【事件の表示】
　特許第２７７４８７２号「ＨＣＶ　ペプチド抗原とＨＣＶの同定方法」の請求項１ないし１８に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７７４８７２号の請求項１ないし１３に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第２７７４８７２号発明は、平成４年６月３０日（優先権主張１９９１年７月４日、ドイツ国、１９９１年１２月１４日、ドイツ国）に出願され、平成１０年４月２４日に設定登録がなされ、その後、三枝英二ら（以下、異義申立人という。）により異義の申立てがなされ、この申立てを受けて当審において第１回の取消理由の通知、訂正拒絶理由通知及び第２回の取消理由の通知がなされ、それぞれの指定期間内に意見書が提出されると共に明細書の訂正請求がなされたものである。なお、第１回の訂正請求は取り下げられている。
　
２．訂正の請求
（１）訂正の概要
　本件訂正の趣旨は、本件特許の明細書を請求書に添付した訂正明細書のとおりに訂正を求めるにあり、その訂正の要旨は、
（イ）特許請求の範囲の減縮を目的として、（ａ）特許請求の範囲の請求項２から、配列番号７で表されるＨＣＶペプチドを削除する、（ｂ）特許請求の範囲の請求項３から、配列番号９および１０で表されるＨＣＶペプチドを削除する、（ｃ）特許請求の範囲の請求項５から、配列番号１５および２９で表されるＨＣＶペプチドならびに鎖長が少なくとも６アミノ酸でありかつ抗ＨＣＶペプチド抗体によって結合され得る配列番号１２、１５および２９の部分配列で表されるＨＣＶペプチドを削除する、（ｄ）特許請求の範囲の請求項６から、鎖長が少なくとも６アミノ酸でありかつ抗ＨＣＶペプチド抗体によって結合され得る配列番号１６の部分配列で表されるＨＣＶペプチドを削除する、（ｅ）特許請求の範囲の請求項８から、鎖長が少なくとも６アミノ酸でありかつ抗ＨＣＶぺプチド抗体によって結合され得る配列番号２３、３０および３１の部分配列で表されるＨＣＶぺプチドを削除する、及び（ｆ）特許請求の範囲の請求項１６から配列番号１４、１５、１７、１８、２０〜２３、２５、２９および３２で表されるＨＣＶぺプチドを削除し、さらに
（ロ）特許請求の範囲の請求項７、９，１０，１４及び１５を削除すると共に、
（ハ）上記（ロ）の訂正に伴い、不明瞭な記載の釈明を目的として、特許請求の範囲の請求項７〜１８の請求項番号を訂正するものである。
（２）訂正の適否
　特許請求の範囲の請求項２，３，５、６及び８を（イ）のように訂正すること、及び同範囲の請求項を（ロ）のように削除することは、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内において特許請求の範囲を減縮するものであり、同範囲の請求項を（ハ）のように訂正することは願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内において（ロ）の訂正に伴う明りょうでない記載を釈明するものであり、かつこれらの訂正は、いずれも実質的に特許請求の範囲を拡張又は変更するものではないと認められる。
　そして、後述するとおり、訂正後の請求項１〜１３に記載された発明は、当業者が下記刊行物１ないし６の記載に基づいて容易になし得たものということはできない上に、他に特許を受けることができない理由を発見しないから、いずれの発明も本件特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　したがって、前記訂正は適法なものであると認められる。
　　　　　　　　　　　　　　　記　
　刊行物１：国際公開公報ＷＯ９０／１１０８９（刊行物１は、平成１１年５月１８日付取消理由通知書で引用した刊行物１と同じものである。特表平４−５０４７１５号公報）
　刊行物２：国際公開公報ＷＯ８９／０４６６９（刊行物２は、同取消理由通知書で引用した刊行物２と同じものである。）
　刊行物３：欧州特許公開公報第０４４２３９４号（刊行物３は、同取消理由通知書で引用した刊行物３と同じものである。）
　刊行物４：Japan J. Exp. Med. Vol.60, 3, p. 167-177, 1990（刊行物４は、同取消理由通知書で引用した刊行物４と同じものである。）
　刊行物５：Journal of Immunological Methods, 102, 259-274, 1987（刊行物５は、同取消理由通知書で引用した刊行物５と同じものである。）
　刊行物６：Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.83, p6159-6173, 1986（刊行物６は、同取消理由通知書で引用した刊行物６と同じものである。）
　
３．特許異議申立てについて
（１）本件特許に係る発明は、上記特許明細書の訂正が認められることから、その特許請求の範囲の請求項１〜１３に記載されている事項により特定される、次のとおりのものである。
【請求項１】　配列番号：１で表されるＨＣＶペプチド。
【請求項２】　配列番号：２、３又は６で表されるＨＣＶペプチド。
【請求項３】　配列番号：４、５又は８で表されるＨＣＶペプチド。
【請求項４】　配列番号：１１で表されるＨＣＶペプチド。
【請求項５】　配列番号：１２で表されるＨＣＶペプチド。
【請求項６】　配列番号：１６で表されるＨＣＶペプチド。
【請求項７】　配列番号：２３、３０又は３１で表されるＨＣＶペプチド。
【請求項８】　配列番号：４，１２及び１６；
　　　　　　　配列番号：４，５，１２及び１６；
　　　　　　　配列番号：３，４，５，１２及び１６；
　　　　　　　配列番号：３，４，５，１２，１６，２６及び２７；
　　　　　　　配列番号：３，４，１１，１２，１６及び２６；
　　　　　　　配列番号：３，４，１２，１６及び２６；又は
　　　　　　　配列番号：６，８，１３，１９及び２８；
からなる抗ＨＣＶ抗体検出用の組合せたＨＣＶペプチド。
【請求項９】　配列番号：２４，３０及び３１からなる抗ＨＣＶ抗体検出用の組合せたＨＣＶペプチド。
【請求項１０】Ｃ末端を形成するアミノ酸をキャリア一に結合させ、当該Ｃ末端から開始してペプチドを段階的に合成し、続いて当該ペプチドをキャリア一から開裂させることから成る、請求の範囲第１〜７項のいずれか１つに記載されたＨＣＶペプチドの調製方法。
【請求項１１】配列番号：１−１１、１２、１３、１６、１９、２４、２６、２７、２８、３０、３１のペプチド抗原のうち、少なくとも２つのペプチド抗原の組合せと共にサンプルをインキュベートし、当該ペプチド抗原に結合したＨＣＶ抗体の量を抗体−抗原複合体の形成が可能な条件下で定量することから成る、ＨＣＶ抗体の定量方法。
【請求項１２】配列番号：４，１２及び１６；
　　　　　　　配列番号：４，５，１２及び１６；
　　　　　　　配列番号：３，４，５，１２及び１６；
　　　　　　　配列番号：３，４，５，１２，１６，２６及び２７；
　　　　　　　配列番号：３，４，１１，１２，１６及び２６；
　　　　　　　配列番号：３，４，１２，１６及び２６；又は
　　　　　　　配列番号：６，８，１３，１９及び２８；
を組合せとして用いる、請求の範囲第１１項に記載の方法。
【請求項１３】配列番号：２４，３０及び３１を組合せとして用いる、請求の範囲第１１項に記載の方法。
（２）特許異議申立人は、訂正前の請求項１〜１８に記載された発明は、甲第１ないし４号証に記載の発明と同一であり、特許法第２９条第１項第３号の規定により特許を受けることができず、さらに、訂正前の請求項１〜１８に記載された発明は、甲第１ないし６号証に記載の発明に基づいて当業者が容易になし得た発明であるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない旨を主張している。
（３）特許法第２９条第１項第３号違反という主張について
（3-1）訂正後の請求項１〜７に記載された発明について
　上記各請求項に係る発明に記載された配列番号１（配列１），同２（同２），同３（同２ａ），同４（同２ｂ），同５（同２ｃ），同６（同２ｄ）、同８（同２ｆ），同１１（同３），同１２（同４），同１６（同６），同２３（同８），同３０（同１１）及び同３１（同１２）で示されるペプチドは、それぞれ１８，３３，１５，１８，２１，６，７，１９，１５，１６，４７，１５及び１８個のアミノ酸を有する特定の長さの、臨床上好適なペプチドであるところ、かかる特定の長さを有するペプチドは刊行物１ないし４には記載されていないし、また、示唆もない。
　この点について、上記各刊行物には、これらの配列をその一部として含むクローン、エピトープ部分或いはエピトープとしての可能性を示唆する領域の記載はあるが、右記載は、これらの特定の長さのペプチドそのものを示すものではないから、本件発明の上記各配列番号で示されるペプチドが各刊行物記載のものと同一であるということはできない。
（3-2）訂正後の請求項８及び９に記載された発明について
　上記請求項に係る発明は特定の長さのペプチドを組み合わせた抗ＨＣＶ抗体検出用のペプチドであるが、これらの組み合わせに使用するものは上記（3-1）で述べたとおりの刊行物１ないし４には記載されていない特定の長さの新規なペプチドである上に、配列番号１３（配列４ａ）、同１９（同６ｃ）、同２４（同８ａ），同２６（同９ａ），同２７（同９ｂ）及び同２８（同９ｃ）で表されるペプチドも刊行物１ないし４には記載されていない特定の長さのペプチドである。
　このため、これらを組み合わせた抗ＨＣＶ抗体検出用ペプチドが、上記刊行物１ないし４に記載された発明と同一であるということはできない。
（3-3）訂正後の請求項１０に記載された発明について 
　上記請求項に係る発明は、上記請求項１〜７に記載された特定の長さの新規なペプチドを合成するための調製方法に関する発明であるから、刊行物１ないし４に記載の発明と同一であるということはできない。
（3-4）訂正後の請求項１１〜１３に記載された発明について
　上記請求項に係る発明は、上記（3-1）及び（3-2）で述べたとおりの新規なペプチド、及び上記刊行物１ないし４に記載されていない配列番号７（配列２ｅ）、同９（同２ｇ）及び同１０（同２ｈ）で示されるペプチドを少なくとも２以上組み合わせてＨＣＶ抗体を定量する方法であるから、上記刊行物１ないし４に記載の発明と同一であるということはできない。
　したがって、訂正後の請求項１〜１３に係る発明は、刊行物１ないし４に記載の発明と同一であるとする特許異議申立人の主張は採用できない。
（４）特許法第２９条第２項違反という主張について
（4-1）訂正後の請求項１〜７に記載された発明について
　上記刊行物１は、抗原性があるとされる１９のクローン（第３８頁１５〜１９行）に加えて、切形の多数のポリペプチド配列（第３８頁２７行から第４０頁２行等）を列記しているものの、これらのポリペプチドの中から、臨床上好適な、即ちＨＣＶ感染の診断に好適なものは、具体的には一個も同定されておらず、また、臨床上好適なポリペプチドを選択するに役立つであろう指針も開示されていない。しかも、同刊行物の第３８頁１１〜１５行には「当業者であれば、抗原性のコンピュータ解析が常に、実際に存在するエピトープを同定するとは限らず、タンパク質のある領域を、エピトープを含むものとして誤って同定することもある、ことが理解されよう。」と記載されていることからもわかるように、本件特許出願当時において、コンピュータ解析を行えば、必然的に、本件特許発明の特定の長さで短鎖の、しかも臨床上有用なポリペプチドを見出すことができたとはいえない。
　次に、刊行物２について検討すると、同刊行物には、クローン５−１−１及びクローン８１においてコードされるＨＣＶポリペプチドとＳＯＤとの融合蛋白質（第９２頁２６行〜第９５頁２６行及び第９２頁１〜２４行）、及びＣ１００ポリペプチドとＳＯＤとの融合蛋白質（第９５頁２８行〜第１０２頁２１行）が抗原性を有することが記載されている。
　しかしながら、同刊行物には、クローン５−１−１の全アミノ酸配列はクローン８１内に含まれるにも拘わらず、３個の血清サンプル１０，１５及び１７は、ＳＯＤ−ＮＡＮＢ（５−１−１）に対してのみ陽性で、ＳＯＤ−ＮＡＮＢ（８１）には陽性でなかったことが示されている。かかる知見は如何なるエピトープを使用するかについて当業者に適切な示唆を与えることが難しいことを示しており、かかる事項を記載する上記刊行物２が、本件特許発明の如くの、臨床上使用しうる特定の長さの短鎖ペプチドを検索しようとする動機を与えるとは言い難い。
　上記刊行物３は、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体の検出等を目的として、各種ポリペプチドを合成し、それについて血清学的確認をしているところ、同刊行物の表１（第１７頁）では、配列II F、II G、II H、III D、III E、III F 及びVEの如く、相当に長い配列が約９０％の相対反応性を示し、また、同配列は多少の差はあれ、Ｃ１００の全配列領域にエピトープが均一に分布していることを示唆している。又、同刊行物の表７（第１８頁）は、５０〜６０又はそれ以上にも及ぶ、多少の差はあれ、長鎖のポリペプチド配列が、より高い相対免疫反応性を有することを示している。これらの実験結果においては、重要なエピトープはＨＣＶ配列の領域全体に均一に分布しており、短鎖のものよりも長鎖のポリペプチドを使用することが有利であることが示唆されていると考えられるから、かかる結果を記載する同刊行物からは、殊更に、短鎖のエピトープを検索し、その臨床効果を確認しようとする動機は生じ難いと考えられる。
　上記刊行物４は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの５’末端配列及びアミノ酸配列の親水性プロファイル（図４）等を記載しているが、同刊行物には、重要なエピトープが、例えば、アミノ酸の約２０〜４０の範囲には存在しないことも示唆しており、かかる刊行物の記載からは、本件特許の如くのポリペプチドを想定することは容易にはなし得ないと考えられる。
　上記刊行物５は、ペプチド合成を用いたエピトープ分析のストラテジーを開示しており、特定のケースにおいてはかかるストラトジーを使用し得るものと認められるが、同刊行物よりも後に刊行され、同刊行物に記載のストラトジーを考慮することができた研究を記載している刊行物３においても、かかる方法は採用されていないこと等からみて、上記ストラトジーが本件発明において容易に採用でき、臨床上好適なＨＣＶエピトープを容易に同定することができたということはできない。
　上記刊行物６は、ＨＩＶエンベロープエピトープに関するものであり、同刊行物に採用されている方法は、刊行物３においても採用されているが、それにも拘わらず、本件発明のペプチドを同定し得なかったことを考慮すると、例え、刊行物３に開示されている知見とあわせても、刊行物６の記載が、本件発明の如くの短鎖のペプチドを得ようとする十分な動機を当業者に与えるとはいうことができない。
  このため、上記各刊行物の記載からは、配列番号２３，同３０及び同３１で示される各ペプチドの如く、いずれのクローンにも含まれないものはいうまでもないことであるが、その他の本件発明の特定の長さで且つ短鎖のペプチドを容易に予測し得るとはいえない。
　一方、上記請求項１〜７に記載されている配列番号１，２，３，４，５，６，８，１１，１２，１６，２３，３０及び３１で示されるペプチドについての臨床上の有用性について検討すると、例えば、配列番号１のものは表Ｉ及びＩＩに、同２のものは表Ｉに、同３のものは表ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに、同４のものは表ＩＩ及びＩＶに、同５のものは表ＩＶに、同６のものは組み合わせに関するデータを示す表Ｖに、同８のものは同表Ｖに、同１１のものは表Ｉ及びＩＩに、同１２のものは表ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに、及び同１６のものは表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶにそれぞれ示されており、また同２３のものは表Ｉ及びＩＩから、同３０及び３１のものは、組み合わせ使用に関する結果を記載する表Ｖから、それぞれのペプチドの臨床上の有用性が具体的に確認し得るものである。
　しかも、配列番号２，１１，１２，１６及び２３は、表Ｉから明らかのように、オルソ・ダイアグノスティック・システム社のＨＣＶ抗体ＥＲＩＳＡ試験では陰性であった血清１に対して陽性であり、配列番号１のものと配列番号１２のものを組み合わせると、血清１を含めた７個の血清全てに陽性であると判定し得るものである。又、表ＩＩによれば、配列番号３，４及び５のものも、かなりの数の血清に対して陽性であることが示されており、しかもオルソ試験では判定が微妙であるものについて判定可能な結果を与えていると認められる。また、配列番号６及び８のイムノアッセイの結果も、それぞれ表ＶＩ、及び表Ｖと表ＶＩに記載されている。そして、これらを適宜組み合わせて使用すれば、多数の血清に対してより広範にかつ正確な判定を可能とすることも、各表例えば、表ＩＩＩ及びＩＶ等から理解しうる。
　このように、本件発明のペプチドが顕著な効果を奏しうることも明らかである。
　したがって、上記各請求項に係る発明は、上記刊行物１ないし６に記載された各発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
（4-2）訂正後の請求項８及び９に記載された発明について
　上記請求項に係る各発明は、（4-1）で述べたとおりの容易に発明することができない各配列番号で示されるペプチド、及び配列番号１３，１９、２４，２６，２７，２８で示されるペプチドを組み合わせたものである。
　そして、かかるペプチドの組み合わせについては、表ＩＩ〜ＶＩＩの適宜箇所において、イムノアッセイの結果が具体的に記載されており、顕著な効果を奏し得たものであるから、上記請求項に記載の組み合わせたペプチドも上記刊行物の記載に基づいて当業者が容易に発明できたものとすることができない。
（4-3）訂正後の請求項１０に記載された発明について
　上記請求項に係る発明は、(4-1)で述べた各ペプチドの合成に関する調製方法であるから、この発明も上記各刊行物の記載に基づいて当業者が容易に発明することができたとすることはできない。
（4-4）訂正後の請求項１１〜１３に記載された発明について
　上記各請求項に係る発明は、（4-1）及び（4-2）で述べたペプチド、及び配列番号７、９及び１０で示されるペプチドを組み合わせてＨＣＶ抗体の量を定量する方法に関するものである。
　そして、配列番号１０のペプチドを組み合わせるイムノアッセイの結果は表ＶＩＩに記載されており、また、配列番号７及び９のペプチドは、それぞれ配列番号６及び配列番号８等のペプチドと極めて近い関係にあり、それぞれの組み合わせ使用における効果も予想し得るものであるから、上記各発明も上記各刊行物の記載に基づいて当業者が容易に発明できたとすることはできない。
　
５．まとめ
　以上のことから、特許異議申立ての上記理由及び提出された証拠方法によっては、本件請求項１〜１３に係る発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年２月２８日（２００１．２．２８）
【訂正の要旨】
　訂正の要旨
Ｉ．特許請求の範囲の減縮を目的として、
　▲１▼　訂正事項ａ　　特許請求の範囲の請求項２から、配列番号７で表されるＨＣＶペプチドを削除する。
　▲２▼　訂正事項ｂ　　特許請求の範囲の請求項３から、配列番号９および１０で表されるＨＣＶペプチドを削除する。
　▲３▼　訂正事項ｃ　　特許請求の範囲の請求項５から、配列番号１５および２９で表されるＨＣＶペプチドならびに「鎖長が少なくとも６アミノ酸でありかつ抗ＨＣＶペプチド抗体によって結合され得る配列番号：１２、１５および２９の部分配列で表されるＨＣＶペプチド」を削除する。
　▲４▼　訂正事項ｄ　　特許請求の範囲の請求項６から、「鎖長が少なくとも６アミノ酸でありかつ抗ＨＣＶペプチド抗体によって結合され得る配列番号：１６の部分配列で表されるＨＣＶペプチド」を削除する。
　▲５▼　訂正事項ｅ　　特許請求の範囲の請求項７を削除する。
　▲６▼　訂正事項ｆ　　特許請求の範囲の請求項８から、「鎖長が少なくとも６アミノ酸でありかつ抗ＨＣＶペプチド抗体によって結合され得る配列番号：２３、３０および３１の部分配列で表されるＨＣＶペプチド」を削除する。
　▲７▼　訂正事項ｇ　　特許請求の範囲の請求項９を削除する。
　▲８▼　訂正事項ｈ　　特許請求の範囲の請求項１０を削除する。
　▲９▼　訂正事項ｉ　　特許請求の範囲の請求項１４を削除する。
　▲１０▼　訂正事項ｊ　　特許請求の範囲の請求項１５を削除する。
　▲１１▼　訂正事項ｋ　　特許請求の範囲の請求項１６から配列番号１４、１５、１７、１８、２０〜２３、２５、２９および３２で表されるＨＣＶペプチドを削除する。
ＩＩ．不明瞭な記載の釈明を目的として、
　▲１２▼　訂正事項ｌ　　特許請求の範囲の請求項７〜１８の請求項番号を請求項７、９、１０、１４および１５の削除に合わせて訂正する。
（５４）【発明の名称】
ＨＣＶペプチド抗原とＨＣＶの同定方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　配列番号：１で表されるＨＣＶペプチド。
　【請求項２】　配列番号：２、３又は６で表されるＨＣＶペプチド。
　【請求項３】　配列番号：４、５又は８で表されるＨＣＶペプチド。
　【請求項４】　配列番号：１１で表されるＨＣＶペプチド。
　【請求項５】　配列番号：１２で表されるＨＣＶペプチド。
　【請求項６】　配列番号：１６で表されるＨＣＶペプチド。
　【請求項７】　配列番号：２３、３０又は３１で表されるＨＣＶペプチド。
　【請求項８】
配列番号：４，１２及び１６；
配列番号：４，５，１２及び１６；
配列番号：３，４，５，１２及び１６；
配列番号：３，４，５，１２，１６，２６及び２７；
配列番号：３，４，１１，１２，１６及び２６；
配列番号：３，４，１２，１６及び２６；又は
配列番号：６，８，１３，１９及び２８；
からなる抗ＨＣＶ抗体検出用の組合せたＨＣＶペプチド。
　【請求項９】　配列番号：２４，３０及び３１からなる抗ＨＣＶ抗体検出用の組合せたＨＣＶペプチド。
　【請求項１０】　Ｃ末端を形成するアミノ酸をキャリアーに結合させ、当該Ｃ末端から開始してペプチドを段階的に合成し、続いて当該ペプチドをキャリアーから開裂させることから成る、請求の範囲第１〜７項のいずれか１つに記載されたＨＣＶペプチドの調製方法。
　【請求項１１】　配列番号：１−１１、１２、１３、１６、１９、２４、２６、２７、２８、３０、３１のペプチド抗原のうち、少なくとも２つのペプチド抗原の組合せと共にサンプルをインキュベートし、当該ペプチド抗原に結合したＨＣＶ抗体の量を抗体−抗原複合体の形成が可能な条件下で定量することから成る、ＨＣＶ抗体の定量方法。
　【請求項１２】
配列番号：４，１２及び１６；
配列番号：４，５，１２及び１６；
配列番号：３，４，５，１２及び１６；
配列番号：３，４，５，１２，１６，２６及び２７；
配列番号：３，４，１１，１２，１６及び２６；
配列番号：３，４，１２，１６及び２６；又は
配列番号：６，８，１３，１９及び２８；
を組合せとして用いる、請求の範囲第１１項に記載の方法。
　【請求項１３】　配列番号：２４，３０及び３１を組合せとして用いる、請求の範囲第１１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
　この発明は、新規なＨＣＶペプチド抗原、当該ペプチド抗原の製造方法、並びに当該ペプチド抗原を用いるＨＣＶの同定方法に関する。
　以前から知られている肝向性の病原体（例えば、ＡＢ型肝炎ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス，肝炎ウイルス，サイトメガロウイルス，及びエプスタイン−バールウイルス）の血清学上のマーカーの非存在下で発生するウイルス性肝炎は、非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢ肝炎）と命名されている。ＮＡＮＢ肝炎は、さらに非経口的かつ特発的に伝染する非Ａ非Ｂ型肝炎と、腸を通じて伝染する非Ａ非Ｂ型肝炎とに分類される。非経口的かつ特発的に伝染するＮＡＮＢ肝炎の原因物質である、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が最近になって分離された（Ｃｈｏｏ　Ｑ．−Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４　（１９８９）３５９−３６２；Ｋｕｏ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４（１９８９）３６２−３６４）。
　ＨＣＶは世界的に広まったＮＡＮＢ肝炎の重大な原因である。そして、ＨＣＶは汚染された血液や血液製剤によって、輸血や親密な個人的接触によって、伝播される。
　ＨＣＶウイルス蛋白のアミノ酸配列は、ＥＰ−Ａ０３１８２１６、ＥＰ−Ａ０３６３０２５、ＥＰ−Ａ０３８８２３２、及びＥＰ−Ａ０３９６７４８により知られている。そのＨＣＶのゲノムは、１０８６２ヌクレオチドの長さを有している。翻訳により現れるその蛋白は、全長が約３０００アミノ酸である。当該蛋白は、構造蛋白（エンベロープ蛋白とコア蛋白）と非構造蛋白（ＮＳｌ−ＮＳ５）とに分類される。
　免疫学的試験を用いて体液中のＨＣＶに対する抗体を検出し、これによりＨＣＶの定量を行うことは得策である。それ故、抗ＨＣＶ抗体に結合する相手が、かかる免疫学的試験において必要とされる。
　例えば、非構造Ｃ１００−３−ＨＣＶ蛋白は免疫学的試験における結合相手として使用しうることが知られている（アボット研究所（米国）とオルソ　ダイアグノステックシステムズ社（米国）の免疫学的試験；Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４（１９８９）３５９−３６４；Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｏｅｌ　Ｃ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｌａｎｃｅｔ　３３７　（１９９１）３１７；Ａｌｔｅｒ　Ｈ．Ｊ．　Ｊ．　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（ｓｕｐｐｌ．）１９９０，７８）。
　これらの試験の欠点は、抗原として組換え蛋白が用いられていることである。蛋白は、変性によって影響を受けやすく、その結果として溶解度と機能が減退する故に診断試験においては取扱いが容易でない。蛋白上のエピトープの密度が低いことの結果として、測定シグナルの強度もまた、抗体の結合相手として短鎖のペプチド抗原を用いる試験におけるよりも小さい。これに加えて、免疫学的試験において抗原として蛋白若しくは長鎖のペプチドを用いる場合、抗体の交差反応と非特異的結合が増加することがある。その上、蛋白との反応はしばしば拡散制御され、これは、免疫学的試験を所望する短時間で達成することの障害になる。さらに、診断を行うのに十分な量と質の蛋白を生産するのには時間とコストがかかる。ペプチドは、合成することにより容易に入手が可能であり、かつ分子が規定されている。
　よって、可能な現り短鎖で、かつ蛋白全体の一部分のみに相当するペプチド抗原を用いることは、抗ＨＣＶ抗体に関する免疫学的試験において有利である。このような免疫学的手法は、０ｋａｍｏｔｏによって記述されている（ＪａｐａｎＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔ．６０（１９９０）２２３−２３４）。しかしながら、当該刊行物に記述された、コア領域に由来する短鎖のペプチド抗原（配列９）は、ＨＣＶに対して十分に感受性とはいえないことがわかってきた。
　これを受けて、本発明の目的は、抗ＨＣＶ抗体に特異的であり、かつ抗ＨＣＶ抗体に関する免疫学的試験に好適なペプチド抗原を提供することにある。
　かかる目的は、以下の配列のペプチド抗原：
又は、少なくとも６個、好ましくは少なくとも７個のアミノ酸より成るこれらのペプチド抗原の部分配列に相当するペプチド抗原によって達成される。
　好ましい部分配列は、配列表中に示されており、また文字／数字の組合せ（例えば、６ａ，２ｂ）によって記されている。
　特に好ましい部分配列は次のものである：
配列２由来
配列４由来
配列６由来
　最大鎖長が９アミノ酸である部分配列が特に好ましい。特に、配列６ｂ，６ｄ，６ｅ，２ｅ，２ｆ，２ｄ，２ｇ，４ａがこれに該当する。
　配列１−３のペプチド抗原は、ＨＣＶ蛋白のＣ１００−３領域に含まれ、配列４−８、１０−１３のペプチド抗原は、ＨＣＶ蛋白のエンベロープ／コア領域に含まれる。本発明に従う配列１−８、１０−１３のペプチド抗原と配列
（ＡｒｇＧｌｙＰｒｏＡｒｇＬｅｕＧｌｙＶａｌＡｒｇＡｌａＴｈｒＡｒｇＬｙｓＴｈｒＳｅｒＧｌｕＡｒｇＳｅｒＧｌｎＰｒｏＡｒｇＧｌｙＡｒｇＡｒｇＧｌｎＰｒｏＩｌｅＰｒｏＬｙｓＡｌａＡｒｇＡｒｇＰｒｏＧｌｕＧｌｙＡｒｇＴｈｒＴｒｐＡｌａＧｌｎＰｒｏＧｌｙＴｙｒＰｒｏＴｒｐＰｒｏ，０Ｋａｍｏｔｏ前掲）のペプチド抗原９は配列表の配列番号１−３２中に明記されている。
　抗ＨＣＶ抗体試験は、当業者に知られている方法により行われる。これにより、本発明は、配列１−１３、若しくは長さが少なくとも６個の、好ましくは少なくとも７個のアミノ酸より成るこれらの部分配列の群がらの少なくとも２つのペプチド抗原の組合せと一緒にサンプルをインキュベートし、そしてペプチド抗原に結合した抗ＨＣＶ抗体の量を、抗体一抗原複合体の形成を可能にする条件において定量することを特徴とする、ＨＣＶ抗体の定量方法に関する。
　本発明によれば、ペプチド抗原又は本発明に従う当該ペプチド抗原の部分配列の少なくとも２つの組合せが用いられる。配列１−３若しくはこれらの部分配列のペプチド抗原が、配列４−１３若しくはこれらの部分配列の群からの少なくとも１つのペプチド抗原と組み合わされるのが好ましい。
　配列９の好適な部分配列は、以下のものである：
かかる抗原の組合せは、例えばいくつかの個々のペプチド抗原を用いることにより、あるいは、好適には自然界でＨＣＶ蛋白中に存在するアミノ酸配列とは異なるアミノ酸橋か、若しくはペプチドリンカーを用いて、ペプチド抗原を互いに共有結合させることによって行われる。
　次の抗原の組合せは特に好ましい：
配列２ｂ，４，及び６
配列２ｂ，２ｃ，４，及び６
配列２ａ，２ｂ，２ｃ，４，及び６
配列２ａ，２ｂ，２ｃ，４，６，９ａ及び９ｂ
配列２ａ，２ｂ，４，６，９ａ及び３
配列２ａ，２ｂ，４，６，及び９ａ
配列２ｅ，２ｇ，４ａ，６ｄ，６ｅ
配列２ｄ，２ｆ，４ａ，６ｃ，９ｃ
配列１１，１２，８ａ
　これらの組合せにおいては、抗原は好ましくはおよそ等モル量で用いられる。
　配列１１，１２，８ａの抗原の組合せは、ＨＣＶ感染が回復しつつある患者の血清（回復期の血清）を検出するのに特に好適である。
　抗原は、互いに共有結合させずに、若しくはペプチドリンカーを用いて一緒に結合させずに、別個に用いることが好ましい。
　感染パラメーターＨＣＶには高感度が必要であるので、検出にはヘテロジニアスイムノアッセイが好適に用いられる。ヘテロジニアス試験では、バックグラウンド信号を相当に減じ、その結果として感度を向上せしめる洗浄工程が可能である。
　定量は、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、又は蛍光抗体法によって行うことができる。このため、通常はペプチド抗原が固定される。抗ＨＣＶ抗体を検査するためのサンプルが加えられ、抗原に結合した抗体が、標識された抗ヒトイムノグロブリン抗体によって定量される。本発明におけるペプチド抗原の固定化は、吸着により、共有結合により、又はビオチン／ストレプトアビジンや抗体／抗原、若しくは糖／レクチンのような生物学的結合対によって行われる。この方法において、ペプチド抗原は、この結合相手に共有結合で結合される。
　本発明によるペプチド抗原は好ましくは当業者に知られている方法で固定化される。例えば、ビーズ、プラスチック管、マイクロタイタープレート（好ましくはポリスチレン若しくはポリスチレン共重合体）に固定化される。これは、好ましくは非特異的にペプチド抗原を表面に吸着させることによって、または官能化された若しくは活性化された表面にペプチド抗原を共有結合させることによって行われる。かかる非特異的な吸着は蛋白にペプチド抗原を結合させて結合体を形成し、そしてこの結合体を前記吸着のために用いることによって改善され得る（例えばＥＰ−Ａ０２６９０９２を参照のこと）。この結合はまた、固定化された抗体によっても行われ得る。このために、ペプチド抗原はエピトープがペプチド−蛋白結合体の形成等による抗体結合によってブロックされないような方法で装飾されるべきである。
　ペプチド抗原と結合相手との結合は、好ましくはスペーサーによって行われる。このスペーサーは好ましくは、１０−５０個の原子を有するのが妥当であり、１０−３０個の原子を有するのが好ましい。そして、このスペーサーはまた本質的に直線状の分子であるのが好ましい。この例としては、アルキル鎖、ポリエーテル鎖、若しくはポリアミド鎖によって形成されているスペーサーが挙げられる。特に好ましい具体例は、４−９アミノ酸の長さによるペプチド抗原が１０−３０原子の直線状スペーサーを介してキャリアーに結合されているものである。仮にアミノ酸で形成されたスペーサーを用いる場合には、そのスペーサーがＨＣＶ遺伝子中のペプチド抗原の近傍にある配列に対応しないアミノ酸で構成されているのが妥当である。
　適切な具体例において、本発明によるペプチド抗原はビオチンに共有結合され、この場合はアビジン／ストレプトアビジン固相によって固定化が行われる。
　定量方法はまた、標識抗体を介するのではなく、標識された付加的なペプチド抗原配列１−１３又はその部分配列を介して検出するのが好適である。
　本発明において、ペプチド抗原は、当業者に知られているペプチド合成法を用いて製造することが可能である。これを受けて、本発明はまた、ペプチド抗原の製造方法に関する。この方法は、キャリアーにＣ末端を形成するアミノ酸を結合させ、Ｃ末端から始めて段階的にペプチド抗原を組立て、続いてキャリアーからペプチド抗原を解離させる工程を含む。
　この方法は詳細には、アミノ酸を例えばそのカルボキシル基を介して不溶性ポリマー（容易にろ過できるもの）に結合させ、その後ペプチド鎖をＣ末端から始めて段階的に組立てる。この目的のためにＮ−保護アミノ酸を人造樹脂の活性基と反応させる。Ｎα−保護基を、キャリアー粒子に共有結合で固定されたアミノ酸から除去し、そして生成するアミノアシルポリマーを、次のＮ−保護アミノ酸と反応させる。Ｎα−保護基をキャリアーに共有結合されたジペプチドから除去し、生成するアミノアシルポリマーを次のＮ−保護アミノ酸と反応させる。すべての過剰な試薬と副産物は、簡便なろ過によって除去される。この方法で所望するペプチド配列が調製されたら、Ｃ末端アミノ酸と高分子キャリアーのアンカー基との間の共有結合を開裂させる。かかる不溶性のキャリアーは、簡便なろ過によって溶液中に存在するペプチドから分離される。このペプチドは、クロマトグラフィー法によって精製される。
　本発明による、ペプチド抗原は、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、ＪＡＣＳ　８５（１９６４）２１４６に従って調製することができる。もしもビオチン化が必要であれば、これは例えばＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８０（１９８３）４０４５　に従って行うことができる。これについての好ましいビオチン化試薬は、ビオチニル−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
　ビオチン化されたペプチド抗原の好ましい製造方法は、ペプチド抗原の固相合成中に、ペプチド抗原のＮ末端にビオチン残基を導入する方法である。この方法は、ペプチド抗原がビオチン化する予定のない数個のε−リシンアミノ基を含む場合に好ましく用いられる。これは、例えば、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ε−ビオチニル−アミノカプロリルリシン、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ε−ビオチニルリシンが用いられる場合か、Ｎ末端アミノ酸のビオチン化のために、ビオチン、ビオチニル−アミノカプロン酸、又はジメトキシトリチルビオチンが、例えばジシクロヘキシカルカルボジイミドのような活性化試薬と共に用いられるか、又は活性型エステルとして用いられる場合である。
　さらに好ましい具体例では、例えばヒトＩｇＧのＦｃ部に向けられた検出抗体が固定される。モノクローナル抗体がこの検出抗体として用いられる。ペプチド抗原は、そのときは溶液中に存在する。サンプル液中の検出すべき抗体（被分析物）と他の全ての抗体は固定化された抗体によって結合される。結合された抗体は、その後被分析物と結合することができ、被分析物は好適な検出系、例えばペプチド抗原−酵素結合体による競合的な検出系により検出され得る。
　また、本発明によるペプチド抗原を用いて、当業者に知られている免疫化法によって抗体を得ることが可能であり、これによりウイルス自体を免疫学的試験で検出することができる。
　かくして、本発明はまた抗体の製造方法に関する。この方法は、哺乳動物を、所望によりキャリアーに結合されている本発明ペプチドで免疫化し、そして抗体を公知の方法に従い、例えば血清や脾臓から得ることにより特徴付けられる。
　好適な具体例としては、免疫された動物のＢリンパ球をトランスフォーミング剤の存在下で好適な細胞系と融合し、所望の抗体を生産する細胞系をクローン化し、培養して、モノクローナル抗体を細胞又は培養上清から単離する。
　この抗体を用いれば、ＨＣＶウイルスを直接定量することが可能である。従って、本発明はまたＨＣＶウイルスの定量方法に関する。この方法は、サンプルを抗原−抗体複合体の形成が許容される条件下で本発明抗体とインキュベートし、その結果形成された抗体−抗原複合体を定量することにより特徴付けられる。
　加えて本発明は、本発明ペプチド抗原を用いるワクチンの製造法に関する。そして、ＨＣＶ　感染を治療するための当該ワクチンは、所望によりキャリアーに結合させて、配列１−８、１０−１３のペプチド抗原を、若しくはこれらの部分配列を、又は配列１−１３か、その部分配列の少なくとも２つのペプチド抗原を、薬理学上効果的な用量でかつ製薬学上許容され得る処方で、免疫原として含んでいる。
　これらのワクチンの製造は、公知の方法によって行うことができる。とはいえ、そのペプチド抗原は、初めに凍結乾燥を行い、その後所望により補助物質を加えて懸濁させることが好ましい。
　本発明によれば、かかるワクチン、又はかかるワクチンの組合せによる予防接種は、当業者に知られている方法、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、又は鼻腔内に行うことができる。
　筋肉内又は皮下投与する場合は、ワクチンを例えば生理食塩水中に懸濁することができる。鼻腔内や眼内に適用するためには、ワクチンを、例えばスプレーか水溶液の形態で用いることができる。局所、例えば経口投与するためには、免疫原を不活性から、例えば口腔内や胃内の蛋白分解酵素から一時的に保護することが往々にして必要である。この一時的な保護は、例えば免疫原をカプセル化することにより達成され得る。このカプセル化は、例えば保護剤でコーティングすることにより（マイクロカプセル化）、又は大量の本発明免疫原を保護キャリアー内に包埋すること（マイクロカプセル化）により行い得る。
　カプセル化用の材料は、半透性か、ヒトや動物の体内に導入されたときに半透性になるものであり得る。一般的には、生物学的に分解される物質がカプセル化のキャリアーとして用いられる。
　本発明は、以下の実施例と配列表によりさらに説明される。
　次に配列表を表示する：
実施例１
Ｈ−ＰｒｏＡｒｇＧｌｙＳｅｒＡｒｇＰｒｏＳｅｒＴｒｐＧｌｙＰｒｏＴｈｒＡｓｐＰｒｏＡｒｇＡｒｇ−ＯＨの合成
　当該ペプチドは、Ｆｍｏｃ（フルオレニルオキシカルボニル）固相合成によって調製した。かかる反応は、ラボテック（Ｌａｂｏｒｔｅｃ；スイス）のＳＰ６４０ペプチド合成機によって行われた。Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体に関して、カップリング反応は、２．４当量のジシクロヘキシルカルボジイミドの２．２当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールにより９０分間行った。ジメチルホルムアミドを反応媒体として用いた。当該Ｆｍｏｃ基は、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンを用いて１０及び２０分間で開裂させた。２．０当量の以下のアミノ酸誘導体を使用した：Ｐｒｏ，Ａｒｇ（ＰＭＣ（ペンタメチルクロマン）保護基を有する）、Ｇｌｙ，Ｓｅｒ（ｔ−ブチル保護基を有する）、Ｔｒｐ，Ｔｈｒ（ｔ−ブチル保護基を有する）、Ａｓｐ（ｔ−ブチルエステル保護基を有する）。カップリング反応は半分の試薬を用いて繰り返した。当該カップリングの結果は、カイザー試験（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４　（１９７０）５９５）によって確認し、樹脂の負荷はそれぞれのピペリジン開裂の後で放出されたフルベン基による紫外線吸光度によって確認した。ペプチドは０．５０ｍＭｏｌ／ｇを負荷しうるワング樹脂（ポリスチレン／１％ジビニルベンゾール）５ｇ上で合成した（ＪＡＣＳ，９５（１９７３）１３２８）。当該合成後、負荷の程度はまだ０．３９ｍＭｏｌ／ｇであった。
　２００ｍｌのトリフルオロ酢酸、２００ｍｌのジクロロメタン、１０ｍｌのエタンジチオール、１０ｍｌのｍ−クレゾール、５ｍｌのエチルメチルスルフィド、及び５ｍｌの水中にて室温で３０分間処理してペプチドを放出させた。この開裂溶液は、トルオールと一緒に数回蒸発させ、その後当該ペプチドをジエチルエーテルで沈澱させた。
　スカベンジャー及び他の小分子を除去するために、その粗物質をセファデックスＧ１０カラム上で精製した。凍結乾燥の後、３．２ｇの物質が４２％（ＲＰ−ＨＰＬＣ）の純度で得られた。当該物質の最終純度を９５％より上とするために、４００ｍｇのペプチドを、Ｃ１８物質（５マイクロメーター，３００オングストローム）が充填された、調製ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（４００ｍｍ×２５０ｍｍ）で、水／トリフルオロ酢酸，アセトニトリル／トリフルオロ酢酸勾配によって精製した。凍結乾燥後、１１８ｍｇの９６．５％（ＨＰＬＣ）の白色物質を得た。当該物質の同一性は、ＦＡＢ−ＭＳによって確認された。
実施例２
　実施例１で得たペプチド抗原をビオチン化するために、アルゴン飽和リン酸カリウム緩衝液（０．１ｍｏ１／，ｐＨ８．０）中に１モル当量を可能な限り濃縮して（溶解度はアミノ酸配列に左右される）溶解した。そして、これにアルゴン飽和ジメチルホルムアミド（５μｌのＤＭＦ中における１μｍｏｌの試薬の溶液）中に溶解した３当量のＤ−ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加する。
　反応混合物は、継続的に分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで監視しつつ、アルゴン雰囲気下で２時間室温において撹拌した。５％未満の遊離体が存在したときには、反応物を直接、調製ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに供した。そして、当該生成物を、０．１％トリフルオロ酢酸／水から０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル勾配によって精製した（勾配：９０分で０％から１００％）。その生成物は、生成物画分を蒸発させ、かつ凍結乾燥することにより得られた。収率は、４０％と９０％の間であった。純度は、ＨＰＬＣ，ＨＰＣＥおよびＴＬＣによって分析し、同一性はＦＡＢ−ＭＳ（モルピーク）と特異的染色試薬（ビオチンではｐ−ジメチル−アミノシンナミックアルデヒド）を用いたＴＬＣによって確認し、そして量は微量分析（窒素）によって検定した。
実施例３
　ＨＣＶ　抗体は、２段階サンドイッチイムノアッセイ法によって定量する。以下の組成の試薬を当該試験に使用する：
試薬１：
　０．１０μｇ／ｍｌ（ペプチド抗原１，３，４，５，６）又は０．２５μｇ／ｍｌ（ペプチド抗原２，４，７）のビオチン化ペプチド抗原、又はこれらのペプチド抗原の１：１混合物。
４０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．０
０．９重量％ＮａＣｌ
１０容量％ウシ血清
試薬２：
　２０ｍＵ／ｍｌ　ヒト免疫グロブリンに対するポリクローナル抗体（ヒツジ）とペルオキシダーゼとの複合体
４０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液　ｐＨ７．０
０．０５重量％　ＴｗｅｅｎＲ２０
０．２％　ウシ血清アルブミン
０．２％　ウシＩｇＧ
　１ｍｌの試薬１と１０μｌのサンプルを、ストレプトアビジンを被覆したポリスチレン管（ＥＰ−Ａ　０３４４５７８の実施例１に従って調製した）の中で室温で１時間インキュベートする。引き続き、当該ポリスチレン管を、水道水で３回洗浄し、そして１ｍｌの試薬２と室温で１時間インキュベートする。次いで、当該ポリスチレン管を３回水道水で洗浄する。１ｍｌのＡＢＴＳＲ（３．２ｍｍｏｌ／ｌの過ホウ酸ナトリウムを含む１００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸−クエン酸塩緩衝液　ｐＨ４．４中に２，２′−アジノージ［３−エチル−ベンゾチアゾリンスルフェート（６）］ジアンモニウム塩を１．９ｍｍｏｌ／ｌ含有）を検出反応のために加える。４２０ｎｍにおける吸光度を６０分後に光度計で測定する。結果を表Ｉに示す。
実施例４
　ストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタープレート上で、２段階サンドイッチイムノアッセイ法によって、ペプチドまたはペプチド混合物を用いて血清を調べた。
　その定量は、概ね実施例３に類似する方法で行った。そのために以下の試薬を使用した：
試薬１：
　１００μｌのインキュベーション緩衝液（４０ｍｍｏｌ／ｌ　リン酸緩衝液　ｐＨ７．０，０．９重量％ＮａＣｌ，１０容量％　ウシ血清）中の、５０ｎｇのペプチド（若しくは表の注釈において記述した量）。
試薬２：
　ヒト免疫グロブリンに対するポリクローナル抗体（ヒツジ）とペルオキシダーゼ（ペルオキシダーゼ活性２０ｍＵ／ｍｌ）との複合体、４０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．０、０．０５重量％ＴｗｅｅｎＲ２０、０．２％ウシ血清アルブミン、０．２％ウシＩｇＧ
洗浄液：
　４０ｍｍｏ１／ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．０、０．９重量％塩化ナトリウム、０．０５重量％ＴｗｅｅｎＲ２０
発色試薬：
　１０ｍｇＡＢＴＳＲ、８０μｌのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．４、１００ｍｍｏｌ／ｌ）１０ｍｌ中の０．４％Ｈ２Ｏ２
　血清（５０μｌのインキュベーション緩衝液で１：１０に希釈）と１００μｌの試薬１を、ストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタープレートの各ウエルに添加する。１時間室温でインキュベートし、引き続いて毎回２００μｌの洗浄液で５回洗浄する。１５０μｌの試薬２を加え、室温で１時間インキュベートして、毎回２００μｌの洗浄液で３回洗浄する。１５０μｌの発色試薬を加え、室温で１時間インキュベートし、４２０ｎｍにおける吸光度を光度計で測定する。
　表ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、及びＶＩＩに結果を示す。
　これらの表における表示は以下の如くである：
表ＩＩ：
　Ｏｒｔｈｏ：オルソ試験における測定信号の相対的大きさ（実施例３を参照のこと）。
　空白部：測定値がブランク値の２倍より小さいか、ブランク値と同一である（ＨＣＶ抗体には反応しない（ナンセンス配列）ビオチン化ペプチドで定量）。
　黒丸：ウエルあたり５０ｎｇのペプチドを用いて、測定値がブランク値の３倍またはそれ以上である。
　白丸：ウエルあたり５０ｎｇのペプチドを用いて、測定値がブランク値の２倍である。
　黒四角：ウエルあたり２５０ｎｇのペプチドを用いて、測定値がブランク値の３倍またはそれ以上である。
　白四角：ウエルあたり２５０ｎｇのペプチドを用いて、測定値がブランク値の２倍またはそれ以上である。
　＊：陰性対照
表ＩＩＩ：
　空白部：表ＩＩと同様である。
　黒丸：ウエルあたり５０ｎｇのペプチドで、測定値がブランク値の４倍またはそれ以上である。
　白丸：ウエルあたり５０ｎｇのペプチドで、測定値がブランク値の３倍またはそれ以上である。
　ｎ．ｔ．：計測しなかった。
　２ａ，２ｂ，３，４，６：単一のペプチド抗原の代わりに、表示したペプチドの各々１０ｎｇの混合物を試薬１中において用いた。
　＊：陰性対照
表ＩＶ：
　記号の意味は、表ＩＩの記載に対応する。
　ペプチド混合物は、個々のペプチドを５０ｎｇ含有する。
実施例５
　表Ｖ、ＶＩ、及びＶＩＩ
実施例３に類似するイムノアッセイの結果を示す。以下のペプチド濃度を試薬１において使用した：
　いくつかの抗原を組み合わせて用いたとき、使用量は個々の抗原の数に応じて減らした。
配列２ａ　　５０μｇ／ｍｌ
配列２ｂ　　５０μｇ／ｍｌ
配列２ｄ　　１００μｇ／ｍｌ
配列２ｆ　　１００μｇ／ｍｌ
配列２ｈ　　１００μｇ／ｍｌ
配列４　　　４００μｇ／ｍｌ
配列４ａ　　３５０μｇ／ｍｌ
配列４ｂ　　２５０μｇ／ｍｌ
配列４ｃ　　３００μｇ／ｍｌ
配列６　　　３５０μｇ／ｍｌ
配列６ａ　　３５０μｇ／ｍｌ
配列６ｂ　　３５０μｇ／ｍｌ
配列６ｃ　　２５０μｇ／ｍｌ
配列６ｄ　　３００μｇ／ｍｌ
配列８ａ　　９００μｇ／ｍｌ
配列９ａ　　３５０μｇ／ｍｌ
配列９ｃ　　３５０μｇ／ｍｌ
配列１１　　３００μｇ／ｍｌ
配列１２　　５５０μｇ／ｍｌ
　＋／一：陽性／陰性（実施例３におけると同様のイムノアッセイにおける陽性信号のカットオフは、６つの陰性対照血清のグループについての４２０ｎｍにおける平均吸光度プラス２標準偏差として定義付けられる。サンプルは、１：１００の希釈で測定した）。