(57)【要約】  本発明は、白血病、好ましくは急性白血病の治療のため、より好ましくはＡＭＬの治療のための医薬の製造における、エラスターゼ阻害剤の使用に関する。
2008509903.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血病の治療のための医薬の製造における、エラスターゼ阻害剤の使用。
【請求項２】
急性白血病の治療のための請求項１記載の使用。
【請求項３】
ＡＭＬの治療のための請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記阻害剤が、エラスターゼ−中和抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記阻害剤が、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫである請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記阻害剤が、ａ１−アンチトリプシンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
白血病を患っている患者における、造血幹細胞（ＨＳＣ）自己移植を補助するための、医薬の製造における、エラスターゼ阻害剤の使用。
【請求項８】
前記医薬がさらに、動員剤を含む請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記患者が、急性白血病を患っている請求項７または８記載の使用。
【請求項１０】
前記患者が、ＡＭＬを患っている請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記阻害剤が、エラスターゼ−中和抗体である請求項７〜１０記載の使用。
【請求項１２】
前記阻害剤が、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫである請求項７〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記阻害剤が、ａ１−アンチトリプシンである請求項７〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
白血病を患っている患者において、造血器官から血液への白血病細胞の放出を防止または阻害するための、医薬の製造におけるエラスターゼ阻害剤の使用。
【請求項１５】
急性白血病にて使用するための請求項１記載の使用。
【請求項１６】
ＡＭＬでの使用のための請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
前記造血器官が、骨髄である請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記阻害剤が、エラスターゼ−中和抗体である請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記阻害剤が、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫである請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記阻害剤が、ａ１−アンチトリプシンである請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
白血病細胞の遊走を防止または阻害するための、医薬の製造における、エラスターゼ阻害剤の使用。
【請求項２２】
急性白血病細胞の遊走を防止または阻害するための請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
ＡＭＬ細胞の遊走を防止または阻害するための請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
前記阻害剤が、エラスターゼ−中和抗体である請求項２１または２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記阻害剤が、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫである請求項２１または２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記阻害剤が、ａ１−アンチトリプシンである請求項２１または２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
白血病細胞の増殖を防止または阻害するための、医薬の製造における、エラスターゼ阻害剤の使用。
【請求項２８】
急性白血病細胞の増殖を防止または阻害するための請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
ＡＭＬ細胞の増殖を防止または阻害するための請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
前記阻害剤が、エラスターゼ−中和抗体である請求項２７または２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
前記阻害剤が、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫである請求項２７または２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
前記阻害剤が、ａ１−アンチトリプシンである請求項２７または２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
エラスターゼ阻害剤との細胞の混合物をインキュベートする工程、および高速遊走細胞を回収する工程を含む、患者から抽出された細胞の混合物中において、白血病細胞から正常造血幹細胞を分離するための、エラスターゼ阻害剤の使用。
【請求項３４】
高速遊走細胞を、ＳＤＦ−１勾配を通して分離する請求項３３記載のエラスターゼ阻害剤の使用。
【請求項３５】
前記患者が急性白血病を患う請求項３３または３４記載の使用。
【請求項３６】
前記急性白血病がＡＭＬである請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
前記阻害剤が、エラスターゼ−中和抗体である請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
前記阻害剤が、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫである請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３９】
前記阻害剤が、ａ１−アンチトリプシンである請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
必要とする患者へのエラスターゼ阻害剤の投与を含む白血病の治療方法。
【請求項４１】
急性白血病の治療のための請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
ＡＭＬの治療のための請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記阻害剤が、エラスターゼ−中和抗体である請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記阻害剤が、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫである請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記阻害剤が、ａ１−アンチトリプシンである請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
動員剤を投与する段階、および動員した細胞をエラスターゼ阻害剤に接触させる段階、細胞を回収する段階、および細胞を患者に移植して戻す段階を含む、白血病を患っている患者における、造血幹細胞（ＨＳＣ）自己移植の方法。
【請求項４７】
急性白血病の治療のための請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
ＡＭＬの治療のための請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記阻害剤が、エラスターゼ−中和抗体である請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記阻害剤が、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫである請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法
【請求項５１】
前記阻害剤が、ａ１−アンチトリプシンである請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
エラスターゼ阻害剤を動員した細胞に接触させる段階が、細胞を患者に移植して戻す前に、生体外で実施される請求項４６〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
エラスターゼ阻害剤の投与を含む、白血病を患っている患者の治療方法。
【請求項５４】
前記患者が、急性白血病を患っている請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記患者が、ＡＭＬを患っている請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記阻害剤が、エラスターゼ−中和抗体である請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記阻害剤が、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫである請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記阻害剤が、ａ１−アンチトリプシンである請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
エラスターゼ阻害剤を、白血病を患っている患者に投与することを含む、該患者において造血器官から血液への、白血病細胞の放出を防止するかまたは阻害する方法。
【請求項６０】
前記患者が、急性白血病を患っている請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記患者が、ＡＭＬを患っている請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記阻害剤が、エラスターゼ−中和抗体である請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記阻害剤が、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫである請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記阻害剤が、ａ１−アンチトリプシンである請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
急性白血病を患っている患者の骨髄中の、エラスターゼの濃度をモニタする段階を含む、該患者における白血病細胞の成熟ステージを診断する方法。
【請求項６６】
前記患者が、急性白血病を患っている請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記患者が、ＡＭＬを患っている請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
細胞の混合物をエラスターゼ阻害剤と共にインキュベートする段階、および高速遊走細胞を回収する段階を含む、患者から抽出した正常造血幹細胞と白血病細胞との混合物を分離する方法。
【請求項６９】
前記細胞が、ＳＤＦ−１勾配中に遊走している請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
免疫不全マウスに、ヒト白血病細胞を注射すること、および該細胞を骨髄に移植して、キメラマウスを得ることを含む、白血病細胞の放出を評価するための動物モデル。
【請求項７１】
請求項７０に記載の動物モデルの使用を含む、白血病細胞の放出または増殖を阻害するまたは防止することが可能である薬物を単離する方法。
【請求項７２】
請求項７０に記載の動物モデルを用いて得られうる、白血病細胞の放出または増殖を阻害または防止可能な薬物。
【請求項７３】
請求項６８に記載の細胞の分離方法を用いて得られうる細胞調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エラスターゼ阻害剤による、急性骨髄性（ＡＭＬ）のようなヒト白血病の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、自己再生および分裂可能であり、より多くの幹細胞または分化細胞を導く。造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血始原細胞（ＨＰＣ）は、造血不全から、致死的に照射されたレシピエントを救うために、十分な造血活性を引き起こす特性を有する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９９５）。
【０００３】
骨髄は、間葉系幹細胞および造血幹細胞を含む。間葉系幹細胞は、骨髄の間質細胞を含む、含脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞系列をのもととなる（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、１９９９）。造血幹細胞（ＨＳＣｓ）は、リンパ球、骨髄性細胞および赤血球系列のもととなる。
【０００４】
マウスにて、ＨＳＣｓは、全骨髄の０．０１％のわずかな集団を表し、Ｔｈｙlow系列−Ｓｃａｌ＋ｃ−ｋｉｔhigh（ＫＴＬＳ）マーカーの組み合わせを用いて単離された。ヒトにおいて、ＣＤ３４＋  Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−造血幹細胞が、マウスＫＴＬＳ造血幹細胞のヒト等価物である（Ｉｋｕｔａら、１９９２）。
【０００５】
幹細胞移植の成功が、レシピエントの骨髄中の移植細胞の十分な標的化に依存することから、循環造血始原細胞（ＨＰＣまたはＨＳＣ）をガイドする機序が、臨床的に重要である（Ｍａｚｏおよびｖｏｎ  Ａｄｒｉａｎ、１９９９）。骨髄移植が、任意の他の器官の移植の場合でのように、侵襲的手術を必要とするのではなく、単純な静脈注入によって実施されうるのは、移植された細胞のこの標的化（またはホーミング）による。ＨＰＣのホーミングは、循環ＨＰＣが、骨髄内皮細胞を認識して接着し、そしてそれを介して遊走可能にし、結果として、骨髄の固有の造血−促進微小環境における、ＨＰＣの蓄積となる、一組の分子相互作用として定義可能である。始原細胞のホーミングは、多段階現象として考えることができる。骨髄に到着したＨＰＣは、まず、骨髄内皮の内腔表面と相互作用するに違いない。この相互作用は、ＨＰＣが、骨髄微小血管に入って数秒以内に発生し、接着細胞を、流れている血液によっておこる剪断力に抵抗させるのに十分な機械的強度を提供するに違いない。ついで接着ＨＰＣが、内皮層を通過して、造血コンパートメントに入るに違いない。管外遊出の後、ＨＰＣは、その並置が、系列特異的ＨＰＣ分化、増殖および成熟、間質誘導サイトカインおよび他の増殖シグナルが関与する行程に加えて、自己−再生行程による、細胞の未熟プールの維持を支持する、特定の間質細胞に遭遇する。
【０００６】
またプレ−Ｂ−細胞増殖−刺激因子（ＰＢＳＦ）とも呼ばれる、ＳＤＦ−１が、リンパ球、単球および初代ＣＤ３４＋細胞に対して、強力な化学誘因物質（ケモカイン）であることが報告されてきている。ＳＤＦ−１は、細胞の遊走を誘導する化学誘導因子であり、細胞運動の方向が、ＳＤＦ−１の濃度勾配によって決定され（ＫｉｍおよびＢｒｏｘｍｅｙｅｒ  １９９８）、末梢血で低く、骨髄で高い。ＳＤＦ−１は、骨髄間質細胞によって産出されるので、ＳＤＦ−１勾配が、骨髄微小環境〜血液系の間で形成される。この勾配が、ＨＰＣを誘引し、この勾配が、血液中に効果器分子が投与されるまたは誘導されることによって破壊されないかぎり、骨髄微小環境にこれらをとどまらせる。
【０００７】
ＳＤＦ−１レセプター、ＣＸＣＲ４は、ＣＤ３４＋細胞、多能性造血前駆細胞である、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞を含む、骨髄細胞、移動骨髄細胞、臍帯血細胞を含む、多くの細胞種上で発現される。移植の前の、抗ＣＸＣＲ４抗体でのヒトＨＰＣｓ、ＣＤ３４＋細胞の処理は結果として、移植ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける、骨髄増殖片の阻害となる（Ｐｅｌｅｄら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９）。
【０００８】
生体内にて、ＳＤＦ−１の勾配に向かって遊走せず、生体内で齧歯類骨髄にホーミングせず、再居住しない、未熟ヒトＣＤ３４＋細胞および未熟ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ細胞が、移植の前に、ＳＬＦおよびＩＬ−６のようなサイトカインでの、短期間１６〜４８時間の生体内刺激によって、機能的再居住細胞になりうる（Ｋｏｌｌｅｔら  ２０００，Ｐｅｌｅｄら、１９９９  Ｌａｐｉｄｏｔ  ２００１）。これらのサイトカインは、表面ＣＸＣＲ４発現、生体内で、ＳＤＦ−１に向かう遊走、生体内でのホーミングおよび再居住を増加させる。
【０００９】
ＳＤＦ−１がまた、骨髄微小環境における、内皮細胞へのヒト幹細胞接着の刺激において、鍵となる因子であることが報告されてきた（Ｐｅｌｅｄら  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １９９９）。したがって、ＳＤＦ−１は、幹および始原細胞に対する化学誘因物質としてのみでなく、骨髄の移植のために必要な、インテグリン依存細胞接着および経内皮遊走のメディエーターとして関わる。
【００１０】
成人期を通して、造血系が、骨髄（ＢＭ）から末梢および第二器官に放出される、成熟リンパ球、骨髄および赤血球細胞の一定の産出によって維持される。興味深いことに、主にＢＭ内に存在する、造血幹細胞がまた、非常に低いレベルで、血中に循環していることがみられる。相当成熟および未熟胞の放出（egress）は、しっかりと制御されていなければならないが、遊走および細胞放出を調節している分子機構は、ほとんど特性化されていない。
【００１１】
ＨＰＣｓは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、およびスティール因子（ＳＬＦ）のような、注入サイトカインに対する応答において、末梢血に対して、脊髄より移動させることができる［Ｓｉｅｎａら、１９８９、Ｄｕｈｒｓｅｎら  １９８８、Ｄｒｉｚｅら  １９９６］。移植手順のために、ドナー骨髄から血液中への幹細胞の移動、および血液からのそれらの復帰が、世界的にますます使用されており、侵襲性手術を用いる、ドナーの骨髄からの、これらの幹細胞の回復を置換している。
【００１２】
移動によって、照射および化学治療処置（自己移植）より前に、患者から回収され、逆の、固有のＨＳＣでの骨髄再居住が可能になる。ＨＳＣの回復は、臍帯血または骨髄施術からよりも、移動からがより多い。
【００１３】
ＢＭ細胞の幹細胞および始原細胞放出の機構を解読することを目的とする研究は、広く、臨床移植のために、ＨＳＣを移動させ、回収させるために使用される、顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を含む、ＬＰＳ、ケモカインまたはサイトカインのような試薬を含む、種々のストレスによって誘導される白血球増加に焦点をあててきた［Ｔｏ、１９９７］［Ｔｈｏｍａｓ、２００２］。最近数年、Ｇ−ＣＳＦ誘導移動を支配している機構が、浮かび上がり始め、Ｇ−ＣＳＦは、間質ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチンレセプターＰＳＧＬ−１ならびにサイトカインＳＤＦ−１およびサイトカインｋｉｔリガンドを分解する、ＢＭ中での多量のエラスターゼおよびカテプシンＧのような好中球プロテアーゼを放出する、骨髄細胞の伸長を誘導する［Ｌａｐｉｄｏｔ、２００２］［Ｐａｐａｙａｈｎｎｏｐｏｕｌｏｕ、２００４］。ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４、ｃ−ｋｉｔ／ｋｉｔリガンドおよびＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用両方が、ＢＭ内での、造血細胞の停泊と保持の重要な調節物であると信じられている。さらに、ＭＭＰ−９のようなメタロプロテナーゼもまた、細胞のＧ−ＣＳＦ誘導放出に関与している［Ｈｅｉｓｓｉｇ、２００２］。興味深いことに、ヒト白血球エラスターゼをコードしているＥＬＡ２遺伝子中のヘテロ接合生殖細胞変異が、環状好中球減少およびコストマン病のような種々の遺伝性好中球減少性症候群と関連し、これらは、循環中への好中球放出の重度の不全によって特徴づけられる［Ａｐｒｉｋｙａｎ、２００１］。
【００１４】
好中球またはリンパ球エラスターゼは、脊髄細胞のアズール顆粒中に保存された、セリンプロテアーゼであり、活性化および脱顆粒に際して放出される。エラスターゼは、非常に広範囲のタンパク質分解酵素であり、その基質には、エラスチン、フィブロネクチンおよびコラーゲンのような種々の細胞外マトリックスタンパク質、ＩＣＡＭ−１および接合部カドヘリンのような接着分子が含まれ、これは、細胞経内皮移動遊走を促進することにおける、エラスターゼの役割を示唆している［Ｇｉｎｚｂｅｒｇ、２００１］。さらに、エラスターゼは、多数の可溶性タンパク質様凝固因子、免疫グロブリン、補体、プロテアーゼ阻害剤、サイトカイン、増殖因子およびそれらのレセプターを分解する［Ｂａｎｋ、２００１］［Ｌｅｅ、２００１］。
【００１５】
白血病の臨床および研究室特徴は、正常の血液細胞の形成の抑制、および悪性クローンによる組織浸潤によって引き起こされる。白血病細胞によって産出される阻害因子、または骨髄空間の置換が、正常の造血を抑制しえ、貧血、血小板減少症および顆粒球減少症を確かにする。白血病細胞の器官浸潤は結果として、肝臓、脾臓およびリンパ節、ときおり肝臓および性腺関与の増大となる。髄膜浸潤が、結果として、頭蓋内圧の増加と関連した臨床特徴となる（たとえば頭蓋神経麻痺）。
【００１６】
白血病は本来、生存予想に基づいて、急性または慢性と呼ばれていたが、現在は、細胞の成熟度に関連して分類されている。急性白血病は、主に未熟の細胞（通常芽形態）からなり、慢性白血病は、より成熟した細胞からなる。
【００１７】
急性白血病は、リンパ性（ＡＬＬ）および骨髄性（ＡＭＬ）型に分けられ、これはさらに、フレンチ−アメリカン−ブリティッシュ（ＦＡＢ）分類（表Ａ）または免疫表現系にしたがって、形態学的および細胞化学的外観によって分けられうる。フローサイトメトリーと一緒に、特定のＢ−細胞およびＴ−細胞、および骨髄−抗原モノクローナル抗体が、ＡＬＬ対ＡＭＬを分類するために非常に助けとなり、治療のために重要である。
【００１８】
【表１】
2008509903.tif 000003
【００１９】
慢性白血病は、リンパ性（ＣＬＬ）または骨髄性（ＣＭＬ）と記述されている。
【００２０】
骨髄異形成症候群は、進行性骨髄不全をあらわすが、ＡＭＬの明確な診断に関して、芽細胞の割合は不十分（＜３０％）であり、４０〜６０％の場合が、ＡＭＬに発展する。
【００２１】
急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）は、その成熟工程にて停止された悪性骨髄始原細胞のＢＭ内での制御されていない増殖と、これらの異常細胞の循環内への放出によって特徴づけられる。先行研究によって、高レベルの細胞内エラスターゼ活性、およびＡＭＬによるエラスターゼタンパク質の分泌が報告された［Ｈｕｎｔｅｒ、２００３］。
【００２２】
白血病細胞は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＴ１−ＭＭＰ（Ｒｉｅｓら  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９９、（５）１１１５）およびエラスターゼのような、種々のプロテアーゼを高レベルで発現しているようである。
【００２３】
最近の証拠によって、エラスターゼが、フィラデルフィアクロモソームと関連した、慢性骨髄性白血病の発達において、そして、慢性相（ＣＭＬ−ＣＰ）のみの元での患者において、役割を果たすことが明らかになった［Ｅｌ−Ｏｕｒｉａｇｈｌｉ、Ｂｌｏｏｄ  １５  Ｖｏｌｕｍｅ  １０２  ｎｕｍｂｅｒ  １０、２００３］。Ｅｌ−Ｏｕｒｉａｇｈｌｉは、ＣＭＬ細胞増殖および正常始原細胞（ＮＰＣ）増殖両方が、エラスターゼによって阻害されるが、ＣＭＬ増殖は、より低い程度阻害されることを報告している。
【００２４】
Ｇ−ＣＳＦは、ＮＰＣの増殖を誘導する増殖因子である。Ｅｌ−Ｏｕｒｉａｇｈｌｉにしたがって、エラスターゼは、増殖を直接は阻害しないが、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦレセプターを消化することによって（Ｈｕｎｔｅｒら  ２００３）、そして結果としてＮＰＣ増殖をさせることによって、阻害する。Ｅｌ−Ｏｕｒｉａｇｈｏｉは、ＣＭＬ細胞増殖が、ＮＰＣと比較して、外部伝達した増殖因子に依存しないので、ＣＭＬは、エラスターゼによって影響を受けにくいが、完全に不感受性というわけではないことを説明している。
【００２５】
Ｅｌ−Ｏｕｒｉａｇｈｌｉは、ＭＭ−９、プロテアーゼ３のような好中球セリンプロテナーゼ、またはカテプシンＧのような、そしてＣＭＬ中のエラスターゼを含む、異なるプロテアーゼの持続濃度が、ＣＭＬ患者の血中への特徴的な未熟骨髄細胞の導入に関して関与しうることを示唆している。
【００２６】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣ４相互作用が、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ不全マウス内に移植した正常ヒト幹細胞のホーミングおよび再移住に関して重要である［Ｋｏｌｌｅｔ、２００１］［Ｐｅｌｅｄ、１９９９］。本発明者らは最近、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍｎｕｌｌマウスでの、ＢＭおよび脾臓への、悪性ヒトＡＭＬおよびプレＢ  ＡＬＬ細胞のホーミングもまた、ＣＸＣＲ４に依存することを示した［Ｔａｖｏｒ、２００４、Ａｓａｆ、Ｂｌｏｏｄ］。
【００２７】
急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の患者の９０％以上で存在する転座が、２つの融合タンパク質ＰＭＬ−ＲＡＲとＲＡＲ−ＰＭＬを産出する。エラスターゼによるタンパク質分解処理が、最近、ＡＰＬの発達において重要な役割を果たすことが示唆された。Ｌａｎｅら（Ｃｅｌｌ  ｖｏｌ１１５  ３０５，２００３）は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に関連した融合タンパク質ＰＭＬ−ＲＡＲが、好中球エラスターゼによって開裂されること、および好中球エラスターゼ欠損マウスが、ＡＰＬの発達から、部分的に保護されること、を示した（Ｌａｎｅ、２００３）。
【００２８】
より最近、エラスターゼの使用が、白血病反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための、白血病の治療のために提案された（Ｆｕｊｉｗａｒａら、２００４  Ｂｌｏｏｄ、１０３（５）３０７６）。
【００２９】
したがって、白血病を治療するための、実現可能な治療方法が提供される必要性が存在する。
【発明の開示】
【００３０】
本発明は、白血病、好ましくは急性白血病の治療のための、より好ましくはＡＭＬの治療のための医薬の製造における、エラスターゼ阻害剤の使用に関する。
【００３１】
本発明の１つの実施態様において、エラスターゼ阻害剤は、エラスターゼ−中和抗体、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫまたはａ１−アンチトリプシンである。
【００３２】
他の実施態様において、本発明は、急性白血病、好ましくはＡＭＬのような白血病を患っている患者における、造血幹細胞（ＨＳＣ）自己移植を補助するための、医薬の製造における、エラスターゼ阻害剤、および任意には動員剤（mobilizing agent）の使用に関する。
【００３３】
さらなる実施態様において、本発明は、急性白血病、好ましくはＡＭＬのような白血病を患っている患者において、造血器官、好ましくは骨髄から血液への白血病細胞の放出を防止または阻害するための医薬の製造における、エラスターゼ阻害剤の使用に関する。
【００３４】
他のさらなる実施態様において、本発明は、白血病細胞の遊走を防止または阻害するための、医薬の製造における、エラスターゼ阻害剤の使用に関する。
【００３５】
他のさらなる実施態様において、本発明は、急性白血病、好ましくはＡＭＬのような、白血病細胞の増殖を防止または阻害するための医薬の製造における、エラスターゼ阻害剤の使用に関する。
【００３６】
他のさらなる実施態様において、本発明は、患者から抽出された細胞の混合物をエラスターゼ阻害剤と共にインキュベートする段階、および高速遊走細胞、好ましくはＳＤＦ−１勾配に遊走する細胞を回収する段階を含む、該細胞の混合物中で白血病細胞から正常造血幹細胞を分離するための、エラスターゼ阻害剤の使用に関する。
【００３７】
他のさらなる実施態様において、本発明は、必要としている患者にエラスターゼ阻害剤を投与することを含む白血病の治療方法に関する。
【００３８】
他のさらなる実施態様において、本発明の方法は、急性白血病および好ましくはＡＭＬに関する。
【００３９】
他のさらなる実施態様において、本発明の方法は、エラスターゼ−中和抗体、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫまたはａ１−アンチトリプシンのようなエラスターゼ阻害剤に関する。
【００４０】
他のさらなる実施態様において、本発明は、動員剤を投与する段階、動員された細胞をエラスターゼ阻害剤に接触させる段階、細胞を回収する段階、および細胞を患者に移植して戻す段階を含む、白血病を患っている患者における、造血幹細胞（ＨＳＣ）自己移植の方法に関する。本発明の好ましい実施態様において、エラスターゼ阻害剤を動員された細胞に接触させる段階が、患者に細胞を移植して戻す前に、生体外で実施される。
【００４１】
他のさらなる実施態様において、本発明は、エラスターゼ阻害剤の投与を含む白血病を患っている患者の治療方法に関する。
【００４２】
他のさらなる実施態様において、本発明は、エラスターゼ阻害剤を、白血病を患っている患者に投与することを含む、該患者において、造血器官から血液への、白血病細胞の放出を防止または阻害する方法に関する。
【００４３】
他のさらなる実施態様において、本発明は、急性白血病を患っている患者の骨髄中のエラスターゼの濃度をモニタする段階を含む、該患者における、白血病細胞の成熟段階を診断する方法に関する。
【００４４】
他のさらなる実施態様において、本発明は、患者から抽出された細胞の混合物をエラスターゼ阻害剤と共にインキュベートする段階、および高速遊走細胞、任意にＳＤＦ−１勾配中を遊走する細胞を回収する段階を含む、正常造血幹細胞および白血病細胞の該混合物を分離する方法に関する。
【００４５】
他のさらなる実施態様において、本発明は、免疫不全マウスにヒト白血病細胞を注射すること、および前記細胞を骨髄に移植して、キメラマウスを得ることを含む、白血病細胞の放出を評価するための動物モデルに関する。
【００４６】
他のさらなる実施態様において、本発明は、本発明の動物モデルの使用を含む、白血病細胞の放出または増殖を阻害または防止することが可能な薬物を単離する方法に関する。
【００４７】
他のさらなる実施態様において、本発明は、本発明の動物モデルを使用することによって得られうる、白血病細胞の放出または増殖を阻害または防止することが可能な薬物に関する。
【００４８】
他のさらなる実施態様において、本発明は、本発明の分離方法を用いて得られうる、細胞調製物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
本発明は、白血病の治療のための、エラスターゼ阻害剤の使用に関する。
【００５０】
１つの態様において、本発明は、正常幹細胞、とりわけ移植により好適な幹細胞の系列の増殖を促進させるとともに、白血病細胞の増殖を阻害するための、エラスターゼ阻害剤の使用に関する。
【００５１】
他の態様において、本発明は、たとえば骨髄のような患者の造血器官から、循環内への、白血病細胞の遊走および放出を防止するためのエラスターゼ阻害剤の使用、および白血病細胞の放出を阻害することが可能な薬物のスクリーニングのためのアッセイに関する。
【００５２】
さらなる態様において、本発明は、白血病患者における自己移植を補助するための、エラスターゼ阻害剤の使用に関する。
【００５３】
さらに、本発明は、白血病患者中の白血病細胞の成熟ステージを検出するための診断方法に関する。
【００５４】
本発明はしたがって、さらに、白血病を治療するための医薬の製造のための、エラスターゼ阻害剤の使用に関する。
【００５５】
本発明は、慢性白血病および、好ましくは急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの急性白血病のような任意の種類の白血病の治療における、エラスターゼ阻害剤の使用に関する。
【００５６】
本発明は、以下のインビトロ実験の発見に基づいている：
ＡＭＬ細胞は、外部刺激に独立してエラスターゼを分泌するだけでなく、細胞表面上に均質にアセンブルしたエラスターゼを構造的に発現もする。Ｃｅｐｉｎｓｋａｓら、（１９９９）は、活性好中球にて、可溶性エラスターゼとは異なり、膜結合エラスターゼが触媒活性的であり、循環プロテアーゼによるタンパク質分解に耐性であることを示唆した。したがって、ＡＭＬの膜エラスターゼは、循環プロテアーゼによる、タンパク質分解から保護され、ＡＭＬ細胞を、骨髄ＥＣＭ（細胞外マトリックス）および内皮バリアに浸潤可能にし、循環内へのその散布を促進する。生体内で得られた結果により、膜結合エラスターゼの役割は、ＢＭ内皮のような、機械的バリアを介したＡＭＬ浸潤を補助することだけでなく、３つの異なるエラスターゼ阻害剤ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫ（ＥＩ）、ａ１−アンチトリプシンまたは抗エラスターゼ抗体を用いてインビトロ遊走アッセイにて観察されたように、たとえば、細胞骨格再編成および細胞極性化を誘導することによって、エラスターゼが、ＡＭＬ運動性（方向的、ＳＤＦ−１依存、および突発性遊走両方）のために必要であることが示される。
【００５７】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍｎｕｌｌマウス中の、悪性ヒトＡＭＬおよびプレＢ  ＡＬＬ細胞の、ＢＭおよび脾臓へのホーミングがまた、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用に依存することが最近示された［Ｔａｖｏｒ、２００４、Ａｓａｆ、Ｂｌｏｏｄ］。ＡＭＬ遊走におけるエラスターゼの役割を示している以上の結果をみると、ＳＤＦ−１が、エラスターゼ調節において役割を有し得ることが予想された。実際、本発明にしたがって、ＳＤＦ−１が、細胞表面エラスターゼの発現を調節し、ＡＭＬにおいてと、正常ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞において、反対の効果をもつことが発見された。ＳＤＦ−１は、ＡＭＬ細胞中の表面エラスターゼを増加させたが、正常ＣＢ  ＣＤ３４＋濃縮細胞上の表面エラスターゼを減少させた。
【００５８】
ＡＭＬは、ＢＭ内での、過剰で、制御されていないＡＭＬ細胞によって特性化される。したがって、本発明者らは、エラスターゼがＡＭＬ細胞増殖の調節にも関与しうる可能性を確認した。
【００５９】
ＡＭＬ増殖におけるエラスターゼの役割を試験するために、ＡＭＬ細胞（初代ＡＭＬ細胞）、または正常臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋濃縮細胞を、エラスターゼ阻害剤（ＥＩ）あり、またはなしでの増殖培地中で増殖させ、生細胞の数を、培養中で、数日後に測定した。得られた結果によって、ＡＭＬ細胞の増殖が、エラスターゼ阻害剤の存在下で細胞を培養することによって阻害され、一方で、エラスターゼ阻害剤が、同様の条件にて培養した、正常ＣＢ  ＣＤ３４＋の増殖速度を増強したことが示されている。さらに、本発明者らは、ＣＤ３４＋／３８−系列のより未熟な始原細胞が、ＥＩの存在下で、培養中で３日後に、有意に増加したことを発見し、これは、正常幹細胞の分化におけるエラスターゼの役割を示唆している。したがって、エラスターゼが、ＡＭＬ増殖のために必要であること、およびエラスターゼ阻害剤が、ＡＭＬ増殖を阻害すること、および正常ＣＤ３４＋細胞の増殖を増加させるだけでなく、加えて、培養中での、未分化始原移植コンピテントＣＤ３４＋／３８−幹細胞を維持したことが示されている。
【００６０】
本発明はまた、ヒトＡＭＬ幹細胞の、骨髄へのホーミングおよび移植（または確立）、および骨髄からの放出を可能にし、したがって、患者における、ヒトＡＭＬの多くの生物学的観点を模倣する、前臨床免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス実験モデルを用いた、以下の生体内実験発見に基づいてもいる（Ｌａｐｉｄｏｔ  Ｎａｔｕｒｅ  １９９４）。
【００６１】
実験モデルにおいて、ヒト（ドナー）細胞、たとえばＡＭＬ細胞を、亜致死照射、非肥満糖尿病重度混合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤまたはＢ２ｍｎｕｌｌ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（レシピエント）に投与し、細胞投与の数時間後（たとえば１６時間）、特定の器官（たとえば骨髄）に到着している、またはホーミングしているヒト細胞をモニタする（Ｋｏｌｌｅｔら  ２００１）。
【００６２】
ホーミングモデルを用いて得られた結果によって、ＥＩ前処理初代ＡＭＬ細胞、または濃縮ＣＤ３４＋  ＡＭＬ始原細胞のホーミングが、未処理細胞と比較して減少したことが示されている。ＡＭＬと反対に、ＥＩ前処理正常ヒトＣＤ３４＋濃縮細胞のホーミングが、未処理細胞と比較して増加した。一緒に考えると、これらの結果は、ＡＭＬホーミングにおけるエラスターゼの中心的役割と、骨髄性白血病ＣＤ３４＋細胞中、および正常ＣＤ３４＋細胞中の、ホーミングにおける、エラスターゼおよびエラスターゼ阻害の反対の効果を示している。
【００６３】
キメラ免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスおよびＡＭＬによって、骨髄から循環へのヒトＡＭＬ幹細胞の放出を試験することが可能なる（放出モデル）。放出モデルは、ＡＭＬ細胞を注射し、ヒトＡＭＬ−マウスキメラ（移植）を確立した、亜致死照射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからなる。骨髄から循環へのＡＭＬ放出を、ＡＭＬ注射後約２〜４週間モニタする。このＡＭＬ放出モデルを用いて、骨髄からのＡＭＬ放出における薬物投与の効果を試験することが可能である。
【００６４】
本発明者らの結果が、ＡＭＬ細胞の遊走におけるエラスターゼの役割を示したので、本発明者らは、エラスターゼが、ＢＭから循環へのＡＭＬの放出を促進する候補プロテアーゼでありうると仮説を立てた。したがって、本発明者らは、放出モデルを用いて、ＡＭＬ細胞の放出におけるＥＩの効果を試験した。得られた結果によって、ＡＭＬ細胞（初代および細胞株）の放出が、未処理マウスと比較して、ＥＩ処理マウスで減少したことが示されている（図５および表１  表Ｂ）。したがって、これらの結果によって、エラスターゼがヒトＡＭＬ放出を制御すること、およびエラスターゼ阻害が、骨髄から循環へのＡＭＬ細胞放出を効果的に押さえうること、が示されている。
【００６５】
本発明の実施態様は、エラスターゼ阻害が、ＡＭＬ増殖、ＢＭからのＡＭＬ遊走およびＡＭＬ放出を阻害することを示している。したがって、エラスターゼ阻害を、ＡＭＬを治療するために使用可能である。
【００６６】
本発明者らは、ＡＭＬおよび正常造血幹および始原細胞のホーミングおよび増殖におけるエラスターゼの異なる効果を示し、これは、白血病患者からのＡＭＬ細胞を本質的に含まない、造血幹細胞の集団を得るために、有利に使用可能である。たとえば、患者から抽出した、正常造血幹細胞と白血病細胞の混合物を、エラスターゼ阻害剤を含む培地中で増殖可能であり、正常造血幹細胞で濃縮された細胞集団からなる、任意にＳＤＦ−１勾配中で、高速遊走している細胞を回収可能である。
【００６７】
本発明者らはまた、ＡＭＬの骨髄中のエラスターゼが、白血病細胞の成熟ステージと相関し、たとえば、最も高いＢＭエラスターゼ濃度が、Ｍ３およびＭ４  ＡＭＬサブタイプでみられ、未分化Ｍ０  ＡＭＬの骨髄中では、非常に低いレベルであり、したがって、白血病患者のＢＭ中のエラスターゼのレベルをモニタすることを、たとえば実施例１で示したように、患者におけるＡＭＬ細胞の成熟ステージを診断するために使用可能であることを示した。
【００６８】
本発明の文脈中の語句「エラスターゼの阻害剤（inhibitor of elastase）」は、エラスターゼ産出および／または活性が減衰、減少または部分的、本質的または完全に抑制またはブロックされる方法で、エラスターゼ産出および／または活性を調節する任意の分子を意味する。語句「エラスターゼ阻害剤（elastase inhibitor）」は、エラスターゼ産出の阻害剤、ならびにエラスターゼ活性の阻害剤を含んで意味する。エラスターゼ阻害剤は、低分子であるか、またはポリペプチドまたはペプチドでありうる。
【００６９】
産出の阻害剤は、エラスターゼの合成、処理または成熟に陰性に影響を与える任意の分子であり得る。本発明にしたがって考慮される阻害剤は、たとえば、エラスターゼの遺伝子発現の抑制物、エラスターゼｍＲＮＡの転写を減少させるかまたは防止し、ｍＲＮＡの分解を導くアンチセンスｍＲＮＡｓ、正確なホールディングを損なわせ、またはエラスターゼの分泌を部分的または本質的に防止するタンパク質、いったん合成されたらば、エラスターゼを分解するプロテアーゼ、エラスターゼ活性化の阻害剤および顆粒から細胞表面へのエラスターゼ分泌の阻害剤でありうる。エラスターゼ活性の阻害剤は、ａ１アンチトリプシンのような天然の阻害剤でありうる。エラスターゼのアンタゴニストは、十分な親和性および特異性で、エラスターゼ分子それ自身に結合するか、または隔離し、エラスターゼのそのリガンドへの結合の原因である、エラスターゼまたはエラスターゼ結合部位（群）を部分的または本質的に中和する。
【００７０】
エラスターゼ活性の阻害剤は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のようなエラスターゼ抗体、またはその標的へのエラスターゼの結合を防止し、したがって、エラスターゼによって仲介される反応を減弱または防止する任意の他の試薬または分子でありうる。
【００７１】
本発明の好ましい実施態様において、エラスターゼの阻害剤は、ＥＩ、エラスターゼに直接対するａ１アンチトリプシン抗体、エラスターゼと競合するエラスターゼのアンタゴニスト、エラスターゼ結合タンパク質から選択される。
【００７２】
本発明の文脈内で、表現「遊走（migration）」および「ホーミング」は、同意語として使用されている。
【００７３】
本発明にしたがって使用されるべき、造血ヒト幹および／または前駆細胞は、ヒト臍帯血細胞のような、胎児および／または新生児のもの、および／または成人幹細胞（たとえば骨髄、記述したような移動末梢血液細胞）でありうる（Ｋｏｌｌｅｔら、２００１）。幹および／または前駆体細胞の供給源は、（ＨＬＡ−ミスマッチドナー）同種異系、好ましくは（ＨＬＡ−マッチサブリングスのような）同型、およびもっとも好ましくは自己（すなわち患者本人より由来する）であってよい。
【００７４】
幹細胞および／または始原細胞は、Ｇ−ＣＳＦのような移動誘導試薬で処理したドナーまたは患者の末梢血から、または外科診療によって骨髄から、回収および単離可能である。Ｇ−ＣＳＦは、造血器官、たとえば骨髄から末梢血への、幹細胞および／または始原細胞の移動を誘導する。
【００７５】
造血幹および始原細胞は、標準の技術（Ｋｏｌｅｔら、２００１）によって、前記造血供給源中の成熟血液細胞とのそれらの細胞混合物から単離され、たとえば、血液試料を、Ｍｇ2+／Ｃａ2+なしの、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１：１に希釈する。低密度単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ファルマシア  バイオテック（Pharmacia Biotech）、ウプサラ、スウェーデン）上での標準の分離の後に回収して、ＰＢＳ中で洗浄した。ＣＤ３４+細胞を、取扱説明書にしたがって、ＭＡＣＳ細胞単離キットおよびＭｉｄｉＭａｃｓカラムまたはＡｕｔｏＭＡＣＳ（ミルテニ  バイオテック（Miltenyi Biotec）、ベルジッヒ・グラバッハ（Bergisch Gladbach）、ドイツ）を用いて、単離可能であり、９５％以上の純度を得ることができる。単離されたＣＤ３４+細胞を、ホーミング実験のために直後に、または１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）または血清フリーおよび幹細胞因子（ＳＣＦ）（５０ｎｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩとともに一晩インキュベートした後に使用可能である。種々の技術を使用して、まず、専用の系統の細胞を除去することによって細胞を分離可能である。特定の系列のマーカーを認識している抗体、たとえば、ＣＸＣＲ４レセプターに対する抗体を、必要とする細胞の分離のために使用可能である。また、濃縮ＣＤ３４+細胞をさらに、ヒト特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）抗−ＣＤ３４  ＦＩＴＣ（ベクトン  ディッキンソン（Becton Dickinson）、サンジョゼ、カリフォルニア）および抗−ＣＤ３８  ＰＥ（ベクトン  ディッキンソン、サンジョゼ、カリフォルニア）で標識化し、ＦＡＣＳＶｅｎｔａｇｅ（ベクトン  ディッキンソン）によって、ＣＤ３４+ＣＤ３８-/low−またはＣＤ３４+ＣＤ３８+−精製亜集団に関してソート可能であり、９７％〜９９％の純度が得られうる。
【００７６】
異なる効果の種々の技術を用いて、細胞の濃縮調節物をえることが可能である。そのような細胞の濃縮した調製物は、総細胞の１０％まで、通常５％以下、好ましくは約１％以下である。
【００７７】
ＨＳＣ／始原細胞系列の分離のための手順には、物理的分離、たとえば密度勾配遠心、細胞表面（レクチンおよび抗体親和性）、磁気分離などが含まれる。よい分離を提供する好ましい技術は、フローサイトメトリーである。
【００７８】
細胞表面マーカーの存在または不在を決定する方法が、本技術分野でよく知られている（Ｅｎｃｕｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｅｄ．Ｒｏｉｔｔ、Ｄｅｌｖｅｓ、Ｖｏｌ−１  １３４）。典型的に、マーカーに特異的な標識化抗体を使用して、細胞集団を同定する。ヒト細胞表面マーカーＴｈｙ−１およびＣＤ３４に特異的な試薬が、本技術分野で公知であり、市販されている。
【００７９】
末梢血内に幹細胞を移動するための方法が、本技術分野で公知であり、一般的に、化学治療薬剤、たとえばシクロホスファミド（ＣＹ）、およびサイトカイン類、たとえばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ＋ＩＬ３などでの処理が含まれる。
【００８０】
化学治療処置ありおよびなしで、サイトカイン刺激によって移動された、単離した患者の造血幹細胞を、ホーミングコンポーネント造血幹細胞の生存および増殖を支持し、白血病細胞の増殖（proliferation）／増殖（growth）を阻害するために、エラスターゼ阻害剤で、移植前に、生体外で処理可能である。
【００８１】
エラスターゼ阻害試薬を産出している遺伝的に改変したＨＳＣを、本発明の方法にしたがって使用してよい。ＨＳＣおよび／または前駆体への遺伝子伝達は、Ｚｈｅｎｇら、２０００およびＬｏｔｔｉら、２００２にて記述されたような、治療試薬、たとえばエラスターゼ阻害剤をコードしている、アデノ−関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ−レトロウイルスキメラの形質導入によって実施可能である。そのような遺伝的に改変されたＨＳＣを、白血病患者において、本発明にしたがって使用可能である。
【００８２】
エラスターゼ阻害剤の内部産出を誘導するおよび／または増強するためのベクターの使用もまた、本発明にしたがって企図される。ベクターには、内生エラスターゼ阻害剤を発現するために好適な細胞内での調節配列機能が含まれる。そのような調節配列は、プロモーターまたはエンハンサーであってよい。調節配列をついで、相同組換えによって、ゲノムの正しい座内に導入し、したがって調節配列を、その配列が誘導または増強されることが必要である遺伝子に動作可能に連結する。この過剰発現は安定であるか、または一過性でありうる。本技術は通常、「内生遺伝子活性化（endogenous gene activation）」（ＥＧＡ）とよばれ、たとえば国際公開第９１／０９９５５号パンフレットで記述されている。
【００８３】
ａ１  アンチトリプシンンのような天然のエラスターゼ阻害剤に加えて、悪性ヒトＡＭＬ細胞中でのエラスターゼ活性を誘導する、ＳＤＦ−１またはそのレセプターＣＸＣＲ４の阻害もまた使用可能である（実施例７を参照のこと）。ＡＭＬ上でのエラスターゼ活性化も防止する、ＳＤＦ−１およびＣＸＣＲ４阻害剤は、たとえば、抗ＳＤＦ−１および抗ＣＸＣＲ４抗体、ＡＭＤ３１００、ＴＣ１４０および、または、リガンドおよび、またはレセプターを不活性化する、タンパク質分解酵素を含む、本ケモカインおよびレセプターの任意の他の阻害剤である（ＣＤ２６  ＭＭＰ２／９、カセプシンＧ）。
【００８４】
エラスターゼ阻害剤を、悪性細胞増殖を防止することによって、白血病負荷を減少させるために、白血病を患っている患者に投与可能である。動員剤との組み合わせでのエラスターゼ阻害剤を、ＨＳＣおよび／または始原移植の前、間または後に、白血病を患っている患者に投与可能であり、そこで、移植は自己または異種である。
【００８５】
本発明はまた、阻害剤を、生理学的に許容可能な担体、および／または安定剤および／または賦形剤と混合することによって、ＥＩ、ａ１−アンチトリプシン阻害剤、抗エラスターゼ抗体、ＳＤＦ−１阻害剤、ＣＸＣＲ４阻害剤、または阻害剤の混合物のようなエラスターゼ阻害剤の投与のために調製し、たとえば投与バイアル中での凍結乾燥によって、投与形態中で調製した薬理学的組成物に関する。
【００８６】
本発明はさらに、治療的に効果的な量のエラスターゼ阻害剤を含む、とりわけ、白血病細胞増殖および／または造血器官から末梢血への放出を防止するために有用である薬理学的組成物に関する。
【００８７】
本発明はさらに、白血病を患っている患者の治療のための、薬理学的に許容可能な担体と、エラスターゼ阻害剤、たとえばＥＩまたは阻害剤の混合を含む、薬理学的組成物に関する。好ましくは、エラスターゼ阻害剤は、細胞移動の前、後、または間に、患者に直接注射することによって投与しうる。
【００８８】
あるいは、内生エラスターゼ阻害剤を、好ましくは、内生エラスターゼ阻害剤を誘導する試薬を投与することによって誘導してよい。
【００８９】
以上で記述したように、エラスターゼ阻害剤は、薬理学的組成物の好ましい活性成分である。
【００９０】
薬理学的組成物は、薬理学的に許容可能な担体、ＥＩ、ａ１−アンチトリプシン阻害剤、抗エラスターゼ抗体、ＳＤＦ−１阻害剤、ＣＸＣＲ４阻害剤、またはこれらの混合物を含んでよく、および任意にさらに１つまたはそれ以上の動員剤を含む。
【００９１】
「薬理学的に許容可能」の定義は、活性成分の生物学的活性の効果と干渉せず、投与される宿主に毒性ではない、任意の担体を含むことを意味する。たとえば、非経口投与のために、活性成分を、食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液のような賦形剤中に、注射のためのユニット投与形態中で処方してよい。
【００９２】
本発明にしたがった薬理学的組成物の活性成分は、種々の方法にて、個体に投与可能である。投与の治療的に効果的な経路が、たとえば、上皮または内皮組織を介した吸収、または活性試薬をコードしているＤＮＡ分子を（たとえばベクターを介して）患者に投与し、結果として、活性試薬が、生体内で発現し、分泌される、遺伝子治療によって使用可能である。さらに、本発明にしたがったエラスターゼ阻害剤（類）を、薬理学的に許容可能な界面活性剤、賦形剤、担体、希釈液および賦形剤のような生物学的に活性な試薬の他の成分とともに投与可能である。
【００９３】
非経口（たとえば静脈内、筋肉内）投与のために、活性エラスターゼ阻害剤（類）を、薬理学的に許容可能な非経口賦形剤（たとえば水、生理食塩水、デキストロース溶液）および等張性（たとえばマンニトール）、または化学的安定性（たとえば保存剤および緩衝液）を維持する添加剤とともに、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として処方可能である。処方は、一般的に使用されている技術によって滅菌する。
【００９４】
本発明にしたがった活性エラスターゼ阻害剤（類）のバイオアベイラビリティーをまた、ヒト体内での分子の半減期を増加させる連結手順を用いて、たとえば、国際公開第９２／１３０９５号パンフレットで記述されたように、分子をポリエチレングリコールに連結して、改良可能である。
【００９５】
治療的に効果的な量の活性分子は、使用する分子の型、分子によって提示される任意の残余細胞毒性活性、投与経路、患者の臨床的な状態を含む、多くの変数の関数であり得る。
【００９６】
「治療的に効果的な量（therapeutically effective amount）」は、投与したときに、エラスターゼ阻害剤が結果として、循環への白血病細胞の放出を減少させるか、またはその増殖を減少させる、および／または遊走および／またはホーミングを減少させることである。個体へ、単一または多重用量として投与された用量は、分子薬物動態学的特性、投与経路、患者の状態および特性（性別、年齢、体重、健康、大きさ）、症状の程度、平行治療、治療の頻度および望む効果を含む、種々の因子に依存して変化しうる。確立した用量範囲の適合および操作を、当業者は心得ており、個体における分子の効果を決定する生体内および生体内法も同様である。
【００９７】
本発明にしたがって、エラスターゼ阻害剤、たとえばＥＩ、ａ１−アンチトリプシン阻害剤、抗エラスターゼ抗体、ＳＤＦ−１阻害剤、ＣＸＣＲ４阻害剤またはこれらの混合物を、治療的に効果的な量で、他の治療レジメ（たとえば多重薬物レジメ）または試薬、とりわけ、移植ＨＳＣおよび／または始原細胞、および／または動員剤の前に、同時に、または連続して、個体に投与可能である。
【００９８】
本発明はさらに、薬理学的に効果的な量のエラスターゼ阻害剤を、それらを必要とする患者に投与することを含む、白血病を治療する方法に関する。
【００９９】
本明細書で完全に本発明を記述しているが、同様なものを、本発明の精神および目的から逸脱しない限り、そして不必要な実験なしに、広い範囲の等価なパラメータ、濃度および条件で実施可能であることが、当業者によって理解されるであろう。
【０１００】
本発明は、その特定の実施態様に関連して記述されているが、さらなる改変が可能であることが理解されるであろう。本明細書は、一般的に、本発明の原理にしたがって、本発明の任意の変化、使用または適合をカバーし、本発明が属する技術内の公知または習慣的な実施内に入る、そして、本明細書以上で列記された重要な特徴に適合可能であり得、付随する請求項の目的内である、本発明からの変化が含まれる。
【０１０１】
雑誌記事または要約、発行されたまたは未発行の米国または海外特許明細書、付与された米国または外国特許または他の参考文献を含む、本明細書で引用されたすべての参考文献は、参考文献内で引用されたすべてのデータ、表、図および文章を含んで、すべて本明細書で、参考文献にて組み込まれている。さらに、本明細書で引用されている参考文献内に引用されている参考文献の全内容もまた、すべて組み込まれている。
【０１０２】
公知の方法段階、従来の方法段階、公知の方法または従来の方法に対する参照は、本発明の任意の態様、記述または実施態様が、関連技術分野で開示され、教義されまたは提案されていることを許容する方法ではない。
【０１０３】
特定の実施態様の以上の記述は、（本明細書で引用された参考文献の内容を含む）当業者の知識を適用することによって、他者が、不必要な実験なしに、本発明の一般的なコンセプトから逸脱することなしに、そのような特定の実施態様の種々の適用に対して、簡単に改変および／または適合可能である、本発明の一般的な特性を完全に明らかにするであろう。したがって、そのような適合および改変は、本明細書で示された教義およびガイダンスに基づいて、広範囲の開示された実施態様の等価物の意味内であることが意図されている。本明細書での語句または用語は、記述の目的であり、制限の目的でなく、本明細書の語句または用語は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書で示された教義およびガイダンスに関して、当業者によって解釈される。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：初代ヒトＡＭＬ細胞が、循環中の芽細胞レベルと相関する、異常に多量のエラスターゼを分泌する。骨髄（ＢＭ）および末梢血（ＰＢ）血清中に分泌されたエラスターゼを、異なるＦＡＢ（フレンチ−アメリカン−ブリティッシュ分類、上記表Ａを参照のこと）サブタイプを有する１０人のＡＭＬ患者において、ＥＬＩＳＡ（取扱説明書にしたがって、ベンダー  メドシステムズ（Bender MedSystems）、サンブルノ（San Bruno）、カリフォルニア）によって定量した。本発明者らは、試料のうちＢＭおよびＰＢ中でのエラスターゼの量の変化を発見した（図１Ａ）。興味深いことに、ＢＭ中のエラスターゼのレベルと、ＡＭＬのサブタイプ（またはＦＡＢ）の間に相関が観察された。たとえば、ほとんど分化していないＡＭＬ型（Ｍ０）では、骨髄中のエラスターゼは非常に低いレベルであるが、一方で、より分化された細胞では、より高い酵素レベルを示した。ＡＰＬおよび骨髄単球性白血病（Ｍ４）では、ＢＭ中に分泌されたエラスターゼが、非常に多量であった（図１Ａ）。しかしながら、ＰＢ中のエラスターゼの量の変化と、異なるＡＭＬサブタイプ間では相関が見られなかった。正常な個体のＰＢ血清と比較した場合、ほとんどのＡＭＬ患者に、有意に高い濃度のエラスターゼが検出された（図１Ｂ）。注目すべきは、循環中にほとんど芽細胞を持たない、２人のＡＭＬ患者（Ｍ２およびＭ５）において、エラスターゼのレベルは正常であると検出されたことである（図１Ｂ）。この発見によって、ＰＢエラスターゼの濃度が、循環白血病芽細胞の数と相関しうることが示唆される。実際、本発明者らが、血清中の分泌されたエラスターゼタンパク質の量と、末梢血中のＡＭＬ芽細胞の数を比較した場合、これらのパラメータ間での有意な相関が見られた（図１Ｃ）。これらの結果によって、血清中の分泌されたエラスターゼタンパク質のレベルが、血中に存在するＡＭＬ芽細胞によることが例証され、エラスターゼが、悪性ＡＭＬ細胞散布（dissemination）に関与しうることが示唆される。注意することは、白血球細胞数は高いけれども、Ｍ０型患者由来のＰＢ血清中では、エラスターゼ濃度は非常に低かった（ＷＢＣ）。
【０１０５】
実施例２：ＡＭＬ細胞は、それら細胞表面上に、構造的にエラスターゼを発現している。好中球にて、エラスターゼ発現が、好中球活性化の後、または該細胞が死ぬときに発生する脱顆粒化の間に誘導される。エラスターゼは、活性化好中球のならし培地中でみることができる。しかしながら、活性化好中球はまた、膜結合エラスターゼを発現し、化学走化性シグナルにおいて、遊走好中球のリーディングエッジ上で再局在化する（Ｃｅｐｉｎｓｋａ、１９９９）。
【０１０６】
ＡＭＬ細胞が、エラスターゼ発現のダウンレギュレート活性化を示したので、本発明者らは、４つのＡＭＬ細胞株（ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＭＬ−１、ＭＬ−２）ならびに初代ＡＭＬ細胞におけるエラスターゼの発現レベルおよび局在化を調査した。
【０１０７】
初代ＡＭＬおよび細胞株上、または正常ＣＢ  ＣＤ３４＋濃縮細胞上の細胞表面エラスターゼを、以下のようにフローサイトメトリーによって解析した。ＡＭＬ細胞を、ポリクローナルウサギ抗ヒトエラスターゼ（バイオデザイン（Biodesign）、ケネバンクポート（Kennebunkport）、メイン）とともに３０分間インキュベートし、洗浄し、抗体の結合を、二次抗−ウサギ−ＦＩＴＣを用いて検出した（図２Ａ、上パネルおよび２Ｂ）。
【０１０８】
細胞質エラスターゼを以下のように検出した。細胞内フローサイトメトリーによって、４％パラホルムアルデヒド中、２０分間の固定化、および０．５％トライトン中１０分間の浸透化後、染色化（図２Ａ下パネル）。このアプローチを用いて、本発明者らは、ＡＭＬ細胞の表面上に、高レベルのエラスターゼを発見した。ＦＡＣＳに加えて、本発明者らは、免疫蛍光顕微鏡によって、膜−結合エラスターゼの存在を確認した（図２Ｂ）。
【０１０９】
さらに、本発明者らは、ＣＸＣＲ４とエラスターゼ間の共局在化がないことを発見した（データは示していない）。
【０１１０】
これらの結果によって、ＡＭＬ細胞が、外部刺激に独立してエラスターゼを分泌するだけでなく、構造的に、細胞表面上に相同的にアセンブルしたエラスターゼを発現することが示唆される。Ｃｅｐｉｎｓｋａｓら、（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１２、１９３７、１９９９）は、活性化好中球中の膜結合エラスターゼが、触媒活性的であり、循環プロテアーゼによるタンパク質分解に耐性であることを示唆した。したがって、ＡＭＬ細胞中の膜結合エラスターゼによって、ＡＭＬ細胞が、骨髄内皮バリアに浸潤可能になり、それらの循環中への散布を促進しうる。
【０１１１】
実施例３：エラスターゼ阻害剤は、ＡＭＬ細胞のＳＤＦ−１誘導性遊走を減少させる。ＡＭＬ細胞の遊走におけるエラスターゼの役割を研究するために、本発明者らは、生体内トランスウェルアッセイによって、自発的、またはＳＤＦ−１誘導性ＡＭＬ遊走におけるエラスターゼ阻害の効果を評価した。遊走アッセイは以下のように実施した。１２５ｎｇ／ｍＬ  組換え体ヒトＳＤＦ−１（ｒｈＳＤＦ−１）（ペプロテック（Peprotech）、ロッキーヒル、ニュージャージー）の存在下または非存在下で、１０％ＦＣＳを含む、合計６００ｍＬのＲＰＭＩを、５ｍｍ孔フィルター（コーニング（Corning）、ニューヨーク）を備えたコスター（Costar）２４−ウェル  トランスウェルプレートの下チャンバーに加えた。３０分間の、エラスターゼ阻害剤（ＥＩ）ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫ（１０μｇ／ｍｌ  カルビオケム（Calbiochem）、ラ・ホーヤ、カリフォルニア）またはモノクローナルマウス抗ヒト好中球エラスターゼＡｂ（７０μｇ／ｍｌを５０〜１００μｌ、ダコ（Dako）、グロストラップ（Glostrup）、デンマーク）での前処理あり、またはなしで、１０万の初代ＭＮＣ白血病細胞またはＡＭＬ細胞株を上チャンバーに加え、３７℃にて４時間、下チャンバーへ遊走させた。遊走細胞を下チャンバーから回収し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン  ディッキンソン）を用いて計数した。
【０１１２】
生体内アッセイによって得られた結果は、ＡＭＬ細胞、初代および細胞株の、５〜１０μｇ／ｍｌ  ＥＩとの３０分間の前インキュベートが、細胞のＳＤＦ−１依存遊走を有意に減少させたことを示した（ｐ＝０．０３９）（図３Ａ）。ＳＤＦ−１非存在下での、自発性遊走もまた減少した（データは示していない）。ＡＭＬ遊走におけるエラスターゼの役割を確かめるために、本発明者らは、同様のアッセイにて、ＥＩの代わりに、中和抗−エラスターゼＡｂｓ、またはプロテアーゼ阻害剤ａ１−アンチトリプシン阻害剤  １００μｇ／ｍｌを用いた（それぞれ図３ＢおよびＣ）。抗体およびプロテアーゼ阻害剤で得られた結果は、ＥＩで得られた結果と同様であり、ＡＭＬ遊走におけるエラスターゼの役割を確認した。
【０１１３】
これらの観察によって、エラスターゼが、自発性およびＳＤＦ−１依存性ＡＭＬ遊走両方に対して重要であることが例証される。エラスターゼ阻害による遊走の減少が、結局ＣＸＣＲ４発現の減少によるのかどうかを試験するために、本発明者らは、ＡＭＬ  ＣＸＣＲ４発現におけるエラスターゼ阻害の効果を試験した。本発明者らは、ＥＩは、ＦＡＣＳによって試験したように、細胞表面ＣＸＣＲ４発現のレベルを変化させなかったことを発見した（データは示していない）。したがって、ＡＭＬ細胞の遊走におけるエラスターゼの役割は、ＣＸＣＲ４調節を介して働くのではないことが明らかである。
【０１１４】
細胞遊走は、細胞骨格再配列を必要とし、ＳＤＦ−１は、細胞骨格再配列を誘導することが示されており、これが、突起の形成および細胞極性化を導く（Ａｖｉｇｄｏｒら  Ｂｌｏｏｄ．２００４  Ａｐｒ  １５；１０３（８）：２９８１−９．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｊａｎ  １５）。白血病細胞を、エラスターゼ阻害剤（ＥＩ）にて前処理した場合、ＳＤＦ−１誘導突起の形成が防止された（図３Ｄ）。注目すべきは、ＳＤＦ−１非存在下での、基底細胞極性化もまた、ＥＩによって止められることである。これらの結果によって、エラスターゼが、細胞骨格再配列および細胞極性化の直接の制御を介して、白血病細胞運動性に関与することが示される。
【０１１５】
トランスウェルアッセイは、空のフィルター上で実施したので、観察された効果は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）巨大分子の分解によるものではない。実際、本発明者らは、エラスターゼ阻害が、細胞極性化および突起形成を防止することを示し、エラスターゼによる、細胞骨格再配列の調節が暗示される。
【０１１６】
結果は、エラスターゼ阻害剤、ａ１−アンチトリプシンまたはエラスターゼ−中和ＡＢｓいずれかによるエラスターゼの阻害が、自発性およびＳＤＦ−１誘導の両方の、ＡＭＬ細胞の遊走に影響を与えることを示している。したがって、結果は、エラスターゼが、ＡＭＬ細胞の遊走のために必要であることを示している。
【０１１７】
実施例４：エラスターゼは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤのＢＭ内へのヒトＡＭＬ細胞のホーミングのために必要である。前臨床免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルによって、ヒトＡＭＬ幹細胞の移植が可能であり、ヒトＡＭＬの多くの観点を模倣可能である（Ｌａｐｉｄｏｔ  Ｎａｔｕｒｅ．１９９４  Ｆｅｂ  １７；３６７（６４６４）：６４５−８）。
【０１１８】
ヒトＡＭＬ細胞のＢＭへのインビボ遊走（またはホーミング）におけるエラスターゼ阻害の効果を査定するために、ＡＭＬ単核細胞（ＭＮＣ）細胞（５×１０6）を、亜致死照射Ｂ２ｍｎｕｌｌ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内に、未処理またはＥＩとの３０分間のインキュベーション（１０μｇ／ｍｌ）後に、注射した。
【０１１９】
より具体的には、示した細胞用量での、ヒト初代ＡＭＬ  ＭＮＣ、濃縮ＣＤ３４＋ＡＭＬまたはＣＢ細胞を、１０％ＦＣＳを含む５００ｍｌのＲＰＭＩ中に懸濁させ、エラスターゼ阻害剤（１０μｇ／ｍｌ）存在下または非存在下のいずれかで、３７℃にて３０分間インキュベートし、背側尾静脈を介して、マウスに注射した。マウスを移植１６時間後に安楽死させ、大腿骨および頸骨両方から流れ出たＢＭ細胞を、回収して、単一細胞懸濁液中に再懸濁させた。ヒト細胞の割合を、抗−ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣ  ｍＡＢ（イムノ  クオリティー  プロダクツ（Immuno Quality Products）フローニンゲン、オランダ）での免疫染色によって決定した。ヒトＦｃレセプターを、抗−マウスＣＤ１６−ＣＤ３２（ファーミンゲン（Pharmingen））（１：５０）による、ヒト血漿（１％）および齧歯類Ｆｃレセプターでブロックした。イソタイプ対照抗体を、擬陽性細胞（ＢＤ）を排除するために使用した。染色後、細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）上で解析した。
【０１２０】
得られた結果は、Ｍ２およびＭ４初代ＡＭＬ細胞の、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスＢＭへのホーミングが、未処理対照細胞と比較して、ＥＩ処理細胞で有意に減少したことを示している（図４Ａ／Ｂ）。興味深いことに、初代Ｍ１およびＭ５  ＡＭＬ細胞は、阻害されず、増加した（図４Ａ）。
【０１２１】
本発明者らは、エラスターゼ阻害の後、正常の濃縮ＣＤ３４＋細胞のホーミングを試験した。同様の原始幹細胞集団を解析するために、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を、異なるＦＡＢサブタイプの３人の他の患者の初代濃縮ＣＤ３４＋ＡＭＬ細胞（１．５〜３×１０6）と比較した。エラスターゼ阻害は、ＡＭＬ濃縮ヒトＣＤ３４＋細胞の、マウスＢＭへのホーミングを減少させ（図４Ｃ）、一方で、正常ＣＤ３４＋細胞のホーミングを増加させた（図４Ｃ）。考え合わせると、これらの結果は、エラスターゼが、正常および骨髄性白血病ＣＤ３４＋細胞のホーミングにおいて、正反対な効果を有することを示唆している。
【０１２２】
実施例５：ＢＭから循環内へのＡＭＬ細胞放出は、生体内でエラスターゼ阻害剤の投与によって阻害される。Ｇ−ＣＳＦは、ＢＭから循環への幹細胞の放出（移動）を誘導する。移動は、カセプシンＧおよびエラスターゼのようなタンパク質分解酵素による、ＶＣＡＭ−１、ｃ−ｋｉｔレセプターおよびＳＤＦ−１の分解を含む、ＢＭ造血微小環境の重度の変化によって引きおこされることが明らかである［Ｐｅｔｉｔ，  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  Ｊｕｌ；３（７）：６８７−９４，２００２；Ｌｅｖｅｓｑｕｅ，２００３  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００３  Ｊａｎ；１１１（２）：１８７−９６，Ｌｅｖｅｓｑｕｅ  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００３  Ｆｅｂ；３１（２）：１０９−１７］。エラスターゼのブロッキングが、Ｇ−ＣＳＦ誘導移動を防止する（ＰｅｔｉｔおよびＬａｐｉｄｏｔ  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００２  Ｓｅｐ；３０（９）：９７３−８１．２００２）。白血病細胞は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＴ１−ＭＭＰのような種々のプロテアーゼ（Ｒｉｅｓら  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｆｅｓｅａｒｃｈ  １９９９、（５）１１１５）およびエラスターゼを高レベルで発現している。エラスターゼが、ＡＭＬ細胞移動性およびホーミングの調節において役割を果たすという本発明者らの発見に関して（実施例３および４）、本発明者らは、ＡＭＬ細胞によって発現されたすべてのプロテアーゼのうち、エラスターゼが、ＢＭから循環へのＡＭＬ細胞の放出を促進しうることを予想した。
【０１２３】
この予想を試験するために、初代ＡＭＬ細胞（２０〜４０×１０6）を、亜致死照射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射して、ヒトＡＭＬ−マウスキメラを確立し、骨髄から循環へのＡＭＬ放出を、未処理マウスと比較して、エラスターゼ阻害剤で処理したマウスにて、２４時間にモニタした。
【０１２４】
よりとりわけ、ヒト初代ＡＭＬ  ＭＮＣ細胞（１０〜３０×１０6）またはＨＬ６０  ＡＭＬ細胞株（２０×１０6）を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。２４週間後、ＥＩ（１ｍｇ）を４連続日間、１日１回注射した。乾燥氷にて窒息させたマウスからのＰＢを、ヘパリン処理チューブ内の心臓吸引によって回収し、ＢＭを前述したように回収した。ヒト細胞の割合を、前述したように、ＣＤ４５に関して、免疫蛍光によって決定した。
【０１２５】
得られた結果は、ＰＢへのＡＭＬ細胞放出が、未処理マウスと比較して、ＥＩ処理マウスで減少したことを示している（図５および表Ｂ）。同様の結果が、ヒト初代細胞およびヒトＡＭＬ株で観察された。
【０１２６】
これらの結果は、初めて、エラスターゼが、ＢＭから循環へのヒトＡＭＬ細胞遊走の調節に関与し、エラスターゼ阻害剤の投与が、骨髄から循環への、ＡＭＬ細胞放出を効果的に防止可能であることを示している。
【０１２７】
【表２】
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【０１２８】
実施例６：ＡＭＬ細胞増殖は、エラスターゼ依存である。ＡＭＬは、ＢＭ内での、広範囲の、無制御ＡＭＬ細胞増殖によって特徴づけられる。本発明者らは、エラスターゼが、ＡＭＬ細胞増殖に影響を与えうるかどうかの可能性を確認した。
【０１２９】
ＡＭＬ細胞の増殖におけるエラスターゼの役割を試験するために、初代ＡＭＬ細胞（１×１０6／ｍｌ）、ＡＭＬ細胞株（１×１０4／ｍｌ）または正常ＣＤ３４＋濃縮臍帯血（ＣＢ）細胞（１×１０5／ｍｌ）を、エラスターゼ阻害剤（１０μｇ／ｍｌ）あり、またはなしで、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ中で増殖させた。生細胞の数を、トリパンブルー排除を用いて、第０、１、３、５および７日に測定した。
【０１３０】
初代ＭＮＣ  ＡＭＬ細胞およびＡＭＬ細胞株（ＭＬ−２、Ｕ９３７）の増殖速度におけるＥＩの効果を、培養中でそれぞれ３〜７日後に評価した。初代細胞の数が、培養中３日後に減少し、ＥＩの添加が、生ＡＭＬ細胞の数を有意に減少させた（図６Ａ）。培養中７日後、ＭＬ２およびＵ９３７の数が増加し、細胞増殖が、ＥＩの存在下での細胞の培養によって阻害された（図６Ａ）。したがって、この結果は、エラスターゼが、ＡＭＬ細胞の増殖を誘導することを示唆している。
【０１３１】
正常ＣＤ  ＣＤ３４＋細胞を、同様の条件下で培養した場合、エラスターゼ阻害が、その増殖速度を増強した（図６Ａ）。さらに、本発明者らは、未発達始原細胞ＣＤ３４＋／３８−の割合が、サイトカインおよびＥＩの存在下、培養中で、３日後に有意に増加したことを発見した（図６Ｂ）。したがって、この結果は、エラスターゼが、正常細胞の増殖を阻害しうることを示唆し、正常幹細胞の分化において役割をもつことを暗示している。
【０１３２】
したがって、本発明にしたがって、エラスターゼが、ＡＭＬ増殖に必要であること，エラスターゼ阻害が、効果的にＡＭＬ細胞増殖を抑制すること、同時に、培養中の未成熟移植−コンピテントＣＤ３４＋／３８−幹細胞を維持する、正常ＣＤ３４＋細胞増殖の増殖を誘導可能であることがわかった。
【０１３３】
実施例７：ＳＤＦ−１は、ＡＭＬ細胞上の表面エラスターゼの発現を増加させ、正常ＣＤ３４＋細胞にて減少させる。本発明者らは最近、ＢＭおよび脾臓ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍｎｕｌｌマウスへホーミングしている悪性ヒトＡＭＬおよびプレＢ  ＡＬＬ細胞がまた、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用依存であることを示した［Ｔａｖｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４  Ａｐｒ  １５；６４（８）：２８１７−２４］。本発明者らは、ＡＭＬ細胞の遊走における、ＳＤＦ−１の効果の一部が、エラスターゼ発現の調節を介している可能性を予想した。
【０１３４】
本発明者らの予想を確かめるために、初代ＡＭＬ細胞および正常ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を、ＳＤＦ−１（２００ｎｇ／ｍｌ）にて、１および３時間処理し、細胞表面エラスターゼの発現をＦＡＣＳによって決定した（図７）。
【０１３５】
得られた結果は、ＳＤＦ−１が、ＡＭＬ中の細胞表面エラスターゼ発現、およびＣＢ  ＣＤ３４＋細胞におけるエラスターゼ発現において、反対の効果を持ち、ＳＤＦ−１が、ＡＭＬ細胞の表面エラスターゼを増加させ、正常ＣＤ  ＣＤ３４＋細胞上の表面エラスターゼを減少させることを示している。
【０１３６】
したがって、得られた結果に関して、ＳＤＦ−１は、正常ＣＤ３４＋細胞遊走とは反対に、細胞表面エラスターゼ発現をアップレギュレートすることによって、ＡＭＬ遊走に影響を与える。
【０１３７】
実施例８：細胞培養。細胞株：ヒト骨髄Ｕ９３７、ＨＬ６０、ＭＬ２およびＭＬ１（Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ中で増殖させた。
【０１３８】
ヒト細胞：全期間伝達からのヒト臍帯血（ＣＢ）細胞、および１５人の新規診断ＡＭＬ患者からの、末梢血（ＰＢ）および／またはＢＭ細胞を得た。白血病の診断は、ＦＡＢ分類を用いて、従来の形態学的評価、免疫表現系決定および細胞化学標本に基づいた。
【０１３９】
試料を、リン酸−緩衝−食塩水（ＰＢＳ）中で１：１に希釈した。低密度単核細胞（ＭＮＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ファルマシア  バイオテック、ウプサラ、スウェーデン）上での標準分離後に回収し、ＰＢＳ中で洗浄した。ＣＤ３４＋細胞を、取扱説明書にしたがって、ＭＡＣＳ細胞単離キットおよびＡｕｔｏＭａｃｓ磁気細胞ソーター（ミルテニ  バイオテック、ベルジッヒ・グラバッハ、ドイツ）を用いて濃縮し、９５％以上の純度を得た。細胞を新鮮に、または液体窒素中での保存のために、ＦＣＳ＋１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で使用した。
【０１４０】
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【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】ＡＭＬ患者のＢＭおよび末梢血におけるエラスターゼのレベルを示す。（Ａ）いろいろな表現系を持つ１０人のＡＭＬ患者由来の、ＢＭ（黒棒）および末梢血（白棒）から、エラスターゼの血清レベルを、ＥＬＩＳＡによって決定した。各試料を三重に測定した。示したデータは、平均値±標準誤差（ＳＥ）を表している。（Ｂ）正常個体（正常）、末梢血中で芽細胞を示しているＡＭＬ患者（ＰＢ）、循環中に芽細胞なし（ＰＢ芽細胞なし）、またはＰＢ中に芽細胞を有するＭ０  ＦＡＢサブタイプのＡＭＬ患者由来の末梢血中のエラスターゼの血清レベル。各試料を二重または三重にて測定した。示したデータは平均値を表している。各群の平均値を示す。（Ｃ）ＰＢエラスターゼレベルと、循環ＡＭＬ芽細胞の数との相関。エラスターゼの血清レベルを、循環芽細胞の数に対してプロットした。Ｒ＝０．６、ｐ＝０．０１。
【図２】ＡＭＬ細胞上のエラスターゼの細胞表面発現を示す。（Ａ）ＡＭＬ細胞株（ＨＬ−６０、Ｕ９３７およびＭＬ−１）ならびにＢＭ由来の初代ＡＭＬ（患者ＢＭ）およびＰＢ由来の初代ＡＭＬ（患者ＰＢ）を、外部および内部エラスターゼに関して染色した。エラスターゼの、ＡＭＬ細胞株（左パネル）および初代白血病細胞（右パネル）のＦＡＣＳ解析。斜線ヒストグラムは、アイソタイプ−適合対照抗体での染色を示し、空ヒストグラムは、エラスターゼ抗体での染色を示す。（Ｂ）ポリ−Ｌ−リジンに接着し、抗−ＣＸＣＲ４および抗−エラスターゼＡｂｓにて間接的に免疫染色された、一次ＡＭＬ患者から得た細胞中の、膜エラスターゼ局在の免疫細胞化学解析。本来の倍率１００×。
【図３】ＡＭＬ細胞によるエラスターゼ分泌が、それらのＳＤＦ−１−誘導トランスウェル遊走に影響を与えることを示す。（Ａ）未処理、またはエラスターゼ阻害剤、１０μｌ／ｍｌ  ＥＩ（ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＣＭＫ）（Ａ）、抗エラスターゼＡｂｓ（Ｂ）またはａ−アンチトリプシン（ａ１−ＡＴ）（Ｃ）で３０分間処理のいずれかの、ＡＭＬ細胞のインビトロトランスウェル遊走アッセイ。結果は、４時間後、１２５ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１に向かって遊走した細胞の割合を示す。（Ｄ）ポリ−Ｌ−リジンコート表面上の初代ＡＭＬ細胞の免疫細胞化学解析。細胞を、エラスターゼ阻害剤（ＥＩ）で３０分間前処理するか、または未処理のままで、２００ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１の非存在下（−）または存在下で、接着させ、固定し、抗−ＣＸＣＲ４および抗−エラスターゼＡｂにて間接的に免疫標識した。本来の倍率１００×。
【図４】エラスターゼ阻害剤が、ＡＭＬ細胞のホーミングを阻害することを示している。（Ａ）未処理、またはエラスターゼ阻害剤（１０μｇ／ｍｌ）で３０分間インキュベートした後の、８人の患者からの初代ヒトＡＭＬ細胞を、亜致死照射Ｂ２ｍｎｕｌｌ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内に注射した。ＢＭ中のヒトＣＤ４５＋細胞の割合を、１６時間後に測定した。（Ａ）データは、未処理対照（１００％）と比較して、エラスターゼ阻害剤−処理ヒト細胞の割合を示している。（Ｂ）代表的な実験のＦＡＣＳ解析。示した数字は、１．５×１０6獲得ＢＭ細胞あたりの、ヒトＣＤ４５＋細胞の数を表している。（Ｃ）初代ＡＭＬ  ＣＤ３４＋細胞および正常ＣＢ高含有ＣＤ３４＋細胞のホーミングにおける、エラスターゼ阻害剤（１０μｇ／ｍｌ）の効果の比較。
【図５】エラスターゼの阻害が、循環中への、移植したヒトＡＭＬ細胞の放出を防止することを示す。ＡＭＬ細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、４連続日、１ｍｇのエラスターゼ阻害剤で処理した。ＢＭ中および末梢血中のＡＭＬ細胞のレベルを、ＣＤ４５染色によって決定した。１つの代表的な実験からのＦＡＣＳ解析を示す（Ａ）。パネルＢは、ＰＢ中のヒト移植細胞の割合／エラスターゼ阻害剤の処置あり、またはなしでの、ＢＭ中の移植細胞の割合を表している。マウス間の移植の割合の変動のために、ＰＢ／ＢＭ比の比較を実施した。データは、４つの独立した実験からの平均の結果を示している。
【図６】エラスターゼ阻害剤が、ＡＭＬ細胞の増殖を阻害することを示す。１０μｇ／ｍｌ  エラスターゼ阻害剤（ＥＩ）あり、またはなしでの、初代ＡＭＬ細胞、ＡＭＬ細胞株およびヒト臍帯血（ＣＢ）細胞を、３〜７日間培養し、生存細胞の数を、トリパンブルー排除を用いて決定した（Ａ）。全期間送出からの濃縮ＣＤ３４＋  ＣＢ細胞を、ＳＣＦ、ＦＬＴ３ＬおよびＩＬ６を含むＲＰＭＩ／１０％  ＦＣＳ中で増殖させた。ＥＩあり、またはなしで培養した、全濃縮ＣＤ３４＋  ＣＢ細胞からのＣＤ３４＋／３８−細胞の割合を、ＦＡＣＳによって決定した（Ｂ）。
【図７】ＳＤＦ−１が、ＡＭＬ細胞上のエラスターゼの細胞表面発現を増加させ、正常ＣＤ３４＋細胞上で減少させることを示す。初代ＡＭＬ細胞およびＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を、ＳＤＦ−１（２００ｎｇ／ｍｌ）で１および３時間処理し、エラスターゼの細胞表面の発現を、ＦＡＣＳによって決定した。（ａ）アイソタイプ対照、（ｂ）未処理細胞、（ｃ）ＳＤＦ−１で１時間、（ｄ）ＳＤＦ−１で３時間。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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