(57)【要約】βアミロイド沈着（例えば、プラーク）および／またはβアミロイド線維の形成を伴うアルツハイマー病または他の障害を発症前または発症後診断する方法、組成物および装置（例えば、テスト・キット、テスト・システム、試薬、関連するコンピュータ・ソフトウェア、計算機等）。また、そのような障害の治療効果を評価する方法、組成物および装置。標本細胞、組織または体液をヒトまたは動物対象から採取、分析して、あるミトコンドリア制御領域（ｍｔＤＮＡ  ＣＲ）が存在するかどうか、またはどの程度存在するのかを判定する。これらのｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異数が著しく増加した場合、対象がβアミロイド沈着（例えば、プラーク）および／またはβアミロイド線維の形成を伴うアルツハイマー病または他の障害に罹患しているか、またはそれを発現するリスクが高いことを示唆している。該障害の治療中にこれらのｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異数が著しく低下した場合、その治療が有効であることが示唆される。
2008500058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物対象においてβアミロイド沈着またはβアミロイド線維の発達を伴う障害を診断またはそのような障害のために対象に提供される治療の効果を評価する方法であって、該方法は
Ａ）ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異の存在を判定する工程を含む方法。
【請求項２】
工程ＡはｍｔＤＮＳ  ＣＲ突然変異が存在するか否かを定性的に判定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ＡはｍｔＤＮＳ  ＣＲ突然変異を定量することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｂ）工程Ａで行われた定量によって得られたｍｔＤＮＳ  ＣＲ値を対照のｍｔＤＮＳ  ＣＲ値と比較して、前記対象が対照よりも有意に多いｍｔＤＮＳ  ＣＲ突然変異を有しているかどうかを判定する工程をさらに含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｂ）工程Ａで行われた定量によって得られたｍｔＤＮＳ  ＣＲ値を、アミロイド沈着またはβアミロイド線維の発達を伴う障害に罹患した対象を表すｍｔＤＮＳ  ＣＲ値と比較する工程をさらに含む請求項３に記載の方法。
【請求項６】
工程ＡはＴ４１４１Ｇ突然変異の試験を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程ＡはＴ４１４Ｃ突然変異の試験を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程ＡはＴ４７７Ｃ突然変異の試験を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程ＡはＴ１４６Ｃ突然変異の試験を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程ＡはＴ１５２Ｃ突然変異の試験を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程ＡはＡ１８９Ｇ突然変異の試験を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程ＡはＴ１９５Ｃ突然変異の試験を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程Ａの少なくとも一部はＰＮＡ固定化ＰＣＲで実施される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
工程Ａの少なくとも一部はオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションによって実施される請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程Ａの少なくとも一部はプライマー伸長法によって実施される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
工程Ａの少なくとも一部は制限酵素消化法によって実施される請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
工程Ａの判定は、
ｉ．脳組織；
ｉｉ．前頭葉からの脳組織；
ｉｉｉ．神経組織；
ｉｖ．神経細胞；
ｖ．血液；
ｖｉ．血液細胞；
ｖｉｉ．尿
ｖｉｉｉ．尿管細胞；
ｉｘ．皮膚；
ｘ．皮膚細胞；
ｘｉ．上皮；
ｘｉｉ．上皮細胞；
ｘｉｉｉ．線維芽細胞；
ｘｉｖ．脳脊髄液；および
ｘｖ．脳脊髄液に含まれる細胞
から選択される組織、細胞または体液の試料において行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は、その障害の症状を呈し始めた対象の該障害の発症後診断のために実施される請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法は、その障害の症状を呈し始めていない対象の該障害の発症前診断のために実施される請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記障害は神経変性疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記障害はアルツハイマー病である請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記障害はパーキンソン病である請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記障害はダウン症候群関連認知症である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記障害は海綿状脳症である請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記障害はＩＩ型糖尿病である請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記障害はクロイツフェルトヤコブ病である請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記障害はハンチントン病である請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記障害は黄斑疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記障害はプリオン病である請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
工程Ａは、
対象から標本細胞を採取する工程と、
該標本細胞からＤＮＡを抽出する工程と、
該抽出したＤＮＡをミトコンドリアＤＮＡ制御領域増幅に供する工程と、
ヘテロプラスミック４１４および４７７ヌクレオチド突然変異について直接配列決定することによって、ホモプラスミック４１４および４７７ヌクレオチド変異が存在するかどうか判定する工程と、
４１４および４７７ヌクレオチド変異が検出された場合に、該突然変異分子をクローニングし、該クローンを配列決定する工程と、を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１から３０のいずれかに記載の方法を実施するのに使用可能な試薬および／または物質を含むテスト・システム。
【請求項３２】
使用説明書をさらに含む請求項３１に記載のテスト・システム。
【請求項３３】
対照データを含む参照物をさらに含む請求項３１に記載のテスト・システム。
【請求項３４】
前記参照物はコンピュータ・ソフトウェアである請求項３３に記載のテスト・システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００４年３月２９日出願の「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」と題する米国特許仮出願第６０／５５７６１２号への優先権を主張するものであり、この全体を参照により本願明細書に明示的に援用する。
【０００２】
本発明は米国立衛生研究所助成金番号ＡＧ１３１５４およびＮＳ２１３２８の下で米政府の支援のもと行われた。米政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は一般に分子生物学および医学に関し、さらに具体的には、アルツハイマー病または他の神経変性疾患に罹患しているか、またはその発症リスクがある患者の診断および予後診断に使用可能な方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳類の身体の正常な生理的機能の多くは、少なくとも一部は、配列依存性の種々の構造を身体に取り入れるタンパク質の能力を介して生じる。しかし、タンパク質の配列はアミロイド線維として知られる異常な、ミスフォールディングした、不溶性の凝集体を形成することがある。これらのアミロイド線維は、これに限定するものではないが、アルツハイマー病、海綿状脳症、パーキンソン病、ＩＩ型糖尿病、クロイツフェルトヤコブ病、ダウン症候群関連認知症、ハンチントン病、黄斑変性、種々のプリオン病および他の多数のアミロイド病などの遺伝性、感染性および／または自然発症性の種々のアミロイド病の発症機序に関与していると考えられている。これらのアミロイド病の少なくとも一部では、アミロイド線維はアミロイド斑の発生を導く。
【０００４】
アルツハイマー病は進行性の神経変性疾患であり、高齢者に見られる進行性認知症の最も一般的な形態である。これは脳内でのβ−アミロイド（Ａβ）斑の蓄積および神経突起のもつれに関連している。しかし、アルツハイマー病の原因のかなりの部分は依然として不明である。
【０００５】
アルツハイマー病の脳ではミトコンドリア異常が見られることが多く、ＯＸＰＨＯＳ酵素の欠損はアルツハイマー病患者の脳および全身的に認められている。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）のある生殖細胞系列の突然変異もまた、欧州人家系のあるアルツハイマー病患者に関連付けられている。これらには、遅発性患者の約５％に認められるヌクレオチド対（ｎｐ）４３３６におけるｔＲＮＡＧｌｎ遺伝子突然変異と、高度に保存されたメチオニンをバリンに転換するＮＤ１  ｎｐ３３９７突然変異とがある。ｎｐ４３３６変異とアルツハイマー病との関連性は欧州の４件の独立した研究のうち３件で確認されている。西欧人のｍｔＤＮＡ系列（ハプログループ）ＪおよびＵｋはアルツハイマー病およびパーキンソン病（ＰＤ）に保護的であり長寿にも関与しているという報告では、アルツハイマー病はさらに生殖細胞系列のｍｔＤＮＡ変異にも関連付けられている。最後に、アルツハイマー病の脳では体細胞ｍｔＤＮＡ再配列変異が増加していることが観察されており、一般的な５キロベース（ｋｂ）のｍｔＤＮＡ欠損は、アルツハイマー病患者の脳においては７５歳までに約１５倍に増加する。
【０００６】
ｍｔＤＮＡ  ＣＲは、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖の転写を開始するためのプロモーター（ＰＨおよびＰＬ）、関連するミトコンドリア転写因子（ｍｔＴＦＡ）結合部位、３個の保存配列ブロック（ＣＳＢ）Ｉ−ＩＩＩおよびＨ鎖複製の開始点（ＯＨ）を含んだｍｔ
ＤＮＡの１０００ヌクレオチド対（ｎｐ）の非コード領域である。したがって、ＣＲはｍｔＤＮＡの転写および複製を調節するための主要な部位である。
【０００７】
このｍｔＤＮＡは１３個の必須ＯＸＰＨＯＳポリペプチド、２２個のｔＲＮＡ遺伝子ならびに１２Ｓおよび１６ＳのｒＲＮＡ遺伝子をコードする。また、ｍｔＤＮＡ  ＣＲは軽（Ｌ）鎖プロモーターおよび重（Ｈ）鎖プロモーター（ＰＬおよびＰＨ）；それらのミトコンドリア転写因子Ａ（ｍｔＴＦＡ）結合部位；下流の保存配列ブロック（ＣＳＢ）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ；ならびにＨ鎖複製開始点（ＯＨ１およびＯＨ2）を包含する。近年、
組織特異的なｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異が加齢に伴って蓄積することが見出された。ｍｔＴＦＡ結合部位ＰＬにおけるＴ４１４Ｇトランスバージョンは、培養皮膚線維芽細胞に蓄積しており、出願人の感受性タンパク質核酸（ＰＮＡ）固定化ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いると、低いレベルで骨格筋で検出されるが、脳においては検出することができない。また、Ａ１８９ＧおよびＴ４０８Ａ  ＣＲ突然変異は加齢に伴って骨格筋に蓄積し、Ｔ１５０Ｃ突然変異は白血球に蓄積する。しかし、正常の脳およびアルツハイマー病患者の脳について、特異的な体細胞ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異は報告されていない。しかし、特異的なｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異は加齢に伴って特定の組織に蓄積することがわかっている。例えば、ｎｐ４１４（Ｔ４１４Ｇ）におけるＴからＧへのトランスバージョンは加齢に伴ってヒト皮膚線維芽細胞に蓄積することがわかっており（非特許文献１）、Ａ１８９ＧおよびＴ４０８Ａ突然変異は骨格筋に蓄積することが認められている（非特許文献２）。しかし、感受性タンパク質核酸（ＰＮＡ）固定化ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、このＴ４１４Ｇ突然変異は正常脳において検出することはできなかった（非特許文献３）。
【非特許文献１】ミチカワら（Ｍｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ）、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８６巻：７７４〜７７９頁
【非特許文献２】ワンら（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ）、２００１年、ＰＮＡＳ、第９８巻：４０２２〜４０２７頁
【非特許文献３】マードックら（Ｍｙｒｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ）、２００２年、ＮＡＲ、第２８巻：４３５０〜４３５５頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ｍｔＤＮＡ  ＣＲ変異が対象身体の組織または細胞に存在するかどうか、またはそれがどの程度存在するのかを判定することによって、βアミロイド沈着（例えば、プラーク）および／またはβアミロイド線維の形成を伴う神経変性疾患を発症前または発症後診断する方法、組成物および装置（例えば、テスト・キット、テスト・システム、試薬、関連するコンピュータ・ソフトウェア、計算機等）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、ヒトまたは動物対象から試料細胞を採取し、該試料細胞からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡをミトコンドリアＤＮＡ制御領域増幅に供する方法が提供される。この後、ノモプラスミック（ｎｏｍｏｐｌａｓｍｉｃ）４１４および４７７のヌクレオチド変異が存在するかどうかを判定する。４１４および４７７ヌクレオチド変異が存在するとみなされる場合、この変異分子をクローン化、配列決定して突然変異を確認する。次いで、そのような突然変異の数を関連する対照群または対照母集団の変異の数と比較することもできる。そのような突然変異の数が対照群よりも著しく多い場合、対象は神経変性疾患または他のβアミロイド疾患（例えば、黄斑変性症）を発症したか、または発症するリスクがあると結論付けることができる。
【００１０】
さらに本発明によれば、ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異の量および重症度の変化を判定することによって、神経変性疾患または他のβアミロイド疾患（例えば、黄斑変性症）の治療
の有効性および無効性を判定する方法が提供される。
【００１１】
本発明のさらなる態様および詳細は、以下に記載の詳細な説明および実施例を読めば当業者には明白となろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
図面の簡単な説明
図１Ａおよび図１Ｂは、ＡＤ脳および対照脳のｍｔＤＮＡ  ＣＲ体細胞突然変異分布を示す。図１Ａは、ｍｔＤＮＡ  ＣＲのｎｐ１６０００〜５７０を示す図である。線の下の数字はｍｔＤＮＡ  ｎｐを示し、線より上の黒四角は調節要素を表す。ＣＲマップ下の太い横線はＡＤ（赤）、対照（青）、または共通（金）のヘテロプラスミック突然変異の場所を表す。図１Ｂは、ＡＤ脳および対照脳のｍｔＤＮＡ  ＣＲ調節要素におけるヘテロプラスミック突然変異の数を示す表である。
【００１３】
図２Ａ−Ｅは、ＡＤ脳および対照脳のＴ４１４Ｇ  ｍｔＤＮＡ突然変異のためのＰＮＡ固定化ＰＣＲアッセイの結果を示す。図２Ａは対照のアガロース・ゲル電気泳動の結果を示す。図２ＡはＡＤ患者のアガロース・ゲル電気泳動の結果を示す。ａおよびｂの個々の標本は対象の年齢によって同定される。２つのＰＣＲを各対象について示し、野生型ｍｔＤＮＡの増幅を抑える４１４野生型塩基を包含するＰＮＡが、一方では存在せず（−）、他方では存在する（＋）。図２Ｃは、ＡＤ脳からのＴ４１４Ｇ突然変異の存在を確認するＡＤ脳および対照脳からのＴ４１４Ｇ突然変異の存在を確認するＰＮＡ固定化ＰＣＲ産物のＦｏｋＩ消化を示す。図２Ｃは、比較のために同じゲルに入れられた、ＰＮＡ固定化ＰＣＲ産物のＦｏｋＩ消化を示す。ｃのレーンはＡＤ患者の年齢で標識し；−ｃのレーンは野生型プラスミドからのＰＣＲ産物から得られたＦｏｋ消化の結果；＋ｃのレーンはＴ４１４Ｇ突然変異プラスミドからの結果。矢印はＴ４１４Ｇ  ＦｏｋＩ産物を示す。図２Ｅは、７４歳の対象からのＣＲフラグメントの配列解析を示すグラフ。４１４領域はＰＮＡ固定化ＰＣＲ増幅され、得られたフラグメントをＰＮＡなしで再増幅し、最終フラグメントをクローニングおよび配列決定した。突然変異ヌクレオチドＧ（矢印で示す）が５つのクローンのうちの３つに見られる。
【００１４】
図３Ａおよび図３は、ＡＤおよび対照の脳標本からのＣＲクローンをクローニングおよび配列決定して観察されたヘテロプラスミックｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異の総数を示す棒グラフである。図３Ａは、全年齢群（５９〜９４歳）からの突然変異の数を示す。Ｐ＜０．０１*。図３Ｂは、年齢の異なる３群：５９〜６９歳、７０〜７９歳、８０歳以上のＤ
ＮＡ突然変異頻度の突然変異の数を示す。８０歳以上でＰ＜０．００１**。
【００１５】
図４Ａ−Ｄは、ＡＤ脳および対照脳の特異的体細胞ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異およびそれらのヘテロプラスミーの割合を示すグラフである。対象は年齢で示す。図４Ａは、対照（正常）脳からのＣＲ  ｎｐ１〜１００のデータである。図４Ｂは、ＡＤ患者脳からのＣＲ  ｎｐ１〜１００のデータである。図４Ｃは、対照（正常）脳からのＣＲ  ｎｐ１０１〜５７０のデータである。図４Ｄは、ＡＤ患者脳からのＣＲ  ｎｐ１０１〜５７０のデータである。特異的突然変異を横座標の下に示す。個々の脳の各突然変異の割合をその色のグラフの高さで示す。ホモプラスミック生殖系列突然変異もこれらの突然変異に観察される。ｎｐ１〜１００領域では、Ａ７３ＧがＡＤ６例および対照４例に見られる。ｎｐ１０１〜５７０領域では、Ｔ１４６ＣがＡＤ３例および対照２例に見られる。Ｔ１５２ＣがＡＤ３例および対照４例に見られる。Ａ１８９ＧはＡＤには見られず、対照１例に見られる。Ｔ１９５ＣがＡＤ２例および対照２例に見られる。Ｔ４１４ＣおよびＴ４７７Ｃは、ＡＤ標本および対照標本いずれにもホモプラスミック状態では見られない。
【００１６】
図５は、ＡＤ、ＤＳ、ＡＤＰＤ、ＰＤおよび対照（正常）対象からの脳のＴ４１４Ｇト
ランスバージョン変異の発生率を比較したグラフである。各群でアッセイした前頭葉標本の数をＸ軸の真下に示す。
【００１７】
図６は、認知症のＤＳ、ＡＤおよび対照脳におけるｍｔＤＮＡ  ＣＲ体細胞ｍｔＤＮＡ突然変異の頻度を示すグラフである。認知症のＤＳ脳は対照に比してｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異数が６１％増加し、ＡＤ脳では７６％増加した。
【００１８】
図７は、ｍｔＤＮＡ  ＣＲ調節要素における認知症のＤＳ、ＡＤおよび対照群の体細胞ｍｔＤＮＡ突然変異分布を示す表である。
図８は、ＤＳ、ＡＤおよび対照脳におけるｍｔＲＮＡレベル（Ｌ鎖／Ｈ鎖）を示すグラフである。このグラフは４０〜７４歳の対照、ＡＤおよびＤＳの脳における重鎖（Ｈ鎖）（ＮＤ２  ｍＲＮＡレベル）に対する軽鎖（Ｌ鎖）（ＮＤ６  ｍＲＮＡレベル）の転写レベルの比を表す。このグラフはＡＤおよびＤＳ症例においてＬ鎖／Ｈ鎖のｍＲＮＡレベル約５０％が著しく低減したことを示す。
【００１９】
実施例の詳細な説明
以下の詳細な説明および実施例、添付図面ならびに図面の簡単な説明は、本発明の特定の実施例のみを説明することを意図したものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【００２０】
出願人らは、アルツハイマー病に罹患した患者の脳において、ｍｔＤＮＡのＬ鎖転写およびＨ鎖複製に関与することが知られている要素内で、ｍｔＤＮＡ  ＣＲ内に位置する突然変異の発生率が増大することを発見した。さらに、これらの突然変異はｍｔＤＮＡ、Ｌ鎖、ＮＤ６  ｍＲＮＡおよびｍｔＤＮＡコピー数の減少に関連している。したがって、体細胞ｍｔＤＮＡ突然変異は散発性ＡＤの共通の特徴であり、観察されたミトコンドリア機能障害の原因であり得ると結論付けされる。
【００２１】
以下の実施例１に示すように、出願人はＡＤ脳の前頭葉を用いてＰＮＡ固定化ＰＣＲ法によってＴ４１４Ｇ突然変異を試験した。このＰＮＡ固定化ＰＣＲ法は本明細書で以下に記載されているし、またマードック  ディージー（Ｍｕｒｄｏｃｋ  ＤＧ）およびウォレス  ディーシー（Ｗａｌｌａｃｅ  ＤＣ）；ＰＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ  Ｃｌａｍｐｉｎｇ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．第２０８巻：１４５〜１６４頁（２００２年）に記載されている。この方法は、本発明によるどのｍｔＤＮＡ  ＣＲの試験にも使用することができる。
【００２２】
これらの試験では、ＡＤ脳の６５％がこの突然変異に対して陽性であったが、正常対照脳はいずれも突然変異を有していなかったことが見出された。この現象についてさらに詳しく調べるために、出願人らはＡＤ患者および年齢適合対照の脳から多数のＣＲクローンをクローニングし、配列決定した。このことからＡＤ脳はＣＲ突然変異が全体的に６３％増加し、これらの突然変異は、ｍｔＤＮＡの転写および調節に関与することが知られているＣＲの配列モチーフに優先的に位置していることが明らかとなった。例えば、出願人らは、ＡＤの脳では、ＣＳＢＩならびにＰＨおよびＰＬ  ｍｔＴＦＡの各々に７個の突然変異があるが、対照の脳にはないことを見出した。さらに、ＡＤ  ＣＲ突然変異の年齢分布は特徴的であり、５９〜６９歳では対照群よりも６５％高く、７０〜７９歳の脳では１４％高く、８０歳以上のＡＤ脳では１３０％高かった。
【００２３】
ＡＤ脳のｍｔＤＮＡ  ＣＲの体細胞突然変異の全体的増加に加え、出願人らはＡＤ患者の脳に特有であった２種類のＣＲ突然変異であるＴ４１４Ｃ突然変異およびＴ４７７Ｃ突然変異も発見した。また、Ｔ１４６Ｃ、Ｔ１５２Ｃ、Ａ１８９ＧおよびＴ１９５Ｃにおける突然変異は、対照群よりもＡＤ脳によく見られた。最後に、Ｔ１４６Ｃ、Ｔ１９５Ｃお
よびＴ４７７Ｃ突然変異はＡＤ脳では非常に高いレベルまで増加し、ある場合には、患者脳では全ｍｔＤＮＡの７０〜８０％を表すに至った。さらに、これらの突然変異はＡＤ脳に認められたが、対照の脳には認められなかった。最後に、これらの特異的ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異は主として７０〜８３歳の患者に非常に高い頻度で見られ、同じ範囲の年齢で、より無作為なＣＲ突然変異の頻度は低かった。このことは２つのクラスのＡＤが存在することを示唆している。１つの場合では、少数のＣＲ突然変異が発達の初期に生じ、脳全体に広範に汎発するようになり、各細胞内でクローン増幅して、脳内に高頻度の少数の突然変異を伴う認知症を早期に発症する。もう一方の場合では、突然変異は発達のより後期に蓄積するので、個々の突然変異はより少数の細胞に閉じ込められる。これらの突然変異がその個々の細胞内でクローン増幅されると、各突然変異は脳内の総ｍｔＤＮＡ  ＣＲの数％を表すようになり得るに過ぎない。
【００２４】
いずれの場合でも、ある細胞内で突然変異ｍｔＤＮＡの割合が十分に高いレベルに達すると、ｍｔＤＮＡ転写および／または複製を阻害する。これによって、Ｌ鎖転写の減少、ｍｔＤＮＡ複製の阻害、呼吸不全、早発性神経細胞死および認知症が生じる。したがって、これらのデータはｍｔＤＮＡ  ＣＲ領域の体細胞突然変異が晩発性ＡＤの原因であることを示唆している。したがって、これらの突然変異を検出することはＡＤの診断を確認し、現在は発症前であるが該疾患のリスクがある個人を予測するための優れた手段となる。
【００２５】
出願人らは、ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異が増大するという仮説について、アルツハイマー病およびパーキンソン病患者（ＡＤＰＤ）の脳を評価した。まず、Ｔ４１４Ｇ突然変異をこのセットの脳標本で試験した。興味深いことに、該患者脳の５２％がこの突然変異に対して陽性であることが認められた。他のＣＲ突然変異はＡＤＰＤ脳についてまだ試験中である。
【００２６】
ダウン症候群（ＤＳ）患者もアミロイド斑およびＡＤに類似する神経原線維変化に伴う老年性認知症を発現するが、その年齢はずっと若年である。したがって、ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異が斑およびもつれに関連して認知症を発現するのに重要である場合、認知症のＤＳ患者脳では、若い年齢でｍｔＤＮＡ体細胞突然変異の多様性および密度がＡＤ患者脳に匹敵するはずであると合理的に予測され得る。
【００２７】
このことが正しいかどうかを判定するために、出願人はＰＮＡ固定化ＰＣＲ法を用いて認知症ＡＤ脳標本からの前頭葉ＤＮＡをＴ４１４Ｇ  ＣＲ突然変異について試験した。上記のＡＤ脳の結果と一致して、５９〜９３歳のＡＤ脳の６５％に比して４０〜６２歳の認知症ＡＤ脳の５７％はＴ４１４Ｇを持っていたが、５９〜９４歳の対照脳は持っていなかったことが決定された。
【００２８】
認知症ＤＳ患者も他のｍｔＤＮＡ  ＣＲ領域突然変異を重要な機能要素に持っているかどうかを判定するために、出願人らは認知症のＤＳ脳７例からの前頭葉ｍｔＤＮＡのＣＲをＰＣＲで増幅、クローニングおよび配列決定し、その結果をわれわれのＡＤ対象および対照対象と比較した。認知症ＤＳ脳はｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異の数が対照群に比して６１％増加していることが認められた。他方、ＡＤ脳では７６％増加した。さらに、ＡＤの場合に見られたのとまったく同じように、認知症ＤＳ  ＣＲ突然変異は知られたｍｔＤＮＡの転写および複製調節要素に集中していた。
【００２９】
最後に、ＡＤ脳の場合のように、認知症ＤＳ脳はＬ鎖ＮＤ６  ｍＲＮＡレベルが５０％低下した。ＤＳ脳の平均比は０．３２±０．０９、対照群の平均比は０．７１±０．３８（Ｐ＝０．０１８）であった。したがって、斑およびもつれの蓄積は体細胞ｍｔＤＮＡミトコンドリア突然変異の増大およびｍｔＤＮＡ転写の低下に関連している。
【実施例１】
【００３０】
アミロイド病に関連するｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異の同定
ＡＤ患者および対照群からの脳標本
これらの実験には年齢を適合させたＡＤおよび対照の死体からの前頭葉標本を用いた。合計でＡＤ２３例および対照群（非ＡＤ）４０例の脳標本を病理学的に確認し、この試験に用いた。各脳標本のｍｔＤＮＡ超可変領域（ｎｐ−１６０００−１００）を配列決定し、西欧人型のｍｔＤＮＡハプログループＨ、Ｕ、ＪおよびＴに属する標本を選択して、さらにクローニングおよび配列決定試験を行い、大陸間の比較に共通する多型の差を最小にした。観察されたＣＲ変異がコードされた核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）の偽の増幅産物、すなわちｍｔＤＮＡ偽遺伝子である可能性を除くために、あらゆるＰＣＲプロトコルをｍｔＤＮＡを欠損した細胞（ρ0細胞）に適用して、ｍｔＤＮＡ様配列を増幅することができない
ことを確実にした。
【００３１】
ＡＤ脳におけるＴ４１４Ｇ突然変異の検出
１０００個の野生型分子の中に１個のｍｔＤＮＡ突然変異を検出することができる図２Ａに示したＰＮＡ固定化ＰＣＲ法によって、前頭葉ＤＮＡでＴ４１４Ｇ突然変異を探した。図２Ｃおよび図２Ｅに示すように、Ｆｏｋｌを用いて切断し、個々のＰＣＲ分子をクローニングおよび配列決定することによって、得られた３３４ｎｐ  ＰＣＲ産物中にＴ４１４Ｇ突然変異が存在することを確認した。
【００３２】
クローニングおよび配列決定によるＡＤ脳中の新規なｍｔＦＮＡ  ＣＲ突然変異の同定
図１に示したようにクローニングおよび配列決定して、ｍｔＤＮＡ  ＣＲのＰＣＲ増幅によってヌクレオチド対（ｎｐ）１６５２７と６３６との間にさらなるｍｔＤＮＡ  ＣＲ体細胞突然変異を同定した。ｐｕｒｅ  ｇｅｎｅキット（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）および高品質のＥｐｉｃｅｎｔｒｅ社のｆａｉｌＳａｆｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと共にプライマーｎｐ１６５２７−１６５４６（５’−ＣＣＴ  ＡＡＡ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＣＧＴ  ＴＣ−３’）およびｎｐ６１７−６３６（５’−ＴＧＡ  ＴＧＴ
ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＴＡＡ  ＡＣ−３’）を用いて増幅したＣＲを使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。アガロース・ゲル電気泳動法を用いて所望のＰＣＲフラグメントを精製し、Ｎｕｃｌｅｏ  Ｔｒａｐゲル・キット（クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて抽出し、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニング・プロトコル（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてクローニングし、少量調製により所望のプラスミドを精製した。ＡＢＩ３１００キャピラリーシーケンサーを利用してＢｉｇＤｙｅ  ジデオキシ法（アプライドバイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））を用いてプラスミドＤＮＡをサイクル・シーケンシングし、シーケンス結果を「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｖ４．０．５」（ジーンコード社（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を用いて分析した。
【００３３】
ｍｔＤＮＡの転写レベルおよびコピー数の定量
ｍｔＤＮＡのＬ鎖転写とＨ鎖転写の比を決定するために、ＴＲＩＺＯＬ（ギブコ−ＢＲＬシステム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  ｓｙｓｔｅｍ））を用いて全てのＲＮＡを前頭葉から抽出し、Ｌ鎖、ＮＤ６、ｍＲＮＡおよびＨ鎖、ＮＤ２、ｍＲＮＡを逆転写し、定量リアルタイム（ｑＲＴ）−ＰＣＲによって増幅した。順方向プライマーｎｐ１４２６０−１４２７９（５’−ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  ＴＧ−３’）および逆方向プライマーｎｐ１４４６６−１４４８５（５’−ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’）を用いて、ＮＤ６を増幅した。ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比２５を決定するのに用いたものと同じプライマーを用いて、ＮＤ２  ｍＲＮＡを増幅した。
【００３４】
ゲノムＤＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲによってｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡの相対比を決定した。ｍｔＤＮＡプライマーをＮＤ２遺伝子に入れ、ｎＤＮＡプライマーを１８Ｓ  ｒＲＮＡに入
れた。
【００３５】
結果
Ｔ４１４Ｇ  ＣＲ突然変異はＡＤ脳には認められたが、対照にはなかった
ＰＮＡ固定化ＰＣＲによって合計ＡＤ脳２３例および対照脳４０例の前頭葉ゲノムＤＮＡを対象にしてＴ４１４Ｇの存在の有無を分析したところ、試験したＡＤ脳の６５％がＴ４１４Ｇ突然変異に対して陽性であったが、対照には見られなかった（図２ＡおよびＢ）。Ｆｏｋｌ制限酵素消化物を用い、直接クローニングおよび直接配列決定によって、Ｔ４１４ＧがＡＤ標本中に存在することを確認した（図２Ｃ、２Ｄおよび２Ｅ）。
【００３６】
ＡＤ脳ＣＲ突然変異の同定および定量
ＡＤ脳においてｍｔＤＮＡ  ＣＲ体細胞突然変異の存在が増大することの一般性を判定するために、われわれはＡＤ１６例および対照１７例各々の脳標本からの１０〜２０個のＣＲクローンをＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定し、合計でＡＤ２５０例および対照クローン２３５例を分析した。図３Ａに示すように、この試験から、対照に比してＡＤ脳ではヘテロプラスミックｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異の頻度が全体的に６３％増加したことが明らかとなった（Ｐ＜０．０１）。また、図３Ｂに示すように、対照に比してｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異では、５９〜６９歳のグループは７９％増加し、７０〜７９歳のグループは１８％増加し、８０歳以上のグループは１３０％増加し、８０歳以上のＡＤ患者と対照群との差は極めて有意なものであった（ｐ＜０．００１）。
【００３７】
これらのＣＲ突然変異の機能的重要性を判定するために、ｍｔＤＮＡ  ＣＲの既知の機能的要素の位置と突然変異の位置を相関させた。再び図１に戻ると、調節要素がほとんど同定されなかったｎｐ１〜１００のＣＲにおいてＡＤ標本と対照標本との間には突然変異の分布に明らかな差はなかった。対照的に、既知のｍｔＤＮＡ調節要素の大半を包含するＡＤ脳クローンのｎｐ１０１〜５７０の領域ではＣＲ突然変異の有意な増加が認められた。
【００３８】
また、対照の突然変異ではなくＡＤ突然変異は、既知の機能的な転写および複製要素に優先的に位置している。例えば、図１Ｂからわかるように、７個のヘテロプラスミックＣＲ突然変異が、ＡＤ脳のＣＳＢＩには観察されるが、対照には見られない。同じく、図２Ｂからわかるように、１７個のヘテロプラスミック突然変異が、ＡＤ脳の４カ所のｍｔＴＦＡ結合部位（２カ所はＰＬとＰＨとの間、もう２カ所はＣＳＢＩとＣＳＢＩＩとの間）に認められるが、対照群では５個しか見られなかった（Ｐ＜０．００１）。実際、７個のヘテロプラスミック突然変異が２カ所のｍｔＴＦＡ結合部位に存在したが、対照の脳のこれらのｍｔＴＦＡ部位には存在しなかった。したがって、ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異はＡＤ患者により共通して認められ、それらは機能的に重要なモチーフに優先的に影響を及ぼす。
【００３９】
ＡＤ脳における高レベルのｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異ヘテロプラスミー
ＣＲ突然変異はＡＤ脳に優先的に存在するだけでなく、図４に示すように、並外れて高い割合のヘテロプラスミーで存在することが多い。ｎｐ１〜１００ではＡＤ脳と対照群の脳との間には有意な差は見られなかったが（図４Ａ対図４Ｂ）、ｎｐ１００〜５７０の領域ではＡＤ脳には対照に比して多数の高い割合のヘテロプラスミック突然変異が認められた（図４Ｃ対図４Ｄ）。
【００４０】
同定されたヘテロプラスミーの割合が高いＣＲ突然変異のうちの２つはＡＤ脳に特異的であることが証明された。１つのＡＤ突然変異であるＴ４１４Ｃは５９歳、８３歳および８４歳のＡＤ患者の約１０％で認められたが、どの対照にも見られなかった。第２のＡＤ特異的突然変異であるＴ４７７Ｃは７６歳、７８歳、８３歳のＡＤ患者の７０〜８０％の
ヘテロプラスミーで認められ、８９歳の患者では２０％のヘテロプラスミーで認められたが、対照には見られなかった（図４Ｃおよび４Ｄ）。
【００４１】
その他の４個の高い割合のヘテロプラスミーＣＲ突然変異はＡＤ脳に優先的に認められたが、レベルはより低く年齢も高くはあるがいくつかの対照でも見られた。Ｔ１４６Ｃ突然変異が７４歳および８３歳のＡＤ患者脳の７０〜８０％のヘテロプラスミーで認められ、９４歳の対照の約５０％のヘテロプラスミーでも見られた。Ｔ１９５Ｃ突然変異が７４歳および８３歳のＡＤ患者のそれぞれ８０％および１０％のヘテロプラスミーで認められ、対照の７７歳の１例の約１０％の突然変異でも見られた。Ｔ１５２Ｃ突然変異が６７歳および７６歳のＡＤ患者の５〜２０％のヘテロプラスミーで認められ、対照の８７歳の１例の５％のヘテロプラスミーでも認められた。Ａ１８９Ｇ突然変異が６２歳、６７歳および９３歳のＡＤ患者の５〜２０％のヘテロプラスミーで認められ、５９歳および８６歳の対照の１０％未満で見られた（図４Ｄ対４Ｃ）。
【００４２】
これらの同じＣＲ突然変異はまた、対照よりもＡＤ脳で同時発生することが多かった。４個のＡＤ脳は２つ以上のヘテロプラスミック突然変異を有していた。６７歳のＡＤ脳はＴ１５２Ｃ突然変異およびＡ１８９Ｇ突然変異の両方を有していたが、ヘテロプラスミーの割合は低かった。７４歳のＡＤ脳はＴ１４６Ｃ突然変異およびＴ１９５Ｃ突然変異を非常に高いレベルのヘテロプラスミーで有していた。７６歳のＡＤ脳はＴ１５２Ｃ突然変異およびＴ４７７Ｃ突然変異をそれぞれ低いレベルおよび高いレベルのヘテロプラスミーで有していた。また、８３歳のＡＤ脳はＴ１４６Ｃ突然変異およびＴ４７７Ｃ突然変異を高い割合で有していたほか、Ｔ１９５Ｃ突然変異およびＴ４１４１Ｃ突然変異を低い割合のヘテロプラスミーで有していた。対照の脳はどれも２つ以上のヘテロプラスミックＣＲ突然変異は有していなかった。また、ＡＤ患者６例はＴ１４６Ｃ突然変異に対してホモプラスミックであり、これらのうちの４例はＴ１９５Ｃ突然変異に対してもホモプラスミックであった。対照的に、Ｔ１４６Ｃ突然変異に対しては対照群の２例のみがホモプラスミックであり、これらのうちのいずれもＴ１９５Ｃを有していなかった。
【００４３】
最後に、７０％以上のヘテロプラスミー・レベルで個々のｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異を有していたＡＤ患者は全て７４歳〜８３歳で生じたが（７例中４例すなわち６０％）、５９歳〜７２歳および８４歳〜９３歳では非常に高いレベルのヘテロプラスミックな突然変異を有する患者は認められなかった。したがって、対照よりもＡＤ患者脳では、ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異はより共通しており、早期に蓄積し、より高い割合のヘテロプラスミーで存在し得る。
【００４４】
ＡＤ脳におけるｍｔＤＮＡ−Ｌ鎖転写体およびコピー数の減少
ＡＤ脳に観察されたヘテロプラスミックｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異の大半は、Ｌ鎖転写が開始される部位であるＰＬ近傍；その後Ｌ鎖転写体がＭＲＰ−ＲＮａｓｅによって切断されて３’−ＯＨ複製プライマーを生成するＣＳＢＩ；ならびにｍｔＤＮＡポリメラーゼγ１６がＨ鎖複製を開始するＯＨ１およびＯＨ2で生じた。したがって、ＡＤ脳で見られ
たＣＲ突然変異はＬ鎖転写およびｍｔＤＮＡコピー数を低減させるはずであると想定することは合理的であり得る。
【００４５】
ＡＤ脳のＬ鎖転写の低減は、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＬ鎖  ＮＤ６、ｍＲＮＡ対Ｈ鎖、ＮＤ２  ｍＲＮＡの比を決定することによって確認した。ＡＤ脳１２例のＮＤ６／ＮＤ２ｍＲＮＡの比は０．２９±０．１８であったが、対照１１例のその比は０．６７±０．３８であり、ＮＤ６  ｍＲＮＡレベルは１／２に低減した（ｐ＝０．０１）。同じく、ｑＲＴ−ＰＣＲによってＮＤ２および１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数のｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比を分析したところ、平均比はＡＤ脳９例では１２±６．９となったが、対照脳１７例では２２±１８となり、ｍｔＤＮＡコピー数５０％低減した（Ｐ＝０．０３）。
【００４６】
結論
病理学的に確認されたＡＤおよび対照の脳前頭葉のｍｔＤＮＡ  ＣＲ配列のバリエーションを分析することによって、出願人は、ＡＤ脳はｍｔＤＮＡ  Ｌ鎖転写およびＨ鎖複製を調節するヘテロプラスミックｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異を高頻度で重要な要素に有していることを見出した。これらの突然変異の機能的な場所と一致して、ＡＤ脳はＬ鎖である、ＮＤ６およびｍＲＮＡのレベルならびに細胞のｍｔＤＮＡコピー数が有意に減少していた。
【００４７】
ＮＤ６はｍｔＤＮＡのＬ鎖コードされた唯一のポリペプチドであるとともに呼吸複合体Ｉアセンブリにとって必須であるので、ＮＤ６  ｍＲＮＡが減少すると、呼吸複合体Ｉが優先的に阻害される。また、Ｌ鎖の転写障害に加えＣＳＢＩならびにＯＨ１およびＯＨ2
配列に突然変異があると、Ｈ鎖複製の開始が低減され、これはｍｔＤＮＡ欠乏が観察される原因となる。このｍｔＤＮＡ欠乏はｍｔＤＮＡでコードされるＯＸＰＨＯＳサブユニットの１３個全てを低減させることになり、これは複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶの酵素活性を抑えることになる。この結果、ＡＤ脳に観察されるｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異は、ＡＤ２に観察されたミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ酵素活性を低減させる原因となる可能性がある。
【００４８】
出願人らの理論は、ＡＤに関与していることを出願人が見出したｍｔＤＮＡ  ＣＲ体細胞突然変異が、ミトコンドリアのＲＯＳ産生によって引き起こされるというものである。ミトコンドリアは細胞ＲＯＳの大半をＯＸＰＨＯＳの毒性副産物として産生する。次に、これらのＲＯＳはミトコンドリアタンパク質および膜を損傷し、ｍｔＤＮＡに突然変異を誘発させる。したがって、ミトコンドリアＲＯＳ産生の比率の高い個体は、ｍｔＤＮＡ体細胞突然変異をより速く獲得し、これによって加齢に伴ってＯＸＰＨＯＳ欠損およびＡＤをより発現しやすくなる。
【００４９】
ＯＸＰＨＯＳがＲＯＳを産生する傾向は、ミトコンドリアの電子伝達系（ＥＴＣ）の電子伝達体に保持された電子の密度によって調節される。環境有害物質またはｔＲＮＡ  ｎｐ４３３６突然変異およびＮＤ１  ｎｐ３９９７突然変異などの弱有害性のミトコンドリア遺伝子突然変異による慢性的阻害があると電子伝達体の電子の密度を上昇させることになり、これによってＯ2への直接的な偽の伝達が促進されてスーパーオキサイド・アニオ
ン（Ｏ2−）が生成される。これが第１のＲＯＳである。次いで、スーパーオキサイド・
アニオンは過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）に転換され、Ｈ2Ｏ2はヒドロキシル・ラジカル（ＯＨ）に転換される。これが残りの２つのＲＯＳである。対照的に、ＯＸＰＨＯＳの部分的な脱共役から生じるであろうようにＥＴＣがより完全に酸化されれば、電子伝達体の電子密度は低減することになり、これによってＲＯＳ産生およびｍｔＤＮＡ変異誘発性は低減されることになろう。
【００５０】
この点に関し、人々が熱帯アフリカからより寒冷な北ユーラシア大陸およびシベリアへと移住するにしたがって、ＯＸＰＨＯＳの脱共役を生じさせるｍｔＤＮＡ突然変異がヒト集団に確立されたことを出願人は明らかにした。これらのｍｔＤＮＡの脱共役変異がＡＴＰ生成を犠牲にしてミトコンドリアの熱産生を増大させ、寒冷地に適合できるようにした。今日、これらの同じ突然変異は寿命の延長ならびにＡＤおよびＰＤの低減に関連している。この現象の驚くべき例は欧州人のハプログループＪ（サブハプログループＪ１およびＪ２）およびハプログループＵｋに見られる。両ハプログループＪ１およびＵｋは、ｎｐ１４７９８のシトクロムｂ（ｃｙｔｂ）突然変異によって別個に発見された。ハプログループＪ２はｎｐ１５２５７の異なるｃｙｔｂ突然変異によって発見された。このｎｐ１４７９８および１５２５７のｃｙｔｂ突然変異はｃｙｔｂの２カ所の補酵素Ｑ１０結合部位の保存されたアミノ酸を変化させるので、複合体ＩＩＩＱサイクルによるプロトン・ポン
プに影響を及ぼす可能性がある。これらの脱共役ｃｙｔｂ突然変異はミトコンドリアのＥＴＣ電子密度、ＲＯＳ産生、ｍｔＤＮＡ体細胞突然変異、およびミトコンドリアが惹起するアポトーシスによるシナプスの損失を低減させるであろう。
【００５１】
体細胞ｍｔＤＮＡ突然変異は、ある個体の生涯の間のどの時点でも、最も初期の胚細胞から最終分化した分裂終了細胞まで、細胞内で生じ得る。発達の早い段階で生じる突然変異はその後の細胞分裂に伝播され、その結果、身体の器官全体に広く分布するであろう。対照的に、発達の後期に生じる突然変異は比較的少ない細胞に限定されよう。一旦ｍｔＤＮＡの有害突然変異が分裂終了細胞に存在するようになると、ｍｔＤＮＡ突然変異は選択的に増幅され、最終的にはその細胞内で優勢になることは十分に裏付けられている。したがって、脳発達の初期に生じるｍｔＤＮＡ突然変異は、細胞分割を介して脳の細胞全体にわたって分布し、その後に実質的にあらゆる細胞において選択的に増幅されるであろう。これらは、ある種のＡＤ患者の脳においてｍｔＤＮＡの７０％以上を表すことになるｍｔＤＮＡ突然変異であろう。発達の初期に発生したｍｔＤＮＡも初期に増幅されるであろうから、これらの突然変異は大半の脳細胞において初期に毒性レベルに達するので、早期に発症するＡＤ患者の脳に認められるであろう。このことは何故７４〜８３歳のＡＤ症例が最低の頻度でヘテロプラスミックｍｔＤＮＡを有するが（対照群に対して１８％増加）（図３Ｂ）、１つ以上の突然変異を７０〜８０％のヘテロプラスミーで有することが多かったのかを説明するであろう（図４Ｃおよび４Ｄ）。
【００５２】
対照的に、体細胞突然変異が発達の後期に生じたＡＤ症例では、個々の突然変異は少数の分裂終了後の脳細胞に限定されるであろう。より多数のこれらの突然変異が発生し、各々がその存在している細胞内で増幅される場合、これらの脳は、各々のヘテロプラスミーの全体的割合は低い状態で、より多くのｍｔＤＮＡ突然変異を有することになろう。これらの体細胞ｍｔＤＮＡ突然変異は発達の後期に生じ、認知症を生じるのに十分な量の細胞を損なうにはより非依存的な突然変異が必要とされるであろうから、この突然変異はより後期に毒性レベルにまで増幅され、より後期に発症する疾患を有する患者を生じるであろう。このシナリオは、何故８０歳以上のＡＤ患者脳が種々のヘテロプラスミックｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異を高頻度で有するが（対照群に対して１３０％）（図３Ｂ）、どの突然変異も脳のｍｔＤＮＡの２０％を超えることはなかった（図４Ｃおよび４Ｄ）のかを説明するであろう。異なる年齢のＡＤ脳におけるｍｔＤＮＡ突然変異遺伝子型の頻度のこのような不連続性は、一般的な５ｋｂのｍｔＤＮＡ欠損について以前に観察されている。この欠損は、７５歳前に死亡したＡＤ患者の脳では対照に比して１５倍増大したが、７５歳以降に死亡したＡＤ患者の脳については対照レベルの１／５であることが認められた。
【００５３】
個人の脳細胞がどのように高レベルのｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異を生じるかに関係なく、ＡＤ患者全てで、最終的にはＮＤ６  ｍＲＮＡが低減し、ｍｔＤＮＡコピー数が減少する。これらの変異ｍｔＤＮＡが細胞の発現閾値を超えると、ＯＸＰＨＯＳが阻害され、ＲＯＳ産生が増大し、ｍｔＰＴＰが感作され、シナプス結合が失われる。
【００５４】
このミトコンドリア仮説は今や、アポＥ対立遺伝子のＡＤの素因に及ぼす影響およびＡＤの疾患過程におけるＡβの役割を説明することができる。アポＥε４対立遺伝子を有する個人はＡＤ３２のリスクが高く、またアポＥε２対立遺伝子およびε３対立遺伝子に比して、ε４体質遺伝子は酸化ストレスに関与していることが明らかとなった。したがって、アポＥε４対立遺伝子はミトコンドリアの酸化ストレスを増大させ、それ故、ｍｔＤＮＡの体細胞突然変異率を上昇させる可能性がある。
【００５５】
他方では、Ａβペプチドは抗酸化防御系として機能して神経シナプスを酸化的損傷から保護することが報告されている。しかし、Ａβは過剰酸生されると、凝集して毒性の酸化促進剤となる。このシナリオを考えると、ミトコンドリアのＲＯＳ産生を増大させる神経
細胞のｍｔＤＮＡ変異はＡβの産生を刺激するであろう。最初は保護的であるが、このＡβはすぐに凝集し、その結果プラークが沈着し、ミトコンドリアが豊富にあるシナプスの神経繊維末端近傍でＲＯＳが増大し、シナプスが失われることになる。さらに、結果的にＡβの過剰産生およびその時期尚早の凝集を生じるＡＰＰまたはプレセニリン複合遺伝子はまた、ＲＯＳ産生、ミトコンドリア損傷、ｍｔＰＡＴの活性化およびシナプスの損失を増大させるであろう。
【００５６】
結論として、これらのデータはＡＤが、ｍｔＤＮＡの酸化的損傷の産物である体細胞ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異が蓄積することの産物であることを示唆している。これらのｍｔＤＮＡ有害突然変異は最終的には、ミトコンドリアのエネルギー欠乏を生じ、酸化ストレス、ｍｔＰＴＰの活性化およびシナプス結合の損失を増大させる。体細胞ｍｔＤＮＡ突然変異の確率的性質およびミトコンドリアが神経細胞のエネルギー産生、ＲＯＳ産生およびアポトーシスで担う中心的役割のために、このミトコンドリアの仮説は散発性ＡＤの遺伝子の異常な特徴および病理学的特徴の簡単な説明となる。
【実施例２】
【００５７】
（発症前対象におけるＡＤの診断）
現時点ではＡＤの症状を呈していない３５歳の女性対象２例から、細胞（例えば、血液細胞、皮膚線維芽細胞、尿管上皮細胞、および／または脳脊髄液細胞）の標本を採取する。細胞収集後、各対象からのＤＮＡをミトコンドリアＤＮＡ制御領域増幅に供し、次いで、ＰＮＡ固定化ＰＣＲを用いて低レベルのヘテロプラスミックな４１４および４７７ヌクレオチド突然変異用の直接配列決定によってホモプラスミックな４１４および４７７ヌクレオチド変異が存在するか、増幅されたＤＮＡを試験した。４１４および４７７ヌクレオチド変異がＰＮＡ固定化ＰＣＲによって検出された場合、その突然変異分子をクローニングおよび配列決定して、突然変異の存在を確認する。
【００５８】
最初の対象では、検出された総数は対照よりも有意に多く、このことからこの対象は後年ＡＤの症状を発現しやすいことが示唆される。
第２の対象では、検出された総数は対照よりは有意に多くなく、このことからこの対象は後年ＡＤの症状を発現し難いことが示唆される。
【実施例３】
【００５９】
（ＡＤ治療の効果の決定）
この実施例では、症状および臨床所見に基づいて８５歳の患者をＡＤであると診断した。治療を始める前に、細胞（例えば、血液細胞、皮膚線維芽細胞、尿管上皮細胞、および／または脳脊髄液細胞）の標本を採取、処理し、４１４および４７７ヌクレオチド変異の有無について試験し、次いで実施例２のように、突然変異分子をクローニングおよび配列決定し、Ｔ４１４１Ｇ、Ｔ４１４ＣおよびＴ４７７Ｃ突然変異の総数のベースラインを定量する。Ｔ４１４１Ｇ、Ｔ４１４ＣおよびＴ４７７Ｃ突然変異のこのベースラインの総数を正常な対照データと比較して、ＡＤの診断と一致する予想数を超えるＴ４１４１Ｇ、Ｔ４１４ＣおよびＴ４７７Ｃ突然変異を対象が有していることを確認する。次いで、ＡＤに対する薬物療法を開始した。周期的（例えば、６カ月毎の）追跡細胞標本をベースラインの血液標本と同様に対象から採取、処理、試験およびクローニングし、これにより治療後のＴ４１４１Ｇ、Ｔ４１４ＣおよびＴ４７７Ｃ突然変異の総数を定量する。各追跡の血液標本において決定されたＴ４１４１Ｇ、Ｔ４１４ＣおよびＴ４７７Ｃ突然変異の総数を治療前のベースラインと（および場合によっては、試験した任意の早期の追跡血液標本と）比較して、投与中のＡＤ治療の効果を決定する。治療が続くにつれてＴ４１４１Ｇ、Ｔ４１４ＣおよびＴ４７７Ｃ突然変異の総数が減少することが認められた場合、その治療はその対象には有効であるとみなされる。他方、治療が続くにつれてＴ４１４１Ｇ、Ｔ４１４ＣおよびＴ４７７Ｃ突然変異の総数が一定のままであるか、または増加することが認めら
れた場合、その治療はその患者には効果なしとみなされ、その治療を調整または変更することが適切であるとみなしてよい。
【実施例４】
【００６０】
（ダウン症候群関連認知症の診断）
ダウン症候群と確定診断された２５歳の対象は、現時点で認知症の症状を呈していない。上記実施例２のように、細胞（例えば、血液細胞、皮膚線維芽細胞、尿管上皮細胞、および／または脳脊髄液細胞）の標本を４１４および４７７ヌクレオチド変異の有無について試験し、次いでその突然変異分子をクローニングおよび配列決定した。Ｔ４１４１Ｇ、Ｔ４１４ＣおよびＴ４７７Ｃ突然変異の総数が対照よりも有意に多い場合、その対象はダウン症候群関連老年性認知症を後年発現しやすいと結論付けてよい。他方、Ｔ４１４１Ｇ、Ｔ４１４ＣおよびＴ４７７Ｃ突然変異の総数が正常な対照よりも有意に多くない場合、その対象はダウン症候群関連老年性認知症を後年発現しやすいと結論付けてよい。
【００６１】
ある場合には、本発明に従って細胞標本の収集、処理、試験および／またはクローニングを実施するのに使用されるテスト・キットが提供される。そのようなテスト・キットには正常な基準（例えば、参照標本）および／または試験結果と比較するための対照データを含み得る。そのような対照データは、単一の数字、ルックアップ・テーブル、機械式または電子式計算機の形態で提供されてよくかつ／またはそのような対照データを含むようにかつ／または比較または統計学的計算を行って特定の対象で検出されたｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異が関連する対照群のｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異と有意に異なっていないかどうかを判定するようにコンピュータをプログラムしてもよい。
【００６２】
本明細書において用いられる場合、「患者」および「対象」という用語は、治療的、予防的、実験的または診断的な治療受けている、ヒト患者のほかにその他の動物の患者および対象、あるいは疾患を有するかまたは疾患になりやすい傾向のあるヒトまたは動物を含む。
【００６３】
明快に理解しやすいように詳細に上記発明を記載してきたが、ある種の改変が特許請求の範囲内で実施されてよいことは明白である。本明細書に引用した刊行物および特許文書は全て、あらゆる目的のために各々が非常に個別に示される場合と同程度にその全体を本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ】ＡＤ脳および対照脳のｍｔＤＮＡ  ＣＲ体細胞突然変異分布を示す図。
【図１Ｂ】ＡＤ脳および対照脳のｍｔＤＮＡ  ＣＲ体細胞突然変異分布を示す図。
【図２Ａ】ＡＤ脳および対照脳のＴ４１４Ｇ  ｍｔＤＮＡ突然変異のためのＰＮＡ固定化ＰＣＲアッセイの結果を示す図。
【図２Ｂ】ＡＤ脳および対照脳のＴ４１４Ｇ  ｍｔＤＮＡ突然変異のためのＰＮＡ固定化ＰＣＲアッセイの結果を示す図。
【図２Ｃ】ＡＤ脳および対照脳のＴ４１４Ｇ  ｍｔＤＮＡ突然変異のためのＰＮＡ固定化ＰＣＲアッセイの結果を示す図。
【図２Ｄ】ＡＤ脳および対照脳のＴ４１４Ｇ  ｍｔＤＮＡ突然変異のためのＰＮＡ固定化ＰＣＲアッセイの結果を示す図。
【図２Ｅ】ＡＤ脳および対照脳のＴ４１４Ｇ  ｍｔＤＮＡ突然変異のためのＰＮＡ固定化ＰＣＲアッセイの結果を示す図。
【図３Ａ】ＡＤおよび対照の脳標本からのＣＲクローンをクローニングおよび配列決定して観察されたヘテロプラスミックｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異の総数を示す棒グラフ。
【図３Ｂ】ＡＤおよび対照の脳標本からのＣＲクローンをクローニングおよび配列決定して観察されたヘテロプラスミックｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異の総数を示す棒グラフ。
【図４Ａ】ＡＤ脳および対照脳の特異的体細胞ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異およびそれらのヘテロプラスミーの割合を示すグラフ。
【図４Ｂ】ＡＤ脳および対照脳の特異的ｍｔＤＮＡ  ＣＲ体細胞突然変異およびそれらのヘテロプラスミーの割合を示すグラフ。
【図４Ｃ】ＡＤ脳および対照脳の特異的体細胞ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異およびそれらのヘテロプラスミーの割合を示すグラフ。
【図４Ｄ】ＡＤ脳および対照脳の特異的体細胞ｍｔＤＮＡ  ＣＲ突然変異およびそれらのヘテロプラスミーの割合を示すグラフ。
【図５】ＡＤ、ＤＳ、ＡＤＰＤ、ＰＤおよび対照（正常）対象からの脳のＴ４１４Ｇトランスバージョン変異の発生率を比較したグラフ。
【図６】認知症のＤＳ、ＡＤおよび対照脳におけるｍｔＤＮＡ  ＣＲ体細胞ｍｔＤＮＡ突然変異の頻度を示すグラフ。
【図７】ｍｔＤＮＡ  ＣＲ調節要素における認知症のＤＳ、ＡＤおよび対照群の体細胞ｍｔＤＮＡ突然変異分布を示す表。
【図８】ＤＳ、ＡＤおよび対照脳におけるｍｔＲＮＡレベル（Ｌ鎖／Ｈ鎖）を示すグラフ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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