(57)【要約】  本発明は広くは医薬および医学の分野に関する。詳細には、本発明は特定の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)および医学におけるその使用、例えば癌(例えば、トリカルボン酸(TCA)回路の酵素の１種の活性がダウンレギュレートされている癌)の治療、血管新生(例えば、低酸素誘発血管新生)の治療におけるその使用に関する。好ましいクラスの化合物は、α-ケトグルタル酸の酸基の１つから形成されたエステル基であるか、もしくはそのエステル基の一部である疎水性部分を有するα-ケトグルタレート化合物、ならびにその製薬上許容される塩、溶媒和物、アミド、エステル、エーテル、Nオキシド、化学的保護形態、およびプロドラッグである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α-ケトグルタル酸の酸基の１つから形成されたエステル基であるか、もしくは該エステル基の一部である疎水性部分を有するα-ケトグルタレート化合物、ならびにその製薬上許容される塩、溶媒和物、アミド、エステル、エーテル、N-オキシド、化学的保護形態、およびプロドラッグ。
【請求項２】
前記疎水性部分が、脂質、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質、アシルグリセロール、ワックス、ステロール、ステロイド(例えばコレステロール)、テルペン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、イソプレノイド、レチノイド、ビオチン、および疎水性アミノ酸(例えばトリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、プロリンおよびチロシン)の１種から誘導される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
次式：
【化１】
2008509209.tif 000023
[ここでR1およびR2は、それぞれ独立に、
(i) H；および
(ii) 疎水性部分；
からなる群より選択されるが、ただしR1およびR2が両方ともHであることはない]
で表される化合物から選択される化合物、ならびにその製薬上許容される塩、溶媒和物、アミド、エステル、エーテル、N-オキシド、化学的保護形態、およびプロドラッグ。
【請求項４】
R1およびR2がいずれもHではない、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
R1およびR2がいずれもHではなく、かつR1とR2が異なる、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
R1およびR2がいずれもHではなく、かつR1とR2が同一である、請求項３に記載の化合物。
【請求項７】
R1とR2の１つだけがHである、請求項３に記載の化合物。
【請求項８】
次式（R1がHでありかつR2がHではない）で表される、請求項３に記載の化合物。
【化２】
2008509209.tif 000024
【請求項９】
次式（R2がHでありかつR1がHではない）で表される、請求項３に記載の化合物。
【化３】
2008509209.tif 000025
【請求項１０】
前記疎水性部分が、独立に、
C1-C30アルキル；
C2-C30アルケニル；
C2-C30アルキニル；
C3-C30シクロアルキル；
C3-C30シクロアルケニル；
C3-C30シクロアルキニル；
C6-C20カルボアリール；
C5-C20ヘテロアリール；
C6-C20カルボアリール-C1-C7アルキル；
C5-C20ヘテロアリール-C1-C7アルキル；
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記疎水性部分が、独立に、
C8-C30アルキル；
C8-C30アルケニル；
C8-C30アルキニル；
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記疎水性部分が、独立にC8-C30アルキルであり、かつ置換されていないまたは置換されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記疎水性部分が、独立にC4-C20アルキルであり、かつ置換されていないまたは置換されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記疎水性部分が、独立にC6-C18アルキルであり、かつ置換されていないまたは置換されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記疎水性部分が、独立にC8-C16アルキルであり、かつ置換されていないまたは置換されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記疎水性部分が、独立に-(CH2)nCH3であり、ここでnは独立に5〜29の整数である、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記疎水性部分が、独立に-(CH2)nCH3であり、ここでnは独立に7〜23の整数である、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
前記疎水性部分が、独立に-(CH2)nCH3であり、ここでnは独立に9〜19の整数である、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記疎水性部分が、独立に-(CH2)nCH3であり、ここでnは独立に9〜17の整数である、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
前記疎水性部分が、独立に、
C6-C20カルボアリール；
C5-C20ヘテロアリール；
C6-C20カルボアリール-C1-C7アルキル；
C5-C20ヘテロアリール-C1-C7アルキル；
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
前記疎水性部分が、独立に、
C6-C12カルボアリール；
C5-C12ヘテロアリール；
C6-C12カルボアリール-C1-C7アルキル；
C5-C12ヘテロアリール-C1-C7アルキル；
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
前記疎水性部分が、独立に、
C6-C10カルボアリール；
C5-C10ヘテロアリール；
C6-C10カルボアリール-C1-C7アルキル；
C5-C10ヘテロアリール-C1-C7アルキル；
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２３】
前記疎水性部分が、独立に、
C6-C20カルボアリール；
C6-C20カルボアリール-C1-C7アルキル；
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２４】
前記疎水性部分が、独立に、
C6-C12カルボアリール；
C6-C12カルボアリール-C1-C7アルキル；
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２５】
前記疎水性部分が、独立に、次式：
【化４】
2008509209.tif 000026
[式中、mは独立に0、1、2、3、4、または5であり、かつ各RPは存在するならば独立に置換基である]で表される、非置換または置換フェニル基である、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
前記疎水性部分が、独立に、次式：
【化５】
2008509209.tif 000027
[式中、mは独立に0、1、2、3、4、または5であり、かつ各RPは存在するならば独立に置換基である]で表される、非置換または置換ベンジル基である、請求項３〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２７】
mが0、1、2、または3である、請求項２５または２６に記載の化合物。
【請求項２８】
前記疎水性部分上の各置換基が、存在するならばRPも含め、独立して、(1) カルボン酸；(2) エステル；(3) アミドもしくはチオアミド；(4) アシル；(5) ハロ；(6) シアノ；(7) ニトロ；(8) ヒドロキシ；(9) エーテル；(10) チオール；(11) チオエーテル；(12) アシルオキシ；(13) カルバメート；(14) アミノ；(15) アシルアミノもしくはチオアシルアミノ；(16) アミノアシルアミノもしくはアミノチオアシルアミノ；(17) スルホンアミノ；(18) スルホニル；(19) スルホネート；(20) スルホンアミド；(21) C5-20アリール-C1-7アルキル；(22) C6-20カルボアリールおよびC5-20ヘテロアリール；(23) C3-20ヘテロシクリル；(24) C1-7アルキル；C8-30アルキル；C2-7アルケニル；C2-7アルキニル；C3-7シクロアルキル；C3-7シクロアルケニル；C3-7シクロアルキニルから選択される、請求項３〜２７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２９】
前記疎水性部分上の各置換基が、存在するならばRPも含め、独立して、ハロ；シアノ；ニトロ；ヒドロキシ；C1-C7アルコキシ；C1-C7アルキル；C1-C7ハロアルキル；およびC8-C30アルキルから選択される、請求項３〜２７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
前記疎水性部分上の各置換基が、存在するならばRPも含め、独立して、ハロ；C1-C4アルキル；C1-C4ハロアルキル；およびC12-C22アルキルから選択される、請求項３〜２７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３１】
前記疎水性部分上の各置換基が、存在するならばRPも含め、独立して、フルオロ；C1-C4アルキル；およびC1-C4フルオロアルキルから選択される、請求項３〜２７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３２】
前記疎水性部分上の各置換基が、存在するならばRPも含め、独立して、F、-CH3、-CF3から選択される、請求項３〜２７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３３】
次の化合物ならびにその製薬上許容される塩、溶媒和物、アミド、エステル、エーテル、N-オキシド、化学的保護形態、およびプロドラッグから選択される、請求項３に記載の化合物:
【化６】
2008509209.tif 000028
2008509209.tif 000029
【請求項３４】
HIFαヒドロキシラーゼを活性化する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３５】
HIF-αプロリルヒドロキシラーゼを活性化する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３６】
α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３７】
HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物。
【請求項３８】
HIF-αプロリルヒドロキシラーゼを活性化する化合物。
【請求項３９】
α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物および製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４１】
細胞を有効量の請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含む、in vitroまたはin vivoでの該細胞においてPHDを活性化する方法。
【請求項４２】
細胞を有効量の請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含む、in vitroまたはin vivoで該細胞においてHIF安定化を阻害または抑制する方法。
【請求項４３】
細胞を有効量の請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含む、in vitroまたはin vivoで該細胞においてHIFαヒドロキシラーゼを活性化する方法。
【請求項４４】
in vitroまたはin vivoで(a)細胞増殖(例えば1個の細胞の増殖)を調節する(例えば阻害する)方法、(b)細胞周期の進行を抑制する方法、(c)アポトーシスを促進する方法、または(d)これらの１以上を組み合わせた方法であって、複数の細胞（または1個の細胞）を有効量の請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４５】
治療法によるヒトまたは動物の処置方法に使用するための請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４６】
症状の進行に伴って低酸素状態になる症状を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項４７】
不適切な、過度の、および／または望ましくない血管新生を特徴とする症状を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項４８】
低酸素誘発血管新生を特徴とする症状を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項４９】
低酸素症のためHIF-1α活性がアップレギュレートされている血管新生を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項５０】
癌、乾癬、アテローム性動脈硬化症、月経過多、子宮内膜症、関節炎(炎症性およびリウマチ様の両方)、黄斑変性、パジェット病、網膜症およびその血管性合併症(増殖性網膜症および糖尿病性網膜症を含む)、良性の血管増殖、線維症、肥満および炎症から選択される症状を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項５１】
増殖性疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項５２】
癌治療用の医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項５３】
固形癌治療用の医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項５４】
褐色細胞腫、パラガングリオーマ、平滑筋腫、腎細胞癌、胃癌、および直腸結腸癌から選択される癌を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項５５】
SDH機能異常を特徴とする癌を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項５６】
疾患の後期にSDHダウンレギュレーションが現れる癌を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項５７】
胃癌または直腸結腸癌、例えばデュークス・ステージCの直腸結腸癌を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項５８】
口腔癌治療用の医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項５９】
低酸素症のためHIF-1α活性がアップレギュレートされている癌を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項６０】
TCA回路の１種の酵素の活性がダウンレギュレートされている癌を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項６１】
前記酵素がコハク酸デヒドロゲナーゼまたはフマル酸ヒドラターゼである、請求項６０に記載の使用。
【請求項６２】
治療される患者が、SDH遺伝子のA、B、CもしくはDサブユニットまたはFH遺伝子に遺伝性突然変異または体細胞突然変異を有するか、あるいは、SDH遺伝子(A、B、CもしくはDサブユニット)のいずれかまたはFH遺伝子の発現のダウンレギュレーションを有するか、あるいは、前記遺伝子によりコードされる酵素の活性低下を有する、請求項４６〜６１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６３】
治療を必要とする患者に、治療上有効量の請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物を投与することを含む、請求項４６〜６０のいずれか１項に記載の症状の治療方法。
【請求項６４】
治療を必要とする患者に、(a)治療上有効量の、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物である第１薬剤、および(b)第２薬剤を併用投与することを含む、請求項４６〜６１のいずれか１項に記載の症状の治療方法。
【請求項６５】
第１薬剤および第２薬剤を、別々に、逐次、または同時に投与する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
第２薬剤がアミノレブリン酸(ALA)シンターゼの促進化合物である、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
第２薬剤が、バルビツール酸類、抗痙攣剤、非麻薬性鎮痛剤、および非ステロイド系抗炎症性化合物から選択される、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６８】
第２薬剤が、アリルイソプロピルアセトアミド、フェノバルビタール、デフェロキサミン、フェルバメート、ラモトリジン、ティアガビン、シクロホスファミド、N-メチルプロトポルフィリン、スクシニルアセトン、カルバマゼピン、エタノール、フェニトイン、アザプロパゾン、クロロキン、パラセタモール、グリセオフルビン、カドミウム、鉄、ピリドキシンから選択される、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６９】
第２薬剤が、エトスクシミド、ジアゼパム、ヒダントイン、メトスクシミド、パラメタジオン、フェノバルビトン、フェンスクシミド、フェニトイン、プリミドン、スクシンイミド、ブロミド、アスピリン、ジヒドロエルゴタミン-メシレート、酒石酸エルゴタミン、クロラムフェニコール、ダプソン、エリスロマイシン、フルクロキサシリン、ピラジンアミド、スルホンアミド、アンピシリン、バンコマイシン、スルホニル尿素、グリピジドインスリン、酢酸α-トコフェロール、アスコルビン酸、葉酸、フルクトース、グルコース、ヘムアルギネート、アミドピリン、ジクローラルフェナゾン、ジクロフェナクNa、ジピロン、オキシフェンブタゾン、プロピフェナゾン、アスピチン、コデインPO4、ジヒドロコデイン、カンタキサンチン、βカロテンから選択される、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項７０】
患者に光線力学療法を施すことをさらに含む、請求項６３〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
(i) (a)請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物である第１薬剤と、(b)光線感作物質とを同時に、別々に、または逐次投与し、続いて(ii)光を照射することを含む、請求項４６〜６１のいずれか１項に記載の症状の治療方法。
【請求項７２】
(a)請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物と、(b)使用説明書とを含むキット。
【請求項７３】
請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の第２薬剤をさらに含む、請求項７２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は広くは医薬および医学の分野に関する。詳細には、本発明は特定の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)および医学におけるその使用、例えば癌(トリカルボン酸(TCA)回路の酵素の１種の活性がダウンレギュレートされている癌など)の治療、血管新生(低酸素誘発血管新生など)の治療などにおけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明、および本発明の属する技術分野の現時点での技術水準を、より詳細に説明し開示するために本明細書に多数の特許および刊行物を引用する。これらの引用文献の完全な引用を本明細書に提供する。こうした引用文献はそれぞれ、参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする。
【０００３】
本明細書および特許請求の範囲の全体に渡り、特に断らないかぎり、「含む」という単語および「含まれる」や「含んでなる」などの変形語は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの一群を含むことを意味し、あらゆる他の整数もしくはステップまたは一群の整数もしくはステップを除外することを意味するものでないことが理解される。
【０００４】
本明細書および請求項に使用する、単数形での記載には、特に明示しないかぎり、複数形への言及も含まれることに留意すべきである。このことから、例えば単数形での「製薬上の賦形剤」という表現には、２種以上のかかる賦形剤の混合物なども含まれる。
【０００５】
本明細書において数値範囲は多くの場合、ある特定の「約」数値から、別の特定の「約」数値までと表現される。このような範囲表現がなされた場合、別の実施形態は、その特定の数値から、別の特定の数値までを含む。同様に、前述の「約」を使用して数値が近似値として表現される場合、その特定の数値は別の実施形態を成すと理解される。
【０００６】
癌は深刻な疾患であり主要な死因である。近年では特定の癌治療に進歩が見られたが、この疾患の治療にはなおも改良が必要とされている。
【０００７】
癌は細胞変化に起因する細胞の制御されない増殖を特徴とし、細胞変化は主に遺伝子の遺伝性突然変異または体細胞突然変異により引き起こされる。こうした遺伝子の同定、およびこれらの遺伝子が癌の発生・進行に影響を及ぼす機構の解明は、癌と戦う戦略を考えるうえで重要である。
【０００８】
ミトコンドリアのトリカルボン酸(TCA)回路の酵素が癌と関連することは長い間知られてきた。いくつかのミトコンドリアタンパク質は腫瘍抑制因子であり、これにはコハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)やフマル酸ヒドラターゼ(FH)が含まれる。SDH遺伝子のB、CまたはDサブユニットへの遺伝性突然変異または体細胞突然変異は、褐色細胞腫およびパラガングリオーマの発生に関与している(Baysal ら, 2000; Eng ら, 2003)。最近、他の種類の癌もまたミトコンドリア遺伝子中に突然変異を有するか獲得していることが示された。例えば、顕著なSDHダウンレギュレーションが胃癌および直腸結腸癌において、特に、限定的デュークス・ステージB腫瘍と比べてより攻撃的なデュークス・ステージC直腸結腸癌への移行中に生じることが示された(Frederiksen ら, 2003; Habano ら, 2003)。
【０００９】
Eng ら (2003)はFHおよびSDHをコードする遺伝子の突然変異と癌との関連性について考察している。その著者らは、TCA回路の酵素の機能不全によるミトコンドリア機能の障害が、深刻なエネルギー不足および多量の酸素フリーラジカルをもたらすと仮定している。次にこうしたラジカルが低酸素誘導因子-1α (HIF-1α)の誘導をもたらし、細胞増殖を促進しまたはアポトーシスを妨げ、そのことにより新生組織形成をもたらす。その著者らはまた、ミトコンドリア膜に挿入されないSDHの変異型が抗アポトーシス活性を有するかもしれないと提唱している。しかしながら、その著者らは抗アポトーシス活性の基礎を成す機構を説明できていない。
【００１０】
Baysal (2003)は、SDHおよびFHが罹患組織型において通常の生理的条件下で細胞増殖の制御に関わっている可能性があると提唱する。しかしながら、著者は制御機構に関してはさらなる提案をなんら提供していない。
【００１１】
さらに、褐色細胞腫およびパラガングリオーマに類似した腫瘍は、一見したところでは無関係のフォン・ヒッペル・リンドウ(VHL)症候群にも観察され、これらの腫瘍の共通の特徴はHIF-1αレベルの上昇である(Eng ら, 2003, Pollard ら, 2003)。重要なこととして、これらの腫瘍におけるSDHまたはVHL突然変異は相互に排他的である(Eng ら, 2003)。
【００１２】
低酸素誘導因子-1(HIF-1)は、アルファ(α)サブユニットおよびベータ(β)サブユニットから構成されるヘテロ二量体である。(しかしながら、「HIF-1」および「HIF-1α」は多くの場合、完全タンパク質HIF-1を意味するよう置き換え可能に使用される)。βサブユニットは、芳香族炭化水素受容体核輸送因子(ARNT/HIF-1β)として同定されており、そのタンパク質レベルは酸素の影響を受けない。HIF-1βと同様にHIF-1αも酸素化状態に拘わらず構成的に発現される。しかしながら、正常酸素条件下ではこのサブユニットは、フォン・ヒッペル・リンドウ腫瘍抑制タンパク質(pVHL)の産物を含有するタンパク質-ユビキチンリガーゼ複合体を介するプロテアソーム仲介分解のために迅速に標的化される。pVHLは、正常酸素条件下でのみHIF-1αの酸素分解ドメイン(ODDD)を認識する。低酸素環境への曝露後、この分解経路が遮断され、HIF-1αを蓄積させ、続いて核へ移動させ、そこでHIF-1αは低酸素応答遺伝子を活性化する。言い換えると、HIFの生理学的機能は、新血管形成および解糖を誘導することにより、細胞の低酸素への適応を促進することである(Semenzaら, 2002; Pugh ら, 2003)。
【００１３】
HIF-1αの安定性はHIFαプロリルヒドロキシラーゼ(PHD)により制御され、PHDは２つの特定のプロリル残基をヒドロキシル化する。より詳細には、PHDは、pVHLのHIFαへの結合を調節するODDD中のプロリル残基をヒドロキシル化する(Ivan ら, 2001; Jaakkola ら, 2001; Yu ら, 2001)。HIFαのPro-402およびPro-564(数字はヒトHIF-1αを対象とする)の４位へのヒドロキシル化は、pVHLへの２つの水素結合形成を可能にしかつpVHLのHIFαへの結合を数桁分も増大させる(Bruick ら, 2001; Epstein ら, 2001)。この翻訳後修飾は、HIFα-プロリルヒドロキシラーゼ(HPH1-3またはPHD1-3)により触媒される(Bruick ら, 2001; Epstein ら, 2001; Ivan ら, 2002)。PHD活性は、分子状酸素に依存性であり、また、動物細胞における重要な酸素感知機構であると考えられている(Safran ら, 2003)。酸素の他に、PHDはα-ケトグルタル酸を共基質として利用し、第一鉄イオン(Fe2+)およびアスコルビン酸を補因子として必要とする(Kaelin ら, 2002; Schofield ら, 1999)。PHDアイソザイムは、Fe2+依存性およびα-ケトグルタル酸依存性のオキシゲナーゼファミリーに属し、これらはその基質をヒドロキシル化し、並行して、α-ケトグルタル酸をコハク酸へと酸化および脱カルボキシル化するために分子状酸素を分解する(Schofield ら, 1999)。
【００１４】
WO 03/028663は、低酸素誘導因子プロリルヒドロキシル化をアッセイして該ヒドロキシル化をモジュレートする化合物を同定するための方法および組成物を開示するが、しかしこの文献はかかる化合物を全く開示していない。
【００１５】
HIF-1α安定化を含む発癌経路を取り巻く現象は研究されているものの、未だに答えられていない疑問が数多く残っている。
【００１６】
とりわけ、HIF-1α安定化を阻害する−そのことにより発癌経路を阻害する−単純で効果的な方法は依然として強く必要とされている。
【００１７】
さらに、今日までに、TCA回路の酵素をコードする遺伝子の突然変異がどのようにしてHIF-1αレベルの上昇をもたらすのかについて、明確な開示または提案はなされていない。従って、これらの癌に使用可能な治療の範囲は制限されている。褐色細胞腫およびパラガングリオーマの主な治療法は適当な医学的ホルモン遮断後の外科切除である。切除不可能な腫瘍は、緩和化学療法(例えばシクロホスファミド、ダカルバジン(decarbazine)、およびビンクリスチン(vincristine)などの化合物を使用)、または骨転移のための外部照射療法、または131I-標識MIGBで治療することができる。しかしながら、これらの治療法は高度に侵襲的であるか、または望ましくない強い副作用を伴う。従って、侵襲性が低く、副作用が殆どまたは全くない治療法が依然として強く必要とされている。かかる治療法は、これらの特定のタイプの癌の根底にある生化学的機構のためにテーラーメイドされることが好ましい。
【００１８】
その上、低酸素誘発血管新生を阻害する化合物は、癌を含めて、この種の血管新生を特徴とする疾患の治療薬として、依然必要とされている。
【発明の開示】
【００１９】
本発明者らは、TCA回路の遺伝子および酵素の突然変異および機能異常がどのように癌と関連しているかを実証した。本発明者らは、癌治療の戦略を開発し、また、これらの治療に有用なクラスの化合物を同定した。
【００２０】
例えば、本発明者らは、TCA回路の特定の酵素(SDHおよびFHなど)の阻害が、細胞内でのコハク酸の蓄積をもたらすことを実証した。次に、コハク酸は、サイトゾル中のHIF-αプロリルヒドロキシラーゼ(PHD)の酵素活性を阻害する。また、本発明者らは、α-ケトグルタレートおよびα-ケトグルタル酸誘導体(例えばエステル)が、低酸素条件下でPHD活性を著しく増強し、そのことによりHIFを劇的に減少させることを実証した。
【００２１】
言い換えると、本発明者らは、低酸素誘発血管新生を治療する新しい方法を確認したが、この方法は、例えば低酸素誘発血管新生を特徴とする疾患の治療において、有用な医薬用途を有する。
【００２２】
発明の概要
本発明の一つの態様は、特定の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、PHDを活性化する化合物、HIF安定化を阻害または抑制する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)に関する。
【００２３】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の活性化合物、および製薬上許容される担体または希釈剤を含む組成物に関する。
【００２４】
本発明の別の態様は、細胞を有効量の本明細書に記載の活性化合物と接触させることを含む、in vitroまたはin vivoで該細胞においてPHDを活性化する方法に関する。
【００２５】
本発明の別の態様は、細胞を有効量の本明細書に記載の活性化合物と接触させることを含む、in vitroまたはin vivoで該細胞中においてHIF安定化を阻害または抑制する方法に関する。
【００２６】
本発明の別の態様は、細胞を有効量の本明細書に記載の活性化合物と接触させることを含む、in vitroまたはin vivoで該細胞においてHIFαヒドロキシラーゼ(例えば、HIF-αプロリルヒドロキシラーゼ)を活性化する方法に関する。
【００２７】
本発明の別の態様は、in vitroまたはin vivoで(a)細胞増殖(例えば１個の細胞の増殖)を調節する(例えば阻害する)方法、(b)細胞周期の進行を抑制する方法、(c)アポトーシスを促進する方法、または(d)これらの１以上を組み合わせた方法であって、複数の細胞(または１個の細胞)を有効量の本明細書に記載の活性化合物と接触させることを含む、前記方法に関する。
【００２８】
本発明の別の態様は、治療法によるヒトまたは動物の処置方法に使用するための、本明細書に記載の活性化合物に関する。
【００２９】
本発明の別の態様は、治療用の医薬の製造における、本明細書に記載の活性化合物の使用に関する。
【００３０】
本発明の別の態様は、治療を必要とする患者に、治療上有効量の本明細書に記載の活性化合物を投与することを含む治療方法である。
【００３１】
ある実施形態において、治療は症状の進行に従って低酸素状態になる症状の治療である。
【００３２】
ある実施形態において、治療は不適切な、過度の、および／または望ましくない血管新生を特徴とする症状の治療である。
【００３３】
ある実施形態において、治療は低酸素誘発血管新生を特徴とする症状の治療である。
【００３４】
ある実施形態において、治療は低酸素症のためにHIF-1α活性がアップレギュレートされている血管新生の治療である。
【００３５】
ある実施形態において、治療は、癌、乾癬、アテローム性動脈硬化症、月経過多、子宮内膜症、関節炎(炎症性およびリウマチ様の両方)、黄斑変性、パジェット病、網膜症およびその血管性合併症(増殖性網膜症および糖尿病性網膜症を含む)、良性の血管増殖、線維症、肥満および炎症から選択される症状の治療である。
【００３６】
ある実施形態において、治療は増殖性の症状の治療である。
【００３７】
ある実施形態において、治療は癌の治療である。
【００３８】
ある実施形態において、治療は固形癌の治療である。
【００３９】
ある実施形態において、治療は褐色細胞腫、パラガングリオーマ、平滑筋腫、腎細胞癌、胃癌、および直腸結腸癌から選択される癌の治療である。
【００４０】
ある実施形態において、治療はSDH機能異常を特徴とする(例えばそれを示す)癌(例えば腫瘍)の治療である。
【００４１】
ある実施形態において、治療は疾患の後期においてSDHダウンレギュレーションを発現する癌の治療である。
【００４２】
ある実施形態において、治療は胃癌または直腸結腸癌、例えばデュークス・ステージCの直腸結腸癌の治療である。
【００４３】
ある実施形態において、治療は口腔癌の治療である。
【００４４】
ある実施形態において、治療は低酸素症のためにHIF-1αの活性がアップレギュレートされている癌の治療である。
【００４５】
ある実施形態において、治療はTCA回路の１種の酵素(例えばコハク酸デヒドロゲナーゼ、フマル酸ヒドラターゼ)の活性がダウンレギュレートされている癌の治療である。
【００４６】
ある実施形態において、治療される患者は、SDH遺伝子のA、B、CもしくはDサブユニットまたはFH遺伝子に遺伝性突然変異または体細胞突然変異を有するか、あるいは、SDH遺伝子(A、B、CもしくはDサブユニット)のいずれかまたはFH遺伝子の発現のダウンレギュレーションを有するか、あるいは前記遺伝子によりコードされる酵素の活性低下を有する。
【００４７】
本発明の別の態様は、治療を必要とする患者に、(a)治療上有効量の本明細書に記載の活性化合物、および(b)第２薬剤を併用投与することを含む治療方法である。
【００４８】
ある実施形態において、第２薬剤は、アミノレブリン酸(ALA)シンターゼの促進化合物である。
【００４９】
ある実施形態において、第２薬剤は、バルビツール酸類、抗痙攣剤、非麻薬性鎮痛剤、および非ステロイド系抗炎症性化合物から選択される。
【００５０】
ある実施形態において、第２薬剤は、アリルイソプロピルアセトアミド、フェノバルビタール、デフェロキサミン、フェルバメート(Felbamate)、ラモトリジン(Lamotrigine)、ティアガビン(Tiagabine)、シクロホスファミド、N-メチルプロトポルフィリン、スクシニルアセトン、カルバマゼピン、エタノール、フェニトイン、アザプロパゾン、クロロキン、パラセタモール、グリセオフルビン、カドミウム、鉄、ピリドキシンから選択される。
【００５１】
ある実施形態において、第２薬剤は、エトスクシミド(Ethosuximide)、ジアゼパム、ヒダントイン(Hydantoins)、メトスクシミド(Methsuximide)、パラメタジオン(Paramethadione)、フェノバルビトン(Phenobarbitone)、フェンスクシミド(Phensuximide)、フェニトイン、プリミドン(Primidone)、スクシンイミド、ブロミド、アスピリン、ジヒドロエルゴタミン-メシレート、酒石酸エルゴタミン、クロラムフェニコール、ダプソン(Dapsone)、エリスロマイシン、フルクロキサシリン(Flucloxacillin)、ピラジンアミド、スルホンアミド、アンピシリン、バンコマイシン、スルホニル尿素、グリピジドインスリン(GlipizideInsulin)、酢酸α-トコフェロール、アスコルビン酸、葉酸、フルクトース、グルコース、ヘムアルギネート(Haem Arginate)、アミドピリン、ジクローラルフェナゾン(Dichloralphenazone)、ジクロフェナクナトリウム(Diclofenac Na)、ジピロン(Dipyrone)、オキシフェンブタゾン(Oxyphenbutazone)、プロピフェナゾン(Propyphenazone)、アスピチン(Aspitin)、コデインPO4(Codeine PO4)、ジヒドロコデイン、カンタキサンチン、βカロテンから選択される。
【００５２】
ある実施形態において、前記方法は患者に光線力学療法を施すことをさらに含む。
【００５３】
本発明の別の態様は、(i) (a)本明細書に記載の活性化合物である第１薬剤、および(b)光線感作物質、を同時に、別々に、または逐次投与し、続けて(ii)光を照射すること、を含む治療方法である。
【００５４】
本発明の別の態様は、(a) 本明細書に記載の活性化合物(好ましくは適当な容器中にかつ／または適当な包装を施されて用意された医薬組成物として提供される)、および(b)使用説明書(例えば活性化合物をどのように投与するかの取扱説明書)を含むキットに関する。
【００５５】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の合成方法により得ることのできる化合物、または本明細書に記載の合成方法を含む方法に関する。
【００５６】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の合成方法により得られた化合物、または本明細書に記載の合成方法を含む方法に関する。
【００５７】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の合成方法に用いるのに適当な、本明細書に記載の新規中間体に関する。
【００５８】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の合成方法における、本明細書に記載のかかる新規中間体の使用に関する。
【００５９】
当業者に理解されるように、本発明のある態様の構成および好ましい実施形態は、本発明の他の態様にも関係するものでもある。
【００６０】
発明の詳細な説明
本発明者らは、驚くべきことに、そして予期せぬことに、α-ケトグルタレートが酸素の少ない(低酸素)条件下で細胞中のPHD活性を著しく増強することを明らかにした。
【００６１】
本発明者らはまた、驚くべきことに、そして予期せぬことに、ミトコンドリア内のトリカルボン酸(TCA)回路の阻害の結果、細胞内に蓄積されるコハク酸が、サイトゾル中でHIF-αプロリルヒドロキシラーゼを阻害し、その結果、TCA回路の１種の酵素の活性がダウンレギュレートされている細胞内でのHIF-1α安定化および活性化をもたらすことを明らかにした。本発明者らはまた、前記細胞にα-ケトグルタレートを供給する(例えば、α-ケトグルタル酸エステルを介して)ことにより、このHIF-1α安定化および活性化を打ち消すことができることを明らかにした。
【００６２】
本発明者らは、ミトコンドリアの代謝機能障害を癌と結びつける新しいシグナル伝達経路を同定した。ここに初めて、SDHのダウンレギュレーションをHIF-1α誘導と結びつける機構を解明した。本発明者らは、SDH阻害に起因するコハク酸蓄積が、「発癌性」シグナルをミトコンドリアからサイトゾルへ伝達することを示した。一旦サイトゾルに入ると、コハク酸はHIF-αプロリルヒドロキシラーゼを阻害し、野生型pVHLの存在下でHIF-1α安定化をもたらす。こうして、コハク酸はHIF転写活性を誘導し、それ故に血管新生、転移および解糖を促進する遺伝子の発現を増大させることにより核内事象をモジュレートすることができ、最終的には腫瘍進行をもたらす。このミトコンドリアからサイトゾルへの経路は、コハク酸を、初めて、細胞内メッセンジャーとして同定するものである。図５を参照されたい。
【００６３】
本発明者らは、低酸素誘発血管新生の治療法を開発したが、これには、例えばHIFαヒドロキシラーゼ（好ましくはHIFαプロリルヒドロキシラーゼ）を特異的に活性化することにより癌（TCA回路の１種の酵素の活性がダウンレギュレートされている）を治療または予防する方法が含まれる。
【００６４】
本発明者らはまた、低酸素誘発血管新生を処置する方法(例えば癌の治療法および予防法が含まれる)に有用なクラスの化合物を同定した。
【００６５】
これらの化合物は、HIFαヒドロキシラーゼを活性化することにより、HIF-1αレベルを正常にする。このため、これらの化合物は低酸素条件下でHIFαレベルを正常に戻すために使用することができる。さらにこれらの化合物は、TCA回路の１種の酵素の活性がダウンレギュレートされている腫瘍の治療に使用することができる。例えば、これらの化合物は、HIFαプロリル-ヒドロキシラーゼに及ぼすコハク酸の阻害効果を打ち消し、そのことによりTCA回路の１種の酵素の活性がダウンレギュレートされている腫瘍中のHIF-1αレベルを正常に戻すために使用することができる。HIF-1αのレベルを正常にすることは、腫瘍の血管形成と転移能(これらはHIF活性により誘発される２つの主要な発癌プロセスである)に格別な影響を及ぼす。
【００６６】
化合物
本発明のある態様は、特定の化合物(本明細書では「α-ケトグルタレート化合物」または「α-ケトグルタレート」または「α-ケトグルタル酸エステル」と言う)、例えばHIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物に関する。これらの化合物は便宜的に、疎水性部分を有する(例えば疎水性部分にコンジュゲートされた、疎水性部分にカップリングされた)α-ケトグルタレートと記載することができる。
【００６７】
例えば、これらの化合物は、α-ケトグルタル酸の酸基の１つから形成されたエステル基(すなわち、-C(=O)OR)であるかまたは該エステル基の一部である疎水性部分を有するα-ケトグルタル酸エステルと表現することができる。
【００６８】
参考のために、関連親化合物であるグルタル酸およびα-ケトグルタル酸を以下に示す。
【化１】
2008509209.tif 000002
【００６９】
従ってある実施形態では、前記化合物は次式：
【化２】
2008509209.tif 000003
【００７０】
[式中、R1およびR2はそれぞれ独立に、
(i) H、および
(ii) 疎水性部分、
からなる群より選択されるが、ただしR1とR2が両方ともHであることはない]
で表される化合物、ならびにその製薬上許容される塩、溶媒和物、アミド、エステル、エーテル、N-オキシド、化学的保護形態、およびプロドラッグである。
【００７１】
R1およびR2基
ある実施形態において、R1もR2もHではない(すなわちジエステル)。
【００７２】
ある実施形態において、R1もR2もHではなく、かつR1とR2は異なる。
【００７３】
ある実施形態において、R1もR2もHではなく、かつR1とR2は同一である。
【００７４】
ある実施形態において、R1とR2の１つだけがHである(すなわちモノエステル)。
【００７５】
ある実施形態において、R1はHである(かつR2はHではない)：
【化３】
2008509209.tif 000004
【００７６】
ある実施形態において、R2はHである(かつR1はHではない)：
【化４】
2008509209.tif 000005
【００７７】
疎水性部分（単数または複数）
本明細書に用いる「疎水性部分」という用語には、限定するものではないが、水または他の極性原子もしくは極性基と相互作用するよりも、互いに相互作用する傾向のある非極性原子もしくは非極性基を有する化学部分が含まれる。疎水性部分は実質的に水に不溶であるかまたは水に僅かしか溶けない。
【００７８】
場合により、疎水性部分は細胞膜の成分(レクチンや脂質ヘッド基など)とのその融合特性または相互作用に基づいて選択することができる。例えば、疎水性部分は、ポリマー(例えば、線状または分枝状ポリマー)；例えば、線状、分枝状、または環状でありうるアルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基(例えば、C1-C30アルキル、C2-C30アルケニル、C2-C30アルキニル、C3-C30シクロアルキル、C3-C30シクロアルケニル、C3-C30シクロアルキニル)；芳香族基(例えばC6-C20カルボアリール、C5-C20ヘテロアリール)；またはその組み合わせを含みうる。
【００７９】
場合により、疎水性部分は、１つ以上の、ヘテロ原子、ヘテロ環式基、ペプチド、ペプトイド、天然物、合成化合物、ステロイド、およびステロイド誘導体(例えば、コレステロール環系のようなステロイド核を含む疎水性部分)を含みうる。
【００８０】
疎水性部分は、α-ケトグルタレート化合物が意図したその機能(例えばサイトゾル／ミトコンドリアへと脂質膜を横断すること)を果たすことができるように選択されるものとする。
【００８１】
疎水性部分の例としては、限定するものではないが、脂質、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質、アシルグリセロール、ワックス、ステロール、ステロイド(例えばコレステロール)、テルペン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、イソプレノイド、レチノイド、ビオチン、および疎水性アミノ酸(例えばトリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、プロリンおよびチロシン)から誘導されるものが挙げられる。
【００８２】
ある実施形態において、疎水性部分または各疎水性部分は、独立に、
C1-C30アルキル、
C2-C30アルケニル、
C2-C30アルキニル、
C3-C30シクロアルキル、
C3-C30シクロアルケニル、
C3-C30シクロアルキニル、
C6-C20カルボアリール、
C5-C20ヘテロアリール、
C6-C20カルボアリール-C1-C7アルキル、
C5-C20ヘテロアリール-C1-C7アルキル、
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている。
【００８３】
ある実施形態において、疎水性部分または各疎水性部分は、独立に、
C1-C30アルキル、
C2-C30アルケニル、
C2-C30アルキニル、
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている。
【００８４】
ある実施形態において、(アルキル、アルケニル、アルキニルの)範囲の下限はC4である、
ある実施形態において、前記範囲の下限はC6である、
ある実施形態において、前記範囲の下限はC8である、
ある実施形態において、前記範囲の下限はC10である、
ある実施形態において、前記範囲の下限はC12である。
【００８５】
ある実施形態において、(アルキル、アルケニル、アルキニルの)範囲の上限はC30である、
ある実施形態において、前記範囲の上限はC24である、
ある実施形態において、前記範囲の上限はC22である、
ある実施形態において、前記範囲の上限はC20である、
ある実施形態において、前記範囲の上限はC18である、
ある実施形態において、前記範囲の上限はC16である。
【００８６】
ある実施形態において、(アルキル、アルケニル、アルキニルの)範囲はC4-C20である、
ある実施形態において、前記範囲はC6-C18である、
ある実施形態において、前記範囲はC8-C16である、
ある実施形態において、前記範囲はC10-C24である、
ある実施形態において、前記範囲はC12-C22である、
ある実施形態において、前記範囲はC14-C20である、
ある実施形態において、前記範囲はC16-C18である。
【００８７】
ある実施形態において、疎水性部分または各疎水性部分は、独立にC1-C30アルキルであり、かつ置換されていないまたは置換されている。
【００８８】
ある実施形態において、(アルキルの)範囲の下限はC4である、
ある実施形態において、前記範囲の下限はC6である、
ある実施形態において、前記範囲の下限はC8である、
ある実施形態において、前記範囲の下限はC10である、
ある実施形態において、前記範囲の下限はC12である。
【００８９】
ある実施形態において、(アルキルの)範囲の上限はC30である、
ある実施形態において、前記範囲の上限はC24である、
ある実施形態において、前記範囲の上限はC22である、
ある実施形態において、前記範囲の上限はC20である、
ある実施形態において、前記範囲の上限はC18である、
ある実施形態において、前記範囲の上限はC16である。
【００９０】
ある実施形態において、(アルキルの)範囲はC4-C20である、
ある実施形態において、前記範囲はC6-C18である、
ある実施形態において、前記範囲はC8-C16である、
ある実施形態において、前記範囲はC10-C24である、
ある実施形態において、前記範囲はC12-C22である、
ある実施形態において、前記範囲はC14-C20である、
ある実施形態において、前記範囲はC16-C18である。
【００９１】
ある実施形態において、アルキル基は、線状または分枝状アルキル基であり、かつ置換されていないまたは置換されている。例えばある実施形態において、疎水性部分は線状または分枝状C1-C30アルキルでありかつ置換されていないまたは置換されている。
【００９２】
ある実施形態において、疎水性部分または各疎水性部分は独立に-(CH2)nCH3であり、ここでnは独立に0〜29の整数である。
【００９３】
ある実施形態において、nの範囲の下限は3である、
ある実施形態において、nの範囲の下限は5である、
ある実施形態において、nの範囲の下限は7である、
ある実施形態において、nの範囲の下限は9である、
ある実施形態において、nの範囲の下限は11である。
【００９４】
ある実施形態において、nの範囲の上限は29である、
ある実施形態において、nの範囲の上限は23である、
ある実施形態において、nの範囲の上限は21である、
ある実施形態において、nの範囲の上限は19である、
ある実施形態において、nの範囲の上限は17である、
ある実施形態において、nの範囲の上限は15である。
【００９５】
ある実施形態において、nは独立に3〜19の整数である、
ある実施形態において、nは独立に5〜17の整数である、
ある実施形態において、nは独立に7〜15の整数である。
【００９６】
ある実施形態において、疎水性部分または各疎水性部分は、独立に、
C6-C20カルボアリール、
C5-C20ヘテロアリール、
C6-C20カルボアリール-C1-C7アルキル、
C5-C20ヘテロアリール-C1-C7アルキル、
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている。
【００９７】
ある実施形態において、疎水性部分または各疎水性部分は、独立に、
C6-C12カルボアリール、
C5-C12ヘテロアリール、
C6-C12カルボアリール-C1-C7アルキル、
C5-C12ヘテロアリール-C1-C7アルキル、
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている。
【００９８】
ある実施形態において、疎水性部分または各疎水性部分は、独立に、
C6-C10カルボアリール、
C5-C10ヘテロアリール、
C6-C10カルボアリール-C1-C7アルキル、
C5-C10ヘテロアリール-C1-C7アルキル、
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている。
【００９９】
ある実施形態において、疎水性部分または各疎水性部分は、独立に、
C6-C20カルボアリール、
C6-C20カルボアリール-C1-C7アルキル、
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている。
【０１００】
ある実施形態において、疎水性部分または各疎水性部分は、独立に、
C6-C12カルボアリール、
C6-C12カルボアリール-C1-C7アルキル、
から選択され、かつ置換されていないまたは置換されている。
【０１０１】
「置換されていないまたは置換されている」という用語に関して、置換基が存在する場合、それは、ある実施形態では、RPについて以下で定義するようなものでありうる。
【０１０２】
例えば、ある実施形態において、各カルボアリール基およびヘテロアリール基は、存在するならば、置換されていないか、または独立にハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、C1-C7アルコキシ、C1-C7アルキル、C1-C7ハロアルキル、およびC8-C30アルキルから選択される１個以上(例えば1、2、3、4個など)の置換基で置換されている。
【０１０３】
ある実施形態において、上記C8-C30アルキル基はC10-C24アルキルである、
ある実施形態において、上記C8-C30アルキル基はC12-C22アルキルである、
ある実施形態において、上記C8-C30アルキル基はC14-C20アルキルである、
ある実施形態において、上記C8-C30アルキル基はC16-C18アルキルである。
【０１０４】
ある実施形態において、疎水性部分または各疎水性部分は、独立に、次式：
【化５】
2008509209.tif 000006
【０１０５】
[式中、mは独立に0、1、2、3、4、または5であり、各RPは、存在するならば、独立に置換基である]で表される非置換または置換フェニル基である。
【０１０６】
ある実施形態において、疎水性部分または各疎水性部分は、独立に、次式：
【化６】
2008509209.tif 000007
【０１０７】
[式中、mは独立に0、1、2、3、4、または5であり、各RPは、存在するならば、独立に置換基である]で表される非置換または置換ベンジル基である。
【０１０８】
ある実施形態において、mは0、1、2、または3である、
ある実施形態において、mは0、1、または2である、
ある実施形態において、mは0または1である。
【０１０９】
ある実施形態において、置換基RPは、独立に次から選択される：(1)カルボン酸、(2)エステル、(3)アミドもしくはチオアミド、(4)アシル、(5)ハロ、(6)シアノ、(7)ニトロ、(8)ヒドロキシ、(9)エーテル、(10)チオール、(11)チオエーテル、(12)アシルオキシ、(13)カルバメート、(14)アミノ、(15)アシルアミノもしくはチオアシルアミノ、(16)アミノアシルアミノもしくはアミノチオアシルアミノ、(17)スルホンアミノ、(18) スルホニル、(19) スルホネート、(20)スルホンアミド、(21)C5-20アリール-C1-7アルキル、(22)C6-20カルボアリールおよびC5-20ヘテロアリール、(23)C3-20ヘテロシクリル、(24)C1-7アルキル、C8-30アルキル、C2-7アルケニル、C2-7アルキニル、C3-7シクロアルキル、C3-7シクロアルケニル、C3-7シクロアルキニル。
【０１１０】
ある実施形態において、置換基RPは、独立に次から選択される：
(1)  -C(=O)OH、
(2)  -C(=O)OR1、ここでR1は独立に(21)、(22)、(23)または(24)に定義した通りである、
(3)  -C(=O)NR2R3または-C(=S)NR2R3、ここでR2およびR3はそれぞれ独立に-Hであるか、または(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りであり、あるいはR2とR3はそれらが結合している窒素原子と一緒になって3〜7個の環原子を有する環を形成する、
(4)  -C(=O)R4、ここでR4は独立に-Hであるか、または(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りである、
(5)  -F、-Cl、-Br、-I、
(6)  -CN、
(7)  -NO2、
(8)  -OH、
(9)  -OR5、ここでR5は独立に(21)、(22)、(23)または(24)に定義した通りである、
(10)  -SH、
(11)  -SR6、ここでR6は独立に(21)、(22)、(23)または(24)に定義した通りである、
(12)  -OC(=O)R7、ここでR7は独立に(21)、(22)、(23)または(24)に定義した通りである、
(13)  -OC(=O)NR8R9、ここでR8およびR9はそれぞれ独立に-Hであるか、または(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りであり、あるいはR8とR9はそれらが結合している窒素原子と一緒になって3〜7個の環原子を有する環を形成する、
(14)  -NR10R11、ここでR10およびR11はそれぞれ独立に-Hであるか、または(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りであり、あるいはR10とR11はそれらが結合している窒素原子と一緒になって3〜7個の環原子を有する環を形成する、
(15)  -NR12C(=O)R13または-NR12C(=S)R13、ここでR12は独立に-Hであるか、または(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りであり、かつR13は独立に-Hであるか、または(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りである、
(16)  -NR14C(=O)NR15R16または-NR14C(=S)NR15R16、ここでR14は独立に-Hであるか、または(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りであり、かつR15およびR16はそれぞれ独立に-Hであるか、または(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りであり、あるいはR15とR16はそれらが結合している窒素原子と一緒になって3〜7個の環原子を有する環を形成する、
(17)  -NR17SO2R18、ここでR17は独立に-Hであるか、または(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りであり、かつR18は独立に-Hであるか、または(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りである、
(18)  -SO2R19、ここでR19は独立に(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りである、
(19)  -OSO2R20、ここでR20は独立に(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りである、
(20)  -SO2NR21R22、ここでR21およびR22はそれぞれ独立に-Hであるか、または(21)、(22)、(23)もしくは(24)に定義した通りであり、あるいはR21とR22はそれらが結合している窒素原子と一緒になって3〜7個の環原子を有する環を形成する、
(21)  C5-20アリール-C1-7アルキル、例えば、ここでC5-20アリールは(22)に定義した通りであり、置換されていないか、または例えば(1)〜(24)に定義した１個以上の基で置換されている、
(22)  C6-20カルボアリール、C5-20ヘテロアリール、例えば(1)〜(24)に定義した１個以上の基で置換されているか、または置換されていない、
(23)  C3-20ヘテロシクリル、例えば(1)〜(24)に定義した１個以上の基で置換されているか、または置換されていない、
(24)  C1-7アルキル、C8-30アルキル、C2-7アルケニル、C2-7アルキニル、C3-7シクロアルキル、C3-7シクロアルケニル、C3-7シクロアルキニル、例えば(1)〜(23)に定義した１個以上の基で置換されているか、または置換されていない、
例えば、ハロ-C1-7アルキル、
例えば、アミノ-C1-7アルキル(例えば、-(CH2)w-アミノ、wは1、2、3、または4である)、
例えば、カルボキシ-C1-7アルキル(例えば-(CH2)w-COOH、wは1、2、3、または4である)、
例えば、アシル-C1-7アルキル(例えば-(CH2)w-C(=O)R4、wは1、2、3、または4である)、
例えば、ヒドロキシ-C1-7アルキル(例えば-(CH2)w-OH、wは1、2、3、または4である)、
例えば、C1-7アルコキシ-C1-7アルキル(例えば-(CH2)w-O-C1-7アルキル、wは1、2、3、または4である)。
【０１１１】
ある実施形態において、置換基RPは独立に以下から選択される：
(1)  -C(=O)OH、
(2)  -C(=O)OMe、-C(=O)OEt、-C(=O)O(iPr)、-C(=O)O(tBu)、-C(=O)O(cPr)、
-C(=O)OCH2CH2OH、-C(=O)OCH2CH2OMe、-C(=O)OCH2CH2OEt、
-C(=O)OPh、-C(=O)OCH2Ph、
(3)  -(C=O)NH2、-(C=O)NMe2、-(C=O)NEt2、-(C=O)N(iPr)2、-(C=O)N(CH2CH2OH)2、
-(C=O)-モルホリノ、-(C=O)NHPh、-(C=O)NHCH2Ph、
(4)  -C(=O)H、-(C=O)Me、-(C=O)Et、-(C=O)(tBu)、-(C=O)-cHex、-(C=O)Ph、-(C=O)CH2Ph、
(5)  -F、-Cl、-Br、-I、
(6)  -CN、
(7)  -NO2、
(8)  -OH、
(9)  -OMe、-OEt、-O(iPr)、-O(tBu)、-OPh、-OCH2Ph、
-OCF3、-OCH2CF3、
-OCH2CH2OH、-OCH2CH2OMe、-OCH2CH2OEt、
-OCH2CH2NH2、-OCH2CH2NMe2、-OCH2CH2N(iPr)2、
-OPh-Me、-OPh-OH、-OPh-OMe、-OPh-F、-OPh-Cl、-OPh-Br、-OPh-I、
(10)  -SH、
(11)  -SMe、-SEt、-SPh、-SCH2Ph、
(12)  -OC(=O)Me、-OC(=O)Et、-OC(=O)(iPr)、-OC(=O)(tBu)、-OC(=O)(cPr)、
-OC(=O)CH2CH2OH、-OC(=O)CH2CH2OMe、-OC(=O)CH2CH2OEt、
-OC(=O)Ph、-OC(=O)CH2Ph、
(13)  -OC(=O)NH2、-OC(=O)NHMe、-OC(=O)NMe2、-OC(=O)NHEt、-OC(=O)NEt2、-OC(=O)NHPh、-OC(=O)NCH2Ph、
(14)  -NH2、-NHMe、-NHEt、-NH(iPr)、-NMe2、-NEt2、-N(iPr)2、-N(CH2CH2OH)2、
-NHPh、-NHCH2Ph、ピペリジノ、ピペラジノ、モルホリノ、
(15)  -NH(C=O)Me、-NH(C=O)Et、-NH(C=O)nPr、-NH(C=O)Ph、-NHC(=O)CH2Ph、
-NMe(C=O)Me、-NMe(C=O)Et、-NMe(C=O)Ph、-NMeC(=O)CH2Ph、
(16)  -NH(C=O)NH2、-NH(C=O)NHMe、-NH(C=O)NHEt、-NH(C=O)NPh、-NH(C=O)NHCH2Ph、-NH(C=S)NH2、-NH(C=S)NHMe、-NH(C=S)NHEt、-NH(C=S)NPh、-NH(C=S)NHCH2Ph、
(17)  -NHSO2Me、-NHSO2Et、-NHSO2Ph、-NHSO2PhMe、-NHSO2CH2Ph、
-NMeSO2Me、-NMeSO2Et、-NMeSO2Ph、-NMeSO2PhMe、-NMeSO2CH2Ph、
(18)  -SO2Me、-SO2CF3、-SO2Et、-SO2Ph、-SO2PhMe、-SO2CH2Ph、
(19)  -OSO2Me、-OSO2CF3、-OSO2Et、-OSO2Ph、-OSO2PhMe、-OSO2CH2Ph、
(20)  -SO2NH2、-SO2NHMe、-SO2NHEt、-SO2NMe2、-SO2NEt2、-SO2-モルホリノ、-SO2NHPh、-SO2NHCH2Ph、
(21)  -CH2Ph、-CH2Ph-Me、-CH2Ph-OH、-CH2Ph-F、-CH2Ph-Cl、
(22)  -Ph、-Ph-Me、-Ph-OH、-Ph-OMe、-Ph-NH2、-Ph-F、-Ph-Cl、-Ph-Br、-Ph-I、
ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、
(23)  ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、アゼピニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、モルホリニル、アゼチジニル、
(24)  -Me、-Et、-nPr、-iPr、-nBu、-iBu、-sBu、-tBu、-nPe、-nHex、-(CH2)7CH3、-(CH2)9CH3、-(CH2)11CH3、-(CH2)13CH3、-(CH2)15CH3、-(CH2)17CH3、-(CH2)19CH3、
-cPr、-cHex、-CH=CH2、-CH2-CH=CH2、
-CF3、-CHF2、-CH2F、-CCl3、-CBr3、-CH2CH2F、-CH2CHF2、および-CH2CF3、
-CH2OH、-CH2OMe、-CH2OEt、-CH2NH2、-CH2NMe2、
-CH2CH2OH、-CH2CH2OMe、-CH2CH2OEt、-CH2CH2CH2NH2、-CH2CH2NMe2。
【０１１２】
ある実施形態において、置換基RPは独立に、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、C1-C7アルコキシ、C1-C7アルキル、C1-C7ハロアルキル、およびC8-C30アルキルから選択される。
【０１１３】
ある実施形態において、置換基RPは独立に、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、C1-C4アルコキシ、C1-C4アルキル、C1-C4ハロアルキル、およびC12-C22アルキルから選択される。
【０１１４】
ある実施形態において、置換基RPは独立に、ハロ、C1-C4アルキル、およびC1-C4ハロアルキルから選択される。
【０１１５】
ある実施形態において、置換基RPは独立に、フルオロ、C1-C4アルキル、およびC1-C4フルオロアルキルから選択される。
【０１１６】
ある実施形態において、置換基RPは独立に、F、-CH3、-CF3から選択される。
【０１１７】
本明細書において用いる「ハロ」という用語にはフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードが含まれる。
【０１１８】
本明細書において用いる「アルキル」という用語は、一価の、単座の、脂肪族(線状または分枝状)の飽和炭化水素部分、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピルなどをさす。
【０１１９】
(非置換)アルキル基の例としては、メチル(C1)、エチル(C2)、プロピル(C3)、ブチル(C4)、ペンチル(C5)、ヘキシル(C6)、ヘプチル(C7)、オクチル(C8)、ノニル(C9)、デシル(C10)、ウンデシル(C11)、ドデシル(C12)、トリデシル(C13)、テトラデシル(C14)、ペンタデシル(C15)、およびエイコデシル(C20)が挙げられる。
【０１２０】
(非置換)線状アルキル基の例としては、メチル(C1)、エチル(C2)、n-プロピル(C3)、n-ブチル(C4)、n-ペンチル(アミル)(C5)、n-ヘキシル(C6)、およびn-ヘプチル(C7)が挙げられる。
【０１２１】
(非置換)分枝状アルキル基の例としては、イソプロピル(C3)、イソブチル(C4)、sec-ブチル(C4)、tert-ブチル(C4)、イソペンチル(C5)、およびneo-ペンチル(C5)が挙げられる。
【０１２２】
本明細書において用いる「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を有する一価の、単座の、脂肪族(線状または分枝状)の炭化水素部分をさす。
【０１２３】
(非置換)アルケニル基の例としては、エテニル(ビニル、-CH=CH2)、1-プロペニル(-CH=CH-CH3)、2-プロペニル(アリル、-CH-CH=CH2)、イソプロペニル(1-メチルビニル、-C(CH3)=CH2)、ブテニル(C4)、ペンテニル(C5)、およびヘキセニル(C6)が挙げられる。
【０１２４】
本明細書において用いる「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素-炭素三重結合を有する一価の、単座の、脂肪族(線状または分枝状)の炭化水素部分をさす。
【０１２５】
(非置換)アルキニル基の例としては、エチニル(ethynyl、ethinyl、-C≡CH)および2-プロピニル(プロパルギル、-CH2-C≡CH)が挙げられる。
【０１２６】
本明細書において用いる「シクロアルキル」という用語は、少なくとも１つの炭素原子環(好ましくは3〜7個の環炭素原子を有する)を有する一価の、単座の、非芳香族の飽和炭化水素部分をさす。
【０１２７】
シクロアルキル基の例としては、飽和単環式炭化水素化合物：シクロプロパン(C3)、シクロブタン(C4)、シクロペンタン(C5)、シクロヘキサン(C6)、シクロヘプタン(C7)、メチルシクロプロパン(C4)、ジメチルシクロプロパン(C5)、メチルシクロブタン(C5)、ジメチルシクロブタン(C6)、メチルシクロペンタン(C6)、ジメチルシクロペンタン(C7)、メチルシクロヘキサン(C7)、ジメチルシクロヘキサン(C8)、メンタン(C10)、および飽和多環式炭化水素化合物:ツジャン(C10)、カラン(C10)、ピナン(C10)、ボルナン(C10)、ノルカラン(C7)、ノルピナン(C7)、ノルボルナン(C7)、アダマンタン(C10)、デカリン(デカヒドロナフタレン)(C10)から誘導されるものが挙げられる。
【０１２８】
本明細書において用いる「シクロアルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素原子環(好ましくは3〜7個の環炭素原子を有する)および少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を有する一価の、単座の、非芳香族の炭化水素部分をさす。
【０１２９】
シクロアルケニル基の例としては、不飽和単環式炭化水素化合物：シクロプロペン(C3)、シクロブテン(C4)、シクロペンテン(C5)、シクロヘキセン(C6)、メチルシクロプロペン(C4)、ジメチルシクロプロペン(C5)、メチルシクロブテン(C5)、ジメチルシクロブテン(C6)、メチルシクロペンテン(C6)、ジメチルシクロペンテン(C7)、メチルシクロヘキセン(C7)、ジメチルシクロヘキセン(C8)、および不飽和多環式炭化水素化合物：カンフェン(camphene)(C10)、リモネン(C10)、ピネン(C10)から誘導されるものが挙げられる。
【０１３０】
本明細書において用いる「シクロアルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素原子環(好ましくは3〜7個の環炭素原子を有する)および少なくとも１つの炭素-炭素三重結合を有する一価の、単座の、非芳香族の炭化水素部分をさす。
【０１３１】
本明細書において用いる「アリール」という用語は、芳香環を有しかつ(特に断らない限り)3〜20個の環原子を有する一価の、単座の部分をさす。好ましくは各環は5〜7個の環原子を有する。環原子は「カルボアリール」基がそうであるように全て炭素原子であってもよく、または「ヘテロアリール」基がそうであるように１個以上(例えば1、2、3、4個など)のヘテロ原子(例えばN、O、およびSから選択される)を有してもよい。これに関して、接頭語(例えばC5-C20、C5-C12、C5-C10など)は、炭素原子であれヘテロ原子であれ、環原子の数または環原子数の範囲を意味する。
【０１３２】
カルボアリール基の例としては、ベンゼン(すなわちフェニル)(C6)、ナフタレン(C10)、アズレン(C10)、アントラセン(C14)、フェナントレン(C14)、ナフタセン(C18)、およびピレン(C16)から誘導されるものが挙げられる。
【０１３３】
縮合環(その少なくとも１つは芳香環である)を有するカルボアリール基の例としては、インダン(例えば2,3-ジヒドロ-1H-インデン)(C9)、インデン(C9)、イソインデン(C9)、テトラリン(1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン(C10)、アセナフテン(C12)、フルオレン(C13)、フェナレン(C13)、アセフェナントレン(C15)、およびアセアントレン(C16)から誘導される基が挙げられる。
【０１３４】
カルボアリール基のさらなる例としては、インデン(C9)、インダン(例えば2,3-ジヒドロ-1H-インデン)(C9)、テトラリン(1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン)(C10)、アセナフテン(C12)、フルオレン(C13)、フェナレン(C13)、アセフェナントレン(C15)、アセアントレン(C16)、コラントレン(C20)から誘導される基が挙げられる。
【０１３５】
単環式ヘテロアリール基の例としては次から誘導されるものが挙げられる：
N1：ピロール(アゾール)(C5)、ピリジン(アジン)(C6)、
O1：フラン(オキソール)(C5)、
S1：チオフェン(チオール)(C5)、
N1O1：オキサゾール(C5)、イソオキサゾール(C5)、イソオキサジン (C6)、
N2O1：オキサジアゾール(フラザン) (C5)、
N3O1：オキサトリアゾール(C5)、
N1S1：チアゾール(C5)、イソチアゾール(C5)、
N2：イミダゾール(1,3-ジアゾール)(C5)、ピラゾール(1,2-ジアゾール)(C5)、ピリダジン(1,2-ジアジン)(C6)、ピリミジン(1,3-ジアジン)(C6)(例えばシトシン、チミン、ウラシル)、ピラジン(1,4-ジアジン)(C6)、
N3：トリアゾール(C5)、トリアジン(C6)、および、
N4：テトラゾール(C5)。
【０１３６】
多環式ヘテロアリール基の例としては、
ベンゾフラン(O1)、イソベンゾフラン(O1)、インドール(N1)、イソインドール(N1)、インドリジン(N1)、インドリン(N1)、イソインドリン(N1)、プリン(N4)(例えばアデニン、グアニン)、ベンゾイミダゾール(N2)、インダゾール(N2)、ベンゾオキサゾール(N1O1)、ベンゾイソオキサゾール(N1O1)、ベンゾジオキソール(O2)、ベンゾフラザン(N2O1)、ベンゾトリアゾール(N3)、ベンゾチオフラン(S1)、ベンゾチアゾール(N1S1)、ベンゾチアジアゾール(N2S)から誘導される(2つの縮合環を有する)C9複素環式基、
クロメン(O1)、イソクロメン(O1)、クロマン(O1)、イソクロマン(O1)、ベンゾジオキサン(O2)、キノリン(N1)、イソキノリン(N1)、キノリジン(N1)、ベンゾオキサジン(N1O1)、ベンゾジアジン(N2)、ピリドピリジン(N2)、キノキサリン(N2)、キナゾリン(N2)、シンノリン(N2)、フタラジン(N2)、ナフチリジン(N2)、プテリジン(N4)から誘導される(2つの縮合環を有する)C10複素環式基、
ベンゾジアゼピン(N2)から誘導される(2つの縮合環を有する)C11複素環式基、
カルバゾール(N1)、ジベンゾフラン(O1)、ジベンゾチオフェン(S1)、カルボリン(N2)、ペリミジン(N2)、ピリドインドール(N2)から誘導される(3つの縮合環を有する)C13複素環式基、ならびに、
アクリジン(N1)、キサンテン(O1)、チオキサンテン(S1)、オキサントレン(O2)、フェノキサチイン(O1S1)、フェナジン(N2)、フェノキサジン(N1O1)、フェノチアジン(N1S1)、チアントレン(S2)、フェナントリジン(N1)、フェナントロリン(N2)、フェナジン(N2)から誘導される(3つの縮合環を有する)C14複素環式基が挙げられる。
【０１３７】
-NH-基の形態で窒素環原子を有するヘテロアリール基は、N置換されて、つまり-NR-として置換されていてもよい。例えば、ピロールはN-メチル置換されてN-メチルピロールとなっていてもよい。N-置換基の例としては、C1-C7アルキル、C6-C20カルボアリール、C6-C20カルボアリール-C1-C7アルキル、C1-C7アルキル-アシル、C6-C20カルボアリール-アシル、C6-C20カルボアリール-C1-C7アルキル-アシル、などが挙げられる。
【０１３８】
-N=基の形態で窒素環原子を有するヘテロアリール基は、N-オキシドの形態で、すなわち-N(→O)=、(または-N+(→O-)=とも表される)として置換されていてもよい。例えば、キノリンは置換されてキノリンN-オキシドとなっていてもよい。ピリジンは置換されてピリジンN-オキシドとなっていてもよい。ベンゾフラザンは置換されてベンゾフラザンN-オキシド(ベンゾフロキサンとも言う)となっていてもよい。
【０１３９】
分子量
ある実施形態において、化合物の分子量は250〜1000である。
【０１４０】
ある実施形態において、前記範囲の下限は275、300、325、350、375、400、425、450である。
【０１４１】
ある実施形態において、前記範囲の上限は900、800、700、600、500、400である。
【０１４２】
ある実施形態において、前記範囲は250〜900である。
【０１４３】
ある実施形態において、前記範囲は250〜800である。
【０１４４】
ある実施形態において、前記範囲は250〜700である。
【０１４５】
ある実施形態において、前記範囲は250〜600である。
【０１４６】
ある実施形態において、前記範囲は250〜500である。
【０１４７】
いくつかの好ましい例
上記実施形態の適合しうる組み合わせはどれも本明細書に明確に開示されているものとする。これらの組み合わせはそれぞれ、各個別の組み合わせが具体的にそして個々に列挙されたかのように本明細書に開示されているものとする。
【０１４８】
いくつかの好ましい化合物の例としては次のものが挙げられる：
【化７】
2008509209.tif 000008
2008509209.tif 000009
【０１４９】
さらなる化合物 - HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物
本発明のある態様は、HIFαヒドロキシラーゼ(例えばHIFαプロリルヒドロキシラーゼ)を活性化する化合物(全般)、および医学におけるその使用に関する。
【０１５０】
「HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物」という用語は、HIFαヒドロキシラーゼ活性の速度またはレベルを上昇させる化合物に関し、ここでHIFαヒドロキシラーゼ活性は最終産物HIF-1αの量により評価し、すなわち、HIF-1αのヒドロキシル化の増加により評価する。従って、HIF-1αタンパク質レベルの減少はHIFαヒドロキシラーゼの活性化を示しうる。
【０１５１】
HIFαヒドロキシラーゼの活性化を測定するのに適した方法は本明細書に記載されており、かつ／または当技術分野で周知である。
【０１５２】
HIFαヒドロキシラーゼ活性の増加は、約2倍〜10倍という低レベルの増加、約10倍〜100倍という中レベルの増加、または約100倍を超える高レベルの増加でありうる。
【０１５３】
HIFαヒドロキシラーゼはこれまでに記載されており、当技術分野で公知である。好ましいHIFαヒドロキシラーゼはHIFαプロリルヒドロキシラーゼである。哺乳動物細胞では、３種のアイソフォーム、具体的にはプロリルヒドロキシラーゼドメイン(PHD)酵素(PHD1、PHD2、PHD3)が同定されており、これらはin vitroでHIFαをヒドロキシル化することが示されている。これらの酵素は共基質として二原子酸素(dioxygen)を絶対的に必要とする。全体的な反応は、HIFαペプチド基質のプロリル残基への１個の酸素原子の挿入をもたらし、もう１個の酸素原子はCO2放出を伴ってα-ケトグルタル酸からコハク酸を生成させる。
【０１５４】
ある実施形態において、前記化合物はHIFαヒドロキシラーゼ（好ましくはHIFαプロリルヒドロキシラーゼ）の基質または補因子として作用する(または追加的に作用する)。
【０１５５】
ある実施形態において、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物は本明細書に記載するようなα-ケトグルタレート化合物である(または追加的に該化合物である)。
【０１５６】
ある実施形態において、本明細書に記載するα-ケトグルタレート化合物はHIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物である(または追加的に該化合物である)。
【０１５７】
さらなる化合物  -  α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物
本発明のある態様は、α-ケトグルタレートのレベルを(例えば細胞内で)上昇させる化合物(全般)および医学におけるその使用に関する。
【０１５８】
例えば、ある化合物は、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼおよび／または分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼのような他の酵素を阻害することによりα-ケトグルタレートレベルを上昇させることができる。こうした酵素を遮断することは、α-ケトグルタレートレベルを上昇させかつスクシネートレベルを減少させる二重の効果をもつ。
【０１５９】
その上、両方の酵素はリポ酸を補因子として使用する構造ホモログである。従って、リポ酸のアナログはこうした酵素の別の阻害剤である可能性があり、そのためα-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物でありうる。
【０１６０】
あるいはまた、ある化合物はグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT)活性を増強することによりα-ケトグルタレートのレベルを上昇させうる。グルタミン酸自体がGOT活性を活性化してα-ケトグルタレートレベルの上昇をもたらす。
【０１６１】
さらに、化合物はTCA回路の上流代謝産物(オキザロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸およびその誘導体が含まれる)から選択することができる。
【０１６２】
さらなる化合物  -  α-ケトグルタレート全般
本発明のある態様は、α-ケトグルタル酸、α-ケトグルタル酸塩、およびα-ケトグルタル酸誘導体(例えばα-ケトグルタル酸のエステル全般)、ならびに特に医学におけるその使用、例えば本明細書に記載する症状の治療でのその使用に関する。
【０１６３】
ある実施形態において、化合物は、アミノ酸部分(例えばα-アミノ酸部分)(例えばオルニチン部分またはアルギニン部分)を有する(例えばアミノ酸部分にコンジュゲートされた、アミノ酸部分にカップリングされた)α-ケトグルタレートである。
【０１６４】
ある実施形態において、化合物は、α-ケトグルタル酸の酸基の１つから形成されるエステル基(すなわち-C(=O)OR)であるかまたは該エステル基の一部である、アミノ酸部分(例えばα-アミノ酸部分)(例えばオルニチン部分またはアルギニン部分)を有するα-ケトグルタル酸エステルである。
【０１６５】
こうした化合物は刊行物で知られており(例えばLe Boucher ら(1997)を参照)、かつ／または市販されており、かつ／または当業者に知られた慣用の合成法を用いて調製することができる。
【０１６６】
異性体
特定の化合物は、１以上の特定の幾何異性体、光学異性体、エナンチオマー、ジアステレオマー、エピマー、アトロピック(atropic）、立体異性体、互変異性体、立体配座異性体、またはアノマーとして存在することができ、こうしたものとしては、限定するものではないが、シスおよびトランス型、EおよびZ体、c、tおよびr体、エンドおよびエキソ型、R、Sおよびメソ型、DおよびL体、dおよびl体、(+)および(-)型、ケト、エノールおよびエノラート型、シンおよびアンチ型、シンクリナル(synclinal)およびアンチクリナル(anticlinal)型、αおよびβ型、アキシアルおよびエクアトリアル型、舟型、いす型、ねじれ型、エンベロープ型、および半いす型、ならびにこれらの組み合わせが挙げられ、以後まとめて「異性体」と言う。
【０１６７】
以下で互変異性体について論じるものを除き、本明細書で使用する「異性体」という用語からは、構造異性体(または構成的異性体)(すなわち、単に原子の空間的位置で異なるのではなく、原子間の接続で異なる異性体)が特に除かれることに留意されたい。例えば、メトキシ基-OCH3と言うとき、それがその構造異性体であるヒドロキシメチル基-CH2OHのことも言うとは解釈されるべきでない。同様に、o-クロロフェニルと言うとき、それがその構造異性体であるm-クロロフェニルのことも言うとは解釈されるべきでない。しかしながら、あるクラスの構造に言及した場合、それはそのクラスに含まれる構造異性体を全て含みうる(例えば、C1-7アルキルはn-プロピルおよびイソプロピルを含み、ブチルはn-、イソ-、sec-、およびtert-ブチルを含み、メトキシフェニルはo-、m-、およびp-メトキシフェニルを含む)。
【０１６８】
上述の除外は互変異性体(例えばケト型、エノール型およびエノラート型)には当てはまらず、例えば次の互変異性体の対には当てはまらない：ケト/エノール(下記に示す)、イミン/エナミン、アミド/イミノアルコール、アミジン/アミジン、ニトロソ/オキシム、チオケトン/エンチオール、N-ニトロソ/ヒドロキシアゾ、およびニトロ/aci-ニトロ。
【化８】
2008509209.tif 000010
【０１６９】
「異性体」という用語には１以上の同位体置換を有する化合物が含まれることに留意されたい。例えば、Hは1H、2H (D)、および3H (T)を含む同位体のいずれであってもよく、Cは12C、13C、および14Cを含む同位体のいずれであってもよく、Oは16Oおよび18Oを含む同位体のいずれであってもよい、といったぐあいである。
【０１７０】
特定の化合物を言うとき、特に断らない限り、それは、(完全または部分的)ラセミ体およびその他の混合物を含めて、全ての異性体を包含する。かかる異性体の調製方法(例えば不斉合成)ならびに分離方法(例えば分別結晶化やクロマトグラフィー手法)は、当技術分野で知られているか、または本明細書に教示する方法もしくは公知の方法を公知の手順で応用することにより容易に得ることができる。
【０１７１】
塩
活性化合物の対応する塩(例えば製薬上許容される塩)を調製し、精製し、かつ／または取り扱うことは好都合であり、望ましいことがある。製薬上許容される塩の例はBergeら, 1977, "Pharmaceutically Acceptable Salts," J. Pharm. Sci., Vol. 66, pp. 1-19.に記述されている。
【０１７２】
例えば、化合物がアニオン性であるか、またはアニオン性となりうる官能基(例えば-COOHは-COO-となりうる)を有する場合、適当なカチオンを用いて塩を形成させることができる。適当な無機カチオンの例としては、限定するものではないが、アルカリ金属イオン(例えばNa+およびK+)、アルカリ土類カチオン(例えばCa2+およびMg2+)、ならびに他のカチオン(Al+3など)が挙げられる。適当な有機カチオンの例としては、限定するものではないが、アンモニウムイオン(すなわちNH4+)および置換アンモニウムイオン(例えばNH3R+、NH2R2+、NHR3+、NR4+)が挙げられる。いくつかの適当な置換アンモニウムイオンの例としては次から誘導されるものが挙げられる：エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミン、ならびにアミノ酸(リシンやアルギニンなど)。一般的な四級アンモニウムイオンの一例はN(CH3)4+である。
【０１７３】
化合物がカチオン性であるか、またはカチオン性となりうる官能基(例えば-NH2は-NH3+となりうる)を有する場合、適当なアニオンを用いて塩を形成させることができる。適当な無機アニオンの例としては、限定するものではないが、次の無機酸から誘導されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸および亜リン酸。
【０１７４】
適当な有機アニオンの例としては、限定するものではないが、次の有機酸から誘導されるものが挙げられる：2-アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、および吉草酸。適当な高分子有機アニオンの例としては、限定するものではないが次の高分子酸から誘導されるものが挙げられる：タンニン酸、カルボキシメチルセルロース。
【０１７５】
特に断らない限り、特定の化合物への言及には、その塩の形態への言及も含まれるものとする。
【０１７６】
溶媒和物
活性化合物の対応する溶媒和物を調製し、精製し、かつ／または取り扱うことは好都合であり、望ましいことがある。「溶媒和物」という用語は、本明細書では通常の意味で用いられ、溶質(例えば活性化合物、活性化合物の塩)と溶媒の複合体をさす。溶媒が水の場合、溶媒和物を便宜的に水和物(例えば一水和物、二水和物、三水和物など)と言うことができる。
【０１７７】
特に断らない限り、特定の化合物への言及には、その溶媒和物形態への言及も含まれるものとする。
【０１７８】
化学的保護形態
活性化合物を化学的保護形態で調製し、精製し、かつ／または取り扱うことは好都合であり、望ましいことがある。「化学的保護形態」という用語は、本明細書では通常の化学的意味で用いられ、１以上の反応性官能基が特定の条件下(例えばpH、温度、放射線、溶媒など)での望ましくない化学反応から保護されている化合物を言う。実施に当たっては、周知の化学的手法を用いて官能基を特定の条件下で可逆的に非反応性とするが、該官能基はさもなくば反応性であるだろう。化学的保護形態では、１以上の反応性官能基が保護された基または保護基(マスキングされた基もしくはマスキング基、またはブロックされた基もしくはブロッキング基とも言う)の形態で存在する。反応性官能基を保護することにより、他の保護されていない反応性官能基が関係する反応を、保護された基に影響を及ぼすことなく実施することができる、保護基は、通常その後の工程で、分子の残りの部分に実質的に影響を及ぼすことなく除去することができる。例えばProtective Groups in Organic Synthesis (T. Green and P. Wuts; 第3版; John Wiley and Sons, 1999)を参照のこと。
【０１７９】
特に断らない限り、特定の化合物への言及には、その化学的保護形態への言及も含まれるものとする。
【０１８０】
種々の「保護」、「ブロッキング」または「マスキング」手法は有機合成で広く使用され周知である。例えば、２つの等価でない反応性官能基を有し、その両方が特定の条件下で反応性である化合物は、官能基の１つが「保護」されるように、それゆえに特定の条件下で非反応性となるように、誘導体化することができる。このように保護すると、前記化合物は反応性官能基を効果的に１つだけ有する反応物質として使用することができる。所望の反応(もう片方の官能基が関係する)が完了した後、保護された基を「脱保護」して、その元の官能基に戻すことができる。
【０１８１】
例えば、ヒドロキシル基はエーテル(-OR)またはエステル(-OC(=O)R)として保護することができ、例えば、t-ブチルエーテル、ベンジル、ベンズヒドリル(ジフェニルメチル)、またはトリチル(トリフェニルメチル)エーテル、トリメチルシリルエーテルまたはt-ブチルジメチルシリルエーテル、またはアセチルエステル(-OC(=O)CH3、-OAc)として保護される。
【０１８２】
例えば、アルデヒド基またはケトン基はそれぞれアセタール(R-CH(OR)2)またはケタール(R2C(OR)2)として保護することができ、このときカルボニル基(＞C=O)は、例えば一級アルコールとの反応により、ジエーテル(＞C(OR)2)に変換される。アルデヒド基またはケトン基は酸の存在下で大過剰の水を用いる加水分解により容易に再生される。
【０１８３】
例えば、アミン基は、例えばアミド(-NRCO-R)またはウレタン(-NRCO-OR)として、例えば、メチルアミド(-NHCO-CH3)、ベンジルオキシアミド(-NHCO-OCH2C6H5、-NH-Cbz)として、t-ブトキシアミド(-NHCO-OC(CH3)3、-NH-Boc)、2-ビフェニル-2-プロポキシアミド(-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5、-NH-Bpoc)として、9-フルオレニルメトキシアミド(-NH-Fmoc)として、6-ニトロベラトリルオキシアミド(-NH-Nvoc)として、2-トリメチルシリルエチルオキシアミド(-NH-Teoc)として、2,2,2-トリクロロエチルオキシアミド(-NH-Troc)として、アリルオキシアミド(-NH-Alloc)として、2(-フェニルスルホニル)エチルオキシアミド(-NH-Psec)として、または、適当な場合(例えば環式アミン)には、ニトロキシドラジカル(＞N-O・)として保護することができる。
【０１８４】
例えばカルボン酸基は、エステルとして、例えばC1-7アルキルエステル(例えばメチルエステル、t-ブチルエステル)、C1-7ハロアルキルエステル(例えばC1-7トリハロアルキルエステル)、トリC1-7アルキルシリル-C1-7アルキルエステル、もしくはC5-20アリール-C1-7アルキルエステル(例えばベンジルエステル、ニトロベンジルエステル)として、またはアミドとして、例えば、メチルアミドとして保護することができる。
【０１８５】
例えばチオール基は、チオエーテル(-SR)として、例えば、ベンジルチオエーテル、アセトアミドメチルエーテル(-S-CH2NHC(=O)CH3)として保護することができる。
【０１８６】
プロドラッグ
活性化合物をプロドラッグの形態で調製し、精製し、かつ／または取り扱うことは好都合であり、望ましいことがある。本明細書において用いる「プロドラッグ」という用語は、(例えばin vivoで)代謝されたときに所望の活性化合物を生じる化合物をさす。典型的にはプロドラッグは不活性であるか、または活性化合物ほどの活性はないが、取り扱い、投与または代謝に有利な性質を提供しうる。
【０１８７】
特に断らない限り、特定の化合物への言及にはそのプロドラッグへの言及も含まれるものとする。
【０１８８】
例えばいくつかのプロドラッグは活性化合物のエステル(例えば生理学的に許容され、代謝的に不安定なエステル)である。代謝においてエステル基(-C(=O)OR)は切断されて活性な薬物を生じる。かかるエステルは、例えば親化合物中の任意のカルボン酸基(-C(=O)OH)のエステル化により形成することができ（その際、適宜に親化合物に存在する他の反応基を前もって保護しておく）、その後必要であれば脱保護する。
【０１８９】
また、いくつかのプロドラッグは酵素的に活性化されて、活性化合物を生じるか、またはさらなる化学反応後に活性化合物を生成する化合物を生じる(例えばADEPT、GDEPT、LIDEPTなどのように)。例えばプロドラッグは糖誘導体または他の配糖体であってもよく、またはアミノ酸エステル誘導体であってもよい。
【０１９０】
化学合成
いくつかのα-ケトグルタル酸エステルの化学合成法を本明細書に記載する。これらおよび／または他の周知の方法は、本明細書に記載の追加のα-ケトグルタル酸エステルおよび他の化合物の合成を促進するように、標準法に従って、容易に入手可能な出発物質から、適当な試薬および反応条件を用いて、公知のやり方で改変し、かつ／または適合させることができる。必要かつ適切であれば、慣用法(例えば、HPLCやフラッシュクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー)を用いて、標的化合物をその反応混合物から単離することができる。
【０１９１】
例えば、α-ケトグルタル酸エステルを調製するための一般的な手法は、α-ケト酸またはその誘導体のアルキル化(例えばベンジル化)を含む(例えばTakeuchiら, 1999; Natsugariら, 1987を参照されたい)。別の一般的な手法はα-ケト酸またはその誘導体のエステル化を含む(例えばHartensteinら, 1993; Beyermanら, 1961を参照されたい)。別の一般的な手法はエステル交換を含む(例えばDomagala ら, 1980を参照されたい)。合成法は一段階または多段階でありうる。
【０１９２】
合成法には保護基を利用することができる。例えばO-保護基、例えば一級および／または二級ヒドロキシル基を保護するのに適当であることが知られている基、例えば“Protective Groups in Organic Chemistry”, J.W.F. McOmie編集, Plenum Press (1973), および“Protective Groups in Organic Synthesis”, 第3版, T.W. Greene & P.G.M. Wutz, Wiley-Interscience (1999)に記載のO-保護基を利用することができる。いくつかの好ましいO-保護基としては、アルキルカルボニル基およびアリールカルボニル基(例えばアシル、例えばベンゾイル)、トリアリールメチル基(例えばトリフェニルメチル(トリチル)およびジメトキシトリチル)およびシリル基(例えばトリメチルシリルのようなトリアルキルシリル)が挙げられる。
【０１９３】
組成物
本発明のある態様は、本明細書に記載の１以上の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、PHDを活性化する化合物、HIF安定化を阻害または抑制する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)および製薬上許容される担体を含む組成物(例えば医薬組成物)である。
【０１９４】
用途
本明細書に記載の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、PHDを活性化する化合物、HIF安定化を阻害または抑制する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)は、例えば、PHDの活性化、HIF安定化の阻害または抑制、低酸素誘発血管新生の治療、および低酸素誘発血管新生により仲介される疾患や症状の治療に有用である。
【０１９５】
PHDの活性化方法での使用
本発明のある態様は、in vitroまたはin vivoで、細胞内のPHDを活性化する方法であって、前記細胞と有効量の本明細書に記載の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、PHDを活性化する化合物、HIF安定化を阻害または抑制する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)を接触させることを含む前記方法に関する。
【０１９６】
PHD活性化を測定するのに適した方法は本明細書に記載されておりかつ／または当技術分野で周知である。
【０１９７】
HIF安定化の阻害方法での使用
本発明のある態様は、in vitroまたはin vivoで、細胞内のHIF安定化を阻害または抑制する方法であって、前記細胞と有効量の本明細書に記載の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、PHDを活性化する化合物、HIF安定化を阻害または抑制する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)を接触させることを含む前記方法に関する。
【０１９８】
HIF安定化を測定するのに適した方法は本明細書に記載されておりかつ／または当技術分野で周知である。
【０１９９】
HIFαヒドロキシラーゼの活性化方法での使用
本発明のある態様は、in vitroまたはin vivoで、細胞内のHIFαヒドロキシラーゼを活性化する方法であって、前記細胞と有効量の本明細書に記載の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、 HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、PHDを活性化する化合物、HIF安定化を阻害または抑制する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)を接触させることを含む前記方法に関する。
【０２００】
HIFαヒドロキシラーゼの活性化を測定するのに適した方法は本明細書に記載されておりかつ／または当技術分野で周知である。
【０２０１】
細胞増殖などの抑制方法での使用
本発明のある態様は、in vitroまたはin vivoにおける、(a)細胞増殖(例えば１個の細胞の増殖)の調節(例えば阻害)方法、(b)細胞周期の進行を抑制する方法、(c)アポトーシスを促進する方法、または(d)これらの１以上を組み合わせた方法であって、複数の細胞(または１個の細胞)を有効量の本明細書に記載の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)と接触させることを含む前記方法に関する。
【０２０２】
ある実施形態において、上記方法はin vitroまたはin vivoにおける細胞増殖(例えば１個の細胞の増殖)の調節(例えば阻害)方法であって、複数の細胞(または１個の細胞)を有効量の本明細書に記載の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、PHDを活性化する化合物、HIF安定化を阻害または抑制する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)と接触させることを含む前記方法である。
【０２０３】
ある実施形態においては、上記方法をin vitroで実施する。
【０２０４】
ある実施形態においては、上記方法をin vivoで実施する。
【０２０５】
ある実施形態においては、化合物を製薬上許容される組成物の形態で提供する。
【０２０６】
あらゆる細胞型が処置可能であり、これには限定するものではないが、肺、胃腸(例えば腸、大腸が含まれる)、乳房(乳腺)、卵巣、前立腺、肝臓(肝)、腎臓(腎)、膀胱、膵臓、脳、および皮膚の細胞が含まれる。
【０２０７】
当業者ならば、ある候補化合物が細胞増殖などを調節(例えば阻害)するか否かを容易に測定することができる。例えば、特定の化合物によりもたらされる活性を評価するのに都合よく使用することのできるアッセイを本明細書に記載する。
【０２０８】
例えば、細胞(例えば腫瘍由来)のサンプルをin vitroで増殖させ、ついでα-ケトグルタレート化合物を前記細胞と接触させ、該化合物がそれらの細胞に及ぼす影響を観察することができる。「影響」の例として、細胞の形態学的状態(例えば生きているか、死んでいるかなど)を判別することができる。化合物が細胞に影響を及ぼすことが見出された場合、この影響を、同じ細胞型の細胞を有する患者の治療法における該化合物の効力の予測マーカーまたは診断マーカーとして利用することができる。
【０２０９】
治療法での使用
本発明の別の態様は、本明細書に記載の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、 HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、PHDを活性化する化合物、HIF安定化を阻害または抑制する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)の、治療法によるヒトまたは動物の処置方法における使用に関する。
【０２１０】
医薬の製造における使用
本発明の別の態様は、(例えば本明細書に記載の症状の)治療用の医薬の製造における、本明細書に記載の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、PHDを活性化する化合物、HIF安定化を阻害または抑制する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)の使用に関する。
【０２１１】
治療方法
本発明の別の態様は、治療を必要とする患者に、治療上有効量の本明細書に記載の化合物(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、PHDを活性化する化合物、HIF安定化を阻害または抑制する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)を、好ましくは医薬組成物の形態で、投与することを含む治療方法に関する。
【０２１２】
治療する症状 - 低酸素状態になる症状
ある実施形態において、治療は、症状の進行に伴って(例えば固形癌が増殖するに従い)低酸素状態になる症状の治療である。
【０２１３】
ある実施形態において、治療は癌、乾癬、アテローム性動脈硬化症、月経過多、子宮内膜症、関節炎(炎症性およびリウマチ様の両方)、黄斑変性、パジェット病、網膜症およびその血管性合併症(増殖性網膜症および糖尿病性網膜症を含む)、良性の血管増殖、線維症、肥満および炎症から選択される症状の治療である。
【０２１４】
こうした症状は進行するに従い低酸素状態になることが当技術分野で周知である。これは特に固形癌を特徴とする癌に当てはまる。
【０２１５】
治療する症状 - 血管新生
本明細書に記載の化合物は血管新生の治療(例えばその阻害)に有用である(例えば「抗血管新生薬」として)。
【０２１６】
ある実施形態において、治療は血管新生の治療(例えば血管新生の阻害)、または不適切な、過度のおよび／または望ましくない血管新生を特徴とする症状の治療である。
【０２１７】
ある実施形態において血管新生は低酸素誘発血管新生である。
【０２１８】
ある実施形態において、血管新生は低酸素症のためにHIF-1αの活性がアップレギュレートされている血管新生である。
【０２１９】
ある実施形態において、治療は低酸素誘発血管新生を特徴とする症状の治療である。
【０２２０】
ある実施形態において、治療は、癌、乾癬、アテローム性動脈硬化症、月経過多、子宮内膜症、関節炎(炎症性およびリウマチ様の両方)、黄斑変性、パジェット病、網膜症およびその血管性合併症(増殖性網膜症および糖尿病性網膜症も含まれる)、良性の血管増殖、線維症、肥満および炎症の治療である。
【０２２１】
治療する症状 - 増殖性症状および癌
本明細書に記載の化合物は増殖性の症状の治療(「抗増殖薬」として)、癌の治療(「抗癌剤」として)などに有用である。
【０２２２】
本明細書において用いる「抗増殖薬」という用語は、増殖性の症状を治療する化合物(すなわち増殖性の症状の治療に有用な化合物)を言う。「増殖性症状」、「増殖性障害」および「増殖性疾患」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、望ましくない過度のまたは異常な細胞の不要なまたは制御されていない細胞増殖、例えば新生物性増殖または過形成増殖を言うために使用する。
【０２２３】
本明細書において用いる「抗癌剤」という用語は癌を治療する化合物(すなわち癌の治療に有用な化合物)を言う。抗癌作用は１以上の機構により現れうるものであり、これには限定するものではないが、細胞増殖の調節、細胞周期の進行の抑制、血管新生(新しい血管の形成)の阻害、転移(その起源からの腫瘍の拡散)の抑制、浸潤(腫瘍細胞の隣接正常構造物への拡散)の阻害、またはアポトーシス(プログラムされた細胞死)の促進が含まれる。
【０２２４】
当業者ならば、ある候補化合物が、どのような特定の細胞型の増殖性症状または癌を治療するか否かを容易に確認することができる。例えば、特定の化合物がもたらす活性を評価するために都合よく使用することのできるアッセイを本明細書に記載する。
【０２２５】
活性化合物には、固有の活性が備わっている化合物(薬物)だけでなく、かかる化合物のプロドラッグ(これらのプロドラッグ自体は固有の活性をほとんどあるいは全く示さない)も含まれることに留意されたい。
【０２２６】
ある実施形態において、治療は増殖性症状の治療である。
【０２２７】
ある実施形態において、治療は良性、前悪性または悪性の細胞増殖を特徴とする増殖性症状の治療であり、こうした症状としては限定するものではないが、新生物、過形成、および腫瘍(例えば、組織球腫、神経膠腫、星状細胞腫、骨腫)、癌(下記参照)、乾癬、骨疾患、線維増殖性疾患(例えば結合組織の線維増殖性疾患)、肺線維症、アテローム性動脈硬化症、血管における平滑筋細胞増殖、例えば血管形成術後の狭窄または再狭窄が挙げられる。
【０２２８】
ある実施形態において、治療は癌の治療である。
【０２２９】
ある実施形態において、治療は次に挙げるものの治療である：肺癌、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、胃腸癌、胃癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、直腸結腸癌、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、精巣癌、肝臓癌、腎臓癌、腎細胞癌、膀胱癌、膵臓癌、脳腫瘍、神経膠腫、肉腫、骨肉腫、骨癌、皮膚癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒色腫、悪性黒色腫、リンパ腫、または白血病。
【０２３０】
ある実施形態において、治療は次に挙げるものの治療である：
癌腫、例えば膀胱、乳房、結腸(例えば結腸腺癌や結腸腺腫のような結腸直腸癌)、腎臓、表皮、肝臓、肺(例えば腺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌)、食道、胆嚢、卵巣、膵臓(例えば膵外分泌腺腫瘍、胃、頸部、甲状腺、前立腺、皮膚(例えば扁平上皮細胞癌)の癌腫、
リンパ球系統の造血性腫瘍、例えば白血病、急性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫、またはバーキットリンパ腫、
骨髄系統の造血性腫瘍、例えば急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形性症候群、または前骨髄球性白血病、
間葉細胞起源の腫瘍、例えば線維肉腫または横紋筋肉腫、 
中枢神経系または末梢神経系の腫瘍、例えば星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫または神経鞘腫、
黒色腫、精上皮腫、奇形癌、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌、またはカポジ肉腫。
【０２３１】
ある実施形態において、治療は固形癌(例えば固形癌の外観を特徴とする癌)の治療である。
【０２３２】
ある実施形態において、治療は褐色細胞腫、パラガングリオーマ、平滑筋腫、腎細胞癌、胃癌および直腸結腸癌から選択される癌の治療である。
【０２３３】
ある実施形態において、治療はSDH機能異常を特徴とする(例えばSDH機能異常を示す)癌(例えば腫瘍)の治療である。
【０２３４】
ある実施形態において、治療は疾患の後期にSDHのダウンレギュレーションを発現する癌の治療である。
【０２３５】
ある実施形態において、治療は胃癌または直腸結腸癌、例えばデュークス・ステージCの直腸結腸癌の治療である。
【０２３６】
ある実施形態において、治療は口腔癌の治療である。(口腔癌では、腺腫から癌腫への移行において、SDH遺伝子発現の低下が観察されている)。
【０２３７】
本明細書に記載の化合物は、本明細書に論じた機構に関わりなく、本明細書に記載の癌の治療に使用することができる。
【０２３８】
ある実施形態において、治療は本明細書に記載の治療であり、ここで患者はSDH遺伝子のA、B、CもしくはDサブユニットまたはFH遺伝子に遺伝性突然変異または体細胞突然変異を有するか、あるいはSDH遺伝子(A、B、CもしくはDサブユニット)のいずれかまたはFH遺伝子の発現のダウンレギュレーションを有するか、あるいは前記遺伝子によりコードされる酵素の活性低下を有する。
【０２３９】
治療する症状 - HIF-1αアップレギュレーションを伴う癌
ある実施形態において、治療は、低酸素症のためにHIF-1α活性がアップレギュレートされている癌(例えば本明細書に記載の癌)の治療である。
【０２４０】
治療する症状 - TCA回路酵素のダウンレギュレーションを伴う癌
ある実施形態において、治療は、TCA回路の１種の酵素の活性がダウンレギュレートされている癌(例えば本明細書に記載の癌)の治療である。
【０２４１】
特定の理論に拘束されることを望まないが、TCA回路の１種の酵素のダウンレギュレーションはコハク酸のレベルの上昇を必然的にもたらすと考えられる。
【０２４２】
TCA回路の酵素の例としては、例えばコハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)およびフマル酸ヒドラターゼ(FH)が挙げられる。
【０２４３】
「SDHのダウンレギュレーション」という語句は、例えば、１以上のSDH遺伝子の突然変異に起因するSDH活性の低下、またはこれらの遺伝子の１種の発現低下に起因する(例えばプロモーターメチル化に起因する)SDH活性の低下、または他の間接的影響、例えばミトコンドリアDNAの突然変異、もしくはSDH機能を負に調節する内因性化合物(例えばFH突然変異に起因するフマル酸、活性酸素種、およびSDHに結合してSDH活性を阻害するタンパク質)のレベルの上昇、に起因するSDH活性の低下を含むことを意図する。
【０２４４】
治療
症状を治療するという文脈で本明細書に用いる「治療」という用語は、一般に、ヒトであろうと動物(例えば獣医用途)であろうと、何らかの望ましい治療効果が達成される(例えば症状の進行が抑制される)治療をさし、これには進行速度の低下、進行速度の停止、疾患の症状の緩和、症状の改善、および症状の治癒が含まれる。予防的手段(すなわち予防法)としての治療もこれに含まれる。例えば、症状がまだ現れてはいないが、該症状が出現するリスクのある患者への使用も、「治療」という用語に包含される。
【０２４５】
例えば癌の治療には、癌の予防、癌の発生率の低減、癌の症状の緩和などが含まれる。
【０２４６】
本明細書に用いる「治療上有効量」という用語は、所望の治療計画に沿って投与したときに、理にかなった利益／リスク比に見合う何らかの望ましい治療効果を生じるのに有効な、活性化合物、または活性化合物を含有する物質、組成物もしくは剤形の量を言う。
【０２４７】
併用療法 - 全般
「治療」という用語には併用処置法および併用療法が含まれ、これは２以上の処置または治療法を(例えば逐次または同時的に)併用する治療である。例えば本明細書に記載の化合物は、例えば他の薬剤(例えば細胞毒性薬剤、抗癌剤など)と併用して、併用療法に使用することもできる。処置法および治療法の例としては、限定するものではないが、化学療法(例えば薬物、抗体(例えば免疫療法において)、プロドラッグ(例えば光線力学療法、GDEPT、ADEPTなどにおいて)を含めて、活性薬剤の投与)、手術、放射線療法、光線力学療法、遺伝子治療、およびコントロールされた食事療法が含まれる。
【０２４８】
特定の組み合わせは臨床医の裁量に委ねられ、臨床医はその一般知識と当業者に周知の投与計画を用いて用量を選択するであろう。
【０２４９】
複数の薬剤(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、PHDを活性化する化合物、HIF安定化を阻害または抑制する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物などと、１種以上の他の薬物)は、同時にまたは逐次投与してもよく、個々に変化する用量計画および異なる経路を介して投与することができる。例えば逐次投与する場合、薬剤を近接する時間間隔で(例えば5〜10分間に渡り)またはより長い間隔で(例えば1、2、3、4時間もしくはそれより長い間隔で、または必要であればさらに長い間隔で)投与してもよく、このとき正確な投与計画は治療剤の性質を考慮する。
【０２５０】
複数の薬剤は単一剤形として一緒に製剤化してもよいし、あるいはまた、個々の薬剤を別々に製剤化して、後述するようにキット（その使用説明書を備えてもよい）の形で提供してもよい。
【０２５１】
併用療法 - ALAシンターゼの促進化合物
何ら特定の理論に拘束されることを望まないが、TCA回路におけるα-ケトグルタル酸からコハク酸への代謝は中間体スクシニルCoAの形成をもたらすと考えられる。δ-ALAは、酵素ALAシンターゼによりスクシニルCoAとグリシンから生成される。ALAはプロトポルフィリンIX (PpIX)に変換され、その後ヘム生合成経路の酵素によるヘムの合成が行われる。ポルフィリン環化合物は、例えば光に曝露されたときに一重項酸素を放出しうることから、高濃度では有毒であることが知られている。
【０２５２】
重ねて特定の理論に拘束されることを望まないが、ALAシンターゼの活性化は、スクシニルCoAを経由するα-ケトグルタレートの代謝をヘム経路の方に転じて、細胞死を誘導することができると考えられる。
【０２５３】
従って、ある実施形態(例えば治療法での使用の、医薬の製造における使用の、治療法の実施形態)では、２つの薬剤が使用される：(a)第１薬剤(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物)、および(b)第２薬剤。
【０２５４】
例えばある実施形態では、治療法は、治療を必要とする患者に、有効量の(a) 第１薬剤(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物)と、(b)第２薬剤とを併用投与することを含む治療方法である。
【０２５５】
ある実施形態において、使用は、治療用医薬の製造における、(a) 第１薬剤(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物)と、(b)第２薬剤の使用である。
【０２５６】
第１薬剤と第２薬剤は別々に、逐次的にまたは同時に投与することができる。
【０２５７】
ある実施形態において、第２薬剤はアミノレブリン酸(ALA)シンターゼの促進化合物である。
【０２５８】
本明細書に用いる「促進化合物」という用語は、ALAシンターゼの活性の速度またはレベルを上昇させる化合物を言う。上昇は約2倍〜10倍という低レベルの上昇、約10倍〜100倍という中レベルの上昇、または100倍を超える高レベルの上昇でありうる。
【０２５９】
ある実施形態において、第２薬剤は、バルビツール酸類、抗痙攣剤、非麻薬性鎮痛剤、および非ステロイド系抗炎症性化合物から選択される。
【０２６０】
ある実施形態において第２薬剤は、アリルイソプロピルアセトアミド、フェノバルビタール、デフェロキサミン、フェルバメート(Felbamate)、ラモトリジン(Lamotrigine)、ティアガビン(Tiagabine)、シクロホスファミド、N-メチルプロトポルフィリン、スクシニルアセトン、カルバマゼピン、エタノール、フェニトイン、アザプロパゾン、クロロキン、パラセタモール、グリセオフルビン、カドミウム、鉄、ピリドキシンから選択される。(これらの化合物がALA合成を誘導または活性化することは当技術分野では周知である)。
【０２６１】
ある実施形態において第２薬剤は、エトスクシミド(Ethosuximide)、ジアゼパム、ヒダントイン(Hydantoins)、メトスクシミド(Methsuximide)、パラメタジオン(Paramethadione)、フェノバルビトン(Phenobarbitone)、フェンスクシミド(Phensuximide)、フェニトイン、プリミドン(Primidone)、スクシンイミド、ブロミド、アスピリン、ジヒドロエルゴタミン-メシレート、酒石酸エルゴタミン、クロラムフェニコール、ダプソン(Dapsone)、エリスロマイシン、フルクロキサシリン(Flucloxacillin)、ピラジンアミド、スルホンアミド、アンピシリン、バンコマイシン、スルホニル尿素、グリピジドインスリン(GlipizideInsulin)、酢酸α-トコフェロール、アスコルビン酸、葉酸、フルクトース、グルコース、ヘムアルギネート(Haem Arginate)、アミドピリン、ジクローラルフェナゾン(Dichloralphenazone)、ジクロフェナクナトリウム(Diclofenac Na)、ジピロン(Dipyrone)、オキシフェンブタゾン(Oxyphenbutazone)、プロピフェナゾン(Propyphenazone)、アスピチン(Aspitin)、コデインPO4(Codeine PO4)、ジヒドロコデイン、カンタキサンチン、βカロテンから選択される。
【０２６２】
併用療法 - 光線力学療法
本明細書に記載の治療法はさらに患者に光線力学療法を施すことを含みうる。
【０２６３】
光線力学療法(photodynamic therapy: PDT)は、光と物質(光線感作物質)の相互作用に基づき細胞をより光感受性にする治療法である。光(光子)の吸収に続き、光線感作物質は光から分子酸素にエネルギーを伝達し、そのことにより活性酸素種(ROS)を生成させる。光線感作物質に対する生物学的応答は、光を浴びた組織の特定の領域のみで活性化される。
【０２６４】
PDTは種々の機構により細胞死を仲介し、かかる機構には次のものが含まれる：(i) PDTにより生成されるROSは腫瘍細胞を直接殺すことができる、(ii) PDTは腫瘍に関連した血管構造を傷つける、および(iii) PDTは腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化することができる(Dolmansら, 2003)。
【０２６５】
PDTは患者に投与された光線感作物質(例えば、膀胱癌の予防的処置に使用される光線感作物質フォトフリンまたは5-アミノレブリン酸(5-ALAまたはLevulan (DUSA Pharma))を利用することができる。細胞または組織内に存在する分子(例えば上述のALAなど)も光線感作物質として利用可能である。
【０２６６】
α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物は、SDHがダウンレギュレートされている細胞では選択的にスクシニルCoAのレベルを上昇させる。なぜならば、こうした細胞ではスクシニルCoAがTCAによりさらにプロセシングされることはないからである。従って、こうした細胞をALAシンターゼ活性促進化合物(およびα-ケトグルタレートレベルを上昇させる化合物)で処理すると、ALAおよびPpIXレベルが上昇し、そのことによりPDTに曝露された細胞においてアポトーシスがもたらされる。
【０２６７】
従って、何ら特定の理論に拘束されることを望まないが、変異したまたは低減したSDH活性を有する細胞をα-ケトグルタレートとALAシンターゼ促進化合物の組み合わせで処置すると、正常細胞と比較してポルフィリン化合物のレベルが上昇し、そのことによりSDH阻害細胞は光に感受性となる、と考えられる。
【０２６８】
このことから、本発明の一つの態様は、患者にさらに光線力学療法を施すことを含む、本明細書に記載の治療方法である。
【０２６９】
本発明の別の態様は、(i) (a)第１薬剤(例えばα-ケトグルタレート化合物、HIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物、PHDを活性化する化合物、HIF安定化を阻害または抑制する化合物、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物など)および(b)光線感作物質(例えばフォトフリン、5-ALA、ALAシンターゼ促進化合物、など)を同時に、別々にまたは逐次投与し、続いて(ii)光を照射することを含む治療方法(例えばPDT)である。
【０２７０】
従って本発明のある態様は、(i) (a)α-ケトグルタレート化合物またはHIFαヒドロキシラーゼを活性化する化合物またはα-ケトグルタレートのレベルを上昇させる化合物および(b)光線感作物質(例えばフォトフリン、5-ALA、ALAシンターゼ促進化合物、など)を同時に、別々にまたは逐次投与し、続いて(ii)光を照射することを含むPDT治療方法である。
【０２７１】
光照射は患者の身体に全体的にまたは局所的に施してもよく、これにはそれぞれ患者の身体全体を照射できるまたは局所を照射できる任意の器具を適当な波長と線量で使用する。
【０２７２】
本明細書に用いる「局所」という用語は患者の身体の一部または複数の部分のみが照射されることを意味する。局所照射により、処置する身体の一部または複数の部分においてROSを活性化することができる。
【０２７３】
既知の化合物やPDT法に優る利点は、治療しようとする細胞のSDH機能異常を当てにすることによって、SDH機能異常が引き起こす過剰量のスクシニルCoAのために、これらの細胞においてのみ光増感が生じることである。従って、α-ケトグルタレートおよび／またはALAシンターゼ誘導物質を全身投与したとしても、光増感は処置／照射されている腫瘍において局所的にのみ、顕著なレベルに増強される。
【０２７４】
他の用途
本明細書に記載の化合物は、細胞培養添加物として、HIFαヒドロキシラーゼを活性化するため、PHDを活性化するため、HIF安定化を阻害または抑制するため、α-ケトグルタレートのレベルを上昇させるため、細胞増殖を阻害するためなどに使用することができる。
【０２７５】
本明細書に記載の化合物はまた、in vitroアッセイの一部として使用可能であり、例えば候補宿主を対象の化合物で処置することが有効である可能性が高いか否かを判別するために使用可能である。
【０２７６】
本明細書に記載の化合物はまた、例えば他の活性化合物を同定するためのアッセイにおいて標準物質として使用することができる。
【０２７７】
キット
本発明のある態様は、(a) 本明細書に記載の活性化合物、または本明細書に記載の活性化合物を含む組成物、例えば好ましくは適当な容器内にかつ／または適当に包装されて提供されるもの、および(b)使用説明書、例えば前記活性化合物または組成物をどのように投与するかに関する取扱説明書、を含むキットに関する。
【０２７８】
取扱説明書には、活性成分が適当な治療薬となる症状のリストも含まれうる。
【０２７９】
ある実施形態において、キットはさらに第２薬剤(例えば本明細書に記載のもの)を含む。
【０２８０】
投与経路
活性化合物を含む医薬組成物または活性化合物は、あらゆる都合のよい投与経路で、全身／末梢または局所(すなわち望まれる作用部位)であれ、被験者に投与することができる。
【０２８１】
投与経路としては、限定するものではないが、次の経路が挙げられる：経口(例えば摂取により)、口腔、舌下、経皮(例えばパッチ、プラスターなどを介するものが含まれる)、経粘膜(例えばパッチ、プラスターなどを介するものが含まれる)、鼻腔内(例えば鼻腔用スプレーにより)、眼(例えば点眼剤により)、肺(例えば吸入療法または吹送療法により、例えばエアロゾルを介して、例えば口または鼻を通して)、直腸(例えば坐剤または浣腸剤により)、膣(例えばペッサリーにより)、非経口、例えば注射により(これには皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、くも膜下腔内、髄腔内、嚢内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下および胸骨内注射が含まれる)、デポーまたはリザーバの(例えば皮下または筋肉内の)埋め込みによるもの。
【０２８２】
被験者／患者
被験者／患者は、脊索動物、脊椎動物、哺乳動物、有胎盤哺乳動物、有袋類(例えばカンガルー、ウォンバット)、単孔類(例えばカモノハシ)、齧歯類(例えばモルモット、ハムスター、ラット、マウス)、ネズミ科動物(例えばマウス)、ウサギ目動物(例えばウサギ)、鳥類(例えばトリ)、イヌ科動物(例えばイヌ)、ネコ科動物(例えばネコ)、ウマ科動物(例えばウマ)、ブタ科動物(例えばブタ)、ヒツジ(例えばヒツジ)、ウシ亜科動物(例えばウシ)、霊長類、類人猿(例えばモンキーまたはサル)、モンキー(例えばマーモセット、ヒヒ)、サル(例えばゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル)またはヒトでありうる。
【０２８３】
さらに、被験者／患者はどのような発達段階のもの(例えば胎児)であってもよい。
【０２８４】
ある好ましい実施形態において、被験者／患者はヒトである。
【０２８５】
製剤化および投与
化合物は医薬組成物に製剤化することができ、これは例えば１以上の適当な担体、希釈剤または賦形剤と混合して、当技術分野で公知の技術を用いて行う。
【０２８６】
種々の送達系に応じて種々の組成物／製剤化要件がありうる。一例として、化合物は、ミニポンプを用いてまたは粘膜経路により(例えば吸入用の鼻腔スプレーもしくはエアロゾルまたは摂取用溶液として)または非経口的に投与するために製剤化することができ、ここで組成物は送達(例えば静脈内、筋肉内もしくは皮下経路による送達)用の注入可能な形態に製剤化される。あるいはまた、化合物を多数の経路から投与するように設計することもできる。
【０２８７】
投与(送達)経路としては、限定するものではないが、次の１以上が挙げられる：経口(例えば、錠剤、カプセル剤または摂取用溶液として)、局所、粘膜(例えば吸入用の鼻腔スプレーもしくはエアロゾルとして)、鼻腔、非経口(例えば注射可能形態により)、胃腸、髄腔内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼球内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、脳室内、大脳内、皮下、眼の(硝子体内もしくは眼房内を含む)、経皮、直腸、口腔、膣、硬膜外、舌下。
【０２８８】
化合物を胃腸粘膜から投与する場合、それは胃腸管を通過する間安定したままでなければならない、例えば前記化合物はタンパク質分解に耐性であり、酸性pHで安定であり、かつ胆汁の界面活性作用に耐性である必要がある。
【０２８９】
適当であれば、化合物は、吸入により、座剤もしくはペッサリーの形態で、ローション剤、溶液剤、クリーム剤、軟膏剤、またはダスティングパウダー剤の形態で局所的に、皮膚パッチの使用により、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤の形態で経口的に、または、カプセルもしくは卵状容器（ovule）に単独もしくは賦形剤との混合物として入れて、または香味化合物もしくは着色化合物を含有するエリキシル剤、溶液剤もしくは懸濁液剤の形態で投与するか、または、これらを非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、または皮下）注射することができる。非経口投与用には、化合物を無菌水溶液の形態で使用するのが最良であり、該溶液は他の物質（例えば、該溶液を血液と等張にするのに十分な塩または単糖類）を含有することができる。口腔または舌下投与用には、組成物を、通常の方法で製剤化することのできる錠剤またはトローチの形態で投与してもよい。
【０２９０】
医薬が錠剤の場合、錠剤は賦形剤(例えば微晶質セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムおよびグリシンなど)、崩壊剤(例えばデンプン、好ましくはコーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、グリコール酸デンプンナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、および特定の複合ケイ酸塩など)、ならびに顆粒化結合剤(例えばポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチンおよびアカシアなど)を含有してもよい。さらに、滑沢剤(例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルク)を追加してもよい。
【０２９１】
同様の種類の固体組成物はゼラチンカプセル中の充填剤として利用することも可能である。この点で好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液剤および／またはエリキシル剤については、化合物を、種々の甘味化合物もしくは香味化合物、着色剤もしくは色素、乳化／懸濁化化合物および希釈剤(例えば水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン)ならびにこれらの組み合わせと一緒にしてもよい。
【０２９２】
化合物を非経口投与する場合、かかる投与の例としては、静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下投与の１以上で成分を投与すること、および／または注入技術を使用することが挙げられる。
【０２９３】
非経口投与については、化合物を無菌水溶液の形態で使用するのが最良であり、該溶液は他の物質（例えば、該溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコース）を含有することができる。必要であれば水溶液を適当に緩衝化(好ましくは3〜9のpHに)すべきである。滅菌条件下での適当な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的医薬技術により容易に行うことができる。
【０２９４】
先に記載したように、化合物は鼻腔内にまたは吸入により投与することができ、都合よく乾燥粉末吸入剤またはエアロゾルスプレー提供物の形態で、加圧された容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器から、適当な噴射剤(例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば1,1,1,2-テトラフルオロエタン(HFA 134ATM)または1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン(HFA 227EATM)、二酸化炭素、または他の適当な気体)を利用して送達することができる。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを備え付けることにより測定することができる。加圧された容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器は、例えばエタノールと噴射剤の混合物を溶媒(さらにソルビタントリオレエートなどの滑沢剤を含みうる)として使用する、化合物の溶液または懸濁液を含有してもよい。吸入器または吹送器に用いるためのカプセルおよびカートリッジ(例えばゼラチン製)は、化合物と適当な粉末基剤(ラクトースまたはデンプンなど)の混合粉末を含有するように製剤化することができる。
【０２９５】
あるいはまた、化合物を坐剤もしくはペッサリーの形態で投与することもでき、またはゲル剤、ヒドロゲル剤、ローション剤、溶液剤、クリーム剤、軟膏剤もしくはダスティングパウダー剤の形態で局所適用することもできる。化合物を、例えば皮膚用パッチを用いて、皮膚塗布または経皮投与することもできる。また、化合物を肺もしくは直腸の経路から投与することもできる。化合物を眼の経路から投与することもできる。眼への使用については、化合物を等張性で、pH調整済みの、滅菌生理食塩水中のナノサイズ（micronized）懸濁液剤として、または好ましくは等張性で、pH調整済みの、滅菌生理食塩水中の溶液剤として、場合により保存剤(塩化ベンザルコニウムなど)と組み合わせて、製剤化することができる。あるいは、これらをワセリンのような軟膏剤中に製剤化してもよい。
【０２９６】
皮膚への局所適用については、化合物を適当な軟膏剤として製剤化することができ、この軟膏剤は例えば１種以上の次の物質を含む混合物中に懸濁または溶解した化合物を含有するものである：ミネラルオイル、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリエチレンポリプロピレン化合物、乳化ロウ、および水、。あるいは化合物を適当なローション剤またはクリーム剤として製剤化してもよく、これは例えば１種以上の次の物質の混合物中に懸濁または溶解されたものである：ミネラルオイル、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水。
【０２９７】
化合物は、例えば皮膚用パッチを用いて、末梢血を介して投与することもできる。
【０２９８】
用量
活性化合物や活性化合物を含む組成物の適当な用量は、個々の患者によって変動しうると当業者には理解されるであろう。最適用量の決定には、一般的に、治療効果のレベルとあらゆるリスクまたは有害な副作用とのバランスをとることが必要である。選択された用量レベルは種々の要因に依存するが、そうした要因としては、限定するものではないが、その特定の化合物の活性、投与経路、投与回数、化合物の排泄速度、治療の持続時間、併用する他の薬物、化合物および／または物質、症状の重さ、ならびに、患者の生物種、性別、年齢、体重、状態、一般的な健康状態、およびそれ以前の病歴が挙げられる。一般には用量は、実質的に有害な副作用を引き起こすことなく所望の効果を達成する作用部位での局所濃度となるように選択されるが、化合物の量および投与経路は、最終的には医師、獣医師または臨床医の裁量による。
【０２９９】
投与は、一回用量で、連続的に、または断続的に(例えば適当な間隔での分割用量で)、治療過程全体を通して行うことができる。最も効果的な投与手段および投与量を決定する方法は、当業者によく知られており、治療に用いる製剤、治療の目的、治療する標的細胞、および治療する被験者によって変動する。単回投与または複数回投与を行うことができ、このときの用量レベルおよびパターンは、治療に当たっている医師、獣医師または臨床医によって選択される。
【０３００】
一般に、活性化合物の適量範囲は約100μg〜約250 mg (より典型的には約100μg〜約25 mg)／被験者のキログラム体重／日である。活性化合物が塩、エステル、アミド、プロドラッグなどの場合、投与量は親化合物に基づいて計算され、そのため使用する実際の量は比例して増える。
【実施例】
【０３０１】
以下の実施例は本発明を例証する目的でのみ提供するものであり、本明細書に記載の本発明の範囲を制限することを意図したものではない。
【０３０２】
化学合成
合成１
2-(2-カルボキシ-エチル)-[1,3]ジチアン-2-カルボン酸エチル
【化９】
2008509209.tif 000011
【０３０３】
DMF中に溶解した1,3-ジチアンカルボン酸エチルと１当量の3-ブロモプロパンカルボン酸ナトリウムの溶液を、5℃に冷却した無水トルエン中の水素化ナトリウム(１当量)の十分に撹拌した懸濁液に少しづつ添加した。この混合物を氷浴で１時間撹拌し、その後室温で12時間撹拌した。トルエン層を20 mLずつの水で３回抽出し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、ついで濃縮した。粗生成物はα-ケトエステルへの脱硫または変換に適しているが、この生成物をクロマトグラフィーにより精製した。例えばElielら, 1978を参照されたい。
【０３０４】
合成２
2-オキソ-ペンタン二酸1-エチルエステル
【化１０】
2008509209.tif 000012
【０３０５】
2-(2-カルボキシ-エチル)-[1,3]ジチアン-2-カルボン酸エチルのアセトニトリル溶液を、80％アセトニトリル水溶液中に溶解したN-クロロスクシンイミド(4当量)と硝酸銀(4.5 当量)の十分に撹拌した溶液(25℃)に素早く添加した。塩化銀が直ちに多量の白色沈殿として分離し、液相は黄色くなった。この混合物を5〜10分撹拌し、１分間隔で連続的に飽和亜硫酸ナトリウム水溶液、飽和炭酸ナトリウム水溶液、および塩水で処理し、ヘキサン／ジクロロメタン1:1を添加し、ついで混合物を濾過した。濾過ケークをヘキサン／ジクロロメタン1:1で十分に洗浄した後、濾液の有機相を乾燥させ(MgSO4)、溶媒を除いた。例えばCoreyら, 1971を参照されたい。
【０３０６】
合成３
2-オキソ-ペンタン二酸
【化１１】
2008509209.tif 000013
【０３０７】
2-オキソ-ペンタン二酸1-エチルエステルをNaOH水溶液(3.5当量)およびエタノールに溶解させ、４時間加熱還流した。溶媒を減圧下で除き、残留物を水に取り上げ、濃塩酸で慎重にpH１に酸性化した。目的の酸をエーテルで抽出し、合わせた有機相を乾燥させた(MgSO4)。例えばSchwetlickら, 2001を参照のこと。
【０３０８】
合成４
2-オキソ-ペンタン二酸1-(3-トリフルオロメチル-フェニル)エステル
【化１２】
2008509209.tif 000014
【０３０９】
2-オキソ-ペンタン二酸を窒素下でTHFに溶解させた。この溶液に１当量のNaHを加え、その後１当量のクロロトリメチルシランを加えた。得られたα-ケト酸のトリメチルシリルエステルをその後１当量の3-トリフルオロメチル-ベンゼンジアゾニウム・テトラフルオロボレート(調製方法については、例えばStarkey, 1943を参照のこと)で滴下処理し、反応混合物を超音波浴に入れて2-オキソ-ペンタン二酸1-(3-トリフルオロメチル-フェニル)エステルを生成させた。例えばOlah, G.A.ら, 1991を参照されたい。
【０３１０】
合成５
2-オキソ-ペンタン二酸1-((1S,2R,5S)-2-イソプロピル-5-メチル-シクロヘキシル)エステル
【化１３】
2008509209.tif 000015
【０３１１】
2-オキソ-ペンタン二酸を窒素下でTHFに溶解させた。この溶液に１当量のNaHを加えた。得られたα-ケト酸のナトリウム塩にその後１当量の(1R,2R,4S)-2-ブロモ-1-イソプロピル-4-メチル-シクロヘキサンを100時間に渡り滴下処理した。例えばDomagala, 1980を参照されたい。
【０３１２】
合成６
2-オキソ-ペンタン二酸1-オクチルエステル
【化１４】
2008509209.tif 000016
【０３１３】
2-オキソ-ペンタン二酸を窒素下でTHFに溶解させた。この溶液に１当量のNaHを加えた。得られたα-ケト酸のナトリウム塩にその後１当量の1-オクチルブロミドを100時間に渡り滴下処理した。例えばDomagala, 1980を参照されたい。別の方法として、クロロギ酸オクチルを、ジクロロメタン(50 mL)中に溶解したα-ケトグルタル酸(10 mmol)とトリエチルアミン(1.0当量)の溶液に周囲温度で滴下した。得られた混合物を周囲温度で16時間撹拌し、その後ジクロロメタン(50 mL)で希釈し、0.5 N塩酸水溶液(50 mL)で洗浄し、乾燥させ(硫酸マグネシウム)、溶媒を減圧下で除いた。
【０３１４】
合成７
2-オキソペンタン二酸1-(3-トリフルオロメチル-ベンジル)エステル
【化１５】
2008509209.tif 000017
【０３１５】
2-オキソ-ペンタン二酸を窒素下でTHFに溶解させた。この溶液に１当量のNaHを加えた。得られたα-ケト酸のナトリウム塩をその後１当量のベンジルブロミドで滴下処理して、2-オキソペンタン二酸1-(3-トリフルオロメチル-ベンジル)エステルを生成させた。例えばNatsugariら, 1987を参照のこと。別の方法として、ベンジルブロミド(1.1当量)を、ジメチルホルムアミド(50 mL)中に溶解したα-ケトグルタル酸(10 mmol)とジシクロヘキシルアミン(1.2当量)の溶液に加え、該溶液を50℃で16時間加熱した。この混合物を減圧下で濃縮し、残留物をジクロロメタン(100 mL)に再懸濁し、0.5 N塩酸水溶液(50 mL)で洗浄した。有機層を乾燥させ(硫酸マグネシウム)、溶媒を減圧下で除いた。粗生成物を順相フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン／酢酸エチル)により精製した。
【０３１６】
合成８
2-オキソ-ペンタン二酸 1-ベンジルエステル
【化１６】
2008509209.tif 000018
【０３１７】
2-オキソ-ペンタン二酸を窒素下でTHFに溶解させた。この溶液に１当量のNaHを加えた。得られたα-ケト酸のナトリウム塩をその後１当量の臭化ベンジルで滴下処理して、2-オキソ-ペンタン二酸1-ベンジルエステルを生成させた。例えばNatsugariら, 1987を参照されたい。別の方法として、臭化ベンジル(1.1当量)を、ジメチルホルムアミド(50 mL)中に溶解したα-ケトグルタル酸(10 mmol)とジシクロヘキシルアミン(1.2当量)の溶液に加え、該溶液を50℃で16時間加熱した。この混合物を減圧下で濃縮し、残留物をジクロロメタン(100 mL)に再懸濁し、0.5 N塩酸水溶液(50 mL)で洗浄した。有機層を乾燥させ(硫酸マグネシウム)、溶媒を減圧下で除いた。粗生成物を順相フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン／酢酸エチル)により精製した。
【０３１８】
合成９
2-オキソ-ペンタン二酸1-ドデシルエステル
【化１７】
2008509209.tif 000019
【０３１９】
2-オキソ-ペンタン二酸を窒素下でジクロロメタンに溶解させた。この溶液に１当量のNaHを加えた。得られたα-ケト酸のナトリウム塩をその後１当量の1-ドデシル-ブロミドで100時間に渡り滴下処理した。例えばDomogala, 1980を参照のこと。
【０３２０】
合成10
2-オキソ-ペンタン二酸1-(3,5-ビス-トリフルオロメチル-ベンジル)エステル
【化１８】
2008509209.tif 000020
【０３２１】
2-オキソ-ペンタン二酸を窒素下でTHFに溶解させた。この溶液に１当量のNaHを加えた。得られたα-ケト酸のナトリウム塩をその後１当量の臭化3,5-ジ-(トリフルオロメチル)ベンジルで滴下処理して、2-オキソ-ペンタン二酸1-(3,5-ビス-トリフルオロメチル-ベンジル)エステルを生成させた。例えばNatsugariら, 1987を参照のこと。
【０３２２】
合成11
2-オキソ-ペンタン二酸1-ヘキサデシルエステル
【化１９】
2008509209.tif 000021
【０３２３】
2-オキソ-ペンタン二酸を窒素下でTHFに溶解させた。この溶液に１当量のNaHを加えた。得られたα-ケト酸のナトリウム塩をその後１当量の1-ヘキサデシルブロミドで100時間に渡り滴下処理した。例えばDomagala, 1980を参照のこと。
【０３２４】
合成12
2-オキソ-ペンタン二酸1-テトラデシルエステル
【化２０】
2008509209.tif 000022
【０３２５】
2-オキソ-ペンタン二酸を窒素下でTHFに溶解させた。この溶液に１当量のNaHを加えた。得られたα-ケト酸のナトリウム塩をその後１当量の1-テトラデシルブロミドで100時間に渡り滴下処理した。例えばDomagala, 1980を参照のこと。
【０３２６】
生物学的手法
プラスミド
SDHD siRNAヘアピンを、以前に記載されたように(Foxら, 2003)、pBABE-PuroΔLTRにU6プロモーターと一緒にクローニングした。テンプレートとしてのpEF6-hU6、およびSDHD DNAヘアピン配列(Di3＝センス5'-GGTCAGACCTGCTCATATCTCAGCA-3'、Di4＝センス5'-GGTGTGGAGTGCAGCACATACAC-3')を含有するプライマーを使用して、PCRに基づくストラテジーを採用した。scRNAiをpSuperRetro (OligoEngine)に、ヘアピン配列、センス5'-GATACGGTAGGGCGACAA-3'と共にクローニングした。スクランブルSDHD-標的化siRNA短鎖ヘアピン、ScおよびDi3もpSUPER-GFP-neoにクローニングした。
【０３２７】
pGL2/HRE-ルシフェラーゼは、タンデムでの3コピー数の24-merオリゴヌクレオチド(5’-tgtcacgtcctgcacgactctagt-3’)を、pGL2-basic (Promega)中の最小チミジンキナーゼプロモーターの前に挿入することにより作製した。このオリゴヌクレオチドは、HREを含むPGKプロモーターからの18塩基対を含有する。
【０３２８】
pRK5/HA-ODDDを作製するに当たっては、まずヒトHIF-1α ODDD (アミノ酸530-652)をインフレームで(読み枠を合わせて)、HA-タグおよびGal4 DNA結合ドメインを含有するベクターにクローニングした。次に全cDNAをpRK5ベクターにクローニングした。
【０３２９】
GFP-ODDD 融合タンパク質をコードするpEGFP/ODDDプラスミドは次のように作製した：PRK5/HA-ODDDをテンプレートとして使用しhHIF-1α ODDDのPCR断片を生成させ、ついでこれをpEGFP-C1 (Clontech)にインフレームで連結した。
【０３３０】
pRC-CMV/HA-pVHLは、GFP-ODD-発現クローンにおいてHA-pVHLを共発現させるために使用した。
【０３３１】
細胞培養
GFP-ODD発現クローンは、pEGFP/ODD、pRC-CMV/HA-pVHL、およびpBabe-PuroをHEK293細胞に共トランスフェクトすることにより作製した。ピューロマイシンで選択した後、96クローンをランダムに採取して、96-ウェルプレートで複製した（それぞれをCoCl2の存在下または不在下でインキュベートした）。GFP蛍光の基底レベルが低く、CoCl2で処理したときに顕著な蛍光が誘導されたクローンをさらに検証した。
【０３３２】
in vitro PHD活性
コムギ胚芽抽出物(Promega)を用いてHA-ODDDをin vitro翻訳(IVT)し、このIVT反応物の4μLアリコートを、50μLのHEK293またはHeLa細胞抽出物［「完全」プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)および100μM ALLNを添加した20 mM Tris (pH 7.4)、5 mM KCl、1.5 mM MgCl2、1 mM DTT］とインキュベートした。反応は15分間37℃で、5 mMアスコルビン酸および100μM FeCl2の存在下で、5 mM DFOまたは示した量のコハク酸または遊離α-ケトグルタル酸またはα-ケトグルタル酸エステルと共に行った。反応はLaemmliサンプルバッファーを添加して直ちに煮沸することにより終了させた。SDS-PAGEの後に、抗HA抗体を用いたウェスタンブロットによりサンプルを分析した。
【０３３３】
SDH活性(II型複合体、コハク酸-DCIP オキシドレダクターゼ)
細胞は、25 mM KHPO4 (pH 7.4)、20 mM コハク酸、50μMデシルユビキノン、5μM ロテノン、2μM アンチマイシンAおよび10 mM NaN3から成るアッセイバッファー中で0.1% v/v Triton X100により溶解した。室温で15分間インキュベートした後に、600 nmでの基底吸光度を記録し、50μM DCIP (ε＝21 mM-1 cm-1)を添加することにより反応を開始させた。吸光度の変化を、50μM 2-テノイルトリフルオロアセトン(TTFA)(反応特異性を確認するために使用されるII型複合体阻害剤)の添加前および添加後に２〜３分間モニターした。TTFA-感受性コハク酸-DCIPオキシドレダクターゼの比活性をnmol/分/mg細胞タンパク質として報告する。
【０３３４】
GCMSによるコハク酸定量
細胞抽出物を、1μg/mL (D4)-コハク酸を含有する90％メタノール、10％酢酸中に調製した。抽出物を窒素下に60℃で蒸発乾固させ、メタノール中の1％HClに60℃で10分間再溶解することによりメチル化した。抽出物を再度乾燥させ、ヘキサンに溶解し、1μLをAutomass Multi GCMSシステムに注入した。この測定機にZB-1カラム(30 m x 0.32 mm id x 1μm フィルム)を装着し、オーブンを次の様にプログラム化した：80℃ (5分)、次に10℃/分で170℃とした；ヘッド圧力は60 kPaとした。質量分析器をEIモードにて70 eVで運転し、選択イオンモニタリングを、119および91 amu((D4)-コハク酸のメチルエステル)ならびに115および87 amu(コハク酸のメチルエステル)におけるイオンについて行った。
【０３３５】
タンパク質分析
HIF-1αイムノブロットの場合は細胞をLaemmliサンプルバッファー中に抽出し、他の全ての分析の場合は細胞をTris溶解バッファー[「完全」プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)および100μM ALLNを添加した50 mM Tris (pH 8.0)、150 mM NaCl、0.5% NP40]中に抽出した。SDS-PAGEに続き、タンパク質をニトロセルロースにブロットし、次の抗体を用いて分析した：抗HIF-1α抗体(BD Biosciences)、抗HA抗体(Roche)、抗GFP抗体(BD Biosciences)または抗アクチン抗体(Sigma)。HA-pVHLの免疫沈降は、Tris溶解バッファー中で抗HA抗体(Roche)とプロテインGセファロースビーズ(Phramacia)を用いて行った。タンパク質は、ビーズをTBS中の1 mg/mL HAペプチドと共に37℃で15分間インキュベートすることにより溶離させた。溶離液を直ちに96ウェルプレート蛍光光度計(Molecular Devices)を用いた蛍光分析にかけて、GFPまたはGFP-ODDDレベルを測定した。
【０３３６】
far-western blot分析用のプローブとしてのHA-pVHLの調製は次のように行った：pRc-CMV/HA-pVHLをHEK293細胞にトランスフェクトし、30時間後、HA-pVHLタンパク質を細胞抽出液から抗HAマトリクス(Roche)上にメーカーの使用説明書に従って免疫精製した。HAペプチドでタンパク質を溶離させた後、溶離液を一晩TBSで透析し、その後HA-pVHLレベルをSDS-PAGEとその後のクーマシーブルー染色およびウェスタンブロット分析により評価した。
【０３３７】
far-western blot分析では、GFP-ODDD発現細胞由来のタンパク質抽出物をニトロセルロースメンブレンにブロットし、TBST中の5％脱脂粉乳で２時間ブロックした。TBSTで数回洗浄後、TBST/粉乳中のHA-pVHLタンパク質 (1μg/mL)をニトロセルロースメンブレンに加え、4℃で一晩インキュベートし、その後TBSTで数回洗浄して、抗HA抗体により検出した。
【０３３８】
α-ケトグルタレートの測定
HEK293細胞を示した条件下で生育させた。全ての作業は4℃で行った。細胞単層をPBSで洗浄し、RIPAバッファーを用いて溶解した。細胞をプレートから回収し、激しくボルテックス(渦巻き状に撹拌)し、ついで抽出物を4℃、15,000 x gで5分間遠心分離した。抽出物のアリコートをα-ケトグルタレートについて直ちに分析した。アッセイは以下からなる：100 mM KH2PO4 (pH 7.2)、10 mM NH4Cl、5 mM MgCl2、および0.15 mM NADH。37℃で抽出物と平衡化した後、５単位のグルタミン酸デヒドロゲナーゼを添加して反応を開始させた。吸光度の低下を340 nmでモニターした。α-ケトグルタレートの細胞内濃度は、NADH (ε＝6.22 mM-1cm-1)の吸光度低下から測定し、パック細胞容積(packed cell volume)はデュープリケートの未抽出細胞サンプルから測定した。
【０３３９】
スフェロイド(Spheroid)培養および処理
HCT116細胞を、10％ウシ胎仔血清を添加したDMEM中の0.5％低融点アガロースで培養した。10 cmディッシュに105/mLの細胞20 mLを播種し、２日毎に培地を変えながら１週間培養した。次に細胞を５つの10 cmディッシュから回収し、10％ウシ胎仔血清を添加した200 mLのDMEMの入った500 mLスピナーフラスコ(60 rpm)に播種し、平均直径が500μmとなるまで約２週間培養した。次に実験の当日に0.5 mLのスフェロイド懸濁物を24ウェルプレートの各ウェル(1 mLの0.5％低融点アガロースが入いっている)に播種した。これらのスフェロイドを、1 mM遊離(非誘導体化)α-ケトグルタル酸、1 mM オクチル-α-ケトグルタレート、または1 mM TFMB-α-ケトグルタレートいずれかにより37℃で24時間処理した。
【０３４０】
生物学的データ
PHD活性をin vitroで次第に増加する量のコハク酸の存在下に分析して、SDHの突然変異がコハク酸の蓄積をもたらし、次にこれがサイトゾル中のHIFαヒドロキシラーゼを生成物阻害により阻害することを実証した。
【０３４１】
in vitro-翻訳されたHA-タグ化ODDDを基質として使用し、細胞抽出物をPHD活性の供給源として使用した。HA-ODDDを細胞抽出物と共にα-ケトグルタレート、Fe2+、およびアスコルビン酸の存在下でインキュベートすると、HA-ODDDはヒドロキシル化されてSDS-PAGEでの移動が速くなる(Ivanら, 2001; Huang ら, 2002)。デフェロキサミン(DFO)はPHD活性を阻害する鉄キレート剤であり、それゆえ特定の細胞中でHIF-αレベルを安定化させるために低酸素症模倣化合物として使用することができる(Safranら, 2003)。DFOはin vitroでPHD活性を阻害し、SDS-PAGE上でHA-ODDD移動度を遅らせた。図1A、レーン６を参照されたい。コハク酸の量を増加させると、ヒドロキシル化されたHA-ODDDの生成量は減少した。図1A、レーン１〜５を参照されたい。IC50はこれらの反応条件下でコハク酸について0.5 mMであると計算された。
【０３４２】
高レベルのコハク酸が細胞中のHIF-1αレベルを上昇させるのに十分であるかを確認するために、細胞を膜透過性のコハク酸ジメチルエステル誘導体(DMS)とインキュベートし、HIF-1αレベルを分析した。DMSの取込み率、コハク酸への変換率、および代謝率は不明だが、48時間に渡り20 mM DMSとインキュベートした細胞は、正常酸素条件下でHIF-1αレベルの上昇を示した。図1Bを参照されたい。やはりPHD活性を阻害することが示されている低酸素症模倣化合物CoCl2(Safranら, 2003)を陽性対照として使用した。図1Bを参照のこと。
【０３４３】
SDH阻害が細胞内コハク酸レベルおよびPHD活性に及ぼす影響を調べるために、RNA干渉(RNAi)を使用してSDHを標的化した。SDHDサブユニットを標的化する低分子干渉性RNA (siRNA)(Di3またはDi4)をコードするベクターを構築し、該ベクターをヒト胚性腎細胞(HEK293)に一過性にトランスフェクトすることによりその機能を分析した。SDHD mRNAレベルをRT-PCRにより分析したところ、２種のSDHD siRNA構築物(Di3またはDi4)のいずれかでトランスフェクトした細胞では、スクランブルsiRNA (scRNAi)でトランスフェクトした細胞に比べて、SDHD mRNAレベルが著しく低いことが観察された。図2Aを参照されたい。
【０３４４】
siRNAが内在性SDH活性を阻害する効力を分析するために、コハク酸と2,6-ジクロロインドフェノール(DCIP)をそれぞれ電子供与体および電子受容体として使用し、SDH活性を分光光度法的に測定した(Foxら, 2003)。細胞をDi3またはDi4のいずれかでトランスフェクトしたところ、細胞集団全体のSDH活性はscRNAiトランスフェクト細胞と比べて約50％減少した。図2Bを参照されたい。GFPコード化プラスミドとの共トランスフェクションから、トランスフェクション効率は約50％と推定された(データ未記載)。このことは、トランスフェクト細胞中のSDH活性が分析時点で著しく減少していたことを示唆する。どのsiRNAでのトランスフェクションもクエン酸シンターゼ活性(無関係の核コード化TCA回路酵素)に影響を及ぼさなかった(データ未記載)。SDH阻害がHIF-1αレベルに及ぼす影響をウェスタンブロットにより分析した。Di3-およびDi4-トランスフェクト細胞では対照トランスフェクト細胞に比べて低酸素条件下での明確なHIF-1αタンパク質の誘導が観察された。図2Cを参照されたい。さらに、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、HIF応答エレメント(HRE)を有する最小プロモーターの下流に含有するベクターと共トランスフェクトしてHIF活性を分析したところ、SDH阻害細胞集団ではHIF活性が３倍誘導されることが観察された。図2Dを参照されたい。
【０３４５】
観察されたSDH阻害がコハク酸の蓄積をもたらすかどうかを確認するために、ガスクロマトグラフィー質量分析(GCMS)を使用して、siRNAトランスフェクト後の細胞のコハク酸レベルを測定した。細胞抽出物中のコハク酸の量は、溶解溶液中の基準として用いた重水素化(D4)-コハク酸の既知量と比較することにより計算した。図3Aを参照されたい。SDHD標的化siRNAのいずれかで細胞をトランスフェクトしたところ、コハク酸が約2.5倍増加することが観察された。図3Aおよび3Bを参照のこと。約50％のトランスフェクション効率に基づいて、トランスフェクト細胞中のコハク酸レベルは過小評価されている。
【０３４６】
要約すると、これらの結果は、SDH阻害と、その結果としてのコハク酸の蓄積およびそれに伴うHIF-1αタンパク質レベルの上昇との間の直接的なつながりを提供する。
【０３４７】
次に、SDH阻害の後のコハク酸レベルの上昇が細胞内のPHD活性を減少させるか否かを確認した。GFP-ODDD融合タンパク質を使用したが、その分解はpVHL過剰発現により促進され(図4A (iii)および(iv)を参照)、従って、GFPとは対照的に、分解についてODDDヒドロキシル化に依存する(図4A(i)および(ii)を参照)。細胞をGFP-ODDD、HA-タグ化pVHLおよびsiRNA構築物のいずれかと共トランスフェクトしたところ、Di3-およびDi4-トランスフェクト細胞ではscRNAi-トランスフェクト細胞と比較してGFPがより高レベルで観察された。図4の(iv)、(v)、および(vi)を参照されたい。
【０３４８】
GFP-ODDDレベルの差異を定量するために、細胞を溶解し、抽出物中のGFP-ODDDの量を抗GFP抗体を用いたウェスタンブロットにより測定した。図4B上部パネルを参照されたい。各トランスフェクションでHA-pVHLは等しく発現されていたことから、GFP-ODDDレベルの差異をトランスフェクト細胞中のpVHLレベルの差異に帰することはできない。図4B下部パネルを参照のこと。従って、SDH阻害細胞では、HIF-1α ODDDがあまり効率よくヒドロキシル化されず、そのためpVHLとGFP-ODDDとの結合が減少する可能性が高い。
【０３４９】
この可能性を調べるために、細胞をHA-pVHL、scRNAiまたはDi3のいずれか、およびGFP-ODDDまたはGFP(後者は陰性対照として用いた)でトランスフェクトした。抗HA抗体を用いた免疫沈降の前または後の抽出物のGFP蛍光を分析し、全GFPおよびVHL結合GFPの両方を測定した。ストリンジェントな洗浄の後、免疫沈降したタンパク質をHAペプチドで溶離させ、ついでGFP蛍光を分析し(VHL結合GFP)、免疫沈降前の抽出物のGFP蛍光(全GFP)と比較した。結果を全GFPに対するVHL結合GFPの％として図4Cに示す。
【０３５０】
GFP-トランスフェクト細胞はGFP-ODDD-トランスフェクト細胞よりも相当強い全蛍光を示すものの(図4A(ii)および(iv)を参照)、VHL関連GFP蛍光はほとんど検出されず、GFP-ODDDトランスフェクト細胞ではpVHL関連GFP蛍光はODDD依存性であることが実証された。Di3-トランスフェクト細胞では、全GFP-ODDDはscRNAi-トランスフェクト細胞のそれよりも高かったものの(図4A(iv)および(v)を参照)、pVHL関連蛍光レベルは著しく低かった(図4Cを参照)。pVHLのHIF-1α ODDDへの結合はPHD活性に依存することから(Kaelinら, 2002; Safranら, 2003)、これらの結果は、細胞中のSDH活性を阻害することが結果的にPHD活性を減少させることを示唆する。
【０３５１】
さらに、細胞をGFP-ODDDと、scRNAi、Di3またはDi4のいずれかとでトランスフェクトした。GFP-ODDDのヒドロキシル化状態は、精製HA-pVHLタンパク質と、こうした細胞で発現されたGFP-ODDDとの結合をfar-western blotで調べることにより確認した。サンプルをGFP-ODDDレベルについて標準化し(図4D、上部パネル参照)、ニトロセルロースメンブレンを精製HA-pVHLタンパク質で釣り上げた。GFP-ODDD／HA-pVHL複合体は抗HA抗体を用いて検出した。図4D、下部パネルを参照のこと。scRNAiトランスフェクト細胞から抽出されたGFP-ODDDとのHA-pVHL結合が観察された(図4D、レーン1〜3参照)が、しかし、Di3およびDi4トランスフェクト細胞では、同量のGFP-ODDDとのHA-pVHL結合の顕著な減少が明らかにされた(図4D、レーン4〜9を参照されたい)。これらの結果はSDH阻害細胞ではPHD活性が減少していることを示唆する。
【０３５２】
こうした結果は、PHD活性を調節し、その結果としてHIF-1αレベルを調節するこれまで解明されていなかった機構の明確な証拠、具体的にはミトコンドリア機能障害を腫瘍形成と結びつける直接的なシグナル伝達経路の明らかな証拠、を提供する。こうした結果はコハク酸が、ミトコンドリアとサイトゾルの間の細胞内メッセンジャーとして機能しうること、ならびに、サイトゾル酵素に対して、結果として核内事象(すなわち遺伝子発現)に対して大きな影響を及ぼすことを示す(図５参照)。コハク酸は、ミトコンドリア内ではSDHの基質となり、サイトゾルではPHD活性の産物となる（そこではα-ケトグルタレートがコハク酸に変換される）。かくして、SDHの突然変異と、高度に血管化された腫瘍（VHL突然変異の不在下でHIF-1α誘導の結果として発生する）との間に機構的関連が示された。
【０３５３】
こうした結果に基づき、細胞内のα-ケトグルタレートレベルを上昇させることは、PHDの活性を促進し、また、PHD活性の阻害ゆえにHIF-1αが安定化されかつ活性化されている細胞内のHIF-1αレベルを低下させるのに役立つ、と仮定された。
【０３５４】
PHD活性に対するα-ケトグルタレートの影響は、in vitroヒドロキシル化アッセイを用いて調べた。このアッセイでは、ヒドロキシル化型と非ヒドロキシル化型を、ゲルシフト移動アッセイを用いて分離した。PHD活性は、基質としてin vitro翻訳されたHAタグ化ODDを、PHDの供給源としてHeLa細胞抽出物を使用して測定した。HA-ODDを、Fe2+およびアスコルビン酸の存在下、コハク酸の不在下で細胞抽出物とインキュベートしたところ、低濃度のα-ケトグルタレートでさえもHA-ODDの最高に近いヒドロキシル化をもたらした。これはSDS-PAGE上でのその移動がより速いことから明らかである(図6A、レーン1〜3を参照されたい)。コハク酸濃度を1 mMで一定に保ったところ、PHD活性の阻害は、より遅く移動する非ヒドロキシル化型のHA-ODDの出現から明らかとなった(図6A、レーン4を参照されたい)。0.1〜1 mMの範囲で次第に増加させた量のα-ケトグルタレートの添加は、PHD活性の濃度依存的刺激をもたらし、より速く移動するヒドロキシル型HA-ODDの生成を次第に増加させた(図6A、レーン4〜6を参照のこと)。これらの結果は、コハク酸がPHDを競合的に阻害すること、およびα-ケトグルタレートがin vitroでこのPHD阻害を逆転させることができることを実証する。
【０３５５】
この仮説を検証するために、数種の膜透過性α-ケトグルタレート類(すなわちエステル)を合成し、PHD活性に対するそれらの作用を分析した。つまり、TCA回路酵素に欠陥(例えばSDH活性の低減)のある細胞内、または高レベルのHIF-1αを誘導することが知られている低酸素条件下の細胞内のHIF-1αレベルに対するそれらの作用を分析した。
【０３５６】
遊離のα-ケトグルタル酸は親水性であり、形質膜を効率的に横断することができず、その結果十分に高い細胞内レベルにまで達することができない。様々な疎水性インデックスを有するα-ケトグルタル酸の膜透過性モノエステル誘導体を設計して合成した。一旦こうした誘導体が細胞内に進入すると、該エステルはサイトゾル性エステラーゼにより加水分解され、サイトゾル中のα-ケトグルタレート濃度が上昇する。サイトゾルでは、遊離の酸は大部分がα-ケトグルタレートと呼ばれるアニオンとして存在する。十分な形質膜透過性と平衡のもとでは、[α-ケトグルタル酸エステル]in は [α-ケトグルタル酸エステル]outと等しくなるはずである。サイトゾル性エステラーゼによるα-ケトグルタル酸エステルのα-ケトグルタル酸への変換は、α-ケトグルタレートを細胞内に捕捉し、かつ、濃度勾配を発生させてより多くのα-ケトグルタル酸エステルを培地からサイトゾルへと駆動する。細胞内でこのように形成され代謝されたα-ケトグルタレートは、外因性α-ケトグルタル酸エステルにより迅速に置き換えられるであろう。
【０３５７】
α-ケトグルタル酸エステルの細胞内α-ケトグルタレートレベルを上昇させる能力を調べるために、HEK293細胞を1mMの遊離α-ケトグルタル酸、オクチル-α-ケトグルタレート、またはトリフルオロメチルベンジル(TFMB)-α-ケトグルタレートのいずれかと5時間インキュベートした。細胞抽出物を調製し、直ちにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)を用いる分光光度アッセイを用いて細胞内α-ケトグルタレートレベルを分析した。高レベルのNH4+ およびNADHを用いてGDH反応をグルタメート形成(還元的アミノ化)の方向にシフトさせたが、この反応ではα-ケトグルタル酸濃度は酸化されるNADH量に対して化学量論的である。抽出時に細胞内に残留する非ヒドロキシル化α-ケトグルタル酸エステルは、遊離酸の測定に寄与しない。
【０３５８】
抽出に先立って、細胞をオクチル-α-ケトグルタレートまたはTFMB-α-ケトグルタレートで5時間処理したところ、細胞内のα-ケトグルタレートは約100μMの基底(内在性)レベルから350〜400μMに上昇した(図6B参照)。しかしながら、遊離α-ケトグルタル酸で処理した細胞は、基底レベルを超える細胞内α-ケトグルタレートレベルの上昇を示さなかった(図6B参照)。これらの結果は外部から添加されたオクチル-およびTFMB-α-ケトグルタル酸エステルの取り込みと加水分解が細胞内α-ケトグルタレートの顕著な上昇をもたらすことを示す。
【０３５９】
α-ケトグルタレート類が細胞内でPHD活性に及ぼす影響を分析するために、GFP-ODD融合タンパク質とpVHLの両方を発現する２種の細胞系(図7A左を参照のこと)を作製した。これらの細胞中ではGFPレベルはPHD活性により厳密に調節され、このPHD活性はpVHL仲介プロテアソーム分解のためにGFP-ODD融合タンパク質を標的とする。細胞をCoCl2(PHD活性を阻害する低酸素症模倣化合物)で処理したところ、ウェスタンブロット分析によりGFP-ODDレベルの上昇が観察された(図7A右を参照されたい)。ゆえに、これらの細胞中のGFP蛍光レベルはPHDの活性をレポートする。上昇したレベルの細胞内α-ケトグルタレートが、コハク酸仲介性PHD阻害を打ち消すことができるか否かを確認するために、細胞をまずコハク酸ジメチル(DMS)で処理した。DMS処理から48時間後、GFP蛍光の上昇が観察された。DMSによる最大GFP-ODD誘導を達成するために細胞を10％酸素で維持したことに留意することは重要である。このレベルの酸素はGFP-ODDの基底レベルに影響を及ぼさない。DMS処理細胞への添加から12時間以内に、オクチル-α-ケトグルタレートまたはTFMB-α-ケトグルタレートはGFP蛍光を減少させたが、このことはPHD活性の刺激を実証する。こうした処理に対応するウェスタンブロット(図7B参照)は、GFP-ODDレベルが、細胞をDMSで処理すると上昇し、α-ケトグルタル酸エステルを添加すると基底レベルにまで降下することを示した。
【０３６０】
次に、α-ケトグルタレートがHEK293細胞（DMSによりHIF1αが誘導されている）中でHIF1αを不安定化させる能力を検討した。細胞をDMSと24時間インキュベートし、その後オクチル-α-ケトグルタレートまたはTFMB-α-ケトグルタレートのいずれかを添加して3時間インキュベートし、続いて細胞を溶解してHIF1αレベルを分析した。TFMBエステルによる処理は、実際にHIF1αタンパク質のレベルを大幅に減少させ、さらにオクチルエステルはHIF1αのDMS誘導を完全に逆転させた(図8Aを参照されたい)。
【０３６１】
上記実験において、遊離α-ケトグルタル酸およびα-ケトグルタル酸エステルで処理した細胞は機能性TCA回路を有することに留意することが重要である。本発明者らは、TCA回路中間体の代謝が損なわれた機能障害性TCA回路を有する細胞中には、大量のα-ケトグルタレートが蓄積すると仮定した。この仮説を検証するために、細胞をDi3 shRNA(SDHDサブユニットを標的とし、細胞内でSDH活性を効率的に抑制することが知られている)で一過的に形質転換した。スクランブルshRNA (Sc)を陰性対照として使用した。トランスフェクションから48時間後、細胞を未処理のまま置くか、または1 mM オクチル-α-ケトグルタレートで5時間処理し、その後上述の様に細胞内α-ケトグルタレートレベルを分析した。いずれのshRNA構築物も未処理細胞のα-ケトグルタレートの基底レベルには影響を及ぼさなかった。しかしながら、オクチル-α-ケトグルタレートで処理したSDH欠損細胞は、スクランブル対照でトランスフェクトした細胞に観察されたものより２倍高いα-ケトグルタレートレベルの上昇を示した(図8Bを参照されたい)。
【０３６２】
SDH阻害細胞中でα-ケトグルタレート濃度を上昇させることがHIF1α誘導をうち消すか否かを確認するために、細胞をDi3 shRNAでトランスフェクトして、α-ケトグルタル酸エステルで処理した。Di3トランスフェクションに伴って観察されたHIF1α誘導は、オクチル-α-ケトグルタレートまたはTFMB-α-ケトグルタレートのいずれかによる24時間処理によって逆転された(図8Cを参照されたい)。このことから、PHD阻害は、SDH機能異常と、その結果としてのコハク酸増加により引き起こされるときは、過剰のα-ケトグルタレートにより打ち消すことができることが実証された。
【０３６３】
さらに、酸化的リン酸化の機能不全を伴う細胞を維持することができる(過剰量のピルビン酸およびウリジンを含む)培地を用いて、コハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)阻害剤-(TTFA)の存在下または不在下で細胞を連続的に生育させた。示したところでは、細胞を、ビヒクル対照(DMSO)、遊離α-ケトグルタル酸(αKG)対照、またはTFMB-α-ケトグルタレート(T-αKG)で処理した。機能異常SDH活性を有する細胞中での細胞内α-ケトグルタレート上昇をもたらす処理(T-αKG)のみが有意な細胞死へとつながる(図9を参照されたい)。
【０３６４】
これらの研究は、ミトコンドリアからサイトゾルへのシグナル伝達機構（該機構によりTCA回路の欠陥が腫瘍形成を促進する）を裏付けている。こうした結果は、過剰量のα-ケトグルタレート(PHDの基質)がPHD不活性化を乗りきることを実証している。本来、コハク酸によるPHD阻害は競合的である。従って、細胞内のα-ケトグルタレートとコハク酸の(絶対濃度ではなく)比がPHD活性およびHIF1α安定性に大きく影響することになる。コハク酸のPHD阻害効果をうち消すために、細胞透過性α-ケトグルタル酸エステルを設計した。これらは、サイトゾル内で加水分解されると、PHD活性を助け、そのことによりSDH欠損細胞中のHIF1αレベルを低下させる。本発明者らは、α-ケトグルタレートがSDH欠損細胞で優先的に蓄積されることを示したが、これはおそらくTCA回路代謝が損なわれているからであろう。このことは、易透過性薬物で処理したとき、標的細胞中のα-ケトグルタレート濃度がコハク酸の効果を完全にうち消すことのできるレベルにまで上昇することを確実にする。本発明者らの研究は、上手く設計されたα-ケトグルタル酸エステルが、SDHの機能的ダウンレギュレーションまたはSDH突然変異を伴う腫瘍の治療において治療薬としての可能性を有し、この治療において該エステルは正常な低レベルのHIF1αを回復することができる、ということを示唆する。
【０３６５】
この仮説を低酸素条件下の細胞において検証するために、膜透過性α-ケトグルタル酸エステルが低酸素細胞のHIF-1αレベルに及ぼす影響も分析した。
【０３６６】
２種の化合物(α-ケトグルタレートベンジルエステル、α-ケトグルタレートトリフルオロメチルベンジルエステル)を用いた初期の分析では、低酸素(3％酸素)下の細胞において正常HIF-1αレベルの部分的または完全な回復がもたらされた(図10参照)。細胞を、低酸素条件(0.5％酸素)下に遊離α-ケトグルタル酸またはオクチル-αKGのいずれかの存在下でも生育させた。細胞内α-ケトグルタレートレベルの上昇をもたらす条件(オクチル-αKGによる処理)のみに有意な細胞死が認められた。
【０３６７】
上皮細胞を半固形培地(マトリゲル)上で生育させ、それらがプレートに付着するのを防止した。こうした条件下では、細胞は球体を形成し、直径数ミリメートルまで大きくなることもある。生育中にこうした球体の中心には壊死ゾーンが現れ、これはほとんどの固形腫瘍と非常によく似ている。これは酸素と養分の拡散が制限されるためである。細胞をこうした条件下で数日間生育させ、その後遊離α-ケトグルタル酸またはTFMB-αKGエステルもしくはオクチル-αKGエステルのいずれかで処理した。細胞内α-ケトグルタレートレベルの上昇をもたらす処理(TFMB-αKGまたはオクチル-αKG)のみが、細胞の三次元的に増殖し続ける能力を喪失させた。
【０３６８】
HIFαはさておき、コハク酸の腫瘍形成作用に寄与することのできる、PHDの他の基質も存在する可能性がある。その上、PHDは細胞内で唯一のα-ケトグルタレート依存性ヒドロキシラーゼではない。従って、SDH欠損腫瘍におけるコハク酸蓄積は、腫瘍発生に対して広範囲にわたる影響を有し、ミトコンドリア機能障害と腫瘍形成を結びつける多様な生化学的結果をもたらす可能性がある。どのような他の酵素または基質がコハク酸により調節されるにせよ、細胞内α-ケトグルタレートレベルを上昇させることはこの効果を逆転させ、腫瘍維持を阻止すると思われる。
【０３６９】
ここまでの記載は、本発明の原理、好ましい実施形態、および操作様式を説明した。しかしながら本発明は、記載した具体的実施形態に限定されると解釈されてはならない。それよりはむしろ、上述の実施形態は制限的ではなく例証的であると見なすべきであり、また、当業者ならば、本発明の範囲を逸脱することなく、こうした実施形態を変更することができると理解するべきである。
【０３７０】
本発明は特許請求の範囲に包含される実施形態に制限されるものではなく、特許請求の範囲は多くの好ましい実施形態群の一部に関するものでしかなく、また、特許請求の範囲はこの時点では主に初期サーチ目的のために添付されたものである。
【０３７１】
参考文献
本発明および本発明の関する技術分野をより十分に説明し開示するために、上にいくつかの特許および刊行物を引用した。こうした文献の完全な引用を下に提供する。これらの各文献は、それぞれの文献があたかも具体的にそして個別に参照により組み入れられるのと同様に、参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする。
【０３７２】
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【図面の簡単な説明】
【０３７３】
【図１】(A)  Fe2+、アスコルビン酸、およびα-ケトグルタレートの存在下で、in vitro翻訳されたHA-ODDD(HA-D)と混合し、0、0.1、0.5、1.0、および5.0 mMコハク酸ジメチルエステル(DMS)(レーン1〜5)、ならびにデフェロキサミン(DFO)(レーン6)で処理した、細胞抽出物のSDS-PAGEゲルの写真。HA-DおよびHA-D-OHを示す。(B)  CoCl2で処理した(左レーン)、未処理(第2、第3、および第4レーン)、ならびにコハク酸ジメチルエステル(DMS)で正常酸素条件下に48時間処理した、細胞抽出物のウェスタンブロットゲルの写真。HIF-1αおよびアクチンを示す。簡潔に説明すると、コハク酸はin vitroでPHD活性を阻害し、細胞内のHIF-1αレベルを誘導する。細胞抽出物を、Fe2+、アスコルビン酸、およびα-ケトグルタレートの存在下でin vitro翻訳されたHA-ODDD (HA-D)と混合した。示した場合は、コハク酸を反応に添加した。鉄キレート剤であるデフェロキサミン(DFO)を添加してPHD活性を阻害した。ヒドロキシル化ポリペプチド(HA-D-OH)はSDS-PAGEでより速く移動する。HIF-1αおよびアクチンのレベルは、未処理細胞由来、またはコハク酸ジメチルエステル(DMS)もしくはCoCl2で正常酸素条件下に48時間処理した細胞由来の抽出物のウェスタンブロットにより評価した。
【図２】(A)  スクランブルsiRNA (scRNAi)、SDHD サブユニットを標的としたsiRNA(Di3 または Di4)でトランスフェクトした細胞の抽出物(三重反復)のRT-PCRゲルの写真。SDHD およびアクチンが示されている。(B)  (A)のようにトランスフェクトした細胞のコハク酸-DCIPオキシドレダクターゼ(SDH)活性(nmol/分/mg)を示す棒グラフ。(C)  (A)のようにトランスフェクトした細胞の細胞抽出物のウェスタンブロットゲルの写真。HIF-1αおよびアクチンが示されている。(D)  (A)のようにトランスフェクトした細胞のSDH阻害後のHIF転写活性(HIF活性のレポーターとしてpGL2/HRE-ルシフェラーゼを使用する二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系(Promega)により測定し、HRE-ルシフェラーゼ強度として記録した)(光単位x 1000)を示す棒グラフ。簡潔に説明すると、SDH活性の阻害はHIF-1αレベルおよびHIF活性を上昇させる。細胞を、スクランブルsiRNA (scRNAi)またはSDHDサブユニットを標的とするsiRNA(Di3またはDi4)のいずれかでトランスフェクトした(三重反復)。トランスフェクト後、SDHDおよびアクチンのmRNAレベルをRT-PCRにより定量した。パネルAのようにトランスフェクトした細胞のコハク酸-DCIPオキシドレダクターゼ活性を分析して、SDH活性の阻害を確認した。HIF-1αレベルは、scRNAi、Di3またはDi4でのトランスフェクト後のウェスタンブロット分析により検出した。ローディング対照としてはアクチンを使用した。SDH阻害後のHIF転写活性は、pGL2/HRE-ルシフェラーゼをHIF活性のレポーターとして使用する二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系(Promega)により評価した。
【図３】(A)  scRNAiまたはDi3でトランスフェクトした細胞由来の抽出物中の選択イオン化断片のGCMSプロフィール(相対存在量(％)vs.保持時間(分)vs.質量対電荷比 (amu))、および(B)  スクランブルsiRNA (scRNAi)、SDHD サブユニット標的化siRNA(Di3またはDi4)でトランスフェクトした細胞について、GCMSを用いて測定したコハク酸レベル(pmol/106 細胞)を示す棒グラフ。簡潔に説明すると、SDH阻害はコハク酸レベルの上昇をもたらす。scRNAiまたはDi3のどちらかでトランスフェクトした細胞由来の抽出物中の選択イオン化断片のGCMSプロフィールを記録した。基準として用いた重水素化(D4)-コハク酸は8.05分の保持時間での119 amuのその主要イオン成分により同定した。コハク酸は8.15分の保持時間での115 amuのその主要イオン成分により同定した。Di3トランスフェクト細胞ではscRNAiトランスフェクト細胞と比較してコハク酸レベルの上昇が見られた。パネルAに記載のように、細胞を、示したsiRNA構築物でトランスフェクトし、GCMSにより分析した。コハク酸レベルは、各トランスフェクションについて106細胞当たりのピコモルとして計算し、それぞれ三重反復して行った２つの独立した実験からの結果をまとめた。
【図４】(A)  以下のの各細胞のGFP蛍光を示す写真：(i)  HA-pVHLを伴わず、scRNAiを伴う、GFPをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞、(ii)  HA-pVHLを伴い、scRNAiを伴う、GFPをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞、(iii)  HA-pVHLを伴わず、scRNAiを伴う、GFP-ODDDをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞、(iv)  HA-pVHLを伴い、scRNAiを伴う、GFP-ODDDをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞、(v)  HA-pVHLを伴い、Di3を伴う、GFP-ODDDをコードプラスミドでトランスフェクトした細胞、(vi)  HA-pVHLを伴い、Di4を伴う、GFP-ODDDをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞。(B)  (A)の(iv)、(v)、および(vi)の細胞の抽出物(三重反復)のゲルの写真、(C)  (A)の(i)、(iii)、および(v)の細胞の抽出物のGFP蛍光を示す棒グラフ、(D)   GFP-ODDD、およびscRNA、Di3、またはDi4 をコードするプラスミド(ただしHA-pVHLを伴わない)でトランスフェクトした細胞のfar-western blotゲルの写真。GFP-ODDD、GFP-ODDD/HA-pVHL、およびHA-pVHLが示されている。簡潔に説明すると、SDHの阻害はPHD活性を減少させる。細胞は、GFP (iおよびii)またはGFP-ODDD (iii、iv、v、vi)のいずれかをコードし、HA-pVHLを伴い(ii、iv、v、vi)または伴わず(i、iii)、かつ次のsiRNA構築物の１つ: scRNAi (i、ii、iii、iv)、Di3 (v)またはDi4 (vi)を伴う、プラスミドでトランスフェクトした。GFP蛍光は顕微鏡により検出した。パネルA、iv、v、viのようにトランスフェクトした細胞の、GFP-ODDDおよびHA-pVHLタンパク質レベルを測定した(三重反復)。細胞は、GFPまたはGFP-ODDDをHA-pVHLとともにコードするプラスミドおよび示されたsiRNAでトランスフェクトした。抗HA抗体を用いた免疫沈降の前または後の細胞抽出物のGFP蛍光を分析した。結果をHA-pVHLに結合したGFP蛍光のパーセントとして示すが、これらは３つの独立したトランスフェクションの平均および標準偏差である。ODDDヒドロキシル化の直接検出をfar-western blot分析を用いて行った。細胞をGFP-ODDDをコードする(ただしHA-pVHLを伴わない)プラスミドおよび示したsiRNAでトランスフェクトした(三重反復)。タンパク質抽出物をニトロセルロースメンブレン上へとブロットし、免疫精製HA-pVHLとブロットされたGFP-ODDDタンパク質との結合を抗HA抗体を用いて検出した。10 ngの免疫精製HA-pVHLタンパク質をレーン10にロードした。
【図５】ミトコンドリアからサイトゾルへのシグナル伝達経路におけるコハク酸の役割をまとめた模式的モデル。簡潔に説明すると、SDH阻害によりミトコンドリアに蓄積したコハク酸はサイトゾルに輸送される。増加したサイトゾルのコハク酸はPHDを阻害し、そのことによりHIFαヒドロキシル化を阻害する。その結果、HIFαとのpVHL結合が減少し、上昇したHIF活性が血管新生、転移および解糖を促進する遺伝子の発現を誘導し、より活動的な腫瘍をもたらす。
【図６】(A)  in vitro翻訳されたODDと混合し、0、0、0、1.0、1.0、および1.0 mMのコハク酸 (Succ) (レーン1〜6)、ならびに、0.01、0.1、1.0、0.01、0.1 および1.0 mMの遊離α-ケトグルタル酸(α-KG)で処理した、細胞抽出物のSDS-PAGEゲルの写真。ODDとOH-ODDが示されている。(B)  オクチル-α-ケトグルタレート(オクチル-αKG)、TFMB-α-ケトグルタレート(TFMB α-KG)、遊離α-ケトグルタル酸(αKG)で処理した細胞、または未処理のままの細胞(対照)の細胞内α-ケトグルタレートレベルを示す棒グラフ。簡潔に説明すると、コハク酸により媒介されるPHD阻害は、in vitroでα-ケトグルタレートレベルを上昇させることにより打ち消すことができる。ODDドメインのヒドロキシル化反応を、表示した量のコハク酸およびα-ケトグルタレートの存在下でin vitroで行った。ODD のヒドロキシル化(OH-ODD)はSDS-PAGE上でより速く移動するバンドをもたらした。細胞を未処理のまま置くか、または表示した1 mMのα-ケトグルタル酸エステルもしくは遊離α-ケトグルタル酸で5時間処理した。細胞内α-ケトグルタレートレベルはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ反応を用いて分析した。
【図７】(A)  対照(Co)細胞またはGFP-ODD融合タンパク質およびHA-タグ化pVHLを共発現するクローン(C2およびC3)由来の抽出物中の、GFP-ODD融合タンパク質、GFP、HA-pVHLまたはアクチン(ローディング対照)のレベルを示すSDS-PAGEゲルの写真。細胞は未処理のまま(U)とするか、またはCoCl2 (CC)で処理した。(B)  未処理のままとする(レーン3〜4)か、またはCoCl2(レーン1〜2)もしくはコハク酸ジメチル(DMS)(レーン5〜10)で48時間処理したクローン3細胞中のGFP-ODD融合タンパク質およびアクチン(ローディング対照)のレベルを示すSDS-PAGEゲルの写真。(DMSとの)インキュベーションの最後の24時間は、α-ケトグルタル酸エステル(オクチル-α-ケトグルタレート(O)(レーン7〜8)またはTFMB-α-ケトグルタレート(T)(レーン9〜10))を添加した。簡潔に述べると、細胞内でのコハク酸によるPHD活性の阻害は、細胞内α-ケトグルタレートレベルの上昇により緩和される。(A)  左側パネルでは、GFP-ODD融合タンパク質とHAタグ化pVHLを共発現するクローン(C2およびC3)を、ウェスタンブロットにより分析した。GFPのみをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした細胞をGFP分子量の基準として用いた(Co)。ローディング対照にはアクチンを使用した。右側パネルでは、クローン3 (C3)細胞を未処理のままとするか、または低酸素症模倣化合物CoCl2で処理し、ウェスタンブロットを用いてGFP-ODDおよびHA-pVHLタンパク質レベルを分析した。(B)  パネルBに示すようにクローン3細胞を処理し、ウェスタンブロットを用いてGFP-ODDレベルを検出した。CoCl2処理細胞をPHD阻害の陽性対照として使用し、アクチンレベルをローディング対照として使用した。
【図８】(A)  未処理(U、レーン1〜2)またはコハク酸ジメチルエステルで処理し(DMS、レーン3〜8)、かつオクチル-α-ケトグルタレート(O、レーン5〜6)またはTFMB-α-ケトグルタレート(T、レーン 7〜8)で処理したHEK293細胞抽出物のウェスタンブロット写真。HIF-1αおよびアクチンが示されている。(B)  スクランブルsiRNA(Sc)またはSDH-Dサブユニット標的化siRNA(Di3)でトランスフェクトし、ついでオクチル-α-ケトグルタレート(オクチル-α-KG)で処理したまたはしなかった細胞の細胞内α-ケトグルタレートレベル(μM)を示す棒グラフ。(C)  (B)のようにトランスフェクトし、ついでTFMB-α-ケトグルタレート(T、レーン5〜6)またはオクチル-α-ケトグルタレート(O、レーン7〜8)で処理した細胞の抽出物のウェスタンブロット写真。HIF-1αおよびアクチンが示されている。簡潔に述べると、α-ケトグルタレートは、HIF1αを分解に向けて再標的化する。HEK293細胞をDMSおよび／または示したα-ケトグルタル酸エステルで処理せずまたは処理し、ついでウェスタンブロットによりHIF1αタンパク質レベルを検出した。ローディング対照にはアクチンを使用した。細胞を、対照のスクランブルshRNA (Sc)またはSDHD標的化shRNA(Di3)で形質転換し、36時間後に、未処理のままとしたか、または1 mM オクチル-α-ケトグルタレートで5時間処理した。細胞内α-ケトグルタレートを上述のように分析した。細胞をアスコルビン酸およびN-アセチルシステインで処理し、対照のスクランブルshRNA (Sc)またはSDHD標的化shRNA(Di3)のいずれかでトランスフェクトした。示した箇所では、異なるα-ケトグルタル酸エステルを添加し、ついでウェスタンブロットによりHIF1αタンパク質レベルを検出した。
【図９】SDH阻害剤(TTFA)の存在下または不在下で生育させ、対照(DMSO)、オクチル-α-ケトグルタレート(オクチルαKG)、TFMB-α-ケトグルタレート(TFMB αKG)または遊離α-ケトグルタル酸(αKG)で処理した細胞の細胞生存率(未処理に対する％)を示す棒グラフ。簡潔に述べると、酸化的リン酸化の機能異常を伴う細胞を維持することができる(過剰量のピルビン酸およびウリジンを有する)培地を用いて、細胞をコハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)阻害剤-(TTFA)の存在下または不在下で連続的に生育させた。示した箇所では、細胞をビヒクル対照(DMSO)、対照としての遊離α-ケトグルタル酸(αKG)、またはTFMB-α-ケトグルタレート(T-αKG)もしくはオクチル-α-ケトグルタレート(O-αKG)で処理した。機能異常SDH活性を有する細胞中で、細胞内α-ケトグルタレートの上昇をもたらす処理(T-αKGまたはO-αKG)のみが、有意の細胞死をもたらした。生存率はMTTアッセイ(Roche)を用いて定量した。
【図１０】低酸素(3％)条件(細胞内でのHIF-1α誘導にとって十分な条件)下で、ビヒクル対照としてのDMSO (D)、α-ケトグルタル酸ベンジルエステル (B) (4 mM)、およびα-ケトグルタル酸トリフルオロメチルベンジルエステル(T) (4 mM)の存在下に3時間インキュベートした細胞の細胞抽出物のウェスタンブロットゲル写真。HIF-1αおよびアクチンが示されている。簡潔に説明すると、α-ケトグルタレートは、低酸素条件下でHIF-1α誘導を阻止する。HEK293細胞を低酸素(3％)条件(これらの細胞でのHIF-1α誘導にとって十分な条件)下で次の化合物の存在下にインキュベートした：D＝DMSOビヒクル対照、B＝α-ケトグルタル酸ベンジルエステル(4 mM)、T＝α-ケトグルタル酸トリフルオロメチルベンジルエステル(4 mM)。細胞を溶解し、抽出物を抗HIF-1α抗体または抗アクチン抗体を用いたウェスタンブロットにより分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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