(57)【要約】  本発明は、Ｔ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）の活性化方法および個体におけるチロシンキナーゼシグナル伝達の阻害方法に関する。本発明は、個体におけるチロシンキナーゼシグナル伝達を阻害することにより治癒可能である疾患または障害の予防または治療方法、およびＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）の活性化に基づく、個体における癌の予防、または癌の成長、浸潤もしくは転移の予防または阻害方法に関する。本発明はまた、前記方法に有用な医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）アミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含むペプチド、またはii）哺乳類細胞において該ペプチドを発現可能なベクターのいずれかである、治療における使用のための薬剤。
【請求項２】
前記薬剤がペプチドであって、細胞膜透過融合タンパク質の形態である請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
ＨＩＶ転写トランスアクチベーター（ＴＡＴ）タンパク質のタンパク質形質導入ドメインおよびアミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含む請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
個体におけるＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）の活性化方法での使用のための医薬組成物の製造のための請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤の使用。
【請求項５】
チロシンキナーゼシグナル伝達の阻害方法、または個体においてチロシンキナーゼシグナル伝達を阻害することによって治癒可能な疾患または障害の予防または治療方法での使用のための医薬組成物の製造のための、該個体においてＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）を活性化できる薬剤の使用。
【請求項６】
前記薬剤が請求項１〜３に記載された薬剤のいずれか１つである請求項５記載の使用。
【請求項７】
前記チロシンキナーゼが上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン受容体およびヤーヌスキナーゼからなる群より選択される請求項５または６記載の使用。
【請求項８】
前記疾患が癌である請求項５〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
癌の予防方法、または個体において癌の成長、浸潤または転移の予防または阻害方法での使用のための医薬組成物の製造のための、該個体においてＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）を活性化できる薬剤の使用。
【請求項１０】
薬剤が請求項１〜３に記載された薬剤のいずれか１つである請求項９記載の使用。
【請求項１１】
治療的有効量のＴＣＰＴＰを活性化できる低分子またはアミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含むペプチドのいずれか、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）が、細胞膜透過性である融合タンパク質に包含される請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記融合タンパク質が、ＨＩＶ転写トランスアクチベーター（ＴＡＴ）タンパク質のタンパク質形質導入ドメインとアミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含む請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
前記担体が組成物の非経口投与に適した請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
アミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含むペプチドをコードする核酸を包含する発現ベクターであり、哺乳動物細胞において該ペプチドを発現することができるベクター、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
核酸がＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはウイルスベクター中に挿入されている請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
ウイルスベクターがアデノウイルス、アルファウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスまたはヘルペスウイルスに基づくものである請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
前記発現ベクターが、脂質と複合化されるか、リポソームに詰められているか、シクロデキストリンもしくは他の複合化剤、生吸収性ポリマーまたは制御された放出投与のための他の好適な担体に組み込まれているか、ナノ粒子またはヒドロゲルに包含されている請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
個体におけるＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）の活性化方法であって、該個体に、ｉ）アミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）またはii）哺乳動物細胞において該ペプチドを発現することができるベクターのいずれかである有効量の薬剤を投与することによる方法。
【請求項２０】
前記薬剤がペプチドであり、それ自体として投与されるかまたは細胞膜透過融合タンパク質として投与される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が、ＨＩＶ転写トランスアクチベーター（ＴＡＴ）タンパク質のタンパク質形質導入ドメインおよびアミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含む請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
個体におけるチロシンキナーゼシグナル伝達を阻害する方法であって、該個体にＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）を活性化する能力を有する薬剤を有効量投与することによる方法。
【請求項２３】
前記チロシンキナーゼが、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン受容体およびヤーヌスキナーゼからなる群より選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤が、ｉ）アミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）またはii）哺乳動物細胞において該ペプチドを発現することができるベクターのいずれかである請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
前記薬剤がペプチドであり、それ自体として投与されるかまたは細胞膜透過融合タンパク質として投与される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記融合タンパク質が、ＨＩＶ転写トランスアクチベーター（ＴＡＴ）タンパク質のタンパク質形質導入ドメインおよびアミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含む請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
個体におけるチロシンキナーゼシグナル伝達を阻害することにより治癒可能な疾患または障害の予防または治療方法であって、該個体にＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）を活性化する能力を有する薬剤を有効量投与することによる方法。
【請求項２８】
前記チロシンキナーゼが、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン受容体およびヤーヌスキナーゼからなる群より選択される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患が癌である請求項２７または２８記載の方法。
【請求項３０】
前記薬剤が、ｉ）アミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）またはii）哺乳動物細胞において該ペプチドを発現することができるベクターのいずれかである請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤がペプチドであり、それ自体として投与されるかまたは細胞膜透過融合タンパク質として投与される請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質が、ＨＩＶ転写トランスアクチベーター（ＴＡＴ）タンパク質のタンパク質形質導入ドメインおよびアミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含む請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
個体における、癌の予防、または癌の成長、浸潤もしくは転移の予防または阻害方法であって、該個体にＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）を活性化する能力を有する薬剤を有効量投与することによる方法。
【請求項３４】
前記薬剤が、ｉ）アミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）またはii）哺乳動物細胞において該ペプチドを発現することができるベクターのいずれかである請求項３３項記載の方法。
【請求項３５】
前記薬剤がペプチドであり、それ自体として投与されるかまたは細胞膜透過融合タンパク質として投与される請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記融合タンパク質が、ＨＩＶ転写トランスアクチベーター（ＴＡＴ）タンパク質のタンパク質形質導入ドメインおよびアミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含む請求項３５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）の活性化方法および個体におけるチロシンキナーゼシグナル伝達の阻害方法に関する。さらに、本発明は個体におけるチロシンキナーゼシグナル伝達を阻害することにより治癒可能である疾患または障害の予防または治療方法に関する。さらにまた、本発明は、Ｔ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）の活性化に基づく、個体における癌の予防、または癌の成長、浸潤もしくは転移の予防または阻害方法に関する。本発明はまた、前記方法に有用な医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景を説明するために本明細書で使用する刊行物および他の資料、および特に、実施に関するさらなる詳細を提供するための事例は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
インテグリン媒介細胞接着は、増殖、生存および異なる細胞性シグナル伝達経路間のクロストークなどの多様な細胞応答を制御する1。これまでのところ、インテグリンは、足場依存性受容体チロシンキナーゼシグナル伝達を可能にする許可シグナルを伝えることが主に示されている2、3。細胞接着への応答において、インテグリンはある細胞質シグナル伝達経路を直接活性化し、間接的に成長因子受容体によるシグナル伝達を調節する。インテグリンの細胞質ドメインは、これらの機能を媒介するのに不可欠である4〜7。しかしながら、それらは固有の触媒活性を欠き、シグナル伝達のために細胞質タンパク質との相互作用を必要とする。コラーゲンは人体に非常に豊富に存在するタンパク質であるが、４つのコラーゲン結合インテグリンα１β１、α２β１、α１０β１およびα１１β１のシグナル伝達については相対的にほとんど知られていない。インテグリンα１β１は、コラーゲンとラミニンの受容体である。その１つのサブユニットは、カベオリン−１と関連していることが示されており、したがって、シグナル伝達アダプタータンパク質Ｓｈｃを補充する（recruit）8。これは次にマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路の活性化ならびにコラーゲン上の線維芽細胞の生存および増殖の増強をもたらす9。さらに、すべてのインテグリン細胞質テイルにみられる保存領域は、パキシリン、テーリン（talin）および焦点接着キナーゼとのつながりによって、焦点接着集合における機能が示されている10。しかしながら、これまでのところα１インテグリンにより明確に活性化されるシグナル伝達経路は確認されていない。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、α−１−インテグリンの細胞質テイルが選択的かつ直接的に遍在的に発現するタンパク質チロシンホスファターゼＴＣＰＴＰ（Ｔ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ）と相互作用し、コラーゲンへの細胞接着の際にそれを活性化させるという発見に基づく。その活性化により、ＥＧＦ刺激の際のＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）リン酸化が減少することとなる。α−１−インテグリンの細胞質テイルは、腫瘍抑制タンパク質、ＴＣＰＴＰの活性化を通してＥＧＦＲシグナル伝達の負の調節因子として機能する。α−１−細胞質ドメインペプチドの細胞への導入により、ホスファターゼ活性が誘導され、インビボでのヒト線維肉腫の接ぎ木（zenografts）においてはもとより、ＥＧＦ誘導細胞増殖およびインビトロにおける悪性腫瘍の足場非依存性成長を誘導する。これらのデータは、インビボにおけるＴＣＰＴＰ活性の制御の最初の証明であり、受容体チロシンキナーゼシグナル伝達のインテグリン媒介性負調節の新規な分子パラダイムを表している。
【０００５】
したがって、１つの側面によれば、本発明は、治療に使用するためのｉ）アミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含むペプチド、またはii）哺乳類細胞において該ペプチドを発現可能なベクターのいずれかである薬剤に関する。
【０００６】
もう１つの側面によれば、本発明は個体におけるＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）の活性化方法であって、該個体に、ｉ）アミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）またはii）哺乳動物細胞において該ペプチドを発現することができるベクターのいずれかである有効量の薬剤を投与することによる方法に関する。
【０００７】
第３の側面によれば、本発明は個体におけるチロシンキナーゼシグナル伝達の阻害方法であって、該個体にＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）を活性化する能力を有する薬剤を有効量投与することによる方法に関する。
【０００８】
第４の側面によれば、本発明は個体における疾患または障害の予防または治療方法であって、該疾患または障害がチロシンキナーゼシグナル伝達を阻害することにより治癒可能なものであり、該個体にＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）を活性化する能力を有する薬剤を有効量投与することによる方法に関する。
【０００９】
第５の側面によれば、本発明は個体における、癌の予防、または癌の成長、浸潤もしくは転移の予防または阻害方法であって、該個体にＴ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）を活性化する能力を有する薬剤を有効量投与することによる方法に関する。
【００１０】
第６の側面によれば、本発明は、治療に効果的な量のＴＣＰＴＰを活性化できる低分子またはアミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含むペプチドのいずれか、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。
【００１１】
第７の側面によれば、本発明は、アミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含むペプチドをコードする核酸を包含する発現ベクターであり、哺乳動物細胞において該ペプチドを発現することができるベクター、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
定義：
用語「治療」または「治療する」は、疾患または障害の完全な治癒ならびに該疾患または障害の改善または軽減を含むことを理解されたい。
【００１３】
用語「予防」は、完全な予防（prevention）、防御（prophylaxis）、および前記疾患または状態を伴う病気になる個体のリスクを低下することを含むことを理解されたい。
【００１４】
用語「個体」は、ヒトまたは動物の被験体を意味する。
【００１５】
用語「有効量」は、特に動物またはヒトの被験体に投与する際に、所望の治療結果をもたらすのに充分な本発明の薬剤の任意の量を意味する。
【００１６】
好ましい実施態様：
ＴＣＰＴＰの活性化に使用される薬剤は、ＴＣＰＴＰを活性化できる低分子であっても、またはアミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含むペプチドのいずれであってもよい。この配列は、α−１−インテグリンの細胞質テイルに特異的である。１つの実施態様によれば、ペプチドは正にアミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）であってよく、たとえば微量注入によって細胞に投与され得る。
【００１７】
あるいは、ペプチドは、アミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を包含するより長い鎖であってもよい。特に好ましい実施態様によれば、ペプチド（鎖ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）またはそれを包含するより長い鎖）は、細胞膜透過性融合タンパク質の一部であってもよい。そのような融合タンパク質の例としては、ＨＩＶ転写トランスアクチベーター（ＴＡＴ）タンパク質のタンパク質形質転換ドメインおよびアミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号１）を含む融合タンパク質があげられる。そのような融合タンパク質の例としては、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＷＫＬＧＦＦＫＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号２）があげられる。配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３）は、ＴＡＴから誘導され、配列ＷＫＬＧＦＦＫ（配列番号４）は、インテグリン（いずれのαインテグリンにも典型的な）から誘導される。
【００１８】
さらなる代替によれば、投与される薬剤は、哺乳動物細胞において所望のペプチドを発現することができる核酸を含むベクターであってもよい。核酸はＤＮＡ配列中、ＲＮＡ配列中またはウイルスベクター中に挿入することができる。そのようなウイルスベクターは、通常、アデノウイルス、アルファウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスまたはヘルペスウイルスに基づく。細胞におけるペプチドの発現については、たとえばM Parsonsら、Molecular and Cellular Biology, Aug. 2002, p.5897-5911.参照。
【００１９】
よって、本発明によるＴＣＰＴＰの活性化は、直接的または間接的に該活性化によって影響される障害または疾患を予防または治療するために使用され得る。
【００２０】
少なくとも部分的に間接的に影響される疾患または障害の例としては、その治癒性がチロシンキナーゼシグナル伝達を阻害することにより恩恵を受け得る任意の疾患または障害があげられる。具体的には、そのような標的の非限定的な例は、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン受容体およびヤーヌスキナーゼがあげられる。ＥＧＦＲの阻害は、癌の予防、癌の成長、浸潤もしくは転移の予防または阻害に有用であり得る。しかしながら、これらの効果も、ＴＣＰＴＰの活性化による他の機序により部分的となり得るかもしれない。
【００２１】
他方、ＥＧＦＲの阻害はまた、他の、非癌疾患または障害の予防または障害に有用であり得る。
【００２２】
インスリン受容体およびヤーヌスキナーゼの阻害は、インスリン受容体によって制御されるエネルギー代謝の異常を誘導するインスリン初期シグナル伝達の亢進と関係する疾患、ならびにインターフェロン受容体と結合するヤーヌスキナーゼの異常な活性を導くインターフェロンによる望ましくない炎症性シグナル伝達と関係する障害の治療または予防に有用であり得る。
【００２３】
配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列１）を含むペプチドは、細胞膜を通して透過できる形態でもたらされるのが好ましい。そのようなペプチドは、組成物の非経口投与に適した任意の担体と投与することができる。たとえば、ペプチドは脂質と複合化されるか、リポソームに詰められるか、シクロデキストリンもしくは他の複合化剤、生吸収性（bioresorbable）ポリマーまたは制御された放出投与のための他の好適な担体、ナノ粒子またはヒドロゲルに組み込まれることができる。
【００２４】
あるいは、アミノ酸配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列１）を含むペプチドをコードする核酸を包含する発現ベクターを個体に投与することもできる。核酸は、正に配列ＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列１）、またはこの配列を含むより長い配列をコードすることができる。ベクターは、たとえば脂質と複合化されるか、リポソームに詰められるか、シクロデキストリンもしくは他の複合化剤、生吸収性ポリマーまたは制御された放出投与のための他の好適な担体、ナノ粒子またはヒドロゲルに組み込まれることができる。
【００２５】
そのような治療を必要とする患者に投与されるペプチドまたは発現ベクターの治療的有効量は、たとえば患者の年齢および体重、治療を必要とする正確な病状、およびその重篤度、および投与経路などの多数の因子に依存し得る。正確な量は、最終的には主治医の裁量であろう。したがって、本発明の実施は任意の用量、他の治療有効薬との組み合わせ、非経口投与のための薬学製剤またはデリバリーシステムを含む。ペプチドまたは発現ベクターは、全身的または局所的に投与される。適切な投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下注射、吸入、局所、眼、舌下、鼻、直腸、腹腔内デリバリー、およびイオン導入または他の経皮デリバリーシステムがあげられる。
【００２６】
本発明を、以下の非制限的な実施例の項により説明する。
【実施例】
【００２７】
方法
酵母ツーハイブリッドシステム
α１−インテグリン細胞質ドメインを、ｐＧＢＫＴ７ベクター（クローンテック）におけるＧＡＬ４  ＤＮＡ−ＢＤに融合し、マウス１７日胚適合マーカーｃＤＮＡライブラリー（ＢＤクローンテック）をスクリーニングするためのベイトとして使用した。そのライブラリーのスクリーニングは、製造元のプロトコールにしたがって行なった。単離した独立したクローンの１つがＧＡＬ４−ＤＢＤ−α１ｃｙｔと相互作用したが、Ｔ細胞タンパク質チロシンホスファターゼをコードする無関係なベイトとは相互作用しなかった。
【００２８】
タンパク質−タンパク質相互作用アッセイ
α１ｃｙｔおよびα２ｃｙｔをｐＧＥＸ４Ｔ１（アマシャムバイオサイエンス）にサブクローニングした。全長ＴＣＰＴＰ（４５ｋＤ）およびその欠失変異体をｐＣＧＴＣ４５プラスミド11からＰＣＲ増幅し、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１にクローニングした。ＧＳＴ融合タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１  ｐＬｙｓＳ）で発現させ、製造元（アマシャムバイオサイエンス）の取扱説明書にしたがい精製した。融合タンパク質をグルタチオンセファロースに固定し、２５ｍＭグルタチオンで溶出するか、またはＧＳＴを製造元の取扱説明書にしたがって正確な（precession）プロテアーゼを用いて切断した。プルダウンアッセイについては、Ｈｅｌａ細胞を溶解緩衝液（１％オクチルグルコシド、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、完全プロテアーゼ阻害剤（ロッシュ））に溶解させ、遠心分離、１０分、１３０００ｒｐｍ＋４Ｃで浄化（clarified）し、グルタチオンセファロースで前除去し（precleared）、そして固定化ＧＳＴ融合タンパク質とインキュベートし、同じ緩衝液１ｍｌで３回洗浄した。結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロットで検出した。あるいは、精製全長ＴＣＰＴＰを溶解緩衝液中で、合成インテグリンα１細胞質テイルペプチド（ＲＰＬＫＫＫＭＥＫＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号５）ジェネムド  シンセシス）の存在下または非存在下で示すようにＧＳＴ−融合タンパク質とインキュベートした。
【００２９】
免疫沈降、ウエスタンブロッディングおよびホスファターゼアッセイ
血清枯渇（starved）Ｈｅｌａ細胞をプラスチック上に未処理のまま置き、１０％ＦＢＳで３０分刺激するか、コラーゲンＩ型またはポリ−Ｌ−リジン（１０μｇ／ｍｌ、シグマ）で被覆した組織培養プレート上に１時間置いた。示した場合、細胞は記述したように表面をビオチン化した12。細胞をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に溶解させウエスタンブロット用にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画するか、または溶解緩衝液に溶解させ、各試料由来のタンパク質をそれぞれ等量Ｇタンパク質−セファロースで前除去し免疫沈降に付した。抗体（抗−ＴＣＰＴＰ、オンコジーン；抗−ａ１、抗−ａ５、抗−ａ６、すべてケミコン；抗−ＳＨＰ−２、サンタクルーズ）をＧタンパク質−セファロースと共にインキュベートし、免疫沈降を４℃で２時間行なった。免疫沈殿物を細胞溶解緩衝液で３回洗浄した。共沈殿アッセイについては、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロットで検出するか、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ試薬（ベクター）でビオチンの検出を行なった。ホスファターゼアッセイについては、免疫沈殿物をホスファターゼ反応緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁させ、反応物の１／３をウエスタンブロッディングに付し、残りのビーズを、基質としてｄｉＦＭＵＰ（モレキュラープローブス）を用い、セリン／スレオニンホスファターゼ阻害剤カクテル（シグマ）の存在下で製造元の取扱説明書にしたがって三重でホスファターゼ活性を評価した。示した場合、合成ペプチドは、ホスファターゼアッセイ反応の前に１５分間免疫沈殿物とプレインキュベートされた（α２ペプチドＫＬＧＦＦＫＲＫＹＥＫＭＴＫＮＰＤＥＩＤＥＴＴＥＬＳＳ（配列番号６）、Heino博士より提供）。精製タンパク質とのホスファターゼアッセイについては、全長ＴＣＰＴＰをホスファターゼ反応緩衝液で、示したようにＴＣＰＴＰ欠失変異タンパク質および合成インテグリン細胞質テイルペプチドの存在下または非存在下でインキュベートした。ウエスタンブロッディングをＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ（ＰＹ）８４５、９９２もしくは１０６８（セルシグナリングテクノロジーズ）、ＴＣＰＴＰ（オンコジーン）またはチューブリン（サンタクルーズバイオテクノロジー）に対して作製された市販の抗体で行なった。抗体の特異的結合を過酸化水素共役二次抗体で検出し、拡張化学発光検出法により可視化した。
【００３０】
トランスフェクション
ＨＴ１０８０細胞を、以前に報告されているように13、Ｆｕｇｅｎｅ６（ロッシュ）試薬を用いてｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏベクター（バンダービルト大学、Pozzi博士より提供）中のα１ｃＤＮＡで一時的にトランスフェクトした。ＴＣＰＴＰを標的とする２つの異なるアニールしたｓｉＲＮＡｓ（ggcacaaaggaguuacauctt（配列番号７）、ggaguuacaucuuaacacatt（配列番号８）；アンビオン（Anbion））またはスクランブル対照ｓｉＲＮＡを、Ｈｅｌａ細胞にオリゴフェクトアミン（インビトロジェン）を用い、製造元のプロトコールにしたがってトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクション細胞を２４時間血清枯渇させ、溶解およびウエスタンブロットアッセイの前に示したように処理した。
【００３１】
免疫蛍光
Ｉ型コラーゲン、フィブロネクチンまたはポリ−Ｌ−リジン（１０μｇ／ｍｌ）でコートした酸洗浄ガラスカバースリップ上に細胞を置き、１時間接着させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。抗体染色については、細胞をＰＢＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に浸透させ（permeabilized）、ブロッキングのためにＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで洗浄した。細胞を室温で１時間、示した抗体で染色した。ついで、Ａｌｅｘａ−４８８またはＡｌｅｘａ−５５５で共役された抗ウサギまたは抗マウス抗体（モレキュラープローブス）による検出の前に、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳと水とで洗浄後、細胞をＭｏｗｉｏｌ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、１０％（ｗ／ｖ）Ｍｏｗｉｏｌ（カルビオケム、サンディエゴ、ＣＡ）および２５％（ｖ／ｖ）グリセロール含有アンチフェイド（antifade）（２．５％（ｗ／ｖ）１，４−ジアザジシクロ−２．２．２−オクタン（シグマ）））に載せた。スライドは、ツァィス倒立蛍光顕微鏡（Zeiss inverted fluorescence microscope）または共焦点レーザー顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２  ＬＳＭ  ５１０；カールツァィス社（Carl Zeiss Inc.）、イェーナ、ドイツ）（６３×／１．４  Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ油浸対物レンズを装備）を用いて調べた。共焦点画像は、約１．０μｍの単一ｚ−断面を表す。ＰＢＳ中、１ｍＭ  ＦＤＰ（モレキュラープローブス）および１ｍｇ／ｍｌのペプチドによる細胞質微量注入法を、ガラスの底３ｃｍプレート上で培養されるＨｅｌａ細胞に行なった。生細胞の蛍光画像は、同一の設定で撮り、強度はＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ４ソフトウエアを用いて定量化した。
【００３２】
細胞増殖および軟寒天アッセイ
９６ウェルプレートをＢＳＡまたは示したマトリックスでコートした。細胞をそのウェルに１０4／ウェルで播いた。ＴＡＴペプチド（α１−ＴＡＴ  ｆｉｔｃ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＷＫＬＧＦＦＫＲＰＬＫＫＫＭＥＫ（配列番号２）、Ｓｃｒ−ＴＡＴ  ｆｉｔｃ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＬＫＧＷＲＦＫＬＫＰＫＦＫＥＭＫ（配列番号２）；ジェネムドシンセシス）およびＥＧＦ（シグマ）を示したように添加し、生存細胞の数をＷＳＴ−１（ロッシュ）で製造元のプロトコールにしたがって検出した。軟寒天アッセイは記載されたように行なった14。２００ｎＭ  ＴＡＴペプチドを含む培地を４８時間毎に置き換え、９日間のインキュベーション後、培養物を二重盲検で撮影した。各視野（４×倍率）由来のコロニーの数と大きさをシンジーン（Syngene）のＧｅｎｅＴｏｏｌｓソフトウエアを用いて分析した。コロニーを大きさで分類した（小＝２００〜４９９ピクセル、中＝５００〜１０００および大１０００以上）。
【００３３】
マウスおよび腫瘍細胞播種
雄の無菌ヌードマウスを４週齢で使用した。ＨＴ１０８０腫瘍細胞（５×１０6細胞／１００μｌ  ＰＢＳ）をヌードマウスの背面右脇腹に皮下注射した。マウスを腫瘍細胞播種部位に隣接した皮下注射（２０μｌ  ＰＢＳ、ＰＢＳ中の２０μＭ  ａ１−ＴＡＴまたは２０μＭ  Ｓｃｒ−ＴＡＴペプチド）で、実験期間中週に３回処置した。播種後４週間でマウスを犠牲死させた。腫瘍を取り出し、その大きさを定量し、免疫組織化学用にパラフィンブロック中に加工した。ＩＨＣを以前に記載されたように行なった（Grant D.S.ら、Int. J. Cancer 2003 104: 121-129）。
【００３４】
結果：
コラーゲンへのα１インテグリン−媒介細胞接着によって活性化されるシグナル伝達経路を特徴付けるために、本発明者らは、α１細胞質ドメイン（α１ｃｙｔ）と相互作用するタンパク質を同定するために酵母ツーハイブリッドシステムを使用した。陽性クローンの１つは、ＴＣＰＴＰの４５ｋＤａ型をコードしていた15。この分子は、遍在的に発現される核非受容体タンパク質チロシンホスファターゼであり、マイトジェンの刺激に応答して細胞質に移行することができる11。
【００３５】
ヒト細胞における新規な相互作用を実証するために、本発明者らは、まず内因性α１インテグリンとＴＣＰＴＰとが同じ場所に局在化する（colocalize）かどうかを調べた。ＰＣ３およびＨｅＬａ細胞を種々のマトリックスタンパク質上に置き、ａ１−インテグリンおよびＴＣＰＴＰを二色免疫蛍光染色により可視化した。インテグリンを活性化できないポリ−Ｌ−リジン上に置かれた細胞では、ＴＣＰＴＰは細胞質および核の両方で見られた。４つのコラーゲン結合インテグリン以外のインテグリンに結合するフィブロネクチン上に置かれた細胞では、ＴＣＰＴＰは細胞質ゾルに広く見られた（図１Ｂ）。対照的に、コラーゲンへの結合では、ＴＣＰＴＰは、細胞膜の末梢領域においてα１β１インテグリンと同じ場所に局在化した（図１Ａ、Ｂ）。これらのデータは、内因性インテグリンα１とＴＣＰＴＰとがコラーゲンへの細胞接着により特異的にヒト細胞において同局在化することを示す。
【００３６】
以前の研究では、ＴＣＰＴＰが分子的には特徴付けされていない機序によりマイトジェン刺激に応答して核から移行することが示されている11。コラーゲンへの細胞接着がα１−インテグリンとＴＣＰＴＰとの同局在化を誘導するので、本発明者らは、マトリックスへの結合またはマイトジェン刺激がその２つのタンパク質の物理的結合を導き得るかどうか調べた。免疫沈降実験において、内因性インテグリンα１β１は、コラーゲンへの接着または血清刺激を受けてＨｅＬａ細胞における内因性ＴＣＰＴＰと結合したが、一方ポリ−Ｌ−リジン上に置かれた、または血清不含条件に維持された細胞においては、相互作用は検出されなかった（図１Ｃ）。さらに、ＴＣＰＴＰは、これらの細胞において血清刺激によってさえフィブロネクチン結合インテグリンα５およびα６と結合できなかった（図１Ｃ）。逆免疫沈降実験において、ＴＣＰＴＰは容易にインテグリンα１β１に結合したが、コラーゲンへの接着または血清誘導によってのみ反復して特異的であった（図１Ｄ）。本発明者らは、内因性α１インテグリンおよびＴＣＰＴＰは、ヒト細胞においてコラーゲンまたはマイトジェン刺激に応答して物理的に結合するようになるという結論に達し、原形質膜へのＴＣＰＴＰ移行についての分子的説明を提供する。
【００３７】
ＨｅＬａ細胞は高いレベルでα１β１表面発現をし（２２５±２３  ＦＡＣＳ平均蛍光）、有意に低いレベルでα２β１インテグリンを発現し（５８．５±１０．４  ＦＡＣＳ平均蛍光）、そしてＲＴ−ＰＣＲにより、α１０またはα１１インテグリンは検出されなかった。Ｈｅｌａ細胞において発現されるＴＣＰＴＰとコラーゲン結合インテグリンとの間の相互作用の特異性を研究するために、本発明者らはプルダウン実験を行った。重要なことには、ＨｅＬａライセート由来のＧＳＴ−融合α１インテグリン細胞質テイル（ＧＳＴ−ｃｙｔα１）およびＧＳＴ−融合α２インテグリン細胞質テイル（ＧＳＴ−ｃｙｔα２）とのプルダウンでは、ＧＳＴ−ｃｙｔα１のみが内因性ＴＣＰＴＰと結合することがわかった（図１Ｅ）。さらに、その相互作用は、精製、組み換えＴＣＰＴＰがＧＳＴ−ｃｙｔα１とは結合するが、ＧＳＴ−ｃｙｔα２とは結合しないので直接的である（図１Ｆ）。プルダウン実験はさらに、すべてのインテグリンαサブユニットと共有する保存されたＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ配列（配列番号９）を欠いた可溶性合成ペプチドがＴＣＰＴＰとの結合においてα１ｃｙｔと競合することができるので、α１ｃｙｔとＴＣＰＴＰとの間の相互作用がα１ｃｙｔにおける非保存アミノ酸と関係しているということを示した（図１Ｆ）。これらのデータは、ＴＣＰＴＰおよびインテグリンの間の相互作用が直接的でありα１β１インテグリンに特異的であることを示す。
【００３８】
過剰発現試験は、ＴＣＰＴＰが、マイトジェン−およびサイトカイン−誘導シグナル伝達を調節するＥＧＥＲ11、インスリン受容体16およびヤーヌスキナーゼ（ＪＡＫｓ）17などのいくつかの原形質膜結合基質を有するということを示している。インビトロ研究は、ＴＣＰＴＰのタンパク質分解性切断フラグメントを使用し、ＴＣＰＴＰの触媒活性がＴＣＰＴＰの４５ｋＤａ型のカルボキシ末端セグメントに関する細胞内阻害によって調節されるということを提案している18。しかしながら、そのような調節機序が細胞内で機能するかどうか、およびそれがどのように作用するかは不明瞭なままである。α１ｃｙｔおよびＴＣＰＴＰのカルボキシ末端セグメントは共に同様の塩基性荷電を共有するので、本発明者らは、ＴＣＰＴＰのα１ｃｙｔとの結合は競合によりこの自動阻害を緩和し、ホスファターゼの活性化を導くという仮説を立てた。実際、コラーゲンへの細胞接着は、特に発現されたＴＣＰＴＰの触媒活性をポリ−Ｌ−リジンに接着した細胞と比較して２．４倍誘導した（図１Ｇ）。さらに、ａ１の細胞質テイルの配列を有する合成ペプチドによる処置に続いて、免疫沈降したＴＣＰＴＰの触媒活性は２．９５±０．４８倍に増加した（図２Ａ）。一方、対応するα２テイルペプチドは効果がなかった。活性化は特異的で、他のタンパク質チロシンホスファターゼ、ＳＨＰ−２はいずれのペプチドによっても活性化されなかった。組み換え、精製ＴＣＰＴＰは、非常に低量の合成α１テイルペプチドにより、高度に活性化された（図２Ｂ）。ＴＣＰＴＰのα１ｃｙｔ誘導活性化の分子的基礎をより詳しく調査するために、組み換え、精製ＧＳＴ−ＴＣＰＴＰ欠失変異体（図２Ｃ）を、全長ＴＣＰＴＰのα１細胞質ペプチド誘導活性化を妨げるその能力について調べた（図２Ｄ）。ＴＣＰＴＰのアミノ末端側半分を含む欠失変異体１が、その活性化を効果的に妨げた。対して、ほとんどのアミノ末端部分が含まれる場合でさえ、またはアミノ末端側半分が欠失されている場合、競合は観察されなかった。したがって、インテグリンα１細胞質テイルはＴＣＰＴＰのアミノ末端部分と結合し、それを活性化するか、あるいは提案された自動制御カルボキシ末端セグメント18がタンパク質のＮ−末端部分と相互作用するのを阻害する可能性がある。
【００３９】
インテグリンと成長因子の媒介シグナルは重なり合い、さらに相乗作用を与える2。マトリックスへの細胞接着は、特に受容体チロシンキナーゼを通した有効なシグナル伝達を可能にする許容性シグナルを伝達する。さらに、インテグリンはＥＧＦＲと結合し、そのリン酸化を誘導する。ＥＧＦＲはまた、ＴＣＰＴＰに対する基質でもあり、ホスファターゼの過剰発現がＥＧＦＲのリン酸化とシグナル伝達を抑制することが示されている19。インテグリンα１β１−媒介細胞接着が、インビボで実際にＴＣＰＴＰを活性化するならば、ＥＧＦＲが影響を受け得る。したがって、本発明者らはＥＧＦＲリン酸化に対するマトリックスへの細胞接着の効果を調べた。プラスチック上に単層に維持するかまたはコラーゲン上に１時間置いた、血清を枯渇させたＨｅＬａ細胞を、ＥＧＦで５分間処理し、ＥＧＦＲリン酸化について分析した。ＥＧＦは、プラスチック上に維持した細胞において試験したチロシン残基全てにおいて効率的にＥＧＦＲリン酸化を誘導した。対してコラーゲン上では、ＥＧＦ−誘導受容体リン酸化は強く阻害された（図３Ａ）。コラーゲンへの接着は、最も効果的にＥＧＦＲリン酸化の初期ＥＧＦ−誘導ピークを弱めた（図３Ｂ）。効果がインテグリン−コラーゲン相互作用により特異的であり、剥離とマトリックスへの再植え付けに関係する一般的な現象ではないということを確認するために、コラーゲンかフィブロネクチンのいずれかの上に置かれたＨｅＬａ細胞にＥＧＦ刺激を行った。ＥＧＦ−誘導受容体リン酸化はコラーゲン上よりもフィブロネクチン上の細胞において特により高く（図３Ｃ）、コラーゲン結合インテグリンがＥＧＦシグナル伝達の阻害に特に関係しているということを示唆している。
【００４０】
本発明者らは、ついでＥＧＦＲリン酸化のコラーゲン−誘導阻害がＴＣＰＴＰの活性化を通して媒介されているかどうかの試験を決定した。ＴＣＰＴＰに特異的な低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）は、ＨｅＬａ細胞においてＴＣＰＴＰの内因性発現を効率的に減少させたが、スクランブル対照ｓｉＲＮＡは減少させなかった（図３Ｄ）。それらはまた、コラーゲン上に置かれた細胞でＥＧＦ−誘導ＥＧＦＲリン酸化を有意に増加させた（図３Ｄ）。これらのノックダウン実験は、ＥＧＦＲシグナル伝達のコラーゲン誘導阻害におけるＴＣＰＴＰの役割を確認する。
【００４１】
ＨｅＬａ細胞は、α２β１インテグリンと同様にα１β１インテグリンによりコラーゲンに接着できる。インテグリン−ＴＣＰＴＰ−ＥＧＦＲシグナル伝達経路のインテグリン特異性を試験するために、本発明者らは３つのストラテジーを用いた。第１は、α１β１インテグリンを発現しないＨＴ１０８０線維肉腫細胞において、コラーゲンへの接着はＥＧＦＲリン酸化を阻害することはできなかった（図２Ｅ）。重要なことは、一時的にα１インテグリンを発現するようにトランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞は、ＥＧＦＲリン酸化のコラーゲン誘導阻害に感受性となった（図２Ｆ）。第２は、接着、血清枯渇ＨｅＬａ細胞において、モノクローナル抗体とインテグリンα１−サブユニットのクラスタリングは、細胞質ＰＴＰ活性を１．５倍増加させ、ＥＧＦＲのＥＧＦ−誘導リン酸化を阻止した（図２Ｇ）。最終的に、本発明者らは、α１インテグリンヌルマウスおよびその野生型同腹子由来のマウス胚線維芽細胞を用いてその特異性を調べた7。野生型とα１−／−細胞は両方コラーゲンに接着した9（図３Ｅ）。しかしながら、α１β１インテグリンの非存在下では、ＴＣＰＴＰは接着部位に見出されず、一方、野生型細胞ではインテグリンα１β１とＴＣＰＴＰが細胞の周囲の接着部位に同局在化した（図３Ｅ）。α１−／−細胞は、コラーゲンまたはフィブロネクチン上に置かれた場合、同等のＥＧＦ−誘導ＥＧＦＲリン酸化を示し、一方、野生型細胞では、コラーゲンへの接着がＥＧＦ−誘導シグナル伝達を阻害する結果となった（図３Ｆ）。まとめると、これらの実験はα１−インテグリンがＴＣＰＴＰを特異的に活性化し、この相互作用がＥＧＦＲのリン酸化の阻害をもたらすということを確認する。
【００４２】
ＴＣＰＴＰの変異体または野生型を用いる過剰発現研究は、細胞増殖の調節におけるその役割を証明した20〜23。さらに、ＴＣＰＴＰは、変異体ＥＧＦＲを発現するグリア芽腫細胞の増殖および足場非依存性成長を抑制することが示されている23。しかしながら、これまでのところ、ＴＣＰＴＰ活性の調節、したがって、その阻害機能のインビボでの実行の機序は知られていない。本発明者らは、インテグリンα１細胞質テイルがインビトロでＴＣＰＴＰを活性化する能力があることを本明細書に示した。それが細胞においてもホスファターゼ活性を誘導するかどうかを試験するために、本発明者らは、非蛍光ジホスホフルオレセイン（ＦＤＰ）を、α１またはα２細胞質テイルペプチドと一緒にＨｅＬａ細胞中に微量注入した。ＦＤＰは脱リン酸化の際に蛍光を発するようになるので、本発明者らは、生ＨｅＬａ細胞においてホスファターゼ活性を調べた。これらの定量アッセイは、α２またはＰＢＳを同時注入した細胞と比較した場合、インテグリンα１細胞質ペプチドがＨｅＬａ細胞においてホスファターゼ活性を誘導したことをはっきりと示した（図４Ａ）。
【００４３】
ホスファターゼ活性の誘導は、ＴＣＰＴＰの過剰発現と同様の様式で細胞の腫瘍形成性に影響を与え得る23。最近、ＨＩＶ転写トランスアクチベーター（ＴＡＴ）タンパク質のタンパク質形質導入ドメインが、生細胞中にペプチドおよびタンパク質を輸送するために使用されている24、25。したがって、本発明者らは、増殖および腫瘍形成アッセイ用に細胞にα１−ｃｙｔペプチドを送達するために、ＴＡＴ−タンパク質に融合した細胞透過性ＦＩＴＣ−共役ペプチドを使用した。α１ｃｙｔ−ＴＡＴペプチドおよびスクランブル対照ペプチドは両方細胞に効率的に入り（図４Ｂ）、蛍光は２４時間以上持続し、細胞の剥離は観察されなかった（示さず）。懸濁液中、５％血清で増殖するＨｅＬａ細胞では、２００ｎＭ  α１−ＴＡＴペプチドが血清誘導細胞増殖を阻害した（図４Ｂ）。これに対して、対照ペプチドでは増殖は有意に変化しなかった。さらに、α１−ＴＡＴペプチドはＥＧＦ誘導細胞増殖の阻害に有用であるが、懸濁液中の血清不含条件に維持されているＨｅＬａ細胞の基礎増殖および生存には効果はなかった（図４Ｄ）。腫瘍形成性Ｂ１０４−１−１細胞（ｎｅｕ−腫瘍遺伝子で形質転換された３Ｔ３線維芽細胞）の血清誘導増殖もα１−ＴＡＴペプチドによって阻害された（図４Ｃ）。興味深いことに、接着ＨｅＬａ細胞の増殖は影響されなかったので、α１−ＴＡＴペプチドは、足場非依存性、ＥＧＦ−促進（driven）増殖の調節にのみ有効であった（図３Ｇ）。さらに、９日間軟寒天で培養されたＨｅＬａ細胞による大きな腫瘍コロニーの形成は、α１−ＴＡＴペプチドによって有意に阻害されたが、対照ペプチドはコロニーサイズを有意に減少させることはできなかった（図４Ｄ）。最終的に、インビボでのマウスにおける皮下腫瘍としてのヒト線維肉腫細胞の増殖は、α１−ＴＡＴペプチドによる処置により阻害された（図５Ａ）。興味深いことに、詳細な免疫組織化学的研究により、α１−ＴＡＴペプチドで処置した腫瘍は、Ｓｃｒ−ＴＡＴのＰＢＳ注射のいずれかで処置した対照腫瘍よりもより壊死を示すということが明らかとなった（図５Ｂ）。これらの実験により、インビボでα１細胞質テイルペプチドによるホスファターゼ活性の誘導が、腫瘍形成性細胞におけるＴＣＰＴＰの過剰発現により達成される効果と同一の効果をもたらすということが証明される20、23。さらに、ペプチドは生細胞に導入することができ、効率的に悪性細胞の足場非依存性、ＥＧＦ誘導増殖を阻止し、インビボでの正常細胞増殖の維持におけるα１−送達負シグナルの可能な役割を示唆する。
【００４４】
インテグリンのα−細胞質ドメインは、インテグリン媒介生物応答の調節に不可欠であるが26、これまでのところ、ほんの少しの相互作用タンパク質が同定されているのみである。インテグリンは受容体チロシンキナーゼシグナル伝達を正に調節すること、さらにリガンドの非存在下でＲＴＫ活性化を誘発することが知られている3、27。また、遍在して発現されるインテグリンα１は、コラーゲンに応答して一次細胞でＥＲＫ  ＭＡＰ−キナーゼ経路を活性化することが示されている9。他方では、インテグリンα１は、乳癌、卵巣癌および肺腺癌においてダウンレギュレートされると思われる3、27、28。ＴＣＰＴＰのインテグリンα１β１媒介活性化によるＥＧＦＲシグナル伝達の負の調節は、細胞応答の接着媒介制御における新規な機序であると思われる。これらの知見は、細胞におけるこの腫瘍抑制タンパク質のホスファターゼ活性の制御に対する分子的説明を提供し、なぜＴＣＰＴＰ（他のＰＴＰｓのように）が単離タンパク質としては不規則であるのに、細胞においては高度に特異的であるのかという１つの機序を証明する29。インテグリンα１によるＴＣＰＴＰの局所調節はそのうえ、タンパク質リン酸化−脱リン酸化平衡の正確な局在化制御が不可欠である他のシグナル伝達経路にとっても重要なようである。たとえば、（インテグリンと結合する27）ＥＧＦＲと極めて接近した原形質膜でのインテグリンα１細胞質ドメインとの相互作用によるＴＣＰＴＰの局在的活性化は、厳重に調節された方法で、ＲＴＫシグナル伝達を制御するための細胞にとっての強力な方法である。α１細胞質ペプチドの生細胞への送達による、細胞の、接着ではなく足場非依存性増殖の阻害は、形質転換細胞を標的化する新しい手段を提供し得る。結論として、腫瘍抑制タンパク質のインテグリンα１β１媒介活性化によるＥＧＦＲのシグナル伝達の負の調節は、細胞応答の接着媒介制御における新規なパラダイムである。
【００４５】
本発明の方法は、さまざまな実施態様の形態で組み込まれ得、そのうちのほんのいくつかを本明細書に開示していることは認識されよう。当業者には、他の実施態様が存在し、それは本発明の精神から逸脱しないことが自明である。したがって、記載した実施形態は例示であり、制限的なものと解釈されるべきでない。
【００４６】
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【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】ＴＣＰＴＰがインテグリンα１鎖の細胞質ドメインと結合するということを示す。ＰＣ３細胞を、１時間コラーゲン、フィブロネクチンまたはポリ−Ｌ−リジンに接着した。インテグリンα１サブユニットおよびＴＣＰＴＰが二色免疫蛍光染色により検出された。矢印は、膜での同局在化の各領域をそれぞれ指し示す。緑と赤のピクセル強度（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１２）を、共焦点顕微鏡ソフトウエアを用いて細胞の縁から開始して評価した、バー５μｍ。
【図１Ｂ】ＴＣＰＴＰがインテグリンα１鎖の細胞質ドメインと結合するということを示す。ＨｅＬａ細胞を、１時間コラーゲン、フィブロネクチンまたはポリ−Ｌ−リジンに接着した。インテグリンα１サブユニットおよびＴＣＰＴＰが二色免疫蛍光染色により検出された。矢印は、膜での同局在化の各領域をそれぞれ指し示す。緑と赤のピクセル強度（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１２）を、共焦点顕微鏡ソフトウエアを用いて細胞の縁から開始して評価した、バー５μｍ。
【図１Ｃ】ＴＣＰＴＰがインテグリンα１鎖の細胞質ドメインと結合するということを示す。血清枯渇ＨｅＬａ細胞を表面ビオチン化し、プラスチック上に置き、１０％ＦＢＳで３０分間刺激する（ＦＢＳ）か、コラーゲンＩ（ＣＩ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上に１時間置いた。免疫沈降（ｉｐ）されたインテグリン、ＴＣＰＴＰおよび対照（ＩｇＧ）を免疫ブロッディングで検出した。
【図１Ｄ】ＴＣＰＴＰがインテグリンα１鎖の細胞質ドメインと結合するということを示す。ＨｅＬａ細胞を図１Ｃと同様に処理し、ライセートを免疫沈降し（ｉｐ）、ＴＣＰＴＰに対しブロットするか、または変性させ、抗−α１抗体で再沈降（ｒｅ−ｉｐ）させ、示したように免疫ブロットした。
【図１Ｅ】ＴＣＰＴＰがインテグリンα１鎖の細胞質ドメインと結合するということを示す。ＨｅＬａ細胞ライセートを固定化グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはＧＳＴ−インテグリン細胞質ドメイン融合タンパク質と共にインキュベートした。結合したタンパク質およびライセート試料をＴＣＰＴＰについてプローブした。ポンソーＳ染色をローディング対照に使用した。
【図１Ｆ】ＴＣＰＴＰがインテグリンα１鎖の細胞質ドメインと結合するということを示す。ポンソーＳ染色をローディング対照に使用した。組み換えおよび精製ＴＣＰＴＰ（１μｇ）をＧＳＴまたはＧＳＴ−融合タンパク質と、α１インテグリン細胞質ドメインペプチド（１μｇ／ｍｌ）と共にまたはなしでインキュベートした。結合したタンパク質（およびＴＣＰＴＰローディング対照、全体）をＴＣＰＴＰおよびＧＳＴについてプローブした。
【図１Ｇ】血清枯渇ＨｅＬａ細胞を剥離し、コラーゲンまたはポリ−Ｌ−リジン上に置き、免疫沈降（ｉｐ）にかけ、そしてホスファターゼ活性（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を測定した。試料の半分をＴＣＰＴＰについてイムノブロットした。
【図１Ｈ】血清枯渇ＨｅＬａ細胞をＰＢＳ、対照ＩｇＧ、または抗−α１  ｍＡｂとインキュベートし、抗−マウス二次抗体により３０分間クラスタリングを誘導した。ライセート由来の等量のタンパク質のホスファターゼ活性（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を三重で分析した。
【図２Ａ】インテグリンα１細胞質テイルがＴＣＰＴＰを活性化することを示す。ＨｅＬａ細胞を、対照（ＩｇＧ）、抗−ＴＣＰＴＰおよび抗−ＳＨＰ−２抗体と共に免疫沈降（ｉｐ）した。ビヒクル（ｃ）および合成α１細胞質テイルペプチド（α１ｐｅｐ）および合成α２細胞質テイルペプチド（α２ｐｅｐ）での処置後、ホスファターゼ活性（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を、ｄｉＦＭＵＰを基質として用いて分析した。免疫沈殿物の半分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ＴＣＰＴＰまたはＳＨＰ−２について標識した。
【図２Ｂ】インテグリンα１細胞質テイルがＴＣＰＴＰを活性化することを示す。組み換え、精製ＴＣＰＴＰ（０．１５μｇ／ｍｌ）を、異なる濃度のペプチドとインキュベートし、ホスファターゼ活性（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を分析した。
【図２Ｃ】インテグリンα１細胞質テイルがＴＣＰＴＰを活性化することを示す。ＴＣＰＴＰ欠失変異体の概略的ダイアグラムを示す。
【図２Ｄ】インテグリンα１細胞質テイルがＴＣＰＴＰを活性化することを示す。競合アッセイでは、全長ＴＣＰＴＰを添加する前に、ＧＳＴと融合したＴＣＰＴＰ欠失変異体、またはＧＳＴのみを示したペプチドと共にインキュベートし、ホスファターゼ活性（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を測定した。
【図２Ｅ】インテグリンα１β１がＥＧＦＲシグナル伝達のコラーゲン誘導減衰に必要とされるということを示す。ＦＡＣＳによってインテグリンの表面発現をＨｅＬａ細胞およびＨＴ１０８０細胞で分析した。ＭＦＩ値を示す。血清枯渇ＨｅＬａ細胞およびＨＴ１０８０細胞をコラーゲンＩ（ＣＩ）またはフィブロネクチン（ＦＮ）上に置き、ＥＧＦで処置した。ＥＧＦＲリン酸化をホスホ特異的抗体を用いて調べた。チューブリンをローディング対照として使用した。
【図２Ｆ】インテグリンα１β１はＥＧＦＲシグナル伝達のコラーゲン誘導減衰に必要とされるということを示す。α１−ｃＤＮＡで一時的にトランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞またはモック−トランスフェクトＨＴ１０８０細胞から血清を枯渇させ、コラーゲンＩ（ＣＩ）上に置き、ＥＧＦで処理した。ＥＧＦＲリン酸化は図２Ｅと同様にして分析した。
【図２Ｇ】インテグリンα１β１はＥＧＦＲシグナル伝達のコラーゲン誘導減衰に必要とされるということを示す。血清枯渇ＨｅＬａ細胞を図１Ｈと同様に処理してα１受容体と交差させ、ＥＧＦＲリン酸化をイムノブロッディングにより調べた。
【図３Ａ】インテグリンα１β１のライゲーションが、ＴＣＰＴＰの活性化を通してＥＧＦＲリン酸化を減衰させることを示す。プラスチック上に維持された、またはコラーゲン（ＣＩ）もしくはフィブロネクチン上に置かれた血清枯渇ＨｅＬａ細胞を、ＥＧＦで処理し、ＥＧＦＲリン酸化をホスホ−特異的抗体を用いて調べた。チューブリンをローディング対照として使用した。
【図３Ｂ】インテグリンα１β１のライゲーションが、ＴＣＰＴＰの活性化を通してＥＧＦＲリン酸化を減衰させることを示す。プラスチック上に維持されたまたはコラーゲン（ＣＩ）もしくはフィブロネクチン上に置かれた血清枯渇ＨｅＬａ細胞を、ＥＧＦで処理し、ＥＧＦＲリン酸化をホスホ−特異的抗体を用いて調べた。ＥＧＦＲをローディング対照として使用した。
【図３Ｃ】インテグリンα１β１のライゲーションが、ＴＣＰＴＰの活性化を通してＥＧＦＲリン酸化を減衰させることを示す。プラスチック上に維持されたまたはコラーゲン（ＣＩ）もしくはフィブロネクチン上に置かれた血清枯渇ＨｅＬａ細胞を、ＥＧＦで処理し、ＥＧＦＲリン酸化をホスホ−特異的抗体を用いて調べた。３つ（Ａ、Ｃ）の実験のデンシトメトリーによる分析（平均±ＳＤ）が示される。チューブリンをローディング対照として使用した。
【図３Ｄ】インテグリンα１β１のライゲーションが、ＴＣＰＴＰの活性化を通してＥＧＦＲリン酸化を減衰させることを示す。ＴＣＰＴＰに対して特異的な２つのｓｉＲＮＡｓ（またはスクランブル対照）でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、コラーゲン上に置き、ＥＧＦで処理した。抽出物を示したタンパク質についてイムノブロットした。同様の結果を有する３つの実験の代表を示す。
【図３Ｅ】インテグリンα１β１のライゲーションが、ＴＣＰＴＰの活性化を通してＥＧＦＲリン酸化を減衰させることを示す。α１−／−マウスまたはその野生型同腹子由来の線維芽細胞をコラーゲン上に置き、インテグリンα１およびＴＣＰＴＰに対して免疫染色した。緑と赤のピクセル強度（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１２）を、共焦点顕微鏡ソフトウエアを用いて細胞の縁から開始して分析した；バー５μｍ。
【図３Ｆ】インテグリンα１β１のライゲーションが、ＴＣＰＴＰの活性化を通してＥＧＦＲリン酸化を軽減することを示す。α１−／−および＋／＋動物由来の血清枯渇線維芽細胞をコラーゲンまたはフィブロネクチン上に置き、ＥＧＦで処理し、イムノブロットした。値はチューブリンに標準化したデンシトメトリーによる評価法である。
【図３Ｇ】インテグリンα１細胞質ペプチドがマトリックス接着細胞のＥＧＦ非依存性増殖に影響を及ぼさないことを示す。ＨｅＬａ細胞をコラーゲンまたはフィブロネクチンでコートしたウェル中、５％血清で、２００ｎＭ  ＴＡＴペプチドおよび５０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦの存在下、または非存在下で培養し、種々の時点での生細胞の数（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を分析した。
【図４Ａ】α１細胞質テイルペプチドがインビボでホスファターゼ活性を誘導し、足場非依存性およびＥＧＦ−誘導細胞増殖を阻害するということを示す。ＨｅＬａ細胞を、脱リン酸化の際に蛍光を発するようになるフルオレセインジホスフェート（ＦＤＰ）と細胞質インテグリンペプチドと共に微量注入した（アスタリスク）。蛍光強度を３０分間モニターし（３０分での代表的な画像を示す。）、個々の細胞における平均強度（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１２）を評価した。
【図４Ｂ】α１細胞質テイルペプチドがインビボでホスファターゼ活性を誘導し、足場非依存性およびＥＧＦ−誘導細胞増殖を阻害するということを示す。ＦＩＴＣ標識ＴＡＴ−α１細胞質テイル融合ペプチド（α１−ＴＡＴ）およびＴＡＴ−スクランブル対照融合ペプチド（Ｓｃｒ−ＴＡＴ）をＨｅＬａ細胞に入れたことを示す。５％血清、２００ｎＭ  ＴＡＴ−ペプチドおよび５０ｎｇ／ｍｌＥＧＦの存在下または非存在下での非接着生ＨｅＬａ細胞の数に対するそれらの効果を測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図４Ｃ】α１細胞質テイルペプチドがインビボでホスファターゼ活性を誘導し、足場非依存性およびＥＧＦ−誘導細胞増殖を阻害するということを示す。血清不含培地で、２００ｎＭ  ＴＡＴ−ペプチドおよび５０ｎｇ／ｍｌＥＧＦの存在下または非存在下での非接着生ＨｅＬａ細胞の数に対するそれらの効果を測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図４Ｄ】α１細胞質テイルペプチドがインビボでホスファターゼ活性を誘導し、足場非依存性およびＥＧＦ−誘導細胞増殖を阻害するということを示す。血清含有培地で、２００ｎＭ  ＴＡＴ−ペプチドおよび５０ｎｇ／ｍｌＥＧＦの存在下または非存在下での腫瘍形成性Ｂ１０４−１−１線維芽細胞の数に対するそれらの効果を測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図４Ｅ】α１細胞質テイルペプチドがインビボでホスファターゼ活性を誘導し、足場非依存性およびＥＧＦ−誘導細胞増殖を阻害するということを示す。ＨｅＬａ細胞を寒天培地中でＴＡＴ−ペプチドと共に、またはなしで９日間増殖させた。代表的な位相差画像を二重盲式で撮影し、コロニーの大きさの分析を示す。
【図５Ａ】α１細胞質テイルペプチドが腫瘍増殖を減少させ、インビボで壊死を誘導することを示す。ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞をヌードマウスの側面に注射し、実験項に示したように処理した。皮下腫瘍は４週間後に取り出した。腫瘍の大きさ（領域）を測り、示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１２）。
【図５Ｂ】α１細胞質テイルペプチドが腫瘍増殖を減少させ、インビボで壊死を誘導することを示す。ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞をヌードマウスの側面に注射し、実験項に示したように処理した。皮下腫瘍は４週間後に取り出した。全腫瘍切断面をマッソン（Masson）トリクロム染色で染色し、全腫瘍領域に対する壊死領域を二重盲式で記録した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１２）。壊死領域の分析を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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