(57)【要約】  本発明の一態様は、被検体における急性の高血糖症及び／又は脂肪酸流動の増加の病理学的続発症の治療方法又は予防方法に関する。この方法は、ＲＯＳ阻害剤を被検体に投与することを伴う。さらに、血管新生の促進方法、酸化又は遊離脂肪酸の過剰放出の阻害方法、及びＲＯＳ介在性損傷の治療又は予防に適した化合物の同定方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非糖尿病被検体、メタボリックシンドローム／インスリン耐性被検体、空腹時の血糖障害被検体、耐糖能障害被検体、及び糖尿病被検体における高血糖症による血糖の急激な増加及び／又は脂肪酸流動の急激な増加の病理学的影響の治療方法又は予防方法であって、該方法は、
該被検体における高血糖症による血糖の急激な増加及び／又は脂肪酸流動の急激な増加の病理学的影響を治療又は予防するのに効果的な状態でＲＯＳ阻害剤を該被検体に付与すること
を含む、該方法。
【請求項２】
前記被検体が骨髄由来の血管内皮細胞前駆体の可動性を損なう状態を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被検体が血管内皮成長因子のＨＩＦ−１α介在性上方調節を損なう状態を有している、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記被検体が血管新生を阻害する状態を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記被検体が虚血状態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記虚血状態が冠動脈疾患である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記虚血状態が末梢血管障害である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記虚血状態が脳血管疾患である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記虚血状態が創傷である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記創傷が慢性的な創傷である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記創傷が糖尿病性創傷である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
糖尿病性網膜症が治療又は予防される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
糖尿病性腎症が治療又は予防される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
糖尿病性神経障害が治療又は予防される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
糖尿病性大血管疾患が治療又は予防される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
糖尿病性足部潰瘍が治療又は予防される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
虚血、血管形成、冠動脈バイパスグラフト及び下肢の血管再生に応じた、糖尿病によって損なわれる血管再生が治療又は予防される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
非アルコール性脂肪性肝炎が治療又は予防される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記被検体が救急救命疾病を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記被検体が急性心筋梗塞を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記被検体が急性脳梗塞を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記被検体が一般外科を受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＯＳ阻害剤がαリポ酸、スーパーオキシドジスムターゼ模倣剤及びカタラーゼ模倣剤から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＯＳ阻害剤がＭｎＴＢＡＰ、ＺｎＴＢＡＰ、ＳＣ−５５８５８、ＥＵＫ−１３４、Ｍ４０４０３、ＡＥＯＬ１０１１２、ＡＥＯＬ１０１１３、ＡＥＯＬ１０１５０、鉄キレート化剤及びそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＯＳ阻害剤がデフェロキサミンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
鉄キレート化剤の混合物が投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記被検体が急性の心筋梗塞を有し、１，０００〜１０，０００ｍｇのデフェロキサミンを筋肉注射することによって治療される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記被検体が急性の心筋梗塞を有し、１００〜１０，０００ｍｇのデフェロキサミンを静脈注射することによって治療される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記被検体が急性の心筋梗塞を有し、１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌの濃度で液体状のデフェロキサミンを静脈注射することによって２４時間以内の症状が治療される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
デフェロキサミンがＤＦＰ、ＩＣＬ−６７０、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ阻害剤又はグルカゴン様ペプチド１とともに投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
デフェロキサミンがニコチンアミド、３−アミノベンズアミド、及びそれらの混合物から成る群から選択されるポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ阻害剤を伴い投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記投与が経口、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、ｉｎｔｒａｖｅｒｓａｌ滴下で、眼球内、鼻腔内、動脈内、病巣内又は粘膜塗布によって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＯＳ阻害剤が医薬上許容可能な塩、担体、賦形剤、又は安定化剤で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
高血糖症の傾向があるか、又は脂肪酸流動が増大しがちである被検体において血管新生を促進する方法であって、該方法は
該被検体において血管新生を促進するのに効果的な状態で該被検体にＲＯＳ阻害剤を投与すること
を含む、該方法。
【請求項３５】
前記血管新生の促進が低酸素のシグナル伝達に応じてのものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記血管新生が血管形成である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記血管形成が心臓の血管形成である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記血管形成が下肢の血管形成である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記血管形成が脳内の血管形成である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記血管新生が脈管形成である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記被検体が虚血状態を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記虚血状態が冠動脈疾患である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記虚血状態が末梢血管障害である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記虚血状態が脳血管疾患である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記虚血状態が創傷である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記創傷が慢性的な創傷である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記創傷が糖尿病性創傷である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＲＯＳ阻害剤がαリポ酸、スーパーオキシドジスムターゼ模倣剤及びカタラーゼ模倣剤から成る群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４９】
前記投与が経口、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、ｉｎｔｒａｖｅｒｓａｌ滴下で、眼球内、鼻腔内、動脈内、病巣内又は粘膜塗布によって実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＲＯＳ阻害剤が医薬上許容可能な塩、担体、賦形剤、又は安定化剤と共に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項５１】
前記被検体がヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項５２】
前記被検体が高血糖症の傾向がある、請求項３４に記載の方法。
【請求項５３】
前記被検体が脂肪酸流動を増大しがちである、請求項３４に記載の方法。
【請求項５４】
被検体において、遊離脂肪酸の酸化又は過剰放出を阻害する方法であって、該方法は、
該被検体において遊離脂肪酸の酸化又は過剰放出の阻害に効果的な状態でチアゾリジンジオン、ニコチン酸、エトモキシル及びラノラジンから成る群から選択される化合物を該被検体に投与すること
を含む、該方法。
【請求項５５】
上記化合物がチアゾリジンジオンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
上記化合物がニコチン酸である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
上記化合物がエトモキシルである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
上記化合物がラノラジンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
酸化が阻害される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
遊離脂肪酸の過剰放出が阻害される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記被検体が哺乳類である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
ＲＯＳ介在性損傷の治療又は予防に適した化合物の同定方法であって、該方法は
糖尿病の動物モデルを提供すること、
該動物モデルにおいて糖尿病を誘導すること、
糖尿病が誘導された該動物モデルへ試験される化合物を投与すること、及び
ＲＯＳ介在性損傷を治療又は予防するための治療用の候補物質として、該動物モデルにおいて、局所酸素圧、血流、血管密度の増加、及び組織生存の回復を達成する化合物を同定すること
を含む、該同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、被検体における高血糖症による血糖の急激な増加及び／又は脂肪酸流動の急激な増加の病理学的影響の治療方法又は予防方法に関する。
【０００２】
本出願は、２００４年５月２４日に提出された米国仮特許出願番号第６０／５７３，９４７号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
糖尿病に関連する心血管系の合併症が主要な公衆衛生問題である
真性糖尿病は、米国において流行病である（Brownlee，"Biochemistry and Molecular Cell Biology of Diabetic Complications" Nature 414:813-20(2001)、Nishikawa他,"Normalizing Mitochondrial Superoxide Production Blocks Three Pathways of Hyperglycaemic Damage" Nature 404:787-90(2000)、Zimmet他,"Global and Societal Implications of the Diabetes Epidemic" Nature 414:782-7(2001)）。現在、米国において１，５００〜１，７００万人の成人（成人人口の５％）がI型糖尿病及びII型糖尿病に侵されている（Harris他,"Prevalence of Diabetes, Impaired Fasting Glucose, and Impaired Glucose Tolerance in U.S. Adults. The Third National Health and Nutrition Examination Survey, 1988-1994" Diabetes Care 21:518-24(1998)、AD Association, "Economic Costs of Diabetes in the U.S. in 2002" Diabetes Care 26:917-932(2003)）。２０２０年には、糖尿病人口は、新たに４４％増加すると予想される(AD Association, "Economic Costs of Diabetes in the U.S. in 2002" Diabetes Care 26:917-932(2003))。真性糖尿病の人々に加えて、さらに多くの人々が耐糖能障害及びインスリン耐性障害及び変化した血管反応性による、メタボリックシンドロームを示す。
【０００４】
糖尿病の最も大きな影響は、脈管系においてである（Caro他, "Lifetime Costs of Complications Resulting From Type 2 Diabetes in the U.S." Diabetes Care 25:476-81(2002)）。糖尿病患者は、心臓、脳及び末梢血管に影響を与える血管疾患の危険性が増大する（Howard他, "Prevention Conference VI: Diabetes and Cardiovascular Disease: Writing Group I: Epidemiology" Circulation 105: e132-7(2002)）。糖尿病患者における心臓血管疾患の相対危険度は、年齢を適合させた対照群よりも２〜８倍高い（Howard他, "Prevention Conference VI: Diabetes and Cardiovascular Disease: Writing Group I: Epidemiology" Circulation 105: e132-7(2002)）。糖尿病は、米国における１年の医療費の１，８００億ドルを占め、この量の８５％が血管合併症によるものである（Caro他, "Lifetime Costs of Complications Resulting From Type 2 Diabetes in the U.S." Diabetes Care 25:476-81(2002)）。実際には、大血管合併症（発作、ＭＩ、ＴＩＡ、アンギナ）及び微小血管合併症（腎症、神経障害、網膜症、創傷治癒）がともに考慮される場合、糖尿病に関する医療費の大部分は血管障害に起因する。
【０００５】
代償性血管成長が損なわれることにより糖尿病患者が悪影響を受ける
糖尿病によって虚血事象後の生存が損なわれるという認識は、前世紀にさかのぼり、２つの重要な疫学研究によって別々に確認された（The Framingham Study and The Diabetes Control and Complications Trial）（Garcia他, "Morbidity and Mortality in Diabetics in the Framingham Population. Sixteen Year Follow-Up Study" Diabetes 23:105-11(1974)、TDCaCTR Group, "The Effect of Intensive Treatment of Diabetes on the Debelopment and Progression of Long-Term Complications in Insulin-Dependent Diabetes Mellitus" N Engl J Med 329:977-86(1993)）。これらのプロスペクティブ研究は、弱い血糖コントロールと心筋梗塞後の生存の減少との関係を立証した。注目すべきは、これらの試みが、虚血発作の発生の増加（Kannel他, "Diabetes and Cardiovascular Risk Factors: the Framingham Study" Circulation; 59:8-13(1979)）に加えて、糖尿病患者において心臓麻痺及び二次虚血イベント等の梗塞後の合併症の発生率がより高くなることを実証したことである（Haffner他, "Mortality From Coronary Heart Disease in Subjects With Type 2 Diabetes and in Nondiabetic Subjects With and Without Prior Myocardial Infarction" N Engl J Med 339:229-34(1998)、Zuanetti他, "Influence of Diabetes on Mortality in Acute Myocardial Infarction: Data From the GISSI-2 Study" J Am Coll Cardiol 22:1788-94(1993)）。これらの違いは、糖尿病集団における梗塞面積の増大によるものではなく（Wilson, "Diabetes Mellitus and Coronary Heart Disease" Am J Kidney Dis 32:S89-100(1998)）、これは機能障害が糖尿病の心筋の代償性応答に存在することを示唆した。同様の機能障害が、四肢及び脳を含む他の糖尿病組織において記載されてきた（Uusitupa他, "5-Year Incidence of Atherosclerotic Vascular Disease in Relation to General Risk Factors, Insulin Level, and Abnormalities in Lipoprotein Composition in Non-Insulin-Dependent Diabetic and Nondiabetic Subjects" Circulation 82:27-36(1990)、Jude他, "Peripheral Arterial Disease in Diabetic and Nondiabetic Patients: a Comparison of Severity and Outcome" Diabetes Care 24:1433-7(2001)、Tuomilehto他, "Diabetes Mellitus as a Risk Factor for Death From Stroke. Prospective Study of the Middle-Aged Finnish Population" Stroke 27:210-5(1996)）。
【０００６】
これらの機能障害があまり適応しない糖尿病の血管系に由来するという概念は、臨床的支持及び実験的支持の両方を得ている。血管形成及び側副路発達は心臓の流域へ血流を回復するというプロセスであるので、微小管系における正常の血管密度の迅速な回復が、虚血に続く患者への影響を最終的に決定する（Helfant他, "Functional Importance of the Human Coronary Collateral Circulation" N Engl J Med 284:1277-81(1971)、Chilian他, "Microvascular Occlusions Promote Coronary Collateral Growth" Am J Physiol 258:H1103-11(1990)）。実際には、血管形成の治療に関する理論的根拠は、虚血性の心臓の流域における微小血管ネットワークが増大することが有益であるだろうという確信(belief)からである。臨床的研究並びに実験的研究は、虚血によって引き起こされる血管新生が糖尿病によって損なわれるという確証を与える（Abaci他, "Effect of Diabetes Mellitus on Formation of Coronary Collateral Vessels" Circulation 99:2239-42(1999)、Tooke, "Microvasculature in Diabetes" Cardiovasc Res 32:764-71(1996)、Waltenberger, "Impaired Collateral Vessel Development in Diabetes: Potential Cellular Mechanisms and Therapeutic Implications" Cardiovasc Res 49:554-60(2001)、Yarom他, "Human Coronary Microvessels in Diabetes and Ischaemia. Morphometric Study of Autopsy Material" J Pathol 166:265-70(1992)）。動物研究において、糖尿病の動物は、後肢の虚血に続く血管密度の減少を実証する（Rivard他, "Rescue of Diabetes-Related Impairment of Angiogenesis By Intramuscular Gene Therapy With Adeno-VEGF" AM J Pathol 154:355-63(1999)、Taniyama他, "Therapeutic Angiogenesis Induced By Human Hepatocyte Growth Factor Gene in Rat Diabetic Hind Limb Ischemia Model: Molecular Mechanisms of Delayed Angiogenesis in Diabetes" Circulation 104:2344-50(2001)、Schatteman他, "Blood-Derived Angioblasts Accelerate Blood-Flow Restoration in Diabetic Mice" J Clin Invest 106:571-8(2000)）。ヒトの血管造影法の研究は、糖尿病患者が非糖尿病の対照群より側副血管が少ないことを実証している（Abaci他, "Effect of Diabetes Mellitus on Formation of Coronary Collateral Vessels" Circulation 99:2239-42(1999)）。さらに、冠動脈血管形成、冠動脈バイパス手術又は下肢の血管再生による血管再開通術は、微小循環レベルでの不具合の存在が示唆されている、患者のバイパスルートの存在下でさえ、糖尿病患者において非常に成功率が低い（Kip他, "Coronary Angioplasty in Diabetic Patients. The National Heart, Lung, and Blood Institute Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty Registry" Circulation 94:1818-25(1996)、Palumbo他, "Diabetes Mellitus: Incidence, Prevalence, Survivorship, and Causes of Death in Rochester, Minnesota, 1945-1970" Diabetes 25:566-73(1976)、Schwartz他, "Coronary Bypass Graft Patency in Patients With Diabetes in the Bypass Angioplasty Revascularization Investigation(BARI)" Circulation 106:2652-8(2002)、Kip他, "Differential Influence of Diabetes Mellitus on Increased Jeopardized Myocardium After Initial Angioplasty or Bypass Surgery: Bypass Angioplasty Revascularization Investigation" Circulation 105:1914-20(2002)）。
【０００７】
【表１−１】
2008500347.tif 000002
【０００８】
【表１−２】
2008500347.tif 000003
【０００９】
これらの観察の優位性にもかかわらず、糖尿病における損なわれた血管新生を基とする仕組みが不明確なままである。損なわれたＶＥＧＦ発現は、重要な要因として関係があると見なされている（Rivard他, "Rescue of Diabetes-Related Impairment of Angiogenesis By Intramuscular Gene Therapy With Adeno-VEGF" Am J Pathol 154:355-63(1999)、Schratzberger他, "Reversal of Experimental Diabetic Neuropathy by VEGF Gene Transfer" J Clin Invest 107:1083-92(2001)、Aiello他, "Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Diabetic Vascular Complications" Kidney Int Suppl 77:S113-9(2000)）。減少したＶＥＧＦ発現の仕組みの詳細な理解は、虚血事象に続く糖尿病の影響を改善するための新しいアプローチに関する有用な構想を提供するであろう。
【００１０】
虚血誘導性血管新生は、２つの仕組み：血管形成及び脈管形成によって起こる
適切な低酸素のシグナル伝達カスケードが開始された後、虚血性障害に応じて代償性血管の成長が２つの異なる仕組みによって起こる（図１）。血管形成では、成人に存在する内皮細胞が血管形成の刺激に応じて現存する血管から新しい血管を成長及び発芽させる。さらに最近説明された仕組みにおいては、脈管形成という用語は、血管の幹細胞（内皮前駆細胞、すなわちＥＰＣ）の特質を有する循環細胞が虚血事象に応じて骨髄から移動し、その後虚血性の血管床へ特異的に戻り、血管新生に貢献することを意味する（Asahara他, "Isolation of Putative Progenitor Endothelial Cells for Angiogenesis" Science 275:964-7(1997)、Shi他, "Evidence for Circulating Bone Marrow-Derived Endothelial Cells" Blood 92:362-7(1998)、Asahara他, "Bone Marrow Origin of Endothelial Progenitor Cells Responsible for Postnatal Vasculogenesis in Physiological and Pathological Neovascularization" Circ Res 85:221-8(1999)、Isner他, "Angiogenesis and Vasculogenesis as Therapeutic Strategies for Postnatal Neovascularization" J Clin Invest 103:1231-6(1999)、Crosby他, "Endothelial Cells of Hematopoietic Origin Make a Significant Contribution to Adult Blood Vessel Formation" Circ Res 87:728-30(2000)、Pelosi他, "Identification of the Hemangioblast in Postnatal Life" Blood 100:3203-8(2002)）。
【００１１】
低酸素誘導性因子１（ＨＩＦ−１）が後に続く血管の成長を含む低酸素応答の主要な媒介物である
虚血が血管の成長を調節するという観察結果は、長年の間既知であったが、Semenza及びその同僚が、エリスロポエチン遺伝子の上方調節を介在する低酸素応答性転写因子（ＨＩＦ−１）について記載した時である、１９９２年まで、その原因になる因子が同定されなかった（Semenza他, "A Nuclear Factor Induced by Hypoxia bia de Novo Protein Synthesis Binds to the Human Erythropoietin Gene Enhancer at a Site Required for Transcriptional Activation" Mol Cell Biol 12:5447-54(1992)、Semenza他, "Hypoxia-Inducible Nuclear Factors Bind to an Enhancer Element Located 3' to the Human Erythropoietin Gene" Proc Natl Acad Sci USA 88:5680-4(1991)）。ＨＩＦ−１は全ての後生動物門で保存される新規の転写因子であり、これまで試験されてきた全ての細胞に普遍的に存在していることが分かった（Carmeliet他, "Abnormal Blood Vessel Development and Lethality in Embryos Lacking a Single VEGF Allele" Nature 380:435-9(1996)）。血管形成への関与に対する証拠が、ＶＥＧＦが低酸素状態によって強く上方調節されたという最初の観察結果から導かれた（Shweiki他, "Vascular Endothelial Growth Factor Induced by Hypoxia May Mediate Hypoxia-Initiated Angiogenesis" Nature 359:843-5(1992)）。その後すぐに、ＨＩＦ−１が低酸素及び低血糖によるＶＥＧＦの上方調節に関与する転写因子と認められた。（Forsythe他, "Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-Inducible Factor 1" Mol Cell Biol 16:4606-13(1996)）。ＨＩＦで調節されたＶＥＧＦ発現は、生理的状態及び病理学的状態における胚発生及び生後の血管新生の両方における血管の発達にとって必須であることが今では明らかである（Carmeliet他, "Abnormal Blood Vessel Development and Lethality in Embryos Lacking a Single VEGF Allele" Nature 380:435-9(1996)、Carmeliet他, "Abnormal Blood Vessel Development and Lethality in Embryos Lacking a Single VEGF Allele" Nature 380:435-9(1996)、Iyer他, "Cellular and Developmental Control of O2 Homeostasis by Hypoxia-Inducible Factor 1 Alpha" Genes Dev 12:149-62(1998)）。ＨＩＦ−１は、酸素で調節されるＨＩＦ−１αサブユニット及び酸素で調節されないＨＩＦ−１βサブユニットから成る。ＨＩＦ−１は、今では血管形成、脈管形成、赤血球成長及びグルコース代謝を含む虚血への適応に必須の上方調節過程による、低酸素への生理学的応答を導く優れた転写因子であると考えられている（図２）。
【００１２】
ＨＩＦ−１α転写活性化の調節
ＨＩＦ−１転写複合体は、ＨＩＦ−１α／β及び遺伝子の転写を調節する他の７つより多い因子から成る。この複合体の２つの優れた機能性の成分は、ＨＩＦ−１α及びＣＢＰ／ｐ３００であり、これは直接相互作用し、遺伝子発現を転写活性化する。ＨＩＦ−１αの機能は、主にタンパク質の安定化及び翻訳後の修正を介して酸素によって調節される。最近の報告では、ＨＩＦ−１αはインビトロでのリン酸化反応によって活性化し、ＨＩＦ介在性遺伝子発現を増大させることが実証されている（Richard他, "p42/p44 Mitogen-Activated Protein Kinases Phosphorylate Hypoxia-Inducible Factor 1 Alpha(HIF-1 alpha) and Enhance the Transcriptional activity of HIF-1" J Biol Chem 274:32631-7(1999)）。この修正がＨＩＦ−１α自体の転写活性機能の直接的な刺激をもたらすか、又はコアクチベータの採用を容易にするかどうかは、明らかではない（Richard他, "p42/p44 Mitogen-Activated Protein Kinases Phosphorylate Hypoxia-Inducible Factor 1 Alpha(HIF-1 alpha) and Enhance the Transcriptional activity of HIF-1" J Biol Chem 274:32631-7(1999)、Sang他, "Signaling Up-Regulates the Activity of Hypoxia-Inducible Factors by Its Effects on p300" J Biol Chem 278:14013-9(2003)）。
【００１３】
また、ＣＢＰ／ｐ３００においても、インビトロでリン酸化反応を調節し、ＨＩＦ−１αとともに転写活性化剤として機能する能力を高めることが最近実証された（Sang他, "Signaling Up-Regulates the Activity of Hypoxia-Inducible Factors by Its Effects on p300" J Biol Chem 278:14013-9(2003)）。したがって、これらの２つの因子のリン酸化反応を促進する細胞内状態が、低酸素誘導性の遺伝子発現を増大すると思われる一方で、脱リン酸化に有利に働くこれら細胞内状態は逆の効果を有している。ＨＩＦ−１介在性遺伝子発現は、血管形成及び脈管形成の両方において必須ではあるが、糖尿病状態における遺伝子発現の調節の役割は、以前に研究されてはいない。
【００１４】
血管形成及び脈管形成の両方は、ＶＥＧＦにより調整される
血管形成がＶＥＧＦによって介在されることが既知であり、この仕組みが広く研究されている（Ferrara他, "The Biology of VEGF and its Receptors" Nat Med 9:669-76(2003)）。最近では、ＶＥＧＦが脈管形成の調節にも関係があると見なされている（図２）。虚血は、骨髄由来の内皮前駆細胞の有力な動員因子(mobilizer)である。ＥＰＣがＶＥＧＦ受容体１及びＶＥＧＦ受容体２の両方をそれらの細胞表面上で発現するので、このことはＶＥＧＦシグナル伝達によって介在されると思われる（Asahara他, "VEGF Contributes to Postnatal Neovascularization by Mobilizing Bone Marrow-Derived Endothelial Progenitor Cells" Embo J 18:3964-72(1999)、Takahashi他, "Ischemia- and Cytokine-induced Mobilization of Bone Marrow-Derived Endothelial Progenior Cells for Neovascularization" Nat Med 5:434-8(1999)、Kalka他, "Vascular Endothelial Growth Factor(165) Gene Transfer Augments Circulating Endothelial Progenitor Cells in Human Subjects" Circ Res 86:1198-202(2002)、Gill他, "Vascular Trauma Induces Rapid but Transient Mobilization of VEGFR2(+)AC133(+) Endothelial Precursor Cells" Circ Res 88:167-74(2001)、Hattori他, "Vascular Endothelial Growth Factor and Angiopoietin-1 Stimulate Postnatal Hematopoiesis by Recruitment of Vasculogenic and Hematopoietic Stem Cells" J Exp Med 193:1005-14(2001)）。ＶＥＧＦ産生が、真性糖尿病において損なわれると、ＥＰＣ可動化を含む脈管形成の様々な局面もまた、損なわれる恐れがあると思われる。実際は、最近の証拠では、これらの血管の前駆細胞の血管への取り込みは、糖尿病状態で減少することが実証されている。
【００１５】
ＶＥＧＦ発現が組織特異的な方法で調節され得る
糖尿病患者において様々な組織及び器官が異なる病状を示すということもまた、明らかである。網膜は、過度の血管形成によって特徴付けられることが多く、一方、糖尿病患者における皮膚、筋肉及び神経は新しい組織形成の不足を被る。同様に、糖尿病性網膜症は眼球のＶＥＧＦレベルの増大によって特徴付けられており（Aiello他, "Vascular Endothelial Growth Factor in Ocular Fluid of Patients with Diabetic Retinopathy and Other Retinal Disorders" N Engl J Med 331:1480-7(1994)、Adamis他, "Increased Vascular Endothelial Growth Factor Levels in the Vitreous of Eyes with Proliferative Diabetic Retinopathy" Am J Ophthalmol 118:445-50(1994)）、一方、損なわれた創傷の治癒は、ＶＥＧＦレベルの大幅な減少によって特徴付けられている（Frank他, "Regulation of Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Cultured Keratinocytes.  Implications for Normal and Impaired Wound Healing" J Biol Chem 270:12607-13(1995)、Peters他, "Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Expression During Embryogenesis and Tissue Repair Suggests a Role in Endothelial Differentiation and Blood Vessel Growth" Proc Natl Acad Sci USA 90:8915-9(1993)、Silhi, N., "Diabetes and Wound Healing" J Wound Care 7:47-51(1998)、Brown, L.F., "Expression of Vascular Permeability Factor(Vascular Endothelial Growth Factor) by Epidermal Keratinocytes During Wound Healing" J Exp Med 176:1375-9(1992)、Nissen他, "Vascular Endothelial Growth Factor Mediates Angiogenic Activity During the Proliferative Phase of Wound Healing" Am J Pahol 152:1445-52(1998)）。このいわゆる「糖尿病パラドックス」（これにより糖尿病表現型が種々の組織における過度の新しい血管形成及び損なわれた新しい血管形成の両方を示す）が、種々の種類の合併症を導く。この現象がＶＥＧＦの転写調節において細胞特異的な相違及び組織特異的な相違を表すと考えられている。
【００１６】
活性酸素種の過剰産生によって高血糖症が細胞機能の特定の機能障害をもたらす：ＶＥＧＦに関連する可能性
低酸素で誘導される損なわれたＶＥＧＦ発現及びＳＤＦ−１発現の原因となる細胞の仕組みは、まだ決定されていない。最近では、高血糖症誘導性細胞障害の生化学的根拠が説明され、高グルコースの多くの影響が４つの特定の細胞経路で介在されることが実証された（図３）（Brownlee, "Biochemistry and Molecular Cell Biology of Diabetic Complications" Nature 414:813-20(2001)、Nishikawa他, "Normalizing Mitochondrial Superoxide Production Blocks Three Pathways of Hyperglycaemic Damage" Nature 404:787-90(2000)）。グルコースの細胞内上昇は、解糖系及びクレブス回路を介する代謝産物の流動を増大させ、ミトコンドリアによるＲＯＳの過剰産生をもたらす。ＲＯＳの過剰産生は、ＧＡＰＤＨ活性を阻害し、解糖系の第一段階における早期グルコース代謝産物の集積をもたらす。これら代謝産物の豊富化、及び代謝産物が解糖系を介して反応を進行させる能力の欠如がグルコース利用の代替的経路（ポリオール経路、へキソサミン経路、タンパク質キナーゼＣ経路及びＡＧＥ経路、図３）へのこれら媒介物のシャントを引き起こす。これらの各経路における最終産物の集積は、遺伝子発現を含む細胞機能における特定の変化を導き（Nissen他, "Vascular Endothelial Growth Factor Mediates Angiogenic Activity During the Proliferative Phase of Wound Healing" Am J Pathol 152:1445-52(1998)）、糖尿病の合併症の病態生理学に関係する（Brownlee，"Biochemistry and Molecular Cell Biology of Diabetic Complications" Nature 414:813-20(2001)）。実際には、１つ、幾つか又は全てのこれら経路の特異的な遮断が、動物モデルにおける糖尿病の合併症を予防するということが分かっており、糖尿病の合併症は虚血性障害に起因するこれらの合併症を含む（Hammes他, "Benfotiamine Blocks Three Major Pathways of Hyperglycemic Damage and Prevents Experimantal Diabetic Retinopathy" Nat Med 9:294-9(2003)、Obrosova他, "Aldose Reductase Inhibitor Fidarestat Prevents Retinal Oxidative Stress and Vascular Endothelial Growth Factor Overexpression in Streptozotocin-Diabetic Rats" Diabetes 52:864-71(2003)）。
【００１７】
高血糖症誘導性の活性酸素種は、ＨＩＦ−１αの、虚血セッティングにおける血管新生に必要なＶＥＧＦ及びケモカインＳＤＦ−１の適切な上方調節を介在する能力を損なわせ。この機能障害はまた、血管のエフェクター細胞の低酸素特異的機能に影響を与える。これは、糖尿病状態における血管形成の減衰、脈管形成の減衰及び組織生存の減少をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、被検体における急性の高血糖症及び／又は脂肪酸流動の増加といった病理学的続発症を治療又は予防することを対象とし、したがって、代謝産物誘導性の活性酸素種で介在される損傷を予防する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
［発明の概要］
本発明の一態様は、非糖尿病被検体、メタボリックシンドローム／インスリン耐性被検体、空腹時の血糖障害被検体、耐糖能障害被検体、及び糖尿病被検体における急性の高血糖症及び／又は増大する脂肪酸流動の病理学的続発症の治療方法又は予防方法に関する。この方法は、上記被検体における急性の高血糖症及び／又は脂肪酸流動の増大の病理学的続発症を治療又は予防するのに効果的な状態でＲＯＳ阻害剤を被検体に投与することを伴う。
【００２０】
本発明の他の態様は、高血糖症の傾向があるか、又は脂肪酸流動が増大しがちである被検体において血管新生を促進する方法に関する。この方法は、上記被検体において血管新生を促進するのに効果的な状態でＲＯＳ阻害剤を被検体に投与することを伴う。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、被検体において、遊離脂肪酸の酸化又は過剰放出を阻害する方法に関する。この方法は、上記被検体において遊離脂肪酸の過剰な放出の阻害に効果的な状態で特定の化合物を被検体に投与することを伴う。これら化合物には、チアゾリジンジオン、ニコチン酸、エトモキシル及びラノラジンが挙げられる。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、ＲＯＳ介在性損傷の治療又は予防に適した化合物の同定方法に関する。この方法は、糖尿病の動物モデルを提供すること、及びこの動物モデルにおいて糖尿病を誘導することを伴う。その後、試験される化合物を動物モデルに投与する。その後、ＲＯＳ介在性損傷を治療又は予防するための治療用の候補物質として、動物モデルにおいて、局所酸素圧、血流、血管密度の増加、及び組織生存の回復を達成する化合物が回復される。
【００２３】
本発明は、グルコース代謝及び脂肪酸代謝の疾患による患者の虚血に応じた不十分な血管形成を回復させる手段を提供する。これは、下肢を切断する割合を大幅に低減させ、心臓麻痺及び心臓発作による心臓障害及び脳損傷の程度を軽減するであろう。さらに、本発明は現在利用可能で効果的な医療が存在しない主要な臨床に関する問題である、糖尿病による難治性足部潰瘍の治癒をもたらすであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
［発明の詳細な説明］
本発明の一態様は、高血糖症による血糖の急激な増加及び／又は非糖尿病被検体、メタボリックシンドローム／インスリン耐性被検体、空腹時の血糖障害被検体、耐糖能障害被検体、及び糖尿病被検体における脂肪酸流動の急激な増加の病理学的影響の治療方法又は予防方法に関する。この方法は、高血糖症による血糖の急激な増加及び／又は上記被検体における脂肪酸流動の急激な増加の病理学的影響を治療又は予防するのに効果的な状態でＲＯＳ阻害剤を当該被検体に付与することを伴う。
【００２５】
上記したように、本発明のこの態様において、請求項の方法は非糖尿病被検体、メタボリックシンドローム／インスリン耐性被検体、空腹時の血糖障害被検体、耐糖能障害被検体、及び糖尿病被検体に適用することができる。各場合において、上記被検体が高血糖症及び／又は脂肪酸流動のベースラインレベルを有する。本発明は高血糖症及び／又は脂肪酸流動のベースラインレベルが迅速、且つ比較的短期間に（いわゆる、急激に）増加する被検体における病的状態を予防又は治療することに関する。
【００２６】
高血糖症における急激な増加及び／又は脂肪酸流動の急激な増加が発生する被検体は、以下の状態のいずれかを患っている可能性がある：網膜（いわゆる、糖尿病性網膜症）；腎糸球体（いわゆる、糖尿病性腎症）；末梢神経（いわゆる、糖尿病性神経障害）；心臓、脳及び下肢に行きわたる動脈に影響を与える促進アテローム性大血管疾患（いわゆる、糖尿病性大血管(macrovasular)疾患）；又は単なる脂肪症から脂肪性肝炎（「ＮＡＳＨ」）、線維症及び肝硬変までに至る肝臓損傷の幅広い領域を含む非アルコール性肝臓疾患（「ＮＡＦＬＤ」）における糖尿病で特徴的な微小血管の病変。高血糖症における急激な増加及び／又は脂肪酸流動の急激な増加の病理学的影響は、動脈バイパス手術又は一般の手術を受けている被検体が重症の疾病、急性心筋梗塞、急性脳梗塞を有するのを予防又は治療することもできる。
【００２７】
高血糖症における急激な血糖の増加及び／又は脂肪酸流動の急激な増加は、骨髄由来の血管内皮細胞前駆体の流動を損なわせる。これは、骨髄由来の血管内皮細胞前駆体の流動を損なう形態、血管内皮成長因子のＨＩＦ−１α介在性上方調節及びＳＤＦ−１介在性上方調節を損なう形態及び／又は血管新生を阻害するＲＯＳ介在性損傷の形態をとり得る。被検体はまた、冠動脈疾患、末梢血管障害、脳血管疾患、治癒しない足部潰瘍又は創傷（急性又は慢性）を含む虚血状態も有する可能性がある。
【００２８】
ＲＯＳ阻害剤は、α脂肪酸、スーパーオキシドジスムターゼ模倣剤又はカタラーゼ模倣剤であってもよい。スーパーオキシドジスムターゼ模倣剤又はカタラーゼ模倣剤は、ＭｎＴＢＡＰ（Ｍｎ（ＩＩＩ）テロラキス（４−安息香酸）ポルフィリン塩化物）（Calbiochem製）、ＺｎＴＢＡＰ（Ｚｎ（ＩＩＩ）テロラキス（４−安息香酸）ポルフィリン塩化物）、ＳＣ−５５８５８（マンガン（ＩＩ）ジクロロ（２Ｒ，３Ｒ，８Ｒ，９Ｒ−ビス−シクロヘキサノ−１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）］Ｅｕｋ−１３４（３，３’−メトキシサレンＭｎ（ＩＩＩ））（Eukarion製）、Ｍ４０４０３（ジクロロ［（４ａＲ，１３ａＲ，１７ａＲ，２１ａＲ）−１，２，３，４，４ａ，５，６，１２，１３，１３ａ，１４，１５，１６，１７，１７ａ，１８，１９，２０，２１−エイコサヒドロ−１１，７−ニトリロ−７Ｈ−ジベンゾ［１，４，７，１０］テトラアザシクロヘプタデシン−ｋａｐｐａＮ５，ｋａｐｐａＮ１３，ｋａｐｐａＮ１８，ｋａｐｐａＮ２１，ｋａｐｐａＮ２２］マンガン）（Metaphore製）、ＡＥＯＬ１０１１２、ＡＥＯＬ１０１１３及びＡＥＯＬ１０１５０（マンガン（ＩＩＩ）メソテトラキス（ジ−Ｎ−エチルイミダゾール）ポルフィリン）（全てのＡＥＯＬ化合物は、Incara Pharmaceuticals製である）。或いは、ＲＯＳ阻害剤は、鉄キレート化剤であってもよい。鉄キレート化剤の中では、デフェロキサミン又はＤＦＯが最も重要であり、これは、デフェロキサミン又はＤＦＯがｔｈａｌｌａｓｅｍｉａにおける鉄過剰治療に対するものとしてＦＤＡに承認されているためである。さらに、ＲＯＳ阻害剤は、鉄キレート化剤の混合物から成る組成物であってもよい。
【００２９】
デフェロキサミンを採用する場合、患者（例えば、急性心筋梗塞を患う患者）は、デフェロキサミン１，０００〜１０，０００ｍｇの筋肉内注射によって又はデフェロキサミン１００〜１０，０００ｍｇの静脈内注射によって治療することができる。このような患者は、デフェロキサミンの１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌの濃度で液状のデフェロキサミンの静脈内注射により症状(兆候）の２４時間以内に治療することができる。デフェロキサミンは、ＤＦＰ、ＩＣＬ−６７０、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ阻害剤及び高血糖症誘導性ＲＯＳ産生を防ぐグルカゴン様ペプチド１分画（例えば、ＧＬＰ−１（９〜３７アミド）及びＧＬＰ−９−３７）とともに投与することもできる。或いは、デフェロキサミンはまた、ニコチンアミド、３−アミノベンズアミド、ＰＪ３４（Ｎ−（６−オキソ−５，６−ジヒドロ−フェナトリジン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されない、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ阻害剤とともに投与することができる。
【００３０】
デフェロキサミンは、鉄過剰状態の患者に対する救命治療を提供することができ、多くのデフェロキサミン誘導体もまた採用することができる。ＤＦＯの脂肪族類似物、芳香族類似物、コハク酸類似物及びメチルスルホン酸類似物がＤＦＯの親油性を高めるために合成された(Ihnat他, "Solution Equilibria of Deferoxamine Amides" J. Pharm Sci. 91:1733-1741(2002)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)。具体的には、これら誘導体には、ホルムアルデヒド−デフェロキサミン、アセトアミド−デフェロキサミン、プロピルアミドデフェロキサミン、ブチルアミド−デフェロキサミン、ベンゾイルアミド−デフェロキサミン、スクシン(succin)アミド−デフェロキサミン及びメチルスルホアミド−デフェロキサミンが挙げられる。デフェロキサミンよりも大きい血中濃度半減期を有することが認められたヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）−デフェロキサミンが合成された(Pedchenko他, "Desferrioxamine Suppresses Experimental Allergic Encephalomyelitis Induced by MBP in SJL mice" J. Neuroimmunol. 84:188-197(1998)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)。抗体と部位特異的に結合するアミノオキシアセチル−フェリオキサミンが調製された(Pochon他, "A Novel Derivative of the Chelon Desferrioxamine for Site-specific Conjugation to Antibodies" Int. J. Cancer. 43:1188-1194(1989)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)。蛍光性デフェロキサミン誘導体はまた、生物学実験条件の範囲で遊離鉄測定のために合成された(Al-Mehdi他, "Depolarization-associated iron release with abrupt reduction in pulmonary endothelial shear stress in situ" Antioxid. Redox Signal. 2:335-345(2000)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)。
【００３１】
他の好適な鉄キレート化剤は、表２で示されるものを含む：
【００３２】
【表２−１】
2008500347.tif 000004
【００３３】
【表２−２】
2008500347.tif 000005
【００３４】
ＨＥＢＥＤは、ＤＦＯよりも高い効果及びより少ない副作用を有すると思われる合成キレート化剤である。しかし、霊長類の研究では、まだ皮下注入により投与しなければいけなかった(Chaston他, "Iron Chelators for the Treatment of Iron Overload Disease: Relationship Between Structure, Redox Activity, and Toxicity" Am J Hematol. 73:200-210(2003)、これは、全体が参照されて本明細書の一部とする)。
【００３５】
ＰＩＨは、ＤＦＯよりもはるかに優れた膜透過をする、経口で活性のある三座(triedentate)キレート化剤である。ＰＣＩＨ（すなわち、２−ピリジルカルボキサルデヒドイソニコチノイルヒドラゾン）化合物（これは、表２で示されていない）は、ＰＩＨと実質的に同等である。キレート化剤のこの分類はまた、ミトコンドリアの鉄プールにアクセスすることができ、（ミトコンドリアの鉄−硫黄複合体シャペロンフラタキシンにおける変異により生じる）珍しい遺伝疾患であるフリードリッヒ運動失調のための潜在的な薬剤にすることができる。
【００３６】
ＨＢＥＤのような、ＤＦＴ及びＧＴ５６−２５２はともに、前臨床試験又は第Ｉ相試験中の二次発生ヒドロキシピロリドンである。
【００３７】
ＤＦＰ又はデフェリポンは、Ｆｅｒｒｉｐｒｏｘという商品名で欧州において、臨床用途に承認されている。これは、経口投与される二座キレート化剤である。しかし、薬剤の効果及び毒性は未だ議論の余地がある。ＤＦＯ及びＤＦＰの併用が提案されている。
【００３８】
Ｓ−ＤＦＯは、静脈内投与後、より長期的な半減期を有する、デンプンと結合したＤＦＯ誘導体である。
【００３９】
ＩＣＬ−６７０は、現在第ＩＩＩ相試験にあるトリアゾール群の三座キレート化剤である。これは、経口で利用可能であり、１日に１回投与される(Hershko, C.他, Blood 97:1115-1122(2001)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)。
【００４０】
鉄キレート化剤の別の分類は、生体模倣分類である(Meijler, MM他 "Synthesis and Evaluation of Iron Chelators with Masked Hydrophilic Moieties" J. Amer. Chem. Soc. 124:1266-1267(2002)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)。これらの分子は、ＤＦＯ及びフェリクロムとして自然に生成される前記キレート化剤の変性類似物である。類似物は、膜透過を非常に高める親油性部分（例えば、アセトキシメチルエステル）の付着を可能にする。その後、親油性部分は内因性エステラーゼによって細胞間で開裂され、キレート化剤を細胞外に漏出することのできない親水性分子に変換させる。これらの化合物は、非常に効果的であり、ＤＦＯよりはるかに効果的に遊離鉄介在性酸化的損傷を軽減すると思われる。
【００４１】
最後に、高度な糖化最終産物（ＡＧＥ）形成及び／又は分解の阻害剤として開発され、且つ糖尿病性合併症の動物モデルにおいて試験される多くの化合物は、キレート化によって作用すると思われる(Price, DL他, JBC 276:48967-72(2001)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)。これらには、（最小の銅キレート化から最大の銅キレート化まで順番に）アミノグアニジン及びピリドキサミン、カルノシン、フェナジンジアミン、ＯＰＢ−９１９５及びテニルセタム(tenilsetam)が挙げれらる。いわゆるＡＧＥブレーカーである、フェナシルチアゾロウム及び臭化フェナシルジメチルチアゾリウム及びこれらの加水分解産物がアスコルビン酸塩の銅触媒の自動酸化の最も強力な阻害剤の１つである。アミノグアニジンは、第ＩＩ相／第ＩＩＩ相試験を通り、ピリドキサミンは第ＩＩ相試験を通り、ＡＧＥブレーカーは現在第ＩＩ相試験中である。
【００４２】
高血糖症又は増加した脂肪酸流動によるＲＯＳ発生はミトコンドリアで行われる。しかし、出願人は、ミトコンドリアでの鉄含有タンパク質のスーパーオキシドから始まる酸化により放出される鉄によって細胞内伝達が介在されると考えている。この鉄は、「フェントン化学」と呼ばれるものによってヒドロキシラジカル及びスーパーオキシドの損傷を起こすことが可能であることが既知である。鉄（ＩＩ）及び鉄（ＩＩＩ）の組み合わせを区別するために、Ｆｅ３＋／Ｈ２Ｏ２混合物のフェントン様試薬を使用し、Ｆｅ２＋／Ｈ２Ｏ２混合物を示すフェントン試薬の使用を制限することが慣習になっている。フェントン様試薬はまた、有機物質を酸化する能力があるが、フェントン試薬よりいくらか反応性が低い。鉄（ＩＩＩ）がフェントン試薬の適用で製造することができるので、フェントン化学及びフェントン様化学はしばしば同時に起こる。したがって、鉄（ＩＩＩ）は脂肪酸流動又は酸化の阻害剤というよりはむしろ実際はＲＯＳ阻害剤である。
【００４３】
前記阻害剤は、経口、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、ｉｎｔｒａｖｅｒｓａｌ滴下で、intracularly、鼻腔内、動脈内、病巣内、又は鼻、喉及び気管支等の粘膜への塗布によって投与することができる。前記阻害剤は単独で又は医薬上許容可能な塩、担体、賦形剤又は安定化剤とともに投与することができ、例えば、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液又はエマルジョンを含む固体形態又は液体形態であり得る。
【００４４】
固体ユニットの投薬形態は従来の型であり得る。固体形態は本発明の阻害剤を含む通常のゼラチン型等のカプセル、並びに担体、例えば滑剤、及びラクトース、スクロース又はコーンスターチなどの不活性充填剤であり得る。別の実施形態では、阻害剤は、ラクトース、スクロース又はコーンスターチ等の従来の錠剤ベースをアカシア、コーンスターチ又はゼラチンのような結合剤、コーンスターチ、ポテトスターチ又はアルギン酸等の崩壊剤及びステアリン酸又はステアリン酸マグネシウムのような滑剤と組み合わせることで錠剤化される。
【００４５】
別の態様では、本発明の阻害剤は、例えば、不活性希釈剤を用いて、又は同化食用担体を用いて経口投与することができるか、或いは殻の堅いカプセル又は殻の軟らかいカプセルで封入され得るか、或いは錠剤状に圧縮され得るか、或いは栄養補助食品で直接組み込まれ得る。経口治療投与に関して、本発明の阻害剤は賦形剤とともに組み込まれ、錠剤、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ等の形態で使用することができる。一態様において、このような製剤には、本発明の阻害剤の少なくとも０．１％が含まれなければいけない。本発明の製剤における阻害剤の割合は、当然変化し得て、好都合にはユニットの約２重量％〜約６０重量％であり得る。本発明の製剤における阻害剤の量は、好適な投薬形態が得られるであろうものである。一例として、本発明による製剤は、経口投薬量ユニットが阻害剤を約１〜２５０ｍｇ含むように調製される。
【００４６】
錠剤、カプセル等はまた、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン等の結合剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑剤；及びスクロース、ラクトース又はサッカリン等の甘味剤を含む。投薬量ユニットの形態がカプセル状である場合、上記型の材料に加えて脂肪油等の液体担体を含み得る。
【００４７】
様々な他の材料はコーティングとして、又は投薬量ユニットの物理的形態を変えるために存在することができる。例えば、錠剤はセラック、糖、又はその両方でコーティングすることができる。シロップは活性成分に加えて、甘味剤としてスクロース、保存料、染料及びサクランボ味又はオレンジ味などの香味料としてメチルパラベン及びプロピルパラベンを含み得る。
【００４８】
上記のように、本発明の一態様では、前記阻害剤を含む製剤が非経口で投与され得る。阻害剤の溶液又は懸濁液はヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤で適度に混合した水で調製することができる。分散剤は油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの混合物で調製することもできる。油の実例は、石油、動物起源油、植物起源油又は合成起源油、例えば大豆油、ピーナッツ油又は鉱油である。一般的には、水、食塩水、水溶性デキストロース及びその関連の糖溶液並びに、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等のグリコールが、特に注射可能な溶液のための好ましい液体担体である。通常の貯蔵及び使用の条件下で、これらの調製が微生物の成長を抑える保存料を含む。
【００４９】
阻害剤がデフェロキサミンである場合、非経口使用のためのデフェロキサミン組成物は溶液又は懸濁液の形態であり得る。このような溶液又は懸濁液にはまた、注射用水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒等の滅菌した希釈剤が挙げられ得る。非経口製剤にはまた、ベンジルアルコール若しくはメチルパラベン等の抗菌剤又は重亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤が挙げられ得る。酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩等の緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の張性の調節剤もまた、添加し得る。非経口の調製はガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てのシリンジ又は複数回投与されるバイアルで封入することができる。
【００５０】
注射可能な使用に適した医薬形態には、滅菌した注射可能な溶液又は分散液の即時調製に関する滅菌した水溶性溶液又は滅菌した水溶性分散液及び滅菌した粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌されていなければならず、容易に注射針を通過する程度の能力を有する液体でなければならない。形態は、製造及び貯蔵の状態下で安定でなければならず、細菌及び菌類等の微生物の汚染作用に対して保護されなければいけない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、これらの好適な混合物及び植物油を含む溶媒又は分散媒であり得る。
【００５１】
微結晶性組成物等の、筋肉内投与における持続放出デフェロキサミン組成物は、標準的方法によって配合することができる。より長期的な半減期を有するデフェロキサミン調製物は、デフェロキサミンと、例えば、デキストラン又はポリエチレングリコールとの結合によって配合することができる。さらに、細胞膜を透過する優れた能力を有するデフェロキサミン誘導体は、デフェロキサミンとアセチロキシメチルエステル等の親油性エステル部位とを結び付けることによって製造することができ、その後当該化合物が細胞内に入ると、エステル部位は細胞内のエステラーゼによって除去される(Meijler他, "Synthesis and Evaluation of Iron Chelators with Masked Hydrophilic Moieties", J. Am. Chem. Soc. 124:12666-12667(2002))。
【００５２】
本発明の阻害剤を含む製剤はまた、エアロゾルの形態で気道に直接投与することができる。エアロゾルとしての使用のために、溶液又は懸濁液中の本発明の阻害剤は、好適な推進体、例えば、従来の補助剤を有するプロパン、ブタン又はイソブタンのような炭化水素推進体とともに加圧されたエアロゾル容器に詰め得る。本発明の阻害剤はまた、噴霧器又は霧吹き等の非加圧形態で投与することもできる。
【００５３】
本発明を実施する場合、ＲＯＳ介在性損傷は治療又は予防することができる。十分に治療又は予防できる高血糖性状態には、慢性高血糖症が挙げられる。これには、高血糖性糖尿病又は（ストレス高血糖症等の）急性高血糖症が挙げられる。インスリン耐性は、本発明のこの態様による代謝産物誘導性の過剰なＲＯＳ産生の別の形態である。これにより、インスリン耐性が血管細胞による遊離脂肪酸流動の増加及び遊離脂肪酸の酸化をもたらすことができる。
【００５４】
本発明の別の態様は、高血糖症又は脂肪酸流動の増加の傾向がある被検体における血管新生を促進する方法に関する。この方法は、被検体において血管新生を促進するのに効果的な状態で、被検体にＲＯＳ阻害剤を投与することを伴う。
【００５５】
ここで血管新生は、低酸素シグナルに応じることができ、また血管形成（例えば、心臓又は下肢）又は脈管形成の両方を伴うことができる。被検体は、冠動脈疾患、末梢血管障害、脳血管疾患、又は慢性若しくは急性のいずれかの創傷等の虚血状態を有し得る。
【００５６】
ＲＯＳ阻害剤、その製剤及び本発明のこの実施形態に関する投与のＲＯＳ阻害剤のモードは、上記のものと同様である。
【００５７】
ここで、上記被検体は、好ましくは高血糖症又は脂肪酸流動の傾向があるヒトである。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、被検体における遊離脂肪酸の酸化又は過剰放出を阻害する方法に関する。この方法は、被検体において遊離脂肪酸の酸化過剰放出を阻害するのに効果的な状態で、被検体に特定の化合物を投与することを伴う。これらの化合物には、チアゾリジンジオン、ニコチン酸、エトモキシル及びラノラジンが挙げられる。
【００５９】
本発明のこの実施形態では、上記で定義した化合物は、上記と実質的に同じ方法で配合され且つ投与される。
【００６０】
本発明のこの態様では、被検体は哺乳類であり、好ましくはヒトである。
【００６１】
本発明のさらなる態様は、ＲＯＳ介在性損傷の治療又は予防に適した化合物を同定する方法に関する。この方法は、糖尿病の動物モデルを提供すること、及び動物モデルにおいて糖尿病を誘導することを伴う。その後、試験される化合物は動物モデルに投与される。その後、ＲＯＳ介在性損傷を治療又は予防するための治療用候補物として局所酸化圧、血管密度における血流の増加及び動物モデルにおける組織生存の回復を達成する化合物が回収される。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
３つの異なる糖尿病のマウスモデルが虚血に応じて組織の壊死の増加を示す
糖尿病組織は虚血耐性が低減していることはよく理解されている(Haffner他, "Mortality From Coronary Heart Disease in Subjects With Type 2 Diabetes and in Nondiabetic Subjects With and Without Prior Myocardial Infarction" N Engl J Med 339:229-34(1998)、Jude他, "Peripheral Arterial Disease in Diabetic and Nondiabetic Patients: a Comparison of Severity and Outcome" Diabetes Care 24:1433-7(2001)、Tuomilehto他, "Diabetes Mellitus as a Risk Factor for Death From Stroke. Prospective Study of the Middle-Aged Finnish Population" Stroke 27:210-5(1996)、Waltenberger, "Impaired Collateral Vessel Development in Diabetes: Potential Cellular Mechanisms and Therapeutic Implications" Cardiovasc Res 49:554-60(2001)、Rivard他, "Rescue of Diabetes-Related Impairment of Angiogenesis By Intramuscular Gene Therapy With Adeno-VEGF" Am J Pathol 154:355-63(1999)、Kip他, "Differential Influence of Diabetes Mellitus on Increased Jeopardized Myocardium After Initial Angioplasty or Bypass Surgery: Bypass Angioplasty Revascularization Investigation" Circulation 105:1914-20(2002)、Partamian他, "Acute Myocardial Infarction in 258 Cases of Diabetes. Immediate Mortality and Five-Year Survival" N Engl J Med 273:455-61(1965)、Simovic他, "Improvement in Chronic Ischemic Neuropathy After Intramuscular phVEGF165 Gene Transfer in Patients With Critical Limb Ishemia" Arch Neurol 58:761-8(2001)、Margolis他, "Risk Factors for Delayed Healing of Neuropathic Diabetic Foot Ulcers: A Pooled Analysis" Arch Dermatol 136:1531-5(2000)、これらは、全体が参照されて本明細書の一部とする)。臨床的には、これは心臓麻痺率の増加、死亡率の増加及び長期にわたる創傷治癒をもたらす。この関連性が心虚血及び後肢虚血の動物モデルにおいて研究されているが(Rivard他, "Rescue of Diabetes-Related Impairment of Angiogenesis By Intramuscular Gene Therapy With Adeno-VEGF" AM J Pathol 154:355-63(1999)、Schratzberger他, "Reversal of Experimental Diabetic Neuropathy by VEGF Gene Transfer" J Clin Invest 107:1083-92(2001)、これらは全体が参照されて本明細書に援用されている)、これらのモデルには限界がある。大血管構造における変動のために、得られた壊死のパターンは予測不可能であり、実験結果の相違をもたらす。さらに、犠牲なくして組織生存を確定することは不可能である。その上、レーザードップラー等の間接的な灌流方法は、度々虚血を評価するのに利用しなければいけないが、これら技法は組織の酸化に関する直接の情報を提供しない。
【００６３】
これらの問題に取り組むために、マウスの背面の軟組織における段階的虚血の新規モデルが作られた（図５）(Tepper他, "Human Endothelial Progenitor Cells From Type II Diabetics Exhibit Impaired Proliferation, Adhesion, and Incorporation Into Vascular Structures" Circulation 106:2781-6(2002)、これは全体が参照により本明細書に援用されている)。マウスの背の血管構造が正確に知られて、主要な軸血管が簡単に視覚化できるので、組織において再利用可能な酸素勾配で虚血の可能性が高い域(reliable zone)を作り出すことができる。これは、最小虚血領域から最大虚血領域の順で０．５ｃｍ間隔で離れた５つの基準点（ｐ１〜ｐ５）を利用する直接的な組織酸素圧測定で確認された。これはまた、別々の虚血の微小環境（Ａ域、Ｂ域、Ｃ域）の研究を可能にし、Ａ域は軟組織の最小の虚血部分であり、Ｃ域は軟組織の最大の虚血部分である。このモデルの設計は、遺伝子発現が変化する特定の酸素圧の相互関係を可能にする或る程度の再現性で、酸素圧、組織生存の定量の順動力学的測定を容易にする。
【００６４】
このモデルを使用すると、虚血への応答性は、全て深刻な高血糖症によって特徴付けられる、３つの異なる糖尿病のマウスモデルにおいて劇的に損なわれるということが観察されている。ｄｂ／ｄｂマウス、すなわちＩＩ型糖尿病のレプチン受容体不足モデルにおいて、虚血が大半の組織の深刻な壊死を引き起こし、一方で非糖尿病の動物では全ての組織が生存する、ということが実証された。同様の結果が、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病マウスモデル（Ｓｔｚ）並びに非糖尿病マウスにおいて観察されるものの約３０％の組織生存率であるＩ型糖尿病のアキタマウスモデルにおいて言及された（図６）。重大なことには、（ＣＤ３１染色及びＦＩＴＣ−レシチン灌流で確定した）酸素圧及び血管密度は、術前の４つ全ての群で同一であり、組織生存における違いは、血管密度のベースラインの違いというよりもむしろ虚血への応答が損なわれることによるものであることが示唆された。
【００６５】
（実施例２）
糖尿病マウスは、虚血への血管新生の応答が低減する
このモデルで観察される組織生存の減少はまた、生存組織において血管新生が低減することに関する。手術の７日後、非糖尿病マウスの虚血軟組織における酸素圧が正常な皮膚の酸素圧に近づき（図７、灰色のプロット）、その一方、糖尿病マウスは同様の基準点での酸素圧において大幅な減少を示している（黒色のプロット）。これらの結論は、ＣＤ３１染色で確定した糖尿病マウス（図８、黒色のプロット）における生存組織で観察された血管数の減少と関連がある。これは、虚血誘導性血管新生が糖尿病マウスにおいて損なわれることを意味している。
【００６６】
（実施例３）
高血糖症誘導性の活性酸素種の予防は糖尿病動物モデルにおいて組織生存を回復させる
酸化的損傷の増加が、糖尿病動物における虚血に対する損なわれた組織応答性の上方調節因子であるかどうかを研究した。この疑問に取り組むために、ミトコンドリアのマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）が過剰発現した遺伝子組み換えマウスを用いた。ＭｎＳＯＤは、スーパーオキシドからの酸素分子の生成を触媒し、ＲＯＳ発生を予防して、高血糖症の損傷の４つ全ての経路を効果的にブロックする。糖尿病は、野生型マウス及びストレプトゾトシン注入によるＭｎＳＯＤ遺伝子組み換えマウスにおいて誘導され、高血糖症（＞４００ｍｇ／ｄｌ）は、１ヶ月間維持された。虚血処置後、１、３及び７日で直接酸素圧測定によって組織がモニタリングされた。野生型の糖尿病マウスに比べて、ＭｎＳＯＤ糖尿病マウスは、局所組織酸素圧、血管新生及び非糖尿病マウスで観察されるものと同様の組織生存の増大において迅速な回復が示された（図９）。非糖尿病ＭｎＳＯＤ対照マウスは、野生型マウスと同様の結果だった。これは、高血糖症誘導性ＲＯＳの予防は虚血イベントに続く糖尿病動物における組織生存を改善するということを示唆している。
【００６７】
（実施例４）
慢性的な高グルコースレベルはまた、増大するミトコンドリア膜電位と関連がある
ミトコンドリア膜電位の高グルコース培養の効果はまた、電位依存性カチオン染料ＪＣ−１を用いる急性高グルコース又は慢性高グルコースにさらされたＣ２Ｃ１２細胞において研究された。これは、酸化ストレスのインジケーターとして用いられた。最近の研究報告に従って(Du他, "Hyperglycemia Inhibits Endothelial Nitric Oxide Synthase Activity by Posttranslational Modification at the Akt Site" J Clin Invest 108:1341-8(2001)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)、正常のグルコース培養又は高グルコースに急激にさらされたもの(exposure)と比べて、慢性高グルコースは、（オレンジ−赤蛍光への移行によって証明された）ミトコンドリアの陽子(proton:プロトン)の電気化学的勾配を大いに増加させた（図１０）(Du他, "Hyperglycemia Inhibits Endothelial Nitric Oxide Synthase Activity by Posttranslational Modification at the Akt Site" J Clin Invest 108:1341-8(2001)、これは全体が参照により本明細書に援用される)。したがって、インビトロにおいて高血糖症、酸化ストレス及びＶＥＧＦ機能障害の間には相関関係が存在する。
【００６８】
（実施例５）
損なわれたＶＥＧＦ産生がＲＮＡ転写レベルで見出される(lies)
高血糖症状態で血管形成が損なわれる一因としてＶＥＧＦ産生の減少が関与するという所見によって、高グルコースがＶＥＧＦ発現を変更する仕組みを研究した。低酸素状態で通常のグルコース培養及び高グルコース培養において存在するＶＥＧＦｍＲＮＡ転写の分析は、高グルコースで培養した細胞におけるＶＥＧＦｍＲＮＡ産生の多大な減少を示した（図１１）。この所見の考えられる解釈としては、高グルコースにおけるｍＲＮＡの安定性の異常又はプロモーター活性の減少が挙げられる。ｍＲＮＡの安定性の問題点に取り組むために、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞におけるＲＮＡの半減期がアクチノマイシンＤを用いた転写阻害によって研究された。これら実験の結果としては、ＶＥＧＦタンパク質レベルにおいて有意な違いがあるにもかかわらず、正常な細胞と高血糖症の細胞との間のＶＥＧＦｍＲＮＡ安定性において違いは見られなかった（図１２）。その後、ＶＥＧＦプロモーター活性は、ルシフェラーゼ遺伝子と融合する全長ＶＥＧＦプロモーターを含むレポーター構築を用いて研究された。この構築は、トランスフェクション効率を制御するウミシイタケプラスミドを構成的に発現させて、正常のグルコース及び高グルコースで培養したＣ２Ｃ１２筋芽細胞に一時的に同時トランスフェクト(co-transfected)した。正常のグルコース対照に比べて、低酸素誘導性ルシフェラーゼ産生が、高グルコース状態で有意に損なわれた（図１３）。これは、低酸素においてＶＥＧＦタンパク質産生が損なわれたことが、インビボでのＶＥＧＦ転写の減少に起因することを実証している。
【００６９】
（実施例６）
ｐ３００及びＨＩＦ−１αは、低酸素誘導性ＶＥＧＦ発現における機能障害への高血糖性の酸化損傷のへキソサミン経路と潜在的に結び付いている、Ｏ結合型グリコシル化の基質である
低酸素誘導性ＶＥＧＦ発現を損なわせる仕組みとして、高グルコースにおいてＨＩＦ−１α転写活性化を損なわせることに関係するという所見に基づいて、ＨＩＦ−１αの潜在的な翻訳後修飾をこれらの条件下で研究した。始めに、ＨＩＦ−１αがＯ結合型グリコシル化の基質であるかどうかを調べた。ＨＩＦ−１αは正常のグルコース状態又は高グルコース状態で成長させた細胞から免疫沈降し、ウエスタンブロットは、Ｏ結合型グリコシル化修飾を含む残渣を特に認識する抗体で精査した。正常なグルコース状態で、グリコシル化ＨＩＦ−１αが存在しなかったが、高グルコースにおいて有意なグリコシル化が存在した（図１４）。これは、ＨＩＦ−１αがＯ結合型グリコシル化の基質であり、好ましくは高グルコースの状態でグリコシル化するということの第１の実証である。
【００７０】
ＨＩＦ−１転写複合体は幾つかの補助活性化因子から成るので、ＨＩＦ−１の主要な補助活性化因子であるｐ３００もまたグリコシル化するかどうかもまた調べた。多くの転写因子が構成的にｐ３００と関連性があることが分かったが、この相互作用が翻訳後修飾によって調節される幾つかの場合が特定されている(Zanger他, "CREB Binding Protein Recruitment to the Transcription Complex Requires Growth Factor-Dependent Phosphorylation of its GF Box" Mol Cell 7:551-8(2001)、Soutoglou他, "Acetylation Regulates Transcription Factor Activity at Multiple Levels" Mol Cell 5:745-51(2000)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)。ＨＩＦ−１の実験を繰り返して、ｐ３００が高グルコース状態において翻訳後Ｏ結合型グルコシル化の基質としての役割も果たすこともまた見出された。ｐ３００と転写因子ペルオキシソーム成長因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）との関連性が、免疫共沈降アッセイによって正常なグルコースと比べて、高グルコース状態で減少したので、このことは生理学的に重要であった（図１５）。興味深いことに、へキソサミン生合成の律速酵素である、アンチセンスオリゴヌクレオチドを有するグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）の阻害が高グルコースでｐ３００のＯ結合型グルコシル化の量を３倍近く減少させ、正常なグルコースで成長した細胞に相当するレベルまでｐ３００／ＰＰＡＲγ相互作用が回復した（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。これは、転写複合体へのｐ３００の補充(recruitment)が高グルコース状態で損なわれるということを示唆し、これはグルコース誘導性Ｏ結合型グリコシル化を阻害することによって逆転させることができる。ＨＩＦ−１αのＯ結合型グリコシル化の生理的関連性は、はっきりしていない。しかし、グリコシル化がｐ３００の機能を変更するという実証は、転写活性因子（いわゆる、ｐ３００）に必要な活性化補助因子を補充する(recruit)及び／又は活性化補助因子に関する能力がないことによって、ＨＩＦ−１転写複合体がＶＥＧＦ発現を上方調節しない可能性のある仕組みを示唆する。
【００７１】
（実施例７）
高血糖症誘導性活性酸素種が内皮細胞の機能を損なわせる細胞損傷の経路を活性化する
今までに提示されたデータは、高グルコースレベル（インビボ及びインビトロ）が低酸素状態でＶＥＧＦを上方調節させる能力において深刻な損失を生み出すという最初の所見に関与する仕組みを研究した。
【００７２】
非虚血セッティングにおける高血糖症誘導性血管損傷を研究している重要な文献は存在するが、虚血セッティングにおける血管機能への高血糖症誘導性細胞損傷の効果を研究した文献は非常に少ない。これは、重要な低酸素の組織によって特徴付けられるシナリオで起こる新たな血管の成長を要求する多くの状況において、臨床学的に重要である。インビトロで高グルコースで成長した内皮細胞がミトコンドリアのＲＯＳ産生の増加を示すということが実証された。このことは、特定の転写因子（ＳＰ１）及びシグナル分子（ｅＮＯＳ）のグリコシル化の増大とともにへキソサミン経路の活性の増大を引き起こし、ＰＫＣ活性の増大が、部分的にＮＦｋＢ活性の増大、ＡＧＥのより大きな集積及びソルビトール経路を通る流動の増大を引き起こす（図１６）。これら細胞内イベントの下方調節の結果が、インビボで観察される血管新生の損傷を引き起こすと思われるが、中間の過程は不明確なままである。
【００７３】
（実施例８）
糖尿病細胞が血管形成に重要である機能において損なわれる
糖尿病の状況において、ＶＥＧＦ発現が変更されることが明らかであるが、他の経路においても糖尿病細胞が損なわれることが実証された。糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）から単離された線維芽細胞では、金塩食運動移動アッセイ(gold salt phagokinetic migration assay)を用いて、コラーゲン及びフィブロネクチンにおいて正常な線維芽細胞よりも移動における劇的な低減（４倍未満）が見られる。これらの細胞の走触性応答を変性Ｂｏｙｄｅｎチャンバー移動アッセイを用いて試験した場合、血清及びＰＤＧＦに応じて移動において７７％の同様の減少が観察された(Lerman他, "Cellular Dysfunction in the Diabetic Fibroblast: Impairment in Migration, Vascular Endothelial Growth Factor Production, and Response to Hypoxia" Am J Pathol 162:303-12(2003)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)。
【００７４】
ここでも、この違いが低酸素によって強調された（図１７）。正常な細胞における移動は低酸素によって上方調節され（２倍）、その一方で糖尿病細胞は、低酸素における移動の割合に違いは見られなかった。これらのアッセイは、再び糖尿病が細胞機能を有しているという重大な影響(profound impact)を再び強調し、この影響は低酸素状態で増幅される。
【００７５】
これらの移動の違いは、糖尿病の線維芽細胞におけるマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）群の成員の異なる発現によるものである可能性がある。糖尿病線維芽細胞は正常の線維芽細胞より多いｐｒｏ−ＭＭＰ−９レベルを有することを実証したが、活性ＭＭＰ−９又は活性ｐｒｏ−ＭＭＰ−２では違いはなかった（図１８）。このことが、高グルコースで培養された内皮細胞における同様の所見を裏付ける(Uemura他, "Diabetes Mellitus Enhances Vascular Matrix Metalloproteinase Activity: Role of Oxidative Stress" Circ Res 88:1291-8(2001)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)。さらに、これらの所見は、糖尿病細胞内機能障害が全ての細胞タンパク質又は細胞機能の単純な下方調整によっては特徴付けられず、特定の遺伝子及びタンパク質の選択的調節を伴うことを示唆している。
【００７６】
（実施例９）
ＩＩ型糖尿病患者からの内皮前駆細胞が、血管構造を成長、付着及び組み込むこれらの能力を損なう
脈管形成のエフェクター細胞、内皮前駆細胞又は前駆細胞における高血糖症の変更はあまり明確にされないままである。近年、ＩＩ型糖尿病患者から採取した内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が通常の酸素状態での年齢に対応した制御に比べて、血管構造の成長、付着及び取り込みの減少が示されたことが実証された(Tepper他, "Human Endothelial Progenitor Cells From Type II Diabetics Exhibit Impaired Proliferation, Adhesion, and Incorporation Into Vascular Structures" Circulation 106:2781-6(2002)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)。糖尿病培養は、膨張の７日後に、有意なより少ないＥＰＣを包含し（図１９）、これは、ＨｂＡ１ｃに反比例していた。さらに、有意なより少ないＥＰＣ支持クラスター(fewer EPC-bearing clusters)は、糖尿病患者の培養について留意された。これは、臨床学的糖尿病の年数に反比例していた（Ｒ＝−０．４７１、Ｐ＜０．０１）。機能的には、これら細胞は、ＴＮＦ−α活性化内皮単分子層とのより小さい付着を見出したが、環境信号に応答するこれらの能力が欠如していることを示唆する静止内皮単分子層との正常な付着を示した。これは、インビトロでの血管形成アッセイで確認され、年齢に対応した制御と比較した場合、より小さい糖尿病ＥＰＣがマトリゲル上の小管に組み込まれることが示された。
【００７７】
（実施例１０）
糖尿病患者からの内皮前駆細胞は低酸素への応答能力を損なう
糖尿病細胞が低酸素への応答を損なうことを示唆する予備データを考慮すると、ＥＰＣの研究は、虚血環境へのこれら細胞の応答を特に研究することであった。ＩＩ型糖尿病患者からのＥＰＣが、低酸素内皮単分子層への付着、低酸素内皮細胞からの順化培地に対する移動及び低酸素環境を拡散する(proliferate)能力において、損なわれることが実証された（それぞれ、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ）。これは、低酸素の環境信号に適当に感知及び応答するこれら細胞の能力を損なわれることについて反映して、その結果血管新生はあまり起こらない。
【００７８】
（実施例１１）
デフェロキサミンは、血管内皮細胞における高血糖症誘導性活性酸素産生を阻害する
培養血管内皮細胞は、デフェロキサミンで処理され、これら細胞による高血糖症誘導性活性酸素の産生におけるデフェロキサミンの効果を確定した。
【００７９】
細胞培養状態：ＲＯＳ測定のために、ウシ大動脈表皮細胞（ＢＡＥＣ、４〜１０代継代）を、１０％ＦＢＳ、必須及び非必須アミノ酸並びに抗生物質を含むイーグルＭＥＭにおいて１００，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに置いた。細胞を、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭデフェロキサミン、３０ｍＭグルコースに加えて２５０μＭデフェロキサミンのいずれかでインキュベートした。デフェロキサミンは新たに調製され、３日間連続で細胞へ添加した。ＲＯＳ測定は、最初の処理の７２時間後に実施された。
【００８０】
細胞内活性酸素種測定：活性酸素種の細胞内形成は、蛍光プローブであるＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ（Molecular Probes）を用いて検出した。細胞（１×１０５ｍｌ−１）は、１０ｉＭ  ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＤＡで充填し、３７℃で４５分間インキュベートして、ＨＴソフトプログラムを用いてＨＴＳ７０００バイオアッセイ蛍光プレートリーダー（Perkin Elmer）で分析した。ＲＯＳ産生はＨ２Ｏ２標準曲線から決定した（１０〜２００ｎｍｏｌｍｌ−１）。
【００８１】
図２１で示されるように、デフェロキサミンは培養中の血管内皮細胞におけるＲＯＳの産生を阻害した。高血糖症の糖尿病レベルがこれら細胞におけるＲＯＳ（スーパーオキシド）産生の増加を引き起こす（図２１、バー２）。２５０μＭのデフェロキサミンを添加することは、この損傷効果を完全に予防する（図２１、バー４）。
【００８２】
したがって、鉄キレート化剤である、デフェロキサミンは血管内皮細胞に対し大きく影響している、すなわち、ヒドロキシルラジカルの高血糖症誘導性過剰産生を完全に予防する（図２１）。
【００８３】
（実施例１２）
ミトコンドリアの過剰なスーパーオキシドの産生を正常化することは、大動脈内皮細胞における細胞内遊離鉄の高血糖症誘導性の増加を阻害する
細胞内遊離鉄の測定のために、ウシ大動脈表皮細胞（「ＢＡＥＣ」、４〜１０代継代）を、１０％ＦＢＳ、必須及び非必須アミノ酸並びに抗生物質を含むイーグルＭＥＭにおいて５００，０００細胞／ウェルで２４ウェルプレートに置いた。細胞はＵＣＰ−１、Ｍｎ−ＳＯＤ又は空のアデノウイルスベクターでそれぞれ４８時間感染させた。３０ｍＭのグルコースをアデノウイルスで感染させた各ウェルに加えた。未感染細胞を対照として５ｍＭ及び３０ｍＭグルコースでインキュベートした。細胞内の遊離鉄を２４時間後に検出した。
【００８４】
細胞内の遊離鉄を検出するために、細胞に、５μＭのｆｕｒａ−２ＡＭを含む１ｍｌのＴＢＳＳ中で３７℃で１５分間、暗所でｆｕｒａ−２ＡＭを充填した。充填後、細胞を５分間２０μＭのＥＤＴＡ１ｍＬで、ＴＢＳＳとともにインキュベートした(Kress他, "The Relationship between Intracellular Free Iron and Cell Injury in Cultured Neurons, Astrocytes, and Oligodendrocytes" J. Neuro., 22(14):5848-5855(2002)、これは全体が参照されて本明細書の一部とする)。蛍光は、パワーＰＣコンピューターのＩ．Ｐ．Ｌａｂスペクトルで起動する１０Ｘｐｌａｎａｐｏ対物レンズを有するオリンパスＩＸ７０を用いて検出された。分析は、Ｉ．Ｐ．Ｌａｂスペクトルで実施した。
【００８５】
図２２で示されるように、高血糖症であるバー２は、３倍近く遊離鉄の量が増加した。ｆｕｒａ−２ＡＭプローブはＦｅ３＋鉄を特異的に検出するので、このことは、増加する遊離鉄がＦｅ３＋であることを示している。電子伝達系によるスーパーオキシド形成を予防するミトコンドリアのタンパク質（バー３）である、脱共役タンパク質−１の過剰発現によるこの効果の阻害は、ミトコンドリアが高血糖症誘導性スーパーオキシドの原因であることを実証している。スーパーオキシドジスムターゼ酵素のミトコンドリアのアイソフォームである、ＭｎＳＯＤの過剰発現によるこの効果の阻害は、ミトコンドリアのスーパーオキシドが、細胞内遊離鉄の増加を誘導する活性酸素種であることを実証している。
【００８６】
（実施例１３）
デフェロキサミンが、大動脈内皮細胞における高血糖症誘導性の細胞内遊離鉄の増加を阻害する
ウシ大動脈表皮細胞（「ＢＡＥＣ」、４〜１０代継代）を、１０％ＦＢＳ、必須及び非必須アミノ酸並びに抗生物質を含むイーグルＭＥＭにおいて５００，０００細胞／ウェルで２４ウェルプレートに置いた。細胞を、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース又は３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭデフェロキサミンのいずれかでインキュベートした。細胞内遊離鉄の測定は、２４時間後に実施した。細胞内遊離鉄を検出するために、実施例１２において上記のようにｆｕｒａ−２ＡＭを細胞に充填した。
【００８７】
実施例１２で行ったように、（５ｍＭグルコース処理で達せられる）図２３Ａで示されるように、図２３Ｂで示されるように、（３０ｍＭグルコースインキュベートによって達せられる）高血糖症が、正常な血糖症に比べて、Ｆｅ３＋形態の細胞内の遊離鉄を劇的に増加させる。図２３Ｃで示されるように、Ｆｅ３＋特異的鉄キレート化剤である、デフェロキサミン（１００μＭ）は高血糖症のこの作用を完全に予防した
【００８８】
（実施例１４）
デフェロキサミン、及びヒドロキシルラジカルスカベンジャーであるＤＭＳＯの両方が、高血糖誘導性の大動脈内皮細胞におけるＤＮＡ鎖切断の増加を阻害する
ウシ大動脈表皮細胞（「ＢＡＥＣ」、４〜１０代継代）を、融合(confluent)まで１０ｍｍ細胞培養プレートに置いた。細胞を、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭ（ｕＭ）デフェロキサミン（ＤＦＯ）又は３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭＤＭＳＯ、ヒドロキシルラジカルスカベンジャーのいずれかで７日間インキュベートした。試薬入りの培地を毎日変えた。ＤＮＡ鎖切断はコメットアッセイ方法を用いて検出した。
【００８９】
ＤＮＡ切断検出は、コメットアッセイキット（Trevigen Gaitherburg MD）を用いて実施した。簡単に言うと、単細胞電気泳動を（一方の電極からもう一方の電極までを測定した）１ボルト／ｃｍで１０分間、コメットスライド上で実施した。空気乾燥後、コメットスライドをＳＹＢＲグリーンで染色した。蛍光は、オリンパスＩＸ７０蛍光顕微鏡を用いて検出し、ＤＮＡ切断（尾長）の蛍光密度の分析は、イメージＪソフトウェアを用いて実施した。
【００９０】
図２４Ｂで実証されるように、ミトコンドリアの電子伝達系による高血糖症誘導性スーパーオキシド産生が、大動脈内皮細胞のＤＮＡ鎖切断を引き起こすことは以前から明らかであった。図２４Ｃで示されるデータは、この作用がスーパーオキシド誘導性の遊離Ｆｅ３＋の増加を要求していることを示している。同様に、図２４Ｄで示されるデータはこの作用がスーパーオキシド誘導性のヒドロキシルラジカル産生を要求することを示している。ともに、これらのデータは、ミトコンドリアの電子伝達系によるスーパーオキシドの連続した過剰産生にもかかわらず、デフェロキサミン処理がヒドロキシルラジカル発生及び次のＤＮＡ鎖切断を予防することを示している。
【００９１】
（実施例１５）
デフェロキサミン、及びヒドロキシルラジカルスカベンジャーであるＤＭＳＯの両方が、高血糖誘導性の大動脈内皮細胞におけるＰＡＲＰ活性の増大を阻害する
ウシ大動脈表皮細胞（「ＢＡＥＣ」、４〜１０代継代）を、融合まで１０ｍｍ細胞培養プレートに置いた。細胞を、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭデフェロキサミン又は３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭＤＭＳＯのいずれかで６日間、培地を毎日変えてインキュベートした。
【００９２】
３Ｈ−ＮＡＤ混入方法は、ＰＡＲＰ活性を評価するために用いられた。ＢＡＥＣは、５６ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、２８ｍＭ  ＫＣｌ、２８ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％ジギトニン、２５ｍＭ  ＮＡＤ＋及び１μＣｉ／ｍｌ  ３ＨＮＡＤ＋から成る緩衝液で３７℃で１０分間インキュベートした。リボシル化タンパク質を沈澱させるためにＴＣＡを加えて、細胞を２％ＮａＯＨで溶解した。混入された３Ｈ−ＮＡＤの検出はシンチレーションカウンターを用いて実施され、ＰＡＲＰ活性は３Ｈ−ＮＡＤｄｐｍの数によって決定した。
【００９３】
図２５で示されるように、ミトコンドリアの電子伝達系による高血糖症誘導性のスーパーオキシド産生が、その後大動脈内皮細胞のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）酵素を活性化するＤＮＡ鎖切断を引き起こすことは以前から明らかであった。バー３で示されるデータは、この作用がスーパーオキシド誘導性の遊離Ｆｅ３＋の増加を要求していることを示している。同様に、バー４で示されるデータはこの作用がスーパーオキシド誘導性のヒドロキシルラジカル産生を要求することを示している。ともに、これらのデータは、ミトコンドリアの電子伝達系によるスーパーオキシドの連続した過剰産生にもかかわらず、デフェロキサミン処理がヒドロキシルラジカル発生、次のＤＮＡ鎖切断及びこれに伴うＰＡＲＰ活性化を予防することを示している。
【００９４】
（実施例１６）
デフェロキサミンは、大動脈内皮細胞におけるプロスタサイクリンシンターゼ（ＰＧＦ−１α）の高血糖症誘導性の阻害を予防する
ウシ大動脈表皮細胞（「ＢＡＥＣ」、４〜１０代継代）を、２４ウェルプレートに置いた（５０，０００細胞／ウェル）。細胞を、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース又は３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭデフェロキサミンのいずれかでインキュベートした。プロスタサイクリンシンターゼ産物である、ＰＧＦ−１αは、２４時間後に測定した。
【００９５】
プロスタサイクリンシンターゼ活性は、プロスタサイクリンシンターゼの安定した産物、ＰＧＦ−１αの濃度として測定した。競合免疫測定方法（Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ−ＥＩＡ）が６−ケト−ＰＧＦ１αの定量測定のために用いられた。ＢＡＥＣ培養培地から回収された試料（１００μｌ）を抗体（６−ケト−ＰＧＦ１α、ＥＩＡ共役溶液）でプレコーティングした(precoated：前被覆した)アッセイプレートに加えた。ＰＧＦ１α濃度を標準曲線に従って算出し、データ分析をアッセイザップソフトウェアを用いて実施した。
【００９６】
ミトコンドリアの電子伝達系による高血糖症誘導性のスーパーオキシド産生は、アテローム性動脈硬化の発達に対する主要な生来の防御である、内皮酵素、プロスタサイクリンシンターゼを完全に不活性化することが以前から明らかであった。図２６のバー２では、高血糖症は、この酵素の活性を９０％以上低減させることが示される。これに対して、バー３はスーパーオキシド誘導性の遊離Ｆｅ３＋の増加がデフェロキサミンによって予防された場合、高血糖症がこの重要な抗動脈硬化性酵素の活性を全く阻害しないことを示す。
【００９７】
（実施例１７）
デフェロキサミンが糖尿病マウスの大動脈におけるプロスタサイクリンシンターゼ（ＰＧＦ−１α）の糖尿病誘導性阻害を予防する
オスのＣ５７Ｂ１６マウス（６〜８週齢）を連続した５日間、８時間の絶食後に０．０５Ｍクエン酸Ｎａ（ｐＨ４．５）で、５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを毎日注射することによって糖尿病にさせた。最初の注射の２週間後、血糖を確定し、糖尿病マウスを平均血糖レベルが等しい２つの群に無作為化した。糖尿病動物の１つの群にデフェロキサミン（１０ｍｇ／ｋｇ）を７日間、１日に１度皮下に注射した。プロスタサイクリンシンターゼ活性測定のために、大動脈を回収した。
【００９８】
プロスタサイクリンシンターゼ活性測定：競合免疫測定方法（Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ−ＥＩＡ）が６−ケト−ＰＧＦ１αの定量測定のために用いられた。マウス大動脈がＰＢＳで洗浄され、２０ｍＭＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．５）及び１５μＭのアラキドン酸を含む４００μｌインキュベーション緩衝液で３時間、３７℃でインキュベートした。試料１００μｌをＰＧＦ１αを測定するのに用いた。
【００９９】
ミトコンドリアの電子伝達系による糖尿病誘導性のスーパーオキシド産生が糖尿病マウスの大動脈中の内皮酵素、プロスタサイクリンシンターゼを完全に不活性化することが以前から明らかであった。図２７のバー２では、高血糖症は、インビボでこの酵素の活性を９０％以上低減させることを示している。これに対し、図２７のバー３では、スーパーオキシド誘導性の遊離Ｆｅ３＋の増加がデフェロキサミンによって予防された場合、高血糖症がこの重要な抗動脈硬化性酵素の活性を全く阻害しないことを示す。
【０１００】
（実施例１８）
デフェロキサミンは、大動脈内皮細胞において内皮酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）の高血糖症誘導性阻害を予防する
ウシ大動脈表皮細胞（「ＢＡＥＣ」、４〜１０代継代）を、２４ウェルプレートに置いた（５０，０００細胞／ウェル）。細胞を、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコースのみ又は３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭデフェロキサミンのいずれかで２４時間インキュベートした。ｅＮＯＳ活性測定の６時間前、アルギニンを含まない培地を細胞に添加し、内因性のアルギニンを使い果した。
【０１０１】
ｅＮＯＳ活性測定は、以下のように達成された。ＢＡＥＣを３７℃で３０分間、４００μｌのＰＢＳ−３Ｈ−アルギニン（１．５μｃｉ／ｍｌ）緩衝液でインキュベートした。反応を１Ｎ  ＴＣＡ（５００μｌ／ウェル、氷冷）を加えて停止し、細胞を２分間、液体窒素で凍結粉砕し、３７℃で５分間解凍して、細胞溶解物を得た。エーテルで抽出後、細胞溶解物を２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭのＥＧＴＡを含むＨｅｐｅｓ緩衝液を用いて、ｐＨ５．５に調節し、その後Ｔｒｉｓ形成ＤＯＷＥＸ  ５０ＷＸ８イオン交換カラムに充填し、３Ｈ−シトルリンを回収した。３Ｈ−シトルリンの検出を、液体シンチレーションカウンターを用いて実施して、ｅＮＯＳ活性を発生した３Ｈ−シトルリンの量から算出した。
【０１０２】
高血糖症誘導性スーパーオキシド形成が、別の臨床学的内皮酵素、内皮酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）を有意に不活性化することが以前から知られていた。この酵素は、低酸素に応じた血管の急性拡張における臨床学的役割及びアテローム性動脈硬化症の発達及び進行に対する別の主要な防御としての重要な役割を果たす。図２８のバー２において、高血糖症はｅＮＯＳ活性を６５％低減することが示されている。これに対して、バー３はスーパーオキシド誘導性の遊離Ｆｅ３＋の増加がデフェロキサミンによって予防された場合、高血糖症がこの重要な抗動脈硬化性酵素の活性を全く阻害しないことを示す。
【０１０３】
（実施例１９）
デフェロキサミンが糖尿病マウスの大動脈における内皮酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）の糖尿病誘導性阻害を予防する
オスＣ５７Ｂ１６（６〜８週齢）を連続した５日間、８時間の絶食後に０．０５Ｍクエン酸Ｎａ（ｐＨ４．５）で、５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを毎日注射することによって糖尿病にさせた。最初の注射の２週間後、血糖を確定し、糖尿病マウスを平均血糖レベルが等しい２つの群に無作為化した。糖尿病動物の１つの群にデフェロキサミン（１０ｍｇ／ｋｇ）を７日間、１日に１度皮下に注射した。皮下酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）活性測定のために大動脈を回収した。
【０１０４】
ｅＮＯＳ活性測定は、以下のように達成された。大動脈を液体窒素中で回収し、組織タンパク質を単離した。免疫沈降方法が組織溶解物からｅＮＯＳを精製するのに用いられた。精製したｅＮＯＳの免疫複合体を１００μｌの反応緩衝液（３μＭのテトラヒドロビオプテリン、１ｍＭのＮＡＰＤＨ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、２００Ｕのカルモジュリン、０．２μＣｉの３Ｈ−Ｌ−アルギニン）で、３７℃で４５分間攪拌してインキュベーションした。インキュベーション後、試料はトリス形成ＤＯＷＥＸ  ５０ＷＸ８イオン交換カラムに充填され、３Ｈ−シトルリンが回収された。３Ｈ−シトルリンを液体シンチレーションカウンターを用いて定量し、ｅＮＯＳ活性を発生した３Ｈ−シトルリンの量から算出した。
【０１０５】
ミトコンドリアの電子伝達系による糖尿病誘導性スーパーオキシドの産生が、糖尿病マウスの大動脈における内皮酵素、ｅＮＯＳを不活性化することが以前から明らかであった。図２９のバー２において、糖尿病高血糖症はインビボでこの酵素活性が６５％減少することが示されている。これに対して、バー３は、遊離Ｆｅ３＋におけるスーパーオキシド誘導性の増加がデフェロキサミンによって予防される場合、この重要な抗動脈硬化性酵素の活性を全く阻害しないことを示す。
【０１０６】
（実施例２０）
虚血への血管形成応答における糖尿病誘導性欠陥
図３０Ａ〜Ｂは、糖尿病動物が、非糖尿病動物が行うような方法で、新しい血管を形成することによって酸化が増大しないことを示している。図３０Ｃ〜Ｄは、糖尿病動物だけが、虚血に応じて骨髄誘導性内皮前駆細胞を非糖尿病動物の１．８３％に対して０．２２％可動化することを示している。図３０Ｅ〜Ｆは、糖尿病動物が虚血組織における毛細血管形成の増大させないことを（黒色のバーによって）示している。
【０１０７】
研究者らによって、マウスの背面の軟組織における段階化された新規の虚血モデルが作られた。マウス背面の血管生体構造が正確に知られており、主要な軸血管が容易に視覚化できるので、このモデルが組織の再現性のある酸素勾配によって、確実な虚血域を作り出す。このことは、最小の虚血領域から最大の虚血領域へ進む、０．５ｃｍ間隔の４つの基準点（ｐ１〜ｐ４）を利用する直接組織酸素圧測定で確認された。
【０１０８】
この糖尿病誘導性欠陥の基になる仕組みは複雑であり、完全には理解されていないが、この欠陥はＳＯＤのミトコンドリアのアイソフォーム(isoform)を過剰発現する糖尿病遺伝子組み換えマウスにおいて大いに予防されるので、この仕組みはミトコンドリアのスーパーオキシドの過剰産生を伴うと思われる。
【０１０９】
（実施例２１）
デフェロキサミン処理が、虚血への血管形成応答における糖尿病誘導性欠陥を修正する
ストレプトゾトシン誘導性糖尿病（ＳＴＺ）マウス及び野生型Ｃ５７（ＷＴ）マウスの虚血性血管新生における鉄キレート化剤であるデフェロキサミンの効果が研究された。オスＣ５７Ｂ１６マウス（６〜８週齢）を０．０５Ｍクエン酸Ｎａ（ｐＨ４．５）における５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを、８時間の絶食後に５日間続けて毎日注射することによって、糖尿病にさせた。最初の注射の２週間後、血糖を確定し、糖尿病マウスを平均血糖レベルの等しい２つの群に無作為化した。
【０１１０】
処理群は、７日間の前処理を受けた後、背面に虚血フラップが作られ、実験を通して、糖尿病動物の１つの群で、７日間、１日に１回デフェロキサミン（１０ｍｇ／ｋｇ）を皮下に注射した。
【０１１１】
図３１Ａで見られるようにドップラーで評価すると、７日目には、非糖尿病非処理群（ＷＴ）及び著しく損なわれたＳＴＺ非処理群（ＤＭ）に比べて、ＳＴＺデフェロキサミン群（ＤＭ＋ＤＥＦ）において血流が正常まで回復したということが見出された。図３１Ｂは、非糖尿病非処理群（ＷＴ）及び著しく損なわれたＳＴＺ非処理群（ＤＭ）に比べて、ＳＴＺデフェロキサミン群（ＤＭ＋ＤＥＦ）において、組織生存が正常まで回復したことを示している。図３２で見られるように、ＣＤ３１陽性血管計測値が、ＳＴＺデフェロキサミン群（ＳＴＺ  Ｄｅｆ  Ｃ）において虚血後血管新生が回復したことを実証している。興味深いことに、野生型のマウス（ＷＴ  Ｄｅｆ  Ｃ）におけるデフェロキサミンもまた、血管新生を改善した。非処理ＳＴＺマウスに比べて、ＥＰＣ可動化もまたＳＴＺデフェロキサミン群において改善された。ＳＴＺマウスをデフェロキサミンで処理した場合、ＳＤＦに対する直線的消耗細胞数移行である、糖尿病の骨髄誘導性移行が正常まで回復した。図３６を参照のこと。
【０１１２】
これらの結果は、デフェロキサミンでの糖尿病動物の処理が完全に、虚血への正常な血管形成応答における糖尿病誘導性欠陥を予防することを示している。
【０１１３】
（実施例２２）
ＭｎＴＢＡＰは、糖尿病創傷治癒を正常化する
また、スーパーオキシド模倣剤である、ＭｎＴＢＡＰで処理することによって、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）における創傷治癒に対する酸化ストレスを低減する効果を研究した。動物は、創傷７日前に、及び実験を通して、腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇで注射された。処理動物は、１６日目に完全な創傷閉塞を示したのに対し、非処理ｄｂマウスは２６日まで創傷が塞がらなかった（図３３Ａ〜Ｂ）。血管新生もまた著しく改善された。図３４で示されるように、処理群におけるＣＤ３１陽性血管計測値は、対照群におけるものの２倍である。局所血管形成因子（ＶＥＧＦ等）が処理動物において正常なレベルまで回復した。図３５で見られるように、創傷ＶＥＧＦ  ＲＮＡレベルは、７日目の処理群において２倍高く、１４日目には３倍高かった。ＭｎＴＢＡＰを用いて、インビトロで培養した糖尿病線維芽細胞はＶＥＧＦを正常に上方調節する能力を示した。したがって、糖尿病動物における酸化ストレスの低減は、糖尿病状態における局所血管形成因子及び血管成長を回復させることにより、創傷治癒を正常化する。
【０１１４】
好ましい実施形態を、本明細書中で詳細に記述し、説明してきたが、本発明の精神から逸脱することなく、様々な修正、追加、代替等が為され得ることが、関連技術分野の熟練者（当業者）には明らかであり、これらは、添付の特許請求の範囲で規定されるように本発明の範囲内であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】血管形成及び脈管形成を示す概略図である。
【図２】虚血応答におけるＨＩＦ及びＶＥＧＦの中心的役割を示す図である。
【図３】高血糖症の損傷の経路を示す図である。
【図４】実験計画を全体的に示す図である。
【図５】段階的な皮膚の虚血のマウスモデルを示す図である。基準点ｐ１（２７ｍｍＨｇ）〜ｐ５（６ｍｍＨｇ）での直接的な組織酸素圧によって測定されるとき、Ａ領域、Ｂ領域及びＣ領域は、漸増的に虚血性組織領域を反映する。
【図６】糖尿病のマウスにおける組織生存を示す図である。
【図７】通常の皮膚酸素圧（ＮＬ皮膚）と比べて、最小の虚血性（ｐ１）から最大の虚血性（ｐ５）までの虚血性組織における酸素圧の測定値を示す図である。
【図８】虚血性フラップのＡ領域、Ｂ領域及びＣ領域におけるＣＤ３１染色によって同定される血管の数を示す図である。
【図９】野生型のマウス及びストレプトゾトシン誘導性糖尿病によるＭｎＳＯＤ遺伝子組み換えマウスにおける操作後の酸素圧の測定値を示す図である。
【図１０】通常のグルコース（５ｍＭ）並びに急性高グルコース及び慢性高グルコース（２５ｍＭ）で培養されるＣ２Ｃ１２筋芽細胞のＪＣ−１染色を示す図である。
【図１１】低酸素に応じた高グルコース及び低グルコースにおけるＶＥＧＦｍＲＮＡを示す図である。
【図１２】通常のグルコース（●）条件又は高グルコース（○）条件で培養される細胞におけるＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの半減期を示す図である。
【図１３】低酸素刺激後の、通常のグルコース（５ｍＭ、灰色）及び高グルコース（２５ｍＭ、黒色）におけるＣ２Ｃ１２筋芽細胞でのＶＥＧＦプロモーター活性を示す図である。
【図１４】ＨＩＦ−１αが通常のグルコース条件（ＮＧ、５ｍＭ）に比べて、高グルコース条件（ＨＧ、２５ｍＭ）で優先的にグルコシル化することを示す図である。
【図１５】図１５Ａ−Ｂは、高グルコース（３０ｍＭ）がｐ３００とＰＰＡＲγとの間の関連性を損なうことを示す図である。この効果は、ＧＦＡＴを阻害することでなくなった。
【図１６】図１６Ａ−Ｃは、反応性酸素種から起因する細胞損傷の経路を選択的に標識化し、且つ阻止することができることを示す図である。
【図１７】図１７Ａ−Ｂは、糖尿病のマウス由来の線維芽細胞が、非糖尿病細胞において見られる、移動における通常の低酸素誘導性の増加を示さないことを示す図である（ｐ＜．０５）。
【図１８】糖尿病のマウス由来の線維芽細胞が、活性化ＭＭＰ−９ではなく、より多くのｐｒｏＭＭＰ−９を産生することを示す図である（Ｐ＜．００１）。
【図１９】図１９Ａ−Ｄは、ＩＩ型糖尿病からのＥＰＣが、拡大の間（Ａ）、あまり増加しないことを示す図である。これは、ＨｂＡ１ｃレベル（Ｂ）と逆相関する。より少ないＥＰＣクラスターが、培養において形成され（Ｃ）、これも糖尿病による全年数と逆相関した。
【図２０】図２０Ａ−Ｃは、ＩＩ型の糖尿病患者からのＥＰＣが、低酸素刺激に応じて付着、移動及び増殖する能力において損なわれることを示す図である（＆＝ｐ＜．００１、＆＆＝ｐ＜．０５）。
【図２１】高血糖症誘導性ＲＯＳにおけるデフェロキサミンの効果を示す図である。
【図２２】ＵＣＰ−１、Ｍｎ−ＳＯＤ又は空のアデノウイルスベクター及びそれに続く５ｍＭグルコース若しくは３０ｍＭグルコースでの処理による感染後のウシ大動脈血管内皮細胞における細胞内遊離鉄の測定を示す図である。ｘ軸は異なる処理を示す。ｙ軸は、遊離型の鉄の量を表す蛍光ユニットを示す。
【図２３】図２３Ａ−Ｃは、２４時間、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコースまたは３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭデフェロキサミンでのインキュベーション後のウシ大動脈血管内皮細胞における細胞内遊離鉄の測定を示す図である。遊離鉄の検出は、蛍光マーカーｆｕｒａ−２  ＡＭを視覚化することにより達せられた。
【図２４】図２４Ａ−Ｄは、７日間、それぞれ５ｍＭグルコース又は３０ｍＭグルコース又は３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭデフェロキシマミン(deferoximamine)でのインキュベーション後の大動脈内皮細胞におけるＤＮＡ鎖分解を示す図である。
【図２５】６日間、５ｍＭグルコース又は３０ｍＭグルコース又は３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭデフェロキサミン、又は３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭＤＭＳＯでのインキュベーション後の大動脈内皮細胞におけるＰＡＲＰ活性を示す図である。３Ｈ−ＮＡＤ混入が、ＰＡＲＰ活性を評価するために用いられた。ｘ軸は、異なる処理を示す。ｙ軸は、ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質で測定されたＰＡＲＰ活性を示す。
【図２６】２４時間、５ｍＭグルコース又は３０ｍＭグルコース又は３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭデフェロキサミンでのインキュベーション後の大動脈内皮細胞におけるプロスタサイクリンシンターゼ活性を示す図である。ｘ軸は、異なる処理を示す。ｙ軸は、プロスタサイクリンシンターゼ産物であるＰＧＦ−１αの濃度として表されるプロスタサイクリンシンターゼ活性を示す。
【図２７】７日間、毎日デフェロキサミンを注入した後の糖尿病のマウス及び対照マウスの大動脈におけるプロスタサイクリンシンターゼ活性を示す図である。ｘ軸は異なる処理を示す。ｙ軸はプロスタサイクリンシンターゼ産物であるＰＧＦ−１αの濃度によって測定されるプロスタサイクリンシンターゼ活性を示す。
【図２８】２４時間、５ｍＭグルコース又は３０ｍＭグルコース又は３０ｍＭグルコースに加えて１００μＭデフェロキサミンでのインキュベーション後の大動脈内皮細胞におけるｅＮＯＳ活性を示す図である。ｘ軸は異なる処理を示す。ｙ軸は１０５個の細胞当た１分間で発生する３Ｈ−シトルリンの関数としてのｅＮＯＳ活性を示す。
【図２９】７日間、毎日デフェロキサミンを注入した後の糖尿病のマウス及び対照マウスの大動脈におけるｅＮＯＳ活性を示す図である。ｘ軸は異なる処理を示す。ｙ軸はタンパク質１ｍｇ当たり１分間で発生する３Ｈ−シトルリンの関数としてのｅＮＯＳ活性を示す。
【図３０】図Ａ−Ｆは、虚血へのマウスの血管形成応答における糖尿病誘導性欠陥を示す図である。図３０Ａ−Ｂは、非糖尿病マウスの酸化レベルを示す。ｙ軸のＰ１〜Ｐ４は、動物への付着部位の最も近くで始まる虚血性皮膚フラップの隣接象限を指定する、すなわちＰ４に遠位で始まるのがＰ１である。図３０Ｃ−Ｄは、虚血に応じた骨髄誘導性の内皮細胞の可動化を示す図である。ｙ軸のＦｌｋ−１は、虚血骨髄誘導性の内皮前駆細胞に対するマーカーである。ｘ軸のＣＤ１１ｂは、骨髄誘導性の内皮前駆細胞に対する一般的マーカーである。図３０Ｅ−Ｆは、非糖尿病マウスにおける毛細血管形成量を示す。ｙ軸のＮＩは、非虚血対照の毛細血管密度を表す。ｙ軸のＣ領域は、7日後の虚血性皮膚フラップにおける毛細血管密度を表す。
【図３１】図３１Ａ−Ｃは、デフェロキサミン処理が、虚血へのマウスの血管形成応答における糖尿病で誘導される欠陥を補正するということを示す図である。処理群は、野生型のマウス（ＷＴ）、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病マウス（図３１ＣにおいてＳＴＺ、及び図３１Ａ、図３１ＢにおいてＤＭとして示される）、及びデフェロキサミン処理のストレプトゾトシン誘導性の糖尿病マウス（図３１ＣにおいてＳＴＺ＋ｄｅｆｅｒｏｘ、及び図３１Ａ、図３１ＢにおいてＤＭ＋ＤＥＦとして示される）であった。
【図３２】野生型マウス（ＷＴ  Ｃ）、デフェロキサミン処理した野生型マウス（ＷＴ  Ｄｅｆ  Ｃ）、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病マウス（ＳＴＺ  Ｃ）及びデフェロキサミンで処理したストレプトゾトシン誘導性糖尿病マウス（ＳＴＺ  Ｄｅｆ  Ｃ）におけるＣＤ３１陽性血管の計測値を示す図である。ｙ軸は、ｈｐｆ当たりのＣＤ３１陽性血管の計測値を示す（高倍率視野）。
【図３３】図３３Ａ−Ｂは、糖尿病マウス（対照）及びＭｎＴＢＡＰで処理した糖尿病マウス（ＴＢＡＰ）における創傷閉塞を示す図である（図３３ＡはＴＢＡＰ、図３３ＢはＭｎＴＢＡＰ）。図３３Ｂのｙ軸は、元の創傷の大きさに対する％の測定値として創傷の領域を示す。該ｘ軸は、創傷後の日数を示す。
【図３４】糖尿病のマウス（Ｄｂ対照）及びＭｎＴＢＡＰで処理した糖尿病のマウス（ＴＢＡＰ処理）におけるＣＤ３１陽性血管の計測値を示す図である。ｙ軸は、ｈｐｆ当たりのＣＤ３１陽性血管の計測値を示す。
【図３５】ＭｎＴＢＡＰ（ＴＢＡＰ処理）又は非処理（Ｄｂ対照）での処理後のＶＥＧＦ  ＲＮＡのレベルを示す図である。ｙ軸は、ＶＥＧＦ  ＲＮＡのコピー数を１０００分の１で表している。
【図３６】対照マウス、ＳＴＺマウス及びＳＴＺ−デフェロキサミンマウスにおけるＥＰＣ可動化を示す棒グラフである。ＥＰＣ可動化は、虚血性障害後７日で確定された。糖尿病が、ＥＰＣ可動化における３倍の減少をもたらした。デフェロキサミンは、非処理のＳＴＺマウスに比べて、特定の虚血性ＥＰＣ可動化を回復させる（ｐ＜．０５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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