(57)【要約】  ヒト癌抑制遺伝子、ヒト癌抑制遺伝子にコードされるタンパク質、ヒト癌抑制遺伝子を含む発現ベクター、及び該ベクターによって形質転換された細胞が開示される。本発明の遺伝子を、ヒト癌の診断、予防及び治療に用いることができる。
2008525014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、及び配列番号３０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、ヒト癌抑制タンパク質。
【請求項２】
前記癌が乳房、肺、胸腺、肝臓、骨格筋、腎臓、脾臓、心臓、胎盤、及び抹消血からなる群より選ばれる正常組織の癌である、請求項１に記載のヒト癌抑制タンパク質。
【請求項３】
対応するタンパク質をコードする、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２９からなる群より選ばれるＤＮＡ配列を有する、ヒト癌抑制遺伝子。
【請求項４】
前記癌が、乳房、肺、胸腺、肝臓、骨格筋、腎臓、脾臓、心臓、胎盤、及び抹消血からなる群より選ばれる正常組織の癌である、請求項３に記載のヒト癌抑制遺伝子。
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子をそれぞれ含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターのそれぞれによって形質転換された細胞。
【請求項７】
前記細胞が微生物または動物細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記細胞が、エシェリキア・コリＤＨ５α／ＧＩＧ１２／ｐｃＤＮＡ３．１（受託番号ＫＣＴＣ  １０６４２ＢＰ）、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ１７／ｐｃＤＮＡ３．１（受託番号ＫＣＴＣ  １０６５５ＢＰ）、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ１９／ｐｃＤＮＡ３．１（受託番号ＫＣＴＣ  １０６５６ＢＰ）、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ２０／ｐｃＤＮＡ３．１（受託番号ＫＣＴＣ  １０６５７ＢＰ）、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ２２／ｐｃＤＮＡ３．１（受託番号ＫＣＴＣ  １０６５８ＢＰ）、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ２５／ｐｃＤＮＡ３．１（受託番号ＫＣＴＣ  １０６５９ＢＰ）、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ３６／ｐｃＤＮＡ３．１（受託番号ＫＣＴＣ  １０６４３ＢＰ）、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ２／ｐｃＤＮＡ３．１（受託番号ＫＣＴＣ  １０６４１ＢＰ）からなる群より選ばれる、請求項７に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ヒト癌抑制遺伝子、ヒト癌抑制遺伝子にコードされるタンパク質、ヒト癌抑制遺伝子を含む発現ベクター、該ベクターによって形質転換された細胞に関するものである。
【０００２】
〔背景技術〕
癌抑制遺伝子産物は、正常細胞がある種の癌細胞に形質転換することを抑制する機能を備えている。それ故、癌抑制遺伝子産物の機能が損なわれることにより、正常細胞が悪性の形質転換細胞になる（Klein, G., FASEB J., 7, 821‐825 (1993)）。癌細胞が悪性腫瘍に成長するためには、細胞は、癌抑制遺伝子の正常なコピー数を制御するための機能を欠失しなくてはならない。ｐ５３癌抑制遺伝子をコードする配列の修飾が、ヒトの悪性腫瘍における一般的な遺伝子変化の一つであることが見つかっている（Bishop, J.M., Cell, 64, 235‐248 (1991); and Weinberg, R.A., Science, 254, 1138‐1146 (1991)）。
【０００３】
しかしながら、報告されているｐ５３の変異は乳癌において３０％の範囲であるから、いくつかの乳癌組織のみが、ｐ５３の変異を示すと見積もられている（Keen, J.C. & Davidson, N. E., Cancer, 97, 825‐833 (2003)、及び、Borresen‐Dale, A‐L., Human Mutation, 21, 292‐300 (2003)）。
【０００４】
ｐ５３の変異は、肝癌、特に、アフラトキシンＢ１に曝された領域またはＢ型肝炎ウィルスに高頻度に感染された領域において少なくとも５０％の割合を占めている。また、ｐ５３の変異は、ｐ５３癌遺伝子の２４９番目のコドンにおけるミスセンス変異によって主に特徴付けられている（Montesano, R. et al., J. Natl. Cancer Inst., 89, 1844‐1851 (1997); Szymanska, K. & Hainaut, P. Acta Biochimica Polonica, 50, 231‐238 (2003)）。しかしながら、アメリカ及び西ヨーロッパにおいてｐ５３の変異は乳癌の３０％の範囲に過ぎず、上述した変異がより頻繁に起こるホットスポットが存在しない（Szymanska, K. & Hainaut, P. Acta Biochimica Polonica, 50, 231‐238 (2003)）。
【０００５】
従って、本発明の発明者らは、正常乳房組織と乳癌との間において、または、正常肝臓組織と肝癌との間において、差次的に発現された遺伝子を効率的に表示するためにｍＲＮＡのディファレンシャル・ディスプレイ法（differential display （ＤＤ）法）（Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967‐971 (1992);及び、Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966‐6968 (1993)）を用いて正常乳房組織から新規な癌抑制遺伝子を分離することを熱心に試みた。
【０００６】
〔発明の開示〕
〔技術的問題点〕
したがって、本発明は先行技術の問題点を解決するために意図されたものであり、それ故、本発明の目的は、新規ヒト癌抑制遺伝子を提供することである。
【０００７】
また、本発明の別の目的は、新規ヒト癌抑制遺伝子によってコードされる癌抑制タンパク質を提供することである。
【０００８】
また、本発明の別の目的は、新規ヒト癌抑制遺伝子を含む発現ベクターを提供することである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、上記発現ベクターによって形質転換された細胞を提供することである。
【００１０】
〔技術的解決〕
上述した目的を達成するために、本発明は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子（増殖抑制遺伝子１２（growth‐inhibiting gene 12）、本明細書においては、「ＧＩＧ１２」とも記載する。）を提供する。
【００１１】
その他の目的を達成するために、本発明は、ＧＩＧ１２遺伝子によってコードされる、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するヒト癌抑制タンパク質を提供する。
【００１２】
また、本発明は、配列番号５に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子（増殖抑制遺伝子１７（growth‐inhibiting gene 17）、本明細書においては、「ＧＩＧ１７」とも記載する。）も提供する。
【００１３】
本発明は、ＧＩＧ１７遺伝子によってコードされる、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するヒト癌抑制タンパク質を提供する。
【００１４】
また、本発明は、配列番号９に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子（増殖抑制遺伝子１９（growth‐inhibiting gene 19）、本明細書においては、「ＧＩＧ１９」とも記載する。）も提供する。
【００１５】
本発明は、ＧＩＧ１９遺伝子によってコードされる、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するヒト癌抑制タンパク質を提供する。
【００１６】
また、本発明は、配列番号１３に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子（増殖抑制遺伝子２０（growth‐inhibiting gene 20）、本明細書においては、「ＧＩＧ２０」とも記載する。）も提供する。
【００１７】
本発明は、ＧＩＧ２０遺伝子によってコードされる、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するヒト癌抑制タンパク質を提供する。
【００１８】
また、本発明は、配列番号１７に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子（増殖抑制遺伝子２２（growth‐inhibiting gene 22）、本明細書においては、「ＧＩＧ２２」とも記載する。）も提供する。
【００１９】
本発明は、ＧＩＧ２２遺伝子によってコードされる、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するヒト癌抑制タンパク質を提供する。
【００２０】
また、本発明は、配列番号２１に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子（増殖抑制遺伝子２５（growth‐inhibiting gene 25）、本明細書においては、「ＧＩＧ２５」とも記載する。）も提供する。
【００２１】
本発明は、ＧＩＧ２５遺伝子によってコードされる、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するヒト癌抑制タンパク質を提供する。
【００２２】
また、本発明は、配列番号２５に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子（増殖抑制遺伝子３６（growth‐inhibiting gene 36）、本明細書においては、「ＧＩＧ３６」とも記載する。）も提供する。
【００２３】
本発明は、ＧＩＧ３６遺伝子によってコードされる、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するヒト癌抑制タンパク質を提供する。
【００２４】
また、本発明は、配列番号２９に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子（増殖抑制遺伝子２（growth‐inhibiting gene 2）、本明細書においては、「ＧＩＧ２」とも記載する。）も提供する。
【００２５】
本発明は、ＧＩＧ２遺伝子によってコードされる、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するヒト癌抑制タンパク質を提供する。
【００２６】
さらにもう一つ別の目的によれば、本発明は、上述した各遺伝子を含む発現ベクターを提供する。
【００２７】
さらにもう一つ別の目的によれば、本発明は、各発現ベクターによって形質転換された細胞を提供する。
【００２８】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の好ましい実施の形態における、これらの特徴、その他の特徴、様態、及び利点は、添付の図面についての以下の詳細な記述においてさらに十分に記載されている。
【００２９】
図面において、図１は、配列番号３に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３２及び配列番号４に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【００３０】
図２は、配列番号７に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ７及び配列番号８に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【００３１】
図３は、配列番号１１に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４５及び配列番号１２に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【００３２】
図４は、配列番号１５に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０及び配列番号１６に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【００３３】
図５は、配列番号１９に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３０及び配列番号２０に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【００３４】
図６は、配列番号２３に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０及び配列番号２４に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【００３５】
図７は、配列番号２７に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ２９及び配列番号２８に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【００３６】
図８は、配列番号３１に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３２及び配列番号３２に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【００３７】
図９は、ＧＩＧ１２の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【００３８】
図１０は、ＧＩＧ１７の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【００３９】
図１１は、ＧＩＧ１９の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【００４０】
図１２は、ＧＩＧ２０の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【００４１】
図１３は、ＧＩＧ２２の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【００４２】
図１４は、ＧＩＧ２５の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【００４３】
図１５は、ＧＩＧ３６の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【００４４】
図１６は、ＧＩＧ２の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【００４５】
図１７（ａ）は、ＧＩＧ１２遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図１７（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００４６】
図１８（ａ）は、ＧＩＧ１７遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図１８（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００４７】
図１９（ａ）は、ＧＩＧ１９遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図１９（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００４８】
図２０（ａ）は、ＧＩＧ２０遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図２０（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００４９】
図２１（ａ）は、ＧＩＧ２２遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図２１（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００５０】
図２２（ａ）は、ＧＩＧ２５遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図２２（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００５１】
図２３（ａ）は、ＧＩＧ３６遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図２３（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００５２】
図２４（ａ）は、ＧＩＧ２遺伝子が、正常肺組織、原発性肺癌組織、転移性肺癌組織、及び肺癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図２４（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００５３】
図２５（ａ）は、ＧＩＧ１２遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図２５（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００５４】
図２６（ａ）は、ＧＩＧ１７遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図２６（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００５５】
図２７（ａ）は、ＧＩＧ１９遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図２７（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００５６】
図２８（ａ）は、ＧＩＧ２０遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図２８（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００５７】
図２９（ａ）は、ＧＩＧ２２遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図２９（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００５８】
図３０（ａ）は、ＧＩＧ２５遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図３０（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００５９】
図３１（ａ）は、ＧＩＧ３６遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図３１（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００６０】
図３２（ａ）は、ＧＩＧ２遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図３２（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００６１】
図３３（ａ）は、ＧＩＧ１２遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図３３（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００６２】
図３４（ａ）は、ＧＩＧ１７遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図３４（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００６３】
図３５（ａ）は、ＧＩＧ１９遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図３５（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００６４】
図３６（ａ）は、ＧＩＧ２０遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図３６（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００６５】
図３７（ａ）は、ＧＩＧ２２遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図３７（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００６６】
図３８（ａ）は、ＧＩＧ２５遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図３８（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００６７】
図３９（ａ）は、ＧＩＧ３６遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図３９（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００６８】
図４０（ａ）は、ＧＩＧ２遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、図４０（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【００６９】
図４１は、野生型ＭＣＦ‐７細胞、ＧＩＧ１２遺伝子によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７乳癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【００７０】
図４２は、野生型ＨｅｐＧ２肝癌細胞株、ＧＩＧ１７遺伝子によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【００７１】
図４３は、野生型ＨｅｐＧ２肝癌細胞株、ＧＩＧ１９遺伝子によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【００７２】
図４４は、野生型ＨｅｐＧ２肝癌細胞株、ＧＩＧ２０遺伝子によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【００７３】
図４５は、野生型ＨｅｐＧ２肝癌細胞株、ＧＩＧ２２遺伝子によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【００７４】
図４６は、野生型ＨｅｐＧ２肝癌細胞株、ＧＩＧ２５遺伝子によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【００７５】
図４７は、野生型ＨｅｐＧ２肝癌細胞株、ＧＩＧ３６遺伝子によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【００７６】
図４８は、野生型Ａ５４９肺癌細胞株、ＧＩＧ２遺伝子によってトランスフェクトされたＡ５４９肺癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＡ５４９細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【００７７】
〔最良の形態〕
以下では、本発明の好ましい実施の形態が、添付の図面を参照しながら詳細に記載されている。
【００７８】
＜１．ＧＩＧ１２＞
本発明の遺伝子は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子３６（ＧＩＧ３６）である。ＧＩＧ３６は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＡＹ４９３４１７として寄託されている（発行日：２００５年３月１日）。そして、寄託された遺伝子のＤＮＡ配列のいくつかは、データベースに受託番号ＮＭ＿００２３４３として寄託されたラクトトランスフェリンのＤＮＡ配列と同一である。ラクトトランスフェリンは主に母乳及び血清において豊富に分布している。また、その機能は、第２鉄イオン（ferric ion）のキャリアーとしてのみ知られている（Kanyshkova, G.T., et al., Biochemistry (Moscow), 66, 1‐7 (2001)）。それと同時に、ラクトトランスフェリンは、強い抗菌活性のみを有していることが見つかっていた(Oppenheimer, J.S. J. Nutr., 131, 6165‐6335 (2001); Shugars, C.D., et al., Gerontology, 47, 246‐253 (2001))。
【００７９】
しかしながら、予め報告されていた機能に反して、本研究の結果からラクトトランスフェリンが様々な発癌現象に密接に関連していることが発見された。様々な正常組織においてＧＩＧ１２癌抑制遺伝子の発現が増加している一方、ＧＩＧ１２癌抑制遺伝子は、乳癌を含む様々なヒト腫瘍においてまったく発現していないことも発見された。
【００８０】
配列番号１に示されるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の１１１から２２４６までの塩基の位置に対応する一つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含んでいる（２２４４から２２４６までの塩基の位置は終止コドンを表す。）。しかしながら、コドンには縮重が存在するという理由から、または、生物にとって遺伝子を発現するためにコドンが優先されることを考慮すれば、本発明の遺伝子は、コード領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化することなくコード領域において様々な修飾を受けてもよい。また、本発明の遺伝子は、遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内のコード領域を除いた領域において様々な修飾を受けてもよいし、または、様々に変更されてもよい。そのような修飾された遺伝子も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本発明は、遺伝子として、及び遺伝子の断片として実質的に同じＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドも含んでいる。用語「実質的に同じポリヌクレオチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のあるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００８１】
本発明の遺伝子から発現したタンパク質は、７１１アミノ酸残基からなり、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有している。また、該タンパク質の分子量は、およそ７８ｋＤａである。しかしながら、タンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内であればタンパク質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換されてもよいし、付加されてもよいし、欠失されてもよい。また、タンパク質のいくつかの部分のみが、その使用に応じて用いられてもよい。そのような修飾されたアミノ酸配列も本発明の範囲に含まれる。従って、本発明は、タンパク質として及びタンパク質断片として実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。用語「実質的に同じポリペプチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のある配列を有しているポリペプチドを意味する。
【００８２】
本発明の遺伝子及びタンパク質は、ヒトの組織から分離されてもよいし、またはＤＮＡもしくはペプチドを合成するための公知の方法にしたがって合成されてもよい。例えば、本発明の遺伝子は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列情報に基づいて従来の方法に従ってスクリーニングされてクローニングされてもよい。もう一つ別の例として、癌組織または癌細胞株において発現していないが、正常組織においてのみ差次的に発現している６８０ｂｐのｃＤＮＡ断片は、配列番号３に示されるランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３２（５’‐ＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＡ‐３’）及び配列番号４に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー（５’‐ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ‐３’）を用いて、正常組織及び癌組織または癌細胞株から抽出された全ＲＮＡに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）を実行することによって取得されてもよい。そして、得られた断片は、プローブとして用いられて、全長ｃＤＮＡクローンを得るためにｃＤＮＡライブラリーに対してプラークハイブリダイズされてもよい。
【００８３】
このようにして調製された遺伝子を公知の微生物または動物細胞において発現させるためのベクターに挿入することにより、発現ベクターが得られる。そして、当該発現ベクターを、例えばエシェリキア・コリ（Escherichia coli）もしくはＭＣＦ‐７細胞株などの適切な宿主細胞に導入することによって、遺伝子のｃＤＮＡが大量に複製されてもよいし、または、その遺伝子のタンパク質が工業用に量産されてもよい。発現ベクターをコンストラクトするときには、プロモーター及びターミネーター、自己複製配列、分泌シグナルなどのようなＤＮＡ調節配列が、遺伝子またはタンパク質を生産するように設計された宿主細胞の種類に依存して適切に選択されてもよいし、連結されてもよい。
【００８４】
本発明の発明者らは、全長のＧＩＧ１２ｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、アメリカ）に挿入して、得られた発現ベクターを用いてエシェリキア・コリＤＨ５αを形質転換して、形質転換体を得た。また、この形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ１２／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけ、受託番号ＫＣＴＣ  １０６４２ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズ（Korean Collection for Type Cultures）に２００４年５月２４日に寄託した。
【００８５】
本発明の遺伝子は、正常組織、好ましくは乳房、肺、胸腺、肝臓、骨格筋、腎臓、脾臓、心臓、胎盤、及び、抹消血に過剰発現しており、発癌を抑制していると考えられる。本発明の遺伝子は、およそ２．４ｋｂのサイズのｍＲＮＡ転写産物としてこれらの組織に主に過剰発現している。特に、本発明の遺伝子は、正常組織においてのみ差次的に発現している。例えば、本発明の遺伝子は、乳癌組織や乳癌細胞株のＭＣＦ‐７などの癌組織及び癌細胞には発現しておらず、正常組織においてのみ差次的に発現している。
【００８６】
本発明の遺伝子が導入された癌細胞株は高死亡率を示すので、本発明の遺伝子は癌に対する治療及び予防に効果的に用いられてもよい。
【００８７】
＜２．ＧＩＧ１７＞
本発明の遺伝子は、配列番号５に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子１７（ＧＩＧ１７）である。ＧＩＧ１７は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＡＹ５４４１２２として寄託されている（発行日：２００５年１２月３１日）。そして寄託された遺伝子は、当該遺伝子の３塩基対が、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号Ｍ１９９２２として寄託されているヒト・フルクトース１，６ビスフォスファターゼのＤＮＡ配列と異なっているという遺伝子多型を有している。
【００８８】
グルコース代謝において最も重要な反応の一つは、フルクトース１，６‐２リン酸をフルクトース‐６‐リン酸に加水分解することである（Marcus, F. et al., Arch. Biol. Med. Exp., 20, 371‐378 (1987); Okar, D,A. & Lange, A.J. Biofactors, 10, 1‐14 (1999)）。その代謝を触媒する酵素が、ヒト・フルクトース１，６ビスフォスファターゼである。ヒト・フルクトース１，６ビスフォスファターゼは、全ての生物に存在している。
【００８９】
しかしながら、以前から報告されていたグルコース代謝に反して、本研究結果からＧＩＧ１７癌抑制遺伝子は、様々な正常組織において顕著に増加している一方で、肝癌を含む様々なヒト腫瘍においてまったく発現していないことが明らかになった。
【００９０】
配列番号５に示されるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の８８から１１０４までの塩基の位置に対応する一つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含んでいる（１１０２から１１０４までの塩基の位置は終止コドンを表す。）。しかしながら、コドンには縮重が存在するという理由から、または、生物にとって遺伝子を発現するためにコドンが優先されることを考慮すれば、本発明の遺伝子は、コード領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化することなくコード領域において様々な修飾を受けてもよい。また、本発明の遺伝子は、遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内のコード領域を除いた領域において様々な修飾を受けてもよいし、または、様々に変更されてもよい。そのような修飾された遺伝子も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本発明は、遺伝子として、及び遺伝子の断片として実質的に同じＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドも含んでいる。用語「実質的に同じポリヌクレオチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のあるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００９１】
本発明の遺伝子から発現したタンパク質は、３３８アミノ酸残基からなり、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有している。また、該タンパク質の分子量は、およそ３７ｋＤａである。しかしながら、タンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内であればタンパク質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換されてもよいし、付加されてもよいし、欠失されてもよい。また、タンパク質のいくつかの部分のみが、その使用に応じて用いられてもよい。そのような修飾されたアミノ酸配列も本発明の範囲に含まれる。従って、本発明は、タンパク質として及びタンパク質断片として実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。用語「実質的に同じポリペプチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のある配列を有しているポリペプチドを意味する。
【００９２】
本発明の遺伝子及びタンパク質は、ヒトの組織から分離されてもよいし、またはＤＮＡもしくはペプチドを合成するための公知の方法にしたがって合成されてもよい。例えば、本発明の遺伝子は、配列番号５に示されるＤＮＡ配列情報に基づいて従来の方法に従ってスクリーニングされてクローニングされてもよい。もう一つ別の例として、癌組織または癌細胞株において発現していないが、正常組織においてのみ差次的に発現している２５０ｂｐのｃＤＮＡ断片は、配列番号７に示されるランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ７（５’‐ＡＡＧＣＴＴＡＡＣＧＡＧＧ‐３’）及び配列番号８に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー（５’‐ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ‐３’）を用いて、正常組織及び癌組織または癌細胞株から抽出された全ＲＮＡに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）を実行することによって取得されてもよい。そして、得られた断片は、プローブとして用いられて、全長ｃＤＮＡクローンを得るためにｃＤＮＡライブラリーに対してプラークハイブリダイズされてもよい。
【００９３】
このようにして調製された遺伝子を公知の微生物または動物細胞において発現させるためのベクターに挿入することにより、発現ベクターが得られる。そして、当該発現ベクターを、例えばエシェリキア・コリもしくはＨｅｐＧ２細胞株などの適切な宿主細胞に導入することによって、遺伝子のｃＤＮＡが大量に複製されてもよいし、または、その遺伝子のタンパク質が工業用に量産されてもよい。発現ベクターをコンストラクトするときには、プロモーター及びターミネーター、自己複製配列、分泌シグナルなどのようなＤＮＡ調節配列が、遺伝子またはタンパク質を生産するように設計された宿主細胞の種類に依存して適切に選択されてもよいし、連結されてもよい。
【００９４】
本発明の発明者らは、全長のＧＩＧ１７ｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、アメリカ）に挿入して、得られた発現ベクターを用いてエシェリキア・コリＤＨ５αを形質転換して、形質転換体を得た。また、この形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ１７／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけ、受託番号ＫＣＴＣ  １０６５５ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズ（Korean Collection for Type Cultures）に２００４年６月１４日に寄託した。
【００９５】
本発明の遺伝子は、正常組織、好ましくは肝臓、腎臓、脾臓、及び、肺に過剰発現しており、発癌を抑制していると考えられる。本発明の遺伝子は、発癌を誘導するためにたとえ白血病、子宮癌、悪性リンパ腫、大腸癌、及び皮膚癌においてでさえも抑制されると考えられる。本発明の遺伝子は、およそ１．３ｋｂのサイズのｍＲＮＡ転写産物としてこれらの組織に主に過剰発現している。特に、本発明の遺伝子は、正常組織においてのみ差次的に発現している。例えば、本発明の遺伝子は、肝癌組織や肝癌細胞株のＨｅｐＧ２などの癌組織及び癌細胞には発現しておらず、正常肝臓組織においてのみ差次的に発現している。
【００９６】
本発明の遺伝子が導入された癌細胞株は高死亡率を示すので、本発明の遺伝子は癌に対する治療及び予防に効果的に用いられてもよい。
【００９７】
＜３．ＧＩＧ１９＞
本発明の遺伝子は、配列番号９に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子１９（ＧＩＧ１９）である。ＧＩＧ１９は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＡＹ５４４１２３として寄託されている（発行日：２００５年１２月３１日）。そして寄託された遺伝子のＤＮＡ配列は、ヒト・アルファ‐１‐ミクログロブリン／ビクニン前駆体（Homo sapiens alpha‐1‐microglobulin/bikunin precursor）のＤＮＡ配列及びヒト・タンパク質ＨＣのｍＲＮＡ（human mRNA for protein HC）（アルファ‐１‐ミクログロブリン）のＤＮＡ配列と同一である。ヒト・アルファ‐１‐ミクログロブリン／ビクニン前駆体及びヒト・タンパク質ＨＣのｍＲＮＡは、既存のデータベースに受託番号ＢＣ０４１５９３及びＸ０４２２５としてそれぞれ寄託されている。ＨＣタンパク質としても参照されるアルファ‐１‐ミクログロブリンは免疫抑制効果を有するリポタンパク質である（Akerstrom, B. et al., Biochimica Biophysica Acta, 1482, 172‐184 (2002); Xu, S. & Venge, P., Biochimica Biophysica Acta, 1482, 298‐307 (2002)）。しかしながら、以前から報告されている癌抑制遺伝子の機能に反して、本研究結果からＧＩＧ１９癌抑制遺伝子は、その発現が様々な正常肝臓組織において顕著に増加している一方で、肝癌においてまったく発現していないことが明らかになった。
【００９８】
配列番号９に示されるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の６１から１１１９までの塩基の位置に対応する一つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含んでいる（５９から６１までの塩基の位置は終止コドンを表す。）。しかしながら、コドンには縮重が存在するという理由から、または、生物にとって遺伝子を発現するためにコドンが優先されることを考慮すれば、本発明の遺伝子は、コード領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化することなくコード領域において様々な修飾を受けてもよい。また、本発明の遺伝子は、遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内のコード領域を除いた領域において様々な修飾を受けてもよいし、または、様々に変更されてもよい。そのような修飾された遺伝子も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本発明は、遺伝子として、及び遺伝子の断片として実質的に同じＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドも含んでいる。用語「実質的に同じポリヌクレオチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のあるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００９９】
本発明の遺伝子から発現したタンパク質は、３５２アミノ酸残基からなり、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有している。また、該タンパク質の分子量は、およそ３９ｋＤａである。しかしながら、タンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内であればタンパク質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換されてもよいし、付加されてもよいし、欠失されてもよい。また、タンパク質のいくつかの部分のみが、その使用に応じて用いられてもよい。そのような修飾されたアミノ酸配列も本発明の範囲に含まれる。従って、本発明は、タンパク質として及びタンパク質断片として実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。用語「実質的に同じポリペプチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のある配列を有しているポリペプチドを意味する。
【０１００】
本発明の遺伝子及びタンパク質は、ヒトの組織から分離されてもよいし、またはＤＮＡもしくはペプチドを合成するための公知の方法にしたがって合成されてもよい。例えば、本発明の遺伝子は、配列番号９に示されるＤＮＡ配列情報に基づいて従来の方法に従ってスクリーニングされてクローニングされてもよい。もう一つ別の例として、癌組織または癌細胞株において発現していないが、正常組織においてのみ差次的に発現している２８１ｂｐのｃＤＮＡ断片は、配列番号１１に示されるランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０（５’‐ＡＡＧＣＴＴＧＴＣＡＧＣＣ‐３’）及び配列番号１２に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー（５’‐ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ‐３’）を用いて、正常組織及び癌組織または癌細胞株から抽出された全ＲＮＡに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）を実行することによって取得されてもよい。そして、得られた断片は、プローブとして用いられて、全長ｃＤＮＡクローンを得るためにｃＤＮＡライブラリーに対してプラークハイブリダイズされてもよい。
【０１０１】
このようにして調製された遺伝子を公知の微生物または動物細胞において発現させるためのベクターに挿入することにより、発現ベクターが得られる。そして、当該発現ベクターを、例えばエシェリキア・コリもしくはＨｅｐＧ２細胞株などの適切な宿主細胞に導入することによって、遺伝子のｃＤＮＡが大量に複製されてもよいし、または、その遺伝子のタンパク質が工業用に量産されてもよい。発現ベクターをコンストラクトするときには、プロモーター及びターミネーター、自己複製配列、分泌シグナルなどのようなＤＮＡ調節配列が、遺伝子またはタンパク質を生産するように設計された宿主細胞の種類に依存して適切に選択されてもよいし、連結されてもよい。
【０１０２】
本発明の発明者らは、全長のＧＩＧ１９ｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、アメリカ）に挿入して、得られた発現ベクターを用いてエシェリキア・コリＤＨ５αを形質転換して、形質転換体を得た。また、この形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ１９／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけ、受託番号ＫＣＴＣ  １０６５６ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズ（Korean Collection for Type Cultures）に２００４年６月１４日に寄託した。
【０１０３】
本発明の遺伝子は、正常組織、好ましくは肝臓組織において過剰発現しており、発癌を抑制していると考えられる。本発明の遺伝子は、およそ１．２ｋｂのサイズのｍＲＮＡ転写産物としてこれらの組織に主に過剰発現している。特に、本発明の遺伝子は、正常組織においてのみ差次的に発現している。例えば、本発明の遺伝子は、肝癌組織や肝癌細胞株のＨｅｐＧ２などの癌組織及び癌細胞には発現しておらず、正常肝臓組織においてのみ差次的に発現している。
【０１０４】
本発明の遺伝子が導入された肝癌細胞株は高死亡率を示すので、本発明の遺伝子は癌に対する治療及び予防に効果的に用いられてもよい。
【０１０５】
＜４．ＧＩＧ２０＞
本発明の遺伝子は、配列番号１３に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子２０（ＧＩＧ２０）である。ＧＩＧ２０は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＡＹ５４４１２４として寄託されている（発行日：２００５年１２月３１日）。そして寄託された遺伝子のＤＮＡ配列は、ヒト・アルブミンのＤＮＡ配列と同一である。ヒト・アルブミンは、既存のデータベースに受託番号ＢＣ０４１７８９として寄託されている。アルブミンは、栄養素を供給する役割のあるタンパク質であることが知られている（Grant, J.P., Ann. Surg., 220, 610‐616 (1994)）。しかしながら、以前から報告されている癌抑制遺伝子の機能に反して、本研究結果からＧＩＧ２０癌抑制遺伝子は、その発現が様々な正常肝臓組織において顕著に増加している一方で、肝癌においてまったく発現していないことが明らかになった。核内のアルブミン遺伝子が肝細胞に存在するので、本発明の遺伝子が癌抑制遺伝子であるという事実は、「アルブミン」タンパク質が正常肝細胞において生産されるということに基づいている。このことが、正常肝細胞はアルブミン遺伝子が正常に作用している細胞であるという理由である。仮にアルブミンのレベルが肝細胞における正常レベルよりも低い場合には、アルブミン遺伝子は、肝細胞において正常に作用しないか、または正常なアルブミン遺伝子の数が減少している。なお、このようなことは肝癌の症状に現れる。
【０１０６】
配列番号１３に示されるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の８から１２６１までの塩基の位置に対応する一つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含んでいる（１２５９から１２６１までの塩基の位置は終止コドンを表す。）。しかしながら、コドンには縮重が存在するという理由から、または、生物にとって遺伝子を発現するためにコドンが優先されることを考慮すれば、本発明の遺伝子は、コード領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化することなくコード領域において様々な修飾を受けてもよい。また、本発明の遺伝子は、遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内のコード領域を除いた領域において様々な修飾を受けてもよいし、または、様々に変更されてもよい。そのような修飾された遺伝子も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本発明は、遺伝子として、及び遺伝子の断片として実質的に同じＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドも含んでいる。用語「実質的に同じポリヌクレオチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のあるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを意味する。
【０１０７】
本発明の遺伝子から発現したタンパク質は、４１７アミノ酸残基からなり、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有している。また、該タンパク質の分子量は、およそ４７ｋＤａである。しかしながら、タンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内であればタンパク質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換されてもよいし、付加されてもよいし、欠失されてもよい。また、タンパク質のいくつかの部分のみが、その使用に応じて用いられてもよい。そのような修飾されたアミノ酸配列も本発明の範囲に含まれる。従って、本発明は、タンパク質として及びタンパク質断片として実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。用語「実質的に同じポリペプチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のある配列を有しているポリペプチドを意味する。
【０１０８】
本発明の遺伝子及びタンパク質は、ヒトの組織から分離されてもよいし、またはＤＮＡもしくはペプチドを合成するための公知の方法にしたがって合成されてもよい。例えば、本発明の遺伝子は、配列番号１３に示されるＤＮＡ配列情報に基づいて従来の方法に従ってスクリーニングされてクローニングされてもよい。もう一つ別の例として、癌組織または癌細胞株において発現していないが、正常組織においてのみ差次的に発現している２５６ｂｐのｃＤＮＡ断片は、配列番号１５に示されるランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０（５’‐ＡＡＧＣＴＴＧＴＣＡＧＣＣ‐３’）及び配列番号１６に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー（５’‐ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ‐３’）を用いて、正常組織及び癌組織または癌細胞株から抽出された全ＲＮＡに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）を実行することによって取得されてもよい。そして、得られた断片は、プローブとして用いられて、全長ｃＤＮＡクローンを得るためにｃＤＮＡライブラリーに対してプラークハイブリダイズされてもよい。
【０１０９】
このようにして調製された遺伝子を公知の微生物または動物細胞において発現させるためのベクターに挿入することにより、発現ベクターが得られる。そして、当該発現ベクターを、例えばエシェリキア・コリもしくはＨｅｐＧ２細胞株などの適切な宿主細胞に導入することによって、遺伝子のｃＤＮＡが大量に複製されてもよいし、または、その遺伝子のタンパク質が工業用に量産されてもよい。発現ベクターをコンストラクトするときには、プロモーター及びターミネーター、自己複製配列、分泌シグナルなどのようなＤＮＡ調節配列が、遺伝子またはタンパク質を生産するように設計された宿主細胞の種類に依存して適切に選択されてもよいし、連結されてもよい。
【０１１０】
本発明の発明者らは、全長のＧＩＧ２０ｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、アメリカ）に挿入して、得られた発現ベクターを用いてエシェリキア・コリＤＨ５αを形質転換して、形質転換体を得た。また、この形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ２０／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけ、受託番号ＫＣＴＣ  １０６５７ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズに２００４年６月１４日に寄託した。
【０１１１】
本発明の遺伝子は、正常組織、好ましくは肝臓組織において過剰発現しており、発癌を抑制していると考えられる。本発明の遺伝子は、およそ２．４ｋｂのサイズのｍＲＮＡ転写産物としてこれらの組織に主に過剰発現している。特に、本発明の遺伝子は、正常組織においてのみ差次的に発現している。例えば、本発明の遺伝子は、肝癌組織や肝癌細胞株のＨｅｐＧ２などの癌組織及び癌細胞には発現しておらず、正常肝臓組織においてのみ差次的に発現している。
【０１１２】
本発明の遺伝子が導入された肝癌細胞株は高死亡率を示すので、本発明の遺伝子は癌に対する治療及び予防に効果的に用いられてもよい。
【０１１３】
＜５．ＧＩＧ２２＞
本発明の遺伝子は、配列番号１７に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子２２（ＧＩＧ２２）である。ＧＩＧ２２は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＡＹ５１２５６５として寄託されている（発行日：２００５年５月３１日）。そして寄託された遺伝子のＤＮＡ配列のいくつかは、ヒト・ＤＮＡＪドメイン含有タンパク質ＭＣＪ遺伝子（DNAJ domain‐containing protein MCJ gene）ＤＮＡ配列と異なっている。ヒト・ＤＮＡＪドメイン含有タンパク質ＭＣＪ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＡＦ１２６７４３として寄託されている。ＧＩＧ２２遺伝子から発現したアミノ酸の配列も、ヒト・ＤＮＡＪドメイン含有タンパク質ＭＣＪのアミノ酸配列と異なっている。卵巣癌について言えば、ＭＣＪ遺伝子の発現が減少することが報告されている（Shridhar, V. et al., Cancer Res., 61, 4258‐4265 (2001)）。しかし、本研究結果からＧＩＧ２２癌抑制遺伝子は、その発現が様々な正常組織において顕著に増加している一方で、肝癌を含む様々なヒトの腫瘍においてまったく発現していないことが明らかになった。
【０１１４】
配列番号１７に示されるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の９５から５４７までの塩基の位置に対応する一つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含んでいる（５４５から５４７までの塩基の位置は終止コドンを表す。）しかしながら、コドンには縮重が存在するという理由から、または、生物にとって遺伝子を発現するためにコドンが優先されることを考慮すれば、本発明の遺伝子は、コード領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化することなくコード領域において様々な修飾を受けてもよい。また、本発明の遺伝子は、遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内のコード領域を除いた領域において様々な修飾を受けてもよいし、または、様々に変更されてもよい。そのような修飾された遺伝子も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本発明は、遺伝子として、及び遺伝子の断片として実質的に同じＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドも含んでいる。用語「実質的に同じポリヌクレオチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のあるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを意味する。
【０１１５】
本発明の遺伝子から発現したタンパク質は、１５０アミノ酸残基からなり、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有している。また、該タンパク質の分子量は、およそ１６ｋＤａである。しかしながら、タンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内であればタンパク質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換されてもよいし、付加されてもよいし、欠失されてもよい。また、タンパク質のいくつかの部分のみが、その使用に応じて用いられてもよい。そのような修飾されたアミノ酸配列も本発明の範囲に含まれる。従って、本発明は、タンパク質として及びタンパク質断片として実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。用語「実質的に同じポリペプチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のある配列を有しているポリペプチドを意味する。
【０１１６】
本発明の遺伝子及びタンパク質は、ヒトの組織から分離されてもよいし、またはＤＮＡもしくはペプチドを合成するための公知の方法にしたがって合成されてもよい。例えば、本発明の遺伝子は、配列番号１７に示されるＤＮＡ配列情報に基づいて従来の方法に従ってスクリーニングされてクローニングされてもよい。もう一つ別の例として、癌組織または癌細胞株において発現していないが、正常組織においてのみ差次的に発現している２８１ｂｐのｃＤＮＡ断片は、配列番号１９に示されるランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３０（５’‐ＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＣＧＴ‐３’）及び配列番号２０に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー（５’‐ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ‐３’）を用いて、正常組織及び癌組織または癌細胞株から抽出された全ＲＮＡに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）を実行することによって取得されてもよい。そして、得られた断片は、プローブとして用いられて、全長ｃＤＮＡクローンを得るためにｃＤＮＡライブラリーに対してプラークハイブリダイズされてもよい。
【０１１７】
このようにして調製された遺伝子を公知の微生物または動物細胞において発現させるためのベクターに挿入することにより、発現ベクターが得られる。そして、当該発現ベクターを、例えばエシェリキア・コリもしくはＨｅｐＧ２細胞株などの適切な宿主細胞に導入することによって、遺伝子のｃＤＮＡが大量に複製されてもよいし、または、その遺伝子のタンパク質が工業用に量産されてもよい。発現ベクターをコンストラクトするときには、プロモーター及びターミネーター、自己複製配列、分泌シグナルなどのようなＤＮＡ調節配列が、遺伝子またはタンパク質を生産するように設計された宿主細胞の種類に依存して適切に選択されてもよいし、連結されてもよい。
【０１１８】
本発明の発明者らは、全長のＧＩＧ２２ｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、アメリカ）に挿入して、得られた発現ベクターを用いてエシェリキア・コリＤＨ５αを形質転換して、形質転換体を得た。また、この形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ２２／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけ、受託番号ＫＣＴＣ  １０６５８ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズ（Korean Collection for Type Cultures）に２００４年６月１４日に寄託した。
【０１１９】
本発明の遺伝子は、正常組織、好ましくは心臓、筋肉、肝臓、腎臓、胎盤、脾臓、肺、小腸、大腸、胸腺、白血球において過剰発現しており、発癌を抑制していると考えられる。本発明の遺伝子は、発癌を誘導するために白血病、子宮癌、悪性リンパ腫、大腸癌、肺癌、及び、皮膚癌において抑制されると考えられる。本発明の遺伝子は、およそ０．６ｋｂのサイズのｍＲＮＡ転写産物としてこれらの組織に主に過剰発現している。特に、本発明の遺伝子は、正常組織においてのみ差次的に発現している。例えば、本発明の遺伝子は、肝癌組織や肝癌細胞株のＨｅｐＧ２などの癌組織及び癌細胞には発現しておらず、正常肝臓組織においてのみ差次的に発現している。
【０１２０】
本発明の遺伝子が導入された癌細胞株は高死亡率を示すので、本発明の遺伝子は癌に対する治療及び予防に効果的に用いられてもよい。
【０１２１】
＜６．ＧＩＧ２５＞
本発明の遺伝子は、配列番号２１に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子２５（ＧＩＧ２５）である。ＧＩＧ２５は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＡＹ５１３２７６として寄託されている（発行日：２００５年１２月３１日）。そして寄託された遺伝子のＤＮＡ配列のいくつかは、ヒト・セリン（またはシステイン）プロテアーゼインヒビター・クレードＡ（アルファ‐１・アンチプロテアーゼ、アンチトリプシン）メンバー３遺伝子のＤＮＡ配列と異なっている。ヒト・セリン（またはシステイン）プロテアーゼインヒビター・クレードＡ（アルファ‐１・アンチプロテアーゼ、アンチトリプシン）メンバー３遺伝子は、既存のデータベースに受託番号ＢＣ０１１０５３０として寄託されている。アルファ‐１・アンチトリプシンはセリン（またはシステイン）プロテアーゼインヒビターの典型的なメンバーである。また、アルファ‐１・アンチトリプシンは、急性期タンパク質であり、その発現レベルが、炎症反応によって３〜４倍に増加することが知られている（Morgan, K., & Kalsherker, N.A., Int. J. Biochem. Cell Biol., 29, 1501‐1511 (1997)）。しかしながら、以前から報告されている癌抑制遺伝子の機能に反して、本研究結果からＧＩＧ２５癌抑制遺伝子は、その発現が様々な正常肝臓組織において顕著に増加している一方で、肝癌においてまったく発現していないことが明らかになった。
【０１２２】
配列番号２１に示されるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の４３６から１２９９までの塩基の位置に対応する一つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含んでいる（４３４から４３６までの塩基の位置は終止コドンを表す。）。しかしながら、コドンには縮重が存在するという理由から、または、生物にとって遺伝子を発現するためにコドンが優先されることを考慮すれば、本発明の遺伝子は、コード領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化することなくコード領域において様々な修飾を受けてもよい。また、本発明の遺伝子は、遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内のコード領域を除いた領域において様々な修飾を受けてもよいし、または、様々に変更されてもよい。そのような修飾された遺伝子も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本発明は、遺伝子として、及び遺伝子の断片として実質的に同じＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドも含んでいる。用語「実質的に同じポリヌクレオチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のあるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを意味する。
【０１２３】
本発明の遺伝子から発現したタンパク質は、２８７アミノ酸残基からなり、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有している。また、該タンパク質の分子量は、およそ３３ｋＤａである。しかしながら、タンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内であればタンパク質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換されてもよいし、付加されてもよいし、欠失されてもよい。また、タンパク質のいくつかの部分のみが、その使用に応じて用いられてもよい。そのような修飾されたアミノ酸配列も本発明の範囲に含まれる。従って、本発明は、タンパク質として及びタンパク質断片として実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。用語「実質的に同じポリペプチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のある配列を有しているポリペプチドを意味する。
【０１２４】
本発明の遺伝子及びタンパク質は、ヒトの組織から分離されてもよいし、またはＤＮＡもしくはペプチドを合成するための公知の方法にしたがって合成されてもよい。例えば、本発明の遺伝子は、配列番号２１に示されるＤＮＡ配列情報に基づいて従来の方法に従ってスクリーニングされてクローニングされてもよい。もう一つ別の例として、癌組織または癌細胞株において発現していないが、正常組織においてのみ差次的に発現している２５０ｂｐのｃＤＮＡ断片は、配列番号２３に示されるランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０（５’‐ＡＡＧＣＴＴＧＴＣＡＧＣＣ‐３’）及び配列番号２４に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー（５’‐ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ‐３’）を用いて、正常組織及び癌組織または癌細胞株から抽出された全ＲＮＡに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）を実行することによって取得されてもよい。そして、得られた断片は、プローブとして用いられて、全長ｃＤＮＡクローンを得るためにｃＤＮＡライブラリーに対してプラークハイブリダイズされてもよい。
【０１２５】
このようにして調製された遺伝子を公知の微生物または動物細胞において発現させるためのベクターに挿入することにより、発現ベクターが得られる。そして、当該発現ベクターを、例えばエシェリキア・コリもしくはＨｅｐＧ２細胞株などの適切な宿主細胞に導入することによって、遺伝子のｃＤＮＡが大量に複製されてもよいし、または、その遺伝子のタンパク質が工業用に量産されてもよい。発現ベクターをコンストラクトするときには、プロモーター及びターミネーター、自己複製配列、分泌シグナルなどのようなＤＮＡ調節配列が、遺伝子またはタンパク質を生産するように設計された宿主細胞の種類に依存して適切に選択されてもよいし、連結されてもよい。
【０１２６】
本発明の発明者らは、全長のＧＩＧ２５ｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、アメリカ）に挿入して、得られた発現ベクターを用いてエシェリキア・コリＤＨ５αを形質転換して、形質転換体を得た。また、この形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ２５／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけ、受託番号ＫＣＴＣ  １０６５９ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズに２００４年６月１４日に寄託した。
【０１２７】
本発明の遺伝子は、正常組織、好ましくは肝臓組織において過剰発現しており、発癌を抑制していると考えられる。本発明の遺伝子は、およそ１．５ｋｂのサイズのｍＲＮＡ転写産物としてこれらの組織に主に過剰発現している。特に、本発明の遺伝子は、正常組織においてのみ差次的に発現している。例えば、本発明の遺伝子は、肝癌組織や肝癌細胞株のＨｅｐＧ２などの癌組織及び癌細胞には発現しておらず、正常肝臓組織においてのみ差次的に発現している。
【０１２８】
本発明の遺伝子が導入された肝癌細胞株は高死亡率を示すので、本発明の遺伝子は癌に対する治療及び予防に効果的に用いられてもよい。
【０１２９】
＜７．ＧＩＧ３６＞
本発明の遺伝子は、配列番号２５に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子３６（ＧＩＧ３６）である。ＧＩＧ３６は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＡＹ５４２３０４として寄託されている（発行日：２００５年１２月３１日）。そして寄託された遺伝子のＤＮＡ配列は、マトリックスＧｌａタンパク質のＤＮＡ配列と同一である。マトリックスＧｌａタンパク質は、既存のデータベースに受託番号Ｍ５８５４９として寄託されている。また、ＧＩＧ３６遺伝子のＤＮＡ配列の１塩基対が、受託番号ＢＣ００５２７２として寄託されているマトリックスＧｌａタンパク質のＤＮＡ配列と異なっている。マトリックスＧｌａタンパク質は、血管平滑筋細胞（Shanahan, C.M., et al., Crit. Rev. Eukaryot Gene Express., 8, 357‐375 (1998)）及び軟骨細胞（Hale, J.E., et al., J. Biol. Chem., 263, 5820‐5824 (1988)）から主に分泌され、石灰化を抑制する機能を有する（Luo, G., et al., Nature, 386, 78‐81 (1997); Price, P.A., et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 18, 1400‐1407 (1998); Price, P.A., et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 20, 317‐327 (2000)）ことが報告されている。マトリックスＧｌａ遺伝子の発現が、卵巣癌（Colleen, D., et al., Cancer Res., 61, 3869‐3876 (2001)）及び乳癌（Chen, L., et al., Oncogene, 5, 1391‐1395 (1990)）を含むいくつかの癌において増加することも報告されている。しかしながら、以前から報告されている研究に反して、本研究結果からＧＩＧ３６癌抑制遺伝子は、その発現が様々な正常組織において顕著に増加している一方で、肝癌を含む様々なヒト腫瘍においてまったく発現していないことが明らかになった。
【０１３０】
配列番号２５に示されるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の１２から３２３までの塩基の位置に対応する一つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含んでいる（３２１から３２３までの塩基の位置は終止コドンを表す。）。しかしながら、コドンには縮重が存在するという理由から、または、生物にとって遺伝子を発現するためにコドンが優先されることを考慮すれば、本発明の遺伝子は、コード領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化することなくコード領域において様々な修飾を受けてもよい。また、本発明の遺伝子は、遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内のコード領域を除いた領域において様々な修飾を受けてもよいし、または、様々に変更されてもよい。そのような修飾された遺伝子も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本発明は、遺伝子として、及び遺伝子の断片として実質的に同じＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドも含んでいる。用語「実質的に同じポリヌクレオチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のあるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを意味する。
【０１３１】
本発明の遺伝子から発現したタンパク質は、１０３アミノ酸残基からなり、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有している。また、該タンパク質の分子量は、およそ１２ｋＤａである。しかしながら、タンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内であればタンパク質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換されてもよいし、付加されてもよいし、欠失されてもよい。また、タンパク質のいくつかの部分のみが、その使用に応じて用いられてもよい。そのような修飾されたアミノ酸配列も本発明の範囲に含まれる。従って、本発明は、タンパク質として及びタンパク質断片として実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。用語「実質的に同じポリペプチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のある配列を有しているポリペプチドを意味する。
【０１３２】
本発明の遺伝子及びタンパク質は、ヒトの組織から分離されてもよいし、またはＤＮＡもしくはペプチドを合成するための公知の方法にしたがって合成されてもよい。例えば、本発明の遺伝子は、配列番号２５に示されるＤＮＡ配列情報に基づいて従来の方法に従ってスクリーニングされてクローニングされてもよい。もう一つ別の例として、癌組織または癌細胞株において発現していないが、正常組織においてのみ差次的に発現している１８２ｂｐのｃＤＮＡ断片は、配列番号２７に示されるランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ２９（５’‐ＡＡＧＣＴＴＡＧＣＡＧＣＡ‐３’）及び配列番号２８に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー（５’‐ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ‐３’）を用いて、正常組織及び癌組織または癌細胞株から抽出された全ＲＮＡに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）を実行することによって取得されてもよい。そして、得られた断片は、プローブとして用いられて、全長ｃＤＮＡクローンを得るためにｃＤＮＡライブラリーに対してプラークハイブリダイズされてもよい。
【０１３３】
このようにして調製された遺伝子を公知の微生物または動物細胞において発現させるためのベクターに挿入することにより、発現ベクターが得られる。そして、当該発現ベクターを、例えばエシェリキア・コリもしくはＭＣＦ‐７細胞株などの適切な宿主細胞に導入することによって、遺伝子のｃＤＮＡが大量に複製されてもよいし、または、その遺伝子のタンパク質が工業用に量産されてもよい。発現ベクターをコンストラクトするときには、プロモーター及びターミネーター、自己複製配列、分泌シグナルなどのようなＤＮＡ調節配列が、遺伝子またはタンパク質を生産するように設計された宿主細胞の種類に依存して適切に選択されてもよいし、連結されてもよい。
【０１３４】
本発明の発明者らは、全長のＧＩＧ３６ｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、アメリカ）に挿入して、得られた発現ベクターを用いてエシェリキア・コリＤＨ５αを形質転換して、形質転換体を得た。また、この形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ３６／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけ、受託番号ＫＣＴＣ  １０６４３ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズに２００４年５月２４日に寄託した。
【０１３５】
本発明の遺伝子は、正常組織、好ましくは肝臓、腎臓、脾臓、及び肺において過剰発現しており、発癌を抑制していると考えられる。本発明の遺伝子は、発癌を誘導するためにたとえ白血病、子宮癌、悪性リンパ腫、大腸癌、及び、皮膚癌においてでさえも抑制される。本発明の遺伝子は、およそ１．３ｋｂのサイズのｍＲＮＡ転写産物としてこれらの組織に主に過剰発現している。特に、本発明の遺伝子は、正常組織においてのみ差次的に発現している。例えば、本発明の遺伝子は、肝癌組織や肝癌細胞株のＨｅｐＧ２などの癌組織及び癌細胞には発現しておらず、正常肝臓組織においてのみ差次的に発現している。
【０１３６】
本発明の遺伝子が導入された癌細胞株は高死亡率を示すので、本発明の遺伝子は癌に対する治療及び予防に効果的に用いられてもよい。
【０１３７】
＜８．ＧＩＧ２＞
本発明の遺伝子は、配列番号２９に示されるＤＮＡ配列を有するヒト癌抑制遺伝子２（ＧＩＧ２）である。ＧＩＧ２は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＡＹ４２３７２０として寄託されている（発行日：２００４年１２月３１日）。そして寄託された遺伝子のＤＮＡ配列は、ヒト・走化性関連タンパク質（motility‐related protein、ＭＲＰ‐１）のｍＲＮＡのＤＮＡ配列及びヒト・ＣＤ９抗原（ｐ２４）（ＣＤ９）遺伝子のＤＮＡ配列と同一である。ヒト・走化性関連タンパク質（ＭＲＰ‐１）のｍＲＮＡ及びヒト・ＣＤ９抗原（ｐ２４）（ＣＤ９）遺伝子は、データベースに受託番号Ｘ６０１１１及びＮＭ＿００１７６９としてそれぞれ寄託されている。即ち、受託番号Ｘ６０１１１として寄託されているヒト・走化性関連タンパク質（ＭＲＰ‐１）のｍＲＮＡは、細胞遊走に関連していることが報告されている（Miyake, M., et al., J. Exp. Med., 174, 1347‐1354 (1991)）。また、受託番号ＮＭ＿００１７６９として寄託されているヒト・ＣＤ９抗原（ｐ２４）（ＣＤ９）遺伝子は、細胞遊走及び乳癌の浸潤能力（Sauer, G. et al., Oncol. Rep., 10, 405‐410 (2003)）及び肺癌の浸潤能力（Funakoshi, T. et al., Oncogene, 22, 674‐687 (2003)）に関連していることも報告されている。
【０１３８】
しかしながら、以前から報告されている細胞遊走及び浸潤能力に反して、本研究結果からＧＩＧ２癌抑制遺伝子は、その発現が様々な正常組織において顕著に増加している一方で、肺癌を含む様々なヒト腫瘍においてまったく発現していないこと、または非常に微かに発現していることが明らかになった。
【０１３９】
配列番号２９に示されるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の１８から７０４までの塩基の位置に対応する一つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含んでいる（７０２から７０４までの塩基の位置は終止コドンを表す。）。しかしながら、コドンには縮重が存在するという理由から、または、生物にとって遺伝子を発現するためにコドンが優先されることを考慮すれば、本発明の遺伝子は、コード領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化することなくコード領域において様々な修飾を受けてもよい。また、本発明の遺伝子は、遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内のコード領域を除いた領域において様々な修飾を受けてもよいし、または、様々に変更されてもよい。そのような修飾された遺伝子も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本発明は、遺伝子として、及び遺伝子の断片として実質的に同じＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドも含んでいる。用語「実質的に同じポリヌクレオチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のあるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを意味する。
【０１４０】
本発明の遺伝子から発現したタンパク質は、２２８アミノ酸残基からなり、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有している。また、該タンパク質の分子量は、およそ２５ｋＤａである。しかしながら、タンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内であればタンパク質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換されてもよいし、付加されてもよいし、欠失されてもよい。また、タンパク質のいくつかの部分のみが、その使用に応じて用いられてもよい。そのような修飾されたアミノ酸配列も本発明の範囲に含まれる。従って、本発明は、タンパク質として及びタンパク質断片として実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。用語「実質的に同じポリペプチド」は、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性のある配列を有しているポリペプチドを意味する。
【０１４１】
本発明の遺伝子及びタンパク質は、ヒトの組織から分離されてもよいし、またはＤＮＡもしくはペプチドを合成するための公知の方法にしたがって合成されてもよい。例えば、本発明の遺伝子は、配列番号２９に示されるＤＮＡ配列情報に基づいて従来の方法に従ってスクリーニングされてクローニングされてもよい。もう一つ別の例として、癌組織または癌細胞株において発現していないが、正常組織においてのみ差次的に発現している２４０ｂｐのｃＤＮＡ断片は、配列番号３１に示されるランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３２（５’‐ＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡ‐３’）及び配列番号３２に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー（５’‐ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ‐３’）を用いて、正常組織及び癌組織または癌細胞株から抽出された全ＲＮＡに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）を実行することによって取得されてもよい。そして、得られた断片は、プローブとして用いられて、全長ｃＤＮＡクローンを得るためにｃＤＮＡライブラリーに対してプラークハイブリダイズされてもよい。
【０１４２】
このようにして調製された遺伝子を公知の微生物または動物細胞において発現させるためのベクターに挿入することにより、発現ベクターが得られる。そして、当該発現ベクターを、例えばエシェリキア・コリもしくはＡ５４９細胞株などの適切な宿主細胞に導入することによって、遺伝子のｃＤＮＡが大量に複製されてもよいし、または、その遺伝子のタンパク質が工業用に量産されてもよい。発現ベクターをコンストラクトするときには、プロモーター及びターミネーター、自己複製配列、分泌シグナルなどのようなＤＮＡ調節配列が、遺伝子またはタンパク質を生産するように設計された宿主細胞の種類に依存して適切に選択されてもよいし、連結されてもよい。
【０１４３】
本発明の発明者らは、全長のＧＩＧ２ｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、アメリカ）に挿入して、得られた発現ベクターを用いてエシェリキア・コリＤＨ５αを形質転換して、形質転換体を得た。また、この形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ２／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけ、受託番号ＫＣＴＣ  １０６４１ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズに２００４年５月３１日に寄託した。
【０１４４】
本発明の遺伝子は、正常組織、好ましくは脳、心臓、筋肉、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、及び白血球において過剰発現しており、発癌を抑制していると考えられる。また、本発明の遺伝子は、急性白血病（ＨＬ‐６０細胞株）及び悪性リンパ腫（ラジ（Ｒａｊｉ）癌細胞株）において癌を誘導するためにまったく発現していないと考えられる。また、本発明の遺伝子は、子宮癌、慢性白血病、大腸癌、肺癌、及び、皮膚癌において発癌を誘導するために微かに発現していると考えられる。本発明の遺伝子は、およそ１．３ｋｂのサイズのｍＲＮＡ転写産物としてこれらの組織に主に過剰発現している。特に、本発明の遺伝子は、正常組織においてのみ差次的に発現している。例えば、本発明の遺伝子は、肺癌組織、転移性肺癌組織、肺癌細胞株（Ａ５４９及びＮＣＩ‐Ｈ３５８）などには発現しておらず、正常肺組織においてのみ差次的に発現している。
【０１４５】
本発明の遺伝子が導入された癌細胞株は高死亡率を示すので、本発明の遺伝子は癌に対する治療及び予防に効果的に用いられてもよい。
【０１４６】
〔発明の形態〕
以下では、本発明が好ましい実施例を参照して詳細に記載されている。それ故、ここに提案されている記述は、説明のための単なる好ましい実施例であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１４７】
（参考例：全ＲＮＡの分離）
全ＲＮＡ試料は、新鮮な組織または培養細胞からＲＮｅａｓｙ全ＲＮＡキット（RNeasy total RNA kit）（キアゲン、インコーポレイティッド、ドイツ（Qiagen Inc., Germany））を用いて分離した。その後、不純物のＤＮＡをＲＮＡ試料からメッセージクリーンキット（message clean kit）（ジェンハンター、コーポレーション、ＭＡ、アメリカ（GenHunter Corp., MA, U.S.)）を用いて除去した。
【０１４８】
（実施例１：全ＲＮＡの分離及びｍＲＮＡディファレンシァル・ディスプレイ）
＜１‐１．ＧＩＧ１２＞
興味のある遺伝子の差次的発現パターンを、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において下記のように測定した。
【０１４９】
正常乳房組織試料を、乳房切除手術の間に乳癌の患者から取得した。また原発性乳癌組織試料を、外科治療をする前に放射線治療または抗癌治療を受けていない患者から根治的乳房切断手術の間に取得した。ＭＣＦ‐７（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ‐２２）をヒトの乳癌細胞株として用いた。本実験を、これらの組織及び細胞のそれぞれから全ＲＮＡを分離するために参考例と同じ方法で繰り返し行った。
【０１５０】
ＲＴ‐ＰＣＲ反応を、以下の発表「Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967‐971 (1992);及び、Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966‐6968 (1993)」に記載されている方法の修正方法に従って、組織及び細胞から分離された全ＲＮＡ試料のそれぞれを用いて、以下のように行った。０．２μｇの全ＲＮＡを、配列番号４に示されたアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーと一緒に、キット（ＲＮＡイメージキット、ジェンハンター（RNAimage kit, GenHunter））を用いて逆転写した。そして、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭの［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ（１，２００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下において同じアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー及び配列番号３に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３２（ＲＮＡイメージプライマー・セット１、ジェンハンター・コーポレーション、アメリカ（RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, U.S.））を用いて、行った。ＰＣＲ反応を、下記の条件にて行った。即ち、９５℃４０秒間の変性工程、４０℃２分間のアニーリング工程、及び７２℃４０秒間の伸長工程からなる増幅サイクルを全４０回行った。その後、７２℃５分間の伸長工程を一回行った。増幅された断片をＤＮＡシークエンス用の６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った後、オートラジオグラフを行った。
【０１５１】
図１は、配列番号３に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）ランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３２及び配列番号４に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いてＰＣＲを行った結果を示す図である。図１において、レーン１、２及び３は正常乳房組織を示し、レーン４、５及び６は乳癌細胞組織を示し、レーン７は、乳癌細胞株のＭＣＦ‐７を示している。図１によれば、６８０ｂｐ（ＧＩＧ１２遺伝子配列の全長の１６１４から２２８３までの塩基の位置）のｃＤＮＡ断片が乳癌組織及び乳癌細胞株において発現しておらず、正常乳房組織のみ差次的に発現していることが明らかになった。このｃＤＮＡ断片をＦＣ２６と名づけた。
【０１５２】
６８０ｂｐのバンド、ＦＣ５断片を乾燥ゲルから除去し、１５分間煮沸してｃＤＮＡを抽出した。そして、ＰＣＲ反応を、上記条件と同じ条件下（ただし、［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ及び２０μＭのｄＮＴＰが用いられていないことは除く）において上記プライマーセットと同じプライマーセットを用いて行い、ｃＤＮＡを再増幅した。再増幅されたｃＤＮＡ断片ＦＣ２６をＴＡクローニングシステム（プロメガ）を用いてｐＧＥＭ‐Ｔ  Ｅａｓｙ発現ベクターにクローニングした。そして、シーケナーゼ・バージョン２．０、ＤＮＡシークエンスシステム（ユナイティッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレーション）（Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System (United States Biochemical Co.)）を用いてシークエンスを行った。このＤＮＡシークエンスをＢＬＡＳＴプログラム及びＦＡＳＴＡプログラムを用いて米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベース内を探索した。その結果、このＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号Ｍ５８５４９及びＢＣ００５２７２として寄託されているマトリックスＧｌａタンパク質のＤＮＡ配列と同一であった。
【０１５３】
＜１‐２．ＧＩＧ１７＞
興味のある遺伝子の差次的発現パターンを、正常肝臓組織、原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株において下記のように測定した。
【０１５４】
正常肝臓組織及び肝癌組織の試料を、組織生検の間に肝癌の患者から取得した。またＨｅｐＧ２（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ番号ＨＢ‐８０６５）をヒトの肝癌細胞株として用いた。本実験を、これらの組織及び細胞のそれぞれから全ＲＮＡを分離するために参考例と同じ方法で繰り返し行った。
【０１５５】
ＲＴ‐ＰＣＲ反応を、以下の発表「Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967‐971 (1992);及び、Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966‐6968 (1993)」に記載されている方法の修正方法に従って、組織及び細胞から分離された全ＲＮＡ試料のそれぞれを用いて、以下のように行った。０．２μｇの全ＲＮＡを、配列番号８に示されたアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーと一緒に、キット（ＲＮＡイメージキット、ジェンハンター）を用いて逆転写した。そして、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭの［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ（１，２００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下において同じアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー及び配列番号７に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ７（ＲＮＡイメージプライマー・セット１、ジェンハンター・コーポレーション、アメリカ）を用いて、行った。ＰＣＲ反応を、下記の条件にて行った。即ち、９５℃４０秒間の変性工程、４０℃２分間のアニーリング工程、及び７２℃４０秒間の伸長工程からなる増幅サイクルを全４０回行った。その後、７２℃５分間の伸長工程を一回行った。増幅された断片をＤＮＡシークエンス用の６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った後、オートラジオグラフを行った。
【０１５６】
図２は、配列番号７に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）ランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ７及び配列番号８に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いてＰＣＲを行った結果を示す図である。図１において、レーン１、２及び３は正常肝臓組織を示し、レーン４、５及び６は肝癌組織を示し、レーン７は、肝癌細胞株のＨｅｐＧ２を示している。図１によれば、２５０ｂｐ（ＧＩＧ１７遺伝子配列の全長の７２１から９７０までの塩基の位置）のｃＤＮＡ断片が肝癌組織において非常に微かに発現しており、肝癌細胞株において発現しておらず、正常肝臓組織のみ差次的に発現していることが明らかになった。このｃＤＮＡ断片をＨＰ２４と名づけた。
【０１５７】
２５０ｂｐのバンド、ＨＰ２４断片を乾燥ゲルから除去し、１５分間煮沸してｃＤＮＡを抽出した。そして、ＰＣＲ反応を、上記条件と同じ条件下（ただし、［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ及び２０μＭのｄＮＴＰが用いられていないことは除く）において上記プライマーセットと同じプライマーセットを用いて行い、ｃＤＮＡを再増幅した。再増幅されたｃＤＮＡ断片ＦＣ５をＴＡクローニングシステム（プロメガ）を用いてｐＧＥＭ‐Ｔ  Ｅａｓｙ発現ベクターにクローニングした。そして、シーケナーゼ・バージョン２．０、ＤＮＡシークエンスシステム（ユナイティッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレーション）を用いてシークエンスを行った。このＤＮＡシークエンスをＢＬＡＳＴプログラム及びＦＡＳＴＡプログラムを用いて米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベース内を探索した。その結果、このＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号Ｍ１９９２２として寄託されているヒト・フルクトース１，６‐ビスフォスファターゼのＤＮＡ配列と同一であった。
【０１５８】
＜１‐３．ＧＩＧ１９＞
興味のある遺伝子の差次的発現パターンを、正常肝臓組織、原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株において下記のように測定した。
【０１５９】
正常肝臓組織及び肝癌組織の試料を、組織生検の間に肝癌の患者から取得した。またＨｅｐＧ２（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ番号ＨＢ‐８０６５）をヒトの肝癌細胞株として用いた。本実験を、これらの組織及び細胞のそれぞれから全ＲＮＡを分離するために参考例と同じ方法で繰り返し行った。
【０１６０】
ＲＴ‐ＰＣＲ反応を、以下の発表「Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967‐971 (1992);及び、Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966‐6968 (1993)」に記載されている方法の修正方法に従って、組織及び細胞から分離された全ＲＮＡ試料のそれぞれを用いて、以下のように行った。０．２μｇの全ＲＮＡを、配列番号１２に示されたアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーと一緒に、キット（ＲＮＡイメージキット、ジェンハンター）を用いて逆転写した。そして、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭの［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ（１，２００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下において同じアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー及び配列番号１１に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０（ＲＮＡイメージプライマー・セット１、ジェンハンター・コーポレーション、アメリカ）を用いて、行った。ＰＣＲ反応を、下記の条件にて行った。即ち、９５℃４０秒間の変性工程、４０℃２分間のアニーリング工程、及び７２℃４０秒間の伸長工程からなる増幅サイクルを全４０回行った。その後、７２℃５分間の伸長工程を一回行った。増幅された断片をＤＮＡシークエンス用の６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った後、オートラジオグラフを行った。
【０１６１】
図３は、配列番号１１に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）ランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０及び配列番号１２に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いてＰＣＲを行った結果を示す図である。図３において、レーン１、２及び３は正常肝臓組織を示し、レーン４、５及び６は肝癌組織を示し、レーン７は、肝癌細胞株のＨｅｐＧ２を示している。図３によれば、２８１ｂｐ（ＧＩＧ１９遺伝子配列の全長の７８１から１０６１までの塩基の位置）のｃＤＮＡ断片が肝癌組織及び肝癌細胞株において発現しておらず、正常肝臓組織のみ差次的に発現していることが明らかになった。このｃＤＮＡ断片をＨＰ４８と名づけた。
【０１６２】
２８１ｂｐのバンド、ＨＰ４８断片を乾燥ゲルから除去し、１５分間煮沸してｃＤＮＡを抽出した。そして、ＰＣＲ反応を、上記条件と同じ条件下（ただし、［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ及び２０μＭのｄＮＴＰが用いられていないことは除く）において上記プライマーセットと同じプライマーセットを用いて行い、ｃＤＮＡを再増幅した。再増幅されたｃＤＮＡ断片ＦＣ５をＴＡクローニングシステム（プロメガ）を用いてｐＧＥＭ‐Ｔ  Ｅａｓｙ発現ベクターにクローニングした。そして、シーケナーゼ・バージョン２．０、ＤＮＡシークエンスシステム（ユナイティッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレーション）を用いてシークエンスを行った。このＤＮＡシークエンスをＢＬＡＳＴプログラム及びＦＡＳＴＡプログラムを用いて米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベース内を探索した。その結果、このＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＢＣ０４１５９３及びＸ０４２２５としてそれぞれ寄託されているヒト・アルファ‐１‐ミクログロブリン／ビクニン前駆体及びヒト・タンパク質ＨＣのｍＲＮＡ（アルファ‐１‐ミクログロブリン）のＤＮＡ配列と同一であった。
【０１６３】
＜１‐４．ＧＩＧ２０＞
興味のある遺伝子の差次的発現パターンを、正常肝臓組織、原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株において下記のように測定した。
【０１６４】
正常肝臓組織及び肝癌組織の試料を、組織生検の間に肝癌の患者から取得した。またＨｅｐＧ２（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ番号ＨＢ‐８０６５）をヒトの肝癌細胞株として用いた。本実験を、これらの組織及び細胞のそれぞれから全ＲＮＡを分離するために参考例と同じ方法で繰り返し行った。
【０１６５】
ＲＴ‐ＰＣＲ反応を、以下の発表「Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967‐971 (1992);及び、Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966‐6968 (1993)」に記載されている方法の修正方法に従って、組織及び細胞から分離された全ＲＮＡ試料のそれぞれを用いて、以下のように行った。０．２μｇの全ＲＮＡを、配列番号１６に示されたアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーと一緒に、キット（ＲＮＡイメージキット、ジェンハンター）を用いて逆転写した。そして、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭの［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下において同じアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー及び配列番号１５に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０（ＲＮＡイメージプライマー・セット１、ジェンハンター・コーポレーション、アメリカ）を用いて、行った。ＰＣＲ反応を、下記の条件にて行った。即ち、９５℃４０秒間の変性工程、４０℃２分間のアニーリング工程、及び７２℃４０秒間の伸長工程からなる増幅サイクルを全４０回行った。その後、７２℃５分間の伸長工程を一回行った。増幅された断片をＤＮＡシークエンス用の６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った後、オートラジオグラフを行った。
【０１６６】
図４は、配列番号１５に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）ランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０及び配列番号１６に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いてＰＣＲを行った結果を示す図である。図４において、レーン１、２及び３は正常肝臓組織を示し、レーン４、５及び６は肝癌組織を示し、レーン７は、肝癌細胞株のＨｅｐＧ２を示している。図４によれば、２５６ｂｐ（ＧＩＧ１９遺伝子配列の全長の７７６から１０３１までの塩基の位置）のｃＤＮＡ断片が肝癌組織及び肝癌細胞株において発現しておらず、正常肝臓組織のみ差次的に発現していることが明らかになった。このｃＤＮＡ断片をＨＰ５０と名づけた。
【０１６７】
２５６ｂｐのバンド、ＨＰ５０断片を乾燥ゲルから除去し、１５分間煮沸してｃＤＮＡを抽出した。そして、ＰＣＲ反応を、上記条件と同じ条件下（ただし、［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ及び２０μＭのｄＮＴＰが用いられていないことは除く）において上記プライマーセットと同じプライマーセットを用いて行い、ｃＤＮＡを再増幅した。再増幅されたｃＤＮＡ断片ＦＣ５０をＴＡクローニングシステム（プロメガ）を用いてｐＧＥＭ‐Ｔ  Ｅａｓｙ発現ベクターにクローニングした。そして、シーケナーゼ・バージョン２．０、ＤＮＡシークエンスシステム（ユナイティッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレーション）を用いてシークエンスを行った。このＤＮＡシークエンスをＢＬＡＳＴプログラム及びＦＡＳＴＡプログラムを用いて米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベース内を探索した。その結果、このＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＢＣ０４１７８９として寄託されているヒト・アルブミンのＤＮＡ配列と同一であった。
【０１６８】
＜１‐５．ＧＩＧ２２＞
興味のある遺伝子の差次的発現パターンを、正常肝臓組織、原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株において下記のように測定した。
【０１６９】
正常肝臓組織及び肝癌組織の試料を、組織生検の間に肝癌の患者から取得した。またＨｅｐＧ２（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ番号ＨＢ‐８０６５）をヒトの肝癌細胞株として用いた。本実験を、これらの組織及び細胞のそれぞれから全ＲＮＡを分離するために参考例と同じ方法で繰り返し行った。
【０１７０】
ＲＴ‐ＰＣＲ反応を、以下の発表「Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967‐971 (1992);及び、Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966‐6968 (1993)」に記載されている方法の修正方法に従って、組織及び細胞から分離された全ＲＮＡ試料のそれぞれを用いて、以下のように行った。０．２μｇの全ＲＮＡを、配列番号２０に示されたアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーと一緒に、キット（ＲＮＡイメージキット、ジェンハンター）を用いて逆転写した。そして、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭの［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下において同じアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー及び配列番号１９に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３０（ＲＮＡイメージプライマー・セット１、ジェンハンター・コーポレーション、アメリカ）を用いて、行った。ＰＣＲ反応を、下記の条件にて行った。即ち、９５℃４０秒間の変性工程、４０℃２分間のアニーリング工程、及び７２℃４０秒間の伸長工程からなる増幅サイクルを全４０回行った。その後、７２℃５分間の伸長工程を一回行った。増幅された断片をＤＮＡシークエンス用の６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った後、オートラジオグラフを行った。
【０１７１】
図５は、配列番号１９に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）ランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３０及び配列番号２０に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いてＰＣＲを行った結果を示す図である。図５において、レーン１、２及び３は正常肝臓組織を示し、レーン４、５及び６は肝癌組織を示し、レーン７は、肝癌細胞株のＨｅｐＧ２を示している。図５によれば、２８１ｂｐ（ＧＩＧ２２遺伝子配列の全長の２６２から５４２までの塩基の位置）のｃＤＮＡ断片が肝癌組織及び肝癌細胞株において発現しておらず、正常肝臓組織のみ差次的に発現していることが明らかになった。このｃＤＮＡ断片をＨＰ５９と名づけた。
【０１７２】
２８１ｂｐのバンド、ＨＰ５９断片を乾燥ゲルから除去し、１５分間煮沸してｃＤＮＡを抽出した。そして、ＰＣＲ反応を、上記条件と同じ条件下（ただし、［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ及び２０μＭのｄＮＴＰが用いられていないことは除く）において上記プライマーセットと同じプライマーセットを用いて行い、ｃＤＮＡを再増幅した。再増幅されたｃＤＮＡ断片ＦＣ５９をＴＡクローニングシステム（プロメガ）を用いてｐＧＥＭ‐Ｔ  Ｅａｓｙ発現ベクターにクローニングした。そして、シーケナーゼ・バージョン２．０、ＤＮＡシークエンスシステム（ユナイティッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレーション）を用いてシークエンスを行った。このＤＮＡシークエンスをＢＬＡＳＴプログラム及びＦＡＳＴＡプログラムを用いて米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベース内を探索した。
【０１７３】
＜１‐６．ＧＩＧ２５＞
興味のある遺伝子の差次的発現パターンを、正常肝臓組織、原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株において下記のように測定した。
【０１７４】
正常肝臓組織及び肝癌組織の試料を、組織生検の間に肝癌の患者から取得した。またＨｅｐＧ２（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ番号ＨＢ‐８０６５）をヒトの肝癌細胞株として用いた。本実験を、これらの組織及び細胞のそれぞれから全ＲＮＡを分離するために参考例と同じ方法で繰り返し行った。
【０１７５】
ＲＴ‐ＰＣＲ反応を、以下の発表「Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967‐971 (1992);及び、Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966‐6968 (1993)」に記載されている方法の修正方法に従って、組織及び細胞から分離された全ＲＮＡ試料のそれぞれを用いて、以下のように行った。０．２μｇの全ＲＮＡを、配列番号２４に示されたアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーと一緒に、キット（ＲＮＡイメージキット、ジェンハンター）を用いて逆転写した。そして、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭの［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下において同じアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー及び配列番号２３に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０（ＲＮＡイメージプライマー・セット１、ジェンハンター・コーポレーション、アメリカ）を用いて、行った。ＰＣＲ反応を、下記の条件にて行った。即ち、９５℃４０秒間の変性工程、４０℃２分間のアニーリング工程、及び７２℃４０秒間の伸長工程からなる増幅サイクルを全４０回行った。その後、７２℃５分間の伸長工程を一回行った。増幅された断片をＤＮＡシークエンス用の６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った後、オートラジオグラフを行った。
【０１７６】
図６は、配列番号２３に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）ランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０及び配列番号２４に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いてＰＣＲを行った結果を示す図である。図１において、レーン１、２及び３は正常肝臓組織を示し、レーン４、５及び６は肝癌組織を示し、レーン７は、肝癌細胞株のＨｅｐＧ２を示している。図６によれば、２５０ｂｐ（ＧＩＧ２５遺伝子配列の全長の１２０１から１４５０までの塩基の位置）のｃＤＮＡ断片が肝癌組織及び肝癌細胞株において発現しておらず、正常肝臓組織のみ差次的に発現していることが明らかになった。このｃＤＮＡ断片をＨＰ７４と名づけた。
【０１７７】
２５０ｂｐのバンド、ＨＰ７４断片を乾燥ゲルから除去し、１５分間煮沸してｃＤＮＡを抽出した。そして、ＰＣＲ反応を、上記条件と同じ条件下（ただし、［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ及び２０μＭのｄＮＴＰが用いられていないことは除く）において上記プライマーセットと同じプライマーセットを用いて行い、ｃＤＮＡを再増幅した。再増幅されたｃＤＮＡ断片ＦＣ７４をＴＡクローニングシステム（プロメガ）を用いてｐＧＥＭ‐Ｔ  Ｅａｓｙ発現ベクターにクローニングした。そして、シーケナーゼ・バージョン２．０、ＤＮＡシークエンスシステム（ユナイティッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレーション）を用いてシークエンスを行った。このＤＮＡシークエンスをＢＬＡＳＴプログラム及びＦＡＳＴＡプログラムを用いて米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベース内を探索した。その結果、このＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＢＣ０１１０５３０として寄託されているヒト・セリン（またはシステイン）プロテアーゼインヒビター・クレードＡ（アルファ‐１・アンチプロテアーゼ、アンチトリプシン）メンバー３（serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A (alpha‐1 antiproteinase, antitrypsin), member 3）のＤＮＡ配列と異なっていた。
【０１７８】
＜１‐７．ＧＩＧ３６＞
興味のある遺伝子の差次的発現パターンを、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において下記のように測定した。
【０１７９】
正常乳房組織試料を、乳房切除手術の間に乳癌の患者から取得した。また原発性乳癌組織試料を、外科治療をする前に放射線治療または抗癌治療を受けていない患者から根治的乳房切断手術の間に取得した。ＭＣＦ‐７（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ‐２２）をヒトの乳癌細胞株として用いた。本実験を、これらの組織及び細胞のそれぞれから全ＲＮＡを分離するために参考例と同じ方法で繰り返し行った。
【０１８０】
ＲＴ‐ＰＣＲ反応を、以下の発表「Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967‐971 (1992);及び、Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966‐6968 (1993)」に記載されている方法の修正方法に従って、組織及び細胞から分離された全ＲＮＡ試料のそれぞれを用いて、以下のように行った。０．２μｇの全ＲＮＡを、配列番号２８に示されたアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーと一緒に、キット（ＲＮＡイメージキット、ジェンハンター）を用いて逆転写した。そして、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭの［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下において同じアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー及び配列番号２７に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ２９（ＲＮＡイメージプライマー・セット１、ジェンハンター・コーポレーション、アメリカ）を用いて、行った。ＰＣＲ反応を、下記の条件にて行った。即ち、９５℃４０秒間の変性工程、４０℃２分間のアニーリング工程、及び７２℃４０秒間の伸長工程からなる増幅サイクルを全４０回行った。その後、７２℃５分間の伸長工程を一回行った。増幅された断片をＤＮＡシークエンス用の６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った後、オートラジオグラフを行った。
【０１８１】
図７は、配列番号２７に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）ランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ２９及び配列番号２８に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いてＰＣＲを行った結果を示す図である。図１において、レーン１、２及び３は正常乳房組織を示し、レーン４、５及び６は乳癌細胞組織を示し、レーン７は、乳癌細胞株のＭＣＦ‐７を示している。図７によれば、１８２ｂｐ（ＧＩＧ３６遺伝子配列の全長の１８３から３６４までの塩基の位置）のｃＤＮＡ断片が乳癌組織及び乳癌細胞株において発現しておらず、正常乳房組織のみ差次的に発現していることが明らかになった。このｃＤＮＡ断片をＦＣ５と名づけた。
【０１８２】
１８２ｂｐのバンド、ＦＣ５断片を乾燥ゲルから除去し、１５分間煮沸してｃＤＮＡを抽出した。そして、ＰＣＲ反応を、上記条件と同じ条件下（ただし、［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ及び２０μＭのｄＮＴＰが用いられていないことは除く）において上記プライマーセットと同じプライマーセットを用いて行い、ｃＤＮＡを再増幅した。再増幅されたｃＤＮＡ断片ＦＣ５をＴＡクローニングシステム（プロメガ）を用いてｐＧＥＭ‐Ｔ  Ｅａｓｙ発現ベクターにクローニングした。そして、シーケナーゼ・バージョン２．０、ＤＮＡシークエンスシステム（ユナイティッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレーション）を用いてシークエンスを行った。このＤＮＡシークエンスをＢＬＡＳＴプログラム及びＦＡＳＴＡプログラムを用いて米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベース内を探索した。その結果、このＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにそれぞれ受託番号Ｍ５８５４９及びＢＣ００５２７２として寄託されているマトリックスＧｌａタンパク質のＤＮＡ配列と同一であった。
【０１８３】
＜１‐８．ＧＩＧ２＞
興味のある遺伝子の差次的発現パターンを、正常肺組織、原発性肺癌組織、転移性肺癌組織、及び、肺癌細胞株において下記のように測定した。正常肺組織、肺癌組織、及び、転移性肺癌組織の試料を、肺癌の患者から手術の間に取得した。またＡ５４９（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ‐１８５）、及び、ＮＣＩ‐Ｈ３５８（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ‐５８０７）をヒトの肺癌細胞株として用いた。本実験を、これらの組織及び細胞のそれぞれから全ＲＮＡを分離するために参考例と同じ方法で繰り返し行った。
【０１８４】
ＲＴ‐ＰＣＲ反応を、以下の発表「Liang, P. and Pardee, A. B., Science, 257, 967‐971 (1992);及び、Liang, P. et al., Cancer Res., 52, 6966‐6968 (1993)」に記載されている方法の修正方法に従って、組織及び細胞から分離された全ＲＮＡ試料のそれぞれを用いて、以下のように行った。０．２μｇの全ＲＮＡを、配列番号３２に示されたアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーと一緒に、キット（ＲＮＡイメージキット、ジェンハンター）を用いて逆転写した。そして、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭの［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下において同じアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマー及び配列番号３１に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐Ａ３２（ＲＮＡイメージプライマー・セット１、ジェンハンター・コーポレーション、アメリカ）を用いて、行った。ＰＣＲ反応を、下記の条件にて行った。即ち、９５℃４０秒間の変性工程、４０℃２分間のアニーリング工程、及び７２℃４０秒間の伸長工程からなる増幅サイクルを全４０回行った。その後、７２℃５分間の伸長工程を一回行った。増幅された断片をＤＮＡシークエンス用の６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った後、オートラジオグラフを行った。
【０１８５】
図８は、配列番号３１に示される５’１３‐塩基数（ｍｅｒ）ランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３２及び配列番号３２に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いてＰＣＲを行った結果を示す図である。図８において、レーン１、２及び３は正常肺組織を示し、レーン４、５及び６は肺癌組織を示し、レーン７は、肺癌細胞株のＮＣＩ‐Ｈ３５８を示している。図８によれば、２４０ｂｐ（ＧＩＧ２遺伝子配列の全長の３７１から６１０までの塩基の位置）のｃＤＮＡ断片が肺癌組織、転移性肺癌組織、及び、肺癌細胞株において発現しておらず、正常肺組織のみ差次的に発現していることが明らかになった。このｃＤＮＡ断片をＬ９３３と名づけた。
【０１８６】
２４０ｂｐのバンド、Ｌ９３３断片を乾燥ゲルから除去し、１５分間煮沸してｃＤＮＡを抽出した。そして、ＰＣＲ反応を、上記条件と同じ条件下（ただし、［α‐35Ｓ］で標識されたｄＡＴＰ及び２０μＭのｄＮＴＰが用いられていないことは除く）において上記プライマーセットと同じプライマーセットを用いて行い、ｃＤＮＡを再増幅した。再増幅されたｃＤＮＡ断片Ｌ９３３をＴＡクローニングシステム（プロメガ）を用いてｐＧＥＭ‐Ｔ  Ｅａｓｙ発現ベクターにクローニングした。そして、シーケナーゼ・バージョン２．０、ＤＮＡシークエンスシステム（ユナイティッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレーション）を用いてシークエンスを行った。
【０１８７】
（実施例２：ｃＤＮＡライブラリースクリーニング）
実施例１‐１において得られたＦＣ２６、実施例１‐２において得られたＨＰ２４、実施例１‐３において得られたＨＰ４８、実施例１‐４において得られたＨＰ５０、実施例１‐５において得られたＨＰ５９、実施例１‐６において得られたＨＰ７４、実施例１‐７において得られたＦＣ５、及び、実施例１‐８において得られたＬ９３３の各ｃＤＮＡ断片を以下の発表「Feinberg, A.P. and Vogelstein, B., Anal. Biochem., 132, 6‐13 (1983)」に開示されている方法にしたがって標識し、32Ｐで標識されたｃＤＮＡが得られた。得られた32Ｐで標識されたｃＤＮＡを、以下の発表「Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989)」に記載されている方法に従って、バクテリオファージλｇｔ１１のヒトの肺の胚性線維芽細胞のｃＤＮＡライブラリー（Miki, T. et al., Gene, 83, 137‐146 (1989)）に対して、プラークハイブリダイズさせた。その結果、ヒト癌抑制遺伝子ＧＩＧ１２，ＧＩＧ１７，ＧＩＧ１９，ＧＩＧ２０，ＧＩＧ２２，ＧＩＧ２５，ＧＩＧ３６及びＧＩＧ２の全長ｃＤＮＡクローンがそれぞれ得られた。
【０１８８】
全長ｃＤＮＡをシークエンスし、その結果、それらのＤＮＡ配列は、配列番号１に示される塩基配列（ＧＩＧ１２），配列番号５に示される塩基配列（ＧＩＧ１７），配列番号９に示される塩基配列（ＧＩＧ１９），配列番号１３に示される塩基配列（ＧＩＧ２０），配列番号１７に示される塩基配列（ＧＩＧ２２），配列番号２１に示される塩基配列（ＧＩＧ２５），配列番号２５に示される塩基配列（ＧＩＧ３６）及び配列番号２９に示される塩基配列（ＧＩＧ２）にそれぞれ一致した。
【０１８９】
ＧＩＧ１２の塩基配列は、７１１アミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレームを有しており、このオープン・リーディング・フレームに由来するアミノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と一致する。生成したタンパク質の分子量は、およそ７８ｋＤａでもある。
【０１９０】
ＧＩＧ１７の塩基配列は、３８８アミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレームを有しており、このオープン・リーディング・フレームに由来するアミノ酸配列は、配列番号６に示されるアミノ酸配列と一致する。生成したタンパク質の分子量は、およそ３７ｋＤａでもある。
【０１９１】
ＧＩＧ１９の塩基配列は、３５２アミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレームを有しており、このオープン・リーディング・フレームに由来するアミノ酸配列は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と一致する。生成したタンパク質の分子量は、およそ３９ｋＤａでもある。
【０１９２】
ＧＩＧ２０の塩基配列は、４１７アミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレームを有しており、このオープン・リーディング・フレームに由来するアミノ酸配列は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と一致する。生成したタンパク質の分子量は、およそ４７ｋＤａでもある。
【０１９３】
ＧＩＧ２２の塩基配列は、１５０アミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレームを有しており、このオープン・リーディング・フレームに由来するアミノ酸配列は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列と一致する。生成したタンパク質の分子量は、およそ１６ｋＤａでもある。
【０１９４】
ＧＩＧ２５の塩基配列は、２８７アミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレームを有しており、このオープン・リーディング・フレームに由来するアミノ酸配列は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と一致する。生成したタンパク質の分子量は、およそ３３ｋＤａでもある。
【０１９５】
ＧＩＧ３６の塩基配列は、１０３アミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレームを有しており、このオープン・リーディング・フレームに由来するアミノ酸配列は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列と一致する。生成したタンパク質の分子量は、およそ１２ｋＤａでもある。
【０１９６】
ＧＩＧ２の塩基配列は、２２８アミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレームを有しており、このオープン・リーディング・フレームに由来するアミノ酸配列は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列と一致する。生成したタンパク質の分子量は、およそ２５ｋＤａでもある。
【０１９７】
得られたＧＩＧの各全長ｃＤＮＡクローンを真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、アメリカ）に挿入して真核生物発現ベクターを得た。そして、得られた真核生物発現ベクターを用いてエシェリキア・コリＤＨ５αを形質転換して、形質転換体を得た。ＧＩＧ１２に関する得られた形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ１２／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけて、受託番号ＫＣＴＣ  １０６４２ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズに２００４年５月２４日に寄託した。ＧＩＧ１７に関する得られた形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ１７／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけて、受託番号ＫＣＴＣ  １０６５５ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズに２００４年６月１４日に寄託した。ＧＩＧ１９に関する得られた形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ１９／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけて、受託番号ＫＣＴＣ  １０６５６ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズに２００４年６月１４日に寄託した。ＧＩＧ２０に関する得られた形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ２０／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけて、受託番号ＫＣＴＣ  １０６５７ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズに２００４年６月１４日に寄託した。ＧＩＧ２２に関する得られた形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ２２／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけて、受託番号ＫＣＴＣ  １０６５８ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズに２００４年６月１４日に寄託した。ＧＩＧ２５に関する得られた形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ２５／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけて、受託番号ＫＣＴＣ  １０６５９ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズに２００４年６月１４日に寄託した。ＧＩＧ３６に関する得られた形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ３６／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけて、受託番号ＫＣＴＣ  １０６４３ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズに２００４年５月２４日に寄託した。全長のＧＩＧ２ｃＤＮＡクローンを真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１  （インビトロジェン、アメリカ）に挿入した。そして、得られた真核生物発現ベクターによってエシェリキア・コリＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ＧＩＧ２／ｐｃＤＮＡ３．１と名づけて、受託番号ＫＣＴＣ  １０６４１ＢＰとして韓国コレクション・フォー・タイプ・カルチァーズに２００４年５月３１日に寄託した。
【０１９８】
形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株をＬＢ培養液において培養し、０．２Ｍ  Ｌ‐アラビノース（シグマ、アメリカ）を培養液に添加した。そして、３７℃で３時間反応させてＧＩＧ３６遺伝子を発現させた。タンパク質試料を得られた培養液から取得して、得られたタンパク質試料を用いてＳＤＳ‐ＰＡＧＥを、以下の発表「Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989)」に記載されている方法に従って、行った。
【０１９９】
図９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６は、ＧＩＧ１２、ＧＩＧ１７、ＧＩＧ１９、ＧＩＧ２０、ＧＩＧ２２、ＧＩＧ２５、ＧＩＧ３６及びＧＩＧ２のそれぞれの遺伝子生産物をＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析した結果を示す図である。図２において、レーン１は、ＩＰＴＧによる誘導を行う前のタンパク質試料を示し、レーン２は、ＧＩＧ遺伝子の発現がＩＰＴＧによって誘導された後のタンパク質試料を示している。図２に示されるように、発現したＧＩＧ１２タンパク質の分子量はおよそ７８ｋＤａであり、この分子量はＧＩＧ１２のＤＮＡ配列に由来する分子量に一致する。また、発現したＧＩＧ１７タンパク質の分子量はおよそ３７ｋＤａであり、この分子量はＧＩＧ１７のＤＮＡ配列に由来する分子量に一致する。また、発現したＧＩＧ１９タンパク質の分子量はおよそ３９ｋＤａであり、この分子量はＧＩＧ１９のＤＮＡ配列に由来する分子量に一致する。また、発現したＧＩＧ２０タンパク質の分子量はおよそ４７ｋＤａであり、この分子量はＧＩＧ２０のＤＮＡ配列に由来する分子量に一致する。また、発現したＧＩＧ２２タンパク質の分子量はおよそ１６ｋＤａであり、この分子量はＧＩＧ２２のＤＮＡ配列に由来する分子量に一致する。また、発現したＧＩＧ２５タンパク質の分子量はおよそ３３ｋＤａであり、この分子量はＧＩＧ２５のＤＮＡ配列に由来する分子量に一致する。また、発現したＧＩＧ３６タンパク質の分子量はおよそ１２ｋＤａであり、この分子量はＧＩＧ３６のＤＮＡ配列に由来する分子量に一致する。また、発現したＧＩＧ２タンパク質の分子量はおよそ２５ｋＤａであり、この分子量はＧＩＧ２のＤＮＡ配列に由来する分子量に一致する。
【０２００】
（実施例３：ＧＩＧ遺伝子のノーザンブロッティング）
＜３‐１．ＧＩＧ１２遺伝子のノーザンブロッティング＞
ＧＩＧ１２遺伝の発現レベルを評価するために、下記のようなノーザンブロッティングを行った。
【０２０１】
実施例１に記載されている、３つの正常乳房組織、３つの原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株ＭＣＦ‐７から得られた全ＲＮＡ試料を各２０μｇずつ変性させて、１％ホルムアルデヒドアガロースゲルの中を電気泳動させた。そして得られたアガロースゲルをナイロンメンブレン（ボエフリンガー・マンヘイン（Boehringer‐Mannheim）、ドイツ）に転写した。それから、ナイロンメンブレンを、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブと一緒に一晩４２℃でハイブリダイズさせた。なお、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブは、リジプライムＩＩ・ランダムプライム標識システム（Rediprime II random prime labelling system）（アマシャム、イギリス）を用いてＧＩＧ１２ｃＤＮＡ全長の部分配列であるＦＣ２６ｃＤＮＡ配列から調製された。ノーザンブロッティングの手法を２回繰り返し行った。一回目は、濃度計（デンシトメーター）を用いて定量を行った。もう一回は、全ｍＲＮＡを決定するためにβ‐アクチンのプローブを用いてハイブリダイズを行った。
【０２０２】
図１７（ａ）は、ＧＩＧ１２遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。図１７（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることにより得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図１７（ａ）、（ｂ）に示されるように、ＧＩＧ１２遺伝子の発現レベルが、３つの正常乳房組織試料の全てにおいて高度に検出された。しかし、正常組織におけるＧＩＧ１２遺伝子の発現レベルよりも３つの乳癌組織試料におけるＧＩＧ１２遺伝子の発現レベルの方が、顕著に低かった。また、１つの乳癌細胞株試料においてＧＩＧ１２遺伝子の発現レベルは、検出されなかった。
【０２０３】
ノーザンブロッティングを、正常ヒト多数組織（normal human multiple tissue）（クロンテック）及びヒト癌細胞株（human cancer cell line）（クロンテック）を用いて行った。すなわち、ノーザンブロッティングを、正常組織及び癌細胞株から抽出された全ＲＮＡ試料のそれぞれが、上述した方法と同じ方法によって転写されているブロットをハイブリダイズすることによって行った。なお、上記ブロットは、クロンテック（アメリカ）社から市販されている。ここで、上記正常組織は、例えば、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、及び抹消血白血球からなる群より選ばれる。また、上記癌細胞株は、例えば、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞からなる群より選ばれる。
【０２０４】
図２５（ａ）は、ＧＩＧ１２遺伝子が、様々な正常組織において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図２５（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図２５（ａ）に示されるように、およそ２．４ｋｂのサイズを有する主要なＧＩＧ１２ｍＲＮＡ転写産物が、肺、胸腺、肝臓、骨格筋、腎臓、脾臓、心臓、胎盤、及び抹消血のような正常組織において過剰発現していた。
【０２０５】
図３３（ａ）は、ＧＩＧ１２遺伝子が様々な癌細胞株において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図３３（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図３３（ａ）に示されるように、ＧＩＧ１２遺伝子は、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞のような組織には発現していなかった。その結果、本発明のＧＩＧ１２遺伝子に、乳房、肺、胸腺、肝臓、骨格筋、腎臓、脾臓、心臓、胎盤及び抹消血のような正常組織において癌を抑制する機能があることが明らかになった。
【０２０６】
＜３‐２．ＧＩＧ１７遺伝子のノーザンブロッティング＞
ＧＩＧ１７遺伝子の発現レベルを評価するために、下記のようなノーザンブロッティングを行った。
【０２０７】
実施例１に記載されている、３つの正常肝臓組織、３つの原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株ＨｅｐＧ２から得られた全ＲＮＡ試料を各２０μｇずつ変性させて、１％ホルムアルデヒドアガロースゲルの中を電気泳動させた。そして得られたアガロースゲルをナイロンメンブレン（ボエフリンガー・マンヘイン、ドイツ）に転写した。それから、ナイロンメンブレンを、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブと一緒に一晩４２℃でハイブリダイズさせた。なお、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブは、リジプライムＩＩ・ランダムプライム標識システム（アマシャム、イギリス）を用いてＧＩＧ１７ｃＤＮＡ全長から調製された。ノーザンブロッティングの手法を２回繰り返し行った。一回目は、濃度計（デンシトメーター）を用いて定量を行った。もう一回は、全ｍＲＮＡを決定するためにβ‐アクチンのプローブを用いてハイブリダイズを行った。
【０２０８】
図１８（ａ）は、ＧＩＧ１７遺伝子が正常肝臓組織、原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株において差次的に発現しているノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図１８（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図１８（ａ）及び（ｂ）に示されるように、ＧＩＧ１７遺伝子の発現レベルが、３つの正常肝臓組織試料の全てにおいて高度に検出された。しかし、正常組織におけるＧＩＧ１７遺伝子の発現レベルよりも３つの肝癌組織試料におけるＧＩＧ１７遺伝子の発現レベルの方が、顕著に低かった。また、１つの肝癌細胞株試料においてＧＩＧ１７遺伝子の発現レベルは、検出されなかった。
【０２０９】
ノーザンブロッティングを、正常ヒト多数組織（normal human multiple tissue）（クロンテック）及びヒト癌細胞株（human cancer cell line）（クロンテック）を用いて行った。すなわち、ノーザンブロッティングを、正常組織及び癌細胞株から抽出された全ＲＮＡ試料のそれぞれが、上述した方法と同じ方法によって転写されているブロットをハイブリダイズすることによって行った。なお、上記ブロットは、クロンテック（アメリカ）社から市販されている。ここで、上記正常組織は、例えば、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、及び抹消血白血球からなる群より選ばれる。また、上記癌細胞株は、例えば、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞からなる群より選ばれる。
【０２１０】
図２６（ａ）は、ＧＩＧ１７遺伝子が、様々な正常組織において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図２６（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図２６（ａ）に示されるように、およそ１．７ｋｂのサイズを有する主要なＧＩＧ１７ｍＲＮＡ転写産物が、肝臓、腎臓、脾臓、及び肺のような正常組織において過剰発現していた。
【０２１１】
図３４（ａ）は、ＧＩＧ１７遺伝子が様々な癌細胞株において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図３４（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図３４（ａ）に示されるように、ＧＩＧ１７遺伝子は、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞のような組織には発現していなかった。その結果、本発明のＧＩＧ１７遺伝子に、肝臓、腎臓、脾臓、及び肺のような正常組織において癌を抑制する機能があることが明らかになった。また、ＧＩＧ１７遺伝子の発現が発癌を誘導するために白血病、子宮癌、悪性リンパ腫、大腸癌、皮膚癌などの組織において抑制されていることを考慮すれば、本発明のＧＩＧ１７遺伝子に癌を抑制する機能があることが明らかになった。
【０２１２】
＜３‐３．ＧＩＧ１９遺伝子のノーザンブロッティング＞
ＧＩＧ１９遺伝子の発現レベルを評価するために、下記のようなノーザンブロッティングを行った。
【０２１３】
実施例１に記載されている、３つの正常肝臓組織、３つの原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株ＨｅｐＧ２から得られた全ＲＮＡ試料を各２０μｇずつ変性させて、１％ホルムアルデヒドアガロースゲルの中を電気泳動させた。そして得られたアガロースゲルをナイロンメンブレン（ボエフリンガー・マンヘイン、ドイツ）に転写した。それから、ナイロンメンブレンを、リジプライムＩＩ・ランダムプライム標識システム（アマシャム、イギリス）を用いてＨＰ４８  ｃＤＮＡから調製された32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブと一緒に一晩４２℃でハイブリダイズさせた。なお、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブは、リジプライムＩＩ・ランダムプライム標識システム（アマシャム、イギリス）を用いてＨＰ４８  ｃＤＮＡから調製された。ノーザンブロッティングの手法を２回繰り返し行った。一回目は、濃度計（デンシトメーター）を用いて定量を行った。もう一回は、全ｍＲＮＡを決定するためにβ‐アクチンのプローブを用いてハイブリダイズを行った。
【０２１４】
図１９（ａ）は、ＧＩＧ１９遺伝子が正常肝臓組織、原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株において差次的に発現しているノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図１９（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図１９（ａ）及び（ｂ）に示されるように、ＧＩＧ１９遺伝子の発現レベルが、３つの正常肝臓組織試料の全てにおいて高度に検出された。しかし、ＧＩＧ１９遺伝子の発現レベルは、３つの肝癌組織試料及び１つの肝癌細胞株試料において検出されなかった。
【０２１５】
ノーザンブロッティングを、正常ヒト多数組織（normal human multiple tissue）（クロンテック）及びヒト癌細胞株（human cancer cell line）（クロンテック）を用いて行った。すなわち、ノーザンブロッティングを、正常組織及び癌細胞株から抽出された全ＲＮＡ試料のそれぞれが、上述した方法と同じ方法によって転写されているブロットをハイブリダイズすることによって行った。なお、上記ブロットは、クロンテック（アメリカ）社から市販されている。ここで、上記正常組織は、例えば、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、及び抹消血白血球からなる群より選ばれる。また、上記癌細胞株は、例えば、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞からなる群より選ばれる。
【０２１６】
図２７（ａ）は、ＧＩＧ１９遺伝子が、様々な正常組織において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図２７（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図２７（ａ）に示されるように、およそ１．２ｋｂのサイズを有する主要なＧＩＧ１９ｍＲＮＡ転写産物が、正常肝臓組織においてのみ過剰発現していた。
【０２１７】
図３５（ａ）は、ＧＩＧ１９遺伝子が様々な癌細胞株において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図３５（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図３５（ａ）に示されるように、ＧＩＧ１９遺伝子は、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞のような組織には発現していなかった。その結果、本発明のＧＩＧ１９遺伝子に、正常肝臓組織において癌を抑制する機能があることが明らかになった。
【０２１８】
＜３‐４．ＧＩＧ２０遺伝子のノーザンブロッティング＞
ＧＩＧ２０遺伝子の発現レベルを評価するために、下記のようなノーザンブロッティングを行った。
【０２１９】
実施例１に記載されている、３つの正常肝臓組織、３つの原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株ＨｅｐＧ２から得られた全ＲＮＡ試料を各２０μｇずつ変性させて、１％ホルムアルデヒドアガロースゲルの中を電気泳動させた。そして得られたアガロースゲルをナイロンメンブレン（ボエフリンガー・マンヘイン、ドイツ）に転写した。それから、ナイロンメンブレンを、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブと一緒に一晩４２℃でハイブリダイズさせた。なお、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブは、リジプライムＩＩ・ランダムプライム標識システム（アマシャム、イギリス）を用いてＨＰ５０ｃＤＮＡから調製された。ノーザンブロッティングの手法を２回繰り返し行った。一回目は、濃度計（デンシトメーター）を用いて定量を行った。もう一回は、全ｍＲＮＡを決定するためにβ‐アクチンのプローブを用いてハイブリダイズを行った。
【０２２０】
図２０（ａ）は、ＧＩＧ２０遺伝子が正常肝臓組織、原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株において差次的に発現しているノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図２０（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図２０（ａ）及び（ｂ）に示されるように、ＧＩＧ２０遺伝子の発現レベルが、３つの正常肝臓組織試料の全てにおいて高度に検出された。しかし、ＧＩＧ２０遺伝子の発現レベルは、３つの肝癌組織試料及び１つの肝癌細胞株試料において検出されなかった。
【０２２１】
ノーザンブロッティングを、正常ヒト多数組織（normal human multiple tissue）（クロンテック）及びヒト癌細胞株（human cancer cell line）（クロンテック）を用いて行った。すなわち、ノーザンブロッティングを、正常組織及び癌細胞株から抽出された全ＲＮＡ試料のそれぞれが、上述した方法と同じ方法によって転写されているブロットをハイブリダイズすることによって行った。なお、上記ブロットは、クロンテック（アメリカ）社から市販されている。ここで、上記正常組織は、例えば、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、及び抹消血白血球からなる群より選ばれる。また、上記癌細胞株は、例えば、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞からなる群より選ばれる。
【０２２２】
図２８（ａ）は、ＧＩＧ２０遺伝子が、様々な正常組織において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図２８（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図２８（ａ）に示されるように、およそ２．４ｋｂのサイズを有する主要なＧＩＧ２０ｍＲＮＡ転写産物が、正常肝臓組織においてのみ過剰発現していた。
【０２２３】
図３６（ａ）は、ＧＩＧ２０遺伝子が様々な癌細胞株において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図３６（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図３６（ａ）に示されるように、ＧＩＧ２０遺伝子は、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞のような組織には発現していなかった。その結果、本発明のＧＩＧ２０遺伝子に、正常肝臓組織において癌を抑制する機能があることが明らかになった。
【０２２４】
＜３‐５．ＧＩＧ２２遺伝子のノーザンブロッティング＞
ＧＩＧ２２遺伝子の発現レベルを評価するために、下記のようなノーザンブロッティングを行った。
【０２２５】
実施例１に記載されている、３つの正常肝臓組織、３つの原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株ＨｅｐＧ２から得られた全ＲＮＡ試料を各２０μｇずつ変性させて、１％ホルムアルデヒドアガロースゲルの中を電気泳動させた。そして得られたアガロースゲルをナイロンメンブレン（ボエフリンガー・マンヘイン、ドイツ）に転写した。それから、ナイロンメンブレンを、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブと一緒に一晩４２℃でハイブリダイズさせた。なお、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブは、リジプライムＩＩ・ランダムプライム標識システム（アマシャム、イギリス）を用いてＧＩＧ２２ｃＤＮＡ全長から調製された。ノーザンブロッティングの手法を２回繰り返し行った。一回目は、濃度計（デンシトメーター）を用いて定量を行った。もう一回は、全ｍＲＮＡを決定するためにβ‐アクチンのプローブを用いてハイブリダイズを行った。
【０２２６】
図２１（ａ）は、ＧＩＧ２２遺伝子が正常肝臓組織、原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株において差次的に発現しているノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図２１（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図２１（ａ）及び（ｂ）に示されるように、ＧＩＧ２２遺伝子の発現レベルが、３つの正常肝臓組織試料の全てにおいて高度に検出された。しかし、正常組織におけるＧＩＧ２２遺伝子の発現レベルよりも３つの肝癌組織試料におけるＧＩＧ２２遺伝子の発現レベルの方が、顕著に低かった。また、１つの肝癌細胞株試料においてＧＩＧ２２遺伝子の発現レベルは、検出されなかった。
【０２２７】
ノーザンブロッティングを、正常ヒト多数組織（normal human multiple tissue）（クロンテック）及びヒト癌細胞株（human cancer cell line）（クロンテック）を用いて行った。すなわち、ノーザンブロッティングを、正常組織及び癌細胞株から抽出された全ＲＮＡ試料のそれぞれが、上述した方法と同じ方法によって転写されているブロットをハイブリダイズすることによって行った。なお、上記ブロットは、クロンテック（アメリカ）社から市販されている。ここで、上記正常組織は、例えば、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、及び抹消血白血球からなる群より選ばれる。また、上記癌細胞株は、例えば、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞からなる群より選ばれる。
【０２２８】
図２９（ａ）は、ＧＩＧ２２遺伝子が、様々な正常組織において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図２９（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図２９（ａ）に示されるように、およそ０．６ｋｂのサイズを有する主要なＧＩＧ２２ｍＲＮＡ転写産物が、心臓、筋肉、肝臓、腎臓、胎盤、脾臓、肺、小腸、大腸、胸腺、及び白血球のような正常組織において過剰発現していた。
【０２２９】
図３７（ａ）は、ＧＩＧ２２遺伝子が様々な癌細胞株において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図３７（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図３７（ａ）に示されるように、ＧＩＧ２２遺伝子は、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞のような組織には発現していなかった。その結果、本発明のＧＩＧ２２遺伝子に、心臓、筋肉、肝臓、腎臓、胎盤、脾臓、肺、小腸、大腸、胸腺、及び白血球のような正常組織において癌を抑制する機能があることが明らかになった。また、ＧＩＧ２２遺伝子の発現が発癌を誘導するために白血病、子宮癌、悪性リンパ腫、大腸癌、肺癌、皮膚癌などの組織において抑制されていることを考慮すれば、本発明のＧＩＧ２２遺伝子に癌を抑制する機能があることが明らかになった。
【０２３０】
＜３‐６．ＧＩＧ２５遺伝子のノーザンブロッティング＞
ＧＩＧ２５遺伝子の発現レベルを評価するために、下記のようなノーザンブロッティングを行った。
【０２３１】
実施例１に記載されている、３つの正常肝臓組織、３つの原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株ＨｅｐＧ２から得られた全ＲＮＡ試料を各２０μｇずつ変性させて、１％ホルムアルデヒドアガロースゲルの中を電気泳動させた。そして得られたアガロースゲルをナイロンメンブレン（ボエフリンガー・マンヘイン、ドイツ）に転写した。それから、ナイロンメンブレンを、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブと一緒に一晩４２℃でハイブリダイズさせた。なお、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブは、リジプライムＩＩ・ランダムプライム標識システム（アマシャム、イギリス）を用いてＨＰ７４  ｃＤＮＡから調製された。ノーザンブロッティングの手法を２回繰り返し行った。一回目は、濃度計（デンシトメーター）を用いて定量を行った。もう一回は、全ｍＲＮＡを決定するためにβ‐アクチンのプローブを用いてハイブリダイズを行った。
【０２３２】
図２２（ａ）は、ＧＩＧ２５遺伝子が正常肝臓組織、原発性肝癌組織、及び肝癌細胞株において差次的に発現しているノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図２２（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図２２（ａ）及び（ｂ）に示されるように、ＧＩＧ２５遺伝子の発現レベルが、３つの正常肝臓組織試料の全てにおいて高度に検出された。しかし、ＧＩＧ２５遺伝子の発現レベルは、３つの肝癌組織試料、及び１つの肝癌細胞株試料においてＧＩＧ２５遺伝子の発現レベルは、検出されなかった。
【０２３３】
ノーザンブロッティングを、正常ヒト多数組織（normal human multiple tissue）（クロンテック）及びヒト癌細胞株（human cancer cell line）（クロンテック）を用いて行った。すなわち、ノーザンブロッティングを、正常組織及び癌細胞株から抽出された全ＲＮＡ試料のそれぞれが、上述した方法と同じ方法によって転写されているブロットをハイブリダイズすることによって行った。なお、上記ブロットは、クロンテック（アメリカ）社から市販されている。ここで、上記正常組織は、例えば、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、及び抹消血白血球からなる群より選ばれる。また、上記癌細胞株は、例えば、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞からなる群より選ばれる。
【０２３４】
図３０（ａ）は、ＧＩＧ２５遺伝子が、様々な正常組織において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図３０（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図３０（ａ）に示されるように、およそ１．５ｋｂのサイズを有する主要なＧＩＧ２５ｍＲＮＡ転写産物が、正常肝臓組織のみにおいて過剰発現していた。
【０２３５】
図３８（ａ）は、ＧＩＧ２５遺伝子が様々な癌細胞株において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図３８（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図３８（ａ）に示されるように、ＧＩＧ２５遺伝子は、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞のような組織には発現していなかった。その結果、本発明のＧＩＧ２５遺伝子に、正常肝臓組織において癌を抑制する機能があることが明らかになった。
【０２３６】
＜３‐７．ＧＩＧ３６遺伝子のノーザンブロッティング＞
ＧＩＧ３６遺伝子の発現レベルを評価するために、下記のようなノーザンブロッティングを行った。
【０２３７】
実施例１に記載されている、３つの正常乳房組織、３つの原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株ＭＣＦ‐７から得られた全ＲＮＡ試料を各２０μｇずつ変性させて、１％ホルムアルデヒドアガロースゲルの中を電気泳動させた。そして得られたアガロースゲルをナイロンメンブレン（ボエフリンガー・マンヘイン、ドイツ）に転写した。それから、ナイロンメンブレンを、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブと一緒に一晩４２℃でハイブリダイズさせた。なお、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブは、リジプライムＩＩ・ランダムプライム標識システム（アマシャム、イギリス）を用いてＧＩＧ３６ｃＤＮＡ全長から調製された。ノーザンブロッティングの手法を２回繰り返し行った。一回目は、濃度計（デンシトメーター）を用いて定量を行った。もう一回は、全ｍＲＮＡを決定するためにβ‐アクチンのプローブを用いてハイブリダイズを行った。
【０２３８】
図２３（ａ）は、ＧＩＧ３６遺伝子が正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現しているノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図２３（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図２３（ａ）及び（ｂ）に示されるように、ＧＩＧ３６遺伝子の発現レベルが、３つの正常乳房組織試料の全てにおいて高度に検出された。しかし、正常組織におけるＧＩＧ３６遺伝子の発現レベルよりも３つの乳癌組織試料におけるＧＩＧ３６遺伝子の発現レベルの方が、顕著に低かった。また、１つの乳癌細胞株試料においてＧＩＧ３６遺伝子の発現レベルは、検出されなかった。
【０２３９】
ノーザンブロッティングを、正常ヒト多数組織（normal human multiple tissue）（クロンテック）及びヒト癌細胞株（human cancer cell line）（クロンテック）を用いて行った。すなわち、ノーザンブロッティングを、正常組織及び癌細胞株から抽出された全ＲＮＡ試料のそれぞれが、上述した方法と同じ方法によって転写されているブロットをハイブリダイズすることによって行った。なお、上記ブロットは、クロンテック（アメリカ）社から市販されている。ここで、上記正常組織は、例えば、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、及び抹消血白血球からなる群より選ばれる。また、上記癌細胞株は、例えば、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞からなる群より選ばれる。
【０２４０】
図３１（ａ）は、ＧＩＧ３６遺伝子が、様々な正常組織において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図３１（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図３１（ａ）に示されるように、およそ０．４ｋｂのサイズを有する主要なＧＩＧ３６ｍＲＮＡ転写産物が、心臓、骨格筋、腎臓、肺、小腸、大腸、肝臓、胎盤、胸腺、及び脾臓のような正常組織において過剰発現していた。
【０２４１】
図３９（ａ）は、ＧＩＧ３６遺伝子が様々な癌細胞株において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図３９（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図３９（ａ）に示されるように、ＧＩＧ３６遺伝子は、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞のような組織には発現していなかった。その結果、本発明のＧＩＧ２５遺伝子に、乳房、心臓、骨格筋、腎臓、肺、小腸、大腸、肝臓、胎盤、胸腺、及び脾臓のような正常組織において癌を抑制する機能があることが明らかになった。
【０２４２】
＜３‐８．ＧＩＧ２遺伝子のノーザンブロッティング＞
ＧＩＧ２遺伝子の発現レベルを評価するために、下記のようなノーザンブロッティングを行った。
【０２４３】
実施例１‐８に記載されている、３つの正常肺組織、２つの原発性肺癌組織、２つの転移性肺癌組織、及び、肺癌細胞株（Ａ５４９及びＮＣＩ‐Ｈ３５８）から得られた全ＲＮＡ試料を各２０μｇずつ変性させて、１％ホルムアルデヒドアガロースゲルの中を電気泳動させた。そして得られたアガロースゲルをナイロンメンブレン（ボエフリンガー・マンヘイン、ドイツ）に転写した。それから、ナイロンメンブレンを、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブと一緒に一晩４２℃でハイブリダイズさせた。なお、32Ｐによって標識されたランダムプライムプローブは、リジプライムＩＩ・ランダムプライム標識システム（アマシャム、イギリス）を用いてＧＩＧ２ｃＤＮＡ全長から調製された。ノーザンブロッティングの手法を２回繰り返し行った。一回目は、濃度計（デンシトメーター）を用いて定量を行った。もう一回は、全ｍＲＮＡを決定するためにβ‐アクチンのプローブを用いてハイブリダイズを行った。
【０２４４】
図２４（ａ）は、ＧＩＧ２遺伝子が正常肺組織、原発性肺癌組織、転移性肺癌組織、及び肺癌細胞株において差次的に発現しているノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図２４（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図２４（ａ）及び（ｂ）に示されるように、ＧＩＧ２遺伝子の発現レベルが、３つの正常肺組織試料の全てにおいて高度に検出された。しかし、２つの原発性肺癌組織、２つの転移性肺癌組織、及び２つの肺癌細胞株においてＧＩＧ２遺伝子の発現レベルは、検出されなかった。
【０２４５】
ノーザンブロッティングを、正常ヒト多数組織（normal human multiple tissue）（クロンテック）及びヒト癌細胞株（human cancer cell line）（クロンテック）を用いて行った。すなわち、ノーザンブロッティングを、正常組織及び癌細胞株から抽出された全ＲＮＡ試料のそれぞれが、上述した方法と同じ方法によって転写されているブロットをハイブリダイズすることによって行った。なお、上記ブロットは、クロンテック（アメリカ）社から市販されている。ここで、上記正常組織は、例えば、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、及び抹消血白血球からなる群より選ばれる。また、上記癌細胞株は、例えば、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞からなる群より選ばれる。
【０２４６】
図３２（ａ）は、ＧＩＧ２遺伝子が、様々な正常組織において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図３２（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図３２（ａ）に示されるように、およそ１．３ｋｂのサイズを有する主要なＧＩＧ２ｍＲＮＡ転写産物が、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺及び抹消血白血球のような正常組織において非常に高度に過剰発現していた。
【０２４７】
図４０（ａ）は、ＧＩＧ２遺伝子が様々な癌細胞株において差次的に発現しているというノーザンブロッティングの結果を示す図である。また、図４０（ｂ）は、同じブロットをβ‐アクチンのプローブと一緒にハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。図４０（ａ）に示されるように、ＧＩＧ２遺伝子は、前骨髄球性白血病のＨＬ‐６０、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株のＫ‐５６２、リンパ芽球性白血病のＭＯＬＴ‐４、バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）、ＳＷ４８０大腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、及びＧ３６１メラノーマ細胞のような組織には発現していなかった。その結果、本発明のＧＩＧ２遺伝子に、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺及び抹消血白血球のような正常組織において癌を抑制する機能があることが明らかになった。また、ＧＩＧ２遺伝子の発現が発癌を誘導するために子宮癌、慢性白血病、大腸癌、肺癌、皮膚癌などの組織において抑制されていることを考慮すれば、本発明のＧＩＧ２遺伝子に癌を抑制する機能があることが明らかになった。
【０２４８】
（実施例４：発現ベクターのコンストラクション及びトランスフェクション）
＜４‐１．ＧＩＧ１２及びＧＩＧ３６＞
ＧＩＧ１２またはＧＩＧ３６遺伝子のどちらか一方のコード領域を含む発現ベクターを下記のようにしてコンストラクトした。最初に、実施例２において調製されたＧＩＧ１２またはＧＩＧ３６ｃＤＮＡクローンの全長を真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、アメリカ）に挿入して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１２及びｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ３６をそれぞれ取得した。各発現ベクターをＭＣＦ‐７乳癌細胞株にリポフェクタミン（ギブコ  ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。それから、０．６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ）を含むＤＭＥＭ培地において培養してトランスフェクトされた細胞を選択した。このとき、ＧＩＧ１２ｃＤＮＡを持っていない発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７細胞を対照群として用いた。
【０２４９】
＜４‐２．ＧＩＧ１７、ＧＩＧ１９、ＧＩＧ２０、ＧＩＧ２２及びＧＩＧ２５遺伝子の群＞
上記のＧＩＧ遺伝子群には属していないＧＩＧ１２及びＧＩＧ３６遺伝子を除いたＧＩＧ遺伝子のコード領域をそれぞれ含む発現ベクターを下記のようにコンストラクトした。最初に、実施例２において調製されたＧＩＧｃＤＮＡクローン全長をそれぞれ真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、アメリカ）に挿入して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１７、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１９、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２０、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２２、及びｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２５をそれぞれ取得した。各発現ベクターをＨｅｐＧ２肝癌細胞株にリポフェクタミン（ギブコ  ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。それから、０．６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ）を含むＤＭＥＭ培地において培養してトランスフェクトされた細胞を選択した。このとき、各ＧＩＧｃＤＮＡを持っていない発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞を対照群として用いた。
【０２５０】
＜４‐３．ＧＩＧ２＞
ＧＩＧ２のコード領域を含む発現ベクターを下記のようにしてコンストラクトした。最初に、実施例２において調製されたＧＩＧ２ｃＤＮＡクローン全長を真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インイトロジェン、アメリカ）に挿入して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２を取得した。発現ベクターをＡ５４９肺癌細胞株にリポフェクタミン（ギブコ  ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。それから、０．６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ）を含むＤＭＥＭ培地において培養してトランスフェクトされた細胞を選択した。このとき、ＧＩＧ２ｃＤＮＡを持っていない発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＡ５４９細胞を対照群として用いた。
【０２５１】
（実施例５）
＜５‐１．ＧＩＧ１２遺伝子によってトランスフェクトされた乳癌細胞の増殖曲線＞
ＧＩＧ１２遺伝子の乳癌細胞の増殖における効果を決定するために、野生型ＭＣＦ‐７細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１２によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７乳癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７細胞をそれぞれ、１×１０5細胞／ｍｌの細胞密度でＤＭＥＭ培地において９日間培養した。各培養液中にトリプシン（シグマ）による処理を行うことによって細胞が付着しているフラスコから細胞を単離した。そして、１日目、３日目、５日目、７日目及び９日目において生存している細胞をトリパンブルー色素排除（Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987)）に従って計測した。
【０２５２】
図４１は、野生型ＭＣＦ‐７細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１２によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７乳癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７細胞の増殖曲線を示す図である。図４１に示されるように、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７細胞、及び野生型ＭＣＦ‐７細胞の死亡率と比較して、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１２によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７乳癌細胞の死亡率は高かった。９日間インキュベーションした後、野生型ＭＣＦ‐７細胞と比較すると、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１２によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７乳癌細胞の５０％だけが、生存していた。この結果から、ＧＩＧ１２遺伝子は、乳癌細胞の増殖を抑制したと考えてもよい。
【０２５３】
＜５‐２．ＧＩＧ１７遺伝子によってトランスフェクトされた肝癌細胞の増殖曲線＞
ＧＩＧ１７遺伝子の肝癌細胞の増殖における効果を決定するために、野生型ＨｅｐＧ２細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１７によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞をそれぞれ、１×１０5細胞／ｍｌの細胞密度でＤＭＥＭ培地において９日間培養した。各培養液中にトリプシン（シグマ）による処理を行うことによって細胞が付着しているフラスコから細胞を単離した。そして、１日目、３日目、５日目、７日目及び９日目において生存している細胞をトリパンブルー色素排除（Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987)）に従って計測した。
【０２５４】
図４２は、野生型ＨｅｐＧ２細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１７によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示す図である。図４２に示されるように、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞、及び野生型ＨｅｐＧ２細胞の死亡率と比較して、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１７によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞の死亡率は高かった。９日間インキュベーションした後、野生型ＨｅｐＧ２細胞と比較すると、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１７によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞の４５％だけが、生存していた。この結果から、ＧＩＧ１７遺伝子は、肝癌細胞の増殖を抑制したと考えてもよい。
【０２５５】
＜５‐３．ＧＩＧ１９遺伝子によってトランスフェクトされた肝癌細胞の増殖曲線＞
ＧＩＧ１９遺伝子の肝癌細胞の増殖における効果を決定するために、野生型ＨｅｐＧ２細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１９によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞をそれぞれ、１×１０5細胞／ｍｌの細胞密度でＤＭＥＭ培地において９日間培養した。各培養液中にトリプシン（シグマ）による処理を行うことによって細胞が付着しているフラスコから細胞を単離した。そして、１日目、３日目、５日目、７日目及び９日目において生存している細胞をトリパンブルー色素排除（Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987)）に従って計測した。
【０２５６】
図４３は、野生型ＨｅｐＧ２細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１９によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示す図である。図４３に示されるように、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞、及び野生型ＨｅｐＧ２細胞の死亡率と比較して、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１９によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞の死亡率は高かった。９日間インキュベーションした後、野生型ＨｅｐＧ２細胞と比較すると、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ１９によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞の４０％だけが、生存していた。この結果から、ＧＩＧ１９遺伝子は、肝癌細胞の増殖を抑制したと考えてもよい。
【０２５７】
＜５‐４．ＧＩＧ２０遺伝子によってトランスフェクトされた肝癌細胞の増殖曲線＞
ＧＩＧ２０遺伝子の肝癌細胞の増殖における効果を決定するために、野生型ＨｅｐＧ２細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２０によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞をそれぞれ、１×１０5細胞／ｍｌの細胞密度でＤＭＥＭ培地において９日間培養した。各培養液中にトリプシン（シグマ）による処理を行うことによって細胞が付着しているフラスコから細胞を単離した。そして、１日目、３日目、５日目、７日目及び９日目において生存している細胞をトリパンブルー色素排除（Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987)）に従って計測した。
【０２５８】
図４４は、野生型ＨｅｐＧ２細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２０によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示す図である。図４４に示されるように、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞、及び野生型ＨｅｐＧ２細胞の死亡率と比較して、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２０によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞の死亡率は高かった。９日間インキュベーションした後、野生型ＨｅｐＧ２細胞と比較すると、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２０によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞の３５％だけが、生存していた。この結果から、ＧＩＧ２０遺伝子は、肝癌細胞の増殖を抑制したと考えてもよい。
【０２５９】
＜５‐５．ＧＩＧ２２遺伝子によってトランスフェクトされた肝癌細胞の増殖曲線＞
ＧＩＧ２２遺伝子の肝癌細胞の増殖における効果を決定するために、野生型ＨｅｐＧ２細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２２によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞をそれぞれ、１×１０5細胞／ｍｌの細胞密度でＤＭＥＭ培地において９日間培養した。各培養液中にトリプシン（シグマ）による処理を行うことによって細胞が付着しているフラスコから細胞を単離した。そして、１日目、３日目、５日目、７日目及び９日目において生存している細胞をトリパンブルー色素排除（Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987)）に従って計測した。
【０２６０】
図４５は、野生型ＨｅｐＧ２細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２２によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示す図である。図４５に示されるように、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞、及び野生型ＨｅｐＧ２細胞の死亡率と比較して、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２２によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞の死亡率は高かった。９日間インキュベーションした後、野生型ＨｅｐＧ２細胞と比較すると、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２２によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞の４０％だけが、生存していた。この結果から、ＧＩＧ２２遺伝子は、肝癌細胞の増殖を抑制したと考えてもよい。
【０２６１】
＜５‐６．ＧＩＧ２５遺伝子によってトランスフェクトされた肝癌細胞の増殖曲線＞
ＧＩＧ２５遺伝子の肝癌細胞の増殖における効果を決定するために、野生型ＨｅｐＧ２細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２５によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞をそれぞれ、１×１０5細胞／ｍｌの細胞密度でＤＭＥＭ培地において９日間培養した。
【０２６２】
各培養液中にトリプシン（シグマ）による処理を行うことによって細胞が付着しているフラスコから細胞を単離した。そして、１日目、３日目、５日目、７日目及び９日目において生存している細胞をトリパンブルー色素排除（Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987)）に従って計測した。
【０２６３】
図４６は、野生型ＨｅｐＧ２細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２５によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示す図である。図４６に示されるように、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞、及び野生型ＨｅｐＧ２細胞の死亡率と比較して、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２５によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞の死亡率は高かった。９日間インキュベーションした後、野生型ＨｅｐＧ２細胞と比較すると、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２５によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞の３５％だけが、生存していた。この結果から、ＧＩＧ２５遺伝子は、肝癌細胞の増殖を抑制したと考えてもよい。
【０２６４】
＜５‐７．ＧＩＧ３６遺伝子によってトランスフェクトされた乳癌細胞の増殖曲線＞
ＧＩＧ３６遺伝子の乳癌細胞の増殖における効果を決定するために、野生型ＭＣＦ‐７細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ３６によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７乳癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７細胞をそれぞれ、１×１０5細胞／ｍｌの細胞密度でＤＭＥＭ培地において９日間培養した。各培養液中にトリプシン（シグマ）による処理を行うことによって細胞が付着しているフラスコから細胞を単離した。そして、１日目、３日目、５日目、７日目及び９日目において生存している細胞をトリパンブルー色素排除（Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987)）に従って計測した。
【０２６５】
図４７は、野生型ＭＣＦ‐７細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ３６によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７乳癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７細胞の増殖曲線を示す図である。図４７に示されるように、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７細胞、及び野生型ＭＣＦ‐７細胞の死亡率と比較して、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ３６によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７乳癌細胞の死亡率は高かった。９日間インキュベーションした後、野生型ＭＣＦ‐７細胞と比較すると、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ３６によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７乳癌細胞の５０％だけが、生存していた。この結果から、ＧＩＧ３６遺伝子は、乳癌細胞の増殖を抑制したと考えてもよい。
【０２６６】
＜５‐８．ＧＩＧ２遺伝子によってトランスフェクトされた肺癌細胞の増殖曲線＞
ＧＩＧ２遺伝子の肺癌細胞の増殖における効果を決定するために、野生型Ａ５４９細胞、実施例４において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２によってトランスフェクトされたＡ５４９肺癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＡ５４９細胞をそれぞれ、１×１０5細胞／ｍｌの細胞密度でＤＭＥＭ培地において９日間培養した。各培養液中にトリプシン（シグマ）による処理を行うことによって細胞が付着しているフラスコから細胞を単離した。そして、１日目、３日目、５日目、７日目及び９日目において生存している細胞をトリパンブルー色素排除（Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987)）に従って計測した。
【０２６７】
図４８は、野生型Ａ５４９細胞、実施例４‐３において調製されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２によってトランスフェクトされたＡ５４９肺癌細胞、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによってトランスフェクトされたＡ５４９細胞の増殖曲線を示す図である。図４８に示されるように、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＡ５４９細胞、及び野生型Ａ５４９細胞の死亡率と比較して、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２によってトランスフェクトされたＡ５４９肺癌細胞の死亡率は高かった。９日間インキュベーションした後、野生型Ａ５４９細胞と比較すると、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＧＩＧ２によってトランスフェクトされたＡ５４９肺癌細胞の４０％だけが、生存していた。この結果から、ＧＩＧ２遺伝子は、肺癌細胞の増殖を抑制したと考えてもよい。
【０２６８】
〔産業上の利用可能性〕
上述したように、本発明の各ＧＩＧ遺伝子を、ヒトの癌の診断、予防及び治療に効果的に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】配列番号３に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３２及び配列番号４に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【図２】配列番号７に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ７及び配列番号８に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【図３】配列番号１１に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４５及び配列番号１２に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【図４】配列番号１５に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０及び配列番号１６に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【図５】配列番号１９に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３０及び配列番号２０に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【図６】配列番号２３に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ４０及び配列番号２４に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【図７】配列番号２７に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ２９及び配列番号２８に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【図８】配列番号３１に示される５’‐１３塩基数（ｍｅｒ）のランダム・プライマー  Ｈ‐ＡＰ３２０及び配列番号３２に示されるアンカード・オリゴ‐ｄＴ・プライマーを用いたＰＣＲの結果を示すゲルの図である。
【図９】ＧＩＧ１２の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【図１０】ＧＩＧ１７の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【図１１】ＧＩＧ１９の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【図１２】ＧＩＧ２０の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【図１３】ＧＩＧ２２の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【図１４】ＧＩＧ２５の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【図１５】ＧＩＧ３６の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【図１６】ＧＩＧ２の遺伝子産物がＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された結果を示す図である。
【図１７】（ａ）は、ＧＩＧ１２遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図１８】（ａ）は、ＧＩＧ１７遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図１９】（ａ）は、ＧＩＧ１９遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図２０】（ａ）は、ＧＩＧ２０遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図２１】（ａ）は、ＧＩＧ２２遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図２２】（ａ）は、ＧＩＧ２５遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図２３】（ａ）は、ＧＩＧ３６遺伝子が、正常乳房組織、原発性乳癌組織、及び乳癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図２４】（ａ）は、ＧＩＧ２遺伝子が、正常肺組織、原発性肺癌組織、転移性肺癌組織、及び肺癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図２５】（ａ）は、ＧＩＧ１２遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図２６】（ａ）は、ＧＩＧ１７遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図２７】（ａ）は、ＧＩＧ１９遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図２８】（ａ）は、ＧＩＧ２０遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図２９】（ａ）は、ＧＩＧ２２遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図３０】（ａ）は、ＧＩＧ２５遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図３１】（ａ）は、ＧＩＧ３６遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図３２】（ａ）は、ＧＩＧ２遺伝子が、各種正常組織において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図３３】（ａ）は、ＧＩＧ１２遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図３４】（ａ）は、ＧＩＧ１７遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図３５】（ａ）は、ＧＩＧ１９遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図３６】（ａ）は、ＧＩＧ２０遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図３７】（ａ）は、ＧＩＧ２２遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図３８】（ａ）は、ＧＩＧ２５遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図３９】（ａ）は、ＧＩＧ３６遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図４０】（ａ）は、ＧＩＧ２遺伝子が、各種癌細胞株において差次的に発現されるノーザンブロッティングの結果を示す図であり、（ｂ）は、β‐アクチンのプローブを用いて同じブロットをハイブリダイズすることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示す図である。
【図４１】野生型ＭＣＦ‐７細胞、ＧＩＧ１２遺伝子によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７乳癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＭＣＦ‐７細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図４２】野生型ＨｅｐＧ２肝癌細胞株、ＧＩＧ１７遺伝子によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図４３】野生型ＨｅｐＧ２肝癌細胞株、ＧＩＧ１９遺伝子によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図４４】野生型ＨｅｐＧ２肝癌細胞株、ＧＩＧ２０遺伝子によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図４５】野生型ＨｅｐＧ２肝癌細胞株、ＧＩＧ２２遺伝子によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図４６】野生型ＨｅｐＧ２肝癌細胞株、ＧＩＧ２５遺伝子によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図４７】野生型ＨｅｐＧ２肝癌細胞株、ＧＩＧ３６遺伝子によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２肝癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図４８】野生型Ａ５４９肺癌細胞株、ＧＩＧ２遺伝子によってトランスフェクトされたＡ５４９肺癌細胞、及び、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１によってトランスフェクトされたＡ５４９細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
2008525014.tif 000041
【図４０】
2008525014.tif 000042
【図４１】
2008525014.tif 000043
【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
2008525014.tif 000050
【配列表】
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【国際調査報告】
2008525014.tif 000051
2008525014.tif 000052
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