(57)【要約】本発明は、サンプル中のグラム陽性菌夾雑物の検出および／または定量化のための方法ならびに組成物を提供する。より具体的には、本発明は、グラム陽性菌夾雑物の検出および／または定量化のための、血液細胞ベースの調製物、このような血液細胞ベースの調製物を作製する方法、およびこのような血液細胞ベースの調製物を使用する方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、サンプル中のリポテイコ酸の存在および／または量を検出するための調製物を生成するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のリポテイコ酸の存在および／または量を検出するための調製物を生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｒｒｏｒａｔｕｓ、Ｈｅｍｉｇｒａｐｓｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、およびＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓからなる群より選択される甲殻類動物から回収される血液細胞調製物を提供する工程であって、該血液細胞が、その中に配置されたリポテイコ酸反応性材料を含む、工程；
（ｂ）該血液細胞から該リポテイコ酸反応性材料を放出させる工程；および
（ｃ）該血液細胞から放出された該リポテイコ酸反応性材料を回収する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記リポテイコ酸反応性材料は、工程（ｂ）において、前記血液細胞の溶解によって放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リポテイコ酸反応性材料は、工程（ｂ）において、前記血液細胞が、リポテイコ酸反応性に対する透過性にされて、放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記血液細胞は、膜透過因子に対する曝露によって、透過性にされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記透過因子は、イオノフォアである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記イオノフォアは、カルシウムイオノフォアである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記イオノフォアは、約０．１μＭ〜約１００μＭの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記イオノフォアは、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記膜は、二価カチオンの存在下において、前記イオノフォアに該膜を曝露することによって透過性にされる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記カチオンは、カルシウムイオンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記甲殻類動物は、Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記リポテイコ酸反応性材料は、プロフェノールオキシダーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リポテイコ酸反応性材料は、前記血液細胞から放出されるときに、活性化されないが、後に活性化されて、プロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記回収されたリポテイコ酸反応性材料と、フェノールオキシダーゼの基質とを合わせるさらなる工程を、工程（ｃ）の後に包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
サンプル中のリポテイコ酸の存在および／または量を検出するための調製物を生成する方法であって、該方法は、
（ａ）血液細胞調製物を提供する工程であって、該調製物中の血液細胞は、（ｉ）外膜を有し、かつ（ｉｉ）その中に配置されたリポテイコ酸反応性材料を含む、工程；
（ｂ）該血液細胞調製物中の血液細胞の該外膜の少なくとも一部に、該リポテイコ酸反応性材料が該血液細胞から放出されるように、該リポテイコ酸反応性材料に対して透過性にする工程；および
（ｃ）該血液細胞から放出された該リポテイコ酸反応性材料を回収する工程；
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記外膜は、工程（ｂ）において、膜透過因子に対する曝露によって選択的に透過性にされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記透過因子は、イオノフォアである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記イオノフォアは、カルシウムイオノフォアである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記イオノフォアは、約０．１μＭ〜約１００μＭの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記イオノフォアは、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記外膜は、二価カチオンの存在下において、前記イオノフォアに該膜を曝露することによって選択的に透過性にされる、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記カチオンは、カルシウムイオンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記血液細胞は、甲殻類動物に由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記甲殻類動物は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｒｒｏｒａｔｕｓ、Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ、Ｈｅｍｉｇｒａｐｓｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、およびＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記甲殻類動物は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓまたはＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記リポテイコ酸反応性材料は、プロフェノールオキシダーゼを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記リポテイコ酸反応性材料は、活性化されたときにプロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する酵素を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記回収されたリポテイコ酸の反応性材料と、フェノールオキシダーゼの基質とを合わせるさらなる工程を、工程（ｃ）の後に包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
リポテイコ酸反応性材料の調製物を生成する方法であって、該方法は、
（ａ）血液細胞調製物を提供する工程であって、該調製物中の血液細胞は、（ｉ）外膜を有し、かつ（ｉｉ）その中に配置されたリポテイコ酸反応性材料を含む、工程；
（ｂ）該血液細胞と膜透過因子とを混合して、該血液細胞の少なくとも一部から該リポテイコ酸反応性材料を放出させる工程；および
（ｃ）該血液細胞から放出された該リポテイコ酸反応性材料を回収する工程；
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記透過因子は、選択的に、前記外膜を前記リポテイコ酸反応性材料に対して透過性にする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記透過因子は、イオノフォアである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記イオノフォアは、カルシウムイオノフォアである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記イオノフォアは、約０．１μＭ〜約１００μＭの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記イオノフォアは、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記外膜は、二価カチオンの存在下において、前記イオノフォアに該外膜を曝露することによって選択的に透過性にされる、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記カチオンは、カルシウムイオンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記血液細胞は、甲殻類動物に由来する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記甲殻類動物は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｒｒｏｒａｔｕｓ、Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ、Ｈｅｍｉｇｒａｐｓｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、およびＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記甲殻類動物は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記リポテイコ酸反応性材料は、プロフェノールオキシダーゼを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記リポテイコ酸反応性材料は、活性化されたときにプロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する酵素を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記回収されたリポテイコ酸の反応性材料と、フェノールオキシダーゼの基質とを合わせるさらなる工程を、工程（ｃ）の後に包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
リポテイコ酸反応性材料の調製物を生成する方法であって、該方法は、
（ａ）血液細胞調製物を提供する工程であって、該調製物中の血液細胞は、（ｉ）外膜を有し、かつ（ｉｉ）その中に配置されたリポテイコ酸反応性材料を含む、工程；
（ｂ）該血液細胞とイオノフォアとを混合して、該血液細胞から該リポテイコ酸反応性材料を放出させる工程；および
（ｃ）該血液細胞から放出された該リポテイコ酸反応性材料を回収する工程；
を包含する、方法。
【請求項４４】
前記イオノフォアは、カルシウムイオノフォアである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記イオノフォアは、約０．１μＭ〜約１００μＭの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記イオノフォアは、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記外膜は、二価カチオンの存在下において、前記イオノフォアに該外膜を曝露することによって選択的に透過性にされる、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記カチオンは、カルシウムイオンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記イオノフォアは、選択的に、前記外膜を前記リポテイコ酸反応性材料に対して透過性にする、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記血液細胞は、甲殻類動物に由来する、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記甲殻類動物は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｒｒｏｒａｔｕｓ、Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ、Ｈｅｍｉｇｒａｐｓｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、およびＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓからなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記甲殻類動物は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記リポテイコ酸反応性材料は、プロフェノールオキシダーゼを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
前記リポテイコ酸反応性材料は、活性化されたときにプロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する酵素を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５５】
前記リポテイコ酸の反応性材料と、フェノールオキシダーゼの基質とを合わせるさらなる工程を、工程（ｃ）の後に包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
請求項１、１５、２９、または４３の方法によって生成されるリポテイコ酸反応性材料の調製物。
【請求項５７】
前記リポテイコ酸反応性材料は、プロフェノールオキシダーゼを含む、請求項５６に記載の調製物。
【請求項５８】
前記リポテイコ酸反応性材料は、活性化されたときにプロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する酵素を含む、請求項５６に記載の調製物。
【請求項５９】
フェノールオキシダーゼの基質をさらに含む、請求項５６に記載の調製物。
【請求項６０】
甲殻類動物の血液細胞に由来する単離された酵素調製物を含む組成物であって、該酵素調製物は、該酵素調製物がリポテイコ酸と接触させられるときにフェノールオキシダーゼに変換されるプロフェノールオキシダーゼを含む、組成物。
【請求項６１】
前記酵素調製物は、外膜が、選択的に、プロフェノールオキシダーゼに対して透過性にされている血液細胞に由来する、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記甲殻類動物は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｒｒｏｒａｔｕｓ、Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ、Ｈｅｍｉｇｒａｐｓｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、およびＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓからなる群より選択される、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】
前記甲殻類動物は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓである、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６４】
前記酵素調製物は、ファクターＣ活性、ファクターＧ活性、もしくはファクターＣ活性およびファクターＧ活性の両方を実質的に含まない、請求項６０、６１、または６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記酵素調製物は、（１→３）−β−Ｄグルカン、リポ多糖類、もしくはプロテオグリカンの存在下において実質的に不活化されたままである、請求項６０、６１、または６３に記載の組成物。
【請求項６６】
前記酵素調製物は、リポテイコ酸の存在下においてプロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する酵素を含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６７】
プロフェノールオキシダーゼを含む甲殻類動物の血液細胞溶解物であって、該プロフェノールオキシダーゼは、該血液細胞溶解物がリポテイコ酸と接触させられるときに、フェノールオキシダーゼに変換される、血液細胞溶解物。
【請求項６８】
前記甲殻類動物は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｒｒｏｒａｔｕｓ、Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ、Ｈｅｍｉｇｒａｐｓｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、およびＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓからなる群より選択される、請求項６６に記載の血液細胞溶解物。
【請求項６９】
フェノールオキシダーゼの基質をさらに含む、請求項６０または６７に記載の組成物。
【請求項７０】
サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出する方法であって、該方法は、該サンプルと請求項５６に記載の調製物とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７１】
前記サンプルは、液体サンプルである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記調製物は、前記サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出するために２工程動的アッセイにおいて使用される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出する方法であって、該方法は、該サンプルと請求項６０または６７に記載の組成物とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７４】
前記サンプルは、液体サンプルである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記調製物は、前記サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出するために２工程動的アッセイにおいて使用される、請求項７３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００４年１２月２日出願の米国特許出願第６０／６３２，７８５号（その全体は、本明細書中に参考として援用される）に基づく利益および優先権を主張する。
【０００２】
（政府支援）
本発明は、一部、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｅｒｏｎａｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｐａｃｅ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎからの助成金番号ＮＡＧ  ２−１２６３に基づく政府支援によってなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般に、サンプル中のグラム陽性菌検出および／または定量化するための方法ならびに組成物に関する。より具体的には、本発明は、サンプル中のグラム陽性菌検出および／または定量化するのに有用な、血液細胞ベースの調製物、ならびにこのような調製物を作製および使用する方法に関する。
【０００４】
（発明の背景）
例えば、グラム陽性菌、グラム陰性菌、酵母、真菌、および糸状菌による微生物汚染は、重篤な疾患を引き起こし得、いくつかの場合では、ヒトに死すらも引き起こす。特定の産業（例えば、製薬産業、医療デバイス産業、および食品産業）における製造業者は、厳しい基準を満たして、彼らの製品があるレベルの微生物夾雑物を含まない（さもなければ、レシピエントの健康状態を損なう）ことを確認しなければならない。これらの産業は、特定の基準（例えば、米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）または環境保護局によって課される基準）を満たすために、このような微生物夾雑物の存在に関して、頻度が高く、正確で、かつ感度の高い試験を要する。例えば、ＵＳＦＤＡは、医薬品および侵襲性医療デバイスの特定の製造業者に、彼らの製品が、検出可能なレベルのグラム陰性菌のエンドトキシンを含まないことを確証するように求めている。
【０００５】
今日まで、試験サンプル中の微生物夾雑物の存在および／または量を検出するために、種々のアッセイが開発された。アッセイの１つのファミリーは、甲殻類動物、例えば、カブトガニの血液リンパから調製された血液細胞溶解物を利用する。これらのアッセイは、代表的には、ある意味では、または別の意味でも、血液細胞溶解物が微生物夾雑物に曝されたときに生じる凝固カスケードを活用する。例えば、図１は、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）の血液リンパから産生された血液細胞溶解物に存在することが公知である特定の凝固カスケードの概略図を示す。このような溶解物は、Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物またはＬＡＬとして、当該分野において公知である。
【０００６】
図１に示されるように、ＬＡＬの凝固系は、哺乳動物の血液凝固系と同様に、エンドトキシン媒介経路またはリポ多糖類（ＬＰＳ）媒介経路（ファクターＣ経路）および（１→３）−β−Ｄグルカン媒介経路（ファクターＧ経路）を含む少なくとも２つの凝固カスケードを含む。例えば、非特許文献１；および非特許文献２を参照のこと。
【０００７】
グラム陰性菌はＬＡＬベースのアッセイを使用して検出され得ることが、理解される。例えば、グラム陰性菌は、ＬＰＳ結合タンパク質に対する結合後にＬＡＬ（図１を参照のこと）中のファクターＣ経路を活性化する、エンドトキシンまたはＬＰＳを産生する。ＬＡＬのエンドトキシンまたはＬＰＳ媒介性の活性化は、よく理解され、そして当該分野において十分に文書化されている。例えば、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６を参照のこと。細菌エンドトキシンは、ＬＡＬと接触される場合、そのエンドトキシンは、ファクターＣ経路として公知である酵素反応を開始させ、このファクターＣ経路は、ファクターＣ、ファクターＢ、およびプロ凝固酵素と称される３種のセリンプロテアーゼ酵素原を含むことが理解される（図１を参照のこと）。簡単にいうと、エンドトキシンに対する曝露の際に、そのエンドトキシン感受性因子（ファクターＣ）は、活性化される。活性化されたファクターＣは、その後、ファクターＢを加水分解して、それを活性化し、その際、活性化されたファクターＢは、プロ凝固酵素を活性化して凝固酵素を産生する。上記凝固酵素は、その後、特異的部位（例えば、コアギュロゲン（ｃｏａｇｕｌｏｇｅｎ）のＡｒｇ１８−Ｔｈｒ１９およびＡｒｇ４６−Ｇｌｙ４７）で無脊椎動物のフィブリン様の凝固可能タンパク質を加水分解して、コアギュリンゲル（ｃｏａｇｕｌｉｎ）のゲルを生成する。例えば、特許文献１を参照のこと。
【０００８】
さらに、（１→３）−β−Ｄグルカンおよび他のＬＡＬ反応性グルカン（酵母および糸状菌のような微生物によって生成される）はまた、ファクターＧ経路として当該分野で公知である異なる酵素経路（図１を参照のこと）を介してＬＡＬの凝固カスケードを活性化し得る。ファクターＧは（１→３）−β−Ｄグルカンまたは他のＬＡＬ反応性グルカンによって活性化されるセリンプロテアーゼチモーゲンであることが、理解される。（１→３）−β−Ｄグルカンに対する曝露の際に、例えば、ファクターＧは、活性化されて、活性化されたファクターＧを生成する。活性化されたファクターＧは、その後、そのプロ凝固酵素を凝固酵素に変換し、その際に、その凝固酵素は、コアギュロゲンをコアギュリンに変換することが、理解される。
【０００９】
現在では、ＬＡＬは、その感度、特異性、およびサンプルに存在し得る他の成分による妨害を避けることが比較的容易であることに起因して、多くの細菌エンドトキシンアッセイにおいて、選択されたアメーバ様細胞溶解物として使用されている。ＬＡＬは、細菌エンドトキシンを含むサンプル、および必要に応じて特定のＬＡＬ基質と合わせられる場合、は、そのサンプル中のエンドトキシンと反応して、検出可能な生成物（例えば、ゲル、濁り度の増加または着色した生成物もしくは発光生成物（合成色素形成性基質の場合））を生成する。得られた生成物は、例えば、視覚的に、または光学検出器を使用するかのいずれかによって検出され得る。
【００１０】
対照的に、グラム陽性菌の汚染を検出および／または定量化するのための上記に匹敵する感度および特異性のアッセイは、開発がより困難であった。Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｐｙｒｏｇｅｎ  Ｔｅｓｔ（ＩＰＴ）として公知であるグラム陽性菌の汚染を検出するための１つのアッセイが、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から入手可能である。上記ＩＰＴアッセイは、インビトロでウサギ発熱物質試験（ｒａｂｂｉｔ  ｐｙｒｏｇｅｎ  ｔｅｓｔ）に代わるものであり、そしてそのアッセイは、ヒトの新鮮な全血またはヒトの低温保存された全血を使用するＥＬＩＳＡベースのアッセイである。発熱物質に曝された場合、その全血内の免疫細胞は、上記ＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出されるインターロイキン−１βを産生する。しかし、上記ＩＰＴアッセイは、それが、グラム陽性菌、グラム陰性菌、酵母およびウイルスに存在する発熱物質によって活性化されるので、グラム陽性菌の存在を選択的に検出しない。
【００１１】
細菌、酵母および真菌の汚染の検出は、極めて重要であり得るが、これらの異なる生物体の間を区別する性能は、個体における感染を引き起こす感染因子または試験サンプルに存在する汚染の供給源および型についての、有用な情報を提供し得る。例えば、一旦感染が同定されると、その後、医師は、感染を処置するための最も適切な医薬を処方し得る。さらに、一旦細菌、酵母および真菌の汚染の型が同定されると、その後、この型の情報は、例えば、上水道における汚染の供給源を同定するプロセスを速め得る。結果として、一旦汚染の供給源が同定されると、さらなる汚染が、軽減され得る。方法および組成物が、現在、グラム陰性菌、酵母、および糸状菌を特異的に検出するために利用可能であるが、目的のサンプル中のグラム陽性菌を特異的に検出するためのさらなる方法および組成物に対する必要性が、依然として存在し続ける。
【特許文献１】米国特許第５，６０５，８０６号明細書
【非特許文献１】Ｍｏｒｉｔａら、ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴ．、１９８１年、第１２９巻、ｐ．３１８−３２１
【非特許文献２】Ｉｗａｎａｇａら、Ｊ．ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＨＥＭ．、１９８６年、第５巻、ｐ．２５５−２６８
【非特許文献３】Ｌｅｖｉｎら、ＴＨＲＯＭＢ．ＤＩＡＴＨ．ＨＡＥＭＯＲＲＨ．、１９６８年、第１９巻、ｐ．１８６
【非特許文献４】Ｎａｋａｍｕｒａら、ＥＵＲ．Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．、１９８６年、第１５４巻、ｐ．５１１
【非特許文献５】Ｍｕｔａら、Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．、１９８７年、第１０１巻、ｐ．１３２１
【非特許文献６】Ｈｏら、ＢＩＯＣＨＥＭ．＆ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．ＩＮＴ．、１９９３年、第２９巻、ｐ．６８７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、一般に、リポテイコ酸（グラム陽性菌の細胞壁内に見出される分子）の存在および／または量を検出するのに有用な方法および組成物を提供する。この情報は、グラム陽性菌が試験サンプル中に存在するか否かを決定するために使用され得、そしてまた、試験サンプルにおける汚染の程度を測定するために使用され得る。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、サンプル中のリポテイコ酸の存在および／または量を検出するための調製物を生成する方法を提供する。本発明は、以下の工程を包含する：（ａ）  Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｒｒｏｒａｔｕｓ、Ｈｅｍｉｇｒａｐｓｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、およびＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓからなる群より選択される甲殻類動物から回収された血液細胞調製物を提供する工程であって、その血液細胞が、リポテイコ酸反応性材料を含む、工程；（ｂ）上記血液細胞から上記リポテイコ酸反応性材料を放出させる工程；ならびに（ｃ）上記血液細胞から放出された上記リポテイコ酸反応性材料を回収する工程。
【００１４】
工程（ｂ）において、上記リポテイコ酸は、種々の手順によって上記血液細胞から放出され得る。例えば、上記血液細胞は、従来の手順（例えば、浸透圧性ショック、超音波処理、均質化、および超遠心分離）によって溶解され得る。あるいは、上記血液細胞の外膜は、上記血液細胞内に配置された上記リポテイコ酸反応性材料に対する透過性（例えば、選択的な透過性）を与えられ得る。このアプローチにおいて、上記血液細胞は、その血液細胞を膜透過因子に曝すことによって、リポテイコ酸反応性材料に対する透過性を与えられ得る。種々の膜透過因子が使用され得るが、好ましい膜透過因子は、イオノフォア（例えば、カルシウムイオノフォア）である。上記イオノフォアは、約０．１μＭ〜約１００μＭ（例えば、約１μＭ〜約１０μＭ）の範囲の最終濃度になるように上記調製物と混合される。カルシウムイオノフォアが使用される場合、そのイオノフォアは、好ましくは、二価カチオン（例えば、カルシウムイオン）と合わされる。
【００１５】
リポテイコ酸反応性材料の得られた調製物は、プロ酵素のプロフェノールオキシダーゼを含む。さらに、上記調製物は、作製されたとき、その調製物が作製された時点で実質的に不活性であるリポテイコ酸反応性材料を含む。しかし、上記調製物が、後にリポテイコ酸と組合されるとき、上記リポテイコ酸反応性材料は、活性化し、その際に、上記プロフェノールオキシダーゼが、フェノールオキシダーゼに変換される。試験サンプル中のフェノールオキシダーゼの量をアッセイするために、上記調製物は、フェノールオキシダーゼに対する１種以上の基質と合わされ得る。次いで上記フェノールオキシダーゼは、ｙ上記基質に作用するか、またはその基質を生成物に変換し、その生成物は、視診もしくは検出器（例えば、分光光度計、フルオリメーター（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）などのような光学検出器）のいずれかによって検出および／または定量化され得る。
【００１６】
別の局面において、本発明は、上記の方法によって生成され得るリポテイコ酸反応性材料の調製物を提供する。上記調製物は、プロ酵素のプロフェノールオキシダーゼを含む。生成されたとき、上記調製物内に含まれるリポテイコ酸反応性材料は、実質的に不活性である。しかし、リポテイコ酸（例えば、グラム陽性菌中およびグラム陽性菌上に存在するリポテイコ酸）に曝された場合、上記リポテイコ酸反応性材料は、活性化し、そして上記プロフェノールオキシダーゼが、フェノールオキシダーゼに変換される。次いで活性フェノールオキシダーゼ酵素は、基質に作用するか、または基質を変換して、検出可能な生成物（視覚的に検出可能であるか、または検出器によって検出可能であるかのいずれか）を生成し得る。
【００１７】
本発明は、甲殻類動物の血液細胞に由来する単離された酵素調製物を含む組成物を提供する。上記調製物は、その酵素調製物がリポテイコ酸（例えば、グラム陽性菌中またはグラム陽性菌上に存在するリポテイコ酸）と接触させられる場合に、フェノールオキシダーゼに変換されるプロフェノールオキシダーゼを含む。この型の調製物は、甲殻類動物の血液細胞の外膜にプロフェノールオキシダーゼおよび甲殻類動物のプロフェノールオキシダーゼカスケードの他の成分に対する透過性（例えば、選択的な透過性）を与えることによって生成され得ることが、理解される。このような調製物は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｒｒｏｒａｔｕｓ、Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ、Ｈｅｍｉｇｒａｐｓｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、およびＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓからなる群より選択される甲殻類動物に由来する血液細胞から生成され得る。
【００１８】
本発明はまた、プロフェノールオキシダーゼを含む甲殻類動物の血液細胞溶解物を提供し、そのプロフェノールオキシダーゼは、その血液細胞溶解物が、調製後に連続してリポテイコ酸（例えば、グラム陽性菌中またはグラム陽性菌上に存在するリポテイコ酸）と接触させられる場合に、フェノールオキシダーゼに変換される。上記甲殻類動物の血液細胞は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｒｒｏｒａｔｕｓ、Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎｕｓ、Ｈｅｍｉｇｒａｐｓｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅａｓ、およびＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓからなる群より選択される甲殻類動物に由来し得る。
【００１９】
上記調製物は、フェノールオキシダーゼの基質と合わせられ得る。したがって、上記調製物が、グラム陽性菌由来のリポテイコ酸反応性材料に対する曝露によって活性化される場合、上記基質は、生成物に変換し、その生成物は、視診もしくは検出器（例えば、光学検出器）のいずれかによって検出および／または定量化され得る。
【００２０】
出発材料および調製条件の選択に依存して、ファクターＣ活性および／またはファクターＧ活性を実質的に含まない単離された酵素調製物の生成が、可能である。得られた調製物は、（ｉ）（１→３）−β−Ｄグルカン、リポ多糖類もしくはプロテオグリカンのうちの１つ（ｉｉ）（１→３）−β−Ｄグルカンとリポ多糖類との組み合わせ、（１→３）−β−Ｄグルカンとプロテオグリカンとの組み合わせ、もしくはリポ多糖類とプロテオグリカンとの組み合わせ、または（ｉｉｉ）（１→３）−β−Ｄグルカンと、リポ多糖類とプロテオグリカンとの組み合わせ、の存在下において実質的に不活性のままであり得る。例えば、酵素調製物は、甲殻類動物Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓの血液細胞膜の透過可能化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）によって生成され得る。例えば、上記甲殻類動物Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓの血液細胞が、膜を透過する量のイオノフォア（例えば、カルシウムイオノフォア）に対する曝露によってリポテイコ酸反応性材料に対する透過性にされる場合、リポテイコ酸の反応性材料を含む得られた調製物は、ファクターＣカスケードおよびファクターＧカスケードを実質的に含まない。結果として、この調製物は、グラム陽性菌によって活性化され、したがってグラム陽性菌の存在を検出するが、グラム陰性菌または酵母および真菌によって活性化されない。
【００２１】
対照的に、甲殻類動物Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓの血液細胞が、従来の手順（例えば、浸透圧性ショック、超音波処理、均質化、および超遠心分離）によって溶解されるか、例えば、膜を透過する量のイオノフォアを使用して透過性にされる場合、リポテイコ酸反応性材料を含む得られる調製物はまた、完全なファクターＣカスケードおよび完全なファクターＧカスケードを含む。結果として、得られる溶解物は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、ならびに酵母および真菌によって活性化され、したがって、グラム陽性菌、グラム陰性菌、ならびに酵母および真菌の存在を検出する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、試験サンプル中のグラム陽性菌の存在および／または量を検出する方法を提供する。この方法は、試験されるべきサンプルと、上記の調製物の１種以上とを接触させる工程を包含する。上記溶解物は種々の異なるアッセイ（例えば、エンドポイント色素形成アッセイ、１工程動的アッセイ、および多工程動的アッセイ）において使用され得ることが、企図される。さらに、上記アッセイは種々の異なる様式（例えば、ウェル、マイクロタイタープレート、または光学カートリッジ）において実行され得ることが、企図される。上記アッセイは、目的の液体サンプル中のグラム陽性菌の存在および／または量を検出するために使用され得る。さらに、固体サンプルは、接触または液体サンプルにおける可溶化の後に分析され得る。さらに、固体表面のスワブは、そのスワブが接触されるか、または液体サンプルにおいて可溶化された後に、分析され得る。
【００２３】
本発明のこれらの局面および特徴は、添付の図面、詳細な説明、および特許請求の範囲を参照することによって、より完全に理解され得る。
【００２４】
本発明は、図面を参照することによって、より明確に理解され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一部、陽性菌中またはグラム陽性菌上に存在するリポテイコ酸と反応する血液細胞ベースの調製物を生成することが可能であるという知見に基づく。結果として、本発明の血液細胞調製物は、試験サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出および／または定量化するために使用され得る。
【００２６】
本発明の血液細胞調製物は、リポテイコ酸反応性材料を含む。出発材料の供給源および血液細胞の処理条件に依存して、リポテイコ酸と特異的に反応する調製物を生成することが、可能である。この調製物は、目的のサンプル中のグラム陽性菌の存在および／または量を検出し得る。あるいは、異なる出発材料および異なる血液細胞の処理条件を使用することで、リポテイコ酸、プロテオグリカン、リポ多糖類および（１→３）−β−Ｄグリカンと反応する調製物を生成することが、可能である。したがって、この調製物は、目的のサンプル中のグラム陽性菌、グラム陰性菌、ならびに酵母および糸状菌の存在および／または量を検出し得る。
【００２７】
図２は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓに由来する血液細胞に存在する凝固カスケードを示す。図２にしたがって、リポテイコ酸（ＬＴＡ）は、存在する場合、ＬＴＡ結合タンパク質に結合する。理論に拘束されることは望まないが、ＬＴＡ結合タンパク質は、その後、セリンプロテアーゼカスケードを活性化し、次にそのセリンプロテアーゼカスケードは、プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素前駆体を活性なプロフェノールオキシダーゼ活性化酵素に変換することが、理解される。上記プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素は、活性化された場合、プロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する。次いで、活性化されたフェノールオキシダーゼは、フェノールオキシダーゼの基質（例えば、硫酸イソプレナリン）と反応して、生成物（例えば、有色生成物）を生成する。
【００２８】
図３は、Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓに由来する血液細胞に存在する凝固カスケードを示す。Ｌｉｍｕｌｕｓ血液細胞は、種々の機構によって、フェノールオキシダーゼを生成し得る、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、（１→３）−β−Ｄグルカン、およびリポ多糖類と反応性であり、次いでそのフェノールオキシダーゼは、フェノールオキシダーゼの基質（例えば、硫酸イソプレナリン）と反応して、生成物（例えば、有色生成物）を生成し得ることが、理解される。理論に拘束されることは望まないが、ＬＴＡがＬＴＡ結合タンパク質によって結合されること、プロテオグリカンがプロテオグリカン結合タンパク質によって結合されること、（１→３）−β−Ｄグルカンが（１→３）−β−Ｄグルカン結合タンパク質によって結合されること、およびリポ多糖類がリポ多糖類結合タンパク質によって結合されることが、理解される。上記結合タンパク質は、一旦それらの特定のリガンドに結合されると、１つ以上のセリンプロテアーゼカスケードを活性化する。次いで上記セリンプロテアーゼカスケードは、プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素前駆体をフェノールオキシダーゼ活性化酵素に変換する。次いで上記フェノールオキシダーゼ活性化酵素は、プロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換し、そのフェノールオキシダーゼは、フェノールオキシダーゼの基質である硫酸イソプレナリンと反応して、生成物（例えば、有色生成物）を生成する。
【００２９】
したがって、出発材料および抽出条件に依存して、（ｉ）リポテイコ酸によってのみ活性化される血液細胞調製物か、または（ｉｉ）リポテイコ酸ならびにリポ多糖類および（１→３）−β−Ｄグルカンによって活性化される血液細胞調製物を生成することが、可能である。例えば、血液細胞は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓから回収され得、一旦活性化されたその血液細胞は、透過可能にされるか、または溶解されるかのいずれかで、その中に配置されたリポテイコ酸反応性材料を放出し得る。
【００３０】
用語「リポテイコ酸反応性材料」は、リポテイコ酸に接触された場合に、プロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換し得る、血液細胞に由来する単離された調製物を意味することが理解される。
【００３１】
ここで、本発明の実施において有用な血液細胞の供給源、抽出手順、アッセイ様式およびアッセイ様式は、より詳細に下で考察される。
【００３２】
（血液細胞調製物）
考察された通り、上記血液細胞は、Ｃａｎｃｅｒ属に属するカニ（例えば、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｒｒａｔｕｓ、Ｃａｒｃｉｎｕｓ  ｍａｅｎａｓ、Ｈｅｍｉｇｒａｐｓｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ（イソガニ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｈｏｒｅ  Ｃｒａｂ）））、Ｌｉｍｕｌｕｓ属に属するカニ（例えば、Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）、Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ属に属するカニ（例えば、Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｇｉｇａｓ、例えば、Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）、およびＣａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ属に属するカニ（例えば、Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａ）より選択される種々の異なる甲殻類動物から回収され得る。
【００３３】
一旦回収されると、上記血液細胞は、当該分野において公知である従来の技術（例えば、浸透圧性ショック、均質化、超音波処置および超遠心分離）によって溶解され得る。例えば、粗溶解物は、Ｌｅｖｉｎら、（１９６８）、ＴＨＲＯＭＢ．ＤＩＡＴＨ．ＨＡＥＭＯＲＲＨ．１９：１８６（改変を伴う）、またはＰｒｉｏｒ、（１９９０）、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｔｅｓｔ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ２８−３６および１５９−１６６、ならびに米国特許第４，３２２，２１７号に、本来記載されるような手順を使用して生成され得る。
【００３４】
あるいは、上記血液細胞の外膜は、その中に配置されたリポテイコ酸反応性材料に対する透過性を与えられ得る。これは、当該分野において公知である種々の膜透過因子（例えば、塩溶液、洗浄剤、抗生物質、およびイオノフォア）を使用して達成され得る。
【００３５】
例示の塩溶液としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、および塩の組み合わせ（例えば、海水中に見出される塩）が挙げられる。例示の洗浄剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０および他の非イオン性洗浄剤が挙げられる。例示の抗生物質としては、例えば、グラミシジン、ポリミキシン、およびテトラサイクリンが挙げられる。例示のイオノフォアとしては、例えば、カルシウムイオノフォア（例えば、Ｃ−７５２２としても公知であるカルシウムイオノフォア  Ａ２３１８７（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）、カルシウムイオノフォアＩＩ  ２１１９３（Ｆｌｕｋａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ製）、およびカルシウムイオノフォアＩＶ  ２１１９８（Ｆｌｕｋａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ製））が挙げられる。
【００３６】
上記カルシウムイオノフォアは、好ましくは、約０．１μＭ〜約１００μＭの範囲（好ましくは、約１μＭ〜約１０μＭの範囲）の最終濃度になるように、上記血液細胞調製物と混合される。上記カルシウムイオノフォアの活性を改良するために、そのイオノフォアは、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（好ましくは、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲）で、二価カチオン（例えば、塩化カルシウム）と合わせられ得る。
【００３７】
例えば、上記血液細胞は、回収された場合、例えば、０．４５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍのグルコース、０．１Ｍのカコジル酸（ｐＨ７．０＋／−１．０のｐＨ単位）を含む塩溶液において洗浄される。次いで洗浄された血液細胞は、その血液細胞から上記リポテイコ酸反応性材料を放出させるためにイオノフォアを含む、放出溶液と合わせられる。例示の放出溶液は、例えば、０．４５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍのグルコース、０．１Ｍのカコジル酸、３μＭのカルシウムイオノフォア、５μＭの塩化カルシウム（ｐＨ７．０＋／−１．０のｐＨ単位）を含む。
【００３８】
上記リポテイコ酸反応性材料は、一旦上記血液細胞から放出されると、直ぐに使用されても、後の使用のために保存されてもよい。例えば、上記血液細胞調製物は、標準的な条件下で凍結乾燥され得るか、または使用するまで、−２０℃〜−８０℃の温度にて冷凍され、そして保存され得る。
【００３９】
得られる血液細胞調製物は、リポテイコ酸反応性材料を含み、そのリポテイコ酸反応性材料は、活性化された場合、プロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する。上記調製物はまた、フェノールオキシダーゼの基質（例えば、硫酸イソプレナリン（Ｉ０２６１、ＴＣＩ−ＧＲ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、イソプロテレノールヘミ硫酸塩（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｎｏｌ  ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ  ｓａｌｔ）（Ｉ−５７５２、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、カテコール（Ｃ−９５１０、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、４−メチルカテコール（Ｍ３，４２０−０  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｌ−ドーパ（Ｄ−９６２８、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ドパミン（Ｈ−８５０２、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、および２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｄ−３９９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ））と合わせられ得る。
【００４０】
上記出発材料の供給源（例えば、甲殻類動物Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓから回収された血液細胞）に依存して、ファクターＣ活性および／またはファクターＧ活性を実質的に含まない調製物を生成することが、可能である。換言すれば、これらの調製物は、それぞれ、リポ多糖類および／または（１→３）β−Ｄグルカンによって活性化されない。同様に、プロテオグリカンによって活性化されない血液細胞調製物を生成することが、可能である。
【００４１】
さらに、リポテイコ酸、（１→３）β−Ｄグルカンおよびリポ多糖類に対する望ましい特異性を有する血液細胞調製物を再構成することが、可能である。例えば、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓから回収されたリポテイコ酸に特異的な血液細胞調製物は、当該分野において公知であるファクターＣに特異的な血液細胞調製物または当該分野において公知であるファクターＧに特異的な血液細胞調製物と合わせられ得る。そのようなものとして、リポテイコ酸、および（１→３）β−Ｄグルカンまたはリポ多糖類のいずれかと反応性である血液細胞調製物を産出することが、可能である。あるいは、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓから回収されたリポテイコ酸に特異的な血液細胞調製物と、ファクターＣカスケードおよびファクターＧカスケードの両方を含む粗Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物とを合わせることによって、リポテイコ酸、（１→３）β−Ｄグルカンおよびリポ多糖類と反応性である血液細胞調製物を産出することが、可能である。したがって、得られる血液細胞調製物は、リポテイコ酸、（１→３）−β−Ｄグルカンおよびリポ多糖類と反応性である。
【００４２】
さらに、特定の環境において、リポテイコ酸、（１→３）−β−Ｄグルカン、リポ多糖類およびプロテオグリカンと反応性である粗Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物を産出することが可能であることが、理解される。粗Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物は、リポテイコ酸反応性を減少させるインヒビターを含むと、考えられる。しかし、上記調製物は、その血液細胞調製物に存在する上記インヒビターの濃度を希釈するために、希釈され得る。したがって、適切な希釈を選択することによって、リポテイコ酸（グラム陽性菌中またはグラム陽性菌上に存在する）、リポ多糖類（グラム陰性菌中またはグラム陰性菌上に存在する）、（１→３）−β−Ｄグルカン（真菌および糸状菌の中または上に存在する）、そして必要に応じて、プロテオグリカン（グラム陽性菌中またはグラム陽性菌上に存在する）と反応性である粗Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物を生成することが、可能である。
【００４３】
当業者にとって明らかであるように、血液細胞調製物中のフェノールオキシダーゼの活性化を促進することが公知である任意の緩衝液および塩、ならびに上記カスケードを不活化し得る極端なｐＨを回避するための緩衝液が、好ましくは、上記血液細胞調製物に含まれる。上記血液細胞調製物と適合性であることが当該分野において理解される任意の緩衝液および塩が、使用され得るが、緩衝溶液は、例えば、カコジル酸、クエン酸塩、リン酸塩、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、およびＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシ）アミノメタン）を含む。代表的な処方用添加剤としては、約１００〜３００ｍＭのＮａＣｌ、約１０〜１００ｍＭの二価カチオン（例えば、Ｍｇ２＋またはＣａ２＋）、約６．５〜約８．５の最終ｐＨを与える生体適合性緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシ）アミノメタン））、ならびにその溶解物を凍結乾燥しようとする場合、糖類（例えば、マンニトールまたはデキストラン）および粘度増強剤（例えば、ポリビニルアルコール）（またはポリビニルアルコールおよびポリプロピレングリコールを含む起泡防止剤（ａｎｔｉ−ｆｒｏｔｈｉｎｇ  ａｇｅｎｔ））が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００４４】
（例示のアッセイ）
試験サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出することに特異的なアッセイは、本発明の血液細胞ベースの調製物を用いて用意され得る。種々の型のアッセイが、上記調製物を用いて行われ得るが、下で考察される通り、本発明のアッセイの各々は、一般に、フェノールオキシダーゼの基質の存在下において、その調製物と、試験サンプルとを接触させる工程を包含する。フェノールオキシダーゼ基質としては、例えば、硫酸イソプレナリン（Ｉ０２６１、ＴＣＩ−ＧＲ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、イソプロテレノールヘミ硫酸塩（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｎｏｌ  ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ  ｓａｌｔ）（Ｉ−５７５２、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、カテコール（Ｃ−９５１０、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、４−メチルカテコール（Ｍ３，４２０−０  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｌ−ドーパ（Ｄ−９６２８、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ドパミン（Ｈ−８５０２、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、および２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｄ−３９９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）が挙げられる。
【００４５】
上記アッセイの阻害または増強は、試験サンプル中の物質が血液細胞調製物の反応を妨害する場合に起こる。阻害は、より長い反応時間を生じ、このことは、その試験サンプル中に実際に存在し得るよりも、低いレベルの微生物汚染を示す。増強は、より短い反応時間を生じ、このことは、その試験サンプル中に実際に存在し得るよりも、高いレベルの微生物汚染を示す。阻害も増強もないことを確認するために、試験サンプルのアリコート（またはその試験サンプルの希釈物）が、測定されるべき微生物夾雑物（例えば、リポテイコ酸）を示す既知量の因子で「スパイク」される。上記微生物夾雑物スパイクは、そのサンプルにおいて、対数ベースで、その標準曲線における最高の微生物夾雑物濃度と最低の微生物夾雑物濃度との間の中間点に等しい最終的な微生物夾雑物濃度を生じることが推奨される。例えば、５０ＰＰＯ単位／ｍＬ〜０．００５ＰＰＯ単位／ｍＬにわたる標準曲線を有するアッセイにおいて、サンプルは、０．５ＰＰＯ単位／ｍＬの最終的な微生物夾雑物濃度を含むようにスパイクされるべきである。１ＰＰＯ単位／ｍＬ〜０．０１ＰＰＯ単位／ｍＬにわたる標準曲線を有するアッセイにおいて、その微生物夾雑物スパイクは、０．１ＰＰＯ単位／ｍＬの最終的な微生物夾雑物濃度を生じるべきである。
【００４６】
上記スパイクされたサンプルは、スパイクされていないサンプルと並行してアッセイされる。そのスパイクされていないサンプルにおいて得られた微生物夾雑物濃度、およびスパイクされたサンプルにおいて回収された微生物夾雑物は、次いで、計算される。その回収された微生物夾雑物は、約２５％内のスパイクの既知の濃度に等しいべきである。その試験サンプル（または希釈物）がその反応を阻害するかまたは増強することが見出される場合、そのサンプルは、その阻害または増強が克服されるまで、さらなる希釈物を要し得る。最初に、試験サンプルの１０倍希釈物を試験することによって、阻害または増強についてスクリーニングすることが求められ得る。一旦適切な非阻害性または非増強性希釈物が決定されると、その正確な希釈物が、この希釈物あたりの２倍希釈物を試験することによって見出され得る。阻害または増強の程度は、その試験サンプルの濃度に依存する。その同じサンプルのいくつかの濃度がアッセイされるべき場合、各濃度についての性能特徴を独立して確立することが必要である。
【００４７】
グラム陽性菌は、種々の異なるアッセイにおいて、本発明の調製物を使用して検出され得る。例えば、エンドポイント色素形成アッセイ、１工程動的アッセイ、および／または多工程動的アッセイは、光学キュベット、マイクロタイタープレートなどにおいて行われ得る。種々の異なるアッセイおよびアッセイ様式は、例えば、公開された米国特許出願２００４−０２４１７８８に記載される。例えば、カートリッジベースのアッセイは、より詳細に下に記載される。
【００４８】
（カートリッジ）
本発明の実施に有用な例示のカートリッジは、図４Ａ〜４Ｄにおいて概略的に示される。一般に、上記カートリッジは、血液細胞調製物ベースのアッセイに使用するための固定化された血液細胞調製物を含む光学カートリッジである。これらのカートリッジは、単独で使用されてもよいし、光学検出器（例えば、携帯型光学検出器）と一緒に使用されてもよい。本発明の方法は、上記カートリッジを使用せずに実施され得るが、本発明の方法は、迅速な試験結果を提供するために現場で使用され得るシステムを提供するために、上記カートリッジに合わせられる場合に特に有効である。このことは、微生物汚染のより迅速な排除および／または処置を促進する。
【００４９】
微生物夾雑物の検出および／または定量のための多くのアッセイは、例えば、図４に例示されるように、本発明のカートリッジにおいて行われ得る。上記カートリッジは、それ自体、および目視によって検出される試験結果に対して使用され得るか、またはそのカートリッジは、光学検出器（例えば、米国特許Ｄｅｓ第３９０，６６１号に示され、記載されるような携帯型光学検出器）と組み合わせて使用され得る。
【００５０】
例示によって、および図４Ａ〜４Ｄに示されるように、カートリッジ１は、例えば、成形可能な生体適合性材料から製造された実質的に平坦なハウジングを有する。そのハウジングは、任意の材料から製造され得るが、透明および／または半透明なガラスまたはポリマーが好ましい。好ましいポリマーとしては、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル（ａｃｒｙｌｉｃ）、ポリエステル、光学等級のポリマー、またはその光学セルが、実質的に半透明であるような任意のプラスチックが挙げられる。そのハウジングは、少なくとも１つの流体入り口ポート４、少なくとも１つの光学セル６、およびこの流体入り口ポート４と光学セル６との間に流体流動連絡を提供するための流体接触表面を有する少なくとも１つのコンジット８を備える。光学セル６についての唯一の要件は、その光学セル６が試験されるべきサンプルを含み得る間隙を規定し、その光学セル６の一部が光に対して透過性であることである。カートリッジ１はまた、そのカートリッジ１をポンプに取り付けるために、流体入り口ポート４および光学セル６とが流体流動連絡状態にある少なくとも１つのポンプポート１２を有する。次いで、そのポンプは、ポンプポート１２を介して陰圧を付与して、そのサンプルを流体入り口ポート４から光学セル６へと引っ張り得る。血球溶解物は、コンジット８の流体接触表面の第１の領域１４上に配置され、その結果、サンプルが流体入り口ポート４に付与される場合、そのサンプルは、領域１４を横断し、そのサンプルが光学セル６に向かって動く場合に、その血球溶解物をサンプルに可溶化または再構成する。この型のカートリッジ１は、例えば、検出可能な変化がサンプルにおいて生じているか否かを決定するために使用され得る。一実施形態において、フェノールオキシダーゼ基質は、第１の領域１４において、そのコンジット８の表面に、その血液細胞調製物と一緒に付与され得る。この型のカートリッジ１は、例えば、動的色素形成アッセイを行うために使用され得る。
【００５１】
別の実施形態において、図４Ａ〜４Ｄに例示されるように、そのコンジット８の流体接触表面の第２の領域１６は、第１の領域１４から間隔を空けて、かつこの領域の下流に配置される。この構成において、血液細胞調製物は、第１の領域１４に配置され、フェノールオキシダーゼ基質は第２の領域１６に配置され、その結果、そのサンプルが領域１４において血液細胞調製物と接触した後、そのサンプル−血液細胞調製物混合物は、コンジット８を横断し、そのフェノールオキシダーゼ基質と領域１６において接触する。そのサンプル−血液細胞調製物−基質混合物は、次いで、コンジット８を光学セル６へと横断する。この型のカートリッジは、以下でより詳細に議論されるように、例えば、エンドポイント色素形成アッセイまたは多工程動的色素形成アッセイを行うために使用され得る。
【００５２】
行われるアッセイの型に依存して、微生物夾雑物を示す、所定の量の因子（すなわち「スパイク」）（例えば、リポテイコ酸）が、１つ以上のコンジット８の流体接触表面の第１の領域１４上に配置される。あるいは、そのスパイクは、そのコンジット８の異なる領域上に配置され得る。
【００５３】
それらのカートリッジは、必要とされる型および／または試験の回数に従って、設計および使用され得る。例えば、単一のサンプルが、例えば、研究実験用途または医療デバイスおよび生物薬剤試験のために、例えば、二連または三連で試験され得る。あるいは、２つ以上の異なるサンプルが、例えば、水および透析液の透析施設試験のために、個々に試験され得る。そのカートリッジは、好ましくは、一度使用したら捨てる、使い捨てのカートリッジであり、これは、１回使用した後に廃棄される。本発明のカートリッジは、マルチウェルプレートにおいて行われる従来のエンドポイント色素形成アッセイまたは動的色素形成アッセイにおいて使用されているものよりも、１サンプルあたり、約２０〜１００分の１より少ない血液細胞調製物を使用し、従って、より低費用でかつより環境に優しい試験を提供する。一旦特定のアッセイ形式が選択されると、そのカートリッジは、以下で議論されるように、製造され得る。そのカートリッジを調製するために使用される全ての試薬および材料は、好ましくは、微生物夾雑物がなく、そのために、そのカートリッジは、最終的に、試験するために使用される。そのカートリッジが選択された任意の血液細胞調製物によって製造され得ることが、企図される。
【００５４】
（カートリッジ製造）
例示のカートリッジを製造するにあたって、その血液細胞調製物を固体支持体の上で乾燥させる前に、その血液細胞調製物およびフェノールオキシダーゼ基質を、少なくとも１種の再可溶化剤（例えば、糖または塩）および少なくとも１種の剥離防止剤（例えば、ポリマー）と組み合わせることは、助けになる。
【００５５】
その再可溶化剤は、好ましくは、その乾燥形態の血液細胞調製物を安定化し、そのアッセイの間の試薬の再可溶化を促進する。有用な再可溶化剤としては、例えば、マンニトール、マンノース、ソルビトール、トレハロース、マルトース、デキストロース、スクロース、ならびに他の単糖類および二糖類が挙げられる。その血液細胞調製物およびフェノールオキシダーゼ基質は、好ましくは、乾燥させる前に、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約１．０％（ｗ／ｖ）の再可溶化剤を含む。
【００５６】
その剥離防止剤は、血液細胞調製物および／またはフェノールオキシダーゼ基質が、乾燥薄片の形態で固体支持体から解離してしまう可能性を防止または減少する薬剤である。その剥離防止剤はまた、好ましくは、乾燥形態の血液細胞調製物またはフェノールオキシダーゼ基質を安定化させる。有用な剥離防止剤は、例えば、１種以上のポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン、マンニトールが挙げられる）、およびタンパク質（例えば、血清アルブミン、血液リンパまたはホモシアニン）が挙げられる。その溶解物は、好ましくは、乾燥させる前に、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約１．０％（ｗ／ｖ）の剥離防止剤を含む。
【００５７】
さらに、特定のポリマーは、その血液細胞調製物および／またはフェノールオキシダーゼ基質が再可溶化されるときに、気泡の形成（例えば、起泡）を減少させることが分かった。有用な起泡防止剤としては、ポリビニルアルコールおよびポリプロピレングリコールが挙げられる。起泡を減少させるために、その血液細胞調製物および／またはフェノールオキシダーゼ基質は、乾燥させる前に、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約１．０％（ｗ／ｖ）の起泡防止剤を含み得る。
【００５８】
そのカートリッジのための例示的製造プロセスは、図５を参照して記載される。ここで図５Ａは、カートリッジ１の底部半体２を示し、図５Ｂは、カートリッジ１の上部半体３を示す。一旦調製されると、そのカートリッジ１の２つの半体が、互いに接着剤、溶媒結合、超音波溶接、スナップフィット結合などにより結合される。
【００５９】
図５Ａにおいて、そのカートリッジ１の底部半体２は、各コンジット８’の一方の半体（各々が、第１の領域１４’および第２の領域１６’を有する）を規定する。そのカートリッジ１の底部半体２の製造の間に、血液細胞調製物は、各第１の領域１４’に付与され、色素形成性基質は、各第２の領域１６’に付与される。図５Ｂにおいて、そのカートリッジ１の上部半体３は、各コンジット８’’の一方の半体を規定する。そのカートリッジ１の上部半体３の製造の間に、微生物夾雑物を示す因子（すなわち、スパイク）（例えば、所定の量のリポテイコ酸）は、アッセイに依存して、領域１４’’に付与される。一旦それらの試薬がそのカートリッジ１のそれぞれの上部半体３および底部半体２に付与されると、そのカートリッジの半体２および３は、その血液細胞調製物の活性を保護し、その血液細胞調製物を再構成して、活性な血液細胞調製物を生成させる条件下で乾燥される。乾燥させる間にそれらの試薬の活性を保護するために、そのカートリッジの半体２および３は、約４℃〜約４０℃、より好ましくは、約１０℃〜約３５℃、より好ましくは、約１５℃〜約３０℃の温度、および約０％〜約３０％、より好ましくは、約２％〜約２０％、より好ましくは、約４％〜約１０％の相対湿度を有する環境に置かれる。好ましい乾燥条件は、約２５℃の温度および約５％の相対湿度を含む。乾燥条件は、例えば、約２５℃の温度および約５％の相対湿度を含み得る。代替的アプローチにおいて、その血液細胞調製物は、標準的条件（減圧下で約−３０℃〜約−４０℃）の下で凍結乾燥によって乾燥され得る。
【００６０】
乾燥させた後に、その２つのカートリッジ半体２および３は、互いに結合されて、完全なカートリッジ１が作られる。図５Ｃは、断面Ａ〜Ａ’を通る断面図であり、ここでそのコンジットの２つの半体（すなわち、８’および８’’）は、一緒になって、完全なコンジット８を作りだし、ここで各コンジットの底部８’の領域１４’は、固定化された血液細胞調製物２０を含み、１つのコンジットの上部８’’の領域１４’’は、固定化されたリポテイコ酸２２を含む。図５Ｄは、断面Ｂ〜Ｂ’を通る断面図であり、ここで各コンジットの底部８’の領域１６’は、固定化されたフェノールオキシダーゼ基質２４を含む。
【００６１】
特定のカートリッジ１の寸法は、行われるべきアッセイの回数および／または型に依存して変動し得る。しかし、一実施形態において、図４Ａに概略的に示されるように、例えば、そのカートリッジ１は、約１０．１６ｃｍ（４．００インチ）の長さ、約２．５４ｃｍ（１．００インチ）の幅、および約０．４７６ｃｍ（０．１８８インチ）の高さを有する。その流体入り口ポート４からその光学セル６へと走るコンジット８の穴は、約０．１２７ｃｍ（０．０５０インチ）である。ここでその血液細胞調製物は、その流体入り口ポート４から約２．３８１ｃｍ（０．９３８インチ）のところで、そのコンジット８の領域１４上で乾燥される。そしてフェノールオキシダーゼ基質は、その流体入り口ポート４から約４．６５ｃｍ（１．８３１インチ）のところで、そのコンジット８の領域１６上で乾燥される。この実施形態におけるその光学セル６は、約２５μＬのサンプルを収容する寸法にされる。
【００６２】
（標本収集および調製）
そのカートリッジは、流体（例えば、哺乳動物に、局所的または全身に（例えば、非経口的に）投与されるべき流体）、または感染について試験される体液（例えば、血液、リンパ液、尿、血清、血漿、腹水、肺吸引液などが挙げられる）における微生物汚染のレベルを決定するために使用され得る。さらに、そのカートリッジは、上水道（例えば、飲料水の供給）における微生物汚染のレベルを決定するために使用され得る。さらに、そのカートリッジは、食品、医薬品または医療デバイスにおける微生物汚染のレベルを決定するために使用され得る。さらに、そのカートリッジは、表面上の微生物汚染のレベルを決定するために使用され得る。例えば、目的の表面は、拭かれ、次いでそのスワブは、液体に導入されるか、または溶解される。次いでその液体は、通常通りにアッセイされ得る。
【００６３】
一般に、試験されるべきサンプルを、採取、保存、またはさもなければ接触するために使用される材料、ならびに試験試薬は、微生物汚染がないべきであり、例えば、発熱物質がないべきである。材料は、例えば、２５０℃で３０分間加熱することによって、発熱物質がないようにされ得る。その後の環境的な汚染から発熱物質除去した材料を保護するためには、適切な予防措置がとられなければならない。
【００６４】
（カートリッジにおいて行われ得る代表的なアッセイ）
種々の血液細胞調製物ベースのアッセイが、本発明のカートリッジにおいて使用され得ることが予測される（例えば、エンドポイント色素形成アッセイ、１工程動的アッセイ、および多工程動的アッセイ）。
【００６５】
（１．エンドポイント色素形成アッセイ）
エンドポイント色素形成アッセイは、Ｐｒｉｏｒ（１９９０）前出，ｐｐ．２８−３４ならびに米国特許第４，３０１，２４５号および同第４，７１７，６５８号に記載される。簡潔には、そのエンドポイント色素形成アッセイは、以下の工程を包含する：（ｉ）血液細胞調製物を分析されるべきサンプルで可溶化する工程、（ｉｉ）その得られた混合物を、約０〜約４０℃、好ましくは約２５〜約４０℃の温度で、所定の時間範囲にわたってインキュベートする工程、（ｉｉｉ）基質（例えば、フェノールオキシダーゼ基質）を含む試験デバイスと、そのインキュベートされたサンプル−血液細胞調製物混合物とを接触させる工程、（ｉｖ）反応インヒビターを添加する工程、および（ｖ）酵素活性によってその基質から生成された物質を、例えば、比色変化によって測定する工程。
【００６６】
図４Ａを参照すると、カートリッジ１においてエンドポイント色素形成アッセイを行うために、サンプルは、例えば、その血液細胞調製物を含むコンジット８の第１の領域１４へと動かされ、例えば、前後方向にポンプ作用をサイクルさせることによって、この領域においてその血球溶解物が可溶化される。所定のインキュベーション期間の後、次いでそのサンプル−血液細胞調製物混合物は、例えば、ポンプによってフェノールオキシダーゼ基質を含むコンジット８の第２の領域１６に動かされ、例えば、前後方向にポンプ作用をサイクルさせることによって、この領域においてその基質が可溶化される。次いでそのサンプル−血液細胞調製物−基質混合物は、反応インヒビターを含む第３の領域に動かされる。そのサンプル−血液細胞調製物−基質混合物は、次いで、光学検出器を用いてそのサンプルの光学特性（例えば、吸光度または透過率特性）を測定するために、光学セル６に動かされる。次いで、特定の所定の時点でのそのサンプル−血液細胞調製物−基質混合物の光学濃度は、例えば、Ｙ軸上に透過率を、対してＸ軸上にリポテイコ酸濃度を示すことによって、所定の標準曲線に内挿されて、そのサンプル中の微生物夾雑物の濃度になる得る。
【００６７】
（２．１工程動的アッセイ）
１工程動的アッセイ（例えば、１工程色素形成アッセイ）は、米国特許第５，３１０，６５７号に記載される。簡潔には、その動的色素形成アッセイは、以下の工程を包含する：（ｉ）血液細胞調製物を、分析されるべきサンプルおよび基質（例えば、フェノールオキシダーゼ基質）で同時に可溶化する工程、（ｉｉ）その得られた混合物を、約０〜約４０℃、好ましくは約２５〜約４０℃の温度で、所定の時間範囲にわたってインキュベートする工程、および（ｉｉｉ）従来の分光光度計を使用して、所定の値または比色読み取り値の変化の比率のいずれかに達するために、比色変化に要した時間を測定する工程。
【００６８】
図４Ａを参照すると、カートリッジ１において動的色素形成アッセイを行うために、サンプルは、例えば、その血液細胞調製物および基質を含むコンジット８の第１の領域１４にポンプ作用によって動かされ、前後方向にポンプ作用をサイクルさせることによって、この領域においてそれらが可溶化される。そのサンプル−血液細胞調製物−基質混合物は、次いで、光学検出器を用いて、そのサンプルの光学特性（例えば、吸光度または透過率特性）を測定するための光学セル６に動かされる。その検出器は、各光学特性が、例えば、光透過率において５％の低下を示すのにどのくらいの時間がかかるかを決定し得る。多重アッセイ（例えば、２つのアッセイ）からの結果は、平均され得る。次いで、その得られた値は、例えば、Ｙ軸上に吸光度または透過率における所定の変化の時間を（場合に応じて）、対してＸ軸上にリポテイコ酸濃度を示す、所定の標準曲線に内挿されて、そのサンプル中の夾雑物の濃度になる得る。
【００６９】
（３．多工程動的アッセイ）
より詳細に議論されるように、そのカートリッジはまた、多工程動的アッセイを行うために使用され得る。その多工程動的アッセイに関連する種々の工程は、図６に概略的に示される。そのアッセイは、その試験されるべきサンプルとある容量の血液細胞調製物とを合わせて、サンプル−血液細胞調製物混合物を生成することによって、開始される。次いで、その混合物は、所定の期間にわたってインキュベートされる。そのサンプル−溶解物混合物は、次いで、基質（例えば、フェノールオキシダーゼ基質）と接触させて、サンプル−血液細胞調製物−基質混合物を生成する。その後、光学特性の所定の変化（例えば、吸光度値における特定の変化または透過率値における特定の変化）が生じる時間が測定される。微生物夾雑物の存在および／または量は、次いで、予め較正された標準曲線（例えば、光学特性（吸光度または透過率）における所定の変化を起こす時間をＹ軸上に、対してリポテイコ酸濃度をＸ軸上に示す標準曲線）に対して、その測定された時間を内挿することによって、決定され得る。
【００７０】
その標準曲線は、例えば、漸増量の因子（例えば、リポテイコ酸）をブランクサンプル（例えば、発熱物質を含まない水）中に添加することによって、作成され得る。光学特性における所定の変化（例えば、吸光度における所定の上昇または透過率における所定の低下）が生じる時間が、そのリポテイコ酸の各濃度に対して決定される。光学特性の標準的変化を達成するその種々の時間測定値は、次いで、そのリポテイコ酸濃度の関数としてプロットされる。一般に、そのリポテイコ酸の濃度は、光学特性における標準的な変化を達成するために必要な時間に反比例する。次いで、その標準曲線は、目的のサンプル中のリポテイコ酸の存在および／または量を評価するために使用され得る。
【００７１】
当業者に明らかであるように、血液細胞調製物およびフェノールオキシダーゼ基質の相対量は、これら２つの成分の有効量が、確実にそのサンプル−血液細胞調製物−基質混合物中に、そのアッセイの最後に存在するように調節され得る。そのアッセイ中の血液細胞調製物タンパク質の最終的な量は、約１μｇ〜約５００μｇ、好ましくは、約２０μｇである。そのアッセイ中の基質（例えば、そのフェノールオキシダーゼ基質）の最終的な量は、約１μｇ〜約５０μｇ、好ましくは、約６．５μｇである。その基質（例えば、フェノールオキシダーゼ基質）の濃度および組成の決定は、当業者の技術水準の範囲内にあると考えられる。
【００７２】
得られたサンプル−血液細胞調製物−基質混合物の最終的な量は、そのサンプルの光学特性における変化を測定するために使用される光学検出器の要件に基づき得る。そのサンプルと、溶解物と、基質との間の容量比は、当業者によって、容易に確立され得る。そのサンプル−溶解物−基質混合物中のサンプル、血液細胞調製物、および基質の相対容量に依存して、そのアッセイの他の成分の濃度は、本明細書に記載される機能する範囲の最終的な濃度に維持されるように調節され得る。
【００７３】
図４Ａを参照すると、例示のカートリッジ１においてその多工程動的アッセイを行うために、サンプルは、まず、例えば、ポンプ作用によって、血液細胞調製物を含む第１の領域１４に動かされ、その領域において、その血球溶解物は混合され、所定の時間にわたってインキュベートされる。そのサンプル−血液細胞調製物混合物は、次いで、例えば、ポンプ作用によって、基質（例えば、フェノールオキシダーゼ基質）を含む第２の領域１６に動かされ、その領域においてその基質が可溶化される。そのサンプル−フェノールオキシダーゼ−基質混合物は、次いで、光学特性の測定のために、光学セル６に動かされる。混合工程およびインキュベート工程に要する時間間隔は、最適な感度および微生物夾雑物濃度の範囲について予めプログラムされている。
【００７４】
スパイクされたサンプルは、そのスパイクされていないサンプルと並行してアッセイされ得ることが、理解される。そのスパイクされていないサンプルにおける微生物夾雑物濃度およびそのスパイクされたサンプルにおいて回収された微生物夾雑物は、上記のように、妨害（例えば、その反応のインヒビターまたはエンハンサー）の存在を決定するために、比較され得る。
【００７５】
その多工程アッセイは、上記で議論された型のカートリッジにおいて行われ得るが、種々の他の形式（例えば、マイクロタイタープレートのウェル内）で使用され得る。種々の試験流体の複数サンプル、ならびにスパイクされたサンプルおよび標準曲線を作成する一連のコントロールサンプルは、そのマイクロタイタープレートのウェル中に入れられ得る。固定量の血液細胞調製物、次いでフェノールオキシダーゼ基質は、好ましくは、自動化システム（例えば、ロボット）を使用して、そのウェルの各々に添加され、そのプレートは、反復様式で各ウェルの吸光度を連続して読み取るようにプログラムされているマイクロプレートリーダーによって処理される。
【実施例】
【００７６】
本発明の実施は、以下の非限定的な実施例からより完全に理解され、その実施例は、例示目的のためにのみ本明細書中に与えられ、そしてその実施例は、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００７７】
（実施例１：Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ由来のリポテイコ酸反応性材料の調製）
リポテイコ酸反応性材料の調製を、以下の方法によってＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞から作製した。
【００７８】
上記カニの外観を、観察し、そして記録した。遠心チューブ（５０  ｍＬ）を、標識し、そして氷上においた。滅菌した１８ゲージの針を、無菌様式で注射器に取り付け、そしてその注射器を、５ｍＬの出血溶液（Ｂｌｅｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（０．４５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍのグルコース、３０μＭのクエン酸ナトリウム、２６μＭのクエン酸、および２．５μＭのＥＤＴＡナトリウム、ｐＨ４．６）で満たした。上記カニの最も後ろの脚の１つの硬化していない内部の膜を、７０％エタノールで洗浄し、そしてその膜を、滅菌した化学雑巾で乾かした。上記針を、その洗浄した後ろ足の１つの硬化していない内部の膜に慎重に挿入した。そのカニを、その針の上に持ち上げ、そしてその注射器を穏やかに引いて、血流を引き出した。その注射器に血液が流れ込まなかった場合、その針の位置を、調節した（例えば、その膜の中により深く動かした）。少なくとも２０〜６０ｍＬの血液を、それぞれのカニから得た。その注射器が満たされたか、または血液がもはや流れ込まなくなった場合、その針を、その注射器から取り除き、そしてその血液を、穏やかに遠心チューブに移した。
【００７９】
さらなる出血溶液を、２：１の血液：出血溶液の比を構成するように添加し、穏やかに混合し、そして氷上に保持した。例えば、２０ｍＬの血液を、収集した場合、合計で１０ｍＬの出血溶液を、添加した（既に上記注射に添加した５ｍＬの出血溶液に加えてさらに５ｍＬの出血溶液）。
【００８０】
上記の方法を、新しい針を用い、全てのカニについて同じ注射器のままであるが、それぞれの新しいカニに関して５ｍＬの出血溶液でその注射器を満たして、それぞれのカニに対して行った。全ての上記チューブを、ＲＣ−３Ｂ冷却遠心器（Ｓｏｒｖａｌｌ、Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの事業部、Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ、ＮＣ）において、３，０００ｒｐｍで１０℃にて５分間遠心分離した。リンパ上清を、廃棄したか、またはさらなる抽出のために清潔な容器中に保存した。出血容量の５０％の洗浄溶液（Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（０．４５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍのグルコース、０．１Ｍのカコジル酸、ｐＨ７．０）を、その細胞ペレットに添加し（例えば、１０ｍＬの洗浄溶液を、２０ｍＬの血液から得られたペレットに添加した）、そしてそのペレットを、ピペットを使用して穏やかに再懸濁した。そのチューブを、ＲＣ−３Ｂ冷却遠心器（Ｓｏｒｖａｌｌ、Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの事業部、Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ、ＮＣ）において、３，０００ｒｐｍで１０℃にて５分間遠心分離した。その洗浄溶液を、廃棄し、そして出血容量の１０％の放出溶液（Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（０．４５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍのグルコース、０．１Ｍのカコジル酸、３μＭのカルシウムイオノフォア  Ｃ７５２２（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、５μＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．０）を、そのペレットに添加した（例えば、２ｍＬの放出溶液を、２０ｍＬの血液から調製したペレットに添加した）。そのペレットを、ピペットを使用して穏やかに再懸濁した。得られた溶液を、約１〜２秒間、慎重にボルテックスし、そして室温にて１時間インキュベートした。次いでそのチューブを、ＲＣ−３Ｂ冷却遠心器において、３，０００ｒｐｍで１０℃にて５分間遠心分離し、そしてその上清を、試験のために新しいチューブに移した。
【００８１】
一旦上記溶解物のプロフェノールオキシダーゼ活性を決定すると、得られた調製物を、アッセイ、凍結乾燥され、固体支持体（例えば、カートリッジ）上で乾燥されたアッセイにおいて新鮮に使用したか、または使用するまでチューブに等分した（例えば、１〜２ｍＬのチューブ、および−２０℃〜−８０℃のいずれかでの凍結）かのいずれかであった。
【００８２】
（実施例２：リポテイコ酸アッセイについてのプロトコル）
このアッセイにおいて、１工程動的アッセイを、マイクロタイタープレートにおいて行った。このアッセイにおいて、リポテイコ酸（ＬＴＡ）（Ｌ２５１５、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、標準曲線を与えるように希釈した。その標準曲線は、０．２ＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）における、６０μｇ／ｍＬから始まり０．７４μｇ／ｍＬまでの３倍連続希釈物を含んだ。Ｔｒｉｓ緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）を、ネガティブコントロールとして使用した。比較可能な標準曲線もまた、ペプチドグリカン（７７１４０、Ｆｌｕｋａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、グルカン（グルカン標準、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ、Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ、ＳＣ）およびリポ多糖類（Ｌ−２６３７、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して作成した。
【００８３】
この実施例において使用されるＣ．ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物を、本質的に、実施例１に記載した通りに調製した。しかし、プロフェニル活性について試験する前の上清を、以下の通りにさらに精製した。簡単にいうと、上記上清を、回収し、そして等量の硫酸アンモニウム飽和溶液を、その上清に添加して、穏やかに混合した。その後、その混合物を、氷上で１時間インキュベートし、次いでＲＣ−３Ｂ冷却遠心器において１０°Ｃにて５分間遠心分離した。得られたペレットを、回収し、そして最初に飽和した硫酸アンモニウムと合わせた上清の容量と等しい量の蒸留水に再懸濁した。次いで、得られた調製物を、プロフェニルオキシダーゼ活性について試験し得る。
【００８４】
リポテイコ酸標準、ペプチドグリカン標準、グルカン標準およびリポ多糖類標準およびコントロールを、適切なウェル（ウェル１つあたり１２０μＬ）に添加した。次いで、１５μＬのＣ．ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞調製物を、各ウェルに添加した。次いで１０μＬの硫酸イソプレナリン基質（（Ｉ０２６１、ＴＣＩ−ＧＲ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）清潔な水中の１６ｍＭ）を、各ウェルに添加し、そして３〜５秒間振盪することによって穏やかに混合した。各ウェルの吸光度を、４９０ｎｍで３７°℃にて４０〜６０分間、定期的（すなわち、動的）に読み取った（最小ＯＤ：０、最大ＯＤ：０．４、開始ＯＤ：０．０５）。その結果を、光学濃度単位で記録し、そして図７に示した。
【００８５】
図７は、上記Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物が、６０μｇ／ｍＬ〜２．２μｇ／ｍＬ未満の範囲の濃度のリポテイコ酸によって活性化されたことを示す。対照的に、ペプチドグリカン、グルカン、およびリポ多糖類は、試験した濃度においてそのＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物を活性化しなかった。これらの結果は、そのＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物が、適切な条件下において、リポテイコ酸を特異的に検出し得ることを示す。
【００８６】
（実施例３：グラム陽性菌の検出のためのＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞調製物の使用）
この実施例において、実施例１に従って生成したＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物を、試験サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出するために使用した。具体的には、この実施例において、その調製物の反応性を、種々のグラム陽性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍおよびＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓを含む）、グラム陰性菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｕｂａｒｃｔｉｃａを含む）、放線菌属（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ａｎｔａｒｔｉｃａを含む）、および真菌（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）に対して試験した。
【００８７】
この実施例において、上記反応性を、マイクロタイタープレートにおいて行った１工程動的アッセイを使用して評価した。このアッセイにおいて、リポテイコ酸（ＬＴＡ）（Ｌ２５１５、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、標準曲線を与えるように希釈した。その標準曲線は、Ｖａｓｓｅ培地（５．５ｍＭのＤ−（＋）−グルコース、４０ｍＭのリン酸カリウム（二塩基性）、１５ｍＭのリン酸カリウム（一塩基性）、０．４ｍＭの硫酸マグネシウム、７．５ｍＭの硫酸アンモニウム、２ｍＭのクエン酸、トリプトン（１０ｇ／Ｌ）、ｐＨ７．０）における、１００μｇ／ｍＬから始まり０．０３２μｇ／ｍＬまでの５倍連続希釈物を含んだ。Ｖａｓｓｅ培地（ｐＨ７．０）を、ネガティブコントロールとして使用した。比較可能な１０倍の曲線をまた、リポ多糖類（Ｌ−２６３７、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｖａｓｓｅ培地、トリプティックソイブロス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｖａｓｓｅ培地、トリプティックソイブロス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（Ｖａｓｓｅ培地、トリプティックソイブロス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ（トリプティックソイブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ））、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ（トリプティックソイブロス）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（トリプティックソイブロス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ（トリプティックソイブロス）、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｕｂａｒｃｔｉｃａ（トリプティックソイブロス）、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ａｎｔａｒｔｉｃａ（トリプティックソイブロス）、およびＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ（トリプティックソイブロス）を使用して作成した。
【００８８】
リポテイコ酸標準、リポ多糖類および細菌サンプルならびにコントロールを、適切なウェル（ウェル１つあたり１２０μＬ）に添加した。マイクロプレートのウェルは、１０μＬの乾燥したＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞調製物を含んだ。次いで、１０μＬの硫酸イソプレナリン基質（（Ｉ０２６１、ＴＣＩ−ＧＲ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）清潔な水中の１６ｍＭ）を、各ウェルに添加した。各ウェルの吸光度を、４９０ｎｍで３７°℃にて９０分間、定期的（すなわち、動的）に読み取った（最小ＯＤ：０、最大ＯＤ：１．０、開始ＯＤ：０．１）。
【００８９】
その結果を、細胞密度の関数としての光学濃度として記録する。グラム陽性生物体Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓの異なる数の細胞に対する上記調製物の反応性（細胞数あたりの光学濃度単位として表される）を、表１に記載し、そして図８にグラフで示した。その結果は、そのＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物が１ｍＬあたり２×１０３個未満の細胞のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓを検出し得ることを示す。
【００９０】
【表１】
2008522640.tif 000002
グラム陽性生物体であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの異なる数の細胞に対する上記調製物の反応性（細胞数あたりの光学濃度単位として表される）を、表２に記載し、そして図９にグラフで示した。その結果は、そのＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物が１ｍＬあたり３×１０５個と６×１０４個との間の細胞のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを検出し得ることを示す。
【００９１】
【表２】
2008522640.tif 000003
多くのグラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌、および放線菌類に対する上記Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物の反応性を、表３に要約する。
【００９２】
その結果は、上記Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物がグラム陽性生物体の全てを検出したことを示す。対照的に、そのＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物は、グラム陰性菌または真菌Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓをいずれも検出しなかった。そのＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物は、放線菌類であるＮｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ａｎｔａｒｔｉｃａの存在を検出したが、この生物体の株は、グラム陽性菌と類似する。
【００９３】
【表３】
2008522640.tif 000004
（実施例４：Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ由来のリポテイコ酸の代表的な材料の調製）
この実施例は、Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ血液細胞が、グラム陽性菌の存在を検出し得るリポテイコ酸反応性材料を含むことを示す。血液を、Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓから収集し、そして上記リポテイコ酸反応性材料を、実施例１に記載した通りに生成した。
【００９４】
次いで得られた調製物を、リポテイコ酸、リポ多糖類およびグルカンに対する反応性について試験した。このアッセイは、マイクロタイタープレートにおいて行った２工程動的アッセイであった。このアッセイにおいて、リポテイコ酸（ＬＴＡ）（Ｌ２５１５、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、標準曲線を与えるように希釈した。その標準曲線は、０．２ＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）における、１００μｇ／ｍＬから始まり０．０１μｇ／ｍＬまでの１０倍連続希釈物を含んだ。Ｔｒｉｓ緩衝液（０．２  Ｍ、ｐＨ  ７．４）を、ネガティブコントロールとして使用した。比較可能な標準曲線をまた、グルカン（グルカン標準、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ、Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ、ＳＣ）およびリポ多糖類（Ｌ−２６３７、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して作成した。
【００９５】
次いでリポテイコ酸標準、ペプチドグリカン標準、グルカン標準およびリポ多糖類標準およびコントロールを、適切なウェル（ウェル１つあたり１００μＬ）に添加した。次いで、１０μＬのＬｉｍｕｌｕｓ血液細胞調製物を、各ウェルに添加し、そして３〜５秒間振盪することによって穏やかに混合した。次いでそのマイクロプレートを、３７°Ｃにて２０分間インキュベートした。次いで、１０μＬの硫酸イソプレナリン基質（（Ｉ０２６１、ＴＣＩ−ＧＲ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）清潔な水中の４ｍＭ）を、各ウェルに添加し、そして３〜５秒間振盪することによって穏やかに混合した。次いで、各ウェルの吸光度を、４９０ｎｍで３７°℃にて９０分間、定期的（すなわち、動的）に読み取った（最小ＯＤ：０、最大ＯＤ：０．４、開始ＯＤ：０．０５）。光学濃度の変化（＋）または光学濃度の変化無し（−）として表される結果を、表４に要約する。これらの結果は、そのＬｉｍｕｌｕｓ調製物がリポテイコ酸を検出し得ることを示す。その結果はまた、そのＬｉｍｕｌｕｓ調製物がまたリポ多糖類およびグルカンを検出し得ることを示す。
【００９６】
【表４】
2008522640.tif 000005
（実施例５：２工程動的アッセイにおけるＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物を用いて使用するためのカートリッジの調製）
この実施例において、実施例１に由来するＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物を、カートリッジに組み込み、そして２工程動的アッセイにおいて使用した。異なる濃度のリポテイコ酸（ＬＴＡ）（Ｌ２５１５、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（０μｇ／ｍＬ、５．６μｇ／ｍＬ、１６．７μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬ）に対するＣ．ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物の反応性を、Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ（Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ、ＳＣ）を使用するカートリッジにおいて試験した。
【００９７】
Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞調製物を、カートリッジの製造の節で上に記載したカートリッジにおいて乾燥した。マンニトール（１％）およびポリビニルアルコール（０．１％）を、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞調製物の希釈形態（発熱物質を含まない水において１：２に希釈した）に添加し、次いで５μＬのこの溶液を、乾燥するためにそのカートリッジの適切な位置においた。
【００９８】
図４に示す型のカートリッジを、以下の通りに用意した。図５Ａを参照して、上記Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物および硫酸イソプレナリン基質を、それぞれ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｍｉｃｒｏｌａｂ  ５４０Ｂ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）を使用してカートリッジ１の底部半体２のコンジット８’の領域１４’および１６’に付与した。簡単にいうと、５μＬの希釈Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物（マンニトール（１％）およびポリビニルアルコール（０．１％）を含む発熱物質を含まない水において１：２）を、領域１４’に付与した。５μＬの硫酸イソプレナリン基質（（Ｉ０２６１、ＴＣＩ−ＧＲ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）清潔な水、１％のマンニトールおよび０．１％のポリビニルアルコールにおいて６ｍＭ）を、領域１６’に付与した。カートリッジ１の底部半体２を、Ｐｕｒｅｇａｓ  ＨＦ２００  Ｈｅａｔｌｅｓｓ  Ｄｒｙｅｒ（ＭＴＩ  Ｐｕｒｅｇａｓ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ）中のＬｕｎａｉｒｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｅａｄｙ  Ｓｔａｔｅ  ＆  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔ  Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｌｕｎａｉｒｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ、Ｗｉｌｌｉａｍｓｐｏｒｔ、ＰＡ）における、制御した２５℃＋／−２℃の温度および５％＋／−５％の湿度の条件下で１時間乾燥した。温度および湿度を、Ｗａｔｌｏｗ  Ｓｅｒｉｅｓ  ９６  １／１６  ＤＩＮ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｗａｔｌｏｗ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって制御した。
【００９９】
図５Ｂを参照して、上記カートリッジの上部半体を、カートリッジ１の上部半体３のコンジット８’’の領域１４’’に付与したスパイク（リポテイコ酸）を用いずに用意した。製造後、２つの半体２および３を、領域１４’および１４’’を一方が他方の上部に整列し、そしてカートリッジ半体２および３の端がＤｕｋａｎｅ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｄｕｋａｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ＩＬ）の制御下でＤｕｋａｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ２１０  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｓｅａｌｅｒ（Ｄｕｋａｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ＩＬ）を使用して超音波でシールされるように組み立てた。
【０１００】
その結果は、図１０に要約され、そしてその結果は、上記Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物がリポテイコ酸の非存在下において反応性を有さなかったことを示す。しかし、その調製物の反応性は、リポテイコ酸の漸増性の濃度の存在を増大した。これらの結果は、そのＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物が、グラム陽性菌中またはグラム陽性菌上に存在するリポテイコ酸を検出し得ることを示す。
【０１０１】
（実施例６：グラム陽性菌、グラム陰性菌、ならびに真菌および糸状菌を検出し得る血液細胞ベースの調製物）
実施例１の教示に従って作製したＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物は、グラム陽性菌の存在を検出し得るが、グラム陰性菌、酵母および糸状菌を検出しない。グラム陽性菌、グラム陰性菌、ならびに酵母および糸状菌を検出し得る調製物が望ましい限り、このような調製物を、実施例１のＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物（グラム陽性菌と反応性である）と粗Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物（グラム陰性菌ならびに酵母および糸状菌と反応性である）とを合わせることによって作製することが、可能である。
【０１０２】
簡単にいうと、Ｌｅｖｉｎら（（１９６８）ＴＨＲＯＭＢ．ＤＩＡＴＨ．ＨＡＥＭＯＲＲＨ．１９：１８６）において最初に記載されるように調製される粗Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物を、等量で、実施例１に従って調製されるＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物と合わせた。
【０１０３】
このアッセイにおいて、１工程動的アッセイを、マイクロタイタープレートにおいて行い、そしてリポテイコ酸（ＬＴＡ）（Ｌ２５１５、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、標準曲線を与えるように希釈した。その標準曲線は、Ｔｒｉｓ緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）における、１００μｇ／ｍＬから始まり１．２８ｎｇ／ｍＬまでの５倍連続希釈物を含んだ。Ｔｒｉｓ緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）を、ネガティブコントロールとして使用した。比較可能な５倍の曲線をまた、ペプチドグリカン（７７１４０、Ｆｌｕｋａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、グルカン（グルカン標準、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ、Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ、ＳＣ）およびリポ多糖類（Ｌ−２６３７、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して作成した。
【０１０４】
次いでリポテイコ酸標準、ペプチドグリカン、グルカン、リポ多糖類およびコントロールを、適切なウェル（ウェル１つあたり１２０μＬ）に添加した。マイクロプレートのウェルは、５μＬの乾燥したＣ．ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞調製物を含んだ。次いで５μＬの粗Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物の調製物を、そのウェルに添加した。最後に、１０μＬの硫酸イソプレナリン基質（（Ｉ０２６１、ＴＣＩ−ＧＲ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）清潔な水中の１６ｍＭ）を、各ウェルに添加した。各ウェルの吸光度を、４９０ｎｍで３７°℃にて１５０分間、定期的（すなわち、動的）に読み取った（最小ＯＤ：０、最大ＯＤ：１．５、開始ＯＤ：０．２）。その結果は、図１１に要約され、そしてその結果は、その調製物がリポ多糖類、ペプチドグリカン、グルカンおよびリポテイコ酸と反応することを示す。これらのデータは、このような溶解物がグラム陽性菌、グラム陰性菌ならびに酵母および真菌を検出し得ることを示唆する。
【０１０５】
（実施例７：フェノールオキシダーゼに対する蛍光基質を使用するリポテイコ酸アッセイ）
この実施例は、蛍光フェノールオキシダーゼ基質がウェル型の様式における１工程動的アッセイに使用され得ることを示す。
【０１０６】
アッセイを、以下の通りに行った。Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓリポテイコ酸反応性材料を、実施例１に記載した通りに生成した。１０μＬのそのＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物（１％のマンニトール）を、マイクロタイタープレートの各ウェル中に乾燥した。リポテイコ酸の連続希釈物を、０．２ＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）において調製した。次いで、１２０μＬのリポテイコ酸標準を、１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、および１２．５μｇ／ｍＬの最終濃度を有する一対のウェルを与えるようにそのウェルに添加した。コントロールのみが、１２０μＬのＴｒｉｓ緩衝液を有した。上記プレートを、３７℃にて３０分間インキュベートした。ついで、２０μＬの２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＤＡ）（Ｄ−３９９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）および８ｍＭのカテコール（Ｃ−９５１０、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、上記対の一方のウェルに添加した。２０μＬのＤＣＦＤＡ、８ｍＭのカテコールおよびエステラーゼ（Ｅ−２８８４、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の１／２５０希釈物を、上記ウェルの対のうちの一方のウェルに添加した。４９０ｎｍにおける吸光度を、１２０分間にわたって記録した。蛍光ユニット対リポテイコ酸の濃度で表されるその結果を、図１２に与える。
【０１０７】
図１２は、蛍光基質がアッセイにおいて使用され得ることを示す。その結果は、上記アッセイが上記エステラーゼの存在下および非存在下において作用し得るが、そのアッセイは、エステラーゼの存在下でより感度が高いことを示す。例えば、１００μｇ／ｍＬのリポテイコ酸は、エステラーゼの非存在下において約１蛍光ユニットに等しいシグナルを与え、そしてエステラーゼの存在下において約４．８蛍光ユニットに等しいシグナルを与える。この型のアッセイは、有色の試験溶液（例えば、血液サンプル）に関して有用であり得る。
【０１０８】
（実施例８：粗Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物中のリポテイコ酸反応性材料）
実施例４は、リポテイコ酸反応性材料がカルシウムイオノフォアによって透過可能にしたＬｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ血液細胞から回収され得ることを示す。この実施例は、リポテイコ酸反応性材料がまた粗Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ血液細胞溶解物に存在することを示す。
【０１０９】
簡単にいうと、Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物を、Ｌｅｖｉｎら（（１９６８）、前出）に最初に記載されるように調製した。その溶解物を、実施例２に記載した通りに、リポテイコ酸反応性材料の存在についてアッセイした。その結果は、粗Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物がサンプル中のリポテイコ酸の存在を検出し得ることを示す。そのサンプル混合物中の粗溶解物の濃度が減少するにつれて上記シグナルが増大することは、興味深い。これらの結果は、粗Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物がプロフェノールオキシダーゼカスケードに対するインヒビターを含むことを示唆する。しかし、そのインヒビターが滴定され得、その結果、その粗溶解物がサンプル中のリポテイコ酸の存在を検出し得ると、考えられる。したがって、その粗Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物がグラム陽性菌を検出し得ると、考えられる。さらに、その粗溶解物は、適切な条件下において、グラム陽性菌（上記プロフェノールオキシダーゼカスケードを介して）、グラム陰性菌（上記ファクターＣカスケードを介して）、ならびに酵母および糸状菌（上記ファクターＧカスケードを介して）の存在を検出し得ると、考えられる。
【０１１０】
（等価物）
本発明は、その趣旨および本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において具現化され得る。前述の実施形態は、従って、全ての点において、本明細書に記載される発明を限定するのではなく、例示であるとみなされるべきである。よって、本発明の範囲は、前述の説明によって示されるのではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および均等の範囲内に入る全ての変化は、その範囲内に包含されると解釈される。
【０１１１】
（参考としての援用）
本願において列挙される全ての出版物および特許文書は、あたかもそれぞれ個々の出版物または特許文書の内容全体が本明細書中に援用されることと同じ範囲に対する全ての目的のために、その全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物に存在するファクターＣカスケードおよびファクターＧカスケードの概略図である。
【図２】図２は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞におけるプロフェノールオキシダーゼ活性化カスケードを示す概略図である。
【図３】図３は、Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ血液細胞に存在するプロフェノールオキシダーゼ活性化カスケードを示す概略図である。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、斜視図（図４Ａ）、上面図（図４Ｂ）、側面図（図４Ｃ）、および端面図（図４Ｄ）における本発明の方法を実施するのに有用な例示のカートリッジの概略図である。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、例示のカートリッジの概略図であり、図５Ａは、固定化された血液細胞調製物およびプロフェノールオキシダーゼ基質の配置を示す例示のカートリッジの底部半体の図であり、図５Ｂは、本発明の例示のカートリッジの上部半体の図であり、図５Ｃは、断面Ａ〜Ａ’を通る製造されたカートリッジの断面図であり、そして図５Ｄは、断面Ｂ〜Ｂ’を通る製造されたカートリッジの断面図である。
【図６】図６は、例示の多工程動的色素形成アッセイについてのフローチャートである。
【図７】図７は、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、グルカンおよびリポ多糖類の存在下でのＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞調製物におけるプロフェノールオキシダーゼ反応性を示すグラフである。
【図８】図８は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（グラム陽性）細菌細胞の存在下でのＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞調製物のプロフェノールオキシダーゼ反応性を示すグラフである。
【図９】図９は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（グラム陽性）細菌細胞の存在下でのＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞調製物のプロフェノールオキシダーゼ反応性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞調製物が異なる濃度のリポテイコ酸と一緒にインキュベートされる場合の、カートリッジベースの２工程動的アッセイにおける時間に伴う光学濃度の変化を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ペプチドグリカン、グルカン、リポ多糖類およびリポテイコ酸の存在下での、粗Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物と合わされたＣａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ血液細胞調製物のプロフェノールオキシダーゼ反応性を示すグラフである。
【図１２】図１２は、エステラーゼの存在下または非存在下において蛍光フェノールオキシダーゼ基質を使用した多工程動的アッセイにおける、Ｃａｎｃｅｒ  ｂｏｒｅａｌｉｓ調製物のプロフェノールオキシダーゼ反応性を示すグラフである。
【図１】
2008522640.tif 000006
【図２】
2008522640.tif 000007
【図３】
2008522640.tif 000008
【図４Ａ】
2008522640.tif 000009
【図４Ｂ】
2008522640.tif 000010
【図４Ｃ】
2008522640.tif 000011
【図４Ｄ】
2008522640.tif 000012
【図５Ａ】
2008522640.tif 000013
【図５Ｂ】
2008522640.tif 000014
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
2008522640.tif 000018
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008522640.tif 000021
【図１１】
2008522640.tif 000022
【図１２】
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【国際調査報告】
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2008522640.tif 000025
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