(57)【要約】  本発明は、遺伝子導入ベクター及びサブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接したアミノ酸を少なくとも３つ含む複合体を提供する。本発明はまた、遺伝子導入ベクター及び複合体を用いて、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法及び、特定の細胞型にタンパク質又は非タンパク質性分子を送達する方法を提供する。【選択図】図１
2008516631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、（ａ）哺乳動物において発現し、免疫応答を誘導する抗原を少なくとも１つコードする核酸配列、及び（ｂ）サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列を含む遺伝子導入ベクターであって、遺伝子導入ベクターがアデノウイルスベクターではないものを哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項２】
遺伝子導入ベクターがウイルスベクターである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、パルボウイルスベクター、及びバクテリオファージベクターからなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
遺伝子導入ベクターが、リポソーム、プラスミド、又はウイルス様粒子である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、（ａ）哺乳動物において免疫応答を誘導する抗原を少なくとも１つ、及び（ｂ）サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列を含む複合体であって、複合体がアデノウイルスではないものを哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項６】
複合体が融合タンパク質である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
アミノ酸配列が、血清型５又は血清型２アデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
アミノ酸配列が、アミノ酸残基リジン−リジン−スレオニン−リジン（ＫＫＴＫ）（配列番号１）を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
抗原が、ペプチド、タンパク質、又は糖タンパク質からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの抗原が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のクレイドＡ、Ｂ、又はＣからのｅｎｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ、並びに前述のいずれかを含む融合タンパク質からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの抗原が、（ＳＡＲＳ）ウイルスのＥタンパク質、Ｍタンパク質、及びスパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの抗原が、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、又は四日熱マラリア原虫から単離される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの抗原が、デングタンパク質Ｍ、デングタンパク質Ｅ、デングＤ１ＮＳ１、デングＤ１ＮＳ２、及びデングＤ１ＮＳ３からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物がヒトである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）タンパク質をコードする核酸配列、及び（ｂ）サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列を含む遺伝子導入ベクターであって、遺伝子導入ベクターがアデノウイルスベクターではない、遺伝子導入ベクター。
【請求項１６】
核酸配列が、抗原又は細胞毒性タンパク質をコードする、請求項１５記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項１７】
遺伝子導入ベクターがウイルスベクターである、請求項１５又は請求項１６記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項１８】
ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、パルボウイルスベクター、及びバクテリオファージベクターからなる群より選択される、請求項１７記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項１９】
遺伝子導入ベクターがリポソーム、プラスミド、又はウイルス様粒子である、請求項１５又は請求項１６記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項２０】
アミノ酸配列が、血清型２又は血清型５アデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含む、請求項１５〜１９のいずれかに記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項２１】
アミノ酸配列が、アミノ酸残基リジン−リジン−スレオニン−リジン（ＫＫＴＫ）（配列番号１）を含む、請求項１５〜２０のいずれかに記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項２２】
（ａ）タンパク質又は非タンパク質性分子、及び（ｂ）サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列を含む複合体であって、複合体がタンパク質を含む場合に複合体がアデノウイルスではない、複合体。
【請求項２３】
複合体がタンパク質を含む、請求項２２記載の複合体。
【請求項２４】
タンパク質が抗原又は細胞毒性タンパク質である、請求項２３記載の複合体。
【請求項２５】
複合体が融合タンパク質である、請求項２２〜２４のいずれかに記載の複合体。
【請求項２６】
複合体が非タンパク質性分子を含む、請求項２２記載の複合体。
【請求項２７】
非タンパク質性物質が小分子である、請求項２６記載の複合体。
【請求項２８】
小分子がハプテンである、請求項２７記載の複合体。
【請求項２９】
アミノ酸配列が、血清型２又は血清型５アデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含む、請求項２２〜２８のいずれかに記載の複合体。
【請求項３０】
アミノ酸配列が、アミノ酸残基リジン−リジン−スレオニン−リジン（ＫＫＴＫ）（配列番号１）を含む、請求項２２〜２９のいずれかに記載の複合体。
【請求項３１】
タンパク質を細胞へ送達する方法であって、細胞を請求項１５記載の遺伝子導入ベクターと接触させ、それによって核酸配列が発現し、タンパク質が産生されることを含む、方法。
【請求項３２】
タンパク質を細胞へ送達する方法であって、細胞を請求項２３記載の複合体と接触させ、それによって核酸配列が発現し、タンパク質が産生されることを含む、方法。
【請求項３３】
非タンパク質性分子を細胞へ送達する方法であって、細胞を請求項２６記載の複合体と接触させることを含む、方法。
【請求項３４】
細胞が樹状細胞である、請求項３１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
細胞が腫瘍細胞である、請求項３１〜３３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府後援の研究及び開発に関する記述
本発明は、ＧｅｎＶｅｃ，Ｉｎｃ．と国立アレルギー感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）を代表する米国公衆衛生局との間で施行された、共同研究開発契約（ＣＲＡＤＡ）番号ＡＩ−１０３４、及びその改定の下での政府の支援で部分的になされた。政府は、本発明において、一定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アデノウイルスファイバータンパク質の一部分を含む組成物、及びそれを利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
治療法として又は生物学的に適切な量の免疫応答を誘導するためのタンパク質の送達は、数十年間、薬物及びワクチン開発の障害物となってきた。伝統的な薬物送達アプローチの成功した代替物であることを証明された１つの解決法は、インビボでの治療因子の産生のための外因性核酸配列の送達である。遺伝子導入ベクターは、理想的には幅広い種類の細胞型に入り、大きな核酸配列を受け入れる許容量があり、安全であり、かつ患者の治療のために必要な量で産生され得る。ウイルスベクターはこれらの有利な性質を有し、生物学的障害を治療又は予防する種々のプロトコルにおいて用いられている。
【０００４】
それらの有利な性質にも関わらず、ウイルス遺伝子導入ベクターの広範な使用は、いくつかの要因によって、妨げられている。この点で、一定の細胞は、現在入手可能なウイルスベクターによる遺伝子送達を容易に受け入れない。例えば、リンパ球は、アデノウイルスの取り込みにおいて、正常に機能しない（Ｓｉｌｖｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６５，３７７−３８７（１９８８）；Ｈｏｒｖａｔｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６２（１），３４１−３４５（１９８８））。
【０００５】
ウイルス遺伝子導入ベクターの利用はまた、ウイルスベクターの免疫原性によって邪魔される。米国の人々の大多数は、遺伝子導入ベクター（例、アデノウイルス）として現在開発下の多数のウイルスの野生型の形態にさらされてきた。その結果、米国の人々の多くは、一定のウイルス由来の遺伝子導入ベクターに、既存の免疫を発達させてきた。その結果、そのようなベクターは、血流から急速に除去され、それによって生物学的に適切な量の遺伝子産物の送達の際のベクターの有効性を低減させる。その上、一定のウイルスベクターの免疫原性は、病原体に対する免疫系を「ブーストする（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）」のに有利であり得る、効率的な繰り返し投薬を妨げ、そしてウイルスベクターの服用量のうちの小量のみが、有効積載量を宿主細胞に送達される結果をもたらす。
【０００６】
したがって、治療上の、あるいは抗原性の遺伝子やタンパク質を標的細胞へ送達する改善された方法への必要性が依然として存在する。本発明は、そのような方法を提供する。本発明のこれら及び他の利点、並びに本発明のさらなる特徴は、本明細書中に提供される発明の記述から明白になるであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明は、（ａ）哺乳動物において発現し、免疫応答を誘導する抗原を少なくとも１つコードする核酸配列、及び（ｂ）サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列を含む遺伝子導入ベクターであって、遺伝子導入ベクターがアデノウイルスベクターではないものを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法を提供する。
【０００８】
本発明はまた、（ａ）哺乳動物において免疫応答を誘導する抗原を少なくとも１つ、及び（ｂ）サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列を含む複合体であって、複合体がアデノウイルスではないものを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、（ａ）タンパク質をコードする核酸配列、及び（ｂ）サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列を含む遺伝子導入ベクターであって、遺伝子導入ベクターがアデノウイルスベクターではないものを提供する。
【００１０】
本発明はさらに、（ａ）タンパク質又は非タンパク質性分子、及び（ｂ）サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列を含む複合体であって、複合体がタンパク質を含む場合に複合体がアデノウイルスではない、複合体を提供する。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、ネイティブ宿主細胞結合のために切断されたサブグループＣアデノウイルスベクターが、アデノウイルスベクターが抗原性導入遺伝子をコードする場合に、ヒト宿主において免疫応答を誘導し得るという発見に基づく。そのようなアデノウイルスベクターは典型的には、ファイバーのノブ（ｋｎｏｂ）ドメインが変化又は欠失しているが、ファイバーのシャフト領域を保持しているファイバータンパク質を含む。
【００１２】
本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、（ａ）哺乳動物において発現し、免疫応答を誘導する抗原を少なくとも１つコードする核酸配列、及び（ｂ）サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列、を含む遺伝子導入ベクターであって、遺伝子導入ベクターがアデノウイルスベクターではない遺伝子導入ベクターを哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
遺伝子導入ベクターは、任意の適切な遺伝子導入ベクターであり得る。適切な遺伝子導入ベクターの例としては、プラスミド、リポソーム、分子複合体（例、トランスフェリン）、及びウイルスが挙げられる。好ましくは、遺伝子導入ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターがアデノウイルスベクターでない限り、任意の適切なウイルスベクターが本発明の方法に用いられ得る。適切なウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、パルボウイルス由来のベクター、例、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のベクター、及びバクテリオファージベクターが挙げられる。これらのウイルスベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク（２００１）、及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，ニューヨーク（１９９４）中に記載されている標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作成され得る。
【００１４】
レトロウイルスは、幅広い種類の宿主細胞に感染し得るＲＮＡウイルスである。感染と同時に、レトロウイルスゲノムは、その宿主細胞のゲノム中へと組み込まれて宿主細胞のＤＮＡと一緒に複製され、それによってレトロウイルスゲノム中へと取り込まれたウイルスＲＮＡ及び任意の核酸配列が常に産生される。そのため、レトロウイルスを用いる場合、治療因子の長期発現が達成可能である。遺伝子療法における利用を意図されたレトロウイルスは、病原性のレトロウイルスは存在するものの、比較的非病原性である。病原性のレトロウイルス（例、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ））を使用する場合、ウイルスゲノムを変化させることにおいて、宿主への毒性を排除するために注意する必要がある。レトロウイルスベクターはその上、ウイルスを複製欠損にさせるために、操作され得る。そのため、レトロウイルスベクターはインビボの安定した遺伝子導入のために特に有用だと考えられている。ＨＩＶ由来のベクターのようなレンチウイルスベクターは、遺伝子送達のために用いられるレトロウイルスベクターとして典型的である。他のレトロウイルスと異なり、ＨＩＶ由来のベクターは、それらのパッセンジャー遺伝子を非分裂細胞中へと取込み、そしてそれゆえに、持続型の疾患を治療するのに有用であり得ることが知られている。
【００１５】
ＨＳＶ由来のウイルスベクターは、核酸を多数の細胞型へと導入する遺伝子導入ベクターとしての利用に適切である。成熟ＨＳＶビリオンは、エンベロープに囲まれた正二十面体のキャプシドと１５２ｋｂである線状二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムからなる。ほとんどの複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を防ぐために、一つ以上の中間−初期遺伝子を取り除くための欠失を含有する。ＨＳＶベクターの利点は、長期ＤＮＡ発現をもたらし得る潜伏段階に入るその能力、及び２５ｋｂまでの外因性ＤＮＡインサートを収容し得るその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。もちろん、外因性タンパク質の長期産生を促進するＨＳＶの能力は、短期の治療計画の観点からは、潜在的に不利である。しかしながら、当業者は、特定の状況のために適当なベクターを決定するのに必要な知識を有する。ＨＳＶ由来のベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、同第５，８４９，５７２号、及び同第５，８０４，４１３号、並びに国際特許出願公開番号ＷＯ９１／０２７８８、ＷＯ９６／０４３９４、ＷＯ９８／１５６３７、及びＷＯ９９／０６５８３中に記載されている。
【００１６】
ポックスウイルスベクターは、高免疫原性であり、容易に設計されるため、感染性の生物に対するワクチンとして、そしてより最近では、腫瘍ワクチンとして、集中的に利用されてきた。ワクシニアウイルス及びポックスウイルス科の他のメンバーは、細胞質中にとどまり、複製及び転写を実行するためにウイルス性にコードされたポリメラーゼを用いる。従って、ゲノム中へのウイルスＤＮＡの組換えは、他のベクター、特にレトロウイルス、で懸念であるようには、ワクシニアウイルスでは懸念ではない。感染サイクルは３つの相に分かれている。典型的には酵素機能を持つタンパク質をコードしている初期相遺伝子は、複製の前に発現する。少数の中間遺伝子の発現は、ゲノムの複製に依存し、次に構造タンパク質及び後期遺伝子の他の産物の発現を駆動する。
【００１７】
ＡＡＶベクターは、ワクチンプロトコルにおける利用のために特に関心を持たれるウイルスベクターである。ＡＡＶは、ヒトに疾患を起こすことが知られていないＤＮＡウイルスである。ＡＡＶゲノムは、ＤＮＡ複製及びウイルスのパッケージングのための認識シグナルを含む逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する２つの遺伝子、ｒｅｐ及びｃａｐ、から形成されている。ＡＡＶは、効率的な複製のためには、ヘルパーウイルス（例、アデノウイルス又は単純ヘルペスウイルス）での同時感染、あるいはヘルパー遺伝子の発現を必要とする。ＡＡＶは、使用されるヘルパーウイルスに応じて、ヒト、サル、及びげっ歯類細胞を含む、幅広い宿主細胞で増殖され得る。核酸配列の投与のために用いられるＡＡＶベクターは、典型的には親ゲノムのおよそ９６％が欠失しており、ＩＴＲが残っているのみである。ＨＩＶに対するワクチンコンストラクトとしてのＡＡＶの利用は、例えば、Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１，７（２００２）中に概説されている。
【００１８】
バクテリオファージ（又はファージ）は、細菌細胞中で成育するウイルスである。バクテリオファージゲノムのコンプレキシティ（複雑さ）に応じて、一部のバクテリオファージは、増殖のために宿主細胞のタンパク質機構に完全に頼っている。バクテリオファージは溶菌性又は溶原性の生活環を手段として増殖する。溶菌性の環においてバクテリオファージは、感染細胞を「ファージ工場（ｐｈａｇｅ  ｆａｃｔｏｒｙ）」に転換し、いくつものファージ子孫を産生する。溶菌性の成育のみをすることができるバクテリオファージは、しばしば「ビルレント（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）」バクテリオファージと呼ばれる。溶原性の生活環は、二本鎖ＤＮＡゲノムを含むバクテリオファージでのみ観察されており、典型的には、バクテリオファージが細菌染色体中へと組み込まれることを伴う。溶原性の環の期間には、子孫バクテリオファージ粒子は産生されない。溶原性の生活環をとり得るバクテリオファージは、しばしば「テンペレート（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）」バクテリオファージと呼ばれ、ＤＮＡ損傷のような一定の条件下で溶菌性の環を経得る（例、Ｍａｌｏｙら，編，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第２版，Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ボストン（１９９４）参照)。バクテリオファージは、哺乳動物を特異的に標的化し、形質導入するために改変されてきた（例、Ｐｏｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８８，２０３−１１（１９９９），Ｍｏｎａｃｉら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３，１５９−６９（２００１），及びＬａｒｏｃｃａら，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，４５−５７（２００２）参照）。遺伝子導入ベクターとしての利用に適切なバクテリオファージとしては、例えば、バクテリオファージλ及びバクテリオファージＭ１３が挙げられる。バクテリオファージのヒトワクチンベクターとしての利用は、例えば、Ｃｌａｒｋら，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ，３，４６３−７６（２００４）中に概説されている。 
【００１９】
ウイルス様粒子は、ウイルス生活環のある段階において機能的に重大であるウイルス遺伝子又は他の遺伝性因子の１つ以上の遺伝性改変の存在によって、宿主細胞を感染することができない欠陥ビリオンである。ウイルス様粒子は、感染性ビリオンに通常見られるウイルスタンパク質の全てを含んでいても、含んでいなくても良く、かつ核酸（即ち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含んでいても、含んでいなくても良い。もし核酸が粒子内に含まれている場合、それは宿主細胞を感染させることはできないであろう。ウイルス様粒子ワクチンコンストラクトの例は、例えば、Ｓｃｈｒｅｃｋｅｎｂｅｒｇｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１６，４８５−９１（２００４）中に開示されている。
【００２０】
本発明の方法の遺伝子導入ベクターは、哺乳動物において発現し、免疫応答を誘導する抗原をコードする核酸配列を含む。「抗原」は、哺乳動物において免疫応答を誘引する分子である。「免疫応答」は、例えば、抗体産生及び／又は免疫エフェクター細胞の活性化を必要とし得る。本発明の文脈において抗原は、理想的には哺乳動物において免疫応答を引き起こし、好ましくは防御免疫をもたらす、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌、原虫、プリオン、細胞、又は細胞外由来のタンパク質、ペプチド、あるいは糖タンパク質を含む任意のタンパク質性分子の任意のサブユニットを含み得る。抗原はまた、自己抗原（即ち、それが外来性の侵入者であるかのように体が反応する自己タンパク質）であり得る。抗原をコードする核酸配列は、一種類の核酸配列又は特定の起源に限定されるものではない。例えば、核酸配列は、組換えＤＮＡであり得、ゲノムＤＮＡであり得、潜在的抗原エピトープのＤＮＡライブラリから取得され得、又は合成的に作出され得る。
【００２１】
１つの実施形態では、抗原はウイルス抗原である。ウイルス抗原は、以下の任意のウイルス科からのウイルスを含むがそれらに限定されない任意のウイルスから単離され得る：アレナウイルス科、アルテリウイルス、アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス科、バドナウイルス（Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ）、バルナウイルス科（Ｂａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ビルナウイルス科、ブロモウイルス科（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブンヤウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス（Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ）、カルラウイルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）、カリモウイルス（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）、サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、クロステロウイルス（Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（例、（ＳＡＲＳ）ウイルスのようなコロナウイルス）、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス（Ｄｅｌｔａｖｉｒｕｓ）、ダイアンソウイルス（Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ）、エナモウイルス（Ｅｎａｍｏｖｉｒｕｓ）、フィロウイルス科（例、マールブルグウイルス及びエボラウイルス（例、ザイール、レストン（Ｒｅｓｔｏｎ）、コートジボワール（Ｉｖｏｒｙ  Ｃｏａｓｔ）、又はスーダン株））、フラビウイルス科、（例、Ｃ型肝炎ウイルス、デングウイルス１、デングウイルス２、デングウイルス３、及びデングウイルス４）、ヘパドナウイルス科（例、Ｂ型肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス科（例、ヒトヘルペスウイルス１、３、４、５、及び６、並びにサイトメガロウイルス）、ハイポウイルス科（Ｈｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科、レヴィウイルス科、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科、オルトミクソウイルス科（例、インフルエンザウイルスＡ及びＢ）、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科（例、はしか、おたふくかぜ、及びヒト呼吸器多核体ウイルス）、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科（例、エンテロウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、へパトウイルス、及びアフトウイルス）、プラスモディウム科（Ｐｌａｓｍｏｄｉｉｄａｅ）（例、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及び四日熱マラリア原虫）、ポックスウイルス科（例、ワクシニアウイルス)、レオウイルス科（例、ロタウイルス）、レトロウイルス科（例、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１及びＨＩＶ２のようなレンチウイルス）、ラブドウイルス科、並びにトティウイルス科（Ｔｏｔｉｖｉｒｉｄａｅ）。好ましくは、本発明の方法の少なくとも１つの抗原は、レトロウイルス抗原である。レトロウイルス抗原は、例えば、ｇａｇ、ｅｎｖ、又はｐｏｌタンパク質の全てあるいは一部のような、ＨＩＶ抗原であり得る。クレイドＡ、Ｂ、Ｃ、ＭＮ等を含むＨＩＶの任意のクレイドは、抗原選択に適している。また好ましくは、遺伝子導入ベクターによってコードされる少なくとも１つの抗原は、ＳＡＲＳウイルス抗原のような、コロナウイルス抗原である。本発明の方法に適切なＳＡＲＳウイルス抗原としては、例えば、ＳＡＲＳウイルスのＥタンパク質、Ｍタンパク質、及びスパイクタンパク質の全て又は一部が挙げられる。適切なウイルス抗原としてはまた、デングタンパク質Ｍ、デングタンパク質Ｅ、デングＤ１ＮＳ１、デングＤ１ＮＳ２、及びデングＤ１ＮＳ３の全て又は一部が挙げられる。任意のウイルスタンパク質が本発明の文脈において用いられ得るため、本明細書中に具体的に列挙される抗原ペプチドは単なる例示に過ぎない。
【００２２】
抗原は、胞子虫抗原のような、しかしそれに限定されない、寄生虫抗原であり得る。例えば、核酸配列は、スポロゾイト周囲（Ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質、スポロゾイト表面タンパク質、肝臓段階抗原（ｌｉｖｅｒ  ｓｔａｇｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）、頂端膜関連タンパク質、又はメロゾイト表面タンパク質の全てあるいは一部のようなマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉａｎ）抗原をコードし得る。
【００２３】
あるいは又はその上、ウイルスベクターによってコードされる抗原の少なくとも１つは、細菌性抗原である。抗原は、放線菌属、アナベナ属、バチルス属、バクテロイデス属、デロビブリオ属（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）、カウロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属、クロロビウム属、クロマティウム属（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、クロストリジウム属、サイトファーガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、デイノコックス属、大腸菌属、ハロバクテリウム属、ヘリオバクター属（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ）、ハイフォミクロビウム属（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メタノバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミオバクテリウム属（Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラスマ属、ミクソコックス属、ナイセリア属、ニトロバクター属、ユレモ属、プロクロロン属、プロテウス属、シュードモナス属、ホドスピリルム（Ｐｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、リケッチア属、サルモネラ属、赤痢菌属、スピリルム属、スピロヘータ属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、ストレプトミセス属、スルフォロバス属、サーモプラズマ属、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びトレポネーマ属を含むが、それらに限定されない任意の細菌に由来し得る。好ましい実施形態では、核酸配列によってコードされる抗原の少なくとも１つは、シュードモナス抗原又はヘリコバクター抗原である。
【００２４】
当然のことながら、免疫応答を生じさせるには、完全で、インタクトなウイルス又は細菌タンパク質は必要ではない。実際は、ほとんどの抗原性エピトープは、サイズが比較的小さく、従って、哺乳動物の免疫系への曝露にはタンパク質断片で十分であり得る。その上、１つ以上の抗原の、２つ以上の抗原性エピトープ間で融合タンパク質が作出され得る。例えば、ＨＩＶ病原体に対して、単一のエピトープによって作出される免疫応答と比較して、より完全な免疫応答を作出するために、ＨＩＶエンベロープの全て又は一部（例、ｇｐ１２０又はｇｐ１６０の全て又は一部）が、ＨＩＶ  ｐｏｌタンパク質の全て又は一部と融合され得る。遺伝子導入ベクターを介した、哺乳動物への融合タンパク質の送達は、免疫系の複数の抗原への曝露を許容し、かつそれによって、単一のワクチン組成物が複数の病原体又は単一の病原体の複数のエピトープに対する免疫を提供することを可能とする。
【００２５】
好ましくは、核酸は、例えば、プロモーター可変発現カセットの一部として、１つ以上のプロモーター及び／又はエンハンサーエレメントと機能可能に連結している（即ち、転写制御下にある）。配列を機能可能に一緒に連結する技術は、当技術分野では周知である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。核酸配列は、プロモーターがその核酸配列の転写を指示し得る場合に、プロモーターに「機能可能に連結している」。プロモーターは、それが機能可能に連結している核酸配列に対して、ネイティブ又は非ネイティブであり得る。
【００２６】
任意のプロモーター（即ち、天然から単離されたか、あるいは組換えＤＮＡ又は合成技術によって産生されたかに関わらず）は、本発明に関連して、核酸配列の転写を提供するために、用いられ得る。プロモーターは、好ましくは、真核生物（望ましくは哺乳動物）細胞において、転写を指示し得る。プロモーターの機能は、ベクター上に存在する１つ以上のエンハンサー及び／又はサイレンサーの存在によって、変更され得る。「エンハンサー」は、隣接遺伝子の転写を刺激又は阻害する、ＤＮＡのシス作用性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーはまた、「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、エンハンサーがいずれの配向でも、そして転写領域の下流の位置からであっても、数キロベース対（ｋｂ）もの距離にわたって、機能し得るという点で、プロモーターにおいてのみ見出される配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質についてのＤＮＡ結合部位（それらは「プロモーターエレメント」とも呼ばれる）とは異なる。
【００２７】
プロモーター領域は、長さ及び配列において変動し得、配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質及び／あるいはエンハンサー又はサイレンサーの１つ以上のＤＮＡ結合部位をさらに含み得る。エンハンサー及び／又はサイレンサーは、同様に、プロモーター自体の外側の核酸配列上に存在し得る。望ましくは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーのような、細胞性又はウイルスのエンハンサーが、プロモーター活性を増強するために、プロモーターに近接して配置される。
【００２８】
任意の適切なプロモーター又はエンハンサー配列は、本発明の文脈において用いられ得る。この点において、抗原コーディング核酸配列は、ウイルスプロモーターに機能可能に連結し得る。適切なウイルスプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター（例えば、米国特許第５，１６８，０６２号及び同第５，３８５，８３９号に記載）のようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＩＶ長末端反復プロモーターのようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来するプロモーター、ＲＳＶ長末端反復のようなラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｌａｐ２プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８，１４４−１４５（１９８１））のようなＨＳＶプロモーター、ＳＶ４０又はエプスタインバーウイルスに由来するプロモーター、ｐ５プロモーターのようなアデノ随伴ウイルスのプロモーターなどが挙げられる。
【００２９】
あるいは、本発明は、細胞プロモーター、即ち、細胞タンパク質の発現を駆動するプロモーターを用いる。本発明での使用のために好ましい細胞プロモーターは、抗原を産生するのに望ましい発現プロファイルに依存するであろう。１つの局面では、細胞プロモーターは、好ましくは、本明細書中に記載されている免疫細胞のような、種々の細胞型で働く構成的プロモーターである。適切な構成的プロモーターは、真核細胞に共通の転写因子、ハウスキーピング遺伝子、又は構造遺伝子をコードする遺伝子の発現を駆動し得る。例えば、Ｙｉｎｇ  Ｙａｎｇ  １（ＹＹ１）転写因子（ＮＭＰ−１、ＮＦ−Ｅ１、及びＵＣＲＢＰとも呼ばれる）は、核マトリクスの固有成分である、遍在性の核内転写因子である（Ｇｕｏら，ＰＮＡＳ，９２，１０５２６−１０５３０（１９９５））。これらのプロモーターは構成的プロモーターとみなされるものの、当技術分野においては、構成的プロモーターは上方調節され得ることが理解される。プロモーター解析は、基底転写に重要なエレメントが、プロモーターからの転写開始部位を起点として、ＹＹ１遺伝子の−２７７から＋４７５までに存在し、そしてＴＡＴＡ及びＣＣＡＡＴボックスを含有することを示す。ＪＥＭ−１（ＨＧＭＷ及びＢＬＺＦ−１としても知られる）もまた、正常及び腫瘍性の組織で同定されている、遍在性の核内転写因子である（Ｔｏｎｇら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１２（１１），１７３３−１７４０（１９９８），及びＴｏｎｇら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６９（３），３８０−３９０（２０００））。ＪＥＭ−１は細胞の増殖制御及び成熟に関与し、レチノイン酸によって上方調節され得る。ＪＥＭ−１プロモーターの最大活性を担う配列は、プロモーターからの転写開始部位を起点として、ＪＥＭ−１遺伝子の−４３２から＋１０１に位置する。ＹＹ１プロモーターとは異なり、ＪＥＭ−１プロモーターはＴＡＴＡボックスを含まない。ユビキチンプロモーター（具体的にはＵｂＣ）は、いくつかの種において機能的である、強力な構成的活性プロモーターである。ＵｂＣプロモーターは、Ｍａｒｉｎｏｖｉｃら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１９），１６６７３−１６６８１（２００２）において、さらに特徴付けられている。
【００３０】
プロモーターはまた、調節可能なプロモーター（即ち、適当なシグナルに応じて、上方及び／又は下方調節されるプロモーター）であり得る。ウイルスおよび寄生虫抗原を含む抗原性タンパク質は、遺伝子導入ベクターを産生するのに用いられる細胞株に対して頻繁に毒性があるため、調節可能なプロモーター又は発現制御配列の利用は、ＤＮＡワクチン開発に特に適用できる。１つの実施形態において、抗原コーディング核酸配列に機能可能に連結した調節配列としては、テトラサイクリン発現系の成分（例、ｔｅｔオペレーター部位）が挙げられる。例えば、抗原コーディング核酸配列は、１つ以上のｔｅｔオペレーター部位に機能可能に連結したプロモーターに機能可能に連結している。そのような発現カセットを含む遺伝子導入ベクターは、ｔｅｔリプレッサータンパク質をコードする核酸配列を含む細胞株において増殖され得る。細胞株においてｔｅｔリプレッサータンパク質を産生することによって、抗原産生が阻害され、そしていかなる付随の抗原媒介性毒性もなく、増殖が進行する。適切な調節可能なプロモーター系としてはまた、ＩＬ−８プロモーター、メタロチオニン誘導性プロモーター系、細菌性ｌａｃＺＹＡ発現系、及びＴ７ポリメラーゼ系が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、異なる発生段階で選択的に活性化されるプロモーター（例、グロビン遺伝子は、胚及び成体におけるグロビン付随プロモーターから差次的に転写される）が、使用され得る。プロモーター配列は、外因性の薬剤による調節に応答性の少なくとも１つの調節配列を含み得る。調節配列は好ましくは、薬物、ホルモン、放射線、又は他の遺伝子産物のような、しかしそれらに限定されない、外因性の薬剤に応答性である。
【００３１】
プロモーターは、組織特異的プロモーター（即ち、所定の組織において優先的に活性化され、活性化された組織において遺伝子産物の発現をもたらすプロモーター）であり得る。本発明における使用のために適切な組織特異的プロモーターは、標的組織又は細胞型に基づいて、当業者によって選択され得る。本発明の方法における利用のために好ましい組織特異的プロモーターは、Ｍｏｒｉｔａら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８、 １７２９−３７（２００１）中に記載の樹状細胞特異的なデクチン−２（Ｄｅｃｔｉｎ−２）プロモーターのように、免疫細胞に特異的である。
【００３２】
さらに別の実施形態では、プロモーターは、キメラプロモーターであり得る。プロモーターは、それが少なくとも２つの異なる供給源（例、生物のゲノムの２つの異なる領域、２つの異なる生物、又は合成配列と組み合わせられた生物）から取得されたか、それらに由来するか、又はそれらに基づく少なくとも２つの核酸配列の部分を含むという点において、「キメラ」である。好ましくは、２つの異なる核酸配列の部分は、約４０％未満、より好ましくは約２５％未満、及びさらにより好ましくは約１０％未満の核酸配列の同一性を、互いに示す（それは本明細書中の他の箇所に記載の方法によって決定され得る）。任意の適切なキメラプロモーターが、本発明の方法において、用いられ得る。好ましくは、キメラプロモーターは、ウイルスプロモーターの機能的部分及び細胞性プロモーターの機能的部分から構成される。さらに好ましくは、キメラプロモーターは、放射線誘導可能であるウイルスプロモーターの機能的部分及び細胞性プロモーターの機能的部分から構成される。最も好ましくは、キメラプロモーターは、ＣＭＶプロモーターの機能的部分及びＥＧＲ−１プロモーターの機能的部分から構成される（即ち、キメラ「ＣＭＶ／ＥＧＲ−１」プロモーターである）。ＣＭＶプロモーターの機能的部分は好ましくは、ヒトＣＭＶ、さらに詳細にはヒトＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター／エンハンサー領域由来である（例、米国特許第５，１６８，０６２号及び同第５，３８５，８３９号参照）。その上、ＥＧＲ−１プロモーターの機能的部分は好ましくは、例えば、米国特許第６，５７９，５２２号及び同第６，６０５，７１２号中に記載されているように、ＥＧＲ−１プロモーターの１つ以上のＣＡｒＧドメインから構成される。本発明の特に好ましい実施形態では、キメラプロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー／プロモーター領域の機能的部分、及び６つのＣＡｒＧドメインから構成されるＥＧＲ−１プロモーターから構成される。このように、ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー／プロモーター領域の部分は、ＥＧＲ−１プロモーターのためのエンハンサーとして機能する。キメラプロモーターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上、及びＡｕｓｕｂｅｌら、同上、中に記載されているような標準的な分子生物学の技術を用いて作出され得る。
【００３３】
プロモーターの「機能的部分」は、機能可能に連結した核酸の発現（典型的には転写）を、測定可能に促進、増強、又は制御するプロモーターの任意の部分である。そのような発現の調節は、任意の適切な技術によってＲＮＡ又はタンパク質検出を介して測定され得、当技術分野において数種類のそのような技術が知られている。そのような技術の例としては、ノーザン解析（例、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上、並びにＭｃＭａｓｔｅｒ及びＣａｒｍｉｃｈａｅｌ，ＰＮＡＳ，７４，４８３５−４８３８（１９７７）参照）、ＲＴ−ＰＣＲ（例、米国特許第５，６０１，８２０号、及びＺａｈｅｅｒら，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．，２０，１４５７−１４６３（１９９５）参照）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（例、米国特許第５，７５０，３４０号及び同第５，５０６，０９８号参照）、抗体媒介技術（例、米国特許第４，３６７，１１０号、同第４，４５２，９０１号、及び同第６，０５４，４６７号参照）、及びルシフェラーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子を利用するプロモーターアッセイ（例、Ｔａｉｒａら，Ｇｅｎｅ，２６３，２８５−２９２（２００１）参照）が挙げられる。一般的な真核生物の発現系は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上中にさらに記載されている。
【００３４】
プロモーターは、その活性の特定のパターンを、抗原の所望の発現のパターン及びレベルと適合させることによって、本発明の方法における利用のために選択され得る。例えば、遺伝子導入ベクターは、異なる抗原をコードし、かつはっきりと識別できる発現プロファイルを示す異なるプロモーターに機能可能に連結している２つ以上の核酸配列を含み得る。例えば、第一のプロモーターは、抗原産生の最初のピークを媒介するように選択され、それによって免疫系を、コード化抗原に対してプライム（ｐｒｉｍｉｎｇ）する。第二のプロモーターは、発現のピークが第一のプロモーターのそれの数日後になるように、同じ又は異なる抗原の産生を駆動するように選択され、それによって免疫系を、抗原に対して「ブースト（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）」する。あるいは、複数のプロモーターの所望の性状を組み合わせたキメラプロモーターが、構築され得る。例えば、ＣＭＶプロモーターの活性の最初の急増をＲＳＶプロモーターの活性の高い維持レベルと組み合わせたＣＭＶ−ＲＳＶハイブリッドプロモーターは、本発明の方法の多くの実施形態における使用のために、特に好ましい。抗原は、真核生物細胞に毒性があり得るという点で、遺伝子導入ベクターを増殖させるのに用いられる細胞株における活性を減少させるのに、プロモーターを改変するのは有利であり得る。
【００３５】
タンパク質産生を最適化するため、好ましくは、抗原をコードする核酸配列はさらに、抗原コーディング核酸配列のコード配列に続いて、ポリアデニル化部位を含む。任意の適切なポリアデニル化配列が用いられ得、例として、合成された最適化配列、並びにＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）、並びにヒトパピローマウイルス及びＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含むパピローマウイルスのポリアデニル化配列が挙げられる。好ましいポリアデニル化配列は、ＳＶ４０（ヒト肉腫ウイルス４０）ポリアデニル化配列である。また、好ましくは、全ての相応な転写シグナル（及び、適当な場合には、翻訳シグナル）は、核酸配列が、それが導入される細胞において相応に発現するように、正確に配置される。所望される場合、核酸配列はまた、ｍＲＮＡ産生を促進するために、スプライス部位（即ち、スプライスアクセプター及びスプライスドナー部位）を組み込み得る。
【００３６】
もし抗原コーディング核酸配列が、プロセス又は分泌されたタンパク質又はペプチドあるいは細胞内で作用するタンパク質をコードするならば、好ましくは、抗原コーディング核酸配列は、プロセシング、分泌、細胞内局在などのために適当な配列をさらに含む。抗原コーディング核酸配列は、分泌のために細胞性機構へタンパク質を標的化するシグナル配列に機能可能に連結され得る。適当なシグナル配列としては、免疫グロブリンの重鎖及びサイトカインのリーダー配列（例、Ｌａｄｕｎｇａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１３−１８（２０００）参照）が挙げられるが、それらに限定されない。宿主細胞からタンパク質を分泌するため、他のタンパク質改変が必要とされ得、それは慣用的な実験室技術を用いて決定され得る。抗原及びシグナル配列をコードする発現コンストラクトを調製することは、例えば、米国特許第６，５００，６４１号中に、さらに記載されている。非分泌性タンパク質を分泌させる方法は、例として、米国特許第６，４７２，１７６号、及び国際特許出願公開ＷＯ０２／４８３７７中に、さらに記載されている。
【００３７】
遺伝子導入ベクターの核酸配列によってコードされる抗原はまた、宿主細胞表面上に抗原を付着させるか又は組み込むために改変され得る。この点において、抗原は、細胞表面上への結合のための、ｇｐｉ−アンカーのような膜アンカーを含み得る。膜貫通ドメインは、抗原タンパク質の末端を細胞膜中へと組み込むために、抗原と融合され得る。細胞表面上にペプチドを提示するための他の戦略は、当技術分野において公知であり、本発明の文脈中での使用に適当である。
【００３８】
サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の一部分は、アデノウイルスが、例えば樹状細胞及び腫瘍細胞のような特定の細胞型に結合し、進入する機構を提供すると考えられている。従って、本発明の遺伝子導入ベクターはさらに、サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ（例、３以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、又は５０以上さえも）含むアミノ酸配列を含む。アデノウイルスのファイバータンパク質は、テイル（ｔａｉｌ）、シャフト（ｓｈａｆｔ）、及びノブ（ｋｎｏｂ）からなる三量体である（Ｄｅｖａｕｘら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，５６７−５８８（１９９０）。ファイバーシャフト領域は２つの交代性のβ−鎖及びβ−ベンド（ｂｅｎｄｓ）を形成すると考えられている、１５アミノ酸モチーフの繰り返しからなる（Ｇｒｅｅｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２，１３５７−１３６５（１９８３），及びＣｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，Ｉｎ  Ｐ．Ｂ．Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ，編，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，第１巻，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ベルリン，ドイツ，１６３−２００ページ（１９９５））。ファイバーシャフト領域の全長及び１５アミノ酸繰り返しの数は、アデノウイルスの血清型間で異なる。例えば、Ａｄ２ファイバーシャフトは長さ３７ナノメートルでかつ２２の繰り返しを含むのに対して、Ａｄ３ファイバーは長さ１１ナノメートルでかつ６つの繰り返しを含む。ファイバータンパク質のレセプター結合ドメインは、タンパク質の最後の２００アミノ酸によってコードされるノブ領域中に局在する（Ｈｅｎｒｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６８（８），５２３９−５２４６（１９９４））。三量体化に必要な領域もまた、タンパク質のノブ領域に位置する（Ｈｅｎｒｙら（１９９４），同上）。ファイバータンパク質のノブ領域の最後の４０アミノ酸を欠く欠失変異体は、三量体化せず、またペントンベースと結合しない（Ｎｏｖｅｌｌｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８５，３６５−３７６（１９９１））。従って、ファイバーとペントンベースの結合には、ファイバータンパク質の三量体化が必要である。タンパク質の細胞質における合成に続いて、ウイルス粒子を形成するためにタンパク質を核へと指示する核局在化シグナルは、タンパク質のＮ末端領域に位置する（Ｎｏｖｅｌｌｉら（１９９１），同上）。ファイバーは、ヘキソンと一緒に、アデノウイルスの血清型特異性を決定する（Ｗａｔｓｏｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６９，５２５−５３５（１９８８））。
【００３９】
シャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列は好ましくは、サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質に由来する。この関連で、アミノ酸配列は、任意の適切なサブグループＣアデノウイルス血清型に由来し得る。適切なサブグループＣアデノウイルス血清型としては、血清型１、２、５、及び６が挙げられる。アミノ酸配列は好ましくは、血清型２又は血清型５アデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ（例、３、１０、２０、３０、４０、５０、又はそれより多い）含む。アミノ酸配列は、サブグループＣ（特に血清型２又は血清型５）アデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域全体であり得る。アミノ酸配列は好ましくは、サブグループＣ（特に血清型２又は血清型５）アデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の約３から約５０の近接アミノ酸（例、１５、２０、３０、４０、又は５０アミノ酸）を含む。アミノ酸配列はより好ましくは、サブグループＣ（特に血清型２又は血清型５）アデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の約３から約２０の近接アミノ酸（例、約５、１０、１５、又は２０アミノ酸）を含む。最も好ましくは、アミノ酸配列は、アミノ酸残基リジン−リジン−スレオニン−リジン（ＫＫＴＫ）（配列番号１）を含む。例えば、アミノ酸配列は配列ＫＫＴＫからなり得る。あるいは、配列番号１は、本発明の遺伝子導入ベクター中に含まれる、より大きなアミノ酸配列の一部であり得る。別の実施形態では、アミノ酸配列は、例えば、ＫＫＴ（配列番号２）又はＫＴＫ（配列番号３）のような、配列番号１の断片を含み得る。Ａｄ５のシャフト領域におけるＫＫＴＫモチーフは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（例、ヘパリン及びヘパラン硫酸プロテオグリカン）と結合することが知られている（例、Ｈｉｌｅｍａｎら，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，２０，１５６−６７（１９９８）及びＳｍｉｔｈら，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，５，７７０−９（２００２）参照）。ＧＡＧは、繰り返しの二糖単位を含む、長い、分岐していない多糖類である。二糖単位は、２つの修飾糖のいずれかを含む。ヒトにおけるＧＡＧの過半数は、コアタンパク質と連結し、プロテオグリカン（またムコ多糖とも呼ばれる）を形成している。ＧＡＧは、主として細胞の表面上又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に位置する。血清型２アデノウイルス及び血清型５アデノウイルスのファイバータンパク質のアミノ酸配列は、Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１６１，５４９−５４（１９８７）中に開示されている。
【００４０】
当業者は、いったん哺乳動物（例、ヒト）に投与された遺伝子導入ベクターによって誘発された免疫応答は、遺伝子導入ベクター内におけるサブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列の位置に依存することを理解する。この関連で、アミノ酸配列は、遺伝子導入ベクター内の任意の適切な位置に存在し得る。この点において、アミノ酸配列は、宿主免疫系による認識を最大化するために、遺伝子導入ベクターの表面上に位置し得る。遺伝子導入ベクターがウイルスベクターである場合、例えば、キャプシドタンパク質の改変の結果、アミノ酸配列は好ましくは、ウイルスキャプシド上又はキャプシド内に位置する。そのような改変としては、例えば、アミノ酸配列を含むキメラキャプシドタンパク質を作出することが挙げられる。そのようなキメラキャプシドタンパク質は、慣用的な分子生物学及び組換えＤＮＡ技術を用いて作出され得る(例、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上、参照)。あるいは、化学的架橋反応のような化学的改変によって、アミノ酸配列をウイルス遺伝子導入ベクターのキャプシドタンパク質に共有結合的に付着させることもできる。化学的架橋反応は、ウイルスベクター上の利用可能なスルフヒドラル（ｓｕｌｆｈｙｄｒａｌ）又はアミド基を用いて起こり得る。そのような基はまた、サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列中に見られる又は導入され得る。適切な架橋剤の例としては、例えば、４−アジド安息香酸（３−スルホ−Ｎ−サクシニミジル）エステルナトリウム塩（スルホ−ＨＳＡＢ）、１，４−ビス［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン、及びビス［２−（Ｎ−サクシニミジル−オキシカルボニルオキシ）エチル］スルホンが挙げられる。タンパク質を化学的に架橋する他の方法が、当技術分野において公知である。
【００４１】
本発明はさらに、（ａ）哺乳動物において免疫応答を誘導する少なくとも１つの抗原、及び（ｂ）サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列であって、アミノ酸配列がインタクトなアデノウイルスではないアミノ酸配列、を含む複合体を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法を提供する。本発明の他の実施形態に関連して、上記の抗原及びサブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列の説明はまた、免疫応答を誘導するという前述の本発明の方法と同一の局面に適用できる。
【００４２】
「複合体」は、２つ以上の別々の分子の共役を介して産出される分子である。本発明の複合体は好ましくは、サブグループＣアデノウイルスのシャフト領域のアミノ酸配列と化学的に共役した抗原を含む。抗原は、任意の適切な化学結合によってアミノ酸配列と化学的に共役し得、そして好ましくは共有結合を介してアミノ酸配列と共役している。適切な化学結合は当分野において周知であり、ジスルフィド結合、酸解離性（ａｃｉｄ  ｌａｂｉｌｅ）結合、光解離性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）結合、ペプチダーゼ解離性（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｌａｂｉｌｅ）結合、チオエーテル結合、及びエステラーゼ解離性（ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｌａｂｉｌｅ）結合を含む。そのような複合体は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上中に記載されているような、慣用的な分子生物学技術を用いて作出され得る。
【００４３】
あるいは、複合体は、抗原及びサブグループＣアデノウイルスのシャフト領域のアミノ酸配列を含む融合タンパク質であり得る。融合タンパク質は、制限酵素又は組換えクローニング技術（例、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）並びに米国特許第５，３１４，９９５号及び同第５，９９４，１０４号参照)のような慣用的な分子生物学技術を用いて作出され得る。複合体が融合タンパク質である場合、本発明はさらに、融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。この点において、「核酸分子」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡのポリマー（即ち、一本鎖又は二本鎖であり得、かつ非天然又は変化させたヌクレオチドを含み得る、ポリヌクレオチド）を包含することを意図している。一つの実施形態では、核酸分子は、イントロン又はその一部分を欠き得る。核酸分子は好ましくはＤＮＡである。核酸分子は、任意の適切な原料から単離又は精製されても良い。核酸分子はまた、当分野において公知の方法で化学的に合成されても良い。
【００４４】
複合体が融合タンパク質である場合、融合タンパク質はまた、融合タンパク質の安定性、精製、及び／又は検出を促進するよう作用する、さらなるペプチド配列を含み得る。例えば、レポーターペプチド部分（例、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、又はそれらの検出可能なドメイン）が、融合タンパク質中に取込まれ得る。精製促進ペプチド配列としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、又はチオレドキシン（ＴＲＸ）由来あるいはそれらから取得されたものが挙げられる。融合タンパク質はさらにあるいはもう一つの方法として、抗体精製され得るエピトープ（例、Ｋｏｄａｋ（ニューヘイブン、コネチカット州）から入手可能なＦｌａｇエピトープ）、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（チャッツワース、カリフォルニア州）から入手可能なｐＱＥベクターにおいて提供されるタグのようなヘキサヒスチジンペプチド、又はＨＡタグ（例、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ，３７，７６７（１９８４）中に記載されているような）でタグされ得る。
【００４５】
本発明の方法において、遺伝子導入ベクター又は複合体は好ましくは哺乳動物（例、ヒト）に投与され、そこにおいて抗原は、抗原に対する免疫応答を誘導する。免疫応答は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、又は望ましくは、体液性及び細胞性免疫の組合せであり得る。理想的には、免疫応答は、抗原でのそれに続くチャレンジの際に防御を提供する。しかしながら、防御免疫は、本発明の文脈中では必要ではない。本発明の方法はさらに、抗体産生及び回収のために用いられ得る。
【００４６】
抗原に対して生じる免疫応答を増強するために、遺伝子導入ベクターはさらに、サイトカイン、ケモカイン、又はシャペロンのような免疫促進剤をコードする核酸配列を含み得る。サイトカインとしては、例えば、マクロファージコロニー刺激因子（例、ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、及びＩＬ−１８）、タンパク質のＴＮＦファミリー、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＦＭＳ関連チロシンキナーゼ３リガンド、（Ｆｌｔ３Ｌ）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、及びＣＤ４０リガンドが挙げられる。ケモカインとしては、例えば、Ｂ細胞誘因性ケモカイン−１（ＢＣＡ−１）、フラクタルカイン、メラノーマ成長刺激性活性タンパク質（ＭＧＳＡ）、血液ろ過ＣＣケモカイン１（ＨＣＣ−１）、インターロイキイン８（ＩＬ８）、インターフェロン刺激性Ｔ細胞アルファ化学誘引物質（Ｉ−ＴＡＣ）、リンフォタクチン、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）、単球走化性タンパク質４（ＭＣＰ−４）、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）、血小板第４因子（ＰＦ４）、活性化によって調節され、正常Ｔ細胞にて発現し、及び推定的に分泌される（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ａｎｄ  ｐｒｅｓｕｍａｂｌｙ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）（ＲＡＮＴＥＳ）、胸部及び腎臓細胞ケモカイン（ＢＲＡＫ）、エオタキシン、エクソーダス（ｅｘｏｄｕｓ）１〜３などが挙げられる。シャペロンとしては、例えば、熱ショックタンパク質のＨｓｐ１７０、Ｈｓｃ７０、及びＨｓｐ４０が挙げられる。サイトカイン及びケモカインは、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎカタログ（２００２），サンディエゴ，カリフォルニアを始めとして、当技術分野において一般に記載されている。同様に、本発明の複合体は任意の１つ以上の前述の免疫促進剤を含み得る。
【００４７】
各々の遺伝子導入ベクターが１つ以上の抗原及び／又は免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸配列を含む複数の遺伝子導入ベクターが、哺乳動物に投与され得る。同様に、各々の複合体が１つ以上の抗原及び／又は免疫調節物質を含む複数の複合体が、哺乳動物に投与され得る。もし遺伝子導入ベクターが、１つより多くの抗原コード核酸配列を含むとき、２つ以上の核酸配列が同一のプロモーターに機能可能に連結され得（例、バイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）な配列を形成するため）、２つ以上の核酸配列が同一型の別々のプロモーター（例、ＣＭＶプロモーター）に機能可能に連結され得、又は２つ以上の核酸配列が別々の異なるプロモーター（例、ＣＭＶプロモーター及びβ−アクチンプロモーター）に機能可能に連結され得る。複数の遺伝子導入ベクターとしては、異なる抗原、同一の抗原タンパク質の異なるエピトープ、微生物の異なる種又はクレイドに由来する同一の抗原タンパク質、異なる微生物からの抗原などをコードする２つ以上の遺伝子導入ベクターコンストラクトを含み得る。同様に、複数の複合体はまた、異なる抗原、同一の抗原タンパク質の異なるエピトープ、微生物の異なる種又はクレイドに由来する同一の抗原タンパク質、異なる微生物からの抗原などを含む２つ以上の複合体を含み得る。当然のことながら、一部の実施形態においては、遺伝子導入ベクター及び／あるいは異なる抗原又は同一の抗原の異なるエピトープを有する複合体の「反応混液（ｃｏｃｋｔａｉｌ）」を投与することは、単一の遺伝子導入ベクタークローン又は単一の複合体を哺乳動物に投与することより効果的な免疫応答を提供し得る。
【００４８】
同様に、遺伝子導入ベクター又は複合体を投与することは、哺乳動物において免疫応答を誘導するための複数工程レジメンの一要素であり得る。特に、本発明の方法は、プライム（ｐｒｉｍｅ）及びブースト（ｂｏｏｓｔ）免疫レジメンの１つの力（ａｒｍ）を表し得る。本発明の方法は、例えば、少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含むプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）遺伝子導入ベクターを、本発明の遺伝子導入ベクターを投与することに先立って哺乳動物に投与することを含み得る。プライミング遺伝子導入ベクター又は複合体の抗原は、引き続き投与される遺伝子導入ベクター又は複合体の抗原と同一又は異なり得る。引き続き投与される遺伝子導入ベクター又は複合体は、次いで特定の病原体への免疫応答を「ブーストする」のに投与される。遺伝子導入ベクター又は複合体を含む１つを超えるブースト組成物が、免疫を維持するために、任意の適切な時間枠（例、プライミングの少なくとも約１週、２週、４週、８週、１２週、１６週前、又はそれよりも後）において提供され得る。
【００４９】
プライミング遺伝子導入ベクター又は複合体は、本発明の方法における利用のために本明細書中に記載されているのとは異なり、遺伝子導入ベクター又は複合体でなくて良い。例えば、プラスミド、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、又はバクテリオファージを含むがそれらに限定されない任意の遺伝子導入ベクターが、プライミング遺伝子導入ベクターとして使用され得る。理想的には、プライミング遺伝子導入ベクターは、プラスミドである。あるいは、免疫応答は、抗原自身（例、抗原タンパク質、不活化病原体など）の投与によってプライム又はブーストされ得る。
【００５０】
任意の投与の経路が、遺伝子導入ベクター又は複合体を哺乳動物へと送達するのに用いられ得る。確かに、１つより多い経路が遺伝子導入ベクター又は複合体を投与するのに用いられ得るが、特定の経路は別の経路より迅速かつより効果的な反応を提供し得る。好ましくは、遺伝子導入ベクター又は複合体は、筋肉注射を介して投与される。遺伝子導入ベクター又は複合体の用量はまた、体腔中へ塗布又は注入されるか、皮膚を通して吸収されるか（例、経皮貼布を介するか）、吸入されるか、経口摂取されるか、組織に局所的に塗布されるか、あるいは、例えば静脈内、腹膜、又は動脈内投与を介して、非経口投与され得る。
【００５１】
遺伝子導入ベクター又は複合体は、スポンジ、生体適合性網目構造、機械的容器、又は機械的移植片のような、制御又は持続性の放出を可能とするデバイス中又はデバイス上で投与され得る。移植片（例、米国特許第５，４４３，５０５号参照）、移植可能なデバイス（例、機械的容器）のようなデバイス（例、米国特許第４，８６３，４５７号参照）あるいはポリマー組成物から構成される移植片又はデバイスは、遺伝子導入ベクター又は複合体の投与に特に実用的である。遺伝子導入ベクター又は複合体はまた、例えばゲル発泡剤、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴ）のようなポリホスホエステル、及び／又はポリ乳酸−グリコール酸を含む持続性放出製剤の形態で投与され得る（例、米国特許第５，３７８，４７５号参照)。
【００５２】
哺乳動物へ投与される遺伝子導入ベクター又は複合体の用量は、遺伝子導入ベクター（例、ウイルス又はリポソーム）あるいは複合体（例、融合タンパク質）の型、標的組織のサイズ、任意の副作用の範囲、投与の特定の経路などを含む数々の要因に依存する。用量は、理想的には、遺伝子導入ベクター又は複合体の「有効量」（即ち、哺乳動物において所望される免疫応答を引き起こす遺伝子導入ベクター又は複合体の用量）を含む。所望される免疫応答は、抗体の産生、それに続くチャレンジの際の保護、免疫寛容、免疫細胞の活性化などを内包し得る。
【００５３】
遺伝子導入ベクター又は複合体は望ましくは、担体、好ましくは、生理学的に（例、医薬的に）許容可能な担体及び遺伝子導入ベクター又は複合体を含む組成物、好ましくは生理学的に許容可能な（例、医薬的に許容可能な）組成物において投与される。任意の適切な担体が、本発明の文脈中において用いられ得、そのような担体は当技術分野において周知である。担体の選択は、組成物が投与されるべき特定の部位及び組成物を投与するために用いられる特定の方法によって、部分的に決定される。組成物は必要に応じて、無菌あるいは本発明の遺伝子導入ベクター又は複合体を除いて無菌であり得る。
【００５４】
適切な担体及びそれらの形態は、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，版，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９版），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，イーストン，ペンシルバニア（１９９５）に記載されている。医薬担体としては、無菌水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、及び生理ｐＨでの緩衝溶液が挙げられる。典型的には、製剤を等張にさせるのに、医薬的に許容可能な塩の適当な量が製剤中に用いられる。製剤のｐＨは好ましくは、約５〜約８（例、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、及びその範囲）である。より好ましくは、ｐＨは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、マトリックスが成形された物品の形状（例、フィルム、リポソーム、又は微小粒子）である遺伝子導入ベクター又は複合体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような持続性放出製剤が挙げられる。特定の担体が、例えば、投与の経路及び投与される組成物の濃度に依存してより好ましくても良いことが、当業者には明らかである。
【００５５】
遺伝子導入ベクター又は複合体を含む組成物（例、医薬組成物）は、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存料、界面活性剤などを含み得る。組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などのような１つ以上の活性成分を含み得る。
【００５６】
遺伝子導入ベクター又は複合体を含む組成物は、局所性又は全身性の治療が所望されるか、及び治療する部位に依存して、任意の適切な様式で投与され得る。投与は局所的（眼、膣、直腸、経皮などを含む）、経口、吸入、又は非経口（静脈点滴あるいは皮下、腔内、腹腔、又は筋肉注射によるものを含む）であり得る。吸入投与とは、１又は両方の鼻孔を通っての鼻及び鼻道中への組成物の送達をいい、スプレー機構又は液滴機構により、あるいは核酸、ベクター又は融合タンパク質のエアロゾル化を通じての送達を含み得る。送達はまた、挿管を介して、呼吸器系の任意の部位（例、肺）へ直接なされ得る。
【００５７】
組成物が、非経口的に投与される場合、投与は一般的に注射による。注射剤は、液状溶液か又は懸濁液のいずれか、注射に先立って液体に懸濁するのに適切な固形、あるいはエマルションの慣用的な形態で調製され得る。その上、非経口投与は、一定の用量が保持されるように、徐放又は持続放出系の製剤を含み得る。非経口投与の製剤としては、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、及びオレイン酸エチルのよう注射可能な有機エステルである。水性の担体としては、水、アルコール／水溶液、生理食塩水を含むエマルション又は懸濁液及び緩衝培養液が挙げられる。非経口的なビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルブドウ糖に基づくようなもの）などが挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどのような保存料及び他の添加剤もまた存在し得る。
【００５８】
局所的投与のための処方物としては、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、点眼剤、座剤、スプレー、液剤、及び粉末であっても良い。慣用的な医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要又は所望されても良い。
【００５９】
経口投与のための組成物としては、粉末又は顆粒、水又は非水性溶媒の懸濁液又は溶液、カプセル、サッシェ、あるいは錠剤が挙げられる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、又は結合剤が所望されても良い。
【００６０】
組成物の一部は潜在的に、例えば塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸のような無機酸、並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸のような有機酸との反応によって、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、並びにモノ−、ジ−、トリアルキル、並びにアリールアミン及び置換エタノールアミンのような有機塩基との反応によって形成された医薬的に許容可能な酸又は塩基付加塩として投与され得る。
【００６１】
遺伝子導入ベクター又は複合体は、医薬的に許容可能な担体と投与され得、当分野で周知の種々の機構（例、裸ＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃を介するＤＮＡの筋肉注射、エンドサイトーシスなど）によって、生体内及び／又は生体外で哺乳動物の細胞へ送達され得る。
【００６２】
生体外の方法が用いられる場合、細胞又は組織は、当分野で公知の標準プロトコルに従って、体外に取り除かれかつ維持され得る。組成物は、リン酸カルシウムによって仲介される遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、又はプロテオリポソームのような任意の遺伝子導入機構を介して細胞に導入され得る。形質導入細胞は次いで、細胞又は組織型に標準的な方法によって、哺乳動物中へと注入され（例、医薬的に許容可能な担体と）あるいは同位置に（ｈｏｍｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ）移植され戻され得る。哺乳動物中への種々の細胞の移植又は注入の標準的な方法が公知である。
【００６３】
さらに、当業者は、遺伝子導入ベクター又は複合体は組成物中に他の治療薬又は生物活性剤と存在し得ることを理解する。例えば、イブプロフェン又はステロイドのような炎症を制御する因子が、遺伝子導入ベクター又は複合体の生体内投与と関連する腫脹及び炎症を減少させるのに、組成物の一部であり得る。本明細書中で議論されるように、免疫系促進剤が、抗原への任意の免疫応答を増進するために投与され得る。抗生物質（即ち、殺菌薬及び殺真菌薬）が、現存の感染を治療し及び／又は遺伝子導入手法と関連する感染のような将来的な感染のリスクを減少させるのに存在し得る。
【００６４】
本発明はさらに、（ａ）タンパク質をコードする核酸配列、及び（ｂ）サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列を含む遺伝子導入ベクターであって、遺伝子導入ベクターがアデノウイルスベクターではないものを提供する。本発明の他の実施形態と関連して、上記の遺伝子導入ベクター及びサブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列の説明はまた、前述の本発明の遺伝子導入ベクターと同一の局面に適用可能である。遺伝子導入ベクターは、上記の任意の適切な遺伝子導入ベクター（例、ウイルスベクター、リポソーム、又はウイルス様粒子）により得る。遺伝子導入ベクターは好ましくはウイルスベクターであるが、アデノウイルスベクターではない。
【００６５】
タンパク質をコードする核酸配列は、任意の原料から取得され得る（例、自然から単離される、合成的に作出される、遺伝子操作生物から単離されるなど）。当業者は、遺伝子導入ベクターに挿入され得る核酸の任意の型（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｃＤＮＡ）が、本発明と関連して利用され得ることを理解する。
【００６６】
本発明の遺伝子導入ベクターの核酸配列は好ましくは、哺乳動物（例、ヒト）細胞に毒性であるタンパク質（即ち、「細胞毒性」タンパク質）をコードする。適切な毒性タンパク質としては、細菌トキシン、ウイルストキシン、真菌トキシン、又は寄生虫病原体によって生産されたトキシン、植物トキシン、細胞毒性薬剤（例、化学療法薬）、及び放射性核種が挙げられる。適切な細菌トキシンとしては、例えば、アエロモナスハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）アエロリジン（ａｅｒｏｌｙｓｉｎ）トキシン、大腸菌溶血素トキシン、エンテロトキシン、表皮剥脱トキシン、毒素ショックトキシン、及び黄色ブドウ球菌のα−トキシン、化膿連鎖球菌ストレプトリジンＯトキシン及び発熱性の外毒素、ジフテリアトキシン、炭疽菌浮腫因子及び致死因子、百日咳菌皮膚壊死性トキシン及び百日咳トキシン、コレラトキシン、破傷風トキシン、並びに緑膿菌外毒素Ａが挙げられる。適切なウイルストキシンとしては、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）、及びヘパドナウイルス科、パルボウイルス科（例、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））、パポバウイルス科（例、パピローマウイルス）、アデノウイルス科（例、ヒトアデノウイルス）、ピコルナウイルス科（例、Ａ型肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス科（例、単純ヘルペス様ウイルス）、レトロウイルス科（例、ＨＩＶ）、又は本明細書中に記載されている任意の他のウイルス科からのウイルスよって産生された任意のトキシンが挙げられる。本発明の遺伝子導入ベクターの核酸配列によってコードされるタンパク質は、しかしながら、これらの典型的なタンパク質に限定されない。実際に、好ましくはヒト細胞である哺乳動物細胞に細胞毒性である任意のタンパク質が、本発明の範囲内である。
【００６７】
別の実施形態では、本発明の遺伝子導入ベクターの核酸配列は、抗原をコードし得る。この点において、核酸配列は本明細書中に記載されるような任意の適切な抗原をコードし得る。
【００６８】
本発明の遺伝子導入ベクターの核酸配列は好ましくは、分泌タンパク質（例、感染細胞から天然に分泌されるタンパク質）をコードする。「分泌タンパク質」とは、細胞によって細胞外環境中へと放出される、任意のペプチド、ポリペプチド、又はその部分を意味する。核酸配列はまた、細胞によって天然に分泌されないが、遺伝子導入ベクター（例、ウイルスベクター）形質導入によって誘導される細胞溶解によって放出されるタンパク質をコードし得る。あるいは、核酸配列は、細胞によって天然に分泌されないが（即ち、非分泌性タンパク質）、タンパク質分泌を容易にするシグナルペプチドを含むタンパク質をコードし得る（例、米国特許第６，４７２，１７６号参照)。このように、例えば、核酸配列は、小胞体（ＥＲ）局在化シグナルペプチド及び非分泌性タンパク質をコードする。小胞体局在化シグナルペプチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はタンパク質を、タンパク質が発現し、分泌のために標的化される小胞体の膜へ指向するように機能する。小胞体局在化シグナルペプチドは望ましくは、細胞の（ｉ）細胞によって通常分泌する（即ち、分泌可能である）ことがないタンパク質及び／又は（ｉｉ）細胞によって通常分泌されるが、低い（即ち、所望されるより低い）量であるタンパク質の分泌（即ち、分泌潜在性）を増加させるように機能する。ポリヌクレオチドによってコードされる小胞体局在化シグナルペプチドは、任意の適切な小胞体局在化シグナルペプチド又はポリペプチド（即ち、タンパク質）であり得る。例えば、核酸配列によってコードされる小胞体局在化シグナルペプチドは、神経成長因子（ＮＧＦ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）（例、Ｉｇκ鎖リーダー配列）、及びミッドカイン（ＭＫ）、又はそれらの部分からなる群より選択されるペプチド又はポリペプチド（即ち、タンパク質）であり得る。適切な小胞体局在化シグナルペプチドはまた、Ｌａｄｕｎｇａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１３−１８（２０００）に記載されているものを含む。
【００６９】
核酸配列は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、又は色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードし得る。好ましくは、遺伝子導入ベクターは、ＴＮＦをコードする核酸配列を含む。ＴＮＦをコードする核酸配列としては、タンパク質のＴＮＦファミリーの任意のメンバー（例、ＣＤ４０リガンド及びＦａｓリガンド）をコードする核酸配列が挙げられる。遺伝子導入ベクターは好ましくは、ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含む。ＴＮＦをコードする核酸配列は、米国特許第４，８７９，２２６号中に記載されている。あるいは、核酸配列はＶＥＧＦをコードし得る。核酸配列は、米国特許第５，３３２，６７１号、同第５，２４０，８４８号、及び同第５，２１９，７３９号中に種々に記載されている、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、又はＶＥＧＦ２０６を含むがそれらに限定されない、任意の適切なＶＥＧＦアイソフォームをコードし得る。最も好ましくは、それらのより高い生理活性のため、核酸配列はＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１６５、特にＶＥＧＦ１２１をコードする。ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５間の注目すべき違いは、ＶＥＧＦ１２１はＶＥＧＦ１６５ほど、ヘパリンと高い程度の親和性で結合しないことである。他の適切なＶＥＧＦペプチドはＶＥＧＦ−ＩＩ、ＶＥＧＦ−Ｃなどである。核酸配列はまた、ＰＥＤＦをコードし得る。初期集団倍化因子−１（ＥＰＣ−１）としてもまた公知であるＰＥＤＦは、セルピンと命名されているセリンプロテアーゼ阻害剤のファミリーと相同性を有する分泌タンパク質である。ＰＥＤＦは主に、網膜色素上皮細胞によって作られ、体のほとんどの組織及び細胞型において検出可能である。ＰＥＤＦは、神経栄養性及び抗血管新生の特徴を有し、従って、幅広い範囲の疾患の治療及び研究において有用である。ＳＬＥＤタンパク質として公知（例、国際特許出願公開番号ＷＯ９９／０４８０６参照）の、ＰＥＤＦの抗血管新生誘導体をコードする核酸配列もまた、本発明と関連して用いられ得る。ＰＥＤＦはさらに、国際特許出願公開番号ＷＯ９３／２４５２９及びＷＯ９９／０４８０６において特徴付けられ、かつＰＥＤＦをコードする核酸配列は米国特許第５，８４０，６８６号中に記載されている。
【００７０】
本発明の遺伝子導入ベクターは、宿主細胞において１つ以上のさらなるタンパク質が発現するように、各々が１つ以上の遺伝子産物をコードする１つ以上のさらなる核酸配列を含み得る。さらなる遺伝子産物の発現は、個別の発現制御配列によって別々に調節され、又は１つの共通の発現制御配列によって協調的に調節され得る。あるいは、さらなる核酸の発現は、前記のタンパク質をコードする核酸配列の発現を調節するのと同一の発現制御配列によって調節され得る；しかしながら、タンパク質をコードする核酸中に存在する任意の転写終結領域は、さらなる核酸配列の転写通読（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を可能とするのに除去される。さらなる核酸配列は、前記のタンパク質をコードする核酸配列と関連して、本明細書中で議論されている任意の適切な発現制御配列及び適切な転写終結領域を含み得る。
【００７１】
核酸配列は、任意のバリアント、ホモログ、又は前述のタンパク質の機能的部分をコードし得る。タンパク質のバリアントは、対応する天然に生じる（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）タンパク質からの１つ以上の変異（例、点変異、欠失、挿入等）を含み得る。「天然に生じる」とは、タンパク質が天然に見出され得、合成的に改変されていないことを意味する。タンパク質をコードする核酸配列に変異が導入されると、そのような変異は望ましくは、コードされたタンパク質における置換に影響し、それによって正電荷残基（Ｈ、Ｋ、及びＲ）をコードするコドンは正電荷残基をコードするコドンと置換され、負電荷残基（Ｄ及びＥ）をコードするコドンは負電荷残基をコードするコドンと置換され、中性極性残基（Ｃ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、及びＹ）をコードするコドンは中性極性残基をコードする残基と置換され、並びに／又は中性非極性残基（Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、及びＷ）をコードするコドンは中性非極性残基と置換されるであろう。さらに、タンパク質のホモログは、アミノ酸レベルでタンパク質と約７０％同一（好ましくは約８０％より多く同一、より好ましくは約９０％より多く同一、そして最も好ましくは約９５％より多く同一）である、任意のペプチド、ポリペプチド、又はその部分であり得る。アミノ酸同一性の程度は、ＢＬＡＳＴ配列データベースのような、当分野で公知の任意の方法を用いて決定され得る。さらに、タンパク質のホモログは、少なくとも中程度、好ましくは高ストリンジェンシーの条件下でタンパク質とハイブリダイズする、任意のペプチド、ポリペプチド、又はその部分であり得る。典型的な中程度のストリンジェンシーの条件としては、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍｌ変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む３７℃の溶液中で一晩インキュベーションし、続いてフィルターを約３７〜５０℃にて１×ＳＳＣ中で洗浄すること、あるいは実質的に類似の条件（例、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上、中に記載されているような、中程度にストリンジェントな条件）を含む。高ストリンジェンシーの条件は、例えば（１）洗浄に、５０℃にて０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような低イオン強度及び高温、（２）ハイブリダイゼーションの間、ホルムアミドのような変性剤を用いる（例えば、４２℃で０．１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド／０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％  ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液）、又は（３）４２℃で５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳ、及び１０％  デキストラン硫酸���用い、（ｉ）４２℃にて０．２×ＳＳＣ中、（ｉｉ）５５℃にて５０％  ホルムアミド中及び（ｉｉｉ）５５℃にて０．１×ＳＳＣ中（好ましくは、ＥＤＴＡとの組合せ）での洗浄を用いる条件である。さらなる詳細及びハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの説明は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、同上において提供されている。「機能的部分」は、天然に生じる、完全長タンパク質の生理活性を、測定可能なレベルで保有するタンパク質の任意の部分である。
【００７２】
核酸配列の発現は、任意の適切なプロモーターによって制御される。理想的には、核酸配列は、本明細書中に記載されているように、プロモーター及びポリアデニル化配列に機能可能に連結している。
【００７３】
本発明はまた、（ａ）タンパク質又は非タンパク質性分子、及び（ｂ）サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列を含む複合体であって、複合体がタンパク質を含む場合に複合体がアデノウイルスではないものを提供する。本発明の他の実施形態と関連して上述した、複合体及びサブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列の説明はまた、前述の本発明の複合体のそれと同一の局面において適応可能である。この点において、複合体は好ましくは、サブグループＣアデノウイルスのシャフト領域のアミノ酸配列と化学的に共役したタンパク質又は非タンパク質性分子を含む。タンパク質又は非タンパク質性分子は、任意の適切な化学結合でアミノ酸配列と化学的に共役し得、かつ好ましくは本明細書中に記載されているような共有結合を介してアミノ酸配列と共役している。より好ましくは、本発明の複合体は融合タンパク質である。
【００７４】
複合体がタンパク質を含む場合、複合体は好ましくはアデノウィルス、特にキャプシド形成されたアデノウイルスではない。キャプシド形成されたアデノウイルスは、アデノウイルスキャプシド内に含有されたアデノウイルスゲノムを含む。キャプシド形成されたアデノウイルスは、複製可能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）、条件的に複製欠損、又は複製欠損であり得る。条件的に複製欠損なアデノウイルスは、実施者によってあらかじめ定められた条件下で複製するように設計される。複製欠損アデノウイルスは、少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠失したアデノウイルスゲノムを含む（即ち、アデノウイルスベクターが典型的な宿主細胞、特に、ヒト患者中のアデノウイルスベクターによって感染され得る宿主細胞において複製しないように）。
【００７５】
１つの実施形態では、複合体は１つ以上のタンパク質を含む。タンパク質は、本明細書中に記載されている任意の適切なタンパク質であり得る。適切なタンパク質としては、例えば、抗原、細胞毒性タンパク質（例、細菌又はウイルストキシン）、分泌タンパク質（例、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、又はＰＥＤＦ）、及び免疫応答を増強するタンパク質（例、ＴＮＦ、ＧＭＣＳＦ又はＩＬ−１２）が挙げられる。
【００７６】
別の実施形態では、複合体は非タンパク質性分子を含む。複合体は、任意の適切な非タンパク質性分子を含み得る。適切な非タンパク質性分子としては、例えば、炭水化物、脂質、及び非タンパク質性小分子が挙げられる。「小分子」とは、それが、核酸、炭水化物、又は脂質を含む高分子とみなされない任意の分子を意味する。小分子は、一般的に低分子量を有する、多様なグループの天然及び合成物質である。例えば、小分子は典型的には、約１，０００より小さい（例、約７００、５００、又は３００より小さい)分子量を有する。小分子は、植物、真菌、又は微生物のような天然の原料から単離され得、あるいはそれらは有機化学によって合成され得る。アスピリン、ペニシリン、及び化学療法剤のようなほとんどの慣習的な医薬品は、小分子である。非タンパク質性分子は好ましくはハプテンである。ハプテンは、抗原決定基を含むが、それ自体は抗原性担体と複合体化されていない限り抗原性ではない、低分子量分子である。本発明における利用に適切なハプテンの例としては、ジニトロフェノール、ホスホリルコリン（ｐｈｏｓｐｈｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、及びデキストランが挙げられる。
【００７７】
本発明は、タンパク質又は非タンパク質性分子を細胞へ送達する方法を提供する。方法は、本明細書中に記載されているように、細胞を遺伝子導入又は複合体と接触させることを含む。
【００７８】
タンパク質又は非タンパク質性分子は、任意の適切な細胞に送達され得る。以前に述べたように、サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の部分が、アデノウイルスを特定の細胞型（例、免疫細胞及び腫瘍細胞）に標的化するのに関与していると考えられている。本発明の方法に従って、タンパク質又は非タンパク質性分子は、免疫細胞、好ましくは樹状細胞、単球、及びマクロファージのような抗原提示細胞に送達され得る。
【００７９】
樹状細胞が望ましい標的細胞である場合、遺伝子導入ベクター又は複合体は、サブグループＣアデノウイルスファイバーシャフト領域のアミノ酸配列を経由して、接着タンパク質、ケモカイン受容体、補体受容体、共刺激タンパク質、サイトカイン受容体、高レベル抗原提示分子、ホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）タンパク質、マーカータンパク質、抗原取込みのための受容体、シグナルタンパク質、ウイルス受容体、等、のような樹状細胞表面に典型的に見られるタンパク質を認識する。樹状細胞におけるそのような潜在的リガンド結合部位の例としては、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、２Ａ１、７−ＴＭ受容体、ＣＤ１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３２、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４バリアント、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５０、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ６４、ＡＳＧＰＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、Ｅ−カドヘリン、インテグリン、Ｍ３４２、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、ＭＩＤＣ−８、ＭＭＲ、ＯＸ６２、ｐ２００−ＭＲ６、ｐ５５、Ｓ１００、ＴＮＦ−Ｒ、等、が挙げられる。樹状細胞が標的化される場合、サブグループＣアデノウイルスファイバータンパク質のシャフト領域の近接アミノ酸を少なくとも３つ含むアミノ酸配列は好ましくは、ＣＤ４０細胞表面タンパク質を認識する。
【００８０】
マクロファージが望まれる標的である場合、遺伝子導入ベクター又は複合体は、サブグループＣアデノウイルスファイバーシャフト領域のアミノ酸配列を経由して、ホスファチジルセリン受容体、ビトロネクチン受容体、インテグリン、接着受容体、シグナル伝達及び／又は炎症に関する受容体、マーカー、サイトカインの誘導のための受容体、あるいは病原体によるチャレンジで上方調節される受容体、グループＢスカベンジャー（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）受容体システイン−リッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバー、シアル酸結合受容体、Ｆｃ受容体ファミリーのメンバー、Ｂ７−１及びＢ７−２表面分子、リンパ球受容体、白血球受容体、抗原提示分子などのようなマクロファージ細胞表面上に典型的に見られるタンパク質を認識する。適切なマクロファージ表面標的タンパク質の例としては、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ１６３、ＣＤ１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２９、Ｃｄ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ７１、ＣＤ８７、ＣＤ９、ＣＤ９８、Ｉｇ受容体、Ｆｃ受容体タンパク質（例、Ｆｃα、Ｆｃγ、Ｆｃε、等、のサブタイプ)、葉酸受容体ｂ、ＨＬＡクラスＩ、シアロアドヘシン（Ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ）、シグレック−５（ｓｉｇｌｅｃ−５）、及びトール様（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体−２（ＴＬＲ２）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８１】
Ｂ−細胞が望まれる標的である場合、遺伝子導入ベクター又は複合体は、サブグループＣアデノウイルスファイバーシャフト領域のアミノ酸配列を経由して、インテグリン及び他の接着分子、補体受容体、インターロイキン受容体、食細胞受容体、免疫グロブリン受容体、活性化マーカー、トランスフェリン受容体、スカベンジャー受容体システイン−リッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバー、成長因子受容体、セレクチン、ＭＨＣ分子、ＴＮＦ−受容体、及びＴＮＦ−Ｒ関連因子のようなＢ−細胞表面上に典型的に見られるタンパク質を認識する。典型的なＢ−細胞表面タンパク質の例としては、β−グリカン、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＡＣ）、Ｂ７−２、Ｂ−細胞受容体（ＢＣＲ）、Ｃ３ｄ受容体、ＣＤ１、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ６９、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ二量体、ＣＤ９５、エンドグリン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）、Ｆａｓ抗原、ヒトＩｇ受容体、Ｆｃ受容体タンパク質（例、Ｆｃａ、Ｆｃｇ、Ｆｃε、等、のサブタイプ)、ＩｇＭ、ｇｐ２００−ＭＲ６、成長ホルモン受容体（ＧＨ−Ｒ）、ＩＣＡＭ−１、ＩＬＴ２、ＣＤ８５、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦ−Ｒ）、α４β７インテグリン、及びαｖβ３インテグリンが挙げられる。
【００８２】
本発明の方法に従って、タンパク質又は非タンパク質性分子は腫瘍細胞に送達され得る。腫瘍細胞が所望される標的である場合、遺伝子導入ベクター又は複合体は、サブグループＣアデノウイルスファイバーシャフト領域のアミノ酸配列を経由して、腫瘍細胞表面上に典型的に見られるタンパク質を認識する。腫瘍細胞は、口腔及び咽頭、消化器系、呼吸器系、骨及び関節（例、骨性の転移）、軟部組織、皮膚（例、黒色腫）、胸部、生殖器系、泌尿器系、眼及び眼窩、脳及び神経系（例、神経膠）、又は内分泌系（例、甲状腺）の癌と関連し得る（即ち、その中に局在する）。腫瘍細胞は、例えば、舌及び口の組織を含む口腔の癌と関連し得る。腫瘍細胞は、例えば、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、及び膵臓を含む消化器系の癌と関連し得る。腫瘍細胞は、例えば、咽頭、肺、及び気管支（例、非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ））を含む呼吸器系の癌と関連し得る。腫瘍細胞は、雄性及び雌性の生殖器系を作り上げる子宮頸部、子宮体部、卵巣外陰部、膣、前立腺、睾丸、及び陰茎、並びに泌尿器系を構成する膀胱、腎臓、腎盂、及び尿管の癌と関連し得る。腫瘍細胞はまた、リンパ腫（例、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、又は白血病（例、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病など）と関連し得る。
【００８３】
遺伝子導入ベクター及び／又は複合体は、当分野で公知の方法を用いて、生体内又は生体外の特定の細胞と接触し得る。この点において、遺伝子導入ベクター及び／又は複合体は、医薬的に許容可能な担体と投与され得、かつ本明細書中に記載されているような当分野で周知の種々の機構によって、生体内及び／又は生体外で哺乳動物の細胞、好ましくはヒト細胞に送達され得る。遺伝子導入ベクター及び／又は複合体は好ましくは、生体内で１つ以上の細胞と接触する。
【００８４】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、もちろん、その範囲を如何なる様式にも制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００８５】
本実施例は、ネイティブ宿主細胞結合のために切断されたアデノウイルスの、哺乳動物における免疫応答を誘導し、免疫細胞に形質導入を生じさせる能力を実証する。
【００８６】
アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ファイバータンパク質のシャフト領域の免疫原性への寄与を試験するため、アデノウイルスベクターのパネルを作成した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現したＡｄ５ベクターを、ペントンベース及びファイバータンパク質において改変した。具体的には、インテグリン結合モチーフ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）、をペントンベースタンパク質から除去し、かつファイバーとコクサッキー（Ｃｏｃｋｓａｘｉｅ）Ｂ及びアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）との相互作用を媒介するファイバータンパク質のノブ領域のアミノ酸残基もまた、除去した。この「二重に切断された（ｄｏｕｂｌｅ−ａｂｌａｔｅｄ）」Ａｄ５ベクターをＡｄｆ．ＤＡと呼んだ。
【００８７】
アデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）ベクターを、Ａｄ３５ファイバータンパク質のシャフト領域がＡｄ５ファイバータンパク質のシャフト領域と置換されるように、慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて改変した。Ａｄ３５ｆ．５Ｓと呼んだこのＡｄ３５ベクターもまた、ＧＦＰタンパク質をコードしていた。それぞれＡｄ３５ｆ及びＡｄｆと呼んだ、ＧＦＰ発現する、アデノウイルス血清型３５及び５の野生型キャプシドベクターをコントロールとした。
【００８８】
５匹のＢａｌｂ／ｃマウスの群を、上記のアデノウイルスベクターの１×１０８〜１×１０１０粒子（ｐｕ）の用量範囲で免疫化した。ＧＦＰ抗原に免疫活性であったＴ−細胞のパーセントを、細胞内サイトカイン染色によって決定した（図１Ａ及び１Ｂ参照）。Ａｄ３５ｆ．５Ｓで免疫化した動物は、最も高いパーセントのサイトカイン陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を示し、コントロールＡｄｆベクターと同じレベルのＣＤ４＋  Ｔ細胞を示した。Ａｄ３５ｆ．５Ｓは、Ａｄ３５ｆによって誘導されたレベルを著しく超えるレベルのＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘導した。ＡｄｆＤＡで免疫化した動物はまた、ＧＦＰへ著しい免疫応答を開始し、かつＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベルは、Ａｄｆで免疫化した動物と少なくとも等しかった。
【００８９】
免疫系の細胞に形質導入することにおける、二重に切断されたベクターの能力、及びＡｄ５シャフト領域の役割を決定した。マウス骨髄細胞を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＡｄＬ）、ＡｄＬＤＡ、又はＡｄｆをコードするＥ１欠損Ａｄ５で感染し、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用の阻害剤の非存在又は存在下のいずれかにおいて、ＧＭＣＳＦと１週間培養した。競合剤は、ヘパリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｈ６２７９）又はヘパラン（ヘパラン硫酸プロテオグリカン、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｈ４７７７）であった。細胞の集団を、ＣＤ１９及びＣＤ１１ｃについてフローサイトメトリーで選別することによって、樹状細胞を濃縮した。この細胞の集団は、骨髄樹状細胞と呼ばれている（例、Ｉｎａｂａら，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６，１６９３−１７０２（１９９２）参照）。競合剤の非存在下では、ＣＤ１９陰性、ＣＤ１１ｃ陽性細胞のルシフェラーゼ活性は、ＡｄＬＤＡ又はＡｄＬによって感染された集団間で等価であった（図２、ＡｄｌｕｃＤＡ及びＡｄｌｕｃ、それぞれを参照)。競合剤の存在下では、ＡｄＬＤＡで感染された細胞のルシフェラーゼ活性のレベルはおよそ１００倍低く、形質導入のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用への依存性を明らかにした。Ａｄ５のシャフト領域におけるＫＫＴＫモチーフが、ヘパラン硫酸プロテオグリカン結合モチーフであることが公知である（例、Ｈｉｌｅｍａｎら，同上、及びＳｍｉｔｈら，同上）ため、これらの結果は、二重に切断されたベクターが、ファイバーシャフト依存的機構を通じて、専門抗原提示細胞を形質導入することを実証する。
【００９０】
二重に切断されたベクターを次に、腫瘍細胞の形質導入について試験した。二重に切断されたベクターは、野生型キャプシドベクターに対して差別的な形質導入を示した。２９３−ＯＲＦ６細胞のＡｄＬ．ＤＡ形質導入は、ＡｄＬと比較して１０００倍低いルシフェラーゼ活性の結果をもたらした一方で、ヒト腺癌株化細胞であるＣａｏｖ３細胞におけるルシフェラーゼ活性は、ＡｄＬ及びＡｄＬ．ＤＡ間で等価であった（図３Ａ参照）。類似の結果が２つのマウス株化細胞でも得られた（図３Ｂ参照）。
【００９１】
本実施例は、Ａｄ５及びＡｄ３５ベクターによって誘導された免疫応答が、ペントンベースタンパク質及びファイバータンパク質のＣＡＲ結合領域によって媒介される相互作用に非依存的であることを実証する。その上、本実施例は、Ａｄ５ファイバーのシャフト領域が免疫系の細胞（例、骨髄樹状細胞）、並びに腫瘍細胞（例、ヒト卵巣腺癌）を形質導入するための特異性を与えることを実証する。
【実施例２】
【００９２】
本実施例は、本発明の遺伝子導入ベクターの調製を実証する。
【００９３】
アデノ随伴ウイルスベクターを、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８，６５９５−６６０９（２００４）において開示されている方法に従って調製する。具体的には、アデノウイルス血清型５ファイバータンパク質のシャフト領域のアミノ酸配列ＫＫＴＫを含むアミノ酸配列を、ＡＡＶ  Ｖ１及びＶ２キャプシドタンパク質の重複領域内のアミノ酸位置１３８で挿入する。その結果生じたＡＡＶベクターを、ＨＩＶのＧＡＧ抗原のような抗原を含むようにさらに改変する。ＡＡＶベクターは、非改変ＡＡＶベクターと比較して、ヒトに投与した場合に、増強された免疫原性を呈す。
【実施例３】
【００９４】
本実施例は、本発明の複合体の調製を実証する。
【００９５】
アデノウイルス血清型５ファイバータンパク質のシャフト領域のアミノ酸配列ＫＫＴＫ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を、組換え炭疽菌防御抗原ワクチン又は組換え炭疽菌致死因子ワクチンのＮ末端又はＣ末端と複合体化する（例、Ｌｅｐｐｌａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０９，１４１−１４４（２００２）に概説されているように）。複合体は、非改変防御抗原ワクチン又は致死因子ワクチンと比較して、ヒトに投与した場合に、増強された免疫原性を呈す。
【００９６】
本明細書中で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、本明細書中で参考として援用されることが個別におよび具体的に示され、かつその全体が本明細書中に示されるのと同じ程度に、本明細書により参考として援用される。
【００９７】
本発明を記載する文脈において（特に、添付の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示語の使用は、本明細書中で他に示されない限り、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するように解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に注記されない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むが、限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。本明細書中での値の範囲の列記は、本明細書中で他に示されない限り、その範囲内にある各々の別々の値を個々に言及する略記方法として働くことが単に意図され、そして各々の別々の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているかのように本明細書中に含まれるものである。本明細書中に記載されている全ての方法は、本明細書中で他に示されない限り、又は他に文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中で提供される任意及び全ての例、又は例示的な言語（例、「等（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をより良く明瞭にすることが単に意図され、そして他に主張されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書中の如何なる言葉も、本発明の実施に必須なものとして、主張されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【００９８】
本発明の実施について本発明者らが把握する最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が、本明細書中に記載されている。それらの好ましい実施形態のバリエーションは、先の記載を読むことで、当業者に明白となるであろう。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを予想し、そして本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されたものとは別の状態で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変物及び均等物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組合せが、本明細書中で他に示されない限り、又は他の文脈に明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１Ａは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするアデノウイルスベクターコンストラクトを投与したマウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞応答を図示するグラフである。  図１Ｂは、緑色蛍光タンパク質をコードするアデノウイルスベクターコンストラクトを投与したマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答を図示するグラフである。
【図２】図２は、グリコサミノグリカン競合剤の存在又は非存在下における、マウス骨髄樹状細胞へのアデノウイルスベクターＡｄｌｕｃＤＡ、Ａｄｌｕｃ、及びＡｄｆの投与後のルシフェラーゼ発現を図示するグラフである。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、それぞれ２９３−ＯＲＦ６細胞、Ｃａｏｖ３ヒト卵巣腺癌細胞、ＬＬ２マウス肺癌細胞、及びＣＴ２６マウス結腸癌細胞へのアデノウイルスベクターＡｄＬ及びＡｄＤＡの投与後のルシフェラーゼ発現を各々図示するグラフである。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、それぞれ２９３−ＯＲＦ６細胞、Ｃａｏｖ３ヒト卵巣腺癌細胞、ＬＬ２マウス肺癌細胞、及びＣＴ２６マウス結腸癌細胞へのアデノウイルスベクターＡｄＬ及びＡｄＤＡの投与後のルシフェラーゼ発現を各々図示するグラフである。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、それぞれ２９３−ＯＲＦ６細胞、Ｃａｏｖ３ヒト卵巣腺癌細胞、ＬＬ２マウス肺癌細胞、及びＣＴ２６マウス結腸癌細胞へのアデノウイルスベクターＡｄＬ及びＡｄＤＡの投与後のルシフェラーゼ発現を各々図示するグラフである。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、それぞれ２９３−ＯＲＦ６細胞、Ｃａｏｖ３ヒト卵巣腺癌細胞、ＬＬ２マウス肺癌細胞、及びＣＴ２６マウス結腸癌細胞へのアデノウイルスベクターＡｄＬ及びＡｄＤＡの投与後のルシフェラーゼ発現を各々図示するグラフである。
【図１】
2008516631.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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