(57)【要約】  本発明は、アンジオスタチン分子の断片に対応する抗血管新生ペプチド、それを含有する薬学的組成物、および血管新生を包含する疾患の予防処置または治療処置におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列を有する抗血管新生ペプチド。
【請求項２】
前記配列番号１のペプチドを含有する薬学的組成物。
【請求項３】
免疫応答を刺激するアジュバントを含有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
血管新生を包含するかまたは血管新生によって仲介される疾患または機能障害の予防処置または治療処置のための医薬品の調製のための配列番号１のペプチドの使用。
【請求項５】
該疾患が、腫瘍、眼疾患、血管、循環器および炎症性疾患、器官および組織の変性疾患、移植合併症、脳血管病理から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
該疾患が、腫瘍、白血病、網膜症、緑内障、黄斑変性症、角膜拒絶反応、レトロレンチキュラー線維増殖症、ルベオーシス、糖尿病、関節リウマチ、粥状動脈硬化症、眼または皮膚の移植と関連した疾患である、請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血管新生活性を有するアンジオスタチンペプチド、それを含有する薬学的組成物および血管新生を包含する疾患の予防処置または治療処置におけるその使用に関する。
【０００２】
背景技術
血管新生は、組織または器官において新たな血管が生じることによる工程である。一定の条件において、例えば腫瘍拡散において、この工程はコントロールされずに進行する。
【０００３】
アンジオスタチン（ＡＳＴ）は、より大きな分子であり血管新生抑制特性を有さないプラスミノーゲンの断片としてつくられる抗血管新生分子である。ＡＳＴは、内皮細胞においてアポトーシスを誘導するが、他の細胞標的にも作用しうる（１）。さらに、ＡＳＴは、原始性および転移性の両腫瘍において血管新生を阻害できる。ＡＳＴで処置した動物において、毒性効果も抵抗性も観察されていない。
【０００４】
ＡＳＴ、その配列変異体およびＤＮＡコード化配列、ならびにそれを単離、精製および合成調製する方法は、米国特許第５８６１３７２号、第５６３９７２５号、第５７９２８４５号、第５８８５７９５号、第５８５４２０５号、第５８５４２２１号、第６０２４６８８号を包含するいくつもの特許に記載されている。アンジオスタチンの治療上の重要性の点において、アンジオスタチンの生物学的効果を再現または改善できるペプチド断片を発見することは特に重要である。
【０００５】
発明の記載
第一の態様において、本発明は、ＩＬ−１２を誘導でき、顆粒球走化性を阻害できる、抗血管新生活性を賦与するＡＳＴのペプチド断片を提供する。ペプチドは、アンジオスタチン分子のクリングル３に局在し、１３マーであり、その配列（HNRTPENFPCKNL−配列番号１）はヒトおよびマウスの種において同一である。マトリゲルスポンジを利用する血管新生インビボアッセイにおいて、ペプチドは、タンパク質の異なる領域に対応する他のペプチドとは異なり、アンジオスタチンよりも活性がある。ペプチドおよびアンジオスタチンの活性は抗ＩＬ−１２抗体により阻害されたが、検査される他のペプチドの活性は阻害されなかった。エマトキシリン−エオシン染色は、ヘモグロビン定量によって示される有力な血管新生阻害を確認した。ペプチド配列番号１の添加は、局所的な細胞浸潤を劇的に低下させ、したがって血管新生を予防した。
【０００６】
ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２−アゴニストならびにＩＬ８が化学誘引物質として使用される好中球についての走化性アッセイにおいて、ペプチド配列番号１は他のアンジオスタチンペプチドと比較して有意に高い活性を示した。さらに、ヌードマウスのカポジ肉腫（ＫＳ）細胞についての移植可能な腫瘍モデルにおいて、細胞注入３日前の単回投与後、ペプチドはアンジオスタチンに対して腫瘍成長を低下できた。この結果は、アンジオスタチンが治療上効果的である連続投与を要することを考慮すると、特に重要である。
【０００７】
さらなる側面において、本発明は、ペプチド配列番号１を含有する薬学的組成物に関する。前者は、経口、直腸、眼、鼻、局所、子宮内、膣内または非経口（例、皮下、静脈内、筋肉内）経路によって投与できる。ペプチド投与のための適切な製剤は、カプセルピルまたは顆粒などの固体、溶液、懸濁液、シロップ、滴剤、チンキ、スプレーまたはエアロゾルなどの液体、あるいは、クリーム、軟膏またはジェルなどの半固体でありうる。製剤は、ペプチド配列番号１のほかに、免疫応答を高めるためにフロイントアジュバントなどの１つ以上のアジュバントを含有しうる。
【０００８】
ペプチド配列番号１の投与量は、治療されるべき疾患または機能障害の重度ならびに、対象の年齢、体重または投与の経路などの他の変数に依存する。動物またはヒトの治療について、０．１〜２５０mg/kgの範囲のペプチド量が使用できる。
【０００９】
本発明に記載のペプチドおよびその製剤は、血管新生を包含するかまたはそれによって仲介される疾患または機能障害、特に固体腫瘍または白血病などの腫瘍、網膜症、緑内障、黄斑変性症、角膜拒絶反応、レトロレンチキュラー線維増殖症（retrolenticular fibroplasia）眼疾患、循環器系などの血管疾患、糖尿病を包含する急性または慢性炎症性疾患、関節リウマチおよび粥状動脈硬化症などの器官および組織変性疾患、特に眼または皮膚の組織の移植、大脳血管病理の治療処置または予防処置について示される。
【００１０】
アンジオスタチンと比較して、本発明のペプチドは、より安定であり、より高い生物学的利用能およびより良好な組織分布を有し、さらに、高い純度および低コストで簡単に製造できる。
【００１１】
ペプチド配列番号１は、溶液、固相または自動合成装置を使用して、確立された手順に従って合成調製できる（Stuart and Young, 1984, solid phase peptide synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co.; Tarn et al., Am Soc, 1983 105: 6442; Merrifield, 1979, The Gross and Meihofer eds NY Academic Press, 1-284）。あるいは、ペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって調製されうる（Sambrook et al., Molecular Cloning, a laboratory manual, CSH Press, CSH, NY, 1982またはAusbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. NY, 1987）。配列番号１内の１つ以上のアミノ酸は、ペプチド活性特性または生物学的利用能を改善するために、ＤまたはＬ配置にある異なる残基によって置換されうるか、または例えばカルボキシ末端のアミド化、親油性基（つまり脂肪酸残基）のグリコシル化への連結、または他の分子への結合によって化学的に修飾されうる。
【００１２】
本発明は、ペプチド配列番号１をコードする核酸分子、その発現ベクターおよびそれらを含有する真核細胞または原核細胞の宿主も提供する。
【００１３】
材料および方法
１．腫瘍細胞の異種移植
ＣＤ１ヌードマウスに側腹部から５００万個のＫＳ−ｉｍｍ細胞を注射し、４群に分けた。１つは、ＰＢＳ−ＢＳＡ１００μl中のＡＳＴ２．５μgを腫瘍周辺に注射し、コントロール群は媒体のみを注射し、第三群はペプチド配列番号１またはコントロールペプチドを２．５mg注射した。マウスを３１日目に屠殺した。
【００１４】
２．マトリゲルスポンジアッセイ
Ｃ５７Ｂ１マウスにおいて記載されるとおりアッセイを実施した（３）。
【００１５】
ＩＬ−１２がＡＳＴ機能の仲介因子であるかどうかを検証するため、中和抗マウスＩＬ−１２抗体（Peproteck Inc. London）およびそれぞれ関連性のない抗ファージ１３抗体（5prime, 3 prime Inc. Boulder, Co. 150 ng/ml）を混合物へ添加した。
【００１６】
３．ペプチド配列
ペプチド５（配列番号１）：ヒトプラスミノーゲン（P00747 Swiss-protデータベース）の位置３０７から始まるHNRTPENFPCKNL
ペプチド３：クリングル３右境界由来のDSSPVSTEQLAPTA
ペプチド４：クリングル１コア由来のSSTSPHRPRFS
【００１７】
４．マトリゲルスポンジの組織学
動物の屠殺後、ペレットを４％ＰＡＦ中で固定し、パラフィン包埋した。４μm切片をヘマトキシリン−エオシンの標準的な手法で染色した。
【００１８】
５．走化性
Ｆａｌｋ（４）にしたがって、４８穴チャンバー（Costar Nucleopore, Milan, Italy）中でアッセイを実施した。各チャンバーの下部区画をＲＰＭＩ０．１％ＢＳＡ（ＳＦＭ）中の化学誘引物質（IL-8, 50 ng/ml）２７μlで満たした。刺激のない自発的な遊走については無血清培地（ＳＦＭ）を使用した。上部区画をＳＦＭ中の多核白血球（polymorphonucleate, PMN）懸濁液５０μl（３×１０6個の細胞/ml）で満たし、各実験点を６通り実施した。加湿雰囲気中の５％ＣＯ２において３７℃で、チャンバーを４５分間インキュベーションした。フィルターを除去し、細胞を１００％エタノールで固定し、トルイジンブルーで染色した。フィルター表面の走査およびＮＩＨ画像解析ソフトウェアによる青色染色の濃度測定によって、遊走した細胞を定量化した。
【００１９】
結果を図１〜３に示す。
【００２０】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１−ａ】ＡＳＴによる腫瘍周辺処置後のＩＬ−１２の血清定量。柱状部は、４週間の処置後の試料の幾何学的平均および標準誤差を示す。
【図１−ｂ】ＡＳＴを使用するマトリゲルインビボ血管新生アッセイ。柱状部は、各６匹の動物を含む群の平均および標準誤差を示す。ＫＳ条件培地（ＫＳＣＭ）は刺激性である（コントロール）。
【図１−ｃ】ペプチドを使用するマトリゲルインビボ血管新生アッセイ。ペプチドと抗ＩＬ−１２抗体との組み合わせを、示されるようなＫＳＣＭを含有する試料へ添加した。
【図２−ａ】図１−ｃにおける実験に対するマトリゲルペレットの標準的なエマトキシリン−エオシン染色。
【図２−ｂ】図１−ｃにおける実験に対するマトリゲルペレットの標準的なエマトキシリン−エオシン染色。
【図２−ｃ】図１−ｃにおける実験に対するマトリゲルペレットの標準的なエマトキシリン−エオシン染色。
【図２−ｄ】図１−ｃにおける実験に対するマトリゲルペレットの標準的なエマトキシリン−エオシン染色。
【図２−ｅ】図１−ｃにおける実験に対するマトリゲルペレットの標準的なエマトキシリン−エオシン染色。
【図２−ｆ】図１−ｃにおける実験に対するマトリゲルペレットの標準的なエマトキシリン−エオシン染色。
【図２−ｇ】図１−ｃにおける実験に対するマトリゲルペレットの標準的なエマトキシリン−エオシン染色。
【図２−ｈ】図１−ｃにおける実験に対するマトリゲルペレットの標準的なエマトキシリン−エオシン染色。
【図３】ＰＭＮ走化性。遊走した細胞の濃度測定。ＩＬ−８は、ＡＳＴまたは関連するペプチドのいずれかを添加した各試料中で刺激を示した。
【図１−ａ】
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【図１−ｂ】
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【図１−ｃ】
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【図３】
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【図２−ａ】
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【図２−ｂ】
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【図２−ｃ】
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【図２−ｄ】
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【図２−ｅ】
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【図２−ｆ】
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【図２−ｇ】
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【図２−ｈ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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