(57)【要約】本発明は、エリスロポエチンレセプター（ＥＰＯ−Ｒ）のアゴニストであるペプチド化合物に関する。本発明はさらに、このようなペプチド化合物を使用して低赤血球産生または赤血球産生欠乏に関連する障害を処置する治療方法に関する。本発明のペプチド化合物を含有する医薬組成物もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１Ａ〜１Ｋに記載の配列番号１〜６６８から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドのＮ末端がアセチル化されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドがモノマーである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドがダイマーである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドがホモダイマーである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドに共有結合する１種以上の水溶性ポリマーをさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ＰＥＧが約５００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの分子量を有する直鎖状の非分岐分子を含む、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ＰＥＧが約２０，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ＰＥＧが約２０，０００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ＰＥＧが約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１２】
２つのＰＥＧ部分が前記ペプチドに共有結合し、該ＰＥＧの各々は直鎖状の非分岐分子を含む、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記ＰＥＧの各々が約２０，０００ダルトン〜約３０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドがエリスロポエチンレセプター（ＥＰＯ−Ｒ）に結合し、エリスロポエチンレセプターを活性化する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１５】
（ａ）第１のペプチド鎖；
（ｂ）第２のペプチド鎖；および
（ｃ）該第１のペプチド鎖と第２のペプチド鎖とをつなぐ連結部分
を含むペプチドダイマーであって、
該第１のペプチド鎖および該第２のペプチド鎖の少なくとも１つは、図１Ａ〜１Ｋに記載の配列番号１〜６６８から選択されるアミノ酸配列を含み、該ペプチドは、エリスロポエチンレセプター（ＥＰＯ−Ｒ）に結合し、エリスロポエチンレセプターを活性化する、ペプチドダイマー。
【請求項１６】
前記連結部分が、式：
−ＮＨ−Ｒ3−ＮＨ−
を含み、式中、Ｒ3は低級（Ｃ1-6）アルキレンである、請求項１５に記載のペプチドダイマー。
【請求項１７】
前記連結部分がリジン残基である、請求項１６に記載のペプチドダイマー。
【請求項１８】
前記連結部分が、式：
−ＣＯ−（ＣＨ2）n−Ｘ−（ＣＨ2）m−ＣＯ−
を含み、式中、ｎは０〜１０の整数であり、ｍは１〜１０の整数であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＣＨ2）pＮＲ1、ＮＣＯ（ＣＨ2）pＮＲ1、およびＣＨＮＲ1から選択され、Ｒ1は、Ｈ、Ｂｏｃ、およびＣｂｚから選択され、そしてｐは１から１０の整数である、請求項１５に記載のペプチドダイマー。
【請求項１９】
ｎおよびｍが各々１であり、ＸはＮＣＯ（ＣＨ2）pＮＲ1であり、ｐは２であり、そしてＲ1はＨである、請求項１８に記載のペプチドダイマー。
【請求項２０】
水溶性ポリマーをさらに含む、請求項１５に記載のペプチドダイマー。
【請求項２１】
前記水溶性ポリマーが、リンカー部分に共有結合している、請求項２０に記載のペプチドダイマー。
【請求項２２】
スペーサー部分をさらに含む、請求項１５に記載のペプチドダイマー。
【請求項２３】
前記スペーサー部分が、式：
−ＮＨ−（ＣＨ2）α−［Ｏ−（ＣＨ2）β］γ−Ｏδ−（ＣＨ2）ε−Ｙ−
を含み、式中、α、βおよびεは、各々、１〜６から独立して選択される値の整数であり、δは０または１であり、γは０〜１０から選択される整数であり、そしてＹは、ＮＨまたはＣＯから選択され、但し、γが１よりも大きい場合、βは２である、請求項２２に記載のペプチドダイマー。
【請求項２４】
α、βおよびεの各々が２であり、γおよびδの各々が１であり、そしてＹがＮＨである、請求項２３に記載のペプチドダイマー。
【請求項２５】
１種以上の水溶性ポリマーをさらに含む、請求項２２に記載のペプチドダイマー。
【請求項２６】
前記水溶性ポリマーが前記スペーサー部分に共有結合している、請求項２５に記載のペプチドダイマー。
【請求項２７】
前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２０または２５に記載のペプチドダイマー。
【請求項２８】
前記ＰＥＧが、約５００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの分子量を有する直鎖状の非分岐ＰＥＧである、請求項２７に記載のペプチドダイマー。
【請求項２９】
前記ＰＥＧが、約５００ダルトン〜約２０，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項２８に記載のペプチドダイマー。
【請求項３０】
前記ＰＥＧが、約２０，０００ダルトン〜６０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項２８に記載のペプチドダイマー。
【請求項３１】
前記ＰＥＧが、約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項３０に記載のペプチドダイマー。
【請求項３２】
２つのＰＥＧ部分が、前記ペプチドに共有結合しており、該ＰＥＧの各々は直鎖状の非分岐分子を含む、請求項２７に記載のペプチド。
【請求項３３】
前記ＰＥＧの各々が、約２０，０００ダルトン〜約３０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項３２に記載のペプチド。
【請求項３４】
患者を処置するための方法であって、
エリスロポエチンの欠損、または低赤血球集団もしくは欠陥赤血球集団によって特徴付けられる障害を有する患者に、図１Ａ〜１Ｋに記載の配列番号１〜６６８から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドの治療有効量を投与する工程
を包含する、前記方法。
【請求項３５】
前記障害が、末期腎不全または透析；ＡＩＤＳ、自己免疫疾患または悪性疾患に関連する貧血；β−サラセミア；嚢胞性線維症；未熟児の初期貧血；慢性炎症疾患に関連する貧血；脊髄損傷；急性失血；加齢；ならびに異常な赤血球生成に伴う腫瘍性疾患状態から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドがモノマーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドがダイマーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドがホモダイマーである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
１種以上の水溶性ポリマーが、前記ペプチドに共有結合している、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰＥＧが約５００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの分子量を有する直鎖状の非分岐ＰＥＧである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＰＥＧが約５００ダルトン〜約２０，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＰＥＧが約２０，０００ダルトン〜６０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項４１に記載のペプチドダイマー。
【請求項４４】
前記ＰＥＧが約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
２つのＰＥＧ部分が、前記ペプチドに共有結合しており、該ＰＥＧの各々は直鎖状の非分岐分子を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＰＥＧの各々が、約２０，０００ダルトン〜約３０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
（ｉ）図１Ａ〜１Ｋに記載の配列番号１〜６６８から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド；および（ｉｉ）薬学的に受容可能なキャリアを含有する、医薬組成物。
【請求項４８】
前記ペプチドがモノマーである、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記ペプチドがダイマーである、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記ペプチドがホモダイマーである、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
１種以上の水溶性ポリマーが、前記ペプチドに共有結合している、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記ＰＥＧが、約５００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの分子量を有する直鎖状の非分岐ＰＥＧである、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記ＰＥＧが、約５００ダルトン〜約２０，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記ＰＥＧが、約２０，０００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記ＰＥＧが、約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
２つのＰＥＧ部分が、前記ペプチドに共有結合しており、該ＰＥＧの各々は、直鎖状の非分岐分子を含む、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記ＰＥＧの各々が、約２０，０００ダルトン〜３０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項５７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、エリスロポエチンレセプター（ＥＰＯ−Ｒ）のアゴニストであるペプチド化合物に関する。本発明はさらに、このようなペプチド化合物を使用して、低赤血球産生または赤血球産生欠乏（insufficient or defective red blood cell production）に関連した障害を処置する治療方法に関する。本発明のペプチド化合物を含有する医薬組成物もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、１６５個のアミノ酸を有する糖タンパク質ホルモンであり、分子量は約３４キロダルトン（ｋＤ）であり、そしてアミノ酸２４位、３８位、８３位および１２６位において好ましいグリコシル化部位を有する。エリスロポエチンは、最初、２３個のアミノ酸のシグナルペプチドをもつ前駆体タンパク質として産生される。ＥＰＯは、３つの形態（α、βおよびアシアロ）で存在し得る。α型とβ型とは、その炭水化物成分にわずかに違いがあるが、同一の有効性、生物活性および分子量を有している。アシアロ型は、末端の炭水化物（シアル酸）が除去されたα型またはβ型である。ＥＰＯをコードするＤＮＡ配列は報告されている［米国特許第4,703,008号（Lin）］。
【０００３】
ＥＰＯは、赤血球前駆細胞の有糸分裂および分化を刺激し、従って、赤血球の産生を確実にする。ＥＰＯは、低酸素状態が優勢になると腎臓で産生される。赤血球前駆細胞のＥＰＯ誘導型の分化の間に、グロビン合成が誘導され；ヘム複合体の合成が刺激され；フェリチンレセプターの数が増加する。これらの変化により、細胞はより多量の鉄を持つようになり、成熟赤血球において酸素を結合する機能ヘモグロビンを合成する。このように、赤血球とそのヘモグロビンは、酸素を体に供給する際に重要な役割を果たしている。これらの変化は、ＥＰＯが赤血球前駆細胞の表面上の適当なレセプターと相互作用することにより開始される［例えば、Graber and Krantz（1978）Ann. Rev. Med. 29：51-66を参照のこと］。
【０００４】
ＥＰＯは、既存の数の赤血球から組織が十分な酸化を受けるような健康状態に体があるときは、非常に低い濃度で血漿中に存在する。この通常の低いＥＰＯ濃度は、通常老化により失われる赤血球の交換を刺激するのに十分である。
【０００５】
循環中のＥＰＯの量は、循環中の血液細胞による酸素の輸送が減少する低酸素の条件下において増加する。低酸素は、例えば、出血による実質的な失血、放射線への過剰曝露による赤血球の破壊、高所もしくは長期の意識消失に起因する酸素の取り込みの減少、または種々の型の貧血により引き起こされ得る。このような低酸素ストレスに応答してＥＰＯレベルが上昇すると、赤血球系前駆細胞の増殖を刺激することにより、赤血球の産生が増加する。循環中の赤血球数が通常の組織酸素要求に必要な量よりも大きくなると、循環中のＥＰＯレベルは低下する。
【０００６】
ＥＰＯは、赤血球形成のプロセスにおいて必須であるので、このホルモンは、低赤血球細胞産生または赤血球細胞産生欠乏により特徴付けられる血液障害の診断および処置の両者に対して、有用な用途を有する可能性がある。最近の研究から、β-サラセミア[Vedovatoら、（1984）Acta. Haematol. 71: 211-213を参照のこと]；嚢胞性線維症[Vichinskyら、（1984） J. Pediatric 105: 15-21を参照のこと]；妊娠および生理の障害[Cotesら、（193）Brit. J. Ostet. Gyneacol. 90: 304-311を参照のこと]；未熟児の初期貧血（early anemia of prematurity）[Hagaら、（1983）Acta Pediatr. Scand. 72: 827-831を参照のこと]；脊髄損傷[Claus-Walkerら、（1984）Arch. Phys. Med. Rehabil. 65: 370-374を参照のこと]；宇宙飛行[Dunnら、（1984）Eur. J. Appl. Physiol. 52: 178-182を参照のこと]；急性失血[Millerら、（1982）Brit. J. Haematol. 52: 545-590を参照のこと]；加齢[Udupaら、（1984）J. Lab. Clin. Med. 103: 574-580および581-588、およびLipschitzら、（1983） Blood 63: 502-509を参照のこと]；異常な赤血球生成に伴う種々の腫瘍性疾患状態[Dainiakら、（1983）Cancer 5: 1101-1106およびSchwartzら、（1983）Otolaryngol. 109: 269-272を参照のこと]；ならびに腎不全[Eschbachら、（1987）N. Eng. J. Med. 316: 73-78を参照のこと]を含む種々の疾患状態、障害および血液学的不規則性の状態に対するＥＰＯの治療効果について予測するための基礎が提供されている。
【０００７】
精製された均質なＥＰＯの特性が調べられている[Hewickの米国特許第4,677,195号]。天然のＥＰＯと同一の生化学的性質および免疫学的性質を有する組換えポリペプチドを生産するために、ＥＰＯをコードするＤＮＡ配列が、精製され、クローニングされ、そして発現された。天然のＥＰＯと同一のオリゴ糖を有する組換えＥＰＯ分子もまた産生されている[Sasakiら、（1987）J. Biol. Chem. 262: 12059-12076を参照のこと]。
【０００８】
ＥＰＯの生物学的効果は、部分的には、細胞膜結合レセプターとの相互作用によって媒介されるようである。マウス脾臓から単離された未成熟赤血球系細胞を用いた初期の研究から、ＥＰＯ結合細胞表面タンパク質は、それぞれ、およそ分子量８５，０００ダルトンと１００，０００ダルトンを有する二つのポリペプチドを含むことが示唆される[Sawyerら、（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3690-3694]。ＥＰＯ結合部位の数は、細胞表面当り平均800〜1000と算出された。これらの結合部位のうち、およそ３００はＥＰＯに約９０ピコモーラー（ｐＭ）のKd値で結合し、残りの部位はＥＰＯに約５７０ｐＭの親和性の減少した状態で結合した[Sawyerら、（1987）J. Biol. Chem. 262: 5554-5562]。独立した研究から、フレンド(Friend)白血病ウイルスの貧血株（ＦＶＡ）を接種したマウスから調製したＥＰＯ応答性脾臓赤芽球は、それぞれのＫd値がおよそ１００ｐＭと８００ｐＭの高親和性および低親和性の、合計約４００のＥＰＯ結合部位を有することが示唆される[Landschulzら、（1989）Blood 73: 1476-1486]。
【０００９】
続く研究から、二つの型のＥＰＯレセプター（ＥＰＯ−Ｒ）が、単一の遺伝子によりコードされていることが示された。この遺伝子はクローニングされている[例えば、Jonesら、（1990）Blood 76, 31-35；Noguchiら、（1991）Blood 78: 2548-2556；Maoucheら、（1991）Blood 78: 2557-2563を参照のこと]。例えば、マウスおよびヒトのＥＰＯ−Ｒタンパク質についてのＤＮＡ配列およびコードされるペプチド配列は、D'AndreaらのPCT公開番号 WO 90/08822に記載されている。現在のモデルは、ＥＰＯがＥＰＯ−Ｒに結合した結果、二つのＥＰＯ−Ｒ分子のダイマー化と活性化を生じ、続いてシグナル伝達の工程を生じることを示唆する[例えば、Watowichら、（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2140-2144を参照のこと]。
【００１０】
ＥＰＯ−Ｒのクローニングした遺伝子が入手できることから、この重要なレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストの探索が容易となる。組換えレセプタータンパク質を利用することにより、種々のランダムおよび半ランダムなペプチド多様性産生システムにおいてレセプター−リガンド相互作用の研究がなされる。これらのシステムには、「プラスミド上のペプチド」システム[米国特許第6,270,170号に記載]；「ファージ上のペプチド」システム[米国特許第5,432,018号およびCwirlaら、（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382に記載]；「コード化合成ライブラリー」（ESL）システム[1992年9月16日出願の米国特許出願第946,239号に記載]；および「大規模固定化ポリマー合成」システム[米国特許第5,143,854号；PCT公開番号第90/15070号；Fodorら、（1991）Science 251: 767-773；DowerとFodor（1991）Ann. Rep. Med. Chem. 26: 271-180；および米国特許第5,424,186号に記載]が含まれる。
【００１１】
少なくともいくらかの程度までＥＰＯ−Ｒに相互作用するペプチドが同定され、例えば、以下に記載されている：Wrightonら、(1996) Science 273: 458- 436、Johnsonら、(1998) Biochemistry 37: 3699-3710、およびWrightonら、(1997) Nat. Biotechnol. 15: 1261- 1265。米国特許第5,773,569号；同第5,830,851号；同第5,986,047号；および同第5,767,078号；WO 96/40749；WO 96/40772； WO01/38342；およびWO01/91780を参照のこと。特に、EPO-Rに結合してEPO依存性の細胞増殖を刺激する、ペプチドモチーフを含むペプチドのグループが同定された。さらに、モチーフを含むとこれまでに同定されたペプチドは、インビトロでＥＰＯ依存性細胞増殖を、約２０ナノモーラー（ｎＭ）と約２５０ｎＭとの間のＥＣ５０値で刺激する。それゆえ、２０ｎＭ〜２５０ｎＭのペプチド濃度が、ＥＰＯにより刺激される最大細胞増殖の５０％を刺激するために必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＥＰＯ−Ｒアゴニストの非常に大きな可能性を考えると、このレセプターにより媒介される重要な生物学的活性の研究、および疾患の処置の両方について、より一層の効力および活性をもつペプチドＥＰＯ−Ｒアゴニストを同定する必要性が残されている。本発明はそのような化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、効力および活性を劇的に強めたＥＰＯ−Ｒアゴニストモノマーペプチドおよび２種のペプチドモノマーを含むダイマーペプチドアゴニストを提供する。これらの新規ペプチドアゴニストの効力は、１種以上の改変（アセチル化、分子内ジスルフィド結合形成、１種以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の共有結合、ならびに図１Ａ〜１Ｋおよび本明細書を全体を通じて列挙された他の改変）によってさらに増強することができる。本発明はまた、保護基および／または疎水基を有するペプチドを提供する。上記ペプチドに結合する保護基および／または疎水基を使用して、循環中のペプチドの半減期を長くすることができ、そして細胞による取り込みおよび細胞膜を通過する輸送を助長することが可能である。本発明はさらに、このようなペプチドアゴニストを含む医薬組成物、およびこのようなペプチドアゴニストを使用して種々の臨床条件を処置するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（定義）
ペプチド中の形式的でないアミノ酸を以下のように省略する：１−ナフチルアラニンは、１−ｎａｌまたはＮｐ；２−ナフチルアラニンは、２−ｎａｌ；Ｎ−メチルグリシン（サルコシンとしてもまた公知）は、ＭｅＧ、ＳｃまたはＳａｒ；ホモセリンメチルエーテルは、Ｈｓｍ；そしてアセチル化グリシン（Ｎ−アセチルグリシン）は、ＡｃＧ。他の略語は、以下の表に提供する。
【００１５】
本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミド結合により一緒に連結したαアミノ酸であるアミノ酸モノマーのポリマーを指す。従って、ポリペプチドは、少なくとも２アミノ酸残基の長さであり、通常はより長い。一般的に、用語「ペプチド」は、数個のアミノ酸残基の長さしかないポリペプチドを指す。本発明の新規のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドは、好ましくは、約５０アミノ酸残基の長さにすぎない。これらは、より好ましくは、約１４〜約４５のアミノ酸残基長である。ペプチドとは対照的に、ポリペプチドは、多くのアミノ酸残基を含み得る。ゆえに、用語ポリペプチドは、ペプチドおよびより長い配列のアミノ酸を包含する。
【００１６】
本明細書において使用される場合、語句「薬学的に受容可能な」は、「一般的に安全とみなされる」分子実体および組成物、例えば、生理学的に許容可能であり、ヒトに投与された場合に、アレルギー反応または同様の不都合な反応（例えば、胃の不調、めまい感など）を典型的に生じさせない分子実体および組成物を指す。好ましくは、本明細書において使用される場合、用語「薬学的に受容可能な」は、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または動物（より好ましくはヒト）での使用について米国薬局方もしくは他の一般的に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリア」は、投与される化合物に含まれる希釈剤、アジュバント、またはビヒクルを指す。このような薬学的キャリアは、水および油などの無菌の液体であり得るものであり、これらの油としては、石油、動物、植物または合成起源のものが挙げられ、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などである。水または水溶液食塩水および水溶性デキストロースおよびグリセロール溶液が、特に注射溶液のためのキャリアとして好ましく使用される。適切な薬学的キャリアは、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【００１７】
本明細書において使用される場合、用語「アゴニスト」は、相補的な生物学的に活性なレセプターに結合し、そのレセプターを活性化して、レセプター中の生物学的反応を引き起こすか、またはレセプターの既に存在する生物学的活性を増強するような生物学的に活性なリガンドを指す。
【００１８】
本明細書において使用される略語は、以下の表および本明細書全体にわたって定義する。
【００１９】
【化１】
2008519858.tif 000002
2008519858.tif 000003
2008519858.tif 000004
さらに、以下は、その他の略語およびそれに関連した化合構造である。
【００２０】
【化２】
2008519858.tif 000005
2008519858.tif 000006
2008519858.tif 000007
2008519858.tif 000008
2008519858.tif 000009
（ＥＰＯ−Ｒアゴニストである新規ペプチド）
本発明は、ＥＰＯ−Ｒのアゴニストであって、かつ効力および活性の劇的な増強を示すペプチドに関する。これらのペプチドアゴニストは、好ましくは約１４アミノ酸長〜約４５アミノ酸長である。
【００２１】
本発明のペプチドは、モノマー、ホモダイマーもしくはヘテロダイマー、または他のホモマルチマーもしくはヘテロマルチマーであり得る。用語「ホモ」は、同一のモノマーを含むことを意味する。従って、例えば、本発明のホモダイマーは、２つの同一のモノマーを含むペプチドである。用語「ヘテロ」は、異なるモノマーを含むことを意味する。従って、例えば、本発明のヘテロダイマーは、同一でない２つのモノマーを含むペプチドである。本発明のペプチドマルチマーは、トリマー、テトラマー、ペンタマー、または他のより高次構造をとることができる。さらに、このようなダイマーおよび他のマルチマーは、ヘテロダイマーであってもヘテロマルチマーであってもよい。本発明のペプチドモノマーは、分解産物（例えば、メチオニンまたは脱アミド化グルタミン（deamidated glutamine）、アルギニン、およびＣ末端アミドの酸化産物）であってもよい。このような分解産物は、本発明において使用することができ、従って、本発明の一部とみなされる。好ましい実施形態において、本発明のヘテロマルチマーは、全てＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドである複数のペプチドを含む。より好ましい実施形態において、本発明のマルチマーは、ホモマルチマーである。すなわち、本発明のマルチマーは、同じアミノ酸配列の複数のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドを含む。
【００２２】
従って、本発明はまた、効力および活性の劇的な増強を示すＥＰＯ−Ｒのホモダイマーペプチドまたはヘテロダイマーペプチドのアゴニストに関する。好ましい実施形態において、本発明のダイマーは、両方がＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドである２つのペプチドを含む。これらの好ましいダイマーペプチドアゴニストは、２種のペプチドモノマーを含み、ここで各ペプチドモノマーは、約１４アミノ酸長〜約４５アミノ酸長である。特に好ましい実施形態において、本発明のダイマーは、同じアミノ酸配列の２つのＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドを含む。
【００２３】
２０種の慣習的なアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸（例えば、ａ，ａ二置換アミノ酸）、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非慣習的なアミノ酸も、本発明の化合物の適切な成分となり得る。非慣習的なアミノ酸の例としては、β−アラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ノルロイシン、および他の類似したアミノ酸およびイミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
他の改変もまた可能であり、これらとしては、アミノ末端の改変、カルボキシ末端の改変、天然に存在する遺伝的にコードされるアミノ酸の１個以上を非慣用的なアミノ酸で置換すること、側鎖の１個以上のアミノ酸残基の改変、ペプチドリン酸化などが挙げられる。好ましいアミノ末端改変は、（例えば、酢酸またはハロゲン置換酢酸を用いた）アセチル化である。好ましい実施形態において、Ｎ末端グリシンが、Ｎ−アセチルグリシン（ＡｃＧ）にアセチル化される。好ましい実施形態において、Ｃ末端グリシンはＮ−メチルグリシン（ＭｅＧ、サルコシンとしてもまた公知）である。
【００２５】
好ましい実施形態において、本発明のペプチドモノマーは、コア配列の２個のシステイン残基の間に分子内ジスルフィド結合を含む。
【００２６】
本発明はまた、これらのペプチドモノマーの結合体も提供する。従って、好ましい実施形態によると、本発明のモノマーペプチドは、ダイマー化またはオリゴマー化されており、そのことによってＥＰＯ−Ｒアゴニスト活性を増強する。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明のペプチドモノマーは、ビオチン／ストレプトアビジン系を使用してオリゴマー化することができる。ペプチドモノマーのビオチン化アナログは、標準的技術によって合成することができる。例えば、上記ペプチドモノマーは、Ｃ末端でビオチン化することができる。次いで、これらのビオチン化モノマーをストレプトアビジンと一緒にインキュベーションすること［例えば、４：１のモル比において、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）またはＨＥＰＥＳ緩衝化ＲＰＭＩ培地（Invitrogen）中で室温で１時間］によってオリゴマー化する。この実施形態のバリエーションにおいて、ビオチン化ペプチドモノマーは、多くの市販の抗ビオチン抗体のうちのいずれか１つ［例えば、Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (Washington, DC)から市販されるヤギ抗ビオチンＩｇＧ］と一緒にインキュベートすることによってオリゴマー化することができる。
【００２８】
好ましい実施形態において、本発明のペプチドモノマーは、少なくとも１つのリンカー部分へ共有結合することによってダイマー化される。上記リンカー（ＬK）部分は、（必須ではないが）好ましくは、必要に応じて１個または２個の−ＮＨ−結合を末端として有し、必要に応じて１個以上の利用可能な炭素原子において低級アルキル置換基で置換されているＣ1-12連結部分である。好ましくは、上記リンカーＬKは−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−を含み、式中、Ｒは、（例えば、固体支持体の表面上に存在し得るような）別の分子部分に結合することができるカルボキシル基またはアミノ基などの官能基で置換された低級（Ｃ1-6）アルキレンである。最も好ましくは、上記リンカーは、リジン残基またはリジンアミド（カルボキシル基がアミド部分（−ＣＯＮＨ2）に変換されているリジン残基）である。好ましい実施形態において、上記リンカーは、２つのペプチドモノマーのＣ末端を、各モノマーのＣ末端アミノ酸に同時に結合することによって架橋する。
【００２９】
例えば、Ｃ末端リンカーＬKがリジンアミドである場合、このダイマーは、式Ｉに示すように構造的に説明することができ、そして式ＩＩに示すように要約することができる：
【００３０】
【化３】
2008519858.tif 000010
式Ｉおよび式ＩＩにおいて、Ｎ2は、リジンのε−アミノ基の窒素原子を表し、そしてＮ1は、リジンのα−アミノ基の窒素原子を表す。ダイマー構造は、以下のように書くことができる：［ペプチド］2Ｌｙｓ−アミド（リジンのα−アミノ基とε−アミノ基との両方に結合するペプチドを示す）、または［Ａｃ−ペプチド］2Ｌｙｓ−アミド（リジンのα−アミノ基とε−アミノ基との両方に結合するＮ末端アセチル化ペプチドを示す）、または［Ａｃ−ペプチド、ジスルフィド］2Ｌｙｓ−アミド（リジンのα−アミノ基とε−アミノ基との両方に結合したＮ末端アセチル化ペプチドで、各ペプチドが分子内ジスルフィドループを有するものを示す）、または［Ａｃ−ペプチド、ジスルフィド］2Ｌｙｓ−スペーサー−ＰＥＧ（リジンのαアミノ基とεアミノ基との両方に結合するＮ末端アセチル化ペプチドで、各ペプチドが、リジンのＣ末端とＰＥＧ部分との間で共有結合を形成する分子内ジスルフィドループおよびスペーサー分子を含むものを示す）、または［Ａｃ−ペプチド−Ｌｙｓ*−ＮＨ2］2−イミノ二酢酸−Ｎ−（Ｂｏｃ−βＡｌａ）（Ｃ末端リジンアミド残基を有するＮ末端アセチル化ペプチドのホモダイマーであって、リジンのεアミンはイミノ二酢酸の２個のカルボキシル基の各々に結合し、そしてＢｏｃ−β−アラニンは、アミド結合を介したイミノ二酢酸の窒素原子に共有結合しているものを示す）。
【００３１】
さらなる実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、２個のペプチドモノマーをダイマー化するリンカーＬKとして役立ち得る：例えば、単一のＰＥＧ部分は、ペプチドダイマーの両方のペプチド鎖のＮ末端に同時に結合することができる。
【００３２】
別のなおさらなる実施形態において、上記リンカー（ＬK）部分は、（必須ではないが）好ましくは２個のカルボン酸を含み、１個以上の利用可能な原子において、１個以上のＰＥＧ分子に結合し得るアミンなどのさらなる官能基で必要に応じて置換されている分子である。このような分子は、以下のように示すことができる：
−ＣＯ−（ＣＨ2）n−Ｘ−（ＣＨ2）m−ＣＯ−
式中、ｎは０〜１０の整数であり、ｍは１〜１０の整数であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＣＨ2）pＮＲ1、ＮＣＯ（ＣＨ2）pＮＲ1、およびＣＨＮＲ1から選択され、Ｒ1は、Ｈ、Ｂｏｃ、Ｃｂｚなどから選択され、そしてｐは１〜１０の整数である。
【００３３】
好ましい実施形態において、上記ペプチドの各々の１つのアミノ基は、リンカーＬKと共にアミド結合を形成する。特に好ましい実施形態において、リンカーＬKに結合するペプチドのアミノ基は、リジン残基のεアミンもしくはＮ末端残基のαアミン、または任意のスペーサー分子のアミノ基である。特に好ましい実施形態において、ｎおよびｍは、両方とも１であり、ＸはＮＣＯ（ＣＨ2）pＮＲ1であり、ｐは２であり、そしてＲ1はＢｏｃである。このような好ましいリンカーを含むダイマーＥＰＯペプチドは、式ＩＩＩに示すように構造的に説明することができる。
【００３４】
【化４】
2008519858.tif 000011
必要に応じて、Ｂｏｃ基を除去して、適切に活性化された水溶性ポリマー種（例えば、ｍＰＥＧ−パラ−ニトロフェニルカーボネート（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド−ＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）などのＰＥＧ種）と共有結合を形成し得る反応性アミン基を遊離させることができる（例えば、米国特許第5,672,662号を参照のこと）。このような好ましいリンカーを含むダイマーＥＰＯペプチドは、式ＩＶに示すように構造的に説明することができる。
【００３５】
【化５】
2008519858.tif 000012
必須ではないが一般的に、ペプチドダイマーはまた、ペプチドモノマーのシステイン残基の間に１個以上の分子内ジスルフィド結合を含む。好ましくは、２つのモノマーは、少なくとも１つの分子内ジスルフィド結合を含む。最も好ましくは、ペプチドダイマーの両方のモノマーは、各モノマーが環状基を含むように分子内ジスルフィド結合を含む。
【００３６】
ペプチドモノマーまたはペプチドダイマーは、１つ以上のスペーサー部分をさらに含み得る。このようなスペーサー部分は、ペプチドモノマーまたはペプチドダイマーに結合することができる。好ましくは、このようなスペーサー部分は、ペプチドダイマーのモノマーをつなぐリンカーＬK部分に結合する。例えば、このようなスペーサー部分は、リジンリンカーのカルボニル炭素を介して、またはイミノ二酢酸リンカーの窒素原子を介してペプチドダイマーに結合することができる。例えば、このようなスペーサーは、ペプチドダイマーのリンカーを、結合した水溶性ポリマー部分または保護基につなぐことができる。別の例において、このようなスペーサーは、結合した水溶性ポリマー部分にペプチドモノマーをつなぐことができる。
【００３７】
１つの実施形態において、上記スペーサー部分は、必要に応じて−ＮＨ−結合またはカルボキシル（−ＣＯＯＨ）基を末端とし、必要に応じて１個以上の利用可能な炭素原子において低級アルキル置換基で置換されているＣ1-12連結部分である。１つの実施形態において、上記スペーサーはＲ−ＣＯＯＨであり、ここでＲは、別の分子部分に結合し得るカルボキシル基またはアミノ基などの官能基で必要に応じて置換された低級（Ｃ1-6）アルキレンである。例えば、上記スペーサーは、グリシン（Ｇ）残基であってもよいし、アミノヘキサン酸であってもよい。好ましい実施形態において、このアミノヘキサン酸は、６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）である。例えば、上記スペーサー６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）がペプチドのＮ末端に結合する場合、そのペプチド末端のアミン基は、標準的なアミドカップリングを介してＡｈｘのカルボニル基に連結することができる。別の例において、ＡｈｘがペプチドのＣ末端に結合する場合、Ａｈｘのアミンは、標準的なアミドカップリングを介してリンカーのカルボキシル基に連結することができる。このようなペプチドの構造は、式Ｖに示すことができ、そして式ＶＩに示すように要約することができる。
【００３８】
【化６】
2008519858.tif 000013
他の実施形態において、上記スペーサーは、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−であり、ここでＲは、別の分子部分に結合し得るカルボニル基またはアミノ基などの官能基で置換された低級（Ｃ1-6）アルキレンである。例えば、上記スペーサーは、リジン（Ｋ）残基またはリジンアミド（Ｋ−ＮＨ2、カルボキシル基がアミド部分（−ＣＯＮＨ2）に変換されているリジン残基）であり得る。
【００３９】
好ましい実施形態において、上記スペーサー部分は、以下の構造を有する：
−ＮＨ−（ＣＨ2）α−［Ｏ−（ＣＨ2）β］γ−Ｏδ−（ＣＨ2）ε−Ｙ−
式中、α、β、γ、δおよびεは、各々独立に選択される値の整数である。好ましい実施形態において、γが１より大きく、βが２であり、そしてＹがＮＨまたはＣＯから選択される場合を除いて、α、βおよびεは、各々、１〜約６から独立して選択される値の整数であり、δは０または１であり、γは０〜約１０から選択される整数である。特に好ましい実施形態において、α、βおよびεは、各々２以上であり、γとδの両方は、１と等しく、そしてＹはＮＨである。例えば、このようなスペーサーを含むペプチドダイマーは、式ＶＩＩに図形的に説明される。図中、リンカーはリジンであり、スペーサーがこのリンカーをＢｏｃ保護基に連結してしいる。
【００４０】
【化７】
2008519858.tif 000014
別の特に好ましい実施形態において、γおよびδは０であり、αおよびεはまとめて５に等しく、そしてＹはＣＯである。
【００４１】
特に好ましい実施形態において、リンカーに加えてスペーサー部分は、式ＶＩＩＩまたは式ＩＸに示される構造を有する。
【００４２】
【化８】
2008519858.tif 000015
本発明のペプチドモノマー、ペプチドダイマー、またはペプチドマルチマーは、１つ以上の水溶性ポリマー部分をさらに含み得る。好ましくは、これらのポリマーは、本発明のペプチド化合物に共有結合している。好ましくは、治療的に使用する最終産物調製のために、このポリマーは薬学的に受容可能である。当業者は、ポリマーペプチド結合体が治療的に使用されるかどうかということ、そしてその場合の所望の投薬量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性、および他の考察に基づいて所望のポリマーを選択することができる。上記水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドのコポリマー、およびポリオキシエチル化ポリオールであり得る。好ましい水溶性ポリマーはＰＥＧである。
【００４３】
上記ポリマーは、任意の分子量であってよく、分岐状でも非分岐状でもよい。本発明において使用するための好ましいＰＥＧは、１０キロダルトン（ｋＤ）よりも大きい分子量（より好ましくは、約２０ｋＤと６０ｋＤとの間の分子量）を有する直鎖状の非分岐ＰＥＧを含む。なおより好ましくは、この直鎖状非分岐ＰＥＧ部分は、約２０ｋＤと４０ｋＤとの間の分子量を有するべきであり、２０ｋＤのＰＥＧが特に好ましい。ＰＥＧの所定の調製において、その分子量は、典型的には個々の分子の間で異なることが理解される。示される分子量よりも、一部の分子量は大きく、一部の分子量は小さい。このようなバリエーションは、一般的に、ＰＥＧ分子の分子量を記載するために用語「約」を使用することによって反映される。
【００４４】
結合するポリマー分子の数は異なる場合がある；例えば、１個、２個、３個またはそれ以上の水溶性ポリマーが、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドに結合することができる。複数の結合ポリマーは、同じ化学部分である場合もあるし、異なる化学部分（例えば、異なる分子量のＰＥＧ）である場合もある。従って、好ましい実施形態において、本発明は、そこに結合される２個以上のＰＥＧ部分を有するＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドを意図する。好ましくは、ＰＥＧ部分の両方は、各々、約１０ｋＤと約６０ｋＤとの間の分子量を好ましくは有する、直鎖状の非分岐ＰＥＧである。より好ましくは、各直鎖状の非分岐ＰＥＧ部分は、約２０ｋＤと４０ｋＤとの間の分子量を有し、さらに好ましくは、約２０ｋＤと３０ｋＤとの間であり、各直鎖状ＰＥＧ部分について約２０ｋＤの分子量が特に好ましい。しかし、ＰＥＧに関して他の分子量もまた、このような実施形態において企図される。例えば、本発明は、そこに結合する２種以上の直鎖状非分岐ＰＥＧ部分を有するＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドを企図および包含し、そのＰＥＧ部分の少なくとも一方または両方は、約２０ｋＤと４０ｋＤとの間または約２０ｋＤと約３０ｋＤとの間の分子量を有する。他の実施形態において、本発明は、そこに結合する２種以上の直鎖状非分岐ＰＥＧ部分を有するＥＰＯ−Ｒアゴニストを企図および包含し、そのＰＥＧ部分の少なくとも一方は、約４０ｋＤと６０ｋＤとの間の分子量を有する。
【００４５】
１つの実施形態において、ＰＥＧは、２つのペプチドモノマーをダイマー化するリンカーとして役立ち得る。１つの実施形態において、ＰＥＧは、ペプチドモノマーまたはペプチドダイマーの少なくとも一方の末端（Ｎ末端またはＣ末端）に結合する。別の実施形態において、ＰＥＧは、ペプチドモノマーまたはペプチドダイマーのスペーサー部分に結合する。好ましい実施形態において、ＰＥＧは、ペプチドダイマーのリンカー部分に結合する。特に好ましい実施形態において、ＰＥＧはスペーサー部分に結合し、ここでこのスペーサー部分は、ペプチドダイマーのモノマーをつなぐリンカーＬK部分に結合する。特に好ましい実施形態において、ＰＥＧは、スペーサー部分に結合し、ここでこのスペーサー部分は、リジンリンカーのカルボニル炭素またはリジンアミドリンカーのアミド窒素を介して、ペプチドダイマーに結合する。
【００４６】
本発明によって包含されるペプチドおよびペプチド配列は、ペプチドモノマーおよびペプチドダイマーを含み、図１Ａ〜１Ｋに示される。便宜上、これらの図に示した個々のペプチドおよびペプチド配列は、図１Ａ〜１Ｋの左側の欄に提供した配列同定番号（配列番号）を参照することによって、本明細書で説明される。
【００４７】
本発明のペプチド配列は、単独で存在してもよいし、ペプチド鎖のＮ末端／Ｃ末端の延長部分（extension）上に結合していてもよい。このような延長部分は、天然には存在しない配列を必要に応じて含む天然にコードされるペプチド配列である場合もあるし、天然には存在しない配列を実質的に含まない天然にコードされるペプチド配列である場合もある；この延長部分は、任意の付加、欠失、点変異、または当業者によって所望されるような他の配列の改変もしくは組み合わせを含み得る。例えば、そして限定ではなく、天然に存在する配列は、全長であっても部分長であってもよく、そして側鎖結合体を介して炭水化物、ＰＥＧ、他のポリマーなどの結合部位を提供するためのアミノ酸置換を含み得る。あるバリエーションにおいて、上記のアミノ酸置換により配列をヒト化して、ヒト免疫系との適合性を与える。非免疫グロブリンスペーサー配列を有するか、もしくは有さない本発明のＥＰＯ−Ｒ活性化配列に隣接する免疫グロブリン配列、またはこれに近接する免疫グロブリン配列を含む、全ての型の融合タンパク質が提供される。１つの型の実施形態は、重鎖および／または軽鎖の可変（Ｖ）領域の代わりにＥＰＯ−Ｒ活性化配列を有する免疫グロブリン鎖である。
【００４８】
（本発明のペプチド化合物の調製）
（ペプチド合成）
本発明のペプチドは、当該分野で公知の古典的な方法によって調製することができる。これらの標準的な方法としては、排除固相合成（exclusive solid phase synthesis）、部分的な固相合成方法、フラグメント濃縮、古典的な溶液合成、および組換えＤＮＡ技術が挙げられる［例えば、Merrifield J. Am. Chem. Soc. 1963 85:2149を参照のこと］。
【００４９】
１つの実施形態において、ペプチドモノマーからなるペプチドダイマーは、個々に合成され、その後ダイマー化されて合成される。好ましい実施形態において、上記ペプチドモノマーのダイマーは、同じアミノ酸配列を有する。
【００５０】
特に好ましい実施形態において、上記ペプチドモノマーのダイマーは、ペプチド合成のための開始部位として役立ち得る２個の官能基と、（例えば、固体支持体の表面上に存在することができるような）別の分子部分に結合し得る第３の官能基（例えば、カルボキシル基またはアミノ基）とを有するリンカーＬK部分によって、それらのＣ末端を介して連結される。この場合において、２種のペプチドモノマーは、固相合成技術のバリエーションにおいて、リンカーＬK部分の２個の反応性窒素原子上で直接的に合成することができる。このような合成は、連続的であっても同時であってもよい。
【００５１】
リンカー上でダイマーのペプチド鎖の連側的な合成が実施される場合、そのリンカー分子の２個のアミン官能基は、直角的に除去され得る（orthogonally removable）２個の異なるアミン保護基で保護される。好ましい実施形態において、上記保護ジアミンは保護リジンである。保護リンカーは、リンカーの第３の官能基を介して固体支持体に連結される。第１のアミン保護基を除去し、その第１の保護アミン部分上でダイマーの第１のペプチドを合成する。次いで、第２のアミン保護基を除去し、その第２の保護アミン部分上でダイマーの第２のペプチドを保護する。例えば、上記リンカーの第１のアミノ部分は、Ａｌｌｏｃで保護することができ、第２のアミノ部分は、Ｆｍｏｃで保護することができる。この場合において、Ｆｍｏｃ基（Ａｌｌｏｃ基ではない）は、穏やかな塩基［例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジン］で処置することによって除去することができ、第１のペプチド鎖が合成される。その後、Ａｌｌｏｃ基を適切な試薬［例えば、Ｐｄ（ＰＰｈ3）／４−メチルモルホリンおよびクロロホルム］で除去することができ、第２のペプチド鎖が合成される。この技術を使用して、２種のペプチド鎖の配列が同一であるダイマーまたは異なるダイマーを作製することができる。ジスルフィド結合形成を制御するために、システインについて異なるチオール保護基が使用される場合（以下に議論する）、ダイマーのペプチド鎖の最終的なアミノ酸配列が同一である場合でさえ本技術を使用しなければならないことに注意されたい。
【００５２】
リンカー上でダイマーのペプチド鎖の同時合成を実施する場合、リンカー分子の２個のアミン官能基は、同じ除去可能なアミン保護基によって保護される。好ましい実施形態において、上記保護ジアミンは、保護リジンである。保護リンカーは、リンカーの第３の官能基を介して固体支持体に連結される。この場合において、上記リンカー分子の２個の保護官能基は、同時に脱保護され、そして２種のペプチド鎖が、脱保護アミン上で同時に合成される。この技術を使用すると、上記ダイマーのペプチド鎖の配列は同一であり、システイン残基についてのチオール保護基は全て同じであることに注意されたい。
【００５３】
ペプチド合成のための好ましい方法は、固相合成である。固相ペプチド合成手順は、当該分野で周知である［例えば、Stewart Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co.: San Francisco) 1969; Novabiochem Corp, San Diego, USAからの2002/2003 General Catalog; Goodman Synthesis of Peptides and Peptidomimetics (Houben-Weyl, Stuttgart) 2002を参照のこと］。固相合成において、合成は、典型的に、α−アミノ保護樹脂を使用してペプチドのＣ末端から開始される。例えば、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ポリスチレン樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂などに必要とされるα−アミノ酸を結合することによって、適切な出発物質を調製することができる。このようなクロロメチル化樹脂の１つは、Bio Rad Laboratories (Richmond, CA)によって商品名BIO-BEADS SX-1で販売されている。ヒドロキシメチル樹脂の調製は記載されている［Bodonszky, et al. (1966) Chem. Ind. London 38:1597］。ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂は記載されており［Pietta and Marshall (1970) Chem. Commun. 650］、塩酸塩形態がBeckman Instruments, Inc. (Palo Alto, CA)から市販されている。例えば、α−アミノ保護アミノ酸は、Gisin (1973) HeIv. Chim. Acta 56:1467によって記載された方法に従って、炭酸水素セシウム触媒を用いてクロロメチル化樹脂に結合させることができる。
【００５４】
最初のカップリングの後、例えば、室温で有機溶媒中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または塩酸（ＨＣｌ）の溶液を使用して、α−アミノ保護基を除去する。その後、α−アミノ保護アミノ酸は、支持体に結合した伸長するペプチド鎖に首尾よくカップリングする。α−アミノ保護基は、ペプチドの段階的合成の分野で有用であることが公知であり、これらとしては、アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基［例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）および置換Ｃｂｚ］、脂肪族ウレタン保護基［例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル］、およびアルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ならびに１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）が挙げられる。
【００５５】
側鎖保護基（典型的には、エーテル、エステル、トリチル、ＰＭＣ（２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル）など）は、カップリングの間変化しないままであり、アミノ末端保護基の脱保護の間またはカップリングの間、分解されない。この側鎖保護基は、最終ペプチドの合成が完了した際に、標的ペプチドを変化させない反応条件のもとで除去可能でなければならない。Ｔｙｒについての側鎖保護基としては、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、Ｚ−Ｂｒ−Ｃｂｚおよび２，５−ジクロロベンジルが挙げられる。Ａｓｐについての側鎖保護基としては、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。ＴｈｒおよびＳｅｒについての側鎖保護基としては、アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジルおよびＣｂｚが挙げられる。Ａｒｇについての側鎖保護基としては、ニトロ、トシル（Ｔｏｓ）、Ｃｂｚ、アダマンチルオキシカルボニルメシトイルスルホニル（mesitoylsulfonyl）（Ｍｔｓ）、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）またはＢｏｃが挙げられる。Ｌｙｓについての側鎖保護基としては、Ｃｂｚ、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｃｂｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｃｂｚ）、ＴｏｓまたはＢｏｃが挙げられる。
【００５６】
α−アミノ保護基を除去した後、残りの保護アミノ酸を所望の順番で段階的にカップリングする。各保護アミノ酸は、一般的に、溶液中（例えば、塩化メチレン（ＣＨ2Ｃｌ2）、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはこれらの混合物中）で、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３テトラメチルウロニウム（tetramethyluronium）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）またはジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などの適切なカルボキシ基活性化剤を使用することによって、約３倍過剰で反応させる。
【００５７】
所望のアミノ酸配列が完成した後、所望のペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはフッ化水素（ＨＦ）などの試薬で処理することによって、樹脂支持体から脱カップリングされる。これは、樹脂からペプチドを切断するだけでなく、全ての残りの側鎖保護基も切断する。クロロメチル化樹脂を使用する場合、フッ化水素で処理すると、遊離ペプチド酸が形成される。ベンズヒドリルアミンを使用する場合、フッ化水素で処理すると、遊離のペプチドアミドが直接生じる。あるいは、クロロメチル化樹脂を使用する場合、側鎖保護ペプチドは、アンモニアでペプチド樹脂を処理することによって脱保護され、所望の側鎖保護アミドを得ることができるか、またはアルキルアミンで処理することによって脱保護され、側鎖保護のアルキルアミドまたはジアルキルアミドを得ることができる。次いで、フッ化水素で処理することによって通常の様式で側鎖保護を除去し、遊離のアミド、アルキルアミドまたはジアルキルアミドを生じる。本発明のエステルを調製する際に、ペプチド酸を調製するために使用される樹脂を用い、側鎖保護ペプチドを塩基および適切なアルコール（例えば、メタノール）で切断する。次いで、フッ化水素で処理することによって通常の様式で側鎖保護基を除去し、所望のエステルを得る。
【００５８】
これらの手順はまた、２０個の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸を含むペプチドを合成するために使用することができ、遺伝的にコードされたアミノ酸は、任意の本発明の化合物の１個、２個またはそれ以上の位置で置換されている。本発明のペプチドに置換され得る合成アミノ酸としては、Ｎ−メチル、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル、δアミノ酸（Ｌ−δ−ヒドロキシリシルおよびＤ−δ−メチルアラニル）、Ｌ−α−メチルアラニル、βアミノ酸、およびイソキノリルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｄ−アミノ酸および天然には存在しない合成アミノ酸も、本発明のペプチドに組み込むことができる。
【００５９】
（ペプチド改変）
本発明のペプチド化合物のアミノ末端および／またはカルボキシ末端を改変して、本発明の他の化合物を生成することができる。アミノ末端改変としては、以下が挙げられる：メチル化（例えば、−ＮＨＣＨ3または−Ｎ（ＣＨ3）2）、アセチル化（例えば、酢酸またはそのハロゲン化誘導体（例えば、α−クロロ酢酸、α−ブロモ酢酸、またはα−ヨード酢酸）を使用）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基の付加、またはＲＣＯＯ−で定義されるカルボン酸官能基またはＲ−ＳＯ2−によって定義されるスルホニル官能基を含む任意の遮断基でのアミノ末端の遮断（ここでＲは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールなど、および類似の基から選択される）。Ｎ末端にデスアミノ酸（desamino acid）を組み込んで（従って、Ｎ末端アミノ酸は存在しない）、プロテアーゼに対する感受性を低下させるか、またはペプチド化合物のコンフォメーションを限定することもできる。好ましい実施形態において、上記Ｎ末端はアセチル化されている。特に好ましい実施形態において、Ｎ末端グリシンをアセチル化して、Ｎ−アセチルグリシン（ＡｃＧ）が生じる。
【００６０】
カルボキシ末端改変としては、構造的拘束を導入するためのカルボキシアミド基での遊離酸の置換、またはカルボキシ末端での環状ラクタムの形成が挙げられる。本発明のペプチドを環状化するか、ペプチドの末端にデスアミノ残基またはデスカルボキシ残基を導入して（従って、末端アミノ基または末端カルボキシル基は存在しない）、プロテアーゼに対する感受性を低下させることができるか、またはペプチドのコンフォメーションを制限することができる。本発明の化合物のＣ末端官能基としては、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、およびカルボニル、およびこれらの低級エステル誘導体、ならびにこれらの薬学的に受容可能な塩が挙げられる。
【００６１】
２０個の遺伝的にコードされたアミノ酸（または立体異性体Ｄアミノ酸）の天然に存在する側鎖は、例えば、アルキル、低級アルキル、環状の４員、５員、６員から７員のアルキル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびこれらの低級エステル誘導体などの基、ならびに４員、５員、６員から７員の複素環を有する他の側鎖で置換することができる。特に、プロリン残基の環サイズが５員から４員、６員または７員に変更されたプロリンアナログを使用することができる。環状基は、飽和であっても不飽和であってもよく、不飽和である場合は、芳香族であっても非芳香族であってもよい。好ましくは、複素環式基は、１個以上の窒素、酸素および／または硫黄のヘテロ原子を含む。このような基の例としては、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、モルホリニル（例えば、モルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば、１−ピペラジニル）、ピペリジル（例えば、１−ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（例えば、１−ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例えば、チオモルホリノ）およびトリアゾリルが挙げられる。これらの複素環式基は、置換されていても置換されていなくてもよい。基が置換されている場合、その置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、または置換フェニルもしくは非置換フェニルであり得る。
【００６２】
リン酸化および他の方法によって、ペプチドを容易に改変することもできる［例えば、Hruby, et al. (1990) Biochem J. 268:249-262に記載される］。
【００６３】
本発明のペプチド化合物はまた、類似の生物学的活性を有する非ペプチド化合物についての構造モデルとして役立つ。リードペプチド化合物と同じかまたは類似の所望の生物学的活性を有するが、溶解度、安定性、および加水分解およびタンパク質分解に対する感受性に関してリードペプチド化合物よりも好ましい活性を有する化合物を構築するために、種々の技術が利用可能であることを当業者は認識する［Morgan and Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252を参照のこと］。これらの技術は、ホスホネート、アミデート、カーバメート、スルホンアミド、第２級アミンおよびＮ−メチルアミノ酸から構成される骨格によるペプチド骨格の置換を含む。
【００６４】
（ジスルフィド結合の形成）
本発明の化合物は、１個以上の分子内ジスルフィド結合を含むことができる。１つの実施形態において、ペプチドモノマーまたはペプチドダイマーは、少なくとも１つの分子内ジスルフィド結合を含む。好ましい実施形態において、ペプチドダイマーは、２個の分子内ジスルフィド結合を含む。
【００６５】
このようなジスルフィド結合は、ペプチドコア配列のシステイン残基の酸化によって形成することができる。１つの実施形態において、システイン結合形成の制御は、所望の異性体の形成を最適化するのに有効な酸化剤の型および濃度を選択することによって行われる。例えば、２個の分子内ジスルフィド結合（各ペプチド鎖上に１個）を形成するためのペプチドダイマーの酸化は、酸化剤がＤＭＳＯである場合、（分子内ジスルフィド結合の形成より優先して）選択的に達成される。
【００６６】
好ましい実施形態において、システイン結合の形成は、ペプチド合成の間にチオール保護基を選択的に使用することによって制御される。例えば、２個の分子内ジスルフィド結合を有するダイマーが所望される場合、第１のモノマーペプチド鎖が、第１のチオール保護基［例えば、トリチル（Ｔｒｔ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、および１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）など］によって保護されたコア配列の２個のシステイン残基を有するように合成され、次いで、第２のモノマーペプチドが、第１のチオール保護基とは異なる第２のチオール保護基［例えば、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）など］で保護されたコア配列の２個のシステイン残基を合成する。その後、第１のチオール保護基を除去して第１のモノマーの二硫化環化（bisulfide cyclization）が起こり、第２のチオール保護基を除去して第２のモノマーの二硫化環化が起こる。
【００６７】
本発明の他の実施形態は、硫黄の１つがＣＨ2基または硫黄についての他のアイソター（isotere）によって置換されている二硫化誘導体のアナログを提供する。これらのアナログは、本発明の化合物から調製することができ、このアナログにおいて各コア配列は、当該分野で公知の方法を使用した分子内置換または分子間置換を介して、第２のＣ残基の代わりに少なくとも１つのＣまたはホモシステイン残基およびα−アミノ−γ−酪酸を含む［例えば、Barker, et al. (1992) J. Med. Chem. 35:2040-2048 and Or, et al. (1991) J. Org. Chem. 56:3146-3149を参照のこと］。α−アミノ−γ酪酸およびホモシステインの他のホモログを使用して、この置換を行うことができることも、当業者には容易に理解される。
【００６８】
前述の環化ストラテジーに加えて、他の非ジスルフィドペプチド環化ストラテジーを使用することができる。このような代替的な環化ストラテジーとしては、例えば、アミド環化ストラテジーならびにチオエーテル結合の形成に関連するストラテジーが挙げられる。従って、本発明の化合物は、分子内アミド結合または分子内チオエーテル結合のいずれかを有する環化形態で存在し得る。例えば、コア配列の１個のシステインがリジンで置換され、第２のシステインがグルタミン酸で置換されるようなペプチドを合成することができる。その後、これら２つの残基の側鎖の間のアミド結合を通じて、環状モノマーを形成することができる。あるいは、コア配列の１個のシステインがリジンで置換されているペプチドを合成することができる。次いで、側鎖のリジン残基とコア配列の第２のシステイン残基の間のチオールエーテル結合を通じて、環状モノマーを形成することができる。従って、ジスルフィド環化ストラテジーに加えて、アミド環化ストラテジーおよびチオエーテル環化ストラテジーが、本発明の化合物を環化するために両方とも容易に使用され得る。あるいは、上記ペプチドのアミノ末端は、α置換酢酸でキャッピングすることができ、ここでα置換基は、α−ハロ酢酸（例えば、α−クロロ酢酸、α−ブロモ酢酸、またはα−ヨード酢酸）などの遊離基である。
【００６９】
（リンカーの付加）
ペプチドダイマーがリンカーＬK部分によってダイマー化されている実施形態において、上記リンカーは、ペプチド合成の間にペプチドに組み入れることができる。例えば、リンカーＬK部分が、ペプチド合成のための開始部位として役立ち得る２個の官能基と、別の分子部分に結合し得る第３の官能基（例えば、カルボキシル基またはアミノ基）とを含む場合、このリンカーを固体支持体に結合体化することができる。その後、２つのペプチドモノマーは、固相合成技術のバリエーションにおいて、リンカーＬK部分の２個の反応性窒素基上に直接合成することができる。
【００７０】
ペプチドダイマーがリンカーＬK部分によってダイマー化される代替的な実施形態において、上記リンカーは、ペプチド合成の後に、ペプチドダイマーの２種のペプチドモノマーに結合体化することができる。このような結合体化は、当該分野で周知の方法によって達成することができる。１つの実施形態において、上記リンカーは、合成ペプチドモノマーの標的官能基に結合するために適切な少なくとも２個の官能基を含む。例えば、２個の遊離アミノ基を有するリンカーは、２種のペプチドモノマーの各々のＣ末端カルボキシル基と反応することができる。別の例において、２個のカルボキシル基を含むリンカーは、前もって処理されているか、または適切なカップリング試薬の存在下のいずれかにおいて、２種のペプチドモノマーの各々のＮ末端もしくは側鎖アミン基、またはＣ末端リジンアミドと反応することが可能である。
【００７１】
（スペーサーの付加）
ペプチド化合物がスペーサー部分を含む実施形態において、上記スペーサーは、ペプチド合成の間にペプチドに組み込むことができる。例えば、スペーサーが、遊離アミノ基と、別の分子部分に結合し得る第２の官能基（例えば、カルボキシル基またはアミノ基）とを含む場合、このスペーサーは、固体支持体に結合体化することができる。その後、標準的な固相技術によって、スペーサーの遊離アミノ基上にペプチドを直接合成することができる。
【００７２】
好ましい実施形態において、２個の官能基を含むスペーサーが、第１の官能基を介して固体支持体にまず連結される。次に、ペプチド合成のための開始部位として役立ち得る２個の官能基と、別の分子部分に結合し得る第３の官能基（例えば、カルボキシル基またはアミノ基）とを有するリンカーＬK部分が、スペーサーの第２の官能基とリンカーの第３の官能基とを介してスペーサーに結合体化する。その後、２種のペプチドモノマーは、固相合成技術のバリエーションにおいて、リンカーＬK部分の２個の反応性窒素基上で直接反応させることが可能である。例えば、固体支持体に連結された遊離アミン基を有するスペーサーは、そのリンカーの遊離カルボキシル基を介してリジンリンカーと反応することができる。
【００７３】
上記ペプチド化合物がスペーサー部分を含む代替的な実施形態において、上記スペーサーは、ペプチド合成の後にペプチドに結合体化することができる。このような結合体化は、当該分野で周知の方法によって達成することができる。１つの実施形態において、上記リンカーは、合成ペプチドの標的官能基に結合するために適切な少なくとも１つの官能基を含む。例えば、遊離アミン基を有するスペーサーは、ペプチドのＣ末端カルボキシル基と反応し得る。別の例において、遊離カルボキシル基を有するリンカーは、ペプチドのＮ末端またはリジン残基の遊離アミン基と反応し得る。さらに別の例において、遊離スルフヒドリル基を含むスペーサーは、酸化によってペプチドのシステイン残基に結合体化してジスルフィド結合を形成することができる。
【００７４】
（水溶性ポリマーの結合）
以下の説明に加えて、米国特許出願番号10/844,933および国際出願PCT/US04/14887（２００４年５月１２日出願）は、本明細書においてその全体が参考として援用される。
【００７５】
近年、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーが、治療および診断の重要性を有するペプチドを共有結合改変するために使用されている。このようなポリマーを結合させて、生物学的活性を増強し、血液循環時間を延長し、免疫原性を低下させ、水溶解度を増加し、そしてプロテアーゼ消化に対する耐性を増強することが考えられる。インビボでの半減期を延長し、および／または免疫原性および抗原性を低減するために、例えば、インターロイキン（Knauf, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263; 15064; Tsutsumi, et al. (1995) J. Controlled Release 33:447）、インターフェロン（Kita, et al. (1990) Drug Des. Delivery 6:157)、カタラーゼ(Abuchowski, et al. (1977) J. Biol. Chem. 252:582）、スーパーオキシドジスムターゼ（Beauchamp, et al. (1983) Anal. Biochem. 131:25）、およびアデノシンデアミナーゼ（Chen, et al. (1981) Biochim. Biophy. Acta 660:293）などの治療ポリペプチドへのＰＥＧの共有結合が報告されている。
【００７６】
本発明のペプチド化合物は、１つの水溶性ポリマー部分をさらに含み得る。好ましくは、これらのポリマーは、上記ペプチド化合物に共有結合する。上記水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれも）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、およびポリオキシエチレン化ポリオールであり得る。好ましい水溶性ポリマーは、ＰＥＧである。
【００７７】
本発明のペプチド、ペプチドダイマーおよび他のペプチドベースの分子は、分子のレセプター結合部分（例えば、ペプチド＋スペーサー）に水溶性ポリマーを連結するための種々の化学的性質のいずれかを使用して、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）に結合することができる。典型的な実施形態は、上記水溶性ポリマーをレセプター結合部分に共有結合するための単一の結合接続（attachment junction）を使用するが、代替的な実施形態においては、複数の結合接続を使用することができる。代替的な実施形態としては、異なる種の水溶性ポリマーが、別個の結合接続においてレセプター結合部分に結合し、スペーサーおよび／または一方もしくは両方のペプチド鎖への共有結合接続を含み得るようなさらなるバリエーションが挙げられる。いくつかの実施形態において、ダイマーまたは高次マルチマーは、別個の種のペプチド鎖（すなわち、ヘテロダイマーまたは他のヘテロマルチマー）を含む。限定ではなく例のために、ダイマーは、ＰＥＧ結合接続を有する第１のペプチド鎖を含み得るものであり、そして第２のペプチド鎖は、ＰＥＧ結合接続を欠いているか、または上記第１のペプチド鎖とは異なる結合化学性質を利用することができるかのいずれかである。いくつかのバリエーションにおいて、スペーサーは、ＰＥＧ結合接続を含んでいても含んでいなくてもよく、このスペーサーは、ＰＥＧ化されている場合には、第１のペプチド鎖および／または第２のペプチド鎖とは異なる結合化学性質を利用することができる。代替的な実施形態は、スペーサー部分のレセプター結合部分に結合したＰＥＧと、分子のペプチド部分の１個のアミノ酸の側鎖に結合体化した異なる水溶性ポリマー（例えば、炭化水素）とを使用する。
【００７８】
多種多様なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）種を、レセプター結合部分（ペプチド＋スペーサー）をＰＥＧ化するために使用することができる。実質的に全ての適切な反応性ＰＥＧ試薬を使用することができる。好ましい実施形態において、この反応性ＰＥＧ試薬は、レセプター結合部分への結合体化の際に、カルバメート結合またはアミド結合を形成する。適切な反応性ＰＥＧ種としては、NOF Corporation (Yebisu Garden Place Tower, 20-3 Ebisu 4-chome, Shibuya-ku, Tokyo 150- 6019)のDrug Delivery Systems catalog (2003) およびNektar Therapeutics (490 Discovery Drive, Huntsville, Alabama 35806)のMolecular Engineering catalog (2003)で市販されているものが挙げられるが、これらに限定されない。限定ではなく例として、以下のＰＥＧ試薬が、多くの場合、種々の実施形態において好ましい：ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、ｍＰＥＧ２−ＡＬＤ、マルチ−Ａｒｍ  ＰＥＧ、ｍＰＥＧ（ＭＡＬ）２、ｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）、ｍＰＥＧ−ＮＨ２、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ、ｍＰＥＧ−チオエステル、ｍＰＥＧ−Ｄｏｕｂｌｅ  Ｅｓｔｅｒｓ、ｍＰＥＧ−ＢＴＣ、ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ、ｍＰＥＧ−ＡＣＥＴ、ヘテロ官能性（heterofunctional）ＰＥＧ（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＶＳ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）、ＰＥＧアクリレート（ＡＣＲＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、ＰＥＧ−リン脂質（例えば、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＳＵＮＢＲＩＴＥシリーズの分岐状（multiarmed）ＰＥＧ（当業者によって選択される化学的性質によって活性化されるグリシンベースのＰＥＧのＧＬシリーズ、ＰＥＧで活性化される任意のＳＵＮＢＲＩＴＥ（カルボニル−ＰＥＧ、ｐ−ＮＰ−ＰＥＧ、Ｔｒｅｓｙｌ−ＰＥＧ、アルデヒドＰＥＧ、アセタール−ＰＥＧ、アミノ−ＰＥＧ、チオール−ＰＥＧ、マレイミド−ＰＥＧ、ヒドロキシル−ＰＥＧ−アミン、アミノ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ヒドロキシル−ＰＥＧ−アルデヒド、カルボン酸無水物型ＰＥＧ、官能化ＰＥＧ−リン脂質が挙げられるが、これらに限定されない）、ならびに特定の適用および使用についての当業者によって選択される他の類似の反応性ＰＥＧおよび／または適切な反応性ＰＥＧ。
【００７９】
上記ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分岐状であっても非分岐状であってもよい。本発明において使用するための好ましいＰＥＧは、約２０キロダルトン（ｋＤまたはｋＤａ）〜約４０ｋＤの分子量を有する直鎖状の非分岐ＰＥＧを含む（用語「約」は、ＰＥＧの調製において、述べられた分子量よりも一部の分子は重く、一部の分子は軽いことを示す）。最も好ましくは、ＰＥＧは、約３０ｋＤ〜約４０ｋＤの分子量を有する。所望の治療プロファイル（例えば、所望の徐放性放出の期間；存在する場合、生物学的活性に対する効果；取り扱いの容易さ；抗原性の程度または抗原性がないこと；および治療ペプチドに対するＰＥＧの他の公知の効果）に依存して、他のサイズを使用することができる。
【００８０】
結合するポリマー分子の数は、異なり得る；例えば、１個、２個、３個またはそれ以上の水溶性ポリマーが、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストに結合することができる。複数の結合したポリマーは、同じ化学部分であってもよいし、異なる化学部分（例えば、異なる分子量のＰＥＧ）であってもよい。いくつかの場合において、ポリマー結合の程度（ペプチドに結合したポリマー部分の数および／またはポリマーが結合するペプチドの総数）は、結合反応におけるペプチド分子に対するポリマー分子の割合によって、そして反応混合物中の各々の全体濃度によって影響され得る。一般的には、ペプチドに対するポリマーの最適な比（反応効率に関して、過剰な未反応のペプチド部分および／またはポリマー部分を生じない）は、ポリマー結合の所望の程度（例えば、モノ−、ジ−、トリ−など）、選択されたポリマーの分子量、そのポリマーが分岐状であるか非分岐状であるかということ、そして特定の結合方法についての反応条件などの因子によって決定される。
【００８１】
好ましい実施形態において、共有結合させる水溶性ポリマーはＰＥＧである。説明の目的のために、ＰＥＧの共有結合（ＰＥＧ化）についての方法の例を以下に記載する。これらの説明的な記載は、限定されるべきことを意図していない。当業者は、広範な水溶性ポリマーの共有結合についての種々の方法が当該分野で十分に確立されていることを認識する。従って、当該分野で公知の多くの結合方法のいずれかによって、当該分野で公知の多くの水溶性ポリマーのいずれかが結合しているペプチド化合物は、本発明によって包含される。
【００８２】
１つの実施形態において、ＰＥＧは、２種のペプチドモノマーをダイマー化するリンカーとして役立ち得る。１つの実施形態において、ＰＥＧは、ペプチドモノマーまたはペプチドダイマーの少なくとも１つの末端（Ｎ末端またはＣ末端）に結合する。別の実施形態において、ＰＥＧは、ペプチドモノマーまたはペプチドダイマーのスペーサー部分に結合する。好ましい実施形態において、ＰＥＧは、ペプチドダイマーのリンカー部分に結合する。特に好ましい実施形態において、ＰＥＧは、ペプチドダイマーのモノマーをつなぐリンカーＬK部分に結合しているスペーサー部分に結合する。より好ましくは、ＰＥＧは、リジンリンカーのカルボニル炭素またはリジンアミドリンカーのアミド窒素を介してペプチドダイマーに結合するスペーサー部分に結合する。
【００８３】
多くのＰＥＧ結合方法が当該分野で利用可能である。例えば、以下を参照のこと：Goodson, et al. (1990) Bio/Technology 8:343（部位指向性変異誘発の後のグリコシル化部位におけるインターロイキン−２のＰＥＧ化）；EP 0 401 384（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧのカップリング）； Malik, et al, (1992) Exp. Hematol. 20:1028-1035（塩化トレシル（tresyl chloride）を使用したＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化）；ＰＣＴ公開番号WO 90/12874（システイン特異的ｍＰＥＧ誘導体を使用して組換えによって導入されたシステイン残基を含むエリスロポエチンのＰＥＧ化）；米国特許第5,757,078号（ＥＰＯペプチドのＰＥＧ化）；および同第6,077,939号（ペプチドのＮ末端α−炭素のＰＥＧ化）。
【００８４】
例えば、ＰＥＧは、反応基を介してアミノ酸残基に共有結合することができる。反応基は、活性化されたＰＥＧ分子が結合することができる基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボニル基）である。例えば、Ｎ末端のアミノ酸残基またはリジン（Ｋ）残基は、遊離アミノ基を有し、そしてＣ末端のアミノ酸残基は、遊離カルボニル基を有する。スルフヒドリル（sulfnydryl）基は、（例えば、システイン残基上でみられる場合）ＰＥＧを結合するための反応基としても使用することができる。さらに、特にペプチドのＣ末端において活性基（例えば、ヒドラジド基、アルデヒド基、および芳香族アミノ基）を導入するための酵素促進型の方法が記載されている［Schwarz, et al. (1990) Methods Enzymol. 184:160; Rose, et al. (1991) Bioconjugate Chem. 2:154; Gaertner, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7224］。
【００８５】
例えば、ＰＥＧ分子は、異なる反応部分を有するメトキシ化ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）を使用して、ペプチドアミノ基に結合することができる。このようなポリマーとしては、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネート、ｍＰＥＧ−イミデート、ｍＰＥＧ−４−ニトロフェニルカーボネート、およびｍＰＥＧ−塩化シアニルが挙げられる。同様に、ＰＥＧ分子は、遊離アミン基を有するメトキシ化ＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＮＨ2）を使用して、ペプチドカルボニル基に結合することができる。
【００８６】
ＰＥＧの結合が非特異的であり、特異的なＰＥＧ結合を含むペプチドが所望される場合、ＰＥＧ化化合物の混合物から所望のＰＥＧ化化合物を精製することができる。例えば、Ｎ末端ＰＥＧ化ペプチドが所望される場合、ランダムにＰＥＧ化されたペプチド集団から上記Ｎ末端ＰＥＧ化形態を精製する（すなわち、他のモノＰＥＧ化部分からこの部分を分離する）ことができる。
【００８７】
好ましい実施形態において、ＰＥＧは、ペプチドに部位特異的に結合する。成長ホルモン放出因子の強力なアナログのＮ末端、側鎖、およびＣ末端での部位特異的なＰＥＧ化は、固相合成を通じて実施されている［Felix, et al. (1995) Int. J. Peptide Protein Res. 46:253］。別の部位特異的な方法は、Ｎ末端スレオニンの過ヨウ素酸ナトリウム酸化によって生成されるＮ末端において、反応性アルデヒド基を通じて部位特異的に、リポソームの表面にグラフト化されたＰＥＧ鎖にペプチドを結合する工程を包含する［Zalipsky, et al. (1995) Bioconj. Chem. 6:705］。しかし、本方法は、Ｎ末端のセリン残基またはスレオニン残基を有するポリペプチドに限定される。ヒドラゾン、還元ヒドラゾン、オキシム、または還元オキシムの結合を介したペプチドのＮ末端ＰＥＧ化のための別の部位特異的方法が、米国特許第6,077,939号（Wei, et al）に記載されている。
【００８８】
１つの方法において、選択的なＮ末端のＰＥＧ化は、特定のタンパク質の誘導体化のために利用可能な異なる型の第１級アミノ基（Ｎ末端に対するリジン）の差別的な反応性を利用する還元アルキル化によって達成することができる。適切な反応条件下で、ＰＥＧを含むカルボニル基は、ペプチドのＮ末端に選択的に結合する。例えば、ペプチドのリジン残基のεアミノ基とＮ末端残基のαアミノ基との間のｐＫaの差を利用するｐＨにおいて反応を実施することによって、タンパク質を選択的にＮ末端でＰＥＧ化することが可能である。このような選択的結合によって、ＰＥＧ化は、他の反応基（例えば、リジン側鎖アミノ基）を顕著に改変することなく、タンパク質のＮ末端において主に行われる。還元アルキル化を使用する場合、ＰＥＧは、タンパク質にカップリングするための一個の反応性アルデヒドを有していなければならない（例えば、ＰＥＧプロプリオンアルデヒド（proprionaldehyde）を使用することができる）。
【００８９】
部位特異的変異誘発は、部位特異的なポリマー結合のためのペプチドを調製するために使用することが可能なさらなるアプローチである。この方法によって、ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチド内の所望の位置で適切な反応基を組み込むように設計される。例えば、WO 90/12874には、システイン残基の挿入、またはシステイン残基のための他の残基の置換によって改変されたタンパク質の部位特異的ＰＥＧ化が記載されている。この公報にはまた、システイン特異的ｍＰＥＧ誘導体をＥＰＯ上で組換え的に導入してシステイン残基と反応させることによる、ｍＰＥＧ−エリスロポエチン（「ｍＰＥＧ−ＥＰＯ」）の調製も記載されている。
【００９０】
ＰＥＧがスペーサーまたはリンカーの部分に結合する場合、類似の結合方法を使用することができる。この場合において、上記リンカーまたはスペーサーは、反応基を含み、そして適切な相補的反応基を含む活性化ＰＥＧ分子を使用して、共有結合が生じる。好ましい実施形態において、上記リンカーまたはスペーサーの反応基は、適切に活性化されたＰＥＧ分子と反応して、アミドまたはカルバメートなどの安定な共有結合を生じる末端アミノ基を含む（すなわち、リンカーまたはスペーサーの末端に位置する）。適切な活性化ＰＥＧ種としては、ｍＰＥＧ−パラ−ニトロフェニルカーボネート（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）、およびｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好ましい実施形態において、リンカーまたはスペーサーの反応基は、適切な反応条件下でアミン含有ＰＥＧ分子と共有結合を形成するために活性化され得るカルボキシル基を含む。適切なＰＥＧ分子としては、ｍＰＥＧ−ＮＨ2が挙げられ、適切な反応条件としては、カルボジイミド媒介型アミド形成などが挙げられる。
【００９１】
（ＥＰＯ−Ｒアゴニスト活性アッセイ）
本発明の種々のペプチド化合物の生物学的活性（例えば、ＥＰＯ−Ｒアゴニストとしての活性）は、当該分野で周知の種々の方法のいずれによってもアッセイすることができる。例えば、国際特許出願番号PCT/US04/14886（２００４年５月１２日出願）を参照のこと。特定の好ましいアッセイの非限定的な例も本明細書において記載する。
【００９２】
（インビトロの機能アッセイ）
インビトロの競合結合アッセイによって、ＥＰＯ−Ｒへの結合についてＥＰＯと競合する試験ペプチドの能力を定量化する。例えば（例えば、米国特許第5,773,569号に記載のものを参照のこと）、ヒトＥＰＯ−Ｒの細胞外ドメイン（ＥＰＯ結合タンパク質、ＥＢＰ）をＥ．ｃｏｌｉにおいて組換え産生し、マイクロタイターディッシュまたは合成ビーズ（例えば、Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)から市販されるSulfolinkビーズ）などの固体支持体に組換えタンパク質を結合することができる。次いで、固定化ＥＢＰを、標識組換えＥＰＯとともに、または標識組換えＥＰＯおよび試験ペプチドとともにインキュベートする。このような実験のために、試験ペプチドの連続希釈が使用される。試験ペプチドを加えていないアッセイポイントは、ＥＢＰへの全ＥＰＯ結合を規定する。試験ペプチドを含む反応について、結合ＥＰＯの量を定量し、コントロール結合のパーセンテージ（全結合＝１００％）として表す。これらの値を、ペプチド濃度に対してプロットする。ＩＣ５０値は、ＥＢＰへのＥＰＯの結合を５０％まで低減させた試験ペプチドの濃度（すなわち、ＥＰＯ結合の５０％阻害）として定義する。
【００９３】
異なるインビトロの競合結合アッセイは、２個のビーズ（ＥＰＯ結合ビーズおよびＥＰＯ−Ｒ結合体化ビーズ）の近さに応じて生じる光シグナルを測定する。ビーズの近接性は、ＥＰＯのＥＰＯ−Ｒへの結合によってもたらされる。ＥＰＯ−Ｒへの結合についてＥＰＯと競合する試験ペプチドは、この結合を妨げ、それによって光放射を減少させる。光放射を５０％減少させる試験ペプチドの濃度は、ＩＣ５０値として定義される。
【００９４】
ＥＰＯ−レセプターに特異的に結合する本発明のモノマーペプチドおよびダイマーペプチドのＥＰＯ−Ｒアゴニストの生物学的活性および効力は、インビトロの細胞ベースの機能アッセイを使用して測定することができる。
【００９５】
１つのアッセイは、ヒトＥＰＯ−Ｒを発現し、ｆｏｓプロモーターに駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物でさらにトランスフェクトされたマウス前Ｂ細胞（pre-B-cell）株をベースにしている。ＥＰＯまたは別のＥＰＯ−Ｒアゴニストへ曝露すると、このような細胞は、ルシフェラーゼを合成することによって反応する。ルシフェラーゼは、その基質であるルシフェリンを添加すると、光の放出を引き起こす。従って、このような細胞でのＥＰＯ−Ｒ活性化レベルは、ルシフェラーゼ活性の測定を介して定量することができる。細胞に試験ペプチドの連続希釈液を添加し、次いで４時間インキュベートすることによって、試験ペプチドの活性を測定する。インキュベーションの後、細胞にルシフェリン基質を添加し、光放出を測定する。光の半値放出（half-maximal emission）を生じる試験ペプチドの濃度を、ＥＣ５０として記録する。
【００９６】
ＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲ細胞を使用して、別のアッセイを実施することができる［Dexter, et al. (1980) J. Exp. Med. 152:1036-1047］。この細胞は、ＥＰＯ−Ｒが安定にトランスフェクトされた細胞株に由来する、十分に特徴付けられた形質転換されていないマウス骨髄である。これらの細胞は、ＥＰＯ依存的な増殖を示す。
【００９７】
１つのこのようなアッセイにおいて、必要な成長因子の存在下において細胞を増殖させて、半定常密度にする（例えば、米国特許第5,773,569号に記載される）。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、成長因子を含まない完全培地中で１６〜２４時間飢餓状態にする。細胞の生存率を決定した後（例えば、トリパンブルー染色による）、ストック溶液（成長因子を含まない完全培地）を作製して５０μＬあたり約１０5細胞とする。試験されるべきペプチドＥＰＯ−Ｒアゴニスト化合物（典型的には、ファージ結合ペプチドまたは他の結合ペプチドまたは固定ペプチドとは対照的な遊離の液相ペプチド）の連続希釈液を、１ウェルあたり５０μＬの最終体積になるように９６ウェル組織培養プレートに作製する。細胞（５０μＬ）を各ウェルに添加し、この細胞を２４〜４８時間インキュベートする。この時点において、陰性対照は、死滅するか休止状態であるはずである。次いで、細胞増殖の指標としてＨ3−チミジン取り込みを測定するＭＴＴアッセイ［Mosmann (1983) J. Immunol. Methods 65:55-63を参照のこと］などの当該分野で公知の技術によって、細胞増殖を測定する。ＥＰＯ−Ｒ発現細胞株と親の非発現細胞株との両方に対して、ペプチドを評価する。最大細胞増殖の半分の増殖に必要な試験ペプチドの濃度を、ＥＣ５０として記録する。
【００９８】
別のアッセイにおいて、ＥＰＯ補充培地において細胞を定常期に成長させ、収集し、次いで、ＥＰＯを含まない培地中で１８時間さらに培養する。この細胞を細胞密度の等しい３つの群（添加因子を含まない群（陰性対照）、ＥＰＯを含む群（陽性対照）および試験ペプチドを含む実験群）に分ける。種々の時間ポイントで培養細胞を収集し、固定し、そしてＤＮＡ結合蛍光色素（例えば、ヨウ化プロピジウムまたはHoechst色素、両方ともSigmaから利用可能である）で染色する。次いで、例えば、FACSスキャンフローサイトメーターを使用して、蛍光を測定する。細胞周期の各期にある細胞の割合は、例えば、CeIIFITソフトウェアのSOBRモデル(Becton Dickinson)を使用して決定することができる。ＥＰＯで処理した細胞または活性ペプチドは、陰性対照群と比較して、Ｓ期にある細胞集団が多いことが示される（増加したＤＮＡ含有量の指標としての蛍光の増加によって決定する）。
【００９９】
類似のアッセイは、ＦＤＣＰ−１細胞株［例えば、Dexter et al. (1980) J. Exp. Med. 152:1036-1047を参照のこと］またはＴＦ−１細胞株［Kitamura, et al. (1989) Blood 73:375-380］を使用して実施することができる。ＦＤＣＰ−１は、ＷＥＨＩ−３ならし培地（ＩＬ−３を含む培地、ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６８）を補充した場合、増殖することはできるが、分化することはできない成長因子依存性のマウス多能性初代造血性前駆細胞株である。このような実験において、ＥＤＣＰ−１細胞株をヒトまたはマウスのＥＰＯ−Ｒでトランスフェクトして、それぞれＦＤＣＰ−１−ｈＥＰＯ−Ｒ細胞株またはＦＤＣＰ−１−ｍＥＰＯ−Ｒ細胞株を作製する。これらの細胞株は、ＥＰＯの存在下において増殖することはできるが、分化することはできない。ＥＰＯ依存性細胞株であるＴＦ−１は、細胞増殖に対するペプチドＥＰＯ−Ｒアゴニストの効果を測定するためにも使用することができる。
【０１００】
さらに別のアッセイにおいて、Ｈ3−チミジンの脾臓細胞への取り込みをベースにしたマイクロアッセイについてKrystal (1983) Exp. Hematol 11:649-660に記載された手順は、本発明の化合物がＥＰＯアゴニストとして役立つ能力を確認するために使用することができる。手短にいえば、Ｂ６Ｃ３Ｆ1マウスに、フェニルヒドラジン（６０ｍｇ／ｋｇ）を２日間毎日注射する。３日目に、脾臓細胞を取り出して、ＭＴＴアッセイを使用して２４時間にわたって増殖能力について確認する。
【０１０１】
エリスロポエチン反応性細胞株におけるＥＰＯ−ＲへのＥＰＯの結合は、レセプターと多くの細胞内タンパク質（Shc、vavおよびJAK2キナーゼを含む）との両方のチロシンリン酸化を誘導する。従って、別のインビトロアッセイは、本発明のペプチドがＥＰＯ−Ｒおよび下流の細胞内シグナルトランスデューサータンパク質のチロシンリン酸化を誘導する能力を測定する。上記に記載された結合アッセイおよび増殖アッセイによって同定される活性ペプチドは、エリスロポエチン反応性細胞においてＥＰＯのリン酸化パターンとほぼ同一のリン酸化パターンを誘発する。このアッセイについて、ＥＰＯ補充培地においてＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲ細胞［Dexter, et al. (1980) J Exp Med 152:1036-47］を維持し、定常期に成長させる。次いで、これらの細胞を、ＥＰＯを含まない培地で２４時間培養する。次に、このような一定数の細胞を、約１０分間３７℃で試験ペプチドと一緒にインキュベートする。ＥＰＯを含む細胞の対照サンプルも、各アッセイを行う。次に、処理した細胞を遠心分離によって収集し、ＳＤＳ溶解緩衝液中に再懸濁し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。ゲル中の電気泳動したタンパク質をニトロセルロースに移し、ブロット上のホスホチロシンを含むタンパク質を標準的な免疫学的技術によって可視化する。例えば、抗ホスホチロシン抗体（例えば、Upstate Biotechnology, Inc.から市販されるマウス抗ホスホチロシンＩｇＧ）を用いてブロットを調べ（probe）、洗浄し、次いで二次抗体［例えば、Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (Washington, DC)から市販されるペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ］で調べることができる。その後、比色定量アッセイ、化学発光アッセイ、または蛍光アッセイを含む標準的技術によって、ホスホチロシン含有タンパク質を可視化することができる。例えば、化学発光アッセイは、Amershamから市販されるECL Western Blotting Systemを使用して実施することができる。
【０１０２】
本発明のペプチドの活性を評価するために使用することができる別の細胞ベースのインビトロアッセイとしては、コロニーアッセイが挙げられ、このアッセイはマウス骨髄またはヒト末梢血細胞を使用する。マウスの骨髄はマウスの大腿から得ることができ、ヒト末梢血のサンプルは、健康なドナーから得ることができる。末梢血の場合において、例えば、Ficoll-Hypaque勾配［Stem Cell Technologies, Inc. (Vancouver, Canada)］による遠心分離によって、血液から単核細胞をまず単離する。このアッセイについて、有核細胞カウントを行って、もとのサンプル中の有核細胞の数および濃度を確認する。製造業者［Stem Cell Technologies, Inc. (Vancouver, Canada)］の指示のとおり、一定数の細胞をメチルセルロース上に蒔く。実験群を試験ペプチドで処理し、陽性対照群をＥＰＯで処理し、陰性対照群は処理しない。次いで、各群の増殖するコロニーの数を、一定期間のインキュベーションの後にスコアリングする（一般的に、１０日目および１８日目）。活性ペプチドは、コロニー形成を促進する。
【０１０３】
本発明の化合物の活性を実証するために使用され得る他のインビトロ生物学的アッセイは、以下に開示される：Greenberger, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2931-2935 （ＥＰＯ依存性造血前駆細胞株）； Quelle and Wojchowski (1991) J. Biol. Chem. 266:609-614 （B6SUt.EP細胞におけるタンパク質チロシンリン酸化）； Dusanter-Fourt, et al. (1992) J. Biol. Chem. 287:10670-10678 （ヒトＥＰＯ反応性細胞におけるＥＰＯレセプターのチロシンリン酸化）；Quelle, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 17055-17060 （ＦＤＣ−ＥＲ細胞における細胞質ゾルタンパク質（ｐｐ１００）のチロシンリン酸化）； Worthington, et al. (1987) Exp. Hematol. 15:85-92 （ヘモグロビンについての比色定量アッセイ）； Kaiho and Miuno (1985) Anal. Biochem. 149:117-120 （２，７−ジアミノフルオレンによるヘモグロビンの検出）； Patel, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:21300- 21302 （ｃ−ｍｙｂの発現）； Witthuhn, et al. (1993) Cell 74:227-236 （ＪＡＫ２の結合およびチロシンリン酸化）； Leonard, et al. (1993) Blood 82:1071-1079 （ＧＡＴＡ転写因子の発現）；および Ando, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9571-9575 （サイクリンＤ２およびサイクリンＤ３によるＧ1移行の制御）。
【０１０４】
Molecular Devices Corp.によって設計されたマイクロフィジオメーター（microphysiometer）として公知の機器は、種々のレポーターに対するアゴニストおよびアンタゴニストの効果を測定するために首尾よく使用されることが報告されている。この機器についての原理は、レセプター活性化に反応する細胞外培地の酸性化速度の変化を測定することである。
【０１０５】
（インビボの機能アッセイ）
試験ペプチドの効力を評価するために使用され得る１つのインビボ機能アッセイは、赤血球増加症の超低酸素症マウス（polycythemic exhypoxic mouse）のバイオアッセイである。このアッセイのために、数日間、交互のコンディショニングサイクルにマウスを供する。このサイクルにおいて、マウスは低圧状態と周囲圧力状態の期間の間を互い違いにされる。その後、２〜３日間マウスを周囲圧力に維持して、その後に試験サンプルを投与する。試験ペプチドサンプル、または陽性対照マウスの場合にはＥＰＯ標準物質を、コンディショニングしたマウスに皮下注射する。放射性標識鉄（例えば、Ｆｅ59）を２日後に投与して、放射性標識鉄の投与の２日後に血液サンプルを採取する。次いで、標準的技術によって、各血液サンプルについてヘマトクリットおよび放射活性の測定値を決定する。活性な試験ペプチドを注射したマウス由来の血液サンプルは、試験ペプチドまたはＥＰＯを受けていないマウスよりも高い放射活性を示す（赤血球ヘモグロビンによるＦｅ59の結合に起因する）。
【０１０６】
試験ペプチドの効力を評価するために使用され得る別のインビボ機能アッセイは、網状赤血球アッセイである。このアッセイのために、正常な未処置マウスに、ＥＰＯまたは試験ペプチドのいずれかを３日間連続して皮下注射する。３日目に、そのマウスに鉄デキストランも腹腔内注射する。５日目に、このマウスから血液サンプルを回収する。血液中の網状赤血球のパーセント（％）を、チアゾールオレンジ染色およびフローサイトメーター分析（reticカウントプログラム）によって決定する。さらに、ヘマトクリットを手作業で決定する。補正した網状赤血球のパーセントは、以下の式を使用して決定する：
％  ＲＥＴＩＣ補正＝％  ＲＥＴＩＣ測定  Ｘ  （ヘマトクリット個体／ヘマトクリット正常）
活性な試験化合物は、試験ペプチドまたはＥＰＯを受けなかったマウスと比較して、％  ＲＥＴＩＣ補正レベルの上昇を示す。
【０１０７】
（本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの使用）
本発明のペプチド化合物は、ＥＰＯの生物学的役割を理解するための手段としてインビトロで有用であり、これらの役割は、ＥＰＯの産生およびＥＰＯ−ＲへのＥＰＯの結合に影響し、そしてこれらのよって影響されると考えられる多くの因子（例えば、ＥＰＯ／ＥＰＯ−Ｒシグナル伝達／レセプター活性化の機構）の評価を含む。本発明のペプチドはまた、ＥＰＯ−Ｒに結合する他の化合物の開発にも有用である。なぜならば、本発明の化合物は開発を助長する重要な構造−活性関係の情報を提供するからである。
【０１０８】
さらに、本発明のペプチドは、ＥＰＯ−Ｒに結合する能力に基づいて、生細胞、固定細胞、生物学的流体、組織ホモジネート、精製された天然の生物学的材料などに対してＥＰＯ−Ｒを検出するための試薬として使用することができる。例えば、このようなペプチドを標識することによって、細胞表面にＥＰＯ−Ｒを有する細胞を同定することができる。さらに、本発明のペプチドは、ＥＰＯ−Ｒに結合する能力に基づいて、インサイチュ染色、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）分析、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）などで使用することができる。さらに、本発明のペプチドは、ＥＰＯ−Ｒに結合する能力に基づいて、レセプター精製、または細胞表面にＥＰＯ−Ｒを発現する細胞（または内部透過化細胞）の精製において使用することができる。
【０１０９】
本発明のペプチドは、種々の臨床研究および診断目的のための市販用試薬として利用することもできる。このような使用としては、以下（１）〜（６）を挙げることができるが、これらに限定されない：（１）種々の機能アッセイにおいて候補ＥＰＯ−Ｒアゴニストの活性を定量するための検定基準物としての使用；（２）ランダムペプチドスクリーニングにおける遮断試薬としての使用（すなわち、ＥＰＯ−Ｒペプチドリガンドの新規ファミリーを探す際に、そのペプチドを使用して、本発明のＥＰＯペプチドの回復（recovery）を遮断することができる）；（３）ＥＰＯ−Ｒと共結晶化する際の使用（すなわち、ＥＰＯ−Ｒに結合した本発明のペプチドの結晶を形成することができ、Ｘ線結晶学によってレセプター／ペプチド構造を決定することができる）；（４）赤血球前駆体細胞が分化を開始することによって、グロビン合成およびヘム複合体合成を誘導する能力、ならびにフェリチンレセプターの数を増加させる能力を測定するための使用；（５）ＥＰＯ依存性細胞株（例えば、ＦＤＣＰ−１−ｍＥＰＯ−Ｒ細胞株およびＴＦ−１細胞株）の増殖および成長を維持するための使用；ならびに（６）他の研究および診断適用（ここでＥＰＯ−Ｒは、好ましくは活性化されているか、またはこのような活性化は、既知量のＥＰＯ−Ｒアゴニストに対して好都合に較正される）など。
【０１１０】
本発明のさらに別の局面において、治療方法および医薬の製造方法が提供される。本発明のペプチド化合物は、ヒトを含む温血動物に投与して、インビボでＥＰＯ−ＲへのＥＰＯの結合を刺激することができる。従って、本発明は、ＥＰＯの欠損に関連する障害の治療的処置のための方法を包含し、この方法は、本発明のペプチドをＥＰＯ−Ｒを刺激するのに十分な量で投与する工程を包含し、こうして、インビボでＥＰＯの欠損に関連する症状を軽減する。例えば、本発明のペプチドは、腎機能不全および／または末期腎不全／透析；ＡＩＤＳに関連する貧血；慢性炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチおよび慢性腸炎症）および自己免疫疾患に関連する貧血；および手術前の患者の赤血球数の上昇（boosting）の処置において用途を見出す。本発明のペプチドを投与することによって処置することができる他の疾患状態、障害、および血液学的不規則性の状態としては、β−サラセミア；嚢胞性線維症；妊娠および生理の障害；未熟児の初期貧血；骨髄損傷；宇宙飛行；急性失血；加齢；および異常な赤血球生成に伴う種々の腫瘍性疾患状態が挙げられる。
【０１１１】
他の実施形態において、本発明のペプチド化合物は、赤血球の減少または欠損によって特徴付けられる障害を治療するために、例えば、輸血前の前処置として使用することができる。さらに、本発明の化合物を投与すると、出血時間を減少させることができ、従って、出血が起こることが予測される手術の前または適応症に対する患者への投与において用途を見出す。さらに、本発明の化合物は、巨核球の活性化において用途を見出す。
【０１１２】
ＥＰＯは、血管内皮細胞に対してマイトジェン効果および走化効果を有し、そして中枢のコリン作用性神経に対して効果を有することが示されているので［例えば、Amagnostou, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5978-5982 および Konishi, et al. (1993) Brain Res. 609:29-35を参照のこと］、本発明の化合物は、創傷治癒の促進；側副冠状血管の成長の促進（例えば、心筋梗塞の後に起こり得る）；外傷処置；および血管移植後の処置などの種々の血管障害の処置についても用途を見出す。本発明の化合物は、他の神経活性物質（例えば、神経伝達物質）と比較してアセチルコリンのレベルが絶対的に低いことまたはアセチルコリンのレベルが比較的低いことによって一般的に特徴付けられる、種々の神経学的障害の処置のためにも用途を見出す。
【０１１３】
（医薬組成物）
本発明のさらに別の局面において、上記ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド化合物の医薬組成物が提供される。このような組成物を投与することによって軽減または制御される状態としては、上記に示した状態が挙げられる。このような医薬組成物は、経口、非経口（筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内（ＩＶ）注射または皮下注射）、経皮（受動的に、またはイオン導入もしくはエレクトロポレーションの使用のいずれか）、経粘膜（鼻、膣、直腸または舌下）の投与経路によって、または生体内分解性挿入物を使用して投与するためのものであることができ、そして各投与経路に適切な投薬形態に処方することができる。一般的には、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドまたは誘導産物の有効量を、薬学的に受容可能な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／またはキャリアとともに含有する医薬組成物は、本発明によって包含される。このような組成物は、種々の緩衝剤内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、ｐＨ強度およびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶化剤（例えば、Tween 20、Tween 80、Polysorbate 80）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール（Thimersol）、ベンジルアルコール）および膨張物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤；ポリマー化合物の特定の調製物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）またはリポソームへ組み込む材料を含む。ヒアルロン酸もまた使用することができる。このような組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、ならびにインビボクリアランスの速度に影響し得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) 1435-1712頁を参照のこと（これは、本明細書において参考として援用される）。上記組成物は、液体形態に調製されてもよいし、乾燥粉末形態（例えば、凍結乾燥形態）であってもよい。
【０１１４】
（経口送達）
本明細書における使用のために、経口固体投薬形態が企図される。これはRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042), Chapter 89において一般的に記載されている（これは本明細書において参考として援用される）。固体投薬形態としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤またはロゼンジ、カシェ剤、ペレット剤、散剤または顆粒剤が挙げられる。また、リポソームまたはプロテイノイドの被膜を使用して、本組成物を処方することができる（例えば、米国特許第4,925,673号に報告されるプロテイノイドミクロスフィア）。リポソーム被膜を使用することができ、そしてこのリポソームは、種々のポリマーで誘導体化することができる（例えば、米国特許第5,013,556号）。治療のための可能な固体投薬形態の記載は、Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics Edited by G.S. Banker and CT. Rhodes Chapter 10, 1979（本明細書において参考として援用される）に提供される。一般的に、上記処方物は、ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド（またはその化学的に改変された形態）と、胃環境に対して保護を提供し腸において生物学的に活性な物質を放出し得る不活性成分とを含む。
【０１１５】
また、本明細書における使用のために、経口投与のための液体投薬形態もまた企図される。これらの形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、およびシロップが挙げられ、不活性化希釈剤、アジュバント（例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤）、ならびに甘味剤、香味剤および香料を含む、他の成分を含むことができる。
【０１１６】
本明細書における使用のために、経口投薬のための液体投薬形態が企図される。これらの形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液およびシロップが挙げられ、これらの形態は、不活性化希釈剤、アジュバント（例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤）、ならびに甘味剤、香味剤および香料を含む、他の成分を含むことができる。
【０１１７】
本発明のペプチドは、その誘導体の経口送達が有効であるように化学的に改変することができる。一般的に、企図される化学的改変は、少なくとも１つの部分を成分分子自体に結合することであり、ここで上記部分は、（ａ）タンパク質分解を阻害することができ、そして（ｂ）胃または腸から血流に取り込むことができる。成分の全体の安定性を高めること、および身体における循環時間を長くすることも所望される。上記に議論したように、ＰＥＧ化は、薬学的使用のために好ましい化学的改変である。使用することができる他の部分としては、プロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン（tioxocane）が挙げられる［例えば、Abuchowski and Davis (1981) 「Soluble Polymer-Enzyme Adducts,」 in Enzymes as Drugs. Hocenberg and Roberts, eds. (Wiley-Interscience: New York, NY) pp. 367-383；およびNewmark, et al. (1982) J. Appl. Biochem. 4:185-189を参照のこと］。
【０１１８】
経口処方物について、放出の位置は、胃であっても小腸（十二指腸、空腸または回腸）であっても大腸であってもよい。当業者は、胃では溶解せず、十二指腸または腸のほかの箇所で物質を放出する利用可能な処方物を有する。好ましくは、この放出は、ペプチド（または誘導体）の保護によって、または腸などの胃環境以外でのペプチド（または誘導体）の放出のいずれかによって、胃環境の有害効果を避けて行う。
【０１１９】
胃での完全な耐性を確実にするためには、少なくともｐＨ５．０まで不浸透性であるコーティングが必要とされる。腸溶剤として使用されるより一般的な不活性化成分の例は、トリメリト酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ  ５０、ＨＰＭＣＰ  ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ、およびＳｈｅｌｌａｃである。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用することができる。
【０１２０】
コーティングまたはコーティングの混合物を、胃に対して保護されることが意図されない錠剤に使用することもできる。これらとしては、糖コーティングまたは錠剤の飲み込みを容易にするコーティングを挙げることができる。乾燥治療剤（すなわち、粉末）の送達のために、カプセルは、硬い外皮（例えば、ゼラチン）からなることができ、液体形態のために軟ゼラチン外皮を使用することができる。カシェ剤の外皮物質は、厚いデンプンまたは他の食用紙であることができる。丸剤、ロゼンジ、成型錠剤または錠剤の粉砕物のために、モイストマッシング技術（moist massing techniques）を使用することができる。
【０１２１】
上記ペプチド（または誘導体）は、粒子サイズ約１ｍｍの顆粒またはペレットの形態で、微細な多重粒子として処方物中に含めることができる。カプセル投与のための物質の処方物は、粉末、軽く圧縮された凝固物として存在し得、または錠剤としてさえ存在し得る。これらの治療剤は、圧縮によって調製することができる。
【０１２２】
着色剤および／または香味剤も含めることができる。例えば、上記ペプチド（または誘導体）は、例えば、リポソームまたはミクロスフィアのカプセル化などによって処方することができ、次いで、着色剤および香味剤を含む冷蔵飲料などの食用製品のなかにさらに含めることができる。
【０１２３】
上記ペプチド（または誘導体）の体積を、不活性物質を用いて希釈または増加させることができる。これらの希釈剤としては、炭水化物、特に、マンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、改変デキストランおよび改変デンプンが挙げられる。特定の無機塩もまた、充填剤として使用することができ、これらとしては、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム、および塩化ナトリウムが挙げられる。市販の希釈剤の一部は、Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、EmcompressおよびAvicellである。
【０１２４】
崩壊剤は、固体投薬形態へ治療剤を処方する際に含めることができる。崩壊剤として使用される物質としては、デンプンベースの市販の崩御剤Explotabを含むデンプンが挙げられるが、これに限定されない。ナトリウムスターチグリコレート、Amberlite、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ウルトラミロペクチン（ultramylopectin）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジの皮、酸性カルボキリメチルセルロース、天然の海綿およびベントナイトは、全て使用することができる。崩御剤は、不溶性カチオン交換樹脂であってもよい。粉末ゴムは、崩御剤および結合剤として使用してもよく、そして粉末ゴム（例えば、アガー、カラヤまたはトラガカント）を含んでもよい。アルギン酸およびそのナトリウム塩もまた、崩御剤として有用である。
【０１２５】
結合剤は、ペプチド（または誘導体）剤を保持して硬い錠剤を一緒に形成するために使用することができ、これらとしては、アカシア、トラガカント、デンプンおよびゼラチンなどの天然産物由来の材料が挙げられる。他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は、両方とも、ペプチド（または誘導体）を顆粒化するためのアルコール溶液中で使用することができる。
【０１２６】
処方プロセスの間にくっつくのを防ぐために、本発明のペプチド（または誘導体）の処方物に抗摩擦剤（antifrictional agent）を含めることができる。ペプチド（または誘導体）とダイ壁との間の層として潤滑剤を使用することができ、これらとしては、ステアリン酸（マグネシウム塩およびカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチエレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、植物油およびワックスを挙げることができるが、これらに限定されない。可溶性潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Carbowax 4000およびCarbowax 6000もまた使用することができる。
【０１２７】
処方の間の薬物の流動特性を改善し、圧縮の間の再配置を助けるために流動促進剤（glidant）を添加することができる。この流動促進剤は、デンプン、発熱性シリカおよび水和シリコアルミネート（hydrated silicoaluminate）を含むことができる。
【０１２８】
水溶性環境へのペプチド（または誘導体）の溶解を助けるために、湿潤剤として界面活性剤を添加することができる。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、およびジオクチル硫酸ナトリウムなどのアニオン性洗剤が挙げられ得る。カチオン性洗剤を使用してもよく、これらとしては、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウム（benzethomium chloride）が挙げられる。界面活性剤として処方物中に含まれ得る可能性のある非イオン性洗剤を列挙すると、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート２０、４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、タンパク質または誘導体の処方物中に、単独または異なる比率の混合物のいずれかで存在することができる。
【０１２９】
ペプチド（または誘導体）の取り込みを増強する可能性のある添加剤は、例えば、脂肪酸オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸である。
【０１３０】
放出が制御された経口処方物が望ましい場合がある。このペプチド（または誘導体）は、拡散機構または浸出機構（例えば、ゴム）のいずれかによる放出を可能にする不活性マトリックスに導入することができる。ゆっくりと変性するマトリックスもまた、上記処方物中に組み込むことができる。一部の腸溶性コーティングも、遅延放出効果を有する。制御放出の別の形態は、Oros治療機構（Alza Corp.）に基づいた方法によるものである。すなわち、薬物は半透膜に封入されており、この半透膜は、浸透圧効果により一個の小さな開口部を通して水を浸入させ、薬物を押し出すことができる。
【０１３１】
上記処方物のために、他のコーティングを使用することができる。これらとしては、コーティングパン中に適用することができる種々の糖が挙げられる。上記ペプチド（または誘導体）はまた、フィルムコーティング錠剤とすることができ、この場合に使用されるマトリックスは、２つの群に分けられる。第１の群は、非腸溶性物質であり、これらとしては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、ナトリウムカルボキシ−メチルセルロース、ポビドン（providone）およびポリエチレングリコールが挙げられる。第２の群は、一般的なフタル酸エステルである腸溶性物質からなる。
【０１３２】
マトリックスの混合物を使用して、最適なフィルムコーティングを提供することができる。フィルムコーティングは、パンコーターもしくは流動床において、または圧縮コーティングによって行うことができる。
【０１３３】
（非経口送達）
非経口投与のための本発明による調製物は、滅菌水溶液もしくは滅菌非水溶液、懸濁液、またはエマルジョンを含む。非水溶性の溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油およびコーン油）、ゼラチン、および注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。このような投薬形態は、アジュバント（例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤）も含むことができる。これらは、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過、滅菌剤の組成物への組み込み、組成物の照射、または組成物の過熱によって滅菌することができる。これらはまた、使用する直前に、滅菌水または一部の他の滅菌注射用媒体を使用することによって製作することもできる。
【０１３４】
（直腸送達または膣送達）
直腸投与または膣投与のための組成物は、好ましくは、活性物質に加えて、カカオ脂などの賦形剤または坐剤ろうを含み得る坐剤である。鼻投与または舌下投与のための組成物はまた、当該分野で周知の標準的な賦形剤と共に調製される。
【０１３５】
（肺送達）
ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド（またはその誘導体）の肺送達もまた、本明細書において企図される。上記ペプチド（または誘導体）は、血流に対する肺上皮の裏打ちを通過する吸入および横断の間に、哺乳動物の肺に送達される［例えば、Adjei, et al. (1990) Pharmaceutical Research 7:565-569；Adjei, et al. (1990) Int. J. Pharmaceutics 63:135-144（酢酸ロイプロリド）；Braquet, et al. (1989) J. Cardiovascular Pharmacology 13(sup5):143-146 （エンドセリン−１）；Hubbard, et al. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. Ill, pp. 206-212 （α１−抗トリプシン）；Smith, et al. (1989) J. Clin. Invest. 84:1145-1146 （α−１−プロテイナーゼ）；Oswein, et al. (1990) 「Aerosolization of Proteins」, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado （組換えヒト成長ホルモン）；Debs, et al. (1988) J. Immunol. 140:3482-3488 （インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）；およびPlatz, et al.に対する米国特許第5,284,656号（顆粒球コロニー刺激因子）を参照のこと］。全身効果についての薬物の肺送達のための方法および組成物は、Wong, et alに対する米国特許第5,451,569号に記載されている。
【０１３６】
本発明の実践において使用するために、治療生成物の肺送達のために設計された広範な機械的デバイスが企図され、これらとしては、噴霧器、定量吸入器、および粉末吸入器が挙げられるがこれらに限定されない（これらは全て、当業者によく知られている）。本発明の実施のために適切な市販のデバイスの一部の特定の例は、Ultravent噴霧器（Mallinckrodt Inc., St. Louis, MO）；Acorn II噴霧器（Marquest Medical Products, Englewood, CO）；Ventolin定量吸入器（Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC）；およびSpinhaler粉末吸入器（Fisons Corp., Bedford, MA）である。
【０１３７】
このような全てのデバイスは、ペプチド（または誘導体）の調剤のために適切な処方物を使用することを必要とする。典型的には、各処方物は、使用されるデバイスの型に対して特異的であり、治療において有用な通常の希釈剤、アジュバントおよび／またはキャリアに加えて、適切な推進物質（propellant material）の使用を包含し得る。また、リポソーム、マイクロカプセルもしくはミクロスフィア、封入複合体、または他の型のキャリアの使用も企図される。化学的に改変されたペプチドも、化学改変の型または使用されるデバイスの型に依存して、異なる処方物中に調製することもできる。
【０１３８】
噴霧器（ジェット式または超音波式のどちらでも）で使用するために適切な処方物は、典型的には、溶液１ｍＬあたり約０．１ｍｇ〜２５ｍｇの生物学的に活性なタンパク質の濃度で水に溶解されたペプチド（または誘導体）を含む。この処方物は、（例えば、タンパク質安定化および浸透圧の調節のための）緩衝剤および単糖も含み得る。噴霧処方物はまた、界面活性剤も含むことができ、これによって、エアロゾルの形成時に溶液の噴霧化によって引き起こされるペプチド（または誘導体）の表面に誘導される凝集を低減または防止することができる。
【０１３９】
定量吸入器デバイスで使用するための処方物は、一般的に、界面活性剤の助けによって推進体に懸濁されたペプチド（または誘導体）を含む微粒化粉末を含む。上記推進体は、この目的のために使用されるいかなる従来物質であってもよい。これらとしては、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンまたはその組み合わせ）が挙げられる。適切な界面活性剤としては、ソルビタントリオレエートおよび大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸もまた、界面活性剤として有用であり得る。
【０１４０】
粉末吸入デバイスから調剤するための処方物は、ペプチド（または誘導体）を含む微粒化乾燥粉末を含み、デバイスからの粉末の調剤を容易にする量（例えば、上記処方物の５０重量％〜９０重量％）の、ラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールなどの膨張性薬剤を含むこともできる。上記ペプチド（または誘導体）は、遠位の肺に最も有効に送達するために、１０ｍｍ（またはミクロン）未満の平均粒子サイズ、最も好ましくは０．５ｍｍ〜５ｍｍの平均粒子サイズの粒子形態で最も有利に調製されるべきである。
【０１４１】
（鼻送達）
ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド（または誘導体）の鼻送達もまた企図される。鼻送達は、治療生成物を鼻に直接投与した後に、肺での生成物の沈着を必要とすることなく、血流にペプチドを通過させることができる。鼻送達のための処方物としては、デキストランまたはシクロデキストランを含む処方物が挙げられる。
【０１４２】
鼻送達を促進するために使用される他の浸透エンハンサーもまた、本発明のペプチドとの使用のために企図される。これは例えば、国際公開公報WO 2004056314（２００３年１２月１７日出願）において記載されており、この公報は、本明細書においてその全体が参考として援用される。
【０１４３】
（投薬量）
さらなる研究を行う場合、ペプチド化合物の全てについて、種々の患者の種々の状態を処置するための適切な投薬量レベルに関する情報が明らかになり、そして当業者は、レシピエントの治療の状況、年齢、および全身の健康状態を考慮して、適切な用量を確定することができる。選択される投薬量は、投与経路および所望される処置の期間に対して所望される治療効果に依存する。１日に体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの一般的な投薬量レベルが、哺乳動物に投与される。一般的には、静脈内注射または注入の投薬量を少なくすることができる。投与スケジュールは、循環半減期および使用される処方物に応じて変化し得る。
【０１４４】
本発明のペプチド（またはその誘導体）は、１以上のさらなる活性成分または医薬組成物と併せて投与することができる。
【０１４５】
（実施例）
本発明は、以下の実施例によって次に記載される。しかし、これらの実施例および本明細書の任意の実施例の使用は、単なる説明であって、本発明または任意の例示的形態の範囲および意味を決して限定しない。同様に、本発明は、本明細書に記載されるいずれの特定の好ましい実施形態にも限定されることはない。実際、本発明の多くの改変およびバリエーションは、本明細書を理解する際に当業者に明らかになり得るものであり、そして本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく多くの改変およびバリエーションをなすことができる。従って、本発明は、本明細書の特許請求の範囲に権利が与えられる範囲と等しい全範囲を含む、添付された特許請求の範囲の用語によってのみ限定される。
【０１４６】
列挙された実施例によって、本発明のペプチドの生物学的活性を確認することができる当業者による実験が記載される。
【実施例１】
【０１４７】
ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの合成
本実施例は、本発明によって変換されたペプチドを合成することができる、好ましい非限定的な実施形態の方法を記載する。しかし、ＥＰＯペプチド部分の合成に関して以前に記載されている他の方法（例えば、PCT/US04/14886（２００４年５月１２日出願）を参照のこと）も、本発明の化合物を調製するために使用することができる。
【０１４８】
本発明のペプチドモノマーおよびペプチドダイマーの両方を合成するための固相技術が提供される。本発明のペプチド化合物にリンカーおよびＰＥＧ部分を結合させるための例示的技術もまた、ペプチド化合物を酸化する（例えば、分子内ジスルフィド結合を形成する）ための方法と共に記載されている。最終的には、本実施例は、これらの方法に従って合成されるペプチド化合物を精製するための技術も提供する。
【０１４９】
（１．ペプチドモノマー合成）
本発明の種々のペプチドモノマーは、Applied Biosystems 433A自動化機器でMerrifield固相合成技術を使用することによって、本明細書に記載の通りに合成することができる［Stewart and Young. Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition (Pierce Chemical, Rockford, IL) 1984を参照のこと］。５−（４’−Ｆｍｏｃ−アミノメチル−３，５’−ジメトキシフェノキシ）吉草酸との架橋ポリスチレンである、樹脂ＰＡＬ（Milligen/Biosearch）を使用する。ＰＡＬ樹脂を使用すると、樹脂からペプチドが切断される際に、カルボキシ末端のアミド官能基を生じる。アミノ酸上の一級アミンの保護をＦｍｏｃを用いて達成し、そして側鎖保護基は、セリン、スレオニンおよびチロシンのヒドロキシルについてはｔ−ブチルであり、グルタミンおよびアスパラギンのアミドについてはトリチルであり、システインについてはＴｒｔまたはＡｃｍであり、そしてアルギニングアニジノ基についてはＰＭＣ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマンスルホネート）である。１時間または２時間の間、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾリル  Ｎ−オキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンズトリアゾール）を用いて、各カップリングを実施する。
【０１５０】
アミド化カルボキシ末端を有するぺプチドの合成のために、９０％トリフルオロ酢酸、５％エタンジチオール、および５％水の混合物で、最初は４℃から開始して徐々に室温まで上昇させて、１．５時間にわたって完全に会合したペプチドを切断する。脱保護生成物を樹脂から濾過し、ジエチルエーテルで沈殿させる。完全に乾燥させた後、アセトニトリル／水（０．１％トリフルオロ酢酸中）の勾配を用いてＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィーによって、生成物を精製する。
【０１５１】
（２．ペプチドダイマー合成）
本発明の種々のペプチドダイマーを、固相技術のバリエーションにおいて、リジンリンカー上で直接合成する。
【０１５２】
２種のペプチド鎖を同時に合成するために、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨをＰＡＬ樹脂（Milligen/Biosearch）にカップリングし、これによって、合成されるべき２つの鎖の間のリンカーとして役立つ最初のリジン残基を提供する。Ｆｍｏｃ保護基を、穏やかな塩基によって除去し（２０％ピペリジン（ＤＭＦ中））、出発地点として得られる遊離アミノ基を使用してペプチド鎖を合成する。上記に記載の固相合成技術を使用して、ペプチド鎖合成を実施する。Ｔｒｔを使用して、全てのシステイン残基を保護する。ダイマーの脱保護、樹脂からの切断、そして精製の後、１００％ＤＭＳＯ中で２〜３日間、５℃〜２５℃で脱保護ダイマーをインキュベートすることによって、システイン残基の酸化を実施する。この酸化反応は、２個の分子内ジスルフィド結合を有するダイマーを主に生じることができる（＞７５％）。
【０１５３】
この２個のペプチド鎖を連続的に合成するために、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨをＰＡＬ樹脂（Milligen/Biosearch）にカップリングさせ、それによって、合成されるべき２つの鎖の間のリンカーとして役立つ最初のリジン残基を提供する。Ｆｍｏｃ保護基を、穏やかな塩基（２０％ピペリジン（ＤＭＦ中））で除去する。次いで、得られる遊離アミノ基を出発地点として使用して、第１のペプチド鎖を合成する。上記に記載の固相技術を使用して、ペプチド合成を実施する。第１の鎖の２個のシステイン残基をＴｒｔで保護する。第１のペプチド鎖の合成の後に、Ｐｄ［Ｐ（Ｃ6Ｈ5）3］4、４−メチルモルホリン、およびクロロホルムを用いて支持体結合リジンリンカーからＡｌｌｏｃ基を除去する。次いで、第２のペプチド鎖をこの第２の遊離アミノ基上で合成する。第２の鎖の２個のシステイン残基をＡｃｍで保護する。トリフルオロ酢酸を使用してＴｒｔ保護基を除去し、その後２０％ＤＭＳＯ中で一晩撹拌して酸化することによって、分子内ジスルフィド結合を第１のペプチド鎖に形成する。次いで、Ａｃｍ保護基を同時に除去し、ヨウ素、メタノール、およびトリフルオロ酢酸タリウムを使用して脱保護システイン残基を酸化することによって、分子内ジスルフィド結合を第２のペプチド鎖に形成する。
【０１５４】
（３．スペーサーの結合）
スペーサーがアミノ酸（例えば、グリシンまたはリジン）である場合、上記スペーサーは、固相ペプチド合成の間にペプチドに組み込まれる。この場合において、スペーサーのアミノ酸は、ＰＡＬ樹脂にカップリングされ、その遊離アミノ基は、別のスペーサーアミノ酸またはリジンリンカーの結合のための土台として役立ち得る。リジンリンカーの結合の後、上記に記載の通りにダイマーペプチドを合成する。
【０１５５】
（４．分子内ジスルフィド結合を形成するためのペプチドの酸化）
２０％  ＤＭＳＯ／水（１ｍｇ乾燥重量ペプチド／ｍＬ）中にペプチドダイマーを溶解し、室温で３６時間静置する。このペプチドを、Ｃ１８  ＨＰＬＣカラム（Waters Delta-Pak C18、15ミクロン粒子サイズ、300Å孔サイズ、40 mm x 200 mm長）上に反応混合物をローディングして、その後、４０分間にわたる５〜９５％ＡＣＮからのＡＣＮ／水／０．０１％ＴＦＡ直線状勾配によって精製する。
【０１５６】
（５．ペプチドのＰＥＧ化）
本発明のペプチドのＰＥＧ化は、いくつかの異なる技術を使用して実施することができる。
【０１５７】
末端ＮＨ2基の形成：ペプチドダイマーを、乾燥ＤＭＦ中の１．５等量（モルベース）の活性化ＰＥＧ種（NOF Corp. Japanから市販されるmPEG-NPC）と混合し、透明な溶液を作製する。５分後、４等量のＤＩＥＡを上記溶液に添加する。この混合物を周囲温度で１４時間撹拌し、その後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製する。ＰＥＧ化ペプチドの構成をＭＡＬＤＩマスによって確認する。以下に略述するように、上記精製ペプチドをカチオン交換クロマトグラフィーを介する精製に供する。
【０１５８】
ペプチドダイマーのＮ末端のＤｉＰＥＧ化：ペプチドダイマーを乾燥ＤＭＦ中の２．５等量（モルベース）の活性化ＰＥＧ種（NOF Corp. Japanから市販されるmPEG-NPC）と混合させて、透明の溶液を作製する。５分後、上記溶液に４等量のＤＩＥＡを添加する。この混合物を周囲温度で１４時間撹拌し、次いで、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによって精製する。以下に略述するように、この精製ペプチドも、カチオン交換クロマトグラフィーを介した精製に供する。
【０１５９】
Ｎ末端のＰＥＧ化を介したペプチドダイマー化：上記ペプチド（２．５等量）およびＰＥＧ−（ＳＰＡ−ＮＨＳ）2（１等量、Shearwater Corp, USA.から市販）を乾燥ＤＭＦ中に０．２５Ｍに溶解し、透明の溶液を作製する。５分後、１０等量のＤＩＥＡを上記溶液に添加する。この混合物を周囲温度で２時間撹拌し、その後Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによって精製する。以下に略述するように、この精製ペプチドもカチオン交換クロマトグラフィーを介した精製に供する。
【０１６０】
Ｃ末端のＰＥＧ化を介したペプチドダイマー化：上記ペプチド（２．５等量）およびＰＥＧ−（ＳＰＡ−ＮＨＳ）2（１等量、Shearwater Corp, USA.から市販）を乾燥ＤＭＦ中に０．２５Ｍに溶解し、透明の溶液を作製する。５分後、１０等量のＤＩＥＡを上記溶液に添加する。この混合物を周囲温度で２時間撹拌し、その後Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによって精製する。以下に略述するように、この精製ペプチドもカチオン交換クロマトグラフィーを介した精製に供する。
【０１６１】
（６．ペプチドのイオン交換精製）
開始ダイマーペプチドを保持する能力に加えて、上記のペプチド−ＰＥＧ結合体を未反応（または加水分解された）ＰＥＧから分離する能力について、いくつかの交換支持体を調査することができる。イオン交換樹脂（２〜３ｇ）を１ｃｍカラムにローディングし、その後、ナトリウム形態に変換し（溶出液がｐＨ１４になるまで、カラムに０．２Ｎ  ＮａＯＨをローディングする（約５倍カラム容量））、次いで水素形態に変換し（溶出液がローディングｐＨ（load pH）と適合するまで０．１Ｎ  ＨＣｌまたは０．１Ｍ  ＨＯＡｃで溶出する（約５倍カラム容量））、その後ｐＨ６になるまで２５％ＡＣＮ／水で洗浄する。結合前のペプチドまたはペプチド−ＰＥＧ結合体のいずれかを２５％ＡＣＮ／水（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡでｐＨを３未満に調整し、次いでカラムにローディングする。２５％ＡＣＮ／水の２〜３倍のカラム容量で洗浄し、５ｍＬフラクションを収集した後、０．１Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃ（２５％ＡＣＮ／水）での溶出によってペプチドをカラムから放出させ、再び５ｍＬフラクションを回収する。ＨＰＬＣを介した分析によって、所望のペプチドを含むフラクションを明らかにすることができる。蒸発光散乱検出器（Evaporative Light-Scattering Detector）（ＥＬＳＤ）での分析によって、ペプチドがカラム上に保持された場合、およびペプチドがＮＨ4ＯＡｃ溶液によって溶出される場合（一般的には、フラクション４とフラクション１０との間）、結合体化していないＰＥＧは夾雑物として観察されないことを示すことができる。最初の洗浄緩衝液においてペプチドを溶出する場合（一般的には、最初の２フラクション）、所望のＰＥＧ結合体の分離は観察することはできず、過剰なＰＥＧが観察され得る。
【０１６２】
以下のカラムは、おそらく、ペプチドおよびペプチド−ＰＥＧ結合体の両方を首尾よく保持することができ、そして結合体化していないペプチドからペプチド−ＰＥＧ結合体を首尾よく精製することができる。
【０１６３】
【化９】
2008519858.tif 000016
【実施例２】
【０１６４】
インビボ活性アッセイ
本実施例は、本発明によって包含されるペプチド（例えば、ＥＰＯ−Ｒアゴニスト）の活性および効力を評価するために有用な特定のインビトロアッセイを記載する。特に、本明細書に記載されたアッセイなどから得られる結果は、ペプチド化合物がＥＰＯ−Ｒに結合しＥＰＯ−Ｒシグナル伝達を活性化するか否かを実証する。このアッセイを使用して、例えば、他の公知のＥＰＯ模倣化合物に対する、化合物の結合効力および生物学的活性を比較することもできる。
【０１６５】
これらのアッセイにおいて試験されるＥＰＯ−Ｒアゴニストのペプチドモノマーおよびペプチドダイマーは、典型的に、実施例１に記載される方法などに従って調製する。次いで、これらペプチドモノマーおよびペプチドダイマーの効力を、一連のインビトロ活性アッセイ（レポーターアッセイ、増殖アッセイ、競合結合アッセイ、およびＣ／ＢＦＵ−ｅアッセイが挙げられる）を使用して評価する。これら４つのアッセイを、以下にさらに詳細に記載する。
【０１６６】
（１．レポーターアッセイ）
このアッセイは、マウス前Ｂ細胞株由来のレポーター細胞（Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux）をベースにしている。このレポーター細胞株は、ヒトＧＣＳＦレセプターの細胞内部分に加えて、ヒトＥＰＯレセプターの細胞外部分を含むキメラレポーターを発現する。ｆｏｓプロモーター駆動性ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物で、この細胞株をさらにトランスフェクトする。エリスロポエチン剤の添加によってこのキメラレセプターを活性化すると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子が発現し、その結果ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを添加した際に光を発する。従って、このような細胞におけるＥＰＯ−Ｒ活性化のレベルは、ルシフェラーゼ活性の測定を介して定量することができる。
【０１６７】
１０％ウシ胎児血清（FBS; Hyclone）、10% WEHI-3上清（WEHI-3細胞（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６８）の培養物由来の上清）、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Gibco）において、Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux細胞を培養する。アッセイのおよそ１８時間前、１０％ＦＢＳおよび０．１％ＷＥＨＩ−３上清を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に細胞を移して、この細胞を飢餓状態にする。アッセイの日に、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＷＥＨＩ−３上清なし）で細胞を一度洗浄し、次いで、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＷＥＨＩ−３上清なし）中の既知濃度の試験ペプチドの存在下において、あるいは陽性対照としてのＥＰＯ（R & D Systems Inc., Minneapolis, MN）とともに、１×１０6細胞／ｍＬを培養する。試験ペプチドの連続希釈を、本アッセイにおいて同時に試験する。５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で４時間、アッセイプレートをインキュベートし、その後、各ウェルにルシフェリン（Steady-Glo; Promega, Madison, WI）を添加する。５分のインキュベーションの後、光放射をPackard Topcount Luminometer（Packard Instrument Co., Downers Grove, III.）で測定する。試験ペプチド濃度に対して光カウントをプロットし、Graph Padソフトウェアを使用して分析する。光の半値放射を生じる試験ペプチドの濃度を、ＥＣ５０として記録する。
【０１６８】
（２．増殖アッセイ）
本アッセイは、ヒトＥＰＯ−Ｒを発現するようにトランスフェクトされたマウス前Ｂ細胞株Ｂａｆ３をベースにしている。得られた細胞株（BaF3/Gal4/Elk/EPOR）の増殖は、ＥＰＯ−Ｒ活性化に依存している。細胞増殖の程度は、ＭＴＴを使用して定量化する。ＭＴＴアッセイでのシグナルは、生存細胞の数に比例する。
【０１６９】
１０％ＦＢＳ（Hyclone）および２％ＷＥＨＩ−３上清（ＡＴＣＣ番号ＴＢ−６８）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Gibco）において、スピナーフラスコでBaF3/Gal4/Elk/EPOR細胞を培養する。１０％ＦＢＳおよび０．１％ＷＥＨＩ−３上清を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において、１×１０6細胞／ｍｌの細胞密度でスピナーフラスコ中で、培養細胞を一晩飢餓状態にする。次いで、飢餓状態の細胞をDulbecco's PBS(Gibco)で２回洗浄し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＷＥＨＩ−３上清なし）中に１×１０6細胞／ｍｌの密度で再懸濁する。次いで、５０μＬのアリコート（約５０，０００細胞）の懸濁液を、９６ウェルのアッセイプレートに三つ組で蒔く。１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＷＥＨＩ−３上清なし）中の試験ＥＰＯ模倣ペプチドの５０μＬのアリコートの一連の希釈、または５０μＬのＥＰＯ（R & D Systems Inc., Minneapolis, MN）またはAranespTM（ダーベポエチン（darbepoeitin）α、Amgenから市販されるＥＲＯ−Ｒアゴニスト）を９６ウェルアッセイプレートに添加する（最終ウェル容積１００μＬ）。例えば、試験ペプチド（またはコントロールＥＰＯペプチド）の最終濃度が８１０ｐＭ〜０．００４５ｐＭにわたる１２種の異なる希釈液を試験することができる。次いで、蒔いた細胞を３７℃で４８時間インキュベートする。次に、各培養ディッシュウェルに１０μＬのＭＴＴ（Roche Diagnostics）を添加し、次いで４時間インキュベートする。次いで、１０％ＳＤＳ＋０．０１Ｎ  ＨＣｌを添加することによって、反応を停止させる。次いで、プレートを３７℃で一晩インキュベートする。次いで、分光測光法によって波長５９５ｎｍで各ウェルの吸光度を測定する。試験ペプチド濃度に対する吸光度の記録のプロットを作成し、Graph Padソフトウェアを使用してＥＣ５０を計算する。半値吸光度（half-maximal absorbance）を生じる試験ペプチドの濃度を、ＥＣ５０として記録する。
【０１７０】
（３．競合結合アッセイ）
２つのビーズ（ビオチン化ＥＰＯ−Ｒ−結合ペプチドトレーサーを有するストレプトアビジンドナービーズおよびＥＰＯ−Ｒに結合するアクセプタービーズ）の近さに応じて光シグナルを生じるアッセイを使用して、競合結合計算を行う。放射の際に第１のビーズから一重項酸素が放出される間に、非放射性エネルギー移動によって光が生じ、この放出された一重項酸素との接触によって、第２のビーズが光を発する。これらのビーズセットは市販されている（Packard）。ビーズの近接は、ＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサーのＥＰＯ−Ｒへの結合によって起こる。ＥＰＯ−Ｒへの結合についてＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサーと競合する試験ペプチドは、この結合を妨げ、これによって光放出の減少が引き起こされる。
【０１７１】
より詳細には、方法は以下のとおりである：４μＬの試験ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの連続希釈液、または陽性対照もしくは陰性対照を、３８４ウェルプレートのウェルに添加する。その後、２μＬ／ウェルのレセプター／ビーズカクテルを添加する。レセプタービーズカクテルは、以下からなる：１５μＬの５ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンドナービーズ（Packard）、１５μＬの５ｍｇ／ｍｌモノクローナル抗体ａｂ１７９（この抗体は、組換えＥＰＯ−Ｒ中に含まれるヒト胎盤アルカリホスファターゼタンパク質の一部分を認識する）、プロテインＡコーティングアクセプタービーズ（プロテインＡは、ａｂ１７９抗体に結合する；Packard）、１１２．５μＬの組換えＥＰＯ−Ｒの１：６．６希釈液（ａｂ１７９標的エピトープを含むヒト胎盤アルカリホスファターゼタンパク質の一部分に対する融合タンパク質として、チャイニーズハムスター卵巣細胞において産生される）および６０７．５μＬのAlphaquest緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１ｍＭ  ＭｇＣｌ2；０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）。軽くたたいて混合する。２μＬ／ウェルのビオチン化ＥＰＯ−Ｒ−結合ペプチドトレーサーを添加する。
【０１７２】
１分間遠心分離して混合する。Packard Top Sealでプレートをシールし、ホイルで包む。室温で一晩インキュベートする。AlphaQuestリーダー（Packard）を使用して、１８時間後に光放出を読み取る。ペプチドの濃度に対する光放出をプロットして、Graph PadまたはExcelで分析する。
【０１７３】
試験ペプチドを含まずに観察された光放出と比較して、光放出を５０％減少させる試験ペプチドの濃度をＩＣ５０として記録する。
【０１７４】
（４．Ｃ／ＢＦＵ−ｅアッセイ）
ＥＰＯ−Ｒシグナル伝達は、骨髄幹細胞の分化を刺激して、増殖する赤血球前駆体にする。本アッセイは、試験ペプチドが、初代ヒト骨髄多能性幹細胞からの赤血球前駆体の増殖および分化を刺激する能力を測定する。
【０１７５】
このアッセイのために、試験ペプチドの連続希釈液を、１０％ＦＢＳ（Hyclone）を補充したＩＭＤＭ培地（Gibco）中に作成する。次いで、これらの連続希釈液または陽性対照のＥＰＯペプチドをメチルセルロースに添加し、最終容積を１．５ｍＬとする。次いで、メチルセルロースとペプチドの混合物を十分にボルテックスで混合する。ヒトの骨髄由来ＣＤ３４＋細胞（Poietics/Cambrex）のアリコート（１００，０００細胞／ｍＬ）を解凍する。５０ｍＬチューブの中で、解凍した細胞を０．１ｍＬの１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ（Stem Cells）に穏やかに添加する。次に、４０〜５０ｍＬのＩＭＤＭ培地を細胞に穏やかに添加する：最初の１０ｍＬについては、５０ｍＬチューブの壁に沿って培地を滴下し、次いで、培地の残りをチューブの側面に沿ってゆっくりと加える。次いで、９００ｒｐｍで２０分間細胞を回転させ、穏やかに吸引することによって培地を注意深く除去する。細胞を１ｍｌのＩＭＤＭ培地に再懸濁し、１ｍＬあたりの細胞密度を血球計スライド上でカウントする（スライド上の細胞懸濁液の１０μＬアリコート、細胞密度は、平均カウント×１０，０００細胞／ｍｌである）。次いで、細胞をＩＭＤＭ培地で希釈して、細胞密度を１５，０００細胞／ｍＬとする。次いで、１００μＬの希釈細胞を、各１．５ｍＬのメチルセルロース＋ペプチドサンプルに添加し（アッセイ培地中の最終細胞濃度は、１０００細胞／ｍＬである）、混合物をボルテックスする。混合物中の泡を消し、次いで、先端が平らな針を使用して１ｍＬを吸引する。各サンプルから吸引した混合物の０．２５ｍＬを、２４ウェルプレート（Falcon brand）の４ウェルの各々に添加する。加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ2のもとで、プレートに蒔いた混合物を１４日間インキュベートする。位相差顕微鏡を使用して（５×〜１０×の対物レンズ、最終倍率１００×）、赤血球コロニーの存在をスコアリングする。ＥＰＯ陽性対照での観察と比較して、形成されたコロニーの数が最大の９０％である試験ペプチドの濃度を、ＥＣ９０として記録する。
【０１７６】
（５．放射リガンド競合結合アッセイ）
代替的な放射リガンド競合結合アッセイを使用して、本発明のペプチドについてＩＣ５０を測定することもできる。本アッセイは、125Ｉ−ＥＰＯのＥＰＯｒに対する結合を測定する。本アッセイは、以下の例示的プロトコルに従って実施することができる：
（Ａ．材料）
【０１７７】
【化１０】
2008519858.tif 000017
（Ｂ．適切なレセプター濃度の決定）
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合した組換えＥＰＯＲ細胞外ドメインの凍結乾燥物の５０μｇバイアルを、１ｍＬのアッセイ緩衝液で再構成する。本アッセイで使用するためのレセプターの正確な量を決定するために、このレセプター調製物の１００μＬの連続希釈液を、１２×７５ｍｍのポリプロピレン試験チューブの中で２００μＬのヨウ化組換えヒトエリスロポエチン（125Ｉ−ＥＰＯ）中に約２０，０００ｒｐｍで合わせる。チューブをキャップし、LabQuake回転シェーカーを用いて４℃で一晩、穏やかに混合する。
【０１７８】
その翌日、プロテイン−Ｇセファロースの５０％スラリーの５０μＬを各チューブに添加する。次いで、チューブを４℃で２時間インキュベートし、穏やかに混合する。次いで、そのチューブを１５分間４０００ＲＰＭ（３２９７×Ｇ）で遠心分離をして、プロテイン−Ｇセファロースをペレットにする。上清を注意深く除去して廃棄する。４℃のアッセイ緩衝液１ｍＬで３回洗浄した後、Wallac Wizardガンマカウンターでペレットをカウントする。次いで、結果を分析して、最大結合値の５０％を達成するのに必要とされる希釈液を計算した。
【０１７９】
（Ｃ．ペプチドについてのＩＣ50の決定）
本発明のペプチドのＩＣ50を決定するために、１００μＬのペプチドの連続希釈液を、１２×７５ｍｍのポリプロピレン試験チューブの中で１００μＬの組換えエリスロポエチンレセプター（１００ｐｇ／チューブ）と合わせる。次いで、１００μＬのヨウ化組換えヒトエリスロポエチン（125Ｉ−ＥＰＯ）を各チューブに添加し、チューブをキャップして４℃で一晩穏やかに混合する。
【０１８０】
その翌日、上記に記載のように結合125Ｉ−ＥＰＯを定量する。GraphPad Software, Inc.（San Diego, CA）から市販されるGraphpad Prismバージョン４．０を使用して、結果を分析してＩＣ50値を計算する。ＩＣ50値をこの手順によって測定する各ペプチドについて、全部で３回の反復ＩＣ50決定のために、このアッセイを好ましくは２回以上繰り返す。
【実施例３】
【０１８１】
インビボ活性アッセイ
本実施例は、本発明によって包含されるペプチド（例えば、ＥＰＯ−Ｒアゴニスト）の活性および効力を評価するために有用な特定のインビボアッセイを記載する。特に、本明細書に記載されたアッセイなどから得られる結果は、ペプチド化合物がＥＰＯ−Ｒに結合するか否か、そしてＥＰＯ−Ｒシグナル伝達を活性化するか否かを実証する。このアッセイは、例えば、他の公知のＥＰＯ模倣化合物に対して、化合物の結合効力および生物学的活性を比較するためにも使用することができる。
【０１８２】
本実施例は、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの活性および効力の評価において有用な種々のインビボアッセイを記載する。これらのアッセイで試験するＥＰＯ−Ｒアゴニストのペプチドモノマーおよびペプチドダイマーは、典型的には、実施例１に記載の方法に従って調製される。次いで、これらのペプチドモノマーおよびペプチドダイマーのインビボ活性は、一連のアッセイ（赤血球増加症の超低酸素のマウスバイオアッセイおよび網状赤血球アッセイが挙げられる）を使用して評価する。これら２つのアッセイを、以下にさらに詳細に記載する。
【０１８３】
（１．赤血球増加症の超低酸素のマウスバイオアッセイ）
Cotes and Bangham (1961), Nature 191: 1065-1067によって記載された方法から改変した赤血球増加症の超低酸素のマウスバイオアッセイにおいて、試験ペプチドのインビボ活性についてアッセイする。このアッセイは、試験ペプチドがＥＰＯ模倣物として機能する能力（すなわち、ＥＰＯ−Ｒを活性化し、新しい赤血球合成を誘導する能力）を試験する。赤血球合成は、合成赤血球のヘモグロビンへの放射標識した鉄の取り込みに基づいて定量する。
【０１８４】
ＢＤＦ１マウスを、７〜１０日間周囲条件に順応させる。全ての動物について体重を決定し、体重が少ない動物（１５ｇ未満）は使用しない。全部で１４日間、低圧チャンバーにおいて、マウスを首尾のよいコンディショニングサイクルに供する。２４時間の各サイクルは、０．４０±０．０２％の大気圧（１８時間）と周囲圧力（６時間）とからなる。コンディショニングの後、投与の前にさらに７２時間、マウスを周囲圧力で維持する。
【０１８５】
試験ペプチド、または組換えヒトＥＰＯ標準物を、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡビヒクル（ＰＢＳ／ＢＳＡ）に希釈する。ペプチドモノマーのストック溶液を、最初にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する。陰性対照の群は、ＰＢＳ／ＢＳＡのみを注射したマウスの群、および１％ＤＭＳＯを注射した群を含む。各投与群は１０匹のマウスを含む。０．５ｍＬの適切なサンプルを、マウスに皮下注射する（頚部の首筋）。
【０１８６】
サンプル注射の４８時間後に、約０．７５μキュリー／マウスの用量として、０．２ｍｌのＦｅ59（Dupont, NEN）をマウスに腹腔内注射して投与する。Ｆｅ59投与の２４時間後にマウスの体重を決定し、Ｆｅ59投与の４８時間後にマウスを屠殺する。心臓穿刺によって各動物から血液を収集し、ヘマトクリットを決定する（抗凝固剤としてヘパリンを使用した）。Packardガンマカウンターを使用して、Ｆｅ59取り込みについて各血液サンプル（０．２ｍｌ）を分析する。適切なデータセットから、非レスポンダーマウス（すなわち、放射活性取り込みが陰性対照群より低いマウス）を除外する。ヘマトクリット値が陰性対照群の５３％よりも低いマウスも除外する。
【０１８７】
各実験投与に対して１０匹の動物のセットから結果を得る。各群から血液サンプルに取り込まれた放射活性の平均量［１分あたりのカウント（ＣＭＰ）］を計算する。
【０１８８】
（２．網状赤血球アッセイ）
ＥＰＯコントロールまたは試験ペプチドのいずれかを、３日間連続で正常なＢＤＦ１マウスに投与する（０．５ｍＬ、皮下注射）。３日目に、鉄デキストラン（１００ｍｇ／ｍｌ）もマウスに投与する（０．１ｍＬ、腹腔内注射）。５日目に、マウスをＣＯ2で麻酔し、心臓穿刺によって採血する。各血液サンプルについて網状赤血球のパーセント（％）を、チアゾールオレンジ染色およびフローサイトメーター分析（reticカウントプログラム）によって決定する。ヘマトクリットを手作業で決定する。網状赤血球の補正したパーセントを以下の式を使用して決定する：
％  ＲＥＴＩＣ補正＝％  ＲＥＴＩＣ測定  Ｘ  （ヘマトクリット個体／ヘマトクリット正常）。
【０１８９】
（３．血液学的アッセイ）
ＥＰＯ陽性対照、試験ペプチド、またはビヒクルのいずれかを、毎週１回４週にわたって、正常なＣＤＩマウスに静脈内ボーラス注射によって投与する。陽性対照および試験ペプチドの用量の範囲（ｍｇ／ｋｇで表す）を、処方物中の活性化合物の濃度を変化させることによって試験する。注射する量は５ｍｇ／ｋｇである。ビヒクル対照群は１２匹の動物からなり、残りの用量群の各々は８匹の動物からなる。毎日の生存度および毎週の体重を記録する。
【０１９０】
投与するマウスを絶食させ、次いで吸入イソフルランで麻酔し、１日目（ビヒクル対照マウス）と、１５日目および２９日目（４匹のマウス／群／日）とに、心臓または腹の大動脈穿刺を介して末端血液サンプルを収集する。Vacutainer（登録商標）ブランドチューブに血液を移す。好ましい抗凝固剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【０１９１】
当該分野で周知の自動化臨床分析器（automated clinical analyser）（例えば、Coulter, Inc.によって製造される分析器）を使用して、赤血球合成および生理学（例えば、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）、および全赤血球カウント（ＲＢＣ））のエンドポイント測定のために、血液サンプルを評価する。
【０１９２】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の明細書および添付の図から当業者に明らかになる。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に属することが意図される。
【０１９３】
全ての値は近似値であり、説明のために提供されることが、さらに理解されるべきである。
【０１９４】
特許、特許出願、および種々の刊行物を含む多数の参考文献が、本明細書の全体にわたって引用され、検討される。このような参考文献の引用および／または検討は、本発明の説明を明白にするために提供されたにすぎず、このような参考文献のいずれかが、本発明に対する「先行技術」であることを容認するものではない。本明細書において引用され検討される全ての引用文献は、その全体が、そしてあたかも各引用文献が個々に参考として援用されるのと同じ程度まで、本明細書において参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｋは、本発明のペプチド配列を含むペプチドの表を示す。ペプチド配列は、１文字のアミノ酸コードを使用して提供する。改変アミノ酸および天然には存在しないアミノ酸は、本明細書において定義した略語を使用して示す。便宜上、各個々のペプチドは、左端の欄に与えられる独自の配列同定番号（配列番号）を参照することによって言及する。スルフヒドリル結合（「ＳＳ結合」）による個々のペプチドのダイマー化は、個々のシステイン残基の上にピンク色で示し、ペプチドのカルボキシル基またはアミン基によるダイマー化（アミド結合の形成）は、それぞれ関連する残基の上に青色および黄色で示す。個々のペプチドのリンカー部分は、存在する場合、「リンカー」の欄において記す。「リンカー−Ｒ」の欄は、存在する場合、リンカー上のＲ基として存在する化学部分を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｋは、本発明のペプチド配列を含むペプチドの表を示す。ペプチド配列は、１文字のアミノ酸コードを使用して提供する。改変アミノ酸および天然には存在しないアミノ酸は、本明細書において定義した略語を使用して示す。便宜上、各個々のペプチドは、左端の欄に与えられる独自の配列同定番号（配列番号）を参照することによって言及する。スルフヒドリル結合（「ＳＳ結合」）による個々のペプチドのダイマー化は、個々のシステイン残基の上にピンク色で示し、ペプチドのカルボキシル基またはアミン基によるダイマー化（アミド結合の形成）は、それぞれ関連する残基の上に青色および黄色で示す。個々のペプチドのリンカー部分は、存在する場合、「リンカー」の欄において記す。「リンカー−Ｒ」の欄は、存在する場合、リンカー上のＲ基として存在する化学部分を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｋは、本発明のペプチド配列を含むペプチドの表を示す。ペプチド配列は、１文字のアミノ酸コードを使用して提供する。改変アミノ酸および天然には存在しないアミノ酸は、本明細書において定義した略語を使用して示す。便宜上、各個々のペプチドは、左端の欄に与えられる独自の配列同定番号（配列番号）を参照することによって言及する。スルフヒドリル結合（「ＳＳ結合」）による個々のペプチドのダイマー化は、個々のシステイン残基の上にピンク色で示し、ペプチドのカルボキシル基またはアミン基によるダイマー化（アミド結合の形成）は、それぞれ関連する残基の上に青色および黄色で示す。個々のペプチドのリンカー部分は、存在する場合、「リンカー」の欄において記す。「リンカー−Ｒ」の欄は、存在する場合、リンカー上のＲ基として存在する化学部分を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｋは、本発明のペプチド配列を含むペプチドの表を示す。ペプチド配列は、１文字のアミノ酸コードを使用して提供する。改変アミノ酸および天然には存在しないアミノ酸は、本明細書において定義した略語を使用して示す。便宜上、各個々のペプチドは、左端の欄に与えられる独自の配列同定番号（配列番号）を参照することによって言及する。スルフヒドリル結合（「ＳＳ結合」）による個々のペプチドのダイマー化は、個々のシステイン残基の上にピンク色で示し、ペプチドのカルボキシル基またはアミン基によるダイマー化（アミド結合の形成）は、それぞれ関連する残基の上に青色および黄色で示す。個々のペプチドのリンカー部分は、存在する場合、「リンカー」の欄において記す。「リンカー−Ｒ」の欄は、存在する場合、リンカー上のＲ基として存在する化学部分を示す。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｋは、本発明のペプチド配列を含むペプチドの表を示す。ペプチド配列は、１文字のアミノ酸コードを使用して提供する。改変アミノ酸および天然には存在しないアミノ酸は、本明細書において定義した略語を使用して示す。便宜上、各個々のペプチドは、左端の欄に与えられる独自の配列同定番号（配列番号）を参照することによって言及する。スルフヒドリル結合（「ＳＳ結合」）による個々のペプチドのダイマー化は、個々のシステイン残基の上にピンク色で示し、ペプチドのカルボキシル基またはアミン基によるダイマー化（アミド結合の形成）は、それぞれ関連する残基の上に青色および黄色で示す。個々のペプチドのリンカー部分は、存在する場合、「リンカー」の欄において記す。「リンカー−Ｒ」の欄は、存在する場合、リンカー上のＲ基として存在する化学部分を示す。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｋは、本発明のペプチド配列を含むペプチドの表を示す。ペプチド配列は、１文字のアミノ酸コードを使用して提供する。改変アミノ酸および天然には存在しないアミノ酸は、本明細書において定義した略語を使用して示す。便宜上、各個々のペプチドは、左端の欄に与えられる独自の配列同定番号（配列番号）を参照することによって言及する。スルフヒドリル結合（「ＳＳ結合」）による個々のペプチドのダイマー化は、個々のシステイン残基の上にピンク色で示し、ペプチドのカルボキシル基またはアミン基によるダイマー化（アミド結合の形成）は、それぞれ関連する残基の上に青色および黄色で示す。個々のペプチドのリンカー部分は、存在する場合、「リンカー」の欄において記す。「リンカー−Ｒ」の欄は、存在する場合、リンカー上のＲ基として存在する化学部分を示す。
【図１Ｇ】図１Ａ〜１Ｋは、本発明のペプチド配列を含むペプチドの表を示す。ペプチド配列は、１文字のアミノ酸コードを使用して提供する。改変アミノ酸および天然には存在しないアミノ酸は、本明細書において定義した略語を使用して示す。便宜上、各個々のペプチドは、左端の欄に与えられる独自の配列同定番号（配列番号）を参照することによって言及する。スルフヒドリル結合（「ＳＳ結合」）による個々のペプチドのダイマー化は、個々のシステイン残基の上にピンク色で示し、ペプチドのカルボキシル基またはアミン基によるダイマー化（アミド結合の形成）は、それぞれ関連する残基の上に青色および黄色で示す。個々のペプチドのリンカー部分は、存在する場合、「リンカー」の欄において記す。「リンカー−Ｒ」の欄は、存在する場合、リンカー上のＲ基として存在する化学部分を示す。
【図１Ｈ】図１Ａ〜１Ｋは、本発明のペプチド配列を含むペプチドの表を示す。ペプチド配列は、１文字のアミノ酸コードを使用して提供する。改変アミノ酸および天然には存在しないアミノ酸は、本明細書において定義した略語を使用して示す。便宜上、各個々のペプチドは、左端の欄に与えられる独自の配列同定番号（配列番号）を参照することによって言及する。スルフヒドリル結合（「ＳＳ結合」）による個々のペプチドのダイマー化は、個々のシステイン残基の上にピンク色で示し、ペプチドのカルボキシル基またはアミン基によるダイマー化（アミド結合の形成）は、それぞれ関連する残基の上に青色および黄色で示す。個々のペプチドのリンカー部分は、存在する場合、「リンカー」の欄において記す。「リンカー−Ｒ」の欄は、存在する場合、リンカー上のＲ基として存在する化学部分を示す。
【図１Ｉ】図１Ａ〜１Ｋは、本発明のペプチド配列を含むペプチドの表を示す。ペプチド配列は、１文字のアミノ酸コードを使用して提供する。改変アミノ酸および天然には存在しないアミノ酸は、本明細書において定義した略語を使用して示す。便宜上、各個々のペプチドは、左端の欄に与えられる独自の配列同定番号（配列番号）を参照することによって言及する。スルフヒドリル結合（「ＳＳ結合」）による個々のペプチドのダイマー化は、個々のシステイン残基の上にピンク色で示し、ペプチドのカルボキシル基またはアミン基によるダイマー化（アミド結合の形成）は、それぞれ関連する残基の上に青色および黄色で示す。個々のペプチドのリンカー部分は、存在する場合、「リンカー」の欄において記す。「リンカー−Ｒ」の欄は、存在する場合、リンカー上のＲ基として存在する化学部分を示す。
【図１Ｊ】図１Ａ〜１Ｋは、本発明のペプチド配列を含むペプチドの表を示す。ペプチド配列は、１文字のアミノ酸コードを使用して提供する。改変アミノ酸および天然には存在しないアミノ酸は、本明細書において定義した略語を使用して示す。便宜上、各個々のペプチドは、左端の欄に与えられる独自の配列同定番号（配列番号）を参照することによって言及する。スルフヒドリル結合（「ＳＳ結合」）による個々のペプチドのダイマー化は、個々のシステイン残基の上にピンク色で示し、ペプチドのカルボキシル基またはアミン基によるダイマー化（アミド結合の形成）は、それぞれ関連する残基の上に青色および黄色で示す。個々のペプチドのリンカー部分は、存在する場合、「リンカー」の欄において記す。「リンカー−Ｒ」の欄は、存在する場合、リンカー上のＲ基として存在する化学部分を示す。
【図１Ｋ】図１Ａ〜１Ｋは、本発明のペプチド配列を含むペプチドの表を示す。ペプチド配列は、１文字のアミノ酸コードを使用して提供する。改変アミノ酸および天然には存在しないアミノ酸は、本明細書において定義した略語を使用して示す。便宜上、各個々のペプチドは、左端の欄に与えられる独自の配列同定番号（配列番号）を参照することによって言及する。スルフヒドリル結合（「ＳＳ結合」）による個々のペプチドのダイマー化は、個々のシステイン残基の上にピンク色で示し、ペプチドのカルボキシル基またはアミン基によるダイマー化（アミド結合の形成）は、それぞれ関連する残基の上に青色および黄色で示す。個々のペプチドのリンカー部分は、存在する場合、「リンカー」の欄において記す。「リンカー−Ｒ」の欄は、存在する場合、リンカー上のＲ基として存在する化学部分を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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