【事件の表示】
　特許第３００７６７２号「抗ＣＲＰモノクローナル抗体、ハイブリドーマ、およびヒトＣＲＰの回収精製方法」の請求項１ないし３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３００７６７２号の請求項１に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第３００７６７２号に係る発明についての出願は、平成２年１０月２５日に特願平２−２８７７９３号として出願され、平成１１年１１月２６日にその特許の設定登録がなされ、その後、林　純より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１３年１月１５日に訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正請求
１．訂正の内容
(1)特許請求の範囲の請求項１及び２を削除する。
(2)特許請求の範囲の請求項３に係る記載「請求項１に記載のモノクロナール抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる、ヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法。」を、「ヒトＣ反応性タンパク質に対してカルシウムまたはマグネシウム依存的反応性を示し、前記反応性がホスホリルコリン存在下でも阻害されないモノクロナール抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いるヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法であって、カルシウムまたはマグネシウム存在下でヒトＣ反応性タンパク質を特異的に吸着させて回収した後、キレート剤を用いた条件でヒトＣ反応性タンパク質を溶出させることを特徴とする、ヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法。」と訂正する。
(3)明細書２頁２〜９行の「本発明は、・・・に関するものである。」を「本発明は、ヒトＣ反応性タンパク質（C reactive protein：以下、ＣＲＰの略称を用いることがある）の回収または精製方法に関するものである。」と訂正する。
(4)同５頁１０行〜６頁６行の「従って、本発明は、・・・精製方法に関する。」を「従って、本発明は、ヒトＣ反応性タンパク質に対してカルシウムまたはマグネシウム依存的反応性を示し、前記反応性がホスホリルコリン存在下でも阻害されないモノクロナール抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いるヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法であって、カルシウムまたはマグネシウム存在下でヒトＣ反応性タンパク質を特異的に吸着させて回収した後、キレート剤を用いた条件でヒトＣ反応性タンパク質を溶出させることを特徴とする、ヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法」と訂正する。
(5)同６頁７行、６頁１７行、及び１２頁９行の「本発明のモノクロナール抗体」を「本発明で用いることのできるモノクロナール抗体」と訂正する。
(6)同１０頁５〜６行、１１頁３行、３２頁下から２〜１行、４３頁６、１４行、４４頁７及び１１行の「本発明のモノクロナール抗体」を「モノクロナール抗体」と訂正する。
(7)同１２頁１５行の「本発明のモノクロナール抗体」を「本発明においては、モノクロナール抗体」と訂正する。
(8)同３０頁１０〜１１行の「本発明におけるモノクロナール抗体」を「本発明で用いることのできるモノクロナール抗体」と訂正する。
(9)同４２頁１５行の「本発明によるハイブリドーマ」を「ハイブリドーマ」と訂正する。
(10)同４４頁４行の「本発明のアフィニティーカラム」を「本発明で用いるアフィニティーカラム」と訂正する。
　
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項(1)は、請求項を削除するものであるから特許請求の範囲の減縮に該当し、訂正事項(2)は、「ヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法」を「カルシウムまたはマグネシウム存在下でヒトＣ反応性タンパク質を特異的に吸着させて回収した後、キレート剤を用いた条件でヒトＣ反応性タンパク質を溶出させる」ことに限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当し、訂正事項(3)乃至(10)は、明りょうでない記載の釈明に該当する。
　そして、上記いずれの訂正も新規事項に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　
３．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４,２項、及び同条３項で準用する１２６条２項から３項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要
　訂正前の本件請求項１及び２に係る発明は、甲第１号証（The Journal of Immunology、Vol.143、221〜228、1989年7月1日）に記載された発明である、或いは、同請求項３に係る発明は、甲第１号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条１項３号或いは同条２項の規定により特許を受けることができない。
　
２．判断
　訂正された請求項１に係る発明（以下、「本件発明」という。）は、ヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製に当たり、ヒトＣ反応性タンパク質に対してカルシウムまたはマグネシウム依存的反応性を示し、前記反応性がホスホリルコリン存在下でも阻害されないモノクロナール抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用い、カルシウムまたはマグネシウム存在下でヒトＣ反応性タンパク質を特異的に吸着させて回収した後、キレート剤を用いた条件でヒトＣ反応性タンパク質を溶出させるものであるところ、甲第１号証には、「ヒトＣ反応性タンパク質に対してカルシウムまたはマグネシウム依存的反応性を示し、前記反応性がホスホリルコリン存在下でも阻害されないモノクロナール抗体」についての記載はあるが、これを用いたアフィニティークロマトグラフィーを、上記のような吸着・回収方法で実施することについて教示するところは全くない。
　そして、本件発明は、明細書記載の所期の効果を奏するものであるから、本件発明は、甲第１号証に記載された発明に基づき、当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　
３．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年１月２９日（２００１．１．２９）
【訂正の要旨】
（訂正の要旨）
（１）特許請求の範囲の請求項１及び２を特許請求の範囲の減縮を目的として削除する。
（２）特許請求の範囲の請求項３に係る記載「請求項１に記載のモノクロナール抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる、ヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として「ヒトＣ反応性タンパク質に対してカルシウムまたはマグネシウム依存的反応性を示し、前記反応性がホスホリルコリン存在下でも阻害されないモノクロナール抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いるヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法であって、カルシウムまたはマグネシウム存在下でヒトＣ反応性タンパク質を特異的に吸着させて回収した後、キレート剤を用いた条件でヒトＣ反応性タンパク質を溶出させることを特徴とする、ヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法。」と訂正する。
　（３）乃至（１０）は、明りょうでない記載の釈明を目的とするものである。
　すなわち、（３）明細書２頁２〜９行の「本発明は、・・・に関するものである。」を「本発明は、ヒトＣ反応性タンパク質（Ｃ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ：以下、ＣＲＰの略称を用いることがある）の回収または精製方法に関するものである。」と訂正する。
（４）同５頁１０行〜６頁６行の「従って、本発明は、・・・精製方法に関する。」を「従って、本発明は、ヒトＣ反応性タンパク質に対してカルシウムまたはマグネシウム依存的反応性を示し、前記反応性がホスホリルコリン存在下でも阻害されないモノクロナール抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いるヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法であって、カルシウムまたはマグネシウム存在下でヒトＣ反応性タンパク質を特異的に吸着させて回収した後、キレート剤を用いた条件でヒトＣ反応性タンパク質を溶出させることを特徴とする、ヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法」と訂正する。
（５）同６頁７行、６頁１７行、及び１２頁９行の「本発明のモノクロナール抗体」を「本発明で用いることのできるモノクロナール抗体」と訂正する。
（６）同１０頁５〜６行、１１頁３行、３２頁下から２〜１行、４３頁６、１４行、４４頁７及び１１行の「本発明のモノクロナール抗体」を「モノクロナール抗体」と訂正する。
（７）同１２頁１５行の「本発明のモノクロナール抗体」を「本発明においては、モノクロナール抗体」と訂正する。
（８）同３０頁１０〜１１行の「本発明におけるモノクロナール抗体」を「本発明で用いることのできるモノクロナール抗体」と訂正する。
（９）同４２頁１５行の「本発明によるハイブリドーマ」を「ハイブリドーマ」と訂正する。
（１０）同４４頁４行の「本発明のアフィニティーカラム」を「本発明で用いるアフィニティーカラム」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
抗ＣＲＰモノクロ−ナル抗体、ハイブリド−マ、およびヒトＣＲＰの回収精製方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　
ヒトＣ反応性タンパク質に対してカルシウムまたはマグネシウム依存的反応性を示し、前記反応性がホスホリルコリン存在下でも阻害されない
ヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法であって、カルシウムまたはマグネシウム存在下でヒトＣ反応性タンパク質を特異的に吸着させて回収した後、キレ−ト剤を用いた条件でヒトＣ反応性タンパク質を溶出させることを特徴とする
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、ヒトＣ反応性タンパク質（Ｃ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ：以下、ＣＲＰの略称を用いることがある
）の
　【０００２】
　【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
　ＣＲＰは、１９３０年にＴｉｌｌｅｔｔらによって、肺炎球菌に感染した肺炎患者の血清中に見い出されたタンパク質である。このタンパク質は肺炎球菌のＣ多糖体とカルシウム存在下で反応して沈降物を生成するところからＣ反応性タンパク質と呼ばれている。
　血清中におけるＣＲＰの存在およびその量は、急性炎症や組織障害の存在の有無およびその程度をよく反映するところから非常に重要な急性期タンパク質と言われており、ＣＲＰの測定は近年益々重要となってきている。このため、ＣＲＰの測定は単に定性的だけでなく、その消長を定量的にとらえることが広く臨床的に行われている。
　ＣＲＰの測定法としては、抗原抗体反応を利用した、毛細ガラス管法、ＳＲＩＤ法、免疫比濁法またはラテックス凝集法が主に行われている。また、ＣＲＰの定量技術の進展に伴い、数百ｎｇ／ｍｌオ−ダでの測定を可能にすることが要求されてきている。
　こうした事情から、測定に用いる抗血清に対して高い特異性と親和性とが要求され、従って、抗血清を得るために抗原として用いるＣＲＰを高度に精製する必要性が高まってきた。
　【０００３】
　従来、ＣＲＰの精製法は、ＣＲＰ陽性患者の血清や腹水等を原料とし、硫安塩析、ホスホリルコリン（またはホスホリルエタノールアミン）−セファロースアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィまたは分子ふるいクロマトグラフィーなどの組合せによって行われているが、精製工程が煩雑な上に、回収率が低い（３０〜４０％程度）という欠点があった。
　一方、抗原を特異的に精製する一般的な方法として抗体アフィニティーカラムを用いることもあるが、抗体の溶出に３Ｍチオシアン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）などの高濃度カオトロピックイオンを用いたり、あるいはグリシン−塩酸（ｐＨ２．０）のような強酸性条件を用いる。ところが、ＣＲＰは非共有結合による５量体構造を有しており、この５量体構造が前記のような溶出条件下では解離または変性を起こすので、ＣＲＰに対して前記の抗体アフィニティーカラム法を用いることは適切ではない。従って、ＣＲＰの精製に抗体アフィニティーカラムを使用することは従来行なわれていなかった。
　【０００４】
　これに対して本発明者は、種々研究の結果、カルシウムまたはマグネシウム依存的にヒトＣＲＰと反応するモノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２、ＣＲＰＢ−３およびＣＲＰＢ−５を見出した。更に、このモノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２、ＣＲＰＢ−３および／またはＣＲＰＢ−５をリガンドとした免疫吸着体を調製し、まずカルシウムあるいはマグネシウム存在下でヒトＣＲＰを特異的に吸着させて回収した後、クエン酸またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤を用いた温和な条件でヒトＣＲＰを溶出させることによりヒトＣＲＰを効率よく回収し、そして精製することができることを見出した。
　【０００５】
　【課題を解決するための手段】
　従って、本発明は、
ヒトＣ反応性タンパク質に対してカルシウムまたはマグネシウム的反応性を示し前記反応性がホスホリルコリン存在下でも阻害されない
ヒトＣ反応性タンパク質の回収または精製方法であってカルシウムまたはマグネシウム存在下でヒトＣ反応性タンパク質を特異的に吸着させて回収した後、キレート剤を用いた条件でヒトＣ反応性タンパク質を溶出させることを特徴とする
に関する。
　【０００６】
　本発明
で用いることのできる
　【０００７】
　以下、本発明
で用いることのできる
　免疫原として用いるヒトＣＲＰは、例えば以下の方法で調製することができる。即ち、ＣＲＰ陽性ヒト血清または腹水などを原料とし、これらを遠心分離および濾過することにより細胞および不溶物を除去する。こうして得られた上清を、例えばホスホリルコリン−セファロースによる吸着クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースによるイオン交換クロマトグラフィー、セファクリルＳ−３００による分子ふるいクロマトグラフィー等による精製操作で処理し、純化ヒトＣＲＰを得る。こうして得られたヒトＣＲＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理後のクマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＢ　Ｒ−２５０）染色で単一のバンドを示す。
　【０００８】
　次に、精製したヒトＣＲＰ免疫原溶液を用いて哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウマ）をイン・ビボ免疫法により免疫する。
　具体的には、例えば、精製したヒトＣＲＰ免疫原溶液を等量のフロインド氏完全アジュバントまたは不完全アジュバントと乳化するまで混合する。この混合液を、例えばマウスの皮下に投与する（第１回免疫）。以後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免疫から数日後に脾臓を無菌的に取り出し、ステンレスメッシュなどで押しつぶして脾臓細胞を調製し、細胞融合工程に用いる。
　【０００９】
　細胞融合に用いるもう一方の親細胞であるミエローマ細胞（骨髄腫細胞）としては、各種の公知の細胞株、例えば、ｐ３（ｐ３／×６３−Ａｇ８）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）〕、ｐ３−Ｕ１〔Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１；１−７（１９７８）〕、ＮＳ−１〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６；５１１−５１９（１９７６）〕、ＭＰＣ−１１〔Ｃｅｌｌ，８；４０５−４１５（１９７６）〕、ＳＰ２／０〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６；２６９−２７０（１９７８）〕、ＦＯ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，３５；１−２１（１９８０）〕、×６３．６．５５．３〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３；１５４８−１５５０（１９７９）〕、Ｓ１９４〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８；３１３−３２３（１９７８）〕、またはラットにおけるＲ２１０〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７；１３１−１３３（１９７９）〕などを使用することができる。
　【００１０】
　免疫脾臓細胞とミエローマ細胞との細胞融合は通常の方法で行うことができ、例えば、公知の融合促進剤（ポリエチレングリコールまたはセンダイウイルスなど）を用い、場合により補助剤（ジメチルスルホキシドなど）を用いることもできる。免疫脾臓細胞とミエローマ細胞との使用比率も常法と同様でよく、例えば、ミエローマ細胞に対して脾臓細胞を約１〜１０倍程度の量で用いる。融合用培地としては、例えば、４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコ−ルを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いることができる。融合は、前記の培地内で免疫脾臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合することによって行う。続いて、選別用培地（例えば、ＨＡＴ培地）を用いてハイブリドーマ以外の細胞を除去し、ハイブリドーマ培養上清の抗体産生の有無を、例えばＥＬＩＳＡ法によって測定し、目的とするハイブリドーマを分離する。
　【００１１】
　こうして得られた
、モ
　【００１２】
　前記のハイブリドーマＣＲＰＢ−２、ＣＲＰＢ−３またはＣＲＰＢ−５を常法によって培養した培養液から、あるいは前記３種のいずれかのハイブリドーマを投与した適当な哺乳動物（例えばマウスまたはラット）の腹水から、目的とするモノクロ−ナルを分離し、精製することが可能である。
　【００１３】
　そのような分離・精製方法としては硫安塩析、ＤＥＡＥ−セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子ふるいゲルを用いる分子分子カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥等がある。
　【００１４】
　こうして得られ
たモ
　【００１５】
　ところで、ヒトＣＲＰがカルシウムと結合するとその立体構造に変化が起きることは既に報告されている〔Ｙｏｕｎｇ，Ｎ．Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１２１，１８９３−１８９８（１９７８）〕。
　また、その立体構造の変化を認識するモノクローナル抗体が確立していることも既に報告されている〔Ｋｉｌｐａｔｒｉｋ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１９，１１５９−１１６５（１９８２）〕。しかしながら、それらのモノクローナル抗体は、ホスホリルコリン存在下においてＣＲＰとの結合が阻害されることが報告されており、本発明
で用いることのできる
　【００１６】
　本発明
においては、
　アフィニティークロマトグラフィーに使用するモノクローナル抗体固定化ゲルは次のようにして調製することができる。
　ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社）を常法により膨潤させてゲル化させた後、前記のようにして分離および精製したモノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２、ＣＲＰＢ−３および／またはＣＲＰＢ−５をそれぞれゲルにカップリングさせる。その後、過剰の活性基をブロックし、未反応のモノクローナル抗体を除去する。こうして得られたモノクローナル抗体固定化ゲルを適当なカラムに充填することによってモノクローナル抗体固定化アフィニティーカラムを調製し、ヒトＣＲＰの回収法および／または精製法に使用することができる。
　【００１７】
　遠心分離および濾過により不溶物を除去したＣＲＰ陽性ヒト血清または腹水等を、カルシウムあるいはマグネシウムを２〜１０ｍＭ（好ましくは、５ｍＭ）含む緩衝液（例えば、５０ｍＭトリス−塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ８．０）に対して透析し、前記のモノクローナル抗体固定化アフィニティーカラムに添加してＣＲＰを結合させる。次に、カルシウムあるいはマグネシウムを含む前記緩衝液によってカラムを充分に洗浄した後、ＥＤＴＡを５〜２０ｍＭ（好ましくは、１０ｍＭ）含む緩衝液（例えば、５０ｍＭトリス−塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ８．０）でヒトＣＲＰを溶出させる。
　【００１８】
　こうして精製したヒトＣＲＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した後、銀染色を行うと、２−メルカプトエタノールなどの還元剤の存在下では２６Ｋｄの単一バンドのみが、そして還元剤の非存在下では２２Ｋｄの単一バンドのみが認められ、タンパク質的に見て実質的に均一なＣＲＰを得ることができる。
　こうして得られる純化ヒトＣＲＰをウサギ等に免疫することにより得ることができる抗ヒトＣＲＰ抗血清は、免疫電気泳動法においてＣＲＰ陽性ヒト血清とγ鎖域に単一の沈降線のみが認められるので、免疫学的にも均一なヒトＣＲＰ抗原として使用することができる。
　【００１９】
　【実施例】
　以下の実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
　以下の実施例で用いるバッファーは以下のとおりである。
バッファーＡ：２０ｍＭトリス−塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ２（ｐＨ８．０）
バッファーＢ：２０ｍＭトリス−塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
バッファーＣ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、９０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）
バッファーＤ：２０ｍＭトリス−塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）
バッファーＥ：０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むバッファーＡ
バッファーＦ：５ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス−塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）
バッファーＧ：０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むバッファーＦ
バッファーＨ：１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）
バッファーＩ：５０ｍＭトリス−塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ２、０．０５％ＮａＮ３（ｐＨ８．０）
　【００２０】
例１：ヒトＣＲＰモノクローナル抗ＣＲＰＢ−２、ＣＲＰＢ−３およびＣＲＰＢ−５の調整
（１）ヒトＣＲＰ抗原の精製
　Ｖｏｌａｎａｋｉｓ，Ｊ．Ｅ．らの方法〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．２３，２８５−２９９（１９７８）〕に準じ行った。操作はすべて４℃にて行った。
　ＣＲＰ陽性ヒト腹水５００ｍｌを１２，０００×ｇで６０分間遠心処理し、上清５００ｍｌを得た。この上清にハイフロースーパーセル（和光純薬）を１％となるように添加し、Ｎｏ．５Ｃ濾紙（アドバンテック）を用いて濾過を行い、濾液約５００ｍｌを得た。
　次に、予めバッファーＡで平衡化しておいたホスホエタールアミン−アガロースカラム（直径２．５ｃｍ×長さ５０ｃｍ）に前記の濾液を添加し、素通り分画のＯＤ２８０が０．０２以下になるまでバッファーＡを流した。溶出はバッファーＢで行い、ＣＲＰの純度として約５０％の溶出分画を得た。
　【００２１】
　溶出分画を限外濾過にて濃縮し、バッファーＣに対して十分に透析した。
　透析後の分画を、予めバッファーＣで平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロースカラム（直径２．６ｃｍ×長さ３５ｃｍ）に添加し、素通り分画のＯＤ２８０が０．０２以下になるまでバッファーＣを流した。溶出は、バッファーＣ、並びに１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１．０ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を用いた濃度勾配溶出法により行った。この溶出法における第２番目のタンパク質ピークをＣＲＰ分画として集めた。
　こうして得られた分画を限外濾過にて濃縮し、バッファーＡに対し十分透析した後、前記と同じ方法でホスホリルエタノールアミン−アガロースカラムに添加し吸着分画を得た。
　【００２２】
　この分画を限外濾過して濃縮した後、予めバッファーＤで平衡化したセファクリルＳ−３００カラム（直径１．６ｃｍ×長さ９０ｃｍ）で分子ふるいクロマトグラフィーを行った。第２番目のタンパク質ピークをＣＲＰ分画として集め、限外濾過にて濃縮し、これをヒトＣＲＰとした。
　こうして調製したヒトＣＲＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５〜２０％グラジエントゲル）にて分画した後、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＢＲ−２５０）で染色したところ、還元下分子量２６Ｋｄおよび非還元下分子量２２Ｋｄの単一バンドを示した。また、ヒトＣＲＰ測定用ラテックス凝集試薬（エルピアエースＣＲＰ；ヤトロン製）を用いて原腹水中のヒトＣＲＰの濃度を測定したところ２９．５μｇ／ｍｌであった。従って、原腹水５００ｍｌ中にヒトＣＲＰは１４．７ｍｇ含まれていたことがわかる。これに対し、前記精製法によって得られたヒトＣＲＰを同様に測定したところ回収量は５．６ｍｇであり、回収率は３８％であった。
　このヒトＣＲＰを免疫原として、また抗ＣＲＰモノクローナル抗体産性ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として使用した。
　【００２３】
（２）免疫化脾臓細胞の調製
　ヒＣＲＰ免疫原溶液１．０ｍｇ／ｍｌを等容量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その混合液２００μｌをＢＡＬＢ／ｃ系マウス腹腔内に投与することにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後、そのマウスに前記と同様の混合液２００μｌを腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２回免疫から２１日経過後、ヒトＣＲＰ免疫原溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）を等量の生理食塩水で希釈し、その希釈液２００μｌを、前記マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾臓を無菌的にマウスから取り出し、次の細胞融合工程に使用した。
　【００２４】
（３）細胞融合工程
　無菌的に摘出した前記の脾臓を、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレに入れた。次に、脾臓を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流して脾臓細胞を流出させた後、この脾臓細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾臓細胞を５０ｍｌ遠心チューブに集め、５００×ｇで１０分間遠心した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液（１５５ｍＭＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭＫＨＣＯ３，１ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ；ｐＨ７．０）４ｍｌを加え、懸濁させた。０℃で５分間放置して懸濁液中の赤血球を破壊させた。１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地１０ｍｌを加えてから遠心分離した。こうして得た細胞ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾臓細胞を測定した。
　【００２５】
　一方、予め培養しておいたマウスミエロ−マ細胞（骨髄腫細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（理化学研究所ジーンバンク細胞銀行）約２×１０７個に前記脾臓細胞１×１０８個を加え、ＤＭＥ培地中で良く混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ、１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、４０％ポリエチレングリコール４０００溶液（３８℃に保温）０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏やかに回転することによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットを混合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を３０秒毎に１ｍｌ加えて、チューブを穏やかに回転させた。この操作を１０回繰り返した後、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地２０ｍｌを加えて、遠心分離（５００×ｇ、１０分間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレットを１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン４×１０−７Ｍ、チミジン１．６×１０−５Ｍ、ヒポキサンチン１×１０−４Ｍになるように添加したもの）で、遠心法によって２回洗浄後、前記ＨＡＴ培地４０ｍｌに懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレ−トの各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７℃で、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を約１００μｌ除き、新たに前記のＨＡＴ培地１００μｌを加えることにより、ＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。８日目から１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０−５Ｍ、ヒポキサンチン１×１０−４Ｍになるように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、１０日目に後述するＥＬＩＳＡ法により抗ヒトＣＲＰ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
　【００２６】
（４）ハイブリドーマの樹立
　ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無は、ＥＬＩＳＡ法により測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎｌｌ；日本ダイナテック株式会社）の各ウエルに前記のヒトＣＲＰ免疫原溶液（１０μｇ／ｍｌ；前記のバッファーＡで希釈）５０μｌずつを分注し、２５℃で２時間放置した。
　次に、０、０５％Ｔｗｅｅｎ２０−５ｍＭＣａＣｌ２−生理食塩水（以下、洗浄液ａ）で３回洗浄した後、各ウエルに培養上清を５０μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。
　前記と同様の方法でウエルを３回洗浄した後、バッファーＥで２００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ＤＡＫＯ社；Ｐ１６１）５０μｌを各ウエルに加えて１時間反応させた。
　反応終了後、各ウエルを前記の方法で洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリンと１０ｍＭフェノールと０．００５％過酸化水素水と含む２０ｍＭトリス−塩酸および１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）２００μｌを各ウエルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、１９２ウエル中５ウエルに抗体産生が認められた。
　【００２７】
　この５ウエル中のハイブリド−マを２４ウエルプレ−トに移し、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ倍地で４〜５日間培養した。その後、再度ＥＬｌＳＡ法によって抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体の産生の有無を確認してから限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法はＨＴ培地でハイブリドーマが５個／ｍｌとなるように希釈した細胞浮遊液を予め正常ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔細胞がウエルあたり２×１０４個分注してある９６ウエルプレートの各ウエルに１００μｌずつ分注した。１０日後、ＥＬＩＳＡ法によって抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーングした。
　その結果、各ハイブリド−マにつき、２０〜４０個の抗体産生クローンの中から、増殖性が良好で、抗体分泌能が高く、しかも安定なクローンを選び、前記と同様の方法で再びクローン化を行い、抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ５種を確立し、それぞれＣＲＰＢ−１、ＣＲＰＢ−２、ＣＲＰＢ−３、ＣＲＰＢ−４およびＣＲＰＢ−５と命名した。
　【００２８】
（５）ハイブリドーマの移植
　プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを１０〜１２週令のＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内に投与し、１４〜２０日経過した後のマウスの腹腔内にイン・ビトロで増殖させた前記の５種ハイブリド−マをマウス一匹あたり２×１０６細胞となるように接種した。
　各ハイブリド−マにつき、一匹のマウスから５〜１５ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は２〜１０ｍｇ／ｍｌであった。
　【００２９】
（６）カルシウムまたはマグネシウム依存的反応性
　ＥＬＩＳＡ法により調べた。すなわち、ヒトＣＲＰ免疫抗原を１０μｇ／ｍｌとなるようにバッファーＡまたはバッファーＦで希釈し、前述のＥＬＩＳＡ用プレートに５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放置した。
　次に、５ｍＭＣａＣｌ２または５ｍＭＥＤＴＡを含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水（以下洗浄液ａまたは洗浄液ｂ）で３回洗浄した後、バッファーＡまたはバッファーＦで５０００倍に希釈した５種類の腹水をウエルに５０μｌずつ加え、２５℃で１時間反応させた。
　次に、洗浄液ａまたは洗浄液ｂでウエルを３回洗浄した後、バッファーＥまたはバッファーＧで２００倍に希釈した前記のペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ＤＡＫＯ社；Ｐ１６１）５０μｌを各ウエルに加え１時間反応させた。
　反応終了後、洗浄液ａまたは洗浄液ｂでウエルを３回洗浄し、前記例１（４）で述べた方法で発色反応を行い、各ウエルの吸光度を測定した。その結果を第１表に示す。
　【００３０】
　【００３１】
　第１表に示すように、モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２、モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−３およびモノクローナル抗体ＣＲＰＢ−５がヒトＣＲＰに対し、カルシウム依存的に反応性を示した。
　更に、カルシウムの代わりにマグネシウムを用いて同様の実験を行ったところ、モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２、モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−３およびモノクローナル抗体ＣＲＰＢ−５は、ヒトＣＲＰに対しマグネシウム依存的に反応性を示した。
　【００３２】
　前記のモノクロ−ナル抗体ＣＲＰＢ−２、ＣＲＰＢ−３およびＣＲＰＢ−５がヒトＣＲＰに対してカルシウムあるいはマグネシウム依存的に反応性を示す際に、ホスホリルコリンの存在によりその反応性が阻害されるか否かを調べた。
　ヒトＣＲＰ免疫抗原を１０μｇ／ｍｌとなるようにバッファーＡで希釈し、前記のＥＬＩＳＡ用プレートに５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放置した。
　次に、洗浄液ａで３回洗浄した後、バッファーＡまたは１ｍＭホスホリルコリンクロライド（シグマ社、Ｐ−０３７８）を含むバッファーＡで５０００倍に希釈した前記の３種の腹水をウエルに５０μｌずつ加えてから２５℃で１時間反応させた。
　続いて、洗浄液ａでウエルを３回洗浄した後、バッファーＥで２００倍に希釈した前記のペルオキシターゼ結合抗マウス抗体（ＤＡＫＯ社、Ｐ１６１）５０μｌを各ウエルに加え、１時間反応させた。
　反応終了後、洗浄液ａでウエルを３回洗浄し、前記例１（４）で述べた方法で発色反応を行い、各ウエルの吸光度を測定した。その結果を第２表に示す。
　【００３３】
　【００３４】
　第２表に示すようにモノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２、ＣＲＰＢ−３およびＣＲＰＢ−５のヒトＣＲＰに対するカルシウム依存的反応性は、ホスホリルコリン存在下においても阻害されなかった。
　更に、カルシウムの代わりにマグネシウムを用いて同様の実験を行ったところ、同じ結果を示した。
　ところで、Ｋｉｌｐａｔｒｉｋ、Ｊ．Ｍ．Ｓ〔Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎ．１９、１１５９−１１６５（１９８２）〕により報告されているヒトＣＲＰに対しカルシウム依存的に反応性を示すモノクローナル抗体４種（ＨＤ２−４、ＥＡ４−１、ＦＢ２−１、ＨＢ３−２）は、いずれもホスホリルコリン存在下において、その反応が阻害される。
　以上のように、本発明
で用いることのできる
　【００３５】
（７）オクタロニー法
　ハイブリドーマＣＲＰＢ１〜ハイブリドーマＣＲＰＢ５の腹水と精製ヒトＣＲＰとの反応をオクタロニー法により調べた。バッファーＡ（またはＦ）で１．０％アガロースプレート（厚さ２．０ｍｍ）を作製し、中心のウエルに精製ヒトＣＲＰ（１．０ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを入れ、周囲の６個のウエルには、１ウエルに陰性コントロールとしてのバッファーＡ（またはＦ）１０μｌを入れ、残りの５ウエルにバッファーＡ（またはＦ）で連続２倍希釈した腹水（原液から１６倍希釈）１０μｌを入れ、４℃で一昼夜反応させた。結果を第３表に示す。
　【００３６】
　【００３７】
　第３表に示すように、モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−１にはカルシウムに依存しない沈降線の形成が認められ、モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２にはカルシウムに依存的な沈降線の形成が認められた。
　更に、カルシウムの代わりにマグネシウムを用いて同様の実験を行ったところ、同様の結果となった。他のモノクローナル抗体ＣＲＰＢ−３、モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−４およびモノクローナル抗体ＣＲＰＢ−５にはいずれの条件においても沈降線の形成が認められなかった。
　【００３８】
　以上の実験から明らかなとおり
、モ
　【００３９】
　以下の実施例においてアフィニティークロマトグラフィーによるヒトＣＲＰの回収および精製を具体的に示すが、カラムのリガンドとして前記のモノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２を用いた。これは、前記のように立体障害の少ない部位にある抗原決定基を認識するモノクローナル抗体をリガンドとすることにより、カラム単位体積当たりのヒトＣＲＰの結合量が増加するものと予想されたからである。しかしながら、ヒトＣＲＰの回収および精製は、前記のモノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２の代わりに、モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−３およびＣＲＰＢ−５をカラムのリガンドとして用いた場合でも、当然に実施することができる。
　【００４０】
例２：ヒトＣＲＰの回収、精製用アフィニティーカラムの調整
（１）抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２の精製
　モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２を含有するマウス腹水２０ｍｌに等容量の飽和硫安溶液を徐々に加え、混合物を氷冷下で３０分間撹拌した後、６０分間放置し、遠心分離処理（１００００×ｇ、１０分間）した後、得られた沈澱物を少量のバッファーＨに溶解し、１０００倍量のバッファーＨに対して透析した。これをバッファーＨで予め平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロースカラム（直径２．５ｃｍ×長さ１８ｃｍ）に添加した。モノクロ−ナル抗体の溶出はバッファーＨと０．２ＭＮａＣｌを含むバッファーＨとの間で濃度勾配法によって行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過で濃縮し、予め２０ｍＭトリス−塩酸および１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したセファクリルＳ−３００カラム（直径２．６ｃｍ×長さ９５ｃｍ）に添加した。２０ｍＭトリス−塩酸および１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出し、精製モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２（４７ｍｇ）を得た。
　【００４１】
（２）モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２固定化アフィニティーカラムの調製
　ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社）の乾燥品４．５ｍｇを計量してとり、１ｍＭＨＣｌで膨潤させてゲル化させた後、ガラスフィルタ−上にてゲルを十分洗浄した。そのゲルをカップリングバッファ−（０．２ＭＮａＨＣＯ３、０．５ＭＮａＣｌ：ｐＨ８．５）中に移し、そこヘカップリングバッファーに対し十分に透析した精製モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２（３０ｍｇ）を加え、４℃で一夜反応させた。
　未反応のモノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２を洗浄して除去した後、ゲルを０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．０）の中に移し、２５℃で２時間放置し、活性基をブロックした。
　次に、ガラスフィルター上で前記ゲルをカップリングバッファー、並びに０．１Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．５ＭＮａＣｌ（ｐＨ４．０）で交互に洗浄することにより非特異的に吸着しているタンパク質を除去した。
　こうして得られたゲルをカラム（直径１．５ｃｍ×長さ８．５ｃｍ；全量１５ｍｌ）に充填し、モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２固定化アフィニティーカラム（以下単にアフィニティーカラムと称する）を調製した。
　【００４２】
例３：アフィニティーカラムを用いたヒトＣＲＰの回収および精製
（１）結合量
　ヒトＣＲＰ陽性のヒト腹水１．５ｌにハイフロースーパーセル（和光純薬）を１．０％となるように添加し、Ｎｏ．５Ｃ濾紙（アドバンテック）で濾過した。この濾液をバッファーＩに対して十分透析した後、遠心分離処理（１２，０００×ｇ；６０分間）して不溶物を除去した。
　前記のように前処理したヒト腹水を、予めバッファ−１で平衡化しておいた例２のアフィニティ−カラムに流速２０ｍｌ／ｈで添加した。このアフィニティーカラムのヒトＣＲＰの結合量を調べる目的で非吸着画分へのヒトＣＲＰの出現をヒトＣＲＰ測定用ラテックス凝集試薬（エルピアエースＣＲＰ；ヤトロン製）を用いて調べた。その結果、ヒト腹水を約１ｌ添加したところで非吸着画分へのヒトＣＲＰの出現が認められ、アフィニティーカラムにヒトＣＲＰが飽和したことが確認された。
　ヒト腹水の添加終了後、カラムを１０体積分のバッファーＩで洗浄した。その後、非特異的に吸着しているタンパク質を除去するために、１０体積分の５０ｍＭトリス−塩酸、１．０ＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ２および０．０５％ＮａＮ３（ｐＨ８．０）でカラムを洗浄した。
　次に、カラムを１０体積分のバッファーＩで再平衡化した後、５０ｍＭトリス−塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡおよび０、０５％ＮａＮ３（ｐＨ８．０）でヒトＣＲＰを溶出した。
　この溶出分画を集め、前記のヒトＣＲＰ測定用ラテックス凝集試薬（エルピアエースＣＲＰ；ヤトロン製）によりヒトＣＲＰを測定し回収量を求めると２５．５ｍｇであった。このことから、アフィニティーカラムに充填したゲル１ｍｌあたり１．７ｍｇのヒトＣＲＰが結合することがわかった。
　【００４３】
　前記実験の溶出パターンを第１図に示す。
　第１図において、Ａは非吸着分画であり、ＢはヒトＣＲＰであり、ａ〜ｄは以下のとおりである。
ａ＝５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ２、０．０５％ＮａＮ３；ｐＨ８．０、
ｂ＝５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１．０ＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ２、０、０５％ＮａＮ３；ｐＨ８．０、
ｃ＝５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ２、０．０５％ＮａＮ３；ｐＨ８．０、
ｄ＝５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３；ｐＨ８．０。
　【００４４】
（２）回収率
　結合量の求められたゲルをあらためて別のカラム（直径１．０ｃｍ×長さ２．０ｃｍ、全量１．５７ｍｌ）に充填し、バッファーＩで再平衡化した。このカラムの飽和結合量の８０％（ヒトＣＲＰとして約２．１ｍｇ）を目安に前記の前処理を加えたヒトＣＲＰ陽性ヒト腹水を添加した。前記と同様の方法で吸着されたヒトＣＲＰを溶出し、ヒトＣＲＰ測定用ラテックス凝集試薬（エルピアエースＣＲＰ）で測定し回収率を求めた。
　同様の操作を同一のカラムで５回繰り返して回収率を求めたところ、第４表に示すようにいずれの場合も回収率は９０％以上であった。
　【００４５】
　【００４６】
（３）純度検定
　前記例３（２）に記載の５回の繰り返し実験で得られた各ヒトＣＲＰ２００ｎｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％〜２０％グラジエントゲル）にて分画した後、銀染色（関東化学製、銀染色キット使用）を行った。結果を第２図に示す。第２図から明らかなように、いずれのヒトＣＲＰにも、２−メルカプトエタノールによる還元下２６Ｋｄ、非還元下２２Ｋｄの単一バンドが認められた。
　また、高速液体クロマトグラフィー（日本分光製；カラムはＡｓａｈｉｐａｋ　ＧＳ−５２０を使用）を用いた分析では分子量１１０Ｋｄの位置に単一の鋭いピ−クが認められた。
　【００４７】
（４）免疫学的特異性
　前記例３（２）に記載の５回の繰作で得られたそれぞれのヒトＣＲＰは１．５％アガロースを支持体としベロナール緩衝液（ｐＨ８．６＝イオン強度０．０５）を用いた免疫電気泳動法において抗正常ヒト全血清ウサギ抗体（ＤＡＫＯ社製；Ａ２０６）とは沈降線を形成せず、抗ヒトＣＲＰウサギ抗体（ＤＡＫＯ社製；Ａ０７３）とはγ領域に単一の沈降線を形成した。
　また、前記（２）に記載の５回目のカラム操作で得られたヒトＣＲＰを１回につき０．５ｍｇずつフロインド氏完全アジュバントと共に、２週間おきに３回、ウサギ（ニュージーランドホワイト；メス）に免疫して得た抗血清は、前記と同様の免疫電気泳動において正常ヒト血清とは沈降線を形成せず、免疫原として用いたヒトＣＲＰおよびＣＲＰ陽性ヒト血清と単一の沈降線を形成した。
　以上の実験から、モノクローナル抗体ＣＲＰＢ−２固定化アフィニティークロマトグラフィーで回収され、精製されたヒトＣＲＰは純品であることが確認された。
　【００４８】
　なお
、ハ
　【００４９】
　【発明の効果】
　
モ
　また
、モ
で用いる
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　第１図は
、モ
　【図２】
　第２図は
、モ