(57)【要約】  本発明は、改善された性質を有するBMP-7の変異体およびそれらの使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：Fx(1-20)-Vb(21)-Fx(22-38)-Vb(39)-Fx(40-64)-Vb(65)-Fx(66-71)-Vb(72)-Fx(73-77)-Vb(78)-Fx(79-92)-Vb(93)-Fx(94-119)-Vb(120)-Fx(121-134)-Vb(135)
式中、
Fx1(1-20)は、ヒトBMP-7（配列番号：5）のアミノ酸残基1-20に相当する；
Vb(21)は、LおよびGからなる群から選択される；
Fx(22-38)は、ヒトBMP-7（配列番号：5）のアミノ酸残基22-38に相当する；
Vb(39)は、K、AおよびSからなる群から選択される；
Fx(40-64)は、ヒトBMP-7（配列番号：5）のアミノ酸残基40-64に相当する；
Vb(65)は、YおよびNからなる群から選択される；
Fx(66-71)は、ヒトBMP-7（配列番号：5）のアミノ酸残基66-71に相当する；
Vb(72)は、AおよびDからなる群から選択される；
Fx(73-77)は、ヒトBMP-7（配列番号：5）のアミノ酸残基73-77に相当する；
Vb(78)は、YおよびHからなる群から選択される；
Fx(79-92)は、ヒトBMP-7（配列番号：5）のアミノ酸残基79-92に相当する；
Vb(93)は、F、H、SおよびTからなる群から選択される；
Fx(94-119)は、ヒトBMP-7（配列番号：5）のアミノ酸残基94-119に相当する；
Vb(120)は、SおよびDからなる群から選択される；
Fx(121-134)は、ヒトBMP-7（配列番号：5）のアミノ酸残基121-134に相当する；
Vb(135)は、AおよびEからなる群から選択される；
を含む、変異体BMP-7タンパク質、ただし、該変異体は、ヒトBMP-7（配列番号:5）と比較してアミノ酸置換を含む。
【請求項２】
置換がL21Gである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項３】
置換がK39Aである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項４】
置換がK39Sである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項５】
置換がY65Nである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項６】
置換がA72Dである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項７】
置換がY78Hである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項８】
置換がF93Hである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項９】
置換がF93Sである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項１０】
置換がF93Tである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項１１】
置換がS120Dである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項１２】
置換がA135Eである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項１３】
K39S-F93S;K39S-S120D;K39S-S120D-Y65N;K39S-S120D-A72D;K39S-S120D-Y78H;K39S-S120D-F93H;K39S-S120D-F93S;Y65N-L21G;Y65N-L21R;Y65N-K39S;Y65N-Y78H;Y65N-S120D;Y78H-A72D;Y78H-F93H-Y65N;Y78H-F93H-A72D;Y78H-F93H-S120D;Y78H-S120DおよびF93H-K39Sからなる群から選択される、少なくとも一組の置換を含む、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項１４】
ヒトBMP-7（配列番号：5）と比較して、L21G、K39A、K39S、Y65N、A72D、Y78H、F93H、F93S、F93T、S120DおよびA135Eからなる群から選択される置換を含む、変異体BMP-7タンパク質。
【請求項１５】
置換がL21Gである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項１６】
置換がK39Aである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項１７】
置換がK39Sである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項１８】
置換がY65Nである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項１９】
置換がA72Dである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項２０】
置換がY78Hである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項２１】
置換がF93Hである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項２２】
置換がF93Sである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項２３】
置換がF93Tである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項２４】
置換がS120Dである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項２５】
置換がA135Eである、請求項１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項２６】
K39S-F93S;K39S-S120D;K39S-S120D-M23R;K39S-S120D-Y65N;K39S-S120D-A72D;K39S-S120D-Y78H;K39S-S120D-F93H;K39S-S120D-F93S;K39S-S120D-Q108D;K39S-S120D-R129D;K39S-S120D-R134E;K39S- S120D-H139R;K39S-N130D;K39S-R134S;Y65N-L21G;Y65N-L21R;Y65N-K39S;Y65N-Y78H;Y65N-A105V;Y65N-S120D;Y78H-A72D;Y78H-F93H-Y65N;Y78H-F93H-A72D;Y78H-F93H-Q108D;Y78H-F93H-F117H;Y78H-F93H-S120D;Y78H-S120D;Y78H-R134E-L21G;Y78H-R134E-M23R;Y78H-R134E-Y65N;Y78H-R134E-A72D;F93H-K39S;およびF93H-R134Sからなる群から選択される少なくとも一組の置換を含む、請求項１４に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項２７】
M23N、Q53G、Q53Hおよび186Dからなる群から選択される置換を含み、野生型BMP-7（配列番号：5）と比較して受容体結合親和性が変化している、変異体BMP-7タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、３５U.S.C 119条(e)により、以下の出願の利益を請求する；2004年3月31日に出願されたUSSN US60/558,189、タイトル「改善された性質を有するシステインノットシステイン変異体」；2004年5月11日に出願されたUS60/570,520、タイトル「改善された性質を有するシステインノットシステイン変異体」; 2004年6月9日に出願されたUS60/578,432、タイトル「改善された性質を有するシステインノットシステイン変異体」および、2004年7月13日に出願されたUS60/587,464、タイトル「改善された性質を有するシステインノットシステイン変異体」(これらは、参照によって、それら全体が明らかに本出願に組み込まれる）。
【０００２】
技術分野
本出願は、改善された性質を有する骨形態形成タンパク質の変異体および他のシステインノット(cysteine knot）成長因子に関し、そして、それらの変異体を利用する組成物の作成および使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
骨形態形成タンパク質（BMP）は、パターン形成および組織の形成（tissue specification）等の発達過程並びに成人組織における創傷治癒および回復過程の促進に寄与する良く知られた成長因子ファミリーである。BMPは、最初に、骨および軟骨形成を促進させる能力により単離され、現在においては、多くの組織および器官における細胞増殖、移動、分化およびアポトーシスを制御することで知られている。
【０００４】
BMPは、BMP-2、BMP-3（オステオゲニン）、BMP-3b（GDF-10）、BMP-4（BMP-2b）、BMP-5、BMP-6、BMP-7（骨形成タンパク質-1またはOP-1）、BMP-8（OP-2）、BMP-8B（OP-3）、BMP-9（GDF-2）、BMP-10、BMP-11（GDF-11）、BMP- 12（GDF-7）、BMP-13（GDF-6、CDMP-2）、BMP-15（GDF-9）、BMP-16、GDF-1、GDF-3、GDF-5（CDMP-1）、およびGDF-8（ミオスタチン）等の多くの関連ヒト蛋白を含む。BMPは、サブファミリーに分類され得る。例えば、BMP-2およびBMP-4は密接な関係があり、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8およびBMP-8Bも同様である。BMP-13、BMP-14、およびBMP-12もまたサブファミリーを構成する。BMPは、また、他の動物種にも存在する。さらに、ヒトの集団の異なるメンバー間で、BMP配列のアレル変化がいくつか存在する。
【０００５】
BMPは、形質転換成長因子-β（TGF-β）ファミリーのサブセットであり、TGF-βファミリーは、また、TGFs（TGF-β１、TGF-β２およびTGF-β３）、アクチビン類（activins）（アクチビンＡ）およびインヒビン類（inhibins）、マクロファージ阻害サイトカイン（MIC-1)、ミュラー管抑制物質、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）を含む。TGF-βファミリーは、同様にシステインノットサイトカインスーパーファミリーのサブセットである。更なるシステインノットサイトカインスーパーファミリーのメンバーには、限定はされないが、血小板由来成長因子（PDGF)、血管内皮成長因子（VEGF)、胎盤成長因子（PIGF）、ノギン（noggin）、神経栄養因子（BDNF、NT3、NT4およびβNGF）、ゴナドトロピン、ホリトロピン（follitropin）、ルトロピン（lutropin）、インターロイキン−１７およびコアグロゲン（coagulogen）が含まれる。
【０００６】
BMPは、多様な症状および疾患の処置に有用性を示してきた。BMP-2およびBMP-7は、骨形成、骨折の治癒、および脊椎固定術の促進に用いられてきた。BMP-4（Rundle et. al. (2003) Bone 32: 591-601）、BMP-5（Arosarena および Collins (2003) Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 129: 1125-1130）、BMP-6（Helm (2003) Gene Ther. 10: 1735-1743）、およびBMP-9（Li et. al. (2003) J. Gene Med. 5: 748-756）もまた、動物モデルにおいて骨治癒の促進を示してきた。動物モデルでは、BMP-7が、腎線維症および腎不全（Wang et. al. (2001) J. Am. Soc. Nephrol.12: 2392-2399; WangおよびHirshberg (2003) Am. J. Physiol. Renal Physiol. 284: 1006-1013; Zeisberg et. al. (2003) Nat. Med. 9: 964-968; およびZeisberg et. al. (2003) Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285: F1060-F1067)、虚血性脳卒中（Chang et. al. (2003) Stroke 34: 558-564 および Harvey et. al. Pharmacol. Ther. (2005) 105:113-125)、および炎症性腸疾患（Maric et. al. (2003) J. Cell Physiol. 196: 258-264）の処置に使用できる可能性があることを示している。
【０００７】
構造的には、BMPは、ダイマーのシステインノット蛋白質である。それぞれのBMPモノマーは、多重な分子間ジスルフィド結合を含む。付加的な分子間ジスルフィド結合は、ほとんどのBMPにおいて、ダイマー化を媒介する。BMPは、ホモダイマーを形成し得る；さらに、いくつかのBMPは、ヘテロダイマーを形成し得る。BMPは、長いプロドメイン、１またはそれ以上の切断部位、および成熟ドメインを含む前駆タンパク質として発現される。プロドメインは、正しいホールディングおよびBMPのプロセッシングを助けると信じられている。さらに、全てではないが、いくつかのBMPでは、プロドメインが非共有結合的に成熟ドメインに結合することができ、そして阻害剤として機能することができる（例えば、Thies et. al. (2001) Growth Factors 18: 251-259）。
【０００８】
BMPのシグナル伝達は、BMPダイマーが、２つのタイプIおよび２つのタイプIIセリン/スレオニンキナーゼ受容体に結合するときに開始される。タイプI受容体は、限定はされないが、ALK-1、ALK-2（ActRlaまたはActRlとも呼ばれる）、ALK-3（BMPRIaとも呼ばれる）、およびALK-6（BMPRIbとも呼ばれる）を含み、タイプ２受容体は、限定はされないが、ActRlla（ActRllとも呼ばれる）、ActRllb、およびBMPRIIを含む。BMPの結合に続いて、タイプII受容体は、タイプI受容体をリン酸化し、タイプI受容体は、転写因子Smadファミリーのメンバーをリン酸化し、そしてSmadは核へ移行して、多くの遺伝子の発現を活性化する。
【０００９】
BMPは、また、BAMBI（BMPおよびアクチビン膜結合阻害剤）、BMPER（BMP-結合内皮細胞前駆体由来レギュレーター）、セルベラス（Cerberus）、コルディン（cordin）、コルディン類（cordin-like）、ダン（Dan）、ダンテ（Dante）、ホリスタチン（follistatin）、ホリスタチン関連タンパク質（follistatin- related protein (FSRP)）、エクトディン（ectodin）、グレムリン（gremlin）、ノギン（noggin）、ダンおよびセルベラスに関連するタンパク質（protein related to Dan and cerberus (PRDC)）、スクレロスチン（sclerostin）、スクレロスチン類（sclerostin-like）およびウテリン感作関連遺伝子-1（uterine sensitization-associated gene-1 (USAG-1)）を含む、阻害剤、可溶性受容体、およびおとり受容体と相互作用する。さらに、BMPは、コレセプターと相互作用することができ、例えば、BMP-2およびBMP-4は、コレセプターDRAGON（Samad et. al. (2005) J. Biol. Chem.）、およびヘパリン硫酸およびヘパリン等の細胞外マトリックス成分と相互作用し得る（Irie et. al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 308: 858-865）。
【００１０】
BMPファミリーの更なる背景は、BalemansおよびHul (2002) Dev. Biol. 250: 231-250; BubnoffおよびCho (2001) Dev. Biol. 239: 1-14; Celeste et. al. (1990) Proc. Nat.Acad. Sci. USA 87: 9843-9847;およびCheng et. al. (2003) J. Bone Joint Surgery 85A: 1544-1552を参照する。
【００１１】
自然発生BMPの多くの好ましくない性質は、BMP治療の発展と使用を制限する。BMPの発現量は、典型的には乏しく、好適な発現ホストは限られ、開発と製造を阻害する。BMPは、しばしば、望まれない副作用を含む、多様な生物作用を有する。BMPの多くは、溶解性に乏しく、貯蔵安定性および生物学的利用率が低下する。最終的に、BMPは、望まれない免疫反応を惹起し得る。
【００１２】
初期の研究から、多くの興味ある性質を有するBMP変異体が単離されてきた。E.coli発現およびその後の封入体からのリホールディングに関して、改善された収率を有するBMP変異体は、開示されている（US 5,399,677; US 5,804,416;およびUS 6,677,432）。BMP様活性を有するコンセンサスBMP変異体も、また開示されている（US 5,011,691; US 6,395,883; US 6,531,445）。BMP-2点突然変異体L51Pは、タイプI受容体には結合せず、タイプII受容体には、正常に結合することが記載されている（Keller et. al. (2004) Nat. Struct. Mol. Biol. 11: 481-488）。BMPシグナリングの競合的阻害剤として機能するBMP-4の欠失変異体は、開示されている（Weber et. al. (2003) J. Bone Miner. Res. 18:2142-2151）。変異実験は、また、受容体結合に重要な残基を同定するためにBMP-2においてなされており、これらの変異体のうちのいくつかは、アンタゴニストとして機能することが見出されている（Kirsch et. al. (2000) EMBO J. 19: 3314-3324およびNickel et. al. (2001) J. Bone Joint Surg. Am. 83-A: S7-S14）。さらに、形態形成タンパク質のアナログを同定する方法が、特許請求されている（US 6,273,598）。さらに、低下したALK-4結合を有するActAのいくつかの点突然変異体が同定されている：S60P、163P、M91E、1105E、およびM108A（Harrison et. al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 28036- 28044）。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明は、改善された発現量、プロドメインの存在しない発現、改善された溶解性、改善された特異的活性、改変された受容体、コレセプター、および阻害の特異性、および低下された免疫原性を含む、改善された性質を有する、ヒト骨形態形成タンパク質の変異体、および他のシステインノットサイトカインタンパク質に関する。
【００１４】
一態様において、本発明は、配列
Fx(1-20)-Vb(21)-Fx(22-38)-Vb(39)-Fx(40-64)-Vb(65)-Fx(66-71)-Vb(72 )-Fx(73-77)-Vb(78)- Fx (79-92)-Vb(93)-Fx(94-119)-Vb(120)-Fx(121-134)-Vb(135)
ここで、
Fx1 (1-20)は、ヒトBMP-7（配列番号５）の1-20アミノ酸残基に相当し；
Vb(21)は、LおよびGからなる群から選択され;
Fx (22-38)は、ヒトBMP-7（配列番号５）の22-38アミノ酸残基に相当し；
Vb (39)は、K、AおよびSからなる群から選択され；
Fx (40-64)は、ヒトBMP-7（配列番号５）の40-64アミノ酸残基に相当し；
Vb (65)は、YおよびNからなる群から選択され；
Fx (66-71)は、ヒトBMP-7（配列番号５）の66-71アミノ酸残基に相当し；
Vb (72)は、AおよびDからなる群から選択され；
Fx (73-77)は、ヒトBMP-7（配列番号５）の73-77アミノ酸残基に相当し；
Vb (78)は、YおよびHからなる群から選択され；
Fx (79-92)は、ヒトBMP-7（配列番号５）の79-92アミノ酸残基に相当し；
Vb (93)は、F、H、SおよびTからなる群から選択され；
Fx (94-119)は、ヒトBMP-7（配列番号５）の94-119アミノ酸残基に相当し；
Vb (120)は、SおよびDからなる群から選択され；
Fx (121-134)は、ヒトBMP-7（配列番号５）の121-134アミノ酸残基に相当し；
Vb(135)は、AおよびEからなる群から選択され；
ただし、該変異体は、ヒトBMP-7（配列番号５）と比較したアミノ酸置換を含む、
を含むBMP-7変異体タンパク質を提供する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、L21G、K39A、K39S、Y65N、A72D、Y78H、F93H、F93S、F93T、S120DおよびA135Eからなる群から選択される、ヒトBMP-7（配列番号５）と比較した置換を含むBMP-7変異体タンパク質を提供する。両者の場合において、単一置換を有する特別な変異体は、L21G、K39A、K39S、Y65N、A72D、Y78H、F93H、F93S、F93T、S120DおよびA135Eを含む。置換の特別なセットは、K39S- F93S; K39S-S120D; K39S-S120D-Y65N; K39S-S120D-A72D; K39S-S12QD-Y78H; K39S-S120D-F93H; K39S-S120D-F93S; Y65N-L21G; Y65N-L21R; Y65N-K39S; Y65N-Y78H; Y65N- S120D; Y78H-A72D; Y78H-F93H-Y65N; Y78H-F93H-A72D; Y78H-F93H-S120D; Y78H-S120DおよびF93H-K39Sを含む。
【００１６】
更なる態様において、本発明は、野生型BMP-7（配列番号５）と比較して受容体結合親和性が変化したBMP-7タンパク質を提供し、そのBMP-7変異体タンパク質は、M23N、Q53G、Q53HおよびI86Dからなる群から選択される、１またはそれ以上の置換を含む。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトBMPとGDFタンパク質の成熟ドメインの配列アラインメントを示す。BMP配列とMIC-1配列の一致は、参照用に示す。成熟ドメインの最N末端残基は、著しく整列されてないので、示してない。
【００１８】
図２は、２個のタイプI受容体および２個のタイプII受容体に結合したBMP-7ダイマーを含む、ヘキサマー構造を示す。ALK-3（灰色、右上および左下）に結合したBMP-2（白）とActRIIa（灰色、左上および右下）に結合したBMP-7（黒）を重ねることにより、構造が作成された。 
【００１９】
図３は、ホモロジーモデリングに用いるための、ヒトタイプIBMP受容体およびヒトタイプIIBMP受容体のアラインメントを示す。
【００２０】
図４は、野生型BMP-7（イメージクローン（Image clone））のActRIIa、BMPRII、BMPRIa、およびBMPRIbに対する結合の１２点結合曲線を示す。
【００２１】
図５は、(A) BMPRIa (ALK-3)、(B) BMPRIb (ALK-6)、(C) ActRIIa、および(D) BMPRIIに対する１２点結合曲線を示す。太い黒線は、野生型BMP-7（イメージクローン）である。細い灰色線は、変異体に対応する。
【００２２】
図６は、選択されたライブラリー１変異体に対する、用量依存性C2C12２重試験データを示す。（A）でハイライトされた変異体は、F93Q (黒抜き円)、F93S (灰色塗りダイヤモンド)、N110D (灰色塗り四角)、S120D (黒抜き四角)、A135E (黒抜き三角)、A135S (黒塗り円)および野生型(太い黒線、マーカー無し)を含む。更なる変異体が（A）および（B）に示される。
【００２３】
図７は、(A) BMPRIa (ALK-3)、(B) BMPRIb (ALK-6)、(C) ActRIIa、および(D) BMPRIIに対する、１２点結合曲線を示す。２個の野生型の複製（イメージクローン）は、（太い黒線、黒塗り円）で示される。変異体は、細い灰色線、マーカー無しで示される。
【００２４】
図８は、野生型ヒトＢＭＰ−７（イメージクローン）および変異体に対する１２点受容体結合曲線の概要を示す。
【００２５】
図９は、選択されたライブラリー２変異体に対する用量依存性C2C12２重試験データを示す。
【００２６】
図１０は、選択されたライブラリー３変異体、ライブラリー１変異体（太い黒線、マーカー無し）、および野生型（細い黒線、マーカー無し）に対する用量依存性C2C12２重試験データを示す。
【００２７】
図１１は、（Ａ）２９３細胞（黒棒）およびＣＨＯ細胞（白棒）における、最良の一重、二重、および三重変異体の発現量のＥＬＩＳＡ定量、（Ｂ）最良発現の一重、二重、および三重変異体の促進された発現量が、連続的に希釈された培養上清に由来するC2C12生物活性の増加をもたらすこと、を示す。
【００２８】
図１２は、選択されたBMP-7変異体の濃度を決定するための、商業的ELISA（R&D Systems）を用いたときの適切な修正率を示す。
【００２９】
図１３は、選択されたBMP-7変異体の精製を示す。
【００３０】
図１４は、（Ａ）色素濃度に応じた、BMP-7変異体Y65N/S120DのAlexa 568標識；および（Ｂ）Alexa-568で標識されたY65N/S120D BMP-7のスケールアップを示す、SDS-PAGEゲルの蛍光イメージを示す。
【００３１】
図１５は、受容体濃度に応じた蛍光異方性を示す。
【００３２】
図１６は、Alexa568で標識されたY65N/S120D BMP-7のActRIIa受容体に対する結合が、標識されてないBMP-7で競合されることを示す。
【００３３】
図１７は、AlphaScreen を用いて決定した、BMP受容体および阻害剤BMPRIb (中空円)、ActRIIa (中塗りダイヤモンド)、BMPRII (中塗り三角)、およびノギン (星)に対する、（Ａ）組み換えヒトBMP-7 (R&D Systems)、（Ｂ）BMP-7変異体565 (Y65N/F93T/R129D)、（Ｃ） BMP-7変異体526 (K39S/S120D/R134E)、および（Ｄ）BMP-7変異体504 (Y65N/S120D)の競合的結合を示す。
【００３４】
図１８は、３個の受容体および１個の阻害剤に対する４個のBMP-7変異体の結合についてのEC50を示す棒グラフを示す。
【００３５】
発明の詳細な説明
本明細書において「BMP反応性疾患」および文法上の等価物は、１またはそれ以上のBMPの処置により利益があり得る疾患、障害、および症状を意味する。BMP反応性疾患の例は、限定はされないが、軟骨、骨、および歯の障害または症状（限定はされないが、骨折、骨変性、骨粗しょう症、脊椎固定術、脊椎変性椎間板疾患、骨切除術、整形外科的および再生手術、および歯周病を含む）；アキレス腱と靱帯の治療；腎臓疾患（限定はされないが、慢性または急性の腎不全、再還流による腎障害、薬物惹起腎毒性、腎繊維症、腎性骨ジストロフィー、腎臓疾患に由来する血管合併症を含む）； 肝臓疾患（限定はされないが、肝硬変、肝線維症を含む）；肺疾患（限定はされないが、喘息、肺気腫、および肺線維症を含む）；創傷治癒；癌（限定はされないが、前立腺癌; 炎症性腸疾患を含む）;神経保護剤により利益のある症状（限定はされないが、卒中、パーキンソン病、外傷性脳損傷、および筋萎縮性側索硬化症を含む）；および皮膚および髪の疾患、を含む。本明細書における「露出された残基」および文法上の等価物は、特定された蛋白構造、好ましくはX線結晶構造において、その側鎖が、溶媒接触可能な表面積を少なくとも５０Å２（オングストロームの２乗）有する残基を意味する。当業者には十分に理解されるように、７５Å２（オングストロームの２乗）等の他の値、５０％等の百分率の値が代わりに使用され得る。さらに、露出された残基を同定するために、とりわけ接触モデルのような別の方法も使用され得る。本明細書において「発現量」および文法上の等価物は、与えられた発現プロトコル（すなわち、特定の発現宿主、トランスフェクション方法、培地、時間等）の下、製造または分泌される蛋白の量、好ましくは、mg/LまたはPCD（ピコグラム／細胞／日）を意味する。
【００３６】
本明細書において「改善された発現量」および文法上の等価物は、与えられた発現条件下での、野生型または親蛋白に比較する、発現量の増加を意味する。好ましい態様では、少なくとも、５０％の改善が成し遂げられ、少なくとも１００％の、５倍、１０倍、またはそれ以上の改善が、とりわけ好ましい。他の好ましい実施態様において、発現量が、少なくとも１μg/mlの量に改善され、少なくとも１０μg/mlまたは１００μg/mlであることが特に好ましい。本明細書において「疎水性残基」および文法上の等価物は、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを意味する。本明細書において「相互作用残基」および文法上の等価物は、蛋白−蛋白の接触の８Å（オングストローム）以内で位置する残基を意味する。５Å（オングストローム）未満の距離がとりわけ好ましい。距離はいずれかの構造において測定され得るが、とりわけ高分解能の結晶構造が好ましい。
【００３７】
本明細書で使用される「ライブラリー」は、特定の折りたたみ構造をとり、または特定のタンパク質特性を有し得る、蛋白配列の収集物を意味する。好ましくは、ライブラリーは、エネルギー計算、または、統計または知識に基づくアプローチを含み得る、計算から得られた配列のセットを含む。約５から約１０１３個の配列の範囲をその規模とするライブラリーが好ましい。ライブラリーは、一般的に実験的に作成され、そして、望まれるタンパク質特性を有するメンバーが存在するか解析される。本明細書において、「成熟ドメイン」とは、BMP-7との関係では、BMP-7の1-137残基を実質的に含むドメインである。野生型BMP-7において、成熟ドメインは、フリン（furin)またはフリン様前駆タンパク質変換酵素によってプロドメインから切り離される。「修飾」および文法上の等価物は、タンパク質または核酸配列への１またはそれ以上の挿入、欠失、または置換を意味する。本明細書において、「自然発生」または「野生型」または「wt」およびそれらの文法上の等価物は、アレル変異体を含む、自然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。好ましい実施態様では、野生型配列は、最も優勢なヒト配列である。しかしながら、野生型ＢＭＰ核酸およびタンパク質は、優勢でないヒトのアレル、または、限定はされないが、齧歯動物（ラット、マウス、ハムスター、モルモット、等）、霊長類、および家畜（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ等を含む）を含む、あらゆる生物由来のＢＭＰ核酸およびタンパク質であり得る。
【００３８】
本明細書において、「核酸」および文法上の等価物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはデオキシ−およびリボヌクレオチドの両方を含む分子を意味する。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび、センスおよびアンチセンス核酸を含むオリゴヌクレオチドを含む。核酸は、また、安定性および半減期を増加させるような、リボース−リン酸バックボーンへの修飾のような、修飾を含み得る。本明細書において、「極性残基」および文法上の等価物は、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、およびスレオニンを意味する。本明細書において、「プロドメイン」は、BMPまたは他のTGF-βファミリーメンバーに関しては、フリンまたはフリン様前駆タンパク質変換酵素による切断の後切り離されるN末ドメインを意味する。プロドメインの存在は、適切なホールディングおよびプロセッシングを促進し得る。
【００３９】
本明細書において、「タンパク質」は、共有結合している少なくとも２個のアミノ酸を含む分子を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。タンパク質は、自然発生アミノ酸およびペプチド結合、またはペプトイド（peptoid）類（Simon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367-9371参照）のような、合成ペプチド模倣構造、により形成され得る。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、およびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸と考えられ、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の両方が、利用され得る。
【００４０】
本明細書において、「タンパク質特性」は、物理的、化学的、および生物学的性質を意味し、限定はされないが、物理的性質（分子量、流体力学的性質（回転半径、正味荷電、等電点等）、スペクトル特性（減衰係数等）を含む）、構造的性質（２次、３次、および４次構造要素を含む）、安定性（温度安定性、ｐＨまたは溶解状態に関する安定性、保管安定性、およびユビキチン化、タンパク質分解、または化学修飾（メチオニン酸化、アスパラギンおよびグルタミンの脱アミド、側鎖のラセミ化またはエピマー化、およびペプチド結合の加水分解等）の抵抗性または感受性、を含む）、溶解性（多様な条件下での凝集のし易さ、オリゴマー化状態、および結晶可能性、を含む）、速度論的および力学的性質（柔軟性、硬直、ホールディング速度、ホールディングメカニズム、アロステリック効果、および、立体構造の変化および相関運動を受ける能力、を含む）、結合親和性および特異性（タンパク質、核酸、ポリサッカライド、脂質、および小分子を含む、１またはそれ以上の分子に対する、そして、親和、会合および乖離速度を含む）、酵素活性（基質特異性；会合、反応、および乖離速度；反応メカニズム；およびｐＨプロフィルを含む）、合成的な修飾への反応のし易さ（ＰＥＧ化および他の分子または表面への結合を含む）、発現特性（１またはそれ以上の発現宿主での量、可溶性に対する封入体発現、細胞内局在、分泌能力、および細胞表面への表示能力、を含む）、プロセッシングおよび翻訳後修飾（蛋白分解プロセッシング、Ｎ−またはＣ−結合グリコシル化、脂質化、硫酸化、およびリン酸化、を含む）、薬物動態学的および薬力学的性質（皮下、筋肉内、口、または肺への送達後の生物学的利用率；血清半減期、分布、および排泄のメカニズムおよび速度、を含む）、および表現型変化または生理変化の惹起能力（抗原性、毒性、シグナルまたはシグナル阻害の能力、細胞増殖、分化、または移動の刺激または阻害の能力、アポトーシスの惹起能力、および疾患処置能力、を含む）を含む。
【００４１】
本明細書において、「溶解性」および文法上の等価物は、特定された条件（例えば、ｐＨ、温度、いくつかの緩衝液成分、塩、界面活性剤、オスモライト等）の溶液中の、望ましいまたは生理的に適切なオリゴマー状態における、タンパク質の最大可能濃度を意味する。他に記載のない限り、ダイマーのBMPが望まれる。本明細書において、「可溶性発現」および文法上の等価物は、原核生物宿主に発現させたとき、タンパク質が封入体よりも少なくとも部分的に溶解して産生され得ることを意味する。少なくとも１μgの可溶性タンパク質が、100ml培養あたりに産生されることが好ましく、少なくとも10μgまたは100μgであることがとりわけ好ましい。
【００４２】
本明細書において、「改善された溶解性」および文法上の等価物は、溶液中の、望ましいまたは生理的に適切なオリゴマー状態における、タンパク質の最大可能濃度が増加することを意味する。例えば、もし、自然発生のタンパク質が、1mMに濃縮でき、同じ溶液条件下で、変異体が5mMに濃縮できるときは、変異体は、改善された溶解性を有すると言うことができる。好ましい実施態様では、溶解性は少なくとも２倍増加し、少なくとも５倍または１０倍の増加が、とりわけ好ましい。当業者には理解されるように、溶解性は、溶液条件の関数である。本発明の目的のためには、溶解性は生理的に許容される溶液条件下で測定されるべきである。特に、ｐＨは6.0および8.0の間であるべきであり、塩濃度は50および250mMの間であるべきである。賦形剤のような追加的な緩衝液の成分は、また含まれ得る；しかしながら、アルブミンは要求されないことが望ましい。
【００４３】
本明細書において、「変異体BMP核酸」および文法上の等価物は、変異体BMPをコードする核酸を意味する。遺伝コードの縮重のため、変異体BMPのアミノ酸配列を変化させないような方法で、１またはそれ以上のコドンの配列を単に修飾することによって、その全てが本発明の変異体BMPをコードする、著しく多数の核酸がつくられ得る。
【００４４】
本明細書において、「変異体BMP」または「非自然発生BMP」およびそれらの文法上の等価物は、少なくとも１個の（１）アミノ酸の挿入、欠失、または置換により、野生型または親のBMPと異なっている非自然発生のBMPを意味する。言及のない限り、変異体BMPおよび変異体BMP核酸の全ての位置番号付けは、これらの配列に基づいていることは注目すべきである。BMP変異体は、予め決定された変化の性質、自然発生のアレルまたはBMP配列の種間の変化から、区別される特徴により、特徴付けられる。BMP変異体は、１またはそれ以上の細胞種において、下記の適切な試験を用いて決定された、野生型BMP活性を少なくとも５０％保持しなければならない。野生型活性の少なくとも７５％または９０％保持する変異体は、より好ましく、野生型よりさらに活性のある変異体がとりわけ好ましい。あるいは、いくつかの実施態様において、BMP変異体は、野生型BMPとは異なる活性を有するように設計され得る。例えば、競合的阻害剤が設計され得る。変異体BMPは、N末、C末、または内部で、挿入、欠失、および／または置換を含み得る。好ましい実施態様において、変異体BMPは、最も類似するヒトBMP配列と異なる少なくとも１残基を有し、少なくとも、２、３、４、または５個の異なる残基を有することがより好ましい。変異体BMPは、更なる修飾、例えば、安定性または抗原性等の付加的な蛋白質特性を変化させ、または、PEG化またはグリコシル化等の翻訳後修飾を可能にしまたは阻害する変異等を含み得る。変異体BMPは、共翻訳または翻訳後の修飾を受けることができ、これらには、限定はされないが、１またはそれ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、PEG化、環状置換（circular permutation）、環化、タンパク質またはタンパク質ドメインとの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加が含まれる。
【００４５】
自然発生BMPは、多数の細胞および器官において、細胞の増殖、移動、分化、およびアポトーシスを制御し、その結果として、BMPは多くの治療用途を提供し得る。しかしながら、自然発生BMPは、大量に製造することが困難であり、難溶性であり、多様な活性を示し、望まれない免疫反応を惹起し得る。
【００４６】
本明細書において、ヒトBMPの新規な変異体が開示される。これらのBMP変異体は、生物物理学的な性質および臨床での性能を改善するために選択された１またはそれ以上の修飾を含む。
【００４７】
発現量改善のための戦略
【００４８】
報告されているBMPの発現量は、典型的には非常に低い。報告されている発現量は、一過性にトランスフェクションされたCOS-1細胞のローラーボトル培養で、2-6ng/ml、DHFR-増強され安定的にトランスフェクションされたCHO細胞で、100-200ng/mlの範囲である（John C. Lee et. al.、米国特許番号6,048,964、参照）。BMPの開発と治療使用を促進するためには、発現量を、少なくとも10μg/mlに増加させるのが望ましいであろうし、少なくとも100μg/mlであることがより好ましく、少なくとも1000μg/mlであることが、特に好ましい。
【００４９】
多くの核酸特性およびタンパク質特性が、発現量に影響し得る；さらに、発現宿主および発現プロトコルが発現量に寄与する。これらのパラメーターのいくつかは、最適化され、発現量が改善され得る。また、発現量は、さらに以下で論じるように、安定性および／または溶解性を改善する１または複数の変位の挿入により改善され得る。さらに、プロドメインと成熟ドメインの間の相互作用は、ホールディング効率に影響を及ぼす可能性があり、よって、プロドメインもまた修飾の標的となり得る。
【００５０】
好ましい実施態様において、核酸特性は最適化され、１またはそれ以上の以下の戦略を用いて発現量を改善する：１）完全でないKozak配列を置換する、２）５'のGC含量およびそのRNAの二次構造を低減する、３）コドン使用を最適化する、４）代替のリーダー配列を使用する、５）キメラのイントロンを含有する、または、６）そのメッセージのC末に最適化されたポリＡテールを付加する。もう一つの好ましい実施態様では、タンパク質特性が最適化され、１またはそれ以上の以下の戦略を用いて発現量を改善する：１）シグナル配列を最適化する、２）タンパク質分解プロセッシング部位を最適化する、３）不適当なジスルフィド結合の形成を最小限にするために、１またはそれ以上のシステイン残基を置換する、４）タンパク質のホールディングの速度または効率を改善する、または５）タンパク質の安定性、特にタンパク質分解安定性を高める。別の好ましい実施態様では、代わりのプロドメイン配列が使用される。例えば、BMP-2由来のプロドメインは、BMP-4発現の助けとして使用され得る（Wozney et. al. (1988) Science 242: 1528-1534）。使用され得るプロドメインは、限定はされないが、BMP配列およびMIC-1プロドメイン由来のプロドメインを含み得る。プロドメインは、シスまたはトランスで発現され得る。
【００５１】
さらなる好ましい実施態様では、トランスフェクションまたは発現条件が最適化され、発現量が増加する。例えば、フリンおよび他の前駆タンパク質変換酵素は、カルシウムを要求するので、発現の間培地にカルシウムを添加することで、適切にプロセッシングされたタンパク質の量が増加され得る。他の例として、プロテアソーム阻害剤が、プロテアソーム分解を最小限にするために添加され得る。ウシ胎仔血清またはヘパリンもまた使用され得る。さらに好ましい実施態様において、発現宿主が発現量を最適化するために選択される。BMPのホールディングおよびプロセッシングは、比較的複雑で、適切なシャペロンにより支援され得る。これらのシャペロンは、全ての哺乳類細胞株において等しく発現されていないかもしれない。BMP-7は腎臓で自然に産生されており、いくつかのよく確立された発現系は、腎臓由来である；好ましい実施態様において、BMP-7は、限定はされないが、293T、293-EBNA、COS、およびBHKを含む、腎臓の細胞株で発現される。もう一つの好ましい実施態様において、BMP-7内の切断部位は最適化され、フリンおよび関連するズブチリシン様タンパク質変換酵素によるタンパク質分解プロセッシングがより効率的に促進される。フリンの基質選択性は、良く特徴付けられており（Henrich et. al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10: 520-526; Holyoak et. al. (2004) Biochem. 43: 2412-2421; and Duckert et. al. (2004) PEDS 17: 107-112）、BMPおよびTGF-β内の切断部位は解析されている（Constam and Robertson (1999) JBC 144: 139-149）。別の好ましい実施態様では、BMP-7は、１またはそれ以上のシャペロンまたは限定はされないがフリンを含むプロセッシングタンパク質と共にコトランスフェクションされた細胞株において、発現される。
【００５２】
別の発現宿主の使用を可能にする戦略
BMPは、典型的には哺乳類細胞で発現される。限定はされないが、酵母発現系を含む別の発現系の使用を可能にするために、１）Ｎ−結合グリコシル化部位の削除、２）可能性のあるＯ−結合グリコシル化部位の削除、３）プロドメイン非存在下で発現を可能にすること、および４）望ましい発現宿主において存在する別のプロテアーゼによるプロセッシングを可能にすること、が望ましい。変異体BMPポリペプチドからのグリコシル化部位の除去は、例えば、（Ｏ−結合グリコシル化部位のために）野生型の配列または変異体BMPポリペプチドの１またはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基を削除すること、または標準的なＮ−結合グリコシル化部位、N-X-Y-X（ここで、Xはプロリン以外のアミノ酸であり、Yはスレオニン、セリンまたはシステインである）の修飾により、成し遂げられ得る。他の好ましい実施態様では、プロドメインの依存は、１）BMPの折り畳まれた状態を安定化する変位の導入；２）BMPの露出された疎水性表面領域の減少；３）BMPのホールディング経路に沿って、１またはそれ以上の中間体を安定化する；または４）ジスルフィド結合を形成する１またはそれ以上のシステイン残基対を置換すること、により低減され、削除される。更なる好ましい実施態様において、フリン切断部位は修飾され、望ましい発現宿主に存在する別のプロテアーゼにより認識される。例えば、フリン切断部位はケキシン（kexin）切断部位に改変され、酵母発現が促進される。ケキシン切断部位は、良く特徴付けられている；例えば、Holyoak et. al. (2004) Biochem. 43: 2412-2421を参照。
【００５３】
別の実施態様において、BMPはインビトロ翻訳を用いて発現される。全タンパク質、および正確にホールディングされたタンパク質の量を改善するために、多くの因子がその反応に付加されることができ、それらは、限定はされないが、１）限定はされないが、BMP-2、BMP-4、BMP-7、およびMIC-1を含むいずれかのTGF-βファミリーメンバー由来のプロドメイン；２）限定はされないが、システインイソメラーゼ、プロリンイソメラーゼ、BiP、熱ショックタンパク質、フリン、および他の前駆タンパク質変換酵素を含む、アクセサリー因子およびシャペロン；３）限定はされないが、グルタチオンを含む酸化還元剤；４）限定はされないが、ナトリウム、カルシウム、亜鉛、およびマグネシウムを含む１価および２価のカチオン；および５）ミクロソーム、を含む。
【００５４】
溶解性改善の戦略
溶解性および発現量が改善されたBMP変異体の設計ために、あらゆる戦略が利用され得る。好ましい実施態様において、１またはそれ以上の以下の戦略を使用する：１）１またはそれ以上の溶媒露出疎水性残基を好適な極性残基に置換することにより、疎水性を低減する、２）１またはそれ以上の天然の極性残基を荷電した極性残基に置換することにより、極性を増加させる、３）例えば、疎水性コア中のパッキングを改善する、ベータシート形成傾向の増加する、へリックスキャッピングおよび双極子相互作用を改善する、または好ましくない静電気的相互作用を取り除く、１またはそれ以上の修飾により、タンパク質安定性を増強させる（タンパク質の安定性の増強は、凝集しやすい部分的に折り畳まれた、または、間違って折り畳まれた状態の集団を減少させることで、溶解性を改善し得る）、および４）タンパク質の等電点に影響を及ぼす１またはそれ以上の残基（すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、チロシン、およびシステイン残基）を修飾する。タンパク質の溶解性は、タンパク質の等電点が周辺溶液のｐHと等しくなるとき、典型的には最小となる。したがって、関連ある環境のｐHからタンパク質の等電点を遠ざける修飾、例えば血清は、溶解性を改善する。さらに、タンパク質の等電点を低下させる修飾は、導入部位での吸収を改善し得る（Holash et. al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11393-11398）。
【００５５】
受容体結合親和性または特異性を変化させる戦略
改善された受容体結合親和性または特異性を有するBMP変異体を設計するためにあらゆる戦略が使用される。好ましい実施態様において、多様性が、１またはそれ以上の受容体相互作用部位に導入される。しかしながら、本分野で知られているように、受容体結合接触面より離れた部位での修飾は、また、結合親和性または特異性を変化させ得る。とりわけ好ましい実施態様において、修飾は、１またはそれ以上の非保存受容体位置に接触するBMP中の部位でなされる。例えば、BMP-7のArg48、Gln53、およびGlu60は、タイプII受容体の位置76と接触する;この位置は、ActRIIbではGluであり、ActRIIではLysであり、BMPRIIではThrである。BMP-2等のいくつかのBMPは、タイプI受容体により強く結合するが、BMP-7等の他のBMPは、タイプII受容体への親和性が高い。更なる好ましい実施態様において、BMPはその低い親和性の受容体結合部位を、その部位が高い親和性部位であるBMPとより類似するように、修飾される。例えば、タイプI受容体とBMP-7との接触面は、BMP-2により類似するように修飾され、または、タイプII受容体とBMP-2の接触面は改変されてよりBMP-7に類似するようにされ得る。別の実施態様において、フリーの立体構造に対し、結合状態のBMPの立体構造を安定化させるために、修飾がなされる。例えば、BMP-7は最初にタイプII受容体に結合し、それからタイプI受容体に結合し、タイプII受容体への結合は、タイプI受容体の結合親和性を増加させ得る。タイプII受容体への結合は、BMP中の立体構造の変化の原因となり、より高い親和性状態となり得るものを作り出す。従って、変異は、結合状態を安定化させるために導入される。
【００５６】
BMP阻害剤を回避する戦略
多くの可溶性の、そして膜結合型のタンパク質が、BMP活性の内因性の阻害剤として機能する。好ましい実施態様では、BMPは、１またはそれ以上のBMP阻害剤との結合親和性を低減または排除する一方、BMP受容体に対する親和性を保持するように設計される。阻害剤の多くが、特定の組織または器官に発現しているので、阻害剤特異性の理論的変化は、BMP活性部位の制御に使用され得る。同様のアプローチが、DRAGON等の共受容体、ヘパリンおよびヘパリン硫酸等の細胞外マトリックス成分、およびアルファ２−マクログロブリン等の血漿成分に対する特異性を変化させるのに使用され得る。
【００５７】
タンパク質のデザインおよび設計方法
改変された性質を有するBMP変異体を産生させる修飾（すなわち、挿入、欠失または置換変異）を同定するために、多くの方法が使用され得る。これらの方法には、限定はされないが、配列プロファイリング（Bowie and Eisenberg (1991) Science 253: 164-170）、回転異性体ライブラリー選択（Dahiyat and Mayo (1996) Protein Sci 5: 895-903; Dahiyat and Mayo, Science (1997) 278: 82-87; Desjarlais and Handel (1995) Prot. Sci. (1995) 4: 2006-2018; Harbury et. al. (1995) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92: 8408-8412; Kono et al., Proteins (1994) 19: 244-255; Hellinga and Richards (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 5803-5807）；および残基対ポテンシャル（residue pair potentials）（Jones (1994) Prot. Sci. 3: 567-574）が含まれる。
【００５８】
好ましい実施態様において、BMPおよび関連タンパク質の１またはそれ以上の配列アラインメントは、それぞれの部位と互換性のありそうな残基を同定するために解析される。好ましい実施態様において、PFAMまたはBLASTアラインメントアルゴリズムが、BMPサブファミリー、TGF-βファミリー、またはシステインノットシステインスーパーファミリーのアラインメントを作成するために使用される。それぞれの可変部位のために、適切な置換が、相同配列の同じ部位で認められる残基として決定される。とりわけ好ましい置換は、相同配列中にたびたび認められる置換である。さらなる好ましい態様において、Analogous Contact Environment (ACE)アルゴリズム、2004年12月8に出願された米国特許出願11/00/,647が、他のBMPまたは同族体における構造的に類似の環境中に位置する、別の好適な残基を同定するために、配列アラインメント情報と共に使用される。とりわけ好ましい実施態様では、改善されたBMP変異体の理論的設計は、Protein Design Automation（登録商標）(PDA（登録商標）)技術；米国特許番号6,188,965; 6,269,312; 6,403,312; 6,708,120; WO98/47089およびUSSNs 09/058,459、09/127,926、60/104,612、60/158,700、09/419,351、60/181,630、60/186,904、09/419,351、09/782,004および09/927,790、60/347,772、および10/218,102;およびPCT/US01/218,102およびU.S.S.N. 10/218,102, U.S.S.N. 60/345,805; U.S.S.N. 60/373,453およびU.S.S.N. 60/374,035を参照、またはsequence prediction algorithm (SPA)（Raha et al. (2000) Protein Sci., 9: 1106-1119; 2001年6月8日出願されたUSSN 09/877,695、および2002年2月6日に出願された10/071,859）を使用することにより成し遂げられる。
【００５９】
BMPの構造解析
BMPの構造の取得
PDA（登録商標）技術計算は、鋳型タンパク質構造を必要とする。ひとつの実施態様として、ヒトＢＭＰの構造は、X線結晶学またはNMRにより得られる。BMPの構造は、BMP-2 (PDB code 3BMP, Scheufler et. al. (1999) J. Mol. Biol. 287: 103)、BMP-2変異体L51P (PDB code 1REU, Keller et. al. (2004) Nat. Struct. Mol. Biol. 11: 481)および野生型ヒトBMP-7 (PDB code 1LXI Griffith et. al. (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93: 878-883)を含む。TGF-β2のようなもう一つのシステインノットシステインタンパク質の結晶構造(PDB code 1TFG, Schlunegger and Grutter (1992) Nature 358: 430)、または、TGF-β1のようなシステインノットシステインタンパク質のNMR構造(PDB codes 1KLA, 1KLC, and 1KLD; Hinck et. al. (1996) Biochem. 35: 5817)を使用することも、また可能である。とりわけ好ましい実施態様では、結晶構造はBMPおよびBMP受容体を含む共結晶構造である。高解像度の構造は、受容体ActRIIaとBMP-7の複合体(PDB code 1LX5, Greenwald et. al. (2003) Mol. Cell 11: 605-617)、ActRIIbに結合したアクチビンA(PDB codes 1NYS and 1NYU, Thompson et. al. (2003) EMBO J. 22: 1555-1566)、およびALK-3に結合したBMP-2(PDB code 1ES7, Kirsch et. al. (2000) Nat. Struct. Biol. 7: 492; and PDB code 1REW, Keller et. al. (2004) Nat. Struct. Mol. Biol. 11: 481)に対して入手可能である。他の好ましい実施態様では、結晶構造はBMPとBMP阻害剤を含む共結晶構造である。高解像度構造は、可溶性阻害剤ノギンに結合したBMP-7(PDB code 1M4U, Groppe et. al. (2002) Nature 420: 636)に対して入手可能である。単独および１またはそれ以上の受容体または阻害剤と結合した、更なるBMPの構造は、限定はされないが上記したものを含むNMRまたはX線結晶構造を、当分野で知られている、ホモロジーモデリング、構造的アラインメント、およびタンパク質−タンパク質ドッキング法とともに用いることにより構築され得る。
【００６０】
フリン切断部位の同定
BMPのフリン切断部位は、一致するフリン切断部位、R-X-X-K/Rを、BMPの成熟ドメインの配列された領域に相対するN末端に位置する残基の中においてスキャンすることにより決定され得る。切断部位領域のBMP-7配列は、（切断部位前のP8からP1および切断部位後のP1'からP4'まで、「｜」は切断される結合を示す）EVHLRSIR|STGGであり、ここで残基「STGG」はBMP-7成熟ドメインの1から4残基を含む。最も好まれるフリンの切断部位は、P4のR、P1のR、およびP2のKまたはRを含む。また、P5-P8残基の中に、少なくとも１個の塩基性残基を有することが好ましい。いくつかのBMPは多重切断部位を有する。例えば、BMP-4は２個の切断部位を有し、そして、連続する切断は、活性およびシグナリングの程度の調節のメカニズムを提供すると考えられる（Degnin et. al. (2004) Mol. Biol. Cell 15: 5012-5020）。
【００６１】
グリコシル化部位の同定
BMP-7は、Asn80にＮ−グリコシル化部位を有する。哺乳類細胞に発現させたとき、BMP-7の成熟ドメインはＯ−結合グリコシル化部位を全く含まない。しかしながら、限定はされないが、酵母およびバキュロ発現系を含む、他の発現宿主においては、１またはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基がグリコシル化を受けやすい可能性がある。そのようなＯ−結合グリコシル化部位の存在および位置は、例えば、マススペクトルを用いて、実験的に決定され得る。
【００６２】
溶媒露出疎水性残基の同定
本明細書で用いられるように、BMP-7中の露出された疎水性残基は、限定はされないが、Tyr44、Trp52、Trp55、Ile57、Phe73、Tyr78、Ile86、Leu90、Phe93、Ile94、Leu115、Tyr116、Tyr117、Val123、Leu125、およびTyr128を含む。BMP-7はまた、秩序のないN末端領域（すなわち、1-35残基）において、３個の疎水性残基を含有する。これらの残基をBMP-7の結晶構造において観察されないが、これらが著しく溶媒に露出されていることは、可能性が高い。好ましい実施態様において、更なる疎水性残基Leu21、Met23、およびVal26は、また溶媒に露出された疎水性残基であると考えられる。
【００６３】
受容体結合部位の残基の同定
好ましい態様では、BMPとそれらの受容体間の分子間相互作用を媒介する残基は、受容体結合親和性または特異性を改善する、構造的かつ機能的に互換性のある残基で置換される。BMP/タイプI受容体接触面での好ましい残基は、限定はされないが、残基Lys39、Phe47、Asp49、Leu50、Gly51、Pro74、Leu75、Asn76、Ser77、Tyr78、Asn80、Asn83、Ile86、Leu90、Phe93、Ile94、Pro96、Tyr116、Lys126、Tyr128、Arg129、Asn130、およびMet131を含む。BMP/タイプII受容体接触面での好ましい残基は、限定はされないが、Tyr44、Arg48、Gln53、Ile57、Ala58、Pro59、Glu60、Gly61、Tyr62、Ala63、Gln108、Asn110、Ala111、Ile112、Ser113、Val114、Leu115、Phe117、Asn122、Val123、Leu125、Lys127、およびArg134を含む。
【００６４】
阻害剤結合部位の残基の同定
好ましい実施態様において、BMPおよびそれらの阻害剤との分子間相互作用を媒介する残基は、阻害剤結合親和性を低減し、または阻害剤結合特異性を増加させる、構造的かつ機能的に互換性のある残基と置換される。ノギン/BMP-7接触面にある好ましい残基は、限定はされないが、Phe73、Pro74、Leu75、Asn76、Ser77、Asn83、Ile86、Val87、およびLeu90を含む。
【００６５】
静電ポテンシャルの高い領域の残基の同定
タンパク質は好ましくない静電気的相互作用の存在により不安定化され、好ましい静電気的相互作用の存在により安定化され得る。したがって、好ましくない静電気的相互作用を取り除くことにより、または好ましい静電気的相互作用を導入することにより、タンパク質は安定化され得る。静電ポテンシャルの高い領域を修飾することは、また、薬物動態の性質に影響を及ぼし得る、血清および細胞外マトリックス成分との相互作用を調節し得る。好ましい実施態様において、それぞれの残基の位置に存在する静電ポテンシャルは、例えば、Debye-Huckel計算を用いて決定される。静電ポテンシャルが0.25より高い、または、-0.25より低い領域に位置するBMP-7の残基は、限定はされないが、Lys40、Ser46、Arg48、Tyr62、Ala64、Tyr65、Tyr66、Cys67、Glu68、Gly69、Glu70、Cys71、Ala72、Tyr78、Asn80、Ala81、Thr82、Asn83、His84、Ala85、Val87、Gln88、Thr89、Ile94、Pro100、Cys104、Ala105、Pro106、Thr107、Gln108、Leu109、Asn110、Ala111、Ile112、Ser113、Asn122、Ile124、Asn130、Met131、Val132、Val133、Arg134、Ala135、Cys136、Gly137、およびHis139を含む。
【００６６】
最適なBMP変異体のデザイン
フリン切断部位の好適な調節の同定
いくつかのBMPのフリン切断配列は、一致するフリン切断配列といくらか相違する。BMP-7において、蛋白分解プロセッシングを改善する好ましい調節は、限定はされないが、(P8)E→QまたはK；(P6)H→KまたはR；(P5)L→K；および(P2)I→KまたはRを含む。
【００６７】
グリコシル化部位の適切な置換の同定
好ましい実施態様において、Ｎ−またはＯ−結合グリコシル化部位を含む残基は、グリコシル化を含まない、構造的かつ機能的に互換性のある残基に置換される。本分野において知られているように、Ｎ−結合グリコシル化部位は、配列N-X-(S/T)-X（ここでXはプロリン以外のいずれかの残基であり得る）によって特定される。したがって、Ｎ−結合グリコシル化部位は、１）Ｎを他のいずれかの残基で置換する、２）どのＸもプロリンで置換する、または３）ＳまたはＴをＴ、Ｓ、またはＣ以外のいずれかの残基で置換する、ことにより除去される。Ｎ−結合グリコシル化部位を取り除く好ましい調節は、限定はされないが、Asn80をAsp、Gln、Ser、またはThrで置換する；Thr82をValで置換し、Asn83をProで置換する、ことを含む。
【００６８】
それぞれの疎水性部位に対する適切な極性残基の同定
好ましい実施態様において、溶媒に露出されている疎水性残基は、構造的かつ機能的に互換性のある極性残基で置換される。アラニンおよびグリシンは、また疎水性の低減を構成する、適切な置換として役立ち得る。さらに、PheをTyrにするような、極性の性質を増加させる変異、およびIleをValにするような、疎水性を低減する変異は、適切であり得る。好ましい実施態様において、好ましい適切な極性残基は、以下の極性残基として定められる：１）PDA（登録商標）技術を用いて決定された、最適な回転異性体構造における、その残基のエネルギーが、その部位の露出された疎水性残基のエネルギーよりもより有利である、および２）最適な回転異性体構造における、その残基のエネルギーが、その位置の全ての極性残基のエネルギーのセットの最も有利なものである。好ましい実施態様において、それぞれの可変部位でライブラリーに含まれる極性残基は、PDA（登録商標）技術計算および配列アラインメントデータの両方により、好適とみなされる。あるいは、ライブラリーに含まれる１またはそれ以上の極性残基は、PDA（登録商標）技術計算および配列アラインメントデータの両方により、好適とみなされる。
【００６９】
とりわけ好ましいBMP-7の修飾は、限定はされないが、以下の置換：L21D、L21G、L21K、L21N、L21R、L21S、M23D、M23G、M23K、M23N、M23R、M23S、V26D、V26E、V26G、V26K、V26N、V26S、Y44A、Y44D、Y44E、Y44G、Y44H、Y44K、Y44N、Y44P、Y44Q、Y44R、Y44S、W52A、W52E、W52K、W52Q、W55A、W55E、W55H、W55K、W55N、W55Q、I57A、I57D、I57E、I57H、I57K、I57L、I57T、I57V、E60R、F73A、F73D、F73E、F73H、F73Q、F73R、F73S、Y78D、Y78G、Y78H、Y78N、Y78R、Y78S、Y78T、I86A、I86D、I86E、I86K、I86Q、I86T、L90E、L90K、L90N、L90Q、L90R、L90S、L90T、F93A、F93D、F93E、F93G、F93H、F93Q、F93R、F93S、F93T、I94A、I94E、I94H、I94K、I94Q、I94R、I94T、L115E、L1115K、L115T、Y116A、Y116D、Y116E、Y116H、Y116K、Y116S、Y116T、F117A、F117D、F117E、F117H、F117K、F117Q、F117R、F117Y、V123A、V123D、V123N、V123R、V123T、L125A、L125E、L125K、L125Q、Y128D、Y128E、Y128H、Y128K、およびY128Qを含む。最もとりわけ好ましい修飾は、改善された発現量または活性のような、改善された性質を与える修飾である。BMP-7における露出された疎水性残基の最もとりわけ好ましい修飾は、限定はされないが、L21G、L21R、M23G、M23N、M23R、M23S、V26G、V26N、Y65N、Y78H、Y78R、I86A、F93D、F93E、F93G、F93H、F93S、F93T、I94R、Y116H、F117H、F117YおよびY128Dを含む。
【００７０】
それぞれの接触部位に対する好適な残基の同定
本明細書で用いられる接触部位に対する好適な残基は、BMPの構造と互換性があり、そして少なくとも１個のBMP受容体に対する相当の結合親和性を保持する、全てのアミノ酸残基を意味する。あるいは、BMPの構造と互換し、少なくとも１個のBMP受容体に対する結合親和性を実質的に排除しない別の残基を同定することによって、競合阻害変異体が作成され得る。好適な残基は、１または２個の受容体に対する親和性を維持または増加させる一方、他の受容体、阻害剤、または更なる結合相手に対する結合親和性を実質的に低減することにより、結合特異性を与える。他の場合、修飾は、例えば、野生型タンパク質と実質的に同じ結合親和性を保持する一方、発現量が改善される等の、他の望ましい性質を与えるために選択される。典型的には、接触部位は実質的に溶媒に露出されるであろう。そのような場合、好ましい置換は、極性残基、アラニンおよびグリシンを含む。しかしながら、ダイマー構造に実質的に埋もれた接触部位のために、疎水性置換が好ましい。好適な極性残基は、また、類似体タンパク質、とりわけ他のBMPにおける相同位置で認められる極性残基のサブセットを含み得る。とりわけ好ましい実施態様において、好適な極性残基は、PDA（登録商標）技術計算またはSPA計算（上記）を用いて決定された、低いまたは有利なエネルギーを有する極性残基のサブセットを含む。
【００７１】
極性BMP-7接触残基のとりわけ好ましい実施態様は、限定はされないが、K39D、K39E、K39G、K39N、K39R、K39S、K39T、R48D、R48E、R48H、R48K、R48N、R48Q、Q53A、Q53D、Q53E、Q53G、Q53H、Q53K、Q53R、Q53S、Q53T、E60H、E60K、E60N、E60P、E60Q、E60R、E60S、E60T、N76A、N76D、N76S、N76T、S77A、S77D、S77E、S77H、S77K、S77N、S77P、S77Q、S77T、K126D、K126E、K126G、K126Q、K126R、K127A、K127D、K127E、K127H、K127N、K127P、K127Q、K127S、K127T、R129D、R129E、R129K、R129N、R129S、R134D、R134E、R134K、R134Q、およびR134Sを含む。とりわけ好ましい修飾は、改善された発現量、改善された活性、または強化された受容体結合特異性のような、改善された性質を与える修飾である。BMP-7における、高静電ポテンシャルの領域内の残基に対する、最もとりわけ好ましい修飾は、限定はされないが、K39A、K39S、R48H、R48N、R48Q、Q53A、Q53K、Q53D、Q53G、Q53S、Q53T、E60R、K126R、K127E、R129D、R129N、R134E、およびR134Sを含む。更なるとりわけ好ましい修飾は、タイプIまたはタイプIIのどちらの受容体に対する結合を低下させ、それにより、BMPの競合阻害剤として潜在的に作用する、修飾である。BMP-7の受容体接触残基に対する、更なるとりわけ好ましい修飾は、限定はされないが、Y44T、W52E、およびI57Qを含む。
【００７２】
更なる好ましい修飾は、BMP阻害剤に対する結合親和性または特異性を変化させる修飾である。ノギンとの結合を低減させる好ましい修飾は、限定はされないが、W55I、W55L、W55K、W55R、I57M、I57Y、I57E、I57H、I57K、I57Q、I57R、A58I、A58L、A58M、A58Y、A58V、A58E、A58H、A58K、A58Q、A58R、P59Y、N76E、N76Q、N76R、S77E、S77Q、N83F、N83W、N83Y、N83H、N83K、N83R、I86L、I86M、I86F、I86Y、I86R、V87H、S113I、S113L、S113M、S113F、S113Y、S113E、S113H、S113K、S113Q、S113R、L115M、L115K、L115R、V123M、V123Y、V123H、K127I、K127V、K127H、Y128I、およびY128Rを含む。ノギンとの結合を増加させる好ましい修飾は、限定はされないが、R48M、P59M、E60I、E60L、E60M、E60V、P74M、N76I、N76V、N76A、S77T、D119I、D119L、K126W、およびK127Mを含む。
【００７３】
静電ポテンシャルが高い領域に対する好適な残基の同定
タンパク質の安定性を増強させ、受容体結合の親和性および特異性を変化させるために、静電ポテンシャルの高い領域を修飾し得る。好ましい実施態様において、静電ポテンシャルの高い領域に位置する残基は、局所的な静電気的領域と有利に相互作用すると予想される構造的、そして機能的に互換性のある残基で置換される。好ましい実施態様では、好適な極性残基は、また、類似体タンパク質、とりわけ他のBMPにおける相同位置で認められる極性残基のサブセットを含み得る。とりわけ好ましい実施態様において、好適な極性残基は、PDA（登録商標）技術計算またはSPA計算（上記）を用いて決定された、低いまたは有利なエネルギーを有する極性残基のサブセットを含む。
【００７４】
静電ポテンシャルの高い領域に位置するBMP-7残基のとりわけ好ましい修飾には、限定はされないが、Q88E、N110D、N110E、N110H、A111D、A111S、N130D、A135D、A135E、およびA135Sを含む。最もとりわけ好ましい修飾は、改善された発現量、改善された活性、または増強された受容体結合特異性等の改善された性質をもたらす修飾である。BMP-7中の受容体接触残基の最もとりわけ好ましい修飾は、限定はされないが、N110D、A135E、およびA135Sを含む。
【００７５】
更なる表面位置に対する好適な残基の同定
【００７６】
BMPの表面上の更なる残基が、安定性、溶解性、または発現量の改善のために修飾され得る。好ましい実施態様において、好適な極性残基は、また、類似体タンパク質、とりわけ他のBMPにおける相同位置で認められる極性残基のサブセットを含み得る。とりわけ好ましい実施態様において、好適な極性残基は、PDA（登録商標）技術計算またはSPA計算（上記）を用いて決定された、低いまたは有利なエネルギーを有する極性残基のサブセットを含む。
【００７７】
BMP-7表面残基の更なるとりわけ好ましい修飾は、限定はされないが、Q36E、Q36N、Q36R、E42D、E42Q、E42R、E42T、D49E、D49S、D54K、D54N、D54R、D54S、E70A、E70Q、N95D、N95K、N95Q、N95R、E97D、E97K、E97R、T98A、T98E、T98K、T98R、Q108D、Q108K、Q108S、D119E、D119N、D119S、D119T、S120D、S120E、S120N、S120R、S121D、S121E、S121K、S121N、S121T、N122E、N122Q、およびN122Rを含む。さらに、残基T98は、削除され得る。最もとりわけ好ましい修飾は、改善された発現量、改善された活性、または増強された受容体結合特異性等の改善された性質をもたらす修飾である。BMP-7中の更なる残基に対する最もとりわけ好ましい修飾は、限定はされないが、S120Dを含む。
【００７８】
好適な変異の組み合わせの同定
好ましい実施態様では、２またはそれ以上の変異を有する変異体が、上記のものに限定されず、作成される。そのような変異体は、点変異体に比較し、発現量、溶解性、または受容体特異性においてより優れた改善を示し得る。そのような変異体は、また１以上のタンパク質特性において改善を示し得る。
【００７９】
２つの変異を含むとりわけ好ましい変異体には、限定はされないが、L21G/F93H、L21R/F93H、M23N/Y65N、M23R/Y65N、K39A/Y65N、K39A/F93H、K39S/Y78H、K39S/F93H、K39S/N110D、K39S/S120D、K39S/N130D、K39S/R134E、K39S/A135E、R48N/F93H、Q53D/Y65N、Q53G/Y65N、Q53G/Y78H、Q53S/Y65N、Q53T/Y65N、I57L/Y65N、Y65N/Y78H、Y65N/Y78R、Y65N/S120D、Y65N/A135E、Y65N/A135S、A72D/F93H、Y78H/F93H、Y78H/A105V、Y78H/Q108D、Y78H/Y116H、Y78H/F117Y、Y78H/S120D、Y78H/N130D、Y78H/R134E、Y78H/R134S、Y78H/A135E、Y78H/A135S、Y78H/H139R、Y78R/F93H、F93H/F117Y、F93H/S120D、F93H/R134S、およびF93H/H139Rを含む。３つの変異を含むとりわけ好ましい変異体は、限定はされないが、L21G/K39S/S120D、M23R/K39S/S120D、K39S/Y65N/S120D、K39S/A72D/S120D、K39S/Y78H/S120D、K39S/Q108D/S120D、Y65N/Y78H/F93H、Y65N/Y78H/R134E、A72D/Y78H/F93H、Y78H/F93H/Q108D、Y78H/F93H/F117H、Y78H/F93H/S120D、およびY78H/F93H/R134Eを含む。４つの変異を含むとりわけ好ましい変異体は、限定はされないが、K39S/F93S/Q108D/S120D、K39S/F93S/S120D/R129D、K39S/Y65N/F93S/S120D、K39S/Y78H/F93S/S120D、K39S/F93S/S120D/R134E、K39S/A72D/F92S/S120D、Y65N/Y78H/F93S/R134E、A72D/Y78H/F93S/R134E、M23R/Y65N/F93S/R129D、Y65N/F93S/Q108D/R129D、K39S/F93T/Q108D/S120D、K39S/F93T/S120D/R129D、K39S/Y65N/F93T/S120D、K39S/Y78H/F93T/S120D、K39S/F93T/S120D/R134E、K39S/A72D/F93T/S120D、Y65N/Y78H/F93T/R134E、A72D/Y78H/F93T/R134E、M23R/Y65N/F93T/R129D、およびY65N/F93T/Q108D/R129Dを含む。
【００８０】
更なる修飾
発現量および／または活性に有利な影響を与え得る更なる修飾は、得られたデータ中の重要な傾向を観察することによって、推論され得る。そのような傾向の１つは、Q108D、N110D、N110E、S120D、K127E、Y128D、R129D、N130D、およびA135E等の変異体の発現および活性によって例示される、BMP7（位置105-139）のフィンガー２領域中への負電荷アミノ酸（EまたはD）の導入が、ほとんどの場合、増強された発現または活性を導くという観察である。この領域中の更なる位置の解析は、BMP7置換体T107D、T107E、S113D、S113Eが、また、非常に高い可能性で、優れた発現および／または活性を有するであろうことを示す。第二の傾向は、露出された疎水性アミノ酸をより極性を有し、またはより疎水性を有する代替物に置換することが、一般的に、Y78H、I86A、Y128D、およびF93の多重置換等の変異体に例示される、発現量または活性の増強を導くことである。この傾向を更に露出された疎水性アミノ酸であるI124に適用することは、更に発現または活性が増強された変異体I124A、I124D、I124E、I124K、I124N、I124Q、I124R、I124S、I124T、およびI124Vを示唆する。
【００８１】
更なる挿入、欠失、および置換が、他の望ましい性質を与えるために、本発明のBMP変異体に組み込まれ得る。好ましい実施態様では、BMP変異体は、2005年1月12日に出願された、U.S.S.N60/643,313「免疫原性の変化された抗体およびFc融合タンパク質」に記載されているような、免疫原性を低下する挿入、欠失、または置換を含む。更なる好ましい実施態様では、BMP変異体は更に修飾されて、安定性を増加させる。上記で議論されたように、安定性を改善する修飾は、また、例えば、部分的に折り畳まれてなく、凝集しやすい種の濃度を減少させることにより、溶解性を改善させることができる。例えば、パッキングを改善し、または、好ましい水素結合または静電気的相互作用を形成しない極性のある、または電荷されている基を取り除く修飾が、タンパク質のコアに導入され得る。静電気的相互作用を安定化させ、また不安定な相互作用を取り除く修飾を導入することも、また可能である。更なる安定化させる修飾もまた用いられる。更なる好ましい実施態様では、共有原子価の修飾を受けやすい部位を挿入または除去するために、１またはそれ以上のシステイン、リジン、ヒスチジン、または他の反応性アミノ酸が変異体BMPに付加され、または取り除かれる。例えば、2004年9月30日に出願された米国特許出願No.10/956,352「論理的化学修飾」を参照のこと。当分野で知られているように、変異体BMPは、エピトープタグ（例えば、ポリ−ヒスチジン（poly-His）、c-myc、またFLAG-tag）または融合パートナー（例えば、免疫グロブリン、免疫グロブリンのFc領域、アルブミン、他のBMP、他のサイトカインタンパク質、BMP受容体タンパク質の細胞外ドメイン、等）の付加により修飾され得る。更なる詳細は、2004年11月12日に出願された米国特許出願No.60/627,774「最適化されたFc変異体」のタグと融合パートナーの記載を参照のこと。
【００８２】
BMPの形態
BMPは、天然には、長いプロドメイン、１またはそれ以上の切断部位、および成熟ドメインを含む、プロタンパク質として発現される。このプロタンパク質は、その後細胞のマシナリーによりプロセッシングされてダイマーの成熟したBMP分子が産生される。好ましい実施態様では、本発明の変異体は同様に製造される。プロドメインは、BMPの正しいホールディングとプロセッシングを助けると信じられている。さらに、全てではないが、いくつかのBMPは、プロドメインが成熟ドメインに非共有結合的に結合し、阻害剤並びにシャペロンとして作用し得る（例えば、Thies et. al. (2001) Growth Factors 18: 251-259）。更なる好ましい実施態様では、本発明の変異体は、この形態で、製造および／または治療的に投与される。別の実施態様では、BMPは、限定はされないが、直接的に製造された、または封入体からリホールディングされた成熟ドメイン、または、完全長天然プロドメインを含む、他の形態で製造され得る。本発明の変異体は、これら、そして他の形態での使用を見出されることが予想される。
【００８３】
変異体の製造
本発明の変異体BMP核酸およびタンパク質は、下記に詳しく述べるような、当業者に公知の多くの方法を用いて製造され得る。
【００８４】
BMP変異体をコードする核酸の調製
好ましい実施態様では、BMP変異体をコードする核酸は、全遺伝子合成、または野生型または変異体BMPをコードする核酸の部位指向的変異によって製造される。テンプレート−ダイレクティド  ライゲーション、帰納的PCR、カセット突然変異誘発、部位−指向的膣全変異誘発、または当分野で公知の他の技術を含む方法が、利用される（例えば、Strizhov et. al. PNAS 93:15012-15017 (1996)、Prodromou and Perl, Prot. Eng. 5: 827-829 (1992), Jayaraman and Puccini, Biotechniques 12: 392-398 (1992)、およびChalmers et. at. Biotechniques 30: 249-252 (2001)を参照）。
【００８５】
発現ベクター
好ましい実施態様では、下記の成分および変異体BMPをコードする遺伝子を含む発現ベクターが作成される。数多くの種類の、多様な宿主細胞に対する適切な発現ベクターおよび好適な制御配列が、当分野に公知である。発現ベクターは、限定はされないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、転写停止シグナル、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列を含む、転写および翻訳制御配列を含み得る。好ましい実施態様では、調節配列は、プロモーターおよび転写開始および停止配列を含む。さらに、発現ベクターは、更なる要素を含み得る。例えば、発現ベクターは２個の複製系を含み、したがって、２種の有機体、例えば、発現のための哺乳類または昆虫細胞、およびクローニングおよび増幅のための原核生物宿主で維持され得る。さらに、発現ベクターを組み込ませるために、発現ベクターは、発現構築物に隣接する、少なくとも１個の宿主細胞ゲノムと相同する配列、好ましくは、２個の相同する配列を含む。組み込まれるベクターは、ベクターに含まれる適切な相同する配列を選択することによって、宿主細胞中の特定の遺伝子座に配向され得る。ベクターを組み込ませるための構築物は、当分野で良く知られている。さらに、好ましい実施態様において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択可能にするための選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は、当分野で良く知られており、使用される宿主で変わり得る。発現ベクターは、自己複製できる染色体外のベクターか、宿主ゲノムに組み込まれるベクターであり得る。
【００８６】
発現ベクターは、宿主細胞から変異体BMPの分泌を提供する、分泌先導配列（secretory leader sequence） またはシグナルペプチド配列を含み得る。タンパク質を分泌に導く適切な分泌先導配列は、当分野に知られている。シグナル配列は、典型的には、細胞からタンパク質を分泌に向かわせる疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、成長培地に分泌されるか、または、原核生物の場合、内側および外側の細胞膜の間にあるペリプラスム空間に分泌される。細菌での発現のためには、変異体BMPをコードする核酸に操作可能に連結された細菌分泌リーダー配列が、通常好ましい。
【００８７】
トランスフェクション／形質転換
変異体BMP核酸は、単独で、または発現ベクターと組み合わされて、続いて起こる核酸の発現に適した様式で、細胞内に導入される。導入方法は、ターゲットとなる細胞のタイプによってほとんど決定される。例示的な方法は、CaPO4沈殿、リポソーム融合（例えば、試薬Lipofectin（登録商標）またはFuGeneの使用）、エレクトロポレーション、ウィルス感染（例えば、PCT/US97/01019で概説されているような）、デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン（polybrene）媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、ダイレクトマイクロインジェクション等を含む。変異体BMP核酸は、宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれるか、一過的にまたは定常的に細胞質に存在し得る。
【００８８】
BMP変異体発現のための宿主
BMP変異体発現のための適切な宿主は、酵母、細菌、古細菌、カビおよび哺乳類を含む昆虫および動物細胞を含む。特に興味深いのは、サッカロマイシス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）等のカビ、および293（例えば、293-Tおよび293-EBNA）、BRK、CHO（例えば、CHOK1およびDG44)、COS、Jurkat、NIH3T3等（ATCC細胞株カタログ参照）を含む哺乳類細胞株である。BMP変異体は、また、限定はされないが、植物（トウモロコシ、タバコ、および藻類等）および動物（ニワトリ、ヤギ、ウシ等）を含む、更に複雑な有機体中で生産され得る；例えば、Dove, Nature Biotechnol. 20: 777-779 (2002)参照。ある実施態様では、細胞は更に遺伝子的に操作され、すなわち、変異体BMP核酸を含む発現ベクター以外に外来の核酸を含む。
【００８９】
発現方法
本発明の変異体BMPは、変異体BMPをコードした核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、変異体BMPの発現を誘導する、または、促す適切な条件の下で、培養することにより生産される。変異体BMP発現に適した条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択により変化し、決まり切った手順の実験によって、当業者に容易に認識される。
【００９０】
精製
好ましい実施態様では、BMP変異体は、発現された後精製され、または単離される。標準的な精製法は、イオン交換、疎水性、アフィニティー、逆相HPLCクロマトグラフィーを含む、電気泳動の、分子の、免疫の、およびクロマトグラフィーの技術、およびクロマトフォーカシングを含む。例えば、BMP変異体は、標準的な抗組み換えタンパク質抗体カラムを用いて精製され得る。限外ろ過およびダイアフィルトレーション（diafiltration）技術は、タンパク質濃縮と組み合わされて、また使用され得る。好適な精製技術の一般的な手引き書として、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 3d ed. (1994)を参照のこと。必要な精製の程度は、望まれる使用に依存して変わり、精製が必要でない場合もあり得る。
【００９１】
翻訳後修飾および誘導体化
一度作成されれば、変異体BMPは、共有結合的に修飾され得る。したがって、タンパク質の共有結合的および非共有結合的修飾は、本発明の範囲内に含まれる。そのような修飾は、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応可能な有機誘導体化試薬と反応させるこよにより、変異体BMPポリペプチドの中に誘導され得る。修飾に対し最適な部位は、限定はされないが、外観検査、構造解析、配列解析および分子シミュレーションを含む、多様な基準を用いて選択される。修飾部位は、プロドメインまたは成熟ドメインに位置され得る。
【００９２】
一つの実施態様では、本発明の変異体BMPは、少なくとも１つの成分、同位体または化学化合物で標識化される。一般的に、標識は３クラスに分類される：a）同位体標識（放射性の、または重同位体であり得る）；ｂ）免疫標識（抗体または抗原であり得る）；およびｃ）有色または蛍光色素。標識は、化合物のいずれの位置にも組み込まれ得る。標識には、限定はされないが、ビオチン、タグ（例えば、FLAG、Myc)および蛍光標識（例えば、フルオレセイン）を含む。二価性の試薬による誘導体化は、例えば、以下に十分に記載するような、抗変異体BMP抗体の精製やスクリーニング試験の方法に使用するための、変異体BMPと水不溶性支持体マトリックスまたは表面へのクロスリンクに有用である。一般的に使用されるクロスリンク試薬は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例えば、4-アジドサリチル酸とのエステル類、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステル類、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタン等の二価性マレイミド類を含むホモ二価性イミドエステル類、およびメチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデート等の試薬を含む。他の修飾は、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の対応するグルタミルおよびアスパルチル残基それぞれへの脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリン、またはスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、N末端のアミンのアセチル化、およびC末端カルボキシル基のアミド化を含む。そのような誘導体化は、溶解性、吸収性、血液脳関門の通過、血清半減期等を改善し得る。あるいは、変異体BMPポリペプチドの修飾は、当該タンパク質の潜在的で望まれない副作用を取り除き、または低減し得る。そのような作用を媒介することができる部分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980)に開示されている。
【００９３】
変異体BMPの共有結合的修飾の他のタイプには、変異体BMPポリペプチドを多様な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン類、の１種に、米国特許番号4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192または4,179,337に説明されるようなやり方で、結合することを含む。当分野で知られているように、多様な結合化学は、PEG結合を成し遂げるのに使用され得る。実施例は、限定はされないが、システイン残基と、限定はされないが、ヒスチジンの基、リジンの基およびN末端（Kinstler et al, Advanced Drug Deliveries Reviews, 54, 477-485 (2002) and MJ Roberts et al, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 459-476 (2002)を参照)を含む１級アミンの置換を可能にする、ShearwaterおよびEnzonの技術を含む。不安定な、および不安定でないPEG結合が使用され得る。共有結合的な修飾の更なる形態は、変異体BMPポリペプチドと親油性の、および親水性の部分からなるポリマーの１または２の分子を結合させることを含む。そのような組成物は、BMPの加水分解または酵素的分解の抵抗性を増強し得る。利用されるポリマーは、例えば、親油性部分のための脂肪酸、および親水性部分のための直鎖ポリアルキレングリコール類を組み込み得る。ポリマーは、BMP結合のために使用されるスペーサーと同様に許容される糖部分を更に組み込み得る。ポリマーの組成および共有結合のための方法は、例えば、米国特許番号5,681,811; 5,359,030に記載されている。
【００９４】
修飾の他のタイプは、変異体BMPへの化学的または酵素的グリコシドの結合である。そのような方法は、当分野、例えば、1987年9月11日に刊行されたWO 87/05330およびAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に、記載されている。あるいは、変異体BMPポリペプチド上に存在する炭化水素部分の除去は、化学的または酵素的に成し遂げられ得る。化学的な脱グルコシル化の技術は、当分野で知られており、例えば、Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)およびEdge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)に記載されている。ポリペプチドの炭化水素部分の酵素的切断は、Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)に記載されているような、多種のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用によって、成し遂げられ得る。
【００９５】
変異体の発現量の試験
本発明の主要な目的は、発現量が増加した変異体BMPの同定である。したがって、１またはそれ以上の発現条件のセットを用いて、変異体および野生型BMPの量が決定される。１つの実施態様では、発現量はELISAを用いて決定される。この技術の１つの制限は、いくつかの変異体が抗体結合親和性を増加または減少させることである。したがって、好ましい実施態様では、ELISAは、異なるエピトープを認識する少なくとも２種のモノクローナル抗体を用いて実施される。変異体を精製し、UV吸収またはBCA試験等の直行法（orthogonal methods）により、それらの濃度を決定することにより、選択された変異体に対するELISA補正係数を導き出すことも可能である。あるいは、BMPはFLAGタグまたはHisタグ等のタグを含むように操作され、そして抗タグ抗体がELISAで使用され得る。もう一つの実施態様では、発現量は、ウェスタンブロッティングを用いて決定される。ELISAと同様に、制限は、いくつかの変異体が、抗体結合親和性を増加させ、または減少させることである。
【００９６】
変異体の溶解性の試験
好ましい実施態様では、変異体BMPの溶解性は、限定はされないが、下記を含む方法を用いて試験される。全ての好ましい実施態様において、変異体および野生型タンパク質は、それぞれの変異体の溶解性を評価するために同じ試験システムで、かつ同じ条件下で直接比較される。BMP変異体の溶解性は、多くの溶媒条件下で決定される。可溶化剤および安定化剤を含む、多様な賦形剤は、BMPの最高溶解濃度を促進させる能力を試験され得る。さらに、異なる塩濃度および多様なｐHが試験され得る。好ましい実施態様では、溶解性は薬学的に許容される条件下で評価される。
【００９７】
ディファレンシャル・ライト・スキャッタリング（DLS）は、オリゴマー化状態を決定するのに使用され得る。DLSは、溶液中の粒子のブラウン運動によるレーザー光散乱の揺らぎからのシグナル補正に基づいて拡散係数を決定する（Heimenz, Chapter 10 in Polymer Chemistry, Marcel Dekker, Inc., NY, 1984, pp. 659-701）。商業的に入手可能な機器は、Stokes-Einstein方程式を用いてレーザー光散乱データの解析／自動補正により計測された拡散係数を変換した後、サイズにより特定の集団の図または表の読み出しを提供する。したがって、サイズは流体力学半径である。集団中の特定サイズの分布は分散度であり、この係数は、特定の集団の均一性のデータを提供する。分散度および凝集の出現の両方が経時的にモニターされ、溶解性が試験される。凝集したタンパク質は容易にDLSにより解析され、凝集物の物理的性質（標的表面積が広いので、単位あたりのレーザー光をより分散させる）により低レベルでも容易に検出される。サンプルは、キュベットに直接導入される（すなわち、最初にクロマトグラフィーの工程を実施する必要はない）。凝集粒子集団に対する単量体分散物の相対比が決定される。任意に、この比率は、質量または光分散強度により重み付けされ得る。したがって、DLSは、凝集物の形成をモニターするのに好ましい技術であり、煩雑でない技術であるという点で有利である。
【００９８】
他の実施態様において、分析超遠心（AUC）が変異体BMPのオリゴマー化状態を決定するのに使用される。AUCは異なる２様式、速度と平衡で実行される。平衡AUCがタンパク質分子量の決定およびオリゴマー状態の測定に最も好ましい方法である。
【００９９】
更なる好ましい実施態様は、サイズ−排除クロマトグラフィー（SEC）の使用である。高速液体クロマトグラフィーを使用するとき、試料は、等張移動相（isocratic mobile phase）に導入され、サイズに基づいてタンパク質を排除するように設計されたゲル浸透マトリックス上で分離され得る。したがって、試料は、凝集したタンパク質が最短の保持時間で最初に溶出されるように「ふるいにかけられる」であろうし、残りから容易に分離され得るであろう。これにより、凝集物を同定し、機器に備えられているピーク解析ソフトウェアを使用してピーク積分することにより、相対的定量化が可能となる。
【０１００】
別の実施態様では、タンパク質濃度は、時間の関数としてモニターされる。低い溶解性のときは、凝集は、時間がたてばタンパク質溶液中に形成され、最終的には完全に沈殿する。これは、遠心分離および溶液相のサンプリングに続いて実施され、その場合、時間と共に溶液タンパク質濃度の低下として測定され得る不溶性は、遠心分離に続いて観察されるであろう。
【０１０１】
別の実施態様では、オリゴマー化状態は、ネイティブゲル電気泳動の相対移動度をモニターリングすることにより決定される。
【０１０２】
他の実施態様では、可溶性発現されたタンパク質の量が決定される。天然タンパク質の溶解性以外の要素が可溶性発現の程度に影響を与え得るが、可溶性発現の改善は、溶解性の改善に関係し得る。任意の多くの方法が、使用され；例えば、発現の後、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動および／またはウェスタンブロットが、粗細胞溶解物または発現培地の可溶画分に対してなされ得る。
【０１０３】
さらに、可溶性発現に対する任意の多くのハイスループットスクリーニングが、使用され得る。ある実施態様では、興味あるタンパク質は、GFPのような蛍光タンパク質に融合され、細胞は蛍光としてモニターされる（Waldo et. al. Nat. Biotechnol. 17: 691 (1999)）。別の実施態様では、興味のあるタンパク質は、抗生物質耐性酵素クロラムフェニコールトランスフェラーゼに融合される。タンパク質が可溶的に発現すると、当該酵素が機能的となり、したがって抗生物質クロラムフェニコールの濃度を増加した培地での成長が可能となる（Maxwell et. al. Protein Sci. 8: 1908 (1999)）。他の実施態様では、興味あるタンパク質は、酵素β−ガラクトシダーゼのアルファドメインと融合して発現される。タンパク質が溶解形態で発現すると、アルファドメインはオメガドメインを補完し、機能性の酵素を産生する。これにより、細胞をインジケーターX-galを含む培地上でプレートすると、白色よりむしろ青色のコロニー形成として検出され得る（Wigley et. al. Nat. Biotechnol. 19: 131 (2001)）。
【０１０４】
変異体の活性の試験
好ましい実施態様では、野生型および変異体タンパク質の活性は、インビトロ受容体結合試験、細胞ベースの活性試験、またはインビボ活性試験を用いて解析される。
【０１０５】
受容体結合試験
好ましい実施態様では、１またはそれ以上のBMP受容体に対する変異体BMPの親和性が決定される。とりわけ好ましい実施態様では、ALK-2、ALK-3、ALK-6、ActRII、ActRIIb、およびBMPRIIに対する親和性が決定される。好適な結合試験には、限定はされないが、ELISA、蛍光異方性および強度、シンチレーション近接アッセイ（SPA）、Biacore（Pearce et al., Biochemistry 38:81-89 (1999)）、DELFIA試験、およびAlphaScreenTM（PerkinElmerから商業的に入手可能である; Bosse R., Illy C.,およびChelsky D (2002)）が含まれる。
【０１０６】
好ましい実施態様では、Biacoreまたは表面プラズモン共鳴試験（例えば、McDonnell (2001) Curr. Opin. Chem. Biol. 5:572-577参照）が、１またはそれ以上のBMP受容体に対する１またはそれ以上のBMP変異体の親和性を決定するのに使用される。例えば、Biacore実験は、プロテインA誘導体化チップまたはNTAチップにBMP受容体−Fc融合タンパク質を結合させ、検体としてそれぞれのBMP変異体を試験することにより、実施され得る。抗BMP抗体をチップに結合させるるか、または、BMP変異体をチップに結合させ、そして可溶性受容体またはFc−受容体融合タンパク質を検体として試験することも、また可能である。Biacore実験は、TGF-βアイソフォームのそれらの受容体に対する結合を特徴付けるために以前より用いられてきた（De Crescenzo et. al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 29632-29643, De Crescenzo et. al. (2003) J. Mol. Biol. 328: 1173-1183）。
【０１０７】
別の好ましい実施態様では、プレートベースの直接結合試験が、１またはそれ以上の受容体に対する１またはそれ以上のBMP変異体の親和性を決定するために使用される。この方法は、BMPが抗BMPモノクローナル抗体を用いて捉えられ、BMP受容体／Fc融合タンパク質を用いて検出される、改変サンドイッチELISAである。
【０１０８】
もう一つの好ましい実施態様では、AlphaScreen（登録商標）試験（Bosse R., Illy C., and Chelsky D (2002). Principles of AlphaScreenTM PerkinElmer Literaure Aplication Note Ref# s4069. http://lifesciences.perkinelmer.com/Notes/S4069-0802.pdf）が使用され、受容体および阻害剤の結合が特徴付けられる。AlphaScreen（登録商標）は、ビーズベースの非放射活性蛍光近接試験で、ドナービーズは、680nmのレーザーにより励起され、一重項酸素を放出する。一重項酸素は拡散し、アクセプタービーズの表面上のチオキセン誘導体と反応し、600nmの蛍光放出を導く。蛍光放出は、ドナーとアクセプターが、それぞれがリガンドおよび受容体（またはリガンドおよび阻害剤）とそれぞれ結合したときに起こる分子相互作用によって、密接に近接したときにのみ起きる。この相互作用は、適切な量の関連する受容体または阻害剤に結合する、適切な量の非標識化BMP変異体を添加することによって、競合され得る。
【０１０９】
ある実施態様では、AlphaScreen（登録商標）試験は、１）適切なタグまたは標識を付加することにより修飾されたBMP；２）BMPを修飾するために用いられたタグまたは標識に結合することができるドナービーズ；３）適切なタグまたは標識の付加により修飾されるBMP受容体または阻害剤；４）BMP受容体を修飾するために用いられたタグまたは標識に結合することができるアクセプタービーズ、および５）競合物として機能する、各種量の標識されてないBMP-7分子、を用いて実施される。ドナーまたはアクセプタービーズを天然BMPまたはBMP受容体を特異的に認識する抗体でコートすること、または、受容体をドナービーズに、そしてリガンドをアクセプタービーズに結合させることも、また可能である。別の実施態様では、AlphaScreen（登録商標）は、１）適切なタグまたは標識を付加することにより修飾された、タイプＩBMP受容体；２）タイプＩBMP受容体を修飾するために用いられたタグまたは標識に結合することができるドナービーズ；３）適切なタグまたは標識を付加することにより修飾されるタイプＩＩBMP受容体；４）タイプＩＩBMPを修飾するために用いられたタグまたは標識に結合することができるアクセプタービーズ；５）BMP、および６）競合物として機能する、各種量の標識されてない変異体BMP-7分子を用いて、実施される。タイプＩBMP受容体をアクセプタービーズに、タイプＩＩＢＭＰ受容体をドナービーズに結合させることも、また可能である。
【０１１０】
もう一つの実施態様では、蛍光試験が使用される。BMP-7またはBMP-7受容体または阻害剤は、蛍光色素で標識され得る（適切な色素の例は、Molecular Probes社カタログを参照）。当業界で知られているように、標識化分子の蛍光強度または異方性は、他方の分子の結合で変わり得る。蛍光試験は、１）蛍光標識されたBMP-7、２）BMP受容体または阻害剤、および３）競合物として機能する、各種量の標識化されてない変異体BMP-7タンパク質を用いて実施される。
【０１１１】
更なる実施態様では、シンチレーション近接試験（SPA）が、受容体結合親和性を決定するために使用される。例えば、BMP受容体−Fc融合は、プロテインAでコートされたSPAビーズまたはフラッシュプレートに結合され、S35−標識BMPで処理される；結合現象により光が生成する。
【０１１２】
細胞ベース活性試験
BMPは多種の細胞の成長および分化を促進させる。BMP活性は、例えば、MC3T3-E1（マウス頭蓋冠由来、骨芽細胞様細胞）、C3H10T1/2（胎児結合組織由来、マウス間葉幹細胞株）、ATDC5（マウス胎生期癌細胞）、L-6（ラット筋芽細胞株）またはC2C12（マウス筋原細胞株）細胞のBMPが惹起する分化を測定することにより、モニターされ得る。分化は、例えば、アルカリホスファターゼのための発光レポーターまたはアルシアンブルー（Alcian Blue）またはPNPP（Asahina et. al. (1996) Exp. Cell Res. 222: 38-47; Inada et. al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 222: 317-322; Jortikka et. al. (1998) Life Sci. 62: 2359-2368; Cheng et. al. (2003) J. Bone Joint Surgery 95A: 1544-1552）のような比色試薬を用いて、モニターされ得る。ラット肢芽軟骨分化試験は、また初代細胞の活性をモニターするために使用され得る。別の実施態様では、レポーター遺伝子またはキナーゼアッセイが使用される。BMPはJAK-STATシグナル伝達経路を活性化する。したがって、GFPまたはルシフェラーゼ等のようなSTAT反応性レポーターを含むBMP反応性細胞株が使用され得る（Kusanagi et. al. (2000) Mol. Biol. Cell. 11: 555-565）。好ましい実施態様では、腎臓細胞でのBMP活性は、細胞ベース試験を用いて決定される；例えば、Wang and Hirschberg (2004) J. Biol. Chem. 279: 23200-23206を参照。
【０１１３】
BMP活性の動物モデル
最も簡単な実施態様では、動物におけるBMPの活性は、皮下投与に続く骨誘導として測定される。好ましい実施態様では、１またはそれ以上のBMP変異体は、BMP-反応性疾患または状態の動物モデルにおいて決定される。腎臓病の動物モデルには、限定はされないが、ラット腎毒性血清腎炎モデル（Zeisberg et. al. 2003）、ラット慢性シクロスポリンＡ惹起腎症モデル（Li et. al. (2004) Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286: F46-57）、マウス片側性尿管閉鎖モデル（Schanstra et. al. (2003) Thromb. Haemost. 89: 735-740）、ストレプトゾトシン惹起糖尿病性腎症（Taneda et. al. (2003) J. Am. Soc. Nephrol. 14: 968-980）、抗thy 1.1 mAbおよびハブ蛇毒惹起糸球体腎炎モデル（Dimmler et. al. (2003) Diagn. Mol. Pathol. 12: 108-117）、およびラット5/6残留腎臓病モデル（Romero et. al. (1999) 腎臓 Int. 55: 945-955）を含む。肝臓病の動物モデルには、限定はされないが、ラット胆管結紮／切断モデル（Park et. al. (2000) Pharmacol. Toxicol. 87: 261-268）、CC14およびエタノール−惹起肝臓損傷（Hall et. al. (1991) Hepatology 12: 815-819）、ジメチルニトロソアミン惹起肝硬変（Kondou et. al. (2003) J. Hepatol. 39: 742-748）、そしてチオアセトアミド惹起肝臓損傷（Muller et. al. (1988) Exp. Pathol. 34: 229-236）を含む。肺疾患の動物モデルには、限定はされないが、オボアルブミン惹起気道線維症（Kenyon et. al. (2003) Toxicol. Appl. Pharmacol. 186: 90-100）、ブレオマイシン惹起肺線維症（Izbicki et. al. (2002) Int. J. Exp. Pathol. 83: 111-119）、モノクロタリン惹起肺線維症（Hayashi et. al. (1995) Toxicol. Pathol. 23: 63-71）、および選択的X線放射（Pauluhn et. al. (2001) Toxicology 161: 153-163）が含まれる。神経学的疾患の動物モデルには、限定はされないが、6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA)片側損傷ラットモデルおよびMPTP惹起パーキンソン病のような、パーキンソン病の動物モデル、変異体SOD1発現ラットまたはマウスのようなALSの動物モデル（Shibata et. al. (2002) Neuropathology 22: 337-349）、エンドセリンまたはキノリン酸の皮質内マイクロインジェクション（Gilmour et. al. (2004) Behav. Brain Res. 150: 171-183）、または脳動脈閉塞（Merchenthaler et. al. (2003) Ann. NY Acad. Sci. 1007: 89-100）により惹起される卒中の動物モデルが含まれる。
【０１１４】
BMP変異体を使用した投与および処置
作成されれば、本発明のBMP変異体は、BMP関連疾患を処置するために患者に投与され得る。BMP変異体は、限定はされないが、経口、非経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、経肺、経膣、直腸内、鼻腔内または眼球内を含む、多様な経路で投与されることができる。いくつかの場合では、変異体BMPは直接、溶液またはスプレーとして適用される。
【０１１５】
本発明に係る医薬組成物は、ＢＭＰ変異体を患者への投与に適した形態で含む。好ましい態様では、医薬組成物は、滅菌され、水溶性の形態であり、そして、薬学的に許容される酸付加塩または薬学的に許容される塩基付加塩を含み得る。医薬的組成物は、また、１またはそれ以上の下記のもの：血清アルブミン等の担体タンパク質；NaOAc等の緩衝液；微結晶性セルロース、ラクトース、コーンおよび他のデンプン等の充填剤；結合剤；甘味料および他の香味剤；着色剤；およびポリエチレングリコール、を含み得る。一般的に安全と認識されている添加剤（GRAS）は、当分野で良く知られており、様々な製剤で使用されている。
【０１１６】
多くの薬剤送達デバイスまたは徐放製剤のいくつかが使用され得る。例えば、変異体BMPは、BMPプロドメインおよびBMP成熟ドメインを含む前駆タンパク質として投与され得る。BMPは、また、BMP浸透マトリックス物質（例えば、Geiger et. al. Adv. Drug Deliv. Rev. (2003) 55: 1613-1629; Hu et. al. J. Biomed. Mater. Res. (2003) 67A: 591-598; Peel et. al. J. Craniofac Surg. (2003) 14: 284-291）として投与され得る；係る投与方法は、骨の治療および成長の促進のためにとりわけ好ましい。さらに、骨の治療のためのインプラントは、骨の治療の促進および骨の強度の改善のために、BMPでコートされ得る（Schmidmaier et. al. Bone (2002) 30: 816-822）。更なる態様では、変異体BMPはミセルの製剤（米国特許No. 5,833,948）、リポソーム（Matsuo et. al. J. Biomed. Mater. Res. (2003) 66A: 747-754）、生体分解ポリマー（Saito and Takaoka, Biomaterials (2003) 24: 2287-2293; Saito et. al. Bone (2003) 32: 381-386; Weber et. al. Int. J. Oral Maxillofac. Surg. (2002) 31: 60-65; Saito et. al. J. Bone Joint Surg. Am. (2001) 83-A: S92-S98）、ヒドロゲル（Yamamoto et. al. Biomaterials (2003) 24: 4375-4383）等で添加される。
【０１１７】
医薬組成物の組み合わせが投与され得る。さらに、組成物は他の治療剤と組み合わされて投与され得る。
【０１１８】
変異体BMPをコードする核酸は、また遺伝子治療に使用され得る。遺伝子治療の適用において、遺伝子は、治療的に有効な遺伝子産物をインビボで合成することを成し得るため、例えば、欠損遺伝子の代替のために、細胞内に導入される。「遺伝子治療」は、１回の治療により永続的な効果が成し遂げられる、従来の遺伝子治療と、治療的に効果があるDNAまたはmRNAの１回または繰り返し投与を必要とする、遺伝子治療薬剤の投与の両方を含む。本分野で知られているいくつかの多様な技術が、関連する細胞への核酸の導入のため使用される。オリゴヌクレオチドは、例えば、負電荷のリン酸ジエステル基を電荷のない基に置換することにより、取り込みを高めるために修飾され得る。遺伝子の作成および遺伝子治療のプロトコルの総説として、Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)を参照できる。
【実施例】
【０１１９】
実施例１：構造のモデリング
【０１２０】
２個のALK-3受容体および２個のActRIIa受容体に結合したBMP-7ダイマーまたはBMP-2ダイマーを含むヘキサマー複合体を、ActRIIaに結合したBMP-7の構造（PDB code 1LX5）およびALK-3に結合したBMP-2の構造（PDB code 1ES7）を用いて構築した。InsightII（Accelrys）を用いて、BMPの構造を下記のように重ね合わせた：BMP-2残基22-32がBMP-7残基47-56に重ね合わせられ、BMP-2残基49-71がBMP-7残基73-95に重ね合わせられ、およびBMP-2残基101-106がBMP-7残基126-131に重ね合わせられた。これは、0.77Åのバックボーン原子RMSDを生じる。BMP-7構造の鎖Aが、BMP-2構造の鎖AおよびC上で重ね合わされるように、重ね合わせを繰り返した。BMP-2およびBMP-7間の配列アライメントは、図２で示されており、ヘキサマー複合体の構造は、図３で示されている。
【０１２１】
ホモロジーモデリングを、BMP-2およびBMP-7に結合した更なるBMP受容体の構造を作成するために用いた。図５に示されるように、ALK-2およびALK-6の配列はALK-3と並べられ、ActRIIbおよびBMPRIIの配列は、ActRIIaと並べられた。InsightIIのModeler toolを、ホモロジーモデルを作成するために使用した。ジスルフィドの組を、下記のように手作業で決めた（1LX5および1ES7から番号付けされた結晶を使用する）：Alk3:238-259、240-244、253-277、287-301、302-307;  ActRIIa:11-41、31-59、66-85、72-84、および86-91。それぞれの分子に対して３モデルが作成され；最良のエネルギーおよび−lnPDFスコアーを有するモデルが、その後のPDA（登録商標）技術計算のために選択された。ホモロジーモデリングを、また、BMP-4、BMP-5、BMP-6、およびBMP-8の構造作成のために使用した。BMP-4はBMP-2構造を用いてモデリングされ、一方、BMP-5、BMP-6およびBMP-8はBMP-7構造を用いてモデリングされた。BMP配列は、図３に示されるように並べられた。PDA（登録商標）技術計算が、BMP-4、BMP-5、BMP-6およびBMP-8構造のモデリングに使用された。
【０１２２】
実施例２：BMPの露出された疎水性残基の同定
【０１２３】
BMP-7ダイマー（「ダイマー」）およびALK-3およびActRIIaに結合したBMP-7ダイマー（「ヘキサマー」）を、溶媒に暴露された疎水性残基を同定するために解析した。それぞれの残基の絶対的で、部分的な溶媒暴露疎水性表面領域を、1.4Åの付加半径を用いてLeeおよびRichardsの方法（J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971)）を利用して計算した。それぞれの残基を、また、コア、境界、または表面として分類した（Dahiyat and Mayo Science 278: 82-87 (1997)参照）。
【０１２４】
BMP-7の溶媒暴露疎水性残基を、BMP-7ダイマー（PDB code 1LX5、鎖A、さらに対称関係BMP-7分子）中の、少なくとも50Å2（オングストロームの２乗）の露出された疎水性表面領域を有する疎水性残基であると定義した。露出された疎水性表面領域を、またBMP-7/ALK-2/ActRIIaヘキサマーで測定し、RESCLASSを、それぞれの位置をコア、境界、または表面として分類するために試行した。
【表１】
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【０１２５】
実施例３：BMP-7中の受容体および阻害剤接触面の同定
【０１２６】
BMP-7およびALK-3、BMP-7およびActRIIa、およびBMP-7およびノギン間の相互作用の可能な部位を、実施例１に記載したヘキサマー構造およびBMP-7およびノギン（PDB code 1M4U）の共結晶を検討することにより同定した。次に、距離の測定が分子間相互作用に係わる可能性がある残基の同定に用いられた。ALK-3、ActRIIa、またはノギンの接触面の５Å（オングストローム）以内に存在するBMP-7の残基（CA-CA距離から測定されるような）は、接触している受容体または阻害剤の位置とともに以下に示す。次に、ホモロジーモデリングで使用される受容体配列アライメントを、多型のために解析した。受容体多型についての情報を、下記の受容体特異的変異体の設計に使用した。受容体の位置が多型なとき、それは表２中に記載されている；「na」は、受容体の位置が、曖昧でなく多型を同定するために、十分に良く整列されていなかったことを示す。しかしながら、受容体特異的BMP変異体は、そのような整列されてない受容体の領域と接触するものと同定され得る。
【表２】
2008500816.tif 000003
【０１２７】
【表３】
2008500816.tif 000004
【０１２８】
【表４】
2008500816.tif 000005
【０１２９】
【表５】
2008500816.tif 000006
【０１３０】
【表６】
2008500816.tif 000007
【０１３１】
【表７】
2008500816.tif 000008
【０１３２】
【表８】
2008500816.tif 000009
【０１３３】
実施例４：BMP-7における静電ポテンシャルの高い領域の同定
【０１３４】
BMP-7におけるそれぞれの位置の静電ポテンシャルを、BMP-7ダイマーにおいてDebye-Huckel方程式を用いて測定した。静電ポテンシャルが0.5以上または-0.5以下の位置は、下表に挙げられている；これらの位置の修飾は、安定性または受容体結合特異性の増加をもたらし得る。
【表９】
2008500816.tif 000010
【０１３５】
実施例５：好ましいBMPの置換の同定
【０１３６】
類似接触環境（Analogous contact environment）（ACE）計算を、BMP-7に対する完全PFAMアライメントを用いて、BMP-7について実施した。ACE計算は、類似タンパク質において構造的に同様な状況で認められるそれぞれの位置に対する代替残基を同定する。計算を、低いストリンジェンシー閾値0.8および高いストリンジェンシー閾値0.5を用いて実施した。
【０１３７】
【表１０】
2008500816.tif 000011
【０１３８】
【表１１】
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【０１３９】
【表１２】
2008500816.tif 000013
【０１４０】
PDA（登録商標）技術計算を、BMP-7構造および機能と互換性のある代替残基を同定するために実施した。それぞれの可変位置で、エネルギーを、野生型残基および疎水性が低減されるか、または極性が増加された代替残基のために計算した。最初に、点突然変異計算を、それぞれの鋳型に対して実施した。最も好適な回転異性体の立体構造における代替アミノ酸それぞれのエネルギーが、結晶学的に回転異性体の立体構造で認められる野生型残基のエネルギーと比較された；下表中の全ての報告されたエネルギーは、[E（野生型）−E（変異体）]である。タイプＩまたはタイプＩＩ受容体における少なくとも１つの原子の５Å以内にある残基に対して、計算を、受容体に結合したBMP-7ダイマーからなる鋳型を使用して、また実施した。
【０１４１】
【表１３】
2008500816.tif 000014
【０１４２】
【表１４】
2008500816.tif 000015
【０１４３】
【表１５】
2008500816.tif 000016
【０１４４】
【表１６】
2008500816.tif 000017
【０１４５】
次に、空間的に近接して位置する複数の可変位置を、変えることができる、組み合わせ計算を行った。最もこのましいアミノ酸配列は、最初DEEであると同定され、その次に、モンテカルロ計算が実施され10,000の好ましいエネルギーを同定した。トップ10,000配列の少なくとも500において与えられた位置のために選択された全ての残基は、記載され、そして発生数は以下の表に与えられる。タイプＩまたはタイプＩＩ受容体において少なくとも１つの原子の５Åの範囲内にある残基のために、計算を、受容体に結合したBMP-７ダイマーからなる鋳型を用いて、また実施した。
【０１４６】
【表１７】
2008500816.tif 000018
【０１４７】
【表１８】
2008500816.tif 000019
【０１４８】
【表１９】
2008500816.tif 000020
【０１４９】
PDA（登録商標）技術計算を、また、BMP阻害剤タンパク質ノギンとの結合を増加させるか、または実質的に取り除く可能性のある変位を同定するために実施した。ノギン中の少なくとも１つの原子の５Ａ以内にあるBMP中のそれぞれの位置で（上記表参照）、（１）BMP-7のみ、および（２）ノギンに結合したBMP-7を含む鋳型を用いて、エネルギーを代替残基のために計算した。好ましい置換は、限定はされないが、下表に掲載されたものを含む。
【０１５０】
【表２０】
2008500816.tif 000021
【０１５１】
【表２１】
2008500816.tif 000022
【０１５２】
【表２２】
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【０１５３】
多くの代替残基が可変位置それぞれに対して選択された。全ての場合で、代替残基はBMP-7ダイマーの構造にも適合できると予想される。代替残基は、競合的阻害変異体、受容体特異的変異体、および高親和性変異体を含む多様な様式で、受容体と相互作用することが予想される。下記に示される表は、配列アライメントデータ、ACE計算、およびPDA（登録商標）技術計算を用いて同定される好ましい置換を示す。「X」は一残基欠失を示す。
【表２３】
2008500816.tif 000024
【０１５４】
【表２４】
2008500816.tif 000025
【０１５５】
容易に理解されるように、これら好ましい置換の多くは、他のBMPおよびTGF-βファミリーメンバーの類似位置に容易に組み込まれ得る。ヒトBMPの配列アライメントは図３に与えられる。どの置換がBMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6およびBMP-8に組み込まれ得るかを同定するために、上記置換のそれぞれのエネルギーを、それぞれのダイマー構造で計算した。２種の異なる構造において、類似エネルギーで置換することは、２種のタンパク質において同様の効果を生み出す可能性がある。
【０１５６】
【表２５】
2008500816.tif 000026
【０１５７】
【表２６】
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【０１５８】
【表２７】
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【０１５９】
【表２８】
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【０１６０】
【表２９】
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【０１６１】
【表３０】
2008500816.tif 000031
【０１６２】
他のBMP鋳型に対するBMP-2鋳型を用いて計算されたエネルギーに対する相関係数（R2）は以下のようである：BMP2 対 BMP4 = 0.93、BMP2 対 BMP5 = 0.52、BMP2 対 BMP6 = 0.44、BMP2 対 BMP-7 = 0.64、およびBMP2 対 BMP8 = 0.52。他のBMP鋳型に対するBMP-7鋳型を用いて計算されたエネルギーに対する相関係数（R2）は以下のようである：BMP-7 対 BMP2 = 0.54、BMP-7 対 BMP4 = 0.54、BMP-7 対 BMP5 = 0.95、BMP-7 対 BMP6 = 0.71、およびBMP-7 対 BMP8 = 0.76。これら傾向はペアの配列類似性と相関する。BMP-7鋳型における修飾ともう一つのBMP鋳型の間のエネルギーの相違が1kcal/mol以下、または、両方のエネルギーが50kcal/molより高ければ、BMP-7への修飾は実質的に他のBMPに対して同様の効果を有する。以下のBMP-7修飾は、実質的にBMP-2に対して同様の効果を有する：Q36E、A37K、K39D、E42R、E42T、R48N、R48Q、Q53D、Q53S、W55A、W55E、W55N、W55Q、E60K、E60Q、E60R、E60S、E60T、A63E、A63Q、Y65D、Y65N、E70Q、S77Q、S77T、Q88E、L90E、L90N、L90Q、F93A、F93D、F93R、F93S、I94E、I94K、I94Q、I94T、N95K、E97D、N110E、A111D、L115E、L115K、Y116D、Y116E、Y116K、Y116T、S120D、S120N、S121D、S121E、S121N、V123A、V123D、V123R、V123T、L125A、L125E、L125K、L125Q、Y128D、R129D、およびR134E。以下のBMP-7修飾は、実質的にBMP-4に対して同様の効果を有する：Q36R、A37K、K39D、K39E、E42Q、E42R、E42T、R48N、R48Q、Q53D、Q53S、W55A、W55E、W55N、W55Q、I57V、E60K、E60Q、E60R、E60S、E60T、A63E、A63Q、E70A、E70Q、A72D、A72E、A72R、S77Q、S77T、Q88E、L90E、L90N、L90Q、F93A、F93D、F93R、F93S、I94E、I94K、I94Q、I94T、E97D、N110E、A111D、L115E、L115K、Y116D、Y116E、Y116K、Y116T、F117A、S120D、S120N、S121D、S121E、S121N、V123A、V123D、V123R、V123T、L125A、L125E、L125K、L125Q、K126Q、Y128D、R129D、R129S、およびR134E。以下のBMP-7修飾は、実質的にBMP-5に対して同様の効果を有する：Q36E、Q36N、Q36R、A37D、A37K、A37R、K39E、K39S、E42D、E42Q、E42R、E42T、Y44A、Y44E、Y44H、Y44K、Y44Q、Y44R、R48E、R48K、R48N、R48Q、D49E、D49S、W52A、W52E、W52K、W52Q、Q53A、Q53D、Q53E、Q53H、Q53R、Q53S、D54S、W55A、W55E、W55H、W55K、W55N、W55Q、W55R、I57V、I57A、I57D、I57E、I57H、I57K、I57T、E60K、E60S、A63S、Y65D、Y65E、Y65N、E70A、E70Q、A72D、A72H、A72K、A72N、A72R、A72S、F73D、F73E、F73Q、F73R、F73S、N76A、N76D、N76S、N76T、S77A、S77D、S77K、S77Q、S77T、Y78H、I86A、I86D、I86E、I86K、I86T、I86T、Q88E、L90E、L90Q、L90R、L90S、F93A、F93D、F93E、F93Q、F93R、F93S、F93T、T98A、Q108D、Q108K、Q108S、N110E、N110H、A111D、A111S、L115E、L115K、L115T、Y116D、Y116E、Y116H、Y116K、Y116S、Y116T、F117D、F117E、F117K、F117Q、F117R、D119E、D119N、D119S、D119T、S120D、S120E、S120N、S120R、S121D、S121E、S121K、S121N、S121T、V123A、V123D、V123N、V123R、V123T、L125A、L125E、L125K、L125Q、K126D、K127D、K127Q、K127S、Y128D、Y128E、Y128H、Y128K、Y128Q、R129D、R129E、R129S、N130D、R134E、R134Q、R134S、およびA135D。以下のBMP-7修飾は、実質的にBMP-6に対して同様の効果を有する：Q36E、Q36N、Q36R、A37E、K39D、E42D、E42T、Y44A、Y44E、Y44H、Y44K、Y44Q、Y44R、R48E、R48K、R48N、R48Q、D49E、D49S、W52A、W52E、W52K、W52Q、Q53H、D54S、W55A、W55E、W55H、W55K、W55N、W55Q、W55R、I57A、I57E、I57K、I57T、E60K、E60S、Y65D、Y65E、Y65N、A72D、A72H、A72K、A72N、A72R、A72S、F73D、F73E、F73Q、F73R、F73S、N76A、N76D、N76S、N76T、S77A、S77D、S77K、S77Q、S77T、Y78H、I86A、I86D、I86E、I86K、I86T、I86T、Q88E、L90E、L90Q、L90R、L90S、F93A、F93D、F93E、F93Q、F93R、F93S、F93T、I94A、I94E、I94K、I94Q、I94R、I94T、E97D、E97K、E97R、T98A、T98E、T98K、T98R、Q108D、Q108K、Q108S、N110E、N110H、A111D、A111S、L115E、L115K、L115T、Y116D、Y116E、Y116H、Y116K、Y116S、Y116T、F117D、F117E、F117K、F117Q、F117R、D119T、S120D、S120E、S120N、S120R、S121D、S121E、S121K、S121N、S121T、V123A、V123D、V123N、V123R、V123T、L125A、L125E、L125K、L125Q、K126D、K127D、K127Q、K127S、Y128D、Y128E、Y128H、Y128K、Y128Q、R129D、R129E、R129S、N130D、R134E、R134Q、R134S、およびA135D。以下のBMP-7修飾は、実質的にBMP-8に対して同様の効果を有する：Q36E、Q36N、Q36R、A37R、K39T、E42D、E42Q、E42R、E42T、Y44A、Y44H、R48Q、D49E、D49S、W52A、W52E、Q53H、D54K、D54R、D54S、W55A、W55E、W55H、W55K、W55N、W55Q、W55R、I57V、I57A、I57D、I57E、I57H、I57T、E60K、E60Q、E60S、A63S、Y65D、Y65N、E70A、E70Q、A72D、A72H、A72K、A72N、A72R、A72S、F73D、F73E、F73Q、F73R、F73S、N76D、S77A、S77D、S77K、S77Q、Y78D、Y78N、Y78S、Y78T、I86A、I86D、I86E、I86K、I86T、I86T、Q88E、L90N、L90Q、L90R、L90S、F93A、F93D、F93E、F93Q、F93R、F93S、F93T、I94R、N95D、T98A、T98K、T98R、Q108K、A111D、L115E、L115K、L115T、Y116D、Y116E、Y116H、Y116K、F117A、D119E、D119N、D119S、D119T、S120D、S120E、S120N、S120R、S121D、S121E、S121K、S121N、S121T、V123A、V123D、V123N、V123R、V123T、L125A、L125E、L125K、L125Q、K126D、K126Q、K127D、K127Q、K127S、Y128D、R129D、R129E、R129S、N130D、R134E、R134Q、およびR134S。
【０１６３】
ACE計算を、また、BMP-7対BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、およびBMP-8におけるそれぞれの可変位置での構造的環境の類似性を評価するために実施した。以下の表で、ACE類似スコアー0.4またはそれ以上の位置で、変異はBMP-7対他のBMPにおいて同様の効果を有し得る。ACE類似スコアーが0.6と0.8の間のときは、変異の効果は同様の効果である可能性が高く、ACE類似スコアーが0.8以上のときは、変異の効果は実質的の同一であり得る。
【０１６４】
【表３１】
2008500816.tif 000032
【表３２】
2008500816.tif 000033
【表３３】
2008500816.tif 000034
【表３４】
2008500816.tif 000035
【０１６５】
上記ACE解析に基づいて、以下の位置でのBMP-7変異体はBMP-2へ転移可能である：36、55、60、83、115、119、125、126、および128。以下の位置のBMP-7変異体はBMP-3へ転移可能である：57、116、117、119、121、123、および125。以下の位置のBMP-7変異体はBMP-3bへ転移可能である：116および119。以下の位置でのBMP-7変異体はBMP-4へ転移可能である：55、60、115、125、126、および128。以下の位置でのBMP-7変異体はBMP-5へ転移可能である：36、37、39、42、44、48、49、52、53、54、55、57、60、65、72、73、76、77、78、82、83、86、88、93、105、110、111、115、116、117、119、120、121、122、123、125、126、127、128、129、130、および139。以下の位置でのBMP-7変異体はBMP-6へ転移可能である：36、39、44、48、49、52、53、54、55、57、60、65、72、73、76、77、78、80、82、83、86、88、93、97、98、105、108、110、111、115、116、117、119、120、121、122、123、125、126、127、128、129、130、および139。以下の位置でのBMP-7変異体はBMP-9へ転移可能である：36、42、44、49、52、53、55、57、60、63、75、78、82、83、93、105、108、115、117、119、121、122、123、125、127、129、130、および139。以下の位置でのBMP-7変異体はBMP-9へ転移可能である：52、125、および126。以下の位置でのBMP-7変異体はBMP-10へ転移可能である：60、119、および125。以下の位置でのBMP-7変異体はBMP-15へ転移可能である：49、52、125、および128。以下の位置でのBMP-7変異体はGDF-1へ転移可能である：36、57、60、115、116、117、119、121、123、および125。以下の位置でのBMP-7変異体はGDF-3へ転移可能である：36、52、60、93、115、117、119、125、および126。以下の位置でのBMP-7変異体はGDF-5へ転移可能である：52、53、55、93、116、117、119、125、および128。以下の位置でのBMP-7変異体はGDF-8へ転移可能である：57、97、および123。以下の位置でのBMP-7変異体はGDF-9へ転移可能である：125。以下の位置でのBMP-7変異体はTGF-β1へ転移可能である：60および97。以下の位置でのBMP-7変異体はTGF-β2へ転移可能である：60、93および97。以下の位置でのBMP-7変異体はTGF-β3へ転移可能である：60および97。
【０１６６】
実施例６：親BMP-7をコードするDNAの作成
【０１６７】
多くの野生型ヒトBMP-7発現を目的とした構築物を作成し、試験した：（１）pSport6ベクター中の天然BMP-7イメージクローン（ATCCから入手）、（２）pCMVTnTベクター（Promega）中のRXXR切断部位の直ぐ後にG4SリンカーとFLAGタグが位置する、FLAGタグBMP-7、（３）pCMVTnTベクター中の完全Kozak配列（MHVよりむしろMAV）を有するFLAGタグBMP-7、（４）pCMVTnTベクター中の、天然BMP-2のKozak配列、シグナル配列、および前駆ドメインを用いたFLAGタグBMP-7、（５）pCMVTnTベクター中の、天然MIC-1のKozak配列、シグナル配列、および前駆ドメインを用いたFLAGタグBMP-7、および（６）6XHisタグを前駆ドメインのN末端に有する、pSport6ベクター（ATCCより入手）中の天然BMP-7イメージクローン。pSport6ベクター中のタグの付いてない天然イメージクローンが、最も高発現量で生産されることが見出され、変異体構築物の鋳型として使用された。
【０１６８】
更なる構築物が酵母発現のために作成された：（１）pYESベクター陰性対照、（２）pYESベクター中のBMP-7成熟ドメイン、（３）pYESベクター中のE-BMP-7成熟ドメイン、（４）pYESベクター中のAEAE-BMP-7成熟ドメイン、（５）pYESベクター中の完全長BMP-7、および（６）pYESベクター中のREKR-完全長BMP-7。
【０１６９】
実施例７：BMP変異体をコードするDNAの作成
【０１７０】
上記表で示されたBMP-7変異体の構築物を部位特異的突然変異誘発法により作成した。pSport6イメージクローン（ATCC）を、全ての変異体に対する鋳型として使用した。望まれる構築物に相当するDNAを、Qiagen MiniprepまたはMaxiprepキットを用いて作成した。BMP-7変異体のいくつかを、変性したオリゴを用いて構築したので、上記ライブラリー１に明確に含まれるものに加えて、変異体を作成した。係る変異体には、以下：L21E、L21G、L21N、L21R、M23G、M23N、M23R、V26E、V26G、V26N、K39A、K39G、K39N、Y44D、Y44G、Y44N、Y44P、Y44S、Y44T、R48D、R48H、W52P、W52T、Q53G、Q53K、Q53T、W55P、W55T、I57L、I57P、I57Q、E60H、E60N、E60P、F73G、F73K、F73N、F73T、N76Y、S77E、S77H、S77N、S77P、Y78P、Y78R、I86P、L90G、L90H、L90P、F93G、F93H、F93P、L115A、L115Q、Y116A、Y116Q、F117S、F117Y、V123G、I125P、I125T、K126G、K127A、K127H、K127N、K127P、K127Y、R129K、R129N、R134L、およびR134Pを含む。さらに、サイレント変異（すなわち、対応するアミノ酸配列を変化させないDNAコドン配列中の変異）をI57、N76、Y116、V123、およびR134に導入した。
【０１７１】
実施例８：野生型BMP-7のインビトロ翻訳
【０１７２】
以下の構築物を作成し、インビトロ翻訳実験のために用いた：（１）成熟ドメインのN末端にFLAGタグを有する完全長BMP-7、（２）成熟ドメインのN末端でFLAGタグを有する完全長MIC-1、（３）N末端FLAGタグを有するBMP-7前駆ドメイン、（４）N末端FLAGタグを有するMIC-1前駆ドメイン、（５）N末端FLAGタグを有するBMP-7成熟ドメイン、（６）N末端FLAGタグを有するMIC-1成熟ドメイン、（７）C末端FLAGタグを有する完全長BMP-7、（８）C末端FLAGタグを有する完全長MIC-1、（９）C末端FLAGタグを有するBMP-7前駆ドメイン、（１０）C末端FLAGタグを有するMIC-1前駆ドメイン、（１１）C末端FLAGタグを有するBMP-7成熟ドメイン、（１２）C末端FLAGタグを有するMIC-1成熟ドメイン。それぞれの構築物の５'末端は、遺伝子の前に、スペーサー、T7プロモーター、グロビンUTR、および最適化されたリボソーム結合部位を有する。ルシフェラーゼを陽性対照として使用した。PCR産物の組み合わされた転写／翻訳を使用した（TnT、Promega）。ルシフェラーゼに匹敵するタンパク質発現を上記（１１）以外のBMP-7構築物の全てについて入手した。
【０１７３】
実施例９：野生型および変異体BMP-7の発現
【０１７４】
以下の小スケール発現プロトコルを、最初のライブラリースクリーニングのために用いた。293T細胞を6穴ディッシュに播種した（4mlDMEM10%FBS中の1-5x105細胞/ml）。次の日、細胞を5μgDNA/ウェルを用いて形質転換した。形質転換効率の内部標準として、いくつかの天然イメージクローンの小量調製物を使用した。3日後、培養上清を回収し、スクリーニングした。発現量を、ELISA（R＆D Systems ELISA Duoset Cat#DY354を用い、全ての変異体に、抗体結合親和性の変化による補正はせずに）およびウェスタンブロッティング（選択された変異体に）を用いて決定した。
【０１７５】
【表３５】
2008500816.tif 000036
【０１７６】
【表３６】
2008500816.tif 000037
【０１７７】
【表３７】
2008500816.tif 000038
【０１７８】
【表３８】
2008500816.tif 000039
【０１７９】
【表３９】
2008500816.tif 000040
【０１８０】
【表４０】
2008500816.tif 000041
【０１８１】
【表４１】
2008500816.tif 000042
【０１８２】
【表４２】
2008500816.tif 000043
【０１８３】
293T細胞において少なくとも２倍の発現量を増加させる修飾を含む好ましい修飾は、限定はされないが、L21N、K39A、K39S、Q53D、Q53T、I57L、E60Q、A63E、A63Q、A63R、A63S、Y65D、Y65N、A72D、A72E、A72H、A72K、A72S、F73H、N76A、N76D、N76S、N76T、Y78D、Y78N、Y78T、I86A、I86D、I86E、I86K、I86Q、F93H、E97D、T98K、N110D、A111S、Y116H、F117H、F117Y、S120D、R129D、N130D、R134E、R134L、R134S、A135E、A135S、およびH139Rを含む。293T細胞において少なくとも５倍の発現量を増加させる修飾を含むとりわけ好ましい修飾は、限定はされないが、A63Q、A63S、Y65D、Y65N、A72D、F73H、Y78N、Y78T、I86A、およびR134Lを含む。さらに、コドンTCAからコドンTATのY116でのサイレント変異は、293T細胞における発現量を2.6倍増加することが見出された。
【０１８４】
更なる発現プロトコルを、異なるスケール（96-、48-、24-、12-、または6-穴ディッシュ並びに10cmまたは15cmプレート）、無血清発現、および代替宿主（CHOおよびBRK-21）での発現のために用いた。
【０１８５】
選択されたライブラリー１変異体の発現量を、下記に示すように、293T、CHO、およびBRK21細胞に対して決定した。野生型イメージクローンの発現は発現宿主間で変化した。しかしながら、異なる変異体に対する相対的な発現量は、宿主を超えて改善される傾向があり、ある種で発現量を改善した変異体は他の宿主で発現量を改善する傾向を示した。
【０１８６】
【表４３】
2008500816.tif 000044
【０１８７】
相対的発現量を、また、DNA用量（5.0、2.5、および1.0μgを試験した）の関数として試験し、用量非依存的であることが見出された。
【０１８８】
実施例１０：BMP-7ライブラリー１変異体の受容体結合親和性の特徴付け
【０１８９】
いくつかのBMP受容体（ActRIa、BMPRIb、ActRIIa、およびBMPRII）に対するヒトおよび変異体BMP-7の親和性を、下記のようなELISA様試験を用いて測定した。抗体をPBS中に2μg/ml希釈し、50μL/ウェル添加し、加湿チャンバー中で、4℃で、一晩または週末中インキュベートすることにより、96穴プレートをキャプチャー抗体（R&D Systems BMP-7 ELISA Duoset DY354, part # 840971）でコーティングした。それぞれのプレートから過剰な液体を取り除いた。175μLのブロッキング溶液（PBS中の1% BSAおよび5%スクロース）を各ウェルに添加し、加湿チャンバー中で、室温で1-2時間インキュベーションすることにより、プレートをブロッキング化した。その後、自動プレート洗浄機を用いて、プレートを洗浄した。50μLのBMP-7含有溶液（例えば、上記BMP-7発現プロトコルから得られた希釈培養上清、または既知濃度の精製組換ヒトBMP-7）を、それぞれのウェルに添加し、加湿チャンバー中で1.5-2時間、室温でインキュベートした。その後、自動プレート洗浄機を用いて、プレートを洗浄した。50μLのPBS中の5μg/mLBMP受容体−Fc融合をそれぞれのウェルに添加し、加湿チャンバー中で、室温で、1.5時間インキュベーションした。その後、自動プレート洗浄機を用いて、プレートを洗浄した。50μLの２次抗体希釈バッファー（0.250μmフィルターで濾過したPBS中の1%BSA）中の1:10,000希釈、抗ヒトIgG-HRPコンジュゲートをそれぞれのウェルに添加し、加湿チャンバー中で、室温、30分インキュベーションした。その後、自動プレート洗浄機を用いて、プレートを洗浄した。50μLの予め混ぜられたTMB溶液（BD Pharmingen # 555214）をそれぞれのウェルに添加し、暗所で10-20分間インキュベーションした。25μLの2NH2SO4をそれぞれのウェルに添加した。450nmでの吸光度測定を540nm波長補正をして行った。
【０１９０】
下表は、野生型タンパク質（1.0に標準化した）に対する選抜されたBMP-7変異体の受容体結合親和性を示す。試験を、特定のタンパク質濃度ではなく、培養上清の決められた体積を用いて実施したので、発現レベルの相違、並びに、受容体結合親和性の相違が結果に影響を及ぼし得ることに注意する。データを、10.0ng/ml以上の発現量を有する変異体に対してのみ示す。
【０１９１】
【表４４】
2008500816.tif 000045
【０１９２】
【表４５】
2008500816.tif 000046
【０１９３】
【表４６】
2008500816.tif 000047
【０１９４】
【表４７】
2008500816.tif 000048
【０１９５】
受容体結合を更に特徴付けるために、培養上清からの12点連続希釈を用いて、用量反応結合試験を、選択されたライブラリー１変異体に対して実施した。
【０１９６】
次に、Prism中の非線形回帰−ワンサイト双曲線モデルを用いて、解離定数（下記、KD）をそれぞれの変異体に対して計算した。実験を、野生型タンパク質に対して繰り返したことに注意する。相対的な結合定数を、各変異体の特異性が明らかに野生型から異なるか否かを決定するために比較した。
【表４８】
2008500816.tif 000049
【０１９７】
【表４９】
2008500816.tif 000050
【０１９８】
【表５０】
2008500816.tif 000051
【０１９９】
上記結果に基づけば、変異体の大部分は、野生型BMP-7と同様の受容体結合親和性を有する。以下の変異体は、タイプII受容体に対して変化した特異性を有するように見える：M23N、Q53G、Q53H、およびI86D。Q53HおよびI86Dは、野生型と同様の親和性でActRIIaに結合するが、BMPRIIには、野生型に比較し約１０倍低下した親和性で結合する。M23NおよびQ53Gは、野生型に比較し、約１０倍増加した親和性でActRIIaに結合するが、BMPRIIには、野生型と同様の親和性で結合する。
【０２００】
実施例１１：C2C12生物試験を用いた、ライブラリー１BMP変異体の特徴付け
【０２０１】
ヒトおよび変異体BMP-7分子の生物活性を、C2C12生物試験を用いて測定した。C2C12細胞は、BMP-7のようなBMPに反応して分化する、マウス筋原細胞株である。C2C12をトリプシン処理し、C2C12培地（DMEM、4 mM L-グルタミン、1.5g/L 重炭酸ナトリウム、4.5g/L グルコース、10% FBS、および抗生物質）で約60,000細胞/mlに希釈した。50μL（3000細胞）を96穴プレートの各ウェルに分注し、37℃で一晩インキュベーションした。翌日、50μLのBMP-7含有溶液（例えば、上記BMP-7発現プロトコルから得た希釈培養上清、または既知濃度の精製ヒト組換BMP-7）を各ウェルに添加した；各サンプルをデュプリケートで試験した。プレートを3日間、37℃でインキュベーションした。その後、プレートを150μLTBS（50mMトリスpH7.5、150mMNaCl）で2回洗浄した。1% Triton-X100を含む25μLのTBSを各ウェルに添加し、プレートを4℃で10-20分インキュベーションした。100-150μLのCSPD SapphireII発光アルカリホスファターゼ基質（Applied Biosystems #T2210）を各ウェルに添加し、暗所で、室温でインキュベーションした。TopCountプレートリーダーを用いて、発光値を各ウェルに対して得た。変異体の相対生物活性を決定するために、BMP-7変異体の発光を、既知量の組換ヒトBMP-7の発光と比較した。
【０２０２】
下表は、野生型タンパク質（1.0に標準化した）に比較した選抜されたBMP-7変異体の生物活性を示す。試験を、タンパク質の特定の濃度ではなく培養上清の決められた体積を用いて実施したので、発現レベルの相違、並びに、受容体結合親和性の相違が結果に影響を及ぼし得ることに注意する。データを、10.0ng/ml以上の発現量を有する変異体に対してのみ示す。
【０２０３】
【表５１】
2008500816.tif 000052
【０２０４】
【表５２】
2008500816.tif 000053
【０２０５】
【表５３】
2008500816.tif 000054
【０２０６】
【表５４】
2008500816.tif 000055
【０２０７】
興味深いことに、多くのライブラリー１変異体が、野生型イメージクローンよりも、著しく高い生物活性を有する。限定はされないが変化された安定性、溶解性、または受容体結合親和性を含む更なる要因が、また、観察される生物活性に影響を及ぼす可能性があるものの、この認められた活性の増大は発現量の増大による可能性がある。野生型に比較して少なくとも２倍生物活性を増大させる置換は、限定はされないが、L21G、M23S、V26G、V26N、Y78H、Y78R、F93D、F93E、F93G、F93H、F93T、R129D、R134L、およびR134Sを含む。
【０２０８】
実施例１２：二重変異体：BMP-7ライブラリー２
【０２０９】
選択されたライブラリー１変異体からの点突然変異を組み合わせて、二重変異体のライブラリーを作成し、ライブラリー２と称した。ライブラリー２変異体の作成およびスクリーニングの方法は、上記のライブラリー１変異体と同様である。イメージクローンが低発現量で、その生物試験シグナルがこの希釈でバックグランドであるので、C2C12生物試験データは、培養上清を1:66に希釈することにより、シングルポイントで決定された。
【０２１０】
【表５５】
2008500816.tif 000056
【０２１１】
【表５６】
2008500816.tif 000057
【０２１２】
上記に認められるように、多くのライブラリー２変異体が、293TおよびCHO細胞において、野生型イメージクローンに比較して、顕著に発現量が増大する。好ましい変異体は、少なくとも１種の発現宿主において、少なくとも10倍の増加を示す；係る変異体には、限定はされないが、L21G/F93H、K39A/F93H、K39S/N110D、K39S/S120D、K39S/N130D、K39S/R134E、Q53D/Y65N、Y65N/Y78H、Y65N/Y78R、Y65N/S120D、Y65N/A135S、A72D/F93H、Y78H/F93H、Y78H/Q108D、Y78H/Y116H、Y78H/F117Y、Y78H/S120D、Y78H/R134E、Y78H/R134S、Y78H/A135E、Y78H/A135S、Y78H/H139R、F93H/F117Y、F93H/S120D、F93H/R134S、F93H/H139Rを含む。とりわけ好ましい変異体は、293TおよびCHO細胞の両方において、少なくとも10倍以上の発現量の増加を示す；係る変異体の例は、限定はされないが、K39A/F93H、Y65N/S120D、A72D/F93H、Y78H/S120D、Y78H/R134E、Y78H/A135E、F93H/F117Y、F93H/S120D、F93H/R134S、およびF93H/H139Rを含む。
【０２１３】
実施例１３．三重、四重、およびそれより高次の変異体の発現量
【０２１４】
BMP-7の三重、四重、およびそれより高次の変異体は、上記のように作成され、そして試験された。これらの変異体の多くは、顕著に増大された発現量または顕著に増加された生物活性を示した。抗体の結合親和性の減少のため、ELISAが、これらの変異体の実質的なフラクションのタンパク質濃度を実質的に過小評価していることに注意する。
【０２１５】
【表５７】
2008500816.tif 000058
【０２１６】
上記三重変異体の全ては野生型の少なくとも50倍、最良の二重変異体の少なくとも２倍、増加した発現量を有する。さらに、上記三重変異体の大部分は、野生型および最良の二重変異体に比較し、顕著に増加した生物活性を有する。とりわけ増加した生物活性を有する三重変異体は、限定はされないが、K39S/F93S/S120D、K39S/S120D/R134E、Y65N/Y78H/R134E、およびA72D/Y78H/R134Eを含む。
【０２１７】
【表５８】
2008500816.tif 000059
【０２１８】
CHO-K1における発現量またはC2C12生物活性が劇的に増加する好ましい変異体は、限定はされないが、K39S/F93S/S120D、K39S/S120D/R129D、K39S/S120D/R134E、Y65N/Y78H/R134E、およびY78H/F93H/S120Dを含む。
【０２１９】
更なる三重変異体が作成され、受容体および阻害剤結合特異性に対する異なる置換の影響を決定した。これらの変異体は、Y65NおよびS120D置換を含み、これらは発現量の増加を提供し、受容体または阻害剤結合にそれほど影響を及ぼさない、そして、更なる一つの置換が結合親和性を変え得る。三重変異体は、Y65N/S120Dを含み、そして以下の一つの置換がなされる：M23R、R48H、R48N、R48Q、Q53G、Q53H、Q53K、Q53T、E60R、F73S、F73T、Y78D、Y78S、Y78T、I86D、K126R、Y128D、Y128H、およびY128Q。
【０２２０】
実施例１４：BMP-7変異体の精製
【０２２１】
従来のクロマトグラフィーを用いて、Y65N/S120Dを部分的に精製した。ヘパリン硫酸セファロース(17-0407-01)をPBSで平衡化した。Y65N/S120D変異体を含む培養上清を、0.45ミクロンフィルターを通してろ過された40mMリン酸pH6.5で1:1希釈し、カラムにロードし、2-3カラム体積のPBSで洗浄し、PBS/1M NaClを用いて１回の均一溶媒ステップで溶出した。ヘパリン結合画分を20mMリン酸、50mMNaCl、pH7.0で透析し、SP-セファロースカラムにロードし、直線勾配（0-100%PBS/1M NaCl）で溶出した。第2精製プロトコルを、変異体457(K39S/F93S)、471(K39S/N130D)、492(Y65N/Y78H)、504(Y65N/S120D)、526(K39S/S120D/R134E)、および565(Y65N/F93T/R129D)の大スケール精製のために用いた。培養上清を中性pHで1:1に希釈し、塩濃度を〜75mMに低下させ、SP-セファロースカラムにロードした。カラムをその後、75mMの塩そしてその後300mMの塩で洗浄し、1M塩でBMP-7を溶出した。
【０２２２】
実施例１５．選択された変異体の受容体、抗体、および阻害剤結合
【０２２３】
選択された変異体のBMP受容体、抗体、および阻害剤への結合を、蛍光結合試験および
AlphaScreen（登録商標）試験を用いて、特徴付けした。上記のように部分精製された、BMP-7変異体Y65N/S120Dを、色素AlexaFluor 568 (Molecular Probes)で標識した。15μMBMP-7および0.3μMから1000μMにわたる色素濃度を用いて、小スケール（25μL）反応を実施した。333μMおよび10μM色素を用いた反応を、その後、750μlタンパク質を用いて実施した。反応をトリスpH8.0で停止し、PD-10脱塩カラムを用いて精製した；第2画分を、以下の実験に使用した。BMP-7をまた、蛍光団とNHS団の間に6-炭素スペーサーを有するFITC-由来蛍光である、C6-FXSで標識した。20mMPO4、500mMNaCl、pH７溶液において、タンパク質と色素の多様な比率の標識化条件を試験した。標識化条件を確立した後、500μgY65N/S120Dを標識化した。過剰な色素を遠心分離およびPD-10脱塩カラムにより取り除いた。
【０２２４】
蛍光標識BMP-7を、連続的に希釈したBMP-7受容体、ActRIa、BMPRIa、BMPRIb、ActRIIa、ActRIIb、およびBMPRII(R&D Systems)の受容体/Fc融合物に添加した。また、蛍光標識BMP-7を、連続的に希釈したノギン/Fcまたはgremlin(R&D Systems)に添加する実験を実施した。標識化BMP-7および受容体または阻害剤はインキュベートされ、蛍光偏光および強度をTopCountプレートリーダーを用いて測定した。強度または異方性の著しい変化を、試験した全ての受容体および阻害剤に対し、少なくとも１つの標識化BMP-7分子について観察した。
【０２２５】
これらの受容体および阻害剤への異なるBMP変異体の結合親和性を、競合実験を実施することにより決定し得る。これらの実験を実施するために、標識化したBMP-7および受容体または阻害剤を、標識化されてないBMP-7に比較して、感知できる程の異方性または強度の変化がおこる量で混合した。それから、第2の非標識BMP-7分子の量を変化させて加え、異方性または偏光の変化を測定した。それから、標識化BMP-7の半分が結合し、半分が結合していないとき、EC50は、競合者の濃度により与えられる。
【０２２６】
BMP-7のY65N/S120D変異体を、また、NHS-ビオチンを用いたAlphaScreen試験のためにビオチン化した。ビオチン化タンパク質の生物活性を確認した。受容体BMPRIa、BMPRIb、ActRIIaおよびBMPRII並びに阻害剤ノギン (R&D Systems)のFc融合体に対する選択されたBMP-7変異体の結合親和性を決定するために、AlphaScreen試験が実施された。抗BMP-7モノクローナル抗体(R&D Systems mAb 3541)に対する選択された変異体の親和性を決定するために、AlphaScreen試験をまた実施した。全ての場合で、12点結合曲線をトリプリケートで得た。それぞれのデータポイントは、10μLの連続的に希釈されたBMP-7変異体、10μLの受容体、阻害剤、または抗体、10μLのビオチン化BMP-7、10μLのAlphaScreen（登録商標）アクセプタービーズ、および10μLのAlphaScreen（登録商標）ドナービーズを含む溶液から産生される発光に対応する。プリズムを、選択された実験に対するEC50値の計算に使用した。
【表５９】
2008500816.tif 000060
【０２２７】
全体として、これら３変異体は、野生型と同様の結合親和性を有する。潜在的に顕著な相違は、限定はされないが、v526の低下したノギン親和性、そしてv565の増加したノギン親和性を含む。
【０２２８】
実施例１６．濃度測定
【０２２９】
いくつかのBMP-7変異体、とりわけ2または3の変異を有する変異体は、低下した抗体結合親和性を示す。結果として、ELISA濃度測定は、体系的にこれらの変異体の濃度を過小評価している。これら変異体のより正確な濃度、並びにELISAを用いて決定した濃度の補正係数を得るために、あらゆる濃度測定が実施された。精製に続いて、BCA試験、SDS-PAGE後のCoomasie blue染色された成熟ドメインのデンシトメトリー解析、およびポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングを用いて、変異体457、471、492、504、526、および565の濃度を評価した。野生型BMP-7（R&D Systems）を標準に用いた。
【０２３０】
実施例１７．特異活性の測定
【０２３１】
5個のとりわけ好ましいBMP-7変異体の特異活性を測定し、R&D Systemsより購入した組換ヒトBMP-7の特異活性と比較した。上記で測定された、それぞれのタンパク質の等しい濃度を、C2C12生物アッセイに3回試験した。
【０２３２】
【表６０】
2008500816.tif 000061
【０２３３】
F93SおよびF93T置換を有する変異体が、野生型タンパク質に比較して特異活性が増加していることを見出した。
【０２３４】
実施例１８．特異的変異体の設計
【０２３５】
タンパク質の発現量の改善および高い生物活性を確保するために、変異体を含む四重変異を設計した。これらの変異体のために選ばれた変異体置換は、単独で、または組み合わさって、BMP-7の性質を改善する全ての変異体のサブセットを含む。安定で発現する変異体は、有益なタンパク質の性質を示し、受容体接触をしないアミノ酸残基に位置する変異のサブセットから選択される。フリンの最適化は、変異のセットの変異体として定義され、BMP-7の正常のプロセッシングと分泌に要求されるフリンプロテアーゼの改変したコンセンサス部位を有する天然またはY65N/S120Dバックグランドに組み込まれる。グリコシル化除去変異体は、変異BMP-7タンパク質であって、コンセンサスグリコシル化部位中に変異を含む天然またはF93H/R134Sバックグランドに組み込まれ、これらの変異体はグリコシル化されないと予想される。下表は、表に挙げられた性質を有するために作成された特異的変異体BMP-7タンパク質のまとめである：
【表６１】
2008500816.tif 000062
【０２３６】
【表６２】
2008500816.tif 000063
【０２３７】
【表６３】
2008500816.tif 000064
【０２３８】
【表６４】
2008500816.tif 000065
【０２３９】
【表６５】
2008500816.tif 000066
【０２４０】
【表６６】
2008500816.tif 000067
【０２４１】
【表６７】
2008500816.tif 000068
【０２４２】
実施例１８．変異体設計
【０２４３】
上記表２３に開示された好ましい実施態様に付け加えて、下記の変異体がまた本発明の好ましい実施態様である。
【表６８】
2008500816.tif 000069
【０２４４】
【表６９】
2008500816.tif 000070
【０２４５】
【表７０】
2008500816.tif 000071
【０２４６】
【表７１】
2008500816.tif 000072
【０２４７】
【表７２】
2008500816.tif 000073
【０２４８】
【表７３】
2008500816.tif 000074
【０２４９】
【表７４】
2008500816.tif 000075
【０２５０】
【表７５】
2008500816.tif 000076
【０２５１】
【表７６】
2008500816.tif 000077
【０２５２】
【表７７】
2008500816.tif 000078
【０２５３】
【表７８】
2008500816.tif 000079
【０２５４】
【表７９】
2008500816.tif 000080
【０２５５】
【表８０】
2008500816.tif 000081
【０２５６】
【表８１】
2008500816.tif 000082
【０２５７】
【表８２】
2008500816.tif 000083
【０２５８】
前述の発明が上記に記載されているが、当業者は、明らかに、本発明の範囲を離れない限り、いろいろ変化を施し、追加的な態様をなし得るであろう。本明細書で引用されている全ての刊行物、特許、特許出願（仮、実用新案およびPCT）または他の書類は、参照により、その全体が組み込まれている。
【０２５９】
配列表
SEQUENCE ID NO: 1 Mature human BMP-2
QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR
SEQUENCE ID NO: 2 Mature human BMP-4
SPKHHSQRARKKNKNCRRHSLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSSIPKACCVPTELSAISMLYLDEYDKVVLKNYQEMVVEGCGCR
SEQUENCE ID NO: 3 Mature human BMP-5
AANKRKNQNRNKSSSHQDSSRMSSVGDYNTSEQKQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAFYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMFPDHVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRSCGCH
SEQUENCE ID NO: 4 Mature human BMP-6
SASSRRRQQSRNRSTQSQDVARVSSASDYNSSELKTACRKHELYVSFQDLGWQDWIIAPKGYAANYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMNPEYVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDNSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 5 Mature human BMP-7
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 6 Mature human BMP-8
AVRPLRRRQPKKSNELPQANRLPGIFDDVHGSHGRQVCRRHELYVSFQDLGWLDWVIAPQGYSAYYCEGECSFPLDSCMNATNHAILQSLVHLMKPNAVPKACCAPTKLSATSVLYYDSSNNVILRKHRNMVVKACGCH
SEQUENCE ID NO: 7 Human ActRIa / ALK-2 ligand binding domain
LYMCVCEGLSCGNEDHCEGQQCFSSLSINDGFHVYQKGCFQVYEQGKMTCKTPPSPGQAVECCQGDWCNRNITAQL
SEQUENCE ID NO: 8 Human BMPRIa / ALK-3 ligand binding domain
FLKCYCSGHCPDDAINNTCITNGHCFAIIEEDDQGETTLASGCMKYEGSDFQCKDSPKAQLRRTIECCRTNLCNQYLQPTL
SEQUENCE ID NO: 9 Human BMPRIb / ALK-6 ligand binding domain
VLRCKCHHHCPEDSVNNICSTDGYCFTMIEEDDSGLPVVTSGCLGLEGSDFQCRDTPIPHQRRSIECCTERNECNKDLHPTL
SEQUENCE ID NO: 10 Human ActRIIa ligand binding domain
ETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCvEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFP
SEQUENCE ID NO: 11 Human ActRIIb ligand binding domain
ETRECIYYNANWELERTNQSGlERCEGEQDKRlHCYASWANSSGTIElVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNfCNERFTHlP
SEQUENCE ID NO: 12 Human BMPRII ligand binding domain
FKDPYQQDLGIGESRISHENGTILCSKGSTCYGLWEKSKGDINLVKQGCWSHIGDPQECHYEECVVTTTPPSIQNGTYRFCCCSTDLCNVNFTENF
SEQUENCE ID NO: 13 Human gremlin
MSRTAYTVGALLLLLGTLLPAAEGKKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
SEQUENCE ID NO: 14 Human noggin
MERCPSLGVTLYALVVVLGLRATPAGGQHYLHIRPAPSDNLPLVDLIEHPDPIFDPKEKDLNETLLRSLLGGHYDPGFMATSPPEDRPGGGGGAAGGAEDLAELDQLLRQRPSGAMPSEIKGLEFSEGLAQGKKQRLSKKLRRKLQMWLWSQTFCPVLYAWNDLGSRFWPRYVKVGSCFSKRSCSVPEGMVCKPSKSVHLTVLRWRCQRRGGQRCGWIPIQYPIISECKCSC
SEQUENCE ID NO: 15 BMP-7 variants at position 21 (X = D,E,G,K,N,R,S) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEAXRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 16 BMP-7 variants at position 23 (X = D,G,K,N,R,S) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRXASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 17 BMP-7 variants at position 26 (X = D,E,G,K,N,S) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASXAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 18 BMP-7 variants at position 36 (X = E,N,R) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRXACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 19 BMP-7 variants at position 37 (X = D,E,H,K,R) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQXCKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 20 BMP-7 variants at position 39 (X = A,D,E,G,N,R,S,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACXKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 21 BMP-7 variants at position 42 (X = D,Q,R,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHXLYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 22 BMP-7 variants at position 44 (X = A,D,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELXVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 23 BMP-7 variants at position 48 (X = D,E,H,K,N,Q) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFXDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 24 BMP-7 variants at position 49 (X = E,S) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRXLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 25 BMP-7 variants at position 52 (X = A,E,K,P,Q,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGXQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 26 BMP-7 variants at position 53 (X = A,D,E,G,H,K,R,S,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWXDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 27 BMP-7 variants at position 54 (X = K,N,R,S) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQXWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 28 BMP-7 variants at position 55 (X = A,E,H,K,N,P,Q,R,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDXIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 29 BMP-7 variants at position 57 (X = A,D,E,H,K,L,P,Q,T,V) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIXAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 30 BMP-7 variants at position 60 (X = H,K,N,P,Q,R,S,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPXGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 31 BMP-7 variants at position 63 (X = E,Q,R,S) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYXAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 32 BMP-7 variants at position 65 (X = D,E,N) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAXYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 33 BMP-7 variants at position 70 (X = A,Q) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGXCAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 34 BMP-7 variants at position 72 (X = D,E,H,K,N,R,S) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 35 BMP-7 variants at position 73 (X = A,D,E,G,H,K,N,Q,R,S,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAXPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 36 BMP-7 variants at position 76 (X = A,D,N,S,T,Y) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLXSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 37 BMP-7 variants at position 77 (X = A,D,E,H,K,N,P,Q,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNXYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 38 BMP-7 variants at position 78 (X = D,G,H,N,P,R,S,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSXMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 39 BMP-7 variants at position 80 (X = D,Q,S,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMXATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 40 BMP-7 variants at position 82 (X = V) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNAXNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 41 BMP-7 variants at position 83 (X = P) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATXHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 42 BMP-7 variants at position 86 (X = A,D,E,K,P,Q,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAXVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 43 BMP-7 variants at position 88 (X = E) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVXTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 44 BMP-7 variants at position 90 (X = E,G,H,K,N,P,Q,R,S,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTXVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 45 BMP-7 variants at position 93 (X = A,D,E,G,H,P,Q,R,S,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHXINPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 46 BMP-7 variants at position 94 (X = A,E,H,K,P,Q,R,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFXNPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 47 BMP-7 variants at position 95 (X = D,K,Q,R) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFIXPDTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 48 BMP-7 variants at position 97 (X = D,K,R) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPXTVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 49 BMP-7 variants at position 98 (X = A,E,K,R or deletion) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDXVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 50 BMP-7 variants at position 105 (X = V) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCXPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 51 BMP-7 variants at position 108 (X = D,K,S) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTXLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 52 BMP-7 variants at position 110 (X = D,E,H) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLXAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 53 BMP-7 variants at position 111 (X = D,S) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNXISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 54 BMP-7 variants at position 115 (X = A,E,K,Q,T) 
STGGKQRSQNRSKTPKNQEALRMASVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNAISVXYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
SEQUENCE ID NO: 55 BMP-7 variants at position 116 (X = A,D,E,H,K,Q,S,T) 
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SEQUENCE ID NO: 56 BMP-7 variants at position 117 (X = A,D,E,H,K,Q,R,S,Y) 
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SEQUENCE ID NO: 57 BMP-7 variants at position 119 (X = E,N,S,T) 
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SEQUENCE ID NO: 58 BMP-7 variants at position 120 (X = D,E,N,R) 
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SEQUENCE ID NO: 59 BMP-7 variants at position 121 (X = D,E,K,N,T) 
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SEQUENCE ID NO: 60 BMP-7 variants at position 122 (X = E,Q,R) 
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SEQUENCE ID NO: 61 BMP-7 variants at position 123 (X = A,D,G,N,R,T) 
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SEQUENCE ID NO: 62 BMP-7 variants at position 125 (X = A,E,K,P,Q,T,Y) 
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SEQUENCE ID NO: 63 BMP-7 variants at position 126 (X = D,E,G,Q,R) 
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SEQUENCE ID NO: 64 BMP-7 variants at position 127 (X = A,D,E,H,N,P,Q,S,T,Y) 
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SEQUENCE ID NO: 65 BMP-7 variants at position 128 (X = D,E,H,K,Q) 
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SEQUENCE ID NO: 66 BMP-7 variants at position 129 (X = D,E,K,N,S) 
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SEQUENCE ID NO: 67 BMP-7 variants at position 130 (X = D) 
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SEQUENCE ID NO: 68 BMP-7 variants at position 134 (X = D,E,K,L,P,Q,R,S) 
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SEQUENCE ID NO: 69 BMP-7 variants at position 135 (X = D,E,S) 
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SEQUENCE ID NO: 70 BMP-7 variants at position 139 (X = R) 
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【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１】図１は、ヒトBMPとGDFタンパク質の成熟ドメインの配列アラインメントを示す。BMP配列とMIC-1配列の一致は、参照用に示す。成熟ドメインの最N末端残基は、著しく整列されてないので、示してない。
【０２６１】
【図２】図２は、２個のタイプI受容体および２個のタイプII受容体に結合したBMP-7ダイマーを含む、ヘキサマー構造を示す。ALK-3（灰色、右上および左下）に結合したBMP-2（白）とActRIIa（灰色、左上および右下）に結合したBMP-7（黒）を重ねることにより、構造が作成された。
【０２６２】
【図３】図３は、ホモロジーモデリングに用いるための、ヒトタイプIBMP受容体およびヒトタイプIIBMP受容体のアラインメントを示す。
【０２６３】
【図４】図４は、野生型BMP-7（イメージクローン（Image clone））のActRIIa、BMPRII、BMPRIa、およびBMPRIbに対する結合の１２点結合曲線を示す。
【０２６４】
【図６】図５は、(A) BMPRIa (ALK-3)、(B) BMPRIb (ALK-6)、(C) ActRIIa、および(D) BMPRIIに対する１２点結合曲線を示す。太い黒線は、野生型BMP-7（イメージクローン）である。細い灰色線は、変異体に対応する。
【０２６５】
【図６】図６は、選択されたライブラリー１変異体に対する、用量依存性C2C12の２重試験データを示す。（A）でハイライトされた変異体は、F93Q (黒抜き円)、F93S (灰色塗りダイヤモンド)、N110D (灰色塗り四角)、S120D (黒抜き四角)、A135E (黒抜き三角)、A135S (黒塗り円)および野生型(太い黒線、マーカー無し)を含む。さらなる変異体が（A）および（B）に示される。
【０２６６】
【図７】図７は、(A) BMPRIa (ALK-3)、(B) BMPRIb (ALK-6)、(C) ActRIIa、および(D) BMPRIIに対する、１２点結合曲線を示す。２個の野生型の複製（イメージクローン）は、（太い黒線、黒塗り円）で示される。変異体は、細い灰色線、マーカー無しで示される。
【０２６７】
【図８】図８は、野生型ヒトＢＭＰ−７（イメージクローン）および変異体に対する１２点受容体結合曲線の概要を示す。
【０２６８】
【図９】図９は、選択されたライブラリー２変異体に対する用量依存性C2C12の２重試験データを示す。
【０２６９】
【図１０】図１０は、選択されたライブラリー３変異体、ライブラリー１変異体（太い黒線、マーカー無し）、および野生型（細い黒線、マーカー無し）に対する用量依存性C2C12の２重試験データを示す。
【０２７０】
【図１１】図１１は、（Ａ）２９３細胞（黒棒）およびＣＨＯ細胞（白棒）における、最良の一重、二重、および三重変異体の発現量のＥＬＩＳＡ定量、（Ｂ）最良発現の一重、二重、および三重変異体の促進された発現量が、連続的に希釈された培養上清に由来するC2C12生物活性の増加をもたらすこと、を示す。
【０２７１】
【図１２】図１２は、選択されたBMP-7変異体の濃度を決定するための、商業的ELISA（R&D Systems）を用いたときの適切な修正率を示す。
【０２７２】
【図１３】図１３は、選択されたBMP-7変異体の精製を示す。
【０２７３】
【図１４】図１４は、（Ａ）色素濃度に応じた、BMP-7変異体Y65N/S120DのAlexa 568標識；および（Ｂ）Alexa-568で標識されたY65N/S120D BMP-7のスケールアップを示す、SDS-PAGEゲルの蛍光イメージを示す。
【０２７４】
【図１５】図１５は、受容体濃度に応じた蛍光異方性を示す。
【０２７５】
【図１６】図１６は、Alexa568で標識されたY65N/S120D BMP-7のActRIIa受容体に対する結合が、標識されてないBMP-7で競合されることを示す。
【０２７６】
【図１７】図１７は、AlphaScreen を用いて決定した、BMP受容体および阻害剤BMPRIb (中空円)、ActRIIa (中塗りダイヤモンド)、BMPRII (中塗り三角)、およびノギン (星)に対する、（Ａ）組み換えヒトBMP-7 (R&D Systems)、（Ｂ）BMP-7変異体565 (Y65N/F93T/R129D)、（Ｃ） BMP-7変異体526 (K39S/S120D/R134E)、および（Ｄ）BMP-7変異体504 (Y65N/S120D)の競合的結合を示す。
【０２７７】
【図１８】図１８は、３個の受容体および１個の阻害剤に対する４個のBMP-7変異体の結合についてのEC50を示す棒グラフを示す。
【図１】
2008500816.tif 000084
【図２】
2008500816.tif 000085
【図３】
2008500816.tif 000086
【図４】
2008500816.tif 000087
【図５】
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【図６】
2008500816.tif 000089
【図７】
2008500816.tif 000090
【図８】
2008500816.tif 000091
【図９】
2008500816.tif 000092
【図１０】
2008500816.tif 000093
【図１１】
2008500816.tif 000094
【図１２】
2008500816.tif 000095
【図１３】
2008500816.tif 000096
【図１４】
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【図１５】
2008500816.tif 000098
【図１６】
2008500816.tif 000099
【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年11月30日(2006.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１を含むアミノ酸配列と比較して少なくとも１個の置換を含む非自然発生変異体BMP-2タンパク質であって、該置換が、S12E、S13K、K15D、P18R、P18T、S24N、S24Q、N29D、N29S、W31A、W31E、W31N、W31Q、P36K、P36Q、P36R、P36S、P36T、H39E、H39Q、F41D、F41N、E46Q、D53Q、D53T、Q64E、L66E、L66N、L66Q、S69A、S69D、S69R、S69F、V70E、V70K、V70Q、V70T、N71K、S72D、S85E、A86D、L90E、L90K、Y91D、Y91E、Y91K、Y91T、N95D、N95S、E96D、E96S、E96N、V98A、V98D、V98R、V98T、L100A、L100E、L100K、L100Q、Y103D、Q104D、およびE109Rからなる群から選択される、非自然発生変異体BMP-2タンパク質。
【請求項２】
置換が、K15D、F41D、F41N、S69A、S69D、S69R、S69F、N95D、およびN95Sからなる群から選択される、請求項１に記載のBMP-2変異体タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の非自然発生変異体BMP-2タンパク質をコードする核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の核酸または請求項４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞を該核酸の発現に適した条件下で培養することを含む、非自然発生BMP-2タンパク質を製造する方法。
【請求項７】
該BMP-2タンパク質を回収することを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１または請求項２に記載のBMP-2タンパク質、および医薬的担体を含む、医薬組成物。
【請求項９】
BMP-2反応性疾患の処置方法であって、請求項１または請求項２に記載の非自然発生BMP-2タンパク質、または請求項８に記載の医薬組成物を該処置が必要な患者に投与することを含む、方法。
【請求項１０】
該BMP-2反応性疾患が、骨折、骨変性、および脊椎固定術からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号２を含むアミノ酸配列に比較して、少なくとも１個の置換を含む非自然発生変異体BMP-4タンパク質であって、該置換が、K14R、N15K、R17D、R17E、S20Q、S20R、S20T、S26N、S26Q、N31D、N31S、W33A、W33E、W33N、W33Q、V35I、P38K、P38Q、P38R、P38S、P38T、Q41E、Q41A、D48A、D48Q、P50D、P50E、P50R、D55Q、D55T、Q66E、L68E、L68N、L68Q、S71A、S71D、S71R、S71F、V72E、V72K、V72Q、V72T、S74D、S87E、A88D、L92E、L92K、Y93D、Y93E、Y93K、Y93T、L94A、Y97D、Y97N、D98S、D98E、D98N、V100A、V100D、V100R、V100T、L102A、L102E、L102K、L102Q、K103Q、Y105D、Q106D、Q106S、およびE111Rからなる群から選択される、非自然発生変異体BMP-4タンパク質。
【請求項１２】
置換が、R17D、R17E、P50D、P50E、S71A、S71D、S71R、S71F、Y97DおよびY97Nからなる群から選択される、請求項１１に記載のBMP-4変異体タンパク質。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載の非自然発生変異体BMP-4タンパク質をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸または請求項１４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の宿主細胞を、該核酸の発現に適した条件下で培養することを含む、非自然発生BMP-4タンパク質を製造する方法。
【請求項１７】
該BMP-4タンパク質を回収することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１または請求項１２に記載のBMP-4タンパク質、および医薬的担体を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
BMP-4反応性疾患の処置方法であって、請求項１１または請求項１２に記載の非自然発生BMP-4タンパク質、または請求項１８に記載の医薬組成物を、該処置が必要な患者に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
該BMP-4反応性疾患が、骨折、骨変性、および脊椎固定術からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
配列：Fx(1-20)-Vb(21)-Fx(22-38)-Vb(39)-Fx(40-64)-Vb(65)-Fx(66-71)-Vb(72)-Fx(73-77)-Vb(78)-Fx(79-92)-Vb(93)-Fx(94-119)-Vb(120)-Fx(121-134)-Vb(135)
式中、
Fx1(1-20)は、ヒトBMP-7（配列番号：５）のアミノ酸残基1-20に相当する；
Vb(21)は、LおよびGからなる群から選択される；
Fx(22-38)は、ヒトBMP-7（配列番号：５）のアミノ酸残基22-38に相当する；
Vb(39)は、K、AおよびSからなる群から選択される；
Fx(40-64)は、ヒトBMP-7（配列番号：５）のアミノ酸残基40-64に相当する；
Vb(65)は、YおよびNからなる群から選択される；
Fx(66-71)は、ヒトBMP-7（配列番号：５）のアミノ酸残基66-71に相当する；
Vb(72)は、AおよびDからなる群から選択される；
Fx(73-77)は、ヒトBMP-7（配列番号：５）のアミノ酸残基73-77に相当する；
Vb(78)は、YおよびHからなる群から選択される；
Fx(79-92)は、ヒトBMP-7（配列番号：５）のアミノ酸残基79-92に相当する；
Vb(93)は、F、H、SおよびTからなる群から選択される；
Fx(94-119)は、ヒトBMP-7（配列番号：５）のアミノ酸残基94-119に相当する；
Vb(120)は、SおよびDからなる群から選択される；
Fx(121-134)は、ヒトBMP-7（配列番号：５）のアミノ酸残基121-134に相当する；
Vb(135)は、AおよびEからなる群から選択される；
を含む、変異体BMP-7タンパク質、ただし、該変異体は、ヒトBMP-7（配列番号:５）と比較してアミノ酸置換を含む。
【請求項２２】
置換が、L21G、K39A、K39S、Y65N、A72D、Y78H、F93H、F93S、F93T、S120D、A135E、L21G、K39A、K39S、Y65N、A72D、Y78H、F93H、F93S、F93T、S120D、およびA135Eからなる群から選択される、請求項２１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項２３】
K39S-F93S;K39S-S120D; K39S-S120D-Y65N;K39S-S120D-A72D;K39S-S120D-Y78H;K39S-S120D-F93H;K39S-S120D-F93S;Y65N-L21G;Y65N-L21R;Y65N-K39S;Y65N-Y78H;Y65N-S120D;Y78H-A72D;Y78H-F93H-Y65N;Y78H-F93H-A72D;Y78H-F93H-S120D;Y78H-S120D;F93H-K39S;K39S-S120D-M23R;K39S-S120D-Q108D;K39S-S120D-R129D;K39S-S120D-R134E;K39S-S120D-H139R;K39S-N130D;K39S-R134S;Y65N-L21G;Y65N-L21R;Y65N-K39S;Y65N-Y78H;Y65N-A105V;Y78H-F93H-Q108D;Y78H-F93H-F117H;Y78H-R134E-L21G;Y78H-R134E-M23R;Y78H-R134E-Y65N;Y78H-R134E-A72D;およびF93H-R134Sからなる群から選択される少なくとも一組の置換を含む、請求項２１に記載のBMP-7変異体タンパク質。
【請求項２４】
ヒトBMP-7（配列番号：５）と比較して、L21G、K39A、K39S、Y65N、A72D、Y78H、F93H、F93S、F93T、S120DおよびA135Eからなる群から選択される置換を含む、変異体BMP-7タンパク質。
【請求項２５】
M23N、Q53G、Q53HおよびI86Dからなる群から選択される置換を含む、野生型BMP-7（配列番号：５）に比較して受容体結合親和性が変化した、変異体BMP-7タンパク質。
【国際調査報告】
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