(57)【要約】  本発明は、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の存在と炭疽菌の結合パートナーを検出するための方法、組成物及びキットに関する。また本発明は、ポリヌクレオチド配列によってコードされている炭疽菌ゲノム及びタンパク質に特異的である、ポリヌクレオチド配列に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）を検出する方法であって、
（ａ）炭疽菌を含んでいることが疑われる試料を提供すること；
（ｂ）試料からの核酸、少なくとも１つの第１のプライマー、及び少なくとも１つの第２のプライマーを含む組成物を形成すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）のプライマーが増幅することができる任意の核酸を増幅すること；及び
（ｄ）ステップ（ｃ）の増幅産物を検出することにより炭疽菌を検出すること
を含み、
（ｉ）少なくとも１つのプライマーが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一であるヌクレオチド断片を含み、その少なくとも１つのプライマーが、炭疽菌のＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合するが、セレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＤＮＡ又はＲＮＡのいずれにも結合せず；並びに／又は、（ｉｉ）少なくとも１つのプライマーが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列の一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む方法。
【請求項２】
各プライマーが、次の６つの配列：配列番号１、２、３及びそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が炭疽菌非特異的ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
試料が宿主の組織、宿主の喀痰、土壌、水及び空気から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
宿主がヒト又は有蹄動物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
有蹄動物がウシ又はヒツジである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試料から核酸を抽出することをさらに含み、前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
核酸をポリメラーゼ連鎖反応により増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のプライマーの少なくとも１つが配列番号４のヌクレオチド配列又は配列番号４の相補配列を有し、前記第２のプライマーの少なくとも１つが配列番号５のヌクレオチド配列又は配列番号５の相補配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のプライマーの少なくとも１つが配列番号６のヌクレオチド配列又は配列番号６の相補配列を有し、前記第２のプライマーの少なくとも１つが配列番号７のヌクレオチド配列又は配列番号７の相補配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のプライマーの少なくとも１つが配列番号９のヌクレオチド配列又は配列番号９の相補配列を有し、前記第２のプライマーの少なくとも１つが配列番号１０のヌクレオチド配列又は配列番号１０の相補配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のプライマーの少なくとも１つが配列番号１１のヌクレオチド配列又は配列番号１１の相補配列を有し、前記第２のプライマーの少なくとも１つが配列番号１２のヌクレオチド配列又は配列番号１２の相補配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のプライマーの少なくとも１つが配列番号１３のヌクレオチド配列又は配列番号１３の相補配列を有し、前記第２のプライマーの少なくとも１つが配列番号１４のヌクレオチド配列又は配列番号１４の相補配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のプライマーの少なくとも１つが配列番号１５のヌクレオチド配列又は配列番号１５の相補配列を有し、前記第２のプライマーの少なくとも１つが配列番号１６のヌクレオチド配列又は配列番号１６の相補配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のプライマーの少なくとも１つが配列番号１７のヌクレオチド配列又は配列番号１７の相補配列を有し、前記第２のプライマーの少なくとも１つが配列番号１８のヌクレオチド配列又は配列番号１８の相補配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの第１のプライマー又は少なくとも１つの第２のプライマーがビオチン又はジゴキシゲニンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの第１のプライマー又は第２のプライマーが検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光部分又はＥＣＬ部分である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＥＣＬ部分が金属を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
金属がルテニウム、レニウム又はオスミウムである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＥＣＬ部分が、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジル（［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋）又は［Ｒｕ（スルホ−ｂｐｙ）２ｂｐｙ］２＋である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｃ）の増幅産物を、その増幅産物を変性させるのに十分な温度でインキュベートすること、及びアンプリコンを検出する前に、変性させた増幅産物を、磁化可能なビーズ上に固定化することができるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｃ）の増幅産物が、配列番号１、２、３の配列又はそれらの相補配列の全部又は一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｃ）の増幅産物が、配列番号１、２、３の配列又はそれらの相補配列の全部又は一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
炭疽菌を検出する方法であって、
（ａ）炭疽菌を含んでいることが疑われる試料を提供すること；
（ｂ）試料からの核酸を、ハイブリダイゼーションに好適な条件下で少なくとも１つのプローブと接触させること；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）のハイブリダイゼーション産物に基づいて試料中の炭疽菌を検出すること
を含み、
（ｉ）少なくとも１つのプローブが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一であるヌクレオチド断片を含み、その少なくとも１つのプローブが、炭疽菌ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合するが、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス及び枯草菌のＤＮＡ又はＲＮＡのいずれにも結合せず；並びに／又は（ｉｉ）少なくとも１つのプローブが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列の一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、方法。
【請求項２６】
プローブを高ストリンジェンシー条件下で炭疽菌核酸とハイブリダイズすることができる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
試料が炭疽菌非特異的ＤＮＡを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
試料が宿主の組織、宿主の喀痰、土壌、水及び空気から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
宿主がヒト又は有蹄動物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
有蹄動物がウシ又はヒツジである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
試料から核酸を抽出することをさらに含み、前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
プローブが固相支持体に結合される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
ハイブリダイゼーション後にプローブを固相支持体に結合させることをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
プローブが配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８の配列、又は配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８に相補的な配列を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのプローブがビオチン又はジゴキシゲニンを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つのプローブが検出可能な標識を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光部分又はＥＣＬ部分である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＥＣＬ部分が金属を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
金属がルテニウム、レニウム又はオスミウムである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＥＣＬ部分が、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジル（［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋）又は［Ｒｕ（スルホ−ｂｐｙ）２ｂｐｙ］２＋である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
サザンブロット法である、請求項２５に記載の方法。
【請求項４２】
ノーザンブロット法である、請求項２５に記載の方法。
【請求項４３】
（ｉ）配列番号１、２、３又はそれらの相補配列のいずれかのヌクレオチド配列の一部と実質的に同一であり（ここで、ポリヌクレオチドは、炭疽菌ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合するが、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス及び枯草菌のＤＮＡ又はＲＮＡのいずれにも結合しない）；並びに／又は（ｉｉ）配列番号１、２、３又はそれらの相補配列のいずれかの少なくとも１２個の連続するヌクレオチドに実質的に同一であるセクションを含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項４４】
炭疽菌染色体ＤＮＡから精製される、請求項４３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４５】
組換え法により調製される、請求項４３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４６】
組換えポリヌクレオチドがプラスミドを形成する、請求項４５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４７】
セクションが、配列番号１、２、３、又はそれらの相補配列のいずれかの少なくとも１２個の連続するヌクレオチドと実質的に同一である、請求項４３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
増幅に基づいた炭疽菌の検出で使用するための１対のオリゴヌクレオチドプライマーであって、各プライマーが、次の６つの配列：配列番号１、２、３、及びそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、１対のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項４９】
第１のプライマーが配列番号４のヌクレオチド配列又は配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号５のヌクレオチド配列又は配列番号５のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項４８に記載のプライマー対。
【請求項５０】
第１のプライマーが配列番号６のヌクレオチド配列又は配列番号６のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号７のヌクレオチド配列又は配列番号７のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項４８に記載のプライマー対。
【請求項５１】
第１のプライマーが配列番号９のヌクレオチド配列又は配列番号９のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号１０のヌクレオチド配列又は配列番号１０のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項４８に記載のプライマー対。
【請求項５２】
第１のプライマーが配列番号１１のヌクレオチド配列又は配列番号１１のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号１２のヌクレオチド配列又は配列番号１２のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項４８に記載のプライマー対。
【請求項５３】
第１のプライマーが配列番号１３のヌクレオチド配列又は配列番号１３のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号１４のヌクレオチド配列又は配列番号１４のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項４８に記載のプライマー対。
【請求項５４】
第１のプライマーが配列番号１５のヌクレオチド配列又は配列番号１５のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号１６のヌクレオチド配列又は配列番号１６のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項４８に記載のプライマー対。
【請求項５５】
第１のプライマーが配列番号１７のヌクレオチド配列又は配列番号１７のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号１８のヌクレオチド配列又は配列番号１８のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項４８に記載のプライマー対。
【請求項５６】
少なくとも１つのプライマーが検出可能な標識をさらに含む、請求項４８に記載のプライマー対。
【請求項５７】
検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光部分又はＥＣＬ部分である、請求項５６に記載のプライマー対。
【請求項５８】
ＥＣＬ部分が金属を含む、請求項５７に記載のプライマー対。
【請求項５９】
金属がルテニウム、レニウム又はオスミウムである、請求項５８に記載のプライマー対。
【請求項６０】
ＥＣＬ部分が、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジル（［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋）又は［Ｒｕ（スルホ−ｂｐｙ）２ｂｐｙ］２＋である、請求項５７に記載のプライマー対。
【請求項６１】
少なくとも１つのプライマーがビオチン又はジゴキシゲニンを含む、請求項４８に記載のプライマー対。
【請求項６２】
ハイブリダイゼーションに基づいた炭疽菌の検出で使用するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、プローブが、次の６つの配列：配列番号１、２、３、及びそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含み、プローブが、炭疽菌ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合するが、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス及び枯草菌のＤＮＡ又はＲＮＡには結合しない、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６３】
プローブが固相支持体に結合される、請求項６２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６４】
検出可能な標識をさらに含む、請求項６２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６５】
検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光部分又はＥＣＬ部分である、請求項６４に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６６】
ＥＣＬ部分が金属を含む、請求項６５に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６７】
金属がルテニウム、レニウム又はオスミウムである、請求項６６に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６８】
ＥＣＬ部分が、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジル（［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋）又は［Ｒｕ（スルホ−ｂｐｙ）２ｂｐｙ］２＋である、請求項６５に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６９】
プローブがビオチン又はジゴキシゲニンを含む、請求項６２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７０】
化学的に活性な基をさらに含む、請求項６２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７１】
化学的に活性な基がアミノ基である、請求項７０に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７２】
プローブが配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８の配列、又は配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８に相補的な配列を有する、請求項６２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７３】
炭疽菌を検出するためのキットであって、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、各プライマーが、次の６つの配列：配列番号１、２、３、及びそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含み、少なくとも１つのプライマーが、炭疽菌ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合するが、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス及び枯草菌のＤＮＡ又はＲＮＡには結合しないキット。
【請求項７４】
少なくとも１つのプライマー対が、配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項７５】
少なくとも１つのプライマー対が、配列番号６及び配列番号７のヌクレオチド配列、又は配列番号６及び配列番号７のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項７６】
少なくとも１つのプライマー対が、配列番号９及び配列番号１０のヌクレオチド配列、又は配列番号９及び配列番号１０のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項７７】
少なくとも１つのプライマー対が、配列番号１１及び配列番号１２のヌクレオチド配列、又は配列番号１１及び配列番号１２のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項７８】
少なくとも１つのプライマー対が、配列番号１３及び配列番号１４のヌクレオチド配列、又は配列番号１３及び配列番号１４のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項７９】
少なくとも１つのプライマー対が、配列番号１５及び配列番号１６のヌクレオチド配列、又は配列番号１５及び配列番号１６のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項８０】
少なくとも１つのプライマー対が、配列番号１７及び配列番号１８のヌクレオチド配列、又は配列番号１７及び配列番号１８のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項８１】
少なくとも１つのプライマーが検出可能な標識を含む、請求項７３に記載のキット。
【請求項８２】
検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光部分又はＥＣＬ部分である、請求項８１に記載のキット。
【請求項８３】
ＥＣＬ部分が金属を含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項８４】
金属がルテニウム、レニウム又はオスミウムである、請求項８３に記載のキット。
【請求項８５】
ＥＣＬ部分が、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジル（［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋）又は［Ｒｕ（スルホ−ｂｐｙ）２ｂｐｙ］２＋である、請求項８２に記載のプライマー対。
【請求項８６】
少なくとも１つのプライマーがビオチン又はジゴキシゲニンを含む、請求項７３に記載のキット。
【請求項８７】
炭疽菌を検出するためのキットであって、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブが、次の６つの配列：配列番号１、２、３、及びそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含み、且つ、プローブが、炭疽菌ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合するが、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス及び枯草菌のＤＮＡ又はＲＮＡには結合しないキット。
【請求項８８】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブが固相支持体に結合される、請求項８７に記載のキット。
【請求項８９】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブが固相支持体に結合され得る、請求項８７に記載のキット。
【請求項９０】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブが検出可能な標識をさらに含む、請求項８７に記載のキット。
【請求項９１】
検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光部分又はＥＣＬ部分である、請求項９０に記載のキット。
【請求項９２】
ＥＣＬ部分が金属を含む、請求項９１に記載のキット。
【請求項９３】
金属がルテニウム、レニウム又はオスミウムである、請求項９２に記載のキット。
【請求項９４】
ＥＣＬ部分が、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジル（［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋）又は［Ｒｕ（スルホ−ｂｐｙ）２ｂｐｙ］２＋である、請求項９１に記載のキット。
【請求項９５】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブが化学的に活性な基をさらに含む、請求項８７に記載のキット。
【請求項９６】
化学的に活性な基がアミノ基である、請求項９５に記載のキット。
【請求項９７】
オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８の配列、又は配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８に相補的な配列を有する、請求項８７に記載のキット。
【請求項９８】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブがビオチン又はジゴキシゲニンを含む、請求項８７に記載のキット。
【請求項９９】
少なくとも１つの炭疽菌タンパク質に特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
（ａ）配列番号１、２又は３の連続する一部によりコードされているタンパク質の少なくとも１２個のアミノ酸をコードしている発現ベクターを宿主細胞に導入して、炭疽菌タンパク質を発現させること；
（ｂ）炭疽菌タンパク質を単離すること；及び
（ｃ）抗体を産生するように、動物宿主を、単離した炭疽菌タンパク質を含む組成物で免疫すること
を含む方法。
【請求項１００】
免疫された動物宿主から炭疽菌特異的抗体を単離することをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
発現ベクターが、プラスミド又はバクテリオファージ、コスミド、複製欠損型アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はレトロウイルスである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
宿主細胞が真核細胞である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
宿主細胞が原核細胞である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０４】
細菌宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
動物宿主がウサギ又はマウスである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０６】
請求項９９の方法により調製される抗体。
【請求項１０７】
炭疽菌核酸を増幅する方法であって、
（ａ）炭疽菌核酸の試料を提供すること；
（ｂ）核酸及びプライマー対を含む組成物を形成することと；
（ｃ）プライマー対の第１のプライマーとプライマー対の第２のプライマーの間のヌクレオチド配列を増幅して、アンプリコンを形成すること；及び
（ｄ）場合によってアンプリコンを検出すること
を含み、
（ｉ）プライマー対の少なくとも１つのプライマーが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一であるヌクレオチド断片を含み、その少なくとも１つのプライマーが、炭疽菌ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合するが、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス及び枯草菌のＤＮＡ又はＲＮＡのいずれにも結合せず、並びに／又は、（ｉｉ）プライマー対の少なくとも１つのプライマーが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列の一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む方法。
【請求項１０８】
核酸がＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
第１のプライマー又は第２のプライマーの少なくとも１つが検出可能な標識を含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
アンプリコンが、配列番号１、２、３の配列又はそれらの相補配列の全部又は一部である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１１】
第１のプライマーが配列番号４のヌクレオチド配列又は配列番号４のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号５のヌクレオチド配列又は配列番号５のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１２】
第１のプライマーが配列番号６のヌクレオチド配列又は配列番号６のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号７のヌクレオチド配列又は配列番号７のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１３】
第１のプライマーが配列番号９のヌクレオチド配列又は配列番号９のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号１０のヌクレオチド配列又は配列番号１０のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１４】
第１のプライマーが配列番号１１のヌクレオチド配列又は配列番号１１のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号１２のヌクレオチド配列又は配列番号１２のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１５】
第１のプライマーが配列番号１３のヌクレオチド配列又は配列番号１３のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号１４のヌクレオチド配列又は配列番号１４のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１６】
第１のプライマーが配列番号１５のヌクレオチド配列又は配列番号１５のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号１６のヌクレオチド配列又は配列番号１６のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１７】
第１のプライマーが配列番号１７のヌクレオチド配列又は配列番号１７のヌクレオチド配列の相補配列を有し、第２のプライマーが配列番号１８のヌクレオチド配列又は配列番号１８のヌクレオチド配列の相補配列を有する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１８】
炭疽菌タンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）配列番号１、２、３、及びそれらの相補配列から選択される少なくとも１つの配列の全部又は一部を発現ベクターに導入すること；及び
（ｂ）炭疽菌タンパク質を発現させること
を含む方法。
【請求項１１９】
炭疽菌タンパク質が融合タンパク質である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
炭疽菌タンパク質に特異的に結合するが、セレウス菌タンパク質、バチルス・チューリンゲンシスタンパク質、及び枯草菌タンパク質には結合しない結合パートナーであって、前記タンパク質が、配列番号１、２、若しくは３、又は配列番号１、２、若しくは３の相補配列を含む遺伝子によりコードされている結合パートナー。
【請求項１２１】
抗体又はそのフラグメントである、請求項１２０に記載の結合パートナー。
【請求項１２２】
請求項１２０の結合パートナーと許容され得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項１２３】
次の６つの配列：配列番号１、２、３、及びそれらの相補配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列の一部と実質的に同一であるＤＮＡのセクションを含み炭疽菌以外である細胞。
【請求項１２４】
大腸菌である、請求項１２３に記載の細胞。
【請求項１２５】
真核細胞である、請求項１２３に記載の細胞。
【請求項１２６】
タンパク質を発現させる方法であって、配列番号１、２、又は３によりコードされているタンパク質の少なくとも１２個のアミノ酸をコードしている発現ベクターを宿主細胞に導入し、炭疽菌タンパク質を発現させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年１２月６日出願の米国仮特許出願第６０／６３２９７０号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の存在を検出するための方法、組成物及びキット、並びに炭疽菌の結合パートナーに関する。また本発明は、炭疽菌ゲノムに特異的であるポリヌクレオチド配列、及びそれらの配列によってコードされているタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
炭疽菌は、ヒト及び動物において死に至る場合が多い、炭疽病の病原体である。この細菌は、栄養細胞と胞子からなる二段階の生活環を持っている。宿主が感染により死亡した場合、炭疽菌の栄養細胞が周囲に放たれる。次いで、これらの栄養細胞は胞子になり、炭疽菌の感染性胞子を形成する。例えば、ウシは汚染土壌中の胞子を取り込むことにより炭疽病にかかる可能性がある。ウシが死亡した場合、栄養細胞は土壌へ放たれ、そこで胞子形成が起こり新しい胞子が形成される。健康なウシが放牧期間中に炭疽菌胞子を取り込むと、このサイクルが繰り返される。炭疽菌胞子は、適当な土壌水分とｐＨ値で出芽可能となり、胞子形成過程が再び始まる前に、生じた栄養細胞に自己複製を起こさせる。水源及び空気源もまた炭疽菌胞子で汚染される可能性がある。
【０００４】
炭疽菌の胞子は、栄養細胞とは異なり、環境で非常に安定している。いくつかの研究では、胞子が付着後、土壌中で４０〜６０年間生存し続けている可能性があることが報告されている（Ｔｉｔｂａｌｌら、Ｊ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒ．Ｓｙｍｐｏｓ．７０：９Ｓ〜１８Ｓ（１９９１））。炭疽菌は、胞子に安定性があること、この細菌は比較的容易に増殖させることができること、及び炭疽病に致死性があることから、残念なことにバイオテロリストの武器となったことがある。ヒトにおいては、健康な個体が炭疽菌胞子を吸入した場合に感染が起こることが多い。幸い、炭疽病は、感染の早い時期に正確な診断が行われた場合は、治療可能な疾患である。従って、炭疽菌の存在を迅速に検出する方法は、ヒトにおける炭疽病の適切な治療にとって、並びに、環境中の細菌を検出することによるヒト及び動物における感染予防にとって重要である。
【０００５】
現在の検出方法として、細菌選択培地（ポリミキシン、リゾチーム、ＥＤＴＡ及び酢酸第１タリウム補充のハートインフュージョン寒天培地（ＰＬＥＴ培地）など）の使用が挙げられる（Ｔｉｔｂａｌｌら、Ｊ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒ．Ｓｙｍｐｏｓ．７０：９Ｓ〜１８Ｓ（１９９１））。しかし、この技術はいろいろな点で制限がある。第１に、寒天上でコロニーを成長させるには長時間が必要であり、胞子を迅速に検出することは不可能である。第２に、この方法は特に感度が高いわけでなく、試料中の細菌濃度を、より感度の高い検出方法を用いる場合よりも高濃度にすることが求められる。例えば、単独試料では、選択培地法は、土壌１グラム当たり芽胞を３個よりも多く必要とし得る。最後に、選択培地法は、炭疽菌の生育に必ずしも特異的であるとは限らない。
【０００６】
現在の他の検出方法としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイ及び動物試験が挙げられる。イムノアッセイは、感染していることが疑われる宿主内の抗炭疽菌抗体の存在を検出する。残念ながら、この方法による診断は、病気の臨床症状が現れた数日後でしか得られないため、ごく初期の検出を行うことができない。或いは、イムノアッセイでは、炭疽菌調製物に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が用いられる。これらのアッセイは感染の検出に必要な時間を短縮するものの、特異性に欠ける点で問題がある。炭疽菌胞子に対して産生される抗体は、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）をはじめとするバチルス属ファミリーの他の細菌とクロス反応する場合が多い。かかる交差反応性を低減するには、血清を、炭疽菌の検出で使用する前に、他のバチルス種と事前吸着させる。最後に、炭疽菌胞子が生息していることが疑われる試料（例えば土壌浸出液）を、モルモット又はマウスでの発症力について試験する。この技術では炭疽菌胞子の検出感度は良くなるが、コストがかかるとともに、炭疽病が動物で発症するまでに十分な時間が必要である。
【０００７】
今日、炭疽菌の検出に分子生物学手法が用いられている。しかし、炭疽菌を検出するための分子アッセイは、炭疽菌のゲノムが同属他種のゲノムに高度に相同であることから、設計するのが特に困難である。具体的には、炭疽菌ゲノムは、Ｂ・セレウス及びＢ・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（これらの生物は同種であることが報告されている）のゲノムに非常に似ている。炭疽菌に対する慣用のアッセイは、毒性炭疽菌に存在するプラスミドを標的としている。しかし、これらのプラスミドはその細菌から欠失する可能性があるとともに、他の細菌に導入される可能性もあり、その結果、偽陰性及び偽陽性の結果が生じる。
【０００８】
細菌の同定に一般に用いられているゲノムＤＮＡ標的（例えば１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子）は、近縁種であるセレウス菌を炭疽菌と明確に区別するには不十分である（Ｓａｃｃｈｉら、Ｅｍｅｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：１１１７〜２２（２００２））。別の研究者らは、異なる手法を用いて、ランダム増幅多型ＤＮＡ（「ＲＡＰＤ」）のＰＣＲ産物をクローニングする炭疽菌に特異的な配列の同定を試みている（米国特許第６４４８０１６号、Ｒａｓｔｏｇｉら）。しかし、クローニングされたこれらの配列をＢＬＡＳＴ分析により試験したところ、それらは炭疽菌に特異的でないことが明らかにされている。さらに別の研究者らは、炭疽菌の検出に有用であると考えられるｇｙｒ遺伝子の遺伝的変異について記載している（米国特許第６０８７１０３号、Ｙａｍａｄａら）。
【０００９】
炭疽菌を検出するための核酸を利用した別の方法は、炭疽病外毒素遺伝子及び／又はポリグルタミン酸莢膜遺伝子（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１２２４〜２９（１９９８））、又はａｔｘＡ遺伝子（Ｈａｒｔｌｅｙ及びＢａｅｕｍｎｅｒ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３７６：３１９〜２７（２００３））を利用する。これらの遺伝子はすべて毒性と関係があり、炭疽病細菌の２つのプラスミドであるｐＸＯ１（１７４ｋｂｐ；毒素）及びｐＸＯ２（９５ｋｂｐ；莢膜）上に位置している。これらのプラスミドは、特定の条件下で、炭疽菌から近縁種であるセレウス菌及びバチルス・チューリンゲンシスに導入されることが知られている（Ｒｕｈｆｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１５７：７０８〜１１（１９８４））。さらに、天然のセレウス菌及びバチルス・チューリンゲンシスは、炭疽病は引き起こさないが、これらのプラスミドの１つ又は両方由来のＤＮＡを含有し得る（Ｂｅｙｅｒら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８７：２２９〜３６（１９９９））。従って、プラスミドＤＮＡ配列のみを利用した炭疽病の検出は、偽陽性の結果をもたらす可能性がある。
【００１０】
炭疽病を引き起こす細菌の存在を特異的に同定するのに好適であると思われる炭疽菌由来の染色体ＤＮＡ配列を同定しようと、多くの試みが行われてきた。同定された配列の１つ（以下、ＢＡ８１３という）は、２７７ｂｐ長のＤＮＡ断片である（Ｐａｔｒａら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：２２３〜３１（１９９６））。もう１つの配列であるｖｒｒＡは、可変反復配列（ｃａａ  ｔａｔ  ｃａａ  ｃａａ）を含有する可変性配列領域である（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３７７〜８４（１９９６））。さらに別の推定上の特定配列は、Ｒａｓｔｏｇｉらにより米国特許第６４４８０１６号に記載されている。しかし、これらの配列はいずれも炭疽菌に限定されていないことから、これもまた偽陽性の結果につながる。
【００１１】
上述のように、慣用の病原性プラスミド上の遺伝子を標的とするアッセイと染色体配列に注目するアッセイは偽陽性の結果をもたらし、誤って試料中の炭疽菌の存在を示す可能性がある。
【００１２】
別の研究者らは、炭疽菌に特異的であると考えられる一塩基多型（ＳＮＰ）を同定した。これらには、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）中のＳＮＰ（Ｙａｍａｄａら、米国特許第６０８７１０４号）及びＲＮＡポリメラーゼサブユニットＢ遺伝子（ｒｐｏＢ）中のＳＮＰ（Ｑｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６７：３７２０〜２７（２００１））が含まれる。しかし、ＳＮＰアッセイは、ポリヌクレオチド配列の存在を検出するアッセイほど確実ではなく、その上、一般的にコストが高い。
【００１３】
炭疽病に特異的な染色体ＤＮＡ配列を同定する別の手法がＲａｄｎｅｄｇｅらによって記載されている（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：２７５５〜６４（２００３））。Ｒａｄｎｅｄｇｅは、差引きハイブリダイゼーション技術を用いて、炭疽菌の診断で利用の可能性があるゲノム差を同定した。これらの手法は、本明細書に記載した、異なる炭疽菌ゲノム配列が同定されるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの（コンピューターを利用した）技術とは異なる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、一実施形態では、本発明は、炭疽菌ゲノム中に存在するが、近縁種である、セレウス菌及びバチルス・チューリンゲンシスには存在せず、炭疽菌の存在を検出するためのアッセイに有用である、ＤＮＡ配列を開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一実施形態では、本発明は、炭疽菌に特異的なポリヌクレオチド配列を提供する。別の実施態様では、本発明は、炭疽菌から得られた核酸とのハイブリダイズに好適なオリゴヌクレオチドプローブを提供する。別の実施態様の中で、本発明は、炭疽菌に存在する核酸配列の増幅に好適なオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。さらに別の実施態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つのプローブ及びプライマーを含む、炭疽菌を検出するためのキットを提供する。
【００１６】
一部の実施態様では、本発明は、炭疽菌を特異的に認識する結合パートナーを提供する。
【００１７】
一部の実施態様では、本発明による炭疽菌特異的配列は、試料中の炭疽菌の存在を検出する方法において使用する。これらの方法としては、核酸配列の増幅及びプローブを用いるアッセイが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに別の実施態様では、本発明は、コンピューターを利用した検索技術を用いて、炭疽菌に特異的な核酸配列を同定する方法を提供する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、炭疽菌を検出する方法を提供し、この方法は
（ａ）炭疽菌を含んでいることが疑われる試料を提供すること；
（ｂ）試料からの核酸、少なくとも１つの第１のプライマー、及び少なくとも１つの第２のプライマーを含む組成物を形成すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）のプライマーが増幅することができる任意の核酸を増幅させること；及び
（ｄ）ステップ（ｃ）の増幅産物を検出することにより炭疽菌を検出すること
を含み、
（ｉ）少なくとも１つのプライマーが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列のいずれか１つの一部と実質的に同一であるヌクレオチド断片を含み、その少なくとも１つのプライマーが、炭疽菌ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合するが、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＤＮＡ又はＲＮＡのいずれにも結合せず；並びに／又は（ｉｉ）少なくとも１つのプライマーが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列の一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施態様では、炭疽菌核酸は増幅されるが、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス、枯草菌及びＢ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）由来の核酸は増幅されない。特定の実施態様では、１つのプライマー又は両プライマーは、検出可能な標識を含んでいてもよい。一部の実施態様では、アンプリコンのヌクレオチド配列は、配列番号１、２又は３のヌクレオチド配列の一部又は全部と実質的に同一である。
【００１９】
一実施形態では、ＤＮＡは、（ｂ）の組成物を形成する前に試料から抽出することができる。別の実施態様では、増幅は、例えばＬｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）などの試薬を用いて、試料で直接行うことができる。
【００２０】
別の実施態様では、本発明は、炭疽菌を検出する方法を提供し、この方法は
（ａ）炭疽菌を含んでいることが疑われる試料を提供すること；
（ｂ）試料からの核酸を、ハイブリダイゼーションに好適な条件下で少なくとも１つのプローブと接触させること；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）のハイブリダイゼーション産物に基づいて試料中の炭疽菌を検出すること
を含み、
（ｉ）少なくとも１つのプローブが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一であるヌクレオチド断片を含み、その少なくとも１つのプローブが、炭疽菌ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合するが、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス及び枯草菌のＤＮＡ又はＲＮＡのいずれにも結合せず；且つ／又は（ｉｉ）少なくとも１つのプローブが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列の一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施態様では、プローブは、高ストリンジェンシーな条件下で炭疽菌核酸とハイブリダイズするが、高ストリンジェンシーな条件下で、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス、枯草菌及びＢ．ハロデュランス由来の核酸にはハイブリダイズしない。特定の実施態様では、プローブは、検出可能な標識を含んでいてもよい。一部の実施態様では、検出される核酸は、配列番号１、２若しくは３のヌクレオチド配列、又は配列番号１、２若しくは３の相補配列の一部と実質的に同一である。
【００２１】
本発明のさらなる目的と利点については、以下の記載の中で一部を記載するか、或いは本発明を実施することにより理解することができる。本発明の目的と利点は、添付の特許請求の範囲で具体的に指摘した要素と組合せにより実現され、達成されるであろう。
【００２２】
前述の一般的な記載と以下の詳細な記載は、両方とも単なる例示及び説明であって、特許請求の範囲に記載の本発明を限定するものではないことは理解されよう。添付の図面（これは本明細書に援用し、また本明細書の一部を構成するものである）は、本発明の実施態様を説明するものであり、また記述とともに、本発明の原理を説明する役目を担っている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
Ｉ．配列
一実施形態では、本発明は、炭疽菌のゲノムで特異的に見出され、且つ、バチルス属の他の種をはじめとする他の細菌のゲノム中では見出されない、ＤＮＡ配列を提供する。別の実施態様では、炭疽菌特異的ＤＮＡ配列は、図１に示す配列番号１である。別の実施態様では、炭疽菌特異的ＤＮＡ配列は、図２に示す配列番号２である。別の実施態様では、炭疽菌特異的ＤＮＡ配列は、図３に示す配列番号３である。また炭疽菌特異的配列には、配列番号１、２又は３のＤＮＡ配列の一部も含まれる。
【００２４】
ＩＩ．定義
本明細書では、「アンプリコン」は、増幅されるヌクレオチド配列を意味する。
【００２５】
本明細書では、「ｂｐ」及び「ｋｂｐ」という略語は、「塩基対」及び「キロ塩基対」を意味する。
【００２６】
本明細書では、「結合パートナー」という用語は、目的の分析物に特異的に結合し得る物質を意味する。一般に、特異的結合は、相対的に高い親和性と相対的に軽度〜中程度のキャパシティーを特徴とする。通常、非特異的結合は、親和性が低く、キャパシティーが中程度〜高度である。一般に、親和定数Ｋａが約１０６Ｍ−１より高い場合、結合は特異的であると考えられる。例えば、親和定数Ｋａが約１０８Ｍ−１より高い場合、結合は特異的であると考えることができる。親和定数が高くなると親和性も増し、従って、一般的に特異性が高くなる。例えば、抗体は、一般に１０６Ｍ−１〜１０９Ｍ−１以上の範囲の親和定数で抗原と結合する。
【００２７】
本明細書では、「抗体」という用語は免疫グロブリン又はその一部を意味するとともに、起源、産生方法又は他の特性にかかわらず、抗原結合部位を含んでいるすべてのポリペプチド（糖部分（単糖類及び多糖類）によりさらに修飾されているもの、又はその修飾のないもの）を包含する。この用語には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、及びＣＤＲ移植抗体、並びに融合タンパク質が含まれる。抗体の一部としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｃｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆｄ、抗体重鎖（ＶＨ）の可変領域、及び抗体軽鎖（ＶＬ）の可変領域をはじめとする、抗原に結合可能なすべてのフラグメントを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
本明細書では、「実質的に同一である」とは、高ストリンジェンシー条件下で２種類のポリヌクレオチドがハイブリダイズすることを意味する。
【００２９】
「高ストリンジェンシー」という用語は、通常、解離温度よりも低い５℃〜１５℃におけるハイブリダイゼーションを意味する。解離温度が、特にポリヌクレオチド塩基対組成物、ハイブリダイズ配列の長さ、プローブ濃度、塩濃度、及び使用する溶媒によって決まることは当業者には理解されよう。一部の実施態様では、高ストリンジェンシー条件には、４２℃の恒湿槽中で一晩、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．２μｇ／μｌポリ（ｄＡ）、０．２μｇ／μｌのヒトｃｏｔ１  ＤＮＡ、及び０．５％ＳＤＳにおいてハイブリダイゼーションを行い、その後、５５℃で５分間、１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で連続洗浄し、その後、５５℃で２０分間、０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで洗浄することを挙げることができる。一部の実施態様では、高ストリンジェンシー条件には、５０℃及び０．１×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行い、５０％ホルムアミド、１×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で４２℃において一晩インキュベーションを行い、その後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することを挙げることができる。別の実施態様では、高ストリンジェンシー条件に、６５℃で約８時間（又はそれ以上）、６×ＳＳＣ、１％（ＳＤＳ）中で水性ハイブリダイゼーション（例えば、ホルムアミド非含有）を行い、次いで、６５℃において０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回又は複数回洗浄することも含むことができる。一実施形態では、高ストリンジェンシーアニーリングは、プライマーの融解温度（Ｔｍ）より５℃低いアニール温度で起こり得る。一般に、おおよそのプライマーＴｍは、プライマー中の各Ａ又はＴに対して２℃、プライマー中の各Ｇ又はＣに対して４℃加えることにより算出することができる。
【００３０】
本明細書では、ヌクレオチド配列が高ストリンジェンシー条件下で、炭疽菌からの核酸にはハイブリダイズするが、
（ｉ）セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス又は枯草菌；
（ｉｉ）セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス、枯草菌、又はバチルス属の他の細菌；
（ｉｉｉ）セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス、枯草菌、又はＢ．ハロデュランス；及び／又は、
（ｉｖ）セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス、枯草菌、Ｂ．ハロデュランス、若しくはバチルス属の他の細菌
から選択される核酸にはハイブリダイズしない場合、「炭疽菌に特異的に結合する」という。
【００３１】
本明細書では、「目的のポリヌクレオチド」という用語は、検出又は増幅しようとするポリヌクレオチドを意味する。アンプリコンは、目的のポリヌクレオチドの一例である。目的のポリヌクレオチドは、大型の核酸配列の断片であってもよい。
【００３２】
「ポリヌクレオチド」という用語は、１ヌクレオチド長よりも長い、ヌクレオチド又は核酸類似体を含む分子を意味する。一実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。一実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞におけるクローニング及び発現などの組換え法によって産生される、組換え型ポリヌクレオチドであってもよい。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、混入物を実質的に含まない、単離ポリヌクレオチドであってもよい。単離ポリヌクレオチドは、これらに限定されるものではないが、組換え法及び化学合成などの複数の方法によって調製することができる。ポリヌクレオチドに関する記載にはオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００３３】
「プライマー」という用語は、標的核酸配列にハイブリダイズすることが可能で、且つ相補鎖を合成することができるオリゴヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドプライマー中の塩基は、リン酸ジエステル結合によって、又は、結合が標的核酸配列の一部へのハイブリダイゼーションを阻害しない限り、リン酸ジエステル結合以外の結合によって結合され得る。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、リン酸ジエステル結合以外のペプチド結合により結合されている構成塩基を有していてもよい。一部の実施態様では、プライマーは、標的核酸配列に実質的に同一であるように調製することができる。
【００３４】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、１００個未満のヌクレオチド長である、ヌクレオチド又は核酸類似体を含む分子を意味する。
【００３５】
「試料」とは、炭疽菌生物又は胞子を含んでいることが疑われるすべての物質を意味する。また試料は、炭疽菌核酸を含んでいることが疑われるすべての物質も意味する。
【００３６】
本明細書では、「検出可能な標識」とは、オリゴマー又はポリマーに結合し、それにより、機器又は方法により検出可能なオリゴマー又はポリマーを提供することができる部分を意味する。
【００３７】
「ＥＣＬ部分」という用語は電気化学発光部分を意味し、これは、電気エネルギー源に暴露することにより電磁放射を繰り返し放出するように誘導することができるすべての化合物である。一部のＥＣＬ部分は、可視スペクトルである電磁放射を放出するが、他のＥＣＬ部分は、赤外線又は紫外線、Ｘ線、マイクロ波などの別のタイプの電磁放射を放出することができる。本発明に関して、「電気化学発光」、「電気化学発光性」、「電気化学発光する」「発光」、「発光性」及び「発光する」という用語を使用する場合、発光が明るいことは要求されないが、発光が電磁放射などの別の形態であることは認められる。
【００３８】
本明細書では、「プローブ」とは、目的の構造又は標的に結合する、「核酸」プローブ又は「核酸類似体」プローブを意味する。
【００３９】
本明細書では、「核酸」とは、天然ヌクレオチド又は未修飾ヌクレオチドから単独で形成された主鎖を有する、オリゴマー、ポリマー又はポリマーセグメントを含有するヌクレオチド配列を意味する。
【００４０】
本明細書では、「修飾核酸」とは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチドから直接誘導されるサブユニットからなる、オリゴマー、ポリマー又はポリマーセグメントを意味する。
【００４１】
「核酸類似体」という用語は、核酸に結合可能な合成分子を意味する。例えば、核酸類似体は、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及び／又はヌクレオチド類似体から構成されていてもよい。例えば、核酸類似体は検出可能な標識を含んでいてもよい。「ヌクレオチド類似体」という用語は、天然ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドの代わりに使用可能な合成部分を意味する。核酸類似体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｓｉｄ）（ＬＮＡ）又は核酸の任意の誘導型であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
「ヌクレオシド三リン酸」又は「ヌクレオチド」という用語は、三リン酸基に共有結合で結合し得るリボース又はデオキシリボースなどの糖分子に共有結合で結合することができる、プリン又はピリミジンなどの窒素含有塩基を意味する。ヌクレオシド三リン酸は、リボヌクレオシド三リン酸及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸の両方を包含することができる。ポリヌクレオチドの形成に、構成単位としてヌクレオシド三リン酸を用いることができる。窒素含有塩基は、これらに限定されるものではないが、シトシン、グアニン、アデニン、チミジン、ウラシル、及びイノシンであってもよい。ヌクレオシド三リン酸は、これらに限定されるものではないが、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウラシル三リン酸（ｄＵＴＰ）、及びデオキシイノシン三リン酸（ｄｌＴＰ）、７−デアザ−ｄＧＴＰ、２−アザ−ｄＡＴＰ、及びＮ４−メチル−ｄＣＴＰであってもよい。
【００４３】
「修飾ヌクレオチド」という用語は、化学的に修飾されたヌクレオチドを意味する。修飾ヌクレオチドの例は、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシル及び２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）、及びＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
本明細書では、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」は、これらに限定されるものではないが、米国特許第５５３９０８２号、第５５２７６７５号、第５６２３０４９号、第５７１４３３１号、第５７１８２６２号、第５７３６３３６号、第５７７３５７１号、第５７６６８５５号、第５７８６４６１号、第５８３７４５９号、第５８９１６２５号、第５９７２６１０号、第５９８６０５３号、第６１０７４７０号、第６２０１１０３号、第６２２８９８２号、及び第６３５７１６３号にペプチド核酸として記載されているか、又は主張されているすべてのオリゴマー又はポリマーセグメントをはじめとする、少なくとも１種又は複数のＰＮＡサブユニット（残基）を含む、すべてのオリゴマー又はポリマーを意味する。またＰＮＡという用語は、以下の刊行物に記載されている核酸模倣体の１種又は複数のサブユニットを含む、すべてのオリゴマー又はポリマーセグメントに用いられる：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１〜８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６：７９３〜９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５〜７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７〜４０（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７〜９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１〜４４（１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１〜８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：１７４３〜４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５３９〜４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５４７〜５４（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５５５〜６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１〜５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：１１１９〜２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：１６５〜１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編  ３７：３０２〜３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３８：４２１１〜４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３：１１６７〜７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．３：９１２〜９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３：１２６９〜７２（２００１）；及びＷＯ  ９６／０４０００に記載されているＳｈａｈらの「ペプチド系の核酸模倣体（ＰＥＮＡＭ）（Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｍｉｃ（ＰＥＮＡＭ））」。
【００４５】
本明細書では、「ホスホロチオエート結合」という用語は、標準的なリン酸ジエステルではなく、ホスホロチオエートとの修飾ヌクレオチド間結合を含む核酸を意味する。これらのタイプの修飾は、ヌクレアーゼにより触媒されるオリゴマーの分解の可能性を低減し、本発明で用いることができる。
【００４６】
本明細書では、「ロックされた核酸」又は「ＬＮＡ」という用語は、少なくとも１つ又は複数のＬＮＡサブユニットを含むオリゴマー又はポリマーを意味する。本明細書では、「ＬＮＡサブユニット」という用語は、リボースの２’−酸素を４’−炭素と連結するメチレン架橋を含有するリボヌクレオチドを意味する。一般には、Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１６２８〜４４（２００３）を参照されたい。
【００４７】
本明細書では、「結合する」という用語は、「ハイブリダイズする」と同意語である。２つの分子がハイブリダイズする場合、それらの分子は、１つ又は複数のタイプの化学結合を介して、或いは相補的塩基対合を介して、２つの分子の化合を形成する。
【００４８】
本明細書では、「相補的な」という用語は、相互にハイブリダイズすることができる核酸塩基を意味する。例えば、アデニンはチミンに相補的であり、またシトシンはグアニンに相補的である。
【００４９】
ＩＩＩ．本発明の組成物
Ａ．ポリヌクレオチド組成物
本発明のポリヌクレオチド組成物は、炭疽菌特異的配列を含んでいる。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは配列番号１、２又は３を含んでいる。また別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、
（ｉ）配列番号１、２、３又はそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一の配列を含み、且つ、炭疽菌のＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合するか、
（ｉｉ）配列番号１、２、３又はそれらの相補配列の一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、
配列番号１、２又は３の断片を含んでいる。本発明のポリヌクレオチド組成物は、炭疽菌の検出においてプライマー及びプローブとして使用可能であり、アンプリコンはそのプライマーを用いることにより産生することができる。本発明の特定の実施態様では、断片は、少なくとも１０ｂｐ長、少なくとも１２ｂｐ長、少なくとも１５ｂｐ長、少なくとも２０ｂｐ長、少なくとも３０ｂｐ長、少なくとも４０ｂｐ長、少なくとも５０ｂｐ長、少なくとも６０ｂｐ長、少なくとも７０ｂｐ長、少なくとも８０ｂｐ長、少なくとも９０ｂｐ長、少なくとも１００ｂｐ長、少なくとも２００ｂｐ長、少なくとも３００ｂｐ長、少なくとも４００ｂｐ長、少なくとも５００ｂｐ長、少なくとも６００ｂｐ長、少なくとも７００ｂｐ長、少なくとも８００ｂｐ長、少なくとも９００ｂｐ長、少なくとも１０００ｂｐ長、少なくとも１３６０ｂｐ長、少なくとも１３６２ｂｐ長、少なくとも１５００ｂｐ長、少なくとも２０００ｂｐ長、少なくとも２５００ｂｐ長、少なくとも２５２０ｂｐ長、又はその間の任意の長さである。
【００５０】
一部の実施態様では、炭疽菌特異的配列は、配列番号１、２、又は３で確認される配列の突然変異を含有する配列を含んでいてもよい。突然変異には、これらに限定されるものではないが、１つ又は複数の塩基対の置換、付加及び欠失が含まれる。一部の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、２、若しくは３で確認される配列又はそれらの相補配列に対して、ヌクレオチド塩基の０〜５、０〜１０、０〜２０、０〜３０、０〜４０、０〜５０、０〜６０、０〜７０、０〜８０、０〜９０個のヌクレオチド付加、欠失又は置換を含んでいてもよい。一部の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３で確認される配列又はそれらの相補配列に対して、８０％、８５％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し得る。本発明のポリヌクレオチドがＲＮＡである実施態様では、ポリヌクレオチド配列中の突然変異の同定目的において、配列番号１、２及び３中のチミジンヌクレオチドはＲＮＡ中のウラシルヌクレオチドに相当するものと見なす。
【００５１】
特定の実施態様では、本発明にはまた、本節でこれより前に記載したポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも含まれる。一実施形態では、本発明は、配列番号１、２及び３の１つ又は複数で確認されている炭疽菌特異的配列を含む発現ベクターを提供する。発現ベクターは、発現しようとする配列に作動可能に連結されているプロモーターと複製起点を含んでいる。一実施形態では、発現ベクターは、発現をさらに調節する別の遺伝学的調節エレメント（例えばエンハンサーなど）をさらに含む。一実施形態では、本発明は、配列番号１、２及び３の１つ又は複数で確認されている炭疽菌特異的配列を含むクローニングベクターを提供する。クローニングベクターは、例えば複製開始点などのクローニングベクターの複製を調節する配列を含む。ベクターとしては、これらに限定されるものではないが、プラスミド、ＹＡＣＳ及び人工染色体が挙げられる。また本発明は、これらの発現ベクター又はクローニングベクターを含む細胞も提供する。
【００５２】
Ｂ．プライマー
一部の実施態様では、１対のオリゴヌクレオチドプライマーの各オリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、若しくは３の少なくとも１２個の連続するヌクレオチド、又は、配列番号１、２、若しくは３に相補的な少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含み、且つ、炭疽菌特異的核酸を増幅する。特定の実施態様では、プライマー対を用いることにより生成されるアンプリコンは、配列番号１、２、又は３の境界領域、及び炭疽菌ゲノムの周辺配列に及んでいてもよい。特定のこれらの実施態様では、第１のプライマーが配列番号１、２、又は３の一部と実質的に同一であり、且つ、炭疽菌に特異的に結合するが、第２のプライマーはそうではない、プライマー対を用いる。炭疽菌ＤＮＡは、第１のプライマーにより付与される特異性に基づいて、特異的に増幅させることができる。
【００５３】
プライマーは、得られた伸長産物の１本鎖の５’末端を表す。３’末端で鋳型鎖上の目的の配列に対して相補的であるプライマーは、ポリメラーゼを用いて伸長させ、鋳型に相補的な配列を合成することができる。３’末端を修飾することで、プライマーとして機能するオリゴヌクレオチドの能力に変化をもたらすことができる。かかる修飾の例は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドの取り込みである。前記ヌクレオチドは、プライマーの特異性を高めることができる（Ｌａｔｏｒｒａら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２２：７９〜８５（２００３））。このプライマーの長さは、特定の用途に応じて調節することができるが、通常、１５〜３０塩基対の大きさである。本発明の一部の実施態様では、プライマーは、１２〜６０ヌクレオチド長であってもよい。他の実施態様では、プライマー長は、１０〜３０ヌクレオチドであってもよい。プライマーを対で用いて、目的の配列上のその２つのプライマーの結合部位間に収まる核酸配列を増幅させることができる。
【００５４】
プライマーは、ハイブリダイゼーションを成功させ、増幅を起こすためには、完全な相補配列である必要はない。例えば、１５〜６０ヌクレオチド長のプライマーは、配列番号１、２、３、又はその相補配列に同一な連続する少なくとも１２塩基を有していてもよい。良好な増幅におけるプライマーと標的との間の同一性に関する最適な量は、アニール温度、塩濃度、プライマー長、及びミスマッチの位置をはじめとする、容易に調節される多数の特性に応じて変わることは当業者に理解されよう。プライマーが完全ではない相補配列である場合には、そのプライマー配列を組み込んだ伸長産物が得られ、後のサイクル中に、そのプライマー配列に対する相補配列が鋳型配列へ組み込まれる。一実施形態では、プライマーは、任意の核酸塩基、任意の修飾核酸、又は核酸類似体を組み入れることができる。それによって、プライマー伸長産物には、プライマー伸長産物を分離及び検出することができるこれらの特徴が組み込まれる。一実施形態では、増幅産物が形成される場合、その増幅産物は、プライマーへ組み込まれた検出可能な標識（例えば［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋、［Ｒｕ（スルホ−ｂｐｙ）２ｂｐｙ］２＋）の特性により検出することができる。或いは、１つのプライマー又は両プライマーに、分子（例えば、標識化結合パートナー（例えばアビジン）を用いてプライマーを検出することができるビオチン）を組み込むことができる。
【００５５】
一部の実施態様では、１つのプライマーは、配列番号１、２、又は３の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドと部分的に又は完全に同一であり、もう１つのプライマーは、配列番号１、２、又は３の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドに相補的である。一部の実施態様では、両プライマー配列は、配列番号１から得られる。別の実施態様では、両プライマー配列は、配列番号２から得られる。別の実施態様では、両プライマー配列は、配列番号３から得られる。一部の実施態様では、試験物質が炭疽菌核酸を含有する場合には、何千〜何百万ものアンプリコンのコピーが合成される。一部の実施態様では、試験物質が炭疽菌核酸を含有していない場合には、検出可能なＤＮＡは増幅されない。
【００５６】
一実施形態では、検出可能な標識は、プライマーに直接的又は間接的に付着させることができる。例えば、リンカーを用いて、検出可能な標識をプライマー又はプローブに間接的に付着させることができる。検出可能な標識は、例えば、蛍光標識試薬、発色団、スピン標識、放射性同位元素、酵素、量子ドット、ビーズ、アミノヘキシル、ピレン、抗体により検出可能な抗原決定基、化学発光部分、又は電気化学発光部分（ＥＣＬ部分）、ハプテン、発光標識、放射性標識、量子ドット、ビーズ、アミノヘキシル、ピレン、金属粒子、スピン標識、及び色素であってもよい。
【００５７】
本発明の方法で使用可能な蛍光標識試薬としては、これらに限定されるものではないが、ＩＲ色素、Ｄｙｏｍｉｃｓ色素、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎｅ）、カスケードブルー、オレゴングリーン４８８、パシフィックブルー、ローダミングリーンなどのローダミン誘導体、５（６）−カルボキシフルオレセイン、シアニン色素（すなわち、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、（ジエチル−アミノ）クマリン、フルオレセイン（すなわちＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン、リザミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、テキサスレッド、ＡＭＣＡ、ＴＲＩＴＣ、ｂｏｄｉｐｙ色素、Ａｌｅｘａ色素、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ類似体、サンゴ礁由来蛍光タンパク質（ＲＣＦＰ）、ＲＣＦＰ類似体、並びに、米国特許第５７８３６７３号、第５２７２２５７号、及び第５１７１８４３号に記載のタンデム色素が挙げられる。
【００５８】
本発明で使用可能な酵素標識としては、ダイズペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
本発明で使用可能な放射性同位元素としては、３２Ｐ及び３５Ｓが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
本発明で使用可能な化学発光部分としては、アクリジニウム、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、アクリジンジオン、１，２−ジオキセタン、ピリドピリダジンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
代表的なＥＣＬ部分は、ＥＬＥＣＴＲＯＧＥＮＥＲＡＴＥＤ  ＣＨＥＭＩＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＣＥ，Ｂａｒｄ，編集，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，（２００４）；Ｋｎｉｇｈｔ，Ａ及びＧｒｅｅｎｗａｙ，Ｇ．Ａｎａｌｙｓｔ  １１９：８７９〜８９０  １９９４；並びに、米国特許第５２２１６０５号、第５５９１５８１号、第５８５８６７６号、及び第６８０８９３９号に記載されている。ＥＣＬ部分を含むプライマーの調製は、例えば、米国特許第６１７４７０９号に記載のように、当技術分野で周知である。
【００６２】
ＥＣＬ部分は遷移金属であってもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、金属を、例えば、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、パラジウム、モリブデン及びテクネチウムから選択することができる、金属含有有機化合物を含むことができる。例えば、金属はルテニウム又はオスミウムであってもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、ルテニウムキレート又はオスミウムキレートであってもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）及びトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）を含んでいてもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、ルテニウム（ＩＩ）トリスビピリジン（［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋）であってもよい。また金属は、例えば、これらに限定されるものではないが、セリウム、ジスプロシウム、エルビウム、ユーロビウム、ガドリニウム、ホルミウム、ランタン、ルテチウム、ネオジム、プラセオジム、プロメチウム、テルビウム、ツリウム、及びイッテルビウムなどの希土類金属から選択することもできる。例えば、金属は、セリウム、ユーロビウム、テルビウム、又はイッテルビウムであってもよい。
【００６３】
金属含有ＥＣＬ部分は、次式：
Ｍ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ
（式中、Ｍは金属であり；ＰはＭの多座配位子であり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６は、Ｍのリガンドであり、これらの各々は、同じであってもよく、又は互いに異なっていてもよく；ｍは１以上の整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は、０以上の整数であり；Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６は、ＥＣＬ部分が電磁放射を放出するように誘導され得るかかる組成物及び数であり、Ｍのリガンドにより提供されるＭへの結合の総数は、Ｍの配位数に等しい）を有していてもよい。例えば、Ｍはルテニウムであってもよい。或いは、Ｍはオスミウムであってもよい。
【００６４】
一部のＥＣＬ部分の例は、１つのＭの多座配位子を有していてもよい。またＥＣＬ部分は、複数の多座配位子を有していてもよい。２つ以上のＭの多座配位子を含む例では、多座配位子は、同一であっても、異なっていてもよい。多座配位子は、芳香族配位子又は脂肪族配位子であってもよい。好適な芳香族多座配位子は、芳香族複素環配位子であってもよく、また窒素を含有していてもよく、例えば、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル、１，１０フェナントロリン、及びポルフィリンである。
【００６５】
好適な多座配位子は、非置換であってもよいし、当技術分野で公知の任意の多数の置換基によって置換されていてもよい。好適な置換基としては、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、置換アラルキル基、カルボキシレート基、カルボキサルデヒド基、カルボキサミド基、シアノ基、アミノ基、ヒドロキシ基、イミノ基、ヒドロキシカルボニル基、アミノカルボニル基、アミジン基、グアニジニウム基、ウレイド基、マレイミド基、硫黄含有基、リン含有基、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボン酸エステルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
一部の実施態様では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６の少なくとも１つは、多座芳香族複素環配位子であってもよい。各種の実施態様では、これらの多座芳香族複素環配位子の少なくとも１つは、窒素を含有していてもよい。好適な多座配位子としては、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル、１，１０フェナントロリン、ポルフィリン、置換ビピリジル、置換ビピラジル、置換テルピリジル、置換１，１０フェナントロリン、又は置換ポルフィリンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの置換多座配位子は、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、置換アラルキル基、カルボキシレート基、カルボキサルデヒド基、カルボキサミド基、シアノ基、アミノ基、ヒドロキシ基、イミノ基、ヒドロキシカルボニル基、アミノカルボニル基、アミジン基、グアニジニウム基、ウレイド基、マレイミド基、硫黄含有基、リン含有基、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボン酸エステルで置換されていてもよい。
【００６７】
一部のＥＣＬ部分は、２種の二座配位子を含有していてもよく、それらの各配位子は、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル、１，１０フェナントロリン、置換ビピリジル、置換ビピラジル、置換テルピリジル、又は置換１，１０フェナントロリンであってもよい。
【００６８】
一部のＥＣＬ部分は、３種の二座配位子を含有していてもよく、それらの各配位子は、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル、１，１０−フェナントロリン、置換ビピリジル、置換ビピラジル、置換テルピリジル、又は置換１，１０−フェナントロリンであってもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、ルテニウム、２種の二座ビピリジル配位子、及び１種の置換二座ビピリジル配位子を含んでいてもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、ポルフィリン又は置換ポルフィリンなどの四座配位子を含有していてもよい。
【００６９】
一部の実施態様では、ＥＣＬ部分は、１種又は複数の単座配位子（その多種多様の配位子が当技術分野では周知である）を有していてもよい。好適な単座配位子は、例えば、一酸化炭素、シアン化物、イソシアン化物、ハロゲン化物、並びに脂肪族ホスフィン、芳香族ホスフィン及び複素環ホスフィン、アミン、スチビン、及びアルシンであってもよい。
【００７０】
一部の実施態様では、１種又は複数のＭの配位子は、例えば、放射性同位体、蛍光成分、又はさらなる発光ルテニウム若しくはオスミウム含有中心などの追加の化学標識に結合させることができる。
【００７１】
例えば、ＥＣＬ部分は、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ホウ酸であってもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、ビス［（４，４’−カルボメトキシ）−２，２’−ビピリジン］２−［３−（４−メチル−２，２’−ビピリジン−４−イル）プロピル］−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）であってもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’ビピリジン［４−（ブタン−１−アール）−４’−メチル−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）であってもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ビピリジン）［４−（４’−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−イル）−酪酸］ルテニウム（ＩＩ）であってもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、（２，２’−ビピリジン）［シス−ビス（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレン］｛２−［３−（４−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−イル）プロピル］−１，３−ジオキソラン｝オスミウム（ＩＩ）であってもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ビピリジン）［４−（４’−メチル−２，２’−ビピリジン）−ブチルアミン］ルテニウム（ＩＩ）であってもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ビピリジン）［１−ブロモ−４（４’−メチル−２，２’−ビピリジン−４−イル）ブタン］ルテニウム（ＩＩ）であってもよい。例えば、ＥＣＬ部分は、ビス（２，２’−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−ブチルアミドルテニウム（ＩＩ）であってもよい。
【００７２】
例えば、ＥＣＬ部分は、構造が、
【化１】
2008522588.tif 000002
（式中、Ｗは、生物材料、結合試薬、酵素基質又は他のアッセイ試薬と反応して、ＮＨＳエステル、活性化カルボキシル、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ヒドラジド、マレイミド、又はホスホルアミダイトなどの共有結合を形成し得る、ＥＣＬ部分に結合されている官能基である）
である、［（Ｒｕ（スルホ−ｂｐｙ））２ｂｐｙ］２＋である。
【００７３】
本発明の特定の実施態様では、検出可能な標識は、例えば、Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１２２８〜２９（１９９８）及びＴｙａｇｉ，Ｓ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９〜５２（１９９８）に記載されている、分子指標（すなわち、ヘアーピンループ含有のオリゴヌクレオチドに結合している構造−感度標識）であってもよい。
【００７４】
特定の実施態様では、プライマーは、結合部分をプライマーへ組み入れることにより標識化することができる。本発明で使用可能な結合部分には、ビオチン及びジゴキシゲニンが含まれる。例えば、ビオチンは、ビーズにコーティングされた別の指標部分（ストレプトアビジンなど）をプローブ又はプライマーに特異的に結合させる。
【００７５】
Ｃ．アンプリコン
特定の実施態様では、配列番号１、２、又は３の一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、プライマーが結合する位置の間に収まる試料ヌクレオチド配列が増幅され、アンプリコンが形成されるように調製することができる。一部の実施態様では、アンプリコンは、２つのプライマー配列と、２つのプライマー結合部位の間に位置する核酸配列を含んでいる。一部の実施態様では、アンプリコンは、配列番号１、２、又は３の検出可能な一部である。特定の実施態様では、アンプリコンは、５０塩基対〜１００，０００塩基対、５０塩基対〜３０００塩基対、５０塩基対〜２５００塩基対、５０塩基対〜２０００塩基対、５０塩基対〜１５００塩基対、５０塩基対〜１０００塩基対、５０塩基対〜５００塩基対、又は５０塩基対〜１００塩基対の長さであってもよく、或いは任意の中間の長さであってもよい。
【００７６】
特定の実施態様では、アンプリコンヌクレオチド配列又はプローブヌクレオチド配列は、アンプリコンヌクレオチド配列又はプローブヌクレオチド配列が炭疽菌に特異的に結合するように、目的のポリヌクレオチド配列又はその相補配列の検出可能な一部と実質的に同一であってもよい。
【００７７】
ＰＣＲ反応の場合には、例えば、高ストリンジェンシー条件は、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２溶液における６４℃でのハイブリダイゼーションを用いる。サザンブロット又はドットブロットなどのブロットの場合には、例えば、高ストリンジェンシー条件は、（１）洗浄において低イオン強度及び高温（例えば、５０℃で、０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳ）を使用するか、（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドなどの変性剤（例えば、４２℃で、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウムを補充した、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）を用いた５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド）を使用する。別の実施例では、４２℃にて、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストランを使用し、４２℃にて０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。また高ストリンジェンシー条件には、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを用いた６５℃での洗浄が含まれる。
【００７８】
アンプリコンヌクレオチド配列は、目的のポリヌクレオチド配列の検出可能な一部に対して、ヌクレオチド塩基に少数の付加、欠失又は置換を含んでいてもよい。アンプリコンヌクレオチド配列中に存在し得る付加、欠失又は置換の数は、アンプリコンの長さ及び組成によって決まることが、当業者には理解されよう。一部の実施態様では、アンプリコンヌクレオチド配列は、目的のポリヌクレオチド配列の検出可能な一部に対して、０〜５、０〜１０、０〜２０、０〜３０、０〜４０ヌクレオチドのヌクレオチド塩基の付加、欠失又は置換を含有することができる。
【００７９】
Ｄ．プローブ
プローブヌクレオチド配列もまた、目的のポリヌクレオチド配列の検出可能な一部に対して、ヌクレオチド塩基の軽微な付加、欠失又は置換を含有することができる。プローブヌクレオチド配列中に存在し得る付加、欠失又は置換の数は、プローブ配列の長さ及び組成によって決まることが、当業者には理解されよう。一部の実施態様では、プローブヌクレオチド配列は、目的のポリヌクレオチド配列の検出可能な一部に対して、０〜５、０〜１０、０〜１５、０〜２０ヌクレオチドのヌクレオチド塩基の付加、欠失又は置換を含有し得る。一部の実施態様では、目的のポリヌクレオチド配列は、配列番号１、２、又は３である。一部の実施態様では、目的のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１２塩基対の長さである、配列番号１、２、又は３の一部である。一部の実施態様では、目的のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１５塩基対の長さである、配列番号１、２、又は３の一部である。
【００８０】
一部の実施態様では、プローブは検出可能な標識を含んでいてもよい。別の実施態様では、検出可能な標識は、プライマーについて上述したように、プローブに直接的又は間接的に結合させることができる。特定の実施態様では、プライマーについて上述したように、プローブへ結合部分を組み込むことによりプローブを標識化することができる。
【００８１】
一部の実施態様では、プローブは、配列番号１、２、又は３の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドであるＤＮＡ配列であってもよい。各種の実施態様では、プローブは、配列番号１、２、又は３の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドに相補的なＤＮＡ配列であってもよい。核酸には、これらに限定されるものではないが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）が含まれる。天然の核酸塩基の例としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、プローブは、配列番号１、２、又は３の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドに結合する核酸類似体であってもよい。別の実施態様では、プローブは、配列番号１、２、又は３の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドの相補配列に結合する核酸類似体であってもよい。
【００８２】
プローブは、修飾ヌクレオチド又は核酸類似体を含有していてもよい。修飾ヌクレオチドの例としては、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、シュードイソシトシン、２−チオウラシル及び２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）、及びＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の好適な核酸塩基の例としては、Ｂｕｃｈａｒｄｔら（米国特許第６３５７１６３号）の図２（Ａ）及び２（Ｂ）に例示されている核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸類似体プローブは、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、又は核酸の任意の誘導体形態を含んでいてもよい。
【００８３】
特定の実施態様では、プローブは、核酸、修飾核酸、又は核酸類似体の混合物を含み得る。別の実施態様では、プローブは、核酸セグメント、修飾核酸セグメント、又は核酸類似体セグメント（各セグメントは、検出可能な標識でそれぞれ標識化される）を含むことができる。
【００８４】
プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨げない限り、リン酸ジエステル結合以外の結合によって結合させることができる。従って、オリゴヌクレオチドプローブは、ホスホジエステル結合ではなく、ペプチド結合により結合されている構成塩基を有していてもよい。プローブは特定の条件下で核酸に結合する。
【００８５】
一部の実施態様では、プライマー又はプローブとして使用可能なオリゴヌクレオチドは、１０〜１００ヌクレオチド長、１０〜９０ヌクレオチド長、１０〜７０ヌクレオチド長、１０〜５０ヌクレオチド長、１０〜４０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、又は１０〜２０ヌクレオチド長であってもよい。
【００８６】
ＩＶ．プライマーを用いる検出方法
一部の実施態様では、本発明は、増幅の標的として配列番号１、２、又は３のヌクレオチド配列の全部又は一部を用いる、炭疽菌の検出方法を提供する。ヌクレオチド配列の増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ；米国特許第５４０９８１８号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０〜５６９（１９８９））、転写媒介性増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ；Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３〜７７（１９８９））、鎖置換増幅（ＳＤＡ；Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１６９１〜９６（１９９２））、自立的配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＳＳＲ；Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４〜７８（１９９０））、及びＱベータレプリカーゼ系（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７〜１２０２（１９８８））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
ＤＮＡ配列の増幅技術は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０〜１３５４（１９８５）；Ｍｕｌｌｉｓら．、米国特許第４６８３１９５号、及びＭｕｌｌｉｓら、米国特許第４６８３２０２号を参照されたい。一実施形態では、２つのプライマーを試料から抽出したＤＮＡと、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、バッファー、及び塩とともに混合し、典型的なＰＣＲ反応のサーモサイクラー装置に置く。
【００８８】
試料としては、土壌試料、空気試料、水試料、宿主からの組織試料、及び宿主からの喀痰が挙げられるが、これらに限定されるものではない。具体的な宿主としては、ヒト及び有蹄動物（ウシ及びヒツジなど）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。かかる試料から核酸を抽出する方法は、当技術分野で周知である。慣用の方法には、タンパク分解酵素で試料を処理し、続いて、有機溶媒（例えばフェノール、クロロホルム）で抽出を行い、カオトロピック剤の存在下でシリカに結合させることが含まれる（Ｂｏｏｍら、米国特許第５２３４８０９号）。血液検体と鼻腔用綿棒の取扱い方法は、例えば、Ｒａｎｔａｋｏｋｋｏ−Ｊａｌａｖａ  Ｋ．及びＶｉｌｊａｎｅｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．９：１０５１〜５６（２００３）に記載されている。土壌試料中の炭疽菌胞子からＤＮＡを調製する具体的な方法は、Ｃｈｅｕｎ  Ｈ．Ｉ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：７２８〜３３（２００３）に記載されている。
【００８９】
アンプリコンは、当業者に周知の種々の手段により検出することができる。一実施形態では、アンプリコンは、ゲル電気泳動法を行い、続いてＤＮＡ特異的染色で染色することにより検出することができる。かかる分析に好適なゲルとしては、アガロースゲル及びポリアクリルアミドゲルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。染色剤としては、エチジウムブロミド、ＳＹＢＲ（登録商標）ゴールド及びＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、及び銀染色剤（Ｂａｓｓａｍ  Ｂ．Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６：８０（１９９１））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施態様では、染色剤（例えばエチジウムブロミド）をゲル中に組み入れることができる。
【００９０】
特定の実施態様では、本発明の炭疽菌検出アッセイは、特異性又は感度を高める成分を添加することにより改良することができる。かかる添加剤としては、ウシ血清アルブミン、ジメチルスルホキシド、ベタイン、及び塩化テトラメチルアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一部の実施態様では、取扱いをより容易にする成分を添加することができる。
【００９１】
本発明の一部の実施態様では、試料中の目的の核酸の存在は、標識プライマーを組み入れた後、標識増幅産物を測定することにより検出することができる。一実施形態では、ＥＣＬ標識は、１つ又は両方のＰＣＲプライマーに組み入れることができる。例えば、オリゴデオキシヌクレオチドプライマーは、目的の炭疽菌核酸配列に十分に相補的であるように調製することができる。プライマーは、合成中に導入されるアミノ基で標識化することができるか、直接合成中に標識ＮＨＳ及び標識ホスホルアミダイト（この場合、標識はそれぞれＥＣＬ部分である）を用いて標識化することができる。一部の実施態様では、化学発光反応によってジゴキシゲニン標識を検出する。
【００９２】
別の実施態様では、検出可能な標識は、合成中に増幅ＤＮＡへ組み入れることができる。別の実施態様では、検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドプライマーの１つ又は両方に結合させることができる。別の実施態様では、検出可能な標識は、新しく合成されたＤＮＡに特異的に結合され得る。核酸を分析し、染色し、標識化する具体的な技術は当技術分野で周知であり、例えば、Ｂｉｒｅｎ，Ｂ，Ｇｒｅｅｎ，Ｅ．Ｄ．，Ｋｌａｐｈｏｌｚ，Ｓ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．、及びＲｏｓｋａｍｓ，Ｊ．，１９９７，Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、並びに、Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ，（編者）、１９９５，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓで確認することができる。
【００９３】
特定の実施態様では、試料中の目的の炭疽菌核酸は、
（ａ）炭疽菌を含んでいることが疑われる試料を提供すること；
（ｂ）試料からの核酸、少なくとも１つの第１のプライマー、及び少なくとも１つの第２のプライマーを含む組成物を形成すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）のプライマーを増幅することができる任意の核酸を増幅すること；及び
（ｄ）ステップ（ｃ）の増幅産物を検出することにより炭疽菌を検出すること
を含み、
（ｉ）少なくとも１つのプライマーが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一のヌクレオチド断片を含み、その少なくとも１つのプライマーが炭疽菌ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合し、並びに／又は、（ｉｉ）少なくとも１つのプライマーが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列の一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む方法により検出することができる。
【００９４】
特定の実施態様では、本方法は、アンプリコンを変性させるのに十分な温度でアンプリコンをインキュベートすること、及びアンプリコンを検出する前に、変性させたアンプリコンを、磁化可能なビーズ上に固定化することができるオリゴヌクレオチド又は固定化されているオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることをさらに含んでいてもよい。本明細書では、「磁化可能な」という用語は、物質の透磁率が自由空間のものとは異なっている、物質の特性を意味する。この用語には、常磁性及び超常磁性が含まれる。
【００９５】
特定の実施態様では、核酸はポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅させることができる。
【００９６】
特定の実施態様では、配列番号１、２、３、又はそれらの相補配列に存在する配列を用いて炭疽菌核酸を増幅させることができる。一実施形態では、炭疽菌配列は、さらなるクローニング用のベクターへ、又は配列番号１、２、３の全部若しくは一部によってコードされているタンパク質の発現用ベクター中にクローニングするために増幅させることができる。クローニング法は、当技術分野で周知である。発現ベクターは、発現させようとする配列に作動可能に連結されているプロモーターと複製起点を含む。一実施形態では、発現ベクターは、発現をさらに調節するために、エンハンサーなどの他の遺伝子調節エレメントをさらに含む。ベクターとしては、プラスミド、ＹＡＣＳ及び人工染色体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
一実施形態では、本発明は、炭疽菌核酸を増幅する方法を提供し、この方法は、
（ａ）炭疽菌核酸の試料を提供すること；
（ｂ）核酸及びプライマー対を含む組成物を形成すること；
（ｃ）プライマー対の第１のプライマーとプライマー対の第２のプライマーの間のヌクレオチド配列を増幅して、アンプリコンを形成させること；及び
（ｄ）アンプリコンを検出すること
を含み、
（ｉ）プライマー対の少なくとも１つのプライマーが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一であるヌクレオチド断片を含み、その少なくとも１つのプライマーが、炭疽菌ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合し、並びに／又は、（ｉｉ）プライマー対の少なくとも１つのプライマーが、配列番号１、２、３又はそれらの相補配列の一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む。
【００９８】
Ｖ．プローブを利用した検出方法
本発明の炭疽菌特異的配列は、増幅を利用した方法の他に、別の技術による試料中の炭疽菌核酸の存在の検出において、プローブとして使用することができる。例えば、核酸試料中の成分は、ゲル上で分離し、膜に移し、次いで、プローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出することができる。特定の実施態様では、配列番号１、２、若しくは３の配列の全部若しくは一部、又は配列番号１、２、若しくは３の配列の全部若しくは一部の相補配列は、核酸試料中の炭疽菌特異的配列の存在を検出するプローブとして用いることができる。一部の実施態様では、プローブは少なくとも１２個以上の塩基を含み得る。特定の実施態様では、プローブは検出可能な標識を含んでいてもよい。プローブ分子は、プローブ分子が試料中の炭疽菌核酸に特異的に結合する条件下で、試料から抽出した核酸と接触させることができ、それによって、炭疽菌核酸を検出することができる。
【００９９】
各種の実施態様では、プローブを利用したアッセイはサザンブロット法である。特定の実施態様では、プローブを利用したアッセイはノーザンブロット法である。プローブを利用したアッセイは、当業者に周知である。例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３〜１７（１９７５）；Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．及びＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９：１２３〜１２９（１９８０）を参照されたい。
【０１００】
適切なハイブリダイゼーション条件は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、第２節、第４節及び第６節に例示されている周知のパラメーターに基づいて、当業者により選択され得る。さらに、ストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、第７章、第９章及び第１１章に記載されており、例えば、１００ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ、及び４０℃〜６５℃である。最適のハイブリダイゼーション条件は、プローブの長さ及び組成によって変わることは、当然、当業者には理解されよう。
【０１０１】
別の実施態様では、プローブは固相支持体に結合させることができる。具体的な固相支持体としては、ガラスビーズ、シリカビーズ、磁化可能なビーズ、マルチウェルプレート及びディップスティックが挙げられるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様では、プローブは、固相支持体への結合を容易にするため、化学的に活性な基をさらに含んでいてもよい。化学的に活性な基は、オリゴヌクレオチドがそれを介して支持体に結合され得る部分である。特定の実施態様では、化学的に活性な基はアミノ基であってもよい。
【０１０２】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１、２、若しくは３のヌクレオチド配列、又は配列番号１、２、若しくは３に相補的なヌクレオチド配列の全部又は一部を含み、オリゴヌクレオチドプローブは、炭疽菌に特異的に結合する。
【０１０３】
特定の実施態様では、試料中の目的の炭疽菌核酸は、
（ａ）炭疽菌を含んでいることが疑われる試料を提供すること；
（ｂ）試料からの核酸を、ハイブリダイゼーションに好適な条件下で少なくとも１つのプローブと接触させること；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）のハイブリダイゼーション産物に基づいて、試料中の炭疽菌を検出すること
を含み、
（ｉ）少なくとも１つのプローブが、配列番号１、２、３、又はそれらの相補配列のいずれかの一部と実質的に同一であるヌクレオチド断片を含み、その少なくとも１つのプローブが、炭疽菌ＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合し、並びに／又は（ｉｉ）少なくとも１つのプローブが、配列番号１、２、３、又はそれらの相補配列の一部と実質的に同一である、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む方法によって検出することができる。
【０１０４】
特定の実施態様では、プローブは固相支持体に結合される。固相支持体は、例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレートであってもよい。
【０１０５】
各種の実施態様では、プローブは、ハイブリダイゼーション後に固相支持体に結合させることができる。例えば、プローブは、ビオチン及び／又はジゴキシゲニンを含有していてもよく、また、アビジン、ストレプトアビジン又は抗ジゴキシゲニン抗体を含む固相支持体上に固定化されていてもよい。
【０１０６】
各種の実施態様では、１種又は複数の相補オリゴヌクレオチドは、合成中に導入されるアミノ基を介して少なくとも１つの結合部分に結合される。
【０１０７】
ＶＩ．キット
別の実施態様では、本発明の１つ又は複数のプローブを含むキットは、炭疽菌を検出する本発明の方法の実施に用いることができる。別の実施態様では、本発明の１つ又は複数のプライマーを含むキットは、炭疽菌を検出する本発明の方法の実施に用いることができる。さらに別の実施態様では、キットは、本発明のプローブ及びプライマーの両方を含んでいてもよい。
【０１０８】
一実施形態では、キットは、プライマー対が、配列番号１、２、若しくは３の少なくとも１２個の連続するヌクレオチド、又は、配列番号１、２、若しくは３に相補的な少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含み、且つ、プライマー対が、炭疽菌ＤＮＡを特異的に増幅するが、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス及び枯草菌からのＤＮＡは増幅しない、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【０１０９】
別の実施態様では、キットは、配列番号１、２、若しくは３のヌクレオチド配列の一部又は配列番号１、２、若しくは３に相補的なヌクレオチド配列の一部を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含み、そのオリゴヌクレオチドプローブは炭疽菌に特異的に結合する。
【０１１０】
ＶＩＩ．結合パートナー
特定の実施態様では、本発明は、炭疽菌タンパク質に特異的に結合するが、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス、又は枯草菌タンパク質には結合しない、結合パートナー、及び結合パートナーの製造方法を提供する。結合パートナーの例としては、相補的ポリヌクレオチド（例えば、相互にハイブリダイズする２つのＤＮＡ配列；相互にハイブリダイズする２つのＲＮＡ配列；相互にハイブリダイズするＤＮＡ及びＲＮＡ配列）、抗体及び抗原、受容体及びリガンド（例えば、ＴＮＦ及びＴＮＦｒ−Ｉ、ＣＤ１４２及びＶＩＩａ因子、Ｂ７−２及びＣＤ２８、ＨＩＶ−１及びＣＤ４、ＡＴＲ／ＴＥＭ８又はＣＭＧ及び炭疸毒素の保護抗原部分）、酵素及び基質、或いは分子及び結合タンパク質（例えば、ビタミンＢ１２と内因子、葉酸と葉酸結合タンパク質）が挙げられる。
【０１１１】
特定の実施態様では、炭疽菌特異的結合パートナーは、炭疽菌感染によって起こる病気の治療又は予防用の医薬組成物の一部であり得る。特定の実施態様では、医薬用担体は、製薬上許容され得る担体をさらに含む。かかる担体の例としては、殺菌済みの液体、例えば、水、油類（石油系油、動物油、植物油、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含む）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。食塩水、水性デキストロース、及びグリセリン溶液もまた液体担体として用いることができる。さらなる担体の例としては、リポソーム、水中油型エマルション、及び／又は、アルミニウム塩（例えば水酸化アルミニウム）をはじめとする金属塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらなる好適な医薬用担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版）に記載されている。
【０１１２】
特定の実施態様では、結合パートナーは、組換えＤＮＡ手法により産生される。特定の実施態様では、結合パートナーは、完全抗体の酵素的切断又は化学的切断によって産生される。特定の実施態様では、結合パートナーは、組換えＤＮＡ手法によって産生される。
【０１１３】
一部の実施態様では、結合パートナーは抗体である。タンパク質抗原に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する技術は、当技術分野で周知である。逆ワクチン学の分野では、病原菌ゲノムについて、その配列を決定し、分析を行って、タンパク質をコードしている潜在的なオープンリーディングフレームを探索することができる。一般には、Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：１７〜２８（２００４）を参照されたい。このコンピューターでの（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）分析中に、これらのタンパク質は、別の公知のタンパク質との相同性の保存領域について分析され、各タンパク質が感染及び複製で果たし得る有望な役割を決定することができる。ゲノム研究所（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ））では、炭疽菌ゲノム全体の配列を決定し、ゲノム中で同定される推定上の各タンパク質について有望な機能を特定することにより、これらの最初の一部のステップが達成されている。この細菌遺伝子全体又はその一部は、大腸菌などの非病原菌での発現用の発現ベクター中にクローニングすることができる。タンパク質が当技術分野の標準技術により発現され、精製されると、ウサギ又はマウスなどの宿主からポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を産生する免疫原として使用することができる。さらに、特定遺伝子産物に対する抗体の調製に、ファージディスプレイ法などのインビトロセレクション法を使用することができる。次いで、得られた抗体が細菌上の表面抗原を認識するか否かを決定するため、抗体をＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイによりスクリーニングすることができる。得られた抗体が中和するか否かを評価するには、細菌感染用又は病因用の動物モデルを用いることができる。
【０１１４】
一実施形態では、少なくとも１つの炭疽菌タンパク質に特異的に結合する抗体を産生する方法は、
（ａ）配列番号１、２及び３の少なくとも１つの核酸配列の全部又は一部を含んでいる発現ベクターを宿主細胞に導入し、炭疽菌タンパク質を発現させること；
（ｂ）炭疽菌タンパク質を単離すること；及び
（ｃ）動物宿主を単離した炭疽菌タンパク質を含む組成物で免疫化し、抗体を産生させること
を含む。
【０１１５】
特定の実施態様では、宿主細胞は細菌などの原核細胞であるが、これらに限定されるものではない。特定の実施態様では、宿主細胞は古細菌細胞である。特定の実施態様では、宿主細胞は真核細胞である。特定の実施態様では、発現ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、複製欠損型アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はレトロウイルスである。特定の実施態様では、動物宿主はマウス又はウサギである。
【０１１６】
以下の実施例は、単に例示目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定又は制限することを意図するものではない。
【実施例】
【０１１７】
（実施例１）
炭疽菌特異的ゲノム配列の同定
配列データベースの「Ｇｅｎｂａｎｋ  ｎｒ」を用いて、炭疽菌の毒性株（Ａｍｅｓ）の配列を公知のすべての細菌ＤＮＡ配列と比較するために、診断アッセイに好適な標的となるであろう炭疽菌ＤＮＡのセグメントを、ＢＬＡＳＴ相同性検索プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで利用可能）を用いて確認した。Ｇｅｎｂａｎｋ  ｎｒデータベースのＢＬＡＳＴ探索に炭疽菌ヌクレオチド配列をランダムに書き入れた。別の細菌の遺伝子配列に対してほとんど同一性を有しておらず、従って炭疽菌の検出において良好な標的である、炭疽菌の核酸配列が同定された。炭疽菌以外の配列に対するビットスコアは１００未満であった。同定した炭疽菌配列に対するビットスコアは、配列番号１、２及び３に関して、それぞれ、４９４８、２６５８及び２５２９であった。
【０１１８】
配列番号１、２及び３に記載したこれらの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中の炭疽菌Ａｍｅｓ株の完全ＤＮＡ配列由来のセグメントであった（アクセッション番号ＡＥ０１６８７９）。
【０１１９】
（実施例２）
ＰＣＲを用いた炭疽菌特異的核酸配列の検出
同定した配列の特異性をＰＣＲアッセイで証明した。簡単に説明すると、配列番号１又は配列番号３の一部を効率的に増幅できるように、ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを設計した。配列番号１のヌクレオチド配列の一部の増幅には、以下のプライマーを用いた：
【化２】
2008522588.tif 000003
このアンプリコンの想定される大きさは１５４ｂｐであった（図１、パネルＢ）。配列番号３のヌクレオチド配列の一部の増幅には、以下のプライマーを用いた：
【化３】
2008522588.tif 000004
このアンプリコンの想定される大きさは、２４８塩基対であった（図１、パネルＡ）。これらのプライマーは、ポジティブコントロールとして、炭疽菌ＤＮＡとのＰＣＲ反応で用いた。また、別の細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌、バチルス・ハロデュランス、又は近縁種であるセレウス菌及びバチルス・チューリンゲンシス由来のゲノムＤＮＡ試料をネガティブコントロールとして用いた。
【０１２０】
各反応は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び２００ｐｇのＤＮＡ鋳型を含有する２５μｌ容量中で実施した。９５℃で７分、続いて９５℃で３０秒、４５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒の３５サイクル、最終の伸長インキュベーションとして７２℃で２分のインキュベーションを行うように設定されたサーマルサイクラー中で試料を増幅させた。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化し、続いてエチジウムブロミドの存在下で染色した。
【０１２１】
図４から明らかなように、アガロースゲルで、炭疽菌レーンに想定した大きさの鮮やかに染色されたＰＣＲ産物が認められたが、他の細菌ＤＮＡ試料のレーンにはエチジウムブロミド染色のＰＣＲ産物は認められなかった。マーカーレーンにおける大きさの基準は、上から下に、２０００、１２００、８００、４００、２００及び１００塩基対の長さであった。
【０１２２】
（実施例２）
ＰＣＲとＥＣＬ検出の組合せを用いた炭疽菌特異的核酸配列の検出
本実施例は、ＰＣＲプライマーの１つを［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋で標識することを含む、炭疽菌を検出するためのＥＣＬ標識プライマーの使用について記載する。配列番号４及び５に記載したプライマーを用いた。配列番号５のプライマーは、Ｇｕｄｉｂａｎｄｅらの米国特許第５６８６２４４号の記載のようにして、［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋ホスホルアミダイトを用いて、合成中にオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋を加えることにより標識化した。炭疽菌、大腸菌、枯草菌、又は、セレウス菌から単離したＤＮＡについて、上述したＰＣＲプロトコルを用いてアンプリコンを作製した。
【０１２３】
ＰＣＲ反応で上記プライマーを用いることにより、得られたアンプリコンに相補的であるオリゴヌクレオチドを調製した。この捕捉オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマー間の２０塩基領域に相補的となるように合成した。この捕捉オリゴヌクレオチド配列は、５’−アミンＡＡＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡ（配列番号８）であった。この捕捉オリゴヌクレオチドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の試薬を用いてメーカーの取扱説明書（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１４３．０５）に従って、Ｄｙｎａｌカルボキシル化Ｍ−２７０超常磁性ビーズ上に、ビーズ上のカルボキシル基にオリゴヌクレオチドアミノ基が結合するように固定化した。
【０１２４】
アンプリコンを固定化した捕捉オリゴヌクレオチドと混合し、ハイブリダイズさせた。詳しくは、２５μｌのＰＣＲ産物を、１５μｇのオリゴヌクレオチドビーズを含有する、６００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＴＷＥＥＮ（商標）２０の等量（もう１つの２５μｌ）と混合した。この懸濁液を９５℃で５分間、続いて４５℃で３０分間インキュベートした。次いで、超常磁性ビーズ担持増幅産物と相補的オリゴヌクレオチドの複合体を、自動リーダー（Ｍ１Ｒ、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で結合されている［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋について分析した。
【０１２５】
図５に示される通り、炭疽菌ＤＮＡだけが、［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋標識プライマーからシグナル（ＤＮＡインプットの３つの対数に対する半対数グラフで直線に丁度重なっている）を生成した。大腸菌、枯草菌、又は、セレウス菌のＤＮＡでは同様の結果は得られなかった。
【０１２６】
（実施例３）
ＰＣＲ特異性の普遍性に関する証明
炭疽菌特異性に関する配列番号１及び２のヌクレオチド配列全体にわたるさらなる部位を試験するため、これらの２つの配列に基づいて、以下の１対のＰＣＲプライマーを設計した：
【化４】
2008522588.tif 000005
【０１２７】
炭疽菌ＤＮＡ（Ｓｔｅｒｎｅ株）によるＰＣＲ反応で、上記の各プライマー対をポジティブコントロールとして用いた。またネガティブコントロールとして、下記の表１に掲げた４３種類の他の細菌由来のゲノムＤＮＡ試料を用いた。各反応は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び１ｎｇのＤＮＡ鋳型を含有する２５μｌ容量中で実施した。試料は、９５℃で７分、続いて９５℃で３０秒、４５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒の３５サイクル、最終の伸長インキュベーション７２℃で２分、ＰＣＲ反応物をインキュベートするように設定されたサーマルサイクラー中で増幅させた。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって可視化し、続いてエチジウムブロミドの存在下で染色した。各組のプライマーにおいて、表１に記載したすべての株由来のＤＮＡは陰性であり、炭疽菌ＤＮＡは陽性であった。
【表１−１】
2008522588.tif 000006
【表１−２】
2008522588.tif 000007
【０１２８】
（実施例４）
炭疽菌特異的タンパク質に結合する抗体の産生及びワクチンの産生
炭疽菌Ａｍｅｓ株のゲノムの配列を決定した。Ａｍｅｓ遺伝子配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ００３９９７を利用することができる。ＴＩＧＲデータベースによれば、配列番号１、２及び３に記載したヌクレオチド配列は、推定上の炭疽菌タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の一部である。具体的には、配列番号１のヌクレオチド配列は、プロファージＬａｍｂｄａＢａ０２、ＦｔｓＫ／ＳｐｏＩＩＩＥファミリータンパク質又は保存されたドメインタンパク質をコードし得る遺伝子で確認される。配列番号２のヌクレオチド配列は、推定上のランチビオティックス生合成センサーヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子で確認される。配列番号３のヌクレオチド配列は、推定上のＡＢＣトランスポーター、ＡＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子で確認される。
【０１２９】
配列番号１、２、又は３の核酸配列の全部又は一部は、ヒスチジン標識タンパク質としてそのコードされているタンパク質を発現するための発現ベクターに入れられる。例えば、ｐＥＴ−２１ｂ＋ベクター（Ｎｏｖｏｇｅｎ）又はＰＧＥＸ−ＫＧベクター（Ｇｕａｎ及びＤｉｘｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：２６２（１９９１））を用いて、ヒスチジン標識タンパク質又はＧＳＴ標識タンパク質としてそのコードされているタンパク質を発現させることができる。次いで得られた融合タンパク質を、ヒスチジン標識タンパク質についてはＮｉ２＋結合キレーティングセファロース（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、又はＧＳＴ標識タンパク質についてはグルタチオンセファロース（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたクロマトグラフィーにより精製する。得られた単離タンパク質の試料は、純度について試験するためＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した後、可溶化し、宿主動物を免疫するためフロイントアジュバントと混合する。
【０１３０】
次いで、マウス又はウサギを免疫化し、続いて１種又は複数の追加免疫投与を行い、試験用抗体を産生させる。例えば、マウスに、最初、精製タンパク質２０μｇを投与し、続いて、初回接種から２１日及び３５日後に追加免疫注射を行う。次いで、免疫したマウスから取得した血清試料から抗体を回収し、表面結合を検出するＥＬＩＳＡで、又は中和活性を測定する炭疽菌動物モデルで分析する。例えば、炭疽菌細菌を免疫動物由来の血清で事前インキュベートし、続いて、事前インキュベートした細菌を感受性宿主に注射することができる。次いで、事前処理した細菌を注射した宿主の生存を、未処理の細菌を注射した宿主の生存と比較する。事前処理した細菌を注射した宿主の高生存率は、ポリクローナル抗体に中和活性があることを証明している。モノクローナル抗体及びそれらの遺伝子操作した対応物（例えば、キメラ抗体及びヒト化抗体など）において、同様のタイプのＥＬＩＳＡ及び中和アッセイを実施する。
【０１３１】
本明細書は、明細書中に引用した文献の教示に照らすと、ほぼ完全に理解される。本明細書中の実施態様は、本発明の実施態様の例を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。当業者は、他の多数の実施態様が本発明に包含されることを容易に理解するであろう。本開示で引用したすべての刊行物及び特許は、その全体を本明細書に援用するものとする。引用により援用されている材料が本明細書に相反する、又は矛盾する限りは、本明細書はかかるすべての材料に優先する。本明細書中のすべての文献の引用は、かかる文献が本発明に対する先行技術であるということを認めるものではない。
【０１３２】
特に明記しない限り、本明細書（特許請求の範囲を含む）で用いている成分の量、反応条件等の記載を表すすべての数値は、すべての場合において、「約」という用語により修飾されているものと理解されたい。従って、逆に特に明記しない限りは、数値パラメーターは近似であり、本発明により得ようと求めている所望の特性に応じて変わり得る。少なくとも、特許請求の範囲の等価物の原則の適用を限定することを意図するものではなく、各数値パラメーターは、有効数字及び通常の四捨五入を考慮して解釈すべきである。
【０１３３】
特に明記しない限り、一連の要素の前の「少なくとも」という用語は、一連のすべての要素を意味するものと理解されたい。当業者は、いつもと同じ程度の実験操作を行うことにより、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に関する多くの等価物を理解するか、確認することができるであろう。かかる等価物は、添付の特許請求の範囲により包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】５’から３’方向の配列番号１のＤＮＡ配列を提供する図である。
【図２】５’から３’方向の配列番号２のＤＮＡ配列を提供する図である。
【図３】５’から３’方向の配列番号３のＤＮＡ配列を提供する図である。
【図４】炭疽菌ゲノムの一部を増幅することによって産生されたＰＣＲ産物の臭化エチジウム染色アガロースゲルを示す図である。炭疽菌から単離したＤＮＡをＰＣＲ反応のポジティブコントロールとして用い、一方、大腸菌、枯草菌、セレウス菌、バチルス・チューリンゲンシス及びバチルス・ハロデュランス由来のＤＮＡをＰＣＲ反応のネガティブコントロールとして用いた。アガロースゲルでは、炭疽菌のレーンで鮮やかに染色されたＰＣＲ産物が認められたが、他の細菌ＤＮＡ試料のレーンではＰＣＲ産物は認められない。図の左側パネル（パネルＡ）に示した反応で用いたプライマー（配列番号６及び７）は、配列番号３の一部を増幅した。図の右側パネル（パネルＢ）に示した反応で用いたプライマー（配列番号４及び５）は、配列番号１の一部を増幅した。
【図５】ＰＣＲプライマーの１つを電気化学発光性ルテニウムキレートのルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジル（［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋）で標識した、ＰＣＲ実験をまとめたグラフである。標識ＰＣＲ産物は超常磁性ビーズに捕捉され、自動リーダー（Ｍ１Ｒ、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で分析された。炭疽菌ＤＮＡだけが［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋標識ＢＡ４０７０プライマーからのシグナルを確かに発生し、これは、ＤＮＡインプットの３つの対数に対する半対数グラフにおいて直線状である。大腸菌、枯草菌又は、セレウス菌からのＤＮＡを用いるネガティブコントロールは、シグナルを示さなかった。またこのグラフは、炭疽菌のデータポイントの中で最小二乗適合を提供する。
【図１−１】
2008522588.tif 000008
【図１−２】
2008522588.tif 000009
【図２】
2008522588.tif 000010
【図３】
2008522588.tif 000011
【図５】
2008522588.tif 000012
【図４】
2008522588.tif 000013
【配列表】
2008522588000001.app
【国際調査報告】
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2008522588.tif 000015
2008522588.tif 000016
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