(57)【要約】ポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法であって、ＰＣＲ系の中に、単体金材料、単体チタン材料、単体ニッケル材料、単体ビスマス材料、単体アンチモン材料、単体セレン材料、単体クロム材料の何れか、又は、前記最適化材料を含む混合物を入れることによって、ＰＣＲの増幅に対する最適化を実現する。具体的には（１）単体最適化材料の調整、（２）単体最適化材料の殺菌、（３）ＰＣＲ系の最適化、（４）ＰＣＲ生成物の検査、（５）最適化材料の反応終了系からの分離を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法であって、ＰＣＲ系の中に、単体形態の最適化媒体材料である単体金材料、単体チタン材料、単体ニッケル材料、単体ビスマス材料、単体アンチモン材料、単体セレン材料、単体クロム材料の何れか、又は、前記最適化材料を含む混合物を入れることによって、ＰＣＲの増幅に対する最適化を実現し、下記（１）乃至（５）の工程を含むことを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
（１）単体形態の最適化媒体材料を調整する工程であって、
前記単体形態を表す各最適化媒体材料は、糸状、シート状、不規則形状、粒状、粉状又はコロイド状であり、該糸状材料、シート状材料、不規則形状材料は、順に無菌水、無水アルコールの中で繰返して洗浄して乾かされ、該粒状、粉状材料は、順に無菌水、無水アルコールの中で洗浄、沈殿、乾燥される工程
（２）糸状、シート状、不規則形状、粒状又は粉状材料を使用する前に、ドライ法、ウエット法又は紫外線を照射して殺菌する工程
（３）適量の前記いずれかの材料又は前記最適化された材料を含む混合物をＰＣＲ反応系に入れてＰＣＲの増幅を行い、ＰＣＲ系の最適化を行う工程
（４）増幅後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動を行い、増幅バンドを検査して、対照系と比較を行い、ＰＣＲ生成物を検査する工程
（５）増幅によって得られたＰＣＲ生成物を回収する必要がある場合、反応終了系の中から最適化材料を分離するために、最適化材料を反応終了系から分離する工程
【請求項２】
前記工程（３）における前記適量とは、２５μＬのＰＣＲ反応系に入れる最適化された材料の使用量において、
前記糸状材料、シート状材料又は不規則形状材料が使用される場合、２５μＬの反応溶液を入れたＰＣＲ反応管の中に入るように適当な長さと形状にして、該材料を溶液に沈め、且つ液面をＰＣＲ管の底から０.６ｃｍより低くし、
前記糸状材料、シート状材料又は不規則形状の単体金材料の最小投入量は、総表面積が４ｍｍ２に達することを限度とし、前記糸状材料、シート状材料又は不規則形状のその他の単体最適化媒体材料の最小投入量は、総表面積が２ｍｍ２に達することを限度とし、
前記粒状材料が使用される場合、粒子の大きさによって１粒から数粒を２５μＬの反応溶液を入れたＰＣＲ反応管の中に入れ、該材料を溶液に沈め、且つ液面をＰＣＲ管の底から０.６ｃｍより低くし、
前記粒状材料の最小投入量は総表面積が２ｍｍ２に達することを限度とし、
最終の２５μＬのＰＣＲ反応系において、２００〜３００メッシュのチタン粉の投入量は２０μｇ〜１０００μｇであり、粉状のその他単体最適化媒体材料の使用量は５０μｇ〜５０００μｇであり、
最終の２５μＬのＰＣＲ反応系において、金コロイドの使用量は０.０６〜６.０μＬであり、コロイド状のその他の単体最適化媒体材料の使用量は０.５〜４μＬであることを特徴とする請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項３】
前記２００〜３００メッシュのチタン粉の投入量が５０μｇ〜８００μｇであることを特徴とする請求項２に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項４】
前記その他の単体最適化媒体材料である２００メッシュのクロム粉の投入量が４５０μｇ〜１５００μｇであることを特徴とする請求項２に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項５】
前記その他の単体最適化媒体材料である２００メッシュのクロム粉の投入量が６００μｇ〜１２００μｇであることを特徴とする請求項４に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項６】
前記その他の単体最適化媒体材料である金粉の投入量が２ｍｇ以上であることを特徴とする請求項２に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項７】
前記金コロイドの粒径が５ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４である場合、その金コロイドの投入量は０.０６〜０.５μＬであり、
前記金コロイドの粒径が１０ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４である場合、その金コロイドの投入量が０.５〜５.０μＬであり、
前記金コロイドの粒径が２０ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４である場合、その金コロイドの投入量が０.８〜６.０μＬであることを特徴とする請求項２に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項８】
前記金コロイドの粒径が５ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４である場合、その金コロイドの投入量が０.０８〜０.１６μＬであり、
前記金コロイドの粒径が１０ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４である場合、その金コロイドの投入量が０.８〜１.６μＬであり、
前記金コロイドの粒径が２０ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４である場合、その金コロイドの投入量が０.８〜３.５μＬであることを特徴とする請求項７に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項９】
前記工程（３）における前記適量とは、２５μＬのＰＣＲ反応系に入れる前記最適化材料を含む混合物の使用量において、
前記混合物は、前記最適化材料を任意に組み合わせた混合物であって、
前記混合物における各成分の使用量は、材料の種類、材料の形状によって決まり、該材料の形状はそれぞれ異なり、
粉状材料の混合物の総使用量は５０μｇ〜５０００μｇであり、
コロイド状材料の混合物の総使用量は０.０６〜６.０μＬであり、
粉状材料とコロイド状材料を混合して使用する場合、粉状材料の総使用量は２０μｇ〜５０００μｇであるとともに、コロイド状材料の総使用量は０.０２〜６.０μＬであることを特徴とする請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項１０】
前記工程（５）において、
糸状材料、シート状材料、不規則形状材料が使用される場合、直接溶液を吸い取って、分離し、
粉状又は粒状材料が使用される場合、低速遠心を行い、上澄み液を吸い取って分離し、
コロイド状材料が使用される場合、−２０℃で一晩冷凍して、解凍後に高速遠心を行い、上澄み液を吸い取って分離することを特徴とする請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物技術分野の方法、特にポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）は、自然のＤＮＡ複製を体外で模擬して複製する核酸増幅技術であり、Ｋ. Ｍｕｌｌｉｓにより１９８５年に発明された。ＰＣＲは、１つのテストチューブの中で研究対象である目的遺伝子或いは特異性のあるＤＮＡの一部を、数時間以内に百万倍に増幅できる。したがって、１本の毛髪、１滴の血液、更には１つの細胞から、分析研究及び検査鑑定に十分な量のＤＮＡを増幅できる。ＰＣＲ反応はすでに成熟した技術となっており、通常の実験においても、比較的失敗率は低い。しかしながら、実際の操作においてＰＣＲの増幅を行う場合、例えば、特異性、検出感度、反応速度など、常に改善しなければならない問題がある。最も際立った問題は、ＰＣＲの増幅には程度の異なる非特異性が存在していることである。ＰＣＲは体外の模擬生化学反応として、メカニズムが非常に複雑であるから、連鎖反応過程において、常にある程度の干渉による副反応が生じる。例えば、プライマーとテンプレートが配合ミスする可能性があり、プライマーが結合してダイマーになることによる増幅が発生するなどの恐れがある。これらの副反応は、通常のＰＣＲ増幅時において、結果にどれだけ影響を及ぼすかは明確ではない。通常のＰＣＲ増幅のテンプレート数量は多く、一般的には１０３以上である。したがって、指数関数的な増幅の過程において、テンプレートの増幅量は副反応産物の増幅数量よりはるかに多く、非特異性の増幅率はかなり低い。しかしながら、下記の状況であれば、副反応産物の増幅は無視できない。例えば、非常に複雑なゲノムのテンプレートの中から、選択的に特異性のコピー数の極めて少ないＤＮＡを増幅すること、モノマーＤＮＡ、長いＤＮＡフラグメントを増幅すること、多重ＰＣＲの増幅、一回目の増幅が完全（成功）ではなく再度行う増幅、及び高速なＰＣＲ増幅などの場合である。これらの副反応は、非特異性の増幅を引き起こす可能性があり（電気泳動分析において、尾を引いたような形状のスメアバンドと非特異性バンドとして表される）、増幅効率を下げる原因となる。さらに、正常な増幅反応を失敗させる可能性もある。ＰＣＲ増幅の特異性と反応効率を向上させるには、プライマー配列の最適化を設計するのみでなく、反応系と手順の最適化を行うことに、かなり依存する。長年にわたって、人々はＰＣＲの反応成分の最適化について多くの研究を行ってきた。この結果、反応系にメチルアミド、グリセリン、ジメチル・スルホキシドなどを入れることによって、ある程度、非特異性の増幅の問題を改善できることが分かってきた。しかしながら、実際の実験及び応用においては効果が顕著でない場合があり、ある添加成分（例えば、ジメチル・スルホキシド）を余分に入れると、逆にポリメラーゼの活性を抑えることになる。
【０００３】
先行技術文献として、特許文献1に、「核酸テンプレートの増幅の誘発に有利な調製方法」が開示されている。該方法によると、ＰＣＲ系の中に耐熱の一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ、ｓｉｎｇｌｅ-ｓｔｒａｎｄｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を入れると、ＳＳＢ蛋白は一本鎖ＤＮＡとのみ結合し、二本鎖とは結合しない。このように、その結合及び一本鎖を含む非特異性のフラグメントの増幅を抑えることにより、ＰＣＲ増幅の最適化を実現する。しかしながら、純化のＳＳＢ蛋白を抽出する技術はとても複雑であり、高い試薬純度が要求される。したがって、調製コストが非常に高くなる。これにより、商品化される試薬キットも非常に高価となり、価格は一般的なＰＣＲ試薬の６〜７倍である。同時に、一本鎖結合蛋白の生物活性を保持するために、厳格に−２０℃で貯蔵することが要求される。また、その生物活性は、比較的短いという時間的制限がある。
【特許文献１】米国特許５,６４６,０１９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、従来技術における問題を克服し、ポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法を提供することにある。そして、当該技術は、最適化増幅の効果が著しく、調整が簡単で、コストが安く、保管しやすく、応用が広く、最適化の材料が系の中から分離しやすいなどのメリットを備え、増幅された生成物の特異性を著しく向上させ、反応中の生成物の生成量を明らかに向上させるとともに、高速なＰＣＲの増幅を実現する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は下記の技術方案によって実現したものである（図１参照）。本発明は、ＰＣＲ系の中に、単体形態の最適化媒体材料（medium material）である単体金材料、単体チタン材料、単体ニッケル材料、単体ビスマス材料、単体アンチモン材料、単体セレン材料、単体クロム材料の何れか、又は、上記最適化材料を含む混合物を添加することによって、ＰＣＲの増幅に対する最適化を実現する。具体的には下記の通りである。
【０００６】
（１）単体形態の最適化媒体材料の調整とは、下記を示す。
１．上記単体形態を表す各最適化媒体材料は、糸状、シート状、不規則形状、粒状、粉状又はコロイド状である。そのうち、糸状、シート状、不規則形状、粒状、粉状の最適化媒体材料は、市販品として購入できる。また、粉状材料の粒径については制限がなく、ナノメートルレベルからマイクロメートルレベルまで全て使用可能である。また、コロイド状材料は市販品でもよく、通常の方法で生成してもよい。また、その粒径の大きさに制限はない。
【０００７】
例えば、金コロイドは、黄燐還元法、クエン酸ナトリウム還元法、クエン酸ナトリウム−タンニン酸還元法など、様々な方法で得ることができる。例えば、Ｆｒｅｎｓにより１９７３年に提唱されたクエン酸三ナトリウム還元法を参照する。まず０.０１％ＨＡｕＣｌ４溶液を沸騰するまで加熱して、素早く一定量の１％クエン酸三ナトリウム水溶液を入れる。最初は少し青色になり、その後、薄い青色、青色となり、再度加熱すると赤色になる。７〜１０分煮沸し、透明のサーモンピンクになればよい。すべての溶液は、殺菌後の純水で調合する。市販の金コロイド（製造元：Ｓｉｇｍａ社）は、粒径が５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍの金コロイドが挙げられ、その濃度は０.０１％ＨＡｕＣｌ４である。使用前に希釈する必要はない。
【０００８】
２．糸状材料、シート状材料、不規則形状材料は、順に無菌水、無水アルコールの中で繰返して洗浄して乾かされる。また、粒状、粉状材料は、順に無菌水、無水アルコールの中で洗浄、沈殿、乾燥される。コロイド状材料は、洗浄処理を行う必要はない。
【０００９】
（２）糸状、シート状、不規則形状、粒状又は粉状材料は、使用する前に、ドライ法、ウエット法又は紫外線で照射して殺菌する。コロイド状溶液は、使用する前に殺菌する必要はない。
【００１０】
ＰＣＲ系の最適化とは、適量の上記いずれかの材料又は上記最適化された材料を含む混合物をＰＣＲ反応系の中に入れて、ＰＣＲの増幅を行うことを指す。適量とは、２５μＬのＰＣＲ反応系の中に入れる最適化された材料の使用量であり、下記の通りである。ＰＣＲ反応系が２５μＬより多い又は少ない場合、最適化された材料の使用量は比率によって調整される。
【００１１】
糸状、シート状又は不規則形状の単体最適化媒体材料は、２５μＬの反応溶液を入れたＰＣＲ反応管の中に入るように適当な長さと形状にする。その後、材料を反応溶液に沈め、反応溶液の液面をＰＣＲ管の底から０.６ｃｍの高さより低くする。この高さより液面が高くなると、温度が均一に分布されなくなる。また、著しい最適化の効果を求めるため、糸状、シート状又は不規則形状の単体金材料の最小投入量は、総表面積が４ｍｍ２に達することを限度とする。糸状、シート状又は不規則形状のその他の単体最適化媒体材料の最小投入量は、総表面積が２ｍｍ２に達することを限度とする。
【００１２】
粒状材料は、粒度の大きさによって１粒から数粒を、２５μＬの反応溶液を入れたＰＣＲ反応管の中に入れる。その後、材料を溶液に沈め、且つ反応溶液の液面をＰＣＲ管の底から０.６ｃｍの高さより低くする。また、材料の最小投入量は総表面積が２ｍｍ２に達することを限度とする。総表面積が２ｍｍ２より小さいと、最適化の効果が顕著ではなくなる。
【００１３】
最終の２５μＬのＰＣＲ反応系において、２００〜３００メッシュのチタン粉の有効使用量は２０μｇ〜１０００μｇであり、好ましい使用量は５０μｇ〜８００μｇである。２００メッシュのクロム粉の有効使用量は４５０μｇ〜１５００μｇであり、好ましい使用量は６００μｇ〜１２００μｇである。その他の粉状材料の有効使用量は５０μｇ〜５０００μｇであり、そのうち、金粉の有効使用量は２ｍｇより多いことが好ましい。正しい量を投入するためには、適量の粉状材料を正確に量り、適量の殺菌水の中に入れる。それを完全に懸濁してから、すぐ適量の懸濁液を吸取り、ＰＣＲ反応系の中に入れる。最後に、純水でＰＣＲ反応系を２５μＬまで補充する。
【００１４】
最終の２５μＬのＰＣＲ反応系において、金コロイドの有効使用量は０.０６〜６.０μＬである。そのうち、粒径が５ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４の金コロイドの有効投入量は０.０６〜０.５μＬであり、好ましい使用量は０.０８〜０.１６μＬである。粒径が１０ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４の金コロイドの有効投入量は０.５〜２.５μＬであり、好ましい使用量は０.５〜１.６μＬである。粒径が２０ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４の金コロイドの有効投入量は０.８〜６.０μＬであり、好ましい使用量は０. ８〜３.５μＬである。コロイド状のその他の単体最適化媒体材料は通常の文献で公表された方法で調整する、又は市販品を購入する。通常の濃度である場合、使用量は０.５〜４.５μＬである。
【００１５】
最終の２５μＬのＰＣＲ反応系において、上記の最適化材料を任意に組み合わせて混合物とすることができる。また、混合物における各成分の使用量は、材料の種類、材料の形状によって決める。粉状材料とコロイド状材料を例にすると、粉状材料の混合物の総使用量は５０μｇ〜５０００μｇであり、コロイド状材料の混合物の総使用量は０.０６〜６.０μＬである。粉状材料とコロイド状材料を混合して使用する場合、粉状材料の総使用量は２０μｇ〜５０００μｇであるとともに、コロイド状材料の総使用量は０.０２〜６.０μＬである。
【００１６】
ＰＣＲの増幅は、通常のＰＣＲ増幅手順により、次の通りである。
【００１７】
まず、９４℃で２分間予熱し、それから３０〜４５のサイクルを行う。各サイクルは、９４℃で３０秒間の変性、５８℃で１〜３分間のアニーリング、７２℃で４５秒〜３分間の伸長を含む。最後に７２℃で７〜１０分間の伸長を行う。ここで、サイクル回数、アニーリング時間、伸長時間などは、増幅の目的、増幅の対象及びプライマーによって決める。
【００１８】
（４）ＰＣＲ産物の検査は、増幅後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動を行い、増幅バンドを検査して、対照系と比較を行う。
【００１９】
（５）最適化材料を反応終了系の中から分離することについて、増幅によって得られたＰＣＲ産物を回収する必要がある場合、反応終了系の中から最適化材料を分離できる。
【００２０】
最適化材料を反応終了系から分離する際、糸状材料、シート状材料、不規則形状材料が使用される場合は、直接溶液を吸い取って、分離できる。粉状又は粒状材料が使用される場合は、低速遠心を行い、上澄み液を吸い取って分離できる。コロイド状材料が使用される場合は−２０℃で一晩冷凍して、解凍後に高速遠心を行い、上澄み液を吸い取って分離できる。
【００２１】
上記のＰＣＲ増幅とは各種のＰＣＲ増幅を指す。これは、通常のＰＣＲ、非常に複雑なゲノムのテンプレートの中から選択的に特異性のコピー数の極めて少ないＤＮＡを拡大すること、ロングフラグメントＰＣＲ、多重ＰＣＲ、モノマーＰＣＲ、一回目の増幅が完全（成功）ではなく再度行う増幅、及び高速ＰＣＲが含まれる。
【００２２】
上記最適化材料の金属金は、ＰＣＲの反応原理と類似するポリメラーゼ伸長反応、及びＰＣＲ方法をベースとするその他の生化学方法の最適化にも適用される。
【００２３】
上記のＰＣＲ系は、各種商業用のポリメラーゼの説明書を参照する。Ｔａｋａｒａ社のＥｘ Ｔａｑ酵素を例にすると、ＰＣＲ系の成分は次の通りである。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
上記のＰＣＲ産物の検査とは、通常の技術でＰＣＲ産物について検査を行うことを指す。例えば、増幅後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う、又は、増幅後のサンプルに対して毛細管電気泳動検査を行う。
【００２６】
上記アガロースゲル電気泳動検査は、既存の技術に基づき、以下の工程を含む。
１）１.５％のアガロースゲルを調製する（染色剤臭化エチジウムを含む）。
２）異なるサンプルのＰＣＲ産物を吸い取って電気泳動槽に注入し、同時に分子量マーカーを参照する。
３）４〜５Ｖ/ｃｍの電圧を加えて、電気泳動を行う。
４）ゲルのイメージングシステムの紫外線検査を行い、結果を分析する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は既存の方法と比べて、最適化増幅の効果が著しく、調整が簡単で、コストが安く、保管しやすく、応用が広く、最適化された材料が系の中から分離しやすいというメリットがある。また、増幅産物の特異性は著しく向上し、反応中の産物の生成量も著しく向上する。また、単体金材料、単体チタン材料、単体ニッケル材料、単体ビスマス材料、単体アンチモン材料、単体セレン材料、単体クロム材料は、ポリメラーゼに対して抑制作用が生じない。また、長期間にわたり４℃で保管でき、且つ、活性を失う心配がない。例えば、商品化されたチタン粉の価格は、一本鎖結合タンパク質の１/１００であり、且つ、特別に調整する必要がない。商品化された金コロイドの価格も一本鎖結合タンパク質より安く、試料の均一性がよく、保管及び正確にサンプルを入れるには有利である。本発明の最適化された後のＰＣＲ反応系は、温度コントロールが精密なＰＣＲ計器に適用されるだけでなく、温度コントロール性能があまりよくないＰＣＲ計器にも適用される。本発明のＰＣＲ増幅の最適化方法は、各種ＰＣＲ増幅、ポリメラーゼの伸長及びＰＣＲ方法をベースにしたその他の生化学方法に応用でき、特に一部の増幅しにくいタイプのＰＣＲ方法などに適用できる。例えば、低コピーテンプレートＤＮＡのＰＣＲ、モノマーＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ロングフラグメントＰＣＲ、一回目の増幅が成功せず再度増幅の必要があるものなどが挙げられる。また、反応時間を短縮し、高速なＰＣＲ増幅を実現できる。本発明は、遺伝子の検査及びクローニング、遺伝分析、臨床診断、遺伝子チップ及び新材料などの分野に対して、潜在的且つ大きな応用価値がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、具体的な実施例をあげて本発明について詳しく述べるが、当該実施例は本発明を制限するものではない。
【００２９】
（実施例１）金箔を用いたＰＣＲ反応に対する最適化
非特異性増幅を形成するＰＣＲ増幅に対する最適化は次の工程を含む。
１．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は下表の通りである。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
ここで、テンプレートはλＤＮＡで、華美生物工程公司から購入したものであり、Ｅｘ Ｔａｑ酵素はＴａｋａｒａ公司から購入したものである。また、増幅フラグメントの長さは２８３ｂｐである。プライマー配列はｐ１：５’‐ＧＧＣＴＴＣＧＧＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴ‐３’と、ｐ２：５’‐ＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＣＴＧＣ-３’である。
【００３２】
２．上記のＰＣＲ系に、清潔にして殺菌処理した最適化材料である金箔を入れる。金箔は２ｍｍ×２ｍｍに切り、各２５μＬの反応系の中に少なくとも１枚入れる。また同時に、最適化媒体材料を入れない対照実験を行う。
【００３３】
３．ＰＣＲ技術を利用して、テンプレート分子に対して増幅を行う。増幅の条件は、９４℃で２分間予熱し、３０のサイクルを行う。各サイクルは、９４℃で３０秒間の変性、５８℃で１分間のアニーリング、７２℃で４５秒間の伸長を含む。最後に７２℃で７分の伸長を行う。
【００３４】
４．増幅した後のＤＮＡサンプルに対して、アガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００３５】
増幅の結果は図２に示す通りである。左から右の順に、１は分子量マーカー（Ｔａｋａｒａ社のＤＬ２０００で、それぞれ２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１００ｂｐである）である。２、３、４は最適化材料として金箔を入れた系で、３つの平行サンプルである。５、６、７は通常のＰＣＲ系で、これも３つの平行サンプルである。最適化材料として金箔を入れた系のＰＣＲ増幅の結果は、非特異性の増幅が極めて少ない。それに対し、金箔を入れていない通常のＰＣＲ系の増幅結果には、尾を引いたような形状のスメアがひどく、非特異性の増幅が非常に大きいことが分かる。このＰＣＲ増幅の結果は、本発明の最適化の方法の効果が顕著であることを示している。
【００３６】
（実施例２）金メッキシートを用いた段階希釈低コピーテンプレートＰＣＲ反応に対する最適化
段階希釈低コピーテンプレートＰＣＲ増幅に対する最適化は、次の工程を含む。
１．プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ分子（華美生物工程公司から購入）に対して段階希釈を行い、系列のコピー数のテンプレートを得る。テンプレート数は１０５コピーから、論理上シングルコピーに近い数まで用いられる。
【００３７】
２．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、異なる点は、テンプレートが異なる段階希釈のｐＢＲ３２２テンプレートであり、増幅フラグメントの長さが３４２ｂｐであることである。プライマー配列はｐ１：５’‐ＣＴＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡ‐３’と、ｐ２：５’‐ＧＡＣＴＴＣＣＧＣＧＴＴＴＣＣＡＧＡＣＴＴＴＡＣ-３’である。
【００３８】
３．上記ＰＣＲ系におけるテンプレート数が１０５、１０４、１０３、１０２コピーである系の中にはいずれも最適化材料を入れておらず、１つずつのサンプルを対照とする。但し、テンプレート数が論理上、シングルコピーに近い系は３つのサンプルを作る。そして、その中の１つのサンプルは最適化材料を入れず対照とし、その他の２つのサンプルは、清潔にして殺菌処理をした最適化材料である金メッキシートを入れる。金メッキシートは、ベースはシリコン材料で、片面に金メッキが行われている。金メッキの表面の大きさは１.５ｍｍ×４ｍｍであり、２５μＬの系ごとに１枚を入れる。
【００３９】
４．ＰＣＲ技術を利用し、テンプレート分子に対してそれぞれ増幅を行う。増幅の条件は９４℃で２分間予熱し、４５のサイクルを行う。各サイクルは、９４℃で３０秒間の変性、５８℃で１分間のアニーリング、７２℃で４５秒間の伸長を含む。最後に７２℃で７分の伸長を行う。
【００４０】
５．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００４１】
増幅の結果は図３に示す通りである。左から右の順に１は分子量マーカー（Ｔａｋａｒａ社のＤＬ２０００で、それぞれ２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１００ｂｐである）である。２はテンプレートのコピー数が１０５個のＰＣＲ系である。３はテンプレートのコピー数が１０４個のＰＣＲ系である。４はテンプレートのコピー数が１０３個のＰＣＲ系である。５はテンプレートのコピー数が１０２個のＰＣＲ系である。６はテンプレートのコピー数が１０１個のＰＣＲ系である。７、８、９はテンプレートのコピー数が１に近いＰＣＲ系である。１０はブランクの陰性対照である。その中の２、３、４、５、６、７はすべて最適化材料である金メッキシートを入れず、８、９および１０は最適化材料である金メッキシートを入れた。図より、最適化材料を入れない系２、３、４、５、６、７はいずれもスメア現象がひどいことが分かる。また、最適化媒体材料である金メッキシートを入れた系は、シングルコピーに近いテンプレートでも非特異性の増幅がなくなり、明らかな単一の目標バンドを示していることが分かる。このＰＣＲ増幅の結果は、本発明の最適化の方法の効果が顕著であることを示している。
【００４２】
（実施例３）金コロイドを用いたモノマーＰＣＲ増幅に対する最適化
モノマーＰＣＲの増幅に対する最適化は次の工程を含む。
１．プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ分子（華美生物工程公司から購入）に対して、原子間力顕微鏡を操作し、モノマーの正確なピックアップを行なう。ピックアップしたモノマーをシングルコピーのテンプレート溶液に調製する。
【００４３】
２．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、異なる点は、テンプレートをシングルコピーのテンプレート溶液に変更したことである。また、増幅フラグメントの長さ、プライマーとも実施例２と同じである。
【００４４】
３．上記ＰＣＲ系の中に最適化された金コロイド材料（Ｓｉｇｍａ社から購入、濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４の１０ｎｍ金コロイド溶液である）を入れる。各２５μＬの系における金コロイド溶液の使用量は１μＬである。また同時に、最適化材料を入れない対照実験を行う。
【００４５】
４．ＰＣＲ技術を利用してそれぞれテンプレート分子に対して増幅を行う。増幅の条件は９４℃で２分間予熱し、５０のサイクルを行う。このサイクルは、以下３工程に分かれている。第一工程は１０のサイクルで、各サイクルは９４℃で３０秒間の変性、６５℃で３分間のアニーリング、７２℃で４５秒間の伸長を含む。第二工程は１０のサイクルで、各サイクルは９４℃で３０秒間の変性、６５℃から５８℃に下げて１分間のアニーリング、７２℃で４５秒間の伸長を含む。第三工程は３０のサイクルで、各サイクルは９４℃で３０秒間の変性、５８℃で１分間のアニーリング、７２℃で４５秒間の伸長を含む。最後に７２℃で７分間の伸長を行う。
【００４６】
５．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００４７】
増幅の結果は図４に示す通りである。左から右の順に１は分子量マーカー（Ｔａｋａｒａ社のＤＬ２０００で、それぞれ２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１００ｂｐである）である。２、３、４は最適化材料である金コロイドを入れたモノマーＰＣＲ増幅系である。５は最適化材料である金コロイドを入れずに段階希釈した１０個分子のＰＣＲ増幅系である。６は最適化材料である金コロイドを入れないモノマーＰＣＲ増幅系である。７、８は最適化材料を入れないブランクの陰性対照である。図より、最適化材料を入れない系５、６はすべてスメア現象がひどいことが分かる。また、最適化媒体材料である金コロイドを入れた系２、３、４は、ともに非特異性の増幅がなくなり、明らかな単一の目標バンドを示していることが分かる。このＰＣＲ増幅の結果は、本発明の最適化の方法の効果が顕著であることを示している。
【００４８】
（実施例４）金コロイドを用いた多重ＰＣＲの増幅に対する最適化
多重ＰＣＲの増幅に対する最適化は次の工程を含む。
１．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、異なる点は８対のプライマーを用いて多重ＰＣＲ増幅を行い、増幅の長さがそれぞれ１５９ｂｐ、２８３ｂｐ、４８５ｂｐ、５７３ｂｐ、６６０ｂｐ、７８５ｂｐ、９４２ｂｐ、及び１２４０ｂｐのＤＮＡ分子であることである。８対のプライマー配列は次の通りである。
プライマー１：p1:５’-GGATGACCCCTCCAGCG-３’;
p2：５’‐CCGTAAACTCCACCCTTCG-３’
プライマー２：p1:５’-GATGCTTGAACCCGCCTAT-３’;
p2：５’‐GCCTGTCGTGGTCCGTC-３’
プライマー３：p1:５’-GGCTTCGGTCCCTTCTGT-３’;
p2：５’‐CACCACCTGTTCAAACTCTGC-３’
プライマー４：p1:５’-TGGAGCGTGAGGAATGGG-３’;
p2：５’‐GCCGTGTTCGGGTAGCA-３’
プライマー５：p1:５’-CTCGCTCATAACAGACATTCACT-３’;
p2：５’‐TCAACATCTTCTCGGGCATA-３’
プライマー６：p1:５’-GCACAAGTCCGACAACCC-３’;
p2：５’‐GCTGAGGAGATAAATAATAAACGAG-３’
プライマー７：p1:５’-CAAAACTAAGGGCATAGACAATAA-３’;
p2：５’‐TGGTTCAGAAGATAAATCGCTC-３’
プライマー８：p1:５’-CGGAACATCTCGGTAACTGC-３’;
p2：５’‐CGTCGCTGTCTCGCCAC-３’
【００４９】
２．最適化媒体材料である金コロイド（Ｓｉｇｍａ社から購入、濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４の１０ｎｍ金コロイド溶液である）を入れる。各２５μＬの系における金コロイド溶液の使用量は１μＬである。また同時に、最適化材料を入れない対照実験を行う。
【００５０】
３．ＰＣＲ技術を利用してテンプレート分子に対して増幅を行う。増幅の条件は実施例１と同じである。
【００５１】
４．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００５２】
結果は図５に示す通りである。左から右の順に、１、２、３は通常のＰＣＲ系の増幅結果であり、３つの平行サンプルである。４、５、６は最適化材料である金コロイドを入れたＰＣＲ系の増幅結果で、これも３つの平行サンプルである。７は分子量マーカー（下から上に、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１５００ｂｐ）である。１、２、３のサンプルの増幅結果においては、複数のバンドがあり、非特異性の増幅又は産物のスミアなどが生じている。また、４、５、６のサンプルはバンドがはっきりしており、明らかに最適化されていることが分かる。
【００５３】
（実施例５）金コロイドを用いたロングフラグメントのＰＣＲ増幅に対する最適化
ロングフラグメントのＰＣＲの増幅に対する最適化は次の工程を含む。
１．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、増幅長は４２００ｂｐのロングフラグメントである。プライマー配列はｐ１：５’‐ＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣ‐３’と、ｐ２：５’‐ＣＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＣ-３’である。
【００５４】
２．処理した最適化媒体材料である金コロイド（Ｓｉｇｍａ社から購入、濃度は０.０１％ＨＡｕＣｌ４の１０ｎｍ金コロイド溶液である）を入れる。各２５μＬの系における金コロイド溶液の使用量は１μＬである。また同時に、最適化材料を入れない対照実験を行う。
【００５５】
３．ＰＣＲ技術を利用してテンプレート分子に対して増幅を行う。増幅の条件は９５℃で２分間予熱し、４０のサイクルを行う。各サイクルは、９４℃で３０秒間の変性、５８℃で１分間のアニーリング、７２℃で３分間の伸長を含む。最後に７２℃で１０分間の伸長を行う。
【００５６】
４．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００５７】
結果は図６に示す通りである。目的フラグメントは４.２ｋｂである。左から右の順に、１は分子量マーカーＤＬ１５,０００（Ｔａｋａｒａ社、ＤＮＡのフラグメントは上から下へ１５,０００ｂｐ、１０,０００ｂｐ、７,５００ｂｐ、５,０００ｂｐ、２,５００ｂｐ、１,０００ｂｐ及び２５０ｂｐからなる）である。２、３、４は普通の反応系の結果である。５、６は普通の反応系の中に金コロイドを入れた結果で、７は陰性ブランク対照である。反応条件が同じ２、３、４のサンプル増幅バンドには比較的広い非特異性の増幅産物のスメア現象などがあることが分かる。また、５、６のサンプルは一本のはっきりしたバンドしかなく、明らかに最適化されていることが分かる。
【００５８】
（実施例６）異なる粒径の金コロイドを用いたＰＣＲの再増幅に対する最適化
実験上要求されることとして、ＰＣＲの生成量を増やさなければならないことがある。又は、１回目の増幅が失敗して増幅があまりよくないバンドの中から特定のバンドを純化する必要がある場合、前回のバッチ操作によるＰＣＲ産物に対して再増幅を行う必要がある。ＰＣＲの再増幅の最適化は次の工程を含む。
【００５９】
１．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、異なる点はテンプレートが前回のＰＣＲ増幅産物で、増幅長が２８３ｂｐのフラグメントであることである。プライマー配列は実施例１と同じである。
【００６０】
２．最適化媒体材料である、Ｓｉｇｍａ社から購入した粒径が５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍの金コロイド溶液（この３種類の金コロイド溶液濃度はすべて０.０１％ＨＡｕＣｌ４である）を入れる。各２５μＬのＰＣＲ反応系において、それぞれ異なる粒径の金コロイドに対して、異なる段階希釈で増加させた量を加える。また同時に、最適化材料を入れない対照実験を行う。
【００６１】
３．ＰＣＲ技術を利用してテンプレート分子に対して増幅を行う。各回の増幅の条件は実施例１と同じである。
【００６２】
４．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００６３】
結果は図７に示す通りである。同図において、１、１３、２５は分子量マーカー（Ｔａｋａｒａ社のＤＬ２０００で、それぞれ２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１００ｂｐである）である。２、１４、２６は最適化材料を入れない通常のＰＣＲ系の再増幅の結果で、陽性対照である。１２、２４、３６は陰性対照である。３、４、５、６、７、８、９、１０、１１は最適化材料である粒径が５ｎｍの金コロイドを入れた再増幅系である。各２５μＬの反応系における５ｎｍの金コロイドの使用量が、３〜１１レーンは、それぞれ０.０３μＬ、０.０６μＬ、０.０８μＬ、０.１μＬ、０.１２μＬ、０.１４μＬ、０.１６μＬ、０.２５μＬ、０.５μＬである。１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３は最適化材料である粒径が１０ｎｍの金コロイドを入れた再増幅系である。各２５μＬの反応系における１０ｎｍの金コロイドの使用量が１５〜２３レーンは、それぞれ０.２μＬ、０.５μＬ、０.６μＬ、０.８μＬ、１.０μＬ、１.３μＬ、１.６μＬ、２.０μＬ、２.５μＬである。２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５は最適化材料である粒径が２０ｎｍの金コロイドを入れた再増幅系である。各２５μＬの反応系における２０ｎｍの金コロイドの使用量が２７〜３５レーンは、それぞれ０.５μＬ、０.８μＬ、１.５μＬ、２.０μＬ、２.５μＬ、３.０μＬ、３.５μＬ、４.５μＬ、６.０μＬである。最適化材料である金コロイドを入れたことにより、再増幅系のＰＣＲの結果は、明らかな最適化作用が生じている。これに対し、金コロイドを入れないＰＣＲ系の結果は、ひどく尾を引いたような形状のスメア現象及び非特異性のバンドが現れていることが図から分かる。金コロイドの粒径によって、最適化に用する量が異なる。粒径が５ｎｍの金コロイドの有効使用量は０.０６μＬから０.５μＬであり、０.０８μＬから０.１６μＬまでの場合、最適化の効果が優れる。粒径が１０ｎｍの金コロイドの有効使用量は０.５μＬから２.５μＬであり、０.５μＬから１.６μＬまでの場合、最適化の効果が優れる。粒径が２０ｎｍの金コロイドの有効使用量は０.８μＬから６.０μＬであり、０.８μＬから３.５μＬまでの場合、最適化の効果が優れる。この結果は、本発明の最適化の方法の効果が顕著であることを示している。
【００６４】
（実施例７）  金コロイドを用いたＰＣＲの再増幅に対する最適化及び目標産物の生成量の測定
ＰＣＲの再増幅に対する最適化は次の工程を含む。
１．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、異なる点はテンプレートが前回のＰＣＲ増幅産物であり、増幅長は２８３ｂｐのフラグメントであることである。プライマー配列は、実施例１と同じである。
【００６５】
２．最適化媒体材料である金コロイド（Ｓｉｇｍａ社から購入、濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４の１０ｎｍ金コロイド溶液である）を入れる。各２５μＬの系中の金コロイド溶液の使用量は１μＬである。また同時に、最適化材料を入れない対照実験を行う。
【００６６】
３．ＰＣＲ技術を利用してテンプレート分子に対して増幅を行う。各回の増幅の条件は実施例１と同じである。
【００６７】
４．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００６８】
結果は図８に示す通りである。左から右の順に１は分子量マーカー（Ｔａｋａｒａ社のＤＬ２０００で、それぞれ２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１００ｂｐである）である。２、３、４、５は通常のＰＣＲ系の再増幅であり、４つの平行サンプルである。６、７、８、９は最適化材料である金コロイドを入れたＰＣＲ系で、これも４つの平行サンプルである。１０は陰性対照である。最適化材料である金コロイドを入れた再増幅系のＰＣＲの結果は、非特異性の増幅が極めて少ないことが分かる。一方、金コロイドを入れないＰＣＲ系の増幅結果には、尾を引いたような形状のスメア及び非特異性バンドがかなり現れている。例えば、２、３、４、５のサンプルは目的バンドすら増幅できず、非特異性の増幅が非常にひどいことが示されている。この結果は、本発明の最適化方法の効果が顕著であることを示している。図８の電気泳動のバンドに対する光密度分析を行うことにより、レーン２の目標産物の量に対して、レーン６、７、８、９の中の目標産物の量は、それぞれ８０％、５０％、２０％、２０％増えた。
【００６９】
（実施例８）チタン粉を用いた通常ＰＣＲ反応に対する最適化
非特異性の増幅を形成するＰＣＲの増幅に対する最適化は次の工程を含む。
１．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、テンプレートはλＤＮＡであり、華美生物工程公司から購入したものである。Ｅｘ Ｔａｑ酵素はＴａｋａｒａ社から購入したものであり、増幅フラグメントの長さは２８３ｂｐである。プライマー配列はｐ１：５’‐ＧＧＣＴＴＣＧＧＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴ‐３’と、ｐ２：５’‐ＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＣＴＧＣ-３’である。
【００７０】
２．上記ＰＣＲ系の中に、最適化材料である金コロイド（Ｓｉｇｍａ社から購入、濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４の１０ｎｍ金コロイド溶液である）又は洗浄及び殺菌処理をした単体チタン粉（上海化学試剤公司から購入し、２００〜３００メッシュである）を入れる。その後、各２５μＬの反応系の中にそれぞれ１０ｎｍ金コロイド溶液を１μＬずつ入れて、３つの平行サンプルとする。入れたチタン粉の量はそれぞれ１００μｇ、４００μｇ、８００μｇである。また同時に、最適化媒体材料を入れない対照実験を行う。
【００７１】
３．ＰＣＲ技術を利用してテンプレート分子に対して増幅を行う。増幅の条件は実施例１と同じである。
【００７２】
４．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００７３】
増幅の結果は図９に示す通りである。左から右の順に、１は分子量マーカー（Ｔａｋａｒａ社のＤＬ２０００であり、それぞれ２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１００ｂｐである）。２、３、４は最適化材料である金コロイドを各１μＬ入れた系で、３つの平行サンプルである。５、６、７は通常のＰＣＲ系で、これも３つの平行サンプルである。８、９、１０はそれぞれ８００μｇ、４００μｇ、１００μｇのチタン粉を入れたＰＣＲ系である。最適化材料であるチタン粉と金コロイドを入れた系のＰＣＲ増幅の結果は非特異性の増幅が極めて少ない。これに対し、最適化媒体材料を入れない通常のＰＣＲ系の増幅結果は、尾を引いたような形状のスメアがかなり現れており、非特異性の増幅がとてもひどいことが分かる。チタン粉を８００μｇ入れたとき、一定の抑制作用を示したが、バンドは単一であった。これに対し、チタン粉を１００μｇ及び４００μｇ入れた場合、ともに良い最適化効果を奏した。このＰＣＲ増幅の結果は、本発明の最適化材料が金コロイド又はチタン粉である場合の最適化の方法は、その効果が顕著であることを示している。
【００７４】
（実施例９）チタン粉を用いたＰＣＲの再増幅に対する最適化
ＰＣＲの再増幅に対する最適化は次の工程を含む。
１．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、異なる点はテンプレートが前回のＰＣＲ増幅産物で、増幅長が２８３ｂｐのフラグメントであることである。プライマー配列は実施例１と同じである。
【００７５】
２．洗浄及び殺菌処理をした最適化媒体材料である単体チタン粉（上海化学試剤公司から購入し、２００〜３００メッシュである）を異なる量入れる。各２５μＬの反応系の中にそれぞれ質量が２０、５０、１００、２００、３００、４００、６００、８００μｇのチタン粉を入れる。また同時に、最適化材料を入れない対照実験を行う。
【００７６】
３．ＰＣＲ技術を利用してテンプレート分子に対して増幅を行う。各回の増幅条件は実施例１と同じである。
【００７７】
４．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００７８】
結果は図１０に示す通りである。左から右の順に１は分子量マーカー（Ｔａｋａｒａ社のＤＬ２０００であり、それぞれ２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１００ｂｐである）。２は最適化材料を入れない通常のＰＣＲ系の再増幅結果であり、陽性対照である。３、４、５、６、７、８、９、１０は最適化材料であるチタン粉を入れた再増幅系であり、各２５μＬの反応系におけるチタン粉の質量は、３〜１０レーンは、それぞれ２０、５０、１００、２００、３００、４００、８００、１０００μｇである。１１は陰性対照である。最適化材料であるチタン粉を入れた再増幅系ＰＣＲの結果は、非特異性の増幅が極めて少なく、チタン粉の有効使用量は２０μｇから１０００μｇであり、特に５０μｇから８００μｇである場合、最適化の効果が優れていることが分かる。一方、陽性対照の増幅結果は、非常にひどく尾を引いたような形状のスメアが現れている。この結果は、本発明の最適化方法の効果が顕著であることを示している。
【００７９】
（実施例１０）チタン糸を用いた多重ＰＣＲの増幅に対する最適化
多重ＰＣＲの増幅に対する最適化は次の工程を含む。
１．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、異なる点は８対のプライマーを用いて多重ＰＣＲ増幅を行い、増幅長がそれぞれ１５９ｂｐ、２８３ｂｐ、４８５ｂｐ、５７３ｂｐ、６６０ｂｐ、７８５ｂｐ、９４２ｂｐ、及び１２４０ｂｐのＤＮＡ分子であることである。プライマー配列は実施例４と同じである。
【００８０】
２．洗浄及び殺菌処理をした最適化媒体材料であるチタン糸を入れる。直径は０.５ｍｍで、長さは３ｍｍである。また同時に、最適化材料を入れない対照実験を行う。
【００８１】
３．ＰＣＲ技術を利用してテンプレート分子に対して増幅を行う。増幅条件は実施例１と同じである。
【００８２】
４．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００８３】
結果は図１１に示す通りである。左から右の順に１、２、３は最適化媒体材料であるチタン糸を入れたＰＣＲ系の増幅結果であり、３つの平行サンプルである。４、５、６は何も最適化媒体材料を入れないＰＣＲ系である。７は分子量マーカー（下から上に、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１５００ｂｐ）である。４、５、６のサンプルの増幅結果においては、複数のバンドがあり、非特異性の増幅又は産物のスメア現象などが生じている。１、２、３のサンプルはバンドがはっきりしており、明らかに最適化されていることが分かる。
【００８４】
（実施例１１）単体ニッケル材料、単体ビスマス材料、単体アンチモン材料、単体セレン材料、単体クロム材料を用いたＰＣＲの再増幅に対する最適化
ＰＣＲの再増幅に対する最適化は次の工程を含む。
１．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、異なる点はテンプレートが前回のＰＣＲ増幅産物であり、増幅長が２８３ｂｐのフラグメントであることである。プライマー配列は実施例１と同じである。
【００８５】
２．一定量の洗浄及び殺菌処理をした最適化媒体材料である単体ニッケル材料、単体ビスマス材料、単体アンチモン材料、単体セレン材料、単体クロム材料を加える。また同時に、最適化材料を入れない対照実験を行う。
【００８６】
３．ＰＣＲ技術を利用してテンプレート分子に対して増幅を行う、各回の増幅条件は実施例１と同じである。
【００８７】
４．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００８８】
結果は図１２に示す通りである。１は分子量マーカーであり、２は何も最適化媒体材料を入れない普通のＰＣＲ系であり、陽性対照である。３、４はニッケル糸を用い、各系の中に直径が０.８ｍｍ、長さが３.２ｍｍのニッケル糸を入れる。５、６はビスマス粒子を用い、各系の中に直径が０.１〜０.２ｍｍの球形ビスマス粒を数粒入れる。その質量は１２ｍｇである。７、８はアンチモン粒子を用い、各系の中に直径が０.１〜０.２ｍｍの球形アンチモン粒を数粒入れる。その質量は３０ｍｇである。９、１０はセレン粉を用い、各系の中に入れる質量は４００μｇである。１１、１２はクロム粉を用い、各系の中に入れる質量は８００μｇである。１３は陰性対照である。一定量のニッケル、ビスマス、アンチモン、セレン、クロムは何れも良好な最適化作用を備え、通常のＰＣＲ系は明らかにスメア現象があることが分かる。
【００８９】
（実施例１２）クロム粉を用いたＰＣＲの再増幅に対する最適化
ＰＣＲの再増幅に対する最適化は次の工程を含む。
１．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、異なる点はテンプレートが前回のＰＣＲ増幅産物で、増幅長が２８３ｂｐのフラグメントであることである。プライマー配列は実施例１と同じである。
【００９０】
２．洗浄及び殺菌処理をした最適化媒体材料である単体クロム粉（２００メッシュ、上海化学試剤公司から購入）を異なる量入れる。各２５μＬの反応系中にそれぞれ質量が１５０、３００、４５０、６００、７５０、９００、１０００、１２００、１５００、２０００μｇのクロム粉を入れる。また同時に、最適化材料を入れない対照実験を行う。
【００９１】
３．ＰＣＲ技術を利用してテンプレート分子に対して増幅を行う。各回の増幅条件は実施例１と同じである。
【００９２】
４．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００９３】
結果は図１３に示す通りである。左から右の順に、１は最適化材料を入れない通常ＰＣＲ系の再増幅結果であり、陽性対照である。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１は最適化材料であるクロム粉を入れる再増幅系であり、各２５μＬの反応系の中のクロム粉の質量は、２〜１１レーンは、それぞれ１５０、３００、４５０、６００、７５０、９００、１０００、１２００、１５００、２０００μｇである。１２は陰性対照である。１３は分子量マーカー（Ｔａｋａｒａ社のＤＬ２０００で、それぞれ２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１００ｂｐ）である。最適化材料であるクロム粉を入れる再増幅系ＰＣＲの結果は、非特異性の増幅が少ない。また、クロム粉の有効使用量は４５０μｇから１５００μｇであり、特に６００μｇから１２００μｇのクロム粉を用いることによる最適化の効果が優れていることが分かる。一方、陽性対照増幅の結果は、非常にひどく尾を引いたような形状のスメアを示している。この結果は、本発明の最適化方法の効果が顕著であることを示している。
【００９４】
（実施例１３）金コロイドを用いた高速ＰＣＲ増幅の実現
高速ＰＣＲ増幅については、次の工程を含む。
１．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、その中、テンプレートは大腸菌ＤＮＡで、博大泰克生物工程公司から購入したものであり、Ｅｘ Ｔａｑ酵素はＴａｋａｒａ公司から購入したものである。増幅フラグメント長は９９７ｂｐである。プライマー配列はｐ１：５’‐ＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧ‐３’であり、ｐ２：５’‐ＡＴＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＣ-３’である。
【００９５】
２．上記ＰＣＲ系に、処理された最適化材料である金コロイド（Ｓｉｇｍａ社から購入、濃度は０.０１％ＨＡｕＣｌ４の１０ｎｍ金コロイド溶液である）を入れる。各２５μＬの反応系中にそれぞれ１０ｎｍ金コロイド溶液を０.５μＬずつ入れて、２つの平行サンプルを作る。また同時に、最適化媒体材料を加えない対照実験を行う。この対照実験も２つの平行サンプルである。
【００９６】
３．ＰＣＲ技術を利用してテンプレート分子に対して増幅を行う。高速増幅手順を用いて、３０のサイクルを行う。各サイクルは、９８℃で１秒間、６０℃で１５秒間のアニーリングを含み、３０のサイクルが終了した後に７２℃で延長５分伸長する。
【００９７】
４．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【００９８】
増幅の結果は図１４に示す通りである。左から右の順に、１は分子量マーカー（Ｔａｋａｒａ社のＤＬ２０００で、それぞれ２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１００ｂｐ）である。２、３は通常のＰＣＲ系で、２つの平行サンプルである。４、５は最適化材料である金コロイドを０.５μＬずつ入れた系で、これも２つの平行サンプルである。６はテンプレートを入れない陰性対照である。高速ＰＣＲ手順において、最適化材料を入れない通常のＴａｑ酵素増幅系は、このような高速増幅手順の場合は目標バンドが得られない。これに対し、最適化材料である金コロイドを入れた系のＰＣＲ増幅は、結果としてはっきりとした目標バンドを得られた。この結果は、本発明の金コロイドを最適化材料とする最適化方法は、反応時間を短縮できるため、高速ＰＣＲ増幅を実現すると共に、増幅の効率と生産量も明らかに向上させることを示している。
【００９９】
（実施例１４）混合物を用いたＰＣＲ再増幅に対する最適化
１．ＰＣＲ系の調製を行う。成分は実施例１と同じであり、異なる点は、テンプレートが前回のＰＣＲ増幅産物で、増幅長が２８３ｂｐのフラグメントであることである。プライマー配列は実施例１と同じである。
【０１００】
２．異なる量の最適化媒体材料混合物を入れる。該混合物は、市販の２００メッシュの単体クロム粉（上海化学試剤公司）と市販の２００〜３００メッシュの単体チタン粉（上海化学試剤公司）の混合物、市販の１０ｎｍ金コロイド溶液（Ｓｉｇｍａ社から購入、濃度は０.０１％ＨＡｕＣｌ４である）と市販の２００〜３００メッシュの単体チタン粉（上海化学試剤公司）の混合物である。また、同時に最適化材料を入れない対照実験を行う。
【０１０１】
３．ＰＣＲ技術を利用してテンプレート分子に対して増幅を行う。各回の増幅条件は実施例１と同じである。
【０１０２】
４．増幅した後のＤＮＡサンプルに対してアガロースゲル電気泳動検査を行う。
【０１０３】
結果は図１５に示す通りである。左から右の順に、１は分子量マーカー（Ｔａｋａｒａ社のＤＬ２０００で、それぞれ２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１００ｂｐ）である。２は最適化材料を入れない通常のＰＣＲ系の再増幅結果であり、陽性対照である。３、４、５、６は最適化材料であるクロム粉とチタン粉の混合物を入れた再増幅系である。各２５μＬの反応系中の混合物について、３レーンはチタン粉が２０μｇ、クロム粉が１２００μｇであり、４レーンはチタン粉が８００μｇ、クロム粉が３００μｇであり、５レーンはチタン粉が２０μｇ、クロム粉が３００μｇであり、６レーンはチタン粉が８００μｇ、クロム粉が１２００μｇである。７、８、９、１０は、最適化材料である１０ｎｍ金コロイドとチタン粉の混合物を入れた再増幅系である。各２５μＬの反応系中の混合物について、７レーンは１０ｎｍ金コロイドが０.３μＬ、チタン粉が８００μｇであり、８レーンは１０ｎｍ金コロイドが１.６μＬ、チタン粉が２０μｇであり、９レーンは１０ｎｍ金コロイドが０.３μＬ、チタン粉が２０μｇであり、１０レーンは１０ｎｍ金コロイド１.６μＬ、チタン粉８００μｇであり、１１は陰性対照である。最適化材料の混合物を入れた再増幅系ＰＣＲ結果は、非特異性の増幅が少なく、混合物中の各材料の有効使用量は単独で使用するときより少ない。これにより、最適化材料の混合物を入れた再増幅系ＰＣＲは、最適化の効果を奏することが分かる。また、陽性対照の増幅結果は、非常にひどく尾を引いたような形状のスメアを示している。この結果は、本発明の最適化方法の効果が顕著であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】本発明方法のフローチャートである。
【図２】金箔を用いた通常のＰＣＲ反応に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図３】金メッキシートを用いた段階希釈低コピーテンプレートＰＣＲ反応に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図４】金コロイドを用いたモノマーＰＣＲ増幅に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図５】金コロイドを用いた多重ＰＣＲ増幅に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図６】金コロイドを用いたロングフラグメントＰＣＲ増幅に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図７】異なる粒径の金コロイドを用いたＰＣＲの再増幅に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図８】金コロイドを用いたＰＣＲの再増幅に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図９】チタン粉を用いた通常のＰＣＲ反応に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図１０】チタン粉を用いたＰＣＲの再増幅に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図１１】チタン糸を用いた多重ＰＣＲ反応に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図１２】単体ニッケル材料、単体ビスマス材料、単体アンチモン材料、単体セレン材料、単体クロム材料を用いたＰＣＲの再増幅反応に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図１３】クロム粉を用いたＰＣＲの再増幅に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図１４】金コロイドを用いた高速のＰＣＲ増幅を実現する効果を示す図である。
【図１５】混合物を用いたＰＣＲの再増幅に対する最適化増幅効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月27日(2007.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法であって、ＰＣＲ系の中に、単体形態の最適化媒体材料である単体金材料、単体チタン材料、単体ニッケル材料、単体ビスマス材料、単体アンチモン材料、単体セレン材料、単体クロム材料の何れか、又は、前記最適化媒体材料を含む混合物を入れることによって、ＰＣＲの増幅に対する最適化を実現する工程を含むことを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項２】
前記方法が、（１）前記何れかの単体形態の最適化媒体材料、又は、前記最適化媒体材料を含む混合物を調整する工程、
（３）前記工程（１）で得られた最適化媒体材料又は最適化媒体材料を含む混合物をＰＣＲ反応系に入れる工程、
（５）ＰＣＲ系の中から最適化媒体材料又は最適化媒体材料を含む混合物を分離し、ＰＣＲ生成物を得る工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項３】
前記方法が、（１）前記何れかの単体形態の最適化媒体材料、又は、前記最適化媒体材料を含む混合物を調整する工程、
（２）前記工程（１）で得られた最適化媒体材料又は最適化媒体材料を含む混合物に対して殺菌する工程、
（３）前記工程（２）で得られた最適化媒体材料又は最適化媒体材料を含む混合物をＰＣＲ反応系に入れる工程、
（４）アガロースゲル電気泳動を行い、ＰＣＲ生成物を検査する工程、
（５）ＰＣＲ系の中から最適化媒体材料又は最適化媒体材料を含む混合物を分離し、ＰＣＲ生成物を得る工程を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項４】
前記単体形態の最適化媒体材料が、糸状、シート状、不規則形状、粒状、粉状又はコロイド状であることを特徴とする請求項１ないし３の何れかに記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項５】
前記工程（１）において、前記単体形態の最適化媒体材料である糸状材料、シート状材料、不規則形状材料は、順に無菌水、無水アルコールの中で繰返して洗浄して乾かされ、
前記単体形態の最適化媒体材料である粒状、粉状材料は、順に無菌水、無水アルコールの中で洗浄、沈殿、乾燥されることを特徴とする請求項１ないし４の何れかに記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項６】
前記工程（３）に入れる最適化媒体材料の使用量が、
最終の２５μＬのＰＣＲ反応系において、２００〜３００メッシュのチタン粉の投入量は２０μｇ〜１０００μｇであり、粉状のその他単体最適化媒体材料の使用量は５０μｇ〜５０００μｇである、または、
最終の２５μＬのＰＣＲ反応系において、金コロイドの使用量は０.０６〜６.０μＬであり、コロイド状のその他の単体最適化媒体材料の使用量は０.５〜４μＬであることを特徴とする請求項１ないし５の何れかに記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項７】
前記２００〜３００メッシュのチタン粉の投入量が５０μｇ〜８００μｇであることを特徴とする請求項６に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項８】
前記その他の単体最適化媒体材料である２００メッシュのクロム粉の投入量が４５０μｇ〜１５００μｇであることを特徴とする請求項６に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項９】
前記その他の単体最適化媒体材料である２００メッシュのクロム粉の投入量が６００μｇ〜１２００μｇであることを特徴とする請求項８に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項１０】
前記その他の単体最適化媒体材料である金粉の投入量が２ｍｇ以上であることを特徴とする請求項６に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項１１】
前記金コロイドの粒径が５ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４である場合、その金コロイドの投入量は０.０６〜０.５μＬであり、
前記金コロイドの粒径が１０ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４である場合、その金コロイドの投入量が０.５〜５.０μＬであり、
前記金コロイドの粒径が２０ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４である場合、その金コロイドの投入量が０.８〜６.０μＬであることを特徴とする請求項６に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項１２】
前記金コロイドの粒径が５ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４である場合、その金コロイドの投入量が０.０８〜０.１６μＬであり、
前記金コロイドの粒径が１０ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４である場合、その金コロイドの投入量が０.８〜１.６μＬであり、
前記金コロイドの粒径が２０ｎｍで濃度が０.０１％ＨＡｕＣｌ４である場合、その金コロイドの投入量が０.８〜３.５μＬであることを特徴とする請求項１１に記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項１３】
前記工程（３）に入れる最適化媒体材料を含む混合物において、
前記混合物は、前記最適化材料を任意に組み合わせた混合物であって、
前記混合物における各成分の使用量は、材料の種類、材料の形状によって決まり、該材料の形状はそれぞれ異なり、
粉状材料の混合物の総使用量は５０μｇ〜５０００μｇであり、
コロイド状材料の混合物の総使用量は０.０６〜６.０μＬであり、
粉状材料とコロイド状材料を混合して使用する場合、粉状材料の総使用量は２０μｇ〜５０００μｇであるとともに、コロイド状材料の総使用量は０.０２〜６.０μＬであることを特徴とする請求項１ないし５の何れかに記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【請求項１４】
前記工程（５）において、
糸状材料、シート状材料、不規則形状材料が使用される場合、直接溶液を吸い取って、分離し、
粉状又は粒状材料が使用される場合、低速遠心を行い、上澄み液を吸い取って分離し、
コロイド状材料が使用される場合、−２０℃で一晩冷凍して、解凍後に高速遠心を行い、上澄み液を吸い取って分離することを特徴とする請求項１ないし１３の何れかに記載のポリメラーゼ連鎖反応増幅の最適化方法。
【国際調査報告】
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