【事件の表示】
　特許第２８４４４８４号「組換え蛋白質の生産方法」の特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２８４４４８４号の請求項１ないし４に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ.手続の経緯
　本件特許第２８４４４８４号の請求項１乃至４に係る発明についての出願は、平成２年２月２２日に特願平２−４１６６６号として出願され、平成１０年１０月３０日にその特許の設定登録がなされ、その後、東洋紡績株式会社より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１２年１月１１日に訂正請求がなされたものである。
　
II.訂正請求
１.訂正の内容
　特許請求の範囲の請求項１に係る記載「有用蛋白質をコードするＤＮＡが組み込まれた発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養して有用蛋白質を生産するに際し、大豆加水分解物を添加した培地で培養することを特徴とする組換え蛋白質の生産方法。」を、「有用蛋白質をコードするＤＮＡが翻訳開始信号とともに組み込まれた発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養して有用蛋白質を生産するに際し、大豆加水分解物を添加した培地で培養し、アミノ酸末端に付加しているメチオニン残基の除去率が向上した有用蛋白質を取得することを特徴とする組換え蛋白質の生産方法。」と訂正する。
２.訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項は、「翻訳開始信号とともに」及び「アミノ酸末端に付加しているメチオニン残基の除去率が向上した有用蛋白質を取得する」という構成要件を直列的に付加するものであるから特許請求の範囲の減縮に該当する。
　そして、上記訂正は新規事項に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
３.独立特許要件
　当審が通知した取消理由の概要は、請求項１乃至２に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であるから、特許法２９条１項３号の規定により、また、請求項３乃至４に係る発明は、甲第１号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができないというものであるところ、後述の「III.３.判断 」の項に記載のように、訂正された請求項１乃至２に係る発明（以下、「本件発明１乃至２」という。）は、甲第１号証に記載された発明ではなく、また、同請求項３乃至４に係る発明（以下、「本件発明３乃至４」という。）は、甲第１号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえないから、本件発明１乃至４は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４,２項、及び同条３項で準用する１２６条２項から４項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III.特許異議申立
１.特許異議申立書の理由の概要
　訂正前の本件請求項１乃至２に係る発明は、甲第１号証（特開昭６２−１９００８７号公報）に記載された発明であるから、特許法２９条１項３号の規定により、また、同請求項３乃至４に係る発明は、甲第１号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、同条２項の規定により特許を受けることができない。
２．甲第１号証の記載内容
　甲第１号証には、
「ブドウ球菌性蛋白質Ａに関連した免疫グロブリンＧ結合領域をコード化する組換体DNAフラグメント(Ｚ)であって、該フラグメントのメチオニンコドンがメチオニン不含有蛋白質の発現を可能にする他のアミノ酸残基のコドンにより置換されていることを特徴とするフラグメント。」（特許請求の範囲(1)の項）、
「本発明はブドウ球菌性蛋白質Ａに関連した免疫グロブリンＧ（以下ＩｇＧと称す）結合領域をコード化する組換体DNAフラグメントに、このようなフラグメントを含むDNA配列に、及びこのようなフラグメント又は配列を用いることにより発現された融合された蛋白質の開裂方法に関する。本発明はまたこのような組換体DNAフラグメント媒介体及び細菌細胞に関する。基本的には、本発明は細菌中に発現された外来蛋白質を製造かつ精製する改善方法に関する。」（２頁右下欄３〜13行）、
「ＴＳＢ：３０ｇのトリプシン系大豆汁を１ｌに調製し、オートクレーブにかけた。」（７頁右上欄11〜12行）、
「プラスミドDNAによる大腸菌Ｋ12の転換は記載されたように行った。」（７頁左下欄13〜14行）、
「菌株を１５mlのＴＳＢに接種し、振盪フラスコ中で１２時間混置した後、・・・」（９頁右上欄１〜２行）が記載されている。
３.判断
(1)本件発明１について
　本件発明１は、「大腸菌を用いて有用蛋白質を生産するに際し、培養方法による生産物の生産量向上と同時にアミノ末端メチオニン残基の除去効率の向上」を目的とするものであって、「有用蛋白質をコードするＤＮＡが翻訳開始信号とともに組み込まれた発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養して有用蛋白質を生産するに際し、大豆加水分解物を添加した培地で培養し、アミノ酸末端に付加しているメチオニン残基の除去率が向上した有用蛋白質を取得することを特徴とする組換え蛋白質の生産方法。」という構成から成るものである。
　しかるに、甲第１号証には、大豆加水分解物を使用する記載はあるものの、そこで発現される蛋白質は、外来蛋白質とブドウ球菌性蛋白質Ａに関連した免疫グロブリンＧ結合領域との融合蛋白質であるのに対し、本件発明１に係る「有用蛋白質」は、融合蛋白質ではなく、しかも、該「有用蛋白質」は「アミノ酸末端に付加しているメチオニン残基の除去率が向上」しているものであるから、本件発明１と甲第１号証に記載の事項とは、相違するところがある。
　そうすると、本件発明１は、甲第１号証に記載された発明であるとはいえない。
(2)本件発明２について
　本件発明２は、本件発明１に係る「大豆加水分解物」を「培地あたり１％から１０（重量）％の濃度範囲で添加される」と、本件発明１を更に限定するものであるから、上記本件発明１についての判断と同様の理由により、甲第１号証に記載された発明であるとはいえない。
(3)本件発明３乃至４について
　甲第１号証には、「ヒトＢ細胞分化因子」乃至「ヒトインターロイキン２」に言及するところはなく、しかも、「アミノ酸末端に付加しているメチオニン残基の除去率が向上した有用蛋白質を取得する」ことについて教示するところはない。
　そうすると、本件発明３乃至４は、甲第１号証に記載された発明に基づき、当業者が容易に想到し得たとはいえない。
３.まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１乃至４についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明１乃至４についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年５月２６日（２０００．５．２６）
【訂正の要旨】
（訂正の要旨）
特許請求の範囲の請求項１に係る記載「有用蛋白質をコードするＤＮＡが組み込まれた発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養して有用蛋白質を生産するに際し、大豆加水分解物を添加した培地で培養することを特徴とする組換え蛋白質の生産方法。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として「有用蛋白質をコードするＤＮＡが翻訳開始信号とともに組み込まれた発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養して有用蛋白質を生産するに際し、大豆加水分解物を添加した培地で培養し、アミノ酸末端に付加しているメチオニン残基の除去率が向上した有用蛋白質を取得することを特徴とする組換え蛋白質の生産方法。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
組換え蛋白質の生産方法
（５７）【特許請求の範囲】
　　【請求項１】　有用蛋白質をコードするＤＮＡが翻訳開始信号とともにプロモーター制御下に組み込まれている発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養して有用蛋白質を生産するに際し、大豆加水分解物を添加した培地で培養し、アミノ末端に付加しているメチオニン残基の除去率が向上した有用蛋白質を取得することを特徴とする組換え蛋白質の生産方法。
　　【請求項２】　大豆加水分解物が、培地あたり１（重量）％から１０（重量）％の濃度範囲で添加されることを特徴とする請求項（１）記載の生産方法。
　　【請求項３】　有用蛋白質がヒトＢ細胞分化因子である請求項（１）記載の生産方法。
　　【請求項４】　有用蛋白質がヒトインターロイキン２である請求項（１）記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
　〔産業上の利用分野〕
　本発明は、組換えＤＮＡ技術により形質転換された大腸菌を用いて、効率よく有用蛋白質を生産する方法に関する。
〔従来の技術〕　
　組換えＤＮＡ技術を用いて大腸菌により真核生物由来の有用蛋白質、例えば、各種インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン、ヒト血清アルブミン等を直接発現法により大量に生産させたい場合、それらの発現プラスミド自体の改良の他、生産菌の培養方法の改良による高生産法が考えられる。特に、目的としている有用蛋白質を医薬品として使用する時などは、大腸菌での遺伝子翻訳開始コドンに対応するアミノ末端メチオニン残基の付加した有用蛋白質は抗原性をもたらす可能性もあり、この観点からメチオニン残基は可能な限り除去しておく必要があること、さらに蛋白質の分離精製段階でのコストダウンを図るためにも、生産菌培養段階で、大量かつアミノ末端メチオニン低含有の目的蛋白質を生産でき得る技術を確立しておく必要があると考えられる。
　一般に、組換え大腸菌の培養方法については従来、ＬＢ（酵母エキス　０．５％、バクトトリプトン　１．０％、ＮａＣｌ　０．５％、グルコース　０．２％、ｐＨ６．５〜７．５）培地やＭ９（０．６％　Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％　ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％　ＮａＣｌ、０．１％　ＮＨ４Ｃｌ、０．２％グルコース、０．００１４７％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ．０５％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）培地、さらにそれにカザミノ酸、酵母エキス等を加えた半合成培地による培養が一般に知られている。
　しかしながら、これらの方法では取得目的の有用蛋白質の生産性、及び生産蛋白質のアミノ末端メチオニン残基除去の点で、まだ十分ではなく、さらなる培養条件の改善が望まれていた。
〔発明が解決しようとする課題〕
　本発明は、大腸菌を用いて有用蛋白質を生産するに際し、培養方法による生産物の生産量向上と同時にアミノ末端メチオニン残基の除去効率の向上化を目的とするものである。
〔課題を解決するための手段〕
　上記の目的は、以下の本発明により達成される。すなわち、本発明は有用蛋白質を発現生産するように組換えＤＮＡ技術により工夫された発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養して、有用目的蛋白質を生産するに際し、主要栄養源として、大豆加水分解物を添加した培地で培養することを特徴とする有用蛋白質の生産方法である。
　本発明の有用蛋白質とは組換えＤＮＡ技術により生産できるものであれば、特に限定はなく、例えば、インターロイキンー２、ヒトＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦと略する）、またα−，β−，γ−インターフェロン等のリンホカイン類、成長ホルモン、インシュリン、ソマトスタチン等のホルモン、ヒト血清アルブミン等の血液関連蛋白質などが挙げられる。尚、ヒトＢＣＤＦはヒトインターロイキン６（ＩＬ−６）ともＢ細胞刺激因子（ＢＳＦ−２）とも呼ばれるが、ここでは従来より用いられているヒトＢＣＤＦという名称を用いる。
　本発明の発現プラスミドは、基本的には、有用蛋白質が大腸菌体内で生産されるよう該蛋白質をコードするＤＮＡ断片が翻訳開始信号とともに、プロモーター制御下に組み込まれているプラスミドであり、さらには構造遺伝子の下流にターミネーターが導入されていてもよい。このプラスミドは公知の方法（例えば、Ｇｏｅｄｄｅ１，Ｄ．Ｖ．ｅｔ　ａ１．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅｒｔｃｈ，８，４０５７（１９８０））により作成することができる。
　該発現プラスミドにより、大腸菌を形質転換する方法としては、公知の方法（例えば、Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．＆Ｍａｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５４（１９７０））にて行なうことができる。
　宿主である大腸菌は特に種類は限定されないが、例えば、Ｋ−１２系のＣ−６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０５、Ｗ３１１０等が挙げられる。
　培地としてはグルコース、ラクトース、ソルビトール等の炭素源、アンモニア、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の窒素源、肉エキス、酵母エキス、カゼイン分解物、及びペプトン等の有機栄養源、リン酸塩などの無機塩、マグネシウム、カリウム、その他微量金属等を適宜含有する産生培地が使用できる。しかしながら、本発明者らは、種々の培地を検討した結果、大豆加水分解物を上記Ｍ９培地（０．６％　Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％　ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％　ＮａＣｌ、０．１％　ＮＨ４Ｃｌ、０．２％　グルコース、０．００１４７％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０５％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの組成より構成される）に、カザミノ酸の代わりに添加した培地を用いることにより、有用蛋白質の生産性、及びそのアミノ末端に付加しているメチオニン残基の除去率が向上する事を見いだした。大豆加水分解物とは例えば、総合アミノ酸（味の素株式会社製、大豆の塩酸加水分解物）、味液、バクトソイトン（ＤＩＦＣＯ製）等である。大豆加水分解物の添加濃度は、基本とする培地組成、培養条件、により多少異なるが、通常培地あたり１％から１０（重量）％、特に２％から４（重量）％が好ましい。
　培養温度は２０℃から４５℃、好ましくは３６℃から３９℃であり、培養中の培地のｐＨは５から９、好ましくは６から７である。培養期間は通常約６時間から約２日である。
〔発明の効果〕
　有用蛋白質をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養し、有用組換え蛋白質を製造する方法に於て、当該大腸菌を大豆加水分解物を添加した培地で培養することを特徴とする、Ｎ末端に翻訳開始コドンＡＴＧに対応するメチオニン残基が効率よく除去された有用蛋白質の増収法を提供するものであり、本発明による培養方法は、有用蛋白質の生産性を向上させると同時に、目的蛋白質のアミノ末端に付加しているメチオニン残基の除去効率も向上させることができる。
　以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これにより本発明の有用性が限定されるものではない。
〔実施例〕
実施例１
　ヒトＢＣＤＦ発現プラスミドを保持する大腸菌ＨＢ　１０１／ｐＢＳＦ２−ＳＤ７を５Ｌ、容ミニジャーを用いて、従来のカザミノ酸を主要栄養源とした培地と大豆加水分解物である総合アミノ酸（味の素株式会社製）を主要栄養源とした培地で比較培養した。なお、プラスミドｐＢＳＦ２−ＳＤ７はプラスミドｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．：Ｇｅｎｅ　３３（１９８５）１０３−１１９に記載）上のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位に、ＥｃｏＲ１側より、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｐＬのＳＤ配列、合成ＳＤ配列、ヒトＢＣＤＦ合成遺伝子、ｔｒｐＡターミネーターが組み込まれた構造をしている。（第１図）本プラスミドを大腸菌ＨＢ１０１株へ形質転換する事により、ヒトＢＣＤＦ生産菌を得た。大腸菌ＨＢ１０１／ｐＢＳＦ２−ＳＤ７（ＡＪ−１２４４８）はＦＥＲＭＰ−１０７５８として、既に寄託されている。（特願平１−１８９２７０に記載）
　Ｍ９カザミノ酸培地組成は、カザミノ酸　１．０ｇ／ｄｌ、酵母エキス　０．２ｇ／ｄｌ、塩化アンモニウム　０．５ｇ／ｄｌ、硫酸マグネシウム七水和物　０．０５ｇ／ｄｌ、塩化カルシウム二水和物　０．００５ｇ／ｄｌ、Ｌ−ロイシン　４０ｍｇ／ｄｌ、Ｌ−プロリン　４０ｍｇ／ｄｌ、ビタミンＢ１　０．４ｍｇ／ｄｌ、グルコース　２．０ｇ／ｄｌ、リン酸−カリ０．１ｇ／ｄｌ、であり、一方、Ｍ９総合アミノ酸培地組成は、上記組成のうちカザミノ酸、ロイシン、プロリンの代わりに総合アミノ酸（味の素株式会社製）を用いた組成の培地となっている。また培養時には両培地に抗生物質であるアンピシリン１００μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン２５μｍ／ｍｌを添加した。
　そして、両生産培地３１．を５１．容ミニジャーに仕込んだ。Ｌブロス（酵母エキス　０．５％、バクトトリプトン　１．０％、ＮａＣｌ　０．５％、グルコース　０．２％、ｐＨ６．５〜７．５）培地にて一晩培養した大腸菌ＨＢ　１０１／ｐＢＳＦ２−ＳＤ７（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０７５８）を１５０ｍｌずつ上記の各々の培地を含むミニジャーに加え、撹拝数７００ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍ、培養温度３７℃、制御ｐＨ６．７にて運転した。培養開始後、３〜５時間で培養液のＯＤ　６６０ｎｍが４〜５に達したので、ｔｒｐプロモーターの誘導剤であるインドールアクリル酸、及びフィード培地を加えた。フィード培地としてはＭ９カザミノ酸培地培養には、カザミノ酸１．０ｇ／ｄ１、Ｌ−ロイシン４０ｍｇ／ｄｌ、Ｌ−プロリン４０ｍｇ／ｄｌ、ビタミンＢ１　０．４ｍｇ／ｄｌ、（ｐＨ６．７）の組成のものを、そして総合アミノ酸培地培養には総合アミノ酸１．０ｇ／ｄ１、ビタミンＢ１　０．４ｍｇ／ｄｌ、（ｐＨ６．７）の組成のものを用いた。
　両培養は１６時間行なった。各々培養経過図を第２図に示す。また、菌体濃度は　最終的にＯＤ　６６０ｎｍでＭ９−カザミノ酸培地では１６、Ｍ９−総合アミノ酸培地では２１に達した。
　次に、両培養液より菌体を遠心分離により集め、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ　ＮａＣｌにて懸濁後、リゾチーム、ＥＤＴＡをそれぞれ終濃度０．２ｍｇ／ｍｌ、０．１Ｍとなるよう添加し、０℃で１時間処理した。その後、超音波破砕機にて菌体液を７０Ｗ、２０ｍｉｎで破砕し、６０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの低速遠心にてヒトＢＣＤＦを含む菌体内封入体を回収した。その封入体を上記緩衝液２０ｍ　ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭＮａＣｌで３回洗浄した後、１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）にて懸濁し、ヒトＢＣＤＦ封入体懸濁液を得た。
　続いて、その封入体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、６Ｍ塩酸グアニジン溶液にて室温１時間で可溶化し、その可溶化溶液を逆相ＨＰＬＣ（ＹＭＣ　Ｃ８カラム　４．６φｍｍ×２５０ｍｍ）にかけ、ヒトＢＣＤＦ画分を単離精製した。
　両培養で得られたヒトＢＣＤＦ生産量はＵＶ２８０ｎｍの吸収量により、算出した。またＮ末端アミノ酸配列は、上記サンプルをプロテインシークエンサー（ＡＢＩ社製４７０Ａ）にかけることにより検定した。結果を下記の第１表に示した。
　以上のように、大豆加水分解物である総合アミノ酸を主要栄養源として用いることで、従来のＭ９−カザミノ酸培地に比べ、ヒトＢＣＤＦの生産量は約２倍に、またアミノ末端のメチオニン除去率が８５％から９８％に向上した。このように、総合アミノ酸培地による培養の結果、アミノ末端メチオニンが効率よく除去できたヒトＢＣＤＦを大量に取得することができた。
実施例２
　ヒトインターロイキン２発現プラスミドを保持する大腸菌ＨＢ　１０１／ｐＴ１３ＳＮｃｏを３Ｌ．容ミニジャーを用いて実施例１と同様に比較培養した。
　ヒトインターロイキン２生産用のプラスミドｐＴ１３ＳＮｃｏ（Ｔｏｎｏｕｃｈｉら．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，３０−３４（１９８８））はｔｒｐプロモーターの制御下にヒトインターロイキン２が発現するように設計された発現プラスミドであり、本プラスミドを大腸菌ＨＢ１０１株に形質転換したヒトインターロイキン２生産菌ＨＢ１０１／ｐＴ１３ＳＮｃｏ（ＡＪ−１２４４７）ＦＥＲＭ　Ｐ−１０７５７として既に寄託されている。
　培地組成、培養条件は、実施例１と同じである。インターロイキン２の場合もＢＣＤＦと同様に、大腸菌体内にインターロイキン２の封入体が形成されていた。生産量、Ｎ末端アミノ酸配列を実施例１と同様に検定した結果、下記の第２表に示したようにインターロイキン２の場合も、Ｍ９−カザミノ酸培地を用いた培養に比べ、Ｍ９−総合アミノ酸培地による培養により、ヒトインターロイキン２の生産量は約１．５倍となり、Ｎ末端メチオニン除去率も３５％から７８％に向上した。このように、アミノ末端メチオニンが効率よく除去できたヒトインターロイキン２を大量に取得することができた。尚、第２表のヒトＩＬ−２はヒトインターロイキン２の略称である。
【図面の簡単な説明】
　第１図はヒトＢＣＤＦの生産プラスミドであるｐＢＳＦ２−ＳＤ７の構造を示す。
　第２図は総合アミノ酸培地を用いた時とカザミノ酸培地の時の、ヒトＢＣＤＦ生産菌の培養経過を示す。