(57)【要約】  本発明は、S1P1レセプターおよび／またはS1P3レセプターへのアンタゴニスト活性を有する化合物を提供する。これらの化合物のS1P1レセプターおよび／またはS1P3レセプターへの選択性ならびに有効性が高められている。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造(I)を有する化合物、あるいは薬学的に許容されるそのエステル。
【化１】
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ここで、XおよびYは独立に、水素、OH、フッ素、塩素、PO3、およびメチル基からなる群から選択されるか、XおよびYが結合している原子とともにケト基を構成するか、であって、また、
R1は、水素、ハロ基、トリフルオロメチル基、(C1-C6)-アルキル基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、もしくはシアノ基で置換された(C1-C6)-アルキル基（(C1-C6) alkyl substituted with halo, hydroxy, alkoxy, or cyano）からなる群から選択され、
R2は、(C1-C6)-アルキル基、アルキル置換された(C3-C8)-シクロアルキル基、(C2-C6)-アルケニル基、(C2-C6)-アルキニル基、アリール基、アルキル置換されたアリール基、アリールアルキル基、およびアリール置換アリールアルキル基からなる群から選択される。
【請求項２】
R2がアミドに対して、オルト位もしくはメタ位であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
R2がアミドに対して、メタ位であることを特徴とする、請求項１もしくは２記載の化合物。
【請求項４】
XおよびYが独立に、フッ素、もしくは、塩素であることを特徴とする、請求項１〜３記載の化合物。
【請求項５】
XおよびYならびにそれらが結合している原子が>C=O基を構成することを特徴とする、請求項１〜３記載の化合物。
【請求項６】
前記R2のアルキル基が5原子から8原子の炭素原子を有することを特徴とする、請求項１〜５記載の化合物。
【請求項７】
前記構造式(I)に係る化合物がエステルであることを特徴とする、請求項１〜６記載の化合物。
【請求項８】
以下の構造を有することを特徴とする、請求項１〜７記載の化合物。
【化２】
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【請求項９】
以下の構造を有することを特徴とする、請求項８記載の化合物。
【化３】
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【請求項１０】
前記化合物が構造式(I)の化合物の薬学的に許容される塩であることを特徴とする、請求項１〜９記載の化合物。
【請求項１１】
前記化合物が構造式(I)の化合物の薬学的に許容されるエステルであることを特徴とする、請求項１〜９記載の化合物。
【請求項１２】
エステル基が、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ベンジルエステル、もしくは以下の構造を有することを特徴とする、請求項１１記載の化合物。
【化４】
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【請求項１３】
以下の構造を有することを特徴とする、請求項１２記載の化合物。
【化５】
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【請求項１４】
以下の構造を有することを特徴とする化合物、もしくは、その薬学的に許容されるエステル。
【化６】
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【請求項１５】
前記化合物が薬学的に許容される塩であることを特徴とする、請求項１４記載の化合物。
【請求項１６】
前記化合物が薬学的に許容されるエステルであることを特徴とする、請求項１４記載の化合物。
【請求項１７】
請求項１〜１６記載の化合物および薬学的に許容されるキャリアーを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
処置を必要とする受療者の腫瘍性の疾病を処置するための方法であって、
請求項１〜１６記載の化合物の血管新生を抑制する量を投与するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
処置を必要とする受療者の同種移植片生着（allograft transplant survival）を延長させるための方法であって、
有効量の請求項１〜１６記載の化合物を投与するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
処置を必要とする受療者の自己免疫疾患を処置するための方法であって、
リンパ球の輸送を変更するため、および、免疫系の調節をするために、有効量の請求項１〜１６記載の化合物を投与するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
処置を必要とする受療者の心不整脈を処置するための方法であって、
有効量の請求項１〜１６記載の化合物を投与するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
医学療法に使用するための、請求項１〜１６のいずれかに記載の化合物。
【請求項２３】
薬剤を調製するための、請求項１〜１６のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項２４】
同種移植片生着を延長させるために有用な薬剤を調製するための、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
腫瘍性の疾病を処置するために有用な薬剤を調製するための、請求項２３記載の使用。
【請求項２６】
自己免疫疾患を処置するために有用な薬剤を調製するための、請求項２３記載の使用。
【請求項２７】
心不整脈を処置するために有用な薬剤を調製するための、請求項２３記載の使用。
【請求項２８】
前記薬剤が液体のキャリアーを含むことを特徴とする、請求項２３〜２７記載の使用。
【請求項２９】
前記薬剤が、非経口的投与、エアロゾル投与、もしくは、経皮的投与に適していることを特徴とする、請求項２３〜２８のいずれかに記載の使用。
【請求項３０】
処置を必要とする受療者に、１種類以上の請求項１〜１６に記載の化合物を投与するためのキットであって、
前記キットは１種類以上の化合物を含む薬学的組成物、アプリケーター、および、それらの使用の説明をするもの
を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願〕
本出願は、"META-SUBSTITUTED ARYL AMIDE SPHINGOSINE 1-PHOSPHATE ANALOGS AS S1P RECEPTOR ANTAGONISTS" という表題の仮出願（2004年12月06日出願、出願番号60/633,587）の優先権を主張する。また、この出願は参照することによって本明細書に含まれる。
【０００２】
〔政府からの資金提供〕
本明細書に記載された発明は、the National Institutes of Healthから与えられた助成金番号GM067958 および GM064101による政府の補助の下になされたものである。米国政府は本発明についての一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
スフィンゴシン一リン酸（Sphingosine 1-phosphate (S1P)）は、内皮細胞分化遺伝子（endothelial cell differentiation gene (EDG)）レセプターファミリーのうちの5種類のものを刺激することによって様々な細胞の応答を引き起こすリゾリン脂質メディエータ（lysophospholipid mediator）である。EDGレセプターはGタンパク質共役レセプター（G-protein coupled receptors (GPCRs)）であって、刺激を受けると、セカンドメッセンジャー信号を、ヘテロ三量体Gタンパクアルファ（Gα）サブユニットおよびGタンパクベータ−ガンマ（Gβγ）二量体を活性化させることによって伝達する。すると最終的には、S1P駆動シグナル伝達（S1P-driven signaling）の結果として、細胞の存続、細胞移動の増加、および、多くの場合には有糸分裂誘発が起こる。S1Pレセプターをターゲットとしたアゴニストの最近の開発からは、生理的ホメオスタシスにおけるこの信号伝達システムの役割に関する知見が得られている。例えば、リン酸化反応に携わる免疫調節剤FTY720（2-アミノ-2[2-(4-オクチルフェニル)エチル]プロパン-1,3-ジオール）は、汎S1Pレセプターアゴニスト（pan S1P receptor agonist）であって、この存在からS1Pトーン（S1P tone）がリンパ球の輸送に関係していることが明らかとなった（1-4）。S1Pレセプターアゴニストの有用性は全く想定外のものではあったが、事前の推論はS1Pアンタゴニストが抗血管新生薬となる可能性（まだ実現されていない）に集中していた。
【０００４】
最近得られた知見もまた、S1Pについて脈間構造の生理的影響を示唆している。まだ詳細に研究されてはいないが、S1Pは内皮細胞における抗炎症作用に、S1Pが高密度リポタンパク質（HDL）を放出することを通して、介在していることがあると仮定されている（5）。さらに、本明細書に記載されているS1P1レセプターアンタゴニストがS1Pの抗炎症作用を阻害したことにより、この影響はS1P1レセプターに関連するものであるという証拠が示された。検証されれば、この結果は単球の血管外遊送への影響を含めたS1P1レセプターの役割にまで拡張してあてはめることができると考えられ、更には、S1P-レセプター特異的な化合物の開発により、この重要なシグナル伝達システムについての我々の生化学上の理解がどれほど深まるかが明らかになるであろう。
【０００５】
個々のS1Pレセプターに関する生化学上の特性を明らかにするために、我々は、S1Pレセプター相互作用に関する構造活性相関（SAR）の拡張と、レセプター特異的な化合物（receptor specific compound）の同定という対をなす2つの目標を持って、S1Pアナログを開発する計画を実行した。我々の研究により5種類のS1Pレセプターのうちの2種類に対してアンタゴニストとして機能する一連のS1Pアナログの同定がなされた。
【０００６】
1種類以上のS1Pレセプターに対する活性を調節できるS1Pアナログが、当該分野では長く必要とされてきた。本発明は、この必要性を充足するものである。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、S1P1レセプターおよび/またはS1P3レセプターに対してアンタゴニスト活性を有する化合物、ならびに/あるいは、生体系で加水分解耐性（ホスファターゼ耐性）である化合物、ならびに/あるいは、S1P1レセプターおよび/またはS1P3レセプターに対する選択性と有効性が改善された化合物を提供する。したがって、それらのエステルもしくは塩であって、構造(I)を有する1種類もしくは2種類の化合物、あるいは薬学的に許容されるそのエステルに共有結合したものも（an ester or a salt thereof, covalently bonded to one or two compounds of formula (I)）提供される。
【０００８】
【化７】
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【０００９】
ここで、XおよびYは独立に、水素、OH、F、Cl、PO3、もしくはメチル基からなる群から選択されるか、あるいはXおよびYがそれらが結合している原子とともにケト基を構成するか、であり、かつ、
R1は、水素、ハロ基、トリフルオロメチル基、(C1-C6)-アルキル基、または、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、もしくはシアノ基で置換された(C1-C6)-アルキル基（(C1-C6) alkyl substituted with halo, hydroxy-, alkoxy, or cyano）からなる群から選択され、かつ、
R2は、(C1-C6)アルキル基、アルキル置換されたシクロアルキル基、(C2-C6)アルケニル基、(C2-C6)アルキニル基、アリール基、アルキル置換されたアリール基、アリールアルキル基、およびアリール置換アリールアルキル基からなる群から選択される。
【００１０】
本発明は、本発明にかかる化合物のエステル類であって、経口での利用能を増大させるためにエステル基を加えてプロドラッグを形成できるものも、また提供する。
【００１１】
本発明は、医学療法に使用するための、構造式(I)の化合物もまた提供する。
【００１２】
他の態様として、本発明は、
構造式(I)の化合物、または、それらの混合物もしくは薬学的に許容される塩、あるいはそれらのエステル、ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物（前記組成物は好ましくは、効果的に拮抗する量の化合物もしくは塩を含む）、
腫瘍性の疾病を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする哺乳類（例えば、ヒト等）に、構造式(I)の化合物、もしくは、その薬学的に許容される塩を投与するステップを含む方法、
腫瘍性の疾病を処置するために、本発明にかかる化合物を用いて腫瘍の中の血管新生（血管の形成)を阻害する方法、
リンパ球の輸送を変更することによって、自己免疫疾患を処置するために免疫系の調節をする方法、もしくは、同種移植片生着（allograft transplant survival）を延長させるための方法、
心不整脈を処置するための方法、
腫瘍の中の血管新生を阻害するための方法であって、癌性細胞（cancerous cell）を、有効に阻害する量の構造式(I)の化合物、もしくは、その薬学的に許容される塩と接触させる（生体外もしくは体内で）ステップを含む方法、
構造式(I)の化合物、もしくは、その薬学的に許容される塩の医療（例えば、腫瘍性の疾病の処置、同種移植片生着の延長、血管新生の阻害のため、リンパ球の輸送の変更、免疫系の調節、自己免疫疾患の処置、もしくは、心不整脈の処置など）での使用、
哺乳類（例えばヒト等)の腫瘍中での血管新生を阻害するための薬剤を調製するための、構造式(I)の化合物、もしくは、その薬学的に許容される塩の使用、も提供する。
【００１３】
本発明は、構造式Iの化合物（例えば、S1P1/S1P3レセプターアンタゴニスト等)を、指定された、前記レセプターに結合させるのに効果的な構造式Iの化合物の量の前記レセプターを（体内もしくは生体外で）含む、S1Pレセプターサイトに結合する方法もまた含む。指定されたS1Pレセプターサイトと結合したリガンドを含む組織は、特定のレセプターサブタイプのためのテスト化合物の選択性を測定するのに用いられる可能性があり、あるいは、アセチルコリン機能障害（acetyl choline disfunction）に関連する疾病もしくは状態の処置のための潜在的な治癒的薬剤の同定のための道具として用いられる可能性がある（前記薬剤を前記リガンド-レセプター複合体（ligand-receptor complex）に接触させること、ならびに、リガンドの置換の程度、および/または、薬剤の結合の程度を測定することによる）。
【００１４】
本発明は、本明細書に開示した、新規な中間体、および、構造式(I)の化合物を調製するのに有用な方法（一般的な中間体、および、特定の中間体、さらには、本明細書に記載したチャートおよび実施例に記載された合成プロセスを含む）もまた提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
〔略語〕
S1P  スフィンゴシン一リン酸、GPCR  Gタンパク質共役レセプター、SAR  構造活性相関、EDG  内皮細胞分化遺伝子、EAE  実験的自己免疫性脳脊髄炎、NOD  非肥満性糖尿病、TNFα  腫瘍壊死因子α、HDL  高密度リポタンパク質、RT-PCR  逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
【００１６】
〔定義〕
特に定義しない限り、本明細書中で用いられている全ての技術用語、および、科学的用語は、この発明が属する技術の分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似しているか、もしくは均等である全ての方法および物質は、本発明の実施もしくは試験に用いられる可能性があるが、好ましい方法、および物質は本明細書に記載されたものである。本明細書中では、個々の以下の用語がこのセクションと関連する意味を有している。以下に記載されているラジカル、置換基、および、範囲についての、具体的、かつ、好ましい値は説明のためのものに過ぎない。つまり、それらは他に定義された値、もしくはラジカル、置換基のために定義された範囲内の他の値を排除するものではない。
【００１７】
本明細書中では、「ある」（”a”および”an”）という冠詞は「一種の」もしくは「一種以上の（すなわち、少なくとも一種の）」について言及する文法的な冠詞である。一例として、「ある成分」（"an element"）は一種類の成分もしくは複数種類の成分の意味である。
【００１８】
レセプター「アンタゴニスト」（"antagonists"）は  1)  固有のアゴニスト活性が欠如し、かつ、2)  surmountableであり可逆的でもある形でS1Pレセプターのアゴニスト(S1Pなど）活性を遮断する化合物として定義される（競合的遮断薬（'competitive antagonist'））。
【００１９】
本明細書中では、「精製された」（"purified"）という語およびそれに類する語は、天然での分子もしくは化合物に普通は関連する他の成分とくらべて、その分子もしくは化合物が濃縮されることを指す。「精製された」（"purified"）という語は、必ずしもある過程において特定の分子が完全に純粋となったことを示すものではない。本明細書中では、「高度に精製された」（"highly purified"）化合物とは90%よりも高い純度のものである。
【００２０】
本明細書中では「ハロゲン」もしくは「ハロ基」の語には、ブロモ基、クロロ基、フルオロ基、およびヨード基が含まれる。
【００２１】
本明細書中では「ハロアルキル」（"haloalkyl"）という語は、少なくとも１箇所以上がハロゲンに置換されているアルキルラジカル、例えば、クロロメチル、フルオロエチル、もしくはトリフルオフロメチル等を意味する。
【００２２】
本明細書中では「C1-C6アルキル基」（"C1-C6alkyl"）は1原子から6原子までの炭素原子を有する、枝分かれした、もしくは直鎖のアルキル基を表す。典型例として、C1-C6アルキル基には、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などを含むがそれらに限定されるわけではない。
【００２３】
本明細書中では「C2-C6アルケニル基」（"C2-C6alkenyl"）は2原子から6原子までの数の炭素原子、および少なくとも1箇所以上の二重結合を有する、枝分かれした、もしくは直鎖の、オレフィン状の不飽和の基を表す。このような基の例としては、1-プロペニル基、2-プロペニル基、1,3-ブタジエニル基、1-ブテニル基、ヘキセニル基、ペンテニル基などを含むがそれらに限定されるわけではない。
【００２４】
本明細書中では「C2-C6アルキニル基」（"C2-C6alkynyl"）は2から特定の数の炭素原子、および少なくとも1箇所以上の三重結合を有する、枝分かれした、もしくは直鎖の、不飽和の基を表す。このような基の例としては、1-プロピニル基、2-プロピニル基、1-ブチニル基、2-ブチニル基、1-ペンチニル基などを含むがそれらに限定されるわけではない。
【００２５】
「C3-C8シクロアルキル基」（"C3-C8cycloalkyl"）はシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、およびシクロオクチル基などを表す。
【００２６】
本明細書中では「任意に置換された」（"optionally substituted"）の語は、0から4箇所が、それぞれ独立に選ばれた置換基で置換されたものを表す。それぞれ独立に選ばれた置換基は、他の置換基と同じであっても、異なっていてもよい。
【００２７】
本明細書中では、「アリール基」（"aryl"）の語は、1もしくは2の芳香環を有する、単環式炭化水素、もしくは二環式炭化水素を表し、フェニル基、ベンジル基、ナフチル基、テトラヒドロナフチル基（tetrahydronaphthyl）、インダニル基（indanyl）、インデニル基（indenyl）、などを含むがそれらに限定されない。
【００２８】
本明細書中では、「任意に置換されたアリール基」（"optionally substituted aryl"）は、0から4箇所が置換されたアリール化合物を含む。また置換されたアリール基には1〜3の置換基を有するアリール化合物を含む。ここで、その置換基には、例えば、アルキル置換基、ハロ置換基、もしくはアミノ置換基などの基が含まれる。
【００２９】
「(C5-C8アルキル)アリール」（(C5-C8alkyl)aryl）は、アルキル基によって親部分に結合している全てのアリール基を表す。また、(C5-C8アルキル)(C5-C6アリール)の語は、C5-C8アルキル基によって親部分に結合している、5員もしくは6員の芳香族環のことを指す。
【００３０】
本明細書中では、「薬学的に許容されるキャリアー」（"pharmaceutically acceptable carrier"）の語は、リン酸緩衝された生理食塩水、ヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリン類（hydroxypropyl beta-cyclodextrin）（HO-プロピルベータシクロデキストリン類）、水、油/水エマルジョンもしくは水/油エマルジョンなどのエマルジョン、およびさまざまなタイプの湿潤剤などの、全ての標準的な薬学的キャリアーが含まれる。この語は、監督官庁たる米国連邦政府（US Federal government）に認可された全ての薬剤、もしくは米国薬局方（US Pharmacopeia）にヒトを含む動物へ使用できる薬剤として記載された全ての薬剤を含む。
【００３１】
本明細書中では、「処置」（"treating"）の語は、特定の疾患もしくは状態の予防、または特定の疾患もしくは状態に伴う症状の軽減、および/または前記症状を予防し、もしくは除去することを含む。
【００３２】
本明細書中では、「有効量」（"effective amount"）は選択された効果を示すのに十分な量を意味する。例えばS1Pレセプターアンタゴニストの有効量は、S1Pレセプターの細胞シグナル伝達活性（cell signaling activity）を減少させる量である。
【００３３】
本明細書中では、「説明書」（"instructional material"）には、刊行物、記録物、図解、もしくは、本発明に係る組成物の指定された用途への有用性を伝えるのに有用な、その他の表現可能な媒体を含む。本発明にかかるキットの説明書に、例えば本発明にかかる組成物を含む容器を加え、もしくは前記組成物を含む容器とともに出荷することもできる。あるいは、この説明書を容器とは別に分けて、受領者がこの説明書と組成物を併せて使うことを意図して出荷することもできる。
【００３４】
本発明に係る方法は、本発明で同定された阻害剤、ならびに、その阻害剤もしくは阻害剤を含む組成物の細胞または動物への投与について記載した説明書を含んだキットを含む。これは、本発明に係る組成物を細胞または動物に投与する前に、その組成物を溶解するもしくは分散するための適切な溶媒（好ましくは無菌である）を含むキットのように、当業者に知られている他の実施例のキットも含むと解されるべきである。好ましくは、その動物はヒトである。
【００３５】
本発明に係る化合物にキラル中心が存在することがあること、および、本発明に係る化合物は任意に光学異性体およびラセミ体の形で単離されることが当業者によって理解される。いくつかの化合物は多形（polymorphism）となることがある。本発明には、本明細書に記載した有用な特性を有する、本発明に係る化合物の任意のラセミ体、光学活性体、多形体、もしくは、立体異性体、またはそれらの混合物が含まれることが理解される。また、当業者には光学活性体の調製法（例えば、再結晶法によるラセミ体の光学分割、光学活性な出発物質からの合成、キラル合成、もしくは、キラル固定相（chiral stationary phase）を用いたクロマトグラフィーによる分離などによる）、ならびに、S1Pアンタゴニスト活性の決定法（本明細所に記載した標準的なテストを用いるか、もしくは、本発明の属する分野において既知の他の同様のテストを用いる）も良く知られている。
【００３６】
構造式(I)の化合物を調製する方法、もしくは、構造式(I)の化合物を調製するのに有用な中間体を調製する方法は、本発明の更なる実施例として提供される。構造式(I)の化合物を調製するのに有用な中間体もまた、本発明の更なる実施例として提供される。
【００３７】
化合物が酸性塩もしくは塩基性塩（acid or base salts）を形成するのに十分に塩基性または酸性である場合には、その化合物を塩として用いるのが適切であることがある。許容される塩の例は、生理学的に許容されるアニオンを形成する酸（例えばトシレート、メタンスルホン酸、酢酸、クエン酸、マロン酸、酒石酸、コハク酸、安息香酸、アスコルビン酸、α-ケトグルタル酸、および、α-グリセロリン酸など）とで形成された有機酸の付加塩（organic acid addition salt）である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸水素塩、および炭酸塩を含む、適切な無機塩も形成することがある。
【００３８】
許容される塩は、例えば、アミンなどの十分に塩基性の化合物を、生理学的に許容されるアニオンを与える適切な酸と反応させるなどの、当業者によって知られている通常の方法を用いて得られることがある。アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、もしくはリチウム）、またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）とのカルボン酸塩も調製することができる。
【００３９】
本発明は、1種類以上のS1Pレセプター（特にS1P1レセプターおよびS1P3レセプター型）のアンタゴニストとして作用するスフィンゴシン1-リン酸（S1P）アナログを対象としている。本発明は、リン酸部分を有する化合物、さらには、ホスホン酸類（phosphonate）のように加水分解耐性のリン酸代用物、特にα置換がハロゲンであるα-置換ホスホン酸類、ならびにホスホチオネート類（phosphothionates）との化合物を含む。
【００４０】
本明細書では、我々のアリールアミド含有化合物（aryl amide-containing compounds）の一部はS1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアンタゴニストであることを開示している。この種類の化合物のリード化合物（lead compound）であるVPC23019は、破砕細胞アッセイおよび全細胞アッセイ（broken cell and whole cell assays）でS1P1レセプターおよびS1P3レセプターの競合的アンタゴニスト（competitive antagonist）として作用することが見出されている。この系列の化合物のSARは急激である。例えば、リード化合物を少しでも変えるとVPC25239になり、これはS1P3レセプターに対してlogオーダー（log order）で1くらい、力価が強力なものとなる。これらの新規な化学物質からはS1Pシグナル伝達の更なる理解が可能となり、更なるS1Pレセプターアンタゴニスト開発のための指針となると考えられる。
【００４１】
S1Pレセプターアンタゴニストのある実施例は、以下の構造を有する、競合的アンタゴニストVPC23019についてものである。
【００４２】
【化８】
2008522977.tif 000004
【００４３】
スフィンゴシン一リン酸（レセプターアンタゴニストとしてのアナログ）、アンタゴニスト活性は  1)  アミノ基の配置が示されているとき（ここではR配置である）、2)  アルキル鎖が8原子（図と同様）か、それ以下の炭素原子を有する、3)  アルキル鎖がアミドに対してメタ位（図と同様）かオルト位であるがパラ位ではないときにのみ実現する。また、VPC23019はヒトS1P1レセプター（pKb= 7.49 ±0.16）およびヒトS1P3レセプター（pKb = 5.98 ± 0.08）に対しては競合的レセプターアンタゴニストとして作用するが、ヒトS1P4レセプター（pEC50= 6.58 ±0.08）に対してはアゴニストであり、ヒトS1P5レセプター（pEC50 = 7.07 ± 0.12）に対しては部分的にアゴニストである。VPC23019は、10マイクロモルまでの濃度ではヒトS1P2レセプターに対して、アゴニストとしてもアンタゴニストとしても不活性である。関連するアンタゴニスト化合物（VPC25239、アルキル鎖は7原子の炭素原子を有する、メタ位；VPC23031、アルキル鎖は6原子の炭素原子を有する、メタ位；VPC23089、アルキル鎖は8原子の炭素原子を有する、オルト位）についての同様のデータを以下に示す。一連の化合物間での顕著な差が、アルキル鎖の炭素原子数を8（VPC23019）から7（VPC25239）に減らしたときに見られ、他のS1Pレセプター型に対しては比較的活性が変化しなかったが、S1P3レセプターへの力価がlogオーダーで増加した。後で述べるとおり、アルキル鎖の長さが9原子から10原子の炭素原子に増加すること（それぞれVPC23079、VPC23069）、アルキル鎖がパラ位で置換される（VPC22277）こと、または、アミノ基の立体配置（spatial orientation）を異なる配置にする（VPC25027（VPC23019のS体のエナンチオマー））ことによって、化合物をS1P1レセプターに対するアンタゴニストからアゴニスト（もしくは部分的アゴニスト）に変換することができる。前述した全ての化合物の合成ルートは添付のDavis et al.の稿本に記載されている。
【００４４】
S1Pレセプターアンタゴニストの他の実施例は、以下の構造を有する、競合的アンタゴニストVPC44116についてものである。
【００４５】
【化９】
2008522977.tif 000005
【００４６】
VPC44116はVPC23019のメチレンホスホン酸アナログ（methylene phosphonate analog）である。VPC44116はリン酸含有化合物に限定されるDavis et al.の稿本には記載されていない。VPC44116のアンタゴニスト特性（力価、S1Pレセプター型選択性）はVPC23019と峻別できない。しかしながら、VPC44116はリン酸モノエステルを含む脂質（例えば、S1P、VPC23019）を分解するリン脂質ホスホヒドロラーゼ（lipid phosphate phosphohydrolases）、のための基質とならないと予測される。したがって、VPC44116は有意に生体内での代謝的な安定性が増加している（例えば、マウスの体内で少なくとも18時間）。
【００４７】
本発明に係る特異的な化合物であるVPC44116のN-Boc保護されたものへの合成ルートを図６Ａおよび６Ｂに示す。
【００４８】
本発明に係る更なる実施例である、構造式(II)の化合物（VPC23019のホスホチオネートアナログ）では、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターへのアンタゴニスト活性を保持すること、および、生体内で加水分解耐性（ホスファターゼ耐性）であることが期待される。
【００４９】
【化１０】
2008522977.tif 000006
【００５０】
本発明に係る更なる実施例では、構造式(III)の化合物は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターへのアンタゴニスト活性を保持すること、および、生体内で加水分解耐性（ホスファターゼ耐性）であることが期待される。
【００５１】
【化１１】
2008522977.tif 000007
【００５２】
ここで、XおよびYは独立に、水素、OH、フッ素、塩素、PO3、もしくはメチル基からなる群から選択されるか、またはXおよびYが結合している原子とともにケト基を構成する。ここで、モノフルオロ化合物、もしくはジフルオロ（F）化合物が好ましい。
【００５３】
低級アルキル基は具体的には、エチル基、もしくは、プロピル基である。
【００５４】
Xは具体的には、フッ素、もしくは、塩素である。
【００５５】
Xは具体的には、フッ素である。
【００５６】
Yは具体的には、フッ素、もしくは、塩素である。
【００５７】
Yは具体的には、フッ素である。
【００５８】
具体的には、XおよびYならびにそれらが結合している原子が>C=O基を構成する。
【００５９】
本発明に係る具体的な化合物では、R1基がアミドに対して、オルト位もしくはパラ位である。
【００６０】
具体的には、R2基のアルキル基は5炭素原子から8炭素原子の長さである。
【００６１】
本発明に係る具体的な化合物では、R2基がアミドに対して、オルト位もしくはメタ位である。
【００６２】
本発明に係る具体的な化合物では、R2基がアミドに対してメタ位である。
【００６３】
本発明は以下の構造を有する化合物も含む。
【００６４】
【化１２】
2008522977.tif 000008
【００６５】
構造式(I)の化合物を調製する方法は本発明に係る更なる実施例として提供され、また以下に示す方法で説明される。なお特に他に定めない限りは、汎用基の意味するところは、前述の通りとする。
【００６６】
化合物が安定で毒性のない酸性塩もしくは塩基性塩（acid or base salts）を形成するのに十分に塩基性または酸性である場合には、その化合物を塩として投与するのが適切であることがある。薬学的に許容される塩の例は、生理学的に許容されるアニオン（例えばトシレート、メタンスルホン酸イオン、酢酸イオン、クエン酸イオン、マロン酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン、安息香酸イオン、アスコルビン酸イオン、-ケトグルタル酸イオン、および、-グリセロリン酸イオンなど）を形成する酸とで形成された有機酸の付加塩（organic acid addition salt）である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸水素塩、および炭酸塩を含む、適切な無機塩も形成することがある。
【００６７】
薬学的に許容される塩は、例えば、アミンなどの十分に塩基性の化合物を、生理学的に許容されるアニオンを与える適切な酸と反応させるなどの、当業者によって知られている通常の方法を用いて得られることがある。アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、もしくはリチウム）、またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）とのカルボン酸塩も調製することができる。
【００６８】
構造式(I)の化合物は薬学的組成物として処方することができ、ヒト受療者のような哺乳類のホストに選択された投与経路（すなわち、経口的経路、または静脈内経路、筋肉内経路、局所経路もしくは皮下の経路による非経口的経路）に応じた様々な形態で投与することができる。
【００６９】
したがって、本発明に係る化合物は、例えば、不活性な増量剤もしくは消化可能な食用のキャリアーなどのような薬学的に許容される媒体と共に経口的に、全身投与されることがある。それらは硬いゼラチンカプセルもしくはソフトゼラチンカプセル（soft shell gelatin capsule）のなかに封入されることがあるし、錠剤の中に含まれることもあるし、もしくは直接的に受療者の食餌に含められることもある。経口的な治療的投与には、活性化合物は1種類以上の賦形剤と混合させることがあり、摂取可能な錠剤（ingestible tablets）、口内錠（buccal tablets）、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、オブラート剤（wafer）などの剤形が用いられる。このような組成物および調合剤（preparations）には少なくとも0.1%の活性化合物が含まれていなくてはならない。組成物および調合剤の、この割合はもちろんさまざまであって、約2から約60%の間の剤形単位（unit dosage form）の重さであるのが好都合なことがある。これらの治療上有用な組成物中の活性化合物の量は有効な投薬レベルが得られると予測される量である。
【００７０】
錠剤、トローチ剤、丸薬、カプセル剤などは以下のものを含む可能性がある。トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチもしくはゼラチンのような結合剤、リン酸水素カルシウム（dicalcium phosphate）のような賦形剤、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸などの分解剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、スクロース、フルクトース、ラクトースもしくはアスパルテームなどのような甘味剤、またはペパーミント、冬緑油もしくはチェリーフレバーのような香料が加えられることがある。剤形単位（unit dosage）がカプセルの場合は、前述のタイプの物質に加えて、植物油脂もしくはポリエチエレングリコールのような液体キャリアーを含むことがある。コーティングとしてもしくは別に固形の剤形単位の物質的な形状を変更するために、その他のさまざまな物質が存在することがある。例えば、錠剤、丸薬、もしくはカプセルは、ゼラチン、ワックス、セラック（shellac）もしくは砂糖などでコーティングされることがある。シロップ剤もしくはエリキシル剤は活性物質、甘味剤としてスクロースもしくはフルクトース、保存剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、着色料およびチェリーもしくはオレンジ風味の香料を含むことがある。もちろん、剤形単位の調合に用いられるいかなる物質も薬学的に許容され、事実上、用いられる量においては毒性がないものでなくてはならない。さらに、本発明にかかる活性化合物が徐放性の調合剤および装置に含まれることもある。
【００７１】
活性化合物は、静脈内のもしくは腹腔内の輸液もしくは注射によって投与されることもある。活性化合物、もしくは、その塩の溶液は水で調製され、オプションとして毒性のない界面活性剤が混合される。分散剤（Dispersion）はグリセリン、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびこれらの混合物、およびオイル中でもまた調製される。通常の状況下（ordinary condition）で保管もしくは使用する場合は、これらの製剤には微生物の増殖を防ぐための保存料を含む。
【００７２】
輸液もしくは注射に適した薬学的剤形には、無菌の水溶液もしくは分散剤または、無菌の水溶液もしくは分散剤の即時調製（extemporaneous preparation）に適した活性成分を含む無菌の粉末があり、オプションとしてリポソーム（liposome）の中に封入される。いかなる場合でも最終的な剤形は、製造もしくは保管される条件下で、無菌の流動体でありかつ安定なものでなければならない。液体のキャリアーもしくは賦形剤は、例えば水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物性油脂、毒性のないグリセリルエステル、および適切なそれらの混合物を含む、溶媒または液体の分散媒である可能性がある。例えばリポソームを形成すること、分散剤の場合には所要の粒径を維持すること、もしくは界面活性剤を使用することにより、適切な流動性が保たれる。例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等のさまざまの抗菌剤および抗真菌剤を添加して微生物の活動を防ぐことができる。多くの場合においては、好ましくは、例えば糖類、バッファーもしくは塩化ナトリウムのような等張剤（isotonic agent）を含むと思われる。注射可能な組成物の吸収を遅らせるには、組成物中に例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような、吸収を遅らせる薬剤を加えることができる。
【００７３】
無菌の注射可能な溶液は、適当な溶媒中に先に列挙したほかの成分と共に、必要量の活性化合物を混合することと、必要に応じたその後の滅菌ろ過（filter sterilization）を行うこととによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の粉末の場合には、このような粉末の好ましい調製法は、あらかじめ滅菌ろ過された（sterile-filtered）溶液中に存在している活性物質（active ingredient）およびあらゆる付加的な望ましい成分の粉末が得られる、減圧乾燥およびフリーズドライ技術である。
【００７４】
局所的投与には、本発明にかかる化合物は純粋な形態（pure form）（すなわち、それらが液体である場合）で用いられることがある。しかしながら、一般には、皮膚科学的に許容されるキャリアー（固体であっても液体であっても良い）と組成物もしくは処方として、それらを皮膚に投与することが望ましい。
【００７５】
有用な固形のキャリアーには、タルク（talc）、クレー（clay）、微細結晶セルロース、シリカ、アルミナなどの微細に分割された固体が含まれる。有用な液体のキャリアーには、有効量の本発明にかかる化合物を溶解もしくは分散させることができ、オプションとして毒性のない界面活性剤の補助を伴って溶解もしくは分散させることができる、水、アルコール類もしくはグリコール類、または水-アルコール/グリコールの混合物が含まれる。芳香剤や付加的な抗菌剤のような補助剤が、与えられた用法についての性質を最適化するために加えられることがある。得られた液体組成物は、吸収パッド（absorbent pads）を使って用いることができ、また包帯および他の包帯剤に十分にしみこませて用いることができ、または、患部にポンプ式スプレーもしくはエアロゾルスプレーを用いてスプレーすることができる。
【００７６】
合成高分子、脂肪酸、脂肪酸塩および脂肪酸エステル、脂肪アルコール（fatty alcohol）、修飾されたセルロースもしくは修飾された無機化合物などの増粘剤もまた、塗り広げることができるペースト剤（spreadable paste）、ゲル剤、軟膏、石鹸などの、直接使用者の皮膚に用いるものを形成するために液体キャリアーと共に用いられる可能性がある。
【００７７】
構造式(I)の化合物を皮膚に送達するのに用いることができる有用な皮膚科学的組成物（dermatological compositions）の例は、本発明の属する分野で既知である。例えば、Jacquet et al. (U.S. Pat. No. 4,608,392)、Geria (U.S. Pat. No. 4,992,478)、Smith et al. (U.S. Pat. No. 4,559,157)、および、Wortzman (U.S. Pat. No. 4,820,508)を参照のこと。
【００７８】
構造式(I)の化合物の有用な投薬量（dosage）は、その生体外での活性と動物モデルの生体内での活性を比較して決定することができる。マウス、および、その他の動物での有効な投薬量からヒトへの投薬量を求める方法は既知である。例えばU.S. Pat. No. 4,938,949を参照のこと。
【００７９】
一般に、ローションのような、液体組成物中（liquid composition）の構造式(I)の化合物の濃度は、約0.1〜25wt%で、好ましくは約0.5〜10wt%である。ゲルや粉末のような、半固形もしくは固形の組成物での濃度は、約0.1〜5wt%で、好ましくは約0.5〜2.5wt%である。
【００８０】
処置に用いるのに必要な化合物もしくは活性の塩、または、それらの誘導体の量は、特定の塩によって様々であるだけでなく、投与経路、処置される状態の性質、ならびに、受療者の年齢および状態によっても様々であり、最終的には、かかりつけの医師もしくは臨床医学者の判断に任される。
【００８１】
しかしながら、一般的には、適切な投与量は、約0.5〜100mg/kgの範囲（例えば、一日当たり、体重に応じて約10〜75mg/kg投与する、受療者の体重1キログラム当たり一日に3〜50mgを投与するなど）で、好ましくは約6〜90mg/kg/dayの範囲で、もっとも好ましくは約15〜60mg/kg/dayである。
【００８２】
化合物は剤形単位（unit dosage form）で簡便に投与される。剤形単位あたりには活性成分が、例えば5〜1000mg、好都合には10〜750mg、もっとも好都合には50〜500mgが含まれる。
【００８３】
理想的には、ピーク時の活性成分の血漿濃度が0.5から約75μM、好ましくは約1から50μM、もっとも好ましくは約2から約30μMとなるように活性成分を投与すべきである。これは、例えば、その活性成分の0.05から5%溶液（オプションとして生理食塩水（saline）中の溶液）を静脈注射することによって、もしくは約1から100mgの活性成分を含んだ巨丸剤として経口投与することにより行うことができる。望ましい血中レベルは、約0.01〜5.0mg/kg/hrの継続的な輸液を行うことで、もしくは断続的な約0.4から15mg/kgの活性成分を含んだ輸液によって維持することができる。
【００８４】
望ましい投与量は、一回の投与量で、もしくは、分割した投与量として（例えば1日に2つ分の下位投与量（sub-dose）、3つ分の下位投与量、4つ分の下位投与量もしくはそれ以上の下位投与量として）適切な間隔で投与することもできる。下位投与量自体は、さらに分割（例えば、吸入器から複数回吸入、もしくは、複数滴を点眼するなどのように、大まかに分けた間隔の投与回数に合わせて）されることがある。
【００８５】
本発明は、本発明を限定すること無く、以下の実施例および例で説明される。
【００８６】
〔物質および方法〕
｛物質｝
合成用の化学物質は、Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI)、Sigma Chemicals (St. Louis, MO)、Advanced ChemTech Chemical Company (Louisville, KY)、および/または、NovaBiochem Chemical Comp any (Laufelfingen, Switzerland)から購入し、さらに精製することなく用いた。[γ-32P]ATP and [γ-35S]GTPは、Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)から購入した。CyQuant Cell Proliferation Assay Kit および Fluo-4AM Calcium Indicatorは、Molecular Probes (Eugene, OR)から購入した。CHO細胞およびT24細胞（CHO and T24 cells）は、American Type Culture Collection (Manassas, VA)から購入した。HEK293T細胞は、Dr. Judy White (Dept. of Cell Biology, University of Virginia, Charlottesville, VA)から得た。組織培養媒体（Tissue culture media）および通常のFBS（normal FBS）はInvitrogen (Carlsbad, CA)から得た。木炭/デキストラン処理したFBS（Charcoal/Dextran stripped FBS、（CD-FBS））は、Gemini Bio-Products (Woodland, CA)から得た。Gタンパク質α、βおよびγのDNAは、Dr. Doug Bayliss (Dept. of Pharmacology, University of Virginia)から贈られた。スフィンゴシン一リン酸は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。
【００８７】
｛例1：VPC23019、VPC23031、VPC25239およびVPC23089の合成｝
メタ置換された化合物であるVPC23031、VPC25239およびVPC23019の合成ルートは、3-ヨード-1-ニトロベンゼンと適切な末端アルキンとの薗頭カップリング（Sonogashira coupling）（6）から開始した。その後、得られた付加体のニトロ基と三重結合を同時に水素化してメタ置換アニリン類を生成した。次にこのアニリン類を、保護されているセリンに結合させて、得られたアミド類を遊離のアルコールを得るために水素化分解した。このアルコール類を続いて、リン酸化し、過酸化水素で酸化し、その後、酸触媒の下で広範囲に脱保護を行って、最終生成物であるVPC23031、VPC25239およびVPC23019を得た。オルト置換された化合物であるVPC23089は薗頭カップリングによる2-ヨードアニリンと1-オクチンの結合から開始した。得られたアニリンを、その後、保護されているセリンとPyBOP試薬を用いて結合させた。得られたアミドをその後、ベンジルエーテル保護基を取り除くと同時にアリール三重結合を還元するために、水素化/水素化分解ステップに進めた。遊離のアルコールを次にリン酸化し、過酸化水素で酸化し、その後、酸触媒の下で広範囲に脱保護を行って、最終生成物であるVPC23089を得た。NMRおよび質量分析を全ての構造を確かめるために用いた。VPC23019はAvanti Polar Lipidsから得ることができる。
【００８８】
｛例１A：VPC44116の合成｝
化合物VPC44116は、図６Aおよび図６Bに説明したとおりに調製した。N-BOC保護基は既知の方法によって除去される。得られた化合物の1Hスペクトルと13Cスペクトルは図７および図８に示したとおりである。質量分析のデータは以下のとおりである。MS m/z = 371.9、370.8(基準ピーク)、348.8、270.5、178.6。
【００８９】
｛例２：HEK293T細胞の一過性発現｝
適切なレセプタープラスミドDNA（ヒトS1P1レセプター、ヒトS1P2レセプター、ヒトS1P3レセプター、ヒトS1P4レセプター、ヒトS1P5レセプター、ヒトLPA1レセプター、ヒトLPA2レセプター、もしくはヒトLPA3レセプターをコードしたもの）を当量のヒトGi2α（S1P3には、変異型（C352F）ラットGi2αを使用）、ウシβ1タンパク質、およびウシγ2タンパク質をコードした発現プラスミドと混合する。その後、これらのDNAを、リン酸カルシウム沈殿法 (7) を用いてHEK293T細胞（ここで「T」はSV-40ウイルスのラージT抗原の発現を示す）の単層（monolayer）を導入するのに用いる。60時間後に細胞を集め、膜を調製し、等分して、使用するまでの間-70℃で保存される(8)。レセプターおよびGタンパク質の形質移入（transfection）は、[γ-35S]GTP結合アッセイ（[γ-35S]GTP binding assay）（後述)によって確認される。Gタンパク質のみで形質移入されたHEK293T細胞の分析では、アゴニストによる刺激に応答しなかった（図２Bを参照）。
【００９０】
｛例３：T24細胞中の安定的な発現｝
24細胞単層は、Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) か FuGENE 6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) を用いて、ヒトS1P1レセプター、ヒトS1P2レセプター、ヒトS1P3レセプターをコードしたDNAと、pIREスプロ2プラスミドDNA（pIRESpuro2 plasmid DNA）（Clontech, San Jose, CA,）とを同時形質移入する。ピューロマイシン（Sigma- Aldrich, St. Louis, MO）を培地に加えることによって、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（puromycin acetyltransferase gene）を発現したクローン群（Clonal population）を選択できる。T24細胞は単層中で37℃、5% CO2/95% 空気の雰囲気下、95% DMEM/F-12媒体、および、10%の木炭/デキストラン処理したFBSからなる培養基（growth media）中で培養される。
【００９１】
｛例４：[γ-35S]GTP結合アッセイ｝
前述のとおり[γ-35S]GTP結合アッセイを行う(8)。膜は1〜5μgのタンパク質を含み、5μgのサポニン、10μgのGDP、0.1nMの[γ-35S]GTP（1200 Ci/mmol）を含む0.1mlの結合バッファで（ｍM単位で含む：HEPES/50、NaCl/100、MgCl2/10、pH 7.5）インキュベートし、30分間、30℃で脂質標識し（indicated lipid(s)）、Brandel Cell Harvester (Gaithersburg, MD)を用いて回収される。その後、試料を結合した放射性核種で分析する。
【００９２】
｛例５：細胞移動アッセイ｝
細胞移動アッセイ（cell migration assay）は、0.1%ゼラチンで下側を覆ったポリカーボネート膜を含む修正したボイデンチャンバー（Boyden chamber）（処置される培養組織、直径24mm、厚み10μm、孔8μm、Transwell（登録商標）; Costar Corp., Cambridge, MA）を用いて行う。ポリカーボネート膜の下側は、一度、移動媒体（migration media）（フェノールレッドを含まないDMEM/F12、および、脂肪酸を含まない0.1% BSA）ですすぎ、2ミリリットルの移動媒体を含んでいる低いチャンバー（lower chamber）に浸す。ヒトS1P1レセプターDNAと安定的に形質移動したT24細胞は、木炭/デキストラン処理したFBSと10μg/mlピューロマイシンを含むDMEM/F12媒体中で、150x25mm の組織培養プレートに100%コンフルエンス（confluence）まで培養し、12時間以上、血清を欠乏させた。血清欠乏細胞（Serum-starved cells）は培養皿から10Xトリプシン-EDTA（5 mM EDTA および 25 mM HEPESを含むハンクス液（Hanks' balanced salt solution）、ならびに0.1%トリプシン；Invitrogen, San Diego, CA）で取り除き、移動バッファ（migration buffer）中で懸濁させ、遠心分離（130 x gで5分間）で集めた。上澄みを吸引によって除去し、cell pelletを移動媒体中に再懸濁させた（106 cells/ml）。1ミリリットルのセル懸濁液を各移動チャンバーの上から加え、S1PアゴニストVPC22277（10nM）を低いチャンバーに加えた。低いチャンバーに加えたアンタゴニストの存在下、もしくは、存在しない状態で（VPC23019 (0 nM〜1000 nM)、VPC23019、VPC23031、VPC23089、およびVPC25239 (全て 50 nM)）、細胞の膜の下側への移動が許容された（4時間、37℃）。上部チャンバー（upper chamber）中の非遊走細胞（non-migrating cell）は吸引によって除去され、膜の底面に付着している遊走細胞（migratory cells）は、10X Trypsin-EDTA中で1分間室温においてインキュベーションし、細胞を膜から除去するためにプレートを軽くたたくことにより単離された。膜ごとの遊走細胞の塊は100μlの細胞懸濁液と同じ体積のCyQuant染料溶液（3.0mlの2X溶解バッファおよび15μl CyQuant染料）とを混合し、得られた溶液の蛍光強度をFlexStation（登録商標） fluorimeter (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて定量することにより評価した。それぞれの測定は2つの個々の移動チャンバーでの平均を表す。VPC23019に付随する拮抗作用の可逆性を測定するために、細胞を10μM VPC23019と共に37℃で30分間インキュベートした。単層はリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、直ちに前述の細胞移動アッセイのための処理をした。
【００９３】
｛例６：細胞内のカルシウム動員の測定｝
未変性のT24細胞、および、ヒトS1P2レセプターDNAかヒトS1P3レセプターDNAかのどちらかを安定に形質移入したT24細胞の細胞内のカルシウムを測定するのに、FlexStation（登録商標） fluorimeter (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いた。細胞を96ウェル（96-well）の透明な底面黒色マイクロプレート（clear bottom black microplate）（Corning Costar Corp.）に播き（〜50000 細胞/ウェル）、37℃で一晩放置した。添加液（20 mM HEPES、脂肪酸を含まない0.1% BSA、および2.5mMプロベネシド（probenecid）を含むハンクス液pH 6.4）中の4 μM Fluo-4AMエステルによって、30分間37℃で染料を添加した。細胞単層をリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄した後、添加液を加え、FlexStation（登録商標）中において、細胞を一連の化合物に25℃で3分間接触させた。全ての場合において、個々の化合物のそれぞれの濃度について、少なくとも3回の実験を行った。VPC23019（10μl）に付随する拮抗作用の可逆性を測定するために、化合物を添加染料と共に細胞に加えて37℃で30分間インキュベートした。細胞はリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、直ちに前述のように化合物に接触させた。
【００９４】
｛例７：VPC23019のS1P1レセプターDNAおよびS1P3レセプターとの結合定数の測定｝
VPC23019のS1P1レセプターDNAおよびS1P3レセプターとの結合定数（Kb）はLewとAngusによって論じられた非線形回帰法(9)を用いてフィッテイングした曲線からSchild分析して決定した。つまり、アゴニストが存在しないときと様々な濃度のアゴニストが存在する場合でのアゴニスト投与量依存曲線から得られたEC50値のlogの値を負にしたものをプロットすることによって生じた最もフィットする曲線の非線形分析を、Kb値を得るためにアンタゴニストの濃度に対してプロットした。アンタゴニストが単純な競合的相互作用の判断基準にあっているかどうかを確立するためにF-テスト分析も行った。
【００９５】
｛例８：S1P放射標識｝
[32P]-S1Pは、スフィンゴシンをインキュベートすることによって調製し、[γ-32P]ATPをHEK293T細胞からの細胞可溶化物とともに、ヒトスフィンゴシンキナーゼ2型DNA（human sphingosine kinase type 2 DNA）と一過性に形質移入した。200μlの反応物には、0.025mMスフィンゴシン、1mCi [γ-32P]ATP (7000 Ci/mmol)およびキナーゼバッファ（ｍM単位で含む： Mg(C2H3O2) (50mM Tris中、pH 7.5)/10、NaF/10、および、セミカルバジド（semicarbizide）/2）が含まれる。反応は、20μgの細胞可溶化物を加え、37℃で30分以上インキュベーションすることから開始した。[32P]-S1Pは、1.0N HCl、2.0M KCl、メタノール、および、クロロホルムを反応混合物に加えて抽出し、ボルテックスし（vortexed）、1000 x gで5分〜10分間遠心分離した。有機相を分離し、水相部分を残したまま、さらに2回抽出した。混合した有機相部分を窒素気流下で乾燥させ、脂肪酸を含まない0.1%BSA水溶液（aqueous 0.1% fatty acid free BSA）に再懸濁させた。得られたもの（[32P]-S1P）の比放射能は、放射標識した[γ-32P]ATPの比放射能（すなわち、7000 Ci/mmol)として見積もった。
【００９６】
｛例９：[32P]-S1P結合アッセイ｝
レセプターおよびGタンパク質DNAの両方と一過性に形質移入したHEK293T細胞からのタンパク質5μgを含む膜を、0.5mlの結合バッファ中（ｍM単位で含む：HEPES/50、NaCl/100、MgCl2/10、pH 7.5）でインキュベートし、50pM [32P]S1P、室温で1時間脂質標識した。結合したリガンドは遊離のリガンドと急速ろ過によって分離し、液体シンチレーションカウンターで分析した。非特異的結合は、過剰のS1P存在下での膜への、レセプターおよびGタンパク質DNAと一過性に形質移入したHEK293T細胞（熱変性させたものと熱変性させていないものの両方）からの放射性リガンドの残余結合（residual binding）として測定し、それは通常は全体の結合の60%であった。リガンド-レセプター相互作用に関する結合定数（Ki）は、Chang-Prusoffの式（Chang-Prusoff equation、Ki = IC50/(1+[L]/Kd）を用いて、IC50値から決定した。この式を適用するにあたって、放射性リガンドの濃度[L]は0.05nMでKd値はS1P-S1P相互作用で報告された値（すなわち、8.1nM（12））を用いた。
【００９７】
〈 統計的分析 〉
全ての投与量依存性曲線についてのEC50値およびIC50値は、Graphpad Prism（コピーライト）プログラムを用いた全てのデータの非線形回帰分析によって決定した。集めたデータについての誤差は標準誤差（S.E.M.）で報告している。
【００９８】
｛例１０：結果｝
〈 VPC23019はS1P1レセプターおよびS1P3レセプターへの受容体活性化作用を有さない。 〉
S1PアナログSARについての我々の実験中に、我々はアリール-アミド化合物VPC23019（図１）が、破砕細胞[γ-35S]GTP結合アッセイ（broken-cell [γ-35S]GTP binding assay）においてS1P1レセプター（図２Ａ）およびS1P3レセプター（図２Ｃ）へのアゴニスト活性を有さないことを発見した。実際には、VPC23019の濃度が100nM以上のときにこのアッセイにおいて逆作動を示唆する特性が観察された。しかしながら、中性アンタゴニストの存在下でのこの活性により、VPC23019についての観察結果をこれらの濃度での逆作動薬活性として特徴付ける必要があると考えられる。これらの化合物が利用（available）できないため、内在性の膜-関連アゴニスト活性についてのVPC23019の変化によって、これらの濃度で観測された[γ-35S]GTP結合の減少が起きたのだと考えることができる。このアゴニスト活性の欠落は、T24細胞（膀胱癌に由来）を用いた全細胞アッセイによって確かめられた。ここで、S1P1レセプター（T24-S1P1）かS1P3レセプター（T24-S1P3）は安定に発現した。RT-PCR分析では、T24細胞中の内在的S1P2レセプターmRNAのみが検出された。しかしながら、応答の有効性は同じであったが、S1P1、S1P2、もしくはS1P3（図２E）の組み換え型が安定に発現しているときは、S1Pは少なくとも100倍以上強力である。したがって、T24細胞系によって形質移入によって導入された個々のS1Pレセプターを調べる機会が提供された。多くの研究によってS1Pが細胞移動を推進することが示されている。しかしながら、最近、S1Pは移動を阻害する（S1P2レセプターの刺激による可能性がある）可能性もあることが示された(10)。この阻害効果を避けるために、我々はVPC22277（図１）を用いた。VPC22277はS1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニストであるがS1P2レセプターのアゴニストではないS1Pアナログである（表１）―（アリールアミド類の全ての化合物（11）はS1P2レセプターへの活性を全く有さない）。pEC50値は、最大の[γ-35S]GTP結合の50%となる化合物のモル濃度の-log（-log molar concentration）である。pEC50値は、pEC50値±S.E.M.で報告する。
【００９９】
【表１】
2008522977.tif 000009
【０１００】
T24-S1P1細胞の移動がVPC22277によって誘発される可能性があることが見出されたが、VPC23019（図２D）に対する応答では全く移動が起こらなかった。同様に、T24-S1P3細胞を用いた多細胞全体でのカルシウム動員の研究では、S1PおよびVPC23019についての投与量依存性のカルシウム動員を観測した（図２E)。しかしながら、この活性はS1P3レセプターの刺激によるものではなく、VPC2301に媒介された（VPC2301-meidated）カルシウム動員が多くの型のT24細胞について観測された（図２F）。したがって、VPC23019は、破砕細胞アッセイおよび全細胞アッセイの両方を用いると、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターに対するアゴニスト活性を有さない。
【０１０１】
〈 VPC23019はS1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を阻害する。 〉
VPC23019がS1P1レセプターもしくはS1P3レセプターに対しての逆作動薬活性を示すという知見により、我々はこの化合物がアゴニスト活性を阻害するかについて調べた。[γ-35S]GTP結合アッセイを用いて、我々はS1P1レセプター（図３A）かそれともS1P3レセプター（図３B）について、VPC23019濃度が増加するにつれてS1Pのインキュベーションが投与量依存性（S1P濃度効果曲線の右側への平行移動）を示すことを見出した。アゴニストに媒介された応答についてのこのシフトは2種類の細胞全体のセルアッセイ（セル移動アッセイ（図３C）およびカルシウム動員）でも見られた。VPC23019は、30μMまでの濃度のLPA1-3EDGファミリーレセプターに活性を示さなかったし、これらのサイトでのLPAの活性の阻害もしなかった。
【０１０２】
〈 VPC23019 S1Pレセプター親和性 〉
[γ-35S]GTP結合アッセイでのVPC23019に関係するアンタゴニスト活性についてのSchild分析により、S1P1レセプター（図３A）およびS1P3レセプター（図３B）についてpKb値、7.49 ±0.15および5.98 ±0.08がそれぞれ得られた。さらに、化合物が競合的アゴニストとして作用するかを予測するLewとAngusによって論じられた非線形回帰法(9)によって、VPC23019が両方のレセプターに対して競合的アゴニストとして作用することが示唆された。T24-S1P3細胞でのカルシウム動員のSchild分析によりVPC23019のKb値が得られ、そのKb値は[γ-35S]GTP結合アッセイで観測されたもののおよそ10倍以下であった。しかしながら、非線形回帰分析により、T24-S1P3細胞でのカルシウム動員アッセイにおいて、VPC23019が競合的アゴニストとして作用しないことが示唆された。重要なことには、両方の細胞全体のS1Pレセプターアッセイ（Ca2+動員（S1P3、図３D）および細胞移動（S1P1、開示なし））では、アンタゴニストを洗い流した後、完全に回復した。したがって、VPC23019の拮抗作用は可逆的であり、さらには十分に克服可能（surmountable）であって、競合的アンタゴニストに不可欠な基準を満たしている。
【０１０３】
VPC23019のS1P1レセプターおよびS1P3レセプターに対する親和性を直接測定するために、我々はS1P1レセプターおよびS1P3レセプターに関連するリガンド-レセプター相互作用を、S1PおよびVPC23019との競合作用について[32P]-S1Pを用いたレセプター結合アッセイにより調べた。放射性リガンド結合アッセイ（図４A）でのS1Pの分析から、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターについてpKi値、8.96および8.12がそれぞれ得られた。これらの値は放射標識したS1Pのこれらのレセプターに対する結合についてのpKd値の文献値（12-14）と一致する。放射性リガンド結合アッセイでも、pKi値とS1P1レセプターとS1P3レセプターとの両方についてSchild分析で得られたVPC23019のpKb値の文献値（すなわち、pKi値はそれぞれ7.86および5.93、図４Bおよび表２）との間で非常に良い相関がみられた。最後にVPC23019はS1P2レセプターに対するアゴニスト活性を有さないことも見出され、S1P2レセプターとの放射性リガンド結合調査から、S1P2レセプターの濃度が10μM（データの開示なし）までは、[32P]-S1PとS1P2レセプターとの結合にVPC23019が影響しないことが明らかになった。
【０１０４】
pIC50値は、[32P]-S1P結合の最大の阻害の50%となる化合物のモル濃度の-logである。pKi値は、Chang-Prusoffの式（Chang-Prusoff equation、Ki = IC50/(1+[L]/Kd）を用いて予測された阻害結合定数（inhibitory binding constant）（Ki）の-logである。この式を適用するにあたって、放射性リガンド（L）の濃度は0.05nMでKd値はS1P-S1P1相互作用で報告された値（すなわち、8.1nM（12））を用いた。結合定数（pKb）は、LewとAngusの修正したSchild分析(9)によって計算した。pKi値およびpKb値は、pKi±S.E.M.およびpKb±S.E.M.でそれぞれ報告する。
【０１０５】
【表２】
2008522977.tif 000010
【０１０６】
｛例１１｝
以下に、構造式Iの化合物（例えば、化合物VPC44116）を含む、ヒトへの治癒的使用もしくは予防的使用のための、個々の薬学的剤形を説明する。
【０１０７】
2008522977.tif 000011
2008522977.tif 000012
【０１０８】
上記の処方は薬学の技術分野で公知である従来の方法を用いても良い。
【０１０９】
〔参考文献〕
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【０１１０】
本明細書で用いられている略語は、化学分野および生物学的分野におけるそれらの通常の意味である。本明細書で参照した全ての刊行物、特許、および特許文書は、あたかも個々に参照されているかのように、参照することによって本明細書に含まれる。矛盾が生じている場合においては、本明細書で開示されている定義が有効である。本発明は様々な具体的および好ましい実施例および技術に関連して記載されている。しかしながら、これらの実施例に対する本発明の本質から外れていないであろう、さまざまな修正がなされることを、当業者は理解できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、スフィンゴシン一リン酸、ならびに、VPC22277、VPC23019、VPC23031、VPC23089 および VPC25239の構造を説明する。
【図２Ａ】図２：（パネルA-F）は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ（broken-cell binding assay）測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。S1P1レセプター（パネルA）およびS1P3レセプター（パネルC）の濃度依存性の刺激がS1P（黒丸）については見られるが、VPC23019（白丸）では見られなかった。レセプタープラスミドDNAを排除したとき、有意な[γ35S]GTP結合は10μM S1P（パネルB）では見られなかった。このことは、活性がレセプター発現の関数であることを示す。[γ35S]GTPの結合は10μM S1PでレセプターとGi2αプラスミドDNAだけで一過性に形質移入されたHEK393T細胞において観測された。しかしながら、応答は、レセプターと3種類全てのGタンパク質プラスミドDNAの両方を添加した場合の3倍以下であった（パネルB）。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（disintegrations per minute、dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルD：ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動が、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）で観測されたが、VPC23019（1nM 〜 1000nM）では観測されなかったことを表している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、0.01% BSAキャリアー（最小値）、およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルEおよびF：未変性のT24細胞（挿入図（inset））、および、ヒトS1P3レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の細胞内カルシウム動員の濃度依存性が、S1Pでは見られたが（黒丸）、VPC23019では見られなかった（白丸）ことを表している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図２Ｂ】図２：（パネルA-F）は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ（broken-cell binding assay）測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。S1P1レセプター（パネルA）およびS1P3レセプター（パネルC）の濃度依存性の刺激がS1P（黒丸）については見られるが、VPC23019（白丸）では見られなかった。レセプタープラスミドDNAを排除したとき、有意な[γ35S]GTP結合は10μM S1P（パネルB）では見られなかった。このことは、活性がレセプター発現の関数であることを示す。[γ35S]GTPの結合は10μM S1PでレセプターとGi2αプラスミドDNAだけで一過性に形質移入されたHEK393T細胞において観測された。しかしながら、応答は、レセプターと3種類全てのGタンパク質プラスミドDNAの両方を添加した場合の3倍以下であった（パネルB）。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（disintegrations per minute、dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルD：ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動が、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）で観測されたが、VPC23019（1nM 〜 1000nM）では観測されなかったことを表している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、0.01% BSAキャリアー（最小値）、およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルEおよびF：未変性のT24細胞（挿入図（inset））、および、ヒトS1P3レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の細胞内カルシウム動員の濃度依存性が、S1Pでは見られたが（黒丸）、VPC23019では見られなかった（白丸）ことを表している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図２Ｃ】図２：（パネルA-F）は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ（broken-cell binding assay）測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。S1P1レセプター（パネルA）およびS1P3レセプター（パネルC）の濃度依存性の刺激がS1P（黒丸）については見られるが、VPC23019（白丸）では見られなかった。レセプタープラスミドDNAを排除したとき、有意な[γ35S]GTP結合は10μM S1P（パネルB）では見られなかった。このことは、活性がレセプター発現の関数であることを示す。[γ35S]GTPの結合は10μM S1PでレセプターとGi2αプラスミドDNAだけで一過性に形質移入されたHEK393T細胞において観測された。しかしながら、応答は、レセプターと3種類全てのGタンパク質プラスミドDNAの両方を添加した場合の3倍以下であった（パネルB）。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（disintegrations per minute、dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルD：ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動が、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）で観測されたが、VPC23019（1nM 〜 1000nM）では観測されなかったことを表している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、0.01% BSAキャリアー（最小値）、およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルEおよびF：未変性のT24細胞（挿入図（inset））、および、ヒトS1P3レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の細胞内カルシウム動員の濃度依存性が、S1Pでは見られたが（黒丸）、VPC23019では見られなかった（白丸）ことを表している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図２Ｄ】図２：（パネルA-F）は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ（broken-cell binding assay）測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。S1P1レセプター（パネルA）およびS1P3レセプター（パネルC）の濃度依存性の刺激がS1P（黒丸）については見られるが、VPC23019（白丸）では見られなかった。レセプタープラスミドDNAを排除したとき、有意な[γ35S]GTP結合は10μM S1P（パネルB）では見られなかった。このことは、活性がレセプター発現の関数であることを示す。[γ35S]GTPの結合は10μM S1PでレセプターとGi2αプラスミドDNAだけで一過性に形質移入されたHEK393T細胞において観測された。しかしながら、応答は、レセプターと3種類全てのGタンパク質プラスミドDNAの両方を添加した場合の3倍以下であった（パネルB）。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（disintegrations per minute、dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルD：ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動が、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）で観測されたが、VPC23019（1nM 〜 1000nM）では観測されなかったことを表している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、0.01% BSAキャリアー（最小値）、およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルEおよびF：未変性のT24細胞（挿入図（inset））、および、ヒトS1P3レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の細胞内カルシウム動員の濃度依存性が、S1Pでは見られたが（黒丸）、VPC23019では見られなかった（白丸）ことを表している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図２Ｅ】図２：（パネルA-F）は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ（broken-cell binding assay）測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。S1P1レセプター（パネルA）およびS1P3レセプター（パネルC）の濃度依存性の刺激がS1P（黒丸）については見られるが、VPC23019（白丸）では見られなかった。レセプタープラスミドDNAを排除したとき、有意な[γ35S]GTP結合は10μM S1P（パネルB）では見られなかった。このことは、活性がレセプター発現の関数であることを示す。[γ35S]GTPの結合は10μM S1PでレセプターとGi2αプラスミドDNAだけで一過性に形質移入されたHEK393T細胞において観測された。しかしながら、応答は、レセプターと3種類全てのGタンパク質プラスミドDNAの両方を添加した場合の3倍以下であった（パネルB）。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（disintegrations per minute、dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルD：ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動が、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）で観測されたが、VPC23019（1nM 〜 1000nM）では観測されなかったことを表している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、0.01% BSAキャリアー（最小値）、およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルEおよびF：未変性のT24細胞（挿入図（inset））、および、ヒトS1P3レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の細胞内カルシウム動員の濃度依存性が、S1Pでは見られたが（黒丸）、VPC23019では見られなかった（白丸）ことを表している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図２Ｆ】図２：（パネルA-F）は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ（broken-cell binding assay）測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。S1P1レセプター（パネルA）およびS1P3レセプター（パネルC）の濃度依存性の刺激がS1P（黒丸）については見られるが、VPC23019（白丸）では見られなかった。レセプタープラスミドDNAを排除したとき、有意な[γ35S]GTP結合は10μM S1P（パネルB）では見られなかった。このことは、活性がレセプター発現の関数であることを示す。[γ35S]GTPの結合は10μM S1PでレセプターとGi2αプラスミドDNAだけで一過性に形質移入されたHEK393T細胞において観測された。しかしながら、応答は、レセプターと3種類全てのGタンパク質プラスミドDNAの両方を添加した場合の3倍以下であった（パネルB）。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（disintegrations per minute、dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルD：ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動が、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）で観測されたが、VPC23019（1nM 〜 1000nM）では観測されなかったことを表している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、0.01% BSAキャリアー（最小値）、およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルEおよびF：未変性のT24細胞（挿入図（inset））、および、ヒトS1P3レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の細胞内カルシウム動員の濃度依存性が、S1Pでは見られたが（黒丸）、VPC23019では見られなかった（白丸）ことを表している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図３Ａ】図３：（パネルA-D）パネルAおよびBはS1P1レセプターおよびS1P3レセプターのVPC23019による拮抗作用を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。[γ35S]GTP破砕細胞結合アッセイでのS1P1、および、S1P3についてのS1P刺激の阻害を、VPC23019が存在しないとき（黒丸）、または、VPC23019が10000nM（白丸）、1000nM（白四角）、および、100nM（黒四角）の濃度で存在するときについて調べた。結合定数（pKb）は、pKb±S.E.M.として報告した。データポイントは6重（hextuplicate）で、それぞれのレセプターについての、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（dpm）値で正規化した。結合がゼロ%のときおよび100%のときについての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルCは、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）存在下での、ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動の阻害が、VPC23019の濃度が10nM、100nMおよび1000nMで観察された結果を示している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、BSA（最小値）およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルDは、ヒトS1P3レセプター（実線）を安定に形質移入したT24細胞で観測されたCa2+移動が、VPC23019（10000nM − 点線)による前処理の後に洗い流すと変化しないことを示している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図３Ｂ】図３：（パネルA-D）パネルAおよびBはS1P1レセプターおよびS1P3レセプターのVPC23019による拮抗作用を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。[γ35S]GTP破砕細胞結合アッセイでのS1P1、および、S1P3についてのS1P刺激の阻害を、VPC23019が存在しないとき（黒丸）、または、VPC23019が10000nM（白丸）、1000nM（白四角）、および、100nM（黒四角）の濃度で存在するときについて調べた。結合定数（pKb）は、pKb±S.E.M.として報告した。データポイントは6重（hextuplicate）で、それぞれのレセプターについての、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（dpm）値で正規化した。結合がゼロ%のときおよび100%のときについての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルCは、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）存在下での、ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動の阻害が、VPC23019の濃度が10nM、100nMおよび1000nMで観察された結果を示している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、BSA（最小値）およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルDは、ヒトS1P3レセプター（実線）を安定に形質移入したT24細胞で観測されたCa2+移動が、VPC23019（10000nM − 点線)による前処理の後に洗い流すと変化しないことを示している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図３Ｃ】図３：（パネルA-D）パネルAおよびBはS1P1レセプターおよびS1P3レセプターのVPC23019による拮抗作用を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。[γ35S]GTP破砕細胞結合アッセイでのS1P1、および、S1P3についてのS1P刺激の阻害を、VPC23019が存在しないとき（黒丸）、または、VPC23019が10000nM（白丸）、1000nM（白四角）、および、100nM（黒四角）の濃度で存在するときについて調べた。結合定数（pKb）は、pKb±S.E.M.として報告した。データポイントは6重（hextuplicate）で、それぞれのレセプターについての、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（dpm）値で正規化した。結合がゼロ%のときおよび100%のときについての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルCは、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）存在下での、ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動の阻害が、VPC23019の濃度が10nM、100nMおよび1000nMで観察された結果を示している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、BSA（最小値）およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルDは、ヒトS1P3レセプター（実線）を安定に形質移入したT24細胞で観測されたCa2+移動が、VPC23019（10000nM − 点線)による前処理の後に洗い流すと変化しないことを示している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図３Ｄ】図３：（パネルA-D）パネルAおよびBはS1P1レセプターおよびS1P3レセプターのVPC23019による拮抗作用を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。[γ35S]GTP破砕細胞結合アッセイでのS1P1、および、S1P3についてのS1P刺激の阻害を、VPC23019が存在しないとき（黒丸）、または、VPC23019が10000nM（白丸）、1000nM（白四角）、および、100nM（黒四角）の濃度で存在するときについて調べた。結合定数（pKb）は、pKb±S.E.M.として報告した。データポイントは6重（hextuplicate）で、それぞれのレセプターについての、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（dpm）値で正規化した。結合がゼロ%のときおよび100%のときについての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルCは、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）存在下での、ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動の阻害が、VPC23019の濃度が10nM、100nMおよび1000nMで観察された結果を示している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、BSA（最小値）およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルDは、ヒトS1P3レセプター（実線）を安定に形質移入したT24細胞で観測されたCa2+移動が、VPC23019（10000nM − 点線)による前処理の後に洗い流すと変化しないことを示している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図４Ａ】図４（パネルAおよびB）は、放射標識したS1Pが、S1P1およびS1P3においてVPC23019によって置き換わることを示している。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。放射標識されたS1Pとの置換は、[32P]S1Pとレセプターの結合を測定する膜結合アッセイを用いて決定した。[32P]S1Pの置換の投与量依存性を、S1P(A) およびVPC23019（B）について、S1P1レセプター（黒丸）とS1P3レセプター（白丸）の両方、それぞれ測定した。pKi値は、阻害結合定数（inhibitory binding constant）（Ki）の-logであり、pKi±S.E.M.として報告する。データポイントは3重で、それぞれのレセプターについて、代表的な2回の独立した実験のものである。結合の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ10000dpm/tubeおよび30000dpm/tubeである。非特異的結合は、過剰のS1P存在下での膜への、レセプターおよびGタンパク質DNAと一過性に形質移入したHEK293T細胞（熱変性させたものと熱変性させていないものの両方）からの放射性リガンドの残余結合（residual binding）として測定し、それは通常は全体の結合の60%であった。
【図４Ｂ】図４（パネルAおよびB）は、放射標識したS1Pが、S1P1およびS1P3においてVPC23019によって置き換わることを示している。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。放射標識されたS1Pとの置換は、[32P]S1Pとレセプターの結合を測定する膜結合アッセイを用いて決定した。[32P]S1Pの置換の投与量依存性を、S1P(A) およびVPC23019（B）について、S1P1レセプター（黒丸）とS1P3レセプター（白丸）の両方、それぞれ測定した。pKi値は、阻害結合定数（inhibitory binding constant）（Ki）の-logであり、pKi±S.E.M.として報告する。データポイントは3重で、それぞれのレセプターについて、代表的な2回の独立した実験のものである。結合の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ10000dpm/tubeおよび30000dpm/tubeである。非特異的結合は、過剰のS1P存在下での膜への、レセプターおよびGタンパク質DNAと一過性に形質移入したHEK293T細胞（熱変性させたものと熱変性させていないものの両方）からの放射性リガンドの残余結合（residual binding）として測定し、それは通常は全体の結合の60%であった。
【図５Ａ】図５（パネルAおよびB）は、S1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてのアゴニスト応答がVPC23019関連のアナログで変化することを示している。パネルA：S1P1アゴニストVPC22277（10nM）存在下での、ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動の阻害が、VPC23019、VPC23031、VPC23089、および、VPC25239（50nM）の存在下で観察された結果を示している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、BSA（最小値）およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。パネルB：ヒトS1P3レセプターを安定に形質移入したT24細胞の刺激によるCa2+移動の阻害を、非存在下（黒丸）、もしくは、10000nMのVPC23031存在下（黒四角）、VPC23089存在下（白丸）、VPC25239存在下（白四角）で実験した。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図５Ｂ】図５（パネルAおよびB）は、S1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてのアゴニスト応答がVPC23019関連のアナログで変化することを示している。パネルA：S1P1アゴニストVPC22277（10nM）存在下での、ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動の阻害が、VPC23019、VPC23031、VPC23089、および、VPC25239（50nM）の存在下で観察された結果を示している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、BSA（最小値）およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。パネルB：ヒトS1P3レセプターを安定に形質移入したT24細胞の刺激によるCa2+移動の阻害を、非存在下（黒丸）、もしくは、10000nMのVPC23031存在下（黒四角）、VPC23089存在下（白丸）、VPC25239存在下（白四角）で実験した。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図６Ａ】図６（パネルA-B）は、本発明に係る化合物（特に、VPC44116）の合成の合成スキームを示している。
【図６Ｂ】図６（パネルA-B）は、本発明に係る化合物（特に、VPC44116）の合成の合成スキームを示している。
【図７】図７は、本発明にかかる化合物である化合物VPC44116の1H NMRスペクトルである。
【図８】図８は、本発明にかかる化合物である化合物VPC44116の13C NMRスペクトルである。
【図１】
2008522977.tif 000019
【図２Ａ】
2008522977.tif 000020
【図２Ｂ】
2008522977.tif 000021
【図２Ｃ】
2008522977.tif 000022
【図２Ｄ】
2008522977.tif 000023
【図２Ｅ】
2008522977.tif 000024
【図２Ｆ】
2008522977.tif 000025
【図３Ａ】
2008522977.tif 000026
【図３Ｂ】
2008522977.tif 000027
【図３Ｃ】
2008522977.tif 000028
【図３Ｄ】
2008522977.tif 000029
【図４Ａ】
2008522977.tif 000030
【図４Ｂ】
2008522977.tif 000031
【図５Ａ】
2008522977.tif 000032
【図５Ｂ】
2008522977.tif 000033
【図６Ａ】
2008522977.tif 000034
【図６Ｂ】
2008522977.tif 000035
【図７】
2008522977.tif 000036
【図８】
2008522977.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月28日(2008.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造(I)を有する化合物、あるいは薬学的に許容されるそのエステルもしくは塩。
【化１】
2008522977.tif 000038
ここで、XおよびYは独立に、水素、OH、フッ素、塩素、PO3、もしくは、メチル基であるか、XおよびYが結合している原子とともにケト基を構成するか、であって、また、
R1は、水素、ハロ基、トリフルオロメチル基、(C1-C6)-アルキル基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、もしくはシアノ基で置換された(C1-C6)-アルキル基であり、
R2は、(C1-C10)-アルキル基、アルキル置換された(C3-C8)-シクロアルキル基、(C2-C6)-アルケニル基、(C2-C6)-アルキニル基、アリール基、アルキル置換されたアリール基、アリールアルキル基、もしくは、アリール置換アリールアルキル基である。
【請求項２】
R2がアミドに対して、オルト位もしくはメタ位であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
R2がアミドに対して、メタ位であることを特徴とする、請求項１もしくは２記載の化合物。
【請求項４】
XおよびYが独立に、フッ素、もしくは、塩素であることを特徴とする、請求項１〜３記載の化合物。
【請求項５】
XおよびYならびにそれらが結合している原子が>C=O基を構成することを特徴とする、請求項１〜３記載の化合物。
【請求項６】
前記R2のアルキル基が5原子から8原子の炭素原子を有することを特徴とする、請求項１〜５記載の化合物。
【請求項７】
前記構造式(I)に係る化合物のエステルであることを特徴とする、請求項１〜６記載の化合物。
【請求項８】
以下の構造を有することを特徴とする、請求項１〜７記載の化合物。
【化２】
2008522977.tif 000039
【請求項９】
以下の構造を有することを特徴とする、請求項８記載の化合物。
【化３】
2008522977.tif 000040
【請求項１０】
前記化合物が構造式(I)の化合物の薬学的に許容される塩であることを特徴とする、請求項１〜９記載の化合物。
【請求項１１】
前記化合物が構造式(I)の化合物の薬学的に許容されるエステルであることを特徴とする、請求項１〜９記載の化合物。
【請求項１２】
エステル基が、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ベンジルエステル、もしくは以下の構造を有することを特徴とする、請求項１１記載の化合物。
【化４】
2008522977.tif 000041
【請求項１３】
以下の構造を有することを特徴とする、請求項１２記載の化合物。
【化５】
2008522977.tif 000042
【請求項１４】
以下の構造を有することを特徴とする化合物、その薬学的に許容されるエステルもしくは塩。
【化６】
2008522977.tif 000043
【請求項１５】
前記化合物の薬学的に許容される塩であることを特徴とする、請求項１４記載の化合物。
【請求項１６】
前記化合物の薬学的に許容されるエステルであることを特徴とする、請求項１４記載の化合物。
【請求項１７】
請求項１〜１６記載の化合物および薬学的に許容されるキャリアーを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
医学療法に使用するための、請求項１〜１６のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９】
薬剤を調製するための、請求項１〜１６のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項２０】
同種移植片生着を延長させるために有用な薬剤を調製するための、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
腫瘍性の疾病を処置するために有用な薬剤を調製するための、請求項１９記載の使用。
【請求項２２】
自己免疫疾患を処置するために有用な薬剤を調製するための、請求項１９記載の使用。
【請求項２３】
心不整脈を処置するために有用な薬剤を調製するための、請求項１９記載の使用。
【請求項２４】
前記薬剤が液体のキャリアーを含むことを特徴とする、請求項１９〜２３記載の使用。
【請求項２５】
前記薬剤が、非経口的投与、エアロゾル投与、もしくは、経皮的投与に適していることを特徴とする、請求項１９〜２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
処置を必要とする受療者に、１種類以上の請求項１〜１６に記載の化合物を投与するためのキットであって、
前記キットは１種類以上の化合物を含む薬学的組成物、アプリケーター、および、それらの使用の説明をするもの
を含むことを特徴とするキット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
スフィンゴシン=1-リン酸（Sphingosine 1-phosphate (S1P)）は、内皮細胞分化遺伝子（endothelial cell differentiation gene (EDG)）レセプターファミリーのうちの5種類のものを刺激することによって様々な細胞の応答を引き起こすリゾリン脂質メディエータ（lysophospholipid mediator）である。EDGレセプターはGタンパク質共役レセプター（G-protein coupled receptors (GPCRs)）であって、刺激を受けると、セカンドメッセンジャー信号を、ヘテロ三量体Gタンパクアルファ（Gα）サブユニットおよびGタンパクベータ−ガンマ（Gβγ）二量体を活性化させることによって伝達する。すると最終的には、S1P駆動シグナル伝達（S1P-driven signaling）の結果として、細胞の存続、細胞移動の増加、および、多くの場合には有糸分裂誘発が起こる。S1Pレセプターをターゲットとしたアゴニストの最近の開発からは、生理的ホメオスタシスにおけるこの信号伝達システムの役割に関する知見が得られている。例えば、リン酸化反応に携わる免疫調節剤FTY720（2-アミノ-2[2-(4-オクチルフェニル)エチル]プロパン-1,3-ジオール）は、汎S1Pレセプターアゴニスト（pan S1P receptor agonist）であって、この存在からS1Pトーン（S1P tone）がリンパ球の輸送に関係していることが明らかとなった（1-4）。S1Pレセプターアゴニストの有用性は全く想定外のものではあったが、事前の推論はS1Pアンタゴニストが抗血管新生薬となる可能性（まだ実現されていない）に集中していた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
〔略語〕
S1P  スフィンゴシン=1-リン酸、GPCR  Gタンパク質共役レセプター、SAR  構造活性相関、EDG  内皮細胞分化遺伝子、EAE  実験的自己免疫性脳脊髄炎、NOD  非肥満性糖尿病、TNFα  腫瘍壊死因子α、HDL  高密度リポタンパク質、RT-PCR  逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明は、1種類以上のS1Pレセプター（特にS1P1レセプターおよびS1P3レセプター型）のアンタゴニストとして作用するスフィンゴシン=1-リン酸（S1P）アナログを対象としている。本発明は、リン酸部分を有する化合物、さらには、ホスホン酸類（phosphonate）のように加水分解耐性のリン酸代用物、特にα置換がハロゲンであるα-置換ホスホン酸類、ならびにホスホチオネート類（phosphothionates）との化合物を含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
スフィンゴシン=1-リン酸（レセプターアンタゴニストとしてのアナログ）、アンタゴニスト活性は  1)  アミノ基の配置が示されているとき（ここではR配置である）、2)  アルキル鎖が8原子（図と同様）か、それ以下の炭素原子を有する、3)  アルキル鎖がアミドに対してメタ位（図と同様）かオルト位であるがパラ位ではないときにのみ実現する。また、VPC23019はヒトS1P1レセプター（pKb = 7.49 ± 0.16）およびヒトS1P3レセプター（pKb = 5.98 ± 0.08）に対しては競合的レセプターアンタゴニストとして作用するが、ヒトS1P4レセプター（pEC50 = 6.58 ± 0.08）に対してはアゴニストであり、ヒトS1P5レセプター（pEC50 = 7.07 ± 0.12）に対しては部分的にアゴニストである。VPC23019は、10マイクロモルまでの濃度ではヒトS1P2レセプターに対して、アゴニストとしてもアンタゴニストとしても不活性である。関連するアンタゴニスト化合物（VPC25239、アルキル鎖は7原子の炭素原子を有する、メタ位；VPC23031、アルキル鎖は6原子の炭素原子を有する、メタ位；VPC23089、アルキル鎖は8原子の炭素原子を有する、オルト位）についての同様のデータを以下に示す。一連の化合物間での顕著な差が、アルキル鎖の炭素原子数を8（VPC23019）から7（VPC25239）に減らしたときに見られ、他のS1Pレセプター型に対しては比較的活性が変化しなかったが、S1P3レセプターへの力価がlogオーダーで増加した。後で述べるとおり、アルキル鎖の長さが9原子から10原子の炭素原子に増加すること（それぞれVPC23079、VPC23069）、アルキル鎖がパラ位で置換される（VPC22277）こと、または、アミノ基の立体配置（spatial orientation）を異なる配置にする（VPC25027（VPC23019のS体のエナンチオマー））ことによって、化合物をS1P1レセプターに対するアンタゴニストからアゴニスト（もしくは部分的アゴニスト）に変換することができる。前述した全ての化合物の合成ルートは添付のDavis et al.の稿本に記載されている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
〔物質および方法〕
｛物質｝
合成用の化学物質は、Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI)、Sigma Chemicals (St. Louis, MO)、Advanced ChemTech Chemical Company (Louisville, KY)、および/または、NovaBiochem Chemical Comp any (Laufelfingen, Switzerland)から購入し、さらに精製することなく用いた。[γ-32P]ATP and [γ-35S]GTPは、Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)から購入した。CyQuant Cell Proliferation Assay Kit および Fluo-4AM Calcium Indicatorは、Molecular Probes (Eugene, OR)から購入した。CHO細胞およびT24細胞（CHO and T24 cells）は、American Type Culture Collection (Manassas, VA)から購入した。HEK293T細胞は、Dr. Judy White (Dept. of Cell Biology, University of Virginia, Charlottesville, VA)から得た。組織培養媒体（Tissue culture media）および通常のFBS（normal FBS）はInvitrogen (Carlsbad, CA)から得た。木炭/デキストラン処理したFBS（Charcoal/Dextran stripped FBS、（CD-FBS））は、Gemini Bio-Products (Woodland, CA)から得た。Gタンパク質α、βおよびγのDNAは、Dr. Doug Bayliss
(Dept. of Pharmacology, University of Virginia)から贈られた。スフィンゴシン=1-リン酸は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
【図１】図１は、スフィンゴシン=1-リン酸、ならびに、VPC22277、VPC23019、VPC23031、VPC23089 および VPC25239の構造を説明する。
【図２Ａ】図２：（パネルA-F）は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ（broken-cell binding assay）測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。S1P1レセプター（パネルA）およびS1P3レセプター（パネルC）の濃度依存性の刺激がS1P（黒丸）については見られるが、VPC23019（白丸）では見られなかった。レセプタープラスミドDNAを排除したとき、有意な[γ35S]GTP結合は10μM S1P（パネルB）では見られなかった。このことは、活性がレセプター発現の関数であることを示す。[γ35S]GTPの結合は10μM S1PでレセプターとGi2αプラスミドDNAだけで一過性に形質移入されたHEK393T細胞において観測された。しかしながら、応答は、レセプターと3種類全てのGタンパク質プラスミドDNAの両方を添加した場合の3倍以下であった（パネルB）。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（disintegrations per minute、dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルD：ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動が、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）で観測されたが、VPC23019（1nM 〜 1000nM）では観測されなかったことを表している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、0.01% BSAキャリアー（最小値）、およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルEおよびF：未変性のT24細胞（挿入図（inset））、および、ヒトS1P3レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の細胞内カルシウム動員の濃度依存性が、S1Pでは見られたが（黒丸）、VPC23019では見られなかった（白丸）ことを表している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図２Ｂ】図２：（パネルA-F）は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ（broken-cell binding assay）測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。S1P1レセプター（パネルA）およびS1P3レセプター（パネルC）の濃度依存性の刺激がS1P（黒丸）については見られるが、VPC23019（白丸）では見られなかった。レセプタープラスミドDNAを排除したとき、有意な[γ35S]GTP結合は10μM S1P（パネルB）では見られなかった。このことは、活性がレセプター発現の関数であることを示す。[γ35S]GTPの結合は10μM S1PでレセプターとGi2αプラスミドDNAだけで一過性に形質移入されたHEK393T細胞において観測された。しかしながら、応答は、レセプターと3種類全てのGタンパク質プラスミドDNAの両方を添加した場合の3倍以下であった（パネルB）。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（disintegrations per minute、dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルD：ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動が、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）で観測されたが、VPC23019（1nM 〜 1000nM）では観測されなかったことを表している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、0.01% BSAキャリアー（最小値）、およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルEおよびF：未変性のT24細胞（挿入図（inset））、および、ヒトS1P3レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の細胞内カルシウム動員の濃度依存性が、S1Pでは見られたが（黒丸）、VPC23019では見られなかった（白丸）ことを表している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図２Ｃ】図２：（パネルA-F）は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ（broken-cell binding assay）測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。S1P1レセプター（パネルA）およびS1P3レセプター（パネルC）の濃度依存性の刺激がS1P（黒丸）については見られるが、VPC23019（白丸）では見られなかった。レセプタープラスミドDNAを排除したとき、有意な[γ35S]GTP結合は10μM S1P（パネルB）では見られなかった。このことは、活性がレセプター発現の関数であることを示す。[γ35S]GTPの結合は10μM S1PでレセプターとGi2αプラスミドDNAだけで一過性に形質移入されたHEK393T細胞において観測された。しかしながら、応答は、レセプターと3種類全てのGタンパク質プラスミドDNAの両方を添加した場合の3倍以下であった（パネルB）。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（disintegrations per minute、dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルD：ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動が、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）で観測されたが、VPC23019（1nM 〜 1000nM）では観測されなかったことを表している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、0.01% BSAキャリアー（最小値）、およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルEおよびF：未変性のT24細胞（挿入図（inset））、および、ヒトS1P3レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の細胞内カルシウム動員の濃度依存性が、S1Pでは見られたが（黒丸）、VPC23019では見られなかった（白丸）ことを表している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図２Ｄ】図２：（パネルA-F）は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ（broken-cell binding assay）測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。S1P1レセプター（パネルA）およびS1P3レセプター（パネルC）の濃度依存性の刺激がS1P（黒丸）については見られるが、VPC23019（白丸）では見られなかった。レセプタープラスミドDNAを排除したとき、有意な[γ35S]GTP結合は10μM S1P（パネルB）では見られなかった。このことは、活性がレセプター発現の関数であることを示す。[γ35S]GTPの結合は10μM S1PでレセプターとGi2αプラスミドDNAだけで一過性に形質移入されたHEK393T細胞において観測された。しかしながら、応答は、レセプターと3種類全てのGタンパク質プラスミドDNAの両方を添加した場合の3倍以下であった（パネルB）。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（disintegrations per minute、dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルD：ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動が、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）で観測されたが、VPC23019（1nM 〜 1000nM）では観測されなかったことを表している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、0.01% BSAキャリアー（最小値）、およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルEおよびF：未変性のT24細胞（挿入図（inset））、および、ヒトS1P3レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の細胞内カルシウム動員の濃度依存性が、S1Pでは見られたが（黒丸）、VPC23019では見られなかった（白丸）ことを表している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図２Ｅ】図２：（パネルA-F）は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ（broken-cell binding assay）測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。S1P1レセプター（パネルA）およびS1P3レセプター（パネルC）の濃度依存性の刺激がS1P（黒丸）については見られるが、VPC23019（白丸）では見られなかった。レセプタープラスミドDNAを排除したとき、有意な[γ35S]GTP結合は10μM S1P（パネルB）では見られなかった。このことは、活性がレセプター発現の関数であることを示す。[γ35S]GTPの結合は10μM S1PでレセプターとGi2αプラスミドDNAだけで一過性に形質移入されたHEK393T細胞において観測された。しかしながら、応答は、レセプターと3種類全てのGタンパク質プラスミドDNAの両方を添加した場合の3倍以下であった（パネルB）。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（disintegrations per minute、dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルD：ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動が、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）で観測されたが、VPC23019（1nM 〜 1000nM）では観測されなかったことを表している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、0.01% BSAキャリアー（最小値）、およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルEおよびF：未変性のT24細胞（挿入図（inset））、および、ヒトS1P3レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の細胞内カルシウム動員の濃度依存性が、S1Pでは見られたが（黒丸）、VPC23019では見られなかった（白丸）ことを表している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図２Ｆ】図２：（パネルA-F）は、S1P1レセプターおよびS1P3レセプターのアゴニスト活性を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ（broken-cell binding assay）測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。S1P1レセプター（パネルA）およびS1P3レセプター（パネルC）の濃度依存性の刺激がS1P（黒丸）については見られるが、VPC23019（白丸）では見られなかった。レセプタープラスミドDNAを排除したとき、有意な[γ35S]GTP結合は10μM S1P（パネルB）では見られなかった。このことは、活性がレセプター発現の関数であることを示す。[γ35S]GTPの結合は10μM S1PでレセプターとGi2αプラスミドDNAだけで一過性に形質移入されたHEK393T細胞において観測された。しかしながら、応答は、レセプターと3種類全てのGタンパク質プラスミドDNAの両方を添加した場合の3倍以下であった（パネルB）。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（disintegrations per minute、dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルD：ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動が、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）で観測されたが、VPC23019（1nM 〜 1000nM）では観測されなかったことを表している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、0.01% BSAキャリアー（最小値）、およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルEおよびF：未変性のT24細胞（挿入図（inset））、および、ヒトS1P3レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の細胞内カルシウム動員の濃度依存性が、S1Pでは見られたが（黒丸）、VPC23019では見られなかった（白丸）ことを表している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図３Ａ】図３：（パネルA-D）パネルAおよびBはS1P1レセプターおよびS1P3レセプターのVPC23019による拮抗作用を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。[γ35S]GTP破砕細胞結合アッセイでのS1P1、および、S1P3についてのS1P刺激の阻害を、VPC23019が存在しないとき（黒丸）、または、VPC23019が10000nM（白丸）、1000nM（白四角）、および、100nM（黒四角）の濃度で存在するときについて調べた。結合定数（pKb）は、pKb±S.E.M.として報告した。データポイントは6重（hextuplicate）で、それぞれのレセプターについての、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（dpm）値で正規化した。結合がゼロ%のときおよび100%のときについての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルCは、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）存在下での、ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動の阻害が、VPC23019の濃度が10nM、100nMおよび1000nMで観察された結果を示している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、BSA（最小値）およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルDは、ヒトS1P3レセプター（実線）を安定に形質移入したT24細胞で観測されたCa2+移動が、VPC23019（10000nM − 点線)による前処理の後に洗い流すと変化しないことを示している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図３Ｂ】図３：（パネルA-D）パネルAおよびBはS1P1レセプターおよびS1P3レセプターのVPC23019による拮抗作用を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。[γ35S]GTP破砕細胞結合アッセイでのS1P1、および、S1P3についてのS1P刺激の阻害を、VPC23019が存在しないとき（黒丸）、または、VPC23019が10000nM（白丸）、1000nM（白四角）、および、100nM（黒四角）の濃度で存在するときについて調べた。結合定数（pKb）は、pKb±S.E.M.として報告した。データポイントは6重（hextuplicate）で、それぞれのレセプターについての、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（dpm）値で正規化した。結合がゼロ%のときおよび100%のときについての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルCは、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）存在下での、ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動の阻害が、VPC23019の濃度が10nM、100nMおよび1000nMで観察された結果を示している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、BSA（最小値）およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルDは、ヒトS1P3レセプター（実線）を安定に形質移入したT24細胞で観測されたCa2+移動が、VPC23019（10000nM − 点線)による前処理の後に洗い流すと変化しないことを示している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図３Ｃ】図３：（パネルA-D）パネルAおよびBはS1P1レセプターおよびS1P3レセプターのVPC23019による拮抗作用を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。[γ35S]GTP破砕細胞結合アッセイでのS1P1、および、S1P3についてのS1P刺激の阻害を、VPC23019が存在しないとき（黒丸）、または、VPC23019が10000nM（白丸）、1000nM（白四角）、および、100nM（黒四角）の濃度で存在するときについて調べた。結合定数（pKb）は、pKb±S.E.M.として報告した。データポイントは6重（hextuplicate）で、それぞれのレセプターについての、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（dpm）値で正規化した。結合がゼロ%のときおよび100%のときについての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルCは、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）存在下での、ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動の阻害が、VPC23019の濃度が10nM、100nMおよび1000nMで観察された結果を示している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、BSA（最小値）およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルDは、ヒトS1P3レセプター（実線）を安定に形質移入したT24細胞で観測されたCa2+移動が、VPC23019（10000nM − 点線)による前処理の後に洗い流すと変化しないことを示している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図３Ｄ】図３：（パネルA-D）パネルAおよびBはS1P1レセプターおよびS1P3レセプターのVPC23019による拮抗作用を示す。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。レセプター活性は、破砕細胞結合アッセイ測定で、[γ-35S]GTPと膜の結合を脂質濃度の関数として測定した。[γ35S]GTP破砕細胞結合アッセイでのS1P1、および、S1P3についてのS1P刺激の阻害を、VPC23019が存在しないとき（黒丸）、または、VPC23019が10000nM（白丸）、1000nM（白四角）、および、100nM（黒四角）の濃度で存在するときについて調べた。結合定数（pKb）は、pKb±S.E.M.として報告した。データポイントは6重（hextuplicate）で、それぞれのレセプターについての、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（dpm）値で正規化した。結合がゼロ%のときおよび100%のときについての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ300dpm/wellおよび3000dpm/wellである。  パネルCは、S1P1アゴニストVPC22277（10nM）存在下での、ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動の阻害が、VPC23019の濃度が10nM、100nMおよび1000nMで観察された結果を示している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、BSA（最小値）およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。  パネルDは、ヒトS1P3レセプター（実線）を安定に形質移入したT24細胞で観測されたCa2+移動が、VPC23019（10000nM − 点線)による前処理の後に洗い流すと変化しないことを示している。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図４Ａ】図４（パネルAおよびB）は、放射標識したS1Pが、S1P1およびS1P3においてVPC23019によって置き換わることを示している。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。放射標識されたS1Pとの置換は、[32P]S1Pとレセプターの結合を測定する膜結合アッセイを用いて決定した。[32P]S1Pの置換の投与量依存性を、S1P(A) およびVPC23019（B）について、S1P1レセプター（黒丸）とS1P3レセプター（白丸）の両方、それぞれ測定した。pKi値は、阻害結合定数（inhibitory binding constant）（Ki）の-logであり、pKi±S.E.M.として報告する。データポイントは3重で、それぞれのレセプターについて、代表的な2回の独立した実験のものである。結合の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ10000dpm/tubeおよび30000dpm/tubeである。非特異的結合は、過剰のS1P存在下での膜への、レセプターおよびGタンパク質DNAと一過性に形質移入したHEK293T細胞（熱変性させたものと熱変性させていないものの両方）からの放射性リガンドの残余結合（residual binding）として測定し、それは通常は全体の結合の60%であった。
【図４Ｂ】図４（パネルAおよびB）は、放射標識したS1Pが、S1P1およびS1P3においてVPC23019によって置き換わることを示している。HEK293T細胞は、同量のヒトS1P1レセプター、もしくは、ヒトS1P3レセプター、ならびに、Gi2αプラスミドDNA、GβiプラスミドDNA、および Gγ2プラスミドDNAで一過性に形質移入された。膜は60時間後に集めた。放射標識されたS1Pとの置換は、[32P]S1Pとレセプターの結合を測定する膜結合アッセイを用いて決定した。[32P]S1Pの置換の投与量依存性を、S1P(A) およびVPC23019（B）について、S1P1レセプター（黒丸）とS1P3レセプター（白丸）の両方、それぞれ測定した。pKi値は、阻害結合定数（inhibitory binding constant）（Ki）の-logであり、pKi±S.E.M.として報告する。データポイントは3重で、それぞれのレセプターについて、代表的な2回の独立した実験のものである。結合の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた壊変毎分（dpm）値で正規化した。ゼロ%の結合および100%結合についての典型的な値は、ヒトS1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてそれぞれ、おおよそ10000dpm/tubeおよび30000dpm/tubeである。非特異的結合は、過剰のS1P存在下での膜への、レセプターおよびGタンパク質DNAと一過性に形質移入したHEK293T細胞（熱変性させたものと熱変性させていないものの両方）からの放射性リガンドの残余結合（residual binding）として測定し、それは通常は全体の結合の60%であった。
【図５Ａ】図５（パネルAおよびB）は、S1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてのアゴニスト応答がVPC23019関連のアナログで変化することを示している。パネルA：S1P1アゴニストVPC22277（10nM）存在下での、ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動の阻害が、VPC23019、VPC23031、VPC23089、および、VPC25239（50nM）の存在下で観察された結果を示している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、BSA（最小値）およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。パネルB：ヒトS1P3レセプターを安定に形質移入したT24細胞の刺激によるCa2+移動の阻害を、非存在下（黒丸）、もしくは、10000nMのVPC23031存在下（黒四角）、VPC23089存在下（白丸）、VPC25239存在下（白四角）で実験した。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図５Ｂ】図５（パネルAおよびB）は、S1P1レセプターおよびヒトS1P3レセプターについてのアゴニスト応答がVPC23019関連のアナログで変化することを示している。パネルA：S1P1アゴニストVPC22277（10nM）存在下での、ヒトS1P1レセプターDNAを安定に形質移入したT24細胞の移動の阻害が、VPC23019、VPC23031、VPC23089、および、VPC25239（50nM）の存在下で観察された結果を示している。データポイントは2重で、代表的な2回の独立した実験である。移動の割合は、BSA（最小値）およびVPC22277（最大値）で得られたRFU値から得られた相対蛍光単位（relative fluorescence unit、RFU）値に基づいて正規化した。移動がなかったときと、100%移動したときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ30000 RFU/Wellおよび100000 RFU/Wellであった。パネルB：ヒトS1P3レセプターを安定に形質移入したT24細胞の刺激によるCa2+移動の阻害を、非存在下（黒丸）、もしくは、10000nMのVPC23031存在下（黒四角）、VPC23089存在下（白丸）、VPC25239存在下（白四角）で実験した。データポイントは3重で、代表的な2回の独立した実験のものである。活性の割合は、S1Pの濃度の最小値および最大値から得られた相対蛍光単位（RFU）値に基づいて正規化した。カルシウム動員が、0%のときと100%のときの典型的な値は、それぞれ、おおよそ400 RFU/Wellおよび4000 RFU/Wellであった。
【図６Ａ】図６（パネルA-B）は、本発明に係る化合物（特に、VPC44116）の合成の合成スキームを示している。
【図６Ｂ】図６（パネルA-B）は、本発明に係る化合物（特に、VPC44116）の合成の合成スキームを示している。
【図７】図７は、本発明にかかる化合物である化合物VPC44116の1H NMRスペクトルである。
【図８】図８は、本発明にかかる化合物である化合物VPC44116の13C NMRスペクトルである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【国際調査報告】
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