(57)【要約】  染色されたミクロスフェアを形成させるための各種の方法が提供される。一つの方法には、熱または光を用いて染料にカップリングさせた化学構造を活性化させて、ミクロスフェアの存在下に反応中間体を形成させることを含む。その反応中間体は、ミクロスフェアのポリマーに共有結合的に付加し、それによって、染料をポリマーにカップリングさせて、染色されたミクロスフェアを形成させる。さらなる方法では、分子にカップリングさせた染色されたミクロスフェアを形成させることを提供する。これらの方法には、染色されたミクロスフェアの外側表面上に分子を合成することに加えて、上述のようにミクロスフェアを染色することが含まれる。染色されたミクロスフェアの集合体も提供される。その集合体の染色ミクロスフェアのそれぞれには、化学的な構造によって、染色されたミクロスフェアのそれぞれのポリマーに付加された染料が含まれる。染料が原因の、染色されたミクロスフェアの集合体の染色特性における変動係数は、約１０％未満である。
2008516240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミクロスフェアの表面特性を変化させるための方法であって、前記ミクロスフェアの表面特性を変性するために、前記ミクロスフェアに、親水性基を含むように変性するジメトキシトリアジンメチルモルホリンをカップリングさせることを含み、ここで、前記ミクロスフェアに、前記ジメトキシトリアジンメチルモルホリンを介して反応剤をカップリングさせることが可能である、方法。
【請求項２】
前記カップリングが、変性された表面特性を有するミクロスフェアを形成させるために、ビニル基を含むモノマーとジメトキシトリアジンメチルモルホリンとを別なモノマーと共重合させることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カップリングが、ジメトキシトリアジンメチルモルホリンをミクロスフェアの表面に付加させることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記変性された表面特性が、前記反応剤を前記ミクロスフェアにカップリングさせたときに、前記反応剤の安定性を向上させる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記変性された表面特性が、前記ミクロスフェアを用いて実施するアッセイの性能を改良する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記反応剤が生体分子を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ジメトキシトリアジンメチルモルホリンが、前記ミクロスフェアの異なった位置にカップリングされた１種または複数のジメトキシトリアジンメチルモルホリン分子を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記表面特性が電荷密度を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記表面特性がｐＫａを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ミクロスフェアのポリマーコアにカップリングされた親水性基を含むように変性されたジメトキシトリアジンメチルモルホリンを含み、それによって、前記ジメトキシトリアジンメチルモルホリンがミクロスフェアの表面特性を変性し、ここで、前記ミクロスフェアに、前記ジメトキシトリアジンメチルモルホリンを介して反応剤をカップリングさせることが可能である、ミクロスフェア。
【請求項１１】
前記ジメトキシトリアジンメチルモルホリンが、ビニル基を含むモノマーとジメトキシトリアジンメチルモルホリンとを他のモノマーと共重合させることにより、前記ポリマーコアにさらにカップリングされる請求項１０に記載のミクロスフェア。
【請求項１２】
前記ジメトキシトリアジンメチルモルホリンが、ジメトキシトリアジンメチルモルホリンのポリマーコアの表面への付加により、ポリマーコアにさらにカップリングされる請求項１０に記載のミクロスフェア。
【請求項１３】
前記変性された表面特性が、前記反応剤を前記ミクロスフェアにカップリングさせたときに、前記反応剤の安定性を向上させる請求項１０に記載のミクロスフェア。
【請求項１４】
前記変性された表面特性が、前記ミクロスフェアを用いて実施するアッセイの性能を改良する請求項１０に記載のミクロスフェア。
【請求項１５】
前記反応剤が生体分子を含む請求項１０に記載のミクロスフェア。
【請求項１６】
前記ジメトキシトリアジンメチルモルホリンが、前記ミクロスフェアの異なった位置にカップリングされた１種または複数のジメトキシトリアジンメチルモルホリン分子を含む請求項１０に記載のミクロスフェア。
【請求項１７】
前記表面特性が電荷密度を含む請求項１０に記載のミクロスフェア。
【請求項１８】
前記表面特性がｐＫａを含む請求項１０に記載のミクロスフェア。
【請求項１９】
ミクロスフェアと、
親水性基を含むように変性されたジメトキシトリアジンメチルモルホリンを含む活性化剤と、
前記ジメトキシトリアジンメチルモルホリンがミクロスフェアの表面特性を変性させるように、ジメトキシトリアジンメチルモルホリンを前記ミクロスフェアのポリマーコアにカップリングさせるために使用することが可能な、１種または複数の化学物質、１種または複数のデバイス、またはそれらのいくつかの組合せとを含み、
、１種または複数の反応剤が、前記ジメトキシトリアジンメチルモルホリンを介して前記ミクロスフェアにカップリングさせられる、キット。
【請求項２０】
ミクロスフェアの表面特性を変化させるための方法であって、前記ミクロスフェアの表面特性を変性させるために、ケイ酸またはケイ酸誘導体を前記ミクロスフェアにカップリングさせることを含み、反応剤が、前記ケイ酸またはケイ酸誘導体を介して前記ミクロスフェアにカップリングされることが可能な、方法。
【請求項２１】
ミクロスフェアの表面特性を変化させるための方法であって、スルホン基と共役しているイオン性極性基をミクロスフェアにカップリングさせて、前記ミクロスフェアの表面特性を変性することを含み、反応剤が、スルホン基と共役しているイオン性極性基を介して前記ミクロスフェアにカップリングされることが可能な、方法。
【請求項２２】
前記スルホン基と共役しているイオン性極性基がミクロスフェアの表面特性を変性させるように、ミクロスフェアのポリマーコアにカップリングされた、スルホン基と共役しているイオン性極性基を含み、反応剤が、スルホン基と共役しているイオン性極性基を介して前記ミクロスフェアにカップリングされることが可能な、ミクロスフェア。
【請求項２３】
ミクロスフェアと、
スルホン基と共役しているイオン性極性基を含む活性化剤と、
前記スルホン基と共役しているイオン性極性基をミクロスフェアのポリマーコアにカップリングさせることに使用でき、それによって前記スルホン基と共役しているイオン性極性基がミクロスフェアの表面特性を変性させる、１種または複数の化学物質、１種または複数のデバイス、またはそれらのいくつかの組合せとを含み、
１種または複数の反応剤を、前記スルホン基と共役しているイオン性極性基を介してミクロスフェアにカップリングさせることが可能な、キット。
【請求項２４】
ミクロスフェアの表面特性を変化させるための方法であって、５−置換ヒドロキシルトロポロンを前記ミクロスフェアにカップリングさせて、前記ミクロスフェアの表面特性を変性させることを含み、反応剤が、前記５−置換ヒドロキシルトロポロンを介して前記ミクロスフェアにカップリングされることが可能である、方法。
【請求項２５】
ミクロスフェアの表面特性を変化させるための方法であって、前記ミクロスフェアの表面特性を変性させるために、シアヌル酸またはシアヌル酸誘導体を前記ミクロスフェアにカップリングさせることを含み、反応剤が、前記シアヌル酸またはシアヌル酸誘導体を介して前記ミクロスフェアにカップリングされることが可能な、方法。
【請求項２６】
ミクロスフェアの表面特性を変化させるための方法であって、前記ミクロスフェアの表面特性を変性させるために、ボロン酸またはボロン酸誘導体を含む混合官能基を前記ミクロスフェアにカップリングさせることを含み、前記ミクロスフェアに、前記混合官能基を介して反応剤をカップリングさせることが可能である、方法。
【請求項２７】
ミクロスフェアの表面特性を変化させるための方法であって：
エノール酸、エノール誘導体、またはエノール酸を含む混合官能基をミクロスフェアの表面にカップリングさせることと、
ミクロスフェアの表面上のエノール酸、エノール誘導体、または混合官能基を変換させてフッ化エノール酸とすることとを含み、
反応剤を、前記フッ化エノール酸を介してミクロスフェアにカップリングさせることが可能な、方法。
【請求項２８】
前記エノール酸、エノール誘導体、または混合官能基が、デルタ酸、スクアリン酸、クロコン酸、またはロジゾン酸を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記エノール酸、エノール誘導体、または混合官能基が、５−置換ヒドロキシトロポロンを含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記エノール酸、エノール誘導体、または混合官能基が、シアヌル酸またはシアヌル酸誘導体を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記エノール酸、エノール誘導体、または混合官能基が、親水性基を含むために変性されるジメトキシトリアジンメチルモルホリンを含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記エノール酸、エノール誘導体、または混合官能基が、混合官能基を含み、そして、前記混合官能基が、ボロン酸またはボロン酸誘導体を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
ミクロスフェアを形成させるための方法であって、２種の異なったモノマーを共重合させて、前記ミクロスフェアの外部表面にカップリングさせた、エノール酸、エノール誘導体、またはエノール酸を含む混合官能基を有するミクロスフェアを形成させる工程を含み、前記モノマーの一つが、ビニル基とエノール酸、エノール誘導体、または混合官能基を含む、方法。
【請求項３４】
前記他のモノマーが、スチレンを含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記エノール酸、エノール誘導体、または混合官能基が、デルタ酸、スクアリン酸、クロコン酸、またはロジゾン酸を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記エノール酸、エノール誘導体、または混合官能基が、５−置換ヒドロキシトロポロンを含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記エノール酸、エノール誘導体、または混合官能基が、シアヌル酸またはシアヌル酸誘導体を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記エノール酸、エノール誘導体、または混合官能基が、親水性基を含ませるために、変性されたジメトキシトリアジンメチルモルホリンを含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記エノール酸、エノール誘導体、または混合官能基が混合官能基を含み、かつ、前記混合官能基がボロン酸またはボロン酸誘導体を含む請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ミクロスフェアの表面特性を変化させるための方法に関する。ある種の実施態様には、ミクロスフェアにエノール酸をカップリングさせて、ミクロスフェアの表面特性を変性して、エノール酸を介してミクロスフェアに反応剤がカップリングできるようにすることが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
以下の記述および実施例は、このセクションの中に含まれているからといって、従来技術であるとみなしてはならない。
【０００３】
化学的および生物学的な系を分析するのに、分光学的な技術が広く採用されている。それらの技術に最もしばしば含まれているのが、対象とする物質による電磁放射線の吸収または放出を測定することである。そのような応用の一つは、マイクロアレイの分野にあるが、これは、コンビナトリアルケミストリーや生物学的アッセイ業界を含めた、多くの学問分野によって開発された技術である。ある会社、すなわちテキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）のルミネックス・コーポレーション（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が、各種に着色した蛍光性のミクロスフェアの表面において生物学的アッセイを実施するシステムを開発した。そのようなシステムの一例は、特許文献１（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ら）に説明されている。この特許を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。そのような流体の流動デバイスにおいては、ミクロスフェアは、レーザーで励起させ、個々のミクロスフェアが検出ゾーンを比較的高速で通過している際に、それの蛍光を検出することによって、調べている。そのようなシステムで得られた測定データは、簡単にデータベースにエクスポートして、さらなる分析を行うことができる。
【０００４】
多重分析のための蛍光性ミクロスフェアをベースとするアッセイは、下記のようないくつかのグループや個人によっても報告されてきた：非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；特許文献２（フルトン（Ｆｕｌｔｏｎ）），特許文献３（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）），特許文献４（フルトン（Ｆｕｌｔｏｎ）），特許文献５（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）），特許文献６（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ら），特許文献７（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）），特許文献８（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ））、特許文献９（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ら）。これらは、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。
【０００５】
上述のシステムにおいては、蛍光染料はミクロスフェアの中に吸収されるか、および／またはミクロスフェアの表面に結合される。染料は、システムの選択された検出ウィンドウの波長にある光を発する性能を基準にして選択する。さらに、検出ウィンドウは、複数の波長に間隔を空けて配置されており、また染料は、隣接した検出ウィンドウ内での染料の蛍光信号のオーバーラップが最小となるように設計しておく。二つの検出ウィンドウと、１０の異なる濃度を有する２種の染料とを用いれば、１００種の蛍光的に区別可能なミクロスフェアのセットが得られることになる。
【０００６】
この３０年の間に、アフィニティクロマトグラフィー、固相合成、生体高分子たとえばタンパク質、オリゴヌクレオチドなどの固定化の分野における進歩によって、ミクロスフェアをベースとした生物医学的な応用分野がもたらされるようになった。たとえば、１種または複数の生体分子を、ミクロスフェアの表面に結合させることができる。その１種または複数の生体分子は、実施する具体的なアッセイに応じて選択する。たとえば、ミクロスフェアの一つの集団に、それぞれが異なった抗原にカップリングされたミクロスフェアの異なったサブセットが含まれる。それらのサブセットがサンプルと組み合わされ、そしてアッセイを実施して、そのサンプル中にどの抗体が存在するかを求めることができる。ミクロスフェアに結合された（１種または複数の）生体分子には、当業者公知の各種生体分子が含まれる。
【０００７】
生体分子またはその他のそのようなエンティティを固定化することは、下記を用いたカップリングによって達成することができる：（ａ）イオン的相互作用；（ｂ）吸着；（ｃ）錯化（たとえば、「金属配位」媒介カップリング）；（ｄ）表面上の活性／安定反応性基と、固定化されるエンティティの上の特定の官能基との間における共有結合の生成。たとえば、粒子（たとえば、ミクロスフェアやナノスフェア；ナノチューブ；各種のサイズ、形状、または組成を有する１種または複数の金属を含む金属粒子；半導体粒子；分子インプリンテッドポリマー（Molecularly imprinted polymer、ＭＩＰＳ）；磁性粒子；およびその他の染色材料）；マイクロタイタープレートは、多くの固定化システムにおける一般的な固相マトリックスである。活性があり、官能化された固相表面を調整し、維持することは、充分に感度の高いアッセイを展開する目的で、生物学的物質を確実に固定するためには重要である。固相表面の上に生体分子を固定化するために現在使用されている手順には一般に、固相表面の上の活性化されたカルボキシル、アミノ、ヒドロキシルまたはチオール基を生体分子と反応させることが含まれる。それらの基を活性化させるか、またはそれらの基に官能化されたスペーサーを導入した後では、その活性化された基によって、生体分子を直接付加させるための、固相表面の上のサイトが与えられる。
【０００８】
しかしながら、直接付加させるサイトを得るために現在使用されている基は、いくつかの欠点を有している。たとえば、それらの官能基の多くのもの（たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、イソチオシアネートなど）は、水性環境においては加水分解を受けやすく、１時間足らずの間に反応性を失ってしまう（すなわち、化学的に不活性となる）。したがって、そのような官能基は、望ましくないことには、それらの官能基を使用して固相の表面へ生体分子を付加させる場合の、量、再現性、均一性が時間の経過によって変化を示す可能性がある。
【０００９】
反応性または官能化ミクロスフェアは従来から、適切に官能化されたモノマーを共重合させるか、あるいは、予備形成させたミクロスフェアを化学変性するかによって製造されている。後官能化は、反応性の粒子を調製するのにはよく用いられる方法であり、たとえば非特許文献６に記載がある。この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。
【００１０】
各種のテーラーメードの粒子の製造と評価に関するさらに最近の研究は、たとえば以下のようないくつかのグループによって報告されている：非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０、非特許文献１１；非特許文献１２。これらの文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。非特許文献１３による総説（この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする）には、反応性で、ラベル化したミクロスフェアの合成と物理化学的性質が記載されている。
【００１１】
非特許文献１４（この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする）には、加水分解抵抗性のアルデヒド官能基を用いて、粒子を予め活性化する戦術についての報告があるが、それらのミクロスフェアでは、８％未満の低い反応収率しか観察されなかった。特許文献１０（ミルトン（Ｍｉｌｔｏｎ））（この特許を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする）には、フッ化アシルで活性化されたポリマー表面と、アミノ誘導体化生体分子との間の室温における反応が記載されている。アミド、ペプチド、ヒドロキサム酸、アミン、ウレタン、カーボネート、スルホンアミド、アルファ−置換カルボニル化合物を固相合成する際にフルオロフェニル樹脂を使用することが、特許文献１１（クラーク（Ｃｌｅｒｃ）ら）に記載されている。この特許を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。
【００１２】
非特許文献１５（この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする）には、ペプチド合成においてスルホ−テトラフルオロフェニルで活性化させたエステルを使用することについての説明があり、水性貯蔵条件下における良好な安定性と関連づけて、それらの反応性を示している。この反応剤を用いてポリスチレンの表面を前もって活性化させることは、明らかに、まだ報告されていない。
【００１３】
ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）は１９５０年に、特許文献１２（ヘイナ（Ｈｅｙｎａ）ら）（この特許を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする）において、セルロースと羊毛繊維を染色するために反応性ビニルスルホン（ＶＳ）変性染料を使用することを特許請求している。シーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ）による総説に、ＶＳとその保護された２−スルファトエチルおよび２−チオスルファトエチルスルホンをベースとして反応性染料に関する完璧な説明がある（非特許文献１６）、この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。特許文献１３（スノー（Ｓｎｏｗ）ら）（この特許を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする）には、ＰＥＧ−担持ＶＳを用いたタンパク質の変性が記載されている。
【００１４】
最も頻繁に使用される、生体分子（たとえば、オリゴヌクレオチド、タンパク質、炭水化物）を蛍光性ミクロスフェアの上に固定化させる方法は、ミクロスフェアの表面上に存在するカルボキシ基を活性化させることによる。その活性化には、過剰のＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と、４〜６のカップリングｐＨとが必要である。カルボジイミドとカルボキシル官能基との間の反応によって、活性化されたＯ−アシル尿素誘導体反応中間体が生成する。次いでその反応中間体が、ミクロスフェアに付加された生体分子のアミノ基の一級窒素による求核的なアタックを受けて、置換尿素を放出し、その反応中間体とその生体分子との間にアミド結合を形成する。
【００１５】
しかしながら、カルボキシ基をそのようにして活性化させることには、いくつかの欠点が存在する。たとえば、その反応中間体の半減期が極めて短く、急速に加水分解を受けたり、あるいは転位してＮ−アシル尿素アダクトを形成したりする。さらに、Ｏ−アシル尿素を形成させるのに最適なｐＨは、約４〜５である。しかしながら、その求核試薬の一級アミノ基は、約４〜５のｐＨでは大部分がプロトン付加されてしまうので、ほとんど非反応性となる。これらのように反応中間体に限度があるので、生体分子とミクロスフェアとのカップリング収率が厳しく抑制されてしまう可能性がある。さらに、低ｐＨでは、生体分子の核酸塩基が強いプロトン付加を受けることもある。そのようなプロトン付加があるとＤＮＡの融解を誘起し、それによってへリックスの疎水性コアが暴露され、そのため、ヘリックスとミクロスフェアの固相マトリックスとの間で、非特異的な疎水的相互作用が起きやすくなる。
【００１６】
これらの欠点があるものの、ＥＤＣ−媒介カップリングは現在のところ、生体分子を固相表面に共有結合的に固定化させるための主流となっており、それについては下記の文献を参照されたい：非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１。これらの文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。
【００１７】
コンビナトリアル・ライブラリーのための、ビルディングブロックとしては、たとえばマロン酸、ジヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシフェニル酢酸、ピロリンカルボン酸、ブロモジヒドロキシ安息香酸、３−オキソ−１−インダンカルボン酸、３−ニトロフェニル酢酸、３，４−ジフルオロ安息香酸などが、たとえば非特許文献２２に記載されている。この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。
【００１８】
ポリマーの表面特性を変性するためにポリマーの中に組み入れることが可能ないくつかの分子が報告されており、それらを以下に示す。
【化１】
2008516240.tif 000003
ポリマー担持触媒、反応剤または基質を使用した有機反応が公知であり、たとえば下記の文献に記載がある。非特許文献２３。この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。
【００１９】
ポリマー担持フェノール性化合物は公知である。たとえば、ポリマー担持テトラフルオロフェノールは、ケミカル・ライブラリー合成のための活性化樹脂として現在使用されており、これについては下記の文献に記載がある。非特許文献２４。この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。
【００２０】
ボロン酸は、１，２および１，３ジオール官能性を有するサッカライドとその他のゲスト化合物を錯化させるための合成レセプターの中に決まり切ったように組み入れられており、それについては下記の文献に記載がある。非特許文献２５，非特許文献２６、非特許文献２７。これらの文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。ボロン酸は、タンパク質を精製するための化学親和力システム(chemical affinity system)の中にも組み入れられており、それについては下記の文献に記載がある、非特許文献２８。この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。２種のエンティティを共に結合させるために各種のボロン酸を使用することについては、下記の特許に記載がある、特許文献１４（ストロビッツ（Ｓｔｏｌｏｗｉｔｚ）），特許文献１５（ストロビッツ（Ｓｔｏｌｏｗｉｔｚ）ら），特許文献１６（ストロビッツ（Ｓｔｏｌｏｗｉｔｚ）ら），特許文献１７（ストロビッツ（Ｓｔｏｌｏｗｉｔｚ）ら）、特許文献１８（ストロビッツ（Ｓｔｏｌｏｗｉｔｚ）ら）。これらの特許を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする
【００２１】
酸性の官能基をガラス表面に添加することも行われてきたが、それについてはたとえば下記の文献に記載がある、非特許文献２９。この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。
【００２２】
【特許文献１】米国特許第５，９８１，１８０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７３６，３３０号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０４６，８０７号明細書
【特許文献４】米国特許第６，０５７，１０７号明細書
【特許文献５】米国特許第６，１３９，８００号明細書
【特許文献６】米国特許第６，２６８，２２２号明細書
【特許文献７】米国特許第６，３６６，３５４号明細書
【特許文献８】米国特許第６，４１１，９０４号明細書
【特許文献９】米国特許第６，４４９，５６２号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，１４６，８３３号明細書
【特許文献１１】国際公開第９９／６７２２８号パンフレット
【特許文献１２】独国特許第９６０，５３４号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，４１４，１３５号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，００８，４０６号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，０７５，１２６号明細書
【特許文献１６】米国特許第６，１２４，４７１号明細書
【特許文献１７】米国特許第６，４６２，１７９号明細書
【特許文献１８】米国特許第６，６３０，５７７号明細書
【非特許文献１】フルトン（Ｆｕｌｔｏｎ）ら、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９７、４３、１７４９〜１７５６
【非特許文献２】ケットマン（Ｋｅｔｔｍａｎ）ら、サイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、１９９８、３３、２３４〜２４３
【非特許文献３】マックデード（ＭｃＤａｄｅ）ら、メディカル・デバイス・アンド・ディアグノスティック・インダストリー（Ｍｅｄ．Ｄｅｖ．Ｄｉａｇ．Ｉｎｄｕｓｔ．）、１９９７、１９（４）、７５〜８２
【非特許文献４】マックヒュー（ＭｃＨｕｇｈ）、メソッズ・イン・セル・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９４，４２、５７５〜５９５
【非特許文献５】ニキフォロフ（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ）ら、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、１９９４、２２、４１６７〜４１７５
【非特許文献６】ウプソン（Ｕｐｓｏｎ）、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス・ポリマー・シンポジウム（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｓｙｍｐ．）、１９８５、７２、４５
【非特許文献７】マーゲル（Ｍａｒｇｅｌ）ら、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．）、１９９１、Ａ−２９、３４７〜３５５
【非特許文献８】マーゲル（Ｍａｒｇｅｌ）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９８１、１２８、３４２〜３５０）
【非特許文献９】ユーゲルシュダッド（Ｕｇｅｌｓｔａｄ）ら、マクロモレキュラー・ヘミー（Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９７９、１８O、７３７〜７４４
【非特許文献１０】ユーゲルシュダッド（Ｕｇｅｌｓｔａｄ）ら、アドバンシス・イン・コロイド・アンド・インターフェース・サイエンス（Ａｄｖ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．）、１９８０、１３、１０２〜１４０）
【非特許文献１１】レムバウム（Ｒｅｍｂａｕｍ）ら、（ブリティッシュ・ポリマー・ジャーナル（Ｂｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．）、１９７８、１０、２７５〜２８０
【非特許文献１２】レムバウム（Ｒｅｍｂａｕｍ）ら、ジャーナル・オブ・マクロモレキュラー・サイセンス・ケミストリー（Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．）、１９７９、Ａ−１３、６０３〜６３２）
【非特許文献１３】Ｒ．アーシャディ（Ｒ．Ａｒｓｈａｄｙ）、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、１９９３、１４、５〜１５
【非特許文献１４】フレイ（Ｆｒａｙ）ら、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、１９９９、１０、５６２〜５７１
【非特許文献１５】メドベドキン（Ｍｅｄｖｅｄｋｉｎ）ら、バイオオルガニチェスカヤ・キミヤ（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．）、１９９５、２１（９）、６８４〜６９０
【非特許文献１６】Ｅ．シーゲル（Ｅ．Ｓｉｅｇｅｌ）、『ザ・ケミストリー・オブ・シンセティック・ダイズ（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｙｅｓ）』、第ＶＩ卷、（Ｋ．ベンカタラマン（Ｋ．Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ）編）；２〜１０８（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９７２
【非特許文献１７】ヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ），Ｇ．Ｔ．、『バイオコンジュゲート・テクニックス（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）』（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（ＮＹ）、１９９６）
【非特許文献１８】フレイ（Ｆｒｅｙ），Ａ．ら、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、１９９９、１０、５６２〜５７１
【非特許文献１９】ギレス（Ｇｉｌｌｅｓ），Ｍ．Ａ．ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９９０、１８４、２４４〜２４８
【非特許文献２０】チャン（Ｃｈａｎ），Ｖ．Ｗ．Ｆ．ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、１９８８、１５１（２）、７０９〜７１６
【非特許文献２１】バルエフ（Ｖａｌｕｅｖ），Ｉ．Ｌ．ら、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、１９９８、１９，４１〜４３
【非特許文献２２】リン（Ｌｉｎ），Ｒ．ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００２、１２４、７６７８〜７６８０
【非特許文献２３】ホッジ（Ｈｏｄｇｅ），Ｐ．『シンセシス・アンド・セパレーションズ・ユージング・ファンクショナル・ポリマーズ（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）』（シェリングトン（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ），Ｄ．Ｃ．およびホッジ（Ｈｏｄｇｅ），Ｐ．編、１９８８、ジョン・ワイリー（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ）、４４〜１１３
【非特許文献２４】サルビーノ（Ｓａｌｖｉｎｏ），Ｊ．Ｍ．ら、ジャーナル・オブ・コンビナトリアル・ケミストリー（Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．）、２０００、２、６９１〜６９９
【非特許文献２５】ツアルニク（Ｃｚａｒｎｉｋ），Ａ．Ｗ．ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９２、１１４、５８７４
【非特許文献２６】シンカイ（Ｓｈｉｎｋａｉ），Ｓ．Ｊ．、ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ・ケミカル・コミュニケーションズ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９９４、４７７
【非特許文献２７】ヘールト＝ジャン・ブーンズ（Ｇｅｅｒｔ−Ｊａｎ  Ｂｏｏｎｓ）ら、テトラへドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ）、２００、４１、６９６５
【非特許文献２８】ベルクサイド（Ｂｅｒｇｓｅｉｄ），Ｍ．ら、バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、２０００、２９、１１２６
【非特許文献２９】ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ），Ｆ．Ｍ．ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００４、１２６、１１７５４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
したがって、生体分子を付加させるために使用される官能基の加水分解のために、ミクロスフェアの表面への生体分子の付加が経時的に変化するといったような、前述の欠点の一つまたは複数を有さない、ミクロスフェアの表面特性を変化させるための方法を開発できれば、有益となるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
各種の方法、ミクロスフェア、キットの実施態様に関する以下の記述は、いかなる点においても、添付された特許請求項の主題を限定するものと受け取ってはならない。
【００２５】
一つの実施態様は、クロスフェアの表面特性を変化させるための方法に関する。その方法には、エノール酸をミクロスフェアにカップリングさせて、ミクロスフェアの表面特性を変性することが含まれる。そのエノール酸には、ミクロスフェアの異なった位置にカップリングされた１種または複数のエノール酸分子が含まれる。エノール酸を介して、反応剤をミクロスフェアにカップリングさせることができる。他の実施態様においては、エノール酸をエノール酸誘導体または混合官能基と置き換えてもよい。さらなる実施態様においては、エノール酸は、より一般的には、化学基と共役関係にあるイオン化可能な極性基として表すことができる。その化学基としては、たとえば、スルホン基またはカルボニル基を挙げることができる。
【００２６】
一つの実施態様においては、エノール酸には少なくとも１個の親水性基を含む。また別な実施態様においては、エノール酸には、デルタ酸、スクアリン酸、クロコン酸、もしくはロジゾン酸、またはその他の同族体が含まれる。別の実施態様においては、エノール酸には、５−置換ヒドロキシトロポロンが含まれる。他の実施態様においては、エノール酸には、シアヌル酸またはシアヌル酸誘導体が含まれる。代わりの実施態様においては、エノール酸には、親水性基を含むように変性されたジメトキシトリアジンメチルモルホリンが含まれる。さらなる実施態様においては、エノール酸には混合官能基が含まれる。その混合官能基には、ボロン酸またはボロン酸誘導体が含まれる。いくつかの実施態様においては、エノール酸には、ケイ酸またはケイ酸誘導体が含まれる。
【００２７】
ある実施態様においては、エノール酸をミクロスフェアにカップリングさせるということには、ビニル基を含むモノマーとエノール酸を別なモノマーと共重合させて、変性された表面特性を有するミクロスフェアを形成することが含まれる。別の実施態様においては、エノール酸をミクロスフェアにカップリングさせるということには、エノール酸をミクロスフェアの表面に付加させるということが含まれる。
【００２８】
表面特性を変性することによって、反応剤をミクロスフェアにカップリングさせたときに、その反応剤の安定性を向上させることができる。表面特性を変性することによってさらに、そのミクロスフェアを用いて実施するアッセイの性能を改良することもできる。その反応剤には、たとえば生体分子が含まれる。
【００２９】
表面特性には、電荷密度が含まれる。さらに、あるいは別なこととして、表面特性にｐＫａが含まれる。上述の方法のそれぞれの実施態様には、本明細書に記載された各種その他の（一つまたは複数の）工程が含まれる。さらに、その方法には、複数のミクロスフェアの上述のような表面特性を同時に（すなわち、同一工程において）変化させることが明らかに含まれる。
【００３０】
また別な実施態様は、ミクロスフェアのポリマーコアにエノール酸をカップリングさせて、エノール酸がミクロスフェアの表面特性を変性するようにしたミクロスフェアに関する。そのエノール酸には、ミクロスフェアの異なった位置にカップリングされた１種または複数のエノール酸分子が含まれる。エノール酸を介して、反応剤をミクロスフェアにカップリングさせることができる。他の実施態様においては、エノール酸をエノール酸誘導体または混合官能基と置き換えてもよい。さらなる実施態様においては、エノール酸は、より一般的には、化学基と共役関係にあるイオン化可能な極性基として表すことができる。その化学基としては、スルホン基またはカルボニル基を挙げることができる。
【００３１】
一つの実施態様においては、エノール酸には少なくとも１個の親水性基を含む。また別な実施態様においては、エノール酸には、デルタ酸、スクアリン酸、クロコン酸、もしくはロジゾン酸、またはその他の同族体が含まれる。別の実施態様においては、エノール酸には、５−置換ヒドロキシトロポロンが含まれる。他の実施態様においては、エノール酸には、シアヌル酸またはシアヌル酸誘導体が含まれる。さらなる実施態様においては、エノール酸には、親水性基を含むように変性されたジメトキシトリアジンメチルモルホリンが含まれる。代わりの実施態様においては、エノール酸には、混合官能基が含まれる。その混合官能基には、ボロン酸またはボロン酸誘導体が含まれる。別な実施態様においては、エノール酸には、ケイ酸またはケイ酸誘導体が含まれる。
【００３２】
一つの実施態様においては、ビニル基を含むモノマーとエノール酸を用いて、別なモノマーと共重合させることにより、エノール酸をポリマーコアにカップリングさせる。別の実施態様においては、エノール酸をポリマーコアの表面に付加させることによって、エノール酸をポリマーコアにカップリングさせる。
【００３３】
表面特性を変性することによって、反応剤をミクロスフェアにカップリングさせたときに、その反応剤の安定性を向上させることができる。表面特性を変性することによってさらに、そのミクロスフェアを用いて実施するアッセイの性能を改良することもできる。その反応剤は、生体分子であってもよい。表面特性には、電荷密度が含まれる。さらに、表面特性にｐＫａが含まれる。ミクロスフェアのそれぞれの実施態様は、本明細書の記載に従って、さらなる配置、構成、および／または形態がとられていてもよい。
【００３４】
それらに加えての実施態様は、キットに関する。そのキットにはミクロスフェアを含む。そのキットにはさらに、エノール酸を含む活性化剤も含まれる。さらに、そのキットには、１種または複数の化合物、１種または複数のデバイス、あるいはそれらのいくつかの組合せが含まれていて、それらを使用することで、エノール酸をミクロスフェアのポリマーコアにカップリングさせて、そのエノール酸がミクロスフェアの表面特性を変性できるようにする。１種または複数の反応剤を、エノール酸を介してミクロスフェアにカップリングさせることができる。
【００３５】
そのキットとキットのそれらの要素に、本明細書の記載に従って、さらなる配置をとらせることも可能である。たとえば、いくつかの実施態様においては、エノール酸をエノール酸誘導体または混合官能基と置き換えてもよい。さらなる実施態様においては、エノール酸は、より一般的には、化学基と共役関係にあるイオン化可能な極性基として表すことができる。その化学基としては、たとえば、スルホン基またはカルボニル基を挙げることができる。
【００３６】
本発明のその他の目的および利点は、以下の詳細な説明を読み、添付の図面を参照することにより明らかになるであろう。
【００３７】
本発明は、各種の修正または置き換えをすることが容易であるが、その具体的な実施態様を、例として図面で示し、本明細書において詳しく説明する。しかしながら、図面とそれに対する詳しい説明は、本発明をその開示された特定の形態に限定することを目的としているのではなく、それとは逆に、添付された特許請求項によって定義される本発明の精神と範囲に入る、すべての修正、等価物、代替物を対象に含めることを目的としたものであることは、理解しておかれたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本明細書においては、「ミクロスフェア」、「粒子」、「ビーズ」という用語は、相互に交換可能に使用され、当業者に公知の各種適切なサイズと形状を有し、本明細書に記載される１種または複数の表面変性剤をカップリングさせることが可能な表面を有する、ばらばらになった固体物質を指す。
【００３９】
本明細書で使用するとき、「表面変性剤」という用語は一般に、ミクロスフェアの表面上にカップリングされるか別な方法で配置されることが可能であり、ミクロスフェアの表面の特性を変化させることが可能な、１種または複数の分子を指す。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「反応剤」という用語は一般に、ミクロスフェアにカップリングされ、それによって、その反応剤が、アッセイまたはそのミクロスフェアを用いて実施する他の実験の際に、分析対象物と反応することができるような分子を指す。適切な反応剤の例としては、生体分子たとえば、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素、抗原、抗体、もしくはヒト、動物、植物などの生体機能中または生体機能に関連して含まれるその他各種の分子、医薬品候補化合物、染料などが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。
【００４１】
通常ではない酸性を有する表面（たとえば、ポリスチレン表面）を有するミクロスフェアを形成させる方法を、本明細書においては一般的に記述する。たとえば、それらの方法は、たとえばエノール酸誘導体のような、１種または複数の表面変性剤をミクロスフェアにカップリングさせるためのものとして、本明細書では記述されている。一つの実施形態においては、クロスフェアの表面特性を変化させるための方法には、エノール酸をミクロスフェアにカップリングさせて、ミクロスフェアの表面特性を変性することが含まれる。エノール酸を介して、反応剤をミクロスフェアにカップリングさせることができる。その方法の実施形態は本明細書においてはミクロスフェアに関連させて記述されているが、エノール酸を複数のミクロスフェアに、同時に（すなわち、その方法の同一の、単一または複数の工程において）カップリングさせることも可能であることは理解されたい。
【００４２】
ポリマーミクロスフェアの表面特性は、バイオアッセイの広汎なスペクトルも含めて、多くの用途において重要な役割を果たす。たとえば、ミクロスフェアの表面特性によって、ミクロスフェアに付加させることが可能かどうか、およびどの反応剤が可能か、が決まってくる。さらに、ミクロスフェアの表面特性によって、反応剤がミクロスフェアにカップリングされるときの、量、予測可能性、再現性、均一性なども決まる可能性がある。市販されているミクロスフェアのほとんどのものにおいては、ＣＯＯＨまたはＳＯ3Ｈ基の末端を有する官能性モノマーを使用して、ミクロスフェアのポリマーコアの活性化された（または、官能化された）表面が形成されてきた。現在のところ、酸性のミクロスフェア表面は、カルボキシル、スルホキシド、ヒドロキシド、ボロン酸、ケイ酸のような基を用いて作られている。
【００４３】
しかしながら、本明細書に記載される方法には、スルホン基またはカルボニル基のような化学基と共役したイオン性極性基のような表面修飾剤を使用して、ミクロスフェア表面を修飾することが含まれる。たとえば、本明細書に記述するように、ミクロスフェア表面は、以下の基を用いて荷電されて（または官能化されて）いてもよい（これらに限定される訳ではない）：隣接した炭素原子の上にあり、二重結合によるかまたはその他の共役結合により分離されたカルボニルおよびＯＨと共役しているカルボニルおよびＯＨ、カルボニルおよびＣＯＯＨと共役しているスルホンおよびＯＨ、スルホンおよびＣＯＯＨ、ボロン酸およびＯＨ、ならびにケイ酸およびＣＯＯＨ。これとは対照的に、表面修飾剤として現在使用されている酸には、炭素、ホウ素、硫黄またはケイ素原子に配置されたイオン性基が含まれている。
【００４４】
エノール酸には、１個または複数の二重結合によって分断された、別な原子の上に位置するオキソ基とヒドロキシル基が含まれている。そのミクロスフェアが置かれた溶液のｐＨに依存して、ミクロスフェアの表面の上にあるエノール酸基がイオン化され、ミクロスフェアの表面電荷（たとえば、電荷密度）や界面電荷（すなわち、水溶液とミクロスフェア表面との界面における電荷）に影響を与える。別の言い方をすれば、エノール酸をミクロスフェアにカップリングさせることにより、ミクロスフェアの表面電荷や界面電荷のような表面特性を変性することができる。表面電荷や界面電荷におけるそのような変化の結果として、ミクロスフェアの表面に対する化学結合性（またはカップリング）、特に生体分子のような反応剤と固相表面との間のカップリングを調節することが可能となる。（１種または複数の）反応剤を、エノール酸を介してミクロスフェアにカップリングさせることも可能である。
【００４５】
本明細書に記載された方法は、下記のエノール酸、エノール酸誘導体、混合官能基を使用して実施することができる。たとえば、本明細書に記載された方法は、エノール酸たとえばスクアリン酸、シアヌール酸、ボロン酸、さらには７員環のヒドロキシ−トロポロン、ならびにトリアルキルシリル化合物を用いて実施することができる。
【００４６】
米国特許出願公開第２００４／００３９２０１号明細書（ルゲード（Ｌｕｇａｄｅ）ら）（この特許を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする）には、生体分子のアミノ基を共有結合的にカップリングさせるために、予備活性化フッ化エノール酸として、フッ化スクアリン酸を使用することが記載されている。明細書に記載された方法では、いくつかのエノール酸とそれらの誘導体を利用して、一連の生物医学的用途のためのさらなる反応剤を開発している。
【００４７】
一つの実施形態においては、たとえばスクアリン酸またはその誘導体のようなエノール酸を使用して、本明細書に記載された方法を実施してもよい。スクアリン酸は、約２〜約３．５の範囲のｐＫａを有する、実質的に強い二塩基酸である。２個の水素を移動させることによって、スクアリン酸はスクアレートジアニオンを発生させることが可能であり、そのものは、水素結合の強力な受容体として機能することが可能な、比較的剛直で非局在化平面芳香族ジアニオンである。この酸のその他の同族体たとえば、デルタ酸、クロコン酸、ロジゾン酸も、本明細書に記載された方法の実施形態において使用することができる。追記されたスクアリン酸エステルを有する（アミン含有表面から作られた）表面が、アミン含有分子と共役させるために使用されてきた。スクアリン酸を含む方法の例は、ブリクスト（Ｂｌｉｘｔ），Ｏ．らの『エニマティック・グリコソイレーション・オブ・リデューシング・オリゴサッカライズ・リンクド・トゥ・ア・ソリッドフェース・オア・リピッド・ヴィア・ア・クリーバブル・スクアレート・リンカー（Ｅｎｙｍａｔｉｃ  ｇｌｙｃｏｓｏｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ａ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｏｒ  ａ  ｌｉｐｉｄ  ｖｉａ  ａ  ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｓｑｕａｒａｔｅ  ｌｉｎｋｅｒ）』（カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９９、３１９、８０〜９１）や、米国特許第６，６０２，６９２号明細書（グルセンカンプ（Ｇｌｕｓｅｎｋａｍｐ）ら）、米国特許第６，６５６，８７６号明細書（アバーグ（Ａｂｅｒｇ）ら）に記載されている。これらの文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。しかしながら、本明細書に記載された方法においては、スクアリン酸を使用して、たとえばミクロスフェアの表面ｐＫａおよび表面電荷のような表面特性を変性する。
【００４８】
また別な実施形態においては、オキソ炭素酸を使用して、本明細書に記載された方法を実施することもできる。下記に示す一般式のオキソ炭素（Ｒ＝Ｃｌ、アルキル、およびアリール）は、コール（Ｃｏｌｅ），Ｒ，Ｊ．ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９７３、１７９、１３２４と、シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ），Ａ．Ｈ．、シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、１９７８、１、に最初に報告されたものである。これらの文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。
【化２】
2008516240.tif 000004
適切なリンカー基、Ｒを使用することにより、表１、見出し番号１に示された一般構造を含むエノール酸を用いて、ミクロスフェアの表面特性を変性することができる。
【００４９】
３−ヒドロキシ−４−（４−スチリル）−３−シクロブテン−１，２−ジオンのようなビニル含有モノマーは、下記の文献に報告されている一般的な方法を発展させることによって調製することができる。マイアー（Ｍｅｉｅｒ），Ｈ．ら、テトラへドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ）、１９９６、３７（８）、１１９１。この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。この官能性モノマーを使用して、重合の際にミクロスフェアの表面にエノール酸基をカップリングさせることができる。ビニルエノール酸たとえば３−ヒドロキシ−４−ビニル−３−シクロブテン−l，２−ジオンは、下記に文献に報告がある。シュプレンガー（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ），Ｈ．Ｅ．ら、アンゲバント・ヘミー・インターナショナル・エディション・イングリッシュ（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．）、１９６８、７、５３０、この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。
【００５０】
別の実施形態においては、本明細書に記載された方法は、トロポロンを使用して実施することができる。たとえば、本明細書に記載された方法において表面変性剤として使用可能なまた別なエノール酸は、５−置換ヒドロキシトロポロンであって、下記の化学構造を有している。
【化３】
2008516240.tif 000005
【００５１】
ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ），Ｔ．ら、モレキュラー・クリスタルズ・アンド・リキッド・クリスタルズ（Ｍｏｌ．Ｃｒｙｓｔ．Ｌｉｑ．Ｃｒｙｓｔ．）、１９８３、９５、２８７（この文献は、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする）に記載されている方法を修正したものは、５−アミノトロポロンを製造するのに使用することが可能であり、それは、以下に示すようにしてミクロスフェアの表面に付加させることができる。
【化４】
2008516240.tif 000006
各種の置換トロポロンの合成手順は、たとえば、ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）（Ｃ）、１９７１、８７８；ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）（ＰＩ）、１９７６、２３２９；ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９５１、２３５２に報告がある。これらの文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。トロポロンおよび、トロポロン表面基を有するミクロスフェアの合成については、以下において示す実施例４〜６に記述する。
【００５２】
さらなる実施形態においては、本明細書に記載された方法において使用可能なその他のエノール酸としては、シアヌル酸とその誘導体、ボロン酸とその誘導体、ケイ酸とその誘導体、その他のエノール酸とそれらの誘導体を挙げることができる。
【００５３】
シアヌル酸とその誘導体としては、表１、見出し番号２に示す一般式で表すことが可能な化合物が挙げられる。アミドを製造するための、塩化シアヌルを用いて活性化させた樹脂と、カルボキシル基における求核性置換のためにカルボキシル基を活性化させるのに使用される、樹脂結合トリアジンは、ベンカタラマン（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ），Ｋ．ら、テトラへドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ）、１９７９、３２、３０３７に記載がある。この文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。
【００５４】
以下において示すようなトリアジンのビニルモノマーを用いて、重合の際の組み込みによって、ミクロスフェアの表面の上にシアヌル酸またはその誘導体をカップリングさせることができる。
【化５】
2008516240.tif 000007
たとえば、先に挙げたもののようなビニルモノマーを利用して、表面にシアヌル酸とその誘導体を含むエノール酸を有するミクロスフェアを調製することができる。同様にして、バルビツール酸とその各種誘導体を、重合によるか、あるいは適切に官能化されたリンカーによるかのいずれかで、組み入れることが可能である（たとえば、表１、見出し番号３参照）。
【００５５】
本明細書に記載された方法の実施形態において使用可能なその他のエノール酸とそれらの誘導体としては、表１、見出し番号５、６に示す一般式で表されるヘテロサイクリック化合物が挙げられるが、このものは、弱ないしは中程度の酸性を示し、種々の供給業者から市販されている。アスコルビン酸のファミリーに属するエノール酸（下記参照）は、約４．０〜４．２のｐＫａを有する。
【化６】
2008516240.tif 000008
【００５６】
「キノノイド」化合物（表１、見出し番号７参照）たとえばクロラニル酸もまた、市販されている。適切なリンカーを使用することによって、これらの化合物をミクロスフェア表面の上に固定化することができる。２−ヒドロキシナフトキノンは、中程度の強さの酸であって、オキソ炭素酸に類似している。この化合物は、セミスクアリン酸のビニローグとして記載されていた。２−ヒドロキシナフトキノンのヒドロキシ基をボロン酸、ケイ酸、セレン酸またはリン酸基と置き換えることによって、この化合物の酸性度、したがってそれをカップリングさせるミクロスフェア表面を変化させる。
【００５７】
ヒドラジド誘導体たとえばルミノール（表１、見出し番号８）は、イオン化可能なＯＨ基を示し、アミノ基を用いてミクロスフェア表面の上に固定化することが可能である。ルミノールのような化合物は、化学発光分析に使用されてきた。
【００５８】
１，３−シクロヘキサンジオンとその誘導体（表１、見出し番号９）は、約４．８のｐＫａ値を有している。フェノールエノンのような化合物は市販されており、適切なリンカーを用いれば、ミクロスフェアにカップリングさせることができる。そのような化合物の酸性度は、当業者公知の適切な各種の基を含めて、電子吸引性や電子供与性基をそのような化合物に導入することにより調節することができる。
【００５９】
オキシカム誘導体の「モビック（Ｍｏｂｉｃ）」は、非ステロイド性抗炎症薬のエノール酸基のひとつのメンバーである。それは、１．１と４．２のｐＫａ値を有している。この化合物の酸性度が高いのは、その構造の中にスルホン残基が存在しているからである。ＯＨ基と共役するスルホンを組み入れることによって、エノール酸の酸性度を向上させることができる（表１、見出し番号１０〜１３参照）。
【００６０】
表１、見出し番号１４に示した構造は、「オキソ」酸として分類される一般的な基に属する酸のタイプを表していて、このものは、オキソ炭素酸の酸性度を模倣している。
【００６１】
他のモノマーと重合してエノール酸含有表面を有するミクロスフェアが得られる最も好適なビニルモノマーの例が、表１、見出し番号１５に示されている。
【００６２】
さらなる実施形態においては、本明細書に記載された方法を、「混合エノール酸」を用いて実施してもよい。たとえば、アニリンやアニソールスクアレートを利用することによって、表１、見出し番号１６〜１９に示した一般構造で表される混合エノール酸の固定化が容易となる。類似の化合物の合成が、下記の文献に記載されている。ガウガー（Ｇａｕｇｅｒ），Ｊ．ら、ヘミッシェ・ベリヒテ（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．）、１９７０、１０３、２６９６；ベルス（Ｂｅｌｌｕｓ），Ｄ．、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９７８、１００、８０２６；ロウ（Ｌａｗ），Ｋ．Ｙ．とベイリー（Ｂａｉｌｅｙ），Ｐ．Ｃ．、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、１９９２、５７、３２７８；および、マイアー（Ｍｅｉｅｒ），Ｈ．ら、テトラへドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ）、１９９６、３７，１１９１。これらの文献は、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。アミノ誘導体化されたトロポロンは、スクアリン酸のようなオキソ炭素酸に付加させることができる（表１、見出し番号１９）。
【００６３】
さらに、本明細書に記載された方法を、「活性化エノール酸」を用いて実施してもよい。たとえば、本明細書に記載された、「エノール酸を用いてコーティングされた」（すなわち、そのミクロスフェア表面上に位置するエノール酸分子を有する）各種のミクロスフェアは、スクアリン酸をフッ化スクアリン酸に変換させる手順（これは、米国特許出願第２００４／００３９２０１号明細書（ルゲード（Ｌｕｇａｄｅ）ら）に記載されている）を用いて、そのフッ化エノール酸形に活性化させることができる。これらの新規フッ化エノール酸は、ルゲード（Ｌｕｇａｄｅ）らによって記載されたようにフッ化スクアリン酸基が架橋剤として使用されたのと同様にして、本特許出願においても、架橋剤として使用することができる。
【００６４】
それらが２官能性であることから、エノール酸が付加されたミクロスフェアは、特定の金属イオン錯体を形成させるのにも使用することができる（たとえば、下記参照）。次いで、金属キレーター錯体を用いて、サイトに特有の生体分子を捕獲したり、タンパク質またはペプチドをアフィニティ精製したりすることが可能である。
【化７】
2008516240.tif 000009
【００６５】
【表１】
2008516240.tif 000010
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【００６６】
本明細書に記載された方法の実施形態において、ミクロスフェアのための表面変性剤およびカップリング促進剤として使用することが可能なシアヌル酸誘導体の例を以下に挙げる。
【００６７】
化合物ジメトキシトリアジンメチルモルホリン（ＤＭＴＭＭ）を、ミクロスフェアのための表面変性剤として検討した。文献においては、ＤＭＴＭＭがペプチド結合活性化剤として使用されていた。アルキル置換トリアジン誘導体は、ＤＭＴＭＭとして市販されている。ＤＭＴＭＭは、下記の実施例１および２に記載したように、合成することも可能である。本願発明者らは、反応剤をミクロスフェアにカップリングさせることを可能とする表面変性剤としてのその使用を検討した（下記参照）。
【化８】
2008516240.tif 000015
【００６８】
ＤＭＴＭＭのミクロスフェアへのカップリングは順調に進行したが、そのＤＭＴＭＭにカップリングさせたミクロスフェアは、一般的に使用される表面変性剤、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を用いて活性化させたミクロスフェアよりも、疎水性が高い。別の言い方をすれば、ＤＭＴＭＭで変性されたミクロスフェアは、水溶液の中に分散するよりも、むしろ互いに粘着し合う傾向を示した。それとは対照的に、スルホ−ＮＨＳ基を用いてそれに付加させたミクロスフェアは、スルホ−ＮＨＳをミクロスフェア上に元々存在するカルボキシル基と反応させたときに、その表面上に好水的な（すなわち、親水性の）基（スルホ）を保持している。したがってそのミクロスフェアは、水中、水溶液中、溶媒中に、良好な分散状態に保たれる。それとは対照的に、ＤＭＴＭＭは、四級アンモニウム塩残基を有しているために、水溶性である。ミクロスフェアの表面上のカルボキシル基と反応した後では、この陽電荷を失い、それと共に水溶性も失う。このようにして、ミクロスフェアの表面上の親水性カルボキシル基が、疎水性の芳香環に置き換えられ、そのためミクロスフェアの親水性が低下する。
【００６９】
活性化されたミクロスフェアの親水性を向上させるために、以下の反応で示すように、ＤＭＴＭＭのメトキシ基をより親水性の鎖に置き換える。ジ（ポリエチレングリコール）トリアジンクロリドは、生体分子の中にポリエチレングリコール鎖を導入する目的で、すでに調製されていて、それは、日本国特許第８０９２２９４号公報（サクライ（Ｓａｋｕｒａｉ）ら）に記載があり、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）らによる総説がある（アドバンスト・ドラッグ・デリバリー・レビュー（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．）、２００２、５４，４５９〜４７６）（これらの文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする）。親水性基を含むその他のトリアジン化合物については、下記の文献に記載がある：パイゾフ（Ｐｙｚｈｏｖ）ら、デポシッテッド・ドック（Ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ  Ｄｏｃ）、１９８２、ＶＩＮＩＴＩ、１４０８〜８２；マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、ジャーナル・ヒュール・プラクティッシェ・ヘミー（Ｊ．Ｐｒａｋ．Ｃｈｅｍ．），１９８１、３２３、６９４〜６９９；カシュキン（Ｋａｓｈｋｉｎ）ら、ズルナル・オルガニチェスコイ・キミイ（Ｚｈｕｒｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃｈｋｏｉ  Ｋｈｉｍｉｉ）、１９７６、１２、２０３０〜２０３３；および、アーネ（Ａｈｎｅ）ら、シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、１９７５、１８４〜１８６。これらの文献は、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする。したがって、一つの実施形態においては、本明細書に記載された方法において使用されるエノール酸には、親水性基を含むように変性されたＤＭＴＭＭが含まれる。ミクロスフェアの表面上の官能基に表面変性剤をカップリングさせてから、親水性基たとえば、四級アンモニウム、スルホン酸塩、ホスホン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、デンドリマー構造などを使用して、ＤＭＴＭＭおよびその他の表面変性剤の親水性を向上させることができる。本明細書に記載された方法においては、ＤＭＴＭＭの親水性誘導体を、ＥＤＣ／ＮＨＳ表面変性および活性化剤の代わりとして使用する。
【化９】
2008516240.tif 000016
そのような親水性誘導体を用いて、（活性化）ミクロスフェアの表面特性を変化させる一例を、後の実施例３に示す。
【００７０】
ミクロスフェアのエノール酸含有表面は、二つの方法によって生成させることができる。たとえば、ビニル基とエノール酸基との両方を含むモノマーを得え、そして、ミクロスフェアの表面の上にエノール酸基を有し、そのために変性された表面特性を有するミクロスフェアを製造するために、そのモノマーを、他のモノマーたとえばスチレンと共重合させる。その重合は、当業者公知の各種適切な方法を用いて実施すればよい。別な方法として、エノール酸をミクロスフェアにカップリングさせるということには、エノール酸をミクロスフェアの表面に付加させるということが含まれる。別の言い方をすれば、すでに形成されているミクロスフェアの表面を、エノール酸を付加させることにより変化させる。形成されているミクロスフェアにエノール酸を付加させることは、本明細書の記載のようにして実施するか、あるいは当業者の公知のその他各種の適切な方法を用いて実施することができる。
【００７１】
一つの実施形態においては、そのエノール酸には、ミクロスフェアの異なった位置にカップリングされた１種または複数のエノール酸分子が含まれる。別の言い方をすれば、２種以上の異なったエノール酸を、１種のミクロスフェアにカップリングさせる。その異なったエノール酸のそれぞれの分子は、ミクロスフェア表面の上に存在する官能基に直接カップリングさせる。別な方法として、異なったエノール酸を含む複数のモノマーを、必要があれば他のモノマーと組み合わせて共重合させて、その表面上に位置するエノール酸を有するミクロスフェアのポリマーコアを形成させる。
【００７２】
一つの実施形態においては、表面特性を変性することによって、反応剤をミクロスフェアにカップリングさせたときに、その反応剤の安定性が向上する。また別の実施形態においては、表面特性を変性することによってさらに、そのミクロスフェアを用いて実施するアッセイの性能が改良される。たとえば、生体分子が異なれば、最適なアッセイを実施しようとすれば（たとえば、サンプル中の分析対象物を最適に結合させたり、反応させたりするためには）、異なった表面環境（すなわち、ミクロスフェアの表面のすぐ近くの環境）が必要となることもある。そのような局所的な環境を作りだし、調節することは、提案された表面基を使用すれば可能である。本明細書に記載された表面変性剤のいくつかは、反応剤の安定性を向上させたり、アッセイの性能を改良する。本明細書に記載されたその他の表面変性剤は、生体分子をミクロスフェア表面により容易に付加できる。
【００７３】
たとえば、上述のＤＭＴＭＭベースの表面変性剤を使用することにより、生物学的物質がクロスフェアの表面へ異常なカップリングをするのを抑制することができる。この方法においては、「自己カップリング(self-coupling)」ミクロスフェア（すなわち、反応剤に選択的かつ自発的にカップリングする表面基を有するミクロスフェア）を形成させるために、表面変性剤を必ず使用しなければならない訳ではなく、それに付加された改良された表面変性剤や、改良された表面特性を有するミクロスフェアを得るために、現行の方法では使用されているＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ架橋ペアーに代えて表面変性剤を使用することができる。
【００７４】
それに加えて、場合によっては、標準となっているＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳカップリング手順は、幾分かの問題を抱えている可能性がある。たとえば、ＥＤＣとスルホ−ＮＨＳは、空気中の湿分と反応する吸湿性固体であって、ビン中に保存した表面変性剤をフレッシュに保つには特別な注意を払わねばならない。表面変性剤として使用する溶液は、使用直前に作らなければならない。ＥＤＣ活性化の際の尿素副生物は、場合によっては、ビーズ懸濁液から除去するのが困難であって、以後の工程のカップリング反応またはアッセイを妨害する可能性がある。
【００７５】
本明細書に記載された方法は、ミクロスフェアに反応剤をカップリングさせるための標準的な方法に比較して、いくつかの利点を有している。たとえば、ＤＭＴＭＭタイプのクロスリンカーは、（２種の表面変性剤を使用する代わりに）単独で使用して、ミクロスフェアを活性化させることができる。さらに、ＤＭＴＭＭの水溶液は、室温で数時間は安定であるし、もし凍結保存をするならば、もっと長時間安定である。さらに、ＤＭＴＭＭ結晶は空気中の湿分に対してより安定であり、そのため、より容易に満足のいくレベルで作用する。その上、ＤＭＴＭＭの合成は、ＥＤＣの場合ほどに込み入っていることはなく、そのため表面変性剤の品質とばらつきの無さが向上する可能性がある。
【００７６】
また別な実施形態は、ミクロスフェアのポリマーコアにエノール酸をカップリングさせて、エノール酸がミクロスフェアの表面特性を変性するようにした、ミクロスフェアに関する。そのミクロスフェアのポリマーコアは、当業者に公知の各種適切なポリマーから形成されていてよい。そのエノール酸には、ミクロスフェアの異なった位置にカップリングされた１種または複数のエノール酸分子が含まれる。エノール酸を介して、反応剤をミクロスフェアにカップリングさせることができる。他の実施形態においては、エノール酸をエノール酸誘導体または混合官能基と置き換えてもよい。さらなる実施形態においては、エノール酸は、より一般的には、化学基と共役関係にあるイオン化可能な極性基として表すことができる。その化学基としては、スルホン基またはカルボニル基を挙げることができる。
【００７７】
一つの実施形態においては、エノール酸には少なくとも１個の親水性基を含む。また別な実施形態においては、エノール酸には、デルタ酸、スクアリン酸、クロコン酸、もしくはロジゾン酸、またはその他の同族体が含まれる。別の実施形態においては、エノール酸には、５−置換ヒドロキシトロポロンが含まれる。他の実施形態においては、エノール酸には、シアヌル酸またはシアヌル酸誘導体が含まれる。さらなる実施形態においては、エノール酸には、親水性基を含むように変性されたＤＭＴＭＭが含まれる。代わりの実施形態においては、エノール酸には、混合官能基が含まれる。その混合官能基には、ボロン酸またはボロン酸誘導体が含まれる。別な実施形態においては、エノール酸には、ケイ酸またはケイ酸誘導体が含まれる。
【００７８】
一つの実施形態においては、ビニル基を含むモノマーとエノール酸を用いて、別なモノマーと共重合させることにより、エノール酸をポリマーコアにカップリングさせる。別の実施形態においては、エノール酸をポリマーコアの表面に付加させることによって、エノール酸をポリマーコアにカップリングさせる。
【００７９】
表面特性を変性することによって、反応剤をミクロスフェアにカップリングさせたときに、その反応剤の安定性を向上させることができる。表面特性を変性させることによってさらに、そのミクロスフェアを用いて実施するアッセイの性能を改良することもできる。その反応剤は、生体分子であってもよい。表面特性には、電荷密度が含まれる。さらに、表面特性にｐＫａが含まれる。ミクロスフェアのそれぞれの実施形態は、本明細書の記載に従って、さらなる配置、構成、および／または形態がとられていてもよい。上述のミクロスフェアの実施形態のそれぞれは、上述の方法の利点をすべて有している。
【００８０】
それに付加された本明細書に記載された表面変性剤を有するミクロスフェアは、「そのまま使用できる(ready to use)」ミクロスフェアとして供給することができる。さらに、１種または複数の表面変性剤を、ミクロスフェアの上の（表面基にカップリングさせる）表面基を活性化させる、分離されたキットとして供給することも可能である。
【００８１】
一つの実施形態においては、そのキットにはミクロスフェアを含む。そのキットにはさらに、１種または複数の表面変性剤たとえばエノール酸を含む活性化反応剤も含む。その上に、キットには、１種または複数の化合物、１種または複数のデバイス、あるいはそれらのいくつかの組合せが含まれていて、それらを使用することで、エノール酸をミクロスフェアのポリマーコア（またはミクロスフェアのポリマーコアの表面上の基）にカップリングさせて、そのエノール酸がミクロスフェアの表面特性を変性できるようにする。１種または複数の反応剤を、エノール酸を介してミクロスフェアにカップリングさせることができる。（１種または複数の）反応剤が、そのキットに含まれるし、含まれていなくてもよい。
【００８２】
そのキットとキットのそれらの要素に、本明細書の記載に従って、さらなる配置をとらせることも可能である。たとえば、いくつかの実施形態においては、エノール酸をエノール酸誘導体または混合官能基と置き換えてもよい。さらなる実施形態においては、エノール酸は、より一般的には、化学基と共役関係にあるイオン化可能な極性基として表すことができる。その化学基としては、たとえば、スルホン基またはカルボニル基を挙げることができる。本明細書に記載のキットの実施形態のそれぞれは、上述の方法の利点をすべて有している。
【００８３】
以下の実施例は、本発明の実施形態を限定するものと考えてはならず、またそれらは説明のみを目的として本明細書の中に含まれている。
【００８４】
実施例１、２の手順は、クニシマ（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａ），Ｍ．ら、テトラへドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ）、４０、５３２７〜５３３０、１９９９と、クローニン（Ｃｒｏｎｉｎ），Ｊ．Ｓ．ら、シンセティック・コミュニケーションズ（Ｓｙｎ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、２６（１８）、３４９１〜３４９４、１９９６において記載されているＤＭＴＭＭの合成をベースとしたものである（これらの文献を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする）。
【００８５】
実施例１：２−クロロ−４，６−ジ−（２−メトキシエトキシ）−１，３，５−トリアジンの合成
１４．４３ｇ（１９０ｍｍｏｌｅ）の２−メトキシエタノール、６．８３ｇ（８１ｍｍｏｌｅ）の重炭酸ナトリウムおよび１．３ｍＬ（７０ｍｍｏｌｅ）の脱イオン水に、室温で、５．０ｇ（２７ｍｍｏｌｅ）の塩化シアヌルを添加した。その溶液の温度を３０℃に上げ、１時間撹拌すると、その時点で二酸化炭素の発生が停止した。溶液の温度を上げて４５℃とし、撹拌を一夜続けた。冷却後に、その混合物を濾過し、塩化メチレンを用いてその固形分を洗い流した。濾液を合わせて、真空中で濃縮すると、８ｇの２−クロロ−４，６−ジ−（２−メトキシエトキシ）−１，３，５−トリアジンがミルク状の液状物として得られ、このものは、冷凍庫の中（−１８℃）で固化してワックス状固形物となった。
【００８６】
得られた生成物のプロトン核磁気共鳴（1ＨＮＭＲ）の結果は次の通りであった：（ＣＤＣｌ3、６０ＭＨｚ）δ  ４．７〜４．４（ｍ，４Ｈｚ）、３．８〜３．５（ｍ，４Ｈｚ）、３．４（ｓ，６Ｈｚ）。生成物（ニート）の赤外（ＩＲ）分光光度法から、下記の特性ＩＲ吸収周波数が得られた：１５５７ｃｍ-1、１４１７ｃｍ-1、１３３Oｃｍ-1、１１１５ｃｍ-1、１０５０ｃｍ-1、１０２２ｃｍ-1、８１４ｃｍ-1。
【００８７】
実施例２：２−クロロ−４，６−ジ−（２−（ジイソプロピルアミノ）エトキシ）−１，３，５−トリアジンの合成
２７．６ｇ（１９０ｍｍｏｌｅ）の２−（ジイソプロピルアミノ）エタノール、６．８３ｇ（８１ｍｍｏｌｅ）の重炭酸ナトリウムおよび１．３ｍＬ（７０ｍｍｏｌｅ）の脱イオン水に、室温で、５．０ｇ（２７ｍｍｏｌｅ）の塩化シアヌルを添加した。その溶液の温度を３０℃に上げ、１時間撹拌すると、その時点で二酸化炭素の発生が停止した。溶液の温度を上げて４５℃とし、撹拌を一夜続けた。冷却後に、その混合物を濾過し、塩化メチレンを用いてその固形分を洗い流した。濾液を合わせ、真空中で濃縮すると、６ｇの２−クロロ−４，６−ジ−（２−（ジイソプロピルアミノ）エトキシ）−１，３，５−トリアジンが液状物として得られた。
【００８８】
実施例３：塩化４−（４，６−ジ−（２−メトキシエトキシ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムの合成
３．５ｍＬの脱水テトラヒドロフラン中の１．０５ｇ（４ｍｍｏｌ）の２−クロロ−４，６−ジ−（２−メトキシエトキシ）−１，３，５−トリアジン（実施例１の記載に従って得られたもの）に、５３０μＬのＮ−メチルモルホリンを添加した。その溶液を３０分間撹拌し、濾過し、アブデルハルデン（Ａｂｄｅｒｈａｌｄｅｎ）装置中でアセトンを使用して１２時間乾燥させると、０．５ｇ（３４％）の塩化４−（４，６−ジ−（２−メトキシエトキシ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムが白色の粉体として得られた。その反応生成物（ニート）のＩＲ分光光度法により、以下の特性ＩＲ吸収周波数が同定された：１６０５ｃｍ-1、１４１７ｃｍ-1、１３３６ｃｍ-1、１３００ｃｍ-1、１１１８ｃｍ-1、１０９４ｃｍ-1、１０６８ｃｍ-1、１０５３ｃｍ-1、１０２８ｃｍ-1、１００９ｃｍ-1、９９１ｃｍ-1、９７２ｃｍ-1、８５８ｃｍ-1、８２１ｃｍ-1。
【００８９】
実施例２で得られた塩化物から、同様にして、塩化４−（４，６−ジ−（２−ジイソプロピルアミノ）エトキシ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムを得た。
【００９０】
実施例４：親水性ＤＭＴＭＭ誘導体を用いてカルボキシレート化ミクロスフェアを活性化させるための一般的手順
９０μＬの適切な、非求核性緩衝液（ｐＨ：５〜９）の中に懸濁させた、５．０Ｅ６のカルボキシレート化ミクロスフェアのアリコートに、同一の緩衝液中に新規に記載された親水性ＤＭＴＭＭ誘導体（たとえば、実施例３に記載した化合物の一つ）を溶解させた、５０ｍｇ／ｍＬの溶液を１０μＬ添加した。その懸濁液を、２０〜６０分間撹拌した。過剰な反応剤を、当業者公知の各種簡便な方法（たとえば、遠心分離とデカンテーションの繰り返し）を用いて、分離することもできる。次いでその活性化されたミクロスフェアを、アミン含有分子（たとえば、タンパク質）と、適切な、非求核性緩衝液（ｐＨ：４〜９）の中で約２時間、自発的な反応をさせる。
【００９１】
実施例５：５−ニトロソトロポロンの合成
６ｍＬの脱イオン水と６ｍＬの氷酢酸中に２．０５ｇ（１６．９ｍｍｏｌｅ）のトロポロンを溶解させた溶液に、撹拌しながら、５ｍＬの脱イオン水に１．２５ｇ（１８．１ｍｍｏｌｅ）の亜硝酸ナトリウムを溶解させた溶液を滴下により添加した。さらに１時間撹拌してから、得られた固形物を濾過し、真空中で２時間乾燥させると、５−ニトロソ−トロポロンが黄色の固形物として得られた。その反応生成物（ニート）のＩＲ分光光度法により、以下の特性ＩＲ吸収周波数が見出された：１６０３ｃｍ-1、１５１９ｃｍ-1、１３１６ｃｍ-1、１１１０ｃｍ-1、１０１５ｃｍ-1、８４５ｃｍ-1、８１２ｃｍ-1、７８１ｃｍ-1。
【００９２】
実施例６：５−アミノトロポロンの合成
０．３９ｇの５−ニトロソトロポロン（２．６ｍｍｏｌｅ、先の実施例で得られたもの）と１０ｍＬの無水エタノールとの撹拌溶液に、２．９２ｇの塩化スズ（ＩＩ）（１２．９ｍｍｏｌｅ）を添加した。環流温度に４０分間加熱してから、その溶液を冷却し、濾過し、その液状部分を、酢酸エチルと水との間に分配させた。有機フラクションを真空中で濃縮すると、３５ｍｇ（１０％）の５−アミノトロポロンが黄色の固形物として得られた。その反応生成物（ニート）のＩＲ分光光度法により、以下の特性ＩＲ吸収周波数が見出された：３３１９ｃｍ-1、３１８１ｃｍ-1、２９２５ｃｍ-1，１５１１ｃｍ-1、１４１０ｃｍ-1、１２６１ｃｍ-1、８３７ｃｍ-1、７８１ｃｍ-1、７３９ｃｍ-1。
【００９３】
実施例７：トロポロン表面基を有するミクロスフェアの合成
０．５ｍＬの炭酸塩緩衝液（ｐＨ：９）中の１００Ｅ６のカルボキシレート化ミクロスフェア（予めスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとＥＤＣを用いて活性化しておいたもの）の溶液に、２５μＬのジメチルスルホキシドに溶解させた２ｍｇの５−アミノトロポロンを添加した。その懸濁液を４時間撹拌してから、過剰の反応剤をミクロスフェアから洗い流した。
【００９４】
ここで図面に戻ると、図１は、本明細書に記載されたミクロスフェアの実施形態を用いた実験を実施するために使用することができる測定システムの一例を示している。図１が縮尺通りには描かれていないことに注意されたい。具体的には、図面の要素のいくつかの縮尺が、要素の特性を強調するために、極端に拡大されている。たとえばデジタルシグナルプロセッサー（ＤＳＰ）のような、この測定システムのいくつかの要素は、簡明とするために、図面には含まれていない。
【００９５】
図１においては、中をミクロスフェア１０が流動するキュベット１２の断面を通る面に沿って、測定システムが描かれている。一つの例においては、そのキュベットは、標準的な流動血球計数器において使用されているような、標準的な石英キュベットである。しかしながら、各種その他の適切なタイプの、視認または搬送チャンバーを使用して、分析のためのサンプルを搬送させるることができる。ミクロスフェア１０は、本明細書に記載された実施形態に従って、形成させることができる。
【００９６】
この測定システムには光源１４が含まれる。光源１４としては、たとえばレーザーなど、当業者公知の各種適切な光源を挙げることができる。光源は、１種または複数の波長を有する光、たとえば青色光または緑色光を放出するように構成させることができる。光源１４を、キュベットの中を通過するミクロスフェアを照射するように構成することができる。その照射によって、ミクロスフェアが、１種または複数の波長または波長帯を有する蛍光を発するようにする。いくつかの実施形態においては、そのシステムが、光源からの光をミクロスフェアまたは流路の上に焦点を合わせるための、１個または複数のレンズ（図示せず）を含んでいてもよい。このシステムには、２種以上の光源を含んでいてもよい。一つの実施形態においては、光源が異なった波長を有する光（たとえば、青色光または緑色光）を用いてミクロスフェアを照射するように、構成されてもよい。いくつかの実施形態は、光源が、異なった方向でミクロスフェアを照射するように、構成されてもよい。
【００９７】
ミクロスフェアから前方に散乱された光は、屈曲ミラー１８または他の同様の導光成分によって、検出システム１６に向ける。別な方法として、検出システム１６を、前方に散乱された光の経路に直接位置させる。この方式では、システムの中に折り曲げミラーやその他の導光成分を設ける必要はない。一つの実施形態においては、図１に見られるように、前方に散乱された光は、光源１４の照射方向から約１８０度の角度にミクロスフェアによって散乱された光である。前方に散乱された光の角度は、光源による照射方向から正確に１８０度でなくてもよく、そのため、光源からの入射光が検出システムの感光性表面の上に当たらなくてもよい。たとえば、前方に散乱された光は、ミクロスフェアによって照射方向から１８０度より小または大の角度で散乱された光（たとえば、約１７０度、約１７５度、約１８５度、または約１９０度の角度で散乱された光）である。
【００９８】
光源による照射方向から約９０度の角度に、ミクロスフェアによって散乱および／または放射された光もまた集光することができる。一つの実施形態においては、この散乱光を、１個または複数のビームスプリッターまたはダイクロイックミラーを用いて、２種以上の光ビームに分離させることができる。たとえば、照射方向に対して約９０度の角度に散乱されて光を、ビームスプリッター２０によって、２種の異なった光ビームに分離することができる。その２種の異なった光ビームを、ビームスプリッター２２、２４を用いてさらに分離させ、４種の異なった光ビームを作ることもできる。それぞれの光ビームを、別々の、１種または複数の検出器を含んでいてもよい検出システムに向かわせることができる。たとえば、４本の光ビームの一つを、検出システム２６に向けることができる。検出システム２６は、ミクロスフェアによって散乱された光を検出できるように構成してもよい。
【００９９】
その他３本の光ビームも、検出システム２８、３０、３２に向かわせることができる。検出システム２８、３０、３２は、ミクロスフェアによって放出された蛍光を検出するように構成されている。それぞれの検出システムは、異なった波長または異なった波長範囲の蛍光を検出できるように構成されていてよい。たとえば、検出システムの一つを、緑色の蛍光を検出するように構成してもよい。また別な検出システムが、黄色〜オレンジ色の蛍光を検出するように構成し、他の検出システムが赤色の蛍光を検出するように構成してもよい。
【０１００】
いくつかの実施形態においては、スペクトルフィルター３４、３６、３８を、それぞれ検出システム２８、３０、３２と組み合わせてもよい。それらのスペクトルフィルターは、検出システムが検出するように構成されているものとは異なった波長の蛍光を遮断するように構成することができる。さらに場合によっては、１個または複数のレンズ（図示せず）をそれぞれの検出システムに組み合わせることも可能である。それらのレンズは、検出器の感光性表面の上に散乱光または放射された蛍光の焦点を合わせるように構成されているのがよい。
【０１０１】
検出器から出力される電流は、それに入射された蛍光に比例し、電流パルスを発生させる。その電流パルスを変換して電圧パルスとし、低域フィルターを通し、次いで、Ａ／Ｄ変換によりデジタル化することができる。ＤＳＰはそのパルス下の面積を積分し、その蛍光の強さを表す数値を与える。
【０１０２】
いくつかの実施形態においては、ミクロスフェアによって放出された蛍光により発生した出力信号を変換して、ミクロスフェアの素性と、ミクロスフェアの表面上で起きた、あるいは起きている反応についての情報を得ることができる。たとえば、出力信号の内の二つを用いて、ミクロスフェアの素性を求め、他の出力信号を用いて、ミクロスフェアの表面上で起きた、あるいは起きている反応を調べることができる。ミクロスフェアの素性は、異なった２個またはそれ以上の検出ウィンドウにおいて発生させられた出力信号の比をベースとして求めることができる。たとえば、検出システム３０と３２が異なった検出ウィンドウを有している場合、ミクロスフェアの素性は、検出システム３０によって発生させられた出力信号と、検出システム３２によって発生させられた出力信号との比率にそれぞれの信号の強度を組み合わせて、求めることができる。したがって、検出器とスペクトルフィルターの選択は、ミクロスフェアに組み入れるか結合させた染料のタイプ、および／または測定する反応（すなわち、反応に含まれる反応剤に組み入れるか結合させた（１種または複数の）染料）に応じて、変化させることができる。
【０１０３】
図１のシステムには、異なった染料特性を有するミクロスフェアを区別するための、２個の異なった検出ウィンドウを有する２個の検出システムが含まれているが、そのシステムには、３個以上のそのような検出ウィンドウ（すなわち、３個の検出ウィンドウ、４個の検出ウィンドウなど）が含まれるということは、理解されたい。そのような実施形態においては、そのシステムに、追加のビームスプリッターや、また別な検出ウィンドウを含む追加の検出システムが含まれる。３個以上の検出システムのための検出ウィンドウは、先に述べたようにして決めることができる。さらに、スペクトルフィルターおよび／またはレンズを、それら追加の検出システムのそれぞれに組み合わせてもよい。
【０１０４】
また別な実施形態においては、ミクロスフェアの表面の上で反応された異なった物質を区別するように構成された２個以上の検出システムが、システムに含まれる。異なった反応剤物質は、ミクロスフェアの染料特性とは異なった染料特性を有していてもよい。
【０１０５】
本明細書に記載された表面変性されたミクロスフェアの上での測定を実施するために使用可能な、測定システムのさらなる例は、以下の特許文献に説明されている：米国特許第５，９８１，１８０号明細書（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ら）、米国特許第６，０４６，８０７号明細書（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ））、米国特許第６，１３９，８００号明細書（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ））、米国特許第６，３６６，３５４Ｂ１号明細書（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ））、米国特許第６，４１１，９０４Ｂ１号明細書（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ））、米国特許第６，４４９，５６２Ｂ１号明細書（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ら）、米国特許第６，５２４，７９３Ｂ１号明細書（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ら）（これらの特許を、本明細書においてそのすべてについて言及したかのように引用し、組み入れたものとする）。本明細書に記載された測定システムはさらに、それらの特許に記載されているような構成とすることも可能である。さらに、その中で本明細書に記載されたミクロスフェア実施形態が使用することができるアッセイと実験は、それらの特許に記載された各種のアッセイと実験、および公知のアッセイと実験にも含まれる。
【０１０６】
本発明が、ミクロスフェアの表面特性を変化させるための方法を与えると考えられるということは、本開示の利点を有する当業者のよく認識するところであろう。本発明の各種の態様をさらに変性したり変更したりした実施形態も、本明細書を鑑みれば、当業者には自明であろう。したがって、本明細書の記述は、説明のためだけのものと受け取るべきであり、本発明を実施するための一般的な方法を当業者に教示するためのものである。本明細書に示し、記載された本発明の形態は、現時点における好ましい実施形態であると理解されたい。要素や材料は、本明細書に説明し、記載されたものと置き換えてもよく、部品やプロセスも入れ替えてもよく、本発明のある種の特徴は独立して使用してもよいが、これらはすべて、本発明についてのこの記述の便宜を得た後では、当業者には自明のことであろう。前述の特許請求項に記載されているような本発明の精神と範囲から外れることなく、本明細書に記載された要素を変更することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本明細書に記載したミクロスフェアの実施形態を使用して実験を実施するのに使用することが可能な、測定システムの一例を示す概略図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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