(57)【要約】  ｈＴＮＦ−αに特異的に結合するヒト化抗体は、ＣＤＲ（相補性決定領域）グラフト法によってマウス単クローン個体から調製し、それらは本来のマウス単クローン抗体と同等の抗原結合親和性および有意に低い免疫原生を示す。従って、このヒト化抗体は、関節リウマチ、クローン病、乾癬性関節炎、乾癬、敗血症、喘息、ヴェーゲナー肉芽腫症、炎症および強直性脊椎炎のようなｈＴＮＦ−α関連疾患の治療に効果的に用いることができる。
2008525048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）相補性決定領域にそれぞれ下記アミノ酸配列を有する重鎖可変領域、
ＨＹＧＭＮ    ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＲＹＤＥＥＦＫＧ    ＹＤＳＲＧＦＤＣ
（配列番号４１〜４３）；
ｂ）相補性決定領域にそれぞれ下記アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
ＴＡＳＳＳＩＳＹＮＹＦＨ    ＳＳＳＮＬＡＳ    ＨＱＹＥＲＳＰＷＴ
（配列番号４４〜４６）；
ｃ）ヒト抗体の重鎖定常領域と同一な重鎖定常領域；及び
ｄ）ヒト抗体の軽鎖定常領域と同一な軽鎖定常領域
を含む、ヒト腫瘍壊死因子−α（hTNF-α）に特異的なヒト化抗体。
【請求項２】
前記重鎖または軽鎖可変領域におけるＣＤＲを除く骨格領域のアミノ酸配列がヒト抗体から由来することを特徴とする、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
前記ヒト化抗体の抗原結合親和性（Ｋｄ）が１×１０−９Ｍ〜１×１０−１３Ｍであることを特徴とする、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により測定される前記ヒト化抗体の解離定数（Ｋｏｆｆ）が１×１０−６ｓ−１〜１×１０−９ｓ−１であることを特徴とする、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
前記ヒト化抗体の重鎖可変領域が配列番号３６、３７または３８のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
前記ヒト化抗体の重鎖可変領域が配列番号３１、３２または３３のヌクレオチド配列を有するＤＮＡによってコードされることを特徴とする、請求項５に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域が配列番号３９または４０のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域が配列番号３４または３５のヌクレオチド配列を有するＤＮＡによってコードされることを特徴とする、請求項７に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
配列番号３６、３７、または３８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む、ｈＴＮＦ−α抗原に特異的なヒト化抗体の重鎖の発現ベクター。
【請求項１０】
ｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２  ＨＦ、ｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦまたはｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ１ｋ  ＨＦであることを特徴とする、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
配列番号３９または４０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む、ｈＴＮＦ−α抗原に特異的なヒト化抗体の軽鎖の発現ベクター。
【請求項１２】
ｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２  ＬＦまたはｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦであることを特徴とする、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項９または１１に記載の発現ベクターで形質転換された大腸菌細胞。
【請求項１４】
ＴＯＰ１０Ｆ／ｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２  ＨＦ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０６９１ＢＰ）、ＴＯＰ１０Ｆ／ｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０６９２ＢＰ）、ＴＯＰ１０Ｆ／ｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ１ｋ  ＨＦ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０８１８ＢＰ）、ＴＯＰ１０Ｆ／ｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２  ＬＦ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０６９０ＢＰ）またはＴＯＰ１０Ｆ／ｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０８１７ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１３に記載の大腸菌細胞。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれか一項に記載のヒト化抗体を含む医薬組成物であって、関節リウマチ、クローン病、乾癬性関節炎、乾癬、敗血症、喘息、ヴェーゲナー肉芽腫症、炎症及び強直性脊椎炎からなる群より選択されるｈＴＮＦ−α関連疾病の治療のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト腫瘍壊死因子−α（human tumor necrosis factor-α）に特異的なヒト化抗体及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腫瘍壊死因子−α（以下、「ｈＴＮＦ−α」という）は、３個の１７ｋＤａタンパク質サブユニットで構成されたホモ三量体（ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒ）である（Ｅｃｋ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ，２６７；２１１９−２１２２，１９９２；Ｓｍｉｔｈ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ，２６２；６９５１−６９５４，１９８７）。ｈＴＮＦ−αは、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）及び単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）などから分泌される炎症性サイトカイン（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であって、細胞壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）及びアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）などの細胞反応における信号伝達者として作用する（Ｂｅｙａｅｒｔ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，３４０；９−１６，１９９４）。ｈＴＮＦ−αは、前炎症性作用を引き起こして組職の破壊、例えば、軟骨及び骨の分解（Ｓａｋｌａｔｖａｌａ  Ｊ，Ｎａｔｕｒｅ，３２２；５４７−５４９，１９８６）、接着分子の誘導、血管内皮細胞における前凝集活性の誘導（Ｐｏｂｅｒ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３６；１６８０−１６８７，１９８６）、好中球及びリンパ球の接着増加（Ｐｏｂｅｒ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８；３３１９−３３２４，１９８７）などをもたらす。また、ｈＴＮＦ−αは、感染性疾患及び腫瘍に対する防御機構における重要な役割を果たすものと知られている（Ｆｉｅｒｓ  Ｗ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，２８５；１９９−２１２，１９９１）。
【０００３】
ｈＴＮＦ−αは、炎症性疾患、自己免疫疾患、バクテリア感染、癌及び退行性疾患などに関係している。このような疾患のうち、ｈＴＮＦ−αは関節リウマチ、クローン病、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎などの特定の生理学的治療のために有用な標的タンパク質として認識されてきた。
【０００４】
一方、関節リウマチを治療する目的としてｈＴＮＦ−α阻害剤を用いることも示唆されている。初期の関節リウマチから得られた滑膜細胞でｈＴＮＦ−αが過剰発現され（Ｂｕｃｈａｎ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，７３；４４９−４５５，１９８８）、前記滑膜細胞を抗ｈＴＮＦ−α単クローン抗体で処理した結果、関節リウマチに関与するサイトカインが減少したことが報告された（Ｂｕｔｌｅｒ  ＤＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ，６；２２５−２３０，１９９５）。更に、コラーゲン誘導マウス関節炎モデルにおいても抗ｈＴＮＦ−α抗体または組み換え水溶性ｈＴＮＦ−α受容体が関節の炎症及び損傷を抑制するということが確認された（Ｐｉｇｕｅｔ  ＰＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７７；５１０−５１４，１９９２；Ｗｏｏｌｅｙ  ＰＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１；６６０２−６６０７，１９９３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＲＯ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８４；４３３−４３９，１９９５）。また、ｈＴＮＦ−αを過剰発現するトランスジェニックマウスにおいても炎症性関節炎が誘導されることが観察された（Ｋｅｆｆｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１０；４０２５−４０３１，１９９１）。
【０００５】
前記の結果は、ｈＴＮＦ−αが関節リウマチにおける炎症性サイトカインを直接または間接的に調節する調節因子として重要な役割を果すことを意味する。従って、関節リウマチを治療するためにｈＴＮＦ−αに対する高い選択性及び反応性を有する単クローン抗体を開発することが求められている。
【０００６】
通常、特定抗原に対して高い選択性及び反応性を有する抗体は、抗原を用いたマウスの免疫化（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）によって得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６；４９５−４９７，１９７５）。マウス単クローン抗体は、抗原に対する高い反応性を有する抗体を作製且つ選別することが容易であるという長所がある。しかし、長期間投与すれば人体に抗マウス抗体が形成されるという問題がある（Ｄｉｍａｇｇｉｏ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆ，１１；１７７−２０３，１９９０）。
【０００７】
マウス単クローン抗体に対する前記のような問題点を解消するために、抗原結合部位以外の骨格領域をヒト抗体の骨格と置換したヒト化抗体が開発されている。このようなヒト化抗体を作製する方法としてマウス抗体の相補性決定領域(CDR；complementarity determining region)のみをヒト抗体に移植するＣＤＲグラフト（ｇｒａｆｔｉｎｇ）法が現在用いられている。前記ＣＤＲグラフトによって作製されたヒト化抗体は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の免疫反応を弱化させるという長所があるが（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２；３２３−３２７，１９８８；Ｎａｋａｔａｎｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７；４３５−４４３，１９９４）、本来のマウス抗体の高い選択性及び反応性が失われるケースが多い（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９；４２８５−４２８９，１９９２）。
【０００８】
本発明者らは、従来のヒト化抗体に係る前記のような諸問題点を解消すべく鋭意研究を重ねた結果、本来のマウス単クローン抗体と同程度の抗原結合親和性及び最小化された免疫反応を示す、ｈＴＮＦ−αに特異的に結合する新規なヒト化抗体を開発し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
［発明の概要］
本発明の目的は、ｈＴＮＦ−αに特異的なヒト化抗体を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記ヒト化抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ、及び前記ＤＮＡを含む発現ベクターを提供することである。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、前記発現ベクターで形質転換された微生物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、前記ヒト化抗体を活性成分として含む、ｈＴＮＦ−α関連疾患治療用の医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一側面に従い、本発明は、以下を含むｈＴＮＦ−αに特異的なヒト化抗体を提供する：
ａ）相補性決定領域にそれぞれ下記アミノ酸配列を有する重鎖可変領域、
ＨＹＧＭＮ    ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＲＹＤＥＥＦＫＧ    ＹＤＳＲＧＦＤＣ
（配列番号４１〜４３）；
ｂ）相補性決定領域にそれぞれ下記アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
ＴＡＳＳＳＩＳＹＮＹＦＨ    ＳＳＳＮＬＡＳ    ＨＱＹＥＲＳＰＷＴ
（配列番号４４〜４６）；
ｃ）ヒト抗体の重鎖定常領域と同一の重鎖定常領域；及び
ｄ）ヒト抗体の軽鎖定常領域と同一の軽鎖定常領域。
【００１４】
［発明の詳細な説明］
本発明のヒト化抗体における、重鎖または軽鎖可変領域のＣＤＲは、マウス単クローン抗体から由来し、重鎖及び軽鎖定常領域のみならず、前記ＣＤＲを除く他の骨格領域はヒト抗体から由来する。好ましくは、本発明のヒト化抗体の抗原結合親和性（Ｋｄ）は、１×１０−９Ｍ〜１×１０−１３Ｍである。また、本発明のヒト化抗体の解離定数（Ｋｏｆｆ）は、表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍａ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）による測定値が１×１０−６ｓ−１〜１×１０−９ｓ−１の範囲である。
【００１５】
本発明によるヒト化抗体は、ｈＴＮＦ−αに特異的なマウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０５１４ＢＰ及び１０５１５ＢＰ）からＣＤＲグラフト法によって作製することができ、この時、マウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４の重鎖可変領域は、配列番号４１〜４３の３個のＣＤＲを含み、軽鎖可変領域は配列番号４４〜４６の３個のＣＤＲを含む。
【００１６】
まず、前記マウス単クローン抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を遺伝子銀行データベース（ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ）のヒトアミノ酸配列と比較してマウス抗体重鎖と最も高い配列相同性を有する、カバット（Ｋａｂａｔ）の定義によるヒト重鎖可変領域のサブグループ１（Ｈｈ１）、及びマウス抗体軽鎖と最も類似するヒト軽鎖カッパ可変領域のサブグループ１（Ｈｋ１）を選別した（Ｈａｒｒｉｓ  Ｌ  ＆  Ｂａｊｏｒａｔｈ  Ｊ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４；３０６−３１０，１９９５）。
【００１７】
ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子は、前記選別されたヒト遺伝子を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用して増幅することができる。この段階において、ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖をコードする各ヌクレオチド配列は、周知の遺伝子分析情報及び抗体構造分析情報に基づいて適宜修飾できる。また、マウス単クローン抗体の特定のアミノ酸残基が抗原結合親和性に影響を及ぼすか、或いは抗体構造を維持するに重要であれば、前記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を変形することなく、保持することが望ましい（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄ．Ｈ．Ｈ．Ｓ．Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ（ＮＩＨ）９１−３２４２，１９９１；Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２；８７７−８８３，１９８９；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ＧＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７；８０５−８１４，１９９４；Ｈａｒｒｉｓ  Ｌ  ＆  Ｂａｊｏｒａｔｈ  Ｊ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４；３０６−３１０，１９９５）。
【００１８】
ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子は、ｈＴＮＦ−αに特異的に結合するマウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４の重鎖可変領域の遺伝子における抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を除く骨格領域をヒト抗体の重鎖サブグループ１（Ｈｈ１）で置換して作製することができる。このようなヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子は、マウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４の重鎖をコードする遺伝子を鋳型に用いてマウス単クローン抗体をヒト化させるためのプライマーを設計する段階；相応するプライマーを用いてＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行う段階；及びこのように増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素及びＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を用いて連結させる段階を含む工程を用いて作製することができる。このように作製されたヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子をＴＮＨＶ２（配列番号３１）、ＴＮＨＶ２ｋ（配列番号３２）、及びＴＮＨＶ１ｋ（配列番号３３）と各々称し、これらはそれぞれ配列番号３６、３７及び３８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする（図１参照）。
【００１９】
前記ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子を含むヒト化抗体の重鎖全長をコードする遺伝子を作製するために、前記遺伝子ＴＮＨＶ２、ＴＮＨＶ２ｋまたはＴＮＨＶ１ｋを適宜なベクター、例えばＴＯＰＯベクター（ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）に挿入して発現ベクターｐＣＲ−ＴＮＨＶ２  Ｈｖ、ｐＣＲ−ＴＮＨＶ２ｋ  Ｈｖ、及びｐＣＲ−ＴＮＨＶ１ｋ  Ｈｖを作製する。ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子断片を発現ベクターｐＣＲ−ＴＮＨＶ２  Ｈｖ、ｐＣＲ−ＴＮＨＶ２ｋ  Ｈｖ、またはｐＣＲ−ＴＮＨＶ１ｋ  Ｈｖから単離し、ヒト抗体の重鎖定常領域をコードする遺伝子を含む発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＣ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０２２９ＢＰ、韓国特許公開公報第２００４−１２２６６号）に挿入してヒト化抗体重鎖の発現ベクターを得る。このように作製された発現ベクターをｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２  ＨＦ、ｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦ、及びｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ１ｋ  ＨＦと各々称する。
【００２０】
特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約により、発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２  ＨＦ、及びｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦで形質転換された大腸菌(E.coli)ＴＯＰ１０Ｆ’形質転換体は、２００４年９月１日付でそれぞれ寄託番号ＫＣＴＣ  １０６９１ＢＰ、及びＫＣＴＣ  １０６９２ＢＰとして韓国遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）（住所：３０５−３３３韓国大田市儒城区魚隱洞５２韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ））に寄託され、発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ１ｋ  ＨＦで形質転換された大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’形質転換体は、２００５年６月１３日付で寄託番号ＫＣＴＣ  １０８１８ＢＰとしてＫＣＴＣに寄託された。
【００２１】
ヒト化抗体の重鎖全長をコードする遺伝子は、重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２  ＨＦ、ｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦ、及びｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ１ｋ  ＨＦから単離することができ、これらをそれぞれＴＮＨＶ２  ＨＦ、ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦ、及びＴＮＨＶ１ｋ  ＨＦと称する。
【００２２】
ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子は、ｈＴＮＦ−αに特異的に結合するマウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４の軽鎖可変領域における抗原結合部位を除く骨格領域をヒト抗体の軽鎖サブグループ１（Ｈｋ１）に置換して作製することができる。このようなヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子は、マウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４の軽鎖をコードする遺伝子を鋳型として用いてマウス単クローン抗体をヒト化させるためのプライマーを設計する段階；相応するプライマーを用いてＰＣＲを行う段階；及びこのように増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて連結させる段階を含む工程を用いて作製することができる。このように作製されたヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を各々ＴＮＬＶ２及びＴＮＬＶ２ｄと称し、これらはそれぞれ配列番号３９及び４０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする（図２参照）。
【００２３】
前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むヒト化抗体の軽鎖全長をコードする遺伝子を作製するために、遺伝子ＴＮＬＶ２またはＴＮＬＶ２ｄを適宜なベクター、例えばＴＯＰＯベクターに挿入して発現ベクターｐＣＲ−ＴＮＬＶ２  Ｌｖ及びｐＣＲ−ＴＮＬＶ２ｄ  Ｌｖを作製する。前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子をｐＣＲ−ＴＮＬＶ２  ＬｖまたはｐＣＲ−ＴＮＬＶ２ｄ  Ｌｖから分離し、ヒト抗体の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を含むベクターｐＨＡＢ−ＫＣ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０２３０ＢＰ、韓国特許公開公報第２００４−１２２６８号）に挿入してヒト化抗体の軽鎖の発現ベクターを得る。このように作製されたヒト化発現ベクターを各々ｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２  ＬＦ及びｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦと称する。
【００２４】
特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約により、発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２  ＬＦで形質転換された大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’形質転換体は、２００４年９月１日に寄託番号ＫＣＴＣ  １０６９０ＢＰとしてＫＣＴＣに寄託され、発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦで形質転換された大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’形質転換体は２００５年６月１３日にＫＣＴＣ  １０８１７ＢＰとしてＫＣＴＣに寄託された。
【００２５】
ヒト化抗体の軽鎖全長をコードする遺伝子は、軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２  ＬＦ及びｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦから単離することができ、これらをそれぞれＴＮＬＶ２  ＬＦ及びＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦと称する。 
【００２６】
ＣＨＯ細胞株をジーン・ポーター（ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ、ＧＴＳ社製、米国）のような適宜な形質転換溶液を用いてヒト化重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２  ＨＦ及びヒト化軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２  ＬＦで形質転換させてＴＮＦ−αに特異的なヒト化抗体を生産する形質転換体を得ることができ、前記形質転換体は、ＣＨＯ−ＹＨＢ１４０６と称する。また、他の形質転換体はヒト化重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦ及びヒト化軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２  ＬＦまたはｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦを使用して前記と同様な方法で作製することができる。このような形質転換体は、各々ＣＨＯ−ＹＨＢ１４１１及びＣＨＯ−ＹＨＢ１４１１−２と称する。また、他の形質転換体は、ヒト化重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ１ｋ  ＨＦ及びヒト化軽鎖発現ベクターＨＡＢ−ＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦを使用して前記と同様な方法で作製することができ、これをＣＨＯ−ＹＨＢ１４０６−２と称する。
【００２７】
前記形質転換細胞株から本発明のヒト化抗体を精製するために、形質転換体ＣＨＯ−ＹＨＢ１４０６、ＣＨＯ−ＹＨＢ１４１１、ＣＨＯ−ＹＨＢ１４１１−２、またはＣＨＯ−ＹＨＢ１４０６−２を適切な培養培地で培養させることができ、それによって得られた培養液上澄をプロテイン−Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製，スウェーデン）またはヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ，Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，米国）を用いるカラムクロマトグラフィーで分離精製することができる。このように精製されたヒト化抗体は、それぞれＹＨＢ１４０６、ＹＨＢ１４１１、ＹＨＢ１４１１−２、及びＹＨＢ１４０６−２と称する。
【００２８】
前記ヒト化抗体の抗原結合親和性は、例えば、競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）ＥＬＩＺＡ、固相（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ）ＥＬＩＺＡ、または表面プラズモン共鳴法によって決定することができる。ｈＴＮＦ−αに特異的に結合するヒト化抗体ＹＨＢ１４０６、ＹＨＢ１４１１、ＹＨＢ１４１１−２、及びＹＨＢ１４０６−２は、１×１０−９〜１×１０−１３Ｍの範囲の抗原結合親和性を示し、これは本発明のヒト化抗体が本来のマウス単クローン抗体と同等の抗原結合能を保持するが、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）は格段に低いので、ｈＴＮＦ−α関連疾患の治療に有用であるということを示す。なお、ＳＰＲによって測定した本発明のヒト化抗体の解離定数（Ｋｏｆｆ）は、１×１０−６ｓ−１〜１×１０−９ｓ−１の範囲であり、これは抗原−抗体複合体の極めて低い解離度を意味する。
【００２９】
このような目的を達成するために、本発明のヒト化抗体は関節リウマチ、クローン病、乾癬関節炎、乾癬、敗血症、喘息、ヴェーゲナー肉芽腫症、炎症、及び強直性脊椎炎などのｈＴＮＦ−α関連疾患を治療するための医薬組成物の有効成分として用いることができる。
【００３０】
本発明の医薬組成物は、当業界に周知のあらゆる方法を用いて、患者に投与後、有効成分の速放性、徐放性または遅延放出を提供するように製剤化することができる。前記組成物は、製薬的に許容される賦形剤、希釈剤、充填剤、崩壊剤、甘味剤、潤滑剤及び風味剤を含むことができる。前記医薬組成物は、ボーラス注入法（ｂｏｌｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）または徐放性点滴（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｄｒｉｐ）による静脈内投与のために、或いは埋め込みカプセル（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｃａｐｓｕｌｅ）から放出させるように製剤化することができる。静脈内投与のための通常の製剤化に生理食塩水を希釈剤として用いる。
【００３１】
患者に実際に投与する本発明の抗体の用量は、投与する特異的抗体、組成物の投与時間及び剤形、投与経路、治療されるべき疾患、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌などを含む様々な関連要素を考慮して決定すべきである。本発明の医薬組成物の一般的な投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜１，０００ｍｇ／ｋｇ／日である。より一般的には、前記投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００３２】
［実施例］
次に、本発明を下記の実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００３３】
ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子の作製
鋳型としてのＴＮＦ−αに特異的なマウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０５１４ＢＰ及び１０５１５ＢＰ）の重鎖可変領域をコードする遺伝子及び配列番号１と配列番号１４のプライマーの対を用いてＰＣＲを行なうことによりリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が含まれたヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子Ａを増幅した。増幅されたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った後、キアゲル抽出キット（ＱＩＡｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ社製，米国）を用いて前記ゲルから回収した。
【００３４】
このように得られた遺伝子Ａを対象に配列番号１及び７、または配列番号６及び１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、その結果得られたＤＮＡ断片と配列番号１及び１４のプライマー対とを利用してオーバラップ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行った。増幅されたＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクター（ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，米国）と共に常温で４５分間反応させてクローニングした後、クローニングされたベクターで大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，米国）を形質転換させた。形質転換された大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地で培養した後、前記大腸菌からプラスミドを回収し、これをＥｃｏＲＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社製，米国）で切断して約４５０ｂｐの重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｂを得た。
【００３５】
前記遺伝子Ｂを鋳型にして、配列番号１及び９、または配列番号８及び１４のプライマー対を用いたＰＣＲを行ってＤＮＡ断片を増幅し、その結果得られたＤＮＡ断片と配列番号１及び１４のプライマー対とを用いてオーバラップＰＣＲを行った。前記と同様に、増幅されたＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングした後、ＥｃｏＲＩで切断して重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｃを得た。
【００３６】
前記と同様な方法で、遺伝子Ｃを対象に配列番号１及び１１または配列番号１０及び１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりＤＮＡ断片を増幅し、その結果得られたＤＮＡ断片と配列番号１及び１４のプライマー対とを用いてオーバラップＰＣＲを行った。このようにして得られたＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングして重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｄを得た。前記遺伝子Ｄを対象に配列番号４及び１４、または配列番号１及び５のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによってＤＮＡ断片を増幅させ、その結果得られたＤＮＡ断片と配列番号１及び１４のプライマー対とを用いてオーバラップＰＣＲを行った。前記と同様な方法で、このように得られたＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングして重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｅを得た。
【００３７】
また、遺伝子Ｅを鋳型にし、配列番号１及び３または配列番号２及び１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりＤＮＡ断片を増幅し、その結果得られたＤＮＡ断片と配列番号１及び１４のプライマー対とを用いてオーバラップＰＣＲを行った。前記と同様な方法で、前記ＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングして重鎖可変領域をコードする遺伝子ＴＮＨＶ２（配列番号３１）を得て、ＴＮＨＶ２が挿入されたＴＯＰＯベクターをｐＣＲ−ＴＮＨＶ２  Ｈｖと命名した。
【００３８】
前記と同様な方法で、ＴＮＨＶ２を鋳型にし、配列番号１及び１３、または配列番号１２及び１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりＤＮＡ断片を増幅させ、その結果得られたＤＮＡ断片と配列番号１及び１４のプライマー対とを用いてオーバラップＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングして重鎖可変領域をコードする遺伝子を得、この遺伝子をＴＮＨＶ２ｋ（配列番号３２）と命名し、遺伝子ＴＮＨＶ２ｋが挿入されたＴＯＰＯベクターをｐＣＲ−ＴＮＨＶ２ｋ  Ｈｖと称する。
【００３９】
また、前記と同じ方法で、遺伝子ＴＮＨＶ２ｋを鋳型にし、配列番号１及び１５のプライマー対を用いるＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングして重鎖可変領域をコードする遺伝子を得、この遺伝子をＴＮＨＶ１ｋ（配列番号３３）と命名し、ＴＮＨＶ１ｋが挿入されたＴＯＰＯベクターをｐＣＲ−ＴＮＨＶ１ｋ  Ｈｖと称した。
【００４０】
各ＰＣＲ反応に用いられたプライマー対及び反応条件を表１に示す。各ＰＣＲ反応は、９５℃で７分間前処理した後、下記表１に示した条件下で３０回行い、７２℃で１０分間反応させて終結させた。
表１
【表１】
2008525048.tif 000003
【実施例２】
【００４１】
ヒト化抗体の重鎖全長遺伝子及びその発現ベクターの作製
前記実施例１で作製したｐＣＲ−ＴＮＨＶ２  Ｈｖベクターに挿入された重鎖可変領域をコードする遺伝子を用いてヒト化重鎖全長をコードする遺伝子を作製するために、ヒト抗体の重鎖定常領域をコードする遺伝子を含むｐＨＡＢ−ＨＣ（ＫＣＴＣ  １０２２９ＢＰ，韓国特許公開公報第２００４−００１２２６６号）ベクターを用いた。
【００４２】
まず、ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子ＴＮＨＶ２を発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＣに挿入するために、ｐＣＲ−ＴＮＨＶ２  ＨｖをＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社製，米国）を用いて３７℃で２時間処理した後１．５％のアガロースゲル電気泳動を行い、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ，ＥｔＢｒ）で染色して約４５０ｂｐの遺伝子断片を確認した。
【００４３】
また、ｐＨＡＢ−ＨＣを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩで処理し、電気泳動後染色して約６．５Ｋｂの切断されたベクターを確認した。その後、前記観察された遺伝子をキアゲル抽出キット（ＱＩＡｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ社製，米国）を用いてゲルから回収した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ，ＢｉｏＬａｂｓ社製，米国）を用いて１６℃で一晩中処理し、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換させて形質転換体を得た。前記形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地で一晩中培養した後、プラスミドを単離した。単離されたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩで処理した後にアガロースゲル電気泳動を行って約１．４Ｋｂのヒト化抗体の重鎖全長遺伝子を得た。
【００４４】
このように作製されたヒト化抗体の重鎖全長遺伝子をＴＮＨＶ２  ＨＦと命名する。また、ＴＮＨＶ２  ＨＦが挿入された発現ベクターをｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２  ＨＦと称し（図３）、それを用いて大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換して得られた形質転換体を２００４年９月１日付で韓国生命工学研究院の遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）（住所：３０５−３３３韓国大田市儒城区魚隱洞５２韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ））に寄託番号ＫＣＴＣ  １０６９１ＢＰで寄託した。
【００４５】
前記と同様な方法で、ヒト化抗体の重鎖全長遺伝子をＴＮＨＶ２ｋまたはＴＮＨＶ１ｋを用いて作製し、このように作製されたヒト化抗体の重鎖全長遺伝子を各々ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦまたはＴＮＨＶ１ｋ  ＨＦと命名する。また、前記重鎖全長遺伝子ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦまたはＴＮＨＶ１ｋ  ＨＦが挿入されたヒト化抗体の重鎖発現ベクターを各々ｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦまたはｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ１ｋ  ＨＦと称し（図４）、これを用いて形質転換された大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’を各々２００４年９月１日または２００５年６月１３日付で韓国生命工学研究院の遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託番号ＫＣＴＣ  １０６９２ＢＰ及びＫＣＴＣ  １０８１８ＢＰで寄託した。
【実施例３】
【００４６】
ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子の作製
ＴＮＦ−αを特異的に認識するマウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を鋳型にし、配列番号１６及び３０のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりリーダー配列が含まれたヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ａを得た。遺伝子Ａに対してアガロースゲル電気泳動を行った後に、ＥｔＢｒ染色し、キアゲル抽出キットを用いてゲルから回収した。
【００４７】
このように精製された遺伝子Ａを対象に配列番号１６及び２５または配列番号２４及び３０のプライマー対を用いてＤＮＡ断片を増幅し、その結果得られたＤＮＡ断片と配列番号１６及び３０のプライマー対とを用いてオーバラップＰＣＲを行った。増幅されたＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクター（ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，米国）と常温で４５分間反応させた後、クローニングされたベクターで大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換させて形質転換体を得た。この形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地で一晩中培養した後、大腸菌からプラスミドを分離してＥｃｏＲＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社製，米国）で切断して約４００ｂｐの軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｂを得た。 
【００４８】
前記遺伝子Ｂを鋳型にし、配列番号２６及び３０または配列番号１６及び２７のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりＤＮＡ断片を増幅し、その結果得られたＤＮＡ断片と配列番号１６及び３０のプライマー対とを用いてオーバラップＰＣＲを行った。前記と同様な方法で、増幅されたＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングした後、ＥｃｏＲＩで切断して軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｃを得た。
【００４９】
前記と同様な方法で、遺伝子Ｃを対象に配列番号１６及び２３、または配列番号２２及び３０のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりＤＮＡ断片を増幅し、その結果得られたＤＮＡ断片と配列番号１６及び３０のプライマー対とを用いてオーバラップＰＣＲを行った。前記と同様な方法で、このように増幅されたＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングして軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｄを得た。
【００５０】
軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｅは、遺伝子Ｄを鋳型にして、配列番号１８及び３０または配列番号１６及び１９のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりＤＮＡ断片を増幅し、その結果得られたＤＮＡ断片と配列番号１６及び３０のプライマー対とを用いてオーバラップＰＣＲを行って得た。前記と同様な方法で、このように得られたＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングした。
【００５１】
軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｆは、軽鎖可変領域遺伝子Ｅを鋳型にして、配列番号２０及び３０または配列番号１６及び２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりＤＮＡ断片を増幅し、その結果得られたＤＮＡ断片と配列番号１６及び３０のプライマー対とを用いてオーバラップＰＣＲを行って得た。前記と同様な方法で、このように得られたＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングした。
【００５２】
また、遺伝子Ｆを鋳型にし、配列番号２８及び３０または配列番号１６及び２９のプライマー対を用いたＰＣＲを行ってＤＮＡ断片を増幅した後、その結果得られたＤＮＡ断片と配列番号１６及び３０のプライマー対とを用いてオーバラップＰＣＲを行った。前記と同様な方法で、前記ＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングして軽鎖可変領域をコードする遺伝子ＴＮＬＶ２（配列番号３４）を得て、遺伝子ＴＮＬＶ２が挿入されたＴＯＰＯベクターをｐＣＲ−ＴＮＬＶ２  Ｌｖと命名した。
【００５３】
また、前記と同様な方法で、ＴＮＨＶ２を鋳型にし、配列番号１６及び１７を用いるＰＣＲを行ってＤＮＡ断片を増幅し、前記断片とメガプライマー（ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ）として配列番号３０のプライマーとを用いるＰＣＲを行ってヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を得た。この遺伝子をＴＮＬＶ２ｄ（配列番号３５）と命名し、ＴＮＬＶ２ｄが挿入されたＴＯＰＯベクターをｐＣＲ−ＴＮＬＶ２ｄ  Ｌｖと称する。
【００５４】
前記ＰＣＲ反応に用いられたプライマー対及びＰＣＲ条件を表２に示す。各ＰＣＲ反応は９５℃で７分間前処理した後、表２の条件下で３０回行い、７２℃で１０分間反応させて終結した。
表２
【表２】
2008525048.tif 000004
【実施例４】
【００５５】
ヒト化抗体の軽鎖全長遺伝子及びその発現ベクターの作製
前記実施例３で作製されたＰＣＲ−ＴＮＬＶ２  Ｌｖベクターに挿入された軽鎖可変領域をコードする遺伝子を用いてヒト化軽鎖全長をコードする遺伝子を作製するために、ヒト抗体の軽鎖定常領域遺伝子を含むｐＨＡＢ−ＫＣ（ＫＣＴＣ  １０２３０ＢＰ，韓国特許公開公報第２００４−１２２６８号）発現ベクターを用いた。
【００５６】
まず、前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子ＴＮＬＶ２を発現ベクターｐＨＡＢ−ＫＣに挿入するために、ｐＣＲ−ＴＮＬＶ２  ＬｖをＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社製，米国）を用いて３７℃で２時間処理した後、１．５％アガロースゲル上に電気泳動を行い、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色して約４００ｂｐの遺伝子断片を確認した。
【００５７】
前記と同様な方法で、発現ベクターｐＨＡＢ−ＫＣをＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷＩで処理して約６．５Ｋｂの切断されたベクター断片を確認した。その後、前記遺伝子断片をキアゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製，米国）を用いて回収し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＢｉｏＬａｂｓ社製，米国）を用いて１６℃で一晩中処理した後、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換させて形質転換体を得た。前記形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地で一晩中培養した後に、プラスミドを培養培地から単離した。単離されたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社製，米国）で処理し、アガロースゲル電気泳動を行って約０．７Ｋｂのヒト化抗体の軽鎖全長遺伝子を得た。
【００５８】
このように作製されたヒト化抗体の軽鎖全長遺伝子をＴＮＬＶ２  ＬＦと命名した。また、ＴＮＬＶ２  ＬＦが挿入された発現ベクターをｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２  ＬＦと称し（図６）、これを用いて大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換させて２００４年９月１日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託番号ＫＣＴＣ１０６９０ＢＰで寄託した。
【００５９】
前記と同様な方法で、ヒト化抗体の軽鎖全長遺伝子を、ＴＮＬＶ２ｄ遺伝子を用いて作製し、このように作製されたヒト化抗体の軽鎖全長遺伝子をＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦと命名した。また、ＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦが挿入された発現ベクターをｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦと称し（図７）、これを用いて大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換して得られた形質転換体を２００５年６月１３日に韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託番号ＫＣＴＣ  １０８１７ＢＰで寄託した。
【実施例５】
【００６０】
ヒト化抗体のＣＨＯ細胞株への形質転換
動物細胞におけるヒト化抗体の活性を測定するために、前記実施例２で作製された重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２  ＨＦ及び前記実施例４で作製された軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２  ＬＦを用いて次のようにＣＨＯ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６，米国）を形質転換させた。
【００６１】
まず、前記ＣＨＯ細胞を、２．０ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム液（Ｓｉｇｍａ社製，米国）及び加熱して不活性化させた１０％ウシ胎仔血清（ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製，米国）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＪＲＨ社製，米国）に加え、３７℃の湿潤ＣＯ２培養器（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）中で２〜３日間培養させた。得られた培養液を常温（２５℃）、１,２００ｒｐｍで５分間遠心分離して培養された細胞を回収し、前記細胞を０．４％トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製，米国）で染色して、血球計数器（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いてその細胞数を測定した。前記細胞、約３×１０５、をＴ−７５のフラスコに播種して継代培養した。
【００６２】
播種したＣＨＯ細胞をフラスコ表面の細胞密度が約６０〜９０％になるまで増殖させた。形質転換のためにｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２  ＨＦ１０μｇ、ｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２  ＬＦ１０μｇ及びジーン・ポーター溶液（ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＧＴＳ社製，米国）の８０μlをＤＭＥＭ／Ｆ１２（無血清）培地５ｍｌと混合した。前記混合物を常温で１０〜４５分間放置後、培養液を除去し、継代培養されたＣＨＯ細胞を前記混合物と３７℃の湿潤培養器中で約３〜５時間培養させてＣＨＯ−ＹＨＢ１４０６と命名された形質転換体を得た。
【００６３】
前記と同様な方法により、前記実施例２及び４でそれぞれ作製された、重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦ及び軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２  ＬＦ、重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦ及び軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦ、または重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ１ｋ  ＨＦ及び軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦを用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて形質転換体を得、これらをそれぞれＣＨＯ−ＹＨＢ１４１１、ＣＨＯ−ＹＨＢ１４１１−２及びＣＨＯ−ＹＨＢ１４０６−２と命名した。
【実施例６】
【００６４】
ヒト化抗体の精製
前記実施例５で得られた形質転換体ＣＨＯ−ＹＨＢ１４０６を１０％ウシ胎仔血清が含有されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含むＴ−７５フラスコに２×１０５細胞数で播種し、これを３７℃の湿潤ＣＯ２培養器で７日間培養させ、ヒト化抗体を発現させた。培養培地を回収し、遠心分離後に濾過して抗体が含まれた無細胞培養液を得た。
【００６５】
前記培養液からヒト化抗体を精製するために、それぞれプロテイン−Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）およびヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，米国）とが結合されたセファロース４ファーストフローカラム（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎ）を用いた。抗体を含む培養培地をプロテイン−Ａが結合されたセファロース４ファーストフローカラムに加えてヒト化抗体がプロテイン−Ａと結合するようにし、グリシン緩衝剤（ｐＨ２．５）をカラムに加えてヒト化抗体を溶出させた。その後、前記溶出液を１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ８．０）と１：１０の体積比で混合して中和させた後、ヤギ抗ヒトＩｇＧが結合されたセファロース４ファーストフローカラムに加えて抗体タンパク質のみを特異的に結合されるようにした。
【００６６】
ヒト化抗体を前記と同様な方法により溶出させ、精製されたヒト化抗体をＹＨＢ１４０６と命名した。
【００６７】
前記と同様な方法で、前記実施例５で作製された形質転換体ＣＨＯ−ＹＨＢ１４１１、ＣＨＯ−ＹＨＢ１４１１−２、及びＣＨＯ−ＹＨＢ１４０６−２をそれぞれ培養した後に、それらから生成された抗体を生成し、それぞれＹＨＢ１４１１、ＹＨＢ１４１１−２、及びＹＨＢ１４０６−２と称される精製されたヒト化抗体を得た。
【００６８】
前記精製されたヒト化抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、約５０ｋＤａ及び約２５ｋＤａのバンドが観察され、これらはそれぞれヒト化抗体の重鎖及び軽鎖であることが確認された（図８）。
【実施例７】
【００６９】
ヒト化抗体のｈＴＮＦ−αに対する抗原結合親和性の測定
前記実施例６で精製して得られたヒト化抗体を競合ＥＬＩＳＡ法で定量した後、これらの抗原結合活性を組み換えｈＴＮＦ−α（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製，米国）を用いて分析した。抗体定量のために、ヤギ抗ヒト兔疫グロブリンＧ.Ａ.Ｍ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，米国）１００ｎｇをマイクロプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，米国）の各ウェルに分株し、４℃で一晩中放置し、兔疫グロブリンでコーティングさせた。この時、マウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４を対照群として用いた。 
【００７０】
ヒト化抗体の組み換えｈＴＮＦ−α抗原に対する抗原結合親和性を測定するために、１０−１１〜１０−７Ｍの範囲の様々な濃度の抗原溶液（各１００μl）をそれぞれ５ｎｇのマウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４、ヒト化抗体ＹＨＢ１４０６、ＹＨＢ１４１１、ＹＨＢ１４０６−２またはＹＨＢ１４１１−２と混合して３７℃で２時間反応させた。各反応物を前記０．４μｇの抗原でコーティングされたウェルプレートに加えて３７℃で約１．５時間放置した。西洋わさびペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されたヤギ抗ヒトポリクローン抗体（ＢｉｏＲａｄ社製，米国）を１：１０００の割合で希釈した後にこれを１００μlずつ各ウェルに加え、３７℃で１時間反応させた。反応完了後、各ウェルの光学密度を西洋わさびペルオキシダーゼ基質キット（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ，ＢｉｏＲａｄ社製，米国）を用いて測定した。
【００７１】
抗原に結合した抗体及び結合しなかった抗体の濃度を前記測定された光学密度から算出して、ヒト化抗体の抗原結合親和性を決定した（Ｆｒｉｇｕｅｔ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，７７；３０５−３１９，１９８５）。その結果を下記表３及び図９に示した。
表３
【表３】
2008525048.tif 000005
【００７２】
前記表３及び図９に示したように、本発明のヒト化抗体ＹＨＢ１４０６、ＹＨＢ１４１１、ＹＨＢ１４１１−２及びＹＨＢ１４０６−２の抗原結合親和性はマウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４と同等なレベルであることが確認された。
【実施例８】
【００７３】
ヒト化抗体の試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）抗原中和能の試験
本発明のヒト化抗体のｈＴＮＦ−α抗原を試験管内で中和させる能力を次のようにＷＨＥＩ  １６４細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７５１，米国）を用いて確認した（Ｋｈａｂａｒ  ＫＳＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．４６；１０７−１１０，１９９５）。
【００７４】
マウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４、及びヒト化抗体ＹＨＢ１４０６、ＹＨＢ１４１１、ＹＨＢ１４１１−２、及びＹＨＢ１４０６−２の各々を０．０２４ｎｇ／ｍｌ〜１．０μｇ／ｍｌ範囲の多様な濃度でＰＢＳ緩衝液に希釈し、得られた希釈液１００μlずつを９６−ウェル培養プレートの各ウェルに加えた。ｈＴＮＦ−α溶液（１００ｐｇ／ｍｌ）５０μlを各ウェルに加えて３７℃で１時間反応させた。その後、アクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ社製，米国）２μｇ／ｍｌで処理したＷＨＥＩ  １６４細胞株（１×１０６細胞数／ｍｌ）５０μlを各ウェルに加えた。
【００７５】
前記細胞を３７℃で２４時間培養した後、培養液１００μlを除去した。５ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ緩衝液で希釈させたメチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ，Ｓｉｇｍａ社製，米国）溶液２０μlを培養プレートの各ウェルに加え、前記プレートを３７℃で４時間反応させて発色させた。その後、各ウェルに０．１  Ｎ  ＨＣｌ−１０％ＳＤＳ溶液（Ｓｉｇｍａ社製，米国）１００μlずつを加え発色沈殿物を完全に溶解させ、各ウェルの吸光度を５９５ｎｍで測定した。
【００７６】
前記で測定された吸光度から、ＷＨＥＩ  １６４細胞株の抗体濃度に対する生存率曲線を作成した。前記抗体が細胞死滅を５０％に阻害する濃度（ＩＣ５０）を前記曲線から算出して、その結果を表４に示す。
表４  抗体の抗原中和能
【表４】
2008525048.tif 000006
【００７７】
前記表４に示したように、マウス単クローン抗体（ＴＳＫ１１４）のＩＣ５０は４．７ｎｇ／ｍｌであり、本発明のヒト化抗体ＹＨＢ１４０６、ＹＨＢ１４１１、ＹＨＢ１４１１−２、及びＹＨＢ１４０６−２のＩＣ５０は各々９．２ｎｇ／ｍｌ、６．７ｎｇ／ｍｌ、５．５ｎｇ／ｍｌ及び６．５ｎｇ／ｍｌであった。このような結果は、本発明のヒト化抗体がマウス単クローン抗体と同等の試験管内の抗原中和能を有することを立証する。
【実施例９】
【００７８】
ＳＰＲによるヒト化抗体のｈＴＮＦ−αに対する抗原結合親和性の測定
マウス単クローン抗体及びヒト化抗体のｈＴＮＦ−αに対する結合親和性を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により測定した。具体的には、ｈＴＮＦ−α（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製，米国）をセンサーチップＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ社製，スウェーデン）に２００μｇ／ｍｌの濃度で固定させ、各々２５、５０、１００、２００、及び４００ｎＭのマウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４またはヒト化抗体ＹＨＢ１４１１−２と反応させた。その後、前記反応の結合及び解離定数をＢｉａｃｏｒｅ  ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製，スウェーデン）で測定した。
【００７９】
前記で測定された結合及び解離定数より抗体の抗原結合親和性を算出して、その結果を表５に示す。
表５  マウス単クローン抗体及びヒト化抗体のｈＴＮＦ−αに対する抗原親和性の比較
【表５】
2008525048.tif 000007
【００８０】
前記表５に示したように、本発明のヒト化抗体ＹＨＢ１４１１−２はピコモルレベル（１０−１２Ｍ）の高い抗原結合親和性及び低い解離定数を示した。また、ヒト化抗体ＹＨＢ１４１１−２の抗原結合親和性はマウス単クローン抗体ＴＳＫ１１４より３倍も高かった。
【００８１】
本発明を前記特定の態様において記載したが、当業者は、添付の特許請求の範囲に規定した本発明の範囲内で本発明に多様な修正や変更を行うことができることを認識するはずである。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
本発明の上記ならびに他の目的および特徴は、それぞれ以下を表す添付の図面と合わせて、下記の本発明の説明から明らかとなる。
【００８３】
【図１】ＴＮＦ−αに特異的に結合するマウス単クローン抗体の重鎖（ＴＳＫ１１４  Ｈ）可変領域（配列番号４７）、ヒト抗体の重鎖サブグループ１（Ｈｈ１）（配列番号４８）、及び本発明のヒト化抗体の重鎖（ＴＮＨＶ２、ＴＮＨＶ２ｋ及びＴＮＨＶ１ｋ）（配列番号３６〜３８）のアミノ酸配列を比較した結果である。
【図２】ＴＮＦ−αに特異的に結合するマウス単クローン抗体の軽鎖（ＴＳＫ１１４  Ｌ）（配列番号４９）、ヒト抗体の軽鎖サブグループ１（Ｈｋ１）（配列番号５０）、及び本発明のヒト化抗体の軽鎖（ＴＮＬＶ２及びＴＮＬＶ２ｄ）（配列番号３９及び４０）のアミノ酸配列を比較した結果である。
【図３】本発明のヒト化抗体の重鎖を発現するベクターｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２  ＨＦの作製工程を示す模式図である。
【図４】本発明によるヒト化抗体の重鎖を発現するベクターｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ２ｋ  ＨＦの作製工程を示す模式図である。
【図５】本発明によるヒト化抗体の重鎖を発現するベクターｐＨＡＢ−ＴＮＨＶ１ｋ  ＨＦの作製工程を示す模式図である。
【図６】本発明によるヒト化抗体の軽鎖を発現するベクターｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２  ＬＦの作製工程を示す模式図である。
【図７】本発明によるヒト化抗体の軽鎖を発現するベクターｐＨＡＢ−ＴＮＬＶ２ｄ  ＬＦの作製工程を示す模式図である。
【図８】動物細胞から生成された後精製された本発明によるヒト化抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図９】マウス単クローン抗体及び本発明によるヒト化抗体のＴＮＦ−α抗原に対する抗原結合親和性を示したグラフである。
【図１】
2008525048.tif 000008
【図２】
2008525048.tif 000009
【図３】
2008525048.tif 000010
【図４】
2008525048.tif 000011
【図５】
2008525048.tif 000012
【図６】
2008525048.tif 000013
【図７】
2008525048.tif 000014
【図８】
2008525048.tif 000015
【図９】
2008525048.tif 000016
【配列表】
2008525048000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月27日(2007.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008525048000001.app
【国際調査報告】
2008525048.tif 000032
2008525048.tif 000033
2008525048.tif 000034