【事件の表示】
　特許第２７５０７８９号「洗浄剤組成物」の請求項1乃至請求項2に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７５０７８９号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理　由】
(1)手続の経緯
　
　特許第2750789号の請求項1及び請求項2に係る発明は、平成3年12月10日に特許出願され、平成10年2月27日にその特許権の設定登録がなされ、その後、プロクター・アンド・ギャンブル・ファー・イースト・インクより特許異議の申立てがなされ、平成11年1月29日付けで第1回目の取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成11年4月26日に提出された訂正請求は平成12年2月17日に取り下げられ、平成12年1月25日付けで第2回目の取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成12年2月17日に訂正請求がなされたものである。
　
(2)訂正の適否についての判断
　
(2-1)訂正の内容
　
　特許権者の求める訂正は、
　
(1)特許明細書の請求項1において、「40KFU/APU以上のヒト角質ケラチン線維に対する分解活性を有するアルカリプロテアーゼを含有することを特徴とする洗浄剤組成物。」を、「40KFU/APU以上のヒト角質ケラチン線維に対する分解活性を有するアルカリプロテアーゼを洗浄剤組成物1kg当たり5〜400P.U.含有することを特徴とする洗浄剤組成物。」と訂正し、
　
(2)特許明細書段落【0006】の「すなわち、本発明は40KFU/APU以上のヒト角質ケラチン線維に対する分解活性を有するアルカリプロテアーゼを含有することを特徴とする洗浄剤組成物を提供するものである。」を、「すなわち、本発明は40KFU/APU以上のヒト角質ケラチン線維に対する分解活性を有するアルカリプロテアーゼを洗浄剤組成物1kg当たり5〜400P.U.含有することを特徴とする洗浄剤組成物を提供するものである。」と訂正するものである。
　
(2-2)訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　
　訂正(1)は、請求項1において洗浄剤組成物中のアルカリプロテアーゼの配合量を特定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。その特定の内容についてみると、訂正前の願書に添付した明細書の発明の詳細な説明には、段落【0049】に「本発明の洗浄剤組成物中への上記アルカリプロテアーゼの配合量は、アルカリプロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物1kg当たり0.1〜6,000P.U.、特に5〜400P.U.が好ましい。」と記載されており、この訂正(1)は、ここで特に好ましいとされている範囲に訂正するものであるので、願書に添付した明細書に記載した事項の範囲内のものである。
　訂正(2)は上記訂正(1)に伴って、特許請求の範囲の記載と発明の詳細な説明の記載の整合を図るため、明りようでない記載の釈明を目的とするものに該当する。訂正(2)も、訂正(1)と同じ理由により、願書に添付した明細書に記載した事項の範囲内のものである。
　そして、いずれの訂正も実質上特許請求の範囲の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
　
(2-3)独立特許要件の判断
　
　特許異議申立人の提出した甲第1号証(特開平1-101885号公報、「刊行物1」という。)には、新規アルカリプロテアーゼ(K-2001等)が記載されており、そのプロテアーゼが尿素変性ヘモグロビン、ケラチンに対して作用すること、尿素変性ヘモグロビンやケラチンに対して高い活性を示し、特にケラチンに対して高い活性を有すること(請求項1等参照)、ケラチン等の不溶性蛋白を良く分解する能力のあるプロテアーゼが洗浄に寄与することが知られていること(4頁左下欄2行〜4行)、アルカリ側でも作用すること及び低温においても活性が高いことに加え、ケラチン等の不溶性蛋白質に対する優れた作用を有するという性質を兼ね備えたプロテアーゼを洗剤中に配合すれば、優れた洗浄力と使い易さを有する洗剤組成物が得られることが期待されること(4頁左下欄6行〜11行)も記載されている。さらに、従来知られているAPI-21の尿素変性ヘモグロビンに対する活性を1としたとき、K-2001の活性は1で、API-21のケラチンに対する活性を1としたとき、K-2001の活性は1.3であること等(8頁第1表参照)が示され、洗剤用酵素として良く知られている酵素API-21、アルカラーゼ、サビナーゼ等と比べ、ケラチン分解性が優れていることが記載されている。
　同じく甲第2号証(繊維消費化学会誌, vol.19 , No.3(1978), 106〜115頁、「刊行物2」という。)は、衣類に付着する表皮角質層汚れの洗浄に関する研究についての雑誌発表であり、「ヒアルロン酸などの細胞間物質を特異的に加水分解する放線菌ヒアルロニダーゼや、キチンなどの構造多糖類などを特異的に加水分解する液化型の糸状菌キチナーゼとケラチンを特異的に加水分解するアルカリ放線菌プロテアーゼとを併用する複合酵素系の反応では表皮角質層に対するすぐれた崩壊・分散効果を示すことが認められる。」という記載があり(106頁要旨8行目〜11行目)、実験結果の総括として、「6)プロテアーゼは一般に表皮表層の細胞にケラチンが生成・沈着した皮膚たん白質に対して低い分解率を示すが、ケラチンを特異的に加水分解するアルカリ性放線菌プロテアーゼ、endopeptidaseとexopeptidase力との両作用を有する中性放線菌プロテアーゼおよびゼラチンの粘度低下力が大きく、相対群特異性を有し、かつ多様な反応を示すアルカリ性細菌プロテアーゼなどの微生物プロテアーゼでは皮膚たん白質に対して比較的高い加水分解率を示し、またすぐれた表皮角質層の崩壊・分散効果を示すことが認められる。」という記載もある(115頁左欄3行〜12行)。
　
　しかし、いずれの刊行物にも、40KFU/APU以上の活性比をもつアルカリプロテアーゼ自体及びそれを配合した洗浄剤組成物についての記載はなく、アルカリプロテアーゼの尿素変性ヘモグロビンに対する活性とケラチンに対する活性の比(KFU/APU)について着目し、それが特定の値以上のものを配合したものが蛋白質汚れに対し優れた洗浄剤となるということについての記載はなく、それを示唆する記載もない。
　
　なお、刊行物1には、アルカリプロテアーゼK-2001等について、尿素変性ヘモグロビンに対する活性とケラチンに対する活性が一覧表として第6表(13頁左上欄)に示されているが、その活性比と洗浄力の関係について言及はなく、そこに記載されている4種類の酵素について、(ケラチンに対する活性)／(尿素変性ヘモグロビンに対する活性）の値を計算してみても、本件発明のものよりはるかに小さい値のものであり、本件発明の40KFU/APU以上の活性比の数値を達成している酵素が記載されているものとは認められない。
　
　また、特許異議申立人は、本件発明の数値限定(40KFU/APU以上)の根拠が不明確であり、数値限定の臨界性についてもこれを裏付けるデータが本件明細書に記載されていないので、特許法第36条第4項に規定する記載要件を満たしていない旨の主張をしているが、明細書には、40KFU/APU以上の具体例として50KFU/APUのアルカリプロテアーゼK-14、48KFU/APUのアルカリプロテアーゼK-16が示され、その酵素の入手方法も詳細に記載されていて、洗剤組成物としての配合例も示されているから、これらの明細書の記載に基いて、請求項1に記載された発明は当業者が容易に実施をすることができるものと認められので、比較例として挙げられた酵素のKFU/APUの値がないことのみをもって容易実施不可能とすることはできない。
　
　さらに、洗浄剤1kg当たりに含有するアルカリプロテアーゼの量が特定されたので、平成11年1月29日付取消理由通知及び平成12年1月25日付取消理由通知で示した本件特許の明細書の記載不備はいずれも解消した。
　したがって、本件請求項1に係る発明は刊行物1乃至刊行物2に記載された発明ではなく、また、刊行物1及び刊行物2に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものでもなく、さらに、特許法第36条第4項に規定する要件を満たしているので、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　
　また、本件請求項2に係る発明は、請求項1に係る発明におけるアルカリプロテアーゼについて、その至適pH、至適温度により特定したものであるから、請求項1に係る発明の場合と同様の理由によって、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　
(2-4)むすび
　
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第120条の4第2項及び同条第3項で準用する同法第126条第2項から第4項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
(3)特許異議の申立てについての判断
　
(3-1)特許異議申立ての理由の概要
　
　特許異議申立人プロクター・アンド・ギャンブル・ファー・イースト・インクは、本件請求項1乃至請求項2に係る発明は、甲第1号証乃至甲第2号証(それぞれ前記(2-3)に記載の通り。)の刊行物に記載された発明であるか、両刊行物に記載された発明に基いて容易に発明をすることができたものであるから、特許法第29条第1項第3号に該当し、特許を受けることができず、また、特許法第29条第2項の規定により特許を受けることができないものであり、さらに、明細書の記載に不備があるから、本件特許出願は特許法第36条第4項に規定する要件を満たしていないので、特許を受けることができないものであるから、請求項1及び請求項2に係る発明の特許を取り消すべきであると主張している。
　
(3-2)当審の判断
　
　前記(2-3)で述べた理由により、本件請求項1乃至請求項2に係る発明は、刊行物1、2に記載された発明であるとすることはできず、また、刊行物1、2に記載された発明に基いて容易に発明をすることができたものであるとすることもできない。また、同じく前記(2-3)で述べたとおり、本件特許出願は特許法第36条第4項に規定する明細書の記載要件を満たしている。
　また、他に本件請求項1及び請求項2に係る発明の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年５月１５日（２０００．５．１５）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
（１）特許明細書の請求項１において、「４０ＫＦＵ／ＡＰＵ　以上のヒト角質ケラチン線維に対する分解活性を有するアルカリプロテアーゼを含有することを特徴とする洗浄剤組成物。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「４０ＫＦＵ／ＡＰＵ　以上のヒト角質ケラチン線維に対する分解活性を有するアルカリプロテアーゼを洗浄剤組成物１ｋｇ当たり５〜４００Ｐ．Ｕ．含有することを特徴とする洗浄剤組成物。」と訂正する。
（２）上記訂正に伴い、特許請求の範囲の記載と発明の詳細な説明の記載の整合を図るため、明りょうでない記載の釈明を目的として、特許明細書段落【０００６】の「すなわち、本発明は４０ＫＦＵ／ＡＰＵ以上のヒト角質ケラチン線維に対する分解活性を有するアルカリプロテアーゼを含有することを特徴とする洗浄剤組成物を提供するものである。」を、「すなわち、本発明は４０ＫＦＵ／ＡＰＵ以上のヒト角質ケラチン線維に対する分解活性を有するアルカリプロテアーゼを洗浄剤組成物１ｋｇ当たり５〜４００Ｐ．Ｕ．含有することを特徴とする洗浄剤組成物を提供するものである。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
洗浄剤組成物
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　４０ＫＦＵ／ＡＰＵ以上のヒト角質ケラチン線維に対する分解活性を有するアルカリプロテアーゼを洗浄剤組成物１ｋｇ当たり５〜４００Ｐ．Ｕ．含有することを特徴とする洗浄剤組成物。
　【請求項２】　アルカリプロテアーゼが、次の至適ｐＨ及び至適温度を有するものである請求項１記載の洗浄剤組成物。
（１）至適ｐＨ（カゼイン基質，４０℃１０分間反応）
　　　１０．０〜１２．５
（２）至適温度（カゼイン基質，Ｃａ２＋イオン無添加ｐＨ１０．０で反応）
　　　５０〜６０℃
　【請求項３】　アルカリプロテアーゼが、バチルスエスピー（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　【請求項４】　バチルス　エスピー（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ
【発明の詳細な説明】
　　　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は洗浄剤組成物に関し、更に詳細には蛋白質汚れに対する洗浄力に優れた洗浄剤組成物に関する。
　　　【０００２】
　【従来の技術】
　衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤等には、従来より蛋白質汚れを除去する目的で種々のプロテアーゼが配合されている。かかるプロテアーゼとしてはアルカリ領域で作用するアルカリプロテアーゼが用いられており、その代表的なものとしては、アルカラーゼ、サビナーゼ（ノボ・ノルディスク社製）ＡＰＩ−２１（昭和電工社製）、マクサカル（ギスト・ブロケイデス社製）等が挙げられるが、これらのアルカリプロテアーゼは家庭洗濯で問題となっている襟、そで口等の水不溶性蛋白質汚れに対し充分な活性を有しておらず、これを配合した洗浄剤は充分な蛋白質汚れ除去作用を発揮し得ないという問題があった。
　　　【０００３】
　一方、界面活性剤に安定なものとしてＹａ酵素（特開昭６１−２８０２７８号公報）等が報告されているが、これは活性領域が高温度側にあるため、一般的に室温付近で洗浄を行う場合には適合しないという問題があった。
　　　【０００４】
　【発明が解決しようとする課題】
　従って、広い温度範囲で活性を有し、更に水不溶性蛋白質に対し高い活性を有するアルカリプロテアーゼを配合した、蛋白質汚れ洗浄力に優れた洗浄剤組成物が望まれていた。
　　　【０００５】
　【課題を解決するための手段】
　そこで本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、水不溶性蛋白質、特にヒト角質ケラチン線維に対して高い分解活性を有するアルカリプロテアーゼを配合すれば、蛋白質汚れ、特に襟、そで口等の水不溶性蛋白質汚れに対する洗浄力の優れた洗浄剤が得られることを見出し、本発明を完成した。
　　　【０００６】
　すなわち、本発明は４０ＫＦＵ／ＡＰＵ以上のヒト角質ケラチン線維に対する分解活性を有するアルカリプロテアーゼを洗浄剤組成物１ｋｇ当たり５〜４００Ｐ．Ｕ．含有することを特徴とする洗浄剤組成物を提供するものである。
　　　【０００７】
　本発明において、ヒト角質ケラチン線維分解活性は、ヒト角質ケラチン線維分解活性能（ＫＦＵ）を水溶性蛋白質である尿素変性ヘモグロビン分解活性（ＡＰＵ）に対する比として示されるものであり、具体的には後記の方法により行われる。
　　　【０００８】
　本発明においてアルカリプロテアーゼとは、その酵素がアルカリ性領域で安定であり、プロテアーゼ活性を示すものをいい、本発明においては特に次の至適ｐＨ及び至適温度を有するものを用いるのが好ましい。
（１）至適ｐＨ（カゼイン基質，４０℃１０分間反応）
　　　１０．０〜１２．５
（２）至適温度（カゼイン基質，Ｃａ２＋無添加ｐＨ１０．０で反応）
　　　５０〜６０℃
　　　【０００９】
　本発明に用いられるアルカリプロテアーゼとしては、上記の条件を具備するものであれば特に限定されないが、具体的にはアルカリプロテアーゼＫ−１６及びアルカリプロテアーゼＫ−１４が挙げられる。
　　　【００１０】
　本発明に用いられるアルカリプロテアーゼＫ−１６及びＫ−１４は、バチルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　　　【００１１】
アルカリプロテアーゼＫ−１６生産菌
（Ａ）形態的性質
　（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌０．８〜１．０μｍ×２．２〜２５μｍ
　（ｂ）多形性：無し。
　（ｃ）運動性：周鞭毛を有し、運動性あり。
　（ｄ）胞子〔大きさ、形、位置〕：１．０〜１．２μｍ×１．４〜２．２μｍ、楕円形、中央準端、胞子嚢の膨潤ややあり。
　（ｅ）グラム染色：陽性
　（ｆ）抗酸性：陰性
　（ｇ）肉汁寒天平板上での発育形態：円形、葉状、表面円滑、淡黄色、半透明のコロニー。
　（ｈ）肉汁寒天斜面上での生育：不規則な葉状、表面少しだけ粗な円滑、淡黄色、半透明のコロニー。
　（ｉ）肉汁液体培養：生育良好で混濁あり菌膜無し。
　（ｊ）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育良好で液化する。
　（ｋ）リトマスミルク：ペプトン化するが、ミルクの凝固なし、リトマスの変化なし。
　　　【００１２】
（Ｂ）生理的性質
　（ａ）硝酸塩の還元：陽性
　（ｂ）脱窒反応：陰性
　（ｃ）ＭＲテスト：陰性
　（ｄ）ＶＰテスト：陽性
　（ｅ）インドール生成：陰性
　（ｆ）硫化水素生成：陰性
　（ｇ）澱粉加水分解：陽性
　（ｈ）クエン酸の利用：陽性
　（ｉ）無機窒素源の利用：硝酸塩を利用するが、アンモニウム塩は利用しない。
　（ｊ）色素の生成：陰性
　（ｋ）ウレアーゼ：陰性
　（ｌ）オキシダーゼ：陽性
　（ｍ）カタラーゼ：陽性
　（ｎ）生育の温度範囲：５５℃以下
　（ｏ）生育のｐＨ範囲：ｐＨ６．６〜１０．３で生育可能。
　（ｐ）酸素に対する態度：好気的
　（ｑ）ＯＦテスト：酸化型（Ｏ型）
　（ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性：１０％塩化ナトリウム存在下で生育する。
　（Ｓ）糖からの酸生成及びガス生成
　　　【００１３】
　【表１】
　　　【００１４】
　以上の菌学的性質について「バージェーズ　マニュアル　オブ　システマティック　バクテリオロジー（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ社，１９８４年）」（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）の記載に準じ検討したところ、本菌株は、バチルスズブチルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ
　　　【００１５】
　以上の結果から明らかなように、本菌株はバチルス　ズブチルスに属させることが妥当であるが、いくつかの点においてこれと相違し、また他の公知の菌株とも異なるので、本菌株をバチルス・エスピー（
ＢａｃｉｌＩＵＳ
　　　【００１６】
アルカリプロテアーゼＫ−１４生産菌
（Ａ）形態的性質
　（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌０．８〜１．０μｍ×２．５〜２５．５μｍ
　（ｂ）多形性：無し。
　（ｃ）運動性：周鞭毛を有し、運動性あり。
　（ｄ）胞子〔大きさ、形、位置〕：１．０〜１．２μｍ×１．５〜２．２μｍ、楕円形、中央準端、胞子嚢の膨潤ややあり。
　（ｅ）グラム染色：陽性
　（ｆ）抗酸性：陰性
　　　【００１７】
（Ｂ）生理的性質
　（ａ）硝酸塩の還元：陽性
　（ｂ）脱窒反応：陰性
　（ｃ）ＭＲテスト：陰性
　（ｄ）ＶＰテスト：陽性
　（ｅ）インドール生成：陰性
　（ｆ）硫化水素生成：陰性
　（ｇ）澱粉加水分解：陽性
　（ｈ）クエン酸の利用：陽性
　（ｉ）無機窒素源の利用：硝酸塩を利用するが、アンモニウム塩は利用しない。
　（ｊ）色素の生成：陰性
　（ｋ）ウレアーゼ：陰性
　（ｌ）オキシダーゼ：陽性
　（ｍ）カタラーゼ：陽性
　（ｎ）生育の温度範囲：５５℃以下
　（ｏ）生育のｐＨ範囲：ｐＨ６．６〜１０．３で生育可能。
　（ｐ）酸素に対する態度：好気的
　（ｑ）ＯＦテスト：酸化型（Ｏ型）
　（ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性：１０％塩化ナトリウム存在下で生育する
　（Ｓ）糖からの酸生成及びガス生成
　　　【００１８】
　【表２】
　　　【００１９】
　以上の菌学的性質について「バージェーズ　マニュアル　オブ　システマティック　バクテリオロジー（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ社，１９８４年）」（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）の記載に準じ検討したところ、本菌株は、バチルス　ズブチルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ
　　　【００２０】
　以上の結果から明らかなように、本菌株はバチルス　ズブチルスに属させることが妥当であるが、いくつかの点においてこれと相違し、また他の公知の菌株とも異なるので、本菌株をバチルス・エスピー（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　　　【００２１】
　これらの菌株を用いて、アルカリプロテアーゼＫ−１６及びＫ−１４を生産するには、当該菌体を適当な培地に接種し、常法に従って培養すればよい。
　　　【００２２】
　使用される培地としては、通常の微生物の培養に用いられ本菌株に利用可能なものであれば何れをも便用することができるが、該培地中には資化しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好ましい。
　　　【００２３】
　この炭素源及び窒素源については特に制限はないが、その例としては、窒素源としてはコーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベーター、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、アジックス等が挙げられる。また、炭素源としては、資化しうる炭素源、例えばアラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、蕪糖、麦芽糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、イノシトール、グリセリン、可溶性澱粉や廉価な廃糖蜜、転化糖等、また資化しうる有機酸、例えば酢酸等が挙げられる。また、その他、リン酸、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。
　　　【００２４】
斯くして得られた培養物中からの目的物質であるアルカリプロテアーゼＫ−１６及びＫ−１４の採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことが出来る。
　　　【００２５】
　すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等することによって菌体を分離し、その菌体及び培養濾液から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン等）によって蛋白質を沈澱させたり、また、限外濾過（例えばダイアフローメンブレンＹＣ、アミコン社製）により濃縮させて目的とするアルカリプロテアーゼを得る。塩析法では、例えば硫安（３０〜７０％飽和画分）、溶媒沈澱では、例えば７５％エタノール中で酵素を沈澱させた後、濾過或いは遠心分離、脱塩することによってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能である。ここで脱塩の方法としては、透析又は、セファデックスＧ−２５等を用いるゲル濾過法等の一般的方法が用いられる。
　　　【００２６】
　このようにして得られる酵素液は、そのまま使用することもできるが、更に公知の方法により精製結晶化して用いることも出来る。更に酵素を精製するには、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロースやＣＭ−バイオゲル等のイオン交換クロマトグラフィー及びセファデックスやバイオゲルのような分子節ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて分別精製すればよい。
　　　【００２７】
　斯くして得られた本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６及びＫ−１４は、以下に示すような酵素学的性質を有する。尚、以下において、酵素活性の測定は次の如くして行った。
　　　【００２８】
カゼイン分解活性
　カゼイン１％を含む５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）１ｍｌを０．１ｍｌの酵素溶液と混合し、４０℃、１０分間反応させた後、反応停止液（０．１２３Ｍトリクロロ酢酸−０．２４６Ｍ酢酸ナトリウム−０．３６９Ｍ酢酸）２ｍｌを加え、３０℃、２０分間放置した。次に濾紙（ワットマン社製、Ｎｏ．２）で濾過し、濾液中の蛋白分解物をフォーリン・ローリー法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ　１９３，ｐ２６５（１９５１））の改良法によって測定した。
　また１Ｐ．Ｕ．は、上記反応条件下において１分間に１ｍｍｏｌのチロシンを遊離する酵素量とした。
　　　【００２９】
ヒト角質ケラチン線維分解活性
（１）尿素変性ヘモグロビンに対する分解活性
　アンソンーヘモグロビン法（Ａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．
Ｊ
Ｇｅｎ
Ｐｈｙｓｉｏｌ
（２）ヒト角質ケラチン線維に対する分解活性
　（２−１）ケラチン線維の調製
　ヒト踵皮（角質）をメスで削り取り、ハサミで細かく裁断したあと、イオン交換水で洗浄する。角質１ｇを８Ｍ尿素、２５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）の２０〜５０ｍｌに懸濁し、一晩スターラーで攪拌する。膨潤した角質をテフロンホモジナイザーを用いてすりつぶした後、遠心分離（３０，０００×ｇ，３０ｍｉｎ）する。上澄液を濾紙を用いて濾過後、濾液をイオン交換水に対して透析し、凍結乾燥、粉末化したものをケラチン線維として用いる。
　（２−２）分解活性の測定
　０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．５）に、調製したケラチン線維を１ｍｇ／ｍｌ、プロテアーゼを２×１０−３ＡＰＵ／ｍｌになるように添加する。温度３０℃、マグネチックスターラーで回転数１００ｒｐｍ（スターラーピース３５ｍｍ）で一定時間インキュベート後、反応液にフェニルメチルスルホニルフルオライドを添加（終濃度２ｍＭ）し、０．５μｍメンブレンフィルターで濾過する。濾液中の可溶化蛋白質をローリー法によりチロシン換算として測定する。
　（２−３）ヒト角質ケラチン線維分解活性の算出
１分間に１ｍｇのチロシンに相当する可溶化蛋白質をヒト角質ケラチン線維から分解生成物として生成させるプロテアーゼ量を１ＫＦＵと規定する。
　　　【００３０】
アルカリプロテアーゼＫ−１６の酵素学的性質
（１）作用
　高アルカリ性条件下で各種蛋白質に対して作用する。特にヒト角質ケラチンに対し４８ＫＦＵ／ＡＰＵの活性を有する。
　　　【００３１】
（２）基質特異性
　アルカリプロテアーゼＫ−１６の各種基質に対する特異性を、他の市販プロテアーゼと比較した。用いた基質は、カゼイン、尿素変性ヘモグロビン、獣毛ケラチン、エラスチンでこれらに対する分解活性を測定した。５０ｍＭホウ酸一ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）に各基質を１％（尿素変性ヘモグロビンは２．２％）加え、各酵素液０．５×１０−４Ｐ．Ｕ．（エラスチンは３．５×１０−４Ｐ．Ｕ．）を添加し、４０℃、１０分間反応を行った。各々の基質におけるアルカリプロテアーゼＫ−１６の活性を１００とした時の各酵素の活性を表３に示す。
　　　【００３２】
　【表３】
　　　【００３３】
　この結果からも明らかなように、アルカリプロテアーゼＫ−１６は水可溶性及び水不溶性の蛋白質を良好に分解し、現在洗剤用酵素として良く用いられている市販酵素Ａ、市販酵素Ｂと比較して、特にエラスチンに対して優れた作用を示す。
　　　【００３４】
（３）至適ｐＨ
　各種ｐＨ緩衝液（５０ｍＭ）中に最終濃度０．９１％となるようにカゼインを加え、アルカリプロテアーゼＫ−１６を５．２×１０−５Ｐ．Ｕ．加えて４０℃、１０分間反応して活性を測定した。最適ｐＨでの活性を１００とし、各ｐＨでの活性を相対的に表した。結果を図１に示す。図１からも明らかなようにアルカリプロテアーゼＫ−１６の至適ｐＨは１１．０〜１２．３である。尚、使用した各種緩衝液、及びそのｐＨ範囲は次のとおりである。
　酢酸緩衝液　　　　　　　ｐＨ３．９〜５．７
　リン酸緩衝液　　　　　　ｐＨ６．６〜８．３
　炭酸緩衝液　　　　　　　ｐＨ９．２〜１０．９
　リン酸−ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ１０．９〜１２．７
　ＫＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ１０．９〜１２．６
　　　【００３５】
（４）ｐＨ安定性
　（３）で用いたのと同じ緩衝液（２０ｍＭ）中に７．９×１０−３Ｐ．Ｕ．のアルカリプロテアーゼＫ−１６を加え、２５℃で４８時間放置した。この処理液を５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で４０倍に希釈後、活性を測定した。処理前の酵素活性を１００％として各ｐＨでの相対活性を求めた。結果を図２に示す。図２から明らかなようにアルカリプロテアーゼＫ−１６は、Ｃａ２＋非存在下ではその安定領域がｐＨ６．０〜１２．０であり、２ｍＭＣａ２＋存在下ではその安定域はｐＨ５．０〜１２．０であった。
　　　【００３６】
（５）至適温度
　基質として０．９１％のカゼインを含む５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）に３．１×１０−５Ｐ．Ｕ．のアルカリプロテアーゼＫ−１６を加え、１０分間各温度で反応を行った。４０℃での活性を１００％として各温度での相対活性を求めた。結果は図３に示す。図３からも明らかなように、アルカリプロテアーゼＫ−１６の至適温度は、Ｃａ２＋非存在下では５５℃であり、５ｍＭＣａ２＋存在下では７０℃であった。
　　　【００３７】
（６）耐熱性
　２０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）に１．６×１０−３Ｐ．Ｕ．のアルカリプロテアーゼＫ−１６を加え、各温度で１０分間熱処理し、氷冷後、５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で５倍希釈した。そして０．９１％カゼインを基質として活性を測定した。未処理時の活性を１００％として各処理温度での相対活性を求めた。結果を図４に示す。図４からも明らかなように、アルカリプロテアーゼＫ−１６はＣａ２＋非存在下で５０℃、５ｍＭＣａ２＋存在下では６０℃まで上記熱処理条件下で、９０％以上の活性が維持された。
　　　【００３８】
（７）分子量
　アルカリプロテアーゼＫ−１６の分子量をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により調べた。分子量マーカーには低分子量用マーカーキット（バイオラッド）すなわち、ホスホリラーゼｂ（分子量：９７，４００）、牛血清アルブミン（分子量：６６，２００）、卵白アルブミン（分子量：４２，７００）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量：３１，０００）、大豆トリプシンインヒビター（分子量：２１，５００）、リゾチーム（分子量：１４，４００）を用いた。この方法によりアルカリプロテアーゼＫ−１６の分子量は２８，０００±１，０００と決定された。
　　　【００３９】
（８）等電点
　アルカリプロテアーゼＫ−１６の等電点を等電点電気泳動法により調べた。カラム用の両性担体にはサーバライト９−１１を用いた。この方法によりアルカリプロテアーゼＫ−１６の等電点は１０．５以上であることがわかった。
　　　【００４０】
（９）金属イオンの影響
　各種金属イオンについて、アルカリプロテアーゼＫ−１６に対して与える影響を調べた。まず、２０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）に各種金属塩を１ｍＭの濃度で添加し、そこに３．９×１０−３Ｐ．Ｕ．の酵素を加えて３０℃、２０分間放置した。その後、５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で５倍に希釈して残存活性を測定した。残存活性は、金属塩無添加で同様に処理した酵素活性に対する相対値で表した。結果を表４に示した。この結果から明らかなように、アルカリプロテアーゼＫ−１６は、Ｈｇ２＋及びＣｕ２＋により活性が阻害されることがわかる。
　また、前記（５）及び（６）の結果よりＣａ２＋により熱安定性が向上することがわかる。
　　　【００４１】
　【表４】
　　　【００４２】
（１０）阻害剤の影響
　一般的な酵素阻害剤について、アルカリプロテアーゼＫ−１６に対して与える影響を調べた。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に各種阻害剤を所定濃度になるように加え、そこにアルカリプロテアーゼＫ−１６　７．９×１０−３ｐ．Ｕ．を添加し、３０℃で２０分間放置した。その後、該処理液をイオン交換水にて２０倍希釈し、残存活性を測定した。残存活性は、阻害剤無添加で同様に処理した酵素活性に対する相対値で表した。結果を表５に示した。この結果から明らかなように、アルカリプロテアーゼＫ−１６は、セリンプロテアーゼの阻害剤であるジイソブロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、キモスタチンで活性が阻害されることから、活性中心にセリン残基を有するプロテアーゼであることがわかる。
　　　【００４３】
　【表５】
　　　【００４４】
（１１）界面活性剤の影響
　６．６×１０−２Ｐ．Ｕ．の酵素液を、所定濃度の各種界面活性剤を溶かした５ｍｌの０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０、エタノールを１０％含む）に加え４０℃で４時間放置し、その後５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で２０倍希釈後、残存活性を測定した。処理時間０分での活性を１００％とし残存活性を相対値で表した。結果を表６に示した。この結果から明らかなようにアルカリプロテアーゼＫ−１６は、各種界面活性剤が高濃度（１〜１０％）存在しても高い安定性を示すものであった。このことより、アルカリプロテアーゼＫ−１６は界面活性剤を含有する洗浄剤成分として有用である。
　　　【００４５】
　【表６】
　　　【００４６】
アルカリプロテアーゼＫ−１４の酵素学的性質
（１）作用
　高アルカリ性条件下で各種蛋白質に対して作用する。特にヒト角質ケラチンに対し５０ＫＦＵ／ＡＰＵの活性を有する。
　　　【００４７】
（２）至適ｐＨ
　前記アルカリプロテアーゼＫ−１６の場合と同様にして検討した結果、図５から明らかなようにアルカリプロテアーゼＫ−１４の至適ｐＨは１０．４〜１２．０であった。
（３）ｐＨ安定性
　前記アルカリプロテアーゼＫ−１６の場合と同様にして検討した結果、図６から明らかなようにアルカリプロテアーゼＫ−１４はＣａ２＋非存在下ではその安定領域がｐＨ７〜１１．５であり、２ｍＭ　Ｃａ２＋存在下ではその安定領域はｐＨ５〜１２であった。
（４）至適温度
　前記アルカリプロテアーゼＫ−１６の場合と同様にして検討した結果、図７から明らかなようにアルカリプロテアーゼＫ−１４の至適温度はＣａ２＋非存在下では５５℃であり、５ｍＭ　Ｃａ２＋存在下では７０℃であった。
　　　【００４８】
（５）耐熱性
　前記アルカリプロテアーゼＫ−１６の場合と同様にして検討した結果、図８から明らかなように、アルカリプロテアーゼＫ−１４はＣａ２＋非存在下で５０℃、５ｍＭ　Ｃａ２＋存在下では６０℃まで９０％以上の活性が維持された。
（６）等電点
　アルカリプロテアーゼＫ−１４の等電点をロトフォア等電点電気泳動法（バイオラッド社製）により測定した。その結果、アルカリプロテアーゼＫ−１４の等電点は１０．０以上であった。
　　　【００４９】
　本発明の洗浄剤組成物中への上記アルカリプロテアーゼの配合量は、アルカリプロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜６，０００Ｐ．Ｕ．、特に５〜４００Ｐ．Ｕ．が好ましい。
　　　【００５０】
　また、本発明の洗浄剤組成物には、公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
　　　【００５１】
（１）界面活性剤：
　平均炭素数１０〜１６のアルキル基を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子内に平均０．５〜８モルのエチレンオキサイドを付加したアルキルエトキシ硫酸塩、平均炭素数１０〜２０のアルキル基を有するアルキル硫酸塩、平均１０〜２０の炭素原子を１分子中に有するオレフィンスルホン酸塩、平均１０〜２０の炭素原子を１分子中に有するアルガンスルホン酸塩、平均１０〜２０の炭素原子を１分子中に有するα一スルホ脂肪酸メチルあるいはエチルエステル塩、平均炭素数８〜２０の高級脂肪酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子内に平均０．５〜８モルのエチレンオキサイドを付加したアルキルエーテルカルボン酸塩などのアニオン性界面活性剤；平均炭素数１０〜２０のアルキル基を有し、１〜２０モルのエチレンオキシドを付加したポリオキシエチレンアルキルエーテル、高級脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキサイド付加物などの非イオン性界面活性剤；その他ベタイン型両性界面活性剤；スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、アミノ酸型界面活性剤、カチオン性界面活性剤など。
　これらの界面活性剤は洗浄剤組成物中５〜６０重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉体状洗浄剤組成物については１０〜４５％、液体洗浄剤組成物については２０〜５５％配合することが好ましい。また、本発明洗浄剤組成物が漂白剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。
　　　【００５２】
（２）二価金属イオン捕捉剤：
　トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、インクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩など。
　この二価金属イオン捕捉剤は、０〜５０％、好ましくは５〜４０％配合される。また、リンを含有しない二価金属イオン捕捉剤を用いることがより好ましい。
　　　【００５３】
（３）アルカリ剤及び無機塩：
　ケイ酸塩、炭酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、アルカノールアミンなど。
　これらは０〜８０％配合される。
　　　【００５４】
（４）再汚染防止剤：
　ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸塩、ポリアクリル酸コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなど。
　再汚染防止剤は０〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。
　　　【００５５】
（５）酵素：
　セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、β一グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、上記アルカリプロテアーゼ以外のプロテアーゼなどの酵素。上記アルカリプロテアーゼは従来公知のアルカリプロテアーゼよりも、セルラーゼ、リパーゼ等の酵素との相性が良好であり、これらの酵素を併用すれば洗浄力をいっそう向上させることができる。
　　　【００５６】
（６）水道水中の有効塩素の捕捉剤又は還元剤：
　有効塩素の捕捉剤として、硫酸アンモニウム、尿素、塩酸グアニジン、炭酸グアニジン、スルファミン酸グアニジン、二酸化チオ尿素、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、又グリシン、グルタミン酸ナトリウム等で代表されるアミノ酸及び牛血清アルブミン、カゼインなどの蛋白質、更には蛋白質の加水分解、肉エキス、魚肉エキスなどが挙げられる。
　還元剤としては、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、亜ニチオン酸塩等のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等及びロンガリットＣ等が挙げられる。
　　　【００５７】
（７）漂白剤：
　過炭酸塩、過硼酸塩、スルホン化フタロシアニン亜鉛塩又はアルミニウム塩、過酸化水素等。
　　　【００５８】
（８）蛍光染料：
　通常洗浄剤に用いられる蛍光染料。
　　　【００５９】
（９）可溶化剤：
　液体洗剤の場合には次のような可溶化剤を用いることができる。
　エタノールなどの低級アルコール、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ一トルエンスルホン酸塩などの低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、プロピレングリコールなどのポリオール類など。
　　　【００６０】
（１０）その他：
　上記以外に香料、ケーキング防止剤、酵素の活性化剤、酸化防止剤、防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活性化剤等の洗剤に常用の成分を必要に応じて配合する
ことができる。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　【００６１】
　本発明の洗浄剤組成物は、上記アルカリプロテアーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合せて常法に従い、製造することができる。洗浄剤の形態は、用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉末、顆粒等とすることができる。また、本発明洗浄剤組成物は、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、配水管洗浄剤、義歯洗浄剤、漂白剤等として便用することができる。
　　　【００６２】
　　【発明の効果】
　本発明の洗浄剤組成物は、アルカリ性領域において高活性を有し、且つアルカリ耐性、更に強いヒト角質ケラチン線維分解活性を有するプロテアーゼ、例えばバチルス・エスピー（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｂａｃｉｉｌｕｓ
　　　【００６３】
　　【実施例】
　次に参考例及び実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例等により限定されるものではない。尚、以下における％は特記しない限り、重量％を示す。
　　　【００６４】
参考例１
　プロテアーゼ産生菌株の分離、採取：
（１）土壌のサンプルの約１ｇを滅菌生理食塩水１０ｍｌに懸濁し、８０℃にて２０分間放置し熱処理した。熱処理上清液０．１ｍｌをケラチンハロー寒天培地へ接種し、３０℃で４８時間静置培養した。用いたケラチンハロー寒天培地の組成は以下に示す通りである。
　グルコース　　　　　　　　　　　　　　１％
　酵母エキス　　　　　　　　　　　　　　０．２％　　　
　獣毛ケラチン　　　　　　　　　　　　　１％
　カルボキシメチルセルロ一ス　　　　　　１％
　リン酸第一カリウム　　　　　　　　　　０．１％
　硫酸マグネシウム・７水塩　　　　　　　０．０２％
　寒天　　　　　　　　　　　　　　　　　１．５％
　　　【００６５】
（２）上記培地組成物に、別滅菌を施した１０％炭酸ナトリウムを１％添加し、最終ｐＨを１０．５に調整後、平板培地を作製した。
　培養後、生育したコロニーの周囲にハローを生じたものを選抜し、同培地で２〜３回純化し、均一のプロテアーゼ生産菌を得た。
　　　【００６６】
（３）上記（２）で得たこれらの菌株を以下に示す液体培地へ接種し、３０℃で
好気的に４８時間振盪培養を行った。
　グルコース　　　　　　　　　　　　　　２．０％
　ポリペプトンＳ　　　　　　　　　　　　１．０％
　酵母エキス　　　　　　　　　　　　　　０．０５％
　リン酸第一カリウム　　　　　　　　　　０．１％
　硫酸マグネシウム・７水塩　　　　　　　０．０２％
　炭酸ナトリウム（別滅菌）　　　　　　　１．０％
　ｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．５
　培養終了後、得られた培養物を遠心分離（３０００ｒｐｍ；１０分間）して菌を除去し、得られた培養上清を酵素液とした。
　　　【００６７】
（４）上記（３）で得られた酵素液から凍結乾燥により粗酵素サンプルを調製し、市販液体洗剤中における４０℃での保存安定性評価を行った。
　そのなかから、最も安定性に優れる酵素を生産するものの菌株としてバチルス・エスピー　ＫＳＭ−Ｋ１６株及びバチルス・エスピー　ＫＳＭ−Ｋ１４株を得た。
　　　【００６８】　　　　　　　　　　　　　　　　
参考例２
　菌体の培養、アルカリプロテアーゼＫ−１６の精製：
（１）参考例１で得られた好アルカリ性細菌、バチルス・エスピー　ＫＳＭ−Ｋ１６を以下の液体培地（３．０１）に接種し、３０℃で好気的に４８時間振盪培養を行い、アルカリプロテアーゼＫ−１６を生産させた。
　グルコース　　　　　　　　　　　　　　２．０％
　角、肉エキス　　　　　　　　　　　　　１．０％
　大豆粉　　　　　　　　　　　　　　　　１．０％
　硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　０．０２％
　リン酸第一カリウム　　　　　　　　　　０．１％
　ｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０
　　　【００６９】
（２）培養終了後、得られた培養物３１を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ；５分間）して菌を除去し、その上清液を凍結乾燥した。凍結乾燥粉末２ｇをイオン交換水１０ｍｌに溶解（粗酵素液）した後、同溶液を透析膜を用いて１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（２ｍＭ　Ｃａ２＋添加、ｐＨ７．５）に対して一晩透析し、２６ｍｌの透析処理液（活性３．１５Ｐ．Ｕ．／ｍＩ、比活性１．９７Ｐ．Ｕ．／ｍｇ蛋白）を得た。次に、１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（２ｍＭ　Ｃａ２＋添加、ｐＨ７．５）で平衡化したＣＭ−５２セルロース担体を充填したカラムにかけ、同緩衝液でカラム内を洗浄した後、０〜０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液でアルカリプロテアーゼＫ−１６を溶出させた。この活性画分を集めたところ全量は１５ｍｌ、活性は１．１２Ｐ　Ｕ．／ｍ１、比活性は５．７５Ｐ．Ｕ．／ｍｇ蛋白であった。そして、当溶液を５０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（１０ｍＭ　Ｃａ２＋、Ｏ．２Ｍ塩化ナトリウム添加、ｐＨ８．０）に対して一晩透析した後、限外濾過（アミコン社製、分画分子量５，０００）により濃縮し、５０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（１０ｍＭ　Ｃａ２＋、０．２Ｍ塩化ナトリウム添加、ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）のゲル濾過クロマトグラフィーにかけ同緩衝液にて展開させた。ここで得られた活性画分は全量１１．５ｍｌ、活性は０．９Ｐ．Ｕ．／ｍｌ、比活性は６．０３Ｐ．Ｕ．／ｍｇ蛋白であった。
　当溶液を、イオン交換水に対して一晩透析後、活性０．５６Ｐ．Ｕ．／ｍｌ、比活性５．６０Ｐ．Ｕ．／ｍｇ蛋白の溶液を得た。
　当溶液を凍結乾燥し、酵素粉末を得た。得られた酵素の比活性は１．８７Ｐ．Ｕ．／ｍｇであり、ヒト角質ケラチン線維分解活性は４８ＫＦＵ／ＡＰＵであった。
　　　【００７０】
参考例３
　菌体の培養、アルカリプロテアーゼＫ−１４の精製：
（１）参考例１で得られた好アルカリ性細菌、バチルス・エスピー　ＫＳＭ−Ｋ１４を以下の液体培地（３．０１）に接種し、３０℃で好気的に４８時間振盪培養を行い、アルカリプロテアーゼＫ−１４を生産させた。
　グルコース　　　　　　　　　　　　　　２．０％
　魚肉エキス　　　　　　　　　　　　　　１．０％
　大豆粉　　　　　　　　　　　　　　　　１．０％
　硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　０．０２％
　リン酸第一カリウム　　　　　　　　　　０．１％
　ｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０
（２）培養終了後、得られた培養物から、参考例２と同様の方法により、アルカリプロテアーゼＫ−１４の精製酵素粉末を得た。
　得られた酵素のヒト角質ケラチン線維分解活性は５０ＫＦＵ／ＡＰＵであった。
　　　【００７１】
　以下の実施例における洗浄試験は次の実験条件のもとに行った。
１）天然襟布汚染布：
　木綿金布（＃２０２３布）をワイシャツの襟に縫い付け、成年男子に３日間着用させる。着用後２５℃、６５％ＲＨに１ケ月放置後、汚れの程度を三段階に分け、このうち最も汚れのひどいもののうち、中心点に対し汚れが対称な布を選び出し、この汚れの対称点で布を半裁し実験に供した。
　　　【００７２】　　　　　　　　　　　　　　　　　
２）洗浄条件及び方法：
　天然汚染布を洗浄する場合、９ｃｍ×３０ｃｍの天然汚染布を対称の位置で半裁し、９ｃｍ×１５ｃｍの一対の汚染布の一方を基準洗剤である酵素無添加洗剤で洗浄し、片方を比較洗剤である本発明の洗剤でそれぞれ洗浄した。まず天然汚染布片１５枚を５０ｃｍ×５０ｃｍの綿布に縫い付け、粉末洗剤の場合には６１の０．４１７％の洗剤溶液に、この汚染布と綿製肌着を合わせて１ｋｇ入れ、３０℃で２時間浸漬後、東芝製洗濯機「銀河」に移し、全量を３０１とした後、強反転で１０分間洗浄し、乾燥後判定に供した。液体洗剤の場合には２０ｃｃの洗剤液を汚染布に均一に塗付け、１０分後、綿製肌着と合わせて１ｋｇとし、東芝製洗濯機「銀河」に移し、全量を３０１とし、強反転にて１０分間洗浄し、乾燥後判定に供した。
　基準洗剤で洗った半裁布と本発明の洗剤で洗った半裁布とを肉眼判定による一対比較で評価した。汚れの程度を表わす１０段階にランクづけした標準汚れを基準にし、洗浄布をランクづけした。洗浄性は基準洗剤の洗浄力を１００としたときの本発明の洗剤の洗浄力の点数で表わした。洗浄力指数の差は０．５以上で有意の差とみなせる。
　　　【００７３】
３）使用した酵素：
（ａ）アルカリプロテアーゼＫ−１６（参考例２で得られたものを芒硝で２００倍に稀釈して造粒したもの）
（ｂ）アルカリプロテアーゼＫ−１４（参考例３で得られたものを芒硝で２００倍に稀釈して造粒したもの）
（ｃ）プロテアーゼ（ノボ・ノルディスク社，サビナーゼ４．０Ｔ）
（ｄ）プロテアーゼ（ギスト・ブロケイデス社，マクサカルＰ−４００，０００）
（ｅ）プロテアーゼ（昭和電工社，ＡＰＩ−２１Ｈ）
（ｆ）セルラーゼ（花王，微工研菌寄第１１３８号，５００１Ｕ／ｇ・造粒物）
（ｇ）セルラーゼ（ノボ・ノルディスク社，セルザイム１．０Ｔ）
（ｈ）リパーゼ（ノボ・ノルディスク社，リポラーゼ１００Ｔ）
　　　【００７４】　　　　　　　　　　　　　　　　
実施例１
　表７に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤を調製した。
　　　【００７５】
　【表７】
　　　【００７６】
　得られた各種洗剤による洗浄試験の結果を表８に示す。尚、表中洗剤番号は、「実施例番号一使用した酵素記号」で表示し、酵素を使用しないものは「実施例番号一◎」と表示する。（以下、同様）
　表８の結果より、本発明品は天然襟汚垢に対し、従来の酵素を含有した洗剤に比べて優れた洗浄力を示すことがわかる。
　　　【００７７】
　【表８】
　　　【００７８】
実施例２
　実施例１の配合組成において、酵素を表９の如く種々組み合わせて用いて弱アルカリ性粉末洗剤を調製した。得られた各種洗剤による洗浄試験の結果を表９に示す。
　表９の結果より、アルカリプロテアーゼＫ−１６とセルラーゼ及び／又はリパーゼとを組み合わせて用いることにより、天然襟汚垢に対して、相乗的な洗浄力の向上効果が得られることがわかる。
　　　【００７９】
　【表９】
　　【００８０】
実施例３
　表１０に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤を調製した。
　　　【００８１】
　【表１０】
　
　　　【００８２】　　　　　　　　　　　　　　　　　
　得られた各種洗剤による洗浄試験の結果を表１１に示す。
　表１１の結果より、本発明洗浄剤の効果が各種ビルダーの使用下において有効に発現されることがわかる。
　　　【００８３】
　【表１１】
　　　【００８４】
実施例４
　表１２に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤を調製した。
　　　【００８５】
　【表１２】
　　　【００８６】
　得られた各種洗剤による洗浄試験の結果を表１３に示す。１
　表１３の結果より、本発明品は天然襟汚垢に対し、従来の酵素を含有した洗剤に比べて優れた洗浄力を示すことがわかる。
　　　【００８７】
　【表１３】
　　　【００８８】
実施例５
　表１４に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤を調製した。
　　　【００８９】
　【表１４】
　　　【００９０】
　得られた各種洗剤による洗浄試験の結果を表１５に示す。
　表１５の結果より、本発明品は天然襟汚垢に対し、従来の酵素を含有した洗剤に比べて優れた洗浄力を示すことがわかる。
　　　【００９１】
　【表１５】
　　　【００９２】
実施例６
　表１６に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤を調製した。
　　　【００９３】
　【表１６】
　　　【００９４】
　得られた各種洗剤による洗浄試験の結果を表１７に示す。
　表１７の結果より、本発明品は天然襟汚垢に対し、従来の酵素を含有した洗剤に比べて優れた洗浄力を示すことがわかる。
　　　【００９５】
　【表１７】
　　　【００９６】
実施例７
　表１８に示す配合組成の弱アルカリ性液体洗剤を調製した。尚、洗剤原液のｐＨは９．６であった。
　　　【００９７】
　【表１８】
　　　【００９８】
　得られた各種液体洗剤中における酵素の安定性試験の結果を表１９に示す。
１）使用した酵素
（ｉ）アルカリプロテアーゼＫ−１６（参考例２で得られたものをグリセロール及び水で１００倍に稀釈して溶解したもの）
（ｊ）アルカリプロテアーゼＫ−１４（参考例３で得られたものをグリセロール及び水で１００倍に稀釈して溶解したもの）
（ｋ）プロテアーゼ（ノボ・ノルディスク社，エスペラーゼ８．０Ｌ）
（ｌ）プロテアーゼ（ノボ・ノルディスク社，サビナーゼ８．０Ｌ）
　　　【００９９】
２）安定性試験
　各組成の液体洗剤を配合後、４０℃の条件下で１０日間及び２０日間放置した後、以下の測定法により各酵素の活性を測定し、次式により酵素活性残存率を算出した。
　　　【０１００】
　【数１】
　　　【０１０１】
　各組成の液体洗剤を１％の水道水溶液（硬度２．５°ＤＨ）とし、自動分析機オートアナライザー（登録商標、テクニコン社）を便用して、酵素活性を測定した。測定の詳細は、下記文献に従った。
　文献：Ａｎａｌｙｓｔ，
９６
　　　【０１０２】
　【表１９】
　　　【０１０３】
【図面の簡単な説明】
　　【図１】
　アルカリプロテアーゼＫ−１６の活性に及ぼすｐＨの影響を示す図面である。
　　【図２】
　アルカリプロテアーゼＫ−１６の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図面である。
　　【図３】
　アルカリプロテアーゼＫ−１６の活性に及ぼす温度の影響を示す図面である。
　　【図４】
　アルカリプロテアーゼＫ−１６の安定性に及ぼす温度の影響を示す図面である。
　　【図５】
　アルカリプロテアーゼＫ−１４の活性に及ぼすｐＨの影響を示す図面である。
　　【図６】
　アルカリプロテアーゼＫ−１４の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図面である。
　　【図７】
　アルカリプロテアーゼＫ−１４の活性に及ぼす温度の影響を示す図面である。
　　【図８】
　アルカリプロテアーゼＫ−１４の安定性に及ぼす温度の影響を示す図面である。