(57)【要約】ＣＴＧＦ発現を伴う眼疾患における結合組織増殖因子ｍＲＮＡの発現を阻害するＲＮＡ干渉が提示される。異常ＣＴＧＦ発現を伴う眼障害には、緑内障、黄斑変性、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生、増殖性硝子体網膜症、及び創傷治癒が含まれる。そのような障害は、本発明の干渉ＲＮＡを投与することによって治療される。本発明の実施形態は、被験体の眼において結合組織増殖因子ｍＲＮＡの発現を減衰させる方法を提供する。この方法は、長さ１９〜４９個のヌクレオチドを有する二本鎖（ｄｓ）ｓｉＲＮＡ又は一本鎖（ｓｓ）ｓｉＲＮＡのような干渉ＲＮＡの有効量及び薬学的に許容される担体を含む組成物を被験体の眼に投与することからなる。
2008525460.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の眼における結合組織増殖因子ｍＲＮＡの発現を減衰させる方法であって、
長さ１９〜４９個のヌクレオチドを有する干渉ＲＮＡの有効量及び薬学的に許容される担体を含む組成物を被験体の眼に投与する工程を包含し、該干渉ＲＮＡは；
センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、及び少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域を含み；
該アンチセンス配列が、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし；配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と、少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域を有し、
結合組織増殖因子ｍＲＮＡの発現が減衰される、方法。
【請求項２】
前記被験体が結合組織増殖因子関連眼障害を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体が結合組織増殖因子関連眼障害を発症する危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記結合組織増殖因子関連眼障害が、緑内障、黄斑変性、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生、増殖性硝子体網膜症又は創傷治癒である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記アンチセンス配列が、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくとも２１〜２３ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域を有し、該センス及び該アンチセンス配列それぞれの３’末端に追加のＴＴ配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記センスヌクレオチド配列及び前記アンチセンスヌクレオチド配列が、ループヌクレオチド配列により結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が局所、硝子体内又は経強膜的経路を介して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド３７９、６９１、８０１、９０１、９３２、９３７、９６９、９８６、１１１９、１１７０、１２０１、１３４６、１４７３、１４７８、１４８１、１４８８、１６２６、１６６０又は１６６６から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド３７９、９０１又は１４８８から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド３７９、６９１、８０１、９０１、９３２、９３７、９６９、９８６、１１１９、１１７０、１２０１、１３４６、１４７３、１４７８、１４８１、１４８８、１６２６、１６６０又は１６６６を含む配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド３７９、９０１又は１４８８を含む配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アンチセンス配列が、
３’−ＴＴｃｃｃｇｕｕｕｕｕｃａｃｇｕａｇｇｃａ−５’      配列番号３３
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンチセンス配列が、
３’−ＴＴｃｃｃｇｇａｇａａｇａｃａｃｕｇａａｇ−５’      配列番号３１
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンチセンス配列が、
３’−ＴＴｃｃａａｕｃａｕａｇｕａｇｕｃｕａｕｃ−５’      配列番号２８
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記干渉ＲＮＡが、
５’−ｇｇｇｃｃｕｃｕｕｃｕｇｕｇａｃｕｕｃＴＴ−３’      配列番号３０、及び
３’−ＴＴｃｃｃｇｇａｇａａｇａｃａｃｕｇａａｇ−５’      配列番号３１
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記干渉ＲＮＡが、
５’−ｇｇｇｃａａａａａｇｕｇｃａｕｃｃｇｕＴＴ−３’      配列番号３２、及び
３’−ＴＴｃｃｃｇｕｕｕｕｕｃａｃｇｕａｇｇｃａ−５’      配列番号３３
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記干渉ＲＮＡが、
５’−ｇｇｕｕａｇｕａｕｃａｕｃａｇａｕａｇＴＴ−３’      配列番号２７、及び
３’−ＴＴｃｃａａｕｃａｕａｇｕａｇｕｃｕａｕｃ−５’      配列番号２８
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
更に、長さ１９〜４９個のヌクレオチドを有し、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、及び少なくとも１９個のヌクレオチドの少なくともほぼ完全に相補的な領域を含む、第２干渉ＲＮＡを前記被験体の眼に投与する工程を包含する、請求項１に記載の方法であって；
該第２干渉ＲＮＡのアンチセンス配列が、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの第２部分にハイブリダイズし、該アンチセンス配列が、配列番号１に対応するｍＲＮＡの第２のハイブリダイズする部分と、少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域を有する、方法。
【請求項１９】
前記被験体の眼における結合組織増殖因子ｍＲＮＡの発現を減衰させる方法であって、
長さ１９〜４９個のヌクレオチドを有する一本鎖干渉ＲＮＡの有効量及び薬学的に許容される担体を含む組成物を被験体の眼に投与する工程を包含し、
該一本鎖干渉ＲＮＡが、生理学的条件下で、ヌクレオチド３７９、６９１、８０１、９０１、９３２、９３７、９６９、９８６、１１１９、１１７０、１２０１、１３４６、１４７３、１４７８、１４８１、１４８８、１６２６、１６６０又は１６６６から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、該干渉ＲＮＡが、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分とほぼ完全に相補的な領域を有し、
結合組織増殖因子ｍＲＮＡの発現が減衰される、方法。
【請求項２０】
治療を必要とする被験体における結合組織増殖因子関連眼障害を治療する薬剤の製造における使用であって、
組成物が、長さ１９〜４９個のヌクレオチドを有する干渉ＲＮＡの有効量及び薬学的に許容される担体を含み、該干渉ＲＮＡが：
センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、及び少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域を含み、
該アンチセンス配列が、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし；配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域を有する、使用。
【請求項２１】
前記結合組織増殖因子関連眼障害が、緑内障、黄斑変性、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生、増殖性硝子体網膜症又は異常創傷治癒である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記アンチセンス配列が、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくとも２１〜２３ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域を有し、該センス及び該アンチセンス配列それぞれの３’末端に追加のＴＴ配列を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記センスヌクレオチド配列及び該アンチセンスヌクレオチド配列が、ループヌクレオチド配列により結合している、請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
前記組成物が局所、硝子体内、又は経強膜的経路のために調製される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２５】
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド３７９、６９１、８０１、９０１、９３２、９３７、９６９、９８６、１１１９、１１７０、１２０１、１３４６、１４７３、１４７８、１４８１、１４８８、１６２６、１６６０又は１６６６から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、請求項２０に記載の使用。
【請求項２６】
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド３７９、９０１又は１４８８から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、請求項２０に記載の使用。
【請求項２７】
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド３７９、６９１、８０１、９０１、９３２、９３７、９６９、９８６、１１１９、１１７０、１２０１、１３４６、１４７３、１４７８、１４８１、１４８８、１６２６、１６６０又は１６６６を含む配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、請求項２０に記載の使用。
【請求項２８】
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド３７９、９０１又は１４８８を含む配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、請求項２０に記載の使用。
【請求項２９】
前記アンチセンス配列が、
３’−ＴＴｃｃｃｇｕｕｕｕｕｃａｃｇｕａｇｇｃａ−５’      配列番号３３
を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項３０】
前記アンチセンス配列が、
３’−ＴＴｃｃｃｇｇａｇａａｇａｃａｃｕｇａａｇ−５’      配列番号３１
を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項３１】
前記アンチセンス配列が、
３’−ＴＴｃｃａａｕｃａｕａｇｕａｇｕｃｕａｕｃ−５’      配列番号２８
を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項３２】
前記干渉ＲＮＡが、
５’−ｇｇｇｃｃｕｃｕｕｃｕｇｕｇａｃｕｕｃＴＴ−３’      配列番号３０、及び
３’−ＴＴｃｃｃｇｇａｇａａｇａｃａｃｕｇａａｇ−５’      配列番号３１
を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項３３】
前記干渉ＲＮＡが、
５’−ｇｇｇｃａａａａａｇｕｇｃａｕｃｃｇｕＴＴ−３’      配列番号３２、及び
３’−ＴＴｃｃｃｇｕｕｕｕｕｃａｃｇｕａｇｇｃａ−５’      配列番号３３
を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項３４】
前記干渉ＲＮＡが、
５’−ｇｇｕｕａｇｕａｕｃａｕｃａｇａｕａｇＴＴ−３’      配列番号２７、及び
３’−ＴＴｃｃａａｕｃａｕａｇｕａｇｕｃｕａｕｃ−５’      配列番号２８
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が更に、長さ１９〜４９個のヌクレオチドを有し、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、及び少なくとも１９個のヌクレオチドの少なくともほぼ完全に相補的な領域を含む、第２干渉ＲＮＡを含む、請求項２０に記載の使用であって；
該第２干渉ＲＮＡのアンチセンス配列が、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの第２部分にハイブリダイズし、該アンチセンス配列が、配列番号１に対応するｍＲＮＡの第２のハイブリダイズする部分と、少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域を有する、使用。
【請求項３６】
治療を必要とする被験体における結合組織増殖因子関連眼障害を治療する薬剤の製造における使用であって、組成物が：
長さ１９〜４９個のヌクレオチドを有する一本鎖干渉ＲＮＡの有効量及び薬学的に許容される担体を含み、
該一本鎖干渉ＲＮＡが、生理学的条件下で、ヌクレオチド３７９、６９１、８０１、９０１、９３２、９３７、９６９、９８６、１１１９、１１７０、１２０１、１３４６、１４７３、１４７８、１４８１、１４８８、１６２６、１６６０又は１６６６から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、該干渉ＲＮＡが、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に相補的な領域を有する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、眼障害における結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）の発現を阻害する干渉ＲＮＡ組成物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
大部分の眼障害は、細胞繁殖、生存、移動、分化、及び血管新生を含む細胞プロセスに関連する。ＣＴＧＦは、これらの細胞プロセスにおける分泌サイトカインであり、中心的なメディエーターである。特に、ＣＴＧＦは、主にＩ型コラーゲン及びフィブロネクチンの付着の増加によって細胞外マトリックスの産生を増大させることが知られている。ＣＴＧＦの過剰発現は、細胞外マトリックス成分の過剰蓄積を生じる、強皮症、線維増殖性疾患及び瘢痕のような病態を引き起こす主な原因因子として関連してきた。
【０００３】
小柱網（ＴＭ）領域における細胞外マトリックス物質の過剰蓄積は、多くの形態の緑内障を示す特徴であり、そのような増加は、水溶液の流出に対する抵抗を増大させ、それによって眼内圧を増加させると考えられている。Ｆｌｅｅｎｏｒ等の国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１２５２１号（特許文献１として２００３年１１月１３日に公告、Ａｌｃｏｎ，  Ｉｎｃ．に譲渡）には、正常なＴＭ細胞と緑内障ＴＭ細胞におけるＣＴＧＦ  ｍＲＮＡの存在の増加が記載されている。したがって、ＣＴＧＦは、小柱網細胞による細胞外マトリックスの産生において役割を果たすと考えられている。
【０００４】
黄斑変性は、黄斑と呼ばれ、高い視力の原因となる網膜中心部分における光受容体の損失を指す。黄斑変性は、網膜色素上皮と血管脈絡膜の間の膜における細胞外マトリックス成分の異常付着に関連する。この細片様物質はドルーゼと呼ばれる。ドルーゼは、検眼の眼底検査で観察される。正常な眼では、黄斑にドルーゼが存在しない場合もあるが、網膜周辺にドルーゼが豊富に存在する場合がある。黄斑視覚の喪失の非存在下での黄斑における軟質ドルーゼの存在は、初期段階のＡＭＤと考えられている。
【０００５】
黄斑変性では、他の眼障害に加えて、一般的に脈絡膜血管新生が起こり、これは、脈絡膜内皮細胞の繁殖、細胞外マトリックスの過剰産生、及び維管網膜下膜の形成に関連する。血管新生促進因子の網膜色素上皮細胞の繁殖及び産生は、脈絡膜血管新生を生じると思われる。
【０００６】
糖尿病網膜症は、毛細管基底膜の肥厚並びに毛細管の周皮細胞と内皮細胞の接触の損失に起因する、糖尿病で発症する眼障害である。周皮細胞の損失は、毛細血管の漏出を増大し、血管網膜関門の崩壊をもたらす。
【０００７】
増殖性硝子体網膜症は、硝子体膜内及び網膜の表面における細胞及び線維膜の細胞繁殖に関連する。網膜色素上皮細胞の繁殖及び移動は、この眼障害において一般的である。増殖性硝子体網膜症に関連する膜は、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＶ型コラーゲン並びにフィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分を含有し、進行的に線維性になる。
【０００８】
創傷治癒障害は、炎症細胞の活性化、増殖因子及びサイトカインの放出、眼細胞の繁殖及び分化、毛細血管透過性の増加、基底膜マトリックス組成の変化、細胞外マトリックスの付着の増加、線維症、血管新生、及び組織再構築を介して、重篤な眼組織損傷をもたらす場合がある。
【０００９】
したがって、ＣＴＧＦの過剰発現は、これらの眼障害における主な原因因子として関連してきた。現行の治療は、これらの障害の病原機序に直接対処していない。
【特許文献１】国際公開第０３／０９２５８４号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、ＣＴＧＦ  ｍＲＮＡを標的にして、ＣＴＧＦ  ｍＲＮＡの発現に干渉する干渉ＲＮＡを対象とする。本発明の干渉ＲＮＡは、緑内障、黄斑変性、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生、増殖性硝子体網膜症及び異常創傷治癒のようなＣＴＧＦ関連眼障害の治療に有用である。
【００１１】
本発明の実施形態は、被験体の眼において結合組織増殖因子ｍＲＮＡの発現を減衰させる方法を提供する。この方法は、長さ１９〜４９個のヌクレオチドを有する二本鎖（ｄｓ）ｓｉＲＮＡ又は一本鎖（ｓｓ）ｓｉＲＮＡのような干渉ＲＮＡの有効量及び薬学的に許容される担体を含む組成物を被験体の眼に投与することからなる。
【００１２】
二本鎖ｓｉＲＮＡは、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、及び少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域からなる。更に、アンチセンス配列は、生理学的条件下で、配列番号１（ヒトの結合組織増殖因子のＤＮＡのセンス鎖配列、ジェンバンク参照番号ＮＭ＿００１９０１）に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と共に、少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域を有する。そのような組成物を投与することによって、被験体の眼における結合組織増殖因子ｍＲＮＡの発現を減衰させることができる。
【００１３】
一本鎖ｓｉＲＮＡは、長さ１９〜４９個のヌクレオチドを有し、ヌクレオチド３７９、６９１、８０１、９０１、９３２、９３７、９６９、９８６、１１１９、１１７０、１２０１、１３４６、１４７３、１４７８、１４８１、１４８８、１６２６、１６６０又は１６６６から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分に、生理的条件下でハイブリダイズし、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に相補的な領域を有する。
【００１４】
本発明の実施形態において、二本鎖干渉ＲＮＡのアンチセンス配列は、ヌクレオチド３７９、６９１、８０１、９０１、９３２、９３７、９６９、９８６、１１１９、１１７０、１２０１、１３４６、１４７３、１４７８、１４８１、１４８８、１６２６、１６６０若しくは１６６６から始まる、又はこれらを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている。
【００１５】
本発明の更なる実施形態は、治療を必要とする被験体における結合組織増殖因子関連眼障害を治療する方法である。この方法は、長さ１９〜４９個のヌクレオチドを有する干渉ＲＮＡの有効量及び薬学的に許容される担体を含む組成物を患者の眼に投与する工程を包含し、該干渉ＲＮＡは、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、及び少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域からなる。アンチセンス配列は、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域を有する。それによって、結合組織増殖因子関連眼障害が治療される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
「ＲＮＡｉ」と呼ばれるＲＮＡ干渉は、小型一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ分子により生じる標的遺伝子の発現を減少させる方法である。干渉ＲＮＡには、二本鎖又は一本鎖の何れかの小型干渉ＲＮＡ（ｄｓ  ｓｉＲＮＡ又はｓｓ  ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等が含まれる。理論に束縛されるものではないが、ＲＮＡ干渉は、ｄｓＲＮＡ前駆体を長さ約２０〜２５個のヌクレオチドの小型ＲＮＡに切断することによりｉｎ  ｖｉｖｏで起こると思われる。切断は、ＲＮａｓｅＩＩＩ−ＲＮＡヘリカーゼ・ダイサーにより達成される。ｓｉＲＮＡの「センス」鎖、即ち、標的ｍＲＮＡ配列と全く同じ配列を有する鎖を除去し、標的ｍＲＮＡに相補的な「アンチセンス」鎖を残して、ｍＲＮＡの発現を減少させる機能を果たす。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）として知られるタンパク質複合体をｍＲＮＡへ導くと、この複合体がＲＩＳＣのＡｕｇｏｎａｕｔｅタンパク質によりｍＲＮＡを切断し、それによってこのｍＲＮＡによりタンパク質の産生を減少させると思われる。干渉ＲＮＡは触媒性であり、ｍＲＮＡの発現の減少は、ｍＲＮＡに対する干渉ＲＮＡの準化学量により達成することができる。ｍＲＮＡの発現の減少は又、転写及び翻訳機序を介して生じる場合もある。
【００１７】
本発明は、眼障害における結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）の発現を阻害する干渉ＲＮＡの使用に関する。本発明によると、眼の組織、特に眼の小柱網細胞は、ｓｉＲＮＡサイレンシングを行い、外因によりもたらされるｓｉＲＮＡがサイレンシングを引き起こす。更に、本発明の態様では、ｓｉＲＮＡのノックダウン効果を判定するＰＣＲベースの手法を使用する場合、ＰＣＲ増幅プライマーは、サイレンシングを正確に測定するｓｉＲＮＡ標的配合を包含するように設計しなければならないことが判明している。
【００１８】
本明細書で引用される核酸配列は、特に指示がない限り、５’から３’の方向で記述されている。本明細書で使用される「核酸」という用語は、ＤＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）又はＲＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」）に存在するプリン又はピリミジン塩基を含む、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はその修飾形態の何れかを指す。本明細書に提示される干渉ＲＮＡは、「Ｔ」塩基がＲＮＡに天然に生じないにもかかわらず、Ｔ塩基を、特に３’末端に含む場合がある。「核酸」は、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語を包含し、一本鎖分子又は二本鎖分子を指してもよい。二本鎖分子は、ＡとＴの塩基、ＣとＧの塩基、及びＡとＵの塩基のワトソン・クリック型塩基対合により形成される。二本鎖分子の鎖は、互いに部分的に、実質的に又は完全に相補的である場合があり、二重鎖ハイブリッドを形成するが、その結合力は、塩基配列の相補性の性質及び程度によって異なる。ｍＲＮＡ配列は、それをコード化するＤＮＡのセンス又はアンチセンス鎖配列を知ることによって、容易に判定される。例えば、配列番号１は、結合組織増殖因子のｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する。ｍＲＮＡの配列は、ＤＮＡのセンス鎖の配合と同一であるが、「Ｔ」塩基は「Ｕ」残基に置換されている。したがって、結合組織増殖因子のｍＲＮＡ配列は、配列番号１として知られている。
【００１９】
結合組織増殖因子ｍＲＮＡ：全米バイオテクノロジー情報センター（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のジェンバンクデータベースには、ヒト結合組織増殖因子のメッセンジャーＲＮＡの対応するＤＮＡ配列を、参照番号ＭＷ−００１９０１としており、以下ではこれを配列番号１とする。結合組織増殖因子のコード配列は、ヌクレオチド１４６〜１１９５である。
【００２０】
配列番号１：
【００２１】
【化１】
2008525460.tif 000003
上述のＣＴＧＦ  ｍＲＮＡ配列の等価物は、代替的なスプライス形態、対立形態、又はその同族である。同族は、配列番号１と相同である別の哺乳類由来の結合組織増殖因子ｍＲＮＡである。配列番号１と関連するＣＴＧＦ核酸配列は、ジェンバンク受入番号ＡＫ０９２２８０、ＡＫ１２５２２０、ＡＹ３９５８０１、ＡＹ５５００２４、ＢＴ０１９７９４、ＢＴ０１９７９５、ＣＲ５４１７５９、Ｍ９２９３４、Ｕ１４７５０及びＸ７８９４７の配列であると共に、参考として本明細書に組み入れられる米国特許第５，５８５，２７０号の配列番号１の配列である。
【００２２】
ｍＲＮＡの発現の減衰：本明細書で使用される「ｍＲＮＡの発現を減衰させる」という語句は、細胞における標的遺伝子の完全なｍＲＮＡ転写レベルを減少させる干渉ＲＮＡの量を投与し、それによって、スクランブル配列を有する対照ＲＮＡよりも、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を減らすことを意味する。ｍＲＮＡの発現の減少は、一般的にｍＲＮＡの「ノックダウン」と呼ばれている。５０％〜１００％の間及びそれらを含む発現量のノックダウンが、本明細書の実施形態で考慮される。しかし、このようなノックダウンレベルが本発明の目的において達成される必要なわけではない。又、２組の干渉ＲＮＡは、個別ではノックダウンにおける効果が弱い場合があるものの、一緒に投与すると、遥かに効果的になる場合もある。一実施形態において、個別のｄｓ  ｓｉＲＮＡは、少なくとも７０％までの量でノックダウンに効果的である。別の実施形態において、複数のｄｓ  ｓｉＲＮＡは、少なくとも７０％までの量で共にノックダウンに効果的である。
【００２３】
ノックダウンは、一般的に定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）増幅法によりｍＲＮＡレベルを判定するか、又はウェスタン・ブロット若しくは酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりタンパク質レベルを判定定することによって測定される。タンパク質レベルを分析することで、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によるｍＲＮＡ分解と、翻訳阻害の両方を評価することができる。ノックダウンを測定する更なる技法には、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、ラジオイムノアッセイ、及び蛍光標識活性化細胞分析が含まれる。更なる測定方法には、ＣＴＧＦを誘導するＴＧＦβ２を過剰発現し、再度ＣＴＧＦ  ｓｉＲＮＡを添加した後、上述の方法の何れかによりＣＴＧＦ  ｍＲＮＡ／タンパク質ノックダウンを測定する方法が含まれる。
【００２４】
ＣＴＧＦの阻害は又、眼障害の改善を観察することによっても、ヒト又は哺乳動物において推測される。例えば、加齢黄斑変性において、視力喪失の減速又は逆転は、ＣＴＧＦの阻害を示し、緑内障患者におけるＣＴＧＦ  ｍＲＮＡのサイレンシングは、眼内圧の低下や、緑内障を発症する危険性がある被験体における症状発症の遅延又は予防をもたらす。
【００２５】
本発明の実施形態の干渉ＲＮＡは触媒的に作用する。即ち、干渉ＲＮＡは、標的ＲＮＡを準化学量で阻害することができる。アンチセンス治療と比べると、治療効果をもたらすために必要となる干渉ＲＮＡが有意に少ない。
【００２６】
二本鎖干渉ＲＮＡ：本明細書で使用される二本鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）は、センスヌクレオチド配列及びアンチセンスヌクレオチド配列を有しており、該センス及びアンチセンス配列は、少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域からなる。干渉ＲＮＡの長さは、１９〜４９個のヌクレオチドを含み、長さ１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９個のヌクレオチドからなる場合がある。ｄｓ  ｓｉＲＮＡのアンチセンス配列は、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域を有する。
【００２７】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、細胞内でＲＩＳＣ複合体に結合し、アンチセンスＲＮＡの配列と相補的な配列においてｍＲＮＡの配列と特異的に結合するようにこの結合した複合体を誘導し、それによってこの結合した複合体によるｍＲＮＡのその後の切断を可能にすることから、このアンチセンス鎖はｓｉＲＮＡの活性誘導剤である。
【００２８】
ｓｉＲＮＡの標的配列を選択する技法は、ロックフェラー大学のウェブサイトより入手可能なＴｕｓｃｈｌ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ”（２００４年５月６日改訂）により、Ａｍｂｉｏｎのウェブサイトに掲載されるＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃５０６，  ”ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ，”  Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．により、Ｇ／Ｃ含有量の最小３０％、最大５５％の検索パラメータを使用するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎウェブサイトにより、及びＤｈａｍａｃｏｎウェブサイトにより提示される。標的配列は、ｍＲＮＡのコード領域又は５’若しくは３’非翻訳領域に位置する場合がある。
【００２９】
ＣＴＧＦのＤＮＡ標的配列の実施形態は、配列番号１のヌクレオチド１４８８〜１５０６に存在する：
５’−ｇｇｔｔａｇｔａｔｃａｔｃａｇａｔａｇ−３’    配列番号１８  ヌクレオチド１４８８。
【００３０】
配列番号１８の対応するｍＲＮＡ配列を標的にし、それぞれの鎖に３’ＵＵオーバーハングを有する、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、以下の通りである：
５’−ｇｇｕｕａｇｕａｕｃａｕｃａｇａｕａｇＵＵ−３’      配列番号２５
３’−ＵＵｃｃａａｕｃａｕａｇｕａｇｕｃｕａｕｃ−５’      配列番号２６。
【００３１】
３’オーバーハングは、複数の「Ｕ」残基、例えば、２、３、４、５及び６個の間及びそれらを含む複数の「Ｕ」残基を有する場合がある。５’末端も又ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する場合がある。配列番号１８の対応するｍＲＮＡ配列を標的にし、それぞれの鎖に３’ＴＴオーバーハングを有する、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、以下の通りである：
５’−ｇｇｕｕａｇｕａｕｃａｕｃａｇａｕａｇＴＴ−３’      配列番号２７
３’−ＴＴｃｃａａｕｃａｕａｇｕａｇｕｃｕａｕｃ−５’      配列番号２８。
【００３２】
二本鎖ｓｉＲＮＡの鎖は、ヘアピンループにより結合されて、以下のように一本鎖ｓｉＲＮＡを形成する場合がある：
５’−ｇｇｕｕａｇｕａｕｃａｕｃａｇａｕａｇＵＵＮＮＮ＼
Ｎ
３’−ＵＵｃｃａａｕｃａｕａｇｕａｇｕｃｕａｕｃＮＮＮＮＮ／      配列番号２９
Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又は当業者に既知の修飾形態である。ヌクレオチドＮの数は、３〜２３、又は５〜１５、又は７〜１３、又は４〜９、又は９〜１１の間及びそれらを含む数であるか、或いはヌクレオチドＮの数は９である。
【００３３】
表１には、配列番号１のＣＴＧＦ  ＤＮＡ標的配列の例を一覧にする。これらから上述の方法により本発明のｓｉＲＮＡが設計されている。
表１．ｓｉＲＮＡのＣＴＧＦ標的配列
【００３４】
【表１】
2008525460.tif 000004
上の例で引用されているように、当業者は、配列番号１における配列位置を参照し、配列番号１と相補的又はほぼ相補的なヌクレオチドを追加又は欠失することによって、表１に示す標的配列情報をもとに、表１に示す配列よりも長さが長い又は短い干渉ＲＮＡを設計することができる。
【００３５】
ｄｓ  ｓｉＲＮＡ又はｓｓ  ｓｉＲＮＡにより誘導される標的ＲＮＡ切断反応は、極めて配列特異的である。一般的に、標的ｍＲＮＡの部分と同一のセンスヌクレオチド配列と、センス配列と全く相補的なアンチセンス部分とを含有するｓｉＲＮＡは、ＣＴＧＦ  ｍＲＮＡを阻害するｓｉＲＮＡの実施形態である。しかし、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡの間の１００％配列相補性は、本発明を実施する上で必要ではない。したがって、本発明は、遺伝子突然変異、系統多型現象、又は進化的分岐に起因すると予測される配列変形を考慮する。例えば、標的配列に対する挿入、欠失又は一点突然変異を有するｓｉＲＮＡ配列は、阻害に有効である。
【００３６】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス配列は、ｍＲＮＡの標的配列と共に少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全な相補性を有する。本明細書で使用される「ほぼ完全な」という表現は、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部分と、ｓｉＲＮＡのアンチセンス配列が「実質的に相補的」であり、ｓｉＲＮＡのセンス配列が「実質的に同一」であることを意味する。当業者に知られている「同一性」とは、配列間のヌクレオチドの順番をマッチングすることによって決定される、ヌクレオチド配列間の配列関係の程度を指す。一実施形態において、標的ｍＲＮＡ配列と８０％の、及び８０％〜１００％の相補性を有するアンチセンスＲＮＡは、ほぼ完全に相補的であると考えられ、本発明で使用することができる。近接する「完全な」相補性は、隣接塩基対の標準的なワトソン・クリック型塩基対合である。近接する「少なくともほぼ完全な」相補性には、本明細書で使用される「完全な」相補性が含まれる。同一性又は相補性を判定するコンピュータ法は、ヌクレオチド配列の最高のマッチング程度を提供するように設計されており、例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４３０−４１０）、並びにＦＡＳＴＡである。
【００３７】
配列番号１の標的配列は、ｍＲＮＡの５’及び３’非翻訳領域、並びにｍＲＮＡのコード領域にある場合がある。
【００３８】
二本鎖干渉ＲＮＡの一方又は両方の鎖は、１〜６個のヌクレオチドからなる３’オーバーハングを有する場合があり、これらのヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド又はこれらの混合物である場合がある。このオーバーハングのヌクレオチドは塩基対ではない。本発明の一実施形態において、干渉ｄｓ  ＲＮＡは、ＴＴ又はＵＵの３’オーバーハングからなる。
【００３９】
二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖は、上述の２本の一本鎖の二重形成において見られる場合もあれば、相補性の領域が塩基対であり、ヘアピン又はループにより共有結合して一本鎖を形成する、単一分子である場合がある。ヘアピンは、ダイサーと呼ばれるタンパク質により細胞内で切断され、二つの個別の塩基対ＲＮＡ分子の干渉ＲＮＡを形成すると考えられる。
【００４０】
干渉ＲＮＡは、１個以上のヌクレオチドの追加、欠失、置換又は修飾により天然に生じるＲＮＡとは異なる場合がある。非ヌクレオチド物質は、５’末端、３’末端又は内部の何れかで干渉ＲＮＡと結合する場合がある。そのような修飾は一般的に、干渉ＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を向上させるため、細胞取り込みを改善するため、細胞標的化を増強するため、干渉ＲＮＡの追跡を助けるため、又は安定性を更に向上させるために設計される。例えば、干渉ＲＮＡは、オーバーハングの末端にプリンヌクレオチドを含む場合がある。例えば、ピロリジンリンカーによりコレステロールをｄｓ  ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に結合することも、ｓｉＲＮＡに安定性をもたらす。更なる修飾には、例えば、３’末端ビオチン分子、細胞侵入特性を有することが知られているペプチド、ナノ粒子、ペプチド模倣薬、蛍光染料、又はデンドリマーが含まれる。
【００４１】
ヌクレオチドは、分子のその塩基部分、その糖部分、又はそのリン酸部分が修飾され、本発明の実施例において機能する場合がある。修飾には、例えば、アルキル、アルコキシ、アミノ、デアザ、ハロ、ヒドロキシル、チオール基、又はこれらの組み合わせによる置換が含まれる。ヌクレオチドは、より安定性のある類似体で置換される場合があり、例えば、Ｕを２’デオキシ−Ｔに置換したり、２’ＯＨが、例えば、２’アミノ若しくは２’メチル基、２’メトキシエチル基、又は２’−０，４’−Ｃメチレン架橋で置換されるような糖修飾を有する場合がある。ヌクレオチドのプリン又はピリミジン類似体の例には、キサンチン、ヒポキサンチン、アザプリン、メチルチオアデニン、７−デアザ−アデノシン、並びにＯ−及びＮ−修飾ヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチドのリン酸基は、リン酸基の１個以上の酸素を水素又は硫黄で置換することによって修飾される場合がある（ホスホロチオエート）。
【００４２】
配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分に相補的でないアンチセンスｓｉＲＮＡの領域が存在する場合もある。非相補性領域は、相補性領域の３’末端、５’末端、又はその両末端に見られる場合がある。
【００４３】
干渉ＲＮＡは、合成により生成され、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写、ｓｉＲＮＡ発現ベクター又はＰＣＲ発現カセットにより生成される場合がある。トランスフェクトされたｓｉＲＮＡとして良好に機能する干渉ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現されたｓｉＲＮＡとしても良好に機能する。
【００４４】
干渉ＲＮＡは、保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用して化学的に合成され、例えば、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（米国テキサス州オースティン）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールスバッド）、又はＤｈａｒｍａｃｏｎ（米国コロラド州ラファイエット）のような民間の供給業者から得る場合がある。干渉ＲＮＡは、例えば、溶媒又は樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、又はこれらの組み合わせにより精製される。或いは、干渉ＲＮＡは、試料の処理に起因する損失を回避するために、殆ど精製せずに使用される場合がある。
【００４５】
干渉ＲＮＡは、当業者に既知のＵ６若しくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、又はＳＰ６、Ｔ３若しくはＴ７プロモーターのような構成的又は誘導的プロモーターを使用した、組み換えプラスミドからの発現により、被験体に提供される場合がある。例えば、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）製のｐｓｉＲＮＡＴＭは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターによる細胞内のｓｉＲＮＡ産生を可能にする。組み換えプラスミドから発現された干渉ＲＮＡは、標準的な技法によって単離される場合がある。
【００４６】
干渉ＲＮＡの発現に使用するウイルスベクターは、例えば、上に記載したプラスミド用のプロモーターを使用して、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクチニアウイルス、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス等から誘導される場合がある。ウイルスベクターの選択、ベクターによる干渉ＲＮＡの発現方法、及びウイルスベクターの送達方法は、当業者の技能の範囲内に含まれる。
【００４７】
干渉ＲＮＡの発現は又、ＰＣＲによるヒトＨ１、ヒトＵ６又はマウスＵ６プロモーターを用いた発現カセットによるＳＩＬＥＮＣＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ［米国テキサス州オースティン］）（ＳＥＣ）を使用することによってももたらされる。サイレンサー発現カセットは、ヘアピンｓｉＲＮＡテンプレートをフランキングするプロモーター及びターミネイター配列を含むＰＣＲ産物である。細胞へトランスフェクションすると、ヘアピンｓｉＲＮＡは、ＰＣＲ産物から発現され、特異的サイレンシングを誘導する。
【００４８】
生理学的条件下でのハイブリダイゼーション：「ハイブリダイゼーション」とは、一本鎖核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が相補的又はほぼ相補的な塩基配列と相互作用して、ハイブリッドと呼ばれる水素結合複合体が一本鎖核酸により形成されるようにする技法を意味する。ハイブリダイゼーション反応は敏感で選択的であるため、対象となる特定の配列は低濃度で存在する試料中でも同定される。ハイブリダイゼーションの特異性（即ち、厳密性）は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのプレハイブリダイゼーション溶液及びハイブリダイゼーション溶液における塩又はホルムアミドの濃度、並びにハイブリダイゼーション温度により制御され、当該技術においてもよく知られている。特に、厳密性は、塩の濃度を減少させる、ホルムアミドの濃度を増大させる、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって増加する。
【００４９】
例えば、厳密性の高い条件は、約５０％のホルムアミドにおいて３７℃〜４２℃の温度で生じることができる。厳密性の低い条件は、約３５％〜２５％のホルムアミドにおいて３０℃〜３５℃で生じることができる。ハイブリダイゼーションの厳密性の条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙに示されている。厳密なハイブリダイゼーション条件の更なる例には、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間保持後、洗浄；又は１ＸＳＳＣ中７０℃若しくは１ＸＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション後、０．３ＸＳＳＣ中７０℃で洗浄；又は４ＸＳＳＣ中７０℃、若しくは４ＸＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション後、１ＸＳＳＣ中６７℃で洗浄という条件が含まれる。ハイブリダイゼーションの温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低い。ここでＴｍは、長さ１９〜４９個の塩基対のハイブリッドの場合、以下の計算式を使用して求められ：Ｔｍ℃＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）；式中、Ｎは、ハイブリッドにおける塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝剤中のナトリウムイオンの濃度である。
【００５０】
本発明の実施形態において、高厳密性条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＣＴＧＦ  ｍＲＮＡによりハイブリダイズする干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、生理学的条件下でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて特異的に結合する。高厳密性条件下で核酸とハイブリダイズしない関連する核酸の同定及び単離は、厳密性の低い条件下で実施される。
【００５１】
一本鎖干渉ＲＮＡ：上述の通り、干渉ＲＮＡは、最終的に一本鎖として機能する。ｓｓ  ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡよりも効能は低いものの、ｍＲＮＡサイレンシングを行うことが見出されている。したがって、本発明の実施形態は又、一本鎖ｓｉＲＮＡが、生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分とハイブリダイズし、配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくとも１９ヌクレオチド連続する少なくともほぼ完全に相補的な領域を有する、ｓｓ  ｓｉＲＮＡの投与も定める。ｓｓ  ｓｉＲＮＡは、上述のｄｓ  ｓｉＲＮＡの場合と同様に、長さ１９〜４９個のヌクレオチドを有する。ｓｓ  ｓｉＲＮＡは、５’リン酸を有するか、又はｉｎ  ｓｉｔｕ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて５’位でリン酸化される。「５’リン酸化」という用語は、例えば、５’糖のＣ５ヒドロキシル（例えば、５’リボース若しくはデオキシリボース、又はそれらの類似体）にエステル結合を介して結合するリン酸基を有する、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを記述するために使用される。ｓｓ  ｓｉＲＮＡは、一リン酸、二リン酸又は三リン酸基を有する場合がある。
【００５２】
ｓｓ  ｓｉＲＮＡは、ｄｓ  ｓｉＲＮＡの場合と同様に、化学的に又はベクターを介して合成される。５’リン酸基がキナーゼによって添加される場合もあれば、５’リン酸がＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果として得られる場合もある。送達はｄｓ  ｓｉＲＮＡの場合と同様である。一実施形態において、保護末端及びヌクレアーゼ耐性修飾を有するｓｓ  ｓｉＲＮＡは、サイレンシングのために投与される。ｓｓ  ｓｉＲＮＡは、保存のために乾燥させる場合もあれば、水溶液に溶解させる場合もある。この溶液は、アニーリングを阻害するため又は安定化させるために、緩衝剤又は塩を含有する場合がある。
【００５３】
ヘアピン干渉ＲＮＡ：ヘアピン干渉ＲＮＡは、一本鎖であり、１本の鎖の中にセンスとアンチセンスの両方の配列を含有する。ＤＮＡベクターによる発現のため、センスｓｉＲＮＡ配列に対応する少なくとも１９個のヌクレオチドの対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、短いスペーサーにより逆相補性アンチセンス配列と結合している。選択した発現ベクターに必要な場合は、３’末端Ｔ及びヌクレオチド形成制限部位を加える場合がある。得られたＲＮＡ転写物は、それ自体が折り畳んで、ステムループ構造を形成する。
【００５４】
投与様式：干渉ＲＮＡは、眼周囲、結膜、テノン下、前房内、硝子体内、網膜下、眼球後部、又は小管内注入のような眼組織注入により；カテーテル又はその他の留置デバイス、例えば網膜ペレット、眼内インサート、坐剤、又は多孔性、非多孔性若しくはゼラチン状物質を含むインプラントを使用した眼への直接適用により；局所点眼剤又は軟膏により；盲嚢中の、又は強膜に隣接（経強膜的）若しくは眼の中に移植した徐放デバイスにより、眼に直接送達する場合がある。前房内注入は、作用物質が小柱網に到達するように、角膜を通して前眼房内に達成される場合がある。小管内注入は、シュレム管に排出する静脈収集チャンネルの中に、又はシュレム管の中に送達する場合がある。
【００５５】
被験体：眼障害の治療を必要とする又は眼障害を発症する危険性がある被験体は、ＣＴＧＦの発現又は活性に関連する病態、即ち、ＣＴＧＦ関連眼疾患を有する、又はその病態を有する危険性があるヒト又はその他の哺乳動物である。そのような眼障害には、例えば、内皮細胞の繁殖又は線維増殖を有する、緑内障、黄斑変性、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生、増殖性硝子体網膜症、創傷治癒、及び過剰な瘢痕を伴う病態が含まれる場合がある。そのような障害に関連する眼構造には、例えば、網膜、脈絡膜、水晶体、角膜、小柱網、桿体、錐体、神経節、黄斑、虹彩、強膜、眼房、硝子体眼房、毛様体、視神経円板、乳頭又は窩が含まれる場合がある。
【００５６】
製剤及び投与量：医薬製剤は、本発明の干渉ＲＮＡ又はその塩を、水、緩衝剤、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトール等のような生理学的に許容される眼用担体と混合して、９９重量％まで含有する。
【００５７】
本発明の干渉ＲＮＡは、液剤、懸濁剤又は乳剤として投与される。以下は、本発明に包含される可能性ある配合の例である。
【００５８】
【表２】
2008525460.tif 000005
【００５９】
【表３】
2008525460.tif 000006
一般的に、本発明の実施形態の干渉ＲＮＡの有効量は、眼部位における又は該部位に隣接する、２００ｐＭ〜１００ｎＭ、又は１ｎＭ〜５０ｎＭ、又は５ｎＭ〜約２５ｎＭの細胞間濃度からなる。局所組成物は、熟練した臨床医の日常的な裁量に従って、１日１〜４回眼の表面に送達される。製剤のｐＨは、ｐＨ４〜９又はｐＨ４．５〜ｐＨ７．４である。
【００６０】
正確なレジームは臨床医の裁量に委ねられているが、干渉ＲＮＡは、１日１〜４回それぞれの眼に１滴点眼するか、又は臨床医の指示に従って投与される場合がある。製剤の有効量は、例えば、被験体の年齢、人種及び性別、又は眼障害の重篤度のような要因により異なる場合がある。一実施形態において、干渉ＲＮＡは眼に局所送達され、治療用量で小柱網、網膜又は眼神経乳頭に到達し、それによってＣＴＧＦ関連疾患過程を改善する。
【００６１】
許容される担体：眼に許容される担体は、多くても全く又は殆ど眼に刺激を与えることがなく、必要に応じて適切な保存をもたらし、本発明の１つ以上の干渉ＲＮＡを同一投与で送達する担体を意味する。本発明の実施形態の干渉ＲＮＡの投与に許容される担体には、Ｍｉｒｕｓ  ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ  ｓｉＲＮＡ  Ｔｒａｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［米国ウィスコンシン州マディソン］）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、リポフェクタミン、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州サンディエゴ］）、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴＴＭ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ［米国イリノイ州シカゴ］）又はポリリシンのようなポリカチオン、リポソーム、又はコレステロールのような脂溶性剤が含まれる。リポソームは、標準的な小胞形成脂質及びコレステロールのようなステロールから形成され、これには、例えば内皮細胞表面抗原に対する結合親和性を有するモノクローナル抗体のような標的分子が含まれる場合がある。更に、リポソームはペグ化リポソームとなる場合がある。
【００６２】
眼への送達では、干渉ＲＮＡは、眼科学的に許容される防腐剤、共溶媒、界面活性剤、粘度増強剤、浸透促進剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、又は水性で無菌の眼科用懸濁液若しくは溶液を形成する水と混合される場合がある。眼科用溶液製剤は、生理学的に許容される等張水性緩衝剤にインヒビターを溶解することによって調製される場合がある。更に、眼科用溶液には、インヒビターの溶解を助ける眼科学的に許容される界面活性剤が含まれる場合がある。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等のような粘度上昇剤を本発明の組成物に添加して、化合物の保持を改善する場合もある。
【００６３】
眼科用無菌軟膏製剤を調製するには、干渉ＲＮＡを、鉱油、液体ラノリン又は白色ワセリンのような適切なビヒクル中の防腐剤と混合させる。眼科用無菌ゲル製剤は、他の眼科用製剤の技術で既知の方法に従って、例えばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＥ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ［米国ノースカロライナ州シャーロット］）等の組み合わせから調製した親水性基剤中に干渉ＲＮＡを懸濁することによって調製される場合がある。例えば、ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．［米国テキサス州フォートワース］）は眼内注入に使用される場合がある。本発明の他の製剤は、干渉ＲＮＡが眼にあまり浸透しない場合に、クレモフォール（ｃｒｅｍｅｐｈｏｒ）及びＴｗｅｅｎ（登録商標）  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ［米国ミズーリ州セントルイス］）のような浸透促進剤を含有する場合がある。
【００６４】
キット：本発明の実施形態は、細胞におけるＣＴＧＦ  ｍＲＮＡの発現を減衰させる試薬を含むキットを提供する。キットは、干渉ＲＮＡに対応する二つの相補性一本鎖ＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列にそれぞれ作動可能に結合する、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター又はＳＰ６プロモーターのような二つの異なるプロモーターを有するＤＮＡテンプレートを含有する。ＲＮＡは、ＤＮＡテンプレートから転写され、アニールされて、標的ｍＲＮＡの発現を減衰させるのに効果的な二本鎖ＲＮＡを形成する。キットは場合により、ＤＮＡテンプレートからＤＮＡ配列を増幅する増幅プライマー、及びＲＮＡを合成するヌクレオチド三リン酸（即ち、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ）を含有する。場合により、キットは、それぞれ、ＤＮＡテンプレートのプロモーターに結合することができ、且つプロモーターが作動可能に結合するヌクレオチド配列を転写することができる、二つのＲＮＡポリメラーゼ、サイズ排除カラムのような、一本鎖ＲＮＡを精製する精製カラム、１つ以上の緩衝剤、例えば一本鎖ＲＮＡをアニーリングして二本鎖ＲＮＡを生じる緩衝剤、及び二本鎖ＲＮＡを精製するＲＮＡｓｅ  Ａ又はＲＮＡｓｅ  Ｔを含有する。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
小柱網細胞におけるＣＴＧＦをサイレンシングする干渉ＲＮＡ、及びサイレンシングを測定する基準
本試験では、ヒト小柱網（ＴＭ）細胞における内皮ＣＴＧＦ発現のレベルをノックダウンするＣＴＧＦ干渉ＲＮＡの能力を試験する。本試験は又、ＱＰＣＲプライマーを使用して測定した際のｍＲＮＡレベルに対する干渉ＲＮＡの効果を判定する基準も提供する。
【００６６】
ＧＴＭ３又はＨＴＭ−３と呼ばれる形質転換ヒトＴＭ細胞株のトランスフェクション（Ｐａｎｇ，  Ｉ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｃｕｒｒ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  １３：５１−６３を参照）は、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ濃度のＣＴＧＦ干渉ＲＮＡ（１００ｎＭ）及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州カールスバッド］）を１：１（ｗ／ｖ）の比率で使用して達成した。既知の配列の商業的に設計された干渉ＲＮＡのプール（ｓｉＧＥＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴＰＯＯＬ（登録商標）  ＣＴＧＦ干渉ＲＮＡ（本明細書ではｓｉＲＮＡ  Ｓ４と呼ぶ）；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ［米国コロラド州ラファイエット］）を使用して、ＣＴＧＦを標的にした。スクランブル及びラミンＡ／Ｃ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を対照として使用した。
【００６７】
対照実験は、スクランブル干渉ＲＮＡ対照と比べると、ラミンＡ／Ｃ干渉ＲＮＡを使用したラミンＡ／Ｃのほぼ９０％のノックダウン効果をもたらした。初期試験は、エクソン５におけるＣＴＧＦ  ｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲに対するプライマー／プローブセットＱ２を使用するｓｉＧＥＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴＰＯＯＬ（登録商標）  ＣＴＧＦ  ｓｉＲＮＡ  Ｍ−０１２６３３−００−００２０（ｓｉＲＮＡ  Ｓ４）を使用した場合、ＣＴＧＦの約２０〜３０％のノックダウンの効率を示した（図２Ｂ）。Ｑ２は、ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ［米国カリフォルニア州フォスターシティー］）製のＱＰＣＲ  ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマー／プローブセットである。
【００６８】
ＣＴＧＦ  ｓｉＲＮＡの乏しい効果の理由を究明するために、幾つかの変形を試験した。ＣＴＧＦ干渉ＲＮＡの用量反応を試験して、最適以下の干渉ＲＮＡ濃度又は最適以下の干渉ＲＮＡと脂質の比率が使用されているかを判定した。得られたデータでは、使用された干渉ＲＮＡ濃度又は干渉ＲＮＡと脂質の比率に関係なく、乏しいＣＴＧＦ  ｍＲＮＡノックダウンが示された。ｓｉＲＮＡ活性に対する細胞取り込みの重要性、及びＴＭ細胞をトランスフェクトする固有の問題点を考慮の上、ＴＭ細胞トランスフェクション効率を上述の条件下で決定した。トランスフェクション効率は、細胞質へのＳＩＴＯＸＴＭ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）送達により誘導される細胞死、又はＳＩＧＬＯＴＭ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）による細胞質蛍光で測定される細胞蛍光の何れかの反映として試験した。何れの場合でも、ほぼ全ての細胞が死亡したか（図１Ａ；ＳＩＴＯＸＴＭ）又は蛍光を示し（図１Ｂ；ＳＩＧＬＯＴＭ）、トランスフェクション効率は、ほぼ定量的であり、本プロセスにおいて律速的な手順ではなかったことを示唆している。
【００６９】
更に、ｓｉＲＮＡ  Ｓ１、Ｓ２及びＳ３と呼ばれるＡｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（米国テキサス州オースティン）製の三つの個別の追加的なＣＴＧＦ  ｓｉＲＮＡ配列を、Ｑ２及びＱ１と呼ばれる二つの異なるＱＰＣＲ  ＴＡＱＭＡＱ（登録商標）プライマー／プローブセット（ＡＢＩ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ［米国カリフォルニア州フォスターシティー］）と組み合わせて試験した。ＡｍｂｉｏｎのｓｉＲＮＡの標的配列は、以下のジェンバンク参照配列番号ＮＭ＿００１９０１のＣＴＧＦのヌクレオチド（ｎｔｓ）である。
【００７０】
Ｓ１の標的：（ヌクレオチド３７９〜３９７）：ｇｇｇｃｃｔｃｔｔｃｔｇｔｇａｃｔｔｃ      配列番号２
Ｓ２の標的：（ヌクレオチド９０１〜９１９）：ｇｇｇｃａａａａａｇｔｇｃａｔｃｃｇｔ      配列番号５
Ｓ３の標的：（ヌクレオチド１４８８〜１５０６）：ｇｇｔｔａｇｔａｔｃａｔｃａｇａｔａｇ      配列番号１８。
【００７１】
上記の各標的配列の各鎖の３’ＴＴオーバーハングを有する二本鎖ｓｉＲＮＡは、以下である。
【００７２】
ｓｉＲＮＡ  Ｓ１：
５’−ｇｇｇｃｃｕｃｕｕｃｕｇｕｇａｃｕｕｃＴＴ−３’      配列番号３０
３’−ＴＴｃｃｃｇｇａｇａａｇａｃａｃｕｇａａｇ−５’      配列番号３１
ｓｉＲＮＡ  Ｓ２：
５’−ｇｇｇｃａａａａａｇｕｇｃａｕｃｃｇｕＴＴ−３’      配列番号３２
３’−ＴＴｃｃｃｇｕｕｕｕｕｃａｃｇｕａｇｇｃａ−５’      配列番号３３
ｓｉＲＮＡ  Ｓ３：
５’−ｇｇｕｕａｇｕａｕｃａｕｃａｇａｕａｇＴＴ−３’      配列番号２７
３’−ＴＴｃｃａａｕｃａｕａｇｕａｇｕｃｕａｕｃ−５’      配列番号２８。
【００７３】
ＱＰＣＲ  Ｑ１プライマーは、ＡＢＩ  ＡＳＳＡＹ  ＯＮ  ＤＥＭＡＮＤＴＭ  Ｈｓ００１７００１４＿ｍ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）の専有配列である。
【００７４】
ＱＰＣＲ  Ｑ２順方向プライマーは、以下の配列：
５’−ＣＡＧＣＴＣＴＧＡＣＡＴＴＣＴＧＡＴＴＣＧＡＡ−３’      配列番号３４
を有し、Ｑ２逆方向プライマーは、以下の配列：
５’−ＴＧＣＣＡＣＡＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＴＣＴ−３’              配列番号３５
を有する。
【００７５】
Ｑ２プローブは以下の配列：
５’−ＡＡＴＣＧＡＣＡＧＧＡＴＴＣＣＧＡＴＴＣＣＴＧＡＡＣＡＧＴＧ−３’  配列番号３６を有し、５’末端にＦＡＭ基（６−カルボキシフルオレセイン）を、３’末端にＴＡＭＲＡ基を有する（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００７６】
個別のｓｉＲＮＡにおけるｓｉＲＮＡ標的部位に対するプライマー／プローブセットの位置を、図２Ａに示す。又、図２Ａの略図には、ＣＴＧＦ遺伝子エクソン（長方形）とイントロン（線）の構造、並びに配列番号１として配列が示されているジェンバンクＣＴＦＧ配列ＮＭ＿００１９０１に対するｓｉＲＮＡ  Ｓ１、Ｓ２及びＳ３と、ＱＰＣＲプライマー／プローブセットＱ１及びＱ２の位置も示す。
【００７７】
図２Ｂには、エクソン５プライマー／プローブセットＱ２及びｓｉＲＮＡ  Ｓ１〜Ｓ４を使用したＣＴＧＦ  ｍＲＮＡのＱＰＣＲ増幅を示す。Ｓ１及びＳ４のｓｉＲＮＡでは、Ｑ２プライマー／プローブセットにより、ＣＴＧＦ  ｍＲＮＡレベルの有意なノックダウンは検出されなかった。ノックダウンはｓｉＲＮＡ  Ｓ２及びＳ３で実証した。プライマー／プローブセットＱ２は、Ｓ１  ｓｉＲＮＡの標的よりも、Ｓ２及びＳ３  ｓｉＲＮＡの標的により密接に近似する。
【００７８】
図２Ｃには、エクソン４／５架橋プライマー／プローブセットＱ１を使用したＣＴＧＦ  ｍＲＮＡのＱＰＣＲ増幅を示す。ＣＴＧＦ  ｍＲＮＡのノックダウンはそれぞれのｓｉＲＮＡで実証され、Ｓ２  ｓｉＲＮＡでは、検出にＱ１プライマー／プローブセットを使用して、約９０％のノックダウンが観察された。プライマー／プローブセットＱ１は、Ｑ２プライマープローブセットよりも、ｓｉＲＮＡによるノックダウンを実証するのにより効果的であると思われる。
【００７９】
図２Ｂ及び図２Ｃのデータでは、３’−ＵＴＲに向けられたプライマー／プローブセットＱ２を使用して増幅した特定の領域が比較的安定している場合があるため、標的ｓｉＲＮＡによるＣＴＧＦ  ｍＲＮＡの切断及び分解を評価するにはあまり良い選択ではないことが示唆されている。したがって、ＱＰＣＲ増幅領域がｓｉＲＮＡ標的領域の外側にある特定の場合では、ｓｉＲＮＡの効果が過小に報告される場合がある。
【００８０】
非特異的で標的を外す効果の機会を減らすために、ＣＴＧＦ  ｍＲＮＡの発現を阻害する可能な限り低いｓｉＲＮＡ濃度を判定した。ＣＴＧＦ  ｍＲＮＡノックダウンは、プライマー／プローブセットＱ１を使用するＱＰＣＲ増幅により評価した。ＧＴＭ３細胞におけるＣＴＧＦ  Ｓ２  ｓｉＲＮＡの用量反応を図３に示す。０、１、３、１０、３０、及び１００ｎＭ用量範囲のＳ２  ｓｉＲＮＡにより２４時間治療を行った後、ＧＴＭ３細胞で約２．５ｎＭのＩＣ５０が観察された。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｏｎ  ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．［米国カリフォルニア州サンディエゴ］）を使用して、勾配変化、Ｓ字型用量反応アルゴリズム、及び頂点拘束１００％によりフィッティングした。
【００８１】
この実施例の結果からは、ｉ）小柱網細胞がｓｉＲＮＡのサイレンシングを実施すること、ｉｉ）本明細書に記載する全てのｓｉＲＮＡは、ある程度のサイレンシングを行うこと、及びｉｉｉ）ｓｉＲＮＡノックダウン効果を判定するＰＣＲベースの手法を使用する場合、ＰＣＲ増幅プライマーは、サイレンシングを最適に検出するｓｉＲＮＡ標的配列を包含するように設計されていることが示されている。
【００８２】
ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼによる標的ｍＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ標的配列の中心近くで起こることが示されており（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５：１８８−２００）、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ  ＲＮａｓｅＨ活性を伴う（Ｌｉｕ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１４３７−１４４１）。しかし、残ったｍＲＮＡの完全な分解は保証されないように思われる。ｍＲＮＡの安定したフラグメントが、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ切断の後に残る場合があり、ＱＰＣＲによるこれらのフラグメントの何れかの増幅によって、本明細書に示すｓｉＲＮＡの効果が過小報告される場合がある。本発明は、ＱＰＣＲプライマーセットが最適なｓｉＲＮＡ効率の読み取りを可能にするｓｉＲＮＡ標的配列を包含する実施形態を提供する。
【００８３】
本明細書に引用する参考文献は、これらが本明細書の記載内容の補足となる例示的な手順又はその他の詳細を示す限りにおいて、参考として明確に組み入れられる。
【００８４】
本発明の開示内容に照らして、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される実施形態の明白な変更を行えることを理解する。本明細書に開示される全ての実施形態は、本発明の開示内容に照らして、過度の実験を行うことなく実行及び実施することができる。本発明の全ての範囲は、本開示内容及びその同等の実施形態に記載されている。本明細書は、本発明が権利を受ける保護の全範囲を過度に狭めるものとして解釈されるべきではない。
【００８５】
本明細書で使用される「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、特に指示がない限り、「１つ」、「少なくとも１つ」又は「１つ以上」の意味をとる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１Ａは、小柱網細胞のトランスフェクション効率が、図１Ｂのデータと一緒にした場合に律速的でないことを実証する、ＳＩＴＯＸＴＭデータを示す。ＧＴＭ３細胞を、ＳＩＴＯＸＴＭ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）トランスフェクション制御でトランスフェクトした。２４時間後、トリパンブルー排除を使用してＳＩＴＯＸＴＭ培養中に残る生存細胞の数を測定したが、この数が、相対的なトランスフェクション効率を反映する。白色の棒：トランスフェクションなし；黒色の棒：ＳＩＴＯＸＴＭによるトランスフェクション。図１Ｂは、トランスフェクション効率が、図１Ａのデータとともに考慮した場合に律速的でないことを実証する、ＧＴＭ３細胞におけるｓｉＲＮＡ取り込みのＳＩＧＬＯＴＭ画像を示す。ＧＴＭ３細胞を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００ＴＭを使用して、ＳＩＧＬＯＴＭ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）によりトランスフェクトした。２４時間後、蛍光顕微鏡を使用してＳＩＧＬＯＴＭ  ｓｉＲＮＡの取り込みを判定した（赤色の不均整形状）。個々の細胞核は、二本鎖ＤＮＡ用の染料である、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）により確認した（青色円形領域）。図１Ａのデータ及び図１Ｂの画像が示す通り、ほぼ全ての細胞が死亡しているか（ＳＩＴＯＸＴＭ）又は蛍光しているか（ＳＩＧＬＯＴＭ）の何れかであった。
【図２】図２Ａは、ＣＴＧＦ遺伝子エクソン（長方形）とイントロン（線）の構造、並びにその配列が配列番号１として提供されているジェンバンクＣＴＦＧ配列ＮＭ＿００１９０１に対するｓｉＲＮＡ  Ｓ１、Ｓ２及びＳ３並びにＱＰＣＲプライマー／プローブセットＱ１及びＱ２の位置を示す略図である。ｓｉＲＮＡ及びプライマー／プローブセットの配列は、実施例１に示す。図２Ｂは、エクソン５プライマー／プローブセットＱ２を使用したＣＴＧＦ  ｍＲＮＡのＱＰＣＲ増幅を示す。Ｓ１及びＳ４のｓｉＲＮＡでは、ＣＴＧＦ  ｍＲＮＡレベルの有意なノックダウンは検出されなかった。図２Ｃは、エクソン４／５架橋プライマー／プローブセットＱ１を使用したＣＴＧＦ  ｍＲＮＡのＱＰＣＲ増幅を示す。それぞれのｓｉＲＮＡでＣＴＧＦ  ｍＲＮＡのノックダウンが観察され、Ｓ２  ｓｉＲＮＡでは約９０％のノックダウンが観察された。
【図３】種々の濃度のＳ２  ｓｉＲＮＡでＣＴＧＦ  ｍＲＮＡレベルのノックダウン効果を試験した滴定試験を示す。ＣＴＧＦ  ｍＲＮＡノックダウンを、プライマー／プローブセットＱ１を使用してＱＰＣＲ増幅により評価した。実施例１で記載されているように、０、１、３、１０、３０及び１００ｎＭのＳ２  ｓｉＲＮＡにより２４時間治療を行った後、ＧＴＭ３細胞で約２．５ｎＭのＩＣ５０が観察された。
【図１】
2008525460.tif 000007
【図２】
2008525460.tif 000008
【図３】
2008525460.tif 000009
【配列表】
2008525460000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月16日(2007.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008525460000001.app
【国際調査報告】
2008525460.tif 000019
2008525460.tif 000020
2008525460.tif 000021
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