(57)【要約】  本発明は、ＫＲＣ分子が骨形成および石灰化を包含する多様な細胞過程の調節における調節剤として複数の重要な機能を有することを示す。骨芽細胞中のＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＫＲＣ、Ｒｕｎｘ２、Ｓｍａｄ３およびＥ３ユビキチンリガーゼＷＷＰ１（Ｒｕｎｘ２のポリユビキチン化およびプロテアソーム依存性の分解を促進するＷＷＰ１の能力によりＲｕｎｘ２の機能を阻害する）の間の多量体複合体の形成を促進する。さらに、ＫＲＣおよびＷＷＰ１はＲＳＫ２と複合体を形成し、それはＲＳＫ２のリン酸化を促進し、かつ、ＲＳＫ２のユビキチン化を促進するＷＷＰ１の能力によりＲＳＫ２の機能を阻害する。ＫＲＣ活性の調節物質の同定方法が提供される。ＫＲＣ発現および／若しくは活性を調節する剤を使用する、免疫応答、骨形成および石灰化、ならびにＫＲＣ関連障害の調節方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成および石灰化が増大されるように、骨芽細胞中のＫＲＣの発現および／若しくは生物学的活性を低下させる剤と骨芽細胞を接触させることを含んでなる、骨形成および石灰化の増大方法。
【請求項２】
被験体における骨形成および石灰化が増大されるように、骨芽細胞中のＫＲＣの発現および／若しくは生物学的活性を低下させる剤と、該被験体からの骨芽細胞を接触させることを含んでなる、被験体における増大された骨形成および石灰化から利益を得るとみられる疾患、障害、状態若しくは傷害の処置若しくは予防方法。
【請求項３】
骨形成および石灰化が低下されるように、骨芽細胞中のＫＲＣの発現および／若しくは生物学的活性を増大させる剤と骨芽細胞を接触させることを含んでなる、骨形成および石灰化の低下方法。
【請求項４】
被験体における骨形成および石灰化が低下されるように、骨芽細胞中のＫＲＣの発現および／若しくは生物学的活性を増大させる剤と、該被験体からの骨芽細胞を接触させることを含んでなる、被験体における骨形成および石灰化から利益を得るとみられる疾患、障害、状態若しくは傷害の処置若しくは予防方法。
【請求項５】
接触させる段階がｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
接触させる段階がｉｎ  ｖｉｖｏで起こる、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
剤が表面上に存在する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
疾患、障害、状態若しくは傷害が、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症および変形性骨炎（骨のパジェット病）よりなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
疾患、障害、状態若しくは傷害が、頭蓋骨縫合早期癒合症および硬化性骨炎よりなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
剤が、ＫＲＣ分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＲＵＮＸ２分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＷＷＰ１分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＲＳＫ２分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＫＲＣ  ｓｉＲＮＡ分子、ＲＵＮＸ２  ｓｉＲＮＡ分子、ＷＷＰ１  ｓｉＲＮＡ分子、ＲＳＫ２  ｓｉＲＮＡ分子  ドミナントネガティブＫＲＣ分子、ドミナントネガティブＲｕｎｘ２分子、ドミナントネガティブＷＷＰ１分子、ドミナントネガティブＲＳＫ２分子、若しくはそれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項１１】
剤が、ＫＲＣポリペプチドをコードする核酸分子、Ｒｕｎｘ２ポリペプチドをコードする核酸分子、ＷＷＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子、ＲＳＫ２ポリペプチドをコードする核酸分子、ＫＲＣポリペプチド、Ｒｕｎｘ２ポリペプチド、ＷＷＰ１ポリペプチド、ＲＳＫ２ポリペプチド、若しくはそれらの組合せよりなる群から選択される、請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項１２】
剤が、ＫＲＣ分子とＲｕｎｘ２分子の間の相互作用を低下させる、請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項１３】
剤が、ＫＲＣ分子とＲｕｎｘ２分子の間の相互作用を増大させる、請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項１４】
剤が、ＫＲＣ分子、ＳＭＡＤ３分子およびＲｕｎｘ２分子の間の相互作用を低下させる、請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項１５】
剤が、ＫＲＣ分子、ＳＭＡＤ３分子およびＲｕｎｘ２分子の間の相互作用を増大させる、請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項１６】
剤が、ＫＲＣ分子とＷＷＰ１分子の間の相互作用を低下させる、請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項１７】
剤が、ＫＲＣ分子とＷＷＰ１分子の間の相互作用を増大させる、請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項１８】
剤が、ＫＲＣ分子、ＲＳＫ２分子およびＷＷＰ１分子の間の相互作用を低下させる、請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項１９】
剤が、ＫＲＣ分子、ＲＳＫ２分子およびＷＷＰ１分子の間の相互作用を増大させる、請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項２０】
剤がＲｕｎｘ２のユビキチン化を低下させる、請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項２１】
剤がＲｕｎｘ２のユビキチン化を増大させる、請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項２２】
骨芽細胞が、Ｒｕｎｘ２のユビキチン化を低下させる剤とさらに接触される、請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項２３】
骨芽細胞が、Ｒｕｎｘ２のユビキチン化を増大させる剤とさらに接触される、請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項２４】
剤がＲＳＫ２のユビキチン化を低下させる、請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項２５】
剤がＲＳＫ２のユビキチン化を増大させる、請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項２６】
骨芽細胞が、ＲＳＫ２のユビキチン化を低下させる剤とさらに接触される、請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項２７】
骨芽細胞が、ＲＳＫ２のユビキチン化を増大させる剤とさらに接触される、請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項２８】
骨芽細胞が成熟骨芽細胞である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
ａ）ＫＲＣおよびＲｕｎｘ２、若しくはそれらの生物学的に活性の部分を含んでなる指標組成物を提供すること；
ｂ）該指標組成物を、試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させること；
ｃ）ＫＲＣおよびＲｕｎｘ２、若しくはそれらの生物学的に活性の部分の相互作用を低下させる目的の化合物を、試験化合物のライブラリーから選択することであって、ここで骨形成および石灰化を増大させる化合物の能力が、該化合物の非存在下での相互作用の量
に比較しての相互作用の低下により示される、
を含んでなる、骨形成および石灰化の増大において有用な化合物の同定方法。
【請求項３０】
ａ）ＫＲＣおよびＲｕｎｘ２、若しくはそれらの生物学的に活性の部分を含んでなる指標組成物を提供すること；
ｂ）該指標組成物を、試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させること；
ｃ）ＫＲＣおよびＲｕｎｘ２、若しくはそれらの生物学的に活性の部分の相互作用を増大させる目的の化合物を、試験化合物のライブラリーから選択することであって、骨形成および石灰化を低下させる化合物の能力が、該化合物の非存在下での相互作用の量に比較しての相互作用の増大により示される、
を含んでなる、骨形成および石灰化の低下において有用な化合物の同定方法。
【請求項３１】
ａ）ＫＲＣおよびＷＷＰ１、若しくはそれらの生物学的に活性の部分を含んでなる指標組成物を提供すること；
ｂ）該指標組成物を、試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させること；
ｃ）ＫＲＣおよびＷＷＰ１、若しくはそれらの生物学的に活性の部分の相互作用を低下させる目的の化合物を、試験化合物のライブラリーから選択することであって、骨形成および石灰化を増大させる化合物の能力が、該化合物の非存在下での相互作用の量に比較しての相互作用の低下により示される、
を含んでなる、骨形成および石灰化の増大において有用な化合物の同定方法。
【請求項３２】
ａ）ＫＲＣおよびＷＷＰ１、若しくはそれらの生物学的に活性の部分を含んでなる指標組成物を提供すること；
ｂ）該指標組成物を、試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させること；
ｃ）ＫＲＣおよびＷＷＰ１、若しくはそれらの生物学的に活性の部分の相互作用を増大させる目的の化合物を、試験化合物のライブラリーから選択することであって、ここで骨形成および石灰化を低下させる化合物の能力が、該化合物の非存在下での相互作用の量に比較しての相互作用の増大により示される、
を含んでなる、骨形成および石灰化の低下において有用な化合物の同定方法。
【請求項３３】
ＫＲＣおよびＲｕｎｘ２分子の相互作用が、ＫＲＣとＲｕｎｘ２の間の複合体の形成を測定することにより測定される、請求項２９若しくは３０に記載の方法。
【請求項３４】
指標組成物が、ＫＲＣポリペプチドおよびＲｕｎｘ２ポリペプチドを含んでなる細胞であり、ならびに、骨形成および石灰化に対する試験化合物の影響が、試験化合物の存在および非存在下でのＲｕｎｘ２ポリペプチドの分解を測定することにより測定される、請求項２９若しくは３０に記載の方法。
【請求項３５】
指標組成物が、ＫＲＣポリペプチド、Ｒｕｎｘ２ポリペプチド、若しくはそれらの生物学的に活性の部分、ならびにＲｕｎｘ２ポリペプチドに応答するレポーター遺伝子を含んでなる細胞であり；ならびに、骨形成および石灰化に対する試験化合物の影響が、試験化合物の存在および非存在下での該レポーター遺伝子の発現を評価することにより測定される、請求項２９若しくは３０に記載の方法。
【請求項３６】
レポーター遺伝子がＯＳＥ２−ルシフェラーゼである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＫＲＣおよびＷＷＰ１分子の相互作用が、ＫＲＣとＷＷＰ１の間の複合体の形成を測定することにより測定される、請求項３１若しくは３２に記載の方法。
【請求項３８】
ＳＭＡＤ３分子もまた指標組成物中に存在する、請求項２９若しくは３０に記載の方法
。
【請求項３９】
Ｒｕｎｘ２分子若しくはその生物学的に活性の部分もまた指標組成物中に存在する、請求項３１若しくは３２に記載の方法。
【請求項４０】
ＲＳＫ２分子もまた指標組成物中に存在する、請求項３１若しくは３２に記載の方法。
【請求項４１】
Ｒｕｎｘ２の生物学的に活性の部分がＲｕｎｔドメインを含んでなる、請求項２９、３０若しくは３９に記載の方法。
【請求項４２】
Ｒｕｎｘ２の生物学的に活性の部分がＰＰＸＹドメインを含んでなる、請求項２９、３０若しくは３９に記載の方法。
【請求項４３】
相互作用がＲｕｎｘ２分子のユビキチン化を測定することにより測定される、請求項３４若しくは３９に記載の方法。
【請求項４４】
相互作用がＲｕｎｘ２  ｍＲＮＡ産生を測定することにより測定される、請求項３４若しくは３９に記載の方法。
【請求項４５】
相互作用がＲｕｎｘ２タンパク質レベルを測定することにより測定される、請求項３４若しくは３９に記載の方法。
【請求項４６】
相互作用が、ＢＳＰ、ＣｏｌＩ（α）１、ＯＣＮ、ＲＡＮＫＬ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＳＫ２およびＡＴＦ４よりなる群から選択される最低１種の分子の発現を測定することにより測定される、請求項３４若しくは３９に記載の方法。
【請求項４７】
指標組成物が、ＫＲＣポリペプチドを発現する細胞である、請求項２９〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４８】
ＫＲＣポリペプチドが内因性ポリペプチドである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＫＲＣポリペプチドが外因性ポリペプチドである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
細胞が骨芽細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
骨芽細胞が成熟骨芽細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
化合物がＲｕｎｘ２およびＣＢＦβの相互作用を低下させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項５３】
化合物がＲｕｎｘ２およびＣＢＦβの相互作用を増大させる、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、“ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＢＯＮＥ  ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＭＩＮＥＲＡＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＢＹ  ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ  ＫＲＣ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ（ＫＲＣ活性を調節することによる骨形成および石灰化の調節方法）”と題された２００５年４月１５日出願の米国仮出願第６０／６７１６１９号の利益を主張する。本出願は、２００２年５月３日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１４１６６号および２００１年５月３日出願の米国仮出願第６０／２８８，３６９号に対する優先権の利益を主張する２００３年１１月３日出願の米国特許出願第１０／７０１，４０１号の一部継続出願である２００４年１１月３日出願の第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３６６４１号に関する。
【０００２】
政府資金援助
本明細書に記述される研究は、少なくとも部分的に、助成金番号ＡＩ２９６７３、ＡＲ４６９８３のもとで国立保健研究所（ＮＩＨ）により支援された。政府は本発明に対しある種の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００３】
転写因子は、細胞外シグナルから細胞内応答への経路を接続するように機能する、細胞内の分子の一群である。環境刺激の直後に、主としてサイトゾルに存するこれらのタンパク質は核に転位され、そこでそれらは標的遺伝子のプロモーター要素中の特定のＤＮＡ配列に結合し、そしてこれらの標的遺伝子の転写を活性化する。転写因子の１ファミリー、ＺＡＳ（ジンクフィンガー酸性ドメイン構造）ＤＮＡ結合タンパク質ファミリーは、遺伝子の転写、ＤＮＡ組換えおよびシグナル伝達の調節に関与している（非特許文献１）。
【０００４】
ジンクフィンガータンパク質は、高度に保存されたＣｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーの存在により同定される（非特許文献１）。ジンクフィンガーは、ＺＡＳドメインと呼ばれるＤＮＡ結合構造の不可欠の一部である。ＺＡＳドメインは、一対のジンクフィンガー、グルタミン酸／アスパラギン酸豊富な酸性配列、およびセリン／トレオニン豊富な配列から構成される（非特許文献１）。ＺＡＳドメインは、遺伝子のプロモーター若しくはエンハンサー領域に見出されるｋＢ様シス作動性調節エレメントと相互作用することが示されている。ＺＡＳタンパク質は、多くの遺伝子、とりわけ免疫応答に関与するもののエンハンサー配列中に存在する核因子ｋＢ結合部位を認識する（非特許文献２）。ＺＡＳ  ＤＮＡ結合タンパク質はこれらの標的遺伝子の転写調節物質であることが示されている（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００５】
ジンクフィンガー転写因子κ認識成分（「ＫＲＣ」、ｓｃｈｎｕｒｒｉ３若しくはＳｈｎ３、およびヒト免疫不全ウイルスタイプＩエンハンサー結合タンパク質３（ＨＩＶＥＰ３）としてもまた知られる）は、タンパク質のＺＡＳ  ＤＮＡ結合ファミリーの１メンバーである（非特許文献２；非特許文献３）。ＫＲＣ遺伝子は、免疫受容体遺伝子の体細胞性Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに関与する七量体のコンセンサスシグナル配列のＤＮＡ結合タンパク質として同定された（非特許文献４）。ＫＲＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで表皮増殖因子受容体キナーゼおよびｐ３４ｃｄｃ２キナーゼの基質である（非特許文献２）。
【０００６】
ショウジョウバエにおいて、Ｓｃｈｎｕｒｒｉ（Ｓｈｎ）は、胚形成の間、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの１メンバー、デカペンタプレジック（Ｄｐｐ）の下流の遺伝子の調節で重要な役割を演じている（非特許文献５）。Ｄｐｐのその受容体への連結は、Ｍａｄ
（ショウジョウバエのＲ−Ｓｍａｄホモログ）とパートナーを組むＭｅｄ（ショウジョウバエのＣｏ−Ｓｍａｄホモログ）をもたらすシグナルカスケードを開始する（非特許文献６）。Ｍａｄ／Ｍｅｄ複合体は核に転位し、そこでそれはＳｈｎと相互作用する。Ｓｈｎが、Ｂｒｉｎｋｅｒ（Ｂｒｋ）の調節領域に結合されたＭａｄ／Ｍｅｄ複合体に必要な転写コリプレッサーを動員することが示されている。ＢｒｋはＤｐｐ媒介性遺伝子発現の包括的リプレッサーであるため、Ｂｒｋ発現のＳｈｎ誘発性の抑制は、従って、標的遺伝子の発現を誘導するＤｐｐの能力を促進する（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。
【０００７】
Ｓｈｎ３がＮＦ−κＢおよびＡＰ−１を包含する他の重要な転写タンパク質の活性を調節することを多数の研究が示しているとは言え、ＴＧＦ−βシグナル伝達における哺乳動物のＳｈｎ遺伝子の役割は未だ同定されなければならなくない（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。さらに、Ｓｈｎ３のｉｎ  ｖｉｖｏでの役割（１種若しくは複数）は大部分が未知のままである。
【０００８】
骨は、そのマトリックス成分が骨格の構造の完全性を保存するように継続的に再構築されている動的組織である。骨のリモデリングは、正常な生理学的条件下で、再吸収が以前に起こった部位でのみ骨形成が起こる循環的過程である。骨格の恒常的リモデリングは、独占的でない場合は破骨細胞および骨芽細胞により主として媒介される（非特許文献１１）。破骨細胞は骨再吸収の原因である造血起源の巨大多核細胞である。間葉系幹細胞から発する骨芽細胞は、骨形成表面上でマトリックス構成要素を合成する。これらの細胞の増殖、分化および骨リモデリング活動は、増殖因子、シグナル伝達タンパク質および転写因子の複雑な一時的ネットワークを必要とする（非特許文献１２）。いずれの１成分の調節不全も、リモデリング過程を破壊し、かつ、骨粗鬆症およびパジェット病のようなある種の骨格障害の病因に寄与しうる。破骨細胞欠損による上昇された骨量をもたらすまれな単一遺伝子障害（集合的に大理石骨病と命名される）が同定されている。上昇された骨量が本質的に上昇された骨芽細胞活性による、Ｃａｍｅｒａｔｉ−Ｅｎｇｅｌｍａｎ症候群により例示される単一遺伝子障害（集合的に骨硬化症と命名される）はよりまれである（非特許文献１３）。
【０００９】
転写因子Ｒｕｎｘ２は、胚の発生の間の骨芽細胞分化の主調節物質である。それは、細胞外シグナルを解釈して恒常的な骨芽細胞の発生および活性を確実にする多数の核転写因子、共活性化物質およびアダプタータンパク質と相互作用する（非特許文献１４；非特許文献１５）。Ｒｕｎｘ２中の突然変異は、ヒト常染色体優性疾患、鎖骨頭蓋異形成を引き起こす（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。Ｒｕｎｘ２−／−マウスは、未石灰化骨格をもたらす膜内および軟骨内双方の骨化の完全な欠如を表す（非特許文献１９；非特許文献１８）。胚の発生の間の骨芽細胞分化を司る分子機序の理解における大きな進歩と対照的に、少数の遺伝子のみが出生後の骨芽細胞機能を調節することが知られている（非特許文献２０；非特許文献２１）。Ｗｎｔ補助受容体ＬＲＰ５は、成体のヒトおよびげっ歯類において骨量の調節で重要である（非特許文献２２）。Ｒｕｎｘ２は、骨芽細胞分化におけるその中心的役割に加え、出生後の骨形成で重要であることが示された別のタンパク質ＡＴＦ４のその誘導に部分的により（非特許文献２３）、成体マウスにおいて成熟骨芽細胞活性もまた調節する（非特許文献２４）。ＴＧＦβは、ＳＭＡＤ３  Ｅ３リガーゼＳｍｕｒｆ１の活性により部分的に媒介される骨恒常性において、複雑な機能を有する。
【００１０】
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）は、骨格パターン形成、骨リモデリングおよび骨マトリックス形成において特別の重要性を有することがしばらくの間知られている（非特許文献２５）。ＴＧＦ−βは骨芽細胞発生（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）の間に多面的役割を有することが見出された。ＴＧＦ−βは、早期の骨芽細胞
分化を促進するがしかし成熟の後の段階を阻害することが示されている（非特許文献２６）。ＴＧＦ−βは、遺伝子転写を正および負に調節するその能力により骨芽細胞中で多様な細胞応答を導き出し得る（非特許文献２７；非特許文献２８）。ＴＧＦ−βによる遺伝子発現の活性化および抑制の双方は同一の組の偏在性Ｓｍａｄタンパク質を利用する。しかしながら、Ｓｍａｄに結合する特異的補助因子が、ある遺伝子がＴＧＦ−βに応答して上方制御されるか若しくは下方制御されるかを指図すると考えられている（非特許文献２９）。類似の転写機構が、骨芽細胞分化に対するＴＧＦ−βの変動性の影響を説明しうる。骨芽細胞分化の早期に発現される転写補助因子は、分化の初期段階を駆動するＴＧＦ−βの下流の遺伝子を調節するのに必要とされうる。骨芽細胞分化の後の時点で発現される多様な補助因子は、その後、ＴＧＦ−βが成熟の終末段階を抑制するのに必要であるとみられる。
【００１１】
骨芽細胞活性に影響する因子のさらなる解明は、骨形成および石灰化を調節することが可能な剤の同定において価値があるとみられる。こうした剤の同定およびこうした剤の使用方法は、増大若しくは減少される骨形成から利益を得るとみられる障害の処置で非常に有益であるとみられる。
【非特許文献１】Ｍａｋ，Ｃ．Ｈ．ら  １９９８．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８：３２−３９
【非特許文献２】Ｂａｃｈｍｅｙｅｒら  １９９９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２７、６４３−６４８
【非特許文献３】Ｗｕら  １９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１、９９８−１００１
【非特許文献４】Ｍａｋ，Ｃ．Ｈ．ら  １９９４．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：３８３−３９０
【非特許文献５】Ａｒｏｒａ，Ｋ．ら（１９９５）．Ｃｅｌｌ  ８１、７８１−７９０
【非特許文献６】Ｄａｉ，Ｈ．ら（２０００）．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２２７、３７３−３８７
【非特許文献７】Ｍａｒｔｙ，Ｔ．ら（２０００）．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２、７４５−７４９
【非特許文献８】Ｈｏｎｇ，Ｊ．Ｗ．ら（２００３）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００、１２３０１−１２３０６
【非特許文献９】Ｏｕｋｋａ，Ｍ．ら（２００４）．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９、１５−２４
【非特許文献１０】Ｏｕｋｋａ，Ｍ．ら（２００２）．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ９、１２１−１３１
【非特許文献１１】Ｅｒｌｅｂａｃｈｅｒ，Ａ．ら（１９９５）．Ｃｅｌｌ  ８０、３７１−３７８
【非特許文献１２】Ｋａｒｓｅｎｔｙ，Ｇ．とＷａｇｎｅｒ，Ｅ．Ｆ．（２００２）．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ２、３８９−４０６
【非特許文献１３】Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２００３
【非特許文献１４】Ｌｉａｎ，Ｊ．Ｂ．ら（２００４）．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  １４、１−４１
【非特許文献１５】Ｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｓ．ら（２００４）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３、４３１５−４３２９
【非特許文献１６】Ｌｅｅ，Ｂ．ら（１９９７）．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １６、３０７−３１０
【非特許文献１７】Ｍｕｎｄｌｏｓ，Ｓ．ら（１９９７）．Ｃｅｌｌ  ８９、７７３−７７９
【非特許文献１８】Ｏｔｔｏ，Ｆ．ら（１９９７）．Ｃｅｌｌ  ８９、７６５−７７１
【非特許文献１９】Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．ら（１９９７）．Ｃｅｌｌ  ８９、７５５−７６４
【非特許文献２０】Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ら（２０００）．Ｃｅｌｌ  １０３、１０８５−１０９７
【非特許文献２１】Ｋｉｍ，Ｓ．ら（２００３）．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １７、１９７９−１９９１
【非特許文献２２】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら（２００４）．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １９、１７４９−１７５７
【非特許文献２３】Ｙａｎｇ，Ｘ．ら（２００４）．Ｃｅｌｌ  １１７、３８７−３９８
【非特許文献２４】Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら（１９９９）．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３、１０２５−１０３６
【非特許文献２５】Ｃｈａｎｇ，Ｈ．ら（２００２）．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  ２３、７８７−８２３
【非特許文献２６】Ｃａｎａｌｉｓ，Ｅ．（２００３）．Ｏｓｔｅｏｅｎｉｃ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｓ．Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓａｓｅ  ａｎｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｍ．Ｊ．Ｆａｖｕｓ編中（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ｐｐ．２８−３１
【非特許文献２７】Ａｌｌｉｓｔｏｎ，Ｔ．ら（２００１）．Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２０、２２５４−２２７２
【非特許文献２８】Ｔａｋａｉ，Ｈ．ら（１９９８）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３、２７０９１−２７０９６
【非特許文献２９】Ｓｈｉ，Ｙ．とＭａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（２００３）．Ｃｅｌｌ  １１３、６８５−７００
【発明の開示】
【００１２】
［発明の要約］
本発明は、少なくとも部分的に、骨芽細胞形成および石灰化をＫＲＣが調節するという発見に基づく。ＫＲＣ中にヌル突然変異を担持するマウスが、増強された骨芽細胞活性および骨形成により顕著な骨硬化性の表現型を表すからである。骨芽細胞中のＴＧＦ−βシグナル伝達の下流で、ＫＲＣ、Ｒｕｎｘ２、Ｓｍａｄ３、ならびに、Ｒｕｎｘ２のポリユビキチン化およびプロテアソーム依存性の分解を促進するＷＷＰ１の能力によりＲｕｎｘ２機能を阻害するＥ３ユビキチンリガーゼＷＷＰ１の間の多量体複合体の形成が促進される。ＫＲＣはこの複合体の不可欠かつ必要とされる成分である。骨芽細胞中のその非存在は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＲｕｎｘ２タンパク質の上昇されたレベル、高められたＲｕｎｘ２転写活性、Ｒｕｎｘ２標的遺伝子の上昇された転写、および大きく増大された骨形成をもたらすからである。本発明はまた、少なくとも部分的に、ＫＲＣおよびＷＷＰ１が、ＲＳＫ２ユビキチン化を促進するＷＷＰ１の能力により、ＲＫＳ２リン酸化を促進しかつＲＳＫ２機能を阻害する、ＲＳＫ２を含む複合体もまた形成するという発見にも基づく。
【００１３】
従って、一局面において、本発明は、骨形成および石灰化が増大されるような、骨芽細胞中のＫＲＣの発現および／若しくは生物学的活性を低下させる剤と骨芽細胞を接触させることを含んでなる、骨形成および石灰化の増大方法に関する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、被験体における骨形成および石灰化が増大されるような、骨芽細胞中のＫＲＣの発現および／若しくは生物学的活性を低下させる剤と、該被験体からの骨芽細胞を接触させることを含んでなる、被験体における増大された骨形成および活性化から利益を得るとみられる疾患、障害、状態若しくは傷害の処置若しくは予防方法に関する。
【００１５】
なお別の局面において、本発明は、骨形成および石灰化が減少されるような、骨芽細胞中のＫＲＣの発現および／若しくは生物学的活性を増大させる剤と骨芽細胞を接触させることを含んでなる、骨形成および石灰化の低下方法に関する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、被験体における骨形成および石灰化が低下されるような、骨芽細胞中のＫＲＣの発現および／若しくは生物学的活性を増大させる剤と、該被験体からの骨芽細胞を接触させることを含んでなる、被験体における骨形成および石灰化から利益を得るとみられる疾患、障害、状態若しくは傷害の処置若しくは予防方法に関する。
【００１７】
一態様において、接触させる段階はｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる。一態様において、接触させる段階はｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。
【００１８】
一態様において、剤は表面上に存在する。
【００１９】
一態様において、疾患、障害、状態若しくは傷害は、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症および変形性骨炎（骨のパジェット病）よりなる群から選択される。
【００２０】
別の態様において、疾患、障害、状態若しくは傷害は、頭蓋骨縫合早期癒合症および硬化性骨炎よりなる群から選択される。
【００２１】
別の態様において、剤は、ＫＲＣ分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＲＵＮＸ２分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＷＷＰ１分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＲＳＫ２分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＫＲＣ  ｓｉＲＮＡ分子、ＲＵＮＸ２  ｓｉＲＮＡ分子、ＷＷＰ１  ｓｉＲＮＡ分子、ＲＳＫ２  ｓｉＲＮＡ分子、ドミナントネガティブＫＲＣ分子、ドミナントネガティブＲｕｎｘ２分子、ドミナントネガティブＷＷＰ１分子、ドミナントネガティブＲＳＫ２分子、若しくはそれらの組合せよりなる群から選択される。
【００２２】
別の態様において、剤は、ＫＲＣポリペプチドをコードする核酸分子、ＳＭＡＤ３ポリペプチドをコードする核酸分子、Ｒｕｎｘ２ポリペプチドをコードする核酸分子、ＷＷＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子、ＲＳＫ２ポリペプチドをコードする核酸分子、ＫＲＣポリペプチド、ＳＭＡＤ３ポリペプチド、Ｒｕｎｘ２ポリペプチド、ＷＷＰ１ポリペプチド、ＲＳＫ２ポリペプチド、若しくはそれらの組合せよりなる群から選択される。
【００２３】
一態様において、剤は、ＫＲＣ分子とＲｕｎｘ２分子の間の相互作用を低下させる。
【００２４】
別の態様において、剤は、ＫＲＣ分子とＲｕｎｘ２分子の間の相互作用を増大させる。
【００２５】
なお別の態様において、剤は、ＫＲＣ分子、ＳＭＡＤ３分子およびＲｕｎｘ２分子の間の相互作用を低下させる。
【００２６】
別の態様において、剤は、ＫＲＣ分子、ＳＭＡＤ３分子およびＲｕｎｘ２分子の間の相互作用を増大させる。
【００２７】
別の態様において、剤は、ＫＲＣ分子とＷＷＰ１分子の間の相互作用を低下させる。
【００２８】
一態様において、剤は、ＫＲＣ分子とＷＷＰ１分子の間の相互作用を増大させる。
【００２９】
別の態様において、剤は、ＫＲＣ分子、ＲＳＫ２分子およびＷＷＰ１分子の間の相互作
用を低下させる。
【００３０】
一態様において、剤は、ＫＲＣ分子、ＲＳＫ２分子およびＷＷＰ１分子の間の相互作用を増大させる。
【００３１】
なお別の態様において、剤はＲｕｎｘ２のユビキチン化を低下させる。
【００３２】
一態様において、剤はＲｕｎｘ２のユビキチン化を増大させる。
【００３３】
なお別の態様において、剤はＲＳＫ２のユビキチン化を低下させる。
【００３４】
一態様において、剤はＲＳＫ２のユビキチン化を増大させる。
【００３５】
一態様において、骨芽細胞は、Ｒｕｎｘ２のユビキチン化を低下させる剤とさらに接触される。
【００３６】
一態様において、骨芽細胞は、Ｒｕｎｘ２のユビキチン化を増大させる剤とさらに接触される。
【００３７】
一態様において、骨芽細胞は成熟骨芽細胞である。
【００３８】
別の局面において、本発明は、
ａ）ＫＲＣおよびＲｕｎｘ２若しくはそれらの生物学的に活性の部分を含んでなる指標組成物を提供すること；
ｂ）該指標組成物を、試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させること；
ｃ）ＫＲＣおよびＲｕｎｘ２若しくはそれらの生物学的に活性の部分の相互作用を低下させる目的の化合物を、試験化合物のライブラリーから選択することであって、骨形成および石灰化を増大させる化合物の能力が、該化合物の非存在下での相互作用の量に比較しての相互作用の低下により示される、
を含んでなる、骨形成および石灰化の増大において有用な化合物の同定方法に関する。
【００３９】
なお別の局面において、本発明は、
ａ）ＫＲＣおよびＲｕｎｘ２若しくはそれらの生物学的に活性の部分を含んでなる指標組成物を提供すること；
ｂ）該指標組成物を、試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させること；
ｃ）ＫＲＣおよびＲｕｎｘ２若しくはそれらの生物学的に活性の部分の相互作用を増大させる目的の化合物を、試験化合物のライブラリーから選択することであって、骨形成および石灰化を低下させる化合物の能力が、該化合物の非存在下での相互作用の量に比較しての相互作用の増大により示される、
を含んでなる、骨形成および石灰化の低下において有用な化合物の同定方法に関する。
【００４０】
別の局面において、本発明は、
ａ）ＫＲＣおよびＷＷＰ１若しくはそれらの生物学的に活性の部分を含んでなる指標組成物を提供すること；
ｂ）該指標組成物を、試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させること；
ｃ）ＫＲＣおよびＷＷＰ１若しくはそれらの生物学的に活性の部分の相互作用を低下させる目的の化合物を、試験化合物のライブラリーから選択することであって、骨形成および石灰化を増大させる化合物の能力が、該化合物の非存在下での相互作用の量に比較しての相互作用の低下により示される、
を含んでなる、骨形成および石灰化の増大において有用な化合物の同定方法に関する。
【００４１】
一態様において、本発明は、
ａ）ＫＲＣおよびＷＷＰ１若しくはそれらの生物学的に活性の部分を含んでなる指標組成物を提供すること；
ｂ）該指標組成物を、試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させること；
ｃ）ＫＲＣおよびＷＷＰ１若しくはそれらの生物学的に活性の部分の相互作用を増大させる目的の化合物を、試験化合物のライブラリーから選択することであって、骨形成および石灰化を低下させる化合物の能力が、該化合物の非存在下での相互作用の量に比較しての相互作用の増大により示される、
を含んでなる、骨形成および石灰化の低下において有用な化合物の同定方法に関する。
【００４２】
一態様において、ＫＲＣおよびＲｕｎｘ２分子の相互作用は、ＫＲＣとＲｕｎｘ２の間の複合体の形成を測定することにより測定される。
【００４３】
一態様において、指標組成物は、ＫＲＣポリペプチドおよびＲｕｎｘ２ポリペプチドを含んでなる細胞であり、ならびに、骨形成および石灰化に対する試験化合物の影響は、試験化合物の存在および非存在下でのＲｕｎｘ２ポリペプチドの分解を測定することにより測定される。
【００４４】
一態様において、指標組成物は、ＫＲＣポリペプチド、Ｒｕｎｘ２ポリペプチド、若しくはそれらの生物学的に活性の部分、ならびにＲｕｎｘ２ポリペプチドに応答するレポーター遺伝子を含んでなる細胞であり；ならびに、骨形成および石灰化に対する試験化合物の影響は、試験化合物の存在および非存在下での該レポーター遺伝子の発現を評価することにより測定される。
【００４５】
別の態様において、レポーター遺伝子はＯＳＥ２−ルシフェラーゼである。
【００４６】
別の態様において、ＫＲＣおよびＷＷＰ１分子の相互作用は、ＫＲＣとＷＷＰ１の間の複合体の形成を測定することにより測定される。
【００４７】
別の態様において、ＳＭＡＤ３分子もまた指標組成物中に存在する。
【００４８】
別の態様において、ＲＳＫ２分子もまた指標組成物中に存在する
別の態様において、Ｒｕｎｘ２分子若しくはその生物学的に活性の部分もまた指標組成物中に存在する。
【００４９】
一態様において、Ｒｕｎｘ２の生物学的に活性の部分はＲｕｎｔドメインを含んでなる。
【００５０】
一態様において、Ｒｕｎｘ２の生物学的に活性の部分はＰＰＸＹドメインを含んでなる。
【００５１】
一態様において、相互作用はＲｕｎｘ２分子のユビキチン化を測定することにより測定される。
【００５２】
なお別の態様において、相互作用はＲｕｎｘ２  ｍＲＮＡ産生を測定することにより測定される。
【００５３】
なお別の態様において、相互作用はＲｕｎｘ２タンパク質レベルを測定することにより測定される。
【００５４】
別の態様において、相互作用は、ＢＳＰ、ＣｏｌＩ（α）１、ＯＣＮ、ＲＡＮＫＬ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＳＫ２およびＡＴＦ４よりなる群から選択される最低１種の分子の発現を測定することにより測定される。
【００５５】
一態様において、指標組成物はＫＲＣポリペプチドを発現する細胞である。
【００５６】
一態様において、ＫＲＣポリペプチドは内因性ポリペプチドである。別の態様において、ＫＲＣポリペプチドは外因性ポリペプチドである。
【００５７】
一態様において、細胞は骨芽細胞である。別の態様において、骨芽細胞は成熟骨芽細胞である。
【００５８】
一態様において、化合物はＲｕｎｘ２およびＣＢＦβの相互作用を低下させる。別の態様において、化合物はＲｕｎｘ２およびＣＢＦβの相互作用を増大させる。
【００５９】
［発明の詳細な記述］
本発明は、少なくとも部分的に、ＫＲＣが、Ｒｕｎｘ２、ＳＭＡＤ３および／若しくはＷＷＰ１と相互作用することにより骨形成および石灰化を調節するという知見に基づく。骨芽細胞中でのＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＫＲＣ、Ｒｕｎｘ２、Ｓｍａｄ３、ならびに、Ｒｕｎｘ２のポリユビキチン化およびプロテアソーム依存性の分解を促進するＷＷＰ１の能力によりＲｕｎｘ２機能を阻害するＥ３ユビキチンリガーゼＷＷＰ１の間の多量体複合体の形成を促進する。ＫＲＣはこの複合体の不可欠かつ必要とされる成分である。骨芽細胞中でのその非存在は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＲｕｎｘ２タンパク質の上昇されたレベル、高められたＲｕｎｘ２転写活性、Ｒｕｎｘ２標的遺伝子の上昇された転写、顕著に増大された骨形成、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの不完全な破骨細胞形成をもたらすからである。本発明はまた、少なくとも部分的に、ＫＲＣおよびＷＷＰ１が、ＲＳＫ２ユビキチン化を促進するＷＷＰ１の能力によりＲＫＳ２リン酸化を促進しかつＲＳＫ２機能を阻害する、ＲＳＫ２を含む複合体もまた形成するという発見にも基づく。
【００６０】
Ｓｃｈｎｕｒｒｉ−３（Ｓｈｎ３）と本明細書で互換性に称されるＫＲＣタンパク質（Ｖ（Ｄ）Ｊ  ＲｓｓのκＢ結合および推定の認識（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）に対する）は、２２８２アミノ酸から構成されるＤＮＡ結合タンパク質である。ＫＲＣはＴ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージ中に存在することが見出されている。ＫＲＣのｃＤＮＡ配列を配列番号１に示す。ＫＲＣのアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＫＲＣは、ｋＢモチーフに結合するジンクフィンガータンパク質の１ファミリーの１メンバーである（Ｂａｃｈｍｅｙｅｒ，Ｃら、１９９９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２７（２）：６４３−６４８）。ジンクフィンガータンパク質は、ＫＲＣ、ならびに２種のＭＨＣクラスＩ遺伝子エンハンサー結合タンパク質ＭＢＰ１およびＭＢＰ２により代表される３分類に分割される（Ｂａｃｈｍｅｙｅｒ，Ｃら、１９９９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２７（２）：６４３−６４８）。
【００６１】
ジンクフィンガータンパク質は、高度に保存されたＣｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーの存在により同定される。ジンクフィンガーはＺＡＳドメインと呼ばれるＤＮＡ結合構造の不可欠の部分である。ＺＡＳドメインは、一対のジンクフィンガー、グルタミン酸／アスパラギン酸豊富な酸性配列、およびセリン／トレオニン豊富な配列から構成される。ＺＡＳドメインは、遺伝子のプロモーター若しくはエンハンサー領域に見出されるｋＢ様シス作動性調節エレメントと相互作用することが示されている。これらのジンクフィンガータンパク質により標的とされる遺伝子は主として免疫応答に関与する。
【００６２】
ＫＲＣのＺＡＳドメインは、とりわけ、一対のＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガー、次いでグルタミン酸／アスパラギン酸豊富な酸性配列、および５コピーのセリン／トレオニン−プロリン−Ｘ−アルギニン／リシン配列を有する。サウスウエスタンブロッティング実験、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）およびメチル化干渉分析は、ＫＲＣ組換えタンパク質がκＢモチーフならびにＲｓｓ配列に結合し（Ｂａｃｈｍｅｙｅｒら  １９９９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２７、６４３−６４８；Ｗｕら  １９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１、９９８−１００１）、また、高度に規則正しい複合体中でそうする（Ｍａｋ，Ｃ．Ｈ．ら  １９９４．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２、３８３−３９０．；Ｗｕら  １９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１、９９８−１００１）こともまた示した。
【００６３】
類似のジンクフィンガー酸性ドメイン構造は、ヒトＫＢＰ１、ＭＢＰ１およびＭＢＰ２、ラットＡＴＢＰ１およびＡＴＢＰ２、ならびにマウスαＡ−ＣＲＹＢＰタンパク質中に存在する。ＫＲＣは、最近、マウス転移関連遺伝子ｓ１００Ａ４／ｍｔｓ１＊のＳｂエレメント（ｋＢ様配列）に結合することにより該遺伝子の転写を調節することが示された。（Ｈｊｅｌｍｓｏｅ，Ｉ．ら  ２０００．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２）：９１３−９２０）。ＫＲＣは、前Ｂ細胞核タンパク質キナーゼがセリンおよびチロシン残基でＫＲＣタンパク質をリン酸化するという事実により証明されるとおり、翻訳後修飾により調節される。リン酸化はＤＮＡ結合を増大させ、ＫＲＣが細胞表面から伝播されるシグナルに応答しうる機構を提供する（Ｂａｃｈｍｅｙｅｒ，Ｃら、１９９９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２７（２）：６４３−６４８）。シグナル伝達で中心的役割を演じる２種の顕著なｓｅｒ／ｔｈｒ特異的プロテインキナーゼは、環状ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣファミリー）である。マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼのファミリーを包含する多数の他のセリン／トレオニン特異的キナーゼが、成長因子受容体若しくはサイトカイン受容体いずれかのシグナル伝達で活性化される重要なシグナル伝達タンパク質としてはたらく。細胞内シグナル伝達に重要な他のタンパク質ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼは、カルシウム依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭ−キナーゼＩＩ）およびｃ−ｒａｆ癌原遺伝子である。ＫＲＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで上皮増殖因子受容体キナーゼおよびｐ３４ｃｄｃ２キナーゼの基質であることが知られている。
【００６４】
ベイトとしてＫＲＣのアミノ酸残基２０４ないし１０５５（３個のジンクフィンガーを包含する）を使用する酵母２ハイブリッドスクリーニングの結果は、ＫＲＣがタンパク質のＴＲＡＦファミリーと相互作用すること、および、この相互作用がＴＲＡＦ  Ｃドメインにより起こること、ならびに、ＫＲＣがＴＲＡＦ５およびＴＲＡＦ５とよりも高親和性でＴＲＡＦ２と相互作用することを示す。（第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１４１６６号明細書の実施例１を参照されたい）。
【００６５】
最近の研究は、ＴＮＦＲシグナル伝達カスケードに参画しているＴＲＡＦ（腫瘍壊死因子受容体関連因子に対する）と命名されたポリペプチド因子の単離に至った。タンパク質のＴＲＡＦファミリーの６メンバーが哺乳動物細胞中で同定されている（Ａｒｃｈ，Ｒ．Ｈ．ら  １９９８．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２、２８２１−２８３０に総説されている）。ＴＲＡＦ１を除く全ＴＲＡＦタンパク質は、Ｚｎ２＋イオンの結合を配位するシステインおよびヒスチジンの特徴的パターンをもつアミノ末端ＲＩＮＧフィンガードメイン（Ｂｏｒｄｅｎ，Ｋ．Ｌ．Ｂ．ら  １９９５．ＥＭＢＯ  Ｊ  １４、１５３２−１５２１）、次いで複数のジンクフィンガーのひと続きを含有する。全部のＴＲＡＦは、受容体結合に必要とされかつ２部分に分割し得る高度に保存されたカルボキシ末端ドメイン（ＴＲＡＦ−Ｃドメイン）、すなわち、ＴＲＡＦタンパク質のホモおよびヘテロ二量体化ならびにまたそれらの関連受容体およびコイルドコイル配置を表すアミノ末端半分とのアダプタータンパク質の会合を媒介する高度に保存されたドメインを共有する。ＴＲＡＦ分子は、個別の組織分布パターンを有し、多様な細胞表面受容体により動員され、そしてＴＲＡＦ欠損マウスの分析により最も明瞭に示されるとおり別個の機能を有する（Ｌｏｍａｇａ，Ｍ．Ａ．ら  １９９９．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３、１０１５−２４；Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．ら  １９９９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６、９８０３−９８０８；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｌ．Ｔ．ら  １９９９．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１、３７９−３８９；Ｘｕ，Ｙ．ら  １９９６．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５、４０７−４１５；Ｙｅｈ，Ｗ．Ｃ．ら  １９９７．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７、７１５−７２５を参照されたい）。
【００６６】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、広範な生物学的効果を導き出す、活性化マクロファージにより主として産生されるサイトカインである。これらは、エンドトキシンショック、ならびに炎症、免疫調節、増殖、細胞傷害性および抗ウイルス活性における重要な役割を包含する（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．ら、１９８６．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５１：５９７−６０９；Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．とＣｅｒａｍｉ，Ａ．、１９８８．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：５０５−５１８；Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．、１９８８．Ｓｃｉ．Ａｍ．２５８（５）：５９−７５；Ｆｉｅｒｓ，Ｗ．１９９９．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８５（２）：１９９−２１２により総説されている）。ＴＮＦにより媒介される多様な細胞応答の誘導は、２種の異なる細胞表面受容体、すなわちＴＮＦＲ１と命名されるおよそ５５ｋＤａの受容体およびＴＮＦＲ２と命名されるおよそ７５ｋＤａの受容体とのその相互作用により開始される。双方の受容体型に対応するヒトおよびマウスのｃＤＮＡが単離かつ特徴付けされている（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，Ｈ．ら、１９９０．Ｃｅｌｌ  ６１：３５１；Ｓｃｈａｌｌ，Ｔ．Ｊ．ら、１９９０．Ｃｅｌｌ  ６１：３６１；Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ら、１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１０１９；Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．ら、１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２８３０−２８３４；Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｒ．Ｇ．ら、１９９１．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：３０２０−３０２６）。
【００６７】
ＴＮＦαは２種の別個の受容体ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２に結合するが、しかし、大部分の細胞型で、ＮＦκＢ活性化およびＪＮＫ／ＳＡＰＫ活性化は主としてＴＮＦＲ１により起こる。ＴＮＦＲ１は、ＲＩＰ、セリントレオニンキナーゼおよびＴＲＡＦ２を包含する他のタンパク質の動員のためのアダプタータンパク質として機能するＴＲＡＤＤと相互作用することが知られている。６種の既知のＴＲＡＦのうち、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５およびＴＲＡＦ６は全部ＮＦκＢ活性化に結びつけられており（Ｃａｏ，Ｚ．ら  １９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：４４３−６；Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．ら  １９９４．Ｃｅｌｌ  ７８：６８１−６９２；Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．ら  １９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１４６６１−１４６６４）、また、ＴＲＡＦ２はとりわけ、ＴＲＡＦ２を欠くか若しくはドミナントネガティブの形態のＴＲＡＦ２を発現する細胞中でこのＭＡＰキナーゼを活性化することのＴＮＦαの失敗によりはっきりと示されるとおり、ＪＮＫ／ＳＡＰＫタンパク質の活性化に結びつけられている（Ｙｅｈ，Ｗ．Ｃ．ら  １９９７．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：７１５−７２５；Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．ら  １９９７．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：１−２０）。
【００６８】
本発明の多様な局面を以下の下位節でさらに詳細に記述する。
【００６９】
Ｉ．定義
本明細書で使用されるところの、「Ｓｈｎ３」若しくは「ｓｃｈｎｕｒｒｉ  ３」と互換性に使用される「ＫＲＣ」という用語は、Ｖ（Ｄ）Ｊ  ＲｓｓのκＢ結合および推定の認識（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を指す。ＫＲＣのヌクレオチド配列を配列番号１に示し、そしてＫＲＣのアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＫＲＣのＺＡＳドメインのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１４９７−２２８２（配列番号８）に示される。ＫＲＣ  ｔｒのアミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸残基２０４ない
し１０５５に示される。本明細書で使用されるところの「ＫＲＣ」という用語は、特定の配列番号を指すのにとくに使用されない限り、下で定義されるところのＫＲＣファミリーポリペプチドを指すと理解されるであろう。
【００７０】
「ＫＲＣファミリーポリペプチド」は、ＫＲＣの構造ドメイン若しくはモチーフを有しかつ本明細書で定義されるところのＫＲＣ分子との十分なアミノ酸若しくはヌクレオチド配列の同一性を有するタンパク質若しくは核酸分子を包含することを意図している。こうしたファミリーメンバーは天然に存在し得るか若しくは天然に存在し得ず、そして、同一若しくは異なる種からであり得る。例えば、あるファミリーは、ヒト起源の第一のタンパク質ならびにヒト起源の他の別個のタンパク質を含有し得るか、若しくは、あるいは、ヒト以外の起源のホモログを含有し得る。ファミリーの好ましいメンバーはまた共通の機能的特徴も有しうる。好ましいＫＲＣポリペプチドは、以下のＫＲＣの特徴、すなわち、一対のＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガー、次いでＧｌｕおよびＡｓｐ豊富な酸性ドメイン、ならびにＤＮＡに結合すると考えられる５コピーのｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ配列の１種若しくはそれ以上を含んでなる。別の好ましいＫＲＣファミリーポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基２０４ないし１０５５（例えば「ＫＲＣ相互作用ドメイン」（ＫＲＣ  ｔｒ））を含んでなる。
【００７１】
本明細書で使用されるところの「ＫＲＣ活性」、「ＫＲＣの生物学的活性」若しくは「ＫＲＣポリペプチドの活性」という用語は、ＫＲＣ、例えばＫＲＣ  ｔｒのようなＫＲＣファミリーポリペプチドにより調節される活性、若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路を調節する能力を包含する。例えば、一態様において、ＫＲＣの生物学的活性は免疫応答の調節を包含する。別の態様において、ＫＲＣは骨形成および石灰化を調節する。例示的ＫＲＣ活性は、例えば、免疫細胞の活性化および／若しくは増殖（サイトカイン遺伝子発現を調節することによるような）、細胞生存（例えばアポトーシスを調節することによる）、シグナル伝達経路（例えばＮＦｋＢシグナル伝達経路、ＪＮＫシグナル伝達経路、および／若しくはＴＧＦβシグナル伝達経路）を介するシグナル伝達、アクチン重合、ＡＰ−１のユビキチン化、ＴＲＡＦのユビキチン化、ｃ−Ｊｕｎの分解、ｃ−Ｆｏｓの分解、ＳＭＡＤの分解、ＧＡＴＡ３の分解、ＧＡＴＡ３発現、Ｔｈ２細胞分化の調節、Ｔｈ２サイトカイン産生の調節、ＩｇＡ産生、ＧＬα転写の調節、骨成長の調節、骨石灰化の調節、破骨細胞形成の調節、例えば骨形成および／若しくは骨のリモデリングにおける破骨細胞活性に対する骨芽細胞活性の調節、オステオカルシン遺伝子転写の調節、Ｒｕｎｘ２の分解、例えばＲｕｎｘ２タンパク質レベルの調節、Ｒｕｎｘ２のユビキチン化、ＲＳＫ２の発現の調節、ＲＳＫ２の分解、例えばＲＳＫ２タンパク質レベルの調節、ＲＳＫ２のユビキチン化、ＲＳＫ２のリン酸化の調節、ＢＳＰ、ＣｏｌＩ（α）１、ＯＣＮ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＡＮＫＬおよびＡＴＦ４の発現の調節、ＡＴＦ４タンパク質レベルの調節、ならびに／またはＡＴＦ４のリン酸化の調節を調節することを包含する。
【００７２】
本明細書で使用されるところの多様な形態の「調節する」という用語は、刺激（例えば特定の応答若しくは活性を増大すなわち上方制御すること）および阻害（例えば特定の応答若しくは活性を低下すなわち下方制御すること）を包含することを意図している。
【００７３】
上および付随する実施例で記述されるとおり、ＫＲＣは、ＴＧＦ−βシグナル伝達の下流にある分子の複雑な相互作用により骨形成および石灰化を調節する。一態様において、ＫＲＣ活性は、ＫＲＣ標的分子若しくは結合パートナーとの会合のような直接活性である。本明細書で使用されるところの「標的分子」、「結合パートナー」若しくは「ＫＲＣ結合パートナー」は、ＫＲＣタンパク質が天然に結合若しくは相互作用して、その結果ＫＲＣに媒介される機能が達成される分子である。
【００７４】
本明細書で使用されるところの「ＴＲＡＦ」という用語は、ＴＮＦ受容体（Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ）関連（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）因子（Ｆａｃｔｏｒ）を指す（例えばＷａｊａｎｔら、１９９９、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １０：１５−２６を参照されたい）。「ＴＲＡＦ」ファミリーは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの多くのメンバーおよびインターロイキン−１受容体からのシグナル伝達を媒介する細胞質アダプタータンパク質の１ファミリーを包含する（例えばＡｒｃｈ，Ｒ．Ｈ．ら、１９９８、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２８２１−２８３０を参照されたい）。本明細書で使用されるところの「ＴＲＡＦ  Ｃドメイン」という用語は、ＴＲＡＦファミリーメンバーで見出される高度に保存された配列モチーフを指す。
【００７５】
本明細書で使用されるところの「ＫＲＣ分子のＴＲＡＦ相互作用部分」若しくは「ＫＲＣ分子のｃ−Ｊｕｎ相互作用部分」という用語は、ＴＲＡＦ若しくはｃ−Ｊｕｎと相互作用するＫＲＣの領域を包含する。好ましい一態様において、ＴＲＡＦ若しくはｃ−Ｊｕｎと相互作用するＫＲＣの領域は、配列番号２のアミノ酸残基２０４−１０５５（配列番号７）である。本明細書で使用されるところの「ＴＲＡＦ分子のＫＲＣ相互作用部分」若しくは「ＴＲＡＦ分子のＫＲＣ相互作用部分」という用語は、ＫＲＣと相互作用するＴＲＡＦ若しくはｃ−Ｊｕｎの領域を包含する。好ましい一態様において、ＫＲＣと相互作用するＴＲＡＦの領域はＴＲＡＦ  Ｃドメインである。
【００７６】
本明細書で使用されるところの「相互作用する」という用語は、例えば酵母２ハイブリッドアッセイ若しくは共免疫沈降を使用して検出され得るような、分子間の検出可能な相互作用を包含することを意味している。相互作用するという用語は、分子間の「結合」相互作用を包含することもまた意味している。相互作用は、性質がタンパク質−タンパク質若しくはタンパク質−核酸でありうる。
【００７７】
本明細書で使用されるところの「接触すること」（すなわち細胞例えば免疫細胞を化合物と接触すること）という用語は、化合物および細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで一緒にインキュベートすること（例えば化合物を培養物中の細胞に添加すること）、若しくは化合物および被験体の細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで接触されるように被験体に化合物を投与することを包含することを意図している。「接触すること」という用語は、被験体中に天然に存在しうるＫＲＣ分子への細胞の曝露（すなわち、天然の生理学的過程の結果として存在しうる曝露）を包含することを意図していない。
【００７８】
本明細書で使用されるところの「試験化合物」という用語は、ＫＲＣ活性および／若しくは発現の調節物質、ならびに／または骨成長および／若しくは石灰化の調節物質として以前に同定もしくはそうであると認識されていない化合物を包含する。
【００７９】
「試験化合物のライブラリー」という用語は、非常に多数の試験化合物を含んでなる一団若しくはプールを指すことを意図している。
【００８０】
本明細書で使用されるところの「細胞を含まない組成物」という用語は、無傷の細胞を含有しない単離された組成物を指す。細胞を含まない組成物の例は、細胞抽出液、および単離されたタンパク質を含有する組成物を包含する。
【００８１】
本明細書で使用されるところの「指標組成物」という用語は、目的のタンパク質（例えば、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子）を包含する組成物、例えば、該タンパク質を天然に発現する細胞、該タンパク質をコードする発現ベクターを細胞に導入することにより該タンパク質を発現するよう工作した細胞、または該タンパク質（例えば精製した天然に存在するタンパク質若しくは組換え工作したタンパク質）を含有する細胞を含まない組成物を指す。
【００８２】
本明細書で使用されるところの「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的、ｍＲＮＡ配列に相補的、若しくは遺伝子のコーディング鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合し得る。
【００８３】
一態様において、本発明の核酸分子はｓｉＲＮＡ分子である。一態様において、本発明の核酸分子はＲＮＡｉを媒介する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して該ｄｓＲＮＡと同一配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する、転写後の標的を定めた遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．とＺａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７、２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ら  Ｃｅｌｌ  １０１、２５−３３（２０００）。Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３、３１９１−３１９７（１９９９）；Ｃｏｔｔｒｅｌｌ  ＴＲとＤｏｅｒｉｎｇ  ＴＬ．２００３．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：３７−４３；Ｂｕｓｈｍａｎ  Ｆ．２００３．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．７：９−１０；ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴとＳｈａｒｐ  ＰＡ．２００２．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．３：７３７−４７）。該過程は、内因性リボヌクレアーゼがより長いｄｓＲＮＡを小分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡと命名されるより短い、例えば２１若しくは２２ヌクレオチド長のＲＮＡに切断する場合に起こる。該より短いＲＮＡセグメントがその後、標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉの合成のためのキットは、例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ若しくはＡｍｂｉｏｎから商業的に入手可能である。一態様において、アンチセンスＲＮＡでの使用について本明細書に記述される化学の１種若しくはそれ以上を、ＲＮＡｉを媒介する分子で使用し得る。
【００８４】
本明細書で使用されるところの「ドミナントネガティブ」という用語は、天然の（すなわち野性型）ＫＲＣ分子と競合するがしかしＫＲＣ活性を有しないＫＲＣ分子（例えばそれらの部分若しくはバリアント）のような分子を包含する。こうした分子は細胞中でＫＲＣ活性を効果的に低下させる。
【００８５】
本明細書で使用されるところの「ＮＦｋＢシグナル伝達経路」という用語は、転写因子ＮＦｋＢの活性化若しくは不活性化を伴いかつＮＦｋＢ因子により少なくとも部分的に媒介される、当該技術分野で既知のシグナル伝達経路のいずれか１つを指す（Ｋａｒｉｎ、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  ｆｒｏｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、４：９２−９９；Ｗａｌｌａｃｈら、１９９９、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７：３３１−３６７）。一般に、ＮＦｋＢシグナル伝達経路は、多数の細胞外の影響、例えばマイトジェン、サイトカイン、ストレスなどに応答する。ＮＦｋＢシグナル伝達経路は、限定されるものでないがアポトーシスの調節を挙げることができる、ある範囲の細胞過程を関与させる。これらのシグナル伝達経路は、しばしば、限定されるものでないがＮＦｋＢの阻害剤ペプチド（ＩκＢ）のリン酸化状態を介する活性化若しくは不活性化を伴う機構を挙げることができ、従って、ＮＦｋＢを間接的に活性化若しくは不活性化する。
【００８６】
本明細書で使用されるところの「ＪＮＫシグナル伝達経路」という用語は、Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）が関わる、当該技術分野で既知のシグナル伝達経路のいずれか１つを指す（Ｋａｒｉｎ、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  ｆｒｏｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、４：９２−９９；Ｗａｌｌａｃｈら、１９９９、Ａｎｎ  Ｒｅｖ
ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７：３３１−３６７）。このキナーゼは、一般に多数の細胞外シグナル、例えばマイトジェン、サイトカイン、ストレスなどに応答する。ＪＮＫシグナル伝達経路は、限定されるものでないがアポトーシスの調節を挙げることができるある範囲の細胞過程を媒介する。好ましい一態様において、ＪＮＫ活性化はＴＲＡＦタンパク質ファミリーの１若しくはそれ以上のメンバーの活性化により起こる（例えば、Ｗ
ａｊａｎｔら、１９９９、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １０：１５−２６を参照されたい）。
【００８７】
本明細書で使用されるところの「ＴＧＦβシグナル伝達経路」という用語は、トランスフォーミング増殖因子βが関わる、当該技術分野で既知のシグナル伝達経路のいずれか１つを指す。ＴＧＦβシグナル伝達経路は、この分子がタイプＩ（ＴβＲＩ）およびタイプＩＩ（ＴβＲＩＩ）セリン／トレオニンキナーゼ受容体よりなるヘテロ二量体細胞表面複合体に結合しかつこれを誘導する場合に開始される。このヘテロ二量体受容体はその後、下流の標的ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化によりシグナルを伝播する。ＳＭＡＤタンパク質の３種の機能的分類、すなわち受容体調節型ＳＭＡＤ（Ｒ−ＳＭＡＤ）、例えばＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３、補助媒介物質ＳＭＡＤ（Ｃｏ−ＳＭＡＤ）ならびに阻害性ＳＭＡＤ（Ｉ−ＳＭＡＤ）が存在する。ヘテロ二量体受容体複合体によるリン酸化後に、Ｒ−ＳＭＡＤはＣｏ−ＳＭＡＤと複合体形成しかつ核に転位し、そこで他の核タンパク質とともにそれらは標的遺伝子の転写を調節する（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．ら（１９９８）Ｃｅｌｌ
９５：７３７−７４０）。Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．とＷｏｔｔｏｎ，Ｄ．（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：１７４５に総説されている。
【００８８】
ヒトＳＭＡＤ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：２０１２７４８９に記述されている。マウスＳＭＡＤ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：３１５６０５６７に記述されている。ヒトＳＭＡＤ３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：４２４７６２０２に記述されている。マウスＳＭＡＤ３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：３１５４３２２１に記述されている。
【００８９】
「ＧＡＴＡ３」は、Ｔｈ２細胞の発生に必要とされるＴｈ２特異的転写因子である。ＧＡＴＡ結合タンパク質は、コンセンサスＷＧＡＴＡＲ（Ｗ＝Ａ若しくはＴ、およびＲ＝Ａ若しくはＧ）に従う標的部位を認識する転写因子の１ファミリーを構成する。ＧＡＴＡ３は、ＴＧＦβシグナル伝達によるそのリン酸化後にＳＭＡＤ３と相互作用して、Ｔヘルパー細胞の分化を誘導する。ヒトＧＡＴＡ３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：４５０３９２８およびｇｉ：１４２４９３６９に記述されている。マウスＧＡＴＡ３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：４０２５４６３８に記述されている。特異的ＤＮＡ結合部位の認識（アミノ酸３０３ないし３４８）およびトランス活性化（アミノ酸３０ないし７４）を司るＧＡＴＡ３のドメインが同定されている。ヒトＧＡＴＡ−３の核局在化のためのシグナル伝達配列は、該タンパク質のアミノフィンガー（アミノ酸２４９ないし３１１）内およびそれを取り囲む配列により賦与される特性である。その転写がＧＡＴＡ３により調節される例示的遺伝子は、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３およびＩＬ−１２Ｒβ２を包含する。
【００９０】
ＴＧＦβは、骨芽細胞の分化ならびに骨の発達およびリモデリングでもまた重要な役割を演じている。骨芽細胞はＴＧＦβを分泌しかつ骨マトリックス中に堆積し、そしてそれらに応答し、従って可能なオートクリン作用様式を可能にし得る。ＴＧＦβはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ双方で骨芽細胞の増殖および分化を調節するが；しかしながら、骨芽細胞分化に対するＴＧＦβの影響は、細胞外環境および細胞の分化段階に依存する。ＴＧＦβは、終末分化を阻害しつつ増殖および早期の骨芽細胞分化を刺激する。従って、ＴＧＦβは、骨芽細胞の分化および機能のマーカーのなかでもアルカリホスファターゼおよびオステオカルシンの発現を阻害することが報告されている（Ｃｅｎｔｒｅｌｌａら、１９９４  Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．、１５、２７−３９）。骨芽細胞はＴＧＦβの細胞表面受容体ならびにエフェクターＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３を発現する。
【００９１】
本明細書で使用されるところの「骨形成および石灰化」という用語は、骨細胞外マトリックスの膠原性前駆体を合成し、骨を形成するようにマトリックスの石灰化を調節する骨芽細胞の細胞活性、ならびに骨リモデリングおよび再形成におけるそれらの機能を指し、例えば、骨量は、骨を形成する骨芽細胞およびそれを分解する破骨細胞の活性の間の均衡により維持される。骨の石灰化は、Ｉ型コラーゲンおよび多様な非膠原性タンパク質よりなる細胞外マトリックス中の炭酸ヒドロキシアパタイトの結晶の沈着により起こる。本明細書で使用されるところの「骨芽細胞」は、間葉系骨細胞前駆細胞に由来しかつそれが骨細胞として囲まれたようになる骨マトリックスを形成する骨形成細胞である。成熟骨芽細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで骨細胞外マトリックスを形成することが可能なものであり、そして、細胞外の生成を反映する石灰化結節を形成するその能力によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定され得る。未熟骨芽細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで石灰化結節を形成することが可能でない。本明細書で使用されるところの「破骨細胞」は、骨組織の吸収および除去で機能する、豊富な好酸性細胞質を伴う大型の多核細胞である。破骨細胞は副甲状腺ホルモンの存在下で高度に活性となり、骨再吸収および骨塩（リンおよびとりわけカルシウム）の細胞外液への放出を引き起こす。
【００９２】
本明細書で使用されるところの、骨Ｇｌａタンパク質ともまた呼ばれる「オステオカルシン」は、骨中で最も豊富な非コラーゲンタンパク質であるビタミンＫ依存性のカルシウム結合骨タンパク質である。オステオカルシンは分化した骨芽細胞および象牙芽細胞中で特異的に発現される。オステオカルシンのＴＧＦ−β媒介性の減少はｍＲＮＡレベルで起こることが示され、そして新たなタンパク質合成を必要としない。オステオカルシンプロモーターからの転写は、Ｒｕｎｘ２としてもまた知られる転写因子ＣＢＦＡ１のオステオカルシンプロモーター中のＯＳＥ２と命名された応答エレメントへの結合を必要とする。
【００９３】
Ｒｕｎｘ因子は、組織特異的な遺伝子の活性化若しくは抑制を助長し得るＤＮＡ結合タンパク質である（Ｌｕｔｔｅｒｂａｃｈ，Ｂ．とＳ．Ｗ．Ｈｉｅｂｅｒｔ．（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４５：２２３−２３５）。哺乳動物のＲｕｎｘ関連遺伝子は血液、骨格および胃の発生に不可欠であり、そして、一般に急性白血病および胃癌で変異している（Ｌｕｎｄ，Ａ．Ｈ．とＭ．ｖａｎ  Ｌｏｈｕｉｚｅｎ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．１：２１３−２１５）。Ｒｕｎｘ因子は組織限定の発現パターンを表し、そして決定的な造血および骨芽細胞成熟に必要とされる。Ｒｕｎｘタンパク質は最近、成長因子のトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーに応答して多彩な発生および生物学的過程を調節するシグナル伝達タンパク質の１ファミリー、Ｓｍａｄと、それらのＣ末端セグメントにより相互作用することが示された。さらに、Ｒｕｎｘタンパク質の核内分布は、核マトリックスターゲッティングシグナル（Ｒｕｎｘ因子のＣ末端に存在するタンパク質モチーフ）により媒介される。重要なことに、ｉｎ  ｖｉｖｏの骨形成は、重なる核内ターゲッティングシグナルおよびＳｍａｄ相互作用ドメインを含有するＲｕｎｘ２のＣ末端を必要とする。ＲｕｎｘおよびＳｍａｄタンパク質は、共同して、表現型遺伝子発現および細胞系譜の決定（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）の調節に関与する。遺伝子破壊研究は、Ｒｕｎｘタンパク質およびＳｍａｄ双方が造血および骨形成に発生的に関与することを示した。さらに、Ｒｕｎｘ２およびＢＭＰ応答性のＳｍａｄは間葉系多能細胞で骨形成を誘導し得る。
【００９４】
「Ｒｕｎｘ２」はショウジョウバエの転写因子、ＲｕｎｔおよびＬｏｚｅｎｇｅの３種の哺乳動物ホモログの１種である（Ｄａｇａ，Ａ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：１１９４−１２０５）。Ｒｕｎｘ２はまたＴリンパ球中でも発現され、そして癌遺伝子ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３およびＰｉｍ１と協同して、マウスでＴ細胞リンパ腫発生を加速する（Ｂｌｙｔｈ，Ｋ．ら（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：２９５−３０２）。
【００９５】
Ｒｕｎｘ２発現は骨芽細胞分化および骨格形成でもまた重要な役割を演じている。オステオカルシンに加え、Ｒｕｎｘ２は、アルカリホスファターゼ、コラーゲン、オステオポンチンおよびオステオプロテゲリンリガンドを包含する、骨芽細胞分化の間に活性化される数種の他の遺伝子の発現を調節する。これらの遺伝子もまた、それらのプロモーター中にＲｕｎｘ２結合部位を含有する。これらの観察結果は、Ｒｕｎｘ２が骨芽細胞分化に不可欠な転写因子であることを示唆する。この仮説は、ｃｂｆａ１遺伝子を不活性化したマウス胚での骨形成の非存在により強く裏付けられる。さらに、若干の骨が完全には発生されないヒトの障害、鎖骨頭蓋異形成が、ｃｂｆａ１遺伝子座中の突然変異と関連付けられている。骨芽細胞分化でのその役割に加え、Ｒｕｎｘ２は分化した骨芽細胞による骨マトリックス沈着の調節に関わる。Ｒｕｎｘ２の発現は骨芽細胞分化に影響する因子により調節される。従って、ＢＭＰはＲｕｎｘ２発現を活性化し得る一方、Ｓｍａｄ２およびグルココルチコイドは阻害し得る。加えて、Ｒｕｎｘ２はそれ自身のプロモーター中のＯＳＥ２エレメントに結合し得、骨芽細胞分化の間の転写調節の自己調節フィードバック機構の存在を示唆している。総説については、Ａｌｌｉｓｔｏｎら（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０：２２５４を参照されたい。
【００９６】
本明細書に記述されるとおり、Ｒｕｎｘ２はそのＲｕｎｔ  ＤＮＡ結合ドメインによりＫＲＣと相互作用する。Ｒｕｎｘ２のＲｕｎｔドメインの最良に記述された結合パートナーは、Ｒｕｎｘ２による高親和性ＤＮＡ結合に必要とされる構成的に発現される因子、ＣＢＦβである（Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｙ．ら（２０００）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５、３９５７９−３９５８８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｃ．Ａ．ら（２００２）．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３２、６３３−６３８）。ＣＢＦβ−／−マウスはＲｕｎｘ１媒介性の造血の重篤な欠損のためＥ１２．５で死ぬとは言え、Ｇａｔａ１プロモーターによるＣＢＦβのトランスジェニック過剰発現によりＣＢＦβ−／−マウスがレスキューされる場合、重篤な侏儒症はＲｕｎｘ２−／−マウスの表現型を模倣するものを生じる（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｃ．Ａ．ら（２００２）．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３２、６３３−６３８）。ＣＢＦβに結合される場合、Ｒｕｎｘファミリーメンバーはユビキチン／プロテアソーム媒介性の分解から保護される（Ｈｕａｎｇ，Ｇ．ら（２００１）．Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２０、７２３−７３３）。ＣＢＦβに結合される場合、Ｒｕｎｘ２の安定性が促進され、そしてそれは標的ＤＮＡ配列を至適に結合する。Ｓｈｎ３に結合される場合、Ｒｕｎｘ２は標的配列をもはや高親和性で結合し得す、そして、高められたユビキチン化およびその後のタンパク質分解によりＲｕｎｘ２の分解が加速される。
【００９７】
ヒトＲｕｎｘ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：１０８６３８８４に記述されている。マウスＲｕｎｘ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：２０８０６５２９に記述されている。ヒトＣＢＦβのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：４７１３２６１５および４７１３２６１６に記述されている。マウスＣＢＦβのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：ｇｉ：３１９８１８５３に記述されている。
【００９８】
本明細書で使用されるところの「ＷＷＰ１」は、Ｎｅｄｄ４、ＷＷＰ２およびＡＩＰ４もまた包含する、複数のＷＷドメインを含むＥ３ユビキチンリガーゼのファミリーの１メンバーである。ＷＷＰ１は、全部のＲ−およびＩ−Ｓｍａｄタンパク質と相互作用すること、ならびにＳｍａｄ６およびＳｍａｄ７のユビキチン化を促進することが以前に示された（Ｋｏｍｕｒｏ，Ａ．ら（２００４）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３、６９１４−６９２３）が；しかしながら、それらのＲｕｎｔドメイン中にＰＰＸＹモチーフもまた有する（Ｊｉｎ，Ｙ．Ｈ．ら（２００４）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９、２９４０９−２９４１７）Ｒｕｎｘタンパク質をユビキチン化するＷＷＰ１の能力は、検討されていなかった。
【００９９】
ヒトＷＷＰ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：３３９４６３３１に記述されている。マウスＷＷＰ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：５１７０９０７１に記述されている。
【０１００】
「骨シアロタンパク質」若しくは「ＢＳＰ」は、オステオポンチン遺伝子ファミリーに属し、そしてヒドロキシアパタイトに強固に結合して骨の石灰化マトリックスの不可欠の部分を形成する非膠原性骨マトリックスタンパク質である。ヒトＢＳＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：３８１４６０９７に記述されている。マウスＢＳＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：６６７８１１２に記述されている。
【０１０１】
Ｉ型コラーゲン（α）１（「ＣｏｌＩ（α）１」）は膠原性骨マトリックスタンパク質である。ヒトＣｏｌＩ（α）１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：１４７１９８２６に記述されている。マウスＣｏｌＩ（α）１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：３４３２８１０７に記述されている。
【０１０２】
「ＣＲＥＢ２」ともまた呼ばれる「ＡＴＦ４」、および「ＳＰ７」ともまた呼ばれる「Ｏｓｔｅｒｉｘ」は、骨のリモデリングの間、例えば骨形成および石灰化の間の骨マトリックス生合成の重要な調節物質である、それぞれｂＺＩＰタンパク質ファミリーおよびＣ２Ｈ２型ジンクフィンガータンパク質ファミリーに属する転写因子である（例えば、Ｙａｎｇ，Ｘ．ら（２００４）．Ｃｅｌｌ  １１７、３８７−３９８；Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｋ．ら（２００２）．Ｃｅｌｌ  １０８、１７−２を参照されたい）。ＢＳＰ、ＣｏｌＩ（α）１、ＡＴＦ４およびＯｓｔｅｒｉｘは骨の形成および発生の特異的マーカーである。ヒトＡＴＦ４のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：３３４６９９７５およびｇｉ：３３４６９９７３に記述されている。マウスＡＴＦ４のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：６７５３１２７に記述されている。ヒトＳＰ７のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：２２９０２１３５に記述されている。マウスＳＰ７のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：１８４８５５１７に記述されている。
【０１０３】
本明細書で使用されるところの「ＡＴＦ４シグナル伝達経路」という用語は、骨芽細胞の発生および機能を調節するのに活性化転写因子４（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ）４が関わる、当該技術分野で既知のシグナル伝達経路のいずれか１つを指す。上で論考されたとおり、ＡＴＦ４はＣＲＥ依存性の転写の特異的リプレッサーとして機能する転写因子である。転写リプレッサー活性は、ＡＴＦ４タンパク質のＣ末端ロイシンジッパーおよび塩基性ドメイン領域内に存する。ＡＴＦ４は成熟骨芽細胞による高レベルのコラーゲン合成に必要であることが示されており、そして骨芽細胞による至適の細胞外マトリックス産生にキナーゼＲＳＫ２によるリン酸化を必要とする（Ｙａｎｇ，ら（２００４）Ｃｅｌｌ  １１７：３８７）。さらに、本明細書に記述されるとおり、ＫＲＣが欠損している動物は、ＡＴＦ４およびＲＳＫ２のｍＲＮＡおよびタンパク質の上昇されたレベル、ならびに過剰リン酸化された（ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）ＡＴＦ４の蓄積を有する。ヒトＲＳＫ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：５６２４３４９４に記述されている。マウスＲｓｋ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：２２５０７３５６に記述されている。
【０１０４】
本明細書で使用されるところの「ＡＰ−１」は、ロイシンジッパーモチーフを介して相
互に結合する２種のタンパク質の二量体から構成されるＤＮＡ結合因子の１ファミリーである、転写因子アクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）を指す。最良に特徴付けられたＡＰ−１因子はタンパク質ＦｏｓおよびＪｕｎを含んでなる。（Ａｎｇｅｌ，Ｐ．とＫａｒｉｎ，Ｍ．（１９９１）Ｂｉｏｃｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０７２：１２９−１５７；Ｏｒｅｎｇｏ，Ｉ．Ｆ．、Ｂｌａｃｋ，Ｈ．Ｓ．ら（１９８９）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４９：７１−７７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ．とＦｒａｎｚａ，Ｂ．Ｒ．，Ｊｒ．（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５５、３９５−３９７）。ＡＰ−１二量体は、シス作動性ホルボール１２−テトラデカン酸１３−酢酸塩（ＴＰＡ）応答エレメントを含有するＤＮＡ上のプロモーター領域に結合しかつこれをトランス活性化して、細胞増殖、転移および細胞代謝に関与する遺伝子の転写を誘導する（Ａｎｇｅｌ，Ｐ．ら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４９、７２９−７３９。ＡＰ−１は多様な刺激により誘導され、そして癌および自己免疫疾患の発症に関わる。ヒトＡＰ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：２０１２７４８９に記述されている。
【０１０５】
本明細書で使用されるところの「核酸」という用語はそれらのフラグメント若しくは同等物（例えば、それらのフラグメント若しくは同等物ＫＲＣ、ＴＲＡＦ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＧＡＴＡ３、Ｒｕｎｘ２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＧＬα、ＣＢＦβ、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／若しくはＷＷＰ１）を包含する。「同等物」という用語は、機能的に同等なタンパク質、すなわち、ＫＲＣの天然の結合パートナー（１種若しくは複数）に結合する能力を有するＫＲＣバリアントタンパク質、またはそれらの生物学的活性を保持する、ＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中のバリアントタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含することを意図している。好ましい一態様において、機能的に同等なＫＲＣタンパク質は、免疫細胞、例えばＴ細胞の細胞質中のＴＲＡＦ、例えばＴＲＡＦ２を結合する能力を有する。別の好ましい態様において、機能的に同等なＫＲＣタンパク質は、免疫細胞、例えばＴ細胞の細胞質中のＪｕｎ、例えばｃ−Ｊｕｎを結合する能力を有する。別の好ましい態様において、機能的に同等なＫＲＣタンパク質は、免疫細胞、例えばＴ細胞の細胞質中のＧＡＴＡ３を結合する能力を有する。なお別の好ましい態様において、機能的に同等なＫＲＣタンパク質は、免疫細胞、例えばＢ細胞の細胞質中のＳＭＡＤ、例えばＳＭＡＤ２および／若しくはＳＭＡＤ３を結合する能力を有する。なお別の好ましい態様において、機能的に同等なＫＲＣタンパク質は、骨芽細胞の細胞質中のＳＭＡＤ３を結合する能力を有する。なお別の好ましい態様において、機能的に同等なＫＲＣは、免疫細胞、例えばＢ細胞の核質中のＲｕｎｘ２を結合する能力を有する。別の好ましい態様において、機能的に同等なＫＲＣはＲｕｎｘ２を結合する能力を有する。なお別の好ましい態様において、機能的に同等なＫＲＣはＷＷＰ１を結合する能力を有する。なお別の好ましい態様において、機能的に同等なＫＲＣは、ＳＭＡＤ３、Ｒｕｎｘ２および／若しくはＷＷＰ１を結合する能力を有する。別の好ましい態様において、ＫＲＣ分子の機能的同等物は、ＰＰＸＹモチーフを含んでなりかつＷＷＰ１を結合する能力を有する。別の好ましい態様において、Ｒｕｎｘ２分子の機能的同等物は、Ｒｕｎｔドメイン、例えばＲｕｎｘ２のアミノ酸１０２−２２９を含んでなり、かつ、ＫＲＣを結合する能力を有する。別の好ましい態様において、Ｒｕｎｘ２分子の機能的同等物は、そのＲｕｎｔドメイン、例えばＲｕｎｘ２のアミノ酸１０２−２２９中にＰＰＸＹモチーフを含んでなり、かつ、ＷＷＰ１を結合する能力を有する。なお別の好ましい態様において、機能的に同等なＫＲＣはＲＳＫ２および／若しくはＷＷＰ１を結合する能力を有する。
【０１０６】
「単離された」核酸分子は、該核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されているものである。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離された」という用語は、該ゲノムＤＮＡが天然に会合している染色体から分離されている核酸分子を包含する。好ましくは、「単離された」核酸分子は、該核酸分子が由来する生物体のゲノムＤＮＡ中で該核酸分子に天然に隣接する配列（すなわち該核酸分子の５’および３’端に位置する配列）を含まない。
【０１０７】
本明細書で使用されるところの「単離されたタンパク質」若しくは「単離されたポリペプチド」は、細胞から単離若しくは組換えＤＮＡ技術により製造される場合に他のタンパク質、ポリペプチド、細胞物質および培地、または、化学合成される場合は化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質若しくはポリペプチドを指す。「単離された」若しくは「精製された」タンパク質若しくはその生物学的に活性の部分は、ＫＲＣタンパク質が由来する細胞若しくは組織供給源からの細胞物質若しくは他の汚染するタンパク質を実質的に含まないか、または、化学合成される場合は化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言語は、該タンパク質が単離若しくは組換え製造される細胞の細胞成分からそれが分離されているＫＲＣタンパク質の調製物を包含する。
【０１０８】
本発明の核酸は、例えば標準的組換えＤＮＡ技術により製造し得る。本発明の核酸は、標準的技術を使用して化学合成もまたし得る。商業的に入手可能なＤＮＡ技術合成機で自動化されている固相合成を包含する多様なポリデオキシヌクレオチド化学合成方法が既知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら  米国特許第４，５９８，０４９号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら  米国特許第４，４５８，０６６号；ならびにＩｔａｋｕｒａ  米国特許第４，４０１，７９６号および同第４，３７３，０７１号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０１０９】
本明細書で使用されるところの「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。１つの型のベクターは「プラスミド」  であり、付加的なＤＮＡセグメントを連結しうる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結しうるウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組込まれ、そしてそれにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターはそれらが効果的に連結される遺伝子の発現を指図することが可能である。こうしたベクターは本明細書で「組換え発現ベクター」若しくは単に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態にある。本明細では、プラスミドがベクターの最も一般に使用される形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」を互換性に使用しうる。しかしながら、本発明は、同等の機能を供するウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のようなこうした他の形態の発現ベクターを包含することを意図している。
【０１１０】
本明細書で使用されるところの「宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターのような本発明の核酸分子が導入された細胞を指すことを意図している。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は本明細書で互換性に使用する。こうした用語は特定の主題の細胞のみならずしかしこうした細胞の子孫若しくは潜在的な子孫を指すことが理解されるべきである。突然変異若しくは環境の影響のいずれかにより、後に続く世代である種の改変が起こりうるため、こうした子孫は実際には親細胞に同一でないかもしれないが、しかし本明細書で使用されるところの該用語の範囲内になお包含される。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。とりわけ好ましい態様において、それは上皮細胞である。
【０１１１】
本明細書で使用されるところの「トランスジェニック細胞」という用語は導入遺伝子を含有する細胞を指す。
【０１１２】
本明細書で使用されるところの「トランスジェニック動物」は、該動物の細胞の１個若しくはそれ以上、および好ましくは本質的に全部が導入遺伝子を包含する動物、例えばヒト以外の哺乳動物、例えばブタ、サル、ヤギ、若しくはげっ歯類、例えばマウスを包含する。導入遺伝子は、例えば微小注入法、トランスフェクション若しくは感染、例えば組換えウイルスへの感染による細胞の前駆体への導入により直接若しくは間接的に細胞に導入する。遺伝子操作という用語は組換えＤＮＡ分子の導入を包含する。この分子は染色体内に組込まれうるか、若しくはそれは染色体外で複製するＤＮＡでありうる。
【０１１３】
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分、すなわち、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、細胞内抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、若しくは他のフラグメント、ならびに細胞内抗体のような、抗原を結合（と免疫反応）する抗原結合部位を含有する分子を包含することを意図している。好ましくは、本発明の抗体は、ＫＲＣ、ＴＲＡＦ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＣＢＦβ、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２、ＷＷＰ１若しくはＲｕｎｘ２分子に特異的に若しくは実質的に特異的に結合する（すなわち、ＫＲＣ以外、ＴＲＡＦ以外、ｃ−Ｊｕｎ以外、ｃ−Ｆｏｓ以外、ＧＡＴＡ３以外、ＳＭＡＤ２以外、ＳＭＡＤ３以外、ＷＷＰ１以外、ＣＢＦβ以外、ＡＴＦ４以外、ＲＳＫ２以外若しくはＲｕｎｘ２以外の分子との交差反応性をほとんどないし全く有しない）。本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」という用語は、抗原の特定の１エピトープと免疫反応することが可能な抗原結合部位の１種のみを含有する抗体分子の一集団を指す一方、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の１抗原と相互作用することが可能な抗原結合部位の複数種を含有する抗体分子の一集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、従って、典型的には、それが免疫反応する特定の１抗原に対する単一結合親和性を表す。
【０１１４】
本明細書で使用されるところの「ＫＲＣ活性若しくは発現の調節から利益を得るとみられる障害」または「ＫＲＣ関連障害」という用語は、ＫＲＣ活性が異常であるか若しくはＫＲＣ活性の調節から利益を得るとみられる障害を包含する。例示的ＫＲＣ関連障害は、骨形成および石灰化の調節が有益であるとみられる障害、疾患、状態若しくは傷害を包含する。
【０１１５】
一態様において、小分子を試験化合物として使用し得る。「小分子」という用語は当該技術分野の用語であり、かつ、約７５００未満、約５０００未満、約１０００未満の分子量若しくは約５００未満の分子量である分子を包含する。一態様において、小分子はペプチド結合を独占的に含むわけではない。別の態様において、小分子はオリゴマーでない。活性についてスクリーニングし得る例示的小分子化合物は、限定されるものでないがペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、小型有機分子（例えばＣａｎｅら  １９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３）および天然産物抽出物のライブラリーを挙げることができる。別の態様において、化合物は小型有機非ペプチド化合物である。さらなる一態様において、小分子は生合成的でない。例えば小分子は好ましくは転写若しくは翻訳の産物それ自身でない。
【０１１６】
本発明の多様な局面を下にさらに詳細に記述する。
【０１１７】
ＩＩ．ＫＲＣにより調節される生物学的応答の調節方法
本発明は、異常なＫＲＣ発現および／若しくは活性と関連する障害の若しくは障害を有する危険にさらされている（若しくはそれに感受性の）被験体の予防的および治療的双方の処置方法を提供する。例えば、本明細書に記述されるところの増大された若しくは低下された骨形成および石灰化から利益を得るとみられる疾患、障害、状態若しくは傷害。
【０１１８】
こうした障害の危険にさらされている被験体は、例えば、当該技術分野で既知の診断若
しくは予後アッセイのいずれか若しくは組合せにより同定し得る。予防的剤の投与は症状の明示前に起こり得、その結果、疾患、障害、状態若しくは傷害が予防、若しくは、あるいはその進行を遅延される。異常の型に依存して、例えば、被験体を処置するのにＫＲＣアンタゴニスト若しくはアゴニスト剤を使用し得る。適切な剤は本明細書に記述されるスクリーニングアッセイに基づき決定し得る。
【０１１９】
本発明の別の局面は、治療目的上のＫＲＣ活性の調節方法に関する。ＫＲＣ活性は骨形成および石灰化を調節するために調節し得る。ＫＲＣは骨形成および石灰化を阻害し、従って、ＫＲＣの発現および／若しくは生物学的活性を低下させることは、骨形成および石灰化を増大させることをもたらす。逆に、ＫＲＣの発現および／若しくは生物学的活性を増大させることは、低下された骨形成および石灰化をもたらすとみられる。
【０１２０】
本発明の調節方法は、細胞（例えばＴ細胞  Ｂ細胞および／若しくは骨芽細胞、例えば成熟骨芽細胞）を、ＫＲＣの発現および／若しくは生物学的活性を調節する剤と接触させることを伴う。ＫＲＣ活性を調節する剤は、ＫＲＣペプチド（例えば、該剤は、ＫＲＣのアミノ酸残基２０４−１０５５を含んでなるペプチド、ＫＲＣに結合するペプチド、ＫＲＣ  ＺＡＳドメイン若しくは小分子でありうる）、前述のペプチドの１種のコードする核酸分子、ＫＲＣアゴニスト若しくはアンタゴニスト、ＫＲＣアゴニスト若しくはアンタゴニストのペプチド模倣物、ＫＲＣペプチド模倣物、または本明細書に記述されるスクリーニング方法を使用して同定される他の小分子のような、本明細書に記述されるところの剤であり得る。付加的な剤は、限定されるものでないが、ＫＲＣ分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＳＭＡＤ３分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＲＵＮＸ２分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＷＷＰ１分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＲＳＫ２分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＫＲＣ  ｓｉＲＮＡ分子、ＳＭＡＤ３  ｓｉＲＮＡ分子、ＲＵＮＸ２  ｓｉＲＮＡ分子、ＷＷＰ１  ｓｉＲＮＡ分子、ＲＳＫ２  ｓｉＲＮＡ分子、ドミナントネガティブＫＲＣ分子、ドミナントネガティブＳＭＡＤ３分子、ドミナントネガティブＲｕｎｘ２分子、ドミナントネガティブＷＷＰ１分子、ドミナントネガティブＲＳＫ２分子、ＳＭＡＤ３ポリペプチド、Ｒｕｎｘ２ポリペプチド、ＷＷＰ１ポリペプチド、ＲＳＫ２ポリペプチド、若しくはそれらの組合せを挙げることができる。
【０１２１】
これらの調節方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば細胞を剤と接触させることにより）、若しくは、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば剤を被験体に投与することにより）で実施し得る。さらに、本発明の調節方法は表面上、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで実施し得る。例えば、外科的に埋込んだ棒状物、ピン、板、ねじ、あるいは、骨、例えば骨折、関節、歯を安定化、修復すること、若しくは関節置換術、または歯置換術の目的上埋込まれた他の埋込物の表面を、骨形成および石灰化が調節、例えば高められ若しくは増大されるような本発明の剤で処置しうる。であるから、本発明は、ＫＲＣポリペプチドの上方若しくは下方調節から利益を得るとみられる疾患、状態、障害若しくは傷害、例えば望ましくない、不十分な若しくは異常な免疫応答を特徴とする障害、または骨形成および石灰化の調節が有益であるとみられるものに苦しめられる個体の処置方法を提供する。一態様において、該方法は、本明細書に記述されるところのＫＲＣ発現若しくは生物学的活性を調節（例えば上方制御若しくは下方制御）する剤（例えば本明細書に記述されるスクリーニングアッセイにより同定される剤）若しくは剤の組合せを投与することを必要とする。
【０１２２】
ＫＲＣ活性の阻害は、ＫＲＣが異常に上方制御されかつ／若しくは低下されたＫＲＣ活性が有益な効果を有することがありそうである状況、例えば増大された骨形成および石灰化が望ましい状況で望ましい。こうした状況は、状態、障害、疾患若しくは傷害を包含するは、限定されるものでないが例えば骨粗鬆症、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症の骨格変
化、および慢性腎不全（腎骨異栄養症）ならびに変形性骨炎（骨のパジェット病）を挙げることができる。
【０１２３】
ＫＲＣの上方調節における使用のための例示的剤（すなわちアゴニスト）は、例えば、ＫＲＣ、ＳＭＡＤ３、ＲＵＮＸ２、ＲＳＫ２、および／若しくはＷＷＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子、ＫＲＣ、ＳＭＡＤ３、ＲＵＮＸ２、ＲＳＫ２および／若しくはＷＷＰ１ペプチド、ならびに例えばＴＲＡＦ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、Ｒｕｎｘ２、ＧＬα、ｃ−Ｊｕｎ、ＣＢＦβ、ＲＳＫ２、ＷＷＰ１とのＫＲＣの相互作用を刺激する化合物（例えば主題のスクリーニングアッセイで同定される化合物）を包含する。
【０１２４】
ＫＲＣの下方調節における使用のための例示的剤（すなわちアンタゴニスト）は、細胞中でＫＲＣの活性を阻害する剤、例えば、ＫＲＣ、ＳＭＡＤ３、ＲＵＮＸ２、ＲＳＫ２若しくはＷＷＰ１分子に対しアンチセンスである核酸分子、ＫＲＣ、ＳＭＡＤ３、ＲＵＮＸ２、ＲＳＫ２若しくはＷＷＰ１  ｓｉＲＮＡ分子、ドミナントネガティブなＫＲＣ、ＳＭＡＤ３、ＲＵＮＸ２、ＲＳＫ２若しくはＷＷＰ１分子、またはそれらの組合せ（例えば主題のスクリーニングアッセイで同定される化合物）を包含する。
【０１２５】
Ａ．ＫＲＣの生物学的活性の下方制御
ＫＲＣポリペプチドの機能を下方制御してそれにより骨形成および石灰化を上方制御すなわち促進するための本発明の多数の態様が存在する。ＫＲＣの機能を下方制御することは、（例えば、例えば閉経前女性のような増大された骨成長若しくは石灰化から利益を得るとみられる状態を発症することがありそうであると診断される被験体における）状態若しくは傷害の発生前に、骨形成および石灰化を促進すなわち増大することの形態にあり得るか、あるいは、例えば骨折（ｂｏｎｅ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）すなわち骨折（ｂｏｎｅ  ｂｒｅａｋ）、歯置換すなわち被験体自身の歯若しくは補綴歯いずれかの置換を処置する、または、例えば、例えば閉経期前後若しくは閉経期と関連する骨喪失のような進行中の状態の症状を改善するために、骨形成および石灰化の誘導を促進することを伴いうる。骨芽細胞および／若しくは活性化された免疫細胞の機能は、従って、骨形成および石灰化を上方制御すること、ならびに／若しくは免疫細胞応答を下方制御すること、または免疫細胞における特異的アネルギーを誘導すること、あるいは双方により、調節し得る。
【０１２６】
例えば、ＫＲＣ活性は、ＫＲＣを発現する細胞を、ＫＲＣの発現若しくは活性を阻害する剤と接触させることにより阻害し得る。こうした剤は、本明細書に記述されるスクリーニングアッセイにより同定される化合物であり得る。別の態様において、剤はペプチドである。好ましい一態様において、剤はＫＲＣのアミノ酸残基２０４−１０５５と相互作用してＫＲＣ活性を阻害し得る。
【０１２７】
ＫＲＣ活性を阻害する剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに添加される場合に免疫細胞の増殖および／若しくはエフェクター機能を阻害するかまたはアネルギーを誘導するそれらの能力により同定し得る。細胞活性化の多数の技術に認識された読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）を、活性化剤の存在下での例えば細胞増殖若しくはエフェクター機能（例えばサイトカイン産生若しくは食作用）を測定するのに使用し得る。この活性化を阻害する試験剤の能力は、測定されている増殖若しくはエフェクター機能の低下を遂げる該剤の能力を測定することにより、容易に測定し得る。
【０１２８】
本発明の別の局面において、ＫＲＣ活性を阻害する剤は、骨形成および石灰化を増大させるそれらの能力により同定し得る。骨形成および石灰化の多数の技術に認識されたｉｎ
ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを、当該技術分野で既知かつ本明細書により詳細に記述されるアッセイを使用して例えば骨芽細胞および破骨細胞の機能を測定するのに使用し得る。
【０１２９】
別の態様において、骨形成および石灰化は、骨芽細胞、例えば成熟骨芽細胞を患者から取り出すこと、該骨芽細胞を、ＫＲＣ活性を下方制御する剤（例えば小分子）とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させること、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理した骨芽細胞を患者に再導入することにより、被験体中で増大させ得る。
【０１３０】
ＫＲＣ活性を阻害することにより骨形成および石灰化を増大させることは、増大された骨形成および石灰化が有益であるとみられる状況で有用である。例えば、骨密度の進行性喪失および骨組織の薄化が存在する、股関節の特発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、一過性骨粗鬆症を包含する骨粗鬆症、骨軟化症、骨のパジェット病および骨減少症は、破損および／若しくは骨折が起こらないとみられるような増大された骨形成および石灰化から利益を得るとみられる状態である。骨粗鬆症および骨減少症は、加齢および生殖状態から生じ得るのみならず、しかしまた多数の疾患および障害に二次的、ならびに多数の医薬品、例えば抗痙攣薬（例えば癲癇のため）、コルチコステロイド（例えば関節リウマチおよび喘息のため）、ならびに／若しくは免疫抑制剤（例えば癌のため）の長期使用によることもあり得る。例えば、グルココルチコイド誘発性の骨粗鬆症は、プレドニゾン（Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ、Ｏｒａｓｏｎｅなど）、プレドニゾロン（Ｐｒｅｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ、Ｈｅｘａｄｒｏｌ）およびコルチゾン（Ｃｏｒｔｏｎｅ  Ａｃｅｔａｔｅ）のようなグルココルチコイド医薬品を服用することにより引き起こされる骨粗鬆症の一形態である。これらの医薬品は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患およびリウマチ性多発筋痛症を包含する多くのリウマチ疾患を制御するのを助けるのに頻繁に使用される。骨粗鬆症が二次的でありうる他の疾患は、限定されるものでないが、若年性関節リウマチ、糖尿病、骨形成不全症、甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、吸収不良症候群、神経性食思不振および／若しくは腎疾患を挙げることができる。加えて、長期の不活動性若しくは不動性、不十分な栄養（とりわけカルシウム、ビタミンＤ）、無月経に至る過剰な運動（月経の非存在）、喫煙、および／若しくはアルコール濫用のような、多数の挙動が骨粗鬆症と関連付けられている。
【０１３１】
例えば、単独若しくは別の下方調節剤とともに、骨芽細胞、例えば成熟骨芽細胞中の例えばＴＲＡＦ、Ｊｕｎ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＣＢＦβ、ＷＷＰ１、ＲＳＫ２および／若しくはＲｕｎｘ２とのＫＲＣの相互作用を阻害することによりＫＲＣの活性を阻害する分子（ＫＲＣ、ＴＲＡＦ、Ｊｕｎ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＣＢＦβ、ＷＷＰ１、ＲＳＫ２および／若しくはＲｕｎｘ２ペプチドまたは小分子のような）の投与は、骨形成および石灰化を増大し得る。
【０１３２】
骨形成および石灰化を増大させるために本発明の下方調節法とともに使用し得る他の調節方法および／若しくは剤は、例えば、外科手術、ＢＭＰ−７としてもまた知られるＯＰ−１Ｒ（骨形成タンパク質スーパーファミリーの１メンバー）、ＢＭＰ−２、ビタミンＤ、カルシウム、ホルモン補充療法、ビスホスホネート、例えば、例えばアレンドロネート、エチドロネート、パミドロネートのような骨再吸収を阻害する内因性ピロリン酸のアナログ、カルシトニン、クロドロネート、選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）、例えばラロキシフェン、副甲状腺ホルモン、例えばテリパラチド、フッ化物、ラネリック酸ストロンチウム、ＴＮＦ−α抗体、オステオプロテゲリン、β−クリプトキサンチンを包含し、また、サイアザイドは、尿中カルシウム排泄を低下させかつ骨喪失を遅延させ得、チロシンホスファターゼ阻害剤、例えばオルトバナジン酸ナトリウム、アルファカルシドール、メナテトレノン、スタチン、例えばシンバスタチンを包含する。
【０１３３】
例示的阻害化合物
ＫＲＣ活性の阻害は、骨形成および石灰化を増大させかつ／または免疫応答を下方調節若しくは阻害するための増大された骨形成および石灰化ならびに／若しくは低下された免
疫応答を伴うため、細胞（例えば骨芽細胞若しくはＴ細胞）を、ＫＲＣ活性を阻害する剤と接触させる。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで剤と接触させることができ、そしてその後該細胞を被験体に投与し得るか、若しくは、あるいは、該剤を被験体に投与しうる（例えばＴ増殖および／若しくは分化が望ましい関節部位に直接）。ＫＲＣ阻害化合物を使用する本発明の方法は、増大された骨形成および石灰化が有益であるか若しくは免疫応答が減少、封鎖、阻害、下方制御などされる障害の処置で使用し得る。
【０１３４】
本発明の阻害化合物は、例えばＫＲＣの発現若しくは活性を特異的に阻害するよう作用する細胞内結合分子であり得る。本明細書で使用されるところの「細胞内結合分子」という用語は、タンパク質若しくは該タンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ分子）に結合することによりタンパク質の発現若しくは活性を阻害するように細胞内で作用する分子を包含することを意図している。下でさらに詳細に記述される細胞内結合分子の例は、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ分子、細胞内抗体、ＫＲＣの標的分子（例えばカルシニューリン、Ｒｕｎｘ２、ＷＷＰ１および／若しくはＳＭＡＤ３）との相互作用を阻害するペプチド化合物、ならびにＫＲＣ活性を特異的に阻害する化学的剤を包含する。
【０１３５】
ｉ．アンチセンス若しくはｓｉＲＮＡ核酸分子
一態様において、本発明の阻害化合物は、ＫＲＣをコードする遺伝子、Ｒｕｎｘ２をコードする遺伝子、ＳＭＡＤ３をコードする遺伝子、ＷＷＰ１をコードする遺伝子、ＲＳＫ２をコードする遺伝子、若しくはＫＲＣが関与するシグナル伝達経路中の分子、または前記遺伝子の一部分に相補的であるアンチセンス核酸分子、あるいは前記アンチセンス核酸分子をコードする組換え発現ベクターである。単純さのため、下で挙げられる例示的アンチセンスおよびｓｉＲＮＡ分子はＫＲＣアンチセンスおよびｓｉＲＮＡ分子を指すことができる。しかしながら、前述の分子、例えばＲｕｎｘ２、ＳＭＡＤ３、ＲＳＫ２、ＷＷＰ１、ＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子、若しくは前記遺伝子の一部分の例示的アンチセンスおよびｓｉＲＮＡ分子もまた本発明に包含されることが理解される。細胞中の特定の１タンパク質の発現を下方制御するためのアンチセンス核酸の使用は当該技術分野で公知である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１）１９８６；Ａｓｋａｒｉ，Ｆ．Ｋ．とＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｗ．Ｍ．（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３１６−３１８；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．とＳｃｈｗａｒｔｚ，Ｓ．Ｍ．（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９２：１９８１−１９９３；Ｍｅｒｃｏｌａ，Ｄ．とＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：４７−５９；Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．（１９９５）Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．５１：２１７−２２５；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．Ｗ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５を参照されたい）。アンチセンス核酸分子は、別の核酸分子（例えばｍＲＮＡ配列）のコーディング鎖に相補的でありかつ従って他の核酸分子のコーディング鎖に水素結合することが可能であるヌクレオチド配列を含んでなる。ｍＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス配列は、ｍＲＮＡのコーディング領域、ｍＲＮＡの５’若しくは３’非翻訳領域、またはコーディング領域および非翻訳領域を架橋する領域（例えば５’非翻訳領域およびコーディング領域の接合部で）に見出される配列に相補的であり得る。さらに、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡをコードする遺伝子の調節領域、例えば転写開始配列若しくは調節エレメントに対し配列が相補的であり得る。好ましくは、アンチセンス核酸は、コーディング鎖上の開始コドンに先行するか若しくはそれにわたる、またはｍＲＮＡの３’非翻訳領域中の１領域に相補的であるように設計される。
【０１３６】
本明細書に開示されるＫＲＣをコードするコーディング鎖配列を考えれば、本発明のアンチセンス核酸はワトソンとクリックの塩基対形成の規則に従って設計し得る。アンチセンス核酸分子は、ＫＲＣのｍＲＮＡのコーディング領域全体に相補的であり得るが、しか
し、より好ましくは、ＫＲＣのｍＲＮＡのコーディング若しくは非コーディング領域の一部分のみに対しアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＫＲＣのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の手順を使用する化学合成および酵素連結反応を使用して構築し得る。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大させるか若しくはアンチセンスおよびセンス核酸の間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された多様に改変されたヌクレオチドを使用して化学合成し得、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用し得る。アンチセンス核酸を生成するのに使用し得る修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを包含する。細胞中での発現を阻害するため、１種若しくはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し得る。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンスの向きにサブクローニングした発現ベクターを使用して生物学的に製造し得る（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、目的の標的核酸に対しアンチセンスの向きのものであることができる。以下の下位節にさらに記述される）。
【０１３７】
それらがＫＲＣタンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／若しくはゲノムＤＮＡとハイブリダイズ若しくはそれらに結合してそれにより例えば転写および／若しくは翻訳を阻害することにより該タンパク質の発現を阻害するような、本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的に、被験体に投与されるか、若しくはｉｎ  ｓｉｔｕで生成される。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための慣習的ヌクレオチド相補性によることができるか、若しくは、例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝中の特異的相互作用によることができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の一例は組織部位での直接注入を包含する。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように改変しかつその後全身投与し得る。例えば、全身投与のために、例えば細胞表面受容体若しくは抗原に結合するペプチド若しくは抗体とアンチセンス核酸分子を連結することにより、選択された細胞表面上で発現される受容体若しくは抗原にそれらが特異的に結合するようなアンチセンス分子を改変し得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記述されるベクターを使用して細胞に送達もし得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するため、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩ若しくはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が好ましい。
【０１３８】
なお別の態様において、本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である
。α−アノマー核酸分子は、通常のβ単位と対照的に鎖が相互に平行に走っている、相補ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）若しくはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）も含み得る。別の態様において、本発明のアンチセンス核酸はＲＮＡｉを媒介する化合物である。ＲＮＡ干渉剤は、限定されるものでないが、標的遺伝子若しくはゲノム配列、例えばＫＲＣ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤおよび／若しくはＲｕｎｘ２、またはそれらのフラグメントに相同であるＲＮＡ分子、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的遺伝子の発現を妨害若しくは阻害する「小分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）、「低分子ヘアピン」あるいは「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）ならびに小分子を包含する核酸分子を挙げることができる。ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して該ｄｓＲＮＡと同一配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する、転写後の標的を定めた遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．とＺａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７、２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ら  Ｃｅｌｌ  １０１、２５−３３（２０００）．Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３、３１９１−３１９７（１９９９））。該過程は、内因性リボヌクレアーゼが、より長いｄｓＲＮＡを、小分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡと命名されるより短い２１若しくは２２ヌクレオチド長のＲＮＡに切断する場合に起こる。該より短いＲＮＡセグメントがその後標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉの合成のためのキットは、例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓおよびＡｍｂｉｏｎから商業的に入手可能である。一態様において、アンチセンスＲＮＡの使用のための上述された化学の１種若しくはそれ以上を使用し得る。
【０１３９】
なお別の態様において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらがそれに対する相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断することが可能であるリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒的ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えばハンマーヘッド型リボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆとＧｅｒｌａｃｈ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記述される）を使用して、ＫＲＣ  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断してそれによりＫＲＣのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＫＲＣをコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、別のＫＲＣファミリーのポリペプチドをコードする配列番号１核酸分子のヌクレオチド配列に基づき設計し得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＫＲＣをコードするｍＲＮＡ中で切断されるべきヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナのＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Ｃｅｃｈら  米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら  米国特許第５，１１６，７４２号明細書を参照されたい。あるいは、ＫＲＣ  ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．とＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８を参照されたい。
【０１４０】
あるいは、遺伝子発現は、標的細胞中のＫＲＣ遺伝子の転写を予防する三重らせん構造を形成するように、ＫＲＣの調節領域（例えばＫＲＣプロモーターおよび／若しくはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列の標的を定めることにより阻害し得る。全般として、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．、１９９１、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ら、１９９２、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．、１９９２、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２）：８０７−１５を参照されたい。
【０１４１】
なお別の態様において、本発明のＫＲＣ核酸分子は、例えば該分子の安定性、ハイブリ
ダイゼーション若しくは溶解性を改良するように、塩基部分、糖部分若しくはリン酸バックボーンで改変し得る。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸バックボーンを、ペプチド核酸を生成するように改変し得る（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら、１９９６、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（１）：５−２３を参照されたい）。本明細書で使用されるところの「ペプチド核酸」若しくは「ＰＮＡ」という用語は、デオキシリボースリン酸バックボーンが偽性ペプチドバックボーンにより置換されかつ４種の天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物、例えばＤＮＡ模倣物を指す。ＰＮＡの中性のバックボーンは、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを見込むことが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら、１９９６、上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−６７５に記述されるところの標準的固相ペプチド合成プロトコルを使用して実施し得る。
【０１４２】
ＫＲＣ核酸分子のＰＮＡは治療および診断の応用で使用し得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写若しくは翻訳の停止を誘導するかまたは複製を阻害することによる遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンス若しくはアンチジーン剤として使用し得る。ＫＲＣ核酸分子のＰＮＡは、（例えばＰＮＡに指図されるＰＣＲクランピングによる）遺伝子中の単一塩基対突然変異の分析において；他の酵素（例えばＳ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ
Ｂ．、１９９６、上記）と組合せで使用される場合に「人工制限酵素」として；またはＤＮＡ配列決定若しくはハイブリダイゼーションのためのプローブ若しくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら、１９９６、上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  上記）もまた使用し得る。
【０１４３】
別の態様において、ＫＲＣのＰＮＡは、ＰＮＡに親油性若しくは他のヘルパー基を結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、またはリポソーム若しくは当該技術分野で既知の他の薬物送達技術の使用により、（例えばそれらの安定性若しくは細胞の取り込みを高めるように）改変し得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せうるＫＲＣ核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。こうしたキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えばＲＮアーゼＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）が、ＰＮＡ部分が高結合親和性および特異性を提供するとみられる一方でＤＮＡ部分と相互作用することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合の数および向きに関して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結し得る（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．、１９９６、上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．、１９９６、上記およびＦｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．ら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３に記述されるとおり実施し得る。例えば、標準的ホスホルアミダイトカップリング化学を使用してＤＮＡ鎖を固体支持体上で合成し得、そして、修飾されたヌクレオシドアナログ、例えば５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトを、ＰＮＡとＤＮＡの５’端の間として使用し得る（Ｍａｇ，Ｍ．ら、１９８９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。ＰＮＡ単量体をその後段階的様式で結合して、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントをもつキメラ分子を製造する（Ｆｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．ら、１９９６、上記）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントをもつキメラ分子を合成し得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら、１９７５、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４）。
【０１４４】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えばｉｎ  ｖｉｖｏで宿主細胞受容体を標的とするため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．８６：６５３３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開第Ｗ０８８／０９８１０号明細書を参照されたい）若しくは血液脳関門（例えばＰＣＴ公開第Ｗ０８９／１０１３４号明細書を参照されたい）を横断する輸送を助長する剤のような他の追加された基を包含しうる。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤（例えばＫｒｏｌら、１９８８、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６を参照されたい）若しくは挿入剤で改変し得る。（例えばＺｏｎ、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照されたい）。この目的のため、オリゴヌクレオチドを別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、若しくはハイブリダイゼーション誘発性切断剤）に複合しうる。
【０１４５】
アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクタント細胞若しくはトランスジェニック細胞中で異種発現カセットから製造しうる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培地中またはｉｎ  ｖｉｖｏで循環系若しくは間質液中のいずれかの外的環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含みうる。外的環境に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞質への到達を獲得しかつ特定のｍＲＮＡ種の転写を阻害することが示されている。
【０１４６】
別の態様において、ＲＮＡｉを促進する化合物を使用して、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現を阻害し得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して該ｄｓＲＮＡと同一配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する、転写後の標的を定めた遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．とＺａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７、２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ら  Ｃｅｌｌ  １０１、２５−３３（２０００）．Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３、３１９１−３１９７（１９９９）；Ｃｏｔｔｒｅｌｌ  ＴＲとＤｏｅｒｉｎｇ  ＴＬ．２００３．Ｔｒｅｎｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：３７−４３；Ｂｕｓｈｍａｎ  Ｆ．２００３．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．７：９−１０：ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴとＳｈａｒｐ  ＰＡ．２００２．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．３：７３７−４７）。該過程は、内因性リボヌクレアーゼが、より長いｄｓＲＮＡを、小分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡと命名されるより短い、例えば２１若しくは２２ヌクレオチド長のＲＮＡに切断する場合に起こる。該より短いＲＮＡセグメントがその後標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉの合成のためのキットは、例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ若しくはＡｍｂｉｏｎから商業的に入手可能である。一態様において、アンチセンスＲＮＡでの使用のための上述された化学の１種若しくはそれ以上を、ＲＮＡｉを媒介する分子で使用し得る。本発明の制限しない例示的ｓｉＲＮＡ分子を下に列挙する。
【０１４７】
ヒトＫＲＣ（配列番号１）に特異的な例示的ｓｉＲＮＡ分子を下に示す。
位置１５７６で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＡＣＣＡＡＧＡＧＵＡＡＵＣＵＣＵＡＣｔｔ（配列番号４）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＵＡＧＡＧＡＵＵＡＣＵＣＵＵＧＧＵＣｔｔ（配列番号５）
位置３３１０で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＡＵＣＵＧＡＵＵＣＵＣＵＣＧＡＧＣＡＧｔｔ（配列番号６）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＣＵＧＣＵＣＧＡＧＡＧＡＡＵＣＡＧＡＵｔｔ（配列番号７）
位置５７２５で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＣＣＡＡＡＵＣＡＣＡＵＣＣＡＧＣＡＵｔｔ（配列番号９）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＡＵＧＣＵＧＧＡＵＧＵＧＡＵＵＵＧＧＣｔｔ（配列番号１０）
ヒトＣＢＦβ（ｇｉ：４７１３２６１６）に特異的な例示的ｓｉＲＮＡ分子を下に示す。
ｇｉ：４７１３２６１６の位置２８８で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＣＡＡＧＵＵＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡｔｔ（配列番号１１）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＵＣＣＵＣＧＵＵＣＵＣＧＡＡＣＵＵＧＣｔｔ（配列番号１２）
ｇｉ：４７１３２６１６の位置６９２で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＡＧＧＣＵＣＧＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣｔｔ（配列番号１３）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＵＧＵＣＣＵＵＣＵＣＣＧＡＧＣＣＵＣｔｔ（配列番号１４）
ｇｉ：４７１３２６１６の位置１１５５で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＡＡＡＣＡＡＧＵＣＡＡＧＡＡＡＵＵＡＡｔｔ（配列番号１５）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＵＵＡＡＵＵＵＣＵＵＧＡＣＵＵＧＵＵＵｔｔ（配列番号１６）
ヒトＳＭＡＤ３（ｇｉ：４２４７６２０２）に特異的な例示的ｓｉＲＮＡ分子を下に示す。
ｇｉ：４２４７６２０２の位置５５６で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＵＡＵＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＧＡＧＧＵＣｔｔ（配列番号１７）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＡＣＣＵＣＧＵＣＣＵＵＣＵＵＣＡＵＡｔｔ（配列番号１８）
ｇｉ：４２４７６２０２の位置１２３１で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＣＣＵＧＡＡＧＡＵＣＵＵＣＡＡＣＡＡＣｔｔ（配列番号１９）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＵＵＧＵＵＧＡＡＧＡＵＣＵＵＣＡＧＧｔｔ（配列番号２０）
ｇｉ：４２４７６２０２の位置１５５７で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＵＵＧＧＡＡＣＵＣＵＡＣＵＣＡＡＣＣＣｔｔ（配列番号２１）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＧＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＵＣＣＡＡｔｔ（配列番号２２）
ヒトＷＷＰ１（ｇｉ：３３９４６３３１）に特異的な例示的ｓｉＲＮＡ分子を下に示す。
ｇｉ：３３９４６３３１の位置８３１で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＧＣＡＣＧＡＡＵＧＧＡＡＵＡＧＡＵＡｔｔ（配列番号２３）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＵＡＵＣＵＡＵＵＣＣＡＵＵＣＧＵＧＣＣｔｔ（配列番号２４）
ｇｉ：３３９４６３３１の位置２１８６で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＡＡＣＡＡＣＵＡＵＵＧＵＣＵＧＣＡＧｔｔ（配列番号２５）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＣＵＧＣＡＧＡＣＡＡＵＡＧＵＵＧＵＵＣｔｔ（配列番号２６）
ｇｉ：３３９４６３３１の位置３２５６で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＡＧＡＵＣＡＵＣＣＵＵＡＡＡＵＵＵＵＧｔｔ（配列番号２７）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＣＡＡＡＡＵＵＵＡＡＧＧＡＵＧＡＵＣＵｔｔ（配列番号２８）
ヒトＲＳＫ２（ｇｉ：５６２４３４９４）に特異的な例示的ｓｉＲＮＡ分子を下に示す。
ｇｉ：５６２４３４９４の位置６１１で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＧＵＣＡＣＡＵＣＡＡＧＵＵＡＡＣＡＧｔｔ（配列番号２９）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＣＵＧＵＵＡＡＣＵＵＧＡＵＧＵＧＡＣＣｔｔ（配列番号３０）
ｇｉ：５６２４３４９４の位置３０７７で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＧＡＡＧＵＡＧＵＣＣＵＵＧＣＡＣＵＵｔｔ（配列番号３１）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＡＡＧＵＧＣＡＡＧＧＡＣＵＡＣＵＵＣＣｔｔ（配列番号３２）
ｇｉ：５６２４３４９４の位置５３６４で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＵＧＣＡＡＣＡＧＡＣＣＣＣＣＡＡＣＵＵｔｔ（配列番号３３）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＡＡＧＵＵＧＧＧＧＧＵＣＵＧＵＵＧＣＡｔｔ（配列番号３４）
ヒトＲＵＮＸ２（ｇｉ：１０８６３８８４）に特異的な例示的ｓｉＲＮＡ分子を下に示す。
ｇｉ：１０８６３８８４の位置４８６で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＡＣＣＡＡＧＵＡＧＣＡＡＧＧＵＵＣＡＡｔｔ（配列番号３５）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＵＵＧＡＡＣＣＵＵＧＣＵＡＣＵＵＧＧＵｔｔ（配列番号３６）
ｇｉ：１０８６３８８４の位置７９７で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＧＡＣＡＧＡＧＵＣＡＧＡＵＵＡＣＡＧｔｔ（配列番号３７）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＣＵＧＵＡＡＵＣＵＧＡＣＵＣＵＧＵＣＣｔｔ（配列番号３８）
ｇｉ：１０８６３８８４の位置１４２３で開始：
センス鎖ｓｉＲＮＡ：ＣＣＡＧＡＡＵＧＡＵＧＧＵＧＵＵＧＡＣｔｔ（配列番号３９）
アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ：ＧＵＣＡＡＣＡＣＣＡＵＣＡＵＵＣＵＧＧｔｔ（配列番号４０）
【０１４８】
ｉｉ．細胞内抗体
細胞中のＫＲＣタンパク質の発現および／若しくは活性を阻害するのに使用し得る別の型の阻害化合物は、本明細書に開示されるＫＲＣと相互作用するポリペプチドに特異的な細胞内抗体である。上に述べられたとおり、単純さのため、下で挙げられる例示的細胞内抗体はＫＲＣ細胞内抗体を指すことができる。しかしながら、前述の分子、例えばＲｕｎｘ２、ＳＭＡＤ３、ＷＷＰ１、ＲＳＫ２、ＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子、若しくは前記遺伝子の一部分の例示的細胞内抗体もまた本発明に包含されることが理解される。細胞中でタンパク質の機能を阻害するための細胞内抗体の使用は当該技術分野で既知である（例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２６３８−２６４６；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．ら（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１０１−１０８；Ｗｅｒｇｅ，Ｔ．Ｍ．ら（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２７４：１９３−１９８；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７４２７−７４２８；Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７８８９−７８９３；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．ら（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：３９６−３９９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．ら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：５９５−６０１；Ｄｕａｎ，Ｌら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５０７５−５０７９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５９３２−５９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３９３１−２３９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：６６６−６７２；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１５４２−１５５１；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．ら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３１３７−３１４１；ＭａｒａｓｃｏらによるＰＣＴ公開第ＷＯ  ９４／０２６１０号明細書；およびＤｕａｎらによるＰＣＴ公開第ＷＯ  ９５／０３８３２号明細書を参照されたい）。
【０１４９】
細胞内抗体を使用してタンパク質の活性を阻害するために、細胞中へのベクターの導入に際して該細胞の細胞内区画中で抗体鎖が機能的抗体として発現されるような形態の抗体鎖をコードする組換え発現ベクターを調製する。本発明の阻害方法による転写因子活性の阻害のため、好ましくは、転写因子を特異的に結合する細胞内抗体を細胞の核内で発現さ
せる。細胞内抗体の核発現は、Ｎ末端の疎水性リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を抗体ＬおよびＨ鎖遺伝子から除去すること、ならびに核局在化シグナルをコードするヌクレオチド配列をＬおよびＨ鎖遺伝子のＮ若しくはＣいずれかの末端に付加することにより達成し得る（例えば、Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．ら（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１０１−１０８；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１５４２−１５５１を参照されたい）。細胞内抗体鎖の核ターゲッティングに使用されるべき好ましい核局在化シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化シグナルである（Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．ら（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１０１−１０８；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１５４２−１５５１を参照されたい）。
【０１５０】
細胞内抗体発現ベクターを製造するため、目的の標的タンパク質、例えばＫＲＣタンパク質に特異的な抗体鎖をコードする抗体ＬおよびＨ鎖ｃＤＮＡを、典型的にはＫＲＣタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから単離する。ＫＲＣタンパク質に対する抗血清の製造法は当該技術分野で記述されている（例えばＲａｏら、米国特許第５，６５６，４５２号明細書を参照されたい）。抗ＫＲＣタンパク質抗体は、適する被験体（例えばウサギ、ヤギ、マウス若しくは他の哺乳動物）をＫＲＣタンパク質免疫原で免疫することにより製造し得る。適切な免疫原調製物は、例えば、組換え発現したＫＲＣタンパク質若しくは化学合成したＫＲＣペプチドを含有し得る。該調製物は、フロイントの完全若しくは不完全アジュバントのようなアジュバント、または類似の免疫刺激化合物をさらに包含し得る。抗体産生細胞を被験体から得、そして元はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）により記述されたハイブリドーマ技術のような標準的技術によりモノクローナル抗体を製造するのに使用し得る（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）ＰＮＡＳ  ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５もまた参照されたい）。モノクローナル抗体ハイブリドーマを製造するための技術は公知である（全般として、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８０）中；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、５４：３８７−４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、３：２３１−３６を参照されたい）。簡潔には、不死細胞株（典型的には骨髄腫）を、上述されたところのＫＲＣタンパク質免疫原で免疫した哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）に融合し、そして、生じるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ＫＲＣタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。リンパ球および不死化細胞株を融合するのに使用される多くの公知のプロトコルのいずれも、抗ＫＲＣタンパク質モノクローナル抗体を生成する目的上、適用し得る（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５２；Ｇｅｆｔｅｒら  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、上記で引用される；Ｌｅｒｎｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、上記で引用される；Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、上記で引用されるを参照されたい）。さらに、当業者は、また有用であるとみられるこうした方法の多くの変形物が存在することを認識するであろう。典型的には、不死細胞株（例えば骨髄腫細胞株）はリンパ球と同一の哺乳動物種由来である。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物で免疫したマウスからのリンパ球を不死化マウス細胞株と融合することにより作成し得る。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。多数の骨髄腫細胞株のいずれも、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３若しくはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株を、標準的技術に従って融合パートナーとして使用しうる。これらの骨髄腫株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、メリーランド州ロックビルから入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾細胞に融合する。融合から生じるハイブリドーマ細胞をその後、未融合および非産生的に融合された骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を使用して選択する（未融合の脾細胞は形質転換されていないため、それらは数日後に死滅する）。ｍａｆタンパク質を特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、例えば標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用してこうした抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより同定する。
【０１５１】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調節することに代わり、ＫＲＣに結合するモノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイライブラリー）を該タンパク質若しくはそのペプチドでスクリーニングすることにより同定かつ単離して、それにより該タンパク質に特異的に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離し得る。ファージディスプレイライブラリーを生成しかつスクリーニングするためのキットが商業的に入手可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａの組換えファージ抗体系、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＳｕｒｆＺＡＰＴＭファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。加えて、抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングにおける使用にとりわけ従う方法および化合物の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒら  米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、国際公開第ＷＯ  ９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒら  国際公開第ＷＯ  ９１／１７２７１号；Ｗｉｎｔｅｒら  国際公開第ＷＯ  ９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄら  国際公開第ＷＯ  ９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら  国際公開第ＷＯ  ９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら  国際公開第ＷＯ  ９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｒｄら  国際公開第ＷＯ  ９２／０９６９０号明細書；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら  Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４に見出し得る。
【０１５２】
ＫＲＣに特異的な目的のモノクローナル抗体（例えば、当該技術分野で既知であるＫＲＣに対するモノクローナル抗体を包含する、ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体若しくはコンビナトリアルライブラリーからの組換え抗体のいずれか）を一旦同定すれば、該モノクローナル抗体のＬおよびＨ鎖をコードするＤＮＡを標準的分子生物学技術により単離する。ハイブリドーマ由来抗体については、ＬおよびＨ鎖ｃＤＮＡを例えばＰＣＲ増幅若しくはｃＤＮＡライブラリースクリーニングにより得ることができる。ファージディスプレイライブラリーからのような組換え抗体については、ＬおよびＨ鎖をコードするｃＤＮＡは、ライブラリースクリーニング過程の間に単離されるディスプレイパッケージ（例えばファージ）から回収し得る。ＰＣＲプライマー若しくはｃＤＮＡライブラリープローブをそれから製造し得る抗体ＬおよびＨ鎖遺伝子のヌクレオチド配列は当該技術分野で既知である。例えば、多くのこうした配列が、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２、および「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースに開示されている。
【０１５３】
一旦得られれば、抗体ＬおよびＨ鎖配列は、標準的方法を使用して組換え発現ベクターにクローン化する。上で論考されたとおり、ＬおよびＨ鎖の疎水性リーダーをコードする配列を除去し、そして核局在化シグナル（例えばＳＶ４０ラージＴ抗原からの）をコードする配列を、ＬおよびＨ鎖双方のアミノ若しくはカルボキシいずれかの末端をコードする配列にインフレームで連結する。該発現ベクターは、数種の異なる形態の１種で細胞内抗体をコードし得る。例えば、一態様において、ベクターは、完全長の抗体が細胞内で発現されるような完全長の抗体ＬおよびＨ鎖をコードする。別の態様において、ベクターは、Ｆａｂフラグメントが細胞内で発現されるような完全長のＬ鎖しかしＨ鎖のＶＨ／ＣＨ１領域のみをコードする。最も好ましい態様において、ベクターは、ＬおよびＨ鎖の可変領域がフレキシブルペプチドリンカー（例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）（配列番号４１）により連結されかつ一本鎖分子として発現される一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする。細胞中の転写因子活性を阻害するため、ＫＲＣ特異的細胞内抗体をコードする発現ベクターは、上述されたところの標準的トランスフェクション法により細胞に導入する。
【０１５４】
ｉｉｉ．ＫＲＣ由来ペプチド化合物
別の態様において、本発明の阻害化合物はＫＲＣのアミノ酸配列由来のペプチド化合物である。上で述べられたとおり、単純さのため、下で挙げられる例示的ペプチド化合物はＫＲＣアミノ酸配列由来のペプチド化合物を指すことができる。しかしながら、前述の分子、例えばＲｕｎｘ２、ＳＭＡＤ３、ＷＷＰ１、ＲＳＫ２、ＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子、若しくは前記遺伝子の一部分の例示的ペプチド化合物もまた本発明に包含されることが理解される。とりわけ、該阻害化合物は、このペプチド化合物とのＫＲＣの接触が標的分子とのＫＲＣの相互作用を競合的に阻害するような標的分子とのＫＲＣの相互作用を媒介するＫＲＣ（若しくはその模倣物）の一部分を含んでなる。例示的一態様において、ペプチド化合物は、例えばＴＲＡＦ、Ｊｕｎ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＷＷＰ１、ＣＢＦβ、ＲＳＫ２および／若しくはＲｕｎｘ２とのＫＲＣの相互作用を媒介するＫＲＣの領域に基づき設計される。本明細書に記述されるとおり、ＫＲＣタンパク質のアミノ酸残基２０４−１０５５は、ＴＲＡＦとのＫＲＣタンパク質の相互作用を媒介し、また、該領域にわたるペプチドは、他の基質に対するＴＲＡＦのホスファターゼ活性に影響を及ぼすことなく、ＫＲＣタンパク質に結合しかつそれをリン酸化するＴＲＡＦの能力を阻害する。さらに、細胞内で発現される場合、この領域にわたるペプチドは、刺激に応答してＫＲＣの脱リン酸化、核転位およびＫＲＣ媒介性の遺伝子発現を阻害して、それによりＫＲＣ依存性の機能を阻害する。
【０１５５】
好ましい一態様において、ＫＲＣ阻害化合物は、ＫＲＣのＴＲＡＦと相互作用する領域に基づき製造されるペプチド化合物である。ペプチドは、ＫＲＣのアミノ酸残基２０４−１０５５を含んでなるアミノ酸配列を有するＫＲＣのＴＲＡＦと相互作用する領域に由来し得る。別の好ましい態様において、ＫＲＣ阻害化合物は、ＫＲＣのｃ−Ｊｕｎと相互作用する領域に基づき製造されるペプチド化合物である。ペプチドは、ＫＲＣのアミノ酸残基２０４−１０５５を含んでなるアミノ酸配列を有するＫＲＣのｃ−Ｊｕｎと相互作用する領域に由来し得る。あるいは、ペプチドのような、ヒトＫＲＣのより長い若しくはより短い領域を使用し得る。
【０１５６】
本発明のペプチド化合物は、該ペプチドをコードする発現ベクターを細胞に導入することにより、骨芽細胞および／若しくは免疫細胞中で細胞内で作成し得る。こうした発現ベクターは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを使用して標準的技術により作成し得る。該ペプチドは、別のタンパク質若しくはペプチドとの融合（例えばＧＳＴ融合）として細胞内で発現させ得る。細胞中でのペプチドの組換え合成の代わりに、該ペプチドは標準的ペプチド合成技術を使用する化学合成により作成し得る。合成したペプチドをその後、細胞にペプチドを導入するための当該技術分野で既知の多様な手段（例えばリポソームなど）により細胞に導入し得る。
【０１５７】
ＫＲＣタンパク質の活性を特異的に阻害するのに使用し得る別の阻害剤は、ＫＲＣ活性を直接阻害するか若しくはＫＲＣと標的分子の間の相互作用を阻害する化合物である。こうした化合物は、上で詳述されたところの、こうした化合物について選択するスクリーニングアッセイを使用して同定し得る。
【０１５８】
Ｂ．ＫＲＣの生物学的活性の上方制御
骨形成および石灰化の下方調節の手段としてのＫＲＣ活性の刺激もまた治療で有用である。例えば、ＫＲＣを高めることにより骨形成および石灰化を低下若しくは阻害することは、例えば頭蓋骨縫合早期癒合症（骨癒合）、大理石骨病（悪性小児性、中間型および成人型を包含する）、原発性骨格外骨形成、例えば顔の多発性粟粒皮下骨腫、および硬化性骨炎のような、２個若しくはそれ以上の骨の未熟な融合が存在するかまたは骨密度が高すぎる疾患、障害、状態若しくは傷害で有益である。
【０１５９】
あるいは、患者から細胞を除去すること、細胞をＫＲＣ活性を高める剤（例えば小分子）とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させること、および該ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した細胞を患者に再導入することにより、患者で骨形成および石灰化が低下した。別の態様において、免疫応答を高める若しくは骨形成および石灰化を低下させる方法は、患者から細胞を単離すること、ＫＲＣ分子をコードする核酸分子でそれらをトランスフェクトすること、および該トランスフェクトした細胞を患者に再導入することを必要とする。
【０１６０】
付加的な一態様において、本明細書に記述される方法のいずれかの実施において、１種若しくはそれ以上の付加的な剤を投与することにより骨形成および石灰化を阻害することは、本発明の範囲内にある。
【０１６１】
別の態様において、免疫応答の上方制御若しくは骨形成および石灰化の低下方法は、細胞が（例えば細胞膜中で）ＫＲＣ分子若しくは（例えば細胞質中で）ペプチドを発現するような、突然変異を伴うＫＲＣ分子若しくは例えばＫＲＣとＴＲＡＦの相互作用を高めるペプチド（例えばＴＲＡＦ−Ｃドメイン）をコードする核酸分子でそれらをトランスフェクトすること、および該トランスフェクトした細胞を患者に再導入することを必要とする。トランスフェクトした細胞の活性化される能力はかように増大させ得る。
【０１６２】
付加的な一態様において、本明細書に記述される方法のいずれかの実施において、１種若しくはそれ以上の付加的な剤を投与することにより骨形成および石灰化を下方制御することは、本発明の範囲内にある。例えば、外科的修復、生物分解性装置の外科的移植、ロシグリタゾン、ＲＡＮＫＬ、トレチノイン、エノキサパリンを、ＫＲＣ活性を高める剤とともに使用し得る。
【０１６３】
例示的刺激化合物
ＫＲＣ活性の上方制御は低下した骨形成および石灰化と関連するため、ＫＲＣ活性および／若しくは発現を特異的に刺激する化合物を、骨形成および石灰化を阻害するのに使用し得る。本発明の刺激方法において、被験体を、ＫＲＣ分子の発現および／若しくは活性を刺激する刺激化合物で処置する。ＫＲＣ刺激化合物を使用する本発明の方法は、骨形成および石灰化の増強が望ましい障害の処置で使用し得る。
【０１６４】
刺激化合物の例は、活性のＫＲＣタンパク質若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子、ＫＲＣをコードする発現ベクター、およびＫＲＣ活性を特異的に刺激する化学的剤を包含する。
【０１６５】
上で述べられたとおり、単純さのため、下で挙げられる例示的刺激化合物はＫＲＣ刺激化合物を指すことができる。しかしながら、前述の分子、例えばＲｕｎｘ２、ＳＭＡＤ３、ＲＳＫ２、ＷＷＰ１、ＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子、若しくは前記遺伝子の一部分の例示的刺激化合物もまた本発明に包含されることが理解される。
【０１６６】
好ましい刺激化合物は、核酸分子が被験体の細胞中のＫＲＣタンパク質の発現に適する形態で被験体（例えば被験体のＴ細胞若しくは骨芽細胞）に導入されている、ＫＲＣをコードする核酸分子である。例えば、ＫＲＣのｃＤＮＡ（完全長若しくは部分的ＫＲＣ  ｃＤＮＡ配列）を組換え発現ベクターにクローン化し、そして標準的分子生物学技術を使用して該ベクターを免疫細胞にトランスフェクトする。ＫＲＣのｃＤＮＡは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する増幅、若しくは適切なｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。ＫＲＣのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は当該技術分野で既知であり、そして、標準的ＰＣＲ法によるｃＤＮＡの増幅を見込むＰＣＲプライマーの設計、若しくは標準的ハイブリダイゼーション法を使用してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用し得るハイブリダイゼーションプローブの設計に使用し得る。
【０１６７】
ＫＲＣのｃＤＮＡの単離若しくは増幅後に、ＤＮＡフラグメントを上述されたとおり適する発現ベクターに導入する。宿主細胞中のＫＲＣの発現に適する形態のＫＲＣをコードする核酸分子は、当該技術分野で既知のヌクレオチド配列を使用して、上述されたとおり製造し得る。該ヌクレオチド配列は、標準的ＰＣＲ法によるｃＤＮＡの増幅を見込むＰＣＲプライマーの設計、若しくは標準的ハイブリダイゼーション法を使用してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用し得るハイブリダイゼーションプローブの設計に使用し得る。
【０１６８】
細胞中のＫＲＣの発現を刺激するための別の形態の刺激化合物は、細胞中の内因性ＫＲＣの発現若しくは活性を特異的に刺激する化合物である。こうした化合物は、本明細書に記述されるところのＫＲＣの発現若しくは活性化を刺激する化合物について選択するスクリーニングアッセイを使用して同定し得る。
【０１６９】
被験体でのＫＲＣ活性の本発明の調節方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏいずれでも実施し得る（後者は以下の下位節でさらに論考する）。該方法をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施するため、細胞（例えばＴ細胞若しくは骨芽細胞）を標準的方法により被験体から得ることができ、そして本発明の刺激若しくは阻害化合物とｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベート（すなわち培養）して、ＫＲＣの活性をそれぞれ刺激若しくは阻害し得る。免疫細胞および骨芽細胞の単離方法は当該技術分野で既知である。
【０１７０】
刺激若しくは阻害いずれかの化合物でｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理した細胞は、被験体での細胞の増殖および／若しくは分化に影響するように該被験体に投与し得る。
【０１７１】
他の態様において、刺激若しくは阻害化合物は、被験体の関節部位に直接のような被験体にｉｎ  ｖｉｖｏで投与する。核酸を含んでなる刺激若しくは阻害剤（例えばＫＲＣをコードする組換え発現ベクター、アンチセンスＲＮＡ、細胞内抗体若しくはＫＲＣ由来ペプチド）について、化合物は、核酸（例えばＤＮＡ）のｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞への当該技術分野で既知の導入方法を使用して、被験体の細胞に導入し得る。こうした方法の例は：
直接注入：裸のＤＮＡは、ＤＮＡを細胞中に直接注入することによりｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に導入し得る（例えば、Ａｃｓａｄｉら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：８１５−８１８；Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８を参照されたい）。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞にＤＮＡを注入するための送達装置（例え
ば「遺伝子銃」）を使用し得る。こうした装置は（例えばＢｉｏＲａｄから）商業的に入手可能である。
【０１７２】
受容体媒介性のＤＮＡ取り込み：裸のＤＮＡは、細胞表面受容体のリガンドに結合されているポリリシンのような陽イオンにＤＮＡを複合体形成させることによってもまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に導入し得る（例えば、Ｗｕ，Ｇ．とＷｕ，Ｃ．Ｈ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；および米国特許第５，１６６，３２０号明細書を参照されたい）。ＤＮＡ−リガンド複合体の受容体への結合は、受容体媒介性のエンドサイトーシスによるＤＮＡの取り込みを助長する。エンドソームを天然に破壊してそれにより物質を細胞質中に放出するアデノウイルスキャプシドに連結したＤＮＡ−リガンド複合体を使用して、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避し得る（例えば、Ｃｕｒｉｅｌら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８８５０；Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２１２２−２１２６を参照されたい）。
【０１７３】
レトロウイルス：欠損レトロウイルスは遺伝子治療の目的上の遺伝子移入での使用について十分に特徴付けられている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１を参照されたい）。目的のヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノム中に組み込ませた組換えレトロウイルスを構築し得る。加えて、レトロウイルスゲノムの部分を除去して該レトロウイルスを複製欠損にし得る。複製欠損レトロウイルスをその後ビリオンにパッケージングし、それを標準的技術によるヘルパーウイルスの使用により標的細胞を感染させるのに使用し得る。組換えレトロウイルスの製造およびこうしたウイルスでｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を感染させるためのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．１０−９．１４節、および他の標準的実験室手引書に見出し得る。適するレトロウイルスの例は、当業者に公知であるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭを包含する。適するパッケージングウイルス株の例は、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍを包含する。レトロウイルスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を包含する多くの異なる細胞型に多様な遺伝子を導入するのに使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−１３９８；ＤａｎｏｓとＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙら（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−６４７；Ｄａｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願第ＷＯ  ８９／０７１３６号；ＰＣＴ出願第ＷＯ  ８９／０２４６８号；ＰＣＴ出願第ＷＯ  ８９／０５３４５号；およびＰＣＴ出願第ＷＯ  ９２／０７５７３号明細書を参照されたい）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノム（およびそれに挿入された外来核酸）が核酸を細胞に安定に導入するように宿主ゲノムに組込まれるために、標的細胞の分裂を必要とする。従って、標的細胞の複製を刺激することが必要でありう��。
【０１７４】
アデノウイルス：それが目的の遺伝子産物をコードしかつ発現するがしかし正常な溶解性ウイルスの生活環において複製するその能力に関して不活性化されるように、アデノウイルスのゲノムを操作し得る。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄタイプ５  ｄｌ３２４若しくは他の株のアデノウイルス（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の適するアデノウイルスベクターが当業者に公知である。組換えアデノウイルスは、それらが効果的な遺伝子送達ベヒクルであるために駆動する細胞を必要とせず、かつ、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）上で引用される）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６４８２−６４８６）、肝細胞（ＨｅｒｚとＧｅｒａｒｄ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８１２−２８１６）および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２５８１−２５８４）を包含する多様な細胞型を感染させるのに使用し得るため、有利である。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含有される外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノム中に組込まれないが、しかしエピソームのまま留まり、それにより、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えばレトロウイルスＤＮＡ）に組込まれたようになる状況で挿入突然変異誘発の結果として生じ得る潜在的問題を回避する。さらに、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの保有能力は他の遺伝子送達ベクターに関して大きい（８キロ塩基まで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、上で引用される；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄとＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。現在使用されている大部分の複製欠損アデノウイルスベクターは、該ウイルスのＥ１およびＥ３遺伝子の全部若しくは一部について欠失されているが、しかしアデノウイルスの遺伝物質の約８０％を保持する。
【０１７５】
アデノ随伴ウイルス：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および生産的生活環のためのヘルパーウイルスとしてアデノウイルス若しくはヘルペスウイルスのような別のウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである。（総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら  Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９を参照されたい）。それはまた、そのＤＮＡを非分裂細胞に組込みうる数種のウイルスの１種でもあり、かつ、高頻度の安定な組込みを表す（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３を参照されたい）。ＡＡＶの約３００塩基対を含有するベクターをパッケージングし得かつ組込み得る。外因性ＤＮＡのための空間は約４．５ｋｂに制限される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０に記述されるもののようなＡＡＶベクターを、ＤＮＡを細胞に導入するのに使用し得る。多様な核酸がＡＡＶベクターを使用して多様な細胞型に導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；およびＦｌｏｔｔｅら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０を参照されたい）
を包含する。
【０１７６】
特定の発現ベクター系および細胞への核酸の導入方法の効率は、当該技術分野で慣例に
使用される標準的アプローチにより評価し得る。例えば、細胞に導入されたＤＮＡは、フィルターハイブリダイゼーション技術（例えばサザンブロッティング）により検出し得、また、導入されたＤＮＡの転写により産生されるＲＮＡは、例えばノーザンブロッティング、ＲＮアーゼ保護若しくは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出し得る。遺伝子産物は、適切なアッセイ、例えば、特異的抗体を用いるような産生されたタンパク質の免疫学的検出、若しくは酵素アッセイのような遺伝子産物の機能的活性を検出するための機能アッセイにより検出し得る。
【０１７７】
ＩＩＩ．診断アッセイ
別の局面において、本発明は、（例えば、例えば骨形成および石灰化の調節、破骨細胞形成の調節、破骨細胞活性に対する骨芽細胞活性の調節、破骨細胞活性に対する骨芽細胞活性の調節、オステオカルシン遺伝子転写の調節、Ｒｕｎｘ２の分解の調節、例えばＲｕｎｘ２タンパク質レベルの調節、Ｒｕｎｘ２のユビキチン化の調節、ＲＳＫ２の発現の調節、ＲＳＫ２の分解、例えばＲＳＫ２タンパク質レベルの調節、ＲＳＫ２のユビキチン化、ＲＳＫ２のリン酸化の調節、ＢＳＰ、ＣｏｌＩ（α）１、ＯＣＮ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＡＮＫＬおよびＡＴＦ４の発現の調節、ＡＴＦ４タンパク質レベルの調節、ならびに／若しくはＡＴＦ４のリン酸化の調節の調節から利益を得るとみられる）異常な生物学的活性若しくはＫＲＣを伴う障害についての被験体の診断方法を特徴とする。
【０１７８】
一態様において、本発明は、ＫＲＣ活性の調節、例えば骨形成および石灰化の調節、破骨細胞形成の調節、破骨細胞活性に対する骨芽細胞活性の調節、オステオカルシン遺伝子転写の調節、Ｒｎｘ２の分解の調節、例えばＲｕｎｘ２タンパク質レベルの調節、Ｒｕｎｘ２のユビキチン化の調節、ＲＳＫ２の発現の調節、ＲＳＫ２の分解、例えばＲＳＫ２タンパク質レベルの調節、ＲＳＫ２のユビキチン化、ＲＳＫ２のリン酸化の調節、ＢＳＰ、ＣｏｌＩ（α）１、ＯＣＮ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＡＮＫＬおよびＡＴＦ４の発現の調節、ＡＴＦ４タンパク質レベルの調節、ならびに／若しくはＡＴＦ４のリン酸化の調節から利益を得るとみられる者と被験体を同定することを含んでなる。
【０１７９】
例えば、一態様において、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現を、ＫＲＣの異常な生物学的活性と関連する障害を有することが疑われる被験体の細胞中で検出し得る。前記被験体の細胞でのＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現をその後対照と比較し得、そして、対照と比較した被験体の細胞中のＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現の差違を使用して、ＫＲＣ活性の調節から利益を得るとみられる者と被験体を診断し得る。
【０１８０】
被験体の細胞中のＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の「発現の変化」若しくは「発現の差違」は、例えば、例えば被験体から細胞を単離すること、ならびにノーザンブロット分析、マイクロアレイ分析、逆転写ＰＣＲ分析およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを包含する当該技術分野で既知の標準的方法により該細胞中のＫＲＣ  ｍＲＮＡ発現のレベルを測定することにより例えばＫＲＣ  ｍＲＮＡのレベルをアッセイすることにより検出し得る、被験体から採取した以前のサンプルに比較して若しくは対照に比較しての該被験体の細胞中のＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現のレベルの変化であり得る。例えば、生物学的試料を患者から得ることができ、そして例えばＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現若しくは活性についてアッセイし得る。例えば、ＰＣＲアッセイを使用して被験体の細胞中のＫＲＣのレベルを測定し得る。対照で見られるレベルより高い若しくはより低い、または該患者で以前に得られたレベルより高い若しくはより低いＫＲＣのレベルは、該患者が、ＫＲＣが関わるシグナル伝達経路の調節から利益を得るとみられることを示す。あるいは、被験体の細胞中のＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現のレベルは、例えば、被験体から細胞を単離すること、ならびにウエスタンブロット分析、免疫沈降法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および免疫蛍光法を包含する当該技術分野で既知の標準的方法によりＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子のタンパク質発現のレベルを測定することにより例えばＫＲＣのレベルをアッセイすることにより検出し得る。こうしたアッセイでの使用のための抗体は、細胞内抗体を作成するための当該技術分野で既知かつ／若しくは本明細書に記述されるところの技術を使用して作成し得る。
【０１８１】
別の態様において、被験体の細胞中のＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現の変化は、１個若しくはそれ以上の突然変異（すなわち野性型からの変化）、例えば、該タンパク質のアミノ酸配列中の１個若しくはそれ以上の突然変異（すなわち野性型からの変化）につながるＫＲＣ遺伝子およびｍＲＮＡから生じる。一態様において、突然変異（１個若しくは複数）は増大された活性（例えば部分的若しくは完全な構成的活性）を伴う分子の形態につながる。別の態様において、突然変異（１個若しくは複数）は低下された活性（例えば部分的若しくは完全な不活性）を伴う分子の形態につながる。突然変異（１個若しくは複数）は分子の発現のレベルを変化させうる（例えば障害を伴う被験体で分子の発現のレベルを増大若しくは低下させること）。あるいは、突然変異（１個若しくは複数）は、例えば、１個若しくはそれ以上の標的との変異体タンパク質の相互作用を調節すること、例えばリン酸化され得ない若しくはＫＲＣ結合パートナーと相互作用し得ないＫＲＣの形態をもたらすことにより、該タンパク質の調節を変化させうる。タンパク質のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列中の突然変異は、ＤＮＡ若しくはタンパク質配列の分析、例えばＤＮＡ若しくはタンパク質配列決定、ＲＦＬＰ分析、および一塩基若しくはアミノ酸多形の分析のための標準的技術を使用して決定し得る。例えば、一態様において、突然変異は、目的の核酸配列に隣接する特異的プライマーを使用する高度に感受性のＰＣＲアプローチを使用して検出し得る。一態様において、変化の検出は、アンカーＰＣＲ若しくはＲＡＣＥ  ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号明細書を参照されたい）、または、あるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばＬａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：３６０−３６４を参照されたい）におけるプローブ／プライマーの使用を必要とする。本方法は、患者から細胞のサンプルを収集する段階、サンプルの細胞から核酸（例えばゲノムＤＮＡ）を単離する段階、配列のハイブリダイゼーションおよび増幅（存在する場合）が起こるような条件下で配列を特異的に増幅する１種若しくはそれ以上のプライマーと該核酸サンプルを接触させる段階、ならびに増幅産物の存在若しくは非存在を検出する段階、または増幅産物の大きさを検出する段階、および該長さを対照サンプルと比較する段階を包含し得る。
【０１８２】
一態様において、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の完全なヌクレオチド配列を決定し得る。ヒト遺伝子中の多形を研究するために実際の配列を決定するための特別の技術が開発されている。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５、５４４−５４８（１９８８）およびＮａｔｕｒｅ  ３３０、３８４−３８６（１９８７）；ＭａｘｉｍとＧｉｌｂｅｒｔ．１９７７．ＰＮＡＳ  ７４：５６０；Ｓａｎｇｅｒ  １９７７．ＰＮＡＳ  ７４：５４６３を参照されたい。加えて、質量分析法による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９４／１６１０１号明細書；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照されたい）を包含する多様な自動化配列決定手順のいずれも、診断的アッセイ（（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８）を実施する場合に利用し得る。
【０１８３】
制限断片長多形マッピング（ＲＦＬＰＳ）は制限酵素部位の変化に基づく。一態様にお
いて、サンプル細胞からの多形を制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、サンプルおよび対照ＤＮＡを単離し、（場合によっては）増幅し、１種若しくはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてフラグメント長の大きさをゲル電気泳動により決定しかつ比較する。さらに、配列特異的リボザイム（例えば米国特許第５，４９８，５３１号明細書を参照されたい）の使用を使用して、特異的リボザイム切断部位の存在について評価し得る。
【０１８４】
特定のＤＮＡセグメント中の特定の多形の別の検出技術は、分析されているＤＮＡセグメント（標的ＤＮＡ）を相補的な標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることを伴う。Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９、８７９−８９４（１９８１）を参照されたい。単一塩基対不適正でさえ含有するＤＮＡ二重鎖は高い熱不安定性を表すため、差別的融解温度を使用して、プローブに完全に相補的である標的ＤＮＡを単一ヌクレオチドのみ異なる標的ＤＮＡと識別し得る。本方法は特定の制限部位の存在若しくは非存在を検出するように改作された（米国特許第４，６８３，１９４号明細書）。該方法は、標的ＤＮＡにハイブリダイズされる、制限部位にわたる末端標識オリゴヌクレオチドプローブを使用することを必要とする。ハイブリダイズされたＤＮＡ二重鎖をその後、その部位に適切な制限酵素とインキュベートする。再形成された制限部位は、制限エンドヌクレアーゼを使用することによるプローブと標的の間の二重鎖の対での消化により切断することができる。短縮されたプローブ分子が検出される場合は、該特定の制限部位が標的ＤＮＡ中に存在する。
【０１８５】
核酸配列中の多形の他の検出方法は、ＲＮＡ／ＲＮＡ若しくはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中の不適正塩基を検出するのに切断剤からの保護を使用する方法を包含する（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）。一般に、「不適正切断」の当該技術の技術は、多形配列を含有する（標識）ＲＮＡ若しくはＤＮＡを、組織サンプルから得た潜在的に多形のＲＮＡ若しくはＤＮＡとハイブリダイズさせることにより形成されるのヘテロ二重鎖を提供することにより開始する。該二本鎖の二重鎖を、対照鎖とサンプル鎖の間の塩基対不適正により存在するであろうような二重鎖の一本鎖領域を切断する剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮアーゼで処理し得、また、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理して、不適正領域を酵素的に消化し得る。他の態様において、ＤＮＡ／ＤＮＡ若しくはＲＮＡ／ＤＮＡいずれの二重鎖も、不適正領域を消化するためにヒドロキシルアミン若しくは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。不適正領域の消化後に、生じる物質をその後変性ポリアクリルアミドゲル上で大きさにより分離する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照されたい。好ましい一態様において、対照ＤＮＡ若しくはＲＮＡを検出のため標識し得る。
【０１８６】
別の態様において、電気泳動の移動度の変化を使用して多形を同定し得る。例えば、一本鎖コンホメーション多形（ＳＳＣＰ）を使用して、変異体および野性型の核酸の間の電気泳動の移動度の差違を検出しうる（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ：８６：２７６６、Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｎｔ  Ｒｅｓ  ２８５：１２５−１４４；およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  Ｔｅｃｈ  Ａｐｐｌ  ９：７３−７９もまた参照されたい）。サンプルおよび対照核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントを変性しかつ再生させ得る。一本鎖核酸の二次構造は配列により変動し、電気泳動の移動度の生じる変化は一塩基変化の検出さえ可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識しても、若しくは標識したプローブで検出してもよい。アッセイの感度は、二次構造が配列中の変化に対しより感受性である、（ＤＮＡよりむしろ）ＲＮＡを使用することにより高めうる。好ましい一態様において、主題の方法は、電気泳動の移動度の変化に基づき二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離するのにヘテロ二重鎖分析を利用する
（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ７：５）。
【０１８７】
なお別の態様において、変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲル中の多形配列を含んでなる核酸分子の動きを、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイする（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５）。ＤＧＧＥを分析方法として使用する場合、例えば高融解ＧＣリッチＤＮＡのおよそ４０ｂｐのＧＣクランプをＰＣＲにより付加することによりＤＮＡが完全には変性しないことを保証するようにそれを修飾し得る。さらなる一態様において、変性勾配の代わりに温度勾配を使用して、対照およびサンプルＤＮＡの移動度の差違を同定する（ＲｏｓｅｎｂａｕｍとＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１２７５３）。
【０１８８】
多形を検出するための他の技術の例は、限定されるものでないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、若しくは選択的プライマー伸長を挙げることができる。例えば、多形領域が中心に配置されているオリゴヌクレオチドプライマーを製造することができ、そしてその後、完全な一致が見出される場合にのみハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズさせうる（Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：６２３０）。こうした遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドをハイブリダイズする膜に結合しかつ標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズさせる場合に、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡ若しくは多数の多様な多形にハイブリダイズさせる。
【０１８９】
ＤＮＡ構造中の差違の別の研究方法は、標識オリゴヌクレオチドプライマーを鋳型ＲＮＡ若しくはＤＮＡとハイブリダイズさせること、ならびにその後ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸を使用して鋳型の５’端にプライマーを伸長することよりなるプライマー伸長法である。標識プライマー伸長生成物の分離を、その後、例えば変性ポリアクリルアミドゲルを介する電気泳動により大きさに基づき分画することにより行う。この方法は、相同なＤＮＡセグメントを比較しかつヌクレオチド挿入若しくは欠失により差違を検出するのにしばしば使用される。大きさがプライマー伸長生成物を特徴付けるのに使用される単一の基準であるため、ヌクレオチド置換による差違は検出されない。
【０１９０】
別の方法は、数種のヌクレオチドアナログのＤＮＡへの取り込みが、該ＤＮＡを電気泳動のような大きさ分画過程にかける場合に移動度の増加的シフトを引き起こすという事実を活用する。ヌクレオチドアナログは電気泳動の移動度シフトを引き起こし得るため、それらを使用して変化を同定し得る。米国特許第４，８７９，２１４号明細書を参照されたい。
【０１９１】
「ＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ
Ｏｖｅｒｖｉｅｗ」、Ｇ．Ｃａｅｔａｎｏ−ＡｎｏｌｌｅｓとＰ．Ｇｒｅｓｓｈｏｆｆ編（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ニューヨーク）１９９７（完全に示されるかのように引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるものを包含する、多形の多くの他の同定および検出技術が当業者に既知である。
【０１９２】
加えて、多くのアプローチもまたＳＮＰを特異的に検出するのに使用されている。こうした技術は当該技術分野で既知であり、そして、多くは例えばＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗｓ．１９９７．Ｃａｅｔａｎｏ−ＡｎｏｌｌｅｓとＧｒｅｓｓｈｏｆｆ編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ニューヨーク、ｐｐ１９９−２１１、およびその中に含有される参考文献）に記述されている。例えば、一態様において、ＳＮＰのような多形の検出への固相アプローチを使用し得る。例えば、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を使用し得る。このアッセイは、補助末端プロービング（ｃｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｂｉｎｇ）オリゴヌクレオチドの末端に相補的な位置の単一ヌクレオチドの差違を識別するＤＮＡリガーゼの能力に基づく（例えば、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら  １９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８９２３を参照されたい。結合増幅およびオリゴヌクレオチドライゲーション（ｃｏｕｐｌｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）（ＣＡＬ）分析と命名されるこのアプローチの変形物が、多重遺伝子型分類に使用されている（例えば、Ｅｇｇｅｒｄｉｎｇ  １９９５  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４：３３７）；Ｅｇｇｅｒｄｉｎｇら  １９９５  Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．５：１５３を参照されたい）。
【０１９３】
別の態様において、遺伝子小片（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂｉｔ）分析（ＧＢＡ）を使用してＳＮＰを検出し得る（例えば、Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら  １９９４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４１６７；Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら  １９９４．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：２８５；Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら  １９９５．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２７：２０１を参照されたい）。別の態様において、マイクロチップ電気泳動を高速ＳＮＰ検出に使用し得る（例えば、Ｓｃｈｍａｌｚｉｎｇら  ２０００．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８を参照されたい）。別の態様において、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ）質量分析を使用してＳＮＰを検出し得る（例えば、Ｓｔｏｅｒｋｅｒら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：１２１３を参照されたい）。
【０１９４】
別の態様において、被験体と対照の間のＫＲＣの生物学的活性の差違を検出し得る。例えば、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の活性を、ＫＲＣの異常な生物学的活性と関連する障害を有することが疑われる被験体の細胞中で検出し得る。被験体の細胞中でのＫＲＣ若しくはＫＲＣαが関わるシグナル伝達経路中の分子の活性をその後対照と比較し得、そして、対照と比較した被験体の細胞中のＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の活性の差違を使用して、該被験体をＫＲＣ活性の調節から利益を得るとみられる者と診断し得る。ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の活性は、本明細書に記述されるか若しくは当該技術分野で既知の方法を使用して検出し得る。
【０１９５】
好ましい態様において、診断アッセイは、細胞サンプル若しくは組織切片（例えば、被験体から取り出した凍結乾燥若しくは新鮮凍結切片）のような被験体からの生物学的サンプルで実施する。別の態様において、被験体の細胞中のＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現のレベルは、放射標識抗体を使用することのような適切な画像化方法を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで検出し得る。
【０１９６】
一態様において、試験被験体の細胞中のＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現のレベルは、障害を伴わない対照に関して上昇（すなわち増大）されうるか、または、被験体は構成的に（部分的に若しくは完全に）活性の形態の該分子を発現しうる。例えばＫＲＣのこの上昇された発現レベル、若しくは構成的に活性の形態のＫＲＣの発現を使用して、増大されたＫＲＣ活性を伴う障害について被験体を診断し得る。
【０１９７】
別の態様において、被験体の細胞中のＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現のレベルは、障害を伴わない対照に関して低減（すなわち減少）されうるか、または、被験体は（部分的に若しくは完全に）不活性の変異体の形態のＫＲＣを発現しうる。ＫＲＣのこの低減された発現レベル若しくは不活性の変異体の形態のＫＲＣの発現を使用して、不十分なサイトカイン産生を特徴とする免疫不全障害のような障害について被験体を診断し得る。
【０１９８】
一態様において、その発現がＫＲＣにより調節される遺伝子の発現のレベルを測定し得る（例えば、ＩＬ−２、ＢＳＰ、ＣｏｌＩ（α１））、ＯＣＮ、ＲＡＮＫＬ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＳＫ２および／若しくはＡＴＦ４。
【０１９９】
別の態様において、被験体をＫＲＣの発現、翻訳後修飾および／若しくは活性（またはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子）の調節から利益を得るとみられる者と診断するアッセイを、被験体の処置前に実施する。
【０２００】
本明細書に記述される方法は、例えば、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子と関わる疾患若しくは疾病の症状若しくは家族歴を表す患者を診断するために例えば臨床状況で便宜的に使用しうる、最低１種のプローブ／プライマー核酸若しくは他の試薬（例えば抗体）を含んでなる、予め包装された診断キットを利用することにより実施しうる。
【０２０１】
ＩＶ．調節剤の投与
本発明の調節剤は、免疫応答（例えばＴ細胞媒介性免疫応答）を高める若しくは抑制する、または骨形成および石灰化を増大若しくは低下させるのいずれかのためのｉｎ  ｖｉｖｏ若しくは表面上での製薬学的投与に適する生物学的に適合性の形態で被験体に投与する。「ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に適する生物学的に適合性の形態」により、いかなる毒性効果も該調節剤の治療効果により超えられる、投与されるべきタンパク質の１形態を意味している。被験体という用語は、免疫応答若しくは骨形成および石灰化が導き出され得る生存生物体、例えば哺乳動物を包含することを意図している。被験体の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、および限定されるものでないが本明細書に記述されるトランスジェニックＫＲＣマウスを挙げることができるそれらのトランスジェニック種を包含する。本明細書に記述されるところの剤の投与は、単独若しくは製薬学的に許容できる担体と組合せの治療上活性の量の剤を包含するいかなる薬理学的形態にもあり得る。
【０２０２】
治療上活性の量の本発明の治療的組成物の投与は、所望の結果を達成するのに必要な投薬量でおよび時間の間有効な量と定義する。例えば、調節剤の治療上活性の量は、個体の疾患状態、齢、性、生殖状態および重量、ならびに該個体で所望の応答を導き出す剤の能力のような因子に従って変動しうる。投薬レジメンは至適の治療応答を提供するよう調節しうる。例えば、数個の分割用量を連日投与しうるか、若しくは、用量は治療状況の緊急の要件により示されるとおり比例して低減しうる。
【０２０３】
本発明の治療的若しくは製薬学的組成物は、例えば静脈内、皮下、筋肉内、経皮、クモ膜下腔若しくは脳内、またはｅｘ  ｖｉｖｏ処置プロトコルでの細胞への投与を包含する当該技術分野で既知のいずれかの適する経路により投与し得るか、あるいは、表面、例えば生物適合性表面、例えば、骨、関節、歯などの安定化、置換などのための例えばパテのような外科的に埋込まれる装置の例えば表面上に送達し得る。投与は注入によるように迅速、または遅延注入若しくは徐放製剤の投与によるような長時間にわたりのいずれでもあり得る。
【０２０４】
ＫＲＣ調節物質はまた、所望の製薬学若しくは薬力学特性を提供する剤と連結若しくは複合もし得る。例えば、ＫＲＣは、溶解性、安定性、半減期の所望の特性および他の製薬学的に有利な特性を得るためにポリエチレングリコールのようなポリマーに安定に連結し得る。（例えば、Ｄａｖｉｓら、１９７８、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｇ  ４：１６９−７３；Ｂｕｒｎｈａｍ、１９９４、Ａｍ  Ｊ  Ｈｏｓｐ  Ｐｈａｒｍ  ５１：２１０−２１８（引用することにより組込まれる）を参照されたい）。
【０２０５】
さらに、ＫＲＣ調節物質は細胞のサイトゾル中への送達で補助する組成物中にあり得る
。例えば、該ペプチドを細胞のサイトゾルに送達することが可能であるリポソームのような担体部分に剤を複合しうる。こうした方法は当該技術分野で公知である（例えば、Ａｍｓｅｌｅｍら、１９９３、Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｌｉｐｉｄｓ  ６４：２１９−２３７（引用することにより組込まれる）を参照されたい）。あるいは、ＫＲＣ調節物質は、特定の輸送ペプチドを包含するよう改変し得るか、若しくは、細胞中にＫＲＣ調節物質を送達することが可能であるこうした輸送ペプチドに融合し得る。加えて、剤は微小注入により細胞中に直接送達し得る。
【０２０６】
組成物は通常、製薬学的製剤の形態で使用する。こうした製剤は製薬学の技術分野で公知の様式で作成される。１種の好ましい製剤は生理学的生理的食塩水溶液のベヒクルを利用するが、しかし、生理学的濃度の他の非毒性の塩、５パーセント水性ブドウ糖溶液、滅菌水などのような他の製薬学的に許容できる担体もまた使用しうることを企図している。本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」は、いかなるおよび全部の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤なども包含する。製薬学的有効成分のためのこうした媒体および剤の使用は当該技術分野で公知である。いずれかの慣習的媒体若しくは剤が有効成分と不適合性である限りを除き、治療的組成物中でのそれらの使用を企図している。補助的有効成分もまた組成物に組み込み得る。適する緩衝剤が組成物中に存在することもまた望ましいことができる。こうした溶液は、所望の場合、容易な注入のための滅菌水の添加による再構成の準備ができている滅菌アンプル中で凍結乾燥かつ保存し得る。主溶媒は水性、若しくは、あるいは非水性であり得る。ＫＲＣはまた、処置を必要とする組織に埋込み得る固体若しくは半固形の生物学的に適合性のマトリックスにも組み込み得る。
【０２０７】
担体は、製剤のｐＨ、オスモル濃度、粘度、澄明性、色、無菌性、安定性、溶解速度若しくは臭いを改変若しくは維持するための他の製薬学的に許容できる賦形剤もまた含有し得る。同様に、担体は、放出若しくは吸収、または血液脳関門を横断する浸透を改変若しくは維持するためのなお他の製薬学的に許容できる賦形剤を含有しうる。こうした賦形剤は、単位投薬量若しくは複数用量の形態物での非経口投与のため、または連続若しくは周期的注入による直接注入のための投薬量を処方するのに通常かつ通例に使用される。
【０２０８】
用量の投与は、投薬製剤の薬物動態パラメータおよび使用される投与経路に依存して反復しうる。ＫＲＣ調節物質を含有するある種の製剤が経口投与されるべきであることもまた提供される。こうした製剤は、好ましくは適する担体とともに固体の投薬形態物に被包化かつ処方される。適する担体、賦形剤および希釈剤のいくつかの例は、乳糖、Ｄ−ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ケイ酸カルシウム、結晶セルロース、オリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびプロピル、タルク、マグネシウム、ステアリン酸塩、水、鉱物油などを包含する。製剤は、加えて、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、保存剤、甘味料若しくは着香料を包含し得る。組成物は、当該技術分野で公知の手順を使用することによる患者への投与後に有効成分の迅速、持続、若しくは遅延放出を提供するように処方しうる。製剤はまた、タンパク質分解性の分解を減少させる物質および／若しくは例えば界面活性剤のような吸収を促進する物質も含有し得る。
【０２０９】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のため非経口組成物を投薬単位形態物に処方することがとりわけ有利である。本明細書で使用されるところの投薬単位形態物は、処置されるべき哺乳動物被験体のための単位投薬量として適する物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる製薬学的担体とともに、所望の治療効果を生じるよう計算された、予め決められた量の有効成分を含有する。本発明の投薬単位形態物の仕様は、（ａ）有効成分の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体での感受性の処
置のためのこうした有効成分の調合の技術分野に固有の制限により支配されかつそれらに直接依存する。特定の用量は、例えば患者のおよその体重若しくは体表面積、または占有されるべき体腔の容量に従って、当業者により容易に計算され得る。用量は、選択される特定の投与経路に依存してもまた計算されるであろう。処置のための適切な投薬量を決定するのに必要な計算のさらなる改良は当業者により慣例になされる。こうした計算は、標的細胞のアッセイ調製物中での本明細書に開示される活性を鑑み、当業者により不要な実験を伴わずになされ得る。正確な投薬量は標準的な用量応答試験と連動して決定される。実際に投与される組成物の量は、処置されるべき状態（１種若しくは複数）、投与されるべき組成物の選択、個々の患者の齢、重量および応答、患者の症状の重症度、ならびに選ばれた投与経路を包含する関連する状況を鑑みて、実務者により決定されるであろう。
【０２１０】
こうした化合物の毒性および治療的有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対し致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療上有効な用量）を決定するための細胞培養物若しくは実験動物における標準的製薬学的手順により決定し得る。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、そしてそれは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表し得る。大きな治療指数を表す化合物が好ましい。毒性の副作用を表す化合物を使用しうる一方、未感染細胞に対する潜在的損傷を最小限としかつそれにより副作用を低減するために、こうした化合物の標的を冒された組織の部位に向ける送達系を設計するように注意を払うべきである。
【０２１１】
細胞培養物アッセイおよび動物試験から得られるデータを、ヒトでの使用のための投薬量の範囲の規定で使用し得る。こうした化合物の投薬量は、好ましくは毒性をほとんど若しくは全く伴わないＥＤ５０を包含するある範囲の循環濃度内にある。投薬量は、使用される投薬形態物および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動しうる。本発明の方法で使用されるいかなる化合物についても、治療上有効な用量は、最初は細胞培養アッセイから推定し得る。用量は、細胞培養物で決定されるところのＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を包含する循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルで規定しうる。こうした情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定し得る。血漿濃度は例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定しうる。
【０２１２】
本発明の一態様において、ＫＲＣ調節物質を、生物学的に活性の形態のＫＲＣ若しくはＫＲＣの前駆体、すなわち身体により生物学的に活性の形態のＫＲＣに容易に転化され得る分子を産生することが可能なベクター若しくは細胞を患者に埋込むことにより、治療的に投与しうる。一アプローチにおいて、ＫＲＣを分泌する細胞を、患者への埋込のため半透膜に被包化しうる。細胞は、ＫＲＣ若しくはその前駆体を通常発現する細胞であり得るか、あるいは、細胞はＫＲＣ若しくはその生物学的に活性なフラグメントまたはそれらの前駆体を発現するよう形質転換し得る。患者がヒトである場合は、細胞がヒト起源のものであることおよびＫＲＣポリペプチドがヒトＫＲＣであることが好ましい。しかしながら、本明細書の処方および方法は、家畜ならびにヒトの応用に使用し得、また、本明細書で使用されるところの「患者」若しくは「被験体」という用語はヒトおよび家畜の患者を包含することを意図している。
【０２１３】
ＫＲＣタンパク質の発現若しくは活性に対する剤（例えば薬物若しくは化合物）の影響をモニターすることは、基礎的な薬物スクリーニングのみならず、しかしまた臨床試験でも応用し得る。例えば、ＫＲＣ遺伝子発現、タンパク質レベルを増大させること、若しくはＫＲＣ活性を上方制御することが本明細書に記述されるところのスクリーニングアッセイにより決定される剤の有効性は、低下されたＫＲＣ遺伝子発現、タンパク質レベル、若しくは下方制御されたＫＲＣ活性を表す被験体の臨床試験でモニターし得る。あるいは、ＫＲＣ遺伝子発現、タンパク質レベルを低下させること、若しくはＫＲＣ活性を下方制御
することがスクリーニングアッセイにより決定される剤の有効性は、増大されたＫＲＣ遺伝子発現、タンパク質レベル若しくは上方制御されたＫＲＣ活性を表す被験体の臨床試験でモニターし得る。こうした臨床試験において、ＫＲＣ遺伝子および好ましくは障害に関与する他の遺伝子の発現若しくは活性を、特定の細胞の表現型の「読み出し」すなわちマーカーとして使用し得る。
【０２１４】
例えば、そして制限としてでなく、ＫＲＣ活性（例えば本明細書に記述されるところのスクリーニングアッセイで同定される）を調節する剤（例えば化合物、薬物若しくは小分子）での処理により細胞中で調節される、ＫＲＣを包含する遺伝子を同定し得る。従って、ＫＲＣ関連障害に対する剤の影響を例えば臨床試験で試験するため、細胞を単離しかつＲＮＡを調製し得、そしてそれぞれＫＲＣおよびＫＲＣ関連障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析し得る。遺伝子発現のレベル（すなわち遺伝子発現パターン）は、本明細書に記述されるところのノーザンブロット分析若しくはＲＴ−ＰＣＲ、または、あるいは、産生されたタンパク質の量を本明細書に記述されるところの方法の１種により測定することにより、またはＫＲＣ若しくは他の遺伝子の活性のレベルを測定することにより定量し得る。この方法で、遺伝子発現パターンは、該剤に対する細胞の生理学的応答を暗示するマーカーとしてはたらき得る。従って、この応答状態は、該剤での個体の処置の前およびその間の多様な点で測定しうる。
【０２１５】
好ましい一態様において、本発明は、（ｉ）剤の投与前に被験体から投与前サンプルを得る段階；（ｉｉ）投与前サンプル中のＫＲＣタンパク質、ｍＲＮＡ若しくはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する段階；（ｉｉｉ）被験体から１個若しくはそれ以上の投与後サンプルを得る段階；（ｉｖ）投与後サンプル中のＫＲＣタンパク質、ｍＲＮＡ若しくはゲノムＤＮＡの発現若しくは活性のレベルを検出する段階；（ｖ）投与前サンプル中のＫＲＣタンパク質、ｍＲＮＡ若しくはゲノムＤＮＡの発現若しくは活性のレベルを、投与後サンプル（１個若しくは複数）中のＫＲＣタンパク質、ｍＲＮＡ若しくはゲノムＤＮＡと比較する段階；および（ｖｉ）被験体への剤の投与を相応して変える段階を含んでなる、剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、若しくは本明細書に記述されるスクリーニングアッセイにより同定される他の薬物候補）での被験体の処置の有効性のモニター方法を提供する。例えば、剤の増大された投与が、ＫＲＣの発現若しくは活性を検出されたより高レベルに増大させる、すなわち剤の有効性を増大させるために望ましいことができる。あるいは、剤の減少された投与が、ＫＲＣの発現若しくは活性を検出されたより低レベルに低下させる、すなわち剤の有効性を低下させるために望ましいことができる。こうした態様により、ＫＲＣ発現若しくは活性を、観察可能な表現型応答の非存在下でさえ、剤の有効性の指標として使用しうる。
【０２１６】
好ましい一態様において、ＫＲＣの発現および／若しくは活性の調節から利益を得るとみられる被験体の上皮細胞での炎症若しくはアポトーシスを調節するＫＲＣ調節剤の能力を、該剤の投与後の患者の状態の改善を検出することにより測定し得る。別の好ましい態様において、ＫＲＣの発現および／若しくは活性の調節から利益を得るとみられる被験体での骨形成および石灰化を調節するＫＲＣ調節剤の能力は、該剤の投与後の患者の状態の改善を検出することにより測定し得る。こうした改善は、該患者の特定の状態に適切な指標を使用して当業者により容易に測定され得る。患者の状態の変化を測定することにより患者の応答をモニターすることは、生検材料の収集が患者の増大された危険および／若しくは不利益を課すとみられる状況で好ましい。
【０２１７】
ＫＲＣのレベルが多様な状況で変わりうること、およびＫＲＣレベルの定量化が臨床上有益な情報を提供するとみられることがありそうである。さらに、細胞により発現されるＫＲＣの増大されたレベルが、生存率を低下させるようにその細胞の細胞死調節機構を移
動し得ることが本明細書で示されたため、一群の細胞、組織若しくは新生物、など中のような細胞（１個若しくは複数）中のＫＲＣのレベルの測定は、その細胞（１個若しくは複数）のアポトーシス状態に関する有用な情報を提供するであろうと考えられる。加えて、これらのＫＲＣと相互作用するポリペプチドの細胞レベルを決定することもまた望ましいことができる。
【０２１８】
さらに、疾患状態の処置において、ＫＲＣを含有する組成物を外因性に投与し得、そして、血清、いずれかの所望の組織区画、若しくは冒されている組織でＫＲＣポリペプチドのある標的レベルを達成することが望ましいことがありそうであるとみられる。従って、患者、若しくは患者から得られた組織生検サンプルを包含する生物学的サンプル中のＫＲＣポリペプチドのレベルをモニターすること、ならびに、いくつかの場合にはまたＫＲＣのレベルをモニターすること、ならびに、いくつかの状況では、ＴＲＡＦ、ｃ−Ｊｕｎ、または例えばＲｕｎｘ２、ＳＭＡＤ３、ＲＳＫ２、ＡＴＦ４および／若しくはＷＷＰ１のような別のＫＲＣと相互作用するポリペプチドのレベルもモニターすることが可能であることが有利であるとみられる。従って、本発明は、患者からのサンプル中のＫＲＣの存在の検出方法もまた提供する。
【０２１９】
Ｖ．ＫＲＣ調節剤を同定するためのスクリーニングアッセイ
ＫＲＣ活性の調節剤は既知であり得る（例えば、ＫＲＣ活性のドミナントネガティブな調節剤、ＫＲＣ活性を妨害するアンチセンスＫＲＣ細胞内抗体、ＫＲＣ由来のペプチド阻害剤）か、若しくは本明細書に記述される方法を使用して同定し得る。本発明は、ＫＲＣ活性を調節する他の調節剤、すなわち候補若しくは試験化合物若しくは剤（例えばペプチド模倣物、小分子若しくは他の薬物）の同定方法、および他の剤の活性の試験若しくは至適化方法（本明細書で「スクリーニングアッセイ」ともまた称される）を提供する。
【０２２０】
例えば、一態様において、例えばＫＲＣまたはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子（例えばＴＲＡＦ、ＮＦ−ｋＢ、ＪＮＫ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＣＢＦβ、Ｒｕｎｘ２、ＷＷＰ１、ＲＳＫ２および／若しくはＡＰ−１）に結合するか、あるいはＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現および若しくは活性に対する刺激若しくは阻害効果を有する分子を同定し得る。例えば、ｃ−Ｊｕｎ、ＮＦ−ｋＢ、ＴＲＡＦ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、Ｒｕｎｘ２、ＷＷＰ１、ＣＢＦβ、ＪＮＫ、ＴＧＦβ、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／若しくはＡＰ−１は、ＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中で機能し、従って、これらの分子のいずれも主題のスクリーニングアッセイで使用し得る。本節および他の節で下述される特定の態様は一例としてこれらの分子の１種を列挙しうるとは言え、ＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の他の分子もまた主題のスクリーニングアッセイで使用し得る。
【０２２１】
一態様において、ＫＲＣの発現、翻訳後修飾（例えばリン酸化）若しくは活性を直接調節する化合物の能力を、本発明のスクリーニングアッセイを使用して指標組成物中で測定する。
【０２２２】
指標組成物は、ＫＲＣタンパク質若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子を発現する細胞、例えば、天然に発現する細胞、若しくは、より好ましくは、該タンパク質をコードする発現ベクターを細胞に導入することにより該タンパク質を発現するよう工作された細胞であり得る。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。一態様において、細胞はＴ細胞である。別の態様において、細胞はＢ細胞である。別の態様において、細胞は骨芽細胞である。別の態様において、細胞は成熟骨芽細胞である。あるいは、指標組成物は、タンパク質を包含する細胞を含まない組成物（例えば、細胞抽出液、または例えば精製された天然の若しくは組換えいずれかのタンパク質を包含する組成物）であり得る。
【０２２３】
本明細書に記述されるアッセイを使用して同定される組成物は、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の異常な発現、翻訳後修飾若しくは活性と関連する障害、例えば：骨形成および石灰化の調節、破骨細胞形成の調節、破骨細胞活性に対する骨芽細胞活性の調節、オステオカルシン遺伝子転写の調節、Ｒｕｎｘ２の分解の調節、例えばＲｕｎｘ２タンパク質レベルの調節、Ｒｕｎｘ２のユビキチン化の調節、ＲＳＫ２の発現の調節、ＲＳＫ２の分解、例えばＲＳＫ２のタンパク質レベルの調節、ＲＳＫ２のユビキチン化、ＲＳＫ２のリン酸化の調節、ＢＳＰ、ＣｏｌＩ（α）１、ＯＣＮ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＡＮＫＬおよびＡＴＦ４の発現の調節、ＡＴＦ４タンパク質レベルの調節、ならびに／若しくはＡＴＦ４のリン酸化の調節の調節から利益を得るとみられる障害を処置するのに有用であり得る。
【０２２４】
ＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の調節から利益を得ることができる状態は、骨形成および石灰化の調節が有益であるとみられる疾患、障害、状態若しくは傷害を包含する。
【０２２５】
別の局面において、本発明は、本明細書に記述されるアッセイの２種若しくはそれ以上の組合せに関する。例えば、調節剤は、細胞に基づく若しくは細胞を含まないアッセイを使用して同定し得、そして、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の活性を調節する該剤の能力を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、例えば骨粗鬆症若しくは大理石骨病の例えば動物モデルのような動物中で確認し得る。
【０２２６】
さらに、本明細書に記述されるとおり同定されるＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の調節物質（例えばアンチセンス核酸分子、若しくは特異的抗体、若しくは小分子）を、こうした調節物質での処置の有効性、毒性若しくは副作用を決定するのに動物モデルで使用し得る。あるいは、本明細書に記述されるとおり同定される調節物質を、こうした調節物質の作用機序を決定するために動物モデルで使用し得る。
【０２２７】
別の態様において、類似のスクリーニングアッセイを使用して、例えば、ＫＲＣが相互作用する分子、例えばシグナル伝達経路中でのＫＲＣの上流若しくは下流いずれかで作用する分子を使用して上述されたもののようなスクリーニングアッセイを実施することにより、ＫＲＣの活性および／若しくは発現を間接的に調節する化合物を同定し得る。
【０２２８】
本発明の細胞に基づくおよび細胞を含まないアッセイを下により詳細に記述する。
【０２２９】
Ａ．細胞に基づくアッセイ
本発明の指標組成物は、ＫＲＣタンパク質、またはＫＲＣシグナル伝達経路中のＫＲＣ以外のタンパク質（例えばＴＲＡＦ、ＮＦ−ｋＢ、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＴＧＦβ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＣＢＦβ、ＷＷＰ１、Ｒｕｎｘ２、ＲＳＫ２、ＡＴＦ４および／若しくはＡＰ−１のような）の最低１種を発現する細胞、例えば、該内因性分子を天然に発現する細胞、または、より好ましくは、タンパク質（１種若しくは複数）をコードする発現ベクターを細胞に導入することにより外因性のＫＲＣ、ＴＲＡＦ、ＮＦ−ｋＢ、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＴＧＦβ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＣＢＦβ、ＷＷＰ１、Ｒｕｎｘ２、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／若しくはタンパク質を発現するように工作された細胞であり得る。あるいは、指標組成物は、ＫＲＣ、またはＴＲＡＦ、ＮＦ−ｋＢ、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＴＧＦβ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＷＷＰ１、ＣＢＦβ、Ｒｕｎｘ２、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／若しくはのようなＫＲＣ以外のタンパク質の最低１種を包含する細胞を含まない組成物（例えば、タンパク質を発現する細胞からの細胞抽出液、あるいは精製されたＫＲＣ、ＴＲＡＦ、ＮＦ−ｋＢ、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＴＧＦβ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＷＷＰ１、Ｒｕｎｘ２、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／またはタンパク質、天然若しくは組換えいずれかのタンパク質を包含する組成物）であり得る。
【０２３０】
ＫＲＣまたはの上流若しくは下流に作用するＫＲＣ以外のタンパク質の発現および／若しくは活性を調節する化合物は、多様な「読み出し」を使用して同定し得る。
【０２３１】
例えば、指標細胞を発現ベクターでトランスフェクトし得、試験化合物の存在および非存在下でインキュベートし得、そして分子の発現若しくはにより調節される生物学的応答に対する該化合物の影響を測定し得る。の生物学的活性は、標準的技術によりｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される活性を包含する。活性は、標的分子若しくは結合パートナー（例えば、Ｊｕｎ、例えばｃ−Ｊｕｎ、ＴＲＡＦ、例えばＴＲＡＦ２、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ、例えばＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＣＢＦβ、Ｒｕｎｘ２、ＲＳＫ２および／若しくはＷＷＰ１のようなタンパク質との会合のような直接活性であり得る。一態様において、Ｒｕｎｘ２およびＣＢＦβの相互作用を測定する。あるいは、活性は、標的分子とのタンパク質の相互作用の下流で起こる細胞のシグナル伝達活性、若しくはその相互作用により誘発されるシグナル伝達カスケードの結果として起こる生物学的効果のような間接的活性である。例えば、ＫＲＣの生物学的活性は、ＴＮＦα産生の調節、ＩＬ−２産生の調節、ＪＮＫシグナル伝達経路の調節、ＮＦｋＢシグナル伝達経路の調節、ＴＧＦβシグナル伝達経路の調節、ＡＰ−１活性の調節、ＲａｓおよびＲａｃ活性の調節、アクチン重合の調節、ＡＰ−１のユビキチン化の調節、ＴＲＡＦ２のユビキチン化の調節、ｃ−Ｊｕｎの分解の調節、ｃ−Ｆｏｓの分解の調節、ＳＭＡＤ３の分解の調節、ＧＡＴＡ３の分解の調節、エフェクターＴ細胞機能の調節、Ｔ細胞アネルギーの調節、アポトーシスの調節、若しくはＴ細胞分化の調節、ＩｇＡ生殖系列転写の調節、骨形成および石灰化の調節、破骨細胞形成の調節、破骨細胞活性に対する骨芽細胞活性の調節、オステオカルシン遺伝子転写の調節、Ｒｕｎｘ２の分解の調節、例えばＲｕｎｘ２タンパク質レベルの調節、Ｒｕｎｘ２のユビキチン化の調節、ＲＳＫ２の発現の調節、ＲＳＫ２の分解、例えばＲＳＫ２タンパク質レベルの調節、ＲＳＫ２のユビキチン化、ＲＳＫ２のリン酸化の調節、ＢＳＰ、ＣｏｌＩ（α）１、ＯＣＮ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＡＮＫＬおよびＡＴＦ４の発現の調節、ＡＴＦ４タンパク質レベルの調節、ならびに／またはＡＴＦ４のリン酸化の調節を包含する。
【０２３２】
試験化合物が、ＫＲＣタンパク質発現、若しくは本明細書に記述されるところのＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中のタンパク質の発現を調節するかどうかを決定するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写アッセイを実施し得る。こうしたアッセイの一例において、ＫＲＣの制御配列（例えば完全長のプロモーターおよびエンハンサー）を、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ＧＦＰ若しくはルシフェラーゼ、例えばＯＳＥ２−ルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に操作可能に連結しかつ宿主細胞に導入し得る。他の技術が当該技術分野で既知である。
【０２３３】
試験化合物が、ＫＲＣのｍＲＮＡ発現、若しくはＫＲＣにより調節される遺伝子、例えばＢＳＰ、ＣｏｌＩ（α）１、ＯＣＮ、ＲＡＮＫＬ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＳＫ２およびＡＴＦ４の発現を調節するかどうかを決定するため、定量的若しくはリアルタイムＰＣＲのような多様な方法論を実施し得る。
【０２３４】
本明細書で互換性に使用されるところの「作動可能に連結される」および「効果的に連結される」は、ヌクレオチド配列が、宿主細胞中での（若しくは細胞抽出液による）該ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御配列に連結されていることを意味することを意図している。制御配列は技術に認識されており、そして適切な宿主細胞中の所望のタンパク質の発現を指図するように選択し得る。制御配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよび他の発現調節領域を包含することを意図している。こうした制御配列は当業者に既知であり、そしてＧｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に記述されている。発現ベクターの設計は、トランスフェクトされるべき宿主細胞の選択、ならびに／または発現されることが望ましいタンパク質の型および／若しくは量のような因子に依存しうる。
【０２３５】
多様なレポーター遺伝子が当該技術分野で既知であり、そして本発明のスクリーニングアッセイでの使用に適する。適するレポーター遺伝子の例は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質若しくはルシフェラーゼをコードするものを包含する。これらの遺伝子産物の活性の標準的測定方法は当該技術分野で既知である。
【０２３６】
多様な細胞型が、スクリーニングアッセイでの指標細胞としての使用に適する。好ましくは、低レベルの内因性ＫＲＣ（または例えばＴＲＡＦ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＮＦ−ｋＢ、ＴＧＦβ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＣＢＦβ、ＷＷＰ１、ＡＰ−１、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／若しくはＲｕｎｘ２）を発現する細胞株を使用し、そしてその後、組換えタンパク質を発現するように工作する。主題のアッセイでの使用のための細胞は真核生物および原核生物双方の細胞を包含する。例えば、一態様において細胞は細菌細胞である。別の態様において、細胞は酵母細胞のような真菌細胞である。別の態様において、細胞は脊椎動物細胞、例えばトリ細胞若しくは哺乳動物細胞（例えばマウス細胞若しくはヒト細胞）である。
【０２３７】
一態様において、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルは、試験化合物の非存在下での該指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルより高く、そして、該試験化合物は、ＫＲＣ（または例えばＴＲＡＦ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＮＦ−ｋＢ、ＴＧＦβ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＣＢＦβ、ＷＷＰ１、ＡＰ−１、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／若しくはＲｕｎｘ２）の発現を刺激する化合物と同定される。別の態様において、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルは、試験化合物の非存在下での該指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルより低く、そして、該試験化合物は、ＫＲＣ（または例えばＴＲＡＦ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＮＦ−ｋＢ、ＴＧＦβ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＣＢＦβ、ＷＷＰ１、ＡＰ−１、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／若しくはＲｕｎｘ２）の発現を阻害する化合物と同定される。
【０２３８】
一態様において、本発明は、ＫＲＣが関与する細胞応答を調節する化合物の同定方法を提供する。
【０２３９】
一態様において、細胞、例えばＴ細胞の分化を、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路の調節の指標として使用し得る。細胞分化は、直接（例えば、細胞分化をモニターするための細胞の顕微鏡検査により）、または、例えば、細胞分化の１種若しくはそれ以上のマーカー（例えば、細胞分化と関連する遺伝子産物のｍＲＮＡの増大、若しくはタンパク質の分泌（例えばサイトカインの分泌）のような細胞分化と関連する遺伝子産物の分泌、若しくは（ＣＤ６９のような）細胞表面マーカーの発現をモニターすることにより間接的にモニターし得る。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびノーザンブロッティングのような目的のｍＲＮＡの標準的検出方法は当該技術分野で既知である。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のような、培養物上清中のタンパク質分泌の標準的検出方法もまた当該技術分野で既知である。タンパク質は、例えば免疫沈降反応で、若しくは染色およびＦＡＣＳ分析のため、抗体を使用してもまた検出し得る。
【０２４０】
別の態様において、エフェクターＴ細胞機能を調節する化合物の能力を測定し得る。例
えば、一態様において、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生および／若しくは細胞傷害性を調節する化合物の能力を、当該技術分野で公知の技術を使用して測定し得る。
【０２４１】
一態様において、ＩＬ−２産生を調節する化合物の能力を測定し得る。ＩＬ−２の産生は例えばノーザン若しくはウエスタンブロッティングを使用してモニターし得る。ＩＬ−２はまた、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、または、例えば標準的技術を使用するＩＬ−２に応答性である細胞（例えばサイトカインに応答して増殖するか若しくはサイトカインの存在下で生存する細胞）を使用するバイオアッセイでも検出し得る。
【０２４２】
別の態様において、アポトーシスを調節する化合物の能力を測定し得る。アポトーシスはＦａｓ媒介性シグナルの存在若しくは非存在下で測定し得る。一態様において、細胞のアポトーシスの間のミトコンドリアからのチトクロームＣ遊離を検出し得る（例えばプラズマ細胞アポトーシス（例えばＢｏｓｓｙ−Ｗｅｔｚｅｌ  Ｅ．ら（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２２：２３５−４２に記述されるところの））。他の例示的アッセイは、細胞を含まない系で誘導される核アポトーシスの細胞蛍光測定的定量（例えばＬｏｒｅｎｚｏ  Ｈ．Ｋ．ら（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２２：１９８−２０１に記述されるところの）；アポトーシスヌクレアーゼアッセイ（例えばＨｕｇｈｅｓ  Ｆ．Ｍ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２２：４７−６２に記述されるところの）；フローサイトメトリーおよびレーザー走査細胞数測定によるアポトーシス細胞、例えばアポトーシスプラズマ細胞の分析（例えばＤａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  Ｚ．ら（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２２：１８−３９に記述されるところの）；アネキシンＶ標識によるアポトーシスの検出（例えばＢｏｓｓｙ−Ｗｅｔｚｅｌ  Ｅ．ら（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２２：１５−１８に記述されるところの）；細胞死遺伝子の一過性トランスフェクションアッセイ（例えばＭｉｕｒａ  Ｍ．ら（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２２：４８０−９２に記述されるところの）；ならびにアポトーシス細胞、例えばアポトーシスプラズマ細胞中のＤＮＡ切断を検出するアッセイ（例えばＫａｕｆｆｍａｎ  Ｓ．Ｈ．ら（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２２：３−１５に記述されるところの）を包含する。アポトーシスは、ヨウ化プロピジウム染色若しくはＴＵＮＥＬアッセイによってもまた測定し得る。別の態様において、アポトーシスに関与するシグナル伝達経路と関連する遺伝子（例えばＪＮＫ）の転写を、標準的方法を使用して検出し得る。
【０２４３】
別の態様において、ミトコンドリア内膜透過処理を、通常は内膜を横断しない色素、例えばカルセインをサイトゾル若しくはミトコンドリアマトリックスに負荷することにより、無傷の細胞で測定し得る（Ｂｅｒｎａｒｄｉら  １９９９．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６４：６８７；Ｌｅｍａｓｔｅｒｓ，Ｊ．，Ｊ．ら  １９９８．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６６：１７７。別の態様において、ミトコンドリア内膜透過処理は、例えばミトコンドリア内膜電位の変化（ΔΨｍ）を測定することにより評価し得る。例えば、細胞をＤｉＯＣ６（Ｇｒｏｓｓら  １９９９．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１９８８）（ヨウ化３，３’ジヘキシルオキサカルボシアニン）若しくはＪＣ−１（ヨウ化５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニン）のような親油性の陽イオン性蛍光色素とともにインキュベートし得る。これらの色素はΨｍにより駆動されてミトコンドリアマトリックスに蓄積する。散逸は蛍光強度の低下（例えばＤｉＯＣ６について（Ｇｒｏｓｓら  １９９９．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１９８８）若しくは色素の醗酵スペクトルのシフトをもたらす。これらの変化を細胞蛍光測定若しくは顕微鏡検査により測定し得る。
【０２４４】
なお別の態様において、核へのＫＲＣの転位を調節する化合物の能力を測定し得る。核へのＫＲＣの転位は、例えば、２種若しくはそれ以上の蛍光標識種の発光を同時に検出す
る核転位アッセイにより測定し得る。例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２のようなＤＮＡに特異的な既知のフルオロフォアで細胞核を標識し得る。ＫＲＣタンパク質は、ＧＦＰとの融合としての発現若しくはＫＲＣに特異的な蛍光標識抗体とサンプルを接触させることを包含する多様な方法により標識し得る。核に転位する量ＫＲＣは、米国特許第６，４００，４８７号明細書（その内容はここに引用することにより組込まれる）に記述されるところの、第二の蛍光標識種すなわちＫＲＣに関して相関若しくは反相関した（ａｎｔｉ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ）様式で分布する第一の蛍光標識種すなわち核の量を測定することにより測定し得る。
【０２４５】
一態様において、ＪＮＫシグナル伝達経路に対する化合物の影響を測定し得る。ＭＡＰキナーゼのＪＮＫグループは、環境ストレスへの細胞の曝露、若しくは炎症前サイトカインでの細胞の処理により活性化される。遺伝子ノックアウトおよびドミナントネガティブ変異体の使用を伴う研究の組合せは、ＪＮＫのリン酸化および活性化にＭＫＫ４およびＭＫＫ７双方を関わらせた。ＪＮＫシグナル伝達経路の標的は転写因子ＡＴＦ２およびｃ−Ｊｕｎを包含する。ＪＮＫはＡＴＦ２およびｃ−ＪｕｎのＮＨ２末端領域に結合し、そして、各転写因子の活性化ドメイン内の２部位をリン酸化して増大された転写活性に至る。ＪＮＫはＴｈｒ−１８３およびＴｙｒ−１８５の二重リン酸化により活性化される。ＪＮＫシグナル伝達経路に対する化合物の影響を決定するため、シグナル伝達経路中の多様な分子の活性化状態を調節する化合物の能力を、標準的技術を使用して測定し得る。例えば、一態様において、ＪＮＫのリン酸化状態は、二重リン酸化されたＴＰＹモチーフを特異的に認識する抗ＡＣＴＩＶＥ−ＪＮＫ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）でのイムノブロッティングにより検査し得る。
【０２４６】
別の態様において、ＮＦｋＢシグナル伝達経路に対する化合物の影響を測定し得る。ＮＦｋＢ経路の多様な成分の活性化状態を調節する化合物の能力を、標準的技術を使用して測定し得る。ＮＦｋＢは、炎症、抗アポトーシスおよび免疫応答の調節で不可欠の役割を演じているＲｅｌドメインを含有する転写因子の１ファミリーを構成する。ＮＦｋＢ／Ｒｅｌファミリーメンバーの機能は、細胞質中でその保持を引き起こすＮＦｋＢの核局在化ドメインを遮蔽するＩＢと命名される細胞質阻害性タンパク質の一分類により調節される。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１によるＮＦｋＢの活性化は、ＮＦｋＢ誘導性キナーゼ（ＮＩＫ）に集中しうる一連のシグナル伝達中間体を伴う。このキナーゼは順にＩＢキナーゼ（ＩＫＫ）アイソフォームを活性化する。これらのＩＫＫは、ＩＢ分子のＮ末端に位置する２個の調節性セリンをリン酸化して、２６Ｓプロテアソーム複合体中のＩＢの迅速なユビキチン化および分解を誘発する。ＩＢの分解はＮＦｋＢ複合体中に存在する核局在化シグナルを曝露して、核へのその迅速な転位を可能にし、そこでそれは同族のＢエンハンサー要素を拘束しかつ多様なＮＦｋＢ応答性標的遺伝子の転写を調節する。一態様において、ＮＦｋＢ阻害剤の状態、核に転位するＮＦｋＢの能力、若しくはＮＦｋＢ依存性の遺伝子転写の活性化の１種若しくはそれ以上を調節する化合物の能力を測定し得る。
【０２４７】
一態様において、ＡＰ−１活性を調節する化合物の能力を測定し得る。ＡＰ−１複合体は転写因子ＦｏｓおよびＪｕｎから構成される。ＡＰ−１複合体の活性は、ＪｕｎおよびＦｏｓ転写の調節ならびに翻訳後修飾により制御され、例えば数種のＭＡＰＫＳすなわちＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮの活性化がＡＰ−１の転写活性に必要とされる。一態様において、ＡＰ−１により媒介される転写の調節を測定し得る。別の態様において、例えばそのリン酸化若しくはそのユビキチン化を調節することによるＡＰ−１の活性を調節する化合物の能力を測定し得る。一態様において、ＡＰ−１のユビキチン化は当該技術分野で既知の技術を使用して測定し得る。別の態様において、ＡＰ−１（またはｃ−Ｊｕｎおよび／若しくはｃ−Ｆｏｓ）の分解を、既知の技術を使用して測定し得る。
【０２４８】
ＡＰ−１の喪失はＴ細胞アネルギーと関連する。従って、一態様において、Ｔ細胞アネ
ルギーを調節する試験化合物の能力を、例えば二次的Ｔ細胞応答をアッセイすることにより測定し得る。Ｔ細胞が、ＩＬ−２合成および／若しくはＴ細胞増殖により測定されるところの、二次活性化の試みに応答しない場合、アネルギーの状態若しくはが誘発されている。標準的アッセイ手順を使用してＴ細胞アネルギーを測定し得、例えば、Ｔ細胞増殖は例えば［３Ｈ］チミジン取り込みをアッセイすることにより測定し得る。別の態様において、シグナル伝達を測定し得、例えば、ＭＡＰキナーゼカスケードのメンバーの活性化若しくはＡＰ−１複合体の活性化を測定し得る。別の態様において、細胞内カルシウム可動化、ＮＦＡＴカスケードのタンパク質レベルメンバーを測定し得る。
【０２４９】
別の態様において、ＲａｓおよびＲａｃ活性に対する化合物の影響を、標準的技術を使用して測定し得る。一態様において、例えばＦ−アクチンの免疫蛍光を測定することによりアクチン重合を測定し得る。
【０２５０】
別の態様において、例えばＡＰ１、ＳＭＡＤ、ＴＲＡＦ、ＲＳＫ２および／若しくはＲｕｎｘ２のユビキチン化に対する化合物の影響を、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ
ｖｉｖｏユビキチン化アッセイにより測定し得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイは、例えばＦｕｃｈｓ，Ｓ．Ｙ．、Ｂら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２１６３−３２１６８に記述されている。ｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化アッセイは例えばＴｒｅｉｅｒ，Ｍ．，Ｌ．ら（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：７８７−７９８に記述されている。
【０２５１】
別の態様において、例えばＫＲＣ標的分子および／若しくはＫＲＣ結合パートナーの分解に対する化合物の影響を、例えば、例えばＳＭＡＤ、ＧＡＴＡ３、Ｒｕｎｘ２、ＲＳＫ２、ＴＲＡＦ、Ｊｕｎおよび／若しくはＦｏｓとのＫＲＣ、例えば完全長ＫＲＣおよび／若しくはそのフラグメントの共免疫沈降により測定し得る。共免疫沈降物のウエスタンブロッティング、ならびに、ＫＲＣならびにＫＲＣ標的分子および／若しくはＫＲＣ結合パートナーに対する抗体でのブロットのプロービングを定量して、分解が起こったかどうかを決定し得る。パルスチェイス実験もまた、タンパク質レベルを測定するのに実施し得る。
【０２５２】
一態様において、Ｂ細胞中のＴＧＦβシグナル伝達を調節する化合物の能力を測定し得る。例えば、本明細書に記述されるとおり、ＫＲＣは、ＧＬαプロモーター活性の共活性化因子およびオステオカルシン遺伝子のコリプレッサーである。ＫＲＣの非存在下で、ＧＬα転写はＢ細胞中で減少され、そして、オステオカルシン遺伝子転写が骨芽細胞中で増強される。従って、一態様において、Ｂ細胞中でのＴＧＦβシグナル伝達を調節する化合物の能力は、ＧＬαの転写を測定することにより測定し得る。別の態様において、オステオカルシン遺伝子転写を測定し得る。一態様において、ＲＴ−ＰＣＲを使用して転写を測定する。さらに、ＳＭＡＤと相互作用しかつＳＭＡＤレポーター構築物の転写を駆動するＫＲＣの能力を考えれば、Ｂ細胞中のＴＧＦβシグナル伝達を調節する化合物の能力は、ＳＭＡＤの転写能力を測定することにより測定し得る。一態様において、ＳＭＡＤ若しくはそのフラグメント、例えば塩基性ＳＭＡＤ結合エレメントを、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に作動可能に連結する。他のＴＧＦβに調節される遺伝子は当該技術分野で既知である（例えば、ＭａｓｓａｇｕｅとＷｏｔｔｏｎ．２０００  ＥＭＢＯ  １９：１７４５．）。
【０２５３】
一態様において、骨芽細胞中のＡＴＦ４シグナル伝達を調節する化合物の能力を測定し得る。例えば、本明細書に記述されるとおり、ＫＲＣの過剰発現は、ＡＴＦ４に駆動される転写およびＡＴＦ４機能のＲＳＫ２媒介性の増強を阻害する。ＫＲＣの非存在下で、ＡＴＦ４のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは上昇され、過剰リン酸化されたＡＴＦ４が蓄積し、そしてＲＳＫ２の自己リン酸化が増大する。従って、一態様において、骨芽細胞中
のＡＴＦ４シグナル伝達を調節する化合物の能力は、例えばＡＴＦ４の転写を測定することにより測定し得る。別の態様において、ＡＴＦ４のリン酸化を測定する。なお別の態様において、ＲＳＫ２の自己リン酸化を測定する。リン酸化は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの使用により測定し得、また、ＲＳＫ２のようなタンパク質の自己リン酸化は、例えば、リン酸化されたおよび／若しくはリン酸化されない形態のタンパク質に特異的な抗体でのイムノブロッティング、ならびに／または２個の上流のアルギニン残基（Ｒｓｋタンパク質基質のコンセンサスモチーフ）により先行されるリン酸化されたセリン／トレオニンを認識する抗体でのイムノブロッティングにより測定し得る。
【０２５４】
別の態様において、骨形成および石灰化を調節する化合物の能力を測定し得る。例えば、本明細書に記述されるとおり、ＫＲＣが欠損している動物は、増強された骨芽細胞活性および骨形成により関連する骨硬化性の表現型を発生する。ＫＲＣ、Ｒｕｎｘ２、Ｓｍａｄ３、および／若しくはＥ３ユビキチンリガーゼＷＷＰ１の間の多量体複合体の形成は、Ｒｕｎｘ２のポリユビキチン化およびプロテアソーム依存性の分解を促進するＷＷＰ１の能力により、Ｒｕｎｘ２機能を阻害する。ＫＲＣはこの複合体の不可欠かつ必要とされる成分である。骨芽細胞中でのその非存在は、Ｒｕｎｘ２タンパク質の上昇されたレベル、高められたＲｕｎｘ２転写活性、Ｒｕｎｘ２標的遺伝子の上昇された転写、および顕著に増大された骨形成をｉｎ  ｖｉｖｏでもたらすからである。同様に、ＫＲＣ、ＲＳＫ２、および／若しくはＥ３ユビキチンリガーゼＷＷＰ１の間の多量体複合体の形成は、ＲＳＫ２のポリユビキチン化を促進するＷＷＰ１の能力、ならびにＲＳＫ２の自己リン酸化を阻害するＫＲＣおよびＷＷＰ１の能力により、ＲＳＫ２機能を阻害する。ＫＲＣの非存在下でＲＳＫ２の自己リン酸化は増大し、ＲＳＫ２機能の調節でのＫＲＣの決定的な役割を示す。骨形成および石灰化を調節する化合物の能力を測定するための多様なｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術が当業者に既知である。例えば、骨格構造は、のデジタルＸ線撮影によりアッセイし得、肉柱形成（すなわち骨髄で満たされている相互連絡する空間の網を形成する海綿骨柱の吻合骨棘）を三次元μ−ＱＣＴ画像化および骨断面の分析により測定し得る。加えて、小柱の数、小柱の厚さ、組織容量あたりの骨容量（ＢＶ／ＴＶ）、および骨ミネラル濃度（ＢＭＤ）もまた、μ−ＱＣＴ画像化により測定し得る。これらの分析は全骨格調製物若しくは個々の骨で実施し得る。石灰化骨および石灰化していない軟骨の形成は、アリザリンレッド／アルシアンブルー染色によるような組織化学分析により決定し得る。破骨細胞機能に対する骨芽細胞機能に対する影響について化合物をアッセイするため、ＴＲＡＰ＋破骨細胞を生成させるようにＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で骨髄（ＢＭ）を培養することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ破骨細胞分化アッセイを実施する。化合物が骨芽細胞機能を遂げるか若しくは破骨細胞を遂げるかのｉｎ  ｖｉｖｏでの決定は、例えば骨髄移植により実施し得る。加えて、多様な組織形態計測パラメータを解析して骨形成速度を決定し得る。例えば、蛍光顕微鏡検査を用いて可視化される骨の二重カルセイン標識は、骨芽細胞の骨形成能力の反映である骨石灰化速度（ＭＡＲ）を骨表面あたりの石灰化表面の面積（ＭＳ／ＢＳ）により乗算することにより計算される骨形成速度（ＢＦＲ）の決定を可能にする。加えて、骨芽細胞集団の信頼できる指標である総骨芽細胞表面を、類骨厚すなわち石灰化をうけていない骨の厚さをし得るように測定し得る。骨の切片は、ｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成の分析のためにｖｏｎ  Ｋｏｓｓａおよびトルイジンブルーで染色することによってもまた分析し得る。骨芽細胞前駆細胞および未熟骨芽細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養もまた、細胞が石灰化結節（細胞外マトリックスすなわち骨の石灰化マトリックスの生成を反映する）を形成する能力を有するかどうかを決定するために実施し得る。さらに、これらの培養物を、例えば細胞計数によりそれらの増殖能力についてアッセイし得、また、例えばアルカリホスファターゼのような骨形成の多様なマーカーの存在について染色し得る。これらの同一の培養物を、例えばＢＳＰ、ＣｏｌＩ（α）１およびＯＣＮ、ＡＬＰ、ＬＲＰ５、Ｏｓｔｅｒｉｘ、Ｒｕｎｘ２、ＲＡＮＫＬ、ＲＳＫ２ならびにＡＴＦ４のような、骨形成および石灰化ならびに破骨細胞形成に関与していることが既知の多数の分子のｍＲＮＡおよびタンパク質産生の多様な分析にもまた使用し得る。
【０２５５】
基質若しくは標的分子（例えば、ＫＲＣの場合にＴＲＡＦ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＣＢＦβ、ＷＷＰ１、ＡＰ−１、ＲＳＫ２および／若しくはＲｕｎｘ２）へのＫＲＣ（若しくはＫＲＣに関与するシグナル伝達経路中の分子）の結合を調節する試験化合物の能力もまた決定し得る。標的分子（例えば基質のような結合パートナー）へのＫＲＣ結合を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子への標的分子の結合を複合体中の標識ＫＲＣ標的分子を検出することにより測定し得るような放射性同位元素若しくは酵素標識と標的分子を結合することにより達成し得る。あるいは、複合体中の標的分子へのＫＲＣ結合を調節する試験化合物の能力をモニターするために、ＫＲＣを放射性同位元素若しくは酵素標識と結合する。ＫＲＣに結合する試験化合物の能力を決定することは、例えば、ＫＲＣへの化合物の結合を複合体中の標識化合物を検出することにより決定し得るような放射性同位元素若しくは酵素標識と化合物を結合することにより達成し得る。例えば、標的は１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ若しくは３Ｈで直接若しくは間接的にのいずれかで標識し得、そして放射性同位元素を放射線発射の直接計数若しくはシンチレーション計数により検出し得る。あるいは、化合物を例えばワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ若しくはルシフェラーゼで例えば標識し得、そして、適切な基質の生成物への転化の測定により酵素標識を検出し得る。
【０２５６】
別の態様において、酵素により作用されるか若しくは基質に作用するＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の能力を測定し得る。例えば、一態様において、ＫＲＣのリン酸化に対する化合物の影響を、当該技術分野で既知である技術を使用して測定し得る。
【０２５７】
反応体のいずれの標識も伴わずにＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子と相互作用する化合物の能力を決定することもまた本発明の範囲内にある。例えば、微小生理学測定装置（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用して、化合物若しくはＫＲＣ分子いずれの標識も伴わずにＫＲＣ分子との化合物の相互作用を検出し得る（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２）。本明細書で使用されるところの「微小生理学測定装置」（例えばサイトセンサー（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ））は、光を取扱可能な電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を、化合物との間の相互作用の指標として使用し得る
ＫＲＣの例示的標的分子は、Ｊｕｎ、ＴＲＡＦ（例えばＴＲＡＦ２）ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ、例えばＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３、ＣＢＦβ、ＲＳＫ２ならびに／若しくはＲｕｎｘ２を包含する。
【０２５８】
別の態様において、ＫＲＣの上流若しくは下流で作用する、ＫＲＣが関わる経路中で作用する異なる（すなわちＫＲＣ以外の）分子を、スクリーニングアッセイでの使用のための指標組成物に包含し得る。こうした分子を使用するスクリーニングアッセイで同定される化合物もまた、たとえ間接的にでもＫＲＣ活性の調節において有用であるとみられる。例えば、ＮＦＫβ依存性遺伝子発現を活性化するＴＲＡＦ（例えばＴＲＡＦ２）の能力を測定し得るか、若しくは、ＴＧＦβ依存性の遺伝子転写を活性化するＳＭＡＤの能力を測定し得る。
【０２５９】
本アッセイで使用される細胞は、起源が真核生物若しくは原核生物であり得る。例えば、一態様において細胞は細菌細胞である。別の態様において、細胞は真菌細胞、例えば酵母細胞である。別の態様において、細胞は脊椎動物細胞、例えばトリ若しくは哺乳動物細胞である。好ましい一態様において、細胞はヒト細胞である。
【０２６０】
本発明の細胞は、内因性のＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の別のタンパク質を発現し得るか、またはそうするように工作し得る。例えば、ＫＲＣタンパク質およびの上流若しくは下流で作用する非タンパク質を発現するように工作されている細胞を、該タンパク質をコードする発現ベクターを該細胞に導入することにより製造し得る。
【０２６１】
ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子（例えばＫＲＣの上流若しくは下流で作用するタンパク質）の発現に使用し得る組換え発現ベクターは当該技術分野で既知である。例えば、ｃＤＮＡを最初に標準的分子生物学技術を使用して組換え発現ベクターに導入する。ｃＤＮＡは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する増幅、若しくは適切なｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。若しくは関わるシグナル伝達経路中の分子のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（例えばヒト、マウスおよび酵母）は当該技術分野で既知であり、そして、標準的ＰＣＲ法によるｃＤＮＡの増幅を見込むＰＣＲプライマーの設計、若しくは標準的ハイブリダイゼーション法を使用してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用し得るハイブリダイゼーションプローブの設計に使用し得る。
【０２６２】
ＫＲＣ、若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中のＫＲＣ以外の分子をコードするｃＤＮＡ分子の単離若しくは増幅後に、ＤＮＡフラグメントを発現ベクターに導入する。本明細書で使用されるところの「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。１つの型のベクターは「プラスミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に連結し得るウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組込まれ、そしてそれにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが効果的に連結されている遺伝子の発現を指図することが可能である。こうしたベクターは本明細書で「組換え発現ベクター」若しくは単に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態にある。本明細において、プラスミドが最も一般に使用される形態のベクターであるため、「プラスミド」および「ベクター」を互換性に使用しうる。しかしながら、本発明は、同等の機能を供するウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のようなこうした他の形態の発現ベクターを包含することを意図している。
【０２６３】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適する形態の核酸分子を含んでなり、これは、該組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に効果的に連結されている、発現に使用されるべき宿主細胞および所望の発現のレベルに基づき選択された１種若しくはそれ以上の制御配列を包含することを意味している。組換え発現ベクター内で「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、若しくはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞中での）発現を見込む様式で制御配列（１個若しくは複数）に連結されていることを意味することを意図している。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節領域（例えばポリアデニル化シグナル）を包含する。こうした制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に記述されている。制御配列は、多くの型の宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、ある種の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば組織特異的制御配列）、若しくはある条件下でのみヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば誘導可能な制御配列）を包含する。
【０２６４】
哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスの調節エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルスおよびＳＶ４０由来である。哺乳動物発現ベクターの制限しない例は、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ
３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）を包含する。多様な制御配列を保有する多様な哺乳動物発現ベクターが商業的に入手可能である。哺乳動物宿主細胞中での核酸の構成的発現のため、好ましい１調節エレメントはサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサーである。さらに、哺乳動物細胞での使用のための誘導可能な制御系、例えば、遺伝子発現が重金属イオン（例えばＭａｙｏら（１９８２）Ｃｅｌｌ  ２９：９９−１０８；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２；Ｓｅａｒｌｅら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９を参照されたい）、熱ショック（例えばＮｏｕｅｒら（１９９１）Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．編、ＣＲＣ、フロリダ州ボカレイトン中ｐｐ１６７−２２０を参照されたい）、ホルモン（例えば、Ｌｅｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：２２８−２３２；Ｈｙｎｅｓら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０３８−２０４２；Ｋｌｏｃｋら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：７３４−７３６；ＩｓｒａｅｌとＫａｕｆｍａｎ（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４；およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ９３／２３４３１号明細書を参照されたい）、ＦＫ５０６関連分子（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９４／１８３１７号明細書を参照されたい）、若しくはテトラサイクリン（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．とＢｕｊａｒｄ，Ｍ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−１７６９；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９４／２９４４２号明細書；およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ９６／０１３１３号明細書）により調節される系が、当該技術分野で既知である。なおさらに、アルブミンプロモーター（肝特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅとＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、とりわけＴ細胞受容体（ＷｉｎｏｔｏとＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７９２−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎとＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経細線維プロモーター；ＢｙｒｎｅとＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば乳ホエイプロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号、および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）を包含する、多くの組織特異的制御配列が当該技術分野で既知である。発達的に調節されるプロモーター、例えばマウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌとＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９���およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓとＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）もまた包含される。
【０２６５】
ベクターＤＮＡは慣習的トランスフェクション技術を介して哺乳動物細胞に導入し得る。本明細書で使用されるところの多様な形態の「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション若しくは電気穿孔法を包含する、外来核酸（例えばＤＮＡ）を哺乳動物宿主細胞に導入するための多様な技術に認識された技術を指すことを意図している。宿主細胞の適するトランスフェクション法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））、および他の実験室手引書に見出し得る。
【０２６６】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのため、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小画分のみがそれらのゲノムに外来ＤＮＡを組込みうることが既知である。これらの組込み体を同定かつ選択するため、選択可能なマーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、一般に、目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートのような薬物に対する耐性を賦与するものを包含する。選択可能なマーカーをコードする核酸は、ＫＲＣをコードするものと別個のベクター、若しくは、より好ましくは同一ベクター上で宿主細胞に導入し得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択により同定し得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存することができる一方、他の細胞は死滅する）。
【０２６７】
一態様において、発現ベクター内のコーディング配列は、指標細胞中で該分子の構成的発現を見込む制御配列に効果的に連結される（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーのようなウイルスの制御配列を使用し得る）。指標細胞中のＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の構成的発現を見込む組換え発現ベクターの使用は、該分子の活性を高める若しくは阻害する化合物の同定に好ましい。代替の一態様において、発現ベクター内のコーディング配列は、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の内因性遺伝子の制御配列（すなわち、内因性遺伝子由来のプロモーター調節領域）に効果的に連結される。発現が該内因性制御配列により制御される組換え発現ベクターの使用は、該分子の転写発現を高める若しくは阻害する化合物の同定に好ましい。
【０２６８】
本発明のなお別の局面において、ＫＲＣタンパク質若しくはそのフラグメントは、ＫＲＣに結合若しくはそれと相互作用し（「結合タンパク質」すなわち「ｂｐ」）かつＫＲＣ活性に関与する他のタンパク質を同定するため、例えば２ハイブリッドアッセイ若しくは３ハイブリッドアッセイの「バイトタンパク質」として使用し得る（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号明細書；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  第ＷＯ  ９４／１０３００号明細書を参照されたい）。こうしたＫＲＣ結合タンパク質はまた、ＫＲＣタンパク質、若しくは例えばＫＲＣに媒介されるシグナル伝達経路の下流の要素のようなＫＲＣの標的によるシグナルの伝播に関与することもありそうである。あるいは、こうしたＫＲＣ結合タンパク質はＫＲＣ阻害剤であり得る。
【０２６９】
２ハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインよりなる大部分の転写因子のモジュールの性質に基づく。簡潔には、該アッセイは２種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物中で、ＫＲＣタンパク質をコードする遺伝子を、既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他方の構築物中では、同定されていないタンパク質（「プレイ」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーからの１ＤＮＡ配列を、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「バイト」および「プレイ」タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用してＫＲＣ依存性複合体を形成することが可能である場合、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは緊密な近接にもたらされる。この近接は、転写因子に応答する転写調節部位に作動可能に連結されているレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し得、そして、機能的転
写因子を含有する細胞コロニーを単離し得、そして、ＫＲＣタンパク質若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子と相互作用するタンパク質をコードするクローン化された遺伝子を得るのに使用し得る。
【０２７０】
Ｂ．細胞を含まないアッセイ
別の態様において、指標組成物は細胞を含まない組成物である。宿主細胞若しくは培地中で組換え法により発現されるＫＲＣ、若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中のＫＲＣ以外のタンパク質を、標準的タンパク質精製方法を使用して宿主細胞若しくは細胞培地から単離し得る。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、および抗体を用いる免疫親和性精製を使用して、細胞を含まない組成物中で使用し得る精製された若しくは半精製されたタンパク質を製造し得る。あるいは、目的のタンパク質を発現する細胞のライセート若しくは抽出液を、細胞を含まない組成物としての使用のため製造し得る。
【０２７１】
一態様において、ＫＲＣ活性若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の活性を特異的に調節する化合物を、ＫＲＣが結合する標的分子とのＫＲＣの相互作用を調節するそれらの能力に基づいて同定する。標的分子はＤＮＡ分子、例えばシャペロン遺伝子の調節領域のようなＫＲＣ応答配列）若しくはタンパク質分子であり得る。タンパク質−タンパク質相互作用の検出を見込む（例えば、免疫沈降法、２ハイブリッドアッセイなど）、若しくは標的ＤＮＡ配列とのＤＮＡ結合タンパク質の間の相互作用の検出を見込む（例えば、電気泳動移動度シフトアッセイ、ＤＮアーゼＩフットプリンティングアッセイなど）適するアッセイが、当該技術分野で既知である。試験化合物の存在および非存在下でこうしたアッセイを実施することにより、これらのアッセイを使用して、標的分子とのＫＲＣの相互作用を調節する（たとえば阻害する若しくは高める）化合物を同定し得る。
【０２７２】
一態様において、試験化合物の存在下でのＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の標的分子への結合の量は、試験化合物の非存在下での標的分子へのＫＲＣの結合の量より大きく、この場合、試験化合物はＫＲＣの標的への結合を高める化合物と同定される。別の態様において、試験化合物の存在下でのＫＲＣの標的分子への結合の量は、試験化合物の非存在下での標的分子へのＫＲＣ（または、例えばＪｕｎ、ＴＲＡＦ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、Ｒｕｎｘ２および／若しくはＷＷＰ１）の結合の量より小さく、この場合、試験化合物はＫＲＣの標的への結合を阻害する化合物と同定される。ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子への試験化合物の結合は、上述されたとおり直接若しくは間接的にのいずれでも測定し得る。試験化合物に結合するＫＲＣタンパク質の能力を決定することは、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．とＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）のような技術を使用してもまた達成し得る。本明細書で使用されるところの「ＢＩＡ」は、反応体（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）のいずれも標識することなく実時間で生物特異的相互作用を研究するための技術である。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象の変化を、生物学的分子間の実時間反応の表示として使用し得る。
【０２７３】
ＫＲＣ（または例えばＪｕｎ、ＴＲＡＦ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、Ｒｕｎｘ２、ＲＳＫ２および／若しくはＷＷＰ１）タンパク質と標的分子の間の相互作用を調節する試験化合物の本発明の同定方法において、完全なＫＲＣアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを該方法で使用し得るか、若しくは、あるいは、該タンパク質の部分のみを含んでなるポリペプチドを使用し得る。例えば、単離されたＫＲＣ相互作用ドメイン（例えば、アミノ酸２０４−１０５５、若しくは相互作用ドメインを包含するより大きな小領域よりなる）を使用し得る。別の態様において、Ｒｕｎｘ２のＲｕｎｔドメイン若しくは
単離されたドメインを含んでなるポリペプチドを本発明のアッセイで使用し得る。なお別の態様において、Ｒｕｎｘ２のＲｕｎｔドメインのＰＰＸＹモチーフを本発明のアッセイで使用し得る。ＫＲＣタンパク質と標的分子の間の相互作用を刺激若しくは阻害のいずれかをする試験化合物を同定するアッセイを使用し得る。該タンパク質と標的分子の間の相互作用を刺激する試験化合物は、試験化合物の非存在下での相互作用の程度と比較して例えばＫＲＣと標的分子の間の相互作用の程度を増大させるその能力に基づき同定され、そして、こうした化合物は細胞中でＫＲＣの活性を増大させることが期待されるとみられる。タンパク質と標的分子の間の相互作用を阻害する試験化合物は、該化合物の非存在下での相互作用の程度と比較してタンパク質と標的分子の間の相互作用の程度を低下させるその能力に基づき同定され、そしてこうした化合物はＫＲＣ活性を低下させると期待されるとみられる。
【０２７４】
本発明の上のアッセイ方法の一態様において、例えば該タンパク質の一方若しくは双方の複合体形成された形態の複合体形成されない形態からの分離を容易にするため、または該アッセイの自動化を適応するために、ＫＲＣ（またはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子、例えばＪｕｎ、ＴＲＡＦ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、Ｒｕｎｘ２、ＲＳＫ２および／若しくはＷＷＰ１）またはそれぞれの標的分子のいずれかを固定することが望ましいかもしれない。ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子への試験化合物の結合、または試験化合物の存在および非存在下での標的分子とのＫＲＣタンパク質（若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子）の相互作用は、反応体を含有するのに適するいかなる容器中でも達成し得る。こうした容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管を包含する。一態様において、タンパク質の一方若しくは双方がマトリックスに結合されることを可能にするドメインが分子の１種若しくはそれ以上に付加されている融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質若しくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）若しくはグルタチオン誘導体化したマイクロタイタープレートに吸着させ得、それをその後試験化合物、または試験化合物および未吸着の標的タンパク質若しくはＫＲＣタンパク質のいずれかと組合せ、そして該混合物を複合体形成に伝導性の条件下で（例えば塩およびｐＨについて生理学的条件で）インキュベートする。インキュベーション後にビーズ若しくはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄していかなる未結合の成分も除去し、ビーズの場合はマトリックスを固定し、そして、複合体形成を例えば上述されたとおり直接若しくは間接的にのいずれかで測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ得、そして標準的技術を使用して結合若しくは活性のレベルを測定し得る。
【０２７５】
マトリックス上にタンパク質を固定するための他の技術もまた本発明のスクリーニングアッセイで使用し得る。例えば、ＫＲＣタンパク質若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子、または標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの複合を利用して固定し得る。ビオチニル化したタンパク質若しくは標的分子を、当該技術分野で既知の技術（例えばビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、イリノイ州ロックフォード）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から製造し得、そして、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定し得る。あるいは、タンパク質若しくは標的分子と反応性であるがしかしその標的分子への該タンパク質の結合を妨害しない抗体を、プレートのウェルに誘導体化し得、そして未結合の標的若しくはＫＲＣタンパク質を抗体複合によりウェル中で捕捉する。ＧＳＴ固定した複合体について上述されたものに加えてのこうした複合体の検出方法は、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子または標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびにＫＲＣタンパク質若しくは標的分子と関連する酵素活性を検出することに頼る酵素結合アッセイを包含する。
【０２７６】
Ｃ．ノックアウト細胞を使用するアッセイ
別の態様において、本発明は、ＫＲＣ（または、例えばＪｕｎ、ＴＲＡＦ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、Ｒｕｎｘ２、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／若しくはＷＷＰ１）欠損細胞を使用する、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の生物学的効果を調節する化合物の同定方法を提供する。実施例に記述されるとおり、細胞中の（例えばＫＲＣ遺伝子の破壊による）ＫＲＣ活性の阻害は、例えば増大された骨形成および石灰化をもたらす。従って、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子が欠損している細胞を使用して、ＫＲＣそれ自身を調節すること以外の手段によりＫＲＣにより調節される生物学的応答を調節する剤（すなわち、ＫＲＣ欠損表現型を「レスキューする」化合物）を同定し得る。あるいは、遺伝子が条件的様式で非機能的にされている「コンディショナルノックアウト」系を使用して、スクリーニングアッセイでの使用のための欠損細胞を創製し得る。例えば、第ＷＯ  ９４／２９４４２号明細書および米国特許第５，６５０，２９８号明細書に記述されるところの遺伝子の条件破壊のためのテトラサイクリンに調節される系を使用して細胞、若しくはそれから細胞を単離し得る動物を創製し得、細胞と接触するテトラサイクリン濃度の調節により制御された様式でＫＲＣ（またはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子、例えばＪｕｎ、ＴＲＡＦ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、Ｒｕｎｘ２、ＣＢＦβ、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／若しくはＷＷＰ１）欠損にし得る。こうした動物からの特定の細胞型、例えばリンパ系細胞（例えば胸腺、脾および／若しくはリンパ節細胞）またはＴ細胞、Ｂ細胞、骨芽細胞、破骨細胞のような精製された細胞を、スクリーニングアッセイで使用し得る。一態様において、ＫＲＣの５．４ｋＢのエキソン２全体を例えばネオマイシンカセットで置換して、ＫＲＣタンパク質を産生しない遺伝子座をもたらし得る。この態様は付随する実施例に記述されている。
【０２７７】
該スクリーニング法において、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子が欠損している細胞を試験化合物と接触させ得、そして、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子により調節される生物学的応答をモニターし得る。（例えば未処理の細胞若しくは対照剤で処理した細胞のような適切な対照と比較しての）ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子が欠損している細胞中の応答の調節は、試験化合物をＫＲＣに調節される応答の調節物質と同定する。
【０２７８】
一態様において、試験化合物をヒト以外のノックアウト動物、好ましくはマウス（例えば、ＫＲＣ遺伝子若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の遺伝子が上述された手段により条件破壊されているマウス、またはリンパ系器官が、上述されたところのＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子が欠損しているキメラマウス）に直接投与して、ＫＲＣが欠損している細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ応答を調節する試験化合物を同定する。別の態様において、ＫＲＣが欠損している細胞を、ヒト以外のＫＲＣ欠損動物若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子が欠損している動物から単離し、そしてｅｘ
ｖｉｖｏで試験化合物と接触させて、細胞中でＫＲＣにより調節される応答を調節する試験化合物を同定する。
【０２７９】
ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子が欠損している細胞は、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子が欠損しているように創製したヒト以外の動物から得ることができる。好ましいヒト以外の動物は、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジを包含する。好ましい一態様において、欠損動物はマウスである。ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子が欠損しているマウスは、当該技術分野で既知の方法を使用して作成し得る。こうした方法、ならびに生じるＫＲＣヘテロ接合およびホモ接合動物の一例を付随する実施例に記述する。典型的に特定の一遺伝子産物が欠損しているヒト以外の動物は、相同的組換えにより創製さ
れる。例示的一態様において、欠失、付加若しくは置換が導入されてそれにより内因性ＫＲＣを変える、例えば機能的に破壊する遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターを製造する。遺伝子は好ましくはマウス遺伝子である。例えば、マウスＫＲＣ遺伝子を、マウスＫＲＣ  ｃＤＮＡをプローブとして使用してマウスゲノムＤＮＡライブラリーから単離し得る。マウスＫＲＣ遺伝子をその後、マウスゲノム中の内因性ＫＲＣ遺伝子を調節するのに適する相同的組換えベクターを構築するのに使用し得る。好ましい一態様において、相同的組換えに際して内因性遺伝子が機能的に破壊されている（すなわち機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともまた称される）ようなベクターを設計する。
【０２８０】
あるいは、相同的組換えに際して、内因性遺伝子が突然変異若しくは別の方法で変えられるがしかしなお機能的タンパク質をコードする（例えば、上流の調節領域が変えられてそれにより内因性ＫＲＣタンパク質の発現を変えることができる）ようなベクターを設計し得る。相同的組換えベクター中で、遺伝子の変えられる部分は、その５’および３’端で、胚性幹細胞中でベクターにより保有される外因性遺伝子と内因性遺伝子の間で相同的組換えを起こさせるための遺伝子の付加的な核酸により隣接されている。該付加的な隣接核酸は、内因性遺伝子との成功裏の相同的組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ（５’および３’双方の端）をベクターに包含する（例えば、相同的組換えベクターの記述については、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．とＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照されたい）。ベクターを胚性幹細胞株に（例えば電気穿孔法により）導入し、そして導入された遺伝子が内因性遺伝子と相同的に組換えられた細胞を選択する（例えばＬｉ，Ｅ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照されたい）。選択した細胞をその後動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入して凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、オックスフォード、１９８７）中、ｐｐ．１１３−１５２を参照されたい）。キメラ胚をその後、適する偽妊娠雌性育成動物に移植し得、そして胚を出産までもたらし得る。それらの生殖細胞中に相同的に組換えられたＤＮＡを担持する子孫を使用して、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達により相同的に組換えられたＤＮＡを含有する動物を繁殖させ得る。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９、ならびに、Ｌｅ  ＭｏｕｅｌｌｅｃらによるＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９０／１１３５４号；Ｓｍｉｔｈｉｅｓらによる同第ＷＯ  ９１／０１１４０号；Ｚｉｊｌｓｔｒａらによる同第ＷＯ  ９２／０９６８号；およびＢｅｒｎｓらによる同第ＷＯ  ９３／０４１６９号明細書に記述されている。
【０２８１】
スクリーニングアッセイの一態様において、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子により調節される生物学的応答を調節するそれらの能力について試験される化合物は、試験化合物をヒト以外の欠損動物にｉｎ  ｖｉｖｏで投与すること、および該動物での応答に対する試験化合物の影響を評価することにより、欠損細胞と接触させる。
【０２８２】
試験化合物は製薬学的組成物として非ノックアウト動物に投与し得る。こうした組成物は、典型的に試験化合物および製薬学的に許容できる担体を含んでなる。本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、製薬学的投与と適合性のいずれかのおよび全部の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌化合物、等張および吸収遅延化合物などを包含する。製薬学的有効成分のためのこうした媒体および化合物の使用は当該技術分野で公知である。いずれかの慣習的媒体若しくは化合物が有効成分と不適合性である限りを除き、組成物中でのそれらの使用を企図している。補助的有効成分
もまた組成物に組み込み得る。製薬学的組成物は下により詳細に記述する。
【０２８３】
別の態様において、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路により調節される生物学的応答を調節する化合物は、ＫＲＣが欠損している細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで１種若しくはそれ以上の試験化合物と接触させること、および読み出しに対する試験化合物の影響を測定することにより同定する。一態様において、ｅｘ  ｖｉｖｏで試験化合物と接触させたＫＲＣ欠損細胞を被験体に再投与し得る。
【０２８４】
スクリーニング方法をｅｘ  ｖｉｖｏで実施するため、例えばＫＲＣ、Ｊｕｎ、ＴＲＡＦ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、Ｒｕｎｘ２、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／若しくはＷＷＰ１が欠損している細胞を、標準的方法によりヒト以外の欠損動物若しくは胚から単離し得、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験化合物とともにインキュベート（すなわち培養）し得る。細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞および／若しくは骨芽細胞）は、例えばＫＲＣ、Ｊｕｎ、ＴＲＡＦ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、Ｒｕｎｘ２、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／若しくはＷＷＰ１欠損動物から標準的方法により単離し得る。別の態様において、細胞はＫＲＣ、Ｊｕｎ、ＴＲＡＦ、ＧＡＴＡ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、Ｒｕｎｘ２、ＡＴＦ４、ＲＳＫ２および／若しくはＷＷＰ１の１種若しくはそれ以上が欠損している動物から単離する。
【０２８５】
別の態様において、ＫＲＣが関わるシグナル伝達経路の１種以上のメンバーが欠損している細胞を主題のアッセイで使用し得る。
【０２８６】
欠損細胞の試験化合物との（ｅｘ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかでの）接触後に、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子により調節される生物学的応答に対する試験化合物の影響を、例えば本明細書に記述されるところの細胞の光学顕微鏡分析、細胞の組織化学分析、タンパク質の産生、ある種の遺伝子、例えばＩＬ−２のようなサイトカイン遺伝子の誘導、ある種のタンパク質の分解、例えばある種のタンパク質のユビキチン化を包含する、本明細書に示されるもののような多様な適する方法のいずれか１種により測定し得る。
【０２８７】
Ｄ．試験化合物
多様な試験化合物を、本明細書に記述されるスクリーニングアッセイを使用して評価し得る。「試験化合物」という用語は、本発明のアッセイで使用されかつＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子の発現および／若しくは活性に影響するその能力についてアッセイされる、いかなる試薬若しくは試験剤も包含する。１種以上の化合物、例えば複数の化合物を、例えばＫＲＣの発現および／若しくは活性を調節するそれらの能力について１スクリーニングアッセイで同時に試験し得る。「スクリーニングアッセイ」という用語は、好ましくは、読み出しに影響する１種の化合物の能力を試験する試験よりもむしろ最適な読み出しに影響する複数の化合物の能力を試験するアッセイを指す。好ましくは、主題のアッセイは、スクリーニングされている効果を有することが以前に知られていない化合物を同定する。一態様において、化合物の活性についてアッセイするためにハイスループットスクリーニングを使用し得る。
【０２８８】
ある態様において、試験されるべき化合物はライブラリー由来であり得る（すなわち、化合物のライブラリーのメンバーである）。ペプチドのライブラリーの使用は当該技術分野で十分に確立されている一方、ベンゾジアゼピン類（Ｂｕｎｉｎら（１９９２）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０９８７；ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９）ペプトイド（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８）オリゴカルバメート（Ｃｈｏら（１９９３）．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６１：１３０３−）およびヒダントイン（ＤｅＷｉｔｔら  上記）のような他の化合物の混合物の製造を可能にした新たな技術が開発された。１０４−１０５の多様性をもつ小有機分子の分子ライブラリーの合成のための１アプローチが記述されている（Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９−；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１−）。
【０２８９】
本発明の化合物は、生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相若しくは溶液相ライブラリー、逆重畳を必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を包含する、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法の多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに制限される一方、他の４種のアプローチは、ペプチド、ペプチド以外のオリゴマー、若しくは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。分子ライブラリーの他の例示的合成方法は、当該技術分野、例えば、Ｅｒｂら（１９９４）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−；Ｈｏｒｗｅｌｌら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３３：６８−；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−に見出し得る。
【０２９０】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第’４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）、若しくはファージ（ＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）上に提示し得；なお別の態様において、コンビナトリアルポリペプチドがｃＤＮＡライブラリーから製造される。
【０２９１】
活性についてスクリーニングし得る例示的化合物は、限定されるものでないが、ペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子および天然産物の抽出物のライブラリーを挙げることができる。
【０２９２】
候補／試験化合物は、例えば１）Ｄおよび／若しくはＬ配置アミノ酸から構成される、Ｉｇ尾状融合ペプチドおよびランダムペプチドライブラリー（例えばＬａｍ，Ｋ．Ｓ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６を参照されたい）ならびにコンビナトリアルケミストリー由来分子ライブラリーを包含する可溶性ペプチドのようなペプチド；２）リンペプチド（例えば、ランダムおよび部分的に縮重の指向性リンペプチドライブラリーのメンバー、例えばＳｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８を参照されたい）；３）抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、および一本鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、および抗体のエピトープ結合フラグメント）；４）小有機および無機分子（例えば、コンビナトリアルおよび天然産物ライブラリーから得られる分子）；５）酵素（例えば、エンドリボヌクレアーゼ、加水分解酵素、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、合成酵素、異性化酵素、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、酸化還元酵素およびＡＴＰアーゼ）、ならびに６）変異体の形態のＫＲＣ（例えば該分子のドミナントネガティブ変異体の形態）を包含する。
【０２９３】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相若しくは溶液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を包含する、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法の多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに制限される一方、他の４種のアプローチは、ペプチド、ペプチド以外のオリゴマー、若しくは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０２９４】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野、例えば、ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出し得る。
【０２９５】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第’４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）、若しくはファージ（ＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ
上記）上に提示され得る。
【０２９６】
主題のスクリーニングアッセイで同定される化合物を、ＫＲＣにより調節される生物学的応答の１種若しくはそれ以上の調節方法で使用し得る。こうした化合物（１種若しくは複数）を、細胞とそれらを接触させる前に製薬学的組成物（上述される）として処方することが望ましいことがあることが理解されるであろう。
【０２９７】
上述された多様な方法の１種により、例えばＫＲＣ発現若しくは活性、またはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子を直接若しくは間接的に調節する試験化合物が一旦同定されれば、該選択した試験化合物（若しくは「目的の化合物」）をその後、例えば該目的の化合物を（例えば目的の化合物を被験体に投与することにより）ｉｎ  ｖｉｖｏ、あるいは（例えば、細胞を被験体から単離することおよび該単離した細胞を目的の化合物と接触させること、または、あるいは目的の化合物を細胞株と接触させることにより）ｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで細胞と接触させること、ならびに（未処理の細胞、または生物学的応答を調節しない対照化合物若しくは担体で処理した細胞のような）適切な対照と比較しての細胞に対する目的の化合物の影響を決定することにより、細胞に対するその影響について、さらに評価し得る。
【０２９８】
本発明はまた、主題のスクリーニングアッセイで同定される化合物にも関する。
【０２９９】
ＶＩ．製薬学的組成物
本発明の製薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように処方される。例えば、非経口、皮内若しくは皮下適用に使用される溶液若しくは懸濁液は、以下の成分、すなわち、注射用水、生理的食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール若しくは他の合成溶媒のような無菌の希釈剤；ベンジルアルコール若しくはメチルパラベンのような抗菌化合物；アスコルビン酸若しくは亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化合物；酢酸塩、クエン酸塩若しくはリン酸塩のような緩衝剤、および塩化ナトリウム若しくはＤ−ブドウ糖のような等張性の調節のための化合物を包含し得る。ｐＨは塩酸若しくは水酸化ナトリウムのような酸若しくは塩基で調節し得る。非経口製剤は、ガラス若しくはプラスチックから作成されるアンプル、使い捨てシリンジ若しくは複数用量バイアルに封入し得る。
【０３００】
注射可能な使用に適する製薬学的組成物は、無菌の水性溶液（水溶解性の場合）若しくは懸濁剤、および無菌の注入可能な溶液若しくは懸濁剤の即座の調製のための無菌粉末を包含する。静脈内投与のためには、適する担体は、生理学的生理的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシッパニー）若しくはリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を包含する。全部の場合で、組成物は好ましくは無菌であることができ、そして、容易な注入可能性が存在する程度まで流動性であるべきである。それは、好ましくは製造および貯蔵の条件下で安定であることができ、かつ、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対し保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適する混合物を含有する溶媒若しくは分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散剤の場合は必要とされる粒子径の維持、および界面活性剤の使用により維持し得る。微生物の作用の予防は、多様な抗菌および抗真菌化合物、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成し得る。多くの場合に、等張化合物、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に包含することが好ましいことができる。注入可能な組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる化合物、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に包含することによりもたらし得る。
【０３０１】
無菌の注入可能な溶液は、必要とされるところの、上で挙げられた成分の１種若しくは組合せを含む適切な溶媒中に必要とされる量の有効成分を組み込むこと、次いで濾過滅菌により製造し得る。一般に、分散剤は、基礎的分散媒および上で挙げられたものからの必要とされる他の成分を含有する無菌ベヒクル中に有効成分を組み込むことにより製造する。無菌の注入可能な溶液の製造のための無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、その以前に滅菌濾過された溶液から有効成分およびいずれかの付加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０３０２】
経口組成物は、一般に不活性希釈剤若しくは可食性担体を包含する。それらはゼラチンカプセル中に封入若しくは錠剤に圧縮し得る。経口の治療的投与の目的上、有効成分を賦形剤と組み込み得、そして錠剤、トローチ剤若しくはカプセル剤の形態で使用し得る。経口組成物は、液体担体中の化合物を経口で適用し、そしてシュッと音を立てかつ吐き出す若しくは飲み込む口腔洗浄剤としての使用のため液体担体を使用してもまた製造し得る。製薬学的に適合性の結合化合物および／若しくは補助物質を組成物の一部として包含し得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下、すなわち、結晶セルロース、トラガカントガム若しくはゼラチンのような結合剤；デンプン若しくは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ若しくはトウモロコシデンプンのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム若しくはＳｔｅｒｏｔｅｓのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；ショ糖若しくはサッカリンのような甘味化合物；またはペパーミント、サリチル酸メチル若しくはオレンジ香味料のような香味化合物の成分、若しくは類似の性質の化合物のいずれかを含有し得る。
【０３０３】
一態様において、試験化合物は、埋込物および微小被包化送達系を包含する徐放製剤のような、身体からの迅速な排除に対し化合物を保護することができる担体とともに製造する。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生物分解性の生物適合性のポリマーを使用し得る。こうした製剤の製造方法は当業者に明らかであろう。物質は、例えばＡｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に得ることもまたできる。リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染させた細胞を標的としたリポソームを包含する）もまた製薬学的に許容できる担体として使用し得る。これらは、当業者に既知の、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記述されるところの方法に従って製造し得る。
【０３０４】
ＶＩＩ．本発明のキット
本発明の別の局面は、本発明のスクリーニングアッセイ、調節法若しくは診断アッセイを実施するためのキットに関する。例えば、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットは、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子を含んでなる指標組成物、読み出し（例えばタンパク質分泌）を測定するための手段、およびＫＲＣの生物学的効果の調節物質を同定するためにキットを使用するための説明書を包含し得る。別の態様において、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットは、ＫＲＣ若しくはＫＲＣが関わるシグナル伝達経路中の分子が欠損している細胞、読み出しを測定するための手段、およびＫＲＣの生物学的効果の調節物質を同定するためにキットを使用するための説明書を包含し得る。
【０３０５】
別の態様において、本発明は、本発明の調節方法を実施するためのキットを提供する。該キットは、例えば、適する容器中のかつＫＲＣの生物学的効果を調節するための調節物質の使用のための説明書とともに適する容器中に包装された、本発明の調節剤（例えばＫＲＣ阻害若しくは刺激剤）を包含し得る。
【０３０６】
本発明の別の局面は、被験体におけるＫＲＣの生物学的活性と関連する障害を診断するためのキットに関する。該キットは、ＫＲＣの発現を測定するための試薬（例えば、ＫＲＣ  ｍＲＮＡを検出するための核酸プローブ、若しくはＫＲＣタンパク質の検出のための抗体）、被験体の結果を比較する対照、および診断の目的上該キットを使用するための説明書を包含し得る。
【０３０７】
本発明の実務は、別の方法で示されない限り、当該技術分野の熟練内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣習的技術を使用することができる。こうした技術は文献に十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈとＭａｎｉａｔｉｓにより編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら  米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓとＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓとＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；専門書、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒとＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４および１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒとＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒとＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８６）を参照されたい。
【０３０８】
本発明は、制限するとして解釈されるべきでない以下の実施例によりさらに具体的に説明される。本出願を通じ引用される全部の参考文献、特許および公開された特許出願、ならびに図面および配列表の内容は、ここに引用することにより組み込まれる。
【０３０９】
実施例
以下の物質および方法を本実施例を通じ使用した。
【０３１０】
ＫＲＣ欠損マウスの生成。
Ｓｈｎ３ターゲッティングベクターを、エキソン３と４の間の５ｋｂのゲノムフラグメントおよびエキソン２の５．５ｋｂのフラグメントをＰＧＫＮＥＯベクターにクローン化することにより創製した。ターゲッティング構築物を直鎖状にしかつＥＳ細胞に電気穿孔した。該遺伝子ターゲッティングベクターは、エキソン４のアミノ酸１−１０８を相同的組換えによりネオマイシン耐性カセットで置換して、Ｓｈｎ３タンパク質を産生しない遺伝子座をもたらした。Ｓｈｎ３を標的としたＥＳクローンをサザンブロット分析により同定し、そしてＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入した。Ｓｈｎ３  ＥＳ細胞は破壊された遺伝子座を１２９／Ｂ６子孫に伝播した。ヘテロ接合性の仔を、解析前に５世代にわたり野性型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに戻し交雑した。全試験で解析したマウスは、ヘテロ接合性Ｆ５交雑受精由来である性別を一致させた同腹子である。遺伝子型分類は、ネオマイシン特異的プライマー、およびＳｈｎ３遺伝子のエキソン４のアミノ酸１−１０３にわたるプライマーを使用する尾状ＤＮＡでのＰＣＲにより実施した。
【０３１１】
骨および軟骨染色
新生マウスの皮膚を剥ぎ、内臓を取り出しかつ９５％ＥＴＯＨで一夜脱水した。サンプルをその後追加の４８時間インキュベーションのためアセトン中に移した。骨格調製物は、以前に記述された（ＭｃＬｅｏｄ，Ｍ．Ｊ．（１９８０）．Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ  ２２、２９９−３０１）とおりアルシアンブルーおよびアリザリンレッドを使用して４日間染色した。染色後、サンプルを９５％ＥＴＯＨで３０分間３回洗浄した。軟組織をその後１％ＫＯＨで除去した。
【０３１２】
組織形態計測分析
ｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成の分析のため、カルセイン（１．６ｍｇ／ｋｇ体重）を、２月齢のＷＴおよびＳｈｎ３−／−マウスに屠殺８日および３日前に腹腔内注入により投与した。脛骨を収集し、軟組織を除去しかつ７０％エタノール中で固定した。組織形態計測分析は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓにより実施した。簡潔には、骨を脱灰を伴わずにメチルメタクリレートブロックに包埋した。切片をＶｏｎ  Ｋｏｓｓａおよびトルイジンブルーで染色したか、若しくは未染色のままとした。組織形態計測は、成長板の最低部分よりおよそ１ｍｍ下の二次海綿質で実施した。解析は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−６０蛍光を装備した顕微鏡およびＯｐｔｒｏｎｉｃｓデジタルカメラ装置を利用して、Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｔｒｕｅ  Ｃｏｌｏｒｓソフトウェアを用いて実施した。
【０３１３】
細胞および組織培養
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成について、骨髄細胞をαＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）中でマウスの大腿骨および脛骨から単離した。赤血球溶解後に細胞を１回洗浄しかつαＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに再懸濁した。骨髄細胞をその後、２５０μｌのαＭＥＭ＋１０％ＦＢＳあたり２×１０５細胞の濃度で４８ウェルプレートにプレーティングした。細胞をその後、５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下で２日間培養した。最初の２日の培養期間後に、細胞をその後、Ｍ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）および２５ｎｇ／ｍｌ若しくは１００ｎｇ／ｍｌいずれかのＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下で追加の５日間培養した。細胞をその後固定し、そして製造元の説明書（Ｓｉｇｍａ）に従い、酒石酸耐性アルカリホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の存在について染色した。
【０３１４】
骨芽細胞は、以前に記述された（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ら（２０００）．Ｃｅｌｌ  １０３、１０８５−１０９７）とおり、新生ＷＴおよびＳｈｎ３−／−の同腹子の頭蓋冠から単離した。頭蓋冠由来細胞を、αＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸＋５ｍＭ  β−グリセロリン酸中で６ウェル皿にプレーティングした。細胞をコンフルエント以下の段階で収集し、そしてαＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸＋５ｍＭ  β−グリセロリン酸中１０４細胞／ｃｍ２の濃度で６ウェル皿に再プレーティングした。ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色のため、細胞を培養第２１日に１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、そして５％硝酸銀で３０分間染色した。ＡＬＰについては、培養物を培養第１４日に１００％エタノールで固定し、そして製造元の説明書に従ってアルカリホスファターゼキット（Ｓｉｇｍａ）を利用して染色した。細胞増殖アッセイのため、頭蓋冠由来細胞（第０日に１０５細胞／ウェル）を、αＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸＋５ｍＭ  β−グリセロリン酸中で６ウェル皿にプレーティングした。細胞を培養第５日に収集し、そして細胞生存率のためのトリパンブルー排除染色後に血球計算板を利用して計数した。
【０３１５】
骨髄移植
２６ゲージ針を伴うシリンジを使用してＲＰＭＩ  １６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）＋１０％ＦＢＳで洗い流すことにより、８週齢ＷＴマウスの大腿骨および脛骨から骨髄細胞を収集した。ＲＢＣ溶解後に細胞をＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁した。１×１０７のＷＴ骨髄細胞をその後、γ線照射（１２００ｒａｄ）した４週齢のＷＴおよびＳｈｎ３−／−マウスへの尾静脈注入により移植した。照射したマウスを移植４週後にＸ線検査により分析した。
【０３１６】
定量的リアルタイムＰＣＲ
定量的リアルタイムＰＣＲのため、Ｓｈｎ３−／−およびＷＴ骨芽細胞からかつ培養１４日にＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して全ＲＮＡを抽出した。増幅等級のＤＮアーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での単離したＲＮＡの処理後にｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、１μｇのＲＮＡで逆転写を実施した。定量的ＰＣＲをその後ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。ＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および０．２μＭの特異的プラーマーを使用して、２５μｌの容量中で実施した。２種のサンプル間の特定の遺伝子のｍＲＮＡの相対レベルは、各サンプル中のｃＤＮＡの量をβ−アクチンＣｔに対し正規化したΔΔＣＴ法を利用して計算した（Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．とＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，Ｔ．Ｄ．（２００１）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５、４０２−４０８）。
【０３１７】
一過性トランスフェクションおよびレポーター遺伝子アッセイ
前骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１サブクローン４、およびマウス間葉系幹細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２をＡＴＣＣから得、そしてＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）＋１０％ＦＢＳ中で維持した。一過性トランスフェクションのため、細胞を８×１０４細胞／ウェルの濃度で１２ウェル皿に一夜播種した。細胞をその後、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドおよび示されるところの発現構築物の多様な組合せでトランスフェクトした。トランスフェクトされたＤＮＡの総量は、必要とされるように対照の空の発現ベクタープラスミドを補充することにより一定に保った。全細胞を、トランスフェクション効率についての正規化対照としてのｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でコトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に細胞を収集し、そして１×受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼアッセイを実施した。Ｓｈｎ３発現プラスミドは以前に記述されている（Ｏｕｋｋａ，Ｍ．ら（２００２）．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ９、１２１−１３１）。
【０３１８】
免疫沈降法およびイムノブロッティング
免疫沈降のため、２９３Ｔ細胞（６×１０６細胞／皿）をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で１０ｃｍ皿にプレーティングし、そしてＥｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬を用い一過性にトランスフェクトした。３６ないし４８時間後に細胞を収集し、そしてプロテアーゼ阻害剤を補充したＴＮＴ溶解緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、２００ｍＭ
ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で溶解した。ライセートを、アガロース結合抗ＦＬＡＧ（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）若しくは抗Ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）モノクローナル抗体での４℃で一夜の免疫沈降にかけた。免疫沈降物をその後溶解緩衝液で３回洗浄し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでＳｈｎ−３（Ｏｕｋｋａ，Ｍ．ら（２００２）．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ９、１２１−１３１）、ＦＬＡＧ（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）若しくはＭｙｃ（９Ｅ１０、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）についてのイムノブロッティングにかけた。
【０３１９】
内因性のＳｈｎ３とＲｕｎｘ２の間の相互作用を検出するため、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を１０ｃｍ皿中でＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清中で集密まで増殖させた。細胞が集密に達した場合に、培地を、記述された（Ｚａｍｕｒｏｖｉｃ，Ｎ．ら（２００４）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９、３７７０４−３７７１５）ところの１０ｍＭ  β−グリセロリン酸、５０μＭアスコルビン酸を補充しかつＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む若しくは含まないαＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清に変更した。細胞を追加の３〜４日間分化させた。溶解の１８時間前にＴＧＦβ（２ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をいくつかの培養物に添加し、また、溶解の２時間前にＭＧ１３２（１０μＭ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）を全培養物に添加した。細胞を収集しかつＴＮＴ緩衝液で溶解した。ライセートを３μｇの抗Ｒｕｎｘ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）若しくは対照ウサギＩｇＧとの４℃で一夜の免疫沈降にかけた。プロテインＡ／Ｇ−アガロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を添加して免疫複合体を沈降させ、それをその後溶解緩衝液で５回洗浄し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳｈｎ３についてのイムノブロッティングを行った。
【０３２０】
追加の共免疫沈降実験をＦＬＡＧ−エピトープ標識Ｒｕｎｘ２欠失変異体で実施した。完全長（アミノ酸１−５２１）はＱＡ、ＲｕｎｔおよびＰＳＴドメインを含有する。ＱＡ変異体（アミノ酸４８−８９）はＱＡドメインを含有するがしかしＲｕｎｔおよびＰＳＴ双方のドメインを欠く。Ｒｕｎｔ変異体（アミノ酸１０２−２２９）はＲｕｎｔおよびＰＳＴドメインを含有する。Ｒｕｎｔ／ＰＳＴ変異体（アミノ酸１０２−５２１）はＲｕｎ
ｔおよびＰＳＴドメインを含有するがしかしＱＡドメインを欠く。これらの変異体とのＳｈｎ３の相互作用を、抗ＦＬＡＧ抗体での免疫沈降後に抗Ｓｈｎ３抗体を用いるウエスタンブロット分析により決定した。
【０３２１】
Ｓｈｎ３−／−およびＷＴ骨芽細胞中での内因性のＡｔｆ４およびＲｕｎｘ２タンパク質レベルを検出するため、第１４および２１日の頭蓋冠骨芽細胞培養物を、プロテアーゼ阻害剤を補充したＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。タンパク質濃度を測定し、そしてサンプルあたり５０μｇタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、次いでＲｕｎｘ２（ＥＭＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｔｆ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）若しくはＨｓｐ９０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）についてイムノブロッティングした。
【０３２２】
ユビキチン化アッセイ
２９３Ｔ細胞中のＲｕｎｘ２のユビキチン化を検出するため、以前に確立されたプロトコルに従った（Ｃａｍｐａｎｅｒｏ，Ｍ．Ｒ．とＦｌｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｅ．Ｋ．（１９９７）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４、２２２１−２２２６）。簡潔には、２９３Ｔ細胞をＨｉｓ−Ｕｂ、ＦＬＡＧ−Ｒｕｎｘ２、Ｍｙｃ−ＷＷＰ１およびＳｈｎ３の組合せで一過性にトランスフェクトした。３６ないし４８時間後に細胞を１０μＭ  ＭＧ１３２で２時間処理した。細胞を洗浄しかつ６Ｍグアニジン−ＨＣｌを含有する緩衝液で溶解した。ユビキチン化されたタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ−アガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ）で沈殿させ、そして溶解緩衝液で洗浄し、次いで２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８、２０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で洗浄した。沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして、ユビキチン化されたＦＬＡＧ−Ｒｕｎｘ２を抗ＦＬＡＧ（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）抗体でのイムノブロッティングにより検出した。
【０３２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでユビキチン化を促進する免疫沈降されたＲｕｎｘ２／Ｓｈｎ３複合体の能力をアッセイするため、ＦＬＡＧ−Ｒｕｎｘ２およびＳｈｎ３の多様な組合せを上のとおり２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。３６ないし４８時間後に細胞を１０μＭ  ＭＧ１３２で２時間処理した。細胞を洗浄し、ＴＮＴ緩衝液で溶解し、そして抗ＦＬＡＧ免疫沈降を上のとおり実施した。免疫複合体をＴＮＴ緩衝液、その後５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＡＴＰを含有するユビキチン化アッセイ（ＵＡ）緩衝液で洗浄した。免疫沈降物を、組換えＥ１およびＥ２（ＵｂｃＨ５ａおよびＵｂｃＨ７、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）を含む若しくは含まないユビキチンおよびビオチニル化ユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ
Ｂｉｏｃｈｅｍ）を補充したＵＡ緩衝液に再懸濁した。ユビキチン化反応を３０℃で２時間進行させた。反応をその後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、そしてユビキチン化されたタンパク質をストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ）を用いるブロッティングにより可視化した。
【０３２４】
パルスチェイス分析
２９３Ｔ細胞（１×１０６細胞）を、６ウェルプレート中でＳｈｎ３（１μｇ）を伴い若しくは伴わずにＦＬＡＧ−Ｒｕｎｘ２（２００ｎｇ）で一過性にトランスフェクトした。３６時間後に細胞を洗浄し、そしてシステイン／メチオニンを含まない培地中で１時間インキュベートした。細胞をその後、０．１ｍＣｉ／ｍｌのＳ３５標識システイン／メチオニンで１時間標識した。次に、細胞を過剰の非放射活性システイン／メチオニンを含有する培地中で指定された時間追跡した。細胞を収集し、そしてプロテアーゼ阻害剤を補充したＴＮＴ緩衝液で溶解し、そして抗ＦＬＡＧ免疫沈降（Ｍ２アガローススラリー、Ｓｉｇｍａ）を４℃で一夜実施した。免疫沈降物を溶解緩衝液で４回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして免疫沈降されたタンパク質をフルオグラフィー（ｆｌｕｏｇｒａｐｈｙ）により可視化しかつＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒで定量した。
【実施例１】
【０３２５】
Ｓｈｎ３欠損マウスの生成。
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳｈｎ３の機能を検討するため、マウスＳｈｎ３遺伝子中にヌル突然変異を担持するマウスを相同的組換えにより生成した。マウス第４染色体上のＳｈｎ３遺伝子のエキソン４は、ＡＴＧ開始コドンを包含する５．４ｋＢのＤＮＡ、ならびに該タンパク質全体の４８パーセントのコーディング配列を含有する。エキソン４中のＡＴＧ開始コドンをネオマイシン耐性カセットで置換した場合、それは、検出可能なｍＲＮＡ若しくはタンパク質を産生しなかったヌルＳｈｎ３遺伝子座をもたらした。標的とされたＳｈｎ３遺伝子座は、１２９／Ｂ６  Ｓｈｎ３ヘテロ接合マウスとして期待された頻度で維持された。全部のその後の実験は、少なくとも５世代でＣ５７ＢＬ／６マウスに戻し交雑したＳｈｎ３−／−およびＷＴマウスを使用して実施した。
【実施例２】
【０３２６】
Ｓｈｎ３欠損マウスにおける増大された骨量。
ホモ接合性Ｓｈｎ３変異体（Ｓｈｎ３−／−）マウスは期待されたメンデル比で生まれ、そして検査した主要臓器における明白な大きな表現型異常を伴わず健康であった。しかしながら、三次元μ−ＱＣＴデジタルＸ線検査による８週齢の野性型（ＷＴ）およびＳｈｎ３−／−マウスの分析は、成熟ホモ接合性変異体マウスの長骨の増大されたＸ線不透過性を示した。二次元μ−ＱＣＴによるこれらのマウスの骨格構造のさらなる分析は、Ｓｈｎ３−／−マウスの長骨および脊椎内に存在する肉柱形成の劇的な増大を示した。Ｓｈｎ３−／−マウスからの大腿骨の連続断面は、増大された海綿骨が、骨幹の遠位領域を包含する大腿骨の長さ全体で存在することを示す（図１Ｅ）。対照的に、ＷＴマウスから単離した大腿骨は骨幹内の肉柱形成を示さず、かつ、大腿骨の骨幹および骨幹端の控えめなレベルのみの海綿骨を示した。定量分析は、小柱数および小柱厚双方がＳｈｎ３−／−マウスの大腿骨で増大されていることを示す。これら２種のパラメータの増大は、ＷＴ対照マウスで観察される海綿骨量を４．５倍上回り増大しているＳｈｎ３−／−マウスの海綿骨量（ＢＶ／ＴＶ）をもたらす。加えて、Ｓｈｎ３−／−マウスの骨ミネラル密度（ＢＭＤ）はＷＴマウスのものの２５０％である。
【０３２７】
成熟Ｓｈｎ３−／−マウスで存在する上昇された骨量は、機能不全の出生前骨発生および／若しくは出生後骨格リモデリングの機能不全から生じうる。Ｓｈｎ３−／−マウスで存在する増大された骨量が骨形態形成の機能不全の結果であるかどうかをより良好に理解するため、骨成長および発生を新生ＷＴおよびＳｈｎ３−／−マウスで分析した。Ｐ４のＷＴおよびＳｈｎ３−／−マウスからの全骨格調製物をアリザリンレッド／アルシアンブルーで染色して、それぞれ石灰化骨および石灰化されていない軟骨の形成を分析した。骨格形態形成は通常、Ｐ４で分析したＳｈｎ３−／−マウスに存在し、未熟軟骨石灰化は軟骨内骨化をうける骨格の領域で検出されない。集合的に、これらの結果は、Ｓｈｎ３が骨形成を阻害するよう機能する骨格リモデリングにおけるＳｈｎ３の出生後の役割を示唆する。
【実施例３】
【０３２８】
Ｓｈｎ３は破骨細胞の分化若しくは機能に必要とされない。
骨格リモデリングにおけるＳｈｎ３の役割を理解するため、Ｓｈｎ３発現を骨リモデリングに関与する細胞型で検査していた。Ｓｈｎ３  ｍＲＮＡは全骨、骨芽細胞、およびより小さい程度まで破骨細胞で検出され得る。Ｓｈｎ３発現の該非制限的パターンは、Ｓｈｎ３−／−マウスで観察される増大された骨量が骨芽細胞および／若しくは破骨細胞の機能の変化から生じうることを示唆する。Ｓｈｎ３が破骨細胞の生物学を調節するように機能するかどうかを決定するため、骨髄を収集しかつＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で培養してＴＲＡＰ＋破骨細胞を生成させる、以前に確立されたプロトコルに従うことにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ破骨細胞分化アッセイを実施した。Ｓｈｎ３−／−マウスから収
集した骨髄の分化は、同一条件下で培養したＷＴ骨髄と比較した場合に、類似の数の多核ＴＲＡＰ＋細胞をもたらした。類似の数の破骨細胞は、破骨細胞形成を促進する条件化でＷＴおよびＳｈｎ３−／−脾細胞を培養した場合にもまた観察された。これらの結果は、Ｓｈｎ３発現が前駆細胞からの破骨細胞の分化に欠かせないことを示唆する。
【０３２９】
破骨細胞に固有の欠陥から生じる骨格異常が照射した宿主の野性型骨髄の移植後にレスキューされ得ることが、以前に報告されている（Ｌｉ．Ｊ．ら（２０００）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７、１５６６−１５７１）。宿主表現型のレスキューは、造血前駆細胞由来であるＷＴドナー破骨細胞の結果として生じ、宿主骨の微小環境を再定着（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）させかつ骨再吸収を媒介する。Ｓｈｎ３−／−マウスで観察される骨格表現型が破骨細胞の固有の欠損の結果でないことを確認するため、致死的に照射した４週齢のＳｈｎ３−／−マウスにＷＴマウスから収集した骨髄細胞を注入した一連の骨髄移植実験を実施した。４週後にマウスを屠殺し、そして大腿骨をＸ線撮影により分析した。ＷＴ骨髄の移植は、レシピエントＳｈｎ３−／−マウスの大腿骨に存在する肉柱形成の量を低下させることに失敗した。これらの結果は、Ｓｈｎ３−／−マウスで存在する増大された骨量が破骨細胞系統の欠乏の結果でなく、しかしむしろ増大された骨芽細胞機能および調節不全の骨形成から生じることをさらに示す。
【実施例４】
【０３３０】
Ｓｈｎ３欠損マウスにおける増大された骨形成速度。
Ｓｈｎ３−／−マウスで見られる増大された骨量が骨形成の変化から生じるかどうかを決定するため、ｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成速度を検査するためのカルセイン二重標識および蛍光顕微鏡検査を包含する多数の組織形態計測パラメータを８週齢のＳｈｎ３−／−およびＷＴマウスで分析した。Ｓｈｎ３−／−マウスの脛骨で観察された２個のカルセイン標識の間の増大された距離は、これらのマウスがＷＴマウスに比較した場合に上昇されたレベルの新たな骨形成を有することを示す。定量分析は、Ｓｈｎ３−／−マウスでの骨形成速度がＷＴ対照動物で観察された速度の５倍であることを示す。ＢＦＲは、骨芽細胞の骨形成能力の反映である骨石灰化速度（ＭＡＲ）を骨表面あたりの石灰化表面の面積（ＭＳ／ＢＳ）により乗算することにより計算する。付加的な組織形態計測分析は、Ｓｈｎ３−／−マウスが骨石灰化速度（ＭＡＲ）および骨石灰化面（ＭＳ／ＢＳ双方の増大を有することを示す。しかしながら、Ｓｈｎ３−／−マウスでの骨芽細胞表面（Ｏｂ．Ｓ／ＢＳ）（骨芽細胞集団の信頼できる指標）はＷＴマウスに匹敵する。これらのデータは、Ｓｈｎ３−／−マウスで観察される骨形成の増大された速度が、骨芽細胞の機能増強により引き起こされかつ骨芽細胞の数の増大により引き起こされないことを示唆する。興味深いことに、類骨層の厚さはＷＴおよびＳｈｎ３−／−マウスの間で比較可能であった。Ｓｈｎ３−／−マウスは、ＷＴ対照マウスに比較した場合に類似の類骨厚、しかしＭＡＲの増大を有するため、類骨形成と石灰化の開始の間の時間がＳｈｎ３−／−マウスで短縮されていなければならない。従って、Ｓｈｎ３−／−マウスで存在する骨硬化性の表現型は異常な骨形成および石灰化から生じる。
【実施例５】
【０３３１】
Ｓｈｎ３−／−骨芽細胞の変えられたｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性。
Ｓｈｎ３−／−マウスで観察される増大された骨量が調節不全の骨芽細胞活性の影響であることを確かめるため、新生Ｓｈｎ３−／−およびＷＴマウスの頭蓋冠由来の初代骨芽細胞で一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を実施した。これらのｅｘ  ｖｉｖｏ骨芽細胞培養物は、主として骨芽細胞前駆細胞および未熟骨芽細胞よりなることが報告されている。培養物中で成熟される場合、これらの骨芽細胞は石灰化結節を形成する能力を有し、これは細胞外マトリックスを生成する該細胞の能力を反映する（Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら（１９９９）．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３、１０２５−１０３６；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ら（２０００）．Ｃｅｌｌ  １０３、１０８５−１０９７）。Ｓｈｎ３−／−およびＷＴ骨芽細胞培養物を、第０および５日に石灰化マトリックスの存在についてｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色により検査した場合、Ｓｈｎ３−／−培養物が増大された数の石灰化骨結節を有することが見出された。さらに、Ｓｈｎ３−／−骨芽細胞培養物中で形成された石灰化結節は、ＷＴ骨芽細胞培養物中で形成された石灰化結節に比較した場合に一般により大きかった。Ｓｈｎ３−／−培養物内に存在する増大された石灰化マトリックスは、増大された数の骨芽細胞を含有するこれらの培養物から生じなかった。ＷＴおよびＳｈｎ３−／−培養物は類似の数のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）陽性細胞を有しかつ類似の細胞増殖速度を表したからである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳｈｎ３−／−骨芽細胞による増大された活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏで増大されたＢＦＲを表すＳｈｎ３−／−マウスと相関し、そして、調節不全の骨芽細胞活性が、観察される表現型の原因であることをさらに示す。
【０３３２】
Ｓｈｎ３−／−骨芽細胞による石灰化結節形成の増大は、骨形成に関与する遺伝子の発現の変化から生じうる。定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）による遺伝子転写の分析は、Ｓｈｎ３−／−骨芽細胞が、ＷＴ骨芽細胞に比較した場合に高められたレベルのＢＳＰ、ＣｏｌＩ（α）１およびＯＣＮのｍＲＮＡ、しかし類似のレベルのＡＬＰのｍＲＮＡを発現することを示した。骨芽細胞の生物学の重要な調節物質ＡＴＦ４（Ｙａｎｇ，Ｘ．ら（２００４）．Ｃｅｌｌ  １１７、３８７−３９８）もまた、Ｓｈｎ３−／−骨芽細胞中で、ｍＲＮＡおよびタンパク質双方のレベルで上昇された。加えて、Ｓｈｎ３それ自身はｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨芽細胞分化の間上方制御され、Ｓｈｎ３の骨芽細胞固有の役割をさらに強調した。従って、Ｓｈｎ３は骨形成および石灰化で重要である多数の遺伝子の発現を調節する。
【実施例６】
【０３３３】
Ｓｈｎ３は直接相互作用によりＲｕｎｘ２タンパク質の安定性を調節する
Ｓｈｎ３−／−骨芽細胞で過剰発現された骨芽細胞特異的遺伝子は、全部、転写因子Ｒｕｎｘ２の直接の標的である（Ｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｓ．ら（２００４）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
２３、４３１５−４３２９；Ｙａｎｇ，Ｘ．ら（２００４）．Ｃｅｌｌ  １１７、３８７−３９８）ため、Ｓｈｎ３は、Ｒｕｎｘ２それ自身に対する効果を介して、骨芽細胞活性に対するその阻害性の影響を発揮しうる。従って、Ｒｕｎｘ２のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルをＳｈｎ３−／−およびＷＴ骨芽細胞で定量していた。興味深いことに、Ｓｈｎ３−／−骨芽細胞は、Ｒｕｎｘ２  ｍＲＮＡのレベルがＳｈｎ３−／−およびＷＴ骨芽細胞の間で比較可能であった場合であっても、Ｒｕｎｘ２タンパク質の上昇されたレベルを示した。これは、Ｓｈｎ３がＲｕｎｘ２タンパク質の安定性を調節しうるかどうかという疑問につながった。２９３Ｔ細胞中で過剰発現される場合、Ｓｈｎ３は定常状態のＲｕｎｘ２レベルの用量依存性の低下につながった。さらに、Ｓｈｎ３の過剰発現は、パルスチェイス実験により判断されるとおり、過剰発現されたＲｕｎｘ２の加速された分解キネティクスにつながった。
【０３３４】
それによりＳｈｎ３がＲｕｎｘ２分解を促進する多数の可能な機構が予見され得、そして、Ｓｈｎ３、Ｒｕｎｘ２およびＴＧＦ−βの間の関係を以下の理由から検討した。第一に、骨中のＴＧＦ−βのｉｎ  ｖｉｖｏ過剰発現は骨粗鬆症につながる（Ｅｒｌｅｂａｃｈｅｒ，Ａ．とＤｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．（１９９６）．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３２、１９５−２１０；Ｅｒｌｅｂａｃｈｅｒ，Ａ．ら（１９９８）．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ９、１９０３−１９１８）一方、ドミナントネガティブなＴＧＦβＲの骨芽細胞特異的過剰発現は、Ｓｈｎ３−／−マウスで観察されるものに類似の増大された海綿骨量につながる（Ｆｉｌｖａｒｏｆｆ，Ｅ．ら（１９９９）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６、４２６７−４２７９）。第二に、ショウジョウバエでのＭａｄへのＳｈｎの結合と同様に、Ｓｈｎ３はＲ−Ｓｍａｄタンパク質、最も顕著にはＴＧＦ−β依存性のＲ−Ｓｍａｄ、Ｓｍａｄ３と直接相互作用し得ることが以前に観察されている。第三に、Ｒｕｎｘ２の十分に報告された結合パートナーはＳｍａｄ３である（Ａｌｌｉｓｔｏｎ，Ｔ．ら（２００１）．Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２０、２２５４−２２７２；Ｉｔｏ，Ｙ．とＺｈａｎｇ，Ｙ．Ｗ．（２００１）．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｍｅｔａｂ  １９、１８８−１９４；Ｓｏｗａ，Ｈ．ら（２００４）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９、４０２６７−４０２７５）。
【０３３５】
Ｓｈｎ３が物理的相互作用によりＲｕｎｘ２タンパク質の安定性を調節することが従って推論された。事実、Ｒｕｎｘ２はコトランスフェクション研究でＳｈｎ３を特異的に共免疫沈降し、そして、この相互作用はＲｕｎｘ２のＲｕｎｔ（ＤＮＡ結合）ドメインを介し媒介された。加えて、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸およびＢＭＰ−２で成熟骨芽細胞にさらに分化されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞中で、内因性のＲｕｎｘ２とＳｈｎ３の間の相互作用を検出することが可能であった（Ｚａｍｕｒｏｖｉｃ，Ｎ．ら（２００４）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９、３７７０４−３７７１５）。低レベルのＳｈｎ３／Ｒｕｎｘ２会合が分化後に細胞中で検出されたとは言え、分化した細胞をＴＧＦ−βで処理することは、Ｒｕｎｘ２とＳｈｎ３の間の会合を劇的に高めた。
【０３３６】
Ｒｕｎｘ２／Ｓｈｎ３の相互作用のＲｕｎｘ２機能に関しての結果を決定するため、オステオカルシンのプロモーター、すなわちＯＳＥ２と命名された十分に特徴付けられたＲｕｎｘ２結合部位（Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら（１９９７）．Ｃｅｌｌ  ８９、７４７−７５４）を利用した。Ｒｕｎｘ２は多量体化されたＯＳＥ２−ルシフェラーゼレポーター構築物からの転写を強力に活性化した一方、Ｓｈｎ３の共発現はＲｕｎｘ２活性を用量依存性に阻害した。ＴＧＦ−βでの細胞の共処理、若しくはＳｍａｄ３の共発現は、Ｒｕｎｘ２に対するＳｈｎ３の阻害効果をさらに増強した。これらの研究から、Ｓｈｎ３がＲｕｎｘ２と物理的に会合し、この会合はＴＧＦ−βシグナル伝達により促進され、そしてＳｈｎ３はこのＴＧＦ−βで誘導可能な複合体の情況でＲｕｎｘ２機能を阻害し得ることが結論される。
【実施例７】
【０３３７】
Ｓｈｎ３はＲｕｎｘ２のユビキチン化を促進する
Ｓｈｎ３がＲｕｎｘ２と会合しかつその分解を促進することが示されたため、Ｓｈｎ３がＲｕｎｘ２のユビキチン化を促進し得るかどうかを決定した。過剰発現研究で、Ｓｈｎ３はＲｕｎｘ２のユビキチン化を促進した。さらに、Ｓｈｎ３／Ｒｕｎｘ２複合体を２９３Ｔ細胞から免疫精製しかつｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイで使用した場合、特異的ユビキチンリガーゼ活性が検出された。
【０３３８】
Ｓｈｎ３はＲｕｎｘ２のユビキチン化を促進するとは言え、Ｓｈｎ３それ自身は正準Ｅ３ユビキチンリガーゼドメインを含有しない（ＲＩＮＧ、ＨＥＣＴ若しくはＵボックス、総説については、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．（２００２）．Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２０００、ＰＥ４；Ｐｉｃａｋｒｔ，Ｃ．Ｍ．（２００１）．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７０、５０３−５３３、）。加えて、Ｓｈｎ３の多様な組換えタンパク質フラグメントは、検出可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有しなかった。これらの観察結果は、Ｓｈｎ３が既知のＥ３ユビキチンリガーゼと会合してＲｕｎｘ２のユビキチン化を促進しうるという仮説に至った。Ｒｕｎｘ２はＳｍｕｒｆ１によりユビキチン化され得ることが以前に示されている（Ｚｈａｏ，Ｍ．ら（２００４）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９、１２８５４−１２８５９；Ｚｈａｏ，Ｍ．ら（２００３）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８、２７９３９−２７９４４）。Ｓｍｕｒｆ１は、その全部が膜ターゲッティングのためのＮ末端Ｃ２ドメイン、ＰＰＸＹモチーフをもつ基質の認識を司る内部ＷＷドメイン、およびＣ末端ＨＥＣＴ  Ｅ３リガーゼドメインを有する、Ｎｅｄｄ４ファミリーと命名されたＨＥＣＴドメイン含有Ｅ３リガーゼの１ファミリーに属する（Ｉｎｇｈａｍ，Ｒ．Ｊ．ら（２００４）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３、１９７２−１９８４）。
【０３３９】
Ｓｈｎ３とＳｍｕｒｆ１の間の物理的相互作用は検出されなかったとは言え、Ｓｈｎ３はＥ３ユビキチンリガーゼのＮｅｄｄ４ファミリーの別のメンバー、ＷＷＰ１を共免疫沈降した。ＷＷＰ１は全部のＲ−およびＩ−Ｓｍａｄタンパク質と相互作用すること、ならびにＳｍａｄ６およびＳｍａｄ７のユビキチン化を促進することが以前に示されている（Ｋｏｍｕｒｏ，Ａ．ら（２００４）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３、６９１４−６９２３）が；しかしながら、またそれらのＲｕｎｔドメインにＰＰＸＹモチーフを有する（Ｊｉｎ，Ｙ．Ｈ．ら（２００４）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９、２９４０９−２９４１７）Ｒｕｎｘタンパク質をユビキチン化するＷＷＰ１の能力は検討されていない。ＷＷＰ１は、２９３Ｔ細胞中で過剰発現される場合に低レベルのＲｕｎｘ２のユビキチン化を促進したことが観察された。しかしながら、ＷＷＰ１をＳｈｎ３と共発現させた場合、該２者はＲｕｎｘ２のユビキチン化を促進するように相乗的に作用した。
【０３４０】
理論により束縛されることを願わないとは言え、これらのデータは、骨芽細胞中のＴＧＦ−βシグナル伝達が、Ｒｕｎｘ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｈｎ３およびＥ３ユビキチンリガーゼＷＷＰ１の間の多量体複合体の形成を促進するモデルを示唆する。この複合体は、Ｒｕｎｘ２のポリユビキチン化およびプロテアソーム依存性の分解を促進するＷＷＰ１の能力によりＲｕｎｘ２機能を阻害する。Ｓｈｎ３は、その非存在下で、骨芽細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでＲｕｎｘ２タンパク質の上昇されたレベル、高められたＲｕｎｘ２転写活性、Ｒｕｎｘ２標的遺伝子の上昇された転写および増大された骨形成を示すため、この複合体の不可欠の成分である。骨芽細胞の表面上で発現されるＴＧＦβ受容体によるシグナル伝達は、Ｓｍａｄ４と複合体形成しかつ核に転位するＳｍａｄ３をもたらす。Ｓｈｎ３は、Ｓｍａｄ３とのその相互作用にもかかわらず、核でこの複合体と会合して、骨マトリックスの生合成に関与する遺伝子の転写を抑制する。核Ｓｈｎ３／Ｓｍａｄ複合体はＨＥＣＴドメイン含有Ｅ３リガーゼ、ＷＷＰ１とさらに会合する。この複合体は、骨芽細胞分化および細胞外マトリックス生合成に関与する遺伝子の重要な転写調節物質、Ｒｕｎｘと相互作用しかつそのユビキチン化を促進する。Ｓｍａｄ／Ｓｈｎ３／ＷＷＰ１複合体によるＲｕｎｘ２のユビキチン化は、Ｒｕｎｘ２の標的をプロテアソーム媒介性の分解に向け、かつ／若しくは、Ｒｕｎｘ２のユビキチン化はこのタンパク質の転写活性を阻害する。
【実施例８】
【０３４１】
不完全な破骨細胞形成がＳｈｎ３−／−マウスでｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。
Ｓｈｎ３欠損マウスで観察される高骨量表現型の一成分は、明らかに、増大された骨芽細胞マトリックス合成活性による。骨マトリックスを合成しかつその石灰化を指図するそれらの能力に加え、骨芽細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで破骨細胞形成を誘導することが知られている決定的なサイトカインＲＡＮＫＬを産生することが知られている（ＴｅｉｔｅｌｂａｕｍとＲｏｓｓ（２００３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．４（８）：６３８−４９）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの不完全な破骨細胞形成が、われわれのＳｈｎ３−／−系統で観察される骨硬化性の表現型の原因でありうるかどうかを決定するため、新生頭蓋冠全載標本を、成熟破骨細胞の特異的マーカーＴＲＡＰについてｉｎ  ｓｉｔｕで染色した。ｉｎ  ｖｉｖｏでの低下された破骨細胞形成を示す、Ｓｈｎ３欠損頭蓋中の低下された数のＴＲＡＰ陽性細胞。全骨若しくは頭蓋冠骨芽細胞培養物からのＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡレベルを分析した。Ｓｈｎ３欠損骨芽細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化の経過を通じて低下されたレベルのＲＡＮＫＬ転写物を示す。従って、機能亢進性の骨芽細胞マトリックス合成がｉｎ  ｖｉｖｏで観察される上昇された骨形成速度に寄与するとは言え、総骨量の顕著な上昇は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの増大された骨芽細胞活性および不完全な破骨細胞形成双方によりうる。
【実施例９】
【０３４２】
ＴＧＦβはｉｎ  ｖｉｖｏで骨量を低下させるためにＳＨＮ３を必要とする。
モデル生物体ショウジョウバエにおいて、Ｓｃｈｎｕｒｒｉ遺伝子はデカペンタプレジ
ック（Ｄｐｐ）シグナル伝達経路中で機能することが既知である。Ｄｐｐサイトカインの哺乳動物ホモログは、多面的シグナル伝達分子、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）である。ＳＨＮ３（ＫＲＣともまた呼ばれる）はショウジョウバエのＳｃｈｎｕｒｒｉの哺乳動物ホモログであるため、骨形成に拮抗するＳＨＮ３の能力がＴＧＦβの下流にあるかどうかを決定した。
【０３４３】
以前の研究は骨格の生物学におけるＴＧＦβの重要な役割を示唆している。活性化されたＴＧＦβを骨で過剰発現するマウス（Ｄ４マウスと命名される）は、石灰化海綿骨の減少、まとまりがなくかつ過形成性の皮質骨、および自発的骨折を伴う劇的な骨減少症を表す（Ｅｒｌｅｂａｃｈｅｒら（１９９８）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．９（７）：１９０３−１８））。
【０３４４】
ＴＧＦβシグナル伝達タンパク質Ｓｍａｄ３が骨芽細胞中でＲｕｎｘ２を結合しかつＲｕｎｘ２媒介性の遺伝子発現を阻害することが以前に報告されていた（Ａｌｌｉｓｔｏｎら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．２０（９）：２２５４−７２；Ｋａｎｇら（２００５）ＥＭＢＯ  Ｊ．２４（１４）：２５４３−２５５５）。ＴＧＦβがｉｎ  ｖｉｖｏで骨量を低下させるためにＳＨＮ３を必要とするかどうかを決定するため、２９３Ｔ細胞をＦＬＡＧ標識バージョンのＳｍａｄ１〜８と一緒にＳｈｎ３でトランスフェクトした。４８時間後に細胞を収集し、次いで抗ＦＬＡＧ免疫沈降した。結合されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてＳｈｎ３若しくはＦＬＡＧについてイムノブロットした。該結果は、ＳＨＮ３がＳｍａｄ３タンパク質と相互作用し得ることを示す。
【０３４５】
さらに、ＳＨＮ３とＲｕｎｘ２の間の相互作用がＴＧＦβにより促進された。ＳＨＮ３がｉｎ  ｖｉｖｏでＴＧＦβの下流にあるかどうかを、従って決定した。事実、野性型バックグラウンドのＤ４マウスは前述の骨格異常を示す一方、Ｄ４  ＳＨＮ３−／−マウスは、海綿骨量の顕著なレスキュー、ならびにより組織化された皮質骨および低下された自発的骨折を示す。従って、ＳＨＮ３はｉｎ  ｖｉｖｏで骨量を低下させるＴＧＦβの能力に必要とされる。
【実施例１０】
【０３４６】
Ｓｈｎ３は直接相互作用によりＲＳＫ２機能を調節する。
未解決の一疑問は、Ｒｕｎｘ２以外のＳＨＮ３／ＷＷＰ１ユビキチンリガーゼ複合体の基質が存在するかどうかである。ＲＳＫ２／ＡＴＦ４経路がＳＨＮ３／ＷＷＰ１により直接調節されるという可能性を、以下の理由、すなわち（１）ＡＴＦ４は成熟骨芽細胞による高レベルのコラーゲン合成に必要とされる転写因子である；（２）ＲＳＫ２は、骨芽細胞による至適の細胞外マトリックス産生に必要とされるＡＴＦ４をリン酸化することが知られているキナーゼである（Ｙａｎｇら（２００４）Ｃｅｌｌ．１１７（３）：３８７−９８）；（３）ＳＨＮ３−／−骨芽細胞は、上昇されたレベルのＡＴＦ４  ｍＲＮＡおよびタンパク質、ならびに過剰リン酸化されたＡＴＦ４の蓄積を示す、から検討した。
【０３４７】
事実、ＳＨＮ３の過剰発現がレポーターアッセイでＲｕｎｘ２に駆動される転写を阻害するとおり、ＳＨＮ３の過剰発現は、ＡＴＦ４に駆動される転写、ならびにＡＴＦ４機能のＲＳＫ２に媒介される増強を阻害する。ＳＨＮ３およびＷＷＰ１はＡＴＦ４タンパク質と物理的に会合しないが、しかし、双方はＲＳＫ２と容易に共免疫沈降する。ＷＷＰ１は低レベルのＲＳＫ２ユビキチン化を促進し得る。加えて、ＳＨＮ３およびＷＷＰ１双方はｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイでＲＳＫ２機能を阻害し得る。
【０３４８】
重要なことに、ＲＳＫ２自己リン酸化のレベルはＳＨＮ３−／−骨芽細胞中で増大され、また、リン特異的抗ＲＳＫ基質抗体で検出可能な数種のタンパク質種の増大された免疫反応性が、ＳＨＮ３−／−骨芽細胞中で検出される。興味深いことに、ＡＴＦ４は野性型骨芽細胞中でＲＳＫ２の重要な基質であると考えられているとは言え、ＳＨＮ３−／−ＡＴＦ−／−マウスは、ＳＨＮ３−／−マウスに匹敵する増大された海綿骨量を示し、ＡＴＦ４以外のＲＳＫ２の基質がＳＨＮ３−／−マウスで見られる増大された骨形成で重要な役割を演じていることを示唆する。
【０３４９】
同等物
当業者は、わずかに慣例の実験を使用して、本明細書に記述される本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するであろうか、若しくは確かめることが可能であろう。こうした同等物は以下の請求の範囲により包含されることを意図している。
【配列表】
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【国際調査報告】
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