(57)【要約】本発明は、細胞表面に外来性捕捉部分を有する細胞であって、前記捕捉部分が、ＨＬＡ分子の前記捕捉部分への付着を補助できることを特徴とする細胞に関する。本発明の別の態様は、細胞表面の捕捉部分と、ＨＬＡ分子とを有する細胞であって、前記ＨＬＡ分子が前記捕捉部分を介して前記細胞に結合していることを特徴とする細胞に関する。前記捕捉部分は好ましくは外来性であり、好ましくは異種性であり、好ましくはＣＤ２０である。本発明はまた、前記細胞を用いたアッセイ及び前記細胞にＨＬＡを付着させる方法に関する。
2008522603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面に外来性の捕捉部分を有する細胞であって、前記捕捉部分が、ＨＬＡ分子の捕捉部分への付着を補助できることを特徴とする細胞。
【請求項２】
細胞表面の捕捉部分と、ＨＬＡ分子とを有する細胞であって、前記ＨＬＡ分子が、捕捉部分を介して細胞に付着していることを特徴とする細胞。
【請求項３】
捕捉部分が外来性であることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞。
【請求項４】
捕捉部分が異種性であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の細胞。
【請求項５】
捕捉部分がＣＤ２０であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の細胞。
【請求項６】
細胞が、内因性ＨＬＡを発現しないことを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の細胞。
【請求項７】
細胞が、天然の抗原提示細胞ではないことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の細胞。
【請求項８】
細胞が、ヒト慢性骨髄性白血病細胞であるか、又はヒト慢性骨髄性白血病細胞由来であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の細胞。
【請求項９】
細胞が、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２であるか、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２由来であることを特徴とする請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか記載の細胞を含む複合体。
【請求項１１】
ＨＬＡ分子又はその断片を標的細胞に付着させる方法であって、標的細胞の表面に捕捉部分を供給するステップと、前記捕捉部分への付着に適したＨＬＡを有する複合体を前記細胞とともにインキュベートするステップとを含む方法。
【請求項１２】
捕捉部分がＣＤ２０であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか記載の細胞と細胞傷害性Ｔリンパ球とを接触させるステップを含むことを特徴とするエリスポットアッセイの方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか記載の細胞と細胞傷害性Ｔリンパ球とを接触させるステップを含むことを特徴とするＴ細胞機能アッセイの方法。
【請求項１５】
請求項１３又は１４記載のアッセイにおける請求項１０記載の複合体の使用。
【請求項１６】
ＨＬＡ分子又はその断片を標的細胞に付着させる方法であって、（ｉ）捕捉部分に選択的に結合できる付着手段と前記細胞とを接触させるステップ及び、（ii）前記付着手段への結合に適したＨＬＡを含む複合体と前記細胞とを接触させるステップを含む方法。
【請求項１７】
捕捉部分がＣＤ２０を含み、付着手段がＢ９Ｅ９一本鎖抗体−ストレプトアビジン融合タンパク質を含み、かつ複合体がビオチン化ＨＬＡ−クラスＩを含むことを特徴とする請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロ診断系及びかかる系の使用に関する。具体的には本発明は、ＨＬＡ−ペプチド結合体（HLA-peptide combinations）を含む複合体、かかる複合体の細胞への結合、及びＨＬＡが制御された細胞自体に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術のエリスポット（Elispot）アッセイでは、抗原提示細胞で任意の抗原を処理し、それをＴ細胞に提示してＴ細胞の活性化及びサイトカインの放出を誘導する必要があるという問題がある。紛らわしいアロ反応性応答（alloreactiveresponse）を刺激しないよう、これらの抗原提示細胞は、すべてのＨＬＡアレル（HLA alleles）に適合していなければならない。しかし、集団の中に見られる多数の全てのＨＬＡの組合せに対応する、十分な種類のクローン抗原提示細胞を得るのは明らかに困難である。
【０００３】
別の先行技術では、人工細胞又は遺伝子組換え細胞（engineered cells）を抗原提示細胞として用いている。この例として、Britten らの研究が挙げられる。Brittenらは、天然にはＨＬＡクラスＩもクラスIIも発現しないヒトＣＭＬ白血病細胞株Ｋ５６２細胞を採取し、この細胞株に単一のＨＬＡクラスＩアレルＨＬＡ−Ａ２をトランスフェクションすることにより、他のＨＬＡクラスＩ又はII分子を発現せず、このアレルのみを発現するＫ５６２／Ａ２０１細胞を作製した。その後かかる細胞株に、ＨＬＡ−Ａ２特異的な結合性ペプチドをロードすることができる。これにより、前記アレル（ＨＬＡ−Ａ２）及び選択したペプチドに特異的なＴ細胞のみと相互作用する抗原提示細胞が作製される。
【０００４】
上記執筆者らは、Ｋ５６２／Ａ２０１細胞を用いてエリスポットアッセイを行ったところ、活性は一般的に用いられるＴ２細胞と同様であったが、バックグラウンドのレベルが低かったと報告した。
【０００５】
当分野の技術水準では研究者は、異なる単一のＨＬＡクラスＩ又はII遺伝子を各々トランスフェクションしたＫ５６２細胞株パネルを維持する必要がある。しかしこれにより、患者のＨＬＡ型集団に対応するために、異なる細胞株を多数作製し、その後培地にて培養し続けなくてはならないというロジスティックな問題が生じる。さらに、多数の細胞株を培養し続けるため、相違する細胞株間の交差汚染もロジスティック面の重大な問題である。
【０００６】
上記先行技術は、指定のウイルス又はガンのエピトープに反応性のあるＴ細胞の機能活性を示すアッセイについて記載している。Ｔ細胞機能アッセイは、研究者にとっては長らく悩みの種であった。これらのアッセイは、ＨＬＡクラスＩ（又はII）アレル及び適切なウイルスペプチド、ガンペプチド、又は自己免疫ペプチド（autoimmune peptide）を有する標的細胞とＴ細胞との相互作用に基づく。Ｔ細胞のＴ細胞受容体と標的細胞上のＨＬＡ／ペプチド複合体との相互作用の結果、Ｔ細胞は、主に標的細胞の膜を破壊する有毒酵素を放出することにより、標的細胞を溶解する。例えば放射性標識クロムを含む細胞内容物の放出により（５１Ｃｒ放出アッセイ）、又は溶解細胞からのＬＤＨ又はその他の酵素の放出に基づく酵素アッセイ等により、標的細胞の死、ひいてはＴ細胞の活性を評価することができる。
【０００７】
これらのアッセイに伴う主な問題の一つは標的細胞にある。標的細胞には、患者自身のウイルス感染細胞又はガン細胞を用いるのが理想的である。なぜならこれらの細胞は、ＨＬＡ組織の型が完全に一致し、また適切なウイルスペプチド又はガンペプチドを発現するからである。しかし、治療中の患者の腫瘍細胞が入手できるのは稀であり、培養が困難であることが多い。したがって、患者自身の腫瘍細胞を日常的に用いることは非現実的である。別法としては、エプスタイン・バー・ウイルス（Epstein-Barr virus）で不死化した患者自身のＢ細胞を用い、適切なウイルス／ガンペプチドをペプチドパルスしたＢ細胞を標的細胞として使用する。
【０００８】
研究によっては、これらの細胞は有用な場合があるが、各々の患者について別個の細胞株を培養する必要があるため、正確性又は大規模な使用をするには制限がある。このような使用は煩雑であり、多数の個人由来の細胞株を樹立することはできない。また標的細胞中のＥＢＶの存在は潜在的に、全ての検査において不正確性をもたらし、ＥＢＶ特異的活性を測定しながら検査することは大変難しい。
【０００９】
これらの問題を克服するために、他の手法が試されてきた。これらの手法としては例えば、ＨＬＡクラスＩ陰性細胞に個々のＨＬＡクラスＩアレルを導入して特定の標的を作製することが挙げられる。この方法は特定のＨＬＡの型には有用な場合があるが、一般的な方法にはなっていない。多くの細胞株の培養維持及び別の細胞株との交差汚染の可能性という点で、この方法にはロジスティック面で重大な問題があるというのがその理由である。
【００１０】
ＷＯ９９／６４４６４は治療とＣＴＬ応答の生成とに重点をおき、自己Ｂ細胞との関連からクラスＩ ＨＬＡについて記載している。
【００１１】
本発明は、上記先行技術に伴う問題点の解決を目指すものである。
【特許文献１】ＷＯ９９／６４４６４
【発明の開示】
【００１２】
本発明により、特性が明確であり、ユーザーが選択する任意の個々のＨＬＡ型及び所望のペプチドの提示に用いることができる単一の細胞株が入手可能となり、本明細書に記載の重要かつ有用な利益及びコスト削減につながる。
【００１３】
先行技術のＣＴＬ活性アッセイでは、アッセイ系における組織の型の不適合及びＨＬＡ型の不調和が障害となってきた。先行技術では、これらの不一致を排除するために、ＨＬＡの適合を強く試みている。本発明は、ＨＬＡ中性検査細胞（HLA neutral test cells）の設計に基づくものである。先行技術のＨＬＡ適合技術とは対照的に、本発明は、細胞の構築及びこれらの細胞に複合体を付着させることに焦点をあてており、かかる複合体は、ユーザーが系への導入を意図するＨＬＡ型のみを有する。このように本発明は、任意のＨＬＡ背景由来ＣＴＬの応答（CTL’s）のアッセイに対応する、単一のアッセイ系を有利に提供するものである。本検査系自体は内因性ＨＬＡをもたらすものではないが、ＨＬＡの不一致から生じる矛盾した、又は紛らわしい結果及び不一致に関係する死又は攻撃（killing or attack）が、本発明の系において有利に低減又は排除される。したがって本発明は、細胞の表面に単一のＨＬＡ型の分子を有するように設計された細胞株、及びかかる細胞株を伴うＥＬＩＳＡ及び機能アッセイの構成（format）に関する。
【００１４】
本発明は、患者由来の試料におけるＣＴＬ応答のアッセイ、及びＣＴＬ応答を起こすためのインビトロベースの技術の評価において、具体的に用いられる。
【００１５】
したがって、本発明の一態様は、その細胞表面に外来性の捕捉部分（capture moiety）を有する細胞であって、かかる捕捉部分が、ＨＬＡ分子の捕捉部分への付着を補助することができる細胞に関する。
【００１６】
本発明の別の態様は、その細胞表面の捕捉部分と、ＨＬＡ分子とを有する細胞であって、前記ＨＬＡ分子が、前記捕捉部分を介して細胞に付着している細胞に関する。本態様において、前記捕捉部分が内因性である場合、捕捉部分を発現させるために細胞を操作する必要がなく有利である。そのような細胞の例としては、ＣＤ２０捕捉部分を内因的に発現するＤａｕｄｉ Ｂ細胞リンパ腫細胞があり、本発明によれば、前記捕捉部分にＨＬＡ分子を付着させることができる。
【００１７】
本発明の別の態様は、前記捕捉部分が外来性である上記の細胞に関する。本発明の別の態様は、前記捕捉部分が異種性（heterologous）である上記の細胞に関する。本発明の別の態様は、前記捕捉部分がＣＤ２０である上記の細胞に関する。本発明の別の態様は、内因性ＨＬＡを発現しない上記の細胞に関する。本発明の別の態様は、天然の抗原提示細胞ではない上記の細胞に関する。本発明の別の態様は、ヒト慢性骨髄性白血病細胞由来である上記の細胞に関する。本発明の別の態様は、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２由来である上記の細胞に関する。本発明の別の態様は、上記の細胞を含む複合体に関する。
【００１８】
本発明の別の態様は、ＨＬＡ分子又はその断片を標的細胞に付着させる方法であって、標的細胞の表面に捕捉部分を供給するステップと、前記捕捉部分への付着に適したＨＬＡを有する複合体とともに前記細胞を培養するステップとを含む方法に関する。前記捕捉部分は、好ましくはＣＤ２０である。本発明の別の態様は、上記の細胞と細胞傷害性Ｔリンパ球とを接触させるステップを含むエリスポットアッセイ法に関する。本発明の別の態様は、上記細胞と細胞傷害性Ｔリンパ球とを接触させるＴ細胞機能アッセイに関する。本発明の別の態様は、上記のアッセイにおける、上記の複合体の使用に関する。
【００１９】
本発明の別の態様は、ＨＬＡ分子又はその断片を標的細胞に付着させる方法であって（ｉ）捕捉部分に選択的に結合できる付着手段と前記細胞とを接触させるステップ及び、（ii）前記付着手段への結合に適したＨＬＡを含む複合体と前記細胞とを接触させるステップを含む方法を提供する。本発明の別の態様は、捕捉部分がＣＤ２０を含み、付着手段がＢ９Ｅ９一本鎖抗体−ストレプトアビジン融合タンパク質を含み、かつ複合体がビオチン化ＨＬＡクラスＩを含む、上記方法を提供する。
【００２０】
したがって本発明は全体として、アッセイ用の細胞を作製するための新しい系、及び前記細胞を用いたアッセイを提供するものと理解される。具体的には本発明は、ＨＬＡを細胞に付着させるための二段階の系であって、捕捉部分を認識できる抗体又はその断片を好ましくは含む付着手段と細胞とを接触させる第１のステップと、次に前記付着手段との会合能を有するように適合させたＨＬＡと前記細胞とを接触させるステップとを含む方法に関する。付着手段とＨＬＡとは、会合を容易にするため、二部結合系のうちの一つの部分を各々有することが好ましい。この目的を達成するため、好適な実施形態において、付着手段はストレプトアビジンを含み、ＨＬＡはビオチンを含む。例えば捕捉部分がＣＤ２０であり細胞が好ましくはＤａｕｄｉ細胞である場合、前記細胞は前記捕捉部分を内因的に発現する。別の実施形態において、細胞は捕捉部分を内因的に発現せず、捕捉部分は本発明により、ＣＤ２０の導入遺伝子発現等の導入遺伝子発現によって提供される。
【００２１】
したがって、本発明は多数の異なるクラスＩ ＨＬＡ及び／又はクラスII ＨＬＡ（例えば３０〜４０種類の異なるＨＬＡ）の付着を、一つの細胞（の型）で補助できる系を有利に提供し、前記ＨＬＡには（現在、医学的関心の対象となっている何百ものペプチドを含む）任意の所望のペプチドを結合させ得るものと理解される。したがって単一の細胞型と安定にストックされた組換えＨＬＡ及び結合手段とを用いて、臨床的に関連性のあるほとんど全てのＨＬＡを試験することができ、また、ＨＬＡを付着させる前にかかるＨＬＡに所望のペプチドを会合させることができ、有利である。それにより先行技術のアッセイ系と比較して、系が大幅に単純化される。
【００２２】
［有利な特徴］
先行技術は単純化を目指しているが、対照的に本発明の系は、特に細胞表面に捕捉部分を備えるという点で複雑である。これは一見、先行技術の教示とは矛盾する。なぜなら、外来性捕捉部分の用意には、オペレータに相当な追加作業の負担がかかり、先行技術では通常、細胞上に既に存在する細胞表面タンパク質を結合に用いている。しかし、本発明の重要な利点の一つは、外来性捕捉部分を備えることにより、先行技術のアッセイの障害であるＨＬＡの不一致を有利に緩和できることである。さらに言えば、本発明の好適な実施形態において、アッセイ系、特にアッセイ系の細胞上に存在するＨＬＡ型は、オペレータが用意したＨＬＡ型のみであり、これが本発明の重要な利点である。
【００２３】
本発明の別の利点は、当技術分野における問題点を認識することにある。先行技術には、抗原の提示及びこれを達成するために実際に役立つ系の選択について数多くの教示がある。しかし、抗原の提示においてＨＬＡの不一致という問題は重要性が低い。なぜなら抗原提示の分野の主要な目的は、その抗原に対する応答を刺激することだからである。しかし、これらの応答の測定に関して言えば、ＨＬＡが制御された抗原提示系を提供するという点で、本発明は大きな利点を有する。この系により、上記の検査系に存在する抗原又は別のＨＬＡ分子による貢献（contribution）に関連する問題の多く又はすべてを軽減させることができる。したがって本発明ではＣＴＬ応答アッセイ時、先行技術の系に比較して、制御の程度をより大きくすることができ、混合の影響（confounding influences）の除外の程度をより大きくすることができ有利である。
【００２４】
本発明の主要なもう一つの利点は、系が共通に（universal）適用可能なことである。先行技術の系では、個々のＨＬＡ型の由来源（source）に対するＣＴＬ応答を測定するために、ＨＬＡが一致した個々の細胞株が要求される。本発明による系は、ＨＬＡが中性又はＨＬＡが制御された系であり、有利である。したがって、本アッセイ系ではＨＬＡ型はオペレータによって指定、制御されているので、任意のＨＬＡ型を有する個人由来のＣＴＬの測定に、同一の基本系を用いることができ、有利である。したがって本発明を用いることにより、様々なＨＬＡ適合細胞株を数多く維持するコスト及び負担が有利に回避され、大きな節約となる。さらに、本アッセイ系の共通コアによって結果の再現性が高まり、かつ、より優れた相互比較ができるようになり、多様な幅の対象由来のＣＴＬのアッセイに用いることができることは、本発明のもう一つの利点である。
【００２５】
先行技術は患者自身のＢ細胞等の、ＨＬＡを有するＢ細胞に焦点をあてている。本発明の利点は、ＨＬＡを有さない（例えばＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスIIを有さない、好ましくはＨＬＡを全く有さない、即ちクラスＩもクラスIIも有さない）Ｂ細胞を用いて、細胞表面に所望のＨＬＡのみを有する、最適なアッセイ用の細胞を作製することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
［捕捉部分］
本明細書において「捕捉部分」なる用語は、ＨＬＡ分子が結合する細胞表面上の分子を意味し、かかる結合には、好ましくは付着手段等の仲介物が介在している。前記捕捉部分は、抗体が結合できる細胞表面分子であれば、どのようなものでもよく、例えば任意の細胞表面抗原（ＣＳＡ）でもよい。前記捕捉分子は好ましくはＢ細胞マーカーであり、好ましくはＣＤ１９又はＣＤ２０であり、好ましくはＣＤ２０である。
【００２７】
捕捉部分は細胞表面上で安定であることが好ましい。「安定」とは、アッセイを妨げるような速さで再循環（recycle）／脱落(shed)／内部移行(internalise)しないという意味である。言い換えれば「安定」とは、前記捕捉部分が、アッセイを完了できるだけの一定時間、細胞表面上にとどまるという意味である。安定とは、好ましくは捕捉部分が少なくとも８時間、例えばＨＬＡの付着から８時間後までとどまるという意味である。前記捕捉部分は、付着から好ましくは少なくとも３日間、好ましくは４日間とどまる。好適な安定な捕捉部分はＣＤ２０である。
【００２８】
いくつかの態様において、捕捉部分は内因性（endogenous）であることが有利である。それにより、捕捉部分を発現させるために細胞を操作する必要がなくなる。本発明の本態様に適した細胞の例は、Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞リンパ腫細胞である。本発明によれば前記細胞はＣＤ２０捕捉部分を内因的に発現し、かかる捕捉部分には、ＨＬＡ分子を付着させることができる。
【００２９】
捕捉部分は好ましくは、その細胞上に天然には発生しない分子である。前記捕捉部分は好ましくは異種性（heterologous）であり、より好ましくは外来性(exogenous)である。前記捕捉部分は最も好ましくは、導入遺伝子の発現による。導入遺伝子の発現は、例えば導入遺伝子のトランスフェクションによる一過性のものでもよく、又は例えば安定にトランスフェクションされた細胞株を介した安定的なものでもよい。好ましくは、前記トランスフェクションは安定なトランスフェクションであり、好ましくは前記導入遺伝子は、細胞の遺伝物質中に安定的に組み込まれる。
【００３０】
捕捉部分は、細胞に付加される場合又は細胞に発現させる場合があるが、好ましくは細胞に発現させる。細胞に発現させる場合には捕捉部分は、前記細胞の遺伝物質中の、天然にはサイレントな遺伝子から発現してもよく、又は外来の核酸により発現してもよい。前記核酸は、トランスフェクション等の任意の適切な方法で細胞に導入することができる。トランスフェクションは一過性であっても安定であってもよいが、好ましくは安定である。
【００３１】
捕捉部分は、出発細胞型において天然には発現されないことが好ましい。したがって前記捕捉部分は、遺伝子発現を操作して所望の遺伝子を活性化させることにより供給される。捕捉部分は好ましくは外来性である。外来性なる用語はその通常の意味を有し、即ち生物又は細胞の外部の由来源から生じるものである。この場合でも、依然として捕捉部分を細胞内で、即ち外来性核酸の発現によって作製できることは明らかである。前記捕捉部分は、好ましくは出発細胞の遺伝物質中に天然に見られる核酸にコードされず、そのゲノム中に存在しないことが好ましく、由来となった生物のゲノム中に存在しないことが好ましい。したがって、捕捉部分は好ましくは異種性である。前記捕捉部分は導入遺伝子の発現によって供給されることが好ましい。この導入遺伝子は、細胞にトランスフェクションされることが好ましく、前記細胞に安定にトランスフェクションされることが好ましい。
【００３２】
本発明による好適な捕捉部分の例として、細胞表面抗原、細胞決定分子、又は細胞表面に存在するその他の物質（other cell surface borne entities）が挙げられる。前記捕捉部分は、好ましくはＣＤ２０又はＣＤ１９であり、好ましくはＣＤ２０である。
【００３３】
［付着手段］
付着手段は、捕捉部分と選択的に結合する分子である。付着手段の一部分はＨＬＡ−ペプチド複合体と会合し、前記付着手段の他の部分は捕捉部分と選択的に結合する。前記付着手段は、捕捉部分との結合能を有し、さらにＨＬＡ−ペプチド複合体との会合能を有する適切な分子であれば、どのようなものでもよい。ＨＬＡ−ペプチド複合体との会合は、好ましくは化学結合により、好ましくは水素結合により、より好ましくは共有結合による。
【００３４】
付着手段の例としては、捕捉部分に対する抗体若しくは抗体の断片、又はその融合物、或いはｓｆｖＳＡが挙げられる。前記付着手段には、好ましくはＣＤ２０に対するｓｆｖＳＡが含まれる。前記付着手段には、好ましくは、Ｂ９Ｅ９一本鎖抗体／ストレプトアビジン融合タンパク質（ｓｆｖＳＡ）が含まれる。
【００３５】
極めて好適な実施形態においては、付着手段及びＨＬＡ分子は、共有結合した単一分子の一部である場合がある。この単一の共有結合分子は、より好ましくは認識ペプチド（標的ペプチド）をさらに含む。
【００３６】
［ＨＬＡ／ペプチド複合体］
（ＨＬＡクラスＩ又はクラスII分子等の）ＨＬＡ分子又はその断片に、ペプチドを結合させることができる。かかるペプチドをＨＬＡ分子又はその断片が提示し、Ｔ細胞が認識するように設計する。前記ペプチドは、Garboczi (PNAS 89, 1992, 3429-3433)に記載の方法に従って、ＨＬＡ分子又はその断片に付着させることができる。
【００３７】
付着手段は、標的細胞の表面の捕捉部分に対し、特異的親和性の高い結合ポリペプチド（linking polypeptide）を含むことが好ましい。前記捕捉部分は、細胞表面分子等のどのような分子でもよいが、ポリペプチドをベースとした分子であることが好ましい。前記捕捉部分は、ガン胎児性抗原、胎盤アルカリフォスファターゼ、多型上皮性ムチン（polymorphic epithelial mucin）、ヒト絨毛ゴナドトロピン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、前立腺特異的抗原、ｃａ−１２５、ＨＭＷ−ＭＡＡ等でもよく、好ましくはＣＤ２０である。
【００３８】
前記結合ポリペプチドは、好ましくは前記捕捉部分と反応／結合できる抗体、好ましくはモノクローナル抗体を有している（Riethmuller and Johnson, Curr. Opin. Immunol. 4, 1992, 647-655）。この用途に適切な抗体としては、Ｃ４６、８５Ａ１２、Ｈ１７Ｅ２、ＨＭＦＧＩ、Ｗ１４、１Ｆ５、２２５．２８ｓ（Buraggi 1985 Cancer Res. 45. 3378-3387）等が挙げられる。これらの抗体を産生する不死化ハイブリッドが、American Type Culture Collection, Rockville MD, USAに寄託されている。さらなる抗体の例は、Maloney et al. (Blood 84, 1994, 2457-2466), Riethmuileret al (Lancet 343, 1994, 1177-1183) 及びHird et al. (Br. J. Cancer 68, 1993, 403-406) に記載されている。
【００３９】
前記結合ポリペプチドは、捕捉部分に対する抗体及び、ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片と前記抗体とをカップリングさせるカップリング系を含んでいてもよい。かかるカップリング系は、性質が特定された（well-characterised）一組の小分子からなる２−ステップ又は３−ステップの結合部位（chain）を含み、かかる結合部位は抗体及びＨＬＡクラスＩ分子に結合して、抗体とＨＬＡクラスＩ分子との間に安定な架橋を形成する。これに関連して用いられる可能性のある一組の小分子の例としては、（以下に限定されないが）ビオチン及びアビジン／ストレプトアビジン（Moro, 1997 Cancer Res. 57, 1922-1928; Altman et al, Science 274, 1996, 9496）、並びにカルモジュリン及びカルモジュリン結合ペプチド（Neri, 1996, J. Invest. Dermatol. 107, 164-170）が挙げられる。あるいは前記結合ペプチドは、捕捉部分に対する抗体を含んでいてもよく、かかる抗体は、ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片に直接付着するように用いられる。
【００４０】
本発明において可能なさらなる実施形態では、前記複合体は組換えタンパク質を有していてもよく、かかる組換えタンパク質は、前記ＨＬＡ分子又はその断片含む部分及び前記付着手段を含む部分を有する。ＨＬＡ分子又はその断片は、血漿若しくは血小板から精製するか、又は組換え技術によって作製することができる。さらに前記ＨＬＡ分子又はその断片は、ウイルス性ペプチド、細菌性ペプチド、寄生虫ペプチド、又はガン特異的なペプチド等の選択した特定のペプチドとの結合により、このペプチドを提示してＴ細胞に認識されるように、さらに設計（arrange）することができる。ＨＬＡ分子又はその断片の捕捉部分への付着は、かかるＨＬＡ分子又はその断片及び前記付着手段を標的細胞の捕捉部分の付近に導入することにより達成できる。前記標的細胞はインビトロ培養細胞でもよいが、患者の身体由来であることが有利である。前記標的細胞は、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞と接触するように設計することが好ましい。前記細胞傷害性Ｔ細胞が、ＨＬＡ分子又はその断片に結合したペプチドによってかかるＨＬＡ分子又はその断片を認識するような構成の場合、これにより本発明のエリスポットアッセイ及び機能アッセイの検出系（read-out）がもたらされる。
【００４１】
本発明に用いられるＨＬＡ／ペプチド複合体は、免疫学的対象となるＨＬＡ／ペプチド複合体であればどのようなものでもよい。ＨＬＡは、好ましくはクラスＩ又はクラスII ＨＬＡであり、好ましくはクラスＩ ＨＬＡである。クラスＩ ＨＬＡの場合、かかるＨＬＡには好ましくはＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３又はＨＬＡ−Ｂ７のうち、１又は２以上が含まれる。好適な実施形態において、前記ＨＬＡはＨＬＡ−Ａ２である。ＨＬＡ／ペプチド複合体の具体例として、これらに限定されないが、ＨＬＡクラスＩ／テロメラーゼ（全ての癌(pan tumor)）、ＨＬＡ−Ａ２／ｍｅｌａｎ Ａ（メラノーマ）、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１（白血病）、又はその他の任意の所望のペプチドが挙げられる。
【００４２】
［付着］
付着手段は、捕捉部分及びＨＬＡ／ペプチド複合体に、選択的に結合することができる。前記複合体は好ましくは、捕捉部分に対し選択的に結合できる分子を含む付着手段によって細胞に付着する。前記付着手段は好ましくは、ＣＤ２０又はＣＤ１９に対するｓｆｖＳＡを含む。前記付着手段は、Ｂ９Ｅ９部分等の、ＣＤ２０に対するｓｆｖＳＡを含むことが好ましい。
【００４３】
［ＨＬＡ］
ＨＬＡ分子の選択はオペレータの事項である。ＨＬＡ分子及びそれらの配列は、当技術分野では周知である。本発明がクラスＩ及び／若しくはクラスII ＨＬＡ又はそれらの組合せの使用も包含することは、特に留意されるべきである。オペレータの選択により、系におけるＨＬＡ型が完全に支配でき、由来となった物質又はその他の要因による制約を受けないことは、本発明の利点である。
【００４４】
本発明のさらなる利点は、複数のトランスフェクションを必要としないことである。先行技術では、要求される各々のＨＬＡ型すべてについて、個別のトランスフェクションを実施することが要求される。一方本発明は、外から複合体を加えて、かかる複合体と細胞とを接触させるだけで、任意のＨＬＡ型を付着させることができる単一の細胞株を提供し、有利である。このようにすれば細胞株は常に一定（constant）であるため、複合体を予め調製しておき、単にアッセイ時に加えればよいので、再現性が高まる。本発明によれば、トランスフェクション及び検証プロセス全体を省略することができ、有利である。さらにこれにより、長時間のトランスフェクションのステップが必要なくなり、調製時間及び試料の処理時間が大幅に短縮される。
【００４５】
ＨＬＡの細胞への付着は、抗体又は抗体断片を含む系を介することが好ましい。ＨＬＡは、（ＣＤ２０をトランスフェクションしたＫ５６２等の）ＨＬＡクラスＩ及びクラスII陰性細胞株に付着させることが好ましい。その後これらの細胞を、好ましくは機能アッセイにおいて単一特異的（mono-specific）なＣＴＬの標的として用いるか、又はエリスポットにおいて、以下に記載するように、細胞を提示する単一特異的抗原として用いる。本発明は診断における用途を見い出すものであり、好適な実施形態において、本発明は組換え（engineered）Ｋ５６２細胞に関する。
【００４６】
［細胞］
基礎細胞又は出発細胞、即ちＨＬＡを付着する前の細胞は、以下より選択される１又は２以上の特徴を有することが好ましい：
１．ＨＬＡクラスＩ陰性
２．ＨＬＡクラスII陰性
３．ＥＢＶ陰性
細胞は、上記３つの特徴のうち２以上を有することが好ましく、上記３つの特徴全てを有することが好ましい。
【００４７】
本発明の好適な態様において、次に、組換えＨＬＡクラスＩ又はII複合体を付着させるための適切な捕捉部分を出発細胞に供給することにより、ＨＬＡ付着用の細胞を調製する。
【００４８】
出発細胞は好ましくはＫ５６２細胞である。これらの細胞はＨＬＡクラスＩ分子もＨＬＡクラスII分子も発現せず、ＥＢＶウイルスも有さないヒト骨髄性白血病細胞株である。捕捉部分は好ましくは遺伝子、好ましくはヒトＣＤ２０を安定的に前記細胞にトランスフェクションすることにより供給する。
【００４９】
いくつかの実施形態において前記細胞は、捕捉部分、好ましくはＣＤ２０を内因的に発現するという特徴をさらに有することが好ましい。この実施形態の利点は、トランスフェクション又は類似の手法により捕捉部分を供給するために費やされたであろう労力を省き、かかる処理に関連して細胞が受ける影響を回避することである。本実施形態における好適な細胞は、クラスII ＨＬＡを発現しＥＢＶに感染しているが、クラスＩ ＨＬＡ陰性であり捕捉部分ＣＤ２０を内因的に発現する有利なＤａｕｄｉ細胞である。
【００５０】
［その他の成分］
このようにして（必要に応じて）本発明の細胞を調製したら、その他の成分を選択に応じて付着させる。ストレプトアビジンを細胞表面上のＣＤ２０（例えば上記Ｋ５６２−ＣＤ２０細胞）に付着させるには、Ｂ９Ｅ９一本鎖抗体−ストレプトアビジン融合タンパク質（ｓｆｖ−ＳＡ）に基づく系などの抗体送達系を用いることが好ましい。ビオチン化された組換えＨＬＡクラスＩ又はＨＬＡクラスII複合体は、これらの細胞に安定に付着させることができ、有利である。好ましくはビオチン−ストレプトアビジン系を用いる。
【００５１】
組換えＨＬＡ分子のクラス及びアレル並びにペプチドの選択により、細胞が機能的独自性を得、選択したＴ細胞のみと相互作用できることは本発明の利点である。
【００５２】
［単一特異的ＨＬＡ被覆細胞］
本発明は、インビトロのエリスポットアッセイ及び／又はＴ細胞機能アッセイの改良方法を提供する。
【００５３】
多くの疾患、特にガン及びＨＩＶの患者において、内因性のＴ細胞応答及び患者がワクチン治療を受けたことにより生じるＴ細胞応答を正確に監視し、数値化（enumeration）することは、益々重要な分野となっている。しかし、これらのアッセイ手法は相対的に感受性が低く、再現性が制限され、患者集団におけるＨＬＡ型の範囲が広いことを考慮すると煩雑になり得る。本分野において、これらのアッセイの感受性を向上させ、再現性を高め、ＨＬＡ型の異なる患者に対して別々の標的細胞株を使用する必要がない手法が要求されている。本発明は、インビトロＴ細胞試験の精度と価値という点で、先行技術に比べ大きな前進となる。好適な実施例において、本アッセイは以下のように実施される。
【００５４】
［１.エリスポット］
本アッセイは、抗原への曝露に対する応答としての、サイトカイン、特にインターフェロンガンマ及びグランザイムＢの産生を調べるものである。目的のサイトカインに対する抗体で被膜したウェルで、Ｔ細胞及び抗原提示細胞を共に培養する。細胞をインキュベートした後、培養液を洗い流し、その後さらなる特異的抗体の結合と酵素アッセイ法に基づく検出系とを組み合わせ、分泌されたサイトカイン／グランザイムの存在を検出する。
【００５５】
好適なペプチドは、ウイルス性（ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザ）ペプチド又はガン（Ｍｅｌａｎ−Ａ）ペプチドである。特定の抗原特異的なＴ細胞の数は、プレートの底のスポットの数を検出することにより評価する。これらの細胞は、他のＨＬＡ分子を有さないことが有利である。他のＨＬＡ分子は、非特異的なＴ細胞の活性化を引き起こし、そのためエリスポットアッセイにとって不適切なスポットを生じさせる可能性がある。
【００５６】
上記のエリスポットアッセイの場合と同様、本発明により、相違する所望のＨＬＡ型及びペプチドの各々を、研究者の選択により個々に提示するのに用いることができる、明確な特性（defined characteristics）を有する単一の細胞株が入手可能となり、重要かつ有用な利益及び費用の削減につながる。
【００５７】
［ＨＬＡ単一特異的抗原提示細胞又は標的細胞］
本発明の一目的は、アッセイの精度を向上させることである。本発明は、ＨＬＡ単一特異的細胞に付着手段を組み合わせて、組換えＨＬＡ複合体に対して用いる新しい手法を提供する。これによりエリスポット分析用の抗原提示細胞、及び／又は機能アッセイ用の標的細胞としてのこれらの細胞の用途が見い出される。
【００５８】
［本発明の系のさらなる利点］
ＨＬＡ単一特異的ＡＰＣ／標的は、任意に選択されたＨＬＡクラスＩ又はIIのアレルと任意に選択されたペプチドとの組合せに対して再現性のあるものを、簡単に速く作製することができる。ユーザーが検査を望む細胞のＨＬＡ型にかかわらず、培養の維持が必要な細胞株は一つである。かかる細胞株（複数可）は、いつ、どこで用いるか、かつどのようなＨＬＡ／ペプチド複合体を選択して共に用いるかにかかわらず、同じベースライン特性を有する。
【００５９】
前記ＨＬＡ単一特異的細胞の表面には他のＨＬＡ複合体が何ら存在しないため、先行技術の系でこれらのアッセイの有効性を制限する場合がある非特異的シグナルを低減させることができる。本発明の細胞は、エリスポットアッセイ／機能アッセイに伴う複雑さを緩和し、データの品質を高め、簡単、迅速に、かつ高い信頼性を持って用いられる。
【００６０】
［エリスポットアッセイ及びＴ細胞機能アッセイの手法］
1/エリスポット
Ｔ細胞が認識する(T-cell defined)ウイルス性抗原及びガン抗原の文献記載数の増加に伴い、慢性ウイルス性感染症又はガン患者の治療用に設計された抗原特異的ワクチン接種試験の件数が急速に増加している。しかし、これらの抗原が記載され同定されているにもかかわらず、患者の体内におけるこれらの抗原の免疫原性、及び最適なワクチン接種方法についての情報は、相対的にほとんどない。
【００６１】
あらゆる有効なワクチン系の最も重要な要件の一つは、免疫化の過程で生じるあらゆるＴ細胞応答の量と性質とを測定する性能であり、これが本発明の中核を成す。Ｔ細胞の機能と数とを測定するために最もよく用いられる手法の一つはエリスポットアッセイである。このアッセイでは、抗原と接触することによるＴ細胞の急速なサイトカイン分泌を、単一のＴ細胞ベースで直接定量化することができる。ＩＦＮ−ガンマエリスポットアッセイ及びより最近ではグランザイムＢアッセイが、感受性が強く実用的であるため、免疫療法試験の過程において、患者の体内の抗原特異的Ｔ細胞免疫応答の監視に広く用いられている。本発明は、これらの両方のアッセイの実施形態において、等しく用いられる。
【００６２】
現在のところ、エリスポットによる頻度解析（frequency analysis）については、プロトコルがほとんど標準化されていない。研究所によって、非分画ＰＢＭＣが用いられたり、確定数の抗原提示細胞を播種した精製Ｔ細胞の亜集団(sub-population)が好んで用いられたりしている。
【００６３】
ワクチン接種の過程における何回かの時点で採取される各々の血液試料では、全ＰＢＭＣにおける抗原特異的Ｔリンパ球及びＡＰＣの絶対値が異なる場合がある。さらに、異なる時点で産生される自己ＡＰＣでは、ＨＬＡ、共刺激分子及び付着分子の発現も相違する可能性があり、これにより、頻度分析による別々の個人の抗原特異的Ｔリンパ球の比較が妨げられる。これにより、一人の患者から得た様々な非分画ＰＢＭＣ試料から得られた結果の比較も制限される可能性がある。この考えを裏付けるものとして、欧州の４つの研究所間で行われた複数施設比較研究（multi-centre comparative study）では、非分画ＰＢＭＣよりも、精製されたＣＤ８ｑＴ細胞を用いた時のほうが、ＩＦＮ−ガンマエリスポットアッセイの感受性が優れていることが示唆された（Scheibenbogen et al., 2000）。
【００６４】
本発明の細胞は、好ましくはScheibenbogen, C., Romeo, P., Rivoltini, L., Herr, W., Schmittel, A., Cerottini, J., Wolfel, T., Eggermont, A.M., Keilholz, U., (2000) “Quantitation of antigen-reactive T cells in peripheral blood by IFN-gamma-elispotassay and chromium-released assay: a four-centre comparative trial.” J. Immunol. Methods 244, 81に基づくアッセイで用いられ、かかるアッセイは参照により本明細書に援用される。
【００６５】
しかし、精製されたＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞亜集団のエリスポットアッセイでは、アッセイにおけるＴ細胞の刺激に、外来性の抗原提示細胞を用いることが要求される。これらは自己（即ち患者自身の）ＡＰＣでも、ＨＬＡが一致した同種（allogeneic）ＡＰＣでもよい。しかし、患者の血液試料はその量に限りがあるため、これらのアッセイを実施するのに十分な数の自己ＡＰＣが入手できることはまれである。したがって、通常の同種のペプチド提示細胞株を用いることが有利であると考えられる。広く用いられているＨＬＡ−Ａ２−拘束性ＣＤ８ Ｔリンパ球に対する自己ＡＰＣの一つは、Ｔ２細胞株であり、かかる細胞株には外来性のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドを非常に効率よくロードすることができる。
【００６６】
しかしＴ２細胞株は、ＨＬＡ−Ａ２複合体を有する一方で、他のＨＬＡクラスＩ及びII複合体も有し、それらの中には、患者自身のＨＬＡ型とＨＬＡ不一致となるものがある。エリスポットアッセイにおいて、この潜在的なアロ反応性（alloreactive）の相互作用により、Ｔ２細胞上のＨＬＡ不一致に対し、ＣＤ８ Ｔリンパ球のバックグラウンド反応性が強力に生成される可能性がある。ＨＬＡ−Ａ２型の人によっては、これらのアロ反応性免疫応答のため、低頻度のＴ細胞応答の検出が妨げられる場合がある。
【００６７】
ヒト細胞株Ｋ５６２は、女性の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の患者の胸水由来の樹立細胞株である。Ｋ５６２細胞には、細胞表面のＨＬＡクラスＩ及びIIの発現がない。ＨＬＡ−Ａ２の遺伝子をトランスフェクションしたＫ５６２細胞は低バックグラウンドであり、ＩＦＮガンマエリスポットアッセイにおいて、ＣＤ８Ｔリンパ球に対し、ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドを効果的に提示できるＡＰＣを誘導することが以前に示されている（Britten CM, Meyer RG, Kreer T, Drexler I, Wolfel T, Herr W. The use of HLA-A*0201-transfected K562 as standard antigen-presenting cells for CD8(+) T lymphocytes in IFN-gamma エリスポット assays.  J ImmunolMethods. 2002 Jan 1;259(1-2):95-1;参照により本明細書に援用される）。
【００６８】
Ｔ２細胞よりも、ＨＬＡ−Ａ２をトランスフェクションしたＫ５６２細胞を用いたほうが結果が向上するように思われるが、Ｋ５６２細胞の利用はＨＬＡクラスＩのアレルをトランスフェクションしたものに限られる。
【００６９】
すべての一般的なＨＬＡクラスＩ及びクラスIIのアレルに対応するｃＤＮＡが入手可能であり、アレルの選択の幅が広がっている。また、選択された全てのアレルを含むように、一連の細胞株を構築することができる。しかしこれにより、多数の細胞株の培養を維持することが要求され、さらに細胞株間の汚染の可能性が生じる。
【００７０】
本発明によれば、ＨＬＡ中性（HLA-neutral）（即ちＨＬＡ陰性）細胞は捕捉部分を備えており、かかる捕捉部分には、例えば組換えＨＬＡ複合体を用いて所望のＨＬＡ複合体をインビトロで付着させることができる。したがって、本発明の単一の共通（universal）細胞を提供することにより、複数の細胞株及び複数のトランスフェクションを伴う先行技術の手法の問題点を軽減することができる。
【００７１】
本発明の系の利点は、標的細胞の表面上の細胞表面分子（捕捉部分）に付着させる組換えＨＬＡ複合体を送達するための、抗体送達系を用いた手法の提供にある。
【００７２】
本明細書に記載の通りに細胞にＨＬＡ複合体を付着させることにより、前記付加された複合体を認識するＴ細胞と良好かつ特異的に相互作用できる標的細胞を作製することができる。これらの細胞は、ＥＬＳＰＯＩＴアッセイ及びＣｒ放出アッセイ等の機能アッセイなどにおいて特に有用であり、これらのアッセイは本発明の有利な実施形態である。
【００７３】
［Ｔ細胞機能アッセイ］
Ｔ細胞の活性は、細胞内容物の放出により測定することができる。これには、放射性標識クロムアッセイ（５１Ｃｒ放出アッセイ）又は溶解細胞からのＬＤＨ放出又はその他の酵素の放出に基づく酵素アッセイが挙げられる。
【００７４】
現在のところこれらのアッセイは、ワクチン治療に応答したＴ細胞機能の監視において、常法に含まれることはまれである。しかし本発明により、上記アッセイの用途を大きく広げることが可能となるが、それには多くの理由がある。
1/ ＰＢＭＣ集団における反応性Ｔ細胞の割合が相対的に低いこと。
2/ アッセイの実施に困難が伴うこと。
3/ アッセイに再現性がないこと。
【００７５】
本アッセイ用の標的細胞の選択肢には以下が挙げられる。
1/ 自己腫瘍細胞
2/ ペプチドをパルスした自己Ｂ細胞
3/ 天然Ｔ２細胞等のＨＬＡが特定されている標的細胞
4/ 天然にはＨＬＡクラスＩ陰性であるが、ＨＬＡ−Ａ２のｃＤＮＡを有するために単一のＨＬＡアレルのみ発現する、遺伝子導入ＣＩＲ−Ａ２細胞
これらの選択肢には各々、欠点がある。
1/ 自己腫瘍細胞は、定期的に入手可能なことはまれであり、通常、培養が困難である。
2/ ペプチドをパルスした自己Ｂ細胞は培養が困難であり、各々の患者に応じて作製しなければならず、ＥＢＶウイルスを有するため、天然のＥＢＶ応答により、紛らわしい結果を生じさせる場合がある。
3/ Ｔ２細胞はＨＬＡ−Ａ２陽性であるが、その他のＨＬＡアレルも有するため、Ｔ細胞と前記その他のアレルとの間のアロ反応性相互作用により、紛らわしい結果を生じさせる場合がある。組織の型が明確に特定されたこのような細胞株は、相対的に数が少ない。さらにＴ２細胞株はＥＢＶウイルスを有する。ＥＢＶは、紛らわしい結果を生じさせる原因であり、また他の細胞株の汚染源ともなる。
4/ 遺伝子導入細胞には、各々のＨＬＡアレルについて、別々のトランスフェクタントを必要とするという問題がある。この問題により、多数の細胞株の培養を維持するという困難、及び不注意による交差汚染の危険性が生じる。
【００７６】
本発明は、天然のＨＬＡクラスＩ又はII分子を有さず、任意のＨＬＡ分子に用いることができる、特性が明らかな単一の細胞株（single defined cell line）を用いることによりこれらの問題に有利に対処する。本発明の利点には以下のことが挙げられる。
単一の細胞系しか培養を維持する必要がない。
前記細胞は天然のＨＬＡクラスＩ又はII分子を有さないため、アロ反応性応答を誘起しない。
前記細胞は、同一の標準的な方法で用いることができるよう同じ品質に調製することができるため、実験を繰り返すことができ、複数の研究施設での比較も可能である。
［実施例]
【実施例１】
【００７７】
［細胞の作製］
本実施例において、本発明の細胞を作製する。
【００７８】
出発細胞はＫ５６２細胞であり、捕捉部分はＣＤ２０である。ＣＤ２０をコードする核酸を、Ｋ５６２細胞においてＣＤ２０の発現の促進能を有する遺伝子発現構築物中にクローン化し、この発現構築物をＫ５６２細胞にトランスフェクションし、安定なトランスフェクタントを選択する。細胞表面での捕捉部分ＣＤ２０の発現を、抗ＣＤ２０抗体を用いて確認する。
【００７９】
[実施例１ａ]  複合体の作製
実施例１ａの細胞をインビトロ培養で増殖させる。Ｂ９Ｅ９一本鎖抗体−ストレプトアビジン融合タンパク質ｓｆｖＳＡ Ｂ９Ｅ９を前記細胞とともにインキュベートし、洗浄により過剰分を取り除く。ビオチン化したＨＬＡクラスＩを有するＭｅｌａｎ−Ａペプチドと細胞とを共にインキュベートし、洗浄により過剰分を取り除く。このように、本発明の複合体を作製する。
【実施例２】
【００８０】
［エリスポット］
この技術を以下の方法でエリスポット環境に適用する。
【００８１】
ＨＬＡクラスＩ及びクラスII陰性細胞株（例えばＫ５６２）に、ヒトＣＤ２０（または前記細胞表面上に安定に発現する別の抗原）等の捕捉部分の遺伝子をトランスフェクションする。捕捉部分に対し、（化学的又は組換えにより結合させた）ストレプトアビジン／ビオチンを有する抗体を用い、前記捕捉部分（例えば細胞表面抗原）に付着させる。次に、ＨＬＡクラスＩ又はII複合体を付着させる（化学的又は組換えによりビオチン／ストレプトアビジンと結合させた）。
【００８２】
この系により、任意の所望のアレル／ペプチド複合体用の単一特異的ＨＬＡクラスＩ又はII標的を幅広く作製することができる。前記標的には、以下のようないくつかの利点がある。
Ａ/ 前記単一特異的細胞は、別々の時に使用しても、ほぼ同一の特性を有する。
Ｂ/ 単一の細胞株しか培養を維持する必要がないが、かかる細胞株はあらゆるアレルと共に用いることができる。
Ｃ/ 細胞は、他の部分ではＨＬＡクラスＩ及びII陰性なので、アロ反応活性がなく、したがって、バックグラウンドのエリスポット活性は非常に低くなる。
Ｄ/ 単一特異的ＨＬＡクラスＩ／II細胞のエピトープの密度は比較的高く均一であるため、Ｔ細胞との相互作用の再現性レベルが優れ、したがってエリスポットで良好な結果が得られる。
【実施例３】
【００８３】
［Ｔ細胞機能アッセイ］
以下に、Ｔ細胞機能アッセイ（しばしばクロムリリースアッセイと称される）の標準的な実施方法を記載する。
【００８４】
２μＣｉ／μＬの５１Ｃｒ（Amersham Pharmacia, UK）を用い、ＣＩＲ−Ａ２細胞を３７℃で一時間標識し、洗浄した。ＣＩＲ−Ａ２細胞に、選択したペプチドを濃度１０μＭで一時間、３７℃でパルスした。かかる標的細胞を、底がＵ字型の９６ウェルプレートに、１ウェルにつき細胞３０００個をプレートした。ＰＢＭＣ、培地又は５％トリトンＸ−１００を添加し、最終量を２００ｍｌとした。プレートを５％ＣＯ２の気相条件下、４時間３７℃でインキュベートし、５０ｍｌの上清を回収して１５０ｍｌの蛍光体（scintillant）に添加した。特異的溶解は以下のように計算した。
％溶解      実験ｃｐｍ−自然ｃｐｍ：１００％
最大ｃｐｍ−自然ｃｐｍ
自然放出量は培地のみでインキュベートした細胞で測定し、最大放出量は５％トリトンでインキュベートした細胞で測定した。各標的は、個々のアレル／ペプチドに特異性を有するＣＴＬのみを用いて溶解する。
【００８５】
本実施例では、本発明により標的の個性（identity）を容易に変化させられることについて記載する。さらに、市販で入手可能であり、選択の幅が広い種々のアレル／ペプチドの組合せの各々も、本発明のアッセイにおける使用に適している。培養の維持が必要なのは、単一の細胞株のみであることが認識できる。標準化された標的は、アッセイ間で、さらに言えば異なる施設で行われるアッセイ間で比較が可能であり、有利である。細胞内サイトカインの染色データは本発明のアッセイが有効であることをさらに示している。
【実施例４】
【００８６】
［細胞内サイトカインアッセイ］
抗原提示細胞への曝露に対する応答としての細胞内サイトカイン産生量の測定は、Ｔ細胞活性の指標としてよく用いられる。本発明は、本明細書に示すアッセイを行いやすくする。ＨＬＡクラスＩ単一特異的細胞を用いると、アッセイの再現性を高め、交差反応を低減させることができる。本実施例では、本発明のＨＬＡクラスＩ単一特異的細胞を、細胞内サイトカインアッセイの抗原提示細胞として用いた結果を示す。
【００８７】
本実施例で用いた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エピトープＨＬＡ−Ａ２／ＮＬＶを認識して増殖した集団（expanded population）が含まれる。次に、これらのＰＢＭＣ細胞を以下と共にインキュベートする。
1/ 追加細胞なし
2/ ＨＬＡクラスＩ陰性細胞
3/ ＨＬＡ−Ａ２／ＮＬＶを有するＨＬＡクラスＩ単一特異的Ｂ細胞
本実施例のＨＬＡクラスＩ陰性Ｂ細胞は、Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞リンパ腫細胞である。これらの細胞は天然には、内因性ＨＬＡクラスＩを有さずＣＤ２０を発現する。本実施例において、ＣＤ２０は捕捉部分である。
【００８８】
本実施例の、ＨＬＡ−Ａ２／ＮＬＶを有するＨＬＡクラスＩ単一特異的Ｂ細胞は同じく、Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞リンパ腫細胞である。ＨＬＡ−Ａ２／ＮＬＶ複合体を、本発明の方法にしたがって付着させる。本実施例では、Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞リンパ腫細胞を、付着手段としての抗ＣＤ２０抗体Ｂ９Ｅ９−ストレプトアビジン融合タンパク質と接触させた。かかるタンパク質は、本実施例の細胞に内因的に発現する捕捉部分ＣＤ２０に結合する。ＨＬＡを含む前記複合体は、ビオチン化ＨＬＡモノマーである。本実施例においては、ＨＬＡ−Ａ２モノマーを予めＮＬＶペプチドと混合して生じた複合体と前記細胞とを接触させる。前記複合体の付着は、ＨＬＡ複合体のビオチン部分と付着手段のストレプトアビジン部分との結合による。こうして、ＨＬＡ−Ａ２／ＮＬＶを有するＨＬＡクラスＩ単一特異的Ｂ細胞を作製する。
【００８９】
図５に、細胞内サイトカイン分析によって評価したＰＢＭＣの活性を示す。この結果は、細胞内サイトカイン染色の際、追加的な刺激を受けなかったＰＢＣＭは０．５６％の陽性を示し、ＨＬＡ−クラスＩ陰性Ｂ細胞に曝露された細胞の細胞内サイトカイン産生は０．９％で、大きな増加をほとんどみせなかったことを示している。しかし、本発明のＨＬＡ−Ａ２／ＮＬＶ複合体を有するＨＬＡクラスＩ単一特異的Ｂ細胞で刺激したＰＢＭＣでは、かかるＰＢＭＣの１８．９％が細胞内サイトカイン産生陽性となったことを示している。
【００９０】
ＨＬＡクラス単一特異的Ｂ細胞は、本アッセイにおいて非常に正確な信号をＰＢＭＣに与え、したがって非常に明快で容易なアッセイとならしめるというのが上記についての結論である。
【００９１】
本明細書で言及した文献はすべて、参照により本明細書に援用される。記載した本発明の方法、複合体、及び細胞の種々の変更及び変形は、本発明の範囲から離れることなく当業者に明らかである。特定の好適な実施例と関連づけて本発明を記載したが、特許請求の範囲記載の発明は、前記特定の実施例に不当に限定されないと理解されるべきである。さらに言えば、生化学及び生命工学又は関連分野の当業者にとって明白な、上記に記載した本発明の実施形態に対する種々の変更は、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】単一特異的ＨＬＡ細胞とＴ細胞との相互作用を示す図（即ち、単一特異的ＨＬＡ被覆細胞の図）である。
【図２】機能アッセイ用の、各種の標準化された単一特異的アレル／ペプチドＣＴＬ標的の作製を示す図（即ち単一特異的ＨＬＡ被覆細胞を用いた機能アッセイの例）である。
【図３】単一特異的ＨＬＡ標的細胞に対するＨＬＡ−Ａ２／Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＴＬの活性を示す棒グラフである。
【図４】エリスポットアッセイのａｐｃとしての単一特異的ｈｌａ細胞を示す図である。
【図５】細胞内サイトカインの分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2008522603.tif 000009