【事件の表示】
　特許第２６１１１５９号「ヒアルロン酸薬理活性画分、その製造方法および医薬組成物」の特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２６１１１５９号の第１項、第８項、第１２項、第１５項に係る特許を維持する。
【理　由】
（１）手続きの経緯
　本件特許第２６１１１５９号は、昭和５９年１０月１１日（パリ条約による優先権主張　１９８３年１０月１１日）に出願した特許出願（特願昭５９−２１４０４６号）の一部を、平成７年８月２１日に新たな特許出願（特願平７−２１１６４６号）としたものであり、平成９年２月２７日にその特許の設定登録がなされ、特許異議の申立てがあり、その後、取消理由が通知されたところ、その指定期間内である平成１２年２月２１日に訂正請求がなされたものである。
(２)訂正の可否についての判断
ｉ，訂正請求の内容
ａ，特許請求の範囲の請求項１における、「ヒアルロン酸の混合物を抽出し、得られた混合物」を「ヒアルロン酸の混合物を抽出し、得られた分子量３０，０００以下の物質を含有する混合物」に、「得ることからなり、上記画分は、」を「得ることからなり、上記分子ろ過は分子量排出限界３０，０００を有する膜を使用するものであり、上記画分は、」に、「平均分子量約３０，０００〜約７３０，０００を有するヒアルロン酸画分」を「平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有するヒアルロン酸画分（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）」に、訂正する。
ｂ、特許請求の範囲の請求項２における「分子量排出限界約３０，０００」を「分子量排出限界３０，０００」に訂正する。
ｃ、特許請求の範囲の請求項４における「分子量排出限界約２０，０００」を「分子量排出限界２０，０００」に訂正する。
ｄ、請求項５を削除する。
ｅ，特許請求の範囲の請求項９を請求項８とし、「平均分子量約３０，０００〜約７３０，０００を有し、」を「平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有し、」に、「３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸が実質的に含まない、」を「分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有する、」に、「非炎症性のヒアルロン酸画分」を「非炎症性のヒアルロン酸画分（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）。」に、訂正する。
ｆ、特許請求の範囲の請求項１３を請求項１２とし、「平均分子量約３０，０００〜約７３０，０００を有し、」を「平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有し、」に、「３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に含まない、」を「分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有する、」に、「非炎症性のヒアルロン酸画分」を「非炎症性のヒアルロン酸画分（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）」に、訂正する。
ｇ、特許請求の範囲の請求項１６を請求項１５とし、「平均分子量約３０，０００〜約７３０，０００を有し、」を「平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有し、」に、「３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に含まない、」を「分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有する、」に、「非炎症性のヒアルロン酸画分」を「非炎症性のヒアルロン酸画分（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）」に、訂正する。
ｈ、請求項６を請求項５とし、「請求項１〜５の何れか」を「請求項１〜４の何れか」に、訂正し、請求項７を請求項６とし、「請求項６記載の」を「請求項５記載の」に訂正し、請求項８を請求項７とし、「請求項７記載の」を「請求項６記載の」に訂正し、請求項１０を請求項９とし、「請求項９記載の」を「請求項８記載の」に訂正し、請求項１０を請求項９とし、「請求項９記載の」を「請求項８記載の」に訂正し、請求項１１を請求項１０とし、「請求項９記載の」を「請求項８記載の」に訂正し、請求項１２を請求項１１とし、「請求項９〜１２の何れか」を「請求項８〜１０の何れか」に訂正し、請求項１４を請求項１３とし、「請求項１３記載の」を「請求項１２記載の」に訂正し、請求項１５を請求項１４とし、「請求項１３記載の」を「請求項１２記載の」に訂正し、請求項１７を請求項１６とし、「請求項１６記載の」を「請求項１５記載の」に訂正し、請求項１８を請求項１７とし、「請求項１６記載の」を「請求項１５記載の」に訂正する。
ii)、訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正ａは、請求項１に係る発明における分子ろ過前の混合物が分子量３０，０００以下の物質を含有することを明りょうにし、その分子ろ過が分子量排出限界３０，０００を有する膜を使用したものであることを限定し、さらに得られたヒアルロン酸画分の平均分子量の範囲を減縮するものであるから、明りょうでない記載の釈明と特許請求の範囲の減縮を目的とするものであり、
訂正ｂ、ｃは、請求項２，４における「分子量排出限界」について「約」の記載を削除してその範囲を明確にするものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とするものであり、
訂正ｄは、請求項５を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものであり、
訂正ｅ、ｆ、ｇ、は各請求項を繰り上げると共に、ヒアルロン酸画分の平均分子量の範囲を減縮し、さらに、ヒアルロン酸画分の分子量分布が特定のものであることを限定するものであり、明りょうでない記載の釈明と特許請求の範囲の減縮を目的とするものであり、
訂正ｈ、は、請求項５を削除したことに伴い、請求項の繰り上げと、引用請求項を整合させたものであり、明りょうでない記載の釈明を目的とするものである。
　また、上記訂正は、願書に添付した明細書に記載した事項の範囲内のものであるし、実質的に特許請求の範囲を拡張又は変更するものではない。
iii)、独立特許要件の判断
　上記訂正後の発明、即ち訂正明細書に記載された発明は、後記（３）に記載するものから明らかなように、独立して特許を受けることができるものである。
　したがって、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び第３項で準用する第１２６条第２〜４項の規定に適合するので、当該訂正請求を認める。
（３）特許異議の申立てについての判断
ｉ）、本件発明
　本件発明は、訂正明細書の記載からみて、その特許請求の範囲に記載された次のとおりのものである。
「請求項１、ヒアルロン酸を含有する、入手可能な出発物質からヒアルロン酸の混合物を抽出し、得られた分子量３０，０００以下の物質を含有する混合物を分子ろ過にかけ平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有するヒアルロン酸画分（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）を得ることからなり、上記分子ろ過は分子量排出限界３０，０００を有する膜を使用するものであり、上記画分は、３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に含まないものである、実質的に純粋で、非炎症性のヒアルロン酸画分を製造する方法。（以下、「第１特許発明」という。）
請求項８　平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有し、分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有する、実質的に純粋で、非炎症性のヒアルロン酸画分（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）。（以下、「第２特許発明」という。）
請求項１２　平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有し、分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有する、実質的に純粋で、非炎症性のヒアルロン酸画分（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）から成る、組織傷の回復促進剤。（以下、「第３特許発明」という。）
請求項１５　平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有し、分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有する、実質的に純粋で、非炎症性のヒアルロン酸画分（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）から成る、眼疾患活性を有する薬剤の眼投与用の医薬担体。（以下、「第４特許発明」という。）
ii)、特許異議申立人の主張の概要
（ａ）、特許異議申立人藤野清也（以下、申立人Ａという。）は、甲第１号証の１（特願昭５９−２１４０４６号の平成７年８月２１日付けの手続補正書）、甲第１号証の２（特公平６−８３２３号公報）、甲第２号証の１（実験報告書、生化学工業株式会社、東京研究所、宮内聡、瀧森純、平成６年７月２８日作成）、甲第２号証の２（試験報告書、日本食品分析センター、第４９０３２６２４号、平成８年５月１７日作成）、甲第３号証（「東京女子医大雑誌」、第４８巻、第１０・１１号、別刷、昭和５３．１１、第８９０〜９１０頁）、甲第４号証（「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅｒａｐｙ　ａｎｄ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，　２０（１１）５０１−５０７（１９８２））、甲第５号証（ＦＥＲＤＩＮＡＮＤ　ＥＮＫＥ　ＶＥＲＬＡＧ　ＳＴＵＴＴＧＡＲＴ　発行　ＢUＣＨＥＲＥＩ　ＤＥＳ　ＡＵＧＥＮＡＲＴＥＳ（Ｂｅｉｈｅｆｔｅ　ｄｅｒ　Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅｎ　Ｍｏｎａｔａｂｌaｔｔｅｒ　ｆuｒ　Ａｕｇｅｎｈｅｉｌｋｕｎｄｅ）　第５３巻、（１９７０）第４２〜４８頁）、甲第６号証（特開昭５６−６３９２１号公報）、甲第７号証（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　第２０７巻（１９８２）第４０９〜４１４頁）、甲第８号証（米国特許第４１４１９７３号明細書）、甲第９号証（特開昭５８−５６６９２号公報）、甲第１０号証（特開昭５６−１３９５０１号号公報）を提出して、
ア、本件特許は適法になされた分割出願に基づくものでないから出願日は遡及しないので、本件請求項１〜１７に係る発明は、本件出願前に頒布されたとされる甲第１号証の２に記載された発明、或いはこの発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第１項第３号或いは同法第２９条第２項に規定により特許を受けることができないし、
イ、本件請求項１〜８、請求項１５〜１７に係る発明は甲第１号証で示される分割原出願と同一であるから、特許法第３９条第２項の規定により特許を受けることができないし、
ウ、本件請求項１〜１７に係る発明は、自然法則に反した技術思想に基づいているので、特許法第２条第１項に規定する「発明」ではなく、特許法第２９条第１項柱書きの規定を満たすものではないから特許を受けることができないし、
エ、本件請求項１〜１７に係る発明は、甲第３〜７号証に記載された発明であるか、若しくは甲第３〜１０号証の記載に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第１項第３号若しくは第２９条第２項の規定により特許を受けることができないし、
オ、本件請求項１，２，５−８、１１，１２，１５−１７に係る発明は、その特許明細書の記載が不備であるから、特許法第３６条に規定する要件を満たしていない、と主張し、
（ｂ）、特許異議申立人ハイアル　ファーマスティカル　コーポレイション（以下、申立人Ｂという。）は、甲第１号証（米国特許第４１４１９７３号明細書）、甲第２号証（米国特許第４２７２５２２号明細書）、甲第３号証（米国特許第４３０３６７６号明細書）、甲第４号証（米国特許第４３２８８０３号明細書）、甲第５号証（Ｃｌｅｌａｎｄ，　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔ．　Ｖｏｌ．７６（１９７２）Ｎｏ．４３０７５ｑ　「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｄｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ」、ｐ７３３−７４２）、甲第６号証（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８１，７９−９１（１９７７），ｐ７９−９１）、甲第７号証（米国特許第３８７０７９１号明細書）、甲第８号証（米国特許第４２５５４１５号明細書）、甲第９号証（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９６８；１５６；ｐ１７−３０）、甲第１０号証（Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｒｏｕｍ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９７１；８（６）６，５０３−５０９頁）、甲第１１号証（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３７（１９８２），　ｐ７３−７８）、甲第１２号証（米国特許第３３９６０８１号明細書）、甲第１３号証（Ｅｘｐ．Ｅｙｅ　Ｒｅｖ．（１９８３），ｐ４８１−４９２）、甲第１４号証（米国特許第４５１７２９５号明細書）を提出して、本件請求項１〜１７に係る発明は、甲第１〜１４号証に記載の事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない、と主張し、
（ｃ）、特許異議申立人中野宗昭（以下、申立人Ｃという。）は、甲第１号証（特願昭５９−２１４０４６号の平成７年８月２１日付けの手続補正書）、甲第２号証（特公平６−８３２３号公報）、を提出して、
ア、本件請求項１，８，１２，１５に係る発明は甲第１，２号証で示される分割原出願の発明と同一であるから、特許法第３９条第１項の規定に該当し、特許を受けることができないものであるし、本件の分割出願は不適法なものであり出願日が遡及しないから、特許法第２９条第１項第３号の規定に該当し特許を受けることができないし、
イ、本件請求項１，８，１２，１５に係る発明について、本件明細書の記載が不備であるから、特許法第３６条に規定する要件を満たしていない、と主張する。
iii)、検討・判断
（ａ）、申立人Ａの主張について
　主張アについて、
　申立人Ａは、本件特許発明は、甲第１号証に示される分割原出願の発明と同一であり、本件特許に係る分割出願は分割要件を満たさないものであるから、その出願日は遡及しないと主張するので、本件特許発明と分割原出願の発明とを対比検討する。分割原出願の発明は、平均分子量が約５０００００〜約７３００００の範囲であるものに限定されたヒアルロン酸画分に関する発明であるのに対して、本件発明は前記訂正請求により、平均分子量約５０００００〜約７３００００を有するヒアルロン酸画分はその範囲から除かれたので、同一の発明であるとはいえないものとなった。
　してみると、本件分割出願は、申立人Ａのいう不適法なものではなく、その出願日が遡及しないものではないから、甲第１号証の２の刊行物は、本件出願前に頒布された刊行物であるとはいえないものである。結局、本件特許発明が特許法第２９条第１項第３号に該当するものではないし、また、特許法第２９条第２項により特許を受けることができないものでもない。
　主張イについて、
　上記「主張アについて」で述べたように、本件特許発明と分割原出願とは、ヒアルロン酸画分の平均分子量が相違しており、同一の発明とすることはできないから、本件特許発明が３９条の規定により特許を受けることができないものとすることはできない。　
　主張ウについて、
　甲第２号証の１には、分子量３００００以下のヒアルロン酸画分を試料として炎症性の試験をした結果、非炎症性であったことが、また、甲第２号証の２には、該試料が分子量３００００以下のヒアルロン酸画分であったことが、それぞれ示されており、これを根拠として、申立人Ａは、分子量３００００以下の分子量のヒアルロン酸が炎症性であるという本件特許発明の技術思想は、自然法則に反している旨の主張をしている。しかしながら、分子量３００００以下のヒアルロン酸を除去した画分を使用することが自然法則に反して利用できないとすることはできないし、また、本件明細書中の表６には、分子量３００００以下のヒアルロン酸を除去していない画分が炎症性を示し、分子量３００００以下のヒアルロン酸を除去した画分が炎症性を示さない試験結果が記載されており、分子量３００００以下のヒアルロン酸自体が炎症性を示すか否かはともかく、炎症性を示すことなく利用するために分子量３００００以下のヒアルロン酸を除去することが有効であることが開示されている。
　してみると、申立人Ａの主張は、分子量３００００以下のヒアルロン酸を除去することにより炎症性を示さないものとなった原因が、該低分子のヒアルロン酸自体を含まない点に拠るのか、或いはその除去に伴う不純物の除去等に拠るのかを究明していないというに止まるものであって、これをもって、本件特許発明が、特許法第２条第１項に規定する「発明」ではないとすることはできないし、特許法第２９条第１項柱書きの規定を満たすものではないとはいえない。
　主張エについて、
　本件特許発明が甲第３号証〜７号証に記載されているか否かについて検討する。
　甲第３号証には、ヒト臍帯あるいはニワトリトサカより抽出、精製したもので、分子量は２５万〜１１０万、蛋白質含有量は０．１％以下で、ＨＡ以外のムコ多糖や核酸等を含まず、パイロジェンや抗原性物質も含まれていないヒアルロン酸を、ウサギの関節内に注入した試験等が記載され、高純度ヒアルロン酸（蛋白含量０．１％以下）によってはマクロファージの浸潤は観察されなかったことが示されている。
　本件第１特許発明と甲第３号証記載の発明とは、「ヒアルロン酸を含有する入手可能な出発物質からヒアルロン酸の混合物を抽出し、得られた混合物を分子ろ過にかけ平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有するヒアルロン酸画分を製造する方法」の点で共通するものであるが、本件第１特許発明は、分子量排出限界３０，０００を有する膜を用いて分子ろ過にかけることにより得られた、３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に含まないものとすることを特定しているのに対して、甲第３号証には、分子量排出限界３０，０００を有する膜を用いて３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に除去することについては何ら記載されていない点で相違している。
　甲第４号証には、雄鶏トサカ由来の平均分子量７０−８０万、蛋白含量０．１％のヒアルロン酸ナトリウムを使用して変形性関節症の患者に、関節内注射を行い、その治療効果を検討し、ヒアルロン酸の関節内注射により局所的な炎症を引き起こさなかったこと、イヌの膝関節に分子量３４万〜８０万のヒアルロン酸を注射して検討し、ヒアルロン酸の注射が損傷を受けた軟骨表面及び滑液の正常化をもたらすことが記載されているが、上記甲第３号証と同様に、分子量排出限界３０，０００を有する膜を用いて３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に除去することについては何ら記載されていない。
　甲第５号証には、分子量１５万のヒアルロン酸ナトリウムを網膜剥離の手術に使用し、炎症症状がなかったことが示され、甲第６号証には、ムラミダーゼと少なくとも約４３万の分子量を有するヒアルロン酸の可溶性塩とを含有する生理食塩溶液からなる食作用活動の刺激用組成物に関して記載され、分子量４．８万、１１万、２６万、４３万、１３０万、２３０万のヒアルロン酸ナトリウムは単独ではいずれも単核食細胞（MNP）における食作用を高めないことが示されており、甲第７号証には、成牛硝子体液から得た平均分子量５．９万のヒアルロン酸画分についてゲル浸透クロマトグラフィーで再分画して、各分画が平均分子量が15.8万、9.4万、5.6万、4.8万、3.0万であったことが示されているが、これら甲第５〜７号証には、上記甲第３号証と同様に、分子量排出限界３０，０００を有する膜を用いて３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に除去することについては何ら記載されていない。
　結局、本件第１特許発明は、甲第３〜７号証に記載された発明とすることはできない。
　また、本件第２〜４特許発明は、本件第１特許発明と同様に、「分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、」実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有するヒアルロン酸画分に関するものであるから、本件第２〜４発明は、本件第１特許発明についての上記理由と同様の理由により、甲第３〜７号証に記載された発明とすることはできない。
　次に、上記相違点について、以下に検討する。
　ところで、比較的低分子量のヒアルロン酸画分、例えば平均分子量５万〜５０万のものは低粘度であり、細胞増殖能を有し、創傷治癒の促進に望ましい特性を有するものの、炎症活性をも有するため、その使用が制約されていたところ、本件第１特許発明は、分子量排出限界３０，０００を有する膜を用いて分子ろ過にかけ、３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に除去した場合に、非炎症性となることを見出して、上記低分子量のヒアルロン酸画分を安全に有効利用することを可能にしたものである。
　これに対して、甲第８号証には約７５万より大きいヒアルロン酸画分について、無菌的であり、蛋白質含量が0.5％以下であり、パイロジェンを含まず、抗原性がなく、皮膚創傷の保護に利用されること等が記載されているが、分子量排出限界３０，０００を有する膜を用いて３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に除去することについては何ら記載されていないし、甲第９号証には、微生物によるヒアルロン酸の製造法において、培養液からのヒアルロン酸の分離に際し、従来から行われている多糖類の分離採取法が利用でき、また、混在する低分子物質は限外ろ過、透析あるいは有機溶媒再沈澱法等により分離除去すること等が記載され、また、甲第１０号証には、ヘパリン酸ナトリウム等のグルコサミノグルカンの塩の水溶液を限外濾過等により、低活性成分、非活性成分を分離し、高活性のフラクションは通過させずに濃縮する方法に関して、分子量６００，５０００、１万、３万等でカットオフする膜を使用することが記載されている。
　しかしながら、これら甲第９、１０号証の記載は、ヒアルロン酸等の分画に限外ろ過膜を使用し得ること、ヘパリン酸ナトリウム等のグルコサミノグルカンの塩を分子量約３万でカットオフし得ることが知られていたことを示すに止まり、３万程度以下の分子量を有するヒアルロン酸を除去することにより、非炎症性のヒアルロン酸分画を得ることについては何ら記載されていない。
　してみると、甲第３〜７号証の記載と甲第８〜１０号証の記載とを併せてみても、分子量排出限界３０，０００を有する膜を用いて３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に除去することにより、比較的低分子量のヒアルロン酸を安全に有効利用することが、当業者にとって容易に想到しうるものであるということはできない。
　また、本件第２〜４特許発明は、本件第１特許発明と同様に、「分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、」実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した特定の分子量分布を有するヒアルロン酸画分に関するものであるから、本件第２〜４発明は、本件第１特許発明についての上記理由と同様の理由により、当業者が容易に発明をすることができたものではない。
　結局、本件第１〜４特許発明が特許法第２９条第１項第３号若しくは第２９条第２項の規定により特許を受けることができない、という上記主張は採用できない。
　主張オについて、
　申立人Ａは、３万以下の分子量のヒアルロン酸を実質的に含有しないヒアルロン酸画分の平均分子量が約３万であることは実体上あり得ないと主張するが、上記訂正請求により平均分子量が５万未満のヒアルロン酸画分に関しては本件特許発明の範囲外のものとなり、上記主張は理由のないものとなった。
（ｂ）、申立人Ｂの主張について
　甲第１号証には、少なくとも約７５万の平均分子量を有するヒアルロン酸画分に関する記載があり、該画分が無菌的であり、蛋白質含量が０．５％以下であり、パイロジェンを含まず、抗原性がなく、皮膚創傷の保護に利用されることが記載されている。
　本件第１特許発明と甲第１号証記載の発明とは、ヒアルロン酸を含有する入手可能な出発物質からヒアルロン酸の混合物を抽出し、得られた混合物を分子ろ過にかけ実質的に純粋で、非炎症性のヒアルロン酸画分を製造する発明に関する点で共通するが、本件第１特許発明は、分子量排出限界３０，０００を有する膜を用いて分子ろ過にかけることにより得られた、３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に含まないものとすることを特定しているのに対して、甲第１号証には、分子量排出限界３０，０００を有する膜を用いて３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に除去することについては何ら記載されていない点で相違している。
　上記相違点について、以下に検討する。
　甲第２号証には、ムラミダーゼと少なくとも約４３万の分子量を有するヒアルロン酸の可溶性塩とを含有する生理食塩溶液からなる食作用活動の刺激用組成物に関して記載され、分子量４．８万、１１万、２６万、４３万、１３０万、２３０万のヒアルロン酸ナトリウムは単独ではいずれも単核食細胞（MNP）における食作用を高めないこと等が示され、甲第３号証には、分子量１万〜３万のヒアルロン酸ナトリウムと分子量１００万〜４５０万のヒアルロン酸ナトリウムとの混合物が化粧料等に有用であること等が記載され、甲第４号証には、ヒアルロン酸ナトリウムを眼科に利用することに関して記載され、甲第５号証にはヒアルロン酸の分子量分布に関して記載され、甲第６号証にはヒアルロン酸の分画として分子量１．０万、１．３万、２．１万、３．１万、５．７万、７．２万のものが記載され、甲第７号証には、眼科用薬剤の投与に際してポリウロン酸やカルボキシメチルセルロース塩を担体として使用する発明に関して記載され、甲第８号証には、ピロカルピン等の眼科用薬剤の局所投与にポリビニルアルコールを含むゲルを使用することに関する発明について記載があり、甲第９号証には、ヒアルロン酸の調製、精製に関して記載があり、分子量約１２０万のもの等が得られた旨が示されており、甲第１０号証には、エリスロマイシン、ストレプトマイシンなどのヒアルロニダーゼ存在下の組織内拡散作用について記載がされ、甲第１１号証には、分子量１２０万のヒアルロン酸等について細胞の接着、解離に関して記載され、甲第１２号証には、タンパク質、抗体、パイロジェンを含まないヒアルロン酸を調製して、眼科分野に利用することについて記載され、甲第１３号証には、成牛硝子体から得たヒアルロン酸の平均分子量が４５万から８２万程度であることが示され、甲第１４号証には、ヒアルロン酸産生微生物を利用して平均分子量５５万のヒアルロン酸を得たこと等が示されている。しかしながら、これら甲第２〜１４号証には、上記相違点に係るところの、分子量排出限界３０，０００を有する膜を用いて３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に除去することについては何ら記載されていない。
　したがって、本件第１特許発明が甲第１〜１４号証の記載に基づいて容易に発明をすることができたとすることはできない。
　また、本件第２〜４特許発明は、本件第１特許発明と同様に、「分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、」実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した特定の分子量分布を有するヒアルロン酸画分に関するものであるから、本件第２〜４発明は、本件第１特許発明についての上記理由と同様の理由により、当業者が容易に発明をすることができたものではない。
　したがって、本件第１〜４特許発明が、特許法第２９条第２項の規定に違反するという申立人Ｂの主張は採用できない。
（ｃ）、申立人Ｃの主張について
　主張アについて、
　申立人Ｃは、甲第１，２号証で示される本件分割出願の原出願と同一であるから、本件特許は、特許法第３９条の規定により特許を受けることができないものであり、また、適法な分割出願でないから、出願日は遡及せず、甲第２号証は本件特許の出願前に頒布されたものであるから、本件特許発明は、特許法第２９条第１項第３号の規定に該当すると主張する。
　しかしながら、本件特許発明と分割原出願の発明とを対比検討すると、分割原出願の発明は、平均分子量が約５０００００〜約７３００００の範囲であるものに限定されたヒアルロン酸画分に関する発明であるのに対して、本件発明は前記訂正請求により、平均分子量約５０００００〜約７３００００を有するヒアルロン酸画分はその範囲から除かれたので、同一の発明であるとはいえないものであり、分割出願は不適法ではなく出願日が遡及しないものではない。
　したがって、本件特許発明が、特許法第３９条の規定及び特許法第２９条第１項第３号の規定に違反するという申立人Ｃの主張は採用できない。
　主張イについて、
　申立人Ｃは、本件特許請求の範囲における、３００００以下の分子量を有するヒアルロン酸を「実質的に」含まないとする意味は、「実質的に」の文言により３万以下のヒアルロン酸が完全に含まないものでないことを示し、その含有量が不明りょうであると指摘する。しかし、該「実質的な」の意味は、本件特許発明の目的とする非炎症性を達成するために、３万以下の分子量を有するヒアルロン酸を十分に除去したものであるが、理論的に含有量が０であるとまではいえない、という程度のものと認められるから、該記載により、特許を取り消すほどに特許請求の範囲の記載が不明確であるとはいえない。
　また、申立人Ｃは、本件特許請求の範囲のヒアルロン酸画分の平均分子量について、「約７３００００」のように「約」の文言を付しているが、これにより該平均分子量が特定されていないという。しかし、この「約」の文言は、単に、正確に測定したときの値をいうものであり、理論値としてではないという程度のものと解され、この「約」の文言により平均分子量が特定されていないとまでいうことは妥当でない。また、申立人Ｃは、本件明細書中で非炎症性等の効果を確認しているのは、平均分子量が５〜１０万、２５万〜３５万、５０万〜７３万のものであり、平均分子量３万〜５万、１０万〜２５万、３５万〜５０万の範囲内のものはその効果が確認されていないから、特許請求の範囲の記載は不当に広い、と主張するが、本件特許発明における非炎症性は３万以下のヒアルロン酸を除去することにより可能とするものであるし、特許請求の範囲に特定した平均分子量のうち、下限値に近いもの、中程度のもの、上限値に近いものについて、その効果が確認されているのであるから、特定された平均分子量の範囲のものの効果は当業者であれば理解できるというべきであり、単に、特許請求の範囲に含まれる平均分子量のものが逐一的に効果の確認をしていないことをもって、特許請求の範囲の記載が不当に広いとすることはできない。また、申立人Ｃは、本件明細書の表３及び段落番号００２７に、平均分子量５０万〜７３万のヒアルロン酸画分であるヒアレクチンは創傷用には有用でないと記載されており、第３特許発明は該画分のヒアルロン酸を組織傷の回復促進剤用に使用するとしており整合していないと主張する。しかし、本件特許発明は前記訂正により平均分子量約５０万〜約７３万のヒアルロン酸画分は含まないものとなっているから、この点についての申立人Ｃの主張も採用できない。
（４）むすび
　以上のとおりであるから、特許異議の申立ての理由及び証拠によっては、本件特許を取り消すことができない。
　また、本件許について、他に取消理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年３月１７日（２０００．３．１７）
【訂正の要旨】
　特許第２８１０７２２号の明細書中、明りょうでない記載の釈明と特許請求の範囲の減縮を目的として、
ａ，特許請求の範囲の請求項１における、「ヒアルロン酸の混合物を抽出し、得られた混合物」を「ヒアルロン酸の混合物を抽出し、得られた分子量３０，０００以下の物質を含有する混合物」に、「得ることからなり、上記画分は、」を「得ることからなり、上記分子ろ過は分子量排出限界３０，０００を有する膜を使用するものであり、上記画分は、」に、「平均分子量約３０，０００〜約７３０，０００を有するヒアルロン酸画分」を「平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有するヒアルロン酸画分（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）」に、訂正し、明りょうでない記載の釈明を目的として、
ｂ、特許請求の範囲の請求項２における「分子量排出限界約３０，０００」を「分子量排出限界３０，０００」に訂正し、
ｃ、特許請求の範囲の請求項４における「分子量排出限界約２０，０００」を「分子量排出限界２０，０００」に訂正し、特許請求の範囲の減縮を目的として、
ｄ、請求項５を削除し、明りょうでない記載の釈明と特許請求の範囲の減縮を目的として、
ｅ，特許請求の範囲の請求項９を請求項８とし、「平均分子量約３０，０００〜約７３０，０００を有し、」を「平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有し、」に、「３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸が実質的に含まない、」を「分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有する、」に、「非炎症性のヒアルロン酸画分」を「非炎症性のヒアルロン酸画分（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）。」に、訂正し、
ｆ、特許請求の範囲の請求項１３を請求項１２とし、「平均分子量約３０，０００〜約７３０，０００を有し、」を「平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有し、」に、「３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に含まない、」を「分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有する、」に、「非炎症性のヒアルロン酸画分」を「非炎症性のヒアルロン酸画分（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）」に、訂正し、
ｇ、特許請求の範囲の請求項１６を請求項１５とし、「平均分子量約３０，０００〜約７３０，０００を有し、」を「平均分子量約５０，０００〜約７３０，０００を有し、」に、「３０，０００以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的に含まない、」を「分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有する、」に、「非炎症性のヒアルロン酸画分」を「非炎症性のヒアルロン酸画分（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）」に、訂正し、明りょうでない記載の釈明を目的として、
ｈ、請求項６を請求項５とし、「請求項１〜５の何れか」を「請求項１〜４の何れか」に、訂正し、請求項７を請求項６とし、「請求項６記載の」を「請求項５記載の」に訂正し、請求項８を請求項７とし、「請求項７記載の」を「請求項６記載の」に訂正し、請求項１０を請求項９とし、「請求項９記載の」を「請求項８記載の」に訂正し、請求項１０を請求項９とし、［請求項９記載の」を「請求項８記載の」に訂正し、請求項１１を請求項１０とし、「請求項９記載の」を「請求項８記載の」に訂正し、請求項１２を請求項１１とし、「請求項９〜１２の何れか」を「請求項８〜１０の何れか」に訂正し、請求項１４を請求項１３とし、「請求項１３記載の」を「請求項１２記載の」に訂正し、請求項１５を請求項１４とし、「請求項１３記載の」を「請求項１２記載の」に訂正し、請求項１７を請求項１６とし、「請求項１６記載の」を「請求項１５記載の」に訂正し、請求項１８を請求項１７とし、「請求項１６記載の」を「請求項１５記載の」に訂正する。
（５４）【発明の名称】
ヒアルロン酸薬理活性画分、その製造方法および医薬組成物
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　ヒアルロン酸を含有する、入手可能な出発物質からヒアルロン酸の混合物を抽出し、得られた
分子量３０，０００以下の物質を含有する
５
（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）
上記分子ろ過は分子量排出限界３０，０００を有する膜を使用するものであり、
　【請求項２】　ヒアルロン酸の上記混合物を、分子量排出限
界３
　【請求項３】　上記最初のヒアルロン酸画分が平均分子量約２５０，０００〜約３５０，０００を有するものである、請求項２記載の方法。
　【請求項４】　上記最初のヒアルロン酸画分を、分子量排除限
界２
　【請求項
５
４
　【請求項
６
５
　【請求項
７
６
　【請求項
８
５
分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有する、
（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）
　【請求項
９
８
　【請求項
１０
８
　【請求項
１１
８〜１０
　【請求項
１２
５
分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有する、
（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）
　【請求項
１３
１２
　【請求項
１４
１２
　【請求項
１５
５
分子量３０，０００以下の物質を含有するヒアルロン酸混合物から分子量３０，０００以下のもののみを実質的に除去する手段を経て得られた、実質的に分子量３０，０００以下の部分が欠除した分子量分布を有する、
（ただし、平均分子量約５００，０００〜約７３０，０００を有するものを除く）
　【請求項
１６
１５
　【請求項
１７
１５
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の背景と分野】
　本発明は、治療的効用を有し、しかも使用時になんら炎症性を示さないヒアルロン酸（以下ＨＡと省略する）の特定分子量の画分に関する。本発明に示すＨＡ画分の一つは創傷治癒を促進するのに有用であり、また他方、第２のＨＡ画分は眼球内液の代用液として眼内使用に有用であり、また骨関節の損傷の治療適用のため関節内注入に有用である。さらにそれらのＨＡ画分は、眼科用薬の賦形薬として角膜上皮とよく適合し得る製剤を調製し、眼科用薬の活性を高めるのに有用であることが明らかにされた。
　【０００２】
　【従来の技術】
　ヒアルロン酸は、天然に産生され、交互に並ぶＤ−グルクロン酸残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基から構成されている異種多糖類である。ＨＡは、一般に約８００万〜１３００万の高い分子量を有する線状のポリマーで、細胞外皮、脊椎動物の結合組織の細胞外間質物質、関節の滑液、眼の眼球内液、ヒトの臍帯組織、および雄鶏のとさかに存在している。
　【０００３】
　ＨＡの利用に関する従来の研究の一つに、眼球内液に代用され、その他の治療にも適用し得る有用なＨＡの１画分を示したバラズスの研究がある（米国特許第４，１４１，９７３号）。然しながら、この特許は平均分子量が約７５０，０００より大きく、好ましくは約１，２００，０００より大きいＨＡ画分を特に指定している。バラズスは、平均分子量が７５０，０００より小さいＨＡ画分は炎症活性があるので治療用に使用できないことを特に指摘している。これらの低級分子量のＨＡ画分はバラズスによると破棄されている。然しこのために、原料組織から入手される利用可能なＨＡの総量の約９０％は破棄され、利用可能なＨＡの僅かな量（約１０％）だけが使用される結果となっている。
　【０００４】
　バラズスの指摘した結果と逆に、本発明者はＨＡの低級分子量の画分が、実際に有用な薬学的活性を有することを発見した。したがって、本発明によると種々の材料から入手し得るＨＡの約８０％までが利用される。特に本発明者は、創傷治癒の促進に有用なＨＡの１画分、および眼の眼球内液の代用液として眼内に注射し、損傷された関節の治療用として関節内注射に使用し得るＨＡの第２の画分を発見した。
　【０００５】
　【発明の詳細な記載】
　前述のように、従来のＨＡの研究では、バラズスの特許に代表される如く、平均分子量が７５０，０００以上の高分子量の画分を使用するように指摘している。本発明者は、低分子量を有する画分と、中間に位置する平均分子量を有するもう一つの画分との２個の新規なＨＡ画分を単離し、確認した。それらの画分は高度の純度を示すので実質的に純粋であると考えられ、しかも炎症活性を有しない。これらの新規ＨＡ画分は、ヒアルロン酸の抽出し得る量を含有する種々の結合組織から入手することができる。本発明に示した特殊画分は、分子濾過の技術に従って逐次的に分別され、分離される。
　【０００６】
　本出願方法によって分離される最初の画分はヒアラスチン（ＨＹＡＬＡＳＴＩＮ）と命名され、約５０，０００〜約１００，０００の平均分子量を有する。このヒアラスチン画分は、その創傷治癒活性から獣医用およびヒト用の治療的応用に好適であることが確認された。本出願方法によって単離された第２の画分はヒアレクチン（ＨＹＡＬＥＣＴＩＮ）と命名され、約５００，０００〜約７３０，０００の平均分子量を有する。このヒアレクチンは眼球内液の代用液として眼科手術の際に使用され、また獣医学領域およびヒトにおける関節の外傷性および退行性疾患の治療に好適である。
　ヒアラスチンは皮内注射、または創傷治癒用の局所剤のいずれでも投与できる。一方、ヒアレクチンは眼内注射および関節内注射が好適である。
　【０００７】
　本出願方法においてはＨＡの各種画分について入念な検討を行い、従来の方法と比べて明らかにより正確な方法を以て、ＨＡの治療上有用な画分と、炎症性で利用できないＨＡ画分とを明瞭に決定づけた。これらの研究の結果から、本発明者はＨＡ画分に特有な二つの性質、即ち細胞可動化（ｃｅｌｌ　ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）活性と固有粘度（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を確認し、検討した。動物における創傷治癒の過程は細胞運動性、特に線維芽細胞の細胞運動性によって促進される。一方、細胞運動性または増殖能（即ち、有系分裂）は、眼球内側の手術の場合はできるだけ回避されるべきである。癒合速度の増大が却って有害な影響をもたらす可能性がある網膜剥離の矯正手術において、このことは特に事実である。
　【０００８】
　固有粘度もまた、ＨＡ画分の有用性の判定に際して考慮すべき重要な指標である。固有粘度が高い画分は、外傷性および退行性の関節疾患の治療における手術適用に有用であり、また眼球内液の代用液としても有用である。一方、高い粘度は、創傷治癒を促進する薬物として使用される画分にとって好ましからぬ特性である。事実、創傷治癒に利用される画分は、実際の適用に当たって使用し易いように低い粘度であるべきである。
　【０００９】
　本発明においてヒアラスチンと呼ばれる画分は、良好な運動性、即ち細胞増殖能を有し、且つ低粘度を有することが確認された。従って、ヒアラスチンは、創傷治癒の促進に有用な物質として望ましい特性を有する。
　同時に一方では、この特性がヒアラスチン画分の眼内注射療法、または関節内注射法への適用を好ましくないものにしている。
　【００１０】
　本発明において、ヒアレクチンと呼ばれる画分は、細胞運動性、即ち増殖能がごく僅かである一方、同時に高い粘度を有することが確認された。従ってこれらの特性から、ヒアレクチン画分は眼内注射療法および関節内注射療法に有用である。然し他方、ヒアレクチンは細胞運動活性を示さないので、この画分は創傷治癒法には有用ではない。
　【００１１】
　ヒアルロン酸の有用な画分を分離する場合、炎症活性を示さない画分を得ることが重要である。前述のバラズスの特許は、炎症活性がないヒアルロン酸画分を得るためには、平均分子量がもっぱら７５０，０００以上の画分だけを使用しなければならないことを教示している。このように、バラズスは炎症活性の理由から有用でないとして、平均分子量７５０，０００以下の画分を破棄している。バラズスの教示に反して、本出願方法はバラズスにより平均分子量７５０，０００以下の画分に帰せられた炎症活性が、実は平均分子量３０，０００以下の不純物に由来していることを発見した。従って本発明は、化学的方法に引続き、分子量３０，０００以下の炎症性画分を除去し得る一連の分子濾過技術からなる方法を提供する。
　【００１２】
　本発明方法によって、特殊な出発材料から入手し得る総ヒアルロン酸に対し、両者を併わせ約８０％の総収率に達する炎症活性のない有用なヒアルロン酸画分を得ることが可能である。この８０％の収率で入手し得るヒアルロン酸画分は、ヒアレクチン画分とヒアラスチン画分の双方を含んでいる平均分子量約２５０，０００〜約３５０，０００の混合画分からなる。更に限定すれば、ヒアレクチン画分は原料組織から入手し得るＨＡの約３０％の収率で得られ、またヒアラクチン画分は入手し得るＨＡの約５０％の収率で得らる。この要素は、前述のバラズスの特許方法に対し、利用し得るヒアルロン酸の薬学的に有用な量を有意に増大させることを発見した本発明の重要な改良点である。平均分子量７５０，０００以上の画分だけを利用するバラズスの特許方法では、動物臓器から利用し得るもとのヒアルロン酸の僅かに約１０％だけの収率しか得られず、利用し得るヒアルロン酸の約９０％は破棄される。このように本発明によって、総ヒアルロン酸抽出物の利用度は著しく高められた。
　【００１３】
　ヒアルロン酸の各種画分の抽出は相対的収率の比較を表１に示す。
　【表１】
　【００１４】
　添付した図１は、本出願方法で確認された各種のＨＡ画分を図式的に示したものである。図１の釣鐘型の曲線は、原料組織から入手し得るＨＡ画分の分布の概略を表している。図１の「Ｂ」領域は、バラズス（米国特許第４，１４１，９７３号）によって確認された薬学的に有用なＨＡ画分を表す。Ａ区分は平均分子量３０，０００以下の炎症性画分であり、Ｉ領域はヒアラスチン画分であり、ＩＩ領域はヒアレクチン画分である。このグラフから、バラズスの方法は平均分子量７５０，０００以下のＨＡ画分を除去することによって利用し得るＨＡ抽出画分の大部分を破棄していることが判る。これに対し、発明では平均分子量が３０，０００以下の低分子量のヒアルロン酸が炎症活性を生じることを、予かじめ研究者らがＨＡの種々の抽出物について着目していたので、入手し得るＨＡの大部分が薬学的に利用できた。
　【００１５】
　本発明者は、特別な治療適応により開示した発明技術に従って分離すれば、入手し得る大部分のＨＡが、実際治療目的に利用できることを発見した。バラズスの特許は入手し得るＨＡの約１０％だけの応用を特定して開示しているが、本発明では創傷治癒の適用に対しヒアラスチン画分の形で、または眼内適用または関節内適用に対しヒアレクチン画分の形で、或いは、創傷治癒の適用に使用できるヒアラスチン画分とヒアレクチン画分を合わせた形で、入手し得るＨＡの約８０％を利用できる。
　【００１６】
　確認された画分の化学的および物理的性質を、本発明で調査し、これらの諸性質を表２にまとめた。
　【００１７】
　【表２】
　【００１８】
製造方法
実施例１：炎症活性のないヒアラスチンとヒアレクチン混合物の製造方法
　新しい、または冷凍した雌鶏のとさか（３０００ｇ）をひき肉器にかけてミンチにひき、次に機械的ホモジナイザーで注意深くホモジネートする。得られたペーストを１０容量の無水アセトンと共に、ステンレススチール製容器ＡＩＳＩ３１６またはガラス製容器に入れる。次いで全内容物を、５０ｇ／分の速度で６時間撹拌した後、１２時間静置して分離し、アセトンをサイフォンで除いて棄てる。
　この抽出操作を、破棄する。アセトンが正しい湿度水準に達するまで（カール・フィッシャー法）反復する。
　得られた物質を次に遠心し、好適な温度で５〜８時間真空乾燥する。この操作により、雌鶏のとさかから約５００〜６００ｇの乾燥粉末が得られる。
　【００１９】
　次に、この乾燥粉末３００ｇを、適量の塩酸システインの存在下にリン酸バッファー緩衝水性媒質中で、パパイン（０．２ｇ）により酵素的に消化させる。次いで、この混合液を６０〜６５℃の一定温度で２４時間、６０ｇ／分の速さで撹拌する。この全量にセライト６０ｇを加えて冷却し、なお１時間撹拌を持続する。
　得られた混合物は、透明な濾液が得られるまで濾過する。次にこの透明な濾液を、分子量の最大端（排出限界）が３０，０００であるメンブランを用いて限外濾過し、分子量３０，０００以上の分子をメンブラン上に補足する。原液の５〜６倍量を限外濾過し、同時に絶えず生成物に蒸留水を加える。蒸留水を加えて懸濁させ、原容量の１／３となるまで生成物を限外濾過する。
　残った液体に、０．１モルになるよう塩化ナトリウムを加え、温度を５０℃に上昇させる。生成物を６０ｇ／分で撹拌しつつ、セチルピリジニウムクロリド４５ｇを加える。この混合液を６０分間撹拌した後、セライト５０ｇを加える。撹拌しつつ生成物の温度を２５℃まで下げ、生成する沈澱を遠心して採取する。このようにして得られた沈澱を、セチルピリジニウムクロリド０．０５％を含有する塩化ナトリウムの０．０１モル溶液（５リットル）に懸濁させる。この懸濁液をさらに５０℃で６０分間撹拌する。温度を２５℃に下げ、沈澱を遠心して採取する。
　【００２０】
　次に、洗浄操作を３回反復し、最後に沈澱物を集めて、セチルピリジニウムクロリド０．０５％を含有する塩化ナトリウムの０．０５モル溶液を加えた容器に入れる。これを６０ｇ／分で６０分間撹拌し、内容物を２５℃の一定温度で２時間放置する。上清を遠沈によって除去する。
　この操作を、０．０５％のセチルピリジニウムクロリドを含有する塩化ナトリウムの０．１モル溶液を用いて、数回反復する。混合物を遠心し、上清を棄てる。沈澱を０．０５％のセチルピリジニウムクロリドを含有する塩化ナトリウムの０．３０モル溶液（３リットル）に分散させる。混合物を撹拌し、沈澱と透明な液の双方を採取する。沈澱はさらに３回、それぞれ前述の溶液０．５リットルを用いて抽出を繰り返す。
　【００２１】
　最後に残った沈澱を除去し、透明な抽出液を１個の容器にまとめる。撹拌しつつ溶液の温度を５０℃に上昇させる。次に溶液に塩化ナトリウムを０．２３モルとなるよう添加する。さらにセチルピリジニウムクロリド１ｇを加え、１２時間撹拌を続ける。混合液を２５℃に冷却し、最初はセライト充填物、次いでフィルター（１μ）を通して濾過する。
　得られた混合液を、次に分子量の最大端（排出限界）３０，０００のメンブランを用い、塩化ナトリウムの０．３３モル溶液を加えて原容量の３倍とし、分子限外濾過を行う。塩化ナトリウム溶液の添加を中止し、液量はもとの容量の１／４まで減少する。
　【００２２】
　このようにして濃縮した溶液は、２５℃で撹拌（６０ｇ／分）しつつ、エタノール（９５％）の３倍量を加えて沈澱させる。沈澱を遠心により採取し、上清は棄てる。沈澱は０．１モルの塩化ナトリウム溶液１リットルに溶解し、９５％エタノールの３倍量を用いて沈澱操作を反復する。
　沈澱を集めて、最初は７５％エタノール（３回）、次に無水エタノール（３回）、最後に無水アセトン（３回）で洗浄する。
　このようにして得られた生成物（ヒアラスチン＋ヒアレクチン画分）は、２５０，０００〜３５０，０００の平均分子量を有する。
　ヒアルロン酸の収率は、もとの新しい組織の０．６％に相当する。
　【００２３】
実施例２：実施例１に記載した方法により得られた混合物からヒアラスチン画分を製造する方法
　実施例１に記載した方法により得られた混合物を、発熱物質を含有しない蒸留水に、生成物１０ｍｇに対し水１ｍｌの割合いで溶解する。このようにして得られた溶液を、分子量の最大端（排出限界）が２００，０００のメンブランを用い、メンブラン上に水を加えることなく濃縮手枝を用いて、分子限外濾過に掛ける。分子量の最大端が２００，０００のメンブランを通して限外濾過の操作を行うことにより、分子量が２００，０００以上の分子は通過しないが、一方、それより小さい分子は水と共に膜を通過しない。濾過操作中は膜の上方部分に水を加えないので、この部分の容量は減少すると共に、分子量が２００，０００以上の分子の濃度は高まる。２回蒸留した発熱物質を含有しない蒸留水の２倍量を加え、容量が１／３となるまで溶液を再度限外濾過に掛ける。この操作をさらに２回反復する。
　膜を通過した溶液に塩化ナトリウムを加えて１．０モルとし、次に９５％エタノールの４倍量を加えて沈澱させる。沈澱は７５％エタノールで３回洗浄し、真空乾燥する。
　このようにして得られた生成物（ヒアラスチン画分）は５０，０００〜１００，０００の平均分子量を有する。
　ヒアルロン酸収率は、もとの新しい組織の０．４％に相当する。
　【００２４】
実施例３：　ヒアレクチン画分の製造方法
　実施例２に記載した分子量の最大端が２００，０００の限外濾過メンブランから容器中に集められた濃縮物を、グルクロン酸を測定する容量分析で、ヒアルロン酸濃度が５ｍｇ／ｍｌの溶液となるまで水で希釈する。
　溶液に塩化ナトリウムを加えて０．１モルに調製し、９５％エタノールの４倍量を加えて沈澱させる。沈澱を７５％エタノールで３回洗浄し、真空乾燥する。
　このようにして得られた生成物（ヒアレクチン画分）は５００，０００〜７３０，０００の平均分子量を有する。これは、高純度の約２，５００〜３，５００サッカライド単位の分子鎖長と規定される特定のヒアルロン酸画分に相当する。
　ヒアルロン酸収率は、もとの新しい組織の０．２％に相当する。
　【００２５】
　【効果】
生物学的および薬学的活性の評価
１．ヒアルロン酸の各画分の生物学的細胞可動化活性
　ＨＡ画分の細胞可動化活性を評価する方法として、培養における線維芽細胞の解離能を測定することからなる方法を使用した。
　マウスＢＡＬＢ３Ｔ３細胞を、１０％ウシ血清、ペニシリン（２５０単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ修飾のイーグル培地に発育させ、５％ＣＯ２、９５％空気中で加湿しながら３７℃でインキュベートした。実験のために、細胞は常に６０ｍｍ直径のプラスチック製組織培養皿に接種（６×１０５細胞／皿）された。
　３Ｔ３細胞の全面（集密的細胞）単層を傾瀉し、新たにＨＡの各種分画のそれぞれ２．０ｍｇ／ｍｌを含有する媒質を加えた。一定時間後に、細胞解離の状態を顕微鏡的、並びにコールターカウンターで運動している細胞数を数えることの両者により観察した。
　解離測定：解離速度を測定するため、細胞をプラスック皿に接否し、２４時間発育させた。この時点で培地を傾瀉して除き、新たに２．０ｍｇ／ｍｌのＨＡを含有する媒質を加えた。それぞれ１枚づつの試験培養と対照培養からなる２枚の皿を、２４時間毎に傾瀉し、上清中にある細胞と付着している細胞とをコールターカウンターでカウントした。
　表３に、先の実施例１〜３で得られた各画分を用いて試験した成績を示した。
　【００２６】
　【表３】
　【００２７】
　表３に報告した成績から、ヒアラスチン画分は高い細胞可動化活性を有し、この画分が創傷治癒適用に有用であることが判る。このヒアラスチンの細胞可動化活性から、この画分の薬学的製剤を障害された組織部位に適用すれば、新生細胞の移動と増殖を盛んにすることになると考えられる。
　これに対して、ヒアレクチン画分は細胞可動化活性が非常に小さく、従って創傷には有用でないと推定される。然し、ヒアレクチンは平均分子量が高く、内部粘度（ｉｎｈｅｒｅｎｔ　ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）も高いので、眼内注射および関節内注射用として有用であり、細胞可動化活性が欠除していることは、特に眼内注射および関節内注射にヒアレクチン画分を有用にする、却って重要な特性となっている。
　【００２８】
ヒアルロン酸各画分の走化性
１．−２
材料および方法
　ヒト血液ＰＭＮ（多核形白血球）はドリスＲ．等の「ラット好中か顆粒球に対するヒアルロン酸およびその可溶性エステル類による走化性作用」（バイオマテリアルズ）（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）に投稿）に記載の方法に従い使用する。
　約７５０，０００ダルトンの分子量を持つヒアルロン酸の熱分解により、ヒアルロン酸の各画分を調製する。
　得られた試料の分子量を下記の表に示す。
　【００２９】
　【表４】
　【００３０】
　ヒアルロン酸のイン・ビトロでの走化性活性は、先行技術のボイデンチャンバー改良型を用いて求められた。この方法では、標準条件（３７℃で１時間インキュベーション）で、フィルター下に通過した溶液とフィルター上に残った細胞の間の勾配の関数により、３μｍの穴をもつミリポールＲ・フィルター内の細胞の通過を測定する。
　【００３１】
　細胞の走化性活性は「走化性指数」（Ｃ．Ｉ．＝Ｃ／Ｒ×１００）によって測定する。このパラメーターは、走化性物質の存在する場合でのフィルター（μｍ）内のＰＭＮの細胞移動（Ｃ）と走化性物質がない場合の細胞移動（Ｒ＝無秩序移動）との比率×１００により得られる。
　【００３２】
　負の対照は、緩衝液ＢＳＳ／ＢＳＡであり、ＦＭＬＰ（Ｎ−ｆｏｍｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）１０−７Ｍ溶液であった。
　ヒアルロン酸の各画分を３種の異なる濃度、１０−４、１０−２、１ｍｇ／ｍｌで試験した（ジグモンド、Ｓ．Ｈおよびヒルシュ　Ｊ．Ｇ．、白血球移動および走化性、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ）、（１９７３年）、１７３巻、３７８−４１０頁）。
　【００３３】
結果
　結果は、ヒアルロン酸の走化性が分子量および濃度に依存していることを示している（下記表）。
　【００３４】
　【表５】
　特に低分子量画分は、正の走化性（細胞移動の増大）を示し、一方、高分子量画分は、走化性を低減する。正傾向と負傾向の間の変移点は、分子量約３５０，０００の画分付近にある（図２参照）。
　【００３５】
　結論として、ヒアルロン酸が、分子量および濃度に依存し、炎症領域内での炎症性細胞の回復を調節できるということが認められ得る。すなわち、炎症性細胞の回復が、低分子量では増強され、高分子量では低減される。ヒアルロン酸のこの調節活性は、異なる症状でのヒアルロン酸の各画分の臨床的使用を正当化するものである。実際、正の走化性は白血球による菌の貧食過程で要求され、一方、走化性の遮断または低減は抗炎症作用を示し、骨関節症のような炎症性疾患の処置におけるヒアルロン酸の使用が要求され、炎症を抑制する。
　２５０，０００から３５０，０００ダルトンのヒアルロン酸画分は非常に低い走化性活性をもつと示されているが、画分の濃度を調節することにより、正か、または負かを調節できることは事実である。この方法では、骨関節症または炎症性疾患の制御の両方に対し、種々の濃度で、この画分を用いることが可能である。
　【００３６】
２．ヒアルロン酸の各画分の炎症活性
　この評価には、家兎における眼内投与後の侵襲細胞をカウントする方法を使用する。
方法
　体重２ｋｇの、視覚に異常のないことを確かめたニュージーランド系またはカリホルニア系家兎５羽を、この試験に使用する。家兎の眼の外側の炎症性の経過は肉眼的に、また内側は検眼鏡を用いて検査する。眼底が明瞭に見え、正常であれば、試験を実施する。
　選ばれた動物は、適宜滅菌した眼科用局所麻酔薬を数滴下して局所麻酔を施す。眼科用アトロピン溶液の数滴を同時に滴下する。
　【００３７】
　試験は無菌条件下に実施する。眼球を圧迫して突出させ、２６ゲージ針を用い縁から約５〜６ｍｍの鞏膜を通してガラス体腔の中心に１００μｌの溶液を注射する。もう一つの眼を対照とする。処置後、抗生物質溶液を２滴滴下した後、動物をそれぞれ単独ケージに収容する。
　５０〜６０時間後、さらに試験を続行する。両眼を、前述の動物を選出した方法と同様にして検査する。ぺントバルビタールを静注して、動物を屠殺する。まず最初に、２６ゲージ針のインスリンシリンジを用いて、眼房水（約０．２ｍｌ）を採取する。次に、眼球を摘出し、すべての異物を除去し、生理食塩液で洗浄し、ビルバララス紙（ｂｉｌｂｕｌｏｕｓ　ｐａｐｅｒ）で乾かし、切開して内容物をペトリ皿にあけ、ガラス体の主要部分を分離し、それを滅菌シリンジで採取する（約０．７ｍｌ）。ガラス体はポリエチレン製の小試験管に採り、５０μｌのヒアルロニダーゼ（１００ｕＮＦ／ｍｌ）を添加する。混合物の粘度を低下させるため、約３時間、３７℃の温度に保つ。
　【００３８】
　顕微鏡下に位相差法（１２０×）により、白血球数をビュルケル計算板でカウントする。各検体毎に一連の計算値を記録し、平均値を算出し、結果を白血球／ｍｍ３として表す。
　その結果、
１）眼になんらの障害の徴候が認められず、
２）処理した５眼のうち、少なくとも４眼で平均白血球数が２００／ｍｍ３）を超えず、各対照眼において平均白血球数が５０／ｍｍ３を超えない時、
試験は陽性と判断する。
　表６に、前述の実施例１〜３で得られたＨＡの各画分をこの評価に用いて、得られた結果を示す。
　【００３９】
　【表６】
　【００４０】
表６に示した成績から、ヒアラスチンおよびヒアレクチンの各画分の炎症活性は対照より低く、またヒアラスチンとヒアラクチンの両者を含有する画分が示した炎症活性の増加は対照に比べて無視し得る程度に過ぎないことが明らかにされた。従って、ヒアラスチン画分およびヒアレクチン画分は、好ましからぬ副作用がなく薬学的に有用である。さらにこれらの結果は、ＨＡ製剤の炎症活性の原因が、約３０，０００以下の平均分子量を有するＨＡ画分にあるとする本発明を裏付けるものである。スワンの文献（Ｓｗａｎ　Ｄ．Ａ．，１９６８，Ｂ．Ｂ．Ａ．１５６，１７〜２９）に記載された方法に従い、雄鶏のとさかから調製したヒアルロン酸は著しい炎症活性を示す。
　【００４１】
　このようにして、平均分子量が約５０，０００〜１００，０００のヒアラスチン画分は高い細胞可動化活性を有し、従って、不快な炎症反応を示すことなく創傷治癒適応に有用であることが明らかになった。平均分子量が約５００，０００〜７３０，０００であるヒアレクチンは、その高い分子量と内部粘度の故に、眼内注射および関節内注射に有用であることが示され、同時にこれらの薬学的適用では回避すべき不快な副作用である細胞可動化活性または炎症反応に亢進しなかった。
　【００４２】
　より明確に述べれば、ヒアラスチン画分は次の特性により、創傷治癒剤として有用であることが見出された。
　１．その製剤によって、通常の治療と比べ、障害部位の急速な清浄化、潰瘍辺縁の正常化、盛んな肉芽組織の形成、マクロファージおよび線維芽細胞の細胞遊走の活性化、および急速な上皮形成を伴う治癒時間の急速な短縮を促進される。
　２．その製剤によって、重症例における再生手術に対する順応の増加が促進される。
　３．瘢痕化組織を最後に仕上げして美容上および機能的に良好な結果を得ることにより、ケロイドまたは退縮製の瘢痕形成を残さないこと。
　【００４３】
　ヒアラスチン製剤は、褥瘡傷（床ずれ）、栄養性潰瘍、火傷、無痛性潰瘍、外傷後潰瘍、静脈および静脈炎後の静脈血腫による潰瘍、皮膚病巣、皮膚移植および単純ヘルペスに由来する皮膚病変を含む種々の傷の処置に有用であることが明らかにされた。これらの創傷治療の処置に、ヒアラスチン製剤、またはそのナトリウム塩はガーゼパッド、クリーム、スプレイまたは皮内注射用注射剤のような種々の方法により投与できる。クリームやガーゼパッドに用いる局所適用には、ヒアラスチンは、露出している部分から出る滲出物を吸収し、同時にヒアルロン酸を効果的に拡散させる乳化剤、および傷の包帯の除去を容易にさせるための水に拡散性の賦形薬と組合せることが望ましい。
　【００４４】
　ヒアレクチン画分は馬の治療、特に競争馬の関節障害、および急性または慢性の外傷、感染または副腎皮質ステロイドの反復した関節内注射に起因する疾患の治療に有用であることが見出された。特にヒアレクチンで治療し得る障害を例示すると、炎症症状を伴う、または無症状の骨関節症、急性または慢性の滑膜炎、関節軟骨の変性過程、および乾性の関節疾患である。これらの疾患に最も良く見受けられる徴候は一般に、疼痛、関節の機能不全、および関節の屈伸性の減退である。本発明のヒアレクチン画分は、通常の治療に比べ、そのような障害馬に対して関節機能の急速で、しかも持続する改善を早め、また疼痛および破行を軽減して治癒期間を著しく短縮するのに効果があることが判明した。これらの臨床的に好ましい効果は、滑液の粘弾性を回復し、関節軟骨における組織修復過程を賦活化することにより促進されるものと考えられる。
　その上、上記の好ましい効果は、すべてヒアレクチン画分が局所的および／または全身的に毒性作用を伴うことからさらに増強される。ヒアレクチンを反復して投与しても、アレルギー反応、および何らの有害性または残存性の影響をも生じない。
　【００４５】
薬学的製剤
　前記の知見から、ヒアラスチン画分およびヒアレクチン画分は薬学的適用に良好な活性を有することが明らかにされた。次に示す製剤例は、ＨＡ画分を実際に生体（インビボ）へ投与する場合に可能な薬学的製剤を、単に例示的に記載する目的で提供するものである。
　【００４６】
Ａ．創傷治癒用製剤
　【表７】
製剤例１：皮内注射用注射剤。１アンプル中：
　　　　　ヒアラスチンナトリウム塩　　　　　　　　　　　　　２ｍｇ
　　　　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１６ｍｇ
　　　　　注射用精製水　　適量を加えて２ｍｌとする。
製剤例２：皮内注射用注射剤。１アンプル中：
　　　　　ヒアラスチンカリウム塩　　　　　　　　　　　　　　５ｍｇ
　　　　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　８ｍｇ
　　　　　注射用精製水　　適量を加えて１ｍｌとする。
製剤例３：局所適用用スプレー。　１瓶中：
　　　　　ヒアラスチンナトリウム塩　　　　　　　　　　　　２０ｍｇ
　　　　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　８０ｍｇ
　　　　　注射用精製水　　適量を加えて１０ｍｌとする。
製剤例４：局所適用用スプレー。１瓶中：
　　　　　ヒアラスチンカリウム塩　　　　　　　　　　　　　３０ｍｇ
　　　　　マンニット　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
　　　　　注射用精製水　　適量を加えて１０ｍｌとする。
製剤例５：局所適用用クリーム。１チューブ中：
　　　　　ヒアラスチンカリウム塩　　　　　　　　　　　　　２５ｍｇ
　　　　　ポリエチレングリコールー
　　　　　モノステアレート４００　　　　　　　　　　　１０００ｍｇ
　　　　　セチオール（オレイン酸
デシルエステル）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５００ｍｇ
　　　　　ラネッテＳＸ（セチルステアーリルアル
コール＋ラウリル硫酸塩９：１）　　　　　　　　　　　　　１５０ｍｇ
　　　　　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　２００ｍｇ
　　　　　ソルビット　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０ｍｇ
　　　　　デヒドロ酢酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
　　　　　ｐ−オキシメチルベンゾエート　　　　　　　　　７．５ｍｇ
　　　　　ｐ−オキシプロピルベンゾエート　　　　　　　　　　５ｍｇ
　　　　　再蒸留水　　適量を加えて１０ｇとする。
製剤例６：局所適用用クリーム。１チューブ中：
　　　　　ヒアラスチンナトリウム塩　　　　　　　　　　　　３０ｍｇ
　　　　　パラフィンゼリー　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｍｇ
　　　　　ポリエチレングリコールー
　　　　　モノステアレート４００　　　　　　　　　　　１０００ｍｇ
　　　　　セチオール（オレフィン酸
デシルエステル）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５００ｍｇ
　　　　　ラネッテＳＸ（セチルステアリルーアル
コール＋ラウリル硫酸塩９：１）　　　　　　　　　　　　　１５０ｍｇ
　　　　　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　２００ｍｇ
　　　　　ソルビット　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０ｍｇ
　　　　　デヒドロ酢酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
　　　　　ｐ−オキシメチルベンゾエート　　　　　　　　　７．５ｍｇ
　　　　　Ｐ−オキシプロピルベンゾエート　　　　　　　　　　５ｍｇ
　　　　　再蒸留水　　適量を加えて１０ｇとする。
製剤例７：医薬用ガーゼパット（局所適用）。
　　　　　１パット中（１０×１０ｃｍ）：
　　　　　ヒアラスチンナトリウム塩　　　　　　　　　　　　　３ｍｇ
　　　　　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｇ
　　　　　ポリエチレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ
　　　　　再蒸留水　　適量を加えて３ｇとする。
製剤例８：医療用ガーゼパット（局所適用）。
　　　　　１パット中（１５×１５ｃｍ）：
　　　　　ヒアラスチンカリウム塩　　　　　　　　　　　　　　６ｍｇ
　　　　　パラフィンゼリー　　　　　　　　　　　　　　　０．５ｍｇ
　　　　　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｇ
　　　　　ポリエチレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ
再蒸留水　　適量を加えて３ｇとする。
製剤例９：創傷治癒用乾燥粉末、乾燥粉末１ｇ中：
　　　　　ヒアラスチンナトリウム塩　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
　　　　　マンニット　　　　　　　　　　　　　　　　　０．７５ｍｇ
　　　　　グリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２４ｍｇ
Ｂ．眼内適用製剤
製剤例１０：１ｍｌバイアル。１バイアル中：
　　　　　　ヒアレクチンナトリウム塩　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
　　　　　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　８ｍｇ
　　　　　　一塩基リン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　　　　０．２５ｍｇ
　　　　　　二塩基リン酸ナトリウム・１２Ｈ２Ｏ　　　　　　　３ｍｇ
　　　　　　注射用精製水　　適量を加えて１ｍｌとする。
製剤例１１：５ｍｌバイアル。１バイアル中：
　　　　　　ヒアレクチンカリウム塩　　　　　　　　　　　　６０ｍｇ
　　　　　　マンニット　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
　　　　　　一塩基リン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　　　　１．２５ｍｇ
　　　　　　二塩基リン酸ナトリウム・１２Ｈ２Ｏ　　　　　　１５ｍｇ
　　　　　　注射用精製水適量を加えて５ｍｌとする。
製剤例１２：シリンジ製剤。１シリンジ中：
ヒ　　　　　アレクチンナトリウム塩　　　　　　　　　　　　４０ｍｇ
　　　　　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　１６ｍｇ
　　　　　一塩基リン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　０．８ｍｇ
　　　　　二塩基リン酸ナトリウム・１２Ｈ２Ｏ　　　　　８．１６ｍｇ
注射用精製水適量を加えて２ｍｌとする。
Ｃ．関節内適用製剤
製剤例１３：２ｍｌバイアル。１バイアル中：
　　　　　　ヒアレクチンナトリウム　　　　　　　　　　　　４０ｍｇ
　　　　　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　１６ｍｇ
　　　　　　注射用精製水　　適量を加えて２ｍｌとする。
製剤例１４：４ｍｌバイアル。１バイアル中：
　　　　　　ヒアレクチンカリウム塩　　　　　　　　　　　　６０ｍｇ
　　　　　　マンニット　　　　　　　　　　　　　　　　　　３５ｍｇ
　　　　　　グリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
　　　　　　注射用精製水　　適量を加えて４ｍｌとする。
製剤例１５：シリンジ製剤。１シリンジ中：
　　　　　　ヒアレクチンナトリウム塩　　　　　　　　　　　２５ｍｇ
　　　　　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　１２ｍｇ
　　　　　　マンニット　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
　　　　　　一塩基リン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　　　　　０．５ｍｇ
　　　　　　二塩基リン酸ナトリウム・１２Ｈ２Ｏ　　　　　　　６ｍｇ
　　　　　　注射用精製水　　適量を加えて２ｍｌとする。
　【００４７】
　上記の製剤は指示的目的を以て記載されたものであり、本発明者によって発見されたヒアラスチン画分およびヒアレクチン画分、またはそのカリウム塩またはナトリウム塩を、薬学的に許容し得るその他の基剤、希釈剤、または賦形薬と組合わせることにより、また特定の使用に応じて種々の投与量製剤として、その他の薬学的製剤を調製できることも、当然類推できる。
　【００４８】
　創傷治癒に適用するために、ヒアラスチン画分の製剤は、前述したクリーム、スプレー、ガーゼパット、乾燥粉末、または皮内注射のような投与形式のいずれか一つの形で、皮膚の損傷部位に適用される。
　【００４９】
　関節内に適用するためには、ヒアレクチン製剤は、前述したバイアル製剤またはシリンジに予製した製剤のいずれかから、一般に関節に対して１投与量２ｍ１の割合で投与される。
　【００５０】
　さらにヒアクロン酸は、種々の分子の担体として使用でき、効果的であることが研究され、特に角膜表皮に対する耐容性と適合性（即ち、感作現象を起こさない）が完全に保証され、眼科用薬基剤として使用される。ヒアルロン酸は眼科用基剤として特に興味深いものと考えられる。前述のように、ＨＡは種々の結合組織および生物学的液体（例えば滑液、および特にガラス体）に存在するグリコサミノグリカンであって、その化学的および物理学的性質、特にその著しい弾粘性により、組織における基本的に重要な構造上の生物学的な役割を果たしている。
　【００５１】
　このような理由から、種々の分子量のＨＡ画分、特にヒアラスチン画分とヒアレクチン画分、およびそれらの混合画分を、点眼剤、ゲル、クリーム、挿入剤、または乾燥粉末のような種々の製剤剤型に調製する応用について研究を行った。特に、各種の眼科用薬の基剤として、この生物的的ポリマーの種々の画分を積極的に利用すべく広汎な知識を得るため検討した。
　【００５２】
　以下に報告する実験は、ヒアルロン酸を賦形薬として含有する製剤が、それらに調合されている主薬の生物学的利用能（バイオアベイラビリティー）を高めるかどうか、また主薬と組合わせることによって相乗効果を生じるかどうかを、特に眼科領域における活性、若しくは有用性を有する薬物について検討することを目的としている。
　【００５３】
　ＨＡの基剤として重要なこれらの活性は、家兎の眼を用い、種類と薬効の異なる４種の眼科用薬、特にピロカルピン、トリアムシノロン、表皮成長促進因子（ＥＧＦ）およびストレプトマイシンおよびゲンタマイシンのような抗生物質を用いて検討した。これらの薬物はすべて縮瞳作用、抗炎症作用、治癒作用および抗微生物作用を有することが知られている。なかでも、ヒアルロン酸を基剤とする抗生物質ストレプトマイシンの活性評価は、この薬剤が眼科領域の感染症に最も広範囲に使用されている抗生物質の一つである理由から非常に重要である。‘
　【００５４】
　研究した実験モデルおよび行った実験を示す。
　１）ヒアルロン酸を基剤とした硝酸ピロカルピンの家兎の眼における縮瞳活性。
　２）デキストランにより起こした家兎の眼の実験的炎症に対する、ヒアルロン酸を基剤としたトリアムシノロンの抗炎症活性。
　３）家兎の角膜表皮の実験的損傷に対するヒアルロン酸を基剤とした表皮成長促進因子（ＥＧＦ）の治癒活性。
　４）ヒアルロン酸を基剤としたストレプトマイシンの、寒天培地中におけるバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）６６３３に対する抗菌活性。
　【００５５】
Ｉ．ヒアルロン酸を基剤とした硝酸ピロカルピンの縮瞳活性材料
　種々の硝酸ピロカルピン製剤の賦形薬として、次の材料を使用した。
　ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアラスチン画分（分子量約１００，０００）、濃度１０ｍｇ／ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌ；
　ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチン画分（分子量約５００，０００〜７３０，０００）、濃度１０ｍｇ／ｍ１および２０ｍｇ／ｍｌ；
　眼科用賦形薬の対照として、５％ポリビニルアルコール。
　種々の、硝酸ピロカルピンの２％製剤（点眼薬またはゲル）を、２種類の異なるＨＡナトリウム塩の１０ｍｇ／ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌ濃度を基剤として調製した。
　【００５６】
　次の溶液を調製した。
製剤１−硝酸ピロカルピン（ＰｉＮＯ３）（２％）生理食塩液溶液（対照）。
製剤２−ＰｉＮＯ３（２％）の５％ポリビニルアルコール溶液（対照）。
製剤３−ＰｉＮＯ３（２％）のヒアラスチン画分ナトリウム塩（１０ｍｇ／ｍｌ）溶液。
製剤４−ＰｉＮＯ３（２％）のヒアラスチン画分ナトリウム塩（２０ｍｇ／ｍｌ）溶液。
製剤５−ＰｉＮＯ３（２％）のヒアレクチン画分ナトリウム塩（１０ｍｇ／ｍｌ）溶液。
製剤６−ＰｉＮＯ３（２％）のヒアレクチン画分ナトリウム塩（２０ｍｇ／ｍ１）溶液。
　【００５７】
方法
　白色ニュージーランド系家兎（２〜２．５ｋｇ）を使用した。試験する製剤をマイクロシリンジ（１０リットル）で１眼に滴下し、他の１眼を対照とした。瞳孔の直径を、適宜時間をおき全例について測定した。各溶液はそれぞれ最低８羽の家兎で試験した。各眼の処置は３回を超えることなく、各処置毎の間に最低１週間の休薬期間を置いて観察した。
　【００５８】
測定パラメーター
　瞳孔の直径は、時間による縮瞳活性曲線を画くため、種々の間隔を置いて測定した。次の活性パラメーターは、縮瞳／時間グラフに基づいて計算した：
Ｉｍａｘ＝処置眼と対照眼の瞳孔直径の最大差。
ピーク時間＝Ｉｍａｘに達するまでの時間。
持続時間＝基準条件に回復するまでに要する時間。
プラトー＝絶対縮瞳活性期。
ＡＵＣ＝縮瞳／時間曲線下の面積。
　【００５９】
結果
　試験結果を表８に示す。試験したすべての溶液の、瞳孔活性／時間曲線から決定された種々のパラメーターの成績から、２％硝酸ピロカルピン溶液にヒアルロン酸を加えると、薬物の縮瞳活性の増加が上昇することが判る。事実、２％硝酸ピロカルピン水溶液（製剤１）に比べて、薬物のバイオアベイラビリティーは２．７倍にまで達する。
　また、ヒアルロン酸のヒアレクチン画分を基剤として使用した場合、１０ｍｇ／ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌ（製剤５、６）の両者とも、ポリビニルアルコールを基剤とした硝酸ピロカルピン溶液（製剤２）と比較して統計的に有意な増加が見られることは注目すべきである。
　ヒアルロン酸を硝酸ピロカルピンの基剤として使用すると、ピロカルピンの縮活性が一層長く持続することから、ヒアルロン酸を基剤として利用することは特に興味深い。即ち、瞳孔の直径が基準条件に回復するまでに要する時間は、ピロカルピンの生理食塩液単独溶液（製剤１）で１１０分であるのに比べ、ヒアルロン酸を含有する製剤（製剤６）では１９０分まで延長される。
　【００６０】
　【表８】
　【００６１】
ＩＩ．ヒアルロン酸を基剤としたトリアムシノロンの抗炎症活性
材料
　次の検体を使用した：
　ヒアルロン酸ナトリウム塩−ヒアレクチン画分（分子量５００，０００〜７３０，０００）の生理食塩液溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）。
　トリアムシノロンの１０％溶液（生理食塩液）。
　【００６２】
方法
　ニュージーランド系雄性家兎（平均体重１．６ｋｇ）で実験を行った。５日間の予備飼育期間後、デキストラン（１０％、０．１ｍｌ）を眼内注射し、家兎の眼内炎症を起こさせた。両眼とも４％ノベシーナ（商標、Ｎｏｖｅｓｉｎａ）で局所麻酔し、前眼房の角膜縁から２ｍｍの位置にシリンジの針を４ｍｍまで挿入し、投与した。試験は１０羽で行った。
　【００６３】
処置
　各動物とも、右眼および左眼に次の液を１日３回、１回３滴づつ滴下し、全例６日間処置した。
左眼（ＬＥ）：１０％トリアムシノロン溶液（生理食塩液）。
右眼（ＲＥ）：ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）＋トリアムシノロン（１０％）。
　【００６４】
評価方法
　デキストランにより生じた炎症反応に対する抗炎症効果を、デキストラン投与前、１、３、２４、４８時間、３日、４日、５日および６日目にスリット光源を用いて眼を観察して評価した。
　各観察時、眼の検査は次の所見によって評価した：
　角膜および結膜に見られる充血、浮腫の有無、特に通常、炎症性薬剤の眼内注射後の炎症経過に敏感な虹彩の所見。
　濃い、または淡い混濁（片雲）が見られるチンダル効果は、前眼房に微粒子体が存在する（炎症）ことを示している。
　観察結果は、効果の段階的評価法により主観的に採点（０〜１）して表した。
　【００６５】
結果
　表９に示した結果から、トリアムシノロンの投与は虹彩に対し抗炎症効果を示し、前眼房の混濁（チンダル効果）が消失することが判る。炎症の経過は１〜３時間目から３〜４日間までの間が著しく、その後、徐々に軽快して、６日目までには殆ど常態に回復し、眼は完全に清澄となる。これに対して、ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチン画分、をトリアムシノロンと一緒に投与すると、上述のトリアムシノロンの単独投与に比較して眼内炎症の期間が短縮される。即ち、虹彩の炎症経過と前眼房の混濁は２４時間までに減少傾向が見られ、４８時間目にはかなり軽快し、４日目以後、炎症反応は完全に消失する。
　結膜および角膜は、デキストランの眼内注射後も殆ど注意すべき反応は観察されなかった。
　【００６６】
　以上のように、トリアムシノロンをヒアルロン酸画分と共に投与すると、家兎の眼の急速な回復が見られ薬物の活性が高められる結果を得た。
　【００６７】
　【表９】
　【００６８】
ＩＩＩ．ヒアルロン酸を基剤とするＥＧＦの創傷治癒活性材料
材料
　次の材料を使用した。
　製剤Ａ−ＥＧＦ（表皮成長促進因子）、生理食塩液に溶解（０．５ｍｇ／５ｍｌ）。
　製剤Ｂ−ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアラスチン（分子量、約１００，０００）、生理食塩液に溶解（１０ｍｇ／ｍｌ）。
　【００６９】
方法
　雄性白色ニュージーランド系家兎（平均体重１．８ｋｇ）で実験を行った。約５日間の予備飼育後、ノベシーナ（４％）による好適な局所麻酔条件下に、角膜表皮の損傷を実施した。損傷は１眼の光学帯に、鋭い縁を有する凹型ガラスシリンダー（径３ｍｍ）で円形に傷をつけた。
　【００７０】
処置
　動物は、各群５羽づつからなる群に分け、結膜に次の液を滴下して、薬理学的な処置を施した。
　【００７１】
　【表１０】
　処置は右眼（ＲＥ）に行い、結膜に８時間毎に２滴づつ滴下し、総計３回投与した。
　【００７２】
評価方法
　角膜表皮の回復は、損傷後、０．８時間後、１６時間後、２４時間後、３２時間後、４０時間後および４８時間後に、眼の観察およびスリット光源による写真記録により評価した。
　【００７３】
結果
　表１１に示したように、眼科的検査の成績から、対照（第１群）は損傷後４８時間で完全治癒に到達した（５／５羽）。ＥＧＦ処置動物（第２群）では、損傷後２４時間程度まで治癒経過が早まり明らかにやや有効であった（４／５羽）。ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチン画分＋ＥＧＦからなる製剤Ｃで処置した動物（第３群）では、治癒経過はすべての動物（５／５羽）で、損傷後１６時間程度で完全になった。
　これらの結果は、角膜損傷の治療効果をより速やかに促進しており、ヒアルロン酸のヒアラスチン画分がＥＧＦの基剤として使用することが治癒過程を速めることを示している。
　【００７４】
　【表１１】
　
　【００７５】
ＩＶ．ヒアルロン酸を基剤とするゲンタマイシンの抗微生物活性
材料
　次の材料を使用した。
　ゲンタマイシンを生理食塩液に溶解（５０ｍｇ／ｍｌ）。
　ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチン画分（２ｍｇ／ｍｌ）。
　【００７６】
方法
　１１羽の家兎の両眼に、シュードモナス・エルビノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の一定量浮遊液（０．１ｍｌ）を注入し、敗血症性炎症を起こさせた。敗血症性炎症を示したそれらの家兎の右眼に、ゲンタマイシンとヒアルロン酸、ヒアレクチン画分の組合わせを滴下投与し、左眼にはゲンタマイシンの生理食塩液の緩衝溶液を投与した。処置（６時間毎に３滴）は感染菌注入直後から開始し、感染が消失するまで続けた。家兎の眼は毎日、スリット光源下に観察した。
　【００７７】
結果
　ゲンタマイシンのヒアルロン酸との併用による治療は、抗生物質の単独投与に比べ、敗血症感染のより速やかな消失を来たした。この結論は、表１２に示した結果から明らかである。
　【００７８】
　【表１２】
　【００７９】
　本発明に示したＨＡ画分を基剤として使用し得る眼科用薬の例を以下に追加して示す。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
　抗生物質：　クロラムフェニコール，ネオマイシン，オーレオマイシン，ミキシンおよびポリミキシン，バシトラシン，マイセチン類
　ホルモン：　ナンドロロンおよび硫酸ナンドロロン
　麻酔剤（局所）：　ヘノキシネート（ｈｅｎｏｘｉｎａｔｅ）およびその塩酸塩
　抗ウイルス剤：　ヨードデオキシウリジン，ヨードデオキシシチジン
　抗炎症剤：　デキサメサゾンおよびそのリン酸塩
および
昇圧剤および血管
　収縮剤：　シネフリンおよびネオシネフリン
　【００８０】
結論
　以上の実験結果から、ヒアルロン酸ナトリウム塩溶液（ヒアラスチンおよびヒアレクチンの両画分）は眼科用薬の基剤として使用でき、異なった生物学的作用を有する種々の型の医薬品に対して効果的であると結論できる。
　例えば、縮瞳作用、抗炎症作用、治癒作用および抗微生物作用がそれぞれ報告されている。硝酸ピロカルピンのような抗線内症薬、トリアムシノロンのような抗アレルギーおよび抗炎症薬、ＥＧＦのような眼の組織治癒を促進させる組織治癒および細胞増殖促進薬、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンのような抗生物質からなる医薬品は、すべてＨＡを基剤として使用し、効果的に投与できる。
　【００８１】
　種々の分子量のヒアルロン酸画分を基剤とする眼科用薬製剤は宿主により完全に忍容され、従って感作現象を高めることなく角膜表皮によく適合することが証明された。
　【００８２】
　また、生物学的生成物ヒアルロン酸が、基剤として使用することにより主薬のインビボのバイオアベイラビリティーを高め、それらの薬物の薬理学的活性を強めることができる有用な基剤であることは、次に示す実験結果からよく観察できる。
　【００８３】
　硝酸ピロカルピンの作用時間を延長し、縮瞳活性を増強し、デキストランにより生じた眼内炎症に対するトリアムシノロンの抗炎症活性を増強し、しかもトリアムシノロン単独と比較して、より短時間に炎症経過を軽減し、角膜の表在性損傷に対する表皮成長促進因子（ＥＧＦ）の防御活性を、明らかな相乗効果によって増強し、ＥＧＦ単独投与により回復時間に比べ治癒時間を短縮し、またゲンタマイシンのような抗生物質のインビボの生物学的活性を増強する。
　この生物学的ポリマー、ヒアルロン酸を、そのような性質と作用の異なる薬物の基剤として使用することにより、他の多くの眼科用薬にその活性を導入することができる。
　【００８４】
　下に示すのは、ヒアルロン酸の二つの画分、ヒアラスチンとヒアレクチンだけを賦形薬として使用した粉末、点眼剤、ゲル、クリームまたは挿入剤の剤型をとり得る眼科用薬の製剤例である。
　【００８５】
　【表１３】
製剤例１：ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレクチン画分　　　１０ｍｇ
　　　　　リン酸緩衝液ｐＨ７，６Ｍを含有する生理食塩液　１０ｍｌ
　　　　　を含有する“人工涙液”に使用し得る点眼薬。
製剤例２：ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレクチン画分　　　２０ｍｇ
　　　　　リン酸緩衝液ｐＨ７，６Ｍを含有する生理食塩液　１０ｍｌ
　　　　　を含有する“人工涙液”に使用し得る点眼薬。
製剤例３：１００ｇ中に；
　　　　　ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアラスチン画分　　　　５５ｇ
　　　　　ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレクチン画分　　　　３０ｇ
　　　　　ＥＧＦ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ
　　　　　再蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　２３．５ｇ
　　　　　を有するゲル剤。
製剤例４：ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアラスチン画分　　１００ｍｇ
　　　　　硝酸ピロカルピン　　　　　　　　　　　　　　　　２ｍｇ
　　　　　を含有する硝酸ピロカルピンの１００ｍｇ挿入剤。
製剤例５：粉末１００ｇ中に；
　　　　　ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアラスチン画分　　　　７０ｇ
　　　　　ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレクチン画分　　２８．５ｇ
　　　　　ストレプトマイシン　　　　　　　　　　　　　　１．５ｇ
　　　　　を含有する局所用ストレプトマイシン含有粉末。
　【００８６】
　上記の製剤は代表例を示すべく記載したが、その他の作用薬と、特殊用途に対する種々の投与剤型についても、ヒアルロン酸画分、特にヒアレクチンまたはヒアラスチン画分、またはヒアレクチン／ヒアラスチンの混合画分、またはそれらのカリウム塩またはナトリウム塩を組合わせることによっても、薬学的製剤を当然調製できる。
　【００８７】
　従って、ヒアルロン酸、特に実質的に純粋なヒアレクチンおよびヒアラスチン画分は、眼科的に有用性または活性を有する種々の薬物と組合わせて使用する効果的な基剤または賦形薬であることが示された。ＨＡ画分を医薬品基剤として含有する薬学的組成物は、ＨＡ画分が眼に対する高度の耐容性と、角膜表皮に対する高度の適合性を有することから特に有用である。
　さらに、ＨＡ画分の使用により、眼科用薬のインビボの生物学的活性を実質的に向上する手段が提供される。特に、ヒアレクチンおよびヒアラスチンのＨＡ画分を使用することは、これらの画分を眼に投与しても不都合な炎症性の副作用を示さないことから、一層有用で、しかも重要である。
【図面の簡単な説明】
　【図１】　図１は、本発明者等の固定したヒアルロン酸画分の種別を示すグラフである。
　【図２】　図２は、ヒアルロン酸各画分の走化活性を示す棒グラフである。