(57)【要約】【課題】単一分子に基づいて核酸塩基を解析するための方法（単一分子検出）を提供する。【解決手段】本発明方法は、核酸塩基上で、相補的な核酸塩基で化学的に修飾された分子探針を走査し、走査された核酸塩基と分子探針との間のトンネル電流を、走査トンネル顕微鏡で測定することを含む方法である。【選択図】  なし
2008525792.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一分子による核酸塩基分析方法であって、相補的な核酸塩基で化学修飾された分子探針を核酸塩基上で走査し、そして走査した核酸塩基と分子探針との間のトンネル電流を走査トンネル顕微鏡で測定することを含む方法。
【請求項２】
核酸中の標的核酸塩基を特定するための請求項1に記載の方法であって、
核酸中の核酸塩基上で分子探針を走査し、この分子探針は標的核酸塩基に相補的な核酸塩基で化学修飾された金属探針であり、
各核酸塩基と分子探針との間のトンネル電流を走査トンネル顕微鏡で測定し、
分子探針を走査した際にトンネル電流が促進される核酸塩基として標的核酸塩基を特定することを含む方法。
【請求項３】
標的核酸塩基を分類するための請求項1に記載の方法であって、
標的核酸上で4つの分子探針を走査し、これらの4つの分子探針はアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンまたはウラシルでそれぞれ化学修飾された金属探針であり、
標的核酸塩基と各分子探針との間のトンネル電流を走査トンネル顕微鏡で測定し、そして
最も大きなトンネル電流が測定された分子探針上の核酸塩基に相補的な標的核酸塩基のタイプを決定することを含む方法。
【請求項４】
核酸の配列決定を行うための請求項1に記載の方法であって、
核酸中の核酸塩基上で4つの分子探針を連続的に走査し、これらの4つの分子探針はアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンまたはウラシルでそれぞれ化学修飾された金属探針であり、
各核酸塩基と各分子探針との間のトンネル電流を走査トンネル顕微鏡で測定し、そして
最も大きなトンネル電流が測定される分子探針上の核酸塩基種に相補的な各核酸塩基のタイプを決定することによって、核酸の配列決定を行うことを含む方法。
【請求項５】
アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルで化学修飾された金属探針である、走査トンネル顕微鏡のための分子探針。
【請求項６】
アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンまたはウラシルでそれぞれ化学修飾された4つの金属探針からなる走査トンネル顕微鏡のための4つの分子探針セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一分子塩基上で核酸塩基を分析するための方法（単一分子検出）に関する。より詳細には、本発明は、走査トンネル顕微鏡を使用することによる、核酸中の核酸塩基を電気的に特定もしくは分類するための、または核酸を電気的にシーケンスするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学における技術的発展により様々な生物のゲノム構造が明らかになり、これにより多くの遺伝的疾患やウィルス性疾患において遺伝子の変異が関与することが明らかになっている。そのため、医学、法医学、分子生物学等の様々な分野において、特定遺伝子配列や遺伝子配列の変異を検出、解析する方法の確立が重要な課題となっている。
【０００３】
なかでも、SNPs（一塩基多型：Single Nucleotide Polymorphisms）に関する研究は、疾病関連遺伝子の探索、疾病に対するリスク診断、薬剤応答性や副作用の解明等において重要と考えられ、注目を集めている。
【０００４】
遺伝子の変異を検出および解析するための方法として、蛍光検出とDNAチップと組合せたキャピラリー電気泳動がよく知られる。しかし、これらの方法は解析に長期間を要するというような、いくつかの問題を有する。
【０００５】
STM分子探針は、試料と探針分子との間の分子間電子トンネル効果を直接的に検出することができ、それぞれの電子波動関数の重なりが生じる化学的相互作用、すなわち水素結合、金属配位結合、電荷移動相互作用（非特許文献1〜8）を介した電子トンネル効果の促進を検出する。核酸塩基分子探針は、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルのチオール誘導体を，金属探針への化学的修飾することによって作製する．この核酸塩基探針の最も先端部の核酸塩基分子は、核酸塩基分子試料との間に生じる分子間電子トンネル効果を探測する。本発明者らは、試料となる核酸塩基分子とその相補的な核酸塩基分子探針との間の電子トンネル効果が、非相補の核酸塩基分子探針の場合と比較して，著しく促進されることを見出した。このことから，核酸塩基探針は、各々の相補的核酸塩基分子を電気的に検出することが可能となる。STM分子探針による化学種選択的イメージング法は、その原理から「分子間トンネル顕微鏡」と呼ぶべきもので、膜および固体表面における化学種選択的なイメージングとして、全般的に重要である。
【非特許文献１】Ito, T., Buhlmann, P. & Umezawa, Y. (1998) Analytical Chemistry 70, 255-259.
【非特許文献２】Ito, T., Buhlmann, P. & Umezawa, Y. (1999) Analytical Chemistry 71, 1699-1705.
【非特許文献３】Nishino, T., Buhlmann, P., Ito, T. & Umezawa, Y. (2001) Physical Chemistry Chemical Physics 3, 1867-1869.
【非特許文献４】Nishino, T., Ito, T. & Umezewa, Y. (2001) Surface Science Letters 490,L579-L584.
【非特許文献５】Ohshiro, T., Ito, T., Buhlmann, P. & Umezawa, Y. (2001) Analytical Chemistry 73, 878-883.
【非特許文献６】Nishino, T., Ito, T. & Umezewa, Y. (2002) Analytical Chemistry 74,4275-4278.
【非特許文献７】Nishino, T., Ito, T. & Umezawa, Y. (2003) Journal of Electroanalytical Chemistry 550, 125-129.
【非特許文献８】Nishino, T., Ito, T. & Umezawa, Y. (2005) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 5659-5662.
【非特許文献９】Wiesendanger, R. & Guntherodt, H. J. (1993) In Scanning Tunneling Microscopy III; Springer Series in Surface Science 29; Springer-Verlag: Berlin
【非特許文献１０】Ulman, A. (1996) Chemical Reviews 96, 1533-1554.
【非特許文献１１】Seeler, J. L. & J. Jayawickramarajah (2005). Chemical Communications,1939-1949.
【非特許文献１２】Nielsen, P. E., Egholm, M., Berg, R. H. & Buchardt, O. (1991) Science 254, 1497-1500.
【非特許文献１３】Wandlowski, T., Lampner, D. & Lindsay, S. M. (1996) Journal of Electroanalytical Chemistry 404, 215-226.
【非特許文献１４】Li, W.-H., Haiss, W., Floate, S. & Nichols, R. J. (1999) Langmuir 15, 4875-4883.
【非特許文献１５】Chen, Q., Frankel, D. J. & Richardson, N. V. (2002) Langmuir 18,3219-3225.
【非特許文献１６】Akiyama, R., Matsumoto, T. & Kawai, T. (1999) The Journal of Physical Chemistry B 103, 6103-6110.
【非特許文献１７】Hamai, C., Tanaka, H. & Kawai, T. (2000) The Journal of Physical Chemistry B 104, 9894-9897.
【非特許文献１８】Tanaka, H. & Kawai, T. (2003) Surface Science Letters 539,L531-L536.
【非特許文献１９】Robins, R. K. (1958) J. Am. Chem. Soc., 80, 6671-6679.
【非特許文献２０】Koppel, H. C., Springer, R. H., Robins, R. K. & Cheng, C. C. (1961) J. Org. Chem., 26, 792-803.
【非特許文献２１】Wangenknecht, H.-A. (2003) Angewandte Chemie International Edition 42,2454-2460.
【非特許文献２２】Fink, H.-W. & Schonenberger, C. (1999) Nature 398,407-410.
【非特許文献２３】Lewis, F. D., Liu, X., Liu, J., Miller, S. E., Hayes, R. T. & Wasielewski, M. R. (2000) Nature 406, 51-53.
【非特許文献２４】Grozema, F. C., Berlin, Y. A. & Siebbeles, L. D. A. (2000) Journal of the American Chemical Society 122, 10903-10909.
【非特許文献２５】Berlin, Y. A., Burin, A. L. & Ratner, M. A. (2001) Journal of the American Chemical Society 123, 260-268.
【非特許文献２６】Barnett, R. N., Cleveland, C. L., Joy, A., Landman, U. & Schuster, G. B. (2001) Science 294, 567-571.
【非特許文献２７】Sessler, J. L., Sathiosatham, M., Brown, C. T., Rhodes, T. A. & Wiederrecht, G. (2001) Journal of the American Chemical Society 123, 3655-3660.
【発明の開示】
【０００６】
本発明者らは、核酸塩基とその相補的な核酸塩基STM分子探針との間における電子トンネル効果が、その非相補的な核酸塩基STM分子探針との間の電子トンネル効果と比較して、促進されることを見出した。発明者らは、核酸塩基STM分子探針により、相補的核酸塩基対間の電子トンネル効果を著しく促進し、相補的な核酸塩基分子を他の非相補的核酸塩基分子と識別可能であることを見出した（図1a）。
【０００７】
発明者らは、本発明をこのような新規な知見から完成した。
【０００８】
第1の発明は、単一分子による核酸塩基分析方法であって、相補的な核酸塩基で化学修飾された分子探針を核酸塩基上で走査し、そして走査した核酸塩基と分子探針との間のトンネル電流を走査トンネル顕微鏡で測定することを含む。
【０００９】
第1の発明の1つの実施態様は、核酸中の標的核酸塩基を特定する（pinpointing）方法であって、
核酸中の核酸塩基上で分子探針を走査し、この分子探針は標的核酸塩基に相補的な核酸塩基で化学修飾された金属探針であり、
各核酸塩基と分子探針との間のトンネル電流を走査トンネル顕微鏡で測定し、
分子探針を走査した際にトンネル電流が促進される核酸塩基として標的核酸塩基を特定することを含む。
【００１０】
第1の発明の別の実施態様は、標的核酸塩基を分類する（typing）方法であって、
標的核酸上で4つの分子探針を走査し、これらの4つの分子探針はアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンまたはウラシルでそれぞれ化学修飾された金属探針であり、
標的核酸塩基と各分子探針との間のトンネル電流を走査トンネル顕微鏡で測定し、そして
最も大きなトンネル電流が測定された分子探針上の核酸塩基に相補的な標的核酸塩基のタイプを決定することを含む。
【００１１】
第1の発明のさらに別の実施態様は、核酸の配列決定を行う方法であって、
核酸中の核酸塩基上で4つの分子探針を連続的に走査し、これらの4つの分子探針はアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンまたはウラシルでそれぞれ化学修飾された金属探針であり、
各核酸塩基と各分子探針との間のトンネル電流を走査トンネル顕微鏡で測定し、そして
最も大きなトンネル電流が測定される分子探針上の核酸塩基種に相補的な各核酸塩基のタイプを決定することによって、核酸の配列決定を行うことを含む。
【００１２】
第2の発明は、走査トンネル顕微鏡のための分子探針であり、これはアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルで化学修飾された金属探針である。
【００１３】
第3の発明は、走査トンネル顕微鏡のための4つの分子探針のセットであり、これはアデニン、グアニン、シトシン、およびチミンまたはウラシルで、それぞれ化学修飾された4つの金属探針からなる。
【００１４】
本明細書中に記載される各発明の特定の特徴、用語および概念は、発明を実施するための最良の形態および実施例の記載においてさらに説明される。発明を行うために用いられる種々の技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子操作および分子生物学の技術は、例えば、Sambrook and ManiatisのMolecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausbel F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1995、またはそれらの教科書において引用される参考文献に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
図1（a）は、本発明の原理を示す。走査トンネル顕微鏡（STM）により測定される、核酸塩基とその相補的な核酸塩基分子探針との間のトンネル電流は、その非相補的な核酸塩基分子探針との間で生じるトンネル電流と比較して，著しく促進される。それゆえ、単一核酸塩基は、標的核酸塩基と分子探針との間のトンネル電流を測定することによって検出され得る。
【００１６】
分子探針は、STM金属探針であり、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）またはチミン（T）（もしくはウラシル（U））で化学修飾される。STM金属探針は、金、プラチナ-イリジウム合金などから作製される。核酸塩基での金属探針の化学修飾について、核酸塩基の誘導体が使用され得る。例えば、核酸塩基のチオール誘導体が、金探針を修飾するために使用され得る。
【００１７】
分子探針は、核酸または核酸中の標的核酸塩基を、STM系下で走査するために使用される。核酸としては、単一鎖ゲノムDNAまたはmRNA、mRNAから合成されたcDNA、または公知の方法（例えば、Carruthers、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418、1982；Adams、J.Am. Chem. Soc.105:661、1983；Belousov、Nucleic Acid Res. 25:3440-3444、1997；Frenkel Free Radic. Biol.Med. 19:373-380、1995；Blommers、Biochemistry 33：7886-7896、1994；Narang、Meth.Enzymol.68:90、1979：Brown、Meth. Enzymol. 68:109、1979；Beaucage、Tetra.Lett.22:1859、1981；米国特許第4,458,066号）により調製された化学合成ポリヌクレオチドが挙げられる。核酸中のSNPを検出する場合において、例えば、潜在的なSNPを含むポリヌクレオチドが、被験体からのゲノムDNAまたは全RNA、および公知のSNPデータベース（例えば、http://SNP.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html）から利用可能なプライマーセットを使用するPCR法により調節され得る。ポリヌクレオチドにおけるSNP位置は、データベースから知ることができ、これは本発明の方法、すなわち、pinpointing方法またはtyping方法により検出される。Pinpointing方法によれば、SNPがアデニン（野生型）-グアニン（変異体）多型である場合において、トンネル電流は標的核酸塩基上でシトシン探針を走査することにより測定される。トンネル電流が増大される場合には、標的核酸塩基はグアニンであるから、SNPは変異型と判断される。他方、トンネル電流がウラシル探針で増大する場合、標的核酸塩基はアデニンであるから、SNPは野生型と判断される。本発明のpinpointing方法はまた、核酸中の特定の核酸塩基の位置を同定すること、または特定の塩基対の容量（例えば、C-Gリッチの程度）を決定することを可能にする。
【００１８】
SNPは、本発明のtyping方法によっても検出される。すなわち、標的核酸塩基のタイプは、4種類の核酸塩基分子探針を走査することによって同定され得る。
【００１９】
本発明の配列決定法において、鎖状ポリヌクレオチド中の核酸塩基は、4種類の核酸塩基分子探針で連続的に走査され、そして各核酸塩基と各分子探針との間のトンネル電流が測定される。各核酸塩基のタイプは、最も大きなトンネル電流が測定される分子探針の核酸塩基タイプに相補的であるとして、連続的に決定される。
【００２０】
核酸は、核酸塩基と分子探針との間の距離を正確に制御するために、平らな導電性基材上に配置するようにする。この目的のために、核酸は、Au（111）などのような基材上に化学的にまたは物理的に固定化される。
【００２１】
好ましくは、探針と試料間のバイアス電圧は-400〜-600ｍVの間であり、そしてトンネル電流は1000〜1400pAである。
【実施例】
【００２２】
本発明は、以下の実施例により詳細に記載されるが、本発明は実施例に制限されない。
1.材料および方法
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルのチオール誘導体の調製
核酸塩基のチオール誘導体試料（図1b）として、4-amino-8-mercaptopyrmidine（1）（非特許文献19）、2,4-hydroxy-6-mercaptopyridine（4）（非特許文献20）が合成され、そして生成物は、1H NMR、13C NMR、および元素分析により分析された。4-amino-2-hydroxy-8-mercaptopyrmidine（3：Sigma-Aldrichの希化学物質ライブラリー）および2-amino-6-hydroxy-8-mercaptopurine（2：Acros）は使用の前にエタノールから3回、再結晶化された。2-mercaptobenzimidazole（98%、Aldrich）およびthiophenol（95%、Wako Pure Chemical、Osaka）はさらなる精製を伴わずに使用された。チミンチオール誘導体の代わりに、ウラシル誘導体（4）がその合成の容易さのために使用された。
1（アデニンのチオール誘導体）：1H NMR（500MHz、DMSO-d6）δ6.74（s、2H）、8.05（s、1H）、12.03（s、1H）、13.03（s、1H）、13C NMR（500MHz、DMSO-d6）δ166.5；152.6；149.8；147.3；107.9；C5H5N5Sの分析算定：C、35.9；H、3.0；N41.9、検出：C、35.7；H、3.2；N41.7。
4（ウラシルのチオール誘導体）：1H NMR（500MHz、DMSO-d6）δ5.61（s、1H）、8.60（s、1H）、10.98（s、1H）、12.05（s、1H）。C4H4N2O2Sの分析算定：C、33.3；H、2.80；N19.43、検出：C、33.1；H、2.82；N19.45。
金（111）基材の調製
原子的に平坦な金（111）平面のマイカ上でのエピタキシャル成長することで調製する。マイカを830Kで予熱した後、約2.0×10-4Pa（1.5×10-6Toor）の圧力条件下にて、金を真空蒸着する。蒸着後に10時間にわたり830Kで基材のアニーリングを行い、金表面上に巨大テラスを得た後、使用の前には水素-酸素炎を用いたアニーリングによりこれを洗浄する。
未修飾金探針で観察された核酸塩基像
1,2,4-trichlorobenzene溶液中のAu（111）上のアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルのチオール誘導体の自己集合単分子膜（SAMs）を、未修飾金STM探針で観察した。像において、核酸塩基試料は明るい点を示した。明るい点の直径は、アデニンは0.34±0.02nm（図5）、グアニンは0.35±0.04nm、シトシンは0.33±0.02nm、ウラシルは0.33±0.06nmであり、これは核酸塩基のピリミジンおよびプリン環の小軸の大きさと一致する。探測探針の高さの値は、それぞれ、アデニンは47.7±6.2pm、グアニンは46.9±5.2pm、シトシンは47.9±6.5ｐｍ、ウラシルは45.8±5.2pmであった。結果は、未修飾探針がSTM像において他の核酸塩基から1つの核酸塩基を区別し得なかったことを示す。
純粋核酸塩基/混合核酸塩基の自己集合単分子膜（SAMs）の調製
核酸塩基の自己集合単分子膜（SAMs）の試料（すなわち、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルのチオール誘導体）を調製するために、金基材を各々の核酸塩基10ｍMのエタノール溶液試料（HPLC級エタノール、Woko Pure Chemical、Osaka、Japan）中に30分、45分、または1時間浸漬した。金基材を溶液から取り出した後、エタノールですすぎ、SAM上に物理的に吸着した過剰な核酸塩基試料を除去して真空乾燥させた。アデニン/グアニン混合SAMsは、アデニンおよびグアニンの10mM混合水溶液から、それらの異なるモル比で混合することによって調製した。
核酸塩基修飾探針（核酸塩基探針）の調製
金線（直径0.25mm；Nilaco、Tokyo、Japan）を3M NaCl中、10V交流条件で電気化学エッチングし、次に超音波浴中またはピラニア溶液中で洗浄することによりSTM金属探針を調製した。核酸塩基分子探針を構築するために、金探針をピラニア溶液で洗浄し、次に核酸塩基のチオール誘導体の10mMエタノール溶液中に3時間浸漬した。次に探針をエタノールですすぎ、アルゴンまたは窒素流中で乾燥させた。
純粋核酸塩基/混合核酸塩基のSAMsのSTM測定
STM測定を、Nanoscope E（Digital Instruments）上で室温にて定電流モードにおいて行った。測定前にAu（111）上のチオ塩基SAMs試料に対して、5μlの1,2,4-trichlorobenzeneを滴下沈着した。STM測定は-500mVのバイアス電圧（試料側陰極）、1200pAのトンネル電流にて周囲条件下、溶液/金の界面で実施した。逆のバイアス電位を加えること(すなわち＋500mV)による極性依存は何ら観察されなかった。探針上の核酸塩基と試料核酸塩基との各々の組み合わせに対して，30本を超える核酸塩基探針によりSTM観察に行い、そのうちの約45%は各々の組み合わせに応じたトンネル電流を促進することを示した。残りの核酸塩基探針による測定では、未修飾金探針で観察された像と同じSTM像を示した。促進の欠如は、金探針の最頂端での核酸塩基分子の不在が起因するようである。
単一鎖ペプチド核酸（PNA）オリゴマーの調製およびSTM測定
HPLCで精製した3種類の単一鎖の18量体のペプチド核酸（PNA）、(i)H2N-TTTTTTTTGTTTTTTTTT-CONH2（グアニン1個およびチミン17個を含む）、（ii）H2N-TTTTTTTGGTTTTTTTTT-CONH2（グアニン2個およびチミン16個を含む）、ならびに（iii）H2N-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-CONH2（チミン18個を含む）を購入し（Fasmac Co. LTD.、Kanagawa、Japan）、そしてそれ以上の精製を行うことなくSTM測定に用いた。試料基材は、Au（111）上にPNA（濃度0.5〜1.0mM）を含む一滴（5μl）の1,2,4-trichlorobenzene溶液を滴下することにより調製した。STM測定は、周囲条件下、-500ｍV（試料側陰極）のバイアス電圧および1200pAのトンネル電流での浸漬により溶液/金界面にて行った。
2.結果および考察
核酸塩基分子探針は、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルのチオール誘導体での金属探針の化学修飾により調製され（方法を参照のこと）（化学構造；図1b、およびそれらの調製物）、そして最も外側の単一核酸塩基分子は、核酸塩基分子試料に対する、またはこの分子試料からの分子間電子トンネル効果を探測する。重要なことは、トンネル電流は、試料および探針分子が、それらの間の電子波動関数の重なりをもたらす化学的相互作用を形成する場合に増大する。STMで観察された電流の増大は、電子波動関数の重なりを介する促進された電子トンネル効果に起因する。今回観察された電子トンネル効果の増大は、塩基の如何なる化学的酸化/還元をも伴わずに生じる。図2a、2b、および2cは、それぞれ、グアニンに対して相補的なシトシン探針、非相補的なアデニン探針、および未修飾探針で観察されたグアニンSAMsの典型的なSTM像を示す（方法を参照のこと）。それらの像のそれぞれの断面プロファイルはまた図2dにおいて示され、これは探針と核酸塩基との間の電子トンネル効果の大きさを表す。グアニンに対して相補的なシトシン探針は、最も促進された電子トンネル効果を、それゆえ、3つの探針間で最も明るいグアニン像を示した。同様に、アデニン、シトシン、およびウラシルについて、それらの相補的な核酸塩基探針は、それらの対応物の最も明るい像を与え、その結果は、評価のために核酸塩基のない探針（未修飾探針，2-mercaptobenzimidazole（MB）およびthiophenol（TP））を使用した結果とあわせて図2eにおいて示される。本発明者らは、絶対的には核酸塩基試料についての探針の高さにより、非相補的な核酸塩基から相補的な核酸塩基を区別した。測定された高さは，トンネル電流の定量的測定である．なぜならトンネル電流Iは、I∝exp(-2kh)としての関係により探針の高さhに関連づけられ、ここでK＝h-1(2mφ)1/2(hはDirach)であり、φは試料の仕事関数である（非特許文献9）。探針の高さhは、装置の簡便性のために、電流Iを一定に維持するので、通常電流Iよりも記録される。例えば、シトシン探針では、探針の高さは、相補的なグアニンについて197±23pm（図2e：黒柱）、非相補的なアデニン、ウラシル、およびシトシンについて、それぞれ、102±5pm、98±9pm、および99±7pm（図2e、黄色柱）であることが見出された。これらの高さは、塩基対間のトンネル電流を定量的に表す。対称的に、未修飾探針または、ピリミジンおよびピリジン様構造を有するが、核酸塩基との水素結合形成についての特定の官能基を何ら有しない2-mercaptobenzimidazole（MB）およびthiophenol（TP）（化学構造；図1b）で修飾された金探針では、電子トンネル効果の選択的な促進は、STM像（図5）において示されるように、何ら観察されなかった（図2e：黄色柱）。全体からみると、探針と試料との核酸塩基対の相補的な組み合わせは、非相補的な組み合わせに比較して、最も大きな電子トンネル効果を促進し、従って特定の核酸塩基は、相補的な核酸塩基探針を使用することにより、STM像において他の核酸塩基から区別され得ることが結論付けられる。
【００２３】
混合核酸塩基SAM（材料および方法を参照のこと）において、核酸塩基探針は、他の核酸塩基の存在下、それぞれの相補的な核酸塩基像を特定し得た。図3aは、シトシン探針で観察されたアデニン/グアニン混合SAMの典型的なSTM像を示す。図3aおよび図2fの挿入図において示されるように、シトシン探針は、相補的なグアニンおよび非相補的なアデニンについて、それぞれ、高いコントラスト像と低いコントラスト像をもたらした。高いコントラストのグアニン像の数は、SAMについての混合試料溶液中の[グアニン+アデニン]に対する[グアニン]のモル比に比例して増加し（図3b、3c、および3dを比較のこと）、その結果は、図3eにおいて示される。同様に、ウラシル探針は、SAMにおいて、非相補的なグアニンの存在下、相補的なアデニン像を選択的に特定することを可能とし（図2g）、そして高いコントラストのアデニン像の数はまた、図3eにおいて示されるように試料溶液中の[グアニン+アデニン]に対する[アデニン]のモル比に比例して増加した。これらの結果は、混合核酸塩基SAMsにおいて、相補的な塩基対を介する大きな電子トンネル効果は、本発明者らが他の核酸塩基の存在下で特定の核酸塩基を特定することを可能にしたことを示す。他方、未修飾探針では、4つの塩基は、混合SAM中であっても同一の像として観察された（図6）。このことは、核酸塩基探針での相補的な塩基の化学的な区別は、4つの塩基の高さにおける差異に起因しなかったことを示す。また、MBおよびTP探針は、電子トンネル効果の選択的な大きな促進を示さず（図2e：黄色柱）、観察された差異が探針上の塩基と基材との間の相補的な塩基対の水素結合にもっぱら起因することが確認された。
【００２４】
本発明者らは、水素結合性アクセプターまたはドナー分子、および官能基の選択的なSTM像のための水素結合ベースの分子探針の使用について、ならびに他の化学相互作用ベースの分子探針；metalloporphyrins中の金属種の選択的なSTM画像のための金属配位結合ベースの分子探針（非特許文献5）、および電子が豊富なポルフィリン環の選択的なSTM像のための電荷移動相互作用ベースの分子探針（非特許文献8）の使用について、以前に報告した。水素結合の酸性度または塩基性度の異なる程度を有する分子探針を調製する際、本発明者らは、試料分子中の、水酸基、カルボキシル基、カルボン酸塩、エーテル酸素、およびその配向、ならびにフリーベースポルフィリン中心を含む特定の官能基を、選択的に特定することに成功した（非特許文献1〜8）。本明細書中で本発明者らは、水素結合で促進される電子トンネル効果、すなわち、相補的な塩基対で促進される電子トンネル効果の別の例を追加した（図1a）。例えば、シトシン探針がグアニン塩基上に置かれる場合、グアニン塩基は、他の塩基に比較して大きな電子密度を全く保有しないが、その代わりにより大きな電子密度が、グアニン塩基上にシトシン探針を配置する際に水素結合面に沿って誘導される。電子密度におけるこの誘導性の増加は、2つの塩基間のより大きな電子結合に、従ってそれらの間のトンネル電流における増大に変換される。結果として、核酸塩基探針は、その相補的な塩基についてのみ、トンネル電流を増大させる。探針および試料の核酸塩基分子間の電子の流れる方向は、同じ組み合わせの核酸塩基間を介する電子トンネル効果の大きさに影響せず（図2e）；例えば、シトシンおよびグアニン探針によって、各々の相補的な塩基であるグアニンおよびシトシンを測定した場合，両者は同じ大きさの電子トンネル効果を生じさせる。これにより，核酸塩基対間の電子波動関数の重なりが，電子トンネル効果を増大させる上での必要不可欠な役割を果たす。
【００２５】
相補的な塩基対を介する特定の水素結合の形成は、探針および試料上で核酸塩基分子のピリジン環およびピリミジン環が，共平面となる必要がある。混合核酸塩基の単分子膜中では，塩基のピリジン環もしくはピリミジン環は、ランダムに配向され（図6）、純粋核酸塩基の単分子膜中では規則的に配向されているが（図２c），何れの場合においても、核酸塩基探針による選択的な電子トンネル効果の促進を生じることから（図2aおよび図3a〜d）、核酸塩基のピリジン環およびピリミジン環は互いに共平面となり、従って相補的な塩基対間で特定の水素結合が形成することが示された。塩基間で共平面となったのは、探針上の核酸塩基チオール誘導中の炭素-硫黄結合の回転ためで、これはチオールSAMsの最密構造においても生じる現象として周知である（非特許文献10）。それゆえ、SAM中の相補的な塩基は、排他的に区別される。HoogsteenおよびG:U Wobble塩基対のような他の水素結合が探針および試料の核酸塩基間に生じる可能性があるが、実際には非相補的な核酸塩基対に生じる程度の小さなトンネル電流にとどまり（図2e〜g）、相補的な核酸塩基対間の電子トンネル効果に基づく化学的識別を妨げることはなかった。個々の核酸塩基分子を扱った超分子化学の分野がある。そこでは，核酸塩基間の熱動力学的な安定性および関連する特性が広範にそして詳細に研究されている．その中で，多くの研究者らは、単量体核酸塩基間で，Watson-Crick型の特異的な相互作用が生じていることを報告している（非特許文献11）。これらの報告は、本研究において観察されたHoogsteenおよびWobble塩基対に対するWatson-Crick結合の優位性および特異的選択性を裏付けている。
【００２６】
DNA鎖におけるホールおよび電子移動は、DNA鎖に沿う（鎖内経路）、および核酸塩基対を介する（鎖間経路）の2つの経路を介して生じる。鎖間経路において、電子移動は相補的な塩基対の水素結合を介して生じる（非特許文献21）。Bartonおよびその共同研究者らは、電子ドナーおよび電子アクセプターを各々異なるDNA単鎖上に連結し，両者をハイブリダイズさせたDNA二重鎖を作製した．そして彼らは，このDNA二重鎖の鎖間経路を介したドナーとアクセプター間の電子移動が、ミスマッチの核酸塩基対を含むDNA二重鎖に比較して，相補的なDNA二重鎖の方が著しく大きいことを見出した。他方、鎖内経路において、電子ホッピングが、塩基対のpi-piスタッキング相互作用を介して生じることが知られている（非特許文献21〜26）。2つの経路のうち、鎖間経路のみが本発明の結果と比較されるべきである。
【００２７】
分子探針は、試料と探針分子との間の分子間電子トンネル効果を直接的に検出し、そしてそれぞれの電子波動関数の重なりを介した化学的相互作用、すなわち、水素結合（非特許文献1〜8）、金属配位結合（非特許文献15）、および電荷移動相互作用（非特許文献8）を介する分子間電子トンネル効果を検出する。本発明者らは、水素結合相互作用に基づいた、種々の官能基に対する化学的選択性を徹底的に研究した。化学的選択性は、分子探針の水素結合の酸性度および塩基性度の程度を制御することにより調整される（非特許文献7）。電子トンネル効果のより大きな促進は、水素結合が生じにくい配向をとるエーテル酸素よりも水素結合が容易な配向をとるエーテル酸素にて観察される。このことから，本発明者らは、分子中において異なって配向される官能基間で区別すること可能にした。これらの結果は、水素結合相互作用を介する促進された電子トンネル効果を実証し、その結果、本研究において相補的な核酸塩基を検出した。また，水素結合を介した電子移動プロセスは、非常に関心がもたれ、そして化学反応プロセスにおけるその根本的な重要性および生物学的な電子移動プロセスにおける重要な役割のために、アクセプター/ドナーマーカーを用いる光誘導性の電子移動を使用して、いくつかのグループにより研究されてきた（非特許文献27）。
【００２８】
特定の核酸塩基の検出の例は、ペプチド核酸（PNA）（DNAの類似構造体）（非特許文献12）の18量体鎖において、本発明の方法を用いて本明細書中に実証された。PNA鎖の未修飾探針での典型的なSTM像は、図4aにおいて示され、鎖中の塩基が、明るい点の列として観察され、そして鎖の成分、グアニンおよびチミンは区別されなかったことを示す。対照的に、シトシン探針は、鎖中の非相補的なチミン間で相補的なグアニンを特定した（図4b〜ｄおよび挿入図）。鎖に沿った電子トンネル効果の程度は、鎖における単一および二重の塩基置換がシトシン探針で区別されたことを示す（図4e）。
【００２９】
結論として、本発明者らは、水素結合媒介性の電子トンネル効果が、核酸塩基探針と核酸塩基試料との間の相補性で生じることを見出した。電子トンネル効果の増大は、各核酸塩基を電気的に特定することを可能とする。これまで、核酸塩基（非特許文献13〜15）およびDNAオリゴマー（非特許文献16〜18）のSTM観察が報告されたが、これらの研究は、STM像のそれらの不十分な化学的選択性のために核酸塩基の化学種を同定できていない。本発明は、特定の核酸塩基を特定することを可能にした。電子トンネル効果の増大は、水素結合、金属配位結合、および電荷移動相互作用のそれぞれに基づいて、特定の官能基および化学種にて生じ、そして結果として、特定の化学種および官能基の位置を同定することを可能にした。この技術は、その原理から「分子間トンネル顕微鏡」と命名され、膜および固体表面での化学種選択的なイメージング法として全般的に重要である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】核酸塩基探針は、電子トンネル効果が促進される塩基対に基づいてその相補的な核酸塩基を特定する。（a）核酸塩基探針と核酸塩基試料との間の相補的な塩基対の形成は、STMにおいて電子トンネル効果を著しく促進させる。従って核酸塩基探針は、対応する相補的な核酸塩基を特定し得る。（ｂ）アデニン（1）、グアニン（2）、シトシン（3）およびウラシル（4）のチオール誘導体についての化学構造が、2-mercaptobenzimidazole（MB）（5）およびthiophenol（TP）（6）とともに示される。
【図２Ａ】グアニン分子像のコントラストの変化。未修飾、非相補的、および相補的な核酸塩基探針で測定したグアニンの分子像を比較している。（a）相補的なシトシン探針で観察されたグアニンのSTM像。（b）非相補的なアデニン探針で観察されたグアニンのSTM像。（ｃ）未修飾の探針で観察されたグアニンのSTM像。像ａ、b、およびcの拡大された像（2.5×2.5nm2）が、それぞれ挿入図において示される。（d）画像ａ、b、およびｃにおける各々に描かれた破線（α-α’、β-β’、γ-γ’）に，沿ったSTM像の断面プロファイル。断面のプロファイルのy軸は、電子トンネル効果の大きさを示す。STM測定においては、定電流モードを満たすために所与の位置からの探針の「高さ」が測定されるため、その高さは、探針と試料間の電子トンネル効果の大きさを示すこととなる。
【図２Ｂ】同じく未修飾、非相補的、および相補的な核酸塩基探針で測定したグアニンの分子像を比較した結果。（e）探針と核酸塩基試料との間の電子トンネル効果の大きさ。核酸塩基探針（すなわち、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル探針）と、核酸塩基試料（すなわち、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル）との間に観察された電子トンネル効果の平均値（n=10）は、探針の「高さ（pm）」において表される（画像dの解説を参照のこと）。比較のため、核酸塩基探針でない探針（すなわち、未修飾の、2-mercaptobenzimidazole（MB）およびthiophenol（TP）探針）による、同一条件下で測定での値も示す。（f、g）アデニンおよびグアニンのみの単分子膜とアデニンとグアニンの混合単分子膜における、アデニン（赤柱）およびグアニン（青柱）分子像についての電子トンネル効果の大きさ。fおよびgの画像は、それぞれ、シトシンおよびウラシル探針による測定で得られた。
【図３】グアニン/アデニン混合自己集合単分子膜(SAMs)における相補的な核酸塩基分子の選択的な検出。（a、b、c）試料溶液から調製されたアデニン／グアニン混合SAMsのSTM像（10×10nm2）、そのアデニンに対するグアニンの分子比は、それぞれ、aについて10.0：1.0、bについて1.0：1.0、およびｃについて1.0：10.0である。像ａの拡大領域（1.5×1.5nm2）を，挿入図中に示す．この図において，低い（α）および高い（β）コントラスト像は、それぞれ、グアニンおよびアデニンを示す。（d）グアニンのみのSAMのSTM像（10×10nm2）。像a、b、c、およびdはシトシン探針で得られた。（e）核酸塩基試料混合溶液中の［グアニン+アデニン］に対する［グアニン］のモル比に比例して、それぞれ、グアニン像の数（黒四角）は増大し、そしてアデニン像の数（○）は減少した。アデニンおよびグアニンの数は、それぞれ、アデニン/グアニン混合SAMの画像（10×10nm2）において計数され、そして手順は、別の9個の画像について同様に行った。結果は、それらから平均した（n=10）。
【図４】18量体の単一ペプチド核酸(PNA)鎖におけるSNP分類。（a）18量体のペプチド核酸(PNA)単一鎖の未修飾探針で測定したSTM像（10×10nm2）．そのPNAの配列はTTTTTTTGGTTTTTTTTTである。挿入図ａ’（3.5×10nm2）に，白点により囲まれた鎖に沿ったPNA鎖の断面プロファイルを示した。画像中に描かれた白矢印は、PNA鎖の一端を特定した。（b、c、d）3種類の配列のPNA鎖；TTTTTTTTGTTTTTTTTT、TTTTTTTGGTTTTTTTTT、およびTTTTTTTTTTTTTTTTTTのシトシン探針でのSTM像（15×15nm2）が、それぞれ、b、c、およびdにおいて示す。像ｂ、ｃ、およびｄの拡大された像（2.0×5.0nm2）は、挿入図b’、c’、およびd’において、それぞれ示す。（ｅ）それぞれ、挿入図b’、c’、およびd’において白点により囲まれたPNA鎖に沿った核酸塩基分子像の断面プロファイル。断面プロファイルのy軸は、鎖に沿った電子トンネル効果の大きさを示す。
【図５】未修飾の金探針で観察したアデニンのチオール誘導体SAMのSTM像，およびアデニン誘導体のCorey-Pauling-Koltun（CPK）モデル（１）。走査領域は10×10nm2、探針と試料間のバイアス電圧は-500ｍV（試料側陰極）、トンネル電流は1,200pA（定電流モード）。STMで観察されたアデニン像の直径は、0.34±0.02nmであり、この値はアデニンCPKモデルから推測されるピリミジンの大きさと同程度である。この結果より、アデニン分子は，金基材上に垂直に立っていることを示す。
【図６】未修飾の金探針で観察されたアデニン/グアニン混合SAMのSTM画像。走査領域は7.0×7.0nm2、探針と試料間のバイアス電圧は-500ｍV（試料側陰極）、トンネル電流は1,200pA（定電流モード）。
【図１】
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【図２Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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