【事件の表示】
　特許第２７９４７２８号「核酸の検出方法」の特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２７９４７２８号の特許を維持する。
【理由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第２７９４７２８号は、昭和６３年１０月３１日に特願昭６３−２７５９２８号として出願され、平成１０年６月２６日にその特許の設定登録がなされ、その後、東洋紡績株式会社より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１１年７月２９日に訂正請求がなされたものである。
ＩＩ．訂正請求
１．訂正の内容
▲１▼特許請求の範囲の請求項１に係る記載「試料核酸の膜への固定後、この膜を０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＡ又は／及び０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＰを含有する溶液に浸して」を、「試料核酸の膜への固定後、この膜を０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＡ、又は０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＡ及び０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＰを含有する溶液に浸して」と訂正する。
▲２▼明細書７頁７行〜９行の「、あるいは、０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＰを含有する溶液（以下、ＰＶＰ溶液溶液と略する）」を削除する。
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項▲１▼は、「０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＰを含有する溶液」のみの場合を削除するものであるから特許請求の範囲の減縮に該当し、訂正事項▲２▼は、訂正事項▲１▼に伴う訂正である。
　そして、上記いずれの訂正も新規事項に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
３．独立特許要件
　当審が通知した取消理由の概要は、請求項１に係る発明は、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明であるから特許法２９条１項３号に該当し、特許を受けることができないというものであるところ、訂正された請求項１（以下、「本件発明」という。）は、後述の「ＩＩＩ．３．判断Ａ」の項に記載のように、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明であるとはいえず、また「ＩＩＩ．１．特許異議申立の理由の概要」に記載したその他の特許異議申立の理由についても、「３．判断」の項に記載のように理由がないものであるから、本件発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４，２項、及び同条３項で準用する１２６条２項から４項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
ＩＩＩ．特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要
　訂正前の本件請求項１に係る発明は、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明である、或いは、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることがでいたものであるから、特許法２９条１項３号或いは同条２項の規定により特許を受けることができない。
　　　　　　　　　記
甲第１号証：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　ＬＡＢＯＬＡＴＯＲＹ
　　　　　　　　　　　　　ＭＡＮＵＡＬ（１９８２）ｐ３２６−３２８
甲第２号証：ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ
　　　　　　　　　　　　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＯＧＹ（１９８７）
　　　　　　　　　　　　２．９．１−２．９．１０，４．９．１−４．９．８，Ａ．２．１−Ａ．２．２
２．甲各号証の記載内容
　　甲第１号証は、コロニーハイブリダイゼーション及びプラークハイブリダイゼーションに関するもので、
「４．予備洗浄液を流し出す。（ａ）１００から１５０ｍｌ、あるいは、（ｂ）６０ｍｌのプレハイブリダイゼーション溶液中で、４２℃で４〜６時間、フィルターをインキュベーションする。
　　　　　　　　　　　　・・・（略）・・・
　プレハイブリダイゼーション溶液
　５０％ホルムアルデヒド　　　　５×　Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ溶液
　５×　ＳＳＰＥ　　　　　　　　０．１％ＳＤＳ
　１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ
　　　　　　　　　・・・（略）・・・
　Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ溶液
　　　フィコール　５ｇ　ポリビニルピロリドン　５ｇ　　ＢＳＡ５ｇ　　　水５００ｍｌとする　」との記載が、
　甲第２号証には、
「プレハイブリダイゼーション溶液
　　５００ｍｌ容量：　　　　　最終濃度：
　ＩＭＫＰＯ４，ｐＨ７．４　１２．５ｍｌ　　　２５ｍＭＫＰＯ４，ｐＨ７．４
　２０×ＳＳＣ（付録２）１２５ｍｌ　５×ＳＳＣ
　１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ溶液　　５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ溶液
　　　（付録２）２５ｍｌ
　５ｍｇ／ｍｌサケ精子　ＤＮＡ５ｍｌ　　サケ精子　ＤＮＡ５０μ　ｇ／ｍｌ
　１００％ホルムアミド　２５０ｍｌ　　　　　５０％ホルムアミド
　水８２．５ｍｌ　　　　　　　最終容量へ　　　　」
「分離されたＲＮＡは、その後、ニトロセルロース膜に転写される。特異的ＲＮＡの大きさや量は、膜上に転写されたＲＮＡを標識された特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることにより求められる。」との記載がある。
３．判断
Ａ．特許法２９条１項３号について
　甲第１号証乃至甲第２号証には、プレハイブリダイゼーション処理にポリビニルピロリドン溶液を使用する記載があるが、本件発明は、「試料核酸の膜への固定後、この膜を０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＡ、又は０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＡ及び０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＰを含有する溶液に浸してブロッキング処理する」ものであって、ポリビニルピロリドン溶液を単独で使用するものではない。
　そうすると、本件発明は、甲第１号証乃至甲第２号証に記載された発明であるとはいえない。
Ｂ．特許法２９条２項について
　上述のように、甲第１号証乃至甲第２号証には、プレハイブリダイゼーション処理にＰＶＰ溶液を使用する記載があるものの、ＰＶＡ溶液を使用する記載はない。
　そして、ＰＶＰとＰＶＡとは別異の物質であり、しかも、本件明細書の記載によると、ＰＶＰ溶液単独よりも、ＰＶＰ溶液とＰＶＡ溶液とを併用したときの方がブロッキング処理の効果が高いといえるので、本件発明は、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
４．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年９月２２日（１９９９．９．２２）
【訂正の要旨】
　特許請求の範囲の請求項１中の「試料核酸の膜への固定後、この膜を０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＡ又は／及び０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＰを含有する溶液に浸して」を特許請求の範囲の減縮を目的として、「試料核酸の膜への固定後、この膜を０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＡ、又は０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＡ及び０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＰを含有する溶液に浸して」と訂正する。
　これに伴い、特許請求の範囲の記載と発明の詳細な説明の記載との整合を図るため、明りょうでない記載の釈明を目的として、明細書第７頁７行目〜９行目の「、あるいは、０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＰを含有する溶液（以下、ＰＶＰ溶液と略する）」を削除する。
（５４）【発明の名称】
核酸の検出方法
（５７）【特許請求の範囲】
（１）検体試料の核酸を膜に固定し，試料核酸の検出しようとする配列順序と実質的に相補な塩基配列を含む核酸を試料核酸とハイブリダイズさせて，試料核酸の検出を行なう方法において，試料核酸の膜への固定後，この膜を０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＡ
，又は０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＡ
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
　本発明は，特定の塩基配列を持つ核酸を検出する方法，詳しくは核酸のハイブリダイゼーションを利用する検出方法に関する。
（ロ）従来技術
　検体試料中の目的とする特定の塩基配列を持つ核酸を検出する方法として核酸のハイブリダイゼーションが利用されている。この分析法は−本鎖に変性された核酸が適当な条件下で相補的な塩基配列を含む別の一本鎖の核酸と配列に特異な水素結合を介してハイブリッドを形成する（ハイブリダイズする）ことを利用したものである。
　すなわち，ハイブリダイゼーションアッセイにおいては，既知の配列を有する核酸をプローブとして用いて，試料のなかにターゲットとなる相補的な配列がないかを調べる。プローブとターゲットによって形成されたハイブリッドに標識を付けることにより，試料中の相補的配列の検出及び定量が可能になる。
　ハイブリッドを検出するためにプローブに標識付けをする方法の一つは，プローブに放射性同位元素（例えば，３２Ｐあるいは１２５Ｉ）を結合させることである。
　しかし，安全性や安定性，また設備等の問題から非放射性標識システムの開発が進められている。
　非放射性標識システムとしては，第一のタイプとして，プローブに直接，共有結合で螢光あるいは化学発光を生ずる官能基を導入するものである。第二のタイプとしては，抗体やビオチンなどの巨大分子によって認識される部位をプローブに共有結合で導入し，螢光標識あるいは化学発光標識した巨大分子で認識し，プローブの存在を検出しようとするものである。第三のタイプとしては，第一及び第二のタイプのシステムに酵素による増幅作用を利用したものである。
　ハイブリダイゼーションアッセイは，疾患の診断に用いられることが多くそのため迅速，簡便，高感度でしかも放射性同位元素を扱うのに必要な特別の設備が不要であることが求められている。これらのことから最近では，第三のタイプの非放射性標識システムの開発が進められている。
　第三のタイプの非放射性システムとしては，例えば，プローブに直接酵素を共有結合で導入したもの（Ｒｅｎｚ，Ｍ．，ａｎｄ　Ｋｕｒｚ，Ｃ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．１２．３４３５‐３４４４）が知られている。
　従来から行われている核酸のハイブリダイゼーションアッセイの概要は以下に示した通りである。
　まず，検体試料中の核酸を変性して一本鎖とした後，支持体であるニトロセルロース製の膜に８０℃で２ｈ程度焼付け，固定する。
　次に，標識プローブの非特異吸着を抑えるためにプレハイブリダイゼーションパッファー（例えば，ＥＤＴＡ，塩化ナトリウム，ドデシル硫酸ナトリウム，ポリエチレングリコール，フィコール，ポリビニルピロリドン，牛血清アルブミン，サケ精子ＤＮＡ及びホルムアミドを含むトリス塩酸緩衝液）中でプレハイブリダイゼーションを行う。プレハイブリダイゼーションは通常３７℃で３０ｍｉｎ程度行うことが多い。
　プレハイブリダイゼーションの後，試料の核酸を固定した膜を標識プローブを含むハイブリダイゼーションバッファー（プレハイブリダイゼーションバッファ一と組成は同じ）中で数ｈから一晩インキユベートする。次いで膜に固定されている試料の核酸にハイブリダイズしていない標識プローブを除去するためにドデシル硫酸ナトリウム，クエン酸ナトリウム，塩化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液等で洗浄する。
　洗浄の終わった膜を酵素反応によって沈着性色素，可溶性色素，螢光性物質，発光性物質等を生成する酵素反応基質を含む緩衝液中でインキユベートすると検体試料中に標識プローブと相補的な配列を持つ核酸が含まれる場合にのみ膜が着色，あるいは螢光，あるいは発光が観測される。このことにより検体試料の核酸中の特定塩基配列を検出する。
（ハ）発明が解決しようとする課題
　しかし，現在十分な感度でしかも迅速，簡便，定量的にターゲットの核酸を検出する非放射性標識システムは確立していない。
　この原因は，ハイブリダイゼーションアッセイを行う過程で酵素等の巨大分子で標識したプローブがターゲット以外のもの，特に試料の核酸の固定に用いるニトロセルロース膜に非特異吸着し，バックグラウンドが上昇するからである。現在，広く用いられているＤｅｎｈａｒｄｔ′ｓ溶液やスキムミルク溶液（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ。Ｇａｕｔｃｈ，Ｊ，ｗ．，ｓｐｏｒｔｓｍａｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ　Ｅｌｄｅｒ，Ｊ．Ｈ．（１９８４）．Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１，３−８）では，十分にプローブの非特異吸着を抑えることができず，高感度にターゲットの核酸を検出することができない。
　本発明は，以上のような状況を鑑みなされたものである。すなわち，標識プローブのターゲット以外への非特異吸着を抑える方法を開発することによって，迅速，簡便，かつ高感度にターゲットの核酸を検出するシステムを供することである。
（ニ）課題を解決するための手段
　本発明は，上記の課題を解決する手段としてハイブリダイゼーションアッセイにおいて試料の核酸を固定した後にこの膜を０．０１〜３０ｗ／ｖ％ＰＶＡ及び０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＰを含有する溶液（以下ＰＶＡ−ＰＶＰ溶液と略する。），あるいは，０．０１〜３０ｗ／ｖ％のＰＶＡを含有する溶液（以下，ＰＶＡ溶液と略する）に浸してブロッキング処理を行う過程を含む核酸の検出法を供するものである。
　本発明においては，用いるＰＶＡは重合度が５００のものが好ましいがこれに限定されるものではない。また，ＰＶＡ及びＰＶＰを溶解する溶媒は蒸留水が好ましいがこれに限定されるものではない。また，本発明におけるブロツキング処理の条件は，処理温度は３０〜５０℃，処理時間は０．２５〜１ｈが好ましいがこれに限定されるものではない。
（ホ）実施例
　以下，実施例に基づき，本発明を具体的に説明する。但し本発明は，実施例に限定されるものではない。
　
アンぺロメトリック検出器によるＭ１３ｍｐ８一本鎖ファージＤＮＡの検出
（１）Ｍ１３ブライマー（５′−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３′）のＡＬＰ標識は、多田ら，特願昭６３−１９１０８７号に記載されている方法に従った。すなわち、Ｍ１３プライマーの５′位ヘリン酸残基を導入し、さらにシスタミンと反応させ，リン酸残基にシスタミン残基を導入し、
さらにジチオスレトールを用いて還元し末端がチオール基に変換されたＭ１３プライマーを得た。
また，ＡＬＰと２５倍相当量のＳＰＤＰとを反応させ，ＡＬＰに２−ピリジルジスルフイド基を導入した。
（２）これらの工程によって得られた５’末端がチオール基に変換されたＭ１３プライマーと２−ピリジルジスフィド基を導入したＡＬＰを反応させ，ＡＬＰ標識したＭ１３プライマーを得た。
（３）Ｍ１３ｍｐ８一本鎖ファージＤＮＡとＡＬＰ標識Ｍ１３プライマーとのハイブリダイゼーション（ブロッキング処理の効果）
　Ｍ１３ｍｐ８一本鎖ファージＤＮＡ（約７０００ｂｐ）をＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・Ｃ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で段階希釈し，一辺５ｍｍの正方形に切ったニトロセルロース膜に１μｌずつ０ｍｏｌ，５ｆｅｍｔｏｍｏｌのＭ１３ｍｐ８一本鎖ファージＤＮＡをドットした。風乾後，オーブンで１８０℃，２ｈ熱しＤＮＡを固定した。これらの膜を，▲１▼ブロッキング処理しないもの▲２▼，ＰＶＰを５ｗ／ｖ％含む溶液で処理するもの▲３▼，ＰＶＡを１ｗ／ｖ％含む溶液で処理するもの▲４▼，ＰＶＡを１ｗ／ｖ％含み，ＰＶＰを５ｗ／ｖ％含む溶液で処理するものに分け９６穴プレートに固定しそれぞれの溶液を１７０μｌ加えマイクロプレートミキサー上で４０℃，３０ｍｉｎ振とうした。その後これらの溶液を捨てリン酸緩衝生理食塩水を各穴に１７０μｌずっ加えマイクロプレートミキサー上で１ｍｉｎ振とうし，膜を洗浄した。さらにこの洗浄操作を１回繰り返した。
　次に各穴にプレハイブリダイゼーション溶液（４×ＳＥＴ，０．０４ｗ／ｖ％ＢＳＡ，０．０４ｗ／ｖ％ＰＶＰ，０．０４ｗ／ｖ％フィコール，６ｖ／ｖ％ポリエチレングリコール，０．１ｗ／ｖ％ＳＤＳ）を１７０μｌずつ加え，マイクロプレートミキサー上で４０℃，１５ｍｉｎ振とうした。
　プレハイブリダイゼーション溶液を捨てた後（１）で調製したＡＬＰ標識プローブを０．６ｐｍｏｌ／１ｍｌ含むハイブリダイゼーション溶液（その他の組成はプレハイブリダイゼーツヨン溶液と同じ。）を１７０μｌずつ加えマイクロプレートミキサー上で４０℃，３０ｍｉｎ振どうしハイブリダイゼーションを行つた。
　その後，１×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ溶液１７０μ１ずつを用いてマイクロプレートミキサー上で室温１ｍｉｎを２回，４０℃，５ｍｉｎを１回，室温，１ｍｉｎを２回振とうしながら膜を洗浄した。次に氷冷した１×ＳＳＣ溶液１７０μｌずつを用いてマイクロプレートミキサー上で１ｍｉｎ，２回振とうしながら膜を洗浄した。続いて氷冷した１．５ｍＭの過塩素酸マグネシウムを含むＣＢ緩衝液１７０μ１ずつを用いてマイクロプレートミキサー上で１ｍｉｎ，２回振とうしながら膜を洗浄した。
　膜をそれぞれ１．５ｍｌのサンプリングチューブに移し替え，１ｍＭのフエニルフォスフェイト及び１．５ｍＭの過塩素酸マグネシウムを含むＣＢ緩衝液を１００μずつ加え，３７℃，１ｈインキュベートした。
　その後，直ちに氷冷し，それぞれに０．１５Ｍリン酸５μ１，０．２ＭＥＤＴＡ−２Ｎａ水溶液２０μｌを加え酵素反応を停止させた。
　酵素反応によって生成したフェノールを検出するために各反応液から１０μｌずつ第１図に示したアンペロメトリック検出器を組み込んだ高速液体クロマトグラフシステムのオートインジェクターからインジェクトした。分析条件は，カラム；ＳＨＩＭ−ＰＡＣＫ　ＯＤＳ内径４．６ｍｍ長さ５０ｍｍ，カラム温度；４０℃，移動相；０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）：メタノール＝４：１，流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ，検出電位：０．８０Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ，検出温度；４０℃である。１ｍＭフェニルフォスフェイト及び１．５ｍＭ過塩素酸マグネシウムを含むＣＢ緩衝液１００μｌを３７℃，１ｈインキュベートし、０．１５Ｍリン酸５μｌ，０．２ＭＥＤＴＡ−２Ｎａ水溶液２０μｌを加えたもの１０μｌをインジェクトして得られたクロマトグラムをベースラインとして３ｍｉｎ付近に現れるピークのピーク電流値を読み取った。ここでＳ／Ｎを５　ｆｍｏｌ　ＤＮＡを固定したものから得られたピーク電流値と０ｍｏｌ　ＤＮＡで得られたピーク電流値の比とすると第２図に示したようにブロッキング処理をしないものではＳ／Ｎ＝３．２であるがＰＶＰ溶液を用いてブロツキング処理するとＳ／Ｎ＝１４まで向上し，ＰＶＡ溶液を用いてブロッキング処理するとＳ／Ｎ＝１６まで向上した。さらにＰＶＡ−ＰＶＰ溶液を用いることによってＳ／Ｎ＝２９まで向上した。
　すなわち，本発明によるＰＶＡ溶液，ＰＶＡ−ＰＶＰ溶液を用いることによつてそれぞれ核酸のハイブリダイゼーションにかける標識プローブの非特異吸着を従来の２０，１１％にまで減少させることができた。
（４）Ｍ１３ｍｐ８一本鎖ファージＤＮＡとＡＬＰ標識Ｍ１３プライマーとのハイブリダイゼーション（ＰＶＡ−ＰＶＰ溶液を用いた高感度検出）
　Ｍ１３ｍｐ８一本鎖ファージＤＮＡ（約７０００ｂｐ）をＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・Ｃｌ，１ｍＭＥＤＴＡ）で段階希釈し，一辺５ｍｍの正方形に切ったニトロセルロース膜に１μ１ずつ０，０．０５，０．５，５，５０，５００，５０００ａｔｔｏｍｏｌのＭ１３ｍｐ８一本鎖ファージＤＮＡをドットした。風乾後，オーブンで１８０℃，２ｈ熱しＤＮＡを固定した。この膜を９６穴プレートに固定し，各穴にＰＶＡを１　ｗ／ｖ％含みＰＶＰを５ｗ／ｖ％含む溶液を１７０μｌ加えマイクロプレートミキサー上で４０℃，３０ｍｉｎ振とうした。その後、このＰＶＡ−ＰＶＰ溶液を捨てリン酸緩衝生理食塩水を穴に１７０μずつ加えマイクロプレートミキサー上で１ｍｉｎ振とうし，膜を洗浄した。さらにこの洗浄操作を１回繰り返した。
　次に各穴にプレハイブリダイゼーション溶液（４×ＳＥＴ，０．０４ｗ／ｖ％ＢＳＡ，０．０４ｗ／ｖ％ＰＶＰ，０．０４　ｗ／ｖ　％フィコール，６ｖ／ｖ％ポリエチレングリコール，０．１ｗ／ｖ％ＳＤＳ）を１７０μｌずつ加え，マイクロプレートミキサー上で４０℃，１５ｍｉｎ振とうした。
　プレハイブリダイゼーション溶液を捨てた後（１）で調製したＡＬＰ標識プローブを０．６ｐｍｏｌ含むハイブリダイゼーション溶液（その他の組成はプレハイブリダイゼーション溶液と同じ。）を１７０μｌずつ加えマイクロプレートミキサー上で４０℃，３０ｍｉｎ振とうしハイブリダイゼーションを行った。
　その後，１×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ溶液１７０μｌずつを用いてマイクロプレートミキサー上で室温，１ｍｉｎを２回，４０℃，５ｍｉｎを１回、室温１ｍｉｎを２回振とうしながら膜を洗浄した。次に氷冷した１×ＳＳＣ溶液１７０μｌずつを用いてマイクロプレートミキサー上で１ｍｉｎ，２回振とうしながら膜を洗浄した。続いて氷冷した１．５ｍＭの過塩素酸マグネシウムを含むＣＢ緩衝液１７０μｌずつを用いてマイクロプレートミキサー上で１ｍｉｎ、２回振とうしながら膜を洗浄した。
　膜をそれぞれ１．５ｍｌのサンプリングチューブに移し替え，１ｍＭのフェニルフォスフェイト及び１．５ｍＭの過塩素酸マグネシウムを含むＣＢ緩衝液を１００μ１ずつ加え，３７℃，１ｈインキュベートした。
　その後，直ちに氷冷し，それぞれに０．１５Ｍリン酸５μ１，０．２ＭＥＤＴＡ−２Ｎａ水溶液２０μ１を加え酵素反応を停止させた。
　酵素反応によって生成したフェノールを検出するために各反応液から１０μｌずつ第１図に示したアンペロメトリック検出器を組み込んだ高速液体クロマトグラフシステムのオートインジェクターからインジェクトした。分析条件は，カラム；ＳＨＩＭ−ＰＡＣＫ　ＯＤＳ内径４．６ｍｍ長さ５０ｍｍ，カラム温度；４０℃・移動相；０．１Ｍカリウムーリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）メタノール＝４：１，流速；１．０ｍ１／ｍｉｎ，検出電位；０．８０Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ，検出温度：４０℃である。ＤＮＡ量が０ａｔｔｏｍｏｌのものから得られたクロマトグラムをベースラインとして３ｍｉｎ付近に現れるピークのピーク電流値を読み取り，グラフにプロットすると第３図のようになった。すなわち，このシステムを用いることによつて５０ａｔｔｏｍｏｌまでのＭ１３ｍｐ８一本鎖ＤＮＡを検出できた。
　（へ）効果
　ＰＶＡ溶液，ＰＶＡ−ＰＶＰ溶液をブロッキング処理に用いることによつて標識プローブの膜への非特異吸着を大幅に減らすことができる。それゆえ，今まではバックグラウンドの中に埋もれていた弱いシグナルも検出することができ，高感度に核酸を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
　第１図は，酵素反応によって生成したフェノールを検出するための高速液体クロマトグラフシステムを示す図，第２図は，本発明に係るブロッキング処理の効果を示す図，第３図は，本発明による処理を施してＭ１３ｍｐ８ＳＳＤＮＡの検出特性図である。