ちする膜の炎症により特性かされ、これが、疼痛、硬直、温熱、発赤および腫脹を引き起こす。炎症細胞は、骨および軟骨を消化し得る酵素を放出する。慢性関節リウマチの結果として、関節の内張りすなわち滑膜の炎症が骨および軟骨を侵襲しそして損傷して、他の生理学的作用の中でも関節悪化および重症疼痛をもたらす。罹患関節はその形状および整列を失って、疼痛および運動損失を生じる。
【０２５５】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、炎症とその後の組織損傷により特定的に特性化され、重症運動障害および死亡率増大をもたらす免疫媒介性疾患である。種々のサイトカインが、リウマチ様関節中で局所的に産生される。2つの原型前炎症性サイトカインＩＬ‐１およびＴＮＦ‐αが、滑膜炎症にならびに新構成関節破壊に関与するメカニズムにおいて重要な役割を演じる、ということを多数の研究が実証している。事実、ＲＡ患者におけるＴＮＦ‐αおよびＩＬ‐１阻害薬の投与は、炎症の臨床的および生物学的兆候の劇的改善、ならびに骨侵食および軟骨破壊の放射線学的兆候の低減をもたらした。しかしながら、これらの勇気付けられる結果にもかかわらず、有意パーセンテージの患者がこれらの作用物質に対して応答せず、このことは、他の媒介物質も関節炎の病理生理学に関与することを示唆する（Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135-149, 2002）。それらの媒介物質のうちの1つはＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆである可能性があり、このようなものとして、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａ活性を結合するかまたは抑制する分子、例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドまたは抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体あるいは結合相手は、慢性関節リウマチおよびその他の関節疾患における炎症を低減するための有益な治療薬として役立ち得る。
【０２５６】
当該技術分野で既知の慢性関節リウマチに関するいくつかの動物モデルが存在する。例えばコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルでは、マウスは、ヒト慢性関節リウマチと非常に良く似た慢性炎症性関節炎を発症する。ＣＩＡはＲＡと類似の免疫学的および病理学的特徴を共有するため、これがそれを潜在的ヒト抗炎症化合物をスクリーニングするための理想的モデルにする。ＣＩＡモデルは、起こる順に、免疫応答および炎症性応答の両方によっているマウスにおける周知のモデルである。免疫応答は、抗原として投与されるコラーゲンに対する応答におけるＢ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の相互作用を包含し、そして抗コラーゲン抗体の産生をもたらす。炎症期は、マウスのネイティブコラーゲンと交差反応し、補体カスケードを活性化するこれらの抗体のいくつかの結果としての、炎症の媒介物質からの組織応答の結果である。ＣＩＡモデルの使用における利点は、病因の基本メカニズムが既知であるという点である。ＩＩ型コラーゲン上の関連Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープが同定されており、そして免疫媒介性関節炎に関する種々の免疫学的（例えば遅延型過敏症および抗コラーゲン抗体）および炎症的（例えばサイトカイン、ケモカインおよびマトリックス分解酵素）パラメーターが確定されており、したがってＣＩＡモデルにおける試験化合物効力を査定するために用いられ得る（Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3: 407-20, 1999；Williams et al., Immunol. 89: 9784-788, 1992；Myers et al., Life Sci. 61: 1861-78, 1997；およびWang et al., Immunol. 92: 8955-959, 1995）。
【０２５７】
一群は、抗マウスＩＬ‐１７抗体が対照と比較してマウスＣＩＡモデルにおける症候を低減する、ということを示し、したがって可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃがヒト疾患を治療するのに有益であり得る、ということを概念的に示している。単一マウスＩＬ‐１７特異的ラット抗血清の投与は、予防的に、または関節炎の症候がモデルにすでに存在した後に導入された場合、動物における関節炎の症候を低減した（Lubberts et al., Arthritis Rheum. 50: 650-9, 2004）。したがってＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃは、特定ヒト疾患、例えば関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、内毒素血症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、結腸炎および本明細書中に開示されたその他の炎症性症状の治療において、ＩＬ‐１７Ａおよび／またはＩＬ‐１７Ｆを中和するために用いられ得る。
【０２５８】
これらのＣＩＡモデルマウスへの、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有ポリペプチド（ＺｃｙｔｏＲ１４）、例えばＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃ４またはその他のＺｃｙｔｏＲ１４可溶性および融合タンパク質の投与は、症候を改善し、疾患経過を変更するために用いられるＩＬ‐１７Ｆに対するアンタゴニストとしての可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４の使用を評価するために用いられ得る。さらに、ＺｃｙｔｏＲ１４によるＩＬ‐１７Ｆの抑制を示す結果は、他のＩＬ‐１７Ｆアンタゴニスト、例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４またはそれに対する中和抗体も、症候を改善し、疾患の経過を変更するために用いられ得る、という概念の証拠を提供する。さらに、ＩＬ‐１７Ａおよび／またはＩＬ‐１７ＦはＩＬ‐１ｂおよびＴＮＦ‐ａ（これらはともに慢性関節リウマチの病因および進行に関連する）の産生を誘導するため、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有ポリペプチド、例えばＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃ４またはその他のＩＬ‐１７Ｆ可溶性受容体（例えばＺｃｙｔｏＲ１４；配列番号３）および抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体、ならびに融合タンパク質の全身または局所投与は、ＲＡにおける炎症性応答を潜在的に抑制し得る。例（非限定的）として、10〜200 ugのＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃ／マウスの注射（s.c.、i.p.またはi.m.投与経路により4週間まで（これに限定されない）、週1〜7回）は、疾患スコア（脚スコア、炎症または疾患の発生事象）を有意に低減し得る。ＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃ投与の開始（例えばコラーゲン免疫感作前または感作時、あるいは二次コラーゲン免疫感作後の任意の時点、例えば疾患がすでに進行している時点）によって、ＺｃｙｔｏＲ１４は慢性関節リウマチの防止に、ならびにその進行の防止に効果的であり得る。その他の考え得る治療薬としては、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体あるいは抗ＩＬ‐１７Ｆ抗体または結合相手等が挙げられる。
【０２５９】
２．内毒素血症
内毒素血症は、一般に感染性作因、例えば細菌およびその他の感染性疾患作因、敗血症、毒性ショック症候に起因する、あるいは日和見感染を蒙った免疫無防備状態患者等における重症症状である。抗炎症性タンパク質、例えば本発明のＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドおよび抗体の治療的有用性は、ヒトおよび動物における内毒素血症を予防し、治療するのに役立つ。ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドまたは抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または結合相手は、内毒素血症における炎症および病理学的作用を低減するための有益な治療薬として役立ち得る。
【０２６０】
リポポリサッカリド（ＬＰＳ）誘導性内毒素血症は、感染性疾患における病理学的作用を生じる多数の前炎症媒介物質の多くに携わっており、齧歯類におけるＬＰＳ誘導性内毒素血症は、潜在的前炎症および免疫調節剤の薬理学的作用を研究するための広範に用いられそして許容可能なモデルである。グラム陰性細菌中で産生されるＬＰＳは、敗血症性ショックの病因における主要原因作因である（Glausner et al., Lancet 338: 732, 1991）。ショック様状態は、実際、動物へのＬＰＳの1回注射により実験的に誘導され得る。ＬＰＳに応答する細胞により産生される分子は、直接または間接的に病原体を標的化し得る。これらの生物学的応答は、侵襲病原体に対して宿主を防御するが、しかしそれらは害も引き起こし得る。したがって重症グラム陰性細菌感染の結果として生じる生得免疫の大刺激は、サイトカインおよびその他の分子の過剰産生、ならびに致命的症候、敗血症性ショック症候（発熱、高血圧、散在性血管内凝固および多臓器不全により特性化される）の発症をもたらす（Dumitru et al., Cell 103: 1071-1083, 2000）。
【０２６１】
ＬＰＳのこれらの毒性作用はほとんど、マクロファージ活性化に関連して、多炎症性媒介物質の放出をもたらす。これらの媒介物質の中で、ＴＮＦは、中和抗ＴＮＦ抗体の投与によるＬＰＳ毒性の防止により示されるように、重要な役割を演じると思われる（Beutler et al., Science 229: 869, 1985）。Ｃ５７Ｂ１／６マウスへの大腸菌ＬＰＳの1 ug注射は、注射後2時間で、循環ＩＬ‐６、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１および急性期タンパク質（例えばＳＡＡ）における有意の増大を生じる、ということが十分に確立されている。これらの媒介物質に対する受動免疫感作は死亡率低減を生じ得るので、ＬＰＳの毒性はこれらのサイトカインにより媒介されると思われる（Beutler et al., Science 229: 869, 1985）。敗血症性ショックの予防および／または治療のための考え得る免疫介入戦略としては、抗ＴＮＦ  ｍＡｂ、ＩＬ‐１受容体アンタゴニスト、ＬＩＦ、ＩＬ‐１０およびＧＣＳＦが挙げられる。
【０２６２】
これらのＬＰＳ誘導性モデルへの可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有ペプチド、例えばＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃ４またはその他のＺｃｙｔｏＲ１４可溶性および融合タンパク質の投与は、ＬＰＳ誘導性疾患の症候を改善し、経過を変更するためのＺｃｙｔｏＲ１４の使用を評価するために用いられ得る。さらに、ＺｃｙｔｏＲ１４によるＩＬ‐１の抑制を示す結果は、他のＩＬ‐１７Ｆアンタゴニスト、例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４またはそれに対する中和抗体も、ＬＰＳ誘導性モデルにおける症候を改善し、疾患の経過を変更するために用いられ得る、という概念の証拠を提供する。モデルは、ＬＰＳ注射によるＩＬ‐１７Ｆの誘導、ならびにＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドによる疾患の潜在的治療を示す。ＬＰＳは、内毒素血症の病態におそらくは関与する前炎症因子の産生を誘導するため、アンタゴニストＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドによるＩＬ‐１７Ｆ活性またはその他の前炎症因子の中和が、内毒素性ショックで観察されるのと同様に、内毒素血症の症候を低減するために用いられ得る。その他の考え得る治療薬としては、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または結合相手等が挙げられる。
【０２６３】
３．炎症性腸疾患ＩＢＤ
米国では、約500,000人もの人々が、結腸および直腸（潰瘍性結腸炎）またはその両方、小腸および大腸（クローン病）に影響を及ぼし得る炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患する。これらの疾患の病因は不明であるが、しかしそれらは罹患組織の慢性炎症を包含する。ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または結合相手は、ＩＢＤおよび関連疾患における炎症および病理学的作用を低減するための有益な治療薬として役立ち得る。
【０２６４】
潰瘍性結腸炎（ＵＣ）は、結腸の粘膜または最も内側の裏打ち層の炎症および潰瘍により特性化される一般に結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患である。この炎症は、しばしば結腸を空にさせて、下痢を引き起こす。症候としては、糞便の軟化、および関連腹部痙攣、発熱および体重損失が挙げられる。ＵＣの正確な原因は不明であるが、しかし近年の研究は、身体が異物であると考える身体内のタンパク質に対して身体の自然の防御が働いている（「自己免疫反応」）、と示唆している。おそらく、それらが腸中の細菌タンパク質に似ているため、これらのタンパク質は、結腸の内層を破壊し始める炎症プロセスを扇動するかまたは刺激し得る。結腸の内層が破壊されると、潰瘍が生じて、粘液、膿および血液を放出する。疾患は通常は直腸領域で開始し、そして最終的には全大腸全体に拡大する。炎症が反復して起きると、瘢痕組織を伴って腸および直腸の壁の肥厚を生じる。結腸組織の死または敗血症が、重症疾患に伴って起こり得る。潰瘍性結腸炎の症候は重症度が種々であり、それらの開始は漸進的または突発的であり得る。発作は、多数の因子、例えば呼吸器感染またはストレスにより惹起され得る。
【０２６５】
ＵＣに関する治癒法は一般に利用可能でないが、しかし治療は、結腸内層における腹腔炎症プロセスの抑制に集中される。コルチコステロイド免疫抑制剤（例えばアザチオプリン、メルカプトプリンおよびメトトレキセート）ならびにアミノサリチレートを含めた治療は、疾患を治療するために利用可能である。しかしながら免疫抑制剤、例えばコルチコステロイドおよびアザチオプリンの長期使用は、種々の副作用、例えば骨細り、白内障、感染、ならびに肝臓および骨髄作用を生じ得る。最新療法が上手くいかない患者では、手術が一選択肢である。手術は、全結腸および直腸摘出を包含する。
【０２６６】
慢性潰瘍性結腸炎を部分的に模倣し得るいくつかの動物モデルが存在する。最も広範に用いられるモデルは、２，４，６‐トリニトロベンスルホン酸／エタノール（ＴＮＢＳ）誘導性結腸炎モデルであり、これは、結腸における慢性炎症および潰瘍を誘導する。ＴＮＢＳが直腸内滴注により感受性マウスの結腸中に導入されると、それは、結腸粘膜におけるＴ細胞媒介性免疫応答を誘導し、この場合、大腸の全壁を通してのＴ細胞およびマクロファージの高密度浸潤により特性化される大粘膜炎症をもたらす。この組織病理学的所見は、漸進的体重損失（衰弱）、血便、脱肛および大腸壁肥厚という臨床像により成し遂げられる（Neurath et al., Intern. Rev. Immunol. 19: 51-62, 2000）。
【０２６７】
別の結腸炎モデルはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を用いるが、これは、血便、体重損失、結腸の短縮および好中球浸潤を伴う粘膜潰瘍により症状発現される急性結腸炎を誘導する。ＤＳＳ誘導性結腸炎は、リンパ系過形成、病巣性陰窩損傷および上皮潰瘍を伴う固有層中への炎症細胞の浸潤により組織学的に特性化される。これらの変化は、上皮に及ぼすＤＳＳの毒性作用のため、そして固有層細胞の食作用ならびにＴＮＦ‐αおよびＩＦＮ‐γの産生により、発生すると考えられる。その一般的使用にもかかわらず、ヒト疾患との関連性についてのＤＳＳのメカニズムに関するいくつかの問題は依然として未解決のままである。ＤＳＳは、それがＴ細胞欠乏動物、例えばＳＣＩＤマウスにおいて観察されるため、Ｔ細胞非依存性モデルとみなされる。
【０２６８】
これらのＴＮＢＳまたはＤＳＳモデルへの、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４含有ポリペプチド、例えばＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃ４またはその他のＺｃｙｔｏＲ１４可溶性および融合タンパク質の投与は、症候を改善し、消化器疾患の経過を変更するための可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４の使用を評価するために用いられ得る。さらに、ＺｃｙｔｏＲ１４によるＩＬ‐１７Ｆの抑制を示す結果は、その他のＩＬ‐１７Ｆアンタゴニスト、例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４またはそれに対する抗体が結腸炎／ＩＢＤモデルにおける症候を改善し、そして疾患の経過を変更するためにも用いられ得る、という概念の証拠を提供する。
【０２６９】
４．乾癬
乾癬は、700万人を超えるアメリカ人に影響を及ぼす慢性皮膚症状である。乾癬は、新しい皮膚細胞が異常に増殖して、皮膚の炎症化、腫脹化および落屑性パッチを生じる場合に起こり、この場合、古い皮膚は迅速に十分にはがれ落ちない。最も一般的な形態であるプラーク乾癬は、銀白色鱗屑を載せた皮膚の炎症化パッチ（「病変」）により特性化される。乾癬は、2〜3のプラークに限定されるか、または皮膚の中等度〜広範囲の面積を包含して、最も一般的には頭皮、膝、肘および胴体上に出現する。それは高度に可視的であるが、しかし乾癬は接触感染性疾患ではない。当該疾患の病因は、罹患組織の慢性炎症を包含する。ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または結合相手は、感染、その他の炎症性皮膚疾患、皮膚および粘膜アレルギー、ならびに関連疾患における炎症および病理学的作用を低減するための有益な治療薬として役立ち得る。
【０２７０】
乾癬は、かなりの不快を引き起こし得る皮膚のＴ細胞媒介性炎症性障害である。それは、治療法がなく、そしてすべての年齢の人々に影響を及ぼす疾患である。乾癬は、欧州および北米の集団の約2％に影響を及ぼす。軽症乾癬を有する個体はしばしば局所作用物質でそれらの疾患を制御し得るが、しかし世界中の100万人より多い患者が、紫外線または全身免疫抑制療法を要する。残念ながら、紫外線照射の不便性および危険性ならびに多数の療法の毒性は、それらの長期使用を制限する。さらに、患者は通常は乾癬の再発を有し、そしていくつかの場合、免疫抑制療法の停止直後にリバウンドを示す。
【０２７１】
ＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体ポリペプチドおよびそれに対する抗体は、ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａリガンドの循環レベルの検出のための診断系内で、そして急性期炎症応答に関連したＩＬ‐１７Ｆの検出にも用いられ得る。関連実施形態内では、本発明のＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体と特異的に結合する抗体またはその他の作用物質は、循環受容体ポリペプチドを検出するために用いられ得る；逆に、ＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体それ自体は、循環性または局所的作用性ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａポリペプチドを検出するために用いられ得る。リガンドまたは受容体ポリペプチドのレベルの上昇または低下は、炎症または癌を含めた病理学的症状を示し得る。ＩＬ‐１７Ｆは、関連急性期炎症応答を誘導することが既知である。さらに、急性期タンパク質または分子、例えばＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆの検出は、ある種の疾患状態（例えば喘息、乾癬、慢性関節リウマチ、結腸炎、ＩＢＤ）における慢性炎症症状を示し得る。このような症状の検出は、疾患診断を助成し、ならびに適正療法を選択するに際して医者を手助けするのに役立つ。
【０２７２】
可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４の子宮内投与は、ＩＬ‐１７Ｆを過剰発現するＩＬ‐１７Ｆトランスジェニック仔、あるいはＩＬ‐１７Ａを過剰発現するＩＬ‐１７Ａトランスジェニック仔に関連した表現型を低減するかまたは排除することにより、疾患モデルにおけるin vivoでの効力を示すために用いられ得る。中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のようなアンタゴニストを用いた子宮内治療に関して当該技術分野における先例がある。ある場合には、Ｂ細胞のＢ‐１サブセットの発生は、Ｂ細胞特異的分子、ＣＤ１９に特異的なｍＡｂを用いて妊娠雌マウスを治療することにより、劇的に影響を及ぼされた（例えばKrop I. Et al., Eur. J. Immunol. 26 (1): 238-42, 1996）。Krop等は、妊娠9日目に開始して、ＰＢＳ中の500 ugのラット抗マウスＣＤ１９  ｍＡｂ（またはラットアイソタイプ整合対照Ａｂ）を妊娠マウスの腹腔内に時限注射し、その後、誕生まで、1日おきに注射した。仔は、10日齢で、これらの抗体500 ugを1回注射された。別の場合、Tanaka等は、ＩＬ‐２受容体β鎖に対するモノクローナル抗体による子宮内治療は、Ｔｈｙ‐１＋樹状上皮細胞の発達を完全に阻止する、ということを見出した。ＩＬ‐２受容体の2つの別個のサブユニット、即ちα鎖（ＩＬ‐２Ｒ  α）およびβ鎖（ＩＬ‐２Ｒ  β）は、胎仔胸腺個体発生を通してほぼ相互排除様式で発現される。ＩＬ‐２Ｒ  βへの中和ｍＡｂの投与による、ＩＬ‐２Ｒのシグナル伝達構成成分であるＩＬ‐２Ｒ  βの遮断は、Ｔｈｙ‐１＋皮膚樹状上皮細胞の完全且つ選択的消失を生じた。任意のその他のＴ細胞サブセットの発生は、非日和見的であった。これは、ＩＬ‐２が胎仔Ｖγ５＋細胞およびそれらの子孫の発生において重要な役割を演じる、ということを示した（Tanaka T. et al., Int. Immunol. 4(4): 487-9, 1992参照）。さらに、Schattemann等は、ＰＤＧＦ‐Ａが、子宮内系を用いた正常ネズミ心臓血管発生のために必要とされる、ということを示した。証拠のいくつかの系列は、血小板由来成長因子Ａ鎖（ＰＤＧＦ‐Ａ）が正常胚性心臓血管発生のために必要とされる、ということを示唆する。子宮内でのマウス脱落膜中への抗ＰＤＧＦ‐Ａ中和抗体の導入は、18〜24時間の期間のin vivoでのＰＤＧＦ‐Ａリガンド‐受容体相互作用の選択的崩壊を商事、そしてＰＤＧＦ‐Ａ画心臓血管発生のために必要とされるか否か、そしてそれが必要とされるのはいつかの査定を可能にした（Schattemann GC et al., Dev. Biol. 176 (1): 133-42, 1996参照）。これらの結果、ならびに当該技術分野で記載される他のものは、アンタゴニスト、例えば中和ｍＡｂまたは可溶性受容体が子宮内で強力な作用を引き出し得る、という証拠を提供する。同様に、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆをそれぞれ過剰発現するＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆトランスジェニック仔で見出される皮膚表現型を低減するかまたは排除するための疾患モデルにおけるin vivoでのモノクローナル抗体を用いた可溶性受容体および／または中和ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆの効力を示すデータが示され得る。
【０２７３】
本明細書中に記載されるその他の疾患モデルのほかに、ヒト乾癬性病変由来の炎症性組織に及ぼす可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４および／または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体の活性は、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスモデルを用いてin vivoで測定され得る。日と細胞が免疫不全売僧に移植されるいくつかのマウスモデル（集合的に異種移植モデルと呼ばれる）が開発されている（例えばCattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18: 513-22, 1994およびFlavell, DJ, Hematological Oncology 14: 67-82, 1996参照）。乾癬に関するin vivo異種移植モデルとして、ヒト乾癬皮膚組織がＳＣＩＤマウスモデルに移植され、適切なアンタゴニストを用いて攻撃誘発される。さらに、当該技術分野におけるその他の乾癬動物モデルは、ＡＧＲ１２９マウスモデル中に移植され、適切なアンタゴニストで攻撃誘発されるヒト乾癬皮膚移植片のようにＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆアンタゴニストを評価するために用いられ得る（例えばBoyman, O. et al., J. Exp. Med. Online publication #20031482, 2004参照（この記載内容は参照により本明細書中で援用される））。ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方の活性を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗し、または中和する可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は好ましいアンタゴニストであるが、しかしながら抗ＩＬ‐１７Ａおよび抗ＩＬ‐２２抗体（単独でまたは組合せて）、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４、ならびにその他のＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆアンタゴニストがこのモデルで用いられ得る。同様に、ヒト結腸炎、ＩＢＤ、関節炎またはその他の炎症性病変由来の組織または細胞がＳＣＩＤモデルで用いられて、本明細書中に記載されるＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆアンタゴニストの抗炎症特性を査定し得る。
【０２７４】
可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体またはその誘導体、アゴニスト、複合体または変異体を用いて炎症を無効にし、遅らせ、または低減するよう意図される療法は、ヒト炎症組織（例えば乾癬性病変等）を保有するＳＣＩＤマウス、または本明細書中に記載されるその他のモデルへの、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４化合物の投与により、試験され得る。治療の効力が測定され、当該技術分野で周知の方法を用いて、長時間に亘る処置集団内の抗炎症作用増大として統計学的に評価される。いくつかの例示的方法としては、例えば乾癬モデルにおいて、表皮厚、上部真皮中の炎症細胞の数、および錯角化症の等級を測定することが挙げられるが、これらに限定されない。このような方法は当該技術分野で既知であり、本明細書中に記載されている（例えばZeigler, M. et al. Lab Invest 81: 1253, 2001；Zollner, T.M. et al. J. Clin. Invest. 109: 671, 2002；Yamanaka, N. et al. Microbiol. Immunol. 45: 507, 2001；Raychaudhuri, S.P. et al. Br. J. Dermatol. 144: 931, 2001；Boehncke, W.H et al. Arch. Dermatol. Res. 291: 104, 1999；Boehncke, W.H et al. J. Invest. Dermatol. 116: 596, 2001；Nickoloff, B.J. et al. Am. J. Pathol. 146: 580, 1995；Boehncke, W.H et al. J. Cutan. Pathol. 24: 1, 1997；Sugai, J., M. et al. J. Dermatol. Sci. 17: 85, 1998；およびVilladsen L.S. et al. J. Clin. Invest. 112: 1571, 2003参照）。炎症は、周知の方法、例えばフローサイトメトリー（またはＰＣＲ）を用いて長時間モニタリングして、試料中に存在する炎症または病変細胞の数、ＩＢＤに関するスコア（体重損失、下痢、直腸出欠、結腸長）、ＣＩＡ  ＲＡモデルに関する脚疾患スコアおよび炎症スコアを定量し得る。例えばこのようなモデルを試験するのに適した療法戦略としては、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４、抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体、その他のＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆアンタゴニスト（単独でまたは一緒に）、または関連複合体、あるいは可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４とそのリガンドＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆとの破壊的相互作用に基づいたアンタゴニストを用いる、もしくは可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体あるいはその誘導体、アゴニスト、複合体または変異体を利用する細胞ベースの療法のための、直接治療が挙げられる。
【０２７５】
さらに、乾癬は、過形成性表皮ケラチノサイトおよび浸潤性単核球、例えばＣＤ４＋記憶Ｔ細胞、好中球およびマクロファージと関連した慢性炎症性皮膚疾患である（Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110: 199, 1996）。環境抗原は、疾患の病態を開始および関与に有意の役割を演じる、と一般に考えられる。しかしながらそれは、乾癬の病態を媒介すると考えられる自己抗原に対する耐性の損失である。樹状細胞およびＣＤ４+Ｔ細胞は、免疫応答を媒介し、病態をもたらす抗原提示および認識に重要な役割を演じると考えられる。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ移入モデルに基づいた乾癬の一モデルを、われわれは近年開発した（Davenport et al., Internat. Immunopharmacol., 2: 653-672）。本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、マウスに投与される。疾患スコア（皮膚病変、炎症サイトカイン）の抑制は、乾癬におけるＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆアゴニスト、例えば抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体またはＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体の有効性を示す。
【０２７６】
５．アトピー性皮膚炎
ＡＤは、ヘルパーＴ細胞サブセット２（Ｔｈ２）の過活性化サイトカインにより特性化される一般的慢性炎症性疾患である。ＡＤの精確な病因は不明であるが、しかし機能亢進性Ｔｈ２免疫応答、自己免疫、感染、アレルゲンおよび遺伝的素因を含めた多因子が関連づけられている。疾患の重要な特徴としては、乾皮症（皮膚の乾燥）、掻痒症（皮膚の痒み）、結膜炎、炎症性皮膚病変、黄色ブドウ球菌感染、血液好酸球増加、血清ＩｇＥおよびＩｇＧ１上昇、ならびにＴ細胞、肥満細胞、マクロファージおよび好酸球浸潤を伴う慢性皮膚炎が挙げられる。黄色ブドウ球菌によるコロニー形成または感染は、ＡＤを悪化させ、そしてこの皮膚疾患の慢性を永続させる。
【０２７７】
ＡＤは、喘息およびアレルギー性鼻炎を有する患者にしばしば見出され、そしてしばしばアレルギー疾患の初期症状発現である。西欧諸国における集団の約20％がこれらのアレルギー性疾患に罹患し、先進国におけるＡＤの発生率は未知の理由のために上昇中である。ＡＤは典型的には小児期に始まり、そしてしばしば青年期を通して成人期まで存続し得る。ＡＤのための一般的治療としては、局所的コルチコステロイド、経口的シクロスポリンＡ、非コルチコステロイド免疫抑制剤、例えばタクロリムス（軟膏形態のＦＫ５０６）、およびインターフェロン‐γが挙げられる。ＡＤのための治療の多様性にもかかわらず、多くの患者の症候は改善せず、あるいは彼等は薬に対する悪反応を示し、他のさらに有効な治療薬を必要とする。本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドおよび抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体、例えば本発明の中和抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、特定のヒト疾患、例えばアトピー性皮膚炎、炎症性皮膚症状および本明細書中に開示されるその他の炎症性症状の治療において、ＩＬ‐１７ＦおよびＩＬ‐１７Ａを中和するために用いられ得る。
【０２７８】
６．喘息
ＩＬ‐１７は、気道中でのアレルゲン誘導性Ｔ細胞活性化および好中球流入に重要な役割を演じる。ＩＬ‐１７に関する受容体は、気道中で発現され（Yao, et al. Immunity 3: 811 (1995)）、そしてアレルギー性喘息におけるＩＬ‐１７媒介性好中球動員が、ＩＬ‐１７刺激性ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）およびヒト気管支繊維芽細胞により産生される化学誘引物質ＩＬ‐８、ＧＲＯ‐αおよびマクロファージ炎症タンパク質‐２（ＭＩＰ‐２）により大いに誘導される（Yao, et al. J Immunol 155: 5483 (1995)；Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108: 430 (2001)）。ＩＬ‐１７はＨＢＥＣも刺激して、ＩＬ‐６好中球活性化因子を放出し（Fossiez, et al., J Exp Med 183: 2593 (1996)およびLinden, et al. Int Arch Allergy Immunol 126: 179 (2001)）、そしてＴＮＦ‐αと相乗作用してin vitroでのヒト好中球の生存を延長することが示されている（Laan, et al. Eur Respir J 21: 387 (2003)）。さらにＩＬ‐１７は、気道再構築に関連したサイトカイン、例えば前繊維性サイトカイン、ＩＬ‐６およびＩＬ‐１１、ならびに炎症調節物質顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）の分泌を増強するその能力により、喘息における炎症性応答を増幅し得る（Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108: 430 (2001)）。
【０２７９】
臨床的証拠は、喘息の急性重症悪化は気道中の好中球の動員および活性化に関連し、したがってＩＬ‐１７が喘息において有意の役割を演じると思われる、ということを示す。軽症喘息患者は、遊離可溶性ＩＬ‐１７Ａタンパク質の局所濃度の検出可能な増大を示す（Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108: 430 (2001)）が、一方、ブタ出産に曝露されたために重症気道炎症を誘導された健常ヒト有志は、気管支肺胞感激中の遊離可溶性ＩＬ‐１７Ａタンパク質の濃度の顕著な増大を示す（Fossiez, et al, J Exp Med 183: 2593 (1996)およびLinden, et al. Int Arch Allergy Immunol 126: 179 (2001)）。さらに喀痰中のＩＬ‐１７レベルは，気道反応亢進増大を示す個体と相関した（Barczyk, et al. Respir Med 97: 726 (2003)）。
【０２８０】
気道過応答性の動物モデルでは、感作マウスによるオバルブミンの慢性吸入は、気管支好酸球性炎症および炎症肺組織におけるＩＬ‐１７ｍＲＮＡ発現の早期誘導を、気管支好中球増加とともに生じた（Hellings, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 28: 42 (2003)）。抗ＩＬ‐１７モノクローナル抗体は気管支好中球流入を強力に低減したが、しかし気管支肺胞洗浄液および血清の両方においてＩＬ‐５レベルを有意に増強し、アレルゲン誘導性気管支好酸球流入を悪化させたが、これは、ＩＬ‐１７Ａが抗原攻撃後の好中球および好酸球蓄積間の平衡の確定に関与し得る、ということを示唆する（同上）。
【０２８１】
ＩＬ‐１７ファミリー成員の中で、ＩＬ‐１７ＦはＩＬ‐１７Ａと最も密接に関連する。ＩＬ‐１７Ｆにより媒介される生物学的活性はＩＬ‐１７Ａのものと類似し、この場合、ＩＬ‐１７ＦはＩＬ‐６、ＩＬ‐８およびＧ‐ＣＳＦの産生を刺激する（Hurst, et al. J Immunol 169: 443 (2002)）。ＩＬ‐１７Ｆは、内皮細胞におけるＩＬ‐２、形質転換成長因子（ＴＧＦ）‐  および単球化学誘引物質タンパク質（ＭＣＰ）の産生も誘導する（Starnes, et al. J Immunol 167: 4137 (2001)）。同様に、アレルゲン攻撃誘発は、アレルギー性喘息患者における局所ＩＬ‐１７Ｆを増大し得る（Kawaguchi, et al. J Immunol 167: 4430 (2001)）。ネズミ肺におけるＩＬ‐１７Ｆの遺伝子送達は、気管支肺胞間隙中の好中球を増大するが、一方、ＩＬ‐１７Ｆ遺伝子の粘膜移入は、Ａｇ誘導性肺好中球増加およびメタコリンに対する気道応答性のレベルを増強する（Oda, et al. Am J Respir Crit Care Med 171: 12 (2005)）。
【０２８２】
喘息とは別に、いくつかの慢性炎症性気道疾患は、気道中の好中球動員により特性化され、ＩＬ‐１７は、呼吸器症状、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、細菌性肺炎および嚢胞性繊維症の病因に重要な役割を演じることが報告されている（Linden, et al. Eur Respir J 15: 973 (2000)、Ye, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 25: 335 (2001)、Rahman, et al. Clin Immunol 115: 268 (2005)）。抗ＩＬ‐１７Ａおよび／または抗ＩＬ‐１７Ｆ治療分子は、炎症のin vitroモデルにおいて慢性炎症性気道疾患に有効であることが実証され得た。培養ＨＢＥＣまたは気管支繊維芽細胞からのＩＬ‐１７Ａおよび／またはＩＬ‐１７Ｆ誘導性サイトカインならびにケモカイン産生を抑制するＩＬ‐１７Ｆおよび／またはＩＬ‐１７Ａ活性に対するアンタゴニスト、例えばＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体およびそれに対する抗体、例えば本発明の抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナルおよび中和抗体の能力は、ＩＬ‐１７Ａおよび／またはＦ刺激に直接起因する炎症媒介物質の産生の防止におけるこのようなアンタゴニストに関する効力の一測定値として用いられ得る。ＩＬ‐１７Ｆおよび／またはＩＬ‐１７Ａ活性に対するアンタゴニスト、例えばＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体およびそれに対する抗体例えば本発明の抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナルおよび中和抗体の付加が炎症媒介物質の産生および発現を顕著に低減する場合、それは、慢性気道炎症と関連する炎症性態様において有効であると予測される。
【０２８３】
薬学的使用に関しては、本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、慣用的方法に従って、非経口的、特に静脈内または皮下送達のために処方される。静脈内投与は、ボーラス注射、例えばミニポンプまたはその他の適切な技法を用いた制御放出による、あるいは1〜数時間の典型的期間に亘る注入によるものである。概して、製剤処方物は、造血タンパク質を、製薬上許容可能なビヒクル、例えば生理食塩水、緩衝化生理食塩水、水中5％デキストロース等と組合せて含む。処方物はさらに、1つまたは複数の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面のタンパク質損失を防止するためのアルブミン等を含む。このような組合せ療法を利用する場合、サイトカインは単一処方物中に併合され得るし、あるいは別個の処方物中で投与され得る。処方方法は当該技術分野で周知であり、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に開示されている。治療用量は一般に、0.1〜100 mg/患者の体重1 kg/日、好ましくは0.5〜20 mg/kg/日の範囲であり、正確な用量は、治療されるべき症状の性質および重症度、患者の特質等を考慮しながら、容認標準に従って臨床医により確定される。用量の確定は、当業者のレベル内である。タンパク質は一般に、化学療法または骨髄移植後28日までの期間に亘って、あるいは血小板数＞20,000/mm3、好ましくは＞50,000/mm3が達成されるまで、投与される。さらに一般的には、タンパク質は、1週間またはそれ未満、しばしば1〜3日の期間、投与される。概して、本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体の治療的有効量は、リンパ系または骨髄系始原細胞の増殖および／または分化における臨床的有意の増大を生じるのに十分な量であり、これは、成熟細胞（例えば血小板または好中球）の循環レベルの増大として明示される。したがって血小板障害の治療は、少なくとも20,000/mm3、好ましくは50,000 /mm3の血小板数が達成されるまで継続される。本発明の可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体は、他のサイトカイン、例えばＩＬ‐３、‐６および‐１１；幹細胞因子；エリスロポイエチン；Ｇ‐ＣＳＦおよびＧＭ‐ＣＳＦと組合せても投与され得る。組合せ療法のレジメン内では、他のサイトカインの1日用量は、概して：ＥＰＯ、150 U/kg；ＧＭ‐ＣＳＦ、5〜15 lg/kg；ＩＬ‐３、1〜5 lg/kg；およびＧ‐ＣＳＦ、1〜25 lg/kgである。例えばＥＰＯを用いる組合せ療法は、低ＥＰＯレベルを有する貧血患者で示される。
【０２８４】
一般的に、投与される可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４（またはＺｃｙｔｏＲ１４類似体または融合タンパク質）または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身的医学的状態および既往症といった因子によって変わる。典型的には、約1 pg/kg〜10 mg/kg（作用物質の量／患者の体重）の範囲である可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体の投与量をレシピエントに提供するのが望ましいが、しかしそれより低いかまたは高い投与量も、環境が指図する場合は投与され得る。
【０２８５】
被験者への可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜腔内、くも膜下注射、局所カテーテルを通した還流による、または直接病変内注射によるものであり得る。注射により治療タンパク質を投与する場合、投与は、連続注入によるかまたは1回または多数回ボーラス注射により得る。
【０２８６】
付加的投与経路としては、経口、粘膜、肺および経皮投与が挙げられる。経口送達は、ポリエステル・マイクロスフェア、ゼイン・マイクロスフェア、プロテノイド・マイクロスフェア、ポリシアノアクリレート・マイクロスフェアおよび脂質ベースの系に適している（例えばDiBase and Morrel, “Oral Delivery of Microencapsulated Proteins,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 255-288 (Plenum Press 1997)参照）。鼻内送達の実現可能性は、例えばインスリン投与方式により例示される（例えばHinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1999)参照）。可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体を含む乾燥または液体粒子が調製され、乾燥粉末分散器、液体エーロゾル発生装置またはネブライザーの助けを借りて吸入され得る（例えばPettit and Gombotz, TIBTECH 16: 343 (1998)；Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 235 (1999)）。このアプローチは、肺にエーロゾル化インスリンを送達するハンド・ヘルド電子吸入器であるＡＥＲＸ糖尿病管理系により例証される。48,000 kDaの大きさのタンパク質は、低周波数超音波の助けを借りて治療濃度で皮膚を通して送達されたという研究が示されているが、これは経皮投与の実現可能性を例証する（Mitragotri et al., Science 269: 850 (1995)）。電気穿孔を用いた経皮送達は、ＺｃｙｔｏＲ１４結合活性を有する分子を投与するための別の手段を提供する（Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10: 213 (1997)）。
【０２８７】
可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体を含む製剤組成物は、既知の方法に従って処方されて、薬学的に有用な組成物を調製し、それにより治療タンパク質が混合物中で製薬上許容可能な単体と併合される。組成物は、その投与がレシピエント患者により耐容され得る場合、「製薬上許容可能な担体」であるといわれる。滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水は、製薬上許容可能な担体の一例である。その他の適切な担体は、当業者に周知である（例えばGennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)参照）。
【０２８８】
治療の目的のために、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体分子および製薬上許容可能な担体は、治療的有効量で患者に投与される。本発明の治療薬分子と製薬上許容可能な担体の組合せは、投与される量が生理学的に有意である場合、「治療的有効量」で投与されるといわれる。作用物質は、その存在がレシピエント患者の生理学に検出可能な変化を生じる場合、生理学的に有意である。例えば炎症を治療するために用いられる作用物質は、その存在が炎症応答を軽減する場合、生理学的に有意である。
【０２８９】
ＺｃｙｔｏＲ１４（またはＺｃｙｔｏＲ１４類似体または融合タンパク質）または中和抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体を含む製剤組成物は、液体形態で、エーロゾルで、または固体形態で供給され得る。液体形態は、注射溶液および経口懸濁液により例証される。例示的固体形態としては、カプセル、錠剤および制御放出形態が挙げられる。後者の形態は、ミニ浸透ポンプおよび移植片により例証される（Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10: 239 (1997)；Ranade, “Implants in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995)；Bremer et al., “Protein Delivery with Infusion Pumps,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997)；Yewey et al., “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997)）。
【０２９０】
リポソームは、静脈内に、腹腔内に、くも膜下に、筋肉内に、皮下に、または経口投与、吸入または鼻内投与により、被験者に治療ポリペプチドを送達するための一手段を提供する。リポソームは、水性区画を取り囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる顕微鏡的小胞である（一般的に、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1): S61 (1993)、Kim, Drugs 46: 618 (1993)およびRanade, “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)参照）。リポソームは組成物中では、細胞膜と類似し、その結果、リポソームは安全に投与され得るし、生分解性である。調製方法によって、リポソームは一重膜または多重膜であり得るし、そしてリポソームは、0.02 μmから10 μmより大きい範囲の直径に伴ってサイズを変え得る。種々の作用物質がリポソーム中に封入され得る：二重膜中の疎水性作用物質区画および内部水性間隙（単数または複数）内の親水性作用物質区画（例えばMachy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987)およびOstro et al., American J. Hosp. Pharm. 46: 1576 (1989)参照）。さらに、リポソームサイズ、二重膜の数、脂質組成、ならびにリポソームの負荷および表面特質を変えることにより、封入作用物質の治療的利用可能性を制御することができる。
【０２９１】
リポソームは、事実上任意の型の細胞に吸着し、次に封入作用物質を徐々に放出し得る。あるいは吸着リポソームは、食作用性である細胞により飲食され得る。飲食作用の後にはリポソーム脂質のリソソーム内分解ならびに封入作用物質の放出が起こる（Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446: 368 (1985)）。静脈内投与後、小リポソーム（0.1〜1.0 μm）は典型的には、主として肝臓および脾臓中に見出される細網内皮系の細胞により取り込まれるが、一方、3.0 μmより大きいリポソームは、肺中に沈着される。細網内皮系の細胞による小型リポソームのこの選択的取り込みは、マクロファージに、そして肝臓の腫瘍に、化学療法薬を送達するために用いられてきた。
【０２９２】
細網内皮系は、いくつかの方法、例えば大用量のリポソーム粒子による浸潤、または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化により、包囲され得る（Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802: 428 (1984)）。さらに、リポソーム膜中への糖脂質またはポリエテレングリコール誘導化リン脂質の取込みは、細網内皮系による有意の取込み低減を生じることが示されている（Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068: 133 (1991)；Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)）。
【０２９３】
リポソームは、リン脂質組成を変えることにより、あるいはリポソーム中に受容体またはリガンドを挿入することにより、特定の細胞または器官を標的化するためにも調製され得る。例えば高含量の非イオン性界面活性剤を用いて調製されたリポソームは、肝臓を標的化するために用いられてきた（日本国特許第04-244,018号（Hayakawa等）；Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16: 960 (1993)）。これらの処方物は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、α‐トコフェロールおよびエトキシル化水素化ヒマシ油（ＨＣＯ‐６０）を混合し、混合物を真空下で濃縮し、次に混合物を水で再構成することにより、調製された。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）と、ダイズ由来ステリルグルコしド混合物（ＳＧ）およびコレステロール（Ｃｈ）とのリポソーム処方物も、肝臓を標的化することが示されている（Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 881 (1997)）。
【０２９４】
あるいは種々のターゲッティング・リガンド、例えば抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミンおよび輸送タンパク質が、リポソームの表面に結合され得る。例えばリポソームは、分枝鎖型ガラクトシル脂質誘導体を用いて修飾されて、肝臓細胞の表面で専ら発現されるアシアロ糖タンパク質（ガラクトース）受容体を標的化する（Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14: 287 (1997)；Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)）。同様に、Wu等（Hepatology 27: 772 (1998)）は、アシアロフェツインによるリポソームの標識化は、リポソーム血漿半減期短縮ならびに肝細胞によるアシアロフェツイン標識化リポソームの取込みの大幅な増強をもたらすことを示した。他方で、分枝鎖型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインの前注射により抑制され得る（Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)）。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、肝臓細胞に対してリポソームをターゲッティングするための別のアプローチを提供する（Kamps et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 94: 11681 (1997)）。さらに、Geho等（米国特許第4,603,044号）は、肝臓の特殊化代謝細胞に関連した肝胆道受容体に対する特異性を有する肝細胞特異的リポソーム小胞送達系を記載する。
【０２９５】
組織ターゲッティングのさらに一般的なアプローチでは、標的細胞は、標的細胞により発現されるリガンドに特異的なビオチニル化抗体で予備標識される（Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)）。遊離抗体の血漿排除後、ストレプトアビジン接合リポソームが投与される。別のアプローチでは、ターゲッティング抗体がリポソームに直接結合される（Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)）。
【０２９６】
ポリペプチドおよび抗体は、標準技法を用いてリポソーム内に封入され得る（例えばAnderson et al., Infect. Immun. 31: 1099 (1981)、Anderson et al., Cancer Res. 50: 1853 (1990)およびCohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063: 95 (1991)、Alving et al., “Preparaton and Use of Liposomes in Immunological Studies,” in Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993)、Wassef et al., Meth. Enzymol. 149: 124 (1987)参照）。上記のように、治療的に有用なリポソームは、種々の構成成分を含有し得る。例えばリポソームは、ポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含み得る（Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)）。
【０２９７】
分解性ポリマー・マイクロスフェアは、高全身レベルの治療タンパク質を保持するよう設計されている。マイクロスフェアは、分解性ポリマー、例えばポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、非生分解性エチルビニルアセテートポリマーから調製され、この場合、タンパク質はポリマー中に包括される（Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6: 332 (1995)；Ranade, “Role of Polymers in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997)；Bartus et al., Science 281: 1161 (1998)；Putney and Burke, Nature Biotechnology 16: 153 (1998)；Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 548 (1998)）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被覆ナノスフェアも、治療タンパク質の静脈内投与のための担体を提供し得る（例えばGref et al., Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)参照）。
【０２９８】
本発明は、結合ＺｃｙｔｏＲ１４活性を有する化学修飾ポリペプチド、例えば、上記のような、ＺｃｙｔｏＲ１４単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体可溶性受容体、ならびにＺｃｙｔｏＲ１４アンタゴニスト、例えば抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体あるいは結合ポリペプチドまたは中和抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体（ポリペプチドがポリマーと連結される）も意図する。
【０２９９】
その他の剤形は、例えばAnsel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)により、ならびにRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)により示されるように、当業者により考案され得る。
【０３００】
例証として、製剤組成物は、ＺｃｙｔｏＲ１４細胞外ドメインを有するポリペプチド、例えばＺｃｙｔｏＲ１４単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体可溶性受容体、あるいはＺｃｙｔｏＲ１４アンタゴニスト（例えばＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチドと結合する抗体または抗体断片、あるいは中和抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体）を含む容器を包含するキットとして供給され得る。治療ポリペプチドは、1回または多数回用量投与のための注射溶液の形態で、あるいは注射前に再構成される滅菌粉末として、提供され得る。あるいはこのようなキットは、治療ポリペプチドの投与のための乾燥粉末分散器、液体エーロゾル発生装置またはネブライザーを包含し得る。このようなキットはさらに、製剤組成物の適応症および使用法に関する情報説明書を包含し得る。さらにこのような情報は、ＺｃｙｔｏＲ１４に対する既知の過敏性を有する患者においてＺｃｙｔｏＲ１４組成物が禁忌される状態を含み得る。
【０３０１】
抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または結合相手（または抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体断片、抗体融合体、ヒト化抗体等）、あるいはＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体を含む製剤組成物は、液体形態で、エーロゾルで、または固体形態で供給される。液体形態は、注射溶液、エーロゾル、液滴、位相幾何学的溶液および経口懸濁液により例証される。例示的固体形態としては、カプセル、錠剤、制御放出形態が挙げられる。後者の形態は、ミニ浸透ポンプおよび移植片により例証される（Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10: 239 (1997)；Ranade, “Implants in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995)；Bremer et al., “Protein Delivery with Infusion Pumps,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997)；Yewey et al., “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997)）。その他の固体形態としては、クリーム、ペースト、その他の位相幾何学的適用等が挙げられる。
【０３０２】
リポソームは、静脈内に、腹腔内に、くも膜下に、筋肉内に、皮下に、または経口投与、吸入または鼻内投与により、被験者に治療ポリペプチドを送達するための一手段を提供する。リポソームは、水性区画を取り囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる顕微鏡的小胞である（一般的に、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1): S61 (1993)、Kim, Drugs 46: 618 (1993)およびRanade, “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)参照）。リポソームは組成物中では、細胞膜と類似し、その結果、リポソームは安全に投与され得るし、生分解性である。調製方法によって、リポソームは一重膜または多重膜であり得るし、そしてリポソームは、0.02 μmから10 μmより大きい範囲の直径に伴ってサイズを変え得る。種々の作用物質がリポソーム中に封入され得る：二重膜中の疎水性作用物質区画および内部水性間隙（単数または複数）内の親水性作用物質区画（例えばMachy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987)およびOstro et al., American J. Hosp. Pharm. 46: 1576 (1989)参照）。さらに、リポソームサイズ、二重膜の数、脂質組成、ならびにリポソームの負荷および表面特質を変えることにより、封入作用物質の治療的利用可能性を制御することができる。
【０３０３】
リポソームは、事実上任意の型の細胞に吸着し、次に封入作用物質を徐々に放出し得る。あるいは吸着リポソームは、食作用性である細胞により飲食され得る。飲食作用の後にはリポソーム脂質のリソソーム内分解ならびに封入作用物質の放出が起こる（Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446: 368 (1985)）。静脈内投与後、小リポソーム（0.1〜1.0 μm）は典型的には、主として肝臓および脾臓中に見出される細網内皮系の細胞により取り込まれるが、一方、3.0 μmより大きいリポソームは、肺中に沈着される。細網内皮系の細胞による小型リポソームのこの選択的取り込みは、マクロファージに、そして肝臓の腫瘍に、化学療法薬を送達するために用いられてきた。
【０３０４】
細網内皮系は、いくつかの方法、例えば大用量のリポソーム粒子による浸潤、または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化により、包囲され得る（Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802: 428 (1984)）。さらに、リポソーム膜中への糖脂質またはポリエテレングリコール誘導化リン脂質の取込みは、細網内皮系による有意の取込み低減を生じることが示されている（Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068: 133 (1991)；Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)）。
【０３０５】
リポソームは、リン脂質組成を変えることにより、あるいはリポソーム中に受容体またはリガンドを挿入することにより、特定の細胞または器官を標的化するためにも調製され得る。例えば高含量の非イオン性界面活性剤を用いて調製されたリポソームは、肝臓を標的化するために用いられてきた（日本国特許第04-244,018号（Hayakawa等）；Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16: 960 (1993)）。これらの処方物は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、α‐トコフェロールおよびエトキシル化水素化ヒマシ油（ＨＣＯ‐６０）を混合し、混合物を真空下で濃縮し、次に混合物を水で再構成することにより、調製された。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）と、ダイズ由来ステリルグルコしド混合物（ＳＧ）およびコレステロール（Ｃｈ）とのリポソーム処方物も、肝臓を標的化することが示されている（Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 881 (1997)）。
【０３０６】
あるいは種々のターゲッティング・リガンド、例えば抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミンおよび輸送タンパク質が、リポソームの表面に結合され得る。例えばリポソームは、分枝鎖型ガラクトシル脂質誘導体を用いて修飾されて、肝臓細胞の表面で専ら発現されるアシアロ糖タンパク質（ガラクトース）受容体を標的化する（Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14: 287 (1997)；Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)）。同様に、Wu等（Hepatology 27: 772 (1998)）は、アシアロフェツインによるリポソームの標識化は、リポソーム血漿半減期短縮ならびに肝細胞によるアシアロフェツイン標識化リポソームの取込みの大幅な増強をもたらすことを示した。他方で、分枝鎖型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインの前注射により抑制され得る（Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)）。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、肝臓細胞に対してリポソームをターゲッティングするための別のアプローチを提供する（Kamps et al., Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 94: 11681 (1997)）。さらに、Geho等（米国特許第4,603,044号）は、肝臓の特殊化代謝細胞に関連した肝胆道受容体に対する特異性を有する肝細胞特異的リポソーム小胞送達系を記載する。
【０３０７】
組織ターゲッティングのさらに一般的なアプローチでは、標的細胞は、標的細胞により発現されるリガンドに特異的なビオチニル化抗体で予備標識される（Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)）。遊離抗体の血漿排除後、ストレプトアビジン接合リポソームが投与される。別のアプローチでは、ターゲッティング抗体がリポソームに直接結合される（Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)）。
【０３０８】
ＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ａ結合活性を有する抗ＺｃｙｔｏＲ１４中和抗体および結合相手、あるいはＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体は、タンパク質顕微封入の標準技法を用いてリポソーム内に封入され得る（例えばAnderson et al., Infect. Immun. 31: 1099 (1981)、Anderson et al., Cancer Res. 50: 1853 (1990)およびCohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063: 95 (1991)、Alving et al., “Preparaton and Use of Liposomes in Immunological Studies,” in Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993)、Wassef et al., Meth. Enzymol. 149: 124 (1987)参照）。上記のように、治療的に有用なリポソームは、種々の構成成分を含有し得る。例えばリポソームは、ポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含み得る（Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)）。
【０３０９】
分解性ポリマー・マイクロスフェアは、高全身レベルの治療タンパク質を保持するよう設計されている。マイクロスフェアは、分解性ポリマー、例えばポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、非生分解性エチルビニルアセテートポリマーから調製され、この場合、タンパク質はポリマー中に包括される（Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6: 332 (1995)；Ranade, “Role of Polymers in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997)；Bartus et al., Science 281: 1161 (1998)；Putney and Burke, Nature Biotechnology 16: 153 (1998)；Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 548 (1998)）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被覆ナノスフェアも、治療タンパク質の静脈内投与のための担体を提供し得る（例えばGref et al., Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)参照）。
【０３１０】
本発明は、化学修飾抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体または結合相手、例えば上記のようなポリマーと連結される抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体またはＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体も意図する。
その他の剤形は、例えばAnsel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)により、ならびにRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)により示されるように、当業者により考案され得る。
【０３１１】
本発明は、本明細書中に記載されるような抗体、ペプチドまたはポリペプチドを含む抗ＩＬ‐１７Ｆ抗体の組成物、ならびに方法および治療的使用を意図する。このような組成物はさらに、担体を含み得る。担体は、慣用的有機または無機担体であり得る。担体の例としては、水、緩衝溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が挙げられる。
【０３１２】
Ｋ）トランスジェニックマウスの生産
トランスジェニックマウスは、全組織中で、あるいは組織特異的または組織選択的調節素子の制御下で、ＩＬ‐１７Ｆ、ＩＬ‐１７ＡまたはＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子を過剰発現するよう工学処理され得る。これらの過剰産生体は、過剰発現に起因する表現型を特性化するために用いられ、そしてトランスジェニック動物は、過剰ＩＬ‐１７Ｆ、ＩＬ‐１７ＡまたはＺｃｙｔｏＲ１４により引き起こされるヒト疾患のためのモデルとして役立ち得る。これらのうちのいずれかを過剰発現するトランスジェニックマウスは、大型動物の乳汁または血液中のＺｃｙｔｏＲ１４、例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４の産生に関するモデルバイオリアクターも提供する。トランスジェニックマウスの生産方法は、当業者に周知である（例えばJacob, “Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice,” in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), pages 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994)、Monastersky and Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995)およびAbbud and Nilson, “Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice,” in Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez and Hoeffler (eds.), pages 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)参照）。
【０３１３】
例えばＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの生産方法は、成体の繁殖力のある雄（繁殖用雄）（Ｂ６Ｃ３ｆ１、2〜8月齢（Taconic Farms, Germantown, NY））、精管切除雄（繁殖不能雄）（Ｂ６Ｄ２ｆ１、2〜8月齢（Taconic Farms, Germantown, NY））、思春期前の繁殖力のある雌（ドナー）（Ｂ６Ｃ３ｆ１、4〜5週齢（Taconic Farms））および成体の繁殖力のある雌（レシピエント）（Ｂ６Ｄ２ｆ１、2〜4月齢（Taconic Farms））を用いて開始し得る。ドナーを1週間順化させて、次に約8 IU/マウスの妊娠雌馬の血清ゴナドトロピン（Sigma Chemical Company; St. Louis, MO）を腹腔内注射し、46〜47時間後、8 IU/マウスのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ（Sigma））を腹腔内注射して、過剰排卵を誘導した。ドナーは、ホルモン注射後、繁殖用雄と交配される。排卵は一般的に、ｈＣＧ注射の13時間以内に起こる。交尾は、交配翌朝の膣栓の存在により確証される。
【０３１４】
受精卵は、手術用顕微鏡下で収集される。卵管が収集され、ヒアルロニダーゼ（Sigma）を含入する尿検査用スライドに卵が放出される。卵はヒアルロニダーゼ中で1回、そして5％ＣＯ2、5％Ｏ2および90％Ｎ2とともに37℃でインキュベートされたWhittenのＷ６４０培地（例えばMenino and O’Claray, Biol. Rreprod. 77: 159 (1986)およびDienhart and Downs, Zygote 4: 129 (1996)により記載）中で2回洗浄される。次に卵は、マイクロインジェクションまで、37℃／5％ＣＯ2インキュベーター中に保存される。
【０３１５】
ＺｃｙｔｏＲ１４コード配列を含有するプラスミドＤＮＡ10〜20 μgが線状化され、ゲル精製されて、マイクロインジェクションのために、最終濃度5〜10 ng/μlで、10 mMトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ7.4）、0.25 mMＥＤＴＡ（ｐＨ7.8）中に再懸濁される。例えばＺｃｙｔｏＲ１４コード配列は、配列番号２のアミノ酸残基２１〜４５２を含むポリペプチドをコードし得る。
【０３１６】
プラスミドＤＮＡは、温ＣＯ2平衡鉱油で覆われたＷ６４０培地１滴中に含入される収穫卵中にマイクロインジェクトされる。ＤＮＡは注射針中に引き抜かれて（内径0.75 mm、外径1 mmのホウシリケートガラス毛管から引かれる）、個々の卵に注射される。各卵は注射針を差し込まれ、針は一倍体前核の一方または両方に入る。
【０３１７】
ピコリットルのＤＮＡを前核に注射し、核小体と接触しないようにして注射針を引き抜く。すべての卵が注射されるまで、当該手法を繰り返す。首尾よくマイクロインジェクトされた卵は、前ガス処理したＷ６４０培地を含有する器官組織培養皿に移されて、37℃／5％ＣＯ2インキュベーター中で一晩貯蔵される。
【０３１８】
翌日、二細胞胚は偽妊娠レシピエントに移される。レシピエントは、精管切除繁殖不能雄との交尾後、交尾栓の存在により同定される。レシピエントは麻酔され、背部左側を剃毛されて、手術用顕微鏡に移される。胸郭、鞍部および後足、膝および脾臓間の中途地点で輪郭を描かれた腹部域の真ん中に筋肉壁を通して皮膚に小切開がなされる。生殖器官は、小手術用布上で体外に露出される。脂肪パッドが手術用布上に広げられ、止血小鉗子（Roboz, Rockville, MD）が脂肪バッドに取り付けられて、マウスの背中上に吊り下げられたままにされて、器官が背部から滑り込まないようにする。
【０３１９】
鉱油とその後に交互にＷ６４０および気泡を含入する微細全量ピペットを用いて、前日の注射からの12〜17個の健常二細胞胚がレシピエントに移される。膨大したアンプルが配置され、アンプルと嚢の間に卵管を保持し、卵管中の切れ目が28 g針で嚢の近くに作られて、アンプルまたは嚢を確実に引き裂かないようにする。
【０３２０】
ピペットは卵管中の切れ目に移されて、胚が吹かれて、最初の気泡をピペットに逃がす。脂肪パッドは静かに腹膜中に押されて、生殖器官を滑り込ませる。腹膜壁は一縫合で閉じられて、皮膚が創傷クリップで閉じられる。マウスは37℃スライドウォーマー上で最低4時間、回復させられる。
【０３２１】
レシピエントはペアでケージに戻されて、19〜21日懐胎させられる。出産後、分娩後19〜21日目に、離乳させられる。離乳仔は雌雄鑑別され、性別ケージに入れられて、0.5 cm生検（遺伝子型分けに用いられる）が清浄鋏で尾から切り取られる。
【０３２２】
例えばQIAGEN DNEASYキットをメーカーの使用説明書に従って用いて、ゲノムＤＮＡが尾小片から調製される。ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子または同一プラスミド中に導入された選択マーカー遺伝子を増幅するよう意図されたプライマーを用いて、ＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡは分析される。動物がトランスジェニックであると確証された後、トランスジェニック雌を野生型雄と、あるいはトランスジェニック雄を1または2匹の野生型雌（単数または複数）と一緒に入れることにより、それらは近交系に戻し交配される。仔が生まれ、離乳されると、性別に分けられて、それらの尾が遺伝子型分けのために切り取られる。
【０３２３】
生きている動物における導入遺伝子の発現に関して検査するために、部分肝切除が実施される。外科標本が、剣状突起の真下の上腹部から作られる。滅菌技法を用いて、小さな1.5〜2 cm切開が胸骨下になされて、肝臓の左外側葉が体外に露出される。4-0絹糸を用いて、下葉周囲にそれを体腔外に固定させる。タイを保持するために非外傷クリップが用いられるが、その間、吸収性Dexon（American Cyanamid; Wayne, N.J.）の二次ループは一次タイの近位に置かれる非外傷クリップが用いられる。Dexonタイから遠位切断がなされ、約100 mgの切除肝組織が滅菌ペトリ皿中に入れられる。切除肝臓切片は、14 mlポリエチレン丸底試験管に移されて、液体窒素中で急速冷凍されて、次にドライアイス上で保存される。外科手術部位が縫合および創傷クリップで閉じられて、動物ケージが37℃加熱パッド上に術後24時間置かれる。動物は術後毎日検査され、手術後7〜10日目に創傷クリップが外される。ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション検定またはポリメラーゼ連鎖反応を用いて、各トランスジェニックマウスに関して、ＺｃｙｔｏＲ１４  ｍＲＮＡの発現レベルが検査される。
【０３２４】
ＩＬ‐１７Ｆ、ＩＬ‐１７ＡまたはＺｃｙｔｏＲ１４を過剰発現するトランスジェニックマウスを生産するほかに、これらの遺伝子のいずれかを異常に低く発現するかまたは全く発現しないトランスジェニックマウスを工学処理することが有用である。このようなトランスジェニックマウスは、ＩＬ‐１７Ｆ、ＩＬ‐１７ＡまたはＺｃｙｔｏＲ１４の欠如に関連した疾患に関する有用なモデルを提供する。上記のように、ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子発現は、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子または外部ガイド配列遺伝子を用いて抑制され得る。ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子を過少発現するトランスジェニックマウスを生産するためには、このような抑制配列がＺｃｙｔｏＲ１４  ｍＲＮＡに対して標的化される。特定遺伝子の異常に低い発現を有するトランスジェニックマウスの生産方法は、当業者に既知である（例えばWu et al., “Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies,” in Methods in Gene Biotechnology, pages 205-224 (CRC Press 1997)参照）。
【０３２５】
ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子発現をほとんどまたは全く有さないトランスジェニックマウスを生産するための代替的アプローチは、非機能性ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子に置き換えられる少なくとも1つの正常ＺｃｙｔｏＲ１４対立遺伝子を有するマウスを生成することである。非機能性ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子を設計する一方法は、ＺｃｙｔｏＲ１４をコードする核酸分子内に、別の遺伝子、例えば選択マーカー遺伝子を挿入することである。これらのいわゆる「ノックアウトマウス」を生産するための標準方法は、当業者に既知である（例えばJacob, “Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice,” in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), pages 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994)およびWu et al., “New Strategies for Gene Knockout,” in Methods in Gene Biotechnology, pages 339-365 (CRC Press 1997)参照）。
以下の非限定実施例により、本発明をさらに例証する。
【実施例】
【０３２６】
実施例
実施例１
ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子の発現
ヒト多組織ブロット（CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）を用いて、ノーザン分析を実施した。ゲル精製ＰＣＲ産物から、2つのプローブを生成した。プライマーとして、以下の：
【化１】
2008509227.tif 000005
および
【化２】
2008509227.tif 000006
を用いて、第一プローブを作製した。メーカーのプロトコールに従って、Amersham（Arlington Heights, IL）からのマルチプライム・ラベリング・キットを用いて、プローブを放射能標識した。NUCTRAPプッシュカラム（STRATAGENE, La Jolla, CA）を用いて、プローブを精製した。ノーザンブロットのための前ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液用に、EXPRESSHYB（CLONTECH）溶液を用いた。ハイブリダイゼーションは、65℃で一晩、実施した。ハイブリダイゼーション後、ブロットを、0.1％ＳＤＳおよびＳＳＣを含有する溶液中で、以下のように、各々30分間洗浄した：2×ＳＳＣ中で室温で2回、0.1×ＳＳＣ中で50℃で3回、0.1×ＳＳＣ中で55℃で1回、そして0.1×ＳＳＣ中で65℃で1回。結果は、ＺｃｙｔｏＲ１４遺伝子が、甲状腺、副腎、前立腺および肝臓組織中で強く発現され、そして心臓、小腸、胃および気管組織中ではそれより低い程度に発現されることを実証した。これに反して、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、結腸、末梢血白血球、脊髄、リンパ節および骨髄中では発現はほとんどまたは全く認められない。
【０３２７】
実施例２
ＰＣＲを用いた細胞株パネル中のｍＲＮＡの分布
全ＲＮＡを、社内で増殖させた休止中および刺激化細胞株から精製し、メーカーの使用説明書に従ってQiagen（Valencia, CA）を用いて、あるいは酸‐フェノール精製プロトコール（Chomczynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 162: 156-9, 1987）に従って、精製した。Agilentバイオアナライザー上でアリコートを走行させることにより、ＲＮＡの質を査定した。ＲＮＡが有意に分解された場合、それはその後の一次鎖ｃＤＮＡの作製に用いなかった。遺伝子間ゲノムＤＮＡの単一部位を増幅するプライマーである以下の：
【化３】
2008509227.tif 000007
および
【化４】
2008509227.tif 000008
を用いて、ＲＮＡのアリコートに関してＰＣＲ検定により、夾雑ゲノムＤＮＡの存在を査定した。夾雑ゲノムＤＮＡ検定に関するＰＣＲ条件を以下に示す：最終容積25 ul中に、2.5 μlの10×緩衝液および0.5 μlのAdvantage２  ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）、2 ulの2.5 mMｄＮＴＰ混合物（Applied Biosystems, Foster City, CA）、2.5 μlの10×Rediload（Invitrogen, Carlsbad, CA）および0.5 μlの20 uM  ｚｃ41011およびｚｃ41012。サイクルパラメーターは、94℃20秒、94℃20秒、60℃1分20秒の40サイクル、ならびに72℃7分の1サイクル。10 ulの各反応物をアガロースゲル電気泳動に付して、夾雑ゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物の存在に関してゲルを検査した。夾雑ゲノムＤＮＡが観察された場合、メーカーの使用説明書に従って無ＤＮＡ試薬（Ambion, Inc, Austin, TX）を用いて、全ＲＮＡをＤＮアーゼ処理し、次に上記のように再試験した。夾雑ゲノムＤＮＡを含有しないと思われるＲＮＡのみを、その後の一次鎖ｃＤＮＡの作製に用いた。
【０３２８】
82のヒト細胞株からの全ＲＮＡ20 μgを、各々、Ｈ2Ｏで98 μlとして、次に、各々10 μgの全ＲＮＡを含有する2つの49 ulアリコートに分割し、2つの96ウエルＰＣＲプレート中に入れた。各アリコートに、一次鎖ｃＤＮＡ合成のための試薬（Invitrogen First Strand cDNA Synthesis System, Carlsbad, CA）を付加した：20 μlの25 mMＭｇＣｌ2、10 ulの10×ＲＴ緩衝液、10 ulの0.1 MＤＴＴ、2 μlのオリゴｄＴ、2 ulのＲＮアーゼＯｕｔ。次に、各細胞株からの1つのアリコートに、2 μlのSuperscriptＩＩ逆転写酵素を付加し、そして対応する細胞株に、約2 μlのＨ2Ｏを付加して、マイナス逆転写酵素陰性対照を作った。全試料を、以下のようにインキュベートした：25℃で10分、42℃で50分、70℃で15分。試料をウエル深皿中に配置し、Ｈ2Ｏで1.7 mlに希釈した。Multipette（Saigan）ロボットを用いて、多数回、96ウエルＰＣＲプレートの各々のウエル中に16.5 μlアリコート化して、細胞株の多数の一用途ＰＣＲパネルを生成して、これを次に密封して、−20℃で保存した。これらのパネル中の各ウエルは、約100 ngの全ＲＮＡからの一次鎖ｃＤＮＡを表わす。82の細胞株を2つのパネル：アレイ＃１１８Ａおよび＃１１８Ｂ全体に広げる。2つの広範に発現されるがしかし中等度に豊富な遺伝子、ＣＬＴＣ（クラスリン）およびＴＦＲＣ（トランスフェリン受容体Ｃ）に対するプライマーを用いて、パネル上の一次鎖ｃＤＮＡの質を査定した。各々0.5 ulのクラスリンプライマー：
【化５】
2008509227.tif 000009
【化６】
2008509227.tif 000010
およびＴＦＲＣプライマー：
【化７】
2008509227.tif 000011
【化８】
2008509227.tif 000012
を、2.5 μlの10×緩衝液および0.5 μlのAdvantage２  ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）、2 ulの2.5 mMｄＮＴＰ混合物（Applied Biosystems, Foster City, CA）、2.5 μlの10×Rediload（Invitrogen, Carlsbad, CA）と混合し、アレイ＃１１８Ａおよび＃１１８Ｂのパネルの各ウエルに付加した。サイクルパラメーターを以下に示す：94℃20秒、94℃20秒、67℃80秒の35サイクル、ならびに72℃7分の1サイクル。10 ulの各反応物をアガロースゲル電気泳動に付して、各細胞株に関して＋ＲＴウエルに特異的な各遺伝子に関する頑強なＰＣＲ産物の存在に関して、ゲルを採点した。
【０３２９】
試料毎にこれらのＰＣＲ条件：2.5 μlの10×緩衝液および0.5 μlのAdvantage２  ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）、2 μlの2.5 mMｄＮＴＰ混合物（Applied Biosystems, Foster City, CA）、2.5 μlの10×Rediload（Invitrogen, Carlsbad, CA）および0.5 μlの20 uMの各センスおよびアンチセンスプライマー：下で、センスオリゴ：
【化９】
2008509227.tif 000013
およびアンチセンスオリゴ：
【化１０】
2008509227.tif 000014
を用いてＰＣＲにより、ＺｃｙｔｏＲ１４に関するヒト一次鎖ｃＤＮＡ中のｍＲＮＡの発現を検定した。サイクル条件は、94℃2分、94℃1分、66℃30秒、72℃1.5分の35サイクル、ならびに72℃7分の1サイクルであった。10 ulの各反応物をアガロースゲル電気泳動に付して、ＺｃｙｔｏＲ１４の陽性または陰性発現に関して、ゲルを採点した。
【０３３０】
ＺｃｙｔｏＲ１４  ｍＲＮＡは、広範囲の組織および細胞型を表わす多数の細胞株中で広範に発現される。特に、ＺｃｙｔｏＲ１４は、非Ｔ細胞末梢血細胞株、例えば単球、Ｂ細胞、および骨髄系統の細胞中で一貫して発現される。さらにまたＺｃｙｔｏＲ１４  ｍＲＮＡは、皮膚由来の細胞株中で確実に発現される。ＺｃｙｔｏＲ１４を発現するその他の細胞株は、アレイ上に存在した5つすべての大腸細胞株である。
【０３３１】
実施例３
ＲＴ  ＰＣＲを用いたマウス細胞株パネル中のｍＲＮＡの分布
全ＲＮＡを、社内で増殖させた60の休止中および刺激化細胞株から精製し、そしてメーカーの使用説明書に従ってQiagen（Valencia, CA）を用いて、酸‐フェノール精製プロトコール（Chomczynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 162: 156-9, 1987）、あるいはトリゾール試薬プロトコール（Invitrogen, Carlsbad, CA）に従って、精製した。
各細胞株からの5 μgの全ＲＮＡを、96ウエル深皿中に配置し、125 μlの3 MＮａＯＡｃおよび100 μlのPellet Paint（Novagen, Madison, WI）を各ウエルに付加し、次に最終容積をＨ2Ｏで1.25 mlに調整した。Multipette（Saigan）ロボットを用いて、多数回、96ウエルＰＣＲプレートの各々のウエル中に25 μl  ＲＮＡ混合物アリコート、その後、75 ul  ＥｔＯＨのアリコートにして、細胞株の多数の一用途ＲＴ  ＰＣＲパネルを生成して、これを次に密封して、−20℃で保存した。Qiagen（Valencia, CA）96ウエル遠心分離機中で6000rpmで10分間、パネルを先ず遠心分離することにより、ＲＴ  ＰＣＲスクリーニングを実施した。プレートを吸取り紙上に逆さにすることにより、上清を除去した。ＲＮＡペレットを100 μlの70％ＥｔＯＨで洗浄し、その後、6000 rpmで5分間遠心分離した。上清を再び除去し、残りのＥｔＯＨが蒸発されるまで、プレートを風乾させた。ＲＮＡペレットを15 μlのＨ2Ｏ中に再懸濁した。
【０３３２】
試料毎にこれらのＲＴ  ＰＣＲ条件：Platinum Taqキットを用いたSuperScriptワンステップＰＣＲ（Invitrogen, Carlsbad, CA）下で、以下の：
【化１１】
2008509227.tif 000015
および
【化１２】
2008509227.tif 000016
を用いて、ＲＴ  ＰＣＲにより、マウス細胞株ＲＮＡパネル中のＺｃｙｔｏＲ１４  ｍＲＮＡの発現を検定した。サイクル条件は：48℃で30分、94℃で2分のサイクル、その後94℃で15秒、55℃で30秒、72℃で1.5分の35サイクル、その後、72℃で7分の1サイクルであった。10 ulの各反応物をアガロースゲル電気泳動に付して、ＺｃｙｔｏＲ１４の陽性または陰性発現に関して、ゲルを採点した。
【０３３３】
ネズミＺｃｙｔｏＲ１４ｍＲＮＡを、いくつかのマウス細胞株中で、特に骨髄由来の細胞株、例えば骨芽細胞、および前脂肪細胞株中で、発現される。さらにまた、マウスＺｃｙｔｏＲ１４  ｍＲＮＡは、内分泌系、例えば膵臓間質細胞株、膵臓島細胞株および視床下部、唾液腺、ならびに精巣細胞株からのいくつかの試料中で表わされる。
【０３３４】
実施例４
大腸菌中で産生されるｐＩＬ‐１７Ｆのリフォールディングおよび精製
Ａ）封入体単離およびｐＩＬ‐１７Ｆの抽出
バッチ発酵またはシェーカーフラスコ培養中でのタンパク質発現の誘導後、大腸菌ブロスを1リットル瓶中で3000 rpmでSorvall旋回バケット回転機中で遠心分離する。200 mMＮａＣｌおよび5 mMＥＤＴＡを含有する50 mMトリス、ｐＨ8.0を用いて、上清が透明になるまで、任意のブロス夾雑物を除去するための細胞ペーストの洗浄を実施する。
【０３３５】
次に細胞ペレットを、氷冷溶解緩衝液（50 mMトリス、ｐＨ8.0；5 mMＥＤＴＡ；200 mMＮａＣｌ、10％スクロース（w/v）；5 mMＤＴＴ；5 mMベンズアミジン）中に、600 nmで10〜20光学濃度単位に懸濁する。次にこのスラリーを8500〜9000 psiで冷却ＡＰＶ2000 Labホモジナイザー中で3回処理して、破壊細胞溶解物を産生する。4℃で1時間、20,000×Gでの細胞溶解物の遠心分離により、不溶性分画（封入体）を回収する。
【０３３６】
20,000×G遠心分離により生じる封入体ペレットを計量し、次に封入体1 g当たり洗浄緩衝液10 mlで、洗浄緩衝液（200 mMＮａＣｌ、5 mMＥＤＴＡ、5 mMＤＴＴ、5 mMベンズアミジンを含有する50 mMトリス、ｐＨ8.0）中に再懸濁する。OMNI Internationalロータースターター発生器を用いてホモジナイズすることにより、完全分散を達成する。この懸濁液を、4℃で30分間、20,000×Gで遠心分離する。上清が透明になるまで、洗浄サイクルを3〜5回反復する。
【０３３７】
0.1 M亜硫酸ナトリウムおよび0.02 Mナトリウムテトラチオネートを含有する40 mMトリス緩衝液、ｐＨ8中の7 MグアンジンＨＣｌ中に、最終洗浄ペレットを可溶化する。4℃で一晩、静かに撹拌しながら、抽出および亜硫酸分解反応を進行させる。その結果生じる桃色を帯びた溶液を、4℃で1時間、35,000×gで遠心分離し、可溶性ｐＩＬ‐１７Ｆを含有する清澄化上清を、0.45 um濾過する。
【０３３８】
Ｂ）ｐＩＬ‐１７Ｆリフォールディング手法
55 mMＭＥＳ、10.56 mMＮａＣｌ、0.44 mMＫＣｌ、0.055％ＰＥＧ（3400 K）、1.1 mMＥＤＴＡ、20％グリセロール、0.5 MグアニジンＨＣｌ、0.75 Mアルギニンおよび1:1比でのグルタチオンレドックス対（1 mMＧＳＨ：1 mMＧＳＳＧ）を含有する氷冷リフォールディング緩衝液中に滴下希釈することにより、可溶化亜硫酸分解化ｐＩＬ‐１７Ｆをリフォールディングする。リフォールディング緩衝液のｐＨをＨＣｌで6.5に調整し、ｐＩＬ‐１７Ｆを付加して、最終濃度を100 ug/mlとする。一旦希釈したら、混合物を冷室中で72時間静かに撹拌させる。
【０３３９】
Ｃ）生成物回収＆精製
リフォールディング化ｐＩＬ‐１７Ｆを、実験室スケールＴＦＦ系上で対10 kDaカットオフ膜で10×濃縮する。次に、0.45ミクロン膜を用いてそれを濾過し、酢酸の付加によりｐＨを5.1に調整する。50 mM酢酸塩緩衝液、ｐＨ5.1中で平衡させたPharmaciaＳＰFast Flowカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィーにより、ｐＨ調整物質を捕獲する。190 cm／時の流量で平衡緩衝液で1:5でインライン配分することにより、ｐＩＬ‐１７Ｆを負荷する。この希釈はイオン強度を低下させて、標的とマトリックスの効率的結合を可能にする。試料負荷完了後、カラムを平衡緩衝液で洗浄して、基線吸光度にする。カラムを50 mM酢酸塩緩衝液、ｐＨ5.1中の0.4 MＮａＣｌで洗浄し、次に結合タンパク質を、50 mM酢酸塩緩衝液、ｐＨ5.1中の0.4 MＮａＣｌから1.5 MＮａＣｌまでの5 CV勾配で溶離する。タンパク質は〜1 MＮａＣｌで溶離し、溶出液分画のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析により、約85％二量体である。ｐＩＬ‐１７Ｆを含有する分画をプールし、サイズ排除クロマトグラフィーによる最終精製および緩衝液交換のための調製物中のAmicon撹拌セルを用いて、10 kDaカットオフ限外濾過膜に対して濃縮する。
【０３４０】
Ｄ）サイズ排除緩衝液交換および処方物
30 cm／時の流量で、109 mMＮａＣｌを含有する50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ7.2中で平衡させたPharmaciaスーパーデックス７５サイズ排除カラム上に、濃縮陽イオンプール（ＣＶの3〜4％の容積で）を注入する。生成物を含有する対称的溶出液ピークを、109 mMＮａＣｌを含有する50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ7.2中で1 mg/mlの濃度に希釈する。最後に、ｐＩＬ‐１７Ｆを0.2 ミクロン滅菌濾過し、アリコート化して、−80℃で保存する。最終プロセス収率は20％である。
【０３４１】
実施例５
哺乳類可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４発現構築物の構築
ヒトＺｃｙｔｏＲ１４［Ｌ２１‐Ｋ４５１］‐ｍＦｃ１を含有する発現構築物（マウスＢＡＬＢ／ｃ  μ２ａ  Ｆｃ）を、ＺｃｙｔｏＲ１４ポリペプチド（配列番号４３）をコードするＤＮＡ断片（配列番号４２）、ｍＦｃ１（配列番号４４）をコードするＤＮＡ断片および発現ベクターｐＺＭＰ２０を用いて、重複ＰＣＲおよび相同組換えにより構築する。断片は、ＰＣＲ増幅により生成する。
ＺｃｙｔｏＲ１４［Ｌ２１‐Ｋ４５１］をコードするＰＣＲ断片は、最適化組織プラスミノーゲン活性剤プレ・プロ分泌リーダー配列コード領域中のｐＺＭＰ２０ベクター配列との５’重複、ＺｃｙｔｏＲ１４細胞外ドメインコード［Ｌ２１‐Ｋ４５１］およびｍＦｃ１コード領域との３’重複を含有する。ＰＣＲ増幅反応は、５’オリゴヌクレオチド：
【化１３】
2008509227.tif 000017
、３’オリゴヌクレオチド：
【化１４】
2008509227.tif 000018
そしてＺｃｙｔｏＲ１４の予備生成ＤＮＡクローンを鋳型として用いる。
【０３４２】
ｍＦｃ１をコードするＰＣＲ断片は、ＺｃｙｔｏＲ１４配列との５’重複、ｍＦｃ１コード領域、およびポリオウイルス内部リボソームエントリー部位領域中のｐＺＭＰ２０との３’重複を含有する。ＰＣＲ増幅反応は、５’オリゴヌクレオチド：
【化１５】
2008509227.tif 000019
、３’オリゴヌクレオチド：
【化１６】
2008509227.tif 000020
そしてｍＦｃ１の予備生成ＤＮＡクローンを鋳型として用いる。
【０３４３】
ＰＣＲ増幅反応条件を以下に示す：94℃で5分を1サイクル；94℃で1分、その後55℃で2分、その後72℃で3分を35サイクル；72℃で10分を1サイクル。ＰＣＲ反応混合物を1％アガロースゲル上で走行させて、予測サイズに対応するＤＮＡ断片を、QIAquickTMゲル抽出キット（Qiagen、カタログ番号28704）を用いてゲルから抽出する。
2つのＰＣＲ断片を、重複ＰＣＲにより接合させる。各々約1 μlの2つのゲル抽出断片を、５’オリゴヌクレオチド：
【化１７】
2008509227.tif 000021
および３’オリゴヌクレオチド：
【化１８】
2008509227.tif 000022
を用いて、ＰＣＲ増幅反応で併合する。ＰＣＲ増幅反応条件を以下に示す：94℃で5分を1サイクル；94℃で1分、その後55℃で2分、その後72℃で3分を35サイクル；72℃で10分を1サイクル。ＰＣＲ反応混合物を1％アガロースゲル上で走行させて、挿入物のサイズに対応するＤＮＡ断片を、QIAquickTMゲル抽出キット（Qiagen、カタログ番号28704）を用いてゲルから抽出する。
【０３４４】
プラスミドｐＺＭＰ２０は、ＭＰＳＶプロモーター、酵母組換え前の線状化のためのＢｇｌＩＩ部位、ｏｔＰＡシグナルペプチド配列、ポリオウイルスからの内部リボソームエントリー素子、膜貫通ドメインのＣ末端で切頭されたＣＤ８の細胞外ドメイン；大腸菌複製起点；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサーおよび複製の起点、ＤＨＦＲ遺伝子およびＳＶ４０ターミネーターを含む哺乳類選択マーカー発現単位；ならびに出芽酵母における選択および複製に必要とされるＵＲＡ３およびＣＥＮ‐ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含有する哺乳類発現ベクターである。
【０３４５】
ゲル抽出ＺｃｙｔｏＲ１４［Ｌ２１‐Ｋ４５１］‐ｍＦｃ１ＰＣＲ断片を用いて、酵母中での組換え前に、プラスミドｐＺＭＰ２０をＢｇｌＩＩで消化する。100 μlのコンピーテント酵母（出芽酵母）細胞を、10 μlのＺｃｙｔｏＲ１４［Ｌ２１‐Ｋ４５１］‐ｍＦｃ１挿入物ＤＮＡおよび100 ngのＢｇｌＩＩ消化ｐＺＭＰ２０ベクターと併合し、混合物を0.2 cm電気穿孔キュベットに移す。酵母／ＤＮＡ混合物を、0.75 kV（5 kV/cm）、∞オームおよび25 μFの電源（BioRad Laboratories, Hercules, CA）設定を用いて、電気パルス処理する。600 μlの1.2 Mソルビトールをキュベットに付加し、酵母を2つのＵＲＡ‐Ｄプレート上の100 μlおよび300 μlアリコート中でプレート化して、30℃でインキュベートする。約72時間後、単一プレートからのＵｒａ+酵母形質転換体を、1 mlのＨ2Ｏ中に再懸濁して、短時間遠心分離して、酵母細胞をペレット化する。細胞ペレットを0.5 mlの溶解緩衝液（2％トリトンＸ‐100、1％ＳＤＳ、100 mMＮａＣｌ、10 mMトリス、ｐＨ8.0、1 mMＥＤＴＡ）中に再懸濁する。500 μlの溶解混合物を、250 μlの酸洗浄ガラスビーズおよび300 μlのフェノール‐クロロホルムを含有するエッペンドルフ管に付加して、3分間かき混ぜて、最大速度でエッペンドルフ管中で5分間遠心分離する。300 μlの水性相を新たな試験管に移して、600 μlのエタノールでＤＮＡを沈殿させた後、最大速度で30分間遠心分離する。試験管をデカントし、ペレットを1 mLの70％エタノールで洗浄する。試験管をデカントし、ＤＮＡペレットを、30 μlの10 mMトリス、ｐＨ8.0、1 mMＥＤＴＡ中に再懸濁する。
【０３４６】
5 μlの酵母ＤＮＡ調製物および50 μlの大腸菌細胞を用いて、エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を実行する。2.0 kV、25 μFおよび400 ohmで、細胞を電気パルス処理する。電気穿孔後、1 mlのＳＯＣ（2％BactoTMトリプトン（Difco, Detroit, MI）、0.5％酵母抽出物（Difco）、10 mMＮａＣｌ、2.5 mMＫＣｌ、10 mMＭｇＣｌ2、10 mMＭｇＳＯ4、20 mMグルコース）を付加し、次に2つのＬＢ  ＡＭＰプレート（ＬＢブロス（Lennox）、1.8％BactoTM寒天（Difco）、100 mg/Lアンピシリン）上の50 μlおよび200 μlアリコート中でプレート化する。
【０３４７】
構築物に関する3つのＤＮＡクローンの挿入物を配列分析に付して、正しい配列を含有する1つのクローンを選択する。メーカーの使用説明書に従って、市販キット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を用いて、大規模プラスミドＤＮＡを単離する。
【０３４８】
実施例６
ＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＨＩＳおよびＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＦＬＡＧを発現する哺乳類可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４発現構築物の構築
ヒトＺｃｙｔｏＲ１４［Ｌ２１‐Ｋ４５１］を、Ｃ末端タグ、Ｇｌｕ‐Ｇｌｕ（ＣＥＥ）、6つのＨｉｓ（ＣＨＩＳ）またはＦＬＡＧ（ＣＦＬＡＧ）とともに含有する発現構築物を、ＺｃｙｔｏＲ１４［Ｌ２１‐Ｋ４５１］（配列番号４２）をコードするＤＮＡ断片および発現ベクターｐＺＭＰ２０を用いて、ＰＣＲおよび相同組換えにより構築する。
【０３４９】
ＺｃｙｔｏＲ１４ＣＥＥをコードするＰＣＲ断片は、最適化組織プラスミノーゲン活性剤プレ・プロ分泌リーダー配列コード領域中のｐＺＭＰ２０ベクター配列との５’重複、ＺｃｙｔｏＲ１４細胞外ドメインコード［Ｌ２１‐Ｋ４５１］、Ｇｌｕ‐Ｇｌｕタグの配列（Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu；配列番号５３）およびポリオウイルス内部リボソームエントリー部位領域中のｐＺＭＰ２０ベクターとの３’重複を含有する。ＰＣＲ増幅反応は、５’オリゴヌクレオチド：
【化１９】
2008509227.tif 000023
、３’オリゴヌクレオチド：
【化２０】
2008509227.tif 000024
そしてＺｃｙｔｏＲ１４の予備生成ＤＮＡクローンを鋳型として用いる。
【０３５０】
ＰＣＲ増幅反応条件を以下に示す：94℃で5分を1サイクル；94℃で1分、その後55℃で2分、その後72℃で3分を35サイクル；72℃で10分を1サイクル。ＰＣＲ反応混合物を1％アガロースゲル上で走行させて、予測サイズに対応するＤＮＡ断片を、QIAquickTMゲル抽出キット（Qiagen、カタログ番号28704）を用いてゲルから抽出する。
【０３５１】
ゲル抽出ＺｃｙｔｏＲ１４ＣＥＥ  ＰＣＲ断片を用いて、酵母中での組換え前に、プラスミドｐＺＭＰ２０をＢｇｌＩＩで消化する。100 μlのコンピーテント酵母（出芽酵母）細胞を、10 μlのＺｃｙｔｏＲ１４ＣＥＥ挿入物ＤＮＡおよび100 ngのＢｇｌＩＩ消化ｐＺＭＰ２０ベクターと併合し、混合物を0.2 cm電気穿孔キュベットに移す。酵母／ＤＮＡ混合物を、0.75 kV（5 kV/cm）、∞オームおよび25 μFの電源（BioRad Laboratories, Hercules, CA）設定を用いて、電気パルス処理する。600 μlの1.2 Mソルビトールをキュベットに付加し、酵母を2つのＵＲＡ‐Ｄプレート上の100 μlおよび300 μlアリコート中でプレート化して、30℃でインキュベートする。約72時間後、単一プレートからのＵｒａ+酵母形質転換体を、1 mlのＨ2Ｏ中に再懸濁して、短時間遠心分離して、酵母細胞をペレット化する。細胞ペレットを0.5 mlの溶解緩衝液（2％トリトンＸ‐100、1％ＳＤＳ、100 mMＮａＣｌ、10 mMトリス、ｐＨ8.0、1 mMＥＤＴＡ）中に再懸濁する。500 μlの溶解混合物を、250 μlの酸洗浄ガラスビーズおよび300 μlのフェノール‐クロロホルムを含有するエッペンドルフ管に付加して、3分間かき混ぜて、最大速度でエッペンドルフ管中で5分間遠心分離する。300 μlの水性相を新たな試験管に移して、600 μlのエタノールでＤＮＡを沈殿させた後、最大速度で30分間遠心分離する。試験管をデカントし、ペレットを1 mLの70％エタノールで洗浄する。試験管をデカントし、ＤＮＡペレットを、30 μlの10 mMトリス、ｐＨ8.0、1 mMＥＤＴＡ中に再懸濁する。
【０３５２】
5 μlの酵母ＤＮＡ調製物および50 μlの大腸菌細胞を用いて、エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を実行する。2.0 kV、25 μFおよび400 ohmで、細胞を電気パルス処理する。電気穿孔後、1 mlのＳＯＣ（2％BactoTMトリプトン（Difco, Detroit, MI）、0.5％酵母抽出物（Difco）、10 mMＮａＣｌ、2.5 mMＫＣｌ、10 mMＭｇＣｌ2、10 mMＭｇＳＯ4、20 mMグルコース）を付加し、次に2つのＬＢ  ＡＭＰプレート（ＬＢブロス（Lennox）、1.8％BactoTM寒天（Difco）、100 mg/Lアンピシリン）上の50 μlおよび200 μlアリコート中でプレート化する。
【０３５３】
構築物に関する3つのＤＮＡクローンの挿入物を配列分析に付して、正しい配列を含有する1つのクローンを選択する。メーカーの使用説明書に従って、市販キット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を用いて、大規模プラスミドＤＮＡを単離する。
【０３５４】
同一プロセスを用いて、Gly Ser Gly Gly His His His His His Hisから成るＣ末端hisタグを有するＺｃｙｔｏＲ１４（ＺｃｙｔｏＲ１４ＣＨＩＳ：配列番号５１）またはGly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysから成るＣ末端ＦＬＡＧタグを有するＺｃｙｔｏＲ１４（ＺｃｙｔｏＲ１４ＣＦＬＡＧ：配列番号５２）を調製する。これらの構築物を調製するために、配列番号５０の３’オリゴヌクレオチドの代わりに、３’オリゴヌクレオチド：
【化２１】
2008509227.tif 000025
を用いてＺｃｙｔｏＲ１４ＣＨＩＳを生成し、あるいは３’オリゴヌクレオチド：
【化２２】
2008509227.tif 000026
を用いてＺｃｙｔｏＲ１４ＣＦＬＡＧを生成する。
【０３５５】
実施例７
ＺｃｙｔｏＲ１４‐ｍＦｃ１融合タンパク質ならびにＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＨＩＳおよびＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＦＬＡＧ  Ｃ末端標識化タンパク質を発現する可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４受容体発現構築物のトランスフェクションおよび発現
3組の各々の200 μgの可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４融合または標識化発現構築物を別々に、37℃で3時間、200単位のＰｖｕＩで消化し、イソプロピルアルコールで沈殿させて、1.5 mL微小遠心管中で遠心分離する。上清をデカントしてペレットを得て、ペレットを1 mLの70％エタノールで洗浄して、室温で5分間インキュベートさせる。試験管を微小遠心管中で14,000 rpmで10分間遠心分離して、上清をデカントしてペレットを得る。次にペレットを滅菌環境中の750 μlのＣＨＯ細胞組織培地中に再懸濁して、60℃で30分間インキュベートさせ、室温に冷却させる。約5×106ＣＨＯ細胞を3つの試験管の各々の中でペレット化して、ＤＮＡ培地溶液を用いて再懸濁する。ＤＮＡ／細胞混合物を0.4 cmギャップ・キュベット中に入れて、以下のパラメーターを用いて電気穿孔する：950 μF、高キャパシタンス、300 Vで。次にキュベットの内容物を取り出して、プールし、ＣＨＯ細胞組織培地で25 mLに希釈して、125 mL振盪フラスコ中に入れる。120 RPMで振盪しながら、37℃、6％ＣＯ2で振盪器上のインキュベーター中にフラスコを入れる。
【０３５６】
ＣＨＯ細胞を栄養選択に付した後、200 nMメトトレキセート（ＭＴＸ）に、次いで1 μMＭＴＸにステップ増幅する。ウエスタンブロットにより融合または標識化タンパク質発現を確証し、タンパク質精製のための収穫物に関して、ＣＨＯ細胞プールを拡大する。
【０３５７】
実施例８
可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４の発現
ＺｃｙｔｏＲ１４＿ＴｂｘのＤＮＡ断片および発現ベクターｐＺＭＰ４０を用いて、相同組換えにより、ＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｔｂｘ‐Ｃ（Ｆｃ９）（配列番号６４）を含有する発現プラスミドを構築した。プライマーｚｃ44531およびｚｃ44545を用いて、ＰＣＲ増幅により、断片を生成した。
【０３５８】
ＰＣＲ断片ＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｔｂｘは、鋳型としてＺｃｙｔｏＲ１４の予備生成クローンを用いて作製された部分的ＺｃｙｔｏＲ１４細胞外ドメインコード領域を含有する。断片は、ｏｔＰＡコード領域中のｐＺＭＰ４０ベクター配列との５’重複、ＺｃｙｔｏＲ１４セグメント（配列番号２のアミノ酸残基２１〜４５１）、リンカー配列、トロンビン切断部位、およびＦｃ９コード領域中のｐＺＭＰ４０ベクターとの３’重複を含む。用いたＰＣＲ条件を以下に示す：94℃で5分を1サイクル；94℃で1分、その後55℃で2分、その後72℃で3分を35サイクル；72℃で10分を1サイクル。
【０３５９】
ＰＣＲ反応混合物を1％アガロースゲル上で走行させて、挿入物のサイズに対応する帯域を、QIAquickTMゲル抽出キット（Qiagen、カタログ番号28704）を用いてゲル抽出した。
プラスミドｐＺＭＰ２０は、ＭＰＳＶプロモーター、コード配列、ｏｔピイＡシグナルペプチド配列およびＦｃ９に関する配列の挿入のための多制限部位；ポリオウイルスからの内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）素子、および膜貫通ドメインのＣ末端で切頭されたＣＤ８の細胞外ドメイン；大腸菌複製起点；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサーおよび複製の起点、ＤＨＦＲ遺伝子およびＳＶ４０ターミネーターを含む哺乳類選択マーカー発現単位；ならびに出芽酵母における選択および複製に必要とされるＵＲＡ３およびＣＥＮ‐ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含有する哺乳類発現ベクターである。それは、ｐＺＭＰ２１から構築された（特許公告US 2003/0232414 A1；アメリカ培養細胞コレクションに寄託され、ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ‐5266と呼ばれる）。
【０３６０】
ＰＣＲ断片を用いて、酵母中での組換え前に、プラスミドｐＺＭＰ４０をＢｇｌＩＩで消化する。100 μlのコンピーテント酵母（出芽酵母）細胞を、個別に、10 μlの挿入物ＤＮＡ（配列番号６６）および100 ngの切断ｐＺＭＰ４０ベクターと併合し、混合物を0.2 cm電気穿孔キュベットに移す。酵母／ＤＮＡ混合物を、0.75 kV（5 kV/cm）、∞オームおよび25 μFの電源（BioRad Laboratories, Hercules, CA）設定を用いて、電気パルス処理する。600 μlの1.2 Mソルビトールをキュベットに付加し、酵母を2つのＵＲＡ‐Ｄプレート上の100 μlおよび300 μlアリコート中でプレート化して、30℃でインキュベートする。約72時間後、単一プレートからのＵｒａ+酵母形質転換体を、1 mlのＨ2Ｏ中に再懸濁して、短時間遠心分離して、酵母細胞をペレット化する。細胞ペレットを0.5 mlの溶解緩衝液（2％トリトンＸ‐100、1％ＳＤＳ、100 mMＮａＣｌ、10 mMトリス、ｐＨ8.0、1 mMＥＤＴＡ）中に再懸濁した。500 μlの溶解混合物を、250 μlの酸洗浄ガラスビーズおよび300 μlのフェノール‐クロロホルムを含有するエッペンドルフ管に付加して、3分間かき混ぜて、最大速度でエッペンドルフ管中で5分間遠心分離した。300 μlの水性相を新たな試験管に移して、600 μlのエタノールでＤＮＡを沈殿させた後、最大速度で30分間遠心分離した。試験管をデカントし、ペレットを1 mLの70％エタノールで洗浄した。試験管をデカントし、ＤＮＡペレットを、30 μlのＴＥ中に再懸濁した。
【０３６１】
5 μlの酵母ＤＮＡ調製物および50 μlの細胞を用いて、エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を実行した。2.0 kV、25 μFおよび400 ohmで、細胞を電気パルス処理した。電気穿孔後、1 mlのＳＯＣ（2％BactoTMトリプトン（Difco, Detroit, MI）、0.5％酵母抽出物（Difco）、10 mMＮａＣｌ、2.5 mMＫＣｌ、10 mMＭｇＣｌ2、10 mMＭｇＳＯ4、20 mMグルコース）を付加し、次に2つのＬＢ  ＡＭＰプレート（ＬＢブロス（Lennox）、1.8％BactoTM寒天（Difco）、100 mg/Lアンピシリン）上の50 μlおよび200 μlアリコート中でプレート化した。
【０３６２】
構築物に関する3つのＤＮＡクローンの挿入物を配列分析に付して、正しい配列を含有する各構築物に関して1つのクローンを選択した。メーカーの使用説明書に従って、市販キット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を用いて、大規模プラスミドＤＮＡを単離した。
【０３６３】
3組の各々の200 μgのＺｃｙｔｏＲ１４［Ｌ２１‐Ｋ４５１］＿Ｔｂｘ＿Ｃ（Ｆｃ９）構築物を別々に、37℃で3時間、200単位のＰｖｕＩで消化し、次にＩＰＡで沈殿させて、1.5 mL微小遠心管中で遠心分離する。上清をデカントしてペレットを得て、ペレットを1 mLの70％エタノールで洗浄して、室温で5分間インキュベートさせた。試験管を微小遠心管中で14,000 rpmで10分間遠心分離して、上清をデカントしてペレットを得た。次にペレットを滅菌環境中の750 μlのＰＦ‐ＣＨＯ培地中に再懸濁して、60℃で30分間インキュベートさせ、室温に冷却させた。５Ｅ６  ＡＰＦＤＸＢ１１細胞を3つの試験管の各々の中で遠心分離して、ＤＮＡ培地溶液を用いて再懸濁した。ＤＮＡ／細胞混合物を0.4 cmギャップ・キュベット中に入れて、以下のパラメーターを用いて電気穿孔した：950 μF、高キャパシタンス、300 V。次にキュベットの内容物を取り出して、プールし、ＰＦ‐ＣＨＯ培地で25 mLに希釈して、125 mL振盪フラスコ中に入れた。120 RPMで振盪しながら、37℃、6％ＣＯ2で振盪器上のインキュベーター中にフラスコを入れた。
【０３６４】
細胞株を栄養選択に付した後、200 nMメトトレキセート（ＭＴＸ）に、次いで1 μMＭＴＸにステップ増幅する。ウエスタンブロットにより発現を確証し、細胞株を拡大し、その後タンパク質精製した。
【０３６５】
実施例９
ＣＨＯ細胞からの可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４の精製
ＺｃｙｔｏＲ１４‐ＴｂＸ‐Ｆｃ９（配列番号６４）を発現するＣＨＯ細胞からの状態調節培地を、2つのBiomax 0.1 m2 30 kD分子量カットオフ膜カセット（Millipore, Bedford, MA）に対してPellicon-II接線流系を用いて約10倍濃縮した。濃縮培地を、氷酢酸でｐＨを5.5に調整し、0.2 m滅菌濾過して、4℃で一晩、バッチクロマトグラフィーにより、プロテインＧセファロースFast Flow樹脂（Pharmacia, Piscataway, NJ）上に負荷した。ｐＨ調整状態調節培地を負荷する前に、5カラム容積（約150 ml）の25 mM酢酸ナトリウム、150 mMＮａＣｌ、ｐＨ5.5で、プロテインＧ樹脂を前平衡させた。濾過、ｐＨ調整、状態調節培地対樹脂の比率は、33:1（v/v）であった。
【０３６６】
周囲温度（約21℃）で、バッチクロマトグラフィーを実施した。バッチ化、ｐＨ調整、0.22 μm濾過、状態調節培地を空の5.5×20.5 cmガラスカラム（BioRad, Hercules, CA）中に注ぎ入れ、重力により詰め込んだ。カラムを10カラム容積（約300 ml）の25 mM酢酸ナトリウム、150 mMＮａＣｌ、ｐＨ5.5で洗浄した。次に結合タンパク質を100 mMグリシン、ｐＨ2.7で溶離した。9.0 ml分画を収集し、直ちに1.0 mlの2.0 Mトリス、ｐＨ8.0で中和した。収集分画をＳＤＳ‐ＰＡＧＥクーマシー染色により分析した。ＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｔｂｘ‐Ｆｃ９を含有する分画をプールし、メーカーの使用説明書に従って5 kD分子量カットオフBiomax膜回転濃縮器（Millipore, Bedford, MA）を用いて、約6倍に濃縮した。
【０３６７】
次にプールした濃縮分画を、7 kD分子量カットオフ膜Slide-A-Lyzer（Pierce, Rockford, IL）を用いて、1×リン酸塩緩衝生理食塩水、ｐＨ7.3（Sigma, St. Louis, MO）に対して、4℃で広範に透析した。1×リン酸塩緩衝生理食塩水、ｐＨ7.3中に処方した場合のＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｔｂｘ‐Ｆｃ９を、0.22 μm濾過した後、アリコート化して、−80℃で貯蔵した。
【０３６８】
実施例１０
ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７ＦとヒトＺｃｙｔｏＲ１４との結合
ヒトＩＬ‐受容体（配列番号２１）、ヒトＺｃｙｔｏＲ１４（配列番号２）またはこれらの受容体の両方をコードする発現ベクターでトランスフェクト化した乳仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を、ビオチニル化ヒトＩＬ‐１７ＡおよびヒトＩＬ‐１７Ｆと結合するそれらの能力に関して査定する。細胞をベルセンを用いて収穫し、計数し、染色培地（ＳＭ）（ＨＢＳＳ＋1 mg/mlウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、10 mMＨｅｐｅｓおよび0.1％アジ化ナトリウム（w/v））中に107細胞／mlに希釈する。ビオチニル化ヒトＩＬ‐１７Ａ（配列番号１４）およびヒトＩＬ‐１７Ｆ（配列番号１６）を、種々の濃度で30分間、氷上で細胞とともにインキュベートする。30分後、過剰サイトカインをＳＭで洗い落とし、フィコエリスリンに接合されたストレプトアビジン（ＳＡ‐ＰＥ）の1:100希釈液を用いて、氷上で30分間、細胞をインキュベートする。過剰ＳＡ‐ＰＥを洗い落とし、細胞をフローサイトメトリーにより分析する。サイトカイン結合量を、サイトカイン染色の平均蛍光強度から定量した。この分析から、ヒトＩＬ‐１７ＡはヒトＩＬ‐１７ＲおよびＺｃｙｔｏＲ１４の両方と同程度に結合する、ということを見出した。さらにまたヒトＩＬ‐１７ＦはＺｃｙｔｏＲ１４と同レベルに結合するが、しかしＩＬ‐１７Ｒは、検出可能であるが、しかしＩＬ‐１７Ａで観察されたよりもかなり低レベルで結合する。
【０３６９】
Ｂ）ビオチニル化サイトカインとヒト末梢血単核球との結合
フィコール密度勾配遠心分離により、全血からヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製した。107細胞/mlのＰＢＭＣを、1 μg/mlのビオチニル化ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆ、ならびに種々の白血球系統を区別するよう設計された特異的細胞表面タンパク質に対する蛍光クロム接合抗体を用いて、同時にインキュベートした。これらのマーカーとしては、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５６およびＣＤ１６が挙げられる。過剰量の抗体およびサイトカインを洗い落とし、上記のようなＳＡ‐ＰＥとともにインキュベートすることにより、特異的サイトカイン結合を検出する。試料をフローサイトメトリーにより分析し、この分析から、ＩＬ‐１７Ａは、検査した事実上すべてのＰＢＭＣ集団と結合するが、しかしヒトＩＬ‐１７Ｆは任意の集団と検出可能的に結合しない、ということを見出した。
【０３７０】
Ｃ）非標識化サイトカインによるビオチニル化ヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの特異的結合の抑制
結合試験を上記と同様に実施するが、しかし過剰量の非標識化ヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆを結合反応中に含める。ＢＨＫ細胞を用いた試験では、非標識化サイトカインの量は、一連の濃度に亘って変わり、そして非標識化ＩＬ‐１７Ａの付加は、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方とＺｃｙｔｏＲ１４およびＩＬ‐１７Ｒの両方との結合に関して競合した、ということが分かる。しかしながら非標識化ＩＬ‐１７Ｆは、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方とＺｃｙｔｏＲ１４との結合に関して競合したが、しかしＩＬ‐１７Ｒとの結合に関しては有効に競合しなかった。これは、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方がＺｃｙｔｏＲ１４と特異的に結合し、そしてそれらが結合に関して交差競合するため、それらは同一であるかまたは重複する部位で有意に結合する、ということを示す。さらにまたＩＬ‐１７ＡはＩＬ‐１７ＦまたはＩＬ‐１７Ｒの相対的に弱い結合に関して競合するが、これは、これら2つのサイトカインがＩＬ‐１７Ｒ中の類似領域とも結合するが、しかしＩＬ‐１７ＦはＺｃｙｔｏＲ１４に比して非常に低い親和性でＩＬ‐１７Ｒと結合することを示す。
【０３７１】
Ｄ）可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４およびＩＬ‐１７Ｒによるビオチニル化ヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの特異的結合の抑制
結合試験を上記と同様に実施するが、但し、可溶性形態のＺｃｙｔｏＲ１４またはＩＬ‐１７Ｒを結合反応中に含める。これらの可溶性受容体は、ヒトＩｇＧ定常（Ｆｃ）領域に融合される各受容体の細胞外ドメイン由来の融合タンパク質である。可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４はヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方とＩＬ‐１７ＲおよびＺｃｙｔｏＲ１４トランスフェクト化ＢＨＫ細胞の両方との結合にを抑制することが分かる。しかしながら可溶性ＩＬ‐１７Ｒは、ＩＬ‐１７Ａといずれかの受容体との結合を抑制するが、しかしＩＬ‐１７ＦとＺｃｙｔｏＲ１４との結合を有効に遮断せず、これはＩＬ‐１７Ｒに関するＩＬ‐１７Ｆの不十分な結合と一致する。
【０３７２】
実施例１１
ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７ＦはＺｃｙｔｏＲ１４と結合する
Ａ）冷却リガンドによる結合抑制
ｈＺｃｙｔｏＲ１４（配列番号２）およびＩＬ‐１７Ｒ（配列番号２１）でトランスフェクトしたＢＨＫ細胞を、24ウエル皿（Costar 3527）中に40,000細胞／ウエルで2日間プレート化した後、検定した。ヨードビーズ法により放射能標識しておいたＩＬ‐１７Ａ（配列番号１４）およびＩＬ‐１７Ｆ（配列番号１６）を、結合緩衝液（ＲＰＭＩ1640培地（ＪＲＨ51502-500Ｍ）＋10mg/mlウシ血清アルブミン（Gibco 15260-037））中の総計250 ul／ウエルを用いて、10 ng/mlで三重反復実験で、別個にウエルに付加した。冷却競合体を100倍モル過剰量で付加した。試験した競合体としては、ＩＬ‐１７Ａ、ＩＬ‐１７Ｂ、ＩＬ‐１７Ｃ、ＩＬ‐１７Ｄ、ＩＬ‐１７Ｅ、ＩＬ‐１７ＦおよびＩＬ‐２１が挙げられる。ウエルを氷上で1時間インキュベートし、その後、2つはＰＢＳ（Invitrogen 20021-027）で洗浄し、1つは高塩溶液（1.5 MＮａＣｌ、50 mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.4）で洗浄した。ウエルを500 ulの0.8 MＮａＯＨで室温で30分間抽出し、計数／分をガンマ計数器（Packard Cobra II A5005）で測定した。
【０３７３】
結果は、100×モル冷却ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆが125ＩＩＬ‐１７ＡとＢＨＫｈＺｃｙｔｏＲ１４との結合を約7倍低減し得たが、一方、ＩＬ‐１７Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＩＬ‐２１は結合に及ぼす作用を全く有さない、ということを示した。100×モル冷却ＩＬ‐１７Ａは、125ＩＩＬ‐１７ＡとＢＨＫＩＬ‐１７Ｒとの結合を約4倍低減したが、一方、ＩＬ‐１７Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＩＬ‐２１は結合に及ぼす作用を全く有さない。100×モル冷却ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆは、125ＩＩＬ‐１７ＦとＢＨＫｈＺｃｙｔｏＲ１４との結合をそれぞれ約4倍および5倍低減したが、一方、ＩＬ‐１７Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＩＬ‐２１は結合に及ぼす作用を全く有さない。
【０３７４】
Ｂ）可溶性受容体による結合抑制：
ｈＺｃｙｔｏＲ１４（配列番号２）およびＩＬ‐１７Ｒ（配列番号２１）トランスフェクト化ＢＨＫ細胞との結合をパート１と同様に実施したが、しかし100倍モル過剰量の可溶性ｈＺｃｙｔｏＲ１４×１／Ｆｃ９（実施例８）および可溶性ＩＬ‐１７Ｒ／Ｆｃ（R&Dから入手；Ref. 177-ＩＲ）を、競合における冷却リガンドの代わりに用いた。パート１の場合と同様に、細胞を洗浄し、抽出して、計数した。
【０３７５】
可溶性ｈＺｃｙｔｏＲ１４／Ｆｃは、125ＩＩＬ‐１７ＦとＢＨＫｈＺｃｙｔｏＲ１４との結合を3つの実験からの10×モル過剰平均のＩＣ50で抑制した。同一細胞株における125ＩＩＬ‐１７Ａの可溶性ｈＺｃｙｔｏＲ１４／Ｆｃ抑制は、20×モル過剰の平均ＩＣ50を示し、そして125ＩＩＬ‐１７Ａの可溶性ＩＬ‐１７Ｒ／Ｆｃ抑制は、20×モル過剰の平均ＩＣ50を示した。
【０３７６】
Ｃ）結合飽和
トランスフェクト化ＢＨＫ細胞を、パート１と同様に、24ウエル皿中にプレート化した。結合緩衝液中の総量250 μl／ウエルを用いて、三重反復実験で、8つの1:3希釈液（1.83 pMの濃度に）において4 nMの濃度で開始して、放射能標識ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆを付加した。別個に、100倍モル過剰量の冷却リガンドを、各希釈時点で付加した。パート１の場合と同様に、細胞を洗浄し、抽出し、計数した。各希釈時点で100倍過剰計数を非競合計数から差し引くことにより、付加した放射能標識リガンドの濃度に対して特定計数／分をプロットした。これらの正規化データをプロットして、放射能標識リガンドおよびトランスフェクト化ＢＨＫ細胞の各組換えに関する飽和結合曲線を作成した。表４は、3つの実験すべてから算定した親和性値を示す。
【０３７７】
【表４】
2008509227.tif 000027
【０３７８】
一部位結合曲線適合度は、ＩＬ‐１７Ｒと結合するＩＬ‐１７Ａ＆ＩＬ‐１７Ｆと最も密接に一致した。二部位結合曲線適合度は、ｈＺｃｙｔｏＲ１４と結合するＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆと最も密接に一致した。高親和性結合部位は、上記の値である。低親和性結合部位は極低親和性を有し、3つの実験間で広範に変化した。
【０３７９】
実施例１２
ネズミＮｉｈ３ｔ３細胞はヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆに応答する
Ａ）細胞プレート化およびｋｚ１４２アデノウイルスレポーター感染
マウス繊維芽細胞に由来するＮｉｈ３ｔ３細胞（ＡＴＣＣで記載）  Ｎｉｈ３ｔ３を、グルタミンを含有し、ピルベートで改良したＤＭＥＭ／10％ＦＢＳを用いて、固体白色細胞培養被覆96ウエルプレート（カタログ番号#3917.Costar）中で5000細胞／ウエルでプレート化し、37℃で5％ＣＯ2で一晩培養した。この第2日目に、プレート化培地を取り出して、5000粒子／細胞の感染多重度のＫｚ142アデノウイルス粒子を、グルタミンを含有し、ピルベートで改良したＤＭＥＭ／10％ＦＢＳ中に調製し、37℃で5％ＣＯ2で一晩培養した。
【０３８０】
Ｂ）ｋｚ１４２アデノウイルスレポーター感染ｎｉｈ３ｔ３細胞のＩＬ‐１７ＡおよびＦ活性化を測定するルシフェラーゼ検定
アデノウイルス粒子レポーターを用いて一晩インキュベーション後、ヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆリガンド処理物を、0.28％ＢＳＡに改良した無血清培地（）中で調製した。アデノウイルス粒子および培地を取り出し、適切なリガンド用量を、三重反復実験で投与した。37℃で5％ＣＯ2でのインキュベーションを4時間継続し、その後、培地を取り出して、細胞を15分間溶解し、ルシフェラーゼ検定系および試薬（カタログ番号#1531, Promega, Medison, WI）ならびにマイクロプレート・ルミノメーターを用いて、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。活性を.1〜1000 ng/mlヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの濃度で検出し、両リガンドに関して約50 ng/mlのＥＣ50値を得た。これらのデータは、ｎｉｈ３ｔ３細胞がこれらのリガンドに対する受容体を保有し、そしてＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７ＦがＮｆＫｂ／Ａｐ‐１転写因子を活性化する、ということを示唆する。
【０３８１】
実施例１３
ネズミＮｉｈ３ｔ３細胞はＩＬ‐１７Ｒ受容体およびＺｃｙｔｏＲ１４受容体の両方に応答する
ｎｉｈ３ｔ３  ＲＮＡのＲＴＰＣＲ分析は、これらの細胞がＩＬ‐１７Ｒ受容体およびＺｃｙｔｏＲ１４受容体の両方に対して陽性であ利、これは、ヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆ媒介に対するそれらのｎｆｋｂ／ａｐ１応答がこれらの受容体の一方または両方により媒介されるのと一致する、ということを実証した。
ＲＴＰＣＲ詳細：
Ａ）マウスｃｙｔｏｒ１４ＰＣＲ
標準方法を用いて、ｎｉｈ３ｔ３細胞から単離した総ＲＮＡから、一次鎖ｃＤＮＡを調製した。HotStarポリメラーゼおよびメーカーの推薦状（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、センスプライマー：
【化２３】
2008509227.tif 000028
およびアンチセンスプライマー：
【化２４】
2008509227.tif 000029
ならびに35サイクルの増幅を用いて、ＰＣＲを適用した。アガロースゲル電気泳動は、予測850 bpサイズの単一の強固なアプリコンを明示した。
【０３８２】
Ｂ）マウスＩＬ‐１７Ｒ  ＰＣＲ
標準方法を用いて、ｎｉｈ３ｔ３細胞から単離した総ＲＮＡから、一次鎖ｃＤＮＡを調製した。HotStarポリメラーゼおよびメーカーの推薦状（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、センスプライマー：
【化２５】
2008509227.tif 000030
およびアンチセンスプライマー：
【化２６】
2008509227.tif 000031
ならびに35サイクルの増幅を用いて、ＰＣＲを適用した。アガロースゲル電気泳動は、予測498 bpサイズの単一の強固なアプリコンを明示した。
【０３８３】
実施例１４
ａｐ１／ｎｆｋｂ転写因子を発現する安定Ｎｉｈ３ｔ３検定クローンの作製
上記のネズミｎｉｈ３ｔ３細胞株を、ネオマイシン選択マーカーを含有するｋｚ１４２  ａｐ１／ｎｆｋｂレポーター構築物で安定的にトランスフェクトした。Ｎｅｏ耐性トランスフェクションプールを、クローン密度でプレート化した。クローニング・リングを用いてクローンを単離氏、そしてヒトＩＬ‐１７Ａリガンドを誘導物質として用いて、ルシフェラーゼ検定によりスクリーニングした。最高平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ａｐ１／ＮｆｋＢルシフェラーゼによる）および最低バックグラウンドを有するクローンを選択した。安定トランスフェクト体細胞株を選択し、ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８と名づけた。
【０３８４】
実施例１５
可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４およびＩＬ‐１７受容体／ＦＣキメラを用いたネズミＮｉｈ３ｔ３細胞中でのヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆによる活性化の抑制
ルシフェラーゼ検定におけるａｐ１／ｎｆｋｂ素子のヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆ活性化のアンタゴニストとして、可溶性形態のＺｃｙｔｏＲ１４またはＩＬ‐１７Ｒを用いた。これらの可溶性受容体は、ヒトＩｇＧ１定常（Ｆｃ）領域に融合された各受容体の細胞外ドメイン由来の融合タンパク質である。可溶性ヒトＩＬ‐１７Ｒ  ＦＣ融合タンパク質を購入した（組換えヒトＩＬ‐１７Ｒ／ＦＣキメラ、カタログ番号177-ＩＲ‐100、R&D Systems, Inc., Minneapolis, Mn）。可溶性ヒトＺｃｙｔｏＲ１４  ＦＣキメラ（ＺｃｙｔｏＲ１４／ＦＣ９）を、上記と同様に構築した。過剰ＺｃｙｔｏＲ１４／ＦＣ９およびヒトＩＬ１７ＲｓＲ／ＦＣキメラは、ネズミｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８検定細胞株のａｐ１／ｎｆｋｂ活性化のヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆ媒介の両方のＥＣ50レベルを抑制する、ということが分かる。
ＺｃｙｔｏＲ１４／ＦＣ９タンパク質はＩＬ‐１７Ｆを拮抗するに際して最大効力を示し、そしてＩＬ１７ＲｓＲ／ＦＣキメラは、ＩＬ‐１７Ａ活性化を拮抗するに際して最大効力を示した。
【０３８５】
実施例１６
ＩＬ‐１７ＦｍＲＮＡは喘息のネズミモデルにおいて上向き調節される
マウスの感作および気道攻撃誘発モデルで、ＩＬ‐１７ＦｍＲＮＡレベルを測定した。マウス（8〜10週齢）の群を、50％Imject 明礬（Pierce）中の10 ugの組換えヤケヒョウダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）アレルゲン１（ＤｅｒＰ１）（Indoor biotechnologies, Cardiff, UK）を、0および7日目に、腹腔内注射することにより感作した。7日後に、50 ulのＰＢＳ中の20 ugのＤｅｒＰ１を用いて、3連続日（14、15および16日目）に、マウスを攻撃誘発した。4匹がこの群を代表した。陰性対照は、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）感作を施した5匹のマウスを含んだ。さらに3匹のマウスには、ＤｅｒＰ１感作とその後のＰＢＳ攻撃誘発を施した。アレルゲン投与または対照攻撃誘発の48時間後に、全肺組織を収穫し、全ＲＮＡを単離した。
【０３８６】
各被験者から同量の総ＲＮＡを用いて、一次鎖ｃＤＮＡを調製した。Qiagen HotStarポリメラーゼ（Qiagen, Valencia, CA）およびメーカーの推薦状を用いて、ＩＬ‐１７ＦＰＣＲを適用した。ＩＬ‐１７ＦＰＣＲは、センスプライマー：
【化２７】
2008509227.tif 000032
およびアンチセンスプライマー：
【化２８】
2008509227.tif 000033
を用いる35サイクルの増幅を利用した。鋳型の質が全被験者間で均一であることを確立するために、ＩＬ‐１７Ｆ増幅に用いられる同一量の各鋳型に、βアクチンＰＣＲを適用した。ＢアクチンＰＣＲは、センスプライマー：
【化２９】
2008509227.tif 000034
およびアンチセンスプライマー：
【化３０】
2008509227.tif 000035
を用いる25サイクルのＰＣＲを包含した。
【０３８７】
ＤｅｒＰ１感作、ＤｅｒＰ１攻撃誘発処置群（喘息模擬実験）からの全4匹のマウスは、強固なＩＬ‐１７Ｆ増幅を示した。逆に、弱ＩＬ‐１７Ｆ増幅が、ＤｅｒＰ１感作／ＰＢＳ攻撃誘発処置群を表わす3被験者のうちの3匹、ならびにＰＢＳ感作／ＰＢＳ攻撃誘発処置群からの5被験者のうちの5匹を含めた陰性対照から観察された。Ｂアクチン増幅は、陰性対照に関しては、喘息模擬実験被験者に関するものと少なくとも同様に強固であったが、これは、弱陰性対照ＩＬ‐１７Ｆ増幅が鋳型問題のためでないことを実証した。
【０３８８】
実施例１７
ＣＯＳ細胞トランスフェクションおよび分泌トラップ
Ａ）Ｃｏｓ細胞トランスフェクションおよび分泌トラップ検定はＺｃｙｔｏＲ１４ｓＲ／Ｆｃ９およびＩＬ‐１７Ｆが受容体／リガンド対であることを示す
分泌トラップ検定を用いて、ヒトＺｃｙｔｏＲ１４（配列番号２）をヒトＩＬ‐１７Ｆ（配列番号１６）と整合させた。可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４ｓＲ／Ｆｃ９融合タンパク質（実施例８）を、分泌検定における結合試薬として用いた。ヒトＩＬ‐１７Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦのｃＤＮＡを含有するＳＶ４０  ｏｒｉ含有発現ベクターを、ＣＯＳ細胞中に一時的にトランスフェクトした。下記の分泌トラップ検定を用いて、ＺｃｙｔｏＲ１４ｓＲ／Ｆｃ９とトランスフェクト化ＣＯＳ細胞の結合を実行した。ＺｃｙｔｏＲ１４ｓＲ／Ｆｃ９の陽性結合は、ヒトＩＬ‐１７Ｆに対して観察されただけであった。これらの結果は、ヒトＺｃｙｔｏＲ１４およびＩＬ‐１７Ｆが受容体／リガンド対である、という新規の知見を実証する。
【０３８９】
Ｂ）ＣＯＳ細胞トランスフェクション
ＣＯＳ細胞トランスフェクションを、以下のように実施した：92 ulの無血清ＤＭＥＭ培地（500 mlのＤＭＥＭ中の55 mgのピルビン酸ナトリウム、146 mgのＬ‐グルタミン、5 mgのトランスフェリン、2.5 mgのインスリン、1 μgのセレンおよび5 mgのフェツイン）中の混合物3 ulプール化ＤＮＡおよび5 ulリポフェクタミンTMを、室温で30分間インキュベートし、次に400 ulの無血清ＤＭＥＭ培地を付加した。この500 ulの混合物を、12ウエル組織培養プレート上にプレート化した1.5×105ＣＯＳ細胞／ウエル上に付加し、37℃で5時間インキュベートする。500 ulの20％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ培地（500 mlのＤＭＥＭ中の100 mlのＦＢＳ、55 mgのピルビン酸ナトリウムおよび146 mgのＬ‐グルタミン）を付加し、一晩インキュベートする。
【０３９０】
Ｃ）分泌トラップ検定
分泌トラップを、以下のように実施した：培地をＰＢＳで細胞洗浄して、次に、ＰＢＳ中の1.8％ホルムアルデヒドで15分間固定した。次に細胞をＴＮＴ（Ｈ2Ｏ中0.1 Mトリス‐ＨＣｌ、0.15 MＮａＣｌおよび0.05％トゥイーン‐２０）で洗浄し、ＰＢＳ中の0.1％トリトン‐Ｘを15分間浸透させて、再びＴＮＴで洗浄した。細胞をＴＮＢ（Ｈ2Ｏ中0.1 Mトリス‐ＨＣｌ、0.15 MＮａＣｌおよび0.5％遮断試薬（NEN Renaissance TSA-Directキット））で1時間遮断し、再びＴＮＴで洗浄した。細胞を、1 μg/mlヒトＺｃｙｔｏＲ１４×１ｓＲ／Ｆｃ９可溶性受容体融合タンパク質細胞とともに1時間インキュベートして、次に、ＴＮＴで洗浄した。細胞を、1:200希釈ヤギ抗ヒトＩｇ‐ＨＲＰ（Ｆｃ特異的）とともにさらに1時間インキュベートした。再び細胞をＴＮＴで洗浄した。
希釈緩衝液で1:50希釈し、4〜6分間インキュベートし、そしてＴＮＴで洗浄したフルオレセインチラミド試薬（ＮＥＮキット）を用いて、陽性結合を検出した。ＴＮＴ中に1:5希釈したベクターフィールド封入培地（Vector Labs Burlingame, CA）を用いて、細胞を保存した。蛍光顕微鏡上でＦＩＴＣフィルターを用いて、細胞を可視化した。
【０３９１】
実施例１８
ネズミ抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナル抗体の生成
Ａ．  抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体の生成のための免疫感作
１．  可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４‐ｍｕＦｃ
隔週スケジュールで、Ｒｉｂｉアジュバント（Sigma）と1:1（v/v）で混合した可溶性ヒトＺｃｙｔｏＲ１４‐ｍｕＦｃタンパク質（実施例２３）25〜50 ugを腹腔内注射することにより、6〜12週齢無傷またはＺｃｙｔｏＲ１４ノックアウトマウスを免疫感作する。3回目の免疫感作後7〜10日目に、眼窩後方放血により血液試料を採取し、血清を収穫して、中和検定におけるＩＬ‐１７またはＩＬ‐１７ＦとＺｃｙｔｏＲ１４との結合を抑制する（例えば本明細書中に記載）、ならびにＦＡＣＳ染色検定においてＺｃｙｔｏＲ１４トランスフェクト化対非トランスフェクト化２９３細胞を染色するその能力に関して評価した。中和力価がプラトーに達するまで、上記のようにマウスを免疫感作し続けて、血液試料を採取し、評価した。その時点で、最高中和力価を有するマウスにＰＢＳ中の可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃタンパク質25〜50 ugを血管内注射した。3日後に、これらのマウスから脾臓およびリンパ節を収穫して、例えばマウス黒色腫（Ｐ３‐Ｘ６３‐Ａｇ8.653.3.12.11）細胞または当該技術分野におけるその他の適切な細胞株を用いて、当該技術分野で既知の標準方法（例えばKearney, J.F. et al., J. Immunol. 123: 1548-50, 1979；およびLane, R.D. J Immunol Methods 81: 223-8, 1985参照）を用いて、ハイブリドーマ生成のために用いた。
【０３９２】
２．  可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４、ＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＨＩＳ、ＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＦＬＡＧ
隔週スケジュールで、Ｒｉｂｉアジュバント（Sigma）と1:1（v/v）で混合した可溶性ヒトＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＨＩＳまたはＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＦＬＡＧ25〜50 ugを腹腔内注射することにより、6〜12週齢無傷またはＺｃｙｔｏＲ１４ノックアウトマウスを免疫感作する。3回目の免疫感作後7〜10日目に、眼窩後方放血により血液試料を採取し、血清を収穫して、中和検定におけるＩＬ‐１７またはＩＬ‐１７ＦとＺｃｙｔｏＲ１４との結合を抑制する（例えば本明細書中に記載）、ならびにＦＡＣＳ染色検定においてＺｃｙｔｏＲ１４トランスフェクト化対非トランスフェクト化２９３細胞を染色するその能力に関して評価した。中和力価がプラトーに達するまで、上記のようにマウスを免疫感作し続けて、血液試料を採取し、評価する。その時点で、最高中和力価を有するマウスにＰＢＳ中の可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４、ＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＨＩＳまたはＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＦＬＡＧ25〜50 ugを血管内注射する。3日後に、これらのマウスから脾臓およびリンパ節を収穫して、例えばマウス黒色腫（Ｐ３‐Ｘ６３‐Ａｇ8.653.3.12.11）細胞または当該技術分野におけるその他の適切な細胞株を用いて、当該技術分野で既知の標準方法（例えばKearney, J.F. et al., J. Immunol. 123: 1548-50, 1979；およびLane, R.D. J Immunol Methods 81: 223-8, 1985参照）を用いて、ハイブリドーマ生成のために用いた。
【０３９３】
３．  ＺｃｙｔｏＲ１４を発現するＰ８１５
1×105の生トランスフェクト化Ｐ８１５細胞、例えばＰ８１５／ＺｃｙｔｏＲ１４細胞の腹腔内注射（例えば2×105細胞／mlの細胞密度で0.5 ml）により、6〜10週齢雌ＤＢＡ／２マウスを免疫感作する。注射前に、細胞を指数増殖期に保持する。注射のために、細胞を収穫し、ＰＢＳで3回洗浄し、次にＰＢＳ中に2×105細胞／mlの密度に再懸濁する。このモデルでは、マウスは2〜3週間以内に腹水腫瘍を発症し、トランスフェクト化標的抗原に対する免疫応答が配備されていない限り、4〜6週までに死に進行する。3週間目に、見かけの腹部腫脹（腹水を示す）を有さないマウスを、2〜3週間間隔で、上記のように再免疫感作する。二次免疫感作後7〜10日目に、眼窩後方放血により血液試料を採取し、血清を収穫して、中和検定におけるＩＬ‐１７またはＩＬ‐１７ＦとＩＬ‐１７またはＺｃｙｔｏＲ１４との結合を抑制する（例えば本明細書中に記載）、ならびにＦＡＣＳ染色検定においてＺｃｙｔｏＲ１４トランスフェクト化対非トランスフェクト化２９３細胞を染色するその能力に関して評価する。中和力価がプラトーに達するまで、上記のようにマウスを免疫感作し続けて、血液試料を採取し、評価する。その時点で、最高中和力価を有するマウスに、1×105の生トランスフェクト化Ｐ８１５細胞を腹腔内注射する。4日後に、これらのマウスから脾臓およびリンパ節を収穫して、例えばマウス黒色腫（Ｐ３‐Ｘ６３‐Ａｇ8.653.3.12.11）細胞または当該技術分野におけるその他の適切な細胞株を用いて、当該技術分野で既知の標準方法（例えばKearney, J.F. et al.、上記；およびLane, R.D.、上記）を用いて、ハイブリドーマ生成のために用いる。
【０３９４】
生トランスフェクト化Ｐ８１５細胞を用いる上記の免疫感作スキームの代替物は、2〜3週間毎の1〜5×106の放射線照射トランスフェクト化細胞の腹腔内注射を包含する。このアプローチでは、腹水を発症し、そして死亡する動物はいない。実際、二次免疫感作後の放血で開始して、上記のようにそれらの血清中のＺｃｙｔｏＲ１４に対する中和免疫応答に関してモニタリングする。一旦中和力価が最大レベルに達したら、最高力価を有するマウスに、5×106の放射線照射細胞の前融合腹腔内注射を施し、そして4日後、これらのマウスからの脾臓およびリンパ節を収穫して、例えばマウス黒色腫（Ｐ３‐Ｘ６３‐Ａｇ8.653.3.12.11）細胞または当該技術分野におけるその他の適切な細胞株を用いて、当該技術分野で既知の標準方法（例えばKearney, J.F. et al.、上記；およびLane, R.D.、上記）を用いて、ハイブリドーマ生成のために用いる。
【０３９５】
Ｂ．  ＺｃｙｔｏＲ１４を結合する、そしてＩＬ‐１７またはＩＬ‐１７ＦとＺｃｙｔｏＲ１４との結合を抑制する抗体に関するハイブリドーマ融合体のスクリーニング
融合後8〜10日目に、ハイブリドーマ上清に関して3つの異なる一次スクリーニングを実施する。一次検定のために、ＨＲＰ接合ヤギ抗マウスκおよび抗λ軽鎖二次ステップ試薬を用いて、ＥＬＩＳＡにより、結合可溶性ヒトＺｃｙｔｏＲ１４、ＺｃｙｔｏＲ１４‐ｍｕＦｃ、ＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＥＥ、ＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＨＩＳまたはＺｃｙｔｏＲ１４‐ＣＦＬＡＧタンパク質を結合して、結合マウス抗体を同定するそれらの能力に関して、上清中の抗体を試験した。ＺｃｙｔｏＲ１４融合タンパク質のＺｃｙｔｏＲ１４部分に関する特異性を実証するために、同一ネズミＦｃ領域（ｍＧ２ａ）、ＥＥ配列、ＨＩＳ配列またはＦＬＡＧ配列と融合された無関連タンパク質に関して、初期検定における陽性上清を評価した。ＺｃｙｔｏＲ１４融合タンパク質と結合するが、無関連ｍｕＦＣまたは融合タンパク質配列を含有する他のタンパク質と結合しない上清中の抗体は、ＺｃｙｔｏＲ１４に特異的であると考えられた。二次検定のためには、ビオチニル化ヒトＩＬ‐１７またはビオチニル化ヒトＩＬ‐１７Ｆの結合を抑制して、結合ＺｃｙｔｏＲ１４‐ｍｕＦｃまたはＺｃｙｔｏＲ１４融合タンパク質をプレート化するそれらの能力に関して、ＥＬＩＳＡにより、すべてのハイブリドーマ上清中の抗体を評価した。
【０３９６】
ＺｃｙｔｏＲ１４と特異的に結合する抗体を含有する全上清を、ＥＬＩＳＡ検定においてそれらがＩＬ‐１７またはＩＬ‐１７ＦとＺｃｙｔｏＲ１４との結合を抑制してもしなくても、その後、ＩＬ‐１７またはＩＬ‐１７ＦとＺｃｙｔｏＲ１４トランスフェクト化Ｂａｆ３またはＢＨＫ細胞あるいは正常ヒト気管支上皮細胞との結合を抑制するそれらの能力に関して試験した。ＩＬ‐１７またはＩＬ‐Ｆ抑制検定のいずれか、あるいはＩＬ‐およびＩＬ‐１７Ｆ抑制検定の両方において中和陽性であるすべての上清を、その後、ＦＡＣＳ分析によりＺｃｙｔｏＲ１４トランスフェクト化対非トランスフェクト化Ｂａｆ３またはＢＨＫ細胞を染色するそれらの能力に関して評価した。この分析は、ＩＬ‐１７またはＺｃｙｔｏＲ１４とのＩＬ‐１７Ｆ結合の抑制が、実際は、ＺｃｙｔｏＲ１４受容体と特異的に結合する抗体によるものである、ということを確証するよう意図された。さらに、ＦＡＣＳ分析は抗ＩｇＧ二次ステップ試薬を用いて実施されるため、特異的ＦＡＣＳ陽性結果は、中和抗体がＩｇＧクラスのものであると考えられた、ということを示す。これらの手段により、プレート結合ＥＬＩＳＡにおいてＺｃｙｔｏＲ１４を結合し、ＥＬＩＳＡベースの抑制検定においてＩＬ‐１７またはＩＬ‐ＦとＺｃｙｔｏＲ１４との結合を抑制し、それぞれＩＬ‐１７およびＩＬ‐１７ＦとＺｃｙｔｏＲ１４トランスフェクト化Ｂａｆ３またはＢＨＫ細胞との相互作用を遮断し、そして抗マウスＩｇＧ二次ステップ試薬によるＺｃｙｔｏＲ１４トランスフェクト化Ｂａｆ３またはＢＨＫ細胞の染色に関して強陽性であるmasterが良好に同定された。
【０３９７】
三次検定は、ＺｃｙｔｏＲ１４を発現し、ＩＬ‐１７Ｆ処理に対して応答してＩＬ‐８またはＩＬ‐６を分泌するよう誘導され得る一次ヒト気管支上皮細胞からなる。これらの細胞によるＩＬ‐１７またはＩＬ‐１７Ｆ刺激性ＩＬ‐８またはＩＬ‐６産生を抑制するその能力により、特異的モノクローナル抗体を検定する。ＩＬ‐８およびＩＬ‐６産生は、上記のようにＩＬ‐１７またはＩＬ‐１７Ｆに応答して検定される。
【０３９８】
あるいはＮＩＨ  ３Ｔ３またはその他のＺｃｙｔｏＲ１４含有細胞におけるＩＬ‐１７またはＩＬ‐１７Ｆ誘導性ルシフェラーゼ産生のモノクローナル抗体；抗ＺｃｙｔｏＲ１４媒介性抑制は、上記の生物活性中和検定のうちの1つとともに、またはその代わりに、用いられ得る。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞におけるＮＦｋＢ媒介性ルシフェラーゼ検定は、本明細書中に記載されている。
【０３９９】
Ｃ）抗ＺｃｙｔｏＲ１４特異的抗体産生ハイブリドーマのクローニング
ＩＬ‐１７およびＩＬ‐１７Ｆと適切にトランスフェクト化されたＢａＦ３またはＢＨＫ細胞との結合を交差中和した特異的抗ＺｃｙｔｏＲ１４  ｍＡｂを産生するハイブリドーマ細胞株を、標準低密度希釈（1細胞／ウエル未満）アプローチによりクローン化する。プレートかの約5〜7日後、例えばプレート結合ヒトＺｃｙｔｏＲ１４‐ｍｕＦｃに関するＥＬＩＳＡと、その後の上記のような無関連ｍｕＦｃ含有融合タンパク質に関するＥＬＩＳＡにより、クローンをスクリーニングする。その上清がＺｃｙｔｏＲ１４‐ｍｕＦｃと結合するが無関連ｍｕＦｃ含有融合タンパク質とは結合しない選択クローンをさらに、中和検定ならびにＦＡＣＳ分析の両方を反復することにより、特異的抗体活性に関して確証する。全選択ＺｃｙｔｏＲ１４抗体陽性クローンを、最低2回クローン化して、組織クローン性を保証し、そして抗体産生の安定性を査定するのを手助けする。好ましくは結果的に生じるクローンの少なくとも95％が中和抗ＺｃｙｔｏＲ１４抗体産生に関して陽性になるまで、上記と同様にさらに何回かクローニングを実施し、スクリーニングする。
【０４００】
Ｄ）抗ＺｃｙｔｏＲ１４ｍＡｂにより認識される分子の生化学的特性化
推定抗ＺｃｙｔｏＲ１４  ｍＡｂにより認識される標的分子ＺｃｙｔｏＲ１４が実際にＺｃｙｔｏＲ１４であるという生化学的確証を、標準免疫沈降と、その後のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析またはウエスタンブロット手法（ともに、ＺｃｙｔｏＲ１４トランスフェクト化対非トランスフェクト化Ｂａｆ３またはＢＨＫ細胞からの可溶性膜調製物を用いる）により、実施する。さらに、ＺｃｙｔｏＲ１４を発現する非トランスフェクト化細胞株の可溶性膜調製物を用いて、ｍＡｂがネイティブ受容体鎖ならびにトランスフェクト化鎖を認識することを示す。あるいは、可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４‐ｍｕＦｃタンパク質を特異的に免疫沈降するかまたはウエスタンブロットするそれらの能力に関して、ｍＡｂを試験する。
【０４０１】
実施例１９
ヒトＺｃｙｔｏＲ１４でトランスフェクトしたＰ８１５細胞を注射したマウスからの血清によるヒトＺｃｙｔｏＲ１４の中和
細胞ベースの中和検定を用いて、生ヒトＺｃｙｔｏＲ１４トランスフェクト化Ｐ８１５細胞（実施例１７）を注射したマウスからの血清を、1％、0.5％、0.25％、0.13％0.06、0.03％、0.02％および0％の連続希釈液として付加する。検定プレートを37℃、5％ＣＯ2で4時間インキュベートし、この時点で、アラマーブルー（Accumed, Chicago, IL）を20 μl／ウエルで付加する。プレートを再び、37℃、5％ＣＯ2で16時間インキュベートする。結果は、動物のうちの4匹からの血清が、ヒトＺｃｙｔｏＲ１４によりｈｕＩＬ‐１７およびｈｕＩＬ‐１７Ｆの両方のシグナル伝達を中和し得る、ということを示した。
【０４０２】
これらのような結果は、例えば本発明のＺｃｙｔｏＲ１４に対する中和モノクローナル抗体によりＩＬ‐１７またはＩＬ‐１７Ｆ活性（個別にまたは一緒に）を結合し、遮断し、抑制し、低減し、拮抗しまたは中和することによりＺｃｙｔｏＲ１４を有効に遮断することが、in vivoでのＩＬ‐１７およびＩＬ‐１７Ｆ（単独でまたは一緒に）の作用を低減するのに有益であり得るし、そしてＩＬ‐１７および／またはＩＬ‐１７Ｆ誘導性炎症、例えばＩＬ‐１７および／またはＩＬ‐１７Ｆにより誘導される乾癬、ＩＢＤ、結腸炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性繊維症またはその他の炎症性疾患、例えばＩＢＤ、関節炎、喘息、乾癬性関節炎、結腸炎、炎症性皮膚症状およびアトピー性皮膚炎を低減し得る、という付加的証拠を提供する。
【０４０３】
実施例２０
抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナル抗体の薬物動態
試験モノクローナル抗体である抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４  ｍＡｂを、例えば約1 mg/mL（280 nMでのＵＶ吸光度により確定）の濃度での、3×3 mLアリコートで提供し、使用するまで−80℃で保存した。ビヒクルは、1×ＰＢＳ（50 mMＮａＰＯ4、109 mMＮａＣｌ）、ｐＨ7.3である。ｍＡｂを使用前に室温で解凍し、アリコート１および２を、それぞれ100 μgＩＶおよびＳＣ用量投与群を提供する場合に用いる。アリコート３の半分を50 μgＳＣ用量投与群用に1×ＰＢＳ中に1:2希釈し、アリコート３の残り半分を10 μgＳＣ用量投与群用に1×ＰＢＳ中に1:10希釈する。メスＳＣＩＤマウス（ｎ＝96）を、Charles River Labsから入手する。動物を到着時に健康に関して検査し、群別に収容する（3匹／ケージ）。マウスは、試験開始時に、12週齢で、平均体重約22 gである。
【０４０４】
Ａ）用量投与プロトコール
雌ＳＣＩＤマウス（ｎ＝24／用量投与群）を、4つの用量投与群に無作為に入れる（表５）。群１には、抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４  ｍＡｂを尾への約93 μLのＩＶ注射により投与し、群２、３および４には、頚部の首筋への約93 μLのＳＣ注射によりｍＡｂを投与する。
【０４０５】
Ｂ）試料収集
血液収集前に、マウスをハロタンまたはイソフルオランで十分に麻酔した。血液試料を全時点に関して心臓スティックにより収集したが、但し、168時間時点では、眼放血により収集し、そして再び同一動物を504時間時点で心臓スティックにより放血させた。血液を血清分離器管中に収集し、15分間凝固させた。試料をその後、14,000 rpmで3分間遠心分離した。遠心分離後、125〜150 uLのアリコートを標識化エッペンドルフ管中に分配し、分析まで、直ちに−80℃で保存した。
【０４０６】
【表５】
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【０４０７】
Ｃ）ＥＬＩＳＡによる血清抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４ｍＡｂ濃度の定量
酵素連結免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を開発し、そして薬物動態試験中の抗ＺｃｙｔｏＲ１４  ｍＡｂを投与した動物からのマウス血清試料を分析するのに適格にする。この検定は、市販の二次抗体およびＴＭＢを用いる比色検定を利用するよう意図される。標準曲線のために用いられる希釈を修正して、標準曲線の線状部分の明確さを改良する。2倍希釈に伴う100 ng/mL〜0.23 ng/mLの範囲の標準曲線は、マウス血清試料の定量を可能にする。ＱＣ試料を、10％ＳＣＩＤマウス血清中に1:100、1:1000および1:10000に希釈し、標準曲線から逆算する。
【０４０８】
Ｄ）薬物動態分析
薬物動態分析のために、血清濃度対時間データを、WinNonlin Professional 4.0ソフトウエア（Pharsight, Inc.; Cary, NC）にダウンロードする。非区画分析を用いて、各時点での平均に基づいた薬物動態パラメーターを確定する。
【０４０９】
実施例２１
抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナル抗体によるＩＬ‐１７およびＩＬ‐１７Ｆ活性の中和
細胞ベースの中和検定を用いて、精製マウス抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナル抗体を、例えば10 μg/ml、5 μg/ml、2.5 μg/ml、1.25 μg/ml、625 ng/ml、313 ng/ml、156 ng/mlおよび78 ng/mlでの連続希釈液として付加する。検定プレートを37℃、5％ＣＯ2で4時間インキュベートし、この時点で、アラマーブルー（Accumed, Chicago, IL）を20 μl／ウエルで付加する。プレートを再び、37℃、5％ＣＯ2で16時間インキュベートする。この検定は、精製抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナル抗体がヒトＺｃｙｔｏＲ１４によりｈｕＩＬ‐１７およびｈｕＩＬ‐１７Ｆの両方のシグナル伝達を中和し得る、ということを実証し得る。非常に有効な抗体に関して、約10 μg/ml濃度で用いる場合、抗体はｈｕＩＬ‐１７またはｈｕＩＬ‐１７Ｆにより誘導される増殖を完全に中和し、増殖の抑制はより低い濃度で用量依存性様式で低減する。上記の濃度で試験されるアイソタイプ整合化ネイティブ対照マウスｍＡｂは、いずれかのサイトカインの増殖の抑制を提供しないと予測される。これらの結果は、ＺｃｙｔｏＲ１４に対するモノクローナル抗体が実際に低濃度で前炎症リガンドＩＬ‐１７およびＩＬ‐１７Ｆの活性を拮抗し得る、ということをさらに実証し得る。
【０４１０】
実施例２２
ＩＬ‐１７Ａはヒト末梢血単核球中の高レベルのＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐αを誘導する
フィコール密度勾配遠心分離により、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を精製し、次に、培地単独、50 ng/ml抗ヒトＣＤ３抗体または50 ng/ml抗ヒトＣＤ３抗体＋1 _g/ml抗ヒトＣＤ２８抗体の組合せ中で、37℃で一晩、インキュベートした。これらの条件の各々に関する同型培養を設定し、無サイトカイン、25 ng/mlヒトＩＬ‐１７Ａまたは25 ng/mlヒトＩＬ‐１７Ｆを投与する。24時間インキュベーション後、各培養からの上清を収穫し、B-D BioscienceのヒトＴｈ／Ｔｈ２血球数測定ビーズアレイ（ＣＢＡ）を用いて、サイトカイン含量に関して検定する。抗ＣＤ３または抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で刺激されていた、そしてＩＬ‐１７Ａを補足されていた培養は、付加されたサイトカインまたはＩＬ‐１７Ｆを受容したものを伴わない培養を上回る有意に高レベルのＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐α（各々3〜5倍増大）を含有する、ということを見出した。抗ＣＤ３刺激を付加しない培養は、サイトカインレベルの有意の変化を示さなかった。さらに、ＩＬ‐１７Ａ付加は、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５およびＩＬ‐１０を含めたＣＢＡを用いて検定される他のサイトカインにおける有意の変化を誘導しなかった。このデータは、ＩＬ‐１７Ａは抗ＣＤ３または抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８を用いて刺激されるＰＢＭＣ培養中のＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐αの産生を増大し得る。
【０４１１】
実施例２３
ＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃはマウスコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける疾患発生率および進行を低減する
10週齢雄ＤＢＡ／１Ｊマウス（Jackson Labs）を13マウス／群の3群に分ける。21日目に、完全フロイントアジュバント（Chondrex, Redmond, WAにより調製）中に処方した1 mg/mlヒヨコＩＩ型コラーゲン50〜100 μlを尾に皮膚内注射し、3週間後、0日目にそれらに同一注射を施すが、但し、不完全フロイントアジュバント中に調製する。ＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃを、0日目から、マウスの大多数が疾患の中等度の症候を示す日までの範囲の異なる時点で、4週間の間、週3回、腹腔内注射として投与する。群は10または100 μgのＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃ／動物／用量投与を摂取し、そして対対照は、ビヒクル対照、ＰＢＳ（Life Technologies, Rockville, MD）を摂取する。動物は二回目のコラーゲン注射後に関節炎の症候を示し始め、ほとんどの動物が1.5〜3週間以内に炎症を発症する。足の厚みを測定するためにカリパスを用いることにより、各足に臨床スコア（0〜3）を割り当てることにより、各足において、疾患の程度を評価する：0＝正常、0.5＝足指（単数または複数）炎症、1＝軽症足炎症、2＝中等度足炎症および3＝重症足炎症（以下で詳述）。
【０４１２】
Ｂ）疾患モニタリング
動物は二回目のコラーゲン注射後直ぐに足指炎症の兆候を示し始め、そして二回目コラーゲン注射の前に足指炎症の兆候を有し始める動物さえ存在することがある。ほとんどの動物が追加免疫注射の1.5〜3週間以内に関節炎を発症するが、しかし長期間を要するものもいる。このモデルにおける疾患発生率は典型的には95〜100％であり、そして0〜2非応答者（観察の6週間後に確定）が典型的には40動物を用いた試験において観察される。炎症が開始すると、可変性の低等級の足または足指炎症の一般的一過性発生が生じ得る、ということに留意されたい。この理由に関しては、動物は顕著な持続性の足腫脹が発症するまで確立された疾患を有すると考えられない。
【０４１３】
全動物を毎日観察して彼等の足の疾患状態を査定するが、これは、足の各々に定性的臨床スコアを割り当てることにより実行される。毎日、各動物を、臨床疾患のその状態によってその4本の足に関してスコアする。臨床スコアを確定するために、足を3つのゾーン、即ち足指、足それ自体（手または足）および手首または足首関節を有すると考える。これらのゾーンに関する炎症の程度および重症度を、以下を含めて留意する：腫脹に関する各足の観察；裂けた爪または足指の赤味；足のいずれかにおける水腫または赤味の任意の証拠の表記；腱または骨の微細解剖学的区分の任意の損失の表記；任意の水腫または赤味に関する手首または足首の評価；ならびに炎症が近位的に足を上昇して拡大する場合の表記。1、2または3という足スコアは、第一に、重症度の全体的印象に、そして第二に、多数のゾーンがどのように包含されるかに基づいている。臨床スコアリングに用いられるスケールを以下に示す。
【０４１４】
Ｃ）臨床スコア
0＝正常
0.5＝1つまたは複数の足指が包含されるが、しかし足指のみが炎症
1＝足（1ゾーン）を包含する軽症炎症、そして単数または複数の足指を含み得る
2＝足における中等度の炎症、そして足指および／または手首／足首（2ゾーン）のいくつかを含み得る
3＝足、手首／足首、そして足指のいくつかまたは全部（3ゾーン）における重症炎症。
【０４１５】
2日間連続で持続する確立された疾患は、足炎症等級2またはそれ以上と定義される。一旦確立された疾患が存在すると、データが記録され、「確立疾患」を有する動物初日と呼ばれる。
【０４１６】
血液を実験を通して収集して、抗コラーゲン抗体の血清レベル、ならびに血清免疫グロブリンおよびサイトカインレベルをモニタリングする。血清抗コラーゲン抗体は、疾患の重症度と良好に相関する。動物を21日目に安楽死させて、血清およびＣＢＳのために血液を収集する。各動物から、一罹患足を組織学用に10％ＮＢＦ中に収集し、そして1つを液体窒素中で凍結指せて、ｍＲＮＡ分析のために−80℃で保存する。さらにまた、1/2脾臓、1/2胸腺、1/2腸間膜リンパ節、1肝葉および左腎をＲＮＡ分析のためにRNAlater中に収集し、そして1/2脾臓、1/2胸腺、1/2腸間膜リンパ節、残りの肝臓および右腎を組織学用に10％ＮＢＦ中に収集する。血清を収集し、免疫グロブリンおよびサイトカイン検定のために−80℃で凍結する。
【０４１７】
全時点でＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃを摂取するマウスの群を、足炎症の開始および／または進行の遅延により特性化する。これらの結果は、ＺｃｙｔｏＲ１４が炎症ならびにこのモデルに関連した疾患活性率および進行を低減し得る、ということを示す。これらの結果はさらに、ＺｃｙｔｏＲ１４‐Ｆｃが血清ＴＮＦａ、ＩＬ‐１ｂおよび抗コラーゲン抗体のレベル低減を生じた、という観察により支持される。
【０４１８】
実施例２４
ａｐ１／ｎｆｋｂ転写因子を発現するネズミ検定細胞株Ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８におけるＺｃｙｔｏＲ１４の安定過剰発現
ネズミｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８検定細胞株を、メトトレキセート耐性遺伝子（ジヒドロフォレートレダクターゼ、ＤＨＦＲ）を有する発現ベクター中のヒトｚｃｙｔｏＲ１４×１（配列番号２）でトランスフェクトした。市販のキットおよびメーカーの推薦状（Mirus, Madison, WI、カタログ番号#MIR218）を用いて、このトランスフェクションを実施した。細胞を1 μM  ｍｔｘ修正増殖培地中に入れて、ヒトｚｃｙｔｏｒ１４Ｘ１導入遺伝子を含有する発現ベクターに関して選択する。選択後、ヒトｚｃｙｔｏＲ１４×１トランスフェクションプールを生成し、ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８／ｈｃｙｔｏｒ１４×１と名づけた。
【０４１９】
Ａ）ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８検定細胞株を用いたルシフェラーゼ検定
ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８は安定ｋｚ１４２レポーターを有するため、このレポーターを付加するためにアデノウイルス感染を必要としない。したがってルシフェラーゼ検定プロトコールを短縮し、以下の方法を実行した：
【０４２０】
１．  細胞プレート化
グルタミンを含有し、ピルビン酸塩で修正したＤＭＥＭ／10％ＦＢＳを用いて、固体白色細胞培養被覆96ウエルプレート（カタログ番号#3917. Costar）中で、5000細胞／ウエルで、ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８細胞をプレート化し、37℃、5％ＣＯ2で一晩培養した。この2日目に、プレーティング培地を除去し、グルタミンを含有し、ピルビン酸塩で修正したＤＭＥＭ／1％ＦＢＳと交換して、37℃、5％ＣＯ2で一晩培養した。
【０４２１】
２．  安定ｋｚ１４２レポーターのＩＬ‐１７ＡおよびＦ活性化を測定するルシフェラーゼ検定
1％ｆｂｓ、ＤＭＥＭ培地中で一晩インキュベーション後、ヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆリガンド希釈液を、ＢＳＡで.28％レベルに修正した無血清培地中で作製した。リガンド希釈液を付加後、細胞を37℃、5％ＣＯ2で4時間インキュベートし、その後、培地を除去し、細胞を15分間溶解し、ルシフェラーゼ検定系および試薬（カタログ番号#1531, Promega, Medison, WI）ならびにマイクロプレート・ルミノメーターを用いて、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。活性を.1〜1000 ng/mlの範囲の濃度で両リガンドに関して検定した。ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８／ｈｃｙｔｏｒ１４×１トランスフェクションプールは、ネズミＩＬ‐１７Ａリガンドに関して親細胞株（実施例１４）の場合と同様の活性を示した。しかしながらｃｙｔｏｒ１４×１トランスフェクト体プールは、これらのリガンド濃度が20 femptogramという低い場合でさえ、ヒトＩＬ‐１７ＡおよびＦに対する応答性増大を示した。ｍＩＬ‐１７Ａシグナル伝達が親細胞株（実施例１４）の場合に匹敵するという事実は、ヒトＺｃｙｔｏＲ１４発現細胞を用いて一般的非特異的問題は存在しないということ、そしてネズミＩＬ‐１７Ａはおそらくは内因性ネズミｎｉｈ３ｔ３細胞ＩＬ‐１７ＲまたはＺｃｙｔｏＲ１４受容体によりシグナル伝達しているということを示唆する。したがってヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆがこのような低リガンド濃度でＭＦＩの増大を引き起こすという事実は、過剰発現ヒトＺｃｙｔｏＲ１４受容体により媒介されるそれらのリガンドに対する細胞の特異的過剰応答性を示し得る。
【０４２２】
この結果は、有意の臨床的および生物学的派生問題を有する。例えば生理学的状況は、ＺｃｙｔｏＲ１４受容体の局所的上向き調節を生じ、これは次に、これらの領域をＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆに対して過応答性にして、ＺｃｙｔｏＲ１４過剰発現を伴わずに、示唆されたものよりはるかに低いリガンド濃度で生物学的活性化を引き起こす。したがって、当業者により従来考えられるかまたは認識されていたよりもはるかに低い受容体レベルが、これらの仮定的により低いリガンド濃度を拮抗するためには十分であり得る。
【０４２３】
実施例２５
ＩＬ‐１７ＦおよびＩＬ‐１７Ａ活性に対するアンタゴニストは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデルにおける疾患発生率および進行を低減する
このモデルは、ＩＢＤ患者からの培養腸組織が、健常対照からの組織と比較して、より高いレベルの炎症媒介物質を産生する、ということを示すよう意図される。炎症媒介物質（例えばＩＬ‐１ｂ、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７ＡおよびＦ、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２３、ＴＮＦ‐ａ、ＩＦＮ‐ｇ、ＭＩＰファミリー成員、ＭＣＰ‐１、Ｇ‐およびＧＭ‐ＣＳＦ等（これらに限定されない））のこの産生増強は、炎症経路および下流エフェクター細胞の活性化に及ぼすそれらの作用（単数または複数）により、ＩＢＤに関連した症候および病態、例えばクローン病（ＣＤ）および潰瘍性結腸炎（ＵＣ）に関与する。次にこれらの経路および構成成分は、in vivoで観察される組織および細胞の損傷／破壊をもたらす。したがってこのモデルは、このＩＢＤの炎症媒介物質増強態様をシミュレートし得る。さらに健常対照からまたはヒト腸上皮細胞（ＩＥＣ）株からの腸組織をこれらの炎症性構成成分の存在下で培養する場合、炎症経路シグナル伝達、ならびに組織および細胞損傷の証拠が観察され得る。
【０４２４】
ヒトＩＢＤにin vivoで有効である治療薬は、炎症媒介物質の産生および／または存在を抑制するかおよび／または中和することにより、上記のex-vivoまたはＩＥＣモデルで作用する。
【０４２５】
このモデルでは、ヒト腸組織をＩＢＤ患者から、または腸生検、切除を受けている健常対照から、あるいは死後組織収集物から収集し、Alexakis等（Gut 53: 85-90; 2004）の変法を用いて処理する。無菌条件下で、試料を多量のＰＢＳで静かに清浄化し、その後、完全組織培地（細菌過剰増殖を防止するために抗生物質をプラス）の存在下で、組織の細分切片を培養する。細分組織の同一プールからの試料を以下のうちの1つで処理する：ビヒクル（ＰＢＳ）；組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ‐１７Ａ；ｒｈＩＬ‐１７Ｆ；またはｒｈＩＬ‐１７Ａ＋ｒｈＩＬ‐１７Ｆ。さらに、これらを、ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆのアンタゴニストを、単独でまたは組合せて（例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４）用いて、または用いずに処理する。この実験プロトコールの後には、ヒトＩＥＣ株を用いた試験を実行するが、但し、細胞は現存ストックから継代される。カラム中で種々の時間（1時間〜数日）後、上清を収集し、炎症媒介物質、例えば上記のもののレベルに関して分析する。ＩＢＤ患者からの試料中またはｒｈＩＬ‐１７Ａおよび／またはＦで処理した試料中では、炎症サイトカインおよびケモカインのレベルは、非処理健常対照組織試料と比較して増大する。ＩＬ‐１７Ｆおよび／またはＩＬ‐１７Ａ活性に対するアンタゴニスト、例えばＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体およびそれに対する抗体、例えば本発明の抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナルおよび中和抗体の付加は、炎症媒介物質の産生を顕著に低減し、したがってヒトＩＢＤに有効であると予測される。
【０４２６】
実施例２６
ＩＬ‐１７ＦおよびＩＬ‐１７Ａ活性に対するアンタゴニストは多発性硬化症（ＭＳ）モデルにおける疾患発生率および進行を低減する
多発性硬化症（ＭＳ）は、多数の因子、例えばリンパ球および単核球炎症浸潤の存在、ならびにＣＮＳ全体を通しての脱髄の存在により媒介されると考えられる複合疾患である。小膠細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）を形成するマクロファージ様細胞であり、損傷または感染時に活性化されるようになる。小膠細胞は、ＭＳを含めた種々のＣＮＳ疾患に重大な役割を演じると関連付けられてきており、疾患の開始、進行および治療のメカニズム（単数または複数）を研究するために用いられ得る（Nagai et al. Neurobiol Dis 8: 1057-1068, 2001；Olson et al. J. Neurosci Methods 128: 33-43, 2003）。固定化ヒト小膠細胞株および／または確立されたヒト星状膠細胞株は、したがって、これらの細胞型に及ぼす炎症媒介物質の作用のうちのいくつか、および中和のためのそれらの能力を試験するために用い得る。炎症媒介物質（例えばＩＬ‐１ｂ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７ＡおよびＦ、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２３、ＴＮＦ‐ａ、ＩＦＮ‐ｇ、ＭＩＰファミリー成員、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ‐１０、ＭＣＰ‐１、Ｇ‐およびＧＭ‐ＣＳＦ等（これらに限定されない））は、炎症経路および下流エフェクター細胞の活性化に及ぼすそれらの作用（単数または複数）によりＭＳに関連した症候および病態に関与し得る。
【０４２７】
ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの前炎症作用、ならびにこれらの作用を中和するかまたは低減するＩＬ‐１７Ｆおよび／またはＩＬ‐１７Ａ活性のアンタゴニスト、例えばＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体およびそれに対する抗体、例えば本発明の抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナルおよび中和抗体の能力を評価するために、培養膠細胞を以下のうちの1つで処理する：ビヒクル；ｒｈＩＬ‐１７Ａ；ｒｈＩＬ‐１７Ｆ；ｒｈＩＬ‐１７Ａ＋ｒｈＩＬ‐１７Ｆ。さらに、これらを、ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆのアンタゴニストを、単独でまたは組合せて（例えば可溶性ＺｃｙｔｏＲ１４）用いて、または用いずに処理する。培養中で種々の時間（1時間〜数日）後、上清および細胞を収集し、炎症媒介物質、例えば上記のもののレベルおよび／または発現に関して分析する。炎症サイトカインおよびケモカインのレベルは、ビヒクル単独で処理した培養と比較して、ｒｈＩＬ‐１７Ａおよび／またはｒｈＩＬ‐１７Ｆの存在下では増大する。ＩＬ‐１７Ｆおよび／またはＩＬ‐１７Ａ活性に対するアンタゴニスト、例えばＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体およびそれに対する抗体、例えば本発明の抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナルおよび中和抗体の付加は、炎症媒介物質の産生および発現を顕著に低減し、したがってヒトＭＳに関連した炎症態様に有効であると予測される。
【０４２８】
実施例２７
ＩＬ‐１７ＦおよびＩＬ‐１７Ａ活性に対するアンタゴニストは慢性関節リウマチ（ＲＡ）および骨関節炎（ＯＡ）モデルにおける疾患発生率および進行を低減する
このモデルは、ＲＡおよびＯＡ患者からのヒト滑膜培養（滑膜マクロファージ、滑膜繊維芽細胞および関節軟骨細胞）および外植片が、健常対照からの培養／外植片と比較して、より高いレベルの炎症媒介物質を産生する、ということを示すよう意図される。炎症媒介物質（例えばオンコスタチンＭ、ＩＬ‐１ｂ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７ＡおよびＦ、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２３、ＴＮＦ‐ａ、ＩＦＮ‐ｇ、ＩＰ‐１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＫＬ、ＭＩＰファミリー成員、ＭＣＰ‐１、Ｇ‐およびＧＭ‐ＣＳＦ、酸化窒素等（これらに限定されない））のこの産生増強は、炎症経路および下流エフェクター細胞の活性化に及ぼすそれらの作用（単数または複数）により、ＲＡおよびＯＡに関連した症候および病態に関与する。次にこれらの経路および構成成分は、炎症性浸潤物、軟骨および基質の損失／破壊、骨損失、ならびにプロスタグランジンおよびシクロオキシゲナーゼの上向き調節をもたらす。したがってこのモデルは、in vitroおよびex-vivo実験におけるＲＡおよびＯＡの破壊的炎症態様をシミュレートし得る。さらに健常対照から外植片および滑膜培養をこれらの炎症性構成成分（例えばオンコスタチンＭ、ＴＮＦ‐ａ、ＩＬ‐１ｂ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１７ＡおよびＦ、ＩＬ‐１５等）のいくつかの存在下で培養する場合、炎症経路シグナル伝達が観察され得る。ヒトＲＡにin vivoで有効である治療薬は、炎症媒介物質の産生および／または存在を抑制するかおよび／または中和することにより、上記のin vitroおよびex-vivoモデルで作用する。
【０４２９】
このモデルでは、ヒト滑膜外植片をＲＡ、ＯＨ患者から、または関節置換を受けている健常対照から、あるいは死後組織収集物から収集し、Wooley and Tetlow（Arthritis Res 2: 65-70; 2000）およびHof等（Rheumatology 39: 1004-1008, 2000）の変法を用いて処理する。滑膜繊維芽細胞、滑膜マクロファージおよび関節軟骨細胞の培養も試験する。同型試料を以下のうちの1つで処理する：ビヒクル（ＰＢＳ）；組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ‐１７Ａ；ｒｈＩＬ‐１７Ｆ；またはｒｈＩＬ‐１７Ａ＋ｒｈＩＬ‐１７Ｆ。いくつかの試料は、＊オンコスタチンＭ、ＴＮＦ‐ａ、ＩＬ‐１ｂ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１７ＡおよびＦ、ならびにＩＬ‐１５の種々の組合せを含有する。さらに、これらを、ＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆのアンタゴニスト、例えばＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体およびそれに対する抗体、例えば本発明の抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナルおよび中和抗体を用いて、または用いずに処理する。培養の種々の時間（1時間〜数日）後、上清を収集し、炎症媒介物質、例えば上記のもののレベルに関して分析する。ＲＡまたはＯＡ患者からの試料中、あるいはｒｈＩＬ‐１７Ａおよび／またはＦ（単独でまたは他の炎症サイトカインと組合せて）で処理した試料中では、炎症サイトカインおよびケモカインのレベルは、非処理健常対照外植片または非処理細胞培養と比較して増大する。ＩＬ‐１７Ｆおよび／またはＩＬ‐１７Ａ活性に対するアンタゴニスト、例えばＺｃｙｔｏＲ１４可溶性受容体およびそれに対する抗体、例えば本発明の抗ヒトＺｃｙｔｏＲ１４モノクローナルおよび中和抗体の付加は、炎症媒介物質の産生を顕著に低減し、したがってヒトＲＡおよびＯＡに有効であると予測される。
【０４３０】
実施例２８
ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆ機能性応答
ＮＩＨ‐３ｔ３／ＫＺ１４２細胞を、ヒトｚｃｙｔｏＲ１４×１（配列番号１）およびマウスｚｃｙｔｏＲ１４×１（配列番号２５）で安定的にトランスフェクトした。上記のように、ＩＬ‐１７Ａ、ＩＬ‐１７Ｆ、ネズミＩＬ‐１７Ｆおよび適切な対照の用量応答で715分間、各株を処理した。ＺｃｙｔｏＲ１４×１（配列番号）をトランスフェクトした場合、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆは、対照株からの固有のシグナル伝達より約30％高い、リン酸化ＩκＢ‐ａおよびｐ３８ＭＡＰＫ転写因子における用量依存性応答を示した。ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆは、ネズミＺｃｙｔｏＲ１４×１（配列番号２５）をトランスフェクトした場合、シグナル伝達増大を示さなかった。ネズミＩＬ‐１７Ｆは、ヒトまたはネズミＺｃｙｔｏＲ１４×１に関するシグナル伝達における増大を示さなかった。
【０４３１】
実施例２９
ネズミ疾患モデルにおけるＩＬ‐１７Ａ、ＩＬ‐１７Ｆ、ＩＬ‐１７ＲおよびＺｃｙｔｏＲ１４発現
疾患の4つのネズミモデル（喘息、ＤＳＳ結腸炎、アトピー性皮膚炎および実験的アレルギー性脳脊髄炎）を、ＩＬ‐１７Ａ、ＩＬ‐１７Ｆ、ＩＬ‐１７ＲおよびＺｃｙｔｏＲ１４の発現に関して、既知の技法を用いて分析した。
【０４３２】
喘息モデルでは、罹患および非罹患マウスにおけるＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆは、肺、脾臓、肺流入領域リンパ節および肺浸潤細胞中の極低〜非検出可能レベルで発現される。ＺｃｙｔｏＲ１４メッセージは、脾臓およびリンパ節と比較して、肺においてより高度に発現されるが、しかし疾患に伴って調節されるわけではないことが判明した。ＩＬ‐１７Ｒは、肺と比較して脾臓および肺流入領域リンパ節でより高度に発現されるが、しかしこれもまた疾患に伴って調節されるわけではなかった。
【０４３３】
喘息モデルと対照して、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆは、近位および遠位結腸の両方でのＤＳＳ‐結腸炎モデルで、罹患マウスにおいては高度に上向き調節されたが、しかし正常マウスではそうではなかった。いずれのサイトカインも、腸間膜リンパ節中で有意に上向き調節されなかった。さらに、両サイトカインの上向き調節は、急性ＤＳＳ誘導性結腸炎の状況では認められるが、慢性ＤＳＳ誘導性結腸炎ではそうではないことが判明した。ＩＬ‐１７Ｒは、近位および遠位結腸と比較して、腸間膜リンパ節中で顕著に発現されるが、しかし疾患に伴って調節されないことが分かった。それに反して、ＺｃｙｔｏＲ１４は、腸間膜リンパ節と比較して、近位および遠位結腸でより高度に発現された。ＺｃｙｔｏＲ１４発現も、疾患に伴って調節されなかった。
【０４３４】
アトピー性皮膚炎では、ＩＬ‐１７Ａ  ｍＲＮＡは検出されなかった。ＩＬ‐１７Ｆは、皮膚および皮膚‐流入域リンパ節中で発現されるが、疾患に伴って有意に調節されるとは思われなかった。ＩＬ‐１７Ｒ  ｍＲＮＡは、皮膚と比較して皮膚‐流入領域リンパ節中でより高度に発現されたが、しかし疾患に伴って調節されることはなかった。ＺｃｙｔｏＲ１４は、皮膚‐流入領域リンパ節と比較して皮膚中でより高度に発現されたが、しかし疾患に伴って調節されることはなかった。
【０４３５】
実験的アレルギー性脳脊髄炎では、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆはともに、罹患マウスにおける脊髄で上向き調節されると思われたが、しかし健常マウスではそうではなかった。ＩＬ‐１７Ｆは、脊髄と比較してリンパ節でより高度に発現されたが、しかしリンパ節中での発現は疾患に伴って調節されなかった。しかしながらこれらの組織中での発現の全体的レベルは、非常に低かった。ＩＬ‐１７Ｒは、脳および脊髄と比較して、リンパ節中でより高度に発現された。ＺｃｙｔｏＲ１４は試験されなかった。
要するに、ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆ発現は、ＤＳＳ誘導性結腸炎および実験的アレルギー性脳脊髄炎モデルの状況では疾患に伴って調節されると思われるが、しかし喘息またはアトピー性皮膚炎に関しては明らかにそうではない。ＩＬ‐１７Ｒおよびｚｃｙｔｏｒ１４発現は、疾患に伴って調節されると思われないが、しかしＩＬ‐１７Ｒ発現は、リンパ系組織中で濃化されると思われ、一方、ｚｃｙｔｏｒ１４発現は非リンパ系組織中で濃化されると思われる。
【０４３６】
実施例３０
ＺｃｙｔｏＲ１４はＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方に対する活性化の媒介物質である
ネズミｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８検定細胞株を、メトトレキセート耐性遺伝子（ジヒドロフォレートレダクターゼ、ＤＨＦＲ）を有する発現ベクター中のヒトｚｃｙｔｏＲ１４×１（配列番号２）でトランスフェクトした。ヒトＩＬ‐１７ＲＡ（配列番号２１）を、同様にこの細胞株中でトランスフェクトした。市販のキットおよびメーカーの推薦状（Mirus, Madison, WI、カタログ番号#MIR218）を用いて、トランスフェクションを実施した。細胞を1 μM  ｍｔｘ修正増殖培地中に入れて、発現構築物を含有する発現ベクターに関して選択する。選択後、トランスフェクションプールを生成し、ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８／ｈｃｙｔｏｒ１４×１およびｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８／ＩＬ‐１７Ｒと名づけた。
【０４３７】
Ａ）ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８ベースの細胞株を用いたルシフェラーゼ検定
ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８は安定ａｐ１／ｎｆｋｂレポーター（ｋｚ１４２）を有するため、このレポーターを付加するためにアデノウイルス感染を必要としない。したがってルシフェラーゼ検定プロトコールを短縮し、以下の方法を実行した：
【０４３８】
１．  細胞プレート化
グルタミンを含有し、ピルビン酸塩で修正したＤＭＥＭ／10％ＦＢＳを用いて、固体白色細胞培養被覆96ウエルプレート（カタログ番号#3917. Costar）中で、5000細胞／ウエルで、細胞をプレート化し、37℃、5％ＣＯ2で一晩培養した。この2日目に、プレーティング培地を除去し、グルタミンを含有し、ピルビン酸塩で修正したＤＭＥＭ／1％ＦＢＳと交換して、37℃、5％ＣＯ2で一晩培養した。
【０４３９】
２．  安定ｋｚ１４２レポーターのＩＬ‐１７ＡおよびＦ活性化を測定するルシフェラーゼ検定
1％ｆｂｓ、ＤＭＥＭ培地中で一晩インキュベーション後、ヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆリガンド希釈液を、ＢＳＡで.28％レベルに修正した無血清培地中で作製した。リガンド希釈液を付加後、細胞を37℃、5％ＣＯ2で4時間インキュベートし、その後、培地を除去し、細胞を15分間溶解し、ルシフェラーゼ検定系および試薬（カタログ番号#1531, Promega, Medison, WI）ならびにマイクロプレート・ルミノメーターを用いて、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。活性を.1〜1000 ng/mlの範囲の濃度で両リガンドに関して検定した。
【０４４０】
下記のＥＣ50は、少なくとも4つの実験の平均である。ｎｉｈ３ｔ３／ｋｚ１４２．８／ｈｃｙｔｏｒ１４×１トランスフェクションプールは、ネズミＩＬ‐１７Ａリガンドに関して、約4 ng/mlのＥＣ50を有する親細胞株（実施例１４）の場合と同様の活性を示した。ｈｃｙｔｏｒ１４×１組換え株におけるｍＩＬ‐１７Ａシグナル伝達が親細胞株（実施例１４）の場合に匹敵するという事実は、ネズミＩＬ‐１７Ａはおそらくは内因性ネズミｎｉｈ３ｔ３細胞ＩＬ‐１７ＲＡまたはｚｃｙｔｏｒ１４受容体によりシグナル伝達しており、そしてｈｃｙｔｏｒ１４×１により細胞を活性化しない、ということを示唆する。しかしながらｈｃｙｔｏｒ１４×１トランスフェクト体プールは、ヒトＩＬ‐１７Ａ処理に対する応答性増大を示し、ＥＣ50は.41 ng/ml対2.8 ng/ml（4実験の平均）（親株）（組換え株の6.8倍のＥＣ50）であった。さらに、ｈＩＬ‐１７ＲＣＸ１組換え株はｈＩＬ‐１７Ｆに対する応答性増強を有し、ＥＣ50は.61 ng/ml（組換え株）対10 ng/ml（親株）であった（組換え株の17倍）。ｈＩＬ‐１７ＲＣＸ１株におけるｈＩＬ‐１７ＡおよびＦに対する効力増大は、ヒトＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの両方に対する高親和性受容体であるヒトｚｃｙｔｏｒ１４×１と一致する。逆に、ｈＩＬ‐１７ＲＡ組換え体株は、ｈＩＬ‐１７Ａに対してのみ感受性増強を示し、ＥＣ50は.6 ng/ml対2.8 ng/ml（親株）であった。ｈＩＬ‐１７ＲＡ組換え体株におけるｈＩＬ‐１７Ｆ  ＥＣ50の増強は認められず、ＥＣは12.4 ng/ml（ＩＬ‐１７Ｆ）対8.9 ng/ml（親株）であった。
【０４４１】
この結果は、それがｈＩＬ‐１７ＡおよびｈＩＬ‐１７Ｆの両方に対する活性化の媒介物質としてのｈｚｃｙｔｏｒ１４×１と特異的に関連するため、有意であり、そしてｈＩＬ‐１７ＲＡがｈＩＬ‐１７Ａ活性化に対してのみシグナル伝達を媒介し、ｈＩＬ‐１７Ｆに対しては媒介しないことを示唆する。
【０４４２】
実施例３１
ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの静脈内投与
種々の時点でのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける全血球数（ＣＢＣ）および血清サイトカイン／ケモカインに及ぼすネズミまたはヒトＩＬ‐１７ＡまたはＩＬ‐１７Ｆの静脈内送達の作用を確定するため。
【０４４３】
1 ug  ｍＩＬ‐１７Ａの静脈内投与は、投与後1〜2時間に、循環好中球（CBCによる）の約2倍増、および血清ＫＣおよびＭＣＰ‐１（Luminexによる）における約10倍増を生じた。これらのケモカインにおける類似の結果は、5 ugのｈＩＬ‐１７Ａを用いて観察された。血中単球レベルも、2時間時点で、1 ugのｍＩＬ‐１７Ａ（最大増大を示した）、5 ｕｇhＩＬ‐１７Ａまたは5 ugｈＩＬ‐１７Ｆで処理したマウスで有意に増大された。ｍおよびｈＩＬ‐１７Ｆの静脈内投与は、1および2時点で血清ＩＬ‐１５の顕著な増大を生じ、そしてこれらの同一時点で、血清ＫＣおよびＭＣＰ‐１の小増大を生じた。
【０４４４】
実施例３２
静脈内投与ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆの中和
サイトカインおよびケモカインの静脈内ＩＬ‐１７ＡおよびＩＬ‐１７Ｆ媒介性増大を中和するために、腹腔内可溶性受容体（ｍＩＬ‐１７ＲＡ：Ｆｃ（ネズミリガンド用）；可溶性ヒトＺｃｙｔｏＲ１４（ヒトリガンド用））を用いた。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＰＢＳ、100 ugのｍＩＬ‐１７ＲＡ：Ｆｃまたは100 ugの可溶性ヒトＺｃｙｔｏＲ１４を、腹腔内注射により投与し、3時間後に、ＰＢＳ；2 ugのｍＩＬ‐１７Ａ、ｍＩＬ‐１７Ｆ、または2 ugのｍＩＬ‐ＡおよびＦの両方（ｍＩＬ‐１７ＲＡ：Ｆｃを摂取したマウス用）；あるいは2 ugのｈＩＬ‐１７Ａ、ｈＩＬ‐１７Ｆ、あるいは2 ugのｈＩＬ‐１７ＡおよびＦの両方（可溶性ヒトＺｃｙｔｏＲ１４を摂取したマウス用）を静脈内尾注射した。血清をリガンド投与の1時間後に収集し、少量の血清サイトカインおよびケモカインに関して分析した。
【０４４５】
腹腔内可溶性受容体で前処置したマウスは、ＰＢＳ＋ＩＬ‐１７Ａで処置したマウスと比較して、ＩＬ‐１７ＡおよびＫＣの血清濃度におけるＩＬ‐１７Ａ媒介性増大の顕著な低減を示した。
【０４４６】
上記から、本発明の特定の実施形態を例証の目的で記載してきたが、本発明の本質および範囲を逸脱しない限り、種々の修正がなされ得る、と理解される。したがって本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、限定されない。
【配列表】
2008509227000001.app
【国際調査報告】
2008509227.tif 000037
2008509227.tif 000038
2008509227.tif 000039
2008509227.tif 000040