(57)【要約】  一般式（Ｉ）（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10およびｎは説明に示す意味を持つ）の心血管作用化合物およびこれらの化合物の製造方法および該方法の中間生成物について説明する。さらに、式（Ｉ）の医薬組成物について明示する。
2008536842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化１】
2008536842.tif 000029
（式中、
Ｒ1はＣ1-4−アルキルであり、
Ｒ2はＣ1-4−アルキルであり、
Ｒ3は、ハロゲン、Ｃ1-6−アルキルまたはＣ1-4−アルコキシルのいずれかで１〜３度置換されていてよいフェニルであり、
Ｒ4は水素、Ｃ1-6−アルキルまたはＣ3-7−シクロアルキル−Ｃ1-4−アルキルであり、
Ｒ5は水素であり、かつ
Ｒ6は水素であり、かつ
Ｒ7は水素であり、かつ
Ｒ8は水素であり、かつ
Ｒ9はＣ1-4−アルキルであり、かつ
Ｒ10はＣ1-6−アルキル、フェニル−Ｃ0-4−アルキルまたはピリジニル−Ｃ0-4−アルキルであるが、但し、
Ｒ5およびＲ9がともにＣ2アルキレンを形成するか、または
Ｒ5およびＲ9がともにＣ1-3アルキレンを形成するか、または
Ｒ6およびＲ9がともにＣ1-3アルキレンを形成するか、または
Ｒ7およびＲ9がともにＣ2-4−アルキレンまたはＣ1-3−アルキレンオキシを形成するか、または
Ｒ8およびＲ9がともにＣ3-5−アルキレンを形成するか、または
Ｒ9およびＲ10がともにＣ4-6−アルキレンを形成する場合に
Ｒ10がフェニルではなく、かつ
ｎは０または１である）で表わされる化合物、またはその任意の生理的に適合可能な塩および／または溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ1およびＲ2が各々メチルである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ3が４−エチルフェニルである請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ4が水素、Ｃ1-6−アルキルまたはシクロプロピルメチルである請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ5およびＲ9がともにＣ1-3−アルキレンを形成する請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ10がＣ1-6−アルキル、フェニル−Ｃ1-4−アルキルまたはピリジニル−Ｃ1-4−アルキルである請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ10がベンジルまたはピリジニルメチルである請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項記載の式Ｉで表わされる化合物であって、以下の
Ｎ−{６−[２−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−２−オキソ−エチル]−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−４−イル}−４−エチル−ベンゼンスルホンアミド、
４−エチルＮ−{３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−[２−オキソ−２−（４−ピリジン−３−イルメチル−ピペラジン−１−イル）−エチル]−クロマン−４−イル}−ベンゼンスルホンアミド、
４−エチル−Ｎ−{３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−[２−オキソ−２−（４−ピリジン−２−イルメチル−ピペラジン−１−イル）−エチル]−クロマン−４−イル}−ベンゼンスルホンアミド、および
４−エチル−Ｎ−{３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−[２−オキソ−２−（４−ピリジン−４−イルメチル−ピペラジン−１−イル）−エチル]−クロマン−４−イル}−ベンゼンスルホンアミド
から成るグループから選択される化合物。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項記載の式Ｉで表わされる化合物であって、
４−エチル−Ｎ−{３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−[２−オキソ−２−（４−ピリジン−３−イルメチル−ピペラジン−１−イル）−エチル]−クロマン−４−イル}−ベンゼンスルホンアミドである化合物。
【請求項１０】
請求項１に記載の式Ｉで表わされる化合物の薬理活性量および従来の補助剤および／または担体を含有する医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の式Ｉで表わされる化合物の、哺乳動物およびヒトの心血管疾患治療のための薬剤を製造するための使用。
【請求項１２】
心血管疾患が不整脈である請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
式Ｉ
【化２】
2008536842.tif 000030
（式中、
Ｒ1はＣ1-4−アルキルであり、
Ｒ2はＣ1-4−アルキルであり、
Ｒ3は、ハロゲン、Ｃ1-6−アルキルまたはＣ1-4−アルコキシルのいずれかで１〜３度置換されていてもよいフェニルであり、
Ｒ4は水素、Ｃ1-6−アルキルまたはＣ3-7−シクロアルキル−Ｃ1-4−アルキルであり、
Ｒ5は水素であり、かつ
Ｒ6は水素であり、かつ
Ｒ7は水素であり、かつ
Ｒ8は水素であり、かつ
Ｒ9はＣ1-4−アルキルであり、かつ
Ｒ10はＣ1-6−アルキル、フェニル−Ｃ0-4−アルキルまたはピリジニル−Ｃ0-4−アルキルであるが、但し、
Ｒ5およびＲ9がともにＣ2アルキレンを形成するか、または
Ｒ5およびＲ9がともにＣ1-3アルキレンを形成するか、または
Ｒ6およびＲ9がともにＣ1-3アルキレンを形成するか、または
Ｒ7およびＲ9がともにＣ2-4−アルキレンまたはＣ1-3−アルキレンオキシを形成するか、または
Ｒ8およびＲ9がともにＣ3-5−アルキレンを形成するか、または
Ｒ9およびＲ10がともにＣ4-6−アルキレンを形成する
場合に、
Ｒ10がフェニルではなく、かつ
ｎは０または１である）で表わされる化合物またはその任意の生理的に適合可能な塩および／または溶媒和物の製造方法において、
ａ） 一般式ＩＩ
【化３】
2008536842.tif 000031
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10およびｎは上記の意味を持つ）の化合物と
一般式ＩＩＩ
Ｘ−ＳＯ2−Ｒ3      ＩＩＩ
（式中、Ｒ3は上記の意味を持ち、またＸは分解可能な脱離基である）の化合物を反応させるか、あるいは
ｂ） 一般式ＩＶ
【化４】
2008536842.tif 000032
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は上記の意味を持つ）の化合物と
一般式Ｖ
【化５】
2008536842.tif 000033
（式中、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10およびｎは、上記の意味を持つ）の化合物を反応させ、必要であれば得られた式Ｉで表わされる遊離化合物をそれらの生理的に適合可能な塩に変換するか、または式Ｉで表わされる化合物の塩を式Ｉで表わされる遊離化合物に変換することを特徴とする製造方法。
【請求項１４】
一般式ＩＩ
【化６】
2008536842.tif 000034
（式中、
Ｒ1はＣ1-4−アルキルであり、
Ｒ2はＣ1-4−アルキルであり、
Ｒ4は水素、Ｃ1-6−アルキル、またはＣ3-7−シクロアルキル−Ｃ1-4−アルキルであり、
Ｒ5は水素であり、かつ
Ｒ6は水素であり、かつ
Ｒ7は水素であり、かつ
Ｒ8は水素であり、かつ
Ｒ9はＣ1-4−アルキルであり、かつ
Ｒ10はＣ1-6−アルキル、フェニル−Ｃ0-4−アルキルまたはピリジニル−Ｃ0-4−アルキルであるが、但し
Ｒ5およびＲ9がともにＣ2アルキレンを形成するか、または
Ｒ5およびＲ9がともにＣ1-3アルキレンを形成するか、または
Ｒ6およびＲ9がともにＣ1-3アルキレンを形成するか、または
Ｒ7およびＲ9がともにＣ2-4−アルキレンまたはＣ1-3−アルキレンオキシを形成するか、または
Ｒ8およびＲ9がともにＣ3-5−アルキレンを形成するか、または
Ｒ9およびＲ10がともにＣ4-6−アルキレンを形成する
場合に
Ｒ10がフェニルではなく、かつ
ｎは０または１である）で表わされる化合物、またはその任意の塩または溶媒和物。
【請求項１５】
一般式ＩＶ
【化７】
2008536842.tif 000035
（式中、
Ｒ1はＣ1-4−アルキルであり、
Ｒ2はＣ1-4−アルキルであり、
Ｒ3は、ハロゲン、Ｃ1-6−アルキルまたはＣ1-4−アルコキシルのいずれかで１〜３度置換されていてよいフェニルであり、
Ｒ4は水素、Ｃ1-6−アルキルまたはＣ3-7−シクロアルキル−Ｃ1-4−アルキルである）で表わされる化合物、またはその任意の塩または溶媒和物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カリウムチャンネル遮断効果、特に心血管系に影響を及ぼす効果を持つ新規アミノアルキル−アミドメチル置換 ２−（４−スルホニルアミノ）−３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル誘導体およびこれらの化合物を含む薬剤に関する。さらに、本発明は、該方法の新規化合物および中間生成物の製造方法に関する。
【０００２】
カリウムチャンネル遮断効果、特に心血管系に有益な効果を持つインダン、ベンゾピランおよびそのような化合物のアナログは、既に明細書ＷＯ ００／１２０７７  Ａ１に記載されている。
【０００３】
文書ＷＯ  ００／５８３００は、薬剤、特に抗不整脈薬として適したクロマン誘導体を開示する。
【０００４】
公開された国際特許出願ＷＯ ２００５／０３７７８０ は、カリウムチャンネル遮断効果、特に心血管系に影響を及ぼす効果を持つ新規アミドメチル置換 ２−（４−スルホニルアミノ）−３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル誘導体およびこれらの化合物を含有する医薬に関する。
【０００５】
本発明は、良好な適合性を持つ高い有効性によって、および抗不整脈作用の場合には明白な心房選択的作用プロファイルによっても優れた新規作用物質が特定の心血管疾患、好ましくは心不整脈の治療に使用できるようにすることを目的とする。
【０００６】
今回驚くべきことに、新規アミノアルキル−アミドメチル置換 ２−（４−スルホニルアミノ）−３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル誘導体の発明によるグループはカリウムチャンネル遮断特性を持ち、心血管疾患の治療、好ましくは心不整脈の治療に適していることが分かった。本発明による化合物は、良好な適合性および高い有効性によって、また抗不整脈作用の場合には明白な心房選択的作用プロファイルによっても優れる。さらに、本発明による化合物は比較的良好なバイオアベイラビリティーを特徴とする。
【０００７】
また、本発明による該化合物は、免疫系に影響を及ぼす付加的な作用を期待させる特性を持っている。
【０００８】
本発明の主題は、一般式Ｉ
【化１】
2008536842.tif 000003
（式中、Ｒ1はＣ1-4−アルキル、Ｒ2はＣ1-4−アルキル、Ｒ3は必要に応じて任意のハロゲン、Ｃ1-6−アルキルまたはＣ1-4−アルコキシルのいずれかで１〜３度置換されるフェニル、Ｒ4は水素、Ｃ1-6−アルキルまたはＣ3-7−シクロアルキル−Ｃ−１−４−アルキル、Ｒ5は水素、およびＲ6は水素、およびＲ7は水素、およびＲ8は水素、およびＲ9はＣ1-4−アルキル、およびＲ5およびＲ9がともにＣ2アルキレンを形成するか、またはＲ5およびＲ9がともにＣ1-3アルキレンを形成するか、またはＲ6およびＲ9がともにＣ1-3アルキレンを形成するか、またはＲ7およびＲ9がともにＣ2-4−アルキレンまたはＣ1-3−アルキレンオキシを形成するか、またはＲ8およびＲ9がともにＣ3-5−アルキレンを形成するか、またはＲ9およびＲ10がともにＣ4-6−アルキレンを形成する場合にＲ10がフェニルではないという条件でＲ10はＣ1-6−アルキル、フェニル−Ｃ0-4−アルキルまたはピリジニル−Ｃ0-4−アルキルであり、およびｎは０または１である）で表わされる新規アミノアルキル−アミドメチル置換 ２−（４−スルホニルアミノ−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル誘導体またはその生理的に適合可能な塩および／または溶媒和物である。
【０００９】
さらに、本発明の主題は式Ｉで表わされる化合物を含む医薬組成物である。さらに、本発明の主題は、式Ｉで表わされる化合物の製造方法および該方法の中間生成物である。
【００１０】
式Ｉで表わされる化合物あるいは本発明の文脈において記載される他の化合物において置換基はＣ1-4−アルキルまたはＣ1-6−アルキルであるかまたはそれを含有し、これらは各々直鎖かまたは分枝している。
【００１１】
Ｒ1およびＲ2は好ましくは各々メチルを表わす。
【００１２】
Ｒ3は、好ましくは必要に応じてハロゲン、Ｃ1-4−アルキルまたはＣ1-4−アルコキシによって１〜２回置換されるフェニルを表わす。
特に、Ｒ3はＣ1-4−アルキルによって一回置換されたフェニルを表わす。ただし、Ｒ3はハロゲンに置換されたフェニルであり、フッ素、塩素または臭素およびヨウ素はハロゲンと考える。特に好ましくは、Ｒ3は４−エチルフェニルを表わす。
【００１３】
Ｒ4は好ましくは水素、Ｃ1-6−アルキルまたはシクロプロピル−Ｃ1-4−アルキル、特にシクロプロピルメチルである。Ｒ4はＣ1-6−アルキルを表わすが、これは特に分枝し、好ましくはネオペンチル、２，２−ジメチルブチル、２−エチルブチル、３−メチルブチルまたは２−メチルプロピルを表わす。
【００１４】
好ましくは、Ｒ5およびＲ9はともにＣ1-3−アルキレンを形成する。
【００１５】
Ｒ10は好ましくはＣ1-4−アルキル、ベンジルまたはフェニルである。より好ましくは、Ｒ10はフェニル−Ｃ1-4−アルキルまたはピリジニル−Ｃ1-4−アルキル、例えばピリジニルメチル、特に２−ピリジニルメチル、３−ピリジニルメチルまたは４−ピリジニルメチルであるか、あるいは、Ｒ9およびＲ10はともにＣ4-6−アルキレンを形成する。
【００１６】
特に好ましい式Ｉで表わされる化合物は、Ｎ−｛６−［２−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−２−オキソ−エチル］−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−４−イル｝−４−エチル−ベンゼンスルホンアミド、４−エチル−Ｎ−｛３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−［２−オキソ−２−（４−ピリジン−３−イルメチル−ピペラジン−１−イル）―エチル］−クロマン−４−イル｝−ベンゼンスルホンアミド、４−エチル−Ｎ―{３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−［２−オキソ−２−（４−ピリジン−２−イルメチル−ピペラジン−１−イル）−エチル]−クロマン−４−イル］−ベンゼンスルホンアミドオヨビ４−エチル−Ｎー｛３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−［２−オキソ−２−（４−ピリジン−４−イルメチル−ピペラジン−１−イル）−エチル］−クロマン−４−イル｝−ベンゼンスルホンアミドから成るグループから選択される。
４−エチル−Ｎ−｛３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−[２−オキソ−２−（４−ピリジン−４−イルメチル−ピペラジン−１−イル）−エチル]−クロマン−４−イル｝−ベンゼンスルホンアミドは、式Ｉで表わされる特に好ましい化合物である。
【００１７】
本発明によれば、式Ｉで表わされる新規化合物は、
ａ）一般式ＩＩ
【化２】
2008536842.tif 000004
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10およびｎは上記の意味を持つ）の化合物と一般式ＩＩＩ
Ｘ−ＳＯ2−Ｒ3      ＩＩＩ
（式中、Ｒ3は上記の意味を持ち、またＸは分解可能な脱離基である）で表わされる化合物を反応させるか、あるいは
ｂ）一般式ＩＶ
【化３】
2008536842.tif 000005
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は上記の意味を持つ）で表わされる化合物と一般式Ｖ
【化４】
2008536842.tif 000006
（式中、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10およびｎは、上記の意味を持つ）で表わされる化合物を反応させることによって得られる。
工程ａ）による反応は、反応条件下で不活性な有機溶媒特にジクロロメタンなどの双極性非プロトン性溶媒内あるいはそのような溶媒の混合物内および塩基の存在下で従来の湿式化学処理を使用して実行することができる。適切な塩基は、第三級アルキルアミン例えばトリエチルアミンなどの非求核性有機窒素塩基である。過剰に使用される液体有機塩基も溶媒として使用することができる。必要であれば、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（＝ＤＭＡＰ）など既知の結合補助剤により反応を触媒してもよい。
【００１８】
適切な反応温度は、室温および８０℃の間、例えば６５℃である。適切な反応圧力は、標準圧および約２００  ｂａｒの間、例えば１８０  ｂａｒである。使用される式ＩＩＩで表わされる化合物が液体の場合、既知の方法、例えば減圧圧力で溶媒に溶解した式ＩＩで表わされる化合物に式ＩＩＩで表わされる化合物を添加後、反応液から溶媒を除去することは有利である。式ＩＩで表わされる出発化合物においてＲ4が水素を表わす場合は、等モル量の式ＩＩＩで表わされる化合物を使用すると好都合である。通常、式ＩＩＩで表わされる化合物における脱離基Ｘとしてハロゲン、好ましくは塩素、臭素またはヨウ素を使用する。さらに、式ＩＩＩで表わされる化合物と式ＩＩで表わされる化合物の反応は固相、特にアミノメチルポリスチレン（ＡＭＰＳ）など反応性樹脂上で既知の方法で行なうことができる。この異種反応は、好ましくは少量の物質、例えば１〜１０ｍｍｏｌの物質の製造に使用することができる。合成が固相上の場合は、好ましくは既知の高分子担持メチルピペリジン（＝ＰＳメチルピペリジン）または高分子担持ピペリジン（＝ＰＳピペリジン）など容易に濾過できる塩基を塩基として使用することができる。固相合成に適している反応温度は１０℃および４０℃の間、好ましくは室温である。式Ｉで表わされる化合物は、既知の方法で反応液から分離し、必要であれば既知の方法で精製してもよい。式Ｉで表わされる化合物において、Ｒ9および／またはＲ10は芳香族または複素芳香族環系の一部ではなく、塩形成が可能である。したがって、結果として生じる式Ｉで表わされる適切な遊離化合物は生理的に適合可能な塩に変換されるか、あるいは式Ｉで表わされる化合物の塩は式Ｉで表わされる遊離化合物に変換される。
【００１９】
工程ｂ）による反応は、アミノアシル化で知られる方法で実行することができる。式ＩＶで表わされるカルボン酸または酸ハロゲン化物などそれらの反応誘導体、特に酸塩化物または酸性臭化物は、アシル化剤として使用される。式ＩＶで表わされる酸そのものをアシル化剤として使用する場合は、それと式Ｖで表わされるアミノ化合物との反応は、ひとつ以上のアミノアシル化反応用の既知のカップリング試薬、例えば１，１−カルボニルジイミダゾール１、エチルクロロホルメート、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（＝ＨＯＢＴ）、アルキルカルボジイミド、例えばＮ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（＝ＥＤＣ）あるいはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（＝ＤＩＣ））、あるいはジシクロヘキシルカルボジイミドなどシクロアルキルカルボジイミドの存在下においても都合よく実行することができる。アシル化は、−３０℃から＋５０℃の温度、好ましくは室温の反応条件下で不活性な有機溶媒内で生じる。適切な溶媒は、ジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素あるいはテトラヒドロフランまたはジオキサンなどの環状エーテルまたはこれらの溶媒の混合物である。
【００２０】
式Ｉで表わされる化合物の生理的に適合可能な塩は、無機酸、例えば硫酸、リン酸、ハロゲン化水素酸、好ましくは塩酸など、あるいは有機酸、例えばマレイン酸、フマル酸、乳酸、酒石酸、クエン酸などの低級の脂肪族モノカルボン酸、ジカルボン酸またはトリカルボン酸など、あるいはスルホン酸、例えばメタンスルフォン酸などの低級アルカンスルフォン酸あるいはトリフルオロメタンスルホン酸、あるいはｐ−トルエンスルフォン酸のように必要に応じてハロゲンまたはより低級アルキルによってベンゼン環を置換したベンゼンスルフォン酸などとの通常の塩である。式Ｉで表わされる化合物の塩酸塩が好ましい。
【００２１】
式ＩＩで表わされる化合物は、新規薬理活性物質の製造、例えば式Ｉで表わされる化合物の製造を行うための中間生成物として都合よく適切な新規化合物である。
【００２２】
Ｒ4が水素を表わす式ＩＩで表わされる化合物は、一般式ＶＩ
【化５】
2008536842.tif 000007
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10およびｎは、上記の意味を持ち、ＰＧ1は酸性媒体好ましくはタートブトキシカルボニル（＝Ｂｏｃ）において分解できるアミノ保護基を表わし、ｍは０または１である）の化合物から保護基ＰＧ1のある酸性媒体において分解することによって既知の方法で製造することができる。保護基の分解は、例えば鉱酸のような酸、好ましくは塩酸、例えば４Ｍの塩酸を式ＶＩで表わされる化合物に加えることにより達成できる。式ＶＩで表わされる化合物あるいは保護基ＰＧ1を含有する任意の化合物において、また以後ｍが０である場合は、ピラン環の３−位の置換基は各例においてヒドロキシであることを意図する。
【００２３】
本出願で述べる適切な保護基ＰＧ1または他の保護基は、本技術において知られており、該技術の熟達者によって日常的に選択することができる。例えばＴ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓの最新版より。
【００２４】
Ｒ4がＣ1-6−アルキルまたはＣ3-7−シクロアルキル基−Ｃ1-4−アルキルを表わす式Ｉで表わされる化合物が必要である場合は、Ｒ4が水素である式Ｉで表わされる化合物、またはＲ4が水素である式Ｉで表わされる化合物の前駆体化合物、すなわち式ＩＩまたはＩＶで表わされる前駆体化合物は、既知の方法でアルキル化することができる。アルキル化は、いずれの場合も最初にＲ4が水素を表わす式Ｉ、ＩＩまたはＩＶで表わされる化合物を一般式ＶＩＩ
Ｒ401−ＣＨＯ      ＶＩＩ
（式中、Ｒ401は水素、Ｃ２−５−アルキルまたはＣ3-7−シクロアルキル基−Ｃ0-3−アルキルである）のアルデヒドと反応させ、次に式Ｉ、ＩＩまたはＩＶで表わされるアルキルアミン化合物に還元剤を添加して結果として生じるイミン中間生成物を還元することによって特にアミノアルキル化として実行することができる。適切な還元剤は、ＮａＢＨ3ＣＮまたは既知の高分子担持ホウ化水素（＝ＰＳ−ＢＨ4）などのホウ化水素複合体である。最初の変種においては、反応条件下で不活性なプロトン性極性有機溶媒において反応を実行することができる。特にメタノール中では、同一溶媒内で分離せずにそのままイミンの還元が行なわれる。この変種に適している反応温度は、室温および６０℃の間、例えば５０℃である。第２の変種においては、Ｒ4は水素を意味する式Ｉ、ＩＩまたはＩＶで表わされる化合物と式Ｖで表わされるアルデヒドのイミン中間生成物を形成する反応は、双極性非プロトン性溶媒、特にテトラヒドロフラン（＝ＴＨＦ）において実行することができる。その場合、反応を促進するために触媒量の親水性剤、例えばオルトエステル、特にオルトギ酸トリメチル（＝ＴＭＯＦ）を加えることは有利である。次に、イミン中間生成物を分離し、最初の変種のために上述のプロトン性極性溶媒に採取してこの溶媒中で還元を行なうことができる。この第２の変種は、好ましくは室温で実行してもよい。
【００２５】
式ＶＩで表わされる化合物は、アミノアシル化と呼ばれる、上で詳細に説明した方法で一般式ＶＩＩＩ
【化６】
2008536842.tif 000008
（式中、Ｒ1、Ｒ2、ＰＧ1およびｍは上記の意味を持つ。）のカルボン酸誘導体を式Ｖで表わされるアミノ誘導体と反応させることによって製造することができる。
【００２６】
式ＶＩＩＩのカルボン酸またはそれらの反応的な誘導体、例えば酸ハロゲン化物、特に酸塩化物または酸臭化物などをアシル化剤として使用してもよい。アシル化剤として式ＶＩＩＩで表わされる酸自体を使用する場合、それと式Ｖで表わされるアミノ化合物との反応も、１つ以上の既知のアミノアシル化反応用カップリング試薬、例えば１，１カルボニルジイミダゾール、エチルクロロホルメート、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（＝ＨＯＢＴ）、アルキルカルボジイミド、例えばＮ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（＝ＥＤＣ）あるいはＮ，Ｎ’−ジイソ−プロピルカルボジイミド（＝ＤＩＣ））、あるいはジシクロヘキシルカルボジイミドなどのシクロアルキルカルボジイミドの存在下において都合よく実行することができる。該アシル化は、−３０℃から＋５０℃までの温度、好ましくは室温の反応条件下で不活性である有機溶媒において生じる。適切な溶媒は、ジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素あるいはテトラヒドロフランまたはジオキサンなどの環状エーテルまたはこれらの溶媒の混合液である。
【００２７】
式Ｖで表わされる化合物および式ＶＩＩで表わされる化合物はそれ自体既知であるか、あるいは既知の方法により既知の化合物から製造することができる。
【００２８】
式ＶＩＩＩで表わされる化合物は、塩基性溶媒において保護基ＰＧ2を一般式ＩＸ
【化７】
2008536842.tif 000009
（式中、Ｒ1、Ｒ2、ＰＧ1およびｍは上記の意味を持ち、ＰＧ2は塩基性溶媒において分離できる炭酸保護基を表わす）で表わされる化合物から分離することによって既知の方法で製造することができる。
【００２９】
ＰＧ2は一般に、塩基性溶媒または酸性溶媒において分離できる炭酸保護基を表わすことができる。ＰＧ2が塩基性溶媒において分離できる炭酸保護基を表わす場合、直鎖または分枝したＣ1-4−アルキルラジカル、好ましくはイソプロピルまたはメチルが適切である。塩基性溶媒において分離できる保護基ＰＧ2の分離は、通常、アルカリ水酸化物塩、例えば水酸化リチウムなどの塩基の添加によって達成することができる。この場合、適切な溶媒は、水またはＴＨＦのようなプロトン性極性有機溶媒、または好ましくは該有機溶媒と水の混合液である。ＰＧ2が酸性溶媒において分離できる炭酸保護基を表わす場合は、分枝したＣ1-4−アルキルラジカル、好ましくはタートブチルが適切である。酸性溶媒において分離できる保護基ＰＧ2の分離は、通常、トリフルオロ酢酸などの酸の添加によって達成することができる。この場合、適切な溶媒は、トルエンまたはキシレンなどの極性非プロトン性有機溶媒、または該有機溶媒の混合物である。
【００３０】
式ＩＸで表わされる化合物は、一般式Ｘ
【化８】
2008536842.tif 000010
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＰＧ2は式ＩＸで表わされる化合物の場合と同様に上記の意味を持つ）で表わされるアミノヒドロキシクロマン誘導体を酸性溶媒において分離できるアミノ保護基、好ましくはＢｏｃ基で保護することによって既知の方法で製造することができる。式Ｘで表わされるＢｏｃ−アミノ保護化合物を製造した場合、Ｂｏｃ−無水物をそれ自体既知の方法で試薬として使用してもよい。通常、この場合は、式Ｘで表わされるモノプロテクト化合物および式Ｘで表わされるジプロテクト化合物の混合物が得られる。一般的に、２：１配分でモノプロテクト生成物の方が多い。通常、式Ｘで表わされる化合物からスタートし、式Ｉで表わされる化合物を得る次の反応は、どちらの場合も出発原料として保護化合物の混合物を使用しながら問題なく行なうことができる。
【００３１】
式Ｘで表わされる化合物は、低級アルキルアルコール、好ましくはエタノールなどの双極性プロトン性溶媒において既知の方法で一般式ＸＩ
【化９】
2008536842.tif 000011
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＰＧ2は式Ｘで表わされる化合物の場合と同様に上記の意味を持つ）で表わされるエポキシド化合物を求核性の有機窒素化合物、好ましくは水酸化アンモニウムのような水溶液中のアンモニアと反応させることにより製造することができる。適切な反応温度は、室温および７０℃の間である。
【００３２】
式ＸＩで表わされる化合物は、反応条件下で不活性である有機極性非プロトン性溶媒、好ましくはジクロロメタンにおいて、塩基の存在下において既知の方法で一般式ＸＩＩ
【化１０】
2008536842.tif 000012
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＰＧ2は式ＸＩで表わされる化合物の場合と同様に上記の意味を持つ）の化合物をエポキシド形成が可能な過酸化物化合物、好ましくはｍ−クロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）と反応させることにより製造することができる。適切な塩基は、特に炭酸水素ナトリウムの水溶液である。該反応は、好ましくは室温で実行してもよい。
【００３３】
式ＸＩＩで表わされる化合物は、既知の方法で、一般式ＸＩＩＩ
【化１１】
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（式中、ＰＧ2１は式ＸＩＩで表わされる化合物におけるＰＧ2と同じ意味を持ち、ＰＧ2１の好ましい代替物はＣ1-4−アルキル、好ましくはメチルなどの直鎖の低級アルキルラジカルである）で表わされる化合物を、一般式ＸＩＶ
【化１２】
2008536842.tif 000014
（式中、Ｒ1およびＲ2は上記の意味を持つ）で表わされる化合物と反応させることによって、さらに必要に応じて、保護基ＰＧ2１を希望する任意の保護基ＰＧ2と既知の方法で交換することによって製造することができる。該反応は、トルエンまたはキシレンなど反応条件下で不活性な有機溶媒において、および共沸蒸留によって水と分離される酸の存在下において実行することができる。適切な酸は、例えば酢酸またはプロピオン酸である。有利なことに、操作はルイス酸、例えばフェニルボロン酸などの触媒の添加も行う。適切な反応温度は、室温および溶媒または混合溶媒の沸点の間、例えば約１２０℃である。
【００３４】
式ＸＩＩＩおよび式ＸＩＶで表わされる化合物はそれ自体既知であるか、または既知の方法で既知の化合物から製造することができる。
【００３５】
式ＩＶで表わされる化合物は、新規薬理活性物質の製造、例えば式Ｉで表わされる化合物の製造のための中間生成物として都合よく適切な新規化合物である。
【００３６】
Ｒ4が水素を意味する式ＩＶで表わされる化合物は、既知の方法で、例えば一般式ＸＶ
【化１３】
2008536842.tif 000015
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は上記の意味を持ち、ＰＧ2は分枝または直鎖Ｃ1-4−アルキルラジカル、好ましくは第三ブチルなどの酸性溶媒において分離される炭酸保護基を表わす）で表わされる化合物から保護基ＰＧ3を分離することによって製造することができる。
【００３７】
式ＸＶで表わされる化合物は、既知の方法で、例えば式Ｘ（式中、ＰＧ2は式ＸＶで表わされる化合物と同じ意味を持つ）で表わされる化合物を式ＩＩＩで表わされる化合物と反応させることによって製造することができる。この反応は、式ＩＩＩで表わされる化合物を式Ｉで表わされる化合物と反応させる工程ａ）において上述のように実行することができる。
【００３８】
式Ｉで表わされる化合物は、少なくともピラン環の３位および４位に、どちらの場合もキラル中心に隣接炭素原子を持ち、したがっていくつかの異性体が生じ得る。本発明の主題は、式Ｉで表わされる異性的に純粋な化合物およびこれらの異性体の混合物の両者である。式Ｉで表わされる光学活性化合物は、例えば式Ｉで表わされる化合物の異性体の混合物から、あるいは式ＩＩまたはＩＶで表わされる化合物の異性体の混合物から既知の方法で得ることができる。Ｒ9および／またはＲ10は芳香族または複素芳香族環系の一部ではない場合に式Ｉで表わされる化合物の異性体の混合物、または式ＩＩで表わされる化合物の異性体の混合物は、適切な光学活性な酸、例えばカンフルスルホン酸あるいはＤまたはＬ酒石酸との反応および得られた塩の分別結晶法によってそれぞれの光学対蹠地へ分別によっても得られる。式ＩＶで表わされる化合物の異性体の混合物は、適切な光学活性塩基との反応および得られた塩の分別結晶法によってそれぞれの光学対蹠地へ分別によっても得られる。
【００３９】
式Ｉで表わされる化合物は、さらに置換基Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7および／またはＲ8を持つ炭素原子にキラル中心を持ってもよい。それらのキラル中心は、適切なキラル中心が既知の方法で既に存在する式ＶＩＩＩで表わされる適切な化合物の選択または合成によって変わってもよい。
【００４０】
式Ｉで表わされる光学活性化合物は、部分的にはキラル合成によって直接製造することもできる。ピラン環３位のヒドロキシ置換基およびピラン環４位のＲ4ＮＳＯ2Ｒ3置換基が互いに立体化学的に明確なトランス位にある式Ｉで表わされる化合物を調整する場合、どちらの場合も出発点は適切な立体化学が予め決定されている式ＸＩで表わされるエポキシドでもよい。従って予め決定された立体化学を有する式ＸＩで表わされるエポキシドは、例えば式ＸＩＩで表わされるアルケンをキラル触媒、例えばヤコブセンの方法（例えばＷＯ ９１／１４６９４ Ａ１を参照）に従って（Ｓ，Ｓ）−（+）−Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルサリチリデン）−１，２−シクロヘキサンジアミノマンガン（ＩＩＩ）クロライド（＝「ヤコブセンの触媒」、「（Ｓ，Ｓ）―マンガン（ＩＩＩ）サレン」）を使用して既知の方法でエポキシド化することにより製造できる。例えば、ピラン環３位のキラル中心がＳ位にあり、ピラン環４位のキラル中心がＲ位にある式Ｉで表わされる化合物を製造する場合、反応条件下で不活性である有機溶媒、特にジクロロメタンにおいてキラル触媒、特に（Ｓ，Ｓ）−マンガン（ＩＩＩ）サレンおよび酸素ドナー、特に次亜塩素酸ナトリウム水溶液の存在下において式ＸＩＩの中間生成物を反応させることができる。有利的に、該反応は９．５および１１．５の間のｐＨ値で実行される。適切なｐＨ値を設定するために、好ましくはＮａ2ＨＰＯ4およびピリジンＮ−オキシドから成る緩衝液を反応混合液に加えることができる。適切な反応温度は、−１０℃および室温の間で、好ましくは０℃である。ピラン環３位のキラル中心がＲ位にあり、ピラン環４位のキラル中心がＳ位にある式Ｉで表わされる化合物を製造する場合は、手順は上記の説明と類似しているが、（Ｓ，Ｓ）−マンガン（ＩＩＩ）サレンの代わりに「（Ｒ，Ｒ）−マンガン（ＩＩＩ）サレン」が使用される。
【００４１】
２つの変種における、上記の式ＸＩで表わされるエポキシドの求核性開環反応において、概してピラン環の３位および４位の隣接置換基、すなわち水酸基およびアミノ基がそれぞれ互いにトランス位にある式Ｘで表わされる化合物が得られる。
【００４２】
式Ｉで表わされる化合物の薬理活性物質としての効果は、以下の背景から明らかである。
【００４３】
心臓のカリウムチャンネルを遮断する物質が、心血管疾患、特に心不整脈に対抗する作用物質として使用することができることは既に分かっている。心臓の外向きのカリウム電流を遮断することによって、心臓の活動電位を延長することができ、不整脈心疾患に有益な効果がある。この既知の治療例は、クラスＩＩＩの抗不整脈薬である。そのような非特異性カリウムチャンネル遮断薬の１つの問題は、別の心臓組織に対する効果に関して選択性が低いことである。したがって、比較的長いこと、特にクラスＩＩＩの抗不整脈薬は心電図（＝ＥＣＧ）においてＱＴ間隔の望ましくない延長および多形性心室性頻脈（「トルサード・ド・ポワント」）につながり、それによって結局望ましくない合併症例えば心室細動が引き起されるとされていた。そのため、心房のカリウム電流に選択的に作用することができるが心室のカリウム電流には作用しないカリウムチャンネル遮断薬が求められていた。以前発見された心臓内のＫV１．５カリウムチャンネルが心室ではなく専ら心房に位置するため、これらのＫV１．５カリウムチャンネル遮断化合物は、心房選択性の抗不整脈薬として適切であると考えられる。しかしながら、ＫV１．５カリウムチャンネルおよび他のカリウムチャンネルは、心臓内だけでなく例えば身体血管内にも存在する。したがって、必ずしもＫV１．５カリウムチャンネル遮断化合物が血管内のカリウムチャンネルの遮断によって血圧を上昇させる可能性を否定することはできない。血圧を上昇させる副作用のないＫV１．５カリウムチャンネル遮断化合物は、したがって好ましい。多くのＫV１．５カリウムチャンネル遮断化合物の投与で生じるその他の有害な副作用は、付加的なクラスｌ−抗不整脈性副作用および陰性変力作用である。
【００４４】
式Ｉで表わされる化合物は、特に明白に且つ選択的に心臓のＫV１．５カリウムチャンネルを遮断する作用によって区別される。特に良好な有効性および明白な心房選択的抗不整脈作用プロファイルに加えて、式Ｉで表わされる化合物は血圧の上昇、クラス１−抗不整脈性副作用および陰性変力作用など多くともわずかに有害な副作用しかない。したがって、式Ｉで表わされる化合物は大型の哺乳動物およびヒトにおいて、心血管疾患、特に心房細動、心房粗動および他の心不整脈の治療および／または予防に適用される。
式Ｉで表わされる化合物は比較的高い水溶性によってさらに特徴づけられ、特に置換基Ｒ10がＣ1-6−アルキルを意味し、フェニル−Ｃ1-4−アルキルまたはピリジニル−Ｃ1-4−アルキルであり、窒素原子がＲ10に直接結合し、したがって芳香族または複素芳香族環系の一部ではない式Ｉで表わされる化合物である。改善された水溶性はバイオアベイラビリティーの向上につながると予想され、したがって有機溶媒および／または溶解増加剤の量が減る、あるいは使用する必要性がない製剤処方が容易になる。
さらに、式Ｉで表わされる化合物は、ＫV１．３カリウムチャンネルの明らかな遮断効果を示す。ＫV１．３カリウムチャンネルは、免疫系の細胞に優先的に存在する。ＫV１．３カリウムチャンネル遮断と特に抗増殖および／または免疫抑制効果の間に関係がある（参照：Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６６  （２００１）  ９３６−９４４）。したがって、ＫV１．３カリウムチャンネルを遮断できる化合物、例えば式Ｉで表わされる化合物は、増殖性、慢性的炎症性および自己免疫性疾患の治療および／または予防に適していると考えられる。この点に関して自己免疫性疾患は、例えばアジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自閉症、自己免疫性アテローム性動脈硬化症、自己免疫性糖尿病、尿崩症、自己免疫性子宮内膜症、自己免疫性眼疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性血友病、自己免疫性肝炎、自己免疫性間質性膀胱炎、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性脊髄障害、自己免疫性心筋炎、自己免疫性神経障害、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性脈管炎、ベーチェット病、ベル麻痺、水疱性類天疱瘡、セリアック病、慢性疲労症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、グレーヴス疾患、ギラン−バレー症候群、橋本甲状腺炎、妊娠疱疹、ハンチントン病、ＩｇＡ腎症、免疫性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、ループスライム病、ミラー・フィッシャー症候群、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、腫瘍随伴性自己免疫性症候群、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、ペーロニー病、多腺内分泌欠損症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性糸球体腎炎、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、ラスムッセン脳炎、再発性多発性軟骨炎、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、皮膚硬化症、シェーグレン症候群、スティッフパーソン症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、側頭動脈炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症などである。さらに、ＫV１．３カリウムチャンネル遮断および代謝疾患の間に関係がある（参照：Ｊ．Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．， Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００３  Ｖｏｌ．１２  Ｎｏ．５，５５１−５５９）。したがって、ＫV１．３カリウムチャンネルを遮断できる化合物、例えば式Ｉで表わされる化合物または公開された国際特許出願ＷＯ ２００５／０３７７８０ （＝  ＵＳ  ２００５／０１４８６５９）において開示および請求された化合物について、それらの化合物は、また、代謝障害または中心性肥満、高血圧、特に動脈高血圧、インスリン耐性、特にＩＩ型糖尿病、耐糖能障害または耐糖能異常、異常リポ蛋白血症、特にＨＤＬコレステロール低下により生じた異常リポ蛋白血症を伴う高トリグリセリド血症、および高尿酸血症などの疾患の治療および／または予防に適していると考えられる。
【００４５】
本発明のアミノアルキル−アミドメチル−置換  ２−（４−スルホニルアミノ）―３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル誘導体あるいはＷＯ  ２００５／０３７７８０に開示されたアミドメチル−置換−２−（４−スルホニルアミノ）−３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル誘導体を、α−アドレナリン受容体拮抗薬（非選択的）、例えばトラゾリンまたはフェノキシベンザミン、α−アドレナリン受容体拮抗薬（選択的）、例えばドキサゾシン（メシレート）、プラゾシン（塩酸塩）（およびポリチアジド）、テラゾシン（塩酸塩）またはウラピジル、α２−アドレナリン受容体拮抗薬（中枢作用α２−アドレナリン受容体拮抗薬を含む）、例えばクロニジン、グアンファシン、酢酸グアナベンズ、メチルドーパおよびモキソニジン、抗狭心症薬、例えばベプリジル、β遮断薬、ジルチアゼム、ニカルジビン、ニフェジピン、硝酸塩、抗凝血薬、例えばダルテパリン、ダナパロイド、エノキサパリン、ヘパリン、チンザパリン、ワルファリン、抗血小板薬、例えばアブシキシマブ、アスピリン、アスピリンおよびジピリダモール（アグレノックス）、シロスタゾール、クロピドグレル、ジピリダモール、エプチフィバチド、チクロジピン、チロフィバン、クラスＩ抗不整脈薬などの抗不整脈薬、例えばナトリウムチャネル遮断薬、ジソピラミド、フレカイニド、リドカイン、メキシレチン、モリシジン、プロカインアミド、プロパフェノン、キニジン、トカイニド、またはクラスＩＩ抗不整脈薬、例えばβ遮断薬、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルベジロール、エスモロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソトロール、チモロール、またはクラスＩＩＩ抗不整脈薬、例えばカリウムチャンネル遮断薬、アミオダロン、アジミライド、ベプリジル、ドフェチリド、イブタリド、ソタロール、テジサミル、またはクラスＩＶ抗不整脈薬、例えばカルシウムチャネル遮断薬、ジルチアゼム、ベラパミル、β−アドレナリン作動性受容体拮抗薬（β遮断薬）、例えばアセブトロール、アルプレノロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、ブプラノロール、カラゾロール・カルテオロール、セリプロロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロールおよびチモロール、カルシウムチャネル遮断薬（＝カルシウム拮抗薬）、例えばアムロジピン、ベプリジル、フェロジピン、イスラジピン、ニカルジビン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ガロパミル、ベラパミル、ジルチアゼムおよびフェンジリン、利尿薬、例えばアデノシンＡ１受容体拮抗薬、チアシド系利尿薬、サイアザイドアナログ、ループ利尿薬、カリウム保持性利尿薬、炭酸アンヒドラーゼ阻害剤および／またはエタクリン酸から選択される少なくとも１つの他の心血管作用薬化合物と（固定した組合せあるいはどちらかの順で）併用投与した場合、有益な効果を期待してもよい。適切なアデノシンＡ１受容体拮抗薬は、１，３−ジプロピル−８−シクロペンチルキサンチン（ＤＰＣＰＸ）、４−���（２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ]４−トランス−シクロヘキサノール、（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−１−（２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−Ｌ−プロリンアミド、８−シクロペンチル−３−Ｎ−［３−（（３−（４−フルオロスルフォニル）ベンゾイル）−オキシ）−プロピル］−１−Ｎプロピル−キサンチン（ＦＳＣＰＸ）、ＢＧ−９９２８  （ＣＡＳ  Ｎｏ．  ３４００２１−１７−２）、ＣＰＸ  （ＣＡＳ  Ｎｏ．  １０２１４６−０７−６）、ＦＫ−３５２  （ＣＡＳ  Ｎｏ．  １４３８８１−０８−７）、ＦＫ−４５３  （ＣＡＳ  Ｎｏ．  １２１５２４−１８−３）、ＦＫ−８３８  （ＣＡＳ  Ｎｏ．  １３１１８５−３７−０）、ＦＲ−１６６１２４  （ＣＡＳ  Ｎｏ．  １７１０５０−４５−６）、ＫＷ−３９０２  （ＣＡＳ  Ｎｏ．  １３６１９９−０２−５）、ＫＷ−３９０２  （ＣＡＳ  Ｎｏ．  １３６１９９−０２−５）、Ｎ−０８６１  （［＋／−］Ｎ６−エンドノルボルナン−２−イル−９−メチルアデニン、 ＣＡＳ  Ｎｏ．  １４１６９６−９０−４）、ＷＲＣ−０３４２  （ＣＡＳ  Ｎｏ．  １７５０９７−３７−７）、 ＷＲＣ−０５７１（８−（Ｎ−メチルイソプロピル）アミノ−Ｎ６−（５’−エンドヒドロキシ−エンドノルボルニル）−９−メチルアデニン、ＣＡＳ  Ｎｏ．  １７５０９７−３５−５）、ｎａＸｉｆｙｌｌｉｎｅ（ＣＡＳ  Ｎｏｓ．  １６６３７４−４８−７および１６６３７４−４９−８） または任意の生理的に適合可能な互変異性体、塩、溶媒和物、プロドラッグまたはそのエステルから成るグループから選択することができる。適切なチアシド系利尿薬は、アルチアジド、ベメチジド、ベンドロフルメサイアザイド、ベンチルヒドロクロロチアジド、ベンズチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、シクロチアジド、シクロペンチアジド、エチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチルクロチアジド、パラフルチジド、ポリチアジド、テクロチアジド、トリクロルメチアジドまたは任意の生理的に適合可能な互変異性体、塩、溶媒和物、プロドラッグまたはそのエステルから成るグループから選択することができる。適切なチアジドアナログ利尿薬は、クロラミノフェナミド、クロルタリドン、クロフェナミド、クロパミド、クロレキソロン、フェンキゾン、インダパミド、メフルシド、メトラゾン、キネサゾン、トリパミドおよびキシパミドから成るグループから選択することができる。適切なループ利尿薬は、アゾセミド、ブメタニド、フロセミド、ピレタニド、トルセミドまたは任意の生理的に適合可能な互変異性体、塩、溶媒和物、プロドラッグまたはそのエステルから成るグループから選択することができる。適切なカリウム保持性利尿薬は、アミロリド、カンレノ酸カリウム、スピロノラクトン、トリアムテレンまたは任意の生理的に適合可能な互変異性体、塩、溶媒和物、プロドラッグまたはそのエステルから成るグループから選択することができる。適切な炭酸アンヒドラーゼ阻害剤利尿薬は、アセタゾラミド、ブリンゾールアミド、ジクロロフェナミド、ドルゾルアミド、エトキスゾラミド、インジスラム・メタゾラミド、ゾニサミドまたは任意の生理的に適合可���な互変異性体、塩、溶媒和物、プロドラッグまたはそのエステルから成るグループあるいはαおよびβ−アドレナリン受容体混合拮抗薬、例えばカルベジロールまたはラベタロールから選択することができる。様々なアデノシン、ジゴキシン。
【００４６】
薬理試験法の説明
引用した実施例番号は、下記に述べる製造例に関する。
【００４７】
１． 該物質のＫV１．５カリウムチャンネル遮断効果のｉｎ−ｖｉｔｒｏ試験
該物質のＫV１．５カリウムチャンネル遮断効果は、既知の試験モデルにおいて、またはこの試験モデルと同じように実証される（参照：Ｗ．  Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．， Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ＴｏＸｉｃｏｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４  （１９９５）  １−７）。この試験モデルにおいて、チャイニーズハムスターの卵細胞の細胞株（＝「チャイニーズハムスター卵母細胞」、「ＣＨＯ」）が使用されるが、これは単細胞から生じて安定してＫV１．５チャンネルを発現する。ＲｂＣｌを含有する培養液または「ローディングバッファー」（全てｍＭ値：ＲｂＣｌ  ５、ＮａＣｌ  １４０、ＣａＣｌ2  ２、ＭｇＳＯ4  １、ＨＥＰＥＳ緩衝液  １０、グルコース  ５）において一晩培養することによって、Ｎａ+／Ｋ+ＡＴＰアーゼの影響下でＲｂ+ｗｐ用いて前述の卵母細胞をロードする。その後、参照基準として阻害薬のない状態で卵母細胞の一部を培養し、一方、式Ｉで表わされる各抑制試験物質の存在下において卵母細胞の別の部分を培養する。次に、細胞外のカリウムイオン濃度を増大させて卵母細胞を脱分極化し、卵母細胞のＫV１．５カリウムチャンネルを開く。阻害薬非存在下で、Ｒｂ+イオンはＫV１．５カリウムチャンネルを通じて周囲の液体に流れ込む。一方式Ｉで表わされる抑制試験物質の存在下においては、Ｒｂ+イオンは卵母細胞内に固定されたままである。式Ｉで表わされる試験物質のＫV１．５カリウムチャンネル遮断効果の程度は、参照基準に対する原子吸光分析によって周囲の液体内のＲｂ+イオン濃度を測定することにより決定する。
【００４８】
チャイニーズハムスター卵母細胞（上を参照）を既知の、ＲｂＣｌ含有ＣＨＯ細胞用培養液で培養し、９６サンプル容量サンプルプレートのサンプルウエル（「９６枚のウエルプレート」）に入れた。卵母細胞を一晩増殖させ、卵母細胞の単層を得た。次に、まず培養液をピペットで除去し、各サンプルウエルを１回につき１００μＬの低カリウムイオン濃度のプレインキュベーション緩衝液（全てｍＭの値：  ＫＣｌ  ５、ＮａＣｌ  １４０、ＣａＣｌ2  ２、ＭｇＳＯ4  １、ＨＥＰＥＳ緩衝液１０、グルコース５）で３回洗浄した。次に各試験物質の溶液（ＤＭＳＯ内の原液、プレインキュベーション緩衝液で希釈、試験バッチ１０μＭ内の最終濃度）あるいは溶媒（陰性対照として）の５０μＬを各サンプルウエルに加え、どちらの場合も室温で１０分間培養した。次に高カリウムイオン濃度の刺激用緩衝液５０μＬ（ＫＣｌ １４５ ｍＭ、ＮａＣｌ ０ ｍＭ、さもなければプレインキュベーション緩衝液と同じ）を各サンプルウエルに加え、サンプルを室温で１０分間さらに培養した。どちらの場合も、各サンプルウエルから卵母細胞の周囲の液体８０μＬを別々に分析用サンプルプレートのサンプルウエルに移し、液体中のＲｂ+イオン濃度を原子吸光分析によって測定した。該試験物質は各々二度試験した。陽性対照として既知の高濃度カリウムチャンネル４−ＡＰ遮断薬（ＫV１．５チャンネル用１００×ＩＣ50）を使用することによって、Ｒｂ+流出のＫV１．５成分を表わす信号部分を測定した。これにより、Ｒｂ+流出のどの部分が４−ＡＰに左右され、したがって、ＫV１．５チャンネルに割り当てられるか判断することができるようになった。１０μＭの濃度で使用した物質については、Ｒｂ+流出は少なくとも５０％減少し、半最大有効濃度を決定できるように低濃度の該試験物質で追試を行なった。どちらの場合も、式Ｉで表わされる試験物質の半最大阻害濃度（ＩＣ50）を固有変数として求めた。
【００４９】
この試験モデルにおいては、次の表１に示す式Ｉで表わされる該試験物質は以下に示すＩＣ50値を示した。
【００５０】
第１表：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける該試験物質のＫV１．５カリウムチャンネル遮断効果
【表１】
2008536842.tif 000016
【００５１】
２． 該物質のＫV１．３カリウムチャンネル遮断効果のｉｎ−ｖｉｔｒｏ試験
該物質のＫV１．３カリウムチャンネル遮断効果を既知の試験モデル（例えばＧｅｎｉｏｎ社、ハンブルグ）により、あるいはこの試験モデルと同様に実証する（参照：Ｊ．Ｐｌａｓｅｋ ａｎｄ Ｋ． Ｓｉｇｌｅｒ， Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ３３ （１９９６） １０１−１２４）。この試験モデルにおいて、安定してＫV１．３カリウムチャンネルを移入したチャイニーズハムスターの既知の卵母細胞（=ＣＨＯ）を使用する。移入した細胞における該細胞特有のＫV１．３カリウムチャンネル活性の遮断には、およそ−４０ｍＶから−３０ｍＶへの膜電位の正の変化が伴うが、平行して試験した野生型のＣＨＯ細胞においては膜電位の有意な変化は認められない。したがって、膜電位の変化はＫV１．３カリウムチャンネル活性の減少に関係する。ＫV１．３カリウムチャンネルを例えば式Ｉで表わされる物質による遮断およびその結果生じる膜電位の変化によって、卵母細胞の細胞内区画における膜電位感受性蛍光色素が蓄積し、その結果蛍光の増大が生じる。したがって、卵母細胞の膜電位の変化は膜電位感受性色素の蛍光の増加量によって間接的に測定される。
【００５２】
該細胞は、市販の移入試薬（ＤＭＲＩＥ−Ｃ、ドイツＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて既知の方法でＫV１．３プラスミドを移入した。移入の成功は、免疫蛍光検査法およびカリウムイオン流の「パッチクランプ」試験によって確認した。Ｔｅｃａｎ社（ドイツ）のＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ蛍光リーダーを使用して蛍光測定を行なった。いずれの場合も、卵母細胞において濃度１０μＭの式Ｉで表わされる物質でＫV１．３カリウムチャンネル遮断によって引き起こされた蛍光強度の増加量を固有の変数として決定した。蛍光強度の増加量は、いずれの場合も標準物質マルガトキシンによって引き起こされる蛍光強度の増加量と比較した割合（％）で示した。マルガトキシンは、選択的なＫV１．３カリウムチャンネル遮断薬として知られている（例えば次を参照：Ｍ．Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，  Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８ （１９９３） １８８６６−１８８７４）。
【００５３】
この試験モデルにおいて、次の第２表に示す式Ｉで表わされる該試験物質は、以下に示す割合であった。
【００５４】
第２表：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける該試験物質のＫV１．３カリウムチャンネル遮断効果
【表２】
2008536842.tif 000017
【００５５】
３． ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるラット心臓の心房に対する該物質の機能的有効性試験
該物質の機能的な抗不整脈的有効性は、以下に述べる試験モデルにおいて実証される。この試験モデルにおいて、ラットの左心房において式Ｉで表わされる該ＫV１．５遮断物質によって機能的不応期がどの程度延長されるか決定される。不応期は、基礎刺激および追加の刺激の間の新たな収縮を引き起こすことができる最小経過時間である。機能的不応期の延長の程度は、本発明による該物質の抗不整脈的有効性の尺度である。機能的不応期は、電気的に刺激した標本で前の収縮からのどれくらいの経過時間で新たな収縮が付加的な電気刺激によって引き起こされるかという試験によって決定される。
【００５６】
屠殺した直後のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ社， Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ， ドイツ）から心臓を取り出した。左心房を分離し、温度管理（３０℃）され曝気（Ｏ2 ９５％およびＣＯ2 ５％）され修飾タイロード液（全てｍＭ値： ＮａＣｌ １３７、ＫＣｌ ２．７、ＣａＣｌ2 １．８、ＭｇＣｌ ０．８、Ｎａ−ＨＣＯ3 １１．９、ＮａＨ2ＰＯ4 ０．６、グルコース５）で満たされた器官バス内の力変換器に固定した。規則的な収縮を引き起こすため、標本を電気的に刺激した（矩形パルス、パルス振幅３．５×閾値刺激、パルス幅１．５ｍｓ、周波数１Ｈｚ）。最初に、基礎刺激の他にエキストラパルスを適用することにより機能的不応期（それ以上の付加的な収縮が生じなくなるまで短縮される前の基礎刺激からの経過時間）の初期値を決定した。次に、式Ｉで表わされる物質濃度を上げつつ（０．１〜３２μＭ）２０分間隔で累積的に添加し、それぞれの場合に添加の１８分後に不応期を決定した。測定前に、試験物質の原液（１００％ＤＭＳＯ中で３．２および０．３２ ｍＭ）を製造した。器官バス（容積２５ｍＬまたは１００ｍＬ）における該物質の所望の最終濃度（０．１〜３２μＭ）を得るために、これらの原液の対応量を器官バスに注入した。
【００５７】
いずれの場合も、式Ｉで表わされる各物質の１０μＭまたは３２μＭの心房標本への添加後数ミリ秒で観察されたラット心臓の左心房において機能的不応期（ＦＲＰ）の延長を固有の変数とした。
【００５８】
この試験モデルにおいて、次の第３表に示す式Ｉで表わされる該試験物質は、以下に示す強い抗不整脈的有効性を表わす高い値の不応期の延長を示した。
【００５９】
第３表：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける該試験物質（１０μＭまたは３２μＭ）のラット心臓左心房に及ぼすＦＲＰ延長効果
【表３】
2008536842.tif 000018
【００６０】
４． ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける該試験物質のモルモット心臓に対する機能的有効性の試験
以下に示す試験モデルにおいて、本発明による該物質は心室の再分極に対して軽度の有害な不整脈誘発効果を示す。このために、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて式Ｉで表わされる化合物の有効不応期（ＥＲＰ）に及ぼす影響およびモルモット心臓に及ぼす他の影響変数を調べた。この試験モデルにおいて、本発明に準拠しないＨＥＲＧおよび／またはＫVＬＱＴ１チャンネルも遮断する非選択的カリウムチャンネル遮断薬は、心電図（=ＥＣＧ）においてＥＲＰおよびＱＴ時間の有害な延長を引き起こした。ＱＴ時間も同様に心臓における再分極の尺度である。該物質によるＥＲＰおよびＱＴ時間の延長は、どちらも各々独立して有害なトルサード・ド・ポワント不整脈発生のリスクの指標として解釈される。さらに、いずれの場合も、心室における刺激の伝導速度の尺度としてＱＲＳ間隔をＥＣＧから決定した。該試験物質によって引き起こされたＱＲＳ間隔の延長でさえも有害な催不整脈副作用のリスクと関係がある。したがってこの試験モデルにおいて、ＥＲＰおよびＱＴの時間延長の欠如は低リスクを意味するが、これに反して適切なＥＲＰおよびＱＴ延長の発生は有害な不整脈誘発効果のリスクが高いことを意味する。またＱＲＳ延長の欠如は心室において影響を受けない刺激の伝導を示すため、式Ｉで表わされる該物質によるＱＲＳ間隔の延長の欠如は、有害な催不整脈副作用のリスクが低いことを示す。逆に、一般的にクラスＩ不整脈治療薬によって引き起こされるＱＲＳの延長は、伝導速度の低下を示し、心室細動や心室性頻脈の発生を促進する可能性がある。
【００６１】
オスのモルモット（Ｄｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）に麻酔（ケタミン５０ｍｇ／ｋｇ、キシラジン１０ｍｇ／ｋｇ）を施行し、各々に頚静脈から式Ｉで表わされる化合物または賦形剤を静脈内投与した。双極刺激カテーテル（刺激周波数５Ｈｚ）を他の頚静脈を経由してモルモットの右心室に挿入した。ステーサム圧力変換器に接続され頚動脈内に挿入したカテーテルによって動脈圧を測定した。針電極を経由してＥＣＧを記録した。測定データをＡ／Ｄ変換器によってデジタル化し、適切なソフトウェアをインストールしたコンピューター（Ｐｏｎｅｍａｈ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ｇｏｕｌｄ社（米国）により記録した。４５分の平衡時間後に、モルモットに式Ｉで表わされる化合物あるいは賦形剤の用量を増加させながら１２分間隔で静脈内（=ｉ．ｖ．）投与した。最初の投与前およびいずれの場合も式Ｉで表わされる物質の用量（０．１〜最大３０μｍｏｌ／ｋｇ）を増大投与の１分後、有効不応期を測定した。このため、いずれの場合も５回の通常の刺激後に追加のパルスを適用し、前のパルスからのその経過時間を心臓活動が起きるまで増大した。観察した時間間隔は、心室筋のＥＲＰに対応する。
【００６２】
該試験物質が血圧に及ぼし得る効果を検出するため、同一の試験モデルにおいて該物質の各投与後に収縮期および拡張期血圧を決定し、以前の血圧レベルと比較した。該物質の各投与の１分および８分後にパラメーターを自動的に記録した。第４表は、さらに以下に示す式Ｉで表わされる該化合物による収縮期血圧の変化（賦形剤によるマイナス効果）を示す。表の該化合物によって血圧は適切に上昇しなかった。
【００６３】
この試験モデルにおいて、以下の第４表に示した式Ｉで表わされる該試験物質は、以下の効果を示した。有意水準Ｐ<０．０５のｔ検定で統計的検定を行い、統計的に有意な効果のみを示した。以下の第４表において、指標「ｎ．ｓ．」（=「統計的に有意でない」）は対応する実施例の物質がリストされた測定変数に対して統計的に有意な影響を及ぼさないことを意味する。
【００６４】
第４表：モルモット心室におけるＥＲＰ、ＱＴおよびＱＲＳ間隔に対する該試験物質（１０または３０μｍｏｌ／ｋｇ 静脈内投与の１分後）の効果および同時に測定したｉｎ ｖｉｖｏにおける収縮期血圧の変化（ｎ．ｓ．＝統計的に有意でない、負の値は短縮または減少を示す。）
【表４】
2008536842.tif 000019
【００６５】
本発明による該化合物の特に良好な適合性は、さらなる薬理試験モデルにおいて実証することができる。したがって、例えばモルモットの心筋標本のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において式Ｉで表わされる該化合物は高々軽度のクラスＩ不整脈治療薬副作用を有するだけであることを実証することができる。さらに、ラット心臓のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルおよびモルモットの心臓の別のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて式Ｉで表わされる該化合物は高々軽度の陰性変力作用を引き起こすだけであることを実証することができる。
【００６６】
式Ｉで表わされる該化合物は、従来の医薬組成物で投与してもよい。個々の場合に、特別な剤形を適応してもよい。使用する用量は個々に異なり、もちろん治療する疾患のタイプおよび使用する物質によって異なる。しかしながら、一般に、有効成分を０．２〜５００ｍｇ、特に１０〜２００ｍｇを含む剤形、個々の用量当たりの有効成分はヒトおよび大型の哺乳動物への投与に適している。
【００６７】
本発明による該化合物は、投与に適する従来の薬剤添加物および／または担体と共に固体または液体の医薬組成物に含ませてもよい。該医薬組成物は、液体または固体の担体などの補助剤を使用する通常の方法によって生成してもよい。使用する医薬組成物の種類は、当業者にとっては仕様および／または該技術の一般知識から明らかである。
【００６８】
固体の組成物の例は、コートタブレット、マイクロタブレットおよびチュアブル錠を含むタブレット、マイクロカプセルを含むカプセル、粉末または顆粒、クリーム剤およびゲル剤を含む坐剤または軟膏剤などである。
固体の剤形の製造のために、作用物質は例えば従来の方法で補助剤および／または担体と混合し、湿潤または乾燥顆粒状であってもよい。顆粒または粉末をカプセルに直接詰めるか、または従来の方法でタブレットコアに押し固めてもよい。必要に応じて、これらを既知の方法でコーティングしてもよい。
【００６９】
活性物質の溶液、非経口液、懸濁液または乳剤などの液状組成物は、水、オイルなどの通常の賦形剤および／またはポリエチレングリコールなどの懸濁剤を含んでもよい。さらに、保存剤、調味剤などその他の補助剤を加えてもよい。
【００７０】
したがって、本発明の医薬組成物は、固体または液体のいずれかで、例えば経腸的、経口的、非経口的（筋肉内または静脈内）、経直腸的または局部的（局所的）に投与される。そのような製剤に適している添加剤は、薬学的に通常の液体または固体の担体、賦形剤および増量剤、溶剤、乳化剤、潤滑剤、錠剤崩壊剤、調味料、着色剤および／または緩衝剤である。言及される頻繁に使用される補助剤は、炭酸マグネシウム、２酸化チタン、ラクトース、マニトールおよび他の糖類または、糖アルコール類、タルク、乳汁タン白、ゼラチン、デンプン、セルロースおよびその誘導体、魚肝油、ヒマワリ、落花生またはゴマ油のような動植物油、ポリエチレングリコールおよび例えば滅菌水のような溶媒、グリセロールなどの一価または多価アルコールなどである。
【００７１】
本発明の該化合物は、化合物、より具体的にはここに開示する特定の化合物の存在のために一般に本発明の重要で新規実施例である医薬組成物として投与される。本発明の実施例において、本発明の１つ以上の医薬組成物成分で満たされた１つ以上の容器から成る薬剤パックまたはキットを提供する。使用説明または医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された書式の注意、該機関によるヒトまたは動物投与のための製造、使用または販売の承認を反映する注意など様々な文書資料が、そのような容器に付随することもある。
【００７２】
以下の実施例は、本発明について、その範囲を限定するものではないが、さらに説明することを意図している。
【００７３】
実施例１
（３Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−｛６−［２−ベンジルピペラジン−１−イル］］−２−オキソエチル]−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−４−イル}−４−ｎプロピルベンゼンスルホンアミド
【化１４】
2008536842.tif 000020
【００７４】
Ａ） ５Ｌのフランジフラスコに４−ヒドロキシフェニル酢酸メチル（１７５．６ｇ）、フェニルボロン酸（１２８．９ｇ）およびｍ−キシレン（３．５Ｌ）を満たした。この混合物に、３−メチルブタ−２−エナール（８８．９ｇ）および氷酢酸（１３０ｍＬ）を添加した。ディーン・スターク装置を使用して、得られた混合物を窒素下、１４０℃で加熱した。ＨＰＬＣ−ＭＳ（高速液体クロマトグラフィー質量分析法）により反応を観察し、それ以上進展が見られない場合に（およそ７２時間）停止した。その後、反応混合物を室温まで冷却、濾過して、真空内で溶媒を除去した。残渣物を１：１  ｖ／ｖ（体積比）のＴＨＦ／水酸化アンモニウムに溶解し、２時間撹拌した。真空内でＴＨＦを除去し、酢酸エチルを添加した。有機質層を分離し、１Ｍ（１モル）の水酸化ナトリウム、ブラインで洗浄して、Ｎａ2ＳＯ4にて乾燥させ、さらに溶媒を真空内で除去した。粗生成物（１５５ｇ）をヘキサン／酢酸エチル１５：１〜１０：１  ｖ／ｖ（体積比）の勾配溶出法を使用して乾燥したフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、２，２−ジメチル−２Ｈ−クロメン−６−イル）酢酸メチルエステル１０６ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（δｐｐｍ、ＣＤＣｌ３）：７．００ （ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．１６，  ２．３２Ｈｚ），  ６．８９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ２．３２Ｈｚ）， ６．７２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．２４  Ｈｚ），  ６．２９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ９．８０Ｈｚ），  ５．６０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ９．８０Ｈｚ），  ３．６９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５１  （ｓ，  ２Ｈ），  １．４２  （ｓ，  ６Ｈ）
ＨＰＬＣ−ＭＳ  （ＥＳ＋，  １０ｅＶ）：  ２３３．２５（Ｍ＋，  １０％），  １７３．１６（［Ｍ−Ｃ２Ｈ３Ｏ2］+，  １００％）．
【００７５】
Ｂ）  １Ｌのフランジフラスコに（２，２−ジメチル−２Ｈ−クロメン−６−イル）酢酸メチルエステル（製造法については上を参照）（５０ｇ）、５００ｍＬのイソプロパノールおよびＴｉ（ＯＥｔ）４（０．７等量）を満たした。得られた溶液を還流下で１６時間加熱した。該反応を複合液体クロマトグラフィー／質量分析（＝ＬＣＭＳ）によって観察し、該反応が完了した時点で停止した。全出発原料の転換（５％のエチルエステルの形成）後に、該反応混合物を室温まで冷却した。水（５０ｍＬ）を滴下して添加し、真空内で溶媒を除去した。得られた固体を濾過し、酢酸エチルで洗浄した。酢酸エチル溶液をシリカを通して濾過し、真空内で蒸発させて、（２，２−ジメチル−２Ｈ−クロメン−６−イル）酢酸イソプロピルエステル５６ｇを得て、さらに精製を行わずに次のステップで使用した。
１Ｈ−ＮＭＲ  （δ  ｐｐｍ， ＣＤＣｌ３）： ７．００  （ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．０８，  ２．２０Ｈｚ），  ６．８９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝  １．９６Ｈｚ），  ６．７１  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．０８Ｈｚ），  ６．２８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ９．７６Ｈｚ），  ５．６０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ９．８０Ｈｚ），  ５．００  （ｓｅｐｔｅｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝  ６．１２Ｈｚ），  ３．４６  （ｓ，  ２Ｈ），  １．４２  （ｓ，  ６Ｈ），  １．２２  （ｄ，  ６Ｈ，  Ｊ＝  ６．１２Ｈｚ）
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：  ２６１．０３  （［Ｍ＋Ｈ］＋，１１％），  ２１８．９１  （［Ｍ−Ｃ３Ｈ７］＋，１００％），１７２．８４ｓ（［Ｍ−Ｃ４Ｈ７Ｏ2］＋，９７％）。
【００７６】
Ｃ）（Ｓ，Ｓ）−（+）−Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルサリチリデン）−１，２−シクロヘキサンジアミノマンガン（ＩＩＩ）クロライド（「ヤコブセンの触媒」、５ ｍｏｌ％）触媒およびピリジンＮ−酸化物（０．５ 等量）を０℃のクロメン（１等量）のジクロロメタン溶液に添加した。冷却したＮａＨＰＯ4（０．０５Ｍ）水溶液および新鮮なＮａＯＣｌ（０．６Ｍ）を混合物に加えた。反応を、０℃で６時間撹拌させた。該反応物にジクロロメタンおよびシーライト（登録商標）を加え、シーライト（登録商標）で覆われたシンターで濾過した。濾過液の有機質層を水層から分離し、ブラインで洗浄してＭｇＳＯ4で乾燥させた後、減圧下で蒸発させた。得られた黒色油をヘプタン／酢酸エチル内で再結晶させた（最初にヘプタンを添加し、次にエポキシドが完全に溶解するまで酢酸エチルを添加した）。（（３Ｓ，４Ｒ）−２，２−ジメチル−１アール，７ｂ−ジヒドロ−２Ｈ−１，３−ジオキサ−シクロプロパ［ａ］ナフタレン−６−イル）酢酸イソプロピルエステルが白い針として得られた。
【００７７】
ＨＰＬＣ−ＭＳ  （ＥＳ＋）：  Ｒｔ  ＝ １．２６ｍｉｎｓ  ２３５．２６（［Ｍ−Ｃ３Ｈ７Ｏ］＋，  １００％），  ２７７．４０  （Ｍ＋，  ４０％），  ３１２．５１  （１３％），  ３１７．４９  （１５％）．
【００７８】
Ｄ）上記のように製造した（（３Ｓ，４Ｒ）−２，２−ジメチル−１ａ，７ｂ−ジヒドロ−２Ｈ−１，３−ジオキサ−シクロプロパ［ａ］ナフタレン−６−イル）酢酸イソプロピルエステルをＥｔＯＨ：ＮＨ４ＯＨ（６：５、ｖ／ｖ）溶液で処理して０．２Ｍのエポキシド溶液を製造した。該溶液を５０℃に１６時間加熱した。冷却しながら溶媒を真空内で除去した。得られた粗生成物は、酢酸エチル、ジクロロメタン、ＭｅＯＨの勾配溶出法を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製することができた。純粋な（（３Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル）−酢酸イソプロピルエステル７．３ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （δ  ｐｐｍ， ＣＤＣｌ３）：  ７．２８  （ｓ，  １Ｈ），  ７．０５  （ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝  １．７２，  ８．２８Ｈｚ），  ６．７４  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．３２Ｈｚ），  ５．００  （ｓｅｐｔｅｔ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ６．３６Ｈｚ）， ３．７０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ９．７６Ｈｚ）， ３．５１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ９．５２Ｈｚ），  ２．９０  （ｂｒｏａｄ，  ｓ，  ３Ｈ）， １．４７  （ｓ，  ３Ｈ），  １．２３  （ｄ，  ６Ｈ，  Ｊ  ＝  ６．３６Ｈｚ），  １．１８  （ｓ，３Ｈ）
ＨＰＬＣ−ＭＳ  （ＥＳ＋）：Ｒｔ  ＝  １．０９ｍｉｎｓ  ２３５．２９  （［Ｍ−Ｃ３Ｈ７Ｏ］＋，  １００％），  ２６３．３６  （１６％），  ２７７．４２  （［Ｍ−ＮＨ2］＋，  ２２％），  ２９４．４８  （Ｍ＋，  ３８％） （［Ｍ＋Ｎａ］＋，  ３５％）。
【００７９】
Ｅ）  上記のように得られた（（３Ｓ，  ４Ｒ）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル）−酢酸イソプロピルエステル（５４ｇ）をジクロロメタン（１０倍量）に溶解し、Ｂｏｃ無水物（１００ｇ）、トリエチルアミン（７８ｍＬ）およびＤＭＡＰ（２２．５ｇ）を添加した。得られた溶液を一晩振盪した。溶媒を真空内で濃縮し、残渣物をヘプタン：酢酸エチル６：１を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製して、６６．７ｇの生成物を得た。（３Ｓ，  ４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル）酢酸イソプロピルエステル（モノプロテクト生成物）および（３Ｓ，  ４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）酢酸イソプロピルエステル（ジプロテクト生成物）をモノプロテクト生成物によって２：１の混合物として分離した。
１Ｈ−ＮＭＲ  （δ  ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３）：  ７．１（複合体， ３Ｈ），  ６．８５ （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ９．０４Ｈｚ），  ６．７５  （ｄ，  ０．５Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．３２Ｈｚ），  ５．０  （複合体， ２Ｈ），  ４．９０  （ｄ，  １Ｈ，  １１．７Ｈｚ），  ４．７８  （複合体， １Ｈ），  ３．９２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  １１．７Ｈｚ），  ３．５０  （ｓ，），  ３．４９  （ｓ，  ），  １．６３  （ｓ，  ９Ｈ），  １．４８  （複合体），  １．２２  （複合体， １２Ｈ）
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：モノプロテクト  Ｒｔ  ＝  １．７１  非割当、ジプロテクト Ｒｔ＝１．８６  非割当
【００８０】
Ｆ） 上記のように得られた（３Ｓ，  ４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル）酢酸イソプロピルエステルおよび（３Ｓ，  ４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）酢酸イソプロピルエステルの混合物（６６．７ｇ）をＴＨＦ：Ｈ2０（１：１、１．４Ｌ）およびＬｉＯＨ（１４．７ｇ）の溶液内で１６時間撹拌した。該反応をＨＰＬＣ−ＭＳで観察した。続いてＬｉＯＨ（０．２６ｇ）をさらに添加し、該反応物をさらに４時間振盪して、ＩＰＣ分析によって反応の完了を判断した。１Ｍ  ＨＣｌを滴下して該溶液を酸性化し、酢酸エチルにて抽出した。混合有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、真空内で濃縮して（３Ｓ，  ４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル）酢酸（モノプロテクト生成物）および（３Ｓ，  ４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）酢酸（ジプロテクト生成物）の混合物（５９ｇ）の白色固体を得た。
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ+）：モノプロテクト  Ｒｔ＝１．１３  ３７４．１９  （［Ｍ＋Ｎａ］＋，  ７０％），  ２９６．０７  （［Ｍ−Ｃ４Ｈ８］＋，  ３０％），  ２３４．９５  （［Ｍ−Ｃ５Ｈ１０ＮＯ2］＋，５５％），  １４６．８２  （１００％）；ジプロテクト  Ｒｔ  ＝  １．５７  ９２５．４６  （［２Ｍ＋Ｎａ＋Ｈ］＋，  ２０％）， ４７４．２８  （［Ｍ＋Ｎａ＋Ｈ］＋，  ４０％），  ３２０．１０  （５０％），  ２３２．９３（１００％）
【００８１】
Ｇ）上記のように得られた（３Ｓ，４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル）酢酸および（３Ｓ，  ４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）酢酸の混合物（４．０ｇ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解した。ＤＩＣ（１．６８ｍＬ）、ＨＯＢＴ（１．４６ｇ）およびＮ−ベンジルピペラジン（１．９０ｇ）を添加し、反応物を室温で１６時間振盪した。真空内で溶液を濃縮し、得られた（３Ｓ，  ４Ｒ）−｛６−［２−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）−２−オキソ−エチル］−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマンー４−イル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（モノプロテクト生成物）および（３Ｓ，４Ｒ）−炭酸６−［２−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）−２−オキソエチル]−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２，２−ジメチルクロマン−３−イル−エステル−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（ジプロテクト生成物）の混合物を、ジクロロメタン：酢酸エチル（４：１）からジクロロメタン：酢酸エチル（１：１）へ、次に酢酸エチル：ＭｅＯＨ（１：１）に増加する勾配溶媒を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製した。
ＨＰＬＣ−ＭＳ  （ＥＳ＋）：モノプロテクト  Ｒｔ  ＝  １．１２ｍｉｎｓ  ４５４．３７（［Ｍ−Ｃ４Ｈ９］＋，  １００％），  ５１０．４１（Ｍ＋，  ２６％），  ５３２．３９  （［Ｍ＋Ｎａ］＋，  ３１％）  ジプロテクト  Ｒｔ  ＝  １．５２ｍｉｎｓ  ４９８．３４  （［Ｍ−Ｃ８Ｈ１８］＋，  ５４％）， ５５４．３８  （［Ｍ−Ｃ４Ｈ９］＋，  １００％），  ６１０．４３  （Ｍ＋，  ６７％）， ６３２．４０  （［Ｍ＋Ｎａ］＋，  ４３％）
【００８２】
Ｈ）上記のように得られた（３Ｓ，  ４Ｒ）−｛６−［２−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）−２−オキソ−エチル]−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−４−イル}カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルおよび（３Ｓ，４Ｒ）−炭酸６−［２−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）−２−オキソエチル]−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２，２−ジメチルクロマン−３−イル−エステル−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの混合物（６．０ｇ）をジオキサン（１２．６ｍＬ）において４Ｍ  ＨＣｌに溶解し、室温で１６時間振盪した。反応をＨＰＬＣ−ＭＳで観察し、該反応を完了させるために必要な場合はさらに試薬を添加した。反応完了後、溶液を真空内で濃縮し、残渣物をジクロロメタン：ＭｅＯＨ（１：１）に再度溶解した。ＡＭＰＳ（２．５等量）を添加し、懸濁液を室温で５時間振盪した。溶液を濾過し、真空内で濃縮して（３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル）−１−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）エタノンを生成し、さらに精製せずに使用した。
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｒｔ  ＝  ０．６５ｍｉｎｓ，  ８１９．４３  （［２Ｍ＋Ｈ］＋，  ２０％），  ４１０．２８  （［Ｍ＋Ｈ］＋，  ５０％），  ３９３．２５  （［Ｍ−ＮＨ2］＋，１００％）
【００８３】
Ｉ）上記のように得られた（３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）−１−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）エタノン（１５ｍｇ）をジクロロメタン（０．６ｍＬ）に溶解した。ＰＳピペリジン（２０ｍｇ）を添加し、次に４−プロピルベンゼンスルホニルクロリド（１等量）を添加した。該反応物を室温で２日間振盪した。樹脂を濾過し、必要な場合はさらにジクロロメタンの他にＰＳ−ＡＭＰＳ（３０ｍｇ）を添加した。該反応物を室温でさらに１６時間振盪した後、濾過し、真空内で濃縮して表題化合物を得た。
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）： ５９２．２７  （［Ｍ＋Ｈ］＋，  １００％）
【００８４】
実施例２
（３Ｓ，４Ｒ）−２−｛４−［（４−クロロ−３−メチルベンゼンスルホニル−（２−エチルブチルアミノ）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）−Ｎ−［２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチル］アセトアミド
【化１５】
2008536842.tif 000021
【００８５】
Ａ）（３Ｓ，４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル）酢酸および（３Ｓ，４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）酢酸（製造法については上記の実施例１Ｆを参照）の混合物（４．０ｇ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解した。ＤＩＣ（１．６８ｍＬ）、ＨＯＢＴ（１．４６ｇ）および２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン（１．３７ｇ）を添加し、反応物を室温で１６時間振盪した。該溶液を真空内で濃縮し、得られた（３Ｓ，４Ｒ）−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−｛［２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチルカルバモイル）メチル］クロマン−４−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（モノプロテクト生成物）および（３Ｓ，  ４Ｒ）−炭酸４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２，２−ジメチル−６−｛［２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチルカルバモイル）メチル］クロマン−３−イルエステルｔｅｒｔ−ブチルエステル（ジプロテクト生成物）の混合物を、ジクロロメタン：酢酸エチル（４：１）からジクロロメタン：酢酸エチル（１：１）へ、次に酢酸エチル：ＭｅＯＨ（１：１）に増加する勾配溶媒を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製した。
ＨＰＬＣ−ＭＳ  （ＥＳ＋）：モノプロテクト  Ｒｔ＝１．０５ｍｉｎｓ４６２．５１（Ｍ＋，１００％）  ジプロテクトＲｔ＝１．４６ｍｉｎｓ５６２．４７（Ｍ＋，  １００％）．
【００８６】
Ｂ）上記のように得られた（３Ｓ，  ４Ｒ）−（３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−｛［２−（１−メチルピロリジン−２−イル）−エチルカルバモイル］メチル｝クロマン−４−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルおよび（３Ｓ，４Ｒ）−炭酸４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２，２−ジメチル−６−｛［２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチルカルバモイル］メチル｝クロマン−３−イルエステルｔｅｒｔ−ブチルエステルの混合物（６．０ｇ）を４Ｍ  ＨＣｌのジオキサン溶液（１２．６ｍＬ）に溶解し、室温で１６時間振盪した。該反応をＨＰＬＣ−ＭＳで観察し、該反応を完了させるために必要な場合はさらに試薬を添加した。 該反応完了後、溶液を真空内で濃縮し、残渣物をジクロロメタン：ＭｅＯＨ（１：１）に再度溶解した。 ＡＭＰＳ（２．５等量）を添加し、懸濁液を室温で５時間振盪した。溶液を濾過し、真空内で濃縮して（３Ｓ，  ４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）−Ｎ−[２−（１−メチルピロリジン−２−イル）−エチル]アセトアミドを生成し、さらに精製せずに使用した。
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｒｔ＝０．７２ｍｉｎｓ３４５．４９（［Ｍ−ＮＨ2］＋，８４％），３６２．５３（Ｍ＋，１００％），３８４．５３（［Ｍ＋Ｎａ］＋，  １５％）
【００８７】
Ｃ）上記のように得られた（３Ｓ，  ４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル−Ｎ−［２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチル］アセトアミドをメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、ＴＭＯＦ（０．２２ｍＬ）を添加した後、分子ふるいにかけた。２−エチルブチルアルデヒドを添加し、反応物を室温で１６時間振盪した。イミン形成完了後、ＨＰＬＣ−ＭＳおよび／または１Ｈ  ＮＭＲ分析によって確認し、ＰＳ−ＢＨ4（５等量）を添加して、反応物をさらに１６時間振盪した。反応を完了させるために必要な場合は、さらにＰＳ−ＢＨ4を添加した。未精製の２級アミンをジクロロメタンに溶解し、ＰＳ−ＣＨＯ（０．４等量）およびＡＭＰＳ（０．６等量）を連続して添加した。反応混合物を室温でさらに１６時間振盪した。次に、樹脂を濾過し、ＴＨＦで洗浄して、濾過液を合わせて、真空内で濃縮した。粗生成物をジクロロメタンからジクロロメタン：ＭｅＯＨ（２０：８０）への勾配を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製し、（３Ｓ，４Ｒ）−２−［４−（２−エチルブチルアミノ）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル］−Ｎ−［２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチル）アセトアミドを得た。
【００８８】
Ｄ）上記のように得られた（３Ｓ，４Ｒ）−２−［４−（２−エチルブチルアミノ）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル］−Ｎ−［２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチル］アセトアミド（１５ｍｇ）をジクロロメタン（０．６ｍＬ）に溶解した。ＰＳピペリジン（２０ｍｇ）を添加し、続いてジクロロメタン（０．４ｍＬ）溶液の４−クロロ−２，５−ジメチルベンゼンスルフォニルクロリド（３等量）を添加した。反応物を室温で２日間振盪した。樹脂を濾過し、必要な場合はさらにジクロロメタンに加え、ＰＳ−ＡＭＰＳ（３０ｍｇ）を添加した。反応物を室温でさらに１６時間振盪した後、濾過し、真空内で濃縮して表題化合物を得た。
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：  ６４８．５３／６５０．５３（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）
【００８９】
実施例３
（３Ｓ，  ４Ｒ）−２−｛３−ヒドロキシ−４−［（４−ヨードベンゼンスルホニル）−（３−メチルブチル）アミノ］−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル｝−Ｎ−（２−ピペリジン−１−イルエチル）アセトアミド
【化１６】
2008536842.tif 000022
【００９０】
Ａ）（３Ｓ，４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル）酢酸および（３Ｓ，４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）酢酸（製造法については上記の実施例１Ｆを参照）の混合物（４．０ｇ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解した。ＤＩＣ（１．６８ｍＬ）、ＨＯＢＴ（１．４６ｇ）およびＮ−（２−アミノエチル）ピペリジン（１．３７ｇ）を添加し、反応物を室温で１６時間振盪した。溶液を真空内で濃縮し、粗生成物をジクロロメタン：酢酸エチル（４：１）からジクロロメタン：酢酸エチル（１：１）の勾配溶媒を使用して、カラムクロマトグラフィーによって試薬および副産物を除去して精製し、次に酢酸エチル：ＭｅＯＨ（１：１）に増加して（３Ｓ，４Ｒ）−{３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−[（２−ピペリジン−１−イルエチル−カルバモイル）メチル]クロマン−４−イル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（モノプロテクト生成物）および（３Ｓ，４Ｒ）−炭酸４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２，２−ジメチル−６−［（２−ピペリジン−１−イルエチルカルバモイル）メチル］クロマン−３−イルエステルｔｅｒｔ−ブチルエステル（ジプロテクト生成物）の混合物を溶出した。
ＨＰＬＣ−ＭＳ  （ＥＳ＋）： モノプロテクト  Ｒｔ＝１．０３ｍｉｎｓ  ４０６．４０（［Ｍ−Ｃ４Ｈ９］＋，３０％），４６２．４９（Ｍ＋，１００％），４８４．４６（［Ｍ＋Ｎａ］＋，  １４％）  ジプロテクト  Ｒｔ  ＝  １．４４ｍｉｎｓ  ５０６．４６（［Ｍ−Ｃ４Ｈ９］＋，１４％），５６２．５０（Ｍ＋，１００％），５８４．４７（［Ｍ＋Ｎａ］＋，１５％）
【００９１】
Ｂ）上記のように得られた（３ｓ，４ｒ）−{３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−［（２−ピペリジン−１−イルエチル−カルバモイル）メチル］クロマン−４−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルおよび（３Ｓ，４Ｒ）−炭酸４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２，２−ジメチル−６−［（２−ピペリジン−１−イルエチル−カルバモイル）メチル）クロマン−３−イルエステルｔｅｒｔ−ブチルエステルの混合物（６．０ｇ）を４Ｍ  ＨＣｌのジオキサン溶液（１２．６ｍＬ）に溶解し、室温で１６時間振盪した。反応をＨＰＬＣ−ＭＳで観察し、該反応を完了させるために必要な場合はさらに試薬を添加した。 反応完了後、溶液を真空内で濃縮し、残渣物をジクロロメタン：ＭｅＯＨ（１：１）に再度溶解した。 ＡＭＰＳ（２．５等量）を添加し、懸濁液を室温で５時間振盪した。 溶液を濾過し、真空内で濃縮して（３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）−Ｎ−（２−ピペリジン−１−イルエチル）アセトアミドを生成し、さらに精製せずに使用した。
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｒｔ＝０．７５ｍｉｎｓ  ３６１．５７（［Ｍ−ＮＨ2］＋，４１％），３７８．６１（Ｍ＋，１００％）
【００９２】
Ｃ）  上記のように得られた（３Ｓ，  ４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）−Ｎ−（２−ピペリジン−１−イルエチル）−アセトアミド（１等量、２ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、ＴＭＯＦ（０．２２ｍＬ）を添加した後、分子ふるいにかけた。イソバレルアルデヒドを添加し、反応物を室温で１６時間振盪した。イミン形成完了後、ＨＰＬＣ−ＭＳおよび1Ｈ  ＮＭＲ分析によって確認し、ＰＳ−ＢＨ4（５等量）を添加して、反応物をさらに１６時間振盪した。 反応を完了させるために必要な場合は、さらにＰＳ−ＢＨ4を添加した。 未精製の２級アミンをジクロロメタンに溶解し、ＰＳ−ＣＨＯ（０．４等量）およびＡＭＰＳ（０．６等量）を連続して添加した。反応混合物を室温でさらに１６時間振盪した。 次に、樹脂を濾過し、ＴＨＦで洗浄して、濾過液を合わせ、真空内で濃縮した。残渣物をジクロロメタンからジクロロメタン：ＭｅＯＨ（２０：８０）への勾配を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製し、（３Ｓ，４Ｒ）−２−［３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−４−（３−メチルブチルアミノ）クロマン−６−イル］−Ｎ−（２−ピペリジン−１−イルエチル）−アセトアミドを得た。
【００９３】
Ｄ）上記のように得られた（３Ｓ，  ４Ｒ）−２−[３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルー４−（３−メチルブチルアミノ）クロマン−６−イル]−Ｎ−（２−ピペリジン−１−イルエチル）アセトアミド（１５ｍｇ）をジクロロメタン（０．６ｍＬ）に溶解した。ＰＳピペリジン（２０ｍｇ）を添加し、次に４−ヨードベンゼンスルホニルクロリド（３等量）のジクロロメタン（０．４ｍＬ）溶液を添加した。反応物を室温で２日間振盪した。樹脂を濾過し、必要な場合はさらにジクロロメタンに加ええＰＳ−ＡＭＰＳ（３０ｍｇ）を添加した。反応物を室温でさらに１６時間振盪した後、濾過し、真空内で濃縮して表題化合物を得た。
【００９４】
実施例４
（３Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−（１−ベンジルピロリジン−３Ｒ−イル）−２−｛４−［（２−エチルブチル）−（３−メトキシベンゼンスルホニル）−アミノ］−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル}アセトアミド
【化１７】
2008536842.tif 000023
【００９５】
Ａ）  （３Ｓ，４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル）酢酸および（３Ｓ，４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）酢酸の混合物（４．０ｇ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解した。ＤＩＣ（１．６８ｍＬ）、ＨＯＢＴ（１．４６ｇ）および（３Ｒ）−（−）−１−ベンジル−３−アミノピロリジン（１．８９ｇ）を添加し、反応物を室温で１６時間振盪した。溶液を真空内で濃縮し、粗生成物をジクロロメタン：酢酸エチル（４：１）からジクロロメタン：酢酸エチル（１：１）の勾配溶媒を使用して、カラムクロマトグラフィーによって精製し、次に酢酸エチル：ＭｅＯＨ（１：１）に増加して（３Ｓ，４Ｒ）−{６−［（１−ベンジルピロリジン−３Ｒ−イルカルバモイル）メチル］−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−４−イル}カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（モノプロテクト生成物）および（３Ｓ，４Ｒ）−炭酸６−［（１−ベンジルピロリジン−３Ｒ−イルカルバモイル）メチル］−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２，２−ジメチルクロマン−３−イルエステルｔｅｒｔ−ブチルエステル（ジプロテクト生成物）の混合物を溶出させた。
ＨＰＬＣ−ＭＳ  （ＥＳ＋）： モノプロテクト  Ｒｔ  ＝  １．１３ｍｉｎｓ  ４５４．４５（［Ｍ−Ｃ４Ｈ９］＋，  ６３％），  ５１０．５１（Ｍ＋，  １００％），  ５３２．４９  （［Ｍ＋Ｎａ］＋，  ４６％）； ジプロテクト  Ｒｔ  ＝  １．５２ｍｉｎｓ  ５５４．４９  （［Ｍ−Ｃ４Ｈ９］＋，  ３２％），  ６１０．５４  （Ｍ＋，  １００％），  ６３２．５０  （［Ｍ＋Ｎａ］＋，  １６％）
【００９６】
Ｂ）上記のように得られた（３Ｓ，４Ｒ）−｛６−［（１−ベンジルピロリジン−３Ｒ―イルカルバモイル）メチル］−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−４−イル}カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルおよび（３Ｓ，４Ｒ）−炭酸６−［（１−ベンジルピロリジン−３Ｒ−イルカルバモイル）メチル］−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノ−２，２−ジメチルクロマン−３−イルエステルｔｅｒｔ−ブチルエステルの混合物（６．０ｇ）を４Ｍ  ＨＣｌのジオキサン溶液（１２．６ｍＬ）に溶解し、室温で１６時間振盪した。該反応をＨＰＬＣ−ＭＳで観察し、該反応を完了させるために必要な場合はさらに試薬を添加した。 反応完了後、溶液を真空内で濃縮し、残渣物をジクロロメタン：ＭｅＯＨ（１：１）に再度溶解した。 ＡＭＰＳ（２．５等量）を添加し、懸濁液を室温で５時間振盪した。 溶液を濾過し、真空内で濃縮して（３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）−Ｎ−１−ベンジルピロリジン−３Ｒ−イル）アセトアミドを生成し、さらに精製せずに使用した。
ＨＰＬＣ−ＭＳ  （ＥＳ＋）：  Ｒｔ  ＝  ０．６７ｍｉｎｓ  ３６１．５６（［Ｍ−ＯＨ］＋，  １００％），  ３７８．５９  （Ｍ＋，  ７２％），  ４００．６０ （［Ｍ＋Ｎａ］＋，  ３５％）
【００９７】
Ｃ）（３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）−Ｎ−１−ベンジルピロリジン−３Ｒ−イル）アセトアミドをメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、ＴＭＯＦ（０．２２ｍＬ）を添加した後、分子ふるいにかけた。２−エチルブチルアルデヒドを添加し、反応物を室温で１６時間振盪した。イミン形成完了後、ＨＰＬＣ−ＭＳおよび1Ｈ  ＮＭＲ分析によって確認し、ＰＳ−ＢＨ4（５等量）を添加して、反応物をさらに１６時間振盪した。 反応を完了させるために必要な場合は、さらにＰＳ−ＢＨ4を添加した。 未精製の２級アミンをジクロロメタンに溶解し、ＰＳ−ＣＨＯ（０．４等量）およびＡＭＰＳ（０．６等量）を連続して添加した。 反応混合物を室温でさらに１６時間振盪した。 次に、樹脂を濾過し、ＴＨＦで洗浄して、濾過液を合わせて、真空内で濃縮した。 残渣物をジクロロメタンからジクロロメタン：ＭｅＯＨ（２０：８０）への勾配を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製し、（３Ｓ，４Ｒ）―Ｎ―（１−ベンジルピロリジン−３Ｒ−イル）−２−［４−（２−エチルブチルアミノ）―３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル］アセトアミドを得た。
【００９８】
Ｄ）上記のように得られた（３Ｓ，４Ｒ）―Ｎ―（１−ベンジルピロリジン−３−イル）−２−［４−（２−エチルブチルアミノ）―３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル］アセトアミド（１５ｍｇ） をジクロロメタン（０．６ｍＬ）に溶解した。ＰＳピペリジン（２０ｍｇ）を添加し、次に４−ヨードベンゼンスルホニルクロリド（３等量）のジクロロメタン（０．４ｍＬ）溶液を添加した。 反応物を室温で２日間振盪した。樹脂を濾過し、必要な場合はさらにジクロロメタンに加え、ＰＳ−ＡＭＰＳ（３０ｍｇ）を添加した。反応物を室温でさらに１６時間振盪した後、濾過し、真空内で濃縮して表題化合物を得た。
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：６６４．７３（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）
【００９９】
実施例５
（３Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−［２−（ブチルエチルアミノ）エチル］−２−｛４−［（２−エチルブチル）−（４−ヨードベンゼンスルホニル）アミノ］−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）アセトアミド
【化１８】
2008536842.tif 000024
【０１００】
Ａ）（３Ｓ，４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル）酢酸および（３Ｓ，４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）酢酸（製造法については上記の実施例１Ｆを参照）の混合物（４．０ｇ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解した。ＤＩＣ（１．６８ｍＬ）、ＨＯＢＴ（１．４６ｇ）および２−（エチル−Ｎ−ブチルアミノ）エチルアミン（１．５５ｇ）を添加し、反応物を室温で１６時間振盪した。該溶液を真空内で濃縮し、残渣物をジクロロメタン：酢酸エチル（４：１）からジクロロメタン：酢酸エチル（１：１）の勾配溶媒を使用して、カラムクロマトグラフィーによって精製し、次に酢酸エチル：ＭｅＯＨ（１：１）に増加して（３Ｓ，４Ｒ）−（６−｛［２−（ブチルエチルアミノ）エチルカルボミル］メチル｝−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−４−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（モノプロテクト生成物）および（３Ｓ，４Ｒ）−炭酸４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−６−｛［２−（ブチルエチルアミノ）エチルカルバモイル］メチル｝−２，２−ジメチルクロマン−３−イルエステルｔｅｒｔ−ブチルエステル（ジプロテクト生成物）の混合物を溶出させた。
ＨＰＬＣ−ＭＳ  （ＥＳ＋）：  モノプロテクト Ｒｔ  ＝  １．１２ｍｉｎｓ  ４７８．５８  （Ｍ＋，１００％）； ジプロテクト  Ｒｔ  ＝  １．５３ｍｉｎｓ  ５７８．５６  （Ｍ＋，  １００％）
【０１０１】
Ｂ）上記のように得られた（３Ｓ，４Ｒ）−（６−｛［２−（ブチルエチルアミノ）エチルカルボミル］メチル｝−３−）ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−４−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルおよび（３Ｓ，４Ｒ）−炭酸４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−６−｛［２−（ブチルエチルアミノ）エチルカルバモイル］メチル｝−２，２−ジメチルクロマン−３−イルエステルｔｅｒｔ−ブチルエステルの混合物（６．０ｇ）を４Ｍ  ＨＣｌのジオキサン（１２．６ｍＬ）に溶解し、室温で１６時間振盪した。反応をＨＰＬＣ−ＭＳで観察し、該反応を完了させるために必要な場合はさらに試薬を添加した。 反応完了後、溶液を真空内で濃縮し、残渣物をジクロロメタン：ＭｅＯＨ（１：１）に再度溶解した。 ＡＭＰＳ（２．５等量）を添加し、懸濁液を室温で５時間振盪した。 溶液を濾過し、真空内で濃縮して（３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）−Ｎ−［２−（ブチルエチルアミノ）エチル］アセトアミドを生成し、さらに精製せずに使用した。
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｒｔ＝０．８４ｍｉｎｓ  ４０７．４３（［Ｍ−ＯＨ］＋，１００％），４２４．４７（Ｍ＋，４４％）
【０１０２】
Ｃ）上記のように得られた（３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）−Ｎ−［２−（ブチルエチルアミノ）−エチル］アセトアミドをメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、ＴＭＯＦ（０．２２ｍＬ）を添加した後、分子ふるいにかけた。２−エチルブチルアルデヒドを添加し、反応物を室温で１６時間振盪した。 イミン形成完了後、ＨＰＬＣ−ＭＳおよび1Ｈ  ＮＭＲ分析によって確認し、ＰＳ−ＢＨ4（５等量）を添加して、反応物をさらに１６時間振盪した。 反応を完了させるために必要な場合は、さらにＰＳ−ＢＨ4を添加した。 未精製の２級アミンをジクロロメタンに溶解し、ＰＳ−ＣＨＯ（０．４等量）およびＡＭＰＳ（０．６等量）を連続して添加した。 反応混合物を室温でさらに１６時間振盪した。 次に、樹脂を濾過し、ＴＨＦで洗浄して、濾過液を合わせて、真空内で濃縮した。 残渣物をジクロロメタンからジクロロメタン：ＭｅＯＨ（２０：８０）への勾配を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製し、（３Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−［２−（ブチルエチルアミノ）−エチル］−２−［４−（２−エチルブチルアミノ）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル］アセトアミドを得た。
【０１０３】
Ｄ）上記のように得られた（３Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−［２−（ブチルエチルアミノ）−エチル］−２−［４−（２−エチルブチルアミノ）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル］アセトアミド（１５ｍｇ）をジクロロメタン（０．６ｍＬ）に溶解した。ＰＳピペリジン（２０ｍｇ）を添加し、次に４−ヨードベンゼンスルホニルクロリド（３等量）のジクロロメタン（０．４ｍＬ）溶液を添加した。 反応物を室温で２日間振盪した。 樹脂を濾過し、必要な場合はさらにジクロロメタンに加え、ＰＳ−ＡＭＰＳ（３０ｍｇ）を添加した。反応物を室温でさらに１６時間振盪した後、濾過し、真空内で濃縮して表題化合物を得た。
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：７２８．６８（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）
【０１０４】
実施例６
（３Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−（４−ベンジルモルホリン−２−イルメチル）−２−｛４−［（３−メトキシベンゼンスルホニル）−３−メチルブチル）アミノ］−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル｝アセトアミド
【化１９】
2008536842.tif 000025
【０１０５】
Ａ）  （３Ｓ，４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−クロマン−６−イル）酢酸および（３Ｓ，４Ｒ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）酢酸（製造法については上記の実施例１Ｆを参照）の混合物（４．０ｇ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解した。ＤＩＣ（１．６８ｍＬ）、ＨＯＢＴ（１．４６ｇ）およびＮ−ベンジル−３−アミノメチルモルホリン（２．２１ｇ）を添加し、反応物を室温で１６時間振盪した。 該溶液を真空内で濃縮し、残渣物をジクロロメタン：酢酸エチル（４：１）からジクロロメタン：酢酸エチル（１：１）の勾配溶媒を使用して、カラムクロマトグラフィーによって精製し、次に酢酸エチル：ＭｅＯＨ（１：１）に増加して（３Ｓ，４Ｒ）−（６−｛［（４−ベンジルモルホリン−２−イルメチル）カルバミル］メチル｝−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−４−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（モノプロテクト生成物）および（３Ｓ，４Ｒ）−炭酸６｛［（４−ベンジルモルホリン−２−イルメチル）カルバモイル］メチル｝−４−ｔｅｒｔ−  ブトキシカルボニルアミノ−２，２−ジメチルクロマン−３−イルエステルｔｅｒｔ−ブチルエステル（ジプロテクト生成物）の混合物を溶出させた。
ＨＰＬＣ−ＭＳ  （ＥＳ＋）：  モノプロテクト Ｒｔ＝１．１５ｍｉｎｓ  ４８４．３８  （［Ｍ−Ｃ４Ｈ９］＋，１７％），５４０．３７（Ｍ＋，１００％），５６２．３４  （［Ｍ＋Ｎａ］＋，１２％）；ジプロテクト  Ｒｔ＝１．５１  ｍｉｎｓ  ５８４．３３（［Ｍ−Ｃ４Ｈ９］＋，  ８％），  ６４０．４３（Ｍ＋，１００％），６６２．４０［Ｍ＋Ｎａ］＋，１０％）
【０１０６】
Ｂ） 上記のように得られた（３Ｓ，４Ｒ）―（６−｛［（４−ベンジルモルホリン−２−イルメチル）カルバモイル］メチル｝−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−４−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルおよび（３Ｓ，４Ｒ）−炭酸６−｛［（４−ベンジルモルホリン−２−イルメチル）カルバモイル］メチル｝−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２，２−ジメチルクロマン−３−イルエステルｔｅｒｔ−ブチルエステルの混合物（６．０ｇ）を４Ｍ  ＨＣｌのジオキサン溶液（１２．６ｍＬ）に溶解し、室温で１６時間振盪した。反応をＨＰＬＣ−ＭＳで観察し、該反応を完了させるために必要な場合はさらに試薬を添加した。 反応完了後、溶液を真空内で濃縮し、残渣物をジクロロメタン：ＭｅＯＨ（１：１）に再度溶解した。  ＡＭＰＳ（２．５等量）を添加し、懸濁液を室温で５時間振盪した。 溶液を濾過し、真空内で濃縮して（３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）−Ｎ―（４−ベンジルモルホリン−２−イルメチル）アセトアミドを生成し、さらに精製せずに使用した。
ＨＰＬＣ−ＭＳ  （ＥＳ＋）：  Ｒｔ  ＝  ０．８４ｍｉｎｓ  ４２３．５９（［Ｍ−ＯＨ］＋，  １００％），  ４４０．６２  （Ｍ＋，  １８％），  ４６２．６１  （［Ｍ＋Ｎａ］＋，  １６％）
【０１０７】
Ｃ）上記のように得られた（３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）−Ｎ−（４−ベンジルモルホリン−２−イルメチル）アセトアミド（１等量、２ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、ＴＭＯＦ（０．２２ｍＬ）を添加した後、分子ふるいにかけた。 イソバレルアルデヒド（１．０等量、２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１６時間振盪した。 イミン形成完了後、ＨＰＬＣ−ＭＳおよび／または１Ｈ  ＮＭＲ分析によって確認し、ＰＳ−ＢＨ4（５等量）を添加して、反応物をさらに１６時間振盪した。 反応を完了させるために必要な場合は、さらにＰＳ−ＢＨ4を添加することができる。 未精製の２級アミンをジクロロメタンに溶解し、ＰＳ−ＣＨＯ（０．４等量）およびＡＭＰＳ（０．６等量）を連続して添加した。 反応混合物を室温でさらに１６時間振盪した。 次に、樹脂を濾過し、ＴＨＦで洗浄して、濾過液を合わせて、真空内で濃縮した。 残渣物をジクロロメタンからジクロロメタン：ＭｅＯＨ（２０：８０）への勾配を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製し、（３Ｓ，４Ｒ）―Ｎ―（４−ベンジルモルホリン−２−イルメチル）−２−［４−（３−メチルブチルアミノ）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル］アセトアミドを得た。
【０１０８】
Ｄ）上記のように得られた（３Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−（４−ベンジルモルホリン−２−イルメチル）−２−［４−（３−メチルブチルアミノ）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル］アセトアミド（１５ｍｇ） をジクロロメタン（０．６ｍＬ）に溶解した。ＰＳピペリジン（２０ｍｇ）を添加し、次に３−メトキシベンゼンスルホニルクロリド（３等量）のジクロロメタン（０．４ｍＬ）溶液を添加した。 反応物を室温で２日間振盪した。 樹脂を濾過し、必要な場合はさらにジクロロメタンに加え、ＰＳ−ＡＭＰＳ（３０ｍｇ）を添加した。 反応物を室温でさらに１６時間振盪した後、濾過し、真空内で濃縮して表題化合物を得た。
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：７０２．５６（［Ｍ＋Ｎａ］＋，２１％），６８０．５７  （［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％），２５６．２７（［Ｍ−Ｃ２５Ｈ３１  Ｎ２Ｏ４］＋，４０％）
【０１０９】
実施例７
（３Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−｛６−［２−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）−２−オキソエチル］−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−４−イル｝−Ｎ−シクロプロピルメチル−４−メチルベンゼンスルホンアミド
【化２０】
2008536842.tif 000026
【０１１０】
Ａ）（３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル）−１−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）エタノン（製造法については上記の実施例１Ｈを参照）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、ＴＭＯＦ（０．２２ｍＬ）を添加した後、分子ふるいにかけた。 シクロプロパンカルボキシアルデヒドを添加し、反応物を室温で１６時間振盪した。 イミン形成完了後、ＨＰＬＣ−ＭＳおよび1Ｈ  ＮＭＲ分析によって確認し、ＰＳ−ＢＨ4（５等量）を添加して、反応物をさらに１６時間振盪した。 反応を完了させるために必要な場合は、さらにＰＳ−ＢＨ4を添加した。 未精製の２級アミンをジクロロメタンに溶解し、ＰＳ−ＣＨＯ（０．４等量）およびＡＭＰＳ（０．６等量）を連続して添加した。 反応混合物を室温でさらに１６時間振盪した。 次に、樹脂を濾過し、ＴＨＦで洗浄して、濾過液を合わせて、真空内で濃縮した。 残渣物をジクロロメタンからジクロロメタン：ＭｅＯＨ（２０：８０）への勾配を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製し、（３Ｓ，４Ｒ）−１−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）−２−［４−（シクロプロピルメチルアミノ）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル］エタノンを得た。
【０１１１】
Ｂ）上記のように得られた（３Ｓ，４Ｒ）−１−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）−２−［４−（シクロプロピルメチルアミノ）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルクロマン−６−イル］エタノン（１５ｍｇ）をジクロロメタン（０．６ｍＬ）に溶解した。ＰＳピペリジン（２０ｍｇ）を添加し、次に４−メチルベンゼンスルホニルクロリド（３等量）のジクロロメタン（０．４ｍＬ）溶液を添加した。 反応物を室温で２日間振盪した。 樹脂を濾過し、必要な場合はさらにジクロロメタンに加え、ＰＳ−ＡＭＰＳ（３０ｍｇ）を添加した。 反応物を室温でさらに１６時間振盪した後、濾過し、真空内で濃縮して表題化合物を得た。
ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：６１８．６５（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）
【０１１２】
実施例８
４−エチル−Ｎ−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−｛２−オキソ−２−［４−（ピリジン−３−イルメチル）ピペラジン−１−イル］エチル}−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−４−イル）ベンゼンスルホンアミド
【化２１】
2008536842.tif 000027
【０１１３】
Ａ）メチル−４−ヒドロキシフェニル酢酸（２５．０ｇ）、３，３−ジメチルアクロレイン（１４．５ｍＬ）およびフェニルボロン酸（１８．３ｇ）を無水トルエン１．０  Ｌにおいて７時間還流させた。次に、氷酢酸（６０ｍＬ）を添加し、得られた混合物を還流下でさらに７時間加熱し、進行を薄層クロマトグラフィー（＝ＴＬＣ）で観察した。次に、該混合物を冷却し、大部分は真空内で蒸発させて、残渣物を酢酸エチル／水の１：１混合液３００ｍＬに注入した。炭酸ナトリウムでｐＨを５に調整し、真空内で酢酸エチル層を分離および濃縮した。残渣物のカラムクロマトグラフィー（移動相：石油エーテル／酢酸エチル１０：１）により淡黄色油としてのメチル（２，２−ジメチル−２Ｈ−クロメン−６−イル）アセテート１６ｇが得られた。
【０１１４】
Ｂ）メチル（２，２−ジメチル−２Ｈ−クロメン−６−イル）アセテート（１８．３ｇ）をエチルアルコール１２５ｍＬに懸濁した。１５％の水酸化ナトリウム溶液１５０ｍＬを添加し、該混合物を室温で３０分撹拌した。次に、水３００ｍＬおよび酢酸エチル１５０ｍＬを添加し、得られた混合物を１０分間強く撹拌した。有機質層を分離し廃棄した。アルカリ性の水層を酢酸エチル１００ｍＬで一回洗浄した。層を分離し、水層を塩酸溶液でｐＨ  ２．０に酸性化した。次に酢酸エチル２００ｍＬを添加し、得られた混合物を１０分間強く撹拌した。有機質層を分離し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過した後、真空内で濃縮した。黄色の残渣物を冷却し、続いて石油エーテルを満たして３０分間撹拌した。得られた結晶を濾過し、５０℃で真空乾燥させて（２，２−ジメチル−２Ｈ−クロメン−６−イル）酢酸６．２ｇを得た。母液を真空内で濃縮し、冷却後、再度石油エーテルで満たした。得られた結晶を真空内で乾燥させ、さらに２．９ｇの（２，２−ジメチル−２Ｈ−クロメン−６−イル）酢酸を得た。
【０１１５】
Ｃ）上記のように得られた（２，２−ジメチル−２Ｈ−クロメン−６−イル）酢酸（３１ｇ、いくつかのバッチからの生成物を合わせた）をジクロロメタン（４５０ｍＬ）に溶解し、ｃｃ．Ｈ2ＳＯ4（１．５ｍＬ）を添加した。この受容溶液に、−１０℃で２−メチルプロペン（２１．０ｇ）を添加し、次に反応混合物を室温で６時間撹拌した。次に、水（５００ｍＬ）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。有機質層をＮａＨＣＯ3水溶液で抽出し、ブラインで洗浄、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過後蒸発させた。残渣物を真空内で乾燥させて、褐色油としてｔｅｒｔ−ブチル（２，２−ジメチル−２Ｈ−クロメン−６−イル）アセテート（３０ｇ）を得た。
【０１１６】
Ｄ）上記のように得られたｔｅｒｔ−ブチル（２，２−ジメチル−２Ｈ−クロメン−６−イル）アセテート（３０．０ ｇ）をジクロロメタン（６００ｍＬ）に溶解し、（Ｓ，Ｓ）−（+）−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−サリチリデン）−１，２−シクロヘキサン−ジアミノ−マンガン（ｌｌｌ）−クロリド（４．２５ｇ）およびピリジン−Ｎ−オキシド（５．２５ｇ）を添加した。市販のＮａＯＣｌ水溶液（５５５ｍＬ、Ｆｌｕｋａより購入、室温でアッセイ〜１０％）および９％のＮａ2ＨＰＯ4水溶液（７５ｍＬ）を氷冷却下で４５分間にわたり添加した。次に、得られた混合物を０℃で４時間撹拌した。有機質層を濾過（セライト  タイプ５０３）し、ジクロロメタンで洗浄して、合わせた有機質層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させた。濾過および真空内蒸発により褐色油を得て、ジエチルエーテルに溶解した。結晶化が始まるまでリグロインを添加した。結晶を吸引濾過により濾過し、乾燥させてｔｅｒｔ−ブチル−[（１ａＳ，７ｂＳ）−２，２−ジメチル−１ａ，７ｂジヒドロ−２Ｈ−オキシレノ[ｃ]クロメン−６−イル]アセテート（１８．４ｇ）を得た。
【０１１７】
Ｅ）上記のように得られたｔｅｒｔ−ブチル−[（１ａＳ，７ｂＳ）−２，２−ジメチル−１ａ，７ｂジヒドロ−２Ｈ−オキシレノ[ｃ]クロメン−６−イル]アセテート（１８．４ｇ）をエタノール（３００ｍＬ）に溶解した。この受容溶液に濃縮したＮＨ4ＯＨ（３００ｍＬ）を添加し、得られた混合物を１時間撹拌して、室温で一晩保存した。ジクロロメタン（４００ｍＬ）を添加し、さらに１５分間撹拌した。有機質層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過後、大部分を真空内で蒸発させて粗製油を得た。該油をジエチルエーテルに溶解し、水で抽出して、有機質層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させた。濾過、蒸発、乾燥後、褐色油としてｔｅｒｔ−ブチル[（３Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル]アセテート（１６．３ｇ）を得た。
【０１１８】
Ｆ）上記のように得られたｔｅｒｔ−ブチル[（３Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル]アセテート（１２．０ｇ）のジクロロメタン（２８０ｍＬ）溶液に最初にトリエチルアミン（１０．８ｍＬ）を添加し、次に４−エチルスルホニルクロリド（８０ｇ）を添加した。得られた懸濁液を室温で５時間撹拌した後、水で抽出した。有機質層をＮａＨＣＯ3水溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過後、最後に真空内で蒸発させて褐色油としてｔｅｒｔ−ブチル（（３Ｓ，４Ｒ）−４−｛［（４−エチルフェニル）フルホニル］アミノ｝３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル）アセテート（１９．６ｇ）を得た。さらに精製するため、該油状生成物１．８ｇをクロマトグラフィー（中圧液体クロマトグラフィー、ＭＰＬＣ： 固定相Ｓｉｌｉ Ｔｅｃｈ（登録商標）（３２−６３、６０ Ａ）移動相シクロヘキサン／酢酸エチル３：１））で分離した。
【０１１９】
Ｇ） 上記のように得られたｔｅｒｔ−ブチル（（３Ｓ，４Ｒ）−４−｛［（４−エチルフェニル）スルホニル］アミノ｝−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル]アセテート（１７．２ｇ）のトルエン（１７０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１７ｍＬ）を添加した。反応混合物を４０℃で５．５時間撹拌した後、水（２００ｍＬ）で抽出した。有機質層をＮａ2ＣＯ3水溶液で抽出した。水層をｐＨ６（ＨＣｌ）に調整し、次に酢酸エチルで２度抽出した。合わせた有機質層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過後、真空内で蒸発させて未精製の褐色油を得た。該油をジエチルエーテルに溶解し、リグロインを添加した。該混合物を結晶化が完了するまで室温で撹拌した。得られた結晶を吸引し、乾燥させて、（（３Ｓ，４Ｒ）−４−{[（４−エチルフェニル）スルホニル]アミノ}−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル）酢酸（９．３ｇ）を得た。
【０１２０】
Ｈ）２５０ｍＬの丸底フラスコに入れた（（３Ｓ，４Ｒ）−４−{[（４−エチルフェニル）スルホニル]アミノ}−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル）酢酸１．３ｇのＴＨＦ溶液４５ｍＬにＣＤｌ ５５０ｍｇを添加した。該懸濁液を室温で０．５時間撹拌した。３−ピリジルメチルピペラジン６００ｍｇを添加し、４時間撹拌した。その後、混合物を室温で一晩保存した。翌日、混合物を蒸発および乾燥させ、２：１の酢酸エチル／Ｈ2Ｏに溶解した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液ｐＨ １０で抽出した後、ＨＣｌ水溶液ｐＨ１で抽出した。ＨＣｌ層のｐＨをＮａＯＨ水溶液でｐＨ ８に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機質層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、濾過後、真空内で蒸発させて黄色の発泡体０．８５ｇを得た。該発泡体をイソプロパノールに溶解し、ＭｅＯＨを３滴滴下した。６Ｎ ＨＣｌのイソプロパノール溶液を添加したところ塩酸塩の結晶化が直ちに始まった。結晶は吸引し、ジエチルエーテルで洗浄後、乾燥させて、４−エチルＮ−（（３Ｓ、４Ｒ）３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−{２−オキソ−２−[４−（ピリジン−３−イルメチル）−ピペラジン−１−イル]エチル}−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−４−イル）ベンゼンスルホンアミド塩酸塩（融点１５９℃）０．７５ｇを得た。
13Ｃ−ＮＭＲ （１０１ ＭＨｚ， ＭｅＯＨ） δ ｐｐｍ １５．７ （ｑ， １ Ｃ） １９．０ （ｑ， １ Ｃ） ２７．０ （ｑ， １ Ｃ） ２９．７ （ｔ， １ Ｃ） ３９．７ （ｔ， １Ｃ） ４０．０ （ｔ， １ Ｃ） ４４．２ （ｔ， １ Ｃ） ５２．６ （ｔ， １ Ｃ） ５３．０ （ｔ， １ Ｃ） ５６．０ （ｄ， １ Ｃ） ５６．９ （ｔ， １ Ｃ） ７４．８ （ｄ， １ Ｃ） ７９．９ （ｓ， １ Ｃ） １１８．６ （ｄ， １ Ｃ） １２４．２ （ｓ， １ Ｃ） １２７．８ （ｓ， １ Ｃ） １２８．４ （ｄ， ２ Ｃ） １２８．９ （ｄ， １ Ｃ） １２９．３ （ｄ， ３ Ｃ） １３０．７ （ｓ， １ Ｃ） １３０．９ （ｄ， １ Ｃ） １４０．６ （ｓ， １ Ｃ） １４４．３ （ｄ， １ Ｃ） １４５．９ （ｄ， １ Ｃ） １５０．６ （ｓ， １ Ｃ） １５１．０ （ｄ， １ Ｃ） １５３．３ （ｓ， １ Ｃ） １７２．３ （ｓ， １ Ｃ）．
【０１２１】
次の第５表に示す式Ｉで挙げられる化合物は、上記実施例に記載の方法に従ってあるいはそれに類似する方法に従って製造することもできる。
【０１２２】
第５表：式Ｉで表わされるその他の化合物
【表５】
2008536842.tif 000028
ＥＸ． =実施例の番号、Ｍｅ=メチル、４−ｅｔ−ｐｈｅｎｙｌ = ４−エチルフェニル、−ｅｔ−Ｒ9 = 置換基Ｒ9とのエチレン架橋の形成、Ｒ5−ｅｔ−= 置換基Ｒ5とのエチレン架橋の形成、ｂｚ=ベンジル、２−／３−／４−ｐｙ=２−／３−／４−ピリジニル、Ｓ， Ｒ：Ｃａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ表示法による炭素原子の絶対立体配置
以下の分光データは13Ｃ−ＮＭＲにおいて測定した。
実施例１０（ＨＣｌ塩）：13Ｃ−ＮＭＲ （１０１ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−Ｄ６） δ ｐｐｍ １５．１ （ｑ， １ Ｃ） １８．７ （ｑ， １ Ｃ） ２６．４ （ｑ， １ Ｃ） ２７．９ （ｔ， １ Ｃ） ３７．８ （ｔ， １ Ｃ） ３８．３ （ｔ， １ Ｃ） ４１．９ （ｔ， １ Ｃ） ５０．１ （ｔ， １ Ｃ） ５０．５ （ｄ， １ Ｃ） ５４．１ （ｄ， １ Ｃ） ５８．６ （ｔ， １ Ｃ） ７２．３ （ｄ， １ Ｃ） ７８．５ （ｓ， １ Ｃ） １１６．４ （ｄ， １ Ｃ） １２２．８ （ｓ， １ Ｃ） １２６．７ （ｄ， ２ Ｃ） １２６．８ （ｓ， １ Ｃ） １２７．９ （ｄ， ２ Ｃ） １２８．７ （ｄ， ２ Ｃ） １２９．１ （ｄ， １ Ｃ） １２９．２ −１２９．６ （２ｄ，ｓ，３ Ｃ） １３１．３ （ｄ， ２ Ｃ） １４０．０ （ｓ， １ Ｃ） １４７．９ （ｓ， １ Ｃ） １５１．１ （ｓ， １ Ｃ） １６９．０ （ｓ， １ Ｃ）
【０１２３】
実施例Ｉ
４−エチル−Ｎ−{３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−[２−オキソ−２−（４−ピリジン−４−イルメチル−ピペラジン−１−イル）−エチル]−クロマン−４−イル}−ベンゼンスルホンアミドを含むカプセル
１カプセル当たり以下の組成を持つカプセルを製造した。
４−エチル−Ｎ−{３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−６−[２−オキソ−２−（４−ピリジン−４−イルメチル−ピペラジン−１−イル）−エチル]−クロマン−４−イル}−ベンゼンスルホンアミド  ２０ ｍｇ
コーンスターチ        ６０ｍｇ
ラクトース          ３００ｍｇ
ＥＡ                      適量
ＥＡを使用して、有効成分、コーンスターチおよびラクトースを均質なペースト状の混合物にした。ペーストを挽き、得られた顆粒を適切なトレーに入れ、４５℃で乾燥させて溶媒を除去した。乾燥した顆粒を粉砕機に通し、ミキサーによりさらに以下の補助剤と混合した。
滑石粉                    ５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ５ｍｇ
コーンスターチ            ９ｍｇ
そして、次に４００ｍｇのカプセル（=カプセルサイズ０）に注入した。
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月3日(2008.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
１． 該物質のＫV１．５カリウムチャンネル遮断効果のｉｎ−ｖｉｔｒｏ試験
該物質のＫV１．５カリウムチャンネル遮断効果は、既知の試験モデルにおいて、またはこの試験モデルと同じように実証される（参照：Ｗ．  Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．， Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ＴｏＸｉｃｏｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４  （１９９５）  １−７）。この試験モデルにおいて、チャイニーズハムスターの卵巣細胞の細胞株（＝「チャイニーズハムスター卵巣細胞」、「ＣＨＯ」）が使用されるが、これは単細胞から生じて安定してＫV１．５チャンネルを発現する。ＲｂＣｌを含有する培養液または「ローディングバッファー」（全てｍＭ値：ＲｂＣｌ  ５、ＮａＣｌ  １４０、ＣａＣｌ2  ２、ＭｇＳＯ4  １、ＨＥＰＥＳ緩衝液  １０、グルコース  ５）において一晩培養することによって、Ｎａ+／Ｋ+ＡＴＰアーゼの影響下でＲｂ+ｗｐ用いて前述の卵巣細胞をロードする。その後、参照基準として阻害薬のない状態で卵巣細胞の一部を培養し、一方、式Ｉで表わされる各抑制試験物質の存在下において卵巣細胞の別の部分を培養する。次に、細胞外のカリウムイオン濃度を増大させて卵巣細胞を脱分極化し、卵巣細胞のＫV１．５カリウムチャンネルを開く。阻害薬非存在下で、Ｒｂ+イオンはＫV１．５カリウムチャンネルを通じて周囲の液体に流れ込む。一方式Ｉで表わされる抑制試験物質の存在下においては、Ｒｂ+イオンは卵巣細胞内に固定されたままである。式Ｉで表わされる試験物質のＫV１．５カリウムチャンネル遮断効果の程度は、参照基準に対する原子吸光分析によって周囲の液体内のＲｂ+イオン濃度を測定することにより決定する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
チャイニーズハムスター卵巣細胞（上を参照）を既知の、ＲｂＣｌ含有ＣＨＯ細胞用培養液で培養し、９６サンプル容量サンプルプレートのサンプルウエル（「９６枚のウエルプレート」）に入れた。卵巣細胞を一晩増殖させ、卵巣細胞の単層を得た。次に、まず培養液をピペットで除去し、各サンプルウエルを１回につき１００μＬの低カリウムイオン濃度のプレインキュベーション緩衝液（全てｍＭの値：  ＫＣｌ  ５、ＮａＣｌ  １４０、ＣａＣｌ2  ２、ＭｇＳＯ4  １、ＨＥＰＥＳ緩衝液１０、グルコース５）で３回洗浄した。次に各試験物質の溶液（ＤＭＳＯ内の原液、プレインキュベーション緩衝液で希釈、試験バッチ１０μＭ内の最終濃度）あるいは溶媒（陰性対照として）の５０μＬを各サンプルウエルに加え、どちらの場合も室温で１０分間培養した。次に高カリウムイオン濃度の刺激用緩衝液５０μＬ（ＫＣｌ １４５ ｍＭ、ＮａＣｌ ０ ｍＭ、さもなければプレインキュベーション緩衝液と同じ）を各サンプルウエルに加え、サンプルを室温で１０分間さらに培養した。どちらの場合も、各サンプルウエルから卵巣細胞の周囲の液体８０μＬを別々に分析用サンプルプレートのサンプルウエルに移し、液体中のＲｂ+イオン濃度を原子吸光分析によって測定した。該試験物質は各々二度試験した。陽性対照として既知の高濃度カリウムチャンネル４−ＡＰ遮断薬（ＫV１．５チャンネル用１００×ＩＣ50）を使用することによって、Ｒｂ+流出のＫV１．５成分を表わす信号部分を測定した。これにより、Ｒｂ+流出のどの部分が４−ＡＰに左右され、したがって、ＫV１．５チャンネルに割り当てられるか判断することができるようになった。１０μＭの濃度で使用した物質については、Ｒｂ+流出は少なくとも５０％減少し、半最大有効濃度を決定できるように低濃度の該試験物質で追試を行なった。どちらの場合も、式Ｉで表わされる試験物質の半最大阻害濃度（ＩＣ50）を固有変数として求めた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
２． 該物質のＫV１．３カリウムチャンネル遮断効果のｉｎ−ｖｉｔｒｏ試験
該物質のＫV１．３カリウムチャンネル遮断効果を既知の試験モデル（例えばＧｅｎｉｏｎ社、ハンブルグ）により、あるいはこの試験モデルと同様に実証する（参照：Ｊ．Ｐｌａｓｅｋ ａｎｄ Ｋ． Ｓｉｇｌｅｒ， Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ３３ （１９９６） １０１−１２４）。この試験モデルにおいて、安定してＫV１．３カリウムチャンネルを移入したチャイニーズハムスターの既知の卵巣細胞（=ＣＨＯ）を使用する。移入した細胞における該細胞特有のＫV１．３カリウムチャンネル活性の遮断には、およそ−４０ｍＶから−３０ｍＶへの膜電位の正の変化が伴うが、平行して試験した野生型のＣＨＯ細胞においては膜電位の有意な変化は認められない。したがって、膜電位の変化はＫV１．３カリウムチャンネル活性の減少に関係する。ＫV１．３カリウムチャンネルを例えば式Ｉで表わされる物質による遮断およびその結果生じる膜電位の変化によって、卵巣細胞の細胞内区画における膜電位感受性蛍光色素が蓄積し、その結果蛍光の増大が生じる。したがって、卵巣細胞の膜電位の変化は膜電位感受性色素の蛍光の増加量によって間接的に測定される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
該細胞は、市販の移入試薬（ＤＭＲＩＥ−Ｃ、ドイツＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて既知の方法でＫV１．３プラスミドを移入した。移入の成功は、免疫蛍光検査法およびカリウムイオン流の「パッチクランプ」試験によって確認した。Ｔｅｃａｎ社（ドイツ）のＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ蛍光リーダーを使用して蛍光測定を行なった。いずれの場合も、卵巣細胞において濃度１０μＭの式Ｉで表わされる物質でＫV１．３カリウムチャンネル遮断によって引き起こされた蛍光強度の増加量を固有の変数として決定した。蛍光強度の増加量は、いずれの場合も標準物質マルガトキシンによって引き起こされる蛍光強度の増加量と比較した割合（％）で示した。マルガトキシンは、選択的なＫV１．３カリウムチャンネル遮断薬として知られている（例えば次を参照：Ｍ．Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，  Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８ （１９９３） １８８６６−１８８７４）。
【国際調査報告】
2008536842.tif 000036
2008536842.tif 000037