【事件の表示】
　特許第２７３８９４７号「抗原組成物およびそれらの製法および用途」の請求項１ないし１４に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２７３８９４７号の請求項１ないし１４に係る特許を維持する。
【理由】
Ｉ　手続の経緯
　本件特許第２，７３８，９４７号の発明は、平成１年２月１７日（パリ条約による優先権主張、１９８８年２月１８日、米国）に出願されたものであり、平成１０年１月１６日に設定登録されたものである。
　本件特許について、申立人伊藤礼子より特許異議の申立があった。取消理由が通知され、それに対して平成１１年８月２３日付で意見書および訂正請求書が提出された。
２．訂正の適否の検討
　前記訂正請求書による訂正の適否について以下検討する
（１）訂正事項
　訂正事項▲１▼：
　明細書１５頁９行（特許公報７欄１３行）の「濃化」を「精製または純化」と訂正する。
　訂正事項▲２▼：
　明細書１５頁１５行（特許公報７欄１８〜１９行）の「「濃化」」を「精製または純化」と訂正する。
（２）訂正の目的
　上記訂正事項▲１▼および▲２▼は、ともに明りょうでない記載の釈明を目的にしているものといえる。
（３）明細書の記載事項の範囲内
　上記訂正事項▲１▼および▲２▼は、いずれも本件特許明細書の記載事項の範囲内であることは明らかである。
（４）拡張・変更
　上記訂正事項▲１▼および▲２▼は、いずれも、特許請求の範囲を拡張するものでなく、また、変更するものでもない
（５）訂正適否の検討結果
　以上述べたとおり、本件訂正は、特許法１２０条の４の２項および３項の規定に適合する。
３．本件発明
　本件特許は、本件訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１〜１４に記載された各発明に係るものである。これらの発明は、各請求項の記載事項により構成される。
　本件の特許請求の範囲は、次のとおりである。
　【特許請求の範囲】
　【請求項１】
　ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで電気泳動した場合、６３０００、５７０００および３１０００ダルトンのバンドに解離する、高濃度に精製されたカンピロバクター・ピロリの表面抗原を含むことを特徴とする、カンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在検出用抗原組成物。
　【請求項２】
　（Ａ）カンピロバクター・ピロリから表面抗原を切り取り、（Ｂ）この表面抗原を精製して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで電気泳動した場合、６３０００、５７０００および３１０００ダルトンのバンドに解離するように純化して得られる、カンピロバクター・ピロリ抗原を含むことを特徴とする、カンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在検出用抗原組成物。
　【請求項３】
　（Ａ）試験試料を、抗カンピロバクター・ピロリ抗体の存在下において、抗原／抗体複合体を形成する請求項１または２に記載の抗原組成物と接触させ、その後（Ｂ）工程（Ａ）で形成された上記抗原／抗体複合体の量を測定することを特徴とする、試験試料中の抗カンピロバクター・ピロリ抗体の検出方法。
　【請求項４】
　（Ａ）胃炎または消化性潰瘍疾患について試験すべき患者から得られた体液試料を、カンピロバクター・ピロリ抗体の存在下において、抗原／抗体複合体を形成する請求項１または２に記載の抗原組成物と接触させ、その後（Ｂ）工程（Ａ）で形成された上記抗原／抗体複合体の量を測定することを特徴とする、胃炎または消化性潰瘍疾患の検出方法。
　【請求項５】
　請求項１または２記載の抗原組成物、この抗原組成物をカンピロバクター・ピロリに対する抗体を含む疑いのある試料と接触させ、この試料が当該抗体を含む場合、抗原／抗体複合体を形成させるための手段、形成された抗原／抗体複合体の量を測定する手段を含むことを特徴とする、カンピロバクター・ピロリに対する抗体の検出用診断キット。
　【請求項６】
　請求項１または２記載の抗原組成物、この抗原組成物をカンピロバクター・ピロリに対する抗体を含む疑いのある体液試料と接触させ、この試料が当該抗体を含む場合、抗原／抗体複合体を形成させるための手段、形成された抗原／抗体複合体の量を測定する手段を含むことを特徴とする、胃炎または消化性潰瘍性疾患の検出用診断キット。
　【請求項７】
　測定手段が標識抗−ＩｇＭを含むものである、請求項５記載のキツト。
　【請求項８】
　測定手段が標識抗−ＩｇＭを含むものである、請求項６記載のキツト。
　【請求項９】
　抗原組成物が、基質上に固定化されている、請求項５記載のキツト。
　【請求項１０】
　抗原組成物が、基質上に固定化されている、請求項６記載のキツト。
　【請求項１１】
　血液または血清試料が、少なくとも１：５００に希釈されている、請求項３記載の方法。
　【請求項１２】
　血液または血清試料が、少なくとも１：５００に希釈されている、請求項４記載の方法。
　【請求項１３】
　抗原／抗体複合体をＩｇＭ特異的標識第２抗体を使用して測定する、請求項３記載の方法。
　【請求項１４】
　抗原／抗体複合体をＩｇＭ特異的標識第２抗体を使用して測定する、請求項４記載の方法。
４．特許異議の申立
４．１　引用刊行物
（１）刊行物１：　Ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｌｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，　１，２０９−２１７（１９８７）
（２）刊行物２：　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　１３３，１６３−１７０（１９８７）
（３）刊行物３：　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ，　Ａｐｒｉｌ　２０，１９８５
４．２　申立の理由の概要
　申立人伊藤礼子の申立の概要は、以下のとおりである。
（１）特許法２９条１項違反
　本件請求項１〜請求項６の各発明は、上記刊行物１に記載された発明である。したがって、これらの各発明に係る特許は、特許法２９条１項の規定に違反してされたものである。
（２）特許法２９条２項違反
　本件請求項１〜請求項１４の各発明は、上記刊行物１〜刊行物３に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。したがって、本件請求項１〜請求項１４の各発明に係る特許は、特許法２９条２項の規定に違反してされたものである。
（３）特許法３６条要件不充足
　本件請求項１〜請求項２の発明について、明細書の記載に不備がある。本件請求項１〜請求項２の発明に係る特許は、特許法３６条に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。
５．　刊行物の記載事項
５．１　刊行物１の記載事項
　刊行物１は、「　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの表面タンパク抗原に応答するヒト血清抗体」という表題の学術論文である。次の事項が記載されている。
（１ａ）表面タンパク抗原（２０９頁アブストラクト１行〜５行）
「　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの表面タンパク抗原は、胃十二指腸疾患の感染患者からの血清を用いたウエスタンブロッティング及び放射免疫沈降法により同定された。単一の共通表面タンパク抗原はすべての血清で検出されなかったが、６１ｋＤａ、５６ｋＤａ、５４ｋＤａ、４８ｋＤａ、３１ｋＤａのタンパク質を含む多数の主要な抗原が観察された。」
（１ｂ）　酸抽出物（２０９頁アブストラクト９行〜１１行）
「　酸性条件下にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉｄｉｓから抽出可能な抗原物質は、種特異的６１ｋＤａ及び３１ｋＤａのタンパク質を含む多数の表面抗原を含み、高度に交差反応性の５４ｋＤａ抗原のレベルは減少した。」
（１ｃ）　５４ｋＤａ抗原；鞭毛抗原
「　Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓとＣ．ｊｅｊｕｎｉの抗原性交差反応は、ウサギ抗血清を用いて明らかにされたが、これは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉの６２ｋＤａ鞭毛タンパク質、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの主要５４ｋＤａタンパク質および微量５６ｋＤａタンパク質に共通の抗原によるところが大きい。Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓにおけるこれらの共通抗原は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉとＣ．ｃｏｌｉの鞭毛に対して作製したＣＦ５モノクローナル抗体によっても検出可能である。このことから、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの５４ｋＤａタンパク質は鞭毛タンパク質であると思われる。Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓやＣ．ｊｅｊｕｎｉに感染した患者の血清においてもこれらのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ間における有意な抗原性交差反応が示された。繰り返しになるが、ここでみられた交差反応性も、主に、鞭毛のものと推定されるタンパク質によるものと思われた。」
（１ｄ）　６１および３１ｋＤａ抗原；酸抽出物
「　しかし、６１および３１ｋＤａタンパク質は、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓに特異的であり、ウサギやヒトの抗Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ抗血清には反応しないことが示されている主要な表面抗原である。これらの抗原は、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの酸抽出物ではこれらの抗原の濃度がより高い。さらに、この酸抽出物では、総タンパク質のプロフィールおよび外膜調製物に比べて５４ｋＤａ抗原の高い交差反応性は低下した。それにもかかわらず、ＥＬＩＳＡ法およびウェスタンブロット法により、ヒト抗Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ抗血清とＣ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの酸抽出物との間にはある程度の交差反応性が示される。このような交差反応性が認められているにも関わらず、酸抽出物を用いて血清中の抗Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓ抗体を検出する重要な免疫分析法が確立された。」
（１ｅ）　精製
「　酸抽出物に含まれる数種の種特異性タンパク質の抗原、特に６１および３１ｋＤａタンパク質が精製されれば、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓ感染症における血清診断法の特異性および感受性は高められるであろう。現在、モノクローナル抗体を用いてこれらの抗原の単離、精製および性質の研究が進められている。」
５．２　刊行物２
　刊行物２は、「Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの外膜タンパク質の同定およびＣ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓ／Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ間の抗原交差反応」という表題の学術論文である。次の事項が記載されている。
（２ａ）　Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓのタンパク質
「　Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの外膜タンパク質および表面タンパク質を１２５Ｉ−表面標識法および外膜タンパク質画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した。これらの方法は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの他の細菌における外膜タンパク質および表面タンパク質の同定に既に用いられている（Ｌｏｇａｎ＆Ｔｒｕｓｔ，１９８２；Ｂｌａｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８３；Ｎｅｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９８４）。本Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓ株の総タンパク質のプロフィールはＭｅｇｒｏｕｄ　ｅｔａｌ．（１９８５）が報告したものと似ていた。Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓには主要な外膜タンパク質は観察されなかった。同様に１２５Ｉ−標識された主要な表面タンパク質は観察されなかった。１２５Ｉ−標識された表面タンパク質の多くは外膜構成タンパク質ではなく周囲に付着したタンパク質であった。６１ｋＤａおよび３１ｋＤａの外膜タンパク質は表面に露出したタンパク質であった。」
（２ｂ）　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属
「　好温性ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒであるＣ．ｊｅｊｕｎｉおよびＣ．ｃｏｌｉの特徴は表面タンパク質が１種類（４２−４７ｋＤａ）であることであるが、Ｃ．ｆｅｔｕｓには２種類の特徴的な外膜タンパク質がある（Ｌｏｇａｎ＆Ｔｒｕｓｔ，１９８２　Ｂｌａｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８３；Ｎｅｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９８４）。Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓには他のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒにみられた主要な外膜タンパク質に相当するタンパク質が存在しないようである。形態、脂肪酸および抗生物質への感受性にみられる顕著な違いから、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属にみられるＧＣＬＯ−１が（Ａｎｏｎ，１９８５）Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓに存在することは疑問視されてきた（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８５；Ｇｏｏｄｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８５，１９８６）。しかし、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓにみられる他の性質（Ｗａｉｔ＆Ｈｕｄｓｏｎ，１９８５；Ｍａｒｓｈａｌ　ｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９８４；Ｍｅｇｒａｕｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９８５）はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの定義と一致する（Ｓｍｉｂｅｒｔ，１９７８）。」
（２ｃ）　鞭毛タンパク質
　機械的に分離したＣ．ｊｅｉｕｎｉの鞭毛から６２ｋＤａの鞭毛タンパク質が同定されたとの報告は既にある。さらにこの鞭毛タンパク質は、外膜タンパク質調製物および外膜画分の酸抽出物の両者の主要構成物質であった。Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの鞭毛タンパク質では同様の方法を用いても決定的な同定は行えなかった。Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの鞭毛調製物のタンパク質プロフィールは複雑であり、泳動に影響を及ぼすと思われるタンパク質が含まれている。このような混乱は、泳動ゲル内のイオン強度の変動や、膜脂質などのタンパク質以外の物質との関連という他の調製物にはみられない影響によるものと思われる。多くの鞭毛調製物を始めとする不定形な物質は、有鞘鞭毛の末端泡に由来することが明らかになった。反対に、機械的分離操作を行っても破壊されずに残った鞭毛や鞭毛断片は、これらＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属における外膜の主要構成物質である（Ｎｅｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９８４）。Ｇｏｏｄｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８５）の形態学的研究から、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの鞭毛鞘は外膜から伸びていることが示されている。外膜タンパク質および鞭毛調製物のタンパク質プロフィールはこの報告と一致しないが、細胞表面に付着する”ドーナッツ状”粒子が鞭毛調製物にみられることは稀である（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８５）。Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの鞭毛は他のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの鞭毛とは形態学的（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８５；Ｇｏｏｄｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８５）および化学的に明らかに異なるものである。それにもかかわらず、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの鞭毛にはかなり顕著な異種間抗原性交差反応が認められる。抗Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ鞭毛抗血清は、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの鞭毛調製物および酸抽出物に認められる２種類以上のタンパク質に免疫学的反応を示す。さらに、これらのタンパク質は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉの６２ｋＤａ鞭毛タンパク質に対して作製され（Ｎｅｗｅｌｌ，１９８６ａ）、ほとんどのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種の鞭毛に対し交差反応を示す（Ｎｅｗｅｌｌ，１９８６ｂ）ＣＦ５モノクローナル抗体によっても標識される。」
（２ｄ）　６１ｋＤａタンパク質
「　６１ｋＤａタンパク質は、抗Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓウサギ抗血清により検出されるＣ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの主要抗原の一つである。この抗血清は抗Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ抗血清には交差反応性を示さない。予備的証拠から、６０−６２ｋＤａタンパク質は、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓに感染した患者の血清を用いたイムノブロットおよび放射線免疫沈降により検出可能な主要抗原であることが示されている（Ｎｅｗｅｌｌ，１９８５）。従って、６１ｋＤａタンパク質はＥＬＩＳＡ法の特異性および感受性を増強する抗原の候補の１つであるといえる。６１ｋＤａタンパク質はＣ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓの酸抽出物に豊富に含まれ、抗Ｃ．ｊｅｊｕｎｉウサギ抗血清に対する交差反応性が全細胞破砕物に比べて有意に低い。現在、胃炎患者を対象に抗Ｃ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓ抗体の特異的反応性を検出することを目的として、酸抽出物を用いたＥＬＩＳＡ法による研究を行っている。」
５．３　刊行物３
　刊行物３は、「消化性潰瘍患者におけるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｐｒｉｏｒｉｄｉｓへの免疫応答性」という表題の学術論文である。次の事項が記載されている。
（３ａ）　酵素結合検定法（ＥＬＩＳＡ法）
「　１９８３年にＷａｒｒｅｎ＆Ｍａｒｓｈａｌｌが胃粘膜から単離した未同定の湾曲したかん菌（ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ様細菌、ＣＬＯ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉｄｉｓ）について初めて報告して以来、この細菌と消化性潰瘍との関連性について高い関心が持たれてきた。頻度は低いものの類似の細菌が健常人からも検出されているので、この細菌が消化性潰瘍患者において果たす役割は単に日和見的なものである可能性がある。我々は酵素結合検定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて、消化性潰瘍患者を対象にＣ．ｐｙｌｏｒｉｄｉｓに特異的な抗体の測定を行った。」
（３ｂ）　細菌抗原
「　症候性患者から内視鏡により採取し、ウマ血液寒天培地にて増殖させた１２株の細菌を用いた。細菌は、濃い乳状懸濁液として回収し、６０℃で加熱殺菌、超音波による破砕後、ミクロタイタープレートのプレコーティング用アジ化ナトリウムを用いて保存した。試験に使用した抗原および標識抗体の濃度はチェッカーポード滴定により求めた。塩化ポリビニル製の使い捨て可擬性ミクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、試験用には０．１％アジ化ナトリウム含有６０ｍｍｏｌ／ｌ炭酸緩衝液（ＰＨ９．６）に希釈した細菌抗原１００μｌを、対照には炭酸緩衝液のみを加えてコーティングした。」
６．請求項１発明と刊行物１発明との対比
　ここで、本件請求項１発明と刊行物１発明とを対比する。
６．１　刊行物１発明との対応関係
　刊行物１には、「酸抽出物」をカンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在検出用抗原組成物とする発明が記載されている（前記（１ｄ）参照）。
　刊行物１発明の「酸抽出物」は、酸性条件下にカンピロバクター・ピロリから抽出可能な抗原物質であり、種特異的６１０００および３１０００ダルトンのタンパク質を含む多数の表面抗原を含むものである（前記（１ｂ）参照）。
６．２　刊行物Ａ発明との一致点
　そうすると、本件請求項１発明は、刊行物Ａ発明と次の点で一致する。
（一致点）
　カンピロバクター・ピロリの表面抗原を含むことを特徴とする、カンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在検出用抗原組成物。
６．３　刊行物１発明との相違点
　そして、本件請求項１発明は、刊行物１発明と次の点で一応相違する。
（相違点）
　本件請求項１発明の表面抗原が、高濃度に精製されたカンピロバクター・ピロリの表面抗原であり、この表面抗原はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した場合、６３０００、５７０００および３１０００ダルトンのバンドに解離するものであるのに対し、刊行物１発明の表面抗原は、酸抽出物であり、この表面抗原は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで６３０００、５７０００および３１０００ダルトンのバンドに解離する表面抗原になるように、高濃度に精製することが記載されていない点。
６．４　相違点についての検討
　そこで、この相違点について検討する。
　本件請求項１発明の、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥで６３０００、５７０００および３１０００ダルトンのバンドに解離する」「高濃度に精製された」表面抗原は、本件明細書の実施例８では（特許公報１９欄参照）、カンピロバクター・ピロリ株由来の鞭毛調整物を、ゲルろ過クロマトグラフィー・カラムに通すことにより精製しているものである。１００分間にわたる分画のうち初回ピークは２０ないし３０分間にカラムを通過し、他のピークは６０分後に通過するものである。この初回ピークは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで６３０００、５７０００および３１０００ダルトンのバンドにのみ解離するものである。
　この鞭毛調整物のゲルろ過分画は、抗原として５株音波処理物を用いたものと比較して、ＥＬＩＳＡの診断効率において、遜色がない（第５表、特許公報２０欄、参照）。
　本件明細書によれば、先行技術における抗体の検出は、広範囲な臨床用途に適った実用的有用性および正確さを提供しうる特異的抗原組成物は同定されなかったのである（特許公報４欄１１行〜１５行参照）。そして、先行技術においては、充分な感度と不充分な特異性とが同時に見られることが多く、その逆も同様である（特許公報４欄２６行〜３０行）。
　刊行物１では、鞭毛に由来する５４ｋＤａ抗原は交差反応性を示す好ましくない抗原として記載している。そして、刊行物１の「酸抽出物」は、６１ｋＤａおよび３１ｋＤａの濃度が高く、この５４ｋＤａ抗原による交差反応性は低下しているものであるが、ある程度の交差反応性を示すものである（前記（１ｄ）参照）。
　そうすると、刊行物１の「酸抽出物」は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで６３０００、５７０００および３１０００ダルトンのバンドに解離する表面抗原になるように、実質的に高濃度に精製されているものということはできない。
　したがって、本件請求項１発明は、刊行物１発明と同一ということはできない。
６．５請求項２〜請求項６の発明
　本件請求項２〜請求項６の各発明は、本件請求項１の発明と同様に、刊行物１発明と前記相違点において相違する。
　したがって、本件請求項２〜請求項６の各発明は、刊行物１発明と同一ということはできない。
６．６　申立理由（１）についての検討結果
　以上検討したように、本件請求項１〜請求項６の各発明は、刊行物１発明と同一ということはできない。
　したがって、本件請求項１〜請求項６の各発明に係る特許が特許法２９条１項の規定に違反してされたものであるとする、申立は理由がない。
７．申立理由（２）について
　本件請求項１〜請求項１４の各発明は、刊行物１発明と前記相違点において相違する。
　この相違点について検討する。
　刊行物２には、６１ｋＤａタンパク質が、カンピロバクター・ピロリの主要抗原の一つであり、ＥＬＩＳＡ法の特異性および感受性を増強する抗原の一つであること、カンピロバクター・ピロリの酸抽出物に豊富に含まれること、が記載されている（前記（２ｄ）参照）。
　そして、刊行物２には、カンピロバクター・ピロリの鞭毛タンパク質では決定的な同定は行えなかったこと、カンピロバクターの鞭毛にはかなり顕著な異種間抗原性交差反応が認められること、が記載されている（前記（２ｃ）参照）。
　刊行物３には、患者から採取した、カンピロバクター・ピロリ抗原を含む、カンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在検出用の抗原組成物が記載されている（前記（３ａ）〜（３ｂ）参照）。
　しかしながら、刊行物２〜刊行物３にも、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥで６３０００、５７０００および３１０００ダルトンのバンドに解離する」「高濃度に精製された」表面抗原は、記載されていない。
　そして、本件発明は、この相違点の構成により、明細書に記載された顕著な効果を奏するものである。
　そうすると、本件請求項１〜請求項１４の各発明は、刊行物１〜刊行物３に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということができない。
　したがって、本件請求項１〜請求項１４の各発明に係る特許が特許法２９条２項の規定に違反してされたものであるとする、申立は理由がない。
８．申立理由（３）について
　申立人は、請求項１の「高濃度に精製」、請求項２の「精製して純化した」は意味が不明りょうである、と主張している。
　用語「高濃度」「精製」「純化」は、いずれも意味が不明りょうということはできない。
　請求項１〜請求項２の「精製」は、実施例では、前述したように（前記６．４参照）、ゲルろ過クロマトグラフィー・カラムに通すことにより行われているものであり、この精製が当業者が容易に実施し得るように明細書に記載されているといえる。
　したがって、本件特許が特許法３６条の要件を満たしていない特許出願に対してされたものであるとする、申立は、理由がない。
９．むすび
　以上述べたように、本件特許異議申立の理由によっては、本件請求項１〜請求項１４の各発明に係る特許を取り消すことができない。
　また、他に本件請求項１〜請求項１４の各発明に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年９月１６日（１９９９．９．１６）
【訂正の要旨】
　　　　　　　　　　　　　訂正の要旨
　明りょうでない記載の釈明を目的にして、下記訂正事項▲１▼〜▲２▼について訂正する。
　訂正事項▲１▼：
　明細書１５頁９行（特許公報７欄１３行）の「濃化」を「精製または純化」と訂正する。
　訂正事項▲２▼：
　明細書１５頁１５行（特許公報７欄１８〜１９行）の「「濃化」」を「精製又は純化と訂正する。
（５４）【発明の名称】
抗原組成物およびそれらの製法および用途
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで電気泳動した場合、６３０００、５７０００および３１０００ダルトンのバンドに解離する、高濃度に精製されたカンピロバクター・ピロリの表面抗原を含むことを特徴とする、カンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在検出用抗原組成物。
　【請求項２】　（Ａ）カンピロバクター・ピロリから表面抗原を切り取り、（Ｂ）この表面抗原を精製して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで電気泳動した場合、６３０００、５７０００および３１０００ダルトンのバンドに解離するように純化して得られる、カンピロバクター・ピロリ抗原を含むことを特徴とする、カンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在検出用抗原組成物。
　【請求項３】　（Ａ）試験試料を、抗カンピロバクター・ピロリ抗体の存在下において、抗原／抗体複合体を形成する請求項１または２に記載の抗原組成物と接触させ、その後（Ｂ）工程（Ａ）で形成された上記抗原／抗体複合体の量を測定することを特徴とする、試験試料中の抗カンピロバクター・ピロリ抗体の検出方法。
　【請求項４】　（Ａ）胃炎または消化性潰瘍疾患について試験すべき患者から得られた体液試料を、カンピロバクター・ピロリ抗体の存在下において、抗原／抗体複合体を形成する請求項１または２に記載の抗原組成物と接触させ、その後（Ｂ）工程（Ａ）で形成された上記抗原／抗体複合体の量を測定することを特徴とする、胃炎または消化性潰瘍疾患の検出方法。
　【請求項５】　請求項１または２記載の抗原組成物、この抗原組成物をカンピロバクター・ピロリに対する抗体を含む疑いのある試料と接触させ、この試料が当該抗体を含む場合、抗原／抗体複合体を形成させるための手段、形成された抗原／抗体複合体の量を測定する手段を含むことを特徴とする、カンピロバクター・ピロリに対する抗体の検出用診断キット。
　【請求項６】　請求項１または２記載の抗原組成物、この抗原組成物をカンピロバクター・ピロリに対する抗体を含む疑いのある体液試料と接触させ、この試料が当該抗体を含む場合、抗原／抗体複合体を形成させるための手段、形成された抗原／抗体複合体の量を測定する手段を含むことを特徴とする、胃炎または消化性潰瘍性疾患の検出用診断キット。
　【請求項７】　測定手段が標識抗−ＩｇＭを含むものである、請求項５記載のキット。
　【請求項８】　測定手段が標識抗−ＩｇＭを含むものである、請求項６記載のキット。
　【請求項９】　抗原組成物が、基質上に固定化されている、請求項５記載のキット。
　【請求項１０】　抗原組成物が、基質上に固定化されている、請求項６記載のキット。
　【請求項１１】　血液または血清試料が、少なくとも１：５００に希釈されている、請求項３記載の方法。
　【請求項１２】　血液または血清試料が、少なくとも１：５００に希釈されている、請求項４記載の方法。
　【請求項１３】　抗原／抗体複合体をＩｇＭ特異的標識第２抗体を使用して測定する、請求項３記載の方法。
　【請求項１４】　抗原／抗体複合体をＩｇＭ特異的標識第２抗体を使用して測定する、請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
［発明の背景］
（産業上の利用分野）
　この発明は、カンピロバクター・ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）に特異的な抗体の存在または不存在の検出方法、さらに特定すればカンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在の検出および／またはある種の胃腸疾患の診断を目的とする新規抗原組成物の臨床用途に関するものである。
　消化性潰瘍疾患、胃炎および他の炎症性胃十二指腸状態は、全世界に共通する疾病である。多くの研究により、カンピロバクター・ピロリ感染の存在および消化性潰瘍疾患またはＢ型胃炎（最も一般的な胃炎形態）に伴う苦痛の間に相関関係の存在することが示されている。それ故、胃腸の症状を訴える患者にカンピロバクター・ピロリ感染が存在するか否かを測定することは、その症状が胃炎または消化性潰瘍に由来するものであるという見込みの決定に有用であり得る。
（従来の技術）
　カンピロバクター・ピロリの多くの現行診断方法は、費用が高くつき、臨床環境では実施困難であり、過度な時間浪費および／または患者に不当な侵襲性および不快さをもたらすものである。例えば、一試験では、組織のバイオプシーを得るために管を口から入れて胃または十二指腸に通す必要がある。別の試験では、尿素を含有する溶液を消費した患者の呼吸において放出された二酸化炭素の増加を測定する（カンピロバクター・ピロリは酵素ウレアーゼを含む。この酵素は分解された尿素から二酸化炭素を放出させる）。この差異の検出には高価な器械類が必要とされる。炭素１４標識尿素を用いる類似試験を行うと、さらに検出が容易な炭素１４標識二酸化炭素が生産される。しかしながら、患者を放射性同位元素に曝す必要があるため、この試験は望ましくない。
　カンピロバクター・ピロリの感染者は、生物体に特異的な抗体を産生することが知られている。しかしながら、先行技術によるこれらの抗体の検出方法では、広範な臨床用途に適った実用的有用性および正確さを提供し得る特異的抗原組成物は同定されなかった。抗原が充分な特異性をもたないため実質的に確実にはカンピロバクター・ピロリ特異抗体のみを誘引し得ない場合、抗原／抗体複合体の形成はカンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在に関して決定的な指標とはなり得ない。逆に言えば、大部分のカンピロバクター・ピロリ株に共通したものではない抗原または強い免疫応答を発生しない抗原は、ある種の菌株に感染した患者のカンピロバクター・ピロリ特異抗体と結合し得ない。その場合、抗原／抗体複合体の形成が認められないことは、必ずしもカンピロバクター・ピロリ感染の不在を示すことにはならない。先行技術においては、充分な感度と不充分な特異性とが同時に見られることも多く、その逆も同様である。さらに、感度が低い場合には、実用的限界は試料が希釈され得る度合に左右される。それ故、不正確な陽性シグナルは、希釈度が高い場合ほど容易に排除され得ない。
（発明が解決しようとする課題）
　従って、この発明の目的は、カンピロバクター・ピロリ感染の存在に関する高特異性および高感度診断試験の提供である。
　この発明の別の目的は、カンピロバクター・ピロリに対する特異抗体を特異的および高感度で誘引および結合する抗原組成物の提供である。
　この発明の別の目的は、比較的非侵襲性であり、患者に殆ど不快感を与えない胃腸症状の診断における補助手順の提供である。
　この発明の別の目的は、臨床または家庭環境での投与が簡単であり、迅速に評価され得る、費用効率の優れたカンピロバクター・ピロリの存在に関する臨床診断試験の提供および前記診断試験実施用キットの提供である。
　この発明の別の目的は、カンピロバクター・ピロリ感染を低減または排除すべく設計された処置の有効性をモニターする手段の提供である。
　この発明の別の目的は、感度が充分高いため高度希釈試料の使用が可能な診断試験の提供である。
（発明の構成）
　前述および他の目的は、カンピロバクター・ピロリの少なくともフラグメントを含み、独特の抗体応答を呈し、かつ大部分のカンピロバクター・ピロリ株に共通した少なくとも１種のフラグメントを高濃度で有し、非感染個体に存在する抗体により実質的に認識されない程度の充分な独自性を呈する抗原組成物を提供することにより達成される。「少なくともフラグメント」なる語は、無傷の細菌、すなわち完全な有機体がその断片部分と同様に使用され得ることを意味する。この発明のある態様では、組成物は、６３０００、５７０００、４５０００および３１０００ダルトンのフラグメントから成る群から選ばれる少なくとも１種のフラグメントを多く含む。別の態様では、抗原組成物は、カンピロバクター・ピロリ鞭毛の少なくともフラグメントを高濃度で有する。別の態様では、抗原組成物は、発明者の認識番号８４−１８０、８４−１８２、８４−１８３、８６−６３および８６−８６で示される５種の単離体から成る群から選ばれる少なくとも１種のカンピロバクター・ピロリ株の少なくともフラグメントを含有する。前記単離体は、この特許出願の出願に先んじて、１９８８年２月１６日またはそれ以前にメリーランド２０８５２、ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にそれぞれ５３７２２、５３７２５、５３７２６、５３７２７および５３７２１の番号で寄託された（以後、「寄託菌株」として集合的に称する）。この寄託は、アメリカ合衆国特許法、ブダペスト条約並びに他の適用可能な法律および規制に従い寄託物の永続性を保証し、容易に利用できるものである。
　個々および互いに組み合わせた形の特定抗原を共に含む上記抗原組成物は、カンピロバクター・ピロリ特異抗体と結合し得る抗原組成物として作用する。これらの抗原組成物は、感染している特定菌株とは関係無く殆ど全てのカンピロバクター・ピロリ感染個体系に存在する抗体と複合体を形成し易い。さらに、これらの抗原は、非感染個体の体液に存在する抗体により認識されにくい。強い抗体検出能を示す組成物に好適な特定抗原には、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以後、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と称す）後の見かけの分子量が約６３０００、５７０００、４５０００および３１０００ダルトンであるカンピロバクター・ピロリ・フラグメントがあるが、これらに限定される訳ではない。ここに報告された見かけの分子量は全て、リソチーム１４４００ダルトン、大豆トリプシン阻害物質２１５００ダルトン、炭酸脱水酵素３１０００ダルトン、卵アルブミン４５０００ダルトン、うし血清アルブミン６６２００ダルトン、ホスホリラーゼＢ９２５００ダルトン、ベータ・ガラクトシダーゼ１１６２５０ダルトンおよびミオシン２０００００ダルトンといった分子量標準の相対電気泳動移動に基づく検量線から算出されたものである。この検量線を使用すると、一般にこの分子量領域では約１０００ダルトン前後の分子量の限定が可能である。ドデシル硫酸ナトリウム（以後、「ＳＤＳ」と称す）、ジチオトレイトールおよびグリセリンを含む緩衝液中で５分間沸騰させた後１−２μｇの試料を各レーンに適用する。分離ゲルは１０％アクリルアミドであり、電気泳動は８℃の恒温で２時間３５ミリアンペアで行なわれる。バンドは銀染色を用いて分離される。ある好ましい態様において、カンピロバクター・ピロリの単離された鞭毛および特に各々約６３０００、５７０００および３１０００ダルトンの見かけの分子量を有する前記鞭毛の単離フラグメントは、単独または互いに組み合わせた形で好みの抗原（複数も可）として使用される。寄託菌株から得られた６３０００、５７０００、４５０００および３１０００ダルトンのフラグメントは、寄託菌株のみならず殆どのカンピロバクター・ピロリにおいて見出され、それらが由来する供給源に関係無くこの発明の抗原組成物において有用である。この明細書に具体的に記載された抗原フラグメントと相同性を有する適当な合成抗原もまた使用され得る。
　この発明に従い、カンピロバクター・ピロリ特異抗体に関して試験すべき試料を、この明細書に記載された抗原組成物と接触させる。好ましい態様では、この接触の後、抗原／抗体複合体形成の程度が、試料がカンピロバクター・ピロリ特異抗体に関して陽性であることを示すいき値を越えるか否かを測定する。抗原／抗体複合体の形成は常套技術により検出される。陽性シグナル（すなわち、試料がカンピロバクター・ピロリ特異抗体を含むことを示す指標）として見なされるべき抗原／抗体複合体の検出範囲は、選択された検出手段により異なるが、一般的には陰性対照群から観察される結果からの平均値に標準偏差の１（および好ましくは３）区間を加えた値より大きい値として定義され得る。陰性対照群は、カンピロバクター・ピロリに感染した個体を含まないと思われる集団の構成員である無症候個体で構成されるべきである。例えば好ましい対照群は、１０歳未満の無症候の子供から成る群である。それらの子供らは感染していないと思われる集団を形成する。
　抗原／抗体複合体形成の好ましい検出技術には、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、間接蛍光検定法およびリポソームに基づく検定法があるが、これらに限定される訳ではない。別法として、ウエスタン・ブロット技術も使用され得る。この方法の場合視覚検分によりバンドが検出され、黒いバンドの実質的出現は陽性指標として見なされ得る。
　この発明のある好ましい態様では、この発明による抗原組成物および抗原／抗体複合体検出手段を共に含む臨床用キットが提供される。
　カンピロバクター・ピロリ感染とある種の胃疾患、例えば消化性潰瘍および胃炎間には相関関係が存在するため、これらの疾患は、この発明に従いカンピロバクター・ピロリに対する抗体に関して試験することにより診断され得る。さらに、カンピロバクター・ピロリ感染の処置後の抗体に関する追跡試験は、この処置の経過のモニターに使用され得る。カンピロバクター・ピロリ感染は上部胃腸管の広範な身体部位に生じ得るため、この発明の検定法は、特定領域のみの試料を得る内視鏡検査およびバイオプシーにより達成され得る正確さにまで改良を加え得る。
　またこの発明のある態様では、特定抗原の濃度を高めずに生産されたカンピロバクター・ピロリのフラグメントが提供される。この場合、抗原混合物を固定し、次いで試料と接触させ、さらに固相酵素免疫検定法またはリポソームに基づく検定法により抗原／抗体複合体形成の程度を測定する。この手順の場合、この明細書に記載された好ましい抗原の１種またはそれ以上による抗原混合物の精製または純化は望ましいが、必要ではない。
　この明細書で使用されている抗原組成物は、特定抗原の濃度が、特定抗原濃度を選択的に高めることのない環境下でカンピロバクター・ピロリが抽出および断片化された結果生じる天然濃度（他の抗原に関して）を越える場合は常に１種またはそれ以上の特定抗原の濃度で精製または純化されていると考えられる。
　この明細書で使用されている「フラグメント」なる語は、細菌性抗原製造における常用技術による細菌細胞の破壊の結果生じた細菌の一部分または前記部分の合成相同体、例えば合成または組換え技法により製造されたポリペプチドを包含する。
（図面の簡単な記載）
　第１図は、カンピロバクター・ピロリに対する尿ＩｇＧ抗体を測定することによる、カンピロバクター・ピロリ感染に関して血清陽性または血清陰性であることが判っている人から得られた尿試料の差異を示す。
　第２−４図は実施例５に関するものであり、その項で説明する。
　第５図は、実施例４に関するものであり、その項で説明する。
　第６図は寄託菌株の全細胞プロフィールであり、ストリップ１−５は各々寄託菌株８６−６３（ＡＴＣＣ５３７２７）、８４−１８０（ＡＴＣＣ５３７２２）、８４−１８２（ＡＴＣＣ５３７２５）、８６−８６（ＡＴＣＣ５３７２１）および８４−１８３（ＡＴＣＣ５３７２６）を示す。
　第７図は、第６図の５種の寄託菌株のリポ多糖類プロフィールである（各レーンは第６図の場合と同じ株を示す）。
　第８図は寄託菌株のウエスタン・ブロットであり、各菌株はその特定菌株に対して生成されたうさぎ血清によりブロットされた。例えば、ストリップＡは、有機体Ａに対して生成されたうさぎ抗血清と反応した有機体Ａの全細胞フラグメントに関するものである。レーンＡ〜Ｅは、各々寄託菌株８４−１８０（ＡＴＣＣ５３７２２）、８４−１８２（ＡＴＣＣ５３７２５）、８４−１８３（ＡＴＣＣ５３７２６）、８６−６３（ＡＴＣＣ５３７２７）および８６−８６（ＡＴＣＣ５３７２１）を表す。
　第９図は５種の寄託菌株のウエスタン・ブロットであり（各レーンは第８図の場合と同じ菌株を表す）、各レーンは、相同有機体に対して生成された抗血清によりブロットされたプロテイナーゼＫ処理全細胞リゼイトを含む。蛋白質はプロテイナーゼＫにより消化されるため、第９図は主としてリポ多糖類を表す。
（好ましい実施態様）
　カンピロバクター・ピロリ抗体の含有が疑われる試料は全てこの明細書に記載された方法に従い試験され得る。好ましくは、試験される試料は、体内流体、例えば血液、血清、尿、涙液、唾液等である。医学および獣医学適用の両方が考えられる。ヒト試料に加えて、他のほ乳類、例えば非ヒト霊長動物、馬、豚などからも試料が採取され得る。記載された試験の感度が優れているため、試験前に試料を高度希釈することが可能かつ好ましい。希釈は、試料、試験される抗体および固定された抗原組成物の各々と融和性の流体を加えることにより行なわれ得る。血清が試料として使用される場合、血清は、好ましくは燐酸緩衝食塩水、ｐＨ７．０−７．４（以後、「ＰＢＳ」と称す）、ＰＢＳ含有トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（以後、「ＰＢＳ　Ｔ」と称す）、ＰＢＳ　Ｔおよびチメロサール（以後、「ＰＢＳ　ＴＴ」と称す）、ＰＢＳ　ＴＴ（ゼラチン）（以後、「ＰＢＳ　ＴＴＧ」と称す）並びにＰＢＳ　ＴＴＧおよびうしガンマグロブリン（以後、「ＰＢＳ　ＴＴＧＧ」と称す）から成る群から選ばれた１種またはそれ以上の流体により希釈され、好ましくはＩｇＧ抗体について試験する場合約１：５００〜約１：１０００、例えば約１：８００の割合で希釈される。ＩｇＡ抗体について試験する場合好ましい希釈割合は、約１：５０〜約１：２００、例えば１：１００である。ＩｇＧ試験が好ましい。
　好ましい希釈剤および希釈割合は、試験されている試料により異なり得る。例えば、尿は既に比較的希釈されており、一般的にはそれ以上希釈しない。しかしながら、他の検定において必要とされることが多い尿の濃縮は、この場合不要である。試験前に、好ましくは尿のｐＨを、抗体機能に適したｐＨ、約７．０ないし７．４に調節する。
　試料の希釈が必要とされない場合に、希釈率が高いと、カンピロバクター・ピロリ特異抗体の非存在下で重要な抗原／抗体複合体が形成されるという可能性が減じられると思われる。陽性シグナルであると考えるべき抗原／抗体複合体のいき値レベルを調節する際に希釈範囲を考慮すべきである。
　この発明により有用な抗原組成物には、５種の寄託菌株のフラグメントから単離された特定抗原、寄託菌株の中から得られた１種またはそれ以上の完全有機体およびそれらの混合物が含まれるが、それらに限定される訳ではない。例えば単離された鞭毛は、抗原組成物における有効な抗原であることが判った。蛋白質、リポ多糖類等であり得るカンピロバクター・ピロリ株の抗原フラグメントは、前述のドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳動の移動度から誘導されたそれらの見かけの分子量により同定される。
　好ましい抗原性混合物には、カンピロバクター・ピロリ株から単離された鞭毛または前記鞭毛のフラグメントおよびカンピロバクター・ピロリ株の単離フラグメントが含まれ、それらのフラグメントは、６３０００、５７０００、４５０００または３１０００ダルトンのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量を有する。５種の寄託菌株全部のプールから得られた抗原混合物は、殆ど全部のカンピロバクター・ピロリ株に存在すると思われる少なくとも１種の抗原を含むものと信じられる。それ故、広い特異性が得られるため、抗原混合物は血清学的検定において有用なものとなり得る。抗原組成物が鞭毛または前記６３０００、５７０００、４５０００もしくは３１０００ダルトンのフラグメントの少なくとも１種を高い割合で含むことが好ましい。さらに好ましくは、組成物の少なくとも５０パーセントまたはカンピロバクター・ピロリ・フラグメントの少なくとも５０パーセントは、鞭毛または具体的に分子量を示したフラグメントである。ある好ましい実施態様では、濃度は８５パーセントまたはそれ以上に達する。適用法次第では、抗原組成物が鞭毛または具体的に分子量を示したフラグメント以外の抗原を実質的に含まないのが望ましい場合もあり得る。
　抗原組成物に対しＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および適当な染色が行なわれた結果、それが興味の対象である抗原に対応する充分画定された単一バンドを呈し、他のバンドが一切視覚に現れない場合は常に、その抗原組成物は興味の対象である抗原以外の抗原を実質的に含まないものと考えられる。
　この開示は寄託されたカンピロバクター・ピロリ株由来の好ましい抗原を得るための容易な方法を提供するが、これらの抗原は、カンピロバクター・ピロリの存在に関する試験においてそれらの有効性により示された通り、大多数のカンピロバクター・ピロリ株に共通していることを強調しておく。寄託菌株およびこの明細書の記載はこれらの抗原の容易な分離方法を提供するが、ただし、この発明は、これらの抗原の使用をそれらの供給源とは関係無く広く包含するものとする。
　この発明による抗原化合物は、好ましくは常用技術を用いて基質上に固定される。例えば、ポリスチレン・プレートは、この発明に従い製造された抗原懸濁液とインキュベーションされ得る。別法として、例えば、電気泳動ゲルにおいて蛋白質バンドとして分離された抗原は、公知方法によりニトロセルロース・シートに移され得る。トウビン等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、７６：４３５０−５４（１９７９）、バーネット等、「バイオケミストリー」（Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１１２：１９５−２０３（１９８１）参照。抗原を実質的に不活性な基質と結合させる多数の他の技術も当業界では知られている。
　好ましくはこの発明による結合抗原を、カンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在に関して試験される試料を含む高度希釈流体と接触させる。抗原および試料を好ましくは少なくとも約１時間インキュベーションする。インキュベーションがヒト体温、約３７℃またはその前後で行なわれる場合、かなり短い時間が要求される。他の温度、例えば４℃でのインキュベーションもまた適しているが、一般的にさらに長いインキュベーション時間を必要とする。３７℃での好ましいインキュベーション時間は、約１０分間〜約９０分間である。次に、結合抗原をリンスすることにより、未結合抗体、すなわち前記抗原に特異的ではない抗体を全て除去すべきである。好ましくはリンス処理は、緩衝液、例えばＰＢＳＴ、ＰＢＳ　ＴＴまたはトリス／トゥイーン／塩化ナトリウム／アジドにより行なわれる。多重リンス処理が好ましい。
　インキュベーション中、カンピロバクター・ピロリ特異抗体は固定された抗原と結合することにより、抗原／抗体複合体を形成させる。未結合抗体は全てリンス工程中に実質的に除去される。この発明の抗原の特異性は高いため、カンピロバクター・ピロリに特異的ではない抗体はこの時点で実質的に除去されてしまう。勿論、試験試料がカンピロバクター・ピロリ特異抗体を含まなかった場合、固定抗原はこの時点でヒト抗体を実質的に含まず、抗原／抗体複合体に関する後続の試験は、当然前記複合体の実質的存在を示さない。他方、試験試料がカンピロバクター・ピロリ特異抗体を多く含んだ場合、これらの抗体は固定された抗原と結合して多量の抗原／抗体複合体を形成するため当然続いて検出される。
　抗原／抗体複合体の検出は、広範な種類の公知方法により達成され得る。好ましい方法には、固相酵素免疫測定法、ウエスタン・ブロット技術、間接蛍光検定法またはリポソームに基づく検定法が含まれるが、それらに限定される訳ではない。
　一般的に、固定抗原と複合体を形成するカンピロバクター・ピロリ特異抗体は、ヒト免疫グロブリンに特異的である、標識または他の手段により検出可能な第２抗体との接触により検出される。標識第２抗体は、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＡタイプ、最も好ましくはＩｇＧに属するヒト抗体に特異的であり得る。急な血清変換が疑われる場合、ＩｇＭ試験が適当であり得る。好ましくは第２抗体を約１５分間〜約２時間、好ましくは３０分間〜６０分間約２０℃〜約３７℃の温度で固定抗原とインキュベーションする。次いで、抗原を緩衝液で洗浄する（好ましくは何回も）ことにより、未結合標識抗体を全て除去する。この時点で、標識抗体は、抗原に存在するヒト免疫グロブリンに結合した場合以外は実質的に除去される。勿論、実質的にこの時点で存在するヒト免疫グロブリンのみが、当然カンピロバクター・ピロリ特異抗体である。それ故、標識第２抗体の存在または不在を測定することにより、カンピロバクター・ピロリ特異抗体の存在は間接的に測定され得る。標識検出に関する多くの公知技術が存在する。例えば、フルオレセイン標識抗体は、フルオレセイン特有の波長での放射光走査により検出され得る。別法として、酵素標識は、適当な基質とのインキュベーションおよび色変化の検査により検出される。これは視覚検査により測定され得るか、または適当な波長での分光光度計装置により自動的に読み取られ得る。例えばウエスタン・ブロッティングでは、酵素が第２抗体とコンジュゲートした場合に陽性シグナルが検出され得る。適当な基質とインキュベーションすると、この方法により分離された抗原バンドの間近に色素産物が酵素的に生成される。反応性バンドの存在は視覚検査により検出され得る。間接免疫蛍光検定法においては、フルオレセイン標識第２抗体は、蛍光活性化検出器または視覚検査により検出され得る。リポソームに基づく検定法は、その表面にカンピロバクター・ピロリ抗原が発現されるリポソームの内側にフルオレセイン、酵素または基質の存在を伴い得る。これらのリポソームを適当な希釈液中で試験すべき体液試料とインキュベーションし、充分洗浄する。抗原／抗体複合体を形成するヒト免疫グロブリンを表面に伴うリポソームは、ポリスチレン管の内壁に特定のヒトＩｇに対する第２抗体を取り込むことにより認識され得る。カンピロバクター・ピロリ抗原に結合した抗体を伴うそれらのリポソームは固定され、非固定リポソームは洗浄除去される。リポソームは、例えばデタージェントまたは補体により溶解され得るため、内部に存在した酵素または基質は、管内の溶液中で相補性基質（または酵素）と自由に反応する。生じた色素反応は、視覚検査または分光光度計による色素測定により検出され得る。別法として、存在するフルオレセインは、蛍光活性化検出器により検出され得る。
　抗原混合物（異種）に存在しない菌株に対して生成されたうさぎ抗血清を用いたこの発明のある種の抗原プールの試験は、そのプールがこれらの株に対して産生された抗体を検出し得、また相同性菌株に対して産生された抗体をも検出し得ることを示した。これは、保存抗原および異種（株特異的）抗原の両方を含む抗原プールが、血清学検定において有用であるべき広範な特異性のタイプを有することを示した。
　この発明による抗体検出の感度および特異性は、定められた集団に属する者から得られた血清を用いて測定された。最初の分析は４０名の健康な子供に関して行なわれ、抗体はＩｇＡ検定ではこの群において見出されず、ＩｇＧ検定では１回だけ見出された（第１および２表）。胃炎および消化性潰瘍疾患はこの集団では非常に稀であるためこのことは重要であり、それを陰性対照群として用いる。次いで、この集団から得られたＥＬＩＳＡ測定法における光学密度値の分布を用いることにより、陽性いき値を確立した。この検定は次に高危険度および低危険度の集団を用い結果を見越して試験されたため、これは重要である。実施例１および２は、この評価の結果を具体的に説明している。
　以下、実施例によりこの発明に関してさらに詳しく説明を行うが、それらはこの発明の非限定的実例に過ぎないものとする。
［実施例］
　実施例１
　抗原組成物における５種の全寄託菌株の音波処理物のプールされた懸濁液を用いたＩｇＧ検定。
　多様な範囲の抗原を表す５種のカンピロバクター・ピロリ株（ＡＴＣＣ寄託番号５３７２２、５３７２１、５３７２５、５３７２６および５３７２７）から抗原組成物を調製した。細菌細胞をチョコレート寒天において培養し、次いで５％が酸素、１０％が二酸化炭素、５％が水素および残りが窒素で構成される雰囲気中４８時間３５℃でインキュベーションした。培養プレートからの細胞を滅菌蒸留水中（３ｍｌ／プレート）で採取し、５０００×ｇで１０分間２５℃で２回遠心分離し、次いで滅菌蒸留水に懸濁した。各株から得られた細胞の濃度を１．５の光学密度（４５０ナノメートル）に標定し、次いで懸濁液を等容量で（各々３ｍｌ）一緒に加えた。プールした懸濁液を、ブランソン振動器（モデルＳ−７５、ブランソン・インスツルメント、ダンバリー、コネチカット）により３０秒間４回（３０秒間休止）氷上で音波処理に付した。次いで、調製物を２０分間５０００×ｇで２回遠心分離にかけることにより、全細胞を除去し、上清を４℃で１時間１０００００×ｇで遠心分離にかけた（Ｌ−７８超遠心機、ベックマン・インスツルメント社、フラートン、カリフォルニア）。沈澱を滅菌蒸留水に懸濁し、１−２ｍｇ／ｍｌの標準濃度にした。音波処理物をアリコートに分け、使用するまで−７０℃で冷凍した。ＥＬＩＳＡにおいて使用するため、音波処理物を炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。
　９６ウェルのポリスチレン・プレート、例えばバージニア、アレキサンドリアのダイナテク・ラボラトリーズから入手され得るイムロンＩＩの平底ウェルを、５０ミリモル炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）１００μｌ中１ウェル当たり１．０μｇの量でこれら５種の選択されたカンピロバクター・ピロリ株からプールされた懸濁液の音波処理物と４℃で一夜インキュベーションした。ウェルを吸引乾燥し、次いで０．０１モル燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）に０．０５％トウィーン−２０および０．１ｍｇ／ｍｌのチメロサールを含む混合物（ＰＢＳ−ＴＴ）で２回洗浄し、次いで２００μｌのＰＢＳ−ＴＴに０．１％ゼラチンを含む混合物（ＰＢＳ−ＴＴＧ）で２回洗浄することにより、非特異的反応性を制限した。
　多くの患者（彼等の既知カンピロバクター・ピロリ特性を下記第１表に記す）から得られた血清試料を調製した。ＰＢＳ−ＴＴＧにさらに５ｍｇ／ｍｌのうしガンマグロブリンを含む混合物（以後、「ＰＢＳ−ＴＴＧＧ」と称す）中１：８００に希釈した相異なる試験血清１００μｌを３つの異なるウェルの各々に加え、プレートを３７℃で１時間インキュベーションした。ウェルを吸引し、ＰＢＳ−ＴＴで３回洗浄することにより未結合抗体を除去し、次いで、１％のうし血清アルブミンおよび０．１％のうしガンマグロブリンを含むＰＢＳ−ＴＴ中希釈率１：５０００の１００マイクロタイター西洋わさびペルオキシダーゼ標識やぎ抗ヒトＩｇＧと３７℃で１時間インキュベーションした。やぎ抗ヒトＩｇＧは、陽性血清、すなわちカンピロバクター・ピロリ特異抗体を含む血清に暴露されたウェルでのみ形成されるべき抗原／抗体複合体と結合する第２抗体である。ウェルをＰＢＳ−ＴＴで５回連続洗浄することにより未結合やぎ抗体を除去した。
　０．００５％の過酸化水素を含むマキルパイン緩衝液（ｐＨ４．６）中１ｍｌ当たり１．０ｍｇの２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）（ＡＢＴＳ）を含む展開溶液の０．１ｍｌ試料を各ウェルに加え、２５℃で３０分間インキュベーションした。
　この基質混合物はペルオキシダーゼ標識を検出し、約４１０ｎｍの波長の光を検出し得るＥＬＩＳＡリーダーにより検出され得る色素産物を形成する。ＥＬＩＳＡリーダーは色の示度を定量化する。検定は３回同様に実施される。各プレートにおける対照ウェルは、試験血清以外の希釈物が加えられたこと以外は同じ要領で処理された。１０歳未満の健康な子供４０名から成る群を試験した場合に観察された結果における平均＋標準偏差の３倍区間より大きい吸光度示数を陽性として定めた。１００μｌの展開溶液を前記と同じ標定された平底マイクロタイター・ウェルに入れたとき、陽性いき値を測定すると４１０ｎｍでの光学密度の０．９１０単位であった。結果を第１表に示す。
　実施例２
抗原組成物における５種の全寄託菌株の音波処理物のプールした懸濁液を用いたＩｇＡ検定
使用された方法は実施例１記載の方法と同じであったが、ただし、試験ヒト血清をＩｇＡ測定において１：５０の希釈率で使用し（血清中低いＩｇＡ濃度であることを示す）、ペルオキシダーゼ標識やぎ抗ヒトＩｇＡを標識第２抗体として使用した（１：１０００希釈）。陽性いき値を測定すると、実施例１と同様に測定された光学密度の０．４７０単位であった。結果を第２表に示す。
　実施例３
　カンピロバクター・ピロリに対する血清抗体を有する者の尿におけるカンピロバクター・ピロリに対するＩｇＧ抗体
　カンピロバクター・ピロリに対する血清抗体を有することが判っている者（実施例１の血清試験により測定）から得られた尿を評価することにより、特定のＩｇＧ抗体が尿中に検出され得るか否かを測定した。使用された方法は実施例１の方法と同じであるが、ただし、１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて尿試料のｐＨを７．４に中和し、この試料１００μｌを各マイクロタイター・ウェルに加えた。被験者および尿希釈物の水和状態における差異を説明するため、尿試料のクレアチニン濃度を測定し、ＥＬＩＳＡでの光学密度をクレアチニン濃度で除した比率として結果を表した。これは、尿濃度の変動に関係無く検定を標準化するものである。ＩｇＧ　ＥＬＩＳＡから得られた結果を第１図に示す。血清陽性であることが判っている４被験者および血清陰性であることが判っている１０被験者から得られた値の間に部分的重複は存在しなかった。陽性のカットオフとして血清陰性者から得られた尿試料における平均＋標準偏差の３倍区間を用いると、血清陽性者は全て陽性であった。いき値陽性指標（光学密度を１０００倍し、次いでｍｇ／ｄｌによるクレアチニン濃度で積を除することにより計算された単位による）は、２．６単位であった。
　実施例４
　ウエスタン・ブロット検定
　試験血清のウエスタン・ブロット分析は以下の要領で行なわれた。実施例１−３と同様の音波処理物のプールを、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下１０％ポリアクリルアミド・スラブ・ゲル電気泳動により分画した。バーネットにより修正された［「アナリティカル・バイオケミストリー」（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１１２：１９５−２０３（１９８１）］トウビン等の方法［「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、７６：４３５０−５４（１９７９）］に従い、ゲル上のバンドはニトロセルロース・シートへ電気泳動により移された。次いで、ストリップ固相酵素免疫測定法を行なった。
　簡単に述べると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、電極緩衝液（１９２ミリモルのグリシン、２５ミリモルのトリス塩基、２０％メタノール）に浸しておいたニトロセルロース紙（ＮＣＰ）でゲルを被覆した。電気ブロッティング・スポンジを脱イオン水でリンスし、次いで電極緩衝液により飽和させた。ゲルをスポンジ上に置いた後、ＮＣＰをゲル上に載せ、次いで第２のスポンジを被せた。このサンドイッチを電気ブロッティング装置中に置き、蛋白質を１８時間１００ｍＡで電気泳動にかけた。ＮＣＰを０．０５％トゥイーン−８０含有ほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）中でリンスし、次いでほう酸緩衝液中３％の脱脂粉乳と室温で１時間インキュベーションした。ほう酸緩衝液中でリンス後、ＮＣＰを多重バンドを含む垂直ストリップに切断し、各ストリップを、３％脱脂粉乳含有ほう酸緩衝液中試験血清試料の１：４００希釈物中２５℃で４時間インキュベーションした。１％脱脂粉乳含有ほう酸緩衝液による１時間洗浄を３回行った後、ＮＣＰストリップを、１％脱脂粉乳ほう酸緩衝液中１：５０００に希釈したペルオキシダーゼ・コンジュゲートうさぎ抗ヒトＩｇＧと２時間２５℃でインキュベーションした。ほう酸緩衝液による２０分洗浄を３回行った後、反応生成物が最適状態で展開されるまで、ＮＣＰストリップをＤＡＢ溶液（５０ミリモルのトリス、０．０２５％ジアミノベンジジンおよび２滴の過酸化水素を含む）中に５〜１０分間入れた。水道水でストリップを洗浄することにより反応を止めた。ストリップを視覚検査により読み取った。
　第５図は、これらの実験結果を図示したものである。ストリップＡは、ヒト抗体の不在下で３％脱脂粉乳含有ほう酸緩衝液のみとインキュベーションしたものである。ストリップＢは、カンピロバクター・ピロリ感染にも胃炎にもり患していない胃腸症状を示す患者から得られた血清とインキュベーションしたものである。ストリップＣは、カンピロバクター・ピロリにも胃炎にもり患していない胃腸症状を示す別の患者から得られた血清とインキュベーションしたものである。ストリップＤは、消化性潰瘍患者から得られた血清とインキュベーションしたものである。ストリップＥは、第２の消化性潰瘍患者から得られた血清とインキュベーションしたものである。ストリップＦは、内視鏡（胃挿管法）によりカンピロバクター・ピロリ感染および胃炎の両方にり患していることが判明した（この場合、生検および培養が胃炎および生物体の存在を示した）胃腸症状を示す患者から得られた血清とインキュベーションしたものである。ストリップＧは、カンピロバクター・ピロリおよび胃炎の両方にり患していることが判明した胃腸症状を示す別の患者から得られた血清とインキュベーションしたものである。ストリップＨは、カンピロバクター・ピロリ感染および胃炎の両方にり患していることが判明した無症候者から得られた血清とインキュベーションしたものである。ストリップＩは、カンピロバクター・ピロリ感染および胃炎の両方にり患していることが判明した別の無症候者から得られた血清とインキュベーションしたものである。
　実施例５
　反応の特異性を調べるため、カンピロバクター・ピロリ細胞を他の病原性生物の細胞と比較分析した。使用された検定法は、カンピロバクター・ピロリまたは対照細胞とカンピロバクター・ピロリＥＬＩＳＡにおける既知陽性血清とのプレインキュベーションの結果、光学密度示数が顕著に減少するか否かを測定するものであった。使用された血清は、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭ　ＥＬＩＳＡにおいて高い値を有するカンピロバクター・ピロリ感染者からのプールであった。プールされた血清は、蒸留プロピレングリコールモノグリセリド、蒸留モノグリセリドおよびステアリルラクチル酸ナトリウム、親水性エトキシル化ソルビタンモノエステル、マルトデキストラン、レシチン、モノグリセリドもしくはジグリセリドと混合、またはカンピロバクター・ピロリ、エシェリヒア・コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、カンピロバクター・フェツス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｆｅｔｕｓ）もしくはカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）の全細胞により混合吸収させた。１プレートにおける一夜培養からの生長細菌を採取し、細胞を蒸留水に懸濁し、滅菌蒸留水で２回洗浄し、次いでプールしたヒト血清１．０ｍｌと混合し、３７℃で４５分間インキュベーションした。細菌懸濁液に対する抗体を５分間１２０００×ｇでの遠心分離により除去した。各吸収後ＥＬＩＳＡ測定用に１００μｌアリコートを取った後、上清を５回再吸収させた。未吸収血清対照を同じインキュベーションおよび遠心分離条件に暴露した。カンピロバクター・ピロリ細胞と陽性血清プールのプレインキュベーションにより、３種の免疫グロブリン全てにおける光学密度は顕著に減少した。カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・フェツスまたはエシェリヒア・コリによるプールの吸収の結果、ＩｇＡ（第３図）およびＩｇＧ　ＥＬＩＳＡ（第４図）における光学密度は最少限の減少を示した。しかしながら、ＩｇＭ　ＥＬＩＳＡ（第５図）の場合、同種および異種生物体による吸収の結果、阻害レベルの多様性は低かった。これらの結果は、ＩｇＡおよびＩｇＧにおいて検出された抗原が、ＩｇＭ　ＥＬＩＳＡにおいて検出された抗原よりもカンピロバクター・ピロリに対する特異性が高いことを示す。
　カンピロバクター・ピロリ感染の血清診断におけるカンピロバクター・ピロリＥＬＩＳＡの特異性をさらに明確にするため、他の対照群での抗体レベルを比較した。糞に白血球が存在する急性細菌性腸炎患者３０名から得た急性および回復期試料間の血清変換は存在しなかった。これらの中には急性カンピロバクター・ジェジュニに感染した患者１２名が含まれ、各々カンピロバクター・ジェジュニ抗原に血清変換していた。
　実施例６
　５種の菌株プールの代わりの検定用抗原としての単一カンピロバクター・ピロリ株の使用。
　実施例１の記載と全く同様に株８４−１８３（ＡＴＣＣ５３７２６）を処理した。しかしながら、この検定を確立するため、５種の菌株からの音波処理物をプールして１ウェル当たり１．０μｇの蛋白質濃度を達成する代わりに、株８４−１８３（ＡＴＣＣ５３７２６）由来の音波処理物を１ウェル当たり１．０μｇの濃度で単独使用した。標準５株の抗原を使用した検定および単一抗原を使用した検定に関する比較結果を第３表に示す。
　これらの結果は、ある種の保存抗原を有する単一カンピロバクター・ピロリ株を選ぶと、プール抗原を使用した場合と類似または同一の診断効率を有する検定が開発され得ることを示している。
　実施例７
　５菌株プールの代わりの検定用抗原としての精製カンピロバクター・ピロリ鞭毛の使用。
　グラム陰性菌の鞭毛は、普通、感染した宿主に一般に抗体を産生させる重要な表面抗原を有する。これらの抗原の中で、カンピロバクター・ピロリ感染者が反応している抗原に事実上含まれるものがあるか否かを測定するため、鞭毛を精製してさらに試験を行った。
　実施例１の記載と全く同様に株８４−１８２（ＡＴＣＣ５３７２５）を生長させた。細胞を滅菌蒸留水中プレートから採取した後、懸濁液を２０分間３０００×ｇでの遠心分離にかけた。上清を吸引し、沈澱物を０．１モルのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁することにより、４５０ナノメートル設定での光学密度を１．５とした。この懸濁液を、４５秒間中高強度でのビルチス・ブレンダーにおいて０℃で通すことにより処理した。これは、カンピロバクター種から鞭毛を剃る方法である［ブレーザー等、「インフェクション・アンド・イミュニティー」（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、１９８６、５３：４７−５２］。次いで、この懸濁液を室温で１０分間１２０００×ｇでの遠心分離にかけることにより、細胞および細胞屑を沈澱させた。次いで、上清を５℃で６０分間５５０００×ｇでの遠心分離にかけ、剃られた鞭毛を沈降させた。この沈澱物を４℃でトリス緩衝液に再懸濁し、蛋白質濃度を測定した。ＥＬＩＳＡを確立するために、この調製物を１マイクロタイター・プレート・ウェル当たり１００ｎｇの蛋白質濃度で用いた。実施例１の記載と全く同じ要領で、検定における次の工程を行った。標準５株抗原を使用した場合および鞭毛調製物を使用した場合のＩｇＧ検定間の比較結果を第４表に示す。
　寄託菌株以外の株を先入観の伴わない方式で選択し、前記と同様に鞭毛組成物を調製した。これらの組成物を１ウェル当たり１００および５００ｎｇの濃度で試験し、結果を第４表に示す。
　実施例８
　５株プールの代わりの検定用抗原としてのカンピロバクター・ピロリ鞭毛のプールしたゲルろ過分画の使用。
　カンピロバクター・ピロリ感染者が反応する抗原がどのカンピロバクター・ピロリ鞭毛関連抗原であるかを測定するために、先入観を伴わない方式で選択されたカンピロバクター・ピロリ株（実施例７と同様の株）由来の鞭毛調製物を、ゲルろ過クロマトグラフィー・カラムに通すことにより分画した。使用されたカラムは、ファーマシア・ファースト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフィック（ＦＰＬＣ）装置におけるスーパローズ１２カラム（ファーマシア・ラボラトリーズ、ニュージャージー、ピスキャタウェイ）であった。鞭毛調製物を２０ミリモルのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。流速は０．３ｍｌ／分であり、１００分間にわたって分画を集めた。初回ピークは２０ないし３０分間にカラムを通過し、他のピークは６０分後に観察された。初回ピークの内容の分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで銀染色によるものであった。この感受性株を用いると、３バンドのみがピークを示す分画において分離された。これらは６３０００、５７０００および３１０００ダルトンにおいて移動した。ＥＬＩＳＡを確立するために、これらの分画をプールし、この調製物を１マイクロタイター・プレート・ウェル当たり１００ｎｇの蛋白質濃度で使用した。実施例１の記載と全く同じ要領でこの検定における次の工程を行った。標準５株抗原を使用した場合および鞭毛調製物のゲルろ過分画を使用した場合のＩｇＧ検定間の比較結果を第５表に示す。
　実施例９
　カンピロバクター・ピロリに対する血清抗体の持続性。
　カンピロバクター・ピロリに対する高レベルのＩｇＡまたはＩｇＧ血清抗体を有する５名の被験者を別の試験用に選択した。最初の評価から少なくとも１年（平均１．２５年）後に各被験者から第２の試料を得て再試験を行った。第１および第２血清における平均抗体レベルを第６表に示す。
　５名全員のレベルは依然として安定した状態であった。この間に血清陽性から血清陰性に変換した血清は無かった。
　実施例１０
　カンピロバクター・ピロリにより攻撃されたボランティアにおける血清変換。
　カンピロバクター・ピロリを摂取したヒトボランティアは、無塩酸症を伴う急性胃炎の症状を現した［モリスおよびニコルソン、「アメリカン・ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー」（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、１９８７、８２：１９２−１９９参照］。その後、症状は明確となったが、慢性胃炎を生じ、カンピロバクター・ピロリ感染は持続していた。系列血清試料を得、カンピロバクター・ピロリに対する抗体に関して試験した。カンピロバクター・ピロリ特異性ＩｇＧおよびＩｇＡに関する検定を実施例１および２の記載と全く同じ要領で行った。ＩｇＭに関する検定も実施例１と全く同様に行ったが、ただし、血清を１：４００に希釈して非特異的反応性を減少させ、ＩｇＭに特異的なペルオキシダーゼ・コンジュゲートやぎ抗体によりにより血清ＩｇＭを検出し、反応を６０分間行わせた。結果を下記第７表に示す。ＩｇＡおよびＩｇＧクラスにおける血清変換は、実験的攻撃の６０ないし４３１日後の間に発生した。ＩｇＭ血清変換基準は具体的には定義されなかったが、攻撃の８ないし２２日後の間に光学密度が約４倍増加し、徐々に下降することが重要である。カンピロバクター・ピロリ特異性ＩｇＭの増加は、感染経過においてＩｇＡまたはＩｇＧ応答よりもかなり早いことは注目すべき点である。
　実施例１１
　数種の検出技術を用いる抗体検出用のカンピロバクター・ピロリ特異性試験キットを構築した。抗体検出用試験キットの一つは、複数のウェルを含む区画された封入体、カンピロバクター・ピロリ抗原により使用前に被覆されたプレート並びにペルオキシダーゼ標識やぎ抗ヒトＩｇＧおよび０．００５％過酸化水素含有マキルバイン緩衝液にＡＢＴＳを含む変色インジケーターから成る酵素検出用ＥＬＩＳＡ材料で構成されるものであった。当然、他の酵素および展開剤も使用され得た。例えば、アルカリ性ホスファターゼ標識やぎ抗ヒトＩｇＧは、ジェタノールアミンおよび塩化マグネシウム緩衝液中ｐ−ニトロフェニルホスフェートと組み合わせて使用され得る。
　ウエスタン・ブロット技術を用いる２番目の抗体検出用試験キットは、容器、カバー、ニトロセルロース・シートおよびポリアクリルアミド・スラブ・ゲルで構成され、中にドデシル硫酸ナトリウム、界面活性剤、ｐＨ修正剤、脱脂粉乳および過酸化水素含有トリスにＤＡＢを含む変色インジケーターを含む酵素検出用材料が存在するものであった。また、このウエスタン・ブロット分析キットは、ペルオキシダーゼ標識やぎまたはうさぎ抗ヒト免疫グロブリンおよびカンピロバクター・ピロリ抗原の供与体を含む。
　間接免疫蛍光検定法を用いる別の抗体検出用カンピロバクター・ピロリ特異性試験キットは、カンピロバクター・ピロリ抗原、ヒト試験血清、燐酸緩衝食塩水およびフルオレセイン・コンジュゲートやぎ抗ヒトＩｇＧを内包する区画された容器を含み得る。
　最後に、別種の抗体検出用カンピロバクター・ピロリ特異性試験キットはリポソームを使用するものであり、容器、ヒト試験血清、表面にカンピロバクター・ピロリ抗原を有する蛍光マーカー（または酵素または基質）充填リポソームおよび表面活性剤を含む。この検定では、容器は、やぎ抗ヒトＩｇＧにより予め被覆された管またはウェルであり得る。
　この明細書で使用されている語および記載事項は、単なる説明として記された好ましい態様であって、当業界の熟練者が前記特許請求の範囲により定義されたこの発明を実践する場合に可能なこととして認めると思われる多くの変形に対する限定を意図するものではない。
　この発明は下記の態様を包含する。
（１）カンピロバクター・ピロリに対する特異抗体の存在検出用抗原組成物であって、カンピロバクター・ピロリの少なくともフラグメントを含み、６３０００、５７０００、４５０００および３１０００ダルトンのフラグメントから成る群から選ばれる少なくとも１種のフラグメントを高濃度で有する組成物。
（２）６３０００、５７０００、４５０００および３１０００ダルトンのフラグメントから成る群から選ばれるカンピロバクター・ピロリのフラグメントが、組成物の少なくとも約５０重量％の濃度で存在する、１記載の抗原組成物。
（３）抗原組成物における全カンピロバクター・ピロリ・フラグメントの少なくとも５０％が、６３０００、５７０００、４５０００および３１０００ダルトンのフラグメントから成る群から選ばれるフラグメントである、１記載の抗原組成物。
（４）抗原組成物における全カンピロバクター・ピロリ・フラグメントの少なくとも８５％が、６３０００、５７０００、４５０００および３１０００ダルトンのフラグメントから成る群から選ばれるフラグメントである、１記載の抗原組成物。
（５）抗原組成物が、６３０００、５７０００、４５０００および３１０００ダルトンのフラグメントから成る群から選ばれるカンピロバクター・ピロリのフラグメント以外の抗原を実質的に含んでいない、１記載の抗原組成物。
（６）組成物が６３０００の分子量を有するカンピロバクター・ピロリ・フラグメントを高濃度で含んでいる、１記載の抗原組成物。
（７）組成物が５７０００の分子量を有するカンピロバクター・ピロリ・フラグメントを高濃度で含んでいる、１記載の抗原組成物。
（８）組成物が４５０００の分子量を有するカンピロバクター・ピロリ・フラグメントを高濃度で含んでいる、１記載の抗原組成物。
（９）組成物が３１０００の分子量を有するカンピロバクター・ピロリ・フラグメントを高濃度で含んでいる、１記載の抗原組成物。
（１０）カンピロバクター・ピロリに対する特異抗体の存在検出用抗原組成物であって、カンピロバクター・ピロリの少なくともフラグメントを含み、カンピロバクター・ピロリ鞭毛の少なくともフラグメントを高濃度で含む組成物。
（１１）鞭毛が、組成物中の全抗原の総重量に基づき少なくとも約５０％の濃度で存在する、１０記載の抗原組成物。
（１２）組成物が実質的に前記鞭毛またはそのフラグメント以外の抗原を含んでいない、１０記載の組成物。
（１３）組成物が、６３０００、５７０００および３１０００ダルトンの鞭毛フラグメントから成る群から選ばれるフラグメントを高濃度で含む、１０記載の組成物。
（１４）ＡＴＣＣ寄託番号５３７２２、５３７２１、５３７２５、５３７２６および５３７２７に相当する菌株から成る群から選ばれるカンピロバクター・ピロリの少なくとも１株の少なくともフラグメントを含む抗原混合物。
（１５）前記菌株のフラグメントが、組成物の少なくとも約５０重量％の濃度で存在する、１４記載の抗原混合物。
（１６）組成物が実質的に前記菌株以外の抗原を含んでいない、１４記載の抗原混合物。
（１７）カンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在検出方法であって、試験試料を、抗体の存在下において検出可能量の抗原／抗体複合体の形成に有効な量の抗原組成物と接触させることを含む方法であり、抗原組成物がカンピロバクター・ピロリの少なくともフラグメントを含み、６３０００、５７０００、４５０００および３１０００ダルトンのフラグメントから成る群から選ばれるフラグメントを高濃度で含むものである方法。
（１８）さらに、上記接触により生じる抗原／抗体複合体の形成度合の測定および陽性指示いき値に対する前記度合の比較工程を含む、１７記載の方法。
（１９）上記測定が、固相酵素免疫測定法、ウエスタン・ブロット技術、間接蛍光検定法およびリポソームに基づく検定法から成る群から選ばれる技術により行なわれる、１８記載の方法。
（２０）カンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在検出方法であって、試験試料を、抗体の存在下において検出可能量の抗原／抗体複合体の形成に有効な量の抗原組成物と接触させることを含む方法であり、抗原組成物がカンピロバクター・ピロリの少なくともフラグメントを含み、カンピロバクター・ピロリ鞭毛の少なくともフラグメントを高濃度で有するものである方法。
（２１）試験試料を、１、６、７、８、９、１０または１３記載の固定抗原組成物の有効量と接触させることを含むカンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在検出方法であって、さらに抗原／抗体複合体の形成度合が陽性指示いき値を越えるか否かを測定する段階を含む方法。
（２２）カンピロバクター・ピロリに対する抗体の存在検出方法であって、抗体の存在下において検出可能量の抗原／抗体複合体の形成に有効な量の固定抗原組成物を試験試料と接触させる工程を含む方法であり、抗原組成物がカンピロバクター・ピロリの少なくとも１菌株の少なくともフラグメントを含むものであり、さらに、固相酵素免疫測定法およびリポソームに基づく検定法から成る群から選ばれる技術により抗原／抗体複合体の形成度合を測定し、陽性指示いき値に対して前記度合を比較する工程を含む方法。
（２３）陽性指示いき値が、類似陰性対照試料において誘導された平均応答値に標準偏差の少なくとも１倍区間を加えることにより決定される、２２記載の方法。
（２４）体液試料を、１、６、７、８、９、１０または１３記載の抗原組成物の有効量と接触させ、次いで上記接触中における抗原／抗体複合体の形成度合が陽性指示いき値を越えるか否かを測定することを含む、胃炎または消化性潰瘍疾患の存在に関する臨床診断試験方法。
（２５）上記測定が、固相酵素免疫測定法、ウエスタン・ブロット技術、間接蛍光検定法およびリポソームに基づく検定法から成る群から選ばれる検出方法により行なわれ、上記体液が、血液、尿、血清、涙液および唾液から成る群から選ばれる、２４記載の方法。
（２６）１、６、７、８、９、１０または１３記載の抗原組成物で被覆されたマルチウェル・プレートおよび前記プレートにおける抗原／抗体複合体の存在検出用材料を含むカンピロバクター・ピロリ特異抗体の検出用診断試験キット。
（２７）検出手段が、酵素検出用ＥＬＩＳＡ材料、正常うさぎ血清、酵素標識抗ヒトＩｇＧおよび変色インジケーターを含む、２６記載の診断試験キット。
（２８）変色インジケーターが、２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）、過酸化水素およびマキルバイン緩衝液を含む、２７記載の診断試験キット。
（２９）酵素がアルカリホスファターゼであり、変色インジケーターがジエタノールアミンおよび塩化マグネシウム緩衝液中にｐ−ニトロフェニルホスフェートを含むものである、２７記載の診断試験キット。
（３０）抗ヒト抗体がＩｇＡに対して誘導される、２６記載のキット。
（３１）ニトロセルロース・シートまたはナイロン膜シート、ポリアクリルアミド・スラブ・ゲル、ドデシル硫酸ナトリウム、界面活性剤、ｐＨ修正剤、脱脂粉乳、変色インジケーター供与体、抗ヒト免疫グロブリンおよび１、６、７、８、９、１０または１３記載の抗原組成物を含む、ウエスタン・ブロット技術を用いるカンピロバクター・ピロリ特異抗体検出用カンピロバクター・ピロリ特異性診断試験キット。
（３２）カンピロバクター・ピロリ感染の早期検出方法であって、試験試料を、抗体の存在下において検出可能量の抗原／抗体複合体の形成に有効な量の抗原組成物と接触させることを含む方法であり、抗原組成物がカンピロバクター・ピロリの少なくともフラグメントを含み、６３０００、５７０００、４５０００、３１０００ダルトンのフラグメントから成る群から選ばれるフラグメントを高濃度で有し、またカンピロバクター・ピロリ鞭毛の少なくともフラグメントを有するものであり、さらにＩｇＭに基づく抗原／抗体複合体の形成範囲の測定段階を含む方法。
【図面の簡単な説明】
　第１図は、カンピロバクター・ピロリに対する尿ＩｇＧ抗体を測定することによる、カンピロバクター・ピロリ感染に関して血清陽性または血清陰性であることが判っている人から得られた尿試料の差別を示す図である。
　第２、３および４図は、それぞれ、実施例５におけるＩｇＡ　ＥＬＩＳＡ、ＩｇＧ　ＥＬＩＳＡおよびＩｇＭ　ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
　第５図は、実施例４のウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
　第６図は寄託菌株の全細胞プロフィールを示す図であり、ストリップ１−５は各々寄託菌株８６−６３（ＡＴＣＣ５３７２７）、８４−１８０（ＡＴＣＣ５３７２２）、８４−１８２（ＡＴＣＣ５３７２５）、８６−８６（ＡＴＣＣ５３７２１）および８４−１８３（ＡＴＣＣ５３７２６）を示す。
　第７図は、第６図の５種の寄託菌株のリポ多糖類プロフィールを示す図である（各レーンは第６図の場合と同じ株を示す）。
　第８図は寄託菌株のウエスタン・ブロットを示す図である。レーンＡ〜Ｅは、各々寄託菌株８４−１８０（ＡＴＣＣ５３７２２）、８４−１８２（ＡＴＣＣ５３７２５）、８４−１８３（ＡＴＣＣ５３７２６）、８６−６３（ＡＴＣＣ５３７２７）および８６−８６（ＡＴＣＣ５３７２１）を表す。
　第９図は５種の寄託菌株のウエスタン・ブロットを示す図である（各レーンは第８図の場合と同じ菌株を表す）。