【事件の表示】
　特許第２７６９３０５号「トリコダーマにおいてタンパク質生成物を産生するための方法」の請求項１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７６９３０５号の請求項１に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第２７６９３０５号に係る出願は、昭和６２年４月３０日に出願した特願昭６２−１０４８３８号の一部を平成７年１０月１１日に新たな特許出願としたものであって、平成１０年４月１０日にその特許の設定登録がなされ、その後、異議申立人内野光平により特許異議の申立てがなされ、取消理由が通知され、平成１３年３月８日に訂正請求がなされたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
ア．訂正の内容
　平成９年８月１８日付け手続補正書により補正された明細書の特許請求の範囲の請求項１に記載の「（ｃ）安定したトリコダーマ形質転換体を選択することができる選択マーカー、」を「（ｃ）安定したトリコダーマ形質転換体を選択することができる、ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ
　ｃｒａｓｓａ）ｐｙｒ４遺伝子に由来する選択マーカーを除く選択マーカー、」と訂正する。
　
イ．訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び拡張・変更の存否
　上記訂正は、本件請求項１に係る発明において使用することができる選択マーカーから、特定の「ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）ｐｙｒ４遺伝子に由来する選択マーカー」を除くものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　そして、選択マーカーに関連する記載として、願書に添付した明細書の発明の詳細な説明には「異なった選択マーカー、たとえばａｒｇＢ（Ａ．ニジュランス又はＴ．リーセイ）、ａｍｄＳ（Ａ．ニジュランス）及びｐｙｒ４（ネウロスポラ　クラサ又はＴ．リーセイ）が使用され得る。」（段落００２６）と記載され、選択マーカーとしてＮ．クラサのｐｙｒ４遺伝子を用いることが実験例１に、Ａ．ニジュランスのａｍｄＳ遺伝子を用いることが実験例３に、Ａ．ニジュランスのａｒｇＢ遺伝子を用いることが実験例４にそれぞれ記載されている。
　これらの記載からみて、Ｎ．クラサのｐｙｒ４遺伝子だけでなく、それ以外のＴ．リーセイのｐｙｒ４遺伝子、Ａ．ニジュランスのａｒｇＢ遺伝子、Ｔ．リーセイのａｒｇＢ遺伝子、及びＡ．ニジュランスのａｍｄＳ遺伝子を選択マーカーとして使用することは、願書に添付した明細書に記載した事項であるといえる。
　してみると、上記訂正は、選択マーカーとして使用できる遺伝子の一部、即ちＮ．クラサのｐｙｒ４遺伝子を削除したに過ぎず、削除した訂正後の事項は、願書に添付した明細書に記載された事項であるので、上記訂正は新規事項の追加にならない。
　また、上記訂正は、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　
ウ．独立特許要件
　後記の「３．特許異議申立てについて」の「ウ．判断」の項に示すとおり、訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１に記載の発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　
エ．むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正は特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する同法第１２６条第２ー４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議申立てについて
ア．本件特許発明
　上記２．で述べたように上記訂正が認められるから、本件特許発明の要旨は、訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１に記載された次のとおりのものである。
「【請求項１】トリコダーマにおけるタンパク質産物の製法であって、以下の段階：
（１）（ａ）所望のタンパク質産物をコードする遺伝子、
（ｂ）上記所望の産物の発現を制御するために作用可能な状態で連結されたプロモーター／エンハンサーを含むＤＮＡ配列を含む遺伝子発現を促進する機能、及び
（ｃ）安定したトリコダーマ形質転換体を選択することができる、ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）ｐｙｒ４遺伝子に由来する選択マーカーを除く選択マーカー、
を含むベクター系により好適なトリコダーマ菌株を形質転換させ、
（２）全窒素源としてニトレートを含まない培地上で上記段階（１）の選択マーカーにより安定して形質転換されたトリコダーマを選択して、トリコダーマの安定した形質転換体を調製し、
（３）好適な培養基中で上記トリコダーマの安定した形質転換体を培養し、そして
（４）上記培養基又はその菌糸体からその発現された所望のタンパク質産物を回収する、
を含む製法。」
　
イ．異議申立ての理由の概要
  異議申立人　内野光平は、下記に示す甲第１ないし３号証を提出して、
「本件明細書において、ｐｙｒ４遺伝子は選択マーカーとして利用が可能なものとして記載されている。しかし、甲第１及び２号証には、ｐｙｒ４遺伝子を用いて得られた形質転換体がその形質を安定に保持し得ないものであることが開示されている。従って、本件特許発明が意図するタンパク質を生産するために、ｐｙｒ４遺伝子は選択マーカーとして利用することができない。ｐｙｒ４についてその発明の実施ができない以上、当業者が容易に実施できるようにその目的、構成、および効果が明細書に記載されていない。また、請求項１に記載の「選択マーカー」にはｐｙｒ４遺伝子が含まれない以上、請求項１は本件特許発明の構成に欠くことができない事項以外を記載している。よって、本件の明細書は特許法第３６条第３項又は第４項に規定する要件を満足しないものであるから、本件特許は取り消されるべきである。」旨主張している。
　　　　　　　　　　　　　　　　記
　甲第１号証　Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ（１９９０）１８：７１−７６
　甲第２号証　Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ（１９９１）１９：３５９−３６５
　甲第３号証　特許第２７０２９２４号公報
　
ウ．判断
　異議申立人が指摘するとおり、甲第１及び２号証には、選択マーカーとしてネウロスポラ・クラサのｐｙｒ４遺伝子を用いて得られた形質転換体は、その形質を安定に保持し得ないことが記載されているが、平成１３年３月８日付け訂正請求により、本件特許発明において使用可能な選択マーカーから
ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）ｐｙｒ４遺伝子に由来する選択マーカーが除かれた結果、異議申立人が主張する記載不備は解消した。
　してみると、甲第３号証（本件特許の原出願について付与された特許第２７０２９２４号公報）を参考にするも、異議申立人の上記主張を採用することはできない。
　
エ．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立ての理由及び提出した証拠方法によっては、本件請求項１に係る特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年４月２６日（２００１．４．２６）
【訂正の要旨】
　＜訂正の要旨＞
　平成９年８月１８日付け手続補正書により補正された明細書の特許請求の範囲の請求項１に記載の「（ｃ）安定したトリコダーマ形質転換体を選択することができる選択マーカー、」を「（ｃ）安定したトリコダーマ形質転換体を選択することができる、ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）ｐｙｒ４遺伝子に由来する選択マーカーを除く選択マーカー、」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
トリコダーマにおいてタンパク質生成物を産生するための方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　トリコダーマにおけるタンパク質産物の製法であって、以下の段階：
（１）（ａ）所望のタンパク質産物をコードする遺伝子、
　（ｂ）上記所望の産物の発現を制御するために作用可能な状態で連結されたプロモーター／エンハンサーを含むＤＮＡ配列を含む遺伝子発現を促進する機能、及び
　（ｃ）安定したトリコダーマ形質転換体を選択することができる
、ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）ｐｙｒ４遺伝子に由来する選択マーカーを除く
を含むベクター系により好適なトリコダーマ菌株を形質転換させ、
（２）全窒素源としてニトレートを含まない培地上で上記段階（１）の選択マーカーにより安定して形質転換されたトリコダーマを選択して、トリコダーマの安定した形質転換体を調製し、
（３）好適な培養基中で上記トリコダーマの安定した形質転換体を培養し、そして
（４）上記培養基又はその菌糸体からその発現された所望のタンパク質産物を回収する、
を含む製法。
　【請求項２】　前記タンパク質産物が、分泌されたタンパク質産物である、請求項１に記載の製法。
　【請求項３】　前記タンパク質産物がトリコダーマと同種である、請求項１に記載の製法。
　【請求項４】　前記タンパク質産物がトリコダーマと異種である、請求項１に記載の製法。
　【請求項５】　前記タンパク質産物がプロキモシンである、請求項１に記載の製法。
　【請求項６】　前記タンパク質産物がＴ．リーセイのエンドグルカナーゼＩ（ＥＧ．Ｉ）である、請求項１に記載の製法。
　【請求項７】　前記菌株が原栄養性Ｔ．リーセイ株である、請求項１に記載の製法。
　【請求項８】　前記菌株が栄養要求性Ｔ．リーセイ株である、請求項１に記載の製法。
　【請求項９】　前記菌株が不所望の産物をコードする遺伝子のいずれをも欠失している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製法。
　【請求項１０】　前記菌株がｃｂｈｌ遺伝子を欠失している、請求項９に記載の製法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明は、トリコダーマの形質転換に使用するためのベクターシステム、トリコダーマにおけるタンパク質の高レベルでの発現及び分泌のための方法、ＤＮＡ組換え体ベクター及び形質転換されたトリコダーマ菌株に関する。
　【０００２】
　【発明の背景】
　繊維状菌類は、種々の発酵生成物を製造するために生物工学に広く使用される下等真核生物である。菌類は多くの工業的に重要な酵素、たとえばグルコアミラーゼ、プロテアーゼ、ラクターゼ、ペクチナーゼ及びグルコセオキシダーゼを分泌する。
　【０００３】
　繊維状菌類は多くの生物工学的利点を有する。それらは一般的に高い量のタンパク質を産生し、大規模での培養は複雑でなく、そして発酵の後、培養液体からの菌糸体の分離が容易である。
　【０００４】
　中温性不完全菌類トリコダーマ　リーセイ〔以前はＴ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）〕（参照１）は、セルロースバイオマスの転換に必要とされる酵素を産生し、そしてたぶん最も広く研究されたセルラーゼ産生生物である。
　【０００５】
　セルロースのグリコースヘの加水分解のためには、３種のタイプの酵素活性が必要とされる；通常、置換された可溶性基質を攻撃し、そして結晶性セルロースに親和性を示さない、ランダム切断性エンドグルカナーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ、ＥＣ．３，２，１，４）；結晶性セルロースを分解することができるが、しかし誘導体化されたセルロースに対する活性を持たないセルロビオヒドロラーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカン　セルロビオヒドロラーゼ、ＥＣ．３，２，１，９１）及びグルコースを得るためにセロビオース及びセロ−オリゴ糖を攻撃するβ−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシド　グルコヒドロラーゼ、ＥＣ．３，２，１，２１）。いくらかのこれらの酵素間の相乗作用が示された（参照２〜４）。
　【０００６】
　菌類のセルラーゼが精製され、そして特徴づけられ、そしてすべての３種の主要タイプの酵素は、多種の形で存在することが示された（参照５）。２つの免疫学的に異なるセルロビオヒドロラーゼ、すなわちＣＢＨＩ及びＣＢＨＩＩは、Ｔ．リーセイの培養培地から検出された（参照４，６）。５〜８の電気泳動的に異なるエンドグルカナーゼが報告され、それらの多くは、基質特異性を変えることを示した（参照７，８，９，１０）。２つの細胞外β−グルコシダーゼの特徴化が報告された（参照１１）。
　【０００７】
　突然変異及びスクリーニングの直接的アプローチを用いて開発された多くの菌株は、いくつかの高収率のＴ．リーセイ突然変異株を好結果をもたらして産生した（参照１１〜２２）。最良のＴ．リーセイ突然変異体によって産生された細胞外タンパク質の量は、培養流体１ｌ当り２０〜３０ｇであり、これは合計細胞タンパク質の５０％以上である。分泌されたタンパク質の主要部分は、セルラーゼを含み、そしてその間には、ＣＢＨＩ成分が最も豊富であり、そして分泌されたセルラーゼタンパク質の６０％まで示す。
　【０００８】
　ＣＢＨＩのための遺伝子は、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒなど（参照２３）及びＴｅｅｒｉなど（参照２４）によってクローンされ、そして該遺伝子の完全なヌクレオチド配列は公表されている（参照２３）。Ｔ．リーセイからまた、主なエンドグルカナーゼＥＧＩのための遺伝子がクローンされ、そして特徴づけられた（参照２５，２６，２７）。他の単離されたセルラーゼ遺伝子はｃｂｈ２（参照２８，２９）及びｅｇｌ３（参照３０）である。
　【０００９】
　産業的に重要な繊維状菌類の分子生物学は、一般的に良く知られていない。これは一部、有性生殖サイクル及び／又は遺伝的な形質転換システムの不十分な認識による。最近、形質転換システムが、ネウロスポク　クラサ（参照３１）、Ａ．ニジュランス（参照３２，３３，３４）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）参照３５）のために開発され、そしてそれらは、ベクター分子によって担持されるそれぞれの機能性遺伝子により突然変異宿主の相補性においてそれらの主成分を一般的に有する。しかしながら、これらの菌類の中でＡ．ニガーのみが当座は、産業的興味の対象である。
　【００１０】
　菌類の分類において、属アスペルジラスは、綱アスコマイセティス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、サブクラス　ユーアスコマイセティス（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に含まれる。ユーアスコマイセティスは、子実体に基づいて３つの群、すなわちプレクトマイセティス（Ｐｌｅｃｔｏｍｙｃｅｔｏｓ）、ピレノマイセテイス（Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）及びジスコマイセティス（Ｄｉｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に分けられる。最も重要な属は、アスペルジラス及びペニシリアム（参照５６）である。代わりに、トリコダーマが不完全菌類のメンバーとして分類される。不完全菌類は、有性生殖又は有性生殖属との明確な類似性を持たない菌類、たとえばひじょうに特徴的なアスペルジラスのキャッチ−オール　カテゴリーである。トリコダーマは、完全なアスコマイセティス種ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）（参照５７）の不完全状態である不十分に定義された生殖段階を有することを報告されたけれども、属アスペルジラス及びトリコダーマは明らかに、分類学上ひじょうに異なると思われる。アスペルジラス　ニジュランスからのａｒｇｂ遺伝子及びネウロスポラ　クラサからのｐｙｒ４遺伝子は、非ストリンジェント条件下でそれぞれのトリコダーマの遺伝子にハイブリダイズせず、従ってトリコダーマは他のアスコマイセテス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）と進化論的にまったく異なるという考えを推定できることもまた示された（Ｖａｎａｎｅｎ，Ｓ．，調製において）。
　【００１１】
　増殖培地中にタンパク質を分泌する、その例外的能力によって、トリコダーマ　リーセイは、タンパク質の産生のための可能な宿主として良好な候補者であると思われる。しかしながら、これまでは、Ｔ．リーセイの遺伝研究は、該菌類のセルラーゼ産生特性を改良することにほとんど向けられ、そしてハイパ−セルロチック（Ｈｙｐｅｒｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃ）トリコダーマ菌株の開発のために使用される技術は、単に従来の突然変異生成及びスクリーニングであった。トリコダーマのための形質転換システムは、今まで開発されていない。
　【００１２】
　トリコダーマ　リーセイのための有効な宿主−ベクターシステムを提供し、トリコダーマ中に異質のタンパク質の高い発現及び分泌レベルを得、又は同質のタンパク質の産生を高めることが本発明の主な目的である。
　【００１３】
　本発明の明細書において、表現“トリコダーマに異質のタンパク質”とは、トリコダーマによって天然に産生されないタンパク質を意味し、ところが“トリコダーマに同質のタンパク質”とは、トリコダーマ自体によって産生されるタンパク質を意味する。
　【００１４】
　初めに開発された菌類の形質転換システムにおいて、すなわちアスペルジラス及びネウロスポラにおいては、形質転換がプロトプラストを用いて行なわれる。形質転換性ＤＮＡが通常、宿主のゲノム中に組込まれる。安定した形質転換体を同定するための選択システムを得るためには、ベクターシステムが、宿主ゲノムの対応する突然変異を補足するか、又は特定の増殖培地上での原栄養株の増殖のために必要な活性、通常酵素を供給する機能的な遺伝子（選択マーカー）を担持すべきかである。
　【００１５】
　【発明の要約】
　本発明は、トリコダーマの形質転換のための組換え体ＤＮＡクローニングベクターシステムを記載する。このＤＮＡクローニングベクターシステムが目的とするタンパク質生成物をコードする　ＤＮＡ配列を含有する場合、本発明のベクターシステムによるトリコダーマの形質転換は、形質転換された微生物が適切な培養培地中において増殖される場合、目的とするタンパク質の高レベルの発現及び分泌を提供するであろう。
　【００１６】
　その第１の観点によれば、本発明は、
　ａ）目的とするタンパク質生成物をコードする遺伝子、
　ｂ）目的とする生成物の発現を制御するために機能可能的に結合されたプロモーター／エンハンサーを含む遺伝子発現を促進する機能、
　ｃ）場合によっては、目的とする生成物のために該遺伝子の５′末端の上流に融合されたシグナル／リーダー配列及び
　ｄ）選択マーカーを含んで成るベクターシステムを提供する。
　【００１７】
　その第２の観点によれば、本発明は、トリコダーマの形質転換のための方法を提供し、ここで適切なトリコダーマ菌株が本発明のベクターシステムにより形質転換される。
　【００１８】
　その第３の観点によれば、本発明は、本発明のベクターシステムによりトリコダーマを形質転換し、該形質転換された菌株を適切な培地中で培養し、そして発現され、そして分泌された生成物を該培地から回収することを含んで成る、トリコダーマにおけるタンパク質の産生のための方法を提供する。
　【００１９】
　本発明はまた、トリコダーマ中にタンパク質の産生のための方法も提供し、この方法によって、ベクターシステムにより形質転換されたトリコダーマ菌株は、適切な培地中で培養され、そして発現され、そして分泌されたタンパク質が該培養培地から回収される。
　本発明はさらに、安定して形質転換されたトリコダーマ菌株を提供する。
　【００２０】
　本明細書に使用される場合、“ベクターシステム”とは、宿主ゲノム中に組込まれるべきＤＮＡ−情報を共に含む単一のベクター又はプラスミドもしくは複数のベクター又はプラスミドを含む。該ベクター又はプラスミドは、線状又は閉環状分子である。トリコダーマ中における自己複製プラスミドは現在知られていないが、本発明はまた、のちに見出されるにちがいない、そのような自己複製プラスミドも包含する。
　【００２１】
　本発明のベクターシステムは、プロモーター、エンハンサー及び転写開始部位並びにターミネーターを含む遺伝子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ−配列、形質転換体の選択のためのマーカー及び目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んで成る。
　【００２２】
　発現された生成物の分泌を確保するために、目的とする生成物のための遺伝子は、好ましくは、細胞の分泌路中に、発現された生成物の有効な方向を確保する前領域を提供される。この前領域（天然に存在するシグナル又はリーダーペプチドもしくはその一部である）は一般的に、分泌の間、目的の生成物から切断され、この後、その成熟した生成物は、培養培地から単離され得る。
　目的とする生成物のための遺伝子は、ゲノム遺伝子又はｃＤＮＡクローンから得られる。ＤＮＡ−配列はまた、合成され得る。
　【００２３】
　シグナル／リーダー配列は、目的とするタンパク質をコードする遺伝子のシグナル／リーダー配列に由来し、又はトリコダーマ又は他の生物源のいづれかからの他の分泌されたタンパク質のための遺伝子に由来する。トリコダーマによって分泌されるタンパク質をコードする遺伝子に由来するシグナル／リーダー配列の例は、ｃｂｈ１シグナル配列又はｅｇｌ１シグナル配列又はその一部である。トリコダーマに異質の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子に由来するシグナル／リーダー配列は、アスペルジラスのアミラーゼ又はグルコアミラーゼのための遺伝子に由来する。また合成シグナル／リーダー配列も使用され得る。
　【００２４】
　プロモーターは、トリコダーマ中に転写活性を示すＤＮＡ配列であり、そしてトリコダーマに同質か又は異質の遺伝子に由来することができる。トリコダーマに同質のタンパク質をコードする遺伝子に由来するプロモーターの例は、ＣＢＨＩプロモーター又はＥＧＩプロモーターもしくはその一部である。トリコダーマに異質のタンパク質のための遺伝子に由来するプロモーターの例は、アスペルジラスのグルコアミラーゼ　プロモーターである。転写ターミネーターは、プロモーターと同じ源に由来する。また合成プロモーター又はターミネーター配列も使用され得る。
　【００２５】
　特別に言及されたすべてのＤＮＡ配列は、コードされた生成物の機能に不可欠な塩基の数個を補正又は欠失することによって変性され得ることが理解され、そしてそれは当業者にとっては明らかである。たとえば、ｃｂｈ１又はｅｇｌ１シグナル又はプロモーター配列に実質的に類似するＤＮＡ配列は、それらがトリコダーマ中において意図された機能を示すかぎり使用され得る。また目的とするタンパク質のための遺伝子は、これがタンパク質の活性に対して悪影響を持たないかぎり、変えられ得る。
　【００２６】
　異なった選択マーカー、たとえばａｒｇＢ（Ａ．ニジュランス又はＴ．リーセイ）、ａｍｄＳ（Ａ．ニジュランス）及びｐｙｒ４（ネウロスポラ　クラサ又はＴ．リーセイ）が使用され得る。
　【００２７】
　宿主菌株は、形質転換方法に使用される選択マーカーに依存して、原栄養性又は栄養要求性トリコダーマ菌株である。本明細書の実験部分に示されているように、Ａ．ニジュランスからのａｍｄＳ遺伝子は、原栄養性Ｉ．リーセイの形質転換のために使用され得る。Ｔ．リーセイは単一の窒素源としてアセトアミド上で完全に増殖せず、そしてその増殖は培地上にＣｓＣｌを添加することによってさらに阻害され得る。従って、ＣｓＣｌの存在下で単一の窒素源としてアセトアミド上での増殖は、ａｍｄＳ＋形質転換体を同定するために選択培地として使用され得る。
　【００２８】
　宿主ゲノムの対応する突然変異を相補する選択マーカーが使用される場合、栄養要求性トリコダーマ突然変異体が構成されるべきである。栄養要求性トリコダーマ突然変異体は、突然変異株を産生するための既知方法によって製造され得る。
　【００２９】
　増殖のためにウラシル、トリプトファン又はアルギニンを必要とする栄養要求性トリコダーマ突然変異体は、Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ（参照３６）によって記載されているようにして、濾過濃縮技法（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によって単離された。アルギニン要求性栄養要求体から、ａｒｇＢ遺伝子を欠失する突然変異体が、アルギニン生合成において異なった中間体によって供給される一連の最少プレートを用いることによって同定された。ウラシル要求性突然変異体から、ｐｙｒ４遺伝子を欠失する菌株を、菌糸体調製物（参照３７）においてオロチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ（ＯＭＰ　ｄｅｃａｓｅ）の活性を測定することによって見出すことができる。
　【００３０】
　ｔｒｐ１遺伝子欠失の突然変異体は、それらの菌糸体におけるＰＲＡイソメラーゼ−ＩｎＧＰシンセターゼ活性の欠失によって特徴づけられる（参照４０）。酵素活性を示さない突然変異体のｔｒｐ１−特性は、たとえばＮ．クラサのｔｒｐ１プラスミド（参照４１）又はＡ．ニジュランスのｔｒｐＣ−プラスミド（参照３４）による形質転換及び相補性によって確認され得る。
　【００３１】
　使用される形質転換技法はＡ．ニジュランスの形質転換法（参照３２，３３）から改造された方法である。プロトプラストは、寒天プレート上で菌糸体を増殖し、そしてＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）２３４の緩衝溶液中に菌糸体を懸濁することによる既知の方法によって調製される。従来のＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）２３４のスクロース溶液の代わりに、ソルビトール溶液が好都合に使用され得る。次に、本発明の実験部にさらに詳しく記載しているようにして、形質転換性ＤＮＡが前記プロトプラスト溶液に添加される。形質転換は普通、同時形質転換として行なわれ、それによって、選択不可能なプラスミドがもう１つのプラスミド中に挿入される選択可能なマーカー（たとえばｐ３ＳＲ２中へのａｍｄＳ又はｐＳａ１４３中へのａｒｇＢ）を用いて高頻度でＴ．リーセイ中に同時形質転換される。等モル量のＤＮＡが形質転換のために使用される場合、高い割合の形質転換体が、ゲノム中に組込まれた選択不可能なプラスミドを含む。ａｒｇＢ−Ｔ．リーセイ菌株が、等モル量のプラスミドｐ３ＳＲ２及びｐＳａ１４３による形質転換に使用される場合、形質転換体を、二重選択培地（最少培地、アセトアミド、ＣｓＣｌ）上に得ることができる。他方、単鎖のプラスミドは、形質転換のために使用され得、ここでまた、マーカーが挿入される。
　【００３２】
　次に、形質転換体は、適切な培地中で培養される。単純な培地中に目的とする生成物を産生することができるためには、グルコース誘導性プロモーターが使用される。トリコダーマが１％グルコースを含む培地上で増殖される場合、プロテアーゼを含む、すべての細胞外タンパク質の分泌が強く抑制される。目的とする酵素をコードする遺伝子がグルコース含有性培地中において強く発現されるプロモーターに連結される場合、目的とする酵素は増殖培地に分泌される。他のタンパク質はこれらの条件下で産生されないので、目的とする酵素は、培地中に分泌される主なタンパク質である。
　【００３３】
　菌類の菌糸体が除去される場合、目的とするタンパク質は、種々の純粋な形でその得られた溶液に存在する。必要により、それはさらにひじょうに容易に、精製され得る。なぜならば、それはほとんどタンパク質のみであるからである。
　【００３４】
　本発明はまた、宿主生物のある酵素活性を産生する遺伝子を変性又は不活性化するためにも使用され得る。例として、セルラーゼ−陰性Ｔ．リーセイ菌株が構成され得る。この突然変異生成は、欠失されたセルラーゼ遺伝子を担持するプラスミドによるトリコダーマ　リーセイの形質転換に基づかれる。染色体セルラーゼ遺伝子産でのプラスミドの同質組換えは、内存性Ｔ．リーセイ　セルラーゼ遺伝子の挿入不活性化を引き起こす。形質転換のために使用されるプラスミドは、セルラーゼコード領域の一部のみを含み、そして不活性タンパク質を産生する。５′を末端とする配列は含まれない。フレームシフト変異がまた、切断されたコード領域に導入され得る。選択マーカー（ａｒｇＢ）又はスクリーニングのためのマーカー（ｌａｃＺ）が形質転換のために使用されるプラスミドに連結され得る。組換えの後、マーカーは、２種の得られた欠陥性セルラーゼ遺伝子の間に、配置されるであろう。その方法の原理は第１図に示される。
　【００３５】
　本発明は、キモシン及びトリコダーマ　リーセイのエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）によって例示される。プロモーター、シグナル及びリーダー並びにターミネーター配列は、アスペルジラス　ニガーからのグルコアミラーゼ遺伝子又はトリコダーマ　リーセイのｃｂｈ１遺伝子のいづれかに由来した。選択マーカーとして、Ａ．ニジュランスからのａｍｄＳ遺伝子が使用された。
　【００３６】
材料
プラスミド：
　ｐ２８５：ＡＴＣＣ　２０６８１
　ｐＣＡＭＧ９１：参照５６
　ｐｉＣ１９Ｒ：参照５７
　ｐＳａ１４３：参照４８＋５１
　ｐ３Ｒ２：参照３０＋３２
　ｐＤＪＢ２：参照３５
　ｐＭＣ１８１７：参照４３
　ｐＴＴ０１，ｐＴＴ１１：参照２７
　ｐＵＣ　９，ｐＵＣ１３：参照５９
　ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９：参照５５
　【００３７】
菌株：
　Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、ＪＭ　１０１，ＪＭ　１０９及びＤＨＩ（参照５９）がＥ．コリ　クローニングにおいて宿主として使用される。トリコダーマ　リーセイ菌株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ　２６９２１）及びＲＵＴ−Ｃ−３０（ＡＴＣＣ　５６７６５）が菌類の形質転換及び発現研究に使用される。
　【００３８】
トリコダーマの最少培地：
　グルコース　　　　　　　２ｇ
　（ＮＨ４）２ＳＯ４　　　５ｇ
　ＫＨ２ＰＯ４　　　　　　１５ｇ
　ＭｇＳＯ４　　　　　　　０．６ｇ
　ＣａＣｌ　　　　　　　　０．６ｇ
　ＦｅＳＯ４，７Ｈ２Ｏ　　５ｍｇ
　ＭｎＳＯ４，Ｈ２Ｏ　　　１．５６ｍｇ
　ＺｎＳＯ４，７Ｈ２Ｏ　　１．４ｍｇ
　ＣｏＣｌ２　　　　　　　２ｍｇ／１Ｈ２Ｏ
　【００３９】
　【実施例】
実　験
例　１
　栄養要求性Ｔ．リーセイ突然変異菌株の誘導、濃縮及び単離。
　増殖のためにウラシル、トリプトファン又はアルギニンを必要とする栄養要求性突然変異体を、Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ（参照３６）によって記載されているようにして、濾過濃縮法を用いて単離する。使用される突然変異誘発剤は、紫外線である。アルギニン要求性の栄養要求体から、ａｒｇＢ遺伝子を欠失する突然変異体が、アルギニン生合成において異なった中間体によって供給される一連の最少プレートを用いることによって同定される（参照３６）。増殖のためにシトルリンを必要とする突然変異体は、可能性あるａｒｇＢ−突然変異体として考慮される。単離された突然変異体のａｒｇＢ−特性は、Ａ．ニジュランスのａｒｇＢ遺伝子（例４）を含むプラスミドｐＳａ１４３を用いて原栄養体中にそれらを形質転換することによって確認される。
　【００４０】
　ウラシル要求性突然変異体から、ｐｙｒ４遺伝子を欠失する菌株が捜し求められる。
　これらの突然変異体のｐｙｒ４−特性を、Ｎ．クラサのｐｙｒ４遺伝子（参照３８）を含むプラスミドによる形質転換によって確認した。
　【００４１】
　例　２
　プロトプラストの調製。
　菌糸体をポテトデキストロース寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ）上のセロファンディスク上で増殖する。５枚のセロファン培養物からの菌糸体を、０．１Ｍリン酸カリウムによりｐＨ５．６で緩衝化された、１．２Ｍソルビトール中Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）２３４の５ｍｇ／ｍｌ溶液１５ｍｌ中に懸濁する。その混合物を３０℃で１．５〜２時間、インキュベートする。焼結ガラス濾過（多孔度１）により菌糸体破壊物からプロトプラストを分離し、４０００ｇで５分間ペレット化し、そして１．２Ｍソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ，ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液により２度洗浄する。
　【００４２】
　プロトプラストのより良好な精製は、Ｔｉｌｌｂｕｒｎなど（参照３３）によって記載された方法を用いることによって達成され得る。ｐＨ５．８で緩衝化された、１．２ＭのＭｇＳＯ４中、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）２３４の５ｍｇ／ｍｌ溶液を、プロトプラスティングのために使用する。インキュベーション及び濾過の後、そのプロトプラスト懸濁液を、０．６Ｍソルビトール−１００ｍＭのＴｒｉｓ，ＨＣｌ（ｐＨ７．０）の等体積と共に４０００ｇで１５分間、遠心分離する。プロトプラストは、管の中間に鋭いバンドを形成する。そのプロトプラストを、１．２Ｍソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ，ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）１体積中に懸濁し、回転沈殿せしめ、そして１．２Ｍソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ，ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）により２度洗浄する。そのプロトプラストを、５×１０６〜５×１０７個のプロトプラスト／ｍｌの濃度で、１．２Ｍソルビトール−１０ｍＭのＣａＣｌ２−１０ｍＭのＴｒｉｓ，ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）中に懸濁する。
　【００４３】
　プロトプラストの生存率を、浸透圧安定剤として１Ｍソルビトールを含むトリコダーマの最少培地上で評価する。その再生頻度は、菌株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ　２６９２１）のためには４０〜８０％である。
　【００４４】
例　３
　Ａ．ニジュランスのアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）を用いてＴ．リーセイの形質転換。
　プラスミドｐ３ＳＲ２を、形質転換に使用する。それは、完全なアセトアミダーゼ構造遺伝子ａｍｄＳ及びその調節領域ａｍｄＩを担持するＡ．ニジュランスＤＮＡを含む（参照４５及び３３）。
　【００４５】
　形質転換性ＤＮＡ２０μｌ（４〜１０μｇ）を、プロトプラスト溶液２００μｌ中に添加する。２５％ＰＥＧ　６０００−５０ｍＭのＣａＣｌ２−１０ｍＭのＴｒｉｓ，ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）５０μｌを添加し、そしてその混合物を、氷上で２０分間、インキュベートする。ＰＥＧ溶液２ｍｌを添加し、そしてその混合物を、室温でさらに５分間、インキュベートする。１．２Ｍソルビトール−１０ｍＭのＣａＣｌ２−１０ｍＭのＴｒｉｓ，ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）４ｍｌを添加し、そしてそのプロトプラストを３％寒天表面上にプレートする。その選択培地は、（ＮＨ４）２ＳＯ４の代わりに単一の窒素源として１０ｍＭアセトアミドを有するトリコダーマ最少培地であり、そして浸透圧安定剤として１Ｍソルビトール及びバックグラウンド増殖を抑制するために１２．５ｍＭのＣｓＣｌにより補充される。
　【００４６】
　４０〜６００個の形質転換体／ＤＮＡμｇの形質転換頻度を、菌株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ　２６９２１）のために得る。最も高い頻度は、ＤＮＡが２サイクルのＣｓＣｌ／エチジウムブロミド遠心分離により精製される場合に得られる。
　【００４７】
　胞子形成は選択培地上ではめったに観察されないが、しかしポテト　デキストロース寒天に移される場合、通常、その形質転換体は胞子形成する。アセトアミド上で増殖するそれらの能力は多様である。選択培地上でのコロニィーの直径は、１ｍｍ以下から１０〜２０ｍｍの範囲である。
　【００４８】
　形質転換体の有糸分裂安定性を調べた。種々のサイズの１０個の大きな形質転換体を、アセトアミド−ＣｓＣｌプレート上に継代培養し、ポテト　デキストロース（ＰＤ）上に胞子形成し、そしてＰＤ上に再プレートした。ヘテロカリオシスによって引き起こされた異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を除くために、１つの胞子から生まれる個々のコロニィーをＡｍｄＳ＋表現型について試験した。おのおのの元の形質転換体からの１つの陽性クローンを、非選択性培地上で連続プレーチング（５増殖サイクル）にゆだね、そしておのおのの世代の後、表現型を選択培地上で試験した。１つのサイクルの後、１０個の大きな形質転換体を非選択培地上で試験し、その１０個の形質転換のうち６個は１００％のＡｍｄＳ＋分生子を与え、３個は４７〜８７％の分生子を与え、そして１つの形質転換体は、ＡｍｄＳ＋分生子を与えなかった。この結果は、５つの非選択性増殖サイクルを通して同様のままであり、初めの不安定なＡｍｄＳ＋表現型が後で安定化され得ることを示唆した。
　【００４９】
　元の１０個の小さなコロニィーのうち、３個は、種々の頻度のＡｍｄＳ＋表現型を有する胞子を与えた（９４％，４４％及び５％の胞子）。他の７個のクローンは、アセトアミド上で増殖し得ない胞子のみを与えた。興味あることには、得られたすべてのＡｍｄＳ＋は、大きなコロニィーの形質転換体の特徴を有する、活発な増殖をアセトアミドプレート上で示した。
　【００５０】
　形質転換体におけるプラスミドＤＮＡの存在を全ＤＮＡのサザン法によって分析し、形質転換体から単離し（Ｒａｅｄｅｒ及びＢｒｏｄａに従って、参照４４）、ＸｈｏＩ又はＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩにより切断した。ベクターｐＵＣ１８及びプラスミドｐ３ＳＲ２のａｍｄＳ遺伝子を含むＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、プローブとして使用する。その形質転換体は、トリコダーマのゲノムＤＮＡ中の多くの異なった部位で、すなわちゲノム当り１〜数個のコピィーでの組換えによって生じることが示された。
　【００５１】
例　４
　Ａ．ニジュランス及びＮ．クラサのプラスミドによるＴ．リーセイの形質転換。
　異質ＤＮＡによる栄養要求性突然変異の相補性をＴ．リーセイにおいて示す。Ａ．ニジュランスからのａｒｇＢ遺伝子を含むプラスミドｐＳａ１４３を使用して、Ｔ．リーセイのａｒｇＢ−突然変異体株を形質転換する。Ｎ．クラサからのｐｙｒ４遺伝子を含むプラスミドｐＤＪＢ２を用いて、Ｔ．リーセイのｐｙｒ４−突然変異体株を形質転換する。その形質転換体を、アルギニン又は３０μｇ／ｍｌウラシルを含まない最少培地上でそれぞれ選択した。両者の場合の形質転換の頻度は、約３００個の形質転換体／ＤＮＡμｇである。
　【００５２】
　染色体ＤＮＡを、その形質転換体から単離し、そしてサザン　ハイブリダイゼーション実験のために使用し、Ｔ．リーセイの染色体ＤＮＡ中へのプラスミドＤＮＡの正しい組込みを確めた。複数のタンデムコピーのｐＳａｌ１４３を、ゲノム中に組込んだ。サザン及びドット　プロット　ハイブリダイゼーションは、分析された形質転換において、ａｒｇＢのコピー数がおよそ２〜１００以上異なることを示した。ＡｒｇＢ＋形質転換体は、少なくとも３世代を通して、表現型的に１００％安定していることが示された。これは、完全培地上で５個の形質転換からの分生子の連続プレーチングによって試験し、そしてその後、最少培地（５０〜８０個のコロニィー／形質転換体）上でＡｒｇ＋表現型を試験した。
　【００５３】
例　５
　ａｍｄＳ及びａｒｇＢプラスミドによるＴ．リーセイの同時形質転換。
　非選択性プラスミドによりトリコダーマを同時形質転換するための可能性は、アルギニン栄養要求性変異体により最初に示された。
　【００５４】
　ａｒｇＢ−Ｔ．リーセイ株を、等モル量のＡ．ニジュランスプラスミドｐＳａ１４３（ａｒｇＢ）及びｐ３ＳＲ２（ａｍｄＳ）により形質転換し、形質転換体をＡｒｇ＋表現型について選択し、そしてアセトアミド−ＣｓＣｌ−プレート上で画線培養することによってａｍｄＳの取得について試験した。ＡｒｇＢ形質転換体のうち、８６％がまたＡｍｄＳ＋であった。同時形質転換体のサザン分析は、両プラスミドが、ゲノム中のいくつかの異なった位置に種々の量のコピーとして組込まれたことを指摘した（データは示されていない）。
　【００５５】
　アセトアミド−ＣｓＣｌ最少培地上での二重選択は、ＤＮＡμｇ当り約１００個のＡｍｄ＋Ａｒｇ＋形質転換体及びａｍｄＳ形質転換の特徴を示す多くの小さなコロニィーをもたらした。
　【００５６】
　ａｒｇＢ　ａｍｄＳ同時形質転換体のＡｒｇＢ＋表現型の安定性を試験する場合、５個のうち３個が１００％安定していると判明され、ところが他は、分析された子孫の７％又は８０％においてＡｒｇＢ＋特性を失っていた。同じ個々のコロニィーはまた、ＡｍｄＳ＋表現型も失なっていた。この不安定性が、たとえば、同じ染色体位置へのａｍｄＳと共にａｒｇＢの同時組込みによって引き起こされたかどうかは、知られていない。
　【００５７】
　Ｅ．コリのｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＡＮ５−４ＩＢがプロモーターに位相が一致して結合し、そしてＡ．ニジュランスのグリセルアルデヒデホスフェート　デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄ）（参照６２）のＮ−末端タンパク質コード領域をまた同時形質転換のために使用した。さらに、このプラスミドは、Ａ．ニジュランスのａｒｇＢ遺伝子及びｐＢＲ３２２配列を含む。原栄養性Ｔ．リーセイ（ＱＭ９４１４）を、プラスミドｐ３ＳＲ２（ａｍｄＳ）及びｐＡＮ５−４ＩＢにより同時形質転換し、形質転換体をＡｍｄ＋表現型について選択し、そしてＸｇａｌを含むアセトアミド−ＣｓＣｌ−プレート上でβ−ｇａｌ発現についてスクリーンした。グルコースが培地中に存在し、そしてＸｇａｌプレートのｐＨが中性である場合、内在性Ｔ．リーセイのβ−ガラクトシダーゼ活性は検出され得なかった。
　【００５８】
　１〜４日の増殖の後、青色が見られた。１．０／０．７のモル比のプラスミド（ｐ３ＳＲ２／ｐＡＮ５−４ＩＢ）を形質転換に使用する場合、１３％の大きなＡｍｄ＋クローン及び６％の小さなＡｍｄ＋クローンがβ−ガラクトシダーゼ活性を示し、そして１．０／２．６モル比で、３９％及び７％のＸｇａｌ＋クローンがそれぞれ得られた。青色を示すＡｍｄ＋形質転換体における両プラスミドの存在は、サザンハイブリダイゼーションによって確められた（データは示されていない）。
　【００５９】
例　６
　ｃｂｈ１　トリコダーマ　リーセイ株の構成。
　記載された方法による異なったセルラーゼ遺伝子の活性化は、特定の組合せのｃｂｈ１−株を産生する一連のＴ．リーセイ株の構成を可能にする。ｃｂｈ１−株はまた、ｃｂｈ１プロモーターを用いる場合、異質タンパク質の有効な産生のためにも重要である。トリコダーマ　リーセイ株　ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ　２６９２１）は、ｃｂｈ１特異性プローブを用いるサザン
　【００６０】
　ハイブリダイゼーションによってｃｂｈ１遺伝子の１つの染色体コピーのみを含むことが示され、そしてその結果、１回の組換え結果が、その遺伝子を不活性化すべきである。不活性遺伝子を次のようにして構成した。ベクターｐＵＣ８中のｃｂｈ１遺伝子の完全な長さのｃＤＮＡクローンを含むプラスミドｐＴＴＯ１（参照２７）を、制限酵素Ｂｇｌ１及びＢｇｌＩＩにより切断した。ｃｂｈ１遺伝子の５′末端領域からの０．８Ｋｂフラグメントを、従来の技法によって、アガロースゲルから単離した。そのフラグメントを、Ｓ１ヌクレアーゼを用いてブラント末端化し、そしてそれを、ＥｃｏＲＩにより切断され、ブラント末端化されたｐＵＣ１８ベクターに連結し、そしてＥ．コリＪＭ１０９に形質転換した。ｃｂｈ１遺伝子フラグメントを含むクローンからのＤＮＡを単離し、そしてｃｂｈ１のＢｇｌＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントの中間を切断する制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化した。ＥｃｏＲＩにより生成された末端をフィルインし、そしてバック連結した。切断されたｃｂｈ１遺伝子フラグメントの中間にフレームシフト変異を含むプラスミドｐＭＳ４を得た（第２図）。
　【００６１】
　トリコダーマを、プラスミドｐＭＳ４及び３〜４倍のモル過剰のプラスミドｐＭＳ４と共にプラスミドｐ３ＳＲ２を含むＡ．ニジュランス　ａｍｄＳにより同時形質転換した。
　形質転換体を、例３に記載しているようにしてａｍｄＳ＋表現型に基づいて選択し、そして単一の炭素源としてアセトアミドを含む選択培地上で精製した。精製された形質転換体を、炭素源として１％Ｓｏｌｋａ　ｆｌｏｃセルロース及び窒素源として０．２％プロテオースペプトンを含むトリコダーマ最少培地２００μｌのマイクロタイタープレート上で増殖した。そのセルラーゼ表現型を、参照５９に記載しているようにしてＣＢＨＩ特異的抗血清（羊）に対する希釈されていない増殖培地を用いるオクテルロニーの免疫拡散によって試験した。多くの形質転換体（正常な量のＣＢＨＨを産生するが、しかし検出できるＣＢＨＩを産生しない）が同定された。
　【００６２】
例　７
　Ｉ．プロキモシン遺伝子を含むプラスミド２８５′ｐｒｏＣの調製（第３図）。
　Ｔ．リーセイにおける異質タンパク質の例として、本発明者は、プロキモシンｃＤＮＡを発現することを選択した（第３図）。プレプロキモシン遺伝子を子牛の胃のｃＤＮＡライブラリィから単離し、そしてＧ−Ｃテイリング（参照４９及び５０）によってｐＢＲ３２２のｐｓｔ１部位中に挿入し、ｐＲ２６を得た。ｐＵＣ９をＳａｌＩにより切断し、そしてクレノウポリマラーゼにより補充し、そしてＴ４リガーゼにより連結した。その得られたプラスミドをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩにより切断し、そして２．７Ｋｂの大フラグメントを、ｐＲ２６からの０．４７ＫｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと連結し、プロキモシン遺伝子のＮ−末端にＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位を含むｐＵＣ９′を得た。ｐＵＣ１３をＢａｍＨＩ−ＮａｒＩ及びＮａｒＩ−ＸｍａＩにより切断し、そしてそれぞれ大小のフラグメントをｐＲ２６の０．６４ＫｂのＸｍａＩ−ＢｃｌＩフラグメントと連結し、プロキモシン遺伝子のＣ−末端にＸｂａＩ−部位を含むプラスミドｐＵＣ１３′を得た。ｐＵＣ１３′からの０．６５ＫｂのＸｍａＩ−ＸｂａＩフラグメントを、第５図に示されているようにしてｐＵＣ９′の０．４６ＫｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩ−ＸｍａＩフラグメント及びｐ２８５の１１ＫｂのＸｂａＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントと連結し、プロキモシン遺伝子を含むプラスミドｐ２８５′ｐｒｏＣを得た。
　【００６３】
　ＩＩ．プラスミドｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍの構成。
　ｐＣＡＭＧ９１をＳａｌＩ及びＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化する。そのような消化物から６９８ｂｐのフラグメントをアガロースゲル上に単離した。このＳａｌＩ−ＰｓｔＩフラグメントは、グルコアミラーゼｍＲＮＡの１４０ｂｐ３′非翻訳部＋５４０ｂｐの３′〜ポリ（Ａ）付加部位をコードする領域を含む。ＸｂａＩリンカーの添加及びＸｂａＩ制限酵素による消化の前、この３′フラグメントをＴ４−ＤＮＡポリマラーゼにより処理し、その制限部位を“ブラント末端”にした。このグルコアミラーゼ遺伝子の３′末端を、ＸｂａＩにより線状にされたｐＵＣ１３に連結し、グルコアミラーゼ遺伝子ｐｏｌｙ（Ａ）付加領域を含むプラスミドｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍを得た。
　【００６４】
　ＩＩＩ．プラスミドｐＭＴ８３７の構成。
　プロモーター及びグルコアミラーゼ（ＡＭＧ）シグナル及びリーダーペプチドをコードする配列を含むｐＣＡＭＧ９１の０．５ＫｂのＳｍａＩＩ−ＢｓｓＨＩＩフラグメントを、ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩにより消化されたｐＵＣ１３及びプロキモシンの最初の６個のアミノ酸をコードする合成ＢｓｓＨＩＩ−ＢａｍＨＩアダプターに連結した。この得られたプラスミド、ｐＭＴ６２６から、０．８ＫｂのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを単離し、そしてｐｒｏＣのＮ末端半分についての配列を含むｐ２８５′ｐｒｏＣからの０．５ＫｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント及びｐｒｏＣについての配列のＣ末端部を含むｐＭＴ６２２の３．０ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩフラグメントに連結した。（ｐＭＴ６２２は単に、ｐＵＣ１３においてｐ２８５′ｐｒｏＣのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩサブクローンである）。その得られたプラスミドｐＭＴ６４８（第４図を参照のこと）は、完全なプロキモシン遺伝子、その先にＡＭＧプロモーター及びシグナル／リーダーコード配列を含む。ｐＭＴ６４８は、Ａ．ニジュランスのａｒｇＢ遺伝子を含むようにさらに変性された（参照５１）。１．８ＫｂのＮａｒＩ−フィルインされたｐＭＴ６４８のＸｂａＩフラグメントを、６．８ＫｂのＣｌａＩ−フィルインされたｐＳａｌ４３のＥｃｏＲＩフラグメントに連結し、ｐＭＴ６５１を得た。ＡＭＧプロモーターのさらに上流の配列（上流の活性化配列；ＵＡＳ）をさらに挿入した。これは、元のクローンｐＣＡＭＧ９１からの３．７ＫｂのＣｌａＩ−ＢｓｓＨＩＩフラグメントを、ｐｒｏＣ配列を含むｐＭＴ６４８からの１．１ＫｂのＢｓｓＨＩＩ−フィルインされたＸｂａＩフラグメント及びｐＭＴ８１３からの３．１ＫｂのＣｌａＩ−フィルインされたＥｃｏＲＩフラグメントとしてａｒｇＢ遺伝子（ｐＭＴ８１３は、ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌＩＩにより切断されたｐｉＣ１９Ｒ中にクローンされた３．１ＫｂのＢａｍＨＩ−ＮｒｕＩフラグメントとしてクローンされたａｒｇＢ遺伝子である）に連結することによって達成された。その得られたプラスミドｐＭＴ８３０は、ＡＭＧからのＵＡＳ、プロモーター、シグナル及びリーダー配列及びｐｒｏＣのための完全な遺伝子を含む発現ユニットを有する。最後に、ＡＭＧのターミネーター配列は、プラスミドｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍから０．６ＫｂのＸｂａＩ−ＸｂａＩフラグメントとして取られ、そしてＸｂａＩにより切断され、そして脱リン酸化されたｐＭＴ８３０中に挿入され、ｐＭＴ８３７が得られた。ｐＭＴ８３７の構成が第５図に例示される。
　【００６５】
例　８
　ｐＭＴ８３７を用いてキモシンの産生。
　Ｔ．リーセイ株ＱＭ９４１４及びＲＵＴ−Ｃ−３０を、プラスミドｐＭＴ８３７及びｐ３ＳＲ２により同時形質転換した。プラスミドｐＭＴ８３７は、プロキモシン遺伝子の先にＡＭＧプロモーター及びシグナル／リーダー配列を含む。プラスミドｐＭＴ８３７の構成法は例７に記載されている（また第３〜５図を参照のこと）。同時形質転換及び選択を例５におけるようにして行なった。
　【００６６】
　キモシン産生のためには、１％Ｓｏｌｋａ　ｆｌｏｃセルロース及び０．２％プロテオースペプトンを含む最少培地上で形質転換体を培養した。
　その菌糸体を集め、そして必要な場合、ＴＣＡ沈殿法によってその上清液を濃縮し、そして２ＭのＮａＯＨ、１０ｍＭのＴｒｉｓ溶液（ｐＨ８．５）中に希釈した。そのサンプルをＳＤＳ−ページ（７．５％〜１５％のポリアクリルアミドグラジェント）上で分別し、そしてニトロセルロースフィルターにエレクトロブロットした。そのフィルターを、ウサギプロキモシン抗血清と共にインキュベートし、そしてシグマから購入されたα−ウサギ−ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ接合体を用いて４−クロロ−１−ナフトールにより染色した。
　【００６７】
　キモシンは、およそ１μｇ／１のレベルで培地中に分泌されることを示された。ＡＭＧプロモーターは、明らかにＴ．リーセイにおいて非能率的に機能するので、相同のＴ．リーセイプロモーター−ターミネーターベクターが、キモシンの産生レベルを改良するために構成された。
　【００６８】
例　９
　ｃｂｈ１プロモーターを用いて、Ｔ．リーセイ中において子牛プロキモシンの産生のための異質発現ベクターの構成。
　Ｉ．ｃｂｈ１ターミネーター領域へのプロキモシン遺伝子の連結。
　子牛プロキモシン遺伝子を、プラスミドｐＲ２７から得た（第６図）。ほとんど全体の遺伝子を含むＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメント（約１１１０ｂｐ）を、従来の技法によってアガロースゲルから単離し、そしてｐＵＣ１９のＰｓｔ１部位に連結した。
　【００６９】
　このプラスミドをＰｓｔＩにより一部消化し、末端をＳ１ヌクレアーゼによりブラント化し、そしてｃｂｈ１遺伝子（クレノウフラグメントによるブラント末端）のＡｖａＩＩターミネーターフラグメント（〜７５０ｂｐ）をこのプラスミドに連結した。ｃｂｈ１遺伝子のターミネーター領域を、ｐＢＲ３２２（参照２４）中にサブクローンされたｃｂｈ１ｃＤＮＡの末端の１．８ＫｂＢａｍＨＩフラグメントから得た。ｐＵＣ１９において、ｃｂｈ１遺伝子のターミネーター領域と連結したｐｒｏＣフラグメントを含むこのプラスミドをｐＡＭＨ１００（第７図）と言及した。
　【００７０】
　ＩＩ．ＢｇｌＩ−ＳａｃＩＩアダプターを用いて、ＣＢＨＩプロモーター領域及びプロキモシンコード領域の融合。
　プロキモシンのＮ−末端領域をコードするＳａｃＩＩ−ＰｓｔＩフラグメント（８０ｂｐ）を、プラスミドｐＲ２７（第６図を参照のこと）から単離した。ゲノムクローンλ４４Ａからのｃｂｈ１プロモーター領域をまず、２．８Ｋｂの長さのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＵＣ１８（プラスミドｐＵＡ０１、第８図）中にサブクローンし、そして次に約２．２Ｋｂの長さのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩフラグメントをこのサブクローンから単離した。ＢｇｌＩ部位は、ｃｂｈ１遺伝子のシグナル配列の中間に配置される。ｃｂｈ１遺伝子のプロモーター及びシグナルペプチドのコード領域の約半分を含む、約２．２Ｋｂの長さのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩフラグメントの約８０ｂｐのＳａｃＩＩ−ＰｓｔＩプロキモシン　フラグメントヘの正確な連結は、ＢｇｌＩ−ＳａｃＩＩアダプター（ＮＯＲ２０２＋ＮＯＲ２０３、第１０図）によって仲介される。アダプターと共にこれらのフラグメントを、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩにより消化されたｐＵＣ１９中に連結した。このプラスミドは、プロキモシンの第１アミノ酸に融合されたＣＢＨＩの完全なシグナル配列、次にそのＮ−末端配列のいくらかをコードする。最後に、この構造体からＥｃｏＲＩ−ｐｃｂｈ１ｓｓ−ｐｒｏＣ−ＰｓｔＩフラグメントを単離し、ＳａｌＩ及びＰｓｔＩにより消化されたｐＡＭＨ１００中にその３′末端から連結した。そのフラグメントの５／末端及びプラスミドｐＡＭＨ１００のＥｃｏＲＩ末端をクレノウによりフィルインし、そして連結した。ｃｂｈ１遺伝子のプロモーター及びｐｒｏＣ′フラグメントを、ｃｂｈ１ターミネーター領域の前の′ｐｒｏＣの前に移した。この構成体を、ｐＡＭＨ１０２（第１１図）と名付けた。
　【００７１】
　ＩＩＩ．クロモシン発現プラスミドヘの選択マーカーの付加。
　発現プラスミドにおける選択マーカーとして、Ａ．ニジュランスのａｍｄＳ遺伝子（参照４２，３０）又はＡ．ニジュランスのａｒｇＢ遺伝子（参照４８）のいづれかを使用することができる。
　ａｍｄＳ遺伝子を、ｐ３ＳＲ２からＰｖｕＩ−ＳａｌＩフラグメントとして単離し、そしてｐＡＭＨ１０２の６Ｋｂの長さのＰｖｕＩ−ＳａｌＩフラグメントに連結する。
　この選択可能なベクターを、ｐＡＭＨ１０４（第１１図）として命名した。
　【００７２】
　ＩＶ．オリゴヌクレオチドを用いてｃｂｈ１プロモーター及びプレプロキモシンコード酸列の正確な融合。
　プレプロキモシンのアミノ末端ＰｓｔＩフラグメント（約１５０ｂｐ）を、ｐＢＲ３２２においてＰｓｔＩ部位に挿入されたＡＴＧから１２ｂｐ上流で始まる、完全なプレプロキモシンｃＤＮＡクローンを含むｐＲ２６（第３図）から単離した。このフラグメントを、ｐＴＺ１９Ｒのポリリンカー中に、ｃｂｈＩ（第８図）のシグナル配列のコードする領域も含む、ｃｂｈＩＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ（約２．６Ｋｂ）プロモーターフラグメントと共にサブクローンした。ｃｂｈＩＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩフラグメントを、元のλ４４Ａクローン（参照２４）の、ｐＵＣ１８（ｐＵＡ０１、第８図）における２．８ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩサブクローンから得た。ｐＴＺ１９Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、複製のＦ１起源及びオリゴヌクレオチドの突然変異生成のために単鎖鋳型の使用を可能にするＴ７プロモーターを含む、ｐＵＣ１９基礎プラスミドである。この得られたプラスミド（ｐＡＭＨ１０５）の構成法は第８図に例示されている。このプラスミドから、ｃｂｈ１プロモーター領域とｐｒｏＣ　ＡＴＧとの間の配列を、特定のオリゴヌクレオチド、ＯＡＭＨ３（第１０図）を用いてループ−突然変異生成によって削除した。オリゴヌクレオチド指図の突然変異生成の実施は第９図に例示されている。問題のオリゴヌクレオチドをリン酸化し、それぞれモル比２０：１でｐＡＭＨ１０５の単鎖ＤＮＡ（参照６０、単鎖ＤＮＡは、Ｐｈａｒｍａｃｉａによって記載されているようにしてＪＭ１０３／ｐＡＭＨ１０５から単離された）にアニールした。オリゴヌクレオチド　プライマーを、参照６０に記載しているようにしてクレノウポリマラーゼ及びＴ４リガーゼを用いて延長した。その延長された混合物を、ＳｍａＩ（ｐＴＺ１９Ｒのポリリンカーに存在する、第９図を参照のこと）により消化し、その後、Ｅ．コリのｍｕｔＬ不適正修復欠失性株、ＢＭＨ７１．１８中に形質転換した。形質転換体のプールを、５ｍｌの液体培養（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む、参照６２に記載のようなＬｕｒｉａブイヨン）中で１晩増殖した。プラスミドＤＮＡを、形質転換体のプールから単離し、そしてそれをＳｍａＩにより再消化し、そしてＥ．コリＪＭ１０９株中に再形質転換した。可能性ある欠失クローンのスクリーニングを、異なった制限酵素を用いる消化によって行ない、そして欠失の特異性もさらに、配列決定することによって確認した。その得られたプラスミドをｐＡＭＨ１１０１（第１２図）と呼ぶ。このプラスミドを、さらにＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにより消化し、そしてその得られたｐｃｂｈ１−ｐｒｅｐｒｏＣフラグメントを単離し（第１４図）、そしてＰｓｔＩ及びＳａｌＩにより消化されたｐＡＭＨ１００プラスミドにそのＰｓｔＩ末端で連結した。その得られた連結フラグメントの末端を、クレノウによってフラントし、そして連結した。その得られたプラスミドをｐＡＭＨ１０１と呼び、そしてそれは、プロキモシンのシグナル配列に融合されたｃｂｈ１プロモーター及びｃｂｈ１遺伝子のターミネーター領域に融合された全プロキモシンコード領域を含む（第１４図）。
　【００７３】
　Ｖ．オリゴヌクレオチドを用いることによって行なわれたシグナル配列融合による、ｃｂｈ１プロモーター及びｐｒｅｐｒｏＣ遺伝子の正確な融合。
　前のチャプターＩＶに詳しく記載されたｐＡＭＨ１１０１の構成と本質的に同じようにしてプラスミドｐＡＭＨ１１０３（第１２図）の構成を行なった。但し、この構成のために使用された特異的オリゴヌクレオチドはＯＡＭＨ１（第１０及び９図）であった。その得られたプラスミドｐＡＭＨ１１０３は、ｐｒｏＣ遺伝子のコード領域のアミノ末端部分（〜１４０ｂｐ）の先のｐｒｅｐｒｏＣシグナル配列からのａａ１２〜１６に融合された、ｃｂｈ１シグナル配列からのアミノ酸（ａａ）１〜１２を含むシグナル配列融合体を含む（第１２図）。プラスミドｐＡＭＨ１１０３からのｐｃｂｈ１−ｓｓｏ−ｐｒｏＣ′（０＝融合）フラグメントを、本質的に前のチャプターＩＶに記載しているようにしてｐＡＭＨ１００にサブクローンした（第１２図を参照のこと）。この得られたプラスミドｐＡＭＨ１０３は、ｃｂｈ１ターミネーター領域に融合されたｐｒｏＣコード領域の先のｃｂｈ１のプロモーター領域及びｃｂｈ１及びｐｒｅｐｒｏＣのシグナル配列融合体を含む。
　【００７４】
　ＶＩ．オリゴヌクレオチドを用いることによるｐｒｏＣコード領域へのｃｂｈ１コード領域の正確な融合。
　プラスミドｐＡＭＨ１１０６（第１３図）の構成を、本質的に前のチャプターＩＶに詳しく記載されたｐＡＭＨ１１０１の構成と同じようにして行なった。但し、この構成のために使用された特異的オリゴヌクレオチドはＯＡＭＨ２（第１０及び９図）であった。ｃｂｈ１のプロモーター領域、ｃｂｈ１のシグナル配列及びｐｒｏＣのコード領域に融合された、成熟ＣＢＨＩの初めの１〜２０のａａのコード領域を含むその得られたプラスミドｐＡＭＨ１１０６からの、ｐｃｂｈ１成熟ｏ−ｐｒｏＣ′を含むフラグメントを、本質的に前のチャプターＩＶに記載しているようにしてｐＡＭＨ１００中にサブクローンした（第１２図）。その得られたプラスミドｐＡＭＨ１０６は、ｃｂｈ１のプロモーター領域、ｃｂｈ１のシグナル配列、ｐｒｏＣのコード領域に融合された成熟ＣＢＨＩのアミノ酸１〜２０のコード領域を含む。
　【００７５】
例１０
　ｐＡＭＨ１０２及びｐＡＭＨ１０４を用いてキモシンの産生。
　Ｔ．リーセイ株ＱＭ９４１４及びＲＵＴ−Ｃ−３０を、それぞれ５：１のモル比でプラスミドｐＡＭＨ１０２及びｐ３ＳＲ２により同時形質転換した。プラスミドｐＡＭＨ１０２の構成法は例９のチャプターＩＩに記載された。同時形質転換及び選択を例５におけるようにして行なった。その形質転換体を、例３に記載されたようにして、選択性アセトアミドプレート上で精製した。
　【００７６】
　キモシン産生のために、形質転換体を、１％Ｓｏｌｋ　ｆｌｏｃセルロース及び０．２％プロテオースペプトンを含む最少培地（１０〜５０ｍｌ）上で培養した。その菌糸体を集め、そしてその上清液をＴＣＡ沈殿法によって濃縮し、そして２ＭのＮａＯＨ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）の溶液中に希釈した。その菌糸体を液体窒素の存在下で破壊し、その破壊された細胞をペレット化し、そしてその上清液を、前記培養培地と同じ方法で処理した。そのサンプルを、ＳＤＳ−ｐａｇｅ（７．５％〜１５％のポリアクリルアミド　グラジェント）上で画分し、そしてニトロセルロースフィルターにエレクトロプロットした。そのフィルターを、ウサギプロキモシン抗血清及びα−ウサギ−ＩｇＧ−ＡＰ（アルカリホスファターゼ）接合体と共にインキュベートし、そしてＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃから購入されたニトロプルーテトラゾリウム及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルにより染色した。菌糸体の内部及び外部のキモシンの量を比較した（第１７図）。菌糸染色体ＤＮＡ中に組込まれたプラスミドｐＡＭＨ１０２の高い数のコピィーを含むクローンがまたよりキモシンを産生したことが、サザンハイブリダイゼーションによって示された。１つのコピィーの形質転換体を用いる場合、分泌されたキモシンの量は１ｌの培養培地当り１００μｇであった（ウェスターンゲルから近づいた場合）（第１７図）。分泌されたプロキモシンは、ウェスターンゲルによって及び凝乳活性（β−カセイン決定基の切断によるキモシン凝乳）によって活性キモシンにプロセスされることが示された（参照６３）。菌糸体の内部の種々の形のキモシン（ｐｒｅｐｒｏＣ，ｐｒｏＣ，Ｃ及び細胞の内部の分解生成物に由来したキモシン）の量は、菌糸体の合計タンパク質の０．０４％であることが測定され（第１７図）、そして分泌されたキモシンの量は、産生された合計キモシンの６０％であった。これは、菌糸体の外部でさえ異質遺伝子生成物を分泌するＴ．リーセイの能力を示す。
　【００７７】
　プラスミドｐＡＭＨ１０４（第１１図）のいくつかのコピィーを有する形質転換体（多量のプロキモシンを分泌できる）を、増殖培地の凝乳活性を決定することによって、スクリーンした。研究された４０のうち最良の形質転換体は、ウェスターンゲル上で及び凝乳活性によって測定される場合、培養培地１ｌ当り５００μｇを分泌することが見出された。
　【００７８】
　培養物が小規模な培養（１０〜５０ｍｌ）と比べて、５１ラボラトリィファーメンター中において増殖される場合、分泌される、活性キモシンの量は、２００倍増大されるので、この型の菌株によって産生されたキモシンの量は、約１００ｍｇ／ｌである。
　【００７９】
例１１
　Ｔ．リーセイにおける同質及び異質のタンパク質の産生のための一般的発現ベクターの構成。
　Ｔ．リーセイにおいて種々のタンパク質の産生のためのベクターを構成するために、ｃｂｈ１遺伝子のプロモーター及びターミネーター領域を含む一般的発現ベクターを構成した。ｃｂｈ１ターミネーターを、３個の読み枠が整合してＳＴＯＰコドンＴＡＡを含むアダプターと共に、ｐＵＣ１９のｐｓｔＩ部位にサブクローンし、プラスミドｐＡＭＨ１１０′（第１５図）を得た。ｐｓｔＩターミネーターフラグメントをｐＡＭＨ１１０′から単離し、ｃｂｈ１プロモーターを、ｐｒｏＣ遺伝子のアミノ末端を含むＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントとしてｐＡＭＨ１０２から単離し、そしてこれらのフラグメントを、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩにより消化されたｐＵＣ１９＊（これから、このサブクローン段階の前、１つのＮｄｅＩ部位がクレノウによりブラントされた）中にサブクローンした。その得られたプラスミドｐＡＭＨ１１０は、ｃｂｈ１遺伝子のプロモーター及びターミネーター及びこれらの配列の間に、ＳａｃＩＩ及びＮｄｅＩによる消化によって除去され得るスタファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントを含む。末端がブラントされた後、遺伝子のｃＤＮＡ又は染色体コピィーを、プロモーター及びターミネーターの間に挿入することができる（第１５図）。
　【００８０】
例１２
　ｃｂｈ１プロモーター下でＴ．リーセイエンドグルカナーゼＩの発現。
　産生されるエンドグルカナーゼの量を増大せしめるために、ｅｇｌ１遺伝子を、より強力なｃｂｈ１プロモーターに連結した。Ｔ．リーセイエンドグルカナーゼＩのためのｃＤＮＡを、スタファーフラグメントを削除するためにまずＳａｃＩＩ−ＮｄｅＩにより消化された一般的な発現ベクターｐＡＭＨ１１０（例１１に記載された）中にＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてサブクローンした（第１６図）。ｃｂｈ１遺伝子のプロモーター及びターミネーターの間にｅｇｌ１遺伝子を含む、その得られたプラスミドｐＡＭＨ１１１を、それぞれ５：１のモル比でｐ３ＳＲ２と共に、Ｔ．リーセイＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ　２６９２１）に同時形質転換した。形質転換体を、Ａｍｄｓ＋表現型について選択し、そしてさらに選択培地上で精製した。６個の個々の形質転換体を、５０ｍｌの液体培養において、セルラーゼ含有培地（炭素源としてＳｏｌｋａ　ｆｌｏｃ，１％）中で４日間、増殖せしめた。次にその培養上清液を、ヒドロキシエチルセルロース（０．１％、参照１２）からの還元性糖の放出を測定することによってエンドグルカナーゼ活性について試験した。形質転換体のＥＧＩ活性を対照（ＱＭ９４１４）と比較し、そして最良の形質転換体は、対照菌株のエンドグルカナーゼ活性の４倍分泌することが示された。この例は、それぞれのプロモーターを変えることによって、Ｔ．リーセイにおいて、異なったセルロース分解酵素の量を調整することが可能であることを示す。
　【００８１】
参考文献
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　【００９１】
　２２．Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｋ．Ｍ．Ｈ．，Ｐａｌｖａ，Ｅ．Ｔ．＆Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．Ｂ．，Ａ　ｈｉｇｈ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ．Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３（１９８０），５９〜６０ページ。
　２３．Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ．，Ｓｃｈｗｅｉｃｋａｒｔ，Ｖ．，Ｌａｄｎｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．，Ｋｗｏｋ，Ｓ．，Ｍｙａｍｂｏ，Ｋ．＆Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｅｘｏｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　Ｉ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｓｔｒａｉｎ　Ｌ２７．ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　１（１９８３），６９１〜６９６ページ。
　【００９２】
　２４．Ｔｅｅｒｉ，Ｔ．，Ｓａｌｏｖｕｏｒｉ，Ｉ．＆Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．，Ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　１（１９８３），６９６〜６９９ページ。
　２５．Ｐｅｎｔｔｉｌａｅ，Ｍ．，Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ，Ｐ．，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｈ．，Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ，Ｒ．＆Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．１９８６．Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ：ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ　Ｉ　ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ（１９８６）４５：２５３〜２６３ページ。
　【００９３】
　２６．ヨーロッパ特許出願１３７．２８０．
　２７．Ｖａｎ　Ａｒｓｔｅｌ，Ｊ．Ｎ．Ｖ．，Ｋｗｏｋ，Ｓ．，Ｓｃｈｗｅｉｃｋａｒｔ，Ｖ．Ｌ．，Ｌａｄｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｔ．Ｈ．＆Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅＩ　ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ．ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ５：６０〜６４ページ。
　２８．特許出願ＷＯ　８５／０４６７２
　【００９４】
　２９．Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｇｒｉｔｚａｌｉ，Ｍ．＆Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｔ．Ｗ．，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ＩＩ　ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ．ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９８７）５：２７４〜２７８ページ。
　３０．Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ，Ｍ．，Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ，Ｐ．，Ｐｅｎｔｔｉｌａｅ，Ｍ．，Ｔｅｅｒｉ，Ｔ．Ｔ．，Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｃｌａｅｙｓｓｅｎｓ，Ｍ．，Ｔｏｍｍｅ，Ｐ．＆Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．，Ａ　ｎｅｗ　ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ．Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ　ｆｏｒ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ．
　【００９５】
　３１．Ｃａｓｅ，Ｍ．，Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｕｓｈｎｅｒ，Ｓ．Ｒ．＆Ｇｉｌｅｓ，Ｎ．Ｈ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ　ｂｙ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６（１９７９），５２５９〜５２６３ページ。
　３２．Ｂａｌｌａｎｃｅ，Ｊ．，Ｂｕｘｔｏｎ，Ｆ．Ｐ．＆Ｔｕｒｎｅｒ，Ｇ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５′−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２（１９８３），２８４〜２８９ページ。
　【００９６】
　３３．Ｔｉｌｂｕｍ，Ｊ．，Ｓｃｈａｚｚｏｃｃｈｉｏ，Ｃ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｇ．Ｔ．，Ｚａｂｉｃｋｙｚｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．＆Ｄａｖｉｅｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｓｐｅｒｇｉ１１ｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ．Ｇｅｎｅ２６（１９８３）２０５〜２２１ページ。
　３４．Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．，Ｈａｍｅｒ，Ｊ．Ｅ．＆Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ，Ｗ．Ｅ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｔｒｐＣ　ｐｌａｓｍｉｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１（１９８４），１４７０〜１４７４ページ。
　【００９７】
　３５．Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．＆Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｂｙｔｈｅ　ａｍｄＳ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　４（１９８５），４７５〜４７９ぺージ。
　３６．Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｈ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｌｙ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｆｕｎｇａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｆｉｎｌａｎｄ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　２６（１９８５）．
　【００９８】
　３７．Ｂｅｃｋｗｉｔｈ，Ｊ．Ｒ．，Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．，Ａｕｓｔｒｉａｎ，Ｒ．＆Ｊａｃｏｂ，Ｆ．，Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｙｒｉｄｉｍｉｄｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５（１９６２），６１８〜６３４ページ。
　３８．Ｂａｌｌａｎｃｅ，Ｄ．Ｊ．＆Ｔｕｒｎｅｒ，Ｇ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ．Ｇｅｎｅ３６（１９８５），３２１〜３３１ページ。
　【００９９】
　３９．Ａｒｒｏｙｏ−Ｂｅｇｏｖｉｃｈ，Ａ．＆ＤｅＭｏｓｓ，Ｊ．Ａ．，Ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｆｒｏｍ　Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８（１９７３），１２６２〜１２６７ページ。
　４０．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｎ−（５′−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｐｈｏｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ｏｆ　ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２０（１９７０），６９９〜７０７ページ。
　【０１００】
　４１．Ｋｅｅｓｅｙ，Ｊ．Ｋ．Ｊ．Ｒ．＆ＤｅＭｏｓｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒｐｌ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ　ｂｙ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｔｒｐＣ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５２（１９８２），９５４〜９５８ページ。
　４２．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｒ．Ｆ．＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　１９８２．
　【０１０１】
　４３．Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ，Ａ．Ｍ．，Ｌｅｈｒａｃｈ，Ｈ．，Ｐｏｕｔｓｋａ，Ａ．＆　Ｍｕｎａｙ，Ｎ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７０（１９８３），８２７ページ。
　４４．Ｐｅｎｔｔｉｌａｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｋ．Ｍ．Ｈ．，Ｒａｙａｌ，Ａ．＆ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．Ｋ．Ｃ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｃｏｄｉｎｇ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓβ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９４（１９８４），４９４〜４９９ページ。
　【０１０２】
　４５．Ｈｙｎｅｓ　Ｍ．Ｊ．，Ｃｏｒｒｉｃｋ，Ｃ．Ｍ．＆　Ｋｉｎｇ，Ｊ．Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｃｌｏｎｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｍｄＳ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３（１９８３），１４３０〜１４３９ページ。
　４６．Ｃａｓａｄａｂａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ａｒｉａｓ，Ａ．，Ｓｈａｐｉｒａ，Ｓ．Ｋ．＆Ｃｈｏｎ，Ｊ．，β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ａｎａｌｙｚｉｎｇ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　ｙｅａｓｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００Ｂ（１９８３），２９３〜３０８ページ。
　【０１０３】
　４７．Ｒａｅｄｅｒ，Ｕ．＆Ｂｒｏｄａ，Ｐ．，Ｒａｐｉｄ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉ．Ｌｅｔｔ．ｉｎ　Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１（１９８５）１７〜２０ページ。
　４８．Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．＆Ｏｋｓａｎｅｎ，Ｊ．，Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｏｎ　ｎｏｎ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ　ｍｅｄｉａ．Ｔｈｉｒｄ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｕｎｉｃｈ　１０−１４　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１９８４．Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，ｖｏｌ　ＩＩ，１５７〜１６２ページ。
　【０１０４】
　４９．Ｓｏｌｌａｚｚｏ，Ｍ．，Ｆｒａｎｋ，Ｒ．＆　Ｃｅｓａｒｅｎｉ，Ｇ．，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＲＮＡｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｃｉｓｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｄｉｎｇ−ｔｏ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｓ．Ｇｅｎｅ３７（１９８５），１９９〜２０６ページ。
　５０．　Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｓｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２（１９８５），４８８〜４９２ぺージ。
　【０１０５】
　５１．Ｊｏｈｎ，Ｍ．Ａ．＆　Ｐｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．Ｆ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｒｇＢ　ｇｅｎｅ．Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６（１９８４），３８６〜３８９ページ。
　５２．Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｒｚｙｂｙｌａ，Ａ．Ｅ．，ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｒ．Ｊ．＆Ｒｕｔｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｆｒｏｍｓｏｕｒｃｅｓ　ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｉｎ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８（１９７８），５２９４〜５２９９ページ。
　【０１０６】
　５３．Ｔｒｕｅｌｓｅｎ，Ｅ．，Ｇａｕｓｉｎｇ，Ｋ．，Ｊｏｃｈｉｍｓｅｎ，Ｂ．，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｐ．＆Ｍａｒｃｋｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｌｅｇｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．６（１９７９），３０６１〜３０７２ページ。
　５４．Ｂｅｒｓｅ，Ｂ．，Ｄｍｏｃｈｏｗｓｋａ，Ａ．，Ｓｋｒｚｙｐｅｋ，Ｍ．Ｗｅｇｌｅｒｉｓｋｉ，Ｐ．，Ｂａｔｅｓ，Ｍ．Ａ．＆Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ　ｃａｒｂａｍｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ．Ｇｅｎｅ２５（１９８３），１０９〜１１７ページ。
　【０１０７】
　５５．Ｆｉｎｃｈａｍ，Ｊ．Ｒ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｆｕｎｇａｌ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ　ｖｏｌ．４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ｐ．６３９，Ｆｏｕｒｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７９．
　５６．Ｄｏｉ，Ｙ．，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ．ＩＩ．Ｈｙｐｏｃｒｅａ　ｄｉｃｈｒｏｍｏｓｐｏｒａ　ｓｐ．ｎｏｖ．ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｔａｔｅ．Ｂｕ１１．Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｍｕｓ．Ｔｏｋｙｏ　１１（１９６８），１８５〜１８９ページ。
　【０１０８】
　５７．Ｂｅｊａ　ｄａ　Ｃｏｓｔａ，Ｍ．＆Ｖａｎ　Ｕｄｅｎ，Ｎ．，Ｕｓｅ　ｏｆ　２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｗｉｔｈ　ｅｎｈａｃｅｄβ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｇｅｎ．２２（１９８０），２４２９〜２４３２ページ。
　５８．Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．＆　Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＪ１３　ｐｈａｇｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　ｓｔｒａｉｎｓ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍ１３　ｍｐ　１８　ａｎｄ　ｐＵＣ　１９　ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ　３３（１９８５），１０３〜１１９ページ。
　【０１０９】
　５９．Ｂｏｅｌ．Ｅ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｈｊｏｒｔ，Ｉ．，Ｈｏｅｇｈ，Ｉ．＆Ｆｉｉｌ，Ｎ．Ｐ．，Ｔｗｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ．Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　３（１９８４），１５８１〜１５８５ページ。
　６０．Ｍａｒｓｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｒｆｌｅ，Ｍ．＆Ｗｙｋｅｓ，Ｅ．Ｊ．Ｔｈｅ　ｐＩＣ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ａｎｄ　ｐｈａｇｅ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｉｔｈ　ｖｅｒｓｔｉｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅｓ　ｆｏｒ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ　３２（１９８４），４８１〜４８５ページ。
　【０１１０】
　６１．Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．＆Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．，Ｔｈｅ　ｐＵＣ　ｐｌａｓｍｉｄｓ，ａｎ　Ｍ１３ｍｐ７−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｇｅｎｅ　１９（１９８２），２５９〜２６８ページ。
　６２．Ｖａｎ　Ｇｏｒｃｏｍ，Ｒ．Ｆ．Ｍ．Ｐｏｕｗｅｌｓ，Ｐ．Ｈ．，Ｇｏｏｓｅｎ，Ｔ．，Ｖｉｓｓｅｒ，Ｊ．，Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｋ，Ｈ．Ｗ．Ｊ．，Ｈａｍｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ，Ｗ．Ｋ．＆Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ．Ｇｅｎｅ　４０（１９８５），９９〜１０６ページ。
　【０１１１】
　６３．Ｎｕｍｍｉ，Ｍ．，Ｎｉｋｕ−Ｐａａｖｏｌａ，Ｍ．−Ｌ．，Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ，Ａ．，Ｅｎａｒｉ，Ｔ．−Ｍ．＆Ｒａｕｎｉｏ，Ｖ．，Ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１５（１９８３），６７７〜６８３ページ。
　６４．Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｃｈ，Ｍ．Ｋ．＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，Ｕｓｅ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｌａｒｇｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４（１９８６），５１１５ページ。
　６５．Ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｐａｕｌ　Ｔｈｏｍａｓ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｌｏｎｄｏｎ．
　【０１１２】
　６６．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．
　６７．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｃｈｙｍｏｓｉｎ　ｉｎ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　ｍｉｌｋ　β−ｋａｓｅｉｎ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　ｂｙ　Ｓｉｉｋａ−ａｈｏ，Ｍ．（１９８３）Ｍｉｋｒｏｂｉｒｅｎｎｉｉｎｉｎ　ｔｕｏｔｔａｍｉｎｅｎ，ＭＳｃ　Ｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＶＴＴ，Ｔｉｅｔｏｔｉｅ　２，０２１５０Ｅｓｐｏｏ，　Ｆｉｎｌａｎｄ．
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　これは、染色体セルラーゼ遺伝子の不活性化の原理を示す。
　【図２】
　これは、Ｔ．リーセイの染色体ＣＢＨＩ遺伝子座の挿入突然変異生成のために使用されるプラスミドｐＭＳ４の構成を示す。ＥｃｏＲＩ部位の不活性化によって生成されたフレームシフト突然変異の位置は＊によりマークされている。
　【図３】
　これは、プラスミドｐ２８５′ｐｒｏＣの構成法を示す。
　【図４】
　これは、プラスミドｐＭＴ６４８及び１５ｐＭＴ８１３の構成法を示す。
　【図５】
　これは、プラスミドｐＭＴ８３７の構成法を示す。
　【図６】
　これは、プラスミドｐＲ２７の制限地図を示す。
　【図７】
　これは、プラスミドｐＡＭＨ１００の制限地図を示す。
　【図８】
　これは、プラスミドｐＡＭＨ１０５の構成法を示す。
　【図９】
　これは、合成されたオリゴヌクレオチド、ＯＡＭＨ１，ＯＡＭＨ２及びＯＡＭＨ３を用いてループ−突然変異生成することによるプラスミドｐＡＭＨ１１０３，ｐＡＭＨ１１０６及びｐＡＭＨ１１０１の構成法を示す。
　【図１０】
　これは、リンカーＮＯＲ２０２，ＮＯＲ２０３，ＯＡＭＨ１，ＯＡＭＨ２及びＯＡＭＨ３を示す。
　【図１１】
　これは、プラスミドｐＡＭＨ１０２及びｐＡＭＨ１０４の制限地図を示す。
　【図１２】
　これは、プラスミドｐＡＭＨ１１０３の制限地図及びｐＡＭＨ１０３の構成法を示す。
　【図１３】
　これは、プラスミドｐＡＭＨ１１０６の制限地図及びｐＡＭＨ１０６の構成法を示す。
　【図１４】
　これは、プラスミドｐＡＭＨ１１０１の制限地図及びｐＡＭＨ１０１の構成法を示す。
　【図１５】
　これは、プラスミドｐＡＭＨ１１０の構成法を示す。
　【図１６】
　これは、ＣＧＨＩプロモーター機能下でＥＧＩの発現のために使用されるプラスミドｐＡＭＨ１１１の構成法を示す。
　【図１７】
　これは、Ｔ．リーセイにおけるキモシンの発現を示す。ウェスターンプロットレーン１；精製されたプロキモシンの対照、微量のプスウドウキモシン及びキモシンを含む、レーン２；ｐＡＭＨ１０２を含む株の増殖からの培養上清液、レーン３；プラスミドを含まない株からの培養上清液、レーン４；ｐ　ＡＭＨ１０２を含む株からの菌糸体。これは、図面に代わる写真である。