【事件の表示】
　特許第２９１３２２９号「油性アジュバントワクチン製剤」の特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２９１３２２９号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理　由】
(Ｉ)手続の経緯
　特許第２９１３２２９号の発明についての出願は、平成３年１０月２１日に特許出願され、平成１１年４月１６日にその発明について特許の設定登録がなされ、その後、その特許について、戸原和雄より特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１２年７月４日に訂正請求がなされたものである。
(II)訂正の適否についての判断
ア．訂正の内容
　特許権者は、以下のａ〜ｃの訂正を請求する。
訂正ａ
　特許請求の範囲の請求項１の「セスキオレイン酸ソルビタンを含む非イオン性界面活性剤」を「セスキオレイン酸ソルビタンおよびモノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンから成る非イオン性界面活性剤」に訂正する。これに伴い、特許請求の範囲の請求項３を削除する。
訂正ｂ
　特許請求の範囲の請求項１の「油中に乳化してなる」を「油中に乳化してなり、該非イオン性界面活性剤の親水性親油性バランスが３〜７である」に訂正する。
訂正ｃ
　発明の詳細な説明の欄【０００３】の「（G. G. Reid et al., Avian Diseases 31, 59-63,(1986)）」を「（G. G. Reid et al., Avian Diseases 31, 59-63,(1987)）」に訂正する。
イ．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　訂正ａ、ｂは、ともに特許請求の範囲に関するものであり、訂正ａは、請求項３を削除し、請求項１において、使用する界面活性剤を「セスキオレイン酸ソルビタンを含む非イオン性界面活性剤」から、訂正前の請求項３に記載されていた「セスキオレイン酸ソルビタンおよびモノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンから成る非イオン性界面活性剤」に限定するものであり、訂正ｂは、これらの配合比率を、特許明細書の発明の詳細な説明の記載「【００１１】本発明で用いる非イオン性界面活性剤は、親水性親油性バランス（ＨＬＢ：Hydrophile - Lipophile　Balance）が３〜７さらに好ましくは３〜６になるような配合比率にすることが奨められる。」なる記載に基づいて、非イオン性界面活性剤の親水性親油性バランスが３〜７である範囲に限定したものといえるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであり、新規事項の追加に該当しない。
　訂正ｃは、誤記の訂正を目的とするものであり、新規事項の追加に該当しない。
　そして、上記いずれの訂正も、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
ウ．独立特許要件
　上記訂正ａ、ｂにより訂正された請求項１〜２に係る発明は、後記することから明らかなように、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する第１２６条第２〜４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
(III)特許異議の申立てについて
ア．本件発明
　本件発明は、訂正した明細書の特許請求の範囲に記載された、以下のとおりのものである。
【請求項１】 不活化されたニューカッスル病ウィルスおよび鶏伝染性気管支炎ウィルスを抗原として含む抗原液を、セスキオレイン酸ソルビタンおよびモノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンから成る非イオン性界面活性剤で油中に乳化してなり、該非イオン性界面活性剤の親水性親油性バランスが３〜７であるｗ／ｏ型油性アジュバントワクチン製剤。
【請求項２】 さらに抗原として不活化された鶏伝染性コリーザを含む請求項１記載のワクチン製剤。
イ．申立ての理由の概要
　これに対し、特許異議申立人戸原和雄は、証拠として
甲第１号証：Veterinary　Record（1981）vol.108,p72-75
甲第２号証：Veterinary　Record（1981）vol.108,p99-101
甲第３号証：西一郎他編、「界面活性剤便覧」産業図書株式会社、昭和36年9月10日修正２刷発行、第909，1078頁
甲第４号証：Develop.Biol.Standard（1982）vol.51,ｐ169-180
甲第５号証：Avian Diseases(1978)vol.22,ｐ666-674
を提示し、本件請求項１に係る発明は、甲第３号証を考慮すれば、甲第１号証または甲第２号証に記載された発明であるから特許法第２９条第１項第３号に該当し、また甲第１〜２号証の記載に基づいて当業者が容易に発明することができたものであるから特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである旨、及び、本件請求項２〜３に係る各発明は、甲第１〜５号証の記載に基づいて当業者が容易に発明することができたものであるから特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである旨主張する。
ウ．判断
　そこで、特許異議申立人の主張について、以下検討する。
　甲第１号証は、鶏の感染症を予防するための不活化ワクチンに関するものであり、ニューカッスル病、伝染性嚢病、鶏伝染性気管支炎の３価混合油性アジュバントワクチンが有効であったこと、かかるワクチンは、Arlacel　83を添加し乳化して製造したものであることが記載されている。
　甲第２号証にも、甲第１号証記載のものと同様の３価ワクチンが記載されている。
　甲第３号証には、Arlacel　83がセスキオレイン酸ソルビタンであること、Arlacel　Ｃがセスキオレイン酸ソルビタンであること、及び、Tween　80がモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであることが記載されている。
　甲第４号証は、不活化した鶏伝染性コリーザを抗原として含むワクチンに関するものであり、これを調製するのに、Tween　80及びArlacel　Ｃを用いた旨が記載されている。
　甲第５号証は、鶏のウイルス抗原又はマイコプラズマ抗原を用いた不活化オイルエマルジョンワクチンの調製に関し、水相中にTween　80を、油相中にArlacel　ＡまたはArlacel　80を含むエマルジョンは、油相の乳化剤のみを含むエマルジョンよりも低粘度であったことが記載され、抗原として、ニューカッスル病、鶏インフルエンザウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルスを用いることが記載されている。
　ここで、本件請求項１に係る発明（以下、本件発明という。）と甲第１号証記載のものとを対比する（なお、甲第２号証記載のものは、甲第１号証記載のものと同様のものなので、甲第２号証についての検討は、甲第１号証についての検討によって代える。）と、甲第１号証記載のArlacel　83は、甲第３号証からみて、セスキオレイン酸ソルビタンであるから、両者は、不活化されたニューカッスル病ウィルスおよび鶏伝染性気管支炎ウィルスを抗原として含む抗原液を、非イオン性界面活性剤で油中に乳化してなるｗ／ｏ型油性アジュバントワクチン製剤である点で一致するが、本件発明は、かかる非イオン性界面活性剤として、セスキオレイン酸ソルビタンおよびモノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンから成るものを用い、さらに、その親水性親油性バランスが３〜７であるような範囲で配合するのに対し、甲第１号証記載のものでは、非イオン性界面活性剤として、セスキオレイン酸ソルビタンのみを用いている点で相違する。
　この点について、特許異議申立人は、甲第４，５号証から明らかなように、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンは、鶏の油性アジュバントワクチンの製造において他の非イオン性界面活性剤（Arlacel　Ｃ、Arlacel　Ａ、Arlacel　80）とともに従来より使用されているものであること、甲第５号証には、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Tween８０）を水相に用いると油相の乳化剤（Arlacel　Ａ、Arlacel　80）のみの場合よりも粘度が低下することが示されていること、を理由として、甲第１号証又は甲第２号証に記載の油性アジュバントワクチンにおいて、乳化剤としてセスキオレイン酸ソルビタンに加えモノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンを用いることは、得られるワクチン製剤の粘度等を考慮した上で当業者が適宜なし得る程度のことである旨主張する。
　しかしながら、甲第４，５号証は、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンが、他のあらゆる油性アジュバントワクチンにおいても有効であるとか、油性ワクチン製造の際に、当業者がまず試用するものであるということまで示すものではなく、各々、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンを使用したワクチンの例を示しているに過ぎないものである。また、甲第４号証は、ウイルスワクチンについては何ら言及しておらず、甲第５号証は、セスキオレイン酸ソルビタンを用いる点についての言及がないから、両号証とも、ウイルスワクチンである甲第１又は２号証に記載の油性アジュバントワクチンにおいて、乳化剤としてセスキオレイン酸ソルビタンに加え、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンを使用することを示唆する内容のものとはいえない。
　一方、特許異議意見書中の表６に示された実験結果によれば、ニューカッスル病ウィルスおよび鶏伝染性気管支炎ウィルスを用いた油性アジュバントワクチンの免疫効果が検討され、この中で、非イオン性界面活性剤として、セスキオレイン酸ソルビタンのみを用いた場合に比べて、これにモノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンを併用した本件発明品の方が、ＩＢ中和抗体価において優れていることが窺える。
　してみれば、本件発明は、甲第１又は２号証に記載の油性アジュバントワクチンにおいて、乳化剤としてセスキオレイン酸ソルビタンに加え、さらに、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンを使用することにより、免疫効果のより優れたワクチンを提供し得たものであり、このような作用効果は、甲第１〜５号証の記載からは予測し得たものとはいえない。
　したがって、本件発明は、甲第１、２号証に記載された発明でないばかりか、甲第１〜５号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものでもない。
　また、本件請求項２に係る発明は、本件発明の抗原として、さらに不活化された鶏伝染性コリーザを併用するものであるから、本件発明についての理由と同様の理由により、甲第１、２号証に記載された発明でないばかりか、甲第１〜５号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものでもない。
　よって、特許異議申立人の主張は採用できない。
(IV)むすび
　以上のとおり、特許異議申立ての理由及び証拠によっては、本件請求項１〜２に係る特許を取り消すことができない。
　また、請求項１〜２に係る特許について、他に取消理由を発見しない。
　よって結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年８月１６日（２０００．８．１６）
【訂正の要旨】
訂正ａ
　特許請求の範囲の請求項１の「セスキオレイン酸ソルビタンを含む非イオン性界面活性剤」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、
「セスキオレイン酸ソルビタンおよびモノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンから成る非イオン性界面活性剤」に訂正する。これに伴い、特許請求の範囲の請求項３を削除する。
訂正ｂ
　特許請求の範囲の請求項１の「油中に乳化してなる」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、
「油中に乳化してなり、該非イオン性界面活性剤の親水性親油性バランスが３〜７である」に訂正する。
訂正ｃ
　発明の詳細な説明の欄【０００３】の「（Ｇ．Ｇ．Ｒｅｉｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ３１，５９−６３，（１９８６））」を、誤記の訂正を目的として、
「（Ｇ，Ｇ．Ｒｅｉｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ３１，５９−６３，（１９８７））」に訂正する。
（５４）【発明の名称】
油性アジュバントワクチン製剤
（５７）【特許請求の範囲】
　　【請求項１】　不活化されたニューカッスル病ウィルスおよび鶏伝染性気管支炎ウイルスを抗原として含む抗原液を、
セスキオレイン酸ソルビタンおよびモノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンから成る
り、該非イオン性界面活性剤の親水性親油性バランスが３〜７である
　　【請求項２】　さらに抗原として不活化された鶏伝染性コリーザを含む請求項１記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
　　　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、不活化された細菌および／またはウィルスを抗原として含む優れた有効性と安定性を有する家畜・家禽用ｗ／ｏ型油性アジュバントワクチン製剤を提供する。
　　　【０００２】
　【従来技術】
　近年、ウィルス、細菌による感染病から家畜や家禽を予防するために各種の生ワクチンおよび不活化ワクチンが開発されている。その中でも不活化ワクチンは、単独では免疫効果が低く抗原として作用しないため、免疫応答を増強させるにはアジュバント化が必要である。現在、市販の不活化ワクチンは抗原液を水酸化アルミニウムゲル、ミョウバンなどの無機塩粒子に吸着させた沈降性アジュバント製剤が大半であるが、この製剤は免疫効果の持続期間が短いために頻回投与しなければならないという欠点があった。以上のような背景から、畜産業界、特に養鶏業界では、経済性、省力化、鶏へのストレス軽減の立場から、少ない抗原量で高い免疫効果を長時間持続させることの可能な投与システム・投与剤型（ドラッグデリバリーシステム；ＤＤＳ）の開発を待望していた。
　　　【０００３】
　効果持続型剤型のひとつに、油で抗原液を包含した油性アジュバント製剤があげられる。１９４２年にＪ．ＦｒｅｕｎｄがベイオールＦ（鉱物油）とアラセルＡ（マンニトールモノオレイン酸エステル）に結核死菌を加えてツベルクリン反応を強めることに成功したが、この油性アジュバント製剤は副作用として接種局所で壊死を起こす等の反応が強く、安全性に問題があった。また、ニューカッスル病ウィルスには有効であるが、抗原液の種類によっては、油性アジュバントにすると免疫効果を認めないものもあり、Ｐ．Ｊ．Ｂｌａｃｋａｌｌらは鶏伝染性コリーザには有用でないことを報告している（Ｇ．Ｇ．Ｒｅｉｄｅｔａｌ．，ＡｖｉａｎＤｉｓｅａｓｅｓ
３１
７
最近では、無水マンニトールオレイン酸エステルと流動パラフィンから成る鶏伝染性気管支炎ウィルスおよびニューカッスル病ウィルスの単味油性アジュバントが開示されている（特開昭６３−３５５２５）。さらに、一方では一回の接種で複数の対象疾患を予防することができるワクチン、すなわち多種混合の油性アジュバントワクチンの開発も進められているが未だ実用化には至らず、ニューカッスル病ウィルスにトリインフルエンザウィルスおよび鶏伝染性気管支炎ウィルスを配合し混合ウィルス製剤にすると互いの免疫原性によって免疫現象を低下させる、すなわち干渉作用を示し混合ワクチンとして有用でないことが報告されている（Ｚｈｉｘｕｎ　Ｘｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ
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　　　【０００４】
　【発明が解決しようとする課題】
　上述のように、鶏伝染性気管支炎ウィルスおよびニューカッスル病ウィルスのようなウィルスの単味油性アジュバント製剤については提供されているものの、細菌の油性製剤については、製剤の安定化が困難であり現在に至るまで安定なアジュバント製剤は提供されていない。さらに細菌および／またはウィルスを複数用いた混合ワクチンについても安定かつ有用な製剤は提供されていないのが現状である。
　　　【０００５】
　【課題を解決するための手段】
　本発明者らは上記の諸問題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、不活化されたニューカッスル病ウィルスおよび鶏伝染性気管支炎ウイルスを抗原として含む抗原液を、セスキオレイン酸ソルビタンを含む非イオン性界面活性剤で油中に乳化することにより、貯蔵安定性に優れ、高い安全性・免疫効果を有するｗ／ｏ型油性アジュバントワクチン製剤を完成するに至った。なお、本発明のワクチン製剤の調製に際しては、前記添加剤の外、さらに陰イオン性界面活性剤を添加しても良く、また適宜、ｐＨ調整剤、等張化剤、局麻剤、防腐剤等の自体公知の添加剤を加えても良い。本発明のニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）および鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）の他に使用される抗原としては、細菌としては、例えば鶏伝染性コリーザ（ＩＣ）、ヘモフィルス菌、ボルデテラ菌、および大腸菌などが、ウィルスとしては日本脳炎ウィルス、伝染性鼻気管炎ウィルス、伝染性肝炎ウィルス、および狂犬病ウィルスなどが例示される。これらを目的に応じ、適宜１種類以上選択して用いればよい。この中では特に鶏伝染性コリーザが使用される。
　　　【０００６】
　ＩＣとしては例えば２２１株（ＡｖｉａｎＤｉｓｅａｓｅｓ
３３
３３
２３
４５
　　　【０００７】
　本発明に使用可能な油としては、鉱物油、植物油、動物油および脂肪酸エステルが挙げられるが、好ましくは、鉱物油を用いる。鉱物油としては、流動パラフィンである、カーネーション、クレアロール、ハイコールＫ−１４０、ハイコールＫ−１４０Ａ、バイコールＫ−１６０、流動パラフィンＮｏ−４０Ｓ、クリストール５２、クリストール７２、ベイオールＦ、Ｄｒａｋｅｒ１６−ＶＲ、Ｍａｒｃｏｌ等（全て商品名）が挙げられ、これらを単独あるいは組み合わせて用いる。
　　　【０００８】
　本発明の非イオン性界面活性剤として、セスキオレイン酸ソルビタンが使用される。その他には、親油性にはソルビタン脂肪酸エステルおよびグリセリン脂肪酸エステル、親水性にはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルとしては例えば、モノオレイン酸ソルビタン、およびトリオレイン酸ソルビタンが挙げられ、グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノオレイン酸グリセリン、モノカプリル酸グリセリンおよびジオレイン酸グリセリンが挙げられ、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンが挙げられ、これらから１種以上が選択されて使用される。陰イオン性界面活性剤としては、アルキル硫酸塩および脂肪酸塩が挙げられ、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸アルミニウムなどが使用可能である。また、本発明においては免疫活性を更に増強する目的で、有機系のキサンタンガム、グアーゴム、ランザンガム、アラビアゴム、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸塩、ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、さらに、無機系のモンモリロナイト、水酸化アルミニウム、ミョウバン、ラジオライト、ホワイトカーボンから選択される１種類以上を添加することも可能である。
　　　【０００９】
　本発明において抗原液とは、通常、媒体中に抗原を約１０８個／ｍｌ含有するものを意味するが、使用目的に応じて適宜濃度調整して本発明の製剤に用いても良い。本発明の油性アジュバントワクチン製剤は次のようにして調製される。まず、油と界面活性剤を混合溶解し、その液を濾過滅菌する。別に、先に調製した抗原液、水、および前記免疫活性増強剤を混合した液を調製し、先の油成分中に徐々に加え、撹拌する。その後、温度を約２５℃以下に保ちながらホモジナイズし、目的の油性アジュバントワクチン製剤を得る。水としてはリン酸緩衝液（ｐＨ７）、生理食塩水あるいは精製水等が使用される。
　　　【００１０】
　本発明の油性アジュバントワクチン製剤の好ましい組成を表１に示す。
　【表１】
　さらに、好ましい非イオン性界面活性剤の配合量は４〜６％である。また、陰イオン性界面活性剤を使用する場合には０．５％以下で配合するのがさらに好ましく、その中でも０．３％以下で配合するのが特に好ましい。抗原の種類によっては、この陰イオン性界面活性剤を加えることで製剤物性（貯蔵後の再分散性）をさらに改善し、免疫効果を向上させることができる。
　　　【００１１】
　本発明で用いる非イオン性界面活性剤は、親水性親油性バランス（ＨＬＢ：Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ　Ｂａｌａｎｃｅ）が３〜７さらに好ましくは３〜６になるような配合比率にすることが奨められる。特に、抗原液が細菌のみ（ウィルスを含まない）の場合は、ＨＬＢが３〜５になることが好ましい。また、製剤中の水相部（抗原液と水）の配合量は、好ましくは１０〜５０％、特に好ましくは２０〜４０％とする。本発明の油性アジュバントワクチン製剤は、通常のワクチン製剤で用いられる投与経路で投与することができるが、０．１〜１．５ｍｌ好ましくは０．１〜０．５ｍｌを、筋肉内注射または皮下注射で投与するとよい。
　　　【００１２】
　【実施例】
　以下に実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例によりなんら限定されるものではない。
１．抗原液の調製
　抗原として、鶏伝染性コリーザ（ＩＣ）のＡ型Ｈｐｇ２２１株およびＣ型ＨｐｇＳ１株、ニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）の佐藤株および石井株、鶏伝染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）のＢｅａｕｄｅｔｔｅ　４２株を用いて抗原液を調製した。
（調製法）
　
ＩＣ
　ＩＣ　Ａ型　Ｈｐｇ　２２１株およびＣ型　Ｈｐｇ　Ｓ１株をそれぞれ０．５％鶏血清加鶏肉汁培地で１８時間培養し培養菌液とした。これにホルマリン（日本薬局方）を０．２％添加し、４℃で２日間不活化感作した。不活化感作した培養菌液を連続遠心後、菌体をＰＢＳで再浮遊し６６０ｎｍの波長でＯＤ値が０．８にしたものを１０倍濃縮しＡ型　Ｈｐｇ　２２１株およびＣ型　Ｈｐｇ　Ｓ１株の抗原とした。
　
ＮＤＶ
　ＮＤＶ佐藤株を１０日齢発育鶏卵の尿膜腔内に１０４．０ＥＩＤ５０／Ｅｇｇを接種し、３６．５℃で２日間培養し、感染尿膜腔液を採取した。これにホルマリン（日本薬局方）を２％添加し、４℃で６日間不活化感作したものをウィルス抗原とした。このウィルス抗原の不活化前ウィルス感染価は１０９．０ＥＩＤ５０／ｍｌであった。ＮＤＶ石井株を１０日齢発育鶏卵の尿膜腔内に１０４．０ＥＩＤ５０／Ｅｇｇを接種し、３６．５℃で４日間培養し、感染尿膜腔液を採取した。これにホルマリン（日本薬局方）を２％添加し、４℃で６日間不活化感作したものをウィルス抗原とした。このウィルス抗原の不活化前ウィルス感染価は１０１０ＥＩＤ５０／ｍｌであった。
　
ＩＢＶ
　ＩＢＶ　Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ　４２株を１０日齢発育鶏卵の尿膜腔内に１０４．０ＥＩＤ５０／Ｅｇｇを接種し、３６．５℃で２日間培養し、感染尿膜腔液を採取した。これにホルマリン（日本薬局方）を１％添加し、４℃で３日間不活化感作したものをウィルス抗原とした。このウィルス抗原の不活化前ウィルス感染価は１０７．５ＥＩＤ５０／ｍｌであった。
　　　【００１３】
　これら抗原液の製剤中の配合量は、
　　ＩＣ　Ｈｐｇ　２２１株の場合　　　　　１〜４％
　　ＩＣ　Ｈｐｇ　Ｓ１株の場合　　　　　　１〜４％
　　ＮＤＶ　佐藤株の場合　　　　　　　　１０〜２０％
　　　　　　　（３倍濃縮した場合　　　　　３〜１０％）
　　ＮＤＶ　石井株の場合　　　　　　　　１０〜２０％
　　　　　　　（３倍濃縮した場合　　　　　３〜１０％）
　　ＩＢＶ　Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ　４２株の場合　１０〜３０％
　　　　　　　（３倍濃縮した場合　　　　　３〜１０％）
とした。
　　　【００１４】
２．製剤（実施例１〜７および参考例１〜１０）の調製
　【表２】
　【表３】
　【表４】
　表２〜４に示すように、原材料を配合し（配合の割合は容量％）、油性アジュバントワクチン製剤を調製した。調製方法は前述の通りである。但し、ホモジナイズは投入式超音波ホモジナイザーを用い、電気出力１６０Ｗで６０秒間照射した。なお、実施例４〜７では上記ＮＤＶ佐藤株、ＩＢＶ　Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ　４２株を超遠心により、さらに３倍濃縮して使用した。
　　　【００１５】
　参考例１〜４はＩＣ　Ｈｐｇ　２２１株の単味油性アジュバントワクチン製剤、参考例５はＩＣ　Ｈｐｇ　Ｓ１株の単味油性アジュバントワクチン製剤、参考例６はＮＤＶ佐藤株の単味油性アジュバントワクチン製剤、参考例７はＩＢＶ　Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ　４２株の単味油性アジュバントワクチン製剤である。また、参考例８はＩＣ　Ｈｐｇ　２２１株とＩＣ　Ｈｐｇ　Ｓ１株との、実施例１はＮＤＶ佐藤株とＩＢＶ　Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ　４２株との、実施例２〜３はＮＤＶ石井株とＩＢＶ　Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ　４２株との２種混合アジュバントワクチン製剤、参考例９はＩＣ　Ｈｐｇ　２２１株、ＩＣ　Ｈｐｇ　Ｓ１株およびＮＤＶ佐藤株の、参考例１０はＩＣ　Ｈｐｇ　２２１株、ＩＣ　Ｈｐｇ　Ｓ１株およびＩＢＶ　Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ　４２株の３種混合油性アジュバントワクチン製剤である。さらに、実施例４〜７はＩＣ　Ｈｐｇ　２２１株、ＩＣ　Ｈｐｇ　Ｓ１株、ＮＤＶ佐藤株、およびＩＢＶ　Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ４２株の４種混合油性アジュバントワクチン製剤である。
　　　【００１６】
３．製剤物性の経時安定性（貯蔵安定性）
　参考例１、５〜１０、実施例２〜４で調製した本発明の製剤を４℃で５日、３０日および９０日保存した後の物理的安定性を、沈殿および層分離の度合いを観察して５段階評価した。その結果、何れの製剤も貯蔵安定性はきわめて良好であった。なお、表５にその代表例を示す。
　【表５】
　　　【００１７】
４．製剤の免疫効果および副作用
　参考例１の製剤の０．３ｍｌおよび０．５ｍｌを、鶏（３０日齢）の大腿部筋肉内に接種した後の免疫効果の推移を測定した。免疫効果は下記の２）生物試験中に記載のＨＩ抗体価の測定方法に従った。その結果を図１に示す。また、フロイント不完全アジュバントを注射すると、接種局所の壊死、腫脹、硬結が認められ安全性に問題がある。そこで参考例１の製剤の０．３ｍｌおよび０．５ｍｌを接種した上記鶏の接種部位を１０週目に解剖し、血腫、チーズ様物質、製剤痕跡の有無を観察した。その結果、接種後の鶏には沈うつ、破行は認められず、餌食いも変化せず、表６に示したように接種１０週目で接種部位に製剤痕跡が少し認められる程度であった。
　【表６】
　　　【００１８】
５．比較実験
　本発明の油性アジュバント製剤と、水酸化アルミニウムゲルを用いた従来の沈降性アジュバント製剤（比較例１〜４）、フロイントの不完全アジュバント製剤（比較例５）および特開昭６３−３５５２５に開示されているＮＤＶ石井株の単味油性アジュバント製剤（比較例６）との比較実験を行なった。比較例１〜５は以下の通り調製した。
　　　【００１９】
　
比較例１
　ＩＣ　Ｈｐｇ　２２１株が製剤全容量の１％となるように、水酸化アルミニウムゲル中に配合し製剤とした。
　
比較例２
　ＩＣ　Ｈｐｇ　２２１株およびＩＣ　Ｈｐｇ　Ｓ１株が、それぞれ製剤全容量の１％および１％となるように水酸化アルミニウムゲル中に配合し製剤とした。
　
比較例３
　ＮＤＶ石井株およびＩＢＶ　Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ　４２株が、それぞれ製剤全容量の１０％および１０％となるように水酸化アルミニウムゲル中に配合し製剤とした。
　
比較例４
　　ＩＣ　Ｈｐｇ　２２１株、ＩＣ　Ｈｐｇ　Ｓ１株、ＮＤＶ佐藤株（３倍濃縮）およびＩＢＶ　Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ　４２株（３倍濃縮）が、それぞれ製剤全容量の１％、１％、３％および５％となるように水酸化アルミニウムゲル中に配合し製剤とした。
　
比較例５
　油（ベイオールＦ）４２．５％と界面活性剤（アラセルＡ）７．５％を混合溶解した後、ＩＣ　Ｈｐｇ　２２１株１％、ＰＢＳ４９％を混合した液を、徐々に加え撹拌した。その後、温度を２５℃以下に保ちながら６０秒間超音波処理（１６０Ｗ）を行ない、フロイント不完全アジュバントを得た。
　
比較例６
　　処方
　　　発育鶏卵培養ニューカッスル病ウィルス（石井株）　　　　１０．０％
　　　無水マンニトールオレイン酸エステル加流動パラフィン　　７０．０％
　　　残り（不活化剤、チメロサール、ｐＨ調製剤（ＰＢＳ））　２０．０％
　　　【００２０】
１）粘度測定
　参考例１、実施例３〜４および比較例５について、温度２０℃、回転数５０ｒｐｍ（但し、比較例５のときは２．５ｒｐｍ）の条件下でＥ型粘度計（東京計器（株））を用いて製剤の粘度（ｃＰ）を測定した。その結果、表７からも分かるようにフロイント不完全アジュバントは粘度が高く、一般に市販されている注射器での接種は困難である。また貯蔵安定性も悪く３０日保存で二層分離し、そのうえ粘度が高いため再分散性も悪い。一方、本製剤はいずれも粘度が２００ｃＰ以下で注射が容易であり、さらに貯蔵安定性（表５参照）にも優れている。
　【表７】
　　　　【００２１】
２）生物試験
　
試験１
　参考例１〜４の製剤および比較例１および５の製剤を、調製直後、９１日および１１２日間４℃で保存後、それぞれ鶏（３０〜３３日齢）の大腿部筋肉内に０．５ｍｌ接種し、経時的に採血を行ない製剤中のそれぞれの抗原について免疫効果を測定した。ＩＣの免疫効果の測定はＨＩ抗体価で行なった。その結果を表８に示す。抗体価の測定は以下のとおりである。
　　　　【００２２】
　（ＩＣ（Ｈｐｇ　２２１株，Ｓ１株）に対するＨＩ抗体価測定法）可検血清の０．０２５ｍｌをリン酸緩衝液食塩水で２倍段階希釈した。０．０２５ｍｌ中に４単位のＩＣ（Ｈｐｇ　２２１株，Ｓ１株）の各赤血球凝集素を含有したリン酸緩衝液食塩水を加えた。
　室温で１０分間感作後、ＩＣ（Ｈｐｇ２２１株）は、０．５％新鮮鶏赤血球を０．５ｍｌ加え、またＩＣ（Ｈｐｇ　Ｓ１株）では、０．００１％ゼラチンと０．１％牛血清アルブミン加食塩水に１．０％ホルマリン固定血球を加えた液を０．５ｍｌ加えた。４５分室温に置いた後、赤血球凝集抑制を示した最高希釈倍数をＨＩ抗体価とした。
　　　【００２３】
　【表８】
　　　【００２４】
　
試験２
　参考例８および比較例２の製剤を鶏（３５日齢）の大腿部筋肉内に０．５ｍｌ接種した後経時的に採血を行ない、上記と同様の方法で製剤中のそれぞれの抗原について免疫効果を測定した。その結果を表９に示す。
　【表９】
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　【００２５】
　
試験３
　実施例２〜３、および比較例３、６の製剤を、鶏（３５日齢）の大腿部筋肉内に０．３ｍｌ接種した後経時的に採血を行ない、製剤中のそれぞれの抗原について免疫効果を測定した。ＮＤＶの免疫効果の測定はＨＩ抗体価で、ＩＢＶの場合は中和抗体価で行なった。その結果を表９に示す。抗体価の測定は以下の通りである。
　（ＮＤＶに対するＨＩ抗体価測定法）
　可検血清の０．０２５ｍｌをリン酸緩衝液食塩水で２倍段階希釈した。０．０２５ｍｌ中に４単位のＮＤＶの各赤血球凝集素を含有したリン酸緩衝液食塩水を加えた。室温で１０分間感作後、０．５％新鮮鶏赤血球を０．５ｍｌ加えた。４５分室温に置いた後、赤血球凝集抑制を示した最高希釈倍数をＨＩ抗体価とした。
　（ＩＢＶの中和抗体価の測定方法）
　１０倍段階希釈ウィルス液０．６ｍｌと非働化済みの被検血清０．６ｍｌと混合し、４℃で１８〜２４時間感作後、各希釈液あたり０．１ｍｌずつ５個の９〜１１日齢発育鶏胚に接種した。接種後２４時間以内の死亡は事故死とみなし、計算より除外した。残りの生死を７日間観察し、５０％感染価をべーレンス・ゲルバー法にて算出した。中和抗体価はウィルス対照との差によって求め対数で表現した。
　　　【００２６】
　【表１０】
　　【００２７】
試験４
実施例４〜７および比較例４の製剤を、鶏（３３日齢）の大腿部筋肉内に０．５ｍｌ接種した後経時的に採血を行ない、上記と同様の方法で製剤中のそれぞれの抗原について免疫効果を測定した。その結果を表１１に示す。
　【表１１】
　　　【００２８】
　【発明の効果】
　以上の記載のごとく、本発明のｗ／ｏ型油性アジュバントワクチン製剤は、製剤の貯蔵安定性に優れ、かつ取り扱いに際し好ましい物性を有した。さらに、現在知られている油性アジュバント製剤に比べて免疫効果が高く、安全性も良好な油性アジュバントワクチン製剤となった。
　　　【００２９】
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　参考例１の製剤の０．３ｍｌおよび０．５ｍｌを、鶏の大腿部筋肉内に接種した後の免疫効果の推移を示す。
【図面】