(57)【要約】  本発明は、遊走能を有する真核細胞の移動を調節するための方法及び組成物を提供する。より詳しくは、本発明は、抗遁走性剤及び免疫応答を増強するに際してのその使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答の増強を必要としている対象における部位において免疫応答を増強する方法であって、対象における部位において免疫細胞特異的遁走活性（fugetactic activity）を阻害するのに有効な量の抗遁走性剤（anti-fugetactic agent）を前記部位に局所投与し、それによって対象における前記部位において免疫応答を増強する、そして
前記抗遁走性剤は、ＣＸＣＲ４拮抗薬、ＣＸＣＲ３拮抗薬、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１拮抗薬及び選択的ＰＫＣ阻害剤であり、
前記ＣＸＣＲ４拮抗薬は、ＡＭＤ３１００、ＫＲＨ−１６３６、Ｔ−２０、Ｔ−２２、Ｔ−１４０、ＴＥ−１４０１１、ＴＥ−１４０１２、ＴＮ−１４００３及びＣＸＣＲ４の二量化を阻害する化合物又はそのリガンドからなる群から選択され、前記ＣＸＣＲ３拮抗薬は、ＴＡＫ−７７９、ＡＫ６０２、ＳＣＨ−３５１１２５及びＣＸＣＲ３の二量化を阻害する化合物又はそのリガンドからなる群から選択され、前記ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１拮抗薬は、タンニン酸、ＮＳＣ６５１０１６、ＣＸＣＲ４の二量化を阻害する化合物及びＳＤＦ−１の二量化を阻害する化合物からなる群から選択され、及び前記ＰＫＣ阻害剤はサリドマイド又はＧＦ１０９２３０Ｘである、
ことを含む方法。
【請求項２】
前記ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１拮抗薬が、タンニン酸、ＮＳＣ６５１０１６、ＣＸＣＲ４の二量化を阻害する化合物及びＳＤＦ−１の二量化を阻害する化合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫細胞特異的遁走活性が、ＳＤＦ−１によって媒介されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記部位が、病原性感染の部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記部位が、腫瘍部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
部位に免疫細胞の遊走を増加する方法であって、免疫細胞特異的遁走活性を阻害するのに有効な量の抗遁走性剤を前記部位に投与し、それによって前記部位に免疫細胞の遊走を増加し、前記抗遁走性剤がＧタンパク質共役型受容体リガンドの競合阻害剤である、ことを含む方法。
【請求項７】
前記部位が、腫瘍の直近周辺領域である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗遁走性剤がＳＤＦ−１二量体の誘導体である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
抗遁走性剤を同定する方法であって、
ａ）抗遁走性剤であると考えられる薬剤を、遁走性剤の存在下で二量体化するポリペプチドと接触させ；
ｂ）前記ポリペプチドを遁走性剤と接触させ；そして
ｃ）前記ポリペプチドの二量体化が阻害されることを決定し、それによって抗遁走性剤を同定する、
工程を含む方法。
【請求項１０】
遁走性剤がＳＤＦ−１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗遁走性剤がＣＸＣＲ３又はＣＸＣＲ４の二量体化を阻害する抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
遁走性剤二量体を同定する方法であって、
ａ）遁走性剤であると考えられるリガンド二量体を、遊走能を有する細胞と接触させ；
ｂ）前記細胞に関連するクリアランス（消失）領域を測定し；そして
ｃ）前記クリアランス（消失）領域が、それによって遁走性剤二量体を同定するに充分な大きさであることを決定する、
工程を含む方法。
【請求項１３】
遁走性剤二量体及び少なくとも１つの適切な医薬添加物を含む医薬組成物。
【請求項１４】
前記リガンドがＳＤＦ−１である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願又は特許及び参照による取込
本発明は、２００４年１１月５日出願の米国特許仮出願第６０／６２５，７３３号の優先権を主張し、その内容を参照して本明細書に取り込む。
【０００２】
米国政府の権利に関する記載
本研究は、国立衛生研究所のグラント第ＮＨＬＢＩ−４４８５１号の助成を一部受けてなされたものであり、米国政府は、本発明に関して特定の権利を有するものである。
【背景技術】
【０００３】
原核生物及び真核生物には、特定の刺激に応答して起きる細胞運動が観察されている（Doetsch R N and Seymour W F., 1970; Bailey G B et al., 1985）。これらの生物に見られる細胞運動は、それぞれ：化学物質の濃度の増加勾配に沿った走化性又は細胞運動；細胞運動が化学刺激の勾配に逆行する、負の走化性；及び、化学運動性又は化学物質に誘発された細胞の無秩序運動の増加；の３つの型に分類される。原核細胞においては、特異的な走化性活性を有する化合物の作用に対する受容体及びシグナル伝達経路が広く明らかになっている。Ｅ．ｃｏｌｉ走化性の研究では、ある濃度及び条件では細菌を誘引する化学物質が、別の濃度及び条件では負の走化性を有する化合物又は忌避物質（chemorepellent）としても作用することを明らかにした（Tsang N et al., 1973; Repaske D and Adler J. 1981; Tisa L S and Adler J., 1995; Taylor B L and Johnson M S., 1998）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ケモカイン（Ward S G and Westwick J, 1998; Kim C H et al., 1998; Baggiolini M, 1998; Farber J M, 1997）と呼ばれるタンパク質種に応答して、哺乳動物の細胞で起きる化学走化性及び化学運動性が観察されている（McCutcheon M W, Wartman W and H M Dixon, 1934; Lotz M and H Harris 1956; Boyden S V, 1962）。更に、Poznanskyら（米国特許第６，４４８，０５４号及びＷＯ２００４／０５３１６５、その全てを参照して取り込む）は、哺乳動物の細胞で忌避活性、又は遁走活性を観察した。走化性、化学運動性及び遁走性について、哺乳動物システムにおけるものと同様な、改善された制御が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書は、遊走細胞忌避活性（以下、「遁走性薬剤」並びに「遁走活性」及び／又は「化学遁走性」と云う）を有する薬剤について記載されている。本発明は、当該遁走性剤を含有する医薬組成物、並びに当該遁走性剤を利用する種々の治療及び診断方法を提供する。本発明は、又、遁走性ポリペプチド及び当該ポリペプチド（抗体を含む）に結合する薬剤を提供する。当該薬剤は特に、対象の特異的部位における細胞遊走（migratory-cell movement）の調節が必要とされる疾患の治療に用いられる。そのような重要な部位には、炎症部位が含まれる。本発明は又、そのような遁走活性の調節に有用な薬剤を同定する方法を提供する。
【０００６】
本発明は又、遁走活性の付与には、Ｇタンパク質共役型受容体及び／又は受容体リガンドの二量体化が重要な役割を果たすという認識に基づくものである。従って、本発明は、リガンドの二量体、その機能的断片及び誘導体を含む遁走性化合物、並びに遁走性化合物をその化合物に対応するＧタンパク質共役型受容体を発現している細胞に接触させて遁走性を誘導する方法に関する。リガンドの二量体は、Ｇタンパク質共役型受容体の未変性の又は合成のリガンドから作成することができる。例えば、リガンドは、ケモカインであってもよい。リガンドの二量体は、未変性のリガンドの二量体であるのが好ましい。特に好ましい態様において、遁走性化合物は、インビボで安定であり（例えば、単量体リガンドへの分解に抵抗性である）、選択的に遁走性であり、そして、化学走化性を有する化合物として実質的に不活性である。
【０００７】
遁走性化合物は、ケモカイン及び／又はケモカイン受容体の二量体化をもたらす又は引き起こす化合物であれば、いずれの化合物であってもよい。ケモカインは、１００ｎＭ未満の濃度でケモカイン受容体に対する単量体として作用することにより、化学走化性を有する化合物として機能する。ＩＬ−８及びＳＤＦ−１を含むある種のケモカインも又、ケモカインの大半が二量体として存在する高濃度（例えば、１００ｎＭを越える）では、忌避物質としての役割を果たすことができる。ケモカインの二量体化により、細胞で反応差が誘発され、ケモカイン受容体を二量体化させるが、それは忌避シグナルと解釈される活性である。それゆえ、細胞表面での、二量体ケモカインの結合及び同種ケモカイン受容体の二量体化は、カルシウム流出の増加及び付随して起こる二次メッセンジャー分子の変化を含む、細胞における差分シグナルを引き出すことができ、それによって遁走性を誘発する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、受容体二量体化を阻害することによって遁走性を阻害する抗遁走性化合物に関する。そのような化合物には、二量体化に必要な受容体に於ける、アミノ酸を標的とする抗体が含まれる。特に好ましくは、抗遁走性化合物は、受容体の化学走化性を実質的に損なわない、選択的抗遁走活性を有している。例えば、抗遁走性化合物は、遁走性リガンド活性又は受容体結合性を妨げることができ、それによって受容体が化学走化性シグナルを受け取ることができる。
【０００９】
一態様において、抗遁走性化合物は、未変性のリガンド二量体とＧタンパク質共役型受容体の間の相互作用を阻害する化合物であってもよい。阻害は、選択的であるのが好ましい。例えば、未変性のリガンド二量体を競合的に阻害する化合物を使用することができる。未変性のリガンド二量体を競合的に阻害する化合物には、２つのタンパク質鎖が含まれていてもよく、その少なくとも１つのタンパク質鎖は、受容体結合機能を取り除くように修飾されたリガンド誘導体である。第２のタンパク質鎖は、受容体を結合するポリペプチドであってもよい。同時に、当該化合物は、受容体に結合することはできるが、受容体の遁走活性を活性化することはできない。
【００１０】
従って、抗遁走性化合物には、ケモカイン及び／又はケモカイン受容体二量体化を特異的に阻害して遁走性剤の忌避反応を遮断する何れの薬剤も含まれる。ケモカイン二量体形成又はケモカイン受容体二量体形成を阻害する抗遁走性剤により、腫瘍から分泌される高濃度のケモカインの忌避効果を遮断することができる。例えば、二量体化ドメイン又はリガンド結合を阻害して、ケモカイン受容体二量体化を標的化し遮断する抗体は、抗遁走性剤である。この効果は、単量体のケモカインの走化性作用を阻害することなく必要に応じて達成することができる。
【００１１】
別の態様において、抗遁走性剤は、ＣＸＣＲ４拮抗薬、ＣＸＣＲ３拮抗薬、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１拮抗薬又は選択的ＰＫＣ阻害剤である。そのような化合物は、ＡＭＤ３１００、ＫＲＨ−１６３６、Ｔ−２０、Ｔ−２２、Ｔ−１４０、ＴＥ−１４０１１、１４０１２及びＴＮ−１４００３；ＴＡＫ−７７９、ＡＫ６０２及びＳＣＨ−３５１１２５；並びにタンニン酸、ＮＳＣ６５１０１６、サリドマイド及びＧＦ１０９２３０Ｘを含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、更に、上記の化合物を同定するためのアッセイに関する。そのようなアッセイは、試験化合物の存在下に、受容体を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）と受容体及び／又は受容体リガンドを接触させ、そして受容体及び／又はリガンドの二量体化の存在又は非存在を検出することを包含している。好ましくは、アッセイは、細胞が、そのような試験化合物の非存在下で、受容体及びリガンドに遁走性的に応答する条件下で、細胞（例えば、Ｔ細胞）の遁走性の存在又は非存在を検出する工程を包含している。アッセイは、細胞が、そのような試験化合物の非存在下に、受容体及びリガンドに走化性的に又は化学運動性的に応答する条件下で、細胞（例えば、Ｔ細胞）の走化性又は化学運動性の存在又は非存在を検出する工程を含んでいてもよい。
【００１３】
一態様において、本発明は、遁走性剤を同定する方法であって、当該方法は：遁走性剤であると思われる薬剤を、遊走能を有する細胞と接触させ；細胞に関連するクリアランス(消失）領域を測定し；そしてクリアランス(消失）領域が、それによって遁走性剤を同定するに充分な大きさであることを決定する工程を含む方法を提供する。ある特定の態様において、遊走能を有する細胞は、造血細胞、神経系細胞、上皮細胞、間葉細胞、胚幹細胞又は生殖細胞である。
【００１４】
別の態様において、本発明は、抗遁走性剤を同定する方法であって、抗遁走性剤であると思われる薬剤を、遁走性剤の存在下で二量体化するポリペプチド、例えばＧタンパク質共役型受容体に対するポリペプチドリガンドのようなポリペプチド、と接触させ；当該ポリペプチドを遁走性剤と接触させ；そして当該ポリペプチドの二量体化が阻害されることを決定し、それによって抗遁走性剤を同定する、工程を含む方法を含む。
【００１５】
なお別の態様において、抗遁走性剤を同定する方法が提供され、当該方法は、抗遁走性剤であると思われる薬剤を、遁走性剤の存在下で遊走能を有する細胞と接触させ、遊走能を有する細胞の運動を遁走性剤と比較して測定し、そして遊走能を有する細胞の運動が阻害されるかどうかを決定し、それによって抗遁走性剤を同定する工程を含む方法である。
【００１６】
なお別の態様において、本発明は、更に、遁走性を調節して対象に治療応答をもたらす方法に関する。一態様において、特異的部位に関連する症状を呈する対象における免疫反応を増強する方法が提供される。当該方法は、本明細書に記載の抗遁走性剤を、免疫細胞特異的な遁走活性を阻害するのに有効な量で、当該治療を必要とする対象の特異部位に局所的に投与することを含む。いくつかの態様において、特異的部位は、病原性感染部位である。ある特定の態様において、特異的部位は、生殖細胞含有部位である。さらなる態様において、特異的部位は、腫瘍直近の周辺部位である。ある特定の態様において、抗遁走性剤は、サイトカイン結合剤である。別の態様において、サイトカイン結合剤は、抗サイトカイン抗体又はサイトカイン作動薬である。好ましい態様において、サイトカインは、ＳＤＦ−１αである。
【００１７】
別の態様において、腫瘍部位への免疫細胞の遊走を増加する方法であって、当該方法は、腫瘍の直近の周辺の領域に本明細書に記載の抗遁走性剤を、免疫細胞特異的遁走活性を阻害する有効な量で投与し、それによって腫瘍部位に免疫細胞の遊走を増加させることを含む方法である。
【００１８】
本発明の更なる態様によると、対象における腫瘍細胞転移を阻害する方法が提供される。当該方法は、そのような治療を必要とする対象における腫瘍部位に、対象における腫瘍部位から腫瘍細胞の転移を阻害するのに有効な量で、本明細書に記載した抗遁走性剤を局所的に投与することを含む。ある特定の態様において、抗遁走性剤は、サイトカイン結合剤である。別の態様において、サイトカイン結合剤は、抗サイトカイン抗体又はサイトカイン作動薬である。好ましい態様において、サイトカインは、ＳＤＦ−１αである。
【００１９】
なお別の態様において、対象において癌を治療する方法が提供されるが、当該方法は、腫瘍部位から離れるようとする腫瘍細胞の運動を減少させるのに有効な量で、本明細書に記載されている抗遁走性剤を対象の腫瘍部位に投与することによって、対象における腫瘍細胞転移を阻害して癌を治療することを含む。癌又は腫瘍の型は、本明細書に記載された方法がなければ、免疫認識されないものとして現在知られている型のものである。
【００２０】
本発明の更なる態様によると、対象における避妊方法が提供される。当該方法は、そのような処置を必要とする対象に、本明細書に記載した抗遁走性剤の対象において生殖細胞の遊走を阻害するのに有効な量を投与することを含む。ある特定の態様において、抗遁走性剤は、サイトカイン結合剤である。いくつかの態様において、サイトカイン結合剤は、抗サイトカイン抗体又はサイトカイン作動薬である。好ましい態様において、サイトカインは、ＳＤＦ−１αである。
【００２１】
本発明は、又、上記したような化合物を使用するキットであって、当該化合物及び使用説明書を含むキットに関する。
本発明のこれら及びその他の態様、並びに利点及び有用性は、好ましい態様に関する詳細な説明により、更に明確に説明する。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
本明細書で使用される「抗体」は、通常の方法論に従って調製されるポリクローナル、モノクローナル、単鎖、キメラ、ヒト化及びヒト抗体を含む。
【００２３】
「サイトカイン」は、一細胞亜集団から放出され、例えば、免疫応答の生成又は調節において細胞間媒介物として作用する非抗体可溶性タンパク質の一般的用語である。Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ (Aggrawal, et al. eds., Blackwell Scientific, Boston, Mass. 1991)を参照されたい。（本書を参照してその全てを本明細書に取り込む）。
【００２４】
「ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１拮抗薬」は、ＣＸＣＲ４に結合するＳＤＦ−１に拮抗する化合物を表す。
【００２５】
「遁走活性」とは、真核細胞の遊走能を阻害（repel）（又は化学的忌避）する薬剤の能力を意味する（すなわち、忌避刺激から離れようとする運動ができる細胞）。従って、遁走活性を有する薬剤は、「遁走性製剤」である。そのような活性は、本明細書に記載されている遊出システム（transmigration systems)のいずれを使用しても検出可能であり（実施例を参照）、又は当技術分野で周知であるその他種々のシステムを使用しても検出可能である（例えば、Springer, T.A.らの米国特許第５，５１４，５５５号、発明の名称：「リンパ球の化学誘引物質に基づくアッセイ及び治療方法」、１９９６年５月７日発行、を参照されたい）。本明細書で用いられる好ましいシステムは、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙらの米国特許第６，４４８，０５４号に記載されており、その全てを参照して本明細書に取り込む。
【００２６】
本明細書で用いられる「免疫細胞」とは、造血細胞由来のものであり（後の考察を参照）抗原の特異的な認識に関与するものである。免疫細胞は、樹状細胞又はマクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞等のような抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）を含む。本明細書で用いられる「成熟Ｔ細胞」は、ＣＤ４ｌｏＣＤ８ｈｉＣＤ６９＋ＴＣＲ＋、ＣＤ４ｈｉＣＤ８ｌｏＣＤ６９＋ＴＣＲ＋、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＲＯ＋及び／又はＣＤ８＋ＣＤ３＋ＲＯ＋表現型のＴ細胞を含む。本発明の化合物に対する成熟Ｔ細胞の遁走性応答は、上記のようにして、又は米国特許第６，４４８，０５４号に詳細に記載されている遊出アッセイにより測定することができる。その他の適切な方法は、当業者には公知であり、通常の実験のみで適用可能である。
【００２７】
本明細書で用いられる「対象」とは、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ又は齧歯類である。全ての態様において、ヒト対象が好ましい。
【００２８】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
本発明は又、遁走活性の付与には、Ｇタンパク質共役型受容体及び／又は受容体リガンドの二量体化が重要な役割を果たすという認識に基づくものである。理論に縛られるわけではないが、遁走性が活性化するのは、これらの受容体リガンド及び／又は受容体が二量体化することによるものと考えられている。よって、本発明は、リガンドの二量体、それらの機能的断片及び誘導体を含む遁走性化合物、並びに当該遁走性化合物を対応するＧタンパク質共役型受容体を発現している細胞に接触させて遁走性を誘導する方法に関する。本発明は、更に、そのようなＧタンパク質共役型受容体及び／又は受容体リガンドの遁走性効果を、例えば、リガンド及び／又は受容体の二量体化を阻害することによって調節する抗遁走性化合物に関する。
【００２９】
本発明は、ケモカインＧタンパク質共役型受容体（ＣＸＣＲ−４など）及びそれらの結合パートナー（ケモカイン（例えば、ＳＤＦ−１及びＩＬ−８））に特異的に結合する種々の大きさ及び型のポリペプチドを含む。サイトカインは、例えば、インターロイキンＩＬ−１からＩＬ−１５、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、腫瘍増殖因子β（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）及び顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む。ＳＤＦ−１αは、胸腺及び骨髄基質で産生され、約１００ｎｇ／ｍｌより低い濃度で非常に効率的で、かつ極めて強力なリンパ球走化性因子として報告されている、サイトカイン（ケモカイン）である（文献１２〜１５及びＨｏｎｊｏらの米国特許第５，７５６，０８４号、発明の名称：「ヒトストローマ細胞由来因子１α及び１β」、１９９８年５月２６日発行）。
【００３０】
標的細胞に於ける各々のサイトカインの作用は、細胞表面受容体への結合により媒介される。サイトカインは、ホルモンの多くの性質を共有しているが、インビボでは、一般的には組織内で細胞の近辺で局所的に作用するという点で古典的ホルモンと異なる。サイトカインの活性は、細胞増殖を促進する（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＬ−７）、及び増殖を阻むことから（ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子及びＴＧＦ−β）、ウイルス抵抗性を誘発する（ＩＦＮα、β、及びγ）まで多岐にわたる。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ (Paul ed., Raven Press, 2nd ed. 1989)：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ(Roitt ed., Academic Press 1992)を参照されたい（これらは、参照してその全てを本明細書に取り込む）。ある特定の態様において、サイトカインは、化学物質誘引性及び／又は化学運動性を有するサイトカインである。そのようなサイトカインの例としては：ＰＡＦ、Ｎ−ホルミル化ペプチド、Ｃ５ａ、ＬＴＢ４、ＬＸＡ４、ケモカイン：ＣＸＣ、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＥＮＡ−７８、ＮＡＰ−２、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、Ｉ−ＴＡＣ、ＳＤＦ−１α、ＢＣＡ−１、ＰＦ４、ボレカイン、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＰＣ−４、ＭＣＰ−５（マウスのみ）、ロイコタクチン−１（ＨＣＣ−２、ＭＩＰ−５）、エオタキシン、エオタキシン−２（ＭＰＩＦ２）、エオタキシン−３（ＴＳＣ）、ＭＤＣ、ＴＡＲＣ、ＳＬＣ（エキソダス−２、６ＣＫｉｎｅ）、ＭＩＰ−３α（ＬＡＲＣ、エキソダス−１）、ＥＬＣ（ＭＩＰ−３β）、Ｉ−３０９、ＤＣ−ＣＫ１（ＰＡＲＣ、ＡＭＡＣ−１）、ＴＥＣＫ、ＣＴＡＫ、ＭＰＩＦ１（ＭＩＰ−３）、ＭＩＰ−５（ＨＣＣ−２）、ＨＣＣ−４（ＮＣＣ−４）、ＭＩＰ−１γ（マウスのみ）、Ｃ−１０（マウスのみ）；Ｃ：リンホタクチン；ＣＸ３Ｃ：フランクテルキン（ニューロタクチン）を含む。より好ましくは、サイトカインは、ケモカインのＣｙｓ−Ｘ−Ｃｙｓファミリーのメンバー（ＣＸＣＲ−４受容体に結合するケモカイン）である。本発明の好ましいそのような薬剤は、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、及びｍｅｔ−ＳＤＦ−１βを含む。更に好ましい態様において、そのような遁走性剤は、他のＣＸＣＲ−４受容体リガンドを含む。ＣＸＣＲ−４リガンドは、限定されないが、ＨＩＶ−１ＩＩＩＢｇｐ１２０、小分子Ｔ１３４、及び／又はＴ２２（［Ｔｙｒ５，１２，Ｌｙｓ７］−ポリフェムシンＩＩ）を含む（Heveker et al., Curr Biol, 1998, 8:369-76）。
【００３１】
ポリペプチドの二量体及び二量体化を調節するポリペプチドを含む、本発明のポリペプチドは、ペプチドライブラリーのような当該技術分野公知のソース由来のものであってもよい。そのようなポリペプチドは、溶液、固定化形態で、又はファージディスプレイライブラリーとして容易に調製可能な縮重ペプチドライブラリーとして供与されてもよい。ライブラリーは、さらに、ペプチド及び非ペプチド合成部分として合成することもできる。
【００３２】
標準的な組換え技術も又、本発明のポリペプチドを製造するのに使用することができる。本発明の実施には、別に指示がなければ、当該技術分野である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の通常の技術が採用される。そのような技術は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology", "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)のような文献に十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリペプチドの製造に利用可能であり、それ自体は、本発明を実施する際及び実行する際に考慮してもよい。
【００３３】
本発明の一態様によれば、本明細書に記載された遁走性化合物は、対象における治療効果を得るために使用することができる。一態様において、対象において免疫細胞の特異的部位への遊走を阻害する方法が提供される。当該方法は、対象の特異的部位に免疫細胞の遊走を阻害するのに有効な量の本明細書に記載された遁走性剤を、そのような治療を必要とする対象の特異的部位に局所的に投与することを含む。
【００３４】
従って本発明は、対象における炎症部位に免疫細胞が遊走するのを阻害する方法を提供するものであり、本明細書で用いられる「炎症」とは、異種抗原、有害な物質、及び／又は傷害組織を破壊し、希釈し、又は隔離するように作用する、異種（非自己）抗原によって、及び／又は組織の損傷又は破壊によって誘発される局所的保護反応である。炎症は、組織が、ウイルス、細菌、外傷、化学物質、熱、寒冷、又はいずれかの他の有害刺激によって損傷される時に起こる。そのような例において、免疫系の古典的武器（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ）は、細胞と炎症反応の媒介物（好中球、好酸球、好塩基球、キニン及び凝固系、及び補体カスケード）である可溶性産物とを相互作用させる。
【００３５】
典型的な炎症反応は、（ｉ）抗原（損傷）局在化部位での白血球の遊走；（ｉｉ）Ｂ及びＴリンパ球、マクロファージ及び別の補体経路によって媒介される「異種」及び他の（壊死／損傷組織）抗原の特異的及び非特異的認識；（ｉｉｉ）補体成分、リンホカイン及びモノカイン、キニン、アラキドン酸代謝物、及び肥満細胞／好塩基球産物による特異的及び非特異的エフェクター細胞の補充（recruitment）による炎症反応の増幅；及び（ｉｖ）食作用による抗原粒子（損傷組織）の究極的な除去を伴う抗原破壊におけるマクロファージ、好中球及びリンパ球の関与、によって特徴付けられる。「自己」と「非自己」（異種）抗原の間を識別する免疫系の能力は、それゆえに、非自己抗原に対する特異的防御として免疫系が機能するために不可欠である。
【００３６】
非自己抗原は、対象に入ってくる物質についての抗原であり、あるいは対象の中に存在するが、対象自身の構成物とは異なって、又は異種として検出される抗原であり、これに対して、自己抗原は、健常な対象において、対象の構成物とは異なって又は異種として検出されない抗原である。
【００３７】
別の重要な態様において、炎症は、自己抗原に対する免疫反応に起因するものであり、本発明による治療を必要とする対象は、自己免疫疾患を有している。本明細書において使用する自己免疫疾患は、対象の免疫系が自己の器官又は組織を攻撃する時、関節リウマチ、ブドウ膜炎、インスリン依存性糖尿病、溶血性貧血、リウマチ熱、クローン病、ギラン・バレー症候群、乾癬、甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、等のような疾患によって例示される、組織の破壊に関連した臨床状態の生成をもたらす。
【００３８】
自己免疫疾患は、遺伝性素因のみによって、ある種の外因性の要因（例えば、ウイルス、細菌、化学物質、等）によって、又は両者に起因している。自己免疫のいくつかの形態は、神経組織又は目の水晶体のようなリンパ球に通常は曝露されない領域への外傷の結果として起こる。これらの領域において組織がリンパ球に曝露されるようになると、それらの表面タンパク質が、抗原として作用することができ、これらの組織を破壊し始める抗体及び細胞免疫反応の産生の引き金を引くことになる。他の自己免疫疾患は、対象自身の組織に抗原性的に類似しているか交叉反応性である抗原に対象が曝露された後に発症する。例えば、リウマチ熱においては、リウマチ熱の原因となる連鎖球菌細菌の抗原が、ヒトの心臓の部分と交差反応性がある。抗体は、細菌の抗原と心臓の筋肉の抗原の間の相異を区別することができず、従って、これらの抗原のいずれかを有する細胞が破壊される。
【００３９】
他の自己免疫疾患、例えば、インスリン依存性糖尿病（インスリンを産生するランゲルハンス島のβ細胞の破壊を含む）、多発性硬化症（神経系の伝導繊維の破壊を含む）及び関節リウマチ（間接内膜組織の破壊を含む）は、ほとんど細胞媒介自己免疫反応の結果であるとして特徴付けられ、一次的にはＴ細胞の作用によって現れる（Sinha et al., Science, 1990, 248:1380を参照）。重症筋無力症及び全身性エリテマトーデスのような、さらに別のものは、一次的には、液性自己免疫反応の結果であるとして特徴付けられる。それにもかかわらず、前述した本発明のいずれかの病態における、炎症の特異的部位への免疫細胞の遊走阻害は、「自己損傷」から、関連する特異的部位（例えば、組織）を防御し、炎症反応の増大を阻害するので、対象には有益である。好ましい態様において、対象は、関節リウマチ、多発性硬化症、又はブドウ膜炎に罹患している。
【００４０】
更に重要な態様において、炎症は、非自己抗原（壊死した自己材料の抗原を含む）に対する免疫反応に起因し、本発明による治療を必要とする対象は、移植を受けた患者であり、アテローム性動脈硬化症を有しており、心筋梗塞及び／又は虚血性脳卒中に罹患しており、膿瘍、及び／又は心筋炎を有している。これは、細胞（又は器官）移植後、又は心筋梗塞若しくは虚血性脳卒中の後に、移植細胞（器官）からのある種の抗原が、又は心臓若しくは脳からの壊死細胞が、免疫リンパ球及び／又は自己抗体の産生を促すからであり、それが後に、炎症／拒絶（移植の場合）の原因になり、あるいは心臓若しくは脳の標的細胞を攻撃し、炎症及び病態の悪化をもたらす（Johnson et al., Sem. Nuc. Med. 1989, 19:238; Leinonen et al., Microbiol. Path., 1990, 9:67; Montalban et al., Stroke, 1991, 22:750）。
【００４１】
本発明の別の態様によると、対象において腫瘍部位への内皮細胞遊走を阻害する方法が、提供される。当該方法は、そのような治療を必要とする対象における腫瘍部位の周辺領域に、対象における腫瘍部位への内皮細胞遊走を阻害するのに有効な量を、本明細書に記載の遁走性剤を局所的に投与することを含む。ある特定の態様において、腫瘍部位の周辺領域とは腫瘍部位の直近ではなく、重要な遁走性剤とは上記したようなものである。
【００４２】
本発明の別の態様によると、不妊並びに、未熟分娩及び切迫流産を含む早期分娩を治療する方法が提供される。当該方法は、対象の（卵子、精子、受精卵、移植胚を含む）生殖細胞の近くに遊走することから免疫細胞を阻害するのに有効な量の本明細書に記載された遁走性剤を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。生殖細胞は、配偶子を産生するように特化した細胞である。それは、より分化した生殖系列細胞をなお生じさせることができる幹細胞より更に分化した細胞である。さらなる態様において、投与は、対象の生殖細胞含有部位への局所的なものである。前述の治療方法は、対象の炎症の部位への免疫細胞の遊走を阻害するために、本発明の遁走性剤と協調して付加的又は相乗的に作用することができる非遁走性剤を、本発明の遁走性剤と共に対象に投与することを包含してもよい。いくつかの態様によると、遁走性剤は、炎症の部位への免疫細胞の遊走を阻害するために、非遁走性剤と実質的に同時に投与される。実質的に同時にとは、遁走性剤が、非遁走性剤の投与と時間的に大差なく対象に局所的に投与され、これによって非遁走性剤が、遁走性剤の遊走阻害活性に対して増強効果を発揮することを意味する。それゆえ、実質的に同時にとは、非遁走性剤の投与の前、同時、及び／又は後に、遁走性剤が投与されることを意味する。遁走性剤は、ポリペプチド及び／又は遁走性剤を発現する核酸として投与することができる。
【００４３】
ある特定の態様において、非遁走性剤は免疫抑制剤である。そのような免疫抑制剤には：アザチオプリン、アザチオプリンナトリウム、シクロスポリン、ダルトロバン、グスペリムス三塩酸塩、シロリムス、タクロリムスが含まれる。
【００４４】
別の態様において、非遁走性剤は、抗炎症剤である。そのような抗炎症剤には：アルクロフェナック；ジプロピオン酸アルクロメタゾン；アルゲストンアセトニド；α−アミラーゼ；アムシナファル；アムシナフィド；アムフェナックナトリウム；アミプリローズ塩酸塩；アナキンラ；アニロラック；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド・二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；ベンジダミン塩酸塩；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン；クリプロフェン；プロピオン酸クロベタゾール；クロベタゾンブチラート；クロピラック；プロピオン酸クロチカゾン；酢酸コルメタゾン；コルトドキソン；デフラザコート；デソニド；デスオキシメタゾン；二プロピオン酸デキサメタゾン；ジクロフェナックカリウム；ジクロフェナックナトリウム；二酢酸ジフロラゾン；ジフルミドンナトリウム；ジフルニザール；ジフルプレドネート；ジフタロン；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリソン；エンリモマブ；エノリカムナトリウム；エピリゾール；エトドラック；エトフェナメート；フェルビナック；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナックフェンクロラック；フェンドサール；フェンピパロン；フェンチアザック；フラザロン；フルアザコート；フルフェナム酸；フルミゾール；酢酸フルニゾリド；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；ブチルフルオコルチン；酢酸フルオロメトロン；フルカゾン；フルルビプロフェン；フルレトフェン；プロピオン酸フルチカゾン；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；プロピオン酸ハルベタゾール；酢酸ハロプレドン；イブフェナック；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール；イントラゾール；酢酸イソフルプレドン；イソキセパック；イソキシカム；ケトプロフェン；塩酸ロフェミゾール；ロルノキシカム；エタボン酸ロテプレドノール；メクロフェナメートナトリウム；メクロフェナム酸；二酪酸メクロリゾン；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；スレプタン酸メチルプレドニゾロン；モルニフルメート；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；塩酸パラニリン；多硫酸ペントサンナトリウム；フェンブタゾンナトリウムグリセレート；ピルフェニドン；ピロキシカム；桂皮酸ピロキシカム；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；プレドナゼート；プリフェロン；プロドール酸；プロクァゾン；プロキサゾール；クエン酸プロキサゾール；リメキソロン；ロマザリット；サルコレクス；サルナセジン；サルサラート；塩化サングイナリウム；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダック；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルマート；タロサラート；テブフェロン；テニダプ；テニダプナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テトリダミン；チオピナク；ピバル酸チキソコルトール；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；トリフ���ミダート；ジドメタシン；ゾメピラクナトリウムが含まれる。
【００４５】
別の態様によると、本発明は、物質の表面から免疫細胞を撃退する方法を含む。本明細書で用いられる「物質の表面」とは、歯科及び整形外科の人工移植物、人工弁並びにステント、同種及び／又は異種組織、臓器及び／又は血管系のような臓器の移植可能な組織を含むがこれらに限定されるものではない。
【００４６】
移植可能な人工器官が、長年に亘り、内部組織の外科的修復又は置換に使用されてきた。整形外科移植は、特定の医療のニーズを満たすのにそれぞれ適した、いろいろな装置を含む。そのような装置の例としては、股関節置換装置、膝関節置換装置、肩関節置換装置、骨折した骨を固定するために使用されるピン、かすがい及びプレートがある。いくつかの現代の整形外科及び歯科の移植には、高強度を達成するためにコバルト・クロム及びチタン合金のような高機能金属を使用する。これらの材料は、鋳造及び加工を含む成熟した金属加工技術を使用して、これらの装置に典型的な複雑な形状に容易に組み立てられる。
【００４７】
免疫細胞を撃退するのに効果的な量の本明細書に記載の遁走性剤で材料の表面を被覆する。重要な態様において、材料の表面は、移植片の一部である。重要な態様において、遁走性剤に加えて、材料の表面は、又、細胞増殖増強剤、抗感染症剤、及び／又は抗炎症剤で被覆してもよい。本明細書で使用される細胞増殖増強剤は、細胞の増殖を促進する薬剤であり、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、及びＧＤＮＦのような増殖因子を含む。
【００４８】
本発明の別の態様によると、遁走性剤を同定する方法が提供される。当該方法は、遁走性剤であると思われる薬剤を遊走能を有する細胞と接触させ、細胞と相対的なクリアランス(消失）領域を測定し、そしてクリアランス(消失）領域が、それによって遁走性剤を同定するに充分なものであることを決定することを含む。ある特定の態様において、遊走能を有する細胞は、造血細胞、神経細胞、上皮細胞、間葉細胞、胚性幹細胞又は生殖細胞である。
【００４９】
造血由来の細胞は、多能性幹細胞、多能性前駆細胞及び／又は特異的造血系になると定められている前駆細胞を含むがそれらに限定はされない。特異的造血系になると定められている前駆細胞は、Ｔ細胞系統、Ｂ細胞系統、樹状細胞系統、ランゲルハンス細胞系統及び／又はリンパ系組織特異的マクロファージ細胞系統の系統であってもよい。造血細胞は、骨髄、末梢血（動員末梢血を含む）、臍帯血、胎盤血、胎仔肝臓、胚細胞（胚性幹細胞を含む）、大動脈−生殖腺−中腎由来細胞、及びリンパ軟組織のような組織由来のものであってもよい。リンパ軟組織は、胸腺、脾臓、肝臓、リンパ節、皮膚、扁桃腺及びパイエル腺叢を含む。別の態様において、「造血由来（hematopietic origin)」細胞は、前述の細胞のいずれかのインビトロ培養物、及び特に前駆細胞のインビトロ培養物から誘導されるのものであってもよい。
【００５０】
神経由来の細胞は、ニューロン及びグリア、及び／又はＲＲ／Ｂを発現する中枢及び末梢神経組織の両者の細胞を含む（Avrahamらの米国特許第５，８６３，７４４号、発明の名称：“Neural cell protein marker RR/B and DNA encoding same”１９９９年１月２６日発行を参照されたい）。
【００５１】
上皮由来の細胞は、身体の自由表面を覆い、裏打ちする組織の細胞を含む。そのような上皮組織は、皮膚及び感覚器の細胞、並びに血管、消化管、空気通路、腎臓の管及び内分泌器官を裏打ちする特化した細胞を含む。
【００５２】
間葉由来の細胞は、コラーゲン、ビメンチン及びフィブロネクチンのような典型的な繊維芽細胞マーカーを発現する細胞を含む。
【００５３】
胚性幹細胞は、全ての系統の細胞を生じさせることができる細胞である。それは、又、自己再生する能力を有している。
【００５４】
本発明のなお別の態様によると、抗遁走性剤が提供される。一態様において、抗遁走性剤は、ケモカイン及び／又はケモカイン受容体二量体化を阻害する薬剤であればいずれの薬剤であってもよい。ケモカインは１００ｎＭ未満の濃度でケモカイン受容体に対して単量体として作用し、それによって、化学誘引物質として機能する。ＩＬ−８及びＳＤＦ−１を含む、ある特定のケモカインは、ケモカインの多くが二量体として存在する高濃度（例えば、１００ｎＭを越える）において、忌避物質としての役割を果たすことができる。ケモカインの二量体化は、細胞において反応差を誘発し、忌避シグナルとして説明される活性、すなわちケモカイン受容体の二量体化を引きおこす。それゆえ、細胞表面での、二量体化ケモカインの結合及びコグネイトケモカイン受容体の二量体化は、カルシウム流出の増加及び二次メッセンジャー分子の同時変化を含む、細胞における差分シグナルを導きだすことができ、それによって遁走性を誘導する。
【００５５】
それゆえに、抗遁走性剤は、ケモカイン及び／又はケモカイン受容体二量体化を特異的に阻害し、それによって遁走性剤に対する忌避反応を遮断する、いかなる薬剤も包含している。腫瘍によって分泌されるケモカインの高濃度の忌避物質効果を遮断することは、ケモカイン二量体形成又はケモカイン受容体二量体形成を阻害する抗遁走性剤によって達成することができる。例えば、二量体化ドメイン又はリガンド結合を妨害することによってケモカイン受容体二量体化を標的化し、遮断する抗体は例えば、抗遁走性剤とすることができる。望むならば、この効果は、単量体ケモカインの走化性活性を阻害することなしに達成することができる。
【００５６】
別の態様において、抗遁走性剤は、ＣＸＣＲ４拮抗薬、ＣＸＣＲ３拮抗薬、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１拮抗薬又は選択的ＰＫＣ阻害剤である。
【００５７】
本発明の抗遁走性剤は、ＣＸＣＲ４拮抗薬、ＣＸＣＲ３拮抗薬、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１拮抗薬又は選択的ＰＫＣ阻害剤であり得るが、これらに限定されない。
【００５８】
当該ＣＸＣＲ４拮抗薬は、ＡＭＤ３１００（Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100(23):13513-8), KRH-1636 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100(7):4185- 90), T-20 (Org Biomol Chem. 2004; 2(5):660-4), T-22 (J Med Virol. 2002 Oct;68(2):147- 55), T-140 (FEBS Lett. 2003; 550(l-3):79-83; Curr Drug Targets Infect Disord. 2004;4(2):103-10), TE-14011 (Biochem Biophys Res Commun. 2004;320(l):226-32), T-14012 (Curr Opin Investig Drugs. 2001; 2(9): 1198-202), or TN14003 (FEBS Lett. 2004; 569(1-3):99-104; Cancer Res. 2004;64(12):4302-8）、又はＣＸＣＲ４の二量体化を妨げる抗体であり得るが、これらに限定されない。
【００５９】
ＣＸＣＲ３拮抗薬は、ＴＡＫ−７７９（J Leukoc Biol. 2003; 73(2):273-80）、 ＡＫ６０２（J Virol. 2004; 78(16):8654-62）、又はＳＣＨ−３５１１２５（J Virol. 2004; 78(8):4134-44; J Virol. 2003; 77(9):5201-8）、又はＣＸＣＲ３の二量体化を妨げる抗体であり得るが、これらに限定されない。
【００６０】
ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１拮抗薬は、タンニン酸（Clin Cancer Res. 2003; 9(8):3115-23）、ＮＳＣ６５１０１６（Clin Cancer Res. 2002; 8(12):3955-60）又はＣＸＣＲ４及び／又はＳＤＦ−１の二量体化を妨げる抗体であり得るが、これらに限定されない。
【００６１】
選択的ＰＫＣ阻害剤は、サリドマイド又はＧＦ１０９２３０Ｘ（J Biol Chem 1991 ; 266:15771-81）であり得るが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明は、又、抗サイトカイン又はサイトカイン受容体抗体のような、抗遁走性剤を提供する。種々の抗体、及びそれらの製造法は、当該技術分野周知である。それゆえ、本発明の抗サイトカイン又はサイトカイン受容体抗体は、目的のサイトカインのエピトープ領域を認識する断片化又は非断片化抗体を含んでいてもよい。当該技術分野周知であるように、抗体分子の小部分のみ、すなわちパラトープが、そのエピトープへの抗体の結合に関与している（一般的に、Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons. Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照）。例えば、ｐＦｃ’及びＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与していない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されている抗体、又はｐＦｃ’領域なしに製造された抗体は、（Ｆ（ａｂ’）２断片という）、未変性の抗体の両方の抗原結合部位を保持している。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されている抗体、又はＦｃ領域なしに製造された抗体は、（Ｆａｂ断片という）、未変性の抗体分子の抗原結合部位の１つを保持している。さらに突き進めると、Ｆａｂ断片は、共有結合した抗体軽鎖及びＦｄで表される抗体重鎖の部分からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要決定基（単一のＦｄ断片は、抗体特異性を変化することなく１０の異なった軽鎖を伴っていてもよい）であり、Ｆｄ断片は、分離した状態でエピトープ結合能を保持している。
【００６３】
当該技術分野で周知のように、抗体の抗原結合部分内には、抗体のエピトープと直接作用する、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、及びパラトープの三次構造を保持する、フレームワーク領域（ＦＲｓ）がある（一般的に、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照）。重鎖Ｆｄ断片及びＩｇＧ免疫グロブリンの軽鎖の両者には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）によってそれぞれ分離されている４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）がある。ＣＤＲｓは、特にＣＤＲ３領域、より具体的には重鎖ＣＤＲ３において、抗体特異性に多大に関わっている。
【００６４】
哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域は、同種又は異種特異性抗体の同様な領域で入れ替わっているが、元の抗体のエピトープ特異性を保持していることは当該技術分野では既定のことである。このことは、機能的抗体を製造するうえで、非ヒトＣＤＲｓがヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有的に結合している「ヒト化」抗体の開発及び使用において最も明確に示されている。例えば、国際公開第ＷＯ９２／０４３８１号公報は、ネズミのＦＲ領域の少なくとも一部分がヒト由来のＦＲ領域によって置換されたヒト化ネズミＲＳＶ抗体の製造及び使用を教示している。このような、抗原結合能を有する未変性の抗体の断片を含む抗体は「キメラ」抗体と称されるものである。
【００６５】
それゆえ、当業者には明らかであるように、本発明は、又、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄ断片；Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同のヒト又は非ヒト配列によって置換されたキメラ抗体；当該ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同のヒト又は非ヒト配列によって置換されたキメラＦ（ａｂ’）２断片抗体；当該ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同のヒト又は非ヒト配列によって置換されたキメラＦａｂ断片抗体；及び当該ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が相同のヒト又は非ヒト配列によって置換されたキメラＦｄ断片抗体を提供する。
【００６６】
なお別の態様において、本発明はさらに、対象において治療反応を提供する遁走性を調節する方法に関し、特異的部位に関与する病態を有する対象の免疫反応を増強する方法を提供するものである。当該方法は、そのような治療を必要とする対象の特異的部位に、対象の特異的部位で免疫細胞特異的遁走活性を阻害するのに有効な量の抗遁走性剤を、局所的に投与することを含む。いくつかの態様において、特異的部位とは病原性感染の部位である。従って、感染の除去を助ける免疫細胞の効果的な補充が有益である。
【００６７】
感染は感染性病原体に曝露することに起因し、病原体には、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫及び真菌が含まれる。
【００６８】
ヒトにおいて見出されているウイルスの例としては：レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＤＴＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶＥ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）のような、ヒト免疫不全ウイルス；及びＨＩＶ−ＬＰのような他の分離株）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクザッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（例えば、胃腸炎の原因となる株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体（ＲＳ）ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンターンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルス及びナイロウイルス）アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びイリドウイルス科（例えば、アフリカブタコレラウイルス）；及び未分類ウイルス（例えば、デルタ型肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトと考えられている）、非Ａ非Ｂ型肝炎（１型＝内部伝染；２型＝非経口伝染（すなわち、Ｃ型肝炎））；ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
グラム陰性及びグラム陽性細菌の両者が、脊椎動物において抗原としての役目を果たしている。そのようなグラム陽性細菌には、パスツレラ（Pasteurella）種、スタフィロコッカス（Staphylococcus）種、及びストレプトコッカス（Streptococcus）種が含まれるがこれらに限定されるものではない。グラム陰性細菌には、エシェリヒア・コリー（大腸菌、Escherichia coli）、シュードモナス種（Pseudomonas）、及びサルモネラ（Salmonella）種が含まれるがこれらに限定されるものではない。感染細菌の特定の例としては、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、ボレリア・バーグドオルフェリー（Borrelia burgdorferi）、レジオネラ・ニュウモフィラ（Legionella pneumophila）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属（例えば、Ｍ．ツベルクローシス（M. tuberculosis）、Ｍ．アビウム（M. avium）、Ｍ．イントラセルラーレ（M. intracellulare）、Ｍ．カンサシイ（M. kansasii）、Ｍ．ゴルドネ（M. gordonae）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ナイセリア・ゴノロエ（Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニンギイティディス（Neisseria meningitidis）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（Ａ群レンサ球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）（Ｂ群レンサ球菌）、ストレプトコッカス（ビリダンスレンサ球菌群）、ストレプトコッカス・フェカーリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・ボービス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス（嫌気性種）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、病原性カンピロバクター種（pathogenic Campylobacter sp.）、エンテロコッカス種（Enterococcus sp.）、ヘモフィレス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、バシラス・アントラシス（Bacillus anthracis）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム種、エリシペロトリックス・リューシオパチエ（Erysipelothrix rhusiopathiae）、クロストリジウム・パーフィリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・テタニー（Clostridium tetani）、エンテロバクター・エロゲネス（Enterobacter aerogenes）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、パスツレラ・マルトシダ（Pasturella multocida）、バクテロイデス種（Bacteroides sp.）、フゾバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、ストレプトバチラス・モニリフォーミス（Streptobacillus moniliformis）、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）、トレポネーマ・パーテヌエ（Treponema pertenue）、レプトスピラ（Leptospira）、リケッチア（Rickettsia）、及びアクチノマイセス・イスラエリイ（Actinomyces israelli）が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００７０】
真菌の例としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシディオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）が挙げられる。
【００７１】
その他の感染生物（すなわち、原生生物）としては、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、卵型マラリア原虫（Plasmodium ovale）、及び三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）のようなプラスモジウム属（Plasmodium spp.）、及びトキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）を含む。血液伝達及び／又は組織寄生体は、プラスモジウム属、畑ネズミバベシア（Babesia microti）、バベシア・ジバージェンス（Babesia divergens）、熱帯リューシュマニア（Leishmania tropica）、リューシュマニア属（Leishmania spp.）、ブラジル・リューシュマニア（Leishmania braziliensis）、ドノバン・リューシュマニア（Leishmania donovani）、ガンビア・トリパノソーマ（Trypanosoma gambiense）及びトリパノソーマ・ローデシエンセ（Trypanosoma rhodesiense）（アフリカ睡眠病）、クルーズ・トリパノソーマ（シャガス病）（Trypanosoma cruzi）、及びトキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）を含む。
【００７２】
その他の医学上関連する微生物は、頻繁に文献に記載されてきたが、例えば、C.G.A. Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983を参照のこと、この内容は参照してその全てを本明細書に取り込む。
【００７３】
ある特定の態様において、特異的部位とは生殖細胞含有部位である。この場合、これらの特異的部位への免疫細胞の補充は、望ましくない生殖細胞、及び／又は移植された及び非移植胚を取り除く一助となるであろう。さらなる態様において、抗遁走性剤以外の避妊薬の共投与も又提供される。非抗遁走性避妊薬は当該技術分野で周知である。
【００７４】
さらなる態様において、特異的部位は、癌又は腫瘍の直ぐ周辺の領域である。大部分の公知の腫瘍は、免疫認識を逃れるので、腫瘍部位への免疫細胞の遊走を増強することは有益である。
【００７５】
癌又は腫瘍は、以下を含む：胆道癌；グリア芽腫及び髄芽腫を含む、脳腫瘍；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；大腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；急性リンパ性白血病及び骨髄性白血病を含む、血液新生物；多発性骨髄腫；エイズ関連白血病及び成人T細胞白血病・リンパ腫；ボーエン病及びページェット病を含む、上皮内新生物；肝臓癌（肝細胞癌）；肺癌；ホジキン病及びリンパ球性リンパ腫を含む、リンパ腫；神経芽細胞腫；扁平上皮細胞癌を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、胚細胞及び間葉細胞から発生するものを含む、卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫及び骨肉腫を含む、非上皮性悪性腫瘍；メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞癌及び扁平上皮細胞癌を含む、皮膚癌；生殖器腫瘍（精上皮腫、非精上皮腫［奇形腫、絨毛癌］）、間質腫瘍及び胚細胞腫瘍を含む、精巣癌；甲状腺々癌及び髄様癌を含む、甲状腺癌；及び腺癌及びウィルムス腫瘍を含む腎臓癌。重要な態様において、免疫認識から逃れる癌又は腫瘍は、神経膠腫、結腸癌、結腸直腸癌、リンパ球様細胞由来白血病、絨毛癌及びメラノーマを含む。
【００７６】
さらなる態様において、抗遁走性剤以外の抗ガン剤の共投与も、又、提供される。非抗遁走性抗ガン剤は、以下を含む：アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アンスラマイシン；アスパラギナーゼ；アスパーリン（Asperlin）；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィド・ジメシラート；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナール・ナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；サイロレマイシン（Cirolemycin）；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトール・メシラート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニン・メシラート；ジアジクォン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン（Duazomycin）；エダトレキサート；塩酸エフロリチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ―Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；塩酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；マイトジリン；マイトマルシン（Mitomalcin）；マイトマイシン；マイトスパー（Mitosper）；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；マイコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポドフィロックス；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピ���ーロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾトシン；スロフェヌル；タリソマイシン；タキソテール；テコガランナトリウム；テガフル；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；塩酸トポテカム；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシル・マスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルリン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビンエピジン（vinepidine）；硫酸ビングリシネート（Vinglycinate）；硫酸ビンロイロシン（vinleurosine）；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビルロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン。
【００７７】
本発明のさらなる態様によると、対象における腫瘍細胞の転移を阻害する方法が提供される。当該方法は、対象において腫瘍部位から腫瘍細胞の転移を阻害するのに有効な量で、抗遁走性剤を、そのような治療を必要とする対象の腫瘍部位に局所的に投与することを含む。ある特定の態様において、抗遁走性剤は、サイトカイン二量体である。別の態様において、サイトカイン結合剤は、抗サイトカイン抗体又はサイトカイン作動薬である。好ましい態様において、サイトカインは、ＳＤＦ−１αである。さらなる態様において、抗遁走性剤以外の抗ガン剤の共投与が提供される。抗ガン剤及び抗遁走性剤は、前述のとおりである。
【００７８】
腫瘍細胞は、近隣組織から放出されたケモカインを受けて、組織を経由して移動して原腫瘍から離れるように動き、浸潤性の腫瘍細胞のコグネイトケモカイン受容体に結合するケモカインを放出する特異な組織に転移する。腫瘍細胞（及び腫瘍内部の間質組織）は高濃度のケモカインを産生し、それは又、腫瘍の周辺で腫瘍細胞の化学反発（chemorepulsion）を引き起こして局所浸潤と転移をもたらす。本発明の抗遁走性剤は、腫瘍細胞の化学反発を遮断し、それによって癌を拡張する原因となる浸潤と転移を減少又は防止する。
【００７９】
本発明のさらなる態様によると、対象における避妊方法が提供される。当該方法は、対象において生殖細胞の遊走を阻害するに効果的な量の抗遁走性剤を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。ある特定の態様において、抗遁走性剤は、サイトカイン結合剤である。ある実施態様において、サイトカイン結合剤は、抗サイトカイン抗体又はサイトカイン作動薬である。好ましい態様において、サイトカインは、ＳＤＦ−１αである。さらなる態様において、投与は、対象の生殖細胞含有部位への局所投与である。
【００８０】
上に記載した組成物は、有効量が投与される。有効量は、投与形態、治療される特定の病態及び望まれる結果に依存する。上記で考察したように、対象の病期、年齢及び身体的条件、もしあれば併用療法の性質、及び医師には周知である要因にも依存するであろう。治療に適用するには、医療上の望ましい結果を得ることができる充分な投与量に依存する。ある場合には、これは、炎症の局所的（部位特異的）軽減である。別の場合には、それは、腫瘍増殖及び／又は転移の阻害である。
【００８１】
一般的に、本発明の活性化合物の投与量は、１日当たり、約０．０１ｍｇ／ｋｇから１日当たり１０００ｍｇ／ｋｇであろう。５０〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量が適切であろうと予測される。種々の投与経路が使用可能である。一般的には、本発明の方法は、臨床的に許容できない副作用を呈することなく、当該活性成分が効果を奏す、医学的に許容されるいかなる投与形態で実施されてもよい。そのような投与形態には、経口、経直腸、局所、経鼻、皮内又は非経口経路が含まれる。「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内又は注入を含む。静脈内又は筋肉内経路は、長期間の治療及び予防にはあまり適していない。しかし、それらは、緊急の状態には好ましい。経口投与は、患者にとっても投与計画にも便利であるので予防治療には好ましいであろう。ペプチドを治療的に使用する時、ある特定の態様において、望ましい投与経路は、肺のエーロゾル吸入である。ペプチドを含有するエーロゾル送達系をつくる技術は、当業者に周知である。一般的に、そのような系は、パラトープ結合能のような抗体の生物学的性質を著しく損なうことのない成分を利用すべきである（例えば、Sciarra and Cutie, “Aerosols”, in Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, pp 1694-1712を参照されたい。また当該文献は、参照して当該明細書に取り込む）。当業者であれば、過度の実験を行うことなく、抗体又はペプチドを製造する種々のパラメーター及び条件を容易に決定することができる。
【００８２】
経口投与に適した組成物は、活性剤の所定量を含有するカプセル、錠剤、トローチ剤のような、個々の単位として提供されてもよい。その他の組成物は、シロップ、エリキシル又はエマルジョンのような水性液剤又は非水性液剤の懸濁液を含む。
【００８３】
非経口用の調合液としては、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液及びエマルジョンを含む。非水性溶媒の例としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような食用油及びオレイン酸エチルのような有機エステルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン又は懸濁液を包含し、生理食塩水及び緩衝媒体も含む。非経口媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液又は不揮発性油を含む。静注媒体は、補液及び栄養補液、（リンゲルデキストロースを基本としたような）電解質補液、その他を含む。保存料及びその他の添加物もあり、例えば、抗生物質、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスその他が提示される。低投与量は、静脈投与のような、他の投与形態からもたらされる。対象における反応が、適用された初期の投与量で不十分の場合には、高投与量（又は、異なった、より局所的な送達経路による効果的な高投与量）を、患者の耐性が許容される程度まで適用してもよい。１日当たり複数回投与が化合物の適切な全身の濃度を達成するよう考慮される。
【００８４】
遁走性剤、遁走性結合剤、これらの断片及び／又は抗遁走性剤は、任意に、医薬として許容される担体と組み合わせてもよい。本明細書で使用される「医薬として許容される担体」という用語は、ヒトに投与するのに適している相性のよい１つ又はそれ以上の固体又は液体賦形剤、希釈剤又はカプセル化物質を意味している。「担体」という用語は、有効成分の適用を助けるために組み合わされる、有機又は無機成分、未変性又は合成のものを意味する。又、医薬組成物の成分は、望ましい医薬の有効性を実質的に損傷する相互作用がないような方法で、互に、本発明の分子と混ざり合うことができるものである。
【００８５】
他の態様における本発明は、遁走性剤及び抗遁走性剤の医薬組成物を含む。
【００８６】
投与に際しては、本発明の医薬組成物は、医薬として許容される量及び医薬として許容されるような組成物として適用される。そのような組成物は、通常、塩、緩衝剤、保存料、相性のよい担体、及び任意にその他の治療剤を含有してもよい。医薬として使用する時には、塩は、医薬として許容されねばならないが、医薬として非許容の塩も便宜的に医薬として許容される塩を製造するために使用してもよく、本発明の範囲から排除されるものではない。そのような薬理学的に及び医薬として許容される塩は、限定されないが、以下の塩から製造されるものを含む：塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、その他。又、医薬として許容される塩は、ナトリウム、カリウム又はカルシウム塩のようなアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩として製造することができる。
【００８７】
遁走性分子及び／又は抗遁走性分子（核酸又はポリペプチド）は、そのような分子は生物抽出物から単離してもよいが、好ましくは、組換え体として製造される。代わりに、遁走性剤及び／又は抗遁走性剤をコードした細胞の直接的投与も又考慮される。
【００８８】
ＳＤＦ−１αのような組み換え的に製造された遁走性剤は、ＳＤＦ−１αタンパク質と他のポリペプチド、例えば、タンパク質−タンパク質結合、配列特異的核酸結合（ＧＡＬ４のような）を提供又は増強することができるポリペプチド、アッセイ条件下でＳＤＦ−１αポリペプチドの安定性を増強することができるポリペプチド、又は緑色蛍光タンパク質のような検出し得る部分を提供することができるポリペプチド、との融合体を含むキメラタンパク質を含む。ＳＤＦ−１αポリペプチド又は断片に融合するポリペプチドは、例えば、免疫学的認識によって又は蛍光標識によって、融合タンパク質を容易に検出する手段も提供できる。
【００８９】
核酸をホストに、インビトロ又はインビボで導入するかによって、細胞に本発明の核酸（ＳＤＦ−１αセンス及びアンチセンス、ドミナントネガティブ）を導入するために、種々の技術を採用することができる。そのような技術は、核酸−ＣａＰＯ４共沈物のトランスフェクション、ＤＥＡＥと会合した核酸のトランスフェクション、目的の核酸を含むレトロウイルスでのトランスフェクション、リポソーム介在トランスフェクション、その他を含む。これらのいくつかを使用するのに、核酸を特定の細胞に対して標的とすることが好ましい。そのような例としては、本発明の核酸を細胞に送達するために使用する伝達手段（例えば、レトロウイルス、又はその他のウイルス；リポソーム）が、それに付着する標的分子を持つことができる。例えば、標的細胞の表面膜タンパク質に特異的な抗体、又は標的細胞の受容体に対するリガンドのような分子が、核酸送達手段に結合することができ、又はその中に取り込まれることができる。例えば、本発明の核酸を送達するためにリポソームを採用した場合、エンドサイトーシスに関連した表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、標的用の及び／又は取り込みを促進するためのリポソーム製剤に取り込まれる。そのようなタンパク質は、特定の細胞型に影響を及ぼすカプシドタンパク質又はそれらの断片、循環してインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を増強するタンパク質、その他を含む。重合体化送達系も又、当業者に知られているように、細胞への核酸を成功裏に送達するために使用されてきた。そのような系により、核酸の経口送達が可能となる。
【００９０】
その他の送達系は、持続放出、遅延放出又は徐放送達系を含む。そのような系は、遁走性剤の反復投与を回避することができ、対象及び医師に対し利便性が向上する。多くの放出遅延系の型は、当業者に利用可能であり公知である。それらは、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキザレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ無水物のようなポリマー基剤系を含む。薬剤を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達系は、又、非ポリマー系も含む、すなわち、コレステロール、コレステロールエステル及び脂肪酸のようなステロール又はモノ−、ジ−及びトリ−グリセリドのような中性脂肪；ヒドロゲル放出系；サイラスティック（シリコン剤）系（sylastic system）；ペプチドを基準とした系；ワックスコーティング；通常の結合剤及び賦形剤を使用した圧縮錠剤；部分的に融合した移植剤；その他である。特異的な例としては、限定されないが：（ａ）抗炎症剤が、米国特許第４，４５２，７７５号、第４，６６７，０１４号、第４，７４８，０３４号及び第５，２３９，６６０号に記載されているようなマトリックス内の形態に含有されている浸食系、及び（ｂ）米国特許第３，８３２，２５３号及び第３，８５４，４８０号に記載されているように、活性化合物が、制御された速度で透過する拡散系を含む。
【００９１】
本発明の好ましい送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系は、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質を基準とする系を含む。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビボ又はインビトロで送達ベクターとして有用な人工膜容器である。大きさが０．２から４．０ｍｍの範囲である、大きな単層の容器（ＬＵＶ）が、大きなマクロ分子をカプセル化することができることが示されてきた。ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び未変性のビリオンを、水性内容物内にカプセル化することができ、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., (1981)6:77）。リポソームが効率的な遺伝子輸送ベクターであるためには、１つ又はそれ以上の以下の特徴がなければならない：（１）生物活性を保持して高い効率で関連した遺伝子をカプセル化すること；（２）非標的細胞と比較して標的細胞に優先的に及び充分に結合すること；（３）標的細胞の細胞質に高い効率でベシクルの水性内容物が送達されること；及び（４）遺伝情報が正確かつ効果的に発現されること。
【００９２】
リポソームは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、又はタンパク質のような特異的リガンドに対してリポソームが結合することによって特定の組織を標的とすることができる。リポソームは、例えば、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）のような陽イオン性脂質の形態をしている、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ．ＴＭ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ．ＴＭ．として、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから市販されている。リポソームを製造する方法は、当該技術分野で周知であり、多くの刊行物に記載されていた。リポソームは又、Gregoriadis, G. in Trends in Biotechnology, (1985) 3:235-241に総説として記載されていた。
【００９３】
一態様において、伝達手段は、哺乳動物の受容者に移植に適した生分解性微小粒子又は移植物である。本方法に従って有用な例示的な生体内分解性の移植物は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７号（国際公開第９５／２４９２９号、名称：Polymeric Gene Delivery System）に記載されている。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７号は、適切なプロモーターの制御下の外来遺伝子を含有するための好ましくは生分解性ポリマー・マトリックスを記載している。当該ポリマー・マトリックスは、患者において、外来遺伝子の徐放性を達成するために使用される。本発明によると、本明細書に記載された遁走性剤及び／又は抗遁走性剤は、生体適合性、好ましくは国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７号に記載されている生分解性ポリマー・マトリックスの内部にカプセル化又は分散される。
【００９４】
ポリマー・マトリックスは、好ましくは、ミクロスフェア（遁走性剤及び／又は抗遁走性剤が固体のポリマー・マトリックスを通して分散されている）又はマイクロカプセル（遁走性剤及び／又は抗遁走性剤はポリマー殻のコアに格納されている）のような微小粒子の形態である。遁走性剤を含ませるためのポリマー・マトリックスの別の形態は、フィルム、コーティング（被覆）、ゲル、インプラント、及びステントを含む。ポリマー・マトリックス装置の大きさ及び組成物は、マトリックスが導入される組織での望ましい放出動力学をもたらすように選択される。更にポリマー・マトリックスの大きさは、使用されるべき送達方法に従って選択される。好ましくは、エーロゾル経路が使用される時、ポリマー・マトリックス及び遁走性剤は、界面活性剤ビヒクルに含ませて用いられる。ポリマー・マトリックス組成物は、輸送の有効性が更に増すように、共に良好な分解速度を有するよう、及び生体接着性の材料で形成されるように選択することができる。マトリックス組成物は又、長期間にわたって分解せず、むしろ分散により放出するよう選択することができる。
【００９５】
別の重要な態様において、送達系は、局所的に、部位特異的送達に適している生体適合性ミクロスフェアである。そのようなミクロスフェアは、Chickeringらの Biotech. And Bioeng., (1996) 52:96-101及びMathiowitzらの Nature, (1997)386:410-414 に記載されている。
【００９６】
本発明の遁走性剤は、非生分解性及び生分解性ポリマー・マトリックスの両方を用いて対象に送達することができるが、生分解性マトリックスが好ましい。そのようなポリマーは、未変性又は合成ポリマーであってもよいが、合成ポリマーが好ましい。望ましい放出時間に合わせてポリマーを選択するが、一般的には、２〜３時間から１年又はそれ以上の長期間のオーダーである。通常は、２〜３時間乃至３〜１２ヵ月の範囲内での放出が特に好ましい。ポリマーは、含水重量の約９０％まで吸収することができるヒドロゲルの形態であってもよく、更に、多価イオン又は他のポリマーと架橋していてもよい。
【００９７】
一般的に、遁走性剤及び／又は抗遁走性剤は、分散により、又はより好ましくは、ポリマー・マトリックスの分解により生体内分解性移植物を使用して送達される。生分解性送達系を形成するように使用することができる例示的な合成ポリマーは以下を含む：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びその共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸エステル及びメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシエチルセルロース、三酢酸セルロース、硫酸セルロースナトリウム塩、ポリメタクリル酸メチル、ポリメタクリル酸エチル、ポリメタクリル酸ブチル、ポリメタクリル酸イソブチル、ポリメタクリル酸ヘキシル、ポリメタクリル酸イソデシル、ポリメタクリル酸ラウリル、ポリメタクリル酸フェニル、ポリアクリル酸メチル、ポリアクリル酸イソプロピル、ポリアクリル酸イソブチル、ポリアクリル酸オクタデシル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、及び乳酸とグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、及びポリ（ラクチド−コカプロラクトン）、及び、アルギン酸塩及び、デキストラン及びセルロースを含む多糖類、コラーゲン、これらの化学誘導体（置換、化学基、例えば、アルキル、アルキレン、の付加、水酸化、酸化、及び当業者によって通常行われるその他の修飾）、アルブミン及びその他の親水性タンパク質、ゼイン及びその他のプロラミン及び疎水性タンパク質、これらのコポリマー及び混合物、のような未変性のポリマー。一般的に、これらの材料は、インビボで酵素的加水分解又は水への曝露のいずれかによって、表面又は全体の浸食により分解する。
【００９８】
非生分解性ポリマーの例としては、エチレン酢酸ビニル、ポリメタクリル酸、ポリアミド、これらのコポリマー及び混合物を含む。
【００９９】
特に関連する生体接着性ポリマーは、H.S. Sawhney, C.P. Pathak and J.A. Hubell in Macromolecules, (1993) 26:581-587（この教示は本明細書に組み入れられている）によって記載されている生侵食性ヒドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリメタクリル酸メチル、ポリメタクリル酸エチル、ポリメタクリル酸ブチル、ポリメタアクリル酸イソブチル、ポリメタクリル酸ヘキシル、ポリメタクリル酸イソデシル、ポリメタクリル酸ラウリル、ポリメタクリル酸フェニル、ポリアクリル酸メチル、ポリアクリル酸イソプロピル、ポリアクリル酸イソブチル、及びポリアクリル酸オクタデシル、を含む。
【０１００】
また、本発明の重要な態様は、ポンプを使用したハードウエア送達系で、そのいくつかは移植に適合しているものを含む。そのような移植可能なポンプは、制御放出マイクロチップを含む。好ましい制御放出マイクロチップは、Santini, J.T. Jr.らの Nature, 1999, 397:335-338に記載されており、その内容を参照して本明細書に明確に取り込む。
【０１０１】
長期間の徐放性放出インプラントの使用は、慢性症状の治療に特に適している。本明細書に使用される長期間放出は、インプラントが、少なくとも３０日間、好ましくは６０日間有効成分の治療濃度を送達するように構成され、配置されていることを意味する。
【０１０２】
ある特定の態様において、本発明の単離された遁走性剤は、炎症のある部位、例えば、関節リウマチの患者の場合の関節、動脈硬化症の器官の血管、等に直接送達される。例えば、これは、単離した遁走性分子（核酸又はタンパク質）をバルーンカテーテルの表面に付着させ、炎症の部位、例えば動脈硬化血管にバルーンの部分が位置するまで患者にカテーテルを挿入し、そしてバルーン表面を閉塞部位の血管壁に接触するようバルーンを膨らませることによって達成することができる。このようにして、組成物を特定の炎症部位に局所的に標的化させて、免疫細胞遊走を調節することができる。別の例において、局所投与は、そのような治療を必要とする部位への移植可能なポンプを含む。好ましいポンプは、上に記載のとおりである。さらなる例において、膿瘍の治療に際し、遁走性剤は、例えば軟膏／皮膚用製剤として局所的に送達してもよい。本発明の遁走性剤は、非遁走性分子（例えば、抗炎症剤、免疫抑制剤、等）と併用して送達してもよい。
【０１０３】
本発明の好ましい態様において、本発明の単離された遁走性剤は、バルーン血管形成法と組み合わせて対象に投与される。バルーン血管形成法は、しぼんだバルーンを有するカテーテルを動脈に挿入することを含む。しぼんだバルーンを、動脈硬化性プラーク及び炎症部位の近傍に位置させ、プラークが動脈壁に対して圧縮されるように膨らませる。その結果、当該動脈の表面の内皮細胞の層が壊され、それによって下にある血管平滑筋細胞が露出する。単離された遁走性分子は、動脈硬化性プラークの部位及び炎症部位で単離された遁走性分子の放出ができるような方式で、バルーン血管形成カテーテルに付着されている。単離された遁走性分子は、当業者に公知の標準的手順によりバルーン血管形成カテーテルに付着させることができる。例えば、単離された遁走性分子は、バルーンが膨らませられ、その点で局所環境に放出されるまで、バルーン血管形成カテーテルのコンパートメントに留め置かれてもよい。別に、単離した遁走性分子は、バルーンが膨らませられると動脈壁の細胞に接触するように、バルーン表面に含浸されていてもよい。遁走性分子は、又、Flugelmanらの Circulation, v.85, p. 1110-1117(1992)に開示されているように有孔バルーンカテーテルで送達してもよい。又、例えば、治療タンパク質をバルーン血管形成カテーテルに付着する例示的方法については、ＰＣＴ国際特許出願第９５／２３１６１号公報を参照されたい。治療用核酸をバルーン血管形成カテーテルに付着させるために、通常の実験を行うだけでこの方法を改変することができる。
【０１０４】
当業者であれば、本明細書に記載された本発明の特異的態様に相当する多くの均等物を認識するであろうし、あるいは通常の実験のみを用いて確認することができるであろう。そのような均等物は、特許請求の範囲に含まれるように意図されている。本明細書に開示されている全ての文献は、参照してその全てを本明細書に取り込む。
【０１０５】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より十分に理解されるであろう。しかし、これらの実施例は、本発明の態様を単に例示するためのものであり、本発明の範囲を何ら制限するものではないと理解されたい。
【実施例１】
【０１０６】
抗遁走性剤はメラノーマによる免疫回避を減少させる
Ｔ細胞は、濃度依存性性に、また、ＣＸＣＲ４受容体媒介機構によってＳＤＦ−１により撃退される。腫瘍抗原特異性Ｔ細胞が、ＳＤＦ−１を発現する腫瘍に撃退（repulsion）されることにより、腫瘍細胞は免疫制御を回避できる。抗遁走性剤は本明細書に示されるように、腫瘍に対する免疫防御を回復させるものである。
【０１０７】
Ｉ．材料と方法
Ａ．Ｃ５７Ｂｌ／６及びＯＴ−Ｉマウス
６〜１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを全ての実験に使用した  （Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）。ＯＴ−Ｉ ＴＣＲトランスジェニックマウスは、W.R. Heath and F. Carbone (Walter and ELiza Hall Institute, Melbourne, Australia)により提供された。このＯＴ−Ｉ ＴＣＲは、ＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現し、ＭＨＣクラスＩ分子Ｈ２−Ｋｂ（Hogquist, K.A., et al. 1994 Cell 76:17-2）に結合するペプチドＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に特異的である。
【０１０８】
Ｂ．細胞株及びＯＴ−ＩＣＴＬｓの調製
ニワトリＯＶＡ（Ｂ１６／ＯＶＡ．ｐｃ）を安定して発現しているＢ１６メラノーマ細胞（Ｈ２ｂ）は、Drs. E. Lord 及び J. Frelinger（Brown, D.M. et al., 2001 Immunology 102:486-497）によって提供された。ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＯＴ−Ｉマウスの脾臓及びリンパ節から、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ及びＳｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  （ＭＡＣＳ）システム（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を使用して単離し、培養して、拡張させた（Delfts, M.W. et al. 2001, Transplantation 71:606-610）。ＣＸＣＲ４発現について、Ｂ１６細胞とナイーブ又はエフェクターＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＸＣＲ４−ＦＩＴＣ  Ａｂ（クローン２Ｂ１１、BD Pharmingen）を使用して免疫染色し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Tree Star, Inc. Ashland, OR）を使用してＦＡＣＳ（Beckton Dickinson）で分析した。活性化ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞も又、ネズミｒＳＤＦ−１α（PeproTech, Rocky Hill, NJ）に、最終濃度１０，１００及び１０００ｎｇ／ｍｌで、２４又は７２時間曝露した。細胞を、ＦＩＴＣ結合アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（Detection kit I, BD Pharmingen）と共にインキュベートした。さらに、ＣＤ６９（クローンＨ１−２Ｆ３）及びＣＤ２５（クローンＰＣ６１、全てBD Pharmingenより）の発現及びＣＦＳＥ染色の定量により、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞のアポトーシス、活性化及び増殖に対するＳＤＦ−１の効果を評価した。アポトーシスを起こした細胞のパーセンテージはＦｌｏｗＪｏソフトウエアを使用してＦＡＣＳにより分析した。
【０１０９】
Ｔ細胞増殖に於けるＳＤＦ−１の効果を解析するため、２×１０５のＯＴ−Ｉ総脾細胞又は精製したＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）（BD Pharmingen）でプレコートした９６丸底ウェルプレートで、可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ（２μｇ／ｍｌ）及びネズミｒＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）の存在下において、３日間増殖させた。ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞は、ネズミＳＤＦ−１で最終濃度５００又は１０００ｎｇ／ｍｌで、ＳＤＦ−１と３時間プレインキュベートした。各濃度のＳＤＦ−１を、増殖過程のＴ細胞に２４時間毎に加えた。
【０１１０】
ＣＦＳＥ分析のために、Ｔ細胞をＰＢＳ中１μＭのＣＦＳＥ（Molecular Probe, Inc., Eugene, OR）で１０分間プレインキュベートした。収穫時に、細胞を冷ＰＢＳバッファで２回洗浄し、抗ＣＤ６９及び抗ＣＤ２５ｍＡｂと、４℃にて１５分間インキュベートし、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）でフローサイトメトリーを実施した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Tree Star, Inc. Ashland, OR）で実施した。各々のマーカーについて、無関係のイソタイプに対応する対照抗体の存在下で観察された非特異的結合の域を越えて正の閾値が見出された。平均対数蛍光強度（ＭＦＩ）の値は、陽性に染色された試料のＭＦＩからイソタイプ対照のＭＦＩを差し引くことにより得た。細胞のピーク間の差が対照に較べて統計的に有意であるかどうかを評価するために、ヒストグラムの解析用のＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ（Ｋ−Ｓ）  ｔｅｓｔを使用した。
【０１１１】
Ｃ．ＳＤＦ−１を発現する遺伝子組換えＢ１６細胞の生成
ネズミＳＤＦ−１αのコード領域（８２−２３２ｂｐ）をＰＣＲで増幅し、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩのクローニング部位を使用して、ＥＧＦＰをコードするバイシストロニックネズミ幹細胞ウイルス由来のレトロウイルストランスファーベクターＭＳＣＶ２．２内にてクローン化した（図１Ａ）。クローニングの結果は、ＤＮＡ塩基配列決定法で確認した。リン酸カルシウム法を使用して、２９３Ｔ  ＨＥＫパッケージング細胞を、以下のベクターと同時形質移入した:ＥＧＦＰをコードするベクターＭＳＣＶ２．２−ＳＤＦ−１又はＭＳＣＶ２．２、パッケージングベクターｐＫａｔ、及びｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルスＧ−糖タンパク質をコードする）。ＳＤＦ−１及びＧＦＰ又はＧＦＰのみをコードするＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルスベクターを、トランスフェクション後４８及び７２時間に集め、Ｂ１６／ＯＶＡメラノーマ細胞の形質導入に使用した（Carlesso, N., et al. 1999, Blood 93:838-848）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶの最も輝度の高い１０％を選択するためにＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅセルソーター（Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ）を使用して細胞選別を実施し、高レベル及び低レベルの蛍光を有する２つの細胞集団をＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１低濃度細胞と称した（図１Ｂ）。
【０１１２】
Ｄ．ＳＤＦ−１生産及び生理活性の定量化
Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞を、８０〜９０％のコンフルエントに達するまで増殖させた。さらに、ＦＳＣを０．５％含有した培地で細胞を２４時間インキュベートした。ならし培地（ＣＭ）を収穫し、Ｂｉｏｍａｘ  ５Ｋ  ＮＭＷＬフィルターユニット（Millipore, Bedford, MA）を使用して濃縮した。ならし培地を、マウスモノクローナル抗ＳＤＦ−１Ａｂ（R&D Systems, Minneapolis, MN）、ＨＲＰ標識ヒツジ抗マウスＡｂ（Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ）、及びＥＣＬ検出キット（Amersham）を使用して、ウェスタンブロット法により分析した。ならし培地中のＳＤＦ−１の濃度は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（QUANTIKINE, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN）によって、決定した。２４時間培養したＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞からならし培地に分泌されたＯＶＡの濃度も又、ＥＬＩＳＡ（Alpha Diagnostic Int. San Antonio, TX）によって測定した。
【０１１３】
遊出（transmigration）アッセイの定量化は、（Poznansky, M.C., et al. 2000 Nature Med 6:543-548）に記載されたトランスウェル・システム（transwell system）を使用して実施した。精製したネズミＣＤ８＋Ｔ細胞（６×１０４細胞）を、各ウェルの上部チャンバーの総容量１５０μｌのＩｓｃｏｖｅ改変培地に加えた。ならし培地の２０倍濃縮、未希釈、又は０．５％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭで１：１０に希釈したものを、トランスウェルの下部、上部、又は下部と上部の両方のチャンバーに加え、細胞遊走の標準的な「チェッカーボード」解析を行った。更に、対照ウェルで、１００ｎｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌの濃度でｒＳＤＦ−１の走化性及び遁走活性を評価した。細胞の遊走は、前述の（Poznansky, M.C., et al. 2000 Nature Med 6:543-548）に記載されたようにして定量した。走化性指標（chemotactic index, CI）及び遁走性指標（fugetactic index, FI）は、実験条件で遊走した細胞数を、ならし培地の対照条件で遊走した細胞の数で除した数の間の比率として、上部及び下部チャンバーの両方について決定した。
【０１１４】
Ｅ．ナイーブ及び免疫化マウスにおけるＢ１６／ＯＶＡの腫瘍形成性
インビトロ増殖のために、５×１０５の腫瘍細胞をＴ２５フラスコ（Becton Dickinson, Le Pont De Claix, France）に播種した。培養物を、連続する３日間、毎日収穫し、生存細胞収量を測定した。腫瘍形成性は、２７Ｇ針を使用して、２×１０５の生存細胞を、総容量２００μｌのＰＢＳで、マウスの脇腹に皮下注射することによって決定した。腫瘍増殖も、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞で抗原投与して（challenged）、ＣＸＣＲ拮抗薬、ＡＭＤ３１００（１．２５ｍｇ／ｋｇ皮下注射、Sigma）を１日２回皮下注射したナイーブマウスで評価した。腫瘍増殖は、キャリパーを使用して３日又は４日毎に測定した。腫瘍容積は、２つの直交する直径（ａ×ｂ；ａ＝最長径；ｂ＝直交する巾）の積として記録した（Hanson, H.L., et al. 2000 Immunity 13:265-276）。免疫化試験では、マウスに、１×１０６個の照射（８５６８ｃＧｙ）されたＢ１６／ＯＶＡ．ｐｃ細胞を容量２００μｌで、第０日目及び第１０日目に、皮下注射（複数の部位）した。免疫化後１４日に、マウスに、２×１０５のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞を両脇腹に皮下注射により抗原投与し、腫瘍増殖を上記のようにして測定した（Dranoff, G., et al. 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:3539-3543）。いくつかの実験において、マウスをＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞で免疫化し、次いでＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１低濃度細胞を抗原投与した。マウスは、１つ又は両方の腫瘍が容積２００ｍｍ２に達した時に、屠殺した。
【０１１５】
Ｆ．養子免疫療法、ナノ粒子標識ＣＴＬの移送、及び生存率分析
生存率分析のために、マウスに、１×１０７のＨＢＳＳ５００μｌのＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈注射により投与した。２群のマウスに、対照としてＨＢＳＳを投与した。ＯＴ−Ｉ ＣＴＬの養子移植後２１日に、実験群及び対照群のマウスに、２００μｌの２×１０５個のＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞又はＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ対照細胞のＨＢＳＳを、２７Ｇ針を使用して右脇腹に皮下注射により抗原投与した（Bathe, O.F. et al. 2001 J Immunol 167:4511-4517）。腫瘍細胞増殖を、３〜４日毎に記録した。検出可能な腫瘍は、＞５ｍｍ２とした。腫瘍の大きさが４００ｍｍ２となった時、マウスを屠殺した。
【０１１６】
Ｔａｔペプチド誘導体化ＣＬＩＯ（ＣＬＩＯ−ＨＤ）は、記載されたようにして合成した（Kircher, M.F., et al. 2003 Cancer Res 63:6838-6846）。それぞれの実験のために、５×１０５個のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞を、マウスの右脇腹及び左脇腹のそれぞれに、皮下注射した。腫瘍の少なくとも１つの直径が１０〜１５ｍｍに達した時、インビトロで広がったＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞（Brown, D.M. et al. 2001 Immunology 102:486-497）を収穫し、ＣＬＩＯ−ＨＤ（３００μｇ／ｍｌ／１×１０７細胞）とインキュベートし、そして３×１０７の標識細胞を同様の大きさの腫瘍を両側に担癌したマウスに腹腔注射した。時間とともに分布したＣＬＩＯ−ＨＤ標識細胞をＭＲ撮像法（Bruker Pharmascan, 4.7 T）で、養子移植２４及び４８時間に評価した。３Ｄ再成を行うためにＴ２画像を使用し、Ｔ２の測定を、記載された（Kircher, M.F. 2003 Cancer Res 63:6838-6846）ようにして標識細胞の腫瘍性補充を定量化するのに使用した。
【０１１７】
画像処理中、マウスを１〜２％イソフルラン、１．５リットル／分で麻酔した。Ｔ細胞補充の解析には、アキシャルＴ２強調グラジエントエコーシーケンス（ＴＲ＝６００ｍｓ、ＴＥ＝６．０、ＦＯＶ  ４．２４×２．１２ｃｍ、ＭＴＸ  ２５６×１２８、４平均）及びアキシャルＴ２強調高速スピンエコーシーケンス（ＴＲ＝２０００ｍｓ、ＴＥ＝４８．６ｍｓ、ＦＯＶ  ４．２４×２．１２ｃｍ、ＭＴＸ  ２５６×１２８、８平均）を使用した。Ｔ２適合値はマルチスライスマルチエコーシーケンスから誘導した（ＴＲ＝２０００ｍｓ、ＴＥ＝６．５×１６ｍｓ、ＦＯＶ  ４．２４×２．１２ｃｍ、ＭＴＸ  １２８×１２８、２平均）。腫瘍の関係領域は手で描写し、Ｔ２適合値は、イン・ハウスプログラム、ＣＭＩＤ−画像、を使用して計算した（Kircher, M.F., et al. 2003 Cancer Res 63:6838）。
【０１１８】
いくつかの実験において、活性化ＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞を、養子移植の前に、１２ウェルプレートにて密度１×１０７細胞／ウェルで、ＣＸＣＲ４拮抗薬、ＡＭＤ３１００を、濃度０．０８及び０．２５μｇ／ｍｌ（室温で１５分）で、ともに前培養した（Hatse, S., et al. 2002, FEBS Lett 527:255）。生存率分析は、腫瘍特異的記憶 Ｔ細胞コンパートメントのインビボ生成後マウスで評価した（Bathe, O.F., et al. 2001. J Immunol, 167:4511）。１×１０７のＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞、（５００μｌのＨＢＳＳを尾静脈から注射）、の養子移植後２１日に、２群のマウスに、２００μｌのＨＢＳＳ中、２×１０５個の、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞、又はＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ対照細胞を、２７Ｇ針を使用して右脇腹に皮下注射により抗原投与した（Bathe, O.F., et al. 2001. J Immunol, 167:4511）。対照として、養子移植を受けなかったマウス２群に、腫瘍を抗原投与した。検出可能な腫瘍は、＞５ｍｍ２とした。腫瘍の大きさが４００ｍｍ２となった時、マウスを屠殺した。
【０１１９】
Ｇ．腫瘍免疫組織化学及び腫瘍浸潤リンパ球のＦＡＣＳ分析
免疫化マウス及びＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移植を受けたマウスを、免疫組織化学によりＴ細胞浸潤を評価した。動物を屠殺し、腫瘍を摘出しカプセルに保存した。切除した腫瘍は１０％の中性緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。５μｍの腫瘍の連続切片を、Ｈ＆Ｅ染色又はポリクローナル抗ＣＤ３Ａｂ若しくはイソタイプ対照Ａｂで染色し、次いで２次ＨＲＰ標識抗ウサギＤａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ａｂ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）でインキュベートした。Ｔ細胞浸潤を、それぞれ０．５ｍｍ２領域の腫瘍切片を無作為に４つ、倍率２００倍で計数することにより定量した。
【０１２０】
ＦＡＣＳによる腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の定量は、生存率分析のためにＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞を投与された全てのマウスについて行った（Shrikant, P., et al. 1999. Immunity 11:483-493）。マウスを屠殺し、腫瘍及び２つの排出リンパ節を収穫した。ＣＤ８／ＴＣＲ−Ｖβ−５−１／Ｖα―２陽性細胞の総数を、１００ｍｇの腫瘍から回収した細胞の総数の割合から計算した。１００ｍｇの腫瘍組織を、２７０ＩＵ／ｍｌのＤＮＡａｓｅＩ、２００ＩＵ／ｍｌのコラゲナーゼ、及び３５ＩＵ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含有したＤＭＥＭ培地で、３７℃にて１時間処理し、ろ過して、ＨＢＳＳで３回洗浄した。
【０１２１】
２．４Ｇ２  ＡｂによるＦｃ結合後、５×１０５の細胞を抗ＣＤ８−ＡＰＣ（クローン５３−６．７）、Ｖα―２−ＴＣＲ―ＰＥ（クローンＢ２０−１）、Ｖβ―５．１，５．２−ＴＣＲ−ＦＩＴＣ（クローンＭＲ９−４）（BD Pharmingen）Ａｂｓで染色し、ＦＡＣＳで試験した。メラニン含有Ｂ１６腫瘍細胞は、ＦＡＣＳで側方拡散及び前方拡散によりＴＩＬから明確に区別した。各腫瘍断片中のＯＴ−ＩＣＤ８＋細胞の総数は、１００ｍｇの腫瘍から回収した細胞の総数中のＣＤ８／ＴＣＲ−Ｖβ−５−１／Ｖα―２陽性細胞の割合から計算した。
【０１２２】
Ｈ．インビトロでのＣＴＬ効力の定量
ＯＴ−ＩＣＤ８＋細胞の細胞毒性を、前述したように丸底ウェルでの標準５１Ｃｒ放出アッセイで測定した（Brainard, D.M., et al. 2004. J Virol 78:5184-5193）。さらに、ＳＤＦ−１を発現する標的細胞との関連においてＣＴＬ遊走の致死効果への効果を決定するために、アッセイを改変し平底ウェルで実施した（Hahne, M., et al. 1996 Science 274:1363-1366）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度標的細胞を、１００μＣｉ／１０６細胞の５１Ｃｒで、３７℃にて１時間標識した。１μＭのＯＶＡ特異性ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを適用した後、１００μｌのアリコート中の５１Ｃｒ標識標的細胞に希釈したエフェクター細胞を加えて、指定されたエフェクター対標的細胞比率（３０：１から１：１まで）をつくり、３７℃にて５％ＣＯ２下で５時間インキュベートした。上清３０μｌを収穫し、放射能をガンマ線カウンターでカウントした。前述のように、細胞毒性は、溶解比率として又は溶解単位３０（ＬＵ３０）としてのいずれかで表した（Brainard, D.M. et al. 2004. J Virol 78:5184-5193; Bryant, J., et al. 1992. J Immunol Meth 146:91-103）。さらに、５１Ｃｒ放出アッセイを、濃度０．２５及び１μｇ／ｍｌでＣＸＣＲ４拮抗薬ＡＭＤ３１００とＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞を前培養した後、平底ウェルによって実施した（Hatse, S. 2002 FEBS Lett 527:255-262）。
【０１２３】
さらに、ＣＴＬへのＳＤＦ−１の効果を、増殖しているＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞をＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−高濃度細胞又はＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ細胞と共培養後測定した。このアッセイで、５×１０６個のＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞を１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８及び５０Ｕ／ｍｌＩＬ−２の存在下で１２ウェルプレートにて５日間増殖させた。５×１０５のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−高濃度細胞を、０．４μＭポアのポリカーボネート膜（Corning Life Sciences, Acton, MA）に播種し、培養第１日から上部チャンバーに設置した。
【０１２４】
平行実験で、ＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞を、５００又は１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに毎日加えたｒＳＤＦ−１の存在下で、増殖させた。この一連の実験で、ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原を適用しないで、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−高濃度細胞に対してＣＴＬ殺活性を測定した。
【０１２５】
Ｉ．ＳＤＦ−１に曝露したＯＴ−ＩＴ細胞の活性化、増殖及びアポトーシスの解析
活性化したＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ネズミｒＳＤＦ−１α（Pepro Tech, Rocky Hill, NJ）に、最終濃度１０、１００及び１０００ｎｇ／ｍｌにて、２４時間又は７２時間曝露した。細胞を、ＦＩＴＣ結合アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（Detection Kit I, BD Pharmingen）とインキュベートした。アポトーシスを起こした細胞の比率を、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Colamussi, M.L., et al. 2001. J Leukoc Biol 69:263）を使用してＦＡＣＳにより解析した。Ｔ細胞増殖へのＳＤＦ−１の効果を解析するために、２×１０５のＯＴ−１総脾細胞又は精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を、２μｇ／ｍｌ可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ及び５０Ｕ／ｍｌネズミｒＩＬ−２の存在下にて１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ｍＡｂ（BD PharMingen）でプレコートした９６丸底ウェルプレートで３日間増殖させた。ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞を、ネズミｒＳＤＦ−１と最終濃度５００又は１０００ｎｇ／ｍｌで３時間プレインキュベートした。また、各濃度のＳＤＦ−１を、増殖しているＴ細胞に２４時間毎に加えた。
【０１２６】
ＣＦＳＥ分析のために、Ｔ細胞をＰＢＳ中で１０分間、１μＭのＣＦＳＥ（Molecular Probe, Inc., Eugene, OR）とプレインキュベートした。収穫時に、細胞を冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、抗ＣＤ６９及び抗ＣＤ２５ｍＡｂと４℃にて１５分間インキュベートして、フローサイトメトリーをＦＡＣＳ・Ｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）で実施した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Tree Star, Inc. Ashland, OR）で実施した。各マーカーについて、陽性度の閾値は、無関係のイソタイプにマッチした対照抗体の存在下で観察された非特異的結合の範囲を越えると見出された。平均対数蛍光強度（ＭＦＩ）は、陽性に染色された試料のＭＦＩからイソタイプ対照のＭＦＩを差し引くことにより得た。Kolmogorov-Smirnov (K-S)テストを使用して、ＭＦＩの分布間の差が、対照に対して統計的に有意であるがどうかを評価した。
【０１２７】
Ｊ．腫瘍微小環境において生成するＳＤＦ−１勾配の数学的モデル化
皮下Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１腫瘍の周辺及び内部のＳＤＦ−１濃度を数学的にモデル化した。正常組織の均質の無限媒体中にケモカインの球形起源として、腫瘍をモデル化した。当該モデルは、ＳＤＦ−１が腫瘍内部で産生されると同時に拡散によって分散され、そして腫瘍及び周辺組織の内部で分解されることを提示する。腫瘍の中心からの距離ｒでのケモカインの濃度ｃは、厚さΔｒの半径の殻の周辺のケモカイン濃度に対するマスバランスから定常状態で計算する。
【数１】
2008519052.tif 000002
式中、Ｖは、腫瘍の容積、ｃ及びＪは、ケモカインの濃度及び流量、Ｄは、拡散係数（０．６×１０−７ｃｍ２／ｓ）（Lankelma, J. et al. 2000. Microvasc Res 59:149-161）である。Ｇは、単位容積当たりのケモカイン産生、及びＥｇは、ＳＤＦ−１の分解速度である。
【０１２８】
ケモカイン流量Ｊは、Ｆｉｃｋの拡散の第１法則から計算する：
【数２】
2008519052.tif 000003
【０１２９】
ＳＤＦ−１の生成率Ｇは、細胞懸濁液で２４時間に生産されたケモカインの測定量から実験的に推定した（５８±２８．５ｎｇ／１０６細胞／２４時間）。ＳＤＦ−１の分解速度は、６〜２４時間の間で推定したものであり、インビボでの研究からの既報告での研究からに基づくものである（Poznansky, M.C., et al. 2000. Nature Med 6:543-548）。
【０１３０】
式（１）に上記を代入すると、腫瘍の中心から距離ｒでのＳＤＦ−１の濃度を支配する偏微分方程式ができる：
【数３】
2008519052.tif 000004
【０１３１】
式（３）は、時間での前進差分及び空間での中心差分により有限差分法を用いて解ける。式は、更に時間についての解はＳＤＦ−１の濃度分布を変更しなかった定常状態までの時間について解ける。
【０１３２】
Ｋ．統計解析
数値データの統計的有意性は、ウイルコクソン符号付順位正確確率検定（Wilcoxon signed rank exact test）又は対応のあるスチューデントｔ検定（Student’s paired t-test）を使用して決定した。統計的生存率分析は、マンテル・コックス・ログ・ランク検定（Mantel-Cox log-rank test）を使用して実施した。
【０１３３】
ＩＩ．結果
Ａ．遺伝子操作Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞は機能的ＳＤＦ−１の高濃度又は低濃度を発現する
セルソーティングを行い、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１低濃度と名付けた、高輝度及び低輝度のＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞である、形質導入Ｂ１６／ＯＶＡ．ｐｃ細胞を選択した（図１Ｂ）。ＧＦＰのみをコードするＭＳＣＶベクターで形質導入された細胞を、全ての実験における対照細胞株として使用した。ウエスタンブロット法及びＥＬＩＳＡによって測定された、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１の高濃度及び低濃度培養からのならし培地中のＳＤＦ−１濃度の推測は、２４時間培養した１×１０６の細胞より、それぞれ、３５〜１１０ｎｇ／ｍｌ（平均＝５８±２８．５ｎｇ）及び２．４〜１３ｎｇ／ｍｌ（平均＝７．６±４．１）の範囲であった（図１Ｃ）。非形質導入のＢ１６／ＯＶＡ細胞又はＭＳＣＶ−ＧＦＰで形質導入されたＢ１６／ＯＶＡ細胞からのならし培地中には、ウエスタンブロット法又はＥＬＩＳＡによりＳＤＦ−１を検出しなかった（データは示されていない）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１形質導入体とＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ細胞の間で（表１、下）、ＭＨＣクラスＩ発現及びＯＶＡ産生における有意差は検出しなかった。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞は、フローサイトメトリーにより、非常に低い濃度のＣＸＣＲ４を発現した（表１、下）。
【０１３４】
【表１】
2008519052.tif 000005
表１．Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度及び低濃度細胞におけるＭＨＣクラスＩ及びＣＸＣＲ４発現のＦＡＣＳ分析。結果は、平均蛍光強度値（ＭＦＩ）として示す。１×１０６Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞を２４時間培養したものからの上清中のＳＤＦ−１及びＯＶＡ分泌の濃度を示す（平均±ＳＤ）。
【０１３５】
腫瘍増殖に対するＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４  ａｘｉｓの効果を、特異的ＣＸＣＲ４拮抗薬、ＡＭＤ３１００、で未処置及び処置したマウスにおいて、インビボで、腫瘍細胞で攻撃後第１日から腫瘍が出現するまで、評価した。腫瘍の２００ｍｍ２の大きさまでの増殖の平均時間は、ＡＭＤ３１００で処置した又は未処置のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶに対して、それぞれ、２２±２日（平均±ＳＤ）及び２４±１．３、であった（ｐ＝０．３２、示していない）。ＡＭＤ３１００未処置及び処置のＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度の腫瘍に対する２００ｍｍ２への腫瘍増殖時間は、それぞれ、２３±１．５及び２３．６±２．０８日であった（ｐ＝０．７２，示していない）。
【０１３６】
Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞及びＢ１６／ＯＶＡ．ＭＣＳＶ細胞から得たならし培地を、遊出アッセイ（transmigration assay）で、機能的活性を試験した（図２）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞から得たならし培地の非希釈のもの、及び１：１０に希釈したものでは、走化性指標（chemotactic index、ＣＩ）（実験として設定したものにおける細胞数を対照として設定したものにおける細胞数で除した数の間の比率であり、ここでならし培地は、トランズウェル(Transwell)の上部チャンバー及び下部チャンバーにおかれている）が、初代ネズミＣＤ８＋Ｔ細胞では、それぞれ、３．６±０．４６（平均±ＳＥＭ）及び２．７±０．５であった（図２Ａ）。ネズミｒＳＤＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）は、５．９±０．９のＣＩを与えた。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞から得たならし培地を、次いで、上部チャンバーに加え、遁走活性の評価にした（図２Ｂ）。遁走性指標（fugetactic index、ＦＩ）（実験として設定したならし培地から遊走した細胞数を、対照として設定したものにおいて遊走した細胞の数で除した数の間の比率であり、ここでならし培地は、トランズウェルの上部及び下部チャンバーにおかれていた）は、２０倍の濃度のならし培地では６．６±２．６、及び１０倍の濃度のならし培地では０．４５±０．０２５であった（図２Ｂ）。上部チャンバーに加えたネズミｒＳＤＦ−１（１μｇ／ｍｌ）では、７．５±１．１のＦＩを与えた。このシステムで、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶからの濃縮及び非希釈ならし培地を試験した時、走化性又は遁走活性は見出されなかった（データは示されていない）。
【０１３７】
Ｂ．Ｂ１６／ＯＶＡ細胞によるＳＤＦ−１の発現は腫瘍細胞の動力学に影響しない
ＭＨＣクラスＩ発現（抗Ｈ−２Ｋｂ、クローンＡＦ６−８８．５，BD Pharmingen）のＦＡＣＳｃａｎ分析は、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞（ＭＦＩ１７．１±１．９ＳＤ）及びＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ（ＭＦＩ１６．２±２．１ＳＤ）における発現と同様なレベルを示した（ｐ＝０．１４、データは示されていない）。ＭＳＣＶ又はＳＤＦ−１を導入したＢ１６／ＯＶＡ細胞は、フローサイトメトリーで非常に低いレベルのＣＸＣＲ４を発現した（ＭＦＩ：それぞれ、３．０６±０．６５及び２．４５±０．６７）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ細胞の増殖は、インビトロでＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞との間に有意な差がなかった（図３Ａ；ｐ＝０．１３）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１腫瘍は、インビボで類似の増殖動力学を示し、ＳＤＦ−１は本明細書に記載のモデルにおける同種マウスの腫瘍増殖には、主要な効果を有していなかった（図３Ｂ；ｐ＝０．２３）。Ｂ１６／ＯＶＡ細胞におけるＣＸＣＲ４発現の非常に低いレベルを考慮して、腫瘍増殖に対するＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４  ａｘｉｓの効果についても、攻撃後の第１日目から腫瘍の出現まで、ナイーブマウスをＣＸＣＲ４拮抗薬、ＡＭＤ３１００でインビボで治療することによって評価した。ＡＭＤ３１００で治療したか、又は治療しなかったＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶについて、大きさが２００ｍｍ２になるまでの腫瘍発展の平均時間は、それぞれ、２２±２日（平均±ＳＤ）及び２４±１．３であった（ｐ＝０．３２）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１腫瘍についての時間は、未治療の腫瘍及びＡＭＤ３１００で治療した腫瘍について、それぞれ、２３±１．５及び２３．６±２．０８であった（ｐ＝０．７２）。
【０１３８】
Ｃ．免疫化したマウスは、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍の増殖を制御しない
腫瘍によるＳＤＦ−１分泌の局所効果を調べるため、非免疫マウス又は免疫マウスに、２×１０５個のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１の両腫瘍細胞を、それぞれ、右及び左の脇腹に抗原投与した（図４Ａ）。続いて腫瘍増殖を３日又は４日毎に測定し、少なくとも１つの腫瘍が２００ｍｍ２に達した時、マウスを屠殺した。ナイーブ非免疫マウスの両側にＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞を注射した時、全ての場合において腫瘍は、２００ｍｍ２の大きさに発展し、そして全てのマウスを、抗原投与後第２５日目に屠殺した。腫瘍自体の増殖に直接的又は間接的に関係した原因により死んだマウスはなかった。各マウスについて、両側の腫瘍を比較すると、増殖のランダムなパターンが観察された（図４Ｂ）。動物の５０％で、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍は、反対側のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍よりも、より急速に増殖した、そして対照のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍を越えたＳＤＦ−１発現腫瘍の有意な増殖の利点はなかった（図４Ｂ；ｐ＝０．７）。対照的に、免疫マウスは、腫瘍増殖の著しく異なったパターンを明確に示した（図４Ｃ）。免疫マウスの５０％が、追跡調査の最後において、右脇腹におけるＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍発展の証拠は示されなかったが、全てのマウスは、左脇腹においてＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍が発展した。両側の腫瘍が発展したマウスの腫瘍の大きさを比較すると、反対側のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍はその大きさが有意に小さかった時に、全てのマウスは、＞２００ｍｍ２のＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍を発展させていた（図４Ｃ；ｐ＝０．０００１）。免疫マウスにおけるＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍増殖は、非免疫マウスにおける腫瘍増殖に比べて、有意に遅延していた（それぞれ、２９．４±４．９対１２．８±２ｄ、平均±ＳＤ、ｐ＝０．０００２）、このことは免疫システムが、このモデルにおいて、腫瘍増殖の制御に役割を果たしていることを示唆している。
【０１３９】
免疫組織化学を、拒絶されなかった腫瘍へのＴ細胞浸潤を定量化するために実施した。非免疫マウスにおいては、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍の両者への最小のＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤があった（データは示されていない）。対照的に、免疫マウスでは、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍への一貫したＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤があった（図５、パネルＡ〜Ｃ）。免疫マウスにおけるＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍へのＴ細胞浸潤は、著しく減少した（図５、パネルＤ〜Ｆ）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍を浸潤している（１群当たり３頭のマウスから４つの２００倍の視野における）ＣＤ３＋Ｔ細胞の数は、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍を浸潤している３４．５±１０．６細胞／ｍｍ２、平均±ＳＤ（ｐ＝０．００１）であるのと対比して、９２．２±２８．８細胞／ｍｍ２（ｐ＝０．０１６）であった。これらのデータは、ＳＤＦ−１の高濃度の腫瘍内発現は、ＴＩＬの減少をもたらすことを示唆している。
【０１４０】
Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１低及び高濃度細胞で両側の抗原投与からマウスを防御するために、高濃度のＳＤＦ−１を発現している照射Ｂ１６／ＯＶＡ細胞を有するマウスの予防接種の効果についても評価した。図６Ａに示したように、両側にＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１低及び高濃度細胞で抗原投与されたナイーブマウスは、ランダムな発展のパターンを示した（ｐ＝０．０８８）。対照的に、高濃度のＳＤＦ−１を発現している照射Ｂ１６／ＯＶＡ細胞での予防接種は、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１低濃度腫瘍の４０％の拒絶をもたらした、これに反して、全てのマウスが、左脇腹において、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍を発展させた（図６Ｂ；ｐ＝０．０２１）。さらに、両側に腫瘍を発展させたマウスは、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍と比較してＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１低濃度腫瘍のより遅い増殖速度を示した（データは示されていない）。免疫組織化学によるＴ細胞浸潤の定量は、ＣＤ３＋細胞の、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍への浸潤（３１±５．１細胞／ｍｍ２；ｐ＝０．００７；図６Ｃ）よりもＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１低濃度腫瘍への浸潤（１０１±１０細胞／ｍｍ２）が有意に、より大きいことを明らかに示した。これらのデータは、ＳＤＦ−１がＢ１６／ＯＶＡ細胞の免疫原性には影響しないが、低濃度では引きつけ、そして高濃度では忌避するという、Ｔ細胞への双方向性の信号としての機能を果たすことができる、という概念を支持している。
【０１４１】
Ｄ．高レベル（低レベルではなく）のＳＤＦ−１は、養子移植（adoptively transferred）されたＯＶＡ特異的ＣＴＬを腫瘍部位に補充するのを減じる
同系のレシピエントへのＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の養子移植は、インビボにおけるＴ細胞の応答を直接可視化し定量化することを可能とする。ＯＴ−１  ＣＤ８＋細胞は、ＯＶＡを発現するＢ１６腫瘍を担癌しているＣ５７ＢＬ／６マウスに養子移植後、早くも１２時間後には、効率的かつ特異的に腫瘍に補充可能であることが以前から明らかになっていた（Kircher, M.F.らの Cancer Res，2003，63:6838-6846）。この研究において、対照のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ（右脇腹）及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞（左脇腹）をマウスに皮下移植し、それぞれが自身の対照の役割を果たすようにした。腫瘍の一つの直径が１０〜１５ｍｍに達した時に、動物の連続ＭＲ画像を撮影した。大きさが同じような腫瘍を担癌している動物を、ＣＬＩＯ−ｔａｔ標識ＯＴ−１細胞の養子移植後２４時間及び４８時間に撮像した。シグナル減少を計量することによって、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍に比べてＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍において腫瘍のリンパ球浸潤が一貫して減少していることが明らかになった。代表的な軸方向の切片において（図７）、不均一ではあるが、ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を注射してから２４時間後に、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍内ではっきりとしたシグナルの減少が可視化された。一方、反対側のＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍では、わずかなシグナル強度の変化が観察されたのみであった。これは、Ｔ細胞がほとんど補充されなかったことを示している（右及び左腫瘍間のＴ２フィット値の比率：０．５８）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞の両方で、ＣＴＬ注射後４８時間のＭＲＩ解析は、ＣＴＬ注射２４時間後のそれと較べて有意に異なるものではなかった（データは示されていない）。標識Ｔ細胞の養子移植後４８時間で腫瘍を収穫し、切片をＨ＆Ｅ及び抗ＣＤ３Ａｂで染色した(図８)。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ細胞おいてＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤が明瞭に観察されたが（図８Ａ−Ｃ）、同じマウスのＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍に於いては、ＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤はわずかしか見出されなかった（図８Ｄ−Ｆ）。免疫組織化学試料におけるＣＤ３＋細胞の定量分析（図８Ｇ）は、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞（３８細胞／ｍｍ２±１７）と比較して、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ（１１５．２細胞／ｍｍ２±３５．５、平均±ＳＤ）において、Ｔ細胞浸潤に３倍の違いがあることを示した（ｐ＝０．０１８）。Ｔ細胞の血管内蓄積の形跡はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞またはＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍において観察されなかった。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞の養子移植を受けなかった対照マウスにおいては、殆ど観察されなかった（データは示されていない）。従って、ＳＤＦ−１が腫瘍で高レベルに発現する時、腫瘍特異的ＣＴＬの早期の補充は減少する。
【０１４２】
ＳＤＦ−１が、高レベル（低レベルでなく）に発現する場合に、ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の補充が減少することを確認するため、ＳＤＦ−１を低レベルに発現する腫瘍でＴ細胞浸潤のレベルを評価した。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１低濃度、又はＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍を両側に担癌するマウスに、ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を養子移植し、４８時間後に免疫組織化学によりＴ細胞浸潤を定量化した。Ｔ細胞浸潤の定量化により、ＳＤＦ−１の低レベル発現は、反対側の大腿部に増殖している対照のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶに於ける腫瘍（１０１±８．５細胞／ｍｍ２）と比較して、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１低濃度に於ける腫瘍を浸潤しているＴ細胞の高い数値（１６４±１４細胞／ｍｍ２）に関連することが示された（図９；ｐ＝０．０３２）。従って、Ｂ１６／ＯＶＡ腫瘍への養子移植された活性化腫瘍抗原特異的ＣＴＬｓの補充は、腫瘍に於けるＳＤＦ−１の発現が低レベルの場合に有意に増加し、ＳＤＦ−１の発現が高レベルの場合に減少する。
【０１４３】
Ｅ．Ｔ細胞がＳＤＦ−１分泌腫瘍を浸潤できないのはＣＸＣＲ４の仲介による
ＳＤＦ−１の高レベル発現が、腫瘍特異的Ｔ細胞に直接的な遁走性効果を及ぼすかどうかの真否を検証するため、ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の早期補充についてＡＭＤ３１００のＣＸＣＲ４遮断効果を調べた（図１０）（Hatse, S. et al. 2002. FEBS Lett 527:255）。ＣＬＩＯ−ＴＡＴ標識したＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を、０．０８及び０．２５μｇ／ｍｌの濃度のＡＭＤ３１００と共にインキュベートし、両側に腫瘍を担癌したマウスに養子移植した。Ｔ細胞の補充を、ＭＲＩ及び免疫組織化学によって評価した。ＡＭＤ３１００で処理していないＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を養子移植して２４時間後に、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍においてＭＲＩシグナルの明確な減少が観察さたが、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍においては観察されなかった（図１０Ａ、Ｄ）。一方で、ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞をＡＭＤ３１００で前処理した場合には、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶはもとよりＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍においてもＴ細胞の補充が明確に観察された（図１０Ｂ、Ｅ）。右及び左の腫瘍に於けるＴ２フィット値を定量したところ、養子移植の前にＯＴ−１  Ｔ細胞をＡＭＤ３１００で前処理した場合には１に近い比率（１±０．１２）であったのに対して、ＡＭＤ３１００前処理設定では比率０．５５±０．１３（平均±ＳＤ、ｎ＝３）であった（ｐ＝０．０１）。ネズミ間のばらつきを排除するため、ＡＭＤ３１００で前処理したＯＴ−１  Ｔ細胞で２回目の養子移植を、前日にＡＭＤ３１００処理していないＯＴ−１  Ｔ細胞を受けた同じマウス群で実施した（図１０）。これらの条件下、Ｔ細胞は再び両腫瘍に浸潤して、ＡＭＤ３１００のＣＸＣＲ４拮抗作用により、ＳＤＦ−１を高濃度で発現する腫瘍においてもＴ細胞の補充が回復されたことが確認された（図１０Ｃ、Ｆ）。
【０１４４】
免疫組織化学によるＴ細胞浸潤の定量によると、養子移植前にＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞をＡＭＤ３１００（０．０８μｇ／ｍｌ又は０．２５μｇ／ｍｌ）とインキュベーションすると、ＡＭＤ３１００で処理されていないＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍における４０±４．１細胞／ｍｍ２と比較して、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍へのＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤における極めて大きな増加をもたらすこと（１０１±１０．６及び８８．１±１６．９細胞／ｍｍ２）(ｐ＝０．００９及びｐ＝０．０１１)が示された（図１０、それぞれ、Ｍ、Ｎ、Ｏ及びＩ、Ｊ、Ｏ）。同じマウス群で、ＡＭＤ３１００で処理されていないＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ対照（１３０±１３．９細胞／ｍｍ２；ｐ＝０．０９８）に比較して（図１０Ｇ、Ｈ、及びＯ）、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍を浸潤するＴ細胞の数に有意な変化はみられなかった（１０９±３．２及び９３±１４．８）（図１０Ｋ、Ｌ及びＯ）。これらのデータは、腫瘍のＳＤＦ−１分泌の一次効果は、腫瘍へのＴ細胞浸潤であり、そしてケモカインの遁走性が腫瘍抗原特異性Ｔ細胞ＣＸＣＲ４拮抗薬であるＡＭＤ３１００で前処理することにより阻害されたことが見いだされたことを裏付けるものである。
【０１４５】
Ｆ．腫瘍細胞による高レベルＳＤＦ−１の分泌は抗原特異的記憶Ｔ細胞による浸潤及び免疫制御を損なう
腫瘍特異的エフェクターＴ細胞の初期補充はＳＤＦ−１が腫瘍の微小環境に高レベルで存在する場合に損傷されることが示されたので、ケモカインの発現がＳＤＦ−１発現腫瘍の長期制御に効果を有していたかどうかを探求した。養子移植腫瘍抗原特異性Ｔ細胞の治療効果は、長期記憶Ｔ細胞として持続するドナー細胞の能力にも依存している（Poznansky, M.C., et al. 2000 Nature Med 6:543-548）。Ｔ細胞のＳＤＦ−１に対する反応はナイーブ、エフェクター、及び記憶ＣＤ８＋細胞の間で変化すること、そしてこれは、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞が記憶Ｔ細胞よりも高レベルのＣＸＣＲ４を発現することによるものであろうということ、が示されてきた（Rempel, S.A., et al. 2000. Clin Cancer Res 6:102-111）。インビトロ刺激及び拡張の５日後のＯＴ−１  ＣＤ８＋細胞のフロー分析によると、ナイーブＯＴ−１細胞が１５．５％±１．５であるのと比較して、エフェクター細胞の６７．２％±９．８（平均±ＳＥＭ）がＣＸＣＲ４を発現することが示された（データは示されていない）。腫瘍へのＴ細胞の亜集団の補充がＳＤＦ−１に対する反応差であるかどうかをＯＴ−１  ＣＤ８＋記憶細胞が養子移植後に確立されるモデルで試験した。インビトロで生成したＯＴ−１  ＣＤ８＋細胞は、記憶細胞の表現型の特徴及び機能的特徴とともに、同系マウスに養子移植した後も長く存続する。ＯＶＡを発現する胸腺腫細胞株で抗原投与したマウスにおいて、持続したＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞は、強力な抗腫瘍活性を示した（Bathe, O.F., et al. 2001. J Immunol 167:4511-4517）。このモデルでは、抗原特異的ＣＤ８＋細胞の回復及びＴ細胞浸潤のレベルの定量化も可能であった。１×１０７個のＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移植後の２１日間、２つのマウス群に２×１０５個のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞を皮下に抗原投与した。予防接種のプロトコールにある様に養子移植を受けたマウスは、養子移植を受けなかった対照マウスと比較して、初期対照のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍と同じ状態を示した（図１１Ａ〜Ｄ）。しかしながら、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍で抗原投与されたマウスの６０％と比較して、養子移植を受けたマウスの２０％は、抗原投与後６０日までにＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍を最終的に発症した（ｐ＝０．０３６；図１１Ｂ、Ｄ及びＥ）。腫瘍を発症したマウスからの腫瘍内ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を回収し、ＦＡＣＳ分析を行った。腫瘍内ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の総画分は、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍（図１２Ｂ）に比較してＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍(図１２Ｄ)では約７倍低かった（それぞれ、０．２２％±０．４、対１．７％±０．７、平均±ＳＤ）。トランスジェニックＶα２−Ｖβ５．１／５．２ＴＣＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の総数を計算すると、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍と較べてＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍で４．５倍の減少が見出された（それぞれ、１２±５．４、対５５．５±１７．６×１０４、平均±ＳＤ；ｐ＝０．００５）（図１２Ｂ、Ｄ、及びＥ）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍を担癌したマウス、及び腫瘍を拒絶したマウスからの排出���ンパ節中のＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析では、トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞の分画に有意な差は示されなかった（ｐ＝０．７；図１２Ｅ）。これらのデータは、養子移植したＯＴ−１  Ｔ細胞から長期間防御することで、増殖している腫瘍がＳＤＦ−１の遁走性濃度を発現する時に、克服されるという見識を支持するものである。
【０１４６】
Ｇ．腫瘍細胞におけるＳＤＦ−１の高レベルの発現は、インビトロでのＣＴＬの遊走及び細胞毒性に影響を及ぼす
腫瘍細胞によるＳＤＦ−１の高発現は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４が介在するエフェクター細胞の反発の結果として、インビトロでのＣＴＬが介在する溶解から腫瘍細胞を保護する。このことは、Ｈ−２ＫｂＭＨＣ Ｉ及びＯＶＡ２５７−２６４ペプチドを認識するＯＴ−１  ＣＴＬｓを使用した、標準５１Ｃｒ放出アッセイによって、及び細胞毒に対するエフェクター細胞遊走の影響を考慮した、最近開発された改変アッセイにおいて（Brainard, D.M., et al. 2004. J Virol 78:5184-5193）明らかにされた。丸底ウェルを用いた標準５１Ｃｒ放出アッセイにより、標的細胞であるＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ細胞及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞を効果的にペレット化し、ＯＶＡ特異的ＣＴＬｓがＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞を殺傷したのと同程度に効果的にＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ細胞も殺傷することが見い出されたが（図１３Ａ；ｐ＝０．１６）、このことは腫瘍のＳＤＦ−１産生は、Ｂ１６／ＯＶＡ細胞がＣＴＬの殺傷効果に対して感受性であるかどうかには影響しないという見解を支持するものである。一方、細胞の線密度が減少する可能性があり、そのため、エフェクター細胞と標的細胞間の距離が増加する平底ウェルで殺活性を計量した場合、抗原特異的ＣＴＬｓは、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ細胞と比較して、ＳＤＦ−１高濃度を発現するＢ１６／ＯＶＡ細胞を殺傷する効果が弱いということがはっきりと示された（図１３Ｂ；ｐ＝０．０００４）。ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＸＣＲ４拮抗薬のＡＭＤ３１００と前培養することがＳＤＦ−１を発現するＢ１６／ＯＶＡ細胞に対する殺活性を回復させるかどうかを試験するために、ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＸＣＲ４拮抗薬であるＡＭＤ３１００（濃度５μｇ／ｍｌ）と前培養した。その結果、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞を殺傷する効果が有意に増加した（ＬＵ３０の未処理ＯＴ−１：４９×１０６±ＳＤ９．２ＳＥＭ；ＡＭＤ３１００とインキュベートしたＯＴ−１、ＬＵ３０：７７×１０６±１５ＳＥＭ；ｐ＝０．０４５）（図１３Ｃ及びＤ）。これらの結果は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでパルスされた腫瘍細胞での実験で得られた。なお、当該ペプチドは、それでパルスされていない腫瘍細胞で観察された溶解レベルと比較して高レベルの特異的溶解を可能とする。同様の結果が、殺活性をペプチドでパルスされていないＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞について測定した場合に観察され（図１４）、このことはインビボモデルでのＯＶＡ発現におけるいかなる相異も排除するものである。
【０１４７】
従って、腫瘍細胞によるＳＤＦ−１の高レベル分泌は、ＣＴＬ遊走が重要な役割を果たすアッセイに於けるＣＴＬ殺傷効果の有効性を損ねるものである。反対に、高度に特異的なＣＸＣＲ４拮抗薬ＡＭＤ３１００によるＣＸＣＲ４受容体の遮断は、ＳＤＦ−１高濃度を発現する腫瘍細胞に関与するＣＴＬの能力を回復させる。これらのデータは、ＡＭＤ３１００によるＣＸＣＲ４受容体の遮断が、高レベルでＳＤＦ−１を発現する腫瘍細胞に浸潤し、関与するＣＴＬの能力を回復するという、本明細書に記載したインビボでの発見と一致する。
【０１４８】
Ｈ．ケモカイン勾配の数学的モデルにより腫瘍微小環境におけるケモカイン濃度がＴ細胞遁走性を誘発することが予測される
ＳＤＦ−１の生物学的活性は、腫瘍の微小環境内のＳＤＦ−１の絶対濃度及びケモカイン勾配の提示に依存している。腫瘍内のケモカインの局所濃度の精密な測定は欠けている。インビトロにおける細胞によるＳＤＦ−１の測定された生産速度及びインビボにおけるＳＤＦ−１分解に基づいた、腫瘍微小環境におけるＳＤＦ−１濃度及び勾配について、予測するためのモデルが構築された（Dunussi-Joannopoulos, K., et al. 2002. Blood 100:1551-1558）。
【０１４９】
このモデルから、腫瘍周辺１０〜５０ミクロン以内のＳＤＦ−１濃度は、６時間及び２４時間の分解速度について、それぞれ、０．２〜０．８μＭの範囲であることが予測される。このＳＤＦ−１濃度範囲で、インビトロ及びインビボにおける静止及び活性化Ｔ細胞の両者の遁走性が誘発されることは既に示されていた（Poznansky, M.C., et al. 2000 Nature Med 6:543-548）。
【０１５０】
Ｉ．ＳＤＦ−１は刺激されたＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞のアポトーシスを増加させず、また、活性化、増殖及び殺活性を損傷しない
ケモカインがＴ細胞の直接プロアポトーシス効果を有したかという問題に取り組むために、エフェクターＯＴ−１  ＣＤ８＋細胞を組換えＳＤＦ−１と２４時間又は７２時間インキュベートした。２４時間におけるアポトーシスしたＯＴ−１  ＣＤ８＋細胞（ＰＩ陰性及びアネキシンＶ陽性）の割合は、１０ｎｇ／ｍｌ・ＳＤＦ−１で７．９±３．０７（平均±ＳＥＭ）；１００ｎｇ／ｍｌ・ＳＤＦ−１で６．１±３．１６；１μｇ／ｍｌ・ＳＤＦ−１で６．５１±２．０５であった。アポトーシスのこれらのレベルは、ＳＤＦ−１（６．６７±３．２７）無しに培養したＯＴ−１  ＣＤ８＋細胞で見られたのからは有意には差はなかった（ｐ＝０．９７，対照対１μｇ／ｍｌＳＤＦ−１、データは示されていない）。アポトーシスしたＴ細胞の割合は、１０、１００、又は１０００ｎｇ／ｍｌＳＤＦ−１の存在下でインキュベーション７２時間後は高かった（それぞれ、１９±０．８、２０．３±０．９及び２２．９±０．８％）、しかし、レベルはＳＤＦ−１非存在下ではアポトーシスした細胞の割合に比べて有意には差がなかった（２１．３±１．６、ｐ＝０．２２、データは示されていない）
【０１５１】
ＯＴ−１  Ｔ細胞の抗体誘導増殖を、走化性及び遁走性濃度で、ＳＤＦ−１の存在下に測定した（図１４Ａ）。増殖３日後ＯＴ−１  Ｔ細胞に対するＣＤ６９及びＣＤ２５発現のレベルは、５００及び１０００ｎｇ／ｍｌの濃度のＳＤＦ−１の存在下において漸次増加した（ＳＤＦ−１の非存在又は１０００ｎｇ／ｍｌの存在下で、それぞれ、７９．４±３．１、対８９．３±１．７４％）（ｐ＝０．０３１）（図１４Ａ及び表２、下）。ＣＤ２５のレベルも又、ＳＤＦ−１の非存在下に増殖しているＣＴＬにおいて７１．９±１．７から、１０００ｎｇ／ｍｌＳＤＦ−１の存在下で８２．５±１．１まで増加した（ｐ＝０．０１１）。ＣＦＳＥによって評価した少なくとも１細胞分裂した細胞の割合は、ＳＤＦ−１の非存在下に増殖している細胞（９５．９±１．８％）と比較して、ＳＤＦ−１、５００ｎｇ／ｍｌの存在下に増殖しているＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞（９５．７±１．３％、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）及び１０００ｎｇ／ｍｌ（９５．２±２．６％）の存在下に増殖しているＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞において有意に差はなかった（ｐ＝０．１３）（図１４Ａ及び表２、下）。
【０１５２】
【表２】
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表２。ＣＤ２５及びＣＤ６９を発現するＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合並びに異なった濃度におけるｒＳＤＦ−１の存在下で活性化後に（ＣＦＳＥによって測定された）細胞分裂を受けた細胞の割合（Ａ）。異なった濃度におけるｒＳＤＦ−１の存在下で活性化されたアポトーシスしたＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＰＩ陰性及びアネキシンＶ陽性）の割合（Ｂ）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞に曝露したＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の殺活性。トランズウェル系の下部チャンバーで増殖したＯＴ−１Ｔ細胞及びＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞を、上部チャンバーで共培養した（Ｃ）。殺活性は、溶解単位３０（ＬＵ３０）×１０６で表す。
【０１５３】
Ｂ１６／ＯＶＡ細胞を殺傷するＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の能力が、ＳＤＦ−１の存在に影響されるかどうか（図１４Ｂ、表２、上）も試験した。トランスウェルシステムの上部チャンバーで増殖中のＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞によって産生された可溶性ＳＤＦ−１又はＳＤＦ−１に、インビトロで増殖中のＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を曝露することでこの問題に取り組んだ。図１４Ｂに示すように、メラノーマ細胞によって製造されるＳＤＦ−１高濃度の存在下に共培養したＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＳＤＦ−１を産生しないＢ１６／ＯＶＡ細胞に曝露されたＴ細胞の殺活性に比較して、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度標的細胞に対して同じ殺活性レベルを示した（それぞれ、ｐ＝０．７５及びｐ＝０．３１）。ＯＴ−１  Ｔ細胞を可溶性ＳＤＦ−１と培養した場合、同様の結果が観察された（データは示されていない）。従って、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化、増殖、及び機能的抗腫瘍活性は、高濃度のＳＤＦ−１により損傷されない。
【０１５４】
遺伝子工学的に処理された腫瘍細胞による高レベルのＳＤＦ−１の局所的発現は、抗原特異性Ｔ細胞による腫瘍の浸潤を阻害する。これは、ケモカイン（すなわち、遁走性）から離れるように動くＴ細胞の活性運動の結果である（Poznansky, M.C. 2000. Nature Med 6:543-548）。ＳＤＦ−１、エオタキシン−３、及びＨＩＶ−１エンベロープタンパク質ｇｐ１２０は、特異的白血球亜集団に反発することが示されていた（Ogilvie, P., et al 2003. Blood 102:789-794, Xiang, Y. Li, et al 2002. Nature Neurosci 5:843-848, and Brainard, D.M. et al. 2004. J Virol 78:5184-5193）。１００ｎＭを越えた濃度の高レベルのＳＤＦ−１によるＴ細胞に対する反発は、ＣＸＣＲ４媒介、百日咳トキシン感受性、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ依存性であり、そして、Ｔ細胞遁走性の情報伝達経路は、ＳＤＦ−１が誘導する細胞走化性に比較して細胞質内ｃＡＭＰ濃度に対して個別に感受性であることが明らかにされた（Poznansky, M.C. 2000. Nature Med 6:543-548）。ＳＤＦ−１は、インビトロでＣＸＣＲ４に対するＳＤＦ−１のＫｄよりも高い濃度で、Ｔ細胞に対する忌避物質として作用する。これは、既に報告されているように野生型ＣＸＣＲ４受容体が細胞表面に急速に再生されること及びＣＸＣＲ４上にＳＤＦ−１に対する低親和性結合部位が存在すると仮定されることによっても引き起こされる（Zlatopolskiy, A., et al. 2001. Immunol Cell Biol 79:340-344 and Cyster, J.G. 2002. J Cl Invest 109:1011-1012）。
【０１５５】
Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞によってインビボでこの系に生成されると予測されるＳＤＦ−１の濃度勾配が、インビボにおける測定された産生レベル及びＳＤＦ−１に対する文献上の分解速度を基にして数学的にモデル化された（Poznansky, M.C. 2000. Nature Med 6:543-548）。このモデルは、ＳＤＦ−１濃度は、Ｔ細胞遁走性を誘導するために腫瘍の周辺において充分に高いと仮定している。ＳＤＦ−１は、血流内で不活化されることが示された最近の事実、及びフィブロネクチンを含むマトリックスタンパク質に高親和性で結合するということから、Ｔ細胞遊走に対する影響は大部分が腫瘍の局所微小環境内におけるものであることが予測された（Villalba, S., et al. 2003. J Leukoc Biol 74:880-888 and Pelletier, A.J., et al. 2000 Blood 96:2682-2690）。
【０１５６】
ＳＤＦ−１は局所免疫反応を制御し、そしてＴ細胞、プレＢリンパ球、及び樹状細胞に対する強力な化学誘引物質である（Bleul, C.C., et al. 1996. J Exp Med 184:1101- 1109 and D'Apuzzo, M., et al. 1997. Eur J Immunol 27:1788-1793）。従って、腫瘍細胞によるＳＤＦ−１の発現は、腫瘍細胞に対する免疫反応をアップレギュレートすると期待される。本明細書に提示されたデータは、ＳＤＦ−１は、１０ｎＭと１００ｎＭの間の低濃度でＴ細胞の誘引し、そして１００ｎＭを越えるケモカインの濃度で反発すると云った、Ｔ細胞遊走に対する二面作用を有するという見解を支持するものである。ＳＤＦ−１を発現するように別のグループによって遺伝子操作された腫瘍細胞に対する免疫反応も又、この反応に対するケモカインの用量依存性効果を示した。Dunussi-Joannopoulosらは、遺伝子操作されたＢ１６Ｆ１メラノーマ細胞により、腫瘍部位に分泌される低発現のＳＤＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）は、腫瘍の増殖を遅延させ、長期生存腫瘍特異的ＣＴＬ反応の発生を支持したことを、明らかにした。しかし、高レベルのＳＤＦ−１を発現する多数（２×１０５より多い）の照射された腫瘍細胞を、予防接種プロトコールに使用した場合に腫瘍に対する治療免疫は観察されなかった（Dunussi-Joannopoulos, K., et al. 2002. Blood 100:1551-1558）。同様に、高濃度のＳＤＦ−１（それぞれ、９０ｎｇ／ｍｌ及び５５ｎｇ／ｍｌ）を分泌する、免疫原性ＭｅｔｈＡ線維肉腫及びＨＭ−１卵巣癌は、腫瘍がＩＬ−２又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及びＳＤＦ−１を共発現するように遺伝子操作された時にのみ、顕著な免疫反応を誘導することができた（Nomura, T., et al. 2001. I 91 :597- 606）。Shrikantらは、最近、マウスに養子移植された抗原特異性Ｔ細胞は、腫瘍抗原投与部位に遊走することができ、そこでは、増殖して、短時間のみ溶解活性を表すが、腫瘍塊から離れて遊走するので結局は腫瘍増殖を制御することができないということを報告した。同様に、Hansonらは、３又は７日間定着させた２つのＣＭ５５線維肉腫腫瘍を担癌したマウスに養子移植した腫瘍特異性のＣＴＬは、腫瘍部位での一過性のリンパ球の存在により、腫瘍を初期（後期でなく）段階で拒絶することができたことを見出した（Cyster, J.G. 2002. JCl Invest 109:1011-1012）。これらのデータは、初期腫瘍は、腫瘍特異的Ｔ細胞の移入によって拒絶され得るが、後期腫瘍は、腫瘍自体への腫瘍特異的Ｔ細胞の浸潤が減少するために、免疫制御に抵抗性であると予測する、最近の免疫療法のパラダイムと一致している（Cyster, J.G. 2002. JCl Invest 109:1011-1012）。本明細書に示されたものは、このモデルに追加したものであり、増殖過程にある腫瘍は、初期にはＴ細胞走化性を誘導するレベルでＳＤＦ−１を生成するが、ＳＤＦ−１の高レベルの活性及びエフェクターＴ細胞の反発により免疫特権部位を最終的に確立する。
【０１５７】
重要なことは、高特異性のＣＸＣＲ４拮抗薬であるＡＭＤ３１００によって腫瘍特異性ＣＴＬに於けるＣＸＣＲ４シグナルが破棄されると、腫瘍細胞が溶解するのを回復させ、このことは、ＣＴＬ反発及び殺傷に対するＳＤＦ−１の効果はＣＸＣＲ４が介在するという見解を裏付けている。
【０１５８】
ＳＤＦ−１は、細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の誘導を経由して内皮細胞へのリンパ球の接着を促進することが示された。しかし、高レベルのＳＤＦ−１を発現する腫瘍部でＴ細胞の血管壁への接着の増加は、本研究では、非免疫マウス又は免疫マウスのいずれかにおいても明らかではなかった。本明細書に提示された結果は、腫瘍微小環境内での高レベルのＳＤＦ−１発現は、腫瘍特異的Ｔ細胞の内皮への強固な接着をもたらすであろうが、しかし、その後直ちに腫瘍からのＳＤＦ−１が介在する反発が続くという見解を支持している。最終的に、対照及びＳＤＦ−１発現腫瘍の両者によるマウスの同時抗原投与は、腫瘍特異的Ｔ細胞のいかなる機能的欠損の可能性も排除している。ＭＲＩ及び免疫組織化学分析のデータは、腫瘍特異的Ｔ細胞の遊走の局所的異常調節は、ＳＤＦ−１を発現している腫瘍の増殖を制御する免疫系の不全をもたらすことを示している。
【０１５９】
高レベルのＳＤＦ−１を発現するように遺伝子操作した腫瘍細胞を試験した。原発性ヒトメラノーマ、卵巣癌及び前立腺癌、及びグリア芽腫は、ＳＤＦ−１及びＩＬ−８を含むケモカインを高レベルに構成的に発現することが示された（Scotton, C.J., et al 2002. Cancer Res 62:5930-5938, Barbero, S., et al. 2003. Cancer Res 63:1969-1974, Mellado, M., et al. 2001 Curr Biol 11:691-696, and Sun, Y.X., et al. 2003 J Cell Biochem 89:462-473）。メラノーマを含む原発性腫瘍細胞は、種々の系でＳＤＦ−１を２５．６ｎｇ／ｍｌ（１×１０６細胞）まで産生する。これらの生産率は、数学的モデルに基づいて腫瘍内及び周辺において、０．１μＭを越えるピークケモカイン濃度を生成するだろう（Mellado, M., et al 2001 Curr Biol 11:691-696）。
【０１６０】
原発性腫瘍により分泌されるケモカインは、腫瘍形成及び身体において特異的腫瘍外部位へ転移する腫瘍細胞の帰巣本能の役割を演じていることが示された。グリア芽腫細胞株又は卵巣癌細胞によるＳＤＦ−１分泌は、ＥＲＫ１／２及びＡｋｔ経路の活性化及びＤＮＡ合成の促進を経て細胞増殖の自己分泌／傍分泌制御につながることが示されてきた（Scotton, C.J., et al. 2002. Cancer Res 62:5930-5938 and Barbero, S., et al. 2003. Cancer Res 63:1969-1974）。Ｂ１６／ＯＶＡ腫瘍による高レベルのＳＤＦ−１の分泌は、本研究において、インビトロ及びインビボにおける腫瘍細胞の増殖に影響を与えなかった。
【０１６１】
結論として、これらの発見は、癌細胞による免疫回避の新規作用機序における高濃度でのＴ細胞遁走性としての本ケモカインの役割を明らかにした。もしメラノーマを含む原発性腫瘍の近辺の微細環境にて産生された高レベルのケモカインからの免疫細胞の反発が免疫回避に寄与するならば、ケモカイン／受容体相互作用の選択的拮抗作用を含めて、本作用機序を克服する戦略は、癌ワクチン及びその他の抗癌免疫療法手段の有効性を増すための有益で新規な補佐役となり得るであろう。
【０１６２】
ＩＩＩ．図面の補足説明
図１：Ｂ１６／ＯＶＡメラノーマ細胞の形質導入に使用したＳＤＦ−１発現構成体（Ａ）。ＦＡＣＳｃａｎ解析による、分別したＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１腫瘍細胞中のＧＦＰ発現（Ｂ）。Ｂ１６／ＯＶＡ.ｐｃ：（点線）；Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ：（実線）；Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１：（破線）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞によって分泌されるＳＤＦ−１レベル（４列目）のウェスタン・ブロット解析（Ｃ）で、ｒＳＤＦ−１：５０ｎｇ（１列目）、２０ｎｇ（２列目）、５ｎｇ（３列目）及びＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ（５列目）と比較した。Ｍ：分子量マーカー。
【０１６３】
図２：Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度細胞を、０．５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで２４時間インキュベートした。ならし培地を集め、無希釈、１：１０希釈又は２０倍濃縮して遊出アッセイに使用した。ｒＳＤＦ−１を、１００ｎｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬの濃度で、対照として使用した。走化性（Ａ）及び遁走性（fugetaxis）（Ｂ）を評価するため、ならし培地をそれぞれ下部チャンバー又は上部チャンバーに入れ、精製したネズミＣＤ８＋Ｔ細胞（６×１０４細胞）を、全量が１５０μＬの各ウェルの上部チャンバーに添加した。走化性及び遁走性の指標は、実験設定における細胞数を、トランスウェルの上部チャンバー及び下部チャンバーにならし培地を入れた対照設定における細胞数で割った比として計算した。
【０１６４】
図３：Ｂ１６／ＯＶＡ.ｐｃ、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１腫瘍細胞のインビトロ増殖性（Ａ）及びインビボ腫瘍原性（Ｂ）、＊ｐ＝０．１３；＊＊ｐ＝０．２３。
【０１６５】
図４：非免疫マウスに、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ細胞（■、右脇腹）及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞（Δ、左脇腹）を同時に接種した（Ａ）。マウス（ｎ＝８）は、少なくとも１つの腫瘍が２００ｍｍ２のサイズに達した時点で屠殺した。屠殺時点の各マウスの腫瘍サイズを示す（Ｂ）。ナイーブマウスでは腫瘍発展に顕著な傾向は認められなかった（Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ対Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１腫瘍）（ｐ＝０．７）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ（■、右脇腹）及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞（Δ、左脇腹）を接種する前に放射線照射Ｂ１６／ＯＶＡ.ｐｃで免疫したマウス（ｎ＝８）についても腫瘍増殖を記録した（Ｃ）。免疫動物における５０％の場合でＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶの腫瘍増殖が見られず、４／８はＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍の増殖が抑制された。各免疫マウスの反対の脇腹に移植したＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１腫瘍は全て（８／８）、急速に２００ｍｍ２のサイズに成長した（ｐ＝０．０００１）。
【０１６６】
図５：免疫マウスから摘出した腫瘍のパラフィン包埋切片を、Ｈ＆Ｅ（Ａ及びＤ）又はポリクローナルα−ＣＤ３Ａｂ（Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦ）で染色した。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍にＣＤ３陽性細胞の有意な浸潤が認められた（Ｂ及びＣ）が、ＳＤＦ−１発現の腫瘍には認められなかった（Ｅ及びＦ）、（倍率＝４０倍又は２００倍）。
【０１６７】
図６：マウス（５群）に、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−低濃度細胞（●、右脇腹）及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−高濃度細胞（Δ、左脇腹）を接種する前に、予防的に放射線照射Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−高濃度細胞で免疫した（Ｂ）。対照として、両腫瘍を非免疫マウスの両脇腹に抗原投与した（Ａ）。右脇腹に移植したＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−低濃度腫瘍は４０％のマウスで成長しなかった（Ｂ）。左脇腹に移植したＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−高濃度腫瘍は全てのマウスで成長した（ｐ＝０．０２１）（Ｂ）。ナイーブマウスでは腫瘍発展の有意な違いは認められなかった（Ａ；ｐ＝０．８８）。腫瘍切片のα−ＣＤ３染色では、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−低濃度腫瘍内へのＴ細胞浸潤を示したが、高レベルＳＤＦ−１発現腫瘍には認められなかった（Ｃ；ｐ＝０．００７）。
【０１６８】
図７：ＣＬＩＯ−ｔａｔ標識ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の早期補充はＳＤＦ−１発現Ｂ１６／ＯＶＡ腫瘍内で機能を損なわせる。マウス大腿部の軸方向ＭＲＩ断面は、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１腫瘍と比較してＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍における著しいシグナル低下を示しており、より多くの標識ＯＴ−１  Ｔ細胞がＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍内に補充された事を示した。暗い領域（Ａ）に相当するＴ細胞動員の強度は、Ｔ２スペクトルカラー図表（Ｂ）としても示される。細胞／ボクセル数は、カラースケールで表示される。示した結果は、４回の独立した実験の典型である。
【０１６９】
図８：Ｂ１６／ＯＶＡ腫瘍内のＴ細胞浸潤の免疫組織化学的研究はＭＲ画像と相関する。養子移植の４８時間後に組織を採取し、切片をＨ＆Ｅ（Ａ、Ｄ）又はポリクローナル抗ＣＤ３Ａｂ（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）で染色した。多数のＣＤ３＋Ｔ細胞がＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍内に存在していた（Ｂ、Ｃ）。反対に、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１腫瘍には、非常に少数のＣＤ３＋Ｔ細胞しか検出されなかった（Ｅ、Ｆ）。結果は、独立した６回の実験の典型である。腫瘍へのＣＤ３＋細胞の浸潤を定量化した。６匹の動物からのｍｍ２当たりのＣＤ３＋細胞数の平均値（＋／−ＳＤ）を示した（Ｇ）。倍率＝４０倍又は２００倍。＊：ｐ＝０．０１８。
【０１７０】
図９：２つの群のマウス（ｎ＝３）は、右脇腹（Ｒ）にＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ細胞そして左脇腹（Ｌ）にＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−低濃度細胞又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−高濃度細胞を抗原投与した。ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移植から４８時間後に腫瘍を採取し、切片をポリクローナル抗ＣＤ３Ａｂで染色した。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶと比較してＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−低濃度腫瘍に、浸潤した有意により多数のＣＤ３＋細胞が認められた。予想したとおり、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−高濃度腫瘍を持つマウスは、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍にＴ細胞浸潤を示したが、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−高濃度腫瘍には無かった。３匹の動物のｍｍ２当たりのＣＤ３＋細胞数の平均値（＋／−ＳＤ）を示した。＊：ｐ＝０．０３２；＊＊：ｐ＝０．００５。
【０１７１】
図１０：ＣＬＩＯ−ｔａｔで標識した活性化ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞は、両側にＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−高濃度腫瘍を持つマウスへの養子移植の前に、ＰＢＳ（Ａ、Ｄ）又はＡＭＤ３１００（０．０８及び０．２５μｇ／ｍＬ）（Ｂ、Ｅ及びＣ、Ｆ）とインキュベートした。この図で示される軸方向ＭＲＩは、養子移植の２４時間後に生成したものである。パネルＣ及びＦは、最初にＡＤＭ３１００処理しないＴ細胞の導入を受け、続いて最初の養子移植から２４時間後にＡＤＭ３１００で処理したＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞による２回目の養子移植を受けた代表的なマウス（＃１）のＭＲ画像を示す。この２回目の養子移植の後２４時間に、ＭＲＩ画像を再度取得した。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−ｈｉｇｈ腫瘍に比較してＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍に有意なＴ２減少が観測された（Ｄ：低Ｔ２適合値比）。ＯＴ−１  Ｔ細胞をＡＭＤ３１００とプレインキュベートした場合、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１−高濃度腫瘍内に同等のＴ細胞浸潤があり、同等のＴ２減少が見られた（Ｅ；Ｔ２適合値は１に近い）。予想した通り、マウス１に対して行ったＡＭＤ３１００で前処理したＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞による２回目の養子移植は、両側性のＴ２信号減少を示した（Ｆ；Ｔ２適合値は１に近い）。養子移植から４８時間後に組織を採取し、抗ＣＤ３Ａｂで染色した（Ｇ〜Ｊ；ＡＭＤ３１００未処理、Ｋ〜Ｎ；ＡＭＤ３１００処理）。０．０８及び０．２５ｎｇ／ｍＬ濃度のＡＭＤ３１００で前処理したＯＴ−１  Ｔ細胞を養子移植した後の、１群当たり３匹の動物のｍｍ２当たりのＣＤ３＋細胞数の平均値（＋／−ＳＤ）を示した（Ｏ）。倍率＝４０倍及び１００倍。＊：ｐ＝０．０９８；＊＊：ｐ＝０．０１１。
【０１７２】
図１１：ＳＤＦ−１が局所的に発現された場合、持続的に養子移植したＯＴ−１  ＣＤ８＋細胞の強力な抗腫瘍活性は克服される。マウスの群（ｎ＝６）に、１×１０７個のＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）養子移植した２１日後に、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ（Ａ及びＢ）又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞（Ｃ及びＤ）を抗原投与した。対照マウスは、ＨＢＳＳ単独をｉ．ｖ．注射した２１日後に抗原投与した（Ａ及びＣ）。腫瘍成長（Ａ〜Ｄ）及び生存時間解析（Ｅ）を示す。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１を持つマウスの３５％は腫瘍を拒絶した（Ｄ及びＥ）、これに対しＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍を抗原投与したマウスは９０％拒絶した（Ｂ及びＥ）。＊：ｐ＝０．０４。
【０１７３】
図１２：回収した腫瘍及びリンパ節（ＬＮ）から得た養子移植したＯＴ−１  ＣＴＬのＦＡＣＳｃａｎによる識別。それぞれの点表示は、コントロール（Ａ及びＣ）及び養子移植したマウス（Ｂ及びＤ）から得て解析したＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１腫瘍の全細胞数中で、Ｖβ５．１／５．２及びＶα２ＴＣＲを発現しているＣＤ８＋細胞の平均画分（±ＳＤ）を表す。各腫瘍及び２つのリンパ液ＬＮ内の持続的ＯＴ−１  ＣＤ８＋細胞の数を測定した（Ｅ）。Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１腫瘍を持つマウス群の間で有意に相違することなく、全てのマウスはＬＮ内にＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を有していた（ｐ＝０．７）。ＳＤＦ−１発現腫瘍内の全ＯＴ−１  ＣＴＬ数は、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ腫瘍から回収した細胞に比べて有意に４倍減少していた（＊：ｐ＝０．００５）。結果は、１群３又は４匹のマウスについての３つの個別の実験の平均＋／−ＳＤとして表した。
【０１７４】
図１３：ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ（■）又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１（●）標的細胞に対する細胞毒性の定量は、標準の５１Ｃｒ放出アッセイ（Ａ）又は平底ウェル内で行う前述の改変アッセイ（Ｂ）で測定した。（＊：ｐ＝０．１６、＊＊：ｐ＝０．０００４）。６つの独立した実験の結果を示す。特異的なＣＸＣＲ４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００（５μｇ／ｍＬ）で前処理した（２列及び４列）又は未処理（１列及び３列）のＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ（１列及び２列）又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１（３列及び４列）と共にインキュベートしたものの細胞毒性を、同様に平底ウェル中の５１Ｃｒ放出アッセイでも評価した（Ｃ）。結果は、ＬＵ３０／１０５ＯＴ−１細胞として提示され、データは平均±ＳＥＭとして示した。（＊：ｐ＝０．０４５）。３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭで表わした結果を示した。
【０１７５】
図１４：ＯＴ−１  Ｔ細胞の活性化、増殖及び致死有効性に及ぼすＳＤＦ−１の影響。ＯＴ−１マウスから得た脾臓細胞又は精製したＣＤ８＋Ｔ細胞を、標示した２つの濃度のＳＤＦ−１と３時間プレインキュベートした。細胞を、９６ウェルプレート中で、固定した抗ＣＤ３抗体、可溶性抗ＣＤ２８抗体及び５０Ｕ／ｍＬのＩＬ２の存在下で３日間増殖させ、標示した濃度のＳＤＦ−１を２４時間毎に各培養物に添加した（Ａ、上部の着色点区画）。Ｔ細胞活性化を解析するため、細胞を抗ＣＤ２５抗体（赤色のヒストグラム）、抗ＣＤ６９抗体（青色ヒストグラム）で標識した。ＣＦＳＥで標識したＴ細胞で３日間刺激した後、細胞増殖を測定した（Ａ、下部の着色点区画）。ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の殺活性は、上部チャンバーに置かれた０．４μｍのポリカーボネート膜内で培養の初日から増殖しているＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１細胞の存在下、抗体誘導によるＴ細胞増殖を５日間行った後に評価した（Ｂ）。ＳＤＦ−１の存在又は非存在下で刺激したＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の殺活性は、ケモカインと５時間インキュベーションした後、丸底ウェルプレート内のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１の標的細胞（ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドによるパルスなし）に対して測定した。
【実施例２】
【０１７６】
胎児胸腺からのＣＤ４細胞の遊走は、抗真菌走性のＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＭＤ３１００によって廃止される
発育中の胸腺細胞は胸腺中を遊出する間に成熟し、最終的に、胸腺から遊出して末梢のリンパ器官に住み着く。胸腺遊出の過程は、部分的にＳＤＦ−１とその同族受容体ＣＸＣＲ−４の間の受容体／リガンド相互作用によって制御される。ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１が胸腺遊出に寄与する詳細なメカニズムは、現在、抗遁走性剤のＡＭＤ３１００で無効に出来るＣＸＣＲ４依存性の遁走性シグナルによって制御される事が明らかにされている。
【０１７７】
Ｉ．材料及び方法
Ａ．マウス
Ｅ１５．５ＣＸＣＲ４−／−胚は、Ｃ５７ＢＬ／６を背景に持つＣＸＣＲ４欠損の異型接合マウスを育種して作成した。膣栓の存在は、妊娠日数が０．５を表すと考えられた。マウス及び胚の遺伝子型は、すでに開示のように特定された（Ma, Q., et al. 1998. Proc Natl Acad Sci USA 95:9448; Ma, Q., et al. 1999. Immunity 10:463）。本章に記載する研究に使用したマウスは、ＮＩＨの動物研究ガイドラインに従い、無菌施設内で飼育した。
【０１７８】
Ｂ．胎児胸腺器官培養
妊娠１５．５日のマウスをＣＯ２で窒息死させ、胚を氷上で冷した。胎児胸腺は、解剖的に確認し得る葉の連結が保たれるように注意しながら、解剖顕微鏡下で注意深く摘出した。胸腺はＨＢＳＳに入れ、氷上に保った。個々の胸腺は、６．５ｍｍトランスウェルの挿入部の孔径３．０μｍのポリカーボネート膜（Corning Incorporated Life Sciences Acton, MA）の表面に穏やかに移した。２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１０％のＨＥＰＥＳ及び１０％のＦＢＳ（Sigma）を補填したＤＭＥＭ（３６０μＬ）をトランスウェルの下室に添加した。この培地の量は、胸腺を培地と空気の境界に置く量である。培養物は５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートし、培地を３日毎に交換した。分析のため、下室に存在する遊出物を収穫する２４時間前に、１個の胸腺が入った各トランスウェル挿入部を新しいウェルに移して、各胸腺からの遊出物を集めた。分析する日、２個の胸腺を収穫し、ＣＸＣＲ４＋／−及びＣＸＣＲ４−／−マウス由来の少なくとも４個の胸腺葉からの遊出物を集めた。成熟期及び全回収細胞の違いを最小にする目的で、各時点について、同時に受精した１匹又は２匹の妊娠マウス由来のＣＸＣＲ４＋／−及びＣＸＣＲ４−／−胸腺を解析した。Ｅ１５．５ＷＴ（ＣＸＣＲ４＋／＋）胸腺は、Ｃ５７ＢＬ／６交配マウス由来の胎児から得た。胸腺遊出に対する阻害を調べるため、ＰＴＸ（１００ｎｇ／ｍＬ、Sigma）又はネズミ組み換えＳＤＦ−１（５０、５００、１０００ｎＭ、PeproTech, Rocky Hill, NJ）を１４日目にＷＴＦＴＯＣに添加し、胸腺及び遊出物を培養１５日目に収穫した（Poznansky, M. C, et al. 2002. J Clin Invest 109: 1101）。ＤＰＣ１５．５ＣＸＣＲ４＋／−又はＣＸＣＲ４−／−胚由来のＦＴＯＣは、上記と同様に調製し、ＡＭＤ３１００（０．５又は１ｇｇ／ｍＬ；Sigma）を下室の１４日目のＦＴＯＣに添加した。２４時間後に、胸腺遊出物を集めた（Hatse, S., et al. 2002. FEBS Lett 527:255）。
【０１７９】
Ｃ．免疫蛍光染色及びフローサイトメトリーによる分析
胸腺葉を採取し、０．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（Clostridium histolyticum, type V 由来、クロストリジオペプチダーゼＡ、SIGMA Chemicals）、１０％のＦＢＳ、０．２ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ及び０．２Ｍのリン酸塩を含む４ｍＬ容のポリスチレン製丸底試験管に移した。胸腺を３７℃で３０分間培養した後、穏やかにピペッティングし、眼に見える断片が残らなくなるまで解離させた。細胞懸濁液は、さらなる酵素作用を阻止するため、ＨＢＳＳ及び１０％ＦＢＳで１回洗浄した。細胞は、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳに再懸濁させ、血球計算板を用いて計数した。Ｆｃ結合を遮断するため０．５ｇｇの２．４Ｇ２抗体と氷上で３０分間培養した後、３色又は４色分析のための直接染色を行った。細胞懸濁液を、４℃で１５分間培養し、次に染色バッファーで２回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）を用いて分析した。データの解析はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star, Inc. Ashland, OR）で行った。次のモノクローナル抗体を使用した：抗ＣＤ４（クローンＲＭ４−５）、抗ＣＤ８（クローン５３−６．７）、抗ＣＤ６２Ｌ（クローンＭＥＬ−１４）、抗ＣＤ３ｃ（クローン１４５−２Ｃ１１）及び抗ＣＸＣＲ４（クローン２Ｂ１１／ＣＸＣＲ４）（BD PharMingen, Mountain View, CA）。アネキシンＶ及びＰＩ染色のために、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（BD Pharmingen）を使用した。各標識について、正値性の閾値は、関係のないコントロール抗体の存在下で見られる非特異的結合から離れている事が認められた。平均のｌｏｇ蛍光強度（ＭＦＩ）は、陽性染色サンプルのＭＦＩからイソタイプコントロールのＭＦＩを差し引いて求めた。細胞ピーク間の違いがコントロールに対して統計的に有意であるかを評価するために、ヒストグラム解析用のコルモゴルフ・スミルノフ検定（Kolmogorov-Smirnov test）を使用した。
【０１８０】
Ｄ．遊出アッセイ
定量的遊出アッセイは、すでに開示の（Poznansky, M. C, et al. 2000. Nat Med 6:543）のように、トランスウェル・システム（Corning Costar Inc., Corning, New York, USA）（直径６．５ｍｍ、孔径５μｍ、ポリカーボネート膜）を使用して行った。精製した胎児（Ｅ．１６）胸腺細胞亜母集団（５×１０４細胞）（ダブルネガティブ（ＤＮ）、ダブルポジティブ（ＤＰ）及びシングルポジティブ（ＳＰ）胸腺細胞）は、前に記したように（Poznansky, M. C, et al. 2002. J Clin Invest 109:1101）、ＦＡＣＳ選別によって調製し、０．５％ＦＣＳを含む全量１５０ｇＬのＤＭＥＭが入った各ウェルの上室に添加した。細胞集団は、＞９９．９％純粋である事がフローサイトメトリー分析によって示された（データは示されていない）。ＳＤＦ−１のポジティブ傾斜、ネガティブ傾斜及び傾斜なしの交差分析用マトリックスを作るため、トランスウェルのそれぞれ下室、上室又は上下両室に、ヒトＳＤＦ−１（PeproTech Inc.,Rocky Hill, New Jersey, USA）を、１００ｎｇ／ｍＬ、１及び１０ｇｇ／ｍＬの濃度で使用した。胸腺細胞亜母集団はまた、遊出アッセイに添加前に、すでに開示のようにＰＴＸ（１００ｎｇ／ｍＬ）又は抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）で前処理した（Poznansky, M. C, et al. 2002. J Clin Invest 109:1101）。
【０１８１】
ＩＩ．結果
Ａ．ＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＭＤ３１００は、胎児胸腺器官培養（ＦＴＯＣ）から正常ＣＤ４細胞遊走を妨げる
特異的非ペプチド性ＣＸＣＲ４アンタゴニストのＡＭＤ３１００は、ＨＩＶ感染に対する強力な活性が報告された最初のバイサイクラム（bicyclam）誘導体であり（Hatse, S., et al. 2002. FEBS Lett 527:255; De Clercq, E., et al. 1992. Proc Natl Acad Sci USA 89:5286）、細胞内Ｃａ＋＋流出の阻害及びＳＤＦ−１に対するネズミ脾細胞の走化反応阻害が示されている（Matthys, P., et al. 2001. J Immunol 167:4686）。ＣＸＣＲ４の発現は、ＦＴＯＣ１４日から得たＳＰ及びＤＰ胸腺細胞で測定した（データは示されていない）。予想したとおり、ＣＸＣＲ４は、ＳＰ細胞と比較し、ＤＰ胸腺細胞に高レベル（ＭＦＩ：５２．１±１１．３）で発現された。ＳＰＣＤ４胸腺細胞は、ＳＰＣＤ８細胞に比べ、有意に高いＣＸＣＲ４発現を示した（それぞれ、ＭＦＩ：２９．１±６．５対１５．５±７．３、ｐ＝０．０１）。培養１４日のＦＴＯＣは、１μｇ／ｍＬのＡＭＤ３１００と２４時間培養した。１μｇ／ｍＬのＡＭＤ３１００によるＦＴＯＣ処理は、未処理のＦＴＯＣに比べ、胸腺内の全細胞数を有意に増加させた（図１５Ａ；それぞれ、３４９±９９．５対２４７±７２．９×１０３／葉；ｐ＝０．０２２）。ＳＰＣＤ８遊出細胞の全数は、ＡＭＤ３１００処理と未処理のＦＴＯＣ間で違いが無かった（ｐ＝０．９３）。しかし、反対に、ＳＰＣＤ４胸腺細胞は、ＡＭＤ３１００処理した胸腺から遊出する能力が、未処理のコントロールに比べて著しく損なわれた（図１５Ａ、Ｃ；それぞれ、１．１±０．１５対４．０７±０．１２×１０３／葉；ｐ＝０．００５）。ＣＤ６２Ｌ発現の分析から、ＡＭＤ３１００処理したＦＴＯＣの胸腺内には、未処理のＣＸＣＲ４＋／＋胸腺と比較して、ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４ＳＰ細胞の滞留が起こることが明らかになった（図１５Ｂ、Ｄ；ｐ＝０．０１７）。ＳＰＣＤ８胸腺細胞によるＣＤ６２Ｌ発現は、ＡＭＤ３１００処理胸腺では影響されなかった（図１５Ｂ、Ｄ；ｐ＝０．５６）。実際、ＡＭＤ３１００で正常胸腺細胞内のＣＸＣＲ４受容体を遮断すると、生体外及び生体内で成熟Ｔ細胞の胸腺内滞留が起こる。従って、抗遁走性剤ＡＭＦ３１００もまた、胸腺から遊出するＴ細胞の抗遁走性を阻害するように働く。
【０１８２】
ＩＩＩ．図面の補足説明
図１５：ＣＸＣＲ４＋／−Ｅ１５．５ＦＴＯＣ（ｎ＝４）を１４日間培養し、次に１μｇ／ｍＬのＡＭＤ３１００で２４時間処理した。胸腺細胞及びＲＴＥを集め、ＣＤ４及びＣＤ８（Ａ、Ｃ）並びにＣＤ６２Ｌ（Ｂ、Ｄ）を染色した。ＡＭＤ３１００処理及び未処理のＦＴＯＣ由来のＳＰ  ＣＤ４及びＣＤ８  ＲＴＥの絶対数（平均±ＳＥＭ）（Ｃ；＊ｐ＝０．００５）並びにＣＤ６２ＬｈｉｇｈＳＰ胸腺内胸腺細胞の割合（平均±ＳＥＭ）（Ｄ；＊＊ｐ＝０．０１７）を示す。
【実施例３】
【０１８３】
プロテインキナーゼＣ阻害剤は好中球に対して抗遁走性の効果を有する
好中球の走化性は、高等真核細胞の遊走及び勾配検知を理解するための原型となる（Iijima, M., et al. 2002. Dev Cell 3:469-78; Parent, C.A., et al. 1999. Science 284:765-70）。好中球は化学誘引を受ける、即ちケモカインのＩＬ−８を含む組織損傷の部位で産生される多数のケモカイン物質に対して持続的で偏向的な移動をすることが立証されている（Baggiolini, M., et al. 1992. FEBS Lett 307:97-101 ; Rot, A. 1993. Eur J Immunol 23:303-6; Luster, A.D. 1998. N Engl J Med 338:436-45）。現在、好中球の遁走性は、ＧＦ１０９２０３Ｘのような抗遁走性のプロテインキナーゼＣ阻害剤によって無効に出来ることが立証されている。
【０１８４】
Ｉ．材料及び方法
Ａ．好中球の分離
ヒト全血は、健常ボランティアから、ヘパリン・ナトリウムの入った試験管（Becton Dickinson, San Jose, CA）に静脈穿刺して得た。好中球は、すでに開示のように（Tager, A.M., et al. 1998. Am J Respir Cell MoI Biol 19:643-52）、密度勾配遠心分離によって分離し、低張溶解によって精製した。
【０１８５】
Ｂ．ミクロ流体の直線的勾配発生器の作成、準備及び特徴付け
ミクロ流体の直線的勾配発生器は、ポリ（ジメチルシロキサン）（PMDS; Sylgard 184, Dow Corning, NY）内に作成し、すでに開示のように（Li Jeon, N., et al. 2002. Nat Biotechnol 20:826-30; Whitesides, G.M., et al. 2001. Annu Rev Biomed Eng 3:335-73）、勾配の生成はフルオレセインイソチオシアネート（FITC; Sigma-Aldrich）を用いて検証した。
【０１８６】
Ｃ．ミクロ流体遊出アッセイ及び経時的顕微鏡検査
濃度が５×１０６細胞／ｍＬの好中球を、遊走通路を横切って均一に負荷し、０．５％（質量／体積）牛胎児血清（FBS; Mediatech）を含むイスコブ改変ダルベッコ培地（IMDM; Mediatech, Herndon, VA）の０．１ｍｍ／秒の流れの中、濃度ピークが１２ｎＭ、１２０ｎＭ及び１．２μＭの直線的勾配を持つヒトインターロイキン−８（７２アミノ酸; Pepro-Tech, Rocky Hill, NJ）の在又は不在の下で遊走させた。遊走は、ニコン  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｓ 顕微鏡（ニコン、日本）で観察した。明視野の画像（１０倍）は、ＩＰＬａｂ  ３．６．１（Scanalytics, Fairfax, VA）でコントロールされたデジタルカメラ（浜松ホトニクス、日本）を使用して３０秒毎に撮影した。細胞の移動及び勾配の検証は、遊走通路に沿った設定点で常に観測した。実験の過程で細胞が分泌するケモカイン物質の二次的影響は、前もって事実上排除されており、アッセイ中に装置を通る液の流速を考慮すると、可能性は低いと考えられた。或る実験では、細胞はＧＦ１０９２０３Ｘで（２５ｍＭ、２５℃で３０分間）プレ培養し、洗浄して装置に負荷された。
【０１８７】
Ｄ．直線勾配発生器内の細胞遊走の数学的解析
細胞遊走は、各細胞についてデカルト座標データの表を作るＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ４．５ （Universal Imaging, Dowington, PA）対象追跡アプリケーションを使用して追跡した。追跡データは、角振動数、平均変位の二乗、遊走速度、持続時間、ランダム運動係数及びランダム歩行長を確定するために、エクセル（マイクロソフト, USA）及び ＭＡＴＬＡＢ  １３（The Mathworks, Inc., Nowton, MA）で解析した。細胞遊走は、次の持続酔歩モデルに基づいて特徴付けした（Moghe, P.V., et al. 1995. J Immunol Methods 180:193-211; McCutcheon, M. 1946. Physiological Reviews 26:319）。各細胞について、変位Ｒ（ｔ）の二乗は、時間の間隔ｔで計算され、
【数４】
2008519052.tif 000007
ここで、ｔ０は開始時間である。開始はデータ設定に従って変わるため、変位は重なる時間間隔を平均化した。平均変位の二乗を計算するために、設定内の細胞全部に包括的な平均化を行った。細胞遊走を、相関した偏った酔歩として数学的にモデル化すると、これは、
【数５】
2008519052.tif 000008
のように書くことができ、ここでｓ及びｐは、それぞれ移動の平均速度及び持続時間の測度である。時間の間隔ｔが持続時間ｐより大きい場合、ブラウン拡散と類似し、平均変位の二乗はｔに対して直線的に比例するようになり、
【数６】
2008519052.tif 000009
ここでμは運動係数である。平均変位の二乗の直線部分に一致する最小二乗回帰線の勾配と切片は、それぞれ、μ及びPの推定値を与える。さらに、運動又は平均自由行路の「持続指標」（PI）は、細胞の全変位を全行路長で割った値として計算した。PIは旋回運動の指標であり、１は直線内の運動、０は正味の変位が無い事を示す。微細加工装置内の特定のＩＬ-８傾斜における好中球遊走の方向の偏りを定量化するために、我々はＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎら（McCutcheon, M. 1946. Physiological Reviews 26, 319; Nossal, R., et al. 1976. Biophys J 16, 1 171-82）に基づいて「屈化性指標」（CI）を計算し、設定された傾斜の方向に対して細胞が横切った正味の行路長を全移動距離で割った値と定義し、最大ケモカイン濃度に向かう又は離れる方向性の測定を含めるように改変した：
【数７】
2008519052.tif 000010
ここで、liは細胞遊走ベクトルの長さであり、φｉは設定された傾斜に対して移動ベクトルが作る角度である。従ってCIは傾斜に対する方向性の正確さの指標であり、細胞が直接傾斜の上方に移動した場合は１、好みの方向性がない場合は０そして細胞が直接傾斜の下方に移動した場合は−１となる。この指標は個々の細胞について計算され、次に遊走細胞集団を平均化して「平均屈化性指標」（MCI）を得た。
【０１８８】
ＩＩ．結果
Ａ．プロテインキナーゼＣ阻害剤ＧＦ１０９２３０Ｘは好中球遊走に影響を及ぼす。
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の二次伝達シグナルの増幅又は抑制が好中球の遁走性の方向的偏りをコントロールするかどうかを究明するため、及びカルシウム依存性ＰＫＣが方向性のある細胞遊走に関与するという発見（Jin, M. et al. 2005. J Neurosci 25:2338-47; Sun, X.G., et al. 1999. Cell Growth Differ 10:343-52; Battle, E., et al. 1998. J Biol Chem 273:15091-8; Carnevale, K.A., et al. 2003. J Biol Chem 278:25317-22）を踏まえて、好中球を選択的カルシウム依存ＰＫＣ阻害剤ＧＦ１０９２０３Ｘ（Toullec, D., et al. 1991. J Biol Chem 266:15771-81）で前処理し、次に好中球遁走性（６００ｎＭから１．２ｍＭ）又は化学誘引性（０から１２０ｎＭ）が優勢なＩＬ−８の傾斜に接触させた。ＧＦ１０９２０３Ｘは、２５μＭの濃度で選択的に遁走性を阻害し、遁走的反応を圧倒的に化学誘引物質反応に変換した（図１６）（ｐ＜０．０００１）。従って、ＰＫＣ阻害剤もまた、抗遁走性剤として機能する。
【０１８９】
ＩＩＩ．図面の補足説明 
図１６：表示したそれぞれの条件についての平均屈化性指標（ＭＣＩ）（+/-標準誤差）は、ＧＦ１０９２３０Ｘ、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ、Ｒｐ−ｃＡＭＰＳ及びＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＧＭＰＳの存在下でのＩＬ−８傾斜の在り又は無しを含む、それぞれのＩＬ−８傾斜条件について示した。ＭＣＩを出すために解析した細胞の行路の数は図の右に括弧で示され、それらは各条件の３回の実験から導かれた。ＭＣＩ値の−０．１は方向的に傾斜の下方に偏ったこと（遁走性）を表し、ＭＣＩ値が＋０．１より大きいのは方向的に傾斜の上方へ移動が偏ったこと（走化性又は誘引）を表す。†ｐ＜０．００５又は＊ｐ＜＜０．０００１：対応する阻害剤の無いコントロール傾斜と比較した、各阻害剤条件についてのＭＣＩのスチューデントｔ−検定比較。
【実施例４】
【０１９０】
遁走性剤及び抗遁走性剤のアッセイ
Ｔ細胞は、遁走性剤により濃度依存性で忌避される。培養において、遁走性剤によるＴ細胞の反発は、細胞の周囲にクリアランス（消失）領域を形成する。抗遁走性阻害剤で前処理すると、遁走性剤が存在してもＴ細胞の周囲にクリアランス（消失）領域を形成しない。従って、本明細書には遁走性及び抗遁走性剤の二元アッセイを記載する。
【０１９１】
Ｉ．材料及び方法
Ａ．ＳＤＦ−１傾斜の形成
β−ＴＣ３細胞によって作られるＳＤＦ−１傾斜でＴ細胞反応を解析するため、ネズミＴ細胞を、予め６ｍｍの円形パッチとしてフィブロネクチン又はラミニンでコーティングした２４ウェル及び４８ウェルプレート（BD BioSciences, Bedford, MA）上に増殖させたＳＤＦ−１分泌細胞及びコントロールのβ−ＴＣ３細胞のミクロウェルに添加し、３７℃で１５時間培養して経時的ビデオ顕微鏡検査により観察した。画像は、ＩＰＬａｂソフトウェアでコントロールされた浜松  カメラ（浜松ホトニクス, 日本）を使用して３０秒毎に撮影した。ＣＸＣＲ４受容体は、すでに開示のように（７０）、Ｔ細胞を５μｇ／ｍＬのＡＭＤ３１００（Sigma, St.Louis, MO）と３７℃で３０分間プレ培養して遮断した。遊走の軌跡は、ランダムに選択したＴ細胞について、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを用いて測定した。β−ＴＣ３細胞に向かう又は遠ざかる移動の方向性の測定として、すでに開示のように、細胞行路追跡及び平均屈化性指標（ＭＣＩ）をＭｅｔａＭｏｒｐｈ及びＭａｔＬａｂソフトウェアを用いて計算した。ここで、＋０．１から−０．１のＭＣＩは化学運動性を表し、＞＋０．１は走化性を、そして＜−０．１は遁走性を表す（Moghe, P.V., et al. 1995 J Immunol Methods 180, 193-211; Mc Cutcheon, M. (1946) Physiological Reviews 26, 319）。
【０１９２】
ＩＩ．結果
急勾配で連続したＳＤＦ−１傾斜がＴ細胞遊走に与える遁走的影響を試験できるアッセイが設計されており、そこでは、ＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞及びコントロール細胞にＴ細胞を添加し、その活動的な動きを経時的顕微鏡検査で直接１５時間観測する。Ｔ細胞は、実験の初めにコントロールのＭＳＣＶ細胞並びにＳＤＦ−１分泌ＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞の入ったウェル内に均一に分配された。コントロール細胞の入ったウェルでは、Ｔ細胞の分布は実験の最後までランダムに保たれ、細胞遊走は、経時的ビデオ顕微鏡検査及び細胞行路追跡並びにＭＣＩ（−０．０１８  ＋／−  ０．０１２）により事実上化学運動的であると記録された（図１７Ａ及びＤ）。反対に、Ｔ細胞はＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞から遠くに遊走し、培養１５時間にはＳＤＦ−１分泌細胞のパッチの周囲にＴ細胞の薄いクリアランス（消失）領域が形成された。Ｔ細胞は、最初の１．５時間の培養の間はＳＤＦ−１分泌細胞に向かって遊走する傾向があった（ＭＣＩ＝＋０．０８  ＋／−  ０．０１８）が、その後遁走性の反応に変わった（ＭＣＩ＝−０．２６８  ＋／−  ０．０１９）（図１７Ｂ及びＥ）。Ｔ細胞の遁走性がＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞によるＳＤＦ−１分泌と直接関係することを確認するため、Ｔ細胞を特異的なＣＸＣＲ４アンタゴニストのＡＭＤ３１００で前処理した。このように処理されたＴ細胞は、ＳＤＦ−１分泌細胞から遠くに遊走出来なく、ＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞の周囲にランダムな分布が保たれた（図１７Ｃ）。この方法で、ＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞及びコントロールでないＭＳＣＶ細胞がＴ細胞から遊走的な応答を引き出す事、及びＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞による高レベルのＳＤＦ−１分泌は、生体外のＣＸＣＲ４が介在するメカニズムを経由してＴ細胞を忌避させるのに十分であることが示された。
【０１９３】
ＩＩＩ．図面の補足説明
図１７：高レベルＳＤＦ−１分泌ＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞からのＴ細胞反発の経時的顕微鏡検査による実証。Ｐａｎ−Ｔ細胞を対照のＭＳＣＶ細胞又はＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞の入ったウェルにランダムに分配し、１５時間培養した。図２４ａ〜２４ｃは、実験の終わりまでの最終的なＴ細胞分布を表し、対照ＭＳＣＶ細胞（Ａ）及びＴ細胞がＣＸＣＲ４アンタゴニストのＡＭＤ３１００で前処理された場合のＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞（Ｃ）の入ったウェルではランダムのままであったが、高レベルＳＤＦ−１産生ＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞からの未処理のＴ細胞の反発は「クリアランス（消失）領域」を形成した（Ｂ）。図１７Ｄ−Ｅは、コントロールＭＳＣＶ細胞（Ｄ）又はＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞（Ｅ）と共培養した初めの２．５時間の未処理のＴ細胞の遊走経路を表す。遊走軌跡の出発点は中心線に沿って分配されており、終点は×で印した。対照ＭＳＣＶウェル内のＴ細胞遊走は生来の化学運動性であるのに対し、ＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞の入ったウェル内のＴ細胞遊走は、最初の時間内はＳＤＦ−１分泌細胞に向かって走化性であるが続いて遁走性に変わった。
【実施例５】
【０１９４】
リガンド二量化の遁走性効果
好中球の高レベル細胞質内カルシウム流出は、ケモカインの遁走的作用に関係することを本明細書に示す。細胞質内カルシウム流出の条件と遁走性剤のＩＬ−８及びＳＤＦ−１が二量化される条件を比較した図は、それらの薬剤が、遁走性の作用を仲介する時二量化されることを示している。
【０１９５】
Ｉ．材料及び方法
Ａ．好中球を分離するための材料及び方法は、上記の実施例３の第Ｉ章に記載した
Ｂ．細胞内カルシウム測定及びＩＬ−８の１０５の後のＣＸＣＲ２の染色
ＩＬ−８に反応した好中球内のカルシウム流出は、すでに開示のように測定した（Mahon, M.J., et al. 2004 J Biol CIiem 279:23550-8）。略記すると、分離した細胞（〜１０７／ｍＬ）を平衡塩類溶液（１２７ｍＭのＮａＣｌ、３．８ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭのＣａＣｌ２、０．８ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭグルコース及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に移し、１．２５μＭのＦｕｒａ−２アセトキシメチル・エステル（Molecular Probes, Eugene, OR）と室温で４５分間培養し、平衡塩類溶液で洗浄し、そして室温で１５分間無負荷に保った。次に細胞を平衡塩類溶液で２回洗浄し、１０６／ｍＬに再懸濁し、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩの室内に入れたカバーガラス（Nalge Nunc International, Naperville, IL）に置いた。標示した濃度のＩＬ−８（Akahoshi, T., et al. 1994 Lymphokine Cytokine Res 13:113-6）に応答したカルシウム流出は、ＰＴＩ  Ｄｅｌｔａｓｃａｎ  ２波長蛍光光度計（Photon Technologies Incorporated, Lawrenceville, NJ）を用いて３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで励起した細胞の蛍光で測定し、ニコン  ダイアフォト  ２００顕微鏡（Melville, NY）及びＳｅｎｓｙｓの電化結合素子カメラ（Photometrics, Ltd., Tucson, AZ）を通して観察し、そしてイメージマスタ  ２ ソフトウェア（Photon Technologies Incorporated）によるＰｏｅｎｉｅ−Ｔｓｉｅｎ比を使って解析した。指定の濃度のＩＬ−８に対するシグナル発信反応は、５μＭのイオノマイシン（Sigma）の処理で測定された最大カルシウム流出に対して調整した。ＩＬ−８の１２０ｎＭ、１．２μＭ及び２．４μＭと接触前及び後の好中球上へのＣＸＣＲ４の発現は、ＰＥ−標識抗ＣＸＣＲ２ ＩｇＧ１抗体（R & D systems）を用いて測定した。好中球はまた、非特異的染色を定量するため、ＰＥ−標識ＩｇＧ１イソタイプのコントロール抗体で染色した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＦｌｏＪｏソフトウェア（Tree 
Star, San Carlos, CA）を用いて測定した。イソタイプのコントロール染色と実験条件下の特異的なＣＸＣＲ２染色から生じたＭＦＩ値との統計的な差は、Ｋｏｌｍｏｇｒｏｖ−Ｓｍｉｍｏｆｆ検定で測定した。
【０１９６】
ＩＩ．結果
Ａ．低及び高濃度のＩＬ−８は示差レベルのカルシウム流出を生じる
細胞内カルシウム流出の測定は、ＧＰＣＲによるシグナル伝達の強度の指標となり、カルシウム及びサイクリック・ヌクレオチドの両者はこれらのシグナルの２次メッセンジャーとして働く。走化性及び遁走性のＩＬ−８投与量によってシグナル出力が生じるかを確認するために、細胞に１．２５μＭのＦｕｒａ２−ＡＭを負荷し、１２０ｎＭ、１．２μＭ及び２．４μＭのＩＬ−８と接触させ、そしてカルシウム結合と非結合Ｆｕｒａ２−ＡＭの比を蛍光光度計でリアルタイムに測定した。ピークのカルシウム流出反応は、１．２０μＭのＩＬ−８（８３％  ＋／−  ７．９％：最大カルシウム流出のパーセント）は１２０ｎＭのＩＬ−８（４８％  ＋／−  ５．１％）よりおおよそ２倍大きかった（ｐ＜０．０５）。前の報告は、１００ｎＭの濃度までで、さらに高濃度に拡大せずに、最大カルシウム流出６０を明らかにした。カルシウム流出の最大ピークは、ケモカイン濃度が１．２μＭ及び２．４μＭで見られ、回収速度の差に関連しており、細胞はケモカインのこれらの濃度の違いを判別できると言う見解を支持した（図１８）。興味あることに、ＩＬ−８の試験した全ての種類の投与量についての回収期間は、結合Ｆｕｒａ２−ＡＭのレベル差を明示し、それぞれのピーク期間後の細胞内カルシウム流出のレベルの違いを表した。従って、ＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ１を通してカルシウム流出によって測られた回収期間中のシグナルの大きさは、ＩＬ−８の濃度の増加によって増大しており、これは好中球が１００ｎＭより高い濃度のＩＬ−８を検出しそれに対する差別的な細胞内反応を起こすことが出来ることを示している。方向性を持つ遊走反応を誘導し、推定される組み換えケモカイン受容体のＫｄより少なくとも１０培高いことが知られるケモカインの濃度に対してカルシウム流出が示差的レベルであることは、ケモカインＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）及びそのＣＸＣＲ４との相互作用で明解に実証されている（Princen, K., et al 2003 Cytometry A 51 :35-45）。
【０１９７】
カルシウム流出によって測定されたシグナル出力が、ＩＬ−８の逐次的な低投与量又は高投与量から生じるのかを測定するために、好中球をＩＬ−８の低及び高濃度の２つのパルスに接触させた（図１８Ａ〜Ｄ）。逐次的なカルシウム流出は、最大の化学誘引性の誘導が見られる低投与量（１２０ｎＭ）（図１８Ａ）及び高投与量（１．２μＭ）（図１８Ｂ）のＩＬ−８の繰り返しパルス、並びに最大の遁走性反応に関連する６００ｎＭ続いて１．２μＭ（図１８Ｃ）の投与量に接触させた細胞に見られた。細胞を最高投与量の２．４μＭ続いてさらに高濃度のケモカインに接触させた場合は、逐次的なカルシウム流出は見られず、１．２μＭを超える濃度では受容体の飽和が起きる事を暗示した（図１８Ｄ）。これらのデータは、好中球が方向性のある遊走及び１．２μＭのピーク濃度までの傾斜検知能力を持つが、それより高いピーク濃度の傾斜では化学運動的な移動しか経験しなかった事と矛盾しない。
【０１９８】
ＩＬ−８の遁走性の濃度による逐次的なカルシウム流出の存在を前提として、ケモカインの最初のパルスの後でも、好中球の表面にＣＸＣＲ２が検出できるかを試験した。好中球は、１２ｎＭ、１２０ｎＭ、１．２μＭ及び２．４μＭの濃度のＩＬ−８で単一パルスした後、ＣＸＣＲ２についての免疫染色をした。ＣＸＣＲ２は、一貫した２〜３倍の平均蛍光強度を低下させ（データ表示無し）そしてコントロールのイソタイプ抗体による染色のＭＦＩ値より４〜５倍（ｐ＝＜０．０１）の強さを保つ化学誘引性及び遁走性の両者のＩＬ−８濃度で、ケモカイン接触直後にベースライン発現レベルから下方制御された。ＣＸＣＲ２は、低又は高濃度のＩＬ−８に接触した後でも、明らかに細胞表面に検出可能であった。
【０１９９】
非ペプチド性ＣＸＣＲ２アンタゴニストのＳＢ２２５００２（Calbiochem, CA）のピコモル濃度が好中球の方向性意思決定に影響を及ぼす能力の影響を考慮して、超低濃度のＳＢ２２５００２が、高濃度のケモカインによる逐次的なカルシウム流出のレベルを低下出来るかを試験した。１ｐＭのＳＢ２２５００２による処理は、続く１．２μＭと１．２μＭ（図１８Ｂ）（ｐ＜０．０５）又は６００ｎＭと１．２μＭ（図１８Ｃ）（ｐ＜０．０５）のＩＬ−８濃度の並行投与による刺激で、受容体アンタゴニストがない場合のカルシウム流出の大きさに比べ、カルシウム流出の逐次的なピークを有意に低下させた。図１８Ｂ及び図１８Ｃに示した条件におけるＳＢ２２５００２処理後のカルシウム流出の大きさは、化学誘引反応に関連するケモカイン低濃度の逐次的パルスで見られたのと類似した大きさであった。これらのデータは、遁走性の条件に接触した細胞の運動的応答において、方向的な偏りを生み出すことが観察された受容体媒介の精緻な感受性を立証する。
【０２００】
ＩＬ−８及びＳＤＦ−１を含むケモカインは、１００ｎＭより高い濃度において、遁走性剤としての役目を果たす。さらに、その様な濃度において、ＩＬ−８及びＳＤＦ−１は二量体化した状態で存在する事が知られている（Lowman, H. B. et al, 1997 Protein Science 6:598-608; Veldkamp, C.T. et al. 2005 Protein Science 14:1071-1081; Horcher, M. et al. 1998 Cytokine 10:1-12）。本明細書に示したように、高濃度のケモカインもまた、遁走性の作用に関連する好中球の細胞質内カルシウム流出を誘導した。このようにして、二量体ケモカインの結合及び細胞表面の同族受容体の二量化が、カルシウム流出を増加させそれが遁走性の応答を生むことを含めて、示差的シグナルを導き出すというシグナル発信のパラダイムを想定することができた。
【０２０１】
ＩＩＩ．図面の補足説明
図１８：特異的カルシウム流出。初期ヒト好中球に１．２５μＭのＦｕｒａ２−ＡＭを負荷し、ケモカインの逐次的パルスに１２０秒離して接触させ（Ａ〜Ｃ）、カルシウム流出を蛍光光度計で測定した。好中球内のカルシウム流出は、ケモカイン濃度が１２０ｎＭの単一パルスとそれに続く次の１２０ｎＭのパルス（Ａ）、１．２μＭに続く１．２μＭ（Ｂ）、６００ｎＭに続く１．２μＭ（Ｃ）又は２．４μＭに続く２．４μＭ（Ｄ）（実線）に暴露した後に観察した。カルシウム流出はまた、（Ｂ）及び（Ｃ）（点線）のように、処理前に１ｐＭのＳＢ２２５００２で前処理した好中球でも観察した。この方法で行った３回の実験の代表的な結果を示した。ケモカインの最初及び２回目のパルス（ｙ軸に沿った矢印で標示）を示した。
【０２０２】
上記の発明は、明瞭さと理解の目的のため図解及び例によって多少詳細に記載されているが、若干の変更及び修飾が可能である事は当業者には明白である。従って、本発明の範囲は、添付の番号が付された請求項によって規定されるものであり、説明及び実施例がその範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０２０３】
本明細書に引用されたそれぞれの申請書及び特許、並びにそれぞれの申請書及び特許に引用されたそれぞれの文書又は文献（各交付済み特許の訴訟期間を含む；「申請引用文書」）、及び相当する及び／又はそれらの何れかに優先権を主張するＰＴＣ及び外国出願又は特許、及びそれぞれの文書引用申請に引用若しくは参照された文書は、参照することによって明確に本明細書に包含される。より一般的には、文書又は文献は、請求項の前の文献リスト内若しくは本明細書自体の中のいずれかで本明細書に引用され、それぞれのこれら文書又は文献（「本明細書引用文献」）、並びにそれぞれの本明細書引用文献に引用されたそれぞれの文書又は文献（いかなる製造者の規格書、説明書などを含む）は参照することによって明示的に本明細書に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
上記の詳細な説明は、例示のためのものであり、本発明をその特定の態様に限定するものではなく、参照して本明細書に取り込む添付の図面と併せて理解されたい。本発明の好ましい特徴及び態様は、本発明を限定するものではなく例示目的で、添付の図面に準拠してより詳しく説明するものである。
【図１】図１は、Ｂ１６／ＯＶＡメラノーマ細胞の形質導入に使用するためのＳＤＦ−１発現の構築を示す。
【図２】図２は、ならし培地（Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高密度細胞を培養した）の存在下に、インビトロ遊出アッセイに付したネズミＣＤ８＋Ｔ細胞で計算した走化性指数及び遁走性指数をｒＳＤＦ−１対照と比較して示した棒グラフ。
【図３】図３は、Ｂ１６／ＯＶＡ．ｐｃ、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１腫瘍細胞のインビトロ増殖（Ａ）及びインビボ腫瘍形成能（Ｂ）を示す。
【図４】図４は、屠殺時点の各マウスの腫瘍のサイズを示す。
【図５】図５は、免疫マウスからの腫瘍のパラフィン包埋切片をＨ＆Ｅ（Ａ及びＤ）染色又はポリクローナルα−ＣＤ３Ａｂ（Ｂ、Ｃ、Ｅ、及びＦ）染色したものである。
【図６】図６は、（照射Ｂ１６／ＯＶＡ.ＳＤＦ−１高密度細胞で）免疫化したマウス対Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１低濃度及び−高濃度腫瘍細胞で免疫化しなかったマウスの抗原投与の結果を示したグラフ。結果は、腫瘍成長／増殖及びＴ細胞浸潤の定量化に関して示す。
【図７】図７は、ＣＬＩＯ−ｔａｔ標識ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期補充は、ＳＤＦ−１を発現しているＢ１６／ＯＶＡ腫瘍では損なわれることを示す。
【図８】図８は、ＭＲ画像と相関する、Ｂ１６／ＯＶＡ腫瘍におけるＴ細胞浸潤の免疫組織化学的研究を示す。
【図９】図９は、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１低濃度細胞、対、同高濃度細胞、対、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ細胞での抗原投与マウスで見られた腫瘍浸潤ＣＤ３＋細胞の数を示した棒グラフ。
【図１０】図１０は、両側性のＢ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ及びＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１高濃度腫瘍担癌マウスに、ＰＢＳ又はＡＭＤ３１００でインキュベートしたＯＴ−１・ＣＤ８＋Ｔ細胞を養子移植した後に生成した、軸方向ＭＲ画像。養子移植後に採取した組織のＣＤ−３特異性染色を示した画像及び同じものの定量化を示した棒グラフ。
【図１１】図１１は、持続的に養子移植したＯＴ−１  ＣＤ８＋細胞の強力な抗腫瘍活性は、ＳＤＦ−１を局所発現した時に克服されることを示す。
【図１２】図１２は、回復した腫瘍及びリンパ節（ＬＮ）から養子移植したＯＴ−１  ＣＴＬのＦＡＣＳｃａｎ同定を示す。
【図１３】図１３は、標準５１Ｃｒ放出アッセイ（Ａ）又は平底ウエルで行われた上記の改良アッセイ（Ｂ）で測定された、Ｂ１６／ＯＶＡ．ＭＳＣＶ又はＢ１６／ＯＶＡ．ＳＤＦ−１標的細胞に対するＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性の定量化を示す。
【図１４】図１４は、ＯＴ−１  Ｔ細胞の活性化、増殖及び殺効率に対するＳＤＦ−１の効果を示す。
【図１５】図１５は、ＡＭＤ３１００処理した胎仔胸腺培養（ＦＴＯＣ）から得た胸腺細胞及び直近の胸腺遊出物（ＲＴＥ）のＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ６２Ｌ染色を示したＦＡＣＳプロット及びグラフ分析を未処理のものと比較して示す。
【図１６】図１６は、ＧＦ１０９２０３Ｘ、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ、Ｒｐ−ｃＡＭＰＳ、又はＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＧＭＰＳの存在下に各ＩＬ−８勾配に対して計算された平均キモトリプシン指数（ＭＣＩ）を示す。
【図１７】図１７は、経時的顕微鏡検査法を使用したＳＤＦ−１高生産性ＭＳＣＶ．ＳＤＦ−１光輝細胞からのＴ細胞遁走性の実証を示す。
【図１８】図１８は、種々のＩＬ−８濃度に対応する好中球でのカルシウム流出の蛍光測定を示す。
【０２０５】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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