(57)【要約】本発明は刺激に対する細胞応答を測定する方法を提供する。試験する細胞は、例えば味蕾を含む舌上皮の切片中に含まれ得る。本発明は味蕾を含む舌上皮の切片中に含まれる味覚細胞（即ち、味蕾を含む未損傷上皮組織中の味覚感覚細胞）の１つ以上の刺激に対する機能的細胞応答を決定する方法を提供する。本発明においては、動物由来の味覚組織（例えば味蕾を含む上皮組織又は味覚乳頭）のような組織を１つ以上の刺激に接触させ、刺激により惹起される少なくとも１つの細胞シグナリング事象の規模を定量的に測定する。
2008536475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物由来の味蕾を含む舌上皮の切片中に含まれる味覚細胞の、１つ以上の試験刺激に対する機能的細胞応答を決定する方法であって、該味蕾を含む舌上皮を１つ以上の試験刺激に接触させること、及び、１つ以上の試験刺激により惹起される少なくとも１つの機能的細胞応答の規模を定量的に測定することを含む、方法。
【請求項２】
前記味蕾を含む舌上皮が検出可能部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出可能部分を含む、味蕾を含む舌上皮の切片中に含まれる味覚細胞の、１つ以上の試験刺激に対する機能的細胞応答を決定する方法であって、該味蕾を含む舌上皮を１つ以上の試験刺激に接触させること、及び、該検出可能部分の状態の変化を検出することにより該１つ以上の刺激に対する味蕾を含む舌上皮の機能的細胞応答を検出することを含む、方法。
【請求項４】
味覚に影響する刺激を同定する方法であって、検出可能部分を含む、味蕾を含む舌上皮の切片中に含まれる味覚細胞を１つ以上の試験刺激に接触させること、及び、該検出可能部分の状態の変化を検出することにより該１つ以上の刺激に対する味蕾を含む舌上皮の機能的細胞応答を検出することを含む、方法。
【請求項５】
更に、前記味蕾を含む舌上皮の前記１つ以上の試験刺激に対する応答を、該味蕾を含む舌上皮の１つ以上の対照刺激に対する応答と比較することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記検出可能部分が分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、物理的手段又は化学的手段により検出することができる、請求項２〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能部分が、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン又はハプテン、あるいは検出可能にされているタンパク質である、請求項２〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記検出可能部分がカルシウム感受性染料である、請求項２〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記カルシウム感受性染料がカルシウムグリーンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能部分が電圧感受性染料である、請求項２〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記味蕾を含む舌上皮が真核生物から得られる、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記真核生物が哺乳動物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物がラット、マウス、ネコ、ウシ、イヌ、ブタ、ウサギ、チンパンジー又はヒトである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物がブタである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記味蕾を含む舌上皮が未損傷の味覚乳頭を含む、請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記味覚細胞が先端表面及び基底表面を有し、前記刺激が該味覚細胞の該先端表面に接触するが、該細胞の基底表面には接触しない、請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出又は決定が光学顕微鏡を使用して行われる、請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記光学顕微鏡が、広視野蛍光画像化顕微鏡、レーザー走査共焦点顕微鏡、又は多光子蛍光寿命画像化顕微鏡である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の試験刺激及び／又は１つ以上の対照刺激が、甘味、酸味、塩味、苦味及び／又は旨みである、請求項１〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の試験刺激及び／又は１つ以上の対照刺激が、アゴニスト又はアンタゴニストである、請求項１〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０の何れか１項に記載の方法により同定される１つ以上の刺激。
【請求項２２】
摂取可能な物質を調製するための、請求項２１に記載の１つ以上の刺激の使用。
【請求項２３】
請求項２１に記載の１つ以上の刺激を含む摂取可能な物質。
【請求項２４】
知覚性味覚品質を生成するために請求項２１に記載の１つ以上の刺激の有効量を哺乳動物に投与することを含む、知覚性味覚品質を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、米国特許出願番号第６０／６３９，１５２号（２００４年１２月２２日出願）およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００５／４１９４６（２００５年１１月１７日出願）の優先権の利益を主張する。これらの出願は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
味覚トランスダクションは動物における化学トランスダクションの最も複雑な形態の一つである。味覚シグナリングは単純な後生動物から最も複雑な脊椎動物まで、動物界全体に渡り存在する。その主要な目的は、非揮発性リガンドに対する信頼性のあるシグナリング応答を与えることである。ヒトは一般的に幾つかの知覚性味覚の品質又は様式、即ち、甘味、酸味、塩味、苦味及び旨みを区別する。これらの様式の各々は、受容体又はチャンネルにより媒介される個別のシグナリング経路により媒介され、受容体細胞の脱分極、受容体又は活動電位の発生、及び味覚求心性ニューロンシナプスにおける神経伝達物質の放出をもたらすと考えられている。
【０００３】
動物における味覚トランスダクションは、味覚受容体細胞と呼ばれる特殊化された神経上皮細胞により媒介される。これらの細胞は、味蕾を形成する約４０〜１００個の細胞群に組織化される。味蕾は、前駆物質細胞、支持細胞及び味覚受容体細胞を含有する。受容体細胞は、脳幹及び視床においてシナプスを介して皮質の味覚中枢に情報を伝達する求心性神経終末により、その基部において神経支配される。味蕾は舌上皮において種々の乳頭内に分布される。舌の真後ろに存在する有郭乳頭は、数１００〜数１０００の味蕾を含有する。一方、舌の後方端に位置する葉状乳頭は、数１０〜数１００の味蕾を含有する。更に、舌の前方３分の２の位置にある茸状乳頭は、種に応じて単一又は数個の味蕾のみを含有する。味覚細胞は又、口蓋及びその他の組織、例えば食道及び胃にも存在する。
【０００４】
味蕾は卵型の構造を有し、主に舌の上皮内に含まれている。味覚トランスダクションは、外界の環境に味覚受容体細胞の微小絨毛が接触する味孔の味蕾尖端部分で開始されると考えられている。種々の味覚刺激は、味覚細胞の脱分極（即ち、膜電位の低下）又は分極亢進（即ち、膜電位の上昇）の何れかを誘発し、求心性神経線維を有する化学シナプスにおける細胞からの神経伝達物質の放出を調節する。感覚細胞からの化学シグナルを受容する一次味覚性感覚線維は、各味蕾の基部に進入する。同じ味蕾内の味覚細胞間の細胞間連絡も又、求心性神経線維に伝達されるシグナルを調節し得る。特定の味覚を誘発する分子は、しばしば「味物質」と呼ばれる。味覚細胞の機能の精神物理学及び生理学に関しては多くが知られているが、その感覚シグナリング応答を媒介する分子及び経路に関しては殆ど知られていない。
【０００５】
一般的に各味覚様式は、各味蕾を形成する細胞の一部において発現される受容体タンパク質の特定の型に関連している。甘味、苦味、旨み及び塩味の物質に関する味覚受容体タンパク質がヒトを含む種々の種からクローニングされている。受容体細胞における細胞応答への刺激−受容体相互作用の結合の性質も又、一部の受容体について明確化されている。これらの受容体の一部は、潜在的な味覚増強剤、遮断薬及び調節剤の発見に使用するバイオアッセイの開発に使用されている。これらの「チップ」系システムは、多くの化合物の高スループットスクリーニングとしての潜在性を有するものの、正常な受容体−応答結合に必要な味覚シグナリング経路の正常な細胞成分を組み込んでいない。したがって、これらのアッセイは、特定の受容体との潜在的刺激物の結合に関する初期情報を提供することにおいて最良のものである。しかし、これらのアッセイは、後の細胞応答があった場合にそれに関する情報を被験物質へ提供することはない。
【０００６】
代替となる手法は、異種の細胞、一般的に哺乳動物細胞系統、例えばヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）内においてクローニングされた味覚受容体を発現し、味覚刺激により誘導される細胞内カルシウムの変化量を測定する方法である。この手法は、刺激−受容体相互作用と、カルシウムの増大をもたらす細胞経路との間の結合を必要とし、一度に多くの細胞における測定を行うことができる。しかし、味覚受容体単位である味蕾の正常な細胞組織化は、味蕾内の細胞間で起こる味覚情報の何れかのプロセシングと共に喪失する。求心性神経線維に直接連絡するのではなく、むしろ神経支配されている隣接する味蕾細胞に連絡する味覚細胞内に甘味及び苦味の受容体が局在化するという最近の結果を鑑みると、この制限は特に重要であると言える。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
長年に渡り、天然の味覚刺激物を模倣又は阻害するために味覚受容体と相互作用する種々の薬剤を開発するために多大な努力が払われてきた。甘味を模倣するために開発された薬剤の例には、サッカリン、モネリン及びソーマチンがある。しかし、今日までに開発された多くの味覚模倣剤又は味覚阻害剤は、経済的でないか、高カロリーであるか、或いは発がん性があるために、食品添加物には適していない。基本味覚を模倣又は阻害する新しい薬剤の開発は、味覚様式のトランスダクションに関する味覚細胞の生物学の知識が欠如しているために制限されている。即ち、味覚トランスダクションに関する、又は影響を与える新しい生成物及び方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は味蕾を含む舌上皮の切片中に含まれる味覚細胞（即ち、味蕾を含む未損傷上皮組織中の味覚感覚細胞）の１つ以上の刺激に対する機能的細胞応答を決定する方法を提供する。本発明においては、動物由来の味覚組織（例えば味蕾を含む上皮組織又は味覚乳頭）のような組織を１つ以上の刺激に接触させ、刺激により惹起される少なくとも１つの細胞シグナリング事象の規模を定量的に測定する。データ値は、例えば、異なる濃度の刺激及び／又は異なる時点において、複数のデータ値が収集され得る。「単離された味蕾を含む未損傷上皮組織」という用語は、組織、及び組織内に含まれる細胞が完全性を保持するように組織が取り出されている、動物から単離された組織試料を指す。例えば、単離された未損傷の味覚組織は、上皮の分極が保持されるように前駆物質細胞、支持細胞及び味覚受容体細胞が含まれる、未損傷の舌上皮組織試料中の未損傷の味蕾となり得る。味覚細胞は先端表面及び基底表面を有する。本発明の特定の実施形態において、刺激は１つ以上の味覚細胞の先端表面に接触するが、１つ以上の細胞の基底表面には接触しない。
【０００９】
本発明は種々の味覚刺激、例えば、味覚細胞及び組織の活性化剤、阻害剤、刺激剤、増強剤、アゴニスト及びアンタゴニストを試験する方法を提供する。本明細書で使用される「味覚細胞」という用語には、乳頭、例えば葉状、茸状及び有郭乳頭として知られる構造の舌の味蕾を形成する群に組織化される神経上皮細胞が含まれる（例えばＲｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）を参照）。味覚細胞には又、口蓋、及び味覚細胞を含有すると考えられるその他の組織、例えば食道、胃、胃腸管、又はその他の内臓（例えば肝臓又は膵臓）の細胞が含まれる。味覚細胞は生物学的試料から採取され得る。そのような試料には、ヒト、マウス、ラット及びブタから単離された組織が含まれるが、これらに限定されない。新鮮組織の他にも、生物学的試料には、組織学的な目的の為に採取された凍結切片のような組織切片が含まれ得る。生物学的試料は一般的に、真核生物、例えば昆虫、原虫、鳥類、魚類、爬虫類又は哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ、ウサギ、チンパンジー又はヒト）から得られる。組織には、舌組織及び単離された味蕾が含まれる。
【００１０】
本発明において「機能的細胞応答」には、例えば、味覚細胞又は組織に対する刺激の機能的、物理的又は化学的作用のような、試験刺激の間接的又は直接的な影響下にある何れかのパラメータに対する応答における１つ以上の細胞の変化が含まれる。機能的細胞応答には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏにおける、リガンド結合、イオンフラックスの変化、膜電位、電流、転写、シグナル伝達、受容体リガンド相互作用、メッセンジャー濃度（サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）又は細胞内Ｃａ＋＋又はその他の陽イオン及び／又は陰イオン、例えばクロリド、ナトリウム又はプロトンを含むがこれらに限定されない）が含まれ、又その他の生理学的作用、例えば神経伝達物質又はホルモンの放出の増加又は減少も含まれる。
【００１１】
本明細書で使用される「機能的細胞応答を決定する」とは、例えば機能的、物理的又は化学的作用のような、試験刺激の間接的又は直接的な影響下にある細胞内又は細胞上のパラメータの増大又は減少について試験することを意味する。そのような機能的作用は、当該分野で既知の何れかの手段、例えば光学的又はスペクトル特性（例えば蛍光、吸光度、屈折率）の変化、流体力学（例えば形状）、クロマトグラフィー又は溶解度の特性、パッチクランプ法、電圧感受性染料、全細胞電流、放射性同位体流出（又は流入）、誘導マーカー；組織培養細胞発現；転写活性化；リガンド結合試験；電圧、膜電位及び導電性の変化；イオンフラックス試験；細胞内第２メッセンジャー、例えばｃＡＭＰ及びイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の変化；細胞内カルシウム濃度の変化；神経伝達物質の放出等により測定できる。「阻害剤」、「活性化剤」及び「調節物質」は、味覚トランスダクションに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験により発見される阻害、活性化又は調節する分子、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、並びにその同族体及びミメティックを指すものとして使用される。阻害剤は、例えば細胞又は細胞成分（例えば受容体）に結合し、刺激を部分的又は完全に阻害し、活性化を低減、防止、遅延し、味覚トランスダクションを不活性化、脱感作又はダウンレギュレートする化合物、例えばアンタゴニストである。活性化剤は、例えば細胞又は細胞成分（例えば受容体）に結合し、活性化を刺激、増大、活性化、促進、増強し、味覚トランスダクションを感作又はアップレギュレートする化合物、例えばアゴニストである。調節物質には、ポリペプチドと受容体、又は活性化剤若しくは阻害剤に結合する細胞外タンパク質、例えばキナーゼとの相互作用を改変する化合物が含まれる。調節物質には、遺伝子的に修飾された、天然に発生する、及び合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小化学分子等が含まれる。阻害剤及び活性化剤のこのような試験には、例えば推定調節物質化合物を、味物質の存在下又は非存在下に適用した後、味覚トランスダクションに対する機能的作用を測定することが含まれる。未損傷の味覚組織中にあるが潜在的な活性化剤、阻害剤又は調節物質で処理した細胞を使用する試料又は試験は、阻害剤、活性化剤又は調節物質を含まない対照試料と比較することにより、調節作用の程度を調べることができる。陽性対照試料（例えば調節物質非添加の味物質）には、１００％の相対的活性値が割り当てられる。阻害剤、活性化剤又は調節物質で処理された試料は、阻害剤、活性化剤又は調節物質を含まない対照試料と比較することにより、阻害、活性化又は調節作用の程度を調べることができる。対照試料（阻害剤、活性化剤又は調節物質で処理されていない試料）は、１００％の相対活性値を割り当てられる。対照と相対比較した活性値が約８０％、場合により５０％、又は２５％、更には０％であると、阻害が達成される。対照と相対比較した活性値が約１１０％、場合により１５０％、場合により２００〜５００％、又は１０００〜３０００％、又はそれ以上であると、活性化が達成される。
【００１２】
本発明は、未損傷の味覚組織中の細胞が味物質と相互作用する程度を確認することを含む、味覚を刺激する方法を提供する。味物質と、未損傷味覚組織中の細胞との相互作用は、本明細書に記載される何れかの試験か使用して測定することができる。味物質は他の味物質と混合して、混合物を形成することができる。所望により、複数の化合物の１つ以上を共有結合的に混合することができる。
【００１３】
本発明は又、味蕾を含む舌上皮組織中の感覚細胞又は感覚細胞群が各対照味物質と相互作用する程度を確認することにより、各対照味物質の刺激プロファイルを作成するために、１つ以上の被験味物質に対して１つ以上の対照味物質を試験する方法を提供する。これらの刺激プロファイルは、その後データ格納媒体上のリレーショナルデータベースに保存され得る。この方法は更に、味覚に関する所望の刺激プロファイルを準備し；所望の刺激プロファイルをリレーショナルデータベースと比較し；所望の刺激プロファイルと最も厳密に一致する対照味物質の１つ以上の組み合わせを確認することを含む場合もある。この方法は更に、確認した１つ以上の組み合わせに対照味物質を混合して味覚を刺激することを含む場合もある。
【００１４】
本発明は又、味物質の調節物質、例えば活性化剤、阻害剤、刺激剤、増強剤、アゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法も提供する。このような味覚トランスダクションの調節物質は、味覚シグナリング経路の薬理学的、化学的及び遺伝子的調節に有用である。これらのスクリーニング方法を使用することで、味覚細胞活性の高親和性アゴニスト及びアンタゴニストを同定することができる。その後、これらの調節化合物は、食品及び医薬品産業で使用することにより、味を個別に作り変える、例えば食品、飲料又は薬品の味を調節することができる。
【００１５】
「摂取可能な物質」とは、食品、飲料又はその他の食用又は経口投与用の製品又は組成物である。本明細書において「香味（ｆｌａｖｏｒ）」とは、対象において味及び／又は臭いを知覚することを指し、これには、甘味、酸味、塩味、苦味、旨み及びその他が含まれる。本明細書において「矯味剤」とは、動物又はヒトにおいて香味又は味を誘導する化合物又はその生物学的に許容される塩を指す。本明細書において「香味調節剤」とは、動物又はヒトにおいて天然又は合成の矯味剤の味及び／又は臭いを調節する、例えば増強又は強化及び誘導する化合物又はその生物学的に許容される塩を指す。本明細書において「香味増強剤」とは、天然又は合成の矯味剤の味又は臭いを増強する化合物又はその生物学的に許容される塩を指す。
【００１６】
本明細書において「風味（ｓａｖｏｒｙ  ｆｌａｖｏｒ）」とは、動物又はヒトにおいて一般的にＭＳＧ（グルタミン酸１ナトリウム）により誘導される風味のある「旨み」の味を指す。本明細書において「風味矯味剤」又は「風味化合物」とは、対象において検知可能な風味を誘発する化合物又はその生物学的に許容される塩、例えばＭＳＧ（グルタミン酸１ナトリウム）を指す。本明細書において「風味調節剤」とは、動物又はヒトにおいて天然又は合成の風味矯味剤、例えばグルタミン酸１ナトリウム（ＭＳＧ）の風味を調節する、例えば増強又は強化、誘導及び阻害する化合物又はその生物学的に許容される塩を指す。本明細書において「風味増強剤」とは、動物又はヒトにおいて天然又は合成の風味矯味剤、例えばグルタミン酸１ナトリウム（ＭＳＧ）の風味を増強又は強化する化合物又はその生物学的に許容される塩を指す。
【００１７】
本明細書において「風味矯味剤量」とは、食用又は医療用の製品若しくは組成物又はその前駆物質において風味を誘導するのに十分な化合物の量を指す。風味矯味剤量は、かなり広範な範囲で約０．００１ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ、又は狭小な範囲で約０．１ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍとなってもよい。風味矯味剤量の代替の範囲は、約０．０１ｐｐｍ〜約３０ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍ、約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍ、又は約０．１ｐｐｍ〜約３ｐｐｍとなってもよい。
【００１８】
本明細書において「風味調節量」とは、ヒト対象により知覚されるのに十分な程度まで食用又は医療用の製品又は組成物又はその前駆物質における風味を改変（増大又は減少の何れか）するのに十分な化合物の量を指す。風味調節量は、かなり広範な範囲で約０．００１ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ、又は狭小な範囲で約０．１ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍとなってもよい。風味調節量の代替の範囲は、約０．０１ｐｐｍ〜約３０ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍ、約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍ、又は約０．１ｐｐｍ〜約３ｐｐｍとなってもよい。
【００１９】
本明細書における「風味増強量」とは、食用又は医療用の製品又は組成物における天然又は合成の矯味剤、例えばグルタミン酸１ナトリウム（ＭＳＧ）の味を増強するのに十分な化合物の量を指す。風味増強量は、かなり広範な範囲で約０．００１ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ、又は狭小な範囲で約０．１ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍとなってもよい。風味増強量の代替の範囲は、約０．０１ｐｐｍ〜約３０ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍ、約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍ、又は約０．１ｐｐｍ〜約３ｐｐｍとなってもよい。
【００２０】
同様の定義は、甘味、酸味、塩味及び苦味のその他の味覚様式にも適用される。
【００２１】
「単離された」、「精製された」又は「生物学的に純粋な」という用語は、天然の状態で観察されるように通常は付随する成分が実質的又は基本的に含まれない物質を指す。純度及び均質性は一般的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーのような分析化学的技法を使用して測定する。
【００２２】
「標識」又は「検出可能部分」とは、検出可能な物理的又は化学的特性、例えば分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段又は化学的手段を有する物質である。例えば、有用な標識には、蛍光染料（例えばフルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン等）、放射性標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐ）、高電子密度試薬、酵素（例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、ビオチン、ジゴキシゲニン又はハプテン、及び、例えば放射標識をペプチドに取り込むことにより検出できるようになるタンパク質が含まれる。
【００２３】
本明細書で使用される「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、単数又は複数の何れを意味してもよい。
【００２４】
本特許又は出願のファイルは、色付けされた少なくとも１枚の図面を含む。色付けされた図面を伴う本特許又は特許出願公開のコピーは、要求があり次第、必要な費用を支払った上で事務局により提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
脊椎動物味蕾の機能的組織化
末梢味覚系の一般的解剖学的特徴
味蕾は、味覚のシグナル伝達を媒介する受容体細胞として少なくとも一部が機能する、幾つかの異なる形態学的及び免疫組織学的な型を含む分極神経上皮細胞５０〜１００個を含有する（Ｗｉｔｔ  ａｎｄ  Ｒｅｕｔｔｅｒ，１９９６；Ｆｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，２０００）。味蕾の３種の形態学的なクラスは、全脊椎動物において簡単に判別されており；暗色（Ｉ型）、明色（ＩＩ型）及び基底又は子孫細胞を含む。しかし、暗色と明色の細胞の中間の概観を有する中間細胞（げっ歯類）、ＩＩＩ型細胞（最初はウサギ内のものであったが、げっ歯類では遥かに不明確である）及びＭｅｒｋｅｌ様基底細胞（有尾類両生類）も又、一部の種において報告されている。更に、味蕾を含む細胞型の分類は、生涯を通した味覚細胞の交換に起因する各発達段階における細胞の存在により更に複雑になっている。
【００２６】
ＩＩＩ型細胞は、最初にウサギで報告された（Ｍｕｒｒａｙ，１９７３）。これらの細胞は、全般的な形態学的特徴においてＩＩ型細胞と類似しているが、稠密なコア部を有する小胞を核周囲の原形質に有しており（Ｔａｋｅｄａ  ａｎｄ  Ｈｏｓｈｉｎｏ，１９７５）、セロトニン様の免疫反応性（ＬＩＲ）を示す（Ｕｃｈｉｄａ，１９８５；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｒｏｐｅｒ，１９９５）。当初は、数多くの大型の稠密コア部保有小胞を有する細胞が報告されていたものの（Ｔａｋｅｄａ  ａｎｄ  Ｈｏｓｈｉｎｏ，１９７５）、ＩＩＩ型細胞はラット及びマウスにおいて報告されていなかった。又、げっ歯類の味覚細胞の小型サブセットはセロトニン−ＬＩＲを有しており、これは即時セロトニン前駆物質５−ＨＴＰによる前処理により顕著に増強される（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｒｏｐｅｒ，１９９５；Ｂｏｕｒｎｅ  ａｎｄ  Ｋｉｎｎａｍｏｎ，１９９９）。ウサギにおいては、シナプス前味覚細胞、即ち求心性シナプスを神経線維上にもたらすものがＩＩＩ型細胞である（Ｍｕｒｒａｙ，１９７３；Ｒｏｙｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｎｎａｍｏｎ，１９９１）。最近の研究は、大部分がＫｉｎｎａｍｏｎにより行われたものであり、げっ歯類の中間細胞を分類し始めているが、その一部はＩＩＩ型細胞のようにセロトニン作用性である。マウスの三つ全ての拡張された味覚細胞型、即ちＩ型、中間及びＩＩ型の細胞は、神経線維とのシナプス接触を有すると報告されている（Ｋｉｎｎａｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｋｉｎｎａｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｒｏｙｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｎｎａｍｏｎ，１９９４）。これらの求心性シナプスには、二つの構造型、即ち斑点状及び手指状のものがある（Ｋｉｎｎａｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｋｉｎｎａｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｋｉｎｎａｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｒｏｙｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｎｎａｍｏｎ，１９９４）。これは、明色及び暗色の細胞の両方が神経線維又は基底細胞とのシナプス接触をもたらすことを示す、魚類におけるより以前の研究と一致している’（Ｒｅｕｔｔｅｒ，１９７１）。ラットにおいては、中間又はセロトニン作用性（現在ではＩＩＩ型と呼ぶ）の細胞のみが、神経線維と古典的なシナプス接触を示している。
【００２７】
味覚細胞の免疫組織化学的特徴
同じように中間性細胞の形態学的特徴の一部を有するラット味蕾の細胞中にセロトニン−ＬＩＲが存在するため、これらの細胞は形式的にＩＩＩ型細胞と分類されている。有郭味蕾においては、シナプスを有する味覚細胞（ＩＩＩ型）のみが、シナプス前膜タンパク質であるＳＮＡＰ−２５に対して免疫反応性を示す（Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＳＮＡＰ−２５は又、大部分の味蕾内及び味蕾周囲の神経線維中にも存在する。このことは、これらの線維が「シナプス前」、即ち、遠心性並びに求心性であることを意味している。例えば、直列又は二方向のシナプスは、一部の両生類で認められている味覚細胞において報告されている。味蕾神経線維中のＳＮＡＰ−２５の存在は、脳幹中のより高次の細胞に対してシナプス前である神経細胞の別の末端からの輸送に起因すると考えられる。これとは対照的に、シナプス小胞ドッキングと神経伝達物質の放出を強調させるためにＳＮＡＰ−２５と共に機能すると考えられる小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）であるシナプトブレビンは、ＩＩＩ型細胞（ＮＣＡＭ−、ＳＮＡＰ−２５−及びセロトニン−ＬＩＲも示す）及びＩＩ型細胞のサブセット（味覚シグナルトランスダクション成分、例えばＰＬＣβ２及びＩＰ３Ｒ３も示す）の両方に存在すると考えられる（Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。このことは、ＴＥＭによる超構造研究では認識されていない「非慣習的」シナプスをＩ型細胞が有することが示唆している（Ｃｌａｐｐ，ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照）。
【００２８】
Ｇタンパク質共役型受容体に関連する味覚トランスダクション成分である、ＩＰ３Ｒ３、ＰＬＣβ２、ＴＲＰＭ５及びＧガンマ１３は、ラットにおけるＩＩ型の大型サブセット及びＩＩＩ型有郭味覚細胞の小型サブセットにおいて発現される（Ｃｌａｐｐ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＮＣＡＭは多くの中間性細胞（ＩＩＩ型細胞）中に存在する（Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｎｇｅｒ，１９９３）。５−ＨＴ−ＬＩＲ及びＰＧＰ９．５−ＬＩＲは、ＩＩＩ型細胞の相互排他的サブセットに存在するが、ＰＧＰ９．５は一部のＩＩ型細胞中にも存在する（Ｙｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＰＬＣシグナリング成分は、大部分のＩＩ型細胞及びＩＩＩ型細胞の小型サブセットに含まれる。脳誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、全てのＩＩＩ型細胞に含まれると考えられるが、ＩＩ型細胞では小型サブセットにのみ含まれると考えられる（Ｙｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ラットのＩＩＩ型細胞のみが神経線維を伴った慣習的シナプスを有する。
【００２９】
味覚系の機能的応答
種々の機能的細胞マーカーがげっ歯類の味蕾において使用されているが、結果は古典的な形態学的細胞型に関して幾分錯綜している。おそらくは機能的に異なる味覚細胞の種々のサブセットが存在すると考えられる。Ｉ型細胞のマーキングには抗原Ｈ（血液型抗原）を、ＩＩ型細胞には抗原Ａを、ＩＩＩ型細胞にはＮＣＡＭを使用して、Ｍｅｄｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）では、ＣＶ及びマウス葉状味覚細胞において電圧ゲート電流の型が発見されている。このように分類すると、全てのＩ型細胞及び多くのＩＩ型細胞が小型電圧ゲートナトリウム及びカリウム電流を示し、カルシウム電流は示さなかったことになる。ＩＩ型細胞のサブセット及びＩＩＩ型細胞の全ては、大型のＮａ及びＫ電流並びに電圧ゲートＣａ電流を有していた。意外にも、ガストデューシン陽性であったＩＩ型細胞のサブセットは、Ｃａ電流を欠失していた。これらの結果は、ＩＩＩ型細胞が神経線維を伴ったシナプスを有するものの、Ｇタンパク質共役型受容体を伴ったＩＩ型細胞は慣習的な化学シナプスを有さないという解釈と一致している。
【００３０】
又、Ｌｙａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５）及びＬｙａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）では、哺乳動物における塩味応答のアミロリド非感受性成分の媒介における新規バニロイド受容体変異体の関与が示唆している。しかし、これらのデータは、塩味応答における上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）の役割を完全に否定するわけではない。
【００３１】
ＡＴＰが味覚系において神経伝達物質としての役割を果たすという生理学的試験による証拠は数多く得られている（Ｆｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｂａｒｙｓｈｎｉｋｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）。Ｐ２Ｘ及び／又はＰ３Ｘイオノトロピック受容体のノックアウトマウスにより、味覚応答は大きく損なわれている。一方、Ｂａｒｙｓｈｎｉｋｏｖ等は、マウス味覚細胞上にＰ２Ｙ（代謝生成物産性）ＡＴＰ受容体が存在しており、内部Ｃａを放出した後にＣａを流入するＩＰ３カスケードであるＰＬＣを介してこれらの受容体がＡＴＰにより活性化されることを示している。Ｐ２Ｘは神経線維上に存在しており、味覚細胞から放出されたＡＴＰへの応答を媒介すると考えられる。しかし、Ｐ２Ｙ受容体は、他の味覚細胞からのＡＴＰに対する、又は遠心性神経終末から放出されたＡＴＰに対する神経調節性応答を媒介する。
【００３２】
神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）であるコレシストキニン及びその他の神経ペプチドを使用した最近の研究も存在する（Ｈｅｒｎｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）。これらの物質は味覚細胞により放出され、放出細胞に対する自己分泌作用及び近隣細胞に対する内分泌作用の両方を有すると考えられる。これらはおそらく味覚受容体細胞の応答性又は感受性の設定において神経調節物質として機能する。ＮＰＹとコレシストキニン又は血管作用性腸ペプチドの重複は１００％であった。細胞の応答性に対するＮＰＹ及びその他のペプチドの逆の作用があるとすれば、これは所定の細胞におけるプッシュプル系を示している。
【００３３】
本発明は１つ以上の刺激に対する味蕾を含む舌上皮組織の機能的細胞応答を決定する方法を提供する。試験する組織には、肝臓、未損傷の味覚細胞が含まれる。組織は生検試料の形態で動物から得る場合もあれば、動物（例えばブタ）の屠殺直後に得る場合もある。組織は更に試験を行うために調製する。一実施形態において、採取された組織は切片に調製される。別の実施形態においては、個々の乳頭が単離される。別の実施形態においては、機能的味蕾と共に個々の味覚乳頭が単離される。次に、単離した組織を、顕微鏡のカバーガラスのような固体基板の内又は上の何れかに静置する。固体基板は組織接着コーティングにより被覆され得る。続いて、酸素添加細胞培地及び刺激物の灌流を行う組織チャンバー内に組織を静置し得る。
【００３４】
試験する組織は、標識又は検出可能部分と接触させ得る。例えば、組織は蛍光染料と接触させ得る。特定の実施形態においては、染料を組織又は細胞又は細胞群内に注入し得る。
【００３５】
試験する組織は、１つ以上の被験味覚刺激物、例えば味覚細胞及び組織の活性化剤、阻害剤、刺激剤、増強剤、アゴニスト及びアンタゴニストと接触させるが、この時、味覚細胞の刺激への曝露が味孔を介した味覚細胞の先端部に限局されるようにする。接触は、味孔領域へのマイクロピペットを介した刺激の近接送達による点送達によるか、又は既知の刺激物濃度の灌流を介したバルク送達（即ち、刺激物への組織の浸積）により行われ得る。刺激は短時間（例えば数秒間）又は長時間（例えば数分）にわたり組織と接触され得る。更に、刺激は一定期間組織と接触させた後、一定期間中断し、再度接触させる場合もある。このサイクルは多数回反復することができる。或いは、刺激を任意の濃度で加えた後、より高値又は低値の何れかの別の濃度で刺激を加える場合もある。
【００３６】
次に刺激により惹起された少なくとも１つの細胞シグナリング事象の規模を検出する及び／又は定量的に測定する。広範な種類の手法及び技法が使用され得る。例としては、特異的結合特性を有するネイティブの蛍光又は蛍光団を使用する広視野蛍光画像化、共焦点レーザー走査顕微鏡（例えば多光子共焦点レーザー走査顕微鏡）が含まれる。データ値は、例えば、異なる濃度の刺激及び／又は異なる時点において、複数のデータ値が収集され得る。
【００３７】
本発明の方法においては、１つ以上の刺激に応答した細胞シグナリングを定量的に測定する。例えば、刺激の非存在下における細胞シグナリング応答を測定し、刺激の存在下における細胞シグナリング応答を測定し、そして更には刺激を除去した後の応答を測定することができる。換言すれば、異なる時間の測定値を求めることができ、そして異なる濃度の測定値を求めることができる。
【００３８】
生存未損傷の味覚細胞／味蕾／組織
本発明の手法は、味蕾内の細胞間の横の相互作用を直接解明することができる。味覚組織系の応答測定を可能にする幾つかの手法が示されている。味蕾組織は試験対象の種の生存被験対象から、又は屠殺動物から摘出され得る。味覚細胞は適切に切片化された味覚乳頭から得て、切片内に味覚細胞及び味蕾の構造の大多数を含む肥厚切片（厚さ２００μｍ）として使用され得る。この切片調製により、ｉｎ  ｓｉｔｕの味蕾の形態学的及び機能的な組織化の殆どを保持するほぼ未損傷の味蕾への実験的接触が可能になる。
【００３９】
味蕾切片の調製は又、味蕾内の細胞における横方向及び／又は逐次的なプロセスにより味覚応答が調節されるかどうかを調べることも可能になる。例えば、膜電位に対する感受性を有する染料を使用して、味覚細胞内で同時に起こる電気的応答を測定することができる。膜染料は又、どの細胞が味覚刺激に応答して神経伝達物質を放出しているかを調べるためにシナプス小胞リサイクリングを測定する際にも使用できる。ルシファーイエローのような染料を使用することで、シグナルプロセシングに対する味覚細胞間の電気的結合の作用を評価することができる。
【００４０】
例えば、ブタ組織の場合、未損傷の舌を現地の屠殺場から入手し、すぐに冷蔵保存（０℃）して実験室に輸送する。次に舌を観察し、茸状乳頭を含む組織切片を舌側部から摘出する。この場合の組織切片は上皮組織のみならず、味覚細胞及び乳頭下部の結合組織を含んでいる。この方法で摘出した切片を、Ｄａｎｉｌｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）のような参考文献に記載の通り、酸素添加された適切な保存溶液に入れる。別の実施形態においては、生検試料を生存動物（例えばブタ）から摘出し、すぐに試験用に調製する。
【００４１】
一実施形態において、組織切片は（例えば振動ミクロトームを使用して）厚さ１００〜２００μｍの切片に調製される。これは切片化の人為的影響を最小限にしながら切片が切り出されるように、冷蔵した組織及び保存溶液を使用することにより達成される。次に個々の組織切片を、組織接着コーティング又はタンパク質（一般的にコラーゲンを使用）で被覆された顕微鏡カバーガラス上に置く。このカバーガラスを、除去可能な好適な接着剤又は高粘度の非反応性グリースを使用して、酸素添加された細胞培地及び刺激物の灌流を行う組織チャンバーに取り付ける。この状態が整うと、適切な細胞シグナリング染料を注入して、切片として刺激への応答を画像化することができる。或いは、乳頭組織に適切なシグナリング染料を注入した後に、切片を上記と同様の態様で調製され得る。
【００４２】
別法としては、組織の上部に位置する上皮細胞及び未損傷の味孔を伴った乳頭組織として舌から摘出した味覚組織の未損傷の調製物を使用する。例えば対象動物（例えばブタ又はヒト）を麻酔し、そして舌の外側に沿って生検試料採取することにより側部上１〜２ミリメートルのブロックを摘出する。次にこの組織を直接冷蔵保存溶液中にいれ、解離用顕微鏡下に単一の茸状乳頭を含有する組織試料に調製する。次にこれを味蕾の尖端面がカバーガラスから突出するようにカバーガラスに移し、味孔及び周囲の上皮組織が露出するようにし、そして乳頭の基底外側の部分を小孔に渡るようにカバーガラスに接合させ、基底外側の面から組織の灌流が可能なようにする。コラーゲンコーティングを使用するか、又はカバーガラスと接触させて乳頭の端部に組織セメントを適用することにより、組織をカバーガラスに接着させ得る。この試料はこれにより、後に適切なシグナリング染料の注入ができるように調製されている。一般的な味覚組織の調製及び注入のプロトコルの例及び結果は、以下の参考文献、即ちＬｉｎｄｅｍａｎｎ，１９９６；及びＣａｉｃｅｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０００に記載されている。
【００４３】
味覚組織（味蕾又は味覚乳頭）は広範な種類の動物から単離できる。例えばげっ歯類はＣａｉｃｅｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０００において提示された研究において味覚感覚系の刺激を含む試験の対象である。更に又、以下の参考文献、即ち、Ｂｏｕｄｒｅａｕ，ｅｔ  ａｌ．，１９７３；Ｂｏｕｄｒｅａｕ，ｅｔ  ａｌ．，１９７７；Ｂｏｕｄｒｅａｕ，ｅｔ  ａｌ．，１９７１；Ｋｒｉｍｍ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８；及びＢｏｕｄｒｅａｕ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５によれば、ネコの標本が味覚応答試験に使用されている。更に又、以下の参考文献、即ち、Ｋｕｍａｚａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｋｕｍａｚａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｋｕｍａｚａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０；及びＮａｋａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１に提示されている研究においてはイヌが味覚感覚系の刺激を含む実験の対象となっている。
【００４４】
味覚組織からの味覚感覚系（味蕾又は味覚乳頭）の単離は哺乳動物対象に限定されない。例えば以下の代表的参考文献、即ち、Ｃａｐｒｉｏ，Ｊ．１９７５；Ｂｒａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｚｖｉｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｈａｙａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｆｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；及びＡｓｈｗｏｒｔｈ，２００４によれば魚類の種が味覚系の試験の対象となっている。
【００４５】
細胞シグナリング事象の蛍光画像化よりなる画像化システム
細胞シグナリング事象の画像化は種々の技法及び技術を使用して実施する。この領域の研究における有力なツールは細胞内の蛍光構造及び特徴の光学顕微鏡観察であり、これは特定の装置及び手法の広範なスペクトルを包含する。第一にネイティブの蛍光及び細胞種への特異的結合特性を有する蛍光団の添加の両方を使用した広視野蛍光画像化が広範に使用されているツールである。更に又、紫外線又は可視光の励起を使用した蛍光標識された細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡観察（ＣＬＳＭ）が細胞試験において益々使用されているツールである。或いは、近赤外レーザーを使用した多光子励起による蛍光標識細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡観察は、蛍光分子の多光子励起において利用される光学的作用のため、より深い組織サンプリング及び低減した組織損傷を可能にする方法である。
【００４６】
蛍光は蛍光団又は蛍光染料と呼ばれる特定の分子（一般的に多芳香族炭化水素又は複素環）において生じる３段階プロセスの結果である。蛍光プローブは生物学的標本の特定の領域内に局在化するため、又は、特定の刺激に応答するために設計された蛍光団である。
【００４７】
第１段階においては、エネルギーｈυＥＸの光子を白熱電球又はレーザーのような外部光源から供給し、そして蛍光団に吸収させ、励起電子の一重項状態（Ｓ１’）を形成する。このプロセスは励起状態が化学反応によりもたらされる化学ルミネセンスから蛍光を区別している。
【００４８】
第２段階においては、励起状態が一瞬存在する（一般的に１〜１０ナノ秒）。その間、蛍光団はコンホーメーションの変化を起こし、そして又その分子環境との可能な相互作用の多くのものに付される。これらのプロセスは二つの重要な結果を示す。第一に、Ｓ１’のエネルギーが部分的に消散し、弛緩した一重項励起状態（Ｓ１）を生じさせ、これから蛍光が発光する。第二に吸収（第１段階）により当初励起された分子の全てが蛍光発光により基底状態（Ｓ０）に戻るわけではない。他のプロセス、例えば衝突消光、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）及び系内交差（後述参照）も又Ｓ１を減少させる。発光された蛍光光子の数（第３段階）の吸収された光子の数（第１段階）に対する比である蛍光の量子収率がこれらのプロセスが起こった相対的範囲の尺度となる。
【００４９】
蛍光励起／発光プロセスの第３段階の間、エネルギーｈυＥＭの光子が発光され、蛍光団をその基底状態Ｓ０に戻す。励起状態の寿命中のエネルギーの消散の為に、この光子のエネルギーは低値となり、従って、励起光子ｈυＥＸより長い波長のものとなる。（ｈυＥＸ−ｈυＥＭ）で表されるエネルギー又は波長の相違はストークスシフトと呼ばれる。ストークスシフトは、それが励起光子から単離された低バックグラウンドに対する発光光子を検出可能とするため、蛍光技法の感度の為に重要である。これとは対照的に吸光度分光分析は同じ波長における高い入射光水準に相対比較して透過光の測定を必要とする。
【００５０】
全体的な蛍光プロセスは周期的である。蛍光団を励起状態において非可逆的に破壊しない限り（後述する通り光退色として知られる重要な減少）、同じ蛍光団を繰り返し励起し、検出することができる。単一の蛍光団が数千個の検出可能な光子を発生できるという事実は、蛍光検出手法の高い感度の為に重要である。溶液中の多原子分子については、ｈυＥＸ及びｈυＥＭで示される異なる電子遷移がそれぞれ蛍光励起スペクトル及び蛍光発光スペクトルと呼ばれるより広範なエネルギースペクトルにより置き換えられる。これらのスペクトルのバンド幅は異なる蛍光団二つ以上が同時に検出される適用例にとって特に重要なパラメータである（後述参照）。殆ど例外なく、希薄溶液中の単一の蛍光団物質種の蛍光励起スペクトルがその吸収スペクトルと同一になる。同じ条件下において、蛍光発光スペクトルは、励起状態寿命の間の励起エネルギーの部分的消散の為に、励起波長から独立している。発光強度は励起波長における蛍光励起スペクトルの振幅に比例する。蛍光に関与する光学的プロセスに関する追加的情報についてはＬａｋｏｗｉｚｅ，Ｊ．Ｒ．，１９９９に記載されている。
【００５１】
蛍光顕微鏡観察は特定の細胞標的への蛍光標識の適用により得ることができる固有の特異性の為に極めて有用である。一例として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは特異的試験及びタグ付け実験を可能にするために官能性付与された標準化蛍光タグの完全なライブラリを商品化し、販売している。例えば、カルシウム感受性染料は、染料の励起又は発光特性を変化させることにより細胞内カルシウムイオン濃度の変化に応答する。カルシウムイオンインジケーターであるｆｕｒａ−２及びｉｎｄｏ−１については、蛍光イオンインジケーターの遊離及びイオン結合形態は異なる発光又は励起スペクトルを有する。この型のインジケーターの場合、光学シグナルの比を使用して会合平衡をモニタリングし、そしてイオン濃度を計算することができる。レシオメトリックな測定は、光脱色及びプローブの注入及び保持の変動により、並びに照明安定性のような機器の要因により生じるデータの歪を排除する。種々の環境における蛍光団の寿命測定は、染料の分布や光学的散乱の相違にかかわらず、環境の変動の定量的な測定を可能にし、これを生組織における測定の魅力的な様式としている。
【００５２】
広視野蛍光顕微鏡観察は局所解剖学的及び力学的な情報の両方を得るために極めて広範に使用されている。これは試料全体を同時に照明することに依存している。光源は通常は水銀灯であり、純粋な白色光を発生する。次に光学的フィルターを使用することにより励起光の波長を選択する（励起フィルター）。励起光を光二色性の鏡（即ちある波長は反射するが他の波長に対しては透過性である鏡）を介して試料に指向させ、そして蛍光をカメラ（通常はＣＣＤカメラ）により検出する。即ち、選択された顕微鏡の対物レンズの全視野に対応できる光の照明と検出の両方が同時に達成される。
【００５３】
或いは、レーザー走査共焦点顕微鏡観察（ＬＳＣＭ又はＣＬＳＭ、本明細書においてはＣＬＳＭと略記）を使用して試験中の系を励起させ、蛍光を採取し得る。ＣＬＳＭにより蛍光を測定することは広視野蛍光顕微鏡観察とは多くの点で異なっている。第一に光源は１つ以上のレーザーである。これにより二つの結果が生じる。第一に、励起光のバンド幅は励起フィルターではなく光源により決定され、従って、広視野蛍光顕微鏡よりも遥かに狭小となる（２０〜３０ｎｍではなく２〜３ｎｍ）。第二に、全視野を照明するためには、レーザー光線はＴＶ画像化を作成するかのように、一連の線として領域を通過させながら急速に走査しなければならない。各点において検出される蛍光は光電子増倍管（ＰＭＴ）において測定され、そして画像化が形成される。この照明方法は視野の選択された領域を照明することが可能であり、これにより、蛍光団の横方向の移動の速度を調べるために、そして、同じ細胞の異なる領域における異なる蛍光団の励起に関して、複雑な光脱色プロトコルを実行可能とするという点において多大な利点を有している。蛍光顕微鏡とＣＬＳＭの間の主要な相違点は光路におけるピンホールの存在である。これは望ましくない焦点外の蛍光を除去する装置であり、３次元画像の光学的スライスを与える。画像化プロトコルの一実施形態において、試料上の励起光の入射が目的の対象物を励起し、そして高解像度の蛍光画像化を与え、そして検出器に到達するヘイズ又は焦点外の光は最小限となる。このような画像を得るためにはピンホールを検出器の光電子増倍管の前面に置き、そしてこの焦点外の光が通過してＰＭＴ内に至ることを阻害する。このことはＰＭＴに進入し、これにより検出される唯一の光は、顕微鏡の対物レンズの焦点面近傍から来ることを意味する。これは試料の領域を通過してとられるため、対象及び周囲の物質を通過するスライスである画像を与える。これは「光学スライシング」として知られており、これによって観察者は対象の内部を調べることが可能となる。これにより鮮明な画像が得られ、詳細も精密に観察することができる。
【００５４】
上記の利点に加えて、顕微鏡の焦点を変更することにより、種々の深度で画像を得ることができる。各画像はｚ断面と呼ばれ、３次元対象の画像を再構築するために使用できる。同様に、この手法は対象を切断してスライスとし、次にスライスを再度積層し直して対象の形状を再構築することに似ている。この原理は多重ｚ断面を使用して同様に達成できる。画像が正しい順序で「積層」されれば、対照の単一の３次元画像が形成できる。
【００５５】
別の実施形態においては、多光子ＣＬＳＭが使用される場合があり、その場合、目的の蛍光団の多光子励起が達成される。前述の通り、発光された蛍光のエネルギーは入射光より低値である。又、赤色光を吸収する蛍光団は緑色蛍光を発光しない。これはほぼ全ての蛍光の用途において当てはまる。しかしながら適切な条件下では低エネルギー入射光を使用した高エネルギー蛍光の発生は、エネルギーは効果的に合算され、そしてより高エネルギーの単一の光子として作用するために十分短時間で空間中の同じ点に励起光の多光子を送達することにより達成される。第１光子の到着により電子は励起するが、より安定な状態に到達するほど十分ではない。この過剰なエネルギーは極めて急速に消失するが、第２の光子が十分迅速に送達されれば電子は高エネルギー単一光子が到達しているがごとく作用し、焦点蛍光団からの蛍光の発光をもたらす。
【００５６】
電子励起の時間枠は意外に短い。第２の光子は＜０．１フェムト秒内に到着しなければならず、従って光子は高速連続で送達しなければならない。しかしながらそのように空間の特定の位置に光子の高速連続流を送達するために必要な電力は多大なものであり、約１テラワット／ｃｍ２にものぼる。生物学的試料への損傷を防止するためには、一般的にパルスレーザーを使用する。一般的な多光子励起レーザーは、〜７００〜１０００ナノメートルの範囲の波長において約１２〜４０ナノ秒隔たった約１００フェムト秒の持続時間の光子のパルスを送達するチタン：サファイアレーザーである。即ち、光のパルスは非常に高強度であるが、試料に送達される平均の電力は比較的低値である。
【００５７】
蛍光画像化において多光子励起を使用することに関しては、幾つかの利点が存在する。第一に、高強度の赤色から近赤外のレーザーは低強度の青色光よりも低効率で散乱するため、目的の対象は従来のＣＬＳＭの場合よりも厚い組織切片において画像化できる。より厚い組織切片はより健全であると考えられ、そして観察される細胞は試料調製において損傷を受けている可能性が低い。第二に、励起光の全体的エネルギーが低値であることは、観察時に起こる光毒性損傷が低減され、そして観察される光脱色が低減され、細胞を観察できる時間が延長される。第三に、多光子ＣＬＳＭは本来共焦点であり、即ちピンホールを必要としない。蛍光団の励起は２光子が相互作用できる場合にのみ起こりえる。２光子が必要な時間枠内に蛍光団と相互作用する確立が二次性であるとすれば、励起は対物レンズの焦点面においてのみ起こる。これにより更に明確な画像が得られる。最後に、多光子ＣＬＳＭにおいて使用される高反復速度パルスレーザーは急速蛍光寿命測定を実施するために比類なく適している。即ち、適切なカルシウム感受性染料、例えばカルシウムグリーンデキストランを伴った細胞は、適切に設計されたＣＬＳＭと共に多光子蛍光寿命画像化を使用して画像化することにより、味覚受容体細胞のような受容体細胞における細胞内カルシウム放出の深部組織測定が可能となる。
【００５８】
細胞シグナリング試験における蛍光顕微鏡の生物学的適用に関する追加的情報は以下の参考文献、即ちＧｒａｔｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋｏｅｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｏｎｉｇ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００３に記載されている。
【００５９】
生組織に適用される定量的刺激送達系
厳密な時間的及び空間的制御の下にプレパレーションに味覚刺激の既知濃度を与える能力は、刺激に応答した細胞シグナリングの定量的測定の為に重要である。刺激の送達は何れかの１つ又は数種の方法により行われ得る。本発明の一実施形態において、例えば刺激の送達は味孔領域へのマイクロピペットを介した刺激の直近の送達による点送達により行われる。別の例示的実施形態において、刺激の送達は、既知の刺激物濃度の灌流により刺激物に組織を効果的に浸積することによるバルク送達により行う。
【００６０】
直近送達法の一実施形態において、味蕾を含有する味覚乳頭の切片を接着タンパク質で被覆されたカバーガラス上に搭載する。カバーガラスは顕微鏡のステージに取り付けられる記録／灌流チャンバーの底部を形成する。酸素添加された生理食塩水（例えばＴｙｒｏｄｅ溶液）の連続的バックグラウンド流動体を独立加熱した灌流系統を介して温度制御タンクからチャンバーに供給する。切片を通過する流動体の方向は味蕾の基部から尖端領域に向かうようにする。味覚刺激又は刺激の混合物を独立した独立した８ラインの温度制御された灌流ペンシルから適用する。７ラインの各々は小型の（通常は閉鎖された）ソレノイド弁を介して加圧された溶液タンクに連結されている。８番目のラインは通常は開放されているソレノイド弁を介して調節された真空ライン及び真空とラップに連結されている。ソレノイドは、刺激弁が開放されている間は真空ラインは所定時間に渡り同時に閉鎖されているように、コンピュータ制御下にある。この装置を味蕾の尖端に近接して僅かに遠位となるように送達先端と共に位置付ける。これにより７種までの異なる刺激の小型パフが味覚細胞の尖端の受容端部に適用できるようになる。刺激タンクの圧力、刺激送達管の位置及びバックグラウンド灌流の速度を調節することにより、刺激を味蕾細胞の先端表面のみに限定することができる。舌表面上の味覚刺激とは通常は相互作用しない味蕾細胞の基底外側膜における細胞経路の活性化は、味覚応答特性に関する誤った結論に導き得るため、防止することが望ましい。刺激送達マニホールドの真空ラインは一般的に、選択された刺激弁の活性化の直後は閉鎖され、そして閉鎖ラインから漏出する溶液を排除することにより刺激の混合を防止するため、及び、選択された送達管をプライミングするために機能する。溶液は一定の流体水準を与えるため、及び溶液表面に「ジッター」又は「スラーピング」を伴うことなく溶液を引き出すために真空ラインによりチャンバーから持続的に除去される。
【００６１】
別の実施形態において、味蕾を含有する舌上皮の小片を穏やかな酵素による処理を使用するか、外科的摘出を介して、伏在する組織から摘出する。上皮は基底外側（漿膜）及び尖端（粘膜）表面の独立した灌流を行う経上皮チャンバー内に搭載する。これにより上皮及びその中にある味蕾の正常な極性が維持できるようになる。基底外側チャンバーをガス発生及び気泡形成を最小限にするために予備加熱してある酸素添加Ｔｙｒｏｄｅ溶液で灌流する。基底外側イオンチャンネル及び輸送の操作は多くの弁を介して他の灌流液タンクに切り替えることにより薬理学的物質を含有するＴｙｒｏｄｅ溶液の適用により走査する。尖端チャンバーは浸積した対象を有する開放配置において、又は、チャンバー上部に結着したカバーガラスで閉鎖されるかの何れかで使用される。何れの場合においても、刺激は、短い配管でチャンバーに連結されたマニホールドに連結されたコンピュータ制御されたソレノイド弁を介して尖端チャンバーに連結された温度制御されたタンクから適用する。このシステムは一定流量シリンジを介して重力により供給するか、加圧タンクによるものとする。何れの場合においても、２４種までの独立した刺激を尖端チャンバーに適用することができ、そして次に、本システムに伴ったコンピュータ制御の下に洗浄される。別の刺激送達の配置においては、刺激は尖端灌流系統とインラインに設置された試料注入ループを介して送達される。注入ループの容量はループの長さにより調節され、静的流速条件下で、刺激は既知時間にて既知濃度を使用して試料チャンバー内に再現可能に導入され得る。
【００６２】
画像化／刺激システムからの刺激／応答データ構造の収集
刺激／応答データ構造は、以下の一般的な態様で生の細胞標本から収集され得る。生の細胞の画像化を可能にするため、細胞及び／又は組織試料を得て、好適な酸素添加槽に取り付ける。細胞／組織は、細胞内マトリックス（又は、膜電位感受性染料の場合には膜、及びシナプス活性マーカーの場合にはリサイクルシナプス小胞）に染料が注入されるように、シグナリング感受性蛍光染料に曝す。この細胞及び／組織試料を、刺激システム及び灌流チャンバーを格納する画像化プラットフォームと支持装置に移し、実験データの収集時に試料の一定した灌流が行えるようにする。画像データは、適切な画像様式と取得パラメータを使用して、細胞及び／又は組織試料から収集し、定量刺激の前にベースライン又は標準の静止応答画像データマトリックスを得る。
【００６３】
刺激物又は一連の刺激物は、代理又は合成の唾液マトリックスで調製された既知の濃度の刺激物の１種以上の溶液の形態で適用する。刺激物の適用は、味孔に最も近く、刺激物流及びピペット位置の制御が可能なマイクロピペットシステムを介して管理される。或いは、刺激物の適用は、灌流培地を介して、即ち、既知の濃度の刺激物中に細胞及び／組織試料を浴することによって管理される。既知の刺激物を細胞及び／又は組織試料に適用する前、適用中、及び適用後に、味蕾を全てではなくとも一部を含む細胞が、画像化システムにより取得された視野内に映し出された状態で、画像データを収集する。画像データは、各段階（刺激前、刺激中、及び刺激後）毎に複数の時点に対応したデータが収集されるように収集する。各時点で収集された画像データは、二つ又は三つの空間寸法を含み得る。
【００６４】
例として、未損傷の豚の舌を現地の屠殺場から入手され、すぐに冷蔵保存（４℃）して実験室に輸送する。次に舌を観察し、茸状乳頭を含む組織切片を舌側部から摘出する。この場合の組織切片は上皮組織のみならず、味覚細胞及び乳頭下部の結合組織を含んでいる。この方法で摘出した切片を、酸素添加された適切なＴｙｒｏｄｅ保存溶液に入れる。
【００６５】
組織切片は、振動ミクロトームを使用して、厚さ１００〜２００μｍの切片に調製される。これは切片化の人為的影響を最小限にしながら切片が切り出されるように、冷蔵した組織及び保存溶液を使用して行われる。次に個々の組織切片を、組織接着コーティング又はタンパク質（一般的にコラーゲンを使用）で被覆された顕微鏡カバーガラス上に置く。このカバーガラスを、除去可能な好適な接着剤又は高粘度の非反応性グリースを使用して、酸素添加された細胞培地及び刺激物の灌流を行う組織チャンバーに取り付ける。この状態が整うと、５ｍｇ／ｍＬカルシウムグリーンデキストラン（３０００／ＭＷ）のような染料をイオン泳動により注入して、切片としてグルタミン酸刺激への応答を画像化することができる。このカルシウム感受性染料の注入は、標準の広視野落射蛍光顕微鏡を介して検証される。次に、この組織切片標本を、記録用顕微鏡の測定チャンバーに移す。このような顕微鏡には、染料の多光子の励磁と５３０ｎｍ以上の発光記録が可能な落射蛍光光学フィルターを備えた多光子共焦点レーザー走査顕微鏡が含まれる。酸素添加された生理食塩水（Ｔｙｒｏｄｅ溶液）の連続したバックグラウンド流が、独立して加熱された灌流系統を介して温度制御タンクからこのチャンバーへ供給される。切片を横切る流れの方向は、基部から味蕾の先端領域へ向けられる。味覚刺激又は刺激物の化合物は、独立した８系統の温度制御灌流ペンシルから適用される。７本の系統はそれぞれ、微小（常閉）電磁バルブを介して加圧溶液タンクへ取り付ける。８本目の系統は、常開電磁バルブを介して制御真空系統及び真空トラップへ取り付ける。これらの電磁バルブは、コンピュータ制御されているため、真空系統が所定の時間にわたり同時に閉鎖されている時に、刺激物バルブが開く。このデバイスは、その送達先端が味蕾の先端に近く、僅かに遠位になるように配置される。
【００６６】
時間＝０の刺激１の場合、灌流及び刺激チャンバーでは刺激のない流れが可能となり、一つ以上の画像フレームが取得され、それによって、発生された蛍光の強度が、組織を介して一つの平面に沿ってピクセル単位で取得され、視野内の組織の細胞の全てではなくとも一部を取り込む。これらのフレームは、刺激の前にベースラインフレームと呼ばれる。刺激のない２〜５分の灌流の後、人工サルビア灌流培地における低濃度刺激物のグルタミン酸塩（０．０５ｎｍｏｌ／Ｌ）が、１２０秒等の事前に定義された期間の間、味孔に隣接した単一のピペットチャンネルを介して適用される。刺激に対する初期応答が、刺激チャンネルが起動されると、蛍光画像化システムを介して記録される。続いて、二つ又はそれより多くの追加の画像フレームが、刺激印加時間中に記録され、刺激中に一連のフレームが発生され収集される。次に、この刺激は、中断され、灌流が刺激無しに続き、味孔周辺の対象領域から刺激を効果的に除去する。刺激物が除去された後、６０秒に対応する時間間隔で、刺激１の後に対象となる味覚系の休止、即ち、刺激後の応答に対応する三つのフレームの画像データを現像するために、蛍光画像化システムを使用して追加のフレームが記録される。
【００６７】
刺激２に対して、灌流及び刺激チャンバーは、刺激のない流れを可能とし、単一の画像フレームが、取得され、それによって、発生された蛍光の強度が、組織を介して一平面に沿ってピクセルベースで取得され、視野内の組織内に細胞の全部ではないが幾つかを取得する。このフレームは、刺激２に対する刺激に先行するベースラインフレームと呼ばれる。刺激のない２〜５分の灌流の後に、人工サルビア灌流培地における低濃度刺激のグルタミン酸塩（０．２５ｎｍｌ／Ｌ）が、１２０秒のような事前に定義された時間長の間、味孔に隣接した単一のピペットチャンネルを介して適用される。刺激に対する初期応答が、刺激チャンネルが起動されると、蛍光画像化システムを介して記録される。続いて、二つの追加の画像フレームが、刺激印加時間中に記録され、刺激中に一連のフレームが発生され収集される。次に、この刺激は、中断され、灌流が刺激無しに続き、味孔回りの対応する領域から刺激を効率的に除去する。刺激が除去された後で且つ６０秒に対応する時間間隔で、追加のフレームが、刺激２の後に学ばれた味覚系の休止、即ち、過去の刺激応答に対応する画像データの三つのフレームを現像するために蛍光画像化システムを使用して記録される。
【００６８】
刺激３に対して、灌流及び刺激チャンバーは、刺激のない流れを可能とし、単一の画像フレームが、取得され、それによって、発生された蛍光の強度が、組織を介して一平面に沿ってピクセルベースで取得され、視野内の組織内にセルの全部ではないが幾つかを取得する。このフレームは、刺激３に対する刺激に先行するベースラインフレームと呼ばれ、このフレームは、ベースライン刺激２フレームとは強度が異なっている。刺激のない２〜５分の灌流の後に、人工サルビア灌流培地における低濃度刺激のグルタミン酸塩（０．７５ｎｍｌ／Ｌ）が、この場合は、１２０秒である事前に定義された時間長の間、味孔に隣接した単一のピペットチャンネルを介して適用される。刺激に対する初期応答が、刺激チャンネルが起動されると、蛍光画像化システムを介して記録される。続いて、二つの追加の画像フレームが、刺激印加時間中に記録され、刺激中に一連のフレームが発生され収集される。次に、この刺激は中断され、刺激物のないに灌流が続き、味孔周辺の対象領域から刺激物を効果的に除去する。刺激物が除去された後、６０秒に対応する時間間隔で、刺激３の後の対象となる味覚系の休止、即ち、刺激後の応答に対応する三つのフレームの画像データを現像するために、蛍光画像化システムを使用して追加のフレームが記録される。これらの三つの時間依存刺激／応答画像データセットを収集することによって、単一の画像データ構造が得られ、これをもとに、細胞内カルシウムの変化の強度に基づくカルシウムグリーンデキストラン蛍光測定によって決定される、刺激と味覚組織応答の間の定量的関係を生成することができる。
【００６９】
この実験の他の実施形態は、以下の通りである。対象となる豚に麻酔が施され、舌の側方部分に沿って生検され、一辺が５μメートルの組織のブロックを除去する。次に、この組織は、直接冷凍保存溶液中に配され、単一の茸状乳頭を含む組織試料に解剖用顕微鏡下で調製される。次に、これは、コラーゲン被覆カバーガラスに送られ、味蕾の先端面がカバーガラスから際立たされる。次に、このカバーガラスは、適切な除去可能接着剤や高粘性非反応性グリースを介して、酸素添加細胞培地及び刺激物の灌流を行う組織チャンバー内に配される。この状態が整うと、５ｍｇ／ｍＬカルシウムグリーンデキストラン（３０００／ＭＷ）のような染料をイオン泳動により注入して、切断切片としてグルコース刺激への応答を画像化することができる。このカルシウム感受性染料の注入は、味孔を介する味蕾の先端に対する染料の付着によって標準の広視野落射蛍光顕微鏡を介して検証される。
【００７０】
次に、未損傷組織調製が記録顕微鏡、この場合は、発生されるべき蛍光寿命画像を可能とするような方法で染料の多光子励起と５３０ｎｍの時間相関ピコ秒蛍光寿命発光の記録を可能とするように設計された落射蛍光光学フィルターを有する多光子共焦点レーザー走査顕微鏡上の測定チャンバーに転送される。これは、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬｅｉｃａＭＰ−ＦＬＩＭシステム）の出力ポートに取り付けられた時間相関単一光子カウント検出器を介して達成される。
【００７１】
上皮は、基底外側（しょう膜）面と先端（粘膜）面の独立灌流を行うトランスポート−上皮チャンバーに取り付けられる。これによって、上皮とその中に維持されるべき味蕾の正磁極が可能となる。基底外側チャンバーは、ガス発生と泡の形成を最小とするために事前に加熱された酸素添加Ｔｙｒｏｄｅ溶液が灌流される。基底外側イオンチャンネルとトランスポートの走査は、バルブバンクを介する他の灌流タンクへの切り替えによって薬剤を含有するＴｙｒｏｄｅ溶液の適用によって操作することができる。刺激は、短い長さの配管を有するチャンバーへ取り付けられたマニホールドに取り付けられたコンピュータ制御の電磁バルブを介して先端チャンバーに取り付けられた温度制御タンクから印加される。
【００７２】
時間０での刺激１に対して、灌流及び刺激チャンバーは、刺激のない流れを可能とし、単一の画像フレームが、取得され、それによって、発生された蛍光の強度が、組織を介して一平面に沿ってピクセルベースで取得され、視野内の組織内に細胞の全部ではないが幾つかを取得する。このフレームは、刺激に先行するベースラインフレームと呼ばれる。刺激のない５〜７分の灌流の後に、人工サルビア灌流培地における低濃度刺激のグルタミン酸塩（０．７５ｎｍｌ／Ｌ）が、この場合は、２４０秒である事前に定義された時間長の間、味孔に隣接した単一のピペットチャンネルを介して適用される。刺激に対する初期応答が、刺激チャンネルが起動されると、蛍光画像化システムを介して記録される。続いて、二つの追加の画像フレームが、刺激印加時間中に記録され、刺激中に一連のフレームが発生され収集される。次に、この刺激は、中断され、灌流が刺激無しに続き、味孔回りの対応する領域から刺激を効率的に除去する。刺激が除去された後で且つ１２０秒に対応する時間間隔で、追加のフレームが、刺激１の後に学ばれた味覚系の休止、即ち、過去の刺激応答に対応する画像データの三つのフレームを現像するために蛍光画像化システムを使用して記録される。
【００７３】
刺激２に対して、灌流及び刺激チャンバーは、刺激のない流れを可能とし、単一の画像フレームが、取得され、それによって、発生された蛍光の強度が、組織を介して一平面に沿ってピクセルベースで取得され、視野内の組織内に細胞の全部ではないが幾つかを取得する。このフレームは、刺激２に対する刺激に先行するベースラインフレームと呼ばれベースライン刺激１フレームとは強度で異なっている。刺激のない５〜７分の灌流の後に、人工サルビア灌流培地における低濃度刺激のグルタミン酸塩（０．２５ｎｍｌ／Ｌ）が、２４０秒のような事前に定義された時間長の間、味孔に隣接した単一のピペットチャンネルを介して適用される。刺激に対する初期応答が、刺激チャンネルが起動されると、蛍光画像化システムを介して記録される。続いて、二つの追加の画像フレームが、刺激印加時間中に記録され、刺激中に一連のフレームが発生され収集される。次に、この刺激は、中断され、灌流が刺激無しに続き、味孔周辺の対象となる領域から刺激を効率的に除去する。刺激が除去された後、１２０秒に対応する時間間隔で、刺激２の後に対象となる味覚系の休止、即ち、刺激後の応答に対応する画像データの三つのフレームを現像するために、蛍光画像化システムを使用して追加のフレームが記録される。
【００７４】
刺激３に対して、灌流及び刺激チャンバーは、刺激のない流れを可能とし、単一の画像フレームが、取得され、それによって、発生された蛍光の強度が、組織を介して一平面に沿ってピクセルベースで取得され、視野内の組織内に細胞の全部ではないが幾つかを取得する。このフレームは、刺激３に対する刺激に先行するベースラインフレームと呼ばれ、このフレームは、ベースライン刺激２フレームとは強度が異なっている。刺激のない５〜７分の灌流の後に、人工サルビア灌流培地における低濃度刺激のグルタミン酸塩（０．７５ｎｍｌ／Ｌ）が、この場合は、２４０秒である事前に定義された時間長の間、味孔に隣接した単一のピペットチャンネルを介して適用される。刺激に対する初期応答が、刺激チャンネルが起動されると、蛍光画像化システムを介して記録される。続いて、二つの追加の画像フレームが、刺激印加時間中に記録され、刺激中に一連のフレームが発生され収集される。次に、この刺激は、中断され、灌流が刺激無しに続き、味孔周辺の対象となる領域から刺激を効率的に除去する。刺激が除去された後、１２０秒に対応する時間間隔で、刺激３の後に対象となる味覚系の休止、即ち、刺激後の応答に対応する画像データの三つのフレームを現像するために、蛍光画像化システムを使用して追加のフレームが記録される。これらの三つの時間依存刺激／応答画像データセットを収集することによって、単一の画像データ構造が得られ、これをもとに、細胞内カルシウムの変化の発光寿命に基づくカルシウムグリーンデキストラン蛍光測定によって決定される、刺激と味覚組織応答の間の定量的関係を生成することができる。
【００７５】
画像データと刺激の間の定量的関係の開発
刺激依存画像データが収集されると、印加される刺激と細胞システムの応答との間の定量的関係が開発される。これは、以下の手順毎の一般的方法によって達成できる。最初に、画像データは、特徴位置（ｘ，ｙ軸）特徴強度（ｚ軸）、及び特徴時間（ｔ軸）に関して標準化される。これは、例えば、特定の刺激印加に関連する各一連の画像に対する刺激印加の開始（開始時即ちＴｉ）と刺激応答の消滅（終了時即ちＴｆ）を定義すること；このような一連の画像（及び一連の刺激印加に対する一連の画像の集合）内の各画像を登録し、この一連の画像内の各画像の空間情報がその一連の画像内の引き続く画像（ＴｉからＴｆ）に相関されること；及びこのような一連の画像内の各画像同士間の応答に対するベースラインと動的範囲を正規化することを含む。
【００７６】
次に、対象となる領域又は複数の領域（ＲＯＩｓ）が、印加された刺激の大きさに関連する現象を含む標準化画像の各々内で定義される。このようなＲＯＩｓ内の情報は、比較手順で独立変数を表すベクトル又はスカラー量を抽出するために使用される。
【００７７】
次に、標準化データＲＯＩｓからの独立変数が抽出される。大きさや濃度の測定のために、これは、スカラー量に対する所与の画像ＲＯＩに対するピクセル値の集合を減少することを含む。時間に関する測定では、これは、ベクトル量に対する一連の画像ＲＯＩ内の寿命や強度比における時間依存強度変化を減少することを含む。空間測定の場合、これには、例えば、ベクトル量に対する（ｘ，ｙ）空間内のＲＯＩｓを介する拡散事象を減少することが含まれる。これには、各画像内の一つより多くのＲＯＩに対する複数のスカラー／ベクトル抽出が含まれ得る。抽出後、次に、独立変数が、特定の刺激印加を表すために単一のベクトルにグループ化される。
【００７８】
次に、公知の刺激印加（従属変数）が、それらに対応する独立変数ベクトルに対して比較される。この比較は、印加された刺激に従ってデータをランク付けするために使用される分類、回帰、或いは定性的手順の要素含むことができる。このような手順は、将来において刺激を受けた試料に関して収集された独立変数ベクトルに適用されると、分類推定値や予測された刺激規模を生じるモデルを定義する。更に、この手順は、分類推定値や刺激の規模の予測に対する独立ベクトル成分と信頼限界に対する相関係数のような統計量の推定値を生じる。
【００７９】
一例として、画像データ標準化は、事前に定義された内部標準状態に対する各画像の応答が同じであるように画像セット内の各画像に強度補正を適用することによって開始される。例えば、既知濃度の不活性蛍光染料が印加された刺激と共に視野内に噴射され、この染料の応答が、特定の規模を有するように定義される。或いは、画像データのセットが、強度の最大と最小の値に対して正規化され、この正規化は、比較のために、引き続く画像に対して適用される。
【００８０】
この手順に続き、画像のセットが、データ取得中に視野内のオブジェクトのランダム移動に対して補正される。一セットの多次元集合の値同士間での任意の差の修正の数学的手順は、プロクラステス回転と呼ばれる。このような手順は、マトリックスＹ（この場合は、デジタル画像）中のポイントの線形変換（並進、反射、直交回転及びスケーリング）を決定してこれらのポイントを最良に他のマトリックスＸにおけるポイントへ一致させる。使用する基準が主に異なる、プロマックス、オルソマックス、バリマックスのような異なる方法が、アラインメントフィッティングにおける推定値の差に対して適用することができる。時間に関する画像を標準化することは、画像の各収集セットに対する刺激印加の開始（開始時即ちＴｉ）と刺激応答の消滅（終了時即ちＴｆ）を定義することを含む。Ｔｉは、事前定義されたベースライン、即ち、刺激を受けてない状態より上のデータ点応答を示すために一連の画像中の最初の画像として定義され、Ｔｆは、ベースライン状態（即ち、画像化視野が「刺激前の」状態に戻っている）より上のデータ点応答がないことを登録するためにＴｉ後の最初の画像を定義する。
【００８１】
生の画像データを修正した後、画像の情報的ＲＯＩｓが、次に、単離される。これは、訓練されたオペレータが画像座標を入力或いは基準画像におけるＲＯＩｓ回りの周辺を対話形式で描くことによって手作業で行われる。より厳密な方法は、ＴｉとＴｆとの間のそのセットの画像中の各画像点に対する応答の規模を計算することである。ある閾値より下の最大応答を有するこれらの値は、「ノイズ」或いは「バックグラウンド」として破棄される。更に、残りのデータポイントは、時間の関数として、与えられた刺激に対する応答のパターンに従って類似のタイプにグループ化される。例えば、視野の幾つかの領域は、時間軸に沿った応答における過渡的「スパイク」を記録でき、他方、他の領域は、ＴｉからＴｆの全期間を通して応答における安定状態増加示す。このパターン認識も又手作業で行われる。或いは、主成分分析法（ＰＣＡ）やコサイン相関分析方（ＣＣＡ）のような迅速数学的ルーチンが、その画像における異なるタイプの情報データポイントを定義するために使用することができる。同様に、時間情報が、定量化にとって重要でない場合、各データのポイントの平均或いは合計応答が所与のセットの画像の時間軸にわたって計算することができる。次に、同様な応答レベルを有する相互接続データポイントのグループが、個別のＲＯＩｓとして定義される。使用された手順には関係なく、一セット及び（同じ視野に対して収集された複数のセットにわたって）内の画像の全て互いに関して位置合せされているため、ＲＯＩ定義は、一回だけ行われることが必要であり、それによって、任意の所与の画像中のＲＯＩは、一セット内及び異なる画像セット間で全ての他の画像上で全く同じ位置にある。
【００８２】
ＲＯＩｓが如何に定義されたかによって、ＲＯＩ内の情報は、与えられた刺激の大きさに対する比較に適するようにスカラー又はベクトル量に変換されなければならない。時間測定に関して、これは、一連の画像ＲＯＩｓ内の寿命や強度比における時間依存強度変化をベクトル量に減少することを含む。これを行うための最も単純な方法は、所与のＲＯＩ内の時間プロファイルの全てを一緒に平均して時間応答の一つのベクトルを形成することである。刺激印加の時間−スパンにわたる外側境界から内側境界への刺激の拡散を示す細胞膜のような空間的勾配を含むＲＯＩｓに関して、拡散勾配は、時間−スパンにわたって画像から画像への最も近い隣接データポイント同士間の差を計測することによって数学的に計算することができる。これは、有限差分を介して導関数を計算することと類似する。この拡散経路は、引き続く画像減算間の最も大きな負の剰余差を表すデータポイントのチェーンとして識別される。例えば、画像Ｔｉから画像Ｔｉ＋１の細胞膜ＲＯＩを減算する。この剰余画像（膜の外側境界上にあるべきである）中の最も大きな負の大きさを有するデータポイントが、拡散勾配の開始点である。次に、画像Ｔｉ＋１から画像Ｔｉ＋２を減算し、前の最大残留ポイントに空間的に近い最も大きな剰余を有するデータポイントを見つける。この手順は、Ｔｆまで（又は最大の負の剰余「ウエーブ」が膜の全幅を横切るまで）残りの画像の全てに対して繰り返される。次に、膜の幅にわたって距離／時間を単位にして剰余強度移動のレートを計算する。それによって、この手順は、例えば、刺激の規模や刺激タイプと比較されるスカラー量（拡散レート）を得る。更に、膜の異なる部分からの幾つかのこのようなウエーブは、平均拡散レートを計算するために計算することができる。異なる種類の情報（即ち、規模／静的、空間的及び／又は時間的）を示す異なるＲＯＩｓから得た画像セットでは、その他幾つかの量が計算できることに留意されたい。これらの値を計算した後、値は、特定の刺激印加と比較する独立変数を表すために、一組の数値（ベクトル）にグループ化される。
【００８３】
この比較は、印加された刺激に従ってデータをランク付けするために使用される分類、回帰又は定性的手順の要素を含み得る。このような手順は、将来において刺激を受けた試料に関して収集された独立変数ベクトルに適用されると、分類推定値や予測された刺激の規模を生じるモデルを定義する。更に、この手順は、例えば、刺激タイプ分類推定値や刺激規模の予測の独立したベクトル成分及び信頼限界に関する相関係数のような統計量の推定値を生じる。比較の分類タイプの例には、異なるタイプの刺激（例えば、甘み、苦み、塩辛さ）に曝された幾つかの画像セットから計算されるベクトル集合でＰＣＡを実行することがあげられる。この減少したデータセットのＰＣＡスコアは、刺激タイプの従って、主成分空間内に群をなす。定量的回帰の適用の例としては、未知の試料で印加された甘味刺激のレベルが、非対話式部分最小二乗法（ＰＬＳ）のような多変量相関アルゴリズムを使用して予測することができる。ＰＬＳは、計算した応答ベクトルとそれらの対応する甘味刺激のレベルの間の相関パターンを構成するために、既知の甘味レベルの幾つかの適用から計算した一組の応答ベクトルに適用される。この相関パターンは、適用した甘味の予測を得るために将来の応答ベクトルに適用することができる数学的モデルを構成する。
【００８４】
本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示のみを目的としたものであり、且つ、それらに照らした種々の修正や変更が当業者に示され、本出願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。
【実施例】
【００８５】
実施例１−多光子蛍光寿命画像化システムの特徴解析：既知の遊離カルシウム濃度のカルシウムグリーン溶液に対する応答
本発明者等は、未損傷味覚細胞、生の豚の味覚組織内のカルシウムダイナミックスを画像化できる多光子寿命蛍光画像化顕微鏡（ＭＰ−ＦＬＩＭ）システムを使用した。この方法では、カルシウム感受性蛍光染料（カルシウムグリーン１デキストランＭＷ＝３０００）を使用し、染料発光特性（蛍光寿命及び強度）がナノモル濃度からｍｍｏｌ濃度の範囲内での細胞内カルシウム濃度の変化によって摂動された。この場合、多光子励起蛍光は、蛍光を可視フルオロフォアから一つ又は二つの光子プロセスを介して励起するためにパルス化近赤外レーザーを使用した。この非線形光学的プロセスは、焦点面外での吸収の欠如と標準の紫外線カルシウム画像化中染料分子の光劣化の結果として一般的に形成される細胞傷害性成分の不在に起因しての近赤外レーザーからの最小の細胞傷害でのフルオロフォア発光の深部組織画像化を可能とした。
【００８６】
この作業で取られた方法は、味覚系（味蕾）の刺激に対する反応を指示し定量化するために細胞内カルシウム濃度の変化を使用した。ＭＰ−ＦＬＩＭ方法の主要な特性は、カルシウム感受性染料から定量的カルシウム濃度情報及び生体内の遊離カルシウムイオンの変化に対するその反応を提供することである。刺激と反応との間の定量的関係を決定するために、システムのバルク遊離カルシウムイオンの変化に対する反応を決定することが必要であった。
【００８７】
更に、バッファ内の染料濃度の影響が、細胞注入の変動が寿命決定における不確実性を引き起こすか否かを決定するために学習された。カルシウムグリーン１デキストランがこの作業のためのカルシウム感受性染料として以下の理由で選択された。（１）カルシウムグリーン１は、味覚細胞の学習のための適切な範囲（〜５４０ｎＭ）内のカルシウムに対するＫＤを有する可視光励起可能カルシウムインジケーター（例えば、５０５／Ｅｍ．５３２）である；（２）カルシウムグリーン１は、カルシウムイオンバインディングにおいて蛍光強度の約１００倍の増加を表示する；（３）カルシウムグリーン１は、げっ歯類における刺激に対して反応して味覚細胞におけるカルシウム（強度）における相対変化の測定のために使用された；及び（４）デキストラン共役染料は、細胞内コンパートメントの染料の腐骨化と細胞タンパク質に対する染料バインディングの問題を大きく減少する。又、ＡＭ（膜透過）染料が注入された味覚細胞における共通の問題である細胞からの染料の移動を減少する。
【００８８】
カルシウムバッファ（ＣａＥＧＴＡ）とカルシウムグリーン１デキストラン（ＣａＧＤ）が分子プローブから追跡された。カルシウムバッファはｐＨと細胞質のイオン強度を蜜に整合するマトリックスにおけるナノモル濃度からｍｍｏｌ濃度の範囲にわたって、遊離Ｃａ＋２を提供する。これらの有限崩壊及び無限崩壊の寿命並びに相対的な寄与率は、マルチ指数曲線を計測データに当て嵌めることによって決定される。バッファキット＃２（０〜３９μｍｏｌ／Ｌ遊離Ｃａ＋２）がカルシウムグリーンデキストランの低カルシウム濃度に対する反応を決定するためにこの作業で使用された。初期の作業は、バッファキット＃３で行われたが、遊離Ｃａ＋２（０〜１０００μｍｏｌ／Ｌ）は、選択された染料にとって高すぎた。カルシウムイオン濃度は、休眠細胞の細胞質においてほぼ０．１μｍｏｌ／Ｌであり、刺激を受けるとマイクロモルの範囲内で増加する（Ｐｏｌｌａｒｄ，２００２）。
【００８９】
試料は、ＭＰ−ＦＬＩＭシステムとクオーツ溶液細胞を使用して各実験中にランダムな順序で分析された。初期の実験は、カルシウムバッファ溶液中で５μｍｏｌ／Ｌ染料を使用して実行され、これらのデータが最初に個別に提示される。各試料は二つの全視野（２５６×２５６）を生成し、各画像ピクセルが崩壊曲線を含む。カルシウムグリーンデキストランは、有限と無限の形態で提示されたため、ダブル指数フィッティングが、ＳＰＣＩ（バージョン２．７．７２３８．０）を使用して実行された。ダブル指数崩壊は、全視野に関して各試料に対して計算され、各視野に対して６５，５３６個の値を発生した。各視野に対する平均崩壊は、各寿命の各ピクセルに対する振幅（寄与）によって重み付けされたピクセル毎の寿命値の合計として計算された。表１は、無限染料蛍光寿命の計算の結果を列挙している。計測からの平均τ１は、４０５．６ｐｓであり、約１．０ｐｓの単純な標準分散を有する。
【００９０】
表１：Ｃａ＋２結果、カルシウムグリーンデキストランＭＷ＝３０００の短（無限）寿命成分の計算、５マクロモル／Ｌ染料
【００９１】
【表１】
2008536475.tif 000003
低標準偏差は、全視野における平均化された試料から試料にわたるバルク測定システムの繰り返し性を述べている。個別の試料は、視野当たり１０９ｐｓの平均τ１偏差を示し、これらのフィッティング条件下でのピクセル間偏差は、１０９ｐｓのオーダーであることを意味する。カルシウムバッファデータのバランスは、短寿命がモデルパラメータ設定ボックスにおいて４０５．６ｐｓに固定されることを除いて表１に与えられるのと同様な条件下でＳＰＣ画像ソフトウェアを使用して分析された。更に、ゼロＣａ＋２バッファ平均寿命は、固定短寿命値を使用して再計算された。ソフトウェアインターフェースの不安定さに起因して、短寿命は、フィってイングパラメータボックスでτ２として指定された。一連のバッファの平均寿命の計算結果は、表２に示す。０〜０．６０２μｍｏｌ／Ｌのカルシウム濃度範囲における平均寿命（ｐｓ）とカルシウム濃度（μｍｏｌ／Ｌ）の二次多項式フィッティングは、以下の関係を生じる：
τａｖｇ＝３０４７ｃ２＋４４７２ｃ＋６０１、Ｒ２＝０．９９７６；ＲＭＳＥ＝３０．９ｐｓ。
【００９２】
表２：各バッファ、バッファ当たり４視野、４０５．６ｐｓへ固定した短寿命に関して計算された平均寿命。単純な標準偏差は、４つの視野の平均寿命から計算された標準偏差である。ピクセルの変動は、視野内の偏差の目安である。染料濃度は５μｍｏｌ／Ｌであった。
【００９３】
【表２】
2008536475.tif 000004
蛍光寿命測定の報告された顕著な利点は、カルシウム濃度への蛍光寿命の依存性は、染料自体が細胞又はキュベット内のカルシウムイオンを緩衝しないように十分に低い濃度である場合、染料濃度に対して感受性がないことである。カルシウムグリーンデキストランシステムにおけるこの特性を試験するために、追加の試料セットが、バッファ溶液中において２．５μｍｏｌ／Ｌ染料と９．９μｍｏｌ／Ｌ染料で作られた。寿命データ中の変動と染料濃度を有する強度データは、夫々、図２及び図３に与えられる。寿命データは、染料濃度では不変であるように見え、寿命データの平均標準偏差（各カルシウム濃度での染料濃度による寿命の変動）は、２５ｐｓのオーダーである。対照的に、強度の変動は顕著であり、蛍光の強度はカルシウム濃度と染料濃度に依存する。
【００９４】
最後に、カルシウムグリーン１の解離定数は、寿命及び強度ベースのデータセットを使用して種々の染料濃度について計算した。キレート剤（インジケーター）のＫｄ、即ち、解離定数は、染料とカルシウムイオンの錯体形成のための結合定数であり、モル／Ｌの単位で表現される。寿命データは、２７．２ｎモル／ＬのＫｄ標準偏差（ｎ＝３）を示し、強度データは、７１．４ｎモル／ＬのＫｄ標準偏差（ｎ＝３）を示した（表３を参照）。
【００９５】
表３：染料濃度、並びに強度又は寿命データに基づき計算されたＫｄによる解離定数の変動。２．５及び９．９μｍｏｌ／Ｌデータは、２００５年３月１１日に収集し、５．０μｍｏｌ／Ｌ染料データは、２００５年３月７日に収集した。２００５年３月１１日の強度に基づく解離定数の計算値は、寿命データから計算した値よりも大きな変動を示している。
【００９６】
【表３】
2008536475.tif 000005
以下の所見及び結論は、この切片で列挙された構成と特徴実験に基づいて行われる。ＭＰ−ＦＬＩＭシステムは、２５〜３０ｐｓの標準偏差で、＜４００ｐｓ〜＞３００ｐｓの範囲の寿命の再生可能蛍光寿命測定を提供する。カルシウムグリーンデキシトランインジケーター蛍光濃度及び寿命は、カルシウム濃度に従って再生可能性を増加する。ＣａＧＤに対する解離定数Ｋｄは、寿命及び強度データを使用して種々の条件下で計算され、供給業者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）によって報告されたものと一致することが分かった。Ｋｄが３２０〜５２０ｎＭの範囲にわたり、寿命決定が、強度ベースの方法に対するものよりもより大きな再生可能Ｋｄを提供する。低マイクロモルインジケーター濃度の場合、蛍光寿命はインジケーター濃度に依存していないものの、蛍光強度は、インジケーター濃度に有意に依存する。
【００９７】
実施例２−定量的アルゴリズムの開発とシステムの光学性能の推定
ＭＰ−ＦＬＩＭシステムから得られる画像データに生じる変化の精密且つ頑健の測定を補償するための多くの作業がある。第一に、光路と検出器によって引き起こされる「真の」画像データに対するアーチファクトを軽減するための試みがなされるべきである。空間的に不変の（即ち、視野内の全てのピクセルが同じ光検出器の作用を受ける）システムにおいて、このようなアーチファクトは、解像度ロス（ぼやけ）又は記録されたピクセル強度誤差（ノイズ）の何れかに分類することができる。第二に、画像データが、流れる細胞内に記録されるため、画像の特徴が時間と共に移動するが、画像登録のプロセスにおいて、基準状態（通常は一連の画像中の第１画像）に関して所与の時系列において画像を再位置合せすることによってこのような移動が補償される。適切な画像の登録は、関心領域（ＲＯＩ）方法を使用して時間経過に従う画像特徴の強度変化を定量化する時に必要である。最後に、ＦＬＩＭデータにおける追加の考察は、各画像ピクセルにおける計測された崩壊から寿命の高速且つ正確な計算である。ＦＬＩＭシステムで含まれる現在使用されているソフトウェアにおける制限は、アルゴリズムをＭＡＴＬＡＢに結合して上述のアーチファクト減少ルーチンと並行してこれらの作業を実行することを必要とすることである。
【００９８】
システムの光学性能の推定
光学システムは、光路を移動する点源と光検出器による測定への影響を測定する点像分布関数（ＰＳＦ）によって特徴付けられる。ＰＳＦは、光学理論（通常、対称ガウス関数であると仮定される）から推測されるが、より正確な特徴付けは、既知の直径の蛍光微小球体を使用してなされる。学習されるべき試料として、同一光学的且つ環境的条件下での単離された球体の顕微鏡写真を収集することによって、これらの変数の標準オブジェクトに対する影響の及ぼし方の画像が得られる。微小球体のサイズは既知であり、その球体が、画像化システムの光学且つデジタル解像度に比較して十分に小さい場合、その球体は、均一点光源と考えられる。従って、このオブジェクトの画像は、そのシステムの実際のＰＳＦとして処理されることができる（図４を参照）。
【００９９】
計算で使用するＰＳＦの唯一の更なる要件は、これが反転時にスケールを保持する（即ち、その要素を合計すると１になる）ことと、これが空間的に不変である（即ち、グリッドの真ん中に重心が位置するように、これが対称グリッド上にプロットされる）ことである。更に、バックグラウンドノイズが微小球体画像から減算され、（それにより「空の」ピクセルがゼロ値となる）、中心強度特徴が僅かに平滑化されて、検出器のノイズに起因する「粗さ」を除去した。元のＰＳＦ画像は、最高の解像度、即ち、光学システムで可能な最高の解像度（６３倍の対物レンズで２０倍のハードウェアズーム）で取得されるため、この処理画像は、特定の試料画像がデコンボリューション前に収集される条件と一致するようにダウンサンプリングした。デコンボリューションとは、ＰＳＦで表す光学システムの関数を試料画像から除去するプロセスである（図５を参照）。
【０１００】
定量的アルゴリズムの開発
Ｌｕｃｙ‐Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（Ｌ−Ｒ）アルゴリズムは、試料画像からＰＳＦをデコンボリューションする手段として選択された。このアルゴリズムは、比較的高速で頑健であり、画像化コミュニティにおいて「最新技術」であると考えられる。Ｌ−Ｒルーチンは、ある「減衰」パラメータを使用してこれを緩和するのを助ける。これらのパラメータは、ポアソン統計（通常、デジタル画像化のような「カウンティング」実験において有効である）の想定の下バックグラウンドノイズの平均と分散（ＰＳＦを公式化するために使用される微小球形画像から計算される）を含む。しかし、これまでのところ、最良潜在特徴解像度とノイズ除去を得るためにデコンボリューションと共にノイズ除去（平滑化）の一部の形態を使用することが必要と思われる。強度勾配に基づく相対平滑化を含む技法が、増幅されたノイズから「実際の」デコンボリューションされた特徴を保護する時に良好に働く。Ｌ−Ｒアルゴリズムに関して、この方法は、ＭＡＴＬＡＢにおいて比較的迅速に動作する。デコンボリューションとノイズ除去のこの組み合わせは、「スピックル」を減少すると共に特徴境界をより明確にすると思われる画像を生成する（図６を参照）。
【０１０１】
機器によるアーチファクトとは別に、画像データにはかなりの移動アーチファクトがある。画像登録のこの問題は、周知であり、多くのタイプのスケール、視点、同じ場面の二つの画像同士間の視野の差に対して効果的に解決されることができる。しかし、この頑健な方法は、ユーザーが基準画像の軸空間上に候補画像を投影するために使用される空間変換マトリックスを構成するために使用される各画像中の基準ポイントを定義することが必要である。味覚細胞の時系列は、通常少なくとも１００枚の画像を含むため、このようなユーザーの介在は不可能である。従って、この場合の画像登録は、第１画像に対してスタックされた各画像の座標シフトの「ブラインド」反復トライアルに依存しなければならない。このプロセスは、実際に、所与の画像の最大の移動が、各方向において１０ピクセル未満であるスタックに対してかなり迅速であり、多分、４ＧＢ  ＲＡＭを有するＰ４  ２．８ＧＨｚコンピュータを使用すると、１００枚の画像（図７参照）のスタックを登録するために２分必要である。
【０１０２】
現在、登録プロセスは、大きな修正（一軸に関して１０ピクセルを越える）を必要とする画像に対して幾らかの誤差を含むが、これらの誤差は、５ピクセル未満であり、個々の特徴に対するＲＯＩ操作を実行可能とする（図８参照）。これらの誤差は、おそらく成功の判断基準が如何に定義されるか、並びに時系列にわたる特徴強度における実際の変化が如何にスタックするかに起因している。
【０１０３】
上記の作業は全て、ＭＰ−ＦＬＩＭデータ並びにＭＰデータに適用されるが、ＭＰ−ＦＬＩＭデータは、画像における蛍光エンティティの寿命並びに画像における各ピクセルに対するこれらの寿命の相対的な強度寄与率を決定することが必要である。そのため、ピクセル当たり５０個のタイムポイントを有する２５６×２５６画像で測定される２成分系の場合、３．７×１０６データポイントにわたって推定されることが必要な２５６×２５６×３＝１．９７×１０５個のパラメータが存在する。全く仮定しない場合は、この作業に数時間が必要であり、その結果は低Ｓ／Ｎデータに対して極めて矛盾したものとなり得る（特に、ダイナミックシステムのＭＰ−ＦＬＩＭでは多い）。解決策の速度及び／又は精度は、フィッティング中に一定に保たれる演繹寿命値を使用することによって大きく増加でき、それによって、相対的な強度寄与率のみをフィッティングさせることが必要である（即ち、「寿命不変」方法）。これらの演繹寿命が正確であり、器具応答関数が既知であれば、次に、これらの仮定を反復フィッティングルーチンに結合することによって良好で迅速な結果が得られる。しかし、その場合でも、速度の劇的な増加は、破棄された強度や極めて迅速な寿命フィッティングに基づいて画像を特徴にセグメント化することによって発見される。これにより、通常は１０個未満の特徴が得られ、次に、これらの特徴は、フィッティングされて初期寿命及び相対強度推定値が生じる。これらの初期推定値を使用して、各ピクセルは、独立してフィッティングされる。これらのフィッティングは、通常、カバリージに対する反復が極めて少なくなる。理由は、初期の特徴ベースの推定値が、所与の領域内のピクセルの全てに対する最終フィッティング値に近似しそうであるからである。実際、この方法は、速度と精度において、高Ｓ／Ｎ画像に対する寿命不変方法に匹敵することが分かる。更に、この方法は、低Ｓ／Ｎ画像に対する速度の順当な減少がある時のみ等しく正確であり、時間不変的方法が、しばしば、非現実的なパラメータ推定値に対するカバーとなる（Ｐｅｌｅｔ，２００４）。最後に、この特徴セグメンテーションは、アルゴリズムの開始時にユーザーの相互作用が必要なため、本手法の発明者等は、画像分割の初期化によって、幾分遅く僅かに精度が低いものの、全自動化される追加の品質を有する一方で種々の画像タイプに対して信頼できる結果をももたらすフィッティングが生成されること証明している。
【０１０４】
較正と予測考察
刺激タイプと濃度の間の機能的対応を従属変数として確立し、独立変数として味蕾応答を確立するためには、ＭＰ及びＭＰ−ＦＬＩＭ画像における情報が、刺激タイプ応答或いは調節剤摂動応答について解くために、予測式への入力を構成する一セットの変数に減らさなければならない。数学的に、この質問は、回帰方程式ｆ（ｘ）＝ｙの種々の成分は何かというものになる。初期刺激応答実験から期待されるものは何かということに対する標準の回帰方法において、ｙは、刺激溶液における味物質濃度に関連する１〜５個の量よりなるマトリックスであり、ｘは、ＭＰ画像における測定された特徴のマトリックスであり、「ｆ」は、ｘとｙの間の回帰関係である。理想的には、ｆは、複数のｘの一次結合であり、これにより、この問題は最も広い範囲の線形又は線形可能技法、例えば、ＰＬＳ変異によって解決可能となる。
【０１０５】
実施例３−組織調製プロトコルの開発
味覚研究において豚の味覚組織の利用は、細胞レベルでの味覚研究の新たな手法である。数人の研究者が豚の行動学的研究を行っており（Ｋａｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９６５）、その中の一人は、神経線維と種々の刺激に曝された豚の周辺味覚系を刺激する全神経からの電気生理学記録を行った（Ｄａｎｉｌｏｖａ，１９９９）。これらの作業は一括で、人間と豚の味覚応答の間の類似性の根拠をもたらすものの、豚の味覚系の生体構造と生理機能に関する知識をもたらすことはない。従って、本発明者等は、多面的な手法に着手し、プロジェクトシステム開発と味覚調節剤を同定するプロジェクト全体の目標を支援する豚の周辺味覚系の知識を開発した。
【０１０６】
この作業を支援して、顕微鏡分析が、豚の味蕾系の生体構造と生理機能を究明するために実行された。これらの分析は、１）味覚構造の高解像度表面生体構造のための走査電子顕微鏡；２）組織品質を評価するために試料調製段を介する広視野顕微鏡検査を含む微細構造研究のための透過型電子顕微鏡；３）細胞内信号とシナプス機能に関連する特定のクラスの細胞機構存在を決定するために固定且つ調整された組織切片に関する免疫細胞化学的研究；及び４）カルシウム感受性染料、この場合、カルシウムグリーンデキストランが注入された組織から味蕾構造の多光子画像化、を含む。
【０１０７】
実施例４−電子顕微鏡及び固定プロトコル
本発明者等は、豚の味蕾と周辺組織の微細構造を決定するために高解像度走査（ＳＥＭ）及び透過電子（ＴＥＭ）顕微鏡写真を得た。これは、ＭＰ−ＦＬＩＭシステムから得られるべき刺激応答データの解釈に役立つ。生物組織の固定と電子顕微鏡検査の準備が複雑であるため、作業は、新鮮なまま得られた組織の小片に適用される一般的哺乳動物の固定剤カクテルで開始された。各固定試行は、光顕微鏡検査と電子（走査と透過）顕微鏡検査を介して処理と画像化のために組織を使用した。
【０１０８】
乳頭の表面形態を介する固定結果の初期検査は、ＳＥＭによって実行された。殆どの場合、舌の側部からの乳頭が、乳頭の僅かに大きなサイズと各乳頭中の味蕾の相対的多さに起因して使用された。乳頭表面に散乱した多くの味孔が観察され、これらが形態学形態及び局所形態によって認められた。又、味孔に対して味物質を案内するのを助けることに関連する可能性がある文献で議論された溝が認められた。複数の味孔がこれらの溝の中に認められる場合もあれば、凹んだ又は隆起した構造として味孔が認められる場合もある。より高い倍率でのＳＥＭ観察時には、乳頭に対して横方向に位置する味孔がたとえあったとしても極めて少ないことが認められた。大部分の味孔は、乳頭の背部表面に散らばっている。
【０１０９】
試験組織を屠殺場から得た場合、味覚細胞、支持細胞及び神経突起の容認可能な保存を達成する固定プロトコルを開発することは困難であった。文献からの一般的な哺乳動物の味蕾固定剤が最初に試みた。固定剤カクテルは、蒸留水中の以下の一部又は全てを含む：パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カコジル酸ナトリウム、及びサッカロース。固定剤濃度及び成分の修正は、光学顕微鏡観察下での組織品質を改良するためにその後の試行で行われた。大人の組織では、固定剤カクテルに対する変更は、決して適切に保存された組織とはならなかった。この組織は、顕著な劣化を示し、細胞同士間と味覚細胞の細胞質と核との間にギャップがあった。更に、精密検査の結果として、事実上、事前固定では損傷が現れた。固定剤の成分と濃度を変えて三回の試行が大人の組織に対して実行された。
【０１１０】
その後、研究豚からの幼児期豚組織が得られ、屠殺された大人の豚組織用に開発された固定剤カクテル療法を受けた。この結果、ＴＥＭ用の許容組織保存状態がもたらされ、豚の味覚組織の有用な第１ＴＥＭ画像が得られた。幼児期の組織は、非常に良好な保存状態を示し、細胞や細胞質と核の間の大きなギャップや空洞がなかった。屠殺された豚から得られた組織が固定に先立って一般的に劣化するという発見は、組織には、屠殺後のしかるべき期間生存能力がない場合があることを示した。これは、屠殺でのストレス、摂食その他の世話の不備、或いは屠殺と舌の除去の間の時間経過に起因する炎症を含め、多くの理由があると思われる。
【０１１１】
実施例５−カルシウムグリーン１デキストランの味覚組織へのイオン泳動注入
本発明者等は、豚の味覚組織のイオン泳動注入法の有効性を評価した。文献の報告では、げっ歯類味覚組織（歯状乳頭）へのデキストラン接合染料の成功した注入例が示されているが、プロセスが豚の茸状乳頭で成功したかどうかについては不明である。茸状乳頭は、試料調製落射蛍光顕微鏡を使用して順当な倍率で幾分可視である組織の表面上に多くの孔構造を示した。初期の実験は、イオン導入のために種々のガラスピペット構成と先端サイズを使用して個々の味孔の注入を最適化するために始められた。個々の味孔に最適化された注入パラメータでは、４〜６μｍの先端直径まで引っ張られたＣｏｒｎｉｎｇ  ７７４０ホウケイ酸塩ガラス（外径１．５ｍｍ）が利用されていることが分かっており、味覚細胞の最も特異的な充填が行われ、組織の損傷が最も少なかった。これは、１孔当たり、脱イオン水中の１ｍｍｏｌ／Ｌ染料で８〜１０分の間４〜６μＡを流すことによって達成された。
【０１１２】
染料注入プロセスを効率化するために、本発明者等は、単一の茸状乳頭（０．８〜１．５ｍｍ）にフィッティングさせるのに十分な大きさの先端を有する火炎研磨されたピペットを使用して単一の乳頭に多くの味蕾を同時に注入するように試みた。孔の幅が広い毛細管を注入する初期実験では、再現性よく対象となる味覚乳頭に全てのアクセス可能味蕾を注入することに成功した。又、最適化手順は、孔の幅が広い毛細管を使用して適用された。最適な注入パラメータは、５ｍｍｏｌ／Ｌ染料を使用して１５分の注入時間中に２００〜３００μＡを流すことであることが分かった。
【０１１３】
注入手順は、組織ブロック上に保持された最小筋肉と結合組織で舌から切除された舌の組織の大きな（３０ｍｍ×１５ｍｍ）切片を利用して開発された。顕微鏡の画像化システムから得られた第１の画像は、電気生理学記録溶液又は人工唾液の静的プール内に組織セメントを使用して、カバーガラス上に固定した組織から取得した。画像化システムが共焦点画像を生成するため、ｚシリーズ画像スタックに対して得られた三次元モデルは、種々の条件下で種々の注入乳頭から作成した。組織品質における変動は、注入された味蕾当たりの細胞の数と、乳頭当たりの注入された味蕾の数の混合した結果を生じた。幾つかの場合、乳頭表面上の孔の存在は、イオン導入注入の後、孔の下の注入された味蕾の存在のインジケーターではなかった。これらの場合、孔を囲む上皮組織は、染料を注入したが、蛍光は、孔の下からは発生せず、そのことは、味蕾が存在しないか味覚細胞の先端部が孔内に延出せず、従って味覚細胞には染料が注入されなかったことを示す。
【０１１４】
注入後の味蕾可視化が、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ共焦点顕微鏡システムを使用後に、ＭＰ−ＦＬＩＭシステム上に可視レーザラインを使用して実行された。組織は、一度に一個の味孔に染料が注入され、次に、画像化チャンバーに配置され、３次元再構成のために光学的に区分された画像スタックを発生するためにｚ−シリーズ取得モードにおいて４８８ｎｍ励起レーザラインと標準共焦点光学を使用して画像化される。画像は、面投影、即ちｚ−シリーズデータの三次元再構成において最大であった。上皮核は、明瞭に可視であり、細胞質における染料摂取に対して、優先的に染料を取り込んだと見えた。或いは、核は、有意な未結合のカルシウムイオンを含み、発光を向上する。画像化細胞は、扁平上皮の表面の下に凡そ３０〜４０μｍであり、可視顕微鏡検査（染料の１−光子励起）による検査深さに対する実際の制限を表す。
【０１１５】
ＭＰ−ＦＬＩＭシステムの設置が完了すると、注入手順が２光子励起モードでシステムを使用して評価された。検出器システムは、評価がデスキャン光検出器、或いはより高い効率の非デスキャン検出器システムを使用して評価を行えるほど十分にフレキシブルあった。初期の多光子分光走査は、２光子励起下での染料の対する最大励起効率を決定するためにカルシウムグリーンデキストラン染料溶液を使用して行われた。幾つかの高解像度３次元データセットが、注入効率と注入された細胞のタイプに対する洞察を提供するために開発作業のプロセスにわたって収集された。これらのデータセットは、５００〜７００ｎｍのスペクトルウィンドウ、６００μｍの開口ピンホール、１．７０Ｗ指示電力での８１０ｎｍレーザー波長を有する共焦点デスキャン検出器を使用して、５１２×５１２又は１０２４×１０２４の画像サイズで収集された。注入された味蕾当たりに収集された画像数は、側底膜への染料注入のレベルに依存するが、一般的に、５０〜７０μｍの全深さは、ｚスライス当たり０．３〜０．５μｍで画像化された。先端及び側底突起は、細胞本体から延出しているのが鮮明に確認できた。組織試料間に注入された細胞数の差は、組織年齢、品質、乳頭の開発状態、及び細胞タイプの優先注入を含む多くの因子に関連し得る。
【０１１６】
実施例６−刺激送達システムと画像化プロトコルの開発
画像化、組織チャンバー及び刺激送達システム
組織注入及び形態学の初期の特徴付けが、電気生理学記録チャンバー内のカバーガラスに接着又は固定した組織片を使用して実行された。この方法は、カルシウムグリーンデキストランに対して最適化されたレーザー電力と波長を有する４０倍と６０倍の水浸漬対物レンズ系が利用された。取り付け手順は、注入の評価に対しては十分であったが、刺激の送達と除去の定量的制御のための手段を提供しなかった。
【０１１７】
商業的に入手可能な温度制御単離味覚上皮チャンバーは、切除された染料注入組織ブロック（５ｍｍ×５ｍｍ）の取り付けのために調達及び利用された。これによって、刺激送達培地と酸素添加基底外側灌流培地の先端灌流の隔離が可能となった。最初に、チャンバーは、開口形態で使用された。組織が、チャンバー頂部プレートと底部プレートとの間に配置され、二つの分離された灌流槽の間に膜を形成した。チャンバーは、高粘性真空グリースでシールされた。酸素添加Ｔｙｒｏｄｅ溶液の底部灌流は、初期に、蠕動ポンプを使用して達成されたが、その結果、蠕動から引き起こされた圧力パルスに起因して組織の許容できない脈動となった。この上の開口されたチャンバーは、重力送りシステムを介して人工唾液が連続的に灌流される。一定量が、適切なレベルに固定され且つ真空ラインに取り付けられた注射針で溶液を除去することによってこのチャンバー内に維持された。一定量の刺激が、独立して起動されるピンチ弁を介してマニホールドに取り付けられた５個の３０ｃｃ注射胴部の一つから上部チャンバーへ印加された。これらのタンクは、必要に応じて加圧される。システムの温度は、刺激実験中３０℃に制御される。
【０１１８】
重力送り液体送達システムと蠕動ポンプの制御が困難なために、フローパスを制限し、灌流液の組織との接触量を減少し、ポンプノイズを減少し、且つチャンバー入口及び出口系統の閉塞を減少するために、チャンバー設計とポンプシステムに対する変更がなされた。灌流液に対するプッシュプルポンピングスキームが、ｄｕａｌ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＰｈＤ注射ポンプとガラスＧａｓ−Ｔｉｇｈｔ注射器を使用して両灌流チャンバーに対して設計及び実施された。これらは変化し、テフロン（登録商標）チューブと手できつく締めた高性能液クロマトグラフィーカプラーと連結され、液流中で最小圧脈動アーチファクトを有する比較的低い流量（０．０５ｍＬ／分〜１．００ｍＬ／分）での再現可能流を得た。更に、重力送りとピンチ弁へ依存することなく、流体系への刺激の導入のために利用可能な可変注入ループを有する遠隔制御試料注入弁が、注文された。自動化試料弁の受領に先立って、手動定量（１．０ｍＬ）弁が、試料を注入するために使用された。
【０１１９】
このシステムの流れ特性が、ベース溶液（ｐＨ＝９）中に蛍光可視染料を有する可変流量の上部灌流を使用して測定された。染料は、試料ループ内に注入され、時系列強度捕捉が、組織位置に近い試料チャンバーへの導入とそれからの除去を可視化するために２−光子モードを使用して行われた。データは、データ捕捉の開始時に「注入」モードにスイッチされる注入ループを有する顕微鏡のｘｚｔモードを使用して収集された。浸漬対物レンズは、組織の周りに非層流形態を生成するために、プロファイルは、期待されたほど均一ではない。同様に、対物レンズを囲むビーズ径の変動が、流れの実験中に気付かれた。しかし、試料注入ループと注射器ポンプシステムは、試料注入の完全性と重力送りシステムに関連する流動安定性を改良した。しかし、対物レンズと接触している変化する液ビーズ径に連結された開口チャンバーの不均一流量特性によって、流量の関数として再現不能試料注入時間となった。更に、染料の流入、拡散、及びチャンバーからの流出の視覚観察によって、チャンバー内の好適な流路が、開口した槽の表面近くの対物レンズの回りにあることが示された。従って、刺激剤流量は、組織に対する刺激剤の露出に関して必然的に拡散につながる。このつながりとビーズの変動は、組織表面への刺激剤の到着時間の正確な予測を邪魔する。
【０１２０】
流れシステムを使用しながらの画像化実験中の組織中での不安定さは、トラブルシューティングの期間を長くし、組織チャンバーデザインと流れシステム、並びに顕微鏡の機械的安定性を顕著に改善した。流れ実験が一旦始められると、手動ステージは、要求される機械的安定性を提供せず、配管及び電気接続が上皮チャンバーに対して行われると、ステージの移動を防止することは明らかであった。静的状況下では、ステージは、高解像度三次元画像化を可能にするのに十分安定している。しかし、ステージに対して流体の流れと変化しやすい機械的注入が加わると、刺激と画像データの取得中に顕著な動きが引き起こされた。幾つかの場合、組織は、６０秒中に２０〜３０μｍ移動し、共焦点画像化の試みを無駄なものにした。システムを安定化するために、コンピュータ制御ｘ−ｙステージは、顕微鏡に改造された。このアップグレードによって、システムの安定性が改良され、流れの不安定さと刺激に対する組織の機械的応答に起因する残留移動の問題の引き続くトラブルシューティングを可能とした。
【０１２１】
最近の一連の組織取り付けと流れシステムの変更は、トップカバーガラス、プレスシールシリコンガスケット材料、及び組織が接着される固体ステンレススチールピンホール基板を使用しての前記チャンバーのガスケットシール閉チャンバーへの変換を含んでいた。最近のシステムの最適化は、再現可能取り付け及び流れ特性を提供した。閉鎖細胞は、均一な流路を提供し、対物レンズと刺激溶液が接触せず、それによって、更なる刺激タイミングの安定性を提供したと共に流れ細胞中における組織上のビーズ径の変化を除去することによって組織位置の安定性を改良した。隔離された上皮チャンバーデザインにおけるこの改良によって、機能が改良され、且つ再現可能で達成可能な取り付けを有するチャンバー内に単一の乳頭が配されることを可能とした。最後に、流れ細胞の閉鎖によって、チャンバー内の泡が捕捉された。この結果、試料注入弁の切り替え中に組織位置にパルスを生成する流れ細胞内の圧縮可能領域が得られた。超音波真空ガス抜きシステムが、泡のない灌流溶液を提供し且つ閉鎖システム中への泡の取り込みを減少するために設置された。
【０１２２】
実施例７−標準味覚刺激選択と灌流に対する屈折率のマッチング
刺激の選択は、制限された文献情報に基づく豚の応答に対する期待によって並びに実際の実験考察によって推進される。高濃度刺激を使用して初期の刺激が印加されると、重大な問題に直面した。刺激溶液は、最初に、人工唾液に調製され、刺激物濃度に基づいて、重大な屈折率の変動を示した。サッカロースのような刺激物の場合、濃度の閾値は、ブランク唾液に対する屈折率摂動が０．０１屈折率単位のオーダーである人間にとって十分に高い。刺激物と灌流液との間のこの屈折率のミスマッチによって、槽への刺激印加時に光路の摂動に起因して大きな逸脱と焦点面のシフトを引き起こした。光路が、対物レンズ、灌流槽、直立の顕微鏡構成を使用する未損傷乳頭画像化のための組織を含むため、このレベルの屈折率のミスマッチは許容できない。一般的なスライス調製のために、刺激物の導入は、組織の非常に近くに配置されるマイクロピペットからの刺激物の逆流適用を介して達成され、従って、刺激物が、画像化路を摂動しない。しかし、スライス調製は、味蕾の完全性と上皮の偏光を維持しないため、我々は、未損傷乳頭を有する槽刺激システムを選択する。槽刺激を使用する文献に報告された強度ベースのカルシウム画像化実験は、刺激物灌流槽ミスマッチから生じる屈折率摂動に関連するアーチファクトを含む可能性がある。
【０１２３】
未損傷乳頭は、この作業に好適な組織試料タイプであるため、刺激物と灌流槽溶液の屈折率のマッチングが追求された。味のない水溶性の低粘性カルボキシメチルセルロースが粉末形態でＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手されて屈折率摂動剤として使用された。刺激物の溶液は、最初に、人工唾液に調製され、５４６ｎｍでの屈折率が手持ち屈折計で測定された。０．０００３屈折率単位の屈折率ミスマッチは、灌流槽中に焦点シフトと画像歪を生成するのに十分であることが決定された。引き続いて、ＣＭＣのストック溶液が脱イオン化水又は１．３４００のオーダーの屈折率を有する唾液に調製された。このストック溶液の希釈液から、溶液中の重量ＣＭＣを屈折率に関連付ける較正曲線が開発された。屈折率マッチング刺激物溶液が調製され、ＣＭＣ較正と目標の±０．０００１ＲＩユニット内に少しずつ調節された。一般的に、一セットの刺激物の内、最も濃縮された刺激物溶液は、ＲＩマッチングのための目標として選択された。この方法は、脱イオン化水及び人工唾液に調整された溶液に良好に適用され、一般的に、画像データにおける屈折率アーチファクトを殆ど或いは全く生成しなかった。
【０１２４】
実施例８−多光子蛍光強度と豚の味覚組織の寿命ベースの応答：刺激物浴における刺激が与えられた組織の予備寿命画像化
新鮮な豚の味覚組織を現地の屠殺場から入手し、舌を除去した後、酸素添加された冷凍Ｔｙｒｏｄｅ溶液に入れて実験室に輸送する。この組織は、コーティングされたペトリ皿に貼着され、味蕾は、延伸毛細管ピペットを介してカルシウムグリーンデキストラン染料（ＤＩ水中１ｍｍｏｌ／Ｌ）をイオン泳動により注入（１．０μＡ）した。幾つかの味孔が１個の乳頭に注入され、全体的に注入された幾つかの乳頭は、染料が注入された３〜５個の味蕾を提供した。組織が、チャンバー内に取り付けられて顕微鏡のステージに配された。試料は、長手方向切片において味蕾と表面特徴を画像化するために、ｘｙｚモード（２５６×２５６ピクセル）において８１０ｎｍ励起での６０％レーザー出力で、６３倍の水浸漬対物レンズを使用して画像化された。ＦＬＩＭシステムの光電子増倍管ゲインは、８５％に設定され、初期Ｌｅｉｃａ設定（非最適化）が１０〜１５分の時間の流れに渡って組織のＦＬＩＭ画像を取得するために使用された。
【０１２５】
次に、同じ視野が、器具の多光子寿命画像化能力を使用して画像化された。寿命画像収集のための光学条件は、光子カウントモードにおいて、収集が適切なＳＮ比のためにこの場合３０秒必要であることを除いて強度ベース画像化と同一である。寿命は、崩壊曲線のダブル指数フィッティングによって計算され、ピクセル当たりの平均寿命に基づいてカラーコード化された。赤の値は、この場合、より寿命が短い。染料が注入される上皮細胞（表面細胞）は、平均で、孔より下に位置される味覚細胞よりも長い寿命を示す。この画像において明白な最も短い寿命は、孔の直下にある味覚細胞の先端と関連する。静止状態において、視野における細胞の全てに対する平均寿命は、１．６３４ピコ秒である。フィッティングの短い寿命成分は、３５０ピコ秒に設定され、この短い寿命成分の推定値は、比較のためにデータの迅速なフィッティングを容易にするために初期カルシウム較正に基づいていた。
【０１２６】
味蕾は、幾つかの全刺激物：脱イオン化水中のシクロへキシミドとスクラロースに曝された。この刺激物実験の目的は、刺激の時間コース中に味蕾が可視のままであるか否かを決定すること、及び可能な場合、寿命画像化を介して全応答の存在を決定することであった。刺激物は、バルク添加を介して組織を保持するチャンバーへ適用され：１ｍＬバッファの除去後、０．５ｍＬの２５μｍｏｌシクロへキシミドが最初に添加され；シクロへキシミド刺激と追加の１ｍＬバッファの除去後、０．５ｍＬの１μｍｏｌスクラロースが添加された。ＭＰ−ＦＬＩＭ画像データは、上述の静止画像を発生するために使用されたのと同じ光学及び露光条件を使用して凡そ１分間隔で収集された。図９は、異なる刺激物に曝されている間取得された一連の画像に対する代表的カラーコード化された平均寿命画像を示す。画像中の文字は、実験中に収集された連続するサブ画像；ａ）静止；ｂ）シクロへキシミド添加；ｅ）再焦点合わせ；ｆ）スクラロース刺激物、に対応する。スクラロース刺激物は、味覚細胞の回りのカルシウムグリーン寿命を大きく短縮することに留意されたい。上皮細胞に関連するカルシウムグリーン寿命が実験中実質的に変化されないままであるため、味覚細胞が刺激物に応答したことは明瞭である。味覚細胞を囲むカルシウム濃度は、スクラロース刺激物に曝されている間減少したことは明らかであり、更に、カルシウムグリーン寿命変化に関連する色の変化は、静止中の細胞に元来画像化されない細胞中に明白である。
【０１２７】
実施例９−豚の味覚組織の多光子蛍光強度ベースの応答：流れている灌流培地中の刺激された組織の事前画像化
組織は、食肉処理場から受け取られ、最適化幅広孔注入方法：１５分の間３００マイクロアンペア通電、を使用してカルシウムグリーン−１デキストランが注入された。互いに近く近接する二つの乳頭がこのように注入された。乳頭は、より大きな片の組織から抽出され、開口チャンバー構成中に配された（この作業は、閉鎖ガスケットチャンバーを使用してその前に行われた）。組織は、時系列データ取得が始まると、注入位置にスイッチされる１．０ｍＬ／分流量で１．０ｍＬ試料ループを使用して、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸で繰り返し刺激された。画像化パラメータは、以下の通りであった。４００Ｈｚガルボ走査レート、６３倍対物レンズを有する２倍ズーム、２５６×２５６ピクセル画像フォーマット、２倍フレーム平均、３６％で８１０ｎｍレーザー、及び０．５Ｈｚフレーム走査レートである。組織は、凡そ８：００ａｍに受け取られ、酸素添加Ｔｙｒｏｄｅ溶液中で研究所に搬送され、凡そ１０：００ａｍに注入され、そして凡そ１１：００ａｍに画像化された。
【０１２８】
第２の乳頭内の二つの隣接する味蕾からの細胞が、凡そ３５μｍの深さにおいてｘｙｚｔモードで画像化された。上部味蕾からの５個の細胞と下部味蕾からの２個の細胞は良好に染料が注入されるように見えた。（図１０を参照）時系列データは、組織移動の問題を処理するために位置合せツール開発を使用して処理された。ここで行われるべき重要なポイントは、多くのクエン酸刺激中に直面する再現可能移動である。酸刺激移動は、流れ細胞のアーチファクトではないか、或いはステージ不安定さに起因する；それは、ｐＨの変化に対する機械的応答である。しかし、この場合の移動は、主にｘ−ｙ面内であり、従って、位置合せアルゴリズムが、十分な位置合せを提供した。
【０１２９】
細胞の幾つかは、カルシウムイオン濃度における細胞内増加を示す平均強度における相対増加を示したことに留意されたい。移動は、画像データにおける優性摂動である殆どの場合、その移動は単調である。しかし、調べられた味蕾における隣接した細胞が酸刺激に対応する大きな強度変化を示すことが明確であった。
【０１３０】
時系列データは、幾つかの細胞に対する相対発光強度における明確な刺激関連変化を示す。しかし、光退色に起因する発光における相対差と勾配における差は、細胞同士間の比較を困難にする。従って、ベースライン補正は、時系列データに適用されてオフセットとトレース同士間の傾きの差を除去する。応答は、引き続く刺激で応答が減少し、組織が生存の終わりに達していることを示した（図１１を参照）。食肉処理と刺激物への露出との間の時間（４時間）によって、組織が死ぬ或いは死につつあるように見えることは驚くべきことではない。
【０１３１】
他の細胞は、平均蛍光強度における僅かな増加で連続する刺激に最小で応答するように現れ、システムにおける他の細胞は、蛍光強度における僅かな減少で応答することに留意すべきであった。味蕾における異なる細胞の異なる応答は、カルシウムイオンの細胞間輸送及び味覚受容体に起因する単一細胞信号事象に応答した細胞間通信の証拠の何れかに起因する。反対に、味覚受容体細胞は、興奮性（細胞内カルシウムの増加）又は阻害（細胞内カルシウムの減少）活性によって応答する。
【０１３２】
全ての出版物、特許及び特許出願は、参考として本明細書に組み入れられている。前述の明細書において、本発明は、その幾つかの実施形態において記述され、多くの詳細が例示の目的で記載されているが、本発明は他の実施形態を受け入れることができ、本明細書に記載される詳細の幾つかが、本発明の基本原理から逸脱することなく、大幅に変更される得ることが、当業者には明白である。
【０１３３】
参考文献
【０１３４】
【表４】
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【０１３５】
【表５】
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【０１３６】
【表６】
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【０１３７】
【表７】
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。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、味蕾の概略図である。この図は、ウェブサイト（ｗｗｗ．ｃｆ．ａｃ．ｕｋ／ｂｉｏｓｉ／ｓｔａｆｆ／ｊａｃｏｂ／ｔｅａｃｈｉｎｇ／ｓｅｎｓｏｒｙ／ｐａｐｉｌｌａｅ．ｇｉｆ）に掲載されているものである。
【図２】図２。カルシウム濃度及び染料濃度を関数として、多光子寿命蛍光画像化（ＭＰ−ＦＬＩＭ）システムにより計算した平均蛍光寿命である。寿命は染料濃度の実験誤差内の不変量として生じる。
【図３】図３。カルシウム濃度及び染料濃度を関数として、ＭＰ−ＦＬＩＭシステムにより測定した平均蛍光強度である。発光強度は染料濃度及び遊離カルシウムイオン濃度の関数である。
【図４】図４Ａ〜４Ｄ。ハードウェアズーム２０（１ピクセル当たり４５ｎｍ以下）において６３倍の対物レンズで撮影した直径１ミクロンの球の多光子蛍光強度（ＭＰ）及び寿命（ＭＰ−ＦＬＩＭ）の画像である。データはｘ／ｙ面及びｘ／ｚ面におけるＣＬＳＭスキャニングにより得たものであり；ｘ／ｚ方向における比較的に低い解像度は、文献値や光学的理論と一致している。図４ＡはＭＰ−ＦＬＩＭのｘ／ｙ画像；図４ＢはＭＰ−ＦＬＩＭのｘ／ｚ画像；図４ＣはＭＰのｘ／ｙ画像；図４ＤはＭＰのｘ／ｚ画像である。
【図５】図５Ａ及び５Ｂ。上の図４に示すＭＰのｘ／ｙ画像から得たｘ／ｙ面の点像分布関数（ＰＳＦ）である。味覚細胞データを収集する条件と一致させるために（本例においては６３倍対物ズーム２）、元の画像を１０分の１にダウンサンプリングしなければならなかった。得られたＰＳＦは、２５×２５ピクセルグリッド（元の２５６×２５６グリッドから低減）のものとなる。図５Ａには、６３倍ズーム２のＰＳＦを示す。図５Ｂには、６３倍ズーム２０のＰＳＦを示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｃ。予備デコンボリュージョン及びデノイジングの結果を示す。Ｌｕｃｙ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎアルゴリズムに基づき、上の図５に示す僅かに高解像度（３倍）のＰＳＦを使用してデコンボリュージョンを実施し、それと共に、上の図４に示す微小球のデータからノイズパラメータを計算することにより、デコンボリュージョンプロセスのノイズ増幅を低減した。次にこの画像を強度勾配計算方法によりデノイジング（即ち「エッジ」を保持したまま「ポイント」をスムーズにする）に付した。図６Ａには、味覚細胞の生ＭＰ画像を示す。図６Ｂには、３倍高精密グリッドＰＳＦによるＬ−Ｒアルゴリズムの１００リットルを示す。図６Ｃは、４次ＰＤＥ法を使用したＬ−Ｒ画像のデノイジングを示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｃ。時系列画像スタックレジストレーションの例を示す。元の位置（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＃１）と比べて、この測定（Ｕｎｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ＃１００）の過程に渡り味蕾の上及び左へかなりずれているのが観察される。レジストレーションされた時系列スタックの最後の画像（Ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ＃１００）は、依然として幾分のずれが見られる（３画像の白楕円内の味覚細胞の位置に注意）。図７ＡはＵｎｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ＃１００を、図７ＢはＲｅｆｅｒｅｎｃｅ＃１を、図７ＣはＲｅｇｉｓｔｅｒｅｄ＃１００を示す。
【図８】図８。図７の白楕円で囲まれた領域の平均強度の傾向を示す。未レジストレーションのスタックにおける強度の大幅な消失が観察されるが、これは、時間が経つにつれてＲＯＩの外へ味覚細胞がずれたことに起因する。レジストレーションされたスタックにも幾分強度の消失が見られたが、その大部分は光脱色によるものである（このデータの視野の全体強度は時間と共に約１０％低下する）。
【図９】図９。シクロヘキシミド及びスクラロースによる刺激時の味蕾領域の時系列多光子画像であり；ａ）静置時；ｂ）シクロヘキシミド添加時；ｅ）再焦点化時；ｆ）スクラロース刺激時を示す。スクラロース刺激により、味覚細胞周囲のカルシウムグリーンの寿命の有意な短縮をもたらされる。上皮細胞と関連するカルシウムグリーン寿命は、実験中基本的に変化しないため、味覚細胞が刺激に応答することは明らかである。
【図１０Ａ】図１０Ａ及び１０Ｂ。それぞれ染料を入れた複数の細胞を有する二つの味蕾を示す画像視野である（図１０Ａ）。刺激の適用は、細胞１及びおそらくは細胞２における細胞内カルシウムの増大をもたらした（図１０Ｂ）。但し、細胞間の傾斜及び基準オフセットにより応答の比較が困難になる。しかし、アライメントアルゴリズムにより、時系列分析に関して個々の細胞のＲＯＩを明確化することができた。
【図１０Ｂ】図１０Ａ及び１０Ｂ。それぞれ染料を入れた複数の細胞を有する二つの味蕾を示す画像視野である（図１０Ａ）。刺激の適用は、細胞１及びおそらくは細胞２における細胞内カルシウムの増大をもたらした（図１０Ｂ）。但し、細胞間の傾斜及び基準オフセットにより応答の比較が困難になる。しかし、アライメントアルゴリズムにより、時系列分析に関して個々の細胞のＲＯＩを明確化することができた。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｃ。連続２０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸刺激時の視野内における全７細胞のベースライン補正時系列データを示す。味蕾は各刺激の間に５分間人工唾液（刺激物非含有）に曝露することにより回復させた。細胞１では刺激に対して強力な応答が見られたのに対し、その他の細胞においては小規模の応答が見られた。後の刺激への応答の減少は、組織の生存力の欠如、又は適合に起因する可能性が最も高い。図１１Ａは、細胞当たりのベースライン補正平均強度、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸刺激１を示し；図１１Ｂは、細胞当たりのベースライン補正平均強度、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸刺激２を示し；そして図１１Ｃは細胞当たりのベースライン補正平均強度、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸刺激３を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｃ。連続２０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸刺激時の視野内における全７細胞のベースライン補正時系列データを示す。味蕾は各刺激の間に５分間人工唾液（刺激物非含有）に曝露することにより回復させた。細胞１では刺激に対して強力な応答が見られたのに対し、その他の細胞においては小規模の応答が見られた。後の刺激への応答の減少は、組織の生存力の欠如、又は適合に起因する可能性が最も高い。図１１Ａは、細胞当たりのベースライン補正平均強度、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸刺激１を示し；図１１Ｂは、細胞当たりのベースライン補正平均強度、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸刺激２を示し；そして図１１Ｃは細胞当たりのベースライン補正平均強度、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸刺激３を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃ。連続２０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸刺激時の視野内における全７細胞のベースライン補正時系列データを示す。味蕾は各刺激の間に５分間人工唾液（刺激物非含有）に曝露することにより回復させた。細胞１では刺激に対して強力な応答が見られたのに対し、その他の細胞においては小規模の応答が見られた。後の刺激への応答の減少は、組織の生存力の欠如、又は適合に起因する可能性が最も高い。図１１Ａは、細胞当たりのベースライン補正平均強度、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸刺激１を示し；図１１Ｂは、細胞当たりのベースライン補正平均強度、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸刺激２を示し；そして図１１Ｃは細胞当たりのベースライン補正平均強度、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸刺激３を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【国際調査報告】
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2008536475.tif 000030