(57)【要約】  本発明は、ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン及びアデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインを含有する新規のポリペプチド並びに前記ポリペプチドの、ＰＤＥモジュレーターの同定方法における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、機能的に連結した、
（ａ）ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン、又はこの機能的に等価である変形、及び
（ｂ）アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメイン又はこの機能的に等価である変形を含有するポリペプチド。
【請求項２】
ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）は、グループ、ＰＤＥ５Ａ１、ＰＤＥ５Ａ２、ＰＤＥ５Ａ３、ＰＤＥ５Ａ４又は、このそのつどの機能的に等価である変形から選択されていることを特徴とする、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）は、アイソフォームＰＤＥ５Ａ１を示すことを特徴とする、請求項１又は２記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ＧＡＦAドメインが、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又はこの配列から、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により導かれる配列を含有するアミノ酸配列を有し、前記配列は、アミノ酸水準で、前記配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６と、少なくとも９０％の同一性、及びＧＡＦAドメインの特性を有することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＧＡＦAドメインが、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含有するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ＧＡＦBドメインが、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はこの配列から、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により導かれる配列を含有するアミノ酸配列を有し、前記配列は、アミノ酸水準で、前記配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と、少なくとも９０％の同一性、及びＧＡＦBドメインの特性を有することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ＧＡＦBドメインが、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含有するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記の機能的に連結した、ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン、又はこの機能的に等価である変形が、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０又はこの配列から、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により導かれる配列を含有するアミノ酸配列を有し、前記配列は、アミノ酸水準で、前記配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０と、少なくとも７０％の同一性、及びヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦドメインの制御性特性を有し、その際この含有された、前記ＧＡＦAドメインのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６及び前記ＧＡＦBドメインのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により、最大で１０％だけ変化することを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記の機能的に連結した、ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン又はこの機能的に等価である変形は、以下のグループ
（ａ）アミノ酸Ｅ５１３までのヒトのＰＤＥ５Ａ１のＮ末端、又は
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０
から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
アデニル酸シクラーゼは、ＧＡＦドメインを含有する細菌由来のアデニル酸シクラーゼ又はこのそのつどの機能的に等価である変形であることを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記アデニル酸シクラーゼは、以下のグループ：
（ａ）アナベナ種ＰＣＣ７１２０からのアデニル酸シクラーゼ又はこの機能的に等価である変形、
（ｂ）アナベナ・バリアビリＡＴＴＣ２９４１３からのアデニル酸シクラーゼ又はこの機能的に等価である変形、
（ｃ）ノストック・パンクチフォルメＰＣＣ７３１０２からのアデニル酸シクラーゼ又はこの機能的に等価である変形、
（ｄ）トリコデスミウム・エリスラムＩＭＳ１０１からのアデニル酸シクラーゼ又はこの機能的に等価である変形、
（ｅ）ブデロビブリオ・バクテリオボラスＨＤ１００からのアデニル酸シクラーゼ又はこの機能的に等価である変形、
（ｆ）マグネトコッカス種ＭＣ−１からのアデニル酸シクラーゼ又はこの機能的に等価である変形、
から選択されるアデニル酸シクラーゼであることを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記アデニル酸シクラーゼは、アイソフォームＣｙａＢ１又はＣｙａＢ２のアナベナ種ＰＣＣ７１２０からのアデニル酸シクラーゼ、又はこの機能的に等価である変形であることを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１３】
アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメイン又はこの機能的に等価である変形は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２又はこの配列から、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により導かれる配列を含有するアミノ酸配列を有し、前記配列は、アミノ酸水準で、前記配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と、少なくとも９０％の同一性、及びアデニル酸シクラーゼの触媒特性を有することを特徴とする、請求項１から１２までのいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１４】
アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメイン又はこの機能的に等価である変形は、以下のグループ
（ａ）アミノ酸Ｌ３８６〜Ｋ８５９のＣｙａＢ１のＣ末端、その際ＣｙａＢ１のＬ３８６は、Ｖ３８６により置き換えられている、又は
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２
から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１から１３までのいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はこれらの配列から、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により導かれる配列を含み、前記配列は、アミノ酸水準で、前記配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と、少なくとも７０％の同一性及びヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦドメインの制御性特性及びアデニル酸シクラーゼの触媒特性を有し、その際この含有された、ＧＡＦAドメインのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＧＡＦBドメインのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、及びアデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２は、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により最大で１０％だけ変化する、請求項１から１４までのいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１６】
アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１７】
アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有するポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドの１つをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
部分配列として、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５又は前記核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、及び
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又は前記核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、及び
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１又は前記核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含有する、請求項１８記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含有する、ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の、ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項１８から２２までのいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含有する、組み換えプラスミドベクター。
【請求項２３】
請求項２２記載のプラスミドベクターを含有する、組み換え宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドの製造において、請求項２３記載の組み換え宿主細胞の培養、請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドの発現及び単離による、請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２５】
ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のモジュレーターの同定方法であって、以下の工程
（ａ）ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）の可能性のあるモジュレーターと、請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドとの接触、及び
（ｂ）前記の可能性のあるモジュレーターが、請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドのアデニル酸シクラーゼ活性を、前記の可能性のあるモジュレーターの非存在下に比較して変更させるかの決定
を含む、ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のモジュレーターの同定方法。
【請求項２６】
工程（ａ）において、ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）の可能性のあるモジュレーターに付加的に、ｃＧＭＰを請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドと接触させる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記アデニル酸シクラーゼ活性の決定は、放射性標識した又は蛍光標識したＡＴＰの変換の測定により行われることを特徴とする、請求項２５又は２６記載の方法。
【請求項２８】
前記モジュレーターの存在下で前記アデニル酸シクラーゼ活性の減少が、前記モジュレーターの非存在下に比較して測定され、そしてこのモジュレーターがＰＤＥ５アンタゴニストであることを特徴とする、請求項２５から２７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
前記モジュレーターの存在下で前記アデニル酸シクラーゼ活性の上昇が、前記モジュレーターの非存在下に比較して測定され、そしてこのモジュレーターがＰＤＥ５アゴニストであることを特徴とする、請求項２５から２８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
前記アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインの直接的なモジュレーターの除外のために、請求項２５から２７までのいずれか１項記載の方法を、アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインを有し、かつヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）の機能性ＧＡＦドメインを有しないポリペプチドの使用下で実施することを特徴とする、請求項２５から２９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
前記方法を細胞アッセイとして請求項２３記載の宿主細胞の存在下で実施することを特徴とする、請求項２５から３０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
前記方法をハイスループットの規模で適用することを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン及びアデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインを含有する新規のポリペプチド、並びに前記ポリペプチドのＰＤＥモジュレーターの同定方法における使用に関する。
【０００２】
公知技術
ホスホジエステラーゼ５（＝ＰＤＥｓ）は真核性のタンパク質であり、環式ヌクレオチドｃＡＭＰ及びｃＧＭＰのモジュレーターとして公知である。ＰＤＥｓは、３つのクラス（Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ）に区分され、これらのうち１１つのＰＤＥファミリー（ＰＤＥ１〜１１と呼称される）を有するクラスＩのみが、哺乳類の場合には現れる。ＰＤＥ５は、平滑筋の弛緩及び収縮において、及びニューロンの生残において役割を果たす。ＰＤＥ５阻害剤の多数が公知であり、そして３つ（シルデナフィル、タダラフィル、及びバルデナフィル）が、勃起不全または肺高血圧症の治療のために使用される。
【０００３】
ＧＡＦドメインは、生命の全ての系列において普遍的であり、かつＡｒａｖｉｎｄ及びＰｏｎｔｉｎｇ（Aravind L. and Ponting C.P :The GAF domain :an evolutionary link between diverse phototransducing proteins. 1997, TIBS, 22, 458-459）により、タンパク質構造及びタンパク質配列比較に基づいて定義された。ＰＤＥ２、ＰＤＥ５、及びＰＤＥ６は、いわゆるｃＧＭＰに結合するＧＡＦドメインを含有し、前記ドメインは、ＰＤＥｓのアロステリックな活性化において役割を果たす。
【０００４】
ＰＤＥ５のＧＡＦAドメインに関しては、高親和性のｃＧＭＰ結合が検出されていて、その一方でＧＡＦBドメインはむしろ、この二量体化に供される（Mc-Allister Lucas L. M., Haik T. L., Colbran J. L., Sonnenburg W. K., Seger D., Turko I. V., Beavo J. A., Francis S. H. and Corbin J.D. :An essential aspartic add at each of the allosteric cGMP-binding sites of a cGMP-specific phosphodiesterase. 1995, JBC, 270, 30671-30679 ;Turko I. V., Haik T.L., McAllister-Lucas L. M., Burns F., Frands S. H. and Corbin J.D.: Identification of key amino adds in a conserved cGMP-binding site of cGMP-binding. 1996, JBC, 271, 22240-22244）。Rybalkin et al.（Rybalkin S. D., Rybalkina I. G., Shimizu-Albergine M., Tang X. B. and Beavo J.A.: PDE5 is converted to an activated state upon cGMP binding to the GAF A domain, 2003, EMBO J. 22,469-78）によれば、このＧＡＦタンデムは、ｃＧＭＰ結合を通じて、前記ＰＤＥ５の活性を、１０倍だけ高める。
【０００５】
アデニル酸シクラーゼ（＝ＡＣｓ）は、生命の全ての範囲において、ＡＴＰからＡＭＰへの変換を触媒する（Cooper D.M. :Regulation and organization of adenylyl cyclases and cAMP. 2003, Biochem J., 375(Pt 3),517-29; Tang W. J. and Gilman A.G. :Construction of a soluble adenylyl cyclase activated by Gsα and forskolin. 1995, Science, 268, 1769-1772）。配列比較及び構造的な考察に基づいて、これらは５つのクラス（Ｉ〜Ｖ）に区分される。分子生物学的な興味がもたれるのは、シアノバクテリアからの、特に、ノストック種  ＰＣＣ  ７１２０からの細菌のクラスＩＩＩのＡＣｓであり、これにはまたＣｙａＢ１も属する。係るシアノバクテリアのＡＣｓ、ＣｙａＢ１及びＣｙａＢ２は同様に、Ｎ末端のＧＡＦドメインを含有し、これは構造的に、前記ＰＤＥｓのものに類似するが、しかしながらｃＡＭＰを活性化リガンドとして有する。ヒトの前記のクラスＩＩＩのＡＣｓの９つの公知のファミリーは、全て膜結合型であり、かつＧタンパク質を介して制御される（Tang W. J. and Gilman A.G. :Construction of a soluble adenylyl cyclase activated by Gsα and forskolin. 1995, Science, 268,1769-1772）。ＧＡＦドメインとの組み合わせは公知でない。
【０００６】
ラットＰＤＥ２のＧＡＦドメインと、アデニル酸シクラーゼＣｙａＢ１の触媒中心とからのキメラの構築は既に記載されている（Kanacher T., Schultz A., Linder J. U.and Schultz J.E. :A GAF-domain-regulated adenylyl cyclase from Anabaena is a self activated cAMP switch. 2002, EMBO J., 21, 3672-3680）。
【０００７】
ヒトのＰＤＥ５と細菌性のアデニル酸シクラーゼとからのキメラは公知でない。同様に、係るキメラの、ＰＤＥ５モジュレーターの同定方法における使用は、公知技術から公知でない。
【０００８】
本発明の詳細な説明
本発明に基づく課題は、ＰＤＥ５モジュレーターの同定方法を提供することにある。
【０００９】
前記課題は、本発明によるポリペプチドであって、機能的に連結した、（ａ）ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン、又はこの機能的に等価である変形、及び（ｂ）アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメイン又はこの機能的に等価である変形を含有する本発明によるポリペプチドの提供、及びＰＤＥ５モジュレーターの同定方法におけるこの使用により解決された。
【００１０】
意外にも、Ｎ末端のヒトのＰＤＥ５−ＧＡＦ−ドメイン及びＣ末端のアデニル酸シクラーゼの触媒中心からなるキメラタンパク質が、エフェクター分子として適することが確認された。キメラタンパク質においては前記ＧＡＦドメインが、この活性化ドメインであり、前記活性化ドメインが、リガンド結合の際にこのコンフォメーションを変更し、これにより前記アデニル酸シクラーゼドメイン（これは読み出し（read-out）として用いられる）の触媒活性が調節される。
【００１１】
本発明は、前記ＰＤＥ５の触媒中心の結合及び遮断を介して作用するのではなく、前記ＰＤＥ５のＮ末端、即ちＧＡＦドメインに対するアロステリックな制御により作用するＰＤＥ５モジュレーター、即ちＰＤＥ５アンタゴニスト又はＰＤＥ５アゴニストを同定することを可能にする。
【００１２】
前述したように、本発明は、ポリペプチドであって、機能的に連結した、
（ａ）ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン、又はこの機能的に等価である変形、及び
（ｂ）アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメイン又はこの機能的に等価である変形を含有するポリペプチドに関する。
【００１３】
ヒトのホスホジエステラーゼ又はＰＤＥ５とは、ヒト由来の酵素が理解され、従って、ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰはこの相応する不活性な５’モノホスファートに移行されることができる。その構造及び特性に基づいて、前記ＰＤＥｓは、様々なファミリーに分類される。ヒトのホスホジエステラーゼ５又はＰＤＥ５とは、特にヒト由来の酵素ファミリーが理解され、前記ファミリーは、ｃＧＭＰはこの不活性な５’モノホスファートに移行されることができる。
【００１４】
本発明により、ＰＤＥ５として、ＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメインを有する全てのＰＤＥ５が理解される。ＰＤＥ５のＧＡＦドメインは、タンデムとしてＮ末端に、タンパク質中で局在している。このＮ末端に最も近接するＧＡＦドメインは、ＧＡＦAドメインと呼称され、この直ぐ次のものはＧＡＦBドメインと呼称される。前記ＧＡＦドメインの発端及び終端は、タンパク質配列比較に基づいて決定されてよい。ＳＭＡＲＴ配列比較（Schultz J., Milpetz F., Bork P. and Pointing C.P. :SMART a simple modular architecture research tool :Identification of signaling domains. 1998, PNAS, 95,5857-5864）は例えば、アイソフォームＰＤＥ５Ａ１のＧＡＦAに対して：Ｄ１６４〜Ｌ３２４、そしてＧＡＦBに対してＳ３４６〜Ｅ５１３を生じる。
【００１５】
アデニル酸シクラーゼとは、ＡＴＰをｃＡＭＰに移行できる酵素が理解される。これに応じて、アデニル酸シクラーゼ活性とは、定義した時間中に、本発明によるポリペプチドにより変換されたＡＴＰ量又は形成されたｃＡＭＰ量が理解される。
【００１６】
アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインとは、アデニル酸シクラーゼがＡＴＰをｃＡＭＰに移行させる特性をまだなお有し、即ちまだなお実質的に機能性であり、従ってアデニル酸シクラーゼ活性を有するために必要であるアデニル酸シクラーゼのアミノ酸配列の部分が理解される。
【００１７】
前記アミノ酸配列の反復的な短縮化及びアデニル酸シクラーゼ活性の引き続く測定により、アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインは容易に決定される。
【００１８】
前記アデニル酸シクラーゼ活性の決定は例えば、放射性の、［α−32Ｐ］−ｃＡＭＰへの［α−32Ｐ］−ＡＴＰの変換の測定により行われてよい。
【００１９】
一般的に、前記アデニル酸シクラーゼ活性は、抗体結合を介した、この生じたｃＡＭＰの測定により、容易に可能である。これには、様々な市販のアッセイキットが存在し、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ(R)のｃＡＭＰ［3Ｈ−］又は［125−Ｉ］Ｂｉｏｔｒａｋ(R)  ｃＡＭＰ  ＳＰＡ  Ａｓｓａｙｓ、又はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ(R)のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ(R)又はＬａｎｃｅ(R)  ｃＡＭＰ  Ａｓｓａｙである：これらは全て、ＡＣ反応の際にＡＴＰから標識していないｃＡＭＰが生じるとの原理に基づく。これは、外来性の添加された３Ｈ標識したｃＡＭＰ、１２５Ｉ標識したｃＡＭＰ、又はビオチン標識したｃＡＭＰと、ｃＡＭＰ特異的抗体に対する結合を競合する。非放射性Ｌａｎｃｅ(R)Ａｓｓａｙでは、Ａｌｅｘａ(R)Ｆｌｕｏｒが、前記抗体に結合し、これは、トレーサーを用いてＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを６６５ｎｍで生ずる。非標識ｃＡＭＰが多く結合するほど、この標識したｃＡＭＰにより惹起されるシグナルは弱くなる。標準曲線を用いて、このシグナル強度は、この相応するｃＡＭＰ濃度に割り当てられてよい。
【００２０】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓによる高効率性蛍光分極（High-Efficiency Fluorescence Polarization）（ＨＥＦＰTM）−ＰＤＥアッセイと同様に、これはＩＭＡＰ技術に基づいているが、放射性標識した物質の代わりに蛍光標識した物質を使用してもよい。ＨＥＦＰ−ＰＤＥ−アッセイの際には、フルオレセイン標識したｃＡＭＰ（ＦＩ−ｃＡＭＰ）が使用され、これはＰＤＥにより、フルオレセイン標識した５′ＡＭＰ（ＦＩ−ＡＭＰ）へと変換される。前記ＦＩ−ＡＭＰは選択的に、特殊なビーズに結合し、これによりこの蛍光は強力に分極する。ＦＩ−ｃＡＭＰは、前記ビーズに結合せず、従ってこの分極の増加は、この生じたＦＩ−ＡＭＰの量に比例する。相応するＡＣ試験のために、蛍光標識したＡＴＰを、ＦＩ−ｃＡＭＰの代わりに、及びビーズ（これは、選択的にＦＩ−ｃＡＭＰに、ＦＩ−ｃＡＭＰの代わりに結合する）を使用してよい（例えば、前記ビーズは、ｃＡＭＰ抗体で負荷されているものである）。
【００２１】
ポリペプチド又はドメインの「機能的に等価である変形」とは、即ち一定の機能を有する前記ポリペプチドの配列部分は、例えば以下に記載するように構造的に相違するが、それでもなお同様の機能を充実するポリペプチド又はドメインであると理解される。ドメインの機能的に等価である変形は、当業者は容易に、例えば以下に詳細に記載するように、前記の相応するドメインの変異及び機能試験により、その他の公知のタンパク質の相応するドメインとの配列比較により、又はこのドメインをコードする相応する核酸配列とその他の生物からの適した配列とのハイブリダイゼーションにより、見出されてよい。
【００２２】
「機能的に連結」とは、連結、有利にはドメインの共有結合が理解され、これはこの機能を充実する前記ドメインの配置を生じる。例示的には、前記ＧＡＦAドメイン、ＧＡＦBドメイン及びアデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインの機能的な連結とは、前記ドメインの以下の配置を生じるこれらのドメインの結合が理解され、この配置は、前記ＧＡＦドメインが、リガンドの結合の際に、例えばｃＧＭＰ又はＰＤＥ５モジュレーターによる結合の際に、そのコンフォメーションを変更し、これにより前記アデニル酸シクラーゼドメインの触媒活性を調節する。更に、例えば前記ＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメインの機能的な連結とは、前記ドメインの以下の配置を生じるこれらのドメインの結合が理解され、この配置は、前記ＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメインが、一緒になってＧＡＦドメインとして、リガンドの結合の際に、例えばｃＧＭＰ又はＰＤＥ５モジュレーターによる結合の際に、そのコンフォメーションを変更する。
【００２３】
有利には、前記ＧＡＦドメイン、ＧＡＦA及びＧＡＦBを考慮するヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）であり、これはグループ、アイソフォームＰＤＥ５Ａ１（アクセッション：ＮＰ＿００１０７４）、ＰＤＥ５Ａ２（アクセッション：ＮＰ＿２３６９１４）、ＰＤＥ５Ａ３（アクセッション：ＮＰ＿２４６２７３）及びＰＤＥ５Ａ４（アクセッション：ＮＰ＿２３７２２３）又はこれらのそのつどの機能的に等価である変形から選択され、特に有利には、アイソフォームＰＤＥ５Ａ１のＧＡＦドメイン又はこの機能的に等価である変形の本発明による使用である。
【００２４】
有利な実施態様において、本発明によるポリペプチドのＧＡＦAドメインは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又はこの配列から、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により導かれる配列を含有するアミノ酸配列を有し、前記配列は、アミノ酸水準で、前記配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６と、少なくとも９０％、有利には少なくとも９１％、より有利には少なくとも９２％、より有利には少なくとも９３％、より有利には少なくとも９４％、より有利には少なくとも９５％、より有利には少なくとも９６％、より有利には少なくとも９７％、より有利には少なくとも９８％、より有利には少なくとも９９％の同一性、及びＧＡＦAドメインの特性を有する。
【００２５】
この際これは前記したように、前記の配列とその他のタンパク質との同一性比較により見出されてよいＧＡＦAドメインの天然の機能的に等価である変形であるか、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列から出発して、人工的な変異により、例えばアミノ酸の置換、挿入、又は欠失により変更された人工的なＧＡＦAドメインであってよい。
【００２６】
「置換」との概念には、本明細書において、１つ又は複数のアミノ酸の、１つ又は複数のアミノ酸による交換であると理解されたい。有利には、いわゆる保存的交換が実施され、前記交換の際には、この置き換えられたアミノ酸が、この当初のアミノ酸と同様の類似の特性を有し、例えばＡｓｐによるＧｌｕ、ＡｓｎによるＧｌｎ、ＩｌｅによるＶａｌ、ＩｌｅによるＬｅｕ、ＴｈｒによるＳｅｒの交換である。
【００２７】
欠失は、アミノ酸の、直接結合による置き換えである。欠失のための有利な位置は、前記ポリペプチドの末端及びこの単独のタンパク質ドメインの間の連結である。
【００２８】
挿入は、前記ポリペプチド鎖中へのアミノ酸の導入であり、その際形式的に、直接結合は、１つ又は複数のアミノ酸により置き換えられる。
【００２９】
２つのタンパク質の間での同一性は、そのつど全体のタンパク質の長さを介したアミノ酸の同一性が理解され、特にＤＮＡＳＴＡＲ社(inc. Madison, Wisconsin USA)のＬａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた比較により、クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法(Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr ;5(2):151-1)の適用下で、以下のパラメーターの調整下で算出された同一性が理解される：
多重アラインメントパラメーター：
ギャップペナルティ  １０
ギャップ長ペナルティ  １０
ペアワイズアラインメントパラメーター：
Ｋタプル  １
ギャップペナルティ  ３
ウィンドウ  ５
斜め保存  ５
タンパク質又はドメインとは、これはアミノ酸水準で、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６と少なくとも９０％の同一性を有するが、相応して、その配列と配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６との比較の際に、特に上述のパラメーターセットを有する上述のプログラムアルゴリズムにより、少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質又はドメインが理解される。
【００３０】
ＧＡＦAドメインの特性とは、特に、ｃＧＭＰに結合するその機能が理解される。
【００３１】
更なる有利な実施態様において、前記の本発明によるポリペプチドのＧＡＦAドメインは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有する。
【００３２】
有利な実施態様において、前記の本発明によるポリペプチドのＧＡＦBドメインは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はこの配列から、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により導かれる配列を含有するアミノ酸配列を有し、前記配列は、アミノ酸水準で、前記配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と、少なくとも９０％、有利には少なくとも９１％、より有利には少なくとも９２％、より有利には少なくとも９３％、より有利には少なくとも９４％、より有利には少なくとも９５％、より有利には少なくとも９６％、より有利には少なくとも９７％、より有利には少なくとも９８％、より有利には少なくとも９９％の同一性、及びＧＡＦBドメインの特性を有する。
【００３３】
この際これは前記したように、前記の配列とその他のタンパク質との同一性比較により見出されてよいＧＡＦBドメインの天然の機能的に等価である変形であるか、又は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６から出発して、人工的な変異により、例えばアミノ酸の置換、挿入、又は欠失により、前述したように変更された人工的なＧＡＦBドメインであってよい。
【００３４】
ＧＡＦBドメインの特性とは、特に、二量体形成を担うその機能が理解され、特にＧＡＦAドメインと一緒になって、ｃＧＭＰの結合により、前記ＰＤＥ５を活性化させる特性、又はＰＤＥ５モジュレーターの結合により、前記ＰＤＥ５活性を調節、即ち高めるか又は減少させる特性が理解される。
【００３５】
更なる有利な実施態様において、前記の本発明によるポリペプチドのＧＡＦBドメインは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を有する。
【００３６】
前記の本発明によるポリペプチドの更なる有利な実施態様において、前記の機能的に連結した、ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン、即ち完全なＧＡＦドメイン又はこの機能的に等価である変形は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０又はこの配列から、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により導かれる配列を含有するアミノ酸配列を有し、前記配列は、アミノ酸水準で、前記配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０と、少なくとも７０％、有利には少なくとも７５％、より有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも８５％、より有利には少なくとも９０％、より有利には少なくとも９３％、より有利には少なくとも９５％、より有利には少なくとも９７％、より有利には少なくとも９８％、より有利には少なくとも９９％の同一性、及びヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦドメインの制御性特性を有し、その際この含有された、ＧＡＦAドメインのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、及びＧＡＦBドメインのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により、最大で１０％、より有利には最大で９％、より有利には最大で８％、より有利には最大で７％、より有利には最大で６％、より有利には最大で５％、より有利には最大で４％、より有利には最大で３％、より有利には最大で２％、より有利には最大で１％、より有利には最大で０．１％だけ変化する。
【００３７】
特に、特に有利なＧＡＦドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のＮ末端残基は、Ｎ末端からＧＡＦAドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６まで自由に変化可能であり、特に短縮可能である。有利には、前記の特に有利なＧＡＦドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のＮ末端残基は、１００アミノ酸だけ、有利には９０アミノ酸だけ、より有利には８０アミノ酸だけ、より有利には７０アミノ酸だけ、より有利には６０アミノ酸だけ、より有利には５０アミノ酸だけ、より有利には４０アミノ酸だけ、より有利には３０アミノ酸だけ、より有利には２０アミノ酸だけ、より有利には１０アミノ酸だけ、より有利には５アミノ酸だけＮ末端で短縮可能である。
【００３８】
前記ＧＡＦAドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６及びＧＡＦBドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸部分配列は、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により、最大で１０％、より有利には最大で９％、より有利には最大で８％、より有利には最大で７％、より有利には最大で６％、より有利には最大で５％、より有利には最大で４％、より有利には最大で３％、より有利には最大で２％、より有利には最大で１％、より有利には最大で０．５％だけ、このそのつどの、前記した機能の損失を生じることなしに変化する。
【００３９】
有利には、機能的に連結した、ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン、即ち完全なＧＡＦドメイン又はこの機能的に等価である変形は、以下のグループ
（ａ）アミノ酸Ｅ５１３までのヒトのＰＤＥ５Ａ１のＮ末端、又は
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０
から選択されたアミノ酸配列を有する。
【００４０】
前記の本発明によるポリペプチドのアデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインの部分のために、有利には、天然の形においてＧＡＦドメインを有するアデニル酸シクラーゼが使用される。特に有利なアデニル酸シクラーゼは、細菌由来のアデニル酸シクラーゼ、特にシアノバクテリアからのアデニル酸シクラーゼであり、これは天然の形においてＧＡＦドメインを有し、又はこれらのそのつどの機能に等価である変形である。
【００４１】
特に有利なアデニル酸シクラーゼは、以下のグループ：
（ａ）アナベナ種ＰＣＣ７１２０からのアデニル酸シクラーゼ又はこの機能的に等価である変形、
（ｂ）アナベナ・バリアビリ（Anabaena variabili）ＡＴＴＣ２９４１３からのアデニル酸シクラーゼ又はこの機能的に等価である変形、
（ｃ）ノストック・パンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ７３１０２からのアデニル酸シクラーゼ又はこの機能的に等価である変形、
（ｄ）トリコデスミウム・エリスラム（Trichodesmium erythraeum）ＩＭＳ１０１からのアデニル酸シクラーゼ又はこの機能的に等価である変形、
（ｅ）ブデロビブリオ・バクテリオボラス（Bdellovibrio bacteriovorus）ＨＤ１００からのアデニル酸シクラーゼ又はこの機能的に等価である変形、
（ｆ）マグネトコッカス（Magnetococcus）種ＭＣ−１からのアデニル酸シクラーゼ又はこの機能的に等価である変形
から選択される。
【００４２】
特に有利なアデニル酸シクラーゼは、アイソフォームＣｙａＢ１又はＣｙａＢ２のアナベナ種ＰＣＣ７１２０からのアデニル酸シクラーゼ、特にＣｙａＢ１（アクセッション：ＮＰ＿４８６３０６、Ｄ８９６２３）又はこの機能的に等価である変形である。
【００４３】
有利な実施態様において、アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメイン又はこの機能的に等価である変形は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２又はこの配列から、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により導かれる配列を含有するアミノ酸配列を有し、前記配列は、アミノ酸水準で、前記配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と、少なくとも９０％、有利には少なくとも９１％、より有利には少なくとも９２％、より有利には少なくとも９３％、より有利には少なくとも９４％、より有利には少なくとも９５％、より有利には少なくとも９６％、より有利には少なくとも９７％、より有利には少なくとも９８％、より有利には少なくとも９９％の同一性、及びアデニル酸シクラーゼの触媒特性を有する。
【００４４】
この際これは前記したように、前記の配列とその他のアデニル酸シクラーゼとの同一性比較により見出されてよいアデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインの天然の機能的に等価である変形であるか、又は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２から出発して、人工的な変異により、例えばアミノ酸の置換、挿入、又は欠失により、前述したように変更された人工的なアデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインであってよい。
【００４５】
アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインの特性とは、前述した、アデニル酸シクラーゼの触媒特性、特にＡＴＰをｃＡＭＰに移行させる能力が理解される。
【００４６】
有利には、アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメイン又はこの機能的に等価である変形は、以下のグループ
（ａ）アミノ酸Ｌ３８６〜Ｋ８５９のＣｙａＢ１のＣ末端、その際ＣｙａＢ１のＬ３８６は、Ｖ３８６により置き換えられている、又は
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２
から選択されたアミノ酸配列を有する。
【００４７】
特に有利な実施態様において、前記の本発明によるポリペプチドは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はこれらの配列から、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により導かれる配列を含み、前記配列は、アミノ酸水準で、前記配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と、少なくとも７０％、有利には少なくとも７５％、より有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも８５％、より有利には少なくとも９０％、より有利には少なくとも９３％、より有利には少なくとも９５％、より有利には少なくとも９７％、より有利には少なくとも９８％、より有利には少なくとも９９％の同一性及びヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のＧＡＦドメインの制御性特性及びアデニル酸シクラーゼの触媒特性を有し、その際この含有された、ＧＡＦAドメインのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＧＡＦBドメインのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、及びアデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２は、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により最大で１０％だけ変化する。
【００４８】
特に、前記の特に有利な本発明によるポリペプチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＮ末端残基は、Ｎ末端からＧＡＦAドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６まで自由に変化可能であり、特に短縮可能である。有利には、前記の特に有利な本発明によるポリペプチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＮ末端残基は、１００アミノ酸だけ、有利には９０アミノ酸だけ、より有利には８０アミノ酸だけ、より有利には７０アミノ酸だけ、より有利には６０アミノ酸だけ、より有利には５０アミノ酸だけ、より有利には４０アミノ酸だけ、より有利には３０アミノ酸だけ、より有利には２０アミノ酸だけ、より有利には１０アミノ酸だけ、より有利には５アミノ酸だけＮ末端で短縮可能である。
【００４９】
ＧＡＦAドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＧＡＦBドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、及びアデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸部分配列は、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失により、最大で１０％、より有利には最大で９％、より有利には最大で８％、より有利には最大で７％、より有利には最大で６％、より有利には最大で５％、より有利には最大で４％、より有利には最大で３％、より有利には最大で２％、より有利には最大で１％、より有利には最大で０．５％だけ、このそのつどの、前記した機能の損失を生じることなしに変化する。
【００５０】
特に有利には、本発明によるキメラポリペプチドはＮ末端に、Ｅ５１３までのヒトのＰＤＥ５Ａ１のＮ末端を含有する（アクセッション：ＮＰ＿００１０７４）。これには、Ｃ末端に、Ｖ３８６から、これはＬ３８６からクローニング切断部位の導入の際に変異されているが、ＣｙａＢ１のＣ末端のＫ８５９（アクセッション：ＮＰ＿４８６３０６）まで引き続く。
【００５１】
特に有利には、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含有する本発明によるポリペプチドである。
【００５２】
特に有利な本発明によるポリペプチドは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有するポリペプチドである。
【００５３】
更なる有利な実施態様において、本発明は更に、前述した、本発明によるポリペプチドの１つをコードするポリヌクレオチド（以下において核酸とも呼称される）に関する。
【００５４】
本明細書において言及されるポリヌクレオチド又は核酸の全ては、例えばＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はｃＤＮＡ配列であってよい。
【００５５】
特に有利な本発明によるポリヌクレオチドは、部分配列として、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５又は前記核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、及び
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又は前記核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、及び
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１又は前記核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含有する。
【００５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５は、特に有利なＧＡＦAドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６をコードする特に有利な部分核酸配列である。
【００５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、特に有利なＧＡＦBドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８をコードする特に有利な部分核酸配列である。
【００５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１は、特に有利なアデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２をコードする特に有利な部分核酸配列である。
【００５９】
前述のドメインをコードする核酸又は部分核酸のための更なる天然の例は、更に、前述した部分核酸から出発して、特に配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、７、又は１１から出発して、ゲノム配列が公知でない様々な生物から、ハイブリダイゼーション技術により、公知の手法において容易に生じる。
【００６０】
このハイブリダイゼーションは、適度（低ストリンジェンシー）な、又は有利にはストリンジェント（高ストリンジェンシー）な条件下で行われてよい。
【００６１】
係るハイブリダイゼーション条件は、例えばSambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T.,: Cloning (A Laboratory Manual), 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 頁9. 31-9.57又はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6. 3.1-6.3.6 に記載されている。
【００６２】
例示的に、洗浄工程の間の前記条件は、低ストリンジェンシー（２×ＳＳＣ  ５０℃で）を有する条件及び高ストリンジェンシー（０．２×ＳＳＣ  ５０℃で、有利には６５℃で）を有する条件により制限される条件の範囲から選択されてよい（２０×ＳＳＣ：０．３Ｍクエン酸ナトリウム、３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）。
【００６３】
更に、前記洗浄工程の間の温度は、室温、２２℃での適度な条件から、６５℃でのストリンジェントな条件まで増加させてよい。
【００６４】
パラメーター、塩濃度及び温度の両者は、同時に変化させても、またこの両者のパラメーターのうち１つを一定に維持し、かつ他方のみを変化させてもよい。前記ハイブリダイゼーションの間に、変性剤、例えばホルムアミド又はＳＤＳを使用してもよい。５０％のホルムアミドの存在下で、前記ハイブリダイゼーションは有利には４２℃で実行される。
【００６５】
ハイブリダイゼーション及び洗浄工程の例示的な条件は、以下に挙げられる：
（１）ハイブリダイゼーション条件、例えば
（ｉ）４×ＳＳＣ、６５℃で、又は
（ｉｉ）６×ＳＳＣ、４５℃で、又は
（ｉｉｉ）６×ＳＳＣ、６８℃で、変性した魚の精子ＤＮＡ１００ｍｇ／ｍｌ、又は
（ｉｖ）６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、変性した、断片化したサケ精子ＤＮＡ１００ｍｇ／ｍｌ、６８℃で、又は
（ｖ）６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、変性した、断片化したサケ精子ＤＮＡ１００ｍｇ／ｍｌ、５０％のホルムアミド、４２℃で、又は
（ｖｉ）５０％のホルムアミド、４×ＳＳＣ、４２℃で、又は
（ｖｉｉ）５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のホルムアミド、０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、４２℃で、又は
（ｖｉｉｉ）２×又は４×ＳＳＣ、５０℃で（適度な条件）、又は
（ｉｘ）３０〜４０％のホルムアミド、２×又は４×ＳＳＣ、４２℃で（適度な条件）。
【００６６】
（２）そのつど１０分間の洗浄工程、例えば以下を用いて：
（ｉ）０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％のＳＤＳ、５０℃で、又は
（ｉｉ）０．１×ＳＳＣ、６５℃で、又は
（ｉｉｉ）０．１×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、６８℃で、又は
（ｉｖ）０．１×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、４２℃で、又は
（ｖ）０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、４２℃で、又は２×ＳＳＣ、６５℃で（適度な条件）。
【００６７】
本発明によるポリペプチドをコードする特に有利な本発明によるポリヌクレオチドは、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含有する。
【００６８】
本発明によるポリペプチドをコードするとりわけ特に有利な本発明によるポリヌクレオチドは、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を示す。
【００６９】
前記の本発明によるポリペプチドは、有利には、本発明によるポリペプチドをコードする前述したポリヌクレオチドを、適した発現ベクター中にクローニングし、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この宿主細胞を本発明によるポリペプチドの発現下で発現させ、引き続き本発明によるタンパク質を単離することにより製造される。
【００７０】
本発明は従って、組み換え宿主細胞の培養、本発明によるポリペプチドの発現及び単離による、本発明によるポリペプチドの製造方法に関する。
【００７１】
この形質転換法は当業者に公知であり、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., :Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 頁9.31-9.57に記載されている。
【００７２】
本発明は更に、本発明によるポリペプチドをコードする本発明によるポリヌクレオチドを含有する組み換えプラスミドベクター、特に発現ベクターに関する。
【００７３】
発現ベクターの種類は決定的ではない。相応する宿主細胞中で、この所望のポリペプチドを発現することができる任意の発現ベクターが使用されてよい。適した発現系は、当業者に公知である。
【００７４】
有利な発現ベクターは、ＰＱＥ３０（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ｐＱＥ６０（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ｐＭＡＬ（ＮＥＢ）、ｐｌＲＥＳ、ＰＩＶＥＸ２．４ａ（ＲＯＣＨＥ）、ＰＩＶＥＸ２．４ｂ（ＲＯＣＨＥ）、ＰＩＶＥＸ２．４ｃ（ＲＯＣＨＥ）、ｐＵＭＶＣＩ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、ｐＵＭＶＣ２（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、ＰＵＭＶＣ３（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、ＰＵＭＶＣ４ａ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、ＰＵＭＶＣ４ｂ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、ｐＵＭＶＣ７（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、ＰＵＭＶＣ６ａ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、ｐＳＰ６４Ｔ、ｐＳＰ６４ＴＳ、ｐＴ７ＴＳ、ｐＣｒｏ７（Ｔａｋａｒａ）、ｐＫＪＥ７（Ｔａｋａｒａ）、ｐＫＭ２６０、ｐＹｅｓ２６０、ｐＧＥＭＴｅａｓｙである。
【００７５】
本発明は更に、本発明によるプラスミドベクターを含有する組み換え宿主細胞に関する。係る形質転換した宿主細胞は、有利には、本発明によるポリペプチドを発現することができる。
【００７６】
前記宿主細胞の種類は決定的ではない。原核宿主細胞も、真核宿主細胞も適する。相応する発現ベクターにより、この所望のポリペプチドを発現できる、任意の宿主細胞が使用されてよい。適した発現系は、発現ベクター及び宿主細胞から、当業者に公知である。
【００７７】
有利な宿主細胞は、例えば原核細胞、例えば大腸菌、コリネバクテリウム、酵母、ストレプトマイセス菌、又は真核細胞、例えばＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、又は昆虫細胞系、例えばＳＦ９、ＳＦ２１、アフリカツメガエル卵母細胞である。
【００７８】
前記の形質転換した宿主細胞の培養条件、例えば培地組成及び発酵条件は、当業者に公知であり、この選択した宿主細胞の種類に適合される。
【００７９】
前記ポリペプチドの単離及び精製は、標準的方法により行われてよく、例えば「Ｔｈｅ  ＱｕｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ(R)」（第５版、２００３年６月）に記載されている。
【００８０】
前述した形質転換した宿主細胞は、これは本発明によるポリペプチドを発現するが、後述する、細胞アッセイ中でのＰＤＥ５モジュレーターの同定方法の実施にも特に適する。これには、固体の担体上でこの相応する宿主細胞を不死化すること、及び／又は相応するスクリーニング方法をハイスループット規模において実施すること（High-Through-Put-Screening）が更に有利であってよい。
【００８１】
前述した核酸配列の全ては、当業者に公知の方法、例えば酵素による方法より、公知の核酸配列から切断され、公知の核酸配列を用いて新規に構成され、そしてこれにより製造される。更に、前述した核酸配列の全ては自体公知の方法において、化学的な合成により、ヌクレオチド構成要素から、例えば、個々の、オーバーラップする、相補的な、二重らせんの核酸構成要素の断片縮合により製造可能である。オリゴヌクレオチドの化学的合成は、例えば公知の方法において、ホスホアミジッド（Phosphoamidit）法（Voet, Voet, 第２版, Wiley Press New York, 896-897頁）により行われてよい。ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いた合成のオリゴヌクレオチドの付加及び間隙の充填及びライゲーション反応並びに一般的なクローニング方法は、Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【００８２】
本発明は更に、ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のモジュレーターの同定方法であって、以下の工程
（ａ）ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）の可能性のあるモジュレーターと、本発明によるポリペプチドとの接触、及び
（ｂ）前記の可能性のあるモジュレーターが、本発明によるポリペプチドのアデニル酸シクラーゼ活性を、前記の可能性のあるモジュレーターの非存在下に比較して変更させるかの決定
を含む同定方法に関する。
【００８３】
本発明による方法の有利な実施態様において、工程（ａ）において、ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）の可能性のあるモジュレーターに付加的に、ｃＧＭＰを本発明によるポリペプチドと接触させる。
【００８４】
本発明による方法において、前記の可能性のあるＰＤＥ５モジュレーターを、有利にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、有利には、精製された本発明によるポリペプチドと、及び特に有利にはｃＧＭＰとインキュベーションし、かつ本発明によるポリペプチドのアデニル酸シクラーゼ活性の変更を、ＰＤＥ５モジュレーターなしの試験バッチに対して測定する。
【００８５】
代替的にこのために、前記の可能性のあるＰＤＥ５モジュレーターの、試験バッチへの添加後の前記アデニル酸シクラーゼ活性の変更が測定されてよく、前記試験バッチは、本発明によるポリペプチド及び場合によりｃＧＭＰを含有する。前記ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性は、以下に詳細に記載するように、一定の量のＡＴＰのｃＡＭＰへの変換により決定される。
【００８６】
ヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のモジュレーター、以下ではＰＤＥ５モジュレーターとは、ＰＤＥ５のＧＡＦドメインへの結合を介して、前記ＰＤＥ５活性を調節でき、即ち変更できる物質が理解され、この際アデニル酸シクラーゼ活性の変更を介して測定される。ＰＤＥ５モジュレーターは従って、ＰＤＥ５のアロステリック中心を介して作用し、そしてＰＤＥ５の触媒中心を介さず作用するか、又は介してのみでなく作用する。前記モジュレーターは、前記ＰＤＥ５の酵素活性を高めることによりアゴニストであってよく（ＰＤＥ５アゴニスト）、又はＰＤＥ５の酵素活性を減少させることによりアンタゴニストであってよい（ＰＤＥ５アンタゴニスト）。
【００８７】
例示的に、本発明による方法により、例えば以下に詳細に説明するように、ｃＧＭＰがＰＤＥ５アゴニストであることが示された。
【００８８】
有利なＰＤＥ５モジュレーターは更に、例えばペプチド、ペプチド擬似体、タンパク質、特に抗体、特にＧＡＦドメインに対して指向したモノクローナル抗体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ポリヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチド、特に有利には、いわゆる「小分子」又はＳＭＯＬｓである。有利なＳＭＯＬｓは、有機又は無機化合物、１０００ｇ／モルより小さい分子量、特に２００〜８００ｇ／モルの分子量、特に有利には３００〜６００ｇ／モルの分子量を有する、ヘテロ有機化合物又は有機金属化合物を含む、有機又は無機化合物である。
【００８９】
本発明によれば、ＰＤＥ５モジュレーターは有利には、本発明によるポリペプチド（ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラ）中のＧＡＦドメインに結合し、そして直接的に、本発明によるポリペプチド（ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラ）のアデニル酸シクラーゼ活性の変更を生じるか、又はＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラによるｃＧＭＰの変更により、ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性の変更を生じる。
【００９０】
本発明による方法が、試験すべき物質としてｃＧＭＰ又はｃＡＭＰを用いるのみであって、そしてＰＤＥ５モジュレーターなしで実施される場合には、図５の用量作用曲線が生じる。前記ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラは、１００μＭのｃＧＭＰにより、約７．８倍活性化される。これは、７８０の％ベース値に相当し、前記ｃＧＭＰは、ＰＤＥ５−ＧＡＦ−アゴニストであることを示す。ｃＡＭＰは非活性性に作用し、そして約１００の％ベース値を有し、即ちこれは、ＰＤＥ５アゴニストでも、ＰＤＥ５アンタゴニストでもない。
【００９１】
この調節は、即ちこの変更は、即ちアデニル酸シクラーゼ活性の上昇又は減少は、前記ＰＤＥ５モジュレーターにより、ｃＧＭＰなしの試験バッチ中で、％ベース値として、以下の式により算出される：
【表１】
2008500824.tif 000002
【００９２】
前記の可能性のあるＰＤＥ５モジュレーターの１００μＭの使用の際の％ベース値が５０より小さい場合には、これはＰＤＥ５アンタゴニストを示唆し、これはＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラ中のＧＡＦドメインに結合し、その一方で２００よりも大きい％ベース値は、ＰＤＥ５アゴニストを示唆する。
【００９３】
本発明は従って、前記モジュレーターの存在下で前記アデニル酸シクラーゼ活性の減少が、前記モジュレーターの非存在下に比較して測定され、そしてこのモジュレーターがＰＤＥ５アンタゴニストである、特に有利な本発明による方法に関する。
【００９４】
更に本発明は、前記モジュレーターの存在下で前記アデニル酸シクラーゼ活性の上昇が、前記モジュレーターの非存在下に比較して測定され、そしてこのモジュレーターがＰＤＥ５アゴニストである、特に有利な本発明による方法に関する。
【００９５】
本発明による方法の特に有利な実施態様において、前記アデニル酸シクラーゼ活性の決定は、放射性標識した又は蛍光標識したＡＴＰの変換の測定により行われる。
【００９６】
本発明によるポリペプチド、ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性の測定は、放射性の［α−32Ｐ］−ＡＴＰの［α−32Ｐ］ｃＡＭＰへの変換の測定により行われてよい。
【００９７】
一般的に前記アデニル酸シクラーゼ活性は容易に、抗体結合を介する、この生じたｃＡＭＰの測定を介して可能である。このためには様々な市販のアッセイキット、例えばｃＡＭＰ［3Ｈ−］又は［125−Ｉ］ＢｉｏＴｒａｋ(R)ｃＡＭＰ  ＳＰＡ−Ａｓｓａｙｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ(R)）又はＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ(R)又はＬａｎｃｅ(R)ｃＡＭＰ  Ａｓｓａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ(R)）が存在する：これら全ては、ＡＣ反応の際にＡＴＰから非標識ｃＡＭＰが生じるとの原理に基づく。これは、外来性の添加された３Ｈ標識したｃＡＭＰ、１２５Ｉ標識したｃＡＭＰ、又はビオチン標識したｃＡＭＰと、ｃＡＭＰ特異的抗体に対する結合を競合する。非放射性Ｌａｎｃｅ(R)Ａｓｓａｙでは、Ａｌｅｘａ(R)Ｆｌｕｏｒが、前記抗体に結合し、これは、トレーサーを用いてＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを６６５ｎｍで生ずる。非標識ｃＡＭＰが多く結合するほど、この標識したｃＡＭＰにより惹起されるシグナルは弱くなる。標準曲線を用いて、このシグナル強度は、この相応するｃＡＭＰ濃度に割り当てられてよい。
【００９８】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓによる高効率性蛍光分極（High-Efficiency Fluorescence Polarization）（ＨＥＦＰTM）−ＰＤＥアッセイと同様に、これはＩＭＡＰ技術に基づいているが、放射性標識された物質の代わりに蛍光標識された物質を使用してよい。ＨＥＦＰ−ＰＤＥ−アッセイの際には、フルオレセイン標識したｃＡＭＰ（ＦＩ−ｃＡＭＰ）が使用され、これはＰＤＥにより、フルオレセイン標識した５′ＡＭＰ（ＦＩＡＭＰ）へと変換される。前記ＦＩ−ＡＭＰは選択的に、特殊なビーズに結合し、これによりこの蛍光は強力に分極する。ＦＩ−ｃＡＭＰは、前記ビーズに結合せず、従ってこの分極の増加は、この生じたＦＩ−ＡＭＰの量に比例する。相応するＡＣ試験のために、蛍光標識したＡＴＰを、ＦＩ−ｃＡＭＰの代わりに、及びビーズ（これは、選択的にＦＩ−ｃＡＭＰに、ＦＩ−ｃＡＭＰの代わりに結合する）を使用してよい（例えば、前記ビーズは、ｃＡＭＰの抗体で負荷されているものである）。
【００９９】
本発明の方法の更なる有利な実施態様において、この変更された％ベース値が、前記物質のＧＡＦ調節性の効果に、又は前記のＡＣ触媒中心の直接的な調節に条件付けられているかを区分するために、付加的にカウンタースクリーンを実施する。
【０１００】
本発明は従って更に、有利な本発明による方法であって、前記アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインの直接的なモジュレーターの除外のために、本発明の方法を、アデニル酸シクラーゼの触媒性ドメインを有し、かつヒトのホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）の機能性ＧＡＦドメインを有しないポリペプチドの使用下で実施する方法に関する。
【０１０１】
有利にはこのために、前述した方法と同様に前記の％ベース値が、有利には、ＰＥＤ５／ＣｙａＢ１キメラを用いる代わりに、タンパク質を用いて算出され、前記タンパク質は、有利には
ａ）ＡＣ触媒中心を含有するか、又は
ｂ）ＧＡＦ機能のために必須であるアミノ酸に関する変異を含有するか、又は
ｃ）前記ＧＡＦドメインだけＮ末端において短縮した
のみである。
【０１０２】
ａ）のための例は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有するポリペプチドであり、但し、Ｎ末端ではＥ２からＬ７２０は欠失しているとの条件付きである。
【０１０３】
ｂ）のための例は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有するポリペプチドであり、但し、これは変異Ｄ２９９Ａを含有するとの条件付きである。
【０１０４】
ｃ）のための例は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有するポリペプチドであり、但し、Ｄ１６４からＥ５１３の部分配列は欠失しているとの条件付きである。
【０１０５】
ａ、ｂ、又はｃにより変性されたタンパク質を有する物質１００μＭが、５０よりも小さい％ベース値を生ずる場合には、前記ＡＣ触媒中心の阻害が存在し、かつ純粋なＧＡＦ拮抗作用は排除されてよい。
【０１０６】
本発明による方法の更なる有利な実施態様において、前記方法は細胞アッセイとして、前述した、本発明による宿主細胞の存在下で実施される。
【０１０７】
このために、前記の生じたｃＡＭＰが、前記アデニル酸シクラーゼ活性に関する程度として、細胞アッセイ中においても測定されてよく、これは例えば、Johnston, P. Cellular assays in HTS, Methods Mol Biol. 190, 107-16. (2002)及びJohnston, P. A. and Johnston, P. A. Cellular platforms for HTS :three case studies.Drug Discov Today. 7,353-63. (2002)に記載されている。
【０１０８】
このために、有利には、本発明によるポリペプチド、ＰＤＥ／ＣｙａＢ１のｃＤＮＡを、適した制限部位を介して、トランスフェクションベクター中に導入し、前記の生じたベクター構築物を用いて、適した細胞、例えばＣＨＯ又はＨＥＫ２９３をトランスフェクションする。本発明によるポリペプチドを安定に発現する細胞クローンが選択される。
【０１０９】
前記のトランスフェクションされた細胞クローンの細胞内ｃＡＭＰ濃度は、本発明によるポリペプチドのアデニル酸シクラーゼ活性により、かなり影響を及ぼされる。ＧＡＦアンタゴニストは、前記アデニル酸シクラーゼ活性の阻害により細胞内ｃＡＭＰの減少を、そしてＧＡＦアゴニストは、細胞内ｃＡＭＰの上昇を引き起こす。
【０１１０】
前記ｃＡＭＰ量は、前述した方法（Ｂｉｏｔｒａｋ(R)、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ(R)、又はＨＥＦＰ(R)）を用いた細胞の溶解により、又は直接的に細胞中で測定されてよい。このためには、前記細胞系においては有利にはリポーター遺伝子を、ＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答配列）にカップリングする（Johnston, P. Cellular assays in HTS, Methods Mol Biol. 190,107-16. (2002)）。高まったｃＡＭＰ濃度は、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質）の、ＣＲＥ制御因子に対する高まった結合、そして従って前記リポーター遺伝子の高まった転写を生じる。リポーター遺伝子として、例えば緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼを用いてよく、この発現レベルは、蛍光測定、光度測定、又は発光測定により測定されてよく、例えばこれは、Greer, L. F. and Szalay, A.A. Imaging of light emission from the expression of luciferase in living cells and organisms :a review. Luminescence 17,43-72 (2002)又はHill, S. et al. Reporter-gene systems for the study of G-protein coupled receptors. Curr. Opin. Pharmacol. 1,526-532 (2001)に記載されている。
【０１１１】
特に有利な実施態様において、前述した本発明による方法は、特にハイスループットの規模にある細胞アッセイとして適用される。
【０１１２】
本発明は、更に以下の、引き続く１５段落に記載されている実施態様に関する：
本発明に基づく課題は、ＰＤＥ５アンタゴニストの同定方法を提供することにある。
【０１１３】
前記課題は、態様Ａによるポリペプチドにより後述するように、そして態様Ｑによる方法により後述するように解決される。有利な実施態様は、後述する下位請求中に示されている。
【０１１４】
意外にも、有利には、Ｎ末端のヒトのＰＤＥ５−ＧＡＦ−ドメイン及び、有利には、アナベナ又はノストック種、ＰＣＣ７１２０からのアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）ＣｙａＢ１のＣ末端の触媒中心からのキメラタンパク質がエフェクター分子として適することが確認された。前記キメラタンパク質は、有利にはＮ末端に、Ｅ５１３までのヒトのＰＤＥ５Ａ１のＮ末端を含有する（アクセッション：ＮＰ＿００１０７４）。これには有利には、Ｃ末端に、Ｖ３８６から、これはＬ３８６からこのクローニング切断部位の導入の際に変異されているが、ＣｙａＢ１のＣ末端のＫ８５９まで引き続く（アクセッション：ＮＰ＿４８６３０６）。キメラタンパク質においては有利には、前記ＧＡＦドメインが活性化ドメインであり、これはリガンド結合の際にこのコンフォメーションを変更し、かつこれによりＡＤドメイン（これは読み出しとして使用される）の触媒活性を高める。
【０１１５】
本発明による方法は、ＰＤＥ５の触媒中心の結合及び遮断を介してではなく、ＰＤＥ５のＮ末端に、即ちＧＡＦドメインにあるアロステリックな制御を介して作用するアンタゴニストの同定を可能にする。
【０１１６】
このために、前記の可能性のあるＰＤＥ５アンタゴニストを、有利には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、精製された本発明によるポリペプチドと、及び有利にはｃＧＭＰとインキュベーションし、かつ本発明によるポリペプチドのアデニル酸シクラーゼ活性の減少を、有利にはＰＤＥ５アンタゴニストなしの試験バッチに対して測定する。代替的にこのために、前記の可能性のあるＰＤＥ５アンタゴニストの、試験バッチへの添加後の前記アデニル酸シクラーゼ活性の減少が測定されてよく、前記試験バッチは、本発明によるポリペプチド及びｃＧＭＰを含有する。前記ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性は有利には、一定の量のＡＴＰのｃＡＭＰへの変換を介して決定される。
【０１１７】
本発明によれば、有利にはＰＤＥ５アンタゴニスト（ＰＤＥ５に対するアンタゴニスト）は、ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラ中のＧＡＦドメインに結合し、そして有利には、直接的に、前記ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼの減少を生じるか、又はＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラによるｃＧＭＰの変更により、ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性の変更による前記ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼの減少を生じる。
【０１１８】
本発明による方法が、試験すべき物質としてｃＧＭＰ又はｃＡＭＰを用いるのみであって、そしてＰＤＥ５アンタゴニストなしで実施される場合には、図５の用量作用曲線が生じる。このＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラは、１００μＭのｃＧＭＰにより、約７．８倍活性化される。これは、７８００の％ベース値に相当し、前記ｃＧＭＰは、ＰＤＥ５−ＧＡＦ−アゴニストであることを示す。ｃＡＭＰは非活性性に作用し、約１００の％ベース値を有し、即ちこれは、ＧＡＦアゴニストでも、アンタゴニストでもない。
【０１１９】
このアデニル酸シクラーゼの阻害は、前記ＰＤＥ５アンタゴニストにより、ｃＧＭＰなしの試験バッチ中で、％ベース値として、以下の式により算出される：
【表２】
2008500824.tif 000003
【０１２０】
前記の可能性のあるＰＤＥ５アンタゴニストの１００μＭの使用の際の％ベース値が５０より小さい場合には、これはＰＤＥ５アンタゴニストを示唆し、これはＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラ中のＧＡＦドメインに結合し、その一方で２００よりも大きい％ベース値は、ＰＤＥ５アゴニストを示唆する。
【０１２１】
発現のためには、前記ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラは、ＭＳＣのＢａｍＨＩ及びＳａｌｌ制限酵素切断部位を介してＰＱＥ３０発現ベクター（Ｑｕｉａｇｅｎ）中に導入される。前記発現は、原核細胞及び真核細胞中で行われてよい。このタンパク質の精製は、標準的な方法により行われ、従って、例えば「ＴｈｅＱｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ(R)」第５版（２００３年６月）により行われる。
【０１２２】
前記ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性の検出は、放射性の、［α−32Ｐ］−ｃＡＭＰへの［α−32Ｐ］−ＡＴＰの変換の測定により行われる。
【０１２３】
一般的に前記アデニル酸シクラーゼ活性は容易に、抗体結合を介するこの生じたｃＡＭＰの測定を介して可能である。このために、様々な市販のアッセイキットが存在し、例えばｃＡＭＰ［3Ｈ−］又は［125−Ｉ］Ｂｉｏｔｒａｋ(R)  ｃＡＭＰ  ＳＰＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ(R)）、又はＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ(R)ｃＡＭＰ  Ａｓｓａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ(R)）が存在する：これら全ては、ＡＣ反応の際にＡＴＰから非標識ｃＡＭＰが生じるとの原理に基づく。これは、外来性の添加された３Ｈ標識したｃＡＭＰ、１２５Ｉ標識したｃＡＭＰ、又はビオチン標識したｃＡＭＰと、ｃＡＭＰ特異的抗体に対する結合を競合する。非標識ｃＡＭＰが多く結合するほど、この標識したｃＡＭＰにより惹起されるシグナルは弱くなる。標準曲線を用いて、このシグナル強度は、この相応するｃＡＭＰ濃度に割り当てられてよい。
【０１２４】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓによる高効率性蛍光分極（High-Efficiency Fluorescence Polarization）（ＨＥＦＰTM）−ＰＤＥアッセイと同様に、これはＩＭＡＰ技術に基づいているが、放射性標識された物質の代わりに蛍光標識された物質を使用してよい。ＨＥＦＰ−ＰＤＥ−アッセイの際には、フルオレセイン標識したｃＡＭＰ（ＦＩ−ｃＡＭＰ）が使用され、これはＰＤＥにより、フルオレセイン標識した５′ＡＭＰ（ＦＩＡＭＰ）へと変換される。前記ＦＩ−ＡＭＰは選択的に、特殊なビーズに結合し、これによりこの蛍光は強力に分極する。ＦＩ−ｃＡＭＰは、前記ビーズに結合せず、従ってこの分極の増加は、この生じたＦＩ−ＡＭＰの量に比例する。相応するＡＣ試験のために、蛍光標識したＡＴＰを、ＦＩ−ｃＡＭＰの代わりに、及びビーズ（これは、選択的にＦＩ−ｃＡＭＰに、ＦＩ−ｃＡＭＰの代わりに結合する）を使用してよい（例えば、前記ビーズは、ｃＡＭＰの抗体で負荷されているものである）。
【０１２５】
前記アッセイが、試験すべき物質としてｃＧＭＰ又はｃＡＭＰとともに実施される場合には、図５の用量作用曲線が生じる。前記ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラは、１００μＭのｃＧＭＰにより、約７．８倍活性化される。これは、７８００の％ベース値に相当し、前記ｃＧＭＰは、ＰＤＥ５−ＧＡＦ−アゴニストであることを示す。ｃＡＭＰは非活性性に作用し、約１００の％ベース値を有し、即ちこれは、ＧＡＦアゴニストでも、ＧＡＦアンタゴニストでもない。
【０１２６】
本発明は更に：
Ａ．  （ａ）ヒトのＰＤＥ５からのＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン、及び（ｂ）ＣｙａＢ１の触媒性ドメインを含有するポリペプチド。
Ｂ．  Ａ記載のポリペプチドであって、（ａ）アミノ酸Ｅ５１３までのヒトのＰＤＥ５Ａ１のＮ末端、及び（ｂ）アミノ酸Ｌ３８６からＫ８５９までのＣｙａＢ１のＣ末端（その際、ＣｙａＢ１のＬ３８６はＶ３８６により置き換えられている）を含有することを特徴とするポリペプチド。
Ｃ．  図１に示したポリペプチド配列を含有する、Ａ記載のポリペプチド。
Ｄ．  図３に示したポリペプチド。
Ｅ．  Ａ記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
Ｆ．  Ｂ記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
Ｇ．  Ｃ記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
Ｈ．  Ｄ記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
Ｉ．  図２に示したヌクレオチド配列を含有する、単離したＤＮＡ分子。
Ｊ．  Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤ記載のポリペプチドをコードする、ｃＤＮＡ配列を含有する、組み換えＤＮＡ分子。
Ｋ．  Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤ記載のポリペプチドと、少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、ｃＤＮＡ配列を含有する、組み換えＤＮＡ分子。
Ｌ．  Ｅ、Ｆ、Ｇ、又はＨ記載のポリヌクレオチドを含有する、組み換えプラスミドベクター。
Ｍ．  Ｌ記載のプラスミドベクターを含有する、組み換え宿主細胞。
Ｎ．  工程（ａ）ＰＤＥ５に対する可能性のあるアンタゴニストと、Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤ記載のポリペプチドとの接触、及び（ｂ）前記の可能性のあるアンタゴニストが、ＰＤＥ５の活性を阻害するかの決定、を含む、ＰＤＥ５に対するアンタゴニストの同定方法。
Ｏ．  工程（ａ）において、ＰＤＥ５に対するアンタゴニストに付加的に、ｃＧＭＰを、Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤ記載のポリペプチドと競合させる、Ｎ記載の方法。
Ｐ．  工程（ａ）の後であってかつ工程（ｂ）の前に、工程（ａ）において使用した前記ポリペプチドのアデニル酸シクラーゼ活性を測定する、更なる工程を含む、Ｎ及びＯ記載の方法。
Ｑ．  アデニル酸シクラーゼ活性の減少を測定する、Ｐ記載の方法。
【０１２７】
以下の実施例は、本発明をこれらの実施例に制限することなく説明するものである：
実施例１
ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラをコードする組み換えＤＮＡの製造
このクローニングは標準的な方法に従って行われた。ヒトのＰＤＥ５Ａ１に対する遺伝子を有する当初のクローン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０４３７３１）は、pcDNA-Zeocin-VectorのA. Friebe教授より提供された。ＰＣＲにより、Kanacher et al., EMBO J. 2002に記載された、ＰＤＥ２−ＧＡＦ−キメラのクローニングと同様に行った。特異的なプライマーを用いて、遺伝子断片ｈＰＤＥ５1〜348を増幅し、これはＧＡＦ−Ａ−ドメインを有するＰＤＥ５−Ｎ末端をコードし、かつＮ末端にＢｇｌｌｌ、並びＣ末端にＸｂａｌ切断部位を含有する。同様に、遺伝子断片ｈＰＤＥ５349〜450を増幅し、これはＧＡＦ−Ｂ−ドメインをコードし、かつＮ末端にＸｂａｌ切断部位並びにＣ末端にＳａｌｌ切断部位を含有する。この両断片は、サブクローニング工程を介して、クローニングベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌ  ＳＫ（−）中で、Ｘｂａｌ切断部位を介して、ｐＰＤＥ５1〜450へとつなぎ合わされる。この遺伝子断片ｈＰＤＥ５1〜450に、Ｓａｌｌ切断部位を介してＣ末端に、ＰＣＲにより産生された、アデニル酸シクラーゼＣｙａＢ１の触媒性ドメインを有する遺伝子断片ＣｙａＢ１386〜859（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｄ８９６２３）を連結した。この際ｈＰＤＥ５1〜450のＮ末端のＳａｌｌ切断部位を、ＣｙａＢ１386〜859のＣ末端のＸｈｏｌ切断部位にクローニングし、ＣｙａＢ１のＬ３８６をＶに変異させた。全てのクローニング工程は、大腸菌のＸｌ１ｂｌｕｅＭＲＦ’中で行った。
【０１２８】
ＰＤＥ−５−ＧＡＦキメラのための遺伝子を、発現ベクターｐＱＥ３０（Ｑｕｉａｇｅｎ）中で再クローニング（Umklonieren）した。
【０１２９】
実施例２
前記ポリペプチドの発現及び精製
発現のために、実施例１から得られた、ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラをコードするＤＮＡ構築物を、ＭＣＳのＢａｍＨｌ及びＳａｌｌの制限酵素切断部位を介して、ＰＱＥ３０発現ベクター（Ｑｕｉａｇｅｎ）中に導入した。ＰＤＥ５−ＧＡＦキメラに対する遺伝子を有するこのｐＱＥ３０ベクターを、大腸菌ＢＬ２１細胞中で再形質転換した。このタンパク質の発現及び精製を、「Ｔｈｅ  ＱｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ(R)」（第５版、２００３年６月）と同様に行った。この際、この最適なタンパク質収率を以下の発現条件で達成した：２５μＭ  ＩＰＴＧで誘導、１６℃で１６時間インキュベーション、及び引き続きこの大腸菌のフレンチプレス処理。
【０１３０】
実施例３
アッセイの実施
ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性を、試験すべき物質有り、及びなしで測定した。この際、前記アデニル酸シクラーゼ活性を、一定量のＡＴＰのｃＡＭＰへの変換、及びSalomon et al.(Salomon Y., Londos C., and Rondbell M.: A highly sensitive adenylate cyclase assay. 1974, Anal. Biochem., 58, 541-548)による２つのカラム工程を介した分離を介して決定した。この変換の検出のために、放射性トレーサーとして、［α−32Ｐ］−ＡＴＰを使用し、かつこの生じた［α−32Ｐ］−ｃＡＭＰの量を測定した。3Ｈ−ｃＡＭＰを、回収率（Wiedefindungsrate）のための内部標準として用いた。このインキュベーション時間は、１〜１２０分間、このインキュベーション温度は２０〜４５℃、このＭｇ2+補因子濃度は１〜２０ｍＭ（これはまた、補因子として相応するＭｎ2+量を使用してもよい）、及びこのＡＴＰ濃度は０．５μＭ〜５ｍＭにあることが望ましい。物質なしに対して、物質有りでの前記変換の上昇は、ＧＡＦアゴニスト効果を示唆する。前記変換が物質添加により阻害される場合には、前記物質のＧＡＦアンタゴニスト効果が示唆される。ＧＡＦ拮抗作用は、天然のＧＡＦリガンドｃＧＭＰによるＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラの活性化の遮断を介しても測定されてよい。このために、上昇性の又は固定のｃＧＭＰ濃度での変換を、物質有り、及びなしで測定する。物質有りでの前記変換が、物質なしでの前記変換を下回る場合には、前記物質のＧＡＦ拮抗作用を示唆する。
【０１３１】
反応バッチは以下を含有する：
・５０μｌのＡＣ試験カクテル（グリセロール４３．５％（Ｖ／Ｖ）、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2）
・４０−ｘ−ｙμｌの酵素希釈液（活性次第で、０．１〜０．３μｇのＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラを、０．１％（Ｗ／Ｖ）のＢＳＡ水溶液中に含有する）
・ｘμｌの物質
・ｙμｌのｃＧＭＰ
・１０μｌの７５０μＭ  ＡＴＰ開始溶液（１６〜３０ｋＢｑ［α32Ｐ］−ＡＴＰを含有する）
前記タンパク質試料及び前記カクテルを、氷上の１．５ｍｌの反応容器中で混合し、この反応をＡＴＰで開始させ、１０分間３７℃でインキュベーションした。１５０μｌのＡＣ停止緩衝液でもってこの反応を終了させ、前記反応容器を氷上に配置し、１０μｌの２０ｍＭ  ｃＡＭＰ（１００Ｂｑ［２，８−3Ｈ］−ｃＡＭＰ及び７５０μｌの水を含有する）を添加した。
【０１３２】
それぞれの試験バッチを２回実施した。ブランクとして、酵素の代わりに水を用いた試験バッチを使用した。物質及びｃＧＭＰなしの試験バッチを用いて、前記酵素−ベース活性を決定した。ＡＴＰとｃＡＭＰとの分離のために、それぞれの試料を１．２ｇのＤｏｗｅｘ−５０ＷＸ４−４００を有するガラスカラム上に付与し、浸透後に３−４ｍｌの水で洗浄した。引き続き、５ｍｌの水を用いて酸化アルミニウムカラム（９×１ｃｍガラスカラム、ＡＬ2Ｏ3  ９０を有する、活性あり、中性）上で溶離させ、これを４ｍｌの０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５を用いて、４ｍｌの装入したシンチレーターUltima XR Goldを有するシンチレーション容器中で溶離させた。十分な混合後、液体シンチレーションカウンター中でカウントした。放射性標識したｃＡＭＰ及びＡＴＰの使用量を、3Ｈ合計、及び32Ｐ合計として、直接的に５ｍｌの溶離緩衝液及び４ｍｌのシンチレーター中でカウントした。
【０１３３】
この変換を酵素活性として以下の式に従って算出した：
【表３】
2008500824.tif 000004
【０１３４】
この物質による前記酵素の阻害又は活性化は、％ベース値として、以下の式に従って算出された：
【表４】
2008500824.tif 000005
【０１３５】
％ベース値が１００μＭの物質の際に５０よりも小さい場合には、これは、ＰＤＥ５−ＧＡＦアンタゴニストを示唆し、その一方で％ベース値が２００よりも大きい場合には、ＧＡＦアゴニストを示唆する。
【０１３６】
前記ベース値が、１００μＭの可能性のあるＰＤＥ５−ＧＡＦアンタゴニストの使用の際に９０よりも小さい場合には、ｃＧＭＰを有する試験バッチ中に、ＰＤＥ５−ＧＡＦ−アンタゴニストが存在する。
【０１３７】
前記カラムは、利用後に以下のように再生される：
Ｄｏｗｅｘカラム：５ｍｌの２Ｎ  ＨＣｌ、２×５ｍｌの水
酸化アルミニウムカラム：２×５ｍｌの０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５
【０１３８】
実施例４
試験物質を用いたアッセイの実施
実施例３と同様に、前記ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性を、ｃＧＭＰ、及び公知のＰＤＥ５阻害剤、シルデナフィル、タダラフィル、及びバルデナフィルの存在下で測定した。この結果を、図６にグラフにより表した。この測定したＰＤＥ５阻害剤のいずれも、ＰＤＥ５アンタゴニスト性作用を示さず、これらはＰＤＥ５のＧＡＦドメインに対する結合を介して作用する。
【０１３９】
実施例５
後続のＬＡＮＣＥ(R)  ｃＡＭＰアッセイを用いたアッセイの実施
ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性を、試験すべき物質有り、及びなしで測定した。この際前記アデニル酸シクラーゼ活性を、一定量のＡＴＰのｃＡＭＰへの変換を介して決定した。前記ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラにより形成されるｃＡＭＰの検出のために、反応バッチ中の本来の酵素反応に、抗体ベースのホモジニアスアッセイ（例えば、Ｌａｎｃｅ  ｃＡＭＰ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｉｍｅｒ；ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ  ｃＡＭＰ  Ａｓｓａｙ、ＤｉｓｖｏｖｅｒＸ；ｃＡＭＰ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｉｍｅｒ）が後続した。この酵素アッセイのインキュベーション時間は、１〜１２０分間、このインキュベーション温度は２０〜４５℃、このＭｇ2+補因子濃度は１〜２０ｍＭ（これはまた、補因子として相応するＭｎ2+量を使用してもよい）、及びこのＡＴＰ濃度は０．５μＭ〜５ｍＭにあることが望ましい。物質なしに対して、物質有りでの前記変換の向上は、ＧＡＦアゴニスト効果を示唆する。物質添加による変換が阻害される場合には、これは前記物質のアンタゴニスト効果を示唆する。ＧＡＦ拮抗作用は、天然のＧＡＦリガンド、ｃＧＭＰによるＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラの活性化の遮断を介して測定されてもよい（例えば以下反応バッチに対して示したように）。このために、上昇性の又は固定のｃＧＭＰ濃度での変換を、物質有り、及びなしで測定する。物質有りでの前記変換が、物質なしでの前記変換を下回る場合には、これは前記物質のＧＡＦ拮抗作用を示唆する。
【０１４０】
後続のＬＡＮＣＥ  ｃＡＭＰアッセイを用いたアッセイのためには、以下のピペッティング工程及びインキュベーション工程が、３８４ウェルプレート中で実施される：
・１μｌの試験すべき化合物（ＤＭＳＯ中で−３〜−１２ｌｏｇ  Ｍ）
・１μｌのｃＧＭＰ（２〜０．２ｍＭ；ＧＡＦドメインの活性化因子）
３μｌの反応緩衝液（２２％グリセリン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）
・反応緩衝液（０．００１〜１００ｎｇの酵素含有）中の１０μｌのＰＤＥ５／ＣｙａＢ１酵素
・５分間のインキュベーション、３７℃で
・５μｌのＡＴＰ（３００μＭ）
・１５分間のインキュベーション、３７℃で
・１０μｌのＡＩｅｘａＦｌｕｏｒ６４７−抗ｃＡＭＰ抗体溶液（Perkin Eimer, LANCE cAMP Assay）の添加
・３０〜６０分間のインキュベーション
・ビオチンｃＡＭＰと混合した、１０μｌのＬＡＮＣＥ  Ｅｕ−Ｗ８０４４標識したストレプトアビジン溶液（Perkin Eｌmer, LANCE cAMP Assay）の添加
・３０分間〜２４時間のインキュベーション
・励起波長３４０±１０ｎｍ及び発光波長６６５±１０ｎｍ及び６１５±１０ｎｍでの測定（ＬＡＮＣＥ又はＨＴＲＦ手法において）
それぞれの試験バッチは２回実施した。ブランクとして、基質であるＡＴＰの添加なしの試験バッチを使用した。物質及びｃＧＭＰなしの試験バッチを用いて、前記酵素−ベース活性を決定した。
【０１４１】
様々な酵素量の使用下での例示的な測定を図７に表した。
【０１４２】
図の説明
図１：ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアミノ酸配列
図２：ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのｃＤＮＡ
図３：精製後のＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのタンパク質配列イタリック体＝発現ベクター（ＰＱＥ３０、Ｑｕｉａｇｅｎ）からの精製タグ；ボールド体＝ＰＤＥ５−ＧＡＦ−ドメインを有するＮ末端；ボールド体かつ下線＝ＧＡＦＡドメイン及びＧＡＦＢドメイン；Ｖ３８６は、Ｌ３８６からのクローニング切断部位の導入の際に変異；下線＝触媒性ドメインを有するＣｙａＢ１のＣ末端
図４：キメラＰＤＥ５／ＣＹＡＢ１ポリペプチドの図示
図５：環式ヌクレオチドによるＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラの活性化前記アッセイが、試験すべき物質としてｃＧＭＰ又はｃＡＭＰとともに実施される場合には、図５の用量作用曲線が生じる。このＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラは、１００μＭのｃＧＭＰにより、約７．８倍活性化される。これは、７８０の％ベース値に相当し、前記ｃＧＭＰは、ＰＤＥ５−ＧＡＦ−アゴニストであることを示す。ｃＡＭＰは非活性性に作用し、約１００の基％底値を有し、即ちこれは、ＧＡＦアゴニストでも、ＧＡＦアンタゴニストでもない。
図６：シルデナフィル、タダラフィル、及びバルデナフィルを用いたアッセイの実施公知のＰＤＥ５阻害剤、シルデナフィル、タダラフィル、及びバルデナフィルの存在下での前記ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性の測定による前記のアッセイの実施。結果を図６にグラフにより表した。この測定したＰＤＥ５阻害剤のいずれも、ＰＤＥ５アンタゴニスト性作用を示さず、これらはＰＤＥ５のＧＡＦドメインに対する結合を介して作用する。
図７：様々な酵素量の使用の際の読み出しとしてＬａｎｃｅ(R)Ａｓｓａｙを用いた例示的な測定
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】図１は、ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、ＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのｃＤＮＡを示す図である。
【図３】図３は、精製後のＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラのタンパク質配列を示す図である。
【図４】図４は、キメラＰＤＥ５／ＣＹＡＢ１キメラポリペプチドの図示を示す図である。
【図５】図５は、環式ヌクレオチドによるＰＤＥ５／ＣｙａＢ１キメラの活性化を示す図である。
【図６】図６は、シルデナフィル、タダラフィル、及びバルデナフィルを用いたアッセイの実施を示す図である。
【図７】図７は、様々な酵素量の使用の際の読み出しとしてＬａｎｃｅ(R)Ａｓｓａｙを用いた例示的な測定を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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