(57)【要約】  本発明は、実質的に対向する方向の電場がタンパク質に対してその分離のために印加される差動交番場電気泳動（ＤＡＦＥ）法の使用を記載する。電場の持続時間を変化させることによって、順方向および逆方向の電場の脈動がタンパク質に前進−追い出し効果を生む。ＤＡＦＥ法の前進−追い出し効果は、分離ゲルを介したタンパク質のマイグレーションを促進し、それゆえに従来的な電気泳動装置を使用したタンパク質の分離が改善される結果となる。これにより、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が受ける多くの制限が克服される。【選択図】図１
2008516227.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スイッチングアセンブリと、
端部を形成する開始位置と目的位置とを有するマイグレーション媒体と、前記マイグレーション媒体を通して電圧を印加するための、前記スイッチングアセンブリと電気的に導通する電極アセンブリとを含み、前記スイッチングアセンブリに電気的に接続可能な電気泳動装置と、
前記開始位置にて導入可能かつ前記マイグレーション媒体に包含可能な巨大分子の少なくとも一部に対する、交番パルスシーケンスの第１電場および第２電場の前記電極アセンブリによる印加を前記スイッチングアセンブリと協働して制御する、前記スイッチングアセンブリと電気的に導通するコントローラと
を含み、
前記第１電場は前記巨大分子の少なくとも一部を第１合成方向に沿って空間的に変位させるためのものであり、前記第２電場は前記巨大分子の少なくとも一部を第２合成方向に沿って移動させるためのものであり、前記第１合成方向は前記第２合成方向と実質的に対向しており、
前記開始位置にて巨大分子が導入される場合は、前記巨大分子に対し、前記交番パルスシーケンスで前記第１電場を第１パルス幅の間印加し、かつ、前記第２電場を第２パルス幅の間印加することによって、前記巨大分子はその分離のために前記目的位置に向かって電気泳動的に移動し、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅はあらかじめ決定されており、各巨大分子は複数の分子特性を有して前記巨大分子は前記複数の分子特性の少なくとも一つに応じて前記マイグレーション媒体によって分離される、巨大分子を分離するための電気泳動システム。
【請求項２】
前記複数の分子特性は、分子量、分子サイズおよび分子配座を含む、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項３】
前記マイグレーション媒体は、巨大分子分離のために形成される固相マトリクスおよび固相システムの一つである、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項４】
前記マイグレーション媒体は、ポリアクリルアミドゲルおよびアガロースの一つである、請求項３に記載の電気泳動システム。
【請求項５】
前記マイグレーション媒体は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルおよびポリアクリルアミドゲルの一つである、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項６】
前記マイグレーション媒体は、前記巨大分子のそれぞれのサイズよりも大きな有効ポアサイズを有する、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項７】
前記第１合成方向は実質的に前記開始位置から遠ざかる方向であり、前記第２合成方向は実質的に前記開始位置に向かう方向である、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項８】
前記第１パルス幅は前記第２パルス幅よりも長い、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項９】
第１パルス幅対第２パルス幅の比は２：１．５から１５：１の範囲内にある、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項１０】
前記巨大分子は、ポリペプチド分子、ミオシン分子、ヒアルロン酸分子、巨大タンパク質複合物および複合タンパク質混合物の少なくとも一つである、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項１１】
前記第１電場のパルス強度は、前記第２電場のパルス強度と実質的に同じである、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項１２】
前記スイッチングアセンブリは、前記電極アセンブリに電気的に接続され、かつ、前記電極アセンブリと電源との電気的インターフェースを形成する少なくとも一つの電気的スイッチを含み、前記少なくとも一つの電気的スイッチは、電気的なスイッチングを行うことにより、前記マイグレーション媒体に送るための前記第１電場と前記第２電場とを交番させるように前記コントローラによって制御可能である、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項１３】
前記少なくとも一つの電気的スイッチはリレーアセンブリおよびダイオードアレイの少なくとも一つである、請求項１２に記載の電気泳動システム。
【請求項１４】
前記コントローラは、前記少なくとも一つの電気的スイッチと電気的に導通し、前記第１パルス幅および第２パルス幅を決定するために少なくとも一つの電気的スイッチと協働し、および前記第１パルス幅および前記第２パルス幅をあらかじめ画定するためにプログラム可能なタイマー装置を含む、請求項１２に記載の電気泳動システム。
【請求項１５】
前記コントローラは、前記少なくとも一つの電気的スイッチと電気的に導通して前記第１パルス幅および前記第２パルス幅をあらかじめ画定するためにプログラム可能な、プログラム可能ロジックコントローラおよびプログラム可能集積回路の少なくとも一つを含み、プログラム可能ロジックコントローラおよびプログラム可能集積回路の前記少なくとも一つは、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅を画定するための前記少なくとも一つの電気的スイッチと前記タイマー装置と協働する、請求項１２に記載の電気泳動システム。
【請求項１６】
前記マイグレーション媒体は、前記開始位置と前記目的位置との間に延びるマイグレーションレーンを含み、前記マイグレーション媒体は、前記マイグレーションレーンに沿ってサンプル分子量範囲を表すように、および、前記サンプル分子量範囲内に複数の分子量を示すように形成され、前記巨大分子の少なくとも一部は、前記サンプル分子量範囲内にあり、それゆえ前記マイグレーション媒体によって分離可能である、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項１７】
前記サンプル分子量範囲の少なくとも一部をなす有効分子量範囲をさらに含み、前記有効分子量範囲は、上限分子量と下限分子量との間に量的に延びており、その範囲内では前記巨大分子の分離分解能および分子量指示が実質的に改善される、請求項１６に記載の電気泳動システム。
【請求項１８】
前記コントローラはさらに全実行時間を画定するためにプログラム可能であり、前記第１電場および前記第２電場は、前記全実行時間内の前記交番パルスシーケンスで前記巨大分子に印加される、請求項１７に記載の電気泳動システム。
【請求項１９】
前記上限分子量および下限分子量は、前記第１パルス幅、前記第２パルス幅および前記全実行時間の関数であり、それゆえ実質的にそれらによって決定される、請求項１８に記載の電気泳動システム。
【請求項２０】
端部を形成する開始位置と目的位置とを有するマイグレーション媒体と、前記マイグレーション媒体を通して電圧を印加するための電極アセンブリとを含む電気泳動装置を与えるステップと、
前記電気泳動装置に電気的に接続可能な、前記電極アセンブリと電気的に導通するスイッチングアセンブリを与えるステップと、
前記スイッチングアセンブリに、前記スイッチングアセンブリと協働して前記電極アセンブリを制御するコントローラを電気的に導通させるステップと、
前記開始位置にて導入可能かつ前記マイグレーション媒体に包含可能な巨大分子の少なくとも一部に対して、交番パルスシーケンスの第１電場および第２電場を前記電極アセンブリによって印加するステップと、
巨大分子に前記交番パルスシーケンスで前記第１電場を第１パルス幅の間印加し、かつ、前記第２電場を第２パルス幅の間印加する場合に、前記開始位置にて導入された巨大分子をその分離のために前記目的位置に向けて電気泳動的に移動させるステップと
を含み、
前記第１電場は前記巨大分子の少なくとも一部を第１合成方向に沿って空間的に変位させるためのものであり、前記第２電場は前記巨大分子の少なくとも一部を第２合成方向に沿って移動させるためのものであり、前記第１合成方向は前記第２合成方向と実質的に対向しており、
前記第１パルス幅および前記第２パルス幅はあらかじめ決定されており、
各巨大分子は複数の分子特性を有して前記巨大分子は前記複数の分子特性の少なくとも一つに応じて前記マイグレーション媒体によって分離される、巨大分子を分離するための差動交番場電気泳動（ＤＡＦＥ）法。
【請求項２１】
電気泳動装置を与えるステップは、分子量、分子サイズおよび分子配座を含む前記複数の分子特性に応じて前記巨大分子を分離するために前記マイグレーション媒体を与えるステップを含む、請求項２０に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２２】
電気泳動装置を与えるステップは、巨大分子を分離するための固相マトリクスおよび固相システムの一つである前記マイグレーション媒体を電気泳動装置に与えるステップを含む、請求項２０に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２３】
電気泳動装置を与えるステップは、ポリアクリルアミドゲルおよびアガロースの一つである前記マイグレーション媒体を電気泳動装置に与えるステップを含む、請求項２０に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２４】
電気泳動装置を与えるステップは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルおよびポリアクリルアミドゲルの一つである前記マイグレーション媒体を電気泳動装置に与えるステップを含む、請求項２０に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２５】
電気泳動装置を与えるステップは、前記巨大分子のそれぞれのサイズよりも大きな有効ポアサイズを有する前記マイグレーション媒体を電気泳動装置に与えるステップを含む、請求項２０に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２６】
交番パルスシーケンスで第１電場および第２電場を印加するステップは、前記第１合成方向が実質的に前記開始位置から離れる方向にある前記第１電場を印加することと、前記第２合成方向が実質的に前記開始位置に向かう方向にある前記第２電場を印加することとを含む、請求項２０に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２７】
交番パルスシーケンスで第１電場および第２電場を印加するステップは、前記第１パルス幅が前記第２パルス幅よりも長い、第１電場および第２電場を印加するステップを含む、請求項２０に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２８】
交番パルスシーケンスで第１電場および第２電場を印加するステップは、第１パルス幅対第２パルス幅の比が２：１．５から１５：１の範囲内にある第１電場および第２電場を印加するステップを含む、請求項２０に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２９】
前記巨大分子を電気泳動的に移動させるステップは、ポリペプチド分子、ミオシン分子、ヒアルロン酸分子、巨大タンパク質複合物および複合タンパク質混合物の少なくとも一つである分子を電気泳動的に移動させるステップを含む、請求項２０に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３０】
交番パルスシーケンスで第１電場および第２電場を印加するステップは、前記第１電場のパルス強度が前記第２電場のパルス強度と実質的に同じである前記第１電場および前記第２電場を印加するステップを含む、請求項２０に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３１】
スイッチングアセンブリを与えるステップは、前記電極アセンブリに電気的に接続され、かつ、前記電極アセンブリと電源との電気的インターフェースを形成する少なくとも一つの電気的スイッチを与えるステップを含み、前記少なくとも一つの電気的スイッチは、電気的なスイッチングを行うことにより、前記マイグレーション媒体に送るための前記第１電場と前記第２電場とを交番させるように前記コントローラによって制御可能である、請求項２０に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３２】
少なくとも一つの電気的スイッチを与えるステップは、リレーアセンブリおよびダイオードアレイの少なくとも一つである少なくとも一つの電気的スイッチのそれぞれを少なくとも一つの電気的スイッチに与えるステップを含む、請求項３１に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３３】
前記スイッチングアセンブリにコントローラを電気的に導通させるステップは、タイマー装置を前記少なくとも一つの電気的スイッチに電気的に導通させるステップを含み、前記タイマー装置は、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅を決定するために前記少なくとも一つの電気的スイッチと協働し、前記タイマー装置は、前記第１パルス幅および第２パルス幅をあらかじめ画定するようにプログラム可能である、請求項３１に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３４】
前記スイッチングアセンブリにコントローラを電気的に導通させるステップは、プログラム可能ロジックコントローラおよびプログラム可能集積回路の少なくとも一つを少なくとも一つの電気的スイッチに電気的に導通させて、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅をあらかじめ画定するためにプログラム可能とするステップを含み、前記プログラム可能ロジックコントローラおよびプログラム可能集積回路の少なくとも一つは、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅を決定するために前記少なくとも一つの電気的スイッチと前記タイマー装置と協働する、請求項３１に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３５】
電気泳動装置を与えるステップは、前記開始位置と前記目的位置との間に延びるマイグレーションレーンを前記マイグレーション媒体に与えるステップを含み、前記マイグレーション媒体は、前記マイグレーションレーンに沿ってサンプル分子量範囲を表すように、および、前記サンプル分子量範囲内に複数の分子量を示すように形成され、前記巨大分子の少なくとも一部は、前記サンプル分子量範囲内にあり、それゆえ前記マイグレーション媒体によって分離可能である、請求項２０に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３６】
電気泳動装置を与えるステップは、前記サンプル分子量範囲の少なくとも一部をなす有効分子量範囲をさらに含み、前記有効分子範囲量は、上限分子量と下限分子量との間に量的に延びており、その範囲内では前記巨大分子の分離分解能および分子量指示が実質的に改善される、請求項３５に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３７】
コントローラを前記スイッチングアセンブリと電気的に導通させるステップは、全実行時間を画定するために前記コントローラをプログラミングするステップを含み、前記第１電場および前記第２電場は、前記全実行時間内の前記交番パルスシーケンスで前記巨大分子に印加される、請求項３６に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３８】
有効分子量範囲を与えるステップは、前記第１パルス幅、前記第２パルス幅および前記全実行時間の関数であり、それゆえ実質的にそれらによって決定される上限分子量および下限分子量を前記有効分子量範囲に与えるステップを含む、請求項３７に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３９】
端部を形成する開始位置と目的位置とを有するマイグレーション媒体と、前記マイグレーション媒体を通して電圧を印加するための電極アセンブリと、を含む電気泳動装置と、
前記開始位置にて導入可能かつ前記マイグレーション媒体に包含可能な巨大分子の少なくとも一部に対して、第１電場および第２電場を交番パルスシーケンスで印加するために前記電極アセンブリと協働する、前記電極アセンブリと電気的に導通するコントローラと
を含み、
前記第１電場は前記巨大分子の少なくとも一部を第１合成方向に沿って空間的に変位させるためのものであり、前記第２電場は前記巨大分子の少なくとも一部を第２合成方向に沿って移動させるためのものであり、前記第１合成方向は前記第２合成方向と実質的に対向しており、
前記開始位置にて巨大分子が導入される場合は、前記巨大分子に対し、前記交番パルスシーケンスで前記第１電場を第１パルス幅の間印加し、かつ、前記第２電場を第２パルス幅の間印加することによって、前記巨大分子はその分離のために前記目的位置に向かって電気泳動的に移動し、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅はあらかじめ決定されており、各巨大分子は複数の分子特性を有して前記巨大分子は前記複数の分子特性の少なくとも一つに応じて前記マイグレーション媒体によって分離される、巨大分子を分離するための電気泳動システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、電気泳動のためのシステムに関する。詳しくは、本発明は、差動交番電場を使用したタンパク質分離のための電気泳動システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
典型的な生物研究室においては、さらなるどの下流分析よりも先立ってタンパク質分離に用いられる著名な技術は、有用かつ便利な、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｅｃｙｌ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ−ＰｏｌｙＡｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））である。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、バンドが拡大したり、電場影響下でのマイグレーション移動度が非常に類似したタンパク質またはタンパク質アイソフォームの分離が無効になるといった制限を受ける。
【０００３】
現在のところ、分子量の差異が近似するタンパク質の分離のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用する最良の方法は、パルスフィールドゲル電気泳動法に関連する。パルスフィールドゲル電気泳動法は、公開文献で実証かつ記載がされている。公開文献においては、異なる筋ミオシン重鎖の分離が、電場を周期的にスイッチオン・オフしてタンパク質バンドのマイグレーションを変更することによって行われた。この新規なアプローチは既存のＳＤＳ−ＰＡＧＥの分解能を改善するものであるが、長い実行周期を要したり、電場がスイッチオフされたときの拡散が寄与してバンドが拡大したり、不便かつ非慣習的な長い（３２ｃｍ）分離ゲルをキャスティングする必要があったりといった付随的な制限もある。
【０００４】
このため、改善された電気泳動システムの必要性が明確に肯定される。
【発明の開示】
【０００５】
タンパク質バンドの鮮明度および分解能、またはミニゲル（６ｃｍ）の制限領域内の関心バンド間の分離距離が改善される点で差別化される、タンパク質／ペプチドまたはアイソフォームの分離のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはネイティブＰＡＧＥを用いた新規なアプローチが実証される。本アプローチは、差動交番場電気泳動法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＡＦＥ））として以下に称され、通常の既存電源システムを、例えばミニゲルセル（好ましくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）のような標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥランニング装置に取り付けられて電場の短パルス（ミリ秒）を順方向および逆方向に送ることができるシステムに有効かつ便利に変換する。順および逆のパルス状周期の形態または比率ならびにゲル濃度を制御することによって、ＤＡＦＥは、ミニ分離ゲルの制限内にある異なる所望の分子量範囲に焦点を合わせる、すなわち「ズームインする」能力を有する。したがって、本方法は、所定のポリアクリルアミドゲル濃度に連動して電場のパルス設定を変更することによって、高分子量タンパク質のほか、低分子量（２８ｋＤａもの低さ）のタンパク質アイソフォームに対しても良好な分解能を有することができる。
【０００６】
したがって、本発明の第１の側面によれば、開示される巨大分子を分離するための電気泳動システムは、
スイッチングアセンブリと、
端部を形成する開始位置と目的位置とを有するマイグレーション媒体と、前記マイグレーション媒体を通して電圧を印加するための、前記スイッチングアセンブリと電気的に導通する電極アセンブリとを含み、前記スイッチングアセンブリに電気的に接続可能な電気泳動装置と、
前記開始位置にて導入可能かつ前記マイグレーション媒体に包含可能な巨大分子の少なくとも一部に対する、交番パルスシーケンスの第１電場および第２電場の前記電極アセンブリによる印加を前記スイッチングアセンブリと協働して制御する、前記スイッチングアセンブリと電気的に導通するコントローラと、
を含み、
前記第１電場は前記巨大分子の少なくとも一部を第１合成方向に沿って空間的に変位させるためのものであり、前記第２電場は前記巨大分子の少なくとも一部を第２合成方向に沿って移動させるためのものであり、前記第１合成方向は前記第２合成方向と実質的に対向しており、
前記開始位置にて巨大分子が導入される場合は、前記巨大分子に対し、前記交番パルスシーケンスで前記第１電場を第１パルス幅の間印加し、かつ、前記第２電場を第２パルス幅の間印加することによって、前記巨大分子はその分離のために前記目的位置に向かって電気泳動的に移動し、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅はあらかじめ決定されており、各巨大分子は複数の分子特性を有して前記巨大分子は前記複数の分子特性の少なくとも一つに応じて前記マイグレーション媒体によって分離される。
【０００７】
本発明の第２の側面によれば、開示される巨大分子を分離するための差動交番場電気泳動（ＤＡＦＥ）法は、
端部を形成する開始位置と目的位置とを有するマイグレーション媒体と、前記マイグレーション媒体を通して電圧を印加するための電極アセンブリと、を含む電気泳動装置を与えるステップと、
前記電気泳動装置に電気的に接続可能な、前記電極アセンブリと電気的に導通するスイッチングアセンブリを与えるステップと、
前記スイッチングアセンブリに、前記コントローラは前記スイッチングアセンブリと協働して前記電極アセンブリを制御するコントローラを電気的に導通させるステップと、
前記開始位置にて導入可能かつ前記マイグレーション媒体に包含可能な巨大分子の少なくとも一部に対して、交番パルスシーケンスの第１電場および第２電場を前記電極アセンブリによって印加するステップと、
巨大分子に前記交番パルスシーケンスで前記第１電場を第１パルス幅の間印加し、かつ、前記第２電場を第２パルス幅の間印加する場合に、前記開始位置にて導入された巨大分子をその分離のために前記目的位置に向けて電気泳動的に移動させるステップと
を含み、
前記第１電場は前記巨大分子の少なくとも一部を第１合成方向に沿って空間的に変位させるためのものであり、前記第２電場は前記巨大分子の少なくとも一部を第２合成方向に沿って移動させるためのものであり、前記第１合成方向は前記第２合成方向と実質的に対向しており、
前記第１パルス幅および前記第２パルス幅はあらかじめ決定されており、
各巨大分子は複数の分子特性を有して前記巨大分子は前記複数の分子特性の少なくとも一つに応じて前記マイグレーション媒体によって分離される。
【０００８】
本発明の第３の側面によれば、開示される巨大分子を分離するための電気泳動システムは、
端部を形成する開始位置と目的位置とを有するマイグレーション媒体と、前記マイグレーション媒体を通して電圧を印加するための電極アセンブリと、を含む電気泳動装置と、
前記開始位置にて導入可能かつ前記マイグレーション媒体に包含可能な巨大分子の少なくとも一部に対して、第１電場および第２電場を交番パルスシーケンスで印加するために前記電極アセンブリと協働する、前記電極アセンブリと電気的に導通するコントローラと、を含み、
前記第１電場は前記巨大分子の少なくとも一部を第１合成方向に沿って空間的に変位させるためのものであり、前記第２電場は前記巨大分子の少なくとも一部を第２合成方向に沿って移動させるためのものであり、前記第１合成方向は前記第２合成方向と実質的に対向しており、
前記開始位置にて巨大分子が導入される場合は、前記巨大分子に対し、前記交番パルスシーケンスで前記第１電場を第１パルス幅の間印加し、かつ、前記第２電場を第２パルス幅の間印加することによって、前記巨大分子はその分離のために前記目的位置に向かって電気泳動的に移動し、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅はあらかじめ決定されており、各巨大分子は複数の分子特性を有して前記巨大分子は前記複数の分子特性の少なくとも一つに応じて前記マイグレーション媒体によって分離される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の実施例は、添付の図面を参照して以下に記載される。
【００１０】
上記問題に取り組むための電気泳動システムを以下に説明する。
【００１１】
本発明の第１実施例、すなわち電気泳動システム２０を、図１を参照して説明する。図１は、電気泳動システム２０の前断面立面図を示す。
【００１２】
電気泳動システム２０は巨大分子を分離するためのものであり、図１に示すように、スイッチングアセンブリ２４およびコントローラ２６を含む。スイッチングアセンブリ２４は、電気泳動装置２８に電気的に接続可能である。
【００１３】
電気泳動装置２８は、従来的な構造的構成を備える従来的なＰＡＧＥ装置であり、マイグレーション媒体３０と、マイグレーション媒体３０を通して電圧を印加するための電極アセンブリ３２と、電極アセンブリ３２に電力を直接的および間接的のいずれか一方で供給するための電源３４を備える。電源３４はスイッチングアセンブリ２４に電気的に接続可能であり、スイッチングアセンブリ２４はさらに電極アセンブリ３２に電気的に接続可能である。
【００１４】
マイグレーション媒体３０は、その端部を形成する開始位置および目的位置を有する。詳しくは、巨大分子（図示せず）は、その電気泳動的なマイグレーションのために開始位置にてマイグレーション媒体３０に導入されて、目的位置に向かう。コントローラ２６は、スイッチングアセンブリ２４と電気的に導通する。コントローラ２６は、スイッチングアセンブリ２４と協働し、図２に示すように、開始位置にてマイグレーション媒体３０に受け取られて包含される巨大分子の一部に対する、電極アセンブリ３２による交番パルスシーケンス４４の第１電場４０および第２電場４２の印加を制御する。
【００１５】
マイグレーション媒体３０は、ドデシル硫酸ナトリウムまたはポリアクリルアミドのプレキャストミニゲルが好ましい。または、想定される巨大分子を分類するための適切な分子ふるいを与えることが可能なキャピラリまたはナノ構造マトリクスを有するアガロースまたはその他の媒体もまた、マイグレーション媒体３０として使用可能である。詳しくは、マイグレーション媒体３０は、巨大分子それぞれのサイズよりも大きな有効ポアサイズを有し、マイグレーション媒体３０内のマイグレーションが観測可能になる。
【００１６】
スイッチングアセンブリ２４は、少なくとも一つの電気的スイッチを含む。少なくとも一つの電気的スイッチはそれぞれ電気的リレーである。または、少なくとも一つの電気的スイッチはそれぞれダイオードアレイである。
【００１７】
少なくとも一つの電気的スイッチは、電極アセンブリ３２に電気的に接続され、電極アセンブリ３２と電源３４との電気的インターフェースをなす。少なくとも一つの電気的スイッチはコントローラ２６によって電気的なスイッチングが制御可能である。これによって第１電場４０と第２電場４２とで交番してそれをマイグレーション媒体３０に送ることが制御可能となる。少なくとも一つの電気的スイッチが一対のリレー５０である電気泳動システムの詳細図を図３に示す。
【００１８】
第１電場４０は巨大分子の少なくとも一部を第１合成方向５２に沿って移動させるためのものであり、第２電場４２は巨大分子の少なくとも一部を第２合成方向５４に沿って移動させるためのものである。第１合成方向５２は、第２合成方向５４と実質的に対向することが好ましい。したがって、巨大分子が開始位置にて導入されると、巨大分子に対し交番パルスシーケンス４４で第１電場４０を第１パルス幅５６の間印加し、かつ、第２電場４２を第２パルス幅５８の間印加することによって、巨大分子がその分離のために対応する目的位置に向かう電気泳動的マイグレーションが生じる。第１パルス幅５６および第２パルス幅５８はあらかじめ決定されている。各巨大分子は複数の分子特性を有し、分子量、分子サイズ等の分子特性の少なくとも一つに応じて巨大分子がマイグレーション媒体３０によって分離される。巨大分子が目的位置に向かって移動するとき、巨大分子のすべてが目的位置に到達するわけではない。各巨大分子が目的位置に向かって移動する程度は、その分子特性に依存し、好ましくはマイグレーション媒体３０のゲル濃度に依存する。
【００１９】
好ましくは、コントローラ２６は、図３に示す少なくとも一つの電気的スイッチと電気的に導通するタイマー装置６０を含む。タイマー装置は少なくとも一つの電気的スイッチを協働して、第１電場４０および第２電場４２をそれぞれ送るための第１パルス幅５６および第２パルス幅５８を決定する。タイマー装置は、第１パルス幅５６および第２パルス幅５８をあらかじめ画定するようにプログラム可能である。または、コントローラ２６は、少なくとも一つの電気的スイッチと電気的に導通して第１パルス幅５６および第２パルス幅５８をあらかじめ画定するためにプログラム可能な、プログラム可能ロジックコントローラおよびプログラム可能集積回路の少なくとも一つを含む。
【００２０】
第１合成方向５２は、実質的に開始位置から遠ざかり目的位置に向かう方向を向く一方で、第２合成方向５４は、実質的に開始位置に向かい目的位置から遠ざかる方向を向く。好ましくは、第１パルス幅５６は、第２パルス幅５８よりも長い。第１パルス幅５６対第２パルス幅５８の比は、２：１．５から１５：１の範囲内にある。第１電場４０および第２電場４２はそれぞれパルス強度を有する。第１電場４０のパルス強度は、第２電場４２のパルス強度と実質的に同じであるのが好ましい。
【００２１】
マイグレーション媒体３０は、開始位置と目的位置との間に延びるマイグレーションレーンを有する。マイグレーション媒体３０は、マイグレーションレーンに沿ってサンプル分子量範囲を表すように、および、サンプル分子量範囲内に複数の分子量を示すように形成される。分離を受ける巨大分子の少なくとも一部は、サンプル分子量範囲内にある。このため、マイグレーション媒体３０によって分離可能となる。
【００２２】
電気泳動システム２０はさらに、サンプル分子量範囲の少なくとも一部を構成する有効分子量範囲を含む。有効分子量範囲は、上限分子量と下限分子量との間に量的に延びており、その範囲内では、巨大分子の分離分解能および分子量指示は実質的に優れている。
【００２３】
コントローラ２６はさらに、全実行時間７２を画定するようにプログラム可能である。第１電場４０および第２電場４２は、全実行時間７２内の交番パルスシーケンス４４で巨大分子に印加される。上限分子量および下限分子量はさらに、マイグレーション媒体３０のゲル濃度によって決定されるのが好ましい。
【００２４】
上限分子量および下限分子量は、第１パルス幅５６、第２パルス幅５８および全実行時間７２の関数であり、それゆえ実質的にそれらによって決定される。
【００２５】
図１、図３に示すように、および図４に画像的に示すように、電気泳動システム２０は、従来的な電気泳動装置２８に容易に組み込まれて、大きな電気的または構造的な変更なしに一体化される。
【００２６】
電気泳動システム２０は、差動交番場電気泳動（ＤＡＦＥ）法を実施するためのものである。ＤＡＦＥ法においては、電気泳動システム２０は、マイグレーション媒体３０に電気的に接続されて、その開始位置に導入された巨大分子に第１電場４０を印加する。
【００２７】
巨大分子は所定の種類のポリペプチド分子の少なくとも一つである。
【００２８】
第１電場４０によって、第１合成方向５２において電気泳動マイグレーションを介した巨大分子のレプテーション（ｒｅｐｔａｔｉｏｎ）が引き起こされる。しかし、巨大分子の構造ゆえに、巨大分子の一部はマイグレーション媒体３０のポア内にとどまるかまたは捕捉される。これによって、第１合成方向５２におけるさらなるマイグレーションが阻止される。
【００２９】
第１電場４０は、第１パルス幅５６の間のみ巨大分子に印加され、その後第２電場４２が第１電場４０不存在下で巨大分子に印加される。
【００３０】
第２電場４２によって、第２合成方向５４において巨大分子のレプテーションが引き起こされ、少なくともその一部がマイグレーション媒体３０のポアから追い出されまたは放出（ｄｅｔｒａｐｐｉｎｇ）される。第２電場４２は、第２パルス幅５８の間のみ巨大分子に印加され、その後第１電場４０が第１電場４０の不存在下で巨大分子に再印加される。
【００３１】
第１電場４０および第２電場４２は、交番パルスシーケンス４４で巨大分子に印加される。第１パルス幅５６と第２パルス幅５８との比によって、合成マイグレーション方向７４が決定される。したがって、コントローラ２６は、第１パルス幅５６および第２パルス幅５８をあらかじめ画定するためにプログラムされる。その結果、合成マイグレーション方向７４は実質的に第１合成方向の方向になり、目的位置に向かっての巨大分子のマイグレーションが促進される。
【００３２】
交番パルスシーケンス４４で第１電場４０および第２電場４２を印加するＤＡＦＥ法は、巨大分子に前進−追い出し効果（ａｄｖａｎｃｉｎｇ−ｄｉｓｌｏｄｇｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）をもたらす。ＤＡＦＥ法の前進−追い出し効果は、マイグレーション媒体３０を通る巨大分子のマイグレーションを促進する。これにより、従来的な電気泳動装置２８のみを用いても巨大分子の分解能および分離度改善される。
【００３３】
以下の例によって、巨大分子の分離に適用された場合の本発明、電気泳動システム２０およびＤＡＦＥ法の所定の側面が実証されるが、その範囲を制限するものと受け取ってはならない。
【００３４】
ヒトアポリポタンパク質、ウサギミオシン軽鎖および重鎖、ヒト血清、ウシ胎児血清、サイログロブリンおよびウシアルブミンからなるタンパク質のサンプルを、巨大分子を形成するために得た。電気泳動装置２８は、ゲルランニング装置、バッファ室、セル、ゲルキャスティング装置および予備染色されたタンパク質分子量マーカを含むその他の付属品を有する。これらは、例えばＢｉｏｒａｄ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ等の電気泳動機器サプライヤから従来的に入手可能である。少なくとも一つの電気的スイッチはそれぞれ、ＡＣリレーであり、電源３４はＡＣ電源である。時間遅延デジタルタイマーがタイマー装置として使用される。
【００３５】
第１例では、主にａ）複合タンパク質混合物、すなわちウシ胎児血清（ＦＣＳ）；ｂ）大および中程度の分子量タンパク質、すなわちサイログロブリン（非変性のＭＷは６６９ｋＤａであり、変性のＭＷは２３８ｋＤ）、およびＣ）低分子量タンパク質、すなわちＭＷが６７ｋＤａのウシアルブミン、という３つの異なる分子量（ＭＷ）のグループからのペプチドおよびタンパク質が、一定場電気泳動（ＣＦＥ）法、および電気泳動システム２０を用いるＤＡＦＥ法を使用して分離された。ＣＦＥ法およびＤＡＦＥ法の分離結果は、図５のセグメントＡおよびＢにそれぞれ示される。レーン１は分子量基準である一方、レーン２、３および４はそれぞれ、１５μｇのＦＣＳ、１０μｇのサイログロブリンおよび１０μｇのアルブミンである。ＤＡＦＥ法に対しては、第１パルス幅５６は３００ミリ秒（ｍｓ）であり、第２パルス幅５８は１６０ｍｓであり、全実行時間７２は１５７分（ｍｉｎ）である。マイグレーション媒体３０に対しては５％分離ゲルが使用され、第１電場４０および第２電場４２はそれぞれ２００ボルトであった。
【００３６】
図５に示すように、ＣＦＥと比べて比較的多かったのは、ＤＡＦＥによって異なるタンパク質グループを分析した場合に分解される、ＭＷが１００ｋＤａよりも大きな分子種である。各タンパク質グループ内には、不確定数の異なるタンパク質／ペプチド種がその複合性および純粋性の程度に応じて存在する。よって、ＣＦＥと比べると、および識別可能なタンパク質／ペプチドバンドの数の分解能を考慮すると、ＤＡＦＥはより優れた方法である。図５のセグメントＢでは、約７００ｋＤａにおける大きな分子量バンドが観測された。これにより、ＤＡＦＥには大きな分子量のタンパク質種を分解する能力があることが示唆される。この能力は、分離を受ける巨大分子に対してＤＡＦＥが有する前進および放出の性質に関連している。図６を参照のこと。
【００３７】
図６に示す第２例において、ＤＡＦＥが、大きな分子量タンパク質の分離に対してＣＦＥよりも優れていることが実証された。レーン１および２は、分子量基準、および約８９０ｋＤａのネイティブ分子量を備える３０μｇの改変された非変性ＧｒｏＥＬである。ＤＡＦＥ法に対しては、第１パルス幅５６は８０ｍｓであり、第２パルス幅５８は４０ｍｓであり、全実行時間７２は１８０ｍｉｎである。マイグレーション媒体３０に対して８％分離ゲルが使用され、第１電場４０および第２電場４２はそれぞれ２００ボルトである。この例によっても、高分子量ＤＮＡおよびＤＮＡ−タンパク質分子および複合体を分解する可能性が最も高いのがＤＡＦＥであることが示唆される。
【００３８】
第３例では、再び中程度の分子量範囲に対してペプチドおよびタンパク質が、電気泳動システム２０を使用するＣＦＥ法およびＤＡＦＥ法を用いて分離された。第３例では、巨大分子は再びウサギ重鎖ミオシンを含む。ＤＡＦＥ法に対しては、第１パルス幅５６は３００ｍｓであり、第２パルス幅５８は２０ｍｓであり、全実行時間７２は１５０ｍｉｎである。マイグレーション媒体３０に対しては５％分離ゲルが使用され、第１電場４０および第２電場４２はそれぞれ１００ボルトであった。従来的なＣＦＥ法およびＤＡＦＥ法の分離結果は、図７のセグメントＡおよびＢにそれぞれ示される。レーン１が分子量マーカである一方、レーン２、３および４は、図７のセグメントＡおよびＢのそれぞれに対する４５０ｎｇ、９００ｎｇおよび１８００ｎｇのミオシンである。
【００３９】
ＤＡＦＥ法に対する図７のセグメントＢから観測可能なように、巨大分子の移動度は、図７のセグメントＡのＣＦＥ法で使用された同じ巨大分子に比べて減少した。これによって示唆されるのは、正しい条件下のＤＡＦＥは、（この場合のように）ゲルの頂部まで所定の分子種を圧縮する能力を有し、それゆえ分子量分析のために物理的ゲル上の所定の分子量領域を選択的に増やすことができるということである。
【００４０】
第４例では、再び低分子量範囲に対してペプチドおよびタンパク質が、電気泳動システム２０を使用するＣＦＥ法およびＤＡＦＥ法を用いて分離された。第４例では、巨大分子はウサギ軽鎖ミオシンおよびヒトアポリポタンパク質を含む。ＤＡＦＥ法に対しては、第１パルス幅５６は８０ｍｓであり、第２パルス幅５８は４０ｍｓであり、全実行時間７２は１２時間（ｈｒ）である。マイグレーション媒体３０に対しては２０％分離ゲルが使用され、第１電場４０および第２電場４２はそれぞれ１００ボルトであった。ＣＦＥ法およびＤＡＦＥ法の分離結果は、図８のセグメントＡおよびＢにそれぞれ示される。レーン１が分子量マーカである一方、レーン２、３および４は、図８のセグメントＡおよびＢのそれぞれに対する４５０ｎｇ、９００ｎｇおよび１８００ｎｇのミオシンであり、レーン５は２００ｎｇのヒトアポリポタンパク質ＡＩである。
【００４１】
ＤＡＦＥ法に対する図８のセグメントＢから観測可能なように、１６ｋＤａから３４ｋＤａまでの有効分子量範囲内のミオシン軽鎖に対するバンドの分離度、分解能および鮮明度は、図８ＡのＣＦＥ法に対するそれと比べて実質的に優れている。さらに、ヒトアポリポタンパク質ＡＩがＣＦＥ法に対して未分解である一方、第２アイソフォームは図８のセグメントＢのＤＡＦＥ法に対して顕著に観測可能である。第４例は、低分子量タンパク質アイソフォームが、電気泳動システム２０によって適用されるＤＡＦＥ法を用いて分解可能であることを実証する。
【００４２】
第５例では、ペプチドおよびタンパク質の複合混合物が、電気泳動システム２０を使用するＣＰＥ法およびＤＡＦＥ法を用いて分離された。第５例では、巨大分子はヒト血清を含む。ＤＡＦＥ法に対しては、第１パルス幅５６は８０ｍｓであり、第２パルス幅５８は４０ｍｓであり、全実行時間７２は１２時間（ｈｒ）である。マイグレーション媒体３０に対しては２０％分離ゲルが使用され、第１電場４０および第２電場４２はそれぞれ１００ボルトであった。ＣＦＥ法に対する実行時間は２７０ｍｉｎである。ＣＦＥ法およびＤＡＦＥ法の分離結果は、図９のセグメントＡおよびＢにそれぞれ示される。レーン１が分子量マーカである一方、レーン２は、図９のセグメントＡおよびＢのそれぞれに対する８μｇのヒト血清である。
【００４３】
図９のセグメントＢから観測可能なように、高分子量種は、ＤＡＦＥ法に対して移動度が減少し、このため、図９のセグメントＡのＣＦＥ法と比べ、より小さな分子量種に対してより大きな分離距離を与えることが実証される。ＤＡＦＥ法によって与えられる大きな分離距離はさらに、大きな分離ゲル（マイグレーション媒体３０）による小さな分子量種に対する分離分解能に寄与する。
【００４４】
上述のように、従来的な一定場電気泳動（ＣＦＥ）法の上述の欠点に取り組むべく、差動交番場電気泳動（ＤＡＦＥ）法を実施するための電気泳動システムが本発明の一実施例により説明される。ＤＡＦＥ法とＣＦＥ法とを対比するための５つの例が与えられる。本発明の唯一の実施例が開示されていても、本発明の範囲および主旨から多数の変化および／または変更が行われうることは本開示に鑑みれば当業者にとって明白である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の実施例に係る差動交番場電気泳動（ＤＡＦＥ）法を実施するための電気泳動システムのシステム構成図である。
【図２】図１の電気泳動システムによって発生する交番パルスシーケンスの方向・時間進行図（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ−ｔｉｍｅ  ｇａｉｔ  ｄｉａｇｒａｍ）である。
【図３】図１の電気泳動システムの電気的模式図である。
【図４】スイッチングユニットを備える、図１の電気泳動システムの部分的画像である。
【図５】定常場電気泳動（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｉｅｌｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＣＦＥ））法（セグメントＡ）、および図１の電気泳動システムを使用したＤＡＦＥ（セグメントＢ）を用いて大きな分子量範囲内のペプチドを分離する第１例のゲルランの写真である。
【図６】ＣＦＥ法（セグメントＡ）、および図１の電気泳動システムを使用したＤＡＦＥ（セグメントＢ）を用いてネイティブゲルの高分子量範囲内のタンパク質を分離する第２例のゲルランの写真である。
【図７】ＣＦＥ法（セグメントＡ）、および図１の電気泳動システムを使用したＤＡＦＥ（セグメントＢ）を用いて中程度の分子量範囲内のペプチドを分離する第３例のゲルランの写真である。
【図８】ＣＦＥ法（セグメントＡ）、および図１の電気泳動システムを使用したＤＡＦＥ（セグメントＢ）を用いて低分子量範囲内のペプチドを分離する第４例のゲルランの写真である。
【図９】ＣＦＥ法（セグメントＡ）、および図１の電気泳動システムを使用したＤＡＦＥ（セグメントＢ）を用いてタンパク質／ペプチドの複合混合物を分離する第５例のゲルランの写真である。
【図１】
2008516227.tif 000003
【図２】
2008516227.tif 000004
【図３】
2008516227.tif 000005
【図４】
2008516227.tif 000006
【図５】
2008516227.tif 000007
【図６】
2008516227.tif 000008
【図７】
2008516227.tif 000009
【図８】
2008516227.tif 000010
【図９】
2008516227.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月30日(2006.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スイッチングアセンブリと、
端部を形成する開始位置と目的位置とを有するマイグレーション媒体と、前記マイグレーション媒体を通して電圧を印加するための、前記スイッチングアセンブリと電気的に導通する電極アセンブリとを含み、前記スイッチングアセンブリに電気的に接続可能な電気泳動装置と、
前記開始位置にて導入可能かつ前記マイグレーション媒体に包含可能なポリペプチドの少なくとも一部に対する、交番パルスシーケンスの第１電場および第２電場の前記電極アセンブリによる印加を前記スイッチングアセンブリと協働して制御する、前記スイッチングアセンブリと電気的に導通するコントローラと
を含み、
前記第１電場は前記ポリペプチドの少なくとも一部を第１合成方向に沿って空間的に変位させるためのものであり、前記第２電場は前記ポリペプチドの少なくとも一部を第２合成方向に沿って移動させるためのものであり、前記第１合成方向は前記第２合成方向と実質的に対向しており、
前記開始位置にてポリペプチドが導入される場合は、前記ポリペプチドに対し、前記交番パルスシーケンスで前記第１電場を第１パルス幅の間印加し、かつ、前記第２電場を第２パルス幅の間印加することによって、前記ポリペプチドはその分離のために前記目的位置に向かって電気泳動的に移動し、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅はあらかじめ決定されており、１．３３から１．９９の範囲の第１パルス幅対第２パルス幅の比を有し、各ポリペプチドは複数の分子特性を有して前記ポリペプチドは前記複数の分子特性の少なくとも一つに応じて前記マイグレーション媒体によって分離される、ポリペプチドを分離するための電気泳動システム。
【請求項２】
前記複数の分子特性は、分子量、分子サイズおよび分子配座を含む、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項３】
前記マイグレーション媒体は、ポリペプチド分離のために形成される固相マトリクスおよび固相システムの一つである、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項４】
前記マイグレーション媒体は、ポリアクリルアミドゲルおよびアガロースの一つである、請求項３に記載の電気泳動システム。
【請求項５】
前記マイグレーション媒体は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルおよびポリアクリルアミドゲルの一つである、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項６】
前記マイグレーション媒体は、前記ポリペプチドの少なくとも一つのサイズよりも小さな有効ポアサイズを有する、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項７】
前記第１合成方向は実質的に前記開始位置から遠ざかる方向であり、前記第２合成方向は実質的に前記開始位置に向かう方向である、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項８】
前記第１パルス幅は前記第２パルス幅よりも長い、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、ポリペプチド分子、ミオシン分子、ヒアルロン酸分子、巨大タンパク質複合物および複合タンパク質混合物の少なくとも一つである、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項１０】
前記第１電場のパルス強度は、前記第２電場のパルス強度と実質的に同じである、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項１１】
前記スイッチングアセンブリは、前記電極アセンブリに電気的に接続され、かつ、前記電極アセンブリと電源との電気的インターフェースを形成する少なくとも一つの電気的スイッチを含み、前記少なくとも一つの電気的スイッチは、電気的なスイッチングを行うことにより、前記マイグレーション媒体に送るための前記第１電場と前記第２電場とを交番させるように前記コントローラによって制御可能である、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項１２】
前記少なくとも一つの電気的スイッチはリレーアセンブリおよびダイオードアレイの少なくとも一つである、請求項１１に記載の電気泳動システム。
【請求項１３】
前記コントローラは、前記少なくとも一つの電気的スイッチと電気的に導通し、前記第１パルス幅および第２パルス幅を決定するために少なくとも一つの電気的スイッチと協働し、および前記第１パルス幅および前記第２パルス幅をあらかじめ画定するためにプログラム可能なタイマー装置を含む、請求項１１に記載の電気泳動システム。
【請求項１４】
前記コントローラは、前記少なくとも一つの電気的スイッチと電気的に導通して前記第１パルス幅および前記第２パルス幅をあらかじめ画定するためにプログラム可能な、プログラム可能ロジックコントローラおよびプログラム可能集積回路の少なくとも一つを含み、プログラム可能ロジックコントローラおよびプログラム可能集積回路の前記少なくとも一つは、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅を画定するための前記少なくとも一つの電気的スイッチと前記タイマー装置と協働する、請求項１１に記載の電気泳動システム。
【請求項１５】
前記マイグレーション媒体は、前記開始位置と前記目的位置との間に延びるマイグレーションレーンを含み、前記マイグレーション媒体は、前記マイグレーションレーンに沿ってサンプル分子量範囲を表すように、および、前記サンプル分子量範囲内に複数の分子量を示すように形成され、前記ポリペプチドの少なくとも一部は、前記サンプル分子量範囲内にあり、それゆえ前記マイグレーション媒体によって分離可能である、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項１６】
前記サンプル分子量範囲の少なくとも一部をなす有効分子量範囲をさらに含み、前記有効分子量範囲は、上限分子量と下限分子量との間に量的に延びており、その範囲内では前記ポリペプチドの分離分解能および分子量指示が実質的に改善される、請求項１５に記載の電気泳動システム。
【請求項１７】
前記コントローラはさらに全実行時間を画定するためにプログラム可能であり、前記第１電場および前記第２電場は、前記全実行時間内の前記交番パルスシーケンスで前記ポリペプチドに印加される、請求項１６に記載の電気泳動システム。
【請求項１８】
前記上限分子量および下限分子量は、前記第１パルス幅、前記第２パルス幅および前記全実行時間の関数であり、それゆえ実質的にそれらによって決定される、請求項１７に記載の電気泳動システム。
【請求項１９】
端部を形成する開始位置と目的位置とを有するマイグレーション媒体と、前記マイグレーション媒体を通して電圧を印加するための電極アセンブリとを含む電気泳動装置を与えるステップと、
前記電気泳動装置に電気的に接続可能な、前記電極アセンブリと電気的に導通するスイッチングアセンブリを与えるステップと、
前記スイッチングアセンブリに、前記スイッチングアセンブリと協働して前記電極アセンブリを制御するコントローラを電気的に導通させるステップと、
前記開始位置にて導入可能かつ前記マイグレーション媒体に包含可能なポリペプチドの少なくとも一部に対して、交番パルスシーケンスの第１電場および第２電場を前記電極アセンブリによって印加するステップと、
ポリペプチドに前記交番パルスシーケンスで前記第１電場を第１パルス幅の間印加し、かつ、前記第２電場を第２パルス幅の間印加する場合に、前記開始位置にて導入されたポリペプチドをその分離のために前記目的位置に向けて電気泳動的に移動させるステップと
を含み、
前記第１電場は前記ポリペプチドの少なくとも一部を第１合成方向に沿って空間的に変位させるためのものであり、前記第２電場は前記ポリペプチドの少なくとも一部を第２合成方向に沿って移動させるためのものであり、前記第１合成方向は前記第２合成方向と実質的に対向しており、
前記第１パルス幅および前記第２パルス幅はあらかじめ決定されており、１．３３から１．９９の範囲の第１パルス幅対第２パルス幅の比を有し、
各ポリペプチドは複数の分子特性を有して前記ポリペプチドは前記複数の分子特性の少なくとも一つに応じて前記マイグレーション媒体によって分離される、ポリペプチドを分離するための差動交番場電気泳動（ＤＡＦＥ）法。
【請求項２０】
電気泳動装置を与えるステップは、分子量、分子サイズおよび分子配座を含む前記複数の分子特性に応じて前記ポリペプチドを分離するために前記マイグレーション媒体を与えるステップを含む、請求項１９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２１】
電気泳動装置を与えるステップは、ポリペプチドを分離するための固相マトリクスおよび固相システムの一つである前記マイグレーション媒体を電気泳動装置に与えるステップを含む、請求項１９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２２】
電気泳動装置を与えるステップは、ポリアクリルアミドゲルおよびアガロースの一つである前記マイグレーション媒体を電気泳動装置に与えるステップを含む、請求項１９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２３】
電気泳動装置を与えるステップは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルおよびポリアクリルアミドゲルの一つである前記マイグレーション媒体を電気泳動装置に与えるステップを含む、請求項１９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２４】
電気泳動装置を与えるステップは、前記ポリペプチドの少なくとも一つのサイズよりも小さな有効ポアサイズを有する前記マイグレーション媒体を電気泳動装置に与えるステップを含む、請求項１９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２５】
交番パルスシーケンスで第１電場および第２電場を印加するステップは、前記第１合成方向が実質的に前記開始位置から離れる方向にある前記第１電場を印加することと、前記第２合成方向が実質的に前記開始位置に向かう方向にある前記第２電場を印加することとを含む、請求項１９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２６】
交番パルスシーケンスで第１電場および第２電場を印加するステップは、前記第１パルス幅が前記第２パルス幅よりも長い、第１電場および第２電場を印加するステップを含む、請求項１９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドを電気泳動的に移動させるステップは、ポリペプチド分子、ミオシン分子、ヒアルロン酸分子、巨大タンパク質複合物および複合タンパク質混合物の少なくとも一つである分子を電気泳動的に移動させるステップを含む、請求項１９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２８】
交番パルスシーケンスで第１電場および第２電場を印加するステップは、前記第１電場のパルス強度が前記第２電場のパルス強度と実質的に同じである前記第１電場および前記第２電場を印加するステップを含む、請求項１９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項２９】
スイッチングアセンブリを与えるステップは、前記電極アセンブリに電気的に接続され、かつ、前記電極アセンブリと電源との電気的インターフェースを形成する少なくとも一つの電気的スイッチを与えるステップを含み、前記少なくとも一つの電気的スイッチは、電気的なスイッチングを行うことにより、前記マイグレーション媒体に送るための前記第１電場と前記第２電場とを交番させるように前記コントローラによって制御可能である、請求項１９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３０】
少なくとも一つの電気的スイッチを与えるステップは、リレーアセンブリおよびダイオードアレイの少なくとも一つである少なくとも一つの電気的スイッチのそれぞれを少なくとも一つの電気的スイッチに与えるステップを含む、請求項２９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３１】
前記スイッチングアセンブリにコントローラを電気的に導通させるステップは、タイマー装置を前記少なくとも一つの電気的スイッチに電気的に導通させるステップを含み、前記タイマー装置は、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅を決定するために前記少なくとも一つの電気的スイッチと協働し、前記タイマー装置は、前記第１パルス幅および第２パルス幅をあらかじめ画定するようにプログラム可能である、請求項２９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３２】
前記スイッチングアセンブリにコントローラを電気的に導通させるステップは、プログラム可能ロジックコントローラおよびプログラム可能集積回路の少なくとも一つを少なくとも一つの電気的スイッチに電気的に導通させて、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅をあらかじめ画定するためにプログラム可能とするステップを含み、前記プログラム可能ロジックコントローラおよびプログラム可能集積回路の少なくとも一つは、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅を決定するために前記少なくとも一つの電気的スイッチと前記タイマー装置と協働する、請求項２９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３３】
電気泳動装置を与えるステップは、前記開始位置と前記目的位置との間に延びるマイグレーションレーンを前記マイグレーション媒体に与えるステップを含み、前記マイグレーション媒体は、前記マイグレーションレーンに沿ってサンプル分子量範囲を表すように、および、前記サンプル分子量範囲内に複数の分子量を示すように形成され、前記ポリペプチドの少なくとも一部は、前記サンプル分子量範囲内にあり、それゆえ前記マイグレーション媒体によって分離可能である、請求項１９に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３４】
電気泳動装置を与えるステップは、前記サンプル分子量範囲の少なくとも一部をなす有効分子量範囲をさらに含み、前記有効分子範囲量は、上限分子量と下限分子量との間に量的に延びており、その範囲内では前記ポリペプチドの分離分解能および分子量指示が実質的に改善される、請求項３３に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３５】
コントローラを前記スイッチングアセンブリと電気的に導通させるステップは、全実行時間を画定するために前記コントローラをプログラミングするステップを含み、前記第１電場および前記第２電場は、前記全実行時間内の前記交番パルスシーケンスで前記ポリペプチドに印加される、請求項３４に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３６】
有効分子量範囲を与えるステップは、前記第１パルス幅、前記第２パルス幅および前記全実行時間の関数であり、それゆえ実質的にそれらによって決定される上限分子量および下限分子量を前記有効分子量範囲に与えるステップを含む、請求項３５に記載のＤＡＦＥ法。
【請求項３７】
端部を形成する開始位置と目的位置とを有するマイグレーション媒体と、前記マイグレーション媒体を通して電圧を印加するための電極アセンブリと、を含む電気泳動装置と、
前記開始位置にて導入可能かつ前記マイグレーション媒体に包含可能なポリペプチドの少なくとも一部に対して、第１電場および第２電場を交番パルスシーケンスで印加するために前記電極アセンブリと協働する、前記電極アセンブリと電気的に導通するコントローラと
を含み、
前記第１電場は前記ポリペプチドの少なくとも一部を第１合成方向に沿って空間的に変位させるためのものであり、前記第２電場は前記ポリペプチドの少なくとも一部を第２合成方向に沿って移動させるためのものであり、前記第１合成方向は前記第２合成方向と実質的に対向しており、
前記開始位置にてポリペプチドが導入される場合は、前記ポリペプチドに対し、前記交番パルスシーケンスで前記第１電場を第１パルス幅の間印加し、かつ、前記第２電場を第２パルス幅の間印加することによって、前記ポリペプチドはその分離のために前記目的位置に向かって電気泳動的に移動し、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅はあらかじめ決定されており、１．３３から１．９９の範囲の第１パルス幅対第２パルス幅の比を有し、各ポリペプチドは複数の分子特性を有して前記ポリペプチドは前記複数の分子特性の少なくとも一つに応じて前記マイグレーション媒体によって分離される、ポリペプチドを分離するための電気泳動システム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、電気泳動のためのシステムに関する。詳しくは、本発明は、差動交番電場を使用したタンパク質分離のための電気泳動システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
典型的な生物研究室においては、さらなるどの下流分析よりも先立ってタンパク質分離に用いられる著名な技術は、有用かつ便利な、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｅｃｙｌ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ−ＰｏｌｙＡｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））である。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、バンドが拡大したり、電場影響下でのマイグレーション移動度が非常に類似したタンパク質またはタンパク質アイソフォームの分離が無効になるといった制限を受ける。
【０００３】
現在のところ、分子量の差異が近似するタンパク質の分離のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用する最良の方法は、パルスフィールドゲル電気泳動法に関連する。パルスフィールドゲル電気泳動法は、公開文献で実証かつ記載がされている。公開文献においては、異なる筋ミオシン重鎖の分離が、電場を周期的にスイッチオン・オフしてタンパク質バンドのマイグレーションを変更することによって行われた。この新規なアプローチは既存のＳＤＳ−ＰＡＧＥの分解能を改善するものであるが、長い実行周期を要したり、電場がスイッチオフされたときの拡散が寄与してバンドが拡大したり、不便かつ非慣習的な長い（３２ｃｍ）分離ゲルをキャスティングする必要があったりといった付随的な制限もある。
【０００４】
このため、改善された電気泳動システムの必要性が明確に肯定される。
【発明の開示】
【０００５】
タンパク質バンドの鮮明度および分解能、またはミニゲル（６ｃｍ）の制限領域内の関心バンド間の分離距離が改善される点で差別化される、タンパク質／ペプチドまたはアイソフォームの分離のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはネイティブＰＡＧＥを用いた新規なアプローチが実証される。本アプローチは、差動交番場電気泳動法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＡＦＥ））として以下に称され、通常の既存電源システムを、例えばミニゲルセル（好ましくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）のような標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥランニング装置に取り付けられて電場の短パルス（ミリ秒）を順方向および逆方向に送ることができるシステムに有効かつ便利に変換する。順および逆のパルス状周期の形態または比率ならびにゲル濃度を制御することによって、ＤＡＦＥは、ミニ分離ゲルの制限内にある異なる所望の分子量範囲に焦点を合わせる、すなわち「ズームインする」能力を有する。したがって、本方法は、所定のポリアクリルアミドゲル濃度に連動して電場のパルス設定を変更することによって、高分子量タンパク質のほか、低分子量（２８ｋＤａもの低さ）のタンパク質アイソフォームに対しても良好な分解能を有することができる。
【０００６】
したがって、本発明の第１の側面によれば、開示される巨大分子を分離するための電気泳動システムは、
スイッチングアセンブリと、
端部を形成する開始位置と目的位置とを有するマイグレーション媒体と、前記マイグレーション媒体を通して電圧を印加するための、前記スイッチングアセンブリと電気的に導通する電極アセンブリとを含み、前記スイッチングアセンブリに電気的に接続可能な電気泳動装置と、
前記開始位置にて導入可能かつ前記マイグレーション媒体に包含可能なポリペプチドの少なくとも一部に対する、交番パルスシーケンスの第１電場および第２電場の前記電極アセンブリによる印加を前記スイッチングアセンブリと協働して制御する、前記スイッチングアセンブリと電気的に導通するコントローラと、
を含み、
前記第１電場は前記ポリペプチドの少なくとも一部を第１合成方向に沿って空間的に変位させるためのものであり、前記第２電場は前記ポリペプチドの少なくとも一部を第２合成方向に沿って移動させるためのものであり、前記第１合成方向は前記第２合成方向と実質的に対向しており、
前記開始位置にてポリペプチドが導入される場合は、前記ポリペプチドに対し、前記交番パルスシーケンスで前記第１電場を第１パルス幅の間印加し、かつ、前記第２電場を第２パルス幅の間印加することによって、前記ポリペプチドはその分離のために前記目的位置に向かって電気泳動的に移動し、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅はあらかじめ決定されており、１．３３から１．９９の範囲の第１パルス幅対第２パルス幅の比を有し、各ポリペプチドは複数の分子特性を有して前記ポリペプチドは前記複数の分子特性の少なくとも一つに応じて前記マイグレーション媒体によって分離される。
【０００７】
本発明の第２の側面によれば、開示される巨大分子を分離するための差動交番場電気泳動（ＤＡＦＥ）法は、
端部を形成する開始位置と目的位置とを有するマイグレーション媒体と、前記マイグレーション媒体を通して電圧を印加するための電極アセンブリと、を含む電気泳動装置を与えるステップと、
前記電気泳動装置に電気的に接続可能な、前記電極アセンブリと電気的に導通するスイッチングアセンブリを与えるステップと、
前記スイッチングアセンブリに、前記コントローラは前記スイッチングアセンブリと協働して前記電極アセンブリを制御するコントローラを電気的に導通させるステップと、
前記開始位置にて導入可能かつ前記マイグレーション媒体に包含可能なポリペプチドの少なくとも一部に対して、交番パルスシーケンスの第１電場および第２電場を前記電極アセンブリによって印加するステップと、
ポリペプチドに前記交番パルスシーケンスで前記第１電場を第１パルス幅の間印加し、かつ、前記第２電場を第２パルス幅の間印加する場合に、前記開始位置にて導入されたポリペプチドをその分離のために前記目的位置に向けて電気泳動的に移動させるステップと
を含み、
前記第１電場は前記ポリペプチドの少なくとも一部を第１合成方向に沿って空間的に変位させるためのものであり、前記第２電場は前記ポリペプチドの少なくとも一部を第２合成方向に沿って移動させるためのものであり、前記第１合成方向は前記第２合成方向と実質的に対向しており、
前記第１パルス幅および前記第２パルス幅はあらかじめ決定されており、１．３３から１．９９の範囲の第１パルス幅対第２パルス幅の比を有し、
各ポリペプチドは複数の分子特性を有して前記ポリペプチドは前記複数の分子特性の少なくとも一つに応じて前記マイグレーション媒体によって分離される。
【０００８】
本発明の第３の側面によれば、開示される巨大分子を分離するための電気泳動システムは、
端部を形成する開始位置と目的位置とを有するマイグレーション媒体と、前記マイグレーション媒体を通して電圧を印加するための電極アセンブリと、を含む電気泳動装置と、
前記開始位置にて導入可能かつ前記マイグレーション媒体に包含可能なポリペプチドの少なくとも一部に対して、第１電場および第２電場を交番パルスシーケンスで印加するために前記電極アセンブリと協働する、前記電極アセンブリと電気的に導通するコントローラと、を含み、
前記第１電場は前記ポリペプチドの少なくとも一部を第１合成方向に沿って空間的に変位させるためのものであり、前記第２電場は前記ポリペプチドの少なくとも一部を第２合成方向に沿って移動させるためのものであり、前記第１合成方向は前記第２合成方向と実質的に対向しており、
前記開始位置にてポリペプチドが導入される場合は、前記ポリペプチドに対し、前記交番パルスシーケンスで前記第１電場を第１パルス幅の間印加し、かつ、前記第２電場を第２パルス幅の間印加することによって、前記ポリペプチドはその分離のために前記目的位置に向かって電気泳動的に移動し、前記第１パルス幅および前記第２パルス幅はあらかじめ決定されており、１．３３から１．９９の範囲の第１パルス幅対第２パルス幅の比を有し、各ポリペプチドは複数の分子特性を有して前記ポリペプチドは前記複数の分子特性の少なくとも一つに応じて前記マイグレーション媒体によって分離される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の実施例は、添付の図面を参照して以下に記載される。
【００１０】
上記問題に取り組むための電気泳動システムを以下に説明する。
【００１１】
本発明の第１実施例、すなわち電気泳動システム２０を、図１を参照して説明する。図１は、電気泳動システム２０の前断面立面図を示す。
【００１２】
電気泳動システム２０は巨大分子、例えばポリペプチドを分離するためのものであり、図１に示すように、スイッチングアセンブリ２４およびコントローラ２６を含む。スイッチングアセンブリ２４は、電気泳動装置２８に電気的に接続可能である。
【００１３】
電気泳動装置２８は、従来的な構造的構成を備える従来的なＰＡＧＥ装置であり、マイグレーション媒体３０と、マイグレーション媒体３０を通して電圧を印加するための電極アセンブリ３２と、電極アセンブリ３２に電力を直接的および間接的のいずれか一方で供給するための電源３４を備える。電源３４はスイッチングアセンブリ２４に電気的に接続可能であり、スイッチングアセンブリ２４はさらに電極アセンブリ３２に電気的に接続可能である。
【００１４】
マイグレーション媒体３０は、その端部を形成する開始位置および目的位置を有する。詳しくは、巨大分子（図示せず）は、その電気泳動的なマイグレーションのために開始位置にてマイグレーション媒体３０に導入されて、目的位置に向かう。コントローラ２６は、スイッチングアセンブリ２４と電気的に導通する。コントローラ２６は、スイッチングアセンブリ２４と協働し、図２に示すように、開始位置にてマイグレーション媒体３０に受け取られて包含される巨大分子の一部に対する、電極アセンブリ３２による交番パルスシーケンス４４の第１電場４０および第２電場４２の印加を制御する。
【００１５】
マイグレーション媒体３０は、ドデシル硫酸ナトリウムまたはポリアクリルアミドのプレキャストミニゲルが好ましい。または、想定される巨大分子を分類するための適切な分子ふるいを与えることが可能なキャピラリまたはナノ構造マトリクスを有するアガロースまたはその他の媒体もまた、マイグレーション媒体３０として使用可能である。詳しくは、マイグレーション媒体３０は、巨大分子の少なくとも一つのサイズよりも小さな有効ポアサイズを有し、マイグレーション媒体３０内のマイグレーションが観測可能になる。
【００１６】
スイッチングアセンブリ２４は、少なくとも一つの電気的スイッチを含む。少なくとも一つの電気的スイッチはそれぞれ電気的リレーである。または、少なくとも一つの電気的スイッチはそれぞれダイオードアレイである。
【００１７】
少なくとも一つの電気的スイッチは、電極アセンブリ３２に電気的に接続され、電極アセンブリ３２と電源３４との電気的インターフェースをなす。少なくとも一つの電気的スイッチはコントローラ２６によって電気的なスイッチングが制御可能である。これによって第１電場４０と第２電場４２とで交番してそれをマイグレーション媒体３０に送ることが制御可能となる。少なくとも一つの電気的スイッチが一対のリレー５０である電気泳動システムの詳細図を図３に示す。
【００１８】
第１電場４０は巨大分子の少なくとも一部を第１合成方向５２に沿って移動させるためのものであり、第２電場４２は巨大分子の少なくとも一部を第２合成方向５４に沿って移動させるためのものである。第１合成方向５２は、第２合成方向５４と実質的に対向することが好ましい。したがって、巨大分子が開始位置にて導入されると、巨大分子に対し交番パルスシーケンス４４で第１電場４０を第１パルス幅５６の間印加し、かつ、第２電場４２を第２パルス幅５８の間印加することによって、巨大分子がその分離のために対応する目的位置に向かう電気泳動的マイグレーションが生じる。第１パルス幅５６および第２パルス幅５８はあらかじめ決定されており１．３３から１．９９の範囲の第１パルス幅対第２パルス幅の比を有する。各巨大分子は複数の分子特性を有し、分子量、分子サイズ等の分子特性の少なくとも一つに応じて巨大分子がマイグレーション媒体３０によって分離される。巨大分子が目的位置に向かって移動するとき、巨大分子のすべてが目的位置に到達するわけではない。各巨大分子が目的位置に向かって移動する程度は、その分子特性に依存し、好ましくはマイグレーション媒体３０のゲル濃度に依存する。
【００１９】
好ましくは、コントローラ２６は、図３に示す少なくとも一つの電気的スイッチと電気的に導通するタイマー装置６０を含む。タイマー装置は少なくとも一つの電気的スイッチを協働して、第１電場４０および第２電場４２をそれぞれ送るための第１パルス幅５６および第２パルス幅５８を決定する。タイマー装置は、第１パルス幅５６および第２パルス幅５８をあらかじめ画定するようにプログラム可能である。または、コントローラ２６は、少なくとも一つの電気的スイッチと電気的に導通して第１パルス幅５６および第２パルス幅５８をあらかじめ画定するためにプログラム可能な、プログラム可能ロジックコントローラおよびプログラム可能集積回路の少なくとも一つを含む。
【００２０】
第１合成方向５２は、実質的に開始位置から遠ざかり目的位置に向かう方向を向く一方で、第２合成方向５４は、実質的に開始位置に向かい目的位置から遠ざかる方向を向く。好ましくは、第１パルス幅５６は、第２パルス幅５８よりも長い。第１パルス幅５６の第２パルス幅５８に対する比は、２：１．５から１５：１の範囲内にある。第１電場４０および第２電場４２はそれぞれパルス強度を有する。第１電場４０のパルス強度は、第２電場４２のパルス強度と実質的に同じであるのが好ましい。
【００２１】
マイグレーション媒体３０は、開始位置と目的位置との間に延びるマイグレーションレーンを有する。マイグレーション媒体３０は、マイグレーションレーンに沿ってサンプル分子量範囲を表すように、および、サンプル分子量範囲内に複数の分子量を示すように形成される。分離を受ける巨大分子の少なくとも一部は、サンプル分子量範囲内にある。このため、マイグレーション媒体３０によって分離可能となる。
【００２２】
電気泳動システム２０はさらに、サンプル分子量範囲の少なくとも一部を構成する有効分子量範囲を含む。有効分子量範囲は、上限分子量と下限分子量との間に量的に延びており、その範囲内では、巨大分子の分離分解能および分子量指示は実質的に優れている。
【００２３】
コントローラ２６はさらに、全実行時間７２を画定するようにプログラム可能である。第１電場４０および第２電場４２は、全実行時間７２内の交番パルスシーケンス４４で巨大分子に印加される。上限分子量および下限分子量はさらに、マイグレーション媒体３０のゲル濃度によって決定されるのが好ましい。
【００２４】
上限分子量および下限分子量は、第１パルス幅５６、第２パルス幅５８および全実行時間７２の関数であり、それゆえ実質的にそれらによって決定される。
【００２５】
図１、図３に示すように、および図４に画像的に示すように、電気泳動システム２０は、従来的な電気泳動装置２８に容易に組み込まれて、大きな電気的または構造的な変更なしに一体化される。
【００２６】
電気泳動システム２０は、差動交番場電気泳動（ＤＡＦＥ）法を実施するためのものである。ＤＡＦＥ法においては、電気泳動システム２０は、マイグレーション媒体３０に電気的に接続されて、その開始位置に導入された巨大分子に第１電場４０を印加する。
【００２７】
巨大分子は所定の種類のポリペプチド分子の少なくとも一つである。
【００２８】
第１電場４０によって、第１合成方向５２において電気泳動マイグレーションを介した巨大分子のレプテーション（ｒｅｐｔａｔｉｏｎ）が引き起こされる。しかし、巨大分子の構造ゆえに、巨大分子の一部はマイグレーション媒体３０のポア内にとどまるかまたは捕捉される。これによって、第１合成方向５２におけるさらなるマイグレーションが阻止される。
【００２９】
第１電場４０は、第１パルス幅５６の間のみ巨大分子に印加され、その後第２電場４２が第１電場４０不存在下で巨大分子に印加される。
【００３０】
第２電場４２によって、第２合成方向５４において巨大分子のレプテーションが引き起こされ、少なくともその一部がマイグレーション媒体３０のポアから追い出されまたは放出（ｄｅｔｒａｐｐｉｎｇ）される。第２電場４２は、第２パルス幅５８の間のみ巨大分子に印加され、その後第１電場４０が第１電場４０の不存在下で巨大分子に再印加される。
【００３１】
第１電場４０および第２電場４２は、交番パルスシーケンス４４で巨大分子に印加される。第１パルス幅５６と第２パルス幅５８との比によって、合成マイグレーション方向７４が決定される。したがって、コントローラ２６は、第１パルス幅５６および第２パルス幅５８をあらかじめ画定するためにプログラムされる。その結果、合成マイグレーション方向７４は実質的に第１合成方向の方向になり、目的位置に向かっての巨大分子のマイグレーションが促進される。
【００３２】
交番パルスシーケンス４４で第１電場４０および第２電場４２を印加するＤＡＦＥ法は、巨大分子に前進−追い出し効果（ａｄｖａｎｃｉｎｇ−ｄｉｓｌｏｄｇｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）をもたらす。ＤＡＦＥ法の前進−追い出し効果は、マイグレーション媒体３０を通る巨大分子のマイグレーションを促進する。これにより、従来的な電気泳動装置２８のみを用いても巨大分子の分解能および分離度改善される。
【００３３】
以下の例によって、巨大分子の分離に適用された場合の本発明、電気泳動システム２０およびＤＡＦＥ法の所定の側面が実証されるが、その範囲を制限するものと受け取ってはならない。
【００３４】
ヒトアポリポタンパク質、ウサギミオシン軽鎖および重鎖、ヒト血清、ウシ胎児血清、サイログロブリンおよびウシアルブミンからなるタンパク質のサンプルを、巨大分子を形成するために得た。電気泳動装置２８は、ゲルランニング装置、バッファ室、セル、ゲルキャスティング装置および予備染色されたタンパク質分子量マーカを含むその他の付属品を有する。これらは、例えばＢｉｏｒａｄ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ等の電気泳動機器サプライヤから従来的に入手可能である。少なくとも一つの電気的スイッチはそれぞれ、ＡＣリレーであり、電源３４はＡＣ電源である。時間遅延デジタルタイマーがタイマー装置として使用される。
【００３５】
第１例では、主にａ）複合タンパク質混合物、すなわちウシ胎児血清（ＦＣＳ）；ｂ）大および中程度の分子量タンパク質、すなわちサイログロブリン（非変性のＭＷは６６９ｋＤａであり、変性のＭＷは２３８ｋＤ）、およびＣ）低分子量タンパク質、すなわちＭＷが６７ｋＤａのウシアルブミン、という３つの異なる分子量（ＭＷ）のグループからのペプチドおよびタンパク質が、一定場電気泳動（ＣＦＥ）法、および電気泳動システム２０を用いるＤＡＦＥ法を使用して分離された。ＣＦＥ法およびＤＡＦＥ法の分離結果は、図５のセグメントＡおよびＢにそれぞれ示される。レーン１は分子量基準である一方、レーン２、３および４はそれぞれ、１５μｇのＦＣＳ、１０μｇのサイログロブリンおよび１０μｇのアルブミンである。ＤＡＦＥ法に対しては、第１パルス幅５６は３００ミリ秒（ｍｓ）であり、第２パルス幅５８は１６０ｍｓであり、全実行時間７２は１５７分（ｍｉｎ）である。マイグレーション媒体３０に対しては５％分離ゲルが使用され、第１電場４０および第２電場４２はそれぞれ２００ボルトであった。
【００３６】
図５に示すように、ＣＦＥと比べて比較的多かったのは、ＤＡＦＥによって異なるタンパク質グループを分析した場合に分解される、ＭＷが１００ｋＤａよりも大きな分子種である。各タンパク質グループ内には、不確定数の異なるタンパク質／ペプチド種がその複合性および純粋性の程度に応じて存在する。よって、ＣＦＥと比べると、および識別可能なタンパク質／ペプチドバンドの数の分解能を考慮すると、ＤＡＦＥはより優れた方法である。図５のセグメントＢでは、約７００ｋＤａにおける大きな分子量バンドが観測された。これにより、ＤＡＦＥには大きな分子量のタンパク質種を分解する能力があることが示唆される。この能力は、分離を受ける巨大分子に対してＤＡＦＥが有する前進および放出の性質に関連している。図６を参照のこと。
【００３７】
図６に示す第２例において、ＤＡＦＥが、大きな分子量タンパク質の分離に対してＣＦＥよりも優れていることが実証された。レーン１および２は、分子量基準、および約８９０ｋＤａのネイティブ分子量を備える３０μｇの改変された非変性ＧｒｏＥＬである。ＤＡＦＥ法に対しては、第１パルス幅５６は８０ｍｓであり、第２パルス幅５８は４０ｍｓであり、全実行時間７２は１８０ｍｉｎである。マイグレーション媒体３０に対して８％分離ゲルが使用され、第１電場４０および第２電場４２はそれぞれ２００ボルトである。この例によっても、高分子量ＤＮＡおよびＤＮＡ−タンパク質分子および複合体を分解する可能性が最も高いのがＤＡＦＥであることが示唆される。
【００３８】
第３例では、再び中程度の分子量範囲に対してペプチドおよびタンパク質が、電気泳動システム２０を使用するＣＦＥ法およびＤＡＦＥ法を用いて分離された。第３例では、巨大分子は再びウサギ重鎖ミオシンを含む。ＤＡＦＥ法に対しては、第１パルス幅５６は３００ｍｓであり、第２パルス幅５８は２０ｍｓであり、全実行時間７２は１５０ｍｉｎである。マイグレーション媒体３０に対しては５％分離ゲルが使用され、第１電場４０および第２電場４２はそれぞれ１００ボルトであった。従来的なＣＦＥ法およびＤＡＦＥ法の分離結果は、図７のセグメントＡおよびＢにそれぞれ示される。レーン１が分子量マーカである一方、レーン２、３および４は、図７のセグメントＡおよびＢのそれぞれに対する４５０ｎｇ、９００ｎｇおよび１８００ｎｇのミオシンである。
【００３９】
ＤＡＦＥ法に対する図７のセグメントＢから観測可能なように、巨大分子の移動度は、図７のセグメントＡのＣＦＥ法で使用された同じ巨大分子に比べて減少した。これによって示唆されるのは、正しい条件下のＤＡＦＥは、（この場合のように）ゲルの頂部まで所定の分子種を圧縮する能力を有し、それゆえ分子量分析のために物理的ゲル上の所定の分子量領域を選択的に増やすことができるということである。
【００４０】
第４例では、再び低分子量範囲に対してペプチドおよびタンパク質が、電気泳動システム２０を使用するＣＦＥ法およびＤＡＦＥ法を用いて分離された。第４例では、巨大分子はウサギ軽鎖ミオシンおよびヒトアポリポタンパク質を含む。ＤＡＦＥ法に対しては、第１パルス幅５６は８０ｍｓであり、第２パルス幅５８は４０ｍｓであり、全実行時間７２は１２時間（ｈｒ）である。マイグレーション媒体３０に対しては２０％分離ゲルが使用され、第１電場４０および第２電場４２はそれぞれ１００ボルトであった。ＣＦＥ法およびＤＡＦＥ法の分離結果は、図８のセグメントＡおよびＢにそれぞれ示される。レーン１が分子量マーカである一方、レーン２、３および４は、図８のセグメントＡおよびＢのそれぞれに対する４５０ｎｇ、９００ｎｇおよび１８００ｎｇのミオシンであり、レーン５は２００ｎｇのヒトアポリポタンパク質ＡＩである。
【００４１】
ＤＡＦＥ法に対する図８のセグメントＢから観測可能なように、１６ｋＤａから３４ｋＤａまでの有効分子量範囲内のミオシン軽鎖に対するバンドの分離度、分解能および鮮明度は、図８のセグメントＡのＣＦＥ法に対するそれと比べて実質的に優れている。さらに、ヒトアポリポタンパク質ＡＩがＣＦＥ法に対して未分解である一方、第２アイソフォームは図８のセグメントＢのＤＡＦＥ法に対して顕著に観測可能である。第４例は、低分子量タンパク質アイソフォームが、電気泳動システム２０によって適用されるＤＡＦＥ法を用いて分解可能であることを実証する。
【００４２】
第５例では、ペプチドおよびタンパク質の複合混合物が、電気泳動システム２０を使用するＣＰＥ法およびＤＡＦＥ法を用いて分離された。第５例では、巨大分子はヒト血清を含む。ＤＡＦＥ法に対しては、第１パルス幅５６は８０ｍｓであり、第２パルス幅５８は４０ｍｓであり、全実行時間７２は１２時間（ｈｒ）である。マイグレーション媒体３０に対しては２０％分離ゲルが使用され、第１電場４０および第２電場４２はそれぞれ１００ボルトであった。ＣＦＥ法に対する実行時間は２７０ｍｉｎである。ＣＦＥ法およびＤＡＦＥ法の分離結果は、図９のセグメントＡおよびＢにそれぞれ示される。レーン１が分子量マーカである一方、レーン２は、図９のセグメントＡおよびＢのそれぞれに対する８μｇのヒト血清である。
【００４３】
図９のセグメントＢから観測可能なように、高分子量種は、ＤＡＦＥ法に対して移動度が減少し、このため、図９のセグメントＡのＣＦＥ法と比べ、より小さな分子量種に対してより大きな分離距離を与えることが実証される。ＤＡＦＥ法によって与えられる大きな分離距離はさらに、大きな分離ゲル（マイグレーション媒体３０）による小さな分子量種に対する分離分解能に寄与する。
【００４４】
上述のように、従来的な一定場電気泳動（ＣＦＥ）法の上述の欠点に取り組むべく、差動交番場電気泳動（ＤＡＦＥ）法を実施するための電気泳動システムが本発明の一実施例により説明される。ＤＡＦＥ法とＣＦＥ法とを対比するための５つの例が与えられる。本発明の唯一の実施例が開示されていても、本発明の範囲および主旨から多数の変化および／または変更が行われうることは本開示に鑑みれば当業者にとって明白である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の実施例に係る差動交番場電気泳動（ＤＡＦＥ）法を実施するための電気泳動システムのシステム構成図である。
【図２】図１の電気泳動システムによって発生する交番パルスシーケンスの方向・時間進行図（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ−ｔｉｍｅ  ｇａｉｔ  ｄｉａｇｒａｍ）である。
【図３】図１の電気泳動システムの電気的模式図である。
【図４】スイッチングユニットを備える、図１の電気泳動システムの部分的画像である。
【図５】定常場電気泳動（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｉｅｌｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＣＦＥ））法（セグメントＡ）、および図１の電気泳動システムを使用したＤＡＦＥ（セグメントＢ）を用いて大きな分子量範囲内のペプチドを分離する第１例のゲルランの写真である。
【図６】ＣＦＥ法（セグメントＡ）、および図１の電気泳動システムを使用したＤＡＦＥ（セグメントＢ）を用いてネイティブゲルの高分子量範囲内のタンパク質を分離する第２例のゲルランの写真である。
【図７】ＣＦＥ法（セグメントＡ）、および図１の電気泳動システムを使用したＤＡＦＥ（セグメントＢ）を用いて中程度の分子量範囲内のペプチドを分離する第３例のゲルランの写真である。
【図８】ＣＦＥ法（セグメントＡ）、および図１の電気泳動システムを使用したＤＡＦＥ（セグメントＢ）を用いて低分子量範囲内のペプチドを分離する第４例のゲルランの写真である。
【図９】ＣＦＥ法（セグメントＡ）、および図１の電気泳動システムを使用したＤＡＦＥ（セグメントＢ）を用いてタンパク質／ペプチドの複合混合物を分離する第５例のゲルランの写真である。
【国際調査報告】
2008516227.tif 000012
2008516227.tif 000013
2008516227.tif 000014