【事件の表示】
　特許第２７４９８８７号「連続細胞系におけるＩＢＤＶの産生」の特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７４９８８７号の請求項１ないし１０に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第２７４９８８７号発明は、平成１年７月２１日（パリ条約による優先権主張１９８８年７月２１日、オランダ国）に特許出願され、平成１０年２月２０日にその特許の設定登録がなされ、その後、財団法人　化学及血清療法研究所より特許異議申立がなされ、当審より取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１２年９月１２日に訂正請求がなされたものである。　
　　　　　　
２．訂正の適否についての判断
(ａ)訂正の内容
　特許請求の範囲の請求項２が
「生きた弱毒化ＩＢＤＶを含むＩＢＤＶワクチンであって、該ワクチンが、ＩＢＤＶで感染させた哺乳動物の細胞系の細胞培養上清から回収した生きたウイルスを含み、生きたウイルスが、飲料水又は点眼薬により家禽に投与されるときに防御的免疫反応を誘導することができることを特徴とするワクチン。」とあるのを
「生きた弱毒化ＩＢＤＶを含むＩＢＤＶワクチンであって、該ワクチンが、ＩＢＤＶで感染させた哺乳動物の細胞系の細胞培養上清から回収した生きたウイルスを含み、生きたウイルスが、点眼薬により家禽に投与されるときに防御的免疫反応を誘導することができることを特徴とするワクチン。」と訂正するものである。
　　　　
(ｂ)訂正の目的の適否、拡張・変更の存否、及び新規事項の追加の有無　　
　本件訂正は、訂正前の、請求項２におけるワクチンの投与態様である飲料水を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当し、特許明細書に記載された範囲内のものであり、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
　　　　　　
(ｃ)独立特許要件の判断
　後述の３．特許異議申し立てについての判断に記載した理由により、訂正後の請求項１〜１０に係る発明は、独立して特許を受けることができる発明というべきである。
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する第１２６条第２〜４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　　　　　
３．特許異議申立についての判断　
（ａ）本件特許発明
　本件請求項１〜１０に係る発明は、訂正された願書に添付された特許明細書の記載からみて、特許請求の範囲の請求項１〜１０に記載されたとおりのものと認められ、その請求項１、請求項２及び請求項７に係る発明は次に記載のとおりである。
「【請求項１】不活化した感染性滑液嚢炎ウイルス（ＩＢＤＶ）を含む感染性滑液嚢炎ウイルスワクチンであって、該ワクチンが、ＩＢＤＶで感染させた哺乳動物の細胞系の細胞培養上清が不活化した抗原集合体を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項２】生きた弱毒化ＩＢＤＶを含むＩＢＤＶワクチンであって、該ワクチンが、ＩＢＤＶで感染させた哺乳動物の細胞系の細胞培養上清から回収した生きたウイルスを含み、生きたウイルスが、点眼薬により家禽に投与されるときに防御的免疫反応を誘導することができることを特徴とするワクチン。
【請求項７】不活化ＩＢＤＶワクチンの調製方法であって、
（ａ）哺乳動物の細胞系でＩＢＤＶを培養すること、
（ｂ）該細胞系から細胞培養上清の抗原集合体を回収すること、
（ｃ）回収した抗原集合体を不活化すること、及び
（ｄ）不活化抗原集合体を医薬上許容可能な担体又はアジュバントと混合することを含むことを特徴とする方法。」
　　　　　　
（ｂ）異議申立の概要
　異議申立人は、甲第１号証(AMERICAN　JOURNAL　OF　VETERINARIY　RESEARCH, Vol.36,　No.4,　p.539-540,　1975)、甲第２号証（VETERINARY RECORD, APRIL, 22,1978, p.362-363）、及び甲第３号証（AVIAN DISEASE vol.22, No.4, p.721-731, 1978）を提出して、本件請求項１〜１０に係る発明は、甲第１号証〜甲第３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることできたものであるから、同法第２９条第２項の規定に違反してされたものであるから、特許法第１１３条第１項第２号の規定により取り消されるべきであると主張している。
　　　　
(ｉ)請求項１に係る発明について
ア、証拠記載の発明  
　甲第１号証には、Ｖｅｒｏ細胞がアフリカミドリザルの腎臓由来の連続細胞系であること（539頁左欄下2〜1行）、ＣＥＫ細胞及びＶｅｒｏ細胞で増殖したＩＢＤＶをワクチンとして用い、市販品ワクチンと比較した結果、ＣＥＫで増殖したＩＢＤＶは、２０〜３０代継代後もなお嚢炎を起こしたが、致死及び体重の減少はワクチネーション後観察されなかったこと、Ｖｅｒｏ細胞で適合させたウイルスは完全に弱毒化され、これを飲料水に入れたとき、攻撃試験では鶏雛を防御せず、低い中和抗体価が誘導されていたこと、Ｖｅｒｏ細胞で適合させたウイルスを皮下投与したとき高い中和抗体価を誘導し、攻撃試験に対する反応では、嚢炎の発生を押さえ、致死及び体重減も起こらなかったこと、（表１及び539頁右欄13行〜26行目）が記載されている。
　甲第２号証には、不活化オイルエマルジョンワクチンをＩＢＤ（Bygrave and Faragher l970）52/70株を点眼接種した６週令鶏雛からファブリキウス嚢を回収し、均質化し、遠心分離で分離後、βプロピオオラクトンを添加し３７℃で２４時間攪拌することにより不活化し、不活化した抗原を１対３の割合で流動パラフィンと混合し、乳化剤、アラセル８３を加え(1:100)、その混合液をシルバーソン混合機で混合して調製したこと、及び、この不活化オイルエマルジョンＩＢＤＶワクチンを接種した母親の卵から孵化した鶏雛の、孵化後、一定間隔で行われたＩＢＤＶ攻撃に対する感受性があることが記載されている。
　甲第３号証には、数種のＩＢＤＶ株のＩＢＤＶワクチンが飲水、点眼、総排泄口、皮下及び噴霧ルートにより投与されたことが記載されている。
　　
イ、対比・判断
　請求項１に係る発明と甲第２号証に記載のものとを対比する。
　ファブリキウス嚢は鳥類の免疫器官であるから、甲第２号証には、ＩＢＤＶで感染させた鶏の細胞であるファブリキウス嚢からの上清を不活化した抗原を含む不活化したＩＢＤＶワクチン（以下、不活化ワクチンという。）が記載されているものと認められる。また、「抗原集合体」について、本件特許明細書には定義されてないが、平成１１年８月１２日付け特許異議意見書において、「抗原集合体」とは「生きた感染性のあるウイルス粒子」又は「非感染性ウイルス粒子で、遺伝情報のすべて又は一部を欠いている完全ウイルス粒子、若しくは亜ウイルス粒子」であると特許権者が述べていることから、病原性ウイルスワクチンにおける「抗原集合体」と「抗原」には意味上に差異は認められない。
　そうすると、両者はＩＢＤＶで感染させた動物細胞由来の不活化した抗原集合体を含む不活化ワクチンである点で一致し、前者は、ＩＢＤＶを感染させる細胞が哺乳動物の細胞系であるのに対して、後者は鶏の細胞である点で相違している。
　そこで、この相違点について検討する。
　甲第１号証には、Ｖｅｒｏ細胞がアフリカミドリザルの腎臓由来の連続細胞系であること、Ｖｅｒｏ細胞で増殖したＩＢＤＶをワクチンとして用いた結果、Ｖｅｒｏ細胞で適合させたウイルスは完全に弱毒化され、これを飲料水に入れたとき、攻撃試験では鶏雛を防御せず、低い中和抗体価が誘導されていたこと、Ｖｅｒｏ細胞で適合させたウイルスを皮下投与したとき高い中和抗体価を誘導し、攻撃試験に対する反応では、嚢炎の発生を押さえ、致死及び体重減も起こらなかったことが記載されている。すなわち、哺乳動物の細胞系であるＶｅｒｏ細胞の培養上清から回収した生きたウイルスを含む弱毒化ＩＢＤＶワクチン（以下、生ワクチンという。）が記載され、飲料水ではワクチンとして機能せず、皮下投与が効果がある旨が記載されているが、Ｖｅｒｏ細胞が不活化ワクチンにおける培養細胞として用いることは記載されていない。
　甲第３号証には、ワクチンの種々の投与ルートが記載されているが、ＩＢＤＶを感染させる培養細胞に哺乳動物の細胞系を用いることは記載されていない。
　ところで、請求項１に係る発明におけるワクチンは、特許明細書の実施例８及び９には、鶏の胚線維芽細胞ＣＥＦ又はＶｅｒｏ細胞で培養産生したＩＢＤＶウイルスのＤ７８又はＳＰ株について不活化後の中和抗体力価が、同じ抗原量に対してＶｅｒｏ細胞のものはＣＥＦ細胞のものに比べて非常に高いものであることが示されている。
　そうすると、甲第１号証に記載のワクチンは生ワクチンであり、生きたウイルス粒子と不活化されたウイルス粒子とではワクチンの効力において相関があるものとはいえないから、甲第２号証に記載の不活化ワクチンにおいて鶏の細胞に代えて、甲第２号証に記載の生ワクチンの調製に用いたＶｅｒｏ細胞を直ちに適用できるものとはいえないし、たとえ、仮に甲第２号証に記載のワクチンにおいて、甲第１号証に記載のＶｅｒｏ細胞を用いることを想定したとしても、Ｖｅｒｏ細胞のものの方が中和抗体価が高いことは予想できるものではない。
　したがって、請求項１に係る発明は甲第１〜３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとは認められない。
　　　
（ii）請求項２に係る発明について
　請求項２に係る発明と甲第１号証に記載の皮下投与のものとを対比すると、両者はＩＢＤＶで感染させた哺乳動物の細胞系の細胞培養上清から回収した生きたウイルスを含む、家禽に投与されるときに防御的免疫反応を誘導することができる生ワクチンである点で一致し、ワクチンの投与形態が、前者は点眼薬であるのに対して、後者は皮下投与である点が相違する。
　この相違点を検討すると、甲第１号証には、Ｖｅｒｏ細胞系で培養した上清から調製した生ワクチンであっても、投与形態が飲料水の場合は防御能がなく、皮下投与の場合に効果があることが記載されているので、生ワクチンの場合ＩＢＤＶの培養細胞のみでその効果が予想されるものではない。そして、甲第２号証には不活化ワクチンについて点眼薬でワクチンの効果が示されているが、上記のように不活化ワクチンと生ワクチンを同等のものとは認められないこと、及び、甲第３号証にはＩＢＤＶワクチンの種々の投与形態が記載されているだけで、投与形態、ＩＢＤＶの培養細胞及びワクチンの効果との相互関係については何ら記載されていないから、甲第１号証に記載の皮下投与のものに代えて甲第２〜３号証に記載の点眼薬を適用してもワクチンとして効果を奏するか否かを予想することはできない。
　したがって、請求項２に係る発明は甲第１〜３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものではない。
　　
（iii）請求項３〜６に係る発明について
　請求項３〜６に係る発明は、請求項１又は２に係る発明をさらに技術的に限定したものであるから、甲第１号証〜甲第３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものではない。
　　　
（iv）請求項７に係る発明について
　請求項７に係る発明と甲第１号証に記載の方法と対比すると、流動パラフィンは医薬上許容可能な担体であることは明らかであるから、両者は動物の細胞でＩＢＤＶを培養すること、該細胞培養上清の抗原集合体を回収すること、回収した抗原集合体を不活化すること、及び不活化抗原集合体を医薬上許容可能な担体又はアジュバントとを混合することを含む不活化ＩＢＤＶワクチンの調製方法である点で一致し、前者は培養細胞を哺乳動物の細胞系であるのに対して、後者は鶏の細胞である点が相違する。
　この相違点は、請求項１に係る発明の場合と同じであるから、上記（ｉ）に述べた理由によって、請求項７に係る発明は甲第１〜３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとは認められない。　　
　　　
（ｖ）請求項８〜１０に係る発明について
　請求項８〜１０に係る発明は、請求項１、２又は７に係る発明をさらに技術的に限定したものであるから、甲第１号証〜甲第３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものではない。
　　　　　
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件特許が特許法第２９条第２項に違反してされたものではない。
　また、本件特許については、他に取消理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年９月２９日（２０００．９．２９）
【訂正の要旨】
　特許請求の範囲の減縮を目的として、特許請求の範囲の請求項２が
「生きた弱毒化ＩＢＤＶを含むＩＢＤＶワクチンであって、該ワクチンが、ＩＢＤＶで感染させた哺乳動物の細胞系の細胞培養上清から回収した生きたウイルスを含み、生きたウイルスが、飲料水又は点眼薬により家禽に投与されるときに防御的免疫反応を誘導することができることを特徴とするワクチン。」とあるのを「生きた弱毒化ＩＢＤＶを含むＩＢＤＶワクチンであって、該ワクチンが、ＩＢＤＶで感染させた哺乳動物の細胞系の細胞培養上清から回収した生きたウイルスを含み、生きたウイルスが、点眼薬により家禽に投与されるときに防御的免疫反応を誘導することができることを特徴とするワクチン。」と訂正するものである。
（５４）【発明の名称】
連続細胞系におけるＩＢＤＶの産生
（５７）【特許請求の範囲】
（１）不活化した感染性滑液嚢炎ウイルス（ＩＢＤＶ）を含む感染性滑液嚢炎ウイルスワクチンであって、該ワクチンが、ＩＢＤＶで感染させた哺乳動物の細胞系の細胞培養上清の不活化した抗原集合体を含むことを特徴とするワクチン。
（２）生きた弱毒化ＩＢＤＶを含むＩＢＤＶワクチンであって、該ワクチンが、ＩＢＤＶで感染させた哺乳動物の細胞系の細胞培養上清から回収した生きたウイルスを含み、生きたウイルスが、点眼薬により家禽に投与されるときに防御的免疫反応を誘導することができることを特徴とするワクチン。
（３）哺乳動物の細胞系がエイプ細胞系であることを特徴とする請求項１又は２に記載のワクチン。
（４）エイプ細胞系がＶｅｒｏ細胞系であることを特徴とする請求項３に記載のワクチン。
（５）ワクチンがＩＢＤウイルスのＤ７８株を含むことを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載のワクチン。
（６）ワクチンが更に、ウイルス、細菌及び寄生虫からなる群から選択される、ＩＢＤＶに関連のない鳥の別の病原体の抗原材料を含むことを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載のワクチン。
（７）不活化ＩＢＤＶワクチンの調製方法であって、
（ａ）哺乳動物の細胞系でＩＢＤＶを培養すること、
（ｂ）該細胞系から細胞培養上清の抗原集合体を回収すること、
（ｃ）回収した抗原集合体を不活化すること、及び
（ｄ）不活化抗原集合体を医薬上許容可能な担体又はアジュバントと混合することを含むことを特徴とする方法。
（８）抗原集合体を、ウイルス感染の２ないし１０日後に回収することを特徴とする請求項７に記載の方法。
（９）抗原集合体を、感染の少なくとも９６時間後に回収することを特徴とする請求項８に記載の方法。
（１０）ＩＢＤに対する家禽の免疫化の方法であって、請求項１又は３ないし６のいずれかに記載の不活化ワクチンを母親の動物に接種することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
　本発明は鳥類に感染性である感染性滑液嚢炎ウイルス（ＩＢＤＶ）及びＩＢＤＶ抗原の増殖のための、永久哺乳動物細胞系の使用に係る。
　鳥類ウイルスは通常、胚形成卵（ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ　ｅｇｇ）、胚形成卵から誘導される鳥類由来支持細胞（例えば一次もしくは二次ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、一次ニワトリ肝細胞又はニワトリ腎細胞）、又は生きた動物の器官（例えばファブリキウス嚢）において産生される。このタイプの起源からのウイルスは不活化ワクチン及び生ワクチンの製造のために世界中で使用されている。
　ワクチンの製造に動物及び胚形成卵を使用する主な欠点は、これらの材料の品質が不確定なことである。特定の病原体をもたないニワトリであっても予期せずして感染する可能性があり、その場合、ワクチン製造には不適当になる。また、この型の感染はしばらくの間検出されずにいる場合もある。
　永久細胞系を使用すると、この問題に理想的な解決が得られる。しかしながら、ワクチン製造に適当なニワトリ細胞系はまだ得られていない。鳥類細胞系の大多数は、リンパ性白血病又はマレック病に罹患した動物から得られるリンパ芽球細胞から構成される。
　正常なニワトリ胚線維芽細胞から永久細胞系を発生させようとする試みは失敗に終わった。正常な胚から細胞系が発生した場合もあったが、いずれの場合もこれらの細胞系はその後の試験でレトロウイルスゲノムを含んでいることが判明し、ウイルス粒子を放出するものさえあった。
　さて、ニワトリ胚線維芽細胞の細胞培養で増殖可能なＩＢＤＶ株（例えばＤ７８及びＳＰ株）は、同様に哺乳動物細胞系でも有効に培養できることが知見された。支持体としての哺乳動物にウイルスを順化させる必要はないことが知見された。更に、哺乳動物細胞における収量はしばしばＣＥＦ系における収量よりも著しく高いことが判明した。ウイルス収量は通常「単位体積当たりの感染ウイルス粒子」（ＥＩＤ５０／ｍｌ；ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）で表される。ウイルス収量を定量する別の方法としては、抗原量を決定する方法がある。ＥＬＩＳＡのような免疫化学的方法を使用すると、ウイルス調製物の抗原含有量を、抗原量単位の固定値が割り当てられた標準調製物の抗原含有量と比較することができる。どちらのタイプの測定方法を使用しても、哺乳動物細胞系はＣＥＦ系よりも著しく高い収量をもたらす。
　更に、驚くべきことにこれらの好ましい収量は、ＣＥＦでの抗原産生に従来使用されているよりも低い細胞濃度で達せられる。哺乳動物細胞系における最適細胞濃度は、ＣＥＦでの産生に慣用されている濃度の３〜６分の１である。これらの結果から明らかなように、哺乳動物細胞は一般にＩＢＤＶの支持体としてＣＥＦよりも良好である。同時に、こうして産生されたウイルス抗原は、ワクチン中において、ＣＥＦで産生される抗原と少なくとも同程度に有効であることが判明した。
　本発明のＩＢＤＶ産生に適当な哺乳動物細胞系は、例えばＶｅｒｏ細胞、チンパンジー肝細胞、バッファローベルベットモンキー細胞及びマウス３Ｔ３細胞である。
　哺乳動物細胞の培養には細胞培養フラスコ及び回転フラスコ中の静置培養システムを使用することができる。他の一般により大規模な細胞培養システムを挙げると、固定源（又は足場）（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）非依存性細胞の培養用として撹拌槽（発酵槽）、固定源依存性細胞の培養用として微粒子担体システム、及びいずれの型の細胞培養にも用いられる中空糸繊維システムがある。更に固定源依存性細胞の培養用として多数の他の静置システムがある。これらのシステムの共通の特徴は、細胞を付着できる表面積が非常に広いことである。
　哺乳動物細胞の培養には複雑な培養液を使用する必要がある。これらの培養液は一般に、化学的に正確に規定される基礎液体（培地）、及び化学的に正確に規定されない１種以上の添加剤から構成される。添加剤は通常、血清及びタンパク質加水分解物のような高タンパク質濃度の溶液である。血清は細胞増殖及び細胞分裂に実質上不可欠である。ほとんどの培養システムに１〜１０容量％の濃度でウシ胎児血清（ＦｏＣＳ）又はウシ絶食血清（ＦａＣＳ）を加える。特殊な場合に限っていうならば、適応期間後に無血清培地、更には無タンパク質培地でも哺乳動物細胞を培養することが可能である。
　本発明のＩＢＤウイルスは、必要に応じて予め弱毒化後に生ウイルスとして、又は不活化ウイルスとしてワクチンに配合され得る。
　生ウイルスを含有するワクチンは懸濁液として調製及び市販され、又は凍結乾燥され得る。
　凍結乾燥したワクチンは好ましくは１種以上の安定剤を含有し得る。適当な安定剤は、例えばＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋ（１９５０）：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
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　ＩＢＤウイルスの不活化の目的は、ウイルスの増殖及び毒性を阻止することである。一般に、これは化学的又は物理的手段により達せられる。化学的不活化は、ウイルスを例えば酵素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミン又はその誘導体、有機溶媒（例えばハロゲン化炭化水素）及び／又は洗浄剤（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ（登録商標）、デオキシコール酸ナトリウム、スルホベタイン又はセチルトリメチルアンモニウム塩）である。その後、必要に応じて不活化した物質を中和するが、例えばホルムアルデヒドで不活化した物質はチオ硫酸塩で中和することができる。物理的不活化は、好ましくは紫外線、Ｘ線又はγ線のような高エネルギー輻射をウイルスに照射することにより実施され得る。必要に応じて処理後にｐＨ値を７に戻してもよい。
　通常、アジュバント（例えば上記に列挙したようなもの）、及び必要に応じて１種以上の乳化剤（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）及びＳｐａｎ（登録商標））も不活化ウイルス材料に加える。
　本発明のワクチンは家禽（例えばニワトリ及びシチメンチョウ）をＩＢＤ（Ｇｕｍｂｏｒｏ病）から保護するために適している。
　本発明のワクチンは、例えば筋肉内、皮下もしくは卵内注射により、又は点眼剤、点鼻薬又は飲料水に混入して、又はスプレー形態で投与され得る。
　本発明は、本発明のＩＢＤＶ材料を含有する混合ワクチンも包含する。不活化ワクチンの場合、このＩＢＤＶ材料をニューカッスル病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、エッグドロップ（ｅｇｇ　ｄｒｏｐ）症候群ウイルス、レオウイルス、細菌（例えば大腸菌）及び／又は寄生虫（例えばＥｉｍｅｒｉａ種）と組み合わせることができる。混合生ワクチンにはニューカッスル病ウイルス及び／又はマレック病ウイルスとの組み合わせが適している。
実施例
哺乳動物細胞系上でのＩＢＤＶの産生
細胞培養
　細胞ストックを液体窒素中でガラスアンプルに保存した。細胞培養を開始するために、アンプルの内容物を迅速に解凍し、細胞培地でゆっくり希釈した。細胞懸濁液を低速で遠心分離し、冷媒中でＤＭＳＯを除去した。沈澱した細胞を完全細胞培養培地に再懸濁し、細胞を適当な培養槽に接種した。通常は、１：１の比のＭ１９９／Ｆ１０培地の混合物、又はＭＥＭにリン酸トリプトースブロスを補充し、この培地で細胞を培養した。培地は２〜１０％のＦｏＣＳを含有するものとし、必要に応じて抗生物質及び殺菌剤を加えた。細胞を静置培養（組織培養フラスコ）又は回転フラスコ（４９０ｃｍ２）で３７℃で培養した。細胞が稠密な単層を形成するような密度に達したら、細胞をトリプシンで処理し、継代培養物を調製した。
ウイルス産生、採取及び不活化
　凍結乾燥した種ウイルスを再び溶かすか、又は急速凍結した種ウイルスを解凍し、種ウイルスを適切な部分に分割することが可能な濃度まで細胞培養培地で希釈した。細胞を１００〜１０−４ＴＣＩＤ５０／細胞のＭ．Ｏ．Ｉ（感染多重度）比で感染させた。
　必要に応じて細胞の接種後に種ウイルスを直接加えた。
　感染した細胞を１０日間までインキュベートした。通常は、ウイルス感染から２〜１０日後にウイルスを採取した。培養槽中の上清液を収集し、ホルマリンで不活化した。このために、０．０５〜０．２％の濃度に達するまでホルムアルデヒドを細胞懸濁液に加えた。混合物を２０〜２２℃で１〜３日間インキュベートした。
ワクチン製造
　ワクチンとして使用するために、不活化したＩＢＤＶ抗原をＷ／Ｏエマルジョン（Ｍａｒｃｏｌ　５２（登録商標））に導入した。
一次ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）上でのＩＢＤＶの産生
ＣＥＦの調製
　当業者に公知の方法に従って、１０〜１１日齢の特定の病原体をもたない抱卵した卵からＣＥＦを調製した。
ＣＥＦの培養
　連続細胞系の培養に使用したと同一の培地でＣＥＦを培養した。濃度が５％に達するまでＦｏＣＳ又はＦａＣＳを培地に加えた。トリプシン処理後に得られた濃縮細胞懸濁液を０．５〜１０×１０６個／ｍｌの細胞濃度が得られるように細胞培養培地で希釈した。細胞懸濁液を組織培養フラスコ又は回転フラスコに移した。細胞を３７〜３９．５℃で約２４時間インキュベートした後、稠密な単層が形成された。
ウイルスの産生、採取及び不活化
　凍結乾燥した種ウイルスを溶解させ、細胞上に接種するのに適当な量に分割できるように十分な量が得られるまで細胞培養培地で希釈した。１００〜１０−５ＴＣＩＤ５０／細胞の濃度でウイルスを加えた。必要に応じて、細胞の接種後に種ウイルスを直接加えた。
　感染した細胞を４８〜９６時間インキュベートした。次に、培養槽から上清液を取り出し、０．２％のホルムアルデヒドで室温で２４時間不活化した。
ＩＢＤＶ抗原量の測定
　定量用サンドイッチＥＬＩＳＡによりＩＢＤＶ抗原を測定した。
１．微量滴定プレートにＩＢＤＶ特異抗体を塗布した。
２．抗原サンプルの希釈系をウェルに充填し、インキュベートした。
３．次に、酵素を結合したＩＢＤＶ特異抗体と共にウェルをインキュベートした。
４．次に、該酵素の支持体をウェルに加えた。
５．しばらくしてから希硫酸を加えてウェル内の酵素反応を停止し、ウェルの内容物の色強度を分光光度法により決定した。
　測定した吸光度を既知の濃度の標準抗原調製物の希釈系の吸光度と比較した。抗原量値をＥＬＩＳＡ単位／ｍｌ（ＥＵ／ｍｌ）として表した。
ウイルス滴定
　微量滴定プレート中、一次ニワトリ胚線維芽細胞上で感染ウイルス力価を測定した。まず、５×１０５個／ｍｌの細胞を含有する一次ＣＥＦ懸濁液中で、サンプルの１０倍希釈系を作成した。次に、いずれの場合も２００μｌのサンプル希釈系を微量滴定プレートのウェルに充填し、各サンプルを６〜１０回試験した。プレートをＣＯ２インキュベーター中で３７〜３９℃で４〜７日間インキュベートした後、細胞変性効果の出現を顕微鏡で調べた。力価をＴＣＩＤ５０／ｍｌとして計算した。通常は、ウイルス力価を１０ｌｏｇＴＣＩＤ５０／ｍｌで表した。
ウイルス中和抗体の定量
　微量滴定プレート中、微量中和試験によりウイルス中和抗体を定量した。このために、血清サンプルの２倍希釈系を無血清細胞培養培地中の１０００ＴＣＩＤ５０のＩＢＤＶと共にＣＯ２インキュベーター中で３７℃で１〜２時間インキュベートした。次に、完全細胞培養培地中の１０５個の一次ニワトリ胚細胞を各ウェルに導入した。プレートをＣＯ２インキュベーター中で３７℃で４〜７日間インキュベートした後、細胞変性効果の出現を顕微鏡で調べた。こうして細胞変性効果が完全になくなるような最高希釈度の逆数としてウイルス中和（ＶＮ）力価を決定した。通常は、ＶＮ力価を２ｌｏｇＶＮ力価として表した。
実施例１
一次ニワトリ胚線維芽細胞上でのＤ７８抗原の大規模産生
　１１日齢の特定の病原体をもたないニワトリ胚からＣＥＦを得た。これらの細胞を、５％ＦａＣＳを補充したＭ１９９／Ｆ１０細胞培養培地で１〜３×１０６個／ｍｌの細胞濃度となるように容量１５８５ｃｍ２のガラス回転フラスコに接種した。
　フラスコを３８．５〜３９．５℃で１８〜２４時間インキュベートした。次に、種ウイルス及び過剰量の細胞をフラスコに加えた。回転フラスコ当たり３〜９×１０６個／ｍｌの細胞と１０４〜１０６ＴＣＩＤ５０のＤ７８種ウイルスとを含有する懸濁液１００ｍｌを加えた。次に回転フラスコを３８．５〜３９．５℃で更に４８〜１２０時間インキュベートした後、ウイルス懸濁液を採取し、ホルムアルデヒドで不活化した。８個の代表的な製造バッチにおける抗原量決定の結果を第１表に要約する。
実施例２
最適化実験室条件下の一次ニワトリ胚線維芽細胞上でのＤ７８抗原の産生
　１１日齢の特定の病原体をもたないニワトリ胚からＣＥＦを得た。５％ＦｏＣＳを補充したＭ１９９／Ｆ１０細胞培養培地で１．５、３．０及び６．０×１０６個／ｍｌの細胞濃度で容量４９０ｃｍ２のプラスチック回転フラスコに細胞を接種した。フラスコ当たり１００ｍｌの細胞懸濁液を使用した。
　同時に１０７．３ＴＣＩＤ５０の種ウイルスを各フラスコに加え、夫々感染量が０．１２、０．０６及び０．０３ＴＣＩＤ５０／細胞となるようにした。回転フラスコを３７℃でインキュベートした。２日間インキュベート後、サンプルを抜き取り、そして３日目に懸濁ウイルスを収集した。２日後のサンプル及び３日後に収集した懸濁ウイルスの双方についてＥＬＩＳＡを使用して抗原量を決定した。結果を第２表に示す。
結論：最適化された実験室条件下では、ＣＥＦ上での抗原量の産生量を実質的に改良することが可能であるが、細胞濃度が増加すると、細胞当たりの産生量は著しく減少する。
実施例３
Ｖｅｒｏ細胞上でのＩＢＤＶ抗原の産生
Ａ．十分に増殖した単層上での感染
　Ｖｅｒｏ細胞を０．２５×１０６個／ｍｌの細胞濃度で容量４９０ｃｍ２の２個の回転フラスコに接種した。リン酸トリプトースブロス及び５％ＦｏＣＳを補充したイーグルＭＥＭ中の細胞懸濁液１００ｍｌを各回転フラスコに加えた。一方のフラスコは３７℃で４日間、他方は５日間インキュベートした。その後、細胞培養培地を取り出し、回転フラスコ当たり１０６ＴＣＩＤ５０のＤ７８種ウイルスを加えた。細胞−ウイルス混合物を３７℃で３０分間インキュベーション後、細胞培養培地１００ｍｌを加えた。夫々更に８日又は７日間インキュベーション後、ウイルス懸濁液を採取し、抗原量を決定した。抗原量は７日間インキュベーション後には１９４１３ＥＵ／ｍｌ、８日後には１９７０６ＥＵ／ｍｌであることが判明した。
Ｂ．懸濁液中でのＩＢＤＶによる細胞感染
　リン酸トリプトースブロス及び５％のＦｏＣＳを補充したイーグルのＭＥＭ中に１×１０６個／ｍｌの細胞濃度となるようにＶｅｒｏ細胞を容量４９０ｃｍ２プラスチック回転瓶に接種した。フラスコ当たり１００ｍｌの細胞懸濁液を使用した。また、ＩＢＤ種ウイルスとしてＤ７８又はＳＰ株を細胞の接種直後に加えた。
　培養物を７日間インキュベートした。感染から４５、９６及び１４４時間後にサンプルを取り出した。これらのサンプルの抗原量をＥＬＩＳＡにより測定した（第３表）。
結論：哺乳動物細胞上でＩＢＤＶを産生させると、実施例２に従って同等の条件でＣＥＦ上で産生させることにより得られる収量の約１０倍の抗原量が得られる。単層及び懸濁液培養でほぼ同一の産生レベルが得られた。
実施例４
Ｖｅｒｏ細胞上で産生したＩＢＤＶの感染性ウイルス力価
　容量４９０ｃｍ２の回転フラスコに１×１０６個／ｍｌの濃度でＶｅｒｏ細胞を接種した。リン酸トリプトースブロス及び５％ＦｏＣＳを補充したイーグルのＭＥＭ中の細胞懸濁液１００ｍｌを各フラスコに導入した。同時に、０．０１ＴＣＩＤ５０／細胞の量のＤ７８又はＳＰ種ウイルスを加えた。フラスコを３７℃でインキュベートした。インキュベーションの間にサンプルを取り出し、サンプル中に含まれる抗原量及び感染性ウイルスを決定した。抗原量はＥＬＩＳＡ（ＥＵ／ｍｌ）を使用して測定した。感染性ウイルス力価は一次ＣＥＦ（１０ｌｏｇＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を使用して微量滴定プレート試験で決定した。結果を第４表に示す。
実施例５
生ワクチン
　４羽のＳＰＦニワトリ（３週齢）から成る２群に、Ｖｅｒｏ細胞上で産生したＩＢＤ生ウイルス、即ちＤ７８株ワクチンを０日目に接種した。ウイルスは０．１ｍｌをニワトリの眼球に投与した。一方の群には１０６ＴＣＩＤ５０／羽を投与し、他方の群には１０４．５ＴＣＩＤ５０／羽を投与した。更に、４羽のニワトリから成る群には同様にして一次ＣＥＦ上で産生したＤ７８ワクチンを接種した。ワクチン接種から１６日後に採血した。血中のＩＢＤＶ中和抗体の存在を試験した。
　結果を第５表に示す。
　ワクチン接種から３、６及び１６日後に多数のニワトリから滑液嚢を取り出し、急性及び亜急性病変を組織学的に試験した。ＣＥＦ上で産生したウイルスを接種したニワトリから取り出した滑液嚢と、Ｖｅｒｏ細胞上で産生したウイルスを接種したニワトリの滑液嚢との間に相違は認められなかった。
　結論：Ｖｅｒｏ細胞上で産生したＩＢＤ生ワクチンは
ＣＥＦ上で産生したＩＢＤ生ワクチンとちょうど同程度の免疫原性及び無毒性を有する。
実施例６
チンパンジー肝細胞系におけるＩＢＤＶ株Ｄ７８の産生
　チンパンジー肝細胞の懸濁液１００ｍｌ（細胞濃度０．６×１０６個／ｍｌ）を容量４９０ｃｍ２の回転フラスコに接種した。ＩＢＤＶ種ウイルス（Ｄ７８株）を１０−４ＴＣＩＤ５０／細胞の濃度で加えた。７日間インキュベート後、抗原量含有量は２７０４２ＥＵ／ｍｌであり、これは接種細胞１０６個当たり約４５×１０３ＥＵに対応する。
実施例７
マウス細胞系におけるＩＢＤＶ株Ｄ７８の産生
　ＮＩＨ３Ｔ３マウス細胞の懸濁液１００ｍｌ（細胞濃度０．３×１０６個／ｍｌ）を容量４９０ｃｍ２の回転フラスコに接種した後、１０−４ＴＣＩＤ５０／細胞の濃度でＩＢＤ種ウイルス（Ｄ７８株）を加えた。７日間インキュベート後、ウイルスの抗原量含有量は３５１４ＥＵであり、これは接種細胞１０６個当たり約１２×１０３ＥＵに対応する。
実施例８
ＣＥＦ又はＶｅｒｏ細胞中で培養したＩＢＤＶ抗原の免疫原性の比較
　一次ＣＥＦ又はＶｅｒｏ細胞中で産生したＤ７８及びＳＰ抗原をホルマリンで不活化し、鉱物油で乳化した。４週齢の特定の病原体をもたないニワトリ（ハクショクレグホン）に夫々上記エマルジョンの１種を０．５ｍｌずつ筋肉内接種した。ワクチン接種から６週間後にこれらのニワトリから採血し、血清を５６℃で３０分間不活化させ、血清中に含まれるウイルス中和抗体を一次ＣＥＦ上で測定した。結果を第６表に要約する。
実施例９
ＣＥＦ又はＶｅｒｏ細胞中で培養したＩＢＤＶ抗原接種の有効性の比較
　８週齢のニワトリを１０羽１群とし、不活化Ｄ７８−油エマルジョンワクチンを接種した。０．５ｍｌのワクチンを各ニワトリに筋肉内投与した。Ｖｅｒｏ細胞上で産生した抗原を１群のニワトリに接種し、ＣＥＦ上で産生した抗原を２群に接種した。両方の抗原とも実施例２及び３に記載した手順に従って回転フラスコ中で製造した。ワクチン接種から６週間後にニワトリから血清を取り出し、ウイルス中和抗体を試験した。結果を第７表に要約する。
　統計的分析の結果は、Ｄ７８／Ｖｅｒｏにより誘導される力価がＤ７８／ＣＥＦにより誘導される力価よりも明らかに高いことを示している（スチューデントのＴ試験；ｐ＜０．０５のＣＥＦ２）。