(57)【要約】  本発明においては、細胞又は組織のサンプルに存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量の定量及び／又は比較評価を行うための方法を提供する。本発明の方法においては、まず、１つ又は複数の遺伝子に対する配列修飾プライマーを用いて、サンプルに含まれるｍＲＮＡの逆転写を１回の反応で行い、配列修飾ｃＤＮＡ分子のプールを得る。逆転写反応の終了後に、余った配列修飾プライマーを除去又は不活化する。続いて、分析対象としたそれぞれの遺伝子について個別に遺伝子特異的増幅反応を行うが、各反応においては、配列修飾ｃＤＮＡからなるテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートを共増幅する。配列修飾ｃＤＮＡテンプレートから誘導した増幅産物と参照ＤＮＡテンプレートから誘導した増幅産物のそれぞれの量を測定し、相対レベルを決定して、個別に行った増幅反応における、ＤＮＡに対する遺伝子特異的ｃＤＮＡの比を得る。最後に、個別に行った増幅反応から得られた比を組み合わせて、サンプルに元々存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量を反映する、サンプル特異的プロファイルを得る。
2008500034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は組織のサンプルに存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量について、定量および比較評価の少なくとも一方を行うための方法であって、
（ａ）１つ又は複数の遺伝子に対する配列修飾プライマーを用いて、サンプルに含まれるｍＲＮＡの逆転写を１回の反応で行い、配列修飾ｃＤＮＡ分子のプールを得、
（ｂ）逆転写反応の終了後に、余った配列修飾プライマーを除去又は不活化し、
（ｃ）分析対象としたそれぞれの遺伝子について個別に増幅反応を行うが、各反応においては、遺伝子特異的プライマーを用いて配列修飾ｃＤＮＡからなるテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートを共増幅して、測定可能な量の増幅産物を生成し、
（ｄ）配列修飾ｃＤＮＡテンプレートから誘導した増幅産物と参照ＤＮＡテンプレートから誘導した増幅産物のそれぞれの量を測定し、相対レベルを決定して、個別に行った増幅反応における、ＤＮＡに対する遺伝子特異的ｃＤＮＡの比を得、そして
（ｅ）個別に行った増幅反応から得られた、ＤＮＡに対する遺伝子特異的ｃＤＮＡの比を組み合わせて、サンプルに元々存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量を反映する、該比のサンプル特異的プロファイルを得る
ことを包含する方法。
【請求項２】
サンプルが、細胞又は組織の溶解物又はホモジェネートを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
逆転写反応の前に、サンプルからＲＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡを単離することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
逆転写反応を、サンプルに含まれるＤＮＡが二本鎖の状態を維持する条件下で行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
配列修飾プライマーが、次の３つの機能的セグメント（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
（ａ）特定の遺伝子のセンス鎖ＤＮＡ配列のみならずｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列であって、続いて行う増幅反応に用いる下流側のプライマーのための結合部位に対する相補的ヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列を含む、５’−末端セグメント、
（ｂ）該遺伝子のセンス鎖ＤＮＡ配列のみならずｍＲＮＡ配列に非相補的である１つ又は複数のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列からなる、中央セグメント、及び
（ｃ）該遺伝子のセンス鎖ＤＮＡ配列のみならずｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、３’−末端セグメント。
【請求項６】
逆転写反応の終了後に行う余った配列修飾プライマーの除去又は不活性化を、酵素分解によって行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
酵素分解を、一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼを用いて行うことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
個々の増幅反応をそれぞれ物理的に隔離された反応容器において行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
参照ＤＮＡテンプレートが、サンプルに存在しているか又は別の原料から単離したゲノムＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
参照ＤＮＡテンプレートが、クローニング又は合成したＤＮＡオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
個別の増幅反応におけるｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートの共増幅を、同じプライマーを用いて競合的に行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
逆転写反応によって生成されるｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を修飾し、ｃＤＮＡ由来の増幅産物を、同じ増幅反応によって得られる参照ＤＮＡテンプレート由来の増幅産物から区別するために、該配列の修飾を用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
増幅産物の定量を、増幅反応の間に行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
増幅産物の定量を、増幅反応の終了後に行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
個別の遺伝子特異的増幅反応において、配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートから誘導する増幅産物の相対レベルが、増幅反応を実施する前の増幅反応系に元々存在した配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートの相対量を反映することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートを増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、請求項１又は１１に記載の方法。
【請求項１７】
ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートを増幅するために、リガーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、請求項１又は１１に記載の方法。
【請求項１８】
ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートを増幅するために、転写媒介性増幅を用いることを特徴とする、請求項１又は１１に記載の方法。
【請求項１９】
増幅産物の定量に、解離曲線解析を用いることを特徴とする、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項２０】
増幅産物の定量に、差別化部位におけるプライマー伸長法を用いることを特徴とする、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項２１】
増幅産物の定量に、ミニシークエンシング法又はサイクリックミニシークエンシング法を用いることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
増幅産物の定量に、ピロシークエンシング法（登録商標）を用いることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
増幅産物の定量に、対立遺伝子特異的プライマー伸長法を用いることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
増幅産物の定量に、配列特異的なハイブリダイゼーションプローブを用いることを特徴とする、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項２５】
増幅産物の定量に、二重に標識した加水分解プローブを用いることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
増幅産物の定量に、モレキュラービーコン（登録商標）プローブを用いることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
増幅産物の定量に、直接的又は間接的な蛍光共鳴エネルギー移動に基づく解析を用いることを特徴とする、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項２８】
増幅産物の定量に、質量分析法を用いることを特徴とする、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項２９】
容器内の少なくとも１つの配列修飾プライマーと、
細胞又は組織のサンプルに存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量について、請求項１の方法に従って定量および比較評価の少なくとも一方を行うための、該配列修飾プライマーの使用方法を解説した説明書
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおける病理学的及び生理学的状態の診断、及びそのような状態に対する治療状況のモニタリングのみならず、状態の追跡調査に関する。本発明はまた、各種の状態における、細胞又は組織特異的な遺伝子発現パターンと遺伝子発現経路の変化の特徴付けにも関する。本発明の技術は、細胞又は組織の小さなサンプルに存在するｍＲＮＡ転写産物の定量及び／又は比較評価を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
種々の生物学的分野に関する技術の発展は、利用可能な遺伝情報の急速な増加をもたらした。ヒトゲノムのシークエンシングの完了と、データを直ちにアクセス可能にするというヒトゲノムプロジェクトの方針は、病理学的及び生理学的状態における遺伝子発現を研究するための基盤を創造した。遺伝子発現マイクロアレイ、ディファレンシャルディスプレイポリメラーゼ連鎖反応（differential display polymerase chain reaction；ＤＤ−ＰＣＲ）、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction；ｑＲＴ−ＰＣＲ）などの技術は、統計学的クラスター化アルゴリズム（statistical clustering algorithm）とともに、遺伝子発現パターン及び遺伝子発現経路の特徴付けのための道具を提供した。これは、特定の薬剤及びその他の治療法に対して異なる予後及び潜在的に異なる反応を示す、公知の病気の新たな亜種を遺伝子発現プロファイルに基づいて定義することにつながった。
【０００３】
遺伝子発現データの急速な蓄積に貢献してきたのは、主としてＤＮＡマイクロアレイ技術である。この技術を用いることにより、いくつかの悪性の疾患のための、遺伝子発現に基づく分類が開発された。しかしながら、現在のＤＮＡマイクロアレイ技術は、かなり非感受性であり且つ定量精度が中庸であるという点において、臨床検査室で使用する診断方法としては大きな欠陥を有している。
【０００４】
臨床の現場で行う遺伝子発現の分析は、様々なタイプの臨床サンプルの特性故に、それぞれに特異的な技術的問題に直面している。組織学的なパラフィン包埋又は凍結組織標本のような固体組織サンプルは、通常、様々な種類の細胞からなる異種混合物である。サンプル中の特定の種類の細胞又は組織における遺伝子発現の測定には、顕微鏡用切片からの（たとえば顕微解剖（microdissection）による）細胞又は細胞の塊の単離や、サンプルから切り取った切片に存在する異なる種類の細胞の相対量を集計することが必要である。針生検（needle biopsy）及び細胞学的サンプルについては、採取する細胞の量は通常少なく、細胞の正確な量は不明である。血液サンプルについては、多くの場合、サンプル中の目的細胞の量比が小さく、サンプル中の特定の種類の細胞を濃縮することが必要である。上記した種類のサンプルから回収できるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量は屡々限られたものであり、このために、遺伝子発現の分析に用いる技術の感受性に対する要求が高まっている。さらに、ｍＲＮＡの分解量と回収量のサンプル間の変動は、核酸精製中のみならず、サンプルの調製中や保存中にも生ずる。In vivoで採取した組織サンプルから比較可能な結果を得るためには、サンプル間のｍＲＮＡレベルの変動を補正し整合性を得るための正規化が必要となる。
【０００５】
ｑＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子発現マイクロアレイを用いて得られた遺伝子発現レベルに関する結果を確認するために広く用いられている。ｑＲＴ−ＰＣＲは、極小量の細胞（単一細胞であってもよい）しか含まないサンプルにおける遺伝子発現の定量のためにも十分な感受性を有する。ＰＣＲによる核酸の増幅は指数関数的に起こるため、この技術は、反応効率の小さな差に起因するチューブ間の変動に敏感である。この問題を克服するために、ＲＮＡ又はＤＮＡ内部対照テンプレートをサンプルに添加してそれぞれの反応における反応効率をモニターすることができる。サンプル間のｍＲＮＡレベルの変動及び整合性の調節は、典型的には、分析の対象とする特定遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子の発現レベル、又はサンプル中の総ＲＮＡ量やリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）量に対して正規化すること、あるいは同じサンプルに存在する複数の遺伝子に対応するｍＲＮＡと比較定量することによって行う。
【０００６】
ゲノムＤＮＡと区別するために逆転写反応の際にｃＤＮＡテンプレートのサイズを変更する方法が、Joo et al.（Journal of Virological Methods 100 (2002) 71-81頁、及び韓国特許出願 KR2002089746 A）に記載されている。Joo et al. の技術では、サイズ変更用のアンカープライマー（size-modifying-anchor primer）を逆転写反応に用いて、生成されるｃＤＮＡの中に修飾したプライマー結合部位を挿入する。この技術は、ゲノムＤＮＡは逆転写反応が非変性条件下で行われるときには二本鎖の状態を維持し、したがって、ゲノムＤＮＡは逆転写反応のためのテンプレートとしては機能できない、という仮説に基づいている。増幅工程においては、同じ遺伝子から得られたｃＤＮＡテンプレートとゲノムＤＮＡテンプレートが、１つの共通した上流側のプライマーとそれぞれ別々の下流側のプライマーを用いて増幅される。得られるｃＤＮＡ由来増幅産物とゲノムＤＮＡ由来増幅産物とは長さが異なるので、個別に検出及び定量を行うことが可能である。一般に、ＲＴ−ＰＣＲ技術においては、ｃＤＮＡ由来の増幅産物とゲノムＤＮＡ由来の増幅産物との分離を可能にするために、少なくとも１つの、エクソン同士の境界を横切る配列の増幅を必要とする。Joo et al. の技術は、ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応の後に、ｃＤＮＡを、それに対応する、１つのエクソンの境界内に存在するゲノムＤＮＡから区別することを可能にする。この技術はまた、遺伝子特異的なｍＲＮＡとＤＮＡの相対レベルの比較を可能にする。
【０００７】
本発明は、細胞又は組織のサンプルに存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量について、定量および比較評価の少なくとも一方を行うための方法を提供する。本発明の方法においては、同じプライマーを用いて、配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートを共増幅する。これは、サンプルに含まれる、又はサンプルに添加したゲノムＤＮＡを普遍的な参照テンプレートとして用いて、個別の遺伝子特異的増幅反応における、チューブ間の増幅効率の変動を正規化することを可能にする。配列修飾ｃＤＮＡテンプレートから誘導した増幅産物と参照ＤＮＡテンプレートから誘導した増幅産物のそれぞれの量を測定し、相対レベルを決定することにより、個別に行った増幅反応における、ＤＮＡに対する遺伝子特異的ｃＤＮＡの比が得られる。分析した各遺伝子について得られた、ＤＮＡに対するｃＤＮＡの比を組み合わせることにより、サンプルに元々存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量を反映する、サンプル特異的遺伝子発現プロファイルを得る。
【０００８】
本発明においては、配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートは、同じプライマーを用いて同じ反応容器内で共増幅する。よって、ｃＤＮＡテンプレート由来増幅産物と参照ＤＮＡテンプレート由来増幅産物のそれぞれの相対レベルは、増幅反応を定常期（plateau phase）に達するまで行っても一定のままである。これは、ｍＲＮＡ転写産物をごく僅かな量しか含まないサンプルを対象としたアッセイの感受性を最適化することを可能にする。
【０００９】
発明の概要 
本発明は、１つ又は複数の遺伝子に対する配列修飾プライマーを用いてサンプルに含まれるｍＲＮＡの逆転写を１回の反応で行い、配列修飾ｃＤＮＡ分子のプールを得ることを特徴とする方法を提供する。ｃＤＮＡ分子は、続いて行う増幅反応に用いるプライマーのための結合部位を変えることなく、１つ又は複数の位置のヌクレオチドを修飾する。逆転写反応の終了後に、余った配列修飾プライマーを除去又は不活性化する、即ち、続いて行う増幅反応に関与できないようにする。分析対象とした遺伝子について個別に増幅反応を行うが、各反応においては、同じ遺伝子特異的プライマーを用いて、配列修飾ｃＤＮＡからなるテンプレート及び参照ＤＮＡテンプレートを競合的に共増幅する。参照ＤＮＡテンプレートは、サンプルに存在しているか又は増幅反応を行う前にサンプルに添加したゲノムＤＮＡを含んでいる。参照ＤＮＡテンプレートは、また、合成又はクローニングしたＤＮＡを含んでいてもよい。逆転写反応によって生じた配列修飾は、ｃＤＮＡ由来の増幅産物に組み込まれ、それぞれの増幅反応において得られる、ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物と参照ＤＮＡテンプレート由来の増幅産物とを個別に検出し、それらの比を決定するために用いられる。それぞれの増幅反応において得られた、ＤＮＡに対する遺伝子特異的ｃＤＮＡの比を組み合わせて、サンプルに元々存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量を反映する、該比のサンプル特異的プロファイルを得る。
【００１０】
従って、本発明の主たる目的は、細胞又は組織のサンプルに存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量について、定量および比較評価の少なくとも一方を行うための方法であって、請求項１に記載の工程（ａ）〜（ｅ）を包含することを特徴とする方法を提供することである。本発明の方法を実施するための様々な態様を、以下に説明する。
【００１１】
発明の詳細な説明 
サンプル及び参照テンプレート 
本発明は、細胞又は組織のサンプルに存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量について、定量および比較評価の少なくとも一方を行うための方法を提供する。サンプルには、細胞又は組織の溶解物又はホモジェネートが含まれる。参照ＤＮＡテンプレートには、サンプルに存在するか又は別の原料から単離したゲノムＤＮＡ、あるいはクローニング又は合成したＤＮＡオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが含まれる。サンプルに存在するゲノムＤＮＡを参照ＤＮＡテンプレートとして用いる場合には、ＲＮＡとゲノムＤＮＡを逆転写反応の前にサンプルから単離してもよい。一方、サンプルに存在するゲノムＤＮＡを参照ＤＮＡテンプレートとして用いない場合には、ＲＮＡを逆転写反応の前にサンプルから単離する。増幅反応開始前のサンプルに、参照ＤＮＡテンプレートは存在しているか添加される。逆転写反応の間、参照ＤＮＡテンプレートはサンプル中に存在してもよいが、この場合は二本鎖でなければならない。参照ＤＮＡテンプレートがサンプルに存在するゲノムＤＮＡ以外のものである場合には、各サンプルに等量の参照ＤＮＡテンプレートを、逆転写反応の終了後で増幅反応の開始前に添加することが好ましい。
【００１２】
逆転写反応によるｃＤＮＡ配列の修飾 
サンプルに含まれるｍＲＮＡの逆転写反応は、１つ又は複数の遺伝子に対する配列修飾プライマーを用いて１回の反応で行い、配列修飾ｃＤＮＡ分子のプールを得る。参照ＤＮＡテンプレートが逆転写反応の際に反応混合物中に存在する場合には、サンプルに含まれるＤＮＡが主として二本鎖の状態を維持し、ｃＤＮＡ合成用のテンプレートとしては機能しない、非変性条件下で逆転写反応を行う。
【００１３】
配列修飾プライマー（図１）は、次の３つの機能的セグメントを含有する。
特定の遺伝子のセンス鎖ＤＮＡ配列のみならずｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列であって、続いて行う増幅反応に用いる下流側のプライマーのための結合部位に対する相補的ヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列を含む、５’−末端セグメント、
該遺伝子のセンス鎖ＤＮＡ配列のみならずｍＲＮＡ配列に非相補的である１つ又は複数のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列からなる、中央セグメント、及び
該遺伝子のセンス鎖ＤＮＡ配列のみならずｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、３’−末端セグメント。
【００１４】
上記の逆転写反応によって合成したｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡヌクレオチド配列のアンチセンス鎖と比較して１つ又は複数のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を含む配列修飾を含有する。ヌクレオチド配列の修飾は、増幅産物に組み込まれるが、続いて行う増幅反応で用いるプライマー結合部位のヌクレオチド配列には影響を及ぼさない位置に導入する。これにより、配列修飾ｃＤＮＡテンプレートとゲノムＤＮＡを含む参照ＤＮＡテンプレートとの共増幅を同じプライマーを用いて行うことが可能になる。
【００１５】
逆転写反応の終了後に行う、余った配列修飾プライマーの除去又は不活性化 
逆転写反応の終了後に、続いて行う遺伝子特異的増幅反応のプライマーとして余った配列修飾プライマーが機能することを防止する必要がある。逆転写反応工程から増幅反応工程へ移動した完全な配列修飾プライマーは、参照ＤＮＡテンプレートを増幅するためのプライミングを行うことができるので、参照ＤＮＡテンプレート由来の増幅産物の一部にヌクレオチド配列の修飾を導入してしまう。このような修飾は、逆転写反応の際にｃＤＮＡ転写産物に導入した配列修飾と同じなので、結果として参照ＤＮＡテンプレート由来の増幅産物の中に配列修飾ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物と同一であって、配列修飾ｃＤＮＡテンプレート由来増幅産物と区別できないものが含まれることとなる。よって、ｃＤＮＡ由来の増幅産物とＤＮＡ由来の増幅産物のそれぞれの相対量を測定しても、増幅反応の前にサンプルに存在する配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートのそれぞれの真の量を反映しなくなってしまう。
【００１６】
余った配列修飾プライマーは、たとえば一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼを用いて酵素分解を行うことによって、除去又は不活性化することができる、即ち、続いて行う遺伝子特異的増幅反応におけるプライマーとして機能できないようにすることができる。酵素分解により、一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーは分解されるが、サンプル内の二本鎖ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッド及び二本鎖参照ＤＮＡは完全なまま残る。また、余った配列修飾プライマーは、増幅反応を行う前に、濾過やその他の方法によってサンプルから物理的に除去することもできる。
【００１７】
逆転写反応系から遺伝子特異的増幅反応系へ移ったいかなる配列修飾プライマーについても、該配列修飾プライマーの３’−末端セグメント及び／又は中央セグメントに特異的に結合するブロッキングオリゴヌクレオチド又は他のブロッキング試薬にハイブリダイズさせることによって、プライマーとしての機能を奪うことができる。
【００１８】
配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートとの共増幅 
逆転写反応及び余った配列修飾プライマーの除去又は不活性化の後に、等量の反応混合物を個別に行う増幅反応系に移す。個別の増幅反応は、分析対象としたそれぞれの遺伝子についてそれぞれ物理的に隔離された反応容器で行うが、各反応においては、遺伝子特異的プライマーを用いて配列修飾ｃＤＮＡからなるテンプレートと、全ての反応に共通する参照ＤＮＡテンプレートとを共増幅して、測定可能な量の増幅産物を生成する。それぞれの増幅反応において、ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートは、同じプライマーを用いて競合的に共増幅する。増幅は、１回の反応で行うこともできるし、ネステッドプライマー（nested primer）を用いて２つの連続した反応で行うこともできる。同一又はほぼ同じ長さのｃＤＮＡテンプレート由来増幅産物と参照ＤＮＡテンプレート由来増幅産物とを得るために、増幅反応用プライマーのための結合部位は、同じエクソンに存在することが好ましい。増幅反応用プライマーの結合部位は、ｃＤＮＡテンプレートに導入した配列修飾がｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物に組み込まれる位置とする。配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートの共増幅を同じプライマーを用いて同じ反応で行うと、増幅反応を定常期に達するまで行っても、２つのテンプレートについての増幅反応効率は、ほぼ等しくなる。その結果、個別に行った遺伝子特異的増幅反応から得られた、配列修飾ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物と参照ＤＮＡテンプレート由来の増幅産物のそれぞれの相対レベルは、増幅反応を実施する前の増幅反応系に元々存在した配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートのそれぞれの相対量を反映する。増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、転写媒介性増幅反応や、２つの類似したテンプレートを同じ反応で競合的に共増幅することのできるその他の酵素反応などによって行うことができ、これにより、逆転写反応によってｃＤＮＡテンプレートに導入した配列修飾は、ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物に組み込まれる。
【００１９】
配列修飾ｃＤＮＡ由来の増幅産物及び参照ＤＮＡ由来の増幅産物の検出と定量 
本発明においては、ｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列中の修飾は、逆転写反応によって導入する。この配列修飾は、ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物に組み込まれ、ｃＤＮＡ由来の増幅産物を、同じ増幅反応系に存在する参照ＤＮＡテンプレート由来の増幅産物から区別するために用いられる。
【００２０】
増幅産物の定量は、増幅反応の間に行うことができ（リアルタイム検出又は動的検出）、配列特異的な二重に標識した加水分解プローブ、蛍光共鳴エネルギー移動プローブ、モレキュラービーコン（Molecular Beacon）（登録商標）プローブや、ｃＤＮＡテンプレート由来増幅産物と参照ＤＮＡテンプレート由来増幅産物を個別に定量的に検出することのできるその他の技術を用いて行うことができる。また、増幅産物の定量は、増幅反応の終了後に行うこともでき（エンドポイント検出）、ミニシークエンシング法（minisequencing）（単一ヌクレオチドプライマー伸長法）、サイクリックミニシークエンシング法（cyclic minisequencing）、ピロシークエンシング法（Pyrosequencing）（登録商標）、対立遺伝子特異的プライマー伸長法、解離曲線解析、配列特異的なハイブリダイゼーションプローブ、質量分析法や、ｃＤＮＡテンプレート由来増幅産物と参照ＤＮＡテンプレート由来増幅産物を個別に定量的に検出することのできるその他の技術を用いて行うことができる。
【００２１】
結果の解釈 
配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートの共増幅を同じプライマーを用いて同じ反応で行うと、増幅反応を定常期に達するまで行っても、２つのテンプレートについての増幅反応効率はほぼ等しくなる。その結果、個別に行った遺伝子特異的増幅反応から得られた、配列修飾ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物と参照ＤＮＡテンプレート由来の増幅産物のそれぞれの相対的なレベルは、増幅反応の間一定であり、増幅反応を実施する前の増幅反応系に元々存在した配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートのそれぞれの相対的な量を反映する。配列修飾ｃＤＮＡテンプレート由来増幅産物と参照ＤＮＡテンプレート由来増幅産物のそれぞれの量を測定し、相対的レベルを決定することによって、それぞれの増幅反応における、ＤＮＡに対する遺伝子特異的ｃＤＮＡの比が得られる。分析対象としたそれぞれの遺伝子について個別に行った増幅反応から得られた、ＤＮＡに対する遺伝子特異的ｃＤＮＡの比を組み合わせることによって、サンプル特異的プロファイルが得られる。サンプル特異的プロファイルにおける、ＤＮＡに対する遺伝子特異的ｃＤＮＡの比は、サンプルに元々存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量を反映し、分析の対象とする遺伝子のｍＲＮＡレベルのサンプル間の変動の比較分析に用いることができる。サンプルに存在するゲノムＤＮＡを参照ＤＮＡテンプレートとして用いる場合には、サンプル中の細胞由来のゲノムに存在する分析対象遺伝子のコピー数の潜在的な変動を考慮する必要がある。
【００２２】
定義 
「配列修飾プライマー」とは、特定の標的遺伝子の野生型ヌクレオチド配列と比較して、ｃＤＮＡ配列にヌクレオチド配列の修飾を誘導するために、逆転写反応に用いるオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。複数の遺伝子に対する配列修飾プライマーを１回の逆転写反応に用いて、配列修飾ｃＤＮＡ分子のプールを得ることができる。
【００２３】
「共増幅」とは、増幅産物のヌクレオチド配列が異なる、２つ又はそれ以上のｃＤＮＡテンプレート及び／又はＤＮＡテンプレートを同時に増幅することを意味する。本願でこの用語を用いて表す共増幅を行うには、増幅反応に用いる複数のテンプレートが全て、プライマー結合部位に同じヌクレオチド配列を有し、複数のテンプレートの増幅が同じ反応容器内で、同じプライマー及びその他の試薬を用いて競合的に行われることが必須である。
【００２４】
「参照ＤＮＡテンプレート」とは、それぞれの増幅反応系に存在するテンプレートであって、チューブ間の増幅効率の変動を正規化するのに役立つものを意味する。参照ＤＮＡテンプレートには、サンプルに存在するか又はサンプルに添加したゲノムＤＮＡ、あるいは分析対象としたそれぞれの遺伝子のためにクローニング又は合成したＤＮＡオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのような、遺伝子特異的テンプレートのプールが含まれる。個別の増幅反応系に存在する配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートは、同じプライマーを用いて競合的に共増幅される。遺伝子特異的な合成又はクローニングした参照ＤＮＡテンプレートを連結反応やその他の方法を用いて鎖状にし、複数の遺伝子のための普遍的な参照ＤＮＡテンプレートとして機能する一本のポリヌクレオチドを形成することができる。
【００２５】
「余った配列修飾プライマーの除去又は不活性化」とは、本発明の目的のために、余った配列修飾プライマーが、逆転写反応の後に行う遺伝子特異的増幅反応においてプライマーとして機能することを防止するために行うすべての操作を意味する。このような操作の例として、プライマーの酵素分解、サンプルからのプライマーの物理的排除、及び適当なブロッキング試薬に対するプライマーのハイブリダイゼーションを挙げることができる。
【００２６】
以下、実施例に参照しながら本発明を詳しく説明するが、これらの実施例は、本発明の目的を具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。当業者であれば、本発明の原理を様々な応用に容易に適用することができる。
【実施例１】
【００２７】
実験計画と本発明の原理の実証 
この実験は、ｃＤＮＡ／ＤＮＡ比の範囲について、アッセイの測定範囲を決めるために行った。この実験においては、単一遺伝子のｃＲＮＡから逆転写した配列修飾ｃＤＮＡの希釈系列を、Ａ）同じ遺伝子から得た、一定量のクローニングしたＤＮＡコピー、又は、Ｂ）ゲノムＤＮＡのいずれかである参照ＤＮＡテンプレートと関連づけて分析することによって、本発明の原理を実証した。
【００２８】
準備段階 
トリプシノーゲン−１ ｃＤＮＡ配列の４６番〜７１４番塩基を含むトリプシノーゲン−１ ＤＮＡクローンを、膵臓ｃＤＮＡ（Clontech 社製）からＰＣＲによって得た。得られたＤＮＡクローンの塩基配列は、ABI Prism ダイターミネーターサイクルシークエンシングコアキット（dye terminator cycle sequencing core kit）と AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ABI Prism 310 遺伝子分析装置（ABI Prism 310 genetic analyzer）（Applied Biosystems 社製）によって、両端からシークエンシングすることで調べた。トリプシノーゲン−１ ｃＲＮＡは、トリプシノーゲン−１ ＤＮＡクローンをテンプレート（Epicentre Technologies 社）として用いた in vitro の転写によって生成し、RNeasy ミニキット（RNeasy Mini Kit）（Qiagen 社製）によって精製した。腫瘍細胞は、５％のＣＯ2を含む高湿度雰囲気下において３７℃で培養した。腫瘍細胞は、１０％の熱不活化胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地の中で維持した。腫瘍細胞のゲノムＤＮＡは、ＲＮＡ／ＤＮＡミニキット（RNA/DNA Mini Kit）（Qiagen 社製）によって抽出した。
【００２９】
分析方法 
逆転写 
逆転写反応は、製造元の説明書に従って ThermoScript Ｒｎａｓｅ Ｈ- 逆転写酵素（Invitrogen 社製）を用い、反応容積を２０μｌとし、ｃＤＮＡ合成用緩衝液［５０ｍＭのトリスアセテート（ｐＨ８．４）、７５ｍＭの酢酸カリウム、４０ｍＭの酢酸マグネシウム］、５０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの配列修飾アンチセンスプライマーであって、得られるｃＤＮＡにＣからＧへの一塩基置換をもたらすもの（5'-CAC ATA GTT GTA GAC CTT GGT GTA GAC TCG AGG C）、７．５Ｕの ThermoScript RT及び５×１０9コピーのトリプシノーゲン−１ ｃＲＮＡを用いて行った。この反応系を、６５℃で５０分間インキュベートし、さらに８５℃で５分間インキュベートした。
【００３０】
エキソヌクレアーゼＩ処理 
逆転写反応の終了後、未結合の配列修飾逆転写プライマーをエキソヌクレアーゼＩ（New England Biolabs 社製）で開裂させた。エキソヌクレアーゼによる処理は、反応容積を２５μｌとし、１×制限緩衝液（６７ｍＭのグリシン−ＫＯＨ、６．７ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ９．５）中で、２０ＵのエキソヌクレアーゼＩを用いて、３７℃で６０分間行い、さらに８０℃で２０分間処理した。エキソヌクレアーゼＩで処理したｃＤＮＡは、増幅反応を行う前に、１０倍に段階希釈した。
【００３１】
ネステッドポリメラーゼ連鎖反応（Nested polymerase chain reaction） 
各５μｌの希釈した逆転写産物を、Ａ）１０3コピーのトリプシノーゲン−１ ＤＮＡクローン、又は、Ｂ）５００個の腫瘍細胞から得たゲノムＤＮＡと共に増幅した。１回目のＰＣＲは、反応容積を４５μｌとし、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌのセンスプライマー（5'-TGA TTC TGG TGG CCC TGT-3'）とアンチセンスプライマー（CAC ATA GTT GTA GAC CTT GGT G）及び２Ｕの Dynazyme II ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes 社製）を含む１×ＰＣＲ緩衝液［１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％の Triton X-100；Finnzymes 社製］中で、初めにテンプレートを９５℃で５分間変性し、続いて９５℃で１分間と５５℃で１分間の条件でテンプレートを増幅するサイクルを３５回行った。このようにして得た１回目のＰＣＲ産物の３μｌを、反応容積を７５μｌとし、７．６ｐｍｏｌのビオチン化ネステッドセンスプライマー（BIO-5'-CTG GTG GCC CTG TGG TCT-3'）と、７６ｐｍｏｌのネステッドアンチセンスプライマー（5'-AGA CCT TGG TGT AGA CTC-3'）とを用い、１回目のＰＣＲと同じプログラムで２回目のＰＣＲを行った。この実験には、３種の対照、具体的には、１０3コピーのトリプシノーゲン−１ ＤＮＡクローン、５００個の細胞から得たゲノムＤＮＡ、及び１０9コピーのトリプシノーゲン−１ ｃＲＮＡから逆転写した配列修飾ｃＤＮＡも含めた。非特異的増幅による産物を排除するために、最終的に得られたＰＣＲ産物の１５μｌ等量を１．５％のアガロースゲル中で分離し、臭化エチジウムで染色した。
【００３２】
ミニシークエンシング法による定量 
配列修飾ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物と参照ＤＮＡテンプレート由来の増幅産物を、3Ｈ−標識ヌクレオチドを用いた固相ミニシークエンシング反応［Syvanen et al., Genomics (1990) 8:684-692; Ihalainen et al., Biotechniques (1994) 16:938-943; Suomalainen and Syvanen, Methods Mol. Biol. (1998) 86:121-131］の変法によって検出した。ＰＣＲ増幅反応に続いて、１０μｌのＰＣＲ産物を、４０μｌの緩衝液［０．１５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）と０．１％の Tween-20］の入った、ストレプトアビジンで被覆したシンチレーションミクロタイタープレート（streptavidin-coated scintillating microtitration plate）（Perkin-Elmer Wallac 社製）のウェルに捕捉した。このために、サンプルを室温で１時間、穏やかな振とう下でインキュベートし、その後プレートを、４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％の Tween-20 を含む緩衝液を用いて、自動マイクロプレート洗浄器（Tecan 96 PW）で４回洗浄した。プレートに結合したＰＣＲ産物を、５０ｍＭのＮａＯＨを１μｌ用いて室温で５分間変性した。その後、各ウェルを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄した。
【００３３】
検出用プライマー（5'-GTA GAC CTT GGT GTA GAC TC-3'）を０．２μＭの濃度で含み、適当な3Ｈ ｄＮＴＰ（参照ＤＮＡテンプレート由来の増幅産物のためのｄＣＴＰと、配列修飾ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物のためのｄＧＴＰ）（Amersham Biosciences 社製）を０．０２μＭの濃度で含み、さらに１００μｌの１×ＰＣＲ緩衝液の中に入った０．５Ｕの Dynazyme ＤＮＡポリメラーゼを含む、ミニシークエンシング反応用の混合物を各ウェルに添加した。各ウェルを、穏やかな振とう下、５５℃で１５分間インキュベートした。その後、各ウェルを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、取り込まれた放射能をベータカウンターである MicroBeta（EG&G Wallac 社製）を用いて測定し、１分間当たりのカウント数（ＣＰＭ）で表した。対照に由来する増幅産物は、４つの異なる3Ｈ ｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ）を用いてミニシークエンシングした。それぞれのサンプルについてのミニシークエンシング分析は、各ヌクレオチドについて同様の実験を２回行った。
【００３４】
結果 
アッセイの測定範囲を決定するために、１０9コピーのトリプシノーゲン−１ ｃＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡと参照ＤＮＡテンプレート（１０3コピーのクローニングしたトリプシノーゲン−１ ＤＮＡ、又は５００個の細胞から得たゲノムＤＮＡ）の１０倍希釈系列を共増幅した。すべてのネステッドＰＣＲ増幅反応を定常期に達するまで行った。アッセイの測定範囲は２桁を超える範囲、即ち、ＤＮＡに対するｃＤＮＡの理論比が１：１よりも小さい値（１０3コピーのクローニングしたＤＮＡ又は５００個の細胞から得たゲノムＤＮＡに対して、１０3コピーのｃＤＮＡ）から１００：１を超える値（１０3コピーのクローニングしたＤＮＡ又は５００個の細胞から得たゲノムＤＮＡに対して、１０5コピーのｃＤＮＡ）にまで及んでいた。ｃＤＮＡテンプレートの理論上のコピー数は、逆転写反応の効率が１００％であると仮定して算出した（図３参照）。
【００３５】
ミニシークエンシングアッセイにより、トリプシノーゲン−１ ｃＤＮＡ、クローニングしたトリプシノーゲン−１ ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを個別に増幅して得られた産物における、配列中の１ヌクレオチドの違いを正確に識別することができた。トリプシノーゲン−１ ｃＤＮＡ由来の増幅産物は、3Ｈ標識ｄＧＴＰを用いて検出し、トリプシノーゲン−１ ＤＮＡ由来の増幅産物とゲノムＤＮＡ由来の増幅産物は、3Ｈ標識したｄＣＴＰを用いて検出した。ミニシークエンシング検出用プライマーによるミスプライミングは、すべての増幅産物を3Ｈ標識ｄＡＴＰ及び3Ｈ標識ｄＴＴＰを用いてミニシークエンシングすることによって排除した（図４参照）。
【実施例２】
【００３６】
実験デザインと本発明の原理の実証 
この実験は、細胞系における遺伝子発現プロファイルを分析するためのアッセイの再現性を調べるために行った。この実験においては、５つの遺伝子［マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体、及びｐ５３］のＣＯＬＯ ２０５ヒト結腸腺癌細胞における発現プロファイルの分析を、次のように行った。まず、ＣＯＬＯ ２０５細胞から抽出したｍＲＮＡの多重的な逆転写（multiplexed reverse transcription）を、上記の５つの遺伝子のそれぞれに対する配列修飾プライマーを用いて行った。次に、遺伝子特異的増幅反応を個別に行った。それぞれの増幅反応においては、配列修飾ｃＤＮＡと参照ＤＮＡテンプレートとして機能するゲノムＤＮＡとを、同じ遺伝子特異的プライマーを用いて競合的に共増幅した。配列修飾ｃＤＮＡ由来の増幅産物と、ゲノムＤＮＡ由来の増幅産物とを、サイクリックミニシークエンシング法［Jarvelainen et al., Hepatology (2001), 33:1148-1153］によって検出して定量した。個別に行った増幅反応で得られた、ＤＮＡに対する遺伝子特異的ｃＤＮＡの比を組み合わせて、サンプルに元々存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量を反映する、上記の比のプロファイルを得た。
【００３７】
準備段階 
ＣＯＬＯ ２０５細胞（米国、メリーランド州、ロックビル、アメリカンタイプカルチャーコレクション）は、５％のＣＯ2を含む高湿度雰囲気下において３７℃で培養した。細胞は、１０％の熱不活化胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地の中で維持した。それぞれの実験において、Oligotex Direct ｍＲＮＡキット（Oligotex Direct mRNA Kit）（Qiagen 社製）によってＣＯＬＯ ２０５細胞から抽出した同じｍＲＮＡサンプルを用いた。ヒトゲノムＤＮＡは、Roche Diagnostic 社（ドイツ国、マンハイム）から購入した。
【００３８】
分析方法 
逆転写 
逆転写反応は、製造元の説明書に従って SuperScript II 逆転写酵素（Invitrogen 社製）を用いて行った。反応容積を１２μｌとし、初めに、得られるｃＤＮＡにＡからＧへの一塩基置換（下線部分）［5'-GGG AAT GGT TGA AGG GAG GGG CGG GGA G-3'（ＭＭＰ−２)、5'-AAA GGT TAG AGA ATC CAA GTT TGT TAG A-3'（ＭＭＰ−９)、5'-ATT CAG TGT AAG GAG TGG TCC TCG CCC CA-3'（ｕＰＡ)、5'-CAA CAC AAC AGC GGC AAC AAT ATT GAT AAT（ｕＰＡＲ)、5'-AAG GGT GGG GTG AAA ATG CGG ATG T-3'（ｐ５３）］をもたらす、２ｐｍｏｌの各配列修飾アンチセンスプライマーを、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、及び１０5個のＣＯＬＯ ２０５細胞から抽出したｍＲＮＡと混合し、６５℃で５分間インキュベートした。この後、反応容積を２０μｌとし、１０ｍＭのＤＴＴ及び２００Ｕの SuperScript RT を含むファーストストランド緩衝液（first-strand buffer）［５０ｍＭのトリスアセテート（ｐＨ８．３）、７５ｍＭの酢酸カリウム、３ｍＭの塩化マグネシウム］を用いて、４２℃で５０分間、逆転写反応を継続した。この後、７０℃で１５分間加熱することにより、逆転写反応を不活化した。
【００３９】
エキソヌクレアーゼＩ処理 
逆転写反応の終了後、未結合の配列修飾逆転写プライマーをエキソヌクレアーゼＩ（New England Biolabs 社製）で分解した。エキソヌクレアーゼＩによる処理は、反応容積を２５μｌとし、１×制限緩衝液（６７ｍＭのグリシン−ＫＯＨ、６．７ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ９．５）中で、２０ＵのエキソヌクレアーゼＩを用いて、３７℃で６０分間行い、さらに８０℃で２０分間処理した。
【００４０】
ポリメラーゼ連鎖反応 
２．５μｌの逆転写産物を２ｎｇのヒトゲノムＤＮＡと共に、個別の遺伝子特異的増幅反応によって増幅した。それぞれの増幅反応においては、反応容積を２５μｌとし、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌのセンスプライマー［5'-CTG GAT GGA GGA AAA CCA AG-3'（ＭＭＰ−２）、5'-TGG GCC CTC TCT TCT CA-3'（ＭＭＰ−９）、5'-TTG GCC AGT TAT CCC TTC-3'（ｕＰＡ）、5'-GAA GAG AAA AGC TGG AGG AAG G-3'（ｕＰＡＲ）、又は 5'-TGG AGC TGG AAG GGT CAA-3'（ｐ５３）］及び２０ｐｍｏｌのアンチセンスプライマー［5'-GGG AAT GGT TGA AGG GAG-3'（ＭＭＰ−２）、5'-AAA GGT TAG AGA ATC CAA GTT-3'（ＭＭＰ−９）、5'-ATT CAG TGT AAG GAG TGG TC-3'（ｕＰＡ）、5'-CAA CAC AAC AGC GGC AAC AA-3'（ｕＰＡＲ）、又は 5'-AAG GGT GGG GTG AAA ATG-3'（ｐ５３）］及び２Ｕの Dynazyme II ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes 社製）を含む１×ＰＣＲ緩衝液［１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％の Triton X-100；Finnzymes 社製］中で、初めにテンプレートを９５℃で５分間変性し、続いて９５℃で１分間と５５℃で１分間の条件でテンプレートを増幅するサイクルを３５回行った。ｍＲＮＡサンプルのｃＤＮＡによるコンタミネーションは、各々のサンプルに対して逆転写酵素を用いない対照反応を行うことによって排除した。非特異的増幅による産物を排除するために、得られたＰＣＲ産物の１５μｌ等量を２％のアガロースゲル中で分離し、臭化エチジウムで染色した。
【００４１】
ミニシークエンシング法による定量 
配列修飾ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物とゲノムＤＮＡテンプレート由来の増幅産物を、Jarvelainen et al.（Hepatology, 2001, 33:1148-1153）のサイクリックミニシークエンシング法、即ち、3Ｈ−標識ヌクレオチドを用いた固相ミニシークエンシング法［Syvanen et al., Genomics (1990), 8:684-692; Ihalainen et al., Biotechniques (1994), 16:938-943; Suomalainen and Syvanen, Methods Mol. Biol. (1998), 86:121-131］に少し変更を加えた変法によって検出した。ＰＣＲ増幅反応に続いて、ＰＣＲ反応系に１Ｕのエビアルカリホスファターゼ（Roche 社製）と５ＵのエキソヌクレアーゼＩを直接添加することによって、未反応の各ｄＮＴＰとプライマーを除去した。ｄＮＴＰとプライマーの分解は３７℃で３０分間行い、その後で、８０℃で１５分間のインキュベーションによって酵素を失活させた。酵素処理したＰＣＲ産物を、２２０μｌの水とともに、YM-30 フィルターユニット（二本鎖ＤＮＡのカットオフ値：５０ｂｐ）を備えた Microcon-96 YM フィルターアッセンブリー（Microcon-96 YM filtrate assembly）を用いて濾過し、続いて２５０μｌの水で２回洗浄した。保持液（retentate）を遠心分離によって回収し、その量を５０μｌに調整した。濾過したＰＣＲ産物の４等量（各５μｌ）を、サイクリックミニシークエンシング反応用試薬の入った、９６穴ＰＣＲプレート（Thermo-Fast 96）（英国、サリー州、エプソム、Abgene 社製）に移した。プレートのウェルには、３ｐｍｏｌのビオチン化サイクリックミニシークエンシングプライマー［5'Biotin-TTC CCG CTC AGC CCT CCC-3'（ＭＭＰ−２）、5'Biotin-TTG TTT TTT GTT GGA GTG TTT CTA A-3'（ＭＭＰ−９）、5'Biotin-CCA ATC CTC ACT GGG TGG GG-3'（ｕＰＡ）、5'Biotin-ATG GGA GAG CTC TTG TTA TTA T-3'（ｕＰＡＲ）、又は 5'Biotin-TTT TAC ATT CTG CAA GCA CAT C-3'（ｐ５３）］、２ｐｍｏｌの3Ｈ−標識ヌクレオチドであるｄＣＴＰ又はｄＴＴＰ、及び０．５Ｕの Dynazyme ＤＮＡポリメラーゼを含む、１５μｌの Dynazyme 緩衝液が入っていた。
【００４２】
上記のプレートをアルミニウム製のシーリング用テープ［粘着性ＰＣＲホイルシール（Adhesive PCR Foil Seal）、Abgene 社製］で被覆し、サイクリックプライマー伸長反応を、９６℃で１０秒間と５７℃で１０秒間の条件下で５０サイクル行った。この後、サイクリックミニシークエンシング反応系の全てを、２０μｌの緩衝液［０．１５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）と０．１％の Tween-20］の入った、ストレプトアビジンで被覆したシンチレーションミクロタイタープレート（Perkin-Elmer Wallac 社製）のウェルに移した。サンプルを室温で１時間、穏やかな振とう下でインキュベートし、その後プレートを、まずＴＥＮＴ緩衝液［４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌと０．１％の Tween-20］を用いて自動マイクロプレート洗浄器（Tecan 96 PW）で洗浄し、次に５０ｍＭのＮａＯＨを用いて室温で５分間洗浄し、さらに、再びＴＥＮＴ緩衝液を用いて洗浄した。取り込まれた放射能をベータカウンターである MicroBeta（EG&G Wallac 社製）を用いて測定し、１分間当たりのカウント数（ＣＰＭ）で表した。それぞれのサンプルについてのミニシークエンシング分析は、それぞれの標識ヌクレオチドについて同様の実験を２回行った。
【００４３】
結果 
図５及び図６に示すように、アッセイは再現可能である。平均値及び標準誤差は、ＭＭＰ−２についてはそれぞれ１３．５及び２．４であり、ＭＭＰ−９についてはそれぞれ１．７及び０．８であり、ｕＰＡについてはそれぞれ８．５及び０．７であり、ｕＰＡＲについてはそれぞれ３１．２及び２．５であり、ｐ５３についてはそれぞれ４８．１及び２．９であった（図６参照）。
【実施例３】
【００４４】
実験計画と本発明の原理の実証 
この実験は、ｃＤＮＡ／ＤＮＡ比の範囲について、アッセイの測定範囲を決めるために行った。この実験においては、単一遺伝子のｃＲＮＡから逆転写した配列修飾ｃＤＮＡの希釈系列を、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（約１０4コピーの各遺伝子に相当する）である参照ＤＮＡテンプレートと関連づけて分析することによって、本発明の原理を実証した。ＰＣＲは LightCycler 装置（LightCycler instrument）（Roche Applied Science 社製）を用いて行い、配列修飾ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物とゲノムＤＮＡテンプレート由来の増幅産物を、LightCycler 装置を用いた解離曲線解析によって検出し定量した。
【００４５】
準備段階 
全長トリプシノーゲン−２ ｃＤＮＡクローンと全長ＭＭＰ−２ ｃＤＮＡクローンは、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。ｃＤＮＡクローンの塩基配列は、ABI Prism ダイターミネーターサイクルシークエンシングコアキットと AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ABI Prism 310 遺伝子分析装置（Applied Biosystems 社製）によって、両端からシークエンシングすることで調べた。トリプシノーゲン−２ ｃＲＮＡとＭＭＰ−２ ｃＲＮＡは、それぞれトリプシノーゲン−２ ｃＤＮＡクローンとＭＭＰ−２ ｃＤＮＡクローンをテンプレート（Epicentre Technologies 社）として用いた in vitro の転写によって生成し、RNeasy ミニキット（Qiagen 社製）によって精製した。
【００４６】
分析方法 
逆転写 
逆転写反応は、製造元の説明書に従って DyNAmo Capillary SYBR Green 2-step ｑＲＴ−ＰＣＲキット（DyNAmo Capillary SYBR Green 2-step qRT-PCR Kit）（Finnzymes 社製）を用いて行い、配列修飾アンチセンスプライマーとしては、得られるｃＤＮＡにＡからＧ又はＴからＣへの５個（トリプシノーゲン−２）又は６個（ＭＭＰ−２）の塩基置換（下線部分）をもたらすもの［5'-CCA CAC AGA ACA TGT TGC TGG CGG CCC TTC CA-3'（トリプシノーゲン−２）、及び 5'-GAA GAG ACT CGG TAG GGA CAC GCC GGG CGG AGT GA-3'（ＭＭＰ−２）］を使用し、テンプレートとしては、５×１０9コピーのトリプシノーゲン−２ ｃＲＮＡ又はＭＭＰ−２ ｃＲＮＡを使用した。
【００４７】
エキソヌクレアーゼＩ処理 
逆転写反応の終了後、未結合の配列修飾逆転写プライマーをエキソヌクレアーゼＩ（New England Biolabs 社製）で分解した。エキソヌクレアーゼＩによる処理は、反応容積を２５μｌとし、１×制限緩衝液（６７ｍＭのグリシン−ＫＯＨ、６．７ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ：９．５）中で、２０ＵのエキソヌクレアーゼＩを用いて、３７℃で６０分間行い、さらに８０℃で２０分間処理した。エキソヌクレアーゼＩで処理したｃＤＮＡは、増幅反応を行う前に、１０倍に段階希釈した。
【００４８】
ポリメラーゼ連鎖反応 
各２．５μｌの希釈した、エキソヌクレアーゼＩ処理済の逆転写産物を、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡと共に、個別の遺伝子特異的増幅反応によって増幅した。それぞれの増幅反応においては、製造元の説明書に従って DyNAmo Capillary SYBR Green 2-step ｑＲＴ−ＰＣＲキット（Finnzymes 社製）を用い、プライマーとしては、5'-GCC AGG CTA AGT GTG AAG-3'（トリプシノーゲン−２のセンスプライマー）、5'-CCA CAC AGA ACA TGT TGC T-3'（トリプシノーゲン−２のアンチセンスプライマー）、5'-CTG GAT GGA GGA AAA CCA AG-3'（ＭＭＰ−２のセンスプライマー）、及び 5'-GGG AAT GGT TGA AGG GAG-3'（ＭＭＰ−２のアンチセンスプライマー）を用いて、３０サイクル行った。ＰＣＲの各サイクルにおいて、LightCycler 装置（Roche Applied Science 社製）を用い、９５℃（１５秒間保持）で変性し、５７℃（１分間保持）でアニーリングした。温度変化速度は２０℃／ｓであり、アニーリングの終了時に蛍光を測定した。ｍＲＮＡサンプルのｃＤＮＡによるコンタミネーションは、各々のサンプルに対して逆転写酵素を用いない対照反応を行うことによって排除した。非特異的増幅による産物を排除するために、得られたＰＣＲ産物の１５μｌ等量を２％のアガロースゲル中で分離し、臭化エチジウムで染色した。
【００４９】
解離曲線の作製と解析 
配列修飾ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物とゲノムＤＮＡテンプレート由来の増幅産物を、増幅反応の直後に、LightCycler 装置を用いた解離曲線解析によって検出し定量した。具体的には、増幅反応の次にさらに９５℃（０秒保持）の変性反応を行い、２０℃／ｓの冷却速度で５７℃まで温度を下げ、０．１℃／ｓの加温速度で９８℃まで温度を上げることによって解離曲線を連続的に作成した。微分解離曲線用のプロットを得るためには、LightCycler のソフトウェアの初期設定を使用した。
【００５０】
結果 
得られるｃＤＮＡにＡからＧ又はＴからＣへの５個又は６個の塩基置換をもたらす配列修飾プライマーを用いることによって、解離温度に約４℃の違いがある、ｃＤＮＡ由来の増幅産物とゲノムＤＮＡ由来の増幅産物を解離曲線解析によって検出し定量することができた。アッセイの測定範囲を決定するために、１０9コピーのトリプシノーゲン−２ ｃＲＮＡ又はＭＭＰ−２ ｃＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡの１０倍希釈系列を、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡと共に増幅した。トリプシノーゲン−２のアッセイの測定範囲は２桁を超える範囲、即ち、ＤＮＡに対するｃＤＮＡの理論比が１０：１よりも小さい値［２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（約１０4コピーの遺伝子に相当）に対して、１０5コピーのｃＤＮＡ］から１０００：１を超える値［２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（約１０4コピーの遺伝子に相当）に対して、１０7コピーのｃＤＮＡ］にまで及んでいた。また、ＭＭＰ−２のアッセイの測定範囲は２桁を超える範囲、即ち、ＤＮＡに対するｃＤＮＡの理論比が１：１０よりも小さい値［２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（約１０4コピーの遺伝子に相当）に対して、１０3コピーのｃＤＮＡ］から１０：１を超える値［２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（約１０4コピーの遺伝子に相当）に対して、１０5コピーのｃＤＮＡ］にまで及んでいた。ｃＤＮＡテンプレートの理論上のコピー数は、逆転写反応の効率が１００％であると仮定して算出した（図７参照）。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】配列修飾プライマーの機能的セグメントを示す概略図。
【図２】本発明の原理を示す概略図。参照ＤＮＡテンプレートは、図に示すように、逆転写反応工程に存在していてもよいし（最上のパネル参照）、また、増幅反応工程を行う前に添加してもよい。検出工程（最下のパネル参照）においては、具体例として二重標識ハイブリダイゼーションプローブを図示した。しかし、本発明は、特定の検出技術に基づくものではなく、ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物と参照ＤＮＡテンプレート由来の増幅産物のそれぞれの量を個別に測定できる方法であれば、どのような方法でも用いることができる。
【図３】ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートの相対レベルを決定するためのアッセイの測定範囲。１０9コピーのトリプシノーゲン−１ ｃＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡの１０倍希釈系列と、１０3コピーのクローニングしたトリプシノーゲンＤＮＡ（上方の２つのパネル）又は５００個の細胞から得たゲノムＤＮＡ（下方の２つのパネル）とを、ネステッドＰＣＲ反応によって共増幅した。配列修飾ｃＤＮＡ由来の増幅産物とゲノムＤＮＡ由来の増幅産物を、固相ミニシークエンシング法を用いて検出し定量した。アッセイの測定範囲は２桁を超える範囲に及んだ（右辺のパネルにおける黒色によって示す）。ｃＤＮＡテンプレートの理論上のコピー数は、逆転写反応の効率が１００％であると仮定して算出した。
【図４】ミニシークエンシング法を用いたアッセイの、テンプレート間の１ヌクレオチドの違いを識別する能力。トリプシノーゲン−１ ｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物（上のパネル）、クローニングしたトリプシノーゲン−１ ＤＮＡ由来のＰＣＲ産物（中央のパネル）、及び腫瘍細胞から得たゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物（下のパネル）について、４つの異なる3Ｈ−標識ヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ）を用いてミニシークエンシングを行った。
【図５】培養細胞の遺伝子発現プロファイルを分析するためのアッセイの再現性。培養したＣＯＬＯ ２０５細胞の５つの遺伝子（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ及びｐ５３）の発現プロファイルを、２箇月間に亘る５つの個別実験によって分析した。それぞれの実験においては、５つの遺伝子のそれぞれについて得られたｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ比を、それらの合計が１００になるように調整した。
【図６】培養細胞における遺伝子の発現プロファイルを分析するためのアッセイの再現性。培養したＣＯＬＯ ２０５細胞の５つの遺伝子（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ及びｐ５３）の発現プロファイルを、２箇月間に亘る５つの個別実験によって分析した。結果は、５つの個別実験から得た平均値（±標準誤差１）を表す。それぞれの実験においては、５つの遺伝子のそれぞれについて得られたｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ比を、それらの合計が１００になるように調整した。
【図７】ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートのそれぞれの相対レベルを決定するためのアッセイの測定範囲。１０9コピーのトリプシノーゲン−２ ｃＲＮＡ（上方のパネル）又はマトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）ｃＲＮＡ（下方のパネル）から逆転写したｃＤＮＡの１０倍希釈系列と、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡとを、LightCycler 装置を用いたＰＣＲ反応によって共増幅した。配列修飾ｃＤＮＡテンプレート由来の増幅産物とゲノムＤＮＡテンプレート由来の増幅産物の定量を、LightCycler 装置を用いた解離曲線解析によって行った。アッセイの測定範囲は２桁を超える範囲に及んだ（右辺のパネルにおける黒色によって示す）。ｃＤＮＡテンプレートの理論上のコピー数は、逆転写反応の効率が１００％であると仮定して算出した。
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
配列番号１：配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号２：センスプライマー
配列番号３：アンチセンスプライマー
配列番号４：ネステッドセンスプライマー
配列番号５：ネステッドアンチセンスプライマー
配列番号６：検出用プライマー
配列番号７：ＭＭＰ−２に対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号８：ＭＭＰ−９に対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号９：ｕＰＡに対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号１０：ｕＰＡＲに対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号１１：ｐ５３に対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号１２：ＭＭＰ−２に対するセンスプライマー
配列番号１３：ＭＭＰ−９に対するセンスプライマー
配列番号１４：ｕＰＡに対するセンスプライマー
配列番号１５：ｕＰＡＲに対するセンスプライマー
配列番号１６：ｐ５３に対するセンスプライマー
配列番号１８：ＭＭＰ−９に対するアンチセンスプライマー
配列番号１９：ｕＰＡに対するアンチセンスプライマー
配列番号２０：ｕＰＡＲに対するアンチセンスプライマー
配列番号２１：ｐ５３に対するアンチセンスプライマー
配列番号２２：ＭＭＰ−２に対するビオチン化サイクリックミニシークエンシング
プライマー
配列番号２３：ＭＭＰ−９に対するビオチン化サイクリックミニシークエンシング
プライマー
配列番号２４：ｕＰＡに対するビオチン化サイクリックミニシークエンシングプライマー
配列番号２５：ｕＰＡＲに対するビオチン化サイクリックミニシークエンシング
プライマー
配列番号２６：ｐ５３に対するビオチン化サイクリックミニシークエンシングプライマー
配列番号２７：トリプシノーゲン−２に対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号２８：ＭＭＰ−２に対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号２９：トリプシノーゲン−２に対するセンスプライマー
配列番号３０：トリプシノーゲン−２に対するアンチセンスプライマー
配列番号３１：ＭＭＰ−２に対するセンスプライマー
配列番号３２：ＭＭＰ−２に対するアンチセンスプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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