(57)【要約】本発明は、８−アミノ−アデノシン及びその変異体を用いて多剤耐性悪性疾患を含む血液悪性疾患を治療する方法を提供する。本発明には、血液悪性疾患と診断された患者のヌクレオシドアナログによる治療に対する応答を予測する方法と、血液悪性疾患を治療する有効性に関して候補薬剤をスクリーニングする方法も包含される。一実施形態において、８−アミノ−アデノシンは、骨髄腫関連症状、例えば、高カルシウム血症、骨粗鬆症、溶解性骨病変、骨痛、原因不明の骨折、貧血、腎損傷、アミロイドーシス、びまん性慢性感染、体重減少、悪心、食欲不振及び精神錯乱の改善又は予防のために、骨髄腫と診断された患者に投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又はそれ以上のＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ａｋｔキナーゼ及びその下流シグナル伝達分子のリン酸化の実質的な低下を達成するのに十分な期間及び用量にてヌクレオシドアナログ剤を投与する工程を含む、血液悪性疾患と診断された被験体を治療する方法。
【請求項２】
前記ヌクレオシドアナログ剤が８−アミノ−アデノシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液悪性疾患が、白血病、リンパ腫又は骨髄腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が、前記血液悪性疾患からの寛解期にあって再発した、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記血液悪性疾患が骨髄腫である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記骨髄腫が、前記被験体の骨髄中の形質細胞数の増加をもたらす、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記形質細胞が骨髄腫細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記骨髄腫細胞が多剤耐性である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体の尿中のベンス・ジョーンズ蛋白質を分析する工程を更に含み、ベンス・ジョーンズ蛋白質の減少又は欠如が前記骨髄腫の有効な治療であることを示す、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベンス・ジョーンズ蛋白質の減少が、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約１０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約２０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約３０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約４０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約５０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約６０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約７０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約８０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約９０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約９５％の減少又は被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約９９％の減少である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体の血清蛋白をＭ蛋白質に関して分析する工程を更に含み、Ｍ蛋白質の減少又は欠如が骨髄腫の有効な治療であることを示す、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｍ蛋白質の減少が、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約１０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約２０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約３０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約４０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約５０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約６０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約７０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約８０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約９０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約９５％の低下又は被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約９９％の低下である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｍ蛋白質の欠如が免疫固定によって判定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記血清蛋白が血清電気泳動によって分析される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
骨髄腫の有効な治療を示す形質細胞数の減少を確認するため、前記被験体の骨髄に対して生検を実施する工程を更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記生検が、形質細胞数の少なくとも約５％の減少、形質細胞数の少なくとも約１０％の減少、形質細胞数の少なくとも約２０％の減少、形質細胞数の少なくとも約３０％の減少、形質細胞数の少なくとも約４０％の減少、形質細胞数の少なくとも約５０％の減少、形質細胞数の少なくとも約６０％の減少、形質細胞数の少なくとも約７０％の減少、形質細胞数の少なくとも約８０％の減少、形質細胞数の少なくとも約９０％の減少、形質細胞数の少なくとも約９５％の減少又は形質細胞数の少なくとも約９９％の減少を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記期間が、２ヶ月間で少なくとも１週間、１週あたり少なくとも１回である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記期間が、２ヶ月間で少なくとも２週間、１週あたり少なくとも１回である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記期間が、２ヶ月間で少なくとも１週間、１週あたり少なくとも５日である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記用量が少なくとも約５００〜２５００ｍｇ／ｍ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレオシドアナログ剤が静脈内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヌクレオシドアナログ剤が経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヌクレオシドアナログ剤の投与が、骨髄腫に関連する症状又は病状を改善又は予防する、請求項５に記載の方法。
【請求項２４】
前記症状又は病状が、高カルシウム血症、骨粗鬆症、溶解性骨病変、骨痛、原因不明の骨折、貧血、腎損傷、アミロイドーシス、びまん性慢性感染、体重減少、悪心、食欲不振及び精神錯乱から成る群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１から２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
血液悪性疾患に罹患した患者におけるヌクレオシドアナログ剤の有効性を治療前に予測する方法であって、
ａ）該患者から細胞を単離する工程と、
ｂ）単離した細胞を該ヌクレオシドアナログ剤で処理する工程と、
ｃ）１つ又はそれ以上の蛋白質であるＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２及びＡｋｔキナーゼ並びにその下流シグナル伝達分子のリン酸化を測定する工程と
を含み、リン酸化の低下が該ヌクレオシドアナログ剤に対する良好な臨床反応を示す、方法。
【請求項２８】
前記細胞が骨髄から単離された形質細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヌクレオシドアナログ剤が８−アミノ−アデノシンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記形質細胞の細胞増殖速度を測定する工程を更に含み、該形質細胞の細胞増殖速度の安定化又は低下は、前記患者が前記ヌクレオシドアナログ剤に良好に反応することを示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記形質細胞の細胞増殖速度を骨髄から単離した正常細胞の細胞増殖速度と比較する工程を更に含み、該正常細胞と比較した形質細胞の細胞増殖の低下は、前記患者が前記ヌクレオシドアナログ剤に良好に反応することを示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記リン酸化の低下が、ヌクレオシドアナログ剤で処理されなかった同一蛋白質のリン酸化より少なくとも約１０％少なく、ヌクレオシドアナログ剤で処理されなかった同一蛋白質のリン酸化より少なくとも約２０％少なく、ヌクレオシドアナログ剤で処理されなかった同一蛋白質のリン酸化より少なくとも約３０％少なく、ヌクレオシドアナログ剤で処理されなかった同一蛋白質のリン酸化より少なくとも約４０％少なく、ヌクレオシドアナログ剤で処理されなかった同一蛋白質のリン酸化より少なくとも約５０％少なく、ヌクレオシドアナログ剤で処理されなかった同一蛋白質のリン酸化より少なくとも６０％少なく、ヌクレオシドアナログ剤で処理されなかった同一蛋白質のリン酸化より少なくとも７０％少なく、ヌクレオシドアナログ剤で処理されなかった同一蛋白質のリン酸化より少なくとも８０％少なく、ヌクレオシドアナログ剤で処理されなかった同一蛋白質のリン酸化より少なくとも９０％少なく、或いはヌクレオシドアナログ剤で処理されなかった同一蛋白質のリン酸化より少なくとも１００％少ない、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記リン酸化の低下が内在性ＡＴＰレベルの喪失に起因しない、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記蛋白質が蛋白質レベルの変化を受けない、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
ＰＰ２Ａのホスファターゼ活性を測定する工程を更に含み、ＰＰ２Ａのホスファターゼ活性の上昇は、前記患者が前記ヌクレオシドアナログ剤に良好に反応することを示す、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記形質細胞のアポトーシスを測定する工程を更に含み、アポトーシスの増加は、前記患者が前記ヌクレオシドアナログ剤に良好に反応することを示す、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
カスパーゼの活性化を検出する工程を更に含み、カスパーゼの活性化は、前記患者が前記ヌクレオシドアナログ剤に良好に反応することを示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
多発性骨髄腫を治療する有効性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）該化合物で骨髄腫細胞を処理する工程と、
ｂ）１つ又はそれ以上の蛋白質であるＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２及びＡｋｔキナーゼ並びにその下流シグナル伝達分子のリン酸化を測定する工程と
を含み、該１つ又はそれ以上の蛋白質のリン酸化の低下が多発性骨髄腫に対する有効な治療であることを示す方法。
【請求項３９】
ＰＰ２Ａのホスファターゼ活性を測定する工程を更に含み、ホスファターゼ活性の上昇が多発性骨髄腫に対する有効な治療であることを示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記骨髄腫細胞のアポトーシスを測定する工程を更に含み、アポトーシスの増加が多発性骨髄腫に対する有効な治療であることを示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記骨髄腫細胞の細胞増殖を測定する工程を更に含み、細胞増殖の低下が多発性骨髄腫に対する有効な治療であることを示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
カスパーゼの活性化を検出する工程を更に含み、カスパーゼの活性化が多発性骨髄腫の有効な治療であることを示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記骨髄腫細胞が多剤耐性骨髄腫細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記骨髄腫細胞がステロイド耐性骨髄腫細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
治療有効量の８−アミノ−アデノシンを投与する工程を含む、血液悪性疾患と診断された被験体を治療する方法。
【請求項４６】
前記血液悪性疾患が骨髄腫である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記被験体が、前記骨髄腫からの寛解期にあって再発した、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記骨髄腫が多剤耐性である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験体の尿中のベンス・ジョーンズ蛋白質を分析する工程を更に含み、ベンス・ジョーンズ蛋白質の減少又は欠如が前記骨髄腫の有効な治療であることを示す、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記ベンス・ジョーンズ蛋白質の減少が、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約１０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約２０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約３０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約４０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約５０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約６０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約７０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約８０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約９０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約９５％の減少又は被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約９９％の減少である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験体の血清蛋白をＭ蛋白質に関して分析する工程を更に含み、Ｍ蛋白質の減少又は欠如が骨髄腫の有効な治療であることを示す、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｍ蛋白質の減少が、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約１０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約２０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約３０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約４０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約５０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約６０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約７０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約８０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約９０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約９５％の低下又は被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約９９％の低下である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記Ｍ蛋白質の欠如が免疫固定によって判定される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記血清蛋白が血清電気泳動によって分析される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
骨髄腫の有効な治療を示す形質細胞数の減少を確認するため、前記被験体の骨髄に対して生検を実施する工程を更に含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
前記生検が、形質細胞数の少なくとも約５％の減少、形質細胞数の少なくとも約１０％の減少、形質細胞数の少なくとも約２０％の減少、形質細胞数の少なくとも約３０％の減少、形質細胞数の少なくとも約４０％の減少、形質細胞数の少なくとも約５０％の減少、形質細胞数の少なくとも約６０％の減少、形質細胞数の少なくとも約７０％の減少、形質細胞数の少なくとも約８０％の減少、形質細胞数の少なくとも約９０％の減少、形質細胞数の少なくとも約９５％の減少又は形質細胞数の少なくとも約９９％の減少を示す、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記８−アミノ−アデノシンが、２ヶ月間で少なくとも１週間、１週あたり少なくとも１回、前記被験体に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
前記８−アミノ−アデノシンが、２ヶ月間で少なくとも２週間、１週あたり少なくとも１回、前記被験体に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
前記８−アミノ−アデノシンが、２ヶ月間で少なくとも１週間、１週あたり少なくとも５日、前記被験体に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
前記被験体に投与される前記８−アミノ−アデノシンの用量が、少なくとも約５００〜２５００ｍｇ／ｍ２である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
前記ヌクレオシドアナログ剤が静脈内投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
前記ヌクレオシドアナログ剤が経口投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
前記８−アミノ−アデノシンの投与が、骨髄腫に関連する症状又は病状を改善又は予防する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６４】
前記症状又は病状が、高カルシウム血症、骨粗鬆症、溶解性骨病変、骨痛、原因不明の骨折、貧血、腎損傷、アミロイドーシス、びまん性慢性感染、体重減少、悪心、食欲不振及び精神錯乱から成る群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記被験体が哺乳動物である、請求項４５〜６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願データ）
本出願は、２００４年１１月１２日に申請された米国仮出願第６０／６２６，８６２号の利益を主張するものであり、同仮出願は参照してその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本出願は、８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログ剤を用いて血液悪性疾患を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
白血病、リンパ腫及び骨髄腫は血液関連癌としても周知の血液悪性疾患であり、米国において癌の中で総合的に発症率では第５位、死亡率では第２位となっている。治療の進歩にもかかわらず、重要な課題が残存する。例えば、現行の治療法では、続発性悪性疾患、臓器不全（心臓、肺及び内分泌）、持続する神経心理学的及び心理社会的問題並びに生活の質と関連する問題を含む有害事象を生じさせる頻度が高い。一部の患者では治療により長期的寛解及び治癒に至り得るが、多くの患者には血液悪性疾患は最終的に死をもたらす慢性疾患である。５年生存率は、例えば、ホジキン病では８３％、非ホジキンリンパ腫では５３％、白血病全体では４５％、多発性骨髄腫では２９％、急性骨髄性白血病では１４％である（２００３年５月１５日の米国上院歳出委員会・防衛小委員会において白血病・リンパ腫学会を代表したＧｅｏｒｇｅ  Ｄａｈｌｍａｎ氏）。従って、これらの疾患に対する新規治療法が多大に必要とされている。
【０００４】
多発性骨髄腫（ＭＭ）とも称される骨髄腫は、悪性形質細胞が骨髄に蓄積するＢ細胞リンパ増殖性疾患である。正常人において形質細胞は細胞に占める割合が５％未満である。しかし、多発性骨髄腫に罹患した患者では、形質細胞は存在する細胞の１０％超を含み得る。大部分の形態の骨髄腫は骨髄及び周囲の骨における多部位に迅速に転移する。骨髄腫細胞と称される骨髄腫形質細胞は、血管新生を促進する血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のような増殖因子を産生する。また、骨髄腫細胞は骨髄を標的とすることを可能にする特殊な接着分子をその表面に有し、骨髄にて間質細胞に付着し、インターロイキン６（ＩＬ−６）のようなサイトカイン、ＮＦ−κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）リガンド及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を産生する。サイトカインは骨髄腫細胞の増殖を刺激し、アポトーシスを阻害し、骨髄腫細胞の増殖、また、最終的に骨破壊を生じさせる。
【０００５】
同疾患に罹患した一患者内の骨髄腫細胞は同一であり、単一クローン性（Ｍ）蛋白質又はパラプロテインと称される同じ免疫グロブリン（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ又はＩｇＥ）を大量に産生する。具体的なＭ蛋白質は患者により異なるが、任意の一患者においてはほぼ常に同じである。全症例の３分の２において、血清免疫グロブリンはＩｇＧクラスに属するが、残りの３分の１は、通常、ＩｇＡである。稀な症例ではＩｇＥ又はＩｇＤ又はこの２つの混交が生じる。血清又は尿電気泳動を用いてＭ蛋白質を同定することができる。ＭＭの別の重要な診断特性は尿中のベンス・ジョーンズ蛋白質と称される軽鎖の存在である。ベンス・ジョーンズ蛋白質はκ又はλ遊離軽鎖を含むが、その両方を含むことはない（Ｈａｅｎ，１９９５，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（血液学の原理））。
【０００６】
ＭＭは疼痛及び骨折を特徴とする体軸骨格の骨破壊を生じさせる。多発性骨髄腫と関連するアミロイドーシスは比較的一般的な所見である。腎不全、高カルシウム血症、貧血、細菌感染感受性の上昇及び正常な免疫グロブリン産生の障害も同疾患の一般的な臨床症状である。
【０００７】
ＭＭは癌全体の約１％及び全癌死の２％を示す。この血液癌に対する治療法はなく、従来の療法で診断後の生存期間中央値は３〜４年である。高用量化学療法及び幹細胞移植は寛解誘導において良好であるが、患者は最終的には再発し、且つ薬剤耐性疾患を発症する、もしくはその一方が起こる（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００８】
細胞傷害性プリン及びピロリジンヌクレオシド誘導体は、抗腫瘍療法に良好に導入された最初期の化学療法剤の１つであり、細胞傷害剤、抗ウイルス剤及び免疫抑制剤を含む薬理学的に多様なメンバーに属する。急性及び慢性血液悪性疾患の治療に一部のヌクレオシドアナログが現在用いられているが、これらのアナログはインビトロで十分な活性を示しておらず、或いは臨床試験においてＭＭ治療の臨床評価を継続する根拠を示していない（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００９】
疾患過程に関与する分子を標的とする薬剤が必要である。ＭＡＰＫはシグナル伝達分子であり、３段階のリン酸化カスケードを通して調節される。ＭＡＰＫは細胞のホスファターゼによってトレオニン残基及びチロシン残基もしくはその一方において脱リン酸化されると、不活性化される（非特許文献７；非特許文献８）。リン酸化カスケードを通し、ＭＡＰＫは多様な細胞外刺激を調整し、遺伝子発現の変化、増殖、分化、細胞周期停止及びアポトーシスを含む基本的な細胞過程を調節する。
【００１０】
Ａｋｔキナーゼ経路は細胞の増殖及び生存の中心的役割を果たす別のシグナル伝達カスケードである。Ａｋｔ基質は、蛋白質合成の調節、代謝、ホメオスタシス、細胞周期、細胞の生存及び増殖並びにアポトーシスを含む複数の細胞過程に関与する（非特許文献９；非特許文献１０）。Ａｋｔキナーゼは、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）依存性及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）非依存性機構によって活性化され、Ｓｒｃホモロジー２ドメイン含有イノシトールホスファターゼ（ＳＨＩＰ−１／２）及びＰＴＥＮホスファターゼによって負に調節されるセリン／トレオニンキナーゼである。Ａｋｔは酵素活性又は細胞局在を変化させることによって下流の標的を負又は正に調節することができる。主に、Ａｋｔは二次メッセンジャーのリン脂質キナーゼＰＩ３Ｋの活性化の結果として活性化されるが、Ａｋｔ活性化のＰＩ３Ｋ／ＰＤＫＩ非依存性機構も存在する。Ａｋｔは酵素活性又は細胞局在を変化させることにより、その下流の標的を調節する。Ａｋｔ基質ＧＳＫ３Ｐは代謝反応の上流にあり、増殖及び抗アポトーシス経路の調節に関与する。ＧＳＫ３Ｐアイソフォームの酵素活性はＡｋｔ媒介リン酸化反応により阻害される（非特許文献１１）。Ｆｏｘｏ蛋白質ファミリーとしても周知のフォークヘッド転写因子ファミリーは、プログラム細胞死に役割を果たすことが詳細に報告されているＡｋｔ基質である。フォークヘッド蛋白質はＡｋｔによってリン酸化されると、１４−３−３蛋白質によって細胞質内に隔離され、アポトーシス誘導転写因子としての機能を果たすことが阻止される（非特許文献９；非特許文献１０）。ＩＧＦ−１は、ＰＩ３Ｋ経路を活性化し、フォークヘッドファミリーメンバーＦＫＨＲＬＩのリン酸化及び不活性化を誘発することにより、細胞をグルココルチコイド誘発アポトーシスから防御する。ＦＫＨＲＬＩの阻害は、細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する能力の喪失に至る（非特許文献１２）。
【非特許文献１】Ｊｅｍａｌら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．（２００４）５４：８−２９
【非特許文献２】Ｓｉｒｏｈｉら、Ｌａｎｃｅｔ．（２００４）３６３：８７５−８７
【非特許文献３】Ｈｊｅｒｔｎｅｒら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．（１９９６）２０：１５５−６０
【非特許文献４】Ｏｋｅｎ、Ｃａｎｃｅｒ（１９９２）７０：９４６−８
【非特許文献５】Ｐｌｕｎｋｅｔｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆ．（２００１）１９：２１−４５
【非特許文献６】Ｎａｇｏｕｒｎｅｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．（１９９３）６７：１０−１４
【非特許文献７】Ｏｎｏ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．（２０００）１２：１−１３
【非特許文献８】Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ．（２００１）４１０：３７−４０
【非特許文献９】Ｆｒａｎｋｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（２００３）２２：８９８３−９８
【非特許文献１０】Ｓｃｈｅｉｄら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（２００３）５４６：１０８−１２
【非特許文献１１】ＪｏｐｅおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（２００４）２９：９５−１０２
【非特許文献１２】Ｑｉａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ．（２００２）９９：４１３８−４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、８−アミノ−アデノシンが血液悪性疾患治療のための新規治療剤であることを示す。詳細には、本発明の発明者らは、８−アミノ−アデノシンが骨髄腫及び多発性骨髄腫の治療に使用され得ることを本明細書で示す。重要なことは、８−アミノ−アデノシンが多剤耐性骨髄腫細胞に対して細胞傷害性を示すことが見出されたことである。
【００１２】
８−アミノ−アデノシンはｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１／２及びＡｋｔ経路のような主要経路に作用することも本明細書で示される。これらの経路における主要蛋白質のリン酸化の低下と骨髄腫細胞の細胞傷害との相関は、血液癌治療剤候補を同定するとともに、このような薬剤に効果的に反応する可能性がある患者を同定する新規の有用な方法の基礎となる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、骨髄腫、リンパ腫又は白血病のような血液悪性疾患と診断された患者を治療有効量の８−アミノ−アデノシンで治療することを包含する。８−アミノ−アデノシンは、抗癌治療の有効性及び安全性を高めるため、他の治療剤と組み合わせて用いることができる。再発性血液悪性疾患及び多剤耐性悪性疾患もしくはその一方に罹患した患者を治療するため、８−アミノ−アデノシンを含有する医薬組成物を用いることもできる。
【００１４】
８−アミノ−アデノシンは、骨髄腫、リンパ腫又は白血病と関連する症状又は病状を改善又は予防するために用いることもできる。一実施形態において、８−アミノ−アデノシンは、骨髄腫関連症状、例えば、高カルシウム血症、骨粗鬆症、溶解性骨病変、骨痛、原因不明の骨折、貧血、腎損傷、アミロイドーシス、びまん性慢性感染、体重減少、悪心、食欲不振及び精神錯乱の改善又は予防のために、骨髄腫と診断された患者に投与される。
【００１５】
本発明は、１つ又はそれ以上のＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ａｋｔキナーゼ及びその下流シグナル伝達分子のリン酸化を実質的に低下させるのに十分な期間及び用量にてヌクレオシドアナログ剤を患者に投与することにより、骨髄腫、リンパ腫又は白血病と診断された患者を治療する方法も含む。一実施形態において、患者は再発性及び薬剤耐性型もしくはその一方の癌に罹患している。
【００１６】
本発明の方法による８−アミノ−アデノシン又はヌクレオシドアナログ剤の投与は、癌の有効な治療と関連する臨床所見、例えば、骨髄腫に罹患した患者の血清中のＭ蛋白質又は尿中のベンス・ジョーンズ蛋白質の減少を含む臨床所見をもたらす。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、抗癌ヌクレオシドアナログの有効性は、血液癌に罹患した患者に対し、患者から細胞を単離し、ヌクレオシドアナログ剤を用いて細胞をインビトロで処理し、１つ又はそれ以上の蛋白質のＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２及びＡｋｔキナーゼ並びにその下流シグナル伝達分子のリン酸化を測定することによって評価することができ、測定されたリン酸化の低下は患者が当該薬剤による治療に反応することを示す。
【００１８】
本発明は、化合物を用いて細胞をインビトロで処理し、１つ又はそれ以上の蛋白質のリン酸化レベルを測定することにより、骨髄腫のような血液悪性疾患の治療の有効性に関して薬剤候補をスクリーニングするための方法も包含する。例えば、培養骨髄腫細胞を薬剤候補で処理し、細胞のリン酸化を測定し、当該薬剤が骨髄腫の治療に有効であるかを判定することができる。本実施形態において用いられる培養細胞は多剤耐性及びステロイド耐性もしくはその一方に対して選択され得る。
【００１９】
本発明の方法は、薬剤候補の血液癌を治療する有効性を評価する付加工程、例えば、ＰＰ２Ａホスファターゼ活性、アポトーシス、細胞増殖及びカスパーゼ活性化を測定する工程も含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、骨髄腫のような血液疾患を８−アミノ−アデノシン（８−ＮＨ２−Ａｄｏ）を用いて治療する新規方法について述べる。本発明の発明者らは、多剤耐性及びステロイド耐性骨髄腫細胞を治療するために８−アミノ−アデノシンを用いることができ、当該薬剤は正常細胞と悪性細胞に対して異なる作用を発現し、血液悪性疾患に理想的な治療剤となることを見出した。
【００２１】
本発明の発明者らは、８−アミノ−アデノシンはＥＲＫ１／２，ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＡｋｔキナーゼを含む複数の重要なシグナル伝達蛋白質の迅速且つ劇的なリン酸化の喪失を引き起こすが、他の既知のピリミジン及びプリンアナログ剤はリン酸化レベルを変化させないという驚くべき知見も得た。多くの細胞蛋白質が８−アミノ−アデノシンの作用を受けるが、ＪＮＫ，ＰＫＣ−８及びＳＴＡＴ蛋白質を含む他の複数のシグナル伝達分子のリン酸化状態は８−アミノ−アデノシン処理による変化を受けず、これは８−アミノ−アデノシンによって引き起こされるリン酸化の低下が全体的な事象ではなく、むしろ特異的作用であることを示す。加えて、８−アミノ−アデノシンと無関係にＡＴＰを欠乏した細胞は重要な細胞蛋白質の同一のリン酸化低下を示さない。従って、８−アミノ−アデノシン処理によって引き起こされる内因性ＡＴＰプールの有意な変化は、リン酸化レベルの変化の原因とはなり得ない。
【００２２】
本明細書で用いるように、「血液癌（ｂｌｏｏｄ  ｃａｎｃｅｒ）」、「血液悪性疾患」、「血液癌（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）」、「造血器悪性腫瘍」及び「造血器癌」は血液関連疾患を指し、白血病、リンパ腫及び骨髄腫並びにその特異的疾患型、例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、重鎖病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（小細胞型、大細胞型及び混合細胞型）及びバーキットリンパ腫を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
骨髄腫と多発性骨髄腫は本明細書で互換的に用いられる。当業者には理解できるように、本発明は骨髄腫とサブタイプの多発性骨髄腫に等しく適用される。骨髄腫は体内の一部位に、或いは体内の多部位に、即ち、多発性骨髄腫として存在し得る。
【００２４】
本明細書で用いられるように、「ヌクレオシドアナログ剤」は化合物を含むヌクレオシドを指す。本発明のヌクレオシドアナログ剤は８−アミノ−アデノシンを含むが、これに限定されない。「薬剤」と「化合物」は本明細書で互換的に用いられ、８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログ剤を指す。
【００２５】
本明細書で用いられるように、８−アミノ−アデノシン（８−ＮＨ２−Ａｄｏ）は、アデニン塩基の８位にリボース糖及びアミン基を有するアデノシンアナログである。当業者であれば、骨髄腫のような血液疾患の治療のために、類似及び関連化合物もしくはその一方、例えば、類似の構造及び機能の化合物も本発明の方法とともに用いられ得ることを理解するであろう。従って、本発明は８−アミノ−アデノシンとその変異体を用いた方法に適用される。
【００２６】
本明細書で用いられるように、「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）」及び「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、血液悪性疾患の治療に効果的な用量を指す。治療有効量は、高カルシウム血症、骨粗鬆症、溶解性骨病変、骨痛、原因不明の骨折、貧血、腎損傷、アミロイドーシス、びまん性慢性感染、体重減少、悪心、食欲不振、感染、出血及び精神錯乱を含むがこれらに限定されない血液悪性疾患と関連する１つ又はそれ以上の症状又は臨床徴候の緩和、即ち、低減に十分な用量となり得る。
【００２７】
治療有効量は、当業者であれば患者の全身症状の改善を推定するように、悪性疾患の臨床指標、即ち、検査所見を量的及び質的もしくはその一方に調整するのに十分な用量ともなり得る。本明細書で用いられるように、「調整」は測定された臨床指標の上昇又は低下のような変化を指す。このような量的性質の指標は、当該技術分野で理解されるように、統計的に有意な量により、好ましくは低下し、或いは上昇するであろう。臨床指標は、細胞数の実質的な増加又は減少、異常形態の細胞の存在、細胞内の異常染色体の存在（例えば、ＣＭＬにおけるフィラデルフィア染色体）、生化学的異常及び過形成骨髄を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
骨髄腫の臨床指標は、血清及び尿中Ｍ蛋白質の存在、尿中のベンス・ジョーンズ蛋白質の存在、異常形態の形質細胞、即ち、「骨髄腫細胞」及び形質細胞の全体的な増加を含む。本明細書で用いられるように、「Ｍ蛋白質」は当該技術分野で公知のように定義付けられ、患者における単一タイプの単一クローン性免疫グロブリンを指す。一実施形態において、骨髄腫の治療のための治療有効量の薬剤、例えば、８−アミノ−アデノシンは、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約１０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約２０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約３０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約４０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約５０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約６０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約７０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約８０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約９０％の低下、被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約９５％の低下又は被測定Ｍ蛋白質レベルの少なくとも約９９％の低下をもたらす。Ｍ蛋白質は、血清電気泳動及び免疫固定（ｉｍｍｕｎｏｆｉｘａｔｉｏｎ）を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の方法により測定することができる。血清電気泳動により測定されるＭ蛋白質は、電気泳動図のガンマグロブリン領域における鋭いピークの存在により同定することができる。
【００２９】
別の実施形態において、骨髄腫の治療のための治療有効量の薬剤、例えば、８−アミノ−アデノシンは、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約１０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約２０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約３０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約４０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約５０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約６０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約７０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約８０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約９０％の減少、被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約９５％の減少又は被測定ベンス・ジョーンズ蛋白質の少なくとも約９９％の減少をもたらす。本明細書で用いられるようなベンス・ジョーンズ蛋白質は、当該技術分野で公知であり、免疫グロブリンの軽鎖断片を指す。ベンス・ジョーンズ蛋白質は、当該技術分野で公知の方法によって血清及び尿中で測定することができる。
【００３０】
本発明は、治療有効量が患者の骨髄中の骨髄腫細胞（異常形質細胞）又は形質細胞数の統計的に有意な減少をもたらす、骨髄腫の治療のための治療有効量の薬剤、例えば、８−アミノ−アデノシンも含む。骨髄腫を有する被験体を指す場合、「骨髄腫細胞」及び「形質細胞」という用語は本明細書で互換的に用いられる。形質細胞が正常な被験体由来であると本明細書で述べない場合、「形質細胞」は骨髄腫細胞を指すものとして解釈する必要がある。
【００３１】
形質細胞の形態及び数は当該技術分野で公知の生検の方法によって求めることができる。本発明の一実施形態において、治療有効量の薬剤、例えば、８−アミノ−アデノシンは、形質細胞数の少なくとも約５％の減少、形質細胞数の少なくとも約１０％の減少、形質細胞数の少なくとも約２０％の減少、形質細胞数の少なくとも約３０％の減少、形質細胞数の少なくとも約４０％の減少、形質細胞数の少なくとも約５０％の減少、形質細胞数の少なくとも約６０％の減少、形質細胞数の少なくとも約７０％の減少、形質細胞数の少なくとも約８０％の減少、形質細胞数の少なくとも約９０％の減少、形質細胞数の少なくとも約９５％の減少又は形質細胞数の少なくとも約９９％の減少をもたらす。
【００３２】
本明細書で用いられるように、「少なくとも約」は概算の最小量を指す。
【００３３】
本明細書で用いられるように、「十分な期間及び用量」は、血液悪性疾患の１つ又はそれ以上の臨床症状の実質的な低減或いは１つ又はそれ以上の蛋白質ＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ａｋｔキナーゼとその下流シグナル伝達分子のリン酸化の低下を実現するために必要な薬剤投与時期及び薬剤投与量を指す。期間及び用量は、例えば、１つ又はそれ以上の特定の蛋白質のリン酸化の実質的な低下をもたらさない場合、十分ではない。当業者であれば、特定の蛋白質のリン酸化の実質的な低下を実現するのに十分な期間及び用量は、病期、患者の健康状態、薬剤投与時期及び薬剤用量に基づいて変動することを理解するであろう。
【００３４】
本明細書で用いられるように、リン酸化の「実質的な低下」は、血液悪性疾患の進行を遅延し、或いは停止するのに十分なリン酸化の低下である。一実施形態において、実質的な低下は統計的に有意な量のリン酸化の低下である。リン酸化の実質的な低下は、リン酸化の少なくとも約１％の低下、少なくとも約５％の低下、少なくとも約１０％の低下、少なくとも約１５％の低下、少なくとも約２０％の低下、少なくとも約２５％の低下、少なくとも約３０％の低下、少なくとも約４０％の低下、少なくとも約５０％の低下、少なくとも約６０％の低下、少なくとも約７０％の低下、少なくとも約８０％の低下、少なくとも約９０％の低下、少なくとも約９５％の低下又は少なくとも約９９％の低下となり得る。
【００３５】
本明細書で用いられるように、「患者」と「被験体」は互換的に用いられる。患者又は被験体は血液悪性疾患と診断された動物である。動物は哺乳動物でよく、ヒトが好ましい。本発明の動物はヒト、イヌ、ネコ、ウシ、霊長動物、マウス及びラットを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
“ＭＫＫ３”，“ＭＫＫ６”及びｐ３８  ＭＡＰキナーゼはｐ３８経路のメンバーである。本明細書で用いられるように、ＭＫＫ３，ＭＫＫ６及びｐ３８  ＭＡＰＫの「下流シグナル伝達分子」は、ＡＴＦ−２、ｐ３６  ＭＡＰキナーゼ、ＣＨＯＰ、ＭＥＦ２、Ｅｌｋ−１、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｓｔａｌ１、ＭＳＫ−１、ＭＡＰＫＡＰＫ−２、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＰＲＡＫ及びヒストンＨ３を含むがこれらに限定されない、ＭＫＫ３，ＭＫＫ６及びｐ３８  ＭＡＰキナーゼのリン酸化の低下の結果としてのリン酸化の変化を受ける分子である。ｐ３８  ＭＡＰキナーゼとｐ３８は本明細書で互換的に用いられる。
【００３７】
５００〜２５００ｍｇ／ｍ２の範囲の量の８−アミノ−アデノシンの１日用量を、２ヶ月間に少なくとも２週間、１週あたり少なくとも１回及び最大５日、治療を必要とする癌患者に投与することができる。当該方法は様々な実施形態において実施することができ、一般的に、治療有効範囲内にて投与される用量が少ないほど、用量はより頻回に投与される。一実施形態において、２ヶ月間に少なくとも２週間、１週あたり少なくとも５日、１日用量５００ｍｇ／ｍ２が投与される。別の実施形態では高用量が用いられ、用量は低頻度で投与される。一実施形態において、２ヶ月間に少なくとも２週間、１週あたり１回、１日用量２５００ｍｇ／ｍ２が投与される。
【００３８】
一実施形態において、８−アミノ−アデノシンが投与される週の後、８−アミノ−アデノシンが投与されない１４〜２８日間が続き、この期間後、更なる１週の８−アミノ−アデノシンによる処理が続くように、治療有効量の８−アミノ−アデノシンが投与される。１週間の処理後、２〜４週の８−アミノ−アデノシンによる処理を行わないことは「治療サイクル」と称される。一般的に、少なくとも２治療サイクルが施行される。別の実施形態では最大６又はそれ以上の治療サイクルが施行される。
【００３９】
別の実施形態において、治療有効量の８−アミノ−アデノシンは、１週間、少なくとも２週連続、少なくとも３週連続、少なくとも４週連続、少なくとも５週連続又は少なくとも６週連続、１週あたり少なくとも１回及び５日を含む最大３日若しくはそれ以上の日数、投与される。本実施形態では、患者は用量制限毒性が発現するまで週連続期間、治療有効量を投与される。
【００４０】
従って、一態様において、被験体に有効量の８−アミノ−アデノシンを投与する工程を含む、被験体における癌を治療するための方法を提供する。本明細書で提供する８−アミノ−アデノシンの投与は、８−アミノ−アデノシンの作用部位への送達を可能にする任意の方法によって達成され得る。一部の実施形態において、８−アミノ−アデノシンは血液循環を介して血液癌細胞又は腫瘍と接触する。８−アミノ−アデノシンを癌組織又は細胞と接触させるため、好適な投与法は、経口経路、十二指腸内経路、非経口注射（静脈内、皮下、筋肉内、血管内又は注入を含む）、局所及び腎経路を含む。治療する血液癌のタイプ及び投与経路に依存し、ある特定の投与経路、例えば、１〜８時間の範囲の時間、静注による投与が好ましい。
【００４１】
本明細書で述べる用量範囲内にて投与される８−アミノ−アデノシンの量は、治療される被験体、癌のタイプ及び重症度、癌の局在性、投与速度、８−アミノ−アデノシンの性質（例えば、溶解性及び細胞毒性）並びに処方医師の裁量に依存する。ある場合には前述の範囲の下限未満の用量レベルが十分以上であり得るが、別の場合には有害な副作用を引き起こすことなく、より高用量が用いられ得て、特にこのような高用量が最初に１日中の投与のために数回の低用量に分割される場合、高用量が用いられ得る。
【００４２】
（治療対象疾患）
治療を必要とするヒトや他の哺乳動物における癌の治療に概して有用な方法及び組成物を提供する。これらの方法は、治療有効量のヌクレオシドアナログ剤、例えば、８−アミノ−アデノシン又はその医薬的に許容可能な塩を単独或いは治療有効量の１つ又はそれ以上の付加抗癌化合物を併用して投与する工程を含む。当該方法及び組成物は血液悪性疾患を治療するために用いることができ、血液悪性疾患は、骨髄腫、多発性骨髄腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、重鎖病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（小細胞型、大細胞型及び混合細胞型）及びバーキットリンパ腫を含むが、これらに限定されない。本発明の一実施形態では、骨髄腫及び多発性骨髄腫を治療するために８−アミノ−アデノシンが用いられる。
【００４３】
当該方法及び組成物は、転移した血液悪性疾患を治療するために用いることもできる。例えば、骨の多部位に拡散した骨髄腫を治療するために８−アミノ−アデノシンを用いることができる。
【００４４】
本発明の一実施形態において、多剤耐性である血液悪性疾患を治療するために８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログ剤が用いられる。例えば、骨髄腫及び非ホジキンリンパ腫は薬剤耐性となることが多い。骨髄腫はｔｈａｌｉｄｏｍｉｎｅ（サリドマイド）及びボルテゾミブ（ベルケード）のようなプロテアソーム阻害剤を含むがこれらに限定されない現行の既知治療法に対して耐性となり得る。多剤耐性血液悪性疾患と診断された患者を治療するため、治療有効量にて単独で、或いは他の抗癌治療剤と組み合わせて用いられる本発明のヌクレオシドアナログ剤を用いることができる。
【００４５】
８−アミノ−アデノシンは他の抗癌剤及び抗腫瘍剤と組み合わせて同時投与することができる。これらの薬剤の１つを併用する場合、付加薬剤の用量は当該薬剤に用いられる標準用量或いは当該薬剤が単独で用いられる場合、用いられるレベルから下方又は上方に修正される。従って、８−アミノ−アデノシンの投与は、既存の薬剤を用いるが、現在の使用より低い濃度又は用量で医師が癌を治療することを可能にする。或いは、８−アミノ−アデノシンの投与は、現在の使用より高い濃度又は用量で既存の薬剤を用いて医師が癌を治療することを可能にし得る。別の抗癌治療剤の用量を増減する能力は、高用量の抗癌剤が望ましくない副作用又は死亡をもたらし得る再発性血液悪性疾患の治療及び予防に重要である。当業者であれば、所定の患者に対する正確な用量の決定は、用いる薬剤の組合せ、治療する特定の疾患及び患者の病状と既往歴を含む多くの要因に依存し、異なることを理解するであろう。
【００４６】
既知で承認済の抗腫瘍剤に対する特定の用量レジメンが、例えば、ニュージャージー州オラデル（Ｏｒａｄｅｌｌ）のＭｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（医師用添付文書集）の現行版に見出される製品説明に示されている。ある特定の抗癌剤に対する例示的な用量レジメンも下記に示されている。当業者は本明細書で考察される多くの既知の抗癌剤が他の薬剤と組み合わせてルーチンに使用されていることを認識するであろう。本明細書で述べる方法に従って、８−アミノ−アデノシンは、使用薬剤に加え、或いは１つ又はそれ以上のこのような薬剤を置き換え、このような多剤治療レジメンにて同時投与することができる。
【００４７】
ＦＤＡに認可された癌治療薬は、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、アロマターゼ阻害剤、ビホスホネート、シクロオキシゲナーゼ阻害薬、エストロゲン受容体モジュレーター、葉酸拮抗剤、無機砒酸塩、微小管阻害剤、調整剤、ニトロソウレア、ヌクレオシドアナログ、破骨細胞抑制剤、白金含有化合物、プロテアソーム阻害剤、レチノイド、トポイソメラーゼ１阻害剤、トポイソメラーゼ２阻害剤及びチロシンキナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない。８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログによる処理の前後、血液悪性疾患の治療のためのこれらの任意のクラス由来の抗癌剤及び他の抗癌剤を投与することができる。
【００４８】
有用なアルキル化剤は、ブスルファン（マイレラン、ブスルフェックス）、クロラムブシル（リューケラン）、シクロホスファミド（シトキサン、Ｎｅｏｓａｒ）、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ（アルケラン）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ）及びテモゾロマイド（テモダール）を含むが、これらに限定されない。本明細書で述べる方法に従って、血液悪性疾患を治療するため、８−アミノ−アデノシンはアルキル化剤と同時投与される。一実施形態において、癌は慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫又は未分化星状細胞腫である。一例として、シクロホスファミドとしても一般的に周知の化合物、２−ビス［（２−クロロエチル）アミノ］テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキサザホスホリン，２−オキシドは、病期ＩＩＩ及びＩＶの悪性リンパ腫、多発性骨髄腫及び白血病の治療に用いられるアルキル化剤である。一般的に、シクロホスファミドは静脈内投与され、３〜５日間にわたり分割用量にて１５００〜１８００ｍｇ／ｍ２の用量で導入療法のために投与される。維持療法ではシクロホスファミドは、７〜１０日ごとに３５０〜５５０ｍｇ／ｍ２又は週２回１１０〜１８５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログは、このような用量で投与されるシクロホスファミドと同時投与され得る。
【００４９】
有用なアントラサイクリンは、ドキソルビシン（アドリアマイシン、ドキシル、ルベックス）、ミトキサントロン（ノバントロン）、イダルビシン（イダマイシン）、バルルビシン（バルスター）及びエピルビシン（エレンス）を含むが、これらに限定されない。８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログは、血液悪性疾患を治療するため、アントラサイクリンと同時投与され得る。例えば、ドキソルビシンとしてより一般的に周知の化合物、（８Ｓ，１０Ｓ）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキソピラノシル）オキシ］−８−グリコロイル−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ  ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓの培養液から単離された細胞傷害性アントラサイクリン系抗生物質である。ドキソルビシンは、播種性腫瘍疾患、例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病並びにホジキン及び非ホジキン型のリンパ腫において腫瘍状態の退縮を生じさせるのに良好に用いられている。通常、ドキソルビシンは、２１日間隔で６０〜７５ｍｇ／ｍ２の範囲の用量；毎週２０ｍｇ／ｍ２の用量；又は４週ごとに反復する各３連続日における３０ｍｇ／ｍ２の用量にて単独静注として投与される。８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログ剤は、このような用量で投与されるドキソルビシンと同時投与され得る。
【００５０】
有用な抗生物質は、ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ（コスメゲン）、ブレオマイシン（ブレノキサン）及びダウノルビシン、ダウノマイシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ，ＤａｎｕｏＸｏｍｅ）を含むが、これらに限定されない。８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログ剤は、血液癌を治療するため、抗生物質と同時投与され得る。
一実施形態では癌は急性リンパ性白血病や他の白血病である。
【００５１】
有用なビホスホネート抑制剤はゾレドロネート（ゾメタ）を含むが、これに限定されない。本明細書で述べる方法に従って、８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログ剤は、血液癌を治療するため、ビホスホネート抑制剤と同時投与される。一実施形態では、癌は多発性骨髄腫、固形癌からの骨転移又は前立腺癌である。
【００５２】
有用な葉酸拮抗剤はメトトレキサート及びｔｒｅｍｅｔｒｅｘａｔｅを含むが、これらに限定されない。８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログ剤は、造血器癌を治療するため、葉酸拮抗剤と同時投与され得る。葉酸拮抗剤は３０年以上にわたり癌化学療法において用いられている。一例として、一般にメトトレキサートとして周知の化合物、Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル  メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸は、進行期の悪性リンパ腫の治療において用いられている葉酸拮抗剤である。５−メチル−６−［［（３，４，５−トリメトキシフェニル）−アミノ］メチル］−２，４−キナゾリンジアミンは別の葉酸拮抗剤であり、トリメトレキサートとして一般に周知である。リンパ腫では３０ｍｇ／ｍ２の用量で週２回の筋注投与が行われる。８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログ剤は、このような用量で投与されるメトトレキサートと同時投与され得る。
【００５３】
微小管の重合又は脱重合を阻害し得る有用な微小管「阻害剤」は、ビンクリスチン（オンコビン）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）、パクリタキセル（タキソール、Ｐａｘｅｎｅ）、ビノレルビン（ナベルビン）、ドセタキセル（タキソテール）、エポチロンＢ又はＤ又はいずれかの誘導体並びにディスコデルモライド又はその誘導体を含むが、これらに限定されない。８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログは、血液悪性疾患を治療するため、微小管阻害剤と同時投与され得る。一実施形態では血液悪性疾患は多発性骨髄腫である。一例として、一般にビンクリスチンとしても周知の化合物、２２−オキソ−ビンカレウコブラスチンは、一般的なニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ  ｒｏｓｅａ，Ｌｉｎｎ．）から得られるアルカロイドであり、急性白血病の治療に有用である。ホジキン病の治療において他の腫瘍溶解剤と組み合わせて有用であることも示されている。ビンクリスチンは小児用では２ｍｇ／ｍ２、成人用では１．４ｍｇ／ｍ２を毎週静注される。８−アミノ−アデノシンのような本発明のヌクレオシドアナログ剤は、このような用量で投与されるビンクリスチンと同時投与され得る。
【００５４】
８−アミノ−アデノシンのような本発明のヌクレオシドと組み合わせて用いることができる有用なヌクレオシドアナログは、メルカプトプリン、６−ＭＰ（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）、フルオロウラシル、５−ＦＵ（Ａｄｒｕｃｉｌ）、チオグアニン、６−ＴＧ（チオグアニン）、シタラビン（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ，ＤｅｐｏＣｙｔ）、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、フルダラビン（フルダラ）、ペントスタチン（Ｎｉｐｅｎｔ）、クラドリビン（ロイスタチン、２−ＣｄＡ）、ゲムシタビン（ジェムザール）及びカペシタビン（ゼローダ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態では血液悪性疾患は多発性骨髄腫又は骨髄腫である。
【００５５】
別の実施形態では血液悪性疾患はリンパ腫又は白血病である。例えば、一般に６−チオグアニンとしても周知の化合物、２−アミノ−１，７−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−チオンは、急性非リンパ性（ｎｏｎ−ｐｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ）白血病の療法において有効なヌクレオシドアナログである。６−チオグアニンは１日あたり体重の約２ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与される。１日総用量は単回用量として投与され得る。このレベルでの４週投与後に改善が認められない場合、投与量は３ｍｇ／ｋｇ／日に増加し得る。８−アミノ−アデノシンのような本発明のヌクレオシドアナログ剤は、急性非リンパ性（ｎｏｎ−ｐｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ）白血病及び他の血液悪性疾患の治療のため、このような用量で投与される６−ＴＧと同時投与され得る。
【００５６】
有用なレチノイドはトレチノイン、ＡＴＲＡ（ベサノイド）、アリトレチノイン（パンレチン）及びベキサロテン（ターグレチン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ））を含むが、これらに限定されない。８−アミノ−アデノシンは血液癌を治療するため、レチノイドと同時投与され得る。一実施形態では癌は多発性骨髄腫である。別の実施形態では癌は急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）又はＴ細胞リンパ腫である。
【００５７】
有用なトポイソメラーゼ１阻害剤は、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）及びイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ）を含むが、これらに限定されない。８−アミノ−アデノシンのような本発明のヌクレオシドアナログは、癌を治療するため、トポイソメラーゼ１阻害剤と同時投与され得る。有用なトポイソメラーゼ２阻害剤は、エトポシド、ＶＰ−１６（ベプシド）、テニポシド、ＶＭ−２６（Ｖｕｍｏｎ）及びエトポシドホスフェート（Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ）を含むが、これらに限定されない。８−アミノ−アデノシンは、多発性骨髄腫又は骨髄腫を治療するため、トポイソメラーゼ２阻害剤と同時投与され得る。別の実施形態において、８−アミノ−アデノシンは急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療のため、トポイソメラーゼ２と同時投与され得る。
【００５８】
有用なチロシンキナーゼ阻害剤はイマチニブ（グリベック）を含むが、これに限定されない。８−アミノ−アデノシンは血液癌を治療するため、チロシンキナーゼ阻害剤と同時投与され得る。一実施形態では癌は多発性骨髄腫又は骨髄腫である。
【００５９】
従って、８−アミノ−アデノシン又はその医薬的に許容可能な塩のような本発明のヌクレオシドアナログと、１つ又はそれ以上の付加抗癌剤が患者に投与される、血液癌を治療する方法を提供する。８−アミノ−アデノシンとの同時投与に好適なこのような他の抗癌剤の具体的な実施形態は、５−メチル−６−［［（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ］−メチル］−２，４−キナゾリンジアミン−ｅ又はその医薬的に許容可能な塩、（８Ｓ，１０Ｓ）−１０−（３−アミノ−２，３，−６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキソピラノシル）オキシ］−８−グリコロイル−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオン又はその医薬的に許容可能な塩；５−フルオロ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン又はその医薬的に許容可能な塩；２−アミノ−１，７−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−チオン又はその医薬的に許容可能な塩；２２−オキソ−ビンカレウコブラスチン又はその医薬的に許容可能な塩；２−ビス［（２−クロロエチル）アミノ］テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキサザホスホリン，２−オキシド又はその医薬的に許容可能な塩；Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］−メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸又はその医薬的に許容可能な塩；或いはシス−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
一実施形態において、他の抗癌剤は、本発明のヌクレオシドアナログが投与される複数の週の１週間に少なくとも１回投与される。一実施形態において、他の抗癌剤は、プリンアナログ、アルキル化剤及び抗生物質から成る群より選択される。プリンアナログはゲムシタビン、フルダラビン及びクラドリビンを含み、一部の実施形態では、これらは８−アミノ−アデノシンとともに過去にアルキル化剤で治療を受けた患者に投与される。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の８−アミノ−アデノシン又はヌクレオシドが投与される複数の週の１週間に少なくとも１回、ＧＣＳＦが投与される。一実施形態において、約３６０〜４８０単位のＧＣＳＦが患者に毎日投与される。別の実施形態では、ニューラスタのような長時間作用型のＧＣＳＦが投与される。
【００６２】
別の実施形態において、８−アミノ−アデノシンが投与される複数の週の１週間に少なくとも１回、エリスロポエチンが投与される。一実施形態において、約４０，０００単位のエリスロポエチンが投与される。好適な製剤はＥｐｏｇｅｎ及びＰｒｏＱｕｉｓｔ製剤を含み、別の好適な製剤は長時間作用型であって、Ａｒａｎｉｓｔ製剤である。
【００６３】
（製剤）
８−アミノ−アデノシン組成物は、例えば、錠剤カプセル、丸薬散剤、持続放出性製剤、液剤、懸濁剤として経口投与に、無菌液剤、懸濁剤又は乳液として非経口注射に、軟膏又はクリームとして局所投与に、或いは坐剤として直腸投与に好適な形態となり得る。８−アミノ−アデノシン組成物は、正確な用量の単回投与に好適な単位投与剤形でよく、通常、従来の医薬用担体又は賦形剤を含む。例示的な非経口投与形態は、無菌水溶液中の８−アミノ−アデノシンの液剤又は懸濁剤、例えば、水性プロピレングリコール又はデキストロース液剤を含む。このような剤形は所望とあれば好適に緩衝処理することができる。好適な医薬用担体は不活性希釈剤若しくは充填剤、水及び種々の有機溶媒を含む。医薬組成物は所望とあれば、香味剤、結合剤、賦形剤などのような付加成分を含み得る。従って、経口投与ではクエン酸のような種々の賦形剤を含む錠剤を、デンプン、アルギン酸及びある種の複合ケイ酸塩のような種々の崩壊剤と、また、スクロース、ゼラチン及びアラビアゴムのような結合剤とともに用い得る。加えて、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクのような滑沢剤が、錠剤化目的に有用な場合が多い。同種の固形組成物は軟質及び硬質充填ゼラチンカプセルにおいて用いることもできる。従って、好ましい材料はラクトース又は乳糖及び高分子量ポリエチレングリコールを含む。経口投与に水性懸濁剤又はエリキシル剤が望ましい場合、その中の８−アミノ−アデノシンは、種々の甘味剤又は着香剤、着色剤又は染色剤、所望であれば乳化剤又は懸濁化剤と、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン又はその組合せのような希釈剤とともに、組み合わせることができる。８−アミノ−アデノシンの局所製剤を治療に用いることができる。このような製剤は油性−水性乳剤及びリポソームを用いて好都合に調製でき、任意で１つ又はそれ以上の付加抗癌剤を含み得る。
【００６４】
特定量の活性剤を用いて種々の医薬組成物を調製する方法は、当業者には既知であり、或いは明らかであり、本開示内容に照らし、本発明の８−アミノ−アデノシン及びヌクレオシドアナログ剤に適用することができる。好適な製剤及び工程の例については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（レミントンの製薬科学），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｅｒ，ペンシルベニア州、第１５版（１９７５）を参照されたい。
【００６５】
一実施形態において、本発明のヌクレオシド誘導体剤は錠剤又は丸剤として製剤化される。製剤は結晶性でよい。医薬組成物は少なくとも約０．１ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約２５０ｍｇ、少なくとも約５００ｍｇ、少なくとも約７５０ｍｇ、少なくとも約１ｇ、少なくとも約３ｇ、少なくとも約５ｇ又は少なくとも約１０ｇのヌクレオシド誘導体剤を含有し得る。同様に、医薬組成物は少なくとも約０．１ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約２５０ｍｇ、少なくとも約５００ｍｇ、少なくとも約７５０ｍｇ、少なくとも約１ｇ、少なくとも約３ｇ、少なくとも約５ｇ又は少なくとも約１０ｇの８−アミノ−アデノシンを含有し得る。
【００６６】
ヌクレオシドアナログ化合物の明らかな実際の利点は、当該化合物を経口、静脈内、筋肉内、局所又は皮下経路のように任意の好都合な態様で投与することができることである。従って、８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログ剤は、例えば、不活性希釈剤とともに経口投与することができ、或いは硬質又は軟質シェルゼラチンカプセルに封入することができ、或いは錠剤に圧縮することができ、或いはダイエット食品と直接混和することができる。経口治療投与では、８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログ剤は、賦形剤と併せて用いることができ、摂取可能な錠剤、バッカル剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で投与することができる。このような組成物及び調製物は、上述の血液癌を有する患者を治療するため、治療有効量の活性剤を含有する。
【００６７】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などの形態の８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシド誘導体剤は、以下のものも含有し得る：トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ若しくはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；サッカリンのような甘味剤及びペパーミントもしくはその一方、冬緑油若しくはチェリー芳香剤のような着香剤。投与単位形態がカプセル剤である場合、上述の成分に加え、液状担体を含有し得る。コーティングとして、或いは投与単位の物理的形態を変形させるため、他の様々な成分が存在し得る。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤にシェラックをコーティングすることができる。
【００６８】
シロップ剤又はエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤、防腐剤としてのメチル及びプロピルパラベン並びにチェリー又はオレンジ芳香剤のような着香剤を含有し得る。勿論、投与単位形態を調製する際に使用される材料は、医薬的に純粋であって用いる量において実質的に無毒性である必要がある。
【００６９】
加えて、ヌクレオシド誘導体剤は当該技術分野で公知の持続放出性調製物及び製剤に組み入れることができる。
【００７０】
８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログ剤は非経口又は腹腔内投与することもできる。遊離酸又は医薬的に許容可能な塩としてのヌクレオシドアナログ剤の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースを含むがこれに限定されない、当該技術分野で公知の界面活性剤と水中で好適に調製することができる。分散液も当該技術分野で公知の方法により調製することができ、これはグリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物並びに油性物の使用を含むが、これらに限定されない。
【００７１】
通常の保存及び使用条件下では、本発明の８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログ剤の医薬調製物は、微生物の増殖を防ぐため、１つ又はそれ以上の防腐剤を含有し得る。
【００７２】
注射使用に好適な８−アミノ−アデノシンのようなヌクレオシドアナログの医薬製剤は、無菌水溶液又は分散液並びに無菌注射液又は分散液の即時調製用の無菌粉末を含む。あらゆる場合において、その形態は無菌性でなければならず、最終形態では注射器を用いて容易に投与される程度に流体性でなければならない。これは製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び菌類のような微生物の汚染作用に対して保存しなければならない。多くの場合、等張剤、例えば、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によってもたらされ得る。
【００７３】
無菌注射液は、上記の他の様々な成分を任意で含む適切な溶媒中に本発明のヌクレオシドアナログ剤を混和し、次に濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は、塩基性分散媒体及び上記から必要とする他の成分を含む無菌ビヒクル中に、種々の滅菌ヌクレオシドアナログ剤を混和することによって調製される。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合、調製法は真空乾燥及び凍結乾燥を含むが、これらに限定されない。これらの方法により、ヌクレオシドアナログ剤に加えて任意の所望の成分の粉末が、予め濾過滅菌されたその溶液から得られる。
【００７４】
本明細書で用いられるように、「医薬的に許容可能な担体」はあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質に対するこのような媒体及び作用剤の使用は当該技術分野で公知である。従来の媒体又は作用剤が活性成分と不適合な場合を除き、これを本発明の治療用組成物において用いることは検討される。補充的な活性成分を本発明の組成物に組み入れることができる。
【００７５】
局所使用に好適である、８−アミノ−アデノシンを含む本発明のヌクレオシドアナログ剤の医薬製剤は、油性・水性乳剤及びリポソーム製剤並びに薬剤の局所投与に一般的に使用されるローション、クリーム及び軟膏を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール、例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど、その好適な混合物並びに植物油を含有する溶媒又は分散媒体となり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散の場合に必要な粒子サイズの維持及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。
【００７６】
投与の容易性及び用量の均等性のため、非経口及び他の組成物を投与単位形態にて製剤化することは本質的に有利である。本明細書で用いられる投与単位形態は、治療対象の哺乳動物に対する単位用量として適切な物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な医薬用担体と組み合わせて所望の治療効果を発揮するように計算された所定量のヌクレオシドアナログ剤を含有する。本発明の新規投与単位形態の仕様は、治療対象となる患者及び癌により決定され、また、それに直接依存し、患者及び癌によって異なり得るが、一般的に、投与単位形態は約０．１ｍｇ〜約１０ｇの８−アミノ−アデノシンを含む。典型的な単位形態は約０．５〜約１ｇの８−アミノ−アデノシンを含み得る。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、８−アミノ−アデノシン及び医薬的に許容可能な担体を含み、１〜８時間の範囲の時間での静注に好適な無菌液であり、８−アミノ−アデノシンは５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する。一実施形態では、医薬的に許容可能な担体は米国薬局方５％デキストロース注射液である。
【００７７】
（キット）
キットは経口及び注射用剤形にて単位用量の８−アミノ−アデノシンを備える。単位用量（経口又は注射）を含む容器に加え、これらのキットは、血液悪性疾患、特に骨髄腫のような形質細胞腫瘍の治療用の８−アミノ−アデノシンの使用及び付随的利益を記載した説明添付文書を含み得る。
【００７８】
（診断法及び予後判定法）
本発明は、血液癌と診断された患者が、１つ又はそれ以上のＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１／２及びＡｋｔキナーゼ並びにその下流分子を標的とする８−アミノ−アデノシン又は他のヌクレオシドアナログ剤による治療に反応する可能性があるかを判定するための方法を含む。本方法は、患者由来の細胞を本発明の８−アミノ−アデノシン又はヌクレオシドアナログ剤で処理する工程と、１つ又はそれ以上の蛋白質のＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２及びＡｋｔキナーゼ並びにその下流シグナル伝達分子のリン酸化を測定する工程とを提供し、１つ又はそれ以上の蛋白質のリン酸化の低下は、当該薬剤が癌の治療に有効であることを示す。妥当な下流分子は、ＡＴＦ−２、ｐ３６  ＭＡＰキナーゼ、ＣＨＯＰ、ＭＥＦ２、Ｅｌｋ−１、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｓｔａｌ１、ＭＳＫ−１、ＭＡＰＫＡＰＫ−２、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＰＲＡＫ及びヒストンＨ３を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
骨髄腫のような血液疾患に対する治療に患者が陽性に反応することを示すリン酸化の低下は、未処理細胞に比し、少なくとも約１％の低下、少なくとも約５％の低下、少なくとも約１０％の低下、少なくとも約１５％の低下、少なくとも約２０％の低下、少なくとも約２５％の低下、少なくとも約３０％の低下、少なくとも約４０％の低下、少なくとも約５０％の低下、少なくとも約６０％の低下、少なくとも約７０％の低下、少なくとも約８０％の低下、少なくとも約９０％の低下、少なくとも約９５％の低下又は少なくとも約９９％の低下による、上記蛋白質の１つのリン酸化の低下により実証される。
【００８０】
患者由来の骨髄細胞は当該技術分野で公知の方法を用いて生検によって抽出できる。骨髄細胞は形質細胞や他の細胞種を含む。任意で、対象とする免疫細胞が更に単離される。一実施形態では、免疫細胞は形質細胞（骨髄腫細胞）である。当該技術分野で公知の方法を用いて骨髄細胞の混合物から特定の細胞種を更に単離することができる。細胞に関する蛋白質のリン酸化レベルを判定するため、当該技術分野で公知のように、細胞を溶解し、且つ細胞から蛋白質を単離するもしくはその一方を行うことが必要となり得る。
【００８１】
１つ又はそれ以上の上記蛋白質のリン酸化レベルは、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて測定することができる。一実施形態では、リン酸化を測定する方法はウェスタンブロット分析である。ブロットは、リン酸化型のＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２又はＡｋｔキナーゼ並びにその下流シグナル伝達分子に対する抗体でプローブすることができる。
【００８２】
本発明の一実施形態において、当該方法は、骨髄腫又は多発性骨髄腫と診断された患者が治療に有効に反応し、或いは治療に反応しないかを判定するために用いられる。形質細胞が患者から単離され、１つ又はそれ以上のＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２又はＡｋｔキナーゼ並びにその下流シグナル伝達分子のリン酸化レベルを低下させることが可能な８−アミノ−アデノシン又は他のヌクレオシドアナログ剤で処理される。
【００８３】
本発明の別の実施形態において、８−アミノ−アデノシン又は他のヌクレオシドアナログで処理された患者由来の細胞は、患者由来の未処理細胞のような対照と比較される。８−アミノ−アデノシン又は他のヌクレオシドアナログで処理された患者由来の細胞は、当該技術分野で公知の対照細胞とも比較される。
【００８４】
（化合物スクリーニング法）
本発明は、リンパ腫、白血病及び骨髄腫の治療の有効性に関して試験化合物をスクリーニングする方法を含む。一実施形態において、細胞が化合物で処理され、１つ又はそれ以上の蛋白質のＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２及びＡｋｔキナーゼ並びに下流シグナル伝達分子のリン酸化が測定される。下流分子は、ＡＴＦ−２、ｐ３６  ＭＡＰキナーゼ、ＣＨＯＰ、ＭＥＦ２、Ｅｌｋ−１、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｓｔａｌ１、ＭＳＫ−１、ＭＡＰＫＡＰＫ−２、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＰＲＡＫ及びヒストンＨ３を含むが、これらに限定されない。１つ又はそれ以上の被測定蛋白質のリン酸化の低下は、血液癌の有効な治療を示す。有効な治療を示すリン酸化の低下は、試験化合物で処理されない細胞に比し、少なくとも約１０％のリン酸化の低下、少なくとも約２０％のリン酸化の低下、少なくとも約３０％のリン酸化の低下、少なくとも約４０％のリン酸化の低下、少なくとも約５０％のリン酸化の低下、少なくとも約６０％のリン酸化の低下、少なくとも約７０％のリン酸化の低下、少なくとも約８０％のリン酸化の低下、少なくとも約９０％のリン酸化の低下又は少なくとも約９９％のリン酸化の低下である。一実施形態では、血液癌は骨髄腫である。
【００８５】
本発明の細胞は当該技術分野で公知の培養免疫細胞でよい。一実施形態では、免疫細胞は骨髄腫細胞のような培養疾患細胞である。細胞は多剤耐性でよく、多剤耐性骨髄腫細胞を含むが、これに限定されない。本発明は、ステロイド耐性骨髄腫細胞のようなステロイド耐性細胞も含む。別の実施形態では、培養細胞は正常形質細胞のような正常免疫細胞である。
【００８６】
本発明の細胞は、当該技術分野で公知の細胞採取及び生検方法により動物から採取される細胞でもよい。一実施形態では、動物はヒトである。別の実施形態では、動物はイヌ、ネコ、ラット、マウス、霊長動物又はウシである。細胞は骨髄腫細胞のような疾患細胞でよく、或いは正常細胞でよい。正常細胞は健常動物から得ることができる。或いは、正常細胞は、正常細胞が疾患細胞に隣接している疾患動物から得ることができる。
【００８７】
本発明の一実施形態において、疾患細胞が試験化合物で処理され、上記のように結果として生じるリン酸化値が、同一化合物で処理された正常健常細胞のリン酸化値と比較される。別の実施形態では、疾患細胞は試験化合物で処理され、未処理疾患細胞と比較される。当業者であれば、骨髄腫のような血液癌を治療する試験化合物の性能を確認するため、陽性及び陰性対照を含む様々な対照を用いることができることを理解するであろう。例えば、試験化合物で処理された骨髄腫細胞のＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２又はＡｋｔキナーゼ並びに下流シグナル伝達分子のリン酸化レベルを、１つ又はそれ以上の蛋白質のリン酸化レベルへの既知の作用を有する化合物で処理された骨髄腫細胞或いは未処理骨髄腫細胞のリン酸化レベルと比較することができる。
【００８８】
本発明の別の実施形態において、当該技術分野で公知の方法を用いて、試験細胞のＰＰ２Ａのホスファターゼ活性が測定される。ホスファターゼ活性の上昇は、当該処理が骨髄腫のような血液悪性疾患に効果的であることを示す。当業者であれば、対照細胞、即ち、化合物で処理されない細胞又は既知のホスファターゼ活性を有する化合物で処理された細胞のホスファターゼ活性を、請求された本発明に対して用いることができることを理解するであろう。少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％のＰＰ２Ａのホスファターゼ活性の上昇は、効果的な処置を示す。
【００８９】
加えて、本発明の方法は、前記骨髄腫細胞のアポトーシスを測定する工程を含むことができ、アポトーシスの増加が多発性骨髄腫に対する有効な治療を示す。アポトーシスは当該技術分野で公知のアッセイにより測定することができる。骨髄腫のような血液癌の有効な治療を示すアポトーシスのレベルは、少なくとも約１０％のアポトーシスの増加、少なくとも約１５％のアポトーシスの増加、少なくとも約２０％のアポトーシスの増加、少なくとも約２５％のアポトーシスの増加、少なくとも約３０％のアポトーシスの増加、少なくとも約４０％のアポトーシスの増加、少なくとも約４５％のアポトーシスの増加、少なくとも約５０％のアポトーシスの増加、少なくとも約６０％のアポトーシスの増加、少なくとも約７０％のアポトーシスの増加、少なくとも約８０％のアポトーシスの増加、少なくとも約９０％のアポトーシスの増加及び少なくとも約９５％のアポトーシスの増加となり得る。
【００９０】
本発明の別の実施形態において、試験細胞は更に細胞増殖に関して分析され、細胞増殖の低下は骨髄腫のような血液癌の有効な治療を示す。細胞は当該技術分野で公知の細胞増殖アッセイを用いて分析することができる。例えば、試験化合物で処理された骨髄腫細胞を細胞増殖に関して分析することができる。試験化合物で処理された細胞の１つ又はそれ以上の蛋白質のＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２及びＡｋｔキナーゼ並びに下流シグナル伝達分子のリン酸化の低下と細胞増殖の低下は、当該薬剤が骨髄腫に対する治療として有効であることを示す。少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％の細胞増殖の低下は、良好な治療を示す。
【００９１】
本発明は、試験化合物で処理された細胞のカスパーゼ活性化を検出する工程を任意で含み、カスパーゼ活性化が血液悪性疾患の有効な治療を示す。一実施形態では、血液悪性疾患は骨髄腫である。別の実施形態では、血液悪性疾患は白血病又はリンパ腫である。
【実施例】
【００９２】
（材料及び方法）
（細胞培養）
ＭＭ．１Ｓ及びＭＭ．１Ｒ細胞株は以前に開発された（Ｇｏｌｄｍａｎ−Ｌｅｉｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：３３５−４５）。元の細胞株（ＭＭ．１）はステロイドベースの療法で処置されたＭＭ患者の末梢血から樹立された。ステロイド感受性クローン（ＭＭ．１Ｓ）が単離され、続いて、グルココルチコイドへの長期曝露によってステロイド耐性変異体（ＭＭ．１Ｒ）が開発された。ＲＰＭＩ８２２６細胞及び多剤耐性誘導ＭＤＲ１ＯＶ  ＭＭ細胞をＷｉｌｌｉａｍ  Ｄａｌｔｏｎ博士（Ｈ・リー・モフィットがんセンター（Ｈ．Ｌｅｅ  Ｍｏｆｆｉｔｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）、フロリダ州タンパ）から得た（Ｂｅｌｌａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：９９５−１００２）。５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベータ中、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ及びファンギゾン２．５μｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、メリーランド州ボルチモア）中で細胞を増殖させた。
【００９３】
（薬剤及び化学物質）
８−ＮＨ２−ＡｄｏをＲ．Ｉ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州オレンジ郡）から、また、８−アミノ−アデノシンをＢｉｏ  Ｌｏｇ社（カリフォルニア州ラ・ホヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ））から購入した。シタラビンをＳｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス）から得た。インビトロ試験用に、ヌクレオシドＦ−ａｒａ−Ａに脱リン酸化された無菌凍結乾燥粉末としてフルダラビンをＢｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（カリフォルニア州アラメダ郡（Ａｌａｍｅｄａ））から購入した。ゲムシタビンをＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．（インディアナ州インディアナポリス）から得た。キナーゼ阻害剤ＳＢ２０２１９０及びＳＢ２０３５８０をＳｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス）から購入し、ＰＤ９８０５９，Ｕ０１２６及びＬＹ２９４００２をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。オカダ酸をＡｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。
【００９４】
（実施例１）
（細胞増殖アッセイ）
過去に報告されているようにＭＴＳアッセイを行った（Ｋｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：１７８１−１７８７）。簡単に述べると、ＭＭ細胞を１ウェルあたり２５，０００個の細胞濃度にて９６ウェルディッシュ中に培養し、８−ＮＨ２−Ａｄｏとともに７２時間インキュベーションした。ＭＴＳ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ａｑｕｅｏｕｓアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を用いて細胞増殖を測定し、これは、生細胞中のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ酵素によるテトラゾリウム化合物のホルマザンへの変換を測定した。４９０ｎｍの吸光度量によって測定されるホルマザン産物量は、培養物中の生細胞の数に直接比例する。データは、同じアッセイにおける対照培地で処理した細胞によって産生されたホルマザンのパーセントとして表した。
【００９５】
（実施例２）
（免疫ブロット分析）
指示された時間の間、５×１０６個の細胞を１０μＭの８−ＮＨ２−Ａｄｏで処理し、採取した。細胞ペレットを冷却リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ＮａＣｌ  ８．１ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４  １．１４ｇ，ＫＣＩ  ０．２２ｇ及びＫＨ２ＰＯ４  ０．２５ｇ／Ｌ）で洗浄し、溶解緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ５０ｍＭ，ＮａＣｌ  １５０ｍＭ，ＭｇＣｌ２  １．５ｍＭ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０，ＮａＦＩ  １００ｍＭ，ピロリン酸Ｎａ  １０ｍＭ，ＰＭＳＦ  ５００μＭ，Ｘ−１００  ０．５％トリトン，グリセロール  １０％）と共に４℃で１時間インキュベーションした。溶解物を９０００ｘｇ，４℃で１分間遠心分離し、上澄みを採取し−２０℃で保存した。Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ））により蛋白濃度を測定した。濃度が３０ｊｉｇの蛋白質をサンプル緩衝液（１２５ｍＭトリス  ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，２０％グリセロール，１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び０．０５％ブロモフェノールブルー）と混合し、トリス−グリシンプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／Ｎｏｖｅｘ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））上で分画した。次に、蛋白質をポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ））に転写した。蛋白質転写後、膜をＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）中の５％脱脂乳によりブロックし、４℃で一晩、一次抗体と共に、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、イリノイ州アーリントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ））と共にインキュベーションした。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング化学発光検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、イリノイ州アーリントンハイツ）を用いてブロットを発色展開させ、Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社、イリノイ州アーリントンハイツ）によりシグナルを可視化した。再プローブすることを目的に、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））製のレストア・ウェスタンブロット・ストリッピングバッファーを用いてブロットを剥離した。ホスホ−ＭＫＫ３／６（Ｓｅｒ１８９／２０７）、ホスホ−ｐ３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、ホスホ−ＡＴＦ−２（Ｔｈｒ６９／７１）、ホスホ−ｃ−Ｒａｆ（Ｓｅｒ２５９）、ホスホ−ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）、総ＭＥＫ１／２、ホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２Ｏ４）、総ＥＲＫ１／２、ホスホ−ｐ９０ＲＳＫ（Ｓｅｒ３８０）、総ＲＳＫ、ホスホ−ＰＤＫ１（Ｓｅｒ２４１）、総ＰＤＫＩ、ホスホ−ＰＴＥＮ（Ｓｅｒ３８０）、総ＰＴＥＮ、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、総Ａｋｔ、ホスホ−ＧＳＫ−３ｐ（Ｓｅｒ９）、総ＧＳＫ−３ｐ、ホスホ−ＦＫＨＲＬＩ（Ｔｈｒ３２）／−ＦＫＨＲ（Ｔｈｒ２４）、ホスホ−ＦＫＨＲ（Ｓｅｒ２５６）一次抗体を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ））から得た。総ＭＫＫ３、総ＭＫＫ６、総ｐ３８、総ＡＴＦ−２、総ｃ−Ｒａｆ、総ＦＫＨＲ、総ＦＫＨＲＬＩ、ホスホ−ＪＮＫ及び総ＪＮＫを、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（カリフォルニア州サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））から購入した。カスパーゼ３、カスパーゼ９及びＰＡＲＰ抗体をＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から、抗ＭＫＰ１をＵｐｓｔａｔｅ社（ニューヨーク州レークプラシッド（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ））から得た。抗カスパーゼ８マウス血清はＭａｒｃｕｓ  Ｐｅｔｅｒ博士（シカゴ大学）から寄贈された。
【００９６】
（実施例３）
（フローサイトメトリー）
ＭＭ１細胞を１０μＭの８−ＮＨ２−アデノシンと共に０．５、１、２、４又は２４時間インキュベーションした。細胞周期内の細胞分布を求めるため、Ｉ×１０６個のＭＭ．ＩＳ細胞をペレット化し（５００ｘｇ，４℃で５分間）、氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、氷冷７０％エタノール中に固定し、分析するまで４℃で保存した。フローサイトメトリーによる分析前、固定した細胞をペレット化し、ＰＢＳ中で洗浄し、氷冷流動緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、ヨウ化プロピジウム１５μｇ／ｍＬ及びＤＮアーゼ非含有ＲＮアーゼ５μｇ／ｍＬを含むＰＢＳ）中に再懸濁した。Ｅｐｉｃｓ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｉ１フローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．、フロリダ州ハイアリーア（Ｈｉａｌｅａｈ））を用いて染色細胞を分析した。図２はこの試験の結果を示す。
【００９７】
（実施例４）
（ＡＴＰ欠乏アッセイ）
１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２．５μｇ／ｍｌファンギゾンを添加した、デキストロース非含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、メリーランド州ボルチモア）中でＭＭ．ＩＳ細胞を増殖させた。種々の濃度のデキストロースを有し、或いは有さない、Ｓｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス）製のアンチマイシン（２μＭ、ミトコンドリア阻害剤）又は２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＯＧ、５ｍＭ、解糖阻害剤）を添加することにより、細胞内ＡＴＰレベルを操作した。異なる６種類の代謝状態を検討した：１）デキストロースを含まないアンチマイシン、２）アンチマイシン＋０．２５ｍＭデキストロース、３）アンチマイシン＋１ｍＭデキストロース、４）アンチマイシン＋１０ｍＭデキストロース、５）デキストロースを含まない２−ＤＯＧ、６）２−ＤＯＧ＋１０ｍＭデキストロース。対照細胞はＡＴＰ欠乏に曝さず、デキストロース非含有ＲＭＰＩ−１６４０に１０ｍＭデキストロースを加えた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ））製のＡＴＰ測定キットを用いてルシフェラーゼベースのアッセイにおいて内在性ＡＴＰを測定し、各処理に対応するレベルを未処理対照に規準化した（２０）。
【００９８】
（実施例５）
（８−ＮＨ２−Ａｄｏは主要シグナル伝達分子のリン酸化の喪失を引き起こす）
ＭＭ．１Ｓ細胞を１０μＭの８−ＮＨ２−Ａｄｏに０、０．５、１、２、４及び６時間曝露し、その後、前述（実施例２）のように細胞を溶解した。蛋白質３０μｇをゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ＭＫＫ３／６，ｐ３８  ＭＡＰＫ，ＡＴＦ−２，ＭＥＫ１／２，ＥＲＫ１／２，ｐ９０ＲＳＫ，ＪＮＫｌ，ＰＤＫｌ，Ａｋｔ，ＦＫＨＲＬ１及びＧＳＫ−３βに対するリン酸化特異的抗体でプローブした。薬剤処理が総蛋白レベルに作用しないように、また、同等の処理量及び転写となるように、ブロットを剥離し、対応する総蛋白抗体で再プローブした。図１Ａ，１Ｂ，１Ｃ及び１Ｄはこのブロットの結果を示す。
【００９９】
（ｐ３８  ＭＡＰＫ経路）
ｐ３８  ＭＡＰＫはその上流の活性化キナーゼＭＫＫ３及びＭＫＫ６もしくはその一方によって活性化される。免疫ブロット分析では、８−ＮＨ２−Ａｄｏ処理が経時的にＭＫＫ３／６の脱リン酸化を誘発することが明らかにした。リン酸化したＭＫＫ３／６蛋白質レベルは２時間の８−ＮＨ２−Ａｄｏ処理により有意に低下し、６時間処理により微量レベルとなる。ｐ３８のリン酸化レベルは１時間の薬剤処理により劇的に低下し、２時間後には顕著なリン酸化は認められない。ｐ３８基質のＡＴＦ−２のリン酸化状態も損なわれ、リン酸化蛋白質レベルは２時間の処理により顕著に低下する（図ＩＡ）。このＭＡＰＫモジュールにおいて評価される全蛋白質に対する総蛋白質レベルには変化がない。
【０１００】
（ＥＲＫＩ／２経路）
ＥＲＫＩ／２蛋白質は劇的な脱リン酸化を受けるが、ＥＲＫ経路の他の化合物のリン酸化レベルは８−ＮＨ２−Ａｄｏ処理によって同様には影響されない。上流ＥＲＫＩ／２活性化キナーゼＭＥＫ１／２のリン酸化レベルは、薬剤処理時に低下ではなく上昇するように思われるが、総ＭＥＫ１／２蛋白質レベルは変化しない。しかし、ＥＲＫＩ／２キナーゼのリン酸化は３０分間の８−ＮＨ２−Ａｄｏ処理により有意に低下し、２時間では微量レベルに低下するが、総ＥＲＫＩ／２レベルは変化しない。総蛋白質レベルに影響はないが、８−ＮＨ２−Ａｄｏ処理はＥＲＫＩ／２基質のｐ９０ＲＳＫのリン酸化レベルを実際にわずかに低下させるように思われるが、この作用はＥｒＫ１／２又はｐ３８  ＭＡＰＫ経路の化合物に関して認められるほど劇的ではない（図１Ｂ）。
【０１０１】
（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ））
ｃ  Ｊｕｎ  Ｎ末端又はストレス活性化キナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ）は、ＭＡＰＫ群のセリン／トレオニン蛋白質キナーゼの一サブファミリーを成し、アポトーシスのような細胞プロセスに関与する。しかし、他のＭＡＰＫ蛋白質ｐ３８及びＥＲＫと異なり、ＪＮＫのリン酸化は８−ＮＨ２−Ａｄｏ処理に影響されない（図１Ｑ）。
【０１０２】
（Ａｋｔキナーゼ経路）
Ａｋｔ調節蛋白質ＰＤＫ１の総レベル及びリン酸化レベルには変化はないが、Ａｋｔキナーゼは８−ＮＨ２−Ａｄｏ処理時にリン酸化を大幅に喪失させる。ホスホ−Ａｋｔレベルは２時間の処理により有意に低下し、最終的には更に微量レベルに低下する。Ａｋｔの下流標的も同様に影響を受ける。フォークヘッド転写因子ファミリーのメンバーは大幅なリン酸化の喪失を受けるが、総蛋白質レベルは変化しない。ＦＫＨＲＬＩのリン酸化は２時間の薬剤処理により大幅に低下し、４時間及び６時間において顕著なリン酸化は認められない。ＦＫＨＲのリン酸化も同様に影響を受ける（データは示さず）。ホスホ−ＧＳＫ−３ｐレベルは２時間の８−ＮＨ２−Ａｄｏ処理により低下し、６時間では微量となる（図１Ｄ）。
【０１０３】
これらの主要シグナル伝達分子のリン酸化レベルの変化が細胞死の直接的な結果であるかを確認するため、細胞周期分析により細胞生存能に関して類似培養物を評価した。アポトーシスを受ける細胞はＤＮＡ小断片の切断及び欠損によってＤＮＡ含量が減少する。従って、アポトーシス細胞は細胞周期のＧ１サブフラクションにおける細胞として同定される。この分析では、Ｇサブフラクションの未処理細胞と最大４時間８−ＮＨ２−Ａｄｏで処理した細胞との間で差異は明らかにならず、これは、ウェスタンブロット法により認められたリン酸化の喪失は細胞生存能の付随的喪失が原因ではなかったことを示す（図２）。
【０１０４】
（実施例６）
（種々のＭＭ細胞株における８−ＮＨ２−Ａｄｏのｐ３８  ＮＪＡＰＫのリン酸化に対する作用）
薬剤誘発性の蛋白リン酸化の変化が複数の細胞株において生じるのか、或いはＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞株に限定されるのかを判定するため、８−ＮＨ２−Ａｄｏのリン酸化レベルに対する作用を付加骨髄腫細胞株において評価した。ＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫親細胞及び多剤耐性誘導ＭＤＲ１０Ｖ細胞並びにグルココルチコイド耐性ＭＭ．１Ｒ細胞はすべて、８−ＮＨ２−Ａｄｏの細胞傷害能の作用を受ける（１２）。８−ＮＨ２−Ａｄｏに反応するｐ３８のリン酸化レベルをこれらの細胞株において評価し、用量依存的に低下することが見出されたが、総ｐ３８レベルは変化しない。このデータは、８−ＮＨ２−Ａｄｏ誘発性の蛋白リン酸化の喪失がＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞株に限定されないことを示唆する（データは示さず）。
【０１０５】
（実施例７）
（他のヌクレオシドアナログのリン酸化レベルに対する作用）
１０μＭの８−クロロ−アデノシンで０、０．５、１、２、４又は６時間、或いは１０μＭシタラビン、フルダラビン、ゲムシタビン又は８−アミノ−アデノシンで４時間ＭＭ．ＩＳ細胞を処理した。細胞を前述のように溶解し、また、蛋白質３０μｇをゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ホスホ−ｐ３８  ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）抗体でプローブした。薬剤処理が総蛋白レベルに作用しないように、また、同等の処理量及び転写となるように、ブロットを剥離し、総ｐ３８  ＭＡＰＫ抗体で再プローブした。典型的な試験の結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。
【０１０６】
８−ＮＨ２−Ａｄｏは主要シグナル伝達分子のリン酸化レベルを有意に変化させることによって新規の細胞作用を誘発するだけではなく、その作用能において他のヌクレオシドアナログ、ピリミジン及びプリンの両方、の中で特異であるようにも思われる。８−ＮＨ２−Ａｄｏの同族体８−クロロ−Ａｄｏ（８−ＣＩ−Ａｄｏ）はＭＭ細胞においてアポトーシスを誘導するが、ＭＭ．ＩＳ細胞における１０μＭの８−クロロ−アデノシン処理の時間経過は、ｐ３８（図３Ａ），ＥＲＫ１／２又はＡｋｔキナーゼのリン酸化状態への作用を示さない（データは示さず）。プリンアナログであるフルダラビン並びにピリミジンアナログであるシタラビン及びゲムシタビンもＭＭ細胞に対して細胞傷害性であることが前記で示された。しかし、８−ＮＨ２−Ａｄｏがこれらのキナーゼのリン酸化の大幅な喪失を引き起こす時間及び濃度である、ＭＭ．１Ｓ細胞中の濃度１０μＭにて４時間使用した場合、これらはｐ３８（図３Ｂ），ＥＲＫ１／２又はＡｋｔのリン酸化の低下を引き起こさない（データは示さず）。
【０１０７】
（実施例８）
（ＭＭＡＳ細胞のＡＴＰ欠乏）
８−ＮＨ２−Ａｄｏは内在性ＡＴＰプールの大幅な変化を引き起こすため、利用可能なＡＴＰの減少がキナーゼ又はホスファターゼに対する作用を有し、最終的に細胞内の重要なシグナル伝達経路のリン酸化に影響を及ぼし得る。ＡＴＰ単独の減少が認められたリン酸化の低下を引き起こすのに十分であるかを試験するため、電子伝達系を阻害するアンチマイシンＡ又は解糖を阻害する２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）の添加により細胞内ＡＴＰレベルを操作し、デキストロースの濃度上昇を導入することにより、段階的なＡＴＰ欠乏を達成した。ＭＭ．１Ｓ細胞をデキストロース非含有培地中で増殖させ、２μＭのアンチマイシンＡ、５ｍＭの２−ＤＯＧ及び種々の濃度のデキストロースで９０分間処理した。ルシフェラーゼベースのアッセイにおいて３組の試料を用いて細胞内ＡＴＰレベルを測定し、本明細書で未処理対照のパーセントとして表す。トリパンブルー排除及び細胞周期の内容によって細胞生存能を評価し、未処理対照のパーセントとして表す。処理後、細胞を前述のように溶解し、また、蛋白質３０μｇをゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ホスホ−ｐ３８  ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）抗体でプローブした。薬剤処理が総蛋白レベルに作用しないように、また、同等の処理量及び転写となるように、ブロットを剥離し、総ｐ３８  ＭＡＰＫ抗体で再プローブした。典型的な試験の結果を図４に示す。更なる２回の試験により同等の結果を得た。付加試験は、ホスホ−ＥＲＫ１／２及びホスホ−Ａｋｔを用いて実施し（データは示さず）、これもリン酸化の低下を示さなかった。これらの結果は、キナーゼモジュールにおけるｐ３８，ＥＲＫ，Ａｋｔや他の蛋白質のリン酸化に対する８−ＮＨ２−Ａｄｏの作用が、単純に内在性ＡＴＰレベルの低下の結果ではないことを示す。
【０１０８】
（実施例９）
（８−ＮＨ２−Ａｄｏの細胞内ホスファターゼへの作用）
キナーゼ分子とその基質のリン酸化低下機序の１つの可能性は、これらを調節するホスファターゼの活性上昇である。この仮説を試験するため、Ｐ３８  ＭＡＰＫを脱リン酸化するように作用することができる二重特異性ホスファターゼＭＫＰＩのレベルを評価した。ＭＭ．１Ｓ細胞を１０μＭの８−ＮＨ２−Ａｄｏに、０、０．５、１、２、４及び６時間曝露し、その後、細胞を前述のように溶解した。蛋白質３０μｇをゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ＭＫＰ１に対する抗体でプローブした。図５Ａに示す結果は、このホスファターゼが関与している可能性は低いことを示唆する。
【０１０９】
加えて、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の負の調節に関与する主要ホスファターゼをコードするＰＴＥＮに対する８−ＮＨ２−Ａｄｏの作用を評価した（図５Ｂ）。ＭＭ．１Ｓ細胞を１０μＭの８−ＮＨ２−Ａｄｏに、０、０．５、１、２、４及び６時間曝露し、その後、細胞を溶解した。蛋白質３０μｇをゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ホスホ−ＰＴＥＮに対する抗体でプローブした。ブロットを剥離し、総ＰＴＥＮ抗体で再プローブした。
【０１１０】
ＭＫＰ１のように、総ＰＴＥＮ及びホスホ−ＰＴＥＮレベルは８−ＮＨ２−Ａｄｏ処理によって変化しない。細胞内部位がＰＴＥＮ機能の調節に主要な役割を果たすが、Ｃ末端ドメインのリン酸化もホスファターゼ活性を負に調節することが示されている（２８，２９）。従って、無変化ホスホ−ＰＴＥＮレベルは、このホスファターゼが蛋白リン酸化に対する薬剤媒介性作用に関与しないことを示す。
【０１１１】
細胞内ホスファターゼの関与を試験する並行的な手法において、セリン／トレオニンホスファターゼＰＰ２Ａ及びＰＰＩが関与するかを評価するため、８−ＮＨ２−Ａｄｏと併せて種々の濃度のホスファターゼ阻害剤のオカダ酸でＭＭ．１Ｓ細胞を４時間処理した。ホスホ−Ｐ３８及び総Ｐ３８抗体に対して免疫ブロットした細胞抽出物は、８−ＮＨ２−Ａｄｏの存在下、３０ｎＭオカダ酸濃度にてリン酸化の部分的回復があることを示した（図５Ｃ）。加えて、オカダ酸によるＭＭ．１Ｓ細胞の処理は、８−ＮＨ２−Ａｄｏ誘発性のＰ３８のリン酸化の喪失を有意に遅延させる。１０μＭの８−ＮＨ２−Ａｄｏと３０ｎＭオカダ酸で処理したＭＭ．１Ｓ細胞の時間経過は、８−ＮＨ２−Ａｄｏ単独で処理したＭＭ．１Ｓと対照的に、細胞オカダ酸の存在下、ホスホ−Ｐ３８レベルの低下が遅延し、６時間時点でも存在することを示す（図５Ｄ）。細胞内の３０ｎＭオカダ酸濃度はＰＰＩに対するＰＰ２Ａの選択的阻害を示し、ＰＰ２Ａの活性化が８−ＮＨ２−Ａｄｏ誘発性のＰ３８のリン酸化の低下に役割を果たし得ることを示唆する。
【０１１２】
（実施例１０）
（カスパーゼ活性及びＰＡＲＰ開裂に対する８−ＮＨ２−Ａｄｏの作用）
ＭＭ．１Ｓ細胞を１０μＭの８−ＮＨ２−Ａｄｏに、０、０．５、１、２、４又は６時間曝露し、その後、細胞を前述のように溶解した。蛋白質３０μｇをゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、図６に示すように抗体でプローブした。矢印はカスパーゼ８及びカスパーゼ９の開裂断片並びにＰＡＲＰ開裂断片を示す。同等の処理量及び転写となるように総蛋白質レベルも評価した（データは示さず）。典型的な試験の結果を示す。更なる２回の試験により同等の結果を得た。
【０１１３】
８−ＮＨ２−Ａｄｏ処理はエフェクターカスパーゼであるカスパーゼ８及びカスパーゼ９を活性化する。図６は、開裂・活性化されたカスパーゼ８及びカスパーゼ９が１０μＭの８−ＮＨ２−Ａｄｏ処理の２〜４時間の間に発現することを示す。ユニバーサルカスパーゼ基質であるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＤ）も薬剤処理の２時間時点に始まり発現する。これらのアポトーシスマーカーはシグナル伝達キナーゼのリン酸化喪失に時間的に追従する。
【０１１４】
（実施例１１）
（８−ＮＨ２−Ａｄｏ媒介性細胞傷害に対するキナーゼ阻害剤の作用）
キナーゼ阻害剤が８−ＮＨ２−Ａｄｏの細胞生存能への作用を調節し得るかを検討するため、細胞増殖アッセイを行った。種々の用量のｐ３８キナーゼ阻害剤ＳＢ２０２１９０及びＳ１３２０３８５０、ＥＲＫ１／２阻害剤ＰＤ９８０５９及びＵ０１２６並びにＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２単独で、また、１０μＭの８−ＮＨ２−Ａｄｏと共にＭＭ．１Ｓ細胞を処理した。細胞生存能アッセイにおいて、１０μＭの８−ＮＨ２−Ａｄｏとキナーゼ阻害剤の併用は、８−ＮＨ２−Ａｄｏの細胞傷害作用を増大させる相乗効果とはならず、また、キナーゼ阻害剤が８−ＮＨ２−Ａｄｏの細胞傷害作用を低下させることもない（データは示さず）。
【０１１５】
本出願において考察した刊行物、特許及び特許出願は、すべて参照して本明細書に組み込まれる。上記明細書において、本発明をその特定の実施形態に関連して説明し、例示目的として多くの詳細事項を示したが、本発明は更なる実施形態を許容し、また、本明細書で述べた特定の詳細事項は本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更され得ることは当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１Ａ】Ａは、８−アミノ−アデノシンで処理された骨髄腫細胞由来であって、リン酸化及び総（リン酸化及び非リン酸化）主要経路蛋白質に対する抗体を用いてプローブされた蛋白質を示すブロット図である。
【図１Ｂ】Ｂは、８−アミノ−アデノシンで処理された骨髄腫細胞由来であって、リン酸化及び総（リン酸化及び非リン酸化）主要経路蛋白質に対する抗体を用いてプローブされた蛋白質を示すブロット図である。
【図１Ｃ】Ｃは、８−アミノ−アデノシンで処理された骨髄腫細胞由来であって、リン酸化及び総（リン酸化及び非リン酸化）主要経路蛋白質に対する抗体を用いてプローブされた蛋白質を示すブロット図である。
【図１Ｄ】Ｄは、８−アミノ−アデノシンで処理された骨髄腫細胞由来であって、リン酸化及び総（リン酸化及び非リン酸化）主要経路蛋白質に対する抗体を用いてプローブされた蛋白質を示すブロット図である。
【図２】８−アミノ−アデノシンと共に０．５、１、２、４及び２４時間インキュベーションされたＭＭ．１Ｓ細胞に対する、フローサイトメトリーによる細胞周期を示すグラフ図である。
【図３】Ａ及びＢは、種々のヌクレオシドアナログと共にインキュベーションされたＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞由来であって、リン酸化ｐ３８  ＭＡＰキナーゼに対する抗体を用いてプローブされた蛋白質を示すブロット図である。
【図４】ＭＭ．１Ｓ細胞中のｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化レベルに対するＡＴＰ欠乏の作用を示すＡＴＰアッセイのブロット及び試験結果図である。
【図５Ａ】Ａは、ＭＭ．１Ｓ細胞中の８−アミノ−アデノシンのそれぞれＭＫＰ−１及びＰＴＥＮ（リン酸化及び総ＰＴＥＮ）レベルに対する作用を示すブロット図である。
【図５Ｂ】Ｂは、ＭＭ．１Ｓ細胞中の８−アミノ−アデノシンのそれぞれＭＫＰ−１及びＰＴＥＮ（リン酸化及び総ＰＴＥＮ）レベルに対する作用を示すブロット図である。
【図５Ｃ】Ｃは、ＭＭ．１Ｓ細胞中の８−アミノ−アデノシン及びオカダ酸処理のリン酸化ｐ３８  ＭＡＰＫ及び総ｐ３８  ＭＡＰＫに対する作用を示すブロット図である。
【図５Ｄ】Ｄは、ＭＭ．１Ｓ細胞中の８−アミノ−アデノシン及びオカダ酸処理のリン酸化ｐ３８  ＭＡＰＫ及び総ｐ３８  ＭＡＰＫに対する作用を示すブロット図である。
【図６】ＭＭ．１Ｓ細胞中の８−アミノ−アデノシンのカスパーゼ８及びカスパーゼ９に対する作用を示すブロット図である。
【図１Ａ】
2008519854.tif 000002
【図１Ｂ】
2008519854.tif 000003
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
2008519854.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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