(57)【要約】  薬物の組成物、融合体および結合体が提供される。薬物融合体および結合体は、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片に融合されるかまたは結合される治療剤または診断剤を含む。薬物の組成物、融合体および結合体は、結合されていないまたは融合されていない治療剤または診断剤と比較してより長いインビボ半減期を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
a-(X)n1-b-(Y)n2-c-(Z)n3-dまたはa-(Z)n3-b-(Y)n2-c-(X)n1-d、
（式中、
Ｘは、第１の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬物であり；
Ｙは、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であり；
Ｚは、第２の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬物であり；
ａ、ｂ、ｃおよびｄは、独立して１〜約１００アミノ酸残基を含むポリペプチドまたは非存在であり；
ｎ１は、１〜約１０であり；
ｎ２は、１〜約１０であり；および
ｎ３は、０〜約１０であり；
ただし、ｎ１およびｎ２が、両方１であり、ｎ３が０である場合、Ｘは、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない）
を有する薬物融合体。
【請求項２】
ｎ１およびｎ３が両方０であり、ｎ２が２〜約１０である、請求項１記載の薬物融合体。
【請求項３】
Ｙが配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：24、配列番号：25および配列番号：26からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の薬物融合体。
【請求項４】
Ｙが、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22および配列番号：23からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の薬物融合体。
【請求項５】
ＸがＩＬ−１ｒａまたはＩＬ−１ｒａの機能的改変体である、請求項１記載の薬物融合体。
【請求項６】
Ｘが鎮痛剤、抗癌剤、ホルモンまたは抗微生物ポリペプチドもしくはペプチドである、請求項１記載の薬物結合体。
【請求項７】
Ｘが免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗生物質、抗炎症剤、細胞毒または細胞傷害性薬剤である、請求項１記載の薬物結合体。
【請求項８】
Ｘがプロテアーゼインヒビターである、請求項１記載の薬物結合体。
【請求項９】
部分Ｘ’およびＹ’を含む薬物融合体であって、
Ｘ’は、ポリペプチド薬物であり、ただし、Ｘ’は、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない；および
Ｙ’は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）である、
薬物融合体。
【請求項１０】
Ｘ’がＹ’に対してアミノ末端側に位置する、請求項９記載の薬物融合体。
【請求項１１】
Ｙ’がＸ’に対してアミノ末端側に位置する、請求項９記載の薬物融合体。
【請求項１２】
ＶＨおよびＶＬがヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する、請求項９記載の薬物融合体。
【請求項１３】
Ｙ’が配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：24、配列番号：25および配列番号：26からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２記載の薬物融合体。
【請求項１４】
Ｙ’が配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22および配列番号：23からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２記載の薬物融合体。
【請求項１５】
ＸがＩＬ−１ｒａまたはＩＬ−１ｒａの機能的改変体である、請求項９記載の薬物融合体。
【請求項１６】
血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および該ＶＨまたはＶＬに共有結合された薬物を含む薬物結合体。
【請求項１７】
単鎖ＶＨを含む、請求項１６記載の薬物結合体。
【請求項１８】
単鎖ＶＬを含む、請求項１６記載の薬物結合体。
【請求項１９】
前記薬物が前記ＶＨまたはＶＬにリンカー部分を介して共有結合される、請求項１６記載の薬物結合体。
【請求項２０】
２つ以上の異なる薬物が前記ＶＨまたはＶＬに共有結合される、請求項１６記載の薬物結合体。
【請求項２１】
薬物がポリペプチドである、請求項１６記載の薬物結合体。
【請求項２２】
前記ポリペプチドがＩＬ−１ｒａまたはＩＬ−１ｒａの機能的改変体である、請求項２１記載の薬物結合体。
【請求項２３】
薬物が鎮痛剤、抗癌剤、ホルモンまたは抗微生物ポリペプチドもしくはペプチドである、請求項１６記載の薬物結合体。
【請求項２４】
薬物が免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗生物質、抗炎症剤、細胞毒または細胞傷害性薬剤、代謝拮抗物質、アルキル化剤、アントラサイクリン、放射性核種である、請求項１６記載の薬物結合体。
【請求項２５】
薬物がプロテアーゼインヒビターである、請求項１６記載の薬物結合体。
【請求項２６】
前記血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：24、配列番号：25、配列番号：26、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22および配列番号：23からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６記載の薬物結合体。
【請求項２７】
請求項１または９記載の薬物融合体をコードする組換え核酸。
【請求項２８】
請求項２７記載の組換え核酸を含む核酸構築物。
【請求項２９】
請求項２７記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２９記載の宿主細胞を前記組換え核酸の発現に適切な条件下で維持し、それによって、薬物融合体を産生させることを含む、薬物融合体の産生方法。
【請求項３１】
請求項１または９記載の薬物融合体および生理学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１６記載の薬物結合体および生理学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３３】
請求項５、１５および２２のいずれか記載の薬物結合体または薬物融合体の治療有効量を個体に投与することを含む、炎症性疾患を有する固体を処置する方法。
【請求項３４】
前記炎症性疾患が関節炎である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
治療、診断または予防における使用のための請求項３、４、１３、１４および２６のいずれか記載の薬物結合体または薬物融合体。
【請求項３６】
治療、診断または予防における使用のための請求項５、１５および２２のいずれか記載の薬物結合体または薬物融合体。
【請求項３７】
炎症性疾患の処置のための医薬の製造のための請求項５、１５および２２のいずれか記載の薬物結合体または薬物融合体の使用。
【請求項３８】
前記炎症性疾患が関節炎である、請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および該ＶＨまたはＶＬに非共有結合により結合された薬物を含む非共有結合薬物結合体。
【請求項４０】
前記ＶＨまたはＶＬおよび前記薬物が相補的結合パートナーを介して非共有結合により結合される、請求項３９記載の非共有結合薬物結合体。
【請求項４１】
前記相補的結合パートナーがビオチンおよびアビジンまたはビオチンおよびストレプトアビジンである、請求項４０記載の非共有結合薬物結合体。
【請求項４２】
薬物の活性を約１０％を超えて減少させずに該薬物のインビボ血清半減期を増加するための医薬の製造のための、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分の使用であって、該医薬は、該薬物が該ポリペプチド結合部分に結合された薬物組成物を含む、使用。
【請求項４３】
薬物のインビボ血清半減期を増加し薬物の免疫原性を減少させるための医薬の製造のための、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分の使用であって、該医薬は、該薬物が該ポリペプチド結合部分に結合された薬物組成物を含む、使用。
【請求項４４】
薬物の活性を約１０％を超えて減少させずに薬物の免疫原性を減少させるための医薬の製造のための、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分の使用であって、該医薬は、該薬物が該ポリペプチド結合部分に結合された薬物組成物を含む、使用。
【請求項４５】
薬物の活性を約１０％を超えて減少させずに薬物のインビボ血清半減期を増加し薬物の免疫原性を減少させるための医薬の製造のための、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分の使用であって、該医薬は、該薬物が該ポリペプチド結合部分に結合された薬物組成物を含む、使用。
【請求項４６】
医薬が、薬物が前記ポリペプチド結合部分に共有結合された薬物組成物を含む、請求項４２〜４５のいずれか記載の使用。
【請求項４７】
薬物組成物が薬物融合体または薬物結合体である、請求項４６記載の使用。
【請求項４８】
医薬が、薬物が前記ポリペプチド結合部分に非共有結合により結合された薬物組成物を含む、請求項４２〜４５のいずれか記載の使用。
【請求項４９】
薬物組成物が非共有結合薬物結合体である、請求項４８記載の使用。
【請求項５０】
前記ポリペプチド結合部分が血清アルブミンに対して結合特異性を有する、請求項４２〜４９いずれか記載の使用。
【請求項５１】
前記ポリペプチド結合部分が血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片である、請求項５０記載の使用。
【請求項５２】
医薬が、前記薬物より大きな活性を有する薬物組成物を含む、請求項４２〜５１いずれか記載の使用。
【請求項５３】
インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に薬物を結合し、それによって薬物組成物を作製することを含み、
ここで該薬物組成物は、該薬物に比べてより長いインビボ血清半減期を有し、該薬物の少なくとも約９０％の活性を有する、
薬物の活性を実質的に減少させずに薬物のインビボ血清半減期を増加する方法。
【請求項５４】
インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に薬物を結合し、それによって薬物組成物を作製することを含み、
ここで該薬物組成物は、該薬物に比べてより長いインビボ血清半減期を有し、該薬物より低い免疫原性である、
薬物のインビボ血清半減期を増加し薬物の免疫原性を減少させる方法。
【請求項５５】
インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に薬物を結合し、それによって薬物組成物を作製することを含み、
ここで該薬物組成物は、該薬物より低い免疫原性であり、該薬物の少なくとも約９０％の活性を有する、
薬物の活性を実質的に減少させずに薬物の免疫原性を減少させる方法。
【請求項５６】
インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に薬物を結合し、それによって薬物組成物を作製することを含み、
ここで該薬物組成物は、該薬物に比べてより長いインビボ血清半減期を有し、該薬物より低い免疫原性であり、該薬物の少なくとも約９０％の活性を有する、
薬物の活性を実質的に減少させずに薬物のインビボ血清半減期を増加し薬物の免疫原性を減少させる方法。
【請求項５７】
前記薬物を前記ポリペプチド結合部分に共有結合させることを含む請求項５３〜５６のいずれか記載の方法。
【請求項５８】
薬物組成物が薬物融合体または薬物結合体である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記薬物を前記ポリペプチド結合部分に非共有結合により結合させることを含む請求項５３〜５６のいずれか記載の方法。
【請求項６０】
薬物組成物が非共有結合薬物結合体である、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
１つ以上のポリペプチドから前記ポリペプチド結合部分を選択することをさらに含み、ここで、選択されたポリペプチド結合部分がインビボ血清半減期を増加するポリペプチドを少なくとも約５ｍＭのＫＤで結合する、請求項５３〜６０いずれか記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリペプチド結合部分が血清アルブミンに対して結合特異性を有する、請求項５３〜６１いずれか記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリペプチド結合部分が血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片である、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
薬物組成物が前記薬物より大きな活性を有する、請求項５３〜６３いずれかの方法。
【請求項６５】
インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に結合される薬物を含む薬物組成物であって、該薬物に比べてより長いインビボ血清半減期を有し、該薬物の少なくとも約９０％の活性を有する、薬物組成物。
【請求項６６】
インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に結合される薬物を含む薬物組成物であって、該薬物に比べてより長いインビボ血清半減期を有し、該薬物より低い免疫原性である、薬物組成物。
【請求項６７】
インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に結合される薬物を含む薬物組成物であって、該薬物より低い免疫原性であり、該薬物の少なくとも約９０％の活性を有する、薬物組成物。
【請求項６８】
インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に結合される薬物を含む薬物組成物であって、該薬物に比べてより長いインビボ血清半減期を有し、該薬物より低い免疫原性であり、該薬物の少なくとも約９０％の活性を有する、薬物組成物。
【請求項６９】
薬物が前記ポリペプチド結合部分に共有結合される、請求項６５〜６８のいずれか記載の薬物組成物。
【請求項７０】
前記薬物組成物が薬物融合体または薬物結合体である、請求項６９記載の薬物組成物。
【請求項７１】
薬物が前記ポリペプチド結合部分に非共有結合により結合される、請求項６５〜６８のいずれか記載の薬物組成物。
【請求項７２】
非共有結合薬物結合体である、請求項７１記載の薬物組成物。
【請求項７３】
前記ポリペプチド結合部分が血清アルブミンに対して結合特異性を有する、請求項６５〜７２のいずれか記載の薬物組成物。
【請求項７４】
前記ポリペプチド結合部分が血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片である、請求項７３記載の薬物組成物。
【請求項７５】
前記薬物より大きな活性を有する、請求項６５〜７４のいずれか記載の薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００４年１２月２日に出願された米国仮特許出願６０／６３２，３６１の利益および２００４年６月１日に出願された米国仮特許出願６０／５７６，２７１の利益を主張する。上記出願の全ての教示は、参照によって本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の背景）
治療および／または診断目的に有用であり得る活性を有する多くの薬物は、投与される場合、体から迅速に除去されるので価値が限られている。例えば、治療に有用な活性を有する多くのポリペプチドは、腎臓を介する循環から迅速に除去される。従って、所望の治療効果を達成するために、大用量が投与されなければならない。改善された薬物動態学的特性を有する改善された治療および診断剤に対する必要が存在する。血清アルブミンに結合するポリペプチドは、当該分野において公知である。（例えば、EP 0486525 Bl (Cemu Bioteknik AB); US 6,267,964 Bl (Nygrenら); WO 04/001064 A2 (Dyax, Corp.); WO 02/076489 Al(Dyax, Corp.); WO 01/45746 (Genentech, Inc.)を参照。）
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、改善された血清半減期を有する薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）に関する。１つの局面において、本発明は薬物融合体であり、ここで、薬物融合体は以下の式を有する連続ポリペプチド鎖である：
a-(X)n1-b-(Y)n2-c-(Z)n3-dまたはa-(Z)n3-b-(Y)n2-c-(X)n1-d、
式中、
Ｘは、第１の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬物であり；
Ｙは、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であり；
Ｚは、第２の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬物であり；
ａ、ｂ、ｃおよびｄは、各々独立して非存在であるかまたは１〜約１００アミノ酸残基であり；
ｎ１は、１〜約１０であり；
ｎ２は、１〜約１０であり；および
ｎ３は、０〜約１０であり、
ただし、ｎ１およびｎ２が両方１であり、ｎ３が０である場合、Ｘは抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない。
【０００４】
いくつかの態様において、Ｙは、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：24、配列番号：25および配列番号：26からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22および配列番号：23からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、Ｘは、ＩＬ−１ｒａまたはＩＬ−１ｒａの機能的改変体である。
【０００５】
別の局面において、薬物融合体は、連続ポリペプチド鎖を含み、この鎖は、部分Ｘ’およびＹ’を含み、ここで、
Ｘ’は、ポリペプチド薬物であり、ただし、Ｘ’は、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まず；および
Ｙ’は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）である。いくつかの態様において、Ｙ’は、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：24、配列番号：25および配列番号：26からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22および配列番号：23からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、Ｘ’は、ＩＬ−１ｒａまたはＩＬ−１ｒａの機能的改変体である。
【０００６】
別の局面において、本発明は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびこのＶＨまたはＶＬに共有結合される薬物を含む薬物結合体である。いくつかの態様において、免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：24、配列番号：25および配列番号：26からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22および配列番号：23からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、薬物は、ＩＬ−１ｒａまたはＩＬ−１ｒａの機能的改変体である。
【０００７】
別の局面において、本発明は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびこのＶＨまたはＶＬに非共有結合により結合される薬物を含む非共有結合薬物結合体である。いくつかの態様において、免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：24、配列番号：25および配列番号：26からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22および配列番号：23からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
本発明はまた、本明細書中に記載される薬物融合体をコードする組換え核酸および構築物、ならびに組換え核酸および／または構築物を含む宿主細胞も提供する。本発明はさらに、薬物融合体を産生する方法を提供し、この方法は、前記組換え核酸の発現に適切な条件下で、本明細書中に記載される薬物融合体をコードする組換え核酸および／または構築物を含む宿主細胞を維持し、それによって薬物融合体が産生される工程を包含する。
【０００９】
本発明はまた、本発明の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載されるような疾患および障害を有する個体を処置するための方法を提供し、この方法は、治療有効量の本発明の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を前記個体に投与する工程を包含する。いくつかの態様において、疾患または障害は、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ）のような炎症性疾患である。本発明はまた、炎症性疾患（例えば、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ））のような疾患または障害の処置のための医薬の製造のための、本発明の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の使用を提供する。本発明はまた、治療、診断または予防における使用のための、本明細書中に記載されるような薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）に関する。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本明細書中では、態様は、明瞭および簡潔な明細書が書かれ得る方法で記載されるが、態様は、本発明から離れることなく種々に組み合わされ得るか、または分離され得ることが意図され、理解される。
【００１１】
本発明の態様の任意の１つと同一の構造式を有する物質の公知の組成物は、それ自体明確に権利を放棄される。対照的に、物質の新規の組成物、公知の組成物の新規の組み合わせ、公知の組成物の新規の使用または公知の組成物を含む新規の方法は、権利を放棄されない。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、「薬物」は、個体において生物学的標的分子に結合および／またはその機能を変更するが、有利な治療または診断効果を生じるために個体に投与され得る任意の化合物（例えば、有機低分子、核酸、ポリペプチド）をいう。標的分子は、個体のゲノムにコードされる内因性標的分子（例えば、酵素、レセプター、成長因子、個体のゲノムにコードされるサイトカイン）または病原体のゲノムにコードされる外因性標的分子（例えば、ウイルス、細菌、真菌、線虫または他の病原菌のゲノムにコードされる酵素）であり得る。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「薬物組成物」は、ポリペプチド結合部分に共有結合的または非共有結合により結合される薬物を含む組成物をいい、ここで、ポリペプチド結合部分は、インビボでの血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含む。薬物組成物は、薬物がポリペプチド結合部分に共有結合的または非共有結合により結合する結合体であり得る。薬物は、直接または間接的に（例えば、適切なリンカーおよび／または相補的な結合パートナー（例えば、ビオチンおよびアビジン）の非共有結合によって）ポリペプチド結合部分に共有結合または非共有結合により結合され得る。相補的結合パートナーが使用される場合、結合パートナーの１つは薬物に直接かまたは適切なリンカー部分によって共有結合され得、相補的な結合パートナーは、ポリペプチド結合部分に直接かまたは適切なリンカー部分によって共有結合され得る。薬物がポリペプチドまたはペプチドである場合、薬物組成物は融合タンパク質であり得、ここで、ポリペプチドまたはペプチド薬物およびポリペプチド結合部分は、連続ポリペプチド鎖の不連続部（部分）である。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「結合体(conjugate)」は、薬物に結合される血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片を含む組成物をいう。そのような結合体は、薬物が共有結合される血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片を含む「薬物結合体」および薬物が非共有結合により結合される血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片を含む「非共有結合薬物結合体」を含む。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「薬物結合体」は、薬物が共有結合される血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片を含む組成物をいう。薬物は、抗原結合断片に、直接かまたは適切なリンカー部分によって間接的に共有結合され得る。薬物は、アミノ末端、カルボキシル末端または適切なアミノ酸側鎖（例えば、リジンのεアミノ基）にる等の、任意の適切な位置で、抗原結合断片に結合され得る。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「非共有結合薬物結合体」は、薬物が非共有結合により結合する血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片を含む組成物をいう。薬物は、抗原結合断片に直接的（例えば、静電相互作用、疎水性相互作用）かまたは間接的（例えば、相補的結合パートナー（例えば、ビオチンおよびアビジン）の非共有結合により、ここで、１つのパートナーは薬物に共有結合され、相補的結合パートナーは抗原結合断片に共有結合される）に非共有結合により結合し得る。相補的結合パートナーが使用される場合、結合パートナーの１つは、薬物に直接的かまたは適切なリンカー部分によって共有結合され得、相補的結合パートナーは血清アルブミンを直接にかまたは適切なリンカー部分によって結合する抗体の抗原結合断片に共有結合され得る。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「薬物融合体」は、血清アルブミンおよびポリペプチド薬物を結合する抗体の抗原結合断片を含む融合タンパク質をいう。血清アルブミンおよびポリペプチド薬物を結合する抗体の抗原結合断片は、単一の連続ポリペプチド鎖の不連続部（部分）として存在する。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「薬物基準」は、活性の評価、測定または決定に使用される薬物（または薬物部分）の量に基づいて標準化された薬物組成物および薬物の活性をいう。一般的に、本発明の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、それが含む薬物より大きな分子量を有する。従って、薬物組成物および薬物の重量的に等価な量は、分子基準またはモル基準で異なる量の薬物を含む。例えば、本発明の薬物組成物が、それが含む薬物の２倍の分子量である分子量を有する場合、これらの量が（遊離薬物としてまたは薬物組成物の一部として）同じ量の薬物を含むために、２μｇの薬物組成物および１μｇの薬物を使用して「薬物基準」に基づいて活性は決定され得る。活性は、例えば、１つの標的結合部位基準あたりに対する、または酵素薬物について１つの活性部位基準あたりに対する活性を表すことによって、適切な計算を使用して「薬物基準」で標準化され、表され得る。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「インターロイキン１レセプターアンタゴニスト」（IL-1ra）は、天然に存在するかまたは内因性哺乳類IL-1raタンパク質をいい、天然に存在するかまたは対応する内因性哺乳類IL-1raタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、合成有機化学の方法を使用して生成された））をいう。したがって、本明細書中で規定される場合、用語は、成熟タンパク質、多型または対立遺伝子改変体、およびIL-1raの他のアイソフォーム（例えば、選択的スプライシングまたは他の細胞加工過程によって産生された）、ならびに前述の修飾または非修飾形態（例えば、脂質化された、グリコシル化された、PEG化された）を含む。天然に存在するかまたは内因性IL-1raは、成熟IL-1ra、多型または対立遺伝子改変体および哺乳類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類）において天然に存在する他のアイソフォームのような野生型タンパク質を含む。このようなタンパク質は、例えばIL-1raを天然に産生する供給源から回収されるかまたは単離され得る。天然に存在するかまたは対応する内因性IL-1raと同じアミノ酸配列を有するこれらのタンパク質およびIL-1raタンパク質は、対応する哺乳類の名前によって参照される。例えば、対応する哺乳類がヒトである場合、タンパク質は、ヒトIL-1raと示される。
【００２０】
IL-1raの「機能的改変体(variant)」は、機能的断片、機能的変異体タンパク質および／または、適切な方法（例えば、突然変異誘発（例えば、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発）、組換えDNA技術）を使用して産生され得る機能的融合タンパク質を含む。「機能的改変体」は、インターロイキン−１  １型レセプターをアンタゴナイズする。一般的に、IL-1raの断片または一部は、成熟IL-1raに比べて、アミノ酸（すなわち、１つ以上のアミノ酸）の欠失および／または付加（すなわち、１つ以上のアミノ酸欠失および／または付加）を有するもの（例えば、N−末端、C−末端または内部欠失）を含む。成熟IL-1raに比べて、連続アミノ酸のみが欠失する断片または一部、あるいは非連続アミノ酸が欠失する断片または一部も構想される。
【００２１】
ヒトIL-1raの機能的改変体は、ヒトIL-1raの成熟１５２アミノ酸形態と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を有し、ヒトインターロイキン−１  １型レセプターをアンタゴナイズする。（Eisenbergら、Nature 343:341-346 (1990)を参照。）改変体は１つ以上のさらなるアミノ酸を含む（例えば、１５３または１５４以上のアミノ酸を含む）。例えば、改変体IL-1raは、アミノ末端メチオニン残基の後に続く配列番号：３３の残基２６〜１７７からなるアミノ酸配列を有し得る(KINERET（登録商標）(anakinra), Amgen Inc.)。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「サポリン」は、植物サポナリアオフィシナリス（Saponaria officinalis）によって産生される一本鎖リボソーム不活性化ポリペプチドのファミリーをいう(Stirpe, F.ら、Biochem. J. 216:617-625 (1983), Bagga, S.ら、J. Biol. Chem. 278:4813-4820 (2003)) 。サポリンポリペプチドは、長さおよび／またはアミノ酸配列が異なるいくつかの形態が存在する(例えば、Id.およびBarthelemy, I.ら、J. Biol. Chem. 268:6541-6548 (1993)を参照)。サポリン−６は、サポリンの最も活性な形態である。(Bagga, S.ら、J. Biol. Chem. 278:4813-4820 (2003)) 。成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の４８位のアミノ酸がAspまたはGluであり、成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の９１位のアミノ酸がArgまたはLysである少なくとも４つの天然に存在するサポリン−６のアイソフォームが記載される。(Barthelemy, I.ら、J. Biol. Chem. 268:6541-6548 (1993)) 。サポリン−６のさらなる形態は、成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の９９位のアミノ酸がSerまたはLeuであり；成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の１３４位のアミノ酸がGlnまたはLysであり；成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の１４７位のアミノ酸がSerまたはLeuであり；成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の１４９位のアミノ酸がSerまたはPheであり；成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の１６２位のアミノ酸がAspまたはAsnであり；成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の１７７位のアミノ酸がAlaまたはValであり；成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の１８８位のアミノ酸がIleまたはThrであり；成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の１９６位のアミノ酸がAsnまたはAspであり；成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の１９８位のアミノ酸がGluまたはAspであり；成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の２３１位のアミノ酸がAsnまたはSerであるポリペプチドおよび；成熟ポリペプチド（配列番号：６５）の２３３位のアミノ酸がLysまたはArgであるポリペプチドを含む。これらのアイソフォームおよび改変体を含むコンセンサス配列は、図１４G（配列番号：６７）に示される。
【００２３】
したがって、用語「サポリン」は、前駆体タンパク質、成熟ポリペプチド、天然のタンパク質、多型または対立遺伝子改変体、および他のアイソフォーム（例えば、選択的スプライシングまたは他の細胞加工過程によって産生された）、ならびに天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチドまたは組換え的に産生されたポリペプチドを含む前述の修飾または非修飾形態（例えば、脂質化された、グリコシル化された、PEG化された）を含む。天然に存在するかまたは内因性サポリンは、成熟サポリン（例えば、成熟サポリン−６）、多型または対立遺伝子改変体およびサポナリアオフィシナリスにおいて天然に存在する他のアイソフォームのような野生型タンパク質を含む。このようなタンパク質は、任意の適切な方法を使用してサポナリアオフィシナリスから回収または単離され得る。サポリンの「機能的改変体」は、適切な方法（例えば、突然変異誘発（例えば、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発）、組換えDNA技術）を使用して産生され得る機能的断片、機能的変異体タンパク質および／または機能的融合タンパク質を含む。一般的に、サポリンの断片または一部（例えば、サポリン−６）は、成熟サポリンに比べて、アミノ酸（すなわち、１つ以上のアミノ酸）の欠失および／または付加（すなわち、１つ以上のアミノ酸欠失および／または付加）を有するもの（例えば、N−末端、C−末端または内部欠失）を含む。連続アミノ酸のみが欠失する断片または一部あるいは成熟サポリンに比べて非連続アミノ酸が欠失する断片または一部も構想される。サポリンの種々の機能的改変体が調製され得る。例えば、アミノ末端伸長を含むサポリン−６の融合タンパク質は、調製され、ウサギ網状赤血球溶解物アッセイにおいて完全なリボソーム阻害活性を保持することが示される。(Barthelemy, I.ら、J. Biol. Chem. 268:6541-6548 (1993)) 。活性部位残基、Tyr72、Tyr120、Glu176、Arg179またはTrp208（配列番号：６５のアミノ酸７２、１２０、１７６、１７９または２０８）をアラニンで置換した改変体またはサポリン−６は、インビトロアッセイにおいて低下した細胞毒性活性を有した。(Bagga, S.ら、J. Biol. Chem. 278:4813-4820 (2003)) 。したがって、サポリンのさらなる機能的改変体を調製することが望ましい場合、活性部位残基の所望される変異、置換、置換、欠失または修飾は避けられるべきである。好ましくは、天然に存在する成熟ポリペプチドより少ないアミノ酸を含むサポリンの機能的改変体は、少なくとも活性部位を含む。例えば、天然に存在する成熟サポリン−６より少ないアミノ酸を含むサポリン−６の改変体は、成熟サポリン−６の活性部位残基（Tyr72、Tyr120、Glu176、Arg179およびTrp208（配列番号：６５のアミノ酸７２、１２０、１７６、１７９および２０８））を含み、少なくとも約１３７アミノ酸長、少なくとも約１５０アミノ酸長、少なくとも約１７５アミノ酸長、少なくとも約２００アミノ酸長、少なくとも約２２５アミノ酸長または少なくとも約２５０アミノ酸長である。
【００２４】
サポリンの「機能的改変体」は、リボソーム不活性化活性（例えば、ｒRNA  N-グリコシダーゼ活性）および／または細胞毒性活性を有する。このような活性は、周知のウサギ網状赤血球溶解物を使用するタンパク質合成の阻害または任意の腫瘍細胞株を使用する周知の細胞毒性アッセイのような任意の適切な方法を使用して容易に評価され得る(例えば、Bagga, S.ら、J. Biol. Chem. 278:4813-4820 (2003)およびBarthelemy, I.ら、J. Biol. Chem. 268:6541- 6548 (1993)を参照)。
【００２５】
いくつかの態様において、サポリンの機能性改変体は、成熟サポリン−６（配列番号：６５）と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２６】
本発明は、薬物およびインビボで血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含むポリペプチド結合部分を含む薬物組成物に関する。血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片を含む薬物組成物に関して、詳細に本明細書中に記載されるように、薬物およびポリペプチド結合部分は、互いに共有結合的または非共有結合により結合され得る。いくつかの態様において、薬物組成物は、ポリペプチド薬物およびインビボで血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗原結合部位を含むポリペプチド結合部分を含む融合タンパク質である。他の態様において、薬物組成物は、インビボで血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗原結合部位を含むポリペプチド結合部分に共有結合または非共有結合により結合される薬物を含む。
【００２７】
典型的には、インビボで血清半減期を増加するポリペプチドは、インビボで天然に存在し、所望されない物質を生物体（例えば、ヒト）から除去する内因性機構による分解または除去を阻止するポリペプチドである。例えば、インビボで血清半減期を増加するポリペプチドは、細胞外マトリクス由来のタンパク質、血液に見出されるタンパク質、血液脳関門または神経組織に見出されるタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚または骨に局在化されるタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的タンパク質、あるいはFc輸送に関与するタンパク質から選択され得る。
【００２８】
インビボで血清半減期を増加する適切なポリペプチドとしては、例えば、トランスフェリンレセプター特異的リガンド−神経薬剤融合タンパク質（米国特許５，９７７，３０７を参照、その教示は、参照として本明細書中に援用される）、脳毛細血管内皮細胞レセプター、トランスフェリン、トランスフェリンレセプター（例えば、可溶性トランスフェリンレセプター）、インスリン、インスリン様成長因子１（IGF1）レセプター、インスリン様成長因子２（IGF２）レセプター、インスリンレセプター、血液凝固因子X、α１−抗トリプシンおよびHNF１αが挙げられる。血清半減期を増加する適切なポリペプチドとしてはまた、α−１糖タンパク質（オロソムコイド；AAG）、α−１抗キモトリプシン（ACT）、α−１ミクログロブリン（タンパク質HC；AIM）、抗トロンビンIII（AT III）、アポリポタンパク質A-1（Apo A-1）、アポリポタンパク質B（Apo B）、セルロプラスミン（Cp）、補体成分C3(C3)、補体成分C４(C４)、C1エステラーゼインヒビター（C1 INH）、C−反応性タンパク質（CRP）、フェリチン（FER）、ヘモペキシン（HPX）、リポタンパク質（a）(Lp（a）)、マンノース結合タンパク質（MBP）、ミオグロビン（Myo）、プレアルブミン（トランスサイレチン；PAL）、レチノール結合タンパク質（RBP）およびリウマチ因子（RF）が挙げられる。
【００２９】
細胞外マトリクス由来の適切なタンパク質としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチンが挙げられる。コラーゲンは、細胞外マトリクスの主要なタンパク質である。約１５の型のコラーゲン分子が現在公知であり、体の種々の部分で見られ、例えば、骨、皮膚、腱、靭帯、角膜、内器官に見出されるI型コラーゲン（体のコラーゲンの９０％を占める）または軟骨、脊椎板、脊索および眼の硝子体液に見られるII型コラーゲンである。
【００３０】
血液由来の適切なタンパク質としては、例えば、血漿タンパク質（例えば、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲン（例えば、フィブリノーゲンA、フィブリノーゲンB）、血清アミロイドタンパク質A、ハプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびβ−２−ミクログロブリン）、酵素および酵素インヒビター（例えば、プラスミノーゲン、リソゾーム、シスタチンC、α−１−抗トリプシンおよび膵臓トリプシンインヒビター）、免疫グロブリンタンパク質（例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫グロブリン軽鎖（κ／λ））のような免疫系のタンパク質、輸送タンパク質（例えば、レチノール結合タンパク質、α−１ミクログロブリン）、ディフェンシン（例えば、β−ディフェンシン１、好中球ディフェンシン１、好中球ディフェンシン２および好中球ディフェンシン３）などが挙げられる。
【００３１】
血液脳関門または神経組織で見出される適切なタンパク質としては、例えば、メラノコルチンレセプター、ミエリン、アスコルビン酸トランスポーターなどが挙げられる。
【００３２】
インビボで血清半減期を増加する適切なポリペプチドとしてはまた、腎臓に局在化するタンパク質（例えば、ポリシスチン、IV型コラーゲン、有機アニオントランスポーターK1、ヘイマンの抗原）、肝臓に局在化するタンパク質（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、G２５０）、肺に局在化するタンパク質（例えば、IgAに結合する分泌性成分）、心臓に局在化するタンパク質（例えば、拡張型心筋症に関連するHSP27）、皮膚に局在化するタンパク質（例えば、ケラチン）、骨形成活性を示すタンパク質のトランスホーミング成長因子βスーパーファミリーの部分集団である形態発生的タンパク質（BMP）のような骨特異的タンパク質（例えば、BMP−２、BMP−４、BMP−５、BMP−６、BMP−７、BMP−８）、腫瘍特異的タンパク質（例えば、トロホブラスト抗原、ハーセプチンレセプター、エストロゲンレセプター、カテプシン（例えば、肝臓および脾臓で見出され得るカテプシンB））が挙げられる。
【００３３】
適切な疾患特異的タンパク質としては、LAG-3（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテゲリンリガンド（OPGL; Nature 402, 304-309 (1999)を参照）、OX40（活性化T細胞上で発現され、ヒトT細胞白血病ウイルスI型（HTLV-I）産生細胞において特異的に上方調節されるTNFレセプターファミリーのメンバー；Immunol. 165 (l):263-70 (2000)を参照）を含む、活性化T細胞上でのみ発現される抗原が挙げられる。適切な疾患特異的タンパク質としてはまた、例えば、ショウジョウバエCG6512、ヒトパラプレギン（paraplegin）、ヒトFtsH、ヒトAFG3L2、マウスftsHを含むメタロプロテアーゼ（関節炎／癌に関連する）；ならびに酸性線維芽細胞成長因子（FGF-1）、塩基性線維芽細胞成長因子（FGF-２）、脈管内皮細胞成長因子／脈管透過性因子（VEGF/VPF）、トランスホーミング成長因子α（TGFα）、腫瘍壊死因子−α（TNF-α）、アンジオゲニン、インターロイキン−３（IL-3）、インターロイキン−８（IL-８）、血小板由来内皮性成長因子（PD-ECGF）、胎盤成長因子（P1GF）、ミッドカイン血小板由来成長因子−BB（PDGF）、およびフラクタルカインを含む脈管成長因子が挙げられる。
【００３４】
インビボでの血清半減期を増加する適切なポリペプチドとしてはまた、熱ショックタンパク質（HSP）のようなストレスタンパク質が挙げられる。HSPは通常、細胞内に見出される。これらが細胞外に見出される場合、細胞が死滅し、その内容物がこぼれることが指標となる。このプログラムされない細胞死（壊死）は、細胞外HSPが外傷、疾患または損傷の結果として免疫系から応答を引き起こす場合に生じる。細胞外HSPへの結合は、本発明の組成物の疾患部位への局在化を生じる。
【００３５】
Fc輸送に関与する適切なタンパク質としては、例えば、ブランベルレセプター（FcRBとしても公知）が挙げられる。このFcレセプターは、２つの機能を有し、この両方は、送達に潜在的に有用である。機能は、胎盤を通る母から子へのIgGの輸送（１）およびIgGの分解からの保護、それによる血清半減期の増加（２）である。該レセプターは、IgGをエンドソームから再生利用すると考えられる(Holligerら、Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997)を参照)。
【００３６】
本発明の薬物組成物は、インビボでの血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含む任意のポリペプチド結合部分を含み得る。好ましくは、ポリペプチド結合部分は、単独の分子実体として、少なくとも３１、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０のアミノ酸、少なくとも約９０のアミノ酸、少なくとも約１００のアミノ酸または少なくとも約１１０のアミノ酸を含む。好ましくは、ポリペプチド結合部分は、少なくとも約５ｍM  KD（KD=Koff(Kd)/Kon(ka)）のKDでインビボでの血清半減期を増加するポリペプチドを結合する。いくつかの態様において、ポリペプチド結合部分は、表面プラズモン共鳴によって決定される場合（例えば、BIACORE装置を使用して）、約１０〜約１００ｎM、または約１００ｎM〜約５００ｎM、または約５００ｎM〜約５ｍMのKDでインビボでの血清半減期を増加するポリペプチドを結合する。特定の態様において、ポリペプチド結合部分は、約５０ｎM、または約７０ｎM、または約１００ｎM、または約１５０ｎM、または約２００ｎMのKDでインビボでの血清半減期を増加するポリペプチドを結合する。
【００３７】
好ましくは、インビボでの血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含むポリペプチド結合部分は、原核生物または細菌のポリペプチドまたはペプチドではない。好ましくは、ポリペプチド結合部分は、真核生物、哺乳類またはヒトのポリペプチドまたはペプチドである。
【００３８】
特定の態様において、インビボでの血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含むポリペプチド結合部分は、折り畳まれたタンパク質ドメインである。他の態様において、ポリペプチド結合部分は、単独の分子実体として、少なくとも約４KDa、少なくとも約４．５KDa、少なくとも約５KDa、少なくとも約５．５KDa、少なくとも約６KDa、少なくとも約６．５KDa、少なくとも約７KDa、少なくとも約７．５KDaまたは少なくとも約８KDaの分子量を有する。
【００３９】
インビボでの血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含む適切なポリペプチド結合部分は、適切な付着アッセイにおいて、天然に存在するポリペプチドまたは天然に存在しないポリペプチドのスクリーニングによるなどの任意の適切な方法を使用して同定され得る。本明細書中に記載される場合、インビボでの血清半減期を増加するポリペプチドに対する抗原結合部位を有する好ましいポリペプチド結合部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片である。しかし、インビボで血清半減期を増加する他のポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片は、本発明において使用され得る。
【００４０】
所望される場合、インビボで血清半減期を増加するポリペプチドを結合する１つ以上の抗体の相補性決定領域（CDR）またはその抗原結合断片は、抗体または抗原結合断片の抗原結合特異性を保持する非免疫グロブリン構造に形式を定められ得る。本発明の薬物組成物は、非免疫グロブリン結合部分等を含み得る。このような非免疫グロブリン結合部分は、任意の適切な方法を使用して調製され得、例えば、SpAのような天然の細菌レセプターは、CDRの接ぎ合わせのための骨格として使用され、エピトープを特異的に結合するポリペプチド結合部分を生成する。この手順の詳細は、米国特許出願５，８３１，０１２に記載され、その教示は、参照として本明細書中に援用される。他の適切な骨格は、フィブロネクチンおよびアフィボディー（affibody）に基づく骨格を含む。適切な手順の詳細は、WO98/58965に記載される。他の適切な骨格は、van den Beukenら、J. MoI. Biol. 310:591-601 (2001)に記載されるようなリポカリンおよびCTLA4ならびに例えば、細菌のGroELまたは他のシャペロンポリペプチドの環構造に基づく、WO00/69907(Medical Research Council)に記載されるような骨格を含む。
【００４１】
いくつかの態様において、本発明の薬物組成物は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する非免疫グロブリン結合部分を含み、ここで、非免疫グロブリン結合部分は、本明細書中に記載される１、２または３つのCDRのVH、VκまたはVHHならびに適切な骨格を含む。特定の態様において、非免疫グロブリン結合部分はCDR3を含むが、本明細書中に記載されるCDR1またはCDR2のVH、VκまたはVHHおよび適切な骨格を含まない。他の態様において、非免疫グロブリン結合部分はCDR1およびCDR2を含むが、本明細書中に記載されるCDR３のVH、VκまたはVHHおよび適切な骨格を含まない。他の態様において、非免疫グロブリン結合部分は、本明細書中に記載されるCDR1、CDR2およびCDR3のVH、VκまたはVHHおよび適切な骨格を含む。他の態様において、薬物組成物は、本明細書中に記載されるCDR3のVH、VκまたはVHHおよび薬物のみを含む。
【００４２】
本発明の薬物組成物は、薬物融合体、薬物結合体および非共有結合薬物結合体について、本明細書中で記載される方法のような適切な方法を使用して調製され得る。さらに、本発明の薬物組成物は、薬物融合体、薬物結合体および非共有結合薬物結合体に関して、本明細書中に詳細に記載される利点および有用性を有する。
【００４３】
本発明は、薬物単独（結合されていない薬物、融合されていない薬物）に比べて、改善された薬物動態学的特性（例えば、血清半減期の増加）および他の利点を有する薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を提供する。薬物結合体、非共有結合薬物結合体および薬物融合体は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片および１つ以上の所望される薬物を含む。
【００４４】
本明細書中で記載される場合、本発明の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、薬物単独に比べた場合、劇的に長くなったインビボ血清半減期および／または増加したAUCを有し得る。さらに、薬物の活性は、一般的に薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）において実質的に変更されない。しかし、薬物単独と比べての薬物組成物の活性のいくらかの変化は、許容され、一般的に薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の改善された薬物動態学的特性によって補償される。例えば、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、薬物単独より低い親和性で薬物標的を結合し得るが、薬物組成物の改善された薬物動態学的特性（例えば、長くなったインビボ血清半減期、より大きなAUC）のために、薬物単独に比べてほぼ等価またはより高い効力を有し得る。さらに、より少ない量の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体および薬物融合体）は、所望される治療または診断効果を達成するために投与され得る。好ましくは、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の活性は、約１００倍以下、または約５０倍以下、または約１０倍以下、または約５倍以下、または約４倍以下、または約３倍以下、または約２倍以下、薬物単独の活性と異なる。例えば、薬物は、１ｎMのKD、Kiまたは中性化用量５０（ND５０）を有し得、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、約２ｎM、または約３ｎM、または約４ｎM、または約５ｎM、または約１０ｎMのKD、KiまたはND５０を有し得る。
【００４５】
好ましくは、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の活性は、薬物の活性に比べた場合、実質的に減少しない。特定の態様において、薬物組成物の活性は、薬物の活性に比べて、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下減少するか、または実質的に変化しない。代替的にいわれる場合、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、薬物の活性の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％を保持するかまたは薬物と実質的に同じ活性を保持する。好ましくは、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）および薬物の活性は、「薬物基準」で決定および／または比較される。
【００４６】
本明細書中に記載され、示される場合、本発明の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、薬物単独より大きな活性（例えば、インビボ活性）を有し得る。例えば、実施例６に示されるように、薬剤が体重あたり同じ用量（１０ｍｇ/Kgまたは１ｍｇ/Kg）で投与された場合、マウスモデルでの関節炎の処置においてDOM7ｍ−１６/IL-1raは、IL-1raより効果的であった。DOM7ｍ−１６/IL-1raは、その分子量がIL-1raの分子量の約２倍であるが、より効果的であった。したがって、DOM7ｍ−１６/IL-1raを受容したマウスは、IL-1raを受容したマウスに比べて約半分のIL-1raのみ（DOM7ｍ−１６/IL-1ra中の部分として）を受容する。
【００４７】
特定の態様において、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、薬物より大きな活性（例えば、インビボ活性）を有し、例えば、薬物組成物は、薬物の活性の少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％または少なくとも約５００％を有し得る。好ましくは薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）および薬物の活性は、「薬物基準」で決定および／または比較される。薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）および薬物の活性は、適切なインビトロまたはインビボ系を使用して決定され得る。特定の態様において、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、インビボで決定される場合、それが含む薬物より大きな活性を有する。他の態様において、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、インビトロで決定される場合、それが含む薬物より大きな活性を有する。
【００４８】
血清アルブミンに対して結合特異性を有するドメイン抗体（ｄAb）を含む薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、さらに利点を提供する。ドメイン抗体は、非常に安定であり、抗体および他の抗体の抗原結合断片に比べて小さく、大腸菌（E.coli）または酵母（例えば、ピキアパストリス（Pichia pastoris））における発現によって高収率で産生され得、本明細書中に記載される場合、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片は、ヒト起源のライブラリーまたは任意の所望の種から容易に選択され得る。したがって、血清アルブミンを結合するｄAbを含む薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、一般的に哺乳類細胞において産生される治療剤より容易に産生され得、免疫原性でないｄAbが使用され得る（例えば、ヒトｄAbは、ヒトにおける疾患を処置または診断するための薬物融合体または薬物結合体に対して使用され得る）。
【００４９】
薬物の免疫原性は、薬物が、血清アルブミンを結合するポリペプチド結合部分（例えば、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片）を含む薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の一部である場合、減少され得る。したがって、薬物は、（薬物単独より）低い免疫原性であり得るかまたは血清アルブミンを結合するポリペプチド結合部分を含む薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の情況において実質的に非免疫原性であり得る。したがって、このような薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、被検体の免疫系による抗薬物抗体の同化による効力の最小の損失を伴って、経時的に繰り返し被験体に投与され得る。
【００５０】
さらに、本明細書中に記載される薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、薬物単独に比べて増加した安全性プロフィールおよびより少ない副作用を有し得る。例えば、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片の血清アルブミン結合活性の結果として、薬物融合体および結合体（薬物結合体、非共有結合薬物結合体）は、血管循環において増加した残存時間を有する。さらに、結合体および薬物融合体は、実質的に血液脳関門を越え得ず、全身投与（例えば、脈管投与）の後中枢神経系に蓄積し得ない。したがって、神経毒性または所望されない向精神性効果を有する薬物を含む結合体（薬物結合体、非共有結合薬物結合体）および薬物融合体は、薬物単独に比べてより高い安全性および減少した副作用を伴って投与され得る。同様に、結合体（薬物結合体、非共有結合薬物結合体）および薬物融合体は、薬物単独より特定の器官（例えば、腎臓または肝臓）に対して減少した毒性を有し得る。本明細書中で記載される結合体および薬物融合体はまた、血管循環において薬物または薬物を結合する標的（例えば、毒素）を隔離し、それによって、組織に対する薬物または標的の効果を減少する（例えば、毒素の効果を阻害する）ために使用され得る。
【００５１】
薬物動態学的分析およびインビボ半減期の決定のための適切な方法は、当該分野で周知である。例えば、Kenneth, Aら、Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPetersら、Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)においてこのような方法は記載される。参照はまた、ｔαおよびｔβ半減期（ｔ1/2α、ｔ1/2β）ならびに曲線下面積（AUC）のような薬物動態学的パラメーターを記載する、Marcel Dekkerにより出版された「Pharmacokinetics」, M Gibaldi & D Perron, 第２改訂版. edition (1982)にもなされる。
【００５２】
半減期（ｔ1/2αおよびｔ1/2β）およびAUCは、結合体または融合体の血清濃度対時間の曲線から決定され得る。WinNonlin分析パッケージ(Pharsight Corp., Mountain View, CA 94040, USAから入手可能)は、例えば、曲線の雛形を作るために使用され得る。第一相（α相）において、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、患者において、いくらかの排出と共に主に分配を受ける。第二相（β相）は、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）が分配され、薬物組成物が患者から除去されるにつれて血清濃度が減少する終末相である。ｔα半減期は、第一相の半減期であり、ｔβ半減期は、第二相の半減期である。したがって、本発明は、１５分以上の範囲の半減期を有する、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）または本発明に従う薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む組成物を提供する。１つの態様において、範囲の下のほうの端は、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間または１２時間である。さらに、または、あるいは、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）または本発明に従う組成物は、１２時間以下の範囲のｔα半減期を有する。１つの態様において、範囲の上のほうの端は、１１、１０、９、８、７、６または５時間である。適切な範囲の例は、１〜６時間、２〜５時間または３〜４時間である。
【００５３】
有利には、本発明は、２．５時間以上の範囲のｔβ半減期を有する薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を提供する。１つの態様において、範囲の下のほうの端は、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間または１２時間である。いくつかの態様において、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、２１日以下の範囲のｔβ半減期を有する。１つの態様において、範囲の上のほうの端は、１２時間、２４時間、２日、３日、５日、１０日、１５日または２０日である。特定の態様において、本発明に従う薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、１２〜６０時間の範囲のｔβ半減期を有する。さらなる態様において、それは、１２〜４８時間の範囲にある。さらなる態様において、それは、１２〜２６時間の範囲にある。
【００５４】
上記基準に対してさらに、または、あるいは、本発明は、０．０１ｍｇ分/ｍL以上または１ｍｇ分/ｍL以上の範囲のAUC値（曲線下面積）を有する薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を提供する。１つの態様において、範囲の下のほうの端は、０．０１、０．１、１、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ分/ｍLである。特定の態様において、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、６００ｍｇ分/ｍLまでの範囲のAUCを有する。１つの態様において、範囲の上のほうの端は、５００、４００、３００，２００、１５０、１００，７５または５０ｍｇ分/ｍLである。他の態様において、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、以下からなる群から選択される範囲のAUCを有する：１５〜１５０ｍｇ分/ｍL、１５〜１００ｍｇ分/ｍL、１５〜７５ｍｇ分/ｍL、１５〜５０ｍｇ分/ｍL、０．０１〜５０ｍｇ分/ｍL、０．１〜５０ｍｇ分/ｍL、１〜５０ｍｇ分/ｍL、５〜５０ｍｇ分/ｍLおよび１０〜５０ｍｇ分/ｍL。
【００５５】
本発明は、薬物およびインビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含むポリペプチド結合部分を含む薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）に関する。薬物組成物の好ましい態様において、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含むポリペプチド結合部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する。
【００５６】
いくつかの態様において、薬物組成物は、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含むポリペプチド結合部分に共有結合される薬物を含む。これらの態様において、薬物は、アミノ末端、カルボキシル末端または適切なアミノ酸側鎖（例えば、リジンのεアミノ基）による等の、任意の適切な位置でポリペプチド結合ドメインに共有結合される。
【００５７】
他の態様において、薬物組成物は、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含むポリペプチド結合部分に非共有結合により結合される薬物を含む。このような態様において、薬物は、抗原結合断片に直接的（例えば、静電相互作用、疎水性相互作用によって）かまたは間接的（例えば、相補的結合パートナー（例えば、ビオチンおよびアビジン）の非共有結的結合によって、ここで、１つのパートナーは、薬物に共有結合され、相補的結合パートナーは抗原結合断片に共有結合される）に非共有結合により結合される。相補的結合パートナーが使用される場合、結合パートナーの１つは、直接的にかまたは適切なリンカー部分を介して薬物に共有結合され得、相補的結合パートナーは、直接的にかまたは適切なリンカー部分を介してポリペプチド結合ドメインに共有結合され得る。
【００５８】
他の態様において、薬物組成物は、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含むポリペプチド結合部分およびポリペプチド薬物を含む融合タンパク質である。融合タンパク質は、第一の部分として、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含むポリペプチド結合部分を含む連続的ポリペプチド鎖および第二の部分として、ポリペプチド鎖の不連続部分として存在するポリペプチド薬物を含む。第一および第二の部分は、互いに、ペプチド結合によって直接結合され得るか、または適切なアミノ酸もしくはペプチドもしくはポリペプチドリンカーを介して結合され得る。さらなる部分（例えば、第三、第四）および／またはリンカー配列は、適切な場合存在し得る。第一の部分は、N-末端位置、C-末端位置または第二の部分（すなわち、ポリペプチド薬物）に比べて内部に存在し得る。特定の態様において、融合タンパク質は、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含む１つ以上のポリペプチド結合部分および１つ以上のポリペプチド薬物部分を含む。これらの態様において、融合タンパク質は、同じまたは異なり得る１〜約１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）のポリペプチド薬物部分および同じまたは異なり得るインビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含む１〜約２０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）のポリペプチド結合部分を含み得る。
【００５９】
インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合部分およびポリペプチド薬物部分は、任意の所望の位置に存在し得る。例えば、アミノ末端からカルボキシル末端に進行する場合、該部分は、以下の順に存在し得る：１つ以上のポリペプチド結合部分、１つ以上のポリペプチド薬物部分、１つ以上のポリペプチド結合部分。別の例において、アミノ末端からカルボキシル末端に進行する場合、該部分は、以下の順で存在し得る：１つ以上のポリペプチド結合部分、１つ以上のポリペプチド薬物部分、１つ以上のポリペプチド結合部分、１つ以上のポリペプチド薬物部分、１つ以上のポリペプチド結合部分。本明細書中に記載される場合、ポリペプチド結合部分およびポリペプチド薬物部分は、互いにペプチド結合を介して直接結合され得るか、または適切なアミノ酸、もしくはペプチドもしくはポリペプチドリンカーを介して結合され得る。
【００６０】
特定の態様において、融合タンパク質は、以下の式（アミノ末端からカルボキシ末端）を有する連続的ポリペプチド鎖である：
a-(P)n2-b-(X)n1-c-(Q)n3-dまたはa-(Q)n3-b-(X)n1-c-(P)n2-d
式中、Xは、ポリペプチド薬物であり；
PおよびQは、各々独立して、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含むポリペプチド結合部分であり；
a、b、cおよびdは、各々独立して、存在しないかまたは１〜約１００のアミノ酸残基であり；
n1、n2およびn3は、それぞれ、X、PまたはQ部分が存在する数を示し；
n1は、１〜約１０であり；
n2は、０〜約１０であり；および
n3は、０〜約１０であり、
ただし、n2およびn3の両方は、０ではなく；
ただし、n1およびn2の両方が１でありn3が０である場合、Xは、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない。
【００６１】
いくつかの態様において、n2は、１、２、３、４、５または６であり、n3は０である。他の態様において、n3は、１、２、３、４、５または６であり、n2は、０である。他の態様において、n1、n2およびn3は、各々１である。
【００６２】
特定の態様において、Xは、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない。
【００６３】
好ましい態様において、PおよびQは、各々独立して、血清アルブミンに対して結合特異性を有するポリペプチド結合部分である。
【００６４】
特に好ましい態様において、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含むポリペプチド結合部分を含み、ここで、ポリペプチド結合ドメインは、血清アルブミンに結合特異性を有する抗体の抗原結合断片である。
【００６５】
本発明はまた、薬物のインビボ血清半減期を増加する方法に関し、方法は、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に薬物を結合し、それによって薬物に比べてより長いインビボ血清半減期を有する薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）が産生される工程を包含する。
【００６６】
いくつかの態様において、方法は、薬物の活性を実質的に減少せずに薬物のインビボ血清半減期を増加するためであり、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に薬物を結合し、それによって薬物に比べてより長いインビボ血清半減期を有し、少なくとも該薬物の約９０％の活性を有する薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）が産生される工程を包含する。
【００６７】
他の態様において、方法は、薬物のインビボ血清半減期を増加し、薬物の免疫原性を減少するためであり、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に薬物を結合し、それによって薬物に比べてより長いインビボ血清半減期を有し、該薬物より免疫原性が低い薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）が産生される工程を包含する。
【００６８】
他の態様において、方法は、薬物の活性を実質的に減少させずに薬物の免疫原性を減少するためであり、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に薬物を結合し、それによって該薬物より低い免疫原性であり、少なくとも該薬物の約９０％の活性を有する薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）が産生される工程を包含する。
【００６９】
他の態様において、方法は、薬物のインビボ血清半減期を増加し、薬物の活性を実質的に減少せずに薬物の免疫原性を減少するためであり、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に薬物を結合し、それによって該薬物に比べてより長いインビボ血清半減期を有し、該薬物より低い免疫原性であり、少なくとも該薬物の約９０％の活性を有する薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）が産生される工程を包含する。
【００７０】
薬物およびインビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分は、本明細書中に記載されるように、リンカーの使用のありなしで共有結合（例えば、ペプチド結合）または非共有結合を介して結合され得る。いくつかの態様において、薬物およびインビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分は、共有結合を介して結合される。例えば、作製される薬物組成物は、薬物結合体または薬物融合体である。他の態様において、薬物およびインビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分は、非共有結合を介して結合され、薬物組成物は、非共有結合薬物結合体である。
【００７１】
該方法を使用して作製される薬物組成物は、薬物より大きな活性（例えば、インビボ活性）を有し得る。いくつかの態様において、方法は、薬物単独よりも大きな活性（例えば、インビボ活性）を有する薬物組成物を産生するためであり、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分に薬物を結合し、それによって薬物に比べてより大きな活性を有する薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）が産生される工程を包含する。このような態様において、好ましくは、薬物組成物の活性は、本明細書中で記載される場合、薬物の活性より高い。
【００７２】
好ましい態様において、ポリペプチド結合部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する。特に好ましい態様において、ポリペプチド結合部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片である。
【００７３】
特定の態様において、方法は、１つ以上のポリペプチドから該ポリペプチド結合部分（例えば、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片）を選択し、それによって、選択されたポリペプチド結合部分が、少なくとも約５ｍMのKDを有する、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドを結合する工程を包含する。
【００７４】
本発明はまた、医薬の製造のための、インビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分の使用に関し、医薬は、薬物のインビボ血清半減期を増加するために該ポリペプチド結合部分に薬物が結合される、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む。
【００７５】
いくつかの態様において、使用は、医薬の製造のためであり、医薬は、約１０％を超える薬物の活性を減少せずに薬物のインビボ血清半減期を増加するために該ポリペプチド結合部分に薬物が結合される、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む。
【００７６】
他の態様において、使用は、医薬の製造のためであり、医薬は、薬物のインビボ血清半減期を増加し、薬物の免疫原性を減少するために該ポリペプチド結合部分に薬物が結合される、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む。
【００７７】
他の態様において、使用は、医薬の製造のためであり、医薬は、約１０％を超える薬物の活性を減少せずに薬物の免疫原性を減少するために該ポリペプチド結合部分に薬物が結合される、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む。
【００７８】
他の態様において、使用は、医薬の製造のためであり、医薬は、薬物のインビボ血清半減期を増加し、約１０％を超える薬物の活性を減少せずに薬物の免疫原性を減少するために該ポリペプチド結合部分に薬物が結合される、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む。
【００７９】
薬物組成物は、本明細書中に記載されるように、リンカーの使用のありなしで共有結合（例えば、ペプチド結合）または非共有結合を介して結合される、薬物およびインビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分を含み得る。いくつかの態様において、薬物およびインビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分は、共有結合を介して結合される。例えば、薬物組成物は、薬物結合体または薬物融合体であり得る。他の態様において、薬物およびインビボ血清半減期を増加するポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチド結合部分は、非共有結合を介して結合され、薬物組成物は、非共有結合薬物結合体である。
【００８０】
特定の態様において、使用は、医薬の製造のためであり、医薬は、薬物より活性（例えば、インビボ活性）を増加するためにポリペプチド結合部分に薬物が結合される薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む。このような態様において、好ましくは、薬物組成物の活性は、本明細書中に記載される場合、薬物の活性より大きい。
【００８１】
好ましい態様において、ポリペプチド結合部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する。特に好ましい態様において、ポリペプチド結合部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片である。
【００８２】
血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片
本発明の薬物結合体、非共有結合薬物結合体および薬物融合体は、１つ（すなわち１つ以上）の、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片を含む。抗原結合断片は、薬物結合体または薬物融合体が投与される動物の血清アルブミンに対して結合特異性を有し得る。好ましくは、抗原結合断片は、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する。しかし、獣医学的適用が企図され、抗原結合断片は、所望の動物由来の血清アルブミン、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、ミンクなど由来の血清アルブミンに対して結合特異性を有し得る。いくつかの態様において、抗原結合断片は、１つを超える種由来の血清アルブミンに対して結合特異性を有する。例えば、本明細書中に記載されるように、ラット血清アルブミンおよびマウス血清アルブミンに対して結合特異性を有するヒトｄAbならびにラット、マウスおよびヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するｄAbが産生される（表１および図７）。このようなdＡｂは、同じ薬物結合体または薬物融合体を使用する臨床前研究および臨床研究を可能にする利点を提供し、適切な代用薬物融合体または薬物結合体を用いた臨床前研究を実施する必要を不要にする。
【００８３】
本発明の使用のために適切な抗原結合断片としては、例えば、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片（単鎖Fv(scＦｖ)およびジスルフィド結合されたFvが挙げられる）、単鎖可変ドメイン、およびdＡｂ（VH、VL)が挙げられる。このような抗原結合断片は、必要な切断特異性を有するペプシン、パパインまたは他のプロテアーゼを使用する抗体のタンパク質分解によるあるいは組換え技術を使用するような任意の適切な方法を使用して産生され得る。例えば、Fv断片は、適切なプロテアーゼを用いて抗体を消化するか、または組換えDNA技術を使用することによって調製され得る。例えば、２〜約２０のグリシル残基のような適切なペプチドリンカーによって連結される軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする核酸が、調製され得る。核酸は、任意の適切な技術（例えば、トランスフェクション、形質転換、感染）を使用して適切な宿主（例えば、大腸菌）に導入され得、宿主は、単鎖Fv断片の発現に適切な条件下で維持され得る。種々の抗体の抗原結合断片は、１つ以上のストップコドンが天然の停止部位の上流に導入される抗体遺伝子を使用して調製され得る。例えば、免疫グロブリン重鎖のF(ab')2部分をコードする発現構築物は、重鎖のヒンジ領域をコードする配列の３’末端で翻訳停止コドンを導入することによって設計され得る。本発明の薬物結合体、非共有結合薬物結合体および薬物融合体は、血清アルブミンを結合する個々の抗体の重鎖および軽鎖または血清アルブミンを結合する個々の鎖の一部（単鎖VH、VκまたはVλ）を含み得る。
【００８４】
所望の血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）を結合する抗体またはその抗原結合断片は、天然または人工の抗体の適切な集団から選択されるか、適切な宿主において適切な免疫原に対して惹起され得る。例えば、血清アルブミン（例えば、単離または精製されたヒト血清アルブミン）または血清アルブミンのペプチド（例えば、少なくとも約８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、３３、３５、３７または４０アミノ酸残基を含むペプチド）を用いて適切な宿主（例えば、マウス、ヒト抗体トランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、非ヒト霊長類（例えば、サル））を免疫化することによって惹起され得る。血清アルブミンを結合する抗体および抗原結合断片はまた、ファージディスプレイライブラリーのような組換え抗体または抗原結合断片のライブラリーから選択され得る。このようなライブラリーは、天然または人工のアミノ酸配列を含む抗体または抗体の抗原結合断片を含み得る。例えば、ライブラリーは、人工的CDR（例えば、ランダムなアミノ酸配列）およびヒトフレームワーク領域を含むFab断片を含み得る(例えば、米国特許6,300,064 (Knappikら)を参照)。他の例において、ライブラリーは、１つ以上のCDRにおいて配列多様性を有するscＦｖ断片またはdAb（単鎖VH、単鎖VκまたはVλ）を含む。(例えば、WO 99/20749 (TomlinsonおよびWinter), WO 03/002609 A2 (Winterら), WO 2004/003019A2 (Winterら)を参照)。
【００８５】
血清アルブミンを結合する適切な抗体およびその抗原結合断片としては、例えば、ヒト抗体およびその抗原結合断片、ヒト化抗体およびその抗原結合断片、キメラ抗体およびその抗原結合断片、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）抗体およびその抗原結合断片、ならびにカメリド（Camelid）抗体およびその抗原結合断片が挙げられる。特定の態様において、薬物結合体、非共有結合薬物結合体および薬物融合体は、血清アルブミンを結合するカメリド（Camelid）VHHを含む。カメリド（Camelid）VHHは、天然では軽鎖が欠けている重鎖抗体由来の免疫グロブリン単鎖可変ドメインポリペプチドである。このような抗体は、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含むカメリド（Camelid）種において生じる。VHH分子は、IgG分子より約１０倍小さく、単鎖ポリペプチドとして非常に安定であり、極端なpＨおよび温度条件に耐性である。血清アルブミンを結合する適切なカメリド（Camelid）VHHは、WO2004/041862(Ablynx N.V.) および本明細書中（図１５および配列番号：７７〜８８）に開示されるものを含む。特定の態様において、カメリド（Camelid）VHHは、ヒト血清アルブミンを結合し、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８３、配列番号：８４、配列番号：８５、配列番号：８６、配列番号：８７、配列番号：８８と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列同一性は、好ましくは、BLAST P(KarlinおよびAltschul, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87(6):2264-2268 (1990))のような適切な配列アライメントアルゴリズムおよびデフォルトパラメーターを使用して決定される。
【００８６】
免疫化抗原の調製ならびにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製は、任意の適切な技術を使用して実施され得る。種々の方法が記載されている。(例えば、Kohlerら、Nature, 256: 495-497 (1975)およびEur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976); Milsteinら、Nature 266: 550-552 (1977); Koprowskiら、米国特許4,172,124; Harlow, E.およびD. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer '94), Ausubel, F.M.ら、編、(John Wiley & Sons: New York, NY), 11章, (1991)を参照)。一般的にモノクローナル抗体が所望される場合、ハイブリドーマは、不死化細胞株（例えば、SP2/0、P3X63Ag8.653のようなミエローマ細胞株またはヘテロミエローマ）由来の適切な細胞を抗体産生細胞と融合させることによって産生される。抗体産生細胞は、ヒト、ヒト抗体トランスジェニック動物または目的の抗原で免疫化される他の適切な動物の末梢血あるいは、好ましくは、脾臓またはリンパ節から得られ得る。ヒト起源の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生する細胞は、適切な方法、例えば、ヒト抗体産生細胞とヘテロミエローマまたはトリオーマとの融合、あるいはエプスタイン−バーウイルスでの感染による活性化B細胞の不死化を使用して産生され得る。(例えば、米国特許6,197,582 (Trakht); Niedbalaら、Hybridoma, 17:299-304 (1998); Zanella ら、J Immunol Methods. 156:205-215 (1992); Gustafsson ら、Hum Antibodies Hybridomas, 2:26-32 (1991)を参照。)  融合または不死化された抗体産生細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を使用して単離され、限定希釈によってクローン化され得る。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適切なアッセイ（例えば、ELISA）を使用して同定され得る。
【００８７】
抗体はまた、ヒト、ヒト抗体トランスジェニック動物または目的の抗原で免疫化される他の適切な動物の単離された抗原特異的抗体産生細胞（例えば、末梢血あるいは好ましくは所望の特異性を有する抗体を産生すると決定された脾臓またはリンパ節由来の細胞）から直接調製（例えば、合成またはクローン化）され得る(例えば、米国特許5,627,052 (Schrader)を参照)。
【００８８】
薬物結合体、非共有結合薬物結合体または薬物融合体がヒトへの投与のためである場合、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）を結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体あるいはそのような抗体の抗原結合断片であり得る。このような型の抗体および抗原結合断片は、ヒトにおいて低い免疫原性であるか、または非免疫原性であり、周知の利点を提供する。例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体の抗原結合断片を含む薬物結合体、非共有結合薬物結合体または薬物融合体は、薬物結合体または薬物融合体に結合するヒト抗体の同化によって、（他の完全に免疫原性の抗体に比べて）より低い効力の損失または効力の損失なしで、ヒトに繰り返し投与され得る。薬物結合体、非共有結合薬物結合体または薬物融合体が獣医学的投与に対して意図される場合、類似の抗体または抗原結合断片が使用され得る。例えば、マウスまたはヒト抗体由来のCDRは、ウマまたはウシのような所望の動物からフレームワーク領域に接合され得る。
【００８９】
ヒト抗体およびそれをコードする核酸は、例えば、ヒトまたはヒト抗体トランスジェニック動物から得られ得る。ヒト抗体トランスジェニック動物（例えば、マウス）は、XENOMOUSE (Abgenix, Fremont, CA)、HUMAB-MOUSE, KIRIN TC MOUSEまたはKM-MOUSE (MEDAREX, Princeton, NJ)のようなヒト抗体のレパートリーを産生し得る動物である。一般的に、ヒト抗体トランスジェニック動物のゲノムは、機能的再配列を受け得るヒト免疫グロブリン座由来のDNAを含む導入遺伝子を含むように変更されている。ヒト抗体トランスジェニック動物中の内因性免疫グロブリン座は、内因性遺伝子によってコードされる抗体を産生する動物の能力を除去するように破壊または欠失され得る。ヒト抗体トランスジェニック動物を産生するための適切な方法は、当該分野で周知である。(例えば、米国特許5,939,598および6,075,181 (Kucherlapatiら)、米国特許5,569,825、5,545,806、5,625,126、5,633,425、5,661,016および5,789,650 (Lonbergら), Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-2555 (1993), Jakobovitsら、Nature, 362: 255-258 (1993), Jakobovitsら、WO 98/50433, Jakobovitsら、WO 98/24893, Lonbergら、WO 98/24884, Lonbergら、WO 97/13852, Lonbergら、WO 94/25585, Lonbergら、EP 0 814 259 A2, Lonbergら、GB 2 272 440 A, Lonbergら、Nature 368:856-859 (1994), Lonbergら、Int Rev Immunol 13(l):65-93 (1995), Kucherlapatiら、WO 96/34096, Kucherlapatiら、EP 0 463 151 Bl, Kucherlapatiら、EP 0 710 719 Al, Suraniら、米国特許5,545,807, Bruggemannら、WO 90/04036, Bruggemannら、EP 0 438 474 Bl, Taylorら、Int. Immunol 6(4)579-591 (1994), Taylorら、Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992), Greenら、Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendezら、Nature Genetics 15:146-156 (1997), Tuaillonら、Proc Natl Acad Sci USA 90(8):3720-3724 (1993)ならびにFishwildら、Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996)を参照、前述の各々の教示は、その全体を参照によって本明細書中に援用される。)
【００９０】
ヒト抗体トランスジェニック動物は、適切な抗原（例えば、ヒト血清アルブミン）を用いて免疫化され得、抗体産生細胞は、従来の方法を使用してハイブリドーマを形成するように単離および融合され得る。所望の特性（例えば、特異性、親和性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマは、任意の適切なアッセイ（例えば、ELISA）を使用して同定され、所望される場合、適切な培養技術を使用して選択され、サブクローン化され得る。
【００９１】
ヒト化抗体および他のCDRグラフティング抗体は、任意の適切な方法を使用して調製され得る。CDRグラフティング抗体のCDRは、血清アルブミンを結合する適切な抗体（ドナー抗体といわれる）に由来し得る。適切なCDRの他の供給源は、ヒトあるいはげっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類（例えば、サル）のような非ヒト供給源またはライブラリーから得られる天然および人工の血清アルブミン特異的抗体を含む。
【００９２】
ヒト化抗体のフレームワーク領域は、好ましくはヒト起源であり、ドナー抗体の抗原結合領域の類似または等価領域（例えば、重鎖可変領域または軽鎖可変領域）に配列類似性を有する任意のヒト抗体可変領域に由来し得る。ヒト起源のフレームワーク領域の他の供給源は、ヒト可変領域コンセンサス配列を含む。(例えば、Kettleborough, C.A.ら、Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carterら、WO 94/04679; Kabat, E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)を参照。) 他の型のCDRグラフティング抗体は、ウマ、ウシ、イヌ、ネコなど由来の生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされるフレームワーク領域のような適切な起源のフレームワーク領域を含み得る。
【００９３】
ヒト起源のフレームワーク領域は、ヒトまたは動物起源のフレームワーク領域におけるアミノ酸残基をドナー抗体の対応する位置由来の残基と置換した「復帰突然変異」のようなアミノ酸置換または交換を含み得る。１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入および置換を含むフレームワーク領域の１つ以上の変異が、なされ得る。改変体は、非ヒトドナーまたはアクセプターヒト鎖の突然変異誘発を含む種々の適切な方法によって産生され得る。(例えば、米国特許5,693,762 (Queenら)および5,859,205 (Adairら)を参照、全教示は、参照によって本明細書中に援用される。) 
【００９４】
抗体、抗体鎖（例えば、重鎖、軽鎖）またはその断片もしくは一部の定常領域は、存在する場合、任意の適切な供給源に由来し得る。例えば、ヒト、ヒト化および特定のキメラの、抗体、抗体鎖（例えば、重鎖、軽鎖）またはその断片もしくは一部の定常領域は、存在する場合、ヒト起源のものであり得、任意の適切なヒト抗体または抗体鎖に由来し得る。例えば、ヒト起源の定常領域またはその一部は、対立遺伝子改変体を含む、ヒトκ軽鎖またはλ軽鎖および／あるいはヒトγ重鎖（例えば、γ１重鎖、γ２重鎖、γ３重鎖、γ４重鎖）、μ重鎖、α重鎖（例えば、α１重鎖、α２重鎖）、δ重鎖またはε重鎖に由来し得る。特定の態様において、抗体または抗原結合断片（例えば、ヒト起源の抗体、ヒト抗体）は、機能（例えば、エフェクター機能）を変更または調整するアミノ酸置換または交換を含み得る。例えば、ヒト起源の定常領域（例えば、γ１定常領域、γ２定常領域）は、相補的活性および／またはFcレセプター結合を低下するように設計され得る。(例えば、米国特許5,648,260 (Winterら), 5,624,821 (Winterら)および5,834,597 (Tsoら)、その全教示は、参照によって本明細書中に援用される。) 好ましくは、このようなアミノ酸置換または交換を含むヒト起源の定常領域のアミノ酸配列は、ヒト起源の変更されない定常領域のアミノ酸配列に全長で少なくとも約９５％同一であり、より好ましくは、ヒト起源の変更されない定常領域のアミノ酸配列に全長で少なくとも約９９％同一である。
【００９５】
ヒト化抗体、CDRグラフティング抗体またはヒト化抗体もしくはCDRグラフティング抗体の抗原結合断片は、任意の適切な方法を使用して調製され得る。いくつかのこのような方法が、当該分野で周知である。(例えば、米国特許5,225,539 (Winter)、米国特許5,530,101 (Queenら)。) ヒト化抗体またはCDRグラフティング抗体（例えば、CDR、フレームワーク、定常領域）の一部は、適切な抗体から得られるかまたはそれに直接由来する（例えば、部分のデノボ合成）か、あるいは、所望の特性（例えば、血清アルブミンを結合する）を有する抗体またはその鎖をコードする核酸は、産生および発現され得る。鎖の一部を調製するために、１つ以上の停止コドンが、所望の位置に導入され得る。例えば、ヒト化可変領域またはCDR接合可変領域をコードする核酸（例えば、DNA）配列は、PCR突然変異誘発法を使用して現存するDNA配列を変更するように構築され得る。(例えば、Kamman, M.ら、Nucl Acids Res. 17:5404 (1989)を参照。) 新規のCDRをコードするPCRプライマーは、同じまたは非常に類似するヒト可変領域に基づく以前にヒト化された可変領域のDNAテンプレートにハイブリダイズされ得る(Sato, K.ら、Cancer Research 53:851-856 (1993))。 類似のDNA配列がテンプレートとしての使用のために利用可能でない場合、可変領域配列をコードする配列を含む核酸は、合成オリゴヌクレオチドから構築され得る。(例えば、Kolbinger, F., Protein Engineering 8:971-980 (1993)を参照)。シグナルペプチドをコードする配列はまた、核酸に組み込まれ得る（例えば、合成の際にベクターへの挿入によって）。アクセプター抗体由来の天然のシグナルペプチド配列、別の抗体由来のシグナルペプチド配列または他の適切な配列が使用され得る(例えば、Kettleborough, C. A., Protein Engineering 4:773- 783 (1991)を参照)。これらの方法または他の適切な方法を使用して、改変体は、容易に産生され得る。１つの態様において、クローン化された可変領域は、突然変異誘発され、所望の特異性を有する改変体をコードする配列が選択され得る（例えば、ファージライブラリーから；例えば、米国特許5,514,548 (Krebberら)およびWO 93/06213 (Hoogenboomら)を参照。) 
【００９６】
血清アルブミンを結合する抗体または抗原結合断片は、キメラ抗体またはキメラ抗体の抗原結合断片であり得る。キメラ抗体またはその抗原結合断片は、１つの種（例えば、マウス）由来の可変領域および別の種（例えば、ヒト）由来の定常領域の少なくとも一部を含む。キメラ抗体またはキメラ抗体の抗原結合断片は、任意の適切な方法を使用して調製され得る。いくつかの適切な方法が、当該分野で周知である。(例えば、米国特許4,816,567 (Cabillyら)、米国特許5,116,946 (Caponら)を参照。) 
【００９７】
血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片を得るための好ましい方法は、抗原結合断片のレパートリーから所望の血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗原結合断片（例えば、scＦＶ、dＡｂ）を選択する工程を包含する。例えば、本明細書中に記載される場合、血清アルブミンを結合するdＡｂは、適切なファージディスプレイライブラリーから選択され得る。多くの適切なバクテリオファージディスプレイライブラリーおよび選択方法（例えば、一価ディスプレイ系および多価ディスプレイ系）が記載されている。(例えば、Griffithsら、米国特許6,555,313 Bl (参照によって本明細書中に援用される); Johnsonら、米国特許5,733,743 (参照によって本明細書中に援用される); McCaffertyら、米国特許5,969,108 (参照によって本明細書中に援用される); Mulligan-Kehoe、米国特許5,702,892 (参照によって本明細書中に援用される); Winter, G.ら、Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994); Soumillion, P.ら、Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994); Castagnoli, L.ら、Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001); WO 99/20749 (TomlinsonおよびWinter); WO 03/002609 A2 (Winterら); WO 2004/003019A2 (Winterら)を参照。) バクテリオファージライブラリーにおいて提示されたポリペプチドは、糸状ファージ（例えば、ｆｄ、M13、F1）、溶解性ファージ（例えば、T4、T7、λ）、またはRNAファージ（例えば、MS2）のような任意の適切なバクテリオファージ上に提示され、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に対する結合について選択され得る。
【００９８】
一般的に、適切なファージコートタンパク質との融合タンパク質としてポリペプチドのレパートリーをディスプレイするファージのライブラリーが使用される。このようなライブラリーは、提示された抗体またはその抗原結合断片をコードするファージベクターまたはファージミドベクターを適切な宿主細菌に導入し、得られた細菌を培養し、（例えば、所望される場合、適切なヘルパーファージまたは相補的プラスミドを使用して）ファージを産生することのような任意の適切な方法を使用して産生され得る。ファージのライブラリーは、沈殿または遠心分離のような任意の適切な方法を使用してこのような培養物から回収され得る。
【００９９】
ライブラリーは、任意の所望される量のアミノ酸配列の多様性を含む抗体またはその抗原結合断片のレパートリーを含み得る。例えば、レパートリーは、所望の生物体由来の天然に存在する抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片を含み得、および／またはランダムまたはランダム化されたアミノ酸配列（例えば、CDR配列）の１つ以上の領域を含み得る。このようなレパートリーまたはライブラリー中の抗体またはその抗原結合断片は、ランダムまたはランダム化されたアミノ酸配列の規定される領域および共通アミノ酸配列の領域を含み得る。特定の態様において、レパートリー中の全てまたは実質的に全てのポリペプチドは、所望の型の抗体の抗原結合断片（例えば、ヒトVHまたはヒトVL）である。例えば、レパートリー中の各ポリペプチドは、VH、VLまたはFv(例えば、単鎖Fv)を含み得る。
【０１００】
アミノ酸配列の多様性が、任意の適切な方法を使用して、抗体またはその抗原結合断片の任意の所望の領域に導入され得る。例えば、アミノ酸配列の多様性は、任意の適切な突然変異誘発法（例えば、低忠実度PCR、オリゴヌクレオチド媒介性または部位特異的突然変異誘発、NNKコドンを使用する多様化）または任意の他の適切な方法を使用して、多様化した抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸のライブラリーを調製することによって、抗体可変ドメインの相補性決定領域のような標的領域に導入され得る。所望される場合、多様化されるべき抗体またはその抗原結合断片の領域は、ランダム化され得る。
【０１０１】
適切なファージディスプレイライブラリーは、血清アルブミンを結合し、他の有利な特性を有する選択された抗体または抗体の抗原結合断片に対して使用され得る。例えば、アンフォールドされた場合、凝集に耐える抗体または抗原結合断片が、選択され得る。凝集は、ポリペプチド濃度によって影響を受け、多くの場合、部分的に折り畳まれたまたはアンフォールドされた中間体から生じると考えられる。部分的に折り畳まれた中間体を好む因子および条件、例えば、高い温度および高いポリペプチド濃度は、不可逆な凝集を促進する。(Fink, A.L., Folding & Design 3:R1-R23 (1998)。) 例えば、凍結乾燥された調製物のような濃縮された形態で精製されたポリペプチドを保存することは、少なくとも一部のポリペプチドの不可逆な凝集をしばしば生じる。また、大腸菌のような生物学的系における発現によるポリペプチドの産生は、凝集したポリペプチドを含む封入体の形成をしばしば生じる。封入体から活性ポリペプチドを回収することは、非常に困難であり、生物学的産生系に対して再折り畳み工程のようなさらなる工程の付加を必要とし得る。
【０１０２】
加熱された場合、凝集に耐え、可逆的にアンフォールドする抗体および抗原結合断片は、適切なファージディスプレイライブラリーから選択され得る。一般的に、提示された抗体またはその抗原結合断片のレパートリーを含むファージディスプレイライブラリーは、提示された抗体またはその抗原結合断片の少なくとも一部がアンフォールドされる温度（Ts）まで加熱され、次いで、Ts>Tcである温度（Tc）まで冷却され、それによって、抗体またはその抗原結合断片の少なくとも一部が再折り畳みされ、ポリペプチドの一部が凝集する。次いで、可逆的にアンフォールドし、血清アルブミンを結合する抗体またはその抗原結合断片は、温度（Tr）で回収される。可逆的にアンフォールドする回収された抗体またはその抗原結合断片は、融解温度（Tm）を有し、好ましくは、レパートリーは、Tsまで加熱され、Tcまで冷却され、可逆的にアンフォールドする抗体またはその抗原結合断片は、Ts>Tm>TcおよびTs>Tm>TrのようなTrで単離された。一般的に、ファージディスプレイライブラリーは、約８０℃まで加熱され、選択の前に約室温または約４℃まで冷却される。可逆的にアンフォールドし、凝集に耐える抗体またはその抗原結合断片はまた、特定のアミノ酸残基を可逆的にアンフォールドする能力を与える残基と置換することによって設計されるか、または遺伝子操作され得る。(WO 2004/101790 (Jespers ら)、ならびに可逆的にアンフォールドする抗体またはその抗原結合断片を選択および設計または遺伝子操作するための方法の詳細な議論については、米国仮特許出願60/470,340 (2003年５月１４日に出願された)および60/554,021 (2004年３月１７日に出願された)を参照。)  WO 2004/ 101790および前述の米国仮特許出願の両方の教示は、参照によって本明細書中に援用される。) 
【０１０３】
可逆的にアンフォールドし、凝集に耐える抗体またはその抗原結合断片は、いくつかの利点を提供する。例えば、凝集に対するこれらの耐性のために、可逆的にアンフォールドする抗体またはその抗原結合断片は、大腸菌のような適切な生物学的産生系を使用する発現によって、可溶性タンパク質として高収率で容易に産生され得る。さらに、可逆的にアンフォールドする抗体またはその抗原結合断片は、処方され得、ならびに／またはより低い凝集および活性の損失を伴って従来のポリペプチドより高い濃度で保存され得る。ＤＯＭ７h−26（配列番号：２０）は、可逆的にアンフォールドするヒトVHである。
【０１０４】
好ましくは、血清アルブミンを結合する抗体またはその抗原結合断片は、１つ以上のフレームワーク領域（FR）が（a）ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、（ｂ）ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続するアミノ酸、または（ｃ）ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされるアミノ酸配列を含む可変ドメイン（VH、Vκ、Vλ）を含み、ここで該フレームワーク領域は、Kabatによって規定される。特定の態様において、１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、または１つ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列がヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされる該対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列に比べて５アミノ酸未満の差異を集合的に含む。
【０１０５】
他の態様において、FR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、またはFR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列が該ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列に比べて１０アミノ酸未満の差異を集合的に含む。他の態様において、該FR1、FR2およびFR3のアミノ酸配列は、該ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じである。
【０１０６】
特定の態様において、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片は、ヒト生殖細胞系配列に基づいた免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、VH、VL）を含み、所望される場合、相補性決定領域のような１つ以上の多様化領域を有し得る。VHについての適切なヒト生殖細胞系配列は、例えば、VH遺伝子断片DP4、DP7、DP8、DP9、DP1O、DP31、DP33、DP45、DP46、DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68およびDP69ならびにJH断片JHl、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5およびJH6によってコードされる配列を含む。VLについての適切なヒト生殖細胞系配列は、例えば、Vκ遺伝子断片DPKl、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK1O、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26およびDPK28ならびにJκ断片Jκ 1、Jκ 2、Jκ 3、Jκ 4およびJκ 5によってコードされる配列を含む。
【０１０７】
特定の態様において、薬物結合体、非共有結合薬物結合体または薬物融合体は、血清アルブミンを結合するマウス、ラットおよび／またはウサギ抗体あるいはこのような抗体の抗原結合断片を含まない。
【０１０８】
抗原結合断片は、任意の所望の親和性、結合速度および解離速度で血清アルブミンを結合し得る。親和性（KD）、結合速度（Konまたはｋa）および解離速度（Koffまたはｋｄ）は、特定の薬物に対する所望の血清半減期を得るために選択され得る。例えば、慢性炎症性障害の炎症性媒介物を無効にする薬物（例えば、炎症性サイトカインを結合し、無効にするdＡｂ）に対する最長の血清半減期を得ることが、所望され得、その一方で、より短い半減期が、いくらかの毒性を有する薬物（例えば、化学療法剤）に対して所望され得る。一般的に、血清アルブミンに対する結合について、速い結合速度および速いまたは中間の解離速度が好ましい。これらの特徴を有する抗原結合断片を含む薬物結合体および薬物融合体は、投与された後に血清アルブミンを迅速に結合し、血清アルブミンを解離し、迅速に再結合する。これらの特徴は、薬物の迅速な除去（例えば、腎臓を通して）を低下するが、薬物標的への効率的な送達および接近をなお提供する。
【０１０９】
血清アルブミンを結合する抗原結合断片（例えば、dＡｂ）は、一般的に、約１nM〜約５００μMのKDで結合する。いくつかの態様において、抗原結合断片は、表面プラズモン共鳴によって決定される場合（例えば、BIACORE装置を使用して）、約１０〜約１００nM、または約１００nM〜約５００nM、または５００nM〜約５mＭのKD（KD＝Koff(kd)/Kon(ka)）で血清アルブミンを結合する。特定の態様において、薬物結合体、非共有結合薬物結合体または薬物融合体は、約５０nM、または約７０nM、または約１００nM、または約１５０nM、または約２００nMのKDで、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）を結合する抗体の抗原結合断片（例えば、ｄAb）を含む。本明細書中に記載される薬物結合体、非共有結合薬物結合体および薬物融合体の改善された薬物動態学的特性（例えば、長くなったｔ１／２β、増加したAUC）は、血清アルブミンを結合する抗原結合断片の親和性と相関し得る。したがって、改善された薬物動態学的特性を有する薬物結合体、非共有結合薬物結合体および薬物融合体は、一般的に、高い親和性（例えば、約５００nM以下、約２５０nM以下、約１００nM以下、約５０nM以下、約１０nM以下、または約１nM以下、または約１００pＭ以下のKD）で血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）を結合する抗原結合断片を使用して調製され得る。
【０１１０】
好ましくは、血清アルブミンを結合する抗原結合断片に結合または融合された薬物は、表面プラズモン共鳴によって測定される場合（例えば、BIACORE装置を使用して）、血清アルブミンに対する抗原結合断片の親和性より強い親和性（KD）および／または血清アルブミンに対する抗原結合断片のKoffより速いKoff(kd)で、その標的（薬物標的）に結合する。例えば、薬物は、SAに対してSAを結合する抗原結合断片の親和性より約１〜約１０００００倍、または約１００〜約１０００００倍、または約１０００〜約１０００００倍、または約１００００〜約１０００００倍強い親和性でもってその標的を結合し得る。例えば、SAを結合する抗体の抗原結合断片は、約１０μMの親和性で結合し得、その一方で、薬物は、約１００pＭの親和性でその標的を結合する。
【０１１１】
特定の態様において、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片は、ヒト血清アルブミンを結合するdＡｂである。例えば、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：24、配列番号：25および配列番号：26からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVκ  ｄAbまたは配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22および配列番号：23からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH  ｄAbである。他の態様において、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片は、ヒト血清アルブミンを結合するdＡｂであり、前述のアミノ酸配列のいずれかのCDRを含む。他の態様において、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片は、ヒト血清アルブミンを結合するdＡｂであり、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：24、配列番号：25、配列番号：26、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22または配列番号：23と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列同一性は、好ましくは、BLAST P(KarlinおよびAltschul, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87(6):2264-2268 (1990))のような適切な配列アライメントアルゴリズムおよびデフォルトパラメーターを使用して決定される。
【０１１２】
薬物
本発明の特定の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体）は、個体に投与され得る任意の薬物（例えば、有機低分子、核酸、ポリペプチド）を含み、例えば、個体において生物学的標的分子に結合および／またはその機能を変更することによって、有利な治療または診断効果を生じ得る。本発明の他の薬物組成物（例えば、薬物融合体）は、ポリペプチドまたはペプチド薬物を含み得る。薬物融合体の好ましい態様において、薬物は、抗体鎖または抗体鎖の断片（例えば、VH、Vκ、Vλ）を含まない。
【０１１３】
本発明における使用のための適切な薬物としては、例えば、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、ラパマイシン、FK506、プレゾニドン）、抗ウイルス剤（アシクロビル、ガンシクロビル、インジナビル）、抗生物質（ペニシリン、ミノサイクリン（mynocyclin）、テトラサイクリン）、抗炎症剤（アスピリン、イブプロフェン、プレゾニドン）、細胞毒または細胞傷害性薬剤（例えば、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシンC、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（dihydroxy anthracindione）、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、１−ジヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン）および前述の任意の薬剤の類似体または相同体が挙げられる。適切な薬物としてはまた、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（decarbazine））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル（thioepachlorambucil）、CC-1065、メルファラン、カルムスチン（BSNU）、ロムスチン（CCNU）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、シスジクロロジアミン白金（II）(DDP)シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（anthramycin）（AMC））、放射性核種（例えば、ヨウ素−１２５、−１２６）、イットリウム（例えば、イットリウム−９０、−９１）およびプラセオジミウム（例えば、プラセオジミウム−１４４、−１４５）、ならびにプロテアーゼインヒビター（例えば、マトリクスメタロプロテイナーゼのインヒビター）が挙げられる。他の適切な薬物は、アンチセンス核酸およびRNAiのような核酸である。カリケアミシンはまた、本発明における使用のために適切である。
【０１１４】
適切な薬物としてはまた、麻酔薬（例えば、コデイン、ナルメフェン（nalmefene）、ナロキソン、フェンタニール、メペリジン、モルヒネ、トラマドール、プロポキシフェン、オキシコドン、メタドン、ナルブフィン）を含む鎮痛剤、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、インドメタシン、ケトロラク、アースロテック（arthrotec）、イブプロフェン、ナプロキセン、サリチル酸塩、セレコキシブ、ロフェコキシブ）、アセトアミノフェン、カプサイシン、ジコノタイド等が挙げられる。
【０１１５】
特定の態様において、薬物は、ポリペプチド毒素、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素のような毒素である。他の適切なポリペプチド薬物としては、抗体または抗体の抗原結合断片（例えば、ｄAb）、ポリペプチドアゴニスト、活性化剤、分泌促進薬、アンタゴニストあるいはインヒビターが挙げられる。例えば、ポリペプチドまたはペプチド薬物は、CD抗原、サイトカインレセプター（例えば、インターロイキンレセプター、ケモカインレセプター）、接着分子あるいは共刺激分子のような細胞表面タンパク質を結合し、アゴナイズまたはアンタゴナイズし得る。例えば、ポリペプチド薬物は、ApoE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン（Cardiotrophin）-1、CEA、CD40、CD40リガンド、CD56、CD38、CD138、EGF、EGFレセプター、ENA-78、エオタクシン（Eotaxin）、エオタクシン（Eotaxin）-2、エキソドス（Exodus）-2、FAPα、FGF-酸性、FGF-塩基性、線維芽細胞成長因子10、FLT3リガンド、フラクタルカイン（Fractalkine）(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βl、ヒト血清アルブミン、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-lα、IL-lβ、IL-Iレセプター、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72アミノ酸)、IL-8(77アミノ酸)、IL-9、IL-1O、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト成長因子-2(KGF-2)、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ミュラー阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球誘引タンパク質、M-CSF、MDC(67アミノ酸)、MDC(69アミノ酸)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67アミノ酸)、MDC(69アミノ酸)、MIG、MIP-1α、MlP-lβ、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄性前駆細胞阻害剤因子-1(MPIF-I)、NAP-2、ニューツリン（Neurturin）、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFlα、SDFlβ、SCF、SCGF、幹細胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNFレセプターI、TNFレセプターII、TNIL-I、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGFレセプター1、VEGFレセプター2、VEGFレセプター3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCCl、1-309、HER 1、HER 2、HER 3およびHER 4を含むがこれらに限定されない、サイトカイン、成長因子、サイトカインレセプター、成長因子レセプターならびに他の標的リガンドを結合し得る。このリストが決して網羅的でないことを認められたい。
【０１１６】
適切な薬物としてはまた、脳下垂体ホルモン（PTH）、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、レニン、黄体形成ホルモン放出因子(LHRH)、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)、黄体形成ホルモン(LH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、アルドステロンなどを含むホルモンが挙げられる。適切な薬物としてはまた、ケラチノサイト成長因子、インターフェロン（例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-γ）、エリトロポイエチン（EPO）、プロテアーゼ、エラスターゼ、LHRHアナログ、アゴニストおよびアンタゴニスト、κオピオイドレセプターアゴニスト（例えば、ジノルフィンA）のようなオピオイドレセプターアゴニスト、カルシトニン及びカルシトニン類似体、抗利尿ホルモン（バソプレッシン）、オキシトシンアンタゴニスト、血管作動性腸ペプチド、トロンビンインヒビター、フォン・ビルブラント因子、界面活性剤ならびに巻貝毒（例えば、ジコノタイド）が挙げられる。
【０１１７】
適切な薬物としてはまた、抗癌活性（例えば、増殖阻害、成長阻害、アポトーシス誘導、転移阻害、癒着阻害、新生血管形成阻害）を有するペプチドおよびポリペプチドが挙げられる。いくつかのこのようなペプチドおよびポリペプチドは、当該分野で公知である。(例えば、Janin Y.L., Amino Acids, 25:1-40 (2003)を参照。この参照の全教示、特にこの参照中に開示されるペプチドおよびポリペプチドは、参照によって本明細書中に援用される。) いくつかのこのようなペプチドのアミノ酸配列は、表８に示される。
【０１１８】
他の適切な薬物は、抗ウイルス活性を有するペプチドおよびポリペプチドを含む。いくつかのこのようなペプチドおよびポリペプチド、例えば、Giannecchiniら、J Viro., 77(6):3724-33 (2003); Wang, J.ら、Clin Chem (2003); Hilleman, M.R., Vaccine, 2l(32):4626-49 (2003); Tziveleka, L.A.ら、Curr Top Med Chem, 3(13):1512-35 (2003); Poritz, M.A.ら、Virology, 313(1):170-83 (2003); Oevermann, A.ら、Antiviral Res, 59(1):23-33 (2003); Cole, A.M.ら、Curr Pharm Des, 9(18):1463- 73 (2003); Pinon, J.D., ら、Virol, 77(5):3281-90 (2003); Sia, S.K.ら、Proc Natl Acad Sci USA, 99(23): 14664-9 (2002); Bahbouhi, B.ら、Biochem J, 66(Pt 3):863-72 (2002); de Soultrait, V.R.ら、J Mol Biol, 18(1):45-58 (2002); Witherell, G., Curr Opin Investig Drugs, 2(3):340-7 (2001); Ruff, M.R.ら、Antiviral Res, 52(1):63-75 (2001); Bultmann, H.ら、J. Virol, 75(6):2634-45 (2001); Egal, M.ら、Int J Antimicrob AGents, 13(1):57-60 (1999);およびRobinson, W.E., Jr., J Leukoc Biol, 63(1):94-100(1998)に開示されるペプチドおよびポリペプチドは、当該分野で公知である。これらの参照の全教示、特にこの参照中に開示されるペプチドおよびポリペプチドは、参照によって本明細書中に援用される。これらのペプチドおよびポリペプチドは、本発明の組成物、薬物融合体、薬物結合体、非共有結合薬物結合体において使用され得る薬物の例である。
【０１１９】
ポリペプチド薬物はまた、サイトカインまたは成長因子またはレセプター（例えば、サイトカインレセプター、成長因子レセプター、ホルモンレセプター）の可溶性部分または上に列挙されたポリペプチドのような他のポリペプチドであり得る。例えば、適切なポリペプチド薬物としてはまた、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト(Eisenbergら、Nature 343:341-346 (1990))、トロンボポイエチンレセプターアゴニスト(例えば、GW395058 (de Serresら、Stem Cells 17:316-326 (1999))、メラノコルチンレセプターアンタゴニスト(例えば、MCR-4 アンタゴニスト (Cepoiら、Brain Res. 1000:64-71 (2004))、アンジネックス、6DBF7 (Mayoら、J. Biol. Chem. 278:45746-45752 (2003))、ケモカイン擬似体（mimetic）(例えば、RANTES 疑似体 (Nardeseら、Nat. Struct. Biol. 8:611-615 (2001))、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、成長ホルモン類似体および成長ホルモン分泌促進薬(例えば、CP-424,391 (MacAndrewら、Eur. J. Pharmacol. 432:195-202 (2001))、成長ホルモン放出ホルモン擬似体(例えば、MK-677 (Chapmanら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 82:3455-3463 (1997))、細胞接着分子相互作用のインヒビター(例えば、LFA-1/ICAM-1, VLA-l/VCAM-1 (Yusuf-Makagiansarら、Med. Res. Rev. 22:146-167 (2002))、インターフェロンの擬似体(例えば、SYR6 (Satoら、Biochem. J. 371(Pt.2):603-608 (2003)、ハーセプチンの擬似体(Nature Biotechnol. 18:137 (2000))、抗原提示のインヒビター(Bolinら、J. Med. Chem. 43:2135-2148 (2000))、GPIIB/IIIAアンタゴニスト(例えば、FK633 (Aokiら、Thromb. Res. 81:439-450 (1996))、アルファブイベータ（alphavbeta）３アンタゴニスト(例えば、SC56631 (Englemanら、J. Clin. Invest. 99:2284-2292 (1997))、エリトロポイエチン擬似体(例えば、EMPl (Johnsonら、Biochemistry 37:3699-3710 (1998))、オピオイドレセプターアンタゴニスト(例えば、[(2S, 3R)- TMTl]DPDPE (Liaoら、J. Med. Chem. 41:4767-4776 (1998))、造血因子(例えば、エリトロポイエチン(EPO)、顆粒球コロニー刺激因子(GM-CSF))のようなレセプター（例えば、成長因子レセプター、サイトカインレセプター、ホルモンレセプター）アゴニストおよびアンタゴニストが挙げられる。
【０１２０】
さらなる適切なペプチドおよびポリペプチド薬物としては、ヒト１型IL-1レセプター（例えば、AF 11377 (FEWTPGYWQPYALPL、配列番号：56)、AFl 11869 (FEWTPGYWQJYALPL、配列番号：57 (J=l-アゼチジン-2-カルボン酸)、FEWTPGYWQJY (配列番号：58)、FEWTPGWYQJY (配列番号：59)、FEWTPGWYQJYALPL (配列番号：60)、またはアシル化されたアミノ末端および／あるいはアミノ化されたカルボキシル末端を随意に含む前述の配列のいずれか (Akesonら、J. Biol Chem. 271:30517-305123 (1996)）を結合するペプチドアンタゴニスト、TNF-α媒介性細胞傷害性のペプチドアンタゴニスト(例えば、Chirinos-Rojasら、J. Immunol. 161:5621-5626 (1998)に開示されたもの)、エリトロポイエチンレセプターのペプチドアゴニスト(例えば、McConnelら、Biol. Chem. 379:1279-1286 (1998)またはWrightonら、Science 273:458-464 (1996)に開示されたもの)、グルカゴン様ペプチド−１（GLP-1、例えば、GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-36)アミドおよびその類似体(例えば、Ritzel U.ら、J. Endocrinology 159:93-102 (1998)を参照)、およびインターフェロン(例えば、INFα, INFβ, INFγ)が挙げられる。さらに適切なポリペプチドおよびペプチド薬物としては、インテグリンインヒビター(例えば、H-Glu[シクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)]2のようなRGD ペプチド(Janssen, M.L.ら、Cancer Research 62:6146-6151 (2002))、シクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)(Kantlehner M.ら、Agnew. Chem. Int. Ed. 38:560(1999))、シクロ(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys) (Haubner, R.ら、J. Nucl. Med. 42:326-336 (2001))、サポリンのようなリボソーム不活性化タンパク質（RIP）（例えば、配列番号：６７）、マトリックスメタロプロテアーゼインヒビター(例えば、米国特許5,616,605)ならびにHIV融合インヒビターのような抗ウイルスペプチドおよびポリペプチド(例えば、T-1249およびT-20 (FUZEON（登録商標）（エンフュービルタイド; Trimeris Inc.)、ならびに免疫接着のような可溶性レセプターアンタゴニスト(例えば、LFA3-Ig、CTLA4-Ig)が挙げられる。
【０１２１】
抗菌性ポリペプチドおよびペプチド薬物はまた、本発明における使用のために適切である。適切な抗菌性ポリペプチドおよびペプチド薬物の例としては、アデノレギュリン（adenoregulin）、ダーミシジン−１L、カテリシジン（cathelicidin）（例えば、カテリシジン様ペプチド、ヒトLL-37/ｈCAP-18）、α−ディフェンシン（例えば、ヒト好中球ペプチド１（HNP-1）、HNP-２、HNP-３、HNP-４、ヒトディフェンシン５、ヒトディフェンシン６）、β−ディフェンシン（例えば、ヒトβ−ディフェンシン−１、ヒトβ−ディフェンシン−２）およびθ−ディフェンシン（例えば、θ−ディフェンシン−１）を含むディフェンシン、ヒスタチン（例えば、ヒスタチン１、ヒスタチン３、ヒスタチン５）、ラクトフェリシン由来ペプチドならびに関連するペプチドが挙げられる(Tomita M.ら、Acta Paediatr. Jpn. 36:585-591 (1994)およびStrom, M.B.ら、Biochem Cell Biol. 80:65-74 (2002)を参照)。
【０１２２】
薬物融合体
本発明の薬物融合体は、第一の部分として血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片を含み、ポリペプチド薬物である第二の部分に連結される、連続ポリペプチド鎖を含む融合タンパク質である。第一および第二の部分は、ペプチド結合を介して互いに直接結合されるか、あるいは適切なアミノ酸またはペプチドもしくはポリペプチドリンカーを介して連結され得る。さらなる部分（例えば、第三、第四）および／またはリンカー配列は、適切な場合、存在し得る。第一の部分は、第二の部分（すなわち、ポリペプチド薬物）に比べてN末端位置、C末端位置または内部に存在し得る。特定の態様において、各部分は、１コピーより多く存在し得る。例えば、薬物融合体は、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片（例えば、ヒト血清アルブミンを結合するVHおよびヒト血清アルブミンを結合するVLまたはヒト血清アルブミンを結合する２つ以上のVHもしくはVL）を各々含む２つ以上の第一の部分を含み得る。
【０１２３】
いくつかの態様において、薬物融合体は、以下の式を有する連続ポリペプチド鎖である：
a-(X)n1-b-(Y)n2-c-(Z)n3-dまたはa-(Z)n3-b-(Y)n2-c-(X)n1-d、
式中、Ｘは、第１の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬物であり；
Ｙは、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の単鎖抗原結合断片であり；
Ｚは、第２の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬物であり；
ａ、ｂ、ｃおよびｄは、各々独立して非存在であるかまたは１〜約１００アミノ酸残基であり；
ｎ１は、１〜約１０であり；
ｎ２は、１〜約１０であり；および、
ｎ３は、０〜約１０であり；
ただし、ｎ１およびｎ２が、両方１であり、ｎ３が０である場合、Ｘは、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない。
【０１２４】
１つの態様において、XもZも抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない。１つの態様において、ｎ1は１であり、ｎ３は、１であり、ｎ２は、２、３、４、５、６、７、８または９である。好ましくは、Yは、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）であるか、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）である。より好ましくは、Yは、ヒト血清アルブミンを結合するｄAb（例えば、VH、VκまたはVλ）である。特定の態様において、XまたはZは、ヒトIL-1raまたはヒトIL-1raの機能的変異体である。
【０１２５】
特定の態様において、Yは、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：24、配列番号：25および配列番号：26からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、Yは、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22および配列番号：23からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
他の態様において、薬物融合体は、部分X'およびY'を含み、ここで、X'は、ポリペプチド薬物であり、ただし、X'は、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まず、Y'は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の単鎖抗原結合断片である。好ましくは、Y'は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）であるか、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）である。より好ましくは、Y'は、ヒト血清アルブミンを結合するｄAb（例えば、VH、VκまたはVλ）である。X'は、Y’に対してアミノ末端側に位置され得るか、またはY'は、X'に対してアミノ末端側に位置され得る。いくつかの態様において、X'およびY’は、アミノ酸によってか、またはペプチドもしくは２〜約１００のアミノ酸を含むポリペプチドリンカーによって分離される。特定の態様において、X'は、ヒトIL-1raまたはヒトIL-1raの機能的改変体である。
【０１２７】
特定の態様において、Y'は、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：24、配列番号：25および配列番号：26からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、Y’は、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22および配列番号：23からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
特定の態様において、薬物融合体は、血清アルブミンおよびヒトIL-1ra（例えば、配列番号：２８）を結合するｄAbを含む。好ましくは、ｄAbは、ヒト血清アルブミンを結合し、ヒトフレームワーク領域を含む。
【０１２９】
他の態様において、薬物融合体または薬物結合体は、ヒトIL-1raの成熟１５２アミノ酸形態と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するヒトIL-1raの機能的改変体を含み、ヒトインターロイキン−１  １型レセプターをアンタゴナイズする。(Eisenbergら、Nature 343:341-346 (1990)を参照)。改変体は、１つ以上のさらなるアミノ酸を含み得る（例えば、１５３または１５４以上のアミノ酸を含む）。本発明の薬物融合体は、任意の適切な方法を使用して産生され得る。例えば、いくつかの態様は、薬物融合体をコードする核酸の適切な発現ベクターへの挿入によって生成され得る。次いで、得られた構築物は、発現のために適切な宿主細胞に導入される。発現の際、融合タンパク質は、細胞溶解物からまたは好ましくは任意の適切な方法を使用して培養培地もしくはペリプラズムから単離または精製され得る。(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M.ら編) 2巻, Suppl. 26, pp. 16.4.1-16.7.8 (1991)を参照)。
【０１３０】
適切な発現ベクターは、多くの構成要素、例えば、複製の起点、選択マーカー遺伝子、転写制御因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）および／または１つ以上の翻訳シグナルのような１つ以上の発現制御要素、シグナル配列またはリーダー配列など、を含み得る。発現制御要素およびシグナル配列は、存在する場合、ベクターまたは他の供給源によって提供され得る。例えば、抗体鎖をコードするクローン化された核酸の転写および／または翻訳制御配列は、発現を指向するために使用され得る。
【０１３１】
プロモーターは、所望される宿主細胞における発現のために提供され得る。プロモーターは、構成性（constitutive）であるかまたは誘導性であり得る。例えば、プロモーターは、核酸の転写を指向するように抗体、抗体鎖またはその一部をコードする核酸に操作可能に連結され得る。原核生物宿主（例えば、大腸菌に対するlac、tac、T3、T7プロモーター）および真核生物宿主（例えば、シミアンウイルス４０初期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長い末端反復プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター）に対する種々の適切なプロモーターが利用可能である。
【０１３２】
さらに、発現ベクターは、典型的に、ベクターを保持する宿主細胞の選択のための選択マーカー、および複製可能な発現ベクターの場合において、複製の起点（origin or replication）を含む。抗生物質または薬物耐性を与える産物をコードする遺伝子は、共通の選択マーカーであり、原核生物細胞（例えば、ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性に対するTet遺伝子）および真核生物細胞（例えば、ネオマイシン（G418またはジェネティシン）、gpt（ミコフェノール酸）、アンピシリンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子）において使用され得る。ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子は、種々の宿主においてメトトレキサートでの選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、LEU2、URA3、HIS３）は、しばしば、酵母において選択マーカーとして使用される。ウイルス（例えばバキュロウイルス）またはファージベクター、およびレトロウイルスベクターのような、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るベクターの使用もまた企図される。哺乳類細胞および原核生物細胞（大腸菌）、昆虫細胞（ドロソフィラシニエラー（Drosophila Schnieder）S2細胞、Sf9）ならびに酵母（P.メタノリカ（methanolica）、P.パストリス（pastoris）、S.セレビシエ（cerevisiae））における発現のための適切な発現ベクターは、当該分野で周知である。
【０１３３】
本明細書に記載されるような薬物融合体を発現する組換え宿主細胞および薬物融合体を調製する方法が提供される。組換え宿主細胞は、薬物融合体をコードする組換え核酸を含む。薬物融合体は、適切な宿主細胞中でタンパク質をコードする組換え核酸の発現によってかまたは他の適切な方法を使用して産生され得る。例えば、本明細書中に記載される発現構築物は、適切な宿主細胞に導入され得、得られた細胞は、構築物の発現に適切な条件下で（例えば、培養物中、動物中に）維持され得る。適切な宿主細胞は、大腸菌（E. coli）、B.サチリス（subtilis）および／または他の適切な細菌のような細菌細胞を含む原核生物のもの、真菌または酵母細胞(例えば、ピキアパストリス（Pichia pastoris）、アスペルギラス（Aspergillus）種、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）、ニューロポラクラッサ（Neurospora crassa）)または他の下等真核生物細胞ならびに昆虫由来の細胞(例えば、Sf9昆虫細胞(WO 94/26087 (O'Connor))または哺乳類(例えば、COS-1 (ATCC受付番号CRL-1650)およびCOS-7 (ATCC受付番号CRL-1651)のようなCOS細胞、CHO (例えば、ATCC受付番号CRL-9096)、293(ATCC受付番号CRL-1573)、HeLa(ATCC受付番号CCL-2)、CVl(ATCC受付番号CCL-70)、WOP (Daileyら、J. Virol. 54:739-749 (1985))、3T3、293T(Pearら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993))、NSO細胞、SP2/0、HuT 78細胞などのような高等真核生物の細胞のような真核生物のものであり得る(例えば、Ausubel, F.M.ら編 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc., (1993)を参照)。
【０１３４】
本発明はまた、薬物融合体を産生する方法を包含し、該方法は、本発明の組換え宿主細胞を薬物融合体の発現に適切な条件下で維持する工程を包含する。方法は、さらに所望される場合、薬物融合体を単離または回収する工程をさらに包含し得る。別の態様において、薬物融合体の構成要素（例えば、ヒト血清アルブミンおよびＩＬ−１raを結合するｄＡｂ）は、化学的に集められ、連続ポリペプチド鎖を作製する。
【０１３５】
結合体
別の局面において、本発明は、薬物に結合された、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片を含む結合体を提供する。このような結合体は、薬物が共有結合された、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片を含む「薬物結合体」および薬物が非共有結合により結合された、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片を含む「非共有結合薬物結合体」を含む。好ましくは、結合体は、十分安定であり、その結果、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片および薬物は、インビボ条件（例えば、ヒトに投与される場合）下で互いに実質的に結合（共有または非共有のいずれか）されたままでいる。好ましくは、結合体の約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下または実質的に０は、解離または分解し、インビボ条件下で薬物および抗原結合断片を放出する。例えば、「インビボ」条件下での安定性は、血清（例えば、ヒト血清）中３７℃で２４時間、薬物結合体または非共有結合薬物結合体をインキュベートすることによって都合よく評価され得る。このような方法の１つの例において、等量の薬物結合体および結合されていない薬物は、血清の２つの異なるガラス瓶に希釈される。各ガラス瓶の内容物の半分は、直ちに−２０℃で凍結され、他の半分は、３７℃で２４時間インキュベートされる。次いで、４つ全ての試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはウエスタンブロットのような任意の適切な方法を使用して分析され得る。ウエスタンブロットは、薬物を結合する抗体を使用して探査され得る。薬物結合物レーン中の全ての薬物は、解離がない場合、薬物結合体の大きさで泳動される。多くの他の適切な方法は、例えば、クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過、イオン交換、逆相）、ＥＬＩＳＡ、質量分析などのような適切な分析方法を使用して上記されるように調製される試料を分析することによって、「インビボ」条件下での安定性を評価するために使用され得る。
【０１３６】
薬物結合体
別の局面において、本発明は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片を含む薬物結合体および該抗原結合断片に共有結合される薬物を提供し、ただし、薬物結合体は、単一の連続ポリペプチド鎖ではない。
【０１３７】
いくつかの態様において、薬物結合体は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および該ＶＨまたはＶＬに共有結合される薬物を含み、ただし、薬物結合体は、単一の連続ポリペプチド鎖ではない。好ましくは、薬物結合体は、血清アルブミンを結合する単鎖ＶＨまたは血清アルブミンを結合する単鎖ＶＬを含む。特定の態様において、薬物結合体は、ヒト血清アルブミンを結合するＶｋ  ｄＡｂを含み、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：24、配列番号：25および配列番号：26からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、薬物結合体は、ヒト血清アルブミンを結合するＶＨ  ｄＡｂを含み、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22および配列番号：23からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
薬物結合体は、任意の所望の薬物を含み得、任意の適切な方法を使用して調製され得る。例えば、薬物は、アミノ末端、カルボキシル末端またはアミノ酸側鎖を介してのような１つ以上の位置で直接にかまたは適切なリンカー部分を介して間接的に、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片に結合され得る。１つの態様において、薬物結合体は、ヒト血清アルブミンを結合するｄＡｂおよびポリペプチド薬物（例えば、ヒトＩＬ−１raまたはヒトＩＬ−１raの機能的改変体）を含み、ポリペプチド薬物（例えば、ヒトＩＬ−１raまたはヒトＩＬ−１raの機能的改変体）のアミノ末端は、直接にかまたは適切なリンカー部分を介してかでｄＡｂのカルボキシル末端に結合される。他の態様において、薬物結合体は、ヒト血清アルブミンを結合するｄＡｂおよびｄＡｂに共有結合される２つ以上の異なる薬物を含む。例えば、第一の薬物は、ｄＡｂのカルボキシル末端に共有結合（直接的または間接的）され得、第二の薬物は、アミノ末端にまたは側鎖アミノ基（例えば、リジンのεアミノ基）を介して共有結合（直接的または間接的）され得る。このような薬物結合体は、選択的カップリングの周知の方法を使用して調製され得る。(例えば、Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)を参照)。
【０１３９】
薬物を血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片に結合させる種々の方法が使用され得る。選択される特定の方法は、結合されるべき薬物に依存する。所望される場合、末端官能基を含むリンカーは、抗原結合断片と薬物とを連結するために使用され得る。一般的に、結合は、反応性官能基を含む（または反応性官能基を含むように改変された）薬物をリンカーと反応させるかまたは血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片と直接反応させることによって達成される。適切な条件下で第二の化学基と反応し得る化学部分または官能基を含む（または含むように改変される）薬物を反応させ、それによって共有結合を形成することによって、共有結合は形成する。所望される場合、適切な反応性化学基は、任意の適切な方法を使用して抗原結合断片またはリンカーに付加され得る。(例えば、Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)を参照)。多くの適切な反応性化学基の組み合わせは、当該分野で公知であり、例えば、アミノ基は、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などのような親電子性基と反応し得る。チオールは、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル（acrylolyl）、ピリジル、ジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（TNB-チオール）などと反応し得る。アルデヒド官能基は、アミン含有またはヒドラジド含有分子と連結され得、アジド基は、三価リン酸基（phosphorous group）と反応し、ホスホラミデートまたはホスホルイミド（phosphorimide）結合を形成し得る。活性化基を分子に導入するための適切な方法は、当該分野で公知である(例えば、Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)を参照)。
【０１４０】
いくつかの態様において、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片は、２つのチオールの反応によって薬物に結合され、ジスルフィド結合を形成する。他の態様において、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片は、イソチオシアネート基および第一級アミンの反応によって薬物に結合され、イソチオ尿素結合を生成する。
【０１４１】
適切なリンカー部分は、直鎖または分枝鎖であり得、例えば、テトラエチレングリコール、Ｃ２〜Ｃ１２アルキレン、-NH-(CH2)P-NH-または-(CH2)P-NH-(式中、Pは1〜12である)、-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-、１〜約１００（好ましくは１〜約１２）アミノ酸を含むポリペプチド鎖などが挙げられる。
【０１４２】
非共有結合薬物結合体
いくつかの非共有結合（例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用）は、安定で高度に特異的な分子間結合を生成し得る。例えば、相補的結合パートナーの間で複数の非共有結合を介して達成される分子認識相互作用は、酵素のその基質への結合、抗体による抗原の認識、リガンドのそのレセプターへの結合、ならびにタンパク質およびペプチドの３次元構造の安定化のような多くの重要な生物学的相互作用の基礎となる。したがって、このような弱い非共有結合相互作用（例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用など）は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片に薬物を結合するために使用され得る。
【０１４３】
好ましくは、抗原結合断片および薬物を連結する非共有結合は、インビボ条件下（例えば、ヒトに投与される場合）で抗原結合断片および薬物が各々に実質的に結合されたままでいる十分な強さである。一般的に、抗原結合断片および薬物を連結する非共有結合は、少なくとも約１０１０Ｍ−１の強さを有する。好ましい態様において、非共有結合の強さは、少なくとも約１０１１Ｍ−１、少なくとも約１０１２Ｍ−１、少なくとも約１０１３Ｍ−１、少なくとも約１０１４Ｍ−１、または少なくとも約１０１５Ｍ−１である。ビオチンとアビジンとの間およびビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用は、多くの条件下で非常に効率が良く安定であることは公知であり、本明細書中に記載されるように、ビオチンとアビジンとの間またはビオチンとストレプトアビジンとの間の非共有結合は、本発明の非共有結合薬物結合体を調製するために使用され得る。
【０１４４】
非共有結合は、血清アルブミンに対して特異性を有する抗体の抗原結合断片と薬物との間で直接形成され得るかまたは適切な相補的結合パートナー（例えば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン）の間で形成され得、ここで、１つのパートナーは、薬物に共有結合され、相補的結合パートナーは、抗原結合断片に共有結合される。相補的結合パートナーが使用される場合、結合パートナーの１つは、直接的にまたは適切なリンカー部分を介して薬物に共有結合され得、相補的結合パートナーは、直接的にまたは適切なリンカー部分を介して血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片に共有結合され得る。
【０１４５】
相補的結合パートナーは、互いに選択的に結合する分子の対である。多くの相補的結合パートナー、例えば、抗体（またはその抗原結合断片）およびその同族の抗原またはエピトープ、酵素およびその基質、ならびにレセプターおよびそのリガンドは、当該分野で公知である。好ましい相補的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジン、ならびにビオチンおよびストレプトアビジンである。
【０１４６】
多くの相補的結合対の、血清アルブミンまたは薬物に対して結合特異性を有する抗原結合断片への直接的または間接的な共有結合は、上記のように、例えば、リンカーの使用のありなしで、反応性官能基を含む（または反応性官能基を含むように改変された）相補的結合パートナーを、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片と反応させることによって達成され得る。選択される特定の方法は、結合される化合物（例えば、薬物、相補的結合パートナー、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片）に依存する。所望される場合、末端反応性官能基を含むリンカー（例えば、ホモ二官能性リンカー、ヘテロ二官能性リンカー）は、抗原結合断片および／または薬物を相補的結合パートナーに連結するために使用され得る。１つの態様において、２つの別個の反応性部分を含むヘテロ二官能性リンカーが、使用され得る。ヘテロ二官能性リンカーが選択され得、その結果、反応性部分の１つが、血清アルブミンまたは薬物に対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片と反応し、もう１つの反応性部分は、相補的結合パートナーと反応する。任意の適切なリンカー（例えば、ヘテロ二官能性リンカー）が使用され得、多くのこのようなリンカーは、当該分野で公知であり、商業的供給源として入手可能である（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., IL)。
【０１４７】
組成物ならびに治療方法および診断方法
医薬組成物または生理学的組成物（例えば、ヒトおよび／または獣医学的投与のための）を含む本発明の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む組成物が提供される。医薬組成物または生理学的組成物は、１つ以上の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）および薬学的または生理学的に許容され得る担体を含む。典型的には、これらの担体は、生理食塩水および／または緩衝化媒体を含む水性またはアルコール性／水性溶液、乳濁液あるいは懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびにラクトリンゲル液（lactated Ringer's）を含む。適切な生理学的に許容され得るアジュバントは、懸濁液中にポリペプチド複合体を保つことが必要な場合、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩のような増粘剤から選択され得る。静脈内ビヒクルは、流体ならびに栄養素補給剤およびリンゲルのデキストロースに基づくもののような電解質補給剤を含む。抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および希ガスのような防腐剤および他の添加物はまた存在し得る(Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版)。
【０１４８】
組成物は、所望の量の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含み得る。例えば、組成物は、約５重量％〜約９９重量％の薬物結合体、非共有結合薬物結合体または薬物融合体を含み得る。特定の態様において、組成物は、約１０重量％〜約９９重量％、または約２０重量％〜約９９重量％、または約３０重量％〜約９９重量％、または約４０重量％〜約９９重量％、または約５０重量％〜約９９重量％、または約６０重量％〜約９９重量％、または約７０重量％〜約９９重量％、または約８０重量％〜約９９重量％、または約９０重量％〜約９９重量％、または約９５重量％〜約９９重量％の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含み得る。１つの例において、組成物は、凍結乾燥（freeze dried）（凍結乾燥（lyophilized））される。
【０１４９】
本明細書中に記載される薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、典型的に、慢性閉塞性肺疾患（例えば、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、気腫）、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、細菌性肺炎（例えば、スタフィロコッカスの（Staphylococcal）肺炎）のような肺炎、自己免疫障害（Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節炎（例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、狼瘡関節炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎））を含むがこれらに限定されない）、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、ベーチェット症候群および重症筋無力症、子宮内膜症、乾癬、腹部癒着（例えば、腹部外科手術後）、喘息ならびに敗血症ショックのような炎症状態（例えば、急性および／または慢性炎症性疾患）の予防、抑制または処置における使用が見出される。本明細書中に記載される薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、慢性または急性外傷疼痛、慢性または急性ニューロパシー性疼痛、急性または慢性筋骨格疼痛、慢性または急性癌疼痛などのような疼痛の予防、抑制または処置のために使用され得る。本明細書中に記載される薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）はまた、診断目的のために投与され得る。
【０１５０】
本明細書中に記載される薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を使用して、予防、抑制または処置され得る癌としては、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫）、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、結腸直腸癌、頭部および頚部癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病）、腺癌、腎臓癌、造血系（haematopoetic）癌（例えば、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害（例えば、真性赤血球増加症、本態性（または原発性）血小板血症、特発性骨髄線維症））などが挙げられる。
【０１５１】
本明細書中に記載される薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）はまた、子宮内膜症、線維症、不妊症、早産、勃起機能不全、骨粗鬆症、糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）、成長障害、ＨＩＶ感染、呼吸窮迫症候群、腫瘍および夜尿症の予防、抑制または処置における使用のために適切である。
【０１５２】
本願において、用語「予防」は、疾患の誘導の前の保護的組成物の投与を含む。「抑制」は、誘導される出来事の後であるが、疾患の臨床的出現の前の組成物の投与をいう。「処置」は、疾患症状が現れた後の保護的組成物の投与を含む。
【０１５３】
疾患に対する保護または疾患の処置において薬物組成物（例えば薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の有効性をスクリーンするために使用され得る動物モデル系が、利用可能である。感受性のマウスにおいて全身性エリテマトーデス（SLE）の試験をするための方法は、当該分野で公知である(Knightら、(1978) J Exp. Med., 147: 1653; Reinerstenら、(1978) New Eng. J. Med., 299: 515)。重症筋無力症（ＭＧ）は、別の種由来の可溶性ＡｃｈＲタンパク質を用いて疾患を誘導することにより、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスにおいて試験される(Lindstromら、(1988) Adv. Immunol., 42: 233)。関節炎は、ＩＩ型コラーゲンの注射によりマウスの感受性の系統において誘導される(Stuartら、(1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233)。アジュバント関節炎が、ミコバクテリアの熱ショックタンパク質の注射によって感受性のラットにおいて誘導されるモデルが記載される(Van Edenら、(1988) Nature, 331 : 171)。変形性関節症の治療に対する有効性は、関節炎がコラーゲナーゼの関節内注射によって誘導されるマウスのモデルにおいて評価され得る(Blom, A.B.ら、Osteoarthritis Cartilage 12:627-635 (2004))。甲状腺炎は、記載されるようにサイログロブリンの投与によってマウスにおいて誘導される(Maronら、(1980) J. Exp. Med., 152: 1115)。インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、自然に発生するかまたはKanasawaら、(1984) Diabetologia, 27: 113に記載されるマウスのようなマウスの特定の系統において誘導され得る。マウスおよびラットにおけるＥＡＥは、ヒトにおけるＭＳに対するモデルになる。このモデルにおいて、脱髄疾患は、ミエリン塩基性タンパク質の投与によって誘導される(Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischerら編 Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlinら、(1973) Science, 179: 478:およびSatohら、(1987) J. Immunol, 138: 179)。
【０１５４】
本発明の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、別々にまたは他の薬剤と共に投与される組成物として使用され得る。これらは、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチン、免疫毒素などのような種々の免疫治療薬を含み得る。医薬組成物は、本発明の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）と共に種々の細胞傷害性薬剤または他の薬剤の「カクテル」あるいは異なる薬物を含む本発明に従う薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の組み合わせを含み得る。
【０１５５】
薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、任意の適切な技術にしたがって任意の個体または被験体に投与され得る。薬物組成物および処置されるべき疾患または状態に依存して、例えば経口的、食事的、局所的、経皮的、直腸的、非経口的（例えば、静脈内、動脈内、筋内、皮下、皮内、腹腔内、クモ膜下（intrathecal）、関節内注射）、および吸入的（例えば、気管支内、鼻内または経口吸入、鼻内滴下）投与の経路を含む、投与の種々の経路が可能である。投与は、指示される場合、局所的または全身的であり得る。投与の好ましい様式は、選択された薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）および処置される状態（例えば、疾患）に依存して変化し得る。投薬量および投与の頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時の投与、反対の指示（counterindications）ならびに臨床医によって考慮されるべき他のパラメーターに依存する。薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の治療有効量が、投与される。治療有効量は、投与の条件下で所望される治療効果を達成するのに十分な量である。
【０１５６】
用語「被験体」または「個体」は、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシ科、ヒツジ科、ウマ科、イヌ科、ネコ科、げっ歯類またはマウス種を含むがこれらに限定されない哺乳類のような動物を含むように本明細書中に規定される。
【０１５７】
薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、中性化合物または塩として投与され得る。アミンまたは他の塩基性基を含む化合物（例えば、薬物組成物、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の塩は、例えば、塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などのような適切な有機酸または無機酸と反応することによって得られ得る。第四級アンモニウム基を含む化合物はまた、塩化物、臭化物、ヨウ化物、アセテート、パークロレートなどのような対イオンを含む。カルボン酸または他の酸性官能基を含む化合物の塩は、適切な塩基、例えば、水酸化物塩基と反応することによって調製され得る。酸性官能基の塩は、ナトリウム、カリウムなどのような対陽イオンを含む。
【０１５８】
本発明はまた、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の被験体（例えば、患者）への投与における使用のためのキットを提供し、該キットは、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）、薬物送達デバイスおよび随意に使用のための指示書を含む。薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、凍結乾燥された製剤のような製剤として提供され得る。特定の態様において、薬物送達デバイスは、シリンジ、吸入器、鼻内または眼の投与デバイス（例えば、霧吹き器、眼または鼻の点滴器）、および針無し注射デバイスからなる群から選択される。
【０１５９】
本発明の薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、保存のために凍結乾燥され、使用の前に適切な担体中で復元され得る。任意の適切な凍結乾燥法（例えば、スプレー乾燥、ケーキ（ｃａｋｅ）乾燥）および／または復元技術が使用され得る。凍結乾燥および復元が種々の程度の抗体活性の損失（例えば、従来の免疫グロブリンに関して、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体より大きな活性の損失を有する傾向にある）をもたらし得ることおよび使用のレベルが補償のために調整されなければいけないかもしれないことは当業者によって理解される。特定の態様において、本発明は、本明細書中に記載されるような凍結乾燥された（lyophilized）（凍結乾燥された（freeze dried））薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む組成物を提供する。好ましくは、凍結乾燥された（凍結乾燥された）薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）は、再水和される場合、その活性（例えば、血清アルブミンに対する結合活性）の約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％以下、または約４５％以下、または約５０％以下を損失する。活性は、凍結乾燥される前の薬物組成物の効果を生じるために必要とされる薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の量である。例えば、所望される期間所望される血清濃度を達成および維持するために必要とされる薬物結合体または薬物融合体の量である。薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）の活性は、凍結乾燥の前に任意の適切な方法を使用して測定され得、活性は、損失した活性の量を決定するために再水和の後同じ方法を使用して測定され得る。
【０１６０】
薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む組成物またはそのカクテルは、予防および／または治療処置のために投与され得る。特定の治療的適用において、投与の条件下で、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、殺傷、またはいくつかの他の測定可能なパラメーターのような所望される治療または予防効果を達成するのに十分な量は、「治療有効量または用量」として規定される。この投薬量を達成するために必要な量は、疾患の重症度および患者自身の免疫系の一般的状態および一般的健康に依存するが、一般的に体重１ｋｇあたり約１０μｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇまたは約０．００５〜５．０ｍｇの薬物結合体または薬物融合体にわたり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使用される。例えば、本発明の薬物組成物（例えば、薬物融合体、薬物結合体、非共有結合薬物結合体）は、毎日（例えば、一日あたり４回投与まで）、二日ごと、三日ごと、一週間に２回、一週間ごと、二週間ごと、一ヶ月ごと、または二ヵ月ごとに、例えば、約10μg/kg〜約80mg/kg、約100μg/kg〜約80mg/kg、約1mg/kg〜約80mg/kg、約1mg/kg〜約70mg/kg、約1mg/kg〜約60mg/kg、約1mg/kg〜約50mg/kg、約1mg/kg〜約40mg/kg、約1mg/kg〜約30mg/kg、約1mg/kg〜約20mg/kg、約1mg/kg〜約10mg/kg、約10μg/kg〜約10mg/kg、約10μg/kg〜約5mg/kg、約10μg/kg〜約2.5mg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kgまたは約10mg/kgの用量で投与され得る。
【０１６１】
予防的適用のために、薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む組成物またはそのカクテルはまた、同様の投薬量またはわずかにより低い投薬量で投与され得る。本発明に従う薬物組成物（例えば、薬物結合体、非共有結合薬物結合体、薬物融合体）を含む組成物は、予防および治療環境において使用され、哺乳類中の選択標的細胞集団の改変、不活性化、殺傷または除去において補助し得る。
【実施例】
【０１６２】
インターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ１−ｒａ）は、インターロイキン１  １型レセプター（ＩＬ−１Ｒ１）へのＩＬ−１結合を競合的に阻害することによってＩＬ−１の生物活性をブロックするアンタゴニストである。ＩＬ−１産生は、炎症刺激に応じて誘導され、炎症および免疫学的応答を含む種々の生理学的応答を媒介する。ＩＬ−１は、軟骨分解（degredation）および骨吸収の刺激を含む活性の範囲を有する。慢性関節リウマチ患者において、局所的に産生されたＩＬ−１の量が、増加され、天然に存在するＩＬ１−ｒａのレベルは、これらの異常に増加した量と競合するのに不十分である。メトトレキサートのような疾患改変抗リウマチ性薬物（DMARD）およびKINERET（登録商標）(anakinra, Amgen Inc)のような生物製剤を含む、ＲＡに対して利用可能ないくつかの治療薬が存在する。
【０１６３】
KINERET（登録商標）(anakinra, Amgen Inc)は、１５３アミノ酸からなるヒトインターロイキン−１レセプターアンタゴニストの組換え非グリコシル化形態であり、１７．３キロダルトンの分子量を有する。（KINERET（登録商標）(anakinra, Amgen Inc)のアミノ酸配列は、天然に存在するＩＬ−１ｒａ中の１５２アミノ酸およびＮ末端のさらなるメチオニンに対応する）。KINERET（登録商標）(anakinra, Amgen Inc)は、１つ以上のＤＭＡＲＤに失敗した１８歳以上の患者において中程度または重症の慢性関節リウマチの徴候および症状を低下させるために必要とされる。投薬量は、１００ｍｇの薬物の毎日の皮下注射の単回使用である。Ｔβ１／２は、４〜６時間であり、患者の７１％は、１４〜２８日目に注射部位反応を生じる。
【０１６４】
ここで、本出願人らは、治療用ポリペプチドを血清アルブミン結合ｄＡｂに連結することが、（ｉ）治療用ポリペプチド単独と類似する活性を有し、（ｉｉ）また、血清アルブミンを結合する化合物を生じることを示す。さらに、本発明は、治療用ポリペプチドの長期血清半減期型を作製する方法を提供する。例えば、本出願人らは、血清アルブミン結合ｄＡｂをＩＬ１−ｒａに連結し、そのことは、ＩＬ１−ｒａ単独より長い血清半減期の化合物を生じる。
【０１６５】
実施例１  マウス、ラットおよびヒト血清アルブミンを結合するドメイン抗体の選択
本実施例は、血清アルブミンに対して指向される単一のドメイン抗体（ｄＡｂ）を作製するための方法を説明する。マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に対するｄＡｂの選択が記載される。
【０１６６】
マウス血清アルブミンに対するｄＡｂを、ＷＯ２００４／００３０１９Ａ２に記載されるように選択した。３つのヒトファージディスプレイ抗体ライブラリーを使用した。各々のライブラリーは、相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）に組み込まれたＮＮＫコドンによってコードされる側鎖多様性を有するVH(V3-23/DP47およびJＨ4b)またはVκ(o12/o2/DPK9およびJｋ1)に対する単一のヒトフレームワークに基づいた。
ライブラリー 1 (VH):
位置での多様性: H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98
ライブラリーの大きさ: 6.2×109
ライブラリー 2 (VH):
位置での多様性: H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98、H99、HlOO、HlOOA、HlOOB
ライブラリーの大きさ: 4.3×109
ライブラリー 3 (Vκ):
位置での多様性: L30、L31、L32、L34、L50、L53、L91、L92、L93、L94、L96
ライブラリーの大きさ: 2×109
【０１６７】
VHおよびVκライブラリーは、それぞれ遺伝的リガンドタンパク質Ａおよびタンパク質Ｌに対する結合について前選択され、その結果、選択されたライブラリーのクローンの大部分は、機能性であった。上記されるライブラリーの大きさは、前選択後の大きさに対応する。
【０１６８】
２ラウンドの選択を、ライブラリーの各々を別個に使用して血清アルブミンに対して実施した。各々の選択について、抗原を、４ｍＬのＰＢＳで１００μｇ／ｍｌの濃度で免疫チューブ（immunotube）（ｎｕｎｃ）上にコートした。選択の第一ラウンドにおいて、３つのライブラリーの各々を、ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）またはＭＳＡ（Ｓｉｇｍａ）に対して別々に選り分けた。選択の第二ラウンドにおいて、６の第一ラウンドの選択の各々からのファージを（ｉ）再度同じ抗原（例えば、第一ラウンドＭＳＡ、第二ラウンドＭＳＡ）および（ｉｉ）交換的な抗原（例えば、第一ラウンドＭＳＡ、第二ラウンドＨＳＡ）に対して選り分け、総計１２の第二ラウンドの選択を得た。各々の場合において、第二ラウンドの選択の後、４８クローンを、ＨＳＡおよびＭＳＡに対する結合について試験した。可溶性ｄＡｂ断片を、ｓｃＦｖ断片についてHarrisonら、Methods Enzymol. 1996; 267: 83-109によって記載されるように産生させ、２％  ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳをブロッキングバッファとして使用し、結合したｄＡｂをプロテインＬ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）（Ｖκ（ＶκＳ）について）およびプロテインＡ−ＨＲＰ(Amersham Pharmacia Biotech)（ＶＨについて）のいずれかで検出することを除いて、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従った（Hoogenboomら (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133）。
【０１６９】
ＭＳＡ、ＨＳＡまたは両方への結合を示すバックグラウンドを超えるシグナルを与えるｄＡｂを、プラスチック単独への結合についてＥＬＩＳＡ不溶性形態において試験したが、全てが血清アルブミンに対して特異的であった。次いで、クローンが配列決定され（表１を参照）、２１の特有のｄＡｂ配列が同定されたことが明らかになった。選択されたＶκｄＡｂクローンの間の最小類似性（アミノ酸レベルでの）は、８６．２５％であった（（６９／８０）×１００；全ての多様化された残基が異なる場合の結果、例えば、クローン２４および３４）。選択されたＶＨｄＡｂクローンの間の最小類似性は、９４％であった（（１２７／１３６）×１００）。
【０１７０】
次に、血清アルブミン結合ｄＡｂを、それらの能力について試験し、溶液からビオチン化された抗原を捕捉した。ＥＬＩＳＡプロトコル（上記のように）を、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌプロテインＬ（Ｖκクローンについて）および１μｇ／ｍｌプロテインＡ（ＶＨクローンについて）でコートしたことを除いて続けた。可溶性ｄＡｂを、プロトコル中にあるように溶液から捕捉し、検出はビオチン化されたＭＳＡまたはＨＳＡおよびストレプトアビジンＨＲＰを用いてであった。ビオチン化されたＭＳＡおよびＨＳＡを、血清アルブミン分子あたり平均２のビオチンを達成する目的で、製造業者の指示書に従って調製した。ＥＬＩＳＡにおいて溶液からビオチン化されたＭＳＡを捕捉した２４のクローンを同定した。これらの２つ（以下のクローン２および３８）はまた、ビオチン化されたＨＳＡを捕捉した。次に、ｄＡｂを、ＣＭ５ビアコアチップ（biacore chip）上にコートされたＭＳＡを結合する能力について試験した。ビアコア上のＭＳＡを結合する８個のクローンを見出した。
【０１７１】
ヒト血清アルブミンおよびラット血清アルブミンに対するｄＡｂを、抗ＭＳＡ  ｄＡｂについてプロトコルに対する以下の改変を除き、上記されるように選択した：合成ＶＨドメインのファージライブラリーは、ＤＰ４７生殖細胞系遺伝子およびＪＨ４断片を含むヒトＶＨ３に基づくライブラリー４Ｇであった。以下の特定の位置での多様性を、CDR1:30、31、33、35; CDR2:50、52、52a、53、55、56;およびCDR3:4-12の多様化された残基:例えば、4G H11中のH95、H96、H97およびH98ならびに4G H19中のH95、H96、H97、H98、H99、H1OO、H1OOa、H1OOb、H1OOc、H1OOd、H1OOeおよびH1OOf中に突然変異誘発（ＮＮＫコドンを使用して；Ｋａｂａｔに従う番号付け）によって導入した。ＣＤＲ３の最後の３つの残基は、ＦＤＹであり、したがって、ＣＤＲ３の長さは、７〜１５残基変化する。ライブラリーは、１×１０１０を超える個々のクローンを含む。
【０１７２】
ＶＨおよびＶκライブラリーの部分集合は、それぞれ、遺伝的リガンドプロテインＡおよびプロテインＬへの結合について前選択され、その結果、選択されないライブラリー中のクローンの大部分は、機能性である。上記されるライブラリーの大きさは、前選択の後の大きさに対応する。
【０１７３】
２ラウンドの選択を、ＶＨおよびＶκライブラリーの部分集合を別々に使用してラットおよびヒト血清アルブミンに対して実施した。各々の選択について、抗原は、（ｉ）４ｍｌのＰＢＳで１００μｇ／ｍｌの濃度で免疫チューブ（ｎｕｎｃ）にコートされるかまたは（ｉｉ）ビオチン化され、次いで可溶性選択に使用され、その後、ストレプトアビジンビーズ（第一ラウンドにおいて）およびニュートラビジン（neutravidin）ビーズ（第二ラウンドにおいて）上に捕捉されるかのいずれかである。（各々のクローンの単離に使用される選択方法の詳細について表１を参照）。各々の場合において、第二ラウンドの選択の後、２４のファージクローンを、ＨＳＡまたはＲＳＡに対する結合について試験した。
【０１７４】
１つの選択においてクローンの有意な割合がファージＥＬＩＳＡにおいて陽性（positive）であった場合、次いで、この選択由来のＤＮＡを、可溶性ｄＡｂの産生のための発現ベクターにクローン化し、個々のコロニーを拾った。可溶性ｄＡｂ断片を、ｓｃＦｖ断片についてHarrisonら、(Methods Enzymol. 1996;267:83-109)によって記載されるように生成し、２％  ＴＷＥＥＮ  ＰＢＳをブロッキングバッファとして使用し、結合したｄＡｂを抗ｍｙｃ−ＨＲＰで検出したこと以外は、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従った（Hoogenboomら (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133）。次いで、ＥＬＩＳＡにおいて陽性であったクローンを、ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴装置 (Biacore  AB)を使用してＭＳＡ、ＲＳＡまたはＨＳＡに対する結合についてスクリーニングした。ＭＳＡ、ＲＳＡまたはＨＳＡに結合したｄＡｂをさらに分析した。次いで、クローンを配列決定し、特有のｄＡｂ配列を同定した。
【０１７５】
【表１】
2008500830.tif 000002
2008500830.tif 000003
【０１７６】
次いで、ＢＩＡＣＯＲＥチップ(Biacore  AB)上で血清アルブミンを結合したｄＡｂをさらに分析し、親和性についての情報を得た。分析を、血清アルブミンでコートされたＣＭ５チップ（カルボキシメチル化デキストラン基質）を使用して実施した。フローセル１は、コートされないブロックされた陰性対照であり、フローセル２は、ＨＳＡでコートされており、フローセル３は、ＲＳＡでコートされており、フローセル４は、ＭＳＡでコートされていた。血清アルブミンを、コートされた物質の５００共鳴単位（ＲＵ）を指向するようにプログラムされたＢＩＡＣＯＲＥコーティングウィザードを使用して、酢酸バッファｐＨ５．５中で固定した。目的の各々のｄＡｂを、２００ｍＬ〜５００ｍＬスケールで大腸菌のペリプラズム中で発現させ、ＶＨに対してプロテインＡストリームライン（A-streamline）親和性樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）に対するバッチ吸着（absorbtion）およびＶκについてプロテインＬ−アガロース親和性樹脂（Ａｆｆｉｔｅｃｈ，Ｎｏｒｗａｙ）に対するバッチ吸着を使用して上清から精製し、その後、グリシンでｐＨ２．２で溶出し、ＰＢＳにバッファ交換した。ｄＡｂの濃度の範囲をＢＩＡＣＯＲＥ  ＨＢＳ−ＥＰバッファ中に希釈して調製し（５ｎＭ〜５μＭの範囲で）、ビアコア（BIACORE）チップに流した。
【０１７７】
親和性（ＫＤ）を、ＫＤの領域におけるｄＡｂの濃度によって生成された線（traces）に結合速度（onrate）および解離速度（offrate）の曲線をフィッティングすることによってＢＩＡＣＯＲＥ線から計算した。血清アルブミンに対して異なる親和性の範囲を有するｄＡｂを同定した。ＤＯＭ７ｈ−８のＨＳＡに対する親和性、ＤＯＭ７ｈ−２のＨＳＡに対する親和性およびＤＯＭ７ｒ−１のＲＳＡに対する親和性は、１０〜１００ｎＭの範囲に含まれた。ＤＯＭ７ｈ−７のＨＳＡに対する親和性、ＤＯＭ７ｈ−８のＲＳＡに対する親和性およびＤＯＭ７ｈ−２６のＨＳＡに対する親和性は、１００ｎＭ〜５００ｎＭの範囲に含まれた。ＤＯＭ７ｈ−２３のＨＳＡに対する親和性およびＤＯＭ７ｈ−１のＨＳＡに対する親和性は、５００ｎＭ〜５μＭの範囲に含まれた。例の線は、図６Ａ〜６Ｃに含まれる。
【０１７８】
実施例２．ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）との融合体として抗血清アルブミン抗体の形式を定める
本実施例は、ＩＬ−１ｒａおよび血清アルブミンに結合するｄＡｂを含む融合タンパク質を作製する方法を記載する。２つの融合体が作製され、１つはＩＬ−１ｒａのＮ末端にｄＡｂを有し（ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａ）、１つはＩＬ−１ｒａのＣ末端にｄＡｂを有する（ＩＬ１−ｒａＭＳＡ１６）。融合体およびベクターの配列を図２Ｃおよび２Ｄに示す。ＭＳＡを結合しない対照融合体をまた作製し、その配列を図２Ｅに示す。
【０１７９】
KINERET (anakinra, Amgen Inc)は、４〜６時間の短い半減期を有し、推奨される投薬養生法は、毎日の注射を要求する。この養生法は、７１％の場合において１４〜２８日目に注射部位反応を導く。したがって、より長い血清半減期を有するヒトＩＬ−１ｒａの形態は、有益であり（beneficially）、効力を増加し、投薬頻度を減少し得る。これらは、両方医薬に対して所望される特性である。
【０１８０】
クローニング
簡単には、２つのマルチクローニング部位（multiple cloning sites）（ＭＣＳ）を、以下に詳述されるように設計し、Ｔ７プロモーターを有する発現ベクターに挿入した。制限部位を、ＩＬ１−ｒａ、ｄＡｂ、ＧＡＳリーダーおよびリンカーの挿入のために設計した。。１つの（ＭＣＳ１＋３）は、ＩＬ−１ｒａのＮ末端にｄＡｂを有するタンパク質をコードし、もう１つの（ＭＣＳ２＋４）は、ＩＬ−１ｒａのＣ末端にｄＡｂを有するタンパク質をコードする。
【０１８１】
ｄＡｂＩＬ１−ｒａ融合体についてのクローニング部位１＋３
NdeI、スタッファー（stuffer）、SalI、NotI、スタッファー、XhoI、BamHI
gcgcatatgttagtgcgtcgacgtcaaaaggccatagcgggcggccgctgcaggtctcgagtgcgatggatcc (配列番号：35)
【０１８２】
ＩＬ１−ｒａｄＡｂ融合体についてのクローニング部位２＋４
NdeI、スタッファー、StUI、SacI、スタッファー、SalI、NotI、TAA TAA BamHI
gcgcatatgttaagcgaggccttctggagagagctcaggagtgtcgacggacatccagatgacccaggcggccgctaataaggatccaatgc (配列番号：36)
【０１８３】
次いで、ＧＡＳリーダーを、適切な制限酵素を使用してＭＣＳを消化し、リーダーをコードするアニーリングされたプライマーをライゲーションすることによって、各ベクターに挿入する。次に、リンカーをコードするリンカーＤＮＡを、類似する手法で挿入した。ＩＬ−１ｒａをコードするＤＮＡをｃＤＮＡからのＰＣＲ（必要とされる制限部位を付加するように設計されたプライマーを使用して）によって得、ＴＯＰＯクローニングベクターに挿入した。核酸配列決定によって正しい配列を確認した後、ＩＬ−１ｒａをコードするＤＮＡを、ＴＯＰＯベクターから削り取り、リーダーおよびリンカーを含むベクターにライゲーションした。最後に、ｄＡｂをコードするＤＮＡを、ｄＡｂ発現ベクターから削り取り、挿入物（ゲル精製によって精製した）およびベクターのＳａｌＩ／ＮｏｔＩ消化によってベクターに挿入した。
【０１８４】
発現および精製
ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａ、ＩＬ１−ｒａＭＳＡ１６およびダミーＩＬ−１ｒａを大腸菌のペリプラズム中で発現させ、プロテインＬ−アガロース親和性樹脂（Ａｆｆｉｔｅｃｈ，Ｎｏｒｗａｙ）へのバッチ吸着を使用して、上清から精製し、その後、グリシンでｐＨ２．２で溶出した。次いで精製されたｄＡｂを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分析し、その後、クマシー染色した。１つのタンパク質（ＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６）について、９０％を超えるタンパク質が所望される大きさであり、したがって、さらなる精製をせずに活性について分析した。他のタンパク質（ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａおよびダミーＩＬ−１ｒａ）は、より小さなバンドが夾雑しており、したがって、ＲＥＳＯＵＲＳＥＱイオン交換カラム上ｐＨ９でＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製された。タンパク質を、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの直線塩勾配を使用して溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動による分析の後、予想された大きさのタンパク質を含む画分を合わせ、９０％を超える純度の合わせた画分を得た。このタンパク質をさらなる分析のために使用した。
【０１８５】
実施例３．インビトロＭＲＣ−５  ＩＬ−８アッセイにおけるｄＡｂ  ＩＬ１−ｒａ融合体の活性の測定
ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体を、ＭＲＣ−５細胞(ATCC受付番号CCL-171; American Type Culture Collection, Manassas, VA)におけるＩＬ−１によるＩＬ−８分泌の誘導を無効にする能力について試験した。この方法は、ＨＵＶＥＣにおけるＩＬ−１によるＩＬ−８の誘導を記載するAkeson, L.ら、(1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523から改作され、ＭＲＣ−５細胞が、ＨＵＶＥＣ細胞株の代わりに使用された。簡単には、マイクロタイタープレートに平板培養されたＭＲＣ−５細胞を、ｄＡｂＩＬ−１ｒａ融合タンパク質またはＩＬ−１ｒａ対照およびＩＬ−１（１００ｐｇ／ｍＬ）と共に一晩インキュベートした。インキュベーション後、上清を吸引し細胞を除き、ＩＬ−８濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。
【０１８６】
融合タンパク質におけるＩＬ−１ｒａの活性は、ＩＬ−８の分泌の減少を導いた。ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａ融合体の活性およびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６融合体の活性から生じるＩＬ−８の分泌の減少を、ＩＬ−１ｒａ対照(組換えヒトIL-1ra, R&D systems) についての見られた減少と比較した。試験されたタンパク質の各々の無効用量５０（ＮＤ５０）を測定し、表２に示す。
【０１８７】
【表２】
2008500830.tif 000004
【０１８８】
結果は、ＩＬ−１ｒａが抗血清アルブミンｄＡｂとの融合構築物の一部として活性なままでいたことを示す。ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａタンパク質を、その薬物動態学を評価するためにさらに研究した（ＰＫ研究）。
【０１８９】
血清アルブミン、抗ＩＬ−１ｒａサンドイッチＥＬＩＳＡ
３つのｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合体を血清アルブミンを結合する能力について試験し、同時にモノクローナル抗ＩＬ１ｒａ抗体によって検出した。試験された融合体は、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６およびダミーＩＬ−１ｒａであった。簡単には、ＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍｌのマウス血清アルブミンで一晩コートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳで５回洗浄し、次いで、４％のＭａｒｖｅｌ  ＰＢＳで１時間ブロックした。ブロッキングの後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳで５回洗浄し、次いで、４％  ＭＰＢＳ中に希釈された各ｄＡｂ、ＩＬ−１ｒａ融合体と共に１時間インキュベートした。各融合体を、１μＭ濃度でおよび７つの４倍連続希釈物でインキュベートした（すなわち、６０ｐＭまで下がる）。インキュベーションの後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳで５回洗浄し、次いで、４％  ＭＰＢＳ中に希釈された製造業者推奨の希釈のヒトＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）に対するウサギポリクローナル抗体（ａｂ−２５７３）と共に１時間インキュベートした。このインキュベーションの後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳで５回洗浄し、次いで、４％  ＭＰＢＳ中に希釈された１／２０００希釈の二次抗体（抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ）と共に１時間インキュベートした。二次抗体とのインキュベーションに続いて、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１ウェルあたり５０μｌのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ，ＭＡ）を用いて顕色し、反応を１ウェルあたり５０μｌのＨＣｌで停止した。吸収（Absorbtion）を４５０ｎｍで読み取った。
【０１９０】
ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６タンパク質の両方を、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて１μＭ濃度でバックグラウンドレベルの２倍を超えて検出した。ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａタンパク質を、３．９ｎＭまで下げた希釈においてバックグラウンドの２倍以上で検出し、その一方で、ＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６タンパク質を、５００ｎＭまで下げてバックグラウンドの２倍のみで検出した。ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体の血清アルブミンへの結合は、対照構築物（ダミーＩＬ−１ｒａ）が血清アルブミンを結合しなかったため、血清アルブミンに対して特異的であることが示された。
【０１９１】
実施例４．マウスＰＫ研究における薬物融合体の血清半減期の測定
Ａ．  ＭＳＡ結合ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質のマウスでの血清半減期の決定
ＭＳＡ結合ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質を、大腸菌のペリプラズム中で発現し、プロテインＬ−アガロース親和性樹脂(Affitech, Norway)へのバッチ吸着を使用して精製し、その後、グリシンｐＨ２．２で溶出した。融合タンパク質の血清半減期を、ＣＤ１株雄動物への約１．５ｍｇ／ｋｇでの単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射の後、マウスにおいて決定した。血清レベルの分析は、ヤギ抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）捕捉および４％ＭａｒｖｅｌでブロックされるプロテインＬ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）検出を使用するＥＬＩＳＡにより行なった。洗浄は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳを用いた。ＭＳＡ結合ｄＡｂ／ＨＡ融合体の既知の濃度の標準曲線を、試験試料との比較可能性を確実にするために１×マウス血清の存在下で設定した。ＭＳＡ結合ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質を示す１区画(compartment)モデル(WinNonlin Software, Pharsight Corp., USA)を用いたモデリングは、２９．１時間の終末相(terminal phase) ｔ1/2および５５９時間μｇ／ｍｌの曲線下面積を有した。これは、数分ほどの短時間であり得るＨＡエピトープタグペプチド単独についての予想された半減期に対する大きな改善を示す。
【０１９２】
薬物モデルとしてＨＡエピトープタグを使用するこの研究の結果は、薬物が血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片（例えば、ｄＡｂ）と薬物融合体または薬物結合体として調製される場合、薬物のインビボ血清半減期を延長し得ることを示す。
【０１９３】
抗ＭＳＡ  ｄＡｂ  ＤＯＭ７ｍ−１６およびＤＯＭ７ｍ−２６ならびにＭＳＡを結合しない対照ｄＡｂのマウスにおけるインビボ半減期をまた評価した。再度、薬物（例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド薬物）に対するモデルを供するＤＯＭ７ｍ−１６、ＤＯＭ７ｍ−２６および対照ｄＡｂは、ＨＡエピトープタグを含んだ。この研究において、ＭＳＡを結合しない対照ｄＡｂは、２０分のインビボ半減期を有し、その一方で、ＤＯＭ７ｍ−１６およびＤＯＭ７ｍ−２６のインビボ半減期は、有意に延長された（図１２）。ＤＯＭ７ｍ−１６は、さらなる研究において２９．５時間のマウスにおけるインビボ半減期を有することが見出された。
【０１９４】
別の研究において、ＨＡエピトープタグを含むＤＯＭ７ｈ−８のインビボ半減期（ｔ1/2β）を、マウスにおいて評価した。２区画モデルを用いたモデリング(WinNonlin Software, Pharsight Corp., USA)は、ＤＯＭ７ｈ−８が２９．１時間のｔ1/2βを有することを示した。
【０１９５】
薬物（例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド薬物）に対するモデルとしてＨＡエピトープタグを使用するこれらの研究の各々の結果は、薬物が血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片（例えば、ｄＡｂ）との薬物融合体または薬物結合体として調製される場合、薬物のインビボ血清半減期を劇的に延長し得ることを示す。
【０１９６】
Ｂ．  ＭＳＡ結合ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質のマウスにおける血清半減期の決定
ＭＳＡ結合ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質（ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ）を大腸菌のペリプラズム中で発現し、プロテインＬ−アガロース親和性樹脂(Affitech, Norway)へのバッチ吸着を使用して精製し、その後、グリシンｐＨ２．２で溶出した。ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ）、ＭＳＡを結合しないｄＡｂとのＩＬ−１ｒａ融合体（ダミーｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ）、およびＨＡエピトープタグに融合された抗ＭＳＡ  ｄＡｂ（ＤＯＭ７ｍ−１６ＨＡタグ）の血清半減期を、ＣＤ１株雄動物への約１．５ｍｇ／ｋｇでの単回ｉ．ｖ．注射の後、マウスにおいて決定した。
【０１９７】
血清レベルの分析は、Ｉｌ−１ｒａサンドイッチＥＬＩＳＡ(R&D Systems, USA)によった。ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａの既知の濃度の標準曲線を、試験試料との比較可能性を確実にするために１×マウス血清の存在下で設定した。モデリングを、WinNonlin薬物動態学ソフトウェア(Pharsight Corp., USA)を使用して実施した。
【０１９８】
抗ＭＳＡ  ｄＡｂとのＩＬ−１ｒａ融合体が、非ＭＳＡ結合ｄＡｂのＩＬ−１ｒａとの融合体である対照と比較される場合、有意に血清半減期を増加することが期待された。対照非ＭＳＡ結合ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合体は、短い血清半減期を有することが予想された。
【０１９９】
研究の結果は表３に示され、抗ＭＳＡ  ｄＡｂとのＩＬ−１ｒａ融合体（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ）は、ＭＳＡを結合しないｄＡｂとのＩＬ−１ｒａ融合体（ダミーｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ）より約１０倍長い血清半減期を有したことを示す。結果はまた、ダミー／ＩＬ−１ｒａ（ＡＵＣ：１．５時間μｇ／ｍｌ）と比べた場合、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ（ＡＵＣ：２６７時間μｇ／ｍｌ）に対する濃度時間曲線下面積において２００倍を超える改善（増加）が存在したことを示した。
【表３】
2008500830.tif 000005
【０２００】
これらの研究の結果は、薬物が、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片（例えば、ｄＡｂ）との薬物融合体または薬物結合体として調製される場合、薬物のインビボ血清半減期およびＡＵＣを有意に延長し得ることを示す。
【０２０１】
実施例５．ＲＳＡ結合ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質のラットにおける血清半減期の決定
抗ラット血清アルブミンｄＡｂを、大腸菌のペリプラズム中でＣ末端ＨＡタグと共に発現し、Ｖｋ  ｄＡｂについてはプロテインＬ−アガロース親和性樹脂(Affitech, Norway)に対するバッチ吸着およびＶＨ  ｄＡｂについてはプロテインＡ親和性樹脂に対するバッチ吸着を使用して精製し、その後、グリシンｐＨ２．２で溶出した。血清半減期を決定するために、４匹のラットの群に、１．５ｍｇ／ＫｇのＤＯＭ７ｒ−２７、ＤＯＭ７ｒ−３１、ＤＯＭ７ｒ−１６、ＤＯＭ７ｒ−３、ＤＯＭ７ｈ−８または関連のない抗原を結合する対照ｄＡｂ（ＨＥＬ４）で単回のｉ．ｖ．注射した。血清試料を、７日の期間にわたる尾静脈からの連続的な出血によって得、ＥＬＩＳＡプレート上にコートされたヤギ抗ＨＡ(Abecam, Cambridge UK)を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析し、その後、プロテインＡ−ＨＲＰ（ＶＨ  ｄＡｂについて）またはプロテインＬ−ＨＲＰ（Ｖκ  ｄＡｂについて）を用いて検出した。ｄＡｂの既知の濃度の標準曲線を、試験試料との比較可能性を確実にするために１×ラット血清の存在下で設定した。２区画モデルを用いたモデリング（WinNonlin薬物動態学ソフトウェア(Pharsight Corp., USA)を使用して、）を使用して、ｔ1/2βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した（表４）。ラットにおけるＨＥＬ４対照に対するｔ1/2βは、３０分までであり、得られたデータに基づいて、ＤＯＭ７ｈ−８に対するＡＵＣは、約１５０時間μｇ／ｍＬと２５００時間μｇ／ｍＬとの間であると予想される。
【表４】
2008500830.tif 000006
【０２０２】
薬物（例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド薬物）に対するモデルとしてＨＡエピトープタグを使用するこのラット研究の結果は、薬物が、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片（例えば、ｄＡｂ）との薬物融合体または薬物結合体として調製される場合、薬物のインビボ血清半減期を劇的に延長し得ることを示す。
【０２０３】
ヒトにおける半減期の予想
ヒトにおけるｄＡｂ、薬物融合体または薬物結合体のインビボ半減期は、相対成長測定学的スケーリング(allometric scaling)を使用して動物において得られた半減期データから評価され得る。３匹の動物において決定されたインビボ半減期の対数を、動物の体重の対数に対してプロットする。直線を、プロットされた点を通って引き、直線の傾きおよびｙ切片を使用し、式logY=log(a)+b log(W)を使用してヒトにおけるインビボ半減期を計算する。ここで、Ｙは、ヒトにおけるインビボ半減期であり、log(a)は、ｙ切片であり、ｂは、傾きであり、Ｗは、ヒトの体重である。直線は、約３５ｇ（例えば、マウス）、約２６０ｇ（例えば、ラット）および約２７１０ｇの体重の動物において得られたインビボ半減期データを使用して得られ得る。この計算において、ヒトの体重は、７００００ｇであるとみなし得る。マウスおよびラットにおいて得られた半減期値に基づいて、ＤＯＭ７ｈ−８のようなヒト血清アルブミンを結合するｄＡｂは、ヒトにおいて、約５．５時間〜約４０時間のｔ1/2および約１５０時間μｇ／ｍＬ〜約２５００時間μｇ／ｍＬのＡＵＣを有することが予想される。
【０２０４】
実施例６．慢性関節リウマチのマウスコラーゲン誘導関節炎モデルにおける抗ＳＡ  ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ薬物融合体の効力
慢性関節リウマチの認識された(recognized)マウスモデル（ＤＢＡ／１マウスにおけるＩＩ型コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ））における融合体ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａの効力およびＩＬ−１ｒａの効力を評価した。研究の間ずっと、マウスを、１２時間明期１２時間暗期周期を有する２０〜２４℃のＨＥＰＡ濾過スキャンテイナー（Ｓｃａｎｔａｉｎｅｒ）に収容した標準的な２つのケージ中の試験施設に維持した。食餌（Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ一般的食餌２０１６）およびＵＶ滅菌された水を随意に提供した。マウスを、研究の開始の前に少なくとも７日試験施設に移入(import)し、適切な順化を確実にした。
【０２０５】
７〜８週齢のＤＢＡ／１マウス（Taconic M and B, Domholtveg, Denmark）に、乳濁液が安定になるまで１：１の比で乳化されたＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡアジュバントおよびＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡコラーゲン（両方MD biosciences）の乳濁液で一回注射した。ビーカーの水に添加された乳濁液の滴が固体の塊を形成する場合、乳濁液は安定であると考えられた。次いで、マウスに乳濁液を注射した。
【０２０６】
乳濁液を注射した２１日後、最も進行した関節性疾患を有する２０匹の動物を研究から排除し、残ったマウスを１０匹の動物の群（各群は、５匹の雄および５匹の雌を含む）に分割した。マウスを表５に示すように処置し、全ての処置を、計算された濃度で送達し、その結果、１０ｍｌ/Ｋｇを投与した。
【表５】
2008500830.tif 000007
2008500830.tif 000008
【０２０７】
関節炎の重症度に対する臨床スコアを、２１日目〜４９日目まで、１週間に３回記録した。マウスを４９日目に安楽死させた。マウスが１２以上の関節炎スコアを示すかまたは動きに深刻な問題を有した場合、個々のマウスをより早く安楽死させた。
【０２０８】
臨床スコアリングについて、各肢を以下の基準に従ってスコアをつけ、４本全ての肢に対するスコアを加算し、マウスに対する総スコアを生じた。得られたこの方法は、各マウスについて０〜１６の点数であった。スコアリングの基準は以下であった：０＝通常；１＝足首または手首の軽いが明確な赤みおよび腫れ物、あるいは罹患した指の数に関わらず個々の指に限定される明らかな赤みおよび腫れ物；２＝足首または手首の中程度の赤みおよび腫れ物；３＝指を含む足全体の重症の赤みおよび腫れ物；４＝複数の関節を含む最高に炎症の起こった肢。
【０２０９】
群平均関節炎スコアを、個々のマウスからの臨床スコアを使用して、全ての処置日に各処置群について計算した。倫理的理由のために研究から取り除かれた任意の動物に、最大スコアの１６を指定した。群平均関節炎スコアを時間に対してプロットした（図１３）。
【０２１０】
４９日目での群平均関節炎スコアの統計的解析を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して実施した。この統計的解析は、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ（１ｍｇ／Ｋｇまたは１０ｍｇ／Ｋｇ（群３および群４）で）で処置された２つの群が生理食塩水対照群（群６）と比較する場合、４９日目に有意に改善された関節炎スコア（それぞれ、Ｐ＜１％およびＰ＜０．０５％の有意なレベルで）を有したことを示した。対照的に、１ｍｇ／ＫｇでのＩＬ−１ｒａを用いた処置（群１）は、４９日目の関節炎スコアにおいて統計的に有意な改善を生じず、その一方で、１０ｍｇ／ＫｇでのＩＬ−１ｒａを用いた処置（群２）は、Ｐ＜５％の有意レベルでの有意な改善を生じた。ENBREL（登録商標）(entarecept; Immunex Corporation)での処置（群５）は、４９日目にＰ＜１０％の有意レベルで関節炎スコアの有意な改善を生じた。
【０２１１】
１０ｍｇ／Ｋｇ投与量でＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａを用いた処置（群４）は、５ｍｇ／ＫｇでENBREL（登録商標）(entarecept; Immunex Corporation)を用いた標準的な処置（群５）に比べた場合、４９日目での関節炎スコアの改善に有効であった（Ｐ＜０．５％レベルで有意）。さらに、より低い１ｍｇ／Ｋｇ投与量でＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａを用いた処置（群３）は、同じ投与量でＩＬ−１ｒａ単独を用いた処置（群１）より、４９日目での関節炎スコアの改善により有力である（Ｐ＜１０％レベルで有意）。
【０２１２】
研究の結果は、特定のＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ投与量がこの研究においてＩＬ−１ｒａまたはENBREL（登録商標）(entarecept; Immunex Corporation)より有効であったことを示す。ＩＬ−１ｒａに対する応答は、予想されるように投与量依存性であり、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａもまた投与量依存性であった。１ｍｇ／ＫｇでＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａを用いる処置に対する平均スコアは、１０ｍｇ／ＫｇでＩＬ−１ｒａを用いる処置によって得られる平均スコアより一貫して低い。これらのプロットされた結果（図１３）は、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａを用いる処置がこの研究においてＩＬ−１ｒａより約１０倍効果的であったことを示す。
【０２１３】
ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａのすぐれた効力は、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質が重量ベースでＩＬ−１ｒａに比べて約半数のＩＬ−１レセプター結合エピトープを含む（例えば、１ｍｇのＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ（ＭＷ＝約３１．２ｋＤ）は、１ｍｇのＩＬ−１ｒａ（ＭＷ＝約１７．１ｋＤ）に比べて約半数のＩＬ−１レセプター結合エピトープを含む）けれども、観察された。
【０２１４】
この研究の結果は、血清アルブミンを結合するｄＡｂがＩＬ−１ｒａ（ＲＡに対する臨床的に証明された治療）に連結され得ることならびに得られた薬物融合体が長い血清半減期特性（ｄＡｂによって与えられた）およびＩＬ−１レセプター結合特性（ＩＬ−１ｒａによって与えられる）の両方を有することを示す。薬物融合体の血清残存時間により、ＣＩＡの処置の効果的なＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａの投与量は、ＩＬ−１ｒａに比べて劇的に減少された。
【０２１５】
この研究の結果は、延長された半減期および増加したＡＵＣの利益に加えて、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片（例えば、ｄＡｂ）との薬物融合体または薬物結合体として調製された薬物が薬物単独より利点を提供する高度に効果的な治療剤であることを示す。例えば、マウスＣＩＡモデルにおいて示されるように、より低い投与量の薬物は、効果的であり、ＩＬ−１ｒａ単独に比べてより長い期間にわたってＩＬ−１によって引き起こされる関節炎症および関節損傷を予防し、疾患の進行に対してより大きな保護を提供した。
【０２１６】
実施例７．抗ＳＡ  ｄＡｂ／サポリン非共有結合薬物結合体
リボソーム不活性化タンパク質サポリン（抗癌薬）は、変性剤およびプロテアーゼに高度に安定であり、Ｔリンパ球に対して標的化された毒素として使用される。非共有結合薬物結合体を、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介してサポリンをＤＯＭ７ｈ−８に結合することによって調製した。この非共有結合薬物結合体を用いて得られた結果は、ＤＯＭ７ｈ−８が薬物に結合された場合その血清アルブミン結合特性を保持することを示す。
【０２１７】
位置１０８のＣ末端アルギニン（配列番号：２４のアミノ酸１０８）がシステイン残基で置換されたＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓといわれる改変体ＤＯＭ７ｈ−８を、ＨＢ２１５１中での組換え核酸の発現によって調製した。細胞を増殖し、遠心分離で上清を回収する前に７２時間、一晩、発現自己誘導ＴＢレディーミックス(Merck KGa, Germany)中３０℃で誘導した。ＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓを、プロテインＬ−アガロース上の親和性捕捉を使用して上清から精製した。次いで、樹脂を１０カラム容量の２×ＰＢＳで洗浄し、ＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓを、０．１ＭグリシンｐＨ２で溶出した。溶出されたＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓを、０．２×容量のＴｒｉｓ  ｐＨ８で中和し、１ｍｇ／ｍｌまで濃縮した(CENTRICON 20 ml 濃縮器(Millipore Corp., MA)を使用して)。
【０２１８】
濃縮されたＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓを、ＮＡＰ５脱塩カラム(GE Healthcare/ Amersham Biosciences, NJ)を使用してＰＢＳにバッファ交換し、濃度を決定した。次いで、ｄＡｂをＥＺ−ＬＩＮＫスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン(Pierce Biotechnology Inc., IL)を使用してビオチン化した（第一級アミンを介して）。ビオチン化ｄＡｂを１：１のモル比でストレプトアビジン−サポリン(Advanced Targeting Systems, SanDeigo)と混合した。
【０２１９】
ｄＡｂ／サポリン複合体が形成されたことを確認するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してインタクトな複合体を検出した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、１ウェルあたり１００μｌの体積で１０μｇ／ｍｌで一晩、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，ＮＹ）の半分にコートした。一晩のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、プレート全体を２％ＰＢＳで２時間ブロックした。ブロッキングの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで２％  ＰＢＳ中に０．５μＭまで希釈されたＤＯＭ７ｈ−８／サポリン非共有結合結合体と共に１時間インキュベートした。同じＥＬＩＳＡプレート上の対照として、０．５μＭの結合されていないサポリンおよび０．５μＭの結合されていないＤＯＭ７ｈ８を、２％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳ中でインキュベートした。さらなる対照は、ＨＡＳでコートせず２％ＴｗｅｅｎでブロックしないＥＬＩＳＡプレートのウェル上でインキュベートされた同じ３つの希釈されたタンパク質であった。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、２％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳ中に希釈された１／２０００希釈のヤギ抗サポリンポリクローナル抗体(Advanced Therapeutic Systems)と共に１時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、二次検出抗体（１／２０００抗ヤギＩｇ  ＨＲＰ結合体）と共に１時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＰＢＳで１回洗浄し、紙上で軽くたたいて乾燥した。ＥＬＩＳＡを、基質として１００μｌの３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジンを用いて顕色(develop)し、反応を５０μｌの１Ｍ塩酸を用いて停止した。ＤＯＭ７ｈ−８およびサポリンの非共有結合結合体の存在を結合体のＯＤ６００を非結合部分のいずれかのＯＤ６００と比較することによって確認した。
【表６】
2008500830.tif 000009
【０２２０】
この研究の結果は、薬物が血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片に結合され得ることおよび結合された抗原結合断片が血清アルブミン結合活性を保持することを示す。さらに、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用の安定性および強さにより、結果は、血清アルブミンを結合する抗体の抗原結合断片の血清アルブミン結合活性を保持する共有結合された結合体および非共有結合により結合された結合体が調製され得ることを示す。
【０２２１】
実施例８．抗ＳＡ  ｄＡｂ／フルオレセイン結合体
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、タンパク質のアミノ、スルフヒドリル、イミダゾイル、チロシルまたはカルボニル基と架橋され得る。それは、多くの低分子薬物と大きさが比較可能である３８９Ｄａの分子量を有する。この結合体を用いて得られた結果は、抗ＳＡ  ｄＡｂが小さな化学的実体と結合される場合その血清アルブミン結合特性を維持することを示し、低分子薬物が抗ＳＡ  ｄＡｂｔｏ結合され得ることを示す。
【０２２２】
濃縮されたＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓは、実施例７に記載されるように調製された。濃縮されたｄＡｂを、ＮＡＰ５脱塩カラム(GE Healthcare/ Amersham Biosciences, NJ)を使用して５０ｍＭホウ酸ｐＨ８（カップリングバッファ）にバッファ交換し、２ｍｌCENTRICON濃縮器(Millipore Corp., MA)を使用して２．３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＦＩＴＣ(Pierce Biotechnology Inc.)を製造業者の指示書に従ってジメチルホルムアミド中１０ｍｇ／ｍｌまで希釈し、次いで、カップリングバッファ中で２４：１  ＦＩＴＣ：ｄＡｂのモル比でｄＡｂと混合した。反応を３０分間進行させた。この時点で、過剰の未反応のＦＩＴＣをＰＢＳで前もって平衡化されたＰＤ１０脱塩カラム(GE Healthcare/Amersham Biosciences, NJ)を使用して反応から除去し、ＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓ／ＦＩＴＣ結合体を、ＰＢＳを用いて溶出した。
【０２２３】
ＦＩＴＣ／ｄＡｂ結合反応が成功したことを確認するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、結合したｄＡｂを検出した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、１ウェルあたり１００μｌで１０μｇ／ｍｌで一晩、ＥＬＩＳＡプレート(Nunc, NY)のウェルの半分にコートした。一晩のインキュベーションの後、プレート全体をＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄し、次いで、全てのウェルを２％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳで２時間ブロックした。ブロッキングの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄し、次いで、２％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳ中で１μＭまで希釈されたＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓ／ＦＩＴＣと共に１時間インキュベートした。同じＥＬＩＳＡプレート上の対照として、１μＭの対照ＦＩＴＣ結合抗体および１μＭの非結合ＤＯＭ７ｈ−８を２％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳ中でインキュベートした。さらなる対照は、ＨＳＡでコートせず２％ＴｗｅｅｎでブロックしないＥＬＩＳＡプレートのウェルでインキュベートされた同じ３つの希釈されたタンパク質であった。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄し、次いで、２％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳ中に希釈された１／５００希釈のラット抗ＦＩＴＣ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）と共に１時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄し、次いで、２％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳ中に希釈された二次検出抗体（１／５０００抗ラットＩｇ  ＨＲＰ結合体）と共に１時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いて３回、ＰＢＳで１回洗浄し、紙上でたたいて乾燥した。ＥＬＩＳＡを、基質として１ウェルあたり１００μｌの３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジンを用いて顕色し、反応を５０μｌの１Ｍ塩酸を用いて停止した。ＤＯＭ７ｈ−８およびＦＩＴＣの結合結合体の存在を結合体のＯＤ６００を非結合部分のいずれかのＯＤ６００と比較することによって確認した。
【表７】
2008500830.tif 000010
【０２２４】
実施例９．抗ＳＡ  ｄＡｂ／ペプチド結合体
多くのペプチドは治療効果を有する。Ｎ−またはＣ−末端システインを有するモデルペプチドは、抗血清アルブミン  ｄＡｂに結合され得る。
【０２２５】
この場合において、以下の４つの異なるペプチドが：ペプチド１  YPYDVPDYAKKKKKKC(配列番号：68)；ペプチド２  CKKKKKKYPYDVPDYA(配列番号：69)；ペプチド３  HHHHHHKKKKKKC(配列番号：70)およびペプチド４：CKKKKKKHHHHHH (配列番号：71) 使用される。ペプチド１および２は、赤血球凝集素タグ（ＨＡタグ）の配列を含み、ペプチド３および４は、Ｈｉｓタグの配列を含む。濃縮されたＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓは、実施例７に記載されるように調製される。
【０２２６】
濃縮されたｄＡｂは、５ｍＭジチオトレイトールを用いて還元され、次いで、ＮＡＰ５脱塩カラム(GE Healthcare/Amersham Biosciences, NJ)を使用してカップリングバッファ(20 mM BisTris pH 6.5、5 mM EDTA、10%グリセロール)にバッファ交換される。システインは、ＤＭＳＯ中１００ｍＭジチオジピリジンのストックからｄＡｂ溶液に添加される最終濃度５ｍＭジチオジピリジンを使用して（それ自身とのｄＡｂ二量体化を防止するために）ブロックされる。ｄＡｂおよびジチオジピリジンは、２０〜３０分間結合するために残される。次いで、未反応のジチオジピリジンは、ＰＤ１０脱塩カラムを使用して除去され、ｄＡｂは、カップリングバッファ(20 mM BisTris pH 6.5、5 mM EDTA、10%グリセロール)中に溶出される。次いで、得られたタンパク質を必要とされるまで凍結する。
【０２２７】
ペプチド１〜４を、２００μＭの濃度で個々に水に溶解し、５ｍＭのＤＴＴを使用して還元し、次いで、ＮＡＰ５脱塩カラム(GE Healthcare/Amersham Biosciences, NJ)を使用して脱塩する。次いで、各ペプチドを、ペプチド−ｄＡｂ結合が生じるように、２０：１の比で還元およびブロックされたｄＡｂの溶液に添加する。ペプチドｄＡｂ結合反応の成功を確認するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、抗ＳＡ  ｄＡｂ／ペプチド結合体を検出する。
【０２２８】
ヒト血清アルブミンを、１ウェルあたり１００μｌの体積で１０μｇ／ｍｌで一晩、ＥＬＩＳＡプレート(Nunc, NY)にコートする。一晩のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、４％  Ｍａｒｖｅｌ  ＰＢＳで２時間ブロックする。ブロッキングの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、４％  Ｍａｒｖｅｌ  ＰＢＳ中で１μＭまで希釈されたＤＯＭ７ｈ−８／ペプチドと共に１時間インキュベートする。同じＥＬＩＳＡプレート上の対照として、２０μＭの未結合のペプチドおよび１μＭの未結合のＤＯＭ７ｈ−８を、４％  ＭＰＢＳ中でインキュベートする。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、ペプチド１および２に対するヤギ抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）の１／２０００希釈ならびに４％  Ｍａｒｖｅｌ  ＰＢＳ中に希釈されたＮｉ  ＮＴＡ−ＨＲＰ（ペプチド３および４について）の１／２０００希釈と共に１時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ヤギ抗ＨＡ抗体を有するウェルを、４％  ＭＰＢＳ中で１／２０００希釈された二次抗ヤギＨＲＰ抗体と共に１時間インキュベートする（他のウェルを１時間ブロックした）。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、紙上でたたいて乾燥する。ＥＬＩＳＡを、基質として３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジンを用いて顕色し、反応を１Ｍ塩酸を用いて停止する。ＤＯＭ７ｈ−８／ペプチド結合体の結合体の存在を、結合体のＯＤ６００を非結合部分のいずれかのＯＤ６００と比較することによって確認する。
【表８】
2008500830.tif 000011
2008500830.tif 000012
2008500830.tif 000013
2008500830.tif 000014
2008500830.tif 000015
【０２２９】
本発明をその好ましい態様に関して具体的に示し記載したが、形態および詳細の種々の変更が、添付の特許請求の範囲によって含まれる本発明の範囲から逸脱することなく本発明中になされ得ることは当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
【図１Ａ】図１Ａは、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に結合することによって選択された３つのＶκのアミノ酸配列のアライメントである。Ｖκからの整列されたアミノ酸配列は、ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号：１）ともいわれるＭＳＡ１６、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号：２）ともいわれるＭＳＡ１２およびＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号：３）ともいわれるＭＳＡ２６と称される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合することによって選択された６つのＶκのアミノ酸配列のアライメントである。Ｖκからの整列されたアミノ酸配列は、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号：４）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号：５）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号：６）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号：７）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号：８）およびＤＯＭ７ｒ−８（配列番号：９）と称される。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合することによって選択された６つのＶκのアミノ酸配列のアライメントである。Ｖκからの整列されたアミノ酸配列は、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号：１０）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号：１１）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号：１２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号：１３）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号：１４）およびＤＯＭ７ｈ−７（配列番号：１５）と称される。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ヒト血清アルブミンに結合することによって選択された７つのＶＨのアミノ酸配列のアライメントおよびコンセンサス配列である。ＶＨからの整列された配列は、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号：１６）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号：１７）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号：１８）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号：１９）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号：２０）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号：２１）およびＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号：２２）と称される。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ヒト血清アルブミンおよびラット血清アルブミンに結合することによって選択された３つのＶκのアミノ酸配列のアライメントである。Ｖκからの整列されたアミノ酸配列は、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号：２４）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号：２５）およびＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号：２６）と称される。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａともいわれる）およびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６融合体（ＩＬ−１ｒａ／ＤＯＭ７ｍ−１６ともいわれる）を発現するために使用されるベクターの概略マップである。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａともいわれる）およびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６融合体（ＩＬ−１ｒａ／ＤＯＭ７ｍ−１６ともいわれる）を発現するために使用されるベクターの概略マップである。
【図２Ｃ】図２Ｃ〜２Ｄは、ＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６融合体（ＩＬ−１ｒａ／ＤＯＭ７ｍ−１６ともいわれる）をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２７）およびその融合体のアミノ酸配列（配列番号：２８）の図解である。
【図２Ｄ】図２Ｃ〜２Ｄは、ＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６融合体（ＩＬ−１ｒａ／ＤＯＭ７ｍ−１６ともいわれる）をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２７）およびその融合体のアミノ酸配列（配列番号：２８）の図解である。
【図２Ｅ】図２Ｅ〜２Ｆは、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａともいわれる）をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２９）およびその融合体のアミノ酸配列（配列番号：３０）の図解である。
【図２Ｆ】図２Ｅ〜２Ｆは、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａともいわれる）をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２９）およびその融合体のアミノ酸配列（配列番号：３０）の図解である。
【図２Ｇ】図２Ｇ〜２Ｈは、血清アルブミンに結合しないダミーＩＬ−１ｒａ融合体をコードするヌクレオチド配列（配列番号：３１）およびその融合体のアミノ酸配列（配列番号：３２）の図解である。
【図２Ｈ】図２Ｇ〜２Ｈは、血清アルブミンに結合しないダミーＩＬ−１ｒａ融合体をコードするヌクレオチド配列（配列番号：３１）およびその融合体のアミノ酸配列（配列番号：３２）の図解である。
【図３】図３Ａは、ＩＬ−１がＨｅＬａ細胞によってＩＬ−８の産生を誘導することを示す説明図であり、ＩＬ８がＥＬＩＳＡアッセイによって検出される機構を示す。図３Ｂは、ＩＬ−１ｒａ（「Ｒ＆Ｄ」と標識される）、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ（）およびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６（）各々が、培養されたＭＲＣ−５細胞によるＩＬ−１誘導ＩＬ−８分泌を阻害したことを示すグラフである。観察された阻害は、ＩＬ−１ｒａ、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６に対して投与量依存的であった。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、ＩＬ−１ｒａ（）およびＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ（）の両方が、マウス血清アルブミンなし（４Ａ）、５％マウス血清アルブミン（４Ｂ）および１０％マウス血清アルブミン（４Ｃ）を含むアッセイにおいて、培養されたＭＲＣ−５細胞によるＩＬ−１誘導ＩＬ−８分泌を阻害したことを示すグラフである。監察された阻害は、試験された全ての条件下で、ＩＬ−１ｒａおよびＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａに対して投与量依存的であった。
【図５】図５は、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体およびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６融合体の両方が、血清アルブミンを結合したが、ダミーＩＬ−１ｒａは結合しなかったことを示すＥＬＩＳＡの結果の概略図である。
【図６Ａ−１】図６Ａは、クローンＤＯＭ７ｈ−１のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する結合（６Ａ）についてのＢＩＡＣＯＲＥ親和性データを示すセンサグラムおよび表である。
【図６Ａ−２】図６Ａは、クローンＤＯＭ７ｈ−１のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する結合（６Ａ）についてのＢＩＡＣＯＲＥ親和性データを示すセンサグラムおよび表である。
【図６Ｂ−１】図６Ｂは、クローンＤＯＭ７ｈ−７のＨＳＡに対する結合（６Ｂ）についてのＢＩＡＣＯＲＥ親和性データを示すセンサグラムおよび表である。
【図６Ｂ−２】図６Ｂは、クローンＤＯＭ７ｈ−７のＨＳＡに対する結合（６Ｂ）についてのＢＩＡＣＯＲＥ親和性データを示すセンサグラムおよび表である。
【図６Ｃ−１】図６Ｃは、クローンＤＯＭ７ｒ−１のラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に対する結合（６Ｃ）についてのＢＩＡＣＯＲＥ親和性データを示すセンサグラムおよび表である。
【図６Ｃ−２】図６Ｃは、クローンＤＯＭ７ｒ−１のラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に対する結合（６Ｃ）についてのＢＩＡＣＯＲＥ親和性データを示すセンサグラムおよび表である。
【図７】図７は、ＤＯＭ７ｈ−１、ＤＯＭ７ｒ−１、ＤＯＭ７ｈ−２、ＤＯＭ７ｒ−３、ＤＯＭ７ｈ−７、ＤＯＭ７ｈ−８、ＤＯＭ７ｒ−８、ＤＯＭ７ｒ−１３、ＤＯＭ７ｒ−１４、ＤＯＭ７ｍ−１６、ＤＯＭ７ｈ−２２、ＤＯＭ７ｈ−２３、ＤＯＭ７ｈ−２６、ＤＯＭ７ｒ−１６、ＤＯＭ７ｍ−２６、ＤＯＭ７ｒ−２７、およびＤＯＭ７Ｒ−３１のこれらが結合する血清アルブミンに対する親和性を示す表である。ＤＯＭ７ｈ−８はまた、ブタ血清アルブミンに６０ｎＭの親和性（ＫＤ）で結合する。
【図８】図８Ａは、受付番号ＮＭ＿１７３８４２でＧｅｎＢａｎｋに付託された、ヒトインターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）をコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号：３３）の図解である。核酸は、位置６５でオープンリーディングフレームの開始を有する。図８Ｂは、図８Ａに示された核酸（配列番号：３３）によってコードされるヒトＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列（配列番号：３４）の図解である。成熟タンパク質は、１５２アミノ酸残基からなる（配列番号：３４のアミノ酸残基２６〜１７７）。
【図９】図９は、ＣＤ１株雄動物への単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射（投与量は、約１．５ｍｇ／ｋｇである）後の、マウス血清中のＭＳＡ結合ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質の濃度（μｇ／ｍＬ）の時間経過（日）を示すグラフである。血清濃度を、ヤギ抗−ＨＡ（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）捕捉物およびプロテインＬ−ＨＲＰ（Invitrogen, USA）検出試薬を使用するＥＬＩＳＡによって決定した。既知の濃度のＭＳＡ結合ｄＡｂ／ＨＡ融合体の標準曲線は、１×マウス血清の存在下で設定され、試験サンプルとの比較可能性を確実にした。１区画モデル(WinNonlin Software, Pharsight Corp., USA)でのモデリングにより、ＭＳＡ結合ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質が、２９．１時間の終末相ｔ1/2および５５９時間μｇ／ｍＬの曲線下面積を有することが示された。
【図１０】ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合することによって選択されるＶκのアミノ酸配列の図解である。Ｖκからの示される配列は、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号：３７）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号：３８）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号：３９）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号：４０）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号：４１）と称される。
【図１１Ａ−１】図１１Ａ〜１１Ｂは、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合するＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列の図解である。ＶＨからの示された配列は、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号：４２）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号：４３）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号：４４）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号：４５）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号：４６）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号：４７）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号：４８）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号：４９）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号：５０）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号：５１）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号：５２）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号：５３）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号：５４）およびＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号：５５）と称される。
【図１１Ａ−２】図１１Ａ〜１１Ｂは、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合するＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列の図解である。ＶＨからの示された配列は、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号：４２）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号：４３）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号：４４）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号：４５）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号：４６）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号：４７）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号：４８）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号：４９）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号：５０）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号：５１）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号：５２）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号：５３）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号：５４）およびＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号：５５）と称される。
【図１１Ａ−３】図１１Ａ〜１１Ｂは、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合するＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列の図解である。ＶＨからの示された配列は、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号：４２）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号：４３）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号：４４）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号：４５）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号：４６）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号：４７）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号：４８）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号：４９）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号：５０）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号：５１）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号：５２）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号：５３）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号：５４）およびＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号：５５）と称される。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合するＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列の図解である。ＶＨからの示された配列は、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号：４２）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号：４３）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号：４４）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号：４５）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号：４６）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号：４７）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号：４８）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号：４９）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号：５０）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号：５１）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号：５２）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号：５３）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号：５４）およびＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号：５５）と称される。
【図１２】図１２は、ＣＤ１株雄動物への単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射（投与量は、約１．５ｍｇ／ｋｇである）後の、マウス血清中のＤＯＭ７ｍ−１６、ＤＯＭ７ｍ−２６またはＭＳＡに結合しない対照ｄＡｂ（これらの各々は、ＨＡエピトープタグを含む）の濃度（μｇ／ｍＬ）の時間経過を示すグラフである。血清濃度を、ヤギ抗−ＨＡ（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）捕捉物およびプロテインＬ−ＨＲＰ（Invitrogen, USA）検出試薬を使用するＥＬＩＳＡによって決定した。既知の濃度のＭＳＡ結合ｄＡｂ／ＨＡ融合体の標準曲線は、１×マウス血清の存在下で設定され、試験サンプルとの比較可能性を確実にした。１区画モデル(WinNonlin Software, Pharsight Corp., USA)でのモデリングにより、対照ｄＡｂが、２０分の終末相ｔ1/2βを有するのに対して、ＤＯＭ７ｍ−１６、ＤＯＭ７ｍ−２６は、血清中に有意により長く存続することが示された。
【図１３】図１３は、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａが、マウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルでの関節炎の処置において、ＩＬ−１ｒａまたはＥＮＢＲＥＬ（登録商標）(entarecept; Immunex Corporation)よりも効果的であったことを示すグラフである。関節炎を誘導し、第２１日目に開始され、マウスを、０．４ｍｇ／Ｋｇのデキサメタゾン（ステロイド）、１ｍｇ／Ｋｇまたは１０ｍｇ／ＫｇのＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ（ＩＬ−１ｒａ／抗−ＳＡ  １ｍｇ／ＫｇまたはＩＬ−１ｒａ／抗−ＳＡ  １０ｍｇ／Ｋｇ）、１ｍｇ／Ｋｇまたは１０ｍｇ／ＫｇのＩＬ−１ｒａ、５ｍｇ／ＫｇのＥＮＢＲＥＬ（登録商標）(entarecept; Immunex Corporation)あるいは生理食塩水で処置した。結果は、この研究において、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａが、ＩＬ−１ｒａまたはＥＮＢＲＥＬ（登録商標）(entarecept; Immunex Corporation)より効果的であったことを示す。ＩＬ−１ｒａに対する応答は、期待されるように投与量依存性であり、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａに対する応答もまた、投与量依存性であった。１ｍｇ／ＫｇのＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａでの処置に対する平均スコアは、１０ｍｇ／ＫｇのＩＬ−１ｒａでの処置によって得られる平均スコアより一貫して低かった。結果は、この研究において、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａでの処置は、ＩＬ−１ｒａより１０倍効果的であったことを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｇは、サポリンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。図１４Ａは、Swissprot受付番号P27559（配列番号：６０）として付託されたサポリン−２前駆体のアミノ酸配列を示す。シグナルペプチドは、配列番号：６０のアミノ酸１〜２４である。
【図１４Ｂ】図１４Bは、Swissprot受付番号P27560（配列番号：６１）として付託されたサポリン−３のアミノ酸配列を示す。
【図１４Ｃ】図１４Cは、Swissprot受付番号P27561（配列番号：６２）として付託されたサポリン−４前駆体のアミノ酸配列を示す。シグナルペプチドは、配列番号：６２のアミノ酸１〜２４である。
【図１４Ｄ】図１４Dは、Swissprot受付番号Q41389（配列番号：６３）として付託されたサポリン−５のアミノ酸配列を示す。
【図１４Ｅ】図１４Eは、Swissprot受付番号P20656（配列番号：６４）として付託されたサポリン−６前駆体のアミノ酸配列を示す。シグナルペプチドは、配列番号：６４のアミノ酸１〜２４であり、潜在的プロペプチドは、配列番号：６４のアミノ酸２７８〜２９９である。成熟ポリペプチドは配列番号：６４のアミノ酸２５〜２７７（配列番号：６５）である。
【図１４Ｆ】図１４Fは、Swissprot受付番号Q41391（配列番号：６６）として付託されたサポリン−７のアミノ酸配列を示す。
【図１４Ｇ】図１４Gは、サポリン−６のいくつかの改変体およびアイソフォームを含むコンセンサスアミノ酸配列（配列番号：６７）を示す。
【図１５】図１５は、WO2004/041862に開示されたマウス血清アルブミンを結合するいくつかのCamelid  VHHのアミノ酸配列を示す。配列A(配列番号：72)、配列B(配列番号：73)、配列C(配列番号：74)、配列D(配列番号：75)、配列E(配列番号：76)、配列F(配列番号：77)、配列G(配列番号：78)、配列H(配列番号：79)、配列I(配列番号：80)、配列J(配列番号：81)、配列K(配列番号：82)、配列L(配列番号：83)、配列M(配列番号：84)、配列N(配列番号：85)、配列O(配列番号：86)、配列P(配列番号：87)、配列Q(配列番号：88)。
【図１Ａ】
2008500830.tif 000016
【図１Ｂ】
2008500830.tif 000017
【図１Ｃ】
2008500830.tif 000018
【図１Ｄ】
2008500830.tif 000019
【図１Ｅ】
2008500830.tif 000020
【図２Ａ】
2008500830.tif 000021
【図２Ｂ】
2008500830.tif 000022
【図２Ｃ】
2008500830.tif 000023
【図２Ｄ】
2008500830.tif 000024
【図２Ｅ】
2008500830.tif 000025
【図２Ｆ】
2008500830.tif 000026
【図２Ｇ】
2008500830.tif 000027
【図２Ｈ】
2008500830.tif 000028
【図３】
2008500830.tif 000029
【図４】
2008500830.tif 000030
【図５】
2008500830.tif 000031
【図６Ａ−１】
2008500830.tif 000032
【図６Ａ−２】
2008500830.tif 000033
【図６Ｂ−１】
2008500830.tif 000034
【図６Ｂ−２】
2008500830.tif 000035
【図６Ｃ−１】
2008500830.tif 000036
【図６Ｃ−２】
2008500830.tif 000037
【図７】
2008500830.tif 000038
【図８】
2008500830.tif 000039
【図９】
2008500830.tif 000040
【図１０】
2008500830.tif 000041
【図１１Ａ−１】
2008500830.tif 000042
【図１１Ａ−２】
2008500830.tif 000043
【図１１Ａ−３】
2008500830.tif 000044
【図１１Ｂ】
2008500830.tif 000045
【図１２】
2008500830.tif 000046
【図１３】
2008500830.tif 000047
【図１４Ａ】
2008500830.tif 000048
【図１４Ｂ】
2008500830.tif 000049
【図１４Ｃ】
2008500830.tif 000050
【図１４Ｄ】
2008500830.tif 000051
【図１４Ｅ】
2008500830.tif 000052
【図１４Ｆ】
2008500830.tif 000053
【図１４Ｇ】
2008500830.tif 000054
【図１５】
2008500830.tif 000055
【配列表】
2008500830000001.app
【国際調査報告】
2008500830.tif 000056
2008500830.tif 000057
2008500830.tif 000058
2008500830.tif 000059
2008500830.tif 000060
2008500830.tif 000061
2008500830.tif 000062