【事件の表示】
　特許第２８８４０４５号「鉄−ラクトフェリン複合体及びその製造法」の特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２８８４０４５号の請求項１ないし６に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　特許第２８８４０４５号は、平成７年３月１７日に出願され、平成１１年２月１２日に設定登録がなされ、その後羽鳥　義一から特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１２年４月１７日付けで訂正請求がなされ、再度の取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１２年１０月２３日付けで訂正請求がなされたものである。
　なお、平成１２年４月１７日付け訂正請求書は取り下げられた。
　
２．訂正の適否
２ー１　訂正の内容
（ａ）特許請求の範囲の請求項１の「ラクトフェリン数１分子当り、鉄を１５乃至１０００分子」を「ラクトフェリン類１分子当り、鉄を１００乃至１０００分子」に訂正する。
（ｂ）特許請求の範囲の請求項３、４、５及び６の「ラクトフェリン類のモル濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の１／１５から１／１０００である。」を「ラクトフェリン類のモル濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の１／１００から１／１０００である。」に訂正する。
（ｃ）明細書５頁第１１行の「Ｌｆ類１分子当り、鉄を１５乃至１０００分子」を「Ｌｆ類１分子当り、鉄を１００乃至１０００分子」に訂正する。
（ｄ）明細書５頁第２３〜２４行及び第６頁第２６〜２７行の「Ｂ溶液のｉｘ）ラクトフェリン類のモルの濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の１／１５から１／１０００である必要がある。」を「Ｂ溶液のｉｘ）ラクトフェリン類のモルの濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の１／１００から１／１０００である必要がある。」に訂正する。
　
２−２　訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記（ａ）の訂正は、ラクトフェリン類１分子当りの鉄の含有量を「１５乃至１０００分子」から「１００乃至１０００分子」に限定するものであり、また上記（ｂ）の訂正は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度に対するラクトフェリン類のモル濃度を「１／１５から１／１０００」から「１／１００から１／１０００」に限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　また、上記（ｃ）及び（ｄ）の訂正は、上記（ａ）及び（ｂ）の特許請求の範囲の訂正に伴って発明の詳細な説明の記載を上記訂正事項（ａ）及び（ｂ）と一致するように訂正するものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とするものである。
　そして、「ラクトフェリン類１分子当り、鉄を１００乃至１０００分子」含有することについては、願書に添付した明細書の実施例４に「塩化第二鉄を鉄イオンとして１ミリモルを含む溶液０．２リットル（Ｂ１溶液）、ウシラクトフェリン（ＵＬＮ社製）１０マイクロモルを含む０．８リットル（Ｂ２溶液）を作製した。Ｂ１とＢ２を混合後、………」と記載されており、この記載からラクトフェリン１分子に対する鉄の分子数、Ｆｅ／Ｌｆ＝１ｍＭ／１０×１０ー３ｍＭ＝１００が導き出せるので、上記（ａ）乃至（ｄ）の訂正は、願書に添付した明細書に記載した事項の範囲内においてなされたものである。
　また、上記（ａ）乃至（ｄ）の訂正は、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　
２−３　独立特許要件の判断
　訂正後の請求項１〜６に係る発明は、後記「３．特許異議の申立てについて」の項に示したとおり、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　
２−４　むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び第３項で準用する同法第１２６条第２−４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議の申立てについて
３−１　異議申立人の主張　
　異議申立人　羽鳥　義一は、甲第１号証（「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第５７巻、第８号、第１３７６〜１３７７ページ、１９９３年）を提出して、（１）本件請求項１、２、３、及び５に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号に該当し、特許を受けることができない、及び（２）本件請求項４及び６に係る発明は、甲第１号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものと認められるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない、旨主張している。
　
３−２　訂正明細書の請求項１〜６に係る発明
　訂正明細書の請求項１〜６に係る発明は、その特許請求の範囲の請求項１〜６に記載されたとおりのものと認められるところ、その請求項１に係る発明は、次の事項により特定されるとおりのものである。
「【請求項１】次の性質を示す炭酸および／または重炭酸ー鉄ーラクトフェリン複合体。
１）ラクトフェリン類１分子当り、鉄を１００乃至１０００分子および、炭酸および／または重炭酸１５分子以上を含有すること、
２）ｐＨ２．１以上９．０以下で常温で少なくとも１ケ月間沈殿を生じないこと、
３）加熱しても沈殿を生じないこと、
４）鉄独特の収斂味がないこと。」
（以下、本件請求項１に係る発明という。）
　
３−３　甲第１号証記載の発明
　甲第１号証には、下記（イ）〜（ホ）に示す事項が記載されている。　　（イ）「重炭酸塩、及びリン酸塩の存在下で、ラクトフェリン（Ｌｆ）による第二鉄の溶解性を調べた。Ｌｆ、及びペプシン及びトリプシンで加水分解されたＬｆは、Ｌｆの特異な鉄結合能よりもはるかに高い７０倍モル当量の鉄を可溶化することができた。Ｌｆは、鉄欠乏貧血症を予防するための治療食の成分として有望であると思われる。」（第１３７６ページ左欄１行〜６行）
（ロ）「この研究においては、われわれは重炭酸塩及びリン酸塩のような抑制性の配位子の存在においてＬｆによる第二鉄イオンの溶解性を調査した。」（第１３７６ページ右欄１０行〜１２行）
（ハ）「Ｌｆ、加水分解Ｌｆ及びＣＣＰ（明治製菓社製）を５％の濃度で脱イオン水に溶解した。この試験に使用したこれらの溶液を、０．２２μｍ親水性濾過膜（ミリポア社製）により濾過して滅菌し、全ての試験管をオートクレーブ滅菌した。異なる量（８〜８００μｌ）の試料溶液を、１ｍｌ当たり４．３ｍｇのＦｅ３＋を含有する塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）溶液２５μｌと混合した。全容量を９００μｌに調整するために、各溶液を１００μｌの０．２Ｍ重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）又は０．２Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）と混合した。これらの溶液の鉄濃度を１．８７５ｍＭの一定に保持した。Ｌｆ溶液の色の即時変化は、Ｌｆが即時に鉄イオンと複合体を形成したことを示した。沈殿を生成させるために３７℃で４８時間保持した後、１０，０００×ｇで１０分間溶液を遠心分離した。」（第１３７６ページ右欄下から２行〜第１３７７ページ左欄１４行）      （ニ）「図３は、所定量の鉄及び重炭酸塩を含有するＬｆ溶液（５?５００μＭ）の色調、並びに沈殿生成における変化を示す。」（第１３７７ページ左欄２９行〜３１行）
（ホ）「ラクトフェリン５００（Ａ）、３００（Ｂ）、１２５（Ｃ）、６０（Ｄ）、３０（Ｅ）、１２．５（Ｆ）、５（Ｇ）、及び０（Ｈ）μＭを含有する塩化第二鉄溶液の色調及び沈殿生成における変化。溶液のｐＨは７．０?７．４の範囲であった。鉄イオン濃度は１．８７５ｍＭの一定に保持した。」（第１３７７ページ図３の標題および注）
　
３−４　対比・判断
　本件請求項１に係る発明と甲第１号証に記載の発明を対比、検討する。　　甲第１号証には、重炭酸塩の存在下でのラクトフェリンによる第二鉄の溶解性に関し、ラクトフェリンはラクトフェリンの特異な鉄結合能よりもはるかに高い７０倍モル当量の鉄を可溶化できることが記載され、さらに、鉄イオン濃度１．８７５ｍＭ及び重炭酸ナトリウム濃度０．０２Ｍの存在下、ラクトフェリンを５００（Ａ）、３００（Ｂ）、１２５（Ｃ）、６０（Ｄ）、３０（Ｅ）、１２．５（Ｆ）、５（Ｇ）、及び０（Ｈ）μＭ添加して試験したときの各試験区のラクトフェリン溶液の色調、並びに沈殿生成の有無が図３に示されている。
　上記図３によれば、試験区（Ａ）〜（Ｅ）においては、対照の試験区（Ｈ）とは異なる色調を呈し、かつ沈殿が生じていないのに対して、試験区（Ｆ）及び（Ｇ）においては、対照の試験区（Ｈ）と同じような色調を呈し、かつ沈殿が生成していることが確認できる。
　この試験結果は、上記試験区（Ａ）〜（Ｅ）においては、沈殿を生じない重炭酸ー鉄ーラクトフェリン複合体が形成されていることを、試験区（Ｆ）及び（Ｇ）においては、沈殿を生じない該複合体が形成されていないことを教示するものである。
　そして、上記各試験区におけるラクトフェリン１分子当たりの鉄分子数を算出すると、試験区（Ａ）においては鉄３．７５分子、試験区（Ｅ）においては鉄６２．５分子、試験区（Ｆ）においては鉄１５０分子、試験区（Ｇ）においては鉄３７５分子になり、同じくラクトフェリン１分子当たりの重炭酸分子数を算出すると、試験区（Ａ）〜（Ｇ）において重炭酸４０〜４０００分子になるものと認められる。
　そうだとすると、甲第１号証の試験区（Ａ）〜（Ｅ）においてそれぞれ形成される重炭酸ー鉄ーラクトフェリン複合体は、本件請求項１において特定する「ラクトフェリン類１分子当り、鉄を１００乃至１０００分子含有する」という要件を満足しないことは明らかであり、本件請求項１に係る重炭酸ー鉄ーラクトフェリン複合体が甲第１号証に記載されているということはできない。
　また、試験区（Ｆ）及び（Ｇ）においては、沈殿を生じない重炭酸ー鉄ーラクトフェリン複合体は形成されないという上記試験結果、及び甲第１号証の「ラクトフェリンはラクトフェリンの特異な鉄結合能よりもはるかに高い７０倍モル当量の鉄を可溶化できる」との記載に基づいて、本件請求項１で特定する上記複合体を製造することは、当業者が容易に想到し得ることではない。
　そして、本件請求項１に係る発明は、請求項１に記載の上記１）〜４）の性質を必須の構成要件とすることにより、特許明細書に記載されたとおりの効果を奏するものである。
　したがって、本件請求項１に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であるとすることはできず、また甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとすることもできない。
　
　また、訂正明細書の請求項２に係る発明は、請求項１を引用する発明であり、また、訂正明細書の請求項３〜６に係る発明は、請求項１に記載の上記１）〜４）の性質を必須の構成要件とする発明であるから、当該請求項２〜６に係る発明は、請求項１と同様の理由で、甲第１号証に記載された発明であるとすることはできず、また甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとすることもできない。
　
３−５　むすび
  以上のとおりであるから、特許異議申立ての理由及び提出した証拠方法によっては、本件請求項１ないし６に係る特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１ないし６に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年１１月７日（２０００．１１．７）
【訂正の要旨】
＜訂正の要旨＞
（ａ）特許請求の範囲の請求項１の「ラクトフェリン数１分子当り、鉄を１５乃至１０００分子」を「ラクトフェリン類１分子当り、鉄を１００乃至１０００分子」に訂正する。
（ｂ）特許請求の範囲の請求項３、４、５及び６の「ラクトフェリン類のモル濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の１／１５から１／１０００である。」を「ラクトフェリン類のモル濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の１／１００から１／１０００である。」に訂正する。
（ｃ）明細書５頁第１１行の「Ｌｆ類１分子当り、鉄を１５乃至１０００分子」を「Ｌｆ類１分子当り、鉄を１００乃至１０００分子」に訂正する。
（ｄ）明細書５頁第２３〜２４行及び第６頁第２６〜２７行の「Ｂ溶液のｉｘ）ラクトフェリン類のモルの濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の１／１５から１／１０００である必要がある。」を「Ｂ溶液のｉｘ）ラクトフェリン類のモルの濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の１／１００から１／１０００である必要がある。」に訂正する。
（５４）【発明の名称】
鉄−ラクトフェリン複合体及びその製造法
（５７）【特許請求の範囲】
　　【請求項１】　次の性質を示す炭酸および／または重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合体。
１）ラクトフェリン類１分子当り、鉄を
１００
２）ｐＨ２．１以上９．０以下で常温で少なくとも１ケ月間沈澱を生じないこと、
３）加熱しても沈澱を生じないこと、
４）鉄独特の収斂味がないこと。
　　【請求項２】　鉄−ラクトフェリン複合体に結合している炭素原子および鉄原子について、（（請求項１記載の鉄−ラクトフェリン複合体１モルあたりの総炭素原子モル数）−（鉄を結合していないラクトフェリン１モルあたりの総炭素原子モル数））／（請求項１記載の鉄−ラクトフェリン複合体１モルあたりの総鉄原子モル数）の値が０．１以上である請求項１記載の複合体。
　　【請求項３】　ｉ）炭酸、またはｉｉ）重炭酸、またはｉｉｉ）炭酸および重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）に、ｉｖ）鉄およびｖ）ラクトフェリン類を含有する溶液（Ｂ溶液）を混合することによって得られ、次の１）から４）の性質を示す炭酸および／または重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合体。
　ただし、このときＢ溶液のｖｉ）鉄イオンモル濃度は、ｖｉｉ）Ａ溶液と、Ｂ溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）に溶解しているｖｉｉｉ）炭酸イオンおよび重炭酸イオンのモル濃度の１／３以下であって、Ｂ溶液のｉｘ）ラクトフェリン類のモル濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の
１／１００
１）ラクトフェリン類１分子当り、鉄を
１００
２）ｐＨ２．１以上９．０以下で常温で少なくとも１ケ月間沈澱を生じないこと、
３）加熱しても沈澱を生じないこと、
４）鉄独特の収斂味がないこと。
　　【請求項４】　ｉ）炭酸、またはｉｉ）重炭酸、またはｉｉｉ）炭酸および重炭酸、かつｉｖ）ラクトフェリン類を含む溶液（Ａ溶液）に、ｖ）鉄を含有する溶液（Ｂ溶液）を混合することによって得られ、次の１）から４）の性質を示す炭酸および／または重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合体。
　ただし、このときＢ溶液のｖｉ）鉄イオンモル濃度は、ｖｉｉ）Ａ溶液と、Ｂ溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）に溶解しているｖｉｉｉ）炭酸イオンおよび重炭酸イオンのモル濃度の１／３以下であって、ｉｘ）Ａ溶液のラクトフェリン類のモル濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の
１／１００
１）ラクトフェリン類１分子当り、鉄を
１００
２）ｐＨ２．１以上９．０以下で常温で少なくとも１ケ月間沈澱を生じないこと、
３）加熱しても沈澱を生じないこと、
４）鉄独特の収斂味がないこと。
　　【請求項５】　ｉ）炭酸、またはｉｉ）重炭酸、またはｉｉｉ）炭酸および重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）に、ｉｖ）鉄およびｖ）ラクトフェリン類を含有する溶液（Ｂ溶液）を混合することを特徴とする、次の１）から４）の性質を示す炭酸および／または重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合体の製造法。
　ただし、このときＢ溶液のｖｉ）鉄イオンモル濃度は、ｖｉｉ）Ａ溶液と、Ｂ溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）に溶解しているｖｉｉｉ）炭酸イオンおよび重炭酸イオンのモル濃度の１／３以下であって、Ｂ溶液のｉｘ）ラクトフェリン類のモル濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の
１／１００
１）ラクトフェリン類１分子当り、鉄
１００
２）ｐＨ２．１以上９．０以下で常温で少なくとも１ケ月間沈澱が生じないこと、
３）加熱しても沈澱を生じないこと、
４）鉄独特の収斂味がないこと。
　　【請求項６】　ｉ）炭酸、またはｉｉ）重炭酸、またはｉｉｉ）炭酸および重炭酸、かつｉｖ）ラクトフェリン類を含む溶液（Ａ溶液）に、ｙ）鉄を含有する溶液（Ｂ溶液）を混合することを特徴とする、次の１）から４）の性質を示す炭酸および／または重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合体の製造法。
　ただし、このときＢ溶液のｖｉ）鉄イオンモル濃度は、ｖｉｉ）Ａ溶液と、Ｂ溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）に溶解しているｖｉｉｉ）炭酸イオンおよび重炭酸イオンのモル濃度の１／３以下であって、Ａ溶液のｉＸ）ラクトフェリン類のモル濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の
１／１００
１）ラクトフェリン類１分子当り、鉄を
１００
２）ｐＨ２．１以上９．０以下で常温で少なくとも１ケ月間沈澱を生じないこと、
３）加熱しても沈澱を生じないこと、
４）鉄独特の収斂味がないこと。
【発明の詳細な説明】
　　　【０００１】
　　【産業上の利用分野】
　本発明は、広いｐＨ域に対して安定であり、かつ耐熱性を示す炭酸および／または重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合体及びその製造法に関する。
　本発明の炭酸および／または重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合体は、鉄独特の収斂味を消し、鉄の持つ過酸化物生成促進作用を防止するので、貧血の予防あるいは治療、鉄強化あるいは病原菌付着防止を目的とした食品、医薬品、飼料、化粧品原料等として有用である。
　　　【０００２】
　　【従来の技術】
　ラクトフェリン（以下、Ｌｆという）には鉄吸収促進、過酸化脂質生成抑制、抗菌、抗ウィルス、細胞増殖、免疫系の制御など様々な生理機能が知られている。そこでＬｆを含有する食品、医薬品、飼料、化粧品などを製造する試みが色々なされている。このような製品の多くは加熱殺菌されたり、使用時に熱湯と接触する場合がある。しかしながら、Ｌｆは熱に不安定であり、熱変性すると沈澱したり、鉄結合能を失いその生理機能も失われてしまうという致命的な欠点があった。そこで、Ｌｆの熱安定化に関する検討が行われ、ｐＨ４にて加熱したＬｆは生のＬｆと同等に鉄を結合する能力を有することが報告された（Ｄａｖｉｄｓｏｎ　ａｎｄ　Ｌｏｎｎｅｒｄａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５７：Ｇ９３０−Ｇ９３４，１９８９）。しかし、このようにして調製されたＬｆは保存中に次第に変性し、その生理機能を失うという欠点があった。また、イオン強度の低い条件でＬｆを加熱すると生理活性を維持し得ることが知られている（特開平４−１０８６２９号公報）。しかし、実際の製品の系ではイオン強度は必ずしも低くない。そこでｐＨと電気伝導度Ωの関係が、Ｌｆの熱安定性におよぼす影響が検討され、
　　　ｌｏｇΩ　≦（２．９６／ｐＨ）＋０．６４　　（ｐＨ＜５）
　　　ｌｏｇΩ　≦（２９．３７／ｐＨ）−４．６２　（５≦ｐＨ≦７．９）
　　　ｌｏｇΩ　≦−０．９１７　　　　　　　　　　（ｐＨ＞７．９）
となるようにＬｆ含有溶液を調整することによってＬｆの熱安定化を図る方法が開発された（特開平４−８２６９号公報）。しかし、この条件を満たさない場合には、この条件に調整したＬｆ溶液と他の原料溶液を別々に殺菌し、無菌的に両者を混合するという手段をとる必要がある。ところが「乳および乳製品等に関する厚生省令」によれば、全ての原料を混合後加熱殺菌することが定められており、別々に殺菌することは実用的ではなかった。そこで本発明者らはさらに検討を重ねた結果、Ｌｆに鉄を十分量結合吸着させることで、耐熱性を賦与させることが可能となることを発見し、その製造方法について特許出願を行った（耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体およびその製法　特開平６−２３９９００号）。しかし、この発明においても、次のような欠点を有していた。
１．製造されたＬｆはｐＨ７．１以上の環境下では沈澱する。
２．製造されたＬｆはｐＨ６．５以上であってｐＨ７以下の環境下では可溶であり耐熱性もあるものの、Ｌｆに結合している鉄が、Ｌｆ１分子あたり１５０分子を越える場合には製造後、ｐＨ６．５以上であってｐＨ７以下の環境下に保存しておくと徐々に不溶化する。
　　　【０００３】
　　【発明が解決しようとする課題】
　本発明は、このような欠点を改善することを目的としてなされたものである。すなわち、本発明は、広いｐＨ範囲で長期間安定で、耐熱性も有する鉄−Ｌｆ複合体およびその製造方法を提供することを課題とする。
　　　【０００４】
　　【課題を解決するための手段】
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討したところ、
　１）炭酸イオンまたは重炭酸イオンを含有する溶液にＬｆ類および鉄イオンを含有する溶液を加えて混合すると炭酸または重炭酸−鉄−Ｌｆ複合体が形成されること、２）この複合体は、炭酸イオンまたは重炭酸イオンを含有する溶液に、炭酸イオンまたは重炭酸イオンに対して特定の比率のＬｆ類および鉄を含有する溶液を加えるという手段をとることによって初めて形成され、得られる鉄を高い比率で含有する複合体が広いｐＨ範囲で長期間に亘り安定で、しかも耐熱性を有し、さらに鉄独特の収斂味を消し、鉄の持つ過酸化物生成促進作用を防止することを見出して本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は、Ｌｆ類１分子当り、鉄を
１００
　　　【０００５】
　そしてこのような複合体は、ｉ）炭酸、またはｉｉ）重炭酸、またはｉｉｉ）炭酸および重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）と、ｉｖ）鉄およびｖ）ラクトフェリン類を含有する溶液（Ｂ溶液）を混合することによって得られ、このときＢ溶液のｖｉ）鉄イオンモル濃度は、ｖｉｉ）Ａ溶液と、Ｂ溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）に溶解しているｖｉｉｉ）炭酸イオンおよび重炭酸イオンのモル濃度の１／３以下、好ましくは１／１０、より好ましくは１／３０、さらには１／６０、最も好ましくは１／１００であって、Ｂ溶液のｉｘ）ラクトフェリン類のモルの濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の
１／１００
　Ｂ溶液の鉄とラクトフェリン類はそれぞれ別々に溶解した溶液をＡ溶液に混合して作成してもよいし、Ａ溶液に別々に混合しても構わない。ただし、鉄溶液をラクトフェリン類溶液より先に添加してはならない。また、反応は溶液内で行われる必要があるが、添加する鉄またはラクトフェリン類のいづれか一方が固体状であっても構わない。さらに、反応溶液中の炭酸イオンおよび重炭酸イオンモル濃度を高く保つために、あらかじめ、溶解しきれない量の炭酸および／または重炭酸塩をＡ溶液に含有させておいてもよいし、Ａ溶液にＢ溶液を添加している途中、つまり、Ｂ溶液の一部がＡ溶液に添加されている階段の反応溶液にｉ）炭酸および／または重炭酸塩、および／またはｉｉ）炭酸および／または重炭酸溶液を添加してもよい。
　　　【０００６】
　また、Ａ溶液にＢ溶液を添加する際には、Ａ溶液の炭酸および／または重炭酸塩、および／または炭酸および／または重炭酸溶液のｐＨが徐々に減少する。この際に、ごくたまに、製造中に沈澱を生じることがある。Ｂ溶液のｐＨは８から９の間にあり、また、Ｌｆの等電点が同じくｐＨ８から９であること（Ｅ．Ｎ．ベーカー、アドバンス　イン　オーガニック　ケミストリー４１，３９０）から、この現象はＬｆおよび／または鉄−Ｌｆ複合体が等電点沈澱をおこしている可能性がある。これを避けるためには、ＡおよびＢ溶液の混合溶液のｐＨをＬｆの等電点より高い値で保つか、ＡおよびＢ溶液の混合液のｐＨがＬｆおよび／または鉄−Ｌｆ複合体の等電点より高いｐＨで製造を終了させるか、Ｂ溶液のｐＨをＬｆの等電点以下に調整してから、あるいは混合液のｐＨをＢ溶液添加中に随時、等電点以下に調整することが好ましい。このようにすると、Ｌｆおよび／または鉄−Ｌｆ複合体の等電点沈澱と思われる沈澱がおさえられ、特に工業規模で行う生産の場合にはより確実に安定的に鉄−Ｌｆ複合体を製造することができる。
　　　【０００７】
　また、本発明の鉄−Ｌｆ複合体は、ｉ）炭酸、またはｉｉ）重炭酸、またはｉｉｉ）炭酸および重炭酸、かつｉｖ）ラクトフェリン類を含む溶液（Ａ溶液）と、ｖ）鉄を含有する溶液（Ｂ溶液）を混合することによっても得られ、このときＢ溶液のｖｉ）鉄イオンモル濃度は、ｖｉｉ）Ａ溶液と、Ｂ溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）に溶解しているｖｉｉｉ）炭酸イオンおよび重炭酸イオンのモル濃度の１／３以下、好ましくは１／１０、さらに好ましくは１／３０、さらには１／６０、最も好ましくは１／１００以下であって、Ａ溶液のｉｘ）ラクトフェリン類のモルの濃度は、Ｂ溶液のｘ）鉄イオンモル濃度の
１／１００
　この製法においても、等電点付近で極くまれに起こる沈澱を防止するため、前記した方法を使用することが好ましい。
　　　【０００８】
　本発明において使用するＬｆ類にはヒトやウシなどの哺乳類の乳などの分泌液から分離されるラクトフェリン、または血液や臓器などから分離されるトランスフェリン、卵などから分離されるオボトランスフェリンなどがある。これらはすでに大量に分離する方法がいくつも知られているが、どのような方法で分離されたものであってもよい。また、遺伝子操作によって微生物、動物細胞あるいはトランスジェニック動物から生産されたものであってもよい。
　また、これらＬｆ類は酵素分解したものであってもよい。Ｌｆ類は完全に分離されている必要はなく、他の成分が含まれていても構わない。
　　　【０００９】
　添加する鉄の量はＬｆ１モルに対して鉄イオンとして１５モル以上、より好ましくは３０モル以上、さらに好ましくは６０モル以上であり、上限は１０００モル以下、好ましくは４８０モル以下である。製造に要する時間を短くするため又は、収率を落とさないためには２４０モル以下が好ましい。加える鉄量が前記の上限を越えると鉄が沈澱してくる。
　使用する鉄剤は、脱イオン水に溶解した時のｐＨが４以下を示す鉄塩、例えば塩化第２鉄、硝酸第２鉄、硫酸第２鉄など、主に３価の鉄剤を例示できる。脱イオン水に溶解した時のｐＨが４を越える鉄塩、例えば硫酸第１鉄などでは鉄−Ｌｆ複合体を形成することができない。また、この時にｐＨを４以下に下げても鉄−Ｌｆ複合体を形成することはできない。
　　　【００１０】
　次に鉄剤の種類による熱安定性の違いを試験例にて示す。
　　【試験例１】
　（材料）
（Ａ溶液）１モル／リットルの重炭酸ナトリウムを含むｐＨ８．３の溶液１リットル
（Ｂ１溶液）各種鉄剤を鉄として５ミリモル含む溶液０．２リットル
（Ｂ２溶液）Ｌｆ（オレオフィナ社製）３３マイクロモルを含む溶液０．８リットルＢ１溶液とＢ２溶液を混合後（Ｂ溶液）、Ａ溶液にＢ溶液を加え、鉄を結合したＬｆを作成した。この溶液を分子量５０００カットの限外濾過膜で脱塩・濃縮後、最終濃度０．０５モル／リットルのイミダゾール、０．１５モル／リットルの食塩を含むｐＨ７．５の液状食品を模倣した緩衝液（模擬緩衝液）で３．６ミリモル／リットルの鉄濃度となるまで希釈し、９０℃１０分間加熱し、Ｌｆの沈澱の生成を観察した。その結果を表１に示す。
　　　【００１１】
　【表１】
　このように、脱イオン水に溶解した時のｐＨが４以下の鉄剤を使用しないと本発明の鉄−Ｌｆ複合体は形成できない。また、脱イオン水に溶解した時のｐＨが４を越える場合に、そのｐＨを４以下に調整しても本発明の鉄−Ｌｆ複合体は形成できない。
　　　【００１２】
　炭酸または重炭酸を含むＡ溶液としては、炭酸水、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム溶液およびそれらの混合溶液などを例示することが出来る。これらにｐＨ調整剤として水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム、塩酸、クエン酸、乳酸などを混合して使用することができる。また、このＡ溶液には、それ以外の物質、例えば、糖、蛋白質、脂肪などが含まれていても構わない。
　　　【００１３】
　しかし、重要なことは反応時の鉄イオン濃度と、炭酸イオンおよび重炭酸イオン濃度の比が、鉄−Ｌｆ複合体の熱安定性に影響を及ぼす点である。このことに関する試験例を示す。
　　【試験例２】
（材料）
（Ａ溶液）各濃度の重炭酸ナトリウムを含む溶液１リットル
（Ｂ１溶液）塩化第二鉄を含む溶液０．２リットル
（Ｂ２溶液）Ｌｆ１ミリモルを含む溶液０．８リットル
　Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合して溶液Ｂを作成し、Ａ溶液にＢ溶液を１リットル加えて鉄を結合したＬｆを作成した。なお、Ｂ溶液は脱イオン水で希釈したものも用いた。最終重炭酸イオンモル濃度を０．６以上とする場合にはＡ溶液とＢ溶液混合時に重炭酸ナトリウムを添加するか、あらかじめＡ溶液に必要量の重炭酸ナトリウムを添加し、飽和の溶液とした。この溶液を分子量５０００カットの限外濾過膜にて加水脱塩し、さらに濃縮した。そして、模擬緩衝液で３．６ミリモル／リットルの鉄濃度となるまで希釈し、９０℃１０分間加熱し、Ｌｆの沈澱生成を観察した。その結果を表２に示す。なお、表の最小重炭酸イオン鉄イオン比は、Ａ溶液とＢ溶液混合後の重炭酸イオンモル濃度を、Ｂ溶液の鉄イオンモル濃度で除して算出した。
　　　【００１４】
　【表２】
　　　【００１５】
　【表３】
　　　【００１６】
　以上のように、Ｂ溶液の鉄濃度を高めるにつれて、ＡＢ混合溶液の重炭酸イオン濃度を高める必要がある。このように、本発明の鉄−Ｌｆ複合体の調製にあたっては、Ａ溶液にＢ溶液を添加して行く過程において、添加した鉄１分子の周囲には少なくとも３分子、好ましくは１０分子以上の炭酸および／または重炭酸分子が常に存在している必要がある。さらにいえば、Ｌｆ１分子に２００分子を越える量の鉄分子を結合させる場合には、鉄１分子の周囲には３０分子以上、好ましくは６０分子以上、より好ましくは１００分子以上の炭酸イオンおよび／または重炭酸イオン分子が存在しているとよい。
　　　【００１７】
　次に、本発明の鉄−Ｌｆ複合体には、どのくらいの炭酸および／または重炭酸が結合しているかについて次の検討を行った。
　　【試験例３】
　（材料）
（Ａ溶液）各濃度の重炭酸ナトリウムを含む溶液１リットル
（Ｂ１溶液）塩化第二鉄１００ミリモルを含む溶液０．２リットル
（Ｂ２溶液）Ｌｆ１ミリモルを含む溶液０．８リットル
　Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合後（Ｂ溶液）、Ａ溶液にＢ溶液を加え、４℃および３７℃にて各反応時間、ゆっくり撹拌して鉄を結合したＬｆを調製した。この溶液を模擬緩衝液で３．６ミリモル／リットルの鉄濃度となるまで希釈し、９０℃、１０分間加熱し、Ｌｆの沈澱生成を観察した。さらに、１９２時間反応後の溶液を分子量５０００カットの限外濾過膜にて鉄を結合したＬｆと水溶液を分離し、膜を透過した溶液中の炭酸イオンおよび重炭酸イオン濃度をイオンクロマト法により分析した。その結果を表４及び表５に示す。
　　　【００１８】
　【表４】
　　　【００１９】
　【表５】
　　　【００２０】
　以上のように、低温下で長時間反応させると炭酸イオンおよび重炭酸イオン／鉄イオン比が１であっても本発明の鉄−Ｌｆ複合体を形成できる。しかし、これ以上の低濃度であると長時間反応させても製造できない。さらに１９２時間反応後の限外濾過膜透過液中の炭酸イオンおよび重炭酸イオン濃度が、最小重炭酸イオン／鉄イオン比が１以下の場合、脱イオン水の濃度と同じであることより、Ａ溶液中の重炭酸は全て鉄−Ｌｆ複合体と結合したものと考えられる。また、３７℃で反応させた場合には、炭酸イオンおよび重炭酸イオン／鉄イオン比が２以下では本発明の鉄−Ｌｆ複合体は形成できない。
　　　【００２１】
　この結果から、本発明の鉄−Ｌｆ複合体には炭酸および／または重炭酸イオンが結合鉄あたり１分子以上含有しているものと考えられる。さらにこの鉄−Ｌｆ複合体形成の反応速度を上げるためには炭酸イオンおよび／または重炭酸イオン濃度を高めることが効果的であることも明らかとなった。
　また、この例から、Ｂ溶液のｉ）鉄イオンモル濃度が、ｉｉ）Ａ溶液と、Ｂ溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶液）のｉｉｉ）炭酸イオンおよび重炭酸イオンモル濃度と同等であっても、鉄−Ｌｆ複合体を形成可能であることが明らかとなった。しかしながら、この条件では、製造に極端に時間を要するため、実用的ではない。
　　　【００２２】
　　【試験例４】
　さらに元素分析により鉄原子および炭素原子のモル数を分析し、本発明の鉄−Ｌｆ複合体の特徴を示す。
　モノクローナル抗体により精製した純度９９％のウシＬｆ（東洋紡績社）はＬｆ溶液を０．１％エチレンジアミン四酢酸を含む０．１モル／リットル　クエン酸溶液（超純水）に対して分子量１００００カットの透析膜（スペクトロポア社）で３日間透析し、脱鉄し、超純水に対してさらに４日間透析を行い、完全に鉄を除去し、さらに凍結乾燥を行った。１モル／リットルの重炭酸ナトリウムを含むｐＨ８．３の溶液１０ミリリットル（Ａ溶液）、塩化第二鉄を３００マイクロモル含む溶液を２ミリリットル（Ｂ１溶液）、Ｌｆ２．５マイクロモルを含む溶液８ミリリットル（Ｂ２溶液）を調製した。Ｂ１溶液にＢ２溶液を混合し（Ｂ溶液）、Ａ溶液にＢ溶液１０ミリリットルを加え、鉄−Ｌｆ複合体を調製し、試料１とした。同様にして、Ｂ１溶液の塩化第二鉄を１．７５ミリモルとして作製した鉄−Ｌｆ複合体を試料２とした。また、脱鉄した未処理のＬｆを試料３とし、試料１、２および３は超純水に対して、５日間分子量１００００カットの透析膜（スペクトロポア社）で透析し、凍結乾燥した。さらに、メノウ乳鉢で良く粉化した後、４５℃、４８時間真空乾燥機により、水分を除去した。得られた試料は原子吸光分析機（ＩＣＰ）により鉄含有量、ＣＨＮ元素分析機により炭素含有量を分析した。
　　【００２３】
　【表６】
　　【００２４】
　以上の元素分析の結果から、本発明の鉄−Ｌｆ複合体には通常のＬｆよりも多量の炭素原子および鉄原子が結合していることが明らかとなった。また、本実験系において、炭素原子が増えたのは、重曹から供給されているとしか考えられず、炭酸イオンまたは重炭酸イオンが鉄原子と結合していることが本試験例で示された。鉄分子に対する炭素原子の割合は０．１以上であったことから、鉄原子１に対して炭酸イオンまたは重炭酸イオンが０．１分子以上の割合で結合していることがわかる。また、試験例３において鉄１分子に対して重炭酸イオンが１分子結合していることが考えられたので、製造条件より鉄、炭素原子の結合割合は変化していると思われる。いずれにしても、本試験例から、炭酸および／または重炭酸イオン、および鉄イオンが鉄−Ｌｆ複合体に結合していることは明らかである。なお、試料３では鉄原子は検出されず、透析により遊離の鉄はほとんどすべて除去されていることを確認した。
　　　【００２５】
　　【試験例５】
　特開平７−１７８７５号公報ではＬｆ溶液に鉄塩を添加した後、アルカリを加えてｐＨを上げ、次いでその溶液から遊離の鉄を除去した後、溶液を蒸発させ、Ｌｆ粉末として取り出すことからなるＬｆ１グラム当たり２．１グラム以上の鉄を安定な状態で保持する鉄／Ｌｆ粉末の製造方法について開示されている。また、特開平４−１４１０６７号公報ではＬｆ１グラムに対して少なくとも１．５ミリグラム以上の割合の鉄に相当する鉄化合物を添加し、Ｌｆと鉄を反応させて鉄／Ｌｆ溶液を調製する製造方法について開示されている。本試験例ではこれらの鉄／Ｌｆ溶液と本発明の鉄−Ｌｆ複合体との構造上の違いについて試験例で示す。
　　　【００２６】
　使用したＬｆは試験例４で示したとおりに脱鉄したものを使用した。本発明の鉄−Ｌｆ複合体は実施例４の試料１と同様に調製し、試料１とした。特開平７−１７８７５号公報の鉄／Ｌｆ溶液はＬｆ２．５マイクロモルを含む溶液２０ミリリットルに塩化第二鉄を１００マイクロモル添加した。さらに、この溶液に１モルの水酸化ナトリウム水溶液を微量ずつゆっくり滴下し、ｐＨが９になるまで調製し、試料２とした。特開平４−１４１０６７号公報の鉄／Ｌｆ溶液はＬｆ２．５マイクロモルを含む溶液２０ミリリットルに鉄として硫酸第一鉄七水和物を３００マイクロモル添加して作製し、試料３とした。さらに対照として脱鉄したＬｆを同じく実施例４の方法で調製し、試料４とした。得られた４つの試料は試験例４と同様に脱塩、凍結乾燥、真空乾燥したのち、鉄原子を原子吸光分析機により、窒素、炭素および水素原子をＣＨＮ元素分析機により分析した。
　　　【００２７】
　　【表７】
　　　【００２８】
　以上の結果から、本発明の鉄−Ｌｆ複合体（試料１）は、通常のＬｆと比較して炭素原子、水素原子、および鉄原子が通常のＬｆよりも極めて多量に結合していることがわかる。このことから、本発明の鉄−Ｌｆ複合体は通常のＬｆとは異なる構造体を形成していることが明らかである。一方、特開平７−１７８７５号公報に開示された鉄／Ｌｆ溶液（試料２）では水素原子で結合水等の影響が出るため、ややばらつきが認められるものの、炭素原子、水素原子、窒素原子ともに通常のＬｆと同じであり、鉄原子のみが増加していることから、本発明の鉄−Ｌｆ複合体とは異なる状態で鉄が存在していることがわかる。さらに、特開平４−１４１０６７号公報の鉄／Ｌｆ溶液も同様に、炭素原子、水素原子、窒素原子ともに通常のＬｆと同じであり、鉄原子のみが若干増加していることがわかる。以上のことから、構造上、本発明の鉄−Ｌｆ複合体は特開平７−１７８７５号公報および特開平４−１４１０６７号公報の鉄／Ｌｆ溶液とは全く構造上違うものであることが明らかである。
　　　【００２９】
　一般にＬｆ、鉄および重炭酸塩を混合すると鉄飽和型Ｌｆが生成することは、従来から知られている。ＬｆはＮロープと呼ばれる領域とＣロープと呼ばれる類似した領域との二つの領域で構成されている。鉄はこの二つの領域のそれぞれに１分子づつ結合する。すなわち、Ｎロープでは、Ａｓｐ６０，Ｔｙｒ１９２，Ｔｙｒ１９２，Ｈｉｓ２５３の４個のアミノ酸残基に１分子の鉄イオンが結合し、さらにこの鉄にＣＯ３２−が１個結合している。Ｃロープにおける同様な鉄結合部位はＡｓｐ３９５，Ｔｙｒ４３５，Ｔｙｒ５２８，Ｈｉｓ５９７である（Ｂ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０９：７１１−７３４，１９８９）。したがって、通常鉄飽和型Ｌｆというのは、Ｌｆ１モル当たり鉄が２モル、ＣＯ３２−が２モル結合している。また、鉄飽和型Ｌｆは鉄の結合していないＬｆに比べると若干安定性が増すが、６５℃以上で加熱すると沈澱してしまう。
　ところが本発明による鉄−Ｌｆ複合体は鉄の結合量、炭酸および／または重炭酸の結合量がいわゆる鉄飽和型Ｌｆよりはるかに多い。
　　　【００３０】
　また、特開平４−１４１０６７号公報において、Ｌｆに多量の鉄を添加すると鉄がＬｆに結合し非遊離状態となり、鉄が安定化されることが示されているが、鉄を多量に添加することによってＬｆに耐熱性が付与されることは何ら示されていない。また、同公報では炭酸イオンまたは重炭酸イオンの必要性や炭酸・炭酸塩・重炭酸塩を用いるということも何ら示されておらず、全ての実施例においても炭酸・炭酸塩・重炭酸塩が使用されていない。さらに、試験例５から鉄原子、炭素原子、水素原子数が本発明の鉄−Ｌｆ複合体と明らかに異っている。したがって本発明による鉄−Ｌｆ複合体とは全く異なる。
　　　【００３１】
　本発明の鉄−Ｌｆ複合体は、炭酸および／または重炭酸の結合量、および鉄結合量がいわゆる鉄を２分子結合した通常鉄飽和型Ｌｆより遥に多い。炭酸および／または重炭酸、および鉄がＬｆの高次構造（３次、４次）変化を起こしたり、炭酸および／または重炭酸、および鉄がＬｆの周囲を取り囲んでいたりするものと考えられる。実際、通常鉄飽和Ｌｆを認識する抗Ｌｆ抗体による本発明の鉄−Ｌｆ複合体の認識の程度は炭酸および／または重炭酸と鉄がＬｆに結合するに従って、低くなっていく。その様子を次に示す。
　　　【００３２】
　　【試験例６】
　Ｌｆは、Ｌｆ溶液を０．１％エチレンジアミン４酢酸を含むクエン酸緩衝液に対して透析し、脱鉄した後、水に対して透析して凍結乾燥したものを用いた。１モル／リットルの重炭酸ナトリウムを含むｐＨ８．３の溶液１リットル（Ａ溶液）、塩化第二鉄を鉄イオンとして０から４８０ミリモルを含む溶液０．２リットル（Ｂ１溶液）、Ｌｆ１ミリモルを含む溶液０．８リットル（Ｂ２溶液）を調製した。Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合後、１〜１００倍に脱イオン水で希釈した（Ｂ溶液）。Ａ溶液にＢ溶液１リットルを加え、鉄を結合したＬｆを調製した。この溶液を模擬緩衝液で倍々に希釈した。
　一方、ＥＬＩＳＡ用プレートに抗ウシＬｆ抗体をコートした後に、ブロックエース（大日本製薬（株）販売）でブロッキングした。先に調製したＬｆ溶液を添加し、室温にて１時間反応させた後、パーオキシダーゼを標識した抗ウシＬｆ抗体を反応させた。よく洗浄した後にＡＢＴＳ基質を加え、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
　このように、鉄がＬｆに対して２分子結合しているときは、鉄がない場合と同様に認識されるのに対して、鉄量が増えるにしたがって、抗体で認識されなくなった。その結果を表８に示す。なお、表の認識率とは、鉄を結合したＬｆの溶液に含有されるＬｆ量に対する、本測定法で定量されるＬｆ量の比率をいう。
　　　【００３３】
　　【表８】
　　　【００３４】
　さらに本発明の鉄−Ｌｆ複合体は、特開平６−２３９９００号あるいは特開平４−１４１０６７号の鉄／ＬｆとｐＨ安定性の面でも異なっている。このことを次の試験例で示す。
　　【試験例７】
　本発明の鉄−Ｌｆ複合体の作製は試験例６と同様に行った。特開平６−２３９９００号の鉄−Ｌｆ結合体は、Ｌｆ３３．７５マイクロモル／リットルの水溶液に塩化第２鉄を鉄として０．５〜１６．２ミリモル／リットルとなるよう添加し、重炭酸ナトリウムでｐＨを６．２に調整して作製した。特開平４−１４１０６７号の鉄／Ｌｆ溶液は、１２．５マイクロモル／デシリットルとなるようＬｆを溶解した水溶液に硫酸第１鉄７水和物を鉄として１８７〜６０００マイクロモル／デシリットル溶解して作製した。この際、炭酸イオンおよび／または重炭酸イオンを発生する炭酸・炭酸塩・重炭酸塩などは使用していない。このように３つの方法で作製した各試料を分子量５０００カットの限外濾過膜にて脱塩・濃縮し、模擬緩衝液（ｐＨ６．４あるいは７．２）にて、Ｌｆとして１２５マイクロモル／リットルとなるよう希釈した。ｐＨを６．５と７．３にそれぞれ調整し、ネジ口付き試験管に密封した後、９０℃、１０分間加熱し、室温まで自然冷却した後に、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清中のＬｆ含量を測定した。なお、この測定にはＢｉｏＲａｄ社製Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔを使用した。上清に残存しているＬｆの割合を表９に示す。
　　　【００３５】
　　【表９】
　　　【００３６】
　このように、本発明ではｐＨ６．５あるいは７．３のいずれにおいても耐熱性を示したが、特開平６−２３９９００号ではｐＨ６．５では耐熱性を示したものの、ｐＨ７．３では耐熱性を示さなかった。また、特開平４−１４１０６７号ではｐＨ６．５および７．３のいずれにおいても耐熱性を示さなかった。
　　　【００３７】
　　【試験例８】
　塩濃度の低い領域では、通常のＬｆでも耐熱性があることが知られている（特開平４−８２６９号）。以下に、本発明の鉄−Ｌｆ複合体のみが塩濃度の高い領域で耐熱性があることを示す。
　本発明の鉄−Ｌｆ複合体の作製は、試験例６と同様に行った。特開平６−２３９９００号の鉄−Ｌｆ結合体および、特開平４−１４１０６７号の鉄／Ｌｆ溶液の作製は試験例７と同様に行った。また、特開平７−１７８７５号の鉄／Ｌｆ溶液は、ＡおよびＢ法の２通りについて作製した。Ａ法では１２．５マイクロモル／デシリットルとなるようＬｆを溶かした水溶液に、塩化第二鉄を鉄として０．５〜１６．２ミリモル／リットルとなるように添加し、さらに１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを９．０に調整して作製した。Ｂ法では１２．５マイクロモル／デシリットルとなるようにＬｆを溶かした５０ミリモル／リットル　シュウ酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）に溶解し、塩化第二鉄を０．５〜１６．２ミリモル／リットルとなるように添加し、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを９．０に調整し作製した。このように５つの方法で作製した各試料を分子量分画１０，０００カットの限外濾過膜（アドバンテック社）にて脱塩、濃縮し、Ｌｆとして２５０マイクロモル／リットルとなるように超純水で希釈した。この時の電気伝導度は０．２ミリジーメンス／センチメートルであった。さらに模擬緩衝液（ｐＨ７．０）で４倍に希釈し、さらに塩濃度を上げるために３０ミリモル／リットルになるように食塩をそれぞれ添加した。ネジ口付き試験管に密封した後、９０℃、１０分間加熱し、Ｌｆの沈澱生成を観察した。沈澱の認められないものを０、沈澱のやや認められるものを１、沈澱の多いもの、および鉄／Ｌｆ溶液作成中にすでに沈澱を生じたものを２とした。
　　　【００３８】
　　【表１０】
　　　【００３９】
　Ｌｆはイオン強度が低い場合、耐熱性があることが既に開示されている（特開平４−８２６９号）。このなかで、Ｌｆ水溶液又は鉄結合型Ｌｆの加熱殺菌が可能な電気伝導度範囲を以下の式によって開示している。
　　ＬｏｇΩ≦２．９６／ｐＨ＋０．６４　　（ｐＨ＜５）　　　　　　▲１▼
　　ＬｏｇΩ≦２９．３７／ｐＨ−４．６２　（５≦ｐＨ≦７．９）　　▲２▼
　　ＬｏｇΩ≦−０．９１７　　　　　　　　（ｐＨ＞７．９）　　　　▲３▼
　ただし、Ωは電気伝導度（ミリジーメンス／センチメートル）を示す。
　例えば、本試験例で脱塩後のｐＨは約７．０であったので、ｐＨ７．０における通常のＬｆの加熱殺菌可能な電気伝導度範囲を計算すると、以下の通りになる。
　▲２▼式より
　　ＬｏｇΩ≦２９．３７／７−４．６２
　　　　　　≦−０．４２
　　これより
　　　　　Ω≦１０−４．６２
　　　　　　≦０．３８　　　　　　　　　▲４▼
　　　【００４０】
　すなわち、電気伝導度０．３８ミリジーメンス／センチメートル以下であれば、殺菌することが可能であることが既に明らかとなっている。従って、通常の脱塩処理によって、Ｌｆは加熱殺菌が可能となる。各試料は異なる調製法であるため、一度全て脱塩し、再度食塩にて塩濃度を上げて同一条件で、その耐熱性試験を行った。今回行った脱塩処理では０．２ミリジーメンス／センチメートルまで脱塩し、０．０３モル／リットルの食塩を添加し、耐熱性試験を行ったものである。この時の電気伝導度は０．５３ミリジーメンス／センチメートルであった。この値は▲４▼よりも高い値であり、通常のＬｆでは耐熱性が認められない領域である。
　表１０から、本発明の鉄−Ｌｆ複合体においては沈澱が認められず、熱に対して通常のＬｆとは異なる高い熱安定性をもつことを示した。また、特開平６−２３９９００号でも通常のＬｆと異なる高い熱安定性を示したが、Ｆｅ／Ｌｆ比が高いところでは不安定になった。特開平４−１４１０６７号および、特開平７−１７８７５号ではいずれも沈澱したことから、通常のＬｆと同程度の耐熱性しかもたないことが示された。このことから、本発明の鉄−Ｌｆ複合体は通常のＬｆおよび他の開示された鉄／Ｌｆ溶液とは異なる構造をとって高い耐熱性を示していることがわかる。
　　　【００４１】
　また、本発明の組成物のより高い電気伝導度における耐熱性については試験例９に示す。
　　【試験例９】
　試験例６と同様にして鉄−Ｌｆ複合体を調製した。ただし、Ｂ１液の鉄含量は１０００ミリモルまでとした。
　この溶液を分子量５０００カットの限外濾過膜で脱塩・濃縮した後、模擬緩衝液でＬｆ含量として６２５マイクロモル／リットルとなるよう希釈した。この場合の模擬緩衝液は、ｐＨ２．０〜３．５はグリシン−塩酸、ｐＨ３．５〜６．０は酢酸、ｐＨ６．０〜７．８はイミダゾール−塩酸、ｐＨ７．８〜９．３はホウ酸−塩化カリウム−水酸化ナトリウムを緩衝剤とした。また、電気伝導度の調整は塩化ナトリウムを用いた。これをネジ口付き試験管に密封した後、９０℃、１０分間加熱し、室温まで自然冷却した後に、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離、上清中のＬｆ含量を測定した。なお、この測定にはＢｉｏＲａｄ社製Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔを使用した。上清に残存しているＬｆの割合を表１１及び表１２に示す。
　　　【００４２】
　【表１１】
　　　【００４３】
　【表１２】
　　　【００４４】
　このようにＬｆ１分子に対して、鉄が１５分子以上１０００分子以下でないと耐熱性が得られず、この範囲内であれば、ｐＨ２．１から９．０の範囲で耐熱性が確認された。さらに言えば、Ｌｆ１分子に対して、鉄が１５分子よりも３０分子のほうが耐熱性が高く、３０分子よりも６０分子、６０分子よりも１２０分子のほうがさらに耐熱性が高い。また、Ｌｆ１分子に対して、鉄が１０００分子よりも４８０分子、４８０分子よりも２４０分子のほうが耐熱性が高い。Ｌｆ１分子に対して、鉄が１０００分子結合している場合は、ｐＨ５以下よりｐＨ５を超える場合のほうが耐熱性が高い。
　特開平６−２３９９００号の方法にて製造された鉄−Ｌｆ結合体は鉄が７２０分子以上Ｌｆに結合することができず沈澱するが、本発明では１０００分子の鉄を結合することができるので、この点からも本発明の鉄−Ｌｆ複合体と特開平６−２３９９００号の方法にて製造された鉄−Ｌｆ結合体は異なっているといえる。
　特開平４−８２６９号ではＬｆの配合された飲料を殺菌する場合、製品の最終ｐＨは電気伝導度Ωの関係が、
　ｌｏｇΩ（ミリジーメンス／センチメートル）＞（２．９６／ｐＨ）＋０．６４（ｐＨ＜５）
　ｌｏｇΩ＞　（２９．３７／ｐＨ）−４．６２（５≦ｐＨ≦７．９）
　ｌｏｇΩ＞　−０．９１７（ｐＨ＞７．９）
であるような場合でないと沈澱を生じたり、Ｌｆが鉄を結合できなくなるような変性を受けるとしている。
　　　【００４５】
　本発明によって得られた鉄−Ｌｆ複合体を配合した製品を製造する場合、１５０ミリジーメンス／センチメートルであって、ｐＨが２．１から９．０の範囲であっても耐熱性を有する極めて安定な鉄−Ｌｆ複合体であるため、ΩとｐＨの関係が上に記した関係以外の場合であっても製造上、全く問題を生じない。
　　　【００４６】
　次に、本発明と特開平６−２３９９００号、特開平７−１７８７５号及び特開平４−１４１０６７号との保存安定性の違いを示す。
　　【試験例１０】
　試験例７、試験例８および試験例９と同様に鉄−Ｌｆ複合体、鉄−Ｌｆ結合体および鉄／Ｌｆ溶液を作製し、試験例９と同様に脱塩して５ミリジーメンスとなるよう電気伝導度を調整した。遠心処理した各試料を密封して９０℃、１０分間加熱した後、室温（３７℃）で一ヵ月保存した。その後の沈澱量を目視にて判定した。沈澱の認められないものを０、沈澱がやや認められるものを１、沈澱が多いものを２とした。なお、特開平７−１７８７５号については、保存期間３週間で行った。
　試験例７の鉄−Ｌｆ結合体および鉄／Ｌｆ溶液の結果を表１３に、試験例９の鉄−Ｌｆ複合体の結果を表１４に、それぞれ示す。
　　　【００４７】
　【表１３】
　　　【００４８】
　【表１４】
　　　【００４９】
　表１３および１４から、本発明の鉄−Ｌｆ複合体はｐＨ２．１から９．０の範囲において、９０℃、１０分の熱ストレスを与えた後であっても、常温で高い保存安定性を有していた。
　表１３から本発明の鉄−Ｌｆ複合体は、他の特許に開示されたＬｆにはない保存安定性があることがわかる。特開平６−２３９９００号ではｐＨ６．５ではＦｅ／Ｌｆモル比が１５０以下であれば安定であるが、ｐＨ７．３では保存安定性がないことがわかる。また、特開平４−１４１０６７号のＬｆ溶液はｐＨ６．５および７．３において、すでに耐熱性がないため、当然のことながら保存安定性を欠いていた。
　また、特開平７−１７８７５号においても、ＡおよびＢ法ともに保存安定性は認められなかった。
　　　【００５０】
　本発明によって得られたＬｆを配合した製品を製造する場合、その製造工程については特に制限はない。
　殺菌は、通常実施されている工程に従い処理し、加熱殺菌あるいは滅菌する。加熱処理は６５℃、３０分間の低温殺菌、１２０℃、２〜３秒間、１４０〜１５０℃、３〜５秒間、あるいはレトルト処理も可能である。
　また、乾燥すればＬｆ含有粉末製品を得ることが出来る。凍結乾燥でもよいが、大量に処理する場合には乾燥コストの安い噴霧乾燥が適している。再溶解させることを目的とした場合には、脱脂乳、乳清、カゼイン、ゼラチン、ショ糖、澱粉などに混合すると溶解性が向上する。
　このようにして得られたＬｆ含有製品は鉄が含まれているので、貧血予防あるいは治療を目的とした食品、飼料、医薬品に特に適している。特に、鉄の収斂味を完全に抑えるので、鉄強化食品や経口投与の医薬品への鉄材として優れている。さらに鉄の過酸化物生成促進作用を防止する性質もあるため、脂肪など酸化され易い食品などへの鉄材として利用価値が高い。
　　　【００５１】
　　【試験例１１】
　試験例７と同様にして鉄−Ｌｆ複合体、鉄−Ｌｆ結合体および鉄／Ｌｆ溶液を調製した。但し、Ｌｆの終濃度は１３．２マイクロモル／リットルとし、添加した鉄剤の終濃度は鉄量として１．９８ミリモル／リットルとなるよう調製した。なお、鉄剤としては、本発明の鉄−Ｌｆ複合体及び特開平６−２３９９００号の鉄−Ｌｆ結合体では塩化第二鉄を使用し、特開平４−１４１０６７号のＬｆ溶液では硫酸第一鉄を使用した。また、対照として、１．９８ミリモル／リットル塩化第二鉄水溶液、１．９８ミリモル／リットル硫酸第一鉄水溶液、１．９８ミリモル／リットル塩化第二鉄を含む１３．２マイクロモル／リットルＬｆ水溶液を調製した。試料番号７は、１．９８ミリモル／リットル塩化第二鉄及び１３．２マイクロモル／リットルＬｆを重炭酸ナトリウム水溶液に同時に添加したものであり、本発明の製造法に従わずに製造した試料である。
　得られた各試料は、分子量１００００カットのモルカット（ミリポア社）に１ミリリットル添加し、脱塩した。それぞれの試料について、リテンテート量が０．２ミリリットルになったところで１ミリリットル加水し、総計６ミリリットル加水した。得られたリテンテート及びパーミエートについては、原子吸光分析機（ＩＣＰ）により鉄含量を測定した。なお、示したモル濃度は全て終濃度で示した。また、リテンテート鉄残存率は次式より求めた。
　　リテンテート鉄残存率（％）＝｛リテンテート鉄総量÷
　　　　　　　（リテンテート鉄総量＋パーミエート鉄総量）｝×１００
　　　【００５２】
　さらに、鉄の収斂味については、調製した試料を限外濾過膜で処理する前に試験した。結果を表１５に示す。
　試料１：本発明の鉄−Ｌｆ複合体
　試料２：特開平６−２３９９００号の鉄−Ｌｆ結合体
　試料３：１．９８ミリモル／リットル塩化第二鉄含有１３．２マイクロモル／リットルＬｆ水溶液
　試料４：特開平４−１４１０６７号のＬｆ溶液
　試料５：１．９８ミリモル／リットル塩化第二鉄水溶液
　試料６：１．９８ミリモル／リットル硫酸第一鉄水溶液
　試料７：１．９８ミリモル／リットル塩化第二鉄及び１３．２マイクロモル／リットルＬｆ含有重炭酸ナトリウム水溶液
　　　【００５３】
　　【表１５】
　　　【００５４】
　試料５及び試料６において全ての鉄はパーミエートに移行しており、水溶液中で使用した鉄剤が分子量１００００カットの膜を透過したことが判った。一方、試料１及び試料２では全ての鉄がリテンテートに残存しており、鉄がＬｆと結合し、分子量１００００カットの膜を透過しなかったことが判った。また、試料３は鉄及びＬｆ混合物を重炭酸ナトリウム水溶液に添加する前の状態を示すものであるが、多くの鉄が遊離状態で存在し、鉄はパーミエートに移行している。さらに、試料７においては、単に塩化第二鉄、Ｌｆ及び重炭酸ナトリウムを同時に接触させるだけでは遊離の鉄が多量に存在することを示している。
　　　【００５５】
　以上の結果から、本発明の鉄−Ｌｆ複合体を調製するに際しては、重炭酸ナトリウム水溶液が必要であり、かつ、その調製手順も重要であることが改めて確認された。なお、試料４においては、鉄は殆どパーミエートに移行しており、遊離の状態であることが判った。
　鉄の収斂味（鉄味）については、試料１及び試料２では認められなかったが、他の試料では認められた。
　　　【００５６】
　つぎに呈味性の成績を示す。
　　【試験例１２】
　試験例７と同様に、３つの方法で作成した各種鉄／Ｌｆ混合溶液を分子量５０００カットの限外濾過膜にて脱塩・濃縮し、模擬緩衝液（ｐＨ６．８）にて鉄イオンとして１３ミリグラム／１００ミリリットルおよび２６ミリグラム／１００ミリリットルとなるよう蒸留水で希釈した。このようにして得られた試料について、以下のような官能評価試験を行った。
　男５女５名のパネラーに模擬緩衝液を対照として各試料の収斂味を感じるかどうかを判定させた。パネラーには目隠しをし、外見による判断要因を与えないよう配慮した。一試料のための試験は、対照、試料の順に試飲させ、一試料評価後、最低一日の間隔をあけて、次の試料を評価するための試験を実施した。また、試料評価の日間偏差をなくすため、各パネラー毎に試料評価の順番をランダム化した。その結果、パネラー１０人のうちで収斂味を感じた人数を表１６に示す。
　　　【００５７】
　【表１６】
　【００５８】
　以上のように、本発明は鉄の収斂味を全く感じさせない優れたマスキング効果を有することが明らかとなった。また、特開平６−２３９９００号では鉄濃度が２６ミリグラム／１００ミリリットルであってＦｅ／Ｌｆモル比が１５０を超える場合に収斂味を感じるパネラーが認められ、特開平４−１４１０６７号では全ての場合においてパネラー１０人全員が収斂味を認めた。
　　　【００５９】
　　【試験例１３】
　試験例９と同様に鉄−Ｌｆ複合体を分子量５０００カットの限外濾過膜にて脱塩・濃縮し、模擬緩衝液にて、鉄イオンとして２６ミリグラム／１００ミリリットルとなるよう希釈し、９０℃１０分間の殺菌を施した。このようにして得た試料を試験例１２と同様の方法にて官能評価試験した。
　　　【００６０】
　【表１７】
　　　【００６１】
　以上のように、本発明の鉄−Ｌｆ複合体は、Ｌｆ１分子に対して鉄が１５分子以上１０００分子以下結合したものであれば、それを取り巻く環境がｐＨ２．１からｐＨ９．０の範囲であれば、鉄の収斂味を抑制する効果を持っていた。この時、Ｌｆ１分子に対して鉄が４８０分子以上結合し、ｐＨ２．１からｐＨ５．０の範囲で若干の収斂味を数名が感じたが、鉄含量を１３ミリグラム／１００ミリリットルとすると１０名のパネラーの内、収斂味を感じたものはいなかった。
　　　【００６２】
　　【実施例１】
　重炭酸ナトリウム１．２モルとＬｆ（ＤＭＶ社製）１０マイクロモルを含む溶液１リットル（Ａ）。硫酸第二鉄を鉄イオンとして１．５ミリモルを含む溶液１リットル（Ｂ）を作成した。ＡにＢを加え、鉄を結合したＬｆを作成した。この試料を分子量５０００カットの限外濾過膜にて脱塩・濃縮し、模擬緩衝液（ｐＨ８．９）にて、鉄濃度が２６ミリグラム／１００ミリリットルとなるよう希釈した。これをネジ口付き試験管に密封した後、９０℃１０分間加熱し、室温まで自然冷却した後、室温にて１か月保存した。沈澱を肉眼にて判定したところ、全く認められなかった。さらに試験例１２と同様の方法にて官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名のうちで収斂味を感じたものは一名も認められなかった。
　　　【００６３】
　　【実施例２】
　炭酸カルシウム０．０５モル、重炭酸アンモニウム１．２モルを含む溶液１リットルを塩酸にてｐＨ７．８に調製した（Ａ溶液）。硫酸第二鉄を鉄イオンとして１．５ミリモルを含む溶液０．２リットル（Ｂ１溶液）、トランスフェリン（アポ型、高純度、牛血漿製、和光純薬工業）１０マイクロモルを含む溶液０．８リットル（Ｂ２溶液）を作成した。Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合後、Ａ溶液にＢｌ／Ｂ２混合液を加え、鉄を結合したトランスフェリンを形成させた。鉄−トランスフェリン結合溶液を分子量５０００カットの限外濾過膜にて脱塩・濃縮し、模擬緩衝液（ｐＨ６．８）にて、鉄濃度が２６ミリグラム／２００ミリリットルとなるよう希釈した。これをネジ口付き試験管に密封した後、９０℃、１０分間加熱し、室温まで自然冷却した後、３７℃にて１か月保存した。沈澱を肉眼にて判定したところ、全く認められなかった。さらに試験例１２と同様の方法にて官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名のうちで収斂味を感じたものは１名も認められなかった。
　　　【００６４】
　　【実施例３】
　炭酸ナトリウム０．５モル、重炭酸カリウム０．７モルを含む溶液１リットルを酢酸にてｐＨ８．３に調製した（Ａ溶液）。硝酸鉄（ＩＩＩ）を鉄イオンとして１．５ミリモルを含む溶液０．２リットル（Ｂ１溶液）、オボトランスフェリン（タイプＩＶ、粗、卵白製、無鉄、シグマ社）１０マイクロモルを含む溶液０．８リットル（Ｂ２溶液）を作成した。Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合後、Ａ溶液にＢ１／Ｂ２混合液を加え、鉄を結合したオボトランスフェリンを作成した。鉄−オボトランスフェリン結合溶液を分子量５０００カットの限外濾過膜にて脱塩・濃縮した。これを模擬緩衝液（ｐＨ６．２）にて、鉄濃度が２６ミリグラム／２００ミリリットルとなるよう希釈した。これをネジ口付き試験管に密封した後、９０℃、１０分間加熱し、室温まで自然冷却した後、３７℃にて１か月保存した。沈澱を肉眼にて判定したところ、全く認められなかった。さらに試験例１２と同様の方法にて官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名のうちで収斂味を感じたものは１名も認められなかった。
　　　【００６５】
　　【実施例４】
　重炭酸ナトリウム１．０モルを含む溶液１リットルを作製した（Ａ溶液）。塩化第二鉄を鉄イオンとして１ミリモルを含む溶液０．２リットル（Ｂ１溶液）、ウシラクトフェリン（ＵＬＮ社製）１０マイクロモルを含む０．８リットル（Ｂ２溶液）を作製した。Ｂ１とＢ２を混合後、Ａ溶液にＢ１／Ｂ２混合液を加えた。溶液のｐＨを８．５に維持するために、適時重炭酸ナトリウムを添加し、鉄−Ｌｆ複合体を作製した。得られた、鉄−Ｌｆ複合体を脱塩を行わずに９０℃１０分間加熱し、室温まで自然冷却した。この状態で沈澱は認められなかった。さらに、３７℃で一ヵ月間保存し、再び、沈澱を肉眼で判定したところ、全く認められなかった。さらに、試験例１２と同様の方法にて官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名のうちで収斂味を感じたものは１名も認められなかった。
　　　【００６６】
　　【実施例５】
　重炭酸ナトリウム０．８モルを含む溶液１リットルを作製した（Ａ溶液）。硫酸第二鉄を鉄イオンとして１ミリモルを含む溶液０．２リットル（Ｂ１溶液）、ウシラクトフェリン（ＵＬＮ社製）１０マイクロモルを含む０．８リットル（Ｂ２溶液）を作製した。Ｂ１とＢ２を混合後、Ａ溶液にＢ１／Ｂ２混合液を加え、鉄−Ｌｆ複合体を作製した。得られた鉄−Ｌｆ複合体を脱塩を行わずに９０℃１０分間加熱し、室温まで自然冷却した。この状態で沈澱は認められなかった。さらに、３７℃で一ヵ月間保存し、再び、沈澱を肉眼で判定したところ、全く認められなかった。さらに、試験例１２と同様の方法にて官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名のうちで収斂味を感じたものは１名も認められなかった。
　　　【００６７】
　　【実施例６】
　炭酸ナトリウム１．０モルを含む溶液１リットルに２Ｎ塩酸でｐＨを８．０まで下げてＡ溶液を作製した。硫酸第二鉄を鉄イオンとして１ミリモルを含む溶液０．２リットル（Ｂ１溶液）、ウシラクトフェリン（ＵＬＮ社製）１０マイクロモルを含む０．８リットル（Ｂ２溶液）を作製した。Ｂ１とＢ２を混合後、Ａ溶液にＢ１／Ｂ２混合液を加え、鉄−Ｌｆ複合体を作製した。得られた、鉄−Ｌｆ複合体を脱塩を行わずに９０℃１０分間加熱し、室温まで自然冷却した。この状態で沈澱は認められなかった。さらに、３７℃で一ヵ月間保存し、再び、沈澱を肉眼で判定したところ、全く認められなかった。さらに、試験例１２と同様の方法にて官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名のうちで収斂味を感じたものは１名も認められなかった。
　　　【００６８】
　　【実施例７】
　重炭酸ナトリウムを２４モル含む溶液８リットル（溶けきらない塩が沈澱している）を調製した（Ａ溶液）。塩化第二鉄を鉄イオンとして２０ミリモルを含む溶液２リットル（Ｂ１溶液）、ラクトフェリン（タツアバイオロジックス社製）１００マイクロモルを含む溶液８リットル（Ｂ２溶液）を作成した。Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合後、Ａ溶液を良く撹拌しながら、Ａ溶液にＢ１／Ｂ２混合液を加え、鉄を結合したラクトフェリンを形成した。この溶液を分子量５０００カットの限外濾過膜にて加水脱塩後、同様の膜で１リットルにまで濃縮した。これを２０リットルの還元脱脂乳（脱脂粉乳１００グラムを水１リットルの比率で還元）に、鉄濃度が２６ミリグラム／２００ミリリットルとなるよう添加した。これを撹拌混合後、プレート型殺菌機を用いて１２０℃にて２秒間殺菌し直ちに５℃に冷却した後、低温（１０℃）にて２週間保存した。一部を３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し沈澱を肉眼にて判定したところ、全く認められなかった。さらに試験例１０と同様の方法にて官能評価試験を実施した。ただし、対照は還元脱脂乳を同様の条件にて殺菌・保存したものを用いた。パネラー１０名のうちで収斂味や味・香りなどに異常を感じたものは１名も認められなかった。
　　　【００６９】
　　【実施例８】
　実施例４で作製・濃縮・脱塩した鉄／Ｌｆ混合溶液を２０リットルの生乳に、鉄濃度が２６ミリグラム／２００ミリリットルとなるよう添加した。これを均質化した後に１５０℃４秒間滅菌し直ちに４℃に冷却し２５０ミリリットルづつ紙容器に無菌的に充填した。３７℃にて３ヶ月保存後、遠心分離し沈澱物の有無を調べたが、沈澱は全く認められなかった。また、大腸菌数および一般細菌数共に０であった。また、鉄が存在しているために保存中に褐変が進行する恐れがあったが、全く褐変は認められなかった。さらに試験例１２と同様の方法にて官能評価試験を実施した。ただし、対照は生乳を同様の条件にて殺菌・保存したものを用いた。パネラー１０名のうちで収斂味や味・香りなどに異常を感じたものは１名も認められなかった。
　　　【００７０】
　　【実施例９】
　実施例４で作製・濃縮・脱塩した鉄／Ｌｆ複合体溶液（試験群）または硫酸第１鉄溶液（対照群１）を、鉄濃度が２０ミリグラム／１００ミリリットルとなるよう、アスコルビン酸およびアスコルビン酸ナトリウムをビタミンＣとして６．２ミリグラム／１００グラム含む生理的リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、９０℃、１０分間の殺菌をしたものを試験試料とした。対照群２として、ビタミンＣを添加した生理的リン酸緩衝液を殺菌したものも作成した。
　離乳直後、２１日齢のウィスター系雌ラット（日本チャールズリバー）の中、体重が４５から５０グラムのものを選び、除鉄食（オリエンタル酵母，鉄含量０．２５ミリグラム／１００グラム飼料）を２週間与え、血中ヘモグロビン値が７グラム／１００ミリリットル以下の貧血ラットを作成した。ラットは１群４匹として、その後も除鉄食を与え続けながら、試験試料を１ミリリットル／日、６週間、強制経口（ゾンデ）投与した。試験試料投与後６週間日に、尾静脈より採血し、自動血球計測装置（東亜医用電子）でヘモグロビン値を測定した。その結果を表１８に示す。
　　　【００７１】
　　【表１８】
　　　【００７２】
　以上のように、本発明の鉄−Ｌｆ複合体は貧血治療効果を示し、さらに、その効果は無機鉄である硫酸第一鉄よりも優れていたことが明らかとなった。
　　　【００７３】
　　【実施例１０】
　実施例４で作製・濃縮・脱塩した鉄−Ｌｆ複合体溶液を、アスコルビン酸およびアスコルビン酸ナトリウムをビタミンＣとして３０ミリグラム／２００ミリリットル添加した生乳に、鉄濃度が１５ミリグラム／２００ミリリットルとなるよう添加し、約２００ミリリットル容量の耐熱ガラス瓶にヘッドスペース１０ミリリットル以下となるよう充填した（試験群）。対照として、鉄−Ｌｆ複合体の代わりにクエン酸鉄ナトリウムを添加したビタミンＣ強化乳を用いた（対照群）。これをＦ値４でレトルト滅菌し、３７℃で２週間保存し、残存するビタミンＣ含量をビタミンＣ測定器（ＴＯＡ電子社製）にて定量した。ビタミンＣ残存率は測定値を初期値で割った百分率とした６その結果を表１９に示す。
　　　【００７４】
　【表１９】
　　　【００７５】
　以上のように、鉄−Ｌｆ複合体は無機鉄に比べてビタミンＣの破壊の程度が低く、酸化および過酸化物生成能の低い鉄材としても有効であることが明らかとなった。
　　　【００７６】
　さらに、試験群について試験例１２と同様の方法にて官能評価試験を実施した。ただし、対照は鉄を添加していないビタミンＣ強化乳を同様の条件にてレトルト処理したものを用いた。パネラー１０名のうちで収斂味などに異常を感じたものは１名も認められなかった。
　　　【００７７】
　　【実施例１１】
　１グラムのＬｆ（ＤＭＶ社製）を０．２モル／リットルの酢酸緩衝液（ｐＨ４）に溶解し、ペプシン（シグマ社）２６０００ユニット添加し、３７℃、２時間反応後、水酸化ナトリウムでｐＨ７．５とした。これにトリプシン（シグマ社）２０００００ユニットを添加して、３７℃、２時間反応させた。このようにして得た分解Ｌｆは電気泳動により、主に分子量５００００，４００００，３００００カットの分解物となっていることを確認した。
　重炭酸ナトリウムを１．３モル含む溶液１リットル（溶けきらない塩が沈澱している）を調製した（Ａ溶液）。塩化第二鉄を鉄イオンとして１．２ミリモルを含む溶液０．２リットル（Ｂ１溶液）、ラクトフェリン分解物を分解前のラクトフェリンとして１０マイクロモルを含む溶液０．８リットル（Ｂ２溶液）を作成した。Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合後、Ａ溶液を良く撹拌しながら、Ａ溶液にＢ１／Ｂ２混合液を加え、鉄を結合したラクトフェリン分解物を作成した。これをネジ口付き試験管に密封した後、９０℃、１０分間加熱し、室温まで自然冷却した後、３７℃にて１か月保存した。沈澱を肉眼にて判定したところ、全く認められなかった。さらに試験例１２と同様の方法にて官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名のうち、収斂味を感じたものは１名も認められなかった。
　【表１３】