(57)【要約】  本発明は、次の要素：１つ又は複数の反応性基と；２つ以上の架橋抗体又はそのフラグメントとから本質的になる化合物であって、前記又は各反応性基がエフェクター分子の結合に適するが、抗体又はそのフラグメントのいずれとも反応しないことを特徴とする化合物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の要素：１つ又は複数の反応性基と；２つ以上の架橋抗体若しくはそのフラグメントとから本質的になる化合物であって、前記又は各反応性基がエフェクター分子の結合に適するが、抗体又はそのフラグメントのいずれとも反応しないことを特徴とする化合物。
【請求項２】
単一の反応性基を含む請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
３つの架橋抗体又はそのフラグメントを含む請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
抗体又はそのフラグメントが抗体のＦａｂ’フラグメントである請求項１から３までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【化１】
2008509885.tif 000036
（式中：
Ａ、Ａ１及びＡ２は独立して、抗体又はそのフラグメントの残基を表し；
Ｌ、Ｌ１及びＬ２は独立して、スペーサー基を表し；
Ｒは、エフェクター分子の結合に適するが、Ａ、Ａ１及びＡ２のいずれとも反応しない反応性基を表し；
Ｙは、共有結合又は−（ＣＨ２）ｙ−を表し；
Ｂ、Ｂ１及びＢ２は独立して、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯ−を表し；
Ｖ、Ｖ１及びＶ２は独立して、共有結合又は−（ＣＨ２）ｖ−を表し；
Ｘ、Ｘ１及びＸ２は独立して、ＣＲ１又はＮを表し；
Ｗ、Ｗ１及びＷ２は独立して、−（ＣＨ２）ＷＯ−を表し；
Ｔ、Ｔ１及びＴ２は独立して、リンカー基を表し；
Ｑは、ＣＯ２Ｒａ又はＣＯＮＲａＲｂを表し；
Ｒａは、水素又はＣ１〜４アルキルを表し；
Ｒｂは、水素又はＣ１〜４アルキルを表し；
Ｒ１は、水素又はＣ１〜４アルキルを表し；
ｖは１、２、３又は４であり；
ｗは１、２、３又は４であり；並びに
ｙは１、２、３、４、５又は６である。）
から選択される請求項１から４までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ａ、Ａ１及びＡ２がそれぞれＦａｂ’フラグメントの残基である請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｌ、Ｌ１及びＬ２がスクシンイミドである請求項５又は６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒが図１中の反応性基の一覧から選択される請求項５から７までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｔ、Ｔ１及びＴ２が、−（ＣＨ２）ｔ−、−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｘＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｒＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−、
【化２】
2008509885.tif 000037
又は
【化３】
2008509885.tif 000038
（式中：
ｔは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり；
ｎは１、２、３、４、５又は６であり；
ｘは２、３、４、５又は６であり；
ｚは１〜５００であり；
ｐは１、２、３、４、５又は６であり；
ｍは１、２、３、４、５又は６であり、
ｒは２、３、４又は５である）
から独立して選択される請求項５から８までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：
【化４】
2008509885.tif 000039
（式中：
Ｚはエフェクター分子の残基であり；
Ｒ２はＺの結合に起因する官能基であり；及び
その他の可変記号はそれぞれ、請求項１で規定されるとおりである）
の化合物。
【請求項１１】
前記エフェクター分子がポリエチレングリコールである請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ２が図１中の一覧から選択される請求項１０又は１１に記載の化合物。
【請求項１３】
次の要素：１つ又は複数の反応性基又はその保護された誘導体と、２つ以上の抗体又はそのフラグメントの架橋に適するリンカーとから本質的になる化合物であって、前記又は各反応性基がエフェクター分子の結合に適し、該反応性基又はその保護された誘導体が、抗体若しくはそのフラグメント又はそれらが結合するリンカー上のスペーサー基と反応しないことを特徴とする化合物。
【請求項１４】
式（Ｖ）又は（ＶＩ）：
【化５】
2008509885.tif 000040
（式中：
Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は、残基Ａ、Ａ１及びＡ２をそれぞれ結合できるか、又はこのような基に変換され得る基を表し；
Ｒ３は、請求項１で規定する基Ｒに相当するか、又はＬ３、Ｌ４及びＬ５と反応しないその保護された誘導体を表し；
その他の可変記号のそれぞれは、請求項１で規定したとおりである）
から選択される請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）：
【化６】
2008509885.tif 000041
（式中、各可変記号は請求項１で規定したとおりである）
を有する請求項１３又は１４に記載の化合物。
【請求項１６】
実施例１〜５で示される請求項１３、１４又は１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
請求項１０から１２までのいずれか一項に記載の化合物を、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤との組み合わせで含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エフェクター分子を抗体に結合させるために用いられる化合物に関する。より具体的には、本発明は、エフェクター分子が結合できる架橋抗体を含む分子に関する。そのような分子の調製方法及びそれらを含有する医薬組成物も提供される。
【背景技術】
【０００２】
抗体の結合特異性を用いて、エフェクター分子、例えば薬剤を特定の治療上の標的、例えば腫瘍細胞に送達することができる。エフェクター分子は、例えば直接結合（例えば米国特許第５，６７７，４２５号；欧州特許第０９４８５４４号を参照されたい）又はリンカーを介する結合（米国特許第５，２１８，１２８号）を含む種々の方法を用いて抗体に結合できる。
【０００３】
架橋抗体は、当該技術において公知である（例えば米国特許第５，２６２，５２４号を参照されたい）。ある架橋抗体は、天然の免疫グロブリンに比べて改善された結合能力、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏでの血中クリアランス及び改善された組織分布を有することが証明されている。例えば、連結構造により互いに結合したＦａｂ’フラグメントを含む三価及び四価の単一特異的抗原結合性タンパク質を記載する国際公開第９２／２２５８３号を参照されたい。国際公開第９２／２２５８３号は、エフェクター分子の結合のための部位としての連結構造の使用も記載している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
本発明は、次の要素：１つ又は複数の反応性基と；２つ以上の架橋抗体若しくはそのフラグメントとから本質的になる化合物であって、各反応性基がエフェクター分子の結合に適するが、該抗体又はそのフラグメントのいずれとも反応しないことを特徴とする化合物を提供する。
【０００５】
本発明は、よって、エフェクター分子が結合し得る抗体を架橋するための新規なリンカーを提供する。有利には、リンカー分子は、エフェクター分子の部位特異的結合に適するが、リンカーに結合している抗体とは反応しない単一の反応性基を含む。さらに、反応性基は抗原結合部位から離れている。これらの特徴により、エフェクター分子は、抗体の抗原結合能力を損なわずに架橋抗体に結合することが可能になる。さらに、本発明の化合物は、従来技術の化合物より調製する効率がより高くかつ用途が広い。エフェクター分子を予め形成された架橋抗体に結合させることにより、その逆（まずリンカーをエフェクター分子に結合させ、次いで抗体を結合させる）よりも、望ましくない副反応が最小限にされ、より均質な生成物が創られる。さらに、架橋抗体はエフェクター分子の存在なしに調製されるので、より安定性の低いエフェクター分子をその後の結合のために選択できる。予め形成された架橋抗体を貯蔵することにより、異なる化合物が必要となる度に最初から化合物全体を合成する必要なしに、実質的に無制限の範囲のエフェクター分子を結合することができる。
【０００６】
好ましくは、本発明の化合物は、１つ又は複数の反応性基、より好ましくは１つの反応性基を含む。
【０００７】
よって、本発明は、次の要素：１つの反応性基と；２つ以上の架橋抗体若しくはそのフラグメントとから本質的になる化合物であって、該反応性基がエフェクター分子の結合に適するが、該抗体又はそのフラグメントのいずれとも反応しないことを特徴とする化合物をも提供する。
【０００８】
本発明の具体的な例を、式（Ｉ）又は（ＩＩ）に示す：
【化１】
2008509885.tif 000002
（式中：
Ａ、Ａ１及びＡ２は独立して、抗体又はそのフラグメントの残基を表し；
Ｌ、Ｌ１及びＬ２は独立して、スペーサー基を表し；
Ｒは、エフェクター分子の結合に適するが、Ａ、Ａ１及びＡ２のいずれとも反応しない反応性基を表し；
Ｙは、共有結合又は−（ＣＨ２）ｙ−を表し；
Ｂ、Ｂ１及びＢ２は独立して、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯ−を表し；
Ｖ、Ｖ１及びＶ２は独立して、共有結合又は−（ＣＨ２）ｖ−を表し；
Ｘ、Ｘ１及びＸ２は独立して、ＣＲ１又はＮを表し；
Ｗ、Ｗ１及びＷ２は独立して、−（ＣＨ２）ＷＯ−を表し；
Ｔ、Ｔ１及びＴ２は独立して、リンカー基を表し；
Ｑは、ＣＯ２Ｒａ又はＣＯＮＲａＲｂを表し；
Ｒａは、水素又はＣ１〜４アルキルを表し；
Ｒｂは、水素又はＣ１〜４アルキルを表し；
Ｒ１は、水素又はＣ１〜４アルキルを表し；
ｖは１、２、３又は４であり；
ｗは１、２、３又は４であり；並びに
ｙは１、２、３、４、５又は６である）。
【０００９】
また、本発明により、エフェクター分子が結合する架橋抗体が提供される。本発明のこの態様の具体例は、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）に示される：
【化２】
2008509885.tif 000003
（式中：
Ｚはエフェクター分子の残基であり；
Ｒ２はＺの結合に起因する官能基であり；及び
その他の可変記号はそれぞれ、式（Ｉ）又は（ＩＩ）に関して上記で規定されたとおりである）。
【００１０】
本明細書で用いる場合、用語「Ｃ１〜４アルキル」は、直鎖状及び分枝鎖状で１〜４炭素原子を含有するアルキル基のことをいう。このような基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル及びｔｅｒｔ−ブチルである。
【００１１】
本明細書で用いる場合、用語「残基」は、このような用語が当業者に周知されているように、置換反応を受けた後に残っているエフェクター分子又は抗体若しくはそのフラグメントの部分を意味すると理解される。
【００１２】
残基Ａ、Ａ１及びＡ２は、抗体全体及びその機能的に活性なフラグメント又は誘導体の残基を含み、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化又はキメラ抗体、単一鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメント並びに上記のいずれのもののエピトープ結合フラグメントであり得る。
【００１３】
抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を含む。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれのクラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ又はＩｇＡ）又はサブクラスでもあり得る。
【００１４】
モノクローナル抗体は、当該技術において知られるいずれの方法、例えばハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６，４９５〜４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１９８３，４，７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，「モノクローナル抗体とがん治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」，ｐｐ．７７〜９６，Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）により作製してよい。
【００１５】
本発明において用いられる抗体は、例えばＢａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３（１５），７８４３〜７８４８、国際公開第９２／０２５５１号、国際公開第２００４／０５１２６８号及び国際公開第２００４／１０６３７７号により記載される方法により、特異的抗体の産生のために選択された単一リンパ球から作製された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡのクローニング及び発現による単一リンパ球抗体法を用いて作製してもよい。
【００１６】
ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域とを有する非ヒト種由来の抗体分子である（例えば米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。
【００１７】
キメラ抗体は、軽鎖及び重鎖の遺伝子が別の種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントで構成されるように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる抗体である。
【００１８】
本発明において用いられる抗体は、当該技術において知られ、Ｂｒｉｎｋｍａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２，４１〜５０；Ａｍｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４，１７７〜１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，２４，９５２〜９５８；Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ，１９９７，１８７，９〜１８；及びＢｕｒｔｏｎら，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７，１９１〜２８０；国際公開第９０／０２８０９号；国際公開第９１／１０７３７号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９２／１８６１９号；国際公開第９３／１１２３６号；国際公開第９５／１５９８２号；及び国際公開第９５／２０４０１号；並びに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号；及び同第５，９６９，１０８号により開示される方法を含む種々のファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。単一鎖抗体の産生のための技術、例えば米国特許第４，９４６，７７８号に記載されるものを、単一鎖抗体を産生するために適合させることもできる。また、トランスジェニックマウス又はその他の哺乳動物を含むその他の生物を用いて、ヒト化抗体を発現させてよい。
【００１９】
ある例において、抗体フラグメントは、天然又は修飾されたヒンジ領域を有するＦａｂ’フラグメントである。いくつかの修飾されたヒンジ領域は、例えば米国特許第５，６７７，４２５号、国際公開第９９１５５４９号及び国際公開第９８２５９７１号に既に記載され、これらは本明細書に参照として組み込まれる。
【００２０】
特定の抗体フラグメントは、国際公開第２００５００３１６９号、国際公開第２００５００３１７０号及び国際公開第２００５００３１７１号に記載されるものを含む。
【００２１】
好ましくは、本発明に用いられる抗体フラグメントは、単一の遊離のチオールを好ましくはヒンジ領域に含む。
【００２２】
本明細書において用いられるような用語「架橋抗体」は、連結構造により連結された２、３又は４つの抗体若しくはそのフラグメントのことをいう。連結構造は、本明細書に記載されるような抗体又はそのフラグメントを一緒に連結できるいずれの分子構造であってもよい。好ましくは、本発明による分子の架橋抗体部分は、３つの抗体フラグメント、好ましくはＦａｂ’フラグメントを含む。
【００２３】
本発明の分子の架橋抗体部分における抗体又はそのフラグメントのそれぞれは、通常、抗原に選択的に結合することができる。各抗体は、同じ又は異なる抗原に結合してよい。よって、本発明による分子の架橋抗体部分は、単一特異的、二重特異的、三重特異的又は四重特異的であってよい。好ましくは、本発明による分子の架橋抗体部分は単一特異的である。
【００２４】
抗原は、いずれの細胞結合抗原、例えば細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、腫瘍細胞等の細胞上の細胞表面抗原でもよく、又は可溶性抗原でもよい。抗原は、いずれの医療上適切な抗原、例えば疾患又は感染の間にアップレギュレートされる抗原、例えば受容体及び／又はそれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面抗原の具体例は、接着分子、例えばβ１インテグリンのようなインテグリン、例えばＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ１３４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、及びＶＥＧＦ、並びに適切であればそれらの受容体を含む。可溶性抗原は、インターロイキン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７、ウイルス抗原、例えば呼吸器合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、免疫グロブリン、例えばＩｇＥ、インターフェロン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、コロニー刺激因子、例えばＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ、並びに血小板由来成長因子、例えばＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−β、並びに適切であればそれらの受容体を含む。
【００２５】
適切には、Ａ、Ａ１及びＡ２は同一である。
【００２６】
本発明において用いられるスペーサー基は、リンカーと抗体又はそのフラグメントとの間に架橋を形成できる、当業者に周知されたいずれの部分をも適切には含む。特に、スペーサー基Ｌ、Ｌ１及びＬ２は、リンカーＴ、Ｔ１及びＴ２と残基Ａ、Ａ１及びＡ２との間にそれぞれ架橋を形成できる、当業者に周知されたいずれの部分をも適切には含む。Ａ、Ａ１及びＡ２がシステイン残基を含む抗体又はそのフラグメントの残基である１つの例において、対応するスペーサー基Ｌ、Ｌ１及びＬ２は、適切にはスクシンイミドである（すなわち、マレイミド残基と、チオール結合を介するシステイン含有ポリペプチド残基Ａ、Ａ１及びＡ２と、マレイミド窒素原子を通してのリンカーＴ、Ｔ１及びＴ２との反応生成物）。
【００２７】
適切には、Ｌ、Ｌ１及びＬ２は同一である。
【００２８】
リンカー基Ｔ、Ｔ１及びＴ２は、スペーサー基Ｌ、Ｌ１及びＬ２とそれぞれＷ、Ｗ１及びＷ２の酸素原子との間又はそれぞれＸ、Ｘ１及びＸ２との間の架橋を形成することができる、当業者に周知されたいずれの部分をも適切には含む。
【００２９】
Ｔ、Ｔ１及びＴ２の典型的な例は、−（ＣＨ２）ｔ−、−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｘＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｒＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−、
【化３】
2008509885.tif 000004
及び
【化４】
2008509885.tif 000005
（式中、
ｔは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり；
ｎは１、２、３、４、５又は６であり；
ｘは２、３、４、５又は６であり；
ｚは１〜５００であり；
ｐは１、２、３、４、５又は６であり；
ｍは１、２、３、４、５又は６であり；そして
ｒは２、３、４又は５である）
を含む。
【００３０】
一実施形態において、Ｔは−（ＣＨ２）ｔ−を表す。
別の実施形態において、Ｔは−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−を表す。
別の実施形態において、Ｔは−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｘＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−を表す。
別の実施形態において、Ｔは−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−を表す。
別の実施形態において、Ｔは−（ＣＨ２）ｒＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−を表す。
【００３１】
一実施形態において、Ｔ１は−（ＣＨ２）ｔ−を表す。
別の実施形態において、Ｔ１は−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−を表す。
別の実施形態において、Ｔ１は−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｘＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−を表す。
別の実施形態において、Ｔ１は−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−を表す。
別の実施形態において、Ｔ１は−（ＣＨ２）ｒＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−を表す。
【００３２】
一実施形態において、Ｔ２は−（ＣＨ２）ｔ−を表す。
別の実施形態において、Ｔ２は−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−を表す。
別の実施形態において、Ｔ２は−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｘＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−を表す。
別の実施形態において、Ｔ２は−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−を表す。
別の実施形態において、Ｔ２は−（ＣＨ２）ｒＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−を表す。
適切には、Ｔ、Ｔ１及びＴ２は同一である。
【００３３】
一実施形態において、ＸはＣＲ１を表す。別の実施形態において、ＸはＮを表す。
一実施形態において、Ｘ１はＣＲ１を表す。別の実施形態において、Ｘ１はＮを表す。
一実施形態において、Ｘ２はＣＲ１を表す。別の実施形態において、Ｘ２はＮを表す。
適切には、Ｘ、Ｘ１及びＸ２は同一である。
【００３４】
一実施形態において、Ｂは−ＣＯＮＨ−を表す。別の実施形態において、Ｂは−ＮＨＣＯ−を表す。Ｂが−ＣＯＮＨ−を表す場合、Ｘは典型的にはＣＨを表す。
一実施形態において、Ｂ１は−ＣＯＮＨ−を表す。別の実施形態において、Ｂ１は−ＮＨＣＯ−を表す。Ｂ１が−ＣＯＮＨ−を表す場合、Ｘ１は典型的にはＣＨを表す。
一実施形態において、Ｂ２は−ＣＯＮＨ−を表す。別の実施形態において、Ｂ２は−ＮＨＣＯ−を表す。Ｂ２が−ＣＯＮＨ−を表す場合、Ｘ２は典型的にはＣＨを表す。
適切には、Ｂ、Ｂ１及びＢ２は同一である。
【００３５】
ある好ましい実施形態において、Ｖは共有結合を表す。別の実施形態において、Ｖは−（ＣＨ２）ｖ−（ここでｖは上記で規定したとおりである）を表す。
ある好ましい実施形態において、Ｖ１は共有結合を表す。別の実施形態において、Ｖ１は−（ＣＨ２）ｖ−（ここでｖは上記で規定したとおりである）を表す。
ある好ましい実施形態において、Ｖ２は共有結合を表す。別の実施形態において、Ｖ２は−（ＣＨ２）ｖ−（ここでｖは上記で規定したとおりである）を表す。
適切には、Ｖ、Ｖ１及びＶ２は同一である。
【００３６】
ある好ましい実施形態において、Ｒａは水素である。別の実施形態において、ＲａはＣ１〜４アルキル、特にメチルを表す。
ある好ましい実施形態において、Ｒｂは水素である。別の実施形態において、ＲｂはＣ１〜４アルキル、特にメチルを表す。
【００３７】
一実施形態において、ＱはＣＯ２Ｈである。別の実施形態において、ＱはＣＯＮＨ２である。
【００３８】
ある好ましい実施形態において、Ｒ１は水素である。別の実施形態において、Ｒ１はＣ１〜４アルキル、特にメチルを表す。
【００３９】
一実施形態において、ｙは１である。
別の実施形態において、ｙは２である。
【００４０】
一実施形態において、ｔは２である。別の実施形態において、ｔは３である。さらなる実施形態において、ｔは４である。好ましくは、ｔは３である。
【００４１】
一実施形態において、ｒは４である。
一実施形態において、ｍは５である。
一実施形態において、ｎは２である。
【００４２】
典型的には、ｚは１〜１０の範囲、又は１０〜２５の範囲、又は２５〜５０の範囲、又は５０〜１００の範囲、又は１００〜２５０の範囲、又は２５０〜５００の範囲であってもよい。ｚの具体的な値は、１、２、３、４、５、６、１０、２５、５０、１００、２５０及び５００を含む。
【００４３】
一実施形態において、ｚは４である。
一実施形態において、ｘは５である。
一実施形態において、ｐは２である。
【００４４】
上記の式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物における残基Ｚは、エフェクター分子の残基であることが適切である。エフェクター分子が、単一のエフェクター分子、又は本発明の化合物に単一残基Ｚとして結合できる単一部分を形成するように連結された２つ以上のそのような分子を含んでよいことが認識されよう。このような部分の例は、分枝連結構造により連結されたエフェクター分子を含む。本発明において用いられるエフェクター分子は、ヒトを含む動物の治療における医療的又は診断的な使用に適する生物活性化合物を含む。
【００４５】
エフェクター分子の例は、細胞毒、又は細胞に有害な（例えば殺す）いずれの作用剤も含む細胞毒作用剤を含んでよい。その例は、コンブレスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎｓ）、ドラスタチン、エポシロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステルリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン、並びにそれらの類縁体又は同族体を含む。
【００４６】
エフェクター分子は、限定されないが、抗代謝剤（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、並びに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）も含む。
【００４７】
その他のエフェクター分子は、キレート化された放射性核種、例えば１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２並びにタングステン１８８／レニウム１８８、又は薬剤、限定されないが例えば、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンを含んでもよい。
【００４８】
その他のエフェクター分子は、本発明の化合物の半減期を延長する及び／又は免疫原性を減少させるのに用い得るタンパク質又はポリマーを含んでよい。適切なタンパク質の例は、アルブミン及びアルブミン結合タンパク質を含む。適切なポリマーの例は、いずれの合成又は天然の実質的に水溶性で、実質的に非抗原性ポリマーを含み、例えば、置換されていてもよい直鎖又は分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、或いは分枝鎖又は非分枝鎖の多糖類、例えばホモ多糖又はヘテロ多糖、例えばラクトース、アミロース、デキストラン又はグリコーゲンを含む。上記の合成ポリマー上に存在してもよい具体的な任意選択の置換基は、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基を含む。合成ポリマーの具体例は、置換されていてもよい直鎖又は分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に、置換されていてもよいポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）を含む。
【００４９】
好ましくは、本発明において用いられるポリマーは、ポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一般的なＰＥＧ部分の結合については、“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９７，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ；及び“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋが参照される。
【００５０】
ポリマーのサイズは、所望により変動してよいが、通常、２５０〜１０００００Ｄａ、好ましくは５０００〜５００００Ｄａ、より好ましくは１００００〜４００００Ｄａ、さらにより好ましくは２００００〜４００００Ｄａの範囲の平均分子量である。ポリマーのサイズは、特に、生成物の意図する使用、例えば腫瘍などの特定組織に対する局在化能又は循環半減期延長能に基づいて選択してもよい（総説として、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１〜５４５を参照されたい）。
【００５１】
その他のエフェクター分子は、タンパク質、ペプチド及び酵素を含む。興味対象の酵素は、限定されないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼを含む。興味対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドは、限定されないが、免疫グロブリン、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス菌体外毒素又はジフテリア毒素、タンパク質、例えばインシュリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノゲンアクチベーター、血栓作用剤又は抗血管新生作用剤、例えばアンジオスタチン若しくはエンドスタチン、或いは生物学的応答調節物質、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）又はその他の成長因子及び免疫グロブリンを含む。
【００５２】
その他のエフェクター分子には、例えば診断において有用な検出可能な物質が含まれる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、接合団、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射活性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影法用）、及び非放射活性常磁性金属イオンを含む。診断用の抗体に複合化できる金属イオンについて、一般的に、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを含む。適切な接合団は、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンを含む。適切な蛍光材料は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリスリンを含む。適切な発光材料は、ルミノールを含む。適切な生物発光材料は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含む。適切な放射活性核種は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃを含む。
【００５３】
本発明において用いられる反応性基Ｒは、エフェクター分子の結合に適するが、リンカーに結合している抗体又はそのフラグメントのいずれとも反応しないいずれの基でもある。典型的には、Ｒは、残基Ｚと反応するが、リンカーに結合している抗体又はそのフラグメントのいずれとも反応しない基である。このような基は当該技術において公知であり、チオール、チオエステル、オキシアミン及びヒドラジドを含んでよい。
【００５４】
一実施形態において、Ｒはチオール基−ＳＨであり、この場合、Ｒ２は二価のチオール残基−Ｓ−である。別の実施形態において、Ｒはチオエステル部分、例えば式−Ｃ（Ｏ）ＳＲ１０（式中、Ｒ１０はアリール又はヘテロアリール基、例えばフェニル又はピリジニルを表す）の基である。別の実施形態において、Ｒはオキシアミン基−ＯＮＨ２である。別の実施形態において、Ｒはヒドラジド基−ＣＯＮＨＮＨ２である。
【００５５】
Ｒが、Ｚ上の特定の反応性基Ｚ１と反応するように選択されることは、当業者であれば認識されよう。好ましくは、反応性基Ｚ１は、リンカーに結合している抗体又はそのフラグメントと反応しないように選択される。さらに、反応性基Ｚ１及び反応性基Ｒは、これらの間の反応が、抗体若しくはそのフラグメント又はエフェクター分子の生物活性に影響しない穏やかな条件下でおこり得るように選択される。
【００５６】
Ｒ２は、ＺのＲへの結合に起因する二価の官能基である。
【００５７】
適切な基は当該技術において公知であり、可能なＲ及びＺ１基並びに得られる二価の官能基（Ｒ２）のいくつかの例を、図１に示す。
【００５８】
反応性基Ｚ１及びＲとして用いるのに適する基のその他の例は、連結反応、例えばクリックケミストリー（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ｋｏｌｂ及びＳｈａｒｐｌｅｓｓ，２００３，ＤＤＴ，８，１１２８〜１１３７）、スタウジンガー連結（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎｓ）（Ｗａｎｇら，２００３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４，６９７〜７０１）及びトレースレス（Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ）スタウジンガー連結（Ｎｉｌｓｓｏｎら，２００１，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３，９〜１２；Ｓａｘｏｎら，２０００，２，２１４１〜２１４３）において用いられる基を含む。
【００５９】
本発明により、次の要素：本明細書において規定される１つ又は複数の反応性基又はその保護された誘導体と；２つ以上の抗体又はそのフラグメントの架橋に適するリンカーとから本質的になる化合物であって、各反応性基がエフェクター分子の結合に適し、それ又はその保護された誘導体が、抗体若しくはそのフラグメント又はそれらが結合するリンカー上のスペーサー基と反応しないことを特徴とする化合物も提供される。
【００６０】
好ましくは、本発明のこの態様による化合物は、１つ又は２つの反応性基、より好ましくは１つの反応性基を含む。
【００６１】
よって、本発明は、次の要素：本明細書において規定される１つの反応性基又はその保護された誘導体と；２つ以上の抗体又はそのフラグメントの架橋に適するリンカーとから本質的になる化合物であって、前記反応性基がエフェクター分子の結合に適し、それ又はその保護された誘導体が、抗体若しくはそのフラグメント又はそれらが結合するリンカー上のスペーサー基と反応しないことを特徴とする化合物も提供する。
【００６２】
よって、別の態様において、本発明は、そのＡ、Ａ１及びＡ２が残基である抗体又はそのフラグメントの結合のための有用な中間体である新規化合物を提供する。よって、本発明は、式（Ｖ）及び（ＶＩ）の化合物も提供する：
【化５】
2008509885.tif 000006
（式中：
Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は、残基Ａ、Ａ１及びＡ２にそれぞれ結合できるか、又はこのような基に変換され得る基を表し；
Ｒ３は、上記で規定する基Ｒに相当するか、又はＬ３、Ｌ４及びＬ５と反応しないその保護された誘導体を表し；
その他の可変記号のそれぞれは、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の関係において上記で規定したとおりである）。
【００６３】
Ｒ３がＲの保護された誘導体である場合、反応性基Ｒは、Ｒがスペーサー基Ｌ３、Ｌ４及びＬ５と反応することを妨げる別の基、「保護基」でマスクされる。このような保護された誘導体は、抗体の存在下で、反応性基Ｒに容易に変換され得る。このような基の例は保護されたチオール基であり、ここで、保護基は容易に除去されて、Ｚとの反応に遊離のチオールを提供できる。除去の条件は、抗体又はそのフラグメントの生物活性が影響されないようなものが好ましい。適切なチオール保護基は当該技術において公知であり、チオールエステル、ジスルフィド、アセチル基及びプロピオニル基を含む。
【００６４】
Ｌ３、Ｌ４及びＬ５基は、抗体又はそのフラグメントに位置するいずれの利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えばいずれの遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシ又はカルボキシル基を通して、対応する残基Ａ、Ａ１又はＡ２に結合してよい。このようなアミノ酸は、例えば抗体フラグメントに天然に存在してよいか、又は組換えＤＮＡ法を用いて抗体又はそのフラグメントに導入してもよい（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号及び米国特許第５，６７７，４２５号を参照されたい）。本発明の好ましい態様において、２つの基は、抗体又はそのフラグメント、好ましくはヒンジに位置するシステイン残基のチオール基を通して共有結合する。共有結合は、一般的に、ジスルフィド結合又は硫黄−炭素結合であり、好ましくは後者である。チオール基が結合点として用いられるある例において、適切に活性化された基、例えばチオール選択性誘導体、例えばマレイミド及びシステイン誘導体を用いてよい。
【００６５】
好ましい特徴において、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５基は同一であり、マレイミド窒素原子を通して分子の残りの部分に結合するマレイミド誘導体を表す。別の特徴において、Ｒ３はアセチル保護されたチオール基を表す。よって、上記の式（Ｖ）及び（ＶＩ）の化合物の例示的な部分集合は、式（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）の化合物により表される：
【化６】
2008509885.tif 000007
（式中、各可変記号は上記で規定したとおりである）。
【００６６】
本発明のさらなる態様によると、式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の化合物を、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤との組み合わせで含む医薬組成物が提供される。
【００６７】
本発明による医薬組成物は、経口、頬側、非経口、経鼻、局所、眼若しくは直腸での投与に適切な形、又は吸入若しくはガス注入による投与に適切な形をとってよい。
【００６８】
経口投与のために、上記の医薬組成物は、例えば、薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶性セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えばバレイショデンプン又はグリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）を用いて通常の手段により調製される錠剤、ロゼンジ又はカプセル剤の形をとってよい。錠剤は、当該技術において公知の方法により被覆してもよい。経口投与用の液体製剤は、例えば溶液、シロップ又は懸濁剤の形をとってよいか、又はこれらは使用前に水又はその他の適切な媒体を用いて戻すための乾燥製品としてあってもよい。このような液体製剤は、薬学的に許容される添加剤、例えば懸濁剤、乳化剤、非水性媒体又は防腐剤を用いて通常の手段により調製してよい。製剤は、緩衝塩、香料、着色剤又は甘味料を適宜含有してよい。
【００６９】
経口投与用の製剤は、活性化合物を制御放出するように適切に製剤してもよい。
【００７０】
頬側投与のために、化合物は、通常の手段で製剤された錠剤又はロゼンジの形をとってよい。
【００７１】
式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物は、注射、例えばボーラス注射又は点滴による非経口投与用に製剤されてよい。注射用の製剤は、例えばガラスアンプル中の単位剤形又は例えばガラスバイアル中の複数用量容器内で与えられてよい。注射用の組成物は、油性又は水性の媒体中の懸濁剤、溶液又はエマルションのような形をとってよく、配合剤、例えば懸濁剤、安定剤、防腐剤及び／又は分散剤を含有してよい。或いは、活性成分は、使用前に適切な媒体、例えばパイロジェンフリーの滅菌水を用いて戻すための粉末の形であってよい。
【００７２】
上記の製剤に加えて、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物は、徐放性製剤として製剤されてもよい。このような長期作用型製剤は、インプラント又は筋肉内注射により投与されてよい。
【００７３】
経鼻投与又は吸入による投与のために、本発明による化合物は、適切な高圧ガス、例えばジクロロジフルオロメタン、フルオロトリクロロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素若しくはその他の適切なガス又は混合ガスを用いた加圧包装又は噴霧器用のエアロゾルスプレーの体裁の形で簡便に送達してよい。
【００７４】
所望により、上記の組成物は、活性成分を含有する１つ又は複数の単位剤形を含んでよいパック又はディスペンサーデバイスで与えられてよい。パック又はディスペンサーデバイスは、投与のための使用説明書と組み合わされてよい。
【００７５】
局所投与のために、本発明による化合物は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体に懸濁又は溶解された活性成分を含有する適切な軟膏剤に簡便に製剤してよい。具体的な担体は、例えば、鉱物油、液体石油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、乳化ワックス及び水を含む。或いは、本発明による化合物は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体に懸濁又は溶解された活性成分を含有する適切なローション剤に製剤してよい。具体的な担体は、例えば、鉱物油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステル類のワックス、セテアリルアルコール、ベンジルアルコール、２−オクチルドデカノール及び水を含む。
【００７６】
眼投与のために、本発明による化合物は、防腐剤、例えば殺菌剤又は防カビ剤、例えば硝酸フェニル水銀、塩化ベンジルアルコニウム又は酢酸クロルヘキシジンを用いるか又は用いない等張ｐＨ調整滅菌生理食塩水中のマイクロイオン化懸濁剤として簡便に製剤されてよい。或いは眼投与のために、化合物は、ワセリンのような軟膏の中に製剤してよい。
【００７７】
直腸投与のために、本発明による化合物は、坐剤として簡便に製剤してよい。これらは、活性成分を、室温で固体であるが直腸温度では液体であるので直腸で融解して活性成分を放出する適切な非刺激性の賦形剤と混合することにより調製できる。このような材料は、例えばカカオ脂、蜜蝋及びポリエチレングリコールを含む。
【００７８】
特定の状態の予防又は治療のために要求される本発明の化合物の量は、選択される化合物及び治療される患者の状態に応じて変動する。しかし、一般的に、一日投与量は、約１０ｎｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、典型的には１００ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば経口又は頬側投与について約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ−体重、非経口投与について約１０ｎｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ−体重、経鼻投与又は吸入若しくはガス注入による投与について約０．０５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、例えば約０．５ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲であり得る。
【００７９】
本発明の化合物は、本明細書に示す実施例に記載されるのと同じ方法を用いて調製してよい。
【００８０】
典型的には、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物は、当業者に公知の手順を用いて残基Ｚを式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物にそれぞれ結合させることを含むプロセスにより調製してよい。
【００８１】
Ｒがチオール基−ＳＨである式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物は、Ｒ３がアセチル保護されたチオール基−ＳＣＯＣＨ３である式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）のそれぞれ対応する化合物から、従来の脱保護方法、例えば塩酸ヒドロキシルアミンを含むＥＤＴＡ含有緩衝液中でのインキュベーションにより調製してよい。
【００８２】
Ｔ、Ｔ１及びＴ２がそれぞれ−（ＣＨ２）ｔ−である式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＩＸ）：
【化７】
2008509885.tif 000008
（式中、各可変記号は上記で規定したとおりである）
の化合物をＮ−メトキシカルボニルマレイミドと反応させることにより調製してよい。
【００８３】
反応は、塩基性条件下、例えば炭酸ナトリウム水溶液の存在下で簡便に行われる。
【００８４】
Ｔ、Ｔ１及びＴ２がそれぞれ−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−である式（ＶＩＩ）の化合物は、上記で規定した式（ＩＸ）の化合物を、式（Ｘ）：
【化８】
2008509885.tif 000009
（式中、ｎは上記で規定したとおりであり、Ｊは活性化されたカルボキシレート部分を表す）
の化合物と反応させることにより調製してよい。
【００８５】
置換基Ｊについての活性化されたカルボキシレート部分の例は、酸塩化物；酸無水物；及びカルボン酸（Ｊ＝−ＣＯ２Ｈ）がＮ−ヒドロキシスクシンイミド又はそのスルホスクシンイミド類縁体と反応したときに形成されるエステルを含む。
【００８６】
式（ＩＸ）の化合物と式（Ｘ）の化合物との間の反応は、適切な溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、典型的には有機塩基、例えばトリエチルアミンの存在下に簡便に行われる。
【００８７】
Ｔ、Ｔ１及びＴ２がそれぞれ−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｘＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−である式（ＶＩＩ）の化合物は、上記で規定するような式（ＩＸ）の化合物を、式（ＸＩ）：
【化９】
2008509885.tif 000010
（式中、ｘ、ｎ及びＪは、上記で規定したとおりである）
の化合物と、化合物（ＩＸ）と（Ｘ）との間の反応について上述したのと同じ条件下で反応させることにより調製してよい。
【００８８】
Ｔ、Ｔ１及びＴ２がそれぞれ−（ＣＨ２）ｔＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ−である式（ＶＩＩ）の化合物は、上記で規定するような式（ＩＸ）の化合物を、式（ＸＩＩ）：
【化１０】
2008509885.tif 000011
（式中、ｐ、ｚ、ｎ及びＪは上記で規定したとおりである）
の化合物と、化合物（ＩＸ）と（Ｘ）との間の反応について上述したのと同じ条件下で反応させることにより調製してよい。
【００８９】
Ｔ、Ｔ１及びＴ２がそれぞれ−（ＣＨ２）ｒＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−である式（ＶＩＩＩ）の化合物は、式（ＸＩＩＩ）の化合物を式（ＸＩＶ）の化合物と反応させることにより調製してよい：
【化１１】
2008509885.tif 000012
（式中、各可変記号は上記で規定したとおりである）。
【００９０】
反応は、塩基性条件、例えばジメチルスルホキシド中のジイソプロピルエチルアミンの下で簡便に行われる。
【００９１】
式（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）の化合物が市販で入手可能でない場合、これらは、以下の実施例に記載されるものと同じ方法によるか、又は当該技術において公知の標準的な方法により調製してよい。
【００９２】
本発明による化合物の調製についての上記のいずれのプロセスから生成物が混合物で得られる場合、所望の生成物は、そこから、適切な段階での従来の方法、例えばゲル浸透クロマトグラフィー；カチオン若しくはアニオン交換；分取ＨＰＬＣ；又はカラムクロマトグラフィーにより、例えば適切な溶媒系と組み合わせてシリカ及び／又はアルミナを利用して分離することができる。
【００９３】
上記のいずれの合成の流れの間に、関係するいずれの分子の感受性又は反応性の基を保護することが必要及び／又は望まれるだろう。このことは、従来の保護基、例えばＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９７３；及びＴ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，第３版，１９９９に記載されるものにより達成してよい。保護基は、当該技術において知られる方法を用いて、いずれの簡便なその後の段階で除去してよい。
【００９４】
以下の限定しない実施例は、本発明を説明する。
【実施例】
【００９５】
中間体１
３−［２−アミノ−３−（２−シアノエトキシ）−２−（２−シアノエトキシメチル）−プロポキシ］−プロピオニトリル
【化１２】
2008509885.tif 000013
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（２４．２ｇ、０．２ｍｏｌ）を、ジオキサン（２５ｍｌ）と水酸化カリウム水溶液（水３ｍｌ中の１．２ｇ  ＫＯＨ）との混液中に加えた。アクリロニトリル（４０ｍｌ、０．６１ｍｏｌ）を滴下した。２時間後に、溶液を冷水浴中に入れていずれの発熱反応を緩和し、ＲＴで１６時間攪拌した。溶液を希ＨＣｌで中和してろ過した。油をＤＣＥに溶解し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過して濃縮した。茶色の油をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  １％〜４％）により精製して、表題の生成物を無色の油として得た（２６．９ｇ、０．０９６ｍｏｌ、４８％）。
【化１３】
2008509885.tif 000014
【００９６】
中間体２
ベンジル｛２−（２−シアノエトキシ）−１，１−ビス［（２−シアノエトキシ）メチル］エチル｝カルバメート
【化１４】
2008509885.tif 000015
クロロギ酸ベンジル（５ｍｌ、３５．０ｍｍｏｌ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１５０ｍｌ）を、ジクロロメタン（１５０ｍｌ）中の中間体１の生成物の溶液（１０ｇ、３５．７ｍｍｏｌ）に窒素の下で加えた。得られた混合物を、ＲＴで１６時間攪拌した。層を分離した。有機層を希ＨＣｌ溶液及び水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過して濃縮した。粗物質をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １：４、次いで１：２）により精製して、表題の生成物を白色固体として得た（１．８８ｇ、７．６６ｍｍｏｌ、５７％）。
【化１５】
2008509885.tif 000016
【００９７】
中間体３
ベンジル［２−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］プロポキシ−１，１−ビス（｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］プロポキシ｝メチル）エチル］カルバメート
【化１６】
2008509885.tif 000017
ＢＨ３．ＴＨＦ（ＴＨＦ中に１．０Ｍ、４０ｍｌ、３９．７８ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（４０ｍｌ）中の中間体２の生成物の溶液（５ｇ、１２．０５ｍｍｏｌ）に、窒素の下で、０℃でゆっくりと加えた。得られた混合物を、０℃で３０分及びＲＴで５時間攪拌した。ＢＨ３．ＴＨＦ（ＴＨＦ中に１．０Ｍ、８ｍｌ、８ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１０ｍｌ）を再び加え、溶液をＲＴで１６時間攪拌した。混合物を、氷と希ＨＣＩ（２Ｍ）との混合物に発泡が停止するまで注ぎ、乾燥するまで濃縮した。ジクロロメタン（８０ｍｌ）、ＮＥｔ３（１７ｍｌ、１２０．５ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ２Ｏ（１３．１５ｇ、６０．２５ｍｍｏｌ）を順番に加えた。得られた混合物をＲＴで１６時間攪拌し、水及び塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過して濃縮した。粗物質をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １：３、次いで１：２）により精製して、表題の生成物を無色の粘着性の油として得た（１．７１ｇ、２．３５ｍｍｏｌ、２０％）。
【化１７】
2008509885.tif 000018
【００９８】
中間体４
ｔｅｒｔ−ブチル［６−アミノ−６−（｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロポキシ｝メチル）−１５，１５−ジメチル−１３−オキソ−４，８，１４−トリオキサ−１２−アザヘキサデシ−１−イル］カルバメート
【化１８】
2008509885.tif 000019
中間体３の生成物（１．７７ｇ、２．４３ｍｍｏｌ）を、エタノール（２０ｍｌ）に溶解し、フラスコを３回の減圧／窒素のサイクルに供した。パラジウム炭（１０％／Ｃ、２５９ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を加えた。フラスコを３回の減圧／水素のサイクルに供した。反応混合物を水素の軽い圧力下で、ＲＴで１６時間攪拌し、セライトのパッドを通してろ過した。ろ液を濃縮した。粗油をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ）により精製して、表題の生成物を粘着性の黄色の油として得た（１．０８ｇ、１．８２ｍｍｏｌ、７５％）。
【化１９】
2008509885.tif 000020
【００９９】
中間体５
Ｓ−［５，５−ビス（｛３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］プロポキシ｝メチル）−１４，１４−ジメチル−３，１２−ジオキソ−７，１３−ジオキサ−４，１１−ジアザペンタデシ−１−イル］エタンチオエート
【化２０】
2008509885.tif 000021
中間体４の生成物（４６９ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）及びＮＥｔ３（０．４ｍｌ、２．９２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（５ｍｌ）中の３−（アセチルチオ）プロピオン酸ＮＨＳエステルの溶液（１．０８ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）に加えた。得られた混合物をＲＴで２４時間攪拌した。生成物ＸＸ（４６９ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）及びＮＥｔ３（０．８ｍｌ、５．８４ｍｍｏｌ）を再び加え、混合物をＲＴで２４時間攪拌した。溶液を水及び塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過して濃縮した。粗固体をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １：４〜１：１）により精製して、表題の生成物を無色のフォームとして得た（９１０ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、６９％）。
【化２１】
2008509885.tif 000022
【０１００】
中間体６
Ｓ−［３−（｛２−（３−アミノプロポキシ）−１，１−ビス［（３−アミノプロポキシ）メチル］エチル｝アミノ）−３−オキソプロピル］エタンチオエート（ＴＦＡ塩）
【化２２】
2008509885.tif 000023
トリフルオロ酢酸（８ｍｌ）を、ジクロロメタン（８ｍｌ）中の中間体５の生成物の溶液（９００ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）にゆっくり加えた。得られた混合物をＲＴで６時間攪拌して、濃縮した。粗油状物質を次の反応に用いた。
【化２３】
2008509885.tif 000024
【０１０１】
中間体７
３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−ｙｌ）−Ｎ−｛６−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−６−オキソヘキシル｝プロパンアミド
【化２４】
2008509885.tif 000025
Ｎ−マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル（５００ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）及び６−アミノヘキサン酸（２３５ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２００ｍｌ）中に溶解させ、ＲＴで１６時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、ＤＭＦ（３０ｍｌ）を加えて蒸発させた。ＤＣＭ（２５ｍｌ）及びＥＤＣＩ（６１３ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加え、混合物をＲＴで４時間攪拌した。水（２０ｍｌ）を加え、層を分離した。水層をＤＣＭ（３×１５ｍｌ）で抽出した。有機層を水（２×４０ｍｌ）及び塩水（２×４０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。粗固体をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ）により精製して、表題の生成物を白色固体として得た（４００ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、５９％）。
【化２５】
2008509885.tif 000026
【０１０２】
中間体８
Ｎ−α−［Ｓ−アセチルチオプロピオニル］リジンリジンリジン（ＡＴＰ−ＫＫＫ−ＯＨ）
Ｈ２Ｎ−［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）］３−Ｗａｎｇレジン（３００ｍｇ）を、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｗａｎｇレジン（０．５３ｍＭｏｌ／ｇ置換）から、標準的なＦｍｏｃ化学を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護工程に２０％のピペリジンＤＭＦ、並びに各カップリング工程にＤＭＦ（１５ｍＬ）中の３倍過剰のＦｍｏｃアミノ酸（ＦｍｏｃＬｙｓ［Ｂｏｃ］ＯＨ）（０．５２ｍＭｏｌ、２２７ｍｇ）、ＴＢＴＵ（０．５２ｍＭｏｌ、１６３ｍｇ）、ＨＯＢＴ（０．５２ｍＭｏｌ、７０．２ｍｇ）及びＤＩＰＥＡ（０．７ｍＭｏｌ、９０．３ｍｇ）を用いて調製した。ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中のＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート（０．２ｍＭｏｌ、５０ｍｇ）を加え、反応物を２時間振とうした（ニンヒドリン陰性）。レジンをろ過し、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、ジエチルエーテルで乾燥した。ペプチドを、９５％ＴＦＡ／水を用いて２時間振とうすることによりレジンから切断し、レジンをろ過により除き、溶媒を蒸発により除いた。残渣を、ジエチルエーテルを用いる粉砕により単離し、分取ＲＰ−ｈｐｌｃ（Ｃ−１８  Ｖｙｄａｃ  ５μｍ粒子径、２８０ｍｍ×２５ｍｍカラム；４０分の勾配溶出、０〜４０％アセトニトリル／水／０．１％ＴＦＡ；２０ｍＬ／分）により精製して表題の化合物、７０ｍｇ、７５％を凍結乾燥後に得た。ＥＳＭＳ  ５３３［Ｍ＋１］；ＲＰ−ｈｐｌｃ保持時間１０．９９分（Ｃ−１８  Ｈｉｃｈｒｏｍｅ、５μｍ粒子径、２５０ｍｍ×６ｍｍカラム、２０分で１０〜９０％アセトニトリル／水／０．１％ＴＦＡ；１ｍＬ／分）。
【０１０３】
（実施例１）
Ｓ−［３−（｛２−（３−｛［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノイル］アミノ｝プロポキシ）−１，１−ビス［（３−｛［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパノイル］アミノ｝プロポキシ）メチル］エチル｝アミノ）−３−オキソプロピル］エタンチオエート
【化２６】
2008509885.tif 000027
Ｎ−マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル（２３０ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）及びＮＥｔ３（０．１７ｍｌ、１．２４ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）中の中間体６の生成物の溶液（１００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）に加えた。得られた混合物をＲＴで１．２５時間攪拌した。水（３ｍｌ）及びジクロロメタン（３ｍｌ）を加え、層を分離した。水層をジクロロメタン（３×３ｍｌ）で抽出した。有機層を水（３×１０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。粗油をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １：１、次いでＥｔＯＡｃ、次いでＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ  ２０％）により精製して、表題の生成物を淡黄色の固体として得た（９５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、４４％）。
【化２７】
2008509885.tif 000028
【０１０４】
（実施例２）
Ｓ−［２１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，５−ビス（｛３−［（６−｛［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−ｙｌ）プロパノイル］アミノ｝ヘキサノイル）アミノ］プロポキシ｝メチル）−３，１２，１９−トリオキソ−７−オキサ−４，１１，１８−トリアザヘニコス−１−イル］エタンチオエート
【化２８】
2008509885.tif 000029
中間体７の化合物（７８．５ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ）及びＮＥｔ３（０．０７ｍｌ、０．４８３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍｌ）中の中間体６の化合物の溶液（５３ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）に加えた。混合物をＲＴで２．５時間攪拌して蒸発させた。水（３ｍｌ）及びＤＣＭｅ（３ｍｌ）を加えた。水層をＤＣＭ（３×３ｍｌ）で抽出した。有機層を水（３×１０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。残渣をシリカゲルのプラグを通して（ＥｔＯＡｃ、次いでＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ１：１）、表題の生成物の第一バッチを得た。水層をＤＣＭ（３×７ｍｌ）で逆抽出した。この有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮し、ＤＣＭ（２ｍｌ）及びメタノール（１ｍｌ）で希釈し、ＰＳ−ＴｓＣｌ（ＨＬ）レジン（２．４０ｍｍｏｌ／ｇ、３００ｍｇ）で３時間処理し、ろ過して蒸発させて、表題の生成物の第二バッチを得た。２つのバッチを合わせて、表題の生成物を白色固体として得た（１１ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、１３％）。
【化２９】
2008509885.tif 000030
【０１０５】
（実施例３）
Ｓ−［３０−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，５−ビス［２５−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−７，２３−ジオキソ−２，１０，１３，１６，１９−ペンタオキサ−６−２２−ジアザペンタコス−１−イル］−３，１２，２８−トリオキソ−７，１５，１８，２１，２４−ペンタオキサ−４，１１，２７−トリアザトリアコンチ−１−イル｝エタンチオエート
【化３０】
2008509885.tif 000031
Ｍａｌ−ｄ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、ＵＳＡ）（１００ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）及びＮＥｔ３（０．０７ｍｌ、０．４８３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍｌ）中の中間体６の化合物の溶液（５２ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）に加えた。混合物をＲＴで２時間攪拌して蒸発させた。ＨＣｌ水溶液（０．１Ｍ、８ｍｌ）及びＤＣＭ（７ｍｌ）を加えた。有機層をＨＣｌ水溶液（０．１Ｍ、３×８ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。残渣をＤＣＭ（５ｍｌ）に溶解し、ＨＣｌ水溶液（０．１Ｍ、３×５ｍｌ）で洗浄した。最初の２回の洗浄の水層を合わせ、ＤＣＭ（２×５ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して表題の生成物を無色の油として得た（１０ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、９％）。
【化３１】
2008509885.tif 000032
【０１０６】
（実施例４）
Ｓ−｛３−［（２−［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロポキシ］−１，１−ビス｛［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロポキシ］メチル｝エチル）アミノ］−３−オキソプロピル｝エタンチオエート
【化３２】
2008509885.tif 000033
中間体６の化合物（８４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を炭酸水素ナトリウム水溶液（１Ｍ、２ｍｌ）中に溶解した。Ｎ−メトキシカルボニルマレイミド（１０２ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。混合物を５分間攪拌し、水（１ｍｌ）及びアセトニトリル（３ｍｌ）で希釈し、ＲＴで３０分未満攪拌した。ＤＣＭ（１０ｍｌ）を加えた。水層をＤＣＭ（３×６ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をＨＣｌ水溶液（０．１Ｍ、３×１５ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。粗油をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １：１）により精製して、表題の生成物を無色の油として得た（１０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、１４％）。
【化３３】
2008509885.tif 000034
【０１０７】
（実施例５）
Ｎ−α−［Ｓ−アセチルチオプロピオニル］−トリス−Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］リジンリジンリジン（ＡＴＰ−（Ｋ−［ＥＭＣ］）３−ＯＨ）
【化３４】
2008509885.tif 000035
中間体８の化合物（７０ｍｇ、０．１３ｍＭｏｌ）、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（２５ｍｇ、０．０８ｍＭｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１５ｍｇ、０．１２ｍＭｏｌ）を、ＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解し、２時間攪拌した。ここで、さらにＮ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（２５ｍｇ、０．０８ｍＭｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１５ｍｇ、０．１２ｍＭｏｌ）を加え、反応物をさらに１時間攪拌した。溶液を水（１０ｍＬ）で希釈し、混合物をＲＰ−ｈｐｌｃ  ｈｐｌｃ（Ｃ−１８  Ｖｙｄａｃ  ５μｍ粒子径、２８０ｍｍ×２５ｍｍカラム；４０分の勾配溶出、２０〜６０％アセトニトリル／水／０．１％ＴＦＡ；２０ｍＬ／分）で精製して、表題の化合物を凍結乾燥後に５０ｍｇ、３５％で得た。
ＥＳＭＳ  １１１２［Ｍ＋１］；  ＲＰ−ｈｐｌｃ保持時間１８．７分（Ｃ−１８Ｈｉｃｈｒｏｍｅ、５μｍ粒子径、２５０ｍｍ×６ｍｍカラム  ２０分で５〜８５％アセトニトリル／水／０．１％ＴＦＡ；１ｍＬ／分）。
【０１０８】
（実施例６）
実施例１〜４の化合物への抗体の複合化
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０（２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）中の１０ｍｇ／ｍｌの単一のヒンジチオールを含有する操作・作製したＦａｂ’（例えば米国特許第５，６７７，４２５号；国際公開第９８２５９７１号を参照されたい）を、最終濃度５ｍＭまで、３７℃で３０分間、２−メルカプトエチルアミンで選択的に還元した。過剰の還元剤をゲル浸透により除去し、生じたチオールを４，４’−ジチオジピリジンを用いて滴定することにより、還元の結果を測定した。リンカー（ＤＭＦ中に１０ｍＭ）を、２つの別々の一定量の還元されたＦａｂ’（２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中に４．９ｍｇ／ｍｌ）に２０分にわたって加え、最終モル比３．３：１（Ｆａｂ’：リンカー）を得た。反応混合物を３７℃に１８時間保持した。反応の程度をＨＰＬＣゲル浸透（ＧＦ２５０：１０％エタノール含有０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）により監視し、架橋をＳＤＳ  ＰＡＧＥ（非還元及び還元条件の両方での）により確かめた。
【０１０９】
反応は、３３％のトリ−Ｆａｂ’；１３％のジ−Ｆａｂ’及び５４％のＦａｂ’となった。
得られたトリ−Ｆａｂ’を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５０中の塩化ナトリウム勾配を用いるカチオン交換（ＳＰ−Ｓｅｐａｒｏｓｅ  ＨＰ）を通して精製し、ＨＰＬＣ（ゲル浸透：ＧＦ２５０；１０％エタノール含有０．２Ｍリン酸ナトリウムを用いて溶出）及びＳＤＳ  ＰＡＧＥにより特性決定した。
【０１１０】
（実施例７）
実施例５の化合物への抗体の複合化
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０（２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）中の１０ｍｇ／ｍｌの単一のヒンジチオールを有する操作・作製したＦａｂ’を、最終濃度５ｍＭまで、３７℃で３０分間、２−メルカプトエチルアミンで選択的に還元した。過剰の還元剤をゲル浸透により除去し、生じたチオールを４，４’−ジチオジピリジンを用いて滴定することにより、還元の結果を測定した。
【０１１１】
リンカー（ＤＭＦ中に２ｍＭ）を、２つの別々の一定量の還元されたＦａｂ’（２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中に５．５０ｍｇ／ｍｌ）に２０分にわたって加え、最終モル比３．３：１（Ｆａｂ’：リンカー）を得た。反応混合物を３７℃に１８時間保持した。反応の程度をＨＰＬＣゲル浸透（ＧＦ２５０：１０％エタノール含有０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）により監視し、架橋をＳＤＳ  ＰＡＧＥ（非還元及び還元条件の両方での）により確かめた。反応は、ＨＰＬＣゲル浸透により判断して５３％のトリ−Ｆａｂ’、１３％のジ−Ｆａｂ；及び３４％のＦａｂ’となった。
【０１１２】
得られたトリ−Ｆａｂ’分子を、カチオン交換：ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰにより精製した。ジ−Ｆａｂ’及びＦａｂ’を、１２５ｍＭ塩化ナトリウム含有５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５０で溶出し、トリ−Ｆａｂ’を、２０カラム容量で１２５ｍＭ〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム勾配を用いる５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５０で溶出した。
【０１１３】
（実施例８）
実施例６及び７のトリ−ＦａｂへのＰＥＧの結合
上記のようにして調製した精製トリ−Ｆａｂ’を、２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５０に緩衝液を交換し、塩酸ヒドロキシルアミン（最終濃度５０ｍＭ）と周囲温度で２時間インキュベートした。チオール基を自由にする脱保護反応の結果を、４，４’−ジチオジピリジンを用いた滴定により測定した：脱保護前混合物（ｐｒｅ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ）はトリ−Ｆａｂ’当たり０．２６チオールとなり、脱保護後混合物（ｐｏｓｔ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ）はトリ−Ｆａｂ’当たり１．１０チオールを与えた。
【０１１４】
０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５０（５０ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）中の脱保護トリ−Ｆａｂ’を、３倍モル過剰のＰＥＧのモノマレイミド誘導体（５〜４９Ｋ）と室温で１８時間インキュベートした。反応の程度を、ＨＰＬＣゲル浸透（ＧＦ２５０：１０％エタノール含有０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）及びＳＤＳ  ＰＡＧＥ（非還元及び還元条件の下での）により分析した。反応は、ＨＰＬＣゲル浸透により判断して、＞８０％のＰＥＧ化された生成物を与えた。非ＰＥＧ化トリ−Ｆａｂ’を、反応混合物をゲル浸透Ｓ−３００ＨＲ（１％  ＰＥＧ２０Ｋを用いて準備）又はカチオン交換ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰに供することにより除去し、得られたＰＥＧ化生成物を、以前のようにしてＨＰＬＣゲル浸透及びＳＤＳ  ＰＡＧＥにより特性決定した。
【０１１５】
（実施例９）
実施例６及び７のトリ−Ｆａｂ’への蛍光色素の結合
実施例８に記載のようにして脱保護トリ−Ｆａｂ’を調製した。０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５０（５０ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）中の脱保護トリ−Ｆａｂ’を、６倍モル過剰のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８Ｃ５マレイミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ−１０２５４）と室温で１８時間インキュベートした。過剰の試薬をゲル浸透により除去した。標識の程度を、吸収極大での適切なモル吸光係数を有するタンパク質及び色素濃度を用いて算出し、ＴＦＭ分子当たり１．１１色素の結果を得た。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１−１】適切な基は当該技術において公知であり、可能なＲ及びＺ１基並びに得られる二価の官能基（Ｒ２）のいくつかの例を、図１に示す。
【図１−２】適切な基は当該技術において公知であり、可能なＲ及びＺ１基並びに得られる二価の官能基（Ｒ２）のいくつかの例を、図１に示す。
【図１−１】
2008509885.tif 000042
【図１−２】
2008509885.tif 000043
【国際調査報告】
2008509885.tif 000044
2008509885.tif 000045
2008509885.tif 000046