(57)【要約】  生体または細胞物質材料からのリボ核酸の促進された単離方法が明らかとなった。固相結合材料への核酸の結合中にＡｇｅｎｔ溶液を用い、溶出後、ＲＮＡ回収を増加させる。固相の洗浄および核酸の溶離は、促進された収率および／または純度のＲＮＡをもたらす。新たな方法を用いることにより、５分以内にＲＮＡを捕捉し、以降のプロセスに適した形で遊離する。本発明のＡｇｅｎｔは、好ましくは、複数の正電荷を有する単量体、オリゴマー、デンドリマー、および高分子有機化合物を含む。
2008536513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料からＲＮＡを単離する方法において、
（ａ）試料とＲＮＡ回収を促進させるＡｇｅｎｔ溶液との混合物を生成する工程と、
（ｂ）混合物と固相結合材料とを接触させる工程と、
（ｃ）溶液から固相結合材料を分離させる工程と、
（ｄ）固相結合材料からのＲＮＡを解離させる工程と、
を含む生体試料からのＲＮＡの単離方法。
【請求項２】
前記生体試料が全血、血漿、漿液、尿、組織、細胞、細菌培養物、およびウイルスからなる群から選択された請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Ａｇｅｎｔが多価である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記多価Ａｇｅｎｔの電荷が２以上の正電荷である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記Ａｇｅｎｔが下記構造式を有する請求項４記載の方法。
2008536513.tif 000033
ここで、各々のＡはＰおよびＮ原子から選択され、Ｌｉｎｋは２以上の炭素を有する飽和および不飽和のアリール基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基からなる群から選ばれる有機スペーサー基であり、Ｌｉｎｋにはヘテロ原子を含んでいてもよく、Ｒは炭素数が１から２０の低級アルキル基またはアラルキル基から選ばれ、Ｘは陰イオンである。
【請求項６】
前記Ａｇｅｎｔが下記構造式を有する請求項５記載の方法。
2008536513.tif 000034
ここで、置換基はオルト、メタまたはパラ配向いずれでもよく、Ａ１およびＡ１は窒素原子またはリン原子からそれぞれ独立に選ばれ、各々のＲは独立した炭素数が１から２０であるアルキル基またはアラルキル基であり、Ｘは陰イオンである。
【請求項７】
前記Ａｇｅｎｔが下記構造式を有する請求項５記載の方法。
2008536513.tif 000035
ここでＡ１およびＡ１は窒素原子またはリン原子から独立に選ばれ、Ｌｉｎｋは炭素数が２以上である飽和および不飽和のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基からなる群から選ばれ、各々のＲは独立した炭素数が１から２０であるアルキル基またはアラルキル基であり、Ｘは陰イオンである。
【請求項８】
前記Ａｇｅｎｔが骨格の一部として、またはペンダント基として電荷を有する基を有するポリマーである請求項４記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマーが下記の構造を有する請求項８記載の方法。
2008536513.tif 000036
ここで、各々のＡはリン原子または窒素原子から選ばれ、各々のＲは炭素数が１から２０の低級のアルキル基、またはアラルキル基であり、ｎは約１０から１０００の間の整数である。
【請求項１０】
前記ポリマーが以下の構造を有する請求項９記載の方法。
2008536513.tif 000037
ここで、各々のＲは炭素数が１から２０の低級のアルキル基またはアラルキル基であり、ｎは約１０から１０００の間の整数である。
【請求項１１】
前記結合材料が粒子、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、テストチューブ、およびマイクロウェルから選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記結合材料が粒子形態であり、サイズが約５０μｍ未満である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記結合材料がシリカ、ガラス、焼結ガラス、制御ポアガラス、焼結ガラス、アルミナ、ジルコニア、チタニア、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類、金属、金属酸化物、金属硫化物およびシリカ、ガラス、合成ポリマーまたは不溶性多糖類によりコーティングされた磁性反応材料から選ばれた基質材料を含む請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記結合材料がさらに基質表面または基質表面付近に共有結合した核酸結合部を有する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記基質と前記核酸結合部間の前記共有結合が選択的に開裂する請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸結合基がヒドロキシル基、シラノール基、カルボキシル基、アミン基、アンモニウム、４級アンモニウムおよびホスホニウム塩および３級スルホニウム塩、またはこれらの２種以上の混合から選ばれる請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸結合基が＋ＰＲ３Ｘ−である４級ホスホニウム基であり、各々のＲはアルキル基であり、Ｘは陰イオンである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記基質と前記核酸結合部間の前記共有結合がアルカリ溶離液により開裂して、（ｄ）工程においてＲＮＡを溶離液に遊離する請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
前記Ａｇｅｎｔが２以上の正電荷を有し、前記固相結合材料が前記基質表面または基質表面付近に共有結合する核酸結合部を有し、該核酸結合部が（ｄ）工程においてＲＮＡを溶離液に遊離させるためのアルカリ溶離液により解離する請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記（ａ）工程において、前記Ａｇｅｎｔの存在によりゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡからＲＮＡを選択的に単離させる請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には生体試料からのリボ核酸の単離に関し、より詳しくは、促進された（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）ＲＮＡ回収のための新規な溶液を用いる単離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床研究、臨床診断試験、および創薬に用いられている現在の分子生物学的手法は、リボ核酸（ＲＮＡ）の研究をより一層利用するようになってきている。ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）として存在している。特定のｍＲＮＡ配列の存在やｍＲＮＡの発現レベルの研究が拡大してきている。ｍＲＮＡの分析、特にマイクロアレイを用いた分析は分子生物学的調査の非常に強力な手法である。試料中のｍＲＮＡ配列のレベルの測定により、個々の遺伝子のアップまたはダウンレギュレーションが決定される。ｍＲＮＡのレベルは外部刺激や病状の相関として評価されうる。例えば、ｐ５３のｍＲＮＡレベルの変化は、多細胞型においてはガンに積極的に関与している。加えて、人間の健康に重大な影響を与えるＨＩＶを含む多くのウイルスはＲＮＡウイルスである。人間の体液又は組織から迅速かつ清潔にウイルスＲＮＡを分離する能力はウイルス学的調査には重要なことである。
【０００３】
現在のＲＮＡ単離方法は細胞を破壊する多くの手段の１つから始まり、ＲＮＡを溶液に遊離させ、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅｓ）からＲＮＡを保護する。溶解はＲＮＡとともに、ＲＮＡから分離しなければならないＤＮＡおよびタンパク質を遊離する。その後、ＲＮＡは可溶化又は沈殿させるための処理がなされる。細胞の溶解、ＲＮＡの可溶化、リボヌクレアーゼの阻害を同時に行うためカオトロピックなグアニジニウム塩を用いることは、Ｃｈｉｒｇｗｉｎらによって明らかにされている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８，５２９４−５２９９（１９７９））。他の手法は、可溶化したＲＮＡを低ｐＨにおいてフェノール／クロロホルムで抽出することにより、タンパク質およびＤＮＡから分離する（Ｄ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１５，３３−４１（１９８７））。一般的に用いられる一工程によるＲＮＡの単離は、４Ｍグアニジニウム塩、酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、フェノール、およびクロロホルム／イソアミルアルコールで順次、細胞を処理することを伴う。試料を遠心分離し、アルコールを添加してＲＮＡを上層から沈殿させる（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９（１９８７））。米国特許Ｎｏ．４，８４３，１５５は、酸性ｐＨにおいてフェノールとグアニジニウム塩の安定な混合物を細胞に添加する手法を開示している。クロロホルムで層を分離後、水相のＲＮＡをアルコールで沈殿させて回収する。
【０００４】
その他の方法には、細胞懸濁液に熱したフェノールを加え、次いでアルコールにより沈殿させること（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））、陰イオン性、又は非イオン性界面活性剤を用いて細胞を溶解し、細胞質ＲＮＡ遊離すること、およびバナジルリボサイド錯体やジエチルピロカーボネートのようなリボヌクレアーゼの阻害物質を使用すること（Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，“Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ”および“ＲＮＡ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｍｉｎｉ  Ｍｅｔｈｏｄ”ｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１３０−１３８（１９９１）がある。
【０００５】
ＤＮＡおよびＲＮＡをガラス又はその他の固相に結合させることにより、生体試料から単離する手法は米国特許Ｎｏ．５，２３４，８０９号（Ｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ）において開示されている。漿液や尿のような生体試料に含まれている細胞は、ＥＤＴＡおよび界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で濃（＞５Ｍ）グアニジニウムチオシアネート溶液にさらす事により溶解させる。ＤＮＡおよびＲＮＡは珪藻土又はＤＮＡおよびＲＮＡと着脱可能な錯体を形成したシリカ粒子を用いた定温放置により生体物質から精製される。
【０００６】
米国特許  Ｎｏ．５，１５５，０１８号は生物活性ＲＮＡをＤＮＡ、タンパク質、炭水化物その他細胞物質を含んでいる生体試料から単離、精製する手法を提供している。ＲＮＡは、濃酸性カオトロピック塩を有する結合溶液存在下、生体試料と微細に粉砕したガラスまたは珪藻土と接触させることにより単離される。これらの条件の下では、ＤＮＡを除去するためエタノール塩溶液による固体材料の後処理も開示されてはいるが、ＲＮＡは選択的に微粒子のシリカ材料と結合することが主張されている。粒子に結合したＲＮＡは試料中に存在する他の生体物質と容易に分離することができる。好ましくは、非特異的吸着物質を除去するため粒子結合ＲＮＡを洗浄する。結合ＲＮＡは希塩緩衝液による溶出により粒子から遊離し、実質的に純粋なものとなり、生物活性ＲＮＡが回収される。溶離液中のＤＮＡを破壊するためにヌクレアーゼを添加することもまた開示されており、選択的なＲＮＡの結合の主張には異議も唱えられている。
【０００７】
正に１価帯電した単量体陽イオン界面活性剤の細胞を破壊する能力およびＲＮＡ、ＤＮＡを溶液から同時に沈殿させる能力は米国特許  Ｎｏ．５，０１０，１８３号と５，９８５，５７２号に記載されている。これら特許では、ＲＮＡはまず不溶性に変換される。’１８３号特許の手法では、４級アンモニウム界面活性剤の溶液とともに４０％尿素およびその他添加物を細胞懸濁液に加え、混合物を遠心分離する。ペレットをエタノール中に再懸濁させ、塩を加えることにより核酸を沈殿させる。
【０００８】
上記ＲＮＡ単離方法の煩雑な多工程が、臨床実務においてＲＮＡの使用を複雑にしている。単離方法はリボヌクレアーゼのようなヌクレアーゼによってＲＮＡが分解される前に、細胞中のタンパク質やＤＮＡからＲＮＡを単離する困難さを克服しなければならない。このようなヌクレアーゼは保護されていないＲＮＡを急速に分解するのに十分な量が血液中には存在する。細胞からＲＮＡを単離する好首尾な方法は、それゆえ、リボヌクレアーゼによる分解を防止する能力が必要である。多くの分析やその後に続く工程へ用いることができるＲＮＡの加水分解および分解を最小とする生体試料からのＲＮＡの迅速、簡易な単離方法が望まれている。
【０００９】
発明の概要
一形態おいては、本発明は、ＲＮＡの回収を促進させるためのＡｇｅｎｔ（以降Ａｇｅｎｔ）および固相結合材料の使用を伴う、細胞培養物を含む生体試料からの促進された新規ＲＮＡ単離方法を提供する。Ａｇｅｎｔは多価の電荷を有する化合物を含むことができる。Ａｇｅｎｔはさらに、第４級オニウム化合物を含むことができる。
【００１０】
他の形態においては、生体試料からＲＮＡを単離、精製するためのキットであって、ここに記載されているように、少なくともＡｇｅｎｔと固相結合材料を含むキットを提供することにある。
【００１１】
発明の詳細な説明
定義
アルキル基  −  １〜２０個の炭素原子を有する分岐、直鎖または環状炭化水素基であり、水素原子以外の１以上の置換基で置換されていてもよい。ここで使用されるような低級アルキル基は、炭素原子を８個まで有するアルキル基を意味する。
【００１２】
アラルキル基  −  アリール基で置換されたアルキル基である。
【００１３】
アリール基  −  １〜５個の炭素環式芳香環を有する芳香環含有基であり、水素原子以外の１以上の置換基で置換されていてもよい。
【００１４】
生体物質  −  全血、抗凝固処理全血、組織、細胞、細胞含有物、細胞外の核酸、およびウイルスを含む。
【００１５】
細胞物質  −  無傷の細胞または物質であり、動物、植物または細菌起源の無傷の細胞を有する組織を含む。
【００１６】
細胞核酸含有物  −  細胞物質の中に見られる核酸を意味し、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスやプラスミドを含む伝染性物質からのその他核酸であってもよい。
【００１７】
磁性粒子  −  外部磁場に対して反応する粒子、微粒子、又はビーズである。粒子自体が磁性、常磁性、超常磁性であってもよい。超常磁性材料または強磁性材料を用いる場合のように、外部磁石かまたは印加磁場に引き付けられてもよい。粒子は磁性的に反応する固体コア部を有し、また、１以上の非磁性的反応層に覆われていてもよい。あるいはまた、磁性的に反応する部分は周囲の層であってもよく、または、非磁性的に反応するコア内に配置された粒子であってもよい。
【００１８】
オリゴマー、オリゴヌクレオチド  −  ここで用いられる化合物は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合および５’−末端モノホスフェート基を有する化合物が該当する。ヌクレオチドは、通常生ずるリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＵまたはデオキシリボヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴであってよい。
【００１９】
核酸  −  ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ等の合成ＤＮＡ類似体であってよい。これら３つのいかなるタイプの鎖の一本鎖化合物および二本鎖ハイブリッドもまた、この用語の範囲内である。
【００２０】
解離、溶離  −  溶液または組成物と接触させることにより、固相材料の表面または細孔と結合した材料の実質的な部分を除去することである。
【００２１】
ＲＮＡ  −  メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含む。
【００２２】
試料  −  核酸を含むかまたは含んでいる可能性のある液体である。本発明の方法において使用可能である代表的な試料は、採取した血液検体に通常見られるように凝固を阻止したものでもよい血液、血漿、漿液、尿、精液、唾液、細胞培養物、組織抽出物等を含む。他のタイプの試料には、溶剤、海水、工業用水試料、食品試料、並びに、環境試料、例えば、土壌または水、植物材料、原核生物、真核生物、細菌、プラスミド、およびウイルス由来の細胞等が含まれる。
【００２３】
固相材料  −  核酸分子を引き寄せ得る表面を有する材料である。この材料は、粒子、微粒子、ナノ粒子、繊維、ビーズ、メンブラン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）、フィルターおよびテストチューブやマイクロウェル（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ）等の他の支持体の形態を有していてよい。
【００２４】
置換  −  １つの基内における少なくとも１個の水素原子を、非水素基により置換することを意味する。置換基に関しては、明確に他のことを示している場合を除き、置換基が複数となる点が存在し得ることを意味することに留意すべきである。
【００２５】
１．本発明のＲＮＡ分離方法
本発明は先に定義したＡｇｅｎｔと固相結合材料を用いた、他の従来の方法と比較して重大な利点をもたらす、生体試料からの促進されたＲＮＡ単離方法を提供する。本出願人の２００５年３月２日出願の同時継続の米国特許出願、出願番号Ｎｏ．１１／０６１，９８４、は生体物質試料から核酸を迅速に単離するための固相結合材料を開示している。本出願人は、核酸の固相への結合に先立ち、または同時に、特定の化合物（Ａｇｅｎｔｓ）を試料に添加することにより、生ずるＲＮＡの量が増加することにより、かつ／または、ＲＮＡがゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡのような他の形態のＤＮＡから選択的に単離されることにより、ＲＮＡの単離が促進されるということを見出した。本発明の方法はこれらのＡｇｅｎｔｓの使用に依存し、これらＡｇｅｎｔｓは以下の実施例で示すように、例えば、ウイルス、細胞、完全な細胞を含む組織からＲＮＡを予期せぬほど効果的に遊離する。
【００２６】
ＲＮＡは本発明の手順に従い、ウイルス、細胞溶解物、組織ホモジネートのような生体液から単離、精製される。一般的な試料には細菌培養物、即ち細菌培養ペレット、血液、尿、細胞、および組織または細胞の溶解物が含まれるが、これに限定されるものではない。本発明の方法は、他の予備的処理を施したか否かにかかわらず、溶解物または完全な細胞、および組織、例えば、培養した細菌、植物または動物細胞株および組織を含む試料に適用することができる。特に、予備的な超音波破壊、または溶解およびエタノール沈殿を施された核酸、または中〜高濃度のグアニジニウム塩溶液による溶解によって得られた核酸を本発明の出発点として利用できる。あるいは、予備的な破壊や溶解を全く必要としない。懸濁液中の細胞からのＲＮＡの精製、即ち、生体液または細胞培養物からのＲＮＡの精製は、例えば、低速度遠心分離による細胞のペレット化および溶媒の除去から始めることができる。ＲＮＡはハンドホモジナイザーもしくはオートホモジナイザー、例えば、ワーリングブレンダー（Ｗａｒｉｎｇ  Ｂｌｅｎｄｅｒ）、またはその他組織ホモジナイザーを用いてホモジナイジングすることにより、完全な組織または臓器から精製してもよい。ホモジネートは、例えば、チーズクロスのような目の粗い濾過器にかけて粗大粒子状物質を除き、または大きい粒子状物質を低スピード遠心分離により分離して調製してもよい。
【００２７】
本発明の方法は、もし必要であれば上記のようにして調整した生体試料を本発明のＡｇｅｎｔ溶液と混合する。試料と本方法におけるＡｇｅｎｔの接触は試料中の細胞の溶解、および核酸とのその他相互作用を促進ことができる。ＲＮＡは同時にまた連続的に固相材料に吸着または結合する。ＲＮＡはさらに、汚染物質を除去するためにＲＮＡを含有する固相を洗浄することによりさらに単離される。最終的に、ＲＮＡは溶離試薬とともに溶出することにより固相から遊離される。全ての工程を遠心分離機のような特殊な設備を用いることなく、単一容器、または単一坦持体で迅速に連続して行うことができる。本方法は多数試料を連続的、並行的に処理をする全自動装置に適用することができる。
【００２８】
本発明の方法は、生体試料からのＲＮＡを抽出する簡易方法を提供する。本発明の方法は迅速で、通常、数分のうちに完了する。特に、本方法により得られたＲＮＡは、臨床またはその他下流での使用、例えば、逆転写酵素の使用に続く、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、クローニング、増幅、ＲＮＡブロット分析、インビトロトランスレーション（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）に用いることができるほど高純度である。優れたことに、この方法を用いる前に細胞を単離する必要がなく、この方法を実施するためには簡易な設備のみが必要である。本方法によれば、試料の処理に先立ち、予備溶解やエタノール沈殿は必要ない。
【００２９】
本発明の実施においては、選択した生体試料、例えば、細胞培養物のペレット化した一部をここに記載したＡｇｅｎｔ溶液とすばやく混合する。一般に、細菌培養物をペレット化した試料を用いた場合、培養物１ｍＬ〜５ｍＬから採取したペレットを１ｍＬのＡｇｅｎｔ溶液に再懸濁させる。培養物、ペレット、およびＡｇｅｎｔ溶液の量は所定の実験で定めて用いることができる。ペレットとＡｇｅｎｔは混合して数秒から５分程度接触させるだけでよい。その他の処理は不要である。
【００３０】
混合物生成のための選択時間後、固相に加える。上澄みを除去し、核酸を有する固相を任意に洗浄液にて洗浄する。その後、ＲＮＡを可溶化し、固相から解離させるために固相を溶出する。１実施形態として、界面活性剤／ＲＮＡ錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）からＲＮＡを溶出するためにアルカリ溶液が用いられる。代表的には、本目的に適した好適なアルカリ濃度は約１ｍＭから１Ｍである。
【００３１】
アウリントリカルボン酸、ＤＴＴまたはＤＥＰＣのようなリボヌクレアーゼ阻害剤を抽出溶媒に任意に添加することにより、抽出されたＲＮＡの質と量は、また高められる。その他リボヌクレアーゼ阻害剤は当業者により目的に応じて選択することができる。
【００３２】
本発明の実施に先立って試料にいかなる予備的な細胞破壊または溶解を施す必要はないが、本方法はそのような処理がなされた核酸溶液に適用することができる。即ち、前処理を施した２段階工程はここに記載された発明の方法の範囲内である。かかる前処理には、細胞の溶解、またはＲＮＡの安定化、または、例えばグアニジニウム塩のようなカオトロピック剤であるリボヌクレアーゼ酵素の不活性化を促進する物質の使用が含まれる。
【００３３】
２．本発明のＡｇｅｎｔ
本発明において、添加剤として有用な物質は、生体物質試料を復元するために使用した場合、水または緩衝培地を試料復元に用いた単離と比較すると、生体物質試料からＲＮＡを効率良く、または選択的に単離する物質または化合物からなる。本発明のＡｇｅｎｔとして機能する物質は、好ましくは少なくとも２個の帯電した基を有する多価の化合物より選ばれる。より好ましくは、電荷は永久であり、ｐＨの変動の結果ではない化合物である。Ａｇｅｎｔの例としては、米国特許５，４５１，３４７号に記載されている２価の陽イオン化合物があり、ホスホニウムおよびアンモニウム塩の２価の陽イオン（ｄｉｃａｔｉｏｎｉｃ）界面活性剤を含む。本発明の実施には以下の構造を有するものが有用である。
2008536513.tif 000003
ここでＡはＰまたはＮ原子であり、Ｌｉｎｋは２以上の炭素原子を有する置換されたまたは置換されていないアリール基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基からなる群から選ばれた有機スペーサー基であり、ここでＬｉｎｋはヘテロ原子を含んでいてもよく、Ｒは炭素数が１から２０の低級アルキル基またはアラルキル基から選ばれ、Ｘは陰イオンである。特定のリンまたは窒素原子に結合しているＲ基は全て同じでもよく、二つの異なった基でもよく、全てが異なった基であってもよい。同じ分子中の隣接するリンまたは窒素原子に結合しているＲ基の群は同じ組み合わせでもよく、または異なった組み合わせでもよい。ここで組み合わせは上記記載に従う。２価陽イオン化合物の典型的な群は次の式で表される。
2008536513.tif 000004
ここで置換基は、オルト、メタ、パラ配向でもよく、Ａ１とＡ１は窒素原子またはリン原子から独立に選ばれ、各々のＲは独立した炭素数１から２０のアルキル基またはアラルキル基であり、Ｘは陰イオンである。この群の代表的な化合物は同一出願人の米国特許５，４３９，６１７号において、１−２３に示された化合物を含む。
【００３４】
その他の典型的な２価陽イオン化合物は以下の式で表される。
2008536513.tif 000005
ここで、Ａ１とＡ１は窒素原子またはリン原子から独立に選ばれ、Ｌｉｎｋは炭素数が２以上の置換されたまたは置換されていないアルキル基、アルケニル基、アルキニル基からなる群から選ばれた有機スペーサー基であり、各々のＲは炭素数１から２０のアルキル基またはアラルキル機から独立に選ばれ、Ｘは陰イオンである。この群の代表的な化合物は同一出願人の米国特許５，４３９，６１７号において、２４−２７に示されている化合物を含む。ここで、Ｌｉｎｋはアルキレン基である。
【００３５】
その他のＡｇｅｎｔの典型的な群は、ポリマーの骨格部またはペンダント基が電荷を有しているポリマーからなる。典型的なポリマー群は以下の式で表される。
2008536513.tif 000006
ここでＡはリン原子および窒素原子から選ばれ、それぞれのＲは炭素数が１から２０の低級アルキルまたはアラルキルであり、ｎは約１０から１０００の間の整数である。特定のリン原子または窒素原子に結合しているＲ基は全て同じ基でも、二つの異なった基でも、３つ全てが異なった基でもよい。隣接するリンまたは窒素原子に結合しているＲ基の組み合わせは同じ組み合わせでもよく、また異なった組み合わせでもよい。ここで組み合わせは上記記載に従う。芳香環上の置換基の相対的な位置はオルト、メタ、パラまたはいかなる割合の三つの混合でもよい。典型的な重合化合物は同一出願人の米国特許５，３９３，４６９号に記載されている。
【００３６】
その他のＡｇｅｎｔの典型的な群は、直鎖、分岐オリゴマーまたはデンドリマー高分子化合物（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ  ｐｏｌｙｉｏｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）である。
【００３７】
上記典型的な単量体および重合体のＡｇｅｎｔ中の陰イオンには、ハロゲン化物、特に塩化物、臭化物およびヨウ化物、水酸化物、ナイトレート、スルフェイト、ホスフェート、アルキル、およびホルメート（ｆｏｒｍａｔｅ）、アセテート、プロピオネート、ベンゾエートのようなアリールカルボキシレート、オキサレート、マロネート、スクシネート（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を含むジカルボキシレート、およびその他シトレート（ｃｉｔｒａｔｅ）のようなポリカルボキシレートがある。
【００３８】
ＲＮＡ単離に関する本発明の方法の使用において、ＡｇｅｎｔはＲＮＡ単離を促進するのに効果的な濃度の水溶液である。有用な濃度は、一般に、高濃度から低濃度までの範囲が１０以上の範囲である。この範囲の境界は以下の具体的な実施例において詳細に記載された方法を用いることにより、容易に経験的に決定することができる。具体的な有効な条件は実施例中にて明らかにされる。Ａｇｅｎｔの水溶液はＲＮＡ分解を阻害するのに有効な量のリボヌクレアーゼ阻害物質を任意に含ませることができる。ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）は一般的なリボヌクレアーゼ阻害剤である。２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールを含むメルカプタン化合物もまた既知のリボヌクレアーゼ阻害物質である。
【００３９】
３．固相物質
試料をＡｇｅｎｔで処理するため促進されたＲＮＡ回収率を示す本発明のＲＮＡ単離方法は、ＲＮＡを結合させる固体担体を用い、その他の試料成分からＲＮＡを単離する。本発明のＡｇｅｎｔにより処理された試料のＲＮＡと結合することができるいかなる固体基質（ｓｏｌｉｄ  ｍａｔｒｉｘ）を使用してもよい。本発明の方法における核酸結合材料は、大きさ、形状、多孔度、機械的性質に特徴がある基質を含み、粒子、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、およびテストチューブやマイクロウェルのような他の支持体の形態でよい。好適な固相材料には、シリカ、ガラス、焼結ガラス、制御ポアガラス、焼結ガラス、アルミナ、ジルコニア、チタニア、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類、および金属、金属酸化物、金属硫化物から選ばれた金属材料、並びにシリカ、ガラス、合成ポリマーまたは不溶性多糖類でコーティングされた磁性反応材料がある。典型的な材料には、細胞を粉砕して核酸を誘引する表面官能基でコーティングされまたは共有結合したシリカベース材料がある。また、好適に表面を官能化された炭水化物ベース材料、およびこの表面官能性を有する重合材料も含まれる。多くの具体的な材料およびそれらの調製は、本出願人により出願中の、米国出願番号１０／７１４，７６３号、１０／７１５，２８４号、１０／８９１，８８０号、１０／９４２，４９１号、６０／６３８，６３１号および１１／０６１，９８４号明細書に記載されている。
【００４０】
一実施形態として、材料はさらに表面上または表面付近に様々な長さの核酸分子を捕捉、結合する共有結合した核酸結合部を有する。表面付近とは固相材料の外表面だけではなく、固相材料内の接近可能ないかなる細孔部の表面をも意味する。
【００４１】
他の実施形態として、材料はさらに表面上または表面近くに様々な長さの核酸分子の捕捉、結合をする非共有的に会合した核酸結合部を有する。非共有会合した核酸結合部は、固体基質と表面上の反対荷電残基と静電気引力、または表面の疎水性引力により会合している。
【００４２】
共有結合または非共有結合により結合した核酸結合基を有するこれら材料の基質材料はいずれも適した物質となりうる。好適な基質材料はシリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類および金属、金属酸化物、金属硫化物から選ばれる金属材料、並びにシリカ、ガラス、合成ポリマー、不溶性多糖類でコーティングされた磁性反応材料より選ばれる。典型的な材料には、細胞を粉砕して核酸を誘引する表面官能基でコーティングされ、または共有結合したシリカベース材料が含まれる。また、好適に表面を官能化された炭水化物ベース材料、およびこの表面官能性を有する重合材料も含まれる。核酸結合基として機能する表面官能基は、細胞の構造的完全性を破壊し、固体支持体に核酸をひきつける能力を有するいかなる基も含む。かかる基は、限定はされないが、ヒドロキシル基、シラノール基、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、４級アンモニウムおよびホスホニウム塩並びに以下に記載される３級スルホニウム塩型の材料が含まれる。結合のために最初の低ｐＨでプロトン化され、かつ、結合する核酸を解離する次の高ｐＨで脱プロトン化されるアミノ基を有する固相材料、例えば、欧州特許ＥＰ０１０３６０８２Ｂ１号明細書に開示されている材料は、本発明において有用な固相材料の範囲内であると考えられる。
【００４３】
多くの用途のために、固相材料は粒子状であることが好ましい。好ましくは約５０μｍ未満の粒子であり、より好ましくは約１０μｍ未満の粒子である。小さい粒子は、より速く溶液中に分散され、高い表面／体積比を有する。大きな粒子およびビーズもまた、重力沈降または遠心分離を使用する方法で有用である。
【００４４】
さらに、固相は好ましくは磁性反応部分を含んでいてもよく、この部分は通常、常磁性、または超常磁性の微粒子の形態であり、粒子は磁場により誘引され、操作することができる。かかる磁性微粒子は磁性金属酸化物または金属硫化物のコアを有し、それらは一般に吸着的または共有結合した層により覆われていて、磁性成分を遮蔽している。核酸結合基はこの層と共有結合することができ、これにより表面を覆っている。磁性金属酸化物コアは、好ましくは酸化鉄または硫化鉄であり、ここで鉄はＦｅ２＋、Ｆｅ３＋または両方である。有機高分子層により覆われている磁性粒子は、米国特許４，６５４，２６７号、５，４１１，７３０号、５，０９１，２０６号および出版物（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ｌｅｔｔ．，４０（１９９９），８１３７−８１４０）において開示されている。
【００４５】
市販されている磁性シリカまたは磁性重合粒子を、本発明における有用な磁性固相結合材料の調製の出発物質として用いることができる。表面カルボキシル基を有する重合粒子の好適な例として、商品名ＳｅｒａＭａｇＴＭ（ｓｅｒａｄｙｎ）やＢｉｏＭａｇＴＭ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が知られている。シリカ磁性粒子の好適な例として、商品名ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が知られている。表面にカルボキシ基またはアミノ基を有するシリカ磁性粒子はＣｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ  （Ｂｅｒｌｉｎ）を用いることができる。
【００４６】
本出願人は、本発明における磁性反応粒子状結合材料を、コーティングされていない、またはコーティングされた金属コアと、核酸結合（ＮＡＢ）部と結合している有機結合基とを結合することにより調製した。コーティングされた金属コアを使用するに際し、好適なコーティングされたコアはシリカコーティングされた磁性コアか、またはガラスコーティングされた磁性コアである。好適な磁性反応金属コアはマグネタイト、Ｆｅ３Ｏ４より得られる。マグネタイトは市場において入手可能であり、また、通常知られている方法により塩基溶液中での鉄（ＩＩ）および鉄（ＩＩＩ）塩の反応により得ることができる。
【００４７】
１つの末端にトリアルコキシシラン基を有している結合基は、シリカまたはガラス−コーティング磁性粒子等のコーティングされた金属材料または金属材料の表面に結合させることができる。好適なトリアルコキシシラン化合物は、構造式Ｒ１−Ｓｉ（ＯＲ）３を有し、ここでＲは低級アルキル基であり、また、Ｒ１は、直鎖、分岐鎖および環から選択される有機基であって、１〜１００個の原子を含む。この原子は、好ましくは、Ｃ、Ｈ、Ｂ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｐ、ハロゲンおよびアルカリ金属から選択される。典型的なＲ１基は、３−アミノプロピル、２−シアノエチルおよび２−カルボキシエチル、並びに、以下により詳細に記載したような開裂可能な部分を有する基である。好適な実施形態として、トリアルコキシシラン化合物は、開裂可能な中央部分と反応基末端部分を有し、ここで反応基は１つの工程で、３級アミン、３級ホスフィンまたは有機硫化物との反応により、４級または３級オニウム塩に転化されうる。かかる結合基はフッ化物イオンを用いる工程において金属粒子およびガラスまたはシリカコーティング金属粒子の表面に導入することができる。この反応は、低級アルコールおよびトルエン等の芳香族溶剤を含む有機溶媒中で行うことができる。好適なフッ化物源は、かかる有機溶剤中で十分な溶解性を有し、セシウムフルオライドおよびテトラアルキルアンモニウムフルオライド塩等が挙げられる。
【００４８】
本発明の方法に有用ないくつかの固相結合材料に含まれているＮＡＢ基は二つの役割を果たす。ＮＡＢ基は様々な長さおよび塩基組成または配列を持つ核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを引き寄せ結合する。これらはまた、核酸を細胞性エンベロープ（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ）から遊離させる若干の能力において役立たせることができる。核酸結合基には、例えば、カルボキシル基、アミン基および３級または４級オニウム基、またはこれらの基の２以上の混合が含まれる。アミン基は、ＮＨ２、アルキルアミン基およびジアルキルアミン基であってよい。好適なＮＡＢ基は、４級トリアルキルアンモニウム基（−ＱＲ３＋）、トリアルキルホスホニウム若しくはトリアリールホスホニウムまたは混合アルキルアリールホスホニウム基を含むホスホニウム基（−ＱＲ３＋）、および３級スルホニウム基（−ＱＲ２＋）を含む３級または４級オニウム基である。固相は、ここに記載されているような核酸結合基の２種以上を含んでもよい。３級、または４級オニウム基、−ＱＲ２＋または−ＱＲ３＋、（式中、Ｒは少なくとも４個の炭素を有するアルキル基）を有する固相材料は、核酸の結合において特に有効であるが、炭素数１のアルキル基もまたアリール基と同様に有効である。かかる固相材料は、結合核酸を強固に保持し、かつ、従来技術において公知の溶離のために使用される大抵の条件下で、核酸の除去または溶離に耐える。低および高イオン強度の両方の大抵の公知の溶離条件は、結合核酸の除去において効果的でない。ＤＥＡＥおよびＰＥＩ基を含む慣用のアニオン交換樹脂とは異なり、３級または４級オニウム固相材料は、反応媒体のｐＨに関わらず、正に帯電されたままである。
【００４９】
いくつかの実施例では、選択的に切断されうる結合を介してＮＡＢ基が基質に結合する固相結合材料が用いられる。効果的に結合が開裂することによって固相からいかなる核酸をも切り離される。結合は化学的、酵素的、光化学的または選択的に結合を開裂するその他の方法により切断されが、目的の核酸を破壊することはない。かかる開裂可能な固相材料は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類、および、金属、金属酸化物、金属硫化物から選択される金属材料から選択される基質を含む固体支持体部分よりなる。核酸を引き付け、結合する核酸結合（ＮＡＢ）部は開裂可能な結合部分により固体支持体の表面に結合している。
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【００５０】
好適な実施形態において、ＮＡＢは上述したように一般式ＱＲ２＋Ｘ−で表される３級オニウム基、またはＱＲ３＋Ｘ−で表される４級オニウム基である。
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【００５１】
開裂可能な結合部分は、好ましくは、直鎖、分岐鎖および環から選択される有機基であり、１〜１００個の原子を含む。この原子は、好ましくは、Ｃ、Ｈ、Ｂ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｐ、ハロゲンおよびアルカリ金属から選択される。典型的な結合基は加水分解により開裂可能な基であり、これは加水分解により開裂する。カルボキシルエステルおよび無水物、チオエステル、カルボネートエステル、チオカルボネートエステル、ウレタン、イミド、スルホンアミド、およびスルホンイミドがスルホネートエステルのように代表的である。好適な実施形態において、開裂可能な結合はアルカリ水溶液で処理される。他の典型的な結合基の種類は、エタンチオール、メルカプトエタノール、およびＤＴＴなどのチオールにより開裂されるジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合などの還元開裂を受ける基である。他の典型的な基は、過酸化（Ｏ−Ｏ）結合を含んでいる有機基である。過酸化結合は、チオール、アミンおよびホスフィンにより開裂可能である。
【００５２】
他の代表的な基は、光化学的に開裂可能な結合基であって、例えば、ニトロで置換された芳香族のエーテル及び下記式のエステルである。
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ここで、Ｒｄは、Ｈ、アルキル基またはフェニル基である。オルト−ニトロベンジルエステルは、以下のよく知られた反応により紫外光により開裂する。
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【００５３】
他の代表的な開裂可能な基は、酵素的に開裂可能な結合基である。典型的な基には、エステラーゼおよび加水分解酵素により開裂可能なエステル、プロテアーゼおよびペプチダーゼにより開裂可能なアミドおよびペプチド、グリコシダーゼにより開裂可能なグリコシド基が含まれる。
【００５４】
他の代表的な開裂可能な基は、開裂可能な１，２−ジオキセタン部分である。かかる材料は、熱分解されうるか、または化学反応もしくは酵素剤により断片化されうるジオキセタン部分を含む。オキシアニオンを生成するための保護基の除去は、ジオキセタン環の分解を促進する。断片化は、過酸化Ｏ−Ｏ結合の開裂により、Ｃ−Ｃ結合と同様に、よく知られたプロセスに従っておこる。開裂可能なジオキセタンは、非常に多くの特許および出版物に記載されている。代表的な例には、米国特許４，９５２，７０７号、５，７０７，５５９号、５，５７８，２５３号、６，０３６，８９２号、６，２２８，６５３号および６，４６１，８７６号明細書がある。
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【００５５】
あるいはまた、結合したオニウム基はアリール基Ａｒに、または、開裂可能な基Ｙに結合可能である。さらにまた、固相および３級または４級オニウム基との結合は、図示する配置とは逆である。
【００５６】
他の開裂可能な結合基は、不安定な１，２−ジオキセタン部分に転化されうるエレクトロンリッチＣ−Ｃ二重結合である。二重結合における少なくとも１個の置換基は、Ｏ、ＳまたはＮ原子を用いて二重結合と結合する。エレクトロンリッチ二重結合と一重項酸素との反応により、不安定な１，２−ジオキセタン環基が生成され、このジオキセタン環基は、周囲温度にて自発的に断片化して、２つのカルボニル断片を生成する。エレクトロンリッチ二重結合から生成される不安定なジオキセタンは、Ａ．Ｐ．ＳｃｈａａｐおよびＳ．Ｄ．Ｇａｇｎｏｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｍ．Ｓｃｏ．，１０４，３５０４−６（１９８２）；Ｗ．Ａｄａｍ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１１６，８３９−４６，（１９８３）；米国特許５，７８０，６４６号明細書によって例示される非常に多くの特許および出版物に記載されている。
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【００５７】
開裂可能部分として開裂可能な結合基を有する固相材料の他の群は、米国特許６，８５８，７３３号および６，８７２，８２８号で明らかにされているようにケテンジチオアセタールを有する。ケテンジチオアセタールはペルオキシダーゼ酵素や過酸化水素による酵素的酸化によって二重結合の酸化開裂を受ける。
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開裂可能な部分は図示するような構造を有し、アクリダン環（ａｃｒｉｄａｎ  ｒｉｎｇ）  上に置換基を有する類似体も含む。ここで、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは有機基であって、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉおよびハロゲンから選ばれた１から約５０個の水素以外の原子を含み、ＲａとＲｂは環を形成するために結合してもよい。当業者にとっては、その他多くの開裂可能な基が明らかであろう。この種の化合物を開裂可能な結合基として用いるために、Ｒｃは固相と結合していてもよく、その際、Ｒａおよび／またはＲｂはＮＡＢ基と結合し、あるいはまたはその反対でもよい。かかる化合物は米国特許６，１２６，８７０号に開示されているように単純にかつ迅速に化学酸化プロセスにより開裂可能である。
【００５８】
好適な実施形態において、固相は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類、およびこれら基質の磁性反応物から選択される基質、並びに、式ＱＲ２＋Ｘ−（ここでＲはＣ１−Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択される）で示される３級スルホニウム基、式ＮＲ３＋Ｘ−（ここでＲはＣ１−Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択される）で示される４級アンモニウム基および式ＰＲ３＋Ｘ−（ここでＲはＣ１−Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘは陰イオンである）で示される４級ホスホニウム基から選択される基質の表面に結合したオニウム基を含む。
【００５９】
４．本発明の溶出試薬
本発明の方法では、固相材料と、結合しているＲＮＡを溶離液に溶出させるための試薬とを接触させることによりＲＮＡを溶出させる。この溶液は、解離した核酸を溶解して、かつ、十分に保護する必要がある。一好適形態において、溶液は、ｐＨ約７〜９である緩衝水溶液を含む試薬組成物であり、任意に０．１〜３Ｍの緩衝塩、金属ハライドあるいは酢酸塩を含んでいてもよく、任意に０．１〜５０％の有機共溶媒または界面活性剤を含んでいてもよい。
【００６０】
他の形態において、固相結合材料から核酸を遊離させるための試薬は、固相結合材料中に存在する開裂可能な結合の開裂後にそのように作用する。好適な試薬は強アルカリ溶液である。少なくとも１０−４Ｍの濃度のアルカリ金属水酸化物または水酸化アンモニウムの溶液は、開裂および開裂した固相からの核酸の溶離に有効である。強アルカリ溶液は、共有結合の切断により断片化または開裂されうる基を介して核酸結合部が基質に結合する固相結合材料と併用するのがよい。かかる材料は、上記、および前述の出願中の米国出願番号１０／７１４，７６３号、１０／７１５，２８４号１０／８９１，８８０号、および１１／０６１，９８４号明細書に記載されている。典型的な材料は開裂可能なエステルまたはチオエステル結合基を有し、これらは４級ホスホニウム基のような核酸誘引オニウム基と結合している。
【００６１】
解離工程は室温で実施することができるが、都合のよいいかなる温度も使用することができる。溶離温度は、核酸を単離する本方法の首尾に対して重要ではない。周囲温度が好ましいが、場合によっては、高温により溶離速度を高めることができる。
【００６２】
５．本発明のキット
１以上の上記Ａｇｅｎｔ溶液を固相材料および溶離試薬とともに生体試料からのリボ核酸の単離用キットにすることができる。任意に、上述の特定された付加的な精製工程を行うための試薬もまた、本方法の迅速な実施のためにキットに含めてもよい。かかる単離方法に従来用いられている他の構成成分もまた、キットに含めてもよい。
【００６３】
本発明において、試料からＲＮＡを単離するキットには、例えば、遊離物質として、即ち水溶液のような溶液として下記式のＡｇｅｎｔと、実施例２記載のホスホニウム置換材料のような固相材料と、５０ｍＭのＮａＯＨ含有溶離液試薬と、１０ｍＭ、ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液のような任意の洗浄緩衝液に溶離試薬とを含有させることができる。
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【実施例】
【００６４】
実施例１
４’−ヒドロキシフェニル４−クロロメチル−チオベンゾエートの合成
３Ｌのフラスコに１００．９ｇの４−クロロメチル−安息香酸と１．２Ｌの塩化チオニルを入れた。反応では４時間還流し、その後、塩化チオニルを減圧下で除去した。塩化チオニル残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２の添加、および減圧下での蒸発により除去した。
【００６５】
１１３．１ｇの４−クロロメチル安息香酸クロライドの入った３Ｌフラスコに、９８．１７ｇの４−ヒドロキシ−チオフェノールと１．５ＬのＣＨ２Ｃｌ２を加えた。アルゴンでパージし、６７．７５ｍＬのピリジンを加えた。一晩攪拌後、反応混合物を１ＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、全量５Ｌの水で抽出した。水相はＣＨ２Ｃｌ２で逆抽出した。混合したＣＨ２Ｃｌ２溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、固形物になるまで濃縮した。固形物を５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、ろ過し、風乾した。１Ｈ  ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）：δ４．８０９（ｓ，２Ｈ），６．９４６−６．９６８（ｄ，２Ｈ），７．３２３−７．３４６（ｄ，２Ｈ），７．６４３−７．６６４（ｄ，２Ｈ），８．００４−８．０２５（ｄ，２Ｈ）
【００６６】
実施例２
トリブチルホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を含有し、ポリメタクリレート結合部分により官能化された磁性シリカ粒子の合成
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【００６７】
磁性カルボン酸により官能化されたシリカ粒子（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ社，ＳｉＭＡＧ−ＴＣＬ，１．０ｍｅｑ／ｇ，１．５ｇ）を２０ｍＬの塩化チオニル中にいれ、４時間還流した。過剰の塩化チオニルを減圧下で除去した。樹脂を２５ｍＬのＣＨＣｌ３に再懸濁し、懸濁液を超音波により分散させた。溶媒を蒸発させ、超音波洗浄処理を繰り返した。粒子をさらなる使用のため、減圧下で乾燥させた。
【００６８】
酸塩化物により官能化された粒子を３８８ｍｇのジイソプロピルエチルアミンと共に３８ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中で懸濁した。４’−ヒドロキシフェニル４−クロロメチルチオベンゾエート（５２４ｍｇ）を加え、密閉反応フラスコ中で一晩振盪機にて振盪した。粒子を５０ｍＬのプラスチック製試験管に移し、磁性分離にて、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨ３ＯＨ、１：１  ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、次いでＣＨ２Ｃｌ２で繰り返し洗浄した。未反応の可溶性出発材料の除去のため、洗浄液をＴＬＣにてモニターした。さらなる使用の前に、固形物を風乾した。
【００６９】
アルゴン雰囲気中で、樹脂（１．２３３ｇ）を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁した。トリブチルホスフィン（３９５ｍｇ）を加え、スラリーを７日間振盪した。粒子を５０ｍＬのプラスチック製試験管に移し、４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、次いで４０ｍＬのＭｅＯＨで４回、４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回洗浄した。次いで、樹脂を風乾し、１．１７ｇのライトブラウンの固形物を得た。
【００７０】
実施例３
核酸単離に用いるＡｇｅｎｔ化合物
次の構造を有し
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かつ化合物１として示される化合物を、核酸の結合および遊離の効果について評価した。化合物１の調製は米国特許５，４３９，６１７号に記載されている。
【００７１】
化合物２および３は米国特許５，３９３，４６９号に記載されているとおりに調製した。
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化合物２：Ｒ＝ｎ−ブチル；化合物３：Ｒ＝３：１比のｎ−ブチルおよびｎ−オクチル；Ｘ＝Ｃｌ；置換は主にパラ位である。
【００７２】
実施例４
本発明におけるウイルス核酸の回収
２μｇのＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ、ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡ、またはルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ＲＮＡを脱イオン水（コントロール）２００μＬに、または１ｍｇ／ｍＬ（０．１％）の化合物１溶液２００μＬに溶解させた。各溶液２００μＬに実施例２の粒子１ｍｇを添加し、３０秒間ボルテックスにて混合した。溶液を除去し、１０ｍＭ、ｐＨ８のＴｒｉｓ  ２００μＬで２回洗浄した。０．１ＭのＮａＯＨ  １００μＬを用いて、３７℃で５分間チューブを振り混ぜることにより、核酸を粒子より溶離した。溶出液を臭化エチジウム染色液とともに１％アガロースゲルに流し込んだ。
【００７３】
もし、リボヌクレアーゼからの生体活性を有さないとわかっている手順で処理されていなければ、脱イオン水を、リボヌクレアーゼ不活性にするために、例えば、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理するべきである。
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結合溶液に化合物１を添加することにより、ゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡの単離を妨げ、または減少させる。
【００７４】
実施例５
細菌培養物からの核酸単離の一般的手順
ＤＨ５α（Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡのみ）およびＥ．ｃｏｌｉ／ｐＵＣ１８、ＪＭ１０９株（ｓｔｒａｉｎｓ）（Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡおよびｐＵＣプラスミドＤＮＡ）を以下の実験に用いた。
【００７５】
培養物（完全に混合）１ｍＬを４℃、７０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。媒体を全てのペレットから除去した。ペレットを脱イオン水１ｍＬに再懸濁させた。懸濁液２００μＬに実施例２のビーズ１ｍｇを加え、３０秒間ボルテックスにて振り混ぜた。この溶液を除去し、ビーズを１０ｍＭ、ｐＨ８のＴｒｉｓ  ２００μＬで２回洗浄した。０．１ＭのＮａＯＨ  １００μＬを用いて、３７℃で５分間振り混ぜることにより、核酸をビーズより溶離した。溶出液を臭化エチジウム染色液とともに１％アガロースゲルに流し込み、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＴＭを用いて蛍光分析した。
【００７６】
実施例６
核酸単離用の再懸濁液／結合溶液中の塩の影響
ＤＨ５αおよびＥ．ｃｏｌｉ／ｐＵＣ１８の両培養物を用いて、ペレットの再懸濁を脱イオン水（コントロール）、および種々の既知濃度のＮａＣｌにて試験をおこなった。ＮａＣｌ濃度は１、０．５、０．２５および０．１Ｍを含む。ゲルおよび蛍光分析の結果、ＮａＣｌ濃度が高いほど、結合および溶出が低いことが示された。ゲノムＤＮＡおよびプラスミドバンドはゲル上で観察された。試験条件ではＲＮＡ単離に選択性を示さなかった。
【００７７】
実施例７
核酸単離における再懸濁液／結合溶液中の非イオン界面活性剤の影響。
ＤＨ５αおよびＥ．ｃｏｌｉ／ｐＵＣ１８培養物の両方を用いてペレットの再懸濁を脱イオン水（コントロール）、種々の既知パーセンテージのＴｗｅｅｎ−２０にて試験をおこなった。Ｔｗｅｅｎ−２０のパーセンテージは５、１、０．１、０．０１を含む。ゲルおよび蛍光分析の結果、Ｔｗｅｅｎ−２０のパーセンテージが大きいほど、より多くの核酸が洗浄過程において除去され、溶出が少ないことが示された。ゲノムＤＮＡ、プラスミドおよびＲＮＡバンドはゲル上で観察された。試験条件ではＲＮＡ単離に選択性を示さなかった。
【００７８】
実施例８
ＤＨ５α培養物からの核酸単離における再懸濁液／結合溶液中のＡｇｅｎｔの影響
化合物１の核酸の結合および遊離に対する影響を通常の手法を用いて評価した。ペレットのＤＨ５α培養物を脱イオン水（コントロール）に、または脱イオン水で調整した種々の濃度の化合物１溶液に再懸濁させた。化合物１の濃度は１、０．５、０．１、０．０１％を含む。蛍光発光はゲルと相関があるが、しかし、極めて濃い（ｉｎｔｅｎｓｅ）ＲＮＡは蛍光発光測定値を飽和している。
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【００７９】
実施例９
Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＵＣ１８培養物からの核酸単離における再懸濁液／結合溶液中のＡｇｅｎｔの影響
実施例８の手順をＥ．ｃｏｌｉ／ｐＵＣ１８培養物を用いて行った。
2008536513.tif 000020
【００８０】
実施例１０
リボヌクレアーゼＡ処理の影響
脱イオン水（コントロール）または、１ｍｇ／ｍＬの化合物１溶液中にペレットを再懸濁させ、実施例８および９の単離手順を繰り返し行った。一定量の各溶離液をリボヌクレアーゼＡ（溶離液中の最終濃度は０．０１％）で直ちに処理をした。コントロールとリボヌクレアーゼで処理した溶離液をゲル電気泳動の後分析した。リボヌクレアーゼＡで処理した試料はゲル上のＲＮＡバンドが少なくとも１０倍以上減退したことを示し、バンドがＲＮＡのものであることが確認された。
【００８１】
実施例１１
ＤＨ５α培養物からの核酸単離における再懸濁液／結合溶液中のＡｇｅｎｔの違いの影響
再懸濁液／結合溶液中で、他のＡｇｅｎｔを試験した。全ての再懸濁緩衝液は０．１％のＤＥＰＣを含有する脱イオン水で調製した。ＤＨ５α培養物を用いて上記手法に従い、ペレットを脱イオン水（コントロール）、０．１％化合物１、０．１％化合物２、０．１％化合物３、０．１％ＣＴＡＢ、０．１％臭化テトラブチルアンモニウム（Ｂｕ４ＮＢｒ）に再懸濁させた。
【００８２】
蛍光分析値によると、化合物２、化合物３およびＣＴＡＢ中の結合は残りの再懸濁緩衝液より低く、それゆえ溶出量が少なかった。
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【００８３】
実施例１２
Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＵＣ１８培養物からの核酸単離における再懸濁液／結合溶液中のＡｇｅｎｔの違いの影響
実施例１１の手順をＥ．ｃｏｌｉ／ｐＵＣ１８培養物について行った。
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【００８４】
実施例１３
ＤＨ５α培養物からの核酸単離における再懸濁液／結合溶液中のＡｇｅｎｔ濃度の違いの影響
本方法における化合物１および２の有効な濃度範囲の更なる調査を上記に従い行った。結果はＣＴＡＢを用いた同様な研究と比較した。
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【００８５】
実施例１４
Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＵＣ１８培養物からの核酸単離における再懸濁液／結合溶液中のＡｇｅｎｔ濃度の違いの影響
本方法における化合物１および２の有効な濃度範囲の更なる調査を上記に従い行った。結果はＣＴＡＢを用いた同様な研究と比較した。ＣＴＡＢの使用はＲＮＡの回収率を促進させなかった。
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【００８６】
実施例１５
培養物ペレットサイズの検討
本方法のさらなる有効性を評価するため、一般的な手順に従って種々の量の培養物を処理した。再懸濁液／結合溶液は脱イオン水に化合物１を０．５％含有している。脱イオン水１ｍＬに加工したＥ．Ｃｏｌｉ／ｐＵＣ１８培養物１ｍＬおよび、０．５％化合物１溶液１ｍＬにペレット化したＥ．Ｃｏｌｉ／ｐＵＣ１８培養物を５０μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、７５０μＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ加えて再懸濁させた。Ｆｉｇ．１に示されているゲルの結果は、これらの条件の下では培養物が２５０μＬと同程度ではＲＮＡを選択的に単離していることを明らかにしている。
【００８７】
各々の溶離液をリボヌクレアーゼＡ（０．０２％）で処理することにより、バンドがＲＮＡのものであることが確認された。
【００８８】
実施例１６
リステリアｉｎｎｏｃｕａからのＲＮＡの単離
Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を用いて実施例５に記載されている方法をＬ．ｉｎｎｏｃｕａ培養物に適用した。全てのＬ．ｉｎｎｏｃｕａ試験は実施例２記載のビーズ１ｍｇを用い、培養物１ｍＬから得たペレットはＤＥＰＣ処理した脱イオン水のウォーターコントロール、または化合物１溶液により処理した。
【００８９】
さらに、精製したＬ．ｉｎｎｏｃｕａゲノムＤＮＡの試料２μｇを水または０．５％化合物１溶液中で３０秒ボルテックスにて結合、または５分間室温にて結合させた。
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【００９０】
実施例１７
Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ培養物からの核酸単離における再懸濁液／結合溶液中のＡｇｅｎｔ濃度の差異
Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａの再懸濁溶液／結合溶液を０：００５−０．５％の範囲の化合物１溶液を用いて試験した。
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【００９１】
実施例１８
培養物ペレットサイズの検討
Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａの再懸濁溶液／結合溶液を０．００５−０．５％の化合物１溶液、および１ｍＬ、５ｍＬの培養物のペレットを用いて試験した。
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【００９２】
実施例１９
グアニジニウム塩との相溶性
ペレット再懸濁の工程にグアニジニウム塩酸塩の添加および加熱という変更を加えた実施例５の手順を繰り返した。特に、Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＵＣ１８培養物１ｍＬからのペレットを０．５％の化合物１溶液０．３３ｍＬ、および０．７ＭのグアニジニウムＨＣｌ  ０．３３ｍＬに加え、１０分間７０℃で加温した。その後、粒子上に結合する前にエタノールまたは脱イオン水０．３３ｍＬで処理した。下記表に示すように、再懸濁溶液／結合溶液中にグアニジニウムが存在しても、ＲＮＡの単離には影響を与えなかった。
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【００９３】
実施例２０
トリブチルホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル基を有し、ポリメタクリレート結合により官能化された磁性シリカ粒子の合成
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ＣＯＯＨにより官能化された出発物質０．７５ｇから調製した実施例２の官能化された粒子の酸塩化物を、０．１５ｇの１，４−ベンゼンジチオールおよび０．４０ｍＬのジイソプロピルエチレンアミンとともに４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁させた。混合物を５分間超音波処理してオービタルシェーカーで１晩攪拌した。固形物を磁性分離を利用してＣＨ２Ｃｌ２、１：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ、およびＣＨ３ＯＨで数回洗浄した。
【００９４】
前工程の粒子の混合物（約０．７ｇ）とＣＨ２Ｃｌ２  ２５ｍＬを４−クロロメチルベンゾイルクロライド０．１９ｇおよびジイソプロピルエチルアミン０．４０ｍＬで処理をした。混合物を５分間超音波処理してオービタルシェーカーで１晩攪拌した。固形物を磁性分離を利用してＣＨ２Ｃｌ２、１：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ、およびＣＨ３ＯＨで数回洗浄した。捕集した固形物を１晩風乾させた。
【００９５】
前工程の固形物（約０．６３ｇ）とＣＨ２Ｃｌ２  ２５ｍＬの混合物を０．３０ｇのトリブチルホスフィンで処理した。この混合物を５分間超音波処理してオービタルシェーカーを用いて合計で１０日間攪拌した。固形物を磁性分離を利用してＣＨ２Ｃｌ２、１：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ、およびＣＨ３ＯＨで数回洗浄した。捕集した固形物を１晩風乾させた。
【００９６】
実施例２１
人間の血液からのＲＮＡの単離
以下の手順を全血試料（Ａｃｉｄ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ｔｕｂｅｓへ採血した）からのＲＮＡの単離に用いた。
【００９７】
新鮮な採血した全血１０試料（１００μＬ）にプロテイナーゼＫ  ６０μｇおよび０．７ＭグアニジンＨＣｌ／２０％Ｔｗｅｅｎ−２０を１００μＬ添加した。各試料を１０分間室温で振り混ぜた。各試料チューブをＤＥＰＣ処理した脱イオン水で調製した０．５％化合物１溶液１００μＬで処理した。結果として得られた各溶液２００μＬに実施例２０の粒子２ｍｇを添加した。核酸を室温、５分間で結合させた。０．７ＭグアニジンＨＣｌ／１０％  Ｔｗｅｅｎ−２０／５０％ＥｔＯＨ  ５００μＬで３回、ＤＥＰＣ処理した脱イオン水２００μＬで２回洗浄した。ＲＮＡを５０ｍＭのＮａＯＨ溶液５０μＬで５分間かけて室温で溶離した。
【００９８】
この第１工程での溶離液はゲノムＤＮＡおよびＲＮＡバンドをアガロールゲル上に示した。
【００９９】
先の溶離液５個を、当該溶離液５０μＬを０．３ＭのＫＯＡｃ、０．２ＭのＨＣｌ、０．０５％の化合物１溶液各５０μＬで希釈して、２回目の結合および溶出手順に使用した。溶液を室温、５分間で実施例２０の粒子２ｍｇと結合させた。粒子を洗浄し、上記と同様に溶出させた。２回目の結合／溶出後、ゲル分析は５個の試料のうち４個の試料のみがＲＮＡバンドを示した。
【０１００】
実施例２２
培養物からのＲＮＡの単離
以下の２工程の手順をＤＨ５αおよびＥ．ｃｏｌｉ／ｐＵＣ１８からのＲＮＡ単離に用いた。
【０１０１】
よく混合した培養物の一双のうち一つの試料１ｍＬを４℃において１０分間７０００ｒｐｍにて遠心分離した。ペレットから媒体を除去し、ペレットを水または０．５％化合物１溶液１ｍＬに再懸濁させた。ペレット懸濁液２００μＬを実施例２０の粒子２ｍｇに加え、３０秒ボルテックスを用いて混合し、ＲＮＡを結合させた。粒子をｐＨ８、１０ｍＭのＴｒｉｓ２００μＬで２回洗浄し、３７℃において５分で０．１ＭのＮａＯＨ  １００μＬにて溶出した。
【０１０２】
各試料の一双の他の試料を、溶離液１００μＬをＳ３＋溶液（０．３ＭのＫＯＡｃ、０．２ＭのＨＣｌ、０．０５％の化合物１）１００μＬにより希釈して、２回目の結合および溶出手順を行った。溶液を室温、３０秒で実施例２０の粒子２ｍｇと結合させた。上記同様、粒子を洗浄し、溶出させた。第二結合／溶出後、ゲル分析は５個の試料のうち４との試料のみがＲＮＡバンドを示した。
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実施例２１、２２ともに従来の核酸抽出処理、条件による核酸の混合物を含む試料からのＲＮＡの濃縮、単離能力を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は種々の量のＥ．ｃｏｌｉ／ｐＵＣ培養物からのＲＮＡ単離を示しているゲルの写真である。５０μＬからの５ｍＬの培養物をペレットにして、０．５％の化合物１溶液１ｍＬに再懸濁させ、磁性粒子上に結合させ、ｐＨ８．０の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓで洗浄し、０．１ＭのＮａＯＨ溶液で溶出した。図１に示すゲル結果物は、これら条件下において、わずか２５０μＬの培養物でＲＮＡが選択的に単離されたことを明らかにした。それぞれの溶離液をリボヌクレアーゼＡ（０．０２％）で処理することで、バンドがＲＮＡであることを確認した。
【図１】
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【国際調査報告】
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