【事件の表示】
　特許第２８０７９４９号「α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法」の請求項１ないし２に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２８０７９４９号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第２８０７９４９号は、平成４年１１月１０日に特願平４−３００１０３号として出願され、平成１０年７月３１日にその特許の設定登録がなされ、その後、新井照二より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１１年８月２５日に訂正請求がなされたものである。
ＩＩ．訂正請求
１．訂正の内容
▲１▼特許請求の範囲の請求項１中の「ｎは０〜２の整数を示す」を、「ｎは０を示す」と訂正する。
▲２▼特許請求の範囲の請求項２中の「ｎは０〜２の整数を示す」を、「ｎは０を示す」と訂正する。
▲３▼明細書【０００１】中の「グルコース数が２〜４個」を「グルコース数が２個」と訂正する。
▲４▼明細書【０００９】【００１１】及び【００２０】中の「ｎは０〜２の整数を示す」を、「ｎは０を示す」と訂正する。
▲５▼明細書【００１２】中の「２〜４個の糖から形成される」を「２個の糖から形成される」と訂正する。
▲６▼明細書【００１２】中の「マルトース、マルトトリオースおよびマルトテトラオース」を「マルトース」と訂正する。
▲７▼明細書【００１７】中の「、２−クロロ−４−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトトリオシド、ｐ−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテトラオシド、ｐ−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテトラオシド」を削除する。
▲８▼明細書【００１７】中の「好ましくは、グルコース数が２であるマルトオリゴ糖誘導体、」を「一般式（Ｉ）で表されるマルトオリゴ糖誘導体は、グルコース数が２であるマルトオリゴ糖誘導体であり、」と訂正する。
▲９▼明細書【００２１】中の「マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースなどの」を「マルトースである」と訂正する。
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項▲１▼▲２▼は、「ｎは０〜２の整数を示す」を「ｎは０を示す」に訂正するものであるから特許請求の範囲の減縮に該当し、訂正事項▲３▼乃至▲９▼は、訂正事項▲１▼▲２▼に伴う訂正である。
　そして、上記いずれの訂正も新規事項に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
３．独立特許要件
　当審が通知した取消理由の概要は、明細書の記載が不備であるから特許法３６条４項に規定する要件を具備しない特許出願に対してなされたものであるというものであるところ、後述の「ＩＩＩ．３．判断」の項に記載のように、訂正された明細書は不備であるとはいえず、また「ＩＩＩ．１．特許異議申立の理由の概要」に記載したその他の特許異議申立の理由についても、「３．判断」の項に記載のように理由がないものであるから、本件発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４，２項、及び同条３項で準用する１２６条２項から４項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
ＩＩＩ．特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要
▲１▼訂正前の本件請求項１に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であるから、特許法２９条１項３号の規定により特許を受けることができない。
▲２▼訂正前の本件請求項１に係る発明は、甲第２号証に記載された発明と同一であるから、特許法２９条の２の規定により特許を受けることができない。
▲３▼訂正前の本件請求項２に係る発明は、未完成発明であり、特許法２９条１項柱書きの規定により特許を受けることができない、或いは、本件明細書は、訂正前の本件請求項２に係る発明を当業者が容易に実施できる程度に記載されておらず、本件は特許法３６条４項の規定により特許を受けることができない。
記
甲第１号証：特開平３−２６４５９６号公報
甲第２号証：特願平５−８８０９６号（特開平６−８６６８３号公報）の願書に最初に添付した明細書（優先日平成４年７月２１日）
甲第３号証：特願平４−２１５５５３号の出願書類一式（甲第２号証で主張された優先権の基礎となる出願）
甲第４号証：「臨床化学」２２：２５８−２６６（１９９３）
甲第５号証：「応用糖質科学」４１巻２号２０７〜２１３頁（１９９４）
２．甲各号証の記載内容
　甲第１号証には、
「下記一般式（１）で表されるガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体。（式略）
（式中、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一方はガラクトシル基であり、他方は水素原子であり、Ｒは水素原子または置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す。）（特許請求の範囲の項（１））、
「そこで、本発明の目的は、共役酵素を用いるα−アミラーゼ測定法に基質として用いた場合に、共役酵素によって分解されることがなく、・・・」（３頁右上欄６〜８行）、
「Ｒで示される置換フェニル基は、α‐アミラーゼの共役酵素であるグルコアミラーゼ、α‐グルコシダーゼまたはβ‐グルコシダーゼによって色素を遊離するものであればいずれでもよい。例えば４−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基等を挙げることができる。」（３頁左下欄１１〜１７行）、
「このようにして得られる本発明のマルトオリゴ誘導体（１）は、α−アミラーゼ活性測定用基質として使用することができる。」（５頁左上欄８〜１０行）が記載され、
甲第２号証には、
「少なくとも１種のマルトオリゴ糖及びβ−ガラクトシル残基をもつ糖との混合物に、β−ガラクトシダーゼを作用させてガラクトシル−マルトオリゴ糖を得る工程、及び得られたガラクトシル−マルトオリゴ糖と、Ｏ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体との混合物に、水−親水性有機溶媒混合溶媒中で、アミラーゼを作用させる工程を含む、下記一般式（１）で表されるガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法。
　　　　　（式（１）省略）
（式中、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一方はガラクトシル残基であり、他方は水素原子であり、Ｒは置換または無置換のフエニル基を示し、ｎは１〜５の整数を示す。）」（特許請求の範囲請求項１）、
「本発明は、α−アミラーゼ活性測定用基質として有用なガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の新規な製造方法に関する。」（２頁１欄３２〜３４行）、
「本発明者らはα−アミラーゼ測定の際に、共役酵素（α−グルコシダーゼあるいはグルコアミラーゼ等）の作用を受けない安定な基質を得る目的で、・・・」（２頁１欄４２〜４４行）が記載され、
　甲第４号証には、図４として、グルコースの非還元末端にガラクトースがβ−１，４結合したＧａｌ−ＧｎＰＮＰ−Ｉ（ｎ＝４〜７、ＰＮＰ＝ｐ−ニトロフェニル）のα−アミラーゼによる水解部位についての検討結果が記載されている。
　甲第５号証には、Ｔａｂｌｅ２に、グルコースの非還元末端にガラクトースがβ−１、４結合したＬＧ３ＰＩ及びＬＧ４ＰＩのα−アミラーゼによる水解部位についての検討結果が記載されている。
３．判断
（異議理由▲１▼について）、
　訂正後の本件請求項１に係る発明（以下、「本件発明１」という。）は、「追随酵素を含有しない」ことを特徴とするところ、この「追随酵素」とは、本件明細書の「本発明において追随酵素とは、非還元性末端からグルコシド結合を加水分解するエキソグルコシダーゼのことであり、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼなどがこれに含まれる。」（本件特許掲載公報４頁８欄４５〜４９行）との記載に徴し、甲第１号証に係る「共役酵素」と同じものである。
　そうすると、甲第１号証は、共役酵素たるグルコアミラーゼ、α‐グルコシダーゼまたはβ‐グルコシダーゼを伴うものであるから、本件発明１とは明らかに相違する。
　したがって、本件発明１は、甲第１号証に記載１
された発明であるということはできない。
（異議理由▲２▼について）
　甲第２号証には、「本発明者らはα−アミラーゼ測定の際に、共役酵素（α−グルコシダーゼあるいはグルコアミラーゼ等）の作用を受けない安定な基質を得る目的で」との記載があるように、甲第２号証は、α−アミラーゼ測定の際に共役酵素を使用する技術を前提に発明されたものであって、当該ガラクトシルーマルトオリゴ糖誘導体をα−アミラーゼ活性測定用基質として使用する場合は、当然共役酵素を併用していると認められる。
　そうすると、「追随酵素を含有しない」ことを特徴とする本件発明１は、甲第２号証に記載された発明と同一であるとはいえない。
（異議理由▲３▼について）
　訂正後の本件請求項２に係る発明（以下、「本件発明２」という。）は、その請求項２に記載されたように、一般式（Ｉ）のｎは０を示すものであるから、もはやＧ−Ｒ３、Ｇ−Ｇ−Ｒ３、またはＧ−Ｇ−Ｇ−Ｒ３が遊離する余地はない。
　すなわち、本件発明に係る一般式（Ｉ）で表されるマルトオリゴ糖誘導体をα−アミラーゼを作用させると、Ｒ３のみ遊離することになる。
　してみれば、本件発明２は、未完成発明であるとか、或いは、本件明細書は、本件発明２を当業者が容易に実施できる程度に記載されていないということはできない。
３．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年１０月１５日（１９９９．１０．１５）
【訂正の要旨】
　特許請求の範囲の減縮を目的として
　　▲１▼　訂正事項ａ
　特許青求の範囲の請求項１中の「ｎは０〜２の整数を示す」を、「ｎは０を示す」と訂正する。
　　▲２▼　訂正事項ｂ
　特許清求の範囲の請求項２中の「ｎは０〜２の整数を示す」を、「ｎは０を示す」と訂正する。
　　▲１▼、▲２▼の訂正に対応して
　　▲３▼　訂正事項ｃ
　明細書段落番号０００１中の「グルコース数が２〜４個」を、「グルコース数が２個」と訂正する。
　　▲４▼　訂正事項ｄ
　明細書段落番号０００９、００１１および００２０中の「ｎは０〜２の整数を示す」を、「ｎは０を示す」と訂正する。
　　▲５▼　訂正事項ｅ
　明細書段落番号００１２中の「２〜４個の糖から形成される」を、「２個の糖から形成される」と訂正する。
　　▲６▼　訂正事項ｆ
　明細書段落番号００１２中の「マルトース、マルトトリオースおよびマルトテトラオース」を、「マルトース」と訂正する。
　　▲７▼　訂正事項ｇ
　明細書段落番号００１７中の「、２−クロロ−４−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトトリオシド、Ｐ−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテトラオシド、ｐ−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテトラオシド」を削除する。
　　▲８▼　訂正事項ｈ
　明細書段落番号００１７中の「好ましくは、グルコース数が２であるマルトオリゴ糖誘導体、」を、「一般式（Ｉ）で表されるマルトオリゴ糖誘導体は、グルコース数か２であるマルトオリゴ糖誘導体であり、」と訂正する。
　　▲９▼　訂正事項ｉ
　明細書段落番号００２１中の「マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースなどの」を、「マルトースである」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法
（５７）【特許請求の範囲】
　　【請求項１】一般式（Ｉ）
　【化１】
（式中、Ｒ１およびＲ２のいずれか一方はβ−ガラクトピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ３はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可能な物質となる基を示し、ｎは０を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を含有し、追随酵素を含有しないα−アミラーゼ活性測定用試薬。
　　【請求項２】（ａ）一般式（Ｉ）
　【化２】
（式中、Ｒ１およびＲ２のいずれか一方はβ−ガラクトピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ３はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可能な物質となる基を示し、ｎは０を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を、追随酵素の非存在下においてα−アミラーゼを含有する試料と接触させて前記マルトオリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応させ、
（ｂ）遊離した測定可能な物質の量を測定することよりなる試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。
【発明の詳細な説明】
　　　【０００１】
　　【産業上の利用分野】
　本発明は、新規なα−アミラーゼ活性測定用試薬およびα−アミラーゼ活性測定方法に関する。さらに詳しくは非還元末端グルコースの４位あるいは６位にβ−ガラクトピラノシル基を有するグルコース数が２個のマルトオリゴ糖誘導体を基質とし、追随酵素を使用しないα−アミラーゼ活性測定用試薬、ならびに当該試薬を用いるα−アミラーゼ活性測定方法に関する。
　　　【０００２】
　　【従来の技術】
　従来から膵液や尿などの体液に含有されるα−アミラーゼの活性を測定することにより各種疾患の診断が行われている。このようなα−アミラーゼの活性測定法には、例えば次のような方法がある。
（１）マルトオリゴ糖（マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースなど）を基質とする方法：
　この方法では、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖とα−グルコシダーゼ等の追随酵素とを作用させて基質からグルコースを遊離させ、グルコースの量を測定することにより、α−アミラーゼの活性値を知る。生成したグルコースを測定する方法としては、グルコースオキシターゼ／パーオキシダーゼ／色素系を利用する測定法、ヘキソキナーゼ／グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを利用する測定法またはヘキソキナーゼ／ホスフォグルコムターゼ／グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ系を利用する測定法などがある。しかしながら、これらの方法ではα−グルコシダーゼが僅かではあるが基質に作用し、ブランク値が上昇するためα−グルコシダーゼと基質とを一液化した試薬とすることが困難である。
　　　【０００３】
（２）マルトオリゴ糖の還元性末端にフェニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコンとして結合させた誘導体を基質とする方法：
　これらの方法では、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖誘導体と必要に応じａ−グルコシダーゼ等の追随酵素を作用させて基質からアグリコンを遊離させ、遊離したアグリコンの量を光学的に測定することにより、α−アミラーゼの活性を測定することができる。
　このような測定法としては、例えば基質としてｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド、２，４−ジクロロフェニルマルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトペンタオシドなどを用いる測定法がある。
　しかしながら、これらの方法においてもα−グルコシダーゼが僅かではあるが基質に作用し、ブランク値が上昇するという欠点がある。また、上記（１）および（２）の方法ではα−グルコシダーゼの基質分解作用のため、α−グルコシダーゼと基質とを一液化することは、試薬としての安定性が損なわれるため好ましくない。さらに、いずれの場合も追随酵素が必要であるので高コストとなってしまう欠点がある。
　　　【０００４】
（３）マルトオリゴ糖の還元性末端にフェニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコンとして結合させたマルトオリゴ糖誘導体の非還元性末端のグルコースの４位および／または６位のヒドロキシル基が何らかの手段で修飾された誘導材を基質とする方法：
　これらの方法も、（２）と同じく、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖誘導体と必要に応じα−グルコシダーゼ等の追随酵素を作用させて基質からアグリコンを遊離させ、遊離したアグリコンの量を光学的に測定することにより、α−アミラーゼの活性を測定するものである。
　具体例としては、非還元性末端グルコースの６位のヒドロキシル基がハロゲン、グルコピラノシル基などで修飾されたタイプの基質（例えば、特開昭６０−２３７９９８号公報）、あるいは４位および６位のヒドロキシル基をアルキル基、アルコイル基またはフェニル基で置換したタイプの基質（例えば、特開昭６０−５４３９５号公報、特開昭１−１５７９９６号公報）あるいは４位または６位のヒドロキシル基をβ−ガラクトピラノシル基で置換したタイプの基質（特開平３−２６４５９６号公報）などがある。これらの方法においては、マルトオリゴ糖の非還元性末端のグルコースのヒドロキシル基が修飾されているため、上記（１）、（２）の方法にみられるような、α−グルコシターゼが僅かではあるが基質に作用しブランク値が上昇する、という欠点は理論上は回避されている。
　しかしながら実用上においては、これらの基質を用いた場合でも、非還元末端が修飾されていない不純物が若干含まれるために、多少のブランク値の上昇は避けられない。さらに、上記（３）の基質を用いる方法も追随酵素が必要であり高コストになってしまうという問題がある。
　　　【０００５】
（４）２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシドを基質とする方法（特開昭６３−１８３５９５号公報）
　この方法は、追随酵素を必要としないので低コストであり、ブランク値上昇も少ないが、感度が不良であるという問題点がある。
　　　【０００６】
　　【発明が解決しようとする課題】
　本発明は上記従来のα−アミラーゼ活性測定基質の欠点および従来のα−アミラーゼ活性測定試薬の欠点を解消しようとするものであり、その目的とするところは、追随酵素が不要であって（すなわち低コストであり、また基質が追随酵素分解を受けないため安定である）、かつα−アミラーゼに親和性が高い高感度のα−アミラーゼ活性測定試薬を提供することにある。
　また本発明の目的は、追随酵素が不要であり、かつ高感度のα−アミラーゼ活性測定先法を提供することにある。
　　　【０００７】
　　【課題を解決するための手段】
　本発明は、一般式（Ｉ）
　　　【０００８】
　【化３】
　　　【０００９】
（式中、Ｒ１およびＲ２のいずれか一方はβ−ガラクトピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ３はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可能な物質となる基を示し、ｎは０を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を含有し、追随酵素を含有しないα−アミラーゼ活性測定用試薬に関する。
　また本発明は、（ａ）一般式（Ｉ）
　　　【００１０】
　【化４】
　　　【００１１】
（式中、Ｒ１およびＲ２のいずれか一方はβ−ガラクトピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ３はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可能な物質となる基を示し、ｎは０を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を、追随酵素の非存在下においてα−アミラーゼを含有する試料と接触させて前記マルトオリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応させ、
（ｂ）遊離した測定可能な物質の量を測定することよりなる試料中のα−アミラーゼ活性測定方法に関する。
　　　【００１２】
　本発明におけるマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）の骨格となるマルトオリゴ糖は、２個の糖から形成される。具体的には、マルトースである。
　マルトオリゴ糖の非還元性末端グルコースの修飾基であるガラクトピラノシル基は、非還元性末端グルコースの４位または６位の水酸基にβ型で結合している。従来、マルトオリゴ糖の非還元性末端グルコースの修飾形態としては、非還元性末端グルコースの６位のヒドロキシル基がグルコピラノシル基で修飾されたタイプの基質、あるいは４位または６位のヒドロキシル基をアルキル基、アルコイル基またはフェニル基で置換したタイプの基質などがあるが、これらの修飾基は天然の基質にはない構造のものであり、アミラーゼとの親和性を考慮した場合、ガラクトピラノシル基は前述の修飾基より優れている。
　　　【００１３】
　マルトオリゴ糖の還元性末端には、α−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元性末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可能な物質と有る基Ｒ３（以後アグリコンともいう）を有している。Ｒ３は還元性末端グルコースの１位水酸基にグリコシド結合を介して結合しており、該グリコシド結合はα型である。Ｒ３で表される基としては、例えばｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、２−クロロ−４−ニトロフェニル、２，４−ジクロロフェニルなどの置換フェニル基、４−メチルウンベリフェリルなどの蛍光性基などが挙げられる。α−アミラーゼの至適ｐＨであるｐＨ７付近における測定感度を考慮した場合、２−クロロ−４−ニトロフェニルが優れている。
　　　【００１４】
　本発明に使用する一般式（Ｉ）で表されるマルトオリゴ糖誘導体としては、具体的には、一般式（ＩＩ）
　　　【００１５】
　【化５】
　　　【００１６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびｎは前記と同意義であり、Ｒ４は水素、またはハロゲン、炭素原子数１〜６のアルキル基、−ＯＲ５、および−ＣＯＯＲ５（Ｒ５は炭素原子数１〜６のアルキル基を示す）よりなる群から選ばれた置換基を示す。）で表される化合物が挙げられる。
　本明細書においてハロゲンとはフッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を示す。アルキル基は直鎖状または分枝鎖状のいずれでもよく、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第３級ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられ、好ましくは炭素数１〜４である。
　　　【００１７】
　一般式（Ｉ）で表されるマルトオリゴ糖誘導体としては、さらに具体的には、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ一ガラクトピラノシル−α−マルトシドなどが挙げられる。一般式（Ｉ）で表されるマルトオリゴ糖誘導体は、グルコース数が２であるマルトオリゴ糖誘導体であり、特に好ましくは２−クロロ−４−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドである。
　　　【００１８】
　本発明で使用するマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）は、特開平３−２６４５９６号公報に記載の方法など種々の公知の方法で製造することができる。例えば、還元末端グルコースに２−クロロ−４−ニトロフェノールを結合したマルトオリゴ糖誘導体（ＩＩＩ）
　　　【００１９】
　【化６】
　　　【００２０】
（式中、ｎは０を示す。）とラクトースをβ−ガラクトシダーゼ共存下に反応させてマルトオリゴ糖誘導体（ＩＩＩ）の非還元性末端にβ−ガラクトピラノシル基を導入することにより製造することができる。
　　　【００２１】
　また別法としては、マルトースであるマルトオリゴ糖およびラクトースを用いてβ−ガラクトシダーゼによりマルトオリゴ糖の非還元性末端にβ−ガラクトピラノシル基を導入して合成したガラクトピラノシルマルトオリゴ糖に、塩基触媒（ピリジンもしくは酢酸ナトリウムなど）の存在下、無水酢酸中で室温あるいは加温してアセチル化し、ガラクトピラノシルマルトオリゴ糖保護体とする。次いで無機溶媒の存在下、もしくは無溶媒下、アルカリおよび無水酢酸およびフェノール類、例えば２−クロロ−４−ニトロフェノールとともに加熱して還元性末端をフェノール類により修飾し、最後にメタノール中、触媒量のナトリウムメチラートによる公知の脱保護反応により、目的であるガラクトピラノシルマルトオリゴ糖誘導体を製造する方法がある。
　　　【００２２】
　本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬は、上記マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）を基質として含有し、追随酵素を含有しないことを特徴とする。本発明において追随酵素とは、非還元性末端からグルコシド結合を加水分解するエキソグルコシダーゼのことであり、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼなどがこれに含まれる。本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬は、必要に応じてその他の添加剤を含有していてもよい。添加剤としては界面活性剤、安定化剤、防腐剤、キレート剤などが挙げられる。
　また本発明の測定試薬は基質を溶解した緩衝液も包含してもよい。該緩衝液としては、ＰＩＰＥＳ緩衝液等のグッド緩衝液をはじめ、ｐＨ７．０付近に緩衝能を有する各種緩衝液が用いられる。
　　　【００２３】
　本発明のα−アミラーゼ活性測定方法は、
（１）前記マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）を、追随酵素の非存在下においてα−アミラーゼを含有する試料と接触させて前記マルトオリゴ糖誘導体とα−アミラーゼを反応させ、
（２）遊離した測定可能な物質の量を測定することよりなる。
　　　【００２４】
　マルトオリゴ糖誘導体とα−アミラーゼの反応は、マルトオリゴ糖誘導体を基質とする従来のα−アミラーゼ活性測定と同様の条件下で行えばよい。例えば反応温度２５〜４０℃、ｐＨ６〜８にて、約１〜２０分間反応を行う。
　　　【００２５】
　試料中のα−アミラーゼの作用によりマルトオリゴ糖誘導体から遊離したアグリコンがそれ自体で吸光度を示す化合物であれば、遊離後、吸光度測定を行う。またアグリコンが蛍光物質である場合は、遊離後、蛍光度測定を行う。
　アグリコンが２−クロロ−４−ニトロフェノールである場合は、４００ｎｍ付近におじる吸光度の変化を測定する。
　　　【００２６】
　本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬を使用する測定方法における基質分解の反応式を２−クロロ−４−ニトロフェニル　４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを基質とする場合を例にあげて説明する。以下の反応式に示すように追随酵素が不要である。
　　　【００２７】
　【化７】
　　　【００２８】
　上記反応にて遊離したアグリコン部分を適当な手段により測定することによってα−アミラーゼの活性を測定することができる。上記例では遊離する２−クロロ−４−ニトロフェノールの吸収スペクトルを直接測定する。２−クロロ−４−ニトロフェノールの測定方法としては、α−アミラーゼの反応を連続的に追跡するレート法および一定時間反応させた後、反応を止めて測定するエンドポイント法のいずれもが使用されうる。
　　　【００２９】
　本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬は体液中のα−アミラーゼ活性測定に限らず、α−アミラーゼ活性を測定することにより試料中のカルシウムイオン、塩素イオンなどを測定する方法にも適用可能である。
　　　【００３０】
　【発明の効果】
　本発明の試薬および測定方法は、α−グルコシダーゼあるいはβ−グルコシダーゼあるいはグルコアミラーゼなどの追随酵素が不要であり、また基質がこれらの追随酵素による酵素分解を受けないため安定である。さらに基質とα−アミラーゼの親和性が高い高感度のα−アミラーゼ活性測定試薬および測定方法である。
　本発明で使用する基質は、非還元性末端修飾基がガラクトピラノシル基であるため、澱粉やアミロースなどのグルコース鎖を認識してその結合を切断するα−アミラーゼの作用様式が純粋に反映されると考えられる。
　　　【００３１】
　　【実施例】
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
実施例
　実施例として後記表１に記載したマルトオリゴ糖誘導体を基質として用い、下記組成からなるα−アミラーゼ活性測定試薬をそれぞれ調製した（実施例ＡおよびＢ）。
　試薬紅成：
　５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０）
　ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　１ｍＭ
　基質　　　　　　　　　　　　　２ｍＭ
　なお、比較例として後記表１に示した基質を用いて上記と同様の試薬を調製し
た（比較例Ａ−１、Ａ−２および比較例Ｂ−１、Ｂ−２）。
　　　【００３２】
　【表１】
　　　【００３３】
実験例α−アミラーゼの活性測定
　上記実施例および比較例で調製した各試薬３ｍｌに三種類の血清１、２および３をそれぞれ０．２５ｍｌ添加し、３７℃にて３分間放置したのち、４１５ｎｍにおける吸光度の変化を測定し、１分間当りの吸光度の変化を算出した。その結果を表２に示した。なお、表２には試薬ブランクの１分間当りの吸光度の変化も伴せて記載した。
　　　【００３４】
　【表２】
　　　【００３５】
　表２に示したように、実施例Ａと比較例Ａ−１の比較と、実施例Ｂと比較例Ｂ−１の比較から、β−ガラクトピラノシル基がα−アミラーゼとの親和性に優れ、非還元末端の修飾基として好ましいことがそれぞれわかる。
　また、実施例Ａと比較例Ａ−１、Ａ−２との比較および実施例Ｂと比較例Ｂ−１、Ｂ−２との比較から、本発明の試薬の測定感度が高いことがそれぞれわかる。