(57)【要約】本発明は、タンパク質−薬物結合体ならびにタンパク質−薬物およびタンパク質標識結合体を作成する方法を提供する。本発明の開示により、１個以上の活性化基（例えば、抗体）を含有するタンパク質に、１個以上のそのような結合の部分還元または完全還元を受けさせて、反応性基を形成させる方法が提供される。本発明の方法において、生じたタンパク質は、反応性基の一部と反応する薬物（例えば特定の放射性金属、キレート剤、および毒素）と反応されて、例えばインビトロ診断、インビボ撮像、および治療において有用な結合体を形成する。
2008500961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分付加抗体であって、該抗体は以下：
少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合、および
少なくとも２個の細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬または標識であって、各薬物または標識は、鎖間チオールに結合体化された、薬物または標識；
を含み、ここで該薬物または標識の結合箇所が容易に割当て可能である、
部分付加抗体。
【請求項２】
前記抗体が少なくとも４個の細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬を有し、各薬物が鎖間チオールに結合されている、請求項１に記載の部分付加抗体。
【請求項３】
種４Ａまたは種４Ｂの配置を有する、請求項１に記載の部分付加抗体。
【請求項４】
種４Ｃまたは種４Ｄの配置を有する、請求項１に記載の部分付加抗体。
【請求項５】
種４Ｅの配置を有する、請求項１に記載の部分付加抗体。
【請求項６】
種４Ｆの配置を有する、請求項１に記載の部分付加抗体。
【請求項７】
前記抗体がヒト化またはキメラ抗体である、請求項１に記載の部分付加抗体。
【請求項８】
前記細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬がＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、またはＡＦＰである、請求項１に記載の部分付加抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
抗体であって、該抗体は、
細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬のための少なくとも結合箇所を含み、ここで、該抗体上の細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬のための該結合箇所が容易に割当て可能であり、考えられるすべての結合箇所より少数が該細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬への結合体化に利用可能である、
抗体。
【請求項１１】
前記結合箇所が鎖間チオールである、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記結合箇所が４Ａから４Ｆの少なくとも１個である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１３】
前記結合箇所が４Ａから４Ｆからなる群の少なくとも１個から選択される、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１４】
割当て可能な結合箇所を有する修飾抗体の組成物であって、該組成物は：
修飾抗体の少なくとも４種を含み、それぞれの種が（ａ）２個の鎖間チオールを有する少なくとも１個の特定結合対および（ｂ）少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合、
を含む、組成物。
【請求項１５】
種４Ａおよび種４Ｂを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
種４Ｃおよび種４Ｄを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
種４Ｅを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
種４Ｆを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記特定結合対が定常軽鎖−定常重鎖間ジスルフィド結合にある、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
前記特定結合対が定常重鎖−定常重鎖間ジスルフィド結合にある、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
前記特定結合対がヒンジ領域のＮ末端より近位である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２２】
前記特定結合対がヒンジ領域のＣ末端より近位である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２３】
前記特定結合対が定常軽鎖−定常重鎖間スルフィド結合に、および前記修飾抗体のＮ末端付近に位置するヒンジ領域にある、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２４】
前記特定結合対が定常軽鎖−定常重鎖間ジスルフィド結合に、および前記修飾抗体のＣ末端付近に位置するヒンジ領域にある、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２５】
定常軽鎖−定常重鎖間ジスルフィド結合における少なくとも２個の特定結合対を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２６】
ヒンジ領域鎖間ジスルフィド結合における少なくとも２個の特定結合対を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２７】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２８】
部分付加抗体であって、該抗体は、以下：
少なくとも１個の抗原結合ドメイン、
該抗体上の少なくとも２個の反応性基、および
少なくとも２個の薬物または標識であって、各薬物または標識は、反応性基に結合体化されて、結合箇所を形成する、薬物または標識
を含み、
ここで、該薬物または標識の結合箇所が容易に割当可能である、
部分付加抗体。
【請求項２９】
割当て可能な結合箇所を有する部分的に付加された修飾タンパク質であって、該タンパク質は、以下：
結合パートナーとの相互作用のための結合領域、
それぞれ薬物または標識に共有結合される少なくとも２個の結合箇所
を含み、
ここで、同様の接近性および活性化性を有する、考えられるすべての結合箇所のより少数が薬物または標識に結合される、
修飾タンパク質。
【請求項３０】
前記タンパク質が抗体である、請求項２９に記載の修飾タンパク質。
【請求項３１】
前記結合箇所がアミノ基、隣接ヒドロキシル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、またはチオール基である、請求項２９に記載の修飾タンパク質。
【請求項３２】
前記タンパク質がレセプター、レセプターリガンド、ホルモン、またはサイトカインである、請求項２９に記載の修飾タンパク質。
【請求項３３】
癌、免疫疾患、自己免疫疾患または感染性疾患の処置のための医薬品の調製における部分付加抗体の使用であって、該部分付加抗体は、少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合、およびそれぞれ鎖間チオールに結合された少なくとも２個の細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬あるいは標識を含み；ここで、該薬物または標識の結合箇所が容易に割当て可能である、部分付加抗体の使用。
【請求項３４】
薬物を還元して、薬物配置の選択性をもたらす抗体に結合させる方法であって：
該抗体を還元剤によって完全に還元する工程；
該完全に還元された抗体を再酸化剤の制限量で処理し、少なくとも２個の鎖間チオールが残存するように、該抗体の少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を再形成する工程；
該薬物を該鎖間チオールに結合体化する工程；
を包含する、方法。
【請求項３５】
前記再酸化剤が、５，５’−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸、４，４’−ジチオジピリジン、２，２’−ジチオジピリジン、テトラチオン酸ナトリウムまたはヨードソ安息香酸である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記薬物が、細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬あるいは免疫抑制剤である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬が、副溝バインダ、ＡＥＢ、またはＡＥＶＢである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記薬物が、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥまたはＡＦＰである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記還元剤がＤＴＴまたはＴＣＥＰである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
抗体鎖間ジスルフィド結合を還元して、生じた鎖間チオールに薬物を結合させて、該抗体に対する該薬物配置の選択性を生じさせる方法であって、該方法は：
該抗体を還元剤によって完全に還元し、鎖間チオールを形成する工程；
該抗体を再酸化剤で部分的に再酸化し、少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を再生成する工程；
該薬物を該鎖間チオールに結合させる工程、
を包含する、方法。
【請求項４１】
前記再酸化剤が、５，５’−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸、４，４’−ジチオジピリジン、２，２’−ジチオジピリジン、テトラチオン酸ナトリウム、またはヨードソ安息香酸である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記還元剤が、ＤＴＴまたはＴＣＥＰである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記部分的に再酸化された抗体を精製する工程をさらに包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記薬物が、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、またはＡＦＰである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
抗体鎖間ジスルフィド結合を還元して、薬物を生じた鎖間チオールに結合させて、薬物を該抗体上に選択的に配置する方法であって、該方法は：
該抗体を還元剤によって部分的に還元し、少なくとも２個の鎖間チオールを形成する工程；および
該薬物を、該部分的に還元された抗体の鎖間チオールに結合体化させる工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、
ここで、前記抗体は、制限濃度の還元剤によって、キレート剤を含む緩衝液中で部分的に還元され；そして
ここで、該抗体溶液を冷却して、前記薬物を冷溶媒に溶解させ、該抗体溶液と混合することによって、該薬物が結合体化され；
該抗体および該薬物溶液を、抗体−薬物結合体を形成するのに十分な時間インキュベートさせ；
過剰の薬物をチオール含有試薬によってクエンチさせ；そして
生じた結合体を精製する、
方法。
【請求項４７】
前記抗体が約３７℃にて約１時間、部分的に還元される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記還元された抗体が約０℃まで冷却される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体および薬剤溶液が、約０℃にて約３０分間インキュベートされる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記チオール含有試薬が、システインまたはＮ−アセチルシステインである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記還元剤が、ＤＴＴまたはＴＣＥＰである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記緩衝液がホウ酸ナトリウム溶液であり、前記キレート剤がジエチレントリアミン五酢酸である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
前記キレート剤が、エチレントリアミン五酢酸またはＥＤＴＡである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記還元された抗体を精製する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記還元された抗体が、カラムクロマトグラフィー、透析、またはダイアフィルトレーションを使用して精製される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記カラムが脱塩カラムである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記脱塩カラムがＰＤ−１０カラムである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５８】
前記還元された抗体が、部分的還元後および結合体化前に精製されない、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
前記結合体がカラムクロマトグラフィー、透析、またはダイアフィルトレーションを使用して精製される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
前記カラムが脱塩カラムである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記脱塩カラムがＰＤ−１０カラムである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６２】
前記溶媒がアセトニトリル、アルコールまたはＤＭＳＯである、請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
前記薬物が細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６４】
薬物の選択的結合を有する抗体を産生する方法であって、該方法は：
ＤＴＮＢ滴定によって決定されるように、大幅に過剰の還元剤を添加して、溶液を約３７℃にて約３０分間インキュベートすることによって、鎖間チオールを生成するのに十分な時間、該抗体を完全に還元する工程；
該抗体を精製する工程；
酸化剤を使用して該抗体を部分的に再酸化し、少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を、以下、
該還元された抗体を０℃に冷却する工程；
該還元および冷却された抗体を該酸化剤１．５〜２．５モル当量で処理する工程；
反転により該溶液を混合する工程；
約０℃にて約１０分間インキュベートする工程
によって形成する工程；
該部分的に再酸化された抗体を精製する工程；
該薬物を該部分的に再酸化された抗体の鎖間チオールに結合体化させ、結合体化抗体を作成する工程；ならびに
該結合体化抗体を精製する工程
を包含する、方法。
【請求項６５】
前記還元剤が、ＤＴＴまたはＴＣＥＰである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗体が、カラムクロマトグラフィー、透析、またはダイアフィルトレーションを使用して精製される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記カラムが脱塩カラムである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記脱塩カラムがＰＤ−１０カラムである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記結合体化抗体が、カラムクロマトグラフィー、透析、またはダイアフィルトレーションを使用して精製される、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記カラムが脱塩カラムである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記脱塩カラムがＰＤ−１０カラムである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記再酸化剤が、５，５’−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸、４，４’−ジチオジピリジン、２，２’−ジチオジピリジン、テトラチオン酸ナトリウム、またはヨードソ安息香酸である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７３】
１個以上のジスルフィド結合を有するタンパク質と、遊離チオールと反応性である薬物との結合体を調製する方法であって、該方法は：
該タンパク質を還元剤によって部分的に還元する工程；
該遊離チオールと反応性である薬物を該部分的に還元されたタンパク質に結合体化する工程
を包含する、方法。
【請求項７４】
１個以上のジスルフィド結合を有するタンパク質と、遊離チオールと反応性である薬物との結合体を調製する方法であって、該方法は：
該タンパク質を還元剤によって完全に還元する工程；
該タンパク質を再酸化剤によって部分的に再酸化する工程；
該遊離チオールと反応性である薬物を抗体に結合体化する工程；
を包含する、方法。
【請求項７５】
部分的に付加された抗体を形成する方法であって、該方法は：
抗体含有溶液を提供する工程、
該抗体溶液のｐＨを約ｐＨ７．５に調整して、キレート剤を添加する工程；
該抗体溶液を約３７℃まで加熱する工程；
モル過剰のＴＣＥＰを該抗体溶液に添加し、約３７℃にて十分な時間反応させて、該抗体の鎖間ジスルフィド基を部分的に還元して鎖間チオールを形成する工程；
該抗体溶液を約２〜８℃まで冷却することと；
わずかにモル過剰の薬物を該抗体溶液に添加することによって、該部分的に還元された抗体の鎖間チオールに該薬物を結合体化させ、そして該部分的に付加された抗体を形成するために十分な時間反応させる工程；ならびに
部分的に付加された抗体を精製する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（継続）
本願は、２００４年３月２日に出願された米国仮特許出願第６０／５４９，４７６号の優先権を主張し、この開示はその全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、例えばタンパク質−薬物結合体の特定異性体を生じる薬物との少なくとも１個の結合箇所を有する修飾タンパク質と、特定異性体を生じるそのような結合の方法とに関する。本発明はさらに、細胞毒性薬および／または細胞増殖抑制薬が結合可能であり、特定異性体を生じる抗体と、その結合の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
本発明は、例えばタンパク質−薬物結合体の特定異性体を生じる薬物との少なくとも１個の結合箇所を有する修飾タンパク質と、特定異性体を生じるそのような結合体化の方法とに関する。本発明はさらに、細胞毒性薬および／または細胞増殖抑制薬が結合体化可能であり、特定異性体を生じる抗体と、その結合体化の方法に関する。
【０００４】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、癌との闘いにおいて価値のある武器である。ｍＡｂは免疫障害の処置でも使用される。癌および免疫障害に対するｍＡｂベースの療法の使用をさらに促進するために、多数の新規な手法が検討されてきた。１つの手法は、殺細胞ペイロードを結合することによって、腫瘍細胞に対するｍＡｂの細胞毒性ポテンシャルを向上させることである。タンパク質毒素、放射性核種、および抗癌剤などの分子は、あるｍＡｂに結合体化されて免疫毒素、放射免疫結合体、および抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）をそれぞれ生成してきた。
【０００５】
ＡＤＣの開発で以前に考慮された因子は、抗体の選択、および薬物成分の効力の最適化、リンカーの安定性、および薬物がｍＡｂに共有結合される方法を含んでいた。ジスルフィド結合によって結合体化されたＡＤＣを生成するための一般的な慣例は、抗体のすべての鎖間ジスルフィド結合を還元することと、還元されたｍＡｂチオールすべてに還元チオールすべてとの相互作用が可能である化合物と反応させて、ある結合部位に対する特異性を得る能力を持たない、薬物８個／ｍＡｂで均一に置換された、すなわち「完全付加された」ＡＤＣを形成することによるものであった。
【０００６】
例えば抗原ＣＤ３０は、ホジキン病（ＨＤ）未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）などの癌で高度に発現される。ＣＤ３０のこの発現は、正常細胞での制限された発現と相まって、それをＡＤＣ療法の魅力的な標的としている。ＣＤ３０を指向するキメラｍＡｂであるｃＡＣ１０は、インビトロと、皮下および播種性ＳＣＩＤマウス異種移植モデルとの両方でＨＤに対する抗腫瘍活性を有する。ｃＡＣ１０の抗腫瘍活性は、８個すべての鎖間チオールが細胞毒性薬オーリスタチンＥの誘導体に薬物成分として結合された完全付加ＡＤＣを産生することによって向上された。これらのＡＤＣは、マウス異種移植モデル内で耐容性に優れた用量にて非常に有効であった。
【０００７】
ＡＤＣの産生における慣習は、それらに薬物を完全付加することであったため、部分付加ＡＤＣが同じまたはそれ以上の治療有効性を持ちうることは、以前は認識されていなかった。さらに抗体での他の置換パターンが同じまたはそれより少ない毒性で同じまたはそれ以上の治療有効性を発生しうることを考慮できる方法が存在しなかった。これらおよび他の過去の制限および問題は、本発明によって解決される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（要旨）
本発明は、タンパク質−薬物結合体ならびにタンパク質−薬物およびタンパク質標識結合体を作成する方法を提供する。薬物または標識を受容するための結合箇所を有するタンパク質も提供される。結合体は、生体内撮像に、または他の用途に治療的に、診断的に（例えばインビトロまたはインビボ）で使用され得る。
【０００９】
一般に、割当て可能な結合箇所を有する部分付加された修飾タンパク質が供給される。修飾タンパク質は一般に、結合パートナーとの相互作用のための結合領域と、少なくとも２個の結合箇所とを含み、各結合箇所は薬物または標識と共有結合している。通例、同様の接近性または活性化性を有する、考えられるすべての結合箇所のより少数が薬物または標識に結合される。修飾タンパク質は例えば、抗体、レセプター、レセプターリガンド、ホルモン、サイトカインなどであり得る。結合箇所は例えば、アミノ基、隣接ヒドロキシル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、またはチオール基であり得る。タンパク質は例えば、レセプター、レセプターリガンド、ホルモン、サイトカインなどであり得る。
【００１０】
さらなる実施形態において、１個以上のジスルフィド結合を有するタンパク質と、遊離チオールと反応性の薬物との結合体を調製する方法が提供される。該方法は一般に、タンパク質を還元剤によって部分的に還元することと；遊離チオールと反応性の薬物を部分還元タンパク質に結合体化することとを含む。なお別の実施形態において、１個以上のジスルフィド結合を有するタンパク質と、遊離チオールと反応性の薬物との結合体を調製する方法が提供される。該方法は一般に、タンパク質を還元剤によって完全に還元することと；タンパク質を再酸化剤によって部分的に再酸化することと；遊離チオールと反応性の薬物を抗体に結合体化させることとを含む。
【００１１】
一部の実施形態において、部分付加抗体が提供される。抗体は、抗原結合領域と、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合と、それぞれ鎖間チオールに結合体化された、少なくとも２つの薬物または標識を含む。薬物または標識の結合箇所は必要に応じて、容易に割当て可能である。１つの例では、抗体は少なくとも４個の細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬を有することが可能であり、各薬物は鎖間チオールに結合体化される。ある実施形態において、抗体は、種４Ａ、種４Ｂ、種４Ｃ、種４Ｄ、種４Ｅまたは種４Ｆの配置を有する。
【００１２】
部分付加抗体は例えば、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはキメラ抗体であり得る。薬物は例えば、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥまたはＡＦＰなどの細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬であり得る。部分付加抗体を含む薬学的組成物も提供される。
【００１３】
別の実施形態において、抗体は、細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬に対する少なくとも１つの結合箇所を有し、抗体上の結合箇所を細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬へ容易に割当てることができるように提供される。抗体では、考えられるすべての結合箇所より少数が細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬への結合体化に利用できる。結合箇所は例えば、鎖間チオールであり得る。結合箇所は例えば、種４Ａ〜４Ｆのうちの少なくとも１個であり得る。
【００１４】
割当て可能な結合箇所を有する修飾抗体の組成物も提供される。該組成物は、例えば少なくとも２個の、少なくとも４個の、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも１０個以上の種の修飾抗体を有することができる。１つの例において、各種は２個の鎖間チオール、および少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を有する、少なくとも１つの特定結合対を持ちうる。抗体種は例えば４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅおよび／または４Ｆを有することができる。さらなる例では、特定結合対は、定常軽鎖−定常重鎖間ジスルフィド結合および／または定常重鎖−定常重鎖間ジスルフィド結合に存在しうる。特定結合対は、ヒンジ領域のＮ末端より近位におよび／またはヒンジ領域のＣ末端より近位にあり得る。別の例では、特定結合対は、定常軽鎖−定常重鎖間スルフィド結合に、および修飾抗体のＮ末端付近に位置するヒンジ領域に、または定常軽鎖−定常重鎖間ジスルフィド結合に、および修飾抗体のＣ末端付近に位置するヒンジ領域に存在する。
【００１５】
抗体の各種は必要に応じて、定常軽鎖−定常重鎖間ジスルフィド結合における少なくとも２個の特定結合対およびヒンジ領域鎖間ジスルフィド結合における少なくとも２個の特定結合対を含むことができる。該組成物は必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含むことができる。
【００１６】
なお別の実施形態において、部分付加抗体が提供される。該抗体は、少なくとも１個の抗原結合ドメインと、抗体上の少なくとも２個の反応性基と、少なくとも２個の薬物または標識を含み、各薬物または標識は、結合箇所を形成するためにそれぞれ反応性基に結合される。薬物または標識に対する結合箇所は容易に割当てられる。
【００１７】
なお他の実施形態において、薬物を還元して、薬物配置の選択性をもたらす抗体に結合させる方法が提供される。該方法は一般に、抗体を還元剤によって完全に還元することと、少なくとも２個の鎖間チオールが残存するように抗体の少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を再形成するために、完全に還元された抗体を再酸化剤の制限量で処理することと；薬物を鎖間チオールに結合体化することとを含む。再酸化剤は例えば、５，５’−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸、４，４’−ジチオジピリジン、２，２’−ジチオジピリジン、テトラチオン酸ナトリウムまたはヨードソ安息香酸であり得る。薬物は例えば、細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬あるいは免疫抑制剤であり得る。一部の例では、薬物は副溝バインダ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥまたはＡＦＰであり得る。還元剤は例えば、ＤＴＴまたはＴＣＥＰであり得る。
【００１８】
関連する実施形態において、抗体鎖間ジスルフィド結合を還元して、薬物を生じた鎖間チオールに結合させて、抗体上に薬物配置の選択性を生じさせる方法が提供される。該方法は一般に、鎖間チオールを形成するために抗体を還元剤によって完全に還元することと；少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を再形成するために、抗体を再酸化剤で部分的に再酸化することと；薬物を鎖間チオールに結合させることとを含む。再酸化剤は例えば、５，５’−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸、４，４’−ジチオジピリジン、２，２’−ジチオジピリジン、テトラチオン酸ナトリウム、またはヨードソ安息香酸であり得る。還元剤例えば、ＤＴＴまたはＴＣＥＰであり得る。薬物は例えばＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、またはＡＦＰであり得る。部分的に再酸化された抗体は必要に応じて、結合体化前に精製され得る。
【００１９】
なお他の関連する実施形態において、抗体鎖間ジスルフィド結合を還元して、薬物を生じた鎖間チオールに結合させて、薬物を抗体上に選択的に配置する方法が提供される。該方法は一般に、少なくとも２個の鎖間チオールを形成するために、抗体を還元剤によって部分還元することと；部分的に還元された抗体の鎖間チオールに結合体化させることとを含む。１つの例では、抗体は制限濃度の還元剤によって、キレート剤を含む緩衝液中で部分的に還元される。該薬物は、例えば抗体溶液を冷却して、薬物を冷溶媒に溶解させ、抗体溶液と混合することによって結合体化できる。抗体および薬物溶液は、１個または複数の部分的に付加された抗体−薬物結合体を形成するのに十分な期間に渡ってインキュベートされる。反応は、過剰な薬物をチオール含有試薬によってクエンチさせることによってクエンチできる。結合体はさらに精製できる。具体的な例において、抗体は約３７℃にて約１時間、部分的に還元される。還元された抗体は例えば約０℃まで冷却することができる。抗体および薬物溶液は例えば、約０℃にて３０分間インキュベートできる。
【００２０】
チオール含有試薬は例えば、システインまたはＮ−アセチルシステインであり得る。還元剤は例えばＤＴＴまたはＴＣＥＰであり得る。緩衝液は例えばホウ酸ナトリウム溶液でもよく、キレート剤はジエチレントリアミン五酢酸である。キレート剤例えば、エチレントリアミン五酢酸またはＥＤＴＡでもあり得る。溶媒は例えば、アセトニトリル、アルコールまたはＤＭＳＯであり得る。薬物は例えば、細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬であり得る。
【００２１】
一部の実施形態において、還元された抗体は結合体化前に例えばカラムクロマトグラフィー、透析、またはダイアフィルトレーションを使用して精製できる。カラムクロマトグラフィーで使用されるカラムは例えば、ＰＤ−１０カラムなどの脱塩カラムであり得る。あるいは還元抗体は、部分的還元後および結合体化前に精製されない。
【００２２】
結合体は例えばカラムクロマトグラフィー、透析、またはダイアフィルトレーションを使用して精製できる。カラムクロマトグラフィーで使用されるカラムは、例えば脱塩カラム、例えばＰＤ−１０カラムであり得る。
【００２３】
なお別の実施形態において、薬物の選択的結合体化によって抗体を産生する方法が提供される。該方法は一般に、例えばＤＴＮＢ滴定によって決定されるように、大幅に過剰の還元剤を添加して、溶液を約３７℃にて約３０分間インキュベートすることによって、鎖間チオールを産生するのに十分な時間抗体を完全に還元することと；抗体を精製することと；酸化剤を使用して抗体を部分的に再酸化し、還元された抗体を０℃に冷却することによって、少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合を形成することと；還元および冷却された抗体を酸化剤１．５〜２．５モル当量で処理することと；反転により溶液を混合することと；約０℃にて約１０分間インキュベートすることによって、抗体を部分的に再酸化することと；部分的に再酸化された抗体を精製することと；結合体化抗体を作成するために、部分的に再酸化された抗体の鎖間チオールに薬物を結合させることと；結合体化抗体を精製することとを含む。
【００２４】
還元剤は例えば、ＤＴＴまたはＴＣＥＰであり得る。部分還元抗体は必要に応じて、例えばカラムクロマトグラフィー、透析、またはダイアフィルトレーションを使用して精製できる。カラムクロマトグラフィーで使用されるカラムは例えば、ＰＤ−１０カラムなどの脱塩カラムであり得る。結合体化抗体は例えば、カラムクロマトグラフィー、透析、またはダイアフィルトレーションを使用して精製できる。カラムクロマトグラフィーで使用されるカラムは例えば、ＰＤ−１０カラムなどの脱塩カラムであり得る。再酸化剤は例えば、５，５’−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸、４，４’−ジチオジピリジン、２，２’−ジチオジピリジン、テトラチオン酸ナトリウム、またはヨードソ安息香酸であり得る。
【００２５】
本発明は、添付図面と併せて、以下の特定の実施形態の詳細な説明を参照することによっても最もよく理解されるで。以下の議論は説明的、例証的、例示的であり、添付の特許請求の範囲によって規定される範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（詳細な説明）
開示を明瞭にするために、そして制限するためでなく、本発明の詳細な説明は、以下に続く小節に分割する。
【００２７】
（Ｉ．定義）
そうでないと定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および化学用語は、記載する方法および組成物に関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および表現は、そうでないと規定しない限り、それらに与えられた意味を有する。
【００２８】
「薬物」という用語は本明細書で使用される場合、例えば薬学的化合物、治療化合物、または薬理化合物を含む、元素、化合物、薬剤、または分子実体を意味する。薬物は、天然または合成あるいはその組合せであり得る。「治療薬」は、治療（例えば有益な）効果を癌細胞または免疫細胞（例えば活性化免疫細胞）に単独で、または他の因子との組合せ（例えばプロドラッグと組合されたプロドラッグ変換酵素）のどちらかで作用させる薬剤である。通例、本明細書で述べるおよび方法および組成物によって有用な治療薬は、細胞毒性、細胞増殖抑制、または免疫抑制効果を作用させる薬物である。ある実施形態において、薬物は放射性元素ではない。
【００２９】
「細胞毒性薬」は薬剤の細胞に対する効果に関して、細胞を殺すことを意味する。
【００３０】
「細胞増殖抑制薬」は、細胞増殖の阻害を意味する。
【００３１】
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーおよびその同等物を指し、特定の長さの生成物を指すものではない；それゆえ「ペプチド」および「タンパク質」は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。ポリペプチドの定義の中には、本明細書で定義された「抗体」も含まれる。「ポリペプチド領域」はポリペプチドのセグメントを指し、そのセグメントは例えば、１個以上のドメインまたはモチーフを含有できる（例えば抗体のポリペプチド領域は、例えば１個以上のＣＤＲを含有できる）。「フラグメント」という用語は、通例、ポリペプチドの少なくとも２０個の連続または少なくとも５０個の連続アミノ酸を有するポリペプチドの部分を指す。「誘導体」は、第２のポリペプチドに対して保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドまたはそのフラグメント；あるいは第２の分子の共有付加によって、例えば非相同ポリペプチドの付加によって、またはグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化などによって修飾されたポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。さらに、例えばアミノ酸（例えば非天然アミノ酸など）の１個以上のアナログを含有するポリペプチドアナログ、非置換連鎖を有するポリペプチド、ならびに天然および非天然の両方の、当該分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。ポリペプチドアナログは例えば、タンパク質模倣物およびボンベシンを含む。
【００３２】
「抗体」という用語は本明細書で使用される場合（ａ）免疫グロブリンポリペプチドおよび免疫グロブリンポリペプチドの免疫活性部分、すなわち特異的抗原へ免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する、免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、またはそのフラグメント、あるいは（ｂ）抗原へ免疫特異的に結合する、そのような免疫グロブリンポリペプチドまたはフラグメントの保存的に置換された誘導体を指す。抗体は一般に、例えばＨａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）に記載されている。
【００３３】
「抗体誘導体」という用語は本明細書で使用される場合、非相同分子の共有付加によって、例えば非相同ポリペプチドの付加によって、あるいは通常は抗体と関連付けられないグリコシル化、アセチル化またはホスホリル化などによって修飾された、上で定義したような抗体を意味する。
【００３４】
「モノクローナル抗体」という用語は、それが産生される方法ではなく、いずれかの真核または原核細胞クローン、あるいはファージクローンを含む単細胞クローンに由来する抗体を指す。それゆえ「モノクローナル抗体」という用語は本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。
【００３５】
「鎖間ジスルフィド結合」という用語は抗体の文脈において、２個の重鎖間の、または重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を指す。
【００３６】
「鎖間チオール」という用語は、鎖間ジスルフィド結合の形成に関与し得る抗体重鎖または軽鎖のチオール基を指す。
【００３７】
タンパク質は、特定の種類のおよび／または同様の反応性の結合箇所すべてが薬物に結合され、タンパク質−薬物結合体の均質な個体群を生じる場合に、「完全付加」と呼ばれる。タンパク質は、特定の種類および／または同様の反応性の考えられる結合箇所の一部のみが薬物に結合され、タンパク質−薬物結合体のある異性体または複数の異性体の生成をもたらす場合に、「部分付加」と呼ばれる。
【００３８】
「単離された」という用語は、分子または高分子（例えば抗体）の文脈において、その自然環境の成分から同定ならびに分離および／または回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、分子の所望の用途（例えば診断または治療）を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性溶質を含み得る。一部の実施形態において、単離された分子または高分子は、（１）例えばＬｏｗｒｙまたはＢｒａｄｆｏｒｄ法によって決定されたような分子または高分子の重量の９５％超まで、または９９％超まで、（２）スピニングカップ・シークエネータの使用により、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーまたは好ましくは、銀染色を使用する還元または非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質となるまで精製される。単離された分子および高分子が組換え細胞内に分子および高分子をインサイチュで含むのは、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからであろう。しかし通常は、単離抗体は少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００３９】
略語「ＡＦＰ」は、すぐ下に示す一般式を有するジメチルバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロイン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミンを指す：
【００４０】
【化１】
2008500961.tif 000003
。
【００４１】
略語「ＭＭＡＥ」は、すぐ下に示す一般式を有するモノメチルオーリスタチンＥを指す：
【００４２】
【化２】
2008500961.tif 000004
。
【００４３】
略語「ＭＭＡＦ」は、すぐ下に示す一般式を有するドバリン−バリン−ドライソロイニン−ドラプロイン−フェニルアラニンを指す：
【００４４】
【化３】
2008500961.tif 000005
。
【００４５】
略語「ＡＥＢ」は、オーリスタチンＥにパラアセチル安息香酸を反応させることによって生成されるエステルを指す。略語「ＡＥＶＢ」は、オーリスタチンＥにベンゾイル吉草酸を反応させることによって生成されるエステルを指す。
【００４６】
「薬学的に受容可能な塩」は本明細書で使用されるように、分子または高分子の薬学的に受容可能な有機または無機塩を指す。酸付加塩は、アミノ基によって形成され得る。塩の例としては、これに限定されるわけではないが、サルフェート、シトレート、アセテート、オキサラート、クロライド、ブロミド、ヨージド、ニトレート、ビスルフェート、ホスフェート、酸ホスフェート、イソニコチナート、ラクテート、サリチラート、酸シトレート、タートレート、オレアート、タンナート、パントテナート、バイタートレート、アスコルベート、スクシナート、マレアート、ゲンチシナート、フマレート、グルコナート、グルクロナート、サッカラート、ホルメート、ベンゾアート、グルタメート、メタンスルホナート、エタンスルホナート、ベンゼンスルホナート、ｐ−トルエンスルホナート、およびパモアート（すなわち１，１’メチレンビス−（２−ヒドロキシ３−ナフトアート））塩が挙げられる。薬学的に受容可能な塩は、アセテートイオン、スクシナートイオンまたは他の対イオンなどの、別のイオンの包含も含む。対イオンは、親化合物上に電荷を安定させるいずれかの有機または無機部分でもよい。さらに薬学的に受容可能な塩は、その構造内に１個を超える荷電原子を有してもよい。複数の荷電原子が薬学的に受容可能な塩の一部である例は、複数の対イオンを有することができる。それゆえ薬学的に受容可能な塩は、１個以上の荷電原子および／または１個以上の対イオンを有することができる。
【００４７】
「薬学的に受容可能な溶媒和物」または「溶媒和物」は、１個以上の溶媒分子および分子または高分子の会合を指す。薬学的に受容可能な溶媒和物を形成する溶媒の例としては、これに限定されるわけではないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、エチルアセテート、酢酸、およびエタノールアミンが挙げられる。
【００４８】
（ＩＩ．ポリペプチド、タンパク質、抗体）
本発明は、タンパク質−薬物結合体およびタンパク質−薬物結合体を作成する方法を提供する。薬物を受容するための結合箇所を有するタンパク質も提供される。タンパク質−薬物結合体は治療に、診断に（例えばインビトロまたはインビボで）、インビボ撮像に、そして他の用途に使用され得る。
【００４９】
抗体、酵素、グリコシル化タンパク質、レクチン、種々の生物学的レセプター、タンパク質ホルモン、および結合パートナーに対する結合剤として作用できる他のタンパク質を含む、タンパク質の種々のクラスが結合体化され得る。タンパク質は、少なくとも１個の反応部位、例えばジスルフィド結合、アミノ基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を含み、そこで薬物のタンパク質への結合体化が起こり得る。
【００５０】
反応部位は、化学反応または手段によって接近可能であり、活性化可能である。一部の実施形態において、結合体化目的で化学的に活性化されるタンパク質は、タンパク質の所期の用途に必須ではないジスルフィド結合を含有するタンパク質、および／またはタンパク質を妨害しないタンパク質（例えばこれに限定されるわけではないが、タンパク質の分解を引き起こす、または結合や他の機能（例えばエフェクタ機能）を妨害する）である。そのようなタンパク質では、ジスルフィド結合は、２個のシステイン残基のチオール（−−ＳＨ）側基の酸化の結果として存在し得る。これらの残基は、別のポリペプチド鎖上に、または同じポリペプチド鎖上に存在する。酸化の結果として、ジスルフィド結合（−−Ｓ−−Ｓ−−）は、元のシステイン残基のベータ炭素間に形成される。還元後、残基は互換的にハーフシステインおよびシステインと呼ばれることが多い。ジスルフィド結合の還元剤による処理は、ジスルフィド結合の還元的開裂を引き起こして、遊離チオール基を残す。ジスルフィド結合を含有するタンパク質の例としては、抗体、多くの酵素、特定のホルモン、および特定のレセプターが挙げられる。
【００５１】
一部の実施形態において、ジスルフィド結合は自然発生的であり得る。一部の実施形態において、スルフヒドリル基もタンパク質（例えば抗体）内に化学的に導入され得る。スルフヒドリル基を導入するための適切な方法は、化学的手段（例えば２−ＩＴなどのチオール化剤を使用して）、または組換えＤＮＡ技術を使用することを含む。例えばシステイン残基は、タンパク質をコードする核酸の突然変異誘発によって、タンパク質中に導入できる。一般に、参考として本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照のこと。スルフヒドリル基は、タンパク質中に、例えばポリペプチド内に、またはカルボキシ末端に導入され得る。
【００５２】
一部の実施形態において、タンパク質は抗体である。そのような抗体は、インビトロまたはインビボ診断、インビボ撮像、あるいは特有の抗原に関する疾患または状態の治療に使用できる。抗体構造の基本単位は、非共有結合と、ジスルフィド結合との両方によって共に結合された、４個のポリペプチド−−２個の同じ低分子量（「軽」）鎖および２個の同じ高分子量（「重」）鎖の複合体である。異なる抗体が、これらの基本単位の１〜５個のいずれかに位置するであろう。抗体は、図式的に「Ｙ」として表される。「Ｙ」の各分岐は、重鎖のアミノ末端部と結合した軽鎖によって形成される。「Ｙ」の基部は、２つの重鎖のカルボキシ末端部によって形成される。「Ｙ」の節はヒンジ領域と呼ばれる。
【００５３】
５つのヒト抗体クラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）、およびこれらのクラス内の種々のサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または免疫グロブリン分子のサブクラスは、構造の差異、例えば１個の抗体分子中の免疫グロブリン単位の数、個々の単位のジスルフィドブリッジ構造、ならびに鎖長および配列の差異に基づいて認識される。抗体のクラスおよびサブクラスは、そのアイソタイプである。
【００５４】
抗体は、インタクトな抗体または抗原結合抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ鎖、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのどちらかを含むフラグメント、あるいはＦａｂ発現ライブラリによって産生されたフラグメントであり得る。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、あるいは以下の実体または部分と組合せて含むことができる：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびＣＬドメイン。また抗原結合フラグメントは、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびＣＬドメインとのいずれの組合せも含むことができる。一部の実施形態において、抗体フラグメントは、鎖間ジスルフィド結合を含む少なくとも１つのドメイン、またはドメインの部分を含む。
【００５５】
通例、抗体はヒト、げっ歯類（例えばマウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ科の哺乳類、ウマ、またはニワトリの抗体である。本明細書で使用される場合「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、以下に、そして例えば米国特許第５，９３９，５９８号および同第６，１１１，１６６号に述べるように、ヒト免疫グロブリンライブラリから、ヒトＢ細胞から、または１個以上のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組換えされた動物から単離された抗体を含む。抗体は単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより多くの多重特異性であり得る。
【００５６】
一部の実施形態において、定常ドメインはエフェクター機能を有する。「抗体エフェクター機能」またはＡＥＣという用語は本明細書で使用される場合、ＩｇのＦｃドメインが寄与する機能を指す。そのような機能は例えばＦｃエフェクタードメインの、食細胞または溶解活性を備えた免疫細胞上のＦｃレセプターへの結合によって、またはＦｃエフェクタードメインの補体系の成分への結合によって影響され得る。通例、Ｆｃ結合細胞または補体成分によって仲介される効果は、ＣＤ７０標的細胞の阻害および／または消耗を引き起こす。エフェクター機能は例えば、「抗体依存性細胞毒性」またはＡＤＣＣ、「抗体依存性細胞食作用」またはＡＤＣＰ、「補体依存性細胞毒性」またはＣＤＣであり得る。他の実施形態において、定常ドメインは１つ以上のエフェクター機能を欠いている。
【００５７】
抗体は、目的の抗原、例えば医療的および／または治療的目的の抗原に対して産生され得る。例えば抗原は、病原体（これに限定されるわけではないが、ウィルス、細菌、真菌、および原虫など）、寄生虫、腫瘍細胞、または特定の医学的状態と関連付けられる抗原であり得る。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の場合、癌は、免疫系、肺、結腸、直腸、乳房、卵巣、前立腺、頭部、頸部、骨、または他のいずれかの解剖学的位置の癌であり得る。目的の抗原はこれに限定されるわけではないが、ＣＤ３０、ＣＤ４０、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、およびＣＤ７０を含む。一部の実施形態において、抗原はＣＤ２、Ｄ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＥＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−Ｄｒ１０、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、Ｌ６、Ｌｅｗｉｓ  Ｘ、アルファフェトタンパク質、ＣＡ２４２、胎盤アルカリフォスファターゼ、前立腺特異的抗原、前立腺酸ホスファターゼ、上皮増殖因子、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、抗トランスフェリンレセプター、ｐ９７、ＭＵＣ１−ＫＬＨ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、ＩＬ−２レセプター、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ムチン、Ｐ２１、ＭＰＧ、およびＮｅｕ癌遺伝子産物である。
【００５８】
一部の有用な特異的抗体は、これに限定されるわけではないが、ＢＲ９６  ｍＡｂ（Ｔｒａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：２１２−２１５）、ＢＲ６４（Ｔｒａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７：１００−１０５）、ＣＤ４０抗原に対するｍＡｂ、例えばＳ２Ｃ６  ｍＡｂ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３２２５−３２３１）、およびＣＤ３０抗原に対するｍＡｂ、例えばＡＣ１０（Ｂｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５８９６−５９０６）を含む。腫瘍特異的抗原に結合する他の多くの内部移行抗体が使用され得、概説されてきた（例えばＦｒａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１５：４５９−７６；Ｍｕｒｒａｙ（２０００），Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２７：６４−７０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８を参照）。これらの参考文献の開示は、参照により本明細書に援用されている。
【００５９】
「腫瘍特異的抗原」という用語は本明細書で使用される場合、特定の腫瘍に特有の、またはそのような腫瘍に強い相関関係のある抗原を示すことが理解されるであろう。しかしながら、腫瘍特異的抗原は腫瘍組織に必ずしも特有でなく、しかしながら、すなわち、それらに対するその抗体は、正常組織の抗原と交差反応することがある。腫瘍特異的抗原が腫瘍細胞にとって特有でない場合、実際問題として、腫瘍特異的抗原に結合する抗体が交差反応による不当なリスクまたは妨害なしに所望の手順を実施するために、腫瘍細胞にとって十分に特異的であることが高い頻度で起こる。多くの因子がこの実際的な特異性に寄与している。例えば腫瘍細胞上の抗原の量は、正常細胞上で見出される交差反応抗原の量を大きく超えるか、または腫瘍細胞上の抗原は、より効果的に提示されうる。したがって「腫瘍特異的抗原」という用語は本明細書では、実際的に有用な特異性に関し、絶対的な特異性を表したり、または抗原が腫瘍に特有であることを示したりするものではない。
【００６０】
抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。被験体がヒト被験体である場合、抗体は抗原に対する有用な免疫反応を開始できるいずれかの動物を免疫化することによって得られ得る。動物はマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウサギまたは他の適切な実験動物であり得る。抗原は、天然の免疫原、またはハプテンおよび免疫原性キャリアの合成免疫原性結合体の形で提示できる。モノクローナル抗体の場合、免疫化動物の抗体産生細胞は、抗体を産生するハイブリドーマを得るために、「不死」または「不死化」ヒトまたは動物細胞と融合することができる。所望ならば、免疫グロブリン鎖の１個以上をコードする遺伝子は、抗体が種々の宿主細胞で産生できるようにクローニングすることができ、所望ならば、産生される抗体の配列、およびそれゆえ免疫的特性を変化させるために、遺伝子を突然変異させることができる。ヒトモノクローナル抗体は、当該分野で公知の多数の技術のいずれかによって産生できる（例えばＴｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８０，７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２−７９；およびＯｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２，３−１６）。
【００６１】
抗体は、例えば当業者に周知の技術で産生されたネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。標準組換えＤＮＡ技術を使用して産生できる、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含む組換え抗体、例えばキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、有用な抗体である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えばマウスモノクローナルに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子である（例えば参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号を参照のこと）。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する非ヒト種からの抗体分子である（例えば参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｑｕｅｅｎ，米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。そのようなキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術、例えば国際公開第８７／０２６７１号；欧州特許出願公開第１８４，１８７号；欧州特許出願公開第１７１４９６号；欧州特許出願公開第１７３４９４号；国際公開第８６／０１５３３号；欧州特許出願公開第１２，０２３号；Ｂｅｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，２２５，５３９；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に述べられている方法を使用して産生可能であり、そのそれぞれが参考として全体が本明細書に援用されている。
【００６２】
完全ヒト抗体は例えば、内在性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用して産生できる。トランスジェニックマウスは、選択した抗原またはその部分を用いて通常の方法で免疫化される。抗原に対して産生されたモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスに含まれるヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配列し、続いてクラス転換および体細胞突然変異を受ける。それゆえそのような技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を産生することができる。ヒト抗体を産生するこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術ならびにそのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば米国特許第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号を参照のこと（そのそれぞれは参考としてその全体が本明細書に援用される）。他のヒト抗体は、例えばＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（フリーモント、カリフォルニア州）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（サンノゼ、カリフォルニア州）から市販され得る。
【００６３】
選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体も、「誘導選択」と呼ばれる技術を使用して産生できる。本手法において、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導するために、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体が使用される。例えばＪｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３を参照のこと。ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリ（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１；ＱｕａｎおよびＣａｒｔｅｒ（２００２），”Ｔｈｅ  ｒｉｓｅ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．”Ａｎｔｉ−ＩｇＥ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊａｒｄｉｅｕ，Ｐ．Ｍ．およびＦｉｃｋ  Ｊｒ．，Ｒ．Ｂ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２０，ｐｐ．４２７−４６９を含む、当該分野で公知の種々の技術を使用しても産生できる。
【００６４】
抗体は二重特異性抗体でもよい。二重特異性抗体を産生する方法は、当該分野で公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の同時発現に基づいている（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１個のみが正しい二重特異性構造を有する、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成する。同様の手順が国際公開第９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９に開示されている。
【００６５】
異なる手法に従って、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を備えた抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は好ましくは、ヒンジＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインによってである。融合物の少なくとも１個に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードする配列を含む核酸、そして所望ならば、免疫グロブリン軽鎖は、独立した発現ベクター内に挿入され、適切な宿主生物内に同時形質移入される。これは、構築で使用された３個のポリペプチド鎖の不等比が最適な収率を与えるときに、実施形態において３個のポリペプチドフラグメントの相互比を調整するために高い柔軟性を提供する。しかしながら、等しい比での少なくとも２個のポリペプチド鎖の発現が高い収率を生じるときに、または比が特に重要でないときに、２個または３個すべてのポリペプチド鎖のコード配列を１個の発現ベクターに挿入することが可能である。
【００６６】
この手法の実施形態において、二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を備えたハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）を有する。二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が、容易な分離方法を提供するため（国際公開第９４／０４６９０号（参照としてその全体が本明細書に援用される））、この非対称構造は、所望の二重特異性化合物の、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの分離を促進する。
【００６７】
二重特異性抗体を産生するためのさらなる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１：６９５４−６９６１；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６３−４７０；Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：６７７−６８１を参照のこと。そのような技術を使用して、二重特異性抗体は、疾患の処置または防止への使用のために調製できる。
【００６８】
二重特異性抗体は、欧州特許第０  １０５  ３６０号にも開示されている。この参考文献に開示されているように、ハイブリッドまたは二重特異性抗体は、生物的に、すなわち細胞融合技術によって、または化学的に、特に架橋剤またはジスルフィドブリッジ形成試薬を用いてのどちらかで誘導可能であり、抗体全体またはそのフラグメントを含みうる。そのようなハイブリッド抗体を得るための方法は例えば、国際公開第８３／０３６７９号、および欧州特許第０  ２１７  ５７７号に開示されており、その両方とも参考としてその全体が本明細書中に援用される。
【００６９】
他の実施形態において、抗体は、抗体の融合タンパク質、またはその機能活性フラグメントであり、例えばその中で抗体は共有結合（例えばペプチド結合）を介して、Ｎ末端またはＣ末端のどちらかにて抗体でない別のタンパク質（またはその部分、好ましくはタンパク質の少なくとも１０、２０または５０アミノ酸部分）のアミノ酸配列に融合される。好ましくは、抗体またはそのフラグメントは、他のタンパク質に定常ドメインのＮ末端にて共有結合される。
【００７０】
なお他の実施形態において、タンパク質は、必要に応じてヒンジ領域を含む抗体重鎖および／または軽鎖定常領域ドメインへ共有結合を介して融合された非抗体分子の結合部分の融合タンパク質であり得る。そのような融合タンパク質は必要に応じて、少なくとも１つの、通例少なくとも２個の鎖間ジスルフィド結合を含むことができる。例えば融合タンパク質は、ＣＨ１およびＣＬ領域、ならびにヒンジ領域を含むことができる。
【００７１】
（ＩＩＩ．活性化方法）
一般に、薬物は活性化部位においてタンパク質または他の適切な分子へ結合され得る。適切な活性化部位としては、チオール基、アミノ基（例えばリジン残基のイプシロンアミノ基またはタンパク質のＮ末端にて）、隣接ヒドロキシル基（１，２−ジオール）（例えば酸化炭水化物）およびカルボキシル基（例えばタンパク質のＣ末端、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基、および炭水化物、例えばシアル酸）などの結合箇所が挙げられる。
【００７２】
薬物は結合箇所に直接結合され得る。例えば薬物は、抗体リジンのε−アミノ基のアルキル化、酸化炭水化物の還元的アミノ化またはヒドラジドとの反応、ヒドロキシル基およびカルボキシル基間のトランスエステル化、アミノ基またはカルボキシル基におけるアミド化、チオール（例えば鎖間チオール）または導入されたチオールへの結合体化、例えばリジンの２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）によるアルキル化によって結合体化することができる。薬物を結合箇所に結合体化する適切な方法は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．），Ｃｈａｐｔｅｒ  １５（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（その開示は、参考としてその全体が本明細書に援用される）に開示されている。
【００７３】
薬物は、別の分子、例えばリンカーを介して間接的に結合させることもできる。例えば薬物は、例えばこれに限定されるわけではないが、抗体のヒンジ領域内においてスルフヒドリル基に結合されたマレイミド基を介して結合体化させることもできる。抗体結合体は、薬物のマレイミド誘導形態に抗体を反応させることによって生成できる。さらに詳細には、抗体結合体は、還元された抗体を産生するために抗体を還元して、アミン薬物を生成し、マレイミド誘導体化薬物を生成するためにアミン薬物をマレイミドによって誘導体化して、マレイミド誘導体化薬物に抗体を反応させることによって生成できる。
【００７４】
例示的な実施形態において、ＩｇＧ１、例えばｃＡＣ１０は多数のジスルフィド結合を所有し、そのわずか４個が鎖間である。４個の鎖間ジスルフィド結合が高度に柔軟性のヒンジ領域に密集し、他の（鎖内）ジスルフィド結合よりはるかに溶媒に接近しやすいため、過剰の例えば還元剤、例えばこれに限定されるわけではないがジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または２−メルカプトエタノールによる還元が４個すべての結合を切断して、８個のシステインを生成する（すなわち遊離チオール基を含有する）。８個すべてのシステインと薬物−リンカーとの結合は、図７に示すように、抗体に付き約８個の薬物を持つ完全付加結合体を生成する。
【００７５】
本発明は驚くべきことに、ＡＤＣの生物特性を抗体当たり平均２、２．５、４または６個の薬物を持つ抗体によって改善可能であり、このことが完全付加結合体、すなわち抗体当たり８個の薬物を持つ結合体の有効性を維持しながら、より低い毒性を生じることを実証する。部分薬物付加結合体の治療濃度域（最低有効用量によって分けられた、毒性が最初に見られる薬物−抗体結合体の濃度）は、８個の薬剤を持つ抗体よりも大きい。８個のシステインに４個の薬物を結合体化させて、多数の潜在的な薬物付加種を生じさせる方法が多数ある（合計９種類、抗体当たり０〜８個の薬物、図１〜７を参照のこと）。４個の薬物を持つ抗体では、４個の薬物を配置するための考えられる方法が６つあり、６個の異性体が生じる（図１および７を参照のこと）。抗体当たり４個の薬物が所望されるときには、８個の薬物が付加された種の均質性は失われる。抗体当たり２または６個の薬物では、薬物を分子に配置するために考えられる方法が３つある。
【００７６】
部分的に付加されたＡＤＣを産生する方法（例えば抗体当たり８個の薬物ではなく４個で（Ｅ４））としては、以下が挙げられる：方法１（「部分還元」）これに限定されるわけではないがＤＴＴまたはＴＣＥＰなどの還元剤による抗体の部分還元と、それに続く結合体化、および方法２（「完全還元および再酸化」）これに限定されるわけではないがＤＴＴまたはＴＣＥＰなどの還元剤におる抗体の完全還元と、それに続く、再酸化剤（例えばこれに限定されるわけではないが５，５’−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、４，４’−ジチオジピリジン、２，２’−ジチオジピリジン、テトラチオン酸ナトリウム、またはヨードソ安息香酸）による抗体の部分再酸化、そして最終的な結合体化。完全還元および再酸化方法では、２つの局面がある：２ａ、ＤＴＮＢ再酸化後の精製、および２ｂ、ＤＴＮＢ再酸化後の精製なし（ワンポット再酸化および薬物結合）。これらの方法は、異なる種の異なる割合（例えばＥ４では、２５〜４０％）を生じ、考えられる種の異なる異性体混合物も生じる。開示には、当業者に公知である上の方法のハイブリッドおよびバリエーションが含まれる。
【００７７】
抗体薬物結合体の一例として、図１は、結合反応中に産生できる６つの考えられるＥ４種（４Ａ〜４Ｆ種と呼ばれる）を示す。種４Ａ〜Ｄは、特定の分析方法によって個別に区別できない；しかしながらそれらは、４Ｅおよび４Ｆから区別できる。
【００７８】
部分還元の方法１の１つの実施形態において、例えば抗体当たり４個の薬物を持つ結合体は、例えばこれに限定されるわけではないがＤＴＴによる抗体の完全還元によって産生可能であり、８個の抗体システインを生じて、４個の薬物同等物への結合体化が続く。これは、抗体が０〜８個の薬物を有する混合物を生じさせる。あるいは４個のジスルフィドのうち平均２個のみが還元されるように（４個のシステインを遊離する）抗体が例えば制限量のＤＴＴによって還元され、完全薬物結合体化が続く場合、偶数の薬物が付加された種（抗体当たり０、２、４、６、および８個の薬物）のみが形成される。このことにより、混合物の複雑さが低減され、これは異なる薬物付加種を単離するための精製によってさらに低減することができる。
【００７９】
一部の実施形態において、タンパク質上のある潜在的な結合箇所は選択的に活性化され得る。この選択的活性化は、タンパク質への薬物の結合部位の即時の割当てを可能にする。例えば制限量の強力な還元剤ＤＴＴまたはＴＣＥＰによる抗体（例えばｃＡＣ１０）の処理は、重鎖−軽鎖ジスルフィドの選択的還元を生じさせる。別の例では、抗体の完全ＤＴＴ還元と、それに続くＤＴＮＢなどの強力なチオール酸化剤を使用する部分再酸化は、重鎖−軽鎖ヒンジジスルフィドの選択的再酸化を引き起こして、主に、ヒンジ領域の重鎖に結合した薬剤を生じさせる。これらの方法の両方によって産生されたＥ２およびＥ６の異性体個体群は、９０％の異性体均質性に到達し得る。
【００８０】
薬物の抗体への結合体化後、結合体化された薬物−抗体種を分離され得る。一部の実施形態において、結合した抗体種は、抗体、薬物および／または結合体の特徴に基づいて分離できる。例えば疎水性相互作用クロマトグラフ（ＨＩＣ）は、抗体当たり０、２、４、６、および８個の薬物に相当する種を単離および分離することに成功している。方法１によるこれらの薬物付加異性体それぞれの収率は、統計的分布によって予想される収率に近い。４個の薬物が付加された種は通例、全物質の３０％である。
【００８１】
薬物付加および抗体上の薬物の位置を判定するための分析方法が開発されてきた（以下も参照のこと）。部分ＤＴＴ還元によって調製した純粋な４個の薬物を付加した結合体の、バイオアナライザ（キャピラリー電気泳動）および架橋ジビニルベンゼンカラム（ＰＬＲＰ）でのＨＰＬＣによるキャラクタリゼーションは、薬物は主に、抗体の重鎖と軽鎖との間に最初にジスルフィドを生成したシステイン上に位置することを明らかにした。従来とは異なり、１つの異性体が他の５つの異性体よりも有利である薬物位置の特異性は、予想外である。
【００８２】
別の実施形態の、方法２、例えば４個の薬物を持つ薬物−抗体結合体を調製するための部分再酸化による完全還元において、抗体は、例えばこれに限定されるわけではないが、ＤＴＴによって完全に還元され、次に４個の抗体システインチオールが残るようにジスルフィドの一部を再形成するために、制限量の、例えばこれに限定されるわけではないがＤＴＮＢによって処理された。これらのシステインは薬物に結合体化され、本明細書で述べる方法によって分析された。混合物中の４つの薬物が付加された抗体の収率は４０％にも上昇し、いったん精製すると、薬物の位置は、ヒンジ領域において重鎖間で最初にジスルフィドを生成したシステイン上への配置が好都合であった。一般的な慣例と比較した、４個の薬物を付加した抗体の収率および選択性はどちらも、ある部分還元方法による異なる異性体に有利であり、予想外であった。種々の化学的方法を使用すると、抗体内の薬物位置は、異なる異性体の産生のために容易に割当てることができる。
【００８３】
還元が制限量の還元剤の添加によって制御され、抗体当たり平均して４個未満の鎖間ジスルフィド結合が破壊される部分還元が起こる。４個の鎖間ジスルフィド結合すべてが高度に露出されているため、還元は種々の経路によって進行し、０、２、４、６、または８個のシステインを持つ種の混合物からなる部分還元抗体を生成する。したがって部分還元抗体の結合は、図１および７に示すように、抗体当たり０、２、４、６、または８個の薬物を持つ結合体の混合物を生成できる。部分還元の程度に応じて、薬物付加分布（すなわち０、２、４、６、または８薬物付加種のパーセント）が変化する。
【００８４】
部分還元は、抗体当たり可変数の薬物を持つ種を含有する混合物を生成するだけでなく、複数の場所の薬物付着の結果として、さらなる不均一性も生じさせる。図７は、２、４、および６薬物付加種が考えられる異性体が２個以上あることを示している。
【００８５】
薬物のタンパク質への結合後、結合された薬物−タンパク質種は分離され得る。例えば一部の実施形態において、結合した抗体種は、抗体、薬物および／または結合体の特徴に基づいて分離できる。例えば疎水性相互作用クロマトグラフ（ＨＩＣ）は、抗体当たり０、２、４、６、および８薬物に相当する種を単離および分離することに成功している。
【００８６】
（ＩＶ．分析方法）
結合体の収率および異性体混合物を決定するために、種々の分析方法が使用され得る。例えば１つの実施形態において、ＨＩＣは、生じた結合体（例えばＥ４結合体について）からの収率および異性体混合物を決定するために使用される分析方法である。この技術は、可変数の薬物を付加した抗体を分離することができる。薬物付加レベルは、例えば２５０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度の比に基づいて決定することができる。例えば薬物が２５０ｎｍで吸収し、一方抗体が２８０ｍｍで吸収し得る場合。したがって２５０／２８０比は、薬物付加と共に上昇する。本明細書で述べた結合体化方法を使用して、一般に偶数の薬物を持つ抗体は、ジスルフィドの還元が偶数の遊離システインチオールを生じるため、抗体に結合されることが観察された。図２および３は、方法２ａおよび２ｂによってそれぞれ生成されたｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥのＨＩＣ分離を示す。図４は、方法１からと同様に、これらのクロマトグラムからの種々の置換についてのパーセント組成を示す。方法１は約３０％のＥ４を生じるが、方法２ｂは約４０％のＥ４を生じる。
【００８７】
ＨＩＣは、置換レベルの混合物からＥ４を精製するために、ミリグラム〜グラムレベルにて分取的に使用することもできる。図３による純Ｅ４（表示された３４〜３８分の収集時間）を得て、２つの方法によって分析して、異性体Ｅ４混合物を決定した。最初に、非共有相互作用を変性させ、タンパク質質量に基づいて分離するＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザを使用して、溶出順に以下の抗体成分を得た：軽鎖（Ｌ）、重鎖（Ｈ）、重鎖−軽鎖（ＨＬ）、重鎖−重鎖（ＨＨ）、重鎖−重鎖−軽鎖（ＨＨＬ）、および重鎖−重鎖−軽鎖−軽鎖（ＨＨＬＬ）。ジスルフィドが還元され、遊離チオールがｖｃＭＭＡＥに結合するときに、より小さい種が形成される。
【００８８】
図１は、種々のＥ４異性体の変性から観察される抗体成分も記載する。図５からわかるように、方法２ｂによって調製された純Ｅ４は、ＨＬによって支配され、少量のＬおよびＨＨＬを含む。この結果は、多少の種４Ａ−Ｄ（ＨＨＬおよびＬを生じる）を含む、主に種４Ｆ（もっぱらＨＬを生じる）の存在によって説明できる。興味深いことに、方法１によって生成されたｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥの同じ分析は、ほぼ等しい量のＬ、ＨＬ、およびＨＨを生じ、このことは主に種４Ｅの、多少の種４Ｆとの混合物と一致する。
【００８９】
分析ツールの別の実施形態は、逆相ＰＬＲＰカラムによるクロマトグラフィーである；カラム支持体は、非特異的にタンパク質を保持できるシリカ支持体で作成された典型的な逆相カラムよりはむしろ、架橋ジビニルベンゼンからなる。この変性および還元技術は、０および１個の薬物を含む軽鎖（Ｌ０およびＬ１）および０〜３個の薬物を含む重鎖（Ｈ０〜Ｈ３）からなる６種を明確に分離する。図１は、種々のＥ４種で観察できる薬物付加レベルを示す。方法２ｂによる純Ｅ４は、図６でＰＬＲＰによって分離された。未修飾軽鎖（Ｌ０）および２個の薬物を含む重鎖（Ｈ２）は、４Ｆから予想された種であるのに対して、Ｌ１およびＨ１は４Ａ〜Ｄから予想される。バイオアナライザを共に用いて、これらのデータは４Ｅ対４Ｆが約２：１の混合物を生成する方法１と一致するが、方法２ｂは、４Ｆ対４Ａ〜Ｄを２：１で生成する。それゆえ異なる化学的条件を使用しても、Ｅ４収率およびＥ４異性体の部分はどちらも、方法１と２ｂでは著しく異なっている。
【００９０】
（Ｖ．タンパク質への結合が可能である化合物）
タンパク質は、細胞増殖抑制薬または細胞毒性薬、免疫抑制剤、毒素、キレート、化合物、分子、放射性核種などの任意の目的の薬物と結合体化できる。
【００９１】
（細胞毒性薬および細胞増殖抑制薬）
細胞毒性薬および細胞増殖抑制薬としては、抗生剤（例えばアドリアマイシン）、抗腫瘍剤、例えばオーリスタチンおよびオーリスタチン誘導体、メトトレキサート、ミトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、およびビンブラスチン、５−フルオロウラシルＤＮＡ副溝バインダ、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えばシスプラチン、モノ（プラチナ）、ビス（プラチナ）おおび３核プラチナ錯体およびカルボプラチンなどのプラチナ錯体）、駆虫剤（例えばペンタミジンイセチオネート）、アントラサイクリン、葉酸拮抗剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プレフォーミング化合物、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、抗菌剤、抗微小管剤などを含む。抗体がそのような薬物に結合されると、抗体は対応する抗原が発生する部位に薬物を方向付ける。抗体に結合できる他の薬剤および薬物は、当業者に公知であるか、または容易に想到され得る。
【００９２】
個々の細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬としては、例えばアンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトセシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、ダカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、ミトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、ストレプトゾトシン、テノポシド、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ＶＰ−１６およびＶＭ−２６が挙げられる。
【００９３】
他の細胞毒性薬としては例えば、ドラスタチン（以下を参照）、エンジイン（例えばカリケアミシン）およびレキシトロプシン（米国特許第６，１３０，２３７号も参照のこと）などのＤＮＡ副溝バインダ、デュオカルマイシン、タキサン（例えばパクリタキセルおよびドセタキセル）、ピューロマイシン、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡ、ＢまたはＤ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、ディスコデルモライド、エレウテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）、およびミトキサントロンが挙げられる。
【００９４】
ある実施形態において、細胞毒性薬は例えばドキソルビシン、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、ミトマイシンＣまたはエトポシドなどの化学療法薬である。加えて、ＣＣ−１０６５アナログ、カリケアミシン、メイタンシン、ドラスタチン１０のアナログ、リゾキシン、およびパリトキシンなどの強力な薬剤は、タンパク質に結合することができる。
【００９５】
具体的な実施形態において、細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬は、オーリスタチンＥ（当該分野でドラスタチン−１０としても公知）またはその誘導体である。通例、オーリスタチンＥ誘導体は例えばオーリスタチンＥとケト酸との間で生成されたエステルである。例えばオーリスタチンＥは、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応させて、それぞれＡＥＢおよびＡＥＶＢを生成させることができる。他の代表的なオーリスタチン誘導体としてはＡＦＰ、ＭＭＡＦ、およびＭＭＡＥが挙げられる。オーリスタチンＥおよびその誘導体の合成および構造は、米国特許出願番号第０９／８４５，７８６号（米国特許出願公開番号第２００３００８３２６３号）および同第１０／００１，１９１号；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２４２０９：国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１３４３５：および米国特許第６，３２３，３１５号；同第６，２３９，１０４号；同第６，０３４，０６５号；同第５，７８０，５８８号；同第５，６６５，８６０号；同第５，６６３，１４９号；同第５，６３５，４８３号；同第５，５９９，９０２号；同第５，５５４，７２５号；同第５，５３０，０９７号；同第５，５２１，２８４号；同第５，５０４，１９１号；同第５，４１０，０２４号；同第５，１３８，０３６号；同第５，０７６，９７３号；同第４，９８６，９８８号；同第４，９７８，７４４号；同第４，８７９，２７８号；同第４，８１６，４４４号；および同第４，４８６，４１４号に述べられている。
【００９６】
ある実施形態において、細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬は、抗チューブリン剤である。抗チューブリン剤の例としては、これに限定されるわけではないが、タキサン（例えばタキソール（登録商標）（パクリタキセル）、テキソテール（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Ｔｕｌａｒｉｋ）、ビンカアルカロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、およびドラスタチン（例えばオーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）が挙げられる。他の抗チューブリン剤としては例えばバッカチン誘導体、タキサンアナログ（例えばエポチロンＡおよびＢ）、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルシミド（ｃｏｌｃｉｍｉｄ）、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモライド、およびエレウテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）が挙げられる。
【００９７】
ある実施形態において、細胞毒性薬は抗チューブリン剤の別の群である、メイタンシノイドである。例えば具体的な実施形態において、メイタンシノイドはメイタンシンまたはＤＭ−１である（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１も参照のこと）。
【００９８】
一部の実施形態において、治療剤は放射性同位体ではない。
【００９９】
一部の実施形態において、細胞毒性薬または免疫抑制剤は、代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は、例えばプリンアンタゴニスト（例えばアゾチオプリンまたはミコフェノール酸モフェチル）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えばメトトレキサート）、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リバビリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカルネト（ｐｏｓｃａｒｎｅｔ）、またはトリフルリジンであり得る。
【０１００】
他の実施形態において、細胞毒性薬または免疫抑制剤は、タクロリムス、シクロスポリンまたはラパマイシンである。さらなる実施形態において、細胞毒性薬は、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、ベキサロテン、ベキサロテン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、クラドリビン、ダルベポエチンアルファ、デニロイキンディフチトクス、デクスラゾキサン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルベストラント、ゲムシタビン、ゴセレリン、イダルビシン、イフォスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロンアルファ−２ａ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミゾール、メクロレタミンまたは窒素マスタード、メゲストロール、メンサ、メトトレキサート、メトキサレン、ミトマイシンＣ、ミトタン、ナンドロロンフェンプロピオナート、オプレルベキン、オキサリプラチン、パミドロナート、ペグアデマーゼ、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、トレミフェン、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビンおよびソレドロナートである。
【０１０１】
一部の実施形態において、薬剤は免疫抑制剤である。免疫抑制剤は例えばガンシクロビル、タクロリムス、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチルまたはメトトレキサートであり得る。あるいは免疫抑制剤は例えば、グルココルチコイド（例えばコルチゾールまたはアルドステロン）またはグルココルチコイドアナログ（例えばプレドニゾンまたはデキサメタゾン）であり得る。
【０１０２】
一部の実施形態において、免疫抑制剤は抗炎症剤、例えばアリールカルボン酸誘導体、ピラゾール含有誘導体、オキシカム誘導体およびニコチン酸誘導体である。抗炎症剤のクラスとしては例えばシクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポオキシゲナーゼ阻害剤、およびロイコトリエンレセプターアンタゴニストが挙げられる。
【０１０３】
適切なシクロオキシゲナーゼ阻害剤としては、メクロフェナム酸、メフェナム酸、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、フェンブフェン、フェノプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、スリンダク、テノキシカム、トルメチン、およびアセチルサリチル酸が挙げられる。
【０１０４】
適切なリポオキシゲナーゼ阻害剤としては、酸化還元阻害剤（例えばカテコールブタン誘導体、ノルジヒドログアヤレチック酸（ＮＤＧＡ）、マソプロコール、フェニドン、イアノパレン（Ｉａｎｏｐａｌｅｎ）、インダゾリノン、ナファザトロム、ベンゾフラノール、アルキルヒドロキシアミン）、および非酸化還元阻害剤（例えばヒドロキシチアゾール、メトキシアルキルチアゾール、ベンゾピランおよびその誘導体、メトキシテトラヒドロピラン、ボスウェリア酸およびボスウェリア酸のアセチル化誘導体、ならびにシクロアルキルラジカルによって置換されたキノリンメトキシフェニル酢酸）、および酸化還元阻害剤の前駆物質が挙げられる。
【０１０５】
他の適切なリポオキシゲナーゼ阻害剤としては、抗酸化剤（例えばフェノール、没食子酸プロピル、フラボノイドおよび／またはフラボノイドを含む天然基質、フラボンのヒドロキシル化誘導体、フラボノール、ジヒドロケルセチン、ルテオリン、ガランギン、オロボル（ｏｒｏｂｏｌ）、カルコンの誘導体、４，２’，４’−トリヒドロキシカルコン、オルト−アミノフェノール、Ｎ−ヒドロキシウレア、ベンゾフラノール、エブセレンおよび還元セレン含有酵素の活性を上昇させる種）、鉄キレート剤（例えばヒドロキサム酸およびその誘導体、Ｎ−ヒドロキシウレア、２−ベンジル−１−ナフトール、カテコール、ヒドロキシルアミン、カルノソールトロロックスＣ、カテコール、ナフトール、スルファサラジン、ジロイトン（ｚｙｌｅｕｔｏｎ）、５−アントラニル酸および４−（オメガ−アリールアルキル）フェニルアルカン酸）、イミダゾール含有化合物（例えばケトコナゾールおよびイトラコナゾール）、フェノチアジン、およびベンゾピラン誘導体が挙げられる。
【０１０６】
なお他の適切なリポオキシゲナーゼ阻害剤としては、エイコサノイド（例えばオクタデカテトラエン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサヘキサエン酸およびドコサヘキサエン酸ならびにそのエステル、ＰＧＥ１（プロスタグランジンＥ１）、ＰＧＡ２（プロスタグランジンＡ２）、ビプロストール、１５−モノヒドロキシエイコサテトラエン酸、１５−モノヒドロキシ−エイコサトリエン酸、および１５−モノヒドロキシエイコサペンタエン酸、およびロイコトリエンＢ５、Ｃ５およびＤ５）の阻害剤、カルシウム流を妨害する化合物、フェノチアジン、ジフェニルブチルアミン、ベラパミル、フスコシド、クルクミン、クロロゲン酸、コーヒー酸、５，８，１１，１４−エイコサテトライエン酸（ＥＴＹＡ）、ヒドロキシフェニルレチンアミド、イオナパレン、エスクリン、ジエチルカルバマジン、フェナントリン、バイカレイン、プロキシクロミル、チオエーテル、ジアリルスルフィドおよびジ−（１−プロペニル）スルフィドが挙げられる。
【０１０７】
ロイコトリエンレセプターアンタゴニストとしては、カルシトリオール、オンタゾラスト、Ｂａｙｅｒ  Ｂａｙ−ｘ−１００５、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  ＣＧＳ−２５０１９Ｃ、エブセレン、Ｌｅｏ  Ｄｅｎｍａｒｋ  ＥＴＨ−６１５、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ−２９３１１１、Ｏｎｏ  ＯＮＯ−４０５７、Ｔｅｒｕｍｏ  ＴＭＫ−６８８、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ  ＢＩ−ＲＭ−２７０、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ  ２１３０２４，  Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ  ２６４０８６、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ  ２９２７２８、Ｏｎｏ  ＯＮＯ  ＬＢ４５７、Ｐｆｉｚｅｒ  １０５６９６、Ｐｅｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＰＦ  １００４２、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＲＰ  ６６１５３、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＳＢ−２０１１４６、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＳＢ−２０１９９３、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＳＢ−２０９２４７、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−５３２２８、Ｓｕｍｉｔａｍｏ  ＳＭ  １５１７８、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＷＡＹ  １２１００６、Ｂａｙｅｒ  Ｂａｙ−ｏ−８２７６、Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  ＣＩ−９８７、Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  ＣＩ−９８７ＢＰＣ−１５ＬＹ  ２２３９８２，Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ  ２３３５６９、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ−２５５２８３，  ＭａｃｒｏＮｅｘ  ＭＮＸ−１６０、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．ＭＫ−５９１、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．ＭＫ−８８６、Ｏｎｏ  ＯＮＯ−ＬＢ−４４８、Ｐｕｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＰＦ−５９０１、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＲＧ  １４８９３、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＲＰ  ６６３６４、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＲＰ  ６９６９８、Ｓｈｉｏｎｏｏｇｉ  Ｓ−２４７４、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−４１９３０、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−５０５０５、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−５１１４６、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−５２７９８、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＳＫ＆Ｆ−１０４４９３、Ｌｅｏ  Ｄｅｎｍａｒｋ  ＳＲ−２５６６、Ｔａｎａｂｅ  Ｔ−７５７およびＴｅｉｊｉｎ  ＴＥＩ−１３３８が挙げられる。
【０１０８】
（毒素）
毒素は、腫瘍、寄生虫または微生物細胞に関連する抗原に特異的な抗体へ有用に結合体化される。毒素は例えば植物（例えばリシンまたはアブリン）、動物（例えばヘビ毒）、または微生物（例えばジフテリアまたは破傷風毒素）に由来する。
【０１０９】
抗体以外に、薬物または毒素は、他のキャリアタンパク質、例えばアルブミンに結合体化させることができる。
【０１１０】
（タンパク質への薬物の結合体化）
薬物は、タンパク質の結合箇所と反応性である基を有するか、それを含むように修飾される。例えば薬物は、アルキル化（例えば抗体リジンのε−アミノ基またはタンパク質のＮ末端にて）、酸化炭水化物の還元的アミノ化、ヒドロキシ基とカルボキシル基との間のトランスエステル化、アミノ基またはカルボキシル基におけるアミド化、チオールへの結合によって付着させることができる。結合に使用できる化学作用の例については、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．），Ｃｈａｐｔｅｒ  １５（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている）を参照。
【０１１１】
例えばタンパク質の化学活性化が遊離チオール基の形成を生じるとき、タンパク質はスルフヒドリル活性剤と結合体化され得る。１つの局面において、薬剤は、遊離チオール基に実質的に特異的な薬剤である。そのような薬剤としては例えば、マレイミド、ハロアセトアミド（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロエステル（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロメチルケトン（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ベンジル型ハライド（例えばヨージド、ブロミドまたはクロライド）、ビニルスルホンおよびピリジルチオが挙げられる。
【０１１２】
（スルフヒドリル反応剤）
スルフヒドリル反応剤としては、ヨードアセトアミドなどのアルファ−ハロアセチル化合物、Ｎ−エチルマレイミドなどのマレイミド、アセテート、クロライドまたはニトレートの対イオンを含む３，６−ビス−（水銀メチル）ジオキサンなどの水銀誘導体、ジスルフィドジオキシド誘導体などのジスルフィド誘導体、ポリメチレンビスメタンチオスルホン酸塩試薬およびクラベセイン（還元抗体のジスルフィド結合に添加されることが示されている、２個の遊離スルフヒドリル基を含有するフルオレセインの蛍光誘導体）が挙げられる。
【０１１３】
ヨードアセテートなどのアルファ−ハロアセチル化合物は、スルフヒドリル基と容易に反応してアミドを生成する。これらの化合物は、遊離チオールをカルボキシメチル化するために使用された。それらは厳密にＳＨ特異性でなく、アミンと反応する。反応は、ハライドの置換を生じる、チオラートイオンの求核攻撃を包含する。反応性ハロアセチル部分Ｘ−−ＣＨ２ＣＯ−−は、種々の目的で化合物に組み込まれている。例えばブロモトリフルオロアセトンは、Ｆ−１９包含に使用され、Ｎ−クロロアセチルヨードチラミンは、放射性ヨウ素のタンパク質への導入に利用されている。
【０１１４】
Ｎ−エチルマレイミドなどのマレイミドは、特に他の基がプロトン化される７以下のｐＨ値では、スルフヒドリル基にかなり特異性であると見なされている。チオールは、マレイミドによるＭｉｃｈａｅｌ反応を受けて、二重結合への付加体を独占的に生じる。生じたチオエーテル結合は非常に安定である。それらは、はるかに低速にてアミノ基およびイミダゾリル基とも反応する。例えばｐＨ７では、単純なチオールとの反応は、対応するアミンとの反応よりも約１，０００倍高速である。反応に関連する３００ｎｍ領域における特徴的な吸光度の変化は、反応を監視するための好都合な方法を提供する。これらの化合物は低いｐＨにおいて安定であるが、高いｐＨにおいて加水分解を受けやすい。一般にＷｏｎｇ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１：Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２および４）を参照のこと。
【０１１５】
スルフヒドリルと本質的に反応性でない分子（例えば薬物）は、化学的に活性化されたタンパク質に、目的の分子と反応性の基とスルフヒドリル反応性基の両方を持つ二官能性架橋剤によってなお結合体化させることができる。この薬剤は、目的の分子（例えばアミノ基、カルボキシル基またはヒドロキシ基）および化学的に活性されたタンパク質の両方と同時に反応できるか、または目的の分子を誘導体化して、薬剤に由来する部分のために次にスルフヒドリル反応性であるパートナー分子を形成するために使用できるか、または化学的に活性されたタンパク質を誘導体化して、目的の分子と反応性にするために使用できる。
【０１１６】
（リンカー）
薬物はリンカーによってタンパク質に結合され得る。適切なリンカーとしては、例えば開裂性および非開裂性リンカーが挙げられる。開裂性リンカーは通例、細胞内条件下で開裂を受けやすい。適切な開裂性リンカーとしては、例えば、細胞内プロテアーゼ、例えばリソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼによって開裂性であるペプチドリンカーが挙げられる。例示的な実施形態では、リンカーはジペプチドリンカー、例えばバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）またはフェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカーであり得る。他の適切なリンカーとしては、５．５未満のｐＨで加水分解可能なリンカー、例えばヒドラゾンリンカーが挙げられる。さらなる適切な開裂性リンカーとしては、ジスルフィドリンカーが挙げられる。
【０１１７】
リンカーは、タンパク質への結合のための基を含むことができる。例えばリンカーとしては、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシルまたはスルフヒドリル反応性基（例えばマレイミド、ハロアセトアミド（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロエステル（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロメチルケトン（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ベンジル型ハライド（例えばヨージド、ブロミドまたはクロライド）、ビニルスルホンおよびピリジルチオ）が挙げられ得る。一般に、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１を参照のこと。
【０１１８】
特定の実施形態において、抗体またはタンパク質薬物結合体は、以下の式：
【０１１９】
【化４】
2008500961.tif 000006
の結合体あるいはその薬学的に許容される塩または溶媒和物であり得る。
式中：
Ａｂは、抗体または他のタンパク質であり、
Ａは、ストレッチャー単位であり、
ａは、０または１であり、
各Ｗは独立して、リンカー単位であり、
ｗは、０〜１２の範囲の整数であり、
Ｙは、スペーサー単位であり、
ｙは、０、１または２であり、
ｐは、１〜約２０の範囲であり、
Ｄは、薬物、標識または他の分子であり、
ｚは、タンパク質上の潜在的な結合部位の数であり、ｐ＜ｚである。
他の実施形態において、ｐは例えば、２、４、８、１０、１２、１６、２５またはそれ以上であり得る。
【０１２０】
ストレッチャー単位は、リンカー単位を抗体または他のタンパク質に結合させることができる。ストレッチャー単位は、抗体または他のタンパク質の官能基と結合を形成できる官能基を有する。有用な官能基としては、これに限定されるわけではないが、スルフヒドリル（−ＳＨ）、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシ、炭水化物のアノマーヒドロキシル基、およびカルボキシルが挙げられる。
【０１２１】
リンカー単位は通例、アミノ酸単位、例えばジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチド単位である。リンカー単位は、細胞内で開裂性または非開裂性であり得る。
【０１２２】
スペーサー単位は存在する場合、リンカー単位を薬物に結合させる。あるいはスペーサー単位は、リンカー単位が非存在のときに、ストレッチャー単位を薬物部分に結合させることができる。スペーサー単位は、リンカー単位およびストレッチャー単位が非存在のときに、抗体またはタンパク質に結合することもできる。
【０１２３】
（ＶＩ．結合体およびその使用）
（インビトロ免疫診断）
ある実施形態において、タンパク質（例えば抗体）は、インビトロ免疫診断で使用するために、検出可能な標識に結合される。標識は、化学的に活性された抗体の結合箇所（例えば遊離チオール基）に直接または間接的に結合可能である、放射性標識、フルオロフォア、または酵素であり得る。サンプルは、臨床性（例えば血液、尿、精液、または脳脊髄液、あるいは固形組織または臓器）または非臨床性（例えば土壌、水、食物）でよい。アッセイは、定性的または非定性的であり、サンドイッチおよび比較形式を含むいずれの所望の形式でもよい。多数の免疫アッセイ形式、標識、固定化技術などは、参考として本明細書に援用される、以下の刊行物に開示されている：Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ（１９７６），Ａｎｎａｌｓ  Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６：２２１−２４０；ＭｃＬａｒｅｎ（１９８１），Ｍｅｄ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．３８：２４５−５１；Ｏｌｌｅｒｉｃｈ（１９８４），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：８９５−９０４；Ｎｇｏ  ａｎｄ  Ｌｅｎｈｏｆｆ（１９８２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４４：３−１２。
【０１２４】
（免疫造影）
免疫結合体は、インビボ免疫造影にも使用され得る。この目的のために、タンパク質（例えば抗体）は、被験体またはその一部、例えば臓器の中のその位置または場所の外部描出を可能にする手段によって標識される。通例、免疫造影剤は、適切な放射性同位体によって直接（テクネチウムと同様に）または間接的に（キレート化インジウムと同様に）標識された抗体である。患者への注射後に、結合体の場所は、放射性標識によって放出された粒子に感受性である検出器によって、例えばガンマエミッタの場合にはガンマ−シンチレーションカメラによって追跡できる。
【０１２５】
（免疫療法）
免疫療法では、タンパク質は適切な薬物、例えば細胞毒性薬または細胞増殖抑制薬、免疫抑制剤、放射性同位体、毒素などに結合体化することができる。結合体は、腫瘍細胞または癌細胞の増殖を阻害するために、腫瘍または癌細胞においてアポトーシスを発生させるために、または患者の癌を処置するために使用できる。結合体はしたがって、動物の癌の処置に核種の状況において使用できる。結合体は、薬物を腫瘍細胞または癌細胞へ送達するために使用できる。理論に縛られることなく、一部の実施形態において、結合体は癌細胞または腫瘍関連抗原と結合または会合して、結合体および／または薬物は、レセプター仲介エンドサイトーシスを通じて腫瘍細胞または癌細胞内に取り込むことができる。抗原は腫瘍細胞または癌細胞に付着できるか、あるいは腫瘍細胞または癌細胞に関連する細胞外マトリクスタンパク質であり得る。細胞内に入ると、結合体内の（例えばリンカーにおける）１個以上の特異性ペプチド配列は、１個以上の腫瘍細胞または癌細胞関連プロテアーゼによって加水分解によって開裂され、薬物の放出を引き起こす。放出された薬物は次に、細胞内で自由に移動して、細胞毒性または細胞増殖抑制あるいは他の活性を誘起する。一部の実施形態において、薬物は腫瘍細胞または癌細胞の外側の抗体から開裂して、次に薬物は細胞に浸透するか、または細胞表面にて作用する。
【０１２６】
それゆえ、一部の実施形態において、結合体または他のタンパク質は、腫瘍細胞または癌細胞に結合する。一部の実施形態において、結合体は、腫瘍細胞または癌細胞の表面上にある腫瘍細胞または癌細胞抗原に結合する。他の実施形態において、結合体は、腫瘍細胞または癌細胞に関連する細胞外マトリクスタンパク質である腫瘍細胞または癌細胞抗原に結合する。
【０１２７】
特定の腫瘍細胞または癌細胞に対するタンパク質の特異性は、最も効果的に処置される腫瘍または癌を判定するために重要であり得る。例えば抗ＣＤ３０を有する抗体または抗ＣＤ４０抗体あるいは他の結合タンパク質は、血液悪性腫瘍を処置するのに有用であり得る。
【０１２８】
タンパク質−薬物結合体によって処置できる他の特定の種類の癌としては、これに限定されるわけではないが：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、骨肉種、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、咽喉癌、へん平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、睾丸癌、小細胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、皮膚癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫を含む固形腫瘍、血液媒介癌（これに限定されるわけではないが：急性リンパ芽球性白血病“ＡＬＬ”、急性リンパ芽球Ｂ細胞白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、急性骨髄芽球性白血病“ＡＭＬ”、急性骨髄球性白血病“ＡＰＬ”、急性単芽球性白血病、急性赤白血病、急性巨核芽球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性非リンパ球性白血病、急性未分化白血病、慢性骨髄球性白血病“ＣＭＬ”、慢性リンパ球性白血病“ＣＬＬ”、毛様細胞白血病、多発性骨髄腫を含む）、急性および慢性白血病（例えばリンパ芽球性、骨髄性、リンパ球性、および骨髄球性白血病）、およびリンパ腫（例えばホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、および真性赤血球増加）が挙げられる。タンパク質は、結合特異性腫瘍または癌ターゲティングを提供する。
【０１２９】
（癌のマルチモード療法）
上述のように、これに限定されるわけではないが、腫瘍、転移を含む癌、あるいは制御できない細胞増殖を特徴とする他の疾患または障害は、タンパク質−薬物結合体の投与によって処置または予防できる。
【０１３０】
他の実施形態において、結合体の有効量および化学療法剤をその必要がある患者に投与することを含む、癌を処置または防止するための方法が提供される。一部の実施形態において、化学療法剤は、それによって癌の処置が抗療性であることが見出されていないということである。一部の実施形態において、化学療法剤は、それによって癌の処置が抗療性であることが見出されているということである。結合体は、処置、例えば癌の処置のための外科手術も受けた患者に投与できる。別の実施形態において、処置の追加の方法は放射線療法である。
【０１３１】
例示的な実施形態において、タンパク質−薬物結合体は、化学療法剤と、または放射線療法と同時に投与される。別の例示的な実施形態において、化学療法剤または放射線療法は、タンパク質−薬物結合体の投与の、１つの局面において、少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１ヶ月前または後に、さらなる局面において、結合体の投与の、数ヶ月（例えば３ヶ月まで）前または後に投与される。
【０１３２】
化学療法剤は、一連のセッションに渡って投与できる。以下に挙げる化学療法剤の１つまたは組合せを投与できる。放射線に関しては、処置される癌の種類に応じていずれかの放射線療法プロトコルが使用できる。例えば制限するわけではないが、Ｘ線照射を投与できる；特に高エネルギーメガボルテージ（１ＭｅＶエネルギーを超える照射）が深い腫瘍に使用可能であり、電子ビームおよびオルトボルテージＸ線照射は皮膚癌に使用できる。ガンマ線放出放射性同位体、例えばラジウム、コバルトおよび他の元素の放射性同位体も投与できる。
【０１３３】
加えて、化学療法または放射線療法の毒性が強すぎることが判明した、または判明しうる場合に、例えば処置される対象によって許容されないまたは耐えられない副作用を引き起こす場合に、タンパク質−薬物結合体による癌の処置方法が化学療法または放射線療法の代替手段として提供される。処置される動物は必要に応じて、どの処置が許容されるまたは耐えられることが判明するかによって、外科手術、放射線療法または化学療法などの別の癌処置によって処置できる。
【０１３４】
タンパク質−薬物結合体は、インビトロまたは生体外方式で、例えばこれに限定されるわけではないが、白血病およびリンパ腫を含むある癌の処置に使用することも可能であり、そのような処置は自己幹細胞移植を包含する。これは動物の自己造血幹細胞が収穫され、癌細胞すべてが一掃される多ステッププロセスを含むことができ、動物の残存する骨髄細胞個体群は次に、付随する高用量放射線療法を伴って、または伴わずに高用量の結合体の投与によって全滅され、そして幹細胞グラフトは動物へ輸液によって戻される。次に対症療法が与えられて、その間に骨髄機能が修復され、動物が回復する。
【０１３５】
（癌の多剤療法）
タンパク質−薬物結合体の有効量および抗癌剤である別の治療剤をその必要がある患者に投与することを含む癌を処置する方法が開示される。適切な抗癌剤としては、これに限定されるわけではないが、メトトレキサート、タキソール、Ｌ−アスパラギナーゼ、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシウレア、シタラビン、シクロホスファミド、イフォスファミド、ニトロソウレア、シスプラチン、カルボプラチン、ミトマイシン、ダカルバジン、プロカルバジン、トポテカン、窒素マスタード、シトキサン、エトポシド、５−フルオロウラシル、ＢＣＮＵ、イリノテカン、カンプトセシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、およびドセタキセルが挙げられる。
【０１３６】
抗癌剤としては、これに限定されるわけではないが、アルキル化剤、例えば窒素マスタード（例えばシクロホスファミド，イフォスファミド、トロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン）、ニトロソウレア（例えばカルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ））、アルキルスルホナート（例えばブスルファン、トレオスルファン）、トリアゼン（例えばデカルバジン）、プラチナ含有化合物（例えばシスプラチン、カルボプラチン）；植物アルカロイド、例えばビンカアルカロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、タキソイド（例えばパクリタキセル、ドセタキソール）；ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、例えばエピポドフィリン（例えばエトポシド、テニポシド、トポテカン、９−アミノカンプトセシン、カンプトセシン、クリスナトール、ミトマイシン（例えばミトマイシンＣ）；代謝拮抗物質、例えば葉酸拮抗剤、例えばＤＨＦＲ阻害剤（例えばメトトレキサート、トリメトレキサート）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ阻害剤（ミコフェノール酸、チアゾフリン、リバビリン、ＥＩＣＡＲ）およびリボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤（例えばヒドロキシウレア、デフェロキサミン）、ピリミジンアナログ、例えばウラシルアナログ（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、ｒａｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シトシンアナログ（例えばシタラビン（ａｒａ  Ｃ）、シトシンアラビノシド、フルダラビン）、およびプリンアナログ（例えばメルカプトプリン、チオグアニン）；ホルモン療法、例えばレセプターアンタゴニスト、例えば抗エストロゲン（例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、メゲストロール）、ＬＨＲＨアゴニスト（例えばｇｏｓｃｒｃｌｉｎ、酢酸ロイプロリド）、および抗アンドロゲン（例えばフルタミド、ビカルタミド；レチノイド／デルトイド、例えばビタミンＤ３アナログ（例えばＥＢ  １０８９、ＣＢ  １０９３、ＫＨ  １０６０）、光線力学療法（例えばベルトポルフィン（ＢＰＤ−ＭＡ）、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、デメトキシ−ヒポクレリンＡ（２ＢＡ−２−ＤＭＨＡ））、サイトカイン（例えばインターフェロン−α、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子）などの薬物はもちろんのこと、ゲムシタビン、ベルケイド、ラバミド、サラミド、イソプレニル化阻害剤（例えばラバスタチン）、ドーパミン神経毒（例えば１−メチル−４−フェニルピリミジンイオン）、細胞サイクル阻害剤（例えばスタウロスポリン）、アクチノマイシン（例えばアクチノマイシンＤ、ダクチノマイシン）、ブレオマイシン、ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＢ２、ペプロマイシン）、アントラサイクリン（ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン）、ＭＤＲ阻害剤（例えばベラパミル）、およびＣａ２＋ＡＴＰａｓｅ阻害剤（例えばタプシガーギン）などの他の薬物が挙げられる。
【０１３７】
（自己免疫疾患の処置）
タンパク質−薬物結合体は、自己免疫疾患を引き起こす細胞を殺す、またはその複製を阻害するために、あるいは自己免疫疾患を処置するために有用である。したがって結合体は、患者の自己免疫疾患の処置のために種々の状況で使用できる。結合体は、薬物を標的細胞に送達するために使用できる。理論に縛られることなく、１つの実施形態において、結合体は標的細胞の表面上の抗原と会合して、次に結合体はレセプター仲介エンドサイトーシスを通じて標的細胞内に取り込まれる。細胞内に入ると、（例えばリンカー内の）１個以上の特異性ペプチド配列は、酵素または加水分解によって開裂され、薬物の放出を引き起こす。放出された薬物は次に、サイトソルにおいて自由に移動して、細胞毒性または細胞増殖抑制活性を誘起する。代わりの実施形態において、薬物は標的細胞の外側の結合体から開裂して、次に薬物は細胞に浸透する。
【０１３８】
一部の実施形態において、タンパク質−薬物結合体は自己免疫抗原に結合する。１つの局面において、抗原は自己免疫状態に関与する細胞の表面上にある。一部の実施形態において、抗体は細胞の表面上にある自己免疫抗原に結合する。例示的な実施形態において、抗体は自己免疫疾患状態に関連する活性化リンパ球に結合する。さらなる実施形態において、結合体は、特定の自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を殺す、またはその増殖を阻害する。
【０１３９】
タンパク質−薬物結合体によって処置できる特定の種類の自己免疫疾患としては、これに限定されるわけではないが、Ｔｈ２リンパ球関連障害（例えばアトピー性皮膚炎、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎、Ｏｍｅｎｎ症候群、全身性硬化症および移植片対宿主疾患）；Ｔｈ１リンパ球関連障害（例えば関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性肝硬変症、ウェゲナー肉芽腫症および結核）；および活性化Ｂリンパ球関連障害（例えば全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、関節リウマチおよびＩ型糖尿病）が挙げられる。他の自己免疫疾患としては、これに限定されるわけではないが、慢性活動性肝炎、アジソン病、アレルギー性肺胞炎、アレルギー反応、アレルギー性鼻炎、アルポート症候群、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、関節炎、回虫症、アスペルギルス症、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、ベーチェット症候群、愛鳥家肺、気管支喘息、カプラン症候群、心筋症、セリアック病、シャーガス病、慢性糸球体腎炎、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性風疹感染、ＣＲＥＳＴ症候群、クーロン病、クリオグロブリン血症、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状狼瘡、ドレッサー症候群、イートン・ランバート症候群、エコーウィルス感染、脳脊髄炎、内分泌眼疾患、エプスタイン−バーウィルス感染、ウマ肺気腫、エリマトーデス、エヴァンス症候群、フェルティ症候群、線維筋痛、フックス毛様体炎、胃萎縮症、消化管アレルギー、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主疾患、グレーブス病、ギラン−バレー病、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、シェンライン−ヘノッホ紫斑、特発性成人胆管減少症、特発性肺線維症、ＩｇＡネフロパシー、炎症性大腸炎、インシュリン依存性真性糖尿病、若年性関節炎、若年性真性糖尿病（Ｉ型）、ランバート−イートン症候群、蹄葉炎、扁平苔癬、ルポイド肝炎、狼瘡、リンパ球減少症、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、多腺性症候群、初老期認知症、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、反復流産、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サンプター症候群、住血吸虫症、シュミット症候群、強皮症、シャルマン症候群、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、交感性眼炎、全身性エリマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺炎、血小板減少症、甲状腺中毒症、中毒性表皮壊死症、Ｂ型インスリン抵抗性、Ｉ型真性糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１４０】
（自己免疫疾患の多剤療法）
タンパク質−薬物結合体の有効量を単独で、または自己免疫疾患の処置で公知の別の治療剤と組合せて、その必要がある患者に投与することを含む、自己免疫疾患を処置する方法も開示されている。抗自己免疫疾患剤としては、これに限定されるわけではないが、以下が挙げられ得る：シクロスポリン、シクロスポリンＡ、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス、タクロリムス、エナネルセプト（ｅｎａｎｅｒｃｅｐｔ）、プレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、アミノカプロン酸、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、クロラムブシル、ＤＨＥＡ、ダナゾール、ブロモクリプチン、メロキシカムおよびインフリキシマブ。
【０１４１】
（感染性疾患の処置）
タンパク質−薬物結合体は、感染性疾患を引き起こす細胞を殺す、またはその複製を阻害するために、あるいは感染性疾患を処置するために有用である。したがって結合体は、患者の感染性疾患の処置のために種々の状況で使用できる。ＡＤＣは、薬物を標的細胞に送達するために使用できる。１つの実施形態において、抗体は感染性疾患細胞に結合する。一部の実施形態において、結合体は、特定の感染性疾患を引き起こす細胞を殺すか、またはその増殖を阻害する。結合体によって処置できる特定の種類の感染性疾患としては、これに限定されるわけではないが以下が挙げられる：細菌性疾患、例えばジフテリア、百日咳、オカルト菌血症、尿路感染症、胃腸炎、蜂巣炎、喉頭蓋炎、気管炎、アデノイド肥大、咽後膿瘍、膿痂疹、膿瘡、肺炎、心内膜炎、敗血症性関節炎、肺炎球菌性腹膜炎、細菌性髄膜炎、急性化膿性髄膜炎、尿道炎、子宮頚管炎、直腸炎、咽頭炎、卵管炎、精巣上体炎、淋病、梅毒、リステリア症、炭疽病、ノカルジア症、サルモネラ、腸チフス、赤痢、結膜炎、副鼻腔炎、ブルセラ症、ツラレミア、コレラ、腺ペスト、破傷風、壊死性腸炎、および放線菌症；混合嫌気性感染症、例えば梅毒、回帰熱、レプトスピラ症、ライム病、ネズミ咬熱、結核、リンパ節炎、ハンセン病、クラミジア症、クラミジア肺炎、トラコーマおよび封入体性結膜炎；全身性真菌疾患、例えばヒストプラスマ症、コクシジオイデス症、ブラストミセス症、スポロトリクム症、クリプトコッカス症、全身性カンジダ症、アスペルギルス症、ムコール菌症、足菌腫、およびクロモミコーシス；リケッチア症、例えばチフス、ロッキ−山紅斑熱、エーリキア症、東半球ダニ媒介性リケッチア症、リケッチア痘症、Ｑ熱およびバルトネラ症；寄生虫症、例えばマラリア、バベシア症、アフリカ睡眠病、シャーガス病、リーシュマニア症、ダムダム熱、トキソプラズマ症、髄膜脳炎、角膜炎、アメーバ症、ランブル鞭毛虫症、クリプトスポリジウム症、イソスポーラ症、サイクロスポリン、微胞子虫症、回虫症、鞭虫感染、鉤虫感染、線虫感染、眼幼虫移行症、旋毛虫病、糸状虫症、リンパ管フィラリア症、ロア糸状虫症、河川盲目症、犬糸状虫感染、住血吸虫症、水泳者かゆみ症、肺吸虫症、肝吸虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、オピストルキス症、条虫感染、包虫症、および多包虫症；ウィルス性疾患、例えば麻疹、亜急性硬化性全汎脳炎、風邪、流行性耳下腺炎、風疹、バラ疹、第５病、水痘、呼吸器合胞体ウィルス感染、クループ、気管支梢炎、感染性単核球症、ポリオ、ヘルパンギーナ、手足口病、ボーンホルム病、陰部ヘルペス、陰部疣贅、無菌性髄膜炎、心筋炎、心膜炎、胃腸炎、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ライ症候群、川崎症候群、インフルエンザ、気管支炎、ウィルス性「歩く」肺炎、急性発熱性呼吸疾患、急性咽頭結膜熱、流行性角結膜炎、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、帯状疱疹、巨細胞封入体症、狂犬病、進行性多病巣性白質脳障害、クル、致死性家族性不眠症、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、熱帯性痙性不全対麻痺、西部ウマ脳脊髄炎、カリフォルニア脳炎ウィルス、セントルイス脳炎、黄熱病、デング熱、リンパ球性脈絡髄膜炎、ラッサ熱、出血熱、繁多ウィルス肺症候群、マールブルグウィルス感染、エボラウィルス感染および天然痘。
【０１４２】
（感染性疾患の多剤療法）
タンパク質−薬物結合体を単独で、または抗感染性疾患剤である別の治療剤と組合せてその必要がある患者に投与することを含む、感染性疾患を処置する方法も開示されている。抗感染性疾患としては、これに限定されるわけではないが、以下が挙げられ得る：β−ラクタム抗生剤、例えばペニシリンＧ、ペニシリンＶ、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、バカンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、メズロシリン、ピペラシリンおよびチカルシリン；アミノグリコシド、例えばアミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシンおよびトブラマイシン；マクロリド、例えばアジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、リンコマイシンおよびクリンダマイシン；テトラサイクリン、例えばデメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリンおよびテトラサイクリン；キノロン、例えばシノキサシン、およびナリジクス酸；フルオロキノロン、例えばシプロフロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシンおよびトロバフロキサシン；ポリペプチド、例えばバシトラシン、コリスチンおよびポリミキシンＢ；スルホンアミド、例えばスルフイソキサゾール、スルファメトキサゾール、スルファジアジン、スルファメチゾールおよびスルファセタミド；ならびに他の抗菌剤、例えばトリメトプリム、スルファメチゾール、クロラムフェニコール、バンコマイシン、メトロニダゾール、キヌプリスチン、ダルフォプリスチン、リファンピン、スペクチノマイシンおよびニトロフラントイン；ならびに抗ウィルス剤、例えば汎用抗ウィルス剤、例えばイドクスウリジン、ビダラビン、トリフルリジン、アシクロビル、ファンシクロビル、ペンシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、フォスカルネット、リバビリン、アマンタジン、リマンタジン、シドフォビル；アンチセンスオリゴヌクレオチド、免疫グロブリンおよびインターフェロン；ならびにＨＩＶ感染用薬物、例えばテノフォビル、エムトリシタビン、ジドブジン、ディダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、ネビラピン、デラビルジン、サクイナビル、リトナビル、インディナビルおよびネルフィナビル。
【０１４３】
（ＶＩＩ．薬学的組成物）
インビボでの使用において、一般に、免疫造影（ｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ）、免疫療法、または他の使用にかかわらず、結合体は被験体に導入される。組成物は、結合体の単一の異性体、または１個以上の部分付加異性体を含むことができる。例えばタンパク質が抗体である場合、組成物は、単一のＥ２、Ｅ４またはＥ６異性体、選択されたＥ２、Ｅ４またはＥ６異性体の混合物、すべて単独のＥ２、Ｅ４またはＥ６異性体、あるいはＥ２、Ｅ４およびＥ６異性体の混合物を含み得る。一部の実施形態において、ある異性体を含有する組成物は、実質的に他の異性体を含まなくてもよい。この文脈において、「実質的に含まない」とは、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満、または約１％未満の他の異性体を含有する組成物を意味する。
【０１４４】
組成物は、その組成物が患者に投与され得るいずれの形態でもよい。例えば組成物は、固体、液体または気体（エアゾール）の形態であり得る。代表的な投与経路としては、経口、局所、非経口、舌下、直腸、膣、眼、腫瘍内、および鼻腔内が挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与として、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内の注射または注入技法が挙げられる。１つの局面において、組成物は非経口投与される。なお別の局面において、結合体または組成物は、静脈内投与される。
【０１４５】
結合体は、注射によって導入され得る。代表的に、結合体は血管内に（静脈内または動脈内に）または髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ）に、しばしば注入によって投与される。さらに、適切な場合には、結合体は、皮下的、粘膜下、筋肉内、頭蓋内、または薬物投与の他の受容される経路によって導入され得る。
【０１４６】
他の実施形態において、組成物は有効量の結合体および薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルを含む。そのような組成物は、動物またはヒトへの投与に適切である。
【０１４７】
薬学的組成物は、患者への組成物の投与時に結合体が生体利用可能であり得るように処方され得る。組成物は、１種以上の投薬単位の形態を取ることができ、ここで例えば錠剤は単一投薬単位であることが可能であり、注射用形態において結合体の容器は、複数回の投薬単位を保持することができる。
【０１４８】
薬学的組成物を調製する際に使用される物質は、使用される量では非毒性であり得る。薬学的組成物中の活性成分の最適投薬量が種々の要因に依存して変わることは、当業者に明らかである。関連する要因としては、動物の種類（例えばヒト）、結合体の特定の形態、投与様式、使用される組成物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルは、組成物が例えば錠剤または粉末形態であるように、粒子状でもよい。キャリアは液体でもよく、組成物は例えば経口シロップまたは注射用液剤である。さらにキャリアは、例えば吸入投与で有用なエアゾール組成物を提供するために、気体状または粒子状でもよい。
【０１５０】
経口投与を目的とする場合、組成物は好ましくは固体形態または液体形態であり、半固体形態、半液体形態、懸濁物形態およびゲル形態は、本明細書で固体または液体のどちらかと見なされる形態に含まれる。
【０１５１】
経口投与用の固体組成物として、組成物は粉剤、顆粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル剤、チューイングガム、カシェ剤などで処方され得る。そのような固体組成物は代表的に、１種以上の不活性希釈剤を含有する。さらに、以下の１種以上が存在できる：結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、またはゼラチン）；賦形剤（例えばデンプン、ラクトース、またはデキストリン）；崩壊剤（例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、コーンスターチなど）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロテックス）；流動促進剤（例えばコロイド状二酸化ケイ素）；甘味料（例えばスクロースまたはサッカリン）、矯味矯臭剤（例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料）、ならびに着色剤。
【０１５２】
組成物がカプセル剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態である場合、組成物は上の種類の物質に加えて、液体キャリア（例えばポリエチレングリコール、シクロデキストリン、または脂肪油）を含有し得る。
【０１５３】
組成物は液体（例えばエリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤または懸濁剤）の形態でもよい。液体は経口投与に、または注射による送達に有用であり得る。経口投与を目的とする場合、組成物は甘味料、保存料、染料／着色料および調味料の１種以上を含むことができる。注射による投与のための組成物では、界面活性剤、保存料、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤および等張剤の１種以上を含むこともできる。
【０１５４】
液体組成物は、それらが液剤、懸濁剤または他の同様の形態であるかどうかにかかわらず、以下の１種以上も含むことができる：滅菌希釈剤（例えば注射用水、食塩水、好ましくは生理的食塩水、リンガー液、等張性塩化ナトリウム、不揮発性油（例えば溶媒または懸濁媒体として作用し得る合成モノグリセリドまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、シクロデキストリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒）；抗菌剤（例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えばアセテート、シトレートまたはホスフェート）および張度の調整のための薬剤（例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース）。非経口組成物は、ガラス、プラスチックまたは他の材料からなるアンプル、使い捨て注射器または複数回用量バイアルに封入され得る。生理的食塩水は例示的なアジュバントである。注射用組成物は好ましくは滅菌されている。
【０１５５】
非経口投与用の調製物は、滅菌水または非水性液剤、懸濁剤、および乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）および注射用有機エステル（例えばオレイン酸エチル）である。水性キャリアは、水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁物（食塩水および緩衝媒体）を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または非揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養素補充薬、電解質補充薬（例えばリンガーデキストロースをベースとするもの）などを含む。保存料および他の添加剤、例えば抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在し得る。
【０１５６】
特定の障害または状態の処置において有効な結合体の量は、障害または状態の性質によって変わり、標準臨床技法によって決定され得る。開示されたタンパク質−薬物結合体の投与のためのこれらの投薬量範囲は、状態または障害の症状が軽減される所望の効果を引き起こすのに十分大きいものである。投薬量は、副作用、例えば望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などを引き起こすほど多くてはならない。加えて、最適投薬量範囲を決定するために、インビトロまたはインビボでのアッセイが必要に応じて利用される。
【０１５７】
組成物において利用される正確な用量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度、投与経路、および疾患または症状の重篤度によっても変わり、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。
【０１５８】
組成物は適切な投薬量が得られるような、有効量の結合体を含む。代表的に、この量は、組成物の重量で少なくとも約０．０１％の結合体である。経口投与を目的とする場合、この量は組成物の重量で約０．１％〜約８０％の範囲で変化し得る。１つの局面において、経口組成物は組成物の重量で約４％〜約５０％の結合体を含むことができる。なお別の局面において、本組成物は、非経口投薬量単位が結合体の重量で約０．０１％〜約２％を含有するように調製される。
【０１５９】
静脈内投与では、組成物は、動物の体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約１００ｍｇの結合体を含むことができる。１つの局面において、組成物は動物の体重１ｋｇ当たり約１〜約１００ｍｇの結合体を含むことができる。別の局面において、投与される量は、約０．１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の結合体の範囲で変化する。
【０１６０】
一般に、患者に投与される結合体の投薬量は代表的に、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２０００ｍｇ／ｋｇ動物体重である。１つの局面において、患者に投与される投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ動物体重である。別の局面において、患者に投与される投薬量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ動物体重である。なお別の局面において、患者に投与される投薬量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ動物体重である。なお別の局面において、投与される投薬量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ動物体重である。なお別の局面において、投与される投薬量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ動物体重である。
【０１６１】
結合体は、いずれかの好都合な経路によって、例えば注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（例えば口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。種々の送達システム、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルへのカプセル化などが公知であり、結合体または組成物を投与するために使用され得る。ある実施形態において、２つ以上の結合体または組成物が患者に投与される。
【０１６２】
特定の実施形態において、１種以上の結合体または組成物を処置が必要な領域に局所的に投与することが望ましい。これは例えば、手術中の局所注入によって；例えば手術後の創傷包帯と併せた局所塗布によって；注射によって；カテーテルによって；坐剤によって；膜（例えばシラスティック膜（ｓｉａｌａｓｔｉｃ））、または繊維を含む、多孔性、非多孔性、あるいはゼラチン性材料の移植）によって達成される。１つの実施形態において、投与は、癌の部位（または形成部位）、腫瘍あるいは新生物または新生物発生前組織への直接注射によって可能である。別の実施形態において、投与は、自己免疫疾患の徴候の部位（または形成部位）への直接注射によって可能である。
【０１６３】
ある実施形態において、１種以上の結合体または組成物を、脳室内および髄腔内注射を含む任意の適切な経路によって中枢神経系に導入することが望まれ得る。脳室内注射は、例えばオンマヤ（Ｏｍｍａｙａ）リザーバーなどのリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易にされ得る。
【０１６４】
例えば吸入器またはネブライザの使用、およびエアゾール化剤を用いた処方によって、あるいはフルオロカーボンまたは合成肺界面活性剤での潅流を介して、肺投与も利用され得る。
【０１６５】
なお別の実施形態において、結合体は制御放出システムで送達可能であり、例えばこれに限定されるわけではないが、ポンプまたは種々のポリマー材料が使用され得る。なお別の実施形態において、制御放出システムは結合体の標的の付近、例えば脳に配置可能であり、それゆえ全身用量の一部のみを必要とする（例えばＧｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照）。Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による概説で述べられている他の制御放出システムが使用され得る。
【０１６６】
一部の実施形態において、タンパク質結合体をキャリアに結合させて組成物を形成することができる。「キャリア」という用語は、希釈剤、アジュバントまたは賦形剤をいい、それと共に結合体が投与される。そのような薬学的キャリアは、液体（例えば水および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油（例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など）であり得る。キャリアは、食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであり得る。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、滑剤および着色剤を使用できる。１つの実施形態において、患者に投与される場合、結合体または組成物および薬学的に受容可能なキャリアは滅菌されている。水は、結合体を静脈内投与する場合の例示的なキャリアである。食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、特に注射用液剤のための液体キャリアとしても利用され得る。適切な薬学的キャリアとしてはまた、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤が挙げられる。所望の場合、組成物は少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤も含むことができる。
【０１６７】
組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、液体を含有するカプセル剤、粉剤、持続放出製剤、坐剤、乳剤、エアゾール、スプレー、懸濁剤の形態、または使用に適した他の任意の形態を取ることができる。適切な薬学的キャリアの他の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に述べられている。
【０１６８】
例示的な実施形態において、結合体は通常の手順に従って、動物、特にヒトへの静脈内投与に適した薬学的組成物として処方される。代表的に、静脈内投与のためのキャリアまたはビヒクルは、滅菌等張性水性緩衝溶液である。必要な場合、組成物は可溶化剤も含むことができる。静脈内投与のための組成物は必要に応じて、注射部位の疼痛を緩和するために、リグノカインなどの局所麻酔薬を含むことができる。一般に成分は、例えば活性剤の量を表示したアンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密閉した容器内の乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、単位投薬形で個別に、または共に混合して提供される。結合体が注入によって投与される場合、例えば滅菌された薬学的用水または食塩水を含有する注入ボトルを用いて投薬できる。結合体が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合できるように、注射用の滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１６９】
経口送達用の組成物は、例えば、錠剤、口内錠、水性懸濁剤または油性懸濁剤、顆粒剤、粉末剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤、またはエリキシル剤の形態が可能である。必要に応じて、経口投与組成物は、例えば、薬学的に口当たりのよい調製物を提供するために、必要に応じて１種以上の薬剤（例えばフルクトース、アスパルテームまたはサッカリンなどの甘味料；ペパーミント、ウィンターグリーンオイル、またはチェリーなどの矯味矯臭剤；着色料；および保存料）を含有できる。さらに、錠剤形態または丸剤形態では、組成物は消化管での崩壊および吸収を遅延させて、それにより長期間に渡って持続作用を提供するために、コーティングすることができる。浸透圧的に活性な駆動化合物を包囲する選択的透過性膜も、経口投与化合物に適切である。このような遅延されたプラットフォームでは、カプセル剤を包囲する環境からの流体は、駆動化合物により吸収されて膨潤し、開口部を通じて薬剤または薬剤組成物を放出する。これらの送達プラットフォームは、即時放出処方物の急上昇特性とは対照的に、本質的にゼロ次送達特性を提供することができる。モノステアリン酸グリセロールまたはステアリン酸グリセロールなどの時間遅延材料も使用できる。
【０１７０】
組成物は局所投与を目的とすることも可能であり、その場合、キャリアは液剤、乳剤、軟膏またはゲルベースの形態であり得る。経皮投与を目的とする場合は、組成物は経皮パッチまたはイオン導入器具の形態を取ることができる。局所処方物は、約０．０５％〜約５０％ｗ／ｖ（組成物の単位体積当たりの重量）、別の局面では０．１％〜１０％ｗ／ｖの結合体の濃度を含むことができる。
【０１７１】
組成物は、例えば直腸で溶解して、結合体を放出する坐剤の形態で、直腸投与を目的とすることができる。
【０１７２】
組成物は、固体または液体投薬単位の物理形態を改良する種々の物質を含むことができる。例えば組成物は、活性成分周囲にコーティングシェルを形成する物質を含むことができる。コーティングシェルを形成する物質は代表的に、不活性であり、例えば糖、シェラック、および他の腸溶コーティング剤から選択できる。あるいは活性成分をゼラチンカプセルに入れることができる。
【０１７３】
組成物は、ガス状投薬単位から成ることがあり、例えばエアゾールの形態を取ることができる。エアゾールという用語は、コロイド状性質のものから加圧パッケージから成る系に渡る種々の系を示すために使用される。送達は、液化ガスまたは圧縮ガスによって、あるいは活性成分を分配する適切なポンプシステムによって可能である。
【０１７４】
本組成物は固体、液体またはガス状の形態であるか否かにかかわらず、癌、自己免疫疾患または感染性疾患の処置に使用される薬剤を含むことができる。
【０１７５】
（ＶＩＩＩ．薬物動態学）
マウスにおいて、精製したｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥの４個の薬物の結合体の毒性および効果のインビトロでの特徴付けを実施し、実施例でさらに詳細に議論する（例えば実施例８および９を参照のこと）。簡潔には、これらの試験は、抗体当たり平均４個の薬物を含む混合物は、８個の薬物を含む結合体と等しく有効であるが（どちらも１ｍｇ／Ｋｇの単回用量）、より毒性が低い（ＭＴＤは、抗体当たり４個の薬物では１００ｍｇ／ｋｇであり、抗体当たり８個の薬物では５０ｍｇ／ｋｇ）ことを示している。ＤＴＴ方法による抗体当たり４個の薬物を含む精製物質は効果および毒性が同様であるのに対して、ＤＴＮＢ方法による抗体当たり４個の薬物を含む精製物質は、やや高い１２０ｍｇ／ＫｇのＭＴＤを有するが、他の結合体の半分の用量（０．５ｍｇ／Ｋｇ）で有効である。
【０１７６】
ｃＡＣ１０に抗体当たり２個、４個、または８個の薬物を付加することは、標的抗原ＣＤ３０への結合に何の影響も及ぼさなかった。ｃＡＣ１０−ＡＤＣのインビトロ有効性は薬物付加に直接依存し、それゆえ全ＭＭＡＥ暴露に直接依存する。
【０１７７】
ｃＡＣ１０−Ｅ４は、Ｋａｒｐａｓ−２９９異種移植モデルにて、ＭＭＡＥ用量の半分であり、同じ用量の抗体で、ｃＡＣ１０−Ｅ８に匹敵する抗腫瘍活性を示した。有効性が薬物付加に直接関連するというインビトロでの発見結果に基づいて、ｃＡＣ１０−Ｅ４とｃＡＣ１０−Ｅ８との同等のインビボ抗腫瘍活性は予想されなかった。ＡＤＣの薬物動態学の調査は、クリアランスがＡＤＣの薬物付加に直接関連し、暴露（曲線下面積−ＡＵＣ）が薬物付加に反比例することを明らかにした。ｃＡＣ１０−Ｅ４のＡＵＣはｃＡＣ１０−Ｅ８よりも３倍高かった。ｃＡＣ１０−Ｅ８と比較したｃＡＣ１０−Ｅ４のより高いＡＵＣは、低下した有効性を補償するのに明らかに十分であり、同等の有効性をもたらした。ＡＵＣを増大させるために血漿消失半減期を減速させることによって有効性を改善する試みは、インターフェロン−αのためのアルブミン融合タンパク質の構築および抗癌剤ルルトテカン（Ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）のリポソーム送達を含む方法によって達成されてきた。目的が血漿半減期を延長させることであるこれらの例とは異なり、ｃＡＣ１０−Ｅ４の暴露向上は、ＭＭＡＥ付加減少の貴重な結果であった。
【０１７８】
実施例８に開示するように、ｃＡＣ１０−Ｅ２を１．０ｍｇ／ｋｇ／用量のｑ４ｄｘ４と共に投薬することは、１０症例中１０の治癒をもたらした。ｃＡＣ１０−Ｅ２は同じｍＡｂ用量ではｃＡＣ１０−Ｅ４と比べて同等の抗腫瘍活性を示さなかったが、ｃＡＣ１０−Ｅ４と比べて同等の抗腫瘍活性を達成するためのｃＡＣ１０−Ｅ２の用量は、インビボ有効性実験に基づいておそらく２分の１未満である。ｃＡＣ１０−Ｅ４と同様に、ｃＡＣ１０−Ｅ２の暴露の改善は、より低いインビトロでの有効性を解決するのに重要な役割を演じ得る。
【０１７９】
ｃＡＣ１０−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣの治療可能性を最大限にするためには、高い治療指数が必要である。ｍＡｂ当たりのＭＭＡＥ分子の量を８から４に減少させることは、治療指数を１００から２００へ向上させた。化学療法試薬の急勾配の用量−反応曲線を考えると、治療指数の２倍の差は、毒性に関する臨床上の意義全体の点から見て重要であり得る。
【０１８０】
ＭＭＡＥの量をｍＡｂ当たり８分子から４分子に減少させることにより、インビトロでの活性の低下があるが、インビボでの同等の抗腫瘍活性がなお示された。抗体当たり２個のＭＭＡＥ分子への薬物付加でのさらなる減少は、インビトロ活性をさらに低下させ、ｃＡＣ１０−Ｅ２は、複数回投薬の状況の２倍の用量で、ｃＡＣ１０−Ｅ４およびｃＡＣ１０−Ｅ８と同等またはより優れた有効性を有していた。治療濃度域は、薬物付加を８ＭＭＡＥ分子から４に減少させることにより２倍に上昇し、抗体当たり薬物２個までのさらなる減少により最低にて維持された。ＡＤＣの薬物置換の最適化には、注目に値する価値がある。
【実施例】
【０１８１】
（方法１の実施例１）
ｃＡＣ１０を制限された濃度のＤＴＴによって以下のように部分還元した：ｃＡＣ１０（８ｍｇ／ｍＬまたは５３．８μＭ）を０．０５Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８、０．０５Ｍ  ＮａＣｌ、および１ｍＭジエチレン−トリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ；Ａｌｄｒｉｃｈ）中のＤＴＴ  ３．５モル当量（１８８．４μＭ；Ｓｉｇｍａ）によって、３７℃にて１時間処理した。次に還元された抗体をＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で脱塩することによって精製した。ＰＤ−１０カラムを１ｍＭ  ＤＴＰＡ（ＰＢＳＤ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４（ＧＩＢＣＯ）２５ｍＬで平衡にして、上の溶液１ｍＬをカラムに添加し、カラムをＰＢＳＤ  １．８ｍＬで洗浄して、ＰＢＳＤ  １．４ｍＬを用いてカラムを溶出させた。１．０ｍｇ／ｍＬ溶液での２８０ｎｍにおける吸収値１．５８を使用してタンパク質濃度を定量して、モル濃度を分子量１５０，０００ｇ／ｍｏｌを用いて決定した。生成された抗体−システインチオールの濃度を５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた滴定によって決定すると、概して、この方法を用いた抗体当たり４個の抗体−システインチオールよりもやや高くなった。
【０１８２】
次に以下のように、薬物ｖｃＭＭＡＥを還元ｃＡＣ１０に結合させた：還元ｃＡＣ１０（代表的に、最終濃度が３０μＭ抗体および１２０μＭ抗体−システインチオール）を最初に０℃まで冷却した。ｖｃＭＭＡＥを冷アセトニトリルに溶解させ、抗体溶液と迅速に混合した。最終アセトニトリル濃度は２０％であるのに対して、最終薬物濃度は１３５〜１５０μＭであった（４．５〜５モル当量、これは抗体−システインチオールよりやや過剰である）。この溶液を０℃にて３０分間インキュベートして、過剰なｖｃＭＭＡＥをシステイン（１ｍＭ最終濃度）によってクエンチさせ、結合体を上述のようにＰＤ−１０カラムを用いて精製した。
【０１８３】
（方法１の実施例２）
抗体当たり４個のｖｃＭＭＡＥを含むｃＡＣ１０（Ｅ４ミックス）は、制限量のＤＴＴを用いて以下のように調製した：ｃＡＣ１０を０．０２５Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８、０．０２５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＰＡ中のＤＴＴ  ３．２５モル当量によって、３７℃にて２時間処理した。この混合物を水で５倍に希釈し、ヒドロキシアパタイトカラム（ＭａｃｒｏｐｒｅｐセラミックタイプＩ  ４０μｍ、ＢｉｏＲａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）に流速１０ｍＬ／分で加えた。カラムサイズは、ｃＡＣ１０  １０ｍｇ当たり１ｍＬであった。カラムは事前に、５カラム容量の０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡にしておいた。添加後、カラムを５カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄して、次に１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出させた。溶出後にＤＴＰＡを１ｍＭまで添加した。１．０ｍｇ／ｍＬ溶液での２８０ｎｍにおける吸光度値１．５８を使用してタンパク質濃度を定量し、モル濃度を分子量１４８，４４９ｇ／ｍｏｌを用いて決定した。生成された抗体−システインチオールの濃度を、ＤＴＮＢを用いた滴定によって決定すると、代表的に、抗体当たり４．０〜４．５個のチオールが生じた。
【０１８４】
還元ｃＡＣ１０を抗体−システインチオールに対してわずかに過剰なｖｃＭＭＡＥ（１．１モル当量）によってアルキル化した。ｖｃＭＭＡＥの溶解性を維持するために、最終反応混合物中に１０％  ＤＭＳＯが存在していた。あるいはｖｃＭＭＡＥは、５体積％のアルコール、例えばエタノールおよびイソプロピルアルコールを含む溶液中に保持することが可能であった。アルキル化反応を０℃にて３０分間実施した。システイン（最終１ｍＭ）を使用して、すべての未反応ｖｃＭＭＡＥをクエンチさせた。ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥは、上述のようにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製した。溶出後に、緩衝液をＡｍｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  ３０Ｋカットオフスピン濃度デバイスを使用して、リン酸緩衝食塩水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）に交換した。タンパク質濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬ溶液での２８０ｎｍにおける吸光度値１．６２を使用して定量した。
【０１８５】
（方法２ａの実施例３）
大幅に過剰のＤＴＴを添加することによって、ｃＡＣ１０を完全に還元した。最終反応濃度は、８ｍｇ／ｍＬ  ｃＡＣ１０、０．０５Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８、０．０５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、および１ｍＭ  ＤＴＰＡであった。この溶液を３７℃にて３０分間インキュベートして、上述のようにＰＤ−１０カラムで脱塩することによって抗体を精製した。ＤＴＮＢ滴定によって決定されたように、これらの条件を使用して８よりもやや多い抗体−システインチオールが生成された。
【０１８６】
部分再酸化は、ＤＴＮＢを酸化剤として使用することによって達成された。還元ｃＡＣ１０（代表的に３０μＭ）を０℃まで冷却して、次にＤＴＮＢ  １．５〜２．５モル当量（最終濃度４５〜７５μＭ；Ｅ４の最高収率は、２．０当量を使用して得られた）で処理した。溶液を反転によって迅速に混合し、０℃にて１０〜２０分間インキュベートした。放出されたＴＮＢ−が黄色であるため、反応の程度が観察できる。代表的に、反応は数秒以内で完了したことが示される。システインを添加して（最終濃度１ｍＭ）、抗体システインとの混合ジスルフィド中ではなく、ＴＮＢ−としてすべてのＴＮＢが存在することを確認した。次に抗体を上述のようにＰＤ−１０カラムまたはヒドロキシアパタイトカラムで精製した。代表的に、４種の抗体−システインチオールは、この部分再酸化手順の後にＤＴＮＢ滴定によって観察された。ｖｃＭＭＡＥ薬物は最終的にこれらの抗体−システインチオールに結合され、上の方法１で述べたようにＰＤ−１０によって精製した。
【０１８７】
（方法２ｂの実施例４）
完全還元ｃＡＣ１０は、上の方法２ａで述べたように調製した。完全還元ｃＡＣ１０（代表的に３０μＭ）を０℃まで冷却し、次にＤＴＮＢ  １．５〜２．５当量（最終濃度４５〜７５μＭ）によって処理した。溶液を反転によって迅速に混合し、０℃にて１０分間インキュベートした。さらに精製せずに、部分的に再酸化させたｃＡＣ１０を次に冷アセトニトリルに溶解させたｖｃＭＭＡＥ  ５当量と迅速に混合した。方法１と同様に、アセトニトリルの最終濃度は２０％であった。結合反応では、ｃＡＣ１０最終濃度は、２４μＭであり（９６μＭ抗体−システインチオールまたは抗体当たり４個）、最終ｖｃＭＭＡＥ濃度は１２０μＭであった（５モル当量）。この溶液を０℃にて３０分間インキュベートしてから、システインによってクエンチさせ、上述のようにＰＤ−１０によって精製した。
【０１８８】
Ｅ４ミックスのヒドロキシアパタイトによる分取精製。数個の１５ｍＬ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  ３０Ｋカットオフスピン濃度デバイスを使用して、ｃＡＣ１０の緩衝液（２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−８０）をＰＢＳに交換した。ＰＢＳ中のｃＡＣ１０  １．０９ｇを、最終体積８９ｍＬのＤＴＴによって、以下のように完全に還元した：ｃＡＣ１０（８２．３μＭ）を０．０２５Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８、０．０２５Ｍ  ＮａＣｌ中の１０ｍＭ  ＤＴＴによって３７℃にて１時間処理した。この混合物を水で２５０ｍＬまで希釈し、７０ｍＬヒドロキシアパタイトカラム（ＭａｃｒｏｐｒｅｐセラミックタイプＩ  ４０μｍ、ＢｉｏＲａｄ）に流速１０ｍＬ／分で加えた。カラムは事前に、５カラム容量の０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡にしておいた。添加後、カラムを５カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄して、次に１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出させた。
【０１８９】
完全還元ｃＡＣ１０をＤＴＮＢによって以下のように再酸化した：上記から溶出された物質（６．０２ｍｇ／ｍＬまたは４０．２μＭ、１７０ｍＬ中１．０２ｇ）を０℃まで冷却し、次にＤＴＮＢ  ２．０当量（１０ｍＭストック）で２０分間処理した。さらに精製せずに、再酸化させたｃＡＣ１０をｖｃＭＭＡＥに結合させた。冷ｃＡＣ１０（最終３１．９μＭ）を、最終体積２１４ｍＬのＤＭＳＯ（最終２０％）中に溶解させたｖｃＭＭＡＥ  ５当量（最終１５９．５μＭ）で処理した。０℃にて４０分後、１００ｍＭシステイン  １．０７ｍＬを添加して、すべての未反応ｖｃＭＭＡＥをクエンチさせ、混合物を水で７５０ｍＬまで希釈した。結合体をＤＴＴ還元のために上述のようにヒドロキシアパタイトカラムで精製した。回収したｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ  Ｅ４ミックス（０．９９ｇ、またはｃＡＣ１０に基づいて９１％の全収率）を濃縮して、数個の１５ｍＬ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  ３０Ｋカットオフスピン濃度デバイスを使用して緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０１９０】
ＨＩＣによる純Ｅ４の分取精製は、４５ｍＬ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌフェニル６５０Ｍ  ＨＩＣカラムによって、流速１０ｍＬ／分で周囲温度にて実施した。溶媒Ａは２Ｍ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７であった。溶媒Ｂは８０％ｖ／ｖ  ５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７および２０％ｖ／ｖアセトニトリルであった。カラムは事前に５カラム容量の溶媒Ａで平衡にした。ヒドロキシアパタイト（上記）によって精製したｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ  Ｅ４ミックス最大４００ｍｇを１容量の４Ｍ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７と混合してカラムに添加した。Ｅ０はカラムによって保持されなかった。連続段階勾配によって、異なる薬物付加種を溶出した：Ｅ２を３５％溶媒Ｂによって溶出させ、Ｅ４を７０％溶媒Ｂによって溶出させ、Ｅ６を９５％溶媒Ｂによって溶出させ、Ｅ８を１００％溶媒Ｂによって溶出させた。精製したＥ４を濃縮して、数個の１５ｍＬ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  ３０Ｋカットオフスピン濃度デバイスを使用して緩衝液をＰＢＳに交換し、４００ｍｇ精製物２回分から純Ｅ４  ２３５ｍｇを得た。分析ＨＩＣによる純度分析（以下）は、９０％を超えるＥ４純度を示した。
【０１９１】
（方法１の実施例５）
ＴＣＥＰ制限還元と、それに続く中間精製なしのアルキル化は、ｃＡＣ１０を０．０２５Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ８、０．０２５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＰＡ中のＴＣＥＰ  ２．７５モル当量により３７℃にて２時間処理することによって実施した。図９も参照のこと。次に混合物を０℃まで冷却して、部分還元ｃＡＣ１０を上述のようにｖｃＭＭＡＥによってアルキル化した。ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥは、リン酸緩衝食塩水で平衡にしたＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を使用して脱塩した（部分還元は、図８に示すように、部分還元抗体の中間精製ステップを用いても実施できる）。
【０１９２】
異性体分布の動力学を決定するために使用したサンプルは、以下のように調製した：ｃＡＣ１０を５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５および５ｍＭ  ＥＤＴＡ中のＤＴＴ  ３．０当量によって３７℃にて還元した。表示した時点でサンプルを取り出して、同量の２００ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ５によってクエンチさせ、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝食塩水によって平衡にしたＰＤ−１０カラムを使用して精製した。還元ｃＡＣ１０は上述のようにｖｃＭＭＡＥによって処理し、リン酸緩衝食塩水によって平衡にしたＰＤ−１０カラムを使用して精製した。
【０１９３】
ＨＩＣによる純Ｅ２、純Ｅ４、および純Ｅ６の精製は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌフェニル６５０Ｍ  ＨＩＣカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，モンゴメリービル、ペンシルベニア州）によって、流速１０ｍＬ／分で周囲温度にて実施した。カラムサイズはｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ  ７．５ｍｇ当たり１ｍＬであった。溶媒Ａは２．０Ｍ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７であった。溶媒Ｂは８０％ｖ／ｖ  ５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７および２０％ｖ／ｖアセトニトリルであった。カラムは事前に５カラム容量の溶媒Ａで平衡にした。ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥを０．６７容量の５Ｍ  ＮａＣｌ（最終２．０Ｍ）と混合して、カラムに添加した。Ｅ０はカラムによって保持されなかった。連続段階勾配によって、異なる薬物付加種を溶出した：Ｅ２を３５％溶媒Ｂによって溶出させ、Ｅ４を７０％溶媒Ｂによって溶出させ、Ｅ６を９５％溶媒Ｂによって溶出させ、Ｅ８を１００％溶媒Ｂによって溶出させた。精製したＥ４を濃縮して、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  ３０Ｋカットオフスピン濃度デバイスを使用して緩衝液をリン酸緩衝食塩水に交換した。
【０１９４】
（分析方法の実施例６）
薬物付加は、２５０および２８０ｎｍにおける吸光度の比（Ａ２５０／２８０）を測定することによって決定した。ｃＡＣ１０当たりのｖｃＭＭＡＥの数は実験的に（Ａ２５０／２８０−０．３６）／０．０６８６と決定されている。
【０１９５】
結合体は、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅエーテル−５ＰＷカラム（ｐａｒｔ０８６４１）を流速１ｍＬ／分およびカラム温度３０℃にて使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、Ｅ４純度のパーセントについて分析した。溶媒Ａは５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７および２Ｍ  ＮａＣｌであった。溶媒Ｂは、８０％  ５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１０％  ２−プロパノール、および１０％アセトニトリルであった。１５分間のアイソクラチック０％Ｂ、５０分間の０〜１００％Ｂの線形勾配、０．１分間の１００〜０％Ｂの線形勾配、そして１４．９分間のアイソクラチック０％Ｂ。注入（代表的に９０〜１００μＬ）は、１容積の精製ｖｃＭＭＡＥ−ｃＡＣ１０結合体（少なくとも３ｍｇ／ｍＬの濃度）および１容積の５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７および４Ｍ  ＮａＣｌであった。
【０１９６】
ＨＩＣクロマトグラフィーからの純Ｅ４を含むＡＤＣをＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて変性および非還元条件下で分析した。タンパク質２００チップを変性条件下であるが、製造業者によって記載されるように使用した。簡潔には、１ｍｇ／ｍＬ  ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ  ４μＬを非還元性付加緩衝液２μＬと混合して、１００℃まで５分間加熱した。水（８４μＬ）を添加し、この混合物６μＬをチップの各ウェルに付加した。
【０１９７】
最後に純Ｅ４をＰＬＲＰ−Ｓカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で分析した。流速は１ｍＬ／分であり、カラム温度は６５℃であった。溶媒Ａは０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液であり、溶媒Ｂは０．０４％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液であった。３分間のアイソクラチック２５％Ｂ、１５分間の５０％Ｂまでの線形勾配、２分間の９５％Ｂまでの線形勾配、１分間の２５％Ｂまでの線形勾配、そして２分間のアイソクラチック２５％Ｂ。注入は、以前に２０ｍＭ  ＤＴＴによって３７℃にて２０分間還元して、鎖間ジスルフィドを開裂させたｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ  １０μＬであった。
【０１９８】
ＡＤＣもまた、変性および還元条件下でＰＬＲＰ−Ｓカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（２．１ｘ１５０ｍｍ、８μ、１０００Å）によって分析した。流速は１ｍＬ／分であり、カラム温度は８０℃であった。溶媒Ａは０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液であり、溶媒Ｂは０．０４％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液であった。３分間のアイソクラチック２５％Ｂ、２５分間の５０％Ｂまでの線形勾配、２分間の９５％Ｂまでの線形勾配、１分間の２５％Ｂまでの線形勾配、そして２分間のアイソクラチック２５％Ｂ。注入は、以前に２０ｍＭ  ＤＴＴによって３７℃にて１５分間還元して、残りの鎖間ジスルフィドを開裂させた１ｍｇ／ｍＬ  ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ  １０〜２０μＬであった。各鎖のモル分率は、以下のモル吸光係数を使用して決定した：０ｖｃＭＭＡＥを含む軽鎖：３０，１６０Ｍ−１ｃｍ−１；１ｖｃＭＭＡＥを含む軽鎖：３１，６６０Ｍ−１ｃｍ−１；０ｖｃＭＭＡＥを含む重鎖：８６，９１５Ｍ−１ｃｍ−１；１ｖｃＭＭＡＥを含む重鎖：８８，４１５Ｍ−１ｃｍ−１；２ｖｃＭＭＡＥを含む重鎖：８９，９１５Ｍ−１ｃｍ−１；３ｖｃＭＭＡＥを含む重鎖：９１，４１５Ｍ−１ｃｍ−１。
【０１９９】
Ｅ２およびＥ６の異性体分布は、ＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣデータのみを使用して決定した。Ｅ２異性体Ａでは（これらの分析では、「異性体Ａ」は図７の異性体２Ａおよび２Ｂの両方を指す）、０ｖｃＭＭＡＥを含む軽鎖（Ｌ０）のモル分率は１ｖｃＭＭＡＥを含む重鎖（Ｈ１）のモル分率と等しいが、Ｅ２異性体Ｃでは、０および１ｖｃＭＭＡＥを含む軽鎖のモル分率および０および１ｖｃＭＭＡＥを含む重鎖のモル分率はすべて等しい。１ｖｃＭＭＡＥを含む軽鎖（Ｌ１）および０ｖｃＭＭＡＥを含む重鎖（Ｈ０）のみが異性体Ｃのパーセンテージに寄与するため、異性体Ｃのパーセントは、以下のように表される：
％Ｃ＝２Ｌ１＋２Ｈ０  （１）。
【０２００】
異性体Ａのパーセントは１００−％Ｃであると仮定される。２または３ｖｃＭＭＡＥを含む少量（合計３％未満）の重鎖がＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣデータに見られることが多い。これらはおそらく、Ｅ２サンプル中のＥ４汚染またはＥ６汚染によるものである。Ｅ２異性体ＡおよびＣのパーセントを計算するために、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ１、およびＨ２のモルパーセントの合計を１００％に設定した。
【０２０１】
同様に、Ｅ６異性体Ａ（これらの分析では「異性体Ａ」は図７の異性体６Ａおよび６Ｂの両方を指す）では、Ｈ２のモル分率はＬ１のモル分率に等しいが、Ｅ６異性体Ｃでは、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ２、およびＨ３のモル分率は等しい。Ｌ０およびＨ３のみが異性体Ｃのパーセンテージに寄与するため、異性体Ｃのパーセントは以下のように表すことができる：
％Ｃ＝２Ｌ０＋２Ｈ３  （２）。
異性体Ａのパーセントは１００−％Ｃであると仮定される。Ｅ２と同様に、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ２、およびＨ３のモルパーセントの合計を１００％に設定した。
【０２０２】
Ｅ４異性体のパーセンテージは、独自の溶液がないため、ＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣデータのみからでは得ることができない。他の２つの異性体についてＰＬＲＰデータを使用して解き得る前に、少なくとも１つの異性体を確定する必要がある。ＨＨＬ、ＨＨ、およびＨＬのモルパーセントは、以下の分子量を使用してバイオアナライザから決定した：１２４，７２０．８（ＨＨＬ）、１００，９９２．６（ＨＨ）、および７４，２２４．５（ＨＬ）ｇ／ｍｏｌ。バイオアナライザは機器の読み出しのために結合染料の蛍光を使用し、そしてＨＨＬ、ＨＨ、およびＨＬが単位分子量当たり染料を等しく結合することが仮定されるが、この仮定が真実である可能性は低い。この仮定から生じる誤差を最小限にするために、以下のようにＨＨＬ、ＨＨ、およびＨＬピーク面積を使用してバイオアナライザデータから異性体Ｅ４Ａのみを計算した（重鎖−重鎖ジスルフィドが開裂される場合に、各抗体は２ＨＬを生成するため、ＨＬピーク面積を２で割る）：
【０２０３】
【化５】
2008500961.tif 000007
次にＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣデータを使用して、Ｅ４異性体ＥおよびＦの残りの寄与について、以下の式を使用して解く：
％Ｅ＝Ｈ１＋Ｌ１−０．５％Ａ  （４）
％Ｆ＝Ｈ２＋ＬＯ−０．５％Ａ  （５）。
【０２０４】
Ｅ４異性体Ａは、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ１、およびＨ２の集団に等しく寄与し、異性体ＡのＨ１およびＬ１による寄与（その全体の寄与の半分）をＨ１およびＬ１の観察された総量から引いて、異性体Ｅの存在に起因するはずであるＨ１およびＬ１の残りの量を得る必要がある。異性体Ａに対するＨ２およびＬ０の寄与に関する同様の引算は、異性体Ｆによって存在する量を与える。Ｅ２およびＥ６と同様に、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ１、およびＨ２のモルパーセントの合計は１００％に設定した。
【０２０５】
（タンパク質の部分付加のための方法についての実施例７）
部分薬物付加ＡＤＣを調製するために、２つの異なる方法を使用した。第１に、限定量のＤＴＴまたはＴＣＥＰによるｃＡＣ１０の部分還元は、８抗体システイン未満で生じた。ＤＴＴおよびＴＣＥＰ約３．２５および２．７５当量はそれぞれ、２個の鎖間ジスルフィド結合を開裂させて、抗体当たり平均４ｃＡＣ１０システインを生じる（０、２、４、６、および８抗体−システインの混合物）。還元剤の量は経験的に決定できる：ｃＢＲ９６は４抗体システインを生じるためにＤＴＴまたはＴＣＥＰ  ２．１当量のみを必要とするが、マウスＩｇＧ１抗体は、還元に対する極度の耐性のためにしばしば使用可能である（データを示さず）。ＤＴＴではなくＴＣＥＰを使用する利点は、ホスフィンはマレイミドとごくわずかしか反応していないので、ｖｃＭＭＡＥを添加する前に残りの還元剤を除去する必要がないことである。過剰なＤＴＴは容易にｖｃＭＭＡＥと反応して、薬物に関して抗体−システインと競合する。抗体還元の後、わずかにモル過剰のｖｃＭＭＡＥによる抗体システインの処理（システイン当たり１．１モル当量）は、抗体当たり４ＭＭＡＥの平均薬物付加されたｃＡＣ１０を生じる（Ｅ４ミックス）。
【０２０６】
あるいはｃＡＣ１０は、１０ｍＭ  ＤＴＴによって完全に還元して、次にＤＴＮＢによって部分的に再酸化することができる。この再酸化プロセスは非常に効率的であり、８個の抗体システインを４個まで再酸化するために、ＤＴＮＢ  ２．０当量を必要とする。この再酸化抗体のシステインなどのチオールによる処理は、結合されたチオニトロ安息香酸を遊離させず、このことは、再酸化システインが混合ＴＮＢ−システインジスルフィドではなく、むしろ抗体ジスルフィドの形であることを示唆している。以下に述べる分析方法も、抗体ジスルフィドの存在を示している。残りの抗体システインは、上述のようにｖｃＭＭＡＥに結合体化してＥ４ミックスを生じ得る。
【０２０７】
薬物付加種の異性体集団を決定するために、Ｅ２、Ｅ４、およびＥ６を分離および単離して、純Ｅ２、純Ｅ４、および純Ｅ６を得る。図１３Ａは、ＤＴＴ部分還元によって生成されたＥ４ミックスの疎水性相互作用（ＨＩＣ）ＨＰＬＣトレースを示す。偶数の薬物が付加された種はすべて相互に分離可能であり得、奇数の薬物が付加された種の少量が偶数種の間の谷間に見られる。これらの種の薬物付加は、ピークのＵＶスペクトルの検査によって割当てられ得る。薬物リンカー内のＰＡＢＡ基は、２４８ｎｍ付近に最大吸収を有するが、抗体は同じ波長に最小吸収を有する。２４８および２８０ｎｍにおける薬物および抗体吸光係数を使用すると、抗体当たりの薬物数は、開始ＡＤＣ混合物および観察された各ピークに対して割当てられ得る（Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：７０６３−７０）。
【０２０８】
表１は、ＤＴＴ部分還元、ＴＣＥＰ部分還元、および部分ＤＴＮＢ再酸化によって調製された偶数薬物付加種のパーセンテージを示す。ＤＴＮＢ部分還元方法は、部分還元方法（ＤＴＴでは３０％、ＴＣＥＰでは３３％）よりもわずかに高いＥ４のパーセンテージ（３８％）を生じる。これは主にＥ６およびＥ８を犠牲にして得られるものであり、Ｅ６およびＥ８はＤＴＴ部分還元では約３４％、ＴＣＥＰ部分還元では３１％に達するが、ＤＴＮＢ部分再酸化ではわずかに２４％である。奇数の薬物が付加された種は表に示しておらず、全物質の７〜１０％に相当する。
【０２０９】
（表１．Ｅ４混合物の組成パーセントａ）
【０２１０】
【表１】
2008500961.tif 000008
ａＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、組成パーセントに統合した。値は４（ＤＴＴ部分還元）、３（ＴＣＥＰ部分還元）、または６（ＤＴＮＢ部分再酸化）の独立バッチについての±標準偏差である。奇数種からの寄与分は示されていないため、合計は１００％未満となっている。
【０２１１】
このＨＩＣ−ＨＰＬＣ方法は、２、３ミリグラムの純Ｅ２、純Ｅ４、および純Ｅ６を単離するために使用できる。あるいは段階的勾配を使用する分取ＨＩＣは、図１３Ｂ、Ｃ、Ｄに示すように、数百ミリグラムの純Ｅ２、純Ｅ４、および純Ｅ６を単離するために使用できる。これらの物質の純度は、薬物付加レベルに関して少なくとも９５％である。
【０２１２】
抗体上での薬物の分布を決定するために、これらの精製物質は、２つの分析方法を受け供された（実施例６を参照）。第１に、ＰＬＲＰ−Ｓカラムを用いた還元および変性ＨＰＬＣ使用して、抗体鎖当たりの薬物数を決定した。過剰なＤＴＴを用いたＡＤＣの予備処理は、残存する鎖間ジスルフィドを切断して、０または１個の薬物を含む軽鎖（Ｌ０およびＬ１）の、０、１、２、または３個の薬物を含む重鎖（Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３）からの分離を可能にする（図４）。第２に、非還元および変性キャピラリー電気泳動は、残存鎖間ジスルフィドがインタクトのままでの抗体鎖の分離を可能にし、６つの潜在的な種：Ｌ、Ｈ、ＨＬ、ＨＨ、ＨＨＬ、およびＨＨＬＬを生じさせる（図１５）。
【０２１３】
ＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって観察された種の定量化は、異性体集団への分類を可能にする。図１および７は、抗体フラグメントおよび異性体それぞれに結合された薬物の数を示す。Ｅ２およびＥ６の異性体集団は、各異性体が独自のパターンを生じるため、ＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣ単独で、またはキャピラリー電気泳動単独で容易に決定できる。たとえば変性および還元条件下では、異性体Ｅ２ＣのみがＬ１およびＨ０を生じるのに対して、Ｅ２ＡのみがＬ０およびＨ１を生じ、変性および非還元条件では、異性体Ｅ２ＡがＨＨＬＬを生じるのに対して、Ｅ２ＣはＬおよびＨＨＬを生じる。Ｅ４では、ＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣもキャピラリー電気泳動も単独では異性体集団を計算するのに十分ではないため、組成を決定するために２つの方法を組合せて使用する必要がある。表２は、これらの各異性体の組成パーセントを示す。ＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣデータを独占的に使用して、式１および２を用いてＥ２およびＥ６異性体の異性体組成を計算した（実施例６を参照）。キャピラリー電気泳動を使用して、式３を用いてＥ４Ａの量を計算し、ＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣを使用して、式４および５を用いて、Ｅ４Ａの寄与を引いて、Ｅ４ＢおよびＥ４Ｃの量を計算した（実施例６を参照）。
【０２１４】
（表２．精製されたＥ２、Ｅ４およびＥ６の異性体集団の組成）
【０２１５】
【表２】
2008500961.tif 000009
ａ式１を用いてＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣデータから決定。ｂ式３を用いてバイオアナライザデータから決定。ｃ式４および５を用いてＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣデータから決定。ｄ式２を用いてＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣデータから決定。
【０２１６】
表２のデータは、産生方法が薬物の配置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）に著しく影響を及ぼすということから、特筆すべきものであり、抗体ジスルフィドを選択的に還元できることを示唆している。部分ＤＴＴ還元は、重鎖−軽鎖ジスルフィドの１つの還元から生じる９２％の異性体Ｅ２Ｃと、両方の重鎖−軽鎖ジスルフィドの還元から生じる５９％の異性体Ｅ４Ｅと、両方の重鎖−重鎖ジスルフィドおよび１つの重鎖−軽鎖ジスルフィドの還元から生じる９８％の異性体Ｅ６Ｃを生じる。１つの重鎖−重鎖ジスルフィドが還元された異性体は、極めて少量である。これに対して、部分ＤＴＮＢ再酸化は、Ｅ２およびＥ４異性体については７７％の異性体Ｅ２Ａおよび７５％のＥ４Ａ（１つの重鎖−重鎖ジスルフィドがインタクトである）という、ほぼ反対の結果、そしてＥ６については９６％のＥ６Ｃという同じ結果を生じる。ＡＥＴを用いた酸性還元は、ＤＴＴ部分還元と非常に類似している異性体集団を生じ、重鎖−軽鎖ジスルフィドの開裂に有利に働く。
【０２１７】
ＤＴＴ部分還元の異性体分布の反応動態を表３に示す。ｃＡＣ１０を、３．０当量のＤＴＴによって還元して、サンプルを定期的に取り出し、ｖｃＭＭＡＥによってアルキル化した。純Ｅ２、純Ｅ４、および純Ｅ６をＨＩＣ−ＨＰＬＣによって得て、異性体分布をＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣおよびバイオアナライザによって決定した。異性体組成は、還元時間１０〜１２０分および抗体当たり薬物１．３〜３．９個の全薬物付加の範囲での実験の過程にわたって同一である。これらの結果は、限定量のＤＴＴによってｃＡＣ１０を２時間還元することによって調製された、表２に示すＤＴＴ部分還元の異性体集団が、還元反応の全過程にわたる異性体集団を代表することを示している。
【０２１８】
（表３．ＤＴＴ部分還元の異性体分布の反応動態）
【０２１９】
【表３】
2008500961.tif 000010
ａ還元時間。いったん還元された場合、すべての抗体をｖｃＭＭＡＥによって同じ時間処理した。ｂＨＩＣ−ＨＰＬＣによって決定。ｃ式１を用いてＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣデータから決定。ｄ式３を用いてバイオアナライザデータから決定。ｅ式４および５を用いてＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣデータから決定。ｆ式２を用いてＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣデータから決定。Ｎ／Ｄ、決定されず。この時点では、ごく少量のＥ６が産生され、この物質は異性体集団を決定するのには不十分であった。
【０２２０】
（表４．ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥのインビトロ結合および細胞毒性）
【０２２１】
【表４】
2008500961.tif 000011
ａ４〜７回の独立した測定から決定された、抗体成分のμｇ／ｍＬでのＫａｒｐａｓ２９９への結合±標準偏差、Ｎ／Ｄ、決定されず。
ｂ３回の独立した測定から決定された抗体成分のｎｇ／ｍＬでのインビトロ細胞毒性±標準偏差。Ｎ／Ｄ、決定されず。ｃＡＣ１０は単独でＫａｒｐａｓ２９９に対して有効性が乏しい。
【０２２２】
表４に、ＡＤＣについて複数の薬物付加レベルで実施したインビトロ結合および細胞毒性実験の結果を挙げる。Ｅ２およびＥ４ミックスは、ＤＴＴ部分還元およびＤＴＮＢ部分再酸化からの純Ｅ２および純Ｅ４と同様に試験した。抗体当たり８個の薬物を持つ完全付加結合体は最も細胞毒性であり、ＣＤ３０陽性Ｋａｒｐａｓ２９９細胞株に対して２．７ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値を有する（抗体の重量に基づいて計算）。抗体当たり４個の薬物を持つＡＤＣはわずかに細胞毒性が低く、ＩＣ５０値は３．４ｎｇ／ｍＬと５．０ｎｇ／ｍＬとの間であり、抗体当たり２個の薬物を持つＡＤＣは最も細胞毒性が低く、ＩＣ５０値は１１．４〜１３．８ｎｇ／ｍＬである。ＡＤＣを産生するために使用した化学作用は、細胞毒性に著しい相違を示さず、混合物とＨＩＣ精製ＡＤＣとの間にも著しい相違がなかった。インビトロ細胞毒性は、薬物の全用量のみに依存すると考えられる。ＣＤ３０陽性細胞への結合はＥ０、Ｅ２、およびＥ４では非常に似ており、Ｅ８はわずかに損なわれ、結合体化が抗原結合を妨害しないことを示す。ＡＤＣのインビトロ細胞毒性（抗体成分の測定）は、予想された傾向：薬物の数が多くなればなるほど、ＩＣ５０値が低くなることを示している。実験誤差の範囲内で、薬物の配置はインビトロ細胞毒性に影響を及ぼさないとみられる。
【０２２３】
（モノクローナル抗体薬物結合体の抗腫瘍活性に対する薬物付加効果についての実施例８）
細胞および試薬。ＣＤ３０陽性ＡＬＣＬ株Ｋａｒｐａｓ−２９９をＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ドイツ）より入手した。異種移植片増殖に適したＨＤ株Ｌ５４０の誘導体である、Ｌ５４０ｃｙは、Ｄｒ．Ｈａｒａｌｄ  Ｓｔｅｉｎ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ，Ｕｎｉｖ．Ｖｅｉｎｉｋｕｍ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｈｉｎｄｅｎｂｕｒｇｄａｍｍ３０，１２２００  ベルリン、ドイツ）から快く提供していただいた。細胞株は、１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，ゲイサーズバーグ、メリーランド州）で培養した。
【０２２４】
ｃＡＣ１０−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣの構築および精製。簡潔には、抗体当たり８個の薬物を持つｃＡＣ１０をジチオトレイトール（ＤＴＴ）と３７℃にて３０分混合することによって産生して、１ｍＭジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を含有するＰＢＳを用いたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５樹脂を介した溶出によって緩衝液を交換した。１ｍＭ  ＤＴＰＡ（ＰＢＳ／Ｄ）を含有するＰＢＳを還元ｍＡｂに添加した（最終濃度２．５ｍｇ／ｍＬ）。Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥと呼ばれる９．５モル過剰のマレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥを還元抗体に４℃にて１時間にわたって添加し、２０倍過剰のシステインを添加することによって結合体化反応をクエンチした。反応混合物を遠心分離限外濾過によって濃縮し、４℃にてＰＢＳ中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５を介して緩衝液を交換した。次に結合体を０．２ミクロンフィルタで滅菌条件下にて濾過した。
【０２２５】
抗体当たり２および４ＭＭＡＥ分子を持つｃＡＣ１０  ＡＤＣの産生は、部分還元と、それに続くＶａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥによる反応を包含した。抗体ｃＡＣ１０（１０ｍｇ／ｍＬ）は、最終ＤＴＴ：ｍＡｂモル比３．０までのＤＴＴの添加と、それに続く３７℃での約２時間のインキュベーションにより部分還元された。次に還元反応を約１０℃まで冷却して、還元ｃＡＣ１０を過剰ＤＴＴからダイアフィルトレーションによって精製した。ダイアフィルトレーション後に、部分還元ｃＡＣ１０のチオール濃度をＤＴＮＢ（Ｅｌｌｍａｎの）アッセイによって決定した；この方法では、平均約２個のジスルフィド結合が還元され、それゆえ約４の還元Ｃｙｓ：ｍＡｂを露出させた。還元Ｃｙｓすべてを結合体化するために、最終Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ：還元Ｃｙｓモル比  約１．１５までＶａｌ−Ｃｉｔ−ｃＭＭＡＥを添加した。１５％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯの存在下で結合反応を実施して、約１０℃にて約３０分間進行させた。結合体化反応の後、過剰な遊離Ｃｙｓ（Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ  １モル当たり２モルのＣｙｓ）を添加して、未反応Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥをクエンチして、Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ付加体を産生させた。Ｃｙｓクエンチング反応を約１０℃にて約３０分間進行させた。Ｃｙｓクエンチング反応混合物を精製し、ダイアフィルトレーションにより緩衝液をＰＢＳに交換して、部分付加ｃＡＣ１０−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥを得た。
【０２２６】
分取ＨＩＣ分画化。すべてのクロマトグラフ工程を室温にて実施した。１．６ｘ２５ｃｍカラム（約５０ｍＬ）にＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ  ＨＩＣ樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，モンゴメリービル、ペンシルベニア州）を充填して、＞５カラム容積の緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）により流速１５ｍＬ／分にて平衡化した。カラムへ充填するためのサンプルを調製するために、部分付加ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ  ３９ｍＬ（１２．９ｍｇ／ｍＬ）を緩衝液Ａ’３９ｍＬ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）とブレンドした。サンプルをカラムに１０ｍＬ／分で充填した；後の工程は、すべて１０ｍＬ／分の流速にて実施した。サンプル充填の後に、Ａ２８０ベースラインに到達するまでカラムを緩衝液Ａで洗浄した。ｃＡＣ１０−Ｅ２は、６５％緩衝液Ａ／３５％緩衝液Ｂからなる段階的勾配を用いて溶出および収集した（８０％ｖ／ｖ  ５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２０％ｖ／ｖアセトニトリル）。ベースラインに再度到達した後、ｃＡＣ１０−Ｅ４を３０％緩衝液Ａ／７０％緩衝液Ｂからなる段階的勾配によって溶出および収集した。ｃＡＣ１０−Ｅ２およびｃＡＣ１０−Ｅ４ピークを、どちらもその各ピーク高さの約２０％まで収集した。目的の画分は、３０ｋＤａの分子量カットオフを用いたＵｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心分離フィルタデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ビルリカ、マサチューセッツ州）を使用して、緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０２２７】
結合体の分析。結合体の分析は、エーテル−５ＰＷカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，モンゴメリービル、ペンシルベニア州）を使用してＨＩＣ−ＨＰＬＣによって実施した。方法は、５０分間の１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｃ（８０％ｖ／ｖ  ５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１０％ｖ／ｖアセトニトリル、１０％ｖ／ｖイソプロパノール）までの線形勾配により構成されていた。流速は１ｍＬ／分に設定され、温度は３０℃に設定され、検出は２４８ｎｍおよび２８０ｎｍの両方にて追跡した。未改変（ｍｏｄｉｆｙ）ｃＡＣ１０およびｃＡＣ１０−Ｅ８ピークの同定は、ｃＡＣ１０およびｃＡＣ１０−Ｅ８標準の注入により確認した。抗体および薬物は別個の吸収極大（それぞれλｍａｘ＝２８０ｎｍおよび２４８ｎｍ）を有するため、ピークスペクトルを重ねることによって、抗体当たり２、４、６個の薬物を持つｃＡＣ１０結合体に相当するピークを同定することが可能であった。
【０２２８】
ｃＡＣ１０−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣのインビトロ特徴づけ。結合体化または薬物の存在が抗原結合に影響を及ぼすかどうかを判定するために、ＡＤＣに対する競合結合を実施した。ｍＡｂおよびＡＤＣの飽和結合を比較するために、５ｘ１０５Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞を、氷上の染色培地中で３０分間、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ユージーン、オレゴン州）によって標識された１μｇ／ｍＬ  ｃＡＣ１０の存在下で、ｃＡＣ１０、ｃＡＣ１０−Ｅ２、ｃＡＣ１０−Ｅ４、またはｃＡＣ１０−Ｅ８の連続希釈と混合し、氷冷染色培地で２回洗浄した。標識細胞をＦｕｓｉｏｎマイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ボストン、マサチューセッツ州）によって検査した。サンプルデータをバックグラウンド補正して、１μｇ／ｍＬ  ｃＡＣ１０−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８単独で染色された細胞の蛍光で割ったサンプル蛍光によって算出された最大蛍光パーセントとして報告した
ＤＮＡ合成を測定することによってｃＡＣ１０結合体の増殖阻害活性を決定した。結合体をＣＤ３０＋Ｋａｒｐａｓ−２９９またはＬ５４０ｃｙ細胞またはＣＤ３０−ＷＳＵ−ＮＨＬ細胞によってインキュベートした。ｃＡＣ１０またはｃＡＣ１０を用いた９２時間のインキュベーションの後、ＡＤＣ細胞を０．５μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］−チミジンによって３７℃にて４時間に渡って標識した。ハーベスタを使用して細胞をフィルタ上に収集し、シンチレーション流体と混合して、放射能をＴｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，メリデン、コネチカット州）を用いて測定した。各分子について未処理のパーセントを濃度に対してプロットして、ＩＣ５０を決定した（ＤＮＡ合成の５０％阻害を与えるｍＡｂ濃度として定義される）。
【０２２９】
ヒトＡＬＣＬの異種移植モデル。ＡＬＣＬの皮下疾患モデルを確立するために、５ｘ１０６Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞をＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウス（Ｈａｒｌａｎ，インディアナポリス、インディアナ州）の右側腹に移植した。各群６〜１０匹の動物の腫瘍サイズが平均して約５０〜１００ｍｍ３になったときに、ＡＤＣを用いた療法を開始した。処置は、１回の注射、または注射４回について４日ごとに注射１回のスケジュール（ｑ４ｄｘ４）を使用した複数回の静脈内注射のどちらかで構成されていた。腫瘍体積は、式（長さｘ幅２）／２を使用して計算した。触診できないほどにサイズが縮小した腫瘍は、完全後退（ＣＲ）として定義した。１０腫瘍倍増時間以上続いた完全後退を治癒として定義した。対照グループの腫瘍のサイズが７５０〜１０００ｍｍ３に達したときに腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を以下のように計算した：
【０２３０】
【化６】
2008500961.tif 000012
最大耐容用量。３匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ，インディアナポリス、インディアナ州）の群に、ｃＡＣ１０−Ｅ８  ３０〜６０ｍｇ／ｋｇ、ｃＡＣ１０−Ｅ４  ６０〜１２０ｍｇ／ｋｇ、またはｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ２  ２００〜２５０ｍｇ／ｋｇを尾静脈に注射して、単回投与最大許容用量（ＭＴＤ）を決定した。マウスを毎日１４日間監視し、重量および臨床観察の両方を記録した。著しい苦痛の徴候を発現したマウスをＡＣＵＣガイドラインに従って殺処分した。最大許容用量は、いずれの動物においても注射の２週間以内に深刻で明白な毒性または２０パーセントを超える体重減少を引き起こさない最大用量として定義した。
【０２３１】
薬物動態学。ｃＡＣ１０、ｃＡＣ１０−Ｅ２、ｃＡＣ１０−Ｅ４、およびｃＡＣ１０−Ｅ８の薬物動態学をＳＣＩＤマウスで評価した。ＳＣＩＤマウス（ｎ＝３）に試験物質１０ｍｇ／ｋｇ（抗体成分に基づいて）を尾静脈注射によって投与した。血液サンプルは、伏在静脈への注射後１時間、４時間、１日、２日、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、および４９日に各マウスから収集した。ヘパリンをコーティングしたチューブに血液を収集して、続いて遠心分離（１４，０００ｘｇ、３分間）にかけて血漿を単離した。ｃＡＣ１０およびＡＤＣの血漿濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０２３２】
簡潔には、ＥＬＩＳＡは以下の工程より構成されていた：プレートコート、ブロック、サンプル結合、二次ｍＡｂ、ＴＭＢ、および酸停止。各工程後に、ウェルを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ＝７．４）で３回洗浄した。プレートコート工程では、９６ウェルプレートへ炭酸塩緩衝液（０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩、ｐＨ＝９．６）中の２μｇ／ｍＬの抗ｃＡＣ１０ｍＡｂを４℃にて一晩コーティングした。プレートコートの後、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加して、室温にて１時間インキュベートした。次に標準または希釈血漿サンプル１００μＬを３つのウェルにて室温で１時間添加した。二次工程は、１時間インキュベートされたマウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，バーミンガム、アラバマ）より構成されていた。次に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ，セントルイス、ミズーリ州）１００μＬを各ウェルに添加して、発色時に１Ｎ硫酸１００μＬによって反応を停止させた。ＶＭａｘ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，サニーベール、カリフォルニア州）によって、光学密度を４５０ｎｍにて、ブランクを６３０ｎｍにて測定した。非コンパートメント（ｎｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，マウンテンビュー、カリフォルニア州）を用いて計算した。
【０２３３】
インビトロ特徴づけ。ＭＭＡＥのｃＡＣ１０への結合体化がＡＤＣのＣＤ３０結合能力を阻害したかどうかを評価するために、競合結合実験を実施した。ＣＤ３０＋Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞を、未標識抗体、ｃＡＣ１０−Ｅ２、ｃＡＣ１０−Ｅ４、またはｃＡＣ１０−Ｅ８の連続希釈と結合させた１μｇ／ｍＬ  蛍光標識ｃＡＣ１０を用いてインキュベートした。図１０に示すように、ＡＤＣ改変体は、それぞれ未標識ｃＡＣ１０と同等に、の蛍光標識ｃＡＣ１０と効果的に競合した。それゆえＭＭＡＥとの結合体化は、抗原結合を減少させなかった。
【０２３４】
ＡＤＣのインビトロ細胞毒性活性を、ＣＤ３０＋Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞およびＬ５４０ｃｙ細胞およびＣＤ３０−ＷＳＵ−ＮＨＬ細胞を用いた［３Ｈ］−ＴｄＲ包含アッセイによって評価した。ｃＡＣ１０−Ｅ８は、１．０ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０が、Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞に対する著しい活性を示した（図１１ａ）。ｍＡｂ当たり４個のＭＭＡＥ分子（ｃＡＣ１０−Ｅ４）に対する薬物の量を半分に減少させると、ＩＣ５０が２．９ｎｇ／ｍＬへと上昇した。薬物付加を再度半分にすると、ｃＡＣ１０−Ｅ２のＩＣ５０が６．２ｎｇ／ｍＬにさらに上昇した。ＨＤ株Ｌ５４０ｃｙに対して、ＡＤＣは同様の傾向を有し、ｃＡＣ１０−Ｅ８、ｃＡＣ１０−Ｅ４、およびｃＡＣ１０−Ｅ２のＩＣ５０値はそれぞれ１．４ｎｇ／ｍＬ、４．５ｎｇ／ｍＬ、および９．２ｎｇ／ｍＬであった（図１１ｂ）。ＡＤＣの選択性を、ＣＤ３０−ＷＳＵ−ＮＨＬ細胞株を用いて評価した。この細胞株は、すべてのｃＡＣ１０−ＡＤＣに対して不感受性であり、ＩＣ５０値＞１０００ｎｇ／ｍＬであった（データは示さず）。
【０２３５】
ヒトＡＬＣＬの異種移植モデル。インビボ抗腫瘍活性に対する薬物付加の効果をＫａｒｐａｓ−２９９皮下異種移植モデルで評価した。療法は、腫瘍体積が５０〜１００ｍｍ３に達したときに開始し、４日ごとに合計４回の注射を投与した（ｑ４ｄｘ４）。このスケジュールを使用した場合、１ｍｇ／ｋｇのｃＡＣ１０−Ｅ８は、１００％  ＣＲを生じさせ、同じ用量でｃＡＣ１０−Ｅ４が１００％  ＣＲを得たことが以前に見出された（データは示さず）。ＡＤＣの活性を比較する目的で、ｃＡＣ１０−Ｅ４およびｃＡＣ１０−Ｅ８についてより少ない用量を使用した。皮下Ｋａｒｐａｓ−２９９異種移植片を保有するマウス集団をｃＡＣ１０−Ｅ２（０．５ｍｇ／ｋｇ／用量または１ｍｇ／ｋｇ／用量）、ｃＡＣ１０−Ｅ４（０．２５または０．５ｍｇ／ｋｇ／用量）、またはｃＡＣ１０−Ｅ８（０．２５または０．５ｍｇ／ｋｇ／用量）の複数回の投与で処置した。表５は、有効性結果のまとめを示す。
【０２３６】
（表５）
【０２３７】
【表５】
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表５：皮下Ｋａｒｐａｓ−２９９異種移植モデルにおけるｃＡＣ１０−Ｅ２、ｃＡＣ１０−Ｅ４、ｃＡＣ１０−Ｅ４混合物、およびｃＡＣ１０−Ｅ８の抗腫瘍活性。腫瘍体積が５０〜１００ｍｍ３に達したら、動物をＡＤＣで処置した。投与は、１回（ｘ１）または４日おきに４回（ｑ４ｄｘ４）与えた。完全後退、治癒および腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）の数を報告する。治癒した１匹のマウスが腫瘍塊の徴候なく第７２日に死亡して発見された。
【０２３８】
ｃＡＣ１０−Ｅ８はＭＭＡＥ量の２倍を同じｍＡｂ用量のｃＡＣ１０−Ｅ４として有していたが、それらは両方の用量レベルで等しく有効であった（図１２Ａ）。０．５ｍｇ／Ｋｇ／用量にて、ｃＡＣ１０−Ｅ４によって処置した１０匹の動物のうち、５匹が完全後退（ＣＲ）を達成し、ｃＡＣ１０−Ｅ８は１０匹中６匹でＣＲを誘起した。未処置腫瘍は、移植１９日後に９８６ｍｍ３の平均腫瘍体積に達した。ｃＡＣ１０−Ｅ４の腫瘍増殖阻害は、ｃＡＣ１０−Ｅ８の９０％に対して９１％であった。０．２５ｍｇ／ｋｇ／用量にて、これらのＡＤＣの両方が未処置対照動物と比較して腫瘍増殖で同様の遅延を誘発したが、完全後退はなかった。０．５ｍｇ／ｋｇ／用量のｃＡＣ１０−Ｅ４および０．２５ｍｇ／ｋｇのｃＡＣ１０−Ｅ８として同じ量のＭＭＡＥを含有する用量である、１．０ｍｇ／ｋｇ／用量でのｃＡＣ１０−Ｅ２は、１０／１０の治癒を誘起した。０．５ｍｇ／ｋｇ／用量のｃＡＣ１０−Ｅ２による腫瘍増殖に対する効果は、６８％のＴＧＩを生じる０．２５ｍｇ／ｋｇ／用量のｃＡＣ１０−Ｅ４およびｃＡＣ１０−Ｅ８で見られた効果に匹敵していた。薬物ＭＭＡＥとｃＡＣ１０との物理的混合物は、０．５ｍｇ／ｋｇ用量のｃＡＣ１０−Ｅ８と同等であり、未処置と比較して腫瘍増殖のわずかな遅延のみを引き起こし、薬物の抗体への結合が抗腫瘍活性を達成するために重要であることを強調した。
【０２３９】
次にこの同じモデルでのｃＡＣ１０−Ｅ２、ｃＡＣ１０−Ｅ４、およびｃＡＣ１０−Ｅ８の単回投与処置を１．０ｍｇ／ｋｇにて比較した（図１２Ｂ）。ｃＡＣ１０−Ｅ８で処置した動物６匹のうち５匹が治癒を達成した。ｃＡＣ１０−Ｅ４で処置した動物６匹のうち、すべてが完全後退を達成して、５匹が試験終了の１０８日までに治癒し、動物１匹が腫瘍塊の徴候なく第７２日に死亡して発見された。１．０ｍｇ／ｋｇのｃＡＣ１０−Ｅ２は、ｃＡＣ１０−Ｅ４の半分のＭＭＡＥを含有するが、マウス６匹のうち４匹がＣＲを達成した。ｃＡＣ１０  １ｍｇ／ｋｇと、ｃＡＣ１０−Ｅ８  １ｍｇ／ｋｇに含有されている薬物の量に相当する遊離ＭＭＡＥ  ０．０３７ｍｇ／ｋｇからなる対照グループは、未処置マウスと比較して腫瘍増殖に対する影響をほとんど有していなかった。
【０２４０】
部分付加ＡＤＣの初期結合は、０〜８個の薬剤／ｍＡｂを含有する種の混合物を生じた。この混合物（ｃＡＣ１０−Ｅ４混合物）の活性を評価するために、ｃＡＣ１０−Ｅ４混合物の単回投与抗腫瘍活性を１．０ｍｇ／ｋｇの精製ｃＡＣ１０−Ｅ４と比較した。前の単回投与実験と同様に、ｃＡＣ１０−Ｅ４で処置したマウス１０匹中９匹がＣＲを達成した。平均モル比４．０のｃＡＣ１０−Ｅ４混合物で処置したマウス１０匹中８匹で完全後退が生じた。部分付加ｃＡＣ１０−Ｅ４混合物は、種々に薬物付加されたＡＤＣの集団を含有しているが、精製ｃＡＣ１０−Ｅ４と同等の抗腫瘍活性を示した。
【０２４１】
最大許容用量および治療濃度域。ｃＡＣ１０−Ｅ２、ｃＡＣ１０−Ｅ４、およびｃＡＣ１０−Ｅ８の単回投与許容性を１群あたり３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスで評価した。最大許容用量（ＭＴＤ）は、いずれの動物においても２０パーセントを超える体重減少あるいは重篤な苦痛の徴候または明白な毒性を誘発しない最高用量として定義した。ｃＡＣ１０−Ｅ８では、３０〜６０ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ間隔でマウスに投薬した。５０ｍｇ／ｋｇの用量では、マウスは注射６日後に１４％の最大体重減少を有し、その後、体重減少は回復した。１匹の動物において、６０ｍｇ／ｋｇの用量は注射６日後に、２３％の体重減少を誘発した。１００ｍｇ／ｋｇのｃＡＣ１０−Ｅ４では、マウスは約１０％の最大体重減少に達した。１２０ｍｇ／ｋｇのｃＡＣ１０−Ｅ４にて、動物１匹が著しい苦痛の徴候および１７％の体重減少を示し、この動物を安楽死させた。試験を行った最高用量の２５０ｍｇ／ｋｇまでの用量のｃＡＣ１０−Ｅ２で処置したマウスは、注射６日後に１０．５％の最大体重減少を経験し、苦痛の徴候はなかった。我々の観察に基づいて、ｃＡＣ１０−Ｅ２のＭＴＤは少なくとも２５０ｍｇ／ｋｇであり、ｃＡＣ１０−Ｅ４は１００ｍｇ／ｋｇであり、ｃＡＣ１０−Ｅ８は５０ｍｇ／ｋｇであった。治療指数は、単回投与ＭＴＤの複数回投与有効用量に対する比として定義され、ｃＡＣ１０−Ｅ８では１００、ｃＡＣ１０−Ｅ４では２００、ｃＡＣ１０−Ｅ２では少なくとも２５０を得た。
【０２４２】
薬物動態学。ＳＣＩＤマウスにｃＡＣ１０、ｃＡＣ１０−Ｅ２、ｃＡＣ１０−Ｅ４、およびｃＡＣ１０−Ｅ８を投与して、薬物付加が薬物動態学にどのような影響を及ぼすかを判定した。表６は、非コンパートメント分析によって確立された薬物動態パラメータを示す。
【０２４３】
【表６】
2008500961.tif 000014
表６．１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＳＣＩＤマウスにおけるｃＡＣ１０およびｃＡＣ１０  ＡＤＣの薬物動態パラメータ。半減期（ｔ１／２）、曲線下面積（ＡＵＣ）、クリアランス（ＣＬ）、分布体積（Ｖｚ）、および注射から第１４日までの曲線下面積（ＡＵＣｔ（０−１４ｄ））は、非コンパートメント分析を使用して計算した。
【０２４４】
ｃＡＣ１０、ｃＡＣ１０−Ｅ２、ｃＡＣ１０−Ｅ４、およびｃＡＣ１０−Ｅ８の時間−濃度曲線は、バイエクスポネンシャルな下降に従った。末期半減期はそれぞれ１６．７日、１６．９日、１４．０日および１４．７日であり、それゆえ薬物付加とは直接相関していなかった。しかしながらＡＵＣによって決定されたＡＤＣの暴露は薬物付加が減少するにつれ上昇し、未改変ｃＡＣ１０の２６３８μｇ日／ｍＬからｃＡＣ１０−Ｅ８の５２０μｇ日／ｍＬの範囲であった。反対に、クリアランス値はｃＡＣ１０の３．８ｍＬ／日／ｋｇからｃＡＣ１０−Ｅ２、ｃＡＣ１０−Ｅ４、およびｃＡＣ１０−Ｅ８それぞれの４．４、６．０および１９．２ｍＬ／日／ｋｇまで上昇した。同様に、分布体積は薬物付加に直接相関することが見出された。
【０２４５】
（インビボ有効性のさらなる試験についての実施例９）
Ｋａｒｐａｓ２９９  ＣＤ３０陽性細胞株を使用してインビボ有効性実験を実施し、表７に示す。皮下Ｋａｒｐａｓ−２９９腫瘍をＣ．Ｂ．−１７  ＳＣＩＤマウスで増殖させ、腫瘍が約１００ｍｍ３（長さｘ幅２）に達したときに、試験品を投与した。動物を５〜１０匹の群に分けて、各群にＡＤＣを静脈内注射した。用量は２倍連続希釈（０．５、１．０、２．０ｍｇ／Ｋｇ）で作製して、測定できないサイズまで退縮した腫瘍を完全寛解として定義した。数回（３〜８回、動物４匹の一群であるＥ６Ｐを除いて、用量当たり動物５〜１５匹）の実験で≧８０％の完全寛解を生じた用量を有効用量として割当てた。試験したすべてのＡＤＣで、注射した薬物成分の量が薬物付加によって変化したという事実にかかわらず、有効用量は１ｍｇ／Ｋｇであった。実験（２倍連続希釈）の精度範囲内で、薬物の異性体分布は有効性に影響を及ぼさなかった。
【０２４６】
ＡＤＣの許容性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃ．Ｂ．−１７ＳＣＩＤの親株）にＡＤＣを投与した。動物の体重を測定して、１４日の期間に渡って臨床観察を記録した。ＭＴＤは、＞２０％の体重減少または苦痛の徴候を生じなかったＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した最高単回用量とした。用量は、Ｅ８では、４０、５０および６０ｍｇ／Ｋｇであり、用量は、Ｅ４では、８０、１００および１２０ｍｇ／Ｋｇであり、用量は、Ｅ２では、２００および２５０ｍｇ／Ｋｇである。以前に観察されたように（実施例８を参照）、絶対薬物付加レベルはＭＴＤに影響を及ぼし、より高い薬物付加レベルはより低いＭＴＤ値を有する。ＤＴＮＢ部分再酸化によって産生された純Ｅ４では、ＭＴＤは、ＤＴＴ部分還元によって産生された純Ｅ４よりもわずかに高かった（１２０対１００ｍｇ／Ｋｇ）。
【０２４７】
（表７．ＣＤ３０＋Ｋａｒｐａｓ２９９細胞に対するｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥのマウスインビボ有効性およびＭＴＤ）
【０２４８】
【表７】
2008500961.tif 000015
ａインビボ用量は、体重Ｋｇ当たりの抗体成分ｍｇに基づいていた。
【０２４９】
本明細書で言及した、または本明細書に援用された特許または特許出願に対して、明示または黙示を問わず実施権は与えられていない。上の議論は説明的、例証的、かつ例示的であり、添付された請求項のいずれかによって定義された範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【０２５０】
特許出願、特許および科学の刊行物を含む種々の参考文献が本明細書で引用され、そのそれぞれの開示は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２５１】
【図１】図１は、概略図の抗体の「Ｅ４」異性体（抗体当たり４個の薬物が結合された異性体）を示す。鎖間ジスルフィド結合は、抗体の重鎖−重鎖間および重鎖−軽鎖間の実線として示されている。薬物および抗体へのその結合箇所を円として示す。非還元（「Ｎｏｎ−ｒｅｄ」）および還元（「Ｒｅｄ」）条件の下で産生されたフラグメントを各異性体の下に示す（カッコ内はフラグメント当たりの薬物の数）。
【図２】図２は、方法２ａ：部分ＤＴＮＢ再酸化、ＰＤ−１０精製、およびｖｃＭＭＡＥ結合体化の１つの局面によって調製されたｖｃＭＭＡＥ−ｃＡＣ１０結合体の、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析におけるクロマトグラムの溶出プロフィールを示す。「Ｅ０」、「Ｅ２」、「Ｅ４」、「Ｅ６」および「Ｅ８」は、抗体当たり０、２、４、６および８個のＭＭＡＦ分子がそれぞれ結合したｃＡＣ１０抗体の異性体を指す。
【図３】図３は、方法２ｂ：ワンポットＤＴＮＢ再酸化およびｖｃＭＭＡＥ結合体化の別の局面のＨＩＣクロマトグラムを示す。「Ｅ０」、「Ｅ２」、「Ｅ４」、「Ｅ６」および「Ｅ８」は、抗体当たり０、２、４、６および８個のＭＭＡＦ分子がそれぞれ結合したｃＡＣ１０抗体の異性体を指す。純粋なＥ４は、約３４〜３８分より収集した（矢印で示す）。
【図４】図４は、方法１、２ａ、および２ｂからの一様な薬物付加種の抗体−薬物結合体の組成パーセントの棒グラフでの比較を示す。各種では、抗体−薬物結合体をＤＴＴ部分還元（左棒）、ＤＴＮＢ再酸化（中央棒）またはワンポットＤＴＮＢ再酸化（右棒）結合体化方法によって調製した。
【図５】図５は、図３（方法２ｂ）でＨＩＣクロマトグラムに示したように収集したＥ４材料のバイオアナライザによるトレースを示す。「Ｌ」は遊離軽鎖を示す。「Ｈ」は遊離重鎖を示す。「ＨＬ」は結合された重鎖−軽鎖を示す。「ＨＨ」は結合された重鎖−重鎖を示す。「ＨＨＬ」は結合された重鎖−重鎖および重鎖−軽鎖を示す。
【図６】図６は、図３（方法２ｂ）のＨＩＣクロマトグラムから収集した材料のＰＬＲＰ分析を示す。「Ｌ０」および「Ｌ１」はそれぞれ、薬物分子が結合していない、または薬物分子が１個結合した軽鎖を示す。「Ｈ０」、「Ｈ１」「Ｈ２」および「Ｈ３」は、０、１、２または３個の薬物分子が結合した重鎖を示す。
【図７】図７は、鎖間ジスルフィド結合の完全または部分還元と、それに続く薬物の結合体化によって得られた主な結合体種の概略表現を示す。完全還元および結合は主に、抗体当たり８つの薬物を持つ完全付加種を生成するのに対して、部分還元および結合は、図示した種すべての産生を引き起こすことができる。０および８薬物付加種にはそれぞれ異性体が１つのみあるが、２、４および６薬物付加種は３つ、４つおよび３つの異性体をそれぞれ含有する（図１を参照して、種４Ａが種４Ｃの鏡像であり、種４Ｂが種４Ｄの鏡像であることに注目する。図７では、種４Ａおよび種４Ｃは種４Ａと呼ばれ、種４Ｂおよび種４Ｄは種４Ｂと呼ばれる）。鎖間ジスルフィド結合は、抗体の重鎖−重鎖間または重鎖−軽鎖間の実線として示す。薬物および抗体へのその結合箇所を円として示す。
【図８】図８は、Ｅ４混合異性体（Ｅ４Ｍ）を産生するためにＤＴＴを使用する「部分還元」結合プロセスの１つの局面のプロセスフローダイアグラムである。ｃＡＣ１０抗体のｐＨは、リン酸水素二ナトリウムによって７．５に調製し、ＥＤＴＡを５ｍＭの最終濃度まで添加する。次に抗体溶液を３７℃に加熱する。抗体を部分還元するために、ＤＴＴ  ２．９５モル当量を抗体溶液に添加して、３７℃にて１０５分間還元する。還元後、抗体溶液を２〜８℃に冷却して、過剰なＤＴＴを定容限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）によって濾過し、還元された精製ｃＡＣ１０を得る。還元された精製ｃＡＣ１０のサンプルを取り、Ａ２８０およびＤＴＮＢ試験によって、チオール濃度、抗体濃度、およびチオール対抗体モル比を決定する。次にやや過剰の薬物−リンカーｖｃＭＭＡＥ（通例、ＤＭＳＯ溶液の形で２〜１５％過剰）を抗体溶液に添加して、結合反応を開始させる。結合反応を２〜８℃にて３０分間進行させて、粗Ｅ４Ｍを得る。結合反応の終わりに、過剰のｖｃＭＭＡＥ薬物−リンカーを、大幅に過剰のシステインと２〜８℃にて１５分間反応させることによってクエンチし、クエンチされた粗Ｅ４Ｍを得る。緩衝液交換ならびに遊離薬物および他の小型分子種の除去は、定容量ＵＦ／ＤＦ（代表的には、６〜１０透析体積）によって実施し、Ｅ４Ｍ薬物物質を得る。
【図９】図９は、Ｅ４混合異性体（Ｅ４Ｍ）を産生するための、中間精製ステップが使用されないＴＣＥＰを使用する「部分還元」結合プロセスの別の局面のプロセスフローダイアグラムである。ｃＡＣ１０抗体のｐＨは、リン酸水素二ナトリウム７．５に調製し、ＥＤＴＡを５ｍＭの最終濃度まで添加する。次に抗体溶液を３７℃に加熱する。抗体を部分還元するために、ＴＣＥＰ  ２．２０モル当量を抗体溶液に添加して、３７℃にて１０５分間還元する。還元反応のサンプルを取り、Ａ２８０およびＤＴＮＢ試験によって、チオール濃度、抗体濃度、およびチオール対抗体モル比を決定する。還元後、抗体溶液を２〜８℃に冷却する。次にやや過剰の薬物−リンカーｖｃＭＭＡＥ（通例、ＤＭＳＯ溶液の形で２〜１５％過剰）を抗体溶液に添加して、結合反応を開始させる。結合反応を２〜８℃にて２０分間進行させて、粗Ｅ４Ｍを得る。結合反応の終わりに、過剰のｖｃＭＭＡＥ薬物−リンカーを、大幅に過剰のＮ−アセチルシステインと２〜８℃にて２０分間反応させることによってクエンチし、クエンチされた粗Ｅ４Ｍを得る。緩衝液交換ならびに遊離薬物および他の小型分子種の除去は、定容ＵＦ／ＤＦ（通例６〜１０透析体積）によって実施し、Ｅ４Ｍ薬物物質を得る。
【図１０】図１０は、ＣＤ３０＋Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞によるｃＡＣ１０結合体化抗体の内部移行のグラフを示す。細胞を蛍光標識ｃＡＣ１０  １ｇ／ｍＬおよびｃＡＣ１０、ｃＡＣ１０−Ｅ２、ｃＡＣ１０−Ｅ４、またはｃＡＣ１０−Ｅ８のいずれかの２０μｇ／ｍＬ〜９ｎｇ／ｍＬの連続希釈物と合せた。抗体による細胞のインキュベーションの後、標識細胞を染色溶媒で洗浄し、蛍光を測定した。実施例８で述べるように、正規化蛍光強度をｍＡｂ濃度に対してプロットした。
【図１１】図１１は、ＣＤ３０＋細胞によるｃＡＣ１０およびｃＡＣ１０結合体化抗体の内部移行のグラフを示す：Ａ）Ｋａｒｐａｓ−２９９およびＢ）Ｌ５４０ｃｙ細胞をｃＡＣ１０ならびにｃＡＣ１０  ＡＤＣのＥ２、Ｅ４およびＥ８種の連続希釈物によってインキュベートした。サンプルを用いた９６時間のインキュベーションの後、［３Ｈ］−ＴｄＲを添加して、その包含を測定した。処置サンプルの放射能を未処理対照へ正規化して、濃度に対してプロットした。
【図１２】図１２は、皮下異種移植を持つＳＣＩＤマウスにおけるｃＡＣ１０およびｃＡＣ１０結合抗体のインビボ有効性を示す。図１２Ａは、ｃＡＣ１０−Ｅ２を０．５ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇにて注射４回を４日おきに注射された、Ｋａｒｐａｓ−２９９皮下腫瘍を持つＳＣＩＤマウスによる結果を示す。ｃＡＣ１０−Ｅ４およびｃＡＣ１０−８は、０．２５または０．５ｍｇ／ｋｇのどちらかで、注射４回を４日おきに投薬された。図１２Ｂは、Ｅ２、Ｅ４またはＥ８の１．０ｍｇ／ｋｇでの単回投与によって処置された、Ｋａｒｐａｓ−２９９皮下腫瘍を持つＳＣＩＤマウスの結果を示した。
【図１３】図１３は、（Ａ）Ｅ４ミックス；（Ｂ）分取ＨＩＣによって作成した純Ｅ２；（Ｃ）分取ＨＩＣによって作成した純Ｅ４；および（Ｄ）分取ＨＩＣによって作成した純Ｅ６のそれぞれの疎水性相互作用クロマトグラフィーＨＰＬＣトレースを示す。サンプルは、ＤＴＴ部分還元と、それに続くＭＭＡＥ結合によって作成した。クロマトグラムは、各クロマトグラムの最高ピークの高さへ正規化した。注射は、２．０Ｍ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７  ５０μＬと混合した、ＰＢＳ中の５〜１０ｍｇ／ｍＬ  ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ  ５０μＬであった。分離は３０℃にて実施した。
【図１４】図１４は、（Ａ）部分ＤＴＴ還元と、それに続くＭＭＡＥ結合によって作成したＥ４ミックス（上トレース）；（Ｂ）ＤＴＮＢ部分再酸化と、それに続くＭＭＡＥ結合によって作成したＥ４ミックス（上から２番目のトレース）；（Ｃ）部分ＤＴＴ還元と、それに続くＭＭＡＥ結合によって作成し、分取ＨＩＣによって精製した純Ｅ４（下から２番目のトレース）；および（Ｄ）部分ＤＴＮＢ再酸化と、それに続くＭＭＡＥ結合によって作成し、分取ＨＩＣによって精製した純Ｅ４（下トレース）のＰＬＲＰ−Ｓ  ＨＰＬＣトレースを示す。注射は、２０ｍＭ  ＤＴＴで３７℃にて１５分間処理した１ｍｇ／ｍＬ  ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ  ２０μＬであった。分離は８０℃にて実施した。
【図１５】図１５は、（Ａ）部分ＤＴＴ還元と、それに続くＭＭＡＥ結合によって作成したＥ４ミックス（上トレース）；（Ｂ）ＤＴＮＢ部分再酸化と、それに続くＭＭＡＥ結合によって作成したＥ４ミックス（上から２番目のトレース）；（Ｃ）部分ＤＴＴ還元と、それに続くＭＭＡＥ結合によって作成し、分取ＨＩＣによって精製した純Ｅ４（下から２番目のトレース）；および（Ｄ）部分ＤＴＮＢ再酸化と、それに続くＭＭＡＥ結合によって作成し、分取ＨＩＣによって精製した純Ｅ４（下トレース）のバイオアナライザ（キャピラリー電気泳動）トレースを示す。サンプルは、メーカーが指示した通りに非還元条件下で調製した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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