(57)【要約】  発明は、標的配列抑圧、標的配列確認及び標的ダウン制御において有用な方法及び組成物を提供する。発明は、遺伝子サイレンシング又はＲＮＡダウン制御に有用なポリヌクレオチド構築物、並びに当該ポリヌクレオチドを含む植物及び種子を提供する。発明は、標的配列を沈黙化するか又はＲＮＡをダウン制御するためにマイクロＲＮＡを使用する方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内で複数の標的配列をダウン制御する方法であって、
（ａ）二重鎖ＲＮＡ又はヘアピンを形成することができる修飾されたｍｉＲＮＡ前駆体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物を細胞に導入するが、その際、修飾されたｍｉＲＮＡ前駆体は修飾されたｍｉＲＮＡ及び当該修飾されたｍｉＲＮＡに相補な配列を含み、但し、修飾されたｍｉＲＮＡは、（ｉ）標的配列に対して完全相補であるか、（ｉｉ）ＧＵ塩基対を除く標的配列に対して完全相補であるか、又は（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡの５’エンドから数えて最初の１０ヌクレオチド中の標的配列に完全相補であるように修飾されたｍｉＲＮＡであり、そして
（ｂ）ｍｉＲＮＡを生産するのに十分な時間、核酸構築物を発現させるが、その際、修飾されたｍｉＲＮＡが標的配列の発現をダウン制御する、
方法。
【請求項２】
核酸構築物が、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞が植物細胞である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
細胞が、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、エンバク、モロコシ属、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、アラビドプシス、及びタバコからなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
修飾されたｍｉＲＮＡが標的配列に結合して、二重鎖ＲＮＡが分割される、請求項１乃至４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
修飾されたｍｉＲＮＡが、標的配列に対して完全相補になるように修飾された植物のｍｉＲＮＡである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
植物ｍｉＲＮＡが、アラビドプシス、トマト、ダイズ、イネ及びトウモロコシからなる群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
修飾されたｍｉＲＮＡが、ＧＵ塩基対の使用を除いて、標的配列に対して完全相補になるように修飾された植物のｍｉＲＮＡである、請求項５記載の方法。
【請求項９】
植物ｍｉＲＮＡが、アラビドプシス、トマト、ダイズ、イネ及びトウモロコシからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
標的配列が植物病原体のＲＮＡである、請求項１乃至９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
プロモーターが病原体により誘導可能なプロモーターである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
標的配列を含む植物病原体が植物ウイルス又は植物ウイロイドである、請求項１０又は１１項記載の方法。
【請求項１３】
標的配列がウイルスの必須領域の配列、ウイルスのファミリーの保存された配列及び別のウイルスファミリーのメンバー間の保存された配列からなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
核酸構築物が２つ又はそれより多い修飾ｍｉＲＮＡ前駆体配列を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
核酸構築物がヘテロ重合体前駆体ｍｉＲＮＡ又はホモ重合体前駆体ｍｉＲＮＡである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
標的配列がＲＮＡの非コーディング領域である、請求項１乃至９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
標的配列がＲＮＡのコーディング領域である、請求項１乃至９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
標的配列がＲＮＡのスプライス部位を含む、請求項１乃至９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
核酸構築物が細胞の遺伝子又はトランス遺伝子のイントロンに挿入された、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
二重鎖ＲＮＡ又はヘアピンを形成することができる修飾されたｍｉＲＮＡ前駆体をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸であって、但し、修飾されたｍｉＲＮＡ前駆体は修飾されたｍｉＲＮＡ及び当該修飾されたｍｉＲＮＡに相補な配列を含み、但し、修飾されたｍｉＲＮＡは、（ｉ）標的配列に対して完全相補であるか、（ｉｉ）ＧＵ塩基対を除く標的配列に対して完全相補であるか、又は（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡの５’エンドから数えて最初の１０ヌクレオチド中の標的配列に完全相補であるように修飾されたｍｉＲＮＡである、単離された核酸。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項２０記載の単離された核酸。
【請求項２２】
修飾されたｍｉＲＮＡが、標的配列に対して完全相補になるように修飾された植物のｍｉＲＮＡである、請求項２０又は２１記載の単離された核酸。
【請求項２３】
植物ｍｉＲＮＡが、アラビドプシス、トマト、ダイズ、イネ及びトウモロコシからなる群から選択される、請求項２２記載の単離された核酸。
【請求項２４】
修飾されたｍｉＲＮＡが、ＧＵ塩基対の使用を除いて、標的配列に対して完全相補になるように修飾された植物のｍｉＲＮＡである、請求項２０記載の単離された核酸。
【請求項２５】
植物ｍｉＲＮＡが、アラビドプシス、トマト、ダイズ、イネ及びトウモロコシからなる群から選択される、請求項２４記載の単離された核酸。
【請求項２６】
標的配列が植物病原体のＲＮＡである、請求項２０乃至２５のいずれか１項記載の単離された核酸。
【請求項２７】
プロモーターが病原体により誘導可能なプロモーターである、請求項２６記載の単離された核酸。
【請求項２８】
標的配列を含む植物病原体が植物ウイルス又は植物ウイロイドである、請求項２６又は２７項記載の単離された核酸。
【請求項２９】
標的配列がウイルスの必須領域の配列、ウイルスのファミリーの保存された配列及び別のウイルスファミリーのメンバー間の保存された配列からなる群から選択される、請求項２８記載の単離された核酸。
【請求項３０】
核酸構築物が２つ又はそれより多い修飾ｍｉＲＮＡ前駆体配列を含む、請求項２９記載の単離された核酸構築物。
【請求項３１】
核酸構築物がヘテロ重合体前駆体ｍｉＲＮＡ又はホモ重合体前駆体ｍｉＲＮＡである、請求項３０記載の単離された核酸。
【請求項３２】
標的配列がＲＮＡの非コーディング領域である、請求項２０乃至２５のいずれか１項記載の単離された核酸。
【請求項３３】
標的配列がＲＮＡのコーディング領域である、請求項２０乃至２５のいずれか１項記載の単離された核酸。
【請求項３４】
標的配列がＲＮＡのスプライス部位を含む、請求項２０乃至２５のいずれか１項記載の単離された核酸。
【請求項３５】
請求項２０乃至３４のいずれか１項記載の単離された核酸を含む細胞。
【請求項３６】
細胞が植物細胞である、請求項３５記載の細胞。
【請求項３７】
植物が、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、エンバク、モロコシ属、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、アラビドプシス、及びタバコからなる群から選択される、請求項３６記載の細胞。
【請求項３８】
単離された核酸構築物が細胞の遺伝子又はトランス遺伝子のイントロンに挿入された、請求項３５乃至３８のいずれか１項記載の細胞。
【請求項３９】
請求項２０乃至３４のいずれか１項記載の単離された核酸を含むトランスジェニック植物。
【請求項４０】
植物が、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、エンバク、モロコシ属、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、アラビドプシス、及びタバコからなる群から選択される、請求項３９記載のトランスジェニック植物。
【請求項４１】
単離された核酸が細胞の遺伝子又はトランス遺伝子のイントロンに挿入された、請求項３９又は４０記載の細胞。
【請求項４２】
請求項３９乃至４１のいずれか１項記載のトランスジェニック植物の種子。
【請求項４３】
細胞内で複数の標的配列をダウン制御する方法であって、
（ａ）互いに作動可能に連結された２つ又はそれより多いポリヌクレオチドを含む核酸構築物を細胞に導入するが、各ポリヌクレオチドは二重鎖ＲＮＡ又はヘアピンを形成することができる修飾されたｍｉＲＮＡ前駆体をコードし、各修飾されたｍｉＲＮＡ前駆体は修飾されたｍｉＲＮＡ及び当該修飾されたｍｉＲＮＡに相補な配列を含み、但し、各修飾されたｍｉＲＮＡは、（ｉ）標的配列に対して完全相補であるか、（ｉｉ）ＧＵ塩基対を除く標的配列に対して完全相補であるか、又は（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡの５’エンドから数えて最初の１０ヌクレオチド中の標的配列に完全相補であるように修飾されたｍｉＲＮＡであり、そして
（ｂ）２つ又はそれより多いｍｉＲＮＡｓを生産するのに十分な時間、核酸構築物を発現させるが、その際、各修飾されたｍｉＲＮＡが標的配列の発現をダウン制御する、
方法。
【請求項４４】
核酸構築物が、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
細胞が植物細胞である、請求項４３又は４４記載の方法。
【請求項４６】
細胞が、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、エンバク、モロコシ属、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、アラビドプシス、及びタバコからなる群から選択される、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
修飾されたｍｉＲＮＡが標的配列に結合して、二重鎖ＲＮＡが分割される、請求項４３乃至４６のいずれか１項記載の方法。
【請求項４８】
修飾されたｍｉＲＮＡが、標的配列に対して完全相補になるように修飾された植物のｍｉＲＮＡである、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
植物ｍｉＲＮＡが、アラビドプシス、トマト、ダイズ、イネ及びトウモロコシからなる群から選択される、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
修飾されたｍｉＲＮＡが、ＧＵ塩基対の使用を除いて、標的配列に対して完全相補になるように修飾された植物のｍｉＲＮＡである、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
植物ｍｉＲＮＡが、アラビドプシス、トマト、ダイズ、イネ及びトウモロコシからなる群から選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
核酸構築物がヘテロ重合体前駆体ｍｉＲＮＡ又はホモ重合体前駆体ｍｉＲＮＡである、請求項４３乃至５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項５３】
標的配列が植物病原体のＲＮＡである、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
プロモーターが病原体により誘導可能なプロモーターである、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
標的配列を含む植物病原体が植物ウイルス又は植物ウイロイドである、請求項５３又は５４項記載の方法。
【請求項５６】
標的配列がウイルスの必須領域の配列、ウイルスのファミリーの保存された配列及び別のウイルスファミリーのメンバー間の保存された配列からなる群から選択される、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
標的配列がＲＮＡの非コーディング領域である、請求項４３乃至５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項５８】
標的配列がＲＮＡのコーディング領域である、請求項４３乃至５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項５９】
標的配列がＲＮＡのスプライス部位を含む、請求項４３乃至５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項６０】
核酸構築物が細胞の遺伝子又はトランス遺伝子のイントロンに挿入された、請求項４３記載の方法。
【請求項６１】
互いに作動可能に連結された２つ又はそれより多いポリヌクレオチドを含む単離された核酸であって、各ポリヌクレオチドは二重鎖ＲＮＡ又はヘアピンを形成することができる修飾されたｍｉＲＮＡ前駆体をコードし、但し、修飾されたｍｉＲＮＡ前駆体は修飾されたｍｉＲＮＡ及び当該修飾されたｍｉＲＮＡに相補な配列を含み、但し、各修飾されたｍｉＲＮＡは、（ｉ）標的配列に対して完全相補であるか、（ｉｉ）ＧＵ塩基対を除く標的配列に対して完全相補であるか、又は（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡの５’エンドから数えて最初の１０ヌクレオチド中の標的配列に完全相補であるように修飾されたｍｉＲＮＡである、単離された核酸。
【請求項６２】
ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項６１記載の単離された核酸。
【請求項６３】
修飾されたｍｉＲＮＡが、標的配列に対して完全相補になるように修飾された植物のｍｉＲＮＡである、請求項６１又は６２記載の単離された核酸。
【請求項６４】
植物ｍｉＲＮＡが、アラビドプシス、トマト、ダイズ、イネ及びトウモロコシからなる群から選択される、請求項６３記載の単離された核酸。
【請求項６５】
修飾されたｍｉＲＮＡが、ＧＵ塩基対の使用を除いて、標的配列に対して完全相補になるように修飾された植物のｍｉＲＮＡである、請求項６４記載の単離された核酸。
【請求項６６】
植物ｍｉＲＮＡが、アラビドプシス、トマト、ダイズ、イネ及びトウモロコシからなる群から選択される、請求項６５記載の単離された核酸。
【請求項６７】
核酸構築物がヘテロ重合体前駆体ｍｉＲＮＡ又はホモ重合体前駆体ｍｉＲＮＡである、請求項６１乃至６６のいずれか１項記載の単離された核酸。
【請求項６８】
標的配列が植物病原体のＲＮＡである、請求項６７記載の単離された核酸。
【請求項６９】
プロモーターが病原体により誘導可能なプロモーターである、請求項６８記載の単離された核酸。
【請求項７０】
標的配列を含む植物病原体が植物ウイルス又は植物ウイロイドである、請求項６７又は６８項記載の単離された核酸。
【請求項７１】
標的配列がウイルスの必須領域の配列、ウイルスのファミリーの保存された配列及び別のウイルスファミリーのメンバー間の保存された配列からなる群から選択される、請求項７０記載の単離された核酸構築物。
【請求項７２】
標的配列がＲＮＡの非コーディング領域である、請求項６１乃至６６のいずれか１項記載の単離された核酸。
【請求項７３】
標的配列がＲＮＡのコーディング領域である、請求項６１乃至６６のいずれか１項記載の単離された核酸。
【請求項７４】
標的配列がＲＮＡのスプライス部位を含む、請求項６１乃至６６のいずれか１項記載の単離された核酸。
【請求項７５】
請求項６１乃至７４のいずれか１項記載の単離された核酸を含む細胞。
【請求項７６】
細胞が植物細胞である、請求項７５記載の細胞。
【請求項７７】
植物が、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、エンバク、モロコシ属、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、アラビドプシス、及びタバコからなる群から選択される、請求項７６記載の細胞。
【請求項７８】
単離された核酸構築物が細胞の遺伝子又はトランス遺伝子のイントロンに挿入された、請求項７５乃至７７のいずれか１項記載の細胞。
【請求項７９】
請求項６１乃至７４のいずれか１項記載の単離された核酸を含むトランスジェニック植物。
【請求項８０】
植物が、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、エンバク、モロコシ属、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、アラビドプシス、及びタバコからなる群から選択される、請求項７９記載のトランスジェニック植物。
【請求項８１】
単離された核酸構築物が細胞の遺伝子又はトランス遺伝子のイントロンに挿入された、請求項７９又は８０記載の細胞。
【請求項８２】
請求項７９乃至８１のいずれか１項記載のトランスジェニック植物の種子。
【請求項８３】
標的配列を含むＲＮＡがウイルスの遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードする、請求項１０記載の方法。
【請求項８４】
標的配列を含むＲＮＡがＨＣ−Ｐｒｏ及びＰ６９からなる群から選択されるポリヌクレオチドをコードする、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
標的配列を含むＲＮＡがウイルスの遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードする、請求項２６記載の単離された核酸。
【請求項８６】
標的配列を含むＲＮＡがＨＣ−Ｐｒｏ及びＰ６９からなる群から選択されるポリヌクレオチドをコードする、請求項８５記載の単離された核酸。
【請求項８７】
標的配列を含むＲＮＡがウイルスの遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードする、請求項５３記載の方法。
【請求項８８】
標的配列を含むＲＮＡがＨＣ−Ｐｒｏ及びＰ６９からなる群から選択されるポリヌクレオチドをコードする、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
標的配列を含むＲＮＡがウイルスの遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードする、請求項６８記載の単離された核酸。
【請求項９０】
標的配列を含むＲＮＡがＨＣ−Ｐｒｏ及びＰ６９からなる群から選択されるポリヌクレオチドをコードする、請求項８９記載の単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
［０００１］  本発明の分野は、一般に、植物分子生物学及び植物バイオテクノロジーに関する。より特定すれば、本発明の分野は、標的遺伝子の発現を抑圧するか又は標的遺伝子をダウン制御するための構築物及び方法に関する。
発明の背景
【０００２】
［０００２］  ＲＮＡ干渉は、短い干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）により媒介される動物内の配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを意味する（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１）。植物内の対応するプロセスは、一般に、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）又はＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、真菌においては鎮圧（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を妨害するために用いられた進化上保存された細胞防御機構であると考えられ、一般には、別種の叢（ｆｌｏｒａ）と門（ｐｈｙｌａ）により共有される（Ｆｉｒｅ（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５：３５８−３６３）。外来遺伝子発現からのそのような防御は、ウイルス感染に由来するか、或いはウイルスゲノムＲＮＡの相同な単鎖ＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答による宿主ゲノムへのトランスポゾン要素のランダムな組み込みに由来する、二重鎖ＲＮＡｓ（ｄｓＲＮＡｓ）の生産に応答して進化してきたのかもしれない。細胞内のｄｓＲＮＡの存在は、今のところ完全に特性決定されなければならない機構によりＲＮＡｉ応答を誘発する。
【０００３】
［０００３］  小ＲＮＡｉ分子の新規なクラスは、動物から植物にわたり多数の真核生物において遺伝子発現を制御することに関与する。これらの短いＲＮＡｓ又はマイクロＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ；ｍｉＲｓ）はメッセンジャーＲＮＡｓを標的としてそれらの翻訳を抑制するか又はそれらの分解を誘導するために特異的に塩基対合する２０−２２ヌクレオチド長の分子である。最近の報告は、脊椎動物、シノラブディスエレガンス、ドロソフィラ及びアラビドプシスサリアナからの多数のｍｉＲＮＡｓを同定した（Ｂａｒｔｅｌ（２００４）Ｃｅｌｌ  １１６：２８１−２９７；Ｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５：５２２−５３１）。
【０００４】
［０００４］  ウイルス、例えば、カブモザイクウイルス（ＴｕＭＶ）及びカブ黄化モザイクウイルス（ＴＹＭＶ）は、甚だしい穀物の損失を全世界で引き起こし、農業に対して重大な経済的衝撃を有する（Ｍｏｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６：６１５７−６１７３；Ｓｋｏｔｎｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １２７：２５−３５；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ（１９８７）Ａｎｎ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｌ  １１０：６６１−６８１）。全てではないがほとんどの（ｍｏｓｔ  ｉｆ  ｎｏｔ  ａｌｌ）植物ウイルスは宿主の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）機構を抑圧することができる一つ又はそれより多くの蛋白質をコードして、宿主細胞においてそれらの複製の成功を保証する。ＰＴＧＳはウイルスゲノムの複製において中間体として生産される二重鎖ＲＮＡｓの分解を誘発することによりウイルスに対して防御するために植物宿主が用いる機構である（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０−９５２；Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ  ３１：２５−３３）。
【０００５】
［０００５］  ウイルス遺伝子を含む特定の遺伝子の活性の低下（遺伝子サイレンシング、又は遺伝子抑圧とも呼ばれる）は、植物において遺伝子操作するいくつかの側面に関して望まれる。標的遺伝子の広い選択に対して遺伝子抑圧を誘導し、そして高い効率にて標的遺伝子の有効なサイレンシングをもたらす、方法及び構築物に関する要求が存在する。
【０００６】
発明の概要
［０００６］  一つの側面によれば、本発明は、細胞内で標的配列をダウン制御する方法、及びこの方法における使用のための核酸構築物、並びに当該核酸構築物における使用のためのポリヌクレオチドを提供する。当該方法は、標的配列を阻害するｍｉＲＮＡを生産することのできる核酸構築物を細胞に導入し、そして当該ｍｉＲＮＡを生産するのに十分な時間、当該核酸構築物を発現させることを含む。当該核酸構築物は、二重鎖ＲＮＡ又はヘアピンを形成することのできる修飾されたｍｉＲＮＡ前駆体をコードするポリヌクレオチドを含み、但し、当該修飾されたｍｉＲＮＡ前駆体は修飾されたｍｉＲＮＡ及び修飾されたＲＮＡに相補な配列を含み、修飾されたｍｉＲＮＡは、（ｉ）標的配列に完全相補であるか又は（ｉｉ）ＧＵ塩基対合を除いて標的配列に完全相補なように修飾されたｍｉＲＮＡである。当業界で知られるとおり、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、二重鎖領域が極めて短く、例えば２１−２５ｂｐの長さを超えないいくつかの場合に、ヘアピンを形成する。当該核酸構築物は、さらに、ポリヌクレオチドに対して作動可能に連結したプロモーターを含んでよい。当該細胞は植物細胞であってよく、単子葉又は双子葉の何れかであり、限定ではないが、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、エンバク、モロコシ属、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、アラビドプシス，タバコを含む。プロモーターは病原体誘導性プロモーター又は他の誘導可能なプロモーターであってよい。修飾されたｍｉＲＮＡの標的ＲＮＡへの結合は、標的ＲＮＡの分割を導く。標的ＲＮＡの標的配列は、コーディング配列、イントロン又はスプライス部位であってよい。
【０００７】
［０００７］  別の側面によれば、本発明は、修飾された植物ｍｉＲＮＡをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、当該修飾前駆体は二重鎖ＲＮＡ又はヘアピンを形成することができ、そして修飾されたｍｉＲＮＡ及び修飾されたｍｉＲＮＡに相補な配列を含み、但し、修飾されたｍｉＲＮＡは、（ｉ）標的配列に完全相補であるか又は（ｉｉ）ＧＵ塩基対合を除いて標的配列に完全相補なように修飾されたｍｉＲＮＡである。ポリヌクレオチドの発現は、標的配列の発現を阻害する成熟ｍｉＲＮＡを提供するように宿主細胞内でプロセシングを受ける（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）ｍｉＲＮＡ前駆体を生産する。当該ポリヌクレオチドは核酸構築物であってよく又は修飾された植物ｍｉＲＮＡ前駆体であってよい。当該核酸構築物は、さらに、ポリヌクレオチドへ作動可能なように連結されたプロモーターを含んでよい。修飾されたｍｉＲＮＡの標的ＲＮＡへの結合は、標的ＲＮＡの分割を導く。標的ＲＮＡの標的配列はコーディング配列、非コーディング配列又はスプライス部位であってよい。
【０００８】
［０００８］  別の側面によれば、本発明は、複数の標的配列を抑圧するための核酸構築物を提供する。当該核酸構築物は、少なくとも２から４５まで又はそれより多いポリヌクレオチドを含み、各々が二重鎖ＲＮＡ又はヘアピンを形成することのできるｍｉＲＮＡ前駆体をコードする。各ｍｉＲＮＡは実質上標的に相補性であるか又は上記のとおり標的に相補なように修飾される。いくつかの態様において、構築物中の前駆体ｍｉＲＮＡｓをコードするポリヌクレオチドの各々は、個別に単一のプロモーターの制御下に配置される。いくつかの態様において、前駆体ｍｉＲＮＡｓをコードする複数のポリヌクレオチドは、単一のプロモーター制御下に配置され得るように、共に作動可能なように連結される。プロモーターは、複数のｍｉＲＮＡｓの構築物へ作動可能なように連結してよく、又は単一のプロモーターに作動可能に連結されるようにして複数のｍｉＲＮＡｓの構築物を宿主ゲノムに挿入してよい。プロモーターは、病原体誘導可能なプロモーターであるか又は他の誘導可能なプロモーターであってよい。いくつかの態様において、複数のポリヌクレオチドが互いに連結されることにより、発現されたときに単一の転写物を形成する。核酸構築物中のポリヌクレオチドの発現は、複数のｍｉＲＮＡ前駆体を生成し、宿主細胞内でプロセシングを受けることにより、複数の成熟ｍｉＲＮＡｓを提供し、各々が標的配列の発現を阻害する。一つの態様において、成熟ｍｉＲＮＡの各々の標的ＲＮＡの各々への結合は、標的ＲＮＡの各々の分割を導く。標的ＲＮＡの標的配列は、コーディング配列、非コーディング配列又はスプライス部位であってよい。
【０００９】
［０００９］  別の側面によれば、本発明は、細胞内で複数の標的配列をダウン制御する方法を提供する。当該方法は、複数のｍｉＲＮＡを生産することのできる核酸構築物を細胞内へ導入し、そして複数のｍｉＲＮＡｓを生産するのに十分な時間、当該核酸構築物を発現させるが、その際、ｍｉＲＮＡｓの各々が標的配列の発現を阻害する。当該核酸構築物は、少なくとも２から４５まで又はそれより多いポリヌクレオチドを含み、各々が二重鎖ＲＮＡ又はヘアピンを形成することのできるｍｉＲＮＡ前駆体をコードする。各ｍｉＲＮＡは実質上標的に相補性であるか又は上記のとおり標的に相補なように修飾される。いくつかの態様において、構築物中の前駆体ｍｉＲＮＡｓをコードするポリヌクレオチドの各々は、個別に単一のプロモーターの制御下に配置される。いくつかの態様において、前駆体ｍｉＲＮＡｓをコードする複数のポリヌクレオチドは、上記のとおり、単一のプロモーター制御下にあり得るように、共に作動可能なように連結される。いくつかの態様においては、複数のポリヌクレオチドが互いに連結されることにより、発現されたときに単一の転写物を形成する。いくつかの態様において、構築物は、ヘテロ重合体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡであるか又はホモ−重合体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡであってよい。核酸構築物中のポリヌクレオチドの発現は、複数のｍｉＲＮＡ前駆体を生成し、宿主細胞内でプロセシングを受けることにより、複数の成熟ｍｉＲＮＡｓを提供し、各々が標的配列の発現を阻害する。一つの態様において、成熟ｍｉＲＮＡの各々の標的ＲＮＡの各々への結合は、標的ＲＮＡの各々の分割を導く。標的ＲＮＡの標的配列は、コーディング配列、非コーディング配列又はスプライス部位であってよい。
【００１０】
［００１０］  さらなる側面によれば、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸構築物を含む細胞を提供する。いくつかの態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸構築物は、細胞の遺伝子又はトランス遺伝子のイントロンに挿入されてよい。細胞は植物細胞であってよく、単子葉又は双子葉の何れかであり、限定ではないが、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、エンバク、モロコシ属、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、アラビドプシス，タバコを含む。
【００１１】
［００１１］  別の側面によれば、本発明は、単離されたポリヌクレオチド又は核酸構築物を含むトランスジェニック植物を提供する。いくつかの態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸構築物は、トランスジェニック植物の遺伝子又はトランス遺伝子のイントロンに挿入されてよい。トランスジェニック植物は、植物細胞であってよく、単子葉又は双子葉の何れかであり、限定ではないが、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、エンバク、モロコシ属、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、アラビドプシス，タバコを含む。
【００１２】
［００１２］  さらなる側面によれば、本発明は、細胞内で標的配列の発現を阻害する方法を提供し、（ａ）第１及び第２オリゴヌクレオチドを含む修飾植物ｍｉＲＮＡ前駆体を含む核酸構築物を細胞内に導入するが、その際、第１及び第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一つが前駆体に対して異種であり、第１のオリゴヌクレオチドは標的配列に対して実質上同一のＲＮＡ配列をコードし、そして第２のオリゴヌクレオチドは標的配列に対して実質上相補なｍｉＲＮＡをコードするが、前駆体はｍｉＲＮＡをコードし；そして（ｂ）ｍｉＲＮＡを生産するのに十分な時間、核酸構築物を発現するが、その際、ｍｉＲＮＡは標的配列の発現を阻害することを含む。
【００１３】
［００１３］  別の側面によれば、本発明は、修飾された植物ｍｉＲＮＡ前駆体を含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、当該修飾前駆体は第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含み、但し、第１及び第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一つが前駆体に対して異種であり、第１のオリゴヌクレオチドは標的配列に対して実質上同一のＲＮＡ配列をコードし、そして第２のオリゴヌクレオチドは標的配列に対して実質上相補なｍｉＲＮＡをコードし、ポリヌクレオチドの発現が標的配列の発現を阻害するｍｉＲＮＡを生産する。本発明は、この単離されたポリヌクレオチドを含む細胞にも関する。当該細胞は、植物細胞であってよく、単子葉又は双子葉の何れかであり、限定ではないが、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、エンバク、モロコシ属、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、アラビドプシス，タバコを含む。
【００１４】
［００１４］  さらなる側面によれば、本発明は、本明細書において記載された何れかのような、細胞内で標的配列の発現を阻害する方法を提供するが、さらに、形質転換された植物を生産することを含み、当該植物はｍｉＲＮＡをコードする核酸構築物を含む。本発明は、そのような方法により生産された植物にも関する。植物は、単子葉又は双子葉の何れかであり、限定ではないが、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、エンバク、モロコシ属、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、アラビドプシス，タバコを含む。
【００１５】
詳細な説明
［００５４］  最近発見された小ＲＮＡｓは、遺伝子発現を制御することにおいて重要な役割を担う。開花を含む多くの発生プロセスは小ＲＮＡｓにより制御される。植物中において小ＲＮＡｓを生産するトランスジェニック構築物を用いることにより、植物の遺伝子の遺伝子発現における変化を操作することが、今は可能である。
【００１６】
［００５５］  発明は、標的とされた配列を抑圧するために有用な方法及び組成物を提供する。当該組成物は、あらゆる種類の植物細胞及び他の細胞において用いることができ、適切なプロセシング成分（例えば、ＲＮＡ干渉成分）を含み、例えば、無脊椎及び脊椎動物の細胞を含む。上記組成物及び方法は、アラビドプシスにおいて発見された内生ｍｉＲＮＡサイレンシングプロセスに基づき、類似の戦略を用いて組成物の数及び当該方法が用いられる生物を拡大することができる。当該方法は、あらゆる真核細胞系において働くように適合させることができる。さらに、本明細書に記載された組成物及び方法は、個々の細胞、培養液中の細胞又は組織、又は生物中においてインビボにて、又は生物の器官又は他の部分において使用することができる。
【００１７】
［００５６］  上記組成物は、標的配列の領域に実質上の相補生を有するｍｉＲＮＡをコードすることにより標的配列を抑圧する。当該ｍｉＲＮＡはＲＮＡに転写された際に、細胞によりプロセシングを受けてｍｉＲＮＡを生じ、のちに標的配列の発現を抑圧するヘアピン構造を形成すると予測される核酸構築物中に提供される。
【００１８】
［００５７］  あらゆる特定の標的配列に関するｍｉＲＮＡをコードするように、核酸構築物が提供される。コードされたｍｉＲＮＡが標的配列を選択的に標的化して抑圧するように、あらゆるｍｉＲＮＡを構築物に挿入することができる。
【００１９】
［００５８］  標的配列を抑圧する方法が提供される。当該方法は、上記の構築物を用い、標的配列の領域に対してｍｉＲＮＡがデザインされて構築物中に挿入される。細胞への導入に際して、生産されたｍｉＲＮＡは標的配列の発現を抑圧する。標的配列は内生植物配列、又は植物中の異種トランス遺伝子であり得る。標的遺伝子は植物病原体由来の遺伝子であってもよく、例えば、病原ウイルス、線虫、昆虫、又は糸状菌（ｍｏｌｄ）又は真菌である。
【００２０】
［００５９］  上記構築物及び／又はｍｉＲＮＡを含む植物、細胞、及び種子が提供される。典型的には、上記細胞は植物からの細胞になるが、他の真核細胞も意図され、限定ではないが、酵母、昆虫、線虫、又は動物の細胞を含む。植物細胞は、単子葉及び双子葉からの細胞を含む。発明は、上記構築物及び／又はｍｉＲＮＡを含む植物及び種子も提供する。当該構築物を含むウイルス及び原核細胞も提供される。
【００２１】
［００６０］  単位、接頭辞及び符号はそれらのＳＩで認められた形態にて記載されてよい。他に示さない限り、核酸は左から右へ５’から３’方向に書かれる；アミノ酸配列は左から右へアミノからカルボキシルの方向に、それぞれ書かれる。明細書内に列挙される数値範囲は、範囲を規定する数を含み、そして規定された範囲内の各整数を含む。アミノ酸は、本明細書においては、一般に知られる３文字符号によるか又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢバイオケミカルノメンクラチャーコミッションにより推奨される１文字標記により呼ばれる。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に認められる１文字コードにより呼ばれる。他に提供しない限り、本明細書において使用される、ソフトウエア、電気用語及び電子用語は、Ｎｅｗ  ＩＥＥＥ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｔｅｒｍｓ（５版、１９９３）に定義されるとおりである。以下に定義される用語は、全体として明細書に対する引用により完全に定義される。
【００２２】
［００６１］  本明細書において使用される「核酸構築物」又は「構築物」は、宿主細胞に導入される単離されたポリヌクレオチドを意味する。この構築物は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又は修飾されたヌクレオチドのあらゆる組み合わせを含んでよい。当該構築物はＲＮＡを形成するように転写されてよく、ＲＮＡは二重鎖ＲＮＡ及び／又はヘアピン構造を形成することができてよい。この構築物は、細胞内で発現されるか、又は単離されるか又は合成により生産してよい。当該構築物は、さらに、プロモーター、又は構築物の操作又は発現を促進させる他の配列を含んでよい。
【００２３】
［００６２］  本明細書において使用される「抑圧」又は「サイレンシング」又は「阻害」は、野生型生物におけるその正常な発現レベルに比較しての、標的配列の生成物の発現のダウン制御を示すために交換可能に使用される。抑圧は、野生型発現レベルに比較して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％低下した発現を含む。
【００２４】
［００６３］  本明細書において使用される「コードする（ｅｎｃｏｄｅｓ）」又は「コードすること（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」は、ＲＮＡ及び／又はポリペプチドを生じるようにプロセシングを受けることができるＤＮＡ配列を意味する。
【００２５】
［００６４］  本明細書において使用される「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」又は「発現すること（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）」は、導入された構築物、内生ＤＮＡ配列、又は安定に取り込まれた異種ＤＮＡ配列からのＲＮＡ転写物の生成を意味する。当該用語は、上記のＤＮＡ前駆体の何れかから生じたｍＲＮＡから生産されたポリペプチドも意味してよい。
【００２６】
［００６５］  本明細書において使用される、核酸に関しての「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は、外来種を起源とする核酸であるか、又は合成によりデザインされたか、又は同じ種からであるなら、意図的なヒトの介在により組成物及び／又は遺伝子座におけるその天然形態からは実質上修飾された核酸である。異種蛋白質は、外来種を起源としてよく、あるいは、同じ種を起源とするなら、意図的なヒトの介在によりその起源の形態から実質上修飾される。
【００２７】
［００６６］  「宿主細胞」は、導入された核酸構築物を含み且つ構築物の複製及び／又は発現を支える細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞、例えば、エシェリヒアコリであるか、又は真核細胞、例えば真菌、酵母、昆虫、両生類、線虫、又は哺乳類の細胞であってよい。あるいは、宿主細胞は、単子葉或いは双子葉植物の細胞であってよい。
【００２８】
［００６７］  用語「導入された」は、核酸又は蛋白質の細胞への提供を意味する。導入されたは、核酸の原核細胞又は真核細胞への取り込みに対する言及を含み、核酸は細胞のゲノムに取り込まれてよく、そして核酸又は蛋白質の細胞への一過性の供給に対する言及を含む。導入されたは、安定な又は一過性の形質転換方法、並びに有性交配に対する言及を含む。
【００２９】
［００６８］  用語「単離された」は、物質、例えば、核酸又は蛋白質を意味し、（１）通常はその天然に生じる環境において見いだされる物質に付随するか又はと相互作用する成分を実質上又は本質的に含まないか又は（２）当該物質がその天然に生じる環境にあるなら、当該物質は、意図的なヒトの介在により組成物に変化されるか及び／又は当該物質に関して天然の位置とは異なる細胞内の位置に置かれたものである。
【００３０】
［００６９］  本明細書において使用される「ｍｉＲＮＡ」は、オリゴリボヌクレオチドを意味し、標的配列転写物を含むポリヌクレオチドの発現を抑圧するか又は標的ＲＮＡをダウン制御する。「ｍｉＲＮＡ前駆体」は、成熟ｍｉＲＮＡを生産するようにプロセシングを受ける大きなポリヌクレオチドを意味し、そしてＲＮＡ前駆体をコードし、そしてｍｉＲＮＡを含むＲＮＡ転写物をコードする。「成熟ｍｉＲＮＡ」はｍｉＲＮＡ前駆体のプロセシングにより生じたｍｉＲＮＡを意味する。「ｍｉＲＮＡ鋳型」は、ｍｉＲＮＡをコードする核酸構築物中の単一又は複数のオリゴヌクレオチド領域である。ｍｉＲＮＡの「バックサイド」領域は、ｍｉＲＮＡ鋳型に実質相補なポリヌクレオチド構築物の部分であり、そしてｍｉＲＮＡ鋳型と塩基対を形成すると予測される。ｍｉＲＮＡ鋳型とバックサイドは、二重鎖ポリヌクレオチドを形成してよく、ヘアピン構造を含む。天然のｍｉＲＮＡｓに関して知られるとおり、成熟ｍｉＲＮＡ及びその相補体はミスマッチを含みバルジを形成してよく、即ち、完全相補である必要はない。
【００３１】
［００７０］  本明細書にて使用される、句「標的配列」及び「目的の配列」は交換可能に使用される。標的配列は、発現の抑圧のために選択される核酸配列を意味するために使用され、そしてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに限定されない。標的配列は、ｍｉＲＮＡに実質上又は完全に相補な配列を含む。標的配列はＲＮＡ又はＤＮＡであることができ、そして標的配列を含むポリヌクレオチドを意味してもよい。
【００３２】
［００７１］  本明細書にて使用される「核酸」は、ポリヌクレオチドを意味し、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の単鎖又は二重鎖重合体を含む。核酸は断片又は修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。
【００３３】
［００７２］  「核酸ライブラリー」は、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡのコレクションを意味し、特定された生物のゲノムの或いはその生物からの組織の全転写フラクションを含み、そして実質上は表す。例示の核酸ライブラリー、例えばゲノムライブラリー及びｃＤＮＡライブラリーの構築は、標準の分子生物学の文献、例えば、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，アカデミックオプレス社、サンディエゴ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，編纂、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，グリーンパブリッシングアソシエイト社とジョンワイリーアンドソンズ社のジョイントベンチャー（１９９４）に教示される。
【００３４】
［００７３］  本明細書にて使用される「作動可能に連結される」は、少なくとも２つの配列の機能性連結に対する言及を含む。作動可能に連結されたは、プロモーターと第２の配列の間の連結を含み、プロモーター配列は第２の配列に相当するＤＮＡ配列の転写を開始して介在する。
【００３５】
［００７４］  本明細書にて使用される「植物」は、植物又は植物の部分を意味し、限定ではないが、植物細胞、植物組織、例えば、葉、幹、根、花及び種子を含む。
【００３６】
［００７５］  本明細書にて使用される「ポリペプチド」は、蛋白質、蛋白質断片、修飾された蛋白質、アミノ酸配列及び合成アミノ酸配列を意味する。ポリペプチドはグリコシル化されているか又はされていない。
【００３７】
［００７６］  本明細書にて使用される「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼ及びその他の蛋白質の転写を開始するための認識及び結合に関与するＤＮＡの領域に対する言及を含む。
【００３８】
［００７７］  用語「選択的にハイブリダイズする」は、ストリンジェント条件下で、非標的核酸配列へのそのハイブリダイゼーションよりも検出上高い程度での（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）特定の核酸標的配列への核酸配列のハイブリダイゼーションに対する言及、及び非標的核酸の実質上の排除に対する言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的には、互いに、約少なくとも８０％同一性、又は９０％配列同一性を有し、１００％配列同一性（即ち、完全相補）を含む。
【００３９】
［００７８］  用語「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズする条件に対する言及を含む。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして別の状況下では異なることになる。ハイブリダイゼーションのストリンジェント及び／又は洗浄条件を制御することにより、プローブに対して１００％相補な標的配列を同定することができる（相同プロービング）。或いは、配列中のいくつかのミスマッチングが低い程度の類似性を検出することを可能にするように、ストリンジェント条件を適合させることができる。一般に、プローブは約１０００ヌクレオチドの長さより短く、任意には、５００ヌクレオチドより短い長さである。
【００４０】
［００７９］  典型的には、ストリンジェント条件は塩濃度が約１．５Ｍ  Ｎａイオン未満、典型的には約０．０１から１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（又は他の塩）であり、ｐＨ７．０から８．３の条件であり、温度は短いプローブに関しては少なくとも約３０℃（例えば、１０から５０ヌクレオチド）であり、そして長いプローブに関しては少なくとも約６０℃（例えば、５０を超えるヌクレオチド）である。ストリンジェント条件は、不安定剤、例えばホルムアルデヒドの添加により達成してもよい。例示の低いストリンジェンシー条件は、３０から３５％のホルムアルデヒド、１Ｍ  ＮａＣｌ，１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のバッファー溶液による３７℃におけるハイブリダイゼーション、及び１Ｘから２ＸのＳＳＣ（２０Ｘ  ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸３ナトリウム）による５０から５５℃における洗浄を含む。例示の中度のストリンジェンシー条件は、４０から４５％のホルムアルデヒド、１Ｍ  ＮａＣｌ，１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、及び０．５Ｘから１ＸのＳＳＣによる５５から６０℃における洗浄を含む。例示の高ストリンジェンシー条件は、５０％のホルムアルデヒド、１Ｍ  ＮａＣｌ，１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、及び０．１ＸのＳＳＣによる６５から６５℃における洗浄を含む。
【００４１】
［００８０］  特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の函数であり、必須の因子は最終洗浄溶液のイオン強度と温度である。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに関しては、ＴｍをＭｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ（（１９８４）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３８：２６７−２８４）の等式から近似することができる：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％フォーム）−５００／Ｌ；式中、Ｍは単価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンとシトシンのヌクレオチドのパーセンテージであり、％形態はハイブリダイゼーション溶液中のホルムアルデヒドのパーセンテージであり、そしてＬは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補標的配列の５０％が完全に適合したプローブにハイブリダイズする温度である（規定されたイオン強度とｐＨ下で）。Ｔｍはミスマッチ１％ごとに約１℃低下する；即ち、Ｔｍ，ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件は、所望の同一性の配列へハイブリダイズするように調節可能である。例えば、≧９０％の同一性の配列を求めるなら、Ｔｍは１０℃低下させることができる。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度とｐＨにおける特定の配列及びその相補体に関して、熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。しかしながら、厳密な（ｓｅｖｅｒｅｌｙ）ストリンジェント条件は、熱融点（Ｔｍ）の１、２、３、又は４℃下でハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる；中度のストリンジェント条件は、熱融点（Ｔｍ）の６、７、８、９、又は１０℃下でハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる；低いストリンジェント条件は、熱融点（Ｔｍ）の１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃下でハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。等式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、及び所望のＴｍを用いることにより、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は溶液中のストリンジェントの変化が本質的に記載されることを理解する。ミスマッチの所望の程度が４５℃（水溶液）よりも低いかあるいは３２℃（ホルムアルデヒド溶液）よりも低いＴｍをもたらすなら、高い温度が使用できるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する大規模なガイドは、Ｔｉｊｅｎｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，パート１、２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」、エルセビア、ニューヨーク（１９９３）；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２章、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，編纂、グリーンパブリッシングアンドワイリーインターサイエンス、ニューヨーク（１９９５）に見いだされる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄の溶液は、少なくとも１０、３０、６０、���０、１２０、又は２４０分間適用可能である。
【００４２】
［００８１］  本明細書にて使用される「トランスジェニック」は、異種ポリヌクレオチドを含む植物又は細胞に対する言及を含む。一般に、異種ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが連続する世代に伝わるように、安定にゲノムに取り込まれる。トランスジェニックは、本明細書においては、あらゆる細胞、細胞系、カルス、組織、植物部分又は植物を含むように使用され、その遺伝子型は最初にそう変更されたトランスジェニック並びに有性交配又は初期トランスジェニックからの非性的増殖により創製されたものを含む、異種核酸の存在により変更された。本明細書にて使用される用語「トランスジェニック」は、慣用の植物育種法によるか又は天然に生じる事象、例えばランダムな受精、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換えトランスポジション、又は自発変異による、ゲノム（染色体又は染色体外）の変更を含まない。
【００４３】
［００８２］  本明細書にて使用される「ベクター」は、発明のポリヌクレオチドの細胞への導入に使用される核酸に対する言及を含む。発現ベクターは、その中に挿入された核酸の転写を許容する。
【００４４】
［００８３］  ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の選択された領域に対して実質同一か、実質相同か、又は実質相補性を有してよい。本明細書にて使用される「実質同一」及び「実質相同」は、互いに配列同一性又は相同性を有する配列を指す。一般に、実質同一又は実質相同な配列は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有し、パーセント配列同一性は全配列に基づき、そしてデフォルトパラメーターを用いたＧＡＰアラインメントにより決定される（ＧＣＧ，ＧＡＰバージョン１０、アクセルリス、サンディエゴ、ＣＡ）。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３−４５３）の計算式を用いることにより、マッチの数を最大にして且つ配列ギャップの数を最小にする２つの全配列のアラインメントを見いだす。１００％同一性を有する配列が同一である。「実質相補」は、互いに相補の配列を意味し、そして互いに塩基対合することができる。相補配列を記載するに際しては、第１配列中の全てのヌクレオチドが第２配列と塩基対合するなら、これらの配列は完全相補性である。
【００４５】
［００８４］  フォワードジェネティックアプローチを通して、アラビドプシスにおいて発生上の表現型を授与するマイクロＲＮＡを同定した。このｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ１７２ａ−２（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：１４８４−１４９５）は、過剰に発現されたときに、初期開花を引き起こし、そして花の器官の同一性を欠く。ｍｉＲ１７２ａ−２の予測された標的は、ＡＰＥＴＡＬＡ２−様転写因子の小さなサブファミリーである（Ｏｋａｍｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｏｒｏｃ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｎａｔｌ  ＵＳＡ  ９４：７０７６−７０８１）。ｍｉＲ１７２ａ−２の過剰発現は、このファミリーの少なくとも一つのメンバーをダウン制御する。さらに、ＡＰ２−様標的遺伝子の一つ、Ａｔ２ｇ２８５５０の過剰発現は開花の遅延を引き起こす。この結果は、Ａｔ２ｇ２８５５０及び他の標的遺伝子、Ａｔ５ｇ６０１２０の機能損失の分析と関連して、ｍｉＲ１７２ａ−２により標的とされたＡＰ２−様遺伝子の少なくともいくつかが開花抑制因子として正常に機能することを示す。ＭｉＲ１７２−ａ２を過剰発現するＥＡＴ−Ｄ系は光周期に対して野生型の応答性を有する。ｍｉＲＮＡをコードするゲノム領域も同定され（配列番号：１）、そして標的配列に対してその他のｍｉＲＮＡｓが挿入され得るカセットを生産するため（配列番号：３）、及び当該カセットをクローン化してｍｉＲＮＡを発現させるのに有用な発現ベクター（配列番号：４）を生産するために使用された。当該発現ベクターは、ｍｉＲＮＡをコードする１．４ｋｂ領域を含む。この領域の発現は、標的遺伝子の発現を抑圧するｍｉＲＮＡを生産するために細胞内でプロセシングされる。或いは、当該ｍｉＲＮＡを合成により生産して細胞に直接に導入してよい。
【００４６】
［００８５］  一つの態様において、標的に実質相補なｍｉＲＮＡをコードする核酸構築物を細胞に導入することを含む、標的配列の抑圧の方法が提供される。いくつかの態様において、当該ｍｉＲＮＡは約１０−２００ヌクレオチド、約１０−１５、１５−２０、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２５−３０、３０−５０、５０−１００、１００−１５０、又は約１５０−２００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、当該核酸構築物はｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの態様において、当該核酸構築物は、二重鎖ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含むヘアピン構造を形成するかもしれないポリヌクレオチド前駆体をコードする。いくつかの態様においては、配列番号：３のヌクレオチド３９−５９及び１０７−１２７を、それぞれ、ｍｉＲＮＡのバックサイド及びｍｉＲＮＡ鋳型により置換する。いくつかの態様においては、この新規な配列が、配列番号：１の均等な領域を置き換える。さらなる態様においては、この新規な配列が、配列番号：４４の均等な領域を置き換える。
【００４７】
［００８６］  いくつかの態様においては、当該核酸構築物は修飾された内生の植物ｍｉＲＮＡ前駆体を含み、但し、標的配列に向けられたｍｉＲＮＡを生産するようにデザインされた配列により、上記内生ｍｉＲＮＡコード領域を置き換えるように、当該前駆体は修飾される。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ前駆体の鋳型はｍｉＲ１７２ａ  ｍｉＲＮＡ前駆体である。いくつかの態様において、ｍｉＲ１７２ａ前駆体はアラビドプシスサリアナ、トマト、ダイズ、イネ又はトウモロコシ由来である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ前駆体は、配列番号：１、配列番号：３又は配列番号：４４である。
【００４８】
［００８７］  別の態様において、上記方法は
【００４９】
［００８８］  細胞内で標的配列の発現を阻害する方法であって、
（ａ）細胞へ、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物を導入するが、但し、当該ポリヌクレオチドは、以下の順序で
（ｉ）配列番号：３のヌクレオチド１−３８の領域内の少なくとも約２０から３８までの連続するヌクレオチド、
（ｉｉ）１０から約５０の連続するヌクレオチドの第１オリゴヌクレオチドであって、第２オリゴヌクレオチドに対して実質相補な第１オリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）配列番号：３のヌクレオチド６０−１０６の領域内の少なくとも約２０から４７までの連続するヌクレオチド、
（ｉｖ）約１０から約５０の連続するヌクレオチドの第２オリゴヌクレオチドであって、ｍｉＲＮＡをコードして、且つ、標的配列に対して実質相補である第２オリゴヌクレオチド、及び
（ｖ）配列番号：３のヌクレオチド１２８−１５９の領域内の少なくとも約２０から３２までの連続するヌクレオチド；
を含み、但し、当該ポリヌクレオチドはヘアピンを形成することのできるＲＮＡ前駆体をコードし、そして
（ｂ）ｍｉＲＮＡを生産するのに十分な時間、上記核酸構築物を発現させるが、その際、ｍｉＲＮＡが標的配列の発現を阻害すること
を含む方法を含む。
【００５０】
［００８９］  別の態様において、上記方法は、遺伝子の標的配列を選択し、そして標的配列に実質相補なｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物をデザインすることを含む。いくつかの態様において、標的配列は、遺伝子のあらゆる領域から選択される。いくつかの態様において、標的配列は、遺伝子のコーディング領域から選択される。いくつかの態様において、標的配列は、停止コドンから約５０から約２００ヌクレオチド上流の領域から選択され、停止コドンの約５０−７５、７５−１００、１００−１２５、１２５−１５０、又は１５０−２００ヌクレオチド上流の領域を含む。さらなる態様において、標的配列及び／又はｍｉＲＮＡは、上記ポリヌクレオチド及びアラビドプシスサリアナ内のＡｐｅｔｅｌａ２−様遺伝子のＥＡＴ抑圧のプロセスに基づく。いくつかの態様においては、配列番号：３のヌクレオチド３９−５９及び１０７−１２７を、ｍｉＲＮＡの鋳型のバックサイド（第１オリゴヌクレオチド）及びｍｉＲＮＡ鋳型（第２オリゴヌクレオチド）によりそれぞれ置換する。いくつかの態様において、この新規な配列は、配列番号：１の均等な領域を置き換える。さらなる態様において、この新規な配列は、配列番号：４４の均等な領域を置き換える。
【００５１】
［００９０］  いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ鋳型（即ち、ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド）は、及びそれによりｍｉＲＮＡが、標的配列に関していくつかのミスマッチを含んでよい。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ鋳型は、標的配列に比較して≧１のヌクレオチドミスマッチを有し、例えば、ｍｉＲＮＡｓ鋳型は標的配列に比較して１、２、３、４、５、又はそれより多くのミスマッチを有し得る。この程度のミスマッチは、標的配列の相補体に対するｍｉＲＮＡ鋳型の同一性パーセントを決定することにより記載してもよい。例えば、ｍｉＲＮＡ鋳型は、標的配列の相補体に比較して、およそ少なくとも７０％、７５％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８％、９９％、又は１００％を含む同一性パーセントを有してよい。
【００５２】
［００９１］  いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ鋳型（即ち、ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド）及びそれによりｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡバックサイドに関していくつかのミスマッチを含んでよい。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ鋳型は、ｍｉＲＮＡバックサイドに比較して≧１のヌクレオチドミスマッチを有し、例えば、ｍｉＲＮＡｓ鋳型はｍｉＲＮＡバックサイドに比較して１、２、３、４、５、又はそれより多くのミスマッチを有し得る。この程度のミスマッチは、ｍｉＲＮＡバックサイドの相補体に対するｍｉＲＮＡ鋳型の同一性パーセントを決定することにより記載してもよい。例えば、ｍｉＲＮＡ鋳型は、ｍｉＲＮＡバックサイドの相補体に比較して、およそ少なくとも７０％、７５％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８％、９９％、又は１００％を含む同一性パーセントを有してよい。
【００５３】
［００９２］  いくつかの態様において、標的配列は、植物病原体から選択される。病原体の標的配列に対するｍｉＲＮＡを含む植物又は細胞は、病原体に対して感度が低下するか及び／又は耐性が増加することが予測される。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む核酸構築物によりコードされる。いくつかの態様において、プロモーターは病原体誘導可能なプロモーターである。
【００５４】
［００９３］  別の態様において、上記方法は、配列番号：３のポリヌクレオチド内のｍｉＲＮＡコード配列を標的遺伝子の標的領域に実質相補なｍｉＲＮＡをコードする配列で置き換えることを含む。
【００５５】
［００９４］  別の態様において、標的配列の発現を細胞中で阻害する方法が提供されるが、
（ａ）第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含む修飾された植物ｍｉＲＮＡ前駆体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物を細胞に導入し、その際、第１又は第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が前駆体に対して異種であり、第１オリゴヌクレオチドは第２オリゴヌクレオチドに実質相補であり、そして第２オリゴヌクレオチドは標的配列に実質相補なｍｉＲＮＡをコードし、前駆体はヘアピンを形成でき；そして
（ｂ）ｍｉＲＮＡを生産するのに十分な時間、核酸構築物を発現させるが、その際、ｍｉＲＮＡは標的配列の発現を阻害する
ことを含む。
【００５６】
［００９５］  別の態様において、標的配列の発現を細胞中で阻害する方法が提供されるが、
（ａ）第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含む修飾された植物ｍｉＲ１７２  ｍｉＲＮＡ前駆体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物を細胞に導入し、その際、第１又は第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が前駆体に対して異種であり、第１オリゴヌクレオチドは第２オリゴヌクレオチドに実質相補であり、そして第２オリゴヌクレオチドは標的配列に実質相補なｍｉＲＮＡをコードし、前駆体はヘアピンを形成でき；そして
（ｂ）ｍｉＲＮＡを生産するのに十分な時間、核酸構築物を発現させるが、その際、ｍｉＲＮＡは標的配列の発現を阻害する
ことを含む。
【００５７】
［００９６］  いくつかの態様において、修飾された植物ｍｉＲ１７２  ｍｉＲＮＡ前駆体は、修飾されたアラビドプシスｍｉＲ１７２  ｍｉＲＮＡ前駆体であるか、又は修飾されたトウモロコシｍｉＲ１７２  ｍｉＲＮＡ前駆体又は等などである。
【００５８】
［００９７］  別の態様において、標的配列を抑圧するための核酸構築物が提供される。当該核酸構築物は、標的に実質相補である。当該核酸構築物は、標的に実質相補なｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの態様において、当該核酸構築物は、さらに、ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの態様においては、プロモーターを欠く核酸構築物をデザインして、宿主ゲノム中で組み込みに際してプロモーターに作動可能に連結されることになるように、導入される。いくつかの態様において、当該核酸構築物は、組換えを用いて組み込まれ、部位特異的組換えを含む。例えば、ＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ９９／２５８２１は引用により本明細書に編入されるが、参照されたい。いくつかの態様において、上記核酸構築物はＲＮＡである。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、部位特異的組換え部位を含む少なくとも一つの組換え部位を含む。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、構築物の組み込み、修飾、又はクローン化を促進させるために、少なくとも一つの組換え部位を含む。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、ｍｉＲＮＡ前駆体に隣接して２つの部位特異的組換え部位を含む。いくつかの態様において、部位特異的組換え部位は、ＦＲＴ部位、ｌｏｘ部位、又はａｔｔ分析とを含み、ａｔｔＢ，ａｔｔＬ，ａｔｔＰ又はａｔｔＲ部位を含む。例えば、ＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ９９／２５８２１、及び米国特許５，８８８，７３２，６，１４３，５５７，６，１７１，８６１，６，２７０，９６９，及び６，２７７，６０８は引用により本明細書に編入されるが、参照されたい。
【００５９】
［００９８］  いくつかの態様において、上記核酸構築物は、修飾された異種植物ｍｉＲＮＡ前駆体を含み、前駆体はｍｉＲＮＡコード領域を、標的配列に向けられたｍｉＲＮＡを生産するようにデザインされた配列により置換するように修飾されている。いくつかの態様において、当該ｍｉＲＮＡ前駆体鋳型は、ｍｉＲ１７２ａ  ｍｉＲＮＡ前駆体である。いくつかの態様において、ｍｉＲ１７２ａ前駆体は、双子葉又は単子葉由来である。いくつかの態様において、ｍｉＲ１７２ａ前駆体は、アラビドプシスサリアナ、トマト、ダイズ、イネ又はトウモロコシ由来である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ前駆体は、配列番号：１、配列番号：３、又は配列番号：４４である。
【００６０】
［００９９］  別の態様において、当該核酸構築物は、修飾された植物ｍｉＲＮＡ前駆体をコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドを含み、修飾された前駆体は第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１又は第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は前駆体に相補性であり、第１オリゴヌクレオチドは第２オリゴヌクレオチドに対して実質相補であり、そして第２オリゴヌクレオチドは標的配列に実質相補なｍｉＲＮＡを含み、前駆体はヘアピンを形成することができる。
【００６１】
［０１００］  別の態様において、上記核酸構築物は、修飾された植物ｍｉＲ１７２  ｍｉＲＮＡ前駆体をコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドを含み、修飾された前駆体は第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１又は第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は前駆体に相補性であり、第１オリゴヌクレオチドは第２オリゴヌクレオチドに対して実質相補であり、そして第２オリゴヌクレオチドは標的配列に実質相補なｍｉＲＮＡを含み、前駆体はヘアピンを形成することができる。いくつかの態様において、修飾された植物ｍｉＲ１７２  ｍｉＲＮＡ前駆体は、修飾されたアラビドプシスｍｉＲ１７２  ｍｉＲＮＡ前駆体であるか、又は修飾されたトウモロコシｍｉＲ１７２  ｍｉＲＮＡ前駆体又は等などである。
【００６２】
［０１０１］  いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、約１０−２００ヌクレオチド、約１０−１５、１５−２０、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２５−３０、３０−５０、５０−１００、１００−１５０、又は約１５０−２００ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、当該核酸構築物はｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの態様において、当該核酸構築物は、二重鎖ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含むヘアピン構造を形成するかもしれないポリヌクレオチド前駆体をコードする。いくつかの態様においては、配列番号：３のヌクレオチド３９−５９及び１０７−１２７を、それぞれ、ｍｉＲＮＡのバックサイド及びｍｉＲＮＡ鋳型により置換する。いくつかの態様においては、この新規な配列が、配列番号：１の均等な領域を置き換える。さらなる態様においては、この新規な配列が、配列番号：４４の均等な領域を置き換える。いくつかの態様において、標的領域は、標的配列の何れかの領域から選択される。いくつかの態様において、標的領域は、非翻訳領域から選択される。いくつかの態様において、標的領域は、コーディング領域から選択される。いくつかの態様において、標的領域は、停止コドンから約５０−２００ヌクレオチド上流の領域から選択され、約５０−７５、７５−１００、１００−１２５、１２５−１５０、又は１５０−２００ヌクレオチド上流の領域を含む。さらなる態様において、標的領域及び／又はｍｉＲＮＡは、上記ポリヌクレオチド及びアラビドプシスサリアナ内のＡｐｅｔｅｌａ２−様配列のＥＡＴ抑圧のプロセスに基づく。
【００６３】
［０１０２］  別の態様において、上記核酸構築物は、以下の順序で、以下を含む、配列番号：３のヌクレオチド１−３８の領域内の少なくとも２０から３８までの連続するヌクレオチド、約１０から約５０の連続するヌクレオチドの第１オリゴヌクレオチドであって、第１オリゴヌクレオチドは第２オリゴヌクレオチドに対して実質相補であって、配列番号：３のヌクレオチド６０−１０６の領域内の少なくとも約２０から４７までの連続するヌクレオチド、約１０から約５０の連続するヌクレオチドの第２オリゴヌクレオチドであって、第２オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡをコードして、且つ、第２オリゴヌクレオチドは標的配列に対して実質相補である、及び配列番号：３のヌクレオチド１２８−１５９の領域内の少なくとも約２０から３２までの連続するヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドはヘアピンを形成することのできるＲＮＡ前駆体をコードする。
【００６４】
［０１０３］  いくつかの態様において、導入されたポリヌクレオチドを含む、及び／又は発明の方法により生産された、細胞、植物及び種子が提供される。当該細胞は、原核細胞及び真各細胞を含み、限定ではないが、細菌、酵母、真菌、ウイルス、無脊椎動物、脊椎動物、及び植物の細胞を含む。発明の植物、植物細胞、及び種子は、裸子植物（ｇｙｎｏｓｐｅｒｍｓ）、単子葉及び双子葉を含み、限定ではないが、例えば、イネ、コムギ、エンバク、オオムギ、キビ、モロコシ属、ダイズ、ヒマワリ、ベニバナ、カノーラ、アルファルファ、ワタ、アラビドプシス、及びタバコを含む。
【００６５】
［０１０４］  いくつかの態様において、上記細胞、植物及び／又は種子は、修飾された植物ｍｉＲＮＡ前駆体を含む核酸構築物を含み、当該前駆体は、標的配列に対して向けられたｍｉＲＮＡを生産するようにデザインされた配列により、内生ｍｉＲＮＡコーディング領域を置き換えるように修飾されている。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ前駆体鋳型は、ｍｉＲ１７２ａ  ｍｉＲＮＡ前駆体である。いくつかの態様において、ｍｉＲ１７２ａ前駆体は双子葉又は単子葉由来である。いくつかの態様において、ｍｉＲ１７２ａ前駆体はアラビドプシスサリアナ、トマト、ダイズ、イネ又はトウモロコシ由来である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ前駆体は、配列番号：１、配列番号：３、又は配列番号：４４である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ前駆体は、配列番号：１、配列番号：３、又は配列番号：４４によりコードされる。いくつかの態様において、当該核酸構築物は、部位特異的組換え部位を含む少なくとも一つの組換え部位を含む。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、構築物の修飾又はクローン化を促進させるために、少なくとも一つの組換え部位を含む。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、ｍｉＲＮＡ前駆体に隣接して２つの部位特異的組換え部位を含む。いくつかの態様において、部位特異的組換え部位は、ＦＲＴ部位、ｌｏｘ部位、又はａｔｔ分析とを含み、ａｔｔＢ，ａｔｔＬ，ａｔｔＰ又はａｔｔＲ部位を含む。例えば、ＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ９９／２５８２１、及び米国特許５，８８８，７３２，６，１４３，５５７，６，１７１，８６１，６，２７０，９６９，及び６，２７７，６０８は引用により本明細書に編入されるが、参照されたい。
【００６６】
［０１０５］  さらなる態様において、標的ＲＮＡをダウン制御する方法が提供され、標的ＲＮＡの領域に相補なｍｉＲＮＡをコードする核酸構築物を細胞に導入することを含む。いくつかの態様において、当該ｍｉＲＮＡは標的ＲＮＡの領域に対して完全相補である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、相補であって、Ｇ−Ｕ塩基対、即ちＧＵの揺らぎの使用を含み、他の点では完全相補である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡの最初の１０ヌクレオチド（ｍｉＲＮＡの５’エンドから数えて）は標的ＲＮＡの領域に対して完全相補であり、そして残りのヌクレオチドは標的ＲＮＡとのミスマッチ及び／又はバルジを含んでよい。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、約１０−２００ヌクレオチド、約１０−１５、１５−２０、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２５−３０、３０−５０、５０−１００、１００−１５０、又は約１５０−２００ヌクレオチドを含む。標的ＲＮＡ中の相補配列へのｍｉＲＮＡの結合は、標的ＲＮＡの分割をもたらす。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡが標的ＲＮＡの標的配列に対して完全相補であるように修飾されているｍｉＲＮＡである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡが標的ＲＮＡの標的配列に完全相補であるように修飾されている内生植物ｍｉＲＮＡである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターへ作動可能に連結される。いくつかの態様において、上記核酸構築物はｍｉＲＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含む。
【００６７】
［０１０６］  いくつかの態様において、上記核酸構築物はｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、ｍｉＲＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、ｍｉＲＮＡを含む二重鎖ＲＮＡ又はヘアピン構造を形成するかもしれないポリヌクレオチドをコードする。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、ｍｉＲＮＡを含む二重鎖ＲＮＡ又はヘアピン構造を形成するかもしれないポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、ｍｉＲＮＡが標的ＲＮＡの標的配列に完全相補であるように修飾されている内生植物ｍｉＲＮＡ前駆体を含む。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、ｍｉＲＮＡ前駆体に対して作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、約５０ヌクレオチドから約３０００ヌクレオチド、約５０−１００、１００−１５０、１５０−２００、２００−２５０、２５０−３００、３００−３５０３５０−４００、４００−４５０、４５０−５００、５００−６００、６００−７００、７００−８００、８００−９００、９００−１０００、１０００−１１００、１１００−１２００、１２００−１３００、１３００−１４００、１４００−１５００、１５００−１６００、１６００−１７００、１７００−１８００、１８００−１９００、１９００−２０００、２０００−２１００、２１００−２２００、２２００−２３００、２３００−２４００、２４００−２５００、２５００−２６００、２６００−２７００、２７００−２８００、２８００−２９００又は２９００−３０００ヌクレオチドを含む。
【００６８】
［０１０７］  いくつかの態様において、宿主ゲノム中への組み込みに際してプロモーターに作動可能に連結されるようになる、プロモーターを欠く核酸構築物がデザインされて、導入される。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、部位特異的組換えを含む組換えを用いて組み込まれる。いくつかの態様において、核酸構築物はＲＮＡである。いくつかの態様において、核酸構築物は部位特異的組換え部位を含む少なくとも一つの組換え部位を含む。いくつかの態様において、核酸構築物は、構築物の組み込み、修飾又はクローン化を促進するために少なくとも一つの組換え部位を含む。いくつかの態様において、核酸構築物は、ｍｉＲＮＡ前駆体に隣接して２つの部位特異的組換え部位を含む。
【００６９】
［０１０８］  別の態様において、上記方法は、標的ＲＮＡの領域に相補なｍｉＲＮＡをコードする核酸構築物を細胞に導入し、そしてｍｉＲＮＡを生産するのに十分な時間、当該核酸構築物を発現させることを含むが、その際、ｍｉＲＮＡが標的ＲＮＡをダウン制御する。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは標的ＲＮＡの領域に完全相補である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、相補であって、Ｇ−Ｕ塩基対、即ちＧＵの揺らぎの使用を含み、他の点では完全相補である。
【００７０】
［０１０９］  別の態様において、上記方法は、標的ＲＮＡを選択し、ｍｉＲＮＡを選択し、標的ＲＮＡの配列（又はそのＤＮＡ）をｍｉＲＮＡの配列と比較し、そしてヌクレオチド配列がｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列と類似であるような標的ＲＮＡ（又はそのＤＮＡ）の領域を同定し、それが標的ＲＮＡの同定された領域のヌクレオチド配列に相補であるようにｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列を修飾し、そして修飾されたｍｉＲＮＡを含む核酸構築物を調製することを含む。いくつかの態様において、上記ｍｉＲＮＡは標的ＲＮＡの同定された領域に完全相補である。いくつかの態様において、上記ｍｉＲＮＡは、相補であって、Ｇ−Ｕ塩基対、即ちＧＵの揺らぎの使用を含み、他の点では完全相補である。いくつかの態様において、核酸構築物は、ｍｉＲＮＡを含む二重鎖ＲＮＡ又はヘアピン構造を形成するかもしれないポリヌクレオチドをコードする。いくつかの態様において、核酸構築物は、ｍｉＲＮＡ前駆体、即ち、この態様に従い修飾されていたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含む。
【００７１】
［０１１０］  別の態様において、上記方法は、標的ＲＮＡを選択し、標的ＲＮＡ内でヌクレオチド配列とを選択し、ｍｉＲＮＡを選択し、それが標的ＲＮＡの同定された領域のヌクレオチド配列に相補であるようにｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列を修飾し、そして修飾されたｍｉＲＮＡを含む核酸構築物を調製することを含む。いくつかの態様において、上記ｍｉＲＮＡは標的ＲＮＡの同定された領域に完全相補である。いくつかの態様において、上記ｍｉＲＮＡは、相補であって、Ｇ−Ｕ塩基対、即ちＧＵの揺らぎの使用を含み、他の点では完全相補である。いくつかの態様において、核酸構築物は、ｍｉＲＮＡを含む二重鎖ＲＮＡ又はヘアピン構造を形成するかもしれないポリヌクレオチドをコードする。いくつかの態様において、核酸構築物は、ｍｉＲＮＡ前駆体、即ち、この態様に従い修飾されていたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含む。
【００７２】
［０１１１］  いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡはマイクロＲＮＡ登録に開示されたｍｉＲＮＡであり、今は、ｍｉＲＢａｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅとしても知られる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ（２００４）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ：Ｄ１０９−Ｄ１１；ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、ａｔｈ−ＭＩＲ１５６ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５６ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５６ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５６ｄ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５６ｅ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５６ｆ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５６ｇ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５６ｈ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５７ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５７ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５７ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５７ｄ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５８ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５８ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５９ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５９ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１５９ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６０ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６０ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６０ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６１，ａｔｈ−ＭＩＲ１６２ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６２ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６３，ａｔｈ−ＭＩＲ１６４ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６４ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６４ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６５ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６５ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６６ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６６ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６６ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６６ｄ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６６ｅ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６６ｆ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６６ｇ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６７ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６７ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６７ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６７ｄ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６８ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６８ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｄ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｅ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｆ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｇ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｈ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｉ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｊ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｋ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｌ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｍ，ａｔｈ−ＭＩＲ１６９ｎ，ａｔｈ−ＭＩＲ１７０，ａｔｈ−ＭＩＲ１７１ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１７１ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１７１ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ１７２ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ１７２ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ１７２ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ１７２ｄ，ａｔｈ−ＭＩＲ１７２ｅ，ａｔｈ−ＭＩＲ１７３，ａｔｈ−ＭＩＲ３１９ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ３１９ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ３１９ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９０ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９０ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９３ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９３ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９４ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９４ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９５ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９５ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９５ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９５ｄ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９５ｅ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９５ｆ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９６ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９６ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９７ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９７ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９８ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９８ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９８ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９９ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９９ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９９ｃ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９９ｄ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９９ｅ，ａｔｈ−ＭＩＲ３９９ｆ，ａｔｈ−ＭＩＲ４００，ａｔｈ−ＭＩＲ４０１，ａｔｈ−ＭＩＲ４０２，ａｔｈ−ＭＩＲ４０３，���ｔｈ−ＭＩＲ４０４，ａｔｈ−ＭＩＲ４０５ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ４０５ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ４０５ｄ，ａｔｈ−ＭＩＲ４０６，ａｔｈ−ＭＩＲ４０７，ａｔｈ−ＭＩＲ４０８，ａｔｈ−ＭＩＲ４１３，ａｔｈ−ＭＩＲ４１４，ａｔｈ−ＭＩＲ４１５，ａｔｈ−ＭＩＲ４１６，ａｔｈ−ＭＩＲ４１７，ａｔｈ−ＭＩＲ４１８，ａｔｈ−ＭＩＲ４１９，ａｔｈ−ＭＩＲ４２０，ａｔｈ−ＭＩＲ４２６，ａｔｈ−ＭＩＲ４４７ａ，ａｔｈ−ＭＩＲ４４７ｂ，ａｔｈ−ＭＩＲ４４７ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５６ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５６ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５６ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５６ｄ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５６ｅ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５６ｆ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５６ｇ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５６ｈ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５６ｉ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５６ｊ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５６ｋ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５６ｌ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５９ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５９ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５９ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５９ｄ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５９ｅ，ｏｓａ−ＭＩＲ１５９ｆ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６０ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６０ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６０ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６０ｄ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６０ｅ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６０ｆ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６２ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６２ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６４ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６４ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６４ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６４ｄ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６４ｅ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｄ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｅ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｆ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｊ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｋ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｌ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｇ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｈ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｉ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｍ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６６ｎ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６７ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６７ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６７ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６７ｄ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６７ｅ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６７ｆ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６７ｇ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６７ｈ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６７ｉ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６７ｊ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６８ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６８ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｄ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｅ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｆ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｇ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｈ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｉ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｊ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｋ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｌ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｍ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｎ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｏ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｐ，ｏｓａ−ＭＩＲ１６９ｑ，ｏｓａ−ＩＲ１７１ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ１７１ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ１７１ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ１７１ｄ，ｏｓａ−ＭＩＲ１７１ｅ，ｏｓａ−ＭＩＲ１７１ｆ，ｏｓａ−ＭＩＲ１７１ｇ，ｏｓａ−ＭＩＲ１７１ｈ，ｏｓａ−ＭＩＲ１７１ｉ，ｏｓａ−ＭＩＲ１７２ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ１７２ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ１７２ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ１７３ｄ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９０，ｏｓａ−ＭＩＲ３１９ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ３１９ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９３，ｏｓａ−ＭＩＲ３９３ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９４，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｄ，ｏｓ���−ＭＩＲ３９５ｅ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｇ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｈ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｉ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｊ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｋ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｌ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｍ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｎ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｏ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｒ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｑ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｆ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９５ｐ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９６ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９６ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９６ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９７ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９７ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９８ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９８ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９９ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９９ｂ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９９ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９９ｄ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９９ｅ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９９ｆ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９９ｇ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９９ｈ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９９ｉ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９９ｊ，ｏｓａ−ＭＩＲ３９９ｋ，ｏｓａ−ＭＩＲ４０８，ｏｓａ−ＭＩＲ４１３，ｏｓａ−ＭＩＲ４１４，ｏｓａ−ＭＩＲ４１５，ｏｓａ−ＭＩＲ４１６，ｏｓａ−ＭＩＲ  ４１７，ｏｓａ−ＭＩＲ４１８，ｏｓａ−ＭＩＲ４１９，ｏｓａ−ＭＩＲ４２６，ｏｓａ−ＭＩＲ４３７，ｏｓａ−ＭＩＲ４３９，ｏｓａ−ＭＩＲ４３９ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ４３９ｄ，ｏｓａ−ＭＩＲ４３８ｅ，ｏｓａ−ＭＩＲ４３９ｆ，ｏｓａ−ＭＩＲ４３９ｇ，ｏｓａ−ＭＩＲ４３９ｈ，ｏｓａ−ＭＩＲ４４０，ｏｓａ−ＭＩＲ４４１ａ，ｏｓａ−ＭＩＲ４４１ｃ，ｏｓａ−ＭＩＲ４４２，ｏｓａ−ＭＩＲ４４３，ｏｓａ−ＭＩＲ４４５ｄ，ｏｓａ−ＭＩＲ４４６，ｚｍａ−ＭＩＲ１５６ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５６ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５６ｃ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５６ｄ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５６ｅ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５６ｆ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５６ｇ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５６ｈ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５６ｉ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５６ｊ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５６ｋ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５９ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５９ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５９ｃ，ｚｍａ−ＭＩＲ１５９ｄ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６０ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６０ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６０ｃ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６０ｄ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６０ｅ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６０ｆ，ｚｍａ−ＭＩＲ  １６１ｌ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６２，ｚｍａ−ＭＩＲ１６４ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６４ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６４ｃ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６４ｄ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ｃ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ｄ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ｅ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ｅ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ｆ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ｇ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ｈ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ｉ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ｊ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ｋ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６６ｍ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６７ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６７ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６７ｃ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６７ｄ，ｚｍａ−ＭＩＲ  １６７ｅ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６７ｆ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６７ｇ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６７ｈ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６８ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６８ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６９ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６９ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６９ｃ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６９ｄ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６９ｅ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６９ｆ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６９ｇ，ｚ���ａ−ＭＩＲ１６９ｉ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６９ｊ，ｚｍａ−ＭＩＲ１６９ｋ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７１ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７１ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７１ｃ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７１ｄ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７１ｅ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７１ｆ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７１ｇ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７１ｈ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７１ｉ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７１ｊ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７１ｋ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７２ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７２ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７２ｃ又はｚｍａ−ＭＩＲ１７２ｄ，ｚｍａ−ＭＩＲ１７２ｅ，ｚｍａ−ＭＩＲ３１９ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ３１９ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ３１９ｄ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９３，ｚｍａ−ＭＩＲ３９４ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９４ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９５ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９５ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９５ｃ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９５ｄ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９６ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９６ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９９ａ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９９ｂ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９９ｃ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９９ｄ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９９ｅ，ｚｍａ−ＭＩＲ３９９ｆ，ｚｍａ−ＭＩＲ４０８である。
【００７３】
［０１１２］  いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡはジェンバンク（ＵＳＡ）、ＥＭＢＬ（欧州）又はＤＤＢＪ（日本）において開示されたｍｉＲＮＡである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは以下のジェンバンク受け入れ番号の一つから選択される：ＡＪ５０５００３，ＡＪ５０５００２，ＡＪ５０５００１，ＡＪ４９６８０５，ＡＪ４９６８０４，ＡＪ４９６８０３，ＡＪ４９６８０２，ＡＪ４９６８０１，ＡＪ５０５００４，ＡＪ４９３６５６，ＡＪ４９３６５５，ＡＪ４９３６５４，ＡＪ４９３６５３，ＡＪ４９３６５２，ＡＪ４９３６５１，ＡＪ４９３６５０，ＡＪ４９３６４９，ＡＪ４９３６４８，ＡＪ４９３６４７，ＡＪ４９３６４６，ＡＪ４９３６４５，ＡＪ４９３６４４，ＡＪ４９３６４３，ＡＪ４９３６４２，ＡＪ４９３６４１，ＡＪ４９３６４０，ＡＪ４９３６３９，ＡＪ４９３６３８，ＡＪ４９３６３７，ＡＪ４９３６３６，ＡＪ４９３６３５，ＡＪ４９３６３４，ＡＪ４９３６３３，ＡＪ４９３６３２，ＡＪ４９３６３１，ＡＪ４９３６３０，ＡＪ４９３６２９，ＡＪ４９３６２８，ＡＪ４９３６２７，ＡＪ４９３６２６，ＡＪ４９３６２５，ＡＪ４９３６２４，ＡＪ４９３６２３，ＡＪ４９３６２２，ＡＪ４９３６２１，ＡＪ４９３６２０，ＡＹ６１５３７４，ＡＹ６１５３７３，ＡＹ７３０７０４，ＡＹ７３０７０３，ＡＹ７３０７０２，ＡＹ７３０７０１，ＡＹ７３０７００，ＡＹ７３０６９９，ＡＹ７３０６９８，ＡＹ５９９４２０，ＡＹ５５１２５９，ＡＹ５５１２５８，ＡＹ５５１２５７，ＡＹ５５１２５６，ＡＹ５５１２５５，ＡＹ５５１２５４，ＡＹ５５１２５３，ＡＹ５５１２５２，ＡＹ５５１２５１，ＡＹ５５１２５０，ＡＹ５５１２４９，ＡＹ５５１２４８，ＡＹ５５１２４７，ＡＹ５５１２４６，ＡＹ５５１２４５，ＡＹ５５１２４４，ＡＹ５５１２４３，ＡＹ５５１２４２，ＡＹ５５１２４１，ＡＹ５５１２４０，ＡＹ５５１２３９，ＡＹ５５１２３８，ＡＹ５５１２３７，ＡＹ５５１２３６，ＡＹ５５１２３５，ＡＹ５５１２３４，ＡＹ５５１２３３，ＡＹ５５１２３２，ＡＹ５５１２３１，ＡＹ５５１２３０，ＡＹ５５１２２９，ＡＹ５５１２２８，ＡＹ５５１２２７，ＡＹ５５１２２６，ＡＹ５５１２２５，ＡＹ５５１２２４，ＡＹ５５１２２３，ＡＹ５５１２２２，ＡＹ５５１２２１，ＡＹ５５１２２０，ＡＹ５５１２１９，ＡＹ５５１２１８，ＡＹ５５１２１７，ＡＹ５５１２１６，ＡＹ５５１２１５，ＡＹ５５１２１４，ＡＹ５５１２１３，ＡＹ５５１２１２，ＡＹ５５１２１１，ＡＹ５５１２１０，ＡＹ５５１２０９，ＡＹ５５１２０８，ＡＹ５５１２０７，ＡＹ５５１２０６，ＡＹ５５１２０５，ＡＹ５５１２０４，ＡＹ５５１２０３，ＡＹ５５１２０２，ＡＹ５５１２０１，ＡＹ５５１２００，ＡＹ５５１１９９，ＡＹ５５１１９８，ＡＹ５５１１９７，ＡＹ５５１１９６，ＡＹ５５１１９５，ＡＹ５５１１９４，ＡＹ５５１１９３，ＡＹ５５１１９２，ＡＹ５５１１９１，ＡＹ５５１１９０，ＡＹ５５１１８９，ＡＹ５５１１８８，ＡＹ５０１４３４，ＡＹ５０１４３３，ＡＹ５０１４３２，ＡＹ５０１４３１，ＡＹ４９８８５９，ＡＹ３７６４５９，ＡＹ３７６４５８，ＡＹ８８４２３３，ＡＹ８８４２３２，ＡＹ８８４２３１，ＡＹ８８４２���０，ＡＹ８８４２２９，ＡＹ８８４２２８，ＡＹ８８４２２７，ＡＹ８８４２２６，ＡＹ８８４２２５，ＡＹ８８４２２４，ＡＹ８８４２２３，ＡＹ８８４２２２，ＡＹ８８４２２１，ＡＹ８８４２２０，ＡＹ８８４２１９，ＡＹ８８４２１８，ＡＹ８８４２１７，ＡＹ８８４２１６，ＡＹ７２８４７５，ＡＹ７２８４７４，ＡＹ７２８４７３，ＡＹ７２８４７２，ＡＹ７２８４７１，ＡＹ７２８４７０，ＡＹ７２８４６９，ＡＹ７２８４６８，ＡＹ７２８４６７，ＡＹ７２８４６６，ＡＹ７２８４６５，ＡＹ７２８４６４，ＡＹ７２８４６３，ＡＹ７２８４６２，ＡＹ７２８４６１，ＡＹ７２８４６０，ＡＹ７２８４５９，ＡＹ７２８４５８，ＡＹ７２８４５７，ＡＹ７２８４５６，ＡＹ７２８４５５，ＡＹ７２８４５４，ＡＹ７２８４５３，ＡＹ７２８４５２，ＡＹ７２８４５１，ＡＹ７２８４５０，ＡＹ７２８４４９，ＡＹ７２８４４８，ＡＹ７２８４４７，ＡＹ７２８４４６，ＡＹ７２８４４５，ＡＹ７２８４４４，ＡＹ７２８４４３，ＡＹ７２８４４２，ＡＹ７２８４４１，ＡＹ７２８４４０，ＡＹ７２８４３９，ＡＹ７２８４３８，ＡＹ７２８４３７，ＡＹ７２８４３６，ＡＹ７２８４３５，ＡＹ７２８４３４，ＡＹ７２８４３３，ＡＹ７２８４３２，ＡＹ７２８４３１，ＡＹ７２８４３０，ＡＹ７２８４２９，ＡＹ７２８４２８，ＡＹ７２８４２７，ＡＹ７２８４２６，ＡＹ７２８４２５，ＡＹ７２８４２４，ＡＹ７２８４２３，ＡＹ７２８４２２，ＡＹ７２８４２１，ＡＹ７２８４２０，ＡＹ７２８４１９，ＡＹ７２８４１８，ＡＹ７２８４１７，ＡＹ７２８４１６，ＡＹ７２８４１５，ＡＹ７２８４１４，ＡＹ７２８４１３，ＡＹ７２８４１２，ＡＹ７２８４１１，ＡＹ７２８４１０，ＡＹ７２８４０９，ＡＹ７２８４０８，ＡＹ７２８４０７，ＡＹ７２８４０６，ＡＹ７２８４０５，ＡＹ７２８４０４，ＡＹ７２８４０３，ＡＹ７２８４０２，ＡＹ７２８４０１，ＡＹ７２８４００，ＡＹ７２８３９９，ＡＹ７２８３９８，ＡＹ７２８３９７，ＡＹ７２８３９６，ＡＹ７２８３９５，ＡＹ７２８３９４，ＡＹ７２８３９３，ＡＹ７２８３９２，ＡＹ７２８３９１，ＡＹ７２８３９０，ＡＹ７２８３８９，ＡＹ７２８３８８，ＡＹ８５１１４９，ＡＹ８５１１４８，ＡＹ８５１１４７，ＡＹ８５１１４６，ＡＹ８５１１４５，ＡＹ８５１１４４又はＡＹ５９９４２０。
【００７４】
［０１１３］  いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは本明細書に引用により編入される米国公表特許出願番号２００５／０１４４６６９に開示された配列の一つから選択される。
【００７５】
［０１１４］  いくつかの態様において、上記のｍｉＲＮＡｓ、並びに本明細書に開示されたものは、本明細書に記載されたように特定の標的に向けられるように修飾された。
【００７６】
［０１１５］  いくつかの態様において、標的ＲＮＡは、植物病原体、例えば植物ウイルス又は植物ウイロイドのＲＮＡである。いくつかの態様において、植物病原体に向けられたｍｉＲＮＡは、病原体誘導可能性プロモーターへ作動可能なように連結される。いくつかの態様において、標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。ｍＲＮＡ中の標的配列は、非コーディング配列（例えば、イントロン配列、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域）、コーディング配列又はｍＲＮＡスプライシングに関与する配列であってよい。ｍｉＲＮＡをイントロン配列に標的化することはｍＲＮＡの成熟化を危険にさらす。ｍｉＲＮＡをｍＲＮＡスプライシング関与配列に標的化することは、異なる蛋白質アイソフォームを提供する別のスプライス形態の成熟に影響する。
【００７７】
［０１１６］  いくつかの態様において、発明のポリヌクレオチドを含み、及び／又は発明の方法により生産される、細胞、植物、及び種子が提供される。いくつかの態様において、当該細胞、植物、及び／又は種子は、修飾された植物ｍｉＲＮＡ前駆体を含む核酸構築物を含み、本明細書において上で記載されたとおりである。いくつかの態様において、核酸構築物中の修飾された植物ｍｉＲＮＡ前駆体は、プロモーターに対して作動可能なように連結される。プロモーターはあらゆる公知のプロモーターであってよく、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーター、脱抑制可能なプロモーター、等、例えば以下に記載されるものを含む。細胞は、原核細胞及び真核細胞を含み、限定ではないが、細菌、酵母、真菌、ウイルス、無脊椎動物、石油移動物、及び植物の細胞を含む。発明の植物、植物細胞、及び種子は、裸子植物（ｇｙｎｏｓｐｅｒｍｓ）、単子葉及び双子葉を含み、限定ではないが、イネ、コムギ、エンバク、オオムギ、キビ、モロコシ属、ダイズ、ヒマワリ、ベニバナ、カノーラ、アルファルファ、ワタ、アラビドプシス、及びタバコを含む。
【００７８】
［０１１７］  別の態様において、複数のｍｉＲＮＡｓ構築物をコードする核酸構築物を細胞に導入することを含む、複数の標的ＲＮＡをダウン制御する方法が提供される。複数のｍｉＲＮＡｓのうちの一つのｍｉＲＮＡは、標的ＲＮＡの一つの領域に相補である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは標的ＲＮＡの領域に対して完全相補である。いくつかの態様において、相補であって、Ｇ−Ｕ塩基対、即ちＧＵの揺らぎの使用を含み、他の点では完全相補である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡの最初の１０ヌクレオチド（ｍｉＲＮＡの５’エンドから数えて）は標的ＲＮＡの領域に対して完全相補であり、そして残りのヌクレオチドは標的ＲＮＡとのミスマッチ及び／又はバルジを含んでよい。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、約１０−２００ヌクレオチド、約１０−１５、１５−２０、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２５−３０、３０−５０、５０−１００、１００−１５０、又は約１５０−２００ヌクレオチドを含む。標的ＲＮＡ中のその相補配列へのｍｉＲＮＡの結合は、標的ＲＮＡの分割をもたらす。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡが標的ＲＮＡの標的配列に対して完全相補であるように修飾されているｍｉＲＮＡである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡが標的ＲＮＡの標的配列に完全相補であるように修飾されている内生植物ｍｉＲＮＡである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、プロモーターへ作動可能に連結される。いくつかの態様において、複数のｍｉＲＮＡｓが互いに連結されることにより、発現された際に単一の転写物を形成する。いくつかの態様において、核酸構築物は、ｍｉＲＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含む。
【００７９】
［０１１８］  いくつかの態様において、核酸構築物は、複数の標的配列を抑圧するためのｍｉＲＮＡｓをコードする。核酸構築物は、少なくとも２つのｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの態様において、各ｍｉＲＮＡは標的に対して実質上相補であるか又は本明細書において記載されたとおりに相補になるように修飾される。いくつかの態様において、核酸構築物は２−３０又はそれより多くのｍｉＲＮＡｓ、例えば、３−４０又はそれより多くのｍｉＲＮＡｓ、例えば、３−４５又はそれより多くのｍｉＲＮＡｓ、及びさらに例えれば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又はそれより多くのｍｉＲＮＡｓをコードする。いくつかの態様において、複数のｍｉＲＮＡｓは互いに連結されることにより、発現された際に単一の転写物を形成する。
【００８０】
［０１１９］  いくつかの態様において、一つより多いｍｉＲＮＡ前駆体ユニットからなる人工のｍｉＲＮＡ前駆体である重合体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓが提供される。重合体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓは、異なるｍｉＲＮＡ前駆体を伴うヘテロ重合体であるか又は同じｍｉＲＮＡ前駆体のいくつかのサブユニットを含むホモ重合体の何れかであり得る。実施例は、ヘテロ重合体のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓが異なる成熟した人工ｍｉＲＮＡｓを生産できることを証明する。例えば、ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳ１１６９ｇ−ＣＰＣ３１５９ａは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＣＰＣ３１５９ａとｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳ１１６９ｇからなるダイマーであるが、植物細胞中で発現させたときに、成熟ｍｉＲ−ＰＤＳ１１６９ｇとｍｉＲ−ＣＰＣ３１５９ａを生産することができる。実施例は、ホモ重合体ｍｉＲＮＡ前駆体が異なる成熟人工ｍｉＲＮＡｓを生産できることも証明する。例えば、ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａとｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａからなるダイマーであるが、成熟ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａとｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａを生産することができる。同様の様式において、本明細書で記載されたようなモノマーユニットをあらゆる数で含むヘテロ−又はホモ−重合体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓが生産される。単一のプロモーターの制御下で複数のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓを含む核酸構築物を製造するための例示の方法を実施例２１と２７に示す。各成熟ｍｉＲＮＡは実施例２２及び２７に例示されるとおり核酸構築物から正確にプロセシングされる。
【００８１】
［０１２０］  いくつかの態様において、上記核酸構築物は複数のポリヌクレオチドを含み、各々のポリヌクレオチドは別々のｍｉＲＮＡ前駆体、即ち、別々のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをコードする。当該ポリヌクレオチドは、単一のプロモーターの制御下に置かれてよいように、互いに作動可能なように連結される。いくつかの態様において、当該複数のポリヌクレオチドは、互いに連結されて、発現された際に複数のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓを含む単一の転写物を形成する。単一の転写物は、宿主細胞中でプロセシングを受けて複数の成熟ｍｉＲＮＡｓを生産するが、各々はその標的遺伝子をダウン制御することができる。所望のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓをコードする多数のポリヌクレオチドが互いに連結され得るけれども、唯一の制限は転写物の最終サイズである。８−１０ｋｂの転写物を植物中で生産できることは知られている。即ち、２−３０又はそれより多くのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ、例えば、３−４０又はそれより多くのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ、例えば、３−４５又はそれより多くのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ、及びさらに例えれば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又はそれより多くのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓのマルチマーをコードする複数のポリヌクレオチドを含む核酸構築物を形成することが可能である。いくつかの態様において、複数のｍｉＲＮＡｓは互いに連結されることにより、発現された際に単一の転写物を形成する。
【００８２】
［０１２１］  いくつかの態様において、上記核酸構築物は、さらに、複数のｍｉＲＮＡｓをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターを欠く核酸構築物をデザインして、宿主ゲノム中に組み込まれた際にプロモーターに作動可能に連結されるようになるような様式にて、導入される。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、組換えを用いて組み込まれるが、部位特異的組換えを含む。例えば、本明細書に引用により編入される、ＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ９９／２５８２１を参照されたい。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、ＲＮＡである。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、少なくとも一つの組換え部位を含むが、部位特異的組換え部位を含む。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、構築物の組み込み、修飾又はクローニングを促進させるために少なくとも一つの組換え部位を含む。いくつかの態様において、上記核酸構築物は、ｍｉＲＮＡ前駆体に隣接して２つの部位特異的組換え部位を含む。いくつかの態様において、部位特異的組換え部位は、ＦＲＴ部位、ｌｏｘ部位、又はａｔｔ分析とを含み、ａｔｔＢ，ａｔｔＬ，ａｔｔＰ又はａｔｔＲ部位を含む。例えば、ＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ９９／２５８２１、及び米国特許５，８８８，７３２，６，１４３，５５７，６，１７１，８６１，６，２７０，９６９，及び６，２７７，６０８は引用により本明細書に編入されるが、参照されたい。
【００８３】
［０１２２］  いくつかの態様において、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、細胞又は植物の遺伝子又はトランス遺伝子内のイントロンに挿入される。遺伝子が複数のイントロンを有するなら、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは同じか又は異なってよく、各イントロン内に挿入することができる。いくつかの態様において、イントロンに挿入されたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは最初のＲＮＡ転写物から放出され、よって、本明細書に例示されるとおり、ｍｉＲＮＡｓの前駆体として機能し得る。ほとんどのイントロンは、５’エンドにスプライシングドナー部位、３’エンドにスプライシングアクセプター部位、そしてイントロン中にブランチ部位を含む。ブランチ部位はイントロンの成熟に重要であり、それがなければ、イントロンは、最初のＲＮＡ転写物から切り出されて放出されることができない。ブランチ部位は、通常スプライシングアクセプター部位の２０−５０ｎｔ上流に位置するが、スプライスドナー部位とブランチ部位の間の距離は、異なるイントロンの間では大きく変更できる。即ち、いくつかの態様において、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、スプライシングドナー部位とブランチ部位の間のイントロンに挿入される。
【００８４】
［０１２３］  いくつかの態様において、標的ＲＮＡは植物病原体のＲＮＡであり、例えばウイルス又は植物ウイロイドのＲＮＡである。いくつかの態様において、植物病原体ＲＮＡに向けられたｍｉＲＮＡを病原体の誘導可能なプロモーターに作動可能なように連結する。いくつかの態様において、標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。ｍＲＮＡ中の標的配列は、イントロン配列、コーディング配列又はｍＲＮＡスプライシングに関与する配列であってよい。ｍｉＲＮＡをイントロン配列に標的化することは、ｍＲＮＡの成熟化を危険にさらす。ｍｉＲＮＡをｍＲＮＡスプライシングに関与する配列に標的化することは、別のスプライス形態の成熟化に影響し、異なる蛋白質アイソフォームを提供する。いくつかの態様において、標的は、農地の制御の特性（ａｇｒｏｎｏｍｉｃ  ｔｒａｉｔｓ）、昆虫耐性、疾患耐性、除草剤耐性、不稔性、穀物の特性、及び市販の製品に影響する遺伝子を含む。
【００８５】
［０１２４］  いくつかの態様において、発明の複数のｍｉＲＮＡｓをコードする核酸構築物を含み、及び／又は発明の方法により提供される、細胞、植物及び種子が提供される。いくつかの態様において、当該細胞、植物及び／又は種子は、複数のポリヌクレオチドを含む核酸構築物を含み、各々が本明細書に記載されたような植物ｍｉＲＮＡ前駆体をコードする。いくつかの態様において、複数のポリヌクレオチドは、作動可能なようにプロモーターに連結される。プロモーターは、あらゆるよく知られたプロモーターであってよく、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーター、脱抑制プロモーター等を含み、以下に記載されるとおりである。ｍｉＲＮＡ前駆体をコードするポリヌクレオチドは互いに連結される。いくつかの態様において、複数のポリヌクレオチドは互いに連結されることにより、細胞、植物又は種子中で発現された際に複数のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓを含む単一の転写物を形成する。細胞は、原核細胞及び真核細胞を含み、限定ではないが、細菌、酵母、真菌、ウイルス、無脊椎動物、脊椎動物、及び植物の細胞を含む。発明の植物、植物細胞、種子は、裸子植物（ｇｙｎｏｓｐｅｒｍｓ）、単子葉及び双子葉を含み、限定ではないが、例えば、イネ、コムギ、エンバク、オオムギ、キビ、モロコシ属、ダイズ、ヒマワリ、ベニバナ、カノーラ、アルファルファ、ワタ、アラビドプシス、及びタバコを含む。
【００８６】
［０１２５］  本発明は、標的配列の抑圧及び／又は機能の確認に有用な方法及び組成物に関する。発明は、機能を評価するか又は表現型の効果及び／又は特性の発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）に関して標的配列を確認するために標的配列を沈黙化させるか又は抑圧するのにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）媒介性ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いる方法にも関する。特定すれば、発明は、サイレンシングを誘導できる小さい核酸分子、ｍｉＲＮＡｓを含む構築物、及びこれらのｍｉＲＮＡｓを用いて選択的に標的配列を沈黙化する方法に関する。
【００８７】
［０１２６］  ＲＮＡ干渉は、短い干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）により媒介される動物内で配列−特異的に転写後遺伝子サイレンシングするプロセスを意味する（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１０）。植物内の相当するプロセスは、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）又はＲＮＡサイレンシングと一般には呼ばれ、あるいは真菌においては鎮圧（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を妨害するために用いられた進化上保存された細胞防御機構であると考えられ、一般には、別種の叢（ｆｌｏｒａ）と門（ｐｈｙｌａ）により共有される（Ｆｉｒｅ（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５：３５８−３６３）。外来遺伝子発現からのそのような防御は、ウイルス感染に由来するか、或いはウイルスゲノムＲＮＡの相同な単鎖ＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答による宿主ゲノムへのトランスポゾン要素のランダムな組み込みに由来する、二重鎖ＲＮＡｓ（ｄｓＲＮＡｓ）の生産に応答して進化してきたのかもしれない。細胞内のｄｓＲＮＡの存在は、今のところ完全に特性決定されなければならない機構によりＲＮＡｉ応答を誘発する。
【００８８】
［０１２７］  長いｄｓＲＮＡｓの細胞内の存在は、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサーは短い干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）として知られるｄｓＲＮＡの短い一片（ｐｉｅｃｅｓ）へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６）。ダイサー活性に由来する短い干渉ＲＮＡは、通常、約２１から約２３ヌクレオチドの長さであり、約１９塩基対の二重鎖を含む（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５：１８８−２００）。ダイサーは、翻訳制御に関係している保存された構造の前駆体ＲＮＡからの２１−及び２２−ヌクレオチドの小さい一過性のＲＮＡｓ（ｓｔＲＮＡｓ）の切り出しにも関係する（Ｈｕｔｖａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８３４−８３８）。ＲＮＡｉ応答はエンドヌクレアーゼ複合体も特徴とし、一般にはＲＮＡにより誘導されたサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれ、ｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖に対して配列相補性を有する一本鎖ＲＮＡの分割に介在する。標的ＲＮＡの分割はｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補な領域の中央で生じる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５：１８８−２００）。さらに、ＲＮＡ干渉は小さいＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ）の介在する遺伝子サイレンシングを含むことができ、おそらくは、クロマチン構造を制御してそれにより標的遺伝子配列の転写を妨害する細胞機構による（例えば、Ａｌｌｓｈｉｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１８１８−１８１９  ２００２；Ｖｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：２２１５−２２１８：Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：２２３２−２２３７を参照）。そうして、発明のｍｉＲＮＡ分子を用いることにより、ＲＮＡ転写物との相互作用によるか又は特定の遺伝子配列との相互作用により遺伝子サイレンシングに介在することができ、そのような相互作用は転写レベルにおけるか又は転写後レベルの何れかにおいて遺伝子サイレンシングをもたらす。
【００８９】
［０１２８］  ＲＮＡｉは様々なシステムにおいて研究されてきた。Ｆｉｒｅら（（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１）は、シノラブディスエレガンスにおいてＲＮＡｉを初めて観察した。ＷｉａｎｎｙとＧｏｅｔｚ（（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：７０）は、マウス胚においてｄｓＲＮＡにより介在されるＲＮＡｉを記載する。Ｈａｍｍｏｎｄら（（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：２９３−２９６）は、ｄｓＲＮＡをトランスフェクトされたドロソフィラの細胞内のＲＮＡｉを記載する。Ｅｌｂａｓｈｉｒら（（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８）は、ヒトの胚の腎臓及びヒーラ細胞を含む培養された哺乳類された内での合成２１−ヌクレオチドＲＮＡｓの二重鎖の導入により誘導されたＲＮＡｉを記載する。
【００９０】
［０１２９］  小ＲＮＡｓは、遺伝子発現を制御することにおいて重要な役割を担う。開花を含む多くの発生プロセスの制御は、小ＲＮＡｓにより制御される。植物内で小ＲＮＡｓを生産するトランスジェニック構築物を用いることにより植物遺伝子の遺伝子発現において変化を工作することが今は可能である。
【００９１】
［０１３０］  小ＲＮＡｓは相補ＲＮＡ又はＤＮＡ標的配列への塩基対合により機能するらしい。ＲＮＡに結合したら、小ＲＮＡはＲＮＡ分割又は標的配列の翻訳阻害の何れかを誘導する。ＤＮＡ標的配列に結合したら、小ＲＮＡｓが標的配列のＤＮＡメチル化を媒介できると考えられる。特定の機構に拘わらず、これらの事象の結果は遺伝子発現が阻害されることである。
【００９２】
［０１３１］  小ＲＮＡｓとそれらのＲＮＡ標的の間の配列相補性は、ＲＮＡ分割又は翻訳阻害のどの機構が用いられるかを決定する助けとなると考えられる。それらの標的に完全相補なｓｉＲＮＡはＲＮＡ分割により働くと信じられる。いくつかのｍｉＲＮＡｓは、それらの標的に対して完全又は完全に近い相補性を有し、そしてＲＮＡ分割がこれらのｍｉＲＮＡｓの少なくともいくつかに関して証明された。他のｍｉＲＮＡｓはそれらの標的といくつかのミスマッチを有し、そして翻訳レベルにおいて見かけ上（ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ）それらの標的を阻害する。再び、作用機構に関する特定の理論に拘束されることなく、完全又は完全に近い相補性が特に最初の１０ヌクレオチド（ｍｉＲＮＡの５’エンドから数えて）の範囲内ではＲＮＡ分割に都合がよく、一方、ｍｉＲＮＡ／標的二重鎖が多数のミスマッチを含む場合には翻訳阻害に都合がよいという一般原則が明らかになっている。これに対する明かな期待は植物中のマイクロＲＮＡ１７２（ｍｉＲ１７２）である。ｍｉＲ１７２の標的の一つは、ＡＰＥＴＡＬＡ２（ＡＰ２）であり、そしてｍｉＲ１７２はＡＰ２と完全に近い相補性を分かつが、ＲＮＡ分割よりもむしろＡＰ２の翻訳阻害を誘導するらしい。
【００９３】
［０１３２］  マイクロＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）は動物及び植物の両方において同定された約１９から約２４ヌクレオチド（ｎｔ）の長さの非コーディングＲＮＡである（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８５３−８５８，Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：７３５−７３９；Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８５８−８６２；Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ａｍｂｒｏｓ（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８６２−８６４；Ｌｌａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１６０５−１６１９；Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６：：７２０−７２８；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：１４８４−１４９５；Ｒｅｉｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６：１６１６−１６２６）。それらは約７０から２００ｎｔのサイズの範囲の長い前駆体転写物からプロセシングされて、前駆体転写物はヘアピン構造を形成する能力を有する。動物においては、ｍｉＲＮＡ前駆体に関与する酵素は、ダイサー、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ様蛋白質と呼ばれる（Ｇｒｉｓｈｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ  １０６：２３−３４；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８３４−８３８；Ｋｅｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５：２６５４−２６５９）。植物もダイサー様の酵素、ＤＣＬ１（以前はＣＡＲＰＥＬ  ＦＡＣＴＯＲＹ／ＳＨＯＲＴ  ＩＮＴＥＧＵＭＥＮＴＳ１／ＳＵＳＰＥＮＳＯＲ１と呼ばれた）を有し、そして最近の証拠は、それがダイサーのようにヘアピン前駆体のプロセシングに関与することにより成熟ｍｉＲＮＡｓを生じさせることを示す（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：１４８４−１４９５；Ｒｅｉｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６：１６１６−１６２６）。さらに、最近の仕事からは、少なくともいくつかのｍｉＲＮＡヘアピン前駆体が長いポリアデニル化転写物として生ずること、及びいくつかの異なるｍｉＲＮＡｓと関連するヘアピンが単一の転写物中に存在できることが明らかになりつつある（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８５３−８５８；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＥＭＢＯ  Ｊ  ２１：４６６３−４６７０）。最近の仕事は、ＤＩＣＥＲによるヘアピンのプロセシングから生じるｄｓＲＮＡ生成物からのｍｉＲＮＡ鎖の選択も試験している（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８）。プロセシングされたｄｓＲＮＡの２つの鎖の安定性（即ち、Ｇ：Ｃ対Ａ：Ｕ含有量。及び／又はミスマッチ）が鎖の選択性に影響するらしく、低い安定性のエンドはヘリカーゼ活性により容易にほどかれる。低い安定性のエンドにおける５’エンドの鎖はＲＩＳＣ複合体に取り込まれて、他方の鎖は分解される。
【００９４】
［０１３３］  動物においては、発生において特定のｍｉＲＮＡｓの役割を示す直接的な証拠が存在する。シノラブディスエレガンスのｌｉｎ−４とｋｅｔ−７  ｍｉＲＮＡｓは一時的な発生を制御することが分かっておりｌｉｎ−４とｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡｓを生じる遺伝子が変異したときに生じる表現型に基づく（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：８４３−８５４；Ｒｅｉｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３−９０１−９０６）。さらに、両方のｍｉＲＮＡｓが発生のタイミングにおいてそれらの役割と一致した一時的な発現パターンを表す。他の動物のｍｉＲＮＡｓは発現の発生において制御されたパターンを一時的なものと組織特異的なものの両方において表す（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８５３−８５３，Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：７３５−７３９；Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８５８−８６２；Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ａｍｂｒｏｓ（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８６２−８６４）ことから、ｍｉＲＮＡｓは、多くの場合、重要な発生プロセスの制御に関与しているかもしれないという仮説を導く。同様に、植物においては、多くのｍｉＲＮＡｓの異なる発現パターンが発生における役割を示唆しており（Ｌｌａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１６０５−１６１９；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２９９２）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：１４８４−１４９５；Ｒｅｉｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６：１６１６−１６２６）、今も示される（例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １７：１３７６−１３８６）。
【００９５】
［０１３４］  マイクロＲＮＡｓはこれらの遺伝子により生産される転写物内に位置する相補配列に結合することにより標的遺伝子を制御するらしい。ｌｉｎ−４とｌｅｔ−７の場合、標的部位は標的ｍＲＮＡｓの３’ＵＴＲｓ内に位置し（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：８４３−８５４；Ｗｉｇｈｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：８５５−８６２；Ｒｅｉｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：９０１−９０６；Ｓｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５：６５９−６６９）、そしてｌｉｎ−４とｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡｓとそれらの標的部位の間にはいくつかのミスマッチが存在する。ｌｉｎ−４又はｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡの結合は、転写物自身に対して影響することなく標的ｍＲＮＡによりコードされる蛋白質の定常状態レベルのダウン制御を誘導するらしい（Ｏｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ａｍｂｒｏｓ（１９９９）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２１６：６７１−６８０）。他方、最近の証拠は、ｍｉＲＮＡｓがいくつかのケースにおいて標的部位内にて標的転写物の特異的なＲＮＡの分割を誘導できることを示唆しており、そしてこの分割工程はｍｉＲＮＡと標的転写物の間の１００％相補性を、特に最初の１０ヌクレオチドの範囲内で要求するらしい（ｍｉＲＮＡの５’エンドから数えて）（Ｈｕｔｖａｎｇａｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：２０５６−２０６０；Ｌｌａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１６０５−１６１９）。ｍｉＲＮＡｓは標的遺伝子の制御の少なくとも２つの経路に侵入することができるらしい。標的の相補性が＜１００％のとき蛋白質ダウン制御であり、そして標的相補性が１００％のときＲＮＡ分割である。ＲＮＡ分割経路に侵入するマイクロＲＮＡｓは、動物においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の間及び植物において転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）の間に生じる２１−２５ｎｔの短い干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）に類似し（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０−９５２；Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：４９４−４９８）、そしてＲＮＡｉに関して観察されるのと類似又は同一のＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれるらしい。
【００９６】
［０１３５］  バイオインフォマティクスによるｍｉＲＮＡｓの標的の同定は、動物においては成功しなかったが、これはおそらく動物のｍｉＲＮＡｓがそれらの標的に対して低い相補性しか有さないという事実による。他方、バイオインフォマティクスのアプローチは植物ｍｉＲＮＡｓの標的を予測するための使用には成功したが（Ｌｌａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１６０５−１６１９；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：１４８４−１４９５；Ｒｈｏａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１０：５１３−５２０）、即ち、植物のｍｉＲＮＡｓは動物のｍｉＲＮＡｓよりもそれらの仮想標的に対して高い全体相補性を有するらしい。植物のｍｉＲＮＡｓのこれら予測された標的転写物のほとんどは、植物の発生パターン又は細胞分化に関係する転写因子のファミリーのメンバーをコードする。にもかかわらず、生物学上の機能は如何なる植物ｍｉＲＮＡに関しても直接証明されていない。Ｌｌａｖｅら（（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：２０５３−２０５６）は、ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ−様転写因子の転写物がアラビドプシスのｍｉＲＮＡであるｍｉｒ１７１の標的であることを示したが、これらの研究は異種においては実施されず、そしてｍｉｒ１７１に関連する植物表現型は報告されていない。
【００９７】
［０１３６］  提供される方法は、形質転換の方法が利用可能な、そして標的配列に関して又は目的の標的配列の隣接の領域に関して少なくともいくつかの配列情報が存在する、あらゆる生物において実施することができる。２つ又はそれより多くの配列が、連続形質転換、一つより多い標的化ベクターにより同時形質転換、又は一つより多いｍｉＲＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物の構築により標的化できたことも認識される。発明の方法は、ランダム標的配列に向けられたｍｉＲＮＡｓのライブラリーを生成するために、コンビナトリアル核酸ライブラリーによっても満たされるかもしれない。ｍｉＲＮＡｓのライブラリーは、遺伝子機能の確認のためにハイスループットスクリーニングのために使用できた。
【００９８】
［０１３７］  目的の配列の一般的カテゴリーは、例えば、制御又は情報に関与する遺伝子、例えば、ジンクフィンガー、転写因子、ホメオティック遺伝子、又は細胞周期及び細胞死変調因子、伝達に関与する遺伝子、例えば、キナーゼ、及びハウスキーピングに関与する遺伝子、例えばヒートショック蛋白質を含む。
【００９９】
［０１３８］  標的配列は、さらに、コーディング領域及び非コーディング領域、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、イントロン等を含み、目的の遺伝子の発現を変更するために修飾されてよい。例えば、イントロン配列を５’領域に加えることにより、蓄積する成熟メッセージの量を増加させることができる（例えば、Ｂｕｃｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ（１９８８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：４３９５−４４０５；及びＣａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １：１１８３−１２００を参照）。
【０１００】
［０１３９］  標的配列は内生配列であってよく、あるいは導入された異種配列又はトランス遺伝子であってよい。例えば、上記方法を用いることにより、トランス遺伝子の制御又は発現を変更するか、又はトランス遺伝子又は他の導入された配列、例えば導入された部位特異的組換え部位を除去してよい。標的配列は病原体からの配列であってもよく、あるいは、標的配列は植物病原体、例えばウイルス、糸状菌又は真菌、昆虫、又は線虫からであってよい。ｍｉＲＮＡは植物中で発現させることができ、感染又は侵入に際して、病原体を標的として植物に対してある程度の耐性を授与する。本明細書中の実施例は、植物に対してウイルス耐性／寛容を授与するように人工のｍｉＲＮＡｓをデザインするための技術を示す。いくつかの態様において、ウイルスの異なる配列に対して向けられた２つ又はそれより多くの人工ｍｉＲＮＡ配列を用いて標的ウイルスが変異することを妨害し、即ち耐性機構をかわすことができる。いくつかの態様において、人工ｍｉＲＮＡの配列はそれらがウイルスＲＮＡの必須の領域（例えば、サイレンシング遺伝子サプレッサーの活性部位）を標的とするように選択することができる。この場合、この選択された領域内のウイルスの変異が、コードされた蛋白質を不活性にして、即ち、耐性機構を逃れる方法としてウイルスの変異を阻止する。いくつかの態様において、ウイルスのファミリーの保存された配列に対して向けられた人工ｍｉＲＮＡは全ファミリーのメンバーに対して耐性を授与するはずである。いくつかの態様において、メンバーの間で保存された配列に向けられた人工ｍｉＲＮＡは、異なるウイルスファミリーのメンバーに対して耐性を授与するはずである（例えば、表１を参照）。
【０１０１】
【表１】
2008522585.tif 000003
【０１０２】
［０１４０］  植物において、標的配列の他のカテゴリーは、農地の制御の特性（ａｇｒｏｎｏｍｉｃ  ｔｒａｉｔｓ）、昆虫耐性、疾患耐性、除草剤耐性、不稔性、穀物の特性、及び市販の製品に影響する遺伝子を含む。目的の遺伝子は、オイル、スターチ、糖質、又は栄養代謝物に関係するもの並びに穀粒サイズ、蔗糖負荷等に影響するものも含む。穀物の質は特性において反映されており、例えば、オイルのレベルと種類、飽和していること及び未飽和であること、必須アミノ酸の質と量、及びセルロースのレベルである。例えば、フィチン酸の生合成経路の遺伝子を抑圧することにより、利用性の高いリンの表現型（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を生じさせることができた。例えば、フィチン酸の生合成酵素は、ＷＯ０２／０５９３２４に開示されたイノシトールポリホスフェートキナーゼ−２ポリヌクレオチド、ＷＯ０３／０２７２４３に開示されたイノシトール１，３，４−トリホスフェート５／６キナーゼポリヌクレオチド、及びＷＯ９９／０５２９８に開示されたミオ−イノシトール１−ホスフェートシンターゼ及び他のフィチン酸の生合成ポリヌクレオチドを含むが、全ては引用により本明細書に編入される。木化（ｌｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）経路の遺伝子は、消化能力及びエネルギー利用性を増強するために抑圧することができた。細胞周期及び細胞死に影響する遺伝子は、成長又はストレス応答に影響するように抑圧することができた。ＤＮＡ修復及び／又は組換えに影響する遺伝子は、遺伝的可変性を増加させるために抑圧することができた。開花時間に影響する遺伝子を抑圧することができ、並びに、稔性に影響する遺伝子も抑圧できた。特定の特性又は表現型におけるその役割を評価するか又は確認するため、又は分子上か、制御か、生化学か、又はプロテオミックの経路又はネットワークを詳細に分析するために、あらゆる標的配列を抑圧することができた。
【０１０３】
［０１４１］  多数のプロモーターを使用することができ、これらのプロモーターは所望の結果に基づいて選択することができる。ｍｉＲＮＡの発現のタイミング、位置及び／又はレベルを変調するために、植物の発現カセットにおいて異なるプロモーターの使用により、異なる応用が増強されると認識される。そのような植物発現カセットは、所望ならば、プロモーター制御領域（例えば、誘導可能か、構成的か、環境的か、又は発生的に制御されたか、又は細胞性か又は組織特異的／選択的発現を授与するもの）、転写開始スタート部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、及び／又はポリアデニル化シグナルを含んでもよい。
【０１０４】
［０１４２］  構成的な組織選択性又は誘導可能なプロモーターを用いることができる。構成的プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、アグロバクテリウムチュメファシエンスのＴ−ＤＮＡ由来の１’−又は２’−プロモーター、ユビキチン１プロモーター、Ｓｍａｓプロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（米国特許番号５，６８３，４３９）、Ｎｏｓプロモーター、ｐＥｍｕプロモーター、ルビスコプロモーター、ＧＲＰ１−８プロモーター及び当業者には知られている様々な植物遺伝子由来の他の転写開始領域を含む。低レベルの発現が望まれるなら、弱いプロモーターを使用してよい。弱い構成的プロモーターは、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアのプロモーター（ＷＯ９９／４３８３８及び米国特許番号６，０７２，０５０）、コア３５Ｓ  ＣＰＣプロモーター等を含む。他の構成的プロモーターは、例えば、米国特許番号５，６０８，１４９；５，６０８，１４４；５，６０４，１２１；５，５６９，５９７；５，４６６，７８５；５，３９９，６８０；５，２６８，４６３；及び５，６０８，１４２を含む。本明細書に引用により編入される米国特許番号６，１７７，６１１も参照されたい。
【０１０５】
［０１４３］  誘導可能なプロモーターの例は、低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）又はコールドストレスにより誘導可能なＡｄｈ１プロモーター、熱ストレスにより誘導可能なＨｓｐ７０プロモーター、共に光により誘導可能なＰＰＤＫプロモーター及びＰＥＰ（ホスホエノールピルベート）カルボキシラーゼプロモーターである。科学的に誘導可能なプロモーターも有用であり、例えば、毒性緩和剤により誘導されるＩｎ２−２プロモーター（米国特許番号５，３６４，７８０）、エストロゲンにより誘導可能なＥＲＥプロモーター、及びオーキシンにより誘導可能であって膜層（ｔａｐｅｔｕｍ）特異的であるがカルスにおいても活性なＡｘｉｇ１プロモーターである（ＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ  ０２／０４６９９）。誘導可能なプロモーターの他の例は、ＧＶＧ及びＸＶＥプロモーターを含み、それぞれグルココルチコイド及びエストロゲンにより誘導される（米国特許番号６，４５２，０６８）。
【０１０６】
［０１４４］  発生調節下のプロモーターの例は、特定の組織、例えば、葉、根、果実、又は花において選択的に転写を開始するプロモーターを含む。例示のプロモーターは、葯特異的プロモーター５１２６（米国特許番号５，６８９，０４９及び５，６８９，０５１）である。種子選択的プロモーターの例は、限定ではないが、２７ｋＤガンマゼインプロモーター及び蝋（ｗａｘｙ）プロモーターを含む（Ｂｏｒｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ４７：９５−１０２；Ｒｅｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＮｕＫｌｏｅｓｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：２３７−２４４）。胚、果皮及びエンド内胚乳において発現するプロモーターは、米国特許番号６，２２５，５２９及びＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ  ００／１２７３３に開示されている。これら各々の開示は、それら全体を引用により本明細書に編入する。
【０１０７】
［０１４５］  いくつかの態様においては、誘導可能なプロモーターから、特に、病原体誘導可能プロモーターから遺伝子を発現させることが有益になる。そのようなプロモーターは、病原体関連蛋白質（ＰＲ蛋白質）からのものを含むが、病原体による感染の後に誘導され；例えば、ＰＲ蛋白質、ＳＡＲ蛋白質、ベータ−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼ、等である。例えば、Ｒｅｄｏｌｆｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．８９：２４５−２５４；Ｕｋｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：６４５−６５６；及びＶａｎ  Ｌｏｏｎ（１９８５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｖｉｒｏｌ．４：１１１−１１６を参照。引用により本明細書に編入されるＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ  ９９／４３８１９も参照されたい。
【０１０８】
［０１４６］  興味深いのは、病原体感染の部位においてか又は近辺で局所的に発現されるプロモーターである。例えば、Ｍａｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９：３３５−３４２；Ｍａｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ２：３２５−３３１；Ｓｏｍｓｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１４９７２−１４９７７を参照。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １０：９５５−９６６；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：２５０７−２５１１；Ｗａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ３：１９１−２０１；Ｓｉｅｂｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９６１−９６８；米国特許番号５，７５０，３８６（線虫誘導可能）；及びそれらに引用される文献も参照されたい。特に興味深いのは、トウモロコシのＰＲｍｓ遺伝子の誘導可能プロモーターであり、その発現は病原体であるフサリウムモニリフォルメにより誘導される（例えば、Ｃｏｒｄｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈ  ４１：１８９−２００を参照）。
【０１０９】
［０１４７］  さらに、病原体は傷又は昆虫による損傷により植物への入り口を発見するように、傷誘導可能プロモーターを上記ポリヌクレオチドの構築において用いてよい。そのような傷誘導可能プロモーターは、ポテトプロテイナーゼ阻害剤（ｐｉｎ  ＩＩ）遺伝子（Ｒｙａｎ（１９９０）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ  ２８：４２５−４４９；Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：４９４−４９８）；ｗｕｎ１及びｗｕｎ２，米国特許番号５，４２８，１４８；ｗｉｎ１及びｗｉｎ２（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１５：２００−２０８）；システミン（ＭｃＧｕｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５：１５７０−１５７３）；ＷＩＰ１（Ｒｏｈｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２：７８３−７９２；Ｅｃｋｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３２３：７３−７６）；ＭＰＩ遺伝子（Ｃｏｒｄｅｒｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ６（２）：１４１−１５０）、等を含み、引用により本明細書に編入される。
【０１１０】
［０１４８］  化学的に制御されるプロモーターを用いることにより、外来の化学制御剤の適用により植物において遺伝子の発現を変調させることができる。目的に応じて、当該プロモーターは化学物質誘導性プロモーターであってよく、化学物質の適用が遺伝子発現を抑圧する。化学物質誘導性プロモーターは当業界で知られており、限定ではないが、ベンズスルフォナミド除草剤毒性緩和剤により活性化されるトウモロコシのＩｎ２−２プロモーター、雑草発芽前の除草剤として使用される疎水性親電子性化合物により活性化されるトウモロコシのＧＳＴプロモーター、及びサリチル酸により活性化されるタバコのＰＲ−１ａプロモーターを含む。興味あるその他の化学制御プロモーターは、ステロイド応答性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：１０４２１−１０４２５及びＭｃＮｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １４（２）：２４７−２５７のグルココルチコイド誘導可能プロモーターを参照）及びテトラサイクリン誘導可能及びテトラサイクリン耐性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２２７：２２９−２３７，及び米国特許番号５，８１４，６１８及び５，７８９，１５６を参照）を含み、引用により本明細書に編入される。
【０１１１】
［０１４９］  組織選択的プロモーターを利用することにより、特定の植物の組織内の興味ある配列の増強された発現を標的化することができる。組織選択的プロモーターは、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １２（２）：２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１２（３）：１３３１−１３４１；Ｖａｎ  Ｃａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１２（２）：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１２（２）：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３５（５）：７７３−７７８；Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２０：１８１−１９６；Ｏｒｏｚｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０；及びＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４（３）：４９５−５０５を含む。そのようなプロモーターは、必要ならば弱い発現のために修飾することができる。
【０１１２】
［０１５０］  葉−選択的プロモーターは当業界で公知である。例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １２（２）：２５５−２６５；Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０５：２５７−２６７；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３５（５）：７７３−７７８；Ｇｏｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ３：５０９−１８；Ｏｒｏｚｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３（６）：１１２９−１１３８；及びＭａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０を参照されたい。さらに、ｃａｂ及びＲＵＢＩＳＣＯのプロモーターも使用できる。例えば、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９５８）ＥＭＢＯ  Ｊ  ４：２７２３−２７２９及びＴｉｍｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５７−５８を参照されたい。
【０１１３】
［０１５１］  根−選択的プロモーターは公知であって、文献からの多数の利用可能なものから選択されるか又は様々な適合可能な種からデノボにて単離することができる。例えば、Ｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０（２）：２０７−２１８（ダイズ根−特異的グルタミンシンセターゼ遺伝子）；Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３（１０）：１０５１−１０６１（フレンチビーンのＧＲＰ１．８遺伝子中の根−特異的調節要素）；Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４（３）：４３３−４４３（アグロバクテリウムチュメファシエンスのマンノパインシンターゼ（ＭＡＳ）遺伝子の根−特異的プロモーター）；及びＭｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３（１）：１１−２２（細胞質グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）をコードする完全長のｃＤＮＡクローンであり、ダイズの根と根粒の中で発現される）を参照されたい。Ｂｏｇｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２（７）：６３３−６４１も参照されたく、窒素固定非マメ科パラスポニアアンデルソニ（Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）及び近縁の非窒素固定非マメ科トレマトメントサ（Ｔｒｅｍａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）由来のヘモグロビン遺伝子から単離された根特異的プロモーターが記載されている。これらの遺伝子のプロモーターを、β−グルクロニダーゼリポーター遺伝子に連結し、そして非マメ科のニコチアナタバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）及びマメ科のロタスコルニクラタス（Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ）の両者に導入したところ、両者の例において、根特異的プロモーター活性が保存された。Ｌｅａｃｈ  ａｎｄ  Ａｏｙａｇｉ（（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｌｉｍｅｒｉｃｋ）７９（１）：６９−７６）は、アグロバクテリウムリゾゲネスの高発現ｒｏｌＣ及びｒｏｌＤ根誘導性遺伝子のプロモーターの彼らによる分析を記載する。彼らは、エンハンサーと組織選択的ＤＮＡ決定基がそれらのプロモーターにおいて分離されると結論した。Ｔｅｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ  ８（２）：３４３−３５０）は、オクトパインシンターゼをコードするアグロバクテリアのＴ−ＤＮＡ遺伝子が根の先端の表皮において特に活性であること、及びＴＲ２’遺伝子が完全な（ｉｎｔａｃｔ）植物においては根特異的であり、そして葉の組織の傷により刺激されることを示すために、ｌａｃＺに対する融合物を用いており、殺虫性（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ）又は殺虫性（ｌａｒｖｉｃｉｄａｌ）の遺伝子と共に使用するための特性に関して特に望まれる組み合わせである。ｎｐｔＩＩ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ）に融合されたＴＲ１’遺伝子は、類似の特性を示した。追加の根選択的プロモーターは、ＶｆＥＮＯＤ−ＧＲＰ３遺伝子プロモーター（Ｋｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９（４）：７５９−７７２）；及びｒｏｌＢプロモーター（Ｃａｐａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５（４）：６８１−６９１．）を含む。米国特許番号５，８３７，８７６；５，７５０，３８６；５，６３３，３６３；５，４５９，２５２；５，４０１，８３６；５，１１０，７３２；及び５，０２３，１７９も参照されたい。ファセオリン遺伝子（Ｍｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３：４７６−４８２及びＳｅｎｇｏｐｔａ−Ｇｏｐａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：３３２０−３３２４）。
【０１１４】
［０１５２］  形質転換プロトコル並びにヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、形質転換のための標的化される植物又は植物細胞の種類、即ち、単子葉か双子葉かに依存して変更されてよい。ＤＮＡ構築物を導入するための適切な方法は、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３２４；及び米国特許番号６，３００，５４３）、有性交配、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６）、アグロバクテリア媒介性形質転換（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許番号５，５６３，０５５；及び米国特許番号５，９８１，８４０）、直接の遺伝子移入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：２７１７−２７２２）、及び弾道粒子加速（例えば、米国特許番号４，９４５，０５０；米国特許番号５，８７９，９１８；米国特許番号５，８８６，２４４；米国特許番号５，９３２，７８２；Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）”Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ，”Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．，Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；及びＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６）を含む。Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７−３７  （タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８７：６７１−６７４（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ９６：３１９−３２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０（イネ）；  Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；米国特許番号５，２４０，８５５；米国特許番号５，３２２，７８３；米国特許番号５，３２４，６４６；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：７６３−７６４；米国特許番号５，７３６，３６９（穀類）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒ��ｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；Ｄｅ  Ｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，  ｅｄ．  Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｏｎｇｍａｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８及びＫａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８４：５６０−５６６（ヒゲ（ｗｈｉｓｋｅｒ）−媒介性形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５  （エレクトロポレーション）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：２５０−２５５及びＣｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｆｏｒｄ（１９９５）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ７５：４０７−４１３（イネ）；Ｏｓｊｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０（アグロバクテリウムチュメファシエンス経由のトウモロコシ）；及び米国特許番号  ５，７３６，３６９（分裂組織形質転換）も参照されたく、全ては引用により本明細書に編入される。
【０１１５】
［０１５３］  ヌクレオチド構築物はウイルス又はウイルス核酸を植物に接触させることにより植物に導入してよい。一般に、そのような方法は、発明のヌクレオチド構築物をウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に取り込むことを含む。さらに、有用なプロモーターはウイルスＲＮＡポリメラーゼによる転写のために利用されるプロモーターを包含することが認識される。ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含むヌクレオチド構築物を植物に導入してその中にコードされる蛋白質を発現させるための方法は、当業界公知である。例えば、米国特許番号５，８８９，１９１，５，８８９，１９０，５，８６６，７８５，５，５８９，３６７及び５，３１６，９３１を参照されたく、引用により本明細書に編入される。
【０１１６】
［０１５４］  いくつかの態様においては、一過性の発現か望まれるかもしれない。それらの場合、標準の一過性形質転換技術を使用してよい。そのような方法は、限定ではないが、ウイルス形質転換法、及びＤＮＡ又はＲＮＡのマイクロインジェクション、並びに当業界公知の他の方法を含む。
【０１１７】
［０１５５］  ヌクレオチド配列を安定に取り込んだ植物からの細胞は、慣用の様式に従い植物中で生育させてよい。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１−８４を参照されたい。これらの植物をあとで生育させ、同じ形質転換株又は異なる株と受粉させ、そして目的のヌクレオチド配列及び／又は遺伝マーカーにより授与された所望の表現型特性の構成的発現を有する結果のハイブリッドが標的部位又は移入カセット中に含まれた。２又はそれより多い世代を生育させることにより、所望の表現型特性の発現が安定に保持されて遺伝することが保証され、そしてのちに所望の表現型特性の発現を保証するように回収された種子が目的を達成した。
【０１１８】
［０１５６］  上記ＤＮＡ構築物を含む細胞及び／又は植物の初期の同定及び選択は、マーカー遺伝子の使用により促進させてよい。遺伝子標的化は、組換え体を同定するための高い感度の方法が存在するなら、例えば、標的化遺伝子修飾がＰＣＲ分析により容易に検出できるなら、あるいはそれが特定の表現型をもたらすなら、選択無しに実施することができる。しかしながら、ほとんどの場合、遺伝子標的化事象の同定は、マーカーの使用により促進されることになる。有用なマーカーは、正及び負の選択可能マーカー、並びにスクリーニングを促進させるマーカー、例えば可視マーカーを含む。選択可能なマーカーは、抗生物質、例えば、スペクチノマイシン（例えば、ａａｄａ遺伝子、Ｓｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４：１９７−２０５）、ストレプトマイシン（例えば、ａａｄａ，又はＳＰＴ，Ｓｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４：１９７−２０５；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１０：８６）、カナマイシン（例えば、ｎｐｔＩＩ，Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：４８０３−４８０７）、ハイグロマイシン（例えば、ＨＰＴ，Ｖａｎｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５：２９９）、ゲンタマイシン（Ｈａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８６：１２１６）、フレオマイシン、ゼオシン、又はブレオマイシン（Ｈｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：１７１）又は除草剤に対する耐性、例えば、ホスフィノスリシン（ｂａｒ遺伝子）、又はスルフォニルウレア（アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）（Ｃｈａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ８：６４３）、不完全培地上の成長必要条件を満たす遺伝子、例えば、酵母のＨＩＳ３，ＬＥＵ２，ＬＹＳ２，及びＴＲＰ１遺伝子、及び他の当業界公知の他のそのような遺伝子を含む。陰性選択可能マーカーは、シトシンデアミナーゼ（ｃｏｄＡ）（Ｓｔｏｕｇａａｒｄ（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３：７５５−７６１）、ｔｍｓ２（ＤｅＰｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ７：６３−６６），硝酸レダクターゼ（Ｎｕｓｓａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １：２６７−２７４），ＳＵ１（Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０５：４７３−４８２）、アグロバクテリアのＴｉプラスミド由来のａｕｘ−２、及びチミジンキナーゼを含む。スクリーニング可能なマーカーは、蛍光蛋白質、例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２；ＵＳ  ６，１４６，８２６；ＵＳ  ５，４９１，０８４；及びＷＯ  ９７／４１２２８）、リポーター酵素、例えば、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ  ５：３８７；米国特許番号５，５９９，６７０；米国特許番号５，４３２，０８１）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、アルカリホ���ファターゼ（ＡＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びルシフェラーゼ（米国特許番号５，６７４，７１３；Ｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：８５６−８５９）、ウイルスマーカー様アントシアニン、例えば、ＣＲＣ（Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：４４９−４５０）Ｒ遺伝子ファミリー（例えば、Ｌｃ，Ｐ，Ｓ），Ａ，Ｃ，Ｒ−ｎｊ，ドロソフィラの体色及び／又は眼の色の遺伝子、哺乳類系におけるコートカラー遺伝子、及び当業界公知のその他の遺伝子を含む。
【０１１９】
［０１５７］  遺伝子標的化事象を選択してスクリーニングするためには、一つ又はそれより多くのマーカーを使用してよい。遺伝子破壊の一つの共通の戦略は、標的がプロモーターレスの選択可能マーカーにより破壊されるような標的修飾ポリヌクレオチドを用いることを含む。選択可能マーカーはプロモーターを欠くから、ランダムな組み込み事象が遺伝子の転写を導く可能性はない。遺伝子標的化事象は、標的遺伝子のためのプロモーターの制御下に選択遺伝子を置くことになる。遺伝子標的化事象は、選択可能な遺伝子の発現に関する選択性により同定される。別の共通の戦略は、正−負選択スキムを利用する。このスキムは２つの選択可能なマーカーを利用するが、一つは耐性（Ｒ＋）を授与し、感受性（＋Ｓ）を授与する他方とカップリングされて、各々がプロモーターを伴う。このポリヌクレオチドがランダムに挿入された場合、結果の表現型はＲ＋／Ｓ＋である。遺伝子標的化事象が生じた場合、上記２つのマーカーはカップリングがはずれて、結果の表現型はＲ＋／Ｓ−である。陽性−陰性選択の例は、Ｔｈｙｋｊａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５：５２３−５３０；及びＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ  ０１／６６７１７に見いだされ、引用により本明細書に編入される。
【０１２０】
［０１５８］  本発明の実施は、他に支持しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養及びトランスジェニック生物学の慣用技術を用いるが、当業界の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｇ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版（Ｃｏｌｇ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第３版（Ｃｏｌｇ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｃ，定期的なアップデートを含む）；Ｇｌｏｖｅｒ（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＬＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ（１９９２）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ（１９９１）Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＰｒｅｓｓＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｇ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｊａｋｏｂｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，ｅｄｓ．（１９７９）“Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．５８（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ  （ＮＹ））．；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  １９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．  １５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ  （Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８；Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，１９８６）；Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，  Ｍ．，Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  （Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ），（４ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２０００）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃ．Ｋｏｎｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒｉｖｅｒ  Ｅｄｇｅ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，  １９９２）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｄ．Ｗｅｉｇｅｌ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００２）を参照されたい。
【０１２１】
実施例
［０１５９］  以下は、発明を例示するために意図された非限定実施例である。本発明は理解の明確化のために例示によりそして実施例によりいくらか詳細に記載されてきたが、特定の変化及び修飾が請求の範囲の範囲内で実施されてよいことは明らかである。例えば、本明細書に記載されたあらゆるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ及びｍｉＲＮＡｓを、実施例にて使用されたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ及びｍｉＲＮＡｓに代えて用いることができる。実施例１−１５は、ＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ  ２００５／０５２１７０及びＷＯ  ２００５／０３５７６９から及び米国公開出願番号ＵＳ  ２００５／０１３８６８９及びＵＳ  ２００５／０１２０４１５からであり、引用により本明細書に編入される。
【０１２２】
実施例１
［０１６０］  本実施例はマイクロＲＮＡの同定を記載する。
【０１２３】
［０１６１］  以下の実験は、アラビドプシスサリアナＣｏｌ−０生態型にて実施される。植物を長日（１６時間光、８時間暗）冷白光（ｃｏｏｌ  ｗｈｉｔｅ  ｌｉｇｈｔ）下で２２℃において生育させる。
【０１２４】
［０１６２］  花の浸し方法（ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ  ｍｅｔｈｏｄ）の修飾バージョンによりアラビドプシス植物を形質転換したが、上から直接に水をかけることによりアグロバクテリア細胞懸濁液を植物に適用する。用いられたＴ−ＤＮＡベクターはｐＨＳｂａｒＥＮＤｓであり、右の縁に隣接してＣＡＭＶ  ３５Ｓエンハンサーを４コピー含んだが、Ｗｅｉｇｅｌら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２２：１００３−１０１３，２０００）に記載されたのと類似の配置である。形質転換された植物はグルフォシネート（ＢＡＳＴＡ）により選択されて、開花時間に関してスクリーニングされ、初期開花ＥＡＴ−Ｄ変異体の同定をもたらした。初期開花と共に分離する（ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｇ）単一のＴ−ＤＮＡがＥＡＴ−Ｄにて同定され、そしてＴＡＩＬ−ＰＣＲを実施することにより、Ｔ−ＤＮＡの左と右の縁に隣接した配列を増幅する。ＥＡＴ−Ｄ変異体においてアップ制御される転写物を同定するために、野生型（Ｃｏｌ−０）及びＥＡＴ−Ｄ植物から抽出されたＲＮＡを含むノーザンブロットを釣る。遺伝子Ａｔ５ｇ０４２７０とＡｔ５ｇ０４２８０（ジェンバンクＮＣ＿００３０７６）のためのプローブは野生型とＥＡＴ−Ｄの間の如何なる差異も検出しないが、属間（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ）領域からのプローブは、野生型よりもＥＡＴ−Ｄにおいて顕著に高いレベルで発現される約１．４ｋｂの転写物を同定する。
【０１２５】
［０１６３］  完全長ＥＡＴ  ｃＤＮＡを単離するために、５’−及び３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲを、５’−キャップｍｉＲＮＡｓを選択するＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン）を用いて実施する。逆転写をオリゴ−ｄＴプライマーを用いて実施し、そしてＰＣＲは、遺伝子特異的プライマー（配列番号：４５  ５’−ＣＴＧＴＧＣＴＣＡＣＧＡＴＣＴＴＧＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＴＣ−３’）を５’キットプライマーと対にするか、又は第２の遺伝子特異的プライマー（配列番号：４６  ５’−ＧＴＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣ−３’）を３’キットプライマーと対にして利用した。
【０１２６】
［０１６４］  アラビドプシスＥＡＴ−Ｄ（初期活性化タグ−ドミナント）変異体を活性化タグ付加集団にて同定する（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）（Ｗｅｉｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２２：１００３−１０１３）。可視検査及びロゼット葉の数を測定することにより明らかとなるとおり（表２）、ＥＡＴ−Ｄ変異体は極端に早く開花する。さらに、ＥＡＴ−Ｄは強いａｐｅｔａｌａ２（ａｐ２）変異体対立遺伝子に関して観察されたのと実質同一の花の欠損を表し（Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１２：１−２０）、花弁の完全な欠如と萼から心皮への形質転換を含む。このａｐ２−様表現型はＥＡＴ−Ｄホモ接合体においてのみ観察されるが、ＥＡＴ−Ｄのヘテロ接合体とホモ接合体の両方共が初期に開花することから、開花時間の表現型は、ａｐ２−様花表現型よりもＥＡＴ−Ｄ用量に対してより敏感であることが示される。
【０１２７】
【表２】
2008522585.tif 000004
【０１２８】
［０１６５］  ＥＡＴ−Ｄ中の活性化タグＴ−ＤＮＡ挿入物は第５染色体の、注釈を付けられた遺伝子Ａｔ５ｇ０４２７０とＡｔ５ｇ０４２８０の間にマップされる。５’−及び３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを次にこの領域内に位置するプライマーと共に用いることにより、１．４ｋｂの転写物（配列番号：１）を同定するが、ＥＡＴと命名され、ＥＡＴ−Ｄにおいてアップ制御される。当該１．４ｋｂのＥＡＴ  ｃＤＮＡが構成的ＣＡＭＶ３５プロモーターに融合される、そして結果の３５Ｓ：：ＥＡＴ構築物が野生型（Ｃｏｌ−０）植物へアグロバクテリア媒介性形質転換（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １６：７３５−７４３）により導入される場合、３５Ｓ：：ＥＡＴ形質転換体は、ＥＡＴ−Ｄに関して観察されるのと同一の初期開花及びａｐ２−様表現型を表す（表１）。３５Ｓ：：ＥＡＴ形質転換体の多くは場合により追加の欠損を表し、芝生の葉縁（ｃａｕｌｉｎｅ  ｌｅａｆ  ｍａｒｇｉｎｓ）上の傷痕状突起（ｓｔｉｇｍａｔｉｃ  ｐａｐｉｌｌａｅ）及び芝生の葉の葉腋内の第２の花序（ｓｅｃｏｎｄ  ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）よりむしろ完全又は部分的な花の形成を含む。３５Ｓ：：ＥＡＴ植物におけるＥＡＴ遺伝子の発現は、よって、開花時間及び花の器官の同一性の仕様（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の両方に影響する。
【０１２９】
［０１６６］  ＥＡＴ遺伝子は、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ方法論に基づくと、５’−キャップされてポリアデニル化されると予測される１４１７−ヌクレオチドの非コードＲＮＡを生産する。いくつかのデータベースのＥＡＴ  ｃＤＮＡによるＢＬＡＳＴＩＮとＢＬＡＳＴＸ検索は、ＥＡＴと他のあらゆる遺伝子の間に広範囲なヌクレオチド又は予測されるアミノ酸配列の同一性を示さない。しかしながら、ＥＡＴ転写物の中央の２１ヌクレオチド（ｎｔ）（配列番号：４）のストレッチは最近同定されたｍｉＲＮＡであるｍｉＲ１７２ａ−２と同一のものである（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：１４８４−１４９５）。ＥＡＴ  ｃＤＮＡ内のｍｉＲ１７２ａ−２配列の機能の重要性を確認するため、ＥＡＴの変異形態を生産するが、ｍｉＲ１７２ａ−２配列を欠失させ、そしてこの変異体ＥＡＴ  ｃＤＮＡ、ｅａｔｄｅｌからなる構築物を３５Ｓプロモーター推進にて作成する。この３５Ｓ：：ｅａｔｄｅｌ構築物を運ぶトランスジェニック植物は野生型と同じ数の花を開花し、正常な花を有した（表１）ことから、ｍｉＲ１７２ａ−２配列はＥＡＴ−過剰発現系において観察される開花時間及び花器官同一性表現型の両方を授与するのに必要であることが示される。
【０１３０】
［０１６７］  Ｐａｒｋら（Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：１４８４−１４９５）により記されるとおり、２１ｎｔのｍｉＲ１７２ａ−２  ｍｉＲＮＡはＡＰ２のコーディング領域の３’エンド近傍の配列を伴うＲＮＡ二重鎖を形成する能力を有する（表３）。
【０１３１】
【表３】
2008522585.tif 000005
【０１３２】
［０１６８］  ＡＰ２遺伝子のこの特定の領域はＡＰ２ファミリー間ではヌクレオチドレベルにおいてあまり保存されていない；にもかかわらず、ｍｉＲ１７２ａ−２に相補なＡＰ２配列（配列番号：４９）は他の３つのアラビドプシスＡＰ２ファミリーメンバー、Ａｔ５ｇ６０１２０（配列番号：５０），Ａｔ２ｇ２８５５０（配列番号：５１），及びＡｔ５ｇ６７１８０（配列番号：５２）において類似の位置に見いだされる。さらに、当該配列はトウモロコシのＡＰ２遺伝子の確認できないｓｐｉｋｅｌｅｔ１（Ｃｈｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２：１１４５−１１５４）（配列番号：５３）及びｇｌｏｓｓｙ１５（Ｍｏｏｓｅ  ａｎｄ  Ｓｉｓｃｏ（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １０：３０１８−３０２７）（配列番号：５４）の対応する位置において、及び他の多くの植物種からのＡＰ２ファミリーメンバーに見いだすことができ、ダイズ、イネ、コムギ、トマト及びエンドウ（示さず）を含む。３つのアラビドプシスと２つのトウモロコシのＡＰ２ファミリーメンバーのアラインメントを以下の表４に示す。
【０１３３】
【表４】
2008522585.tif 000006
【０１３４】
［０１６９］  アラビドプシスゲノムの第２染色体上にｍｉＲ１７２ａ−２のｍｉＲＮＡの追加のコピーが存在し（ｍｉＲ１７２ａ−１，図２ｄ）、そしてｍｉＲ１７２ａ−２は３つの他のアラビドプシス座に対して類似性が高い。ｍｉＲ１７２ａ−２  ｍｉＲＮＡのように、上記配列の４つ全ての繰り返しは、属間領域内、即ち、ジェンバンクにおいて現在記されたアラビドプシス遺伝子の間の中にある。さらに、上記配列は、トマト、ポテト及びダイズからのＥＳＴｓに見いだされ、そして４つのコピーがイネノゲノミック配列中に見いだされた。
【０１３５】
実施例２
［０１７０］  この実施例は発現ベクターの構築を記載する。
【０１３６】
［０１７１］  ＥＡＴ遺伝子を過剰に発現させるため、ＸｈｏＩ部位を含むプライマー（配列番号：５５  ５’−ＧＡＣＴＡＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＡＡＣ−3’及び配列番号：５６  ５’−ＧＡＣＴＡＣＴＣＧＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＧＡＧＣＡＣＴＴＧＡＡＡＡＣ−３’）をデザインすることにより、Ｃｏｌ−０  ＤＮＡから完全なＥＡＴ遺伝子を増幅する。ＰＣＲ産物をＸｈｏＩにより消化して、ＢａｍＨＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を欠いた修飾されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋ベクター（ストラタジーン、ラホーヤ、ＣＡ）に挿入し、ＥＡＴＸ４（配列番号：４４）を生じさせる。３５Ｓ：：ＥＡＴ形質転換体を生成するため、ＸｈｏＩにより切断されたＥＡＴ遺伝子が二元ベクターｐＢＥ８５１へＣＡＭＶ  ３５Ｓプロモーターとｂ−ファゼオリンターミネーターの間に挿入され、そしてＣｏｌ−０を花の浸しにより形質転換した。ｅａｔｄｅｌ構築物を生成するために、２つのオリゴヌクレオチドを合成する（配列番号：５７  ５’−ＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＴＧＴＣＧＴＴＧＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＴＡＡＧＡＴＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＡＡＡＴＡＣ−３’及び配列番号：５８  ５’−ＣＣＴＡＡＡＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＴＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＡＴＡＣＣＴＡＡ−３’）が、断片中に位置する２１ｎｔのｍｉＲ１７２ａ−２配列を欠く以外はＥＡＴのｃＤＮＡのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を完全に再生した。これらの２つのオリゴをそれらの合成された相補鎖にアニールさせ（配列番号：５９  ５’−ＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＡＴＣＡＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＴＣＴＴＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＣＧＣＣＴＡＣＡＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＧ−３’及び配列番号：６０  ５’−ＡＧＣＴＴＴＡＧＧＴＡＴＴＴＧＴＡＧＣＣＧＴＣＧＡＴＴＧＴＴＧＡＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＡＡＴＴ−３’）、そしてＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化されていたＥＡＴＸ４に３分子連結反応にて連結した。これにより、野生型のＥＡＴ配列の１５９ｂｐの１３８ｂｐ変異体配列による置き換えがもたらされた。上記のとおりに、ｅａｔｄｅｌ  ｃＤＮＡを、次に、ｐＢＥ８５１にサブクローン化し、そして形質転換した。ＢＡＳＴＡを用いて、ＥＡＴとｅａｔｄｅｌの両方の過剰発現構築物に関して植物内で選択する。
【０１３７】
［０１７２］  ｍｉＲ１７２ファミリーの別のメンバー、ｍｉＲ１７２ａ−１がｍｉＲ１７２ａ−２のそれと類似の表現型を授与するか否かを試験するために、ｍｉＲ１７２ａ−１を包囲するゲノミック領域に融合された３５Ｓプロモーターを含む構築物を生成する。３５Ｓ：：ｍｉＲ１７２ａ−１を含む植物は、開花が早く、そしてａｐ２表現型を表す（表１）ことから、ｍｉＲ１７２ａ−１は過剰発現された際にｍｉＲ１７２ａ−２と同一の様式にて挙動することが示される。
【０１３８】
［０１７３］  ｍｉＲ１７２  ｍｉＲＮＡファミリーメンバーの全てが、ＲＮＡヘアピンを形成することを許容する配列コンテクスト内に位置する（図１）。おそらく、このヘアピンは、のちに植物のダイサーホモログにより分割されて成熟ｍｉＲＮＡを生成する基質である。ヘアピン内、即ちステムの３’側上のｍｉＲＮＡの位置はｍｉＲ１７２ファミリーのメンバー全ての間で保存されており、これはこの特定のｍｉＲＮＡファミリーのプロセシングに対する構造上の要求を反映するのかもしれない。２１ｎｔのｍｉＲ１７２−ａ  ｍｉＲＮＡは、よって、これらの遺伝子内で２１ｎｔの同源の（ｃｏｇｎａｔｅ）配列とＲＮＡ二重鎖を形成することによりＡＰ２遺伝子のサブセットを制御する能力を有するｍｉＲＮＡｓのファミリーのメンバーであると予測される。
【０１３９】
実施例３
［０１７４］  当該実施例は、マイクロＲＮＡ発現とＡＰ２発現の分析を記載する。
【０１４０】
［０１７５］  全ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ試薬（シグマ）を用いて既に開花した野生型及びＥＡＴ−Ｄ全植物から単離される。５０ｍｇの各ＲＮＡを１５％  ＴＢＥ−尿素標準ゲル（バイオラッド）の電気泳動に供し、ハイボンド−Ｎ＋フィルターペーパー（アマシャム）上にＴｒａｎｓＢｌｏｔ−ＳＤ装置（バイオラッド）を用いてエレクトロブロットする。次に、フィルターを一晩３７℃においてＵｌｔｒａＨｙｂ−Ｏｌｉｇｏバッファー（アンビオン）中で３２Ｐ−標識オリゴとハイブリダイズさせる。オリゴは、ｍｉＲ１７２ａ−２のｍＲＮＡのセンス又はアンチセンス鎖の何れかに対応する３０マーであり、４−５ｎｔの隣接配列を各サイドに有する。フィルターを２回３７℃において２Ｘ  ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳを含むバッファー中で洗浄する。Ｓ１分析に関して、オリゴ（配列番号：６１）（５’−ＡＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＴ−３’）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと３２Ｐを用いた末端標識により、プローブを作成する。Ｓ１反応のハイブリダイゼーションとプロセシングを標準プロトコルを用いて実施する。ｍｉＲ１７２ａ−２とｍｉＲ１７２ａ−１の発生学分析のために、全ＲＮＡを実施例４に示された様々なステージ及び組織において、Ｒｎｅａｓｙキット（キアゲン）を用いて植物から得る。ＲＴ−ＰＣＲを標準プロトコルを用いて実施し、そしてｍｉＲ１７２ａ−２に隣接する配列（配列番号：６２）（５’−ＧＴＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧ  ＡＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣ−３’）及び（配列番号：６３）（５’−ＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＣＡＡＴＣＡＡ  ＴＡＴＣ−３’）又はｍｉＲ１７２ａ−１に隣接する配列（配列番号：６４）（５’−ＴＡＡＴＴＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣ  ＧＧＴＣＧＴＴＧＴＴＧ−３’）及び（配列番号：６５）（５’−ＡＡＴＡＧＴＣＧＴＴＧＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧＣＡＧＣＡＴＣ−３’）に特異的なオリゴを用いる。ＡＣＴ１１（アクチン）転写物を増幅するのに用いられたオリゴは：（配列番号：６６）５’−ＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＡＴＴＣＡＧ−３’、及び（配列番号：６７）５’−ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＴＧ  ＧＡＣＴＡＴＴＧＡＴＧ−３’であった。ＡＰ２のＲＴ−ＰＣＲ分析を花のつぼみからのＲＮＡに実施し、そして以下のオリゴ：（配列番号：６８）５’−ＴＴＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＧＧＴＡＧ−３’、及び（配列番号：６９）５’−ＧＴＴＣＧＣＣＴＡＡＧＴＴＡＡＣＡＡＧＡＧＧＡＴＴＴＡＧＧ−３’を利用した。ＡＮＴ転写物を増幅するのに用いられたオリゴは：（配列番号：７０）５’−ＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＴＧＡＣＴＡＡＣＴＣＴＧ  ＧＴＴＴＴＣ−３’、及び（配列番号：７１）５’−ＧＴＴＡＴＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＣＴＧＴＴＴＣＡＣＡＴＧ−３’であった。
【０１４１】
［０１７６］  ＡＰ２のイムノブロット分析を花のつぼみから抽出された蛋白質に実施する。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動の後に、蛋白質をハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｐ膜（アマシャム）に転写して、ＡＰ２蛋白質に特異的な抗体（ａＡ−２０，サンタクルズバイオテクノロジー）とインキュベートする。ブロットをＥＣＬ−プラスキット（アマシャム）を用いて処理する。
【０１４２】
［０１７７］  ｍｉＲ１７２ａ−２  ｍｉＲＮＡに対するセンス及びアンチセンス鎖の両方のプロトコルを用いたノーザン分析は、野生型に比較して、ＥＡＴ−Ｄ変異体植物においてはるかに高いレベルにまで蓄積する２１−２５ヌクレオチドの小一本鎖ＲＮＡを同定する。野生型において観察される少量の転写物は、おそらくは、ｍｉＲ１７２ａ−２  ｍｉＲＮＡのみならずそのファミリーメンバーの内生レベルも表し、上記プロトコルとクロスハイブリダイズするのに十分類似している。予測されたｍｉＲ１７２ａ−２ヘアピンは１１７ｎｔの長さであり（図１）、少量の約１００ｎｔ転写物の蓄積がＥＡＴ−Ｄに観察され、これは部分的にプロセシングされたｍｉＲ１７２ａ−２ヘアピン前駆体を表すらしい。ｍｉＲ１７２ａ−２  ｍｉＲＮＡのＳ１ヌクレアーゼマッピングは、Ｐａｒｋら（（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：１４８４−１４９５）により報告されたｍｉＲ１７２ａ−２の５’エンドの独立した確認を提供する。
【０１４３】
実施例４
［０１７８］  当該実施例はＥＡＴのｍｉＲＮＡ発現における発生パターンを記載する。
【０１４４】
［０１７９］  その他のアラビドプシスファミリーメンバーとは異なるｍｉＲ１７２ａ−２の約１００発現パターンに取り組むため、ｍｉＲ１７２ａ−２を含む１．４ｋｂのＥＡＴ完全長前駆体転写物の断片を特異的に検出するためにＲＴ−ＰＣＲを用いる。ＥＡＴ前駆体転写物の発現は時間的に制御され、発芽の２日後には転写物がほとんど又は全く検出されず、そして植物が開花に達すると進化上より安定な状態の転写物の蓄積が観察される。ｍｉＲ１７２ａ−１の前駆体転写物は類似の時間的発現パターンを示す。ｍｉＲ１７２ａ−２とＭｉＲ１７２ａ−２の前駆体転写物は両方共に開花が起きた後も発現され続けて、葉でも花のつぼみでも共に蓄積する。他のｍｉＲ１７２ファミリーメンバーの前駆体の発現は検出されないが、おそらくは、この分析に含まれない組織種におけるそれらの広範囲の発現によるか又はそれらの前駆体転写物が検出するにはあまりに一過性であるためである。ｍｉＲ１７２ａ−２及びｍｉＲ１７２ａ−１に関して観察された時間的発現パターンは、シノラブディスエレガンスにおいて発生の時間を制御する２つのｍｉＲＮＡｓｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４に関して観察されたパターンを暗示する（Ｆｅｉｎｂａｕｍ  ａｎｄ  Ａｍｂｒｏｓ（１９９９）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２１０：８７−９５；Ｒｅｉｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：９０１−９０６）。
【０１４５】
実施例５
［０１８０］  公知の開花時間経路内にｍｉＲ１７２を位置付ける試みにおいて、様々な開花時間変異体におけるｍｉＲ１７２のレベルを評価する。ｍｉＲ１７２のレベルは試験された変異体の何れにおいても変化せず、そしてＥＡＴ転写物のレベルは長日で生育した植物対短日で生育した植物にて同一である。
【０１４６】
実施例６
［０１８１］  当該実施例は蛋白質発現の評価を記載する。
【０１４７】
［０１８２］  イムノブロット分析は、ＡＰ２蛋白質がＥＡＴ−Ｄ変異体において野生型に比較して約３．５倍低下するのに対し、ＡＰ２転写物は影響されないことを示す。このデータはｍｉＲ１７２ａ−２  ｍｉＲＮＡが翻訳阻害によりＡＰ２を負に制御することを暗示する。ｍｉＲ１７２ａ−２のｍｉＲＮＡとＡＰ２標的部位の間の予測されたほぼ完全な相補性は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路によるＡＰ２  ｍＲＮＡ分割を誘発することが予測される（Ｌｌａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１６０５−１６１９；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：２０５６−２０６０）。事実、もっぱら仮想標的に対するそれらのほぼ完璧な相補性のために、多数の植物ｍｉＲＮＡｓがＲＮＡｉ経路に侵入することを他者が提案した（Ｒｈｏａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１０：５１３−５２０）。予測されたｍｉＴ１７２ａ−２／ＡＰ２  ＲＮＡ二重鎖内のＧＵ揺らぎ塩基対に関して証拠はないが、ＭｉＲ１７２ファミリーメンバーとそれらのＡＰ２標的の間には全ての予測された二重鎖において保存されている。機構はさておき、ＡＰ２発現データ及びＥＡＴ−Ｄの観察された表現型からは、少なくともｍｉＲ１７２ａ−２が過剰発現されたときには、ＡＰ２がｍｉＲ１７２ａ−２による負の制御の標的であることは明白である。
【０１４８】
実施例７
［０１８３］  初期開花ＥＡＴ−Ｄ変異体を同定した同じ遺伝子スクリーンにおいて、ＬＡＴ−Ｄと命名された活性化タグ後期開花変異体を同定する。ＬＡＴ−Ｄ変異体は後期開花以外に付加的な表現型を示さず（表１）、そして後期開花表現型は単一のＴ−ＤＮＡ挿入とは互いに分離する（ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｅｓ）。ＬＡＴ−Ｄ中のＴ−ＤＮＡの配列分析は、４Ｘ  ３５Ｓエンハンサーが、ｍｉＲ１７２により制御されることが有力なＡＰ２様標的遺伝子のひとつであるＡｔ２ｇ２８５５０の約５ｋｂ上流に位置することを示す。Ａｔ２ｇ２８５５０に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲは、この遺伝子に対応する転写物が野生型に比較してＬＡＴ−Ｄ変異体において高いレベルで事実発現されることを示す。Ａｔ２ｇ２８５５０の過剰発現が後期開花を誘導することを確認するため、全Ａｔ２ｇ２８５５０コーディング領域を含むゲノミック領域（開始コドンから停止コドンまで）を３５Ｓプロモーターに融合し、そしてこの構築物を含むトランスジェニック植物を創製する。トランスジェニック３５Ｓ：：Ａｔ２ｇ２８５５０植物は野生型よりも遅く開花して、ＬＡＴ−Ｄ変異体よりもわずかに遅い（表１）。この後期開花表現型は複数の個別の形質転換体において観察される。
【０１４９】
［０１８４］  Ａｔ２ｇ２８５５０の過剰発現が後期開花を誘導するという事実は、ＭｉＲ１７２がＡｔ２ｇ２８５５０をダウン制御することにより開花を一部促進させることを示唆する。しかしながら、ｍｉＲ１７２はその標的遺伝子の転写物の蓄積よりも蛋白質に影響するらしいので、そしてＡｔ２ｇ２８５５０遺伝子産物に対する抗体は存在しないので、この制御は遺伝的交配により間接的に試験される。ＬＡＴ−Ｄに関してヘテロ接合の植物をＥＡＴ−Ｄに関してホモ接合の植物と交配させるが、全てのＦ１子孫がＥＡＴ−Ｄを１コピー含み、そしてＦ１子孫の５０％がＬＡＴ−Ｄ対立遺伝子を１コピー含むようにする。Ｆ１子孫をＰＣＲによりＬＡＴ−Ｄの存在又は不在に関してスコアし、そして、開花時間に関してもスコアする。Ｆ１植物の全部がＬＡＴ−Ｄ対立遺伝子のコピーを含んだか否かに拘わらず、初期開花であることは、ＥＡＴ−ＤがＬＡＴ−Ｄに対して上位であることを示す。この結果は、ＥＡＴ−Ｄにおいて過剰に発現されるｍｉＲ１７２ａ−２がＬＡＴ−Ｄにおいて過剰に発現されるＡｔ２ｇ２８５５０を直接ダウン制御するという見解と一致する。
【０１５０】
実施例８
［０１８５］  Ａｔ２ｇ２８５５０機能を低下させる効果を査定するため、Ａｔ２ｇ２８５５０遺伝子内にＴ−ＤＮＡ挿入物を含む植物を同定する。さらに、ｍｉＲ１７２標的配列も含む近い同類の（ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ）ＡＰ２様遺伝子であるＡｔ２ｇ２８５５０のＴ−ＤＮＡ変異体を同定する。Ａｔ２ｇ２８５５０挿入物又はＡｔ５ｇ６０１２０挿入物の何れかに関してホモ接合の植物は、野生型に比較してわずかに早く開花する（表１）。２つの変異体を交配させ、二重変異体をＰＣＲ遺伝子型判定により単離する。Ａｔ２ｇ２８５５０／Ａｔ５ｇ６０１２０二重変異体は個々の変異体の何れかよりも開花が早い（表１）ことから、当該遺伝子はオーバーラップした機能を有することが示唆される。Ａｔ２ｇ２８５５０／Ａｔ５ｇ６０１２０二重変異体の初期開花の表現型はｍｉＲ１７２−過剰発現系の初期開花表現型がＡｔ２ｇ２８５５０及びＡｔ５ｇ６０１２０を含むいくつかのＡＰ２−様遺伝子のダウン制御によるという見解と一致する。おもしろいことに、Ａｔ２ｇ２８５５０／Ａｔ５ｇ６０１２０二重変異体はｍｉＲ１７２過剰発現系ほど早くはない（表１のＥＡＴ−ＯＸ参照）ので、ｍｉＲ１７２の他のＡＰ２様標的、例えば、ＡＰ２つのそれ自身又はＡｔ５ｇ６７１８０も開花時間制御に貢献することが示唆される。ａｐ２変異体は初期開花ではないから、ＡＰ２による負の開花制御の如何なる可能性のものも、遺伝的重複性により、通常はマスクされるに違いない。
【０１５１】
実施例９
［０１８６］  この実施例は標的の選択方法及び配列番号：３及び４４の構築物を用いてｍｉＲＮＡｓを生成するためにＤＮＡ構築物をデザインする方法を記載する。以下の方法を用いて生成されたｍｉＲＮＡにより、サイレンシングのために興味のあるあらゆる遺伝子を選択することができる。
【０１５２】
［０１８７］  １．標的配列に対する目的の遺伝子の中のコーディング鎖から領域を選択されたい。一般には、停止コドンの約１００ｎｔ上流の領域である、ＡＰ２−様遺伝子中のＥＡＴにより標的とされる領域に対して類似の位置に見いだされる約１０−５０ヌクレオチドの領域を選択されたい。標的の正確な位置は、しかしながら、必須ではないらしい。〜５０％ＧＣを有し且つ配列の複雑性が高い領域、即ち繰り返し又は長いポリヌクレオチド域を選択することが薦められる。選択された領域は、相補ｍｉＲＮＡがＡ又はＵで始まるように、Ｔ又はＡで終わることも薦められる。これは、その二重鎖中でｍｉＲＮＡの５’エンドの低い安定性を保証する助けとなる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８）。例えば、ｍｉＲ１７２ａ−２前駆体においては、ｍｉＲＮＡ配列がＡで開始し、その他の多くのｍｉＲＮＡｓはＵから開始する。
【０１５３】
［０１８８］  ２．配列番号：３の構築物を用いるために、２１ｎｔの標的領域に相補な２１ヌクレオチドの配列を創製されたい（ｍｉＲＮＡ）。オプションで、標的配列とＧＵの揺らぎを生じてＥＡＴにみられるＧＵ揺らぎを模倣するように、ｍｉＲＮＡ中のＣをＴに代えられたい。
【０１５４】
［０１８９］  ３．ヘアピンの２１ヌクレオチドの「バックサイド」配列を創製されたい。これは、工程２からのｍｉＲＮＡに実質上相補になる。注目すべきは、このバックサイド配列も標的配列に実質上同一になる。一般には、オリジナルのＥＡＴヘアピン中のバルジに類似したヘアピンのステム中のいくつかのバルジを作成するために、数個のミスマッチを導入されたい。オプションとして、ｍｉＲＮＡの５’エンドにミスマッチを創製するために、バックサイドの３’エンドにＡＰを導入されたい。この最後の工程は、その二重鎖ダイサー生成物携帯においてｍｉＲＮＡの５’エンドに低い安定性を保証する助けとなるかもしれない（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８）。
【０１５５】
［０１９０］  ４．ＥＡＴのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ構築物（配列番号：３）中の２１ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列と２１ヌクレオチドの「バックサイド」配列を、工程２及び３からの新規なｍｉＲＮＡと「バックサイド」配列で置換されたい。
【０１５６】
［０１９１］  ５．工程４からの新規なヘアピンとオリジナルのヘアピンを比較するために、ＭＦＯＬＤ（ＧＣＧ，アクセルリス、サンディエゴ、ＣＡ）又は均等なプログラムを使用されたい。一般には、上記配列が実質上オリジナルのヘアピンの構造を複製する（図１）。導入されたバルジは、オリジナルに対して長さ、配列、又は位置が正確に同一である必要がない。ダイサーの予測されたｄｓＲＮＡの５’及び３’エンドの相対的安定性に関してヘアピン中のｍｉＲＮＡｓ配列を試験されたい。
【０１５７】
［０１９２］  ６．ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を創製する指向性ライゲーションを促進するために、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位及び４ヌクレオチドの突出を含む２つの二重鎖断片を生成するため、７６−７７ヌクレオチドの長さの合成オリゴヌクレオチドを生成されたい。突出のデザインは当業者により実施することができ、本実施例は配列番号：３の７９−８２位（ＣＣＴＡ）の４ヌクレオチド領域を用いる。よって、例えば：
【０１５８】
［０１９３］  オリゴ１は、５’エンドに不対のＢａｍＨＩ部位を有することとなり、配列番号：３の７８位で終わることになる。
【０１５９】
［０１９４］  オリゴ２は、５’エンドに７９−８２位（ＣＣＴＡ）のヌクレオチドを有することとなり、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の直前（又は配列番号：３の１５１−１５４位）で終わることになる。
【０１６０】
［０１９５］  オリゴ３は、オリゴ１に本質的には相補になり（配列番号：３のヌクレオチド５−７８）、そしてオリゴ２のヌクレオチド１−４（ＣＣＴＡ）に相補な４ヌクレオチドで終わることになる。
【０１６１】
［０１９６］  オリゴ４は、オリゴ２に本質的には相補になり、５位のヌクレオチドから始まり、３’エンドのＨｉｎｄＩＩＩで終わることになる。
【０１６２】
［０１９７］  次のプラスミド配列とのライゲーション反応において使用される２つの断片を生成するために上記オリゴヌクレオチドをアニールされたい。
【０１６３】
［０１９８］  オプションに、ａｔｔＢ配列を含む２つの合成オリゴヌクレオチドを合成してアニールすることにより、ａｔｔＢ−を隣接した（ｆｌａｎｋｅｄ）ｍｉＲＮＡ前駆体を創製して、のちに、組換えクローニング（ＧＡＴＥＷＡＹ，インビトロジェン社、カールスバッド、ＣＡ）を用いてベクターに組み込まれる。
【０１６４】
［０１９９］  ７．工程６からの２つのＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにて切断されたプラスミドとの３分子反応においてライゲーションされたい。本実施例は配列番号：４４の修飾されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋プラスミドを用いるが、配列番号：１の１．４ｋｂのＥＡＴ配列を含み、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、そして標準分子生物学技術を用いて小さい断片からゲル精製される。目的の遺伝子に対して新たにデザインされたｍｉＲＮＡが、前のｍｉＲＮＡを置き換えた。
【０１６５】
［０２００］  ａｔｔＢ−隣接配列が工程６から使用されるなら、ＢＰとＬＲの組換え反応（ＧＡＴＥＷＡＹ，インビトロジェン社、カールスバッド、ＣＡ）を用いて、完全長のｍｉＲ１７２ａ−２前駆体を含む指定ベクターに修飾されたヘアピンを挿入することができる。
【０１６６】
［０２０１］  ８．要求どおりにあらゆるその他の調製又は修飾に供された、工程７からのプラスミドを用いて、標的のために適した技術を用いて標的生物を形質転換する。
【０１６７】
［０２０２］  ９．標的遺伝子のサイレンシングは当業界でよく知られた技術、例えば、ノーザンブロット分析を用いて評価することができ、目的の標的遺伝子がポリペプチドをコードするならイムノブロット分析を用いることができ、標的遺伝子に関連する如何なる表現型上のスクリーンも、例えば、開花時間又は花の形態を用いることができる。
【０１６８】
実施例１０
［０２０３］  この実施例で記載されるのは、植物細胞へのポリヌクレオチド又はポリペプチドの導入のために使用される方法である。
【０１６９】
［０２０４］  Ａ．トウモロコシ粒子媒介性ＤＮＡデリバリー。
【０１７０】
［０２０５］  ＤＮＡ構築物を適切な培養培地上で生育できるトウモロコシ細胞に導入することができる。そのようなコンピテント細胞はトウモロコシ懸濁培養液、固形培地上のカルス培養液、新たに単離された未成熟胚又は分裂組織（ｍｅｒｉｓｔｅｍ）細胞由来であり得る。Ｈｉ−ＩＩ遺伝子型の未成熟胚を標的細胞として用いることができる。授粉の約１０日後に雌穂を回収し、そして１．２−１．５ｍｍの未成熟胚を種から単離し、そしてトウモロコシ培養培地上に胚盤の側面の下へ（ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ−ｓｉｄｅ  ｄｏｗｎ）置く。
【０１７１】
［０２０６］  未成熟胚を雌穂から回収した１８−７２時間後に砲撃する（ｂｏｍｂａｒｄｅｄ）。砲撃前の６から１８時間、未成熟胚を追加の浸透により（ｗｉｔｈ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ）培地上に置く（ＭＳ基礎培地、Ｍｕｓａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  １５：４７３−４９７，０．２５ｍソルビトールと共に）。高い浸透圧培地上の胚を砲撃標的として用い、そして砲撃からさらに１８時間この培地上に放置する。
【０１７２】
［０２０７］  粒子の砲撃のために、プラスミドＤＮＡ（上記）を標準ＣａＣｌ２−スペルミジン化学（例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３）を用いて１．８ｍｍタングステン粒子上に沈殿させる。各プレートを６００  ＰＳＩにて一度砲撃し、デュポンヘリウムガンを用いる（Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ  １３：６７７−６８２）。トウモロコシ未成熟胚の単離、カルスイニシエーション、カルス増殖、及び植物の再生のために使用された一般の培地の処方に関しては、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ（１９９４）Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ中、Ｍ．Ｆｒｅｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｖ．Ｗａｌｂｏｔ編纂、スプリンガーフェアラグ、ＮＹ，ｐｐ６６３−６７１を参照。
【０１７３】
［０２０８］  粒子砲撃の１−７日以内に、胚は、３ｍｇ／ｍｌの選択剤ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）を含むＮ６−ベースの培養培地に移動する。胚、及び後のカルスを２週ごとに新鮮な選択プレートに移す。未成熟胚から発生した複数のカルス（ｃａｌｌｉ）を所望の表現型に関してスクリーンする。６−８週後に、形質転換された複数のカルスを回収する。
【０１７４】
［０２０９］  Ｂ．ダイズ形質転換。
【０１７５】
［０２１０］  ダイズ胚懸濁培養液を３５ｍｌの液体培地ＳＢ１９６又はＳＢ１７２の中に２５０ｍｌのエレンマイヤーフラスコにてロータリーシェーカー上で、１５０ｒｐｍにて２６Ｃにおいて冷たい白色蛍光と共に１６：８時間の明／暗の光周期にて３０−３５ｕＥ／ｍ２ｓの光強度に維持する。培養物は、約３５ｍｇの組織を３５ｍｌの新鮮な液体培地に接種することにより、２週ごとに継代する。あるいは、培養物を６−ウエルのコースタープレートにてイニシエートして維持する。
【０１７６】
［０２１１］  ＳＢ１７２培地を以下のとおりに調製する：（リットルあたり）。１ボトルのムラシゲスクーグ培地（Ｄｕｃｈｅｆａ  ＃  Ｍ  ０２４０）、１ｍｌのＢ５ビタミン１０００Ｘストック、１ｍｌの２，４−Ｄストック（ギブコ  １１２１５−０１９）、６０ｇの蔗糖、２ｇのＭＥＳ、０．６６７ｇのＬ−アスパラギン無水物（ギブコＢＲＬ  １１０１３−０２６）、ｐＨ５．７。ＳＢ１９６培地は以下のとおりに調製する：（リットルあたり）１０ｍｌのＭＳ  ＦｅＥＤＴＡ，１０ｍｌのＭＳ硫酸、１０ｍｌのＦＮ−ハロゲン鉱物（Ｌｉｔｅ  Ｈａｌｉｄｅｓ）、１０ｍｌのＦＮ−鉱物Ｐ，Ｂ，Ｍｏ，１ｍｌのＢ５ビタミン１０００Ｘストック、１ｍｌの２，４−Ｄストック（ギブコ  １１２１５−０１９）、２．８３ｇのＫＮＯ３，０．４６３ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４，２ｇのＭＥＳ，１ｇのアスパラギン無水物、粉末（ギブコ１１０１３−０２６）、１０ｇの蔗糖、ｐＨ５．８。２，４−Ｄストック濃度１０ｍｇ／ｍｌは以下のとおりに調製する：２，４−Ｄを０．１ＮのＮａＯＨに溶解し、フィルター滅菌し、そして−２０℃に保存する。Ｂ５ビタミン１０００Ｘストックは以下のとおりに調製する／：（１００ｍｌあたり）−アリコートを−２０℃にて１０ｇのミオ−イノシトール、１００ｍｇのニコチン酸、１００ｍｇのピリドキシンＨＣｌ，１ｇのチアミン。
【０１７７】
［０２１２］  ダイズの懸濁液培養物を、粒子銃砲撃の方法により様々なプラスミドで形質転換する（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０）。砲撃のための組織を調製するため、そのもっとも最近の継代培養以来回収するのに約１から２週を要したほぼ２つのフラスコの懸濁液培養組織を、水分を吸収するのを助けるために底に１枚の滅菌フィルターペーパーを含む６０ｘ２０ｍｍの滅菌ペトリ皿の中に置く。組織（即ち、懸濁クラスター約３−５ｍｍのサイズ）を、各ペトリプレートを等しく横切るように広げる。砲撃の前に、残りの液体をピペットで組織から除去するか、又は過剰な水分を除去するために蒸発を許容する。実験あたり、４−６プレートの組織を砲撃する。各プレートを２つのフラスコから作成する。
【０１７８】
［０２１３］  砲撃のための金粒子を調製するために、３０ｍｇの金をエタノール中で洗浄し、遠心分離し、そして０．５ｍｌの滅菌水に懸濁する。砲撃のために使用される各プラスミドの組み合わせ（処理）のため、別のマイクロ遠心分離チューブを用意し、上記のとおりに調製した金粒子を５０μｌにて開始する。各チューブに、以下も加える；５μｌのプラスミドＤＮＡ（１μｇ／μｌ）、５０μｌのＣａＣｌ２、及び２０μｌの０．１Ｍスペルミジン。この混合物をボルテックスシェーカーで３分間撹拌し、そして次に、マイクロ遠心分離機を１４，０００ＲＰＭにて１０秒間遠心分離する。上清をデカントして付着した沈殿ＤＮＡを伴う金粒子を２回４００μｌアリコートのエタノールで洗浄する（各洗浄の間には、上記のとおり簡単に遠心分離する）。各チューブあたりの１００％遠心分離の最終容量を４０μｌに調節し、そしてこの粒子／ＤＮＡ懸濁液を、砲撃に使用するまで氷上に放置する。
【０１７９】
［０２１４］  粒子／ＤＮＡ懸濁液を適用する直前に、チューブを簡単にソニケーターに浸すことにより、粒子を分散させ、そして次に、５μｌのＤＮＡ沈殿を各フライングディスクにピペットで移して乾燥させる。次に、フライングディスクをデュポンバイオリスティクスＰＤＳ１０００／ＨＥに入れる。ダイズ懸濁液クラスターへの粒子媒介性ＤＮＡデリバリーのためのデュポンバイオリスティクスＰＤＳ１０００／ＨＥ装置を用いて、以下の設定を用いる。膜破壊圧は１１００ｐｓｉである。チャンバーを２７−２８インチ水銀の真空間にする。組織を固定／停止スクリーンから約３．５インチ（底から第３の棚（ｓｈｅｌｆ））に置く。各プレートを２回砲撃して、ショットの間に、滅菌スパチュラを用いて組織クラスターを配置し直す。
【０１８０】
［０２１５］  砲撃後に、組織を液体培養培地に再度懸濁するが、各チューブは新鮮なＳＢ１９６又はＳＢ１７２を含む２つのフラスコの間で分割し、上記のとおりに培養する。砲撃の４から７日後に、培地を、選択因子を含む新鮮な培地と取り替える。選択培地は毎週４週間はリフレッシュして、６週目に再びリフレッシュする。細胞密地と培地の濁度が高いなら、４週後の毎週の取り替えが必要かもしれない。
【０１８１】
［０２１６］  砲撃の４から８週後に、未形質転換の壊死した胚性クラスターから成長した、緑の形質転換された組織が観察されるかもしれない。単離された緑の組織を取り出し、そして液体培地を含む６−ウエルのマイクロタイタープレートに接種することにより、クローンから増殖された形質転換胚性懸濁液クラスターを生じさせる。
【０１８２】
［０２１７］  各胚性クラスターを選択因子と共に５ｍｌの新鮮なＳＢ１９６培地を含むコースター６−ウエルプレートの一つのウエルに入れる。培養物を、２−６週間、２周後地に新鮮な培地に交換しながら維持する。十分な組織が入手できたら、生存する形質転換クローンの一部を、汚染に対する防御のためのバックアップとして第２の６−ウエルプレートに継代する。
【０１８３】
［０２１８］  インビトロの成熟を促進させるために、形質転換された胚性クラスターを液体ＳＢ１９６から取り出して、固形寒天培地ＳＢ１６６に２週間入れる。２−４ｍｍサイズの組織の凝集物を、プレートあたり１０から１５クラスターの組織密度にてプレートする。プレートを拡散する弱い光の中で２６＋／−１℃にてインキュベートする。２週間後に、クラスターをＳＢ１０３培地へ３−４週間継代する。
【０１８４】
［０２１９］  ＳＢ１６６は以下のとおりに調製する：（リットルあたり）、１ｐｋｇ，ＭＳ塩（ギブコ／ＢＲＬ−カタログ番号１１１１７−０１７）、１ｍｌのＢ５ビタミン１０００Ｘストック、６０ｇのマルトース、７５０ｍｇのＭｇＣｌ２−６水和物、５ｇの活性炭、ｐＨ５．７，２ｇのゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）。ＳＢ１０３培地は以下のとおりに調製する：（リットルあたり）、１ｐｋｇ．ＭＳ塩（ギブコ／ＢＲＬ−カタログ番号１１１１７−０１７）、１ｍｌのＢ５ビタミン１０００Ｘストック、６０ｇのマルトース、７５０ｍｇのＭｇＣｌ２−６水和物、ｐＨ５．７，２ｇのゲルライト。５−６週間の成熟後に、胚を、１ｃｍ２部分のＳＢ１０３を有する１００  Ｘ  １５のペトリ皿に入れることにより、死なずに一部乾燥させることを促進するように十分な湿度を伴うチャンバーを創製して、個々の胚を完全に乾燥させる。
【０１８５】
［０２２０］  約２５の胚をプレートあたり完全に乾燥させる。プレートをパラフィルム数層により密封して、再び弱い光の条件下に置く。乾燥工程の期間は経験的に決定するのが最良であり、プレートあたりに置かれた胚のサイズと量に依存する。例えば、小さな胚又は僅かな胚／プレートは短い乾燥時間を要求し、大きな胚又は多数の胚／プレートは長い乾燥時間を必要とする。約３日後に胚をチェックするのが最良であるが、正確な乾燥は５から７日かかる。胚はこのプロセスの間にサイズが低下する。
【０１８６】
［０２２１］  乾燥した胚をＳＢ７１−１又はＭＳＯ培地に植えるが、それらは懸濁液培養に関して記載されたのと同じ条件下で発芽するように放置する。苗木が２つの完全に成長した三つ葉を有する場合、発芽して根が生えた胚を滅菌土壌に移して、ＭＳ肥料により給水する。種子を回収して分析するために、植物を成熟するまで発育させる。健康で繁殖力のあるトランスジェニック植物をグリーンハウス内で育てる。
【０１８７】
［０２２２］  ＳＢ７１−１を以下のとおりに調製する：１ボトルのＧａｍｂｏｒｇ’ｓ  Ｂ５塩  ｗ／蔗糖（ギブコ／ＢＲＬ−カタログ番号２１１５３−０３６）、１０ｇの蔗糖、７５０ｍｇのＭｇＣｌ２−６水和物、ｐＨ５．７，２ｇのゲルライト。ＭＳＯ培地は以下の通りに調製する：１ｐｋｇ  ムラシゲスクーグ塩（ギブコ１１１１７−０６６），１ｍｌのＢ５ビタミン  １０００Ｘストック、３０ｇの蔗糖、ｐＨ５．８，２ｇのゲルライト。
【０１８８】
実施例１１
［０２２３］  この実施例は、実施例９に記載された方法を用いた、トウモロコシ、ダイズ、及び／又はアラビドプシスに見いだされる様々な遺伝子に向けられたｍｉＲＮＡ標的及びヘアピンのデザイン及び合成を記載する。
【０１８９】
［０２２４］  Ａ．アラビドプシスＡＧＡＭＯＵＳ，Ａｔ４ｇ１８９６０標的化する。
【０１９０】
［０２２５］  配列番号：４のｍｉＲＮＡ配列を選択してデザインする。当該配列を、配列番号：１２−１５の合成オリゴヌクレオチドをアニールして、それらを配列番号：４４のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボーン断片にライゲーションすることにより、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩヘアピンカセットに入れる。
【０１９１】
［０２２６］  アラビドプシスサリアナＣｏｌ−０を実施例１のとおりに形質転換して生育させる。配列番号：４のｍｉＲＮＡを含むベクターにより形質転換した後に、８８％の形質転換体は変異体ＡＧＡＭＯＵＳ（ａｇ）花表現型を呈し、渦巻き３の中の雄蘂の花弁への転化、及び渦巻き４の中の心皮の別なａｇ花への転化により特徴付けられる（Ｂｏｗｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：７４９−７５８）。変異体の表現型は形質転換体の間で変動し、約１／３が強いａｇ表現型を呈し、１／３が中間のａｇ表現型を呈し、そして１／３が弱いａｇ表現型を呈する。形質転換体から単離された小ＲＮＡｓのゲル電気泳動及びノーザンブロット分析は、変異体ａｇ表現型の程度が直接に抗ＡＧ  ｍｉＲＮＡのレベルに関連することを証明し、もっとも強い表現型はプロセシングを受けたｍｉＲＮＡの最大の蓄積を有する（約２１ｎｔ）。
【０１９２】
［０２２７］  Ｂ．アラビドプシスＡｐｅｔｅｌａ３（ＡＰ３）、Ａｔ３ｇ５４３４０を標的化する。
【０１９３】
［０２２８］  ＡＰ３からの２つのｍｉＲＮＡ標的を選択してオリゴヌクレオチドをデザインする。
【０１９４】
［０２２９］  配列番号：５のｍｉＲＮＡ配列を選択してデザインする。当該配列は、配列番号：１６−１９の合成オリゴヌクレオチドをアニールして、それらを配列番号：４４のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボーン断片にライゲーションすることにより、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩヘアピンカセットに入れる。
【０１９５】
［０２３０］  配列番号：６のｍｉＲＮＡ配列を選択してデザインする。当該配列は、配列番号：２０−２３の合成オリゴヌクレオチドをアニールして、それらを配列番号：４４のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボーン断片にライゲーションすることにより、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩヘアピンカセットに入れる。
【０１９６】
［０２３１］  アラビドプシスサリアナＣｏｌ−０を実施例１のとおりに形質転換して生育させる。配列番号：５のｍｉＲＮＡを含むベクターによる形質転換の後に、形質転換体は新規の葉及び花の表現型を有するが、如何なる変異体ＡＰ３表現型も呈さない。形質転換体からの２週齢の古いロゼット葉組織から単離されたＲＮＡのゲル電気泳動及びノーザン分析は、プロセシングを受けたｍｉＲＮＡ（約２１ｎｔ）のもっとも高い蓄積が、新規の葉及び花の表現型を生じるために別の標的配列を明らかに沈黙化させる、前駆体の「バックサイド」鎖に対応することを示す。
【０１９７】
［０２３２］  新規な標的配列が選択され、ｍｉＲＮＡ標的鎖がＲＩＳＣへの取り込みの間に選択されるための正確な対称性を伴う（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８）。配列番号：６のｍｉＲＮＡ配列を選択してデザインする。当該配列をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩヘアピンカセットに入れるが、配列番号：２０−２３の合成オリゴヌクレオチドをアニールして、配列番号：４４のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボーン断片にそれらを連結することによる。花の表現型及び電気泳動の分析により示されるとおり、９０％を超える形質転換体がＡＰ３遺伝子に関してサイレンシングを示す。約２１ｎｔのｍｉＲＮＡ（抗ＡＰ３ｂ）がトランスジェニック植物中で高レベルにて検出され、野生型対照植物においてはされない。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＡＰ３転写物の量が野生型対照植物に比較して形質転換体において減少したことを証明した。
【０１９８】
［０２３３］  Ｃ．トウモロコシフィトエンデサチュラーゼの標的化
【０１９９】
［０２３４］  フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）由来の２つのｍｉＲＮＡ標的を選択してオリゴヌクレオチドをデザインする。
【０２００】
［０２３５］  配列番号：７のｍｉＲＮＡ配列を選択してデザインする。当該配列をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩヘアピンカセットに入れるが、配列番号：２４−２７の合成オリゴヌクレオチドをアニールして、配列番号：４４のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボーン断片にそれらを連結することによる。
【０２０１】
［０２３６］  配列番号：８のｍｉＲＮＡ配列を選択してデザインする。当該配列をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩヘアピンカセットに入れるが、配列番号：２８−３１の合成オリゴヌクレオチドをアニールして配列番号：４４のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボーン断片にそれらを連結することによる。
【０２０２】
［０２３７］  Ｄ．トウモロコシフィチン酸生合成酵素の標的化
【０２０３】
［０２３８］  ３つのトウモロコシフィチン酸生合成酵素遺伝子標的を選択してｍｉＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドをデザインする。イノシトール３リン酸キナーゼ−２ポリヌクレオチドは、ＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ  ０２／０５９３２４に開示されており、引用により本明細書に編入される。イノシトール１，３，４−３リン酸５／６キナーゼポリヌクレオチドは、ＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ  ０３／０２７２４３に開示されており、引用により本明細書に編入される。ミオ−イノシトール１−リン酸シンターゼポリヌクレオチドは、ＰＣＴ国際公開出願番号ＷＯ  ９９／０５２９８に開示されており、引用により本明細書に編入される。
【０２０４】
［０２３９］  イノシトールポリヌクレオチドキナーゼ−２（ＩＰＰＫ２）
【０２０５】
［０２４０］  配列番号：９のｍｉＲＮＡ配列を選択してデザインする。当該配列をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩヘアピンカセットに入れるが、配列番号：３２−３５の合成オリゴヌクレオチドをアニールして、配列番号：４４のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボーン断片にそれらを連結することによる。
【０２０６】
［０２４１］  イノシトール１，３，４−３リン酸５／６キナーゼ−５（ＩＴＰＫ５）
【０２０７】
［０２４２］  配列番号：１０のｍｉＲＮＡ配列を選択してデザインする。当該配列をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩヘアピンカセットに入れるが、配列番号：３６−３９の合成オリゴヌクレオチドをアニールして、配列番号：４４のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボーン断片にそれらを連結することによる。
【０２０８】
［０２４３］  ミオ−イノシトール１−リン酸シンターゼ（ｍｉｌｐｓ）
【０２０９】
［０２４４］  配列番号：１１のｍｉＲＮＡ配列を選択してデザインする。当該配列をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩヘアピンカセットに入れるが、配列番号：４０−４３の合成オリゴヌクレオチドをアニールして、配列番号：４４のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボーン断片にそれらを連結することによる。
【０２１０】
［０２４５］  Ｅ．ダイズＡｐｅｔｅｌａ２−様配列（ＡＰ２）の標的化
【０２１１】
［０２４６］  アラビドプシスの形質転換に用いられた、配列番号：１を含む、同じＥＡＴ（ｍｉＲ１７２ａ−２）構築物を用いてダイズを形質転換する。この構築物は、配列番号：４８のｍｉＲＮＡをコードするｍｉＲＮＡ鋳型配列を有する。当該構築物は、アラビドプシスからのｍｉＲ１７２ａ−２前駆体配列のＰＣＲ増幅、制限消化、及びライゲーションを用いて実施例２に記載されたとおりに創製される。
【０２１２】
［０２４７］  本質的には実施例１０に記載されたとおりに、ダイズ組織を形質転換して生育させる。萼から葉への転化により特性決定されたところによれば、形質転換後、４２％の形質転換体が変異体の表現型を呈する。もっとも強い表現型を呈する植物は不稔性であり、種子を生産しない。器官のホメオティックな転化と稔性に対する効果の両方が、アラビドプシスにおけるａｐ２変異体対立遺伝子に関して観察されたのと類似する。ｍｉＲ１７２ａ−２に対するオリゴヌクレオチドプローブアンチセンスにより釣り上げられた、小ＲＮＡゲル電気泳動及びノーザン分析は、トランスジェニック系列におけるｍｉＲ１７２の蓄積を示す。少量の内生ダイズｍｉＲ１７２は、ダイズ対照系列においても検出される。変異体表現型の程度はｍｉＲＮＡのレベルに直接関連し、もっとも強い表現型はプロセシングされたｍｉＲＮＡ（約２１ｎｔ）のもっとも高い蓄積を示す。
【０２１３】
［０２４８］  Ｆ．アラビドプシスＡＰ２−様遺伝子の標的化
【０２１４】
［０２４９］  配列番号：７２のｍｉＲＮＡ配列を選択してデザインする。当該配列をａｔｔＢヘアピンカセットに入れるが、配列番号：７３−７４の合成オリゴヌクレオチドをアニールして、ＢＰ組換え反応（ＧＡＴＥＷＡＹ）を実施することによりａｔｔＬ中間体を生成することによる。この中間体をＬＲ反応において用いることにより、ａｔｔＲ部位を含み、ヘアピンの代わりに負の選択マーカーを含むＥＡＴ−完全長前駆体を含む、実施例１２に一般化して記載された目的のベクターと組換える。この反応の生成物は、ａｔｔＲ部位を隣接したｍｉＲ１７２ａ−２前駆体ヘアピンカセットを含む（即ち、ヘアピンがマーカーカセットを置き換える）。
【０２１５】
［０２５０］  Ｇ．アラビドプシス脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ２）の標的化
【０２１６】
［０２５１］  配列番号：７５のｍｉＲＮＡ配列をＮＭ＿１１２０４７（Ａｔ３ｇ１２１２０）の配列に基づいて選択してデザインする。当該配列をａｔｔＢヘアピンカセットに入れるが、配列番号：７６−７７の合成オリゴヌクレオチドをアニールして、ＢＰ組換え反応（ＧＡＴＥＷＡＹ）を実施することによりａｔｔＬ中間体を生成することによる。この中間体をＬＲ反応において用いることにより、ａｔｔＲ部位を含み、ヘアピンの代わりに負の選択マーカーを含むＥＡＴ−完全長前駆体を含む、実施例１２に一般化して記載された目的のベクターと組換える。この反応の生成物は、ａｔｔＲ部位を隣接したＦＡＤ２のｍｉＲＮＡ前駆体ヘアピンカセットを含む（即ち、ヘアピンがマーカーカセットを置き換える）。抗−ＦＡＤ２のｍｉＲＮＡの効果は、脂肪酸プロフィールにおける変化を測定するための脂肪酸分析において決定することができ、例えば、引用により本明細書に編入される、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１３：３４７−３５６を参照されたい。
【０２１７】
［０２５２］  Ｈ．アラビドプシスフィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）の標的化
【０２１８】
［０２５３］  配列番号：７８のｍｉＲＮＡ配列をＮＭ＿２０２８１６（Ａｔ４ｇ１４２１０）の配列に基づいて選択してデザインする。当該配列をａｔｔＢヘアピンカセットに入れるが、配列番号：７９−８０の合成オリゴヌクレオチドをアニールして、ＢＰ組換え反応（ＧＡＴＥＷＡＹ）を実施することによりａｔｔＬ中間体を生成することによる。この中間体をＬＲ反応において用いることにより、ａｔｔＲ部位を含み、ヘアピンの代わりに負の選択マーカーを含むＥＡＴ−完全長前駆体を含む、実施例１２に一般化して記載された目的のベクターと組換える。この反応の生成物は、ａｔｔＲ部位を隣接したＰＤＳのｍｉＲＮＡ前駆体ヘアピンカセットを含む（即ち、ヘアピンがマーカーカセットを置き換える）。抗ＰＤＳ構築物を含むトランスジェニック植物は、系列の約９０％より多くにおいて発芽に際して光漂白される（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｅｄ）ことから、ＰＤＳのサイレンシングが示唆される。
【０２１９】
実施例１２
［０２５４］  この実施例は、組換えクローニング技術を用いた発現ベクターの構築を記載する。
【０２２０】
［０２５５］  実施例２に記載されたベクターの配列（配列番号：４４）を修飾して、ａｔｔ組換え部位を組み込むことにより、ＧＡＴＥＷＡＹ技術（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）を用いた組換えクローニングを促進させる。ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩセグメントを、以下の順で含む配列：ａｔｔＲ１−ＣＡＭ−ｃｃｄＢ−ａｔｔＲ２で置き換える。ｍｉＲＮＡヘアピン前駆体構築物を隣接したａｔｔＢ部位を含むオリゴによる組換え（ＢＰ＋ＬＲ）に際して、選択可能なマーカーをｍｉＲＮＡヘアピン前駆体で置き換える。
【０２２１】
実施例１３
［０２５６］  この実施例、特に表５は、実施例で記載されたｍｉＲＮＡサイレンシングに用いられた標的配列及びオリゴを要約する。
【０２２２】
【表５】
2008522585.tif 000007
【０２２３】
実施例１４
［０２５７］  この実施例は、トウモロコシのｍｉＲ１７２前駆体の同定と単離を記載する。
【０２２４】
［０２５８］  ナショナルキャンサーフォーバイオテクノロジーインフォメーション（ＮＣＢＩ）のゲノムサーベイシークエンス（ＧＳＳ）データベースを、２１ｎｔのｍｉＲ１７２ａ−２配列を用いて検索することにより、ｍｉＲ１７２前駆体配列を含むゲノミックトウモロコシ配列を同定する。いくつかのトウモロコシｍｉＲ１７２前駆体を同定し、そしてｍｉＲ１７２ｅ（配列番号：８１−８５）と命名し、表６に要約される。各配列をベクターＮＴＩ（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）に引き入れ、コンティグの分析を行った。当該分析は、４つの異なる座を同定したが、各々が唯一のコンセンサス配列を有した。各座からのｍｉＲＮＡ配列を取り囲む約２００ヌクレオチドの領域を、ＲＮＡ構造ソフトウエアを用いて二次構造フォールディングに関して試験する（引用により本明細書に編入されるＭａｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：７２８７−７２９２）。この分析の結果は、トウモロコシの配列ｍｉＲ１７２ａ−ｅの各々のヘアピン前駆体を明らかにする。
【０２２５】
【表６】
2008522585.tif 000008
【０２２６】
［０２５９］  Ｂ７３ゲノミックトウモロコシライブラリーからのｍｉＲ１７２ａ又はｍｉＲ１７２ｂを増幅するためにオリゴヌクレオチドをデザインし、これらのプライマーはクローニングを促進させるために制限酵素認識部位も追加する（ＢａｍＨＩ又はＥｃｏＲＶ）。あるいは、組換えクローニングのためにａｔｔ部位を創製するためにデザインされたＰＣＲプライマーを使用することができる。ＰＣＲ増幅の後に、生成物を単離し、精製し、そして配列分析により確認する。確認したら、これらの配列を、トウモロコシのユビキチン（ＵＢＩ）プロモーターを含む構築物に挿入する。この構築物をさらなる形質転換ベクター構築物のために使用することができ、例えば、ａｔｔ部位の添加により、ＧＡＴＥＷＡＹシステムを使用することができる。
【０２２７】
［０２６０］  以下のＰＣＲプライマーを用いて、トウモロコシｍｉＲ１７２ａのヘアピン前駆体を含む配列を増幅する
フォワードプライマー（配列番号：８７）：５’  ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＣＡＣＴＡＧＴＧＧＧＧＴＴＡＴＴ  ３’
リバースプライマー（配列番号：８８）： ５’ＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴＴ  ３’
【０２２８】
［０２６１］  以下のＰＣＲプライマーを用いて、トウモロコシｍｉＲ１７２ｂのヘアピン前駆体を含む配列を増幅する
フォワードプライマー（配列番号：８９）：５’  ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＧ  ３’
リバースプライマー（配列番号：９０）：５’  ＧＡＴＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＴ  ３’
【０２２９】
実施例１５
［０２６２］  この実施例は、トウモロコシのｍｉＲ１７２ｂのｍｉＲＮＡ前駆体を用いる使用のための、トウモロコシに見いだされる様々な遺伝子標的物に向けられたｍｉＲＮＡ標的物及びヘアピンのデザインと合成を記載する。
【０２３０】
［０２６３］  Ａ．トウモロコシにおけるｍｉＲ１７２ｂ標的物
【０２３１】
［０２６４］  アラビドプシスのＥＡＴの実施例と同様に、トウモロコシのｍｉＲ１７２ｂヘアピン前駆体をトウモロコシにおける過剰発現に関して試験する。ｍｉＲＮＡ鋳型を含む前駆体配列は、配列番号：９１に示される。当該ｍｉＲＮＡは配列番号：９２に示され、ｍｉＲＮＡ二重鎖のバックサイドは配列番号：９３に示される。当該ｍｉＲＮＡ前駆体及びＢａｍＨＩとＫｐｎＩのための制限酵素突出を含む二重鎖ＤＮＡ分子を、配列番：９７及び９８のオリゴヌクレオチドをアニールすることにより創製する。
【０２３２】
［０２６５］  Ｂ．フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）
【０２３３】
［０２６６］  ｍｉＲＮＡ鋳型を含むオリゴヌクレオチドは配列番号：９４に示される。ＰＤＳに向けられたｍｉＲＮＡは配列番号：９２に示され、ｍｉＲＮＡ二重鎖のバックサイドは配列番号：９３に示される。当該ｍｉＲＮＡ前駆体及びＢａｍＨＩとＫｐｎＩのための制限酵素突出を含む二重鎖ＤＮＡ分子を、配列番：９９及び１００のオリゴヌクレオチドをアニールすることにより創製する。
【０２３４】
［０２６７］  この実施例のオリゴヌクレオチドを、制限消化及びライゲーション、及び／又は組換えクローニング、例えばＧＡＴＥＷＡＹを含む標準クローニング技術を用いて、トウモロコシの形質転換のためにベクターに挿入することができる。
【０２３５】
実施例１６
［０２６８］  この実施例は、実施例１７−１９に使用された材料と方法を記載する。
【０２３６】
［０２６９］  プラスミド構築物
【０２３７】
［０２７０］  アラビドプシスのｍｉＲ１５９ａの全配列を含む２７６塩基対の断片（以下参照）をＰＣＲ増幅法によりプライマーＣＡＣＣ−ｍｉＲ１５９ａ−ｐｒｅｃ：配列5’ ＣＡＣＣＡＣＡＧＴＴＴＧＣＴＴＡＴＧＴＣＧＧＡＴＣＣ  ３’（配列番号：１０１）及びｍｉＲ１５９ａ−Ｘｍａ：配列
【０２３８】
【化１】
2008522585.tif 000009
を用いてクローン化した。ｍｉＲ１５９ａ−Ｘｍａは、成熟ｍｉＲ１５９ａの２１ヌクレオチドのうちの１８（太字）及び導入されたＸｍａＩ部位（イタリック）を含む。当該ＰＣＲ断片を、ｐＥＮＴＲ−ｍｉＲ１５９ａ−ｐｒｅｃを得るための製造者の指示書に従い、ｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローン化した。
【０２３９】
［０２７１］  Ｇａｔｅｗａｙ組換えシステムを用いて、ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａ配列を植物用二元ベクターｐＫ２ＧＷ７に移したが、当該ベクターはｐＫ２−ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａを生成するために３５Ｓプロモーターを２コピーとＮＯＳターミネーターを含む。
【０２４０】
［０２７２］  ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａの変異導入はＰＣＲにより以下のオリゴヌクレオチドを用いて実施した。
【０２４１】
［０２７３］  ５’−ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ：
【０２４２】
【化２】
2008522585.tif 000010
【０２４３】
［０２７４］  ３’−ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ：
【０２４４】
【化３】
2008522585.tif 000011
【０２４５】
［０２７５］  上記のプライマーとｐＥＮＴＲ−ｍｉＲ１５９ａ−ｐｒｅｃ  ＤＮＡを鋳型として用いたｍｉＲ１５９ａ前駆体のＰＣＲ増幅は、ＭｇｌＩＩ及びＸｍａＩにより消化されて再びｐＥＮＴＲ−ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａに挿入されたＤＮＡ断片を生じ、ｐＥＮＴＲ−ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａを生じた。Ｇａｔｅｗａｙシステムの手法を再び用いて、ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ前駆体をｐＫ２ＧＷ７に移して、ｐＫ２−ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａを生じさせた。
【０２４６】
［０２７６］  ｍｉＲ−ＰＤＳ１６９ｇを以下のとおりクローン化した。ｍｉＲ１６９ｇ配列を含む２２２塩基対のアラビドプシスゲノミック断片（以下参照）を、プライマーｍｉＲ１６９ｇ−Ｆ  ５’ＣＡＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＴＣ  ３’（配列番号：１０５）及びｍｉＲ−Ｒｅｖ  ５’ＣＡＡＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＣＧＡＴＴＣＡＴＧＡ  ３’（配列番号：１０６）を用いて増幅した。結果のＰＣＲ断片をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）に挿入することにより、ｐＥＮＴＲ−ｐｒｅ−ｍｉＲ１６９ｇを生成した。ｐｒｅ−ｍｉＲ１６９ｇ配列を次に二元ベクターｐＢＡＤＣ及びｐＢ２ＧＷ７にガラクトシダーゼシステムを用いて移すことにより、ｐＢＡ−ｐｒｅ−ｍｉＲ１６９ｇ及びｐＢ２−ｐｒｅ−ｍｉＲ１６９ｇを生じさせた。
【０２４７】
［０２７７］  ２つのｍｉＲ−ＰＤＳ１６９ｇ前駆体を、ｐＥＮＴＲ−ｐｒｅ−ｍｉＲ１６９ｇを鋳型として及びストラタジーンからのクイックチェンジミュータジェネシスキットを用いて創製した。ｐＥＮＴＲ−ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳａ１６９ｇを以下のオリゴヌクレオチドを用いて作成した：
【０２４８】
［０２７８］  ｍｉＲ１６９ＰＤＳａ：５’  ＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＴＴＧＡＧＴＴＴＡＧＴＣＴＧＡＣＴＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＡ  ＣＣＡＡＴＧ  ３’  配列番号：１０７），及び
【０２４９】
［０２７９］  ｍｉＲ１６９  ＰＤＳａ＊：５’  ＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＣＴＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣ  ＴＴＣＴＣ  ３’  （配列番号：１０８）。
【０２５０】
［０２８０］  ｐＥＮＴＲ−ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳｂ１６９ｇを生成するのに用いたオリゴヌクレオチドは：
【０２５１】
［０２８１］  ｍｉＲ１６９ＰＤＳｂ：５’  ＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＴＴＧＡＴＣＴＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＡＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡ  ＣＣＡＡＴＧ  ３’（配列番号：１０９）、及び
【０２５２】
［０２８２］  ｍｉＲ１６９ＰＤＳｂ＊：５’  ＧＡＴＴＣＴＧＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＴ  ＣＴＣＴＴＣ  ３’（配列番号：１１０）。  
【０２５３】
［０２８３］  上記の２つの変異導入されたｍｉＲ−ＰＤＳ１６９ｇ前駆体を次に植物二元ベクターｐＢＡＤＣ及びｐＢ２ＧＷ７に移すことにより、ｐＢＡ−ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳａ１６９ｇ，ｐＢ２−ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳａ１６９ｇ；ｐＢＡ−ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳｂ１６９ｇ及びｐＢ２−ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳｂ１６９ｇを生じさせた。
【０２５４】
［０２８４］  ニコチアナベンサミアナｒｂｃＳ転写物を標的とする人工のｍｉＲＮＡｓの前駆体（ｐＥＮＴＲ−ｐｒｅ−ｍｉＲ−ｒｂｃＳ１５９ａ−Ａ）を、ｐＥＮＴＲ−ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａに関して記載されたのと類似の手法を用いて、以下のプライマーを使用して生成し、そしてｐＫ２ＧＷ７にクローン化した：
【０２５５】
［０２８５］  ＭｒｂｃＳＡ−Ｓ：５’  ＴＣＴＧＡＣＧＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣＧＣＣＣＧＡＣＡＴＴＣＧＡＡＡＡＴＧＡＧＴＴ  ＧＡ  ３’（配列番号：１１１）、及び
【０２５６】
［０２８６］  ＭｒｂｃＳＡ−Ｒ：５’  ＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＧＴＴＣＣＴＣＧＣＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＡＧＡＧＡＧＴＡＡ  ＡＡＧ  ３’（配列番号：１１２）。
【０２５７】
［０２８７］  全てのクローン化された配列はＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２５８】
［０２８８］  用いられた前駆体配列
【０２５９】
［０２８９］  ｍｉＲ１５９ａ前駆体鋳型配列（２７６ｂｐ）
【０２６０】
【化４】
2008522585.tif 000012
（クローン化されたｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａの配列。ｍｉＲ１５９ａ＊とｍｉＲ１５９ａ（イタリック）の配列を太字で示す。ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａにおいて変化したヌクレオチドに下線を引く。）
【０２６１】
［０２９０］  ｍｉＲ−１５９ａ成熟鋳型
５’ＴＴＴＧＧＡＴＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＴＡ  ３’（配列番号：１１４）
【０２６２】
［０２９１］  ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ成熟鋳型
５’ＴＴＴＧＧＡａａｔＡｔＧＧＧＡｔＣＴＣＴｔ  ３’（配列番号：１１５）
【０２６３】
［０２９２］  ｍｉＲ１６９ｇ前駆体鋳型配列０．３ｋｂ（２２２ｂｐ）
【０２６４】
【化５】
2008522585.tif 000013
（クローン化されたｐｒｅ−ｍｉＲ１６９ｇ断片の配列（０．３ｋｂ）。ｍｉＲ１６９ｇ（イタリック）とｍｉＲ１６９ｇ＊の配列を太字で示す。ｍｉＲ−ＰＤＳ１６９ｇにおいて変化したヌクレオチドに下線を引く。）
【０２６５】
［０２９３］  ｍｉＲ１６９ｇ成熟鋳型
５’ＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧ  ３’（配列番号：１１７）
【０２６６】
［０２９４］  ｍｉＲ−ＰＤＳａ１６９ｇ成熟鋳型
５’ＧＡＧｔｔｔＡＧｔｃＴＧＡＣＴＴＧｇＣｃａ  ３’（配列番号：１１８）
【０２６７】
［０２９５］  ｍｉＲ１６９ｇ成熟鋳型
５’ＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧ  ３’（配列番号：１１９）
【０２６８】
［０２９６］  ｍｉＲ−ＰＤＳｂ１６９ｇ成熟鋳型
５’ＧＡｔＣｔｃｔｔｔｃｃａｇｔｃＴｔＣａＧＧ  ３’（配列番号：１２０）
【０２６９】
［０２９７］  ｍｉＲ１６９ｇ前駆体鋳型配列２．０ｋｂ（２４７４ｂｐ）
【０２７０】
【化６】
2008522585.tif 000014
（クローン化されたｐｒｅ−ｍｉＲ１６９ｇ断片の配列（２．０ｋｂ）。ｍｉＲ１６９ｇ（イタリック）とｍｉＲ１６９ｇ＊の配列を太字で示す。）
【０２７１】
［０２９８］  用いられた標的遺伝子配列：
【０２７２】
［０２９９］  ニコチアナベンサミアナＰＤＳ配列：
【０２７３】
［０３００］  ５’エンドプローブ配列（Ｌｅ−ＰＤＳの１−２６８位に対応、図１５Ａ参照）：
ＡＴＧＣＣＴＣＡＡＡＴＴＧＧＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＡＣＴＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧＧＴＡＧＴＴＣＡＧＣＴＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＴＧＴＴＴＴＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＡＡＴＣＡＡＴＧＧＧＴＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＡＴＧＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＡＧ  （配列番号：１２２）
【０２７４】
［０３０１］  部分的な５’ＲＡＣＥ断片。部分的なニコチアナベンサミアナＰＤＳ配列（ジェンバンクＡＪ５７１７００）からの集合した配列と５’ＲＡＣＥ実験（Ｌｅ−ＰＤＳの８５８−１５１４位に対応、図１５Ａ参照）。
【０２７５】
【化７】
2008522585.tif 000015
（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｙ  ｍｉＲ−ＰＤＳａ１６９ｇ  により標的とされる配列（太字）、ｍｉＲ−ＰＤＳｂ１６９ｇ（太字及びイタリック）及びｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ（下線）を示す。）
【０２７６】
［０３０２］  ニコチアナベンサミアナｒｂｃＳ配列（６つ全てのｒｂｃＳ遺伝子配列中の太字の配列はｍｉＲ−ｒｂｃＳ１５９ａ−Ａにより標的とされる配列に相当する。）：
【０２７７】
［０３０３］  ｒｂｃＳ１（ジェンバンク受け入れ番号：ＣＮ７４８９０４：５６−６３３ｂｐ，ＣＮ７４８０６９：４１９−エンド）
【０２７８】
【化８】
2008522585.tif 000016
【０２７９】
［０３０４］  ｒｂｃＳ２（ジェンバンク受け入れ番号：ＣＮ７４８４９５：３−５５２ｂｐ，ＣＮ７４８９４５：３６４−５７５ｂ）
【０２８０】
【化９】
2008522585.tif 000017
【０２８１】
［０３０５］  ｒｂｃＳ３（ジェンバンク受け入れ番号：ＣＮ７４６３７４：２２−１０８ｂ，ＣＮ７４８７５７：１５６−１７５  ｂ，ＣＮ７４８９２９：１５８−３０９  ｂ，ＣＮ７４８９１３：３１９−４８９  ｂ，ＣＮ７４８７７７：４８５−６０３  ｂ，ＣＮ７４８１８８：４５３−５２９  ｂ）
【０２８２】
【化１０】
2008522585.tif 000018
【０２８３】
［０３０６］  ｒｂｃＳ４（ジェンバンク受け入れ番号：ＣＮ７４８９０６：９−６０７ｂ，ＣＮ７４７２５７：６２９−７０９ｂ）
【０２８４】
【化１１】
2008522585.tif 000019
【０２８５】
［０３０７］  ｒｂｃＳ５（ジェンバンク受け入れ番号：ＣＮ７４４７１２：１６−７１３  ｂ）
【０２８６】
【化１２】
2008522585.tif 000020
【０２８７】
［０３０８］  ｒｂｃＳ６（ジェンバンク受け入れ番号：ＣＮ７４５０３０：１４−１２３  ｂ，ＣＮ７４８０７７：１−５２３）
【０２８８】
【化１３】
2008522585.tif 000021
【０２８９】
［０３０９］  ニコチアナベンサミアナのアグロバクテリウムチュメファシエンスによる浸潤
【０２９０】
［０３１０］  適切なプラスミドを含むアグロバクテリウムチュメファシエンスの浸潤を以下のとおりに実施した。細胞を適切な抗生物質及び４０μＭアセトシリンゴン存在下で対数期まで生育させた。それらを遠心分離により回収して、１５０μＭアセトシリンゴンを含む１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に懸濁して、そして撹拌せずに室温において２時間インキュベートした。浸潤は、葉の背軸側に適用された針なしのシリンジを用いることにより実施した。１、２、又は３日後に葉の組織を回収し、凍結し、そしてＲＮＡ抽出前に液体窒素中ですりつぶした。
【０２９１】
［０３１１］  ノーザンブロットハイブリダイゼーション
【０２９２】
［０３１２］  ニコチアナベンサミアナの葉を用いてＴｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を使用して全ＲＮＡを抽出した。１０−２０μｇの全ＲＮＡを、１５％ポリアクリルアミド／１ｘＴＢＥ（８．９ｍＭ  Ｔｒｉｓ，８．９ｍＭホウ酸、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）／８Ｍ尿素ゲルにて解析して、ハイボンドＮ＋膜（アマシャム）にブロットした。ｍｉＲＮＡｓに対して正確に逆相補性配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを３２Ｐ−γ−ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランド）により末端標識して、高比活性プローブを生じさせた。ハイブリダイゼーションをＵＬＴＲＡＨｙｂ−Ｏｌｉｇｏ溶液を用いて、製造者の指示書（アンビオン、ＴＸ）に従い実施し、そしてシグナルをオートラジオグラフにより検出した。各場合において、プローブは、検出されると予測されるｍｉＲＮＡの正確なアンチセンス配列を含んだ。
【０２９３】
［０３１３］  ＰＤＳ  ｍｉＲＮＡ富裕性を検出するためのノーザンブロット分析を標準手法に従い実施した。５’エンドプローブは、トマトのＰＤＳ遺伝子配列の１−２６８位（ジェンバンクＸ５９９４８，上記参照）に均等な以前に報告された（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ３４：３８３−３９２）ニコチアナベンサミアナのＰＤＳ遺伝子の断片に相当した。
【０２９４】
［０３１４］  ５’ＲＡＣＥ
【０２９５】
［０３１５］  ｍｉＲＮＡにより指示された分割の生成物を同定するために、ファーストチョイスＲＬＭ−ＲＡＣＥキット（アンビオン）を５’ＲＡＣＥ実験において用いたが、但し、ＲＮＡサンプルのさらなるプロセシングなしに、全ＲＮＡ（２μｇ）をＲＮＡアダプターへの直接ライゲーションに使用した。次の工程は製造者の指示書に従った。ＰＤＳ分割断片のネステッドＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチド配列は：
３’Ｎｂ−ＰＤＳ１ ５’  ＣＣＡＣＴＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣ  ３’（配列番号：１３０）
３’Ｎｂ−ＰＤＳ２ ５’  ＡＣＡＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＡＴＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＧＣ  ３’（配列番号：１３１）
３’Ｎｂ−ＰＤＳ３ ５’  ＧＡＴＣＴＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＣＡＣ  ３’（配列番号：１３２）
であった。全部で３つのプライマーをトマトＰＤＳ遺伝子に関する利用可能な配列情報に基づいてデザインしたが、ニコチアナベンサミアナＰＤＳ遺伝子配列の全体はまだ公表されていないからである。
【０２９６】
［０３１６］  ５’ＲＡＣＥ実験から得られたＰＣＲ断片をｐＣＲ４ベンサミアナ（インビトロジェン）にクローン化して、個々のクローンのＤＮＡ配列決定により分析した。
【０２９７】
［０３１７］  ＲＴ−ＰＣＲ
【０２９８】
［０３１８］  第１鎖ｃＤＮＡを５μｇの全ＲＮＡからオリゴ−ｄＴプライマー（シグマ）及びＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄビーズ（アマシャムバイオサイエンセズ）を用いて合成した。第１鎖ｃＤＮＡの量はＰＣＲによりＥＦ１αに関して標準化した（Ｎｉｓｈｉｈａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １０９：８７−９９）。ｒｂｃＳのｃＤＮＡｓのＤＮＡ断片を増幅するために、以下のプライマーを用いた。
ＮＢｒｂｃｓ５：１／２−Ｆ：  ５’  ＴＴＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＧ  ３’  （配列番号：１３３）
ｒｂｃＳ３−Ｆ：  ５’  ＣＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣ  ３’  （配列番号：１３４）
ｒｂｃＳ４／６−Ｆ：  ５’  ＴＣＣＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＣＣ  ３’  （配列番号：１３５）
ＮＢｒｂｃＳ５−Ｆ：  ５’  ＴＧＴＧＡＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣ  ３’  （配列番号：１３６）
ＮＢｒｂｃｓ１  ｒｅｖ２：  ５’  ＡＡＣＴＣＡＧＴＡＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＴＴＧＧ  ３’  （配列番号：１３７）
ＮＢｒｂｃｓ２  ｒｅｖ２：  ５’  ＡＡＴＡＴＧＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＧＣＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＧＴ  ３’  （配列番号：１３８）
ＮＢｒｂｃｓ３／４／５  ｒｅｖ１：  ５’  ＧＴＴＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＧＡ  ３’  （配列番号：１３９）
ＮＢｒｂｃｓ６  ｒｅｖ１：  ５’  ＡＡＡＣＡＡＡＣＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＴＡＣＡＴＡＧＧＧ  ３’  （配列番号：１４０）
【０２９９】
実施例１７
［０３１９］  この実施例は、ニコチアナベンサミアナのフィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）のｍＲＮＡｓを分割するための人工マイクロＲＮＡのデザインを記載する。
【０３００】
［０３２０］  これまでに同定されたアラビドプシスのｍｉＲＮＡｓは、異なるｍＲＮＡｓを標的として、かなりの数が転写因子をコードする（Ｂａｒｔｅｌ（２００４）Ｃｅｌｌ  １１６：２８１−２９７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ５：Ｒ６５；Ｒｈｏａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１０：５１３−５２０）。植物のｍｉＲＮＡｓのそれらの標的ｍＲＮＡｓへの塩基対形成はほとんど完全であり、ＲＮＡ分子の分割をもたらすことは、いくつかの例により示されるとおりであり（Ｊｏｎｅｓ−Ｒｈｏａｄｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｌ（２００４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １４：７８７−７９９）、遺伝子発現のサイレンシングをもたらす。あるいは、標的ｍＲＮＡへのｍｉＲＮＡの相互作用は、アラビドプシスのｍｉＲ１７２に関して示されたとおり、ｍＲＮＡ分割よりも翻訳の阻害をもたらし得る（Ａｕｋｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｓａｋａｉ（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５：２７３０−２７４１：Ｃｈｅｎ（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：２０２２−２０２５）。
【０３０１】
［０３２１］  特定の遺伝子の発現を阻害できる人工のｍｉＲＮＡｓをデザインする努力において、我々は、特別のｍＲＮＡを標的とするように公知のｍｉＲＮＡの配列を修飾しようとした。
【０３０２】
［０３２２］  アラビドプシスのｍｉＲ１５９はＭＹＢ転写因子のセットを標的とすることが示された。ｍｉＲ１５９のその標的ｍＲＮＡｓに対する塩基対形成は、ほとんど完全であり、ＲＮＡ分子の分割をもたらす（Ａｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：３３５７−３３６５；Ｐａｌａｔｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２５：２５７−２６３）。ｍｉＲ１５９をコードする可能性を有するゲノミック配列が３つ存在する（ＭＩＲ１５９ａ．ＭＩＲ１５９ｂ，ＭＩＲ１５９ｃ）。ｍｉＲ１５９の自然界のプロモーターと正確な前駆体配列は公知でなく、マイクロＲＮＡ遺伝子がＤＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩにより転写されるか否かも知られていない。我々は、アラビドプシスｍｉＲ１５９ａを含む２７６ｂｐのＤＮＡ断片を前駆体配列として用いることを決定した。この前駆体配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａと呼ばれ、３５Ｓプロモーターの下流に置かれ、そして３’エンドにおいてノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンターゼ遺伝子のポリＡ付加配列を隣接した（図１１Ａ）。我々は、我々が人工のマイクロＲＮＡをデザインしてそのｍＲＮＡを分割できて、それによりその発現に障害を生じさせ得るか否かを観察するために標的としてニコチアナベンサミアナのフィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）遺伝子を用いようと決定した。我々は、Ａｔ−ｍｉＲ１５９ａの配列を、ＰＤＳの配列と比較することにより、２つの配列の間の最良の適合を見いだした。ＰＤＳのｍＲＮＡの一つの特定の領域に関して、我々は、たった６つの塩基の変化で、ｍｉＲ１５９ａを、ＰＤＳ  ｍＲＮＡと塩基対形成できるｍｉＲＮＡへ変換するのに十分であることを発見した。我々は、この配列をｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａと命名した。
【０３０３】
［０３２３］  ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａを生成するために、ｍｉＲ１５９ａとｍｉＲ１５９ａ＊配列（前駆体配列中のｍｉＲＮＡに対して反対のアームに位置するＲＮＡ配列）の両者に、アラビドプシスのｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａのコンテクスト中にて点変異を導入しようと、ＰＣＲ技術を用いた。結果の前駆体を、強いカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓの制御下に置き、そして適切な構築物を含むアグロバクテリウムチュメファシエンスの浸潤によりニコチアナベンサミアナにて発現させた。
【０３０４】
［０３２４］  アラビドプシスｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａのニコチアナベンサミアナにおける発現を、最初に、その配列中に導入された変異がそのプライマー及びｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａの成熟に影響しないことを確認するために分析した。ノーザンブロット分析は、浸潤の２また３日後にｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａが明らかに発現され（図１１Ｃ）、内生ｍｉＲ１５９に匹敵するレベルに蓄積することを示した。公知のｍｉＲＮＡｓの生合成は、実際のｍｉＲＮＡのものと比較した場合に寿命が短くて極めて低レベルでしか蓄積しない、ほとんど相補なｍｉＲＮＡ＊の生成を含む。一貫して、ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ＊の存在は検出されたが、その富裕性はｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａのそれよりも有意に低かった（図１１Ｃ，中央のパネル）。内生のｍｉＲ１５９ａ発現はこれらの条件下で変化せず、そして負荷対照及びプローブ特異性対照の両者として機能した（図１１Ｂ、底のパネル）。さらに、この結果は、アラビドプシスのｍｉＲＮＡ前駆体に基づいた人工ｍｉＲＮＡの発現が内生のニコチアナベンサミアナのｍｉＲ１５９ａの発現に影響しないことを示す。最後に、これらの発見は、自然界のマイクロＲＮＡ前駆体のプロセシングのための酵素的機構が多大なる速度制限性ではなくて、多大なる有効性を伴って人工の前駆体をプロセシングできることを暗示する。
【０３０５】
［０３２５］  我々は、次に、ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａの発現が内生のＰＤＳ  ｍＲＮＡの予測された分割をもたらすか否かを決定した。ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａを発現するサンプルのノーザンブロットハイブリダイゼーションは、ＰＤＳ  ｍＲＮＡレベルの明確な低下を示した（図１２Ａ）。ＰＤＳ  ｍＲＮＡ低下の機構をさらに確認するために、我々は、（１）ＰＤＳ  ｍＲＮＡがｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａにより分割されて診断用５’リン酸を含むか否か、及び（２）分割点がＰＤＳ  ｍＲＮＡ：ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ塩基対形成相互作用に基づいて予測された部位に対応するか否かを定義するよう設定した。我々は、６つの別個のクローンのうちの５つの５’エンド配列がｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａの５’エンドから数えて１０番目のヌクレオチドの後の分割部位にマップされたことを見いだした。分割部位の位置は、他のｍｉＲＮＡ標的に関して公表された研究に完全に一致する（Ｊｏｎｅｓ−Ｒｈｏａｄｅｓ  ａｎｄ  ｂａｒｔｅｌ（２００４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １４：７８７−７９９）。
【０３０６】
［０３２６］  上記の結果は、ＰＤＳ  ｍＲＮＡレベルの低下がｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａにより指示された正確な分割により引き起こされたことを証明する。
【０３０７】
実施例１８
［０３２７］  この実施例は、ＰＤＳ  ｍＲＮＡのマイクロＲＮＡ指示による分割が異なるマイクロＲＮＡ前駆体から生産され得ることを証明する。
【０３０８】
［０３２８］  人工のｍｉＲＮＡｓの発現がｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａの用途に限定されないことを示すため、我々は、２つの異なるｍｉＲ−ＰＤＳ１６９ｇを生成するように、アラビドプシスｍｉＲ１６９ｇを含む仮想前駆体配列に基づいて異なるｍｉＲ−ＰＤＳをデザインした（図１３Ａ）。ｍｉＲ１６９ｇに関しての発現ベクターのデザインの間、我々は、２２２ｂｐのステムループ前駆体のみを含む構築物がｍｉＲ１６９ｇ遺伝子を含む完全な２．０ｋｂの属間領域を含む構築物よりも、成熟ｍｉＲＮＡの高い蓄積をもたらしたことを認めた（図１３Ｂ）。この結果に基づいて、我々は、限定的に短い前駆体ベクターを用いてｍｉＲＮＡ配列の我々の変異導入を継続することを決定した。ｍｉＲ１６９ｇ配列を有するＰＤＳ  ｍＲＮＡの実験は、ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａに関して見いだされたのとは異なる、ｍｉＲＮＡ分割に感受性のｍＲＮＡ配列内の領域を明らかにした。７つの点変異が、ｍｉＲ１６９ｇを、ＰＤＳ  ｍＲＮＡと完全に塩基対形成できるマイクロＲＮＡに変換させる（ｍｉＲ−ＰＤＳａ１６９ｇ，図１３Ａ）。ｍｉＲ１５９ａに基づくｍｉＲ−ＰＤＳに関して前に示されたとおり、ニコチアナベンサミアナにおけるｍｉＲ−ＰＤＳａ１６９ｇの一過性発現は容易に検出される（図１３Ｃ）。さらに、完全なｍｉＲＮＡがそのオリジナルの配列とは独立して変化し得るか否かを試験するために、我々は、ｍｉＲ−ＰＤＳｂ１６９ｇ（図１３Ａ及び図１３Ｃ）を生成したが、オリジナルのｍｉＲ１６９ｇに対するその相同性に拘わらず選択されたＰＤＳ  ｍＲＮＡ内の異なる領域を標的とする。ｍｉＲ−ＰＤＳａ１６９ｇとｍｉＲ−ＰＤＳｂ１６９ｇの両者を用いて、我々は、５’ＲＮＡ分析による測定によりＰＤＳ  ｍＲＮＡの分割を検出し（図１３Ｄ）、そしてノーザンブロット分析による測定によりＰＤＳ  ｍＲＮＡレベルの低下を検出することができた（図１３Ｅ）。
【０３０９】
［０３２９］  これらの結果は、異なるｍｉＲＮＡ前駆体を用いてＰＤＳ  ｍＲＮＡの分解を標的とすることが可能であること、そして重要なことは、人工物をデザインするためにオリジナルのｍｉＲＮＡの配列を広範囲に変化させ得ることを示す。
【０３１０】
実施例１９
［０３３０］  この実施例は、ニコチアナベンサミアナのｒｂｃＳ  ｍＲＮＡｓのマイクロＲＮＡ指示性特異的分割を証明する。
【０３１１】
［０３３１］  このアプローチを用いてＰＤＳ由来の他の遺伝子を標的とし得ることを示すため、我々は、ニコチアナベンサミアナの異なる数のルビスコ小サブユニット（ｒｂｃＳ）遺伝子ファミリーを標的とするように、ｍｉＲ１５９ａ内に点変異を導入した。我々は、好適に利用可能なデータベースに存在するｒｂｃＳ  ＥＳＴ５転写物に関して検索し、そして少なくとも６つの異なるｒｂｃＳ転写物がニコチアナベンサミアナにおいて発現されることを発見した。これらのｒｂｃＳ転写物のコード領域のヌクレオチド配列が互いに９０％を超えて同一であって、そして上記遺伝子ファミリーの全てのメンバーを標的とするｍｉＲ−ｒｂｓＳ１５９ａ−Ａのデザインを可能にさせた。ここでは、ｍｉＲ１５９ａに導入された配列はｒｂｓＳを標的とするはずの最小の数の変化によりガイドされないが、全てのｒｂｓＳ  ｍＲＮＡｓに共通の特定領域を標的とする要求を反映し、即ちいくつかの変化を含んだ。この様式において、我々は、６つの全部のｒｂｃＳ  ｍＲＮＡｓを標的とする一つのｍｉＲＮＡを生成させた（ｍｉＲ−ｒｂｃＳ１５９ａ−Ａ，図１４Ａ）。
【０３１２】
［０３３２］  前の実施例におけるとおり、我々は、ｍｉＲ−ｒｂｃＳ１５９ａ−Ａの有効な発現を検出したが（図１４Ｂ）、このファミリーのメンバー間の相同性の程度の高さゆえ、ノーザンブロット分析により別のｒｂｃＳ  ｍＲＮＡｓを検出するのは難しかった。代わりに、我々は、ｍｉＲ−ｒｂｃＳ１５９ａ−Ａ構築物を含むアグロバクテリア株を浸潤された植物におけるｍＲＮＡｓのレベルを測定するために、半定量性ＲＴ−ＰＣＲを用いた。空の二元ベンサミアナを浸潤された葉と比較すると（図１４ＣのＣ）、ｒｂｃＳ遺伝子１、２及び３に関する蓄積は低下したが、ｒｂｃＳ遺伝子４、５及び６に関しては、ｍｉＲ−ｒｂｃＳ１５９ａ−Ａ構築物を浸潤したサンプルにおいて検出することができなかった（図１４ＣのＡ）。これらの結果は、全てのｒｂｃＳ  ｍＲＮＡｓを標的とした人工ｍｉＲＮＡが意図されたものであったが、各ケースに関して効果は多様であったことを示す。最後に、人工ｍｉＲＮＡの存在は他の植物の遺伝子、例えばＥＦ１αの発現を干渉しなかった（図１４Ｃ，一番下のパネル）。
【０３１３】
［０３３３］  本明細書に提示した人工ｍｉＲＮＡｓはＰＤＳ  ｍＲＮＡ内の３つの異なる位置の近辺（ａｌｏｎｇ）に分散し（図１５Ａに要約される）、２つの異なる遺伝子を標的とするために使用された（ＰＤＳ及びｒｂｃＳ、図１５Ａ及び図１５Ｂ）。この範囲の使用はｍｉＲＮＡ配列の柔軟性も反映され、人工ｍｉＲＮＡｓはほとんど各ヌクレオチド位置が変化し得ることを示す（図１６）。２つの人工ｍｉＲＮＡｓを創世するためのｍｉＲ１５９ａ内の変化は、たった８つの位置のみが変化しないにすぎなかった（図１６Ａ）。ｍｉＲ１６９ｇの場合、この数は３つの位置に減少した（図１６Ｂ）。さらに、両ｍｉＲＮＡｓの変異を共に分析したところ、最初の２つのヌクレオチド位置が影響を受けていないだけである。これは、ｍｉＲＮＡ配列に沿った各位置が変化し得て、遺伝子サイレンシングのために人工ｍｉＲＮＡｓを用いる利点を付加する。
【０３１４】
実施例２０
［０３３４］  この実施例は、人工ｍｉＲＮＡＣＰＣ１５９ａがアラビドプシスの毛根発生を阻害することを示す。
【０３１５】
［０３３５］  根の表皮細胞は毛根細胞と無毛細胞に分化する。毛根細胞表皮細胞のみが毛根に分化できる。アラビドプシスの根において、１６−２２の細胞のファイル全ての間で、８つの対称に位置する細胞ファイルが毛根細胞であり、そしてその他全てが無毛細胞ファイルである。ＣＡＰＲＩＣＥ（ＣＰＣ）はＭＹＢ様の蛋白質であり、無毛細胞への根表皮細胞の分化を促進させるＧＬＡＭＲＡ２（ＧＬ２）を負に制御することにより毛根発生を正に制御する。ｃｐｃ変異体においては、ＧＬ２が、ほとんどの表皮細胞が根の無毛細胞へ分化するように誘導して、極めて僅かな細胞しか毛根に発生することができない。ＣＰＣを過剰発現するｇｌ２変異体又は野生型トランスジェニック植物の根は、野生型の根に比較して、より多数の毛根を生成する（図１７；Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９：５４０９−５４１９）。
【０３１６】
［０３３６］  ＣＰＣの機能喪失表現型が種子の発生の間のごく初期のステージに出現し、致死性は誘導しないし、且つ観察するのが容易であるから、ＣＰＣは遺伝子機能を沈黙化するか又は抑圧するための人工ｍｉＲＮＡｓの利用性を調査するための良好な候補である。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ１５９をバックボーンとして使用して、ＣＰＣ  ｍＲＮＡの異なる領域を標的化するように、２つの人工ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ，ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ及びｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ３１５９ａをデザインした。成熟ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ及びｍｉＲＣＰＣ３１５９ａはＣＰＣメッセンジャーＲＮＡのそれぞれｎｔ２３３−２５３及びｎｔ３１０−３３０に位置する配列に相補性である。前駆体及び成熟ｍｉＲＮＡｓのヌクレオチド配列を以下に示す。
【０３１７】
［０３３７］  ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ前駆体鋳型：
５’ａｃａｇｔｔｔｇｃｔｔａｔｇｔｃｇｇａｔｃｃａｔａａｔａｔａｔｔｔｇａｃａａｇａｔａｃｔｔｔｇｔｔｔｔｔｃｇａｔａｇａｔｃｔｔｇａｔｃｔｇａｃｇａｔｇｇａａｇａａｇａｇｇｔｇａｇｔａａｔｇｔｔｇａａａｃａｔｇａｇｔｔｇａｇｃａｇｇｇｔａａａｇａａａａｇｃｔｇｃｔａａｇｃｔａｔｇｇａｔｃｃｃａｔａａｇｃｃｃｔａａｔｃｃｔｔｇｔａａａｇｔａａａａａａｇｇａｔｔｔｇｇｔｔａｔａｔｇｇａｔｔｇｃａｔａｔｃｔｃａｇｇａｇｃｔｔｔａａｃｔｔｇｃｃｃｔｔｔａａｔｇｇｃｔｔｔｔａｃｔｃｔｔｃｔｔｔｃｇａｔａｃｔａｃｔｃａｃｃｔｃｔｔｃａｔｃｃｃｇｇｇｔｃａ  ３’  （配列番号：１５１）。
【０３１８】
［０３３８］  ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ成熟鋳型：５’  ｔｔｔｃｇａｔａｃｔａｃｔｃａｃｃｔｃｔｔ  ３’  （配列番号：１５２）。
【０３１９】
［０３３９］  ｍｉＲＣＰＣ３１５９ａ前駆体鋳型：
５’ａｃａｇｔｔｔｇｃｔｔａｔｇｔｃｇｇａｔｃｃａｔａａｔａｔａｔｔｔｇａｃａａｇａｔａｃｔｔｔｇｔｔｔｔｔｃｇａｔａｇａｔｃｔｔｇａｔｃｔｇａｃｇａｔｇｇａａｇｃｔｃｇｔｔｇｇｃｇａｃａｇｇｔｇｇｇａｇｃａｔｇａｇｔｔｇａｇｃａｇｇｇｔａａａｇａａａａｇｃｔｇｃｔａａｇｃｔａｔｇｇａｔｃｃｃａｔａａｇｃｃｃｔａａｔｃｃｔｔｇｔａａａｇｔａａａａａａｇｇａｔｔｔｇｇｔｔａｔａｔｇｇａｔｔｇｃａｔａｔｃｔｃａｇｇａｇｃｔｔｔａａｃｔｔｇｃｃｃｔｔｔａａｔｇｇｃｔｔｔｔａｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｃａｃｃｔｇａｃｇｃｃａａｃｇａｇｃａｔｃｃｃｇｇｇｔｃａ  ３’  （配列番号：１５３）。
【０３２０】
［０３４０］  ｍｉＲＣＰＣ３１５９ａは成熟鋳型：５’  ｃｔｃｃｃａｃｃｔｇａｃｇｃｃａａｃｇａｇ  ３’  （配列番号：１５４）。
【０３２１】
［０３４１］  これら２つの人工ｐｒｅ−ｍＲＮＡを、これらの前駆体の発現のための構成的３５Ｓプロモーターを含むベクターにクローン化した。３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ又はｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ３１５９ａを含むアグロバクテリアにより浸潤されたニコチアナベンサミアナのノーザンブロット分析は、成熟ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ及びｍｉＲＣＰＣ３１５９ａの生産の成功を示した。
【０３２２】
［０３４２］  アラビドプシスサリアナ植物をＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ又は３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａを含むアグロバクテリアにより形質転換したところ、多数のトランスジェニック系列が得られた。ＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ植物のＴ１種子をカナマイシン含有抗生物質選択培地上で生育させ、そして耐性のトランスジェニック幼植物（ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ）を、ＸＶＥシステムの誘導因子であるβ−エストラジオールを含むか又は含まないＭＳ培地に移した。ＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９を含むＴ１トランスジェニック系列を対照として用いた。ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９は、人工ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａを構築するために使用されたバックボーンである。
【０３２３】
［０３４３］  誘導因子を含む培地上で生育させたＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９幼植物と又は含まない培地上で生育させたＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９幼植物の間に、毛根発生に差異は観察されなかった（図１８、パネルｃ及びｄ）。対照的に、β−エストラジオールを含む培地上で生育させたＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ幼植物は、明らかに、誘導因子なしで生育させたものよりも少ない毛根しか発生しなかった（図１８、パネルａ）。
【０３２４】
［０３４４］  ３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ，３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９及び３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ６９１５９ａを有するトランスジェニックアラビドプシス幼植物のＴ１幼植物を調査したところ、ＸＶＥ誘導系列と類似の結果が得られた。トランスジェニック系列のＴ１種子をＢＡＳＴＡ−選択培地上で生育させ、そして２週齢の幼植物を、組織培養室に垂直に置かれたＭＳ培地プレートに移した。この実験においては、２つの陰性対照：３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９を有するトランスジェニック系列及び３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＰ６９１５９ａを有するトランスジェニック系列を用いた。後者は、ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９をバックボーンとして用いることにより、カブ黄化モザイクウイルス（ＴＹＭＶ；Ｂｏｚａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８７：１２４−１３０）のＰ６９  ｍＲＮＡのｎｔ２１４−２３４を標的とする人工ｐｒｅ−ｍｉＲＰ６９１５９ａを生産するためにデザインされた。上記前駆体と成熟ｍｉＲＮＡｓのヌクレオチド配列を以下に示す：
【０３２５】
［０３４５］  ｍｉＲＰ６９１５９ａ前駆体鋳型：
５’ａｃａｇｔｔｔｇｃｔｔａｔｇｔｃｇｇａｔｃｃａｔａａｔａｔａｔｔｔｇａｃａａｇａｔａｃｔｔｔｇｔｔｔｔｔｃｇａｔａｇａｔｃｔｔｇａｔｃｔｇａｃｇａｔｇｇａａｇｃｃａｃａａｇａｃａａｔｃｇａｇａｃｔｔｔｃａｔｇａｇｔｔｇａｇｃａｇｇｇｔａａａｇａａａａｇｃｔｇｃｔａａｇｃｔａｔｇｇａｔｃｃｃａｔａａｇｃｃｃｔａａｔｃｃｔｔｇｔａａａｇｔａａａａａａｇｇａｔｔｔｇｇｔｔａｔａｔｇｇａｔｔｇｃａｔａｔｃｔｃａｇｇａｇｃｔｔｔａａｃｔｔｇｃｃｃｔｔｔａａｔｇｇｃｔｔｔｔａｃｔｃｔｔｃａａａｇｔｃｔｃｇａｔｔｇｔｃｔｔｇｔｇｇｃａｔｃｃｃｇｇｇｔｃａ  ３’  （配列番号：１５５）
【０３２６】
［０３４６］  ｍｉＲＰ６９１５９ａ成熟鋳型：５’  ａａａｇｔｃｔｃｇａｔｔｇｔｃｔｔｇｔｇｇ  ３’  （配列番号：１５６）。
【０３２７】
［０３４７］  トランスジェニック植物の両方の種の幼植物は野生型植物のように豊富な毛根を発生した（図１９，パネルａ及びｃ）。対照的に、３０の個別の３５Ｓ：：ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ系列の中で、１８の系列（図１９、パネルｂ）が陰性対照植物（図１９、パネルａ及びｃ）に比較して明らかに少ない毛根を示した。
【０３２８】
［０３４８］  陰性対照トランスジェニック植物においては（３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９及びｐｒｅ−ｍｉＲＰ６９１５９ａ）、毛根先端領域の表皮内の全ての毛根ファイル細胞が毛根を発生することができた（図２０、パネルａ，矢印参照）。しかしながら、３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａを有するトランスジェニック系列においては、毛根ファイル中の多数の細胞が毛根を生産することができなかった（図２０、パネルｂ；矢印参照）。これらの結果は、人工のｍｉＲＣＰＣ１１５９ａが内生のＣＰＣ  ｍＲＮＡの分割を誘導することにより、ＣＰＣ遺伝子機能の損失機能を引き起こし、そして毛根の発生を阻害することができることを示す。
【０３２９】
実施例２１
［０３４９］  この実施例は、重合体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをデザインするためのプロセスの一つの態様を記載する。
【０３３０】
［０３５０］  工程１：５’エンドにＡｖｒＩＩ部位を含ませて３’エンドにＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ部位を含ませるように、別のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓをＰＣＲにより増幅する。各ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを、次に、ｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）のようなベクターにクローン化して、例えば、ｐＥＮＴＲ／ｐｒｅ−ｍｉＲＡ，ｐＥＮＴＲ／ｐｒｅ−ｍｉＲＢ及びｐＥＮＴＲ／ｐｒｅ−ｍｉＲＣを生成する（図２１Ａ）。
【０３３１】
［０３５１］  工程２：ｐＥＮＴＲ／ｐｒｅ−ｍｉＲＡを制限酵素ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩにより消化する。制限酵素ＡｖｒＩＩ及びＸｈｏＩを用いて、ｐＥＮＴＲ／ｐｒｅ−ｍｉＲＢベクターを消化する（図２１Ｂ）。開かれたベクターｐＥＮＴＲ／ｐｒｅ−ｍｉＲＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＢのＤＮＡ断片を回収して、次の工程で精製する。
【０３３２】
［０３５２］  工程３：工程２からの開かれたベクターｐＥＮＴＲ／ｐｒｅ−ｍｉＲＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＢのＤＮＡ断片を連結することにより、ダイマーのｐｒｅ−ｍｉＲＡ−Ｂを生成する（図２１Ｃ）。ＡｖｒＩＩとＳｐｅＩの互換性粘着末端のために、ｐｒｅ−ｍｉＲＢ断片を、開かれたベクターｐＥＮＴＲ／ｐｒｅ−ｍｉＲＡに挿入することができて、ＡｖｒＩＩ部位とＳｐｅＩ部位は共にライゲーション後に消失する（図２１Ｃ）。
【０３３３】
［０３５３］  工程４：ｐＥＮＴＲ／ｐｒｅ−ｍｉＲＡ−Ｂを制限酵素ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩにより消化し、そしてｐＥＮＴＲ／ｐｒｅ−ｍｉＲＣを制限酵素ＡｖｒＩＩ及びＸｈｏＩにより消化する（図２１Ｄ）。開かれたベクターｐＥＮＴＲ／ｐｒｅ−ｍｉＲＡ−Ｂ及びｐｒｅ−ｍｉＲＣのＤＮＡ断片を回収して次の工程で精製する。
【０３３４】
［０３５４］  工程５：工程４からの開かれたベクターｐＥＮＴＲ／ｐｒｅ−ｍｉＲＡ−Ｂ及びｐｒｅ−ｍｉＲＣのＤＮＡ断片を連結することにより、三重合体のｐｒｅ−ｍｉＲＡ−Ｂ−Ｃを生成する（図２１Ｅ）。
【０３３５】
［０３５５］  この様式において、又は機能上均等な、より多くのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡユニットを含む制限酵素重合体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓを調製することができる。望まれるとおりに多数のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓがこの様式にて共に結合されるなら、唯一の制限は転写物の最終的なサイズである。８−１０ｋｂの転写物が植物中で生産できることが知られている。即ち、２−３０又はそれより多く、例えば、３−４０又はそれより多く、例えば、３−４５又はそれより多く、そしてさらにたとえれば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又はそれより多いｍｉＲＮＡｓを含む多重ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ分子を形成することができる。
【０３３６】
実施例２２
［０３５６］  この実施例は、ダイマーｐｒｅ−ｉＲＮＡの２つの成熟ｍｉＲＮＡｓへのプロセシングの成功を証明する。
【０３３７】
［０３５７］  実施例２１に記載されたとおりに、人工のｐｒｅ−ｍｉＲＰＤＳ１１６９ｇ及びｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ３１５９ａを連結して、ダイマー前駆体ｐｒｅ−ｍｉＲＰＤＳ１６９ｇ−ＣＰＣ１５９ａを形成させた。このダイマーｍｉＲＮＡ前駆体を、３５Ｓプロモーターがｐｒｅ−ｍｉＲＰＤＳ１１６９ｇ−ＣＰＣ３１５９ａの発現を推進するようなベクターにクローン化した（図２２）。前駆体及び成熟ｍｉＲＮＡｓのヌクレオチド配列は以下のとおりである。
【０３３８】
［０３５８］  ｍｉＲＰＤＳ１１６９ｇ前駆体鋳型：
５’ａａｔｇａｔｇａｔｔａｃｇａｔｇａｔｇａｇａｇｔｃｔｃｔａｇｔｔｇｔａｔｃａｇａｇｇｇｔｃｔｔｇｃａｔｇｇａａｇａａｔａｇａｇａａｔｇａｇｇｔｔｇａｇｔｔｔａｇｔｃｔｇａｃｔｔｇｇｃｃａｇｔｔｔｔｔｔｔａｃｃａａｔｇａａｔｃｔａａｔｔａａｃｔｇａｔｔｃｔｇｇｔｇｔｔｇｇｃｃａａｇｔｃａｇａｃｔａａａｃｔｃｔｇｔｔｔｃｃｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｔｔｇｇａｔｇｔｃａｇａｃｔｃｃａａｇａｔａｔｃｔａｔｃａｔｃａｔｇａａｔｃｇｔｇａｔｃａａａｃｔｔｔｇ  ３’  （配列番号：１５７）。
【０３３９】
［０３５９］  ｍｉＲＰＤＳ１１６９ｇ成熟鋳型：５’  ｇａｇｔｔｔａｇｔｃｔｇａｃｔｔｇｇｃｃａ  ３’  （配列番号：１５８）。
【０３４０】
［０３６０］  ｍｉＲＰＤＳ１１６９ｇ−ＣＰＣ３１５９ａ前駆体鋳型：
５’ｃａｃｃｔａｇｇａａｔｇａｔｇａｔｔａｃｇａｔｇａｔｇａｇａｇｔｃｔｃｔａｇｔｔｇｔａｔｃａｇａｇｇｇｔｃｔｔｇｃａｔｇｇａａｇａａｔａｇａｇａａｔｇａｇｇｔｔｇａｇｔｔｔａｇｔｃｔｇａｃｔｔｇｇｃｃａｇｔｔｔｔｔｔｔａｃｃａａｔｇａａｔｃｔａａｔｔａａｃｔｇａｔｔｃｔｇｇｔｇｔｔｇｇｃｃａａｇｔｃａｇａｃｔａａａｃｔｃｔｇｔｔｔｃｃｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｔｔｇｇａｔｇｔｃａｇａｃｔｃｃａａｇａｔａｔｃｔａｔｃａｔｃａｔｇａａｔｃｇｔｇａｔｃａａａｃｔｔｔｇａａｇｇｇｔｇｇｇｃｇａｃｔａｇｇａｃａｇｔｔｔｇｃｔｔａｔｇｔｃｇｇａｔｃｃａｔａａｔａｔａｔｔｔｇａｃａａｇａｔａｃｔｔｔｇｔｔｔｔｔｃｇａｔａｇａｔｃｔｔｇａｔｃｔｇａｃｇａｔｇｇａａｇｃｔｃｇｔｔｇｇｃｇａｃａｇｇｔｇｇｇａｇｃａｔｇａｇｔｔｇａｇｃａｇｇｇｔａａａｇａａａａｇｃｔｇｃｔａａｇｃｔａｔｇｇａｔｃｃｃａｔａａｇｃｃｃｔａａｔｃｃｔｔｇｔａａａｇｔａａａａａａｇｇａｔｔｔｇｇｔｔａｔａｔｇｇａｔｔｇｃａｔａｔｃｔｃａｇｇａｇｃｔｔｔａａｃｔｔｇｃｃｃｔｔｔａａｔｇｇｃｔｔｔｔａｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｃａｃｃｔｇａｃｇｃｃａａｃｇａｇｃａｔｃｃｃｇｇｇｔｃａａａｇｇｇｔｇｇｇｃｇａｃｔａｇｔｃｔａｇａｃｔｃｇａｇｔａｔｔ  ３’  （配列番号：１５９）。
【０３４１】
［０３６１］  異なる構築物である３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＰＤＳ１１６９ｇ，３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ３１５９ａ及び３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＰＤＳ１６９ｇ−ＣＰＣ３１５９ａを有するアグロバクテリアを浸潤されたタバコニコチアナベンサミアナの葉のノーザンブロット分析は、成熟ｍｉＲＰＤＳ１６９ｇとＣＰＣ３１５９ａがダイマーｍｉＲＮＡ前駆体からうまく生産されたことを示す（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。この実験においては、処理１が３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＰＤＳ１１６９ｇ、処理２が３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ３１５９ａそして処理３が３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＰＤＳ１６９ｇ−ＣＰＣ３１５９ａである。ｍｉＲＰＤＳ１１６９ｇアンチセンスＤＮＡオリゴをプローブとする場合、１及び３の処理は、ダイマー前駆体が成熟したｍｉＲＰＤＳ１１６９ｇを生成できたことを証明するシグナルを示した。プローブがｍｉＲＣＰＣ３１５９ａアンチセンスＤＮＡオリゴの場合、処理３のシグナルは、ｐｒｅ−ｍｉＲＰＤＳ１６９ｇ−ＣＰＣ３１５９ａが成熟ｍｉＲＣＰＣ３１５９ａを生成する能力を確証させた。
【０３４２】
実施例２３
抗ウイルスｍｉＲＮＡｓのデザイン
［０３６２］  ウイルス遺伝子サイレンシングサプレッサーは宿主の防御を打ち消すために使用さるから、我々は、特定のｍｉＲＮＡｓの発現によりこれらのサプレッサーの生産を損なわせることが植物ウイルスに対して耐性又は寛容を付与するための有効な機構なはずであると推理した（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  １０２：９７−１０８）。この原理はＴｕＭＶを例として用いることにより証明される。
【０３４３】
［０３６３］  ＨＣ−Ｐｒｏ及びＰ６９は、それぞれＴｕＭＶ及びＴＹＭＶによりコードされる植物ＰＴＧＳサプレッサーである（Ａｎａｎｄａｌａｋｓｈｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１３０７９−１３０８４；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６：１３０２−１３１３；Ｋａｓｓｃｈａｕ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：４６１−４７０）。これら２つのウイルスサプレッサー遺伝子を標的として用いて、それらのコーディング配列に相補な配列により人工ｍｉＲＮＡｓをデザインした。
【０３４４】
［０３６４］  Ａｔ−ｍｉＲ１５９ａは、ほとんどのアラビドプシス器官において高レベルにて強く発現される。類似の高レベルの発現は、トウモロコシ及びタバコのような他の植物種においても見いだされた。これらの理由のため、ｍｉＲ１５９ａ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａ）をバックボーンとして使用することにより、人工のｍｉＲＮＡｓを生成した。ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａは１８４ｎｔのステムループＲＮＡであり、３’エンド近傍のステムのベースから成熟ｍｉＲ１５９ａ（５’−ｕｕｕｇｇａｕｕｇａａｇｇｇａｇｃｕｃｕａ−３’；配列番号：１６０）を生成する。このベースステム配列はｍｉＲ１５９ａ配列であって、相補鎖はｍｉＲ１５９ａ＊配列（図２４；配列番号：１６１）と呼ばれる。人工のｍｉＲＮＡをデザインするために、ｍｉＲ１５９ａ配列を、ＴｕＭＶゲノム配列の２０４５−２０６５のＨＣ−Ｐをコードするウイルス配列に相補な配列５’−ａｃｕｕｇｃｕｃａｃｇｃａｃｕｃｇａｃｕｇ−３’（配列番号：１６２）で置き換えた。ｍｉＲ１５９ａ＊配列もステム構造を維持するために変更した。より有効なｍｉＲＮＡプロセシング及び人工ｍｉＲＮＡ前駆体の便利な操作のために、ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９の上流のゲノム配列からクローン化された７８ｂｐの配列をこの人工ｍｉＲＮＡ前駆体の５’エンドに追加した。この初期ｍｉＲＮＡ−様人工ｍｉＲＮＡ前駆体をｐｒｅ−ｍｉＲＨＣ−Ｐ１５９ａと呼んだ。そのＤＮＡ配列は以下のとおりである。
【０３４５】
［０３６５］  ｐｒｅ−ｍｉＲＨＣ−Ｐ１５９ａ
５’ｃａｇｔｔｔｇｃｔｔａｔｇｔｃｇｇａｔｃｃａｔａａｔａｔａｔｔｔｇａｃａａｇａｔａｃｔｔｔｇｔｔｔｔｔｃｇａｔａｇａｔｃｔｔｇａｔｃｔｇａｃｇａｔｇｇａａｇｃａｇｔｃｇａｇｔｇｃｇｔｇａｇｃａａｇｔｃａｔｇａｇｔｔｇａｇｃａｇｇｇｔａａａｇａａａａｇｃｔｇｃｔａａｇｃｔａｔｇｇａｔｃｃｃａｔａａｇｃｃｃｔａａｔｃｃｔｔｇｔａａａｇｔａａａａａａｇｇａｔｔｔｇｇｔｔａｔａｔｇｇａｔｔｇｃａｔａｔｃｔｃａｇｇａｇｃｔｔｔａａｃｔｔｇｃｃｃｔｔｔａａｔｇｇｃｔｔｔｔａｃｔｃｔｔｃａｃｔｔｇｃｔｃａｃｇｃａｃｔｃｇａｃｔｇｃ  ３’  （配列番号：１６３）
【０３４６】
［０３６６］  同じ方法を用いて、ｐｒｅ−ｍｉＲＰ６９１５９ａも構築した。ｐｒｅ−ｍｉＲＰ６９１５９ａは、成熟人工ｍｉＲＮＡ  Ｐ６９１５９ａ，５’−ａａａｇｕｃｕｃｇａｕｕｇｕｃｕｕｇｕｇｇ−３’（配列番号：１６４）を生成することにより、ＴＹＭＶのＰ６９遺伝子を標的とすることが予測された。そのＤＮＡ配列は以下のとおりである。
【０３４７】
［０３６７］  ｐｒｅ−ｍｉＲ  Ｐ６９１５９ａ
５’ｃａｇｔｔｔｇｃｔｔａｔｇｔｃｇｇａｔｃｃａｔａａｔａｔａｔｔｔｇａｃａａｇａｔａｃｔｔｔｇｔｔｔｔｔｃｇａｔａｇａｔｃｔｔｇａｔｃｔｇａｃｇａｔｇｇａａｇｃｃａｃａａｇａｃａａｔｃｇａｇａｃｔｔｔｃａｔｇａｇｔｔｇａｇｃａｇｇｇｔａａａｇａａａａｇｃｔｇｃｔａａｇｃｔａｔｇｇａｔｃｃｃａｔａａｇｃｃｃｔａａｔｃｃｔｔｇｔａａａｇｔａａａａａａｇｇａｔｔｔｇｇｔｔａｔａｔｇｇａｔｔｇｃａｔａｔｃｔｃａｇｇａｇｃｔｔｔａａｃｔｔｇｃｃｃｔｔｔａａｔｇｇｃｔｔｔｔａｃｔｃｔｔｃａａａｇｔｃｔｃｇａｔｔｇｔｃｔｔｇｔｇｇｃ  ３’  （配列番号：１６５）
【０３４８】
実施例２４
ニコチアナベンサミアナにおけるｐｒｅ−ｍｉＲＨＣ−Ｐ１５９ａ
及びｐｒｅ−ｍｉＲＰ６９１５９ａの発現
［０３６８］  ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９中のｍｉＲ１５９とｍｉＲ１５９＊配列の置換は、ｍｉＲＮＡ生合成に重要であると信じられているＲＮＡフォールディング構造をあるいはもたらすのかもしれない。タバコの一過性発現システムを用いることにより、これら２つの人工ｍｉＲＮＡ前駆体が所望のｍｉＲＮＡｓを生成できるか否かをチェックした。３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ，３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ，３５Ｓ：：ＨＣ−Ｐｒｏ，３５Ｓ：：Ｐ６９，及びＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａを有するプラスミドを含むアグロバクテリア細胞を、ニコチアナベンサミアナの葉を浸潤させるのに用いた（Ｌｌａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１３４０１−１３４０６；Ｖｏｉｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ  １０３：１５７−１６７）。
【０３４９】
［０３６９］  別々の構築物を有するアグロバクテリウムチュメファシエンスの静止期培養カルチャー１ｍｌを、一晩、１００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシン及び５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む５０ｍｌのＬＢ培地中で培養して、４，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することにより細胞を回収した。細菌沈殿物を、７５μｌの１００ｍＭアセトシリンゴンを含む５０ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液に懸濁した。室温において３時間撹拌せずにインキュベーションした後に、アグロバクテリア懸濁液をニコチアナベンサミアナの葉へシリンジにより浸潤させた。２日後に、全ＲＮＡをトリゾール試薬（インビトロジェン）を用いて浸潤した葉から抽出し、そしてノーザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １７：１３７６−１３８６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ５：Ｒ６５）。２０μｇの全ＲＮＡサンプルを１５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分析して、ハイボンド−Ｎ＋膜（アマシャム）にブロットした。ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ又はｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａに完全相補な配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで末端標識して、高い比活性のプローブを生じさせた。ハイブリダイゼーションをＵＬＴＲＡ−Ｈｙｂ  Ｏｌｉｇｏ溶液を用いて製造者の指示書（アンビオン）に従い実施して、シグナルをオートラジオグラフにより検出した。
【０３５０】
［０３７０］  ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａのノーザンブロット分析を３つの異なる処理により実施した：（１）アグロバクテリア細胞を３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａにより処理、（２）アグロバクテリア細胞を３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏにより処理、及び（３）アグロバクテリア細胞を３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ及び３５Ｓ：：ＨＣ−Ｐｒｏにより処理。結果を図２５に示す。
【０３５１】
［０３７１］  成熟ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａシグナルがｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａによる全処理において検出されたことに注目されたい（図２５のカラム１、２、５、６）。葉に３５Ｓ：：ＨＣ−Ｐｒｏ構築物のみを浸潤させた場合には、シグナルが検出されなかった（図２５のカラム３及び４）。この結果は、人工のｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａが植物細胞において成熟ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａを生成できるということを示す。
【０３５２】
［０３７２］  ｍｉＲ−Ｐ６９の場合、４つの異なる処理を実施した：（１）３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａを有するアグロバクテリア細胞、（２）ＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａを有するアグロバクテリア細胞、（３）３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９を有するアグロバクテリア細胞、及び（４）３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ及び３５Ｓ：：Ｐ６９を有するアグロバクテリア細胞。ＸＶＥシステムはβ−エストラジオールに応答性の転写誘導可能システムである（Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８（２）：１５７−６１）。
【０３５３】
［０３７３］  ノーザンブロット分析（図２６）は、成熟ｍｉＲ−１６９１５９ａが３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ及びＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａプラス誘導因子を浸潤させた葉においてのみ検出可能であった（図２６のカラム３、５、及び７）。一緒にすると、これらの結果は、人工ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａを用いることにより、うまく、ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａを生成できることを示す。
【０３５４】
実施例２５
高い人工ｍｉＲＮＡｓ発現レベルを有する
安定なアラビドプシストランスジェニック系列
［０３７４］  ３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ又は３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐｒｏ１５９ａを含む構築物を、アグロバクテリアにより媒介されるアラビドプシスＣｏｌ−０エコタイプにて花の浸し方法（ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて形質転換した（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １６：７３５−４３）。
【０３５５】
［０３７５］  トランスジェニック幼植物（ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ）を選択培地（ＭＳ塩４．３ｇ／ｌ蔗糖１０ｇ／ｌ＋Ｂａｓｔａ  １０ｍｇ／ｌ＋カルベニシリン  ２００ｍｇ／ｌ  ＋寒天  ８ｇ／ｌ）上で生育させた。１２の異なる３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ又は３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａＴ２トランスジェニック系列をランダムに拾い上げて、ノーザンブロットにより成熟ｍｉＲＮＡレベルを分析するのに使用した。１２のトランスジェニック３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ系列のうち、１１の系列がｍｉＲＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａの高いレベルの発現を示した（図２７）。アラビドプシストランスジェニック３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ植物においては、試験された全てのＴ２系列がｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａシグナルを示し、そして１０系列が高い発現レベルを示した（図２８）。
【０３５６】
実施例２６
ＷＴ及びトランスジェニック植物のＴｕＭＶウイルスチャレンジ
［０３７６］  ＴｕＭＶを有するＷＴ及びトランスジェニック植物の接種
【０３５７】
［０３７７］  ニコチアナベンサミアナの葉にチューリップモザイクウイルス（ＴｕＭＶ）を接種し（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓ  ８７：９０１−９０５）、そして２週後に組織を１：２０（ｗｔ／ｖｏｌ）希釈にて０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）中で抽出した。この抽出物をウイルス抽出物として使用した。３５Ｓ：：ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａトランスジェニックアラビドプシス系列のＴ２植物をグリーンハウス中で、接種前４週間生育させた（５から６葉のステージ）。植物を第１から第４の葉に６００メッシュのカーボランダムにより空中散布して（ｄｕｓｔｅｄ）、２００μｌの接種物をやさしくこすった（ｒｕｂｂｅｄ）。野生型アラビドプシスサリアナ（ｃｏｌ−０）植物及び３５Ｓ：：ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａを発現するトランスジェニック植物を対照として用いた。接種された植物を温度制御されたグリーンハウスに維持し（２３℃から２８℃）、そして兆候の発症を毎日２週間監視した。
【０３５８】
［０３７８］  エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
【０３５９】
［０３７９］  ＴｕＭＶを感染させた各植物の異なる全身の葉からの葉のディスク（全部で０．０１ｇ）を、感染１４日後に採り（ｄｐｉ）（ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、そして間接エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりＴｕＭＶコート蛋白質（ＣＰ）に対するポリクローナル抗血清（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＰＬａｎｔ  Ｄｉｓ  ８７：９０１−９０５）及びアルカリホスファターゼをコンジュゲートされたヤギ抗−ウサギイムノグロブリンＧを用いてアッセイした。基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートを発色に用いた。Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＶｅｒｓａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏ．，ＣＡ）を用いることにより、４０５ｎｍにおける吸光を読むことにより、結果を記録した。
【０３６０】
［０３８０］  ウエスタンブロット分析
【０３６１】
［０３８１］  ＴｕＭＶコート蛋白質（ＣＰ）に対するポリクローナル抗血清（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓ  ８７：９０１−９０５）及びアルカリホスファターゼをコンジュゲートされたヤギ抗−ウサギイムノグロブリンＧを用いて、ウエスタンブロット分析を実施した。アラビドプシス植物からの全身の葉を２０容量（ｗｔ／ｖｏｌ）の変性バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，４％  ＳＤＳ，２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、及び０．００１％ブロムフェノールブルー）中でホモジェナイズした。抽出物を１００℃に５分間加熱して、８，０００ｘｇにて３分間遠心分離することにより、植物の残渣を沈殿させた。各サンプル（１５μｌ）の全蛋白質を１２％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、そして次に電気転写装置（バイオラッド）を用いてＰＶＤＦ膜（イモビロン−Ｐ，ミリポア、ベッドフォード、ＭＡ）に転写した。当該膜を、一次抗体としてのＴｕＭＶに対するポリクローナル抗血清及びパーオキシダーゼコンジュゲートされた二次抗体（アマシャムバイオサイエンセズ）と、免疫反応性蛋白質の可視化の前にＥＣＬキット（アマシャムバイオサイエンセズ）を用いてインキュベートした。ゲルをクマジーブリリアントブルーＲ２５０により染色して、ＲＵＢＩＳＣＯ（５５ｋｄ）のラージサブユニットのレベルを負荷対照として用いた。
【０３６２】
［０３８２］  ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ人工ｍｉＲＮＡを発現するトランスジェニック植物がＴｕＭＶ感染に耐性であることが見いだされた（図２９）。接種の２週間後に写真を撮った（感染から１４日後）。ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ（系列＃１１；図３３Ｂ）は正常な蛍光を発したが、ＷＴ植物及び３５Ｓ：：ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａを発現するトランスジェニック植物（系列＃１１；図３３Ｂ）はウイルス感染の兆候を示した。
【０３６３】
［０３８３］  ＴｕＭＶ感染の１４日後に、ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ（系列＃１１）及びｃｏｌ−０植物は花の間の短い節間を蛍光において示したが、ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａトランスジェニック植物（系列＃１１）は正常な蛍光発色を示した（図３０、上部パネル）。ＴｕＭＶ感染アラビドプシス植物における蛍光のクローズアップビュー。ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ（系列＃１１）及びｃｏｌ−０植物は老年期及び授粉の欠損を示したが、ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ植物（系列＃１１）は正常な花と長角果の発生を示した（図３０、底部パネル）。偽の感染に関しては、植物にバッファーのみを接種した。
【０３６４】
［０３８４］  ＴｕＭＶ感染ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ（系列＃１１）及びＷＴ（ｃｏｌ−０）植物においては、長角果は小さくて不完全に発生した（ｍａｌ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ植物（系列＃１１）はＴｕＭＶ感染に耐性であって、正常な長角果発生を示した（図３１）。バッファーを接種された植物（偽接種）を対照として用いた。
【０３６５】
［０３８５］  様々なトランスジェニックｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ及びＷＴ植物のＴｕＭＶ感染に対する耐性を調査するために、２つの別個の実験を実施した。実験１：Ｔ２トランスジェニック系列の１６の個々の植物（ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ植物の系列＃１１及びｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ植物の系列＃１１）を用いた。１２の個々の植物に、バッファーを対照として接種した（ＭＯＣＫ）。２週間後に、ウエスタンブロット分析のためにＴｕＭＶ  ＣＰに対する抗体を用いて全身の葉を回収した。ＴｕＭＶ  ＣＰはｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａトランスジェニック植物において検出されなかったが、ＴｕＭＶ  ＣＰはｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ及びＷＴ  ｃｏｌ−０植物において高発現された（図３２）。ＲＵＢＩＳＣＯのラージサブユニット（５５ｋｄ）を負荷対照として用いた。レーン６（上部パネル）及びレーン４（中央のパネル）においてＣＰは検出されなかったことに注目されたいが、ウイルス接種の失敗によるらしい。これらの植物は兆候を有さなかった。感染アッセイの結果を表７に示す。
【０３６６】
【表７】
2008522585.tif 000022
【０３６７】
［０３８６］  実験２：以下のトランスジェニック系列及びＷＴ植物を用いた。（１）３５Ｓ：：ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ植物：系列＃１０（１２の植物にＴｕＭＶを接種して、４つにバッファーを接種）；系列＃１１（１２の植物にＴｕＭＶを接種して、４つにバッファーを接種）；系列＃１２（９つの植物にＴｕＭＶを接種して、４つにバッファーを接種）；系列＃１３（１０の植物にＴｕＭＶを接種して、４つにバッファーを接種）。（２）３５Ｓ：：ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ植物：系列＃１（８つの植物にＴｕＭＶを接種して、４つにバッファーを接種）；系列＃２（７の植物にＴｕＭＶを接種して、４つにバッファーを接種）；系列＃３（９の植物にＴｕＭＶを接種して、４つにバッファーを接種）；系列＃７（５つの植物にＴｕＭＶを接種して、４つにバッファーを接種）；系列＃１３（１０の植物にＴｕＭＶを接種して、４つにバッファーを接種）。
【０３６８】
［０３８７］  各トランスジェニック系列からの代表の植物のウエスタンブロットの結果を図３３、パネルＡに示す。ＲＵＢＩＳＣＯのラージサブユニット（５５ｋｄ）のレベルを負荷対照として用いた。３５Ｓ：：ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａを発現する全ての植物はウイルスに対して耐性であって、如何なる可視性の兆候も示さなかったし、如何なるＴｕＭＶ  ＣＰも発現しなかった。全てのＷＴ植物及び３５Ｓ：：ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ植物は、ＴｕＭＶ感染の兆候を示し、そしてＴｕＭＶ  ＣＰを高レベルにて発現した。全ての偽感染植物は正常であって、如何なるＴｕＭＶ  ＣＰも発現しなかった。人工ｍｉＲＮＡのｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ及びｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａトランスジェニックアラビドプシスにおける発現を図３３、パネルＢに示す。感染性アッセイの結果を表８に示す。
【０３６９】
【表８】
2008522585.tif 000023
【０３７０】
［０３８８］  ＴｕＭＶの感染１４日後に、全身の葉のサンプルを回収して、ＥＬＩＳＡにより抽出物をアッセイした。結果は、２つの異なる実験からの９又は１２の植物のＥＬＩＳＡの読みの平均である。結果（図３４）は、ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ植物がＴｕＭＶ感染に対して完全に耐性であったことを示す。読みは基質の加水分解の３０分後に採られた。
【０３７１】
実施例２７
ホモ重合性ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓを用いた
同じ転写物からの一つより多いｍｉＲＮＡｓの生産
［０３８９］  重合性ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓは、一つより多いｍｉＲＮＡ前駆体ユニットからなる人工ｍｉＲＮＡ前駆体である。それらは、異なるｍｉＲＮＡ前駆体によるヘテロ重合体、又は同じｍｉＲＮＡ前駆体のいくつかのユニットを含むホモ重合体の何れかであり得る。前の実施例において、ヘテロ重合体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓが異なる成熟人工ｍｉＲＮＡｓを生産できることを証明した。例えば、ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳａ１６９ｇ−ＣＰＣ３１５９ａはｐｒｅ−ｍｉＲ−ＣＰＣ３１５９ａとｐｒｅ−ｍｉＲ−ＰＤＳ１１６９ｇからなるダイマーであり、植物細胞中で発現されたときに、ｍｉＲ−ＰＤＳ１１６９ｇとｍｉＲ−ＣＰＣ３１５９ａを生産できる。ここでは、異なる成熟人工ｍｉＲＮＡｓを生産するためのホモ重合体ｍｉＲＮＡ前駆体の使用が記載される。
【０３７２】
［０３９０］  ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａとｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａをｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａバックボーンから生成した。それらは同じｍｉＲＮＡ前駆体に由来する。それらを共に連結することにより、ホモ重合体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ，ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａを形成させる。ＤＮＡ配列は以下の通りである。
【０３７３】
［０３９１］  ｐｒｅ−ｍｉＲＰ６９１５９ａ−ＨＣ−Ｐ１５９ａ
【化１４】
2008522585.tif 000024
【０３７４】
［０３９２］  小文字の配列はＡｔ−ｍｉＲ１５９バックボーンである。太字の配列はｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａである。イタリック体はｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａである。太字のイタリック体はリンカー配列である。
【０３７５】
［０３９３］  タバコ一過性発現システムを用いて、このホモ重合体ｍｉＲＮＡ前駆体が所望の成熟ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ及びｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａを生産できるか否かをチェックした。この実験においては、３つの処理を実施した：（１）アグロバクテリアの３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａによる処理、（２）アグロバクテリアの３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａによる処理、及び（３）アグロバクテリアの３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａによる処理。ノーザン分析は、ホモ重合体ｍｉＲＮＡ前駆体、ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａが成熟ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａとｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａを生産できることを示した（図３５）。
【０３７６】
実施例２８
イントロン配列に挿入されたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓからのｍｉＲＮＡｓの発現
［０３９４］  ＲＮＡスプライシングの間に、イントロンが初期ＲＮＡ転写物から放出されて、ｍｉＲＮＡｓの前駆体として機能する可能性があり得る。この実施例においては、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓのそのようなイントロン配列への挿入により人工ｍｉＲＮＡｓを生産することが記載される。
【０３７７】
［０３９５］  ほとんどのイントロンは配列５’−ＧＵ−３’で始まって配列５’−ＡＧ−３’で終わる。これらの配列はそれぞれスプライシングドナー部位及びスプライシングアクセプター部位と呼ばれる。これらの配列に加えて、イントロン内に位置するブランチ部位もイントロンの成熟に重要である。当該ブランチなしでは、イントロンが切り出されて初期ＲＮＡ転写物から放出され得ない。ブランチ部位はスプライシングアクセプター部位の２０−５０ｎｔ上流に位置する。スプライスドナー部位とブランチ部位の間の距離は異なるイントロンで大きく異なる。この理由のため、これら２つの部位、即ち、イントロンのスプライスドナー部位とブランチ部位の間に人工ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓを挿入することを決定した。
【０３７８】
［０３９６］  アラビドプシスＣＡＲＰＲＩＣＥ（ＣＰＣ）遺伝子は３つのエクソンと２つのイントロンを含む。ブランチ部位の５’−ＣＵ（Ａ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｕ）−３’（式中、Ａは全ての配列において保存されている）のコンセンサス配列に続き、開始コドンの１２８から１３２ｎｔ（イントロン１）及び７２２から７２５ｎｔ（イントロン２）に位置する２つのブランチ部位が予測される。１１１から１１４ｎｔ及び２７２から６９７ｎｔの配列はそれぞれイントロン１及びイントロン２の中に位置しており、ｍｉＲ１５９ａバックボーンを含む人工ｍｉＲＮＡ前駆体により置換した。ＤＮＡ配列は以下のとおりである。
【０３７９】
［０３９７］  ＣＰＣゲノム配列
【０３８０】
【化１５】
2008522585.tif 000025
【０３８１】
［０３９８］  小文字の配列はエクソンである。太字のイタリック体の配列はブランチ部位である。太字の配列が人工ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓにより置き換えられた。イントロン配列は普通の文字、太字及び太字イタリック体の配列を含む。
【０３８２】
［０３９９］  構築物３５Ｓ：：ＣＰＣ−Ａ及び３５Ｓ：：ＣＰＣ−Ｂを生成して、人工ｍｉＲＮＡｓの生産のために人工ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを挿入するためにスプライスされていないＣＰＣ転写物のイントロン１又はイントロン２を用いることができるか否かをチェックした。ＣＰＣ−Ａ構築物においては、ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａをイントロン１に挿入したが、イントロン２は変化させなかった。ＣＰＣ−Ｂにおいては、ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａをイントロン２に挿入したが、イントロン１は変化させなかった（図３６）。３５Ｓ：：ＣＰＣ−Ａ，３５Ｓ：：ＣＰＣ−Ｂ，３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ，及び３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａを有するアグロバクテリア細胞に、一過性発現のためにニコチアナベンサミアナの葉を浸潤させた。ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａに相補なプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションは、ＣＰＣ−Ａ及びＣＰＣ−Ｂを浸潤させた４つの別個の実験の葉のサンプルがｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａを発現させたことを示した（図３７）。この結果は、ＣＰＣ転写物のイントロン１及びイントロン２の両者を用いて人工ｍｉＲＮＡｓを生産できることを示す。
【０３８３】
［０４００］  構築物３５Ｓ：：ＣＰＣ−Ｃ及び３５Ｓ：：ＣＰＣ−Ｄを生成して、両イントロンにおいてｍｉＲＮＡｓを生産する能力を決定した。ＣＰＣ−Ｃ構築物においては、ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａをイントロン１に挿入し、そしてｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａをイントロン２に挿入した。ＣＰＣ−Ｄにおいては、ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａをイントロン１に挿入し、そしてｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａをイントロン２に挿入した（図３８）。３５Ｓ：：ＣＰＣ−Ｃ，３５Ｓ：：ＣＰＣ−Ｄ，３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ，及び３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａを有するアグロバクテリア細胞に、一過性発現のためにニコチアナベンサミアナの葉を浸潤させた。図３９は、４つの個別の実験のノーザンブロットの結果を示す。４つのサンプル全てがｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａｍｉＲＮＡ及びｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａに相当するシグナルを示し、サンプル１のシグナルが弱いことに注目されたい（３５Ｓ：：ＣＰＣ−Ｃの図３９）。この弱いシグナルは、この特定のサンプルの低い一過性発現効率によると言えよう。類似の状況は３５Ｓ：：ＣＰＣ−Ｄの実験において遭遇した。これらの結果は、一つの転写物において同時に２つの異なる人工ｍｉＲＮＡｓを生産するためにＣＰＣイントロンを使用できることを証明する。
【０３８４】
［０４０１］  上記の実施例は、発明を例示するためであって、その範囲を限定するために提供されたのではない。発明の他の変更物が当業者には容易に認識されて請求の範囲に包含される。例えば、上記の実施例においては、ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａとｐｒｅ−ｍｉＲ１６９ｇを用いることにより、人工ｍｉＲＮＡｓを生成させた。しかしながら、他のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ、例えば本明細書に記載したものを、ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａとｐｒｅ−ｍｉＲ１６９ｇと交換して用いることができた。本明細書に引用された全ての刊行物、特許、特許出願、及びコンピュータープログラムは引用により本明細書に編入される。この明細書において及び請求の範囲において、単一形態の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、コンテクストが明らかに他を指し示さない限り、複数のレファレンスを含む。さらに、この明細書において及び請求の範囲において、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」はオープンエンドであることを意図し、引用された要素又は工程のみならず、いかなる追加の要素又は工程をも含むと認識される。
【図面の簡単な説明】
【０３８５】
【図１】［００１５］  図１は、ｍｉＲ１７２ａ−２の周囲の配列により形成された予測上のヘアピン構造を示す。成熟マイクロＲＮＡをグレーのボックスで示す。
【図２】［００１６］  図２は、ｍｉＲ１７２−ａの過剰発現表現型を示す。ａ，野生型（コロンビア生態型）植物、３．５週齢。ｂ，ＥＡＴ−Ｄ植物、３．５週齢。ｃ，野生型の花。ｄ，ＥＡＴ−Ｄの花。第２の螺旋器官（ｗｈｏｒｌ  ｏｒｇａｎｓ）（花弁）の不在に注意。矢印は、先端の葉縁（ｍａｒｇｉｎｓ）と傷痕を有する乳頭状突起（ｓｔｉｇｍａｔｉｃ  ｐａｐｉｌｌａｅ）に沿った胚珠（ｏｖｕｌｅｓ）を有する萼片（ｓｅｐａｌ）を示す。ｅ，３５Ｓ−ＥＡＴ植物からの芝生の葉の縁（ｃａｕｌｉｎｅ  ｌｅａｆ  ｍａｒｇｉｎ）。矢印は、葉縁から防御する乳頭状突起の束を示す。単生の雌器（矢印）３５Ｓ−ＥＡＴ植物の芝生の葉の葉腋から出てくる。
【図３】［００１７］  図３は、ＡＰＥＴＡＬＡ２（ＡＰ２）に相補なｍｉＲＮＡを含むＥＡＴ遺伝子を示す。ａ，ＥＡＴ遺伝子の第５染色体上の位置。Ｔ−ＤＮＡの挿入と３５Ｓエンハンサーの配置を示す。ｍｉＲ１７２ａ−２に対応する２１−ｎｔ配列をＥＡＴ遺伝子の下に示す（配列番号：８６）。ｂ，仮想２１−ｎｔ  ｍｉＲ１７２ａ−２／ＡＰ２  ＲＮＡ二重鎖をＡＰ２の遺伝子構造の下に示す。二重鎖中のＧＵの揺らぎ（ｗｏｂｂｌｅ）に下線を引く。ｃ，ＡＰ  ２１−ｎｔ領域（黒いバー）のアラインメント及び周囲の配列と３つの他のアラビドプシスＡＰ２ファミリーメンバー、及び２つのトウモロコシＡＰ２遺伝子（ＩＤＳ１及びＧＬ１５）。ｄ，ｍｉＲ１７２ａ−２  ｍｉＲＮＡ（黒いバー）のアラインメント及びアラビドプシス、トマト、ダイズ、ポテト及びイネからのｍｉＲ１７２−様配列と周囲配列。
【図４】［００１８］  図４は、ｍｉＲ１７２ａ−２のｍｉＲＮＡの配列を示す。ａ，野生型（レーン３と７）及びＥＡＴ−Ｄ（レーン４と８）からの全ＲＮＡのノーザンブロット。ブロットは、ｍｉＲ１７２ａ−２のｍｉＲＮＡに対するセンスオリゴ（レーン１−４）又はアンチセンスオリゴ（レーン５−８）により釣られた。１００ｐｇのセンスオリゴ（レーン２と６）及びアンチセンスオリゴ（レーン１と５）をハイブリダイゼーション対照として負荷した。ヌクレオチドサイズマーカーを左に示す。ｂ，ｍｉＲ１７２ａ−２のｍｉＲＮＡのＳ１ヌクレアーゼマッピング。未消化（レーン１）か又は又は野生型（レーン２）、ＥＡＴ−Ｄ（レーン３）、又はｔＲＮＡ（レーン４）からの全ＲＮＡにハイブリダイゼーション後に消化した５’−エンド標識されたプローブ。
【図５】［００１９］  図５は、ｍｉｒＲ１７２ファミリーメンバーの発生発現パターンを示す。ａ，発芽の２、５、１２、２１日後に収穫された野生型の種苗（それぞれ、レーン１−４）から、又は成熟葉（レーン５）及び花のつぼみ（レーン６）からの全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ。ＰＣｒのためのプライマーを左に示す。ｂ，野生型（Ｃｏｌ）と比較した、示された変異体のｍｉｒＲ１７２のノーザン分析。ブロットは、ｍｉＲ１７２ａ−２に対するオリゴにより釣った；しかしながら、全てのｍｉＲ１７２がクロスハイブリダイズするべきである。
【図６】［００２０］  図６は、仮想ＥＡＴ標的遺伝子の発現分析を示す。ａ，野生型（Ｃｏｌ）又はＥＡＴ−Ｄ葉なのつぼみから単離された、ポリＡ＋  ＲＮＡのノーザン分析。ハイブリダイゼーションのためのプローブを右に示す。ｂ，ＡＰ２抗体により釣った、野生型又はＥＡＴ−Ｄの花のつぼみからの蛋白質のウエスタンブロット。ＲｂｃＬ，負荷対照としての、リブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼのラージサブユニット。
【図７】［００２１］  図７は、ＬＡＴ−Ｄの同定を示す。ａ，Ａｔ２ｇ２８５５０とＡｔ２ｇ２８５６０の間の、ＬＡＴ−Ｄ中のＴ−ＤＮＡ挿入物の位置。４Ｘ  ３５ＳエンハンサーはＡｔ２ｇ２８５５０からの約５ｋｂである。ｂ，野生型対ＬＡＴ−Ｄ植物におけるＡｔ２ｇ２８５５０発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図８】［００２２］  図８は、ＥＡＴ−ＤがＬＡＴ−Ｄに対して上位である。ＥＡＴ−ＤとＬＡＴ−Ｄ植物の間の遺伝上のクロスであり、結果のＦ１植物をそれらの開花時間（ロゼット葉の数により測定）と共に示す。
【図９】［００２３］図９は、Ａｔ２ｇ２８５５０（２−２８５５０）とＡｔ５ｇ６０１２０（６−６０１２０）変異体の機能の損失を示す。各系のＴ−ＤＮＡの位置をイントロン／エクソン構造と共に示す。
【図１０】［００２４］  図１０は、ｍｉＲ１７２のｍｉＲＮＡファミリーの可能性のある機能を示す。ａ，ｍｉｒＲ１７２ａ−２及びその親族の一過性発現がＡＰ２標的の一過性ダウン制御を誘導するかもしれず、標的蛋白質が臨界の閾値（点線）を下回るまで生産が落ちれば、開花を誘発するかもしれない。ｂ，様々な位置におけるダイサー分割が、ｍｉｒＲ１７２ファミリーから少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡｓを生成するかもしれない（ｍｉＲＮＡコンセンサス配列と共に単一のヘアピンとして示される）。各ｍｉＲＮＡの５’及び３’エンドの配列を、楕円で示された不変の中央の１５ｎｔと共に示す。個々のｍｉＲＮＡｓにより認識される仮想標的を、各々の下に括弧で示す。
【図１１】［００２５］  図１１Ａ−Ｃは、ニコチアナベンサミアナのフィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）ｍＲＮＡｓを分割するようにデザインされた人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を示す。図１１Ａは、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター（３５Ｓ）とＮＯＳターミネーター（Ｔｎｏｓ）の制御下のｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａ配列構築物の構造を示す。成熟ｍｉＲＮＡの配置と位置を矢印により示す。図１１Ｂは、ｍｉＲ１５９ａ（配列番号：１４１）中の点変異（矢印により示される）が、それをｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ（配列番号：１４２）に変換することにより、ニコチアナベンサミアナのＰＤＳのｍＲＮ中の領域の完全に相補になることを示す。図１１Ｃは、アグロバクテリア浸潤ニコチアナベンサミアナ葉のノーザンブロット分析が、空のベクター（ｖｅｃｔｏｒ）又は人工ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ）を浸潤させたサンプル中の、浸潤から１，２，３日後の（ｄ．ｐ．ｉ．）ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ，ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ＊及びｍｉＲ１５９の発現を示すことを示す。
【図１２】［００２６］  図１２は、ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ（配列番号：１４２）がＰＤＳ  ｍＲＮＡ（配列番号：１４３）の分割を引き起こすことを示す。図１２Ａは、浸潤の１又は２日後（ｄ．ｐ．ｉ．）の空のベクター又はｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａにより浸潤されたサンプルからのＰＤＳ  ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す（上部パネル）。図１２Ｂは、ｍｉＲＮＡの分割の部位を示す。５’ＲＡＣＥ分析を、ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ構築物により浸潤されたサンプルに実施したところ、６クローン中の５つの５’エンド配列が矢印により示されるとおりにｍｉＲＮＡの分割部位を示した。
【図１３】［００２７］  図１３は、ｍｉＲ−ＰＤＳ１６９ｇの発現がＰＤＳ  ｍＲＮＡの分割をもたらすことを示す。図１３Ａは、それがそれをｍｉＲ−ＰＤＳａ１６９ｇ（配列番号：１４５）又はｍｉＲ−ＰＤＳｂ１６９ｇ（配列番号：１４６）に変換することにより、ニコチアナベンサミアナのＰＤＳのｍＲＮＡ中の領域の完全に相補になるｍｉＲ１６９ｇ中の点変異（下線のヌクレオチド）を示す。図１３Ｂは、２つの異なるｍｉＲ１６９ｇ発現構築物のノーザンブロット分析を示す。全ＲＮＡを、非浸潤の葉から（Ｃ）又は０．３ｋｂ（０．３ｋｂ）又は０．２ｋｂ（０．２ｋｂ）断片のコンテクストにてｐｒｅ−ｍｉＲ１６９ｇ配列を含むアグロバクテリアを浸潤された葉から、又はアラビドプシスの葉（＋）から抽出した。矢印は、ｍｉＲ１６９シグナルの位置を示す。図１３Ｃは、０．３ｋｂの構築物を含む浸潤された葉の中のｍｉＲ−ＰＤＳａ１６９ｇ（ａ）及びｍｉＲ−ＰＤＳ１６９ｇ（ｂ）の発現を示すノーザンブロットを示すが、対照においては含まず、空のベクター（ｖｅｃｔｏｒ）を用いた。図１３Ｄは、ｍｉＲＮＡの分割の部位を示す。５’ＲＡＣＥ分析を、ｍｉＲ−ＰＤＳ１５６ｇａ（配列番号：１４５）及びｂ（配列番号：１４６）構築物により浸潤されたサンプルに実施し、独立のクローンから同定された５’エンド配列を、矢印により、分析されたクローンの数と共に示す。ＰＤＳのｍＲＮＡｓは、配列番号：１４７及び配列番号：１４８である。図１３Ｅは、空のベクター（Ｃ）又はｍｉＲ−ＰＤＳａ１６９ｇ（ａ）又はｍｉＲ−ＰＤＳ１６９ｇ（ｂ）を発現する構築物を有するアグロバクテリア株を浸潤させた植物内のＰＤＳ  ｍＲＮＡレベルを検出するためのノーザンブロット分析を示す。
【図１４】［００２８］  図１４Ａ−Ｃは、ニコチアナベンサミアナのｒｂｃＳ  ｍＲＮＡｓのマイクロＲＮＡ−指向性分割を示す。図１４Ａは、ｍｉＲ１５９ａ（配列番号：１４１）内の点変異（矢印により示される）がそれをｍｉＲ−ｒｂｃＳ１５９ａ−Ａ（配列番号：１４９）に変換することにより、全てのニコチアナベンサミアナのｒｂｃＳのｍＲＮＡｓ（ｒｂｃＳ  ｍＲＮＡと示す；配列番号：１５０）に共通の領域に対して相補になることを示す。ｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡの塩基対を垂直線により示し、そしてＧ：Ｕの揺らぎ（ｗｏｂｂｌｅ）の塩基対をコロンにより示す。図１４Ｂは、ニコチアナベンサミアナの葉を浸潤させたアグロバクテリアのノーザンブロット分析が、空のベクター（Ｃ）又は人工のｍｉＲＮＡ（Ａ）を浸潤させたサンプル内で浸潤の２日後に（ｄ．ｐ．ｉ．）ｍｉＲ−ｒｂｃＳ１５９ａ−Ａの発現を示すことを示す。図１４Ｃは、ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いてＢに示されるのと同じサンプル内で６つ全ての遺伝子に関してのｒｂｃＳのｍＲＮＡの富裕性を検出した。ＥＦ１αのｍＲＮＡの増幅は負荷対照として作用した。
【図１５】［００２９］  図１５Ａ−Ｂは、図１１−１４において示される作業において使用された遺伝子と関連配列の模式的描写を示す。図１５Ａは、ニコチアナベンサミアナからの完全なＰＤＳ遺伝子が公知でないため（セグメントの損失が破線により示される）、参照配列として用いられたリコペルシカムエスキュレンタムからのＰＤＳ遺伝子を示す。大きなグレーの矢印は、テキストにおいて記載されたｍｉＲ−ＰＤＳ構築物により標的とされた位置を示す。小さな矢印は、５’ＲＡＣＥ分析のために使用されたプライマーを示す。公知のニコチアナベンサミアナＰＤＳ断片を配列のオリジンと共に示す。図１５Ｂは、本明細書にて描写されたｒｂｃＳ遺伝子配列をアッセンブルするために使用された、別に報告された配列を示す。グレーの矢印は、ｍｉＲ−ｒｂｃＳ１５９ａ−Ａにより標的とされた配列の位置を示し、矢印は図１４Ａ−１４Ｃにおいて示されたＲＴ−ＰＣＲ実験に使用されたプライマーの位置を示す。
【図１６】［００３０］  図１６Ａ−１６Ｂは、アラビドプシスのｍｉＲ１５９ａとｍｉＲ１６９ｇに導入された変化の要約を示す。図１６Ａは、ｍｉＲ１５９ａ（配列番号：１４１）と比較した、ｍｉＲ−ＰＤＳ１５９ａ（配列番号：１４２）とｍｉＲ−ｒｂｃＳ１５９ａ−Ａ（配列番号：１４９）の配列を示す。各ケースにおける塩基の変化に下線を引き、未修飾の位置は星印を付す。図１６Ｂは、ｍｉＲ１６９ｇ（配列番号：１４４）と比較した、ｍｉＲ−ＰＤＳ１６９ｇ（配列番号：１４５）とｍｉＲ−ＰＤＳｂ１６９ｇａ（配列番号：１４６）の配列を示す。各ケースにおける塩基の変化に下線を引き、未修飾の位置は星印を付す。
【図１７】［００３１］  図１７は、野生型、変異体及びトランスジェニック植物中のアラビドプシスの毛根の発生を示す。パネルＡ：野生型の毛根は多数の毛根構造を示す。パネルＢ：ｃｐｃ変異体中の極めて僅かな毛根。パネルＣ：３５Ｓ：：ＣＰＣ植物は、より多くの毛根を示す。パネルＤ：ｇｌ２変異体中の、より多い毛根。この図面は、Ｗａｄａら（（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９：５４０９−５４１９）から引用される。
【図１８】［００３２］  図１８は、トランスジェニック植物中のアラビドプシスの毛根の発生を示す。パネルａ：ＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａのインデューサー（エストラジオール）なし。パネルｂ：ＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａのインデューサー（エストラジオール）あり。パネルｃ：ＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａのインデューサー（エストラジオール）なし。パネルｄ：ＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９ａのインデューサー（エストラジオール）あり。
【図１９】［００３３］  図１９は、トランスジェニック植物中のアラビドプシスの毛根の発生を示す。パネルａ：３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９。パネルｂ：３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ。パネルｃ：３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＰ６９１５９ａ。
【図２０】［００３４］  図２０は、トランスジェニック植物中のアラビドプシスの毛根の発生を示す。パネルａ：３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ１５９。パネルｂ：３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ１１５９ａ。
【図２１Ａ】［００３５］  図２１Ａ−２１Ｅは、重合体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをデザインするためのプロセスのダイアグラムを表す。図２１Ａ：３つの異なるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓの増幅の生成物（ｐｒｅ−ｍｉＲ  Ａ，ｐｒｅ−ｍｉＲ  Ｂ及びｐｒｅ−ｍｉＲ  Ｃ）であって、ＡｖｒＩＩ，ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ部位が増幅により追加された。
【図２１Ｂ】図２１Ｂ：ｐｒｅ−ｍｉＲ  ＡをＳｐｅＩ及びＸｈｏＩにより消化して、ｐｒｅ−ｍｉｒ  ＢをＡｖｒＩＩ及びＸｈｏＩにより消化する。
【図２１Ｃ】図２１Ｃ：消化されたｐｒｅ−ｍｉＲ  Ａとｐｒｅ−ｍｉＲ  Ｂを連結することにより、ダイマーのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを形成する。
【図２１Ｄ】図２１Ｄ：−ｍｉＲ  Ａ−ＢをＳｐｅＩ及びＸｈｏＩで消化して、ｐｒｅ−ｍｉＲ  ＣをＡｖｒＩＩ及びＸｈｏＩで消化する。
【図２１Ｅ】図２１Ｅ：消化されたｐｒｅ−ｍｉＲ  Ａ−Ｂとｐｒｅ−ｍｉＲ  Ｃを連結することにより三重合体ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを形成させる。
【図２２】［００３６］  図２２は、ｐｒｅ−ｍｉＲＰＤＳ１１６９ｇとｐｒｅ−ｍｉＲＣＰＣ３１５９ａを含むダイマー構築物のダイアグラムである。
【図２３】［００３７］  図２３Ａ及び２３Ｂは、成熟ｍｉＲＤＰＳ１１６９ｇ（図２３Ａ）及びｍｉＲＣＰＣ３１５９ａ（図２３Ｂ）の上記ダイマー構築物からの生産が成功したことを示す。レーン１は、３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＰＤＳ１１６９ｇであり、レーン２は３５Ｓ：：ＣＰＣ３１５９ａであり、そしてレーン３は３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＰＤＳ１１６９ｇ−ＣＰＣ３１５９ａである。
【図２４】［００３８］  図２４は、ｍｉＲ１５９ａ前駆体（配列番号：１６１）の構造を示す。
【図２５】［００３９］  図２５は、ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａのノーザンブロット分析が、３つの異なる処置：（１）３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａによりアグロバクテリアの細胞を処置、（２）３５Ｓ：：ＨＣ−Ｐｒｏによりアグロバクテリアの細胞を処置、そして（３）３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ及び３５Ｓ：：ＨＣ−Ｐｒｏによりアグロバクテリアの細胞を処置、と共に実施されたことを示す。
【図２６】［００４０］  図２６は、ｍｉＲ−Ｐ６９のノーザンブロット分析を示し、４つの異なる処置を実施した：（１）３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａによりアグロバクテリアの細胞を処置、（２）ＸＶＥ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａによりアグロバクテリアの細胞を処置、（３）３５Ｓ：Ｐ６９を有するアグロバクテリアの細胞、及び（４）３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ及び３５Ｓ：：Ｐ−Ｐ６９を有するアグロバクテリアの細胞。
【図２７】［００４１］  図２７は、ランダムに拾い上げたＴ２３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａトランスジェニック系列（植物）の成熟人工ｍｉＲＮＡレベルのノーザンブロット分析を示す。当該Ｔ２植物はトランスジェニックであることが知られているが、それらがＷＴを除去するためにＫａｎ含有培地上で最初に選択されたからである。当該Ｔ２植物はヘテロ接合体（１コピー）又はホモ接合体（２コピー）の何れかであり、比は２：１であるべきである。
【図２８】［００４２］  図２８は、ランダムに拾い上げたＴ２３５Ｓ：：ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａトランスジェニック系列（植物）の成熟人工ｍｉＲＮＡレベルのノーザンブロット分析を示す。
【図２９】［００４３］  図２９は、ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ人工ｍｉＲＮＡを発現するＴ２トランスジェニック植物がＴｕＭＶ感染に耐性であることを示す。写真は接種の２週間後に（感染の１４日後に）撮られた。ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａを発現するＴ２トランスジェニック植物（系列＃１１；図３３Ｂ）は、正常なインフルオレッセンスを発したが、ＷＴとｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａを発現するＴ２トランスジェニック植物（系列＃１；図３３Ｂ）は、ウイルス感染の兆候を示した。バーは３ｃｍを表す。
【図３０】［００４４］  図３０は、ＴｕＭＶ感染により引き起こされたインフルオレッセンスの兆候を示す。（上のパネル）ＴｕＭＶ感染の１４日後、Ｔ２トランスジェニックｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ植物（系列＃１１）とｃｏｌ−０植物はインフルオレッセンス内の花の間の短い節間を示したが、Ｔ２ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａトランスジェニック植物（系列＃１１）は正常なインフルオレッセンスの発生を呈した。バーは１ｃｍを表す。（下部のパネル）ＴｕＭＶ感染したアラビドプシス植物の上のインフルオレッセンスのクローズアップ観察。Ｔ２トランスジェニックｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ植物（系列＃１１）とｃｏｌ−０植物は、老化期と受粉の欠損を示したが、Ｔ２トランスジェニックｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ植物（系列＃１１）は正常な花と長角果の発生を示した。偽の感染に関しては、植物にバッファーのみを接種した。バーは０．２ｃｍを表す。
【図３１】［００４５］  図３１は、ＴｕＭＶ感染により引き起こされる長角果の兆候を示す。ＴｕＭＶ感染したＴ２トランスジェニックｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ植物（系列＃１１）及びＷＴ（ｃｏｌ−０）植物においては、長角果が小さくて発生不全であった（ｍａｌ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。Ｔ２トランスジェニックｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ植物（系列＃１１）は、ＴｕＭＶ感染に対して耐性であり、正常な長角果の発生を示した。バッファーを接種した植物（偽接種された）を対照として用いた。バーは０．５ｃｍを表す。
【図３２】［００４６］  図３２は、異なるトランスジェニックとＷＴ植物の葉におけるＴｕＭＶコート蛋白質（ＣＰ）のレベルのウエスタンブロット分析を示す。
【図３３】［００４７］  図３３は、（Ａ）３５Ｓ：：ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ，３５Ｓ：：ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ，及びＷＴ（Ｃｏｌ−０）及びの代表的植物のウエスタンブロット分析及び（Ｂ）トランスジェニック植物により生産されたｍｉＲＮＡｓのノーザンブロット分析を示す。
【図３４】［００４８］  図３４は、異なるトランスジェニック及び非トランスジェニックアラビドプシスにおけるＴｕＭＶのＥＬＩＳＡ検出を示す。
【図３５】［００４９］  図３５は、ホモ−ダイマーｍｉＲＮＡ前駆体、ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａが成熟ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ及びｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａを生産可能なことを示す、ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ，ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａ及びｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａのノーザンブロット分析を示す。
【図３６】［００５０］  図３６は、ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａをＣＰＣ遺伝子のイントロン１又はイントロン２の何れかの中に置いた構築物を示す。
【図３７】［００５１］  図３７は、図３６の構築物のノーザンブロット分析を示し、そしてＣＰＣ転写物のイントロン１とイントロン２を用いて人工のｍｉＲＮＡｓを生産できることを証明する。
【図３８】［００５２］  図３８は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−ＨＣ−Ｐｒｏ１５９ａをイントロン１又はイントロン２の何れかの中に置いて、且つｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｐ６９１５９ａをＣＰＣ遺伝子のイントロン２又はイントロン１の何れかの中に置いた構築物を示す。
【図３９】［００５３］  図３９は、図３８の構築物のノーザンブロット分析を示し、そしてそれが２つの異なる人工ｍｉＲＮＡｓを同時に一つの転写物中にて生産するためにＣＰＣイントロンを使用できることを証明する。
【図１】
2008522585.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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