【事件の表示】
　特許第２６３５９３２号「シクロデキストリングリコシル転移酵素、該転移酵素の製造法並びにγ−シクロデキストリンの産生法」の請求項１ないし４に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２６３５９３２号の請求項１ないし４に係る特許を維持する。
【理由】
Ｉ．手続の経緯
　特許第２６３５９３２号の請求項１−４に係る発明は、平成６年６月２２日に特許出願され（パリ条約による優先権主張１９９３年６月２４日、１９９３年７月２２日、ドイツ）、平成９年４月２５日にその特許の設定登録がされ、その後、メルシャン株式会社から特許異議の申立てがなされ、これを受けて取消理由通知がなされたところ、その指定期間内に訂正請求がなされ、さらに訂正拒絶理由通知がなされ、指定期間内に手続補正書が提出されたものである。
ＩＩ．訂正の適否
　本件訂正請求は、本件特許第２６３５９３２号の明細書を、上記手続補正書により適法に補正された訂正明細書のとおりに訂正することを求めるものであり、その訂正の内容は、以下ａ−ｃのとおりである。
ａ．特許請求の範囲の減縮を目的として、特許請求の範囲を以下のとおり訂正する（請求項１及び請求項３を訂正）。
　【請求項１】シクロデキストリン（ＣＤ）への澱粉または澱粉様の変換の際に高められた量でγ−ＣＤを産生するシクロデキストリングルコシル転移酵素（ＣＧＴａｓｅ）において、該転移酵素のアミノ酸配列　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｘｘｘ　Ａｓｐを有し、該配列中のＸｘｘが、アミノ酸位置２１１またはアミノ酸位置２２９に存在するものであり、この場合、該蛋白質配列の位置１はＣＧＴａｓｅのシグナルベプチドの開始点であり、Ｘｘｘは、ＴｒｐまたはＳｅｒを表わすことを特徴とする、シクロデキストリングリコシル転移酵素。
　【請求項２】ＸｘｘがＴｒｐを表わす、請求項１に記載のシクロデキストリングリコシル転移酵素。
　【請求項３】シクロデキストリン（ＣＤ）への澱粉または澱粉様の変換の際に高められた量でγ−ＣＤを産出するシクロデキストリングリコシル転移酵素（ＣＤＴａｓｅ）を製造するための方法において、β−またはγ−ＣＧＴａｓｅのためにコーディングされた遺伝子のＤＮＡ配列を、自体公知の突然変異生成法を用いて、突然変異したＣＧＴａｓｅ中で組み込まれたβ−またはγ−ＣＧＴａｓｅ中の配列モチーフ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ中のアミノ酸位置２１１またはアミノ酸位置２２９に存在するＴｙｒが、ＴｒｐまたはＳｅｒと交換されているように変異することを特徴とする、シクロデキストリングリコシル転移酵素の製造法。
　【請求項４】γ−シクロデキストリンの産生法において、請求項１または請求項２に記載のシクロデキストリングリコシル転移酵素を使用することを特徴とする、γ−シクロデキストリンの産生法。
　ｂ．上記特許請求の範囲の訂正にあわせて、不明瞭な記載の釈明を目的として、発明の詳細な説明の項の記載を訂正する。（略）
　ｃ．誤記の訂正を目的として、【００１４】及び【００１５】の「位値」を「位置」と、【００５５】の「レイ」を「例」と、【００２０】の表１中の菌株Ｂ．ｓｐ．２０９−３の「位置」欄の「２０８」を「２０７」と訂正する。
　上記訂正について検討する。
ａについての検討
　この訂正は、アミノ酸配列で示すＸｘｘの位置を、訂正前の請求項１で規定する範囲内の特定のものに限定したものであるから、特許請求の範囲を減縮するものである。
　また、当該訂正が願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内であるかどうか検討すると、上記特定された位置は、具体的に技術の開示があるものであるから、当該訂正事項は、願書に添付した明細書に記載されている事項の範囲内のものと認められる。そして、これら訂正は実質上特許請求の範囲を拡張しまたは変更するものでもない。
　さらに、訂正後の請求項１−４に係る発明は、下記ＩＩＩ，ＩＶで述べるように当該特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
ｂの検討
　この訂正は、上記請求項１及び請求項３に係る訂正に伴い不明瞭となる発明の詳細な発明の項の記載を訂正するものであり、当該訂正が、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内であり、実質上特許請求の範囲を拡張しまたは変更するものでもないことは、上述のａの検討で明らかである。
ｃの検討
　「位値」及び「レイ」がそれぞれ「位置」及び「例」の誤記であることは明細書全体の記載から明らかである。
　また、「２０８」が「２０７」の誤記であることは、例１の記載から明らかである。
　そして、これら訂正は、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内であり、実質上特許請求の範囲を拡張しまたは変更するものでもない。
　さらに、訂正後の請求項１−４に係る発明は、下記ＩＩＩ，ＩＶで述べるように当該特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項ただし書及び同条第３項により準用する同法１２６条第２項から第４項の訂正に関する規定が平成６年法律第１１６号附則第６条第１項の規定によりなお従前の例によりとされることから適用される、平成５年特許法第１２６条第１項ただし書、第２項、及び第３項の規定に適合するので、当該訂正は認められる。
ＩＩＩ．特許異議の申立てについて
　本件訂正後の請求項１−４に係る発明は、上記手続補正書により補正された訂正明細書の特許請求の範囲に記載されたとおりのものと認める（上記ＩＩ参照）。
　特許異議申立人は、下記甲第１号証を提出して、
▲１▼本件訂正前の請求項１に係る発明は、本件特許の出願の日（優先日）前の他の出願であって、その出願後に出願公開された下記出願（甲第１号証）の願書に最初に添付した明細書又は図面（以下先願明細書という）に記載された発明と同一であるから、本件請求項１−４に係る発明の特許は、特許法第２９条の２第１項の規定に違反してされたものであり、取り消されるべきである旨主張している。
　そこで、上記主張について検討する。
　まず、先願明細書をみてみると、サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（シクロデキストリングルコシル転移酵素と認められる。以下シクロデキストリングリコシル転移酵素という）のアミノ酸配列において、１８８番目のＴｙｒをＴｒｐに変換したものが記載され（配列表、配列番号１）、その１８６番目から１８９番目のアミノ酸配列は、「Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ」であり、これらアミノ酸配列は、シクロデキストリングリコシル転移酵素のシグナルペプチドの開始点から数えると、アミノ酸位置２１５番目から２１８番目に相当する。又、１８８番目のアミノ酸がＳｅｒである、１８６番目から１８９番目のアミノ酸配列が「Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ」のものも記載されている（請求項１、【００１１】、【００１３】【００３１】〜【００３３】）。
　上記配列を有するシクロデキストリングルコシル転移酵素は、アミノ酸配列「Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｘｘｘ　Ａｓｐを有し」、該配列の「Ｘｘｘが、Ｔｒｐ又はＳｅｒ」である点では本件訂正後の請求項１で規定する酵素と一致するが、Ｘｘｘの位置（シグナルペプチド開始点を位置１とした場合）が、本件訂正後の請求項１に係る発明においては、「２１１または２２９」であるのに対して、先願明細書におけるＸｘｘに相当するアミノ酸の位置は、「２１７」である点で相違している。
　そして、先願明細書には、Ｘｘｘの位置が「２１１または２２９」であるものについては、示唆もないので、本件訂正後の請求項１で規定する酵素は、先願明細書には開示されているとすることはできない。
　又、訂正後の請求項２に係る発明は、同請求項１に係るシクロデキストリングリコシル転移酵素のＸｘｘがＴｒｐのものであり、同請求項３に係る発明は、同請求項１に係るシクロデキストリングリコシル転移酵素の製造方法であり、同請求項４に係る発明は、同請求項１または同請求項２に係るシクロデキストリングリコシル転移酵素を使用することを特徴とするγ−シクロデキストリンの産生法であるが、上述のように同請求項１に係る酵素自体が先願明細書に開示されているといえない以上、さらに詳細に検討するまでもなく、同請求項２−４に係る酵素，シクロデキストリングリコシル転移酵素の製造方法及びγ−シクロデキストリンの産生法が先願明細書に記載されているといえないことは明らかである。
　してみれば、本件訂正後の請求項１−４に係る発明は、先願明細書に記載された発明と同一であるとはいえない。
　よって、特許異議申立人の主張は採用できない。
　記
　甲第１号証：特願平４−４７９９３号（特開平５−２１９９４８号公報）
ＩＶ．結び
　以上のとおりであるから、特許異議の申立て及び提出された証拠方法によっては、本件訂正後の請求項１−４に係る発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件訂正後の請求項１−４に係る発明の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年１２月１４日（１９９９．１２．１４）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
▲１▼訂正事項ａ
　平成８年１１月２７日の本件請求人提出による手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１に関する記載の
「該転移酵素の蛋白質配列が、アミノ酸位置１８０とアミノ酸位置２４０との間の領域に、アミノ酸配列　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｘｘｘ　Ａｓｐを有し、」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、
「該転移酵素のアミノ酸配列　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｘｘｘ　Ａｓｐを有し、該配列中のＸｘｘが、アミノ酸位置２１１またはアミノ酸位置２２９に存在するものであり、」と訂正する。
　これに伴い、特許請求の範囲の記載と発明の詳細な説明の記載との整合をはかるため、不明瞭な記載の釈明を目的として、明細書第５頁下から１０行〜８行の「ＣＧＴａｓｅの蛋白質配列が、アミノ酸位置１８０およびアミノ酸位値２４０の間の領域に、アミノ酸配列　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐを有し、この場合」を「ＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｘｘｘ　Ａｓｐを有し、該配列中のＸｘｘが、アミノ酸位置２１１またはアミノ酸位置２２９に存在するものであり、この場合」と訂正し、同第５頁下から４〜２行の「アミノ酸配列のアミノ酸位置１８０およびアミノ酸位値２４０の間の領域に、アミノ酸配列Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　ＡｓｐまたはＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐを有し、この場合、」を
「アミノ酸配列Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｘｘｘ　Ａｓｐを有し、該配列中のＸｘｘが、アミノ酸位置２１１またはアミノ酸位置２２９に存在するものであり、この場合」と訂正し、同第６頁第２〜４行の「該ＣＧＴａｓｅの蛋白質配列のアミノ酸位置１８０およびアミノ酸位置２４０の間の領域に、配列モチーフＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｐを有し、この場合、」を「該ＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｐを有し、該配列中のＴｒｐが、アミノ酸位置２１１またはアミノ酸位置２２９に存在するものであり、この場合」と訂正する。
▲２▼訂正事項ｂ
　平成８年１１月２７日の本件請求人提出による手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項３に関する記載の「１８０および２４０の間の領域に存在する」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「アミノ酸位置２１１またはアミノ酸位置２２９に存在する」と訂正する。
▲３▼訂正事項ｃ
　明細書第５頁下から９行の「位値」を、誤記の訂正を目的として、「位置」と訂正する。
▲４▼訂正事項ｄ
　明細書第５頁下から３行の「位値」を、誤記の訂正を目的として、「位置」と訂正する。
▲５▼訂正事項ｅ
　明細書第１７頁下から７行の「レイ」を、誤記の訂正を目的として、「例」と訂正する。
▲６▼訂正事項ｆ
　明細書第７頁第１０行の「Ｂ．ｓｐ．２９０−３　２０８」を、誤記の訂正を目的として、「Ｂ．ｓｐ．２９０−３　２０７」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
　シクロデキストリングリコシル転移酵素、該転移酵素の製造法並びにγ−シクロデキストリンの産生法
（５７）【特許請求の範囲】
　　【請求項１】　シクロデキストリン（ＣＤ）への澱粉または澱粉様の基質の変換の際に高められた量でγ−ＣＤを産生するシクロデキストリングルコシル転移酵素（ＣＧＴａｓｅ）において、
該転移酵素のアミノ酸配列
有し、該配列中のＸｘｘが、アミノ酸位置２１１またはアミノ酸位置２２９に存在するものであり、
　　【請求項２】　ＸｘｘがＴｒｐを表わす、請求項１に記載のシクロデキストリングリコシル転移酵素。
　　【請求項３】　シクロデキストリン（ＣＤ）への澱粉または澱粉様の基質の変換の際に高められた量でγ−ＣＤを産出するシクロデキストリングリコシル転移酵素（ＣＤＴａｓｅ）を製造するための方法において、β−またはγ−ＣＧＴａｓｅのためにコーディングされた遺伝子のＤＮＡ配列を、自体公知の突然変異生成法を用いて、突然変異したＣＧＴａｓｅ中で組み込まれたβ−またはγ−ＣＧＴａｓｅ中の配列モチーフＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ中の
アミノ酸位置２１１またはアミノ酸位置２２９に存在する
　　【請求項４】　γ−シクロデキストリンの産生法において、請求項１または２に記載のシクロデキストリングリコシル転移酵素を使用することを特徴とする、γ−シクロデキストリンの産生法。
【発明の詳細な説明】
　　　【０００１】
　　【産業上の利用分野】
　本発明は、γ−シクロデキストリンの産生のためのシクロデキストリングリコシル転移酵素（ＣＧＴａｓｅ）ＥＣ２．４．２．１９および該転移酵素の製造法並びにγ−シクロデキストリンの産生法に関する。
　　　【０００２】
　　【従来の技術】
　一般に、シクロデキストリンは、澱粉または澱粉様の基質から製造される。この場合、澱粉は、ＣＧＴａｓｅによって酵素的にシクロデキストリン（ＣＤ）に変換される。熱動力学的理由から、該澱粉は、反応が熱動力学的平衡（最大ＣＤ−収量）に達するまで実施される場合には、変換のために使用されたＣＧＴａｓｅとは独立に、主としてβ−ＣＤに変換される。しかしながら、開始段階、澱粉変換反応の開始時に、変換のために使用された酵素は、第一生成物混合物の組成において異なっている。前記開始段階で酵素によって主として形成された生成物、α−、β−またはγ−ＣＤに応じて、α−、β−またはγ−ＣＧＴａｓｅの問で区別される。
　　　【０００３】
　この種の工業的ＣＤ−製造に適当でかつまた既に使用された酵素は、これまで専ら、細菌の場合に検出された。α−ＣＧＴａｓｅは、これまで専ら、バシラス　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８６年）第１６６巻、第１１１８〜１１２２頁）、バシラス　ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（英国特許第２１６９９０２号明細書）およびクレブシエラ　オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ）（Ｇｅｎｅ（１９８６年）第４７巻、第２６９〜２７７頁）の場合に確認された。β−ＣＧＴａｓｅは、例えばバシラス　サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ．（１９９０年）第３４巻、第２２９〜２３０頁）、バシラスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（米国特許第３８１２０１１号明細書）、バシラス　オーベンシス（特開昭４９−１２４２８５号公報）、ミクロコッカス　ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）（欧州特許第００１７２４２号明細書）および分類学上厳密には分類されていない好アルカリ性細菌、例えばバシラス　ｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）３８−２（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８年）第１３４巻、第９７〜１０５頁）、１７−１（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　４ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ（１９８８年）、第８７〜９２頁）、１０１１（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９８７年）第２６巻、第１４９〜１５３頁）、１−１（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　４ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ（１９８８年）、第７１〜７６頁）の場合に確認された。初期に高いγ−ＣＤ−形成活性を有する酵素は、バシラス　サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）３１３（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８６年）第５０巻、第２１６１〜２１６２頁）、バシラス　ｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）Ａｌ−６（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９０年）第７０巻（３）、第１５０〜１５４頁）およびバシラス　ｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）２９０−３（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　４ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ（１９８８年）、第８７〜９２頁）からのものが記載されている。
　　　【０００４】
　Ｘ線構造分析によって、バシラス　サーキュランスからのβ−ＣＧＴａｓｅの立体構造が明らかにされた（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１年）第２１７巻、第７３７〜７５０頁）。前記構造から、どのアミノ酸基が、直接、前記ＣＧＴａｓｅの基質結合部位および活性中心部の構成に与っていてもよいのかは導き出すことができたが、しかし、どのアミノ酸基が、前記ＣＧＴａｓｅの産生特異性を決定するのかは導き出せなかった（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２年）第３１巻、第８７４０〜８７４６頁）。
　　　【０００５】
　シクロデキストリンの工業的製造の際に使用されたＣＧＴａｓｅは、シクロデキストリンに澱粉を変換する際に、常に、多数のシクロデキストリンからなる混合物を産出するので、種々の方法が、純粋なシクロデキストリン（α、βまたはγ）の取得のために開発された：
−　定義されたＣＤは、生成物混合物から、例えばその分子量の相違に基づいて、クロマトグラフィーにより分離することができる（例えば、米国特許第４８０８２３２号明細書に記載されている）。
　　　【０００６】
−　澱粉をシクロデキストリンに酵素的に変換する場合には、定義されたＣＤとだけ反応し、ひいては例えば反応混合物から生理学的に分離することができるような不溶性錯体を形成する鎖形成剤が添加される。引続き、該錯体を溶解し、かつ均一なＣＤを取得される（例えば、欧州特許第０２９１０６７号明細書に記載されている）。
　　　【０００７】
−　有機溶剤、例えばエタノールを反応混合物に添加することによって、生成組成物は、γ−ＣＧＴａｓｅの使用の際に、γ−ＣＤの方向に移動することができる（Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９０年）第７０巻（３）、第１５０〜１５４頁）。
　　　【０００８】
　前記方法の全ての場合、最適には、純粋に製造されるべきＣＤのためのできるだけ高い開始時の生成物形成傾向（Ｐｒｏｄｕｋｔｂｉｌｄｕｎｇｓｐｒａｅｆｅｒｅｎｚ）を有するようなＣＧＴａｓｅが使用される。
　　　【０００９】
　今日までに知られたα−ＣＧＴａｓｅおよびβ−ＣＧＴａｓｅの特異性は、相応するシクロデキストリンの工業的産生のために十分なものである。これとは異なり、公知のγ−ＣＧＴａｓｅはいずれも、γ−ＣＤ−産生を可能にする生成物特異性を有していない。
　　　【００１０】
　従って、γ−ＣＤの製造のために、特開平３−５３８９２号公報中では、α−シクロデキストリンおよび／またはβ−シクロデキストリンを、γ−ＣＤ−特異性錯体形成剤グリコシルグリシルリジン、麦芽糖およびＣＧＴａｓｅの添加によって、γ−ＣＤに変換することが提案された。
　　　【００１１】
　　【発明が解決しようとする課題】
　本発明の課題は、ＣＤに澱粉または澱粉様の基体を変換する際に、高められた量でγ−ＣＤを産生するようなシクロデキストリングリコシル転移酵素（ＣＧＴａｓｅ）を提供することであった。
　　　【００１２】
　本発明のもう１つの課題は、記載されたＣＧＴａｓｅの製造法を提供することであった。
　　　【００１３】
　本発明のもう１つの課題は、記載されたＣＧＴａｓｅを用いるγ−ＣＤの産生法を提供することであった。
　　　【００１４】
　　【課題を解決するための手段】
　本発明の課題は、ＣＧＴａｓｅの蛋白質配列が、アミノ酸位置１８０およびアミノ酸位置２４０の間の領域（但し、アミノ酸位置２１５の場合を除く）に、アミノ酸配列Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐを有し、この場合、該蛋白質配列の位置１は、ＣＧＴａｓｅのシグナルペプチドの開始点であり、かつＸｘｘは、Ｔｙｒを除いて天然アミノ酸を表わすことによって特徴付けられるＣＧＴａｓｅによって解決される。
　　　【００１５】
　有利に、本発明によるＣＧＴａｓｅは、該ＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列のアミノ酸位置１８０およびアミノ酸位置２４０の問の領域（但し、アミノ酸位置２１５の場合を除く）に、アミノ酸配列Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　ＡｓｐまたはＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐを有し、この場合、蛋白質配列の位置１は、ＣＧＴａｓｅのシグナルペプチドの開始点である。
　　　【００１６】
　特に有利に、本発明によるＣＧＴａｓｅは、該ＣＧＴａｓｅの蛋白質配列のアミノ酸位置１８０およびアミノ酸位置２４０の間の領域（但し、アミノ酸位置２１５の場合を除く）に、配列モチーフＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｐを有し、この場合、該蛋白質配列の位置１は、ＣＧＴａｓｅのシグナルペプチドの開始点である。
　　　【００１７】
　本発明によるＣＧＴａｓｅは、澱粉または澱粉様の基質を変換する際に、γ−ＣＤからの商およびα−ＣＤおよびβ−ＣＤからの総和が、それぞれ変化していない出発酵素を用いる澱粉変換の際に達成される前記生成物の商よりも大きいような生成物分布中にＣＤを産生する。
　　　【００１８】
　この場合、出発酵素とは、本発明によるＣＧＴａｓｅの製造のために使用されたＣＧＴａｓｅである。従って、本発明によるＣＧＴａｓｅは、予想外に、該ＣＧＴａｓｅの製造のために使用された出発酵素よりも高いγ−ＣＤ特異性を有する。
　　　【００１９】
　本発明によるＣＧＴａｓｅの例は、表１中に記載されたＣＧＴａｓｅから、それぞれ下線を引かれたＴｙｒと別の天然アミノ酸との交換によって得られるＣＧＴａｓｅである。有利に、Ｔｙｒが、ＴｒｐまたはＳｅｒと交換されているようなＣＧＴａｓｅである。特に有利に、Ｔｙｒが、Ｔｒｐと交換されているようなＣＧＴａｓｅである。
　　　【００２０】
　　　【００２１】
　表１中のリストは、例えばいくつかのＣＧＴａｓｅに基づいて、β−ＣＧＴａｓｅおよびγ−ＣＧＴａｓｅ中に通常存在するアミノ酸配列領域並びに前記配列領域中の生成物特異性の変性のために重要なＴｙｒを示している。位置としては、表１中では、それぞれ再現されたアミノ酸配列の第一アミノ酸の数が付され、この場合、位置１としては、それぞれＣＧＴａｓｅ配列のシグナルペプチドの第一アミノ酸が数えられた。一般に知られた標準方法に基づいて、相応する配列領域は、全てのβ−ＣＧＴａｓｅおよびγ−ＣＧＴａｓｅに場合に確認することができる。従って、例えば、本明細書中にも記載されているような同様に公知の標準方法を用いてこの種のＣＧＴａｓｅ中のＴｙｒの本発明による突然変異生成によって、本発明による酵素は、任意のβ−ＣＧＴａｓｅおよびγ−ＣＧＴａｓｅから生産することができる。
　　　【００２２】
　本発明のもう１つの課題は、β−ＣＧＴａｓｅまたはγ−ＣＧＴａｓｅのためにコーディングされた遺伝子のＤＮＡ配列が自体公知の突然変異生成法を用いて、突然変異したＣＧＴａｓｅ中で組み込まれたβ−ＣＧＴａｓｅまたはγ−ＣＧＴａｓｅの配列モチーフＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ中のアミノ酸位置１８０および２４０の間の領域に存在するＴｙｒが、１つの別の天然アミノ酸と交換されているような程度に変異されているような方法によって解決される。
　　　【００２３】
　本発明によるＣＧＴａｓｅを製造するためには、全てのβ−ＣＧＴａｓｅおよびγ−ＣＧＴａｓｅが適当である。ＣＧＴａｓｅのためにコーディングしている遺伝子は、公知の方法を用いて単離され、かつ本発明による突然変異が“生体内”または“試験管内”突然変異生成法によってＣＧＴａｓｅの遺伝子中に挿入される。
　　　【００２４】
　“生体内”突然変異生成法とは、特に、染色体的および／またはエピソーム的に、ＣＧＴａｓｅのためにコーディングしている遺伝子を有する微生物と、突然変異源、例えばＵＶ−光、ニトロソグアニジンまたはエチルメチルスルホン酸塩を用いて非特異的に突然変異されるような方法のことである。この種の方法は、例えばＭｉｌｌｅｒ　Ｊ．Ｈ．によって（１７２）Ｅｘｐｅｒｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｈ．Ｙ．中に記載されている。
　　　【００２５】
　引続き、公知方法、例えばｖｏｎ　Ｓａｎｇｅｒ他、ＰＮＡＳ第７４巻（１９７７年）第５４６３から５４６７頁中に記載された連鎖中断法による配列分析によって、少なくとも、バシラス　サーキュランスからのＣＧＴａｓｅのＴｙｒ２２９に相同であるチロシンのためにコーディングしているＣＧＴａｓｅ遺伝子のコドンが、１つの別の天然アミノ酸、有利にセリンまたはトリプトファン基、特に有利にトリプトファン基のためにコーディングしているコドンによって代替されているような突然変異体は同定される。
　　　【００２６】
　本発明の範囲内では、バシラス　サーキュランスからのＣＧＴａｓｅのＴｙｒ２２９にであるようなコドンとは、表１中で下線を引かれたＴｙｒのために該表１中に記載されたアミノ酸配列モチーフのためにコーディングしている別のＣＧＴａｓｅ遺伝子の、Ｔｙｒのためにコーディングしているコドンのことである。
　　　【００２７】
　“試験管内”突然変異生成法とは、本発明の範囲内では、単離されたＣＧＴａｓｅ遺伝子またはＣＧＴａｓｅ遺伝子のフラグメントが、自体公知の方法で、少なくともバシラス　サーキュランスからのＣＧＴａｓｅ中のＴｙｒ２２９に相同しているアミノ酸基が、１つの別のアミノ酸基、有利にトリプトファン基またはセリン基、特に有利にトリプトファラン基によって代替されたＣＧＴａｓｅ酵素のためにコーディングしているような遺伝子が生じるような程度に変性されているような方法のことである。
　　　【００２８】
　公知技術水準から知られた、“試験管内”突然変異生成のための方法は、例えば、“ＰＣＲ”技術を用いる特異性突然変異生成法（Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２年）第１３巻（３）、第３４２〜３４６頁）または非特異性突然変異生成法（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（１９８９年）第１巻（１）、第１１〜１５頁）である。同様に、突然変異が、意図されて、合成されたオリゴヌクレオチドを用いて目的遺伝子中に挿入するような方法は公知である。これは、いわゆる“一本鎖法（Ｅｉｎｚｅｌｓｔｒａｎｇｖｅｒｆａｈｒｅｎ）”（Ａｕｓｕｂｅｌ　Ｆ．Ｍ他（１９８７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）あるいはまた“二本鎖法（Ｄｏｐｐｅｌｓｔｒａｎｇｖｅｒｆａｈｒｅｎ）”（Ｐｒｏｍｅｇａ　第１９９２〜１９９３号　カタログ、１５０）または、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５年）第１９巻、第４２３〜４６２頁に記載されているような別の方法を用いて行うことができる。
　　　【００２９】
　澱粉からγ−ＣＤを取得するための使用は、高められたγ−ＣＤ形成活性を有する本発明によるＣＧＴａｓｅの主要使用領域である。本発明によるＣＧＴａｓｅは、このために、普及している製造法を用いて利用することができる。本発明によるＣＧＴａｓｅが前記ＣＧＴａｓｅの代りに使用できるようなγ−ＣＤの産生のための普及している製造法は、例えば次の場合に記載されている：
−　Ｊｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９０年）第７０巻（３）、第１９０〜１９２頁：強化されたγ−ＣＤ産出を引き起こすようなエタノールの存在下にバシラス　ｓＰ．ＡＬ−６からの、β−、γ−ＣＤを形成するＣＧＴａｓｅの使用下のγ−ＣＤの製造。
　　　【００３０】
−　特開昭６２−２５９７６号公報：バシラス　ｓｐ．３１３からのγ−ＣＧＴａｓｅの使用下のγ−ＣＤの製造。
　　　【００３１】
−　欧州特許第２９１０６７号明細書：バシラス　マセランからのＣＧＴａｓｅの使用下のγ−ＣＤの製造。γ−ＣＤのための生成特性は、錯形成剤、例えばシクロヘキサデク−８−エン−１−オンの添加によって達成される。
　　　【００３２】
−　ドイツ連邦共和国特許第４００９８２２号明細書：バシラス　ｓｐ．２９０　　−３からのγ−ＣＧＴａｓｅを用いるγ−ＣＤの産生。
　　　【００３３】
　γ−ＣＤは、α−ＣＤ並びにβ−ＣＤと比べて、一連の使用のために、唯一可能なＣＤまたは最も適したＣＤであることが明らかである特異的な利点を有する。
　　　【００３４】
　６個のグルコース単位から構成されたα−ＣＤと比べて、８個のグルコース単位からなるγ−ＣＤは、α−ＣＤの立体的理由から錯体化することができないようなゲスト分子（Ｇａｓｔｍｏｌｅｋｕｅｌｅ）の錯体化をも可能にする、より大きな疎水性の空隙を有する。
　　　【００３５】
　β−ＣＤ（室温での水中での溶解度：約１８．５ｇ／ｌ）と比べて、γ−ＣＤは、本質的により高い溶解度（室温で：約２３２．０ｇ／ｌ）を有し、ひいては水溶液からなる錯体化反応に、β−ＣＤよりも良好に適している。β−ＣＤおよび変性されたβ−ＣＤ誘導体に対するγ−のもう１つの利点は、γ−ＣＤの僅かな毒性である。経口投与並びに静脈内投与の場合、α−ＣＤ誘導体およびβ−ＣＤ誘導体は、動物モデル中で、γ−ＣＤよりも毒性である。
　　　【００３６】
　次の実施例は、本発明を更に詳説するのに有用である。
　　　【００３７】
　　【実施例】
例　１：バシラス　ｓｐ．２９０−３（ＤＳＭ　５８５０）からのγ−ＣＧＴａｓｅの突然変異生成
　バシラス　ｓｐ．２９０−３（ブラウンシュヴァイク在ドイツ　ザンムルング　フュア　ミクロオルガニスメンでの寄託番号ＤＳＭ　５８５０で寄託されている）からのγ−ＣＧＴａｓｅ中の位置２１１でのアミノ酸基チロシンと任意の他のアミノ酸基、しかしながら殊に、トリプトファン基またはセリン基との交換は、ＣＧＴａｓｅ構造遺伝子の、チロシン２１１のためにコーディングしている塩基性トリプレットを、当業者に公知の方法で、任意のアミノ酸、しかしながら好ましくはトリプトファン基のためにコーディングしている別の塩基性トリプレットによって代替することによって達成される。
　　　【００３８】
　突然変異生成のために、バシラス　ＳＰ．２９０−３からのγ−ＣＧＴａｓｅ遺伝子を、まず、市販により入手可能なＥ．ｃｏｌｉ−ベクターｐＵＣ１９（べーリンガー、マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ））中にクローニングした。このために、Ａｕｓｕｂｅｌ　Ｆ．Ｍ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻；Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　＆　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．で記載されているように、バシラス　ｓｐ．２９０−３からの染色体ＤＮＳ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　４ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ（１９８８年）第８７〜９２頁）の場合のように単離し、かつ同時に制限ヌクレアーゼＳａｕ３ＡＩ（べーリンガー、マンハイム）を用いて分割した。２〜５ｋｂの間の大きな範囲でのフラグメントを単離し、かつ制限ヌクレアーゼＢａｍＨＩ（べーリンガー、マンハイム）を用いて線状化されたｐＵＣ１９−ＤＮＳおよびＴ４　ＤＳＮ−リガーゼと一緒に１６℃で１２時間恒温保持した。連結反応の記載を、公知方法で（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２年）、Ｎ．Ｙ．）ＤＮＳの受入れのために適確にされたＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ　１２−細胞の形質転換のために使用した。形質転換後に澱粉を含有する指示薬板の上に澱粉分解空隙（Ｓｔａｅｒｋｅａｂｂａｕｈｏｅｆｅ）を形成したようなＥ．ｃｏｌｉ細胞から、バシラス　ｓｐ．２９０−３からのγ−ＣＧＴａｓｅのための遺伝子を有する組換えプラスミドを単離した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２年）、Ｎ．Ｙ．、第８６〜９２頁）。前記遺伝子の突然変異生成を、エックシュタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）によって開発された方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９８６年）第１４巻、第９６７９〜９６９８頁およびＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９８８年）第１６巻、第７９１〜８０２頁）を基礎として、アーメルサーム社（Ｆｉｒｍａ　Ａｍｅｒｓｈａｍ）（ブラウンシュヴァイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ））によって市販されている‘オリゴヌクレオチド（Ｏ１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（試験管内突然変異系対応）バージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）２．１’を用いて実施した。この突然変異生成を、正確に、アーメルサーム社の記載された突然変異生成系に添付しているような始原細胞により実施した。この方法を、次に、簡略的に再現する。詳細には、記載された突然変異生成系の始原細胞から確認される。
　　　【００３９】
　市販により得られる酵素、例えば制限ヌクレアーゼおよびＴ４　ＤＮＳ−リガーゼ（べーリンガー、マンハイム）の使用下に、アミノ酸基のためにチロシンを前記ＣＧＴａｓｅの位置２１１でコーディングしている塩基性トリプレットを有するような、バシラス　ｓｐ．２９０−３からのγＣＧＴａｓｅのための、ｐＵＣ１９中でクローニングされた遺伝子の部分を、市販により得られるベクターＭ１３（ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））中にクローニングした。この種のフラグメントの例は、０．６ｋｂの大きさのＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ−フラグメントである。前記フラグメントを、制限ヌクレアーゼＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで分割されたＭ１３−ベクター中にクローニングした。
　　　【００４０】
　組換えＭ１３−ベクターを取り込んだようなＥ．ｃｏｌｉ−ホスト細胞から、アーメルサーム社の上記の突然変異生成系を用いて産出された試験始原細胞により一本鎖の組換えＭ１３−ＤＮＳ（原型（Ｖｏｒｌａｇｅｎ）−ＤＮＳ）を単離した。
　　　【００４１】
　本来の突然変異生成のために、化学的に定義された突然変異生成オリゴヌクレオチドを、それぞれ望ましい配列で合成した。この種のオリゴヌクレオチドは、例えばＦａ．ＭＷＧ社（エ一ベルスベルク（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ））で市販により入手可能である。突然変異生成オリゴヌクレオチドの配列を、突然変異生成オリゴヌクレオチド中の塩基の順番が、チロシン基のためにバシラス　ＳＰ２９０−３からのγＣＧＴａｓｅの位置２１１でそれぞれ１５個の塩基をコーディングしている、原型−ＤＮＳ中に含有された塩基性トリプレットを、上流および下流の方向に包囲している、原型−ＤＮＳのヌクレオチド配列の部分に対して逆相補的であるように選択した。しかしながら、チロシンのためにコーディングしている塩基性トリプレットの代りに、突然変異生成オリゴヌクレオチドは、生じた突然変異生成後にγ−ＣＧＴａｓｅ誘導体の産生を生じ、位置２１１で、１つのチロシン基の代りに、１つの別のアミノ酸基が位置決定されているようなヌクレオチドを有する。
　　　【００４２】
　表２には、２つの使用された突然変異生成オリゴヌクレオチドの配列が記載されている。
　　　【００４３】
表　２：
　５’−ＡＴＴ　ＴＡＴ　ＣＧＡ　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＴＴＡ　ＧＣＴ　ＡＧＴ　ＣＴＡ−３’
　５’−ＡＴＴ　ＴＡＴ　ＣＧＡ　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＮＮＮ　ＧＡＴ　ＴＴＡ　ＧＣＴ　ＡＧＴ　ＣＴＡ−３’
　表２中の上側に記載された突然変異生成オリゴヌクレオチドの使用は、チロシン基２１１がトリプトファン基によって代替されたγ−ＣＧＴａｓｅ誘導体を生じた。
　　　【００４４】
　表２中の下側に記載された突然変異生成オリゴヌクレオチドの使用、いわゆる変性したかまたは‘混合された’オリゴヌクレオチドの場合、チロシン２１１のためにコーディングしている塩基性トリプレットを、Ｔｙｒのためのコーディングしているトリプレットを除いて６４個の可能な塩基性トリプレットにすべてによって代替することができる。従って、前記オリゴヌクレオチドは、アミノ酸基チロシンが位置２１１で別の天然アミノ酸のそれぞれ１つによって代替されているようなγ−ＣＧＴａｓｅ誘導体の製造に適している。
　　　【００４５】
　この突然変異生成オリゴヌクレオチドを、５’−末端で、Ｔ４ポリヌクレオチドーキナーゼおよびＡＴＰ（アーメルサーム）の使用下にホスホリル化した。このホスホリル化された突然変異生成オリゴヌクレオチドを、原型−ＤＮＳの相同の領域で結合させた。このために、一本鎖の原型−ＤＮＳ５μｇを、ホスホリル化した突然変異生成オリゴヌクレオチド約４ピコモルと一緒に３分間７０℃で恒温保持し、次に３０分間３７℃で恒温保持した。引続き、突然変異すべき位置を除いて原型−ＤＮＳに対して相補的なＤＮＳ−鎖の合成を行い、この場合、原型−ＤＮＳに結合した突然変異生成オリゴヌクレオチドは、合成の出発点として使用し、かつ原型−ＤＮＳは、突然変異したＤＮＳ一鎖の新合成のための原型として使用した。この合成自体は、ＤＮＡ−ポリメラーゼの０クレノウフラグメント（アーメルサーム）、Ｔ４　ＤＮＳ−リガーゼおよび、ヌクレオチド　ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰの代りにチオヌクレオチド　ｄＣＴＰαＳ（アーメルサーム）を有するヌクレオチド混合物の添加後に１５分間１６℃で行った。
　　　【００４６】
　前記合成バッチ量から一本鎖原型−ＤＮＳの残留分子を除去した。このために、該バッチ量にＮａＣ１を添加し、特異性の一本鎖ＤＮＳを結合するニトロセルロース濾紙（アーメルサーム）を介して濾過した。透過の際に残留した二本鎖ハイブリッドＤＮＳを、ＥｔＯＨ一沈殿によって濃縮し、かつ脱塩した。引続き、該ハイブリッド−ＤＮＳを、ＮｃｉＩ（アーメルサーム）、ヌクレオチド配列ＣＣ（Ｇ／Ｃ）ＧＧが認識されるが、しかし、ヌクレオチド類似体ｄＣＴＰαＳを有するようなものではなく、天然のＤＮＳ一鎖だけが認識される制限ヌクレアーゼを用いて分割し、適当な恒温保持緩衝液（アーメルサーム）中で９０分間３７℃で恒温保持した。前記の処理によって、突然変異していなかった鎖（原型−ＤＮＳ）中にだけ損傷を挿入した。
　　　【００４７】
　この後、３７℃で、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（アーメルサーム）、任意の末端からＤＮＳ−鎖を分解する酵素を用いる３０分間の処理の場合に、原型−ＤＮＳを除去した。エキソヌクレアーゼＩＩＩの熱不活性化後に（７０℃で１５分間）、残留した一本鎖ＤＮＳ−鎖および突然変異したＤＮＳ−鎖を、ＤＮＳ−ポリメラーゼＩ（アーメルサーム）、Ｔ４　ＤＮＳ−リガーゼおよびヌクレオチド　ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰと一緒に３時間、１６℃で恒温保持した。この場合、突然変異した一本鎖−ＤＮＳを、二本鎖に補填した。更に、生成のためのＥｔＯＨ−沈殿後に、突然変異したＤＮＳを、適確なＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２−細胞に形質転換させることができる。
　　　【００４８】
　形質転換の際に得られたクローンの５個からの組換えＤＮＳの当該領域の配列分析によって、突然変異生成法の成果を制御した。変性された突然変異生成オリゴヌクレオチド（表２の下側）の使用の場合、前記の配列化の際に、得られた突然変異を特定した。突然変異が確認されたこの種のベクターから、突然変異生成のために最初にＭ１３でクローニングしたＤＮＳ−フラグメントを適当な制限酵素で分割した。本明細書で使用された０．６ｋｂフラグメントの場合、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩを用いて分割した。
　　　【００４９】
　引続き、相応するが、しかし、突然変異したＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ−フラグメントを、バシラス　ｓｐ．２９０−３からのγ−ＣＧＴａｓｅのための、ｐＵＣ１９を基礎とする発現プラスミドから分割し、かつＴ４　ＤＮＳ−リガーゼの使用下に突然変異したフラグメントによって代替させた。
　　　【００５０】
例　２：バシラス　ｓｐ．１−１からのβ−ＣＧＴａｓｅの突然変異生成
　例１に記載された方法と同様に、チロシン基のために相応するＣＧＴａｓｅの位置２１７でコーディングしている、バシラスｓｐ．１−１からのβ−ＣＧＴａｓｅ遺伝子のコドンを、トリプトファン基のためにコーディングしているトリプレットによって代替させた。表３は、前記突然変異生成のために使用されたオリゴヌクレオチドを示している。
　　　【００５１】
表　３：
　５’−ＡＴＴ　ＴＡＣ　ＡＧＡ　ＡＡＣ　ＴＴＡ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＧＡＣ　ＴＡＴ−３’
例　３：バシラス　サーキュランスからのβ−ＣＧＴａｓｅの突然変異生成
　例１と同様に、チロシン基のために相応するＣＧＴａｓｅの位置２２９でコーディングしている、バシラス　サーキュランスからのβ−ＣＧＴａｓｅ遺伝子のコドンを、トリプトファン基（表４の上側）またはセリン基（表４の下側）のためにコーディングしているトリプレットによって代替させた。表４は、前記突然変異生成のために使用されたオリゴヌクレオチドを示している。
　　　【００５２】
表　４：
　５’−ＡＴＣ　ＴＡＣ　ＡＡＡ　ＡＡＣ　ＣＴＧ　ＴＧＧ　ＧＡＣ　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＧＡＣ　ＴＴＣ−３’
　５’−ＡＴＣ　ＴＡＣ　ＡＡＡ　ＡＡＣ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＧＡＣ　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＧＡＣ　ＴＴＣ−３’
例　４：バシラス　ｓｐ．２９０−３からのγ−ＣＧＴａｓｅおよびその本発明による誘導体のＥ．ｃｏｌｉ中での産生
　バシラス　ｓｐ．２９０−３からのγ−ＣＧＴａｓｅおよび例１の記載により得られた誘導体の産生のために、ｐＵＣ１９−を基礎とする、例１に記載された発現プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ−分泌菌株中に形質転換させた。Ｅ．ｃｏｌｉ−分泌菌株としては、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＷＣＭ１０５を使用した。前記菌株を、欧州特許第３３８４１０号明細書に記載されたように、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＳ　４１０から得た。
　　　【００５３】
　従って、バシラス　ｓｐ．２９０−３からのγ−ＣＧＴａｓｅまたはその誘導体の産生のために、適当なＣＧＴａｓｅ−発現プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ　ＷＣＭ１０５の細胞を、乳糖１０ｇ／ｌおよびアンピシリン０．１ｇ／ｌを含有するＬＢ−培地（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２年）、Ｎ．Ｙ．）中で、７２時間３０℃で、水浴振盪装置（Ｗａｓｓｅｒｂａｄｓｃｈｕｅｔｔｌｅｒ）（回転数２５０ｒｐｍ）中で恒温保持した。次に、前記細胞を、５０００Ｇで遠心分離によって分離した。細胞不含の培養上澄液は、γ−ＣＧＴａｓｅまたはその誘導体を含有している。
　　　【００５４】
例　５：バシラス　ｓｐ．１−１からのβ−ＣＧＴａｓｅおよびその本発明による誘導体のＥ．ｃｏｌｉ中での産生
　例４と同様に、例２に記載された発現プラスミドの使用下に産生を行った。
　　　【００５５】
例　６：バシラス　サーキュランスからのβ−ＣＧＴａｓｅおよびその本発明による誘導体のＥ．ｃｏｌｉ中での産生
　例４と同様に、第３に記載された発現プラスミドの使用下に産生を行った。
　　　【００５６】
例　７：シクロデキストリンヘの澱粉の変換
　ＣＧＴａｓｅの活性の決定を、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０年）第１９１巻、第１７７〜１８５頁に記載された方法により行った。
　　　【００５７】
　試験すべきＣＧＴａｓｅの、澱粉１ｇ当たりそれぞれ１０単位を、トリス／ＨＣ１２０ｍＭ、ｐＨ７．２およびＣａＣｌ２５ｍＭからなる緩衝液中の可溶性の澱粉（メルク社、ダルムシュタット（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ））の５％の溶液を用いて、定義された時間４５℃で恒温保持した。前記の時間の後に、この反応を、メタノール１．５容量部の添加によって終了させた。変換しなかった残りの澱粉を、４℃で１時間の恒温保持によって沈殿させ、かつ遠心分離（１０分巻、１２０００Ｇ）によって分離した。生じた生成物を、ヌクレオシル　１０ＮＨ２−カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ　＆　Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｅｒｅｎ）を用いるＨＰＬＣにより測定し、この場合、定義されたシクロデキストリンまたは線状のマルトオリゴ糖（シグマ、ミュンヘン（Ｓｉｇｍａ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ））を標準として使用した。
　　　【００５８】
例　８：バシラス　ｓｐ．２９０−３並びに例４の記載により得られた誘導体からの突然変異していないγ−ＣＧＴａｓｅの使用下の澱粉の変換。
　　　【００５９】
　反応を、例７に記載されたものと同様にして実施した。相応する線状のマルトオリゴ糖（Ｇ１−Ｇ７）の量を合計した。次の結果が得られた：
　　　【００６０】
　　　【００６１】
例　９：バシラス　サーキュランス並びに例６の記載により得られた、チロシン基を位置２２９でトリプトファン基によって代替させた誘導体からの突然変異していないβ−ＣＧＴａｓｅの使用下の澱粉の変換
　反応を、例７に記載されたものと同様にして実施した。次の結果が得られた：
　　　【００６２】
　　　【００６３】
例　１０：バシラス　サーキュラス並びに例６の記載により得られた、チロシン基を位置２２９でトリプトファン基によってγ−ＣＤ−錯体形成剤の存在下に代替させた誘導体からの突然変異していないβ−ＣＧＴａｓｅの使用下の澱粉の変換
　変換を、次のよづに変更して例７に記載されたものと同様に実施した：
−　可溶性の澱粉をジャガイモ澱粉によって代替し、
−　澱粉１０ｇ当たりにＣＨＤＣ（シクロヘキサデセノン）１．２５ｇを添加した
　次の結果が得られた：
　　　【００６４】
　　　【００６５】
例　１１：バシラス　サーキュラスからの突然変異していないβＣＧＴａｓｅ並びに、チロシン基を位置２２９でセリン基によって代替させた、例６からの本発明による誘導体の使用下の澱粉の変換
　反応を、例７に記載されたものと同様にして実施した。２０分間の恒温保持の場合、次の結果が得られた：
　　　【００６６】