(57)【要約】本発明は、患者の神経毒性もしくは神経病理などの神経変性疾患に関する症状（特にβ-アミロイドに起因する神経毒性およびアルツハイマー病）に関連する障害または疾病が進行するリスク、あるいはそれらの症状に付随する症候が進行するリスクを、処置もしくは抑止もしくは軽減するための方法ならびにキットならびに配合物ならびに組成物、に関する。また本発明は、患者に本発明に係る化合物の治療上有効量を投与することによって、幹細胞の神経細胞への分化を誘導するための方法も提供する。【選択図】図１４
2008516972.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の神経前駆細胞を神経細胞への分化を誘導する方法であって、
前記神経前駆細胞を、下記の構造式(I)の化合物
【化１】
2008516972.tif 000007
（ここで式中の、 R1 、 R2 、 R4 、 R7 、 R11、R12 、 R15 、および R16 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、硫酸基、または、任意に -NH- 、 -N((C1-C8)アルキル)- 、 -O- 、 -S- 、-SO- 、 -SO2- 、 -O-SO2- 、 -SO2-O- 、 -C(O)- 、-C(O)-O- 、 -O-C(O)- 、 -C(O)-NR'- 、もしくは -NR'-C(O)- を挿入した(C1-C8)アルキル基であって、ここで、R'は、Hもしくは(C1-C8)アルキル基であり、また、； R3 は、ヒドロキシ基、(C1-C6)アルキルCO2-、 HO2C(CH2)2CO2- 、トルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、また、；R6 、 R8 、 R9、 R10 、 R13 、およびR14 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシ基であり、また、； R17 が、 -CH(CH3)CH(OH)(CH2)2CH(CH3)2もしくは-CH(CH3)CH(OC(=O)CH3)(CH2)2CH(CH3)CH2N(C(=O)CH3)2である）か、あるいは薬学的に許容されるそれらの塩かの有効量と接触させるステップ
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
R1 、 R2 、 R4 、 R6 、 R7、R8 、 R9 、 R11 、 R12 、 R14、およびR15 が、Hであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
R16 が、Hもしくはアセトキシ基であることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、22R-ヒドロキシコレステロールもしくは酢酸=26-ジアセチルアミノ-(22ξ)-アセトキシ-(16ξ)-アセトキシ-コレスタ-5-エン-イルから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
哺乳類の神経前駆細胞を神経細胞への分化を誘導するための方法であって、
前記神経前駆細胞を、構造式(II)の化合物
【化２】
2008516972.tif 000008
（ここで式中の R1 、 R2 、 R4 、 R7 、 R11、R12 、および R15 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C4)アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、硫酸基、または、任意に -NH- 、 -N((C1-C4)アルキル)- 、 -O- 、 -S- 、 -SO- 、-SO2- 、 -O-SO2- 、 -SO2-O- 、 -C(O)- 、 -C(O)-O- 、-O-C(O)- 、 -C(O)-NR'- 、もしくは -NR'-C(O)- を挿入した(C1-C6)アルキル基であって、ここで、R'は、Hもしくは(C1-C8)アルキル基であり、また、R3は、ヒドロキシ基、(C1-C6)アルキルCO2-、 HO2C(CH2)2CO2- 、トルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、また、；R6 、 R8 、 R9 、 R10 、 R13、およびR14 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C4)アルキル基、ヒドロキシル(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシ基であり、また、； R19 が、OH基もしくは(C1-C2)アルコキシ基であり、また、；R20が、3位をメチル=アミドメチル基で置換したブチル基である）か、あるいは薬学的に許容されるそれらの塩かの有効量で処理するステップ
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項６】
R1 、 R2 、 R3 、 R4 、 R6、R7 、 R8 、 R9 、 R11 、 R12、R14 、および R15 が、Hであることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
R10 および R13 が、CH3基であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項８】
R19 がメトキシ基であることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
R3 が、アセトキシ基もしくはOH基であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、酢酸=(20ξ)-26-アセチルアミノ-(22ξ)-ヒドロキシフロスタ-5-エン-3ξ-イル、酢酸=(20ξ)-26-アセチルアミノ-(22ξ)-メトキシフロスタ-5-エン-3α-イル、および酢酸=(20ξ)-26-アセチルアミノ-(22ξ)-エトキシフロスタ-5-エン-3ξ-イルから成る群から選択されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
哺乳類の神経前駆細胞を神経細胞への分化を誘導するための方法であって、
前記神経前駆細胞を、構造式(III)の化合物
【化３】
2008516972.tif 000009
（ここで式中の R1 、 R2 、 R4 、 R7 、 R11、R12 、および R15 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、硫酸基、または、任意に -NH- 、 -N((C1-C8)アルキル)- 、 -O- 、 -S- 、 -SO- 、-SO2- 、 -O-SO2- 、 -SO2-O- 、 -C(O)- 、 -C(O)-O- 、-O-C(O)- 、 -C(O)-NR'- 、もしくは -NR'-C(O)- を挿入した(C1-C8)アルキル基であって、ここで、R'は、Hもしくは(C1-C8)アルキル基であり、また、；R3は、ヒドロキシ基、(C1-C6)アルキルCO2- 、 HO2C(CH2)2CO2-、トルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、また、； R6 、 R8 、 R9、 R10 、 R13、および R14 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシ基であり、また、；Xが、O、N(H)、N(Ac)、N(トルエン-4-スルホニルオキシ)基である）か、あるいは薬学的に許容されるそれらの塩かの有効量に接触させるステップ
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１２】
R3 が、OH基もしくは(C1-C6)CO2- であることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
XがOであることを特徴とする、請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１４】
XがNHであることを特徴とする、請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１５】
R10 および R13 が、CH3基であることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
R1 、 R2 、もしくは R12 が、OH基であることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
R1 、 R2 、 R4 、 R6 、 R7、R8 、 R9 、 R11 、 R12 、 R14、およびR15 が、Hであることを特徴とする、請求項１２、１３、もしくは１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、(20α)-25ξ-メチル-(22R,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3ξ-オール、(20ξ)-25ξ-メチル-N-アセチル-(22R,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3ξ-オール、(22R,25ξ)-(20α)-スピロスタ-5-エン-(2α,3ξ)-ジオール、パラトルエンスルホン酸=(20α)-25ξ-メチル-N-パラトルエンスルホニル-(22R,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3ξ-イル、(22R,25ξ)-(20α)-(14α,20α)-スピロスタ-5-エン-(3β,12β)-ジオール、(22R,25S)-(20ξ)-スピロスタ-5-エン-3ξ-オール、安息香酸=(22R,25ξ)-(20α)-スピロスタ-5-エン-3β-イル、ヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イル、(22R,25ξ)-(20α)-スピロスタ-5-エン-(1ξ,3ξ)-ジオール、(22R,25S)-(20α)-スピロスタ-5-エン-3β-オール、琥珀酸=(22R,25S)-(20α)-スピロスタ-5-エン-3β-イル、およびプロパン酸=(20α)-25S-メチル-N-アセチル-(22S,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3β-イル、から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、ヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イルであることを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳類の神経前駆細胞が、ヒトの細胞であることを特徴とする、請求項１、５、もしくは１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳類の神経前駆細胞が、NT2細胞であることを特徴とする、請求項１、５、もしくは１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記神経細胞が、NT2N表現型を示すことを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記神経細胞が、ニューロンであることを特徴とする、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記接触ステップが、in vitroで行われることを特徴とする、請求項１、５、もしくは１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記接触ステップが、in vivoで行われることを特徴とする、請求項１、５、もしくは１１に記載の方法。
【請求項２６】
前記接触ステップが、前記前駆細胞と前記化合物を、連続的または同時に投与することによって行われることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記量が、GFRα2蛋白の発現を増大する上で有効なものであることを特徴とする、請求項１、５、もしくは１１に記載の方法。
【請求項２８】
前記神経前駆細胞が幹細胞であることを特徴とする、請求項１、５、もしくは１１に記載の方法。
【請求項２９】
前記幹細胞が神経幹細胞であることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記幹細胞が胚幹細胞であることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
前記幹細胞が成人型多能性組織幹細胞（multipotent adult progenitor cell; MAPC）であることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
前記幹細胞が骨髄間質細胞であることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
治療上有効量の神経前駆細胞を、分化を誘導する量の構造式I、II、もしくはIIIの化合物と併せて含むことを特徴とする、組成物。
【請求項３４】
前記神経前駆細胞が幹細胞であることを特徴とする、請求項３３記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願データ〕
本出願は、U.S. Provisional Patent Application No. 60/364,140（2002年03月15日出願）、U.S.Provisional Patent Application No. 60/319,846（2003年01月09日出願）、U.S. Provisional Patent Application No. 60/618,696（2004年10月14日出願）、およびU.S. Patent Application Serial No. 11/031,538（2005年01月07日）の優先権を主張するところの、U.S. Patent Application Serial No. 10/389,189（2003年03月14日出願）ならびにU.S. Patent Application Serial No. 10/663,619（2003年09月16日出願）の一部継続出願である。これらの出願は、この参照によりそのすべてが本開示に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞死（変性）は、個体に破壊的且つ不可逆な影響を与える可能性を持つものであって、例えば卒中、心発作、あるいは脳または脊椎での他の虚血もしくは外傷の結果として発生しうる。加えて、神経細胞死をともなう神経変性障害としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、ダウン症、卒中、外力性脳損傷、脳虚血、脳低酸素症、発作、脳感染症、脊髄振盪症／節（spinalcord concussion/section）、コルサコフ病、が含まれる。
【０００３】
アルツハイマー病（AD）は、進行性の神経変性症であり、臨床的には知能が漸進的に失なわれてゆくことを特徴とする。ADは、65歳以上の人口のうちの約10%を冒している。また、75〜85歳の個人の19%、85歳以上の個人の45%で発病する。ADは、心臓病、癌、卒中に次ぐ、成人の第四位の死因である。ADは、老人性痴呆症のうちの約75%の原因となっている。この中枢神経系障害の特徴は、ニューロンの変性、アミロイド斑の拡大、神経原線維の縺れ、アセチルコリンの欠乏、および大脳皮質の萎縮、などの種々の症候を特徴とする。ADの患者は、まずは短期記憶の喪失、続いて認識能力の低下、ついには自身を保護するための能力の喪失を蒙る。診断、看護、在宅介護、および賃金損失を含む患者介護の費用は、年あたり約八百億〜九百億ドルと見積られている。
【０００４】
早期発症型である家族性（遺伝性）アルツハイマー病（アルツハイマー病の症例のうちの5%未満）は、APP遺伝子の変異か、またはPS1遺伝子およびPS2遺伝子の変異かによって起こる。晩期発症型である孤発性アルツハイマー病（アルツハイマー病の症例のうち95%を超える）の原因は、ミトコンドリア擬似遺伝子CO1およびCO2の変異、またはApoE遺伝子のε4アレルといったいくつかの素因が発見されているにもかかわらず、今もって不明である。さらに加えて、この疾病の原因を説明しようとする理論の数々が提唱されてきており、そこにはアミロイド作動性要因（amyloidergic origin）、酸化ストレス、カルシウム恒常性の崩壊、ミトコンドリアの機能不全／代謝低下、および興奮性アミノ酸の毒性が含まれている。
【０００５】
ADにともなって機能が著しく損耗する原因は、新皮質および海馬における老人斑（neuritic plaques）の存在、コリン作動性ニューロンのシナプス前部の標識形質（markers）の喪失、ならびにコリン作動性ニューロンの喪失である。老人斑は、変性している軸索および神経末端から成り、これらはアミロイドのコアを包んでいる場合があり、且つ通常は反応性の神経膠成分を含んでいる。アルツハイマー病の別の病理的特徴としては、神経原線維の縺れがあり、これは神経細胞内の塊であって、二重螺旋状線維と呼ばれる原線維構造内で重合した異常燐酸化タウ蛋白質の蓄積に符合するものである。加えて、神経原線維の縺れには、重度に燐酸化した神経線維蛋白も含まれている。
【０００６】
この疾病の病態生理学的機構の解明については大きな進展があったにもかかわらず、ADの原因については依然としてわずかしか理解が進んでいない。疑わしい原因としては、遺伝子的素因（PS-1、PS-2、APP、apoE、CO1、CO2遺伝子の変異）、神経伝達物質の欠乏（アセチルコリンの欠失）、炎症、代謝低下、遊離ラジカルストレス、または興奮性アミノ酸の毒性、などいくつか挙がっている。
【０００７】
現行のADの病原に関する理解に基づいたADの処置についての臨床研究に、現在かけられている化合物がいくつか存在する。これらの薬剤のうちで注目に価するのは、アセチルコリンエステラーゼ（AchE）阻害剤である。近年、二種のAchE阻害剤（タクリンとドネペジル）が、AD処置用として監督官庁から承認されている。タクリンは、認識作用の低下に対して中程度の有益な効果を与えるが、血清肝性酵素の増大といったいくつかの有害な影響を及ぼしてしまう。
【０００８】
したがって、新規な神経保護薬には強い要望があると考えられ、特に、卒中、心発作、または、脳もしくは脊髄の外傷と併発しうる神経細胞死（変性）の拡大を抑止もしくは何らかの処置をするための薬剤、あるいは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、ダウン症、およびコルサコフ病などの神経変性障害、または上記で開示した他の症状のいずれかを処置するための薬剤に強い要望があると考えられる。
【０００９】
アルツハイマー病は、β-アミロイド蛋白質もしくはAβと呼ばれる、39〜43個のアミノ酸から成るペプチドが、原線維状の形態で蓄積することを特徴とし、こうしたペプチドは、細胞外のアミロイド斑および神経細胞内での沈着物として顕在し、さらに脳血管壁中のアミロイドとしても顕在する。アルツハイマー病における、原線維状のAβアミロイドの沈着は、患者に有害であると考えられており、やがてはADの顕著な特徴である毒性と神経細胞死を齎す。これまでに積み立てられてきた物証（エビデンス）からは、アミロイドが、ADの発生病理の主要な要因であることが暗示されている。
【００１０】
アミロイド誘導体である拡散性リガンド（配位子）（amyloid-derived diffusible ligands; ADDL）に属するトリマーおよびテトラマーは、だいたい13〜108kDの範囲の非原線維性オリゴマーであって（Klein, Neurochem. Int., 41, 345-352 (2002)）、5〜10nM程度の低濃度で強力な神経毒性を呈する（Lambert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 6448-6453 (1998); Dahlgren et al., J. Biol. Chem., 277(35), 32046-32053 (2002)）。最近の報告では、Aβの神経毒性を抑制するものとしてのADDLについて述べられている。Klein, Neurochem. Int., 41, 345-352 (2002) 。
【００１１】
また、ヒトの他のさまざまな疾病でもアミロイド沈着は観察されており、通常、全身性器官（則ち、中枢神経系の外部に在る器官もしくは組織）にまでもアミロイドが蓄積して、器官が機能不全もしくは不全症に陥いることになる。ADおよび「全身性」アミロイド病については、現在のところ治療法も有効な処置法も存在せず、患者は発症から3〜10年以内に死亡するのが普通である。
【００１２】
ADについては多数の研究が行われているが、ADおよび他のアミロイド症（アミロイドーシス）で発生するアミロイドの形成、沈着、蓄積、および／もしくは残留を抑えるための療法に用いる化合物もしくは試薬について、これまでに得られた知見はほとんど無い。
【００１３】
したがって、ADおよび他のアミロイド症で発生するアミロイドの形成、沈着、蓄積、および／もしくは残留を抑止するまたは恢復させる療法に用いるための、新規な化合物もしくは試薬が必要とされている。
【００１４】
このため、Aβの機能の阻害剤としての活性を有するような、同定されている既存の化合物、および／もしくは合理的に修飾された化合物、および／もしくは新たに設計された化合物に基づいた新規な療法を構築することができれば、その利益はきわめて大きい、と考えられる。
【００１５】
さらにまた、総称して「幹細胞療法」（"stem cell therapy"）と云う方法論を使って、神経細胞の損失を取り戻し且つ関連する機能を復元することにより、ADおよび他の神経病によって引き起こされる脳の損傷の修復を行う手法には、非常に大きな見込みがある。幹細胞をニューロンへと分化させることができれば、神経変性病および卒中の処置が可能となる。既に、ドーパミン作動性ニューロンへと分化させた幹細胞が、パーキンソン病に冒された患者の処置に成功裡に使用されている（T. Barberi et al., Nature Biotechnology, 21, 1200 (2003)）。しかしながら、神経細胞の損失が非常に重要であるような疾病もしくは症状（アルツハイマー病（AD）、脳卒中、もしくは外力性脳損傷など）では、分化させた幹細胞の移殖は、（危険な作業であるにもかかわらず）脳の損傷を補償して損なわれた機能を復元するためには充分では無いと考えられる。恢復効果を最大限に得るためには、こうした移殖を、in situでの神経組織発生のための刺戟と組み合わせて行う必要があると考えられる。ヒト成人の脳では、神経性幹細胞は、脳室下帯（SVZ）と海馬歯状回で見られる（P. S. Eriksson et al., Nature Medicine, 4, 1313 (1998); V. Silani et al., Lancet, 364, 200 (2004)）ので、神経経路を通じた神経性幹細胞の分化を薬学的に誘導することができれば、神経細胞の置換療法への重要なステップとなると考えられる。in vitroでのNSCの分化を誘導するために、レチノイン酸もしくはシクロパミンといった多種の小さい分子が用いられてきたが、これらは毒性が強いためin vivoでの使用が困難であった。デキサメタゾン、フルオキセチン、もしくはゲルダナマイシンは、有害な副作用を有する（S. Ding et al., Nature Biotech., 22, 833 (2004)）。
【００１６】
したがって、神経障害の進行を遅緩、抑止、もしくは逆行させるための方法、あるいはそれらの神経障害の症状を改善するための方法の必要性は依然として存在している。
【発明の開示】
【００１７】
本発明は、被験者体内の神経毒性（特にβ-アミロイドに起因する神経毒性）に関する障害もしくは疾病、またはそれらに関連する症状が進行するリスクを、処置、抑止、もしくは軽減するための方法ならびにキットならびに配合物ならびに組成物、を指向する。本発明に係る化合物のうちのいくつかは、共通するスピロスタ-5-エン-3-オール構造を含み、また構造式(I)、(II)、もしくは(III)の構造を有する。これらを下記に示す。
【００１８】
本発明は、構造式(I)、(II)、もしくは(III)の構造を有する神経毒性阻害剤または幹細胞分化剤（stem cell differentiating agents）を使った処置を必要とするような、症状もしくは障害の処置方法を指向し、この方法には、本発明に係る組成物を、それらを必要とする被験者へと投与することが含まれる。より好ましくは、本発明では、Aβの形成による神経毒性作用、もしくは患者の脳内のβ-アミロイド沈着の残留を阻害するための方法が提供され、この方法には、患者に対して、構造式(I)、(II)、もしくは(III)の化合物の治療上有効量を投与することが含まれる。
【００１９】
或る特徴として、本発明は、記憶、集中力、および短期記憶から成るβ-アミロイド形成に関連する精神的質もしくは認識的質の群から選択される、患者のひとつもしくは複数の精神的質または認識的質を、促進、維持、もしくは増強するための方法を提供し、この方法には、患者に対して、構造式(I)、(II)、もしくは(III)の化合物の治療上有効量を投与することが含まれる。
【００２０】
別の特徴として、本発明は、認識力もしくは記憶力の低下、ならびに精神の劣化から成るβ-アミロイド形成に関連する精神的影響もしくは認識的影響の群から選択される、患者のβ-アミロイド形成に関連するひとつもしくは複数の精神的影響または認識的影響を低減するための方法を提供し、この方法には、患者に対して、構造式(I)、(II)、もしくは(III)の化合物の治療上有効量を投与することが含まれる。
【００２１】
なおも別の特徴として、本発明は、β-アミロイドの形成もしくは残留に関連する患者の精神状態を処置するための方法も提供し、この方法には、患者に対して、構造式(I)、(II)、もしくは(III)の化合物の治療上有効量を投与することが含まれる。
【００２２】
さらに別の特徴として、本発明は、全節性および限局性の虚血ならびに出血性卒中、外力性脳損傷、脊髄損傷（廃用（recision）もしくは切断など）、低酸素症か虚血に起因する神経細胞損傷、急性心停止もしくは新生児特発性呼吸窮迫（neonatal distress）によって起こる神経細胞の損傷、癲癇、不安、糖尿病、多発性硬化症、幻肢痛、灼熱痛、神経痛、帯状疱疹、脊髄病変、痛覚過敏、異疼痛、AD、ハンチントン舞踏病、コルサコフ病、ならびにパーキンソン病、から選択される神経系の疾病もしくは障害、あるいは上述した他の症状のいずれか、を有する患者の処置方法も提供し、この処置には、患者に対して、構造式(I)、(II)、もしくは(III)の化合物の治療上有効量を投与することが含まれる。
【００２３】
さらなる特徴として、本発明は、患者の心臓、脾臓、腎臓、副腎皮質、もしくは肝臓へのβ-アミロイド沈着（アミロイド症と呼ぶ）を特徴とする疾病の処置方法であって、患者に対して、構造式(I)、(II)、もしくは(III)の化合物の治療上有効量を投与することを含む方法も提供する。
【００２４】
さらなる特徴として、本発明は、成人型もしくは胎児型の幹細胞などの哺乳類の神経前駆細胞の、神経細胞もしくは星状細胞（ニューロンなど）、ならびに／あるいはアストロサイトへの分化を誘導するための方法も提供し、この方法では、こうした神経前駆細胞を、in vitroもしくはin vivoで、構造式(I)、(II)、もしくは(III)の化合物の有効量と接触させる。例えば、成人型多能性組織幹細胞（multipotent adult progenitor cells; MAPC）は、当該技術分野で利用可能な方法を使って得ることができる。この細胞は、in vitroで神経細胞に分化してから標的部位へ投与することもでき、あるいは、苦しむ哺乳類の標的部位へと直接投与して、それと同時もしくはその後に、分化を誘導する量の構造式(I)、(II)、もしくは(III)の化合物を投与して分化することもできる。こうしてin vivoで分化した幹細胞は、損傷した組織を再生もしくは置換する。
【００２５】
なおもさらなる特徴として、本発明は、β-アミロイドへの結合親和性を有する化合物の同定方法であって、22R-ヒドロキシコレステロールとの構造的な相同性について、公知の化合物のデータベースをスクリーニングするステップと、データベースから22R-ヒドロキシコレステロールとの構造的な相同性が最も高い化合物を抽出し、22R-ヒドロキシコレステロールとの相同性の程度に基づいて、データベース中の化合物の序列をつくるステップと、β-アミロイドへのin vitroでの結合について抽出して序列をつくるステップと、in vitroの親和性が最大となる化合物を選択するステップと、を含む方法も提供する。
【００２６】
別の特徴として、本発明は、ADDL（β-アミロイドのトリマーおよびテトラマーなど）の形成を、Aβに結合して安定な無毒性ポリマーを形成することによって阻害するような新規な化合物も提供する。
【００２７】
なおも別の特徴として、本発明は、β-アミロイドへの結合親和性を有する化合物の設計方法であって、22R-ヒドロキシコレステロールを二つ以上の別々の構造ブロックに分けて写像（マッピング）するステップと、22R-ヒドロキシコレステロールの裡のひとつもしくは複数のブロックを修飾して新規な化合物を設計するステップと、設計した化合物をβ-アミロイドへのin vitro結合に応じて列ねるステップと、最大のin vitro結合親和性を有する化合物を選択するステップと、を含むような設計方法も提供する。
【００２８】
さらなる特徴として、本発明は、β-アミロイドへの結合親和性を有する化合物の設計方法であって、β-アミロイドをマッピングするステップと、β-アミロイドもしくはそのフラグメントの構造を補完する化合物をコンピュータースクリーン上で構築するステップと、設計した化合物をβ-アミロイドへのin vitro結合に応じて列ねるステップと、最大のin vitro結合親和性を有する化合物を選択するステップと、を含むような設計方法も提供する。
【００２９】
なおも別の特徴として、本発明は、体液中のAβを検出および定量するための方法であって、試料液を得るステップと、検出できるように標識（例えば放射性標識）した構造式(I)もしくは(II)もしくは(III)の化合物を試料液中に入れてインキュベートするステップ（任意に、標識していない化合物の漸加する濃度群を与えることもできる）と、試料をインキュベートした液体から分離してから試料を膜上に移すステップと、この膜を標識感受性板（label-sensitive screen）に付着するステップと、膜の成分をイメージング（ホスホイメージング（phospho-imaging）など）によって分析して、体液中のAβの存在を検出するかもしくは体液中に存在するAβを定量するステップと、を含むような方法も提供する。
【００３０】
なおも別の特徴として、本発明は、被験者のADを診断する方法であって、被験者の脳から試料液を採取するステップと、検出できるように標識した構造式(I)もしくは(II)もしくは(III)の化合物を試料液中に入れてインキュベートするステップ（任意に、標識していない化合物の漸加する濃度群を与えることもできる）と、試料をインキュベートした液体から分離してから試料を膜上に移すステップと、この膜を標識感受性板に付着するステップと、膜の成分をイメージングによって分析して、体液中のAβの存在を検出するかもしくは体液中に存在するAβを定量するステップと、を含むような方法も提供する。
【００３１】
したがって、本発明の主な特徴は、β-アミロイドに起因する神経毒性に関連する障害を処置するか、もしくは被験者の神経変性障害を処置するための、薬学的組成物に関する。この組成物は、構造式(I)、(II)、もしくは(III)の化合物の有効量と、薬学的に許容される担体とを含む。また、こうした障害のうちのひとつを処置する上で用いる医薬を製造するための、構造式(I)、(II)、もしくは(III)の化合物の使用方法についても、本発明の範囲内である。これらの症状の処置は、被験者に本発明に係る化合物もしくは組成物の治療上有効量を投与することによって行われる。
【００３２】
本発明のひとつもしくは複数の実施形態の詳細については、以下の記載で述べる。本発明の他の特徴、物、および利点については、本明細書の記載と請求項から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は数多のさまざまな形態で実施可能であるが、本明細書中では特定のいくつかの実施形態について説明をしている。本明細書の記載は、本発明の枢要の例示としてのみ見做されるべきものであって、示した実施形態に本発明を限定しようとするものでは無い、ということを理解されたい。
【００３４】
本明細書中で用いる略語は以下である。5-コレステン-3β,22R-ジオール（22R-ヒドロキシコレステロール）、5-コレステン-3β,22S-ジオール（22S-ヒドロキシコレステロール）、5-コレステン-3β-オール（コレステロール）、5-アンドロステン-3β-オール-17-オンもしくはデヒドロエピアンドロステロン（DHEA）、5-プレグネン-3β,17α-ジオール-20-オン（17α-ヒドロキシプレグネノロン）、5-プレグネン-3β-オール-20-オン（プレグネノロン）、Ntera2/D1畸形癌細胞（NT2）、分化したヒトNT2ニューロン（NT2N）、β-アミロイドペプチド（Aβ）、アルツハイマー病（AD）、コレステロール-蛋白質結合ブロットアッセイ（cholesterol-protein binding blot assay; CPBBA）、レチノイン酸（RA）。
【００３５】
本発明のひとつの特徴は、神経毒性に関連する障害（特にAD）を処置する方法に関し、この方法には、そうした処置を必要とする被験者に、一種以上の構造式(I)、(II)、および／もしくは(III)の化合物を投与するステップが含まれる。化合物(I)の構造式は以下であって、
【００３６】
【化４】
2008516972.tif 000003
ここで式中の、 R1 、 R2 、 R4 、 R7 、 R11、R12 、 R15 、および R16 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、硫酸基、または、任意に -NH- 、 -N((C1-C8)アルキル)- 、 -O- 、 -S- 、-SO- 、 -SO2- 、 -O-SO2- 、 -SO2-O- 、 -C(O)- 、-C(O)-O- 、 -O-C(O)- 、 -C(O)-NR'- 、もしくは -NR'-C(O)- を挿入した(C1-C8)アルキル基であって、ここで、R'は、Hもしくは(C1-C8)アルキル基であり、また、； R3 は、ヒドロキシ基、(C1-C6)アルキルCO2-、 HO2C(CH2)2CO2- 、トルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、また、；R6 、 R8 、 R9、 R10 、 R13 、およびR14 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシ基であり、また、； R17 が、 -CH(CH3)CH(OH)(CH2)2CH(CH3)2もしくは-CH(CH3)CH(OC(=O)CH3)(CH2)2CH(CH3)CH2N(C(=O)CH3)2であり、あるいは、薬学的に許容されるそれらの塩である。
【００３７】
好ましくは、R1 、 R2 、 R4 、 R6 、 R7、 R8 、 R9 、 R11 、 R12 、 R14、およびR15 が、Hである。好ましくは、 R10 および R13 が CH3であって、また、好ましくは、R16 が、Hもしくはアセトキシ基である。
【００３８】
構造式(II)の構造は以下であって、
【００３９】
【化５】
2008516972.tif 000004
ここで式中の R1 、 R2 、 R4 、 R7 、 R11、 R12 、および R15 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C4)アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、硫酸基、または、任意に -NH- 、 -N((C1-C4)アルキル)- 、 -O- 、 -S- 、 -SO- 、 -SO2- 、 -O-SO2- 、 -SO2-O- 、 -C(O)- 、 -C(O)-O- 、 -O-C(O)- 、 -C(O)-NR'- 、もしくは -NR'-C(O)- を挿入した(C1-C6)アルキル基であって、ここで、R'は、Hもしくは(C1-C8)アルキル基であり、また、R3は、ヒドロキシ基、(C1-C6)アルキルCO2- 、 HO2C(CH2)2CO2- 、トルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、また、； R6 、 R8 、 R9 、 R10 、 R13、および R14 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C4)アルキル基、ヒドロキシル(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシ基であり、また、；R19 が、OH基もしくは(C1-C2)アルコキシ基であり、また、； R20が、3位をメチル=アミドメチル基で置換したブチル基である）か、あるいは薬学的に許容されるそれらの塩である。
【００４０】
好ましくは、 R1 、 R2 、 R4 、 R6 、 R7、 R8 、 R9 、 R11 、 R12 、 R14、および R15 が、Hである。好ましくは、 R10 および R13 が、CH3基である。
【００４１】
構造式(III)の化合物は下記であって、
【００４２】
【化６】
2008516972.tif 000005
ここで式中の R1 、 R2 、 R4 、 R7 、 R11、 R12 、および R15 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、硫酸基、または、任意に -NH- 、 -N((C1-C8)アルキル)- 、 -O- 、 -S- 、 -SO- 、 -SO2- 、 -O-SO2- 、 -SO2-O- 、 -C(O)- 、 -C(O)-O- 、 -O-C(O)- 、 -C(O)-NR'- 、もしくは -NR'-C(O)- を挿入した(C1-C8)アルキル基であって、ここで、R'は、Hもしくは(C1-C8)アルキル基であり、また、；R3は、ヒドロキシ基、(C1-C6)アルキルCO2- 、 HO2C(CH2)2CO2-、トルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、また、； R6 、 R8 、 R9、 R10 、 R13、および R14 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシ基であり、また、；Xが、O、N(H)、N(Ac)、N(トルエン-4-スルホニルオキシ)基である）か、あるいは薬学的に許容されるそれらの塩である。
【００４３】
R10 および R13 は、CH3基であるのが好ましい。
【００４４】
構造式(III)の化合物においては、 R1 、 R2 、 R4 、 R6、 R7 、 R8 、 R9 、 R11 、 R12、 R14 、および R15 が、Hであるのが好ましい。 R1 、 R2、もしくは R12 は、HもしくはOH基であるのが好ましい。
【００４５】
また、 R3 は、 OR23 であってもよく、ここで R23 は、脱離可能なヒドロキシ保護基であって、例えば、トシル基、メシル基、トリアルキルシリル基、THP、EtO(Et)、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基（benzyl oxycarbony）、などとすることができる。また、 C3 がヒドロキシ置換された、真の(C8-C22)脂肪酸エステル化合物についても、本発明の範囲内であって、ここでそのアルコキシ鎖には、1〜2個のCH=CHユニット、および／もしくは、1〜2個のOH置換基、エポキシ置換基、もしくはメチル置換基を含めることができる。
【００４６】
好ましい立体異性体としては、スピロステン-3-オールの番号付けに従って番号付けをした炭素骨格で言って、3S、10R、および13S、さらには20S、22S、および25Sがある。したがって、構造式(III)の好ましい化合物は、ヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イル（SP233）である。特に他に定めの無い限りは、構造式(I)、(II)、もしくは(III)中の炭素原子は水素で飽和しているものとする。
【００４７】
特に他に定めの無い限りは、「アルキル」（"alkyl"）、接頭辞 "alk" （アルコキシ alkoxy 中で）、および接尾辞 "-alkyl" （ヒドロキシアルキル hydroxyalkyl 中で）という語は、 C1-8 の炭化水素の直鎖（ブチルなど）もしくは分鎖（イソブチルなど）のことを指す。アルキレン、アルケニレン（alkenylene）、およびアルキニレン（alkynylene）とは、それぞれ、二重結合を持つ C1-8 アルキル（エチレンなど）、アルケン、およびアルキンの基を指す。「アルキル」（"alkyl"）という語は、シクロアルキル基、(シクロアルキル)アルキル基、およびアルキル(シクロアルキル)アルキル基を含む。同様に「アルケニル」（"alkenyl"）という語は、1〜2個のCH=CHユニットを含んだアルキル基を含み、さらにはそれに対応するシクロアルケニル部分も含む。
【００４８】
特に、(C1-C8)アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、iso-ブチル基、sec-ブチル基、ペンチル基、3-ペンチル基、ヘプチル基（beptyl）、もしくはオクチルヘキシル基（octyl hexyl）とすることができる。また、(C3-C8)シクロアルキル基は、単環、二環、もしくは三環とすることができるものであって、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、ビシクロ[2.2.2]オクタニル基、もしくはノルボルニル基を含み、さらには種々のテルペン構造およびテルペノイド構造も含む。(C3-C6)シクロアルキル(C1-C2)アルキル基は、上述したシクロアルキル基を含むものであって、シクロプロピルメチル基、シクロブチルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、2-シクロプロピルエチル基、2-シクロブチルエチル基、2-シクロペンチルエチル基、もしくは2-シクロヘキシルエチル基とすることができる。ヘテロシクロアルキル基であって、そのシクロアルキル環系が、単環、二環、もしくは三環であり、且つ、任意に1〜2個のS、過酸化物では無いO、もしくはN(R')と、4〜5個の環員炭素原子を含むようなものであって、例えば、モルホリニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、インダニル基、1,3-ジチアン-2-イル基、などである。すべてのシクロアルキル環系は、任意に、1〜3個の二重結合もしくはエポキシ部分を含み、且つ、任意に、1〜3個のOH、(C1-C6)アルカノイルオキシ基、(CO)、(C1-C6)アルキル基、もしくは(C2-C6)アルキニル基で置換される。(C1-C8)アルコキシ基には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、iso-ブトキシ基、sec-ブトキシ基、ペントキシ基、3-ペントキシ基、もしくはヘキシルオキシ基を含めることができる。(C2-C6)アルケニル基は、ビニル基、アリル基、1-プロペニル基、2-プロペニル基、1-ブテニル基、2-ブテニル基、3-ブテニル基、1-ペンテニル基、2-ペンテニル基、3-ペンテニル基、4-ペンテニル基、1-ヘキセニル基、2-ヘキセニル基、3-ヘキセニル基、4-ヘキセニル基、もしくは5-ヘキセニル基とすることができる。ヒドロキシ(C1-C8)アルキル基もしくはヒドロキシ(C1-C8)アルコキシ基は、1〜2個のOH基で置換したアルキル基とすることができ、こうした1〜2個のOH基で置換したアルキル基としては、例えばヒドロキシメチル基、1-ヒドロキシエチル基、2-ヒドロキシエチル基、1-ヒドロキシプロピル基、2-ヒドロキシプロピル基、3-ヒドロキシプロピル基、1-ヒドロキシブチル基、4-ヒドロキシブチル基、3,4-ジヒドロキシブチル基、1-ヒドロキシペンチル基、5-ヒドロキシペンチル基、1-ヒドロキシヘキシル基、もしくは6-ヒドロキシヘキシル基である。(C1-C6)アルキルCO2-は、アセトキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイルオキシ基、イソブタノイルオキシ基、ペンタノイルオキシ基、もしくはヘキサノイルオキシ基とすることができる。
【００４９】
下記に示した表１は、上述した構造式(I)、(II)、および(III)の化合物のいくつかを示したものであって、本発明を実施する上で使用することができるものを示している。
【００５０】
【表１】
2008516972.tif 000006
【００５１】
本発明において有用である22R-ヒドロキシコレステロールの他のアナログ（類縁体）を、構造に基づいたデータベース検索を使って同定することが可能である。二通りの手法について述べる。ひとつの手法は、22R-ヒドロキシコレステロールの構造に基づいたものである。22R-ヒドロキシコレステロールをいくつかの構造ブロックへと解体して、この22R-ヒドロキシコレステロールのブロックのうちのひとつもしくは複数を含んだ化合物を、データベースから検索する。この適用で得られる結果に基づいて、22R-ヒドロキシコレステロールの22Rヒドロキシ基の官能性が保たれるように、絞り込み検索を構成する。22R-ヒドロキシコレステロールと構造的に類似する化合物を、データベースから抽出して、それらの化合物のAβへの結合親和性をin vitroで実験する。最も大きな結合親和性を示した化合物を選び出し、さらなるin vivo研究にかける。第二の手法は、Aβの構造に基づいたものである。つまり、（受容体の）構造に基づく3Dデータベース検索において、目的分子であるAβの3D構造をNMR解析を用いて決定し、その後に、構造的に異なる合成物および天然物の無数の3D構造を含んだ大容量化学データベースから、電算化された分子ドッキングについて検索して、Aβと効果的に相互作用できる低分子を同定する。
【００５２】
Aβの鋳型3D構造を形成する際には、Aβの主鎖の原子のそれぞれを、開始時の立体配座に基づいた位置にあてがい、また、側鎖の原子の位置を、各側鎖について最小のエネルギーとなる内部配位に基づいたものとする。こうして得られる鋳型構造を、鋳型の内部エネルギーが最小になるように、さらに最適化する。最適化したAβの構造に基づいて、Aβに関する化合物データベースから得た化合物を配置することにより、ホスト-ゲスト複合体を作成する。このホスト-ゲスト複合体の構造を、三次元参照画面（referential）での複合体中の各原子が占める位置から定める。
【００５３】
目的とする結合部位に対して、Aβの原子と大幅に好ましからざる重なり合いをすること無く配置可能な化合物を選択することによって、幾何学的に適合する群を作成する。幾何学的に適合する群中の化合物のそれぞれについて、Aβの受容部位への予想される結合親和性を、化合物の原子とAβの原子との相互作用を表すエネルギー函数を最小化することによって定量する。このエネルギー函数の最小化は、化合物の位置を変化させて、最小のエネルギー函数が得られるようなゲスト-ホスト複合体の構造にすることによって行われる。結合部位の原子と最も好ましいエネルギー相互作用をする化合物を同定して、任意にさらなる処理にかける。例えば、化合物-Aβ複合体を表示して目視で検査し、最も有望な化合物の候補を同定する。
【００５４】
表示した複合体を目視で検討し、候補化合物の群を作成して、in vitro試験にかける。例えば、Aβの（ひとつもしくは複数の）受容部位もしくはポケットの中に、化合物がドッキングもしくは適合をするその特性を目視で定めることによって、複合体の検査を行う。目視での検査により、in vitro試験にかけるための化合物の同定を行う上での有効な礎が得られる。
【００５５】
推測上の結合をする化合物を同定した後に、こうした化合物がAβに特異的に結合する能力を、in vitroおよび／もしくはin vivoで確認する。
【００５６】
別の特徴として、本発明はAβに結合するよう合理的に設計された新規な化合物も提供する。新規な化合物の合理的な設計は、Aβの結合部位に関する情報に基づいたものである。Aβの構造および先導化合物の構造を解析して、この化合物の構造が、Aβの結合部位への結合が可能な活性を持つように構成する。
【００５７】
先導化合物の構造を複数の設計ブロックに分割し、先導化合物とAβの結合部位との相互作用への、修飾の与える影響を探索する。その後、種々の設計ブロックの組み合わせを有する化合物を合成して、確認された機構に関するその活性を試験する。こうした試験は、上述したものと同様の手法を用い、in vitroおよび／もしくはin vivoで行われる。そうしてこれらの試験を通じて得られる情報を、合理的薬剤設計の新規サイクル中に組み込む。所望の特性を有する先導化合物が同定されるまで、設計-合成-試験サイクルをくりかえす。その後、先導化合物を臨床検査にかける。
【００５８】
別の特徴として、本発明はADDLの形成を阻害する新規な化合物も提供し、例えば、Aβに結合して安定な無毒性オリゴマーもしくはポリマーを形成することによって阻害を行う、トリマーおよびテトラマーを提供する。
【００５９】
本明細書中では、「処置する」（"treat"）もしくは「処置」（"treatment"）という語は、被験者の体内の神経毒性もしくはβ-アミロイドに起因する神経毒性に関する疾病もしくは障害に関連する疾病または障害へのすべての処置を指し、障害もしくは疾病に罹りやすくなっていると思しいがまだそれらの障害もしくは疾病に罹患したとは診断されてはいないような被験者の障害もしくは疾病からの予防、あるいは、障害もしくは疾病の抑止（例えば障害もしくは疾病の進行の停止）、あるいは、障害もしくは疾病の軽減（例えば障害もしくは疾病を逆行させること）、あるいは、疾病もしくは障害に起因する症状の軽減（例えば疾病もしくは障害の症候の抑止）、を含むが、これらに限定はされない。本明細書中では、「神経変性障害」（"neurodegenerative disorder"）もしくは「神経病理」（"neuropathology"）とは、上述したすべての障害を包含しうるものである。
【００６０】
「抑止する」（"prevent"）もしくは「抑止」（"prevention"）という語は、被験者体内の神経毒性もしくはβ-アミロイドに起因する神経毒性に関連する疾病または障害に関係する場面においては、何も起きていない場合には、疾病もしくは障害が進行しないということであり、また、障害もしくは疾病の進行が既に進行していた場合には、障害もしくは疾病の進行がさらには進まないということであり、また、疾病についての論理的に観察可能な徴候を示す症候が無いということでもある。
【００６１】
幹細胞は、自己更新能力を有し、別個の細胞系統へと分化可能な後代を産生する、ということを特徴とする。早期胚に由来する幹細胞は、すべての体細胞型に分化可能であるが、成人の組織に由来する幹細胞は、その組織の特性を持つ（その組織中に存在する）細胞系統しか産生できないと考えられている。例えばEvans et al., Nature. 292, 154 (1981); Martin, PNAS USA. 78, 7634 (1981), Pedersen, Reprod. Fetil. Dev., 16, 543 (1994)を参照のこと。例えば、骨髄中に在る造血性幹細胞は、血液の要素だけを発生する（Morrison et al., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 11, 35 (1994)）。また、幹細胞は、成人の腸、生殖腺、皮膚、および脳の中で確認されている（Hull et al., Development, 106, 619 (1989); Morrison et al., Cell, 88, 287 (1997)）。神経幹細胞は、神経変性障害などの中枢神経系の疾病を処置するための有用なベクター（媒介体）であると考えられてはいるが、その利用しづらさから有用性に欠ける。
【００６２】
近年、幹細胞は、従来に予想されていたよりも大きな組織形成能（plasticity）を有するということが数々の報告で示された。EglitisとMezeyは、骨髄から得た少量の供与体（ドナー）細胞を、免疫欠損マウスに移入したところ、宿主の脳内で星状神経膠細胞（macroglia）として恢復した、と報告している（Eglitis et al., PNAS USA., 94, 4080 (1997)）。しかしながら、脳内に移殖した骨髄細胞の性質については定見が得られていない。Azizi et al., PNAS USA, 95, 3908 (1998) では、ラットの脳に、ヒトの骨髄基質細胞（marrow stromal cells; MSC）を注入している。このMSCは、拡大、自己更新、および種々の間葉細胞系統への分化が可能であるということが、Owen, J. Cell. Sci. Suppl., 10, 63 (1988) および Aubin, J. Cell. Biochem. Suppl., 30, 73 (1998) に示されている。ヒトのMSCを、脳室内の星状細胞と同様の手法で、脳内に移殖したが、細胞が神経細胞型へと分化したかどうかについては判然としなかった。関連する実験であるBjornson et al., Science, 238, 534 (1999) では、神経幹細胞を、放射線標識したホストの造血系内に移殖した後に、類骨髄球様細胞系統およびリンパ球様細胞系統へと分化した、ということを示している。それと共に、これらの発見からは、別個の胚芽層に由来（separate dermal origin）する幹細胞を使用した組織の再構築が可能である、ということが示唆される。
【００６３】
間葉幹細胞が、神経細胞となる宿命を受け入れられるのかどうかを判別するために、Kopen et al., PNAS USA, 96, 10711 (1999) では、新生児マウスの側脳室内にマウスMSCの純化母集団（purified population）を注入して、これらの細胞の宿命を免疫組織化学法で検査した。注入後12日間経過したところ、宿主の脳構造を破壊すること無く、MSCが前脳と大脳の全般に亘って殖生していた。線条体と海馬の分子層との中のMSCのうちのいくらかは、グリア線維酸性蛋白を発現しており、これは則ちMSCが成熟した星状細胞へと分化していたということである。また、MSCは、ニューロンに富む領域（Calleja島、嗅球、および大脳の内顆粒層、を含む）にも棲息していた。また、多数のMSCが、大脳の外顆粒層内部で発見された。加えて、脳幹網様体内では、神経細糸陽性供与体細胞（neurofilament positive donor cells）が発見されており、このことはMSCがニューロンに分化可能であることを示唆している。 "Bone Marrow Cells as a Source of Neurons for Brain and Spinal Cord Repair," Sanchez-Rames et al., U.S. Pat. No. 6,528,245; Woodbury et al., J. Neurosci. Res., 61, 364 (2000); Hofstetter et al., PNAS, 99, 2199 (2002)も参照のこと。したがって、MSCは、新生児マウスの脳内に移殖された後に、異なる胚芽層由来（different dermal origin）である分化した後代を産生する能力を有する。こうした結果からは、天然の幹細胞もしくは遺伝形質転換された（トランスジェニック）幹細胞が、中枢神経系の種々の障害の処置のためのベクターとして、さらには幹細胞がin vitroもしくはin vivoで価値ある神経細胞へと分化する能力を増強しうる試薬として有用である可能性を持つ、ということが示唆される。
【００６４】
したがって、本発明に係る方法の別の特徴では、哺乳類（ヒトなど）の神経前駆細胞を、in vitroもしくはin vivoで構造式(I)、(II)、および／もしくは(III)の化合物の有効量と接触させることにより、それらの神経細胞もしくは星状細胞（成熟したニューロンを含む）への分化を誘発する方法を提供する。したがって、本発明に係る化合物は、神経前駆細胞（神経幹細胞、間葉系幹細胞、骨髄基質細胞（MSC）、成人型多能性組織幹細胞、もしくは胚幹細胞など）のin vitroでの分化の前処置もしくは開始のために使用できる。幹細胞は、神経細胞系統にひとたび関係づければ、神経変性障害に苦しむ患者体内の目標部位（CNS中など）へと投与できる。別の手法として、幹細胞と、分化を起こす上での有効量の構造式(I)もしくは(II)もしくは(III)の化合物とを、（例えば、同時にもしくは短間隔をとって連続的に）併せて、苦しむ患者の体内の目標部位へと投与することが可能である。当然のことながら、本発明に係る化合物を患者に直接投与すると、患者の神経前駆細胞（関係づけられていない（コミットされていない）成人型幹細胞を含む）の余量（reserve）の刺戟を誘発して、関係づけられた神経前駆細胞への分化、または成熟した機能性神経細胞への分化を、in vivoで引き起こすことができる。こうした神経細胞の成長もしくは修復への刺戟が、神経変性障害の有効な処置法を齎すことが予想される。
【００６５】
「MAPC」もしくは成人型多能性組織幹細胞とは、非胚組織から誘導したものであって、分化により胚の三種すべての層の細胞系統（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）を発生させることが可能であるような細胞のことを指す。この細胞は、U.S. Patent application Serial Nos. 10/048,757 および 10/467,963（この参照によりその内容は本開示に含まれる）によって大きく取り上げられており、MAPCとその単離（特にヒト組織からの単離）について述べられている。MAPCは、細胞表面の標識形質の発現に関して大きな特徴を有し、GlyA、CD44、CD45、およびHLAの細胞表面発現について陰性を呈する。
【００６６】
一般に「幹細胞」（"stem cells"）と称される、複能性もしくは多能性の系統に関連づけられた（コミットされた）細胞もしくは未分化の細胞について開示している他の文献としては、U.S. Pat. Nos. 6,090,625; 5,827,735（間葉系幹細胞）; 6,200,806; 5,843,780、ならびに、published U.S. applications 20030008392（胚幹細胞）; 20030013910（非胚多能性幹細胞）; 20030073234（クローン性ヒト胚幹細胞株）; 20030161817（臍帯基質から得た全能性幹細胞）; 20020142457; 20021060509および20020164794が含まれる。
【００６７】
加えて、幹細胞は遺伝子的に改変可能なので、幹細胞には、所望の蛋白質をコードしたひとつもしくは複数の遺伝子のコピー、または内因性遺伝子の過剰発現をさらに含めることができる。遺伝子的に改変された幹細胞は、組換え体蛋白質の強力な発現をうながす促進因子の制御下で、アミノ酸（L-DOPAなど）の合成を増進するような酵素をコードするDNAも含むことができる。Schwartz et al.は、L-DOPAを発現する、遺伝形質転換したBSCを使って、6-ヒドロキシドーパミンで病変させたマウスの脳を処置した。Human Gene Therapy, 10, 2539 (1999) を参照のこと。別の手法として、酵素の発現を高度に制御して調節することもしくは時間的調節することを必要とするような条件下で、細胞が、誘導促進因子もしくは他の制御機構によって、調節可能である遺伝子を発現することもできる。
【００６８】
本発明に係る方法において有用である幹細胞は、遺伝子的に改変して、単離した異種DNA（isolated heterologous DNA）を含むようにすることもでき、これは、当業者に公知である種々の方法を使って、単離した異種DNAもしくはRNAを細胞中に導入することで行うことができる。こうした方法は以下の四種に大別される。即ち、 （１） ウイルス性転移：レトロウイルス（レンチウイルス属を含む）、サルウイルス40（Simian virus 40; SV40）、アデノウイルス、シンドビスウイルス（Sindbis virus）、およびウシ乳頭腫症ウイルス（bovine papillomavirus）などの、DNAもしくはRNAのウイルス性ベクターの使用を含む。 （２） 化学的転移：燐酸カルシウムトランスフェクション法、およびDEAE-デキストラントランスフェクション法を含む。 （３） 膜融合転移：リポソーム、赤血球残影、および原形質体（プロトプラスト）などの、DNAを担持した膜小胞体を使う。 （４） 物理的移送法：微量注入法（マイクロインジェクション）、電気穿孔法、もしくは「裸の」DNAを直接移送する方法など。
【００６９】
幹細胞、もしくは関連づけられたそれらの後代は、本発明に係る化合物と共に投与することができ、こうした投与は、カテーテル投与を含む限局性注入法、全身性注入法、腹腔内注入法、頭蓋内注入法、髄腔内注入法、筋肉内注入法、肝内注入法、非経口的注入法、動脈内注入法、側脳室内注入法、胎盤内注入法などを介して行うことができる。注入は複数の部位に向けて行うことが可能であり、例えば複数の外傷部位もしくは他の損傷部位にに向けることができる。
【００７０】
最適な効果を得るにあたって、幹細胞の治療上使用法に関して重要なことは、細胞の量である。ヒトの自家単核骨髄細胞についての現在の研究では、1〜4 x 107個の細胞数とした実験的用量が有望な結果を示した。しかしながら、所望の組織内へ注入する細胞の量には最適化が必要であるとする別の話もある。例えばU.S. Pat. No. 6,767,531での自家幹細胞移殖を使った骨髄置換法に関する記載を参照されたい。したがって、投与する細胞の量は、処置を行う被験者に応じて変更することになる。ヒトの被験者に投与できる本発明に係る幹細胞の数は、好ましい実施形態においては104〜108個、より好ましくは105〜107個、最も好ましくは3 x 107個とし、さらに任意に、一日あたり50〜500μg/kgのサイトカインも投与可能である。しかしながら、有効な用量を精確に決めるにあたっては、各被験者に固有の因子（被験者の大きさ、年齢、目標とする器官、および、望まざる基質の蓄積が始まって以来経った時間の量、を含む）に基づいて考慮することができる。したがって用量は、本開示と当該技術分野における知識とを使って、当業者が容易に確認できる。
【００７１】
一般に、ヒトの被験者は、マウスもしくは他の実験動物よりも処置時間が長くなるということに留意されたい。処置時間の長さは、治療過程の長さと効率に比例したものとなる、。こうした用量は、一回分の用量であってもよく、あるいは数日間に亘る複数回分の用量であってもよい。したがって当業者は、本開示と本明細書中で参照した文献と当該技術分野における知識とを使って、動物実験（ラット、マウス、イヌなど）の結果をヒトへと拡張することができる。処置期間の長さは、治療過程の長さと薬剤効率と処置される被験者に比例したものとなる。
【００７２】
本発明に係る、有効量の幹細胞および／もしくは有効な化合物は、神経毒性に関連する疾病の処置のための投与に先立ち、薬学的に許容される担体と併せて薬学的組成物として処方することができる。「有効量」（"an effective amount"）もしくは「薬学的有効量」（"pharmacologically effective amount"）とは、処置を受ける被験者に治療効果を与える上で必要とされる化合物の量のことを指す。動物用の用量と、ヒト用の用量との相関（体表面積の平方メートルあたりのミリグラムに基づくもの）については、Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 50, 219 (1966) に記載されている。体表面積は、患者の身長と体重から概算できる。例えばScientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537を参照のこと。有効用量は、本発明に係る化合物のin vitro濃度に基づいたものとすることができ、この化合物は、以下で詳細に説明するように、ヒトのAD患者の体内の既知であるAβ濃度に対応した濃度のAβの毒性を阻害する上で有効であることが発見されているものである。モデル神経細胞株を刺戟する上で有用な本発明に係る化合物の用量について、以下で開示してゆく。当業者には理解できることだが、有効用量は、投与経路、賦形剤の使用、および任意である他の治療薬との共投与、に依って変更することもできる。
【００７３】
活性成分の毒性と治療効率については、標準的な薬学的手順を使って定量することが可能であり、例えば、 LD50 （母集団の50%を死に至らしめる用量）およびED50 （母集団の50%に有効な用量）を定めるような手順を使うことができる。毒性と治療効果とについての用量の比は治療指数であり、 LD50/ED50 で表わせる。大きな治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物であっても使用することができるが、こうした化合物を罹患組織の部位へと向かわせる送達系（delivery system）を設計するにあたっては、未感染の細胞へ与えうる損傷を最小限に留めて、副作用を軽減するために、注意が必要となる。
【００７４】
本発明に係る方法、キット、配合物、および薬学的組成物には、記載した化合物の、結晶形態（多形体など）、鏡像異性体、異性体、および互変異性体、ならびに、それらの薬学的に許容される塩が含まれる。薬学的に許容される塩の例は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、琥珀酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、林檎酸、酒石酸、枸櫞酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、ステアリン酸、サリチル酸、p-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、embonic acid（パモン酸 pamoic acid）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルギン酸（algenic acid）、b-ヒドロキシ酪酸（b-hydroxybutyric acid）、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸、から調製される。
【００７５】
「プロドラッグ」（"prodrug"）という語は、体内の代謝過程による転換の結果として、薬学的活性を生じるような、薬剤もしくは化合物（活性部）のことを指す。一般的に言ってプロドラッグとは、被験者への投与とその後の吸収を経て、代謝過程などのいくつかの過程を介して、活性種もしくはより強い活性種へと転換されるような、薬剤の前駆体のことであると考えられている。転換過程から生じる他の産物は、身体により容易に処分される。一般にプロドラッグは、その上に、薬剤の活性を抑えるように、ならびに／あるいは、薬剤に可溶性もしくは他の特性を付与するようにはたらく化学基を有する。このような化学基は、例えば、エステルもしくはアシル基である。こうした化学基がプロドラッグから切断されると、より活性の強い薬剤が生成することになる。プロドラッグは、薬剤の可逆性誘導体として設計でき、また、部位（特定の組織）への薬剤搬送を増進する調節剤（modifiers）として利用することもできる。今日のプロドラッグ設計は、治療用化合物の有効な水溶性を増進するような方向で行われており、これは、このような化合物が目標とする領域では、水が主要な溶媒となるからである。例えば、Fedorak, et al., Am. J. Physiol., 269, G210-218 (1995) は、デキサメタゾン-β-D-グルクロニド（dexamethasone-beta-D-glucuronide）について記載している。McLoed, et al., Gastroenterol., 106, 405-413 (1994) は、琥珀酸デキサメタゾン=デキストラン類（dexamethasone-succinate-dextrans）について述べている。Hochhaus, et al., Biomed. Chrom., 6, 283-286 (1992) は、21-スルホ安息香酸デキサメタゾンナトリウム（dexamethasone-21-sulphobenzoate sodium）および21-イソニコチン酸デキサメタゾン（dexamethasone-21-isonicotinate）について示している。加えて、J. Larsen and H. Bundgaard, Int. J. Pharmaceutics, 37, 87 (1987) では、N-アシルスルホンアミドのプロドラッグ誘導体としての可能性についての評価を行っている。J. Larsen et al., Int. J. Pharmaceutics. 47, 103 (1988) は、N-メチルスルホンアミド類のプロドラッグ誘導体としての可能性についての評価を行っている。また、プロドラッグについては、例えばSinkula et al., J. Pharm. Sci., 64, 181-210 (1975) にも記載されている。また、プロドラッグは、当該技術分野で公知である合成的転換を用いた構造式(I)、(II)、もしくは(III)の他の化合物の調製にあたっての合成中間体としても有用である。例えば、I. T. Harrison, Compendium of Organic Synthetic Methods, Wiley-Interscience (1971) では、スピロステノールの置換基を転換する上で有用な方法について触れている。
【００７６】
「誘導体」（"derivative"）という語は、類似した構造を有する別の化合物から、そのうちの或る原子、分子、もしくは基を他のものに置換することによって生成される化合物のことを指す。例えば、化合物中の水素原子を、アルキル基、アシル基、アミノ基などに置換して、その化合物の誘導体を生成することができる。
【００７７】
「血中濃度」（"plasma concentration"）とは、血漿中もしくは血清中の物質の濃度を指す。
【００７８】
「薬剤吸収」（"drug absorption"）もしくは「吸収」（"absorption"）とは、全身循環へと薬剤を投与した部位から、被験者の血流中などへの、移動の過程のことを指す。
【００７９】
「生体利用度」（"bioavailability"）とは、活性部（薬剤もしくは代謝中間体）が、全身循環中に吸収されて、身体中の部位で薬剤活性を利用できるようになるその程度のことを指す。「代謝」（"metabolism"）とは、身体中での薬剤の化学的変形過程のことを指す。
【００８０】
「薬力学」（"pharmacodynamics"）とは、作用部位における薬剤の濃度に依って観察される、生物学的反応を決定する因子のことを指す。
【００８１】
「薬物動態」（"pharmacokinetics"）とは、作用部位における薬剤の適切な濃度の達成および維持を決定する因子のことを指す。
【００８２】
「血中半減期」（"plasma half-life"）とは、薬剤の血中濃度が、最高濃度の50%まで減少するためにかかる時間のことを指す。
【００８３】
本開示における「約」（"about"）という語は、「凡そ」（"approximately"）という意味であって、関連する技術を実施する間に生じうるパラメータの揺れを包含する概念である。例示的には、「約」という語の使用は、例示した範囲から外れた用量も有用且つ安全でありうることを示しており、またそのような用量も本発明の請求の範囲に含有される、ということを示している。
【００８４】
「測定可能な血清中濃度」（"measurable serum concentration"）という語は、投与後に血流中に吸収された、治療薬の血清中濃度（典型的には、血清のml、dl、もしくはlあたりの、mg、μg、もしくはngで測定した治療薬）を意味する。
【００８５】
本明細書中で形容詞的に用いている「薬学的に許容される」（"pharmaceutically acceptable"）という語句は、それで修飾された名詞が薬学的製品に用いるにあたって適切である、という意味である。薬学的に許容される塩には、金属イオンと有機イオンが含まれる。より好ましい金属イオンは、適切なアルカリ金属（Ia族）塩、アルカリ土類金属（IIa族）塩、および他の生理学的に許容される金属イオンを含むが、これらに限定はされない。イオンの例としては、通常の価数であるアルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、および亜鉛が含まれる。好ましい有機イオンとしては、プロトン化三級アミンおよび四級アンモニウムカチオン類が含まれ、その一部を挙げれば、トリメチルアミン、ジエチルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン）、およびプロカインがある。薬学的に許容される酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、燐酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、蟻酸、酒石酸、マレイン酸、林檎酸、枸櫞酸、イソ枸櫞酸、琥珀酸、乳酸、グルコン酸、グルクロン酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸、フマル酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、などが含まれるがこれらに限定はされない。
【００８６】
本発明に係る組成物は、通常は、薬学的組成物の形態として投与される。こうした組成物は任意の適切な経路で投与でき、例えば、経口、経鼻胃、直腸、経皮、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、脊髄内、および皮内の、注射法または注入法を用いた投与）、鼻腔内、経粘膜、移殖、膣、局所、頬側、ならびに舌下、を含むような経路で投与できるがこれらに限定はされない。その調製にあたっては、緩衝剤、保存料、滲透促進剤、適合性担体、ならびに、他の治療成分もしくは非治療成分を含めるのが普通である。
【００８７】
また本発明は、本発明に係る組成物を、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と併せて使うための方法も含む。本明細書中では、「薬学的に許容される担体」（"pharmaceutically acceptable carrier"）もしくは「薬学的に許容される賦形剤」（"pharmaceutically acceptable excipients"）という語は、任意且つすべての溶媒、分散媒体、外被物、抗真菌剤および抗菌剤、ならびに、等張剤および吸収遅緩剤、などを含む。物質の摂取のための、こうした媒体および試薬の使用法については、当該技術分野で公知となっている。本発明に係る組成物と不適合である場合を除き、従来技術に係る任意の媒体もしくは試薬の使用が想定される。また、付加的な活性成分もこの組成物に組み込むことができる。本発明に係る組成物の製造にあたっては、（ひとつもしくは複数の）組成物を、薬学的に許容される賦形剤と併せて混合し、この賦形剤で希釈することもでき、または、担体（カプセル、包（sachet）、もしくは他の容器）中に包含させることもできる。本発明に係る組成物の製造に際して使用できる担体物質は、製薬で常用されている賦形剤のうちのいずれかとすることができるが、こうした担体は、活性薬剤との適合性と、所望の投与形態における放出プロファイル特性とに基づいて選択すべきである。
【００８８】
例えば、薬学的な賦形剤は以下に挙げる例から選択される。
（ａ） アラビアゴム（acasia）、アルギニン酸およびその塩、セルロース誘導体、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピル-セルロース、珪酸マグネシウムアルミニウム、ポリエチレングリコール、ゴム類、多糖類の酸、ベントナイト類、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、クロスポビドン、ポビドン、ポリメタクリラート類、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファ化澱粉、エチルセルロース、トラガカントゴム、デキストリン、微細結晶セルロース、スクロース（蔗糖）、もしくはグルコース（葡萄糖）などの、結合剤（バインダー）。
（ｂ） 澱粉、アルファ化コーンスターチ、アルファ化澱粉、セルロース類、架橋カルボキシメチルセルロース、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスポビドン、架橋ポリビニルピロリドン、クロスカルメロースナトリウム、微細結晶セルロース、カルシウム、アルギニン酸ナトリウム錯体、粘土類、アルギニン酸塩類、ゴム類、もしくは澱粉グリコール酸ナトリウム、ならびに、錠剤調製において用いられる任意の崩壊剤、といった崩壊剤。
（ｃ） ラクトース（乳糖）、炭酸カルシウム、燐酸カルシウム、燐酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、微細結晶セルロース、粉末セルロース、デキストロース、デキストラン塩類、デキストラン、澱粉類、アルファ化澱粉、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール、などといった充填剤。
（ｄ） ラウリル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリソルベート類、ポロクサマー類（polaxomers）、胆汁酸塩類、モノステアリン酸グリセリル、 PluronicTM系列（BASF）、などといった界面活性剤。
（ｅ） 枸櫞酸、琥珀酸、フマル酸、林檎酸、酒石酸、マレイン酸、グルタル酸炭酸水素ナトリウム（glutaric acid sodium bicarbonate）、およびグルタル酸炭酸ナトリウム、などといった可溶化剤。
（ｆ） 任意の抗酸化剤、緩衝剤、もしくは酸、などといった安定剤も使用できる。
（ｇ） ステアリン酸マグネシウム、水酸化カルシウム、滑石、ステアリルフマル酸ナトリウム、硬化植物油、ステアリン酸、ベハピン酸グリセリン（glyceryl behapate）、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、滑石、蝋類、Stearowet、硼酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、DL-ロイシン、ポリエチレングリコール類、オレイン酸ナトリウム、もしくはラウリル硫酸ナトリウム、などといった滑沢剤。
（ｈ） オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、モノオレイン酸ソルビタン、ソルビタンモノラウラート（sorbitan monolaurate）、オレイン酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（polyoxyethylene sorbitan monolaurate）、オレイン酸ナトリウム、もしくはラウリル硫酸ナトリウム、などといった湿潤剤。
（ｉ） ラクトース、澱粉、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、微細結晶セルロース、燐酸水素カルシウム、スクロースに基づく賦形剤、粉砂糖、硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物、乳酸カルシウム三水和物、デキストラン塩類、イノシトール、加水分解された穀物固形物、アミロース、粉末セルロース、炭酸カルシウム、グリシン、もしくはベントナイト、などといった希釈剤。
（ｊ） 滑石、コーンスターチ、DL-ロイシン、ラウリル硫酸ナトリウム、およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸ナトリウム、などといった固結防止剤（anti-adherents）あるいは流動促進剤（glidants）。
（ｋ） アラビアゴム、ゼラチン、コロイド二酸化珪素、グリセロ燐酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、珪酸マグネシウム、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、塩化ナトリウム、燐酸三カルシウム、燐酸二カリウム、ステアリル乳酸カルシウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、もしくはアルファ化澱粉、などといった、薬学的に適合する担体。
【００８９】
加えて、薬剤処方については、例えばRemington's The Science and Practice of Pharmacy (2000) で考察されている。薬剤処方の別の考察については、Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980 に見つけることができる。本発明に係る組成物を含んだ錠剤もしくは顆粒は、被膜することもでき、または腸溶剤皮で包むこともできる。
【００９０】
ヒトの処置用として有用であることに加えて、本発明は、獣医学上の動物、爬虫類、鳥類、外来動物、ならびに畜獣を含む他の被験者に対しても有用であって、こうした被験者には例えば、哺乳類、および齧歯類なども含まれる。哺乳類には、例えばサルもしくはキツネザルである霊長類、ウマ、イヌ、ブタ、またはネコが含まれる。齧歯類には、ラット、マウス、リス、もしくはモルモットが含まれる。
【００９１】
本発明に係る薬学的組成物は、神経毒性阻害剤の投与が必要とされるような場合に有用である。これらの組成物は、老人性認識障害および／もしくは痴呆症（ADなど）の処置において特に有用であることが見出されている。
【００９２】
神経変性障害の処置にあたり、本発明に係る組成物を使用して、Aβに起因する細胞毒性の低減などの治療反応を充分に引き出せる量である本発明に係る化合物の用量が得られるようにすることができ、例えばその用量は、約5ng〜約1000mg、または約100ng〜約600mg、または約1mg〜約500mg、または約20mg〜約400mgである。通常は、体重に対しての有効な用量は、約0.0001mg/kgから1500mg/kg、より好ましくは1から1000mg/kg、より好ましくは約1から150mg/kgの範囲であり、もっとも好ましくは体重に対して50から100mg/kgの範囲である。一回分の用量を、一日につき一回から約四回の服用に分割して投与することもでき、また、治療効果を引き出すために、複数回分の用量を一日で投与することもできる。例示的には、本発明に係る組成物の剤型単位は、例えば本発明に係る化合物を約5ng、50ng、100ng、500ng、1mg、10mg、20mg、40mg、80mg、100mg、125mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、700mg、800mg、900mg、もしくは1000mg含むのが典型的である。剤型は、特定の用量を実現するために用いられる所望の頻度での投与に適合するように、選択することができる。投与する本発明に係る組成物の剤型単位の量と、症状もしくは障害を処置するための投薬療法とは、種々の因子（被験者の年齢、体重、性別、および症状、ならびに、症状もしくは障害の重篤度、ならびに、投与の経路および頻度を含む）に依存し、これは周知の通り広汎に変更可能である。
【００９３】
本発明の或る実施形態においては、組成物は被験者に有効量で投与される。これはつまり、本発明に係る化合物の治療効果を示すような用量が、所望の治療効果を引き出すための或る期間内において被験者の血清中に存在できるように、組成物を投与する、ということである。例えば、絶食している成人（だいたい10時間以上の絶食をしている成人）においては、組成物の投与より約5分後の時点から、被験者の血清中において、本発明に係る化合物の治療上有効量が得られるような投与が行われる。本発明の別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約10分後の時点から、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明の別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約20分後の時点から、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明のなおも別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約30分後の時点から、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明のさらに別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約40分後の時点から、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明の或る実施形態においては、被験者への組成物の投与より約20分から約12時間の間に、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明の別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約20分から約6時間の間に、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明のなおも別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約20分から約2時間の間に、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明のさらに別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約40分から約2時間の間に、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。また、本発明のなおも別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約40分から約1時間の間に、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。
【００９４】
本発明に係る或る実施形態においては、本発明に係る組成物は、本発明に係る組成物の最大半量（half maximum dose）である濃度が、血清中濃度となるような用量で投与される。例えば、本発明に係る組成物を被験者に投与することにより、約0.01から約1000nM、もしくは約0.1から約750nM、もしくは約1から約500nM、もしくは約20から約1000nM、もしくは約100から約500nM、もしくは約200から約400nMの血清中濃度が得られる。
【００９５】
本発明において想定される組成物では、本発明に係る化合物を投与後に約5分間から約24時間の間隔をおいて投薬することで、治療効果が得られ、望むならば一日一度もしくは二日に一度の投与とすることも可能である。本発明の或る実施形態では、被験者への組成物を投与に適した1回分を投与してから約10分後、約20分後、約30分後、もしくは約40分後に、本発明に係る化合物の用量の最大半量が、約1μg/ml以上、もしくは約5μg/ml以上、もしくは約10μg/ml以上、もしくは約50μg/ml以上、もしくは約100μg/ml以上、もしくは約500μg/ml以上、もしくは約1000μg/ml以上の平均血清中濃度が得られる。
【００９６】
治療効果を引き出すために必要である本発明に係る化合物の量は、例えば、血清中への化合物の吸収率、試薬の生物学的利用能、および障害の処置に関する効能、といったことに基づいて実験的に定量することができる。しかしながら、本発明に係る化合物の、任意の特定の被験者への特定の投薬量は、種々の要因に依存しており、そのような要因としては、使用する特定の化合物の活性、被験者の年齢・体重・総合的な健康状態・性別・食餌（例えば被験者が絶食しているか、もしくは食後かといったことを含む）、投与時間、排出率、薬剤の配合、ならびに処置される特定の障害の重篤度、ならびに投与の形態、が含まれる、ということを理解されたい。一般に処置用量は、安全性および有効性を最適化するために漸増することができる。典型的には、in vitroおよび／もしくはin vivoでの初期実験から得られる用量-作用効果の相関が、被験者への投与に適した用量を導き出す上で有用となる。一般的に、本発明に関する胃腸の障害もしくは疾病の処置のために有用な用量を評価するための手引きとして、実験動物による研究を行うことができる。処置プロトコールの観点から言うと、投与される用量が、投与される特定の試薬、投与経路、特定の被験者の体調などといった種々の因子に依存する、ということを当業者は正しく理解することができる。一般的に言って、本発明に係る化合物は、治療効果を引き出すために有用な期間に亘ってin vitroで有効であるとされた濃度を得る上で適切な血清中量を得られるような量で、投与することが望ましい。したがって、例えば、200nMの最大半量でin vitro活性を示すことが見出された化合物の場合には、例えば、β-アミロイドに起因する高い神経毒性、および、当業者によって適切に測定されるようなものとして選択される他の指標に関連した障害を処置するというような所望の治療効果を引き出せる期間に亘って、in vivo濃度200nMの概算最大半量が得られるために有効である量の薬剤を投与するのが望ましいということになる。これらのパラメータの定量については当該技術分野において公知である。これらの考慮事項は当該技術分野において公知であり、標準的教科書に記載されている。
【００９７】
被験者に送達する、本発明に係る化合物の有効量を測定および定量するために、標準的アッセイ法を用いて、本発明に係る化合物の血清中濃度を測定することができる。
【００９８】
本発明で想定される組成物は、被験者への投与後に、約30分間〜約24時間経ってから治療効果を齎す。或る実施形態においては、組成物はこうした治療効果を約30分間で呈する。別の実施形態においては、組成物は、治療効果を約24時間に亘って呈し、一日一度の投与でよくなるため、患者の便に供する。
【００９９】
また、本発明に係る方法、キット、および組成物は、神経変性障害を処置もしくは抑止することを目的とした別の治療薬と併せて使用すること（「併用療法」 "combination therapy"）も可能であり、例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（ガランタミン、塩酸ドネペジル（donezepil hydrochloride））と組み合わせることができる。本発明と連携して用いる場合、即ち併用療法を行う場合には、望まざる副作用のうちのすべてではないにせよ多くを、軽減または除去できるような付加作用もしくは相乗作用を得ることができる。これらの薬剤から副作用が軽減されると、例えば、投与された配合物の治療作用効果を得るために必要な用量を軽減することにつながる。
【０１００】
「併用療法」という語は、被験者の神経変性障害を処置もしくは抑制するための別の薬剤と、本発明に係る組成物とを連携して投与することを、神経変性障害の処置のためのこれらの治療薬の補助活性（co-action）から、有益な作用効果を得ることを意図した特定の処置療法の一部として、包含する。併用による有益な作用効果としては、治療薬の併用から生じる薬物動態学的もしくは薬力学的な補助活性が含まれるが、これに限定はされない。これらの治療薬を配合物として投与する際は、典型的には所定の時間（選択した配合に応じて、つねに実質的に同時に（usually substantially simultaneously）、分単位、時単位、日単位、週単位、月単位、もしくは年単位とする）をおいて行われる。「併用療法」は、一般的には、本発明と併用したときに付随的且つ恣意的な結果を与えるような別々の単独の療法の一部としての、二種以上の治療薬の投与を包含することを表すものではない。「併用療法」は、これらの治療薬の連続的な投与、即ち、それぞれの治療薬を異なる時刻に投与すること、さらに、これらの治療薬、もしくは二種以上の治療薬を実質的に同時に投与することを含む意味である。実質的に同時である投与は、例えば、被験者に、それぞれの治療薬を固定比で含んでいる単独の錠剤もしくはカプセルを被験者に投与すること、あるいは、それぞれの治療薬の単独のカプセルもしくは錠剤を複数組み合わせて被験者に投与することによって行うことができる。それぞれの治療薬を、連続的投与、もしくは実質的に同時に投与するにあたっては、任意の適切な経路で行うことができる。本発明に係る組成物は、経口的もしくは経鼻胃的に投与することができ、その一方で併用する他の試薬を、その試薬に対して適切である任意の経路で投与することができる。こうした経路としては、口腔経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、もしくは粘膜組織からの直接の吸収、が含まれるが、これらに限定はされない。例えば、本発明に係る組成物を、経口的もしくは経鼻胃的に投与して、且つ、併用する治療薬を経口的もしくは経皮的に投与する、といったことができる。連続的に治療薬を投与することは、狭義においては重篤なことではない。「併用療法」は、さらに、例えば鎮痛薬であるがそれに限定はされないような他の生理活性成分と配合した上述した治療薬の投与のことも包含し、また、例えば外科手術であるがそれに限定はされないような非投薬療法と組み合わせた上述した治療薬の投与のことをも包含する。
【０１０１】
併用療法を構成する治療薬は、配合して一体とした剤型、もしくは、実質的に同時に投与されるような別々の剤型とすることができる。また、併用療法を構成する治療薬と、二段階の投与を要する療法において投与されるいずれかの薬剤とを連続的に投与することもできる。したがって、複数の間隔をおいた別々の治療薬の投与と併せた、複数の治療薬の連続的な投与を要するような療法とすることもできる。それぞれの治療薬の効能、溶解性、生物学的利用能、血中半減期、および動態学的プロファイルといったそれぞれの治療薬の特性に応じて、さらに摂食の影響、ならびに被験者の年齢および病態に応じて、複数の投与ステップの時間間隔を、例えば数分間から数時間から数日間の範囲とすることができる。また、目標分子の濃度の概日変化から、最適な投薬間隔を決定することもできる。同時に、実質的に同時に、もしくは連続的に投与されるような併用療法の治療薬には、経口で投与されるひとつの治療薬と、口腔経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、もしくは粘膜組織からの直接の吸収などで投与される別の治療薬とのために求められる療法が含まれる。併用療法の治療薬を、経口投与、吸入スプレーによる投与、直腸投与、局所投与、口内投与、舌下投与、または非経口的投与（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、および皮内への注射）のいずれかによって別々にあるいは共に投与される場合のいずれにおいても、それぞれの治療薬は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、もしくは他の処方成分を含んだ適切な薬学的処方とすることができる。
【０１０２】
経口投与のために、本発明に係る薬学的組成物には、構造式(I)、(II)、もしくは(III)の化合物の所望の量を含めることができ、例えば、錠剤、ハードカプセル、ソフトカプセル、薬用ドロップ、包、トローチ、必須ではない粉末、細粒、懸濁液、エリキシル剤、液体、もしくは、経口投与にあたって妥当である任意の他の形態であるような形態で投与される。例えば、このような薬学的組成物は、所定の量の化合物を含んだ、錠剤もしくはカプセルのような個別の剤型単位として調製することができる。このような経口投与形態は、例えば緩衝剤をさらに含む。錠剤、丸薬、および類似物は、腸溶外被を付加して調製することもできる。
【０１０３】
口内投与もしくは舌下投与のための薬学的組成物には、例えば、スクロース、アラビアゴム、もしくはトラガカントゴムのようなフレーバーベース中の本発明に係る化合物を含む薬用ドロップ、また、ゼラチンおよびグリセリン、または、スクロースおよびアラビアゴムといった不活性ベース中の化合物を含む香錠（pastilles）、が含まれる。
【０１０４】
経口投与のための液状調剤には、当該技術分野で通常使用される不活性な賦形剤（例えば水）を含んだ薬学的に許容される乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が含まれる。このような組成物には、例えば、湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤、ならびに、甘味料、フレーバー、香料を含めることもできる。
【０１０５】
適切な液状調剤には、本発明に係る化合物、ならびにβ-シクロデキストリン、または、β-シクロデキストリン=スルホブチルエーテル、ヘプタキス-2,6-ジ-O-メチル-β-シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、およびジメチル-β-シクロデキストリンといった水溶性のβ-シクロデキストリン誘導体を含む水溶液が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１０６】
また、本発明に係る薬学的組成物は、注射（静脈内、筋肉内、皮下）によって投与することもできる。このような注射可能な組成物には、適切な担体物質として、例えば、生理食塩水、デキストロース、もしくは水を使用できる。必要であれば、適切な酸、塩基、もしくは緩衝剤を用いて、組成物のpH値を調節することもできる。また、適切な賦形剤、分散剤、湿潤剤、もしくは懸濁剤（マンニトール、およびポリエチレングリコール（PEG 400など）を含む）を、組成物に含めることもできる。また、適切な非経口的組成物には、注射筒内に凍結乾燥された活性化合物を含めることもできる。注射に先立ち、水溶液を加えて組成物を溶解することもできる。
【０１０７】
薬学的組成物は、座薬などの形態でも投与できる。このような直腸処方には、本発明に係る化合物を、総量にして例えば約0.075〜約75% w/w、もしくは約0.2〜約40% w/w,、もしくは約0.4〜約15% w/w で含めるのが好ましい。ココアバター、カカオバター、および他の油脂といった担体物質、ならびにポリエチレングリコール系座薬基剤を、これらの組成物に用いることができる。外被（例えば、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース被膜）、および崩壊剤（例えば、クロスカルメロースナトリウム、および架橋ポビドン）といった他の担体物質を、所望であれば用いることもできる。
【０１０８】
被験化合物は、遊離形態であってもよいし、あるいは、マイクロカプセル中に内包するこも、またはコロイド性薬剤送達系（リポソーム、微細乳濁液（microemulsions）、および粗大乳濁液（macroemulsions）など）に内包してもよい。
【０１０９】
これらの薬学的組成物は、本発明に係る活性化合物と、ひとつもしくは複数の担体物質とを配合させるステップを含むような、任意の適切な薬学的方法を用いて調製できる。一般的には、組成物は、液体もしくは細粒状固体担体、またはその両方と、均一且つ充分に混合されて、必要であればその後に製品として成形される。例えば、化合物の粉末もしくは顆粒に、任意にひとつもしくは複数の添加成分を加えて圧縮するかもしくは流し固めることで、錠剤を調製できる。圧縮錠剤は、粉末もしくは顆粒といった流動体である化合物に、任意に結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、および／もしくは界面活性／分散剤を混合して、適切な機械を用いて圧縮することによって調製することができる。凝固錠剤（molded tablets）は、不活性な希釈液で湿らせた化合物粉末を、適切な機械を用いて流し固めて調製することができる。
【０１１０】
本発明に係る錠剤は、OpadryTM White YS-1-18027A（もしくは別の色）のような従来技術に係る外被物質でコートすることもでき、コートされた錠剤の総重量のうちの約3%程度を外被物の重量とすることができる。本発明に係る薬学的組成物は、患者に投与された後に、当該技術分野で公知である方法によって、本発明に係る化合物が、即座に放出、持続放出、もしくは遅延放出するように処方することができる。
【０１１１】
賦形剤に希釈剤としての役割も持たせる場合には、賦形剤を固体、半固体、もしくは液体の物質とすることができ、これらはまた、活性成分のための溶媒（vehicle）、担体、もしくは媒体としても機能する。したがって組成物を、錠剤、咀嚼錠、丸薬、粉末、薬用ドロップ、包、オブラート包、エリキシル剤、懸濁液、乳濁液、溶液、シロップ、エアロゾル（固体として、もしくは液体媒体中に溶かして）、ソフトゼラチンカプセル、ハードゼラチンカプセル、および滅菌パッケージ済み粉末といった形態とすることができる。
【０１１２】
本発明の或る実施形態においては、製造プロセスとして、以下の方法のうちのひとつを行うこともでき、またはそれらを組み合わせて行うこともできる。即ち、 （１） 乾燥混合（空練り; dry mixing）、 （２） 直接圧縮、 （３） 粉砕、 （４） 乾燥造粒もしくは無加水造粒、 （５） 加水造粒、または （６） 溶融。Lachman et al., The Theory and Practice of Industrial Pharmacy (1986) 。
【０１１３】
本発明の別の実施形態においては、本発明に係る化合物を薬学的賦形剤と混合して、本発明に係る化合物と賦形剤との均一（ホモジーナス）な混合物を含んだ固形の予備処方組成物を作成することによって、錠剤のような固形組成物を調製することができる。（ひとつもしくは複数の）これらの予備処方組成物を均一であると称する場合には、治療薬が組成物全体に亘ってむらなく分散し、この組成物を、同等に有用な剤型単位（錠剤、丸薬、およびカプセルなど）へと容易に再分割できる、ということを意味している。こうした固形の予備処方は、本明細書中で記載したような類の剤型単位へと再分割される。
【０１１４】
圧縮錠剤とは、活性成分と、加工を援け且つ製品の特性を改善するように選択された賦形剤とを含む処方を、凝縮することによって調製される固体の剤型のことである。「圧縮錠剤」（"compressed tablet"）という語は、一般的には、添加物の少ない、被覆されていない経口投与のための錠剤であって、一回の圧縮で調剤されるような錠剤、または、先立つ予備打錠と最終的な圧縮とで調剤されるような錠剤のことを指す。
【０１１５】
本発明に係る錠剤もしくは丸薬は被覆することも、または、長期間の活性の利点が得られるような別の方法による調合をすることもできる。例えば、錠剤もしくは丸薬は内剤（inner dosage）および外剤（outer dosage）を含むことができ、この後者が前者を被覆するように構成することができる。腸溶層もしくは腸溶外被を使用するためには、数多のポリマーの酸、ならびに、ポリマーの酸と、シェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースとの混合物、を含むような種々の物質を用いることができる。
【０１１６】
本発明に係る組成物の継続投与を必要とする患者の、神経変性障害の処置にあたっては、長期持続放出インプラントの使用が適している。本明細書中で用いる「長期」放出（"long-term" release）とは、本発明に係る化合物の治癒力のある量を、少なくとも三十日間、好ましくは六十日間に亘り送達することができるようにインプラントが組立・構成されていることを意味する。長期持続放出インプラントは、当業者には公知のものであって、上述したような放出系を含む。
【０１１７】
本発明の別の実施形態においては、神経変性障害を処置するための化合物を、本発明に係るひとつもしくは複数の治療薬を含んだキットまたはパッケージの形状に収める。これらの治療薬は、時間毎、日毎、週毎、もしくは月毎（または他の周期毎）の用量を収め、且つ連続的もしくは同時の投与に適するように構成された、キットあるいはパッケージの形状として包装することができる。本発明では、連日の投与のための複数の別々にパッケージされた剤型単位を含み、それぞれの剤型単位が本発明に係る少なくともひとつの治療薬を含んでいるようなキットもしくはパッケージもさらに提供する。この薬剤送達系を用いることによって、本発明に係る任意の治療薬の投与を容易にすることができる。或る実施形態では、系は、日毎もしくは週毎に投与されるべき用量を複数含んでいる。キットもしくはパッケージには、剤形（dosage form）の適切な投与を容易にするために併用療法で利用できる他の治療薬を含めることもできる。キットもしくはパッケージには、被験者への説明書のセットを含めることもできる。
【０１１８】
本発明について、後述する詳細な例を参照してさらに記述してゆく。なお、Aβ1-42ペプチド断片は、American Peptide Co.（Sunnyvale, CA）から購入した。ウサギ多クローン性抗β-アミロイドペプチド（商品番号 71-5800）は、Zymed Laboratories（San Francisco, CA）から入手した。[22-3H]R-ヒドロキシコレステロール（sp.act. 20 Ci/mmol）は、American Radiolabeled Chemical（St Louis, MO）で合成された。コレステロール、22R-ヒドロキシコレステロール、22S-ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、17α-ヒドロキシプレグネノロン、プロゲステロン、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）、および3-アミノ-9-エチルカルバゾール（AEC）は、Sigma-Aldrich（St.Louis, MO）から購入した。細胞培養供給器は、GIBCO（Grand Island, NY）から、また、細胞培養プラスチック容器はCorning（Corning, NY）から購入した。電気泳動用試薬および材料は、Bio-Rad（Richmond, CA）から得た。使用したその他の化学物質は、分析用等級であって、種々の販路から得たものである。
【実施例】
【０１１９】
〔実施例 I〕
◆ 組織試料
すべてのヒト組織試料は、the Harvard Brain Tissue Resource Center（Belmont, MA）から得た。ステロイド測定に使う試料は、液体窒素中で、急速凍結（snap frozen）か徐凍結（passively frozen）をした。脳の海馬と前頭葉皮質の試料を、19名の患者から採取し、そのうちの12名はAD患者（うち6名が男性、6名が女性）で、7名は年齢を合わせた対照患者（うち4名が男性、3名が女性）であった。AD患者らは、the Harvard Tissue Resource Centerによって「重篤なAD」であると分類された。すべての患者についての平均年齢は、AD患者で74.6±7.2歳、対照患者で73.4±10.5歳であった。平均死後経過時間は、AD患者で10.2時間、対照患者で14.7時間であった。ヒト組織の使用プロトコールは、the Georgetown University Internal Review Boardによって承認された。
【０１２０】
◆ 22R-ヒドロキシコレステロールの精製および測定
試料は、過去の記事に倣って逆相HPLCから抽出して精製した。Brown et al., J. Neurochem., 74, 847-859 (2000) 。22R-ヒドロキシコレステロールを含んだ分劃を回収して（22R-ヒドロキシコレステロールの保持時間＝55分間）、コレステロール酸化酵素アッセイを使って22R-ヒドロキシコレステロールを定量した。Gamble et al., J. Lipid Res., 19, 1068-1070 (1978) 。
【０１２１】
◆ 細胞培養、細胞の毒性と生存率の分析
ラットPC12細胞を、過去の記事に倣って培養した。Yao et al., Brain Res., 889, 181-190 (2001) 。ヒトNT2前駆細胞（Ntera2/D1畸形癌細胞）は、Stratagene（La Jolla, CA）から入手し、供給元の指示に従って培養した。分化したヒトNT2ニューロン（NT2N）は、NT2前駆細胞をレチノイン酸で処理して得た。Andrews, Dev. Biol., 103, 285-293 (1984) 。Aβを媒体に溶かして、凝集させた状態（4℃で一晩置いたもの）か、可溶状態（ダイマーおよびテトラマーなどのオリゴマーを含んだもの）かのいずれかの状態で、過去の記事に倣って電気泳動にかけた。Yao et al., Brain Res., (2001) 。AβおよびAβ断片の細胞毒性を、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム（MTT）アッセイ（Trevigen, Gaithersburg, MD）を用いて、過去の記事（同上）に倣って分析した。細胞生存率を、トリパンブルー排除法を用いて、過去の記事（同上）に倣って測定した。要約すると、これらの研究では、Aβを与えないかあるいはAβの漸加する濃度群を与えた細胞を、ステロイド類で72時間に亘って処理した。培養期間の終わりに、細胞をPBSで三度洗い、0.1% トリパンブルー染色液を与えて室温で15分間培養した。PBSで三度洗ってから、細胞に0.1N NaOHを与え、トリパンブルー染色を、the Victor quantitative detection spectrophotometer（EGG-Wallac, Gaithersburg, MD）を450nmで使って定量した。細胞の蛋白質量を、同じ試料を使って、Bradfordの方法（Bradford, Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)）で、クマシーブルー染色（coomassie blue staining）を590nmで検出して測定した。
【０１２２】
◆ コレステロール=蛋白質結合ブロットアッセイ（CPBBA）
精製した Aβ1-42 蛋白質（50μM）、もしくはさまざまなAβの断片（50μM）を、 3H-22R-ヒドロキシコレステロールと併せた上で、標識していない22R-ヒドロキシコレステロールを与えないか、または体積20μlでのその漸加する濃度群を加えるようにして、37℃で24時間に亘ってインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、試料を1.5% アガロース（Type I-B）ゲル電気泳動を使って分離して、10XSSCバッファ中のニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell, Keene, NH）に移した。この膜をトリチウム感受性板に付けて、Cyclone Storage phosphor system（Packard BioScience, Meridien, CT）を使ってホスホイメージングで解析した。画像濃度分析（image-densitometric analysis）を、the OptiQuant software（Packard）を用いて行った。この方法によって、放射性標識したコレステロールを組み込んだAβ複合体（Yao, Z. & Papadopoulos, V., 原稿送付済）、および天然条件下の22R-ヒドロキシコレステロールの分離、可視化、および同定が可能となる。低分子量であって組み込まれていない（low molecular weight unincorporated）22i-ヒドロキシコレステロールは、電気泳動中に分離して除去する。
【０１２３】
◆ Aβ凝集アッセイ
精製したAβ1-42 蛋白質（50mM）を、単独でまたは22R-ヒドロキシコレステロールの漸加する濃度群を加えて、細胞培地に入れて37℃で24時間に亘りインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、4〜20%の傾斜をつけたアクリルアミド-ビス-アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEを125Vで2時間に亘って行い、蛋白質を分離した。蛋白質はクマシーブルー染色で可視化した。Aβ種を、イムノブロット分析で同定した。Yao, Z. et al., Brain Res., (2001) 。
【０１２４】
◆ イムノブロット分析
その後、22R-ヒドロキシコレステロール=Aβペプチド複合体を付けた膜を使い、Aβ量の検査を行った。膜を、5% 乳に溶かしたニトロセルロースでインキュベートして停止させてから、ECL試薬（Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ）を使って、Aβの免疫検出法のための処理を施した。Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 1267-1272 (2001) 。Aβに対する抗体および二次抗体を、それぞれ、0.2μg/mlと1:5000希釈で用いた。
【０１２５】
◆ ペプチドのモデリングおよび22R-ヒドロキシコレステロールのドッキング
22R-ヒドロキシコレステロールと、 Aβ17-40 および Aβ25-35 とのコンピュータ上でのドッキングを、CDおよびNMR分光法から作成したデータから得たAβ1-40Met(O)（MMDB Id: 7993 PDB Id: 1BA）の溶液構造から生成した、Aβ構造を使って実行した。Watson et al., Biochemistry, 37, 12700 (1998) 。残基17〜40を抽出するために、炭素骨格の隣接する二面角と座標を維持しつつ、Met(O) SME 35残基をMetで置換した。22R-ヒドロキシコレステロールの構造は、the Alchemy 2000 program（Tripos, St. Louis, MO）を使って開発した。ドッキングは、モンテカルロ法によりシミュレートしたアニーリング（Monte Carlo simulated annealing）（Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2001)）を使って実現され、Autogrid/Autodock（修正版）で実行された。Morris et al., J. Comput. Chem., 19, 1639-1662 (1998) 。約109種の立体配座のうちで、最小のエネルギーとなる立体配座を査定した。100回の実行から成る五度のセッションを、それぞれの開始時に、無作為な初期相対位置と配位子の目標への配向とをとるようにして、実行した。各実行は、約 2 x 104 回の改良ステップを使った100回分のアニーリングサイクルから構成した。修正プログラムを使った総計算時間は、1.7GHz、1GB RAMのPCで約15分間であった。
【０１２６】
◆ 統計
統計的解析を、INSTAT 3.00 package（GraphPad, San Diego, CA）を使って、一方向分散分析（ANOVA）およびunpaired Student's t testで行った。
【０１２７】
◆ 結果
図２に示したように、ヒトの脳内の内因性22R-ヒドロキシコレステロールの量を、HPLC精製の後にコレステロール酸化酵素アッセイを用いて定めた。示したデータは、12名のAD例および7名の年齢を合わせた対照例から二重測定した、means±SEMである。図２では、AD患者の脳標本の海馬中の22R-ヒドロキシコレステロールの量が、年齢を合わせた対照群と比較して、60%減少した（p=0.04）、ということを示している。また、AD患者の脳標本の前頭葉皮質中の22R-ヒドロキシコレステロールの量が、年齢を合わせた対照群と比較して、有意では無かったが50%減少していた。
【０１２８】
PC12細胞を、示した濃度の Aβ1-42 を与えて24時間処理した際に、他に何も与えない場合と、さらに22R-ヒドロキシコレステロール（図３Ａ）、コレステロール（図３Ｂ）、プレグネノロン（図３Ｃ）、17α-ヒドロキシプレグネノロン（図３Ｄ）、DHEA（図３Ｅ）、もしくは22S-ヒドロキシコレステロール（図３Ｆ）の漸加する濃度群を加えた場合とについて示した。結果は、means±SD （n=6〜12）で示した。22R-ヒドロキシコレステロールが、ラットPC12神経細胞をAβに起因する細胞毒性から救う能力について、ミトコンドリアジアホラーゼアッセイMTTを使って検査した。
【０１２９】
Aβ1-42 によって、用量依存的な神経毒性が誘発され、5.0μMおよび50μMのAβの存在により、それぞれ、26%（p<0.001）および40%（p<0.001）の細胞死が生じた（図３Ａ）。22R-ヒドロキシコレステロールの漸加する濃度群を与えていっても、PC12細胞の生存率には影響しなかったが、10μMおよび100μMの22R-ヒドロキシコレステロールが存在した場合に有意では無い生存率の向上が見られた（図３Ａ）。22R-ヒドロキシコレステロールは、すべての細胞を25μM Aβに起因する細胞毒性（p<0.001）から救うことができ、また、50μM Aβの存在下で死にゆく細胞のうちの50%を救う（p<0.01）ことができた（図３Ａ）。興味深いことに、22R-ヒドロキシコレステロールは、Aβと同時に存在した場合にのみ効果を呈した。PC12細胞を22R-ヒドロキシコレステロールで前処理してから、Aβで処理したところ、細胞の保護の試みはすべて失敗した（データ提示せず）。
【０１３０】
22R-ヒドロキシコレステロールの神経保護作用は、その前駆体であるコレステロール（図３Ｂ）でも、その代謝物であるプレグネノロン（図３Ｃ）でも、再現できなかった。対照的に、コレステロールとプレグネノロンはいずれも、単独では細胞に毒性を与えた。さらに、コレステロールの存在により、低濃度のAβの毒性が促進された。また、単独の17α-ヒドロキシプレグネノロンも、細胞への毒性を示した（図３Ｄ）。100μM DHEAは、細胞生存率へ正の効果を示した。同濃度のDHEAは、5μM Aβに起因する細胞毒性への保護作用を示したが（p<0.001）、50μM Aβに起因する細胞毒性に対しては示さなかった（図３Ｅ）。22S-ヒドロキシコレステロールが、Aβに起因する神経毒性に抗する保護を示さなかっただけにはとどまらず、濃度100μMの22S-ヒドロキシコレステロールが神経毒性を示した（図３Ｆ）ため、22R-ヒドロキシコレステロールの作用は立体特異的であったと言える。
【０１３１】
本研究では、凝集したAβ（4℃で一晩置いたもの）を使用したということに留意されたい。別の実験では、可溶性Aβ（オリゴマーを含んだもの）をPC12細胞に直接投与したところ、毒性を示した（データ提示せず）。また、22R-ヒドロキシコレステロールは、Aβオリゴマーに起因する毒性に抗する保護効果も示した（提示せず）。
【０１３２】
22R-ヒドロキシコレステロールの神経保護作用は、PC12細胞には限定されず、分化したヒトNT2Nニューロンでも再現された（図４）。分化したヒトNT2Nニューロンを、22R-ヒドロキシコレステロールが存在する場合と存在しない場合とについて、25μM Aβ1-42 で72時間に亘って処理した。25 μM Aβが、ヒトニューロンの生存率を50%抑制する（p<0.001）一方で、1μMおよび10μMの22R-ヒドロキシコレステロールは、このAβに起因する毒性に対して、それぞれ、50%（p<0.01）および100%（p<0.001）の保護作用を示した（図４）。22R-ヒドロキシコレステロールが、ヒトNT2細胞を、他の毒性侵襲から救うことができるのかどうかを評価するために、NT2細胞を、22R-ヒドロキシコレステロールが存在しない場合と、1〜50μMの22R-ヒドロキシコレステロールが存在する場合とについて、5mM グルタマートで三日間に亘って処理した。グルタマートによって、細胞生存率が30%減少し（MTTアッセイによる測定）、22R-ヒドロキシコレステロールが存在しても、これらの細胞の保護はできなかった（データ提示せず）。
【０１３３】
MTTアッセイにより得られた結果を、トリパンブルー色素排除アッセイを使ってさらに検証した。PC12細胞を、 Aβ1-42（図５Ａ）もしくは Aβ25-35 （図５Ｂ）の漸加する濃度群を用いて、100μMの22R-ヒドロキシコレステロールもしくはDHEAが存在する場合と存在しない場合とについて、72時間に亘る処理にかけた。NT2細胞を、Aβ1-42 （図５Ｃ）もしくは Aβ25-35 （図５Ｄ）の漸加する濃度群を用いて、25μMの22R-ヒドロキシコレステロールもしくはDHEAが存在する場合と存在しない場合とについて、72時間に亘る処理にかけた。生存率の程度を、物質および方法の項で記載したトリパンブルーアッセイを使って、測定した。結果は、すべての細胞蛋白質のそれぞれについて、トリパンブルーで染色された細胞の数を、対照の未処理細胞群と比較しての倍率で表した。結果はmeans±SD（n=6〜12）で示した。図５Ａおよび図５Ｃでは、22R-ヒドロキシコレステロールが、ラットPC12細胞（図５Ａ）とヒトNT2細胞（図５Ｃ）の双方を、 Aβ1-42に起因する細胞死から救ったことを示している。対照的に、DHEAは、ラットPC12細胞を Aβ1-42 に起因する細胞死から保護したに留まり、NT2細胞の保護はできなかった（図５Ａおよび図５Ｃ）。22R-ヒドロキシコレステロールもDHEAも、PC12細胞およびNT2細胞を、 Aβ25-35 に起因する細胞死から救うことはできなかった（図５Ｂおよび図５Ｄ）。
【０１３４】
また、22R-ヒドロキシコレステロールが、Aβの凝集を改変する能力についても検査を行った。細胞培地中の精製 Aβ1-42蛋白質（50μM）を、単独で、または、22R-ヒドロキシコレステロールの漸加する濃度群を加えて、37℃で24時間に亘ってインキュベートした。インキュベーションの終わりに、蛋白質をSDS-PAGEで分離して、クマシーブルーで可視化した（図６Ａ）。形成したAβ種を、抗Aβ多クローン性抗血清を用いたイムノブロットで同定した（図６Ｂ）。Aβ凝集がゲル上面に観られるが、これは対照媒体の区劃（レーン）では観られない。図６Ａおよび図６Ｂからは、クマシーブルーで染色したゲル（図６Ａ）のイムノブロットアッセイ（図６Ｂ）で確認されるAβ凝集には、22R-ヒドロキシコレステロールは影響を及ぼさない、ということがわかる。対照媒体を含むすべての試料で使用されたAβ多クローン性抗血清で反応した100kDa帯は、おそらくは、抗血清の非特異的結合を表したものである。
【０１３５】
その後、22R-ヒドロキシコレステロールの活性機構を検査した。22R-ヒドロキシコレステロールはAβが存在する場合にのみ神経保護作用を呈する、と考えて、22R-ヒドロキシコレステロールとAβとの直接相互作用を、新規な手法であるCPBBAを使って調査した。放射性標識した22R-ヒドロキシコレステロールを、 Aβ1-42と共に、37℃で24時間に亘ってインキュベーションにかけたところ、高分子放射性標識帯の存在（図７Ａ）が、Aβに特異的な抗体によって反応した（図７Ｂ）。22R-ヒドロキシコレステロールによる Aβ1-42 の放射性標識の特異性を、標識していない22R-ヒドロキシコレステロールを使った競合研究によって示した（図７Ａ）。これらの研究では、50μMおよび200μMの22R-ヒドロキシコレステロールによって、それぞれ、放射性標識した22R-ヒドロキシコレステロールの50μM Aβ1-42 への結合を、50%および90%阻害した、ということが放射性標識したAβ1-42 の画像解析からわかった（図７Ａ）。インキュベーション反応と、CPBBAとにおいて、等量の Aβ1-42の担持を行い、放射性標識した Aβ1-42 のイムノブロット分析によって評価した（図７Ｂ）。50〜200μM 22R-ヒドロキシコレステロールが存在した場合には、観察された Aβ1-42 の放射性標識が減少したが、その一方で、各区劃中での Aβ1-42の量には互いに違いが無かった、ということに留意されたい。これらのデータからは、天然の条件下では、22R-ヒドロキシコレステロールがAβに結合する、ということが示唆される。CPBBAと種々のAβ合成ペプチドとを用いて、Aβ中の22R-ヒドロキシコレステロール結合部位を、Aβのアミノ酸 17〜40 であると位置づけた（図７Ｃおよび図７Ｅ）。興味深いことに、22R-ヒドロキシコレステロールの存在時に神経毒性を保っていたペプチドAβ25-35（図７Ｂおよび図７Ｄ）は、22R-ヒドロキシコレステロールには結合しなかった（図７Ｃ）。これらのデータを、コンピュータ上でのドッキングシミュレーションを使ってさらに検証した。ドッキング結果からは、 Aβ17-40が、22R-ヒドロキシコレステロールが結合可能なポケットを形成していることがわかった（図７Ｄ）。アミノ酸 G29A30I31により形成されたこのポケットは、22R-ヒドロキシコレステロールのC27-29 原子を捕捉する。R配置は、S配置とは異なり、22R-ヒドロキシコレステロールのドッキングを許容する。同様の研究を Aβ25-35を使って行ったところ、 19〜36 領域に在るアミノ酸のうちのいくつかが存在したにもかかわらず、 Aβ25-35の22R-ヒドロキシコレステロールとのドッキングエネルギー（-6.0510kcal/mol）が、 Aβ17-40 （-8.6939kcal/mol） や Aβ1-42 （-9.6960kcal/mol）と較べて高くなった。このことからは、このステロイドは Aβ25-35には結合しない、ということが示唆され、これはCPBBAでのデータとも一致する。
【０１３６】
◆ 考察
22R-ヒドロキシコレステロールの量が、AD患者の脳標本において、年齢を合わせた対照群と較べて低くなっていたことがわかった。22R-ヒドロキシコレステロールの量が、脳の辺縁系の組織である海馬中で有意に減少しており、この海馬は、認識能（学習と記憶など）にとって不可欠なものであって、且つADによる影響を蒙るものである。Aβの生理機能は、コレステロールの輸送を制御するためのものである（Yao et al., FASEB, 16, 1677-1679 ( )）。この発見に基づくと、22R-ヒドロキシコレステロールの減少は、AD患者の脳におけるAβの過剰産生に因るものであると考えられ（Roller et al., J. Biol. Chem., 286, 3072-3083 (1993); Younkin, J. Physiol., 92, 289-292 (1998)）、この過剰産生によって、コレステロール輸送が阻害されるか、または細胞のコレステロール摂取が減少し、その結果として神経ステロイド形成のための基礎コレステロールの利用度に影響が顕われて、AD患者の脳内での22R-ヒドロキシコレステロールの合成が減少することになる、と考えられる。あるいはまた、コレステロールからのプレグネノロンおよびDHEAの新規合成が、AD脳標本中で増大していたことを考慮すると、この合成によって、AD中で利用可能であった中間生成22R-ヒドロキシコレステロールが消耗してしまったとも考えられる。AD海馬中でのプレグネノロンおよびDHEAの増量（Brown et al., Neurobiology of Aging, 24, 57-65 (2003)）は、Aβによって誘発される（Brown, et al., J. Neurochem., 74, 847-859 (2000)）。また、Aβに起因するコレステロール輸送の減少と、コレステロール代謝の増大との両方の現象が、ADで起こって22R-ヒドロキシコレステロールの量を減らしている、という可能性も考えられる。
【０１３７】
これらの研究では、充分に確立されているラットPC12神経細胞モデルを使用した。しかしながら、22R-ヒドロキシコレステロールの神経保護作用は、齧歯類のニューロンのみに限られたものでは無く、ヒトNT2神経細胞およびNT2N神経細胞でも観察された。NT2細胞はヒト畸形癌細胞のクローン株であり、また、NT2N細胞は、NT2細胞から誘導された、有糸分裂後の末端が分化したニューロン（post-mitotic, terminally differentiated neurons）であって、中枢神経系のニューロンと一致する細胞表面標識形質を持つ。Andrews, Dev. Biol. (1984) 。22R-ヒドロキシコレステロールは、ラットニューロンおよびヒトニューロンの双方について、Aβに起因する毒性を用量依存的に保護したことが発見されており、その IC50S は、PC12細胞で10μM、NT2N細胞で3μMであった。細胞を22R-ヒドロキシコレステロールで処理すると、濃度25μMで用いた場合にはAβに対して完全な保護作用を呈し、また、濃度50μMで用いた場合にはこのペプチドに対して50%神経保護作用を示した。
【０１３８】
ブルーホルマザン（blue formazan）の形成を評定するMTTアッセイを使って、22R-ヒドロキシコレステロールの作用のみならず、コレステロールの代謝に含まれる種々のステロイド類の神経保護特性を検査した。Aβに起因するPC12神経毒性に対して試験したステロイド類では、22R-ヒドロキシコレステロールおよびDHEAを除いたそのすべてが毒性であった。DHEAの齧歯類ニューロンへの神経保護作用は、過去の研究結果と一致する。Kimonides et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1852-1857 (1998); Cardounel et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 222, 145-149 (2000) 。しかし、22R-ヒドロキシコレステロールとは異なり、DHEAは、Aβに起因するヒトNT2細胞死に対しては効果を齎さなかった。このことからは、22R-ヒドロキシコレステロールの作用は種に特異的なものでは無く、おそらくは、このステロイドがAβと直接相互作用することに因るものである、ということが示唆される。22R-ヒドロキシコレステロールの前駆体であるコレステロールは、神経毒性を持つことが発見されている。しかしながら、炭素原子 22(R) のヒドロキシル基の存在は、コレステロールの毒性を軽減するだけにはとどまらず、Aβに起因する神経毒性に対する保護作用も与える。22R-ヒドロキシコレステロールの作用の特異性については、その鏡像異性体である22S-ヒドロキシコレステロールが不活性であり且つ高濃度では神経毒性を示す、ということからも裏づけられる。
【０１３９】
22R-ヒドロキシコレステロールとAβとの間の直接相互作用を、新規な分析法であるCPBBAを使って示した。このアッセイを使うことによって、天然条件下での、放射性標識したステロイドと、AβもしくはAβペプチド断片との、直接相互作用の研究と可視化ができる。放射性標識した22R-ヒドロキシコレステロールがAβに結合し、標識していない22R-ヒドロキシコレステロールがその結合したステロイドと置き換わる。CPBBAからは、22R-ヒドロキシコレステロールは Aβ1-42 および Aβ17-40 には結合するが、 Aβ1-40とは単に相互作用をするだけである、ということが示された。精製したアミロイド斑の質量分光解析により、アミロイド沈着のうちの主要部分は Aβ1-42であるということが明らかとなっているため、 Aβ1-42 がADの病理発生の主要因であると考えられている。Roher et al., J. Biol. Chem. (1993); Younkin, Physiol. (1998) 。また、40個のアミノ酸から成る短い形態のAβは、病理作用を持たないと考えられており（Brown et al., J. Neurochem. (2000)）、この形態はAD脳内では乏しくなっている（Roher et al., J. Biol. Chem. (1993); Younkin, J. Physiol. (1998)）。Aβの報告された構造に基づいた、コンピュータ上でのモデリングシミュレーションからは、アミノ酸 19〜36 が、ヒドロキシル基がR配置である場合に22R-ヒドロキシコレステロールの側鎖を捕捉する、ということが示された。興味深いことに、毒性が知られているペプチド Aβ25-35 （Schubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1989-1993 (1995)）は、22R-ヒドロキシコレステロールが存在する場合であってもその神経毒性を維持する。コンピュータ上でのモデリングシミュレーションおよびCPBBAでは、22R-ヒドロキシコレステロールとペプチドAβ25-35 との相互作用を示すことはできなかった。このことからは、本来のアミノ酸配列では無く、Aβ1-42 および Aβ17-40 の三次元構造こそが、アミノ酸 19〜36 と22R-ヒドロキシコレステロールとが相互作用する能力を齎している、という示唆が得られる。
【０１４０】
Aβ1-42 のアミノ酸 17〜40 に結合する22R-ヒドロキシコレステロールは、齧歯類神経細胞とヒト神経細胞の双方について、 Aβ1-42に起因する細胞毒性および細胞死からの保護／救護を誘引する。22R-ヒドロキシコレステロールがAβの神経毒性作用を阻止するその正確な機構については未知である。しかし、本明細書中に示したデータからは、22R-ヒドロキシコレステロールはAβの重合には影響しない、ということが示されている。22R-ヒドロキシコレステロールがAβ1-42 に結合することにより、Aβのモノマーもしくはポリマーの立体配座が変化して、Aβを不活性にするか、あるいは、Aβと細胞との相互作用もしくは毒性を媒介する細胞内機構の活性を抑止する、と考えられる。つまり、AD患者の脳内の22R-ヒドロキシコレステロールの量が、年齢を合わせた対照群と比較して少ないことが、AD脳内のAβ1-42 産生の増大と組み合わさって、 Aβ1-42 に起因する神経毒性に対する脳の抵抗力が減退／喪失してしまう、ということである。このことは、Aβ1-42の最大量を有するプレセニリン1類似家族性アルツハイマー病（FAD）の患者については特に真であると考えられる。Borchelt et al., Neuron, 17, 1005-1013 (1996) 。
【０１４１】
〔実施例 II〕
◆ 物質
Aβ1-42 ペプチドは、American Peptide Co.（Sunnyvale, CA）から購入した。22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）は、Sigma（St.Louis, MO）から購入した。[22-3H]R-ヒドロキシコレステロール（sp.act. 20 Ci/mmol）は、American Radiolabeled Chemical（St Louis, MO）で合成された。22R-ヒドロキシコレステロール誘導体（SP223〜238）は、Interbioscreen（Moscow, Russia）から購入した。細胞培養供給器は、GIBCO（Grand Island, NY）から、また、細胞培養プラスチック容器はCorning（Corning, NY）およびPackard BioSciences Co.（Meriden, CT）から得た。
【０１４２】
◆ 22R-ヒドロキシコレステロール誘導体のインシリコスクリーニング
天然産生物のthe Interbioscreen Databaseから、22R-ヒドロキシコレステロールの構造を含む化合物について、the ISIS software（Information Systems, Inc., San Leandro, CA）を用いて選別を行った。選択して試験した22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）およびその誘導体（SP223〜238）の構造は図１に示し、またそれぞれの化合物の呼称と化学名と由来を表１に示した。
【０１４３】
◆ 細胞の培養と処理
ATCC（Manassas, VA）から得たPC12細胞（ラット褐色神経細胞腫）を、グルタミンを含まないRPMI 1640培地中で、37℃且つ5% CO2で培養し、10% ウシ胎児血清と5% ウマ血清を与えた。Yao Z, Drieu K and Papadopoulos V., The Gingko biloba extract EGb 761 rescues PC12 neuronal cells from β-amyloid-induced cell death by inhibiting the formation of β-amyloid-derived diffusible neurotoxic ligands, Brain Res, 889, 181-190 (2001) 。細胞を96ウェル（well）プレートに播種した（8 x 104 細胞数/ウェル）。培養して一晩置いた後、凝集したAβの漸加する濃度群（0.1μM、1μM、および10μM）を細胞に加え、示した濃度のSP化合物が存在する場合と存在しない場合とについて、検査を行った。72時間の培養の後、細胞生存率を示す種々のパラメータと標識形質を測定した。マウスMA-10腫瘍ライディッヒ細胞を、DMEM/Ham's F12培地（Biofluids, Rockville, MD）中で37℃に保ち、5% 熱失活仔ウシ血清と2.5% ウマ血清を与えて5% CO2を流した。細胞を96ウェルプレートで密度 2.5x104 細胞数/ウェル で一晩培養した。0.2ml/well の血清を含まない培地に、示した濃度で入れた種々のSP化合物で、細胞を2時間に亘り刺戟した。培地を回収して、放射免疫測定法（ラジオイムノアッセイ）でプロゲステロン産生を検査した。
【０１４４】
◆ MTT細胞毒性アッセイ
Aβの細胞毒性を、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム（MTT）アッセイ（Trevigen, Gaithersburg, MD）を用いて分析した。要約すると、10μlのMTT溶液を、100μlの培地中で培養した細胞に与えた。4時間の培養期間の後、100μlの洗浄剤を与えて、細胞を37℃で一晩培養した。ホルマザンブルー形成を、the Victor quantitative detection spectrophotometer（EGG-Wallac, Gaithersburg, MD）を600nmおよび690nmで使って定量し、結果を(DO600 - DO690) で表した。MTTアッセイは、Aβで処理した神経細胞の細胞毒性を解析するために広汎に用いられているが、種々のステロイドの存在として得られた結果は、Aβ依存的な小胞リサイクリング（vesicle recycling）を反映していると考えられ、これにより、増大されたMTTホルマザン細胞外排出作用および喪失（increased MTT formazan exocytosis and loss）が齎されると考えられる。Liu Y and Schubert D, Steroid hormones block amyloid fibril-induced 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) formazan exocytosis: relationship to neurotoxicity, J. Neurochem., 19, 1639-1662 (1998) 。この理由から、追加で細胞毒性アッセイおよび細胞生存率アッセイを行った。
【０１４５】
◆ トリパンブルー細胞生存率測定法
細胞生存率を、われわれが以前に述べたトリパンブルー排除法を使って測定した。Yao et al., The Gingko biloba extract EGb 761 rescues PC12 neuronal cells from β-amyloid-induced cell death by inhibiting the formation of β-amyloid-derived diffusible neurotoxic ligands, Brain Res., 889, 181-190 (2001) 。要約すると、Aβの漸加する濃度群を与えた場合と、Aβが存在しない場合とについて、細胞をSP化合物で72時間に亘って処理した。培養の終わりに、細胞をPBSで三度洗浄して、0.1% トリパンブルー染色液で室温で15分間に亘り培養した。PBSで三度洗浄して、0.1N NaOHを細胞に加え、トリパンブルーをthe Victor quantitative detection spectrophotometer（EGG-Wallac, Gaithersburg, MD）を450nmで使って測定した。
【０１４６】
◆ 膜電位の測定
また、ルミネセンスに基づくキットである CytoLiteTM （Packard BioScience Co.）を、製造者の推奨に従って使用して、細胞生存率を評価した。要約すると、細胞を96ウェルプレート培養して処理し、72時間の培養時間を経て、25μlのActivator溶液を細胞に加えた後、150μlのAmplifier溶液を加えた。5分間の計数遅延（precount delay）を取った後、ルミネセンスを TopCount NXTTM counter（Packard BioSciences Co.）で測定した。
【０１４７】
◆ 細胞ATP量の測定
細胞ATP濃度を、ATPLite-MTM luminescence assay（Packard BioSciences Co.）を使って測定した。このアッセイのために、細胞を黒色96ウェルのViewPlateTM で培養してから、ATP濃度をTopCount NXTTM counter（Packard BioSciences Co.）を製造者の勧めに従って用いて測定した。
【０１４８】
◆ ラジオイムノアッセイ
MA-10細胞のプロゲステロン産生を、抗プロゲステロン抗血清（ICN, Costa Mesa, CA）を用いたラジオイムノアッセイで、製造者の勧める条件下で測定した。プロゲステロン産生は、各ウェル中の蛋白質量で規格化した。ラジオイムノアッセイのデータは、the MultiCalc software（EG&G Wallac, Gaithersburg, MD）を使って解析した。
【０１４９】
◆ 22R-ヒドロキシコレステロール=蛋白質結合ブロットアッセイ（CPBBA）
精製したAβ（50μM）および 3H-22R-ヒドロキシコレステロールを、単独で、または、100μMの22R-ヒドロキシコレステロール（SP-222）もしくは種々の22R-ヒドロキシコレステロール誘導体の存在下で、体積20μlで8時間もしくは24時間に亘り37℃でインキュベートした。インキュベーションの終わりに、試料を、天然条件下で1.5% アガロース（Type I-B）ゲル電気泳動を用いて分離してから、10XSSCバッファ中のニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell, Keene, NH）に移した。この膜をトリチウム感受性板に付けて、the Cyclone Storage phosphor system （Packard BioScience）を用いたホスホイメージングで解析した。画像濃度分析（image-densitometric analysis）を、the OptiQuant software（Packard BioScience）を用いて行った。この方法によって、放射性標識したコレステロールを組み込んだAβ複合体（Yao Z. and Papadopoulos-V., Function of β-amyloid in cholesterol transport: a lead to neurotoxicity, FASEB J., 16, 1677-1679 (2002)）、ならびに、天然条件下の22R-ヒドロキシコレステロール（Yao et al., J. Neurochem., 83, 1110-1119 (2002)）および22R-ヒドロキシコレステロール誘導体の、分離、可視化、および同定が可能となる。低分子量である組み込まれていない22R-ヒドロキシコレステロールおよび誘導体は、電気泳動中に分離して排除する。
【０１５０】
◆ ペプチドのモデリングとドッキングシミュレーション
22R-ヒドロキシコレステロールおよびその16個の誘導体と、 Aβ1-42 との、コンピュータ上でのドッキングを、CDおよびNMR分光法から作成したデータから得たAβ1-40Met(O)（MMDB Id: 7993 PDB Id: 1BA）の溶液構造から生成した、Aβ構造を使って実行した。Watson A. A., Fairlie D. Pand Craik D. J., Solution structure of methionine-oxidized amyloid beta-peptide(1-40). Does oxidation affect conformational switching?, Biochem., 37, 12700-12706 (1998) 。炭素骨格の隣接する二面角と、付加した I41 残基および A42 残基とを維持しつつ、Met(O) SME 35残基をMetで置換した。その後、構造のエネルギーをthe Alchemy 2000 program（Tripos, St. Louis, MO）を使って最小化した。また、22R-ヒドロキシコレステロール誘導体の構造も、Alchemy 2000を使って作成した。ドッキングは、過去の記事（Li et al., Cholesterol binding at the cholesterol recognition/ interaction amino acid consensus (CRAC) of the peripheral-type benzodiazepine receptor and inhibition of steroidogenesis by an HIV TAT-CRAC peptide, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 1267-1272 (2001) ）に記載されたモンテカルロ法によりシミュレートしたアニーリングを使って実現され、Autogrid/Autodock（修正版）で実行された。Morris et al., Distributed automated docking of flexible ligands to proteins: parallel applications of AutoDock 2.4, J. Comput. Chem., 19, 1639-1662 (1998) 。化合物／Aβ対のそれぞれについて、約108種の立体配座のうちで、最小のエネルギーとなる立体配座を査定した。100回の実行から成る三度のセッションを、それぞれの開始時に、無作為な初期相対位置と配位子の目標への配向とをとるようにして、実行した。各実行は、約 2 x 104 回の改良ステップを使った100回分のアニーリングサイクルから構成した。配位子／ターゲット対のそれぞれについての平均計算時間は、1.7GHz、1GB RAMのPCで約2時間半であった。
【０１５１】
◆ 統計分析
統計的解析を、the INSTAT 3.00（GraphPad, San Diego, CA）を使って、一方向分散分析（ANOVA）およびunpaired Student's t testで行った。
【０１５２】
◆ 結果
PC12細胞を、Aβの漸加する濃度群に3日間曝露させたところ、用量依存的な細胞死が起こり（図８）、最大で細胞のうちの50%にまで達した。このことはわれわれの以前のデータと適合する。Yao et al., J Neurochem., 83, 1110-1119 (2002); Yao et al., The Gingko biloba extract EGb 761 rescues PC12 neuronal cells from β-amyloid-induced cell death by inhibiting the formation of β-amyloid-derived diffusible neurotoxic ligands, Brain Res., 889, 181-190 (2001) 。AD脳内に存在するAβの濃度に近づけるために、0.1〜10μMのAβ濃度を使用した。神経保護作用を検査した化合物は、濃度30μMおよび50μMで実験を行った（図９〜１５）。
【０１５３】
図９〜１１は、Aβに起因する神経毒性への、先導化合物である22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）の作用と、22R-ヒドロキシコレステロール構造を含んだ化合物（SP223〜238）の作用とを、MTTアッセイ（NADPHジアホラーゼ活性の測定）を使って示したものである。図９〜１１では、これらの化合物の、0.1μM、1.0μM、および10.0μMのAβに起因する神経毒性への作用を、NADPHジアホラーゼ活性の阻害率として表してそれぞれ示している。100%の阻害率は、Aβを単独で投与した場合に誘発されるブルーホルマザン形成の減少量に対応している。
【０１５４】
SP222は、PC12細胞を、0.1μMおよび1μMのAβから保護したが、10μMで投与したAβに対しては限られた神経保護作用しか呈さなかった。高濃度のAβに対するSP-222の作用では、使用した細胞継代（the passage of the cells）に依って高い細胞生存率が観察されたことに留意されたい。SP228、SP229、SP233、SP235、SP236、SP237、およびSP238は、Aβ 0.1μMに対して神経保護活性を示したが、そのうちでSP233、SP235、SP236、およびSP238だけが、SP222よりも有意に強く且つ外れ値の影響を受けにくい（robust）作用を呈した（図９Ａ〜９Ｐ）。SP233、SP236、およびSP238は、1μM Aβに起因する毒性に対しては神経保護作用を保ったが（図１０Ａ〜１０Ｐ）、そのうちでSP233とSP238だけが10μM Aβの存在下で神経保護特性を維持できた（図１１Ａ〜１１Ｐ）。
【０１５５】
MTTアッセイで得られた結果を、SP222、SP233、SP235、SP236、およびSP238について、膜電位分析であるCytolite assayを使って評価した。図１２Ａでは、Aβ曝露によって、膜電位を評価するルミネセンスが、用量依存的に減少したことを示している。SP222は、0.1μM Aβに対する保護をしたが（図１２Ｂ）、Aβの上位二種の濃度に対しては保護できなかった（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）。使用した種々のSP化合物は、SP222と比較して有意に良好な神経保護作用を呈し、このことは測定したルミネセンスの増大として示された。MTTアッセイを用いて観察された（図１１）SP233およびSP238の10μM Aβに対する神経保護作用は、同条件下で信号の上昇として再現された（図１２Ｄ）。
【０１５６】
ミトコンドリア機能の指標となるATP量を、化合物SP222〜SP238が存在した場合と存在しなかった場合とについて、Aβの漸化する濃度群で処理したPC12細胞中で測定した（図１３Ａ〜１３Ｄ）。AβはPC12細胞のATP産生を用量依存的に減少させており、0.1μM、1.0μM、および10μMのAβの存在下では、それぞれ、18%、22%、および25%のATP量の減少が観られた（p<0.001 by ANOVA; 図１３Ａ）。実験した化合物のうち、SP233とSP236だけが、0.1μMおよび1.0μMのAβに起因するATP量減少を恢復させることができた（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。10μM Aβが存在した場合には、SP化合物はATP合成への有益な作用はいっさい齎さなかった。
【０１５７】
細胞のトリパンブルー摂取を四番目の試験として用いて、有望なSP233化合物が、Aβに起因する毒性へと与える影響の評価を行った（図１４）。予想通りに、0.1μM、1μM、および10μMのAβは、PC12細胞のトリパンブルー摂取を用量依存的（それぞれ、33%、36%、および97%; p<0.001 by ANOVA）に増した。30μMおよび50μMのSP233は、Aβに起因する細胞死を阻害した（p<0.001 by ANOVA）。図１５には、SP233の神経保護作用が用量依存的であって、しかもAβの三種すべての濃度で維持されたことを示している。なお、SP233の作用効果は、病態生理的な基準以上の高濃度のAβの存在下では減少した。
【０１５８】
22R-ヒドロキシコレステロール誘導体を同定する理由のひとつとして、P450sccによって代謝されてプレグネノロンになり、さらに組織特異的な最終生成ステロイド産物とならないような、生体活性である（神経保護作用を持つ）化合物が求められている、ということがある。ステロイド産生性細胞によるこれらの化合物の代謝について評価するために、われわれは、充分に特徴的なステロイド産生性細胞モデルであるMA-10マウス腫瘍ライディッヒ細胞中でのこれらの化合物のステロイド形成能力を検査した。ここで、22R-ヒドロキシコレステロールは、P450sccの優れた基質であり、大量のステロイド類を産生しうるものである。Li et al., cholesterol binding at the cholesterol recognition/interaction amino acid consensus (CRAC) of the peripheral-type benzodiazepine receptor and inhibition of steroidogenesis by an HIV TAT-CRAC peptide, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 1267-1272 (2001) 。図１６は、SP222とは対照的に、SP233が最終ステ
ロイド産物を代謝できなかったことを示している。
【０１５９】
22R-ヒドロキシコレステロール誘導体のAβへの直接相互作用を、放射性標識した22R-ヒドロキシコレステロール／Aβ複合体に対して置換研究を行って示した（図１７）。放射性標識した22R-ヒドロキシコレステロールを、Aβと併せて24時間に亘り37℃でインキュベーションしたところ、高分子量の放射性標識された帯の存在（図１７）が、Aβに特異的な抗体によって確認された（Yao et al., 2002; データは提示せず）。Aβの22R-ヒドロキシコレステロールによる放射性標識の特異性を、標識していない22R-ヒドロキシコレステロールを使った競合研究によって示した（図１７）。このとき、100μM SP222が、Aβに結合した放射性標識したSP222化合物の80%を置換した。試験したSP化合物のうち、SP237、SP238、SP226、SP227、およびSP233は、放射性標識した22R-ヒドロキシコレステロールのAβへの結合を、それぞれ、46%、44%、65%、38%、および35%置換した（図１７）。
【０１６０】
これらのデータを、コンピュータ上でのAβとのドッキングシミュレーションを使ってさらに検証した。ドッキングの結果からは、 Aβ1-42 のうちの 19〜36 アミノ酸領域にポケットが形成されて、22R-ヒドロキシコレステロールが結合できるようになっていることがわかった。このことは、われわれの過去のデータとも一致する。Yao et al., J. Neurochem., 83, 1110-1119 (2002) 。試験した種々の化合物のドッキングエネルギーを、Aβとの結合に要する最小のエネルギーの順番で並べると以下のようになった。 （-10.34kcal/mol） SP229<SP232<SP224<SP237<SP222<SP233<SP228<SP223<SP230<SP234<SP225<SP238<SP236<SP226<SP235<SP231<SP227 （-8.35kcal/mol）。図１８および図１９では、SP222の結合特性を、SP233のそれと比較している。これは、各化合物について100回のドッキング実行をして解析したものである。このデータからは、SP233がドッキングした回数のうちの約23%でエネルギーが -7.0〜-7.5Kcal/mol であったのに対し、SP222では、 ドッキングした回数のうちの約25%で 5.5〜6.0Kcal/mol であったことがわかる。SP233がより強い（より負である）ドッキングエネルギーを持つ確率は、SP222のそれよりも有意に大きい。回数のほぼ100%で、SP233は-6.0kcal/molよりも低いエネルギーで結合していたが、その一方でSP222はそれと等回数を行っても、約-4.0kcal/molよりも低いエネルギーにしかならなかった。結合エネルギーをとった回数の分布を解析すると、二峰性プロファイルが得られ、これはAβには二箇所の結合部位が存在する、ということを示唆している。SP233では、ピークは -7〜-7.5kcal/mol と -8〜-8.5kcal/mol の双方に存在していると考えられ、一方、SP222ではピークは -5.5〜-6.0kcal/mol と -4.0〜-4.5kcal/mol とに在ると思われる。
【０１６１】
◆ 考察
このアッセイを用いたところ、試験した化合物のうちのいくつか（即ち、SP233、SP235、SP236、およびSP238）が、PC12細胞を10μM程度の高濃度のAβに曝露した場合に、神経保護作用を示した。興味深いことに、これらの化合物は、対照分子である22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）よりも有効であった。
【０１６２】
Aβの活性機構の後半の現象は、ミトコンドリア呼吸鎖の直接的もしくは間接的な破壊であって、これによりATP産生が減少すると、それだけでも細胞死を齎しうる。化合物SP222、SP235、およびSP238は、PC12細胞をAβに起因する毒性から救うことはできたが、Aβに起因するATP産生の変化は阻止できなかった。こうした説明を要するような明らかな不整合が残ってはいるが、MTTアッセイ（ミトコンドリアジアホラーゼ活性）とATP産生とが、呼吸鎖の同一部分の状態を反映していないという可能性がある。対照的に、SP233およびSP236は、（一部とは云え）Aβに起因するATP産生の減少を抑制した。SP223が持つATP貯蔵を保存する能力から、この化合物の有望な神経保護作用（トリパンブルー摂取細胞生存率アッセイによってさらに確認された）を説明できる。SP233は、すべてのアッセイにおいて最大の有効性を示しただけには留まらず、in vitroの10μM程度の低濃度のAβに対しても最も有望な神経保護作用を見せた、ということに留意されたい。
【０１６３】
本明細書中に示した研究は、0.1μM、1.0μM、および10.0μMの Aβ1-42 を使って行った。AD患者および対照群の脳脊髄液中に存在するAβ1-42 濃度は、 500 1000 ng/l （0.1〜0.2nM）の範囲であるので、上記した濃度は、病態生理的な濃度以上となる。Aβ1-42が10倍の濃度でAD脳内に存在すると仮定したとしても、 Aβ1-42 の病態生理的濃度の見積もりは1〜2nMの範囲となると考えられ、これは本出願人の行った実験で用いた濃度の100〜10,000倍も小さい。これらの濃度を考慮すると、0.1μM Aβに対してSP233が75%の保護を示したということが、薬学的観点からして適切であるのは明らかと言える。
【０１６４】
22R-ヒドロキシコレステロールとは異なり、22R-ヒドロキシコレステロールの生体活性を持つ誘導体であるSP233は、ステロイド形成を誘発できなかった。
【０１６５】
SP化合物の神経保護特性は、構造／活性相関（structure/activity relationship; SAR）に従うと考えられる。SP231とSP235は、ジオスゲニン（diosgenin）の立体異性体であるが（図１）、SP235だけがAβに起因する神経毒性への保護作用を呈する。SP235の立体化学は、C3R, C10R, C13S, C20S, C22S, C25Sであって、主骨格（motif）はSP233およびSP236と共通である（図１）。高い神経保護活性を示し且つ高濃度のAβの存在下で活性であるようなSP化合物には、C3にエステル、特に脂肪酸もしくは脂肪酸類似構造が含まれていた。実際、C3に非置換ヒドロキシル基を有するSP235は、限られた神経保護作用しか示さず、0.1μM Aβに対してのみ効果を呈した。それとは対照的に、SP235のC3を琥珀酸エステルにした構造を持つSP236は、より高濃度のAβに対して活性であり、また、SP235のC3をヘキサン酸エステルにした構造を持つSP233は、最も有望な化合物である。SP238はATP量の維持には作用しなかったとは云え、SP238がPC12細胞をAβに起因する毒性から保護できたという発見により、C3にまったく側鎖を持たないSP238の誘導体（SP226）が神経保護作用を示さなかったことをさらに考え合わせると、この仮説がさらに裏づけられる。SP232での安息香酸置換が、神経保護作用に関しては有効では無かったという発見からは、この程度の長さの脂肪族鎖の存在が芳香族構造置換したものよりも適切である、ということが示唆される。これらのデータはSARを示しており、C3における脂肪酸鎖の存在の重要性を強調する（highlights the importance of the presence of a fatty acid chain at C3）。
【０１６６】
SP222誘導体が、 Aβ1-42 に結合して失活させることによって神経保護作用を示す能力について、検証を行った。Aβに起因する細胞死に対する神経保護特性を示すSP化合物は、アミロイドペプチドに結合した放射性標識された22R-ヒドロキシコレステロールを置換する。
【０１６７】
SP-Aβ相互作用の特性をさらに評価するために、コンピュータ上でのドッキングシミュレーションを使った。この研究からは、Aβ上に、生体活性を持つSP化合物が結合する二箇所の結合部位が存在する可能性が明らかとなった。第一の結合部位は、22R-ヒドロキシコレステロールに対して強く特異的であると思われ、また、第二の結合部位は、SP233やSP236などの化合物に対して高い親和性を示す。SP226もこの第二の結合部位に結合することが示されたが、この化合物について計算した結合エネルギーは、神経保護作用を有するSP分子が示した結合エネルギーよりもかなり小さかった。引き続いて行ったコンピュータ上でのドッキングシミュレーション研究では、SP222およびSP233の結合エネルギーが二峰性分布を成すことがわかり、Aβ上の二箇所の結合部位の存在が、強く裏づけられた。結合エネルギーをさらに計算したところ、SP222の、第二の結合部位への親和性は、SP233と比較すると弱いことがわかり、エステル鎖の存在によって、SP233がAβ上の両方の結合部位に結合する能力を得ている可能性が示唆された。これらの観察結果に基づくと、Aβの第二の結合部位の占有が、アミロイドペプチドの失活を保つ上で必要である、という可能性が考えられる。
【０１６８】
Aβの直接の失活には関係しない他の機構も、SP233の神経保護活性に寄与していた可能性がある。スピロステノールの核受容体への結合についてはほとんど知られていないが、ステロイド受容体ファミリーの修飾の可能性についても除外はできなかった。Aβは、GLUT3を含んだ小胞の融合を阻害して、ミトコンドリアのホメオスタシスの破壊、ひいては神経細胞死を齎してしまうことが知られている。その一方で、通常のマウスと、ストレプトゾトシンで糖尿病を誘発させたマウスとに、Polygonatiの根茎から抽出したスピロステノール誘導体を与えると、グルコース吸収の増進が起こる。これらの結果を考え合わせると、細胞内グルコース輸送の恢復が、スピロステノール SP233 によって活性化される保護機構である、と考えられる。
【０１６９】
〔実施例 III〕
◆ 物質および方法
◇ Aβの重合およびアミロイド誘導体である拡散性リガンド（ADDL）形成についてのイムノブロット解析
漸加する濃度群のAβ（0.1μM、1μM、および10μM）を、PC12培地中で、24時間および72時間に亘って37℃で 5% CO2雰囲気下で、SP233の漸加する濃度群（1μM、10μM、および100μM）が存在する場合とSP233が存在しない場合とについて、インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、試料の分離を、4〜20% Tris-Glycine gel electrophoresis（Invitrogen）を天然条件下で125Vで2時間に亘って使用して行った。その後、ニトロセルロース膜（HybondTMECLTM, Amersham Pharmacia Biotech）に移して130Aで30分間に亘り分離を行った。5% 乳中でニトロセルロースをインキュベートして、抗体の非特異的吸収を停めた。Aβ種の免疫探査のために、Aβ蛋白質の 30 アミノ酸ペプチドを認識するようなAβに対する多クローン性抗体（Zymed Laboratories, San Francisco, CA）を用いて、ブロットを処理した。膜を1:2000に希釈した一次抗体中で1時間に亘り室温でインキュベートした。その後、膜を1:1000に希釈した二次抗体中で1.5時間に亘り室温でインキュベートした。ブロットを、the ECLTM Western Blotting Analysis System（Amersham Biosciences）を使って可視化した。画像濃度分析を、the OptiQuant software（Packard BioScience）を用いて行った。この方法により、Aβ複合体、ポリマー、およびADDLの、分離、可視化、および同定ができる。
【０１７０】
◆ 結果
漸加する濃度群のAβに、漸加する濃度群のSP233を加えてインキュベートした後に、電気泳動を行って、Aβから形成されたオリゴマーの確認と、この形成時にSP233により誘発された干渉の確認とができるようにした。図２０Ａおよび図２０Ｆには、インキュベーション後24時間経過した後（図２０Ａ）と72時間経過した後（図２０Ｆ）とに行ったイムノブロット解析を示した。われわれが用いた実験条件下では、0.1μM Aβの存在下ではモノマー種はすべての時点でまったく検出できず、また、トリマーもしくはテトラマー（ADDL）も、0.1μMおよび1μMのAβの存在下では、24時間目および72時間目の時点で検出されなかった。SP233は、濃度1μMおよび10μMのAβの存在下で（ion the presence）、24時間目（図２０Ｂ）および72時間目（図２０Ｇ）に測定したモノマー種の量を、用量依存的に減少させた。また、この用量−作用の相関は、トリマーADDLおよびテトラマーADDLに対しても、SP233を10μM Aβと共にインキュベートした場合において、24時間目（図２０Ｃと図２０Ｄ）および72時間目（図２０Ｈと図２０Ｉ）に観察された。しかしSP233は、ポリマー種の量については、わずかに用量依存的に増加させたにとどまった（図２０Ｅと図２０Ｊ）。このことから、SP233がAβに結合して、このペプチドと結合して安定な高分子である複合体を形成することによって、神経毒性を有するADDLの形成を阻害する、ということが示唆される。
【０１７１】
◆ 考察
アミロイドの誘導体である拡散性リガンド（ADDL）に属するトリマーおよびテトラマーは、約13〜108kDの範囲の非原線維性オリゴマーであって（Klein, Neurochem. Int., 41, 345-352 (2002)）、5〜10nM程度の低濃度で神経毒性を持つ可能性がある（Lambert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 6448-6453 (1998); Dahlgren et al., J. Biol. Chem., 277(35), 32046-32053 (2002)）。最近の報告では、ADDLについて、Aβの神経毒性を顕出させるものとして述べている。Klein, Neurochem. Int., 41, 345-352 (2002) 。SP233は、インキュベーション後24時間もしくは72時間が経過した後に、これらのトリマーおよびテトラマーの形成を用量依存的に減少させており、このことはSP233の神経保護作用と符合する。さらに、SP233は、ADDL形成で利用されうるモノマーの量も減少させた。SP233によるADDL量の用量依存的減少は、高分子量ポリマーの用量依存的増加によって起こっており、これからは、22R-ヒドロキシコレステロールおよびSP233が、Aβに結合して安定な無毒性ポリマーを形成することで、Aβを失活させている、ということが示唆される。
【０１７２】
〔実施例 IV： 22R-ヒドロキシコレステロールを用いた神経前駆細胞の分化〕
この実施例では、22R-ヒドロキシコレステロールが、NT2細胞の増殖を阻害（inbits）して、それらの細胞が「ニューロン様」（"neuron-like"）細胞および「星状細胞様」（"astrocyte-like"）細胞へと分化するように誘導する、ということを示してゆく。NT2細胞の22R-ヒドロキシコレステロールに起因する分化の間には、高分子量の神経線維蛋白質であるNF 200の発現が増大し、また、低分子量の神経線維蛋白質であるNF 70の発現は減少し、また、GFRα2の蛋白発現は増加した。こうした22R-ヒドロキシコレステロールの作用は、その鏡像異性体である22S-ヒドロキシコレステロールもしくは他のステロイド類ではNT2細胞の分化を誘導できなかったことから考えると、立体特異的であったと言える。
【０１７３】
◆ 細胞培養、細胞生存率（細胞毒性）、細胞増殖、およびフローサイトメトリー（流動細胞計測法）
ヒトNT2前駆細胞（Ntera2/D 1 畸形癌細胞）は、Stratagene（La Jolla, CA, USA）から入手し、供給者の指示に従って培養した。22R-ヒドロキシコレステロールの、細胞生存率（細胞毒性の逆測定）および細胞増殖への影響について、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム（MTT）アッセイ（Trevigen, Gaithersburg, MD）と、乳酸塩脱水素酵素放出（lactatedehydrogenase release; LDH）アッセイ（Boehringer Manneim; Indianapolis, IN, USA）と、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）ELISA （Boehringer Manneim; Indianapolis, IN, USA）とを用いて、過去の記事（Yao et al., Brain Res., 889, 181 (2001) ）および以下の企業プロトコール（company protocol）に倣って分析をした。フローサイトメトリーのために、細胞を10cm培養皿で24時間に亘り成長させてから、0日（対照群）、3日、6日、および12日間に亘り種々の濃度群の22R-ヒドロキシコレステロールで処理した。トリプシン処理をした後、細胞を回収して、懸濁し（1〜2 X 106 個の細胞を、0.1ml 枸櫞酸／DMSO溶液に入れた）、沃化プロピジウム（50μg/ml）とRNase（10μg/ml）とを含んだ溶液で染色してから、Modfit software program（Vindelov et al., Cytometry, 3, 332 (1983)）を搭載したFACS Scan flow cytometer（Becton Dickinson, Menlo Park, CA, USA）に入れてフローサイトメトリーにかけた。
【０１７４】
◆ 免疫細胞化学法およびイムノブロット法
70-kDa、145-kDa、および200-kDaの神経線維蛋白質およびGFRα受容体での実験のために、NT2細胞を8ウェルチャンバースライド中で培養し、濃度25μMの22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理した。細胞を新規に調製した3.7% ホルムアルデヒドに15分間浸して固定してから、ブロッキング剤（Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA）で停止させた。免疫染色法を、ウサギanti-NF200、anti-NF145、およびanti-NF70（すべて1:200）、ならびにヤギanti-GFRα1、anti-GFRα2、およびanti-GFRα3（すべて1:100）（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）を使用して行った。すべての抗体は200μg/mlで用いた。4℃で一晩インキュベーションした後、免疫反応を、セイヨウワサビペルオキシダーゼと複合した抗ウサギもしくは抗マウスのIgGを使って1時間に亘り室温で処理して検出し、さらにAECを使って可視化した。
【０１７５】
イムノブロットのために、NT2細胞を6ウェルプレートで培養して、種々の濃度の22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理した。その後、細胞を燐酸緩衝食塩水（PBS）で洗って、添加液（loading buffer）に溶解した。蛋白質を、4〜20%の傾斜をつけたアクリルアミド-ビス-アクリルアミドゲル上で、125Vで2時間に亘りドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）にかけて分離し、その後にニトロセルロース膜上に電気的に移した。5% 脱脂乳で停止した後に、ウサギ anti-NF200、anti-NF145、およびanti-NF70（すべて1:4000）（Chemicon International, Temecula, CA, USA）、ならびに、ヤギ anti-GFRα1、anti-GFRα2、およびanti-GFRα3（すべて1:500）（200μg/ml; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）、ならびに、二次抗体として用いたヤギ 抗-ウサギIgG-セイヨウワサビペルオキシダーゼもしくはウサギ 抗-ヤギIgG-セイヨウワサビペルオキシダーゼ（1:5000）（Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA）、を膜に加えて一晩インキュベーションして、イムノブロット解析にかけた。蛋白質帯をECL試薬（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA）を使って可視化した。免疫反応蛋白質帯の画像濃度分析を、OptiQuant-image analysis software（Packard BioScience, Meriden, CT, USA）を用いて行った。グリセルアルデヒド-3-燐酸脱水素酵素（GAPPH）を内部標準として使った。
【０１７６】
◆ 3H-22R-ヒドロキシコレステロール摂取アッセイ
22R-ヒドロキシコレステロール摂取を測定するために、NT2細胞（2 x 105 細胞数/ウェル）を、24ウェルプレート内の、1mlの10% ウシ胎児血清を含み且つ0.1μCi 3H-22R-ヒドロキシコレステロールを加えた培地中で、0日、1日、3日、および6日間に亘ってインキュベートした。インキュベーション後に、細胞をPBSで洗って、1mlの0.1N NaOHに溶解させた。放射能を液体閃輝分光法（液体シンチレーションスペクトロメトリー）で測定した。蛋白質量を、Bradfordの色素結合アッセイ（Bradford, Anal. Biochem., 72, 242 (1976)）でウシ血清アルブミンを標準として使って測定した。
【０１７７】
◆ コレステロール−蛋白質結合ブロットアッセイ（CPBBA）
NT2細胞蛋白質（4μg）および 3H-22R-ヒドロキシコレステロール（0.1μCi）を、体積20μlで、単独で、または漸加する濃度群の標識していない22R-ヒドロキシコレステロールの存在下で、37℃で3時間に亘りインキュベートした。インキュベーション後に、試料を1.0% アガロース（Type I-B）ゲル電気泳動で分離し、 10 x 食塩水-枸櫞酸ナトリウム（SSC）緩衝液中のニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA）に移した。膜をトリチウム感受性板に付けて、the Cyclone Storage Phosphor System（Packard BioScience, Meridien, CT, USA）を用いたホスホイメージングで解析した。画像濃度分析を、the OptiQuant software（Packard）を用いて行った。この方法により、放射性標識したコレステロール（Yao et al., FASEB, 16, 677 (2002)）、および天然条件下の22R-ヒドロキシコレステロール（Yao et al., J. Neurochem., 83, 1110 (2002)）を組み込んだ22R-ヒドロキシコレステロール=蛋白質複合体の、分離、可視化、および同定ができる。低分子量である組み込まれていない22R-ヒドロキシコレステロールは、電気泳動中に分離して排除した。
【０１７８】
◆ 統計
統計的解析を、INSTAT 3.00 package（GraphPad, San Diego, CA）を使って、一方向分散分析（ANOVA）およびunpaired Student's t testで行った。
【０１７９】
◆ 結果
位相コントラスト顕微鏡写真には、NT2細胞を25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで3日、6日、および12日間に亘り処理したことによって、形態学的変化が引き起こされたことを示している（図１、上側のパネル）。22R-ヒドロキシコレステロールで6日間処理した後に、細胞の形態に劇的な変化が生じたことがはっきりと示されていた（図２１Ｃ）。フローサイトメトリー分析からは、22R-ヒドロキシコレステロールがNT2細胞の増殖に影響したことがさらにわかった（図２１、下側のパネル）。データには、12日間の処理によって、 G0/G1 期の細胞の割合が、35.32%から50.34%へと増加し、且つ、G2/M 期の細胞の割合が、34.43%から15.90%に減少したことが明らかに示されている。
【０１８０】
22R-ヒドロキシコレステロールのNT2細胞の形態（分化）への作用は、濃度25μMの、その鏡像異性体である22S-ヒドロキシコレステロール（図２２ａ）、またはその前駆体（コレステロール）、またはその代謝物であるプロゲステロンおよびDHEA（図２２ｂ）で、6日間に亘り細胞を処理しても、再現することはできなかった。興味深いことに、22R-ヒドロキシコレステロールがNT2細胞の分化を誘導する作用は、立体特異的であるだけにはとどまらず、NT2細胞に限定されたものであった（PC12細胞、MDA-MB-231細胞、もしくはヒトグリオーマ（神経膠腫）細胞株U87を使ったところ、こうした作用は得られなかった（データ提示せず））。
【０１８１】
in vivoでのCNSの成長の間、細胞は二種の相反する過程、即ち増殖と死に、能動的に関与する（Ross, Trends Neurosci., 19, 62 (1996)）。NT2細胞では、早期細胞枯死（プログラムされた死）は、RAによる分化の誘発と関連しており、こうした細胞枯死は主に未分化細胞で起こり、このことは神経細胞表現型（NT2N）について最初に行われた調査結果と一致する（Guilemain et al., J. Neurosci. Res., 71, 38 (2003)）。本研究では、22R-ヒドロキシコレステロール、22S-ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、およびプロゲステロンの、NT2細胞の生存および増殖への影響を、LDHアッセイ、MTIホルマザン細胞外排出アッセイ、ならびにBrdUアッセイを使って定量した。LDHアッセイ（図２２ｃ、上段のパネル）およびMTTアッセイ（図２２ｃ、中段のパネル）で得られた結果からは、これらすべてのステロイド類が、高濃度（25〜50μM）では細胞毒性を呈するということがわかった。濃度50μMでは、これら四種すべてのステロイド類が、NT2細胞の増殖を抑制したが、その一方で濃度25μMでは、細胞増殖が有意に抑制されたのは22R-ヒドロキシコレステロール（p<0.05）および22S-ヒドロキシコレステロール（p<0.01）のみであった（図２２ｃ、下段のパネル）。これらのデータは、未分化NT2細胞のアポトーシス性細胞死も、22R-ヒドロキシコレステロールに起因する分化の間に発生していたことを示している。
【０１８２】
神経線維蛋白質の発現の増大を、3日間のRAに起因する分化の後に、NT2細胞中で検出できること（Pleasure et al., J. Neurosci. Res., 35, 585 (1993)）を考慮して、22R-ヒドロキシコレステロールで6日間処理を行った際の、神経線維蛋白質NF70、NF145、およびNF200のNT2細胞中での発現への作用については、免疫細胞化学法（図２３、上側のパネル）およびイムノブロット分析法（図２３、下側のパネル）で検証を行った。結果からは、細胞中でのNF70蛋白の発現が、22R-ヒドロキシコレステロールの濃度が増してゆくにつれて漸減していったことがわかった。イムノブロットアッセイでは、22R-ヒドロキシコレステロールの濃度を1μMから50μMまで増やしていったところ、NF70蛋白の量が、対照群の量に対して83%から18%まで減少したことが示された。なお、この変化は、細胞のNF70蛋白発現が少量であったため、免疫細胞化学的なデータには顕れていない。また、22R-ヒドロキシコレステロールは、NF145の発現にも影響し、濃度25μMの場合で、対照群の量に対して56%まで発現を減少させた。なお、この変化は、低濃度での処理では、5μMで増加が顕われたことを除けば、有意では無かった（図２３ｅ）。22R-ヒドロキシコレステロール（5〜25μM）での処理は、NF200蛋白発現を際立って増大させており（p<0.001）、この増大は、濃度25μMでは濃度5μMに較べて若干弱まっていて、対照値に対してそれぞれ180%と210%という結果になった（図２３ｆ）。
【０１８３】
22R-ヒドロキシコレステロールの活性機構を探るために、神経膠細胞株が誘導した神経栄養因子受容体蛋白質（glial cell line-derived neurotrophic factor receptor proteins）への22R-ヒドロキシコレステロールの作用を、免疫細胞化学法（図２４ａ、バンドc、上側のパネル）およびイムノブロット分析法（図２４ａ、バンドc、下側のパネル）を使って検証した。結果からは、25μM 22R-ヒドロキシコレステロールの存在は、GFRα1の発現に有意な作用をしなかった（図２４ａ）ということが示された。対照的に、22R-ヒドロキシコレステロール（25μM）は、GFRα2蛋白の発現に対しては強く作用し、6日間の処理により、対照群の量を45%も上回るほどに増大させた（図２４ｂ、下側のパネル）。また、22R-ヒドロキシコレステロール（25μM）での処理は、NT2細胞中のGFRα3蛋白の発現に対しても作用し、約16%減少させた（図２４ｃ、下側のパネル）。
【０１８４】
22R-ヒドロキシコレステロールが、NT細胞が分化している間にその中に入っているのかどうかを確認するために、細胞の22R-ヒドロキシコレステロール摂取を、1日、3日、および6日間の培養の後に測定した。3H-22R-ヒドロキシコレステロール摂取に基づいたアッセイにより、この物質は1日培養した後のNT細胞によって摂取されることがわかった（図２４ｄ、上側のパネル）。CPBBAを使って、NT2細胞の総蛋白質と、22R-ヒドロキシコレステロールとの直接相互作用を研究した。生成されたパターンからは、3時間の37℃のインキュベーションの後に、 3H-22R-ヒドロキシコレステロールを付した蛋白質の放射性標識強度が、漸加する濃度群の蛋白質の存在下では増大し、且つ、漸加する濃度群の標識していない22R-ヒドロキシコレステロール蛋白質の存在下では減少した（図２４ｄ、下側のパネル）。
【０１８５】
◆ 考察
未分化NT2細胞は、胚細胞腫から誘導されるものであって、しかも神経細胞分化の研究のための完全真正モデルとは云えないものではあるのだが、この細胞は、明らかに、関連づけられたヒト神経前駆細胞株であると云えるものであり、幹細胞の特徴をいくつか保持しており、ニューロンへの終末分化をする能力のみを有している（Pleasure et al., Neurosci. Res., 35, 585 (1993)）。したがって、***NT2細胞をNT2N細胞へと変態させることで、ヒトニューロンの研究のための独特なモデル系が得られることになる（同上; Pleasure et al., J. Neurosci., 12, 1802 (1992)）。NT2細胞は、RAに曝露すると、in vitroで広汎に分化し、その過程は、形態学的にまったく異なるいくつかの細胞種の出現と、細胞表面表現型の変化とを特徴とする（同上; Andrews, Dev. Biol., 103, 285 (1984)）。
【０１８６】
分化した細胞の中では、ニューロンが、軸索束の拡がった系に内部接続したクラスターを形成し、また、神経線維蛋白質および他の神経細胞標識形質を発現する（同上）。RA処理の後に、NT2細胞が、安定な神経細胞表現型（NT2N）へとこのように関連づけられることは、培地中で2ヶ月以上も有糸分裂活性もしくは表現型逆転が起きなかったことから確認できるように、不可逆な過程であると思われる。経時変化に間して述べると、NT2細胞の島は、RAによる3日間に亘る処理の後に神経線維蛋白質の発現の増大を示し、また、10〜14日後には、これらの細胞の形態が、ニューロンのそれに類似しはじめていた。このような事実を踏まえた上で、NT2細胞が、RAに起因する前駆細胞のニューロンおよび星状細胞の双方への分化の研究において広汎に使用されてきたということ（Bani-Yaghoub et al., Exp. Neurol., 156, 16 (1999); Neuroreport, 10, 3843 (1999); Sandhu et al., J. Neurosci. Res., 68, 604 (2002)）を考慮して、このモデルを、細胞の増殖および分化への22R-ヒドロキシコレステロールの作用を検証するために用いた。
【０１８７】
これらの結果からは、NT2細胞を25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで処理することによって、NT2細胞の「ニューロン様」細胞もしくは「星状細胞様」細胞への分化が誘発される、ということが示された。細胞形態に関して述べると、図２１の位相コントラスト顕微鏡写真には、NT2細胞を25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで3日、6日、および12日間に亘り処理したことで形態学的変化が誘発されたことがはっきりと示されており、これらの変化は、6日間の処理の後には明瞭になっていた。さらに、フローサイトメトリー法からは、22R-ヒドロキシコレステロールに起因するこれらの形態学的変化が、NT2細胞の増殖への作用と同時に起こることが示された。このステロイドでの12日間の処理の後には、 G0/G1 期の細胞の割合は増大し、また、G2/M 期の細胞の割合は減少した（図２１、下側のパネル）。この発見は、以下のような近年の他の研究成果を鑑みると、興味深いものであると言える。例えば、22R-ヒドロキシコレステロールによる処理に類似したものとして、NT2細胞を、ヘキサメチレン-ビスアセトアミド（HMBA; 種々の変態細胞の分化を誘発する一群のハイブリッド極性化合物（hybrid polar compounds）の原型となる化合物）によって処理すると、G1期の細胞の蓄積と、終末分化とが引き起こされた（Baldassare et al., Oncogene, 21, 1739 (1999)）。HMBAに起因するこうしたNT2細胞の生長停止および分化は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤p27の発現の増大と、p27とサイクリンE/CDK2複合体との会合の増進と、サイクリンE/CDK2に関連するキナーゼ活性の抑制とを伴っていた。こうした22R-ヒドロキシコレステロールとHBMAの双方の作用からは、これらの物質が、細胞サイクルの調節および神経細胞の分化を調整する際の分子機構に干渉しうる、ということが示される。
【０１８８】
特に、これらの結果は、22R-ヒドロキシコレステロールが、細胞分裂を調節する際に付随する、発生過程で制御された内因性分子シグナル（developmentally-controlled endogenous molecular signal）として機能する可能性を示唆しており、これはつまり、22R-ヒドロキシコレステロールが、細胞が増殖を続けるかまたは成長を停めるかを決定して、分化および枯死の発生を起こす際に関与している可能性がある、ということである。NT2細胞の分化を誘発する22R-ヒドロキシコレステロールの作用が、立体特異的であったこと、そしてさらには、その前駆体（コレステロール）、またはその代謝物であるプロゲステロンおよびDHEA（図２ｂ）ではこのような作用が観察されなかったこと、また、PC12細胞、MDA-MB-231細胞、もしくはヒトグリオーマ細胞株U87を用いた場合にも観られなかったことを考えると、この説は強く裏づけられると言える。
【０１８９】
in vivoでのCNS成長の間、細胞は二種の相反する過程、即ち増殖と死に、能動的に関与する（Ross, Trends Neurosci., 19, 62 (1996)）。NT2細胞では、早期細胞枯死（アポトーシス）は、RAによる分化の誘発と関連しており、こうした細胞枯死は主に未分化細胞で起こる。このことは神経細胞表現型（NT2N）について最初に行われた調査結果、即ち、アネキシンV（annexin V）標識をアポトーシスの標識形質として使ったRA処理の3日目および4日目に有意なアポトーシス性細胞死を定量することができた、ということと一致する（Guilemain et al., J. Neurosci. Res., 71, 38 (2003)）。本研究では、22R-ヒドロキシコレステロール、22S-ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、およびプロゲステロンの、NT2細胞の生存および増殖への影響を、LDHアッセイ、MTIホルマザン細胞外排出アッセイ、ならびにBrdUアッセイを使って定量した（図２２参照）。LDHアッセイおよびMTTアッセイで得られた結果からは、これらすべてのステロイド類が、高濃度（25〜50μM）では細胞毒性を呈するということがわかった。濃度50μMでは、これら四種すべてのステロイド類が、NT2細胞の増殖を抑制したが、その一方で濃度25μMでは、細胞増殖が有意に抑制されたのは22R-ヒドロキシコレステロールおよび22S-ヒドロキシコレステロールのみであった。したがって、未分化NT2細胞のアポトーシス性細胞死も、22R-ヒドロキシコレステロールに起因する分化の間に発生していた。また、MTTアッセイから、22R-ヒドロキシコレステロールは、高濃度（>10μM）でのみ未分化NT2細胞の生存に影響し、且つ、分化したNT2N神経細胞には作用を及ぼさなかった、ということにも留意したほうがよいと思われる。
【０１９０】
22R-ヒドロキシコレステロール処理の、NT2細胞による神経線維蛋白質の発現への作用に関して述べると、22R-ヒドロキシコレステロールでの6日間に亘る処理により、NF70、NF145、およびNF200の発現が変化した（図２３参照）。イムノブロットアッセイでは、22R-ヒドロキシコレステロールの濃度を1μMから50μMまで増やしていったところ、NF70蛋白の量が、対照群の量に対して83%から18%まで減少したことが示された。また、22R-ヒドロキシコレステロールは、NF145の発現にも影響し、濃度25μMの場合で、対照群の量に対して56%まで発現を減少させた。また、22R-ヒドロキシコレステロールは、濃度範囲5〜25μMで、NF200蛋白発現を有意に大きく増加させた。
【０１９１】
神経線維は神経軸索および樹状突起の主要な細胞骨格要素であること、ならびに、神経線維の発現は組織特異的であって発生過程で制御されたものであること、ならびに、神経線維は通常はニューロンに限定されること、を考慮すると、これらの発見は、NT2細胞の神経細胞への分化を誘発する22R-ヒドロキシコレステロールの作用を充分に支持するものであると言える。この説は、RAに起因するNT細胞のニューロンへの分化には、神経線維蛋白質の誘発が伴うことを示した過去の研究によっても、さらに実証される。例えば、Lee et al., J. Neurosci., 6, 514 (1986) には、RAに曝露した2日後という早期の時点で、神経細胞的な形態を取っていない少数のNT2細胞の中に、神経線維蛋白質NF195、NF170、およびNF70を検出することができたこと、また、神経線維陽性の細胞の数がRA曝露後の時間経過とともに増加していったこと、また、2週間後には神経線維を発現している細胞の多くが神経細胞的な形態を取っていたこと、が示されている。また、Webb et al., J. Neuroimmunol., 11, 67 (1986) の研究では、NT2細胞から、RA処理開始後3週間に、「ニューロン様」形態を取り且つNF55およびNF210を発現した細胞が培養された。これらの発見もまた、ADを含む多くの神経変性病を患ったニューロン中に、神経線維蛋白質が蓄積することを踏まえると、興味深いものである。
【０１９２】
22R-ヒドロキシコレステロールに起因する神経細胞分化の基礎を成す機構を明らかにしようとする企てとして、NT2細胞中のGFRα受容体蛋白質の発現への、22R-ヒドロキシコレステロールの作用を、免疫細胞化学法およびイムノブロット分析を使って検証した（図２４）。25μM 22R-ヒドロキシコレステロールでの6日間に亘る処理により、GFRα2蛋白の発現が対照群の量を45%上回るほどに増大し、また、GFRα3蛋白の発現が約16%に減少した。GDNFファミリーの構成員およびGDNFファミリー配位子は、中枢ニューロンおよび辺縁系ニューロンの個々の組の発生と維持に欠かせないものであって、この配位子は、それらの受容体チロシンキナーゼへと通ずる細胞内伝達経路の活性化を行っている、ということが知られている（Airaksinen et al., Nat. Rev. Neurosci., 3, 383 (2002)）。
【０１９３】
さらにこれらの発見に関して言うと、GDNFファミリーの構成員（GDNF、ニュールツリン（neurturin）、アルテミン（artemin）、およびパーセフィン（persephin））は、神経の生長に不可欠な調節因子であって、中脳ドーパミン作動性ニューロンおよび松果体運動ニューロンの生存を支えるものである（Sanchez et al., Nature. 382, 70 (1996); Widenfalk et al., J. Neurosci., 17, 8506 (1997)）。GDNFファミリー配位子は、それらの特異的GFRα受容体に結合し、Ret膜横断受容体チロシンキナーゼ（Ret transmembrane receptor tyrosine kinase）を活性化する（Airaksinen et al., Mol. Cell. Neurosci., 13, 313 (1999); Airaksinen (2002)）。最近の研究では、RETが介在する、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤 p27kipl の上方調節を通して、GDNFがNT2細胞増殖の抑制を誘発することを示しており（Baldassarre et al., Oncogene, 21, 1739 (2002)）、この p27kipl は、NT2細胞の生存と分化の鍵となる役割を担っている（Baldassarre et al., Oncogene, 18, 6241 (1999)）。
【０１９４】
一般的に言って、22R-ヒドロキシコレステロールでの処理がGRFα2およびGRFα3の発現の変化を誘発するということを示すこれらの発見は、NT2細胞の22R-ヒドロキシコレステロールへの曝露が、神経発生調節に伴う機構に干渉するだけでは無く、「星状細胞様」細胞および（おそらく）「寡突起神経膠細胞様」細胞の形成に伴う機構に対しても干渉する、ということも示している、と考えることができる。これに関連して、Bani-Yaghoub et al., Neuroreport, 10, 3843 (1999) では、NT2細胞が星状細胞へと分化できることを報告しており、NT2細胞は、胎児型幹細胞と同様に、神経細胞株および星状細胞株の双方の礎となりえる、と結論している。また、Sandhu et al., J. Neurosci. Res., 68, 604 (2002) では、NT2細胞が、RAでの4週間の処理により、機能性星状細胞へと分化できることを発見しており、この分化には、細胞増殖の減少と細胞サイクルの停止が随伴していたことが、フローサイトメトリーおよびKi67の免疫染色およびBrdUの組み込みによる測定からわかった。
【０１９５】
また、実施例IVでは、 3H-22R-ヒドロキシコレステロールを、培地中に1日置いたNT2細胞によって摂取させて、37℃で3時間に亘りインキュベートした後に、3H-22R-ヒドロキシコレステロールと組み合わせた蛋白質の放射性標識強度が、漸加する濃度群の蛋白質の存在下では増大し、且つ、漸加する濃度群の標識していない22R-ヒドロキシコレステロール蛋白質の存在下では減少した（図２４）ことを示している。これらの結果からは、22R-ヒドロキシコレステロールと細胞蛋白質との物理化学的相互作用が、NT2細胞の分化を誘発する22R-ヒドロキシコレステロールの作用に寄与している、ということが示唆される。
【０１９６】
プレグネノロンおよびDHEAといった神経ステロイド類が、認識能力を保存および／もしくは増進すること（Valee et al., PNAS USA, 94, 14865 (1997)）、ならびに、高齢動物の記憶を改善すること（Roberts, The Biological Role of Dehydroepiandrosterone, Kalima et al., eds., de Gruyter (1990) at pages 13-42）から、こうした神経ステロイド類が脳内で生理的機能を担っている可能性を示した過去の研究結果を踏まえると、本明細書中に示した結果は、さらに重要性を増すと言える。プレグネノロンおよびDHEAは、辺縁系内分泌器官による供給によって独立に蓄積し（Baulieu et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 37, 395 (1990)）、神経修飾物質（ニューロモデュレーター）として機能することが明らかになっている（Paul et al., FASEB J., 6, 2311 (1992)）。神経膠細胞は、コレステロールをプレグネノロンに転換できる。
【０１９７】
in vitro研究によって、寡突起神経膠細胞、グリオーマ株、およびシュワン細胞が、コレステロールからプレグネノロンへの転換に関与するシトクロムP450コレステロール側鎖開裂酵素を発現することが示されている（Jung-Testas et al., Endocrinol., 125. 2083 (1989); Papadopoulos et at., PNAS USA, 89, 5113 (1992); Akwa et al., C. R. Acad. Sci. III (France), 316, 410 (1993)）。また、22R-ヒドロキシコレステロールが、この酵素による開裂反応中に形成される三種のヒドロキシル化中間生成物のうちのひとつであることも、充分に記載されている（Dixon et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 49, 161 (1970); Hall, Anal. N. Y. Acad. Sci., 458, 203 (1985)）。また、AD患者の脳標本中の22R-ヒドロキシコレステロールの量が、年齢を合わせた対照群と比較して少ない、という発見も特筆すべき事項である。22R-ヒドロキシコレステロールの量は、認識能（学習と記憶など）にとって不可欠なものであって且つADによる影響を蒙る脳の辺縁系の組織である海馬中で有意に減少していた（Yao et al., J. Neurochem., 83, 1110 (2002)）。NT2細胞の22R-ヒドロキシコレステロールにより誘発されるNT2N表現型への分化の礎となっている正確な機構については、本明細書中に示した結果を以ってしても不明なままではあるが、実施例4では、22R-ヒドロキシコレステロールが、何らかの未知の（ひとつもしくは複数の）蛋白質と結合するかまたは相互作用することによって、この（ひとつもしくは複数の）蛋白質を活性化し、GFRα2蛋白質発現を増大させて、GFRα-Ret回路を活性化し、その結果として、細胞の増殖を抑制して分化を誘発する、ということを示している。
【０１９８】
〔実施例 IV： 神経細胞分化誘発のためのスピロステノールの使用〕
｛A. 物質および方法｝
◇ 1. 物質
(20α)-25ξ-メチル-(22R,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3ξ-オール（SP-224）は、Interbioscreen（Moscow, Russia）から購入した。細胞培養供給器は、GIBCO（Grand Island, NY）から、また、細胞培養プラスチック容器はCorning（Corning, NY）から購入した。マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細胞は、ATCC（Manassas, VA）から購入した。in vivo研究のために、体重300〜325gの雄Long-EvansラットをCharles-Riverから購入し、the Department of Comparative Medicine at Georgetown Universityで飼育した。連続14日間に亘り毎時間5.0μlを搬送する滲透圧マイクロポンプ（2ML2）を、DURECT Corp.（Cupertino, CA）から購入した。
【０１９９】
ウサギ anti-GAP43抗体、モルモット anti-ダブルコルチン（DCX）抗体、マウス anti-βIIIチュブリン抗体、およびウサギ anti-コリン-アセチル転移酵素（ChAT）抗体は、Chemicon（Chemicon International, Temecula, CA）から、また、マウス anti-CNPase抗体、ウサギ anti-GFAP抗体、およびマウス anti-MAP2抗体は、Abcam（Cambridge, MA）から、また、ウサギ anti-シナプトフィジン抗体はZymed Laboratories（San Francisco, CA）から、また、マウス anti-ブロモ-デオキシウリジン（bromo-desoxyuridine; BrdU）抗体はNeomarkers（Lab Vision Corp., Fremont, CA）から、それぞれ購入した。
【０２００】
Texas red抱合抗体、ローダミン抱合抗体、ローダミン(TRITC)抱合抗体、およびFITC抱合抗体は、Jackson Immunoresearch Laboratories（West Grove, PA）から購入した。DAPIおよび臭化エチジウム核対比染色色素は、Molecular Probes（Eugene, OR）から購入した。
【０２０１】
◇ 2. 細胞培養および処理
マウス胎児畸形癌P19細胞を、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを加え、仔ウシ血清（7.5%）とウシ胎児血清（2.5%）を含めて、直径13mmガラスカバースリップに入れたAlpha Minimum Essential培地中で、37℃且つ95% CO2で培養した。PC12細胞（ラット褐色神経細胞腫）を、直径13mmガラスカバースリップに入れた、グルタミンを含まないRPMI1640培地中で、37℃且つ5% CO2で培養し、10% ウシ胎児血清と5% ウマ血清を与えた。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。
【０２０２】
◇ 3. in vivo研究
体重300〜325gの雄のLong-Evansラット（生後3〜4ヶ月）を、天然の昼夜サイクルに従って飼育し、食餌と水は自由にした。手術前に、ラットをequithesin（3ml/kg, i.p.）で麻酔して、定位装置に固定した。電極マイクロマニピュレーターを使って、滲透圧マイクロポンプの出口を、座標 D = 3.4mm, L = 1.4mm, AP = 0.92mm（尾側からブレグマへの方向）に従って左脳室に埋め込んだ。滲透圧ポンプのタンクは、ラットの背中の肩甲骨中央部の皮下内腔に埋め込んだ。手術後、ラットを恢復させるために電気毛布上に置いた。全術式の間、体温を監視して37℃で安定するようにした。ポリプロピレングリコール／グリセロール／蒸留水（50/25/25）に375μMで溶かしたSP-224を、i.c.v.経路を使って2週間に亘り毎時5μlで灌流した。まず洗浄溶液（NaCl 8g/l、デキストロース 4g/l、スクロース 8g/l、塩化カルシウム 0.23g/l、無水カコジル酸ナトリウム 0.25g/l、を脱イオン水に溶かしたもの）を、その後に固定性カコジル酸塩緩衝液（スクロース 40g/l、パラホルムアルデヒド 40g/l、無水カコジル酸ナトリウム 10.72g/l、を脱イオン水に溶かしたもの）を使った脳注入が完了してから3週間後に、ラットを殺した。脳は、固定性カコジル酸塩緩衝液中でさらに1週間に亘り保存して、その後にパラフィンの中に封入した。神経幹細胞の増殖を研究するために、ラットには日毎にBrdU溶液を100mg/kg与えた。最初の注入は手術の次の日に行い、また最後の注入は安楽死の前の日に行った。
【０２０３】
◇ 4. 免疫細胞化学法および免疫組織化学法
P19細胞を-20℃のメタノールで15分間固定し、その後、0.1% Triton 100Xを含めた1X PBS pH=7.4 で室温で30分間に亘って脱膜（permeabilized）した。GAP43に対する抗体（1/1000）、DCXに対する抗体（1/3000）、βIIIチュブリンに対する抗体（1/500）、シナプトフィジンに対する抗体（1/200）、MAP2に対する抗体（1/500）、ChATに対する抗体（1/2000）、GFAPに対する抗体（1/1000）、もしくはCNPaseに対する抗体（1/250）を細胞に与えて、40℃で24時間に亘りインキュベートした。Texas red抱合抗体、ローダミン抱合抗体、ローダミン(TRITC)抱合抗体、もしくはFITC抱合抗体を室温で2時間に亘りインキュベートして（1/200）、免疫染色陽性を顕出させた。細胞核を、DAPIもしくは臭化エチジウムを使って対比染色した。
【０２０４】
脳は切除後ただちにパラフィンブロックに封入し、20μm厚の切片に切り分けた。これらの脳切片を、4℃で24時間インキュベートした種々の一次抗体（anti-BrdU（1/100）およびanti-DCX（1/3000））で処理してから、FITC抱合二次抗体もしくはローダミン二次抱合抗体（1/200）を使ってシグナルを顕出させた。
【０２０５】
｛B. 結果｝
◇ 1. 未分化ヒト神経NT2細胞、マウス胎児畸形癌P19細胞、およびマウス褐色細胞腫PC12細胞における、神経突起様新芽形成の誘発
上記の細胞株は、神経細胞分化モデルとして広汎に使用されていることを踏まえて用いた（Houldsworth et al., 2002; Chou et al., 2003; Das et al., 2004）。新芽形成（発芽; sprouting）を誘発するために、細胞を6ウェルプレート中で培養し、90μM SP-224で2日間（P19）もしくは5日間（PC12およびNT2）に亘って処理した後、新しい培地で洗って、5日以上（P19）もしくは10日以上（PC12およびNT2）に亘って培養した。われわれが用いた実験条件下では、これら三種の細胞が有意な新芽形成を見せ（図２５Ｂ、図２５Ｄ、図２５Ｆ）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（図２５Ｄ）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。対照細胞群は、SP-224を含まない培地で2日間処理した後、SP-224で処理した細胞群と同様の条件下で洗い流しを行った。対照細胞群は、密集状態になった後にも生長を続けたが、いかなる類の新芽形成もまったく示さなかった（図２５Ａ、図２５Ｃ、図２５Ｅ）。
【０２０６】
◇ 2. 分化したP19細胞中の神経細胞標識形質および非神経細胞標識形質の確認
SP-224がP19細胞の神経細胞的分化を誘発する能力を、以下のように評価した。P19細胞を2日間処理した後、5日間の洗い流し期間をとった（図２６）。28日後に、神経細胞標識形質発現の研究を行って（図２７）、5日目に観察された発現が一時的なものなのか永久的なものなのかを確かめた。対照群では、神経細胞標識形質はシナプトフィジンを除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（図２６Ｃ）。SP-224曝露によって、βIIIチュブリン（図２６Ａ）、シナプトフィジン（図２６Ｂ）、MAP2（図２６Ｃ）、およびChAT（図２６Ｄ）といった研究に用いた種々の神経細胞標識形質の強い発現が誘発された。また、遊走性神経芽細胞標識形質であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞中で強く発現した（図２６Ｅ）。図２６Ａは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。28日間の洗い流しの後、神経細胞的分化はさらにいっそう重みを増した。βIIIチュブリン免疫染色によって示したように、軸索および樹状突起の系が劇的に伸長した（図２７Ａ）。シナプトフィジン標識の重みからは、新たに形成されたニューロンがシナプス接合を確立したことが示された（図２７Ｂ)。
【０２０７】
神経膠的標識形質であるGFAPおよびCNPaseの発現は、SP-224がP19細胞の星状細胞および寡突起神経膠細胞への分化を起こさせる能力を反映したものであって、こうした能力については分化過程の最終的な特異性を解析する目的で研究が重ねられている。90μM SP-224を2日間与えてからSP-224を含まない培地で5日間の培養を行うというプロトコールを用いたところ、SP-224も、P19細胞の寡突起神経膠細胞への分化を引き起こしたが（図２８Ｂ）、陽性のGFAPシグナルは検出されなかった（図２８Ｄ）。GFAPとCNPaseのどちらの標識形質も、対照P19細胞群では発現しなかった。
【０２０８】
◇ 3. 神経幹細胞増殖のin vivoでの特徴と、神経細胞の早期標識形質であるDCXの同定
この実験は、in vitroで得られた結果を検証するためと、そしてラットの脳の脳室下帯（SVZ）に存在する神経幹細胞の神経細胞的分化を誘発できるSP-224の能力を評価するために行った。SP-224は、375μMの溶液として脳室内経路に2週間に亘って投与し、これはラット毎に総量530nMのSP-224を与えたことに相当する。in vitroプロトコールのうちの洗い流し期間をシミュレートするために、ラットを改めて3週間に亘りそのまま涵養して、その後に脳を取り出した。免疫組織化学法により、SP-224がSVZ内の神経幹細胞の自己更新を誘発できたことを示す、重みのあるBrdUが顕出された（図２９Ｃ〜Ｇ）。加えて、BrdU陽性細胞のうちのいくつかは、SVZから充分に離れた位置（白矢印）で検出され、このことからは、いくつかの細胞が既に遊走過程に入っていた可能性が示唆される。また、SP-224の注入によって、SVZ細胞中に、神経細胞の早期標識形質であるDCXの発現も誘発されており、このことからは、in vitroと同様に、SP-224が、この領域に在る神経幹細胞を神経細胞へと分化するように促すことができる（図２９Ｄ〜Ｈ）ということが示された。
【０２０９】
｛C. 考察｝
神経幹細胞療法によって、損傷したニューロンを置換して、いくつかの神経変性疾患および症状（パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、外力性脳損傷、卒中、および末梢神経損傷など）を処置することができると考えられる（T. L. Limke et al., Stem Cell Res., 12, 615 (2003); D. J. Watson et al., J.Neuropathol. Exp. Neurol, 62, 368 (2003); S. Chiba et al., J. Neurol. Sci., 219, 107 (2004); V. Silani et al., Lancet, 364, 200 (2004); Y. Tai et al., Curr. Opin. Pharmacol., 4, 98 (2004); M. Tohill et al., Biotechol. Appl. Biochem., 40, 17 (2004)）。二つの最も有望な方策があり、それは、in vitroで分化させた幹細胞の移殖と、内因性幹細胞の増殖および分化の誘発である（O. Lindvall et al., Nature Medicine, 10, S42 (2004)）。しかしながら、利用可能な神経前駆細胞が少数であることが、成人の脳の能力を修復する上での制限となってしまいうるため、二つの方策即ち移殖とin situ分化を組み合わせることが、成功へとつながる最上の治療手法であると考えられる。レチノイン酸もしくはシクロパミンなどの多数の低分子が、NSCのin vitroでの神経細胞的分化を誘発させるための道具として用いられてきたが、これらの分子は毒性を持つためin vivoでの使用は非常に難しい。デキサメタゾン、フルオキセチン、もしくはゲルダナマイシンは、有害な副作用を有する（S. Ding et al., Nature Biotech., 22, 833 (2004)）。本発明に従って、天然産生のフロスタノール（furostenol）即ち (20α)-25ξ-メチル-(22R,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3ξ-オール（SP-224）を入手して、in vitroおよびin vivoのラット脳での神経組織発生を誘発するために用いた。
【０２１０】
SP-224での2〜5日間の処理によって、P19細胞、NT2細胞、およびPC12細胞に神経突起様組織の形成が誘発され、その後、5〜10日間の洗い流しにより、これらの幹細胞の有望な分化の最初の形跡が顕わになった。興味深いことに、SP-224が作用を示したのは、処理プロトコール中に洗い流し期間が含まれていた場合のみであった。事実、「治療力」（"therapeutic pressure"）が2日後に除去されなかった場合には、我々はいかなる神経突起も観察することができなかった。ここからは、活性が「急襲的」（"hit and run"）機構を持つことが示唆される。分化したP19細胞中のこの構造的修飾は、特異的神経細胞標識形質であるβIII-チュブリンおよびMAP2の出現を伴う。βIII-チュブリン免疫染色法により、洗い流しを5日間行った後に形成された軸索の長さが、約500μMに達していたことを可視化できた。
【０２１１】
重要なこととして、SP-224は、シナプトフィジンの発現も誘発し、これはつまり新規に形成されたニューロンがシナプス構造を築くことができたということを意味する。シナプスの構築は、新規に形成されたニューロンを既存の神経系に統合する上で不可欠であって、5日間の洗い流し期間が完了した後にも進化を続け、1ヶ月間の生長の後にも観察された。このことからは、SP-224の作用は一時的なものでは無い、ということが示唆される。加えて、分化しているP19細胞は、強いChATシグナルを呈したため、コリン作動性表現型を示した。SP-224がP19細胞をコリン作動性表現型になるよう促したという事実は、この化合物が、ヒト神経幹細胞をADに罹った患者の海馬内に再移植する前に前処理する上での理想的な試薬となる、ということを指し示すものであり、興味深いと言える。
【０２１２】
神経細胞的分化は、ダブルコルチン（doublecortin）の発現によって確かめられた。なおダブルコルチンは、遊走性未成熟ニューロン中に特異的に発現することが示されている標識形質である（F. Francis et al., J. Neuron., 23, 247 (1999)）。これらの結果からは、SP-224は、神経幹細胞のin vitro神経細胞的分化の誘発と、シナプスおよび神経系接続の形成の促進を行うことができるだけにはとどまらず、さらには、分化しているニューロンを、それらのニューロンが通常の機能を行う領域へと遊走させるトリガーとしても機能する、ということが示唆される。SP-224は、P19細胞の星状細胞への分化のトリガーとしては機能せず、また、寡突起神経膠細胞に特異的な標識形質であるCNPaseの発現はきわめて少なかった。このことからは、神経細胞的分化経路は、SP-224によりin vitroで特異的に活性化されるということが示唆された。
【０２１３】
成年哺乳類の脳には、主に二つの胚細胞領域（germinal area）が在り、即ち、脳室下帯（SVZ）と海馬歯状回である（B. J. Chiasson et al., J. Neurosci., 19, 4462 (1999); Alvarez-Buylla et al., Brain Res. Bull., 57, 571 (2002)）。SP-224を左脳室に2週間に亘り継続的に注入すると、ラット脳のSVZの細胞によるBrdUの劇的な増大が誘発される。これらのデータは、SP-224が、SVZ内に在るNSCの増殖を誘発できることを示している。さらには、BrdU免疫染色法により、神経細胞的分化の早期標識形質であるDCXが共に局在化したので、in vitroで観察されたSP-224の分化特性を、in vivoでも検証できた。また、BrdU染色は、SVZの近傍であって線条体内部である箇所で検出されたため、いくつかの細胞が遊走していたことが示唆される。SP-224の作用は、脳組織へのいかなる毒性も示すことなく発揮された、ということに留意されたい。
【０２１４】
結論として、SP-224は、幹細胞療法に使用できる低分子として有望であることが明らかとなった。構造式(I)、(II)、もしくは(III)の別の化合物についても、22R-ヒドロキシコレステロールの結合親和性を模倣するように選択してあるため、同様の生体活性を呈すると考えられる。
【０２１５】
本発明に係る数多の実施形態について記載してきた。だが、本発明の本質から逸脱すること無くさまざまな改変を施しうるということを理解されたい。したがって、他の実施形態は随伴する請求項の範囲内に在り、また、上述した組成物、処方、配合、および方法には、本発明の本質から逸脱すること無くさまざまな改変を施すことが可能であるため、上記に含まれるすべての要件は例示として解釈されるべきであって、何ら限定的な意味合いは有さない。本明細書中で参照した特許文献および引用文献は、この参照により本開示に含まれる。
【０２１６】
図面は、本発明に係る化合物のいくつかと、これらの化合物を同定するための方法と、本発明に関して示した化合物の活性を示すin vitroおよびin vivoでの生物学的検査の結果とを示している。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】図１は、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および天然の誘導体の構造の数々を示している。
【図２】図２は、ADの脳の試料および対照群の脳の試料における22R-ヒドロキシコレステロールの量を示した図である。
【図３Ａ】図３Ａは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の漸加する濃度群を使った場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロールの漸加する濃度群を与えたときのラットPC12神経細胞の生存度への作用を示す折れ線グラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の漸加する濃度群を使った場合とにおける、コレステロールの漸加する濃度群を与えたときのラットPC12神経細胞の生存度への作用を示す折れ線グラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の漸加する濃度群を使った場合とにおける、プレグネノロンの漸加する濃度群を与えたときのラットPC12神経細胞の生存度への作用を示す折れ線グラフである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の漸加する濃度群を使った場合とにおける、17α-ヒドロキシプレグネノロンの漸加する濃度群を与えたときのラットPC12神経細胞の生存度への作用を示す折れ線グラフである。
【図３Ｅ】図３Ｅは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の漸加する濃度群を使った場合とにおける、DHEAの漸加する濃度群を与えたときのラットPC12神経細胞の生存度への作用を示す折れ線グラフである。
【図３Ｆ】図３Ｆは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の漸加する濃度群を使った場合とにおける、22S-ヒドロキシコレステロールの漸加する濃度群を与えたときのラットPC12神経細胞の生存度への作用を示す折れ線グラフである。
【図４】図４は、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 が存在する場合とにおける、分化したヒトNT2Nニューロンの生存度への、22R-ヒドロキシコレステロールの作用を示す折れ線グラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、ラットPC12神経細胞における Aβ1-42 に起因する毒性への、22R-ヒドロキシコレステロールおよびDHEAの作用を示す折れ線グラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ラットPC12神経細胞における Aβ25-35 に起因する毒性への、22R-ヒドロキシコレステロールおよびDHEAの作用を示す折れ線グラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ヒトNT2細胞における Aβ1-42 に起因する毒性への、22R-ヒドロキシコレステロールおよびDHEAの作用を示す折れ線グラフである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ヒトNT2細胞における Aβ25-35 に起因する毒性への、22R-ヒドロキシコレステロールおよびDHEAの作用を示す折れ線グラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、Aβ凝集への22R-ヒドロキシコレステロールの作用を示す、クマシーブルーゲルである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Aβ凝集への22R-ヒドロキシコレステロールの作用を示す、図６Ａのクマシーブルー染色ゲルのイムノブロット分析である。
【図７Ａ】図７Ａは、 Aβ1-42-22R-ヒドロキシコレステロール結合および結合部位を識別する、CPBBAを使ったイムノブロット分析である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａに示したブロット上で、β-アミロイドペプチドに対するウサギ多クローン性抗血清を用いて Aβ1-42 を識別する、イムノブロット分析である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、Aβ上の22R-ヒドロキシコレステロール結合部位を識別する、イムノブロット分析である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、コンピュータ上での、22R-ヒドロキシコレステロールの Aβ1-42 へのドッキングのシミュレーションである。
【図７Ｅ】図７Ｅは、コンピュータ上での、22R-ヒドロキシコレステロールの Aβ17-40 へのドッキングのシミュレーションである。
【図７Ｆ】図７Ｆは、コンピュータ上での、22R-ヒドロキシコレステロールの Aβ17-40 へのドッキングのシミュレーションである。
【図７Ｇ】図７Ｇは、コンピュータ上での、22R-ヒドロキシコレステロールの Aβ1-42 へのドッキングのシミュレーションである。
【図７Ｈ】図７Ｈは、コンピュータ上での、22R-ヒドロキシコレステロールの Aβ1-42 へのドッキングのシミュレーションである。
【図７Ｉ】図７Ｉは、 Aβ1-42 内の22R-ヒドロキシコレステロール結合部位の配置を示すアミノ酸配列（配列表の配列番号1）である。
【図８】図８は、PC12細胞を、Aβの漸加する濃度群に三日間曝露して用量依存的に細胞死が起ったことを示す棒グラフである。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｄ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｅ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｆ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｇ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｈ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｉ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｊ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｋ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｌ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｍ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｎ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｏ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図９Ｐ】図９Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 0.1μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｆ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｇ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｈ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｉ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｊ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｋ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｌ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｍ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｎ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｏ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１０Ｐ】図１０Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 1.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｆ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｇ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｈ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｉ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｊ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｋ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｌ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｍ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｎ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｏ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１１Ｐ】図１１Ａ〜Ｐは、 Aβ1-42 が存在しない場合と、 Aβ1-42 の濃度が 10.0μM である場合とにおける、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の漸加する濃度群を与えたときの、ラットPC12神経細胞の生存率への作用を示す一連の棒グラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Aβ曝露によって、膜電位を算定するためのルミネセンスが用量依存的に減少することを示す棒グラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、0.1μMのAβに起因する神経毒性に対する、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の作用を示す棒グラフである。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、1.0μMのAβに起因する神経毒性に対する、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の作用を示す棒グラフである。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、10.0μMのAβに起因する神経毒性に対する、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の作用を示す棒グラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、0.1μM、1.0μM、および10.0μMのAβに起因する神経毒性の存在下で、Aβが、PC12細胞によるATP産生を用量依存的に減少させたことを示す棒グラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、0.1μMのAβに起因する神経毒性の存在下での、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の、ATPへの作用を示す棒グラフである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、1.0μMのAβに起因する神経毒性の存在下での、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の、ATPへの作用を示す棒グラフである。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、10.0μMのAβに起因する神経毒性の存在下での、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）および誘導体の、ATPへの作用を示す棒グラフである。
【図１４】図１４は、Aβ単独で存在する場合と、Aβ + SP233 30μM が存在する場合と、Aβ + SP233 50μM が存在する場合での、細胞によるトリパンブルーの吸収を示す折れ線グラフである。
【図１５】図１５は、ラットPC12神経細胞上での0.1μM、1.0μM、および10.0μMのAβに起因する神経毒性に対して、SP233の漸加する濃度群を与えたときの作用を示す折れ線グラフである。
【図１６】図１６は、MA-10ライディッヒ細胞のステロイド形成への、SP233の作用を示す折れ線グラフである。
【図１７】図１７は、Aβ-SP結合および結合部位を、CPBBAを用いて確認した棒グラフである。
【図１８】図１８は、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）およびSP233の、 Aβ1-42 への結合エネルギーをとった回数を示す、コンピュータ上のドッキングシミュレーションである。
【図１９】図１９は、22R-ヒドロキシコレステロール（SP222）およびSP233が、 Aβ1-42 に結合する確率を示す、コンピュータ上のドッキングシミュレーションである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、細胞培地中で24時間インキュベートした後に、SP233の漸加する濃度群（1μM、10μM、100μM）を与えたときの、Aβ重合とADDL形成とのイムノブロット分析である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、図２０Ａのイムノブロット分析によって確認されたAβモノマーを示す棒グラフである。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、図２０Ａのイムノブロット分析によって確認されたAβトリマーを示す棒グラフである。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、図２０Ａのイムノブロット分析によって確認されたAβテトラマーを示す棒グラフである。
【図２０Ｅ】図２０Ｅは、図２０Ａのイムノブロット分析におけるAβポリマーおよびADDL（トリマーとテトラマーの合計）の形成を示す折れ線グラフである。
【図２０Ｆ】図２０Ｆは、細胞培地中で72時間インキュベートした後に、SP233の漸加する濃度群（1μM、10μM、100μM）を与えたときの、Aβ重合とADDL形成とのイムノブロット分析である。
【図２０Ｇ】図２０Ｇは、図２０Ｆのイムノブロット分析によって確認されたAβトリマーを示す棒グラフである。
【図２０Ｈ】図２０Ｈは、図２０Ｆのイムノブロット分析によって確認されたAβテトラマーを示す棒グラフである。
【図２０Ｉ】図２０Ｉは、図２０Ｆのイムノブロット分析によって確認されたAβテトラマーを示す棒グラフである。
【図２０Ｊ】図２０Ｊは、図２０Ｆのイムノブロット分析におけるAβポリマーおよびADDL（トリマーとテトラマーの合計）の形成を示す折れ線グラフである。
【図２１Ａ】22R-ヒドロキシコレステロールの、NT2細胞の分化への影響。上側のパネル（ａ〜ｄ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化（下のパネル、但し（ａ）は対照群である）を、処理していない対照細胞群（上のパネル）と比較して示した位相コントラスト顕微鏡写真。下側のパネル（ｅ〜ｈ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したことに応じた、NT2細胞の神経細胞表現型（NT2N）への分化を、処理していない対照細胞群と比較して示したフローサイトメトリー（流動細胞計測）分析。
【図２１Ｂ】22R-ヒドロキシコレステロールの、NT2細胞の分化への影響。上側のパネル（ａ〜ｄ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化（下のパネル、但し（ａ）は対照群である）を、処理していない対照細胞群（上のパネル）と比較して示した位相コントラスト顕微鏡写真。下側のパネル（ｅ〜ｈ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したことに応じた、NT2細胞の神経細胞表現型（NT2N）への分化を、処理していない対照細胞群と比較して示したフローサイトメトリー（流動細胞計測）分析。
【図２１Ｃ】22R-ヒドロキシコレステロールの、NT2細胞の分化への影響。上側のパネル（ａ〜ｄ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化（下のパネル、但し（ａ）は対照群である）を、処理していない対照細胞群（上のパネル）と比較して示した位相コントラスト顕微鏡写真。下側のパネル（ｅ〜ｈ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したことに応じた、NT2細胞の神経細胞表現型（NT2N）への分化を、処理していない対照細胞群と比較して示したフローサイトメトリー（流動細胞計測）分析。
【図２１Ｄ】22R-ヒドロキシコレステロールの、NT2細胞の分化への影響。上側のパネル（ａ〜ｄ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化（下のパネル、但し（ａ）は対照群である）を、処理していない対照細胞群（上のパネル）と比較して示した位相コントラスト顕微鏡写真。下側のパネル（ｅ〜ｈ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したことに応じた、NT2細胞の神経細胞表現型（NT2N）への分化を、処理していない対照細胞群と比較して示したフローサイトメトリー（流動細胞計測）分析。
【図２１Ｅ】22R-ヒドロキシコレステロールの、NT2細胞の分化への影響。上側のパネル（ａ〜ｄ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化（下のパネル、但し（ａ）は対照群である）を、処理していない対照細胞群（上のパネル）と比較して示した位相コントラスト顕微鏡写真。下側のパネル（ｅ〜ｈ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したことに応じた、NT2細胞の神経細胞表現型（NT2N）への分化を、処理していない対照細胞群と比較して示したフローサイトメトリー（流動細胞計測）分析。
【図２１Ｆ】22R-ヒドロキシコレステロールの、NT2細胞の分化への影響。上側のパネル（ａ〜ｄ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化（下のパネル、但し（ａ）は対照群である）を、処理していない対照細胞群（上のパネル）と比較して示した位相コントラスト顕微鏡写真。下側のパネル（ｅ〜ｈ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したことに応じた、NT2細胞の神経細胞表現型（NT2N）への分化を、処理していない対照細胞群と比較して示したフローサイトメトリー（流動細胞計測）分析。
【図２１Ｇ】22R-ヒドロキシコレステロールの、NT2細胞の分化への影響。上側のパネル（ａ〜ｄ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化（下のパネル、但し（ａ）は対照群である）を、処理していない対照細胞群（上のパネル）と比較して示した位相コントラスト顕微鏡写真。下側のパネル（ｅ〜ｈ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したことに応じた、NT2細胞の神経細胞表現型（NT2N）への分化を、処理していない対照細胞群と比較して示したフローサイトメトリー（流動細胞計測）分析。
【図２１Ｈ】22R-ヒドロキシコレステロールの、NT2細胞の分化への影響。上側のパネル（ａ〜ｄ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化（下のパネル、但し（ａ）は対照群である）を、処理していない対照細胞群（上のパネル）と比較して示した位相コントラスト顕微鏡写真。下側のパネル（ｅ〜ｈ）：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで、3日間、6日間、および12日間に亘って処理したことに応じた、NT2細胞の神経細胞表現型（NT2N）への分化を、処理していない対照細胞群と比較して示したフローサイトメトリー（流動細胞計測）分析。
【図２２Ａ】NT2細胞の分化、生存度、および増殖へのステロイド類の作用。位相コントラスト顕微鏡写真： （ａ） 25μM 22S-ヒドロキシコレステロール（中段のパネル）もしくは25μM 22R-ヒドロキシコレステロール（下段のパネル）で6日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化を、処理しない対照群（上段のパネル）と比較したもの。 （ｂ） 25μM コレステロール（上から二番目のパネル）、もしくは25μM プロゲステロン（下から二番目のパネル）、もしくは25μM DHEA（下のパネル）で6日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化を、処理しない対照群（上のパネル）と比較したもの。（ｃ） 22R-ヒドロキシコレステロール、22S-ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、もしくはプロゲステロンでの3日間に亘る処理の、NT2細胞の生存度および増殖への作用効果の分析。LDH（上段のパネル）、MTT（中段のパネル）、BrdU（下段のパネル）を用いた。有意さ：未処理のもの（対照群）の値と比較して、 *p<0.05 、 **p<0.01 、および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表値である。
【図２２Ｂ】NT2細胞の分化、生存度、および増殖へのステロイド類の作用。位相コントラスト顕微鏡写真： （ａ） 25μM 22S-ヒドロキシコレステロール（中段のパネル）もしくは25μM 22R-ヒドロキシコレステロール（下段のパネル）で6日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化を、処理しない対照群（上段のパネル）と比較したもの。 （ｂ） 25μM コレステロール（上から二番目のパネル）、もしくは25μM プロゲステロン（下から二番目のパネル）、もしくは25μM DHEA（下のパネル）で6日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化を、処理しない対照群（上のパネル）と比較したもの。（ｃ） 22R-ヒドロキシコレステロール、22S-ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、もしくはプロゲステロンでの3日間に亘る処理の、NT2細胞の生存度および増殖への作用効果の分析。LDH（上段のパネル）、MTT（中段のパネル）、BrdU（下段のパネル）を用いた。有意さ：未処理のもの（対照群）の値と比較して、 *p<0.05 、 **p<0.01 、および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表値である。
【図２２Ｃ】NT2細胞の分化、生存度、および増殖へのステロイド類の作用。位相コントラスト顕微鏡写真： （ａ） 25μM 22S-ヒドロキシコレステロール（中段のパネル）もしくは25μM 22R-ヒドロキシコレステロール（下段のパネル）で6日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化を、処理しない対照群（上段のパネル）と比較したもの。 （ｂ） 25μM コレステロール（上から二番目のパネル）、もしくは25μM プロゲステロン（下から二番目のパネル）、もしくは25μM DHEA（下のパネル）で6日間に亘って処理したNT2細胞の形態学的変化を、処理しない対照群（上のパネル）と比較したもの。（ｃ） 22R-ヒドロキシコレステロール、22S-ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、もしくはプロゲステロンでの3日間に亘る処理の、NT2細胞の生存度および増殖への作用効果の分析。LDH（上段のパネル）、MTT（中段のパネル）、BrdU（下段のパネル）を用いた。有意さ：未処理のもの（対照群）の値と比較して、 *p<0.05 、 **p<0.01 、および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表値である。
【図２３Ａ】NT2細胞による神経細糸（神経フィラメント）蛋白質の発現への、22R-ヒドロキシコレステロール処理の作用効果。上側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理したNT2細胞中での、神経細糸蛋白質であるNF70（ａ）、NF145（ｂ）、およびNF200（ｃ）の発現を、処理していない対照群と比較して示した、免疫細胞化学的染色法。結果として、四回の独立した実験の代表を示している。倍率：40倍。下側のパネル：6日間に亘り22R-ヒドロキシコレステロールの漸加する濃度群を与えて処理を行ったNT2細胞中での、NF70（ｄ）、NF145（ｅ）、およびNF200（ｆ）を、処理していない対照群と比較して示した、イムノブロット分析（特異的抗血清を使用）および定量的画像解析。GAPDH（グリセルアルデヒド-3-燐酸脱水素酵素）を使って、担持蛋白質の量を規格化した。有意さ：未処理の対照群と比較して、 **p<0.01 および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表値である。
【図２３Ｂ】NT2細胞による神経細糸（神経フィラメント）蛋白質の発現への、22R-ヒドロキシコレステロール処理の作用効果。上側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理したNT2細胞中での、神経細糸蛋白質であるNF70（ａ）、NF145（ｂ）、およびNF200（ｃ）の発現を、処理していない対照群と比較して示した、免疫細胞化学的染色法。結果として、四回の独立した実験の代表を示している。倍率：40倍。下側のパネル：6日間に亘り22R-ヒドロキシコレステロールの漸加する濃度群を与えて処理を行ったNT2細胞中での、NF70（ｄ）、NF145（ｅ）、およびNF200（ｆ）を、処理していない対照群と比較して示した、イムノブロット分析（特異的抗血清を使用）および定量的画像解析。GAPDH（グリセルアルデヒド-3-燐酸脱水素酵素）を使って、担持蛋白質の量を規格化した。有意さ：未処理の対照群と比較して、 **p<0.01 および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表値である。
【図２３Ｃ】NT2細胞による神経細糸（神経フィラメント）蛋白質の発現への、22R-ヒドロキシコレステロール処理の作用効果。上側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理したNT2細胞中での、神経細糸蛋白質であるNF70（ａ）、NF145（ｂ）、およびNF200（ｃ）の発現を、処理していない対照群と比較して示した、免疫細胞化学的染色法。結果として、四回の独立した実験の代表を示している。倍率：40倍。下側のパネル：6日間に亘り22R-ヒドロキシコレステロールの漸加する濃度群を与えて処理を行ったNT2細胞中での、NF70（ｄ）、NF145（ｅ）、およびNF200（ｆ）を、処理していない対照群と比較して示した、イムノブロット分析（特異的抗血清を使用）および定量的画像解析。GAPDH（グリセルアルデヒド-3-燐酸脱水素酵素）を使って、担持蛋白質の量を規格化した。有意さ：未処理の対照群と比較して、 **p<0.01 および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表値である。
【図２３Ｄ】NT2細胞による神経細糸（神経フィラメント）蛋白質の発現への、22R-ヒドロキシコレステロール処理の作用効果。上側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理したNT2細胞中での、神経細糸蛋白質であるNF70（ａ）、NF145（ｂ）、およびNF200（ｃ）の発現を、処理していない対照群と比較して示した、免疫細胞化学的染色法。結果として、四回の独立した実験の代表を示している。倍率：40倍。下側のパネル：6日間に亘り22R-ヒドロキシコレステロールの漸加する濃度群を与えて処理を行ったNT2細胞中での、NF70（ｄ）、NF145（ｅ）、およびNF200（ｆ）を、処理していない対照群と比較して示した、イムノブロット分析（特異的抗血清を使用）および定量的画像解析。GAPDH（グリセルアルデヒド-3-燐酸脱水素酵素）を使って、担持蛋白質の量を規格化した。有意さ：未処理の対照群と比較して、 **p<0.01 および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表値である。
【図２３Ｅ】NT2細胞による神経細糸（神経フィラメント）蛋白質の発現への、22R-ヒドロキシコレステロール処理の作用効果。上側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理したNT2細胞中での、神経細糸蛋白質であるNF70（ａ）、NF145（ｂ）、およびNF200（ｃ）の発現を、処理していない対照群と比較して示した、免疫細胞化学的染色法。結果として、四回の独立した実験の代表を示している。倍率：40倍。下側のパネル：6日間に亘り22R-ヒドロキシコレステロールの漸加する濃度群を与えて処理を行ったNT2細胞中での、NF70（ｄ）、NF145（ｅ）、およびNF200（ｆ）を、処理していない対照群と比較して示した、イムノブロット分析（特異的抗血清を使用）および定量的画像解析。GAPDH（グリセルアルデヒド-3-燐酸脱水素酵素）を使って、担持蛋白質の量を規格化した。有意さ：未処理の対照群と比較して、 **p<0.01 および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表値である。
【図２３Ｆ】NT2細胞による神経細糸（神経フィラメント）蛋白質の発現への、22R-ヒドロキシコレステロール処理の作用効果。上側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理したNT2細胞中での、神経細糸蛋白質であるNF70（ａ）、NF145（ｂ）、およびNF200（ｃ）の発現を、処理していない対照群と比較して示した、免疫細胞化学的染色法。結果として、四回の独立した実験の代表を示している。倍率：40倍。下側のパネル：6日間に亘り22R-ヒドロキシコレステロールの漸加する濃度群を与えて処理を行ったNT2細胞中での、NF70（ｄ）、NF145（ｅ）、およびNF200（ｆ）を、処理していない対照群と比較して示した、イムノブロット分析（特異的抗血清を使用）および定量的画像解析。GAPDH（グリセルアルデヒド-3-燐酸脱水素酵素）を使って、担持蛋白質の量を規格化した。有意さ：未処理の対照群と比較して、 **p<0.01 および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表である。
【図２４Ａ】22R-ヒドロキシコレステロールに起因するNT2細胞の分化についての、可能性がある機構。 （ａ〜ｃ） NT2細胞中でのGFRα受容体蛋白質の発現への、22R-ヒドロキシコレステロールの作用。上側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理した後のNT2細胞中での、GFRα1 （ａ） 、GFRα2 （ｂ） 、およびGFRα3 （ｃ） の発現を、対照群と比較して示した、免疫細胞化学的染色法。示した結果は、四回の独立した実験の代表である（倍率：40倍）。下側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理した後のNT2細胞中での、GFRα1（ａ） 、GFRα2 （ｂ） 、およびGFRα3 （ｃ） を、対照群と比較して示した、イムノブロット分析（特異的抗血清を使用）および定量的画像解析。GAPDHを使って、担持蛋白質の量を規格化した。 （ｄ） NT2細胞の神経細胞表現型（NT2N）への分化の際の 3H-22R-ヒドロキシコレステロールの吸収（上側のパネル）と、 3H-22R-ヒドロキシコレステロールとNT2N細胞蛋白質との相互作用（下側のパネル）。有意さ： 未処理の対照群と比較して、*p<0.05 および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表値である。
【図２４Ｂ】22R-ヒドロキシコレステロールに起因するNT2細胞の分化についての、可能性がある機構。 （ａ〜ｃ） NT2細胞中でのGFRα受容体蛋白質の発現への、22R-ヒドロキシコレステロールの作用。上側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理した後のNT2細胞中での、GFRα1 （ａ） 、GFRα2 （ｂ） 、およびGFRα3 （ｃ） の発現を、対照群と比較して示した、免疫細胞化学的染色法。示した結果は、四回の独立した実験の代表である（倍率：40倍）。下側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理した後のNT2細胞中での、GFRα1（ａ） 、GFRα2 （ｂ） 、およびGFRα3 （ｃ） を、対照群と比較して示した、イムノブロット分析（特異的抗血清を使用）および定量的画像解析。GAPDHを使って、担持蛋白質の量を規格化した。 （ｄ） NT2細胞の神経細胞表現型（NT2N）への分化の際の 3H-22R-ヒドロキシコレステロールの吸収（上側のパネル）と、 3H-22R-ヒドロキシコレステロールとNT2N細胞蛋白質との相互作用（下側のパネル）。有意さ： 未処理の対照群と比較して、*p<0.05 および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表値である。
【図２４Ｃ】22R-ヒドロキシコレステロールに起因するNT2細胞の分化についての、可能性がある機構。 （ａ〜ｃ） NT2細胞中でのGFRα受容体蛋白質の発現への、22R-ヒドロキシコレステロールの作用。上側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理した後のNT2細胞中での、GFRα1 （ａ） 、GFRα2 （ｂ） 、およびGFRα3 （ｃ） の発現を、対照群と比較して示した、免疫細胞化学的染色法。示した結果は、四回の独立した実験の代表である（倍率：40倍）。下側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理した後のNT2細胞中での、GFRα1（ａ） 、GFRα2 （ｂ） 、およびGFRα3 （ｃ） を、対照群と比較して示した、イムノブロット分析（特異的抗血清を使用）および定量的画像解析。GAPDHを使って、担持蛋白質の量を規格化した。 （ｄ） NT2細胞の神経細胞表現型（NT2N）への分化の際の 3H-22R-ヒドロキシコレステロールの吸収（上側のパネル）と、 3H-22R-ヒドロキシコレステロールとNT2N細胞蛋白質との相互作用（下側のパネル）。有意さ： 未処理の対照群と比較して、*p<0.05 および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表値である。
【図２４Ｄ】22R-ヒドロキシコレステロールに起因するNT2細胞の分化についての、可能性がある機構。 （ａ〜ｃ） NT2細胞中でのGFRα受容体蛋白質の発現への、22R-ヒドロキシコレステロールの作用。上側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理した後のNT2細胞中での、GFRα1 （ａ） 、GFRα2 （ｂ） 、およびGFRα3 （ｃ） の発現を、対照群と比較して示した、免疫細胞化学的染色法。示した結果は、四回の独立した実験の代表である（倍率：40倍）。下側のパネル：25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで6日間に亘り処理した後のNT2細胞中での、GFRα1（ａ） 、GFRα2 （ｂ） 、およびGFRα3 （ｃ） を、対照群と比較して示した、イムノブロット分析（特異的抗血清を使用）および定量的画像解析。GAPDHを使って、担持蛋白質の量を規格化した。 （ｄ） NT2細胞の神経細胞表現型（NT2N）への分化の際の 3H-22R-ヒドロキシコレステロールの吸収（上側のパネル）と、 3H-22R-ヒドロキシコレステロールとNT2N細胞蛋白質との相互作用（下側のパネル）。有意さ： 未処理の対照群と比較して、*p<0.05 および ***p<0.001 。示した結果は、三回の独立した実験の代表値である。
【図２５Ａ】マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細胞を、直径13mmのカバーガラス片上で培養した。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。こうした実験条件下で、三種の細胞において有意な新芽形成が見られ（パネル1B、D、F）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（パネルD）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。
【図２５Ｂ】マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細胞を、直径13mmのカバーガラス片上で培養した。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。こうした実験条件下で、三種の細胞において有意な新芽形成が見られ（パネル1B、D、F）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（パネルD）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。
【図２５Ｃ】マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細胞を、直径13mmのカバーガラス片上で培養した。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。こうした実験条件下で、三種の細胞において有意な新芽形成が見られ（パネル1B、D、F）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（パネルD）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。
【図２５Ｄ】マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細胞を、直径13mmのカバーガラス片上で培養した。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。こうした実験条件下で、三種の細胞において有意な新芽形成が見られ（パネル1B、D、F）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（パネルD）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。
【図２５Ｅ】マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細胞を、直径13mmのカバーガラス片上で培養した。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。こうした実験条件下で、三種の細胞において有意な新芽形成が見られ（パネル1B、D、F）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（パネルD）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。
【図２５Ｆ】マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細胞を、直径13mmのカバーガラス片上で培養した。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。こうした実験条件下で、三種の細胞において有意な新芽形成が見られ（パネル1B、D、F）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（パネルD）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。
【図２６Ａ】対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジンを除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルA）、シナプトフィジン（パネルB）、MAP2（パネルC）、およびChAT（パネルD））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルE）。さらにパネルAでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【図２６Ｂ】対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジンを除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルA）、シナプトフィジン（パネルB）、MAP2（パネルC）、およびChAT（パネルD））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルE）。さらにパネルAでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【図２６Ｃ】対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジンを除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルA）、シナプトフィジン（パネルB）、MAP2（パネルC）、およびChAT（パネルD））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルE）。さらにパネルAでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【図２６Ｄ】対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジンを除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルA）、シナプトフィジン（パネルB）、MAP2（パネルC）、およびChAT（パネルD））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルE）。さらにパネルAでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【図２６Ｅ】対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジンを除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルA）、シナプトフィジン（パネルB）、MAP2（パネルC）、およびChAT（パネルD））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルE）。さらにパネルAでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【図２６Ｆ】対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジンを除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルA）、シナプトフィジン（パネルB）、MAP2（パネルC）、およびChAT（パネルD））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルE）。さらにパネルAでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【図２６Ｇ】対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジンを除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルA）、シナプトフィジン（パネルB）、MAP2（パネルC）、およびChAT（パネルD））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルE）。さらにパネルAでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【図２６Ｈ】対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジンを除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルA）、シナプトフィジン（パネルB）、MAP2（パネルC）、およびChAT（パネルD））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルE）。さらにパネルAでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【図２６Ｉ】対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジンを除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルA）、シナプトフィジン（パネルB）、MAP2（パネルC）、およびChAT（パネルD））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルE）。さらにパネルAでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【図２６Ｊ】対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジンを除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルA）、シナプトフィジン（パネルB）、MAP2（パネルC）、およびChAT（パネルD））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルE）。さらにパネルAでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【図２７Ａ】P19細胞を、2日間処理してから、30日間に亘って洗い流しを行い、その後に神経細胞標識形質を免疫標識した。軸索と樹状突起から成る網状構造が劇的に伸長したことが、βIIIチュブリン染色から示された（パネルA）。シナプトフィジン標識（パネルB）の重みから、新たに形成されたニューロンがシナプス接合を確立したことが示された。
【図２７Ｂ】P19細胞を、2日間処理してから、30日間に亘って洗い流しを行い、その後に神経細胞標識形質を免疫標識した。軸索と樹状突起から成る網状構造が劇的に伸長したことが、βIIIチュブリン染色から示された（パネルA）。シナプトフィジン標識（パネルB）の重みから、新たに形成されたニューロンがシナプス接合を確立したことが示された。
【図２８Ａ】神経膠細胞標識形質（glial markers）であるGFAPおよびCNPaseの発現。この発現は、SP224がP19細胞の星状細胞および寡突起神経膠細胞への分化を起こさせる能力を反映したものであって、こうした能力については分化過程の最終的な特異性を解析する目的で研究が重ねられている。90μMSP-224を2日間与えてからSP-224を含まない培地で5日間の培養を行うというプロトコールを用いたところ、SP-224も、P19細胞の寡突起神経膠細胞への分化を引き起こしたが（パネルB）、陽性のGFAPシグナルは検出されなかった（パネルD）。GFAPとCNPaseのどちらの標識形質も、対照P19細胞群では発現しなかった。
【図２８Ｂ】神経膠細胞標識形質（glial markers）であるGFAPおよびCNPaseの発現。この発現は、SP224がP19細胞の星状細胞および寡突起神経膠細胞への分化を起こさせる能力を反映したものであって、こうした能力については分化過程の最終的な特異性を解析する目的で研究が重ねられている。90μMSP-224を2日間与えてからSP-224を含まない培地で5日間の培養を行うというプロトコールを用いたところ、SP-224も、P19細胞の寡突起神経膠細胞への分化を引き起こしたが（パネルB）、陽性のGFAPシグナルは検出されなかった（パネルD）。GFAPとCNPaseのどちらの標識形質も、対照P19細胞群では発現しなかった。
【図２８Ｃ】神経膠細胞標識形質（glial markers）であるGFAPおよびCNPaseの発現。この発現は、SP224がP19細胞の星状細胞および寡突起神経膠細胞への分化を起こさせる能力を反映したものであって、こうした能力については分化過程の最終的な特異性を解析する目的で研究が重ねられている。90μMSP-224を2日間与えてからSP-224を含まない培地で5日間の培養を行うというプロトコールを用いたところ、SP-224も、P19細胞の寡突起神経膠細胞への分化を引き起こしたが（パネルB）、陽性のGFAPシグナルは検出されなかった（パネルD）。GFAPとCNPaseのどちらの標識形質も、対照P19細胞群では発現しなかった。
【図２８Ｄ】神経膠細胞標識形質（glial markers）であるGFAPおよびCNPaseの発現。この発現は、SP224がP19細胞の星状細胞および寡突起神経膠細胞への分化を起こさせる能力を反映したものであって、こうした能力については分化過程の最終的な特異性を解析する目的で研究が重ねられている。90μMSP-224を2日間与えてからSP-224を含まない培地で5日間の培養を行うというプロトコールを用いたところ、SP-224も、P19細胞の寡突起神経膠細胞への分化を引き起こしたが（パネルB）、陽性のGFAPシグナルは検出されなかった（パネルD）。GFAPとCNPaseのどちらの標識形質も、対照P19細胞群では発現しなかった。
【図２９Ａ】体重300〜325gの雄のLong-Evansラットに、滲透圧マイクロポンプを移殖し、その出口を座標 D = 3.4mm, L = 1.4mm, AP = 0.92mm（尾側からブレグマへの方向）に従って左脳室に埋め込んだ。滲透圧ポンプのタンクは、ラットの背中の肩甲骨中央部の皮下内腔に埋め込んだ。SP-224を375μMでポリプロピレングリコール／グリセロール／蒸留水（50/25/25）に溶かし、i.c.v.経路を使って2週間に亘り1時間毎に5μlで灌流した。ラットは脳注入が完了してから3週間後に殺した。免疫組織化学法によって、SP-224がSVZ中の神経幹細胞の自己更新（self-renewal）を起こすことができるということを示す、統計的重みを有するBrdU領域（パネルC〜G）が明らかとなった。加えてさらに、BrdU陽性の細胞のいくつかが、SVZから充分に離れた位置（白矢印）で検出され、このことからは、いくつかの細胞が既に遊走過程に入っていた可能性が示唆される。また、SP-224の注入によって、SVZ細胞中に、神経細胞の早期標識形質であるDCXの発現も誘発されており、このことからは、invitroと同様に、SP-224が、この領域に在る神経幹細胞を神経細胞へと分化するように促すことができる（パネルD〜H）ということが示された。
【図２９Ｂ】体重300〜325gの雄のLong-Evansラットに、滲透圧マイクロポンプを移殖し、その出口を座標 D = 3.4mm, L = 1.4mm, AP = 0.92mm（尾側からブレグマへの方向）に従って左脳室に埋め込んだ。滲透圧ポンプのタンクは、ラットの背中の肩甲骨中央部の皮下内腔に埋め込んだ。SP-224を375μMでポリプロピレングリコール／グリセロール／蒸留水（50/25/25）に溶かし、i.c.v.経路を使って2週間に亘り1時間毎に5μlで灌流した。ラットは脳注入が完了してから3週間後に殺した。免疫組織化学法によって、SP-224がSVZ中の神経幹細胞の自己更新（self-renewal）を起こすことができるということを示す、統計的重みを有するBrdU領域（パネルC〜G）が明らかとなった。加えてさらに、BrdU陽性の細胞のいくつかが、SVZから充分に離れた位置（白矢印）で検出され、このことからは、いくつかの細胞が既に遊走過程に入っていた可能性が示唆される。また、SP-224の注入によって、SVZ細胞中に、神経細胞の早期標識形質であるDCXの発現も誘発されており、このことからは、invitroと同様に、SP-224が、この領域に在る神経幹細胞を神経細胞へと分化するように促すことができる（パネルD〜H）ということが示された。
【図２９Ｃ】体重300〜325gの雄のLong-Evansラットに、滲透圧マイクロポンプを移殖し、その出口を座標 D = 3.4mm, L = 1.4mm, AP = 0.92mm（尾側からブレグマへの方向）に従って左脳室に埋め込んだ。滲透圧ポンプのタンクは、ラットの背中の肩甲骨中央部の皮下内腔に埋め込んだ。SP-224を375μMでポリプロピレングリコール／グリセロール／蒸留水（50/25/25）に溶かし、i.c.v.経路を使って2週間に亘り1時間毎に5μlで灌流した。ラットは脳注入が完了してから3週間後に殺した。免疫組織化学法によって、SP-224がSVZ中の神経幹細胞の自己更新（self-renewal）を起こすことができるということを示す、統計的重みを有するBrdU領域（パネルC〜G）が明らかとなった。加えてさらに、BrdU陽性の細胞のいくつかが、SVZから充分に離れた位置（白矢印）で検出され、このことからは、いくつかの細胞が既に遊走過程に入っていた可能性が示唆される。また、SP-224の注入によって、SVZ細胞中に、神経細胞の早期標識形質であるDCXの発現も誘発されており、このことからは、invitroと同様に、SP-224が、この領域に在る神経幹細胞を神経細胞へと分化するように促すことができる（パネルD〜H）ということが示された。
【図２９Ｄ】体重300〜325gの雄のLong-Evansラットに、滲透圧マイクロポンプを移殖し、その出口を座標 D = 3.4mm, L = 1.4mm, AP = 0.92mm（尾側からブレグマへの方向）に従って左脳室に埋め込んだ。滲透圧ポンプのタンクは、ラットの背中の肩甲骨中央部の皮下内腔に埋め込んだ。SP-224を375μMでポリプロピレングリコール／グリセロール／蒸留水（50/25/25）に溶かし、i.c.v.経路を使って2週間に亘り1時間毎に5μlで灌流した。ラットは脳注入が完了してから3週間後に殺した。免疫組織化学法によって、SP-224がSVZ中の神経幹細胞の自己更新（self-renewal）を起こすことができるということを示す、統計的重みを有するBrdU領域（パネルC〜G）が明らかとなった。加えてさらに、BrdU陽性の細胞のいくつかが、SVZから充分に離れた位置（白矢印）で検出され、このことからは、いくつかの細胞が既に遊走過程に入っていた可能性が示唆される。また、SP-224の注入によって、SVZ細胞中に、神経細胞の早期標識形質であるDCXの発現も誘発されており、このことからは、invitroと同様に、SP-224が、この領域に在る神経幹細胞を神経細胞へと分化するように促すことができる（パネルD〜H）ということが示された。
【図２９Ｅ】体重300〜325gの雄のLong-Evansラットに、滲透圧マイクロポンプを移殖し、その出口を座標 D = 3.4mm, L = 1.4mm, AP = 0.92mm（尾側からブレグマへの方向）に従って左脳室に埋め込んだ。滲透圧ポンプのタンクは、ラットの背中の肩甲骨中央部の皮下内腔に埋め込んだ。SP-224を375μMでポリプロピレングリコール／グリセロール／蒸留水（50/25/25）に溶かし、i.c.v.経路を使って2週間に亘り1時間毎に5μlで灌流した。ラットは脳注入が完了してから3週間後に殺した。免疫組織化学法によって、SP-224がSVZ中の神経幹細胞の自己更新（self-renewal）を起こすことができるということを示す、統計的重みを有するBrdU領域（パネルC〜G）が明らかとなった。加えてさらに、BrdU陽性の細胞のいくつかが、SVZから充分に離れた位置（白矢印）で検出され、このことからは、いくつかの細胞が既に遊走過程に入っていた可能性が示唆される。また、SP-224の注入によって、SVZ細胞中に、神経細胞の早期標識形質であるDCXの発現も誘発されており、このことからは、in vitroと同様に、SP-224が、この領域に在る神経幹細胞を神経細胞へと分化するように促すことができる（パネルD〜H）ということが示された。
【図２９Ｆ】体重300〜325gの雄のLong-Evansラットに、滲透圧マイクロポンプを移殖し、その出口を座標 D = 3.4mm, L = 1.4mm, AP = 0.92mm（尾側からブレグマへの方向）に従って左脳室に埋め込んだ。滲透圧ポンプのタンクは、ラットの背中の肩甲骨中央部の皮下内腔に埋め込んだ。SP-224を375μMでポリプロピレングリコール／グリセロール／蒸留水（50/25/25）に溶かし、i.c.v.経路を使って2週間に亘り1時間毎に5μlで灌流した。ラットは脳注入が完了してから3週間後に殺した。免疫組織化学法によって、SP-224がSVZ中の神経幹細胞の自己更新（self-renewal）を起こすことができるということを示す、統計的重みを有するBrdU領域（パネルC〜G）が明らかとなった。加えてさらに、BrdU陽性の細胞のいくつかが、SVZから充分に離れた位置（白矢印）で検出され、このことからは、いくつかの細胞が既に遊走過程に入っていた可能性が示唆される。また、SP-224の注入によって、SVZ細胞中に、神経細胞の早期標識形質であるDCXの発現も誘発されており、このことからは、invitroと同様に、SP-224が、この領域に在る神経幹細胞を神経細胞へと分化するように促すことができる（パネルD〜H）ということが示された。
【図２９Ｇ】体重300〜325gの雄のLong-Evansラットに、滲透圧マイクロポンプを移殖し、その出口を座標 D = 3.4mm, L = 1.4mm, AP = 0.92mm（尾側からブレグマへの方向）に従って左脳室に埋め込んだ。滲透圧ポンプのタンクは、ラットの背中の肩甲骨中央部の皮下内腔に埋め込んだ。SP-224を375μMでポリプロピレングリコール／グリセロール／蒸留水（50/25/25）に溶かし、i.c.v.経路を使って2週間に亘り1時間毎に5μlで灌流した。ラットは脳注入が完了してから3週間後に殺した。免疫組織化学法によって、SP-224がSVZ中の神経幹細胞の自己更新（self-renewal）を起こすことができるということを示す、統計的重みを有するBrdU領域（パネルC〜G）が明らかとなった。加えてさらに、BrdU陽性の細胞のいくつかが、SVZから充分に離れた位置（白矢印）で検出され、このことからは、いくつかの細胞が既に遊走過程に入っていた可能性が示唆される。また、SP-224の注入によって、SVZ細胞中に、神経細胞の早期標識形質であるDCXの発現も誘発されており、このことからは、invitroと同様に、SP-224が、この領域に在る神経幹細胞を神経細胞へと分化するように促すことができる（パネルD〜H）ということが示された。
【図２９Ｈ】体重300〜325gの雄のLong-Evansラットに、滲透圧マイクロポンプを移殖し、その出口を座標 D = 3.4mm, L = 1.4mm, AP = 0.92mm（尾側からブレグマへの方向）に従って左脳室に埋め込んだ。滲透圧ポンプのタンクは、ラットの背中の肩甲骨中央部の皮下内腔に埋め込んだ。SP-224を375μMでポリプロピレングリコール／グリセロール／蒸留水（50/25/25）に溶かし、i.c.v.経路を使って2週間に亘り1時間毎に5μlで灌流した。ラットは脳注入が完了してから3週間後に殺した。免疫組織化学法によって、SP-224がSVZ中の神経幹細胞の自己更新（self-renewal）を起こすことができるということを示す、統計的重みを有するBrdU領域（パネルC〜G）が明らかとなった。加えてさらに、BrdU陽性の細胞のいくつかが、SVZから充分に離れた位置（白矢印）で検出され、このことからは、いくつかの細胞が既に遊走過程に入っていた可能性が示唆される。また、SP-224の注入によって、SVZ細胞中に、神経細胞の早期標識形質であるDCXの発現も誘発されており、このことからは、invitroと同様に、SP-224が、この領域に在る神経幹細胞を神経細胞へと分化するように促すことができる（パネルD〜H）ということが示された。
【図１】
2008516972.tif 000010
【図２】
2008516972.tif 000011
【図３Ａ】
2008516972.tif 000012
【図３Ｂ】
2008516972.tif 000013
【図３Ｃ】
2008516972.tif 000014
【図３Ｄ】
2008516972.tif 000015
【図３Ｅ】
2008516972.tif 000016
【図３Ｆ】
2008516972.tif 000017
【図４】
2008516972.tif 000018
【図５Ａ】
2008516972.tif 000019
【図５Ｂ】
2008516972.tif 000020
【図５Ｃ】
2008516972.tif 000021
【図５Ｄ】
2008516972.tif 000022
【図６Ａ】
2008516972.tif 000023
【図６Ｂ】
2008516972.tif 000024
【図７Ａ】
2008516972.tif 000025
【図７Ｂ】
2008516972.tif 000026
【図７Ｃ】
2008516972.tif 000027
【図７Ｄ】
2008516972.tif 000028
【図７Ｅ】
2008516972.tif 000029
【図７Ｆ】
2008516972.tif 000030
【図７Ｇ】
2008516972.tif 000031
【図７Ｈ】
2008516972.tif 000032
【図７Ｉ】
2008516972.tif 000033
【図８】
2008516972.tif 000034
【図９Ａ】
2008516972.tif 000035
【図９Ｂ】
2008516972.tif 000036
【図９Ｃ】
2008516972.tif 000037
【図９Ｄ】
2008516972.tif 000038
【図９Ｅ】
2008516972.tif 000039
【図９Ｆ】
2008516972.tif 000040
【図９Ｇ】
2008516972.tif 000041
【図９Ｈ】
2008516972.tif 000042
【図９Ｉ】
2008516972.tif 000043
【図９Ｊ】
2008516972.tif 000044
【図９Ｋ】
2008516972.tif 000045
【図９Ｌ】
2008516972.tif 000046
【図９Ｍ】
2008516972.tif 000047
【図９Ｎ】
2008516972.tif 000048
【図９Ｏ】
2008516972.tif 000049
【図９Ｐ】
2008516972.tif 000050
【図１０Ａ】
2008516972.tif 000051
【図１０Ｂ】
2008516972.tif 000052
【図１０Ｃ】
2008516972.tif 000053
【図１０Ｄ】
2008516972.tif 000054
【図１０Ｅ】
2008516972.tif 000055
【図１０Ｆ】
2008516972.tif 000056
【図１０Ｇ】
2008516972.tif 000057
【図１０Ｈ】
2008516972.tif 000058
【図１０Ｉ】
2008516972.tif 000059
【図１０Ｊ】
2008516972.tif 000060
【図１０Ｋ】
2008516972.tif 000061
【図１０Ｌ】
2008516972.tif 000062
【図１０Ｍ】
2008516972.tif 000063
【図１０Ｎ】
2008516972.tif 000064
【図１０Ｏ】
2008516972.tif 000065
【図１０Ｐ】
2008516972.tif 000066
【図１１Ａ】
2008516972.tif 000067
【図１１Ｂ】
2008516972.tif 000068
【図１１Ｃ】
2008516972.tif 000069
【図１１Ｄ】
2008516972.tif 000070
【図１１Ｅ】
2008516972.tif 000071
【図１１Ｆ】
2008516972.tif 000072
【図１１Ｇ】
2008516972.tif 000073
【図１１Ｈ】
2008516972.tif 000074
【図１１Ｉ】
2008516972.tif 000075
【図１１Ｊ】
2008516972.tif 000076
【図１１Ｋ】
2008516972.tif 000077
【図１１Ｌ】
2008516972.tif 000078
【図１１Ｍ】
2008516972.tif 000079
【図１１Ｎ】
2008516972.tif 000080
【図１１Ｏ】
2008516972.tif 000081
【図１１Ｐ】
2008516972.tif 000082
【図１２Ａ】
2008516972.tif 000083
【図１２Ｂ】
2008516972.tif 000084
【図１２Ｃ】
2008516972.tif 000085
【図１２Ｄ】
2008516972.tif 000086
【図１３Ａ】
2008516972.tif 000087
【図１３Ｂ】
2008516972.tif 000088
【図１３Ｃ】
2008516972.tif 000089
【図１３Ｄ】
2008516972.tif 000090
【図１４】
2008516972.tif 000091
【図１５】
2008516972.tif 000092
【図１６】
2008516972.tif 000093
【図１７】
2008516972.tif 000094
【図１８】
2008516972.tif 000095
【図１９】
2008516972.tif 000096
【図２０Ａ】
2008516972.tif 000097
【図２０Ｂ】
2008516972.tif 000098
【図２０Ｃ】
2008516972.tif 000099
【図２０Ｄ】
2008516972.tif 000100
【図２０Ｅ】
2008516972.tif 000101
【図２０Ｆ】
2008516972.tif 000102
【図２０Ｇ】
2008516972.tif 000103
【図２０Ｈ】
2008516972.tif 000104
【図２０】
2008516972.tif 000105
【図２１Ａ】
2008516972.tif 000106
【図２１Ｂ】
2008516972.tif 000107
【図２１Ｃ】
2008516972.tif 000108
【図２１Ｄ】
2008516972.tif 000109
【図２１Ｅ】
2008516972.tif 000110
【図２１Ｆ】
2008516972.tif 000111
【図２１Ｇ】
2008516972.tif 000112
【図２１Ｈ】
2008516972.tif 000113
【図２２Ａ】
2008516972.tif 000114
【図２２Ｂ】
2008516972.tif 000115
【図２２Ｃ】
2008516972.tif 000116
【図２３Ａ】
2008516972.tif 000117
【図２３Ｂ】
2008516972.tif 000118
【図２３Ｃ】
2008516972.tif 000119
【図２３Ｄ】
2008516972.tif 000120
【図２３Ｅ】
2008516972.tif 000121
【図２３Ｆ】
2008516972.tif 000122
【図２４Ａ】
2008516972.tif 000123
【図２４Ｂ】
2008516972.tif 000124
【図２４Ｃ】
2008516972.tif 000125
【図２４Ｄ】
2008516972.tif 000126
【図２５】
2008516972.tif 000127
【図２６Ａ】
2008516972.tif 000128
【図２６Ｂ】
2008516972.tif 000129
【図２６Ｃ】
2008516972.tif 000130
【図２６Ｄ】
2008516972.tif 000131
【図２６Ｅ】
2008516972.tif 000132
【図２６Ｆ】
2008516972.tif 000133
【図２６Ｇ】
2008516972.tif 000134
【図２６Ｈ】
2008516972.tif 000135
【図２６Ｉ】
2008516972.tif 000136
【図２６Ｊ】
2008516972.tif 000137
【図２７】
2008516972.tif 000138
【図２８Ａ】
2008516972.tif 000139
【図２８】
2008516972.tif 000140
【図２８Ｃ】
2008516972.tif 000141
【図２９Ａ】
2008516972.tif 000142
【図２９Ｂ】
2008516972.tif 000143
【図２９】
2008516972.tif 000144
【図２９Ｄ】
2008516972.tif 000145
【図２９Ｅ】
2008516972.tif 000146
【図２９Ｆ】
2008516972.tif 000147
【図２９Ｈ】
2008516972.tif 000148
【配列表】
2008516972000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月19日(2007.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の神経前駆細胞を神経細胞への分化を誘導する方法であって、
前記神経前駆細胞を、下記の構造式(I)の化合物
【化１】
2008516972.tif 000149
（ここで式中の、 R1 、 R2、 R4 、 R7 、 R11 、 R12 、 R15、および R16 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、硫酸基、または、任意に -NH- 、 -N((C1-C8)アルキル)- 、 -O- 、 -S- 、 -SO- 、 -SO2- 、 -O-SO2- 、 -SO2-O- 、 -C(O)- 、 -C(O)-O- 、 -O-C(O)- 、 -C(O)-NR'- 、もしくは -NR'-C(O)- を挿入した(C1-C8)アルキル基であって、ここで、R'は、Hもしくは(C1-C8)アルキル基であり、また、； R3 は、ヒドロキシ基、(C1-C6)アルキルCO2- 、 HO2C(CH2)2CO2- 、トルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、また、； R6 、 R8 、 R9、 R10 、 R13 、および R14 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシ基であり、また、； R17 が、 -CH(CH3)CH(OH)(CH2)2CH(CH3)2もしくは -CH(CH3)CH(OC(=O)CH3)(CH2)2CH(CH3)CH2N(C(=O)CH3)2である）か、あるいは薬学的に許容されるそれらの塩かの有効量と接触させるステップ
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
R1 、 R2 、 R4、 R6 、 R7 、 R8 、 R9 、 R11、 R12 、 R14 、および R15 が、Hであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
R16 が、Hもしくはアセトキシ基であることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、22R-ヒドロキシコレステロールもしくは酢酸=26-ジアセチルアミノ-(22ξ)-アセトキシ-(16ξ)-アセトキシ-コレスタ-5-エン-イルから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
哺乳類の神経前駆細胞を神経細胞への分化を誘導するための方法であって、
前記神経前駆細胞を、構造式(II)の化合物
【化２】
2008516972.tif 000150
（ここで式中の R1 、 R2、 R4 、 R7 、 R11 、 R12 、および R15のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C4)アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、硫酸基、または、任意に -NH- 、 -N((C1-C4)アルキル)- 、 -O- 、 -S- 、 -SO- 、 -SO2- 、 -O-SO2- 、 -SO2-O- 、 -C(O)- 、 -C(O)-O- 、 -O-C(O)- 、 -C(O)-NR'- 、もしくは -NR'-C(O)- を挿入した(C1-C6)アルキル基であって、ここで、R'は、Hもしくは(C1-C8)アルキル基であり、また、R3は、ヒドロキシ基、(C1-C6)アルキルCO2- 、 HO2C(CH2)2CO2- 、トルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、また、； R6 、 R8 、 R9 、 R10 、 R13、および R14 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C4)アルキル基、ヒドロキシル(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシ基であり、また、； R19 が、OH基もしくは(C1-C2)アルコキシ基であり、また、； R20が、3-(アセチルアミドメチル)ブチル基および／もしくはその構造異性体の基である）か、あるいは薬学的に許容されるそれらの塩かの有効量で処理するステップ
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項６】
R1 、 R2 、 R3、 R4 、 R6 、 R7 、 R8 、 R9、 R11 、 R12 、 R14 、および R15 が、Hであることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
R10 および R13 が、CH3基であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項８】
R19 がメトキシ基であることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
R3 が、アセトキシ基もしくはOH基であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、酢酸=(20ξ)-26-アセチルアミノ-(22ξ)-ヒドロキシフロスタ-5-エン-3ξ-イル、酢酸=(20ξ)-26-アセチルアミノ-(22ξ)-メトキシフロスタ-5-エン-3α-イル、および酢酸=(20ξ)-26-アセチルアミノ-(22ξ)-エトキシフロスタ-5-エン-3ξ-イルから成る群から選択されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
哺乳類の神経前駆細胞を神経細胞への分化を誘導するための方法であって、
前記神経前駆細胞を、構造式(III)の化合物
【化３】
2008516972.tif 000151
（ここで式中の R1 、 R2、 R4 、 R7 、 R11 、 R12 、および R15のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、硫酸基、または、任意に -NH- 、 -N((C1-C8)アルキル)- 、 -O- 、 -S- 、 -SO- 、 -SO2- 、 -O-SO2- 、 -SO2-O- 、 -C(O)- 、 -C(O)-O- 、 -O-C(O)- 、 -C(O)-NR'- 、もしくは -NR'-C(O)- を挿入した(C1-C8)アルキル基であって、ここで、R'は、Hもしくは(C1-C8)アルキル基であり、また、； R3は、ヒドロキシ基、(C1-C6)アルキルCO2- 、 HO2C(CH2)2CO2- 、トルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、また、； R6 、 R8 、 R9、 R10 、 R13 、および R14 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシ基であり、また、；Xが、O、N(H)、N(Ac)、N(トルエン-4-スルホニルオキシ)基である）か、あるいは薬学的に許容されるそれらの塩かの有効量に接触させるステップ
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１２】
R3 が、OH基もしくは(C1-C6)CO2- であることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
XがOであることを特徴とする、請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１４】
XがNHであることを特徴とする、請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１５】
R10 および R13が、CH3基であることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
R1 、 R2 、もしくは R12 が、OH基であることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
R1 、 R2 、 R4、 R6 、 R7 、 R8 、 R9 、 R11、 R12 、 R14 、および R15 が、Hであることを特徴とする、請求項１２、１３、もしくは１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、(20α)-25ξ-メチル-(22R,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3ξ-オール、(20ξ)-25ξ-メチル-N-アセチル-(22R,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3ξ-オール、(22R,25ξ)-(20α)-スピロスタ-5-エン-(2α,3ξ)-ジオール、パラトルエンスルホン酸=(20α)-25ξ-メチル-N-パラトルエンスルホニル-(22R,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3ξ-イル、(22R,25ξ)-(20α)-(14α,20α)-スピロスタ-5-エン-(3β,12β)-ジオール、(22R,25S)-(20ξ)-スピロスタ-5-エン-3ξ-オール、安息香酸=(22R,25ξ)-(20α)-スピロスタ-5-エン-3β-イル、ヘキサン酸=(22S,25R)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イル、(22R,25ξ)-(20α)-スピロスタ-5-エン-(1ξ,3ξ)-ジオール、(22R,25S)-(20α)-スピロスタ-5-エン-3β-オール、琥珀酸=(22R,25S)-(20α)-スピロスタ-5-エン-3β-イル、およびプロパン酸=(20α)-25S-メチル-N-アセチル-(22S,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3β-イル、から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、ヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イルであることを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳類の神経前駆細胞が、ヒトの細胞であることを特徴とする、請求項１、５、もしくは１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳類の神経前駆細胞が、NT2細胞であることを特徴とする、請求項１、５、もしくは１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記神経細胞が、NT2N表現型を示すことを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記神経細胞が、ニューロンであることを特徴とする、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記接触ステップが、in vitroで行われることを特徴とする、請求項１、５、もしくは１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記接触ステップが、in vivoで行われることを特徴とする、請求項１、５、もしくは１１に記載の方法。
【請求項２６】
前記接触ステップが、前記前駆細胞と前記化合物を、連続的または同時に投与することによって行われることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記量が、GFRα2蛋白の発現を増大する上で有効なものであることを特徴とする、請求項１、５、もしくは１１に記載の方法。
【請求項２８】
前記神経前駆細胞が幹細胞であることを特徴とする、請求項１、５、もしくは１１に記載の方法。
【請求項２９】
前記幹細胞が神経幹細胞であることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記幹細胞が胚幹細胞であることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
前記幹細胞が成人型多能性組織幹細胞（multipotent adult progenitor cell; MAPC）であることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
前記幹細胞が骨髄間質細胞であることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
治療上有効量の神経前駆細胞を、分化を誘導する量の構造式I、II、もしくはIIIの化合物と併せて含むことを特徴とする、組成物。
【請求項３４】
前記神経前駆細胞が幹細胞であることを特徴とする、請求項３３記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
〔関連出願データ〕
本出願は、U.S. Provisional Patent Application No. 60/364,140（2002年03月15日出願）およびU.S. Provisional Patent Application No. 60/319,846（2003年01月09日出願）の優先権を主張するところのU.S. Patent Application Serial No. 10/389,189（2003年03月14日出願、同日に同じ優先権を基にWO/2003/077869も出願されている）からの一部継続出願である、U.S. Patent Application Serial No. 10/663,619（2003年09月16日出願）およびU.S. Patent Application Serial No. 11/031,538（2005年01月07日出願、U.S. Patent Application Serial No. 10/663,619の一部継続出願でもある）のうちの、U.S. Patent Application Serial No. 11/031,538の優先権と、U.S. Provisional Patent Application No. 60/618,696（2004年10月14日出願）の優先権とを、主張する。これらの出願は、この参照によりそのすべてが本開示に含まれる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
神経細胞死（変性）は、個体に破壊的且つ不可逆な影響を与える可能性を持つものであって、例えば卒中、心発作、あるいは脳または脊椎での他の虚血もしくは外傷の結果として発生しうる。加えて、神経細胞死をともなう神経変性障害としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、ダウン症、卒中、外力性脳損傷、脳虚血、脳低酸素症、発作、脳感染症、脊髄振盪症／障碍（spinal cord concussion/section）、コルサコフ病、が含まれる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
【化４】
2008516972.tif 000152
ここで式中の、 R1 、 R2 、 R4、 R7 、 R11 、 R12 、 R15 、および R16のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、硫酸基、または、任意に -NH- 、 -N((C1-C8)アルキル)- 、 -O- 、 -S- 、 -SO- 、 -SO2- 、 -O-SO2- 、 -SO2-O- 、 -C(O)- 、 -C(O)-O- 、 -O-C(O)- 、 -C(O)-NR'- 、もしくは -NR'-C(O)- を挿入した(C1-C8)アルキル基であって、ここで、R'は、Hもしくは(C1-C8)アルキル基であり、また、； R3 は、ヒドロキシ基、(C1-C6)アルキルCO2- 、 HO2C(CH2)2CO2- 、トルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、また、； R6 、 R8 、 R9、 R10 、 R13、および R14 のそれぞれが独立に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシ基であり、また、； R17 が、 -CH(CH3)CH(OH)(CH2)2CH(CH3)2もしくは -CH(CH3)CH(OC(=O)CH3)(CH2)2CH(CH3)CH2N(C(=O)CH3)2であり、あるいは、薬学的に許容されるそれらの塩である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
化合物(II)の構造は以下の構造式(II)
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
また、 R3 は、 OR23 であってもよく、ここで R23 は、脱離可能なヒドロキシ保護基であって、例えば、トシル基、メシル基、トリアルキルシリル基、THP、EtO(Et)、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、などとすることができる。また、 C3 がヒドロキシ置換された、真の(C8-C22)脂肪酸エステル化合物についても、本発明の範囲内であって、ここでそのアルコキシ鎖には、1〜2個のCH=CHユニット、および／もしくは、1〜2個のOH置換基、エポキシ置換基、もしくはメチル置換基を含めることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
好ましい立体異性体としては、スピロステン-3-オールの番号付けに従って番号付けをした炭素骨格で言って、3S、10R、および13S、さらには20S、22S、および25Sがある。したがって、構造式(III)の好ましい化合物は、ヘキサン酸=(22S,25R)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イル（SP233）である。特に他に定めの無い限りは、構造式(I)、(II)、もしくは(III)中の炭素原子は水素で飽和しているものとする。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
特に、(C1-C8)アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、iso-ブチル基、sec-ブチル基、ペンチル基、3-ペンチル基、ヘプチル基、もしくはオクチルヘキシル基（octyl hexyl）とすることができる。また、(C3-C8)シクロアルキル基は、単環、二環、もしくは三環とすることができるものであって、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、ビシクロ[2.2.2]オクタニル基、もしくはノルボルニル基を含み、さらには種々のテルペン構造およびテルペノイド構造も含む。(C3-C6)シクロアルキル(C1-C2)アルキル基は、上述したシクロアルキル基を含むものであって、シクロプロピルメチル基、シクロブチルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、2-シクロプロピルエチル基、2-シクロブチルエチル基、2-シクロペンチルエチル基、もしくは2-シクロヘキシルエチル基とすることができる。ヘテロシクロアルキル基であって、そのシクロアルキル環系が、単環、二環、もしくは三環であり、且つ、任意に1〜2個のS、過酸化物では無いO、もしくはN(R')と、4〜5個の環員炭素原子を含むようなものであって、例えば、モルホリニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、インダニル基、1,3-ジチアン-2-イル基、などである。すべてのシクロアルキル環系は、任意に、1〜3個の二重結合もしくはエポキシ部分を含み、且つ、任意に、1〜3個のOH、(C1-C6)アルカノイルオキシ基、(CO)、(C1-C6)アルキル基、もしくは(C2-C6)アルキニル基で置換される。(C1-C8)アルコキシ基には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、iso-ブトキシ基、sec-ブトキシ基、ペントキシ基、3-ペントキシ基、もしくはヘキシルオキシ基を含めることができる。(C2-C6)アルケニル基は、ビニル基、アリル基、1-プロペニル基、2-プロペニル基、1-ブテニル基、2-ブテニル基、3-ブテニル基、1-ペンテニル基、2-ペンテニル基、3-ペンテニル基、4-ペンテニル基、1-ヘキセニル基、2-ヘキセニル基、3-ヘキセニル基、4-ヘキセニル基、もしくは5-ヘキセニル基とすることができる。ヒドロキシ(C1-C8)アルキル基もしくはヒドロキシ(C1-C8)アルコキシ基は、1〜2個のOH基で置換したアルキル基とすることができ、こうした1〜2個のOH基で置換したアルキル基としては、例えばヒドロキシメチル基、1-ヒドロキシエチル基、2-ヒドロキシエチル基、1-ヒドロキシプロピル基、2-ヒドロキシプロピル基、3-ヒドロキシプロピル基、1-ヒドロキシブチル基、4-ヒドロキシブチル基、3,4-ジヒドロキシブチル基、1-ヒドロキシペンチル基、5-ヒドロキシペンチル基、1-ヒドロキシヘキシル基、もしくは6-ヒドロキシヘキシル基である。(C1-C6)アルキルCO2- は、アセトキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイルオキシ基、イソブタノイルオキシ基、ペンタノイルオキシ基、もしくはヘキサノイルオキシ基とすることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
【表１】
2008516972.tif 000153
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
一般に、ヒトの被験者は、マウスもしくは他の実験動物よりも処置時間が長くなるということに留意されたい。処置時間の長さは、治療過程の長さと効率に比例したものとなる。こうした用量は、一回分の用量であってもよく、あるいは数日間に亘る複数回分の用量であってもよい。したがって当業者は、本開示と本明細書中で参照した文献と当該技術分野における知識とを使って、動物実験（ラット、マウス、イヌなど）の結果をヒトへと拡張することができる。処置期間の長さは、治療過程の長さと薬剤効率と処置される被験者の体調に比例したものとなる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
本発明に係る方法、キット、配合物、および薬学的組成物には、記載した化合物の、結晶形態（多形体など）、鏡像異性体、異性体、および互変異性体、ならびに、それらの薬学的に許容される塩が含まれる。薬学的に許容される塩の例は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、琥珀酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、林檎酸、酒石酸、枸櫞酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、ステアリン酸、サリチル酸、p-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、embonic acid（パモン酸 pamoic acid）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルギン酸、β-ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸、から調製される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
本明細書中で形容詞的に用いている「薬学的に許容される」（"pharmaceutically acceptable"）という語句は、それで修飾された名詞が薬学的製品に用いるにあたって適切である、という意味である。薬学的に許容される塩には、金属イオンと有機イオンが含まれる。より好ましい金属塩は、適切なアルカリ金属（Ia族）塩、アルカリ土類金属（IIa族）塩、および他の生理学的に許容される金属イオンを含むが、これらに限定はされない。イオンの例としては、通常の価数であるアルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、および亜鉛が含まれる。好ましい有機イオンとしては、プロトン化三級アミンおよび四級アンモニウムカチオン類が含まれ、その一部を挙げれば、トリメチルアミン、ジエチルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン）、およびプロカインがある。薬学的に許容される酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、燐酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、蟻酸、酒石酸、マレイン酸、林檎酸、枸櫞酸、イソ枸櫞酸、琥珀酸、乳酸、グルコン酸、グルクロン酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸、フマル酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、などが含まれるがこれらに限定はされない。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
神経変性障害の処置にあたり、本発明に係る組成物を使用して、Aβに起因する細胞毒性の低減などの治療反応を充分に引き出せる量である本発明に係る化合物の用量が得られるようにすることができ、例えばその用量は、約5ng〜約1000mg、または約100ng〜約600mg、または約1mg〜約500mg、または約20mg〜約400mgである。通常は、体重に対しての有効な用量は、約0.0001mg/kgから1500mg/kg、より好ましくは1から1000mg/kg、より好ましくは約1から150mg/kgの範囲であり、もっとも好ましくは体重に対して50から100mg/kgの範囲である。一回分の用量を、一日につき一回から約四回の服用に分割して投与することもでき、また、治療効果を引き出すために、複数回分の用量を一日で投与することもできる。例示的には、本発明に係る組成物の剤型単位は、例えば本発明に係る化合物を約5ng、50ng、100ng、500ng、1mg、10mg、20mg、40mg、80mg、100mg、125mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、700mg、800mg、900mg、もしくは1000mg含むのが典型的である。剤型は、特定の用量を実現するために用いられる所望の頻度での投与に適合するように、選択することができる。投与する本発明に係る組成物の剤型単位の量と、症状もしくは障害を処置するための投薬療法とは、種々の因子（被験者の年齢、体重、性別、および症状、ならびに、症状もしくは障害の重篤度、ならびに、投与の経路および頻度を含む）に依存し、これらは周知の通り広汎に変更可能である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
治療効果を引き出すために必要である本発明に係る化合物の量は、例えば、血清中への化合物の吸収率、試薬の生物学的利用能、および障害の処置に関する効能、といったことに基づいて実験的に定量することができる。しかしながら、本発明に係る化合物の、任意の特定の被験者への特定の投薬量は、種々の要因に依存しており、そのような要因としては、使用する特定の化合物の活性、被験者の年齢・体重・総合的な健康状態・性別・食餌（例えば被験者が絶食しているか、もしくは食後かといったことを含む）、投与時間、排出率、薬剤の配合、ならびに処置される特定の障害の重篤度、ならびに投与の形態、が含まれる、ということを理解されたい。一般に処置用量は、安全性および有効性を最適化するために漸増することができる。典型的には、in vitroおよび／もしくはin vivoでの初期実験から得られる用量-作用効果の相関が、被験者への投与に適した用量を導き出す上で有用となる。一般的に、本発明に関する神経系の障害もしくは疾病の処置のために有用な用量を評価するための手引きとして、実験動物による研究を行うことができる。処置プロトコールの観点から言うと、投与される用量が、投与される特定の試薬、投与経路、特定の被験者の体調などといった種々の因子に依存する、ということを当業者は正しく理解することができる。一般的に言って、本発明に係る化合物は、治療効果を引き出すために有用な期間に亘ってin vitroで有効であるとされた濃度を得る上で適切な血清中量を得られるような量で、投与することが望ましい。したがって、例えば、200nMの最大半量でin vitro活性を示すことが見出された化合物の場合には、例えば、β-アミロイドに起因する高い神経毒性、および、当業者によって適切に測定されるようなものとして選択される他の指標に関連した障害を処置するというような所望の治療効果を引き出せる期間に亘って、in vivo濃度200nMの概算最大半量が得られるために有効である量の薬剤を投与するのが望ましいということになる。これらのパラメータの定量については当該技術分野において公知である。これらの考慮事項は当該技術分野において公知であり、標準的教科書に記載されている。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
◆ コレステロール=蛋白質結合ブロットアッセイ（CPBBA）
精製した Aβ1-42 蛋白質（50μM）、もしくはさまざまなAβの断片（50μM）を、 3H-22R-ヒドロキシコレステロールと併せた上で、標識していない22R-ヒドロキシコレステロールを与えないか、または体積20μlでのその漸加する濃度群を加えるようにして、37℃で24時間に亘ってインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、試料を1.5% アガロース（Type I-B）ゲル電気泳動を使って分離して、10XSSCバッファ中のニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell, Keene, NH）に移した。この膜をトリチウム感受性板に付けて、Cyclone Storage phosphor system（Packard BioScience, Meridien, CT）を使ってホスホイメージングで解析した。画像濃度分析（image-densitometric analysis）を、the OptiQuant software（Packard）を用いて行った。この方法によって、放射性標識したコレステロールを組み込んだAβ複合体（Yao Z. and Papadopoulos-V., Function of β-amyloid in cholesterol transport: a lead to neurotoxicity, FASEB J., 16, 1677-1679 (2002)）、および天然条件下の22R-ヒドロキシコレステロールの分離、可視化、および同定が可能となる。低分子量であって組み込まれていない（low molecular weight unincorporated）22R-ヒドロキシコレステロールは、電気泳動中に分離して除去する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
22R-ヒドロキシコレステロールの神経保護作用は、PC12細胞には限定されず、分化したヒトNT2Nニューロンでも再現された（図４）。分化したヒトNT2Nニューロンを、22R-ヒドロキシコレステロールが存在する場合と存在しない場合とについて、25μM Aβ1-42 で72時間に亘って処理した。25 μM Aβが、ヒトニューロンの生存率を50%抑制した（p<0.001）一方で、1μMおよび10μMの22R-ヒドロキシコレステロールは、このAβに起因する毒性に対して、それぞれ、50%（p<0.01）および100%（p<0.001）の保護作用を示した（図４）。22R-ヒドロキシコレステロールが、ヒトNT2細胞を、他の毒性侵襲から救うことができるのかどうかを評価するために、NT2細胞を、22R-ヒドロキシコレステロールが存在しない場合と、1〜50μMの22R-ヒドロキシコレステロールが存在する場合とについて、5mM グルタマートで三日間に亘って処理した。グルタマートによって、細胞生存率が30%減少し（MTTアッセイによる測定）、22R-ヒドロキシコレステロールが存在しても、これらの細胞の保護はできなかった（データ提示せず）。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
MTTアッセイにより得られた結果を、トリパンブルー色素排除アッセイを使ってさらに検証した。PC12細胞を、 Aβ1-42 （図５Ａ）もしくは Aβ25-35 （図５Ｂ）の漸加する濃度群を用いて、100μMの22R-ヒドロキシコレステロールもしくはDHEAが存在する場合と存在しない場合とについて、72時間に亘る処理にかけた。NT2細胞を、 Aβ1-42 （図５Ｃ）もしくは Aβ25-35 （図５Ｄ）の漸加する濃度群を用いて、25μMの22R-ヒドロキシコレステロールもしくはDHEAが存在する場合と存在しない場合とについて、72時間に亘る処理にかけた。生存率の程度を、トリパンブルーアッセイを使って、測定した。結果は、すべての細胞蛋白質のそれぞれについて、トリパンブルーで染色された細胞の数を、対照の未処理細胞群と比較しての倍率で表した。結果はmeans±SD （n=6〜12）で示した。図５Ａおよび図５Ｃでは、22R-ヒドロキシコレステロールが、ラットPC12細胞（図５Ａ）とヒトNT2細胞（図５Ｃ）の双方を、 Aβ1-42に起因する細胞死から救ったことを示している。対照的に、DHEAは、ラットPC12細胞を Aβ1-42 に起因する細胞死から保護したに留まり、NT2細胞の保護はできなかった（図５Ａおよび図５Ｃ）。22R-ヒドロキシコレステロールもDHEAも、PC12細胞およびNT2細胞を、 Aβ25-35 に起因する細胞死から救うことはできなかった（図５Ｂおよび図５Ｄ）。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
◆ 考察
22R-ヒドロキシコレステロールの量が、AD患者の脳標本において、年齢を合わせた対照群と較べて低くなっていたことがわかった。22R-ヒドロキシコレステロールの量が、脳の辺縁系の組織である海馬中で有意に減少しており、この海馬は、認識能（学習と記憶など）にとって不可欠なものであって、且つADによる影響を蒙るものである。Aβの生理機能は、コレステロールの輸送を制御するためのものである（Yao et al., FASEB J., 16, 1677-1679 (2002)）。この発見に基づくと、22R-ヒドロキシコレステロールの減少は、AD患者の脳におけるAβの過剰産生に因るものであると考えられ（Roller et al., J. Biol. Chem., 286, 3072-3083 (1993); Younkin, J. Physiol., 92, 289-292 (1998)）、この過剰産生によって、コレステロール輸送が阻害されるか、または細胞のコレステロール摂取が減少し、その結果として神経ステロイド形成のための基礎コレステロールの利用度に影響が顕われて、AD患者の脳内での22R-ヒドロキシコレステロールの合成が減少することになる、と考えられる。あるいはまた、コレステロールからのプレグネノロンおよびDHEAの新規合成が、AD脳標本中で増大していたことを考慮すると、この合成によって、AD中で利用可能であった中間生成22R-ヒドロキシコレステロールが消耗してしまったとも考えられる。AD海馬中でのプレグネノロンおよびDHEAの増量（Brown et al., Neurobiology of Aging, 24, 57-65 (2003)）は、Aβによって誘発される（Brown, et al., J. Neurochem., 74, 847-859 (2000)）。また、Aβに起因するコレステロール輸送の減少と、コレステロール代謝の増大との両方の現象が、ADで起こって22R-ヒドロキシコレステロールの量を減らしている、という可能性も考えられる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
細胞のトリパンブルー摂取を四番目の試験として用いて、有望なSP233化合物が、Aβに起因する毒性へと与える影響の評価を行った（図１４）。予想通りに、0.1μM、1μM、および10μMのAβは、PC12細胞のトリパンブルー摂取の用量依存的な増大（それぞれ、33%、36%、および97%; p<0.001 by ANOVA）を抑制した。30μMおよび50μMのSP233は、Aβに起因する細胞死を阻害した（p<0.001 by ANOVA）。図１５には、SP233の神経保護作用が用量依存的であって、しかもAβの三種すべての濃度で維持されたことを示している。なお、SP233の作用効果は、病態生理的な基準以上の高濃度のAβの存在下では減少した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
本明細書中に示した研究は、0.1μM、1.0μM、および10.0μMの Aβ1-42を使って行った。AD患者および対照群の脳脊髄液中に存在する Aβ1-42 濃度は、 500〜1000 ng/l （0.1〜0.2nM）の範囲であるので、上記した濃度は、病態生理的な濃度以上となる。 Aβ1-42 が10倍の濃度でAD脳内に存在すると仮定したとしても、 Aβ1-42 の病態生理的濃度の見積もりは1〜2nMの範囲となると考えられ、これは本出願人の行った実験で用いた濃度の100〜10,000倍も小さい。これらの濃度を考慮すると、0.1μM Aβに対してSP233が75%の保護を示したということが、薬学的観点からして適切であるのは明らかと言える。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
SP化合物の神経保護特性は、構造／活性相関（structure/activity relationship; SAR）に従うと考えられる。SP231とSP235は、ジオスゲニン（diosgenin）の立体異性体であるが（図１）、SP235だけがAβに起因する神経毒性への保護作用を呈する。SP235の立体化学は、C3R, C10R, C13S, C20S, C22S, C25Sであって、主骨格（motif）はSP236と共通である（図１）。高い神経保護活性を示し且つ高濃度のAβの存在下で活性であるようなSP化合物には、C3にエステル、特に脂肪酸もしくは脂肪酸類似構造が含まれていた。実際、C3に非置換ヒドロキシル基を有するSP235は、限られた神経保護作用しか示さず、0.1μM Aβに対してのみ効果を呈した。それとは対照的に、SP235のC3を琥珀酸エステルにした構造を持つSP236は、より高濃度のAβに対して活性であり、また、SP235のC3をヘキサン酸エステルにした構造を持つSP233は、最も有望な化合物である。SP238はATP量の維持には作用しなかったとは云え、SP238がPC12細胞をAβに起因する毒性から保護できたという発見により、C3にまったく側鎖を持たないSP238の誘導体（SP226）が神経保護作用を示さなかったことをさらに考え合わせると、この仮説がさらに裏づけられる。SP232での安息香酸置換が、神経保護作用に関しては有効では無かったという発見からは、この程度の長さの脂肪族鎖の存在が芳香族構造置換したものよりも適切である、ということが示唆される。これらのデータはSARを示しており、C3における脂肪酸鎖の存在の重要性を強調する。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
◆ 結果
漸加する濃度群のAβに、漸加する濃度群のSP233を加えてインキュベートした後に、電気泳動を行って、Aβから形成されたオリゴマーの確認と、この形成時にSP233により誘発された干渉の確認とができるようにした。図２０Ａおよび図２０Ｆには、インキュベーション後24時間経過した後（図２０Ａ）と72時間経過した後（図２０Ｆ）とに行ったイムノブロット解析を示した。われわれが用いた実験条件下では、0.1μM Aβの存在下ではモノマー種はすべての時点でまったく検出できず、また、トリマーもしくはテトラマー（ADDL）も、0.1μMおよび1μMのAβの存在下では、24時間目および72時間目の時点で検出されなかった。SP233は、濃度1μMおよび10μMのAβの存在下で、24時間目（図２０Ｂ）および72時間目（図２０Ｇ）に測定したモノマー種の量を、用量依存的に減少させた。また、この用量−作用の相関は、トリマーADDLおよびテトラマーADDLに対しても、SP233を10μM Aβと共にインキュベートした場合において、24時間目（図２０Ｃと図２０Ｄ）および72時間目（図２０Ｈと図２０Ｉ）に観察された。しかしSP233は、ポリマー種の量については、わずかに用量依存的に増加させたにとどまった（図２０Ｅと図２０Ｊ）。このことから、SP233がAβに結合して、このペプチドと結合して安定な高分子である複合体を形成することによって、神経毒性を有するADDLの形成を阻害する、ということが示唆される。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
〔実施例 IV： 22R-ヒドロキシコレステロールを用いた神経前駆細胞の分化〕
この実施例では、22R-ヒドロキシコレステロールが、NT2細胞の増殖を阻害して、それらの細胞が「ニューロン様」（"neuron-like"）細胞および「星状細胞様」（"astrocyte-like"）細胞へと分化するように誘導する、ということを示してゆく。NT2細胞の22R-ヒドロキシコレステロールに起因する分化の間には、
高分子量の神経線維蛋白質であるNF 200の発現が増大し、また、低分子量の神経線維蛋白質であるNF 70の発現は減少し、また、GFRα2の蛋白発現は増加した。こうした22R-ヒドロキシコレステロールの作用は、その鏡像異性体である22S-ヒドロキシコレステロールもしくは他のステロイド類ではNT2細胞の分化を誘導できなかったことから考えると、立体特異的であったと言える。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
◆ 結果
位相コントラスト顕微鏡写真には、NT2細胞を25μM 22R-ヒドロキシコレステロールで3日、6日、および12日間に亘り処理したことによって、形態学的変化が引き起こされたことを示している（図２１、上側のパネル）。22R-ヒドロキシコレステロールで6日間処理した後に、細胞の形態に劇的な変化が生じたことがはっきりと示されていた（図２１Ｃ）。フローサイトメトリー分析からは、22R-ヒドロキシコレステロールがNT2細胞の増殖に影響したことがさらにわかった（図２１、下側のパネル）。データには、12日間の処理によって、 G0/G1 期の細胞の割合が、35.32%から50.34%へと増加し、且つ、 G2/M 期の細胞の割合が、34.43%から15.90%に減少したことが明らかに示されている。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
特に、これらの結果は、22R-ヒドロキシコレステロールが、細胞分裂を調節する際に付随する、発生過程で制御された内因性分子シグナル（developmentally-controlled endogenous molecular signal）として機能する可能性を示唆しており、これはつまり、22R-ヒドロキシコレステロールが、細胞が増殖を続けるかまたは成長を停めるかを決定して、分化および枯死の発生を起こす際に関与している可能性がある、ということである。NT2細胞の分化を誘発する22R-ヒドロキシコレステロールの作用が、立体特異的であったこと、そしてさらには、その前駆体（コレステロール）、またはその代謝物であるプロゲステロンおよびDHEA（図２２ｂ）ではこのような作用が観察されなかったこと、また、PC12細胞、MDA-MB-231細胞、もしくはヒトグリオーマ細胞株U87を用いた場合にも観られなかったことを考えると、この説は強く裏づけられると言える。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９７】
in vitro研究によって、寡突起神経膠細胞、グリオーマ株、およびシュワン細胞が、コレステロールからプレグネノロンへの転換に関与するシトクロムP450コレステロール側鎖開裂酵素を発現することが示されている（Jung-Testas et al., Endocrinol., 125. 2083 (1989); Papadopoulos et al., PNAS USA, 89, 5113 (1992); Akwa et al., C. R. Acad. Sci. III (France), 316, 410 (1993)）。また、22R-ヒドロキシコレステロールが、この酵素による開裂反応中に形成される三種のヒドロキシル化中間生成物のうちのひとつであることも、充分に記載されている（Dixon et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 49, 161 (1970); Hall, Anal. N. Y. Acad. Sci., 458, 203 (1985)）。また、AD患者の脳標本中の22R-ヒドロキシコレステロールの量が、年齢を合わせた対照群と比較して少ない、という発見も特筆すべき事項である。22R-ヒドロキシコレステロールの量は、認識能（学習と記憶など）にとって不可欠なものであって且つADによる影響を蒙る脳の辺縁系の組織である海馬中で有意に減少していた（Yao et al., J. Neurochem., 83, 1110 (2002)）。NT2細胞の22R-ヒドロキシコレステロールにより誘発されるNT2N表現型への分化の礎となっている正確な機構については、本明細書中に示した結果を以ってしても不明なままではあるが、実施例4では、22R-ヒドロキシコレステロールが、何らかの未知の（ひとつもしくは複数の）蛋白質と結合するかまたは相互作用することによって、この（ひとつもしくは複数の）蛋白質を活性化し、GFRα2蛋白質発現を増大させて、GFRα-Ret回路を活性化し、その結果として、細胞の増殖を抑制して分化を誘発する、ということを示している。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
〔実施例 V： 神経細胞分化誘発のためのスピロステノールの使用〕
｛A. 物質および方法｝
◇ 1. 物質
(20α)-25ξ-メチル-(22R,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3ξ-オール（SP-224）は、Interbioscreen（Moscow, Russia）から購入した。細胞培養供給器は、GIBCO（Grand Island, NY）から、また、細胞培養プラスチック容器はCorning（Corning, NY）から購入した。マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細胞は、ATCC（Manassas, VA）から購入した。in vivo研究のために、体重300〜325gの雄Long-EvansラットをCharles-Riverから購入し、the Department of Comparative Medicine at Georgetown Universityで飼育した。連続14日間に亘り毎時間5.0μlを搬送する滲透圧マイクロポンプ（2ML2）を、DURECT Corp.（Cupertino, CA）から購入した。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１０】
SP-224での2〜5日間の処理によって、P19細胞、NT2細胞、およびPC12細胞に神経突起様組織の形成が誘発され、その後、5〜10日間の洗い流しにより、これらの幹細胞の有望な分化の最初の形跡が顕わになった。興味深いことに、SP-224が作用を示したのは、処理プロトコール中に洗い流し期間が含まれていた場合のみであった。事実、「治療力」（"therapeutic pressure"）が2日後に除去されなかった場合には、我々はいかなる神経突起も観察することができなかった。ここからは、活性が「急襲的」（"hit and run"）機構を持つことが示唆される。分化したP19細胞中のこの構造的修飾は、特異的神経細胞標識形質であるβIII-チュブリンおよびMAP2の出現を伴う。βIII-チュブリン免疫染色法により、洗い流しを5日間行った後に形成された軸索の長さが、約500μmに達していたことを可視化できた。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２５Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５Ａ】  マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細
胞を、直径13mmのカバーガラス片上で培養した。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。こうした実験条件下で、三種の細胞において有意な新芽形成が見られ（パネルB、D、F）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（パネルD）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２５Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５Ｂ】  マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細
胞を、直径13mmのカバーガラス片上で培養した。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。こうした実験条件下で、三種の細胞において有意な新芽形成が見られ（パネルB、D、F）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（パネルD）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２５Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５Ｃ】  マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細
胞を、直径13mmのカバーガラス片上で培養した。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。こうした実験条件下で、三種の細胞において有意な新芽形成が見られ（パネルB、D、F）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（パネルD）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２５Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５Ｄ】  マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細
胞を、直径13mmのカバーガラス片上で培養した。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。こうした実験条件下で、三種の細胞において有意な新芽形成が見られ（パネルB、D、F）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（パネルD）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２５Ｅ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５Ｅ】  マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細
胞を、直径13mmのカバーガラス片上で培養した。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。こうした実験条件下で、三種の細胞において有意な新芽形成が見られ（パネルB、D、F）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（パネルD）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２５Ｆ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５Ｆ】  マウス胎児畸形癌P19細胞、PC12ラット褐色細胞腫、およびNT2ヒト神経細
胞を、直径13mmのカバーガラス片上で培養した。細胞の密集度（confluence）が70%に達したところで、培地を、90μM SP-224を含んだ新たな培地に取り替えた。その後、P19細胞とP12細胞を2日間培養してから、SP224を洗い流して、標準培地に取り替えた。培地を5日間に亘って2日毎に取り替えた後、細胞を免疫細胞化学法のために固定した。NT2細胞は、5日間に亘り処理してから、10日間に亘り洗い流しを行った。こうした実験条件下で、三種の細胞において有意な新芽形成が見られ（パネルB、D、F）、最も劇的な効果はP19細胞で観察された（パネルD）。興味深いことに、新芽形成は洗い流し期間中に始まっており、処理期間中には形態変化はまったく観察されなかった。その一方で、処理した細胞への生長抑止効果も観察された。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２６Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６Ａ】  対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジン
を除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルB）、シナプトフィジン（パネルD）、MAP2（パネルF）、およびChAT（パネルH））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルJ）。さらにパネルBでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２６Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６Ｂ】  対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジン
を除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルB）、シナプトフィジン（パネルD）、MAP2（パネルF）、およびChAT（パネルH））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルJ）。さらにパネルBでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２６Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６Ｃ】  対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジン
を除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルB）、シナプトフィジン（パネルD）、MAP2（パネルF）、およびChAT（パネルH））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルJ）。さらにパネルBでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２６Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６Ｄ】  対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジン
を除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルB）、シナプトフィジン（パネルD）、MAP2（パネルF）、およびChAT（パネルH））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルJ）。さらにパネルBでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２６Ｅ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６Ｅ】  対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジン
を除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルB）、シナプトフィジン（パネルD）、MAP2（パネルF）、およびChAT（パネルH））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルJ）。さらにパネルBでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２６Ｆ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６Ｆ】  対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジン
を除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルB）、シナプトフィジン（パネルD）、MAP2（パネルF）、およびChAT（パネルH））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルJ）。さらにパネルBでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２６Ｇ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６Ｇ】  対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジン
を除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルB）、シナプトフィジン（パネルD）、MAP2（パネルF）、およびChAT（パネルH））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルJ）。さらにパネルBでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２６Ｈ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６Ｈ】  対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジン
を除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルB）、シナプトフィジン（パネルD）、MAP2（パネルF）、およびChAT（パネルH））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルJ）。さらにパネルBでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２６Ｉ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６Ｉ】  対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジン
を除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルB）、シナプトフィジン（パネルD）、MAP2（パネルF）、およびChAT（パネルH））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルJ）。さらにパネルBでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２６Ｊ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６Ｊ】  対照群では、神経細胞標識形質（neuronal marker）はシナプトフィジン
を除き観察されなかった。そしてシナプトフィジンについても、非常に染色が薄かった（パネルC）。SP-224曝露によって、研究対象である種々の神経細胞標識形質（βIIIチュブリン（パネルB）、シナプトフィジン（パネルD）、MAP2（パネルF）、およびChAT（パネルH））の強い発現が引き起こされた。また、遊走性神経芽細胞標識形質（migrating neuroblasts marker）であるDCXも、SP-224に曝露したP19細胞において強く発現した（パネルJ）。さらにパネルBでは、100μMスケールバーよりも充分に長い、軸索に類似した構造上での、βIIIチュブリン免疫染色も示している。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｃ】
2008516972.tif 000154
【手続補正４６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｄ】
2008516972.tif 000155
【手続補正４７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２Ｃ】
2008516972.tif 000156
【国際調査報告】
2008516972.tif 000157