(57)【要約】  末梢性ベンゾジアゼピン受容体とは無関係の機構により、腫瘍細胞において反応性酸素種のミトコンドリア内生成を生じさせる化合物の適用を通して癌を治療する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カスパーゼ９アポトーシス経路を活性化するための作用物質を被験者に治療有効量投与する工程を含む、被験者において細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、前記作用物質が前記細胞のミトコンドリアと相互作用してミトコンドリア内スーパーオキシド生成を生じさせることを特徴とする、該方法。
【請求項２】
前記作用物質がさらに前記細胞内におけるシトクロムＣの放出を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記作用物質がミトコンドリア内に内在化される、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記ミトコンドリア内スーパーオキシド生成が、ＮＡＤＰＨオキシダーゼと前記作用物質の間の相互作用の結果である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ミトコンドリア内スーパーオキシド生成が、前記作用物質へのＮＡＤＰＨオキシダーゼの酵素作用の結果である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＡＤＰＨオキシダーゼが前記作用物質から少なくとも１個のハロゲン原子を除去する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ハロゲンが塩素である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＮＡＤＰＨオキシダーゼが前記作用物質から少なくとも１個のハロゲン原子を除去し、前記除去したハロゲン原子の各々を酸素原子で置換する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ミトコンドリアが、アデニンヌクレオチドトランスロケーター部分を備える表面遷移孔を有し、前記生成スーパーオキシドが、前記ミトコンドリア表面遷移孔の前記アデニンヌクレオチドトランスロケーター部分のチオール酸化を生じさせる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記作用物質がＰＫ１１１９５及びＭＰＴＰから成る群より選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
癌を有する患者にミトコンドリア内スーパーオキシドを生成するための作用物質を治療有効量投与することを含む、癌を有する患者を治療するための方法。
【請求項１２】
前記作用物質がさらにカスパーゼ９アポトーシス経路を活性化する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記作用物質がさらに前記細胞内におけるシトクロムＣの放出を誘導する、請求項１１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記作用物質を複数回投与物として前記患者に投与する、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が抗腫瘍薬を投与することをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記抗腫瘍薬の少なくとも１回の投与を前記作用物質の少なくとも１回の投与の７日以内に実施する、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記抗腫瘍薬を前記作用物質の少なくとも１回の投与の４８時間以内に投与する、請求項１５〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記作用物質がＰＫ１１１９５及びＭＰＴＰから成る群より選択される、請求項１１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
カスパーゼ９アポトーシス経路を活性化するための作用物質を細胞に投与することを含む、細胞を抗腫瘍薬治療に対して感作させるための方法であって、前記作用物質が前記細胞のミトコンドリアと相互作用してミトコンドリア内スーパーオキシド生成を生じさせる、該方法。
【請求項２０】
前記作用物質がさらに前記細胞におけるシトクロムＣの放出を誘導する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記作用物質を抗腫瘍薬より前に又は抗腫瘍薬と同時に投与する、請求項１９〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記作用物質を抗腫瘍薬の投与前４８時間以内に投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
癌の治療のために有用な化合物を特定するための方法であって、
ａ．成育可能なミトコンドリアを含む試料を提供する工程；
ｂ．前記試料を候補化合物と接触させる工程；及び
ｃ．前記ミトコンドリアによるスーパーオキシド産生のレベル又は前記ミトコンドリアの膜電位を評価し、前記ミトコンドリアのスーパーオキシド産生を上昇させる又は膜電位を変化させる化合物を癌の治療のために有用な化合物として特定する工程
を含む、該方法。
【請求項２４】
前記試料がマイトプラストを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が成育可能な細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ミトコンドリアが実質的な量の末梢性ベンゾジアゼピン受容体を含んでいない、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記接触工程において前記細胞がＮＢＤ  ＦＧＩＮ−１−２７に結合しない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記接触工程における前記細胞がＨＬ６０前骨髄性白血病細胞又はジャーカットＴ細胞性白血病細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記特定工程がＣＭＨ２ＤＣＦ蛍光を検出する工程を含む、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
癌の治療のために有用な化合物を特定するための方法であって、
ａ．ＮＡＤＰＨオキシダーゼを含む試料を提供する工程；
ｂ．ハロゲン原子を含有する候補化合物に前記試料を接触させる工程；及び
ｃ．前記化合物からの前記ハロゲン原子の除去又は前記試料における反応性酸素種の生成を評価し、前記ＮＡＤＰＨオキシダーゼによって除去されるハロゲン原子を有する化合物又は反応性酸素種の生成を生じさせる化合物を癌の治療のために有用な化合物として特定する工程
を含む、該方法。
【請求項３１】
癌細胞においてＮＡＤＰＨオキシダーゼレベルを評価する工程を含む、カスパーゼ９経路を通してアポトーシスの活性化を生じさせる作用物質を用いて治療し得る癌細胞を特定するための方法であって、カスパーゼ９経路を通してアポトーシスの活性化を生じさせる前記作用物質の治療有効量を反応性酸素種に変換するのに十分なＮＡＤＰＨオキシダーゼレベルを有する細胞を、前記作用物質を用いて治療し得る癌細胞として特定することを特徴とする、該方法。
【請求項３２】
前記細胞をヒト患者から得る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
癌を治療するため又は他の抗癌治療化合物と共に使用するための作用物質であって、細胞内のミトコンドリアを活性化して又はミトコンドリアに結合して、該細胞内におけるシトクロムＣの放出とカスパーゼ９アポトーシス経路の活性化とを導くミトコンドリア内スーパーオキシド生成を生じさせる、該作用物質。
【請求項３４】
前記作用物質が、ＮＡＤＰＨオキシダーゼと相互作用してミトコンドリア内スーパーオキシドの形成を生じさせる、請求項３３に記載の作用物質。
【請求項３５】
請求項３３〜３４のいずれかに記載の作用物質と製薬上許容される担体とを含有する組成物。
【請求項３６】
カスパーゼ９アポトーシス経路を活性化するための作用物質の治療有効量を被験者に投与することを含む、該被験者においてリンパ球のアポトーシスを誘導するための方法であって、前記作用物質が前記リンパ球のミトコンドリアと相互作用してミトコンドリア内スーパーオキシド生成を生じさせる、該方法。
【請求項３７】
前記作用物質がさらに前記リンパ球内でのシトクロムＣの放出を誘導する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記作用物質がＰＫ１１１９５又はその類似体である、請求項３６〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記作用物質がＭＰＴＰ又はその類似体である、請求項３６〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
請求項２３〜３０に記載のスクリーニング方法によって特定される作用物質。
【請求項４１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法に従って被験者を治療するための薬剤の製造における、作用物質の使用であって、該作用物質が細胞のミトコンドリアと相互作用してミトコンドリア内スーパーオキシド生成及びカスパーゼ９アポトーシス経路の活性化を生じさせることを特徴とする、該使用。
【請求項４２】
前記細胞がリンパ球である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
請求項１１〜１８のいずれかに記載の方法に従って癌を有する患者を治療するための薬剤の製造における、作用物質の使用であって、該作用物質がミトコンドリア内スーパーオキシドを生成することを特徴とする、該使用。
【請求項４４】
請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法に従って細胞を抗腫瘍薬治療に対して感作させるための薬剤の製造における、作用物質の使用であって、該作用物質が細胞のミトコンドリアと相互作用してミトコンドリア内スーパーオキシド生成及びカスパーゼ９アポトーシス経路の活性化を生じることを特徴とする、該使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌及び他の疾患を治療するために、ミトコンドリア電子伝達鎖の複合体Ｉ又はＮＡＤＰＨオキシダーゼを通して行われるようなミトコンドリア内でのスーパーオキシドの生成の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常細胞に対し腫瘍細胞において選択的にアポトーシスを誘導することは癌治療薬発見の重要な目標である。臨床開発段階にある多くの薬剤は、特に細胞質内あるいは細胞膜又はその付近で反応性酸素種の生成を生じさせる、細胞におけるシグナル伝達経路の引き金を引くことにより、選択的にアポトーシスを誘導するように設計されており、最終的にミトコンドリア膜透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）の開口を引き起こす効果を奏する。ＰＴＰＣの開口はミトコンドリアの膜脱分極を生じさせ、それがシトクロムｃの放出を引き起こし、アポトーシスによる細胞死へと導くプログラムされた一連の工程を開始させる。
【０００３】
末梢性ベンゾジアゼピン受容体（ＰＢＲ）を結合させることによるアポトーシスの誘導は、癌治療のための戦略として注目を集めてきた。ＰＢＲは理解しにくい機能を有するミトコンドリアタンパク質である。ＰＢＲは、化学療法により誘導される細胞死の期間の早期に、ミトコンドリア膜貫通電位を消失させる酸化還元感受性メガチャネルであるＰＴＰＣと物理的に結合する。ＰＢＲは、イソキノリンカルボキサミドＰＫ１１１９５の細胞傷害促進活性に基づき、ＰＴＰＣの調節に関係付けられてきた。
【０００４】
ＰＫ１１１９５はＰＢＲに対してナノモルレベルの結合親和性を示す（１、２）。ＰＢＲは、原子間力顕微鏡によって明らかにされたように、五量体立体配置でミトコンドリア外膜に局在する１８ｋＤａタンパク質である（３）。ＰＢＲはＰＴＰＣと結合し、ここで該ＰＴＰＣの多量体構造は、ミトコンドリア外膜では電位依存性陰イオンチャネル（ＶＤＡＣ）とヘキソキナーゼから成り、ミトコンドリア内膜ではアデニンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）とシクロフィリンＤから成る（４−６）。ＰＴＰＣは次に、細胞のアポトーシス閾値を調節するＢｃｌ−２ファミリーの細胞死アゴニスト及び細胞死アンタゴニストの両方のタンパク質と物理的に結合する（７、８）。ＰＫ１１１９５は、インビトロ及びインビボで多種多様なアポトーシス誘導物質に対してＢｃｌ−２及びＢＣＬ−ＸL抵抗性となるよう細胞を感作させることが示されており（９−１２）、ＰＴＰＣへのＰＢＲ依存性作用を示唆した（１１）。ＰＫ１１１９５はまた、呼吸調節の阻害（１３）、細胞増殖の阻害（１４）、及びミトコンドリアのコレステロール輸送の調節（１５）を含む、多様な細胞作用を媒介することが示された。
【０００５】
ＰＢＲについての役割はＰＫ１１１９５の細胞作用の多くを媒介することに関係付けられてきたが、増殖の阻害及び細胞傷害の増強などの一部の薬理作用はもっぱら、受容体を飽和させるのに必要とされるよりも何桁も大きいマイクロモル範囲で起こることがインビトロで示された（１６、１７）。従って、ＰＢＲに帰せられる機能は誤って報告されており、それにより、とりわけ癌を治療するために特に有用な新しい治療化合物を特定するために、観察された細胞作用を十分に利用するという試みを妨げてきたと我々は考える。
参照文献
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８．Ｍａｒｚｏ，Ｉ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｃ，Ｚａｍｚａｍｉ，Ｎ．，Ｓｕｓｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｂｅｕｔｎｅｒ，Ｇ．，Ｂｒｄｉｃｚｋａ，Ｄ．，Ｒｅｍｙ，Ｒ．，Ｘｉｅ，Ｚ．Ｈ．，Ｒｅｅｄ，Ｊ．Ｃ，ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．Ｔｈｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ：Ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｓｐａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｂｃｌ−２−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  ＥＸＰ  ＭＥＤ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８７：１２６１−１２７１，１９９８．
９．Ｂａｎｋｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｆｅｎｎｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｌｍａｎ，Ｃ．Ｌ．，Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，Ｆ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｏｔｔｅｒ，Ｆ．Ｅ．ＰＫ１１１９５，ａ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ，ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｂｙ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ，２６：９１−１０６．，２００２．
１０．Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｉｍｂｕｌａ，Ｇ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｇｌａｓｃｏｔｔ，Ｐ．Ａ．，Ｊｒ．，Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｆａｒｂｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７１：２９７９２−２９７９８，１９９６．
１１．Ｈｉｒｓｃｈ，Ｔ．，Ｄｅｃａｕｄｉｎ，Ｄ．，Ｓｕｓｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ，Ｐ．，Ｌａｒｏｃｈｅｔｔｅ，Ｎ．，Ｒｅｓｃｈｅ−Ｒｉｇｏｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．ＰＫ１１１９５，ａ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  Ｂｃｌ−２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２４１：４２６−４３４，１９９８．
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１８．Ｃａｒａｙｏｎ，Ｐ．，Ｐｏｒｔｉｅｒ，Ｍ．，Ｄｕｓｓｏｓｓｏｙ，Ｄ．，Ｂｏｒｄ，Ａ．，Ｐｅｔｉｔｐｒｅｔｒｅ，Ｇ．，Ｃａｎａｔ，Ｘ．，Ｌｅ  Ｆｕｒ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｃａｓｅｌｌａｓ，Ｐ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｒａｄｉｃａｌ  ｄａｍａｇｅ．Ｂｌｏｏｄ，８７：３１７０−３１７８，１９９６．
１９．Ｚｉｓｔｅｒｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｃａｍｐｉａｎｉ，Ｇ．，Ｎａｃｃｉ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｃ．Ｐｙｒｒｏｌｏ−１，５−ｂｅｎｚｏｘａｚｅｐｉｎｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＨＬ−６０，Ｊｕｒｋａｔ，ａｎｄ  Ｈｕｔ−７８  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２９３：４８−５９，２０００．
２０．Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｐ．，Ｋｏｔｏｕｌａ，Ｍ．，Ｍａ，Ｄ．，Ｂｏｕｊｒａｄ，Ｎ．，Ｔｕｃｋｍａｎｔｅｌ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａ  ７−ｎｉｔｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔａｍｉｄｅ：ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ−ｔｙｐｅ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，４０：２４３５−２４３９，１９９７．
２１．Ｇｏｒｍａｎ，Ａ．，ＭｃＧｏｗａｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｃｏｔｔｅｒ，Ｔ．Ｇ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４０４：２７−３３，１９９７．
２２．Ｃｒｏｍｐｔｏｎ，Ｍ．Ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３４１：２３３−２４９，１９９９．
２３．Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｉｍｂｕｌａ，Ｇ．，Ｇｉｌｆｏｒ，Ｅ．，Ｈｏｅｋ，Ｊ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｆａｒｂｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ＩＸ，ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｒｏｔｅｎｏｎｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６９：３１０４１−３１０４６，１９９４．
２４．Ｌａｒｏｃｈｅｔｔｅ，Ｎ．，Ｄｅｃａｕｄｉｎ，Ｄ．，Ｊａｃｏｔｏｔ，Ｅ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｃ，Ｍａｒｚｏ，Ｉ．，Ｓｕｓｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｚａｍｚａｍｉ，Ｎ．，Ｘｉｅ，Ｚ．，Ｒｅｅｄ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．Ａｒｓｅｎｉｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｖｉａ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２４９：４１３−４２１，１９９９．
２５．Ｒａｖａｇｎａｎ，Ｌ．，Ｍａｒｚｏ，Ｉ．，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｐ．，Ｓｕｓｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｚａｍｚａｍｉ，Ｎ．，Ｐｅｔｉｔ，Ｐ．Ｘ．，Ｈｉｒｓｃｈ，Ｆ．，Ｇｏｕｌｂｅｒｎ，Ｍ．，Ｐｏｕｐｏｎ，Ｍ．Ｆ．，Ｍｉｃｃｏｌｉ，Ｌ．，Ｘｉｅ，Ｚ．，Ｒｅｅｄ，Ｊ．Ｃ，ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．Ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｖｉａ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ，Ｂｃｌ−２−ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８：２５３７−２５４６，１９９９．
２６．Ｃａｍｉｎｓ，Ａ．，Ｄｉｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｃ，Ｃａｍａｒａｓａ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｅｓｃｕｂｅｄｏ，Ｅ．Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｄｏｇ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２９：１５９−１６６，１９９５．
２７．Ｂｕｒｋｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗａｒｄｍａｎ，Ｐ．Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｃａｔａｌｙｓｔ  ｏｆ  ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２８２：３２９−３３３．，２００１．
２８．Ｃａｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｐ．Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｉｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ  ｌｏｓｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３：１１４０１−１１４０４，１９９８．
２９．Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｐ．，Ｃｈｅｒｎｙａｋ，Ｂ．Ｖ．，Ｐｅｔｒｏｎｉｌｌｉ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｎａｒｄｉ，Ｐ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｔｈｉｏｌ  ｂｙ  ｍｏｎｏｂｒｏｍｏｂｉｍａｎｅ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，３６２：２３９−２４２，１９９５．
３０．Ｐｅｔｒｏｎｉｌｌｉ，Ｖ．，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｐ．，Ｓｃｏｒｒａｎｏ，Ｌ．，Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｒ．，Ｐａｓｓａｍｏｎｔｉ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｎａｒｄｉ，Ｐ．Ｔｈｅ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｓｅｎｓｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ  ｉｓ  ｔｕｎｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｖｉｃｉｎａｌ  ｔｈｉｏｌｓ．Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｙ  ｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６９：１６６３８−１６６４２，１９９４．
３１．Ｃｈｅｒｎｙａｋ，Ｂ．Ｖ．ａｎｄ  Ｂｅｒｎａｒｄｉ，Ｐ．Ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ  ｉｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｏｔｈ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ａｔ  ｔｗｏ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｓｉｔｅｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２３８：６２３−６３０，１９９６．
３２．Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｐ．，Ｂｅｌｚａｃｑ，Ａ．Ｓ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｈ．Ｌ．，Ｌａｒｏｃｈｅｔｔｅ，Ｎ．，ｄｅ  Ｐａｂｌｏ，Ｍ．Ａ．，Ｚａｍｚａｍｉ，Ｎ．，Ｓｕｓｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｃ，ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｔｈｉｏｌ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ  ｅｎｆｏｒｃｅｓ  ｂｃｌ−２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：３０７−３１４，２０００．
３３．Ｚａｍｚａｍｉ，Ｎ．，Ｍａｒｚｏ，Ｉ．，Ｓｕｓｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｃ，Ｌａｒｏｃｈｅｔｔｅ，Ｎ．，Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ，Ｐ．，Ｒｅｅｄ，Ｊ．，Ｋｏｆｌｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．Ｔｈｅ  ｔｈｉｏｌ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｄｉａｍｉｄｅ  ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ｂｙ  ｅｎｆｏｒｃｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１６：１０５５−１０６３，１９９８．
３４．Ｃｈｅｌｌｉ，Ｂ．，Ｆａｌｌｅｎｉ，Ａ．，Ｓａｌｖｅｔｔｉ，Ｆ．，Ｇｒｅｍｉｇｎｉ，Ｖ．，Ｌｕｃａｃｃｈｉｎｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎｉ，Ｃ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ−ｔｙｐｅ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６１：６９５−７０５．，２００１．
３５．Ｄｅｃａｕｄｉｎ，Ｄ．，Ｇｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｈｉｒｓｃｈ，Ｔ．，Ｃａｓｔｅｄｏ，Ｍ．，Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ，Ｐ．，Ｍａｃｈｏ，Ａ．，Ｋｏｆｌｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．Ｂｃｌ−２  ａｎｄ  Ｂｃｌ−ＸＬ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５７：６２−６７，１９９７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＰＫ１１１９５の作用を説明するための新しい機構を開示することが、本発明の１つの態様である。
【０００７】
適切な位置で反応性酸素種（ＲＯＳ）を生成することができる化合物をスクリーニングするために、前記新たに開示する機構を利用する方法を提供することが、本発明のもう１つの態様である。
【０００８】
反応性酸素種を用いて癌を治療するための方法を提供することが、本発明のさらにもう１つの態様である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の様々な態様及び作動可能な細胞内機構についての新たな理解により、ミトコンドリアを通して機能し、癌を治療するために特に有用な細胞傷害作用を生じることができる反応性酸素種を特定するための新しい方法が提供される。
【００１０】
我々は、ＰＫ１１１９５がマイクロモル濃度範囲でＨＬ６０ヒト白血病細胞におけるミトコンドリア脱分極を誘導すること、及びこのミトコンドリア脱分極の誘導はボンクレキン酸によって阻害され、透過性遷移を含むことを見いだした。ＰＫ１１１９５は、ＰＢＲ陽性ＢＶ１７３及びＰＢＲ陰性ジャーカット白血病細胞の両方においてミトコンドリアに局在する過酸化水素の生成を媒介し、該生成はカタラーゼ阻害可能であり用量依存的である。スーパーオキシド（Ｏ2-●）の生成は、ミトコンドリア脱分極を媒介するために必要であり、そのことはマンガンＯ2-●ジスムターゼ模倣体（mimetic）であるマンガン（ＩＩＩ）テトラキス（４−安息香酸）ポルフィリンクロライド（ＭｎＴＢＡＰ）のミトコンドリア脱分極の反応速度への阻害作用によって証明される。ＰＫ１１１９５は、ミトコンドリアタンパク質Ｂｃｌ−２及びＢＣＬ−ＸLの抗細胞死作用に拮抗することが、これまでに示されている。我々はまた、この性質が、以前に誤って報告されたようなＰＴＰＣとのＰＢＲ依存性相互作用及びメガチャネル形成によってではなく、もっぱら酸化還元感受性ＰＴＰＣへのＰＫ１１１９５の酸化促進作用から生じることを見いだした。
【００１１】
我々は、ＰＫ１１１９５がマイクロモル濃度範囲で反応性酸素種を生成し、ＰＴＰＣによるミトコンドリア透過性遷移（ＭＰＴ）の促進を伴うミトコンドリア毒性を引き起こすことを見いだした。さらに、ＰＢＲの発現は、ＰＫ１１１９５分子の直接作用を示唆するこの酸化促進作用のための必須条件ではない。
【００１２】
結果として、本発明は、カスパーゼ９アポトーシス経路を活性化するための作用物質を被験者に治療有効量投与する工程を含む、被験者において細胞のアポトーシスを誘導する（例えば癌を治療する）ための方法であって、前記作用物質が前記細胞のミトコンドリアと相互作用してミトコンドリア内スーパーオキシド生成を生じさせることを特徴とする、該方法に関する。前記作用物質がミトコンドリア内に内在化されるとき、又は作用物質の投与がミトコンドリアＮＡＤＰＨオキシダーゼと作用物質の相互作用によってミトコンドリア内スーパーオキシド生成を生じさせるとき、又は作用物質の投与がＮＡＤＰＨオキシダーゼの酵素作用（最も好ましくは作用物質自体への直接の酵素作用）によってミトコンドリア内スーパーオキシド生成を生じさせるとき、及び特に、ＮＡＤＰＨオキシダーゼが作用物質から少なくとも１個のハロゲン原子（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ）を除去するときに、好ましい結果が生じる。そのようなハロゲンは塩素であり得る。好ましい実施形態は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼによる作用物質からの少なくとも１個のハロゲン原子の除去及び各々のそのような除去されたハロゲン原子の酸素による置換を含む。本発明の好ましい方法では、ミトコンドリアは、アデニンヌクレオチドトランスロケーター部分を備える表面遷移孔を有し、生成されるスーパーオキシドは、ミトコンドリア表面遷移孔のアデニンヌクレオチドトランスロケーター部分のチオール酸化を生じさせる。上記方法に関して有用な好ましい作用物質は、ＰＫ１１１９５、ＭＰＴＰ、及びその類似体を含む。前記治療薬は、１回投与又は、約２４時間、４８時間、３日間、１週間、２週間、４週間又はそれ以上の間隔をあけ得る複数回の投与によって投与し得る。もう１つの実施形態では、アポトーシスを誘導するための方法は、抗腫瘍薬の投与をさらに含む。抗腫瘍薬は、１回投与又は、約２４時間、４８時間、３日間、１週間、２週間、４週間又はそれ以上の間隔をあけ得る複数回の投与によって投与し得る。さらに、抗腫瘍薬は、本発明の治療薬と同時に又は異なる時点（本発明の治療薬より前又は本発明の治療薬より後）で投与し得る。好ましい実施形態では、本発明の治療薬を抗腫瘍薬より少なくとも１回の投与の約１２時間前、２４時間前、４８時間前又は１週間前に投与する。
【００１３】
本発明はまた、細胞内でのミトコンドリアからのシトクロムＣの放出及びカスパーゼ９アポトーシス経路の活性化を生じさせるための作用物質を細胞に投与する工程を含む、細胞を抗癌治療に対して感作させるための方法を提供する。前記作用物質は、抗腫瘍薬の投与と同時に又は抗腫瘍薬の投与前に投与し得る。
【００１４】
本発明はまた、癌の治療のために有用な化合物を特定するための方法であって、（ａ）成育可能なミトコンドリアを含む試料を提供する工程；（ｂ）前記試料を候補化合物と接触させる工程；及び（ｃ）前記ミトコンドリアによるスーパーオキシド産生のレベル又は前記ミトコンドリアの膜電位を評価し、前記ミトコンドリアのスーパーオキシド産生を上昇させる又は膜電位を変化させる化合物を癌の治療のために有用な化合物として特定する工程
を含む、該方法を提供する。好ましくは、成育可能なミトコンドリアは、マイトプラスト調製物中で又は成育可能な細胞内で提供される。１つの実施形態では、ミトコンドリアは実質的な量の末梢性ベンゾジアゼピン受容体を発現しない。もう１つの実施形態では、ミトコンドリアが成育可能な細胞中で提供されるとき、細胞はＮＢＤ  ＦＧＩＮ−１−２７に結合しない。有用な細胞としては、例えばＨＬ６０前骨髄性白血病細胞又はジャーカットＴ細胞性白血病細胞が挙げられる。もう１つの実施形態では、ＣＭＨ２ＤＣＦ蛍光を使用してスーパーオキシド産生を検出する。
【００１５】
本発明はまた、いずれの作用物質が抗癌化合物として有用であり得るかの予備決定を行うために１又はそれ以上の作用物質をスクリーニングするための方法であって、スクリーニングする作用物質を、酵素反応を可能にする条件下でＮＡＤＰＨオキシダーゼと接触させる工程、及び少なくとも１又はそれ以上のハロゲン原子が除去された又はＮＡＤＰＨオキシダーゼの作用によって反応性酸素種に変換された作用物質を所望物質として特定する工程を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、癌の治療のために有用な化合物を特定するための方法であって、（ａ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼを含む試料を提供する工程；（ｂ）ハロゲン原子を含有する候補化合物に前記試料を接触させる工程；及び（ｃ）前記化合物からのハロゲン原子の除去又は前記試料における反応性酸素種の生成を評価し、ＮＡＤＰＨオキシダーゼによって除去されるハロゲン原子を有する化合物又は反応性酸素種の生成を生じさせる化合物を癌の治療のために有用な化合物として特定する工程、を含む、該方法を提供する。好ましい作用物質は、前記スクリーニング方法のいずれかによって特定されるものである。
【００１７】
本発明はまた、カスパーゼ９経路を通してアポトーシスの活性化を生じさせる作用物質で成功裏に治療し得る癌、癌細胞、腫瘍あるいはそのような癌又は腫瘍を有する患者を特定するための方法であって、カスパーゼ９経路を通してアポトーシスの活性化を生じさせる作用物質の治療有効量を反応性酸素種に変換するのに十分なＮＡＤＰＨオキシダーゼレベルを有する癌又は腫瘍を特定する工程を含む、該方法を提供する。好ましくは、前記細胞はヒト患者から得られる。細胞は生検を用いて入手し得る。
【００１８】
本発明はまた、癌を治療するため又は他の抗癌治療化合物と共に使用するための作用物質であって、細胞内のミトコンドリアを活性化して又はミトコンドリアに結合して、該細胞内におけるシトクロムＣの放出とカスパーゼ９アポトーシス経路の活性化とを導くミトコンドリア内スーパーオキシド生成を生じさせる、該作用物質を提供する。より好ましい作用物質は、製薬上許容される担体を含有する、治療上許容される製剤をさらに含む。
【００１９】
本発明はまた、哺乳動物において非癌細胞に対し癌細胞を選択的に死滅させるための方法であって、反応性酸素種のミトコンドリア内生成を上昇させる作用物質の治療有効量を化学療法化合物と別々に又は同時に前記哺乳動物に併用投与する工程を含む、該方法を提供する。好ましい実施形態では、反応性酸素種のミトコンドリア内生成は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼと作用物質との相互作用によって起こる。さらに一層好ましい実施形態では、作用物質は癌細胞内でミトコンドリアに結合して、癌細胞におけるカスパーゼ９アポトーシス経路の活性化を導くミトコンドリア内スーパーオキシド生成を生じさせる。さらに一層好ましい実施形態では、前記方法は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼとの相互作用によるミトコンドリア内での反応性酸素種の生成を含む。
【００２０】
本発明はまた、カスパーゼ９アポトーシス経路を活性化するための作用物質の治療有効量を被験者に投与することを含む、該被験者においてリンパ球のアポトーシスを誘導するための方法であって、前記作用物質がリンパ球のミトコンドリアに結合して、リンパ球内でのシトクロムＣの放出とカスパーゼ９アポトーシス経路の活性化とを導くミトコンドリア内スーパーオキシド生成を生じさせる、該方法を提供する。この方法は、例えば慢性関節リウマチ、狼瘡及び他の自己免疫疾患を含む、リンパ球活性化に関連する炎症性疾患を治療するために使用し得る。
【００２１】
本発明の前記方法のいずれかにおいて使用し得る好ましい作用物質としては、ＰＫ１１１９５、ＭＰＴＰ及びそれらの類似体が挙げられる。
【００２２】
図面を参照することにより、本発明の様々な原理及び態様のさらなる理解が得られよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
試薬
カルセイン−ＡＭ及び３−３’−ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物（ＤｉＯＣ6（３））、及びクロロメチル−Ｘ−ロサミンはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫより購入した。ボンクレキン酸（ＢＡ）は、Ｂｉｏｍｏｌ（ＵＫ）より購入した。７ニトロ２，１，３，ベノキサジアゾール−４−イル２−フェニルインドール−３−アセトアミド（ＮＢＤ  ＦＧＩＮ−１−２７類似体）は、Ａｌｅｘｉｓ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（ＵＫ）より購入した。１−（２−クロロフェニル−Ｎ−メチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−メチルプロピル）−イソキノリンカルボキサミド（ＰＫｌ１１９５）、ヨウ化プロピジウム、カタラーゼ、ジヒドロエチジウム、及び全ての細胞培養試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌｔｄ，ＵＫより購入した。マンガン（ＩＩＩ）テトラキス（４−安息香酸）ポルフィリンクロライド（ＭｎＴＢＡＰ）は、Ｏｘｉｓ  Ｈｅａｌｔｈ  ｐｒｏｄｕｃｔｓより購入した。
細胞培養及び処理
ＨＬ６０前骨髄性白血病、ＰＢＲを欠くジャーカットＴ細胞性白血病細胞（１８）（１９）（Ｄｒ  Ｄ．Ｅ．Ｂａｎｋｅｒ及びＤｒ  Ｆ．Ａｐｐｌｅｂａｕｍ，Ｔｈｅ  Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＵＳＡの好意により提供された）、及びＢＶ１７３白血病細胞を、１０％ウシ胎仔血清、５ｍＭグルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌペニシリンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地での対数懸濁液培養に保持した。３７℃、５％ＣＯ2／９５％空気の加湿環境中で細胞を増殖させた。ＰＫ１１１９５を８．７ｍｇ／ｍｌの原液濃度でエタノールに溶解し、７５μＭの最終濃度で４時間細胞に添加した；賦形剤単独も培地で使用した。
【００２４】
フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡検査。
【００２５】
対数増幅を有する前方散乱検出器を用いて１０，０００事象を獲得するためにＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ（Ｏｘｆｏｒｄ）を使用した。リンパ球富化ゲートを規定した。対応するＤｉＯＣ6（３）又はＣＭＨ2ＤＣＦＤＡ蛍光を、ＦＬ１（５３０ｎｍ）バンドパスフィルタを用いて分析した。ヨウ化プロピジウム又はエチジウム蛍光は、ＦＬ３（６２０ｎｍ）バンドパスフィルタを用いて分析した。ＷＩＮＭＤＩ  ２．８を使用してリストモードデータを解析した。蛍光顕微鏡検査は、ＩＰＬａｂ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍソフトウエアを走らせるコンピュータによるデジタルキャプチャーを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ４色蛍光顕微鏡を用いて実施した。
ミトコンドリア膜電位分極及びＭＰＴの測定
細胞を陽イオン性親油性（両親媒性）プローブＤｉＯＣ6（３）（８０ｎＭ）と共に暗所において３７℃で２０分間インキュベートし、その後ヨウ化プロピジウム（２０μｇ／ｍｌ）で１０分間対比染色した。ＤｉＯＣ6（３）は、ネルンスト式によれば、内膜電位（ΔΨm）のためにミトコンドリアマトリックス内に隔離され、その散逸はミトコンドリアにおける保持の低下及び細胞ＤｉＯＣ6（３）蛍光の低下を導く。細胞を５０μＭボンクレキン酸と共に３０分間インキュベートすることによってΔΨmの減衰を予防した。形質膜完全性を喪失した死細胞を排除するために、ヨウ化プロピジウム蛍光の上昇を有する事象を、ゲーティングによって、ＤｉＯＣ6（３）ヒストグラムから差し引いた。用量反応曲線は、ＤｉＯＣ6（３）low細胞の算定比率を縦座標の従属変数として使用した。ＭＰＴを直接測定するために、細胞を１μＭカルセインＡＭと共に３０分間インキュベートし、次に１ｍＭカルシウムコバルトと共にインキュベートした。コバルトはカルセインの蛍光を消失させるが、カルセインが平衡しているミトコンドリアマトリックスに入るために無傷ミトコンドリア内膜を通過することはできない。ＰＴＰＣの開口がコバルトの進入を可能にし、カルセイン蛍光を低下させる。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応及び蛍光顕微鏡検査によるＰＢＲ  ｍＲＮＡの検出
Ｑｕｉｃｋｐｒｅｐ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してＢＶ１７３及びジャーカット白血病細胞からポリＡ+ｍＲＮＡを抽出し、縮重プライマーとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素を用いた一本鎖合成によって相補的ＤＮＡを合成した。正プライマー５’ＣＴＡＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＧＧＣＡＧＴ（配列番号１）及び逆プライマー５’ＣＣＡＴＧＴＴＣ−ＣＡＡＧＡＡＣＡＴＧＣ（配列番号２）を用いてエクソン１〜４にわたるＰＢＲの５９０塩基フラグメントを増幅するためにＴＡＱポリメラーゼ連鎖反応を使用した。網膜芽細胞腫ｍＲＮＡの平行増幅を対照アンプリコンとして使用した。ジャーカット又はＢＶ１７３細胞を１μＭのＮＢＤ  ＦＧＩＮ−１−２７類似体（２０）と共に暗所において３７℃で４５分間インキュベートすることによって末梢性ベンゾジアゼピン受容体を視覚化し、緑色波長のバンドパスフィルタを用いた蛍光顕微鏡検査によって視覚化した。
過酸化水素及びＯ2-●生成の測定と阻害
５μＭのジヒドロエチジウム（これはエチジウムへと酸化される）中で細胞を１５分間インキュベートすることによってＯ2-●を検出した。Ｏ2-●生成へのＯ2-●ジスムターゼ阻害剤の作用を試験するために、細胞を１００μＭのＭｎＴＢＡＰで４５分間処理した。細胞に５μＭのＣＭ−Ｈ2ＤＣＦＤＡを３０分間ロードすることによって過酸化水素を検出し、５００Ｕ／ｍｌカタラーゼと共に３０分間プレインキュベートすることによってその形成を阻害した（２１）。ＣＭ−Ｈ2ＤＣＦＤＡについての用量反応曲線は、ＣＭ−Ｈ2ＤＣＦＤＡhigh細胞の算定比率を従属変数として使用した。
【実施例１】
【００２６】
ＰＫ１１１９５はＨＬ６０白血病細胞においてＢＡ阻害可能なＭＰＴを直接誘導する
ＰＫ１１１９５で処理したＨＬ６０白血病細胞は、ミトコンドリアΔΨmの減衰と一致して、対照（図１Ａ）と比較して３時間以内に検出可能なＤｉＯＣ6（３）蛍光の低下（図１Ｂ）を示した。ＡＮＴ特異的阻害剤ＢＡは、ＰＫ１１１９５を介したミトコンドリア脱分極を予防し（図１Ｃ）、ＰＫ１１１９５が誘導するＤｉＯＣ6（３）蛍光低下の過程へのＡＮＴの関与を示唆した。ミトコンドリアのカルセイン蛍光は、開口ＰＩＰＣを通してのサイトゾルコバルトとミトコンドリアの平衡に一致して、ＰＫ１１１９５によって消光された（図１Ｄ及び１Ｅ）。ＢＡ処理した細胞ではカルセイン消光は認められなかった（図示せず）。
【実施例２】
【００２７】
ＰＫ１１１９５によって媒介される用量依存的過酸化水素生成はミトコンドリアに局在する
ＨＬ６０細胞におけるＣＭＨ2ＤＣＦ蛍光は、ＲＯＳの生成と一致して（図２Ａ）、ＰＫ１１１９５濃度依存的に上昇し、５０〜１００マイクロモル濃度範囲で起こった（図１Ａ）。このＣＭＨ2ＤＣＦ蛍光の上昇は、カタラーゼで処理した細胞では阻害され、ＰＫ１１１９５によって媒介される過酸化水素依存性酸化と一致した（図２Ｂ）。ＣＭＨ2ＤＣＦＤＡをロードしたＨＬ６０細胞の蛍光顕微鏡検査により、ＰＫ１１１９５処理後のＨ2Ｏ2生成の点状細胞質分布が示された（図２Ｃ）；これは、ミトコンドリアのＨ2Ｏ2生成と一致して、電位差測定プローブＣＭＸ−ロサミンの分布と共に局在した。
【実施例３】
【００２８】
ＰＢＲはＰＫ１１１９５が誘導するＨ2Ｏ2生成に関与しない
ＰＫ１１１９５を介したＲＯＳへのＰＢＲの関与を測定するために、異なるＰＢＲ発現を有する細胞系においてＨ2Ｏ2生成を調査した。ジャーカットＴ細胞性白血病細胞系はＰＢＲ発現を欠くことがこれまでに示されている。これは、蛍光顕微鏡検査によって認められたＮＢＤ  ＦＧＩＮ−１−２７類似体結合の不在を通して明らかにされた（図３Ａ）。これに対し、ＢＶ１７３白血病細胞は、明らかな点状細胞質分布と共に、ＮＢＤ  ＦＧＩＮ−１−２７類似体の強い陽性染色を示した（図３Ｂ）。これらの所見と一致して、ＢＶ１７３細胞ではＲＴ−ＰＣＲによってＰＢＲの発現が特定されたが、ジャーカット細胞では特定されなかった（図３Ｃ）。しかしながら、ＰＢＲの発現に関わりなく、ＰＫ１１１９５処理は、Ｈ2Ｏ2生成と一致してＢＶ１７３及びジャーカット細胞の両方においてＣＭＨ2ＤＣＦ蛍光の上昇を生じさせた（図３Ｄ及び３Ｅ）。
【実施例４】
【００２９】
ＰＫ１１１９５によって媒介されるミトコンドリア毒性はＯ2-●の生成を必要とする
Ｏ2-●は、内在性Ｏ2-●ジスムターゼによってＨ2Ｏ2へと生理的に不均化され得る。ＰＫ１１１９５がＨ2Ｏ2の上流のＯ2-●生成を誘導するかどうかを調べるために、ＰＫ１１１９５処理後にエチジウム蛍光を測定した。エチジウム蛍光の初期上昇が認められ（図４Ａ）、これはマンガンＯ2-●ジスムターゼ模倣体であるＭｎＴＢＡＰによって阻害された（図４Ｂ）。ミトコンドリア脱分極へのＯ2-●の役割を調べるために、ＭｎＴＢＡＰの存在下と不在下におけるＰＫ１１１９５投与後のＤｉＯＣ6（３）蛍光の低下の速度を測定した。ＰＫ１１１９５が生成するＯ2-●が内膜電位、ΔΨmの安定性に及ぼす直接作用と一致して、ＭｎＴＢＡＰの存在下でミトコンドリア内膜脱分極の速度低下が生じた。
【実施例５】
【００３０】
ＭＰＴＰ及びＰＫ１１１９５による腫瘍細胞死滅はＲＯＳスカベンジャーであるＭｎＴＢＡＰによってブロックされるが、ＨＡ１４−１による腫瘍細胞死滅はブロックされない
上記工程を、アポトーシス誘導性ＲＯＳの形成を生じさせることができるもう１つ別の化合物を特定するために使用できるか否かを調べるための化合物をスクリーニングする方法として使用した。これらの試みの結果として、ＭＰＴＰも、新たに記述された本発明の機構に従って機能すること、また、抗癌治療薬としても使用し得ることが発見された。これは、部分的には、ＭｎＴＢＡＰのブロッキング作用によって確認された。
【００３１】
５０マイクロモルの抗腫瘍薬ＨＡ１４−１（ミトコンドリア遷移孔を通してアポトーシスを誘導するがＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路に関与しない化合物）によるアポトーシスの誘導は、ＭｎＴＢＡＰによってブロックされない（「ＨＡ５０」と「ＨＡ＋ＭＮＴ」を比較）。
【００３２】
染色体１４番と１８番（Ｂｃｌ−２遺伝子が位置する）の間の転座によって高レベルのアポトーシス促進性タンパク質Ｂｃｌ−２を有しているリンパ腫細胞系であるＤｏＨＨ２細胞を、ミトコンドリアＲＯＳスカベンジャーであるＭｎＴＢＡＰの存在下と不在下でＭＰＴＰ、ＰＫ１１１９５及びＨＡ１４−１に暴露した。ＭｎＴＢＡＰは、ＭＰＴＰ誘導及びＰＫ１１１９５誘導のアポトーシスを阻害し、ＭＰＴＰとＰＫ１１１９５がどちらもＲＯＳのミトコンドリア内生成を通して機能することを示唆したが、ＭｎＴＢＡＰはＨＡ１４−１によって誘導されるアポトーシスを阻害しなかった。
【００３３】
加えて、我々は、ＰＫ１１１９５の効果がＮＡＤＰＨオキシダーゼレベルに依存することを見いだした。ＰＫ１１１９５耐性リンパ芽球細胞系を作製し、ＰＫ１１１９５感受性細胞系と耐性細胞系を遺伝子発現アレイデータによって比較した。ＰＫ１１１９５に耐性であるように作製したリンパ芽球細胞系は、ＰＫ１１１９５に感受性であるリンパ芽球に比べて低いレベルのＮＡＤＰＨを発現する。さらに、ＰＫ１１１９５処理は、正常細胞よりも高いレベルのＮＡＤＰＨオキシダーゼを有する一次慢性リンパ性白血病細胞ではアポトーシスを誘導するが、正常な非悪性リンパ球ではアポトーシスを誘導しない。遺伝子発現アレイを使用して、我々は、ＰＫ１１１９５に感受性の細胞型においてＮＡＤＰＨオキシダーゼが上方調節されることを見いだした。ＮＡＤＰＨオキシダーゼの上方調節はＰＣＲによって確認された。我々は、理論に拘束されることを望むものではないが、腫瘍細胞と比較して正常細胞におにおいてはＮＡＤＰＨオキシダーゼのレベルがより低く、そのため正常細胞はＰＫ１１１９５によるアポトーシスの誘導に対してより抵抗性を有しており、一方、腫瘍細胞においてはＮＡＤＰＨオキシダーゼのレベルがより高く、そのため腫瘍細胞はＰＫ１１１９５によるアポトーシスに対してより感受性を有している、と考える。
【００３４】
我々は、ＰＫ１１１９５がＲＯＳを生成する機構を検討した。ＰＫ１１１９５処理細胞に関して実施したＮＭＲ試験は、ＰＫ１１１９５に結合する塩素原子が悪性（ＰＫ１１１９５感受性）細胞ではＰＫ１１１９５から開裂されることを示した。また、塩素が１個の酸素原子で置換されることも認められた。この反応はＮＡＤＰＨオキシダーゼによって酵素的に実施され得るものであるので、我々は、理論に拘束されることを望むものではないが、ＰＫ１１１９５がＮＡＤＰＨオキシダーゼの酵素反応を通してＲＯＳを生成すると考える。
【００３５】
（考察）
ＰＴＰＣは、細胞死及びアポトーシスの生理学において中心的役割を果たす（２２）。様々な毒素のＰＫ１１１９５による細胞死の促進は、ＰＴＰＣ機能の推定上の調節剤として働くＰＢＲを細胞死の調節に関係付けた（１０、１１、２３〜２５）。我々は、しかしながら、ＰＢＲリガンドＰＫ１１１９５が、Ｏ2-●の生成を通してＰＴＰＣを標的する細胞内酸化促進活性を示すことを見いだした。ＲＯＳ産生は、ＰＢＲ陰性ジャーカットＴ細胞において、及びＰＢＲ陽性細胞においても同程度に明らかにされたように、ＰＢＲ発現とは無関係に起こる。Ｈ2Ｏ2の起源はミトコンドリアであり、ＰＫ１１１９５のマイクロモル濃度で生じる。これは、ＰＫ１１１９５のＰＢＲ結合親和性より何桁も大きく、ＨＬ６０のような感受性細胞系において細胞傷害作用を認めるために必要な濃度範囲である。
【００３６】
ＰＫ１１１９５については以前に、酸化的ストレスの結果であることが示唆される現象である、マイクロモル濃度範囲でイヌ好中球において熱ショックタンパク質ＨＳＰ  ７２及びＨＳＰ  ９０の用量依存的発現を誘導することが示されていた（２６）。ＰＫ１１１９５は、無傷ΔΨmの存在下でＲＯＳを誘導する（１７）。シトクロムｃはＰＫ１１１９５によってミトコンドリアから放出され（１１）、Ｈ2ＤＣＦを強力に酸化することが示されているが（２７）、アポトーシス抵抗性を付与するにも関わらずＢＣＬ−２の高発現はＲＯＳ生成を調節することができなかったこと（１７）、及びＰＫ１１１９５が誘導するＨ2Ｏ2及びＯ2-●のカタラーゼ及びＭｎＴＢＡＰによるそれぞれの阻害は、ＲＯＳの直接の関与を示唆する。シトクロムＣの放出によりＯ2の４電子から１電子の還元変化及びＯ2-●の生成を起こるが（２８）、ＰＫ１１１９５は、機能的電子伝達を欠くρ0細胞におけるＲＯＳの強力な誘導物質であり（１７）、直接の酸化促進活性を強く裏付ける。
【００３７】
ＰＴＰＣは、ゲートの開閉を調節するＡＮＴに面した側のマトリックスに重要な隣接チオールを有する、酸化還元感受性の多量体タンパク質複合体である（２９−３１）。システイン５６の酸化は、ＡＮＴ（レドックスセンサーとして働く）によるチャネル形成の確率を上昇させ、ジアミド及びｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを含む他の酸化促進剤の細胞傷害活性の基礎となる（３２、３３）。ＰＫ１１１９５によるミトコンドリア脱分極の誘導は、ＭＰＴに関わる、ＡＮＴ特異的リガンド、ボンクレキン酸によって阻害された。ＭＰＴのＰＴＰＣ特異的阻害剤であるシクロスポリンＡは、これまでに、ＰＫ１１１９５が誘導する心筋細胞ミトコンドリアの腫脹をブロックすることが示されている（３４）。
【００３８】
スーパーオキシドを捕捉するＭｎＴＢＡＰを使用することは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路をブロックすることと同様の作用を有する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼが機能性である場合にのみ、ミトコンドリア膜脱分極を誘導するスーパーオキシドがミトコンドリア内に存在する。ＨＡ１４−１はＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を通して機能しないので、ＭｎＴＢＡＰは、ＭｎＴＢＡＰによって引き起こされる膜脱分極を低下させないが、ＰＫ１１１９５及びＭＰＴＰによって生じる膜脱分極を低下させる。これは、ＭＰＴＰがＰＫ１１１９５と同様にＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を通して機能することを追認する。
【００３９】
Ｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスタンパク質はＰＴＰＣに局在し、細胞傷害性化学療法に対する抵抗性に関与する（３５）。ジアミドなどの酸化促進剤と同様に、Ｂｃｌ−２抵抗性を以って細胞死を促進するＰＫ１１１９５の能力から、ＰＴＰＣに対するＰＢＲのアロステリック効果ではなく、ミトコンドリアの酸化還元状態の変化が、この現象の基礎である、と我々は考えるが、理論に拘束されることを望むものではない。さらに、ＰＫ１１１９５の酸化還元改変作用は、これまでもっぱらＰＢＲに帰せられてきた、マイクロモル範囲で起こる多様な作用の一部を説明し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ＰＫ１１１９５によるＨＬ６０白血病細胞でのＭＰＴの誘導を示す。親油性陽イオンＤｉＯＣ6（３）によって測定したＨＬ６０ミトコンドリアの同期的ミトコンドリア脱分極（１Ａ）は、蛍光強度中央値を左側にシフトさせた（１Ｂ）が、これはＡＮＴ特異的リガンドＢＡでの前処理によって元に戻される（１Ｃ）。１Ｄ．閉じたＰＴＰＣを有するミトコンドリアに対応するカルセイン蛍光（左）は、ＭＰＴと一致し、ＤｉＯＣ6（３）蛍光の低下と同時に起こる、ＰＫ１１１９５処理後の消光を生じた（右）。
【図２】図２は、ミトコンドリアがＰＫ１１１９５を介したＲＯＳのソースであることを示す。２Ａ．ＰＫ１１１９５は、ＨＬ６０細胞においてＣＭＨ2ＤＣＦ蛍光によって測定される過酸化水素の濃度依存的上昇を生じさせた；これはマイクロモル濃度範囲で起こった。２Ｂ．カタラーゼと共にプレインキュベートしたＨＬ６０細胞では、ＰＫ１１１９５誘導による過酸化水素生成が妨げられた。２Ｃ．ＰＫ１１１９５は、ミトコンドリアの位置と一致するＣＭＨ2ＤＣＦ蛍光の点状細胞質分布を生じさせた。
【図３】図３は、ＰＫ１１１９５を介した過酸化水素生成に末梢性ベンゾジアゼピン受容体は必要でないことを示す。３Ａ．ジャーカット細胞は、ＢＶ１７３白血病細胞（３Ｂ）と比較して、ＮＢＤ  ＦＧＩＮ−１−２７類似体によって染色したＰＢＲの点状分布を示すことができなかった。３Ｃ．ＰＢＲの発現はジャーカット細胞ではＲＴ  ＰＣＲによって認められなかったが、ＮＢＤ  ＦＧＩＮ−１−２７蛍光顕微鏡検査と一致してＢＶ１７３細胞では明らかに認められる。３Ｃ及び３Ｄ．ＰＫ１１１９５は、ＰＢＲの発現に関わりなく、ジャーカット細胞とＢＶ１７３細胞の両方においてＣＭＨ2ＤＣＦ蛍光の上昇を媒介した。
【図４】図４は、白血病細胞においてＰＫ１１１９５によるＯ2-●の生成がミトコンドリア脱分極を直接的に誘導することを示す。４Ａ．エチジウム蛍光は、対照と比較してＰＫ１１１９５によって上昇した。４Ｂ．ＰＫ１１１９５が誘導するエチジウム蛍光の上昇は、マンガンＯ2-●ジスムターゼ模倣体、ＭｎＴＢＡＰによって阻害された。４Ｃ．ＤｉＯＣ6（３）蛍光を用いて測定される、ＨＬ６０白血病細胞においてＰＫ１１１９５によって誘導されるミトコンドリア脱分極の速度は、ＭｎＴＢＡＰによって低下した。
【図５】図５は、化合物１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は、ＰＫ１１１９５のように、ＲＯＳによる腫瘍細胞の死滅を誘導するが、（ＨＡ１４−１）は腫瘍細胞の死滅を誘導しないことを示す。リンパ球細胞系であるＤｏＨＨ２細胞を、ＲＯＳのスカベンジャーであるＭｎＴＢＡＰの存在下と不在下でＭＰＴＰ、ＰＫ１１１９５及びＨＡ１４−１によって処理した。ＨＬ６０白血病細胞においてＰＫ１１１９５によって誘導されるミトコンドリア脱分極の速度を、ＤｉＯＣ6（３）蛍光を用いて測定した。ＭｎＴＢＡＰは、ＭＰＴＰによって誘導されるアポトーシス及びＰＫ１１１９５によって誘導されるアポトーシスを阻害したが、ＨＡ１４−１によって誘導されるアポトーシスは阻害しなかった。各々のレーンの３つの柱は、３つの時間経過（左から右へ：２４時間目、４８時間目及び７２時間目）を示す。対照レーン（ＣＯＮ）は、未処理細胞での２４、４８及び７２時間目のアポトーシスレベルを示す。ＭＰＴＰ  １０００マイクロモルによる処理の結果としての同じ時点でのアポトーシスの誘導をレーン「１０００」に示す。「１０００＋ＭＮＴ」は、スーパーオキシドスカベンジャーＭｎＴＢＡＰによる処理後のアポトーシス誘導の低下を示す。
【００４１】
ＭＰＴＰのアポトーシス誘導の、ＭｎＴＢＡＰによる遮断は、ＰＫ１１１９５のものに匹敵する。「ＰＫ１００」と表示するレーンは、ＰＫ１１１９５  １００マイクロモルによる処理を示し、その後のレーン（「ＰＫ＋ＭＮＴ」）ではＭｎＴＢＡＰによって遮断される。しかしながら、これに対し、ミトコンドリア遷移孔を通してアポトーシスを誘導するがＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路に関与しない化合物である抗腫瘍薬ＨＡ１４−１  ５０マイクロモルによるアポトーシスの誘導は、ＭｎＴＢＡＰによっては遮断されない（「ＨＡ５０」と「ＨＡ＋ＭＮＴ」を比較）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008509975.tif 000008
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