(57)【要約】ｔＮＯＸを発現する癌細胞を有する生物体に、アブラナ科の野菜からなる群から選ばれる植物およびトウガラシ属の植物の組み合わせの治療的活性量を投与することを含む生物体におけるｔＮＯＸを阻害する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アブラナ科の野菜およびトウガラシ属の植物からなる群から選ばれる採取植物の組み合わせの治療的活性量を生物体に投与することを含む、ｔＮＯＸを発現する癌細胞を有する生物体におけるｔＮＯＸを阻害する方法。
【請求項２】
アブラナ科の野菜がブロッコリーである請求項１の方法。
【請求項３】
ブロッコリーがスルフォラファンを含む請求項２の方法。
【請求項４】
トウガラシ属の植物がカプシカム・アニュム種に由来する請求項１の方法。
【請求項５】
トウガラシ属の植物の細かく粉末化された果実が使用される請求項４の方法。
【請求項６】
果実がカプシカム・バニロイドを含む請求項５の方法。
【請求項７】
バニロイドがカプサイシンおよびバニリルアミンからなる群から選ばれる請求項６の方法。
【請求項８】
ブロッコリーがスルフォラファンを含む請求項７の方法。
【請求項９】
癌治療を必要とする患者における癌を治療する方法であって、トウガラシ属の植物およびアブラナ科の野菜の群から選ばれる少なくとも二つの植物の生産物を含む組成物の治療的有効量を前記患者に投与することを含む前記方法。
【請求項１０】
トウガラシ属の植物の生産物が細かく粉末化された乾燥果実である請求項９の方法。
【請求項１１】
果実がカプシカム・バニロイドを含む請求項１０の方法。
【請求項１２】
バニロイドがカプサイシンとバニリルアミンからなる群から選ばれる請求項１１の方法。
【請求項１３】
アブラナ科の野菜がブロッコリーである請求項１２の方法。
【請求項１４】
ブロッコリーの生産物が、細かく挽いて粉砕されたブロッコリー芽、市場で入手し得るブロッコリー芽、およびブロッコリー芽の抽出溶液の群から選ばれる請求項１３の方法。
【請求項１５】
ブロッコリー芽の抽出溶液が水性抽出物である請求項１４の方法。
【請求項１６】
癌を治療する方法が、相乗的活性化を提供するために活性である程度の少なくとも２つの前記抽出物を組み合わせて、および、癌細胞のｔＮＯＸ活性の阻害を前記原材料の組み合わせにより達成する時間に渡って少なくとも哺乳動物に導入することを含む請求項１５の方法。
【請求項１７】
乾燥カプシカム・アニュム果実と比較してブロッコリー乾燥抽出物の重量による抗癌有効量が１０：１〜１００：１の間にある請求項１６の方法。
【請求項１８】
ブロッコリー抽出物がブロッコリー芽である請求項１７の方法。
【請求項１９】
ブロッコリー芽が凍結乾燥される請求項１８の方法。
【請求項２０】
組成物が薬学的許容可能な担体を含む請求項１９の方法。
【請求項２１】
癌治療を必要とする患者における癌を治療する方法であって、生理学上許容可能な配合で、精製されたカプシノイドおよびスルフォラファンの組み合わせの抗癌有効量を該患者に投与することを含んでなる癌の治療方法。
【請求項２２】
カプシノイドがカプシカム・アニュム栽培品種および／またはその構成物の粉末化された果実に由来する請求項２１の方法。
【請求項２３】
スルフォラファンが凍結乾燥ブロッコリー芽を起源とする請求項２２の方法。
【請求項２４】
生物体において癌を治療するための組成物であって、該癌がｔＮＯＸを発現する癌細胞を有する型であり、該組成物がアブラナ科の野菜およびトウガラシ属の植物からなる群から選ばれる採取植物の組み合わせの治療的活性量を含む組成物。
【請求項２５】
アブラナ科の野菜がブロッコリーである請求項２４の組成物。
【請求項２６】
トウガラシ属の植物がカプシカム・アニュムに由来する請求項２７の組成物。
【請求項２７】
トウガラシ属の植物の果実が細かく粉末化された請求項２６の組成物。
【請求項２８】
果実がカプシカム・バニロイドを含む請求項２７の組成物。
【請求項２９】
バニロイドがカプサイシン、バニリルアミンからなる群から選ばれる請求項２８の組成物。
【請求項３０】
ブロッコリーがスルフォラファンを含む請求項２９の組成物。
【請求項３１】
ブロッコリーが凍結乾燥ブロッコリー芽である請求項３０の組成物。
【請求項３２】
凍結乾燥されたブロッコリー芽が１０：１〜１００：１の間の重量比で粉末化されたシマトウガラシ（カプシカム・アニュム種）と組み合わせた請求項３１の組成物。
【請求項３３】
癌がｔＮＯＸを発現する癌細胞を有する型であり、癌細胞内のｔＮＯＸ発現を阻害することにより、癌の予防治療を提供するためにアブラナ科の野菜およびトウガラシ属の植物からなる群から選ばれる採取植物の組み合わせを生物体に投与することを含む方法である生物体における癌細胞分裂を阻害する方法。
【請求項３４】
アブラナ科の野菜がブロッコリーである請求項３３の方法。
【請求項３５】
ブロッコリーがスルフォラファンを含む請求項３４の方法。
【請求項３６】
トウガラシ属の植物がカプシカム・アニュム種に由来する請求項３５の方法。
【請求項３７】
トウガラシ属の植物の細かく粉末化された果実が使用される請求項３６の方法。
【請求項３８】
果実がカプシカム・バニロイドを含む請求項３７の方法。
【請求項３９】
バニロイドがカプサイシンおよびバニリルアミンからなる群から選ばれる請求項３８の方法。
【請求項４０】
ブロッコリーがスルフォラファンを含む請求項７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたｔＮＯＸの阻害をもたらす組成物および治療方法に関する。
特に、本発明は、選択的にｔＮＯＸを阻害し、および従って癌細胞の増殖を阻害する組成物および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は制御しえない増殖の細胞内現象である。成熟動物における通常細胞は、制御様式で分割する。癌に特有の細胞は異常で無秩序な増殖によって発生し、ついに周囲の身体組織を破壊しうる。多くの実例において、癌はまた、転移と呼ばれる過程で身体の他の部分に広がることがある。
【０００３】
２００３年の米国死亡統計において、癌はあらゆる死亡の中で２３％の死亡原因となり、癌を発症する男性の危険率は２人に１人であり、女性は３人に１人である。
【０００４】
癌治療における現代の治療は、化学治療もしくは放射線治療のいずれかの利用または癌を切除しようとする手術を含む。
【０００５】
化学療法は、様々な複合的な薬剤の使用を含み、それらの多くは製造所で合成される。そのような薬剤は、癌細胞の増殖周期を崩壊させる目的で、他の化合物と組み合わせてしばしば投与される。
【０００６】
これらの薬剤の多くは、脱毛、嘔吐、吐き気および白血球数の減少を含む、人間に著しい副作用を及ぼし、患者が二次感染を被る可能性が増加しうる。これは多くの既存の薬剤の癌治療が通常細胞に影響するという事実による。これらの不利益な副作用の存在が、薬剤摂取計画に従う患者の不足に起因する効能の不足に結びつきうる。
【０００７】
さらに、合成薬剤は、時間および患者に最終的に求められる財源の両方において著しい投資を要求するので、生産するのがしばしば困難である。癌治療の有効性および費用は、特定の化学治療を続けることを決める患者において重要な要因になる。
【０００８】
人間の健康における残存する主な問題は、安価で、安全で、そして効果的な癌の予防および治療の方法の必要性である（Ｃｏｏｐｅｒ、Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ，  ジョーンズおよびバートレット（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ），  Ｂｏｓｔｏｎ，  １９９２）。
【０００９】
天然植物抽出物の異なる疾病の治療における利用が知られている。例のみのために、日本１０−２３６９６８号は、濃度依存性様式で癌細胞を阻害するためにパラディクソムパプリカ（ｐａｒａｄｉｃｓｏｍ  ｐａｐｒｉｋａ）の抽出物の使用を開示する。しかしながら、癌細胞阻害を達成するために、たとえばアセトンおよびヘキサンのような有機溶媒を使用して、植物から適切な化合物を抽出することがはじめに必要である。
【００１０】
米国特許５，８３０，８８７号において、ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ダイドゼイン（Ｄａｉｄｚｅｉｎ）、フォルモノネチン（Ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ）およびビオカニンＡ（Ｂｉｏｃｈａｎｉｎ  Ａ）から選ばれる、天然のファイト−エストロゲン（ｐｈｙｔｏ−ｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ）あるいはそのアナログを濃縮した組成物を使用した癌を治療する方法の開示がある。そのようなファイト−エストロゲンは大豆胚軸およびアカツメクサから入手可能である。
【００１１】
癌の有効な治療に対して天然由来化合物を使用するという強い傾向がある。患者は、天然由来の薬剤の副作用が非天然物で考えられる副作用のように深刻にならないと考えるので、植物のような天然資源から由来する患者が知る薬剤を受け入れるより強い傾向がある。
【００１２】
さらに、活性成分の主要原料が天然資源から入手可能である場合、そうするとこれは、著しく低価格であり、およびしたがってより入手可能な最終癌治療または薬剤に結びつきうる。
【００１３】
トウガラシ属の植物（Capsicum plants）に由来する化合物は、麻酔薬として使用されている（米国特許４３１３９５８号および米国特許４４９３８４８号）。トウガラシ属の化合物もまた、非ステロイド抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）（米国特許４８１２４４６号）またはオピオイド（ｏｐｉｏｉｄｓ）（米国特許４５９９３４２号）のような、他の鎮痛性の化合物と組み合わされている。これらの異なるクラスの鎮痛性化合物の組み合わせは、その組み合わせがいずれかの化合物単独より大きな鎮痛効果を生み出したという点で、相乗効果を生み出した。
【００１４】
米国特許５６６５３７８号は、カプサイシン、ＮＳＡＩＤおよびパマブロム（ｐａｍａｂｒｏｍ）を含有するパッチ型で処方された、経皮的治療性組成物について記載する。使用されたＮＳＡＩＤは、ヂフルニサル（ｄｉｆｌｕｎｉｓａｌ）、フェノプロフェン（ｆｅｎｏｐｒｏｆｅｎ）、イブプロフェン（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）、メクロフェナメイト（ｍｅｃｌｏｆｅｎａｍａｔｅ）、ナプロキセン（ｎａｐｒｏｘｅｎ）などを含む。
【００１５】
トウガラシ属を基礎とした化合物もまた、主としてパッチ型において、患者外部の関節炎、筋違い（ｓｔｒａｉｎｓ）、打撲傷および捻挫のような病気を治療するために他の組成物の中で使用されているが、局所適用のためのエアロゾル（ａｅｒｏｓｏｌｓ）を含むたくさんのクリームもある。
【００１６】
ほとんどの実例において、活性トウガラシ属化合物に加えて、必要によっては、ある方法においてカプサイシンによって引き起こされた皮膚のかぶれを低減する二次的な成分がある。通常、これは、カプサイシンに結合する皮膚麻酔薬または化合物である。
【００１７】
以上から、トウガラシ属を基礎とした化合物を含む治療の組成物および方法の主な焦点は、局所疾病の効果を取り除くことであった。
【００１８】
カリフラワー、キャベツおよびケイル（ｋａｌｅ）のようなアブラナ科の野菜は知られた酸化防止剤であるイソチオシアン酸塩であるスルフォラファンを含んでいる。スルフォラファンおよび他のイソチオシアン酸塩は、ブロッコリーおよび他のアブラナ科の野菜の摂取に関連する癌の危険率低下の原因であると信じられている。
【００１９】
しかしながら、そのようなイソチオシアン酸塩の使用は、控えめに予防的であると単に考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
［発明の目的］
本発明は、癌を治療する方法を提供することを目的とする。
【００２１】
より具体的には、本発明は、従来のｔＮＯＸの阻害と異なる方法で提供するという点で有用である、相乗効果のある組み合わせ、組成物、および生物体の治療の方法を提供することを目的とする。
【００２２】
より具体的には、本発明は、スルフォラファンの活性を増加させることにより癌を治療する方法を提供することを目的とする。
【００２３】
本発明の別の目的は、先行技術の不利な点および欠点を克服するか、または、少なくとも本質的にそれらを改善することである。
【００２４】
本発明の他の目的および本発明の利点は、随伴する図と一緒に、下記の記載から明白になり、説明および例のために、本発明の実施例は開示される。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
［発明の要約］
本発明によれば、下記の記載が必ずしも本発明の唯一の形態、または確かに最も広い形態であることは意図されていないが、アブラナ科の野菜から成る群から選ばれる植物性薬品およびトウガラシ属の植物の組み合わせの治療的活性量を、ｔＮＯＸを発現する癌細胞を有する生物体に投与することを含む、生物体内のｔＮＯＸを阻害する方法を提供する。
【００２６】
好ましくは、アブラナ科の野菜はブロッコリーである。
【００２７】
好ましくは、前記トウガラシ属の植物は、カプシカム・アニュム（Capsicum annum）種に由来する。
【００２８】
好ましくは、トウガラシ属の植物の細かく粉末化された果実が使用される。
【００２９】
好ましくは、前記果実はカプシカム・バニロイド（Capsicum vanilloids）を含んでいる。
【００３０】
好ましくは、前記バニロイドは、カプサイシンおよび／またはバニリルアミン（ｖａｎｉｌｌｙｌａｍｉｎｅ）である。
【００３１】
好ましくは、前記ブロッコリーはスルフォラファンを含んでいる。
【００３２】
発明のさらなる形態において、癌治療を必要とする患者における癌を治療する方法であって、トウガラシ属およびアブラナ科の野菜の群から選ばれる少なくとも２つの植物の生産物を含む組成物の癌治療有効量を摂取することによって前記患者へ投与する前記方法が提供される。
【００３３】
好ましくは、トウガラシ属の植物の生産物が細かく粉末化された乾燥果実である。
【００３４】
好ましくは、アブラナ科の野菜はブロッコリーである。
【００３５】
好ましくは、ブロッコリーの生産物が細かく挽いて粉砕されたブロッコリー芽、市場で入手し得るブロッコリー芽、およびブロッコリー芽の抽出溶液の群から選ばれる。
【００３６】
好ましくは、ブロッコリー芽抽出溶液が水性抽出物である。
【００３７】
好ましくは、癌を治療する方法は、少なくとも２つの相乗的活性化を提供するために活性である程度の前記抽出物を組み合わせて、および癌細胞のｔＮＯＸ活性の阻害を前記原材料の組み合わせにより達成する時間に渡って少なくとも哺乳動物に導入することを含む。
【００３８】
好ましくは、カプシカム・アニュム果実と比較してブロッコリーの乾燥抽出物の重量による前記抗癌有効量が１０：１〜１００：１の間である。
【００３９】
好ましくは、前記ブロッコリーはブロッコリー芽である。
【００４０】
好ましくは、ブロッコリー芽は凍結乾燥される。
【００４１】
好ましくは、組成物は薬学的に許容可能な担体を含む。
【００４２】
本発明のさらなる形態において、癌治療を必要とする患者における癌を治療する方法であって、生理学的許容可能な処方における精製されたカプシノイド（ｃａｐｓａｉｃｉｎｏｉｄ）およびスルフォラファンの組み合わせの抗癌有効量を食物摂取によって前記患者に投与することを含む前記方法を開示する。
【００４３】
好ましくは、カプシノイドが、カプシカム・アニュム栽培品種および／またはその構成物の粉末された生産物に由来する。
【００４４】
好ましくは、スルフォラファンは凍結乾燥されたブロッコリー芽を起源とする。
【００４５】
用語の“薬学的に許容可能能な担体”は、無毒な固体、半固体または液体の充填物、希釈物などの、任意の型の原材料または処方補助物をカプセルに入れたものを制限せずに意味することを意図されている。
【００４６】
さらなる形態において、本発明は、生物体が生命保持過程を有する型であり、腫瘍が正常または非癌細胞からのいくつかの発現に矛盾して独自にｔＮＯＸを発現する生物体内の癌細胞の増殖を阻害する生物体の治療方法であって、アブラナ科の野菜抽出物の効果の改良を導く相乗効果があるトウガラシ属またはトウガラシ属の抽出物および（スルフォラファンの本質的な量を含む）アブラナ科の野菜の抽出物である治療材料を生物体内に有効的に活性であるように少なくともある本質的な時間に渡って、生物体に導入する段階を含む方法にあると言うことができる。
【００４７】
好ましくは、トウガラシ属の抽出物はバニロイドを含むトウガラシ調製物である。
【００４８】
さらなる形態において、本発明は、生物体における腫瘍の治療に対する治療材料であって、前記材料（混合物として、または協働的に包装されるかまたはともに投与されるかもしくは販売される）が、ブロッコリー抽出物の重量で１００単位であり、およびトウガラシ属の抽出物の重量で１〜１０単位であると言うことができる。
【００４９】
好ましくは、前記トウガラシ属の抽出物は、カプシカム・アニュム種種に由来する。
【００５０】
好ましくは、前記トウガラシ属抽出物が、トウガラシ属の植物の細かく粉末化された果実である。
【００５１】
好ましくは、前記トウガラシ属抽出物はトウガラシ・バニロイドを含んでいる。
【００５２】
好ましくは、前記バニロイドはカプサイシンおよび／またはバニリルアミンである。
【００５３】
好ましくは、前記ブロッコリー抽出物はスルフォラファンを含む。
【００５４】
本発明のさらなる形態において、本発明は、１０：１〜１００：１の間の重量比で粉末化されたシマトウガラシ（チリ）（カプシカム・アニュム種）と組み合わされた凍結乾燥されたブロッコリー芽からなる植物学的補助物であり、それによりｔＮＯＸおよび細胞培養物の両方の分析においてブロッコリー芽の腫瘍細胞の分裂阻害活性が相乗的に増強されると言うことができる。
【００５５】
独自の原形質膜ＮＡＤＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）、ヒドロキノン（ＮＡＤＨ）オキシダーゼおよびジスルフィド・チオール交換活性タンパク質を有し、ホルモンおよび成長因子によく応答する独自の細胞表面タンパク質が同定されている。
【００５６】
さらに、癌細胞に特異的である、ｔＮＯＸを指定したＮＯＸのホルモン無反応および薬剤反応型の形態が報告されている。
【００５７】
ＮＯＸタンパク質は、外部原形質膜表面に局在化され、膜内外ではないのでＮＡＤＨオキシダーゼとしての機能的役割は恐らく考慮されない。
【００５８】
ＮＡＤＨの酸化が活性を分析する便利な方法に対して基本原理を提供しているが、最終的な電子の生理的供与体として、ＮＡＤＨ酸化および／またはチオール−ジスルフィド交換タンパク質より大きいかまたは等しいヒドロキノン酸化に対して特異活性を有する最も可能性のあるのはヒドロキノンである。
【００５９】
ＣＮＯＸは、ｔＮＯＸに対する正常な相当物である非形質転換細胞の原形質膜に関連した、薬剤と無関係に構成的なＮＡＤＨオキシダーゼ活性として元々は定義された。
【００６０】
確かに、ネズミの肝臓および植物から単離された３６ｋＤのタンパク質にはｔＮＯＸ阻害剤に反応しないＮＯＸ活性がある。
【００６１】
癌細胞は、薬剤阻害性でありホルモンおよび成長因子に依存する（ＣＮＯＸ）だけでなく、薬剤反応性でありホルモンおよび成長因子に作用しない（ｔＮＯＸ）活性の両方を示すが、非形質転換細胞は薬剤に作用せずホルモン性かつ薬剤反応性のＣＮＯＸだけを示す。 非形質転換細胞および組織のいわゆる構成的またはＣＮＯＸの活性の最初の記載物の中には、ラット肝臓の原形質膜の活性が、成長因子であるディフェリック（ｄｉｆｅｒｒｉｃ）トランスフェリンによって刺激されたという記載があった。後続の研究は、観察されたＮＡＤＨオキシダーゼがいくつかのホルモンおよび成長因子に反応性を示す独特な酵素によって触媒されたことを実証した。ミトコンドリアのオキシダーゼと異なり、ラット肝臓の原形質膜のホルモンに刺激されたＮＡＤＨオキシダーゼの活性はシアニド（ｃｙａｎｉｄｅ）によって阻害されない。酵素はまた、様々な洗浄剤（たとえば、コール酸ナトリウム、トリトンＸ−１００およびＣＨＡＰＳなど）とならびにいくつかの一般的なオキシドレダクターゼ（oxidoreductase）阻害剤（たとえば、カタラーゼ、アジ化物、クロロキンなど）に対する感応性によって他のオキシダーゼ活性と区別された。癌細胞のｔＮＯＸのように、ＣＮＯＸは、ＮＡＤＨを酸化することができ、しかしホルモンと成長因子によって調整される活性を有する、独特な細胞膜に関連するタンパク質である。
【００６２】
従来の化学療法剤の非選択性によって一般に引き起こされる悪影響を有さない癌治療の必要性が残っている。
【００６３】
ｔＮＯＸ、トウガラシ属およびブロッコリー生産物の上記した組み合わせによる細胞外の細胞膜に関連するタンパク質の阻害は、癌細胞増殖の選択的な阻害および最終的にアポトーシスをもたらす。
【００６４】
今回提供されるものは今まで知られていなかった癌を治療する方法か手段である。該方法はカプサイシンおよびバニリルアミンのようなカプシカム・バニロイドとの組み合わせによって、スルフォラファン、ブロッコリーの主な抗癌性成分の活性を以前に知られていないレベルに増強する。スルフォラファンおよびカプシカム・バニロイドの両方が、癌に関連し、増殖に関連するＥＣＴＯ−ＮＯＸタンパク質のｔＮＯＸを標的とする。効能評価は、培養中のヒト子宮頚癌（ＨｅＬａ）細胞のｔＮＯＸ活性の阻害、およびＨｅＬａおよび４Ｔ１（マウスの乳癌）の細胞の増殖の阻害に基づいている。阻害の相乗効果は両方のシステムにおけるスルフォラファンおよびバニロイドに対して観察される。具体的には、ある請求項は、同じ相対濃度で比較された場合、ブロッコリー芽またはシマトウガラシ粉末単独と比較して、ｔＮＯＸと細胞培養物の両方の分析において、ブロッコリー芽の活性が組み合わせにより２〜５倍に増強される、１０：１〜１００：１の間の比率で粉末化シマトウガラシ（カプシカム・アニュム種）と組み合わせられた凍結乾燥せしめたブロッコリーからなる新規な植物学補助剤に対してなされる。
【００６５】
［発明の詳細な説明］
本発明は、潜在的な抗癌剤に対するスクリーニング方法としての実用性を有する細胞表面のＮＡＤＨオキシダーゼ活性の解明をその基礎として有している。より有力なＮＯＸ阻害剤の中には、カプサイシン（８−メチル−Ｎ−バニリル−６−ノネアミド（ｎｏｎｅａｍｉｄｅ）、シマトウガラシ胡椒およびＥＧＣｇ（（‐）−エピガロカテキンガレート）の刺激性成分、主要な茶カテキンがある。この出願において、本発明者らは、癌の治療および／または予防における潜在的な実用性を有する、カプシカム・アニュム栽培品種の粉末化果実および／またはその構成成分および凍結乾燥されたブロッコリー芽および／またはその構成成分からなる組成物を記載する。
【００６６】
Ｌ−スルフォラファン（スルフォラファン）は、化合物によって引き起こされた癌の開始を防ぐブロッコリーにおいて分布しているイソチオシアン酸塩であり、ｔＮＯＸ癌標的の有力な阻害剤であることが示された。約１ｍＭの５０％有効濃度（ＥＣ５０）を有するＬ−スルフォラファンの活性は、ＨｅＬａ細胞（図１および２）からのｔＮＯＸ、および４Ｔ１マウス乳房細胞（図３）のｔＮＯＸに対して示された。非癌ＭＣＦ−１０Ａヒト乳房上皮のＣＮＯＸは、大豆原形質膜（図５）のＣＮＯＸ活性と同様にＬ−スルフォラファン（図４）に影響されなかった。Ｌ−スルフォラファンは、０．１〜１ｍＭの間のＥＣ５０を有するＨｅＬａ細胞およびヒト乳癌（ＢＴ−２０）細胞の増殖を阻害した（図６）。しかしながら、細胞の増殖での安全余裕率は、ほとんど癌細胞と同じ程度まで阻害された非癌ＭＣＦ−１０Ａ細胞での１０単位（ｆａｃｔｏｒ）未満だった。
【００６７】
スルフォラファンが天然原料、カプサイシン、バニリルアミンおよびＥＧＣｇからの他のｔＮＯＸ阻害剤と組み合わされた時、有益な感応性が、カプサイシン（図７）、およびバニリルアミン（図８）とにおいて、スルフォラファンの追加の前（図７Ｂ、図８Ｂ）または後（図７Ａ、図８Ａ）において見られた。ＥＧＣｇは、緑茶と同様にすべての組み合わせ（図７Ｃ−Ｆ、図８Ｃ−Ｆ）において相反した。
【００６８】
これらの観察に基づいた植物の発展物として、凍結乾燥されたブロッコリー芽が使用された。２５℃および４日間で発芽した有機ブロッコリー種子（サン有機農場（Sun Organic Farm）、サンマルコス、ＣＡ）に由来する暗成長種苗は、直接収穫され、凍結されそして凍結乾燥された。細かく挽かれ、および篩にかけられた芽または芽の市販調製物（アリゾナ健康食品（Arizona Health Foods））が、分析に先立って夜通し抽出され水冷された。１．２５ｍｇ／ｍｌの標準ブロッコリー抽出物は１：１０、１：２０または１:５０で希釈され、および、１：１００のさらなる希釈において９６穴型で増殖されたＨｅＬａまたは４Ｔ１細胞に加えられた。ブロッコリー抽出物によるＨｅＬａおよび４Ｔ１細胞の増殖の阻害用のＥＣ５０は、１：５００（最終希釈）であった（図１０）。
【００６９】
異なる種類（胡椒粉末）の細かく粉末化されたカプシカム・アニュム果実を有するブロッコリー抽出物の組み合わせは、およそ５単位だけブロッコリー調製物の細胞殺傷を増強した（図１１）。２つの異なる胡椒から混合された粉末は単一原料よりさらに活性であった（図１２）。凍結乾燥されたブロッコリー芽および胡椒粉末の組み合わせの最適比は、胡椒粉末１単位に対して凍結乾燥されたブロッコリー芽２５単位であるとわかった。同様の結果はＮＡＤＨオキシダーゼ活性の阻害に対してＨｅＬａ細胞表面から得られた（図１３）。
【００７０】
培養中のＬｎＣａｐ（ヒト前立腺癌）細胞の増殖は、凍結乾燥されたブロッコリー芽抽出物によって阻害されたが、しかし強い阻害反応を達成するために２５：１比においては胡椒粉末の混合物の追加が要求された。
【００７１】
細胞の増殖
【００７２】
ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）ヒト頚部の腺癌細胞は、１．５ｇ／ｌの重炭酸ナトリウム、０．２ｍＭの非必須アミノ酸、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むために調整され、および１０％の子牛血清（加熱不活性化型）および５０ｇ／ｌのゲンタマイシン硫酸塩（シグマ）を補充した、イーグル平衡塩溶液および２ｍＭのＬ−グルタミンを有する最小基礎培地（イーグル）で培養された。
【００７３】
４Ｔ１乳房癌細胞系統は、ＢＡＬＢ／ｃＣ３Ｈマウス（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、１９８７年）を起因とした。４Ｔ１細胞は、ＤＭＥ−１０、５％の胎児子牛血清、５％の再生子牛血清、１ｍＭの混合非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ  ｍＬ−１）およびストレプトマイシン（１００ｇｍＬ−１）を補充したダルベッコ改変イーグル培地において増殖された。
【００７４】
ＨｅＬａ細胞および無細胞抽出物の調製
【００７５】
（浮遊で増殖した）ＨｅＬａＳ細胞は、遠心分離によって回収され、および１ｍＬの酢酸に対する１ｍＬの圧縮細胞量の比において、ｐＨ５の０．１ｍＭの酢酸ナトリウムにおいて市販の供給業者（セレックス・バイオサイエンス（Ｃｅｌｌｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ミネアポリス、ＭＮ）によって凍結され出荷された。細胞は室温で融解され、再懸濁され、タンパク質を放出するために３７℃で１時間保温された。細胞は６０分間３７０００ｇでの遠心分離によって取り除かれ、および無細胞の上清液が−７０℃、１ｍＬ試料で再凍結され、保存された。
【００７６】
ＮＡＤＨオキシダーゼの分光測光法の分析
【００７７】
ＮＡＤＨオキシダーゼ活性は、低レベルのミトコンドリアのオキシダーゼ活性を阻害するために２５ｍＭトリス−メス（Ｍｅｓ）緩衝液（ｐＨ７．２）、１ｍＭのシアンカリウム（ＫＣＮ）を含む反応混合物において３４０ｎｍで測定され、ＮＡＤＨの消失として決定された。そして１５０として（温度調節（±０．５℃）で３７℃でのＪ−Ｍ ＮＡＤＨおよび攪拌）決定された（１４）。活性は組み合わせられた日立Ｕ３２１０分光光度計を使用して測定された。分析はＮＡＤＨの添加によって開始された。原形質膜および細胞全体で、分析は１分間であり、および、指示された時間に対して１．５分ごとに同じ試料で繰り返された。６．２２ｍＭの吸光係数は、特定の活性を決定するために使用された。タンパク質は標準としてウシ血清アルブミンを有するビシンコニニック（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ）酸方法により評価された。
【００７８】
増殖測定
【００７９】
増殖はリン（Ｌｉｎ）らにより記載された通りの９６穴プレート分析を用いて決定された（１７）。ＨｅＬａ（５×１０４）またはＣＨＯ（１０４）細胞は、各プレートのウェル（コースター組織培養プレート（Costar tissue culture plate））に撒かれた。細胞を３７℃で２４時間増殖させ、評価される物質が加えられた後に、示された通りにさらに４８時間または７２時間の保温を続けた。培地は除去され、および細胞はリン酸塩緩衝食塩水で洗浄され、およびその後に０．５時間１００Ｌの２．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドの添加により固定され、蒸留水洗浄を続けた。細胞は１００Ｌの１％水性クリスタルバイオレットで０．５時間染色され、蒸留水で徹底的に洗浄され、その後に２００Ｌの３３％（ｖ／ｖ）酢酸で５分間浸した。吸光度は自動プレートリーダーを使用して、５８０ｎｍで決定された。増殖は、一般式［（ｂ−ｃ）×１００］／（ａ−ｃ）］に従って決定された。ここで、ａは無処理の培地における細胞の吸光度、ｂは処理した培地での細胞、およびｃは培地単独（背景）である。
【００８０】
これらの結果から、本発明者らは、血清において、結果は２つの指定された原材料の同時使用に起因する著しい相乗効果を示し、これらの結果がインビボでの等価な有益な増強を示すであろうことを確証した。
【００８１】
生体内の試験結果
【００８２】
向上したＰＳＡ（前立腺特異抗原）のレベルを持った３人の患者には、前記の通り、異なる種類（胡椒粉末）の細かく粉末化されたカプシカム・アニュムを有するブロッコリー抽出物の組み合わせが提供された。患者はそれぞれ、４時間ごとに細かく粉末化された胡椒粉末を有するブロッコリー抽出物の組み合わせの７００ｍｇを食物摂取した。
【００８３】
各場合においては、ＰＳＡレベルに対する顕著な感応性があり、ＰＳＡレベルの全面的な上昇速度の減少を示していたか、あるいはＰＳＡレベルが水平になっていた。
【００８４】
１人の患者は、治療に先立って、８か月の期間の間１３．３％で増加していたＰＳＡレベルを有していた。細かく粉末化された胡椒粉末を有するブロッコリー抽出物の組み合わせによる治療の間、ＰＳＡの上昇は２．７８％の増加だけ減少した。
【００８５】
別の患者は、細かく粉末化された胡椒粉末を有するブロッコリー抽出物の組み合わせの不和（ｄｉｓｔｒａｃｔｉｏｎ）に先立って、１日当たり５単位だけ上昇することで記録されたＰＳＰレベルを有していた。患者がその組み合わせを食物摂取していた１４日間に、患者のＰＳＡレベルは、水平になり、およびわずかに減少し始めた。試験の終了後、患者のＰＳＡレベルが１日当たり６単位上昇し始めた。
【００８６】
この記載の目的は、本発明を説明することであり、かつそれに制限されない。
【００８７】
本願の中で見聞きされおよび記載されている本発明は、最も具体的および好ましい実施例であると理解されるけれども、新方針が本発明の範囲内でなされうることが認識され、本願中に記載された詳細事項に限定されることはなく、任意のおよびすべての等価な方法を包含するように付加された請求項の十分な範囲を与えられるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】スルフォラファンによってＨｅＬａ細胞表面からの（完全に酸化せしめた）ＮＯＸ活性の阻害。
【図２】スルフォラファンによってＨｅＬａ細胞表面からの（Ｈ２０２でない）ＮＯＸ活性の阻害。
【図３】スルフォラファンによる４Ｔ１マウス乳房細胞の（完全に酸化せしめた）ＮＯＸ活性の阻害。
【図４】スルフォラファンは、ｔＮＯＸを欠くヒト乳房（癌ではない）上皮のＮＯＸ活性を阻害しない。
【図５】スルフォラファンは、ｔＮＯＸを欠く大豆の暗下で育てられた胚軸から単離された原形質膜のＮＯＸ活性を阻害しない。
【図６】治療の４８時間および７２時間での培養中のＨｅＬａ細胞およびヒト乳房癌（ＢＴ−２０）細胞の増殖に対するスルフォラファンの効果。
【図７Ａ】Ａ〜Ｄの、左から右まで与えられた順に加えられた、ＨｅＬａ細胞表面からのＮＯＸ活性におけるスルフォラファン、カプサイシンおよびＥＧＣｇの連続添加の効果。
【図７Ｂ】Ａ〜Ｄの、左から右まで与えられた順に加えられた、ＨｅＬａ細胞表面からのＮＯＸ活性におけるスルフォラファン、カプサイシンおよびＥＧＣｇの連続添加の効果。
【図８】左から右まで与えられた順に加えられた、ＨｅＬａ細胞表面からのＮＯＸ活性におけるスルフォラファン、バニリルアミンおよびＥＧＣｇの連続添加の効果。
【図９】ブロッコリー抽出物単独（Ａ）および様々な胡椒粉末と組み合わせたことによるＨｅＬａ細胞表面からのＮＯＸ活性の阻害。
【図１０】ブロッコリー抽出物単独の異なる希釈での治療の７２時間後のＨｅＬａ細胞および４Ｔ１細胞の生存。
【図１１】胡椒（カプシカム・アニュム）粉末の２つの異なる原料を比較するＨｅＬａ細胞（ＡとＣ）および４Ｔ１細胞（ＢとＤ）の生存：Ａ、Ｂ、アンチョ（Ａｎｃｈｏ）；Ｃ、Ｄ、リクイン（Ｐｉｑｕｉｎ）。組み合わせのための最適比は２５単位の凍結乾燥されたブロッコリー芽に対して１単位の胡椒粉末である。
【図１２】２つの胡椒粉末の混合物を除き、図１１と同様。最適比は、再び、２５単位の凍結乾燥されたブロッコリー芽に対して１単位の胡椒粉末である。
【図１３】凍結乾燥されたブロッコリー芽および胡椒粉末の異なる比率を比較するＮＡＤＨオキシダーゼの活性。阻害用の最適比は２５単位の凍結乾燥されたブロッコリー芽に対する１単位の胡椒粉末であった。
【図１４】２５：１の比における胡椒粉末（ＰＰ）の有無での、培養中でのＬｎＣａｐ（ヒト前立腺癌）細胞の生存および凍結乾燥されたブロッコリー芽（ＢＳＬ）の抽出物への感応性。Ｇ＝グイアリジョ（ｇｕｉａｌｌｉｊｏ）。Ａ＝アンチョ（ａｎｃｈｏ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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