(57)【要約】  本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）から誘導されるペプチド、およびそれらをコードする核酸に関する。ペプチドは、宿主においてＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘発するペプチドである。本発明はまた、ＨＣＶ感染の防止および処置のための組成物ならびにワクチンならびに患者におけるＨＣＶ暴露の検出のための診断方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶタンパク質から誘導され、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性Ｔリンパ球応答を誘導することが可能な少なくとも２つのペプチドを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、少なくとも１つのペプチドがＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドであることを特徴とする、単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項２】
前記少なくとも２つのペプチドが、遺伝子型１ａ、１ｂおよび／または３ａのＨＣＶコンセンサス配列に存在することをさらに特徴とする、請求項１に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項３】
少なくとも１つのＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドが、ＨＬＡ分子に結合し、前記分子は、ＨＬＡ−ＣグループＨＬＡ−Ｃｗ０３、Ｃｗ０４、Ｃｗ０６またはＣｗ０７から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項４】
少なくとも２つのペプチドが、ＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドならびに、
・ＨＬＡ分子に結合し、前記分子は、ＨＬＡ−ＡグループＨＬＡ−Ａ０１、−Ａ０２、−Ａ０３、−Ａ１１または−Ａ２４から選択されることを特徴とするＨＬＡ−Ａ結合性ペプチド、
・ＨＬＡ分子に結合し、前記分子は、ＨＬＡ−ＢグループＨＬＡ−Ｂ０７、−Ｂ０８、−Ｂ３５、−Ｂ４０または−Ｂ４４から選択されることを特徴とするＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチド、
・ＨＬＡ分子に結合し、前記分子は、ＨＬＡ−ＣグループＨＬＡ−Ｃｗ０３、Ｃｗ０４、Ｃｗ０６またはＣｗ０７から選択されることを特徴とするＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチド、および
・ＨＬＡ分子に結合し、前記分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１グループＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１、−ＤＲＢ１＊０３または−ＤＲＢ１＊０４から選択されることを特徴とするＨＬＡ−ＤＲＢ１結合性ペプチド、
からなる群から選択されるペプチドからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項５】
少なくとも２つのペプチドが表１３および／または１４から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項６】
少なくとも１つのＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドが、配列番号１０４８、１０９５、１７３０、３４９、４７５、１１１、２０６６、１５１１、１４５４、１１００および９０７からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項７】
配列番号５５７、１２４１、１４５６、１４７８、１８３３、１８８７、６７、９２２、６６、３６１、１０７０、１０７２、１１５１、７１、１２３３、１２６９、７５、７３、１３９６、５、８７、９１、２３８、２６５、１６６１、１７５３、７６、８１、９２、１９３３、１９３４、６９、２０４３、２０４７、７４、６３、２０５３、８３、５６、１５５、１５６、１２０５、１２０６、１６７、１３５０、４７、１４６、１６０９、１４４、３、３９、１５８、１６、１２２、１０３４、１０９５、１０９６、１１５０、２４６、１４０６、２３、１４８３、１５１２、８７、９３、１６２５、１６２６、５９、１７１０、２５０、８１、１８８５、１９１６、１９３８、２０４８、２７１、２０８３、１、８７７、１７、７、１０８６、１０８７、１４６８、１７００、１８９４、４０２、８３６、３８１、３７１、８５３、３７０、３８７、３０７、１２３７、１２８９、１３４３、１４１８、１４１９、３７５、１４３０、３８０、４５０、１５８２、３９０、１６７７、１６８７、１２１、３８６、３７２、９５、４４３、３９６、４５５、１４４１、４３６、１７１９、９２、３９４、１９６９、２８７、１２３７、１２８９、３７５、１４３０、１４４４、５８２、１１１７および５９からなる群から選択されるペプチドをさらに含んでなる、請求項６に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項８】
配列番号５５７、１２４１、１４５６、１４７８、１８３３、１８８７、６７、９２２、６６、３６１、１０７０、１０７２、１１５１、７１、１２３３、１２６９、７５、７３、１３９６、５、８７、９１、２３８、２６５、１６６１、１７５３、７６、８１、９２、１９３３、１９３４、６９、２０４３、２０４７、７４、６３、２０５３、８３、５６、１５５、１５６、１２０５、１２０６、１６７、１３５０、４７、１４６、１６０９、１４４、３、３９、１５８、１６、１２２、１０３４、１０９５、１０９６、１１５０、２４６、１４０６、２３、１４８３、１５１２、８７、９３、１６２５、１６２６、５９、１７１０、２５０、８１、１８８５、１９１６、１９３８、２０４８、２７１、２０８３、１、８７７、１７、７、１０８６、１０８７、１４６８、１７００および１８９４からなる群から選択されるＨＬＡ−Ａ結合性ペプチドから選択される少なくとも３つのペプチドを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、
そのことによって、前記ペプチドは、ＣＴＬ応答を誘導することが可能であることを特徴とする、単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項９】
配列番号４０２、８３６、３８１、３７１、８５３、３７０、３８７、３０７、１２３７、１２８９、１３４３、１４１８、１４１９、３７５、１４３０、３８０、４５０、１５８２、３９０、１６７７、１６８７、１２１、３８６、３７２、９５、４４３、３９６、４５５、１４４１、４３６、１７１９、９２、３９４、１９６９、２８７、１２３７、１２８９、３７５、１４３０、１４４４、５８２、１１１７および５９
からなる群から選択されるＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチドから選択される少なくとも３つのペプチドを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、
そのことによって、前記ペプチドは、ＣＴＬ応答を誘導することが可能であることを特徴とする、単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１０】
配列番号１０４８、１０９５、１７３０、３４９、４７５、１１１、２０６６、１５１１、１４５４、１１００および９０７からなる群から選択されるＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドから選択される少なくとも３つのペプチドを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、
そのことによって、前記ペプチドは、ＣＴＬ応答を誘導することが可能であることを特徴とする、単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１１】
配列番号２１４２、２２１３、２１５７、２２４５、２１６２、２１６４、２２３５、２１１３、２１８２、２１１１、２１８０、２２３６、２１１２、２１３２、２１９２、２１０７、２１３７、２１２５、２２２９、２１６６、２１３６、２１７７、２１５３、２１１０、２１５６、２２４１、２２２８、２２１９、２１８７、２２４９、２１９４、２２０７、２２３７、２１４９、２２０１、２１５８、２１０８および２２３２からなる群から選択されるＨＬＡ−ＤＲＢ１結合性ペプチドから選択される少なくとも３つのペプチドを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、
そのことによって、前記ペプチドは、ＨＴＬ応答を誘導することが可能であることを特徴とする、単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１２】
配列番号２１４２、２２１３、２１５７、２２４５、２１６２、２１６４、２２３５、２１１３、２１８２、２１１１、２１８０、２２３６、２１１２、２１３２、２１９２、２１０７、２１３７、２１２５、２２２９、２１６６、２１３６、２１７７、２１５３、２１１０、２１５６、２２４１、２２２８、２２１９、２１８７、２２４９、２１９４、２２０７、２２３７、２１４９、２２０１、２１５８、２１０８および２２３２からなる群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲＢ１結合性ペプチドをさらに含んでなる請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項１３】
前記少なくとも３つのペプチドが、遺伝子型１ａ、１ｂおよび／または３ａのＨＣＶコンセンサス配列に存在することをさらに特徴とする、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドの少なくとも１つが、異なるＨＬＡグループまたは遺伝子座から誘導されるＨＬＡ分子に対する交差結合活性を有することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項１５】
ＨＬＡ−Ａ結合性ペプチドがＨＬＡ分子に結合し、前記分子が、ＨＬＡ−ＡグループＨＬＡ−Ａ０１、−Ａ０２、−Ａ０３、−Ａ１１または−Ａ２４から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項１６】
ＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチドがＨＬＡ分子に結合し、前記分子が、ＨＬＡ−ＢグループＨＬＡ−Ｂ０７、−Ｂ０８、−Ｂ３５、−Ｂ４０または−Ｂ４４から選択されることを特徴とする、請求項９に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項１７】
ＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドがＨＬＡ分子に結合し、前記分子が、ＨＬＡ−ＣグループＨＬＡ−Ｃｗ０３、Ｃｗ０４、Ｃｗ０６またはＣｗ０７から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項１８】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１結合性ペプチドがＨＬＡ分子に結合し、前記分子が、ＨＬＡ−ＤＲＢ１グループＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１、−ＤＲＢ１＊０３または−ＤＲＢ１＊０４から選択されることを特徴とする、請求項１１または１２に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項１９】
少なくとも２つのペプチドが、異なるＨＬＡ遺伝子座から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項２０】
配列番号５５７、１２４１、１４５６、１４７８、１８３３、１８８７、６７、９２２、６６、３６１、１０７０、１０７２、１１５１、７１、１２３３、１２６９、７５、７３、１３９６、５、８７、９１、２３８、２６５、１６６１、１７５３、７６、８１、９２、１９３３、１９３４、６９、２０４３、２０４７、７４、６３、２０５３、８３、５６、１５５、１５６、１２０５、１２０６、１６７、１３５０、４７、１４６、１６０９、１４４、３、３９、１５８、１６、１２２、１０３４、１０９５、１０９６、１１５０、２４６、１４０６、２３、１４８３、１５１２、８７、９３、１６２５、１６２６、５９、１７１０、２５０、８１、１８８５、１９１６、１９３８、２０４８、２７１、２０８３、１、８７７、１７、７、１０８６、１０８７、１４６８、１７００、１８９４、４０２、８３６、３８１、３７１、８５３、３７０、３８７、３０７、１２３７、１２８９、１３４３、１４１８、１４１９、３７５、１４３０、３８０、４５０、１５８２、３９０、１６７７、１６８７、１２１、３８６、３７２、９５、４４３、３９６、４５５、１４４１、４３６、１７１９、９２、３９４、１９６９、２８７、１２３７、１２８９、３７５、１４３０、１４４４、５８２、１１１７、５９、１０４８、１０９５、１７３０、３４９、４７５、１１１、２０６６、１５１１、１４５４、１１００、９０７、２１４２、２２１３、２１５７、２２４５、２１６２、２１６４、２２３５、２１１３、２１８２、２１１１、２１８０、２２３６、２１１２、２１３２、２１９２、２１０７、２１３７、２１２５、２２２９、２１６６、２１３６、２１７７、２１５３、２１１０、２１５６、２２４１、２２２８、２２１９、２１８７、２２４９、２１９４、２２０７、２２３７、２１４９、２２０１、２１５８、２１０８および２２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド。
【請求項２１】
５０アミノ酸残基未満の免疫原性ペプチドに含まれる請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２２】
前記ペプチドはＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性Ｔリンパ球応答を誘導することが可能である、請求項２０または２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
請求項２０に記載のペプチドのアミノ酸配列に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列からなる単離されたペプチドであって、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性Ｔリンパ球応答を誘導することが可能である、単離されたペプチド。
【請求項２４】
表１３および１４から選択される２つもしくはそれ以上のエピトープを含んでなる単離されたネステッドエピトープ。
【請求項２５】
２つもしくはそれ以上のエピトープは表Ａから選択される、請求項２４に記載のネステッドエピトープ。
【請求項２６】
配列番号２２５４〜２２７８によって同定されるアミノ酸配列、またはその一部からなる、請求項２４または２５に記載のネステッドエピトープ。
【請求項２７】
９〜３５アミノ酸からなる請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のネステッドエピトープ。
【請求項２８】
請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチドまたはネステッドエピトープを含んでなる、単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項２９】
請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の少なくとも２つのペプチドまたはネステッドエピトープを含んでなる、単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項３０】
請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の少なくとも３つのペプチドまたはネステッドエピトープを含んでなる、単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項３１】
少なくとも３つのペプチドが、少なくとも２つのＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチドを少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ結合性ペプチドまたは少なくとも１つのＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドと組み合わせたものである、請求項３０に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項３２】
少なくとも２つのＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチドがＨＬＡ−Ｂ遺伝子座内の異なるＨＬＡグループから選択される、請求項３１に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項３３】
少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ結合性ペプチド、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチドおよび少なくとも１つのＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドを含んでなる、請求項３０に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項３４】
前記少なくとも２つもしくは３つのペプチドが、遺伝子型１ａ、１ｂおよび／または３ａのＨＣＶコンセンサス配列に存在することを特徴とする、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項３５】
ＨＴＬエピトープをさらに含んでなる、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項３６】
ＨＴＬエピトープが表１４から選択される、請求項３５に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項３７】
ＨＴＬエピトープがＰＡＮＤＲ結合性ペプチドである、請求項３５に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項３８】
少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ結合性ペプチド、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドまたは少なくとも１つのＨＣＶ由来ペプチドをさらに含んでなる、請求項１〜１９および２８〜３７のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項３９】
ペプチドが連続であるか、あるいはリンカーまたはスペーサーアミノ酸もしくはスペーサーペプチドによって分離されるかのいずれか一方である、請求項１〜１９および２８〜３７のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項４０】
ペプチドがホモポリマーおよび／またはヘテロポリマーとして存在する、請求項１〜１９および２８〜３７のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載のペプチド、ネステッドエピトープまたはポリエピトープペプチドをコードする、単離された核酸またはポリヌクレオチド。
【請求項４２】
少なくとも１つのスペーサー核酸をさらに含んでなる、請求項４１に記載の単離された核酸またはポリヌクレオチド。
【請求項４３】
シグナル配列および／またはプロモーター配列をさらに含んでなる、請求項４１または４２に記載の単離された核酸またはポリヌクレオチド。
【請求項４４】
請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の核酸またはポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
【請求項４５】
プラスミドである、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４６】
ウイルスベクターである、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４７】
請求項４４〜４６のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項４８】
請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の核酸またはポリヌクレオチドをベクターに導入することを含んでなる、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載のベクターを生成するための方法。
【請求項４９】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載のペプチド、ネステッドエピトープもしくはポリエピトープペプチド、または請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の核酸もしくはポリヌクレオチド、または請求項４４〜４６のいずれか一項に記載のベクター、あるいはそれらの組み合わせを含んでなる、組成物。
【請求項５０】
ペプチドまたは核酸が混合物として存在する、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
医薬組成物である、請求項４９または５０に記載の組成物。
【請求項５２】
薬学的に許容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルのうち少なくとも１つをさらに含んでなる、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
ワクチン組成物である、請求項５１または５２に記載の組成物。
【請求項５４】
医薬品としての使用のための請求項１〜４０のいずれか一項に記載のペプチド、ネステッドエピトープもしくはポリエピトープペプチド、または請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の核酸もしくはポリヌクレオチド、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載のベクター、または請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の組成物、あるいはそれらの組み合わせ。
【請求項５５】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載のペプチド、ネステッドエピトープもしくはポリエピトープペプチド、または請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の核酸もしくはポリヌクレオチド、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載のベクター、または請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の組成物、あるいはそれらの組み合わせの投与を含んでなる、被験体においてＨＣＶに対する免疫応答を誘導するための方法。
【請求項５６】
ＨＣＶを伴うかまたはその危険性のある被験体の処置のための医薬品の製造のための請求項１〜４０のいずれか一項に記載のペプチド、ネステッドエピトープもしくはポリエピトープペプチド、または請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の核酸もしくはポリヌクレオチド、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載のベクター、または請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の組成物、あるいはそれらの組み合わせの使用。
【請求項５７】
合成もしくは組換え的製造工程を含んでなる、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のペプチド、ネステッドエピトープまたはポリエピトープペプチドを生成するための方法。
【請求項５８】
合成的製造工程を含んでなる、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の核酸またはポリヌクレオチドを生成するための方法。
【請求項５９】
被験体が、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の１つもしくはそれ以上のペプチド、またはそれらをコードする核酸に対して免疫応答を有するかどうかを決定する工程を含んでなる、ＨＣＶに暴露された被験体について感染の結果を決定する方法。
【請求項６０】
免疫応答を評価するための請求項１〜４３のいずれか一項に記載のペプチド、またはそれらをコードする核酸の使用。
【請求項６１】
免疫リコール応答を評価するための請求項１〜４３のいずれか一項に記載のペプチド、またはそれらをコードする核酸の使用。
【請求項６２】
ワクチンの効力を評価するための請求項１〜４３のいずれか一項に記載のペプチド、またはそれらをコードする核酸の使用。
【請求項６３】
ＨＣＶワクチンの治療効果の結果を評価もしくは推定するための請求項１〜４３のいずれか一項に記載のペプチド、またはそれらをコードする核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）から誘導されるペプチドまたはそれらをコードする核酸に関する。ペプチドは、宿主において細胞障害性および／またはヘルパーＴリンパ球応答を誘発するペプチドである。本発明はまた、ＨＣＶ感染の防止および処置のためのワクチンならびに患者におけるＨＣＶ暴露の検出のための診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶウイルスの約９．６ｋｂ一本鎖ＲＮＡゲノムは、５’−および３’−非コーディング領域（ＮＣＲ）、ならびにこれらのＮＣＲの間に、約３０００アミノ酸のＨＣＶポリタンパク質をコードする約９ｋｂの単一の長いオープンリーディングフレームを含んでなる。
【０００３】
ＨＣＶポリペプチドは、オープンリーディングフレームからの翻訳および同時翻訳タンパク質分解プロセシングによって産生される。構造タンパク質は、コーディング領域のアミノ末端側の４分の１から誘導され、カプシドまたはＣｏｒｅタンパク質（約２１ｋＤａ）、Ｅ１エンベロープ糖タンパク質（約３５ｋＤａ）およびＥ２エンベロープ糖タンパク質（約７０ｋＤａ、以前はＮＳ１と呼ばれる）、ならびにＰ７（約７ｋＤａ）を含む。Ｅ２タンパク質は、ｐ７タンパク質のＣ末端融合を伴うまたは伴わずに生じ得る（非特許文献１）。最近、Ｆ（フレームシフト）タンパク質と呼ばれる約１７ｋＤのタンパク質をコードおよび発現しているＣｏｒｅ領域における代替的オープンリーディングフレームが見出された（非特許文献２；ウーおよびクー（Ｏｕ＆Ｘｕ）による特許文献１）。同じ領域において、他の１４〜１７ｋＤａ  ＡＲＦＰ（代替リーディングフレームタンパク質）のためのＯＲＦ、Ａ１〜Ａ４が発見され、少なくともＡ１、Ａ２およびＡ３に対する抗体が慢性感染患者において検出された（非特許文献３）。ＨＣＶコーディング領域の残りの部分から、ＮＳ２（約２３ｋＤａ）、ＮＳ３（約７０ｋＤａ）、ＮＳ４Ａ（約８ｋＤａ）、ＮＳ４Ｂ（約２７ｋＤａ）、ＮＳ５Ａ（約５８ｋＤａ）およびＮＳ５Ｂ（約６８ｋＤａ）を含む非構造ＨＣＶタンパク質が誘導される（非特許文献４）
【０００４】
ＨＣＶは、世界中に広まった非Ａ非Ｂ型肝炎の主な原因である。ＨＣＶによる急性感染（すべての急性肝炎感染の２０％）は、しばしば、慢性肝炎（すべての慢性肝炎の症例の７０％）および末期の肝硬変をもたらす。２０％までのＨＣＶの慢性キャリアが約２０年の期間の間に肝硬変を発症し、肝硬変を伴うキャリアのうち１〜４％／年の間は肝臓癌腫を発症する危険性がある（非特許文献５、非特許文献６）と推測される。ＨＣＶにより生じる末期の肝臓疾患の寿命を増加する選択肢は、肝移植である（世界中のすべての肝移植の３０％がＨＣＶ感染による）。
【０００５】
ウイルス特異的ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ拘束性細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、ウイルス感染のインビボでの防止および除去において主な役割を果たすことが公知である（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。
【０００６】
ＭＨＣ分子は、クラスＩまたはクラスＩＩのいずれか一方に分類される。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、事実上すべての有核細胞上で発現される。クラスＩ  ＭＨＣ分子に関連して提示されるペプチドフラグメントは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球（細胞障害性Ｔリンパ球またはＣＴＬ）によって認識される。ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、しばしば、刺激抗原を有する細胞を溶解することができる細胞障害性エフェクターに成熟する。ＣＴＬは、腫瘍細胞を排除し、ウイルス感染に抵抗するのに特に有効である。
【０００７】
クラスＩＩ  ＭＨＣ分子は、活性化されたリンパ球および抗原提示細胞において主に発現される。ＣＤ４＋Ｔリンパ球（ヘルパーＴリンパ球またはＨＴＬ）は、マクロファージまたは樹状細胞のような抗原提示細胞において通常見出されるクラスＩＩ  ＭＨＣ分子によって提示される独特なペプチドフラグメントの認識によって活性化される。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、増殖して、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の産生を介して抗体仲介応答を支持するか、またはＩＬ−２およびＩＦＮ−Γの産生を介して細胞仲介応答を支持するサイトカインを分泌する。
【０００８】
Ｔリンパ球は、無傷な（ｉｎｔａｃｔ）外来性抗原自体ではなく、むしろ、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合したペプチドフラグメントの形態の抗原を認識する。ＭＨＣクラスＩ分子によって提示される抗原は、典型的に、細胞によって内因的に合成されるもの（例えば、細胞内病原体）である。得られる細胞質抗原は、通常、プロテアソームによって、細胞質において小さなフラグメントに分解される（非特許文献１３）。ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される抗原は、通常、食作用、飲作用、または受容体仲介エンドサイトーシスを介して抗原提示細胞に進入する可溶性抗原である。一旦、細胞内に存在すると、抗原は、エンドソームの酸性プロテアーゼによって部分的に分解される（非特許文献１４；非特許文献１５）。
【０００９】
機能的ＨＬＡは、内在性ならびに外来性の潜在的な抗原ペプチドが結合する深い結合溝によって特徴付けられる。溝は、良好に規定される形状および物理化学的特性によってさらに特徴付けられる。ＨＬＡクラスＩ結合部位が閉じられ、ここで、ペプチドの末端は溝の端部に枢着される。それらはまた、水素結合と保存されたＨＬＡ残基とのネットワークに関与する（非特許文献１６）。これらの拘束性を考慮すると、結合ペプチドの長さは８〜１０残基に制限される。しかし、１２アミノ酸残基までのペプチドもまた、ＨＬＡクラスＩに結合することが可能であることが、非特許文献１７によって実証されている。異なるＨＬＡ複合体の構造の重ねあわせによって、結合の一般的態様が確認されたが、ここで、ペプチドは、相対的に線状の伸長された立体配座を採用する。
【００１０】
同時に、異なるペプチドの立体配座の有意な変動性も観察された。この変動性は、些細な構造的差異から顕著に異なる結合態様にまで範囲が及ぶ。クラスＩ分子が、長さ（８〜１２残基）およびアミノ酸配列においてばらつきがある数千種の異なるペプチドに結合することができるという事実を考慮すると、そのような変動は予想されない。異なるクラスＩアロタイプは、特定の位置における１または２つの保存されたアミノ酸残基を共有するペプチドに結合する。これらの残基は、アンカー残基と称され、相補的ポケットに収容される（非特許文献１８）。第１のアンカーの他に、より浅いポケットにおいて占有される第２のアンカー残基もまた存在する（非特許文献１９）。全体では、Ａ〜Ｆと呼ばれる６つのアリル特異的ポケットが特徴付けられている（非特許文献２０；非特許文献２１）。これらのポケットの構成は、クラスＩ分子の多型に従って変動し、高い程度の特異性（制限された交差反応性）を生じる一方、同時に広範な結合能を保存する。
【００１１】
ＨＬＡクラスＩ結合部位とは対照的に、クラスＩＩ部位は両端部において開いている。このため、ペプチドは、実際の結合領域から延在することが可能であり、それによって、両端部から「突き出して」いる（非特許文献２２）。従って、クラスＩＩ  ＨＬＡは、９〜２５アミノ酸残基を超える範囲の多様な長さのペプチドリガンドに結合することができる。ＨＬＡクラスＩと同様に、クラスＩＩリガンドの親和性は、「定常」および「可変」成分によって決定される。定常部もまた、ＨＬＡクラスＩＩの溝における保存された残基と結合されたペプチドの主鎖との間で形成される水素結合のネットワークから生じる。しかし、この水素結合のパターンは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端残基に制限されないが、鎖の全体に分布する。それは、複合されたペプチドの立体配座を厳密な線状態様の結合に制限するため、後者は重要である。これは、すべてのクラスＩＩアロタイプに共通である。ペプチドの結合親和性を決定する第２の成分は、クラスＩＩ結合部位内の多型の所定の位置によって変動する。異なるアロタイプは溝内において異なる相補的ポケットを形成し、それによって、ペプチド、または特異性のサブタイプ依存的選択を担う。重要なことに、クラスＩＩポケット内に保持されるアミノ酸残基に対する制約は、一般に、クラスＩに対するものより「柔軟」である。異なるＨＬＡクラスＩＩアロタイプ間には、ペプチドのさらに多くの交差反応性が存在する。クラスＩとは異なり、クラスＩＩアロタイプと相関関係があるペプチドリガンドにおける高度に保存された残基パターン（いわゆるモチーフ）を同定することはこれまで不可能であった。
【００１２】
いくつかのＭＨＣ複合体に結合するペプチドは、酸溶出（ａｃｉｄ  ｅｌｕｓｉｏｎ）方法（非特許文献２３）、クロマトグラフィー方法（非特許文献２４および非特許文献１８）、ならびに質量分析方法（非特許文献２５）によって同定されている。ＭＨＣクラスＩ分子に結合する天然にプロセスされるペプチドのレビューについては、非特許文献２６に記載されている。
【００１３】
複雑な外来性病原体によってコードされる数千種の可能なペプチドのうち、小さな画分のみが、最終的にＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ抗原に結合することが可能なペプチド形態になり、従って、一致するＴ細胞受容体を含有する場合、Ｔ細胞に認識され得る。この現象は、免疫優性として公知である（非特許文献２７）。さらに簡単に説明すると、免疫優性は、免疫化または生来の抗原全体への暴露によって、生来の抗原が含有するすべてのエピトープよりむしろ抗原の１つもしくは若干の「優性」エピトープに対する免疫応答を生じる現象を説明する。免疫優性は、ＭＨＣペプチド親和性、抗原プロセシングおよびＴ細胞受容体認識を含む様々な因子の影響を受ける。
【００１４】
ＨＣＶ感染によって観察される異種免疫応答を考慮すると、複数のＨＣＶエピトープに対して同時に指向される多特異的細胞免疫応答の誘導は、ＨＣＶに対する有効なワクチンの開発に重要であるようである。しかし、ＨＣＶ感染を除去する患者において認められる応答に対応する免疫応答を誘発するワクチン実施形態を確立する必要がある。
【００１５】
ＨＬＡ多型は、ワクチン開発のためのエピトープに基づくアプローチによって考慮するのに、かなりの程度で重要な因子である。この因子に取り組むために、エピトープ選択は、高度もしくは中程度の親和性で複数のＨＬＡ分子に結合することが可能なペプチドの同定または最も優勢なＨＬＡタイプに結合するペプチドの選択を含むことができる。ＨＣＶワクチン開発において考慮すべきもう１つの重要な因子は、異なるＨＣＶ遺伝子型およびサブタイプの存在である。従って、ＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプ特異的免疫原性エピトープは、すべての考慮される遺伝子型またはサブタイプについて同定する必要がある。しかし、２つ以上のＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプを含むエピトープを同定することが好適である。
【００１６】
クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の異なる特徴は、潜在的Ｔ細胞エピトープの推定に関連する特定の問題を担う。先に考察したように、クラスＩ分子は、良好に規定された残基タイプパターンを示す短いペプチドに結合する。
【００１７】
これは、ペプチドの特定の位置における特定の残基タイプについての実験的に決定された統計的採択に基づく多様な推定方法をもたらしている。
【００１８】
これらの方法が相対的に良好に作用しても、保存されていない位置に関連する不定部分はそれらの確度を制限する。
【００１９】
ＭＨＣ／ペプチド結合推定のための方法は、大まかに２つのカテゴリー：実験的に得られる親和性データによって推進される「統計的方法」およびＭＨＣ分子の入手可能な３Ｄ構造の情報に基づく「構造に関連する方法」にサブ分類することができる。あるいは、分子動力学シミュレーションは、時々、ＭＨＣ結合溝内のペプチドをモデル化するために実施される（非特許文献２８）。もう１つのアプローチは、ループモデリングとシミュレートされたアニーリングとを組み合わせることである（非特許文献２９）。ほとんどの研究グループは、親和性推定工程において使用されるスコアリング機能の重要性を強調している。
【００２０】
いくらかのＭＨＣ結合性ＨＣＶペプチドについては、既に、例えば、特許文献２（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ）、特許文献３および特許文献４（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ）、特許文献５（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ）、特許文献６（Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、特許文献７（Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｈｅ  ｕｓａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、特許文献８（Ｃｈｉｒｏｎ）、特許文献９（ｉｍｍｕｓｙｓｔｅｍｓ  Ｇｍｂｈ）、特許文献１０（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｎ．Ｖ）および特許文献１１（Ｃｙｔｅｌ  Ｃｏｒｐ）において開示されている。
【００２１】
主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩ分子についてペプチドの親和性を推定する方法の構造推定および親和性評価の両方の工程を実施的に改善する必要がある。この分野において遭遇する主な問題は、実験的に決定されるデータ（結合および構造の情報の両方）が乏しいＭＨＣアリルに関する推定アルゴリズムの不良な性能である。これは、例えば、ＨＬＡ−Ｃについての場合である。
【００２２】
従って、いくつかのＭＨＣ結合性ペプチドが同定されている一方、当該分野においては、それらが起源とするＨＣＶに対する免疫応答を生じさせるために利用することができるＨＣＶから新規のＭＨＣ結合性ペプチドを同定する必要性が存在する。また、合理的な親和性で結合する（および結合していること）が推定されるペプチドは、免疫原性であるために、遅い解離速度を必用とする（非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２）。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／００７６４１５号明細書
【特許文献２】国際公開第０２／３４７７０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／２１１８９号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／２００３５号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０４／０２４１８２号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９５／２５１２２号パンフレット
【特許文献７】国際公開第９５／２７７３３号パンフレット
【特許文献８】ＥＰ  ０９３５６６２号明細書
【特許文献９】国際公開第０２／２６７８５号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第９５／１２６７７号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第９７／３４６２１号パンフレット
【非特許文献１】シモトウノ，Ｋ．（Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ，Ｋ．）ら、「Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．ｈｅｐａｔｏｌ．」２２，８７−９２頁，１９９５年
【非特許文献２】クー，Ｚ．（Ｘｕ，Ｚ．）ら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ．ｅｍｂｏ  ｊ．」２０，３８４０−３８４８頁，２００１年
【非特許文献３】ヴァレフスキー，Ｊ．Ｌ．（Ｗａｌｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｌ．）、ケラー，Ｔ．Ｒ．（Ｋｅｌｌｅｒ，Ｔ．Ｒ．）、スタンプ，Ｄ．Ｄ．（Ｓｔｕｍｐ，Ｄ．Ｄ．）およびブランチ，Ａ．Ｄ．（Ｂｒａｎｃｈ，Ａ．Ｄ．）、「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｎｅｗ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｉｎ  ａｎ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ．ＲＮＡ．」７，７１０−７２１頁，２００１年
【非特許文献４】グラコウイ，Ａ．（Ｇｒａｋｏｕｉ，Ａ．）、ウィッチョウスキー，Ｃ．（Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ，Ｃ．）、リン，Ｃ．（Ｌｉｎ，Ｃ．）、ファインストーン，Ｓ．Ｍ．（Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｍ．）およびライス，Ｃ．Ｍ．（Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」６７，１３８５−１３９５頁，１９９３年
【非特許文献５】ラウエル，Ｇ（Ｌａｕｅｒ，Ｇ．Ｍ．）およびウォーカー，Ｂ．Ｄ．（Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｄ．）、「ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ｎ．ｅｎｇｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．」３４５，４１−５２頁，２００１年
【非特許文献６】シッフマン，Ｍ．Ｌ．（Ｓｈｉｆｆｍａｎ，Ｍ．Ｌ．）、「Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．ｖｉｒａｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｒｅｖｉｅｗｓ」５，２７−４３頁，１９９９年
【非特許文献７】ウーサイント  Ｅ（Ｈｏｕｓｓａｉｎｔ  Ｅ）、ソールクイン  Ｘ（Ｓａｕｌｑｕｉｎ  Ｘ）、スコテット  Ｅ（Ｓｃｏｔｅｔ  Ｅ）、ボンヌヴィル  Ｍ（Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ  Ｍ）「Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．」２００１年９月；５５（７）：３７３−８０頁．「Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ．」
【非特許文献８】グルタース  ＲＡ（Ｇｒｕｔｅｒｓ  ＲＡ）、バンバーレン  ＣＡ（ｖａｎ  ｂａａｌｅｎ  ＣＡ）、オスターハウス  ＡＤ（Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ  ＡＤ）．「Ｖａｃｃｉｎｅ．」２００２年５月６日；２０（１５）：２０１１−５．「Ｔｈｅ  ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．」
【非特許文献９】ツァイ  ＳＬ（Ｔｓａｉ  ＳＬ）、ハング  ＳＮ（Ｈｕａｎｇ  ＳＮ）．「Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９７年１０月；１２（９−１０）：Ｓ２２７−３５．Ｔ  Ｃｅｌｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ａｎｄ  Ｃ．」
【非特許文献１０】マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら、１９９２年（マレイ  Ｎ（Ｍｕｒｒａｙ  Ｎ）、マックマイケル  Ａ．(ＭｃＭＩＣＨＡＥＬ  Ａ）「Ｃｕｒｒ  ｏｐｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌ．」１９９２年８月；４（４）：４０１−７頁．「Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．」
【非特許文献１１】ルカーチャー  ＡＥ（Ｌｕｋａｃｈｅｒ  ＡＥ）、ブレイシアレ  ＶＬ（Ｂｒａｃｉａｌｅ  ＶＬ）、ブレイシアレ  ＴＪ（Ｂｒａｃｉａｌｅ  ＴＪ）．「Ｊ  ＥｘＰ  Ｍｅｄ．」１９８４年９月１日；１６０（３）：８１４−２６頁  「ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｌｏｎｅｓ  ｉｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ．」
【非特許文献１２】ティゲス  ＭＡ（Ｔｉｇｇｅｓ  ＭＡ）、コウアレ  Ｄ（Ｋｏｅｌｌｅ  Ｄ）、ハルトグ  Ｋ（Ｈａｒｔｏｇ  Ｋ）、ゼクロビチ  ＲＥ（Ｓｅｋｕｌｏｖｉｃｈ  ＲＥ）、コーリー  Ｌ（Ｃｏｒｅｙ  Ｌ）、バーク  ＲＬ（Ｂｕｒｋｅ  ＲＬ）、「Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．」１９９２年３月；６６（３）：１６２２−３４年「Ｈｕｍａｎ  ＣＤ８＋  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｌｏｎｅｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｖｉｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．」
【非特許文献１３】ニーダーマン（Ｎｉｅｄｅｒｍａｎｎ）ら、「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、２：２８９−９９，１９９５年
【非特許文献１４】ブルム（Ｂｌｕｍ）ら、Ｇｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｎｕｎｏｌ．，１７：４１１−１７，１９９７年
【非特許文献１５】アルント（Ａｒｎｄｔ）ら、Ｉｍｍｕｎｏ．Ｌ  Ｒｅｓ．，１６：２６１−７２，１９９７年
【非特許文献１６】マッデン，Ｄ．Ｒ．（Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．）ら、（１９９２年）Ｃｅｌｌ  ７０，１０３５−１０４８
【非特許文献１７】ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６４，１９９２年
【非特許文献１８】フォーク，Ｋ．（Ｆａｌｋ，Ｋ．）ら、（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，２９０−２９６）
【非特許文献１９】マツムラ，Ｍ．（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．）ら、（１９９２年）「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２５７，９２７−９３４頁
【非特許文献２０】サペル，Ｍ．Ａ．（ＳＡＰＥＲ，Ｍ．Ａ．）ら、（１９９１年）「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２１９，２７７−３１２頁
【非特許文献２１】レイトラン，Ｆ．（Ｌａｔｒｏｎ，Ｆ．）ら、（１９９２年）「Ｓｃｉｅｎｃｅ」  ２５７，９６４−９６７頁
【非特許文献２２】ブラウン．Ｊ．（Ｂｒｏｗｎ．Ｊ．）ら、（１９９３年）「Ｎａｔｕｒｅ」  ３６４，３３−３９頁
【非特許文献２３】ブアス（Ｂｕｕｓ）ら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」  ２４２：１０６５頁，１９８８年
【非特許文献２４】ジャルデッツキー（Ｊａｒｄｅｔｚｋｙ）ら、「Ｎａｔｕｒｅ」  ３５３：３２６頁，１９９１年
【非特許文献２５】ハント（Ｈｕｎｔ）ら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」  ２２５：１２６１頁，１９９２年
【非特許文献２６】ロッツシュケ（Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅ）およびフォーク（Ｆａｌｋ）、「Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ」  １２：４４７頁，１９９１年
【非特許文献２７】イェウデル（Ｙｅｗｄｅｌｌ）ら、「Ａｕｒｚ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」，１７：５１−８８頁，１９９７年
【非特許文献２８】リム，Ｊ．Ｓ．（Ｌｉｍ，Ｊ．Ｓ．）ら、（１９９６年）「Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」３３，２２１−２３０頁
【非特許文献２９】ロニャン，Ｄ．（Ｒｏｇｎａｎ，Ｄ．）ら、（１９９９年）「Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．」４２，３０  ４６５０−４６５８頁
【非特許文献３０】ミケレッティ（Ｍｉｃｈｅｌｅｔｔｉ）ら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，９６：４１１−４１５頁，１９９９年）
【非特許文献３１】ブルックス（Ｂｒｏｏｋｓ）ら、「Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」，１６１：５２５２−５２５９頁，１９９８年
【非特許文献３２】バンデルブルグ（ｖａｎ  ｄｅｒ  ｂｕｒｇ）ら、「Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」，１５６：３３０８−３３１４頁，１９９６年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＣｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４（ＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂ）ならびにＮＳ５（ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ）タンパク質から誘導されるペプチドまたはエピトープに関する。ペプチドは、免疫された宿主においてＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性Ｔリンパ球応答を誘発するペプチドである。より具体的には、本発明のＨＬＡクラスＩ拘束性ペプチドは、次のＨＬＡクラスＩグループ：ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、ＨＬＡ−Ａ＊０３、ＨＬＡ−Ａ＊１１、ＨＬＡ−Ａ＊２４、ＨＬＡ−Ｂ＊０７、ＨＬＡ−Ｂ＊０８、ＨＬＡ−Ｂ＊３５、ＨＬＡ−Ｂ＊４０、ＨＬＡ−Ｂ＊４４、ＨＬＡ−Ｃｗ０３、ＨＬＡ−Ｃｗ０４、ＨＬＡ−Ｃｗ０６またはＨＬＡ−Ｃｗ０７の少なくとも１つのＨＬＡ分子に結合する。好適なペプチドを表１３にまとめて示す。本発明のＨＬＡクラスＩＩ拘束性ペプチドは、次のＨＬＡクラスＩＩグループ：ＨＬＡ−ＤＲＢ１、−ＤＲＢ２、−ＤＲＢ３、−ＤＲＢ４、−ＤＲＢ５、−ＤＲＢ６、−ＤＲＢ７、−ＤＲＢ８または−ＤＲＢ９の少なくとも１つのＨＬＡ分子に結合する。前記ＨＬＡクラスＩＩグループは、時々、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−９としてまとめられる。好適なクラスＩＩ拘束性ペプチドを表１４に示す。
【００２４】
本発明のＨＬＡクラスＩおよびＩＩ結合性ペプチドは、国際公開第０３／１０５０５８号パンフレット−Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓにおいて記載の方法、国際公開第０１／２１１８９号パンフレットにおいてＥｐｉｍｍｕｎｅにより記載の方法および／または３つの公的なデータベース推定サーバー、それぞれ、Ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ、ＢｉｍａｓおよびｎＨＬＡＰｒｅｄによって同定されている。それぞれのペプチド自体（表に列挙されている）は本発明の一部である。さらに、各ペプチドが、複数の反復として同じペプチド、あるいはさらなるリンカーを伴うかもしくは伴わずに他の任意のペプチドまたはエピトープとの組み合わせで使用され得ることもまた、本出願の発明態様である。従って、本発明はまた、組成物、より具体的には、ポリエピトープペプチドに関する。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明は、表１３において開示されるＨＬＡ−Ｂおよび／またはＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドから選択される少なくとも３つのペプチドを含んでなるポリエピトープペプチドに関する。
【００２６】
さらなる実施形態において、本発明は、ＨＣＶタンパク質から誘導され、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性Ｔリンパ球応答を誘導することが可能な少なくとも２つのペプチドを含んでなるポリエピトープペプチドであって、ここで、少なくとも１つのペプチドはＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドである、ポリエピトープペプチドに関する。
【００２７】
さらなる実施形態において、本発明は、表１４において開示されるペプチドから選択される少なくとも２つのＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドを含んでなるポリエピトープペプチドに関する。
【００２８】
本発明の特定の実施形態において、ペプチドは、遺伝子型１ａ、１ｂおよび／または３ａのＨＣＶコンセンサス配列に存在することを特徴とする。
【００２９】
さらに、本発明は、本明細書に記載のペプチドをコードする核酸に関する。より詳細には、本発明は、本明細書に記載のポリエピトープペプチドをコードする「ミニ遺伝子」またはポリヌクレオチドに関する。
【００３０】
本発明はまた、本明細書に記載の核酸またはミニ遺伝子を含んでなるベクター、プラスミド、組換え体ウイルスおよび宿主細胞に関する。
【００３１】
本発明のペプチド、対応する核酸ならびに組成物は、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答の産生を刺激することによって、ＨＣＶに対する免疫応答を刺激するのに有用である。生来のＨＣＶアミノ酸配列から誘導される本発明のペプチドエピトープは、ＨＬＡ分子に結合し、ＨＣＶに対する免疫応答を誘導または刺激することが可能であるように選択されている。特定の実施形態において、本発明は「ネステッドエピトープ」を提供する。本発明はまた、ネステッドエピトープを含んでなるポリエピトープペプチドに関する。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明は、先行のワクチンよりも広範な集団適用範囲を提供するために、エピトープが、多様な遺伝子アリルによってコードされるＨＬＡ分子と直接的または間接的に相互作用することが可能であるエピトープに基づくワクチンを可能にするポリエピトープペプチド、ポリヌクレオチド、組成物およびそれらの組み合わせを提供する。
【００３３】
好適な実施形態において、本発明は、ＨＣＶ特異的ＣＴＬエピトープ、ＨＣＶ特異的ＨＴＬエピトープまたはそれらの組み合わせを含んでなる組成物に関する。前記組成物は、１つもしくはそれ以上のＣＴＬエピトープ、１つもしくはそれ以上のＨＴＬエピトープ、またはそれらの組み合わせを含んでなるミニ遺伝子の形態であり得る。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明のペプチド、またはそれらをコードする核酸は、処置レジメンの決定、ＨＣＶ感染の結果の決定、免疫応答の評価もしくはワクチンの効力の評価のような診断方法において使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＣｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４（ＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂ）またはＮＳ５（ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ）タンパク質から誘導されるペプチドに関する。ペプチドは、免疫された宿主においてＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性Ｔリンパ球応答を誘発するペプチドである。
【００３６】
より具体的には、本発明のＨＬＡクラスＩ拘束性ペプチド（ＣＴＬエピトープ）は、次のＨＬＡクラスＩグループ：ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、ＨＬＡ−Ａ＊０３、ＨＬＡ−Ａ＊１１、ＨＬＡ−Ａ＊２４、ＨＬＡ−Ｂ＊０７、ＨＬＡ−Ｂ＊０８、ＨＬＡ−Ｂ＊３５、ＨＬＡ−Ｂ＊４０、ＨＬＡ−Ｂ＊４４、ＨＬＡ−Ｃｗ０３、ＨＬＡ−Ｃｗ０４、ＨＬＡ−Ｃｗ０６またはＨＬＡ−Ｃｗ０７の少なくとも１つのＨＬＡ分子に結合する。好適なペプチドを表１３にまとめて示す。本発明のＨＬＡクラスＩＩ拘束性ペプチド（ＨＴＬエピトープ）は、次のＨＬＡクラスＩＩグループ：ＨＬＡ−ＤＲＢ１、−ＤＲＢ２、−ＤＲＢ３、−ＤＲＢ４、−ＤＲＢ５、−ＤＲＢ６、−ＤＲＢ７、−ＤＲＢ８または−ＤＲＢ９の少なくとも１つのＨＬＡ分子に結合する。前記ＨＬＡクラスＩＩグループは、時々、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−９としてまとめられる。好適なＨＴＬエピトープを表１４に示す。
【００３７】
それぞれのＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩペプチド自体（表に列挙されている）は本発明の一部である。さらに、各エピトープが他の任意のエピトープとの組み合わせで使用され得ることは本発明の態様である。
【００３８】
ペプチドの同定
数百種の既知のＨＣＶ遺伝子型およびサブタイプ（配列あたり少なくとも３０００アミノ酸）に基づき、本明細書に記載の方法に従って、数千種の理論的ＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープが推定される。前記の大多数から開始して、推定される結合親和性に基づいて、エピトープの第１選択が行われている。
【００３９】
本発明のＨＬＡクラスＩおよびＩＩ結合性ペプチドは、国際公開第０３／１０５０５８号パンフレット−Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓにおいて記載の方法、国際公開第０１／２１１８９号パンフレットにおいてＥｐｉｍｍｕｎｅにより記載の方法および／または３つの公的なエピトープ推定サーバー、それぞれ、Ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ、ＢＩＭＡＳおよびｎＨＬＡＰｒｅｄによって同定されている。
【００４０】
ＣＴＬペプチドの第１の組は、Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ  Ｎ．Ｖ．，Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、白国により国際公開第０３／１０５０５８号パンフレット（本明細書において参照により援用される）において記載の方法によって誘導される。前記方法は、主要組織適合性（ＭＨＣ）受容体についての潜在的抗原ペプチドの親和性の構造に基づく推定に関する。
【００４１】
はじめに、ＨＣＶコンセンサス配列が設計される。これを行うために、「ＬＯＳ  ＡＬＡＭＯＳ」データベースに存在するＨＣＶ  １ｂ型由来のＨＣＶ配列の選択をクラスター化し、整列する。Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌラボラトリー由来のＨＣＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベースは：ｈｔｔｐ：／／ｈｃｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｃｖ−ｄｂ／ＨｅｌｐＤｏｃｓ／ｃｌｕｓｔｅｒ−ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌにおいて見出すことができる。
【００４２】
作製された複数の配列アラインメントは、ＣＴＬエピトープ推定のために、ＨＣＶタンパク質における興味深い（即ち保存された）領域を同定するために使用されている。
【００４３】
図１は、本発明における９マーＣＴＬエピトープ推定に使用されるＨＣＶコンセンサス配列を開示する。表１〜１１において認められる９マーについてのアミノ酸番号付けは、前記配列に基づく。
【００４４】
図２は、本発明における１０マーＣＴＬエピトープ推定に使用されるＨＣＶコンセンサス配列を開示する。表１〜１１において認められる１０マーについてのアミノ酸番号付けは、前記配列に基づく。
【００４５】
推定は、ＨＬＡ−Ａ０１０１、ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ２４０２、ＨＬＡ−Ｂ０７０２、ＨＬＡ−Ｂ０８０１、ＨＬＡ−Ｂ３５０１、ＨＬＡ−Ｂ４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ０４０１、ＨＬＡ−Ｃｗ０６０２およびＨＬＡ−Ｃｗ０７０２について行った。
【００４６】
表１〜１１は、上記のアルゴリズムによって誘導される本発明のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドについて開示する。分類は、Ｋｄｐｒｅｄ＜０．１μＭの強いバインダー（Ｓ）、Ｋｄｐｒｅｄ０．１〜１ΜＭの中等度のバインダー（Ｍ）およびＫｄｐｒｅｄ１〜１０μＭの弱いバインダー（Ｗ）の間で行われる。Ｋｄｐｒｅｄは、アルゴリズムによって推定される親和性（解離定数）である。
【００４７】
さらなる選択は、最も優勢な遺伝子型におけるエピトープの存在に基づいて行われる。従って、以下において存在するそれらのペプチド
・少なくとも遺伝子型３ａ、または
・少なくとも遺伝子型１ｂ、または
・少なくとも遺伝子型１ａおよび１ｂ、または
・少なくとも遺伝子型１ａ、１ｂおよび３ａ、
がさらなる試験のために保持される。これらのペプチドを表１３にまとめて示す。
【００４８】
さらに、他のＨＣＶ遺伝子型（例えば、遺伝子型４ａ）が、優勢および／または重要性を考慮して保持され得る。
【００４９】
ペプチドの第２の組は、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、米国による国際公開第０１／２１１８９号パンフレット（本明細書において参照により援用される）において記載の方法によって同定される。ウイルス、細菌、寄生体もしくは腫瘍関連抗原のゲノムまたはプロテオミック配列データから潜在的エピトープを迅速に同定するために、専用のコンピュータアルゴリズムが使用される。プログラムを使用して、免疫応答を増強または抑制するためにエピトープ（アナログ）を修飾することもできる。
【００５０】
アルゴリズムは、係数に基づくスコアのＫＤ（ＩＣ５０）推定（ＰＩＣスコア）への変換に基づき、異なるペプチドサイズまたはアリルに関与する組み合わされた探索を容易にする。倍率と指数べき乗補正（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｏｗｅｒ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を組み合わせて使用すると、計算上および実際のＩＣ５０値の間に良好な適合度がもたらされる。アルゴリズムは何らかの親和性を伴って結合するエピトープを推定するため、ＨＬＡタイプに係わらず、最高スコアのエピトープのみを選択するより厳密な候補選択手順を利用することができる。
【００５１】
５７のＨＣＶ単離体由来のタンパク質配列データを、指定されたスーパーモチーフまたはモチーフの存在について評価した。５７の株には、ＣＯＬＯＮＥＬ−ＡＣＣ−ＡＦ２９０９７８、Ｈ７７−ＡＣＣ−ＮＣ、ＨＥＣ２７８８３０−ＡＣＣ−ＡＪ２７８８３０、ＬＴＤ１−２−ＸＦ２２２−ＡＣＣ−ＡＦ５１１９４８、ＬＴＤ６−２−ＸＦ２２４−ＡＣＣ−ＡＦ５１１９５０、ＪＰ．ＨＣ−Ｊ１−ＡＣＣ−Ｄ１０７４９、ＵＳ．ＨＣＶ−Ｈ−ＡＣＣ−Ｍ６７４６３、ＵＳ．ＨＣＶ−ＰＴ−ＡＣＣ−Ｍ６２３２１、Ｄ８９８１５−ＡＣＣ−Ｄ８９８１５、ＨＣ−Ｊ４−ＡＣＣ−ＡＦ０５４２５０、ＨＣＲ６−ＡＣＣ−ＡＹ０４５７０２、ＨＣＶ−ＣＧ１Ｂ−ＡＣＣ−ＡＦ３３３３２４、ＨＣＶ−ＪＳ−ＡＣＣ−Ｄ８５５１６、ＨＣＶ−Ｋ１−Ｒ１−ＡＣＣ−Ｄ５０４８０、ＨＣＶ−Ｓ１−ＡＣＣ−ＡＦ３５６８２７、ＨＣＶＴ０５０−ＡＣＣ−ＡＢ０４９０８７、ＨＰＣＨＣＰＯ−ＡＣＣ−Ｄ４５１７２、Ｍ１ＬＥ−ＡＣＣ−ＡＢ０８０２９９、ＭＤ１１−ＡＣＣ−ＡＦ２０７７５２、ＳＯＵＲＣＥ−ＡＣＣ−ＡＦ３１３９１６、ＴＭＯＲＦ−ＡＣＣ−Ｄ８９８７２、ＡＵ．ＨＣＶ−Ａ−ＡＣＣ−ＡＪ０００００９、ＣＮ．ＨＣ−Ｃ２−ＡＣＣ−Ｄ１０９３４、ＣＮ．ＨＥＢＥＩ−ＡＣＣ−Ｌ０２８３６、ＤＥ．ＨＣＶ−ＡＤ７８−ＡＣＣ−ＡＪ１３２９９６、ＤＥ．ＨＤ−１−ＡＣＣ−Ｕ４５４７６、ＤＥ．ＮＣ１−ＡＣＣ−ＡＪ２３８８００、ＪＰ．ＨＣＶ−ＢＫ−ＡＣＣ−Ｍ５８３３５、ＪＰ．ＨＣＶ−Ｊ−ＡＣＣ−Ｄ９０２０８、ＪＰ．ＨＣＶ−Ｎ−ＡＣＣ−ＡＦ１３９５９４、ＪＰ．Ｊ３３−ＡＣＣ−Ｄ１４４８４、ＪＰ．ＪＫ１−ＦＵＬＬ−ＡＣＣ−Ｘ６１５９６、ＪＰ．ＪＴ−ＡＣＣ−Ｄ１１３５５、ＪＰ．ＭＤ１−１−ＡＣＣ−ＡＦ１６５０４５、ＫＲ．ＨＣＵ１６３６２−ＡＣＣ−Ｕ１６３６２、ＫＲ．ＨＣＶ−Ｌ２−ＡＣＣ−Ｕ０１２１４、ＲＵ．２７４９３３ＲＵ−ＡＣＣ−ＡＦ１７６５７３、ＴＲ．ＨＣＶ−ＴＲ１−ＡＣＣ−ＡＦ４８３２６９、ＴＷ．ＨＣＵ８９０１９−ＡＣＣ−Ｕ８９０１９、ＴＷ．ＨＰＣＧＥＮＡＮＴＩ−ＡＣＣ−Ｍ８４７５４、Ｇ２ＡＫ１−ＡＣＣ−ＡＦ１６９００３、ＨＣ−Ｊ６ＣＨ−ＡＣＣ−ＡＦ１７７０３６、ＭＤ２Ａ−１−ＡＣＣ−ＡＦ２３８４８１、ＮＤＭ２２８−ＡＣＣ−ＡＦ１６９００２、ＪＰ．ＪＣＨ−１−ＡＣＣ−ＡＢ０４７６４０、ＪＰ．ＪＦＨ−１−ＡＣＣ−ＡＢ０４７６３９、ＪＰ．ＴＤ−６−ＡＣＣ−Ｄ００９４４、ＪＰＵＴ９７１０１７−ＡＣＣ−ＡＢ０３０９０７、ＭＤ２Ｂ−１−ＡＣＣ−ＡＦ２３８４８６、ＪＰ．ＨＣ−Ｊ８−ＡＣＣ−Ｄ１０９８８、ＢＥＢＥ１−ＡＣＣ−Ｄ５０４０９、ＣＢ−ＡＣＣ−ＡＦ０４６８６６、Ｋ３Ａ−ＡＣＣ−Ｄ２８９１７、ＮＺＬ１−ＡＣＣ−Ｄ１７７６３、ＤＥ．ＨＣＶＣＥＮＳ１−ＡＣＣ−Ｘ７６９１８、ＪＰ．ＨＣＶ−ＴＲ−ＡＣＣ−Ｄ４９３７４およびＥＧ．ＥＤ４３−ＡＣＣ−Ｙ１１６０４が含まれる。
【００５２】
推定は、ＨＬＡ−Ａ０１０１、ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ１１０１、ＨＬＡ−Ａ２４０２、ＨＬＡ−Ｂ０７０２、ＨＬＡ−Ｂ−０８０１およびＨＬＡ−Ｂ４００２について行われる。Ｂ０８０１については、ＰＩＣアルゴリズムを利用することができないため、モチーフポジティブ配列を選択した。
【００５３】
表１、２、３、４、５、６および８は、上記のアルゴリズムによって誘導されるＰＩＣスコア＜１００を生じる本発明のＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂペプチドを開示する。
【００５４】
さらなる選択は、最も優勢な遺伝子型におけるエピトープの存在に基づいて行われる。従って、以下において存在するそれらのペプチド
・少なくとも遺伝子型３ａ、または
・少なくとも遺伝子型１ｂ、または
・少なくとも遺伝子型１ａおよび１ｂ、または
・少なくとも遺伝子型１ａ、１ｂおよび３ａ、
がさらなる試験のために保持される。これらのペプチドを表１３にまとめて示す。
【００５５】
さらに、他のＨＣＶ遺伝子型（例えば、遺伝子型４ａ）が、優勢および／または重要性を考慮して保持され得る。
【００５６】
ペプチドの第３の組は、３つの公的に利用可能なアルゴリズムによって同定される。
【００５７】
はじめに、ＨＣＶ  １ｂコンセンサス配列が設計される。８０のＨＣＶ  １ｂ型配列由来のＨＣＶ配列を、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＩＮｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ）のＨＣＶ配列データベースｈｔｔｐ：／／ｈｃｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｃｖ−ｄｂ／ｉｎｄｅｘから検索した。
【００５８】
作製された複数の配列アラインメントは、ＣＴＬエピトープ推定のために、ＨＣＶタンパク質における興味深い領域を同定するために使用される。図２は、ＣＴＬエピトープ推定のために使用されるＨＣＶコンセンサス配列を開示する。本明細書におけるアミノ酸の番号付けは、前記配列に基づく。
【００５９】
前記コンセンサス配列に基づいて、ＣＴＬエピトープ推定のために、３種の異なる推定アルゴリズムを使用した：
Ａ）Ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ：
Ｈａｎｓ−ｇｅｏｒｇ  Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｊｕｔｔａ  Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｎｉｅｌｓ  Ｎｉｋｏｌａｕｓ  ｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｏｓｋａｒ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｂａｃｈｏｒ，Ｓｔｅｆａｎ  Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ：ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｔｉｆｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９年）５０：２１３−２１９；  ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）
【００６０】
推定は、公開されたモチーフ（プール配列決定、天然のリガンド）に基づき、アンカーおよび補助アンカー位置におけるアミノ酸、ならびに他の頻出アミノ酸を考慮する。スコアリングシステムは、所定のペプチド内のすべてのアミノ酸を評価する。個々のアミノ酸には、それぞれの位置についてごく僅かに好適であるアミノ酸については任意値１が付与され得、至適アンカー残基には値１５が付与され；これらの２つの間のいずれかの値が可能である。所定の配列位置においてペプチドの結合能に対して不利であるアミノ酸に対しては、マイナスの値も可能である。値の配置は、天然のリガンド、Ｔ細胞エピトープ、または結合性ペプチドにおけるそれぞれのアミノ酸の頻度に基づく。最大スコアは、異なるＭＨＣアリルの間で変動する。大量のデータが利用可能であるそれらのＭＨＣクラスＩアリルのみがＳＹＦＰＥＩＴＨＩの「エピトープ推定」セクションに含まれる。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩは、ＨＬＡ−Ｃアリルについての推定は行わない。
【００６１】
推定は、ＨＬＡ−Ａ０１、Ａ０２０１、Ａ０３、Ａ２４０２、Ｂ０７０２、Ｂ０８およびＢ４４について行われる。それぞれのクラスについて、９および１０マーの両方が推定され、但しＢ０８については、８および９マーが推定され、１０マーは推定されなかった。
【００６２】
Ｂ）ＢＩＭＡＳ：
このアルゴリズムは、使用者が、ＨＬＡクラスＩ分子に対するペプチド結合性モチーフを含有する８マー、９マー、または１０マーペプチドを局在化し、ランク付けすることを可能にする。前記ランク付けは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ）ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーランド州のケニス  パーカー（Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｐａｒｋｅｒ）博士による文献から推察されるアミノ酸／位置係数テーブルを用いる。ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）は、パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）博士の協力で、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  ＭＯｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  （ＢＩＭＡＳ），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （ＣＢＥＬ），Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＣＩＴ），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈのローランド  テイラー（Ｒｏｎａｌｄ  Ｔａｙｌｏｒ）により作成された。
【００６３】
初期（ランニング）スコアは１．０に設定されている。各残基の位置について、プログラムは、どのアミノ酸が当該位置に出現するかについて試験する。次いで、ランニングスコアに、選択されたＨＬＡ分子について、当該位置における該アミノ酸タイプの係数を掛ける。これらの係数は、ＨＬＡ係数ファイルのコレクションとしての個別のディレクトリにおけるスコアリングアルゴリズムによる使用のために、予め算出され、格納されている。これらのテーブルの背後にある考えは、第１の近似に対して、ペプチドにおける各アミノ酸は、独立して、クラスＩ分子への結合に寄与するという仮定である。結合に極めて好ましい優勢なアンカー残基は、テーブル中に１と有意に異なる係数を有する。高度に有利なアミノ酸は、実質的に２以上の係数を有し、好ましくないアミノ酸は１未満の正の係数を有する。補助アンカー残基は、１とは異なるが、優勢なアンカー残基よりも大きさが小さい。９マーを使用する場合、９回の掛け算が実施される。１０マーを使用する場合も、配列の５位に存在する残基が無視されるため、９回の掛け算が実施される。得られるランニングスコアに最後の定数を掛けて、解離の半減期の推測値が得られる。最後の掛け算から、アプトプットにおいて法広告されるスコアが得られる。
【００６４】
推定は、ＨＬＡ−Ａ０１、Ａ０２０１、Ａ０３、Ａ２４、Ｂ０７、Ｂ０８、Ｂ３５０１、Ｂ４４０３、Ｃｗ０３０１、Ｃｗ０４０１、Ｃｗ０６０２およびＣｗ０７０２について行われる。それぞれのクラスについて、９および１０マーの両方が推定され、但しＢ０８については、８、９および１０マーが推定された。
【００６５】
Ｃ）ｎＨＬＡＰｒｅｄ
ｎＨＬＡＰｒｅｄは、多数のクラスＩ  ＭＨＣアリルについての高度に正確なＭＨＣバインダーの推定方法である。（ＧＰＳ  ラグハバ（ＧＰＳ  ＲＡＧＨＡＶＡ）、コーディネーター、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｏｒ  ３９Ａ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，Ｉｎｄｉａ；ｈｔｔｐ：／／ｉｍｔｅｃｈ．ｒｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ）。アルゴリズムは、２つの部分ＣｏｍＰｒｅｄおよびＡＮＮｐｒｅｄに区分される。ＣｏｍＰｒｅｄ部分では、推定は、定量マトリックスと人工神経ネットワークとのハイブリッドアプローチに基づく。ＡＮＮＰｒｅｄでは、推定は、人工神経ネットワークにのみ基づく。
【００６６】
Ｃｏｍｐｒｅｄ：アルゴリズムのこの部分は、６７のＭＨＣアリルについてＭＨＣ結合性ペプチドを推定することができる。方法は、以下のとおり体系的に開発されている：
最初に、定量マトリックス（ＱＭ）に基づく方法が、ＭＨＣＢＮデータベースにおいて利用可能な最大１５のバインダーを有する４７のＭＨＣクラスＩアリルについて開発された。
【００６７】
定量マトリックスにより、線形モデルは性能を実行し易くなる。マトリックスアプローチを使用することのもう１つの利点は、それが結合ポテンシャルを伴う広範なペプチドを対象範囲として含むこと、およびそれが各ペプチドに定量スコアを付与することである。
【００６８】
さらに、人工神経ネットワーク（ＡＮＮ）に基づく方法が、４０もしくはそれ以上のバインダーを有するこれらの４７のＭＨＣアリルのうち３０について開発された。ＡＮＮは、提出されたデータに存在するパターンを抽出および保持し、続いて、これまで認められていなかった入力においてそれらを認識することが可能であるセルフトレーニングシステムである。ＡＮＮは、ＭＨＣバインダーと非バインダーとを、他と比較して正確に分類することが可能である。ＡＮＮは、データをきわめて良好に一般化することが可能である。神経に基づく推定の主な制約は、それが、トレーニングのための大きなデータを必要とすることである。
【００６９】
さらに、本方法は、文献において報告される定量マトリックスを使用する２０より多いＭＨＣアリルに対するバインダーの推定を可能にする。
【００７０】
推定は、ＨＬＡ−Ａ０１、Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４、Ｂ０７０２、Ｂ０８、Ｂ３５０１、Ｂ４４０３、Ｃｗ０３０１、Ｃｗ０４０１、Ｃｗ０６０２およびＣｗ０７０２について行われる。ｎＨＬＡＰｒｅｄは、９マーのみを推定することができる。
【００７１】
推定アルゴリズム、タンパク質およびＨＬＡアリルのそれぞれの組み合わせについて、最高のランク付けペプチド（＝最高の親和性を有すると推定される）のリストが検索される。
【００７２】
リストは、すべてのＨＬＡアリルに対するすべてのペプチドで、親和性の高い順に作成した（示さず）。このリストでは、異なるＨＣＶ遺伝子型（１ｂ、１ａおよび／または３ａコンセンサス配列）における発生およびＨＬＡアリル間での交差反応に従って、ペプチドに印を付した。各ＨＬＡクラスについて、異なる推定サーバーによって推定されるすべてのペプチドは、カラムあたりの推定サーバーのそれぞれについてのランク番号と、１テーブルにおいて組み合わされる（示さず）。各ペプチドについて、ランク番号６０または１００まで割り当てられた推定サーバーの数が計数される。
【００７３】
２〜４のアルゴリズムによって推定され、６０または１００個の最良内にあるそれらのペプチドが最終的に選択される。結合解析（以下を参照のこと）時に、ごく少数の高親和性結合性ペプチドが同定される場合、（例えば、Ｅｐｉｍｍｕｎｅアルゴリズムによって推定され、ＰＩＣスコア＜１０００を生じるペプチドから）さらなる選択を行うことができる。すべてのこれらのペプチドを表１３に示す。
【００７４】
例として、Ｂ０７ペプチドの選択が実施例２に開示されている。Ｅｐｉｍｍｕｎｅアルゴリズムおよび３つの公的アルゴリズムによって推定される他のＨＬＡ結合性ペプチドについての同種の手順が続いて行われた。
【００７５】
表１３は、所定のＨＬＡに結合することが推定され、上記の手順によって誘導される本発明のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃペプチドの選択を開示する。本発明のペプチドおよび対応する核酸組成物は、ＣＴＬ応答の産生を刺激することによって、ＨＣＶに対する免疫応答を誘導または刺激するのに有用である。
【００７６】
本発明のＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドは、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、米国による国際公開第０１／２１１８９Ａ１号パンフレット（本明細書において参照により援用される）において記載の方法によって同定されている。５７のＨＣＶ単離体由来の（ＣＴＬ推定に関する）タンパク質配列データを、指定されたスーパーモチーフまたはモチーフの存在について評価した。推定は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０１０１およびＤＲＢ１＊０７０１に結合するペプチドに対するＨＬＡ  ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフを使用して、およびＤＲＢ１＊０３０１に結合するペプチドに対するＨＬＡ  ＤＲ３モチーフを使用して、行った。
【００７７】
推定されるＨＴＬペプチドを表１２に示す。
【００７８】
さらなる選択は、最も優勢な遺伝子型におけるクラスＩＩエピトープのコアの存在に基づいて行われる。「コア」は、全エピトープ配列のセントラル９（奇数量の全アミノ酸）または１０（偶数量の全アミノ酸）アミノ酸として規定される。例えば、次のエピトープ（１５ａａ−奇数）のコア（９ａａ）は、太字／下線で示される：ＡＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬＧ。
【００７９】
従って、以下において存在するコアを有するそれらのペプチド
・少なくとも遺伝子型３ａ、または
・少なくとも遺伝子型１ｂ、または
・少なくとも遺伝子型１ａおよび１ｂ、または
・少なくとも遺伝子型１ａ、１ｂおよび３ａ、
がさらなる試験のために保持される。これらのペプチドを表１４にまとめて示す。
【００８０】
さらに、他のＨＣＶ遺伝子型（例えば、遺伝子型４ａ）が、優勢および／または重要性を考慮して保持され得る。
【００８１】
ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ分子に対する結合親和性と、結合抗原（ＨＬＡ分子）に対する個別のペプチドまたはエピトープの免疫原性との間の関係は、異なる２つの実験アプローチ（例えば、セッテ（Ｓｅｔｔｅ）ら、１９９４年を参照のこと）において分析することができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ０２０１について、第１のアプローチでは、ＨＬＡ結合性親和性において１０．０００倍の範囲を超える範囲の潜在的エピトープの免疫原性を、ＨＬＡ−Ａ０２０１トランスジェニックマウスにおいて分析することができる。第２のアプローチでは、異なる約１００種のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来潜在的エピトープ（すべて、Ａ０２０１結合性モチーフを短持する）の抗原性を、急性肝炎患者由来のＰＢＬを使用して評価した。これらのアプローチに従って、約５００ＮＭ（好ましくは、５０ＮＭもしくはそれ以下）の親和性閾値が、ＣＴＬ応答を誘発するペプチドエピトープの能力を決定することが決定された。前記値は、他のＨＬＡクラスＩアリルではまだ利用することができない。
【００８２】
これらのデータは、天然にプロセスされたペプチドおよび合成されたＴ細胞エピトープに対するクラスＩ結合親和性の測定については正しい。
【００８３】
ＨＬＡクラスＩＩ  ＤＲ分子に関して免疫原性に関連する親和性閾値もまた示されている（例えば、サウスウッド（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ）ら、１９９８年を参照のこと）。ＤＲ結合親和性の生物学的に有意な閾値を規定するために、それらの拘束する側のエレメント（即ち、モチーフに結合するＨＬＡ分子）に対する３２のＤＲ拘束性エピトープの結合親和性のデータベースを編集した。この場合、１０００ｎＭは、ＤＲ分子に関する免疫原性に関連する親和性閾値として規定することができる。
【００８４】
本発明のペプチドの推定される結合親和性（スコア）を、表１〜１１に示す。ＨＬＡ分子に対するペプチドの実験的に決定される結合親和性または阻害定数（Ｋｉ）は、実施例３に記載のように決定することができる。阻害定数（Ｋｉ）は、標識された参照ペプチドによる競合実験において決定されるペプチドの親和性である。Ｋｉは、以下の式に従って、実験的に決定されるＩＣ５０値から算出される：
【数１】
2008509654.tif 000002
【００８５】
それぞれのＨＬＡクラスＩおよびＩＩアリルに対する本発明のペプチドの結合親和性（ＫｉまたはＩＣ５０）を、表１３および１４に示す。
【００８６】
「ＩＣ５０」は、参照ペプチドの結合の５０％阻害が観察される結合アッセイにおけるペプチドの濃度である。明細書全体を通して、「結合データ」の結果は、しばしば、ＩＣ５０の用語で表現される。アッセイが稼動する条件（即ち、ＨＬＡタンパク質および標識ペプチド濃度を制限する）が与えられる場合、これらの値はＫｉ値とほぼ同じである。これらの値は使用されるペプチド／ＭＨＣ調製物の量／精製度および結合データを解析するために使用される非線形回帰のタイプに依存するため、算出されたＫｉ値は表示値であって、それ自体は絶対的な値ではないこともまた留意すべきである。
【００８７】
結合は、以下を使用するものを含むアッセイシステムを使用して、決定され得る：
生細胞（例えば、ケッペリニ（Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉ）ら、１９８９年；クリストニック（Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋ）ら、１９９１年；ブッシュ（Ｂｕｓｃｈ）ら、１９９０年；ヒル（Ｈｉｌｌ）ら、１９９１年；デルグエルシオ（ｄｅｌ  Ｇｕｅｒｃｉｏ）ら、１９９５年）、界面活性剤溶解物を使用する無細胞系（例えば、セルンドロ（ＣｅｒｕｎｄｏｌＯ）ら、１９９１年）、固定化された精製されたＭＨＣ（例えば、ヒル（Ｈｉｌｌ）ら、１９９４年；マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）ら、１９９４年）、ＥＬＩＳＡシステム（例えば、レアイ（Ｒｅａｙ）ら、１９９２年）、表面プラズモン共鳴（例えば、キルコ（Ｋｈｉｌｋｏ）ら、１９９３年）；高流動性可溶性相アッセイ（ハマー（Ｈａｍｍｅｒ）ら、１９９４年）、およびクラスＩ  ＭＨＣ安定化または集成の測定（例えば、リュンッグレン（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ）ら、１９９０年；シューマッハー（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ）ら、１９９０年；タウンゼント（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）ら、１９９０年；パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら、１９９２年）。本発明において使用される結合アッセイを、実施例３および４において実証する。表１３および１４において示される結果は、個々の実験の結果または多くの実験の平均のいずれかである。
【００８８】
ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ分子について本明細書において使用される「高い親和性」あるいは「強いバインダー」は、１００ｎＭもしくはそれ以下のＫｉまたはＩＣ５０値を伴う結合として規定され；「中等度の親和性」あるいは「中間のバインダー」は、約１００〜約１０００ｎＭの間のＫｉまたはＩＣ５０値を伴う結合として規定される。
【００８９】
本明細書において使用される「閾値親和性」は、ペプチドが、ヒトおよび／または動物において高い確実性を伴う免疫原性を確実にする所定のＨＬＡタイプを表示するのに必要とする最小の親和性である。閾値親和性は、異なるＨＬＡタイプについて異なり得るが、異なってはならない。
【００９０】
結合実験から誘導されるデータに基づいて、候補エピトープのさらなる選択が行われる。より高いＨＬＡ結合親和性は、典型的に、より高い免疫原性と相関関係がある。免疫原性は、いくらかの異なる方法で表すことができる。免疫原性は、免疫応答が果たして誘発されるかどうか、および任意の特定の応答の活力、ならびに応答が誘発される集団の程度に対応する。例えば、ペプチドは、多様なアレイの集団において免疫応答を誘発し得るが、活発な応答を生じる例はまだ認められていない。これらの原理に従えば、中等度の親和性で約５０％が結合するペプチドとは対照的に、高い親和性の結合性ペプチドは９０％付近が免疫原性であることが見出されている（セッテ（Ｓｅｔｔｅ）ら、１９９４年；アレクサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）ら、２００３年）。さらに、より高い結合親和性ペプチドは、より活発な免疫応答（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）をもたらす。結果として、高い親和性の結合性ペプチドが使用される場合、類似の生物学的効果を誘発させるためのペプチドはほとんど必要ない。従って、本発明の好適な実施形態では、高い親和性の結合性ペプチド（強いバインダー）および中間の親和性ペプチド（中間のバインダー）が特に有用である。
【００９１】
免疫原性を評価するために、以下を含む多様なストラテジーを利用することができる：
１）正常個体由来の初代Ｔ細胞培養の評価（例えば、ウェントワース（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ）ら、１９９５年；セリース（Ｃｅｌｉｓ）ら、１９９４年；ツァイ（Ｔｓａｉ）ら、１９９７年；カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ）ら、１９９８年を参照のこと）。この手順は、数週間の期間にわたるインビトロでの抗原提示細胞の存在下における試験ペプチドによる正常被験体由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の刺激を必要とする。ペプチドに特異的なＴ細胞は、この期間に活性化され、例えば、ペプチド感作標的細胞を必要とする５１ＣＲ放出アッセイを使用して、検出される。
２）ＨＬＡトランスジェニックマウス（例えば、ウェントワース（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ）ら、１９９６年；ウェントワース（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ）ら、１９９６年；アレクサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）ら、１９９７年を参照のこと）または代理母マウスの免疫化。この方法では、ペプチド（例えば、不完全フロイントアジュバントにおいて処方される）が、ＨＬＡトランスジェニックマウスまたは代理母マウスの皮下に投与される。免疫化の数週間後、脾臓細胞を取り出し、試験ペプチドの存在下で約１週間、インビトロで培養する。例えば、ペプチド感作標的細胞および内因的に作製された抗原を発現する標的細胞を必要とする５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、ペプチド特異的Ｔ細胞を検出する。
３）効果的にワクチン接種されている、感染から回復している免疫個体、および／または慢性感染患者由来のリコールＴ細胞応答の実証（例えば、レーエルマン（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ）ら、１９９５年；ドゥーラン（Ｄｏｏｌａｎ）ら、１９９７年；バートニ（Ｂｅｒｔｏｎｉ）ら、１９９７年；トレルケルド（Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄ）ら、１９９７年；ディェポルダー（Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ）ら、１９９７年を参照のこと）。このストラテジーを適用する際、リコール応答は、例えば、感染を介して抗原に天然に暴露されており、従って、「天然に」免疫応答を生じている被験体、または目的のペプチドを含んでなるワクチンをワクチン接種された患者由来のＰＢＬを培養することによって、検出される。被験体由来のＰＢＬを、インビトロで、１〜２週間、試験ペプチド＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養し、「生来の」Ｔ細胞に比べて、「メモリー」Ｔ細胞の活性化を可能にする。培養期間の終了時に、ペプチド感作標的、Ｔ細胞増殖、またはリンフォカイン放出を必要とする５１Ｃｒ遊離を含むＴ細胞活性のためのアッセイを使用して、Ｔ細胞活性を検出する。
【００９２】
Ｔ細胞反応性が該ペプチドで感作された標的に対して示され得る場合、所定のエピトープは免疫原性であるといえる。所定のエピトープに対する免疫原性については、実施例５〜８に記載のように、該特定のエピトープに対してＴ細胞反応性を示す、ＨＬＡが一致するように感染もしくはワクチン接種した被験体（例えば、ヒト、トランスジェニックマウス、代理母マウス）のグループにおける個体の数、または例えば、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて検出されるスポットの数によって、さらに説明することができる。
【００９３】
これらの実験の１つから誘導されるデータに基づいて、それらの免疫原性に従って、候補エピトープのさらなる選択が行われる。本発明のペプチドに対する免疫原性を、表１３および１４に示す。「＋」は、少なくとも１つの被験体におけるＴ細胞反応性を示す。
【００９４】
広範な適用範囲の現存のＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプを有するワクチンが好適である。
【００９５】
遺伝子型１ｂ、１ａおよび３ａは、（ＨＣＶ感染個体の中で）最も優勢なＨＣＶ遺伝子型であり、従って、考慮することが重要である。他の遺伝子型（例えば、遺伝子型４ａ）が、それらの優勢および／または重要性を考慮して保持され得る。本発明は、免疫原性が示されており、遺伝子型１ｂ、１ａおよび／または遺伝子型３ａのコンセンサス配列に存在するすべての選択されたＣＴＬならびにＨＴＬエピトープを含有する。前記コンセンサス配列を図２、５および６に示す。従って、本発明のペプチドは、以下のコンセンサス配列に存在する：
・少なくとも遺伝子型１ａ、
・少なくとも遺伝子型１ｂ、
・少なくとも遺伝子型３ａ、
・少なくとも遺伝子型１ａおよび１ｂ、
・少なくとも遺伝子型１ａおよび３ａ、
・少なくとも遺伝子型１ｂおよび３ａ、または
・少なくとも遺伝子型１ａ、１ｂおよび３ａ。
【００９６】
本明細書において記載の方法によって得られるエピトープは、異なるＨＣＶ株または遺伝子型の間および／または内のそれらの管理に基づいて、さらに評価することができる。
【００９７】
本発明のさらなる工程において、エピトープのアレイは、ワクチンにおける使用のためのポリエピトープ組成物における封入のためか、あるいはワクチンに封入すべきおよび／またはミニ遺伝子のような核酸によってコードされるべき個別のエピトープを選択するために、選択される。該選択を行うために、以下の原理のそれぞれについて、取捨選択することが好ましい：
１）ＨＣＶの生来のエピトープまたはアナログのエピトープ（ａｎａｌｏｇｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ）のいずれかの選択。
２）最も優勢および／または重要なＨＣＶ遺伝子型もしくはサブタイプに存在する生来のＨＣＶエピトープの選択。
３）免疫原性との相関関係を確立するのに必要な結合親和性：ＨＬＡクラスＩについて１０００ｎＭもしくはそれ以下のＩＣ５０またはＫｉ、あるいはＨＬＡクラスＩＩについて１０００ｎＭもしくはそれ以下のＩＣ５０またはＫｉを有するエピトープを選択する。
４）投与時に、Ｔ細胞応答（ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ）を誘導するエピトープを選択する。
５）広範な集団適用範囲を付与するために、十分なスーパーモチーフを所有するペプチドおよび／または十分なアレイのアリル特異的ペプチドを選択する。特定の配列を伴う所定の病原体について、完全なＨＬＡ遺伝子座およびその結果として完全な集団を対象範囲として含むような十分な免疫原性エピトープを見出すことはかなり困難である。従って、２もしくは３つのＨＬＡクラスＩ遺伝子座、即ち、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび／または−Ｃについての免疫原性ペプチドを考慮することにより、所定の病原体に対する集団適用範囲が有意に増加する。
６）「ネステッドエピトープ」と称されるエピトープも関連する。ネステッドエピトープは、少なくとも２つのエピトープが、所定のペプチド配列において、部分的または完全に重複する箇所に生じる。ネステッドペプチド配列は、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩエピトープの両方、２もしくはそれ以上のＨＬＡクラスＩエピトープまたは２もしくはそれ以上のＨＬＡクラスＩＩエピトープを含んでなり得る。
７）例えば、自己抗体を誘導することによって、エピトープ配列が、処置される被験体において病理学的または他の有害な生物学的特性を有さないことを確実にするために、エピトープ配列をスクリーニングする（例えば、哺乳動物のゲノム配列と比較する）ことが重要である。
８）ポリエピトープ組成物において使用する場合、スペーサーアミノ酸残基を導入して、接合部のエピトープ（標的抗原には存在しない免疫系によって認識され、エピトープの人工的並列によってのみ作製されるエピトープ）を回避するか、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによって、エピトープ提示を増強することができる。レシピエントは、生来ではないエピトープに対して免疫応答を生じ得るため、接合部のエピトープは一般に回避される。「優性エピトープ」である接合部エピトープは特に重要である。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減弱または抑制されるような強い応答をもたらし得る。
【００９８】
用語「ペプチド」は、「オリゴペプチド」および「ポリペプチド」と交換可能に使用され、典型的に、隣接するアミノ酸のアミノおよびカルボキシル基の間のペプチド結合によって、一方と他方が接続される一連のアミノ酸を示す。本発明の好適なＣＴＬ誘導性ペプチドは、１３残基長もしくはそれ以下であり、通常、８、９、１０、１１または１２残基、好ましくは９または１０残基からなる。好適なＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドは、５０残基長未満であり、通常、６〜３０残基の間、より通常は１２〜２５の間、しばしば、１５〜２０残基の間からなる。より好適には、ＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくはそれ以上のアミノ酸残基からなる。
【００９９】
本発明のペプチドは、古典的な化学合成によって調製することができる。「合成ペプチド」は、化学合成または組換えＤＮＡ技術のような方法を使用して人工的に作製されるペプチドを指す。合成は、均質な溶液または固相において行うことができる。例えば、使用することができる均質な溶液における合成技術は、ホーベンウェイル（Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ）、書籍の表題「Ｍｅｔｈｏｄｅ  ｄｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  ｃｈｅｍｉｅ」（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、編者Ｅ．ウンシュ（Ｅ．Ｗｕｎｓｈ）、１５−ＩおよびＩＩ巻．ＴＨＩＥＭＥ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９７４年によって記載の合成技術である。本発明のポリペプチドはまた、アサトン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）およびシェパード（Ｓｈｅｐａｒｄ）、彼らの書籍の表題「Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９年）により記載の方法に従って、固相において調製することができる。本発明に従うポリペプチドはまた、以下に記載の組換えＤＮＡ技術によって調製することもできる。
【０１００】
保存的置換は、本発明に従うこれらのＨＣＶポリペプチドにおいて導入することができる。本明細書において使用される用語「保存的置換」は、１つのアミノ酸残基が、別の生物学的に類似の残基によって置き換えられていることを表す。保存的置換を有するペプチドは、本来のペプチドに類似の親和性でＨＬＡ分子に結合し、本来のペプチドに対して作製されるかあるいは該ペプチドを認識するＣＴＬおよび／またはＨＴＬは、改変されたペプチドを提示する細胞の存在下で活性化される（および／またはその逆）。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンのような１つの疎水性残基の別の残基に対する置換、またはアルギニンおよびリジンの間、グルタミン酸およびアスパラギン酸の間もしくはグルタミンおよびアスパラギンの間などのような１つの極性残基の別の残基に対する置換が挙げられる。前記１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含有するペプチドがなお免疫原性である限り、他の置換を導入することができる。これは、実施例５および６に記載のＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて分析することができる。従って、本発明はまた、表１３および１４において開示されるペプチドのアミノ酸配列に少なくとも７０、７５、８０、８５もしくは９０％同一であるアミノ酸配列からなるペプチドに関し、ここで、前記ペプチドはなおＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性Ｔリンパ球応答を本来のペプチドを提示する細胞に導入することが可能である。
【０１０１】
異なるＨＬＡタイプ間または所定のスーパーモチーフもしくはアリル内のペプチドの交差反応性を改善するためのストラテジーは、ペプチド内に存在する１つもしくはそれ以上の有害な残基を欠失し、ペプチドのＴ細胞認識に影響を及ぼしてはならないＡｌａのような小さな「中性の」残基を置換することである。そのような改善されたペプチドは、時々、アナログのペプチド（Ａｎａｌｏｇｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）と称される。
【０１０２】
ペプチドは、それらの天然（非荷電）形態あるいは塩である形態であり得、グリコシル化、側鎖酸化、もしくはリン酸化のような修飾がないかまたはこれらの修飾を含有するかのいずれかである。グリコシル単位のようなアミノ酸側鎖、脂質、またはリン酸のような無機イオンに付着したさらなる置換基によって修飾されたペプチド、ならびにスルフヒドリル基の酸化のような鎖の化学的変換に関する修飾もまた定義に含まれる。従って、「ポリペプチド」またはその等価な用語は、言及される適切なアミノ酸配列を含むことを意図し、その機能性が破壊されない限り、上記の修飾のそれらに供され得る。
【０１０３】
特にアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識、あるいはＴ細胞に関して、Ｔ細胞受容体タンパク質および／または主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子による認識に必要なそれらの残基に関与するアミノ酸残基の組である。免疫系の設定では、インビボまたはインビトロ、エピトープは、一次、二次および三次ペプチド構造、ならびに電荷のような分子の集合的特徴であって、共に、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体またはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。本明細書全体を通して、「エピトープ」および「ペプチド」は、交換可能に使用される。
【０１０４】
語句「単離された」または「生物学的に純粋な」は、それがその生来の状態において見出される場合、通常、材料に伴う成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。従って、本発明の単離されたペプチドは、好ましくは、それらのインサイチュでの環境において、通常、ペプチドに関連する材料を含有しない。「単離された」エピトープは、エピトープが誘導された抗原またはポリペプチドの配列全体を含まないエピトープを指す。
【０１０５】
本発明のエピトープならびにさらなるアミノ酸を含んでなるタンパク質またはペプチド分子もなお、本発明の範囲内にあることを理解すべきである。
【０１０６】
「免疫原性ペプチド」は、ペプチドがＨＬＡ分子に結合し、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘導するように、表１３および／または１４において開示される配列、あるいはアリル特異的モチーフもしくはスーパーモチーフを含んでなるペプチドを含んでなるペプチドである。本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合することが可能なペプチドを含んでなり、免疫原性ペプチドは、免疫原性ペプチドが誘導される抗原に対するＨＬＡ拘束性細胞障害性および／またはヘルパーＴ細胞応答を誘導することができる。ＣＴＬ応答は、ＭＨＣ−Ｉに関して免疫原性ペプチドを提示する細胞によって活性化されるＴ細胞の異なる生物学的応答の組であり、細胞の細胞障害性、ＩＦＮ−ガンマ産生および増殖を含むが、これらに限定されない。ＨＴＬ応答は、ＭＨＣ−ＩＩに関して免疫原性ペプチドを提示するＡＰＣによって活性化されるＴ細胞の異なる生物学的応答の組であり、（ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−４のような）サイトカイン産生および増殖を含むが、これらに限定されない。本発明の好適な実施形態では、免疫原性ペプチドは、５０未満のアミノ酸残基からなる。さらにより詳細には、免疫原性ペプチドは、４５、４０、３５、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０または９未満のアミノ酸残基からなる。
【０１０７】
セッテ（Ｓｅｔｔｅ）およびシドニー（Ｓｉｄｎｅｙ）（１９９９年）（本明細書において参照により援用される）は、ワクチン開発のためのエピトープアプローチについて記載しており、それぞれが、いくらかの異なるＨＬＡアリルに結合するペプチドリガンドの能力に対応するいくらかのＨＬＡスーパーモチーフを同定した。特定のＨＬＡスーパーモチーフを所有するペプチドに結合するＨＬＡアリル変異体は、集合的にＨＬＡスーパータイプと称される。
【０１０８】
「スーパーモチーフ」は、２つもしくはそれ以上のＨＬＡアリルによってコードされるＨＬＡ分子により共有される特異性に結合するペプチドである。好ましくは、スーパーモチーフを所有するペプチドは、２つもしくはそれ以上のＨＬＡ抗原によって、（本明細書に規定されるような）高いまたは中等度の親和性で認識される。用語「モチーフ」は、規定の長さのペプチド、通常、クラスＩ  ＨＬＡモチーフに対する８、９、１０、１１、１２もしくは１３アミノ酸のペプチドおよびクラスＩＩ  ＨＬＡモチーフに対する約６〜約５０アミノ酸、またはより具体的には、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２２、２４、２５、３０、３５、４０もしくは５０アミノ酸のペプチドにおける残基のパターンを指し、特定のＨＬＡ分子によって認識される。
【０１０９】
ＡＬスーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のファミリー（即ち、ＨＬＡ−ＡＬスーパータイプ）は、少なくともＡ０１０１、Ａ２６０１、Ａ２６０２、Ａ２５０１およびＡ３２０１を含む。Ａ２スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のファミリー（即ち、ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ）は、少なくとも：Ａ０２０１、Ａ０２０２、Ａ０２０３、Ａ０２０４、Ａ０２０５、Ａ０２０６、Ａ０２０７、Ａ０２０９、Ａ０２１４、Ａ６８０２およびＡ６９０１からなる。
【０１１０】
Ａ３スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のファミリー（ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ）のメンバーは、少なくともＡ０３０１、Ａ１１０１、Ａ３１０１、Ａ３３０１およびＡ６８０１を含む。Ａ２４スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のファミリー（即ち、Ａ２４スーパータイプ）は、少なくともＡ２４０２、Ａ３００１およびＡ２３０１を含む。Ｂ７スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のファミリー（即ち、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ）は：Ｂ０７０２、Ｂ０７０３、Ｂ０７０４、Ｂ０７０５、Ｂ１５０８、Ｂ３５０１、Ｂ３５０２、Ｂ３５０３、Ｂ３５０４、Ｂ３５０５、Ｂ３５０６、Ｂ３５０７、Ｂ３５０８、Ｂ５１０１、Ｂ５１０２、Ｂ５１０３、Ｂ５１０４、Ｂ５１０５、Ｂ５３０１、Ｂ５４０１、Ｂ５５０１、Ｂ５５０２、Ｂ５６０１、Ｂ５６０２、Ｂ６７０１およびＢ７８０１を含む少なくとも２６種のＨＬＡ−Ｂタンパク質からなる。Ｂ４４スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子のファミリー（即ち、Ｂ４４スーパータイプ）のメンバーは、少なくとも：Ｂ１８０１、Ｂ１８０２、Ｂ３７０１、Ｂ４００１、Ｂ４００２、Ｂ４００６、Ｂ４４０２、Ｂ４４０３およびＢ４００６を含む（国際公開第０１／２１１８９号パンフレット）。
【０１１１】
好適な実施形態に従えば、本発明の免疫原性ペプチドは、５０未満、２５未満、２０未満または１５未満のアミノ酸である。ペプチドモチーフは、典型的に、各ヒトＨＬＡアリルによってコードされるタンパク質ごとに異なり、一次および二次アンカー残基のパターンが異なる。
【０１１２】
「交差反応結合性」は、ペプチドが、２以上のＨＬＡアリル群または遺伝子座から誘導される２以上のＨＬＡ分子によって結合されることを示し；同義語は縮重結合性である。
【０１１３】
「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」はヒトクラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合性複合体である（例えば、スティッテス（Ｓｔｉｔｅｓ）ら、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第８版、Ｌａｎｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ、カリフォルニア州（１９９４年）を参照のこと）。「主要組織適合性複合体」または「ＭＨＣ」は、生理学的免疫応答を担う細胞相互作用の制御において役割を果たす遺伝子のクラスターである。ヒトでは、ＭＨＣ複合体もまた、ＨＬＡ複合体として公知である。ＭＨＣおよびＨＬＡ複合体の詳細な説明については、ポール（Ｐａｕｌ）、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＰＤＥＤ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９３年を参照のこと。本明細書において使用したＨＬＡの命名法は、一般に、当該分野において公知であり、例えば、「Ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ、マーシュ（Ｍａｒｓｈ）ら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年」に記載されている。
【０１１４】
また、ＨＬＡ配列に関する情報および現在使用されている命名法については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｔｈｏｎｙｎｏｌａｎ．ｏｒｇ．ｕｋ／ＨＩＧ／において見出すことができる。
【０１１５】
ポリエピトープペプチド
本発明はまた、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための本明細書に記載のペプチドの使用、より具体的には、おそらく、１つもしくはそれ以上の同じまたは他のペプチドあるいはエピトープと組み合わされた表１３〜１４において提供される少なくとも１つのペプチドを含んでなる組成物に関する。本発明のペプチドは、ポリマー（マルチマー）を形成するために連結を介して組み合わせることができるか、または混合物として、連結を伴わずに、組成物において処方することができる。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、ポリエピトープペプチドとして、連結され得る。ポリエピトープペプチドにおける異なるペプチドの連結ため、全体のアミノ酸配列は、天然に存在する配列とは異なる。しかし、本発明のポリエピトープペプチド配列は、天然には存在しない配列である。従って、本発明は、表１３および１４において開示されるペプチドから選択される少なくとも１つのペプチドを含んでなる組成物またはポリエピトープペプチドに関する。ＫｉまたはＩＣ５０＜１０００ｎＭを伴うペプチドは特に興味深い。より好ましくは、目的のペプチドは、本明細書に記載のストラテジーによる評価後、ポジティブな免疫原性を有するこれらのペプチドである。以下によって同定されるＨＬＡクラスＩ結合性ペプチドが特に好適である：
・ＨＬＡ−Ａについて：配列番号５５７、１２４１、１４５６、１４７８、１８３３、１８８７、６７、９２２、６６、３６１、１０７０、１０７２、１１５１、７１、１２３３、１２６９、７５、７３、１３９６、５、８７、９１、２３８、２６５、１６６１、１７５３、７６、８１、９２、１９３３、１９３４、６９、２０４３、２０４７、７４、６３、２０５３、８３、５６、１５５、１５６、１２０５、１２０６、１６７、１３５０、４７、１４６、１６０９、１４４、３、３９、１５８、１６、１２２、１０３４、１０９５、１０９６、１１５０、２４６、１４０６、２３、１４８３、１５１２、８７、９３、１６２５、１６２６、５９、１７１０、２５０、８１、１８８５、１９１６、１９３８、２０４８、２７１、２０８３、１、８７７、１７、７、１０８６、１０８７、１４６８、１７００および１８９４；
・ＨＬＡ−Ｂについて：配列番号４０２、８３６、３８１、３７１、８５３、３７０、３８７、３０７、１２３７、１２８９、１３４３、１４１８、１４１９、３７５、１４３０、３８０、４５０、１５８２、３９０、１６７７、１６８７、１２１、３８６、３７２、９５、４４３、３９６、４５５、１４４１、４３６、１７１９、９２、３９４、１９６９、２８７、１２３７、１２８９、３７５、１４３０、１４４４、５８２、１１１７および５９；
・ＨＬＡ−Ｃについて：配列番号１０４８、１０９５、１７３０、３４９、４７５、１１１、２０６６、１５１１、１４５４、１１００および９０７。
【０１１６】
好適なＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドは、配列番号２１４２、２２１３、２１５７、２２４５、２１６２、２１６４、２２３５、２１１３、２１８２、２１１１、２１８０、２２３６、２１１２、２１３２、２１９２、２１０７、２１３７、２１２５、２２２９、２１６６、２１３６、２１７７、２１５３、２１１０、２１５６、２２４１、２２２８、２２１９、２１８７、２２４９、２１９４、２２０７および２２３７によって同定されるＩＣ５０＜５００ｎＭを伴うペプチドである。
【０１１７】
特に好適なＨＬＡクラスＩＩペプチドは、配列番号２２３５、２１６４、２１６２、２１１３、２１８２、２１８０、２２３６、２１４９、２１１２、２２０１、２２４９、２１５８、２１０８、２１０７、２２２９、２１９４、２１５６、２２２８、２２０７および２２３２によって同定される。
【０１１８】
より好ましくは、組成物またはポリエピトープペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０またはそれ以上のペプチドを含んでなる。好ましくは、ペプチドは、表１３および１４から選択される。任意の組み合わせのペプチドが可能であり、例えば、組成物は、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ結合性ペプチドおよび少なくとも１つのＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドを含んでなることができる。さらに、組成物はまた、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチドおよび少なくとも１つのＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドを含んでなることができる。より具体的には、組成物は、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂおよび少なくとも１つのＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドを含んでなる。好適な実施形態において、ポリエピトープペプチドまたは組成物は、ＨＣＶタンパク質から誘導され、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性Ｔリンパ球応答を誘導することが可能な少なくとも２つのペプチドを含んでなり、ここで、少なくとも１つのペプチドはＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドである。さらなる実施形態において、組成物は、好ましくは表１４から選択される少なくとも２つのＨＬＡ−ＤＲＢ結合性ペプチドを含んでなる。
【０１１９】
「ＨＬＡ−Ａ結合性ペプチド」は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の少なくとも１つの分子に結合することが可能なペプチドとして規定される。前記規定は、他の遺伝子座、即ち、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−９などにも当てはめることができる。
【０１２０】
特に、本発明のエピトープは、ＨＬＡ群拘束性ポリエピトープと組み合わせることができる。用語「ＨＬＡ群拘束性ポリエピトープ」は、同じＨＬＡグループのアリルまたは分子に結合する少なくとも２つのエピトープを含んでなるポリエピトープペプチドを指す。本明細書において使用したＨＬＡの命名法は、一般に、当該分野において公知であり、例えば、「Ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ、マーシュ（Ｍａｒｓｈ）ら編、ＡＣａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，２０００年」に記載されている。好適な実施形態では、ＨＬＡ群拘束性ポリエピトープは、ＨＬＡ−Ａ０１拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ａ０２拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ａ０３拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ｂ０７拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ｂ０８拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ｂ３５拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ｂ４０拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ｂ４４拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ｃｗ０３拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ｃｗ０４拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ｃｗ０６拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−Ｃｗ０７拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１拘束性ポリエピトープ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３拘束性ポリエピトープまたはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４拘束性ポリエピトープである。
【０１２１】
ＨＬＡ群拘束性ポリエピトープにおけるエピトープの数に制限はなく、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５もしくはそれ以上であり得る。ＨＬＡ群拘束性ポリエピトープは、構築物におけるエピトープのサブセットの免疫原性を確立する第１の相において使用することができる。そのようなＨＬＡ群拘束性ポリエピトープを使用する利点は、かなりの数のＨＬＡ拘束性エピトープを、１つおよび同じ構築物において評価することができることである。さらに、処置を所望にあわせて変更するために、２以上のＨＬＡ群拘束性ポリエピトープの特定の選択を行うことができる。具体的には、選択は、所定のＨＬＡ遺伝子座（または２、３もしくはそれ以上のＨＬＡ遺伝子座を含む）内の２以上のＨＬＡ群拘束性ポリエピトープを含んでなることができる。
【０１２２】
より詳細には、本明細書に記載の組成物は、連続であるか、あるいはリンカーまたはスペーサーアミノ酸もしくはスペーサーペプチドによって分離されている連結されたペプチドを含んでなる。これは、ポリエピトープまたはマルチエピトープペプチドと称される。
【０１２３】
「連結」または「接合」は、ペプチドを（直接またはリンカーを介して）機能的に接続するための当該分野において公知の任意の方法を指し、組換え融合、共有結合、非共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、高分子化、環化、静電的結合および中央リンカーまたはキャリアを介する接続を含むがこれらに限定されない。高分子化は、例えば、日常的な方法論を使用して、グルタルアルデヒドとリジン残基の−ＮＨ２基との間の反応によって、達成することができる。ペプチドはまた、中央キャリア、例えば、ポリリジンコア樹脂への直接的な所望されるペプチドの合成を介して、分岐した構造として連結させてもよい。
【０１２４】
このより大きな、好ましくは、ポリもしくはマルチエピトープペプチドを、合成的、組換え的、または生来の供給源由来の切断を介して、作製することができる。
【０１２５】
ポリエピトープペプチドは、複数コピーの同じペプチドを含んでなるホモポリマー、または多様なペプチドのヘテロポリマーとして存在することができる。ポリマーは、免疫反応の増加、ならびに、ポリマーを作製するために異なるペプチドエピトープを使用する場合、免疫応答について標的化される病原性生物体の異なる抗原決定基と反応する抗体、ＨＴＬおよび／またはＣＴＬを誘導するさらなる能力の利点を有する。多エピトープ構築物は、例えば、イシオカ（Ｉｓｈｉｏｋａ）ら、１９９９年；フェルダース（Ｖｅｌｄｅｒｓ）ら、２００１年；または国際公開第０４／０３１２１０号パンフレット−Ｅｐｉｍｍｕｎｅに記載の方法に従って、調製することができる。ポリエピトープペプチドは、１つのタンパク質として、発現させることができる。細菌、真核細胞（酵母を含む）またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＫ１３、ＣＯＳ１、ＢＨＫ、およびＭＤＣＫ細胞のような培養された脊椎動物宿主、もしくは昆虫細胞のような無脊椎宿主においてポリエピトープペプチドの発現を行うために、以下の工程が行われる：
・組換えベクター、またはアデノウイルス、インフルエンザウイルス、ＢＣＧ、および他の任意の生体キャリアシステムによる適切な細胞宿主の形質転換であって、ここで、本発明のポリペプチドの１つをコードするヌクレオチド配列は、適切な調節エレメント、特に、細胞宿主もしくは生体キャリアシステムのポリメラーゼによって認識されるプロモーター、および真核宿主の場合、前記ヌクレオチド配列の前記細胞宿主において発現を可能にする適切なリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）の制御下で挿入される。
・前記挿入物の発現を可能にする条件下での前記形質転換された細胞宿主の培養。
【０１２６】
ポリエピトープペプチドは、当業者に周知の方法によって精製することができる。
【０１２７】
広範な集団適用範囲を有するワクチンは、より商業的に存続可能であり、最も多くの人々に適用可能であるため、好適である。広範な集団適用範囲は、総合的に考慮する場合、集団の最も多くの個体において存在するＨＬＡアリルに結合するペプチドを選択することを介して、得ることができる。Ａ２−、Ａ３−、およびＢ７スーパータイプは、５つの主要な民族群、即ち、白人、北アメリカ黒人、日本人、中国人およびヒスパニック人のそれぞれにおいて、４０％を超える平均で、それぞれ存在する。８０％を超える適用範囲は、これらのスーパーモチーフの組み合わせによって達成される。Ｂ４４−、ＡＬ−、およびＡ２４−スーパータイプは、これらの主要民族集団において、平均で２５％〜４０％の範囲で存在する。ＨＬＡ群Ｃｗ０４、Ｃｗ０３、Ｃｗ０６およびＣｗ０７は、これらの主要民族集団において、平均で１３％〜５４％の範囲で存在する。従って、最も頻度の高いＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび／または−Ｃアリル由来のエピトープを含むことによって、９０〜９９％の平均集団適用範囲が、５つの主要な民族群について得られる。特に、ＨＬＡ−Ｃの領域では、ＨＣＶエピトープについての実験的に決定されたデータ（結合性および免疫原性の両方）が乏しい。従って、本発明は、ＨＣＶタンパク質から誘導され、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性Ｔリンパ球応答を誘導することが可能な少なくとも２つのペプチドを含んでなる組成物またはポリエピトープペプチドであって、ここで、少なくとも１つのペプチドはＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドである、上記組成物またはポリエピトープペプチドに関する。より好適には、前記組成物またはポリエピトープペプチドは、少なくとも２、３、４、５もしくはそれ以上のＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドを含んでなる。より詳細には、１つもしくはそれ以上のＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドは、次のＨＣＶ領域：Ｃｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂの少なくとも１つから誘導される。ＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドは、遺伝子型１ａ、１ｂおよび／または３ＡのＨＣＶコンセンサス配列に存在することをさらに特徴とすることがさらにより好適である。場合により、組成物またはポリエピトープペプチドは、少なくとも１、２、３、４もしくはそれ以上のＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチドおよび／または少なくとも１、２、３、４もしくはそれ以上のＨＬＡ−Ａ結合性ペプチドおよび／または少なくとも１、２、３、４もしくはそれ以上のＨＬＡ−ＤＲＢ１−９結合性ペプチドをさらに含んでなることができる。より好適には、本発明の組成物またはポリエピトープペプチドは、場合により、ＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドと組み合わせて、少なくとも１、２、３、４もしくはそれ以上のＨＬＡ−Ａ結合性ペプチド、少なくとも１、２、３、４もしくはそれ以上のＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチドおよび少なくとも１、２、３、４もしくはそれ以上のＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドを含んでなる。特定の実施形態において、ペプチドは、表１３または１４から選択される。
【０１２８】
さらに、本発明は、表１３および１４から選択される少なくとも１つのペプチドならびに少なくとも１つの他のＨＬＡクラスＩ結合性ペプチド、ＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドまたはＨＣＶ由来のペプチドを含んでなる組成物に関する。本発明のペプチドと組み合わせて使用すべき前記「他の」ＨＬＡクラスＩ結合性ペプチドおよび前記ＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドは、ＨＣＶまたは外来性抗原もしくは生物体（非ＨＣＶ）から誘導され得る。前記他のペプチドには長さに制限はなく、これらは、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のアミノ酸の長さを有することができる。「少なくとも１つ」は、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００もしくはそれ以上のペプチドを含むことができる。好ましくは、前記ＨＬＡクラスＩ結合性ペプチドは、１つもしくはそれ以上のＨＬＡクラスＩアレルに結合することが可能なペプチドである。より具体的には、前記ペプチドは、次のＨＬＡ群：ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ５８、ＨＬＡ−Ｂ６２、ＨＬＡ−Ｃｗ０３、ＨＬＡ−Ｃｗ０４、ＨＬＡ−Ｃｗ０６および／またはＨＬＡ−Ｃｗ０７の分子に結合するペプチドからなる群から選択される。
【０１２９】
ＨＬＡクラスＩＩについて、ＨＴＬエピトープとも呼ばれるペプチドはまた、好ましくは、ＨＬＡ遺伝子座ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱおよび／またはＨＬＡ−ＤＰの分子に結合するペプチド、あるいは例えば、国際公開第９５／２７７３３号パンフレット、国際公開第０２／２６７８５号パンフレット、国際公開第０１／２１１８９号パンフレット、国際公開第０２／２３７７０号パンフレット、国際公開第０３／０８４９８８号パンフレット、国際公開第０４／０２４１８２号パンフレット、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ）ら、１９９５年、ディェポルダー（Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ）ら、１９９７年、ヴェルハイマー（Ｗｅｒｈｅｉｍｅｒ）ら、２００３年ならびにラモナカ（Ｌａｍｏｎａｃａ）ら、１９９９年（本明細書において参照により援用される）に記載のペプチドからなる群から選択される。好適なＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドは、約５０残基長未満であり、通常、約６〜約３０残基の間、より通常は約１２〜２５の間、しばしば、約１５〜２０残基の間からなる。例えば、ＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくはそれ以上のアミノ酸残基からなる。ワクチンにおける使用のため、あるいはワクチンに封入すべきおよび／またはミニ遺伝子のような核酸によってコードされるべき個別のエピトープを選択するためのポリエピトープ構築物に封入するための候補ＨＴＬエピトープのさらなるかつ好適な例を、表１４に開示する。
【０１３０】
「ＣＴＬ誘導性ペプチド」は、ＣＴＬ応答を誘導することが可能なＨＬＡクラスＩ結合性ペプチドである。「ＨＴＬ誘導性ペプチド」は、ＨＴＬ応答を誘導することが可能なＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドである。
【０１３１】
特定の実施形態において、本発明は、表１３から選択される少なくとも２つのＨＬＡクラスＩ結合性ペプチドもしくは表１４から選択される少なくとも２つのＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドを含んでなる組成物またはポリエピトープペプチドに関する。任意の組み合わせが可能である。より好適には、同じまたは異なるＨＬＡ遺伝子座、即ち、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−ＣもしくはＤＲＢ１から誘導されるＨＬＡ分子に結合するための少なくとも２つのペプチドが選択される。あるいは、同じまたは異なるＨＬＡ群から誘導されるＨＬＡ分子に結合するための少なくとも２つのペプチドが選択される。好適なＨＬＡ群は：ＨＬＡ−Ａ０１、Ａ０２、Ａ０３、Ａ１１、Ａ２４、Ｂ０７、Ｂ０８、Ｂ３５、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｃｗ０３、Ｃｗ０４、Ｃｗ０６、Ｃｗ０７、ＤＲＢ１＊０１、ＤＲＢ１＊０３およびＤＲＢ１＊０４である。
【０１３２】
より好適な実施形態において、本発明は、表１３から選択される少なくとも３つのＨＬＡクラスＩ結合性ペプチドを含んでなる組成物またはポリエピトープペプチドに関する。例えば、以下のような任意の組み合わせが可能である：
・少なくとも３つのＨＬＡ−Ａ結合性ペプチド、
・少なくとも３つのＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチド、
・少なくとも３つのＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチド、
・少なくとも２つのＨＬＡ−Ａ結合性ペプチドおよび少なくとも１つのＨＬＡ−ＢもしくはＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチド、
・少なくとも２つのＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチドおよび少なくとも１つのＨＬＡ−ＡもしくはＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチド、
・少なくとも２つのＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチドおよび少なくとも１つのＨＬＡ−ＡもしくはＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチド、または
・少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂおよび少なくとも１つのＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチド。
【０１３３】
より好適には、各組み合わせについて、同じまたは異なるＨＬＡ群から誘導されるＨＬＡ分子に結合するための少なくとも３つのペプチドが選択される。好適なＨＬＡ群は：ＨＬＡ−Ａ０１、Ａ０２、Ａ０３、Ａ１１、Ａ２４、Ｂ０７、Ｂ０８、Ｂ３５、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｃｗ０３、Ｃｗ０４、Ｃｗ０６およびＣｗ０７である。
【０１３４】
より具体的には、組成物またはポリエピトープペプチドは、表１３から選択される少なくとも３つのペプチドを含んでなり、前記少なくとも３つのペプチドは以下のとおりである：
・結合性ペプチドであるＨＬＡ−Ａ０１、Ａ０２、Ａ３、Ａ１１もしくはＡ２４から選択される少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ結合性ペプチド、
・結合性ペプチドであるＨＬＡ−Ｂ０７、Ｂ０８、Ｂ３５、Ｂ４０もしくはＢ４４から選択される少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂ結合性ペプチド、および／または
・結合性ペプチドであるＨＬＡ−Ｃｗ０３、Ｃｗ０４、Ｃｗ０６またはＣｗ０７から選択される少なくとも１つのＨＬＡ−Ｃ結合性ペプチド。
【０１３５】
ＨＬＡ−Ａ０１結合性ペプチドは、ＨＬＡ−０１型の少なくとも１つの分子に結合することが可能なペプチドとして規定される。前記規定は、他のアレル群、即ち、Ａ０２、Ａ０３、Ａ１１、Ａ２４、Ｂ０７、Ｂ０８、Ｂ３５、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｃｗ０３、Ｃｗ０４、Ｃｗ０６、Ｃｗ０７などにも当てはめることができる。
【０１３６】
本発明のＨＬＡクラスＩ結合性ペプチドを、ＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドと混合し、連結させ、細胞障害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を容易にすることができる。従って、本発明の組成物またはポリエピトープペプチドは、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドをさらに含んでなる。従って、本発明の組成物またはポリエピトープペプチドは、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドを含んでなる。より具体的には、前記ＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドは、表１４から選択される。ＨＴＬエピトープの量は制限されず、即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくはそれ以上である。ＨＴＬエピトープは、本発明の組成物またはポリエピトープペプチドを含み得る。特定の実施形態において、組成物またはポリエピトープペプチドは、表１３から選択される少なくとも３つのＣＴＬペプチドおよび表１４から選択される少なくとも１つのＨＴＬペプチドを含んでなる。
【０１３７】
さらなる実施形態において、組成物またはポリエピトープペプチドもまた、ＰＡＤＲＥ（登録商標）（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；例えば、米国特許第５７３６１４２号明細書または国際公開第９５／０７７０７号パンフレット（本明細書において参照により援用される）に記載されている）と呼ばれる普遍的Ｔ細胞エピトープを含んでなることができる。「ＰａｎＤＲ結合性ペプチドまたはＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチド」は、２以上のＨＬＡクラスＩＩ  ＤＲ分子に結合する分子のファミリーのメンバーである。ＰＡＤＲＥ（登録商標）ファミリーの分子を規定するパターンは、ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフとみなすことができる。ＰＡＤＲＥ（登録商標）は、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ分子に結合し、インビトロおよびインビボでヒトヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）応答を刺激する。あるいは、Ｔヘルプエピトープ（Ｔ−ｈｅｌｐ  ｅｐｉｔｏｐｅ）は、破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｏｓ  ｔｏｘｏｉｄ）のような普遍的に使用されるワクチンであり得る。
【０１３８】
さらなる実施形態において、組成物またはポリエピトープペプチドにおけるペプチドは、ＨＣＶタンパク質、より具体的には、次のＣｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂからなる群から選択されるＨＣＶ領域の少なくとも１つから誘導されることを特徴とする。ペプチドは、遺伝子型１ａ、１ｂおよび／または３ａのＨＣＶコンセンサス配列に存在することを特徴とすることがさらにより好適である。
【０１３９】
さらなる実施形態において、ポリエピトープペプチドにおける２つもしくはそれ以上のエピトープは、個別のＨＣＶアミノ酸配列（個別のエピトープ）またはネステッドＨＣＶアミノ酸配列（ネステッドエピトープ）からなる。「ネステッドエピトープ」は特に好適である。ネステッドエピトープは、少なくとも２つの個体または個別のエピトープが、所定のペプチド配列において、部分的または完全に重複する箇所に生じる。ネステッドエピトープは、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩエピトープの両方、２つもしくはそれ以上のＨＬＡクラスＩエピトープ（ここで、エピトープは、クラスＩ遺伝子座、スーパータイプまたは群の２つもしくはそれ以上のアリルに結合する）、あるいは２つもしくはそれ以上のＨＬＡクラスＩＩエピトープ（ここで、エピトープは、クラスＩＩ遺伝子座、スーパータイプまたは群の２つもしくはそれ以上のアリルに結合する）を含んでなることができる。ネステッドエピトープは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくはそれ以上の個々のエピトープを含んでなることができる。ネステッドエピトープは、それらが制限された数のアミノ酸によって、多数のエピトープを提供するため、広範な集団適用範囲を伴うエピトープに基づくワクチンを可能にする。ワクチンのエピトープの数は、製造、処方および製品安定性から生じる制約によって制限されるため、このことは特に有利である。ネステッドエピトープの長さは、含まれる個々のエピトープの量に従って変動する。通常、ネステッドエピトープは９〜３５アミノ酸からなる。好ましくは、ネステッドエピトープは、３５アミノ酸もしくはそれ以下、即ち、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０または９アミノ酸からなる。より好適には、ネステッドエピトープは、９〜３０アミノ酸、９〜２５アミノ酸、１０〜３０アミノ酸または１０〜２５アミノ酸からなる。
【０１４０】
本発明において同定される３もしくはそれ以上の個々のエピトープに基づき、ここで、個々のエピトープは、所定のＨＬＡに対し、１０００ｎＭ未満の結合親和性を有するネステッドエピトープの例を、表Ａに示す。前記個々のエピトープは、少なくとも３アミノ酸の重複を有する。
【０１４１】
【表１】
2008509654.tif 000003
【０１４２】
【表２】
2008509654.tif 000004
【０１４３】
【表３】
2008509654.tif 000005
【０１４４】
【表４】
2008509654.tif 000006
【０１４５】
従って、本発明は、９〜３５アミノ酸よりなり、表１３および１４から選択される少なくとも２つのエピトープを含んでなるネステッドエピトープを包含する。より具体的には、ネステッドエピトープは、表Ａに示される２つもしくはそれ以上の個々のエピトープを含んでなる。より好適には、ネステッドエピトープは、表１３および１４から選択される３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくはそれ以上のエピトープを含んでなる。そのようなネステッドエピトープの例を、表Ａに示す。従って、本発明は、９〜３５アミノ酸よりなり、配列番号２２５４〜２２７８、もしくはその一部からなる群から選択されるネステッドエピトープに関し、ネステッドエピトープあるいはその一部は、少なくとも２つの個々のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含んでなることを特徴とする。より好適には、前記ネステッドエピトープまたはその一部は、少なくとも表Ａにおいて提示される３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくはそれ以上の個々のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含んでなる。
【０１４６】
本発明におけるネステッドエピトープの適用、即ち、可能な組み合わせ、修飾、組成物、キット、治療および診断的用途は、本発明の（ポリエピトープ）ペプチドについて記載のものと同じである。
【０１４７】
好適な実施形態では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つのネステッドエピトープまたはそのフラグメントを含んでなるポリエピトープペプチドに関する。
【０１４８】
ペプチドまたはポリペプチドまたはポリエピトープペプチドは、場合により、脂質化（例えば、脂質に接合されたペプチド）、標的化または他の配列の付加などによって、修飾することができる。
【０１４９】
本明細書に記載のＨＣＶペプチドにおいて、前記ペプチドに含まれる１つのシステイン残基、または２もしくはそれ以上のシステイン残基を、「可逆的あるいは不可逆的にブロック」してもよい。
【０１５０】
「不可逆的にブロックされたシステイン」は、システインチオール基が化学的手段によって不可逆的に保護されるシステインである。特に、化学的手段による「不可逆的保護」または「不可逆的ブロッキング」は、アルキル化、好ましくは、例えば、活性ハロゲン、エチレンイミン（ｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）もしくはＮ−（ヨードエチル）トリフルオロ−アセトアミドのようなアルキル化剤によるタンパク質におけるシステインのアルキル化を指す。これに関して、システインチオール基のアルキル化は、（ＣＨ２）ＮＲ［式中、ｎは０、１、２、３もしくは４であり、Ｒ＝Ｈ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＣＯＮＨ２、フェニル、またはそれらの任意の誘導体である］によるチオール−水素の置き換えを指すことを理解すべきである。アルキル化は、例えば、活性ハロゲン（Ｘ（ＣＨ２）ＮＲ［式中、Ｘは、Ｉ、Ｂｒ、ＣｌまたはＦのようなハロゲンである］のような当該分野において公知の任意の方法によって、実施することができる。活性ハロゲンの例には、ヨウ化メチル、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、および２−ブロモエチルアミンがある。
【０１５１】
「可逆的にブロックされたシステイン」は、システインチオール基が可逆的に保護されるシステインである。特に、本明細書において使用される用語「可逆的保護」または「可逆的ブロッキング」は、システインチオール基への修飾剤の共有結合、ならびにシステインチオール基の還元状態を保持する（遮蔽）ようなタンパク質環境を操作することを考慮する。システインチオール基の可逆的保護は、化学的または酵素的に行うことができる。本明細書において使用する用語「酵素的手段による可逆的保護」は、例えば、アシルトランスフェラーゼ、例えば、パルミトイルアシルトランスフェラーゼのようなチオエステル化を触媒することに関与するアシルトランスフェラーゼのような酵素によって仲介される可逆的保護を考慮する。本明細書において使用する用語「化学的手段による可逆的保護」は、以下による可逆的保護を考慮する：
１．例えば、スルフォン化およびチオエステル化などによってシステイニルを修飾する修飾剤によって；
２．例えば、重金属、特にＺＮ２＋、ＣＤ２＋、モノ−、ジチオ−ならびにジスルフィド−化合物（例えば、アリール−およびアルキルメタンチオスルホネート、ジチオピリジン、ジチオモルホリン、ジヒドロリポアミド、Ｅｌｌｍａｎｎ試薬、ａｌｄｒｏｔｈｉｏｌｔＭ（アルドリッチ）（レイン（Ｒｅｉｎ）ら１９９６年）、ジチオカルバメート）、またはチオール化剤（例えば、グルタチオン（ｇｌｕｔｈａｔｈｉｏｎ）、Ｎ−アセチルシステイン、システインアミン）によるような本発明のシステイニルを可逆的に修飾する修飾剤によって。ジチオカルバメートは、Ｒ１Ｒ２ＮＣ（Ｓ）ＳＲ３官能基を所有する広範なクラスの分子を含んでなり、それらに、スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基と反応する能力を付与する。チオール含有化合物は、好ましくは、０．１〜５０ｍＭの濃度、より好ましくは、１〜５０ｍＭの濃度、さらにより好ましくは、１０〜５０ｍＭの濃度で使用される；
３．チオールの状態を保存する（安定化する）修飾剤、特に、１０μＭ〜１０ｍＭの濃度範囲、より好ましくは、１〜１０ｍＭの濃度での例えば、ＤＴＴ、ジヒドロアスコルビン酸（ｄｉｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂａｔｅ）、ビタミンおよび誘導体、マンニトール、アミノ酸、ペプチドおよび誘導体（例えば、ヒスチジン、エルゴチオネイン、カルノシン、メチオニン）、没食子酸、ヒドロキシアニソール、ヒドロキシトルエン、ヒドロキノン、ヒドロキシメチルフェノールおよびそれらの誘導体のような抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｉａ）の存在によって；
４．例えば、（Ｉ）金属イオン（ＺＮ２＋、ＭＧ２＋）、ＡＴＰとしての補因子、（ＩＩ）ＰＨの制御（例えば、タンパク質では、ほとんどの場合、ＰＨ約５またはＰＨは、好ましくは、チオールのＰＫａ−２；例えば、ＰＨ約２で逆相クロマトグラフィーによって精製されるペプチドについて）のようなチオール安定化条件によって。
【０１５２】
（１）、（２）、（３）および（４）に記載のような可逆的保護の組み合わせを適用してもよい。
【０１５３】
可逆的保護およびチオール安定化化合物は、モノマー、ポリマーまたはリポソームの形態下で提示することができる。
【０１５４】
システイン残基の可逆的保護状態の除去は、化学的または酵素的に、例えば、以下によって達成することができる：
・還元剤、特に、１〜２００ｍＭの濃度、より好ましくは、５０〜２００ｍＭの濃度の特に、ＤＴＴ、ＤＴＥ、２−メルカプトエタノール、亜ジチオン酸、ＳｎＣｌ２、水素化ホウ素ナトリウム、ヒドロキシルアミン、ＴＣＥＰ；
・例えば、ＰＨの増加によるチオール安定化条件または薬剤の除去；
・酵素、特に、０．０１〜５μＭの濃度、さらにより特に０．１〜５μＭの濃度範囲の特に、チオエステラーゼ、グルタルレドキシン（ｇｌｕｔａｒｅｄｏｘｉｎｅ）、チオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｅ）；
・上記の化学的および／または酵素的条件の組み合わせ。
【０１５５】
システイン残基の可逆的保護状態の除去は、例えば、細胞または個体において、インビトロもしくはインビボで、行うことができる。
【０１５６】
あるいは、本明細書において記載のＨＣＶペプチドに含まれる１つのシステイン残基、または２もしくはそれ以上のシステイン残基は、天然アミノ酸、好ましくは、メチオニン、グルタミン酸、グルタミンまたはリジンに変異され得る。
【０１５７】
本発明のペプチドは、ポリマー（マルチマー：ホモポリマーもしくはヘテロポリマー）を形成するために連結またはスペーサーアミノ酸を介して組み合わせることができるか、あるいは混合物として、連結を伴わずに、組成物において処方することができる。「スペーサーアミノ酸」または「スペーサーペプチド」は、典型的に、生理学的条件下で実質的に荷電していないアミノ酸またはアミノ酸擬似物のような１つもしくはそれ以上の比較的小さな、天然の分子からなる。スペーサーは、典型的に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、または非極性アミノ酸もしくは中性の極性アミノ酸の他の中性のスペーサーから選択される。任意の本スペーサーは同じ残基からなる必要はなく、従って、ヘテロまたはホモオリゴマーであってもよいことが理解されよう。存在する場合、スペーサーは、少なくとも１残基、さらに通常は、２、３、４、５もしくは６残基、またはさらに７、８、９、１０、１５、２０、３０、もしくは５０残基までである。スペーサーアミノ酸残基を導入して、接合部のエピトープ（免疫系によって認識され、標的抗原には存在しせず、エピトープの人工的並列によってのみ作製されるエピトープ）を回避するか、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによって、エピトープ提示を増強することができる。特に、３残基より長いスペーサー配列では、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、およびＡｓｎのような極性残基も存在し得るが、一般に、スペーサー配列は非極性アミノ酸を含む。各スペーサー配列の全体の長さおよび性質に関する唯一の限界は、合成、タンパク質分解プロセシング、およびポリペプチドの操作のし易さを検討することで導かれる。
【０１５８】
さらに、本発明はまた、上記で規定されるいずれかのペプチドの複数の反復もしくは上記で規定されるいずれかのペプチドの組み合わせを含んでなるかまたはそれらからなるポリペプチドを考慮する。
【０１５９】
ミニ遺伝子
本発明のさらなる実施形態は、表１３および１４から選択されるペプチドをコードする核酸に関する。前記核酸は、「単離された」または「合成」のものである。用語「単離された」は、材料が天然に存在する環境において見出される材料に通常伴う成分を実質的に含まない材料を指す。しかし、本発明の単離された核酸は、異種細胞成分または標識などを含んでなり得ることを明確にすべきである。用語「核酸」または「ポリ核酸」は、本出願を通して交換可能に使用され、一本鎖もしくは二本鎖の形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、天然のヌクレオチドの既知のアナログを包含し得る。
【０１６０】
より詳細には、本発明は、本明細書に記載のポリエピトープペプチドをコードする「ミニ遺伝子」またはポリヌクレオチドに関する。用語「マルチエピトープ構築物」は、核酸を指す場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ミニ遺伝子」および「マルチエピトープ核酸ワクチン」ならびに他の等価な語句と交換可能に使用することができ、免疫系において機能する分子、好ましくは、ＨＬＡクラスＩおよびＴ細胞受容体またはＨＬＡクラスＩＩおよびＴ細胞受容体に結合することができる任意の長さのペプチドエピトープをコードする複数のエピトープ核酸を含んでなる。マルチエピトープ構築物におけるエピトープ核酸は、ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩエピトープの組み合わせまたはネステッドエピトープをコードすることができる。ＨＬＡクラスＩをコードするエピトープ核酸はＣＴＬエピトープ核酸と称せられ、ＨＬＡクラスＩＩをコードするエピトープ核酸はＨＴＬエピトープ核酸と称せられる。いくつかのマルチエピトープ構築物は、ＨＬＡクラスＩエピトープをコードするマルチエピトープ核酸のサブセットおよびＨＬＡクラスＩＩエピトープをコードするマルチエピトープ核酸の別のサブセットを有することができる。マルチエピトープ構築物は、１つもしくはそれ以上のスペーサー核酸を有してもよい。スペーサー核酸は、構築物において各エピトープ核酸に隣接し得る。スペーサー核酸は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸（スペーサーアミノ酸）をコードし得る。あるいは、ミニ遺伝子は、ツィ−リャーング  カイ（Ｑｉ−Ｌｉａｎｇ  Ｃａｉ）ら、２００４年により記載の技術を使用して、構築することができる。
【０１６１】
従って、本発明は、表１３および１４から選択される少なくとも１つのペプチドを含んでなるかもしくは表Ａから選択される少なくとも１つのネステッドエピトープを含んでなるポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはミニ遺伝子に関する。
【０１６２】
さらに、本発明はまた、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０もしくはそれ以上のペプチドを含んでなるポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはミニ遺伝子を包含する。好ましくは、ペプチドは、表１３および１４から選択される。ペプチドの任意の組み合わせは、ポリエピトープペプチドについて記載のとおり、可能である。従って、ポリヌクレオチドまたはミニ遺伝子は、例えば、表Ａにおいて示されるような１つもしくはそれ以上のネステッドエピトープ、もしくはそのフラグメントをコードすることができる。
【０１６３】
より詳細には、本発明の核酸は、ＨＬＡ群拘束性構築物に組み入れることができる。前記「ＨＬＡ群拘束性構築物」は、同じＨＬＡ群のアレルまたは分子に結合するペプチドをコードする少なくとも２つの核酸エピトープを含んでなる。ＨＬＡ型拘束性構築物におけるエピトープの数に制限はなく、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５もしくはそれ以上であり得る。ＨＬＡ群拘束性ポリエピトープペプチドについて記載のように、同じ組み合わせが可能である。
【０１６４】
好適な実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるポリエピトープペプチドは、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ結合性ペプチド、ＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドまたはＨＣＶ由来のペプチドをさらに含んでなる。前記ＨＬＡクラスＩ結合性ペプチドおよび前記ＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドは、外来性の抗原または生物体（非ＨＣＶ）から誘導することができる。前記ペプチドには長さに制限はなく、これは、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のアミノ酸の長さを有することができる。
【０１６５】
さらなる実施形態において、本明細書において記載のポリヌクレオチドまたはミニ遺伝子は、１つもしくはそれ以上のスペーサー核酸、即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれ以上をさらに含んでなることができる。特定の実施形態において、ミニ遺伝子は、１つもしくはそれ以上の調節配列および／または１つもしくはそれ以上のシグナル配列および／または１つもしくはそれ以上のプロモーター配列をさらに含んでなる。
【０１６６】
市販されていないポリヌクレオチドまたは核酸については、ボーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカラザーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、１９８１年によって最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従い、バンデバンター（Ｖａｎ  Ｄｅｖａｎｔｅｒ）ら、１９８４年において記載の自動化シンセサイザーを使用して、化学的に合成することができる。ポリヌクレオチドの精製は、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動またはピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリーニアー（Ｒｅａｎｉｅｒ）、１９８３年において記載のような陰イオン交換ＨＰＬＣのいずれかによる。他の精製方法は、逆相分離およびハイドロキシアパタイトであり、当業者に周知である。化学的に合成および精製されたポリヌクレオチドは、ＰＣＲに基づく方法（ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）ら、１９９５年；クリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ）ら、１９９１年）によって、より長いポリヌクレオチドに集成することができる。
【０１６７】
マルチエピトープ構築物のエピトープは、典型的に、転写を指令するプロモーターならびにエンハンサーおよびポリアデニル化部位のような他の調節配列を含有する発現ベクターにサブクローニングされる。ベクターのさらなるエレメントは、宿主細胞におけるマルチエピトープ構築物の発現に必要な例えば、シグナルまたは標的配列、転写開始および終結配列、５’および３’非翻訳領域ならびにイントロンである。
【０１６８】
治療または予防的免疫化の目的のために、本明細書において既に記載のように、本発明の（ポリエピトープ）ペプチドを、プラスミドベクターならびにウイルスまたは細菌ベクターによって、発現させることができる。用語「ベクター」は、プラスミド、コスミド、原核生物体、ファージ、あるいは真核生物体、例えば、ウイルス、動物もしくはヒト細胞または酵母細胞を含んでなり得る。発現ベクターは、典型的に、宿主細胞におけるマルチエピトープ構築物の発現に必要なすべてのさらなるエレメントを含有する転写単位または発現カセットを含有する。従って、典型的な発現カセットは、マルチエピトープ構築物に作動可能に連結されたプロモーターおよび転写の十分なポリアデニル化に必要なシグナルを含有する。カセットのさらなるエレメントは、エンハンサーならびに機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位を伴うイントロンを含んでもよい。
【０１６９】
適切なプロモーターは当該分野において周知であり、例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４年）に記載されている。哺乳動物細胞のための真核細胞発現系は当該分野において周知であり、市販されている。そのようなプロモーターエレメントとして、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス長末端反復（ＲＳＶ  ＬＴＲ）およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）が挙げられる。他の適切なプロモーター配列については、例えば、米国特許第５，５８０，８５９号明細書および同第５，５８９，４６６号明細書を参照のこと。
【０１７０】
プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた、構造遺伝子の下流に、十分な集結を提供するための転写終結領域を含有することができる。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なる遺伝子から得ることができる。
【０１７１】
医学的使用
さらなる実施形態において、本発明はまた、医薬品としての使用のための本発明の（ポリエピトープ）ペプチド、ネステッドエピトープ、核酸、ミニ遺伝子または組成物に関する。好ましくは、前記医薬品はワクチンである。特定の実施形態において、本発明はまた、医薬品としての使用のための本明細書に記載の核酸もしくはミニ遺伝子を含んでなるベクター、プラスミド、組換え体ウイルスまたは宿主細胞に関する。より具体的には、本発明は、ＨＣＶ感染を防止もしくは処置するための医薬品の製造のための表１３および１４から選択される少なくとも１つのペプチドまたは前記ペプチドをコードする核酸配列の使用に関する。特定の実施形態において、本発明はまた、ＨＣＶ感染を防止もしくは処置するための医薬品の製造のための本明細書に記載の核酸またはミニ遺伝子を含んでなるベクター、プラスミド、組換え体ウイルスあるいは宿主細胞に関する。
【０１７２】
ワクチンおよびワクチン組成物
本発明はさらに、本明細書に記載のＨＣＶ（ポリエピトープ）ペプチドまたは対応する核酸のうち任意のいずれかを含んでなる組成物に関する。特定の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルのうち少なくとも１つをさらに含んでなる。用語「組成物」、「免疫学的組成物」および「医薬組成物」は、「ワクチン組成物」または「ワクチン」と交換可能に使用される。１つもしくはそれ以上のペプチドのカクテル、ポリエピトープペプチドにおいて含まれる本発明の１つもしくはそれ以上のエピトープ、および／またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸、例えば、ポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子によるような本発明に従うワクチンの多数の実施形態が存在する。ワクチンはまた、ペプチドをパルスした抗原提示細胞を含んでなることができ、例えば、エピトープは、樹状細胞上のＨＬＡ分子に結合され得る。より詳細には、前記免疫原性組成物はワクチン組成物である。さらにより詳細には、前記ワクチン組成物は、予防用ワクチン組成物である。あるいは、前記ワクチン組成物はまた、治療用ワクチン組成物であってもよい。予防用ワクチン組成物は、ＨＣＶ感染を防止することを目的とし、まだＨＣＶに感染していない健康なヒトに投与すべきワクチン組成物を指す。治療用ワクチン組成物は、ＨＣＶ感染の処置を目的とし、ＨＣＶに感染している患者に投与すべきワクチン組成物を指す。
【０１７３】
ワクチンまたはワクチン組成物は、以下の少なくとも１つもしくは両方を引き起こすのに十分に広範かつ活発な免疫応答を誘発することが可能な免疫原性組成物である：
・宿主に既に存在し、ワクチン組成物が標的にする病原体の増殖に対する安定化効果。ワクチン組成物はまた、病原体に既に感染している宿主において免疫応答を誘導し得、該病原体に対して、免疫応答は疾患の安定化、退行または回復をもたらす；および
・前記病原体を標的とするワクチン組成物による免疫化後、宿主において新たに誘導される病原体が、前記宿主から回復する速度の増加。
【０１７４】
ワクチン組成物はまた、宿主に既に存在する病原体の生存に対してネガティブな効果を発揮するのに広範かつ強力な、または免疫された宿主が、新たに誘導される病原体によって生じる疾患の徴候を発達することを防止するのに十分な広範かつ強力な免疫応答を生じ得る。特に、本発明のワクチン組成物は、ＨＣＶワクチン組成物である。特に、ワクチンまたはワクチン組成物は、本発明の有効量のペプチドもしくは核酸を含んでなる。特定の実施形態において、前記ワクチン組成物は、本発明の核酸もしくはミニ遺伝子を含んでなるベクター、プラスミド、組換え体ウイルスまたは宿主細胞を含んでなる。前記ワクチン組成物は、１つもしくはそれ以上のさらなる活性物質および／または少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリア、アジュバントもしくはビヒクルをさらに含んでもよい。
【０１７５】
ワクチンまたはワクチン組成物における「有効量」のペプチドもしくは核酸は、免疫応答を誘発するのに必要かつ十分な量と称される。ワクチン組成物により予想される効果を引き起こすのに十分広範かつ活発な免疫応答には、ワクチン接種のスキームまたはワクチンス接種のスケジュールの一部として、ワクチン組成物による（時間的に）連続した免疫化が必用であることは、当業者に明白である。「有効量」は、処置しようとする個体の健康および身体的状態、処置しようとする個体の年齢（例えば、小児の用量は成人より低くあり得る）、処置しようとする個体の分類学的グループ（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が有効な免疫応答を実装する能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、処置する医師の評価、感染している病原体の株および他の関連要因に依存して変動し得る。ワクチン組成物の有効量は、日常的な治験を介して決定することができる比較的広範な範囲、即ち、０．０１〜５０ｍｇ／用量；より好ましくは、０．１〜５ｍｇ／用量の間にあると予想される。通常、量は、０．０１〜１０００μｇ／用量、より詳細には、０．１〜１００μｇ／用量で変動する。投与処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールがあり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤との併用で投与してもよい。用量、投与経路、および投与スケジュールは、当該分野において公知の方法論に従って調整される。
【０１７６】
組成物またはワクチン組成物は、２以上のペプチドまたは核酸、即ち、それらのものの複数、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４もしくはそれ以上、例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０もしくはそれ以上までの個別のペプチドまたは核酸を含んでもよい。
【０１７７】
キャリア、アジュバントおよびビヒクル−送達
一旦、適切な免疫原性ペプチド、またはそれらをコードする核酸が規定されたら、本明細書において「組成物」、「ワクチン組成物」または「医薬組成物」と称される多様な手段によって、それらを貯蔵および送達することができる。本発明のペプチドならびに本発明の薬学的およびワクチン組成物は、ＨＣＶ感染を処置および／または防止するための哺乳動物、特にヒトへの投与に有用である。本発明のペプチド、またはそれらをコードするＤＮＡを含有するワクチン組成物は、ＨＣＶ抗原に対する免疫応答を誘発し、従って、患者自身の免疫応答能を増強するために、ＨＣＶ感染患者またはＨＣＶ感染に掛かり易いか、もしくはそうでなければＨＣＶ感染の危険性がある個体に投与される。
【０１７８】
多様な分野において認識されている送達システムを使用して、ペプチド、ポリエピトープポリペプチド、またはペプチドもしくはポリエピトープポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適切な細胞に送達することができる。それらをコードするペプチドおよび核酸は、薬学的に許容可能なキャリアにおいて、あるいは希釈剤を伴うもしくは伴わずに、コロイド懸濁液、または散剤として、送達することができる。それらは、「裸の状態（ｎａｋｅｄ）」であるかまたは送達ビヒクルに関連し、当該分野において公知の送達システムを使用して、送達し得る。
【０１７９】
「薬学的に許容可能なキャリア」または「薬学的に許容可能なアジュバント」は、任意の適切な賦形剤、希釈剤、キャリアおよび／またはアジュバントであり、それら自体では、組成物を服用する個体に有害な抗体の産生を誘導せず、それらは保護を誘発しない。好ましくは、薬学的に許容可能なキャリアまたはアジュバントは、抗原によって誘発される免疫応答を増強する。適切なキャリアまたはアジュバントは、典型的に、以下の非網羅的リストに含まれる１つもしくはそれ以上の化合物を含んでなる：
大きな緩徐に代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム（国際公開第９３／２４１４８号パンフレットを参照のこと）、ミョウバン（ＫＡｌ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏ）、または３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａと組み合わされたこれらのうちの１つ（国際公開第９３／１９７８０号パンフレットを参照のこと）；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（米国特許第４，６０６，９１８号明細書を参照のこと）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン２−（１’，２’−ジパルミトイル−ＳＮ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン；２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中のモノホスホリル脂質Ａ（即ち、無毒化エンドトキシン）を含有するＲＩＢＩ（ＩＭＭｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ、モンタナ州、米国）、トレハロース−６，６−ジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）。３つの成分ＭＰＬ、ＴＤＭまたはＣＷＳのいずれもまた、単独で使用してもよく、または２つずつ組み合わせてもよい；アジュバント、例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、マサチューセッツ州、米国）、ＳＡＦ−１（Ｓｙｎｔｅｘ）；アジュバント、例えば、水中油型エマルジョンでさらに補充され得るＱＳ２１と３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａとの間の組み合わせ（国際公開第９４／００１５３号パンフレットを参照のこと）（例えば、国際公開第９５／１７２１０号パンフレット、同第９７／０１６４０号パンフレットおよび同第９８５６４１４号パンフレットを参照のこと）、ここで、水中油型エマルジョンは、代謝可能な油脂およびサポニン、もしくは代謝可能な油脂、サポニン、およびステロールを含んでなるか、またはサイトカインでさらに補充され得る（国際公開第９８／５７６５９号パンフレットを参照のこと）；アジュバント、例えば、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、またはポリ［ジ（カルボキシラートフェノキシ）ホスファゼン］に基づくアジュバント（Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ブロックコポリマーに基づくアジュバント、例えば、Ｏｐｔｉｖａｘ（Ｖａｘｃｅｌ，Ｃｙｔｒｘ）またはインスリンに基づくアジュバント、例えば、ＡＬｇａｍｍｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｇａｍｍａｉｎｕｌｉｎ（Ａｎｕｔｅｃｈ）；完全または不完全フロイントアジュバント（それぞれ、ＣＦＡもしくはＩＦＡ）あるいはＧｅｒｂｕ調製物（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ）；サポニン、例えばＱｕｉｌａ、精製されたサポニン、例えば、ＱＳ２１、ＱＳ７またはＱＳ１７、Β−エスシンまたはジギトニン；非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド、例えば、［プリン−プリン−ＣＧ−ピリミジン−ピリミジン］オリゴヌクレオチドを含んでなる免疫刺激性オリゴヌクレオチド。これらの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧクラスＡ、Ｂ、およびＣ分子（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＳＳ（Ｄｙｎａｖａｘ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｒｓ（Ｈｙｂｒｉｄｏｎ）を含む。免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、例えば、リーデル（Ｒｉｅｄｌ）ら（２００２年）により記載のカチオン性ペプチド；サポニン、例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ（ＩＳＣＯＭＳ）を含んでなる免疫性激性複合体；本来的に非毒性および非治療的である賦形剤および希釈剤、例えば、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤または乳化剤、ＰＨ緩衝物質、保存剤など；生分解性および／または生体適合性油脂、例えば、１〜１０％または２．５〜５％の濃度のスクアラン、スクアレン、エイコサン、テトラテトラコンタン、グリセロール、ピーナツ油、植物油；ビタミン、例えば、ビタミンＣ（アスコルビン酸またはその塩もしくはエステル）、ビタミンＥ（トコフェロール）、あるいはビタミンＡ；カロテノイド、または天然または合成フラボノイド；微量元素、例えば、セレン；バートン（Ｂａｒｔｏｎ）およびメドズヒトフ（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ）（２００２年）においてレビューされている任意のトール（Ｔｏｌｌ）様受容体リガンドと組み合わせてもよい。
【０１８０】
上記の任意のアジュバントは３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ含んでなり、前記３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａは、小さな粒子を形成し得る（国際公開第９４／２１２９２号パンフレットを参照のこと）。
【０１８１】
上記の任意のアジュバントにおいて、ＭＰＬまたは３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａは、ＲＣ−５２９と称される合成アナログまたは他の任意のアミノ−アルキルグルコサミド４−リン酸により置き換えることができる（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、１９９９年、ペルシング（Ｐｅｒｓｉｎｇ）ら、２００２年）。あるいは、それは、ＯＭ−１９７のような他の脂質Ａアナログにより置き換えることができる（ブイリ（Ｂｙｌ）ら、２００３年）。
【０１８２】
「薬学的に許容可能なビヒクル」は、水、食塩水、生理的食塩水溶液、グリセロール、エタノールなどのようなビヒクルを含む。湿潤または乳化剤、ＰＨ緩衝物質、保存剤のような補助物質もそのようなビヒクルに含まれ得る。当該分野において公知の送達システムは、例えば、リポペプチド、ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド（「ＰＬＧ」）においてカプセル化されたペプチド組成物、マイクロスフェア、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含有されるペプチド組成物、複数の抗原ペプチドシステム（ＭＡＰ）、ウイルス送達ベクター、ウイルスまたは合成起源の粒子、アジュバント、リポソーム、脂質、微粒子またはマイクロカプセル、金粒子、ナノ粒子、ポリマー、縮合剤、多糖、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、ＱＳ２１、吸着増強材料、脂肪酸、あるいは、裸のもしくは粒子吸収されたＣＤＮＡである。
【０１８３】
典型的に、ワクチンまたはワクチン組成物は、注入用として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製される。注入は、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、髄腔内、皮内、表皮内、または「遺伝子銃」によってであり得る。他のタイプの投与は、エレクトロポレーション、インプラント、坐剤、経口摂取、腸適用、吸入、エアロゾル化または鼻スプレーまたは点鼻を含んでなる。注入前の液体ビヒクルに対する溶解、または懸濁に適切な固体形態を調製することもできる。調節物はまた、アジュバント効果を増強するために、リポソーム内に乳化またはカプセル化してもよい。
【０１８４】
液体処方は、油脂、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、または充填剤を含むことができる。好ましくは、炭水化物は、糖または糖アルコール、例えば、モノ−、ジ−、もしくは多糖類、または水溶性グルカンを含む。糖類またはグルカンは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、ΑおよびΒシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（Ｈｙｄｒｏｘｅｔｈｙｌ  Ｓｔａｒｃｈ）ならびにカルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合物を含むことができる。スクロースは最も好適である。「糖アルコール」は、−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素として規定され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールを含む。マンニトールは最も好適である。上記のこれらの糖または糖アルコールは、個々にまたは組み合わせて使用してもよい。糖または糖アルコールが水性調製物に可溶性である限り、使用する量に一定の限界値は存在しない。好ましくは、糖または糖アルコール濃度は、１．０％（ｗ／ｖ）〜７．０％（ｗ／ｖ）の間、より好ましくは、２．０〜６．０％（ｗ／ｖ）の間である。好ましくは、アミノ酸は、左旋（Ｌ）型のカルニチン、アルギニン、およびベタインを含む；しかし、他のアミノ酸を添加してもよい。好適なポリマーは、２，０００〜３，０００の間の平均分子量を伴うポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または３，０００〜５，０００の間の平均分子量を伴うポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。また、凍結乾燥前または再構成後に、溶液におけるｐＨ変化を最小限にするために、組成物において緩衝液を使用することも好ましい。いずれの生理学的緩衝液を使用してもよいが、クエン酸、リン酸、コハク酸、およびグルタミン酸緩衝液またはそれらの混合物が好適である。クエン酸緩衝液が最も好適である。好ましくは、濃度は、０．０１〜０．３モルである。処方に添加することができる界面活性剤については、ＥＰ特許出願第ＥＰ０２７０７９９号明細書および同第ＥＰ０２６８１１０号明細書に示されている。
【０１８５】
さらに、ポリマーへの共有結合によって、ポリペプチドを化学的に修飾し、例えば、それらの循環半減期を増加することができる。好適なポリマー、およびそれらをペプチドに付着させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６号明細書；同第４，１７９，３３７号明細書；同第４，４９５，２８５号明細書；および同第４，６０９，５４６号明細書に示されている。好適なポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは室温で水に可溶であり、一般式：Ｒ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ＮＯ−Ｒ［式中、Ｒは、水素、またはアルキルもしくはアルカノール基のような保護基であり得る］を有する。好ましくは、保護基は１〜８の間の炭素を有し、より好ましくは、それはメチルである。記号Ｎは正の整数であり、好ましくは、１〜１，０００の間、より好ましくは、２〜５００の間である。ＰＥＧは、１０００〜４０，０００の間、より好ましくは、２０００〜２０，０００の間、最も好ましくは、３，０００〜１２，０００の間の好適な平均分子量を有する。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、より好ましくは、それは、末端のヒドロキシ基である。このヒドロキシ基こそが好適に活性化される。しかし、反応性基のタイプおよび量は、本発明の共有結合されたＰＥＧ／ポリペプチドを活性化するために変動され得ることが理解される。
【０１８６】
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた、本発明において有用である。それらは、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などを含む。ＰＯＧが好適である。ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格は、例えば、動物およびヒトにおいてモノ−、ジ−、トリグリセリドの天然に存在するのと同じ骨格であるため、１つの反応が存在する。従って、この分岐は、必ずしも身体において外来性因子として認められるわけではない。ＰＯＧは、ＰＥＧと同じ範囲の好適な分子量を有する。ＰＯＧの構造は、クナウフ（Ｋｎａｕｆ）ら、１９８８年に示されており、ＰＯＧ／ＩＬ２コンジュゲートの考察は、米国特許第４，７６６，１０６号明細書に見出される。
【０１８７】
循環半減期を増加するためのもう１つの薬物送達システムは、リポソームである。本発明のペプチドおよび核酸はまた、リンパ組織のような特定の組織を標的化するか、または選択的に感染細胞を標的化し、ならびにペプチドおよび核酸組成物の半減期を増加する役割を果たすリポソームを介して投与してもよい。リポソームは、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層などを含む。これらの調製物では、送達しようとするペプチドあるいは核酸は、リポソームの一部として組み入れられるか、あるいは単独で、またはＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体のようなリンパ系細胞の間で優勢な受容体に結合する分子との、または他の治療的もしくは免疫原性組成物との併用で包埋される。従って、本発明の所望されるペプチドまたは核酸で充填されるか、もしくは装飾されるリポソームは、リンパ系細胞の部位に指向させることができ、ここで、リポソームは、次いで、ペプチドおよび核酸組成物を送達する。本発明に従う使用のためのリポソームは、標準的な小胞を形成する脂質から形成され、一般に、中性および負に荷電したリン脂質ならびにコレステロールのようなステロールを含む。脂質の選択は、一般に、例えば、リポソームのサイズ、酸不安定性および血流におけるリポソームの安定性を考慮することによって、誘導される。例えば、ゾーカ（Ｓｚｏｋａ）ら、１９８０年、ならびに米国特許第４，２３５，８７１号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、および同第５，０１９，３６９号明細書において記載のように、様々な方法が、リポソームを調製するために利用することが可能である。
【０１８８】
免疫系の細胞を標的化するために、リポソームに組み入れようとするリガンドは、例えば、所望される免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントを含むことができる。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、静脈内、局部的、局所的などに、とりわけ、投与様式、送達されるペプチド、および処置される疾患の段階に従って変動する用量で、投与することができる。例えば、免疫原性エピトープをコードする免疫原性ポリペプチドまたは核酸のいずれかを担持するリポソームは、インビボでＣＴＬ応答を誘発することが公知である（レディ（Ｒｅｄｄｙ）ら、１９９２年；コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、１９９２年；フライズ（Ｆｒｉｅｓ）ら、１９９２年；ネイブル（Ｎａｂｅｌ）ら、１９９２年）。
【０１８９】
液体の医薬組成物を調製した後、それは、分解を防止し、無菌状態を保つために、好ましくは、凍結乾燥される。液体組成物を凍結乾燥するための方法は、当業者に公知である。使用直前に、組成物を、さらなる成分を含み得る無菌の希釈剤（例えば、リンゲル液、蒸留水、または滅菌食塩水）で再構成してもよい。再構成時に、組成物は、好ましくは、当業者に公知のそれらの方法を使用して、被験体に投与される。
【０１９０】
「裸のＤＮＡ」として公知のアプローチは、臨床治験における筋肉内（ＩＭ）投与のために現在使用されている。ミニ遺伝子ＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大にするために、精製されたプラスミドＤＮＡを処方するための代替的方法が所望であり得る。様々な方法が記載されており、新規の技術が利用可能であり得る。カチオン性脂質もまた、処方に使用することができる（例えば、国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；マンニノ（Ｍａｎｎｉｎｏ）およびグールド−フォーゲリテー（Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ）１９８８年；米国特許第５，２７９，８３３号明細書；国際公開第９１／０６３０９号パンフレット；ならびにフェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、１９８７年により記載を参照のこと）。さらに、保護、相互活性、非縮合化合物として集合的に称される糖脂質、膜融合リポソーム、ペプチドおよび化合物もまた、精製されたプラスミドＤＮＡと複合され、安定性、筋肉内分散、または特定の器官または細胞タイプへの輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）のような可変因子に影響を及ぼし得る。
【０１９１】
ＤＮＡに基づく送達技術のさらなる例は、容易にされた（ブピビカイン（ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ）、ポリマー、ペプチド仲介）送達、カチオン性脂質複合体、粒子仲介（「遺伝子銃」）または圧仲介送達（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号明細書を参照のこと）、荷電または非荷電脂質で処方されたＤＮＡ、リポソームにおいて処方されたＤＮＡ、乳化されたＤＮＡ、ウイルスベクターに含まれるＤＮＡ、トランスフェクションを容易にするタンパク質もしくはポリペプチドと共に処方されたＤＮＡ、標的化するタンパク質またはポリペプチドと共に処方されたＤＮＡ、カルシウム沈殿剤で処方されたＤＮＡ、挿入キャリア分子に結合されたＤＮＡ、およびアジュバントと共に処方されたＤＮＡを含む。これに関して、従来のワクチン処方におけるアジュバントの使用に関する事実上すべての考慮が、ＤＮＡワクチンの処方にも当てはまることが認められる。
【０１９２】
組換え体ウイルスまたは生体キャリアベクターはまた、ヒトにおける生ワクチンとして直接使用してもよい。従って、本発明はまた、表１３および１４において開示されるペプチドの少なくとも１つをコードする核酸を含んでなる組換え体ウイルス、発現ベクターまたはプラスミド、ならびに宿主細胞に関する。
【０１９３】
本発明の好適な実施形態では、核酸またはミニ遺伝子はベクターの形態で導入され、ここで、発現は、ウイルスプロモーターの制御下にある。従って、本発明のさらなる実施形態は、本明細書において記載のペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、それぞれのペプチドを発現することが可能である発現ベクター、発現ベクターを含んでなる宿主細胞ならびに本明細書に記載のペプチドを産生させ、精製する方法、本明細書に記載のペプチドならびに薬学的に許容可能なキャリアおよび／またはアジュバントを含んでなる医薬組成物である。「本明細書に記載のペプチド」は、表１３および１４において開示されるペプチドを指す。
【０１９４】
核酸ワクチンの処方および使用に関する詳細な開示内容は、例えば、ドネリー  Ｊ．Ｊ．（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  Ｊ．Ｊ．）ら、１９９７年および１９９７Ａにより利用可能である。発現ベクターの例には、ワクシニア（ｖａｃｃｉｎｉａ）または鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）のような弱毒ウイルス宿主が含まれる。本アプローチの例として、ワクシニアウイルスは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとして使用される。宿主への導入時に、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって、宿主ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘発する。ワクシニア（ｖａｃｃｉｎｉａ）ベクター、例えば、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、および免疫化プロトコルにおいて有用な方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号明細書に記載されている。もう１つのベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ））である。ＢＣＧベクターについては、ストウバー（Ｓｔｏｖｅｒ）ら、１９９１年に記載されている。さらなる例は：アルファウイルス属（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ）（セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  Ｖｒｉｕｓ）、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  Ｅｑｕｉｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＶＥＥ））、導入遺伝子単純ヘルペスウイルス（ＨＥＲＰＥＳ  ＳＩＭＰＬＥＸ  ＶＩＲＵＳ）（ＨＳＶ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）（ヒトまたはサル）の複製欠損株、ＳＶ４０ベクター、ＣＭＶベクター、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）ベクター、およびエプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ）ウイルス由来のベクターである。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化に有用な広範な多様性の他のベクター、例えば、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化された炭素菌毒素ベクターなどは、本明細書の記載から当業者に明らかである。
【０１９５】
さらなるベクター修飾は、ミニ遺伝子発現および免疫原性を至適にするために所望され得る。場合により、イントロンには、効率的な遺伝子発現が要求され、１つもしくはそれ以上の合成または天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写された領域に組み入れられ得る。ｍＲＮＡ安定化配列および哺乳動物細胞における複製のための配列の封入はまた、ミニ遺伝子発現の増加のために考慮され得る。
【０１９６】
さらに、免疫刺激性配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、核酸ワクチンの免疫原性において役割を果たすようである。免疫原性を増強することが所望であれば、ミニ遺伝子コーディング配列以外に、これらの配列をベクターに含めることができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ミニ遺伝子によってコードされるエピトープおよび第２のタンパク質（免疫原性を増加または減少するために含められる）の両方の産生を可能にするバイシストロニックな発現ベクターを使用することができる。同時発現される場合、免疫応答を有益に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例として、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導性分子（例えば、ＬｅＩＦ）、同時刺激分子、またはＨＴＬ応答については、ｐａｎ−ＤＲ結合性タンパク質（Ｐａｄｒｅ（登録商標）、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）が挙げられる。
【０１９８】
ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内標的化シグナルに接合させ、発現されるＣＴＬエピトープとは個別に発現させることができる；これは、ＣＴＬエピトープとは異なる細胞コパートメントへのＨＴＬエピトープの指向性を可能にする。必用であれば、これは、ＨＴＬエピトープのＨＬＡクラスＩＩ経路へのより効率的な侵入を容易にし得、それによって、ＨＴＬ導入が改善される。ＨＴＬまたはＣＴＬ導入とは対照的に、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−Ｐ）の同時発現によって免疫応答を特異的に減少することは、所定の疾患において有益であり得る。
【０１９９】
マルチエピトープミニ遺伝子の使用については、例えば、米国特許第６，５３４，４８２号明細書；アン（ＡＮ）およびホイットン（Ｗｈｉｔｔｏｎ）、１９９７年；トムソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ）ら、１９９６年；ホイットン（Ｗｈｉｔｔｏｎ）ら、１９９３年；ハンケ（Ｈａｎｋｅ）ら、１９９８年に記載されている。例えば、ＨＣＶポリタンパク質配列の複数の領域から誘導されるスーパーモチーフおよび／またはモチーフを所有するＨＣＶエピトープをコードするマルチエピトープＤＮＡプラスミド、ＰＡＤＲＥ（登録商標）普遍的ヘルパーＴ細胞エピトープ（またはＨＣＶ由来の複数のＨＴＬエピトープ）、ならびに小胞体転移性シグナル配列を操作することができる。
【０２００】
ペプチドもしくはポリエピトープポリペプチドをコードする核酸またはミニ遺伝子、あるいはペプチドまたはポリエピトープペプチド自体を、単独でまたは当該分野において公知の他の治療を組み合わせて、投与することができる。さらに、本発明のポリペプチドおよび核酸は、例えば、アジュバントまたはサイトカイン（もしくはサイトカインをコードする核酸）との同時投与によって、免疫応答を増強するように設計された他の処置との組み合わせで投与することができ、これは、は当該分野において周知である。従って、本発明のペプチドまたは核酸あるいはワクチン組成物はまた、インターフェロンのような抗ウイルス薬、もしくはウイルス感染他の処置と組み合わせて使用することができる。
【０２０１】
タンパク質または（ポリ）ペプチドに基づく医薬組成物に関するアジュバントの使用に関する本明細書におけるすべての開示内容は、必要な変更を加えて核酸ワクチン化技術におけるそれらの使用に当てはめられる。同じことが、処方および態様および投与経路に関する他の考慮についても言え、従って、従来の医薬組成物と組み合わせて本明細書において考察されるこれらの考慮もまた、核酸ワクチン化技術におけるそれらの使用に準用する。
【０２０２】
さらなる実施形態において、本発明は、ＨＣＶに対して免疫を誘導する本明細書に記載のペプチドおよび／または核酸の使用に関し、前記ペプチドおよび／または核酸は、時間および化合物の系列の部分として使用されることを特徴とする。これに関して、用語「時間および化合物の系列」は、免疫応答を誘発するのに使用される化合物を時間間隔で個体に投与することを指すことを理解すべきである。後者の化合物は、次の成分：ペプチドもしくはポリエピトープペプチド、核酸もしくはミニ遺伝子またはベクターのいずれかを含んでなり得る。
【０２０３】
これに関して、系列は、以下のいずれかを投与することを含んでなる：
（ｉ）ペプチドもしくはポリエピトープペプチド、あるいは
（ｉｉ）核酸、ミニ遺伝子またはベクター、ここで、前記核酸、ミニ遺伝子またはベクターは、同時、もしくは交互の時間間隔を含む異なる時間間隔で、投与することができる、あるいは
（ｉｉｉ）核酸、ミニ遺伝子もしくはベクターと組み合わされたペプチドまたはポリエピトープペプチド、ここで、前記ペプチドまたはポリエピトープペプチドおよび前記核酸、ミニ遺伝子またはベクターは、同時、もしくは交互の時間間隔を含む異なる時間間隔で、投与することができる、あるいは
（ｉｖ）時間間隔で、おそらく、他のペプチドもしくは核酸もしくはベクターと組合された（ｉ）または（ｉｉ）のいずれか一方。
【０２０４】
本発明のペプチドおよび核酸組成物は、ワクチン投与についての指示書を伴うキットの形態で提供され得る。典型的に、キットは、容器、好ましくは、単位剤形における所望されるペプチド組成物および投与のための指示書を含む。代替的キットは、投与のための指示書と共に、容器、好ましくは、単位剤形における本発明の所望される核酸を伴うミニ遺伝子構築物を含む。ＩＬ−２またはＩＬ−１２のようなリンフォカインもまた、キットに含まれ得る。所望され得る他のキット成分は、例えば、滅菌シリンジ、追加投与、および他の所望される賦形剤を含む。
【０２０５】
免疫応答を評価するためのペプチドの使用
ペプチドはまた、診断試薬としての用途を見出し得る。例えば、本発明のペプチドは、ペプチド、関連するペプチドまたは他の任意のＨＣＶワクチンを用いる処置レジメンに対する特定の個体の感受性を決定するために使用され得、従って、現存の処置プロトコルを修飾するかまたは罹患個体の予後を決定するのに有益であり得る。さらに、ペプチドはまた、どの個体が慢性ＨＣＶ感染を発達する実質的な危険性にあるかを推定するために使用され得る。
【０２０６】
従って、本発明は、ＨＣＶに暴露された被験体の結果を決定する方法であって、被験体が表１３および１４から選択される１つもしくはそれ以上のペプチドに対して免疫応答を有するかどうかを決定する工程を含んでなる、方法に関する。
【０２０７】
本発明の好適な実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、免疫応答を評価するための試薬として使用することができる。評価しようとする免疫応答は、自然感染によってまたは試薬として用いられるべきペプチドを認識し、結合する抗原特異的ＣＴＬもしくはＨＴＬの産生を生じ得る任意の因子を免疫原として使用することによって、誘導させることができる。ペプチド試薬は、免疫原として使用する必要はない。そのような解析に使用することができるアッセイシステムは、細胞内リンフォカインおよびインターフェロン遊離アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイついて染色するテトラマーのような比較的最近の技術的発展を含む。
【０２０８】
例えば、本発明のペプチドは、抗原または免疫原への暴露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血液の単核球を評価するためのテトラマー染色アッセイにおいて使用することができる。ＨＬＡ−テトラマー複合体は、抗原特異的ＣＴＬＳを直接可視化し（例えば、アグ（ＯＧＧ）ら、１９９８年；およびアルトマン（Ａｌｔｍａｎ）ら、１９９６年を参照のこと）、末梢血液の単核球のサンプルにおける抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を決定するために使用される。本発明のペプチドを使用するテトラマー試薬は、以下のとおりに作製され得る：ＨＬＡ分子に結合するペプチドを、対応するＨＬＡ重鎖およびΒ２−ミクログロブリンの存在下で再フォールディングさせ、三分子複合体を作製する。複合体を、予めタンパク質に操作された部位における重鎖のカルボキシル末端で、ビオチン化する。次いで、ストレプトアビジンの添加によって、テトラマー形成を誘導する。蛍光標識されたストレプトアビジンによって、テトラマーを使用して、抗原−特異的細胞を染色することができる。次いで、例えば、フローサイトメトリーによって、細胞を同定することができる。そのような解析は、診断または予後の目的で使用してもよい。手順によって同定される細胞はまた、治療目的のためにも使用することができる。また、テトラマーの代替物として、ペンタマーまたはダイマーを使用することもできる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００年）単元１７．２、補遺３５）。
【０２０９】
本発明のペプチドはまた、免疫リコール応答を評価するための試薬として使用してもよい。（例えば、バートニ（Ｂｅｒｔｏｎｉ）ら、１９９７年およびパーマ（Ｐｅｒｍａ）ら、１９９１年を参照のこと）。例えば、特異的ペプチドを使用して、ＨＣＶ感染を伴う個体由来の患者ＰＢＭＣサンプルを、抗原特異的ＣＴＬまたはＨＴＬの存在について、解析することができる。単核球細胞を含有する血液サンプルを、ＰＢＭＣを培養し、本発明のペプチドを伴う細胞を刺激することによって、評価することができる。適切な培養期間後、例えば、細胞障害性活性（ＣＴＬ）またはＨＴＬ活性について、拡大培養した細胞集団を解析することができる。
【０２１０】
ペプチドはまた、ワクチンの効力を評価するための試薬として使用してもよい。
【０２１１】
例えば、上記の方法のいずれかを使用して、免疫原をワクチン接種した患者から得られるＰＢＭＣを、解析することができる。患者をＨＬＡ型で分類し、該患者に存在するアレル特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬を、解析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣサンプルにおけるエピトープ特異的ＣＴＬおよび／またはＨＴＬの存在によって示される。
【０２１２】
本発明のペプチドはまた、当該分野において周知の技術を使用して、抗体を作製するために使用することができる（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ニューヨーク州；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９年を参照のこと）。そのような抗体は、ＨＬＡ分子に関するペプチドを認識する抗体、即ち、ペプチドＭＨＣ複合体に結合する抗体を含む。
【０２１３】
表
本発明のペプチドを、表１〜１４に示す。
【０２１４】
本明細書において使用されるように、「ＣＳ＿ｆｒ」および「ＣＳ＿ｔｏ」は、図１または２において開示されるＨＣＶコンセンサス配列の残基番号に対するコンセンサス配列の「〜から」および「〜まで」を意味する。
Ｓ：強、Ｋｄｐｒｅｄ＜０．１μＭ；Ｍ：中間、Ｋｄｐｒｅｄ０．１〜１μＭ；Ｗ：弱、Ｋｄｐｒｅｄ１〜１０μＭ
【０２１５】
【表５】
2008509654.tif 000007
【０２１６】
【表６】
2008509654.tif 000008
【０２１７】
【表７】
2008509654.tif 000009
【０２１８】
【表８】
2008509654.tif 000010
【０２１９】
【表９】
2008509654.tif 000011
【０２２０】
【表１０】
2008509654.tif 000012
【０２２１】
【表１１】
2008509654.tif 000013
【０２２２】
【表１２】
2008509654.tif 000014
【０２２３】
【表１３】
2008509654.tif 000015
【０２２４】
【表１４】
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【０２２５】
【表１５】
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【０２２６】
【表１６】
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【０２２７】
【表１７】
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【０２２８】
【表１８】
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【０２２９】
【表１９】
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【０２３０】
【表２０】
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【０２３１】
【表２１】
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【０２３２】
【表２２】
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【０２３３】
【表２３】
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【０２３４】
【表２４】
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【０２３５】
【表２５】
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【０２３６】
【表２６】
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【０２３７】
【表２７】
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【０２３８】
【表２８】
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【０２３９】
【表２９】
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【０２４０】
【表３０】
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【０２４１】
【表３１】
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【０２４２】
【表３２】
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【０２４３】
【表３３】
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【０２４４】
【表３４】
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【０２４５】
【表３５】
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【０２４６】
【表３６】
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【０２４７】
【表３７】
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【０２４８】
【表３８】
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【０２４９】
【表３９】
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【０２５０】
【表４０】
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【０２５１】
【表４１】
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【０２５２】
【表４２】
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【０２５３】
【表４３】
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【０２５４】
【表４４】
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【０２５５】
【表４５】
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【０２５６】
【表４６】
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【０２５７】
【表４７】
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【０２５８】
【表４８】
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【０２５９】
【表４９】
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【０２６０】
【表５０】
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【０２６１】
【表５１】
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【０２６２】
【表５２】
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【０２６３】
【表５３】
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【０２６４】
【表５４】
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【０２６５】
【表５５】
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【０２６６】
【表５６】
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【０２６７】
【表５７】
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【０２６８】
【表５８】
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【０２６９】
【表５９】
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【０２７０】
【表６０】
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【０２７１】
【表６１】
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【０２７２】
【表６２】
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【０２７３】
【表６３】
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【０２７４】
【表６４】
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【０２７５】
【表６５】
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【０２７６】
【表６６】
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【０２７７】
【表６７】
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【０２７８】
【表６８】
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【０２７９】
【表６９】
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【０２８０】
【表７０】
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【０２８１】
【表７１】
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【０２８２】
【表７２】
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【０２８３】
【表７３】
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【０２８４】
【表７４】
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【０２８５】
【表７５】
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【０２８６】
【表７６】
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【０２８７】
【表７７】
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【０２８８】
【表７８】
2008509654.tif 000080
【０２８９】
【表７９】
2008509654.tif 000081
【０２９０】
【表８０】
2008509654.tif 000082
【０２９１】
【表８１】
2008509654.tif 000083
【実施例】
【０２９２】
実施例１：Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓアルゴリズムを使用するＣＴＬ特異的ＨＣＶペプチドペプチドの同定
標的化すべきＨＬＡクラスＩタンパク質サブクラスを次のように規定する：ＨＬＡ−Ａ０１、０２、０３および２４；ＨＬＡ−Ｂ０７、０８、３５および４４；ＨＬＡ−Ｃｗ０４、−Ｃｗ０６およびＣｗ０７。
【０２９３】
これらのＨＬＡ−クラスＩサブクラスを、既知のホモログ構造に基づいてモデル化する。
【０２９４】
Ｘ線データに基づいて、前記ＨＬＡクラスＩに結合した異なるペプチドについての所定のＨＬＡクラスＩサブクラスにおける主鎖の立体配座の変更について徹底的分析を行う。この解析により、骨格多様性が生じる場合に適用される規則が得られる。
【０２９５】
一連のエピトープに基づき、Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓフレキシブル・ペプチド・ドッキング・ツール（Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ）を使用して、ＨＬＡ−クラスＩサブクラスのそれぞれについて平均で８〜１０の異なるＨＬＡクラスＩペプチド複合体が構成される（ここで、ペプチドの主鎖および側鎖はフレキシビリティ、ならびにＨＬＡ分子の側鎖とみなされる）。これは、合計で８８〜１１０種の異なる３次元モデルを生じる。
【０２９６】
主鎖のフレキシビリティについての上記の規則を使用することによって、および／または分子動力学技術もしくは主鎖の擾乱／弛緩アプローチを使用することによって、上記のモデルの結合ペプチドの付近の主鎖の立体配座が異なる約５つの異なるバージョンを誘導する。従って、ＨＬＡ−クラスＩペプチド複合体の約５００の異なる３次元モデルが作成される。
【０２９７】
ＨＬＡ−クラスＩペプチドモデルのそれぞれについて、ＨＬＡ分子の周囲に関するペプチド部分の配列多様性の推定を行う：ペプチド骨格に沿って、すべての既知のＨＣＶ遺伝子型についての目的のすべてのＨＣＶタンパク質配列を挿通し、各「挿通した」ペプチドについて、それが、基礎になるＨＬＡ−クラスＩを伴う安定な複合体を形成し得る可能性を評価する。
【０２９８】
これは、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｅａｄ−Ｅｎｄ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎフレームワーク内で開発されているＡｌｇｏｎｏｍｉｃｓアドバンスト・インバース・フォールディング・ツール（Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ’  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ）を使用して行う。この解析の終了点は、１１のＨＬＡクラスＩサブクラスのそれぞれについての結合性ペプチドのリストである。
【０２９９】
実施例２：４つの異なるアルゴリズムを使用するＣＴＬ特異的Ｂ０７拘束性ペプチドの同定
ＨＬＡ  Ｂ０７については、最も良好なスコアのペプチドの選択は、ＨＣＶコンセンサス配列１ｂを使用する３つのオンライン推定サーバー（ＢＩＭＡＳ、ＳｙｆｐｅｉｔｈｉおよびｎＨＬＡＰｒｅｄ）、ならびに５７のＨＣＶ配列を使用するＥＰＩＭＭＵＮＥにより記載のＰＩＣアルゴリズムから検索される。これらのペプチドは、８マー、９マー、１０マー、および場合により、１１マーのいずれかであり得る。４００のペプチドを、ＢＩＭＡＳから、２５０のペプチドをＳｙｆｐｅｉｔｈｉから、１００をｎＨＬＡＰｒｅｄから、および５８をＥｐｉｍｍｕｎｅ由来のＰＩＣアルゴリズムから検索した。前記ペプチドを表１５に示す。
【０３００】
【表８２】
2008509654.tif 000084
【０３０１】
【表８３】
2008509654.tif 000085
【０３０２】
【表８４】
2008509654.tif 000086
【０３０３】
【表８５】
2008509654.tif 000087
【０３０４】
【表８６】
2008509654.tif 000088
【０３０５】
【表８７】
2008509654.tif 000089
【０３０６】
【表８８】
2008509654.tif 000090
【０３０７】
【表８９】
2008509654.tif 000091
【０３０８】
【表９０】
2008509654.tif 000092
【０３０９】
【表９１】
2008509654.tif 000093
【０３１０】
【表９２】
2008509654.tif 000094
【０３１１】
【表９３】
2008509654.tif 000095
【０３１２】
【表９４】
2008509654.tif 000096
【０３１３】
【表９５】
2008509654.tif 000097
【０３１４】
【表９６】
2008509654.tif 000098
【０３１５】
【表９７】
2008509654.tif 000099
【０３１６】
【表９８】
2008509654.tif 000100
【０３１７】
【表９９】
2008509654.tif 000101
【０３１８】
遺伝子型１ａおよび１ｂの少なくともコンセンサス配列に存在するそれらのペプチドが選択される。表１５は、それらのスコアを伴うこれらのすべてのペプチド、および個別のカラムにおける推定サーバーのそれぞれの指定された格付け番号、および異なる遺伝子型におけるそれらの発生を含有する。
【０３１９】
遺伝子型および格付け番号に従う選択により、２３２の異なるペプチド配列がもたらされる、即ち、１５０＋１１３＋４５＋２８＝３３６。表１６は、４つの推定サーバーのうち最小で２つがランク＝＜１００を示すペプチドの選択を含有する。これは、４０の異なる配列を表す。前記ペプチドを表１３に最終的に組み入れる。
【０３２０】
潜在的ＨＬＡ  Ｂ０７ペプチドバインダーの選択を以下にまとめる：
ＢＩＭＡＳ（Ｂ７）：
出力推定サーバー：２００  ９マー
２００  １０マー
ＢＩＭＡＳの結果：９マー＋１０マーをペーストし、ＢＩＭＡＳスコアに対して分類する
→４００のペプチド、９および１０マーについての個別の格付け番号（２×１〜２００）
→同じスコアが知られていないペプチドについてのＢＩＭＡＳランク付け
ＢＩＭＡＳ選択：遺伝子型に対する選択（少なくとも１Ｂ＋１Ａコンセンサスにおいて）：
→１５０ペプチド
【０３２１】
Ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ（Ｂ０７０２）：
出力推定サーバー：３００２  ９マー
３００１  １０マー
Ｓｙｆｐｅｉｔｈｉの結果：９マー＋１０マーをペーストし、Ｓｙｆｐｅｉｔｈｉスコアに対して分類する
→２５０のペプチドを選択し、１格付け１〜２５０（１２６  ９マー＋１２４  １０マー）
→同じスコアが知られていないペプチドについてのＳｙｆｐｅｉｔｈｉランク付け
Ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ選択：遺伝子型に対する選択（少なくとも１ｂ＋１ａコンセンサスにおいて）：
→１１３ペプチド
【０３２２】
ｎＨＬＡＰｒｅｄ（Ｂ０７０２）：
出力推定サーバー：２００  ９マー
なし  １０マー
ｎＨＬＡＰｒｅｄの結果：→１００ペプチドを選択し、格付け１〜１００
→同じスコアが知られていないペプチドについてのｎＨＬＡＰｒｅｄランク付け
ｎＨＬＡＰｒｅｄ選択：遺伝子型に対する選択（少なくとも１ｂ＋１ａコンセンサスにおいて）：
→４５ペプチド
【０３２３】
ＥＰＭＮ（Ｂ０７）：
ＥＰＭＮの結果：モチーフを伴う８５ペプチド（３８  ９マー＋４７  １０マー）  ＯＫ
０．１７〜６３３５１９の間のＰＩＣ；ＰＩＣ＝＜１００を伴う６４
ＥＰＭＮ選択：→遺伝子型に対する選択：少なくとも１／３２において存在する５８ペプチドを選択する
推定に用いられる１ｂ配列ＥＰＭＮ
ＥＰＭＮ第２の選択：遺伝子型に対する選択（少なくとも１ｂ＋１ａコンセンサスにおいて）：
→２８ペプチド（ＰＩＣ＝＜１００を伴う１６）
【０３２４】
【表１００】
2008509654.tif 000102
【０３２５】
実施例３：ＨＬＡクラスＩ競合細胞に基づく結合アッセイ
ペプチドとＨＬＡ分子の結合溝との相互作用について、ケスラー（ＫＥＳＳＬＥＲ）ら（２００３年）による記載の競合に基づく細胞ペプチド結合アッセイを使用して、研究する。簡単に説明すると、目的のクラスＩアレルを発現するエプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞系統（Ｂ−ＬＣＬ）を使用する。ＥＢＶ形質転換は、標準的手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１年、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）に従って行う。天然の結合型クラスＩペプチドを、酸処置により、Ｂ−ＬＣＬから溶出させ、遊離のクラスＩ分子を得る。続いて、Ｂ−ＬＣＬを、フルオレセイン（Ｆｌ）標識参照ペプチド、および滴定量の競合する試験ペプチドの混合物と共にインキュベートする。参照ペプチドは、ＨＬＡ分子について既知の高い親和性を有するべきである。細胞結合型の蛍光をフローサイトメトリーによって決定する。Ｆｌ標識参照ペプチドの結合の阻害を決定し、ＩＣ５０値を算出する（ＩＣ５０＝ＨＬＡ分子の５０％を占有し得る競合するペプチドの濃度）。参照ペプチドの親和性（Ｋｄ）を、個別の実験において決定し、該実験では、異なる濃度の参照ペプチドの直接結合をモニターし、１部位結合相互作用についてのモデルを使用して、データを解析する。競合するペプチドの阻害定数（Ｋｉ）（それらの親和性を反映する）を、以下のとおり算出する：
【数２】
2008509654.tif 000103
［ＦＬ−ｐｅｐ］：競合実験において使用されるＦｌ標識ペプチドの濃度
【０３２６】
推定されるペプチドを、標準的な技術を使用して合成し、対応するＨＬＡアレルによるＢ−ＬＣＬへの結合について試験した。Ｆｌ標識参照ペプチドは、Ｃｙｓ誘導体として合成され、標識は、ｐＨ８．３（５０ｍＭ重炭酸／１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液）において、５−（ヨードアセトアミド）フルオレセインにより実施する。標識されたペプチドを脱塩し、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。標識したペプチドを、質量分析により分析した。
【０３２７】
例として、推定された強い結合性ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２との相互作用を示す。ＨＬＡ−Ａ０２ポジティブＢ−ＬＣＬ（ＪＹ，ケスラー（ＪＹ，ＫＥＳＳＬＥＲ）ら、２００３年）は、Ｆｌ参照ペプチドＦＬＰＳＤＣ（Ｆｌ）ＦＰＳＶおよび推定されるペプチド（配列番号６２〜配列番号９３）の競合を解析するのに使用される。参照ペプチドのＨＬＡ  Ａ０２への結合を図３に示す。１部位結合モデルに従ってデータを解析すると、約１０ｎＭの参照ペプチドの親和性を示す。典型的な競合実験を図４に示す。この特定の設定を、すべてのクラスＣ結合性ペプチドならびにＨＬＡ  Ａ２４結合性ペプチドの一部に使用した。表１３は、算出された阻害定数（Ｋｉ）を含有する。
【０３２８】
実施例４：可溶性ＨＬＡを使用するＨＬＡクラスＩおよびＩＩ競合結合アッセイ
可溶性ＨＬＡ分子に結合するペプチドの以下の例は、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩペプチドの結合親和性の定量化を実証する。
【０３２９】
エプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）形質転換ホモ接合細胞系統、線維芽細胞または形質転換体を、ＨＬＡクラスＩ分子の供給源として使用した。細胞溶解物を調製し、ＨＬＡ分子を、開示されたプロトコル（シドニー（Ｓｉｄｎｅｙ）ら、１９９８年；シドニー（Ｓｉｄｎｅｙ）ら、１９９５年；セッテ（Ｓｅｔｔｅ）ら、１９９４年）に従って精製した。
【０３３０】
ＨＬＡ分子を、アフィニティークロマトグラフィーにより溶解物から精製した。溶解物を、適切な抗体を結合させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂビーズのカラム上を通過させた。
【０３３１】
細胞溶解物からのＨＬＡの抽出に使用される抗体は、Ｗ６／３２（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃの場合）、Ｂ１２３．２（ＨＬＡ−Ｂおよび−Ｃの場合）ならびにＬＢ３．１（ＨＬＡ−ＤＲの場合）である。
【０３３２】
次いで、抗ＨＬＡカラムを、１％ＮＰ−４０中１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８、ＰＢＳ、０．４％ｎ−オクチルグルコシドを含有するＰＢＳで洗浄し、ＨＬＡ分子を、０．４％Ｎ−オクチルグルコシドを含有する０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中５０ｍＭジエチルアミン、ｐＨ１１．５で溶出させた。１／２５容積の２Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８を溶出物に添加して、ｐＨを±ｐＨ８に低下させた。次いで、溶出物を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州）における遠心分離により、濃縮した。タンパク質含有量を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）によって評価し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【０３３３】
ペプチドのクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣへの結合を測定するのに利用されるプロトコルの詳細な説明については、（セッテ（Ｓｅｔｔｅ）ら、１９９４年；シドニー（Ｓｉｄｎｅｙ）ら、１９９８年）により公開されている。簡単に説明すると、精製されたＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）を、多様な非標識ペプチドインヒビターおよび１〜１０ｎＭ１２５Ｉ放射性標識プローブペプチドと共に、４８時間、プロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下、０．０５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ４０）を含有するＰＢＳにおいて、インキュベートした。すべてのアッセイは、ｐＨ７においてであったが、但し、ＤＲＢ１＊０３０１については、ｐＨ４．５で実施し、ＤＲＢ１＊１６０１（ＤＲ２ｗ２１  ｌ）およびＤＲＢ４＊０１０１（ＤＲｗ５３）については、ｐＨ５で実施した。
【０３３４】
インキュベーション後、ＭＨＣペプチド複合体を、７．８ｍｍ×１５ｃｍ  ＴＳＫ２００カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ  １６２１５，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ペンシルバニア州）上でのゲルろ過によって、遊離のペプチドから分離した。ＴＳＫカラムからの溶出物を、Ｂｅｃｋｍａｎ１７０放射性同位元素検出器に通過させ、放射能をプロットし、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ３３９６Ａ積分器を使用して積算し、結合したペプチドの画分を決定した。あるいは、ＭＨＣペプチド複合体を、抗ＨＬＡ抗体で被覆したＥＬＩＳＡプレート上で捕獲することによって、遊離のペプチドから分離した。遊離のペプチドを洗浄除去した後、上記と同じ方法を使用して、残留する反応性を測定した。
【０３３５】
クロラミンＴ法を使用して、放射性標識ペプチドを、ヨウ素化した。
【０３３６】
典型的に、予備実験では、各ＭＨＣ調製物を、固定された量の放射性標識ペプチドの存在下で滴定し、全放射能のうち１０〜２０％に結合するのに必要なＨＬＡ分子の濃度を決定した。その後のすべての阻害および直接結合アッセイは、これらのＨＬＡ濃度を使用して、実施した。
【０３３７】
これらの条件［ｌａｂｅｌ］＜［ＨＬＡ］およびＩＣ５０≧［ＨＬＡ］下のため、測定されるＩＣ５０値は、真のＫＤ値の合理的な近似値である。ペプチドインヒビターは、典型的に、１２０μｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験され、２〜４回の完全に独立した実験で試験される。異なる実験において得られるデータの比較を可能にするために、阻害に対するポジティブコントロールのＩＣ５０を、各試験されたペプチド（典型的に、放射性標識プローブペプチドの非標識のバージョン）のＩＣ５０で割ることによって、各ペプチドについての相対的結合値を算出する。データベース、および実験の相互比較の目的のために、相対的結合値を編集する。続いて、これらの値は、阻害に対するポジティブコントロールのＩＣ５０ｎＭを、目的のペプチドの相対的結合で割ることによって、ＩＣ５０ｎＭ値に変換して戻すことができる。このようなデータ編集の方法は、異なる日、または異なるロットの精製されたＭＨＣで試験されているペプチドを比較するのに最も正確かつ一貫していることが証明されている。
【０３３８】
この特定の設定値を、すべてのクラスＡおよびＢ結合性ペプチドに使用した（但し、いくつかのＨＬＡ  Ａ２４結合性ペプチドについては、細胞に基づく結合アッセイを使用した）。表１３はＩＣ５０値を含有する。
【０３３９】
ＨＬＡ−ＤＲ精製に使用される抗体（ＬＢ３．１）はΑ鎖特異的であるため、βＬ分子は、β３（および／またはβ４およびβ５）分子から分離されない。結合アッセイのβ１特異性は、ＤＲＢ１＊０１０１（ＤＲ１）、ＤＲＢ１＊０８０２（ＤＲ８ｗ２）、およびＤＲＢ１＊０８０３（ＤＲ８ｗ３）の場合において明白であり、ここで、β３は発現されない。それはまた、ＤＲＢ１＊０３０１（ＤＲ３）およびＤＲＢ３＊０１０１（ＤＲ５２ａ）、ＤＲＢ１＊０４０１（ＤＲ４ｗ４）、ＤＲＢ１＊０４０４（ＤＲ４ｗ１４）、ＤＲＢ１＊０４０５（ＤＲ４ｗ１５）、ＤＲＢ１＊１１０１（ＤＲ５）、ＤＲＢ１＊１２０１（ＤＲ５ｗ１２）、ＤＲＢ１＊１３０２（ＤＲ６ｗｌ９）およびＤＲＢ１＊０７０１（ＤＲ７）についても実証されている。ＤＲＢ１＊１５０１（ＤＲ２ｗ２ｂｅｔａ−１）、ＤＲＢ５＊０１０１（ＤＲ２ｗ２ｂｅｔａ−２）、ＤＲＢｌ＊１６０１（ＤＲ２ｗ２１ｂｅｔａ−１）、ＤＲＢ５＊０２０１（ＤＲ５１Ｄｗ２１）、およびＤＲＢ４＊０１０１（ＤＲｗ５３）アッセイについてのβ鎖特異性の問題は、線維芽細胞の使用によって回避される。ＤＲβ分子特異性に関するアッセイの開発およびバリデーションについては、先に記載されている（例えば、サウスウッド（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ）ら、１９９８年を参照のこと）。表１４は、ＩＣ５０値を含有する。
【０３４０】
実施例５：ＣＤ８エピトープに対するヒトリコール応答を評価するためのペプチドの使用
本発明のペプチドエピトープは、患者における急性またはリコール応答のようなＴ細胞応答を評価するための試薬として使用される。そのような解析は、感染から回復しているか、ＨＣＶの慢性感染であるか、またはＨＣＶワクチンをワクチン接種されている患者において実施することができる。
【０３４１】
例えば、ＰＢＭＣは、感染から回復した患者から回収され、ＨＬＡ型分類される。強いまたは中等度の親和性を伴う好適に結合している（より好ましくは、閾値未満の親和性）本発明の適切なペプチドエピトープは、次いで、該ＨＬＡ型を所有する患者から誘導されるサンプルの解析に使用される。
【０３４２】
これらの患者由来のＰＢＭＣは密度勾配において分離され、プレート化される。ＰＢＭＣは、異なる時点でペプチドで刺激される。続いて、培養物は、細胞障害活性について試験される。
【０３４３】
細胞障害性アッセイは、以下の様式で実施される。標的細胞（ヒト志願者または患者から確立される自家移植または同種のＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬのいずれか；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１年）は、１晩、合成ペプチドエピトープと共にインキュベートされ、５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、イリノイ州）で標識され、その後、それらは、洗浄され、放射能が計数される。細胞障害性パーセントは、次の式から決定される：１００×［（実験的遊離−自発的遊離）／最大遊離−自発的遊離）］。最大の遊離は、標的の溶解によって決定される。
【０３４４】
そのような解析の結果は、ＨＬＡ拘束性ＣＴＬ集団が、ＨＣＶまたはＨＣＶワクチンへの先の暴露によって刺激されている程度を示す。
【０３４５】
あるいは、ＨＬＡ拘束性ＨＣＶ特異的ＣＴＬエピトープに対する慢性および回復したＨＣＶ患者におけるヒトインビトロＣＴＬリコール応答は、ヒトＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて評価され得る。例として、選択された組のＨＬＡ−Ａ０２拘束性ペプチドに対するＨＬＡ−Ａ０２ドナー（ホモ接合またはヘテロ接合）由来の細胞のインビトロリコール応答について記載する。基本的に、ヒトＰＢＭＣとＨＬＡ拘束性ペプチドとの１晩のインキュベーション後、インビトロＣＴＬリコール応答は、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて可視化される。
【０３４６】
同じことが、ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０８およびＨＬＡ−Ｃｗ０４、Ｃｗ０６およびＣｗ０７についても行われている。
【０３４７】
材料および方法
ヒトＰＢＭＣ
それぞれ個々のペプチドに対するカットオフ値を決定するために使用される健康なドナー由来のＰＢＭＣは、標準的な手順に従って、単離される。
【０３４８】
慢性ＨＣＶ感染および（治療により）回復したＨＣＶ患者由来のＰＢＭＣは、ＨＣＶ特異的応答を決定するために使用される。すべてのドナーは、ＨＬＡ−Ａ０２ポジティブである。
【０３４９】
ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける使用のために、ＰＢＭＣを、標準的な手順に従って、融解し、１０％不活性化ウシ胎児血清（ｉＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、Ｂｕｅｒｋｅｒ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｒｅにおいてトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ）で被覆する。細胞を、１０％ｉＦＣＳを補充した完全ＲＰＭＩ培地（＝ＲＰＭＩ培地＋ＮＥＡＡ＋ＮａＰｙ＋ゲンタマイシン＋βＭｅＯＨ）に再懸濁し、適切な細胞密度にした。
【０３５０】
ＨＬＡ−Ａ０２拘束性ＣＴＬペプチド
ＨＬＡ−Ａ０２拘束性ＨＣＶペプチドの選択を、それらの親和性（ＩＣ５０）に基づいて行った。試験されるペプチドを表Ｂに示す。ＧＩＬＧＦＶＦＴＬは、コントロールペプチドとして使用されるＨＬＡ−Ａ０２拘束性免疫優性インフルエンザ特異的エピトープである。すべてのペプチドは、１００％ＤＭＳＯにおいて５または１０ｍｇ／ｍｌで溶解され、水溶液中−２０℃で貯蔵される。
【０３５１】
使用直前、ペプチドを、１０％ｉＦＣＳを補充した完全ＲＰＭＩ培地でさらに希釈し、１０μｇ／ｍｌの最終濃度のＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用する。
【０３５２】
サイトカイン
凍結乾燥されたヒトＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ２０７−ＩＬ）およびヒトＩＬ−１５（Ｒ＆Ｄ２１５−ＩＬ）を、１０％ｉＦＣＳを補充したＲＰＭＩ培地に５μｇ／ｍｌで再構成し、水溶液中−７０℃で貯蔵される。
【０３５３】
両方のサイトカインは、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、サイトカインあたり０．５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用される。
【０３５４】
ヒトＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ
ＥＬＩＳＰＯＴプレートのメンブランを予め湿潤させるために、５０μｌのエタノール９９％ｐ．ａ．を各ウェルに添加する。室温で１０分間後、エタノールを、すべてのウェルを、精製水で２回、ＰＢＳで１回洗浄することによって、取り出す。
【０３５５】
予め湿潤させた９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートを、１晩、抗ヒトＩＦＮγ抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ  Ｍａｂ−１−Ｄ１Ｋ）で被覆し、２時間、１０％ｉＦＣＳを補充したＲＰＭＩ培地でブロックする。
【０３５６】
ＰＢＭＣを、１０％ｉＦＣＳを補充した完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、３×１０５細胞／ウェル〜４×１０５細胞／ウェルの間の要求される細胞密度で、被覆されたＥＬＩＳＰＯＴプレートにおいて３連で播種する。細胞を、１０μｇのペプチド／ｍｌでＨＬＡ−Ａ０２拘束性（ＣＴＬ）ペプチドと共に、またはポジティブコントロールとして２μｇ／ｍｌで多クローン刺激フィトヘムアグルチニン（ｐＨＡ）と共に、サイトカインを伴うかまたは伴わずに、インキュベートする。
【０３５７】
２３時間のインキュベーション後、すべての細胞を溶解し、洗浄除去し、プレートを、ビオチン化抗ヒトＩＦＮγ抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ  Ｍａｂ７−Ｂ６−１−ｂｉｏ）およびストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＤ５５７６３０）でさらに展開する。スポットを、基質としてＡＥＣ（ＢＤ５５１９５１）を使用して、可視化する。プレートを流水（ｔａｐ  ｗａｔｅｒ）で濯ぎ、着色反応を停止する。プレートを乾燥した後、Ａ．ＥＬ．ＶＩＳ  ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを使用して、スポット／ウェルの数を決定する。すべてのスポットは、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋細胞である。
【０３５８】
データ解析のための方法
少なくとも一人の患者がペプチドに対して活性な応答（＝カットオフレベルＰ８０を超える応答）を示し、ここで、この活性な応答がサイトカインカクテル（ＩＬ−７＋ＩＬ−１５）の添加を伴うおよび伴わないの両方で認められる場合、該ペプチドはヒトリコールにおいてポジティブとみなされる。
【０３５９】
カットオフ値は、健康な個体（ｎ＝２０）における免疫応答を測定することによって決定され、統計的にｐ８０およびｐ９０値に基づく（＝それぞれ個々のペプチドについてのバックグランドの免疫応答の格付け後、バックグランドの免疫応答のそれぞれ８０％、９０％がこのカットオフ値未満である）。全体として、サイトカインの添加後、より高いカットオフが測定される。
【０３６０】
結果
表Ｂは、１組のＨＬＡ−Ａ０２結合性ペプチドの結果を含有する。結果「＋」もまた、表１３に示される。
【０３６１】
【表１０１】
2008509654.tif 000104
【０３６２】
クラスＩＩ拘束性ＨＴＬ応答もまた、同等の方法で解析することができる。
【０３６３】
実施例６：トランスジェニック（Ｔｇ）または代理母マウスにおけるＣＴＬエピトープの活性
本実験は、１つもしくはそれ以上のＨＣＶ  ＣＴＬエピトープの使用によるトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬの誘導を例示する。エピトープ組成物は、本発明に記載およびより具体的には、表１３において示されるＣＴＬエピトープの任意の組み合わせを含んでなることができる。
【０３６４】
同様に、代理母マウスは、トランスジェニック動物が得られない場合に使用することができる。
【０３６５】
代理母マウスは、特定のヒトＨＬＡ分子に似たＭＨＣ分子を発現する非トランスジェニック動物であり、それ自体ヒトＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープの評価に有用である。代理母マウスの例には：ＨＬＡ−Ａ２４についてはＣＢ６Ｆ１、ＨＬＡ−Ｂ４４についてはＣＢＡ、ＨＬＡ−Ａ０１についてはＰＬＪおよびＨＬＡ−ＤＲについてはＢａｌｂ／Ｃがある。
【０３６６】
ＨＬＡ−Ｂ０７およびＢ３５エピトープ
この特定の実施例について、実験は、表１３、セクションＢ０７およびＢ３５において開示されるＫｉ＜１０００ｎＭを伴うペプチドの免疫原性を評価するために実施される。
【０３６７】
ＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウス（Ｆ１、Ｂａｌｂ／ｃと交配）におけるＩＦＡにおいて乳化されたＢ７またはＢ３５に結合するペプチドによって誘導されるＨＬＡ−Ｂ７拘束性ＣＴＬ応答が評価される。比較として、生来のマウスのグループを含めた。免疫化ＨＬＡ−Ｂ７／ＫｂトランスジェニックマウスにおけるＨＬＡ−Ｂ７および−Ｂ３５拘束性エピトープに対するＣＴＬ応答の大きさが生来の動物の応答と比較される。
【０３６８】
実験設定
ＨＬＡ−Ｂ７／Ｋｂトランスジェニックマウス（ＢＡＬＢ／ｃ×ＨＬＡ−Ｂ７／Ｋｂ．Ｃ５７ＢＬ／６Ｆ１マウス；Ｈ２ｂｘｄ）、（雄性および雌性の両方）を利用した。マウスは、８〜１４週齢の間で使用した。各グループは、３匹のマウスおよび４匹のマウスからなる生来の群よりなった。各設定は２つの独立した実験で反復した。
【０３６９】
免疫化および試験スキームを表１７に示す。一般に、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｋｂマウスを、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）において乳化されたＢ７拘束性ＣＴＬペプチドのプールで免疫化した。２５μｇ／ペプチドの用量で類似の結合親和性の９つのペプチドプール（それぞれが４〜６ＣＴＬペプチドからなる）、および１２０μｇのＨＴＬエピトープ、ＨＢＶ  Ｃｏｒｅ１２８（ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ）（動物において既知のＨＴＬエピトープ）を試験した。各実験は３つのプールを試験し、各プールは、２つの独立した実験で試験された。生来の（naive）動物（非免疫化ＨＬＡ−Ｂ７／Ｋｂトランスジェニックマウス）は、コントロール群として各実験に含めた。マウスの尾の付け根の皮下に１００μｌのエマルジョンで、免疫化した。免疫化の１１〜１４日後、マウスを安楽死させ、脾臓を取り出した。
【０３７０】
【表１０２】
2008509654.tif 000105
【０３７１】
膵臓を、１５−ｍｌ組織グラインダーで破砕し、得られる単細胞懸濁液をＤＮＡＳＥ溶液（ＰＢＳ中３０ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅの１０μｌ／膵臓）で処置し、２％ＦＣＳを伴うＲＰＭＩ−１６４０において洗浄し、計数した。次いで、脾臓細胞を、４℃、１５〜２０分間、３００μｌ  ＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび２ＭＭ  ＥＤＴＡを伴うＰＢＳ）中、３５μｌのＭＡＣＳ  ＣＤ８ａ（Ｌｙ−２）マイクロビーズ／１０８細胞と共に、製造者の仕様書に従って、インキュベートした。次いで、細胞を、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｌｔｅｎｙｉ）に適用し、４回洗浄した。１０％ＦＢＳを補充したＨＥＰＥＳを伴うＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μＭ２−ＭＥ，  ０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍＬペニシリン（ＲＰＭＩ−１０）からなる培養培地においてカラムから細胞を取り出し、洗浄し、再度計数した。
【０３７２】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、ＣＴＬエピトープに対する応答を評価した。簡単に説明すると、ＩＰメンブランに基づく９６ウェルプレート（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＢＥＤＦＯＲＤ、マサチューセッツ州）を、１晩、４℃、Α−マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＭａｂＡＮ１８）で、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌの濃度で被覆した。ＰＢＳで３回洗浄後、ＲＰＭＩ−１０を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間、インキュベートし、プレートをブロックした。精製されたＣＤ８＋細胞を、ブロックされたメンブランプレートに、４×１０５細胞／ウェルの細胞濃度で適用した。
【０３７３】
ペプチドをＲＰＭＩ−１０に溶解し（最終ペプチド濃度１０μｇ／ｍｌ）、標的細胞（１０５ＨＬＡ−Ｂ７／Ｋｂ形質転換Ｊｕｒｋａｔ細胞／ウェル）と混合した。培地のみおよびＣＯＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）のコントロールもまた利用した。標的細胞／ペプチド混合物を、メンブランプレートにおいてエフェクター細胞上に重層し、２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０３７４】
次いで、培地および細胞を、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄してＥＬＩＳＰＯＴプレートから離し、プレートをαマウスビオチン化α−ＩＦＮ−γ抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＭａｂＲ４−６Ａ２−ビオチン）と共に、１μｇ／ｍｌの最終濃度で４時間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、プレートを、製造者の指示に従って調製したアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ）と共にインキュベートし、室温で１時間、インキュベートした。最後に、プレートを、ＡＥＣ（１錠の３−アミノ−９−エチルカルバゾールを２．５ｍｌジメチルホルムアミドに溶解し、酢酸緩衝液で５０ｍｌに調節した；２５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２をＡＥＣ溶液に添加した）で展開し、洗浄し、乾燥した。スポットを、ＡＩＤプレートリーダーを使用して計数した。
【０３７５】
データ解析
各ペプチドを、免疫化したグループおよび生来のグループの両方において、認識について試験した。各実験条件について、データを３連で回収した。
【０３７６】
培地コントロールに対する生データを、各グループ（生来および免疫化の両方）について平均化した。正味のスポットを、グループ内の生データから各グループの平均培地コントロールを差し引くことによって、算出した。次いで、平均および標準誤差を各ペプチドについて算出し、平均および標準誤差を、（２．５の因子を掛けることによって）１０６細胞に正規化した。最後に、タイプ１、片側Ｔ検定を実施して、免疫化したグループのデータを、生来のコントロールのデータと比較した。データをペプチド特異的ＩＦＮγ産生細胞／１０６ＣＤ８＋細胞の数として報告する。
【０３７７】
２つの再現実験由来のデータを比較する。不一致のデータを伴うペプチド（即ち、一方の実験ではポジティブおよび他方の実験ではネガティブ）は、第３の実験において反復する。２つもしくはそれ以上の実験由来のデータは、上記のように平均することができる。
【０３７８】
Ｂ７およびＢ３５拘束性ペプチドのペプチド免疫原性結果
データを表１８（Ｂ７）および１９（Ｂ３５）に示し、２〜４回の独立した実験における応答を提示する。生来のマウスの応答と比較した場合、２６のペプチドがポジティブの応答を示した（ｐ≦０．１）。
【０３７９】
試験したペプチドのうち１０が、Ｂ７およびＢ３５の両方（６ペプチド）またはＢ３５のみ（４ペプチド）に結合した。Ｂ７およびＢ３５の両方に結合した６ペプチドのうち、４は、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｋｂトランスジェニックマウスにおいて免疫原性であった（表２）。Ｂ３５のみに結合した４ペプチドは、Ｂ７トランスジェニックマウスにおいてすべてネガティブであった。
【０３８０】
【表１０３】
2008509654.tif 000106
【０３８１】
【表１０４】
2008509654.tif 000107
【０３８２】
ＨＬＡ−Ａ０１、Ａ０２、Ａ０３／Ａ１１、Ａ２４およびＢ４４エピトープ
それぞれのＴＧまたは代理母動物における同等の実験を、表１３において開示されるＫｉ＜１０００ｎＭを伴うすべてのペプチドにおいて実施した。結果を表２０〜２５に示す。
【０３８３】
【表１０５】
2008509654.tif 000108
【０３８４】
【表１０６】
2008509654.tif 000109
【０３８５】
【表１０７】
2008509654.tif 000110
【０３８６】
【表１０８】
2008509654.tif 000111
【０３８７】
【表１０９】
2008509654.tif 000112
【０３８８】
ＨＬＡ−Ａ２４エピトープ
本実験では、ペプチド応答の解析が個々のマウスにおいて実施されるＨＬＡ−Ａ２４結合性エピトープの免疫原性の評価について、僅かに異なるアプローチを使用する。ＥＬＩＳＰＯＴの結果は、マウスあたり百万個の（ＣＤ８選択性）脾臓細胞あたりのペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の数として報告し、反応する動物における応答の３連の（刺激を伴わないネガティブコントロール条件を差し引くことによる）平均のΔ値を算出する。少なくとも１つ動物が該ペプチドに対して有意なポジティブな応答を示す場合、ペプチドは、マウスモデルにおいて免疫原性であるとみなされる。
【０３８９】
【表１１０】
2008509654.tif 000113
【０３９０】
実施例７：トランスジェニック（Ｔｇ）および代理母マウスにおけるＨＴＬエピトープの活性
ＨＬＡ−ＤＲペプチドの免疫原性を試験するための実験は、完全フロイントがアジュバントとして使用される点で、実施例６と若干異なる。ペプチドは、ＤＲＢ１＊０４０１−Ｔｇマウスまたは代理母マウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣＢＡ）のいずれかにおいて試験される。この特定の実施例では、ＨＬＡ拘束性ペプチド応答は、プールされたサンプルにおいて解析される。
【０３９１】
ＤＲ４トランスジェニックマウスのデータを表２６に示し、２つの独立した実験における応答を提示する。１７のペプチドが、これらのマウスにおいて、ポジティブの応答を付与した（＞１０ＳＦＣ／１０６ＣＤ４＋細胞およびｐ≦０．０５として規定される）。
【０３９２】
Ｈ２ｂｘｄバックグランド（Ｂａｌｂ／ｃ）のデータを表２７に示し、２つの独立した実験における応答を提示する。７のペプチドが、これらのマウスにおいて、ポジティブの応答を付与する（＞１０ＳＦＣ／１０６ＣＤ４＋細胞およびｐ≦０．０５として規定される）。
【０３９３】
ＣＢＡマウス（Ｈ２ｋ）のデータを表２８に示し、２つの独立した実験における応答を提示する。１２のペプチドが、これらのマウスにおいて、ポジティブの応答を付与する（＞１０ＳＦＣ／１０６ＣＤ４＋細胞およびｐ≦０．０５として規定される）。
【０３９４】
【表１１１】
2008509654.tif 000114
【０３９５】
【表１１２】
2008509654.tif 000115
【０３９６】
【表１１３】
2008509654.tif 000116
【０３９７】
図７に示されるように、結合性と免疫原性との間には緊密な関係が検出される。
【０３９８】
５００ｎＭ未満の結合親和性を伴うすべてのペプチドが免疫原性であると結論付けることができる。従って、ＤＲＢ１の閾値親和性は５００ｎＭである。
【０３９９】
実施例８：ネステッドエピトープにおいて包埋されるＣＴＬエピトープの免疫原性
本実施例は、感受性マウスに注入される場合のネステッドエピトープにおいて包埋されるエピトープの選択に対するＣＴＬ応答の誘導を例示する。同様の実験を、ネステッドエピトープにおいて包埋されるエピトープに対するＨＴＬ応答の誘導を例示するために実施することができる。
【０４００】
本実施例については、Ａ２４拘束性エピトープを含有するネステッドエピトープを注入されたＨＬＡ  Ａ２４  ＴｇマウスにおけるＡ２４特異的Ｔ細胞応答が測定される。個々のＨＬＡ−Ａ２４拘束性エピトープに対するＣＴＬ応答の大きさが決定され、緩衝液／アジュバント（ＣＦＡ）コントロールで免疫化されるマウス由来の細胞におけるこれらのエピトープに対して測定される応答と比較される。５００ｎＭ未満の親和性（ＫＩ）を伴うすべてのＨＬＡ−Ａ２４エピトープ結合性を試験した。
【０４０１】
これらのネステッドエピトープにおいて包埋され、他のＨＬＡ−クラスＩ型に対して拘束性であるエピトープの免疫原性は、感受性マウスにおいて同等の方法で評価することができる。
【０４０２】
インビボ実験設定
５匹のマウス（８〜１０週齢、無作為化された雌性および雄性）の２つのグループが含まれ、各グループの動物は、ＣＦＡに乳化されたネステッドエピトープかまたはネガティブコントロールとして、ペプチドを伴わずにＣＦＡにおいて乳化された緩衝液のいずれか一方の単回注入を受ける。すべての注入は、尾の付け根の皮下において実施した。本特定の実験では、ネステッドエピトープＦＷＡＫＨＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮＰＡ（配列番号２２７８）を評価した（表２９）。
【０４０３】
【表１１４】
2008509654.tif 000117
【０４０４】
インビトロ実験設定
すべての個々の動物由来の脾臓細胞を、注入の１１〜１４日後に単離する。直接的エクスビボＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、代理母ＣＴＬのリードアウトとして使用する。このため、それぞれの個々のマウス由来のＣＤ８脾臓細胞は、脾臓細胞（の一部）に対してポジティブな磁気ビーズの分離によって精製される。
・グループ０５  ０４０／３では、それぞれの個々のマウス由来の精製されたＣＤ８脾臓細胞（２．１０５細胞／ウェル）における応答を、ＨＬＡ−Ａ２４／Ｋｂ分子を提示する抗原提示細胞（１０４細胞／ウェル）およびγ−照射同系膵臓細胞（２．１０５細胞／ウェル）に対してＨＬＡ−Ａ２４−特異的ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を提示することによって、評価する。充填後、洗浄により過剰のペプチドを取り出す。
・グループ０５  ０４０／５では、各マウス由来の脾臓細胞を、ＣＤ８精製前にプールする。上記と同じ条件を使用するＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを実施して、試験するすべてのペプチドに対して基準となる応答を決定する。
【０４０５】
【表１１５】
2008509654.tif 000118
【０４０６】
データ解析のための方法
ＥＬＩＳＰＯＴの結果を、マウスまたはプールしたグループあたり百万個の（ＣＤ８／ＣＤ４選択性）脾臓細胞あたりのペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の数として報告する。（刺激を伴わないネガティブコントロールを差し引くことによる）３回反復の平均／メジアンデルタ値に基づいて、試験する各エピトープの異なるグループ／実験設定値間の記述的比較を行う。
【０４０７】
さらに、コントロールの非免疫化マウスにおける非特異的なバックグランド応答をさらなるネガティブコントロールとして使用し、個々のエピトープの免疫原性を決定する。
【０４０８】
承認基準
実験のインビボ部分では、研究の開始時および終了時に、すべてのマウスを評価し（一般的な健康状態に関する文書）、秤量する。
【０４０９】
インビトロで行われる実験の結果の受容は、細胞の多クローン刺激後の良好に立証されている生存能およびポジティブな応答に基づく。個々のマウスにおいて試験した４つのＨＬＡ−Ａ２４エピトープの結果を示す。
【０４１０】
【表１１６】
2008509654.tif 000119
【０４１１】
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ヴェルトハイマー  ＡＭ（Ｗｅｒｔｈｅｉｍｅｒ  ＡＭ）ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３７：５７７−５８９
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【図面の簡単な説明】
【０４１２】
【図１】Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ  Ｎ．Ｖ．に記載の方法による９マーペプチド設計に使用される部分の同定（太字）による利用可能なＨＣＶ配列の選択に基づくＨＣＶ１Ｂコンセンサス配列（配列番号７６９）；前記部分はＣｏｒｅ、ＮＳ３およびＮＳ５である；表１〜１１において認められる９マーのアミノ酸の番号付けは、図１に開示されるＨＣＶ配列に基づく。
【表１１７】
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【図２】Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ  Ｎ．Ｖ．に記載の方法による１０マーペプチド設計に使用され、ＨＣＶ遺伝子型交差反応性の決定に使用される部分の同定（太字）によるＨＣＶ１ｂコンセンサス配列（配列番号７７０）；前記部分はＣｏｒｅ、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５である。アミノ酸の番号付けは、図１と同じである。表１〜１１において認められる１０マーのアミノ酸の番号付けは、図２に開示されるＨＣＶ配列に基づく。
【図３】細胞に基づく結合アッセイにおけるＨＬＡ−Ａ０２に対するＨＬＡ−Ａ０２参照ペプチドＦＬＰＳＤＣ（Ｆｌ）ＦＰＳＶの結合。
【図４】細胞に基づく結合アッセイにおける典型的なＨＬＡ−Ａ０２競合実験の例。
【図５】ＨＣＶ遺伝子型交差反応性の決定のために使用されるＨＣＶ１ａコンセンサス配列（配列番号７７１）。
【図６】ＨＣＶ遺伝子型交差反応性の決定のために使用されるＨＣＶ３ａコンセンサス配列（配列番号７７２）。
【図７】ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１Ｔｇマウスにおける結合対免疫原性。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月2日(2007.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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