(57)【要約】本発明は、カスパーゼ−２を認識し、その活性を妨げかつ阻止する新規選択的カスパーゼ−２阻害剤であって、２−キノリニルカルボニル−Ｌ−バリニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）−Ｌ−バリニル−Ｌ−アラニル−アスパルチル（メチルエステル）２，６−ジフルオロフェニルエステル（配列１）およびその誘導体の骨格をベースとするものに関する。配列１は、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）に相当する。カスパーゼ−２が関与する疾患を予防および治療するための前記阻害剤の適用。
2008509079.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カスパーゼ−２を認識し、その活性を妨げおよび阻止する新規選択的カスパーゼ−２阻害剤であって、２−キノリニルカルボニル−Ｌ−バリニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）−Ｌ−バリニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）  ２，６−ジフルオロフェニルエステル（配列１）およびその誘導体である骨格をベースとし、配列１は、式Iaまたは1b：
【化１】
2008509079.tif 000037
に相当するカスパーゼ−２阻害剤。
【請求項２】
構造II：
【化２】
2008509079.tif 000038
をベースとする、請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項３】
構造III：
【化３】
2008509079.tif 000039
をベースとし、ここで、
（i）各アミノ酸の絶対配置はＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）Ｒ１およびＲ２は、水素原子、重水素原子、Ｃ１−２０脂肪族、置換または無置換アリール、シクロアルキル、ナフチル、置換ナフチル、２−ベンゾオキサゾリル、置換２−オキサゾリル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ置換フェニル、（ＣＨ２）ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎヘテロアリール、ＣＨ２Ｎ２、ＣＨ２Ｙ、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＣＯＲ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２、ＣＨ２ＯＣＯＲ、ＣＨ２Ｏ−ＣＯアリール、ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）置換アリール（例：２，６−ジメチルベンゾイルオキシメチル）、ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）置換アリール、ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）ヘテロアリール、ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）置換ヘテロアリールまたはＣＨ２ＯＰＯＲ２であり；
（iii）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、２０種のアミノ酸のうちの１つの側鎖（システインを除く）であり、例えば、ペンタペプチドは、Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐの類似体であってもよく；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はまた、Ｃ１−２０脂肪族、シクロアルキル、ナフチル、置換ナフチル、２−ベンゾオキサゾリル、置換２−オキサゾリル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ置換フェニル、（ＣＨ２）ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎヘテロアリール、ＣＨ２Ｎ２、（ＣＨ２）ｎＺ、ＣＨ２ＯＣＯＲ、ＣＨ２ＯＣＯ（アリール）、ＣＨ２ＯＣＯ（置換アリール）、ＣＨ２ＯＣＯ（ヘテロアリール）、ＣＨ２ＯＣＯ（置換ヘテロアリール）またはＣＨ２ＯＰＯＲ２であり；
（iv）Ｒ７は水素原子であり、Ｒ８はＲ、Ｕ、ＣＯ（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｕ）またはＣＯ（ＣＨ２）ｎＳ（Ｕ）であり；
（v）Ｕは、（無）置換（２−、３−、４−、５−、６−、７−または８−）キノリニル、Ｃ１−２０直鎖または分枝鎖アルキル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ置換フェニル、（ＣＨ２）ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎヘテロアリールまたはマーカー基、例えば、蛍光マーカーまたは電子顕微鏡法において有用なマーカーであり；
（vi）Ｒ７およびＲ８はまた、介在窒素と共にひとまとめになって、ヘテロ環、例えば、置換または無置換テトラヒドロキノリン、テトラヒドロイソキノリン、ジヒドロアクリジン、ベンズアゼピン、ピロリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ジヒドロピリジン、ベンズイミダゾール、イミダゾール、イミダゾリン、ピロール、ピロリジン、ピロリン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、チアゾール、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、カルバゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、ジヒドロフェナジン、ジヒドロシンノリン、ジヒドロキノキサリン、ジヒドロナフチリジン、テトラヒドロナフチリジン、ジヒドロアクリジン、インドール、イソインドール、ジヒドロインドール、インドリン、インダゾール、プリン、９，１０−ジヒドロフェナントリジン、５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン、１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン、β−カルボリン、ピリド［４，３−ｂ］インドール、２，３，９−トリアゾフルオレン、９−チア−２，１０−ジアザアントラセン、チエノ［３，２ｂ］ピロールまたはジヒドロフェナントリンを形成し；
（vii）Ｒは、水素原子、Ｃ１−２０脂肪族基、アリール、置換アリール（例：４−ニトロフェニルまたはクマリン誘導体）、ヘテロアリール（例：２−ピリジン）、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、ナフチル、置換ナフチル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ置換フェニル（例：２，６−ジハロフェニル）、（ＣＨ２）ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎヘテロアリールまたは（無）置換（２−、３−、４−、５−、６−、７−または８−）キノリニルまたはフルオレンメチルであり；
（viii）Ｙは、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、アリールまたはアルキルスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシを含む電気陰性脱離基、ＯＲ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、またはＯＰ（Ｏ）Ｒ２であり、ここで、Ｒは、脂肪族基、アリール基、アラルキル基、カルボ環基、アルキルカルボ環基またはヘテロ環基であり；
（ix）Ｚは、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、ＣＮ、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＣＯＲ、ＣＯ２ＲまたはＣＯＮＲ２であり；
（x）ｎは０〜２０である、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項４】
式IV.1〜IV.7：
【化４】
2008509079.tif 000040
のカルバ類似体を含む構造IVをベースとし、ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項５】
式V.1〜V.7：
【化５】
2008509079.tif 000041
（ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置はＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは上記の通りである）
のペンタペプチドＶＤＶＡＤのケトメチレン類似体を含む構造Vをベースとする、請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項６】
式VI：
【化６】
2008509079.tif 000042
（ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  Ｘは、ＯまたはＮＨであり、少なくとも１つのＸは酸素原子であり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りであり；
−  Ｒ９は、水素原子、（２−、３−、４−、５−、６−、７−または８−）キノリニル、Ｃ１−２０直鎖または分枝鎖アルキル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ置換フェニル、（ＣＨ２）ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎヘテロアリール、ＯＣＯＲまたはＯＣＮＨＲである）
のデプシペプチド類似体を含む構造VIをベースとする、請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項７】
式VII：
【化７】
2008509079.tif 000043
（ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  Ｘは、ＯまたはＮＨであり、少なくとも１つのＸは酸素原子であり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは上記の通りであり；
−  Ｒ９は、水素原子、（２−、３−、４−、５−、６−、７−または８−）キノリニル、Ｃ１−２０直鎖または分枝鎖アルキル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ置換フェニル、（ＣＨ２）ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎヘテロアリール、ＯＣＯＲまたはＯＣＮＨＲである）
のデプシペプチド類似体を含む構造VIIをベースとする、請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項８】
式VIII.1〜VIII.7：
【化８】
2008509079.tif 000044
のヒドロキシエチレン類似体を含む構造VIIIをベースとし、ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項９】
式IX.1〜IX.6：
【化９】
2008509079.tif 000045
の還元型ペンタペプチド類似体を含む構造IXをベースとし、ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは上記の通りである、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項１０】
式X.1〜X.7：
【化１０】
2008509079.tif 000046
の不飽和類似体を含む構造Xをベースとし、ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは上記の通りである、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項１１】
式XI.1〜XI.9：
【化１１Ａ】
2008509079.tif 000047
【化１１Ｂ】
2008509079.tif 000048
のベータペプチド、ガンマペプチド、尿素およびカルバメートの類似体を含む構造XIをベースとし、ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  Ｘは、ＣＨ２、ＮＨまたはＯであり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項１２】
式XII.1〜XII.15：
【化１２Ａ】
2008509079.tif 000049
【化１２Ｂ】
2008509079.tif 000050
のＶＤＶＡＤの配座制限類似体を含む構造XIIをベースとし、ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  Ｗ、ＸおよびＹは、ＣＨ、ＣまたはＮであり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項１３】
式XIII.1〜XIII.15：
【化１３Ａ】
2008509079.tif 000051
【化１３Ｂ】
2008509079.tif 000052
のＶＤＶＡＤの配座制限類似体を含む構造XIIIをベースとし、ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  Ｗ、ＸおよびＹは、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項１４】
式XIV.1〜XIV.15：
【化１４Ａ】
2008509079.tif 000053
【化１４Ｂ】
2008509079.tif 000054
【化１４Ｃ】
2008509079.tif 000055
のＶＤＶＡＤの配座制限類似体を含む構造XIVをベースとし、ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項１５】
式XV.1〜XV.15：
【化１５Ａ】
2008509079.tif 000056
【化１５Ｂ】
2008509079.tif 000057
【化１５Ｃ】
2008509079.tif 000058
のＶＤＶＡＤの配座制限類似体を含む構造XVをベースとし、ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは上記の通りである）、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項１６】
式XVI.1〜XVI.15：
【化１６Ａ】
2008509079.tif 000059
【化１６Ｂ】
2008509079.tif 000060
【化１６Ｃ】
2008509079.tif 000061
のＶＤＶＡＤの配座制限類似体を含む構造XVIをベースとし、ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項１７】
式XVII.1〜XVII.15：
【化１７Ａ】
2008509079.tif 000062
【化１７Ｂ】
2008509079.tif 000063
【化１７Ｃ】
2008509079.tif 000064
のＶＤＶＡＤの配座制限類似体を含む構造XVIIをベースとし、ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項１８】
式XVIII.1〜XVIII.15：
【化１８Ａ】
2008509079.tif 000065
【化１８Ｂ】
2008509079.tif 000066
【化１８Ｃ】
2008509079.tif 000067
のＶＤＶＡＤの配座制限類似体を含む構造XVIIIをベースとし、ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項１９】
式XIX.1〜XIX.15：
【化１９Ａ】
2008509079.tif 000068
【化１９Ｂ】
2008509079.tif 000069
【化１９Ｃ】
2008509079.tif 000070
のＶＤＶＡＤの配座制限類似体を含む構造XIXをベースとし、ここで、
−  各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
−  ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである、
請求項１に記載の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１つに記載された少なくとも１種の化合物の有効量を、製薬上許容される担体と関連してまたは関連しないで含む医薬組成物。
【請求項２１】
インビボの細胞死を低減させる、経口、経鼻投与、局所（脳室内、海馬内、その他の脳内送達、機械的送達用器具の脳内移植）または全身（例えば、腹腔内、静脈内等）投与または皮内送達またはくも膜下送達のための、または、エアロゾルとしての、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
細胞死におけるカスパーゼ−２の活性を妨げるまたは阻止する、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記細胞は、ニューロン、神経細胞または非神経細胞である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
神経保護作用または脳保護作用を提供するための、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
細胞保護作用を提供するための、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
局所脳虚血に続く虚血性損傷を含む病的状態の治療のための、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ＭＣＡＯの結果としての局所脳虚血に続く虚血性損傷を含む病的状態の治療のための、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
出生時または周産期中の脳卒中の結果としての局所脳虚血に続く虚血性損傷を含む病的状態の治療のための、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
非脳部位における血栓の結果としての局所脳虚血に続く虚血性損傷を含む病的状態の治療のための、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
局所動脈梗塞の治療のための、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
患者の動脈管、または左総頸動脈を含むより直接的なルートからの血行性の差異によって引き起こされる、中大脳動脈（ＭＣＡ）域または左脳半球における虚血病変の治療のための、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
ＭＣＡの皮質またはレンズ核線状体の枝または主要枝の閉塞を含む虚血性多発性病変の閉塞の治療のための、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
心不全または心臓血管損傷の間の血流減少または低酸素症の結果としての全脳虚血に続く虚血損傷を含む病的状態の治療のための、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
血流および酸素圧が乱されることにより脳（一過性または永続性）損傷がもたされた病的状態を含む病的状態の治療のための、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カスパーゼ−２阻害剤およびそれらの生物学的適用、特に、局所脳虚血および全脳虚血の治療のためのそれらの適用に関する。
【０００２】
（Ｉ  本発明の分野）
本発明は、医薬品生物学および化学の領域内にあり、プロアポトーシス性のカスパーゼ−２（Ｎｅｄｄ−２；Ｉｃｈ−１）を阻害して、カスパーゼ−２活性が関係する疾患および損傷を治療する新規な化合物および医薬組成物に関連する。より詳細には：
（ａ）本発明は、細胞死、特に、インビボの脳細胞死を阻止、予防または治療する手段、方法および産物に関する；
（ｂ）本発明は、カスパーゼ−２が、神経細胞死（特にアポトーシス）のインビトロおよびインビボの、低酸素性脳虚血症（hypoxia-ischemia：Ｈ−Ｉ）損傷を含む病的状況および（ニューロンまたは他の非ニューロン細胞の）脳損傷をもたらす脳卒中様の状況：例えば、ＭＣＡＯ（Middle Cerebral Artery Occlusion：中大脳動脈閉塞）の、全体（心不全または心臓血管損傷の間の血流減少または虚血症の結果として）または局所の、一過性または永続性の、成人または新生児のＨ−Ｉ、低酸素症を伴うまたは伴わない虚血症および／または低血糖症、再潅流を伴うまたは伴わないＨ−Ｉの阻害のための上流の主要なチェックポイントであることの発見に関する；
（ｃ）本発明は、選択的カスパーゼ−２阻害剤（例えば、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ）が、インビボの神経細胞死を予防しまたは減少させることの発見に関する；
（ｄ）本発明は、選択的カスパーゼ−２阻害剤（例えば、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ）が、局所の一過性新生児Ｈ−Ｉに続く虚血損傷を含むインビボの病的状況において脳細胞死を予防または減少させることの発見に関する；
（ｅ）本発明は、選択的カスパーゼ−２阻害剤（例えば、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ）が、心不全または心臓血管損傷の間の血流減少性低酸素症に続く成人の全脳虚血を含むインビボの病的状況において脳細胞死を予防または減少させることの発見に関する；
（ｆ）本発明は、血流および酸素圧が乱されている病的状況、すなわち、（一過性または永続性の）局所脳虚血症または全脳虚血症の間の脳細胞死を減少させるための局所的（例えば、脳室内、海馬内等）送達または全身的（腹腔内、静脈内等）投与を含む、特定の新しいカスパーゼ−２阻害剤の新しい適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（ＩＩ  本発明をサポートするデータ）
本発明は、細胞死、特に、ニューロンの細胞死を阻止、予防または治療するための手段、方法および産物に関する。
【０００４】
ニューロンの細胞死は、適切な前および後シナプス接続を確実にし、機能的な成人脳の形成を可能にするように過剰のニューロンを除去するために胚形成の間に起こる。正常な加齢に関連する分裂終了死とは別に、環境的または遺伝子的な突然変異因子が、急性の損傷（例えば、低酸素性虚血症、脳卒中、脊髄損傷、外傷）または慢性の神経変性疾患の間に成人のヒトにおいてニューロン死を誘導し得る。これらの障害に伴う細胞死は、形態学的および生化学的特徴を呈する３つの相異なるメカニズムであるネクローシス、オートファジーまたはアポトーシスにより起こり得る。生理学的および病理学的なニューロン死は、しばしば、欠陥のあるアポトーシス調節と関連し、この活性な細胞の自殺メカニズムにつながるシグナリング経路は、哺乳動物細胞においてシステインアスパラギン酸特異的プロテアーゼ（カスパーゼ）−依存性対カスパーゼ非依存性経路に分けられ得る。
【０００５】
ニューロンのアポトーシスは活性な細胞自殺メカニズムであり、これは、開始、決定、実行および分解を含む経時的な相に分けられ得る。この事象のカスケードは、特有の機構の活性化によって分けられ、この活性化は、システイン依存性アスパラギン酸特異性プロテアーゼ（カスパーゼ）および決定的（または増幅）調節オルガネラとして作用し得るミトコンドリアの両方の活性化を含む。実際に、ミトコンドリアの変化は、ミトコンドリア内膜の電気化学的勾配（ΔΨｍ）の喪失およびアポトーシス因子（例えば、シトクロムｃ、Smac/Diablo）およびアポトーシス誘導因子の放出を含む。一旦、ミトコンドリアから放出されると、これらの因子が引き金となって、カスパーゼ依存性および／またはカスパーゼ非依存性の細胞質および核が解体される。それ故に、カスパーゼと結び付けられるミトコンドリア因子は、細胞収縮、核凝縮、アポトーシス体の放出および「イート・ミー」シグナルの出現（食作用前の形質膜の外側リーフレットへのフォスファチジル・セリンのトランスロケーション等）をもたらすアポトーシスの分解相に関与する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
インビトロまたはインビボのニューロンのアポトーシスの間のミトコンドリア、カスパーゼおよび他の事象のそれぞれの寄与は、依然として、特に虚血性または脳卒中性の損傷について解明されていない。
【０００７】
説明されるように、本発明は、インビボの虚血に関連する実験モデルとしてのニューロン培養において特異的なインビトロカスパーゼアッセイおよび血清枯渇を用いることによって、インビトロおよび細胞内でカスパーゼ−２活性を阻害することを可能にする有用な手段および分子を提供する。
【０００８】
本発明の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤は、カスパーゼ−２を認識し、その活性を妨げおよび阻害するものであり、これは、次の骨格をベースとしている：２−キノリニルカルボニル−Ｌ−バリニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）−Ｌ−バニリル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）  ２，６−ジフルオロフェニルエステル（配列１）。
【０００９】
１つの好ましい分子は、配列１に相当する。
【００１０】
他の好ましい分子は、特に表１〜１４に示されるような構造II〜XIXを含む。
【００１１】
本発明の別の目的は、プロアポトーシス・カスパーゼ−２活性を阻害し、細胞保護作用を誘導する新規な産物（分子または製剤）を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、カスパーゼ−２が関与する疾患および損傷の治療の産物および医薬組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、カスパーゼ−２活性を直接的に阻害し、カスパーゼ−２によって媒介されるインビボおよびインビトロの細胞死を軽減させるための薬理学的に特有のペプチド（優先的ではあるが排他的ではないペンタペプチドをベースとする分子）を開発した。
【００１４】
このような阻害剤は、細胞死の活性を妨げまたは阻害することが可能である。前記細胞は、ニューロン、ニューロン細胞または非ニューロン細胞である。
【００１５】
上記に規定された阻害剤は、神経防護作用または脳保護作用を提供するためのカスパーゼ−２活性のインビボ阻害に有用である。それらはまた、細胞保護作用を提供するためのカスパーゼ−２活性のインビボ阻害に有用である。
【００１６】
一つの態様によると、本発明は、（全または局所）虚血損傷に続く脳における細胞死を予防する方法に関する。
【００１７】
実施例によって説明されるように、本発明は、細胞死、特に、損傷を受けた（虚血性）脳における細胞死を阻止または予防または治療するための手段、方法および産物を提供する。
【００１８】
説明されるように、本発明者らは、特異的なカスパーゼ−２阻害剤（単回の腹腔内注射服用）が、新生児の一過性低酸素虚血脳損傷において重篤な梗塞の低減を誘導することを証明する。梗塞容量の減少は、虚血開始の前後にカスパーゼ−２阻害剤が投与された場合に得られた。阻害剤によって提供された細胞保護作用は、温度（体温降下または体温上昇）調節によって調停されない。しかし、インビボのカスパーゼ−２の活性またはカスパーゼ−２のプロセシングは、阻害剤の注射後に根絶された。
【００１９】
説明されるように、本発明者らは、特有の脳室内（ＩＣＶ）のカスパーゼ−２阻害剤の投与（単回服用）が、結果として、クレシルバイオレット強度染色の部分的な増加、損傷細胞でのFluoro Jade Bの取込の欠如、核形態の改善または維持（ヘキスト（登録商標）３３３４２）並びに阻害剤により処理されたラットの行動における相当の改善（虚血後の再供給；自発的活動および反応に関するテストにおいてより高いスコア）をもたらすことを証明する。阻害剤によって提供される細胞保護および行動の効果は、温度（体温降下または体温上昇）調節によって調停されない。
【００２０】
別の態様によると、本発明はまた、カスパーゼ−２活性を予防することが可能な分子およびカスパーゼ−２が関与する疾患および損傷を治療するのに有用な医薬組成物に関する。
【００２１】
合成された分子は、カスパーゼ−２阻害のための条件下に、ヒトまたは動物に導入される。導入工程は、適切なキャリアとしてまたは注射によって実施されるように分子の化学的な改変を含む。
【００２２】
したがって、これは、特異的なカスパーゼ−２阻害剤を含む医薬組成物を提供するための本発明の別の目的である。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、上記に規定された少なくとも１種のカスパーゼ−２阻害剤の治療上の有効量を、製薬上許容される担体と関連して含む。
【００２４】
阻害剤の投与は、経口、経鼻、局所（脳室内、海馬内または他の脳内送達、機械的送達用器具（例えば、化合物または医薬組成物を充填したGelfoam（登録商標））の脳内移植）または全身性（腹腔内、静脈内）ルートまたは脳内送達によってまたはエアロゾルとしてインビボの脳細胞死を低減させるために行われる（しかし、これに制限されるわけではない）。
【００２５】
本発明はまた、カスパーゼ−２活性が関与する病状の予防または治療用の薬品を製造するための前記カスパーゼ−２阻害剤の使用に関する。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、細胞死を伴う病状、特に、Ｈ−Ｉ損傷および脳卒中様の状況の脳損傷：例えば、全体的または局所的な、一過性または永続性の、成人または新生児の、脳または心臓レベルの起源を持つ、再潅流を伴うまたは伴わないＨ−Ｉ（低酸素／低血糖を伴うまたは伴わない虚血症）またはＭＣＡＯ（Middle Cerebral Artery Occlusion：中大脳動脈閉塞）を予防、低減および治療するために特に有用である。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、特に、
・慢性変性疾患、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、球脊髄性筋萎縮症（spinobulbar astrophy）、プリオン病、痴呆を含む神経変性疾患の間のアポトーシスを予防および／または治療する、または、
・網膜周皮細胞のアポトーシス、網膜ニューロンのアポトーシスの緑内障、局所的虚血に由来する網膜損傷、糖尿病性網膜症を予防および／または治療する、または、
・てんかんを予防および／または治療する、または、
・脊髄損傷の間のアポトーシスを予防および／または治療する、または、
・外傷性の脳損傷、網膜虚血に由来するアポトーシスを予防および／または治療する、または、
・局所脳虚血の病的状況の間のアポトーシスを予防および／または治療する、または、
・脳保護作用を提供する、または、
・自己免疫疾患および移植拒絶反応に伴う細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞媒介型アポトーシスを予防および／または治療する、または、
・心不全、心筋症、心臓のウイルス感染または細菌感染、心筋虚血、心筋梗塞および冠動脈バイパスグラフトを含む心臓細胞の細胞死を予防および／または治療する、または、
・（例えば、化学療法またはＨＩＶ治療の結果としての）ミトコンドリアの薬物中毒を予防および／または治療する、または、
・ウイルス感染または細菌感染の間の細胞死を予防および／または治療する、または、
・炎症または炎症性疾患、炎症性大腸疾患、敗血症および敗血症性ショックを予防および／または治療する、または、
・卵胞から卵母細胞への段階、卵母細胞から成熟卵への段階および精子（例えば、卵巣組織を凍結および移植する方法、人工授精）の細胞死を予防する、または、
・化学療法後の女性および男性の生殖能力を守る、または、
・雌および雄の動物の生殖能力を守る、または、
・黄斑変性症および緑内障を予防および／または治療する、または、
・急性肝炎、慢性活動性肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を予防および／または治療する、または、
・男性型禿頭症、放射線、化学療法または感情的ストレスに起因する脱毛を予防および／または治療する、または、
・（高レベルの放射線への露出、熱、火傷、化学品、日光および自己免疫疾患に起因する）皮膚損傷を治療または改善する、または、
・骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome：ＭＤＳ）における骨髄細胞の細胞死を予防する、または、
・膵炎を予防および／または治療する、または、
・呼吸器症候群を予防および／または治療する、または、
・変形性関節症、関節リウマチ、乾癬、糸球体腎炎、動脈硬化症および移植片対宿主病を予防および／または治療する、または、
・アポトーシスの増加が関係する疾患状態を予防および／または治療する、または、
・植物（例えば、草木、花、葉状植物（キノコ、海草）等）の細胞死を予防する
ために有用である。
【００２８】
本明細書において用いられる場合の用語「治療または治療する」は、臨床結果を含めて有益または望みの結果を得るための取り組みを意味する。有益なまたは望みの臨床結果は、１以上の症状または状態の軽減または改善、疾患の範囲の縮小、安定化された（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患の予防拡大、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的）を、検出可能または検出不可能であるにせよ含み得るが、これらに限定されるわけではない。「治療する」は、治療を受けない場合に予想される生存と比較して延命することも意味する。
【００２９】
本発明はまた、細胞死を伴う病状、特に、虚血および脳卒中様損傷を治療する方法であって、上記に規定されたような医薬組成物の治療上の有効量の用量を投与する工程を包含する方法に関する。
【００３０】
本発明の正確な特徴および利点は、下記データ中に、図面を参考にしながら与えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（III  ペプチドおよび疑ペプチドのカスパーゼ−２阻害剤）
１．Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ
Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ（配列１）は、疑ペプチド（分子量：８２７）であり、これは、ヒト組み換えカスパーゼ−２をインビトロで選択的に阻害する（ＩＣ５０＝８０ｎＭ）が、他のシステインプロテアーゼを阻害しない。それは、ペンタペプチドＶＤＶＡＤ（アスパラギン酸残基上でＯ−メチル基（ＯＭｅ）により置換されたＬ−バリニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−バリニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラチル）部分、キノリニルカルボニルおよび２，６−ジフルオロフェニルエステル骨格を結合する。その化学式は、キノリン核上に置換されたＶＤ（ＯＭｅ）ＶＡＤ（ＯＭｅ）−Ｏｐｈの位置に従ってIa／Ibである：例えば、２−キノリニルカルボニル−Ｌ−バリニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）−Ｌ−バリニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）−２，６−ジフルオロフェニルエステル（II，ｎ＝０）である。
【００３２】
【化１】
2008509079.tif 000003
【００３３】
２−キノリニルカルボニル−Ｌ−バリニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）−Ｌ−バリニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）−２，６−ジフルオロフェニルエステル＝配列１
２．アミノ酸側鎖および官能基の改変
本発明の他の新規選択的カスパーゼ−２阻害剤は、下記構造IIIをベースとする。
【００３４】
【化２】
2008509079.tif 000004
【００３５】
ここで、
（i）各アミノ酸の絶対配置はＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）Ｒ１およびＲ２は、水素原子、重水素原子、Ｃ１−２０脂肪族、置換または無置換アリール、シクロアルキル、ナフチル、置換ナフチル、２−ベンゾオキサゾリル、置換２−オキサゾリル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ置換フェニル、（ＣＨ２）ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎヘテロアリール、ＣＨ２Ｎ２、ＣＨ２Ｙ、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＣＯＲ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２、ＣＨ２ＯＣＯＲ、ＣＨ２Ｏ−ＣＯアリール、ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）置換アリール（例：２，６−ジメチルベンゾイルオキシメチル）、ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）置換アリール、ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）ヘテロアリール、ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）置換ヘテロアリールまたはＣＨ２ＯＰＯＲ２であり；
（iii）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、２０種のアミノ酸のうちの１つの側鎖（システインを除く）であり；例えば、ペンタペプチドは、Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐの類似体であってよい；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はまた、Ｃ１−２０脂肪族、シクロアルキル、ナフチル、置換ナフチル、２−ベンゾオキサゾリル、置換２−オキサゾリル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ置換フェニル、（ＣＨ２）ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎヘテロアリール、ＣＨ２Ｎ２、（ＣＨ２）ｎＺ、ＣＨ２ＯＣＯＲ、ＣＨ２ＯＣＯ（アリール）、ＣＨ２ＯＣＯ（置換アリール）、ＣＨ２ＯＣＯ（ヘテロアリール）、ＣＨ２ＯＣＯ（置換ヘテロアリール）またはＣＨ２ＯＰＯＲ２であり；
（iv）Ｒ７は水素原子であり、Ｒ８はＲ、Ｕ、ＣＯ（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｕ）またはＣＯ（ＣＨ２）ｎＳ（Ｕ）であり；
（v）Ｕは、（無）置換（２−、３−、４−、５−、６−、７−または８−）キノリニル、Ｃ１−２０直鎖または分枝アルキル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ置換フェニル、（ＣＨ２）ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎヘテロアリールまたはマーカー基、例えば、蛍光マーカーまたは電子顕微鏡検査法において有用なマーカー；特に、ビオチン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ヨードアセトアミド、ＤＴＮＢ、ＣＯＲ（例：２−キノリニルカルボニル）、ＣＯＯＲ、ＣＯ（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｚ）、アクリジン誘導体（赤、黄、オレンジ等）、フルオレセイン誘導体（フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、５−（および６−）カルボキシナフトフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、ＢＣＥＣＦ、ナフトフルオレセイン等）、オレゴングリーン（登録商標）（２’，７’−ジフルオロフルオレセイン）染料（オレゴングリーン（登録商標）４８８、オレゴングリーン（登録商標）５１４等）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）染料（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６６５等）、Ｂｉｍａｎｅ、クマリン誘導体（アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）、ＡＭＣＡ、アミノクマリン、ジエチルアミノクマリン、ヒドロキシメチルクマリン、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、ＡＦＣ等）、シアニン誘導体（フィコシアニン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＣＹ３．１８、ＣＹ５．１８、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等）、エリトリン／フィコエリトリン誘導体（Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、Ｂ−フィコエリトリン等）、ＡＰＣ／ＰＥ−Ｃｙ接合体（ＰＥ−Ｃｙ５接合体、ＰＥ−Ｃｙ７接合体、ＡＰＣ−Ｃｙ７接合体等）、カルセイン誘導体（カルセイン、ＳＮＡＦＬカルセイン等）、ＤＡＮＳ、ＤＡＮＳＡ、カスケードブルー、ルシファーイエロー、ＮＢＤ、Ｒｅｄ  ６１３、ＦｌｕｏｒＸ、ローダミン誘導体（ローダミン１２３、ローダミン１１０、ローダミンＢ、ローダミン６Ａ、ローダミン６Ｇ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−ローダミン、スルホローダミン、ローダミン  Ｒｅｄ−Ｘ、リッサミン（登録商標）、ローダミンＢ、ＤＨＲ、ローダミングリーン等）、ＰｅｒＣＰ、テキサスレッド、ＴｒｕＲｅｄ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏ（登録商標）（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０等）、Ｑ−ＤＯＴｓ（登録商標）誘導体（６５５、６０５、５８５、５２５等）、ＳＮＡＲＦ、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）誘導体（Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ｚｅｎｏｎ（登���商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）アロフィコシアニン、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）ビオチン−ＸＸ、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ｒ−フィコエリトリン等）；ＮＢＤ、テキサスレッド（登録商標）、ＱＳＹ（登録商標）染料（ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＱＳＹ（登録商標）２１）、ヘキスト（登録商標）（３３３４２、３３２５８）、ＤＡＰＩ、クロモマイシンＡ３、ミトラマイシン、ＳＹＴＯＸ（ブルー、グリーン、オレンジ）、エチジウム、臭化エチジウム、７−ＡＡＤ、ＴＯＴＯ染料、ＹＯＹＯ染料、ＴＯ−ＰＲＯ染料、ＢＯＢＯ染料、ＪＯ−ＰＲＯ染料、ＬＯ−ＰＲＯ染料、ＰＯ−ＰＲＯ染料、ＹＯ−ＰＲＯ染料、チアゾールオレンジ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＬＤＳ７５１、Ｉｎｄｏ（登録商標）染料（Ｉｎｄｏ−１等）、Ｆｌｕｏ（登録商標）染料（Ｆｌｕｏ−３等）、ＤＣＦＨ、ｐＮＡ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ＳｙＰｒｏ（オレンジ、ルビー）、ＥＤＡＮＳ、ＩＲ８００、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤｉＤ、ＳＮＡＲＦ（登録商標）誘導体、Ｆｕｒａ染料、ＱＵＩＮ染料、ＮＡＮＯＧＯＬＤ粒子、ＮＡＮＯＧＯＬＤマレイミド、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ＦｌｕｏｒｏＮＡＮＯＧＯＬＤ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ＦｌｕｏｒｏＮＡＮＯＧＯＬＤストレプトアビジン、マラカイトグリーン、Ｄａｂｃｙｌ、Ｄａｂｓｙｌ、カスケードイエロー、ダンシル、Ｄａｐｏｘｙｌ、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ベンゾオキサジアゾール誘導体、ストレプトアビジン−／ニュートラアビジン−ビオチン標識蛍光ミクロスフェア、ストレプトアビジンのＣＭＮＢ−ｃａｇｅｄ蛍光接合体、ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  ｗｈｉｔｅ、ナイルレッド、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、ＥＢＦＰ、ＧＦＰ野生型、ＱＦＰ突然変異Ｈ９／Ｐ４／Ｐ９／Ｐ１１／Ｗ、ＧＦＰｕｖ、ＥＣＦＰ、Ｙ６６Ｗ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ＤｓＲｅｄ１、ＤｓＲｅｄ２、ＮＡＮＯＧＯＬＤ（登録商標）粒子、ストレプトアビジン−Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｎａｎｏｍａｌｅｉｄｏ  Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｍｏｎｏ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｍｏｎｏａｍｉｎｏ  Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、陽／陰荷電Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）（ＮＮ、ＮＨＳＮ、ＮＨＳＮＡ、ＮＨＳＮＳ）、Ｎｏｎ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｍｏｎｏｍａｌｅｉｄｏ  Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｍｏｎｏ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｍｏｎｏａｍｉｎｏ  Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）接合体、Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）−ストレプトアビジン、脂質−Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）（パルミトイル  Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、ＤＰＰＥ  Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、パルミトイル  Ｕｎｄｅｃａｇｏｌｄ、ＤＰＰＥ  Ｕｎｄｅｃａｇｏｌｄ）、Ｎｉ−ＮＴＡ−Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８  ＦｌｕｏｒｏＮａｎｏｇｏｌｄ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４  ＦｌｕｏｒｏＮａｎｏｇｏｌｄ、フルオレセイン  ＦｌｕｏｒｏＮａｎｏｇｏｌｄ、ＨＲＰ基質−Ｎａｎｏｇｏｌｄであり；
（vi）Ｒ７およびＲ８はまた、介在する窒素と共にひとまとめになって、ヘテロ環、例えば、置換または無置換テトラヒドロキノリン、テトラヒドロイソキノリン、ジヒドロアクリジン、ベンズアゼピン、ピロリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ジヒドロピリジン、ベンズイミダゾール、イミダゾール、イミダゾリン、ピロール、ピロリジン、ピロリン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、チアゾール、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、カルバゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、ジヒドロフェナジン、ジヒドロシンノリン、ジヒドロキノキサリン、ジヒドロナフチリジン、テトラヒドロナフチリジン、ジヒドロアクリジン、インドール、イソインドール、ジヒドロインドール、インドリン、インダゾール、プリン、９，１０−ジヒドロフェナントリジン、５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン、１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン、β−カルボリン、ピリド［４，３−ｂ］インドール、２，３，９−トリアゾフルオレン、９−チア−２，１０−ジアザアントラセン、チエノ［３，２ｂ］ピロール、ジヒドロフェナントリンを形成し；
（vii）Ｒは、水素原子、Ｃ１−２０脂肪族基、アリール、置換アリール（例：４−ニトロフェニルまたはクマリン誘導体）、ヘテロアリール（例：２−ピリジン）、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、ナフチル、置換ナフチル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ置換フェニル（例：２，６−ジハロフェニル）、（ＣＨ２）ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎヘテロアリールまたは（無）置換（２−、３−、４−、５−、６−、７−または８−）キノリニルまたはフルオレンメチルであり；
（viii）Ｙは、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等）、アリール−またはアルキルスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシを含む電気陰性脱離基、ＯＲ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ２（ここで、Ｒは、脂肪族基、アリール基、アラルキル基、カルボ環基、アルキルカルボ環基またはヘテロ環基であり；
（ix）Ｚは、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、ＣＮ、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＣＯＲ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２であり；
（ｘ）ｎは０〜２０である。
【００３６】
本明細書において用いられる場合、特に断らない限り、下記の規定が適用される。略語ＱおよびＯＰＨは、それぞれ、キノリルカルボニルおよび２，６−ジフルオロフェノキシ表す。本明細書における用語「脂肪族」は、完全に飽和したまたは１以上の不飽和構成単位を含む直鎖または分枝鎖のＣ１−２０炭化水素を意味する。単独でまたはより大きな部分の一部として用いられる用語「アルキル」は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の両方を指す。用語「アリール」は、５〜１４個の原子を有する単環または多環の芳香族環基、例えば、フェニル、ナフチル、アントリル等を指す。用語「ヘテロ環基」は、１以上のヘテロ原子および３〜９の環サイズを含む飽和または不飽和の多環または単環の環系、例えば、フラニル、チエニル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ジオキソラニル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソオキサロリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、ジオキソラニル、モルホリニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、トリアジニル、トリチアニル、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、インドリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンズアミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、１，８−ナフチリジニル、プテリジニル、キヌクリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル等を指す。「ヘテロアリール」は、芳香族であるヘテロ環系の環を指す。用語「カルボ環基」は、３〜１４個の炭素原子の不飽和の単環または多環の炭素環系であって、アリールまたはヘテロ環基に縮合されてもよいものを指す。単独でまたはより大きい部分の一部として用いられる脂肪族、アルキル、アリール、ヘテロアリール（例：キノリン）、ヘテロ環またはカルボ環は、置換または無置換基を指す。置換される場合、これらの基は、１以上の置換基を含んでよい。これらの置換基は、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ＯＨ、Ｕ、ＣＯ（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｕ）、ＣＯ（ＣＨ２）ｎＳ（Ｕ）、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＯＣＯＲ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ２（ここで、Ｒは、脂肪族基、アリール、置換基、アラルキル基、カルボ環基、アルキルカルボ環基、ヘテロ環基または放射性同位体（例：Ｉ１２５、Ｈ３、Ｓ３５、Ｃ１４、Ｐ３３、Ｐ３２、Ｃｒ５１、Ｃａ４５、Ｆｅ５９、Ｎｉ６３、Ｂａ１３３、Ｃｓ１３７、Ｅｕ１５２、Ｒａ２２６、Ｘｅ１３３、テクネチウム９９、タリウム２０１）であり得る。ＦＩＴＣは、フルオレセインイソチオシアネートを表す。
【００３７】
（３．ペプチド等量式または生物等量式）
（ａ）本発明はまた、式IV.1〜IV.7のカルバ類似体（carba analogue）に関する（表１）。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置はＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである。
【００３８】
【表１】
2008509079.tif 000005
【００３９】
（ｂ）本発明はまた、式V.1〜V.7のケトメチレン類似体に関する（表２）。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置はＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは前述の通りである。
【００４０】
【表２】
2008509079.tif 000006
【００４１】
（ｃ）本発明はまた、一般式VIおよびVIIのデプシペプチド類似体に関する。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置はＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ＸはＯまたはＮＨであり少なくとも１つのＸは酸素原子であり；
（iii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは上記の通りであり；
（iv）Ｒ９は、水素原子、（２−、３−、４−、５−、６−、７−または８−）キノリニル、Ｃ１−２０直鎖または分枝鎖アルキル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ置換フェニル、（ＣＨ２）ｎ（１−または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎヘテロアリール、ＯＣＯＲまたはＯＣＮＨＲである。
【００４２】
【化３】
2008509079.tif 000007
【００４３】
（ｄ）本発明はまた、式VIII.1〜VIII.7のヒドロキシエチレン類似体に関する（表３）。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置はＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである。
【００４４】
【表３】
2008509079.tif 000008
【００４５】
（ｅ）本発明はまた、式IX.1〜IX.6の還元されたペンタペプチド類似体に関する（表４）。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである。
【００４６】
【表４】
2008509079.tif 000009
【００４７】
（ｆ）本発明はまた、式X.1〜X.7の不飽和類似体に関する（表５）。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである。
【００４８】
【表５】
2008509079.tif 000010
【００４９】
（ｇ）本発明はまた、式XI.1〜XI.9のβ−ペプチド、γ−ペプチド、尿素およびカルバメートの類似体に関する（表６）。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ＸはＣＨ２、ＮＨまたはＯであり；
（iii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである。
【００５０】
【表６Ａ】
2008509079.tif 000011
【００５１】
【表６Ｂ】
2008509079.tif 000012
【００５２】
（４．ＶＤＶＡＤペンタペプチドの配座制限類似体）
本発明はまた、表７〜１４に示されるＶＤＶＡＤペンタペプチドの配座制限（constrained）類似体に関する。これらの化合物において、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロ環は、置換または無置換基を指す。置換された場合、これらの基は、１以上の置換基を含んでよい。これらの置換基は、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ＯＨ、Ｕ、ＣＯ（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｕ）、ＣＯ（ＣＨ２）ｎＳ（Ｕ）、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＯＣＯＲ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ２であり得る。ここで、ＲおよびＵは上記の通りである。
【００５３】
（ａ）本発明はまた、ペンタペプチドＶＤＶＡＤの配座制限類似体としての３−アミノピリジン−２（１Ｈ）−オン、３−アミノピラジン−２（１Ｈ）−オン、５−アミノピリミジン−４（３Ｈ）−オン、ピリダジン−３（２Ｈ）−オン、４−アミノピリダジン−３（２Ｈ）−オン、５−アミノ−１，２，４−トリアジン−６（１Ｈ）−オン、５−アミノ−１，２，３−トリアジン−４（３Ｈ）−オンおよび６−アミノ−１，２，３，４−テトラジン−５（４Ｈ）−オンであるXII.1〜ＸII.15に関する（表７）。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）Ｗ、ＸおよびＹは、ＣＨ、ＣまたはＮであり；
（iii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、前述の通りである。
【００５４】
【表７Ａ】
2008509079.tif 000013
【００５５】
【表７Ｂ】
2008509079.tif 000014
【００５６】
（ｂ）本発明はまた、３−アミノピペリジン−２−オン、３−アミノピペラジン−２−オン、５−アミノ−テトラヒドロピリミジン−４（１Ｈ）−オン、４−アミノピペラジン−３−オン、６−アミノ−１，２，４−トリアジナン−５−オン、５−アミノ−１，２，４−トリアジナン−６−オン、５−アミノ−１，２，３−トリアジナン−４−オンおよび６−アミノ−１，２，３，４−テトラジナン−５−オンであるXIII.1〜XIII.15に関する（表８）。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）Ｗ、ＸおよびＹは、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
（iii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは上記の通りである。
【００５７】
【表８Ａ】
2008509079.tif 000015
【００５８】
【表８Ｂ】
2008509079.tif 000016
【００５９】
（ｃ）本発明の化合物はまた、３−アミノ−３，４−ジヒドロキノリン−２（１Ｈ）−オンであるXIV.1〜XIV.15を含む（表９）。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、前述の通りである。
【００６０】
【表９Ａ】
2008509079.tif 000017
【００６１】
【表９Ｂ】
2008509079.tif 000018
【００６２】
【表９Ｃ】
2008509079.tif 000019
【００６３】
（ｄ）本発明はまた、４−アミノ−１，２−ジヒドロイソキノリン−３（４Ｈ）−オンであるXV.1〜XV.15に関する（表１０）。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、前述の通りである。
【００６４】
【表１０Ａ】
2008509079.tif 000020
【００６５】
【表１０Ｂ】
2008509079.tif 000021
【００６６】
【表１０Ｃ】
2008509079.tif 000022
【００６７】
（ｅ）本発明はまた、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキサミドであるXVI.1〜XVI.15に関する（表１１）。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、前述の通りである。
【００６８】
【表１１Ａ】
2008509079.tif 000023
【００６９】
【表１１Ｂ】
2008509079.tif 000024
【００７０】
【表１１Ｃ】
2008509079.tif 000025
【００７１】
（ｆ）本発明はまた、４−アミノ−１，２，４，５−テトラヒドロベンゾ［ｃ］アゼピン−３−オンであるXVII.1〜XVII.15に関する。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、前述の通りである。
【００７２】
【表１２Ａ】
2008509079.tif 000026
【００７３】
【表１２Ｂ】
2008509079.tif 000027
【００７４】
【表１２Ｃ】
2008509079.tif 000028
【００７５】
（ｇ）本発明は、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレンであるXVIII.1〜XVIII.15に関する。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、前述の通りである。
【００７６】
【表１３Ａ】
2008509079.tif 000029
【００７７】
【表１３Ｂ】
2008509079.tif 000030
【００７８】
【表１３Ｃ】
2008509079.tif 000031
【００７９】
（ｈ）本発明はまた、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデンであるXIX.1〜XIX.15に関する（表１４）。ここで、
（i）各アミノ酸またはその等量式の絶対配置は、ＬまたはＤのいずれかであり；
（ii）ｎ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｕ、ＹおよびＺは、上記の通りである。
【００８０】
【表１４Ａ】
2008509079.tif 000032
【００８１】
【表１４Ｂ】
2008509079.tif 000033
【００８２】
【表１４Ｃ】
2008509079.tif 000034
【００８３】
前記カスパーゼ−２阻害剤は、有利には、実施例において説明される合成ルートによって得られる。スキーム１〜３に与えられた構造の誘導体は、当業者により、化学合成の古典的な方法を用いることによって得られることになる。
【００８４】
本発明の他の特徴および利点は、以下において図１〜１１を参照にしながら与えられることになる。
【００８５】
５．Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐは、選択的なカスパーゼ−２阻害剤である。
【００８６】
５．１実験セクション
５．１．１  インビトロのカスパーゼ活性アッセイ。
【００８７】
ヒトの組み換えカスパーゼ１〜１０（２５Ｕ；QuantiZyme（登録商標）Assay System，BIOMOL，Plymouth，Pennsylvania，米国）が、アッセイバッファ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，  １００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  ＣＨＡＰＳ，１０ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％グリコール）中、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐと共に３０分３７℃で事前にインキュベートされ、対応する蛍光性カスパーゼ基質（５００μＭ；BIOMOL）と混合された：Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−１）、Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−２）、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−３／７）、Ａｃ−ＷＥＨＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−４／５）、Ａｃ−ＶＥＩＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−６）、Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−８）、Ａｃ−ＬＥＨＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−９）またはＡｃ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣ（カスパーゼ−１０）。基質の分断は、蛍光マイクロプレートリーダー（TECAN，Genios；発光５１０ｎｍ、励起４０５ｎｍ）上で評価され、ＩＣ５０値は、用量−応答Ｓ字形曲線から測定された。各カスパーゼの特異的活性は、対応する特異的阻害剤（１〜２μＭ，BIOMOLおよびMPBioMedicals）により内部コントロールされた。他のインビトロアッセイは、カルパインおよびグランザイムをベースとする試験のためのＣＥＲＥＰでまたはＣＥＲＥＰプロトコールにより行われた。
【００８８】
ＩＣ５０の測定は、１００μｌのアッセイバッファ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，  １００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  ＣＨＡＰＳ，１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％  グリセロール）中の組み換えカスパーゼ−２によりＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの増加する濃度を熟考することによって行われた。組み換えカスパーゼ−２（１２５Ｕ）による５０μＭのＶＤＶＡＤ−ＡＭＣの分断は、３０分後に３７℃で、蛍光マイクロプレートリーダー上で、４０５ｎｍでの励起の際の５１０ｎｍでの蛍光発光をモニタリングすることによって測定された。
【００８９】
５．１．２  一次皮質ニューロンの単離、培養およびアポトーシス誘導
一次皮質ニューロンは、Ｅ１４  ＳＷＩＳＳマウス胚（Janvier）から培養された。マウスは、頸椎脱臼によって犠牲にされ、胚は、帝王切開によって取り出された。大脳皮質が抽出され、組織は、機械的に、１５回、Ｌ１５培地（Gibco BRL）において、１０００μｌのチップ（Eppendorf）を用いることによって粉砕され、次いで、残骸は取り除かれ、細胞懸濁液は、１０分にわたり８５０ｒｐｍの遠心分離にかけられた。ニューロンは、１％のグルタミン、５％のウマ血清（HS，Eurobio）および２．５％のウシ胎仔血清（FCS，Eurobio）が補給されたイーグルの基本培地（Eurobio）中、高密度（ｃｍ２当たり７×１０５個の生存細胞）で、１ｍｇ／ｍｌのポリエチレンイミン（Sigma）により予めコーティングされた６または２４ウェル−プレート（Sarstedt）または４−ウェル−Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）チャンバ型カバーグラス（Nalge Nunc International）上に２日間にわたり置かれた。ＤＩＶ３で、培地は、日毎に変更され、ニューロンは、１８０ｍｇ／ｌのグルコース、５％のＨＳおよび１％のＦＣＳ、３μＭのシトシン  β−Ｄ−アラビノフラノシド（Sigma）および１μＭのマレイン酸５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾシクロヘプテン−５，１０−イミン（MK-801，Sigma）を含むＮ５完全培地中に維持された。培地の純度（＞９５％）は、抗微小管結合タンパク質２（anti-Microtubule Associated Protein 2：ＭＡＰ−２）モノクローナル抗体（Sigma）および抗グリア細胞繊維性酸性タンパク質（anti-Glial Fibrillary Acidic Protein：ＧＦＡＰ）ポリクローナル抗体（Dako）を用いて制御された。用いられるニューロンは、６ＤＩＶまで２４ウェルプレート上で培養され、血清枯渇に付された。簡単には、Ｎ５完全培地において培養されたニューロンは、迅速に、血清を欠いたＮ５において３回洗浄され、２４時間にわたり、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの存在下または不存在下に、血清のないＮ５培地においてインキュベートされた。
【００９０】
５．１．３  アポトーシスのアッセイ
分析は、前もって染色された付着ニューロンについて、蛍光顕微鏡法（ＦＭ）（DMIRB倒立蛍光顕微鏡，Leica，Rueil-malmaison，フランス）によって行われた。該顕微鏡は、１００Ｗの水銀ショートアークランプおよびＸ  ４０Ｎ  ＰＬＡＮ  Ｌ対物レンズまたは水浸型Ｘ  １００  Ｎ  ＰＬＡＮ対物レンズを備えている。通常、定量研究は、１実験当たりランダムに選択された５〜１０の領域を記録することによる約２００〜６００細胞／領域についてのＦＭおよびより高いサンプル処理量のためのフローサイトメトリー（flow cytometry：ＦＣ）の両方によって行われた。アポトーシスのＦＣ分析は、染色されたニューロンのトリプシン処理後に、１５ｍＷの空冷４８８ｎｍアルゴンレーザ（Becton Dickinson）を備えた３色FACSCaliburサイトメータを用いて行われた。活性化されたカスパーゼ−２は、特異的なＦＡＭ接合ペプチド（ＦＬＩＣＡ：CaspaTag（登録商標）fluorescein Caspase Activity Kits，Q-Biogen，Illkirch，フランス；ApoFluor（登録商標）Caspase Ditection Kits，MP BioMedicalsと呼ばれる）：ＦＡＭ−ＶＤＶＡＤ−ｆｍｋを用いて検出された。生存率の損失は、７−ＡＡＤ（Sigma）取込によって評価された。
【００９１】
５．１．４  製剤の研究
化合物Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ（配列１）は、Ｔｗｅｅｎ２０またはＰｌｕｒｏｎｃ  Ｆ−６８賦形剤に可溶である。安定性は、７日にわたって、室温（ＲＴ）でまたは種々の１０〜１００％の賦形剤を含む水溶液の凍結／解凍後に、ＨＰＬＣ（Nucleosile  Ｃ１８（８μｍ，３．９×１５０ｍｍ）を備えたVarian ProStar410，２１４ｎｍで検出）を用いることによって追跡された。
【００９２】
５．２  結果
Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐは、選択的カスパーゼ−２阻害剤であり（ＩＣ５０＝６５〜８０ｎＭ）、シグナル伝達およびニューロンの代謝、一酸化窒素経路またはプロスタグランジン代謝に関与する他のカスパーゼまたは少なくとも３２の他の関連プロテアーゼまたは酵素に対する交差反応性を有していない（図１）。Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐは、細胞透過性である。なぜならば、皮質ニューロン培養における血清枯渇の間カスパーゼ−２活性を妨げるからである。加えて、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐは、２４時間で、この実験的なカスパーゼ−２依存性細胞死の実例においてニューロン死を妨げる（図１）。さらに、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐは、Ｔｗｅｅｎ２０またはＰｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８をベースとする混合物へのその高い溶解性のために、動物またはヒトへの投与に適している。室温で７日まで放置された場合または凍結／解凍後に、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの分解は見られなかった（図２）。
【００９３】
これらのデータは、下記図面によって例示される。
【００９４】
（図１）
Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐのインビトロの特異性および効果。（ａ）一団のヒト組み換えカスパーゼ（１〜１０；５０Ｕ）についてのＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐのインビトロの特異性。インビトロの分断アッセイは、０．１μＭのＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐにより行われた（ｎ＝３；ヒストグラムは、カスパーゼ活性の％±ＳＤを示す）。（ｂ）ＩＣ５０（ヒト組み換えＣ２（１２５Ｕ）によるＡｃ−ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ分断の５０％を妨げる濃度）の組み換えヒトカスパーゼ−２に対する測定範囲；６５〜８０ｎＭ（ｎ＝３，異なるバッチによる）。（ｃ）２４時間血清枯渇（ＳＤ）ニューロンについてのＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの細胞保護作用。Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐは、２４時間でのカスパーゼ−２活性および細胞死を妨げる（ｎ＝３）。（ｄ）プロテアーゼ、シグナル伝達およびニューロン代謝、一酸化窒素経路またはプロスタグランジン代謝に関連する３２の他のインビトロ薬理学的アッセイ上で決定されたＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ（１μＭ）の阻害プロフィール（ｎ＝２）。
【００９５】
（図２）
製剤の安定性：ＨＰＬＣ測定。Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ（２０％のＴｗｅｅｎ２０を含む生理緩衝液中５×１０−３Ｍ）は、室温で７日後に分解されなかった。
【００９６】
（ＩＶ  局所脳虚血に続くラットにおけるＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの効果）
（序論）
脳卒中は、先進国世界の成人における３番目に高い死因、および児童における生存率および慢性神経病学的羅漢率の重要な原因である。多くの児童脳卒中は、周産期中、誕生の直前または出産後のその月内に起こる。母体の虚血性脳卒中の危険性も出生時近くで高まり、出産の２日前および１日後において、妊娠早期または妊娠していない状態時の３４倍高い。母体および子供の双方における虚血性脳卒中さらには非脳部位における血栓に対する高められた脆弱性は、重大局面での大出血の危険性を減少させるためのおそらく漸進的な順応である分娩による凝固メカニズムの活性化におそらく関連する。
【００９７】
周産期の虚血性脳卒中は、局所動脈梗塞の病理学的または放射線学的証拠を有する出生時前後の脳血管の事象である。大部分の周産期脳卒中が起こるのは、中大脳静脈（ＭＣＡ）の領域内である。左半球病変の優勢性がある。これは、患者の動脈管または左の左総頸動脈を含むより直接的なルートからの血行力学の相違によって引き起こされ得る。脳梗塞の分布は、妊娠期間早産児により幾分異なり、ＭＣＡの皮質またはレンズ核線状体の枝を含めて多発性病変を有する傾向があり、これに対して、満期出産乳児は、主要枝の閉塞を有する傾向がある。
【００９８】
１．実験モデル
１．１  一過性片側局所虚血モデル
新生のウイスター系ラット（寝わら当たり母獣＋９匹の仔ラット）がJanvier（Le Genest-St.Isle，フランス）から得られた。その時の仔ラットは３〜４日齢であった。仔ラットは、それらの寝わらとともに、１２：１２時間の明暗サイクル下、食餌および水が自由に利用できるようにして収容された。動物実験は、フランスおよび欧州共同体の、実験動物の注意および使用のためのガイドラインにしたがって行われた。虚血は、７日齢のラット（１７〜２１ｇ）において、既に記載されたように（Renolleau et al．，１９９８）行われた。仔ラットは、抱水クロラール（３５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔をかけられた。麻酔されたラットは、仰向けに置かれ、正中切開が首においてなされ、左総頸動脈が露出させられた。次いで、ラットは、右側が下になるように横向きに置かれ、耳と目の間に斜め皮膚切開がなされた。側頭筋切除の後、頭蓋骨が、前頭縫合線から頬骨弓より下の高さにかけて除去された。その後、左中大脳動脈は、その出現の直後に嗅脳溝上に露出させられ、大脳静脈の下方の高さで凝固させられた。この手順の後、クリップが、左総頸動脈を塞ぐように置かれた。次いで、ラットは、体温低下を避けるためにインキュベータ内に置かれた。５０分後に、クリップは取り除かれた。頸動脈流の回復は、顕微鏡の助けを得て確認された。次いで、首および頭蓋皮切除が閉じられた。外科的手順の間、体温は、３７〜３８℃に維持された。仔ラットは、回復までインキュベータ（３２℃）に移され、その後、それらの寝わらに移された。
【００９９】
Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐは、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、虚血の開始前５〜１５分または虚血１時間後に腹腔内投与された。コントロールの動物は、１０％のＤＭＳＯ（カスパーゼ阻害剤を可溶化するために必要とされる賦形剤）を含む０．９％生理食塩水の等価容積を受けた（ｎ＝１５）（賦形剤処理群）。虚血の間、または殺す前の死亡率は、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ処理群と賦形剤処理群との間で異ならなかった（＜４％）。再灌流の４８時間後にラットは殺され、脳が取り出された。梗塞病変（薄いゾーン）は、動物の処理に対して先入観のない観察者によって視覚によって記録された。明らかな虚血薄色ゾーンのない脳は、拡大鏡下に観察された。明らかなＭＣＡ凝固を呈していないものは廃棄された。
【０１００】
前部の線条体から背部の海馬にわたる１６の切片（Paxinosのラット脳地図帳におけるプレート９〜２７に相当する）が選択され、等間隔の０．５ｍｍの間隔で取り出された。病変域は、クレシルバイオレット染色された切片について、画像解析機（ＮＩＨ画像ソフトウェア）を用いて測定され、各環状切片間の距離は、梗塞容積を計算するために用いられた。脳切片は、ＤＮＡ鎖切断（ＴＵＮＥＬアッセイ）のために、in situ のFluorescein Cell Death Detection Kit（Roche，Meylan，フランス）を用い、製造業者の指令書にしたがって処理された。
【０１０１】
Ｔｕｎｎｅｌ分析のために、脳は、その後２日、４％緩衝ホルムアルデヒドに固定された。５０マイクロメータの環状脳切片がクリオスタット上に切り取られ、ゼラチン被覆スライド上に集められた。
【０１０２】
下記の通り統計分析が行われた。βリスクを０．２、αリスクを０．０５とみなすと、２つの群の間で５０％の梗塞容積低下を検出するために各群において１５〜１６の動物が必要とされることが見積もられた。３つの群の動物が実験において比較されたため、これらの値は、参考情報にすぎない。６の動物のブロックを有する所定のリストが、３つの群間で動物を任意抽出するために用いられた。処理条件に対して先入観を持たない調査者が全ての測定を行った。手段間の相違は、クラスカル・ウォリスのノンパラメトリック多重比較検定、およびこれに続くノンパラメトリックな値についてのニューマンクール検定によって評価された。本発明者らは、５％レベル（Ｐ＜０．０５）で相違が有意であると考える。
【０１０３】
１．２  ウエスタン・ブロット分析による脳溶解質におけるインビトロＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ分断およびカスパーゼ−２分断
タンパク質抽出およびウエスタン・ブロット分析
脳半球は、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、４２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５％のＣＨＡＰＳ（コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche，Meylan，フランス）によって補給された）に、氷上で手動ポッターを用いることによって溶解させられた。ホモジネートは、１００００ｇ／４℃で１０分にわたり遠心分離にかけられ、その後、表面浮遊物が生じた状態となった。タンパク質濃度は、ＢＣＡテストを用いて測定された。タンパク質（５０μｇ）は、１２．５％のポリアクリルアミドゲル上で分離され、ＰＶＤＦ膜（Amersham）に転写された。免疫染色は、ＥＣＬ（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて明らかにされた。モノクローナル抗マウスカスパーゼ−２抗体（５２ｋＤａ；１１Ｂ４，Alexis Biochemicals）が１：１０００の希釈度で用いられた：アクチン（４２ｋＤａ；Sigma；１：５０００に希釈された抗体）が等価なローディングコントロールとして用いられた。
【０１０４】
カスパーゼ−２の活性（１００μｇのタンパク質の脳サンプル）が、１００μｌのアッセイ緩衝液（５０ｍMのHEPES（ｐH７．４）、１００ｍMのＮａＣｌ、０．１％のＣＨＡＰＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール）中で評価された。組み換えカスパーゼ−２による５０μＭのＶＤＶＡＤ−ＡＭＣの分断が、２時間後に３７℃で、蛍光マイクロプレートリーダー上で、４０５ｎｍで励起した際の５１０ｎｍでの蛍光発光をモニタリングすることによって測定された。ＶＤＶＡＤアーゼ活性の阻害のために、阻害剤（２μＭ）が、３０分間３７℃で、カスパーゼ−２の存在下に予備的にインキュベートされ、その後に、続いて、５０μＭのＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ（３０分、３７℃）と共にインキュベーションが行われた。顕著な蛍光バックグランドは、ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ単独により観察されなかった。
【０１０５】
２．結果
この一過性の片側局所虚血モデルにおいて、仔ラットは、永続性の左中大脳動脈の閉塞を、再灌流を伴う左総頸動脈の一過性の閉塞と関連して経た。その後、脳は、４８時間後（大きな浮腫なく（１．５％以下）梗塞が安定化させられる時間点）に分析された。虚血は、５５．０±３．４ｍｍ３の梗塞容積を誘導した。これは、病変同側半球における２２．１±１．４％の損傷を示す。梗塞容積は正規分布で出現した（１５〜２６％）（図３）。単回用量のＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ（５ｍｇ／ｋｇ；腹腔内）が仔ラットに投与され、その後、虚血が開始された。この単回用量は、ニューマンクール検定において（コントロール群（Ｖ＝２２．１±１．４％，中央値２１）と比較して）有意性の大きい７４％の梗塞容積の低下を誘導した（５．７±２．３％，ｐ＜０．０１（中央値＝０．５））（図３）。興味深いことに、１２の研究された動物に関して、４のＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ処理された動物は、中間的な保護（Ｖ＝１６．５±１．３２％）を示し、８の動物は、虚血コントロール動物と比較して完全な保護または中大脳動脈のレベル（プレート１２および１３に相当するレベル）においてのみ視認することができるが背部および海馬のレベル（プレート２１）において視認することができない極めて著しくより小さい梗塞（中央値＝０．５％）を示す（図３）。
【０１０６】
単回用量のＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ（０．１ｍｇ／ｋｇ；腹腔内）が、ＭＣＡＯの１時間後（再灌流の開始に相当する）に仔ラットに投与された。この単回用量は、ニューマンクール検定において、（コントロール群（Ｖ＝２２．６４±１．６％）と比較して）有意性の大きい４４％の梗塞容積の低減を誘導した（９．９５±２．８％，ｐ＜０．０１）（図３）。さらに、ターミナルトランスフェラーゼｄＵＴＰのニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）は、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ処理動物において有意に減少させられた（図３）。Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐによって提供された保護作用は、体温調節によって介在されない（図３）。
【０１０７】
最後に、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐは、インビボでカスパーゼ−２を適切にターゲットにする；効果的に、それは、虚血仔ラットの脳においてカスパーゼ−２活性並びにカスパーゼ−２プロセシングを阻害した（図４）。
【０１０８】
本発明者らは、カスパーゼ−２が新生児脳卒中における良好な神経保護予後に関連するターゲットであることを証明する。カスパーゼ−２のインビボでの不活性化の結果、一過性局所虚血の間の梗塞容積の大きな減少がもたらされるからである。本発明者らは、カスパーゼ−２が、出生時または周産期の脳卒中（ヒトの新生児における主要な医療）における低酸素虚血症脳疾患のインビボ予防のための有効なターゲットであり得ることを提案する。
【０１０９】
データは、以下の図面によって例示される。
【０１１０】
（図３）
Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐによる選択的カスパーゼ−２阻害は、虚血性脳損傷に付されたラット新生児の細胞死および脳梗塞を強力に妨げる。（ａ；左パネル）賦形剤（ｎ＝１７）処理ラットおよびＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ（腹腔内，５ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝１２）処理ラットにおける虚血４８時間後の平均の梗塞容積（平均±標準偏差）。Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐは、虚血が始まる５〜１５分前に投与された場合に７４％の低減を誘導する（＊＊＊＝ｐ＜０．００１，クラスカルウォリス検定）。（ａ；右パネル）Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ処理は、高い／全体的（高い）または低保護（４つ）を表示する２つのグループを提供する。単一の梗塞容積データがプロッティングされている。水平方向の太いバーおよび薄いバーは、それぞれ、群の中央値および平均を表す。（ｂ）背部の海馬（プレート２１，Paxinosのラット脳地図）および前交連（プレート１２）のレベルでの再灌流後４８時間における動物からの代表的なクレシルバイオレット染色された冠状断面。点線は梗塞域を示す。矢印は、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ処理動物における梗塞の欠如を示す。バーは、１３０μｍを表す。（ｃ；左パネル）賦形剤処理ラット（ｎ＝２２）およびＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ（腹腔内，０．１ｍｇ／ｋｇ）処理ラット（ｎ＝１９）における虚血４８時間後の平均の梗塞容積（平均±標準偏差）。Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐは、虚血が始まる１時間後に投与された場合に４４％の低減を誘導する（＊＊＊＝ｐ＜０．００１，クラスカルウォリス検定）。（ｃ，右パネル）単一の梗塞容積データがプロッティングされている。太い水平バーおよび薄い水平バーは、それぞれ、群の中央値および平均を示す。（ｄ）賦形剤処理動物およびＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ処理動物の同側皮質における細胞死。in situの３’ＯＨ端ＤＮＡラベリング後の代表的な（プレート１２からの）蛍光顕微鏡写真（バー；１００μｍ）。（ｅ）身体温は、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ投与の前後に測定された（前および後虚血）。
【０１１１】
（図４）
虚血性の仔ラットは、５ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）のＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐにより処理された。動物は、２４時間で犠牲にされた。脳のホモジネートは、カスパーゼ−２活性アッセイおよびウエスタンブロット分析に付された。ＩＬ：同側の損傷半球、ＣＬ：対側未病変半球。（ａ）賦形剤処理ラット対Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ処理ラットにおけるカスパーゼ−２活性の測定。（ｂ）賦形剤処理ラット対Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ処理ラットからの脳ホモジネートにおけるカスパーゼ−２プロセシングのウエスタンブロット分析。
【０１１２】
Ｖ．全脳虚血に続くラットにおけるＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの効果
全脳虚血は、心不全または心血管障害後に誘導され得る、かつ、血流減少および低酸素症の両方をもたらす状態である。病変は、選択的に損傷を受け易い脳領域において出現し、ニューロンは、このような全脳虚血の間にアポトーシスによって損傷を受け得る。全虚血の結果、拡散脳浮腫および全体性損傷と結びつく広範囲にわたる全体的なエネルギー代謝産物の損失ももたらされる。病変の成長に関与するメカニズムは、とりわけ、システイン−プロテアーゼ（カスパーゼ）の活性化、興奮毒性、梗塞周囲脱分極（peri-infarct depolarization）、ラクトアシドーシス、微小循環障害（microcirculatory disturbance）および血流−代謝脱共役（flow-metabolism uncoupling）を含み得る。いくつかの（実行主体）カスパーゼが全虚血の間に活性化され得る場合、誰も、このような病的状況におけるカスパーゼ−２の役割に関してコメントすることができない。最近、本発明者らは、新しい選択的カスパーゼ−２阻害剤（２−キノリニルカルボニル−Ｌ−バリニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）−Ｌ−バリニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパルチル（メチルエステル）  ２，６−ジフルオロフェニルエステル（Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐと称する）を開発した。この阻害剤は、新生児の脳虚血の間に強力なインビボ神経保護作用を提供した。ここで、本発明者らは、心不全後に起こる脳病変に抗するその細胞保護媒介作用および行動が関連する利点を調査した。それ故に、本発明者らは、若年成熟ラットの一過性全脳虚血（４ＶＯ（four vessel occlusion（４血管閉塞））のインビボ実験モデルにおけるＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの効果を、Pulsinelliの試験（１９７９）に基づいて試験した。
【０１１３】
１．実験モデル
１．１  ＶＯモデル
全脳虚血は、４血管閉塞（４ＶＯ）によって、Pulsinelliの派生法（Pulsinelli et al．，１９８２；PulsinelliおよびBuchman，１９８８）に従い、若年成熟ラット（１０〜１２週齢の雄ウィスター，３２０ｇ±１０ｇ；Janvier）において誘導された。第一日に、麻酔されたラットの頭部が脳定位イヤーバー（stereotaxic ear bar）内に置かれ、水平方向に対して約３０°下に傾けられた。頸椎レベルでの正中切開の後、両方の椎骨動脈が、顕微鏡下に露出させられ、次いで、翼状孔（alar foramina）を通して第一頸椎のレベルで電気灼熱ニードルによって凝固させられた。次いで、両方の総頸動脈が、２４時間後に露出させられ、２０〜３０分にわたりクランプ固定された（両方の椎骨動脈の電気灼熱が首尾良く行われた時に、ラットは昏睡状態に陥った）。次いで、頸動脈は、血流の再灌流を可能とするようにクランプ固定が解かれた。賦形剤およびＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ（II，ｎ＝０）が、左の脳室のレベルに、虚血（頸動脈閉塞）の最初の１５分内に投与された。ラットは、水および食餌が無制限に与えられるそれらのケージ内に置かれた。
【０１１４】
１．２  細胞保護作用の評価
脆弱な細胞の選択的な喪失およびＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの効果（脳室内（intracerebroventricular：ＩＣＶ）投与された）が７２時間において評価された。ラットは犠牲にされ、脳は、パラホルムアルデヒドによる経心臓かん流によって固定された。前頭脳スライス（２５μｍ）は、クレシル−バイオレットによって染色され、または、ヘキスト（登録商標）３３３４２およびFluoro Jade Bによって共染色されて、海馬および皮質における細胞死が評価された。クレシル−バイオレットは、生細胞における細胞質体Nissl（小胞体構造）および核をラベリングするためのピンク〜赤の染料であり、これにより、死細胞では、淡いまたは染色が欠落することになる。Fluoro Jade B（緑色蛍光）の取込は、浸透性の形質膜を有する細胞においてのみ可能であり、それ故に、死細胞においてより特徴的である。ヘキスト（登録商標）３３３４２（青色蛍光）は全細胞の核をラベリングし、細胞死の間の核の形態変化を評価することを可能にする。
【０１１５】
細胞は、左脳海馬のカニューレのレベル並びにカニューレ後の６５０μｍおよび７８０μｍ（前−後軸）において計数された。細胞は、これらの連続スライスにおける海馬（ＣＡ１、ＣＡ３、歯状回）および皮質におけるそのようなレベルにおいて計数される。クレシル−バイオレット染色スライスは、白色光（４０倍および２０倍の対物レンズおよびLEICA IM50ソフトウェア備えるNikon Eclipse E 800M顕微鏡）下に観察された。Fluoro Jade Bおよびヘキストの両方により染色されたスライスは、４０倍対物レンズおよびLEICA IM1000/Qfluorobaseソフトウェア（ＢＰ  ３４０−８０励起フィルタ）を備えるLeica DMIRB反転蛍光顕微鏡下に観察された（ＢＰ  ３４０−８０励起フィルタは、ヘキスト用のＬＰ  ４２５発光フィルタと結合され、ＢＰ  ４８０／４０励起フィルタは、FluoroJade B用のＢＰ  ５１５−５６０励起フィルタと結合された）。
【０１１６】
１．３  行動獲得の評価
身体温度は、第１日の外科的処置の間に、麻酔から工程１（脊椎の電気灼熱およびカニューレ挿入）および工程２（頸動脈単離）にわたって測定された。身体温度はまた、第２日の虚血の開始後０、１０、２０分に測定された。温度は、第５日において虚血後２４、４８、７２時間およびかん流ための最後の麻酔前に測定された。行動研究（摂食、自発行動および反応性）が行われ、下記を下記記録により評価された；
摂食：第５日の胃の内容物を観察する
再摂食の場合＝１；摂食なし＝０
自発行動：ケージ内の動物の一般的な行動（活動対非活動期の交互性および把持に対する反応）
活発＝１；多少活発＝０．５；活発でないもしくは乏しい＝０
反応性：動物は、騒音に対して感受性があり、かつ反応性があり、騒音の元に移動する。
【０１１７】
好奇心ありの場合＝１；比較的好奇心ありの場合＝０．５；全く好奇心なし＝０。
【０１１８】
２．結果
図５〜７は、虚血後７２時間の成熟ラットの海馬（少数は皮質）においてＣＡ１のレベルで細胞死が発生することを示す；細胞の９０〜１００％は、それらのクレシル−バイオレットラベリングを喪失し、異常な細胞形態を有し、４０〜６０％は、核変化を呈し、４０〜５０％は、虚血脳のＣＡ１（ＣＡ１ａ、ｂおよびｃサブエリア）においてFluoroJade Bを維持した。細胞死の徴候は、ＣＡ３、ＤＧ（歯状回）において見出されなかった（ＣＡ２およびＣＡ４においても見出されなかった（図示せず））。虚血はまた、棒状（常駐ミクログリア）または鎌状（血液脳関門決裂後に脳に侵入する移行ミクログリア）を呈するミクログリア細胞の存在によって制御された。
【０１１９】
図８は、海馬または皮質における観察のレベルが何であれ６０〜６００ｎｇのＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐにより処理された非虚血ラット（脳質内）において細胞死がない（基本閾値（１０％）以下）ことを示す：クレシル−バイオレット陰性細胞の欠如、異常核の欠如、Fluoro Jade B取込なし。このため、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐは、６０〜６００ｎｇで局所的に毒性でない。
【０１２０】
図９〜１０は、虚血脳におけるＣＡ１のレベルでのＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの細胞保護作用を示す。虚血ラットに対する明敏な対照において、Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ処理動物は、異常核（核が、より大きく、縮み方がより少ない）がより少なく、Fluoro Jade Bを取り込んだ細胞はほとんどない（５０〜６０％ではなく１０〜２０％）。このため、着色スライスは、虚血がないものより強く見える。さらに、クレシル−バイオレット染色強度は、部分的に非虚血動物のレベルに修復されたが、細胞形態の全体的な回復はなかった。
【０１２１】
Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの効果は、温度についての調節効果とは関係がない（図１１）。
【０１２２】
Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐは、虚血処理されたラットの一般的な行動に関して有益な効果を有する。これらのラットが、未処理ラットより良好なスコアリングを有し、それらはより活動的であり、騒音に対してより反応性があり、かつ、それらは食餌もよく取るからである（図１１）。
【０１２３】
これらのデータは、下記の図面によって説明される。
【０１２４】
（図５：虚血ラット（４ＶＯ）モデルの海馬および皮質における細胞死）
（Ａ）：虚血後７２時間の成熟ラットの海馬（ＣＡ１、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質における細胞死。一過性全脳虚血は、４血管閉塞（４ＶＯ）によって誘導された（ｎ＝５）。ラットは、ＤＭＳＯ（ここでは、７．２５５％；０．７２５５％（図示せず））により処理された（脳室内）。スライスは、クレシル−バイオレットによって染色された。（Ｂ）：虚血後７２時間成熟ラットの海馬（ＣＡ１）における細胞死。一過性全脳虚血が４血管閉塞（４ＶＯ）によって誘導された（ｎ＝５）。ラットは、ＤＭＳＯ（７．２５５％）により処理された（脳室内）。スライスは、ヘキスト（登録商標）３３４３２（核：青）およびFluoro Jade B（核および細胞質：緑）によって染色された。（Ｃ）；ヘキスト（登録商標）およびFluoro Jade B蛍光顕微鏡写真の高拡大（サイズは、それぞれ、２および６倍に大きくされている）。（Ｄ）；虚血マーカーとしてのミクログリアの活性化。ミクログリア細胞は、棒状（常駐ミクログリア）または鎌状（血液脳関門決裂後に脳に侵入する移行ミクログリア）を呈する。
【０１２５】
（図６）
ＣＡ３、歯状回（ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）上の虚血の影響。成熟ラットにおける虚血７２時間後での海馬（ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）における細胞死。一過性全脳虚血は、４血管閉塞（４ＶＯ）によって誘導された（ｎ＝５）。ラットは、ＤＭＳＯ（ここでは、７．２５５％；０．７２５５％（図示せず））により処理された（脳室内）。スライスは、ＣＡ１レベルでFluoro Jade B／ヘキスト（登録商標）によって共染色された（ｎ＝５）。
【０１２６】
（図７）
虚血７２時間後での細胞死の定量化。成熟ラットにおける虚血７２時間後での海馬（ＣＡ１、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）における細胞死。一過性全脳虚血は、４血管閉塞（４ＶＯ）によって誘導された（ｎ＝５）。ラットは、ＤＭＳＯ（ここでは、７．２５５％；０．７２５５％（図示せず））により処理された（脳室内）（ｎ＝５）。（Ａ）；ＤＭＳＯ（１）またはＴＲＰ６  ６５０μＭ（２）、７８０μＭ（３）の注入後のレベルでのクレシル−バイオレット陽性細胞の定量化。（Ｂ）：虚血性および非虚血性の脳の海馬（ＣＡ１ａ，ｂ，ｃ、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）におけるヘキスト染色によって評価された異常核の定量化。（Ｃ）：虚血性および非虚血性の脳の海馬（ＣＡ１ａ，ｂ，ｃ、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）におけるFluoro Jade B陽性細胞の定量化。
【０１２７】
（図８）
非虚血ラットにおけるＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの非毒性。非虚血ラットにおけるＤＭＳＯ（ここでは、７．２５５％；０．７２５５％（図示せず））またはＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ（６０または６００ｎｇ）の脳室内投与７２時間後での海馬（ＣＡ１、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）における細胞死（ｎ＝５）。（Ａ）；ＤＭＳＯ（１）またはＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ  ６５０μＭ（２）または７８０μＭ（３）の注入後のレベルでの増加用量のＴＲＰ６の存在下でのクレシル−バイオレット陽性細胞の定量化。（Ｂ）：賦形剤処理ラットおよびＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ処理ラットの海馬（ＣＡ１ａ，ｂ，ｃ、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）におけるヘキスト染色によって評価された異常核の定量化。（Ｃ）：虚血性および非虚血性の脳の海馬（ＣＡ１ａ，ｂ，ｃ、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）におけるFluoro Jade B陽性細胞の定量化。
【０１２８】
（図９）
若年成熟ラットの海馬における虚血（４ＶＯ）７２時間後でのＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐによる神経保護作用。（Ａ）：賦形剤処理（ＤＭＳＯ  ０．７２５５％）またはＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ処理（６０ｎｇ）虚血ラット対非虚血動物（賦形剤処理）におけるＣＡ１およびそのサブエリア（ＣＡ１ａ、ＣＡ１ｂ、ＣＡ１ｃ）を代表する顕微鏡写真（４００倍）。スライスは、クレシル−バイオレット（上部行）、ヘキスト（青：核；左欄）またはFluoro Jade B（緑色蛍光：右欄）により染色された。（Ｂ）；ヘキストおよびFluoro Jade B蛍光顕微鏡写真の高拡大（６倍）。
【０１２９】
（図１０）
虚血後７２時間でのＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの定量的効果。成熟ラットにおける虚血７２時間後での海馬（ＣＡ１、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）における細胞死。一過性全脳虚血は、４血管閉塞（４ＶＯ）によって誘導された（ｎ＝５）。ラットは、ＤＭＳＯ（ここでは、７．２５５％；０．７２５５％（図示せず））またはＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ（６０または６００ｎｇ）により処理された（脳室内）（ｎ＝５）。（Ａ）；ＤＭＳＯ（１）またはＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ  ６５０μＭ（２）または７８０μＭ（３）の注入後のレベルでのＴＲＰ６の増加用量の存在下でのクレシル−バイオレット陽性細胞の定量化。（Ｂ）；賦形剤処理ラットおよびＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ処理ラットの海馬（ＣＡ１ａ，ｂ，ｃ、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）におけるヘキスト染色によって評価された異常核の定量化。（Ｃ）：虚血性および非虚血性の脳の海馬（ＣＡ１ａ，ｂ，ｃ、ＣＡ３、ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）におけるFluoro Jade B陽性細胞の定量化。
【０１３０】
（図１１）
生理学および行動試験。（Ａ）：生理学的研究。身体温度測定；第１日の間の外科手順の麻酔から工程１（椎骨電気灼熱およびカニューレ挿入）および工程２（頸動脈単離）まで；第２日の虚血の開始０、１０、２０分後；第５日の虚血２４、４８、７２時間後およびかん流ための最終麻酔前。（Ｂ）：行動研究：１群当たりのパラメータの平均。摂食：第５日での胃内容物の観察；再摂食の場合＝１、摂食なしの場合＝０；自発活動：ケージ内の動物の一般的な行動（活性対非活性期の交互性および把持に対する反応），活発＝１、多少活発＝０．５、活発性がないもしくは乏しい＝０；反応性：動物は、騒音に対して感受性であり反応性があり、騒音源へ移動する。好奇心有りの場合＝１、比較的好奇心有り＝０．５、好奇心を示さない＝０。（Ｃ）：行動研究：全スコアリング（１群当たりの全スコアの合計）。
【０１３１】
（実施例：構造IIのカスパーゼ−２阻害剤の取得）
合成のために用いられた主たる工程は、スキーム１〜３上に要約される。
【０１３２】
【化４】
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【０１３３】
【化５】
2008509079.tif 000036
【０１３４】
（書誌の参照）
Pulsinelli WA, Waldman S, Rawlinson D, Plum F, Moderate hyperglycemia augments ischemic brain damage: a neuropathologic study in the rat. Neurology. 1982, 32, :1239-1246.
Pulsinelli W.A., Buchman A.M. (1988). The Four- vessel Occlusion Rat Model: Method for Complete Occlusion of vertebral arteries and control of collateral circulation. Stroke. 19, 913- 914
Renolleau, S., D. Aggoun-Zouaoui, Y. Ben-Ari, and C. Charriaut-Marlangue. 1998. A model of transient unilateral focal ischemia with reperfαsion in the P7 neonatal rat: morphological changes indicative of apoptosis. Stroke 29: 1454-1461. 
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐのインビトロの特異性および効果
【図２】製剤の安定性：ＨＰＬＣ測定。Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐ
【図３】Ｑｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐによる選択的カスパーゼ−２阻害は、虚血性脳損傷に付された仔ラットの細胞死および脳梗塞を強力に予防する。
【図４】新生児虚血性脳損傷の間のＱ−ＶＤＶＡＤ−ＯＰＨによるカスパーゼ−２活性およびカスパーゼ−２プロセシングのインビボ阻害
【図５】虚血ラット（４ＶＯ）モデルの海馬および皮質における細胞死
【図６】ＣＡ３、歯状回（Dentus gyrus：ＤＧ）および皮質（ＣＯＲ）についての虚血の影響
【図７】虚血後７２時間での細胞死の定量化
【図８】非虚血ラットにおけるＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの非毒性
【図９】若年成体ラットの海馬における虚血後（４ＶＯ）７２時間のＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐによる神経防護作用
【図１０】虚血後７２時間でのＱｃｏ−ＶＤＶＡＤ−ｄｆｐの定量的効果
【図１１】生理学および行動に関する試験
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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