(57)【要約】  本発明は、結合性モチーフおよび細胞機能を調整する方法であって、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体の共通β鎖（βｃ）のモチーフに等価な結合性モチーフ中の単一アミノ酸残基、好ましくはＴｙｒを標的にする方法に関する。細胞機能は、細胞中の細胞生存および増殖に影響を与えるものが好ましい。方法は、細胞生存および増殖に関与する条件を処置するために使用することができ、さらに、たとえば移植の目的で、前駆細胞を増やすために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質タンパク質に結合することができる結合性モチーフであって、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンまたはその等価物である）からなるモチーフ。
【請求項２】
細胞質タンパク質に結合することができる受容体分子の結合性モチーフであって、モチーフは、アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンまたはその等価物である）からなるモチーフ。
【請求項３】
以下を含む群から選択される受容体に由来する請求項１または２に記載の結合性モチーフ。
（１）  ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体
（２）  ＩＬ６ヒトインターロイキン−６受容体β鎖前駆体（ＩＬ−６Ｒ−β）
（３）  ＬＥＰＲヒトレプチン受容体前駆体（ＬＥＰ−Ｒ）（ＯＢ受容体）（ＯＢ−Ｒ）．
（４）  ＴＮＲ２ヒト腫瘍壊死因子受容体２前駆体（腫瘍壊死因子）
（５）  ＶＧＲ１ヒト血管内皮成長因子受容体１前駆体
（６）  ＴＲＫ３ヒト受容体タンパク質−チロシンキナーゼＴＫＴ前駆体（ＥＣ２．７．１．１１２）
（７）  Ｑ０１９７４タンパク質−チロシンキナーゼ膜貫通型受容体ＲＯＲ２前駆体
（８）  ＦＧＲ１ヒト塩基性線維芽細胞成長因子受容体１前駆体（ＢＦＧＦ−Ｒ）
（９）  Ｑ１５４２６タンパク質−チロシンフォスファターゼ、受容体型、Ｈ前駆体（ＥＣ３．１．３．４８）
（１０）  ＰＴＰＭヒトタンパク質−チロシンフォスファターゼミュー前駆体（ＥＣ３．１．３．４８）（Ｒ−ＰＴＰ−ＭＵ）
（１１）  ＰＤＧＳヒトα血小板由来成長因子受容体前駆体（ＥＣ２．７．１．１１２）（１２）  ＦＧＲ４ヒト線維芽細胞成長因子受容体４前駆体（ＦＧＦＲ−４）（ＥＣ２．７．１．１１２）
（１３）  ＦＧＲ２ヒト線維芽細胞成長因子受容体２前駆体（ＦＧＦＲ−２）（ＥＣ２．７．１．１１２）
（１４）  Ｑ１３６３５パッチタンパク質相同体（ＰＴＣ）
（１５）  ＭＡＮＲヒトマクロファ−ジマンノース受容体前駆体．
（１６）  ＬＲＰ２ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２前駆体（メガリン）
（１７）  ＩＤＤヒト統合膜タンパク質ｄｇｃｒ２／ｉｄｄ前駆体（ＫＩＡＡ０１６３）（１８）  ＡＭＦＲヒト自己分泌運動性因子受容体前駆体（ＡＭＦ受容体）（ｇｐ７８）（１９）  ＡＣＨ５ヒト神経細胞アセチルコリン受容体タンパク質、α−５鎖前駆体
（２０）  ＫＫＩＴヒト：幹細胞成長因子受容体（癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼキット）（Ｃ−ＫＩＴ）（ＣＤ１１７抗原）
（２１）  ＴＰＯＲヒト：トロンボポイエチン受容体前駆体（ＴＰＯ−Ｒ）（骨髄増殖性白血病タンパク質（Ｃ−ＭＰＬ）．ＴＰＯＲまたはＭＰＬ．
（２２）  ＴＰＯＲマウス：トロンボポイエチン受容体前駆体（ＴＰＯ−Ｒ）（骨髄増殖性白血病タンパク質）（Ｃ−ＭＰＬ）．ＴＰＯＲまたはＭＰＬ．
（２３）  アセチルコリンＲ
（２４）  アセチルコリンＲα−５
（２５）  Ｃ−Ｃケモカイン受容体６
（２６）  ミドルＴ抗原
（２７）  インテグリンα１
（２８）  ＦＧＦＲ２（ＫＧＦ  Ｒ）
（２９）  ＦＧＦＲ１（ｆｌｇ）
（３０）  ＦＧＦＲ５
（３１）  Ｅｒｂ４
（３２）  ワクシニアウィルスタンパク質Ａ３６Ｒ
（３３）  マクロファ−ジマンノースＲ（ＭＲＣ１）
（３４）  ＬＤＬＲ
（３５）  ＶＬＤＬ（ラット）
（３６）  ＬＲＰ１低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１
（３７）  インテグリンβ１
（３８）  インテグリンβ７
（３９）  インテグリンβ３
（４０）  インテグリンβ５
（４１）  インテグリンβ６
（４２）  Ｇ−ＣＳＦＲ１（第２）
（４３）  Ｇ−ＣＳＦＲ１
（４４）  ｇ−ｃｓｆ−ｒ
（４５）  ＩＬ−６Ｂ（ｇｐ１３０）
（４６）  レプチンＲ
（４７）  プロラクチンＲ
（４８）  インシュリンＲ
（４９）  ｉｒｓ−１
（５０）  ＩＧＦＩ  Ｒ
（５１）  ｆｌｔ３Ｒ
（５２）  ＶＥＧＦＲ２（ＦＬＫ１）
（５３）  ＰＤＧＦ  Ｒ−α
（５４）  ＩＬ−９Ｒ
（５５）  βＲ
またはこれらの機能的等価物または類似体。
【請求項４】
以下を含む群から選択される配列に由来する請求項１〜３のいずれか１つに記載の結合性モチーフまたはその等価物。
【表１】
2008500954.tif 000005
【請求項５】
以下を含む群から選択される配列を有する請求項１〜４のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【表２】
2008500954.tif 000006
【請求項６】
配列がサイトカイン受容体に由来する請求項１〜５のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項７】
受容体がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体である請求項１〜６のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項８】
配列が共通β鎖（βｃ）を含む請求項１〜７のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項９】
Ｔｙｒ残基が共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である請求項１〜８のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項１０】
Ｔｙｒ残基に等価な残基における変性を有する請求項１〜９のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項１１】
Ｔｙｒ残基に等価な残基がＰｈｅ残基で置換されている請求項１〜１０のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項１２】
１４−３−３タンパク質、Ｓｈｃ、ＳＨＩＰ−２、プロリルイソメラーゼのＷＷ−ドメイン、Ｐｉｎ１およびユビキチンリガーゼ、ＮＥＤＤ４を含む群から選択される細胞質タンパク質に結合する請求項１〜１１のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項１３】
細胞質タンパク質がＳｈｃまたはＳＨＩＰ−２である請求項１〜１２のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項１４】
細胞内で活性を調節する方法であって、
細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフを修飾することを含み、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなるモチーフである方法。
【請求項１５】
細胞内で活性を調節する方法であって、
請求項１〜１３のいずれか１つに記載の結合性モチーフを修飾することを含む方法。
【請求項１６】
チロシン残基が共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
共通β鎖が（βｃ）がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体のそれである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
活性化がモチーフのＴｙｒのリン酸化の修飾の導入によって調節される請求項１５〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
リン酸化が細胞をリン酸化剤で処理することによって増加される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
リン酸化剤がキナーゼである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｔｙｒを変異する、置換するまたは欠失することによってリン酸化を減少させる請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ＴｙｒがＰｈｅの代わりに置換されている請求項２３記載の方法。
【請求項２３】
細胞をＴｙｒのリン酸化を阻害する拮抗剤で処理することによってリン酸化を減少させる請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
細胞をキナーゼ阻害剤で処理してＴｙｒのリン酸化を阻害することによってリン酸化を減らす請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
細胞活性化を阻害する請求項２１〜２４のいずれか１つに記載の方法であって、Ｔｙｒモチーフのリン酸化の減少あるいは阻害を含む方法。
【請求項２６】
細胞内で活性を阻害する請求項２５に記載の方法であって、モチーフへの細胞質タンパク質のモチーフへの結合の阻害を含む方法。
【請求項２７】
細胞質タンパク質が、１４−３−３タンパク質、Ｓｈｃ、ＳＨＩＰ−２、プロリルイソメラーゼのＷＷ−ドメイン、Ｐｉｎ１およびユビキチンリガーゼ、ＮＥＤＤ４を含む群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞質タンパク質がＳｈｃである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞活性を活性化する請求項１９または２０に記載の方法であって、モチーフのＴｙｒのリン酸化を誘発することを含む方法。
【請求項３０】
細胞活性が、細胞生存、増殖、分化、有糸分裂誘発、形質転換、細胞遊走、運動能、増強された食作用、増強された細菌殺菌、スーパーオキシドの産生および細胞毒性を含む群から選択される請求項１４〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
細胞活性が細胞生存である請求項１４〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
細胞活性が増殖である請求項１４〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
細胞が造血細胞である請求項１４〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
増殖を増大させる請求項３２記載の方法であって、Ｔｙｒのリン酸化を阻害することを含む方法。
【請求項３５】
増殖を阻害する請求項３２に記載の方法であって、Ｔｙｒのリン酸化を誘発することを含む方法。
【請求項３６】
細胞成長を増加する請求項３２に記載の方法であって、Ｔｙｒの活性化を阻害することを含む方法。
【請求項３７】
細胞内で活性を調節する方法であって、
細胞質タンパク質に結合することができる受容体の結合性モチーフへの修飾の導入を含み、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなる方法。
【請求項３８】
チロシン残基が共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
共通β鎖（βｃ）がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体のそれである請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
増殖を増大する請求項３７に記載の方法であって、Ｔｙｒのリン酸化を阻害することを含む方法。
【請求項４１】
増殖を阻害する請求項３７に記載の方法であって、Ｔｙｒのリン酸化を誘発することを含む方法。
【請求項４２】
細胞成長を増加する請求項３７に記載の方法であって、Ｔｙｒの活性化を阻害することを含む方法。
【請求項４３】
細胞の移植方法であって、
細胞内で請求項１〜１３のいずれか１つに記載の結合性モチーフのＴｙｒの活性化を阻害することと、
前記細胞を移植することとを含む方法。
【請求項４４】
移植効率を増加する方法であって、
細胞内で請求項１〜１３のいずれか１つに記載の結合性モチーフのＴｙｒの活性化を阻害することと、
前記細胞を移植することとを含む方法。
【請求項４５】
Ｔｙｒの活性化が移植の前に生体外で阻害される請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
Ｔｙｒの活性化が移植領域内で阻害される請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４７】
活性化が、Ｔｙｒのリン酸化を阻害することによって阻害される請求項４３〜４６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４８】
ＴｙｒがＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体の共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７
に等価である請求項４３〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４９】
共通β鎖（βｃ）がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体のそれである請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
患者の創傷治癒を改善する方法であって、
創傷部内にある請求項１〜１３のいずれか１つに記載の結合性モチーフのＴｙｒの活性化を阻害することを含む方法。
【請求項５１】
活性化が、Ｔｙｒのリン酸化を阻害することによって阻害される請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
Ｔｙｒが、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体の共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
共通β鎖（βｃ）がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体のそれである請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
創傷の治癒用の医薬の存在下での、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の結合性モチーフのＴｙｒの活性化の阻害剤としての使用。
【請求項５５】
阻害剤が、Ｔｙｒのリン酸化を阻害する請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
Ｔｙｒが共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である請求項５４または５５に記載の使用。
【請求項５７】
共通β鎖（βｃ）がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体のそれである請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
細胞成長を促進する化合物のスクリーニング方法であって、
Ｔｙｒ５７７残基または等価物を有するβｃを含む受容体をもつ細胞を得ることと；
請求項１〜１３のいずれか１つに記載の結合性モチーフ中のＴｙｒまたは等価物のリン酸化を誘発することと；
前記細胞を前記化合物に曝露することと；
細胞のコロニー形成を評価することとを含む方法。
【請求項５９】
Ｔｙｒが共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
共通β鎖（βｃ）がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体のそれである請求項５６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、結合性モチーフおよび細胞機能を調整する方法であって、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体の共通β鎖（βｃ）のモチーフに等価な結合性モチーフ中の単一アミノ酸残基を標的にする方法に関する。細胞機能は、細胞中の細胞生存および増殖に影響を与えるものが好ましい。方法は、細胞生存および増殖に関する条件を処置するために使用することができ、さらに、たとえば移植の目的で、前駆細胞を増やすために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
背景
生体外および生体内で産生する造血細胞の数は、生存、増殖および成長因子受容体から発生する分化シグナルの集成によって、厳重に調整される。これらの過程を調整する分子機構を規定することは、造血前駆細胞およびそれらの骨髄移植用の子孫を増やす新しい方針を設計する上で、および我々が白血病、骨髄増多症、細胞製造および機能の正常なバランスが壊れる慢性的炎症を理解する上で、欠かせないものである。
【０００３】
ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５のような多くのサイトカインと、ＰＤＧＦおよびＩＧＦ−１のような多くの成長因子は、当初、細胞増殖を促進する能力のため、分裂促進因子として発見されたが、後に、これら因子の多くはまた、プログラムされた細胞死、すなわちアポトーシスを抑制する能力によって、細胞生存の強力な調整因子としても知られた。これらの生物学的活性は、受容体二量化、チロシンキナーゼの活性、続いて起こる受容体細胞質尾部のチロシンリン酸化、ｓｒｃ−ホモロジー２（ＳＨ２）ドメインまたはホスフォチロシン結合（ＰＴＢ）ドメインを介して起こる多タンパク質シグナル伝達複合体の受容ホスフォチロシン残基への結合、および細胞応答を促進する下流シグナル伝達カスケードの活性化を含む、規則正しい一連のシグナル伝達事象を開始する、サイトカインまたは成長因子が同種の細胞表面受容体へ結合することによって調整される。
【０００４】
サイトカインを始めとする多くの因子が細胞生存および増殖に寄与することができ、制御を簡単に操作するためのこれらの制御は、単純なものではない。１つの制御因子の識別は、有用な治療の開発および細胞製造と機能とがバランスを崩している状態の診断において手助けとなりうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
サイトカインのようなシグナル伝達分子の作用は、あまり理解されていなかった。これらの細胞タンパク質は細胞内で活性を作動させるようである。しかし、実際の誘因メカニズムおよびこれらがどのようにして中継して、最終的な活性に至るのかについては知られていない。細胞周期は明らかに関与しているが、細胞生存、増殖および分化のようなシグナル伝達分子と受容体と作用との間のリンクは明らかではない。
【０００６】
ヒト顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびＩＬ−５を含むタンパク質は、正常な形質転換造血細胞を刺激することができる。各々について、シグナル形質導入のための開始事象は、その受容体表面へタンパク質が結合することである。これらの受容体は、α鎖および共通β鎖（βｃ）のようなサブユニットから構成されてもよい。細胞質タンパク質が表面受容体に結合することによってβｃの関与が起こる結果、細胞生存、増殖、適切な系列における分化および成
熟細胞エフェクター機能が起こり、生物学的活性が誘発された受容体の媒介においてβｃによって果たされる主なシグナル伝達を強調する事体となる。
【０００７】
受容体の活性化およびシグナル伝達カスケードの開始における第１事象の１つは、βｃのチロシンリン酸化である。これは、受容体シグナル伝達サブユニットの間の共通のテーマであり、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体および顆粒球コロニー刺激性因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体のようなホモ二量体受容体、ＩＬ−６およびＩＬ−２受容体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５受容体システムのようなヘテロ二量体受容体中で見ることができる。
【０００８】
受容体シグナル伝達サブユニットのチロシンリン酸化は、シグナル伝達分子の関連のためのドッキング部位の創造において、重要なステップのようであった。受容体のチロシンリン酸化の重要性は、認知されているにもかかわらず、ある細胞においては、それがなくてもシグナル伝達は進むことができることが明らかになってきている。これは、全チロシンの置換がそれらの活性を止めることができない、ＥＰＯおよびＴＰＯ受容体において実証される。
【０００９】
どのようにしてタンパク質がそれらの受容体に結合してこれらの分子およびそれらの受容体と関連した特定された機能となることができるのか、今まで、明らかではなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要約
本発明の第１態様では、細胞質タンパク質に結合することができる結合性モチーフが提供され、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンまたはその等価物である）からなるモチーフである。
【００１１】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体のβｃのＴｙｒ５７７に対応する単一アミノ酸は、細胞活性化の調整において制御因子として同定されている。この理由により、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦサイトカインのＧＭ−ＣＳＦ受容体と関連する細胞活性化を調節するこのアミノ酸残基を標的にする。
【００１２】
好ましい実施形態では、受容体の結合性モチーフが提供される。受容体は、細胞外分子またはタンパク質に結合しうる任意の受容体であって、Ｓｈｃのような細胞質分子またはタンパク質、細胞のシグナル伝達経路および、有糸分裂誘発、増殖、形質転換、分化および細胞生存のような生物学的機能に導く事象のカスケードを活性化することができるシグナル伝達分子とさらに結合することができる任意の細胞質分子またはタンパク質、または任意の他の細胞質分子またはタンパク質の結合によってその機能を媒介する受容体であってもよい。
【００１３】
他の本発明の態様では、細胞内で活性を調節する方法であって、
細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフを修飾することを含み、モチーフは、下記配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなるモチーフである方法が提供される。
【００１４】
他の本発明の態様では、細胞内で活性化を調節する方法であって、
細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンを修飾することを含み、モチー
フは、下記配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなるモチーフであり、チロシンは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体またはその等価物の共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である方法が提供される。
【００１５】
したがって、さらに他の好ましい実施形態では、本発明は、細胞内で活性を調節する方法であって、細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンのリン酸化を修飾することを含み、モチーフは、下記配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなるモチーフである方法が提供される。
【００１６】
さらに他の好ましい本発明の態様では、細胞成長を増大する方法であって、
細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンの活性化を阻害することを含み、モチーフは、下記配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなるモチーフである方法が提供される。
【００１７】
さらに他の本発明の態様では、細胞の移植または移植効率を増加する方法であって、細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンの１またはそれ以上の細胞において活性化を阻害することと；
細胞をそのような治療を必要とする患者に移植することとを含み、モチーフは、下記配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなるモチーフである方法が提供される。
【００１８】
他の本発明の態様では、患者の創傷治癒を改善する方法であって、
細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンの活性化を阻害することを含み、モチーフは、下記配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙは創傷部内のチロシンである）からなるモチーフである方法が提供される。
【００１９】
さらに他の本発明の態様では、細胞成長を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｔｙｒ５７７またはその等価物のリン酸化を誘発する細胞を提供することと；
細胞を化合物に曝露することと；
細胞のコロニー形成を評価することとを含む方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明の第１態様では、細胞質タンパク質に結合することができる結合性モチーフであって、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンまたはその等価物である）からなるモチーフが提供される。
【００２１】
本明細書で使用される用語「モチーフ」は、保存され、アミノ酸が相互作用する単位を形成する識別可能なアミノ酸配列を意味する。
【００２２】
シグナル伝達分子は、増殖、生存または分化に関与する経路のような、しかし、これらの経路に限定されないが、細胞経路に関与する分子であってもよい。このような経路の例示として、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路、ｒａｓ／ＭＡＰキナーゼ経路またはＰＩ−３−キナーゼ経路が挙げられる。全ての経路は、これらの機能と直接または間接的に関与していてもよい。
【００２３】
本明細書で使用される用語「細胞のシグナル伝達経路」は、細胞の機能の一因となる全ての細胞経路および細胞反応を含む。それは、受容体へのサイトカイン媒介結合から生じる反応に限定されない。しかし、活性は、サイトカイン結合によって活性化される活性が最も好ましい。
【００２４】
細胞質タンパク質は、特定のアミノ酸、すなわちチロシンによって細胞受容体と相互作用するものであるが、アミノ細胞に結合する細胞質タンパク質は、１４−３−３タンパク質、Ｓｈｃ、ＳＨＩＰ−２、プロリルイソメラーゼのＷＷドメイン、Ｐｉｎ１およびユビキチンリガーゼ、ＮＥＤＤ４および好ましくは、細胞のシグナル伝達経路、または他の経路、および有糸分裂誘発、増殖、形質転換、分化および細胞生存のような細胞内での生物学的機能に導く事象のカスケードを活性化する他のシグナル伝達分子を結合しうる任意の細胞質タンパク質を含む群から選択されることが好ましい。さらに好ましくは、細胞質タンパク質はＳｈｃである。最も好ましくは、Ｓｈｃがチロシンに結合するものである。
【００２５】
用語「シグナル伝達分子」は、細胞シグナル伝達経路において活性化をシグナルで送ることのできる任意の分子である。
【００２６】
Ｓｈｃは、そのＰＴＢドメインを介してＴｙｒに結合し、細胞内シグナル伝達を正におよび負に調整する潜在能力を有する。たとえば、Ｓｈｃは、ｇｒｂ２／ｓｏｓの漸加によるＲａｓ／Ｍａｐキナーゼ経路とｇｒｂ２／ＧＡＢ２／ＰＩ３−キナーゼ複合体の漸加によるＰＩ３−キナーゼ経路とを介するシグナル伝達の促進において、正の役割が示唆されていることに加え、フォスファターゼＳＨＰ２およびＳＨＩＰを含むシグナル伝達の負のレギュラータを漸加することも知られている。
【００２７】
アミノ酸に結合する細胞質タンパク質は、さらに、細胞のシグナル伝達経路およびこれらに限定されないが、有糸分裂誘発、増殖、形質転換、分化および細胞生存のような生物学的機能に導く事象のカスケードを活性化することができるシグナル伝達分子、またはシグナルを送らない他の細胞質分子またはタンパク質に結合する。
【００２８】
チロシン残基は、細胞質タンパク質と反応することができ、次にチロシンと細胞質タンパク質とが相互作用し、細胞活性を活性化できることが好ましい。
【００２９】
チロシンに結合する細胞質タンパク質は、ＳｈｃまたはＳＨＩＰ−２がさらに好ましい。
【００３０】
好ましい実施形態では、受容体の結合性モチーフが提供される。受容体は、細胞外の分子またはタンパク質に結合することができ、Ｓｈｃのような細胞質分子あるいはタンパク質、細胞のシグナル伝達経路および有糸分裂誘発、増殖、形質転換、分化および細胞生存のような生物学的機能に導く事象のカスケードを活性化する他のシグナル伝達分子を結合しうる他の任意の細胞質分子あるいはタンパク質、または他の任意の細胞質分子あるいはタンパク質の結合によってその機能を媒介する、任意の受容体であってよい。
【００３１】
本明細書で使用される受容体は、以下のものを含む群から選択されてもよい。
（１）  ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体
（２）  ＩＬ６ヒトインターロイキン−６受容体β鎖前駆体（ＩＬ−６Ｒ−β）
（３）  ＬＥＰＲヒトレプチン受容体前駆体（ＬＥＰ−Ｒ）（ＯＢ受容体）（ＯＢＲ）．（４）  ＴＮＲ２ヒト腫瘍壊死因子受容体２前駆体（腫瘍壊死因子）
（５）  ＶＧＲ１ヒト血管内皮成長因子受容体１前駆体
（６）  ＴＲＫ３ヒト受容体タンパク質−チロシンキナーゼＴＫＴ前駆体（ＥＣ２．７．１．１１２）
（７）  Ｑ０１９７４タンパク質−チロシンキナーゼ膜貫通型受容体ＲＯＲ２前駆体
（８）  ＦＧＲ１ヒト塩基性線維芽細胞成長因子受容体１前駆体（ＢＦＧＦ−Ｒ）
（９）  Ｑ１５４２６タンパク質−チロシンフォスファターゼ、受容体型、Ｈ前駆体（ＥＣ３．１．３．４８）
（１０）  ＰＴＰＭヒトタンパク質−チロシンフォスファターゼミュー前駆体（ＥＣ３．１．３．４８）（Ｒ−ＰＴＰ−ＭＵ）
（１１）  ＰＤＧＳヒトα血小板由来成長因子受容体前駆体（ＥＣ２．７．１．１１２）（１２）  ＦＧＲ４ヒト線維芽細胞成長因子受容体４前駆体（ＦＧＦＲ−４）（ＥＣ２．７．１．１１２）
（１３）  ＦＧＲ２ヒト線維芽細胞成長因子受容体２前駆体（ＦＧＦＲ−２）（ＥＣ２．７．１．１１２）
（１４）  Ｑ１３６３５パッチタンパク質相同体（ＰＴＣ）
（１５）  ＭＡＮＲヒトマクロファ−ジマンノース受容体前駆体．
（１６）  ＬＲＰ２ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２前駆体（メガリン）
（１７）  ＩＤＤヒト統合膜タンパク質ｄｇｃｒ２／ｉｄｄ前駆体（ＫＩＡＡ０１６３）（１８）  ＡＭＦＲヒト自己分泌運動性因子受容体前駆体（ＡＭＦ受容体）（ｇｐ７８）（１９）  ＡＣＨ５ヒト神経細胞アセチルコリン受容体タンパク質、α−５鎖前駆体
（２０）  ＫＫＩＴヒト：幹細胞成長因子受容体（癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼキット）（Ｃ−ＫＩＴ）（ＣＤ１１７抗原）
（２１）  ＴＰＯＲヒト：トロンボポイエチン受容体前駆体（ＴＰＯ−Ｒ）（骨髄増殖性白血病タンパク質（Ｃ−ＭＰＬ）．ＴＰＯＲまたはＭＰＬ．
（２２）  ＴＰＯＲマウス：トロンボポイエチン受容体前駆体（ＴＰＯ−Ｒ）（骨髄増殖性白血病タンパク質）（Ｃ−ＭＰＬ）．ＴＰＯＲまたはＭＰＬ．
（２３）  アセチルコリンＲ
（２４）  アセチルコリンＲα−５
（２５）  Ｃ−Ｃケモカイン受容体６
（２６）  ミドルＴ抗原
（２７）  インテグリンα１
（２８）  ＦＧＦＲ２（ＫＧＦ  Ｒ）
（２９）  ＦＧＦＲ１（ｆｌｇ）
（３０）  ＦＧＦＲ５
（３１）  Ｅｒｂ４
（３２）  ワクシニアウィルスタンパク質Ａ３６Ｒ
（３３）  マクロファ−ジマンノースＲ（ＭＲＣ１）
（３４）  ＬＤＬＲ
（３５）  ＶＬＤＬ（ラット）
（３６）  ＬＲＰ１低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１
（３７）  インテグリンβ１
（３８）  インテグリンβ７
（３９）  インテグリンβ３
（４０）  インテグリンβ５
（４１）  インテグリンβ６
（４２）  Ｇ−ＣＳＦＲ１（第２）
（４３）  Ｇ−ＣＳＦＲ１
（４４）  ｇ−ｃｓｆ−ｒ
（４５）  ＩＬ−６Ｂ（ｇｐ１３０）
（４６）  レプチンＲ
（４７）  プロラクチンＲ
（４８）  インシュリンＲ
（４９）  ｉｒｓ−１
（５０）  ＩＧＦＩ  Ｒ
（５１）  ｆｌｔ３Ｒ
（５２）  ＶＥＧＦＲ２（ＦＬＫ１）
（５３）  ＰＤＧＦ  Ｒ−α
（５４）  ＩＬ−９Ｒ
（５５）  βＲ
またはこれらの機能的等価物または類似体。
【００３２】
受容体はサイトカイン受容体が好ましい。さらに好ましくは、βｃを含むＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体である。
【００３３】
モチーフの結合容量は、当業者が使用できる任意の結合技術または実験によって分析してもよい。そのような実験として、指定された細胞質タンパク質の結合性モチーフへの結合能力の測定が挙げられる。たとえば、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡまたはバンドシフトアッセイ）または、フットプリント分析またはプルダウン実験が特定の結合を測定するものとして入手可能である。
【００３４】
モチーフ（Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ）は、好ましくはアミノ酸配列Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ中のチロシンの存在と、指定された細胞質タンパク質を結合する能力とによって、同定することができる。指定された細胞質タンパク質として、Ｓｈｃ、ＳＨＩＰ−２または細胞のシグナル伝達経路および有糸分裂誘発、増殖、形質転換、分化および細胞生存のような生物学的機能へ導く事象のカスケードを活性化する他のシグナル伝達分子を結合しうる任意の細胞質タンパク質が挙げられる。細胞質タンパク質としてＳｈｃまたはＳＨＩＰ−２がさらに好ましい。
【００３５】
受容体としては、共通β鎖（βｃ）を含むＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体が好ましい。サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５は、βｃを介する表面受容体によってそれらの作用を合図することが発見された。結合性モチーフは、図６による共通βｃのアミノ酸Ｔｙｒ５７７に対応するアミノ酸Ｔｙｒ、またはその機能的等価物または類似体を含む配列を含むことが最も好ましい。
【００３６】
本明細書で使用される用語「その機能的等価物または類似体」は、配列の活性または機能は実質的に変化せずに、同様の方法で（しかし欠損、付加、または置換があってもよい）機能する配列を意味する。
【００３７】
共通β鎖（βｃ）は、サイトカインシグナル受容体の構成成分であり、該受容体のシグナル伝達サブユニットの一部である。サイトカインは、βｃを通じてその機能を示し、細胞生存、増殖、分化および成熟細胞エフェクター機能のような同定可能な生物学的機能においてカスケードし、完結する事象を開始すると考えられている。しかし、本発明は、βｃのモチーフに限定されず、受容体およびβｃに類似した配列を有し、等価位置にチロシ
ン残基を含む細胞の範囲内の他のタンパク質のモチーフも含む。２座配位子モチーフが上記のように同定された構造を持ち、この構造によって、細胞上でサイトカインがその効果を発揮するものも本発明の範囲内である。好ましくは、Ｔｙｒ５７７を含むβｃの領域で結合モチーフが見出されることである。これをガイドとして有することで、Ｔｙｒ５７７を含むβｃの領域に対応する類似のモチーフをもつタンパク質全てが本発明の範囲内に入る。
【００３８】
βｃのアミノ酸Ｔｙｒ５７７またはその機能的等価物を含む領域またはモチーフは、好ましくは、１４−３−３タンパク質、Ｓｈｃ、ＳＨＩＰ−２、プロリルイソメラーゼのＷＷドメイン、Ｐｉｎ１およびユビキチンリガーゼ、ＮＥＤＤ４または細胞のシグナル伝達経路および有糸分裂誘発、増殖、形質転換、分化および細胞生存のような生物学的機能へ導く事象のカスケードを活性化する他のシグナル伝達分子を結合しうる任意の細胞質タンパク質から選択される細胞質タンパク質と相互作用する残基を含んでもよい。しかし、本発明は、この配列に限定されるのではなく、同じ機能を発揮しうる別の等価の配列も含む。
【００３９】
本明細書および請求の範囲を通して使用される語「含む」およびその変形である「含んでいる」および「含む」は他の添加剤、構成成分、整数および工程を排除するものではない。
【００４０】
２座配位子モチーフは、細胞のどのような形ででも存在してよい。上記のアミノ酸配列を含むモチーフ構造は、どのような細胞でもスクリーニングすることができる。しかし、ＧＭ−ＣＳＦによって効果をもたらされうる、またはβｃを含む細胞であることが好ましい。最も好ましくは、該細胞は、Ｔｙｒに場所を提供するβｃへシグナル伝達分子が結合することによって効果を発揮する細胞、さらに好ましくはβｃのＴｙｒ５７７に対応する細胞である。細胞としては、リンパ系細胞、骨髄系細胞、および赤血球系細胞（これらに限定されない）のような造血細胞が最も好ましい。特に、Ｂ細胞およびＴ細胞を含むリンパ系列は、抗体を産生し、細胞免疫を調整し、血液中の病原微生物のような異物剤を検出する。単核細胞、顆粒球および巨核球を含む骨髄系列は、異物に関し血液をモニターし、腫瘍細胞に対して保護し、異物を廃棄し、血小板を生成する。赤血球系列は酸素を運ぶ赤血球を含む。したがって、２座配位子モチーフは最も好ましくは造血細胞ラインに影響を与えるので、これらの任意の細胞ラインと関連する細胞活性が、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−５／ＩＬ−３のβｃのＴｙｒ５７７の修飾を標的とすることによって調節することも本発明の範囲内である。
【００４１】
本発明の他の実施形態では、モチーフが以下の配列のいずれか１つから選ばれることが好ましい。
【００４２】
【表１】
2008500954.tif 000002
【００４３】
配列は以下に対応してもよい。
【００４４】
【表２】
2008500954.tif 000003
【００４５】
さらに好ましくは、結合性モチーフまたは等価物は、以下の配列のいずれか１つを有していてもよい。
【００４６】
【表３】
2008500954.tif 000004
【００４７】
本発明で、Ｔｙｒ５７７の変異は、ＧＭ−ＣＳＦに応答した造血細胞生存を消失させることが必要であることが発見された。このことは、これらの残基が独立して細胞生存を調整することができることを示唆する。
【００４８】
出願人はさらにＳｈｃはＰｌ−３キナーゼ活性化に必要なＴｙｒ１７９を介して、１４−３−３と相互作用することを発見している。このシグナル伝達分子を介して、さらにシグナル伝達経路が活性化され、有糸分裂誘発、増殖、形質転換、分化、細胞生存、細胞遊走、運動能、増強された食作用、細菌殺菌、スーパーオキシドの産生および細胞毒性のような細胞活性を導く。
【００４９】
他の本発明の態様では、細胞内で活性を調節する方法であって、該方法は細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフを修飾することを含み、モチーフは下記配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなる方法が提供される。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、細胞内で活性を調節する方法であって、該方法は細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンを修飾することを含み、モチーフは下記配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなり、チロシンは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体またはその等価物の共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である方法が提供される。
【００５１】
用語「受容体の共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価な」または「Ｔｙｒ５７７または等価物」を使用する場合、βｃまたは他の残基のＴｙｒ５７７、好ましくは図６のような共通βｃアミノ酸配列に基づくＴｙｒ５７７と整列させることのできる位置にあるチロシンを意味する。等価物は、共通βｃ上のＴｙｒ５７７に似たように振舞い、同じ効果を持つものを言う。
【００５２】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体のβｃのＴｙｒ５７７に対応する単一アミノ酸は、細胞活性化の調
整において制御因子として同定されていた。この理由で、本発明は、このアミノ酸残基および細胞活性化を調節するこの残基を取り囲み、支持するモチーフを標的にする。
【００５３】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体の殆どは、受容体のβｃへの細胞質タンパク質の結合からカスケードする、数多くの細胞活性化の原因である。βｃへのシグナル伝達分子の進入は、数多くの細胞活性化の刺激となる。
【００５４】
共通β鎖（βｃ）は、サイトカイン受容体の構成成分であり、該受容体のシグナル伝達サブユニットである。サイトカインは、βｃによってその機能を示し、細胞生存、増殖、分化および成熟細胞エフェクター機能のような同定可能な生物学的機能においてカスケードし、完結する事象を開始すると考えられている。しかし、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦのβｃに限定されず、βｃに類似した配列を有し、Ｔｙｒ５７７残基に似た位置に残基を含む受容体のモチーフも含む。
【００５５】
本明細書で使用される「細胞活性化」または「細胞内での活性化」は、細胞生存、増殖、分化、有糸分裂誘発、形質転換、細胞遊走、運動能、増強された食作用、増強された細菌殺菌、スーパーオキシドの産生および細胞毒性を含む群から選択されてもよい。細胞活性化は、受容体に直接関係する任意の活性化が好ましい。最も好ましくは、細胞活性化は、細胞成長、コロニー成長および細胞生存および増殖に導く活性である。
【００５６】
しかし、これらの活性は、細胞活性化の制御因子として、βｃのＴｙｒ５７７または等価物残基を標的にすることによって調節することができる。この残基は、予め、受容体のアダプタータンパク質ＳｈｃおよびチロシンフォスファターゼＳＨＩＰ−２にカップリングで関係づけられている。
【００５７】
細胞活性化に関して本明細書で使用される「調節」または「調節する」は、修飾されていないレベルと比較して、活性が修飾され、変更され、あるいは変化することを意味する。活性は増加されてもよいし、減少されてもよい。たとえば、増殖は増加しても、減少してもよい。調節は、細胞活性を増強してもあるいは低下させてもよい。どのような場合でも、細胞活性は、βｃのアミノ酸残基Ｔｙｒ５７７で受容体の修飾の効能によって変化させられる。
【００５８】
任意の細胞がチロシン、好ましくは共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７、への修飾によって影響されてもよい。しかし、ＧＭ−ＣＳＦによって影響される細胞、またはβｃを含む細胞が一般的である。細胞としては、シグナル伝達分子がＴｙｒ５７７をかくまうβｃに結合することによって影響を受ける細胞が最も好ましい。細胞としては、リンパ系細胞、骨髄系細胞、および赤血球系細胞（これらに限定されない）のような造血細胞が最も好ましい。特に、Ｂ細胞およびＴ細胞を含むリンパ系列は、抗体を産生し、細胞免疫を制御し、血液中の病原微生物のような異物剤を検出する。単核細胞、顆粒球および巨核球を含む骨髄系列は、異物に関し血液をモニターし、腫瘍細胞に対して保護し、異物を廃棄し、血小板を生成する。赤血球を含む赤血球系列は、酸素を運ぶ。したがって、Ｔｙｒ５７７は最も好ましく造血細胞ラインに影響を与えるので、これらの任意の細胞ラインと関連する細胞活性が、ＧＭ−ＣＳＦのβｃのＴｙｒ５７７の修飾を標的とすることによって調節することも本発明の範囲内である。
【００５９】
本明細書で使用される細胞は、単離された細胞でもよく、あるいは体内組織あるいは体液中に含まれている細胞でもよい。好ましくは、細胞は、前記造血細胞である。一般に、細胞はＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインのための受容体を持つことになるものである。最も好ましくは、細胞はＧＭ−ＣＳＦ受容体を持ち、βｃを介して活性化されることになるものである。
【００６０】
造血細胞は、骨髄または末梢血、細胞培養物または組織検体のようなどのような産生源から由来してもよい。それらは当業者に入手しうる方法で単離される。
【００６１】
本発明の方法では、Ｔｙｒ、好ましくはβｃのＴｙｒ５７７の等価物を修飾することによる少なくとも１つの細胞活性化の調節を必要とする。本発明で使用される修飾の導入としては、βｃのＴｙｒ５７７に等価な残基に変異を導入すること、あるいはβｃ上のＴｙｒ５７７の位置に変異を有するβｃ変異を形質導入するが挙げられる。細胞活性化を調節するためにＴｙｒ５７７の効果をブロックする方法もまた、本発明の範囲内であり、Ｔｙｒ５７７を修飾するという精神の範囲内である。この場合、結合することによって起こる事象のカスケードを活性化する、ＳｈｃまたはＳＨＩＰ−２の結合をブロックするＴｙｒ５７７残基に関する分子、またはＴｙｒ５７７のリン酸化を阻止することも含まれる。
【００６２】
Ｔｙｒ５７７が唯一の標的であり、細胞活性の調節は、Ｔｙｒ５７７の修飾のみに依存するのが好ましい。
【００６３】
好ましい実施形態の１つでは、修飾は、βｃ上のＴｙｒ５７７に等価な位置で変異を誘発することによって行われる。変異には、βｃ上のＴｙｒ５７７に等価な位置が弱体化し、結合性細胞質タンパク質のようにその正常な機能を行うことができないということではもはや機能的ではなくなるような、置換、欠失または他のアミノ酸の挿入が含まれる。
【００６４】
アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を類似の構造および／または化学的特性をもつ他のアミノ酸で置換した結果、すなわち、保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいてなされる。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン；極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン；正に帯電した（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジン、およびヒスチジン；および負に帯電した（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００６５】
「欠失」は、アミノ酸が物理的に除かれる結果である。位置は、変異形成を示す部位に使用されるような、当業者に知られている方法によって、標的とされてもよい。
【００６６】
「挿入」は、類似のアミノ酸は挿入されないが別のアミノ酸が挿入される場合が挙げられる。したがってそれは非保存的アミノ酸変化である。
【００６７】
好ましくは、置換は、Ｔｙｒ５７７または等価物を、他のアミノ酸で置き換える。好ましくは、該Ｔｙｒ５７７または等価物をフェニルアラニン（Ｔｙｒ５７７Ｐｈｅ）で置き換える。
【００６８】
さらに他の好ましい実施形態では、Ｔｙｒ５７７または等価物の修飾は、Ｔｙｒ５７７または等価物の拮抗剤、阻害剤、模倣物または誘導体を使用することによって達成する。本明細書で使用される用語「拮抗剤」または「阻害剤」は、Ｔｙｒ５７７または等価物に結合した時、Ｔｙｒ５７７または等価物の活性化をブロックするまたは調節する分子を言う。拮抗剤および阻害剤として、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、またはＴｙｒ５７７または等価物に結合するリガンドを含む他の任意の分子が挙げられる。Ｔｙｒ５７７または等価物の活性化および／または発現の他の調節剤として、合理的に設計された合成阻害剤の範囲のものが挙げられる。
【００６９】
Ｔｙｒ５７７または等価物での修飾は、直接または間接的な方法によって達成される。Ｔｙｒ５７７または等価物の活性化の調節は、当業者に知られている直接的な方法を用いて達成されてもよい。ノックアウト技術、標的変異、遺伝子治療が挙げられるがこれらに限定されない。Ｔｙｒ５７７または等価物の活性化を調節する間接的方法として、細胞質タンパク質ＳｈｃまたはＳＨＩＰ−２調整剤のような、上流または下流標的調整剤が挙げられる。
【００７０】
さらに他の好ましい実施形態では、細胞活性化を調節するＴｙｒ５７７または等価物の修飾は、Ｔｙｒ５７７または等価位置に変異を有するβｃ変異体を含む細胞にコンストラクトを導入することによって達成される。
【００７１】
出願人は、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体の共通β鎖における単一アミノ酸置換は、細胞生存および増殖を増やす結果となり、造血細胞の挙動で顕著な効果を有することを発見した。内因性β共通およびβＩＬ−３を欠いているマウスからのプライマリーの胎児肝臓を使用し、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体のα鎖とβ鎖とを含むＩＲＥＳコンストラクトで形質導入した。β鎖変異体Ｔｙｒ５７７Ｐｈｅで形質導入された胎児肝臓細胞によって、ヒトＧＭ−ＣＳＦの非存在下でも存在下でも生存の増加が発揮された。さらにそれらはサイズがより大きい、１４日目コロニーを非常に数多く形成した。デルタアッセイは、７日間ＧＭ−ＣＳＦを含む液体培養液で培養した後、細胞を形成した１４日目コロニーの膨張を示した。増加した細胞増殖は、また、ヒトＧＭ−ＣＳＦに応答して、左にシフトしたことによって実証されるように、Ｔｙｒ５７７Ｐｈｅ変異体受容体で形質導入されたＣＴＬ−ＥＮ細胞においても見られた。Ｔｙｒ５７７Ｐｈｅ変異体は、受容体、ＪＡＫ−２の活性化またはＳＴＡＴ−５のリン酸化に対するＳＨＩＰ−２の漸加を変更しなかったが、Ｔｙｒ５７７の変異は、受容体へＳｈｃを補い、そのチロシンリン酸化を促進することはできなかった。
【００７２】
ラットの活性化およびＳＨ−２含有イノシトールフォスファターゼＳＨＩＰの活性化において、重大な効果が発見されたことは重要なことである。
【００７３】
受容体の、好ましくは受容体のβｃのＴｙｒ５７７または等価物残基の導入された変異を有する細胞を、細胞生存に影響を及ぼすことができる化合物をスクリーニングするアッセイで使用してもよい。
【００７４】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、細胞内で増殖を調節する方法であって、該方法は細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフを修飾することを含み、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなる方法を提供する。
【００７５】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、細胞内で増殖を調節する方法であって、細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンを修飾することを含み、モチーフは下記配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなり、チロシンは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体またはその等価物の共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である方法を提供する。
【００７６】
Ｔｙｒ５７７または等価物の修飾は、本明細書で記載した任意の方法で行ってもよい。しかし、Ｔｙｒ５７７または細胞質タンパク質ＳｈｃまたはＳＨＩＰ−２の等価物の相互作用を開放する方法であればどれも増殖を調節するためには最も好ましい。Ｓｈｃまたは
ＳＨＩＰ−２細胞質タンパク質の完全開放は、Ｔｙｒ５７７または等価物のリン酸化の完全な阻害へ導くことを出願人は発見した。この事象を弱体化することによって、細胞の活性化および増殖が増大し、生存およびより大きなコロニーが増える結果となる。
【００７７】
したがって、さらに他の好ましい実施形態では、本発明は、細胞内で活性を調節する方法であって、
細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンのリン酸化を修飾することを含み、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなる方法を提供する。
【００７８】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、細胞内で活性を調節する方法であって、細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンのリン酸化を修飾することを含み、モチーフは下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなり、チロシンは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体またはその等価物の共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である方法を提供する。
【００７９】
細胞活性は細胞成長および／または増殖であることが好ましい。両活性ともより大きな細胞、より大きなコロニーへと導く。
【００８０】
結合性モチーフ上のチロシンをリン酸化するリン酸化事象の調整は、細胞質タンパク質の結合に影響し、これは次にシグナル伝達分子の活性化に影響し、細胞シグナル伝達経路および細胞活性化に導く事象のカスケードを活性化する。細胞活性は、有糸分裂誘発、増殖、形質転換、差別化、細胞生存、細胞遊走、運動能、増強された食作用、細菌殺菌、スーパーオキシドの産生および細胞毒性を含む群から選択されることが好ましい。細胞活性は、増殖または細胞生存が最も好ましい。さらに好ましいのは、細胞生存である。
【００８１】
Ｔｙｒまたは等価物のリン酸化の修飾は、残基のリン酸化を増やしてもよいし、減らしてもよい。リン酸化を増やすあるいは減らす（阻害する）方法は、当業者に知られている。しかし、具体的には、特定のキナーゼ阻害剤を使用してリン酸化を抑制するのに好ましい。
【００８２】
最も好ましくは、βｃのＴｙｒ５７７はリン酸化によって修飾される。Ｔｙｒ５７７のリン酸化を阻害することによって、細胞増殖を増やすことができる。逆に言えば、リン酸化を誘発することによって、細胞成長を阻害することができる。
【００８３】
理論に拘束されるものではないが、βｃのＴｙｒ５７７のリン酸化は残基に対するＳｈｃやＳＨＩＰ−２のような細胞質タンパク質の結合を改善するため、細胞質タンパク質が残基またはその等価物と結合する時、結合は、他の細胞質タンパク質やシグナル伝達分子を受容体の隣に持っていくように起こることが明らかにされている。リン酸化は、フォスフォリル（フォスフェート）基をＴｙｒ５７７に移動する任意の手段によって起こってもよい。
【００８４】
さらに他の好ましい本発明の態様では、細胞成長を増やす方法であって、
細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンの活性化を阻害することを含み、モチーフは下記のアミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなる方法を提供する。
【００８５】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、細胞成長を増やす方法であって、
細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンの活性化を阻害することを含み、モチーフは下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなり、チロシンは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体またはその等価物の共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である方法を提供する。
【００８６】
本発明において発見されたように、モチーフのチロシン、さらに好ましくはＴｙｒ５７７または等価物は、細胞の生存に不可欠なメカニズムの、最も好ましくは細胞成長および増殖の活性化において中心的なものである。細胞成長を増やすことは、細胞コロニーを増大することになり、本明細書で記載した方法は、また、細胞内のコロニーのサイズを大きくすることにも有用である。
【００８７】
細胞として最も好ましいものは、上記したように造血細胞であり、ＧＭ−ＣＳＦ受容体を、さらに具体的には共通βｃを組み込む細胞である。しかし、他の細胞を本明細書で記載したモチーフを使用して修飾してもよい。
【００８８】
置換、欠失または挿入、阻害による、またはリン酸化の非活性化によるＴｙｒ５７７または等価物の効果の損失が、細胞成長およびコロニーサイズにおける増加を起こすことは上記した通りである。Ｔｙｒ５７７または等価物の活性化を阻害するこれらの型は、本発明の範囲内である。
【００８９】
リン酸化されたまたはリン酸化されていない型においてＴｙｒ５７７または等価物に結合する拮抗剤は、Ｔｙｒ５７７または等価物の活性化を阻害するために使用することができることが好ましい。これによって、ＴｙｒまたはＴｙｒ５７７または等価物は、細胞質タンパク質を結合し、さらに細胞シグナル伝達経路を活性化する能力を失うことができることを意味する。これは細胞生存または活性化を増やすために有用であるかもしれない。好ましくは、拮抗剤は、リン酸化を阻止する、好ましくはＴｙｒ５７７またはβｃの等価リン酸化またはまたは等価物を阻止することによって細胞生存または活性化を増やし、そうすることで、結合性モチーフへの細胞質タンパク質結合を阻止するために、有用である。あるいは、それらは、Ｓｈｃまたは等価物を結合するフォスフォチロシンに結合するシグナル伝達分子の結合の相互作用を阻止してもよい。
【００９０】
上記したβｃまたはＴｙｒ５７７または等価物のリン酸化の阻止は、Ｔｙｒ５７７または等価物の活性化も阻害してよく、これは、Ｔｙｒ５７７または等価物残基のリン酸化に関与する特定のキナーゼの阻害によって達成されてもよく、または、ＳｈｃまたはＳＨＩＰ−２のような細胞質タンパク質を細胞周期経路の結合および活性化させないように、残基の変異を含んでもよい。ＰＫＡに結合するＨ８９のようなキナーゼ  阻害剤を使用してもよい。好ましくは細胞浸透性キナーゼ阻害剤が使用される。
【００９１】
拮抗剤として、抗体、小ペプチド、低分子、ペプチド模倣剤、または当業者に知られている任意の型の分子であって、Ｔｙｒ５７７または等価物に向けられ、Ｓｈｃ、ＳＨＩＰ−２のような細胞質タンパク質がＴｙｒ残基へ、またはシグナル伝達分子に結合するのを防ぐ分子が挙げられる。抗体は、前記Ｔｙｒ５７７または等価物の任意のものに応答して、当業者に知られ入手可能な方法によって、生成されてもよい。
【００９２】
しかし、本発明はさらにＴｙｒ５７７または等価物にも結合する細胞質タンパク質を修飾することを包含してもよい。細胞内でＴｙｒ５７７または等価物を影響することなく、
修飾は、細胞質タンパク質または等価物のリン酸化を起こすかもしれない他の因子に対して行うことができる。本発明では、Ｔｙｒ５７７または等価物と細胞質タンパク質、すなわちＳｈｃとＳＨＩＰ−２との間の相互作用の開放を起こす任意の手段を含むことが効果的である。
【００９３】
さらに他の本発明の態様では、細胞の移植方法であって、
細胞内で細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンの活性化を阻害することと；
該細胞をそのような治療を必要とする患者に移植することとを含み、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなる方法を提供する。
【００９４】
本発明のさらに好ましい実施形態においては、細胞の移植方法であって、
細胞内で細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンの活性化を阻害することと；
該細胞をそのような治療を必要とする患者に移植することとを含み、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなり、チロシンは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体またはその等価物の共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である方法が提供される。
【００９５】
細胞成長を増やすためにＴｙｒ５７７または等価物の活性化を阻害するこの方法は、生体内でも生体外でも行ってよい。細胞数を増やすための細胞培養技術は、本明細書に記載された方法で、Ｔｙｒ５７７または等価物と細胞質タンパク質ＳｈｃまたはＳＨＩＰ−２との相互作用を阻害することによって増強してもよい。これは、細胞のコロニーを増やし、患者に注射する前に生体外で前駆細胞を増やすために、特に有用である。しかし、Ｔｙｒ５７７または等価物の相互作用は、特定のキナーゼ阻害剤の使用により生体内で進めてもよい。
【００９６】
細胞内の活性化の阻害は、移植効率を増加するために有用であるかもしれない。活性化を阻害することで細胞の増殖を増やすことによって、移植において、より多くの細胞が首尾よく合体し相和する。
【００９７】
同様に、移植領域内の細胞は、細胞成長を増強し移植の拒絶を減らすために、その領域内の細胞増殖および成長を増やすように、Ｔｙｒ５７７または等価物の活性化を阻害する処理がされてもよい。これは、移植片を「取り出す」際、手助けをし、移植するために必要な細胞の数を減らすかもしれない。もし、より少ない数の細胞を移植するのであれば、該方法は、骨髄移植の後、特に、幹細胞の定着と骨髄回復との間の時間に保護を提供するのに有用なコロニー形成細胞を増やすために有用である。
【００９８】
移植を受ける患者は、細胞成長を増やすように、あるいは移植組織の生存の機会を改良する細胞成長を増強するように、リン酸化の阻害剤で処置され、移植の領域に対して行われてもよい。
【００９９】
他の本発明の態様では、患者の創傷治癒を改善する方法であって、
細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンの活性化を阻害することを含み、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙは創傷部内にあるチロシンである）からなる方法が提供される。
【０１００】
本発明のさらに好ましい実施形態では、細胞の移植方法であって、
細胞内で細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフのチロシンの活性化を阻害することを含み、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなり、チロシンは、創傷部内にある、ＧＭ−ＣＳＦ受容体またはその等価物の共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である、である方法が提供される。
【０１０１】
βｃのＴｙｒ５７７または等価物の活性化を阻害することによって、細胞は、損傷部内で増殖を誘発されることができる。上記したように、Ｔｙｒ５７７または等価物の活性化を阻害する方法があり、上記したこれらの方法のいかなるものでも、Ｔｙｒ５７７または等価物を阻害するために使用してよく、それによってＳｈｃまたはＳＨＩＰ−２からＴｙｒ５７７を開放する。Ｔｙｒ５７７または等価物のリン酸化の阻害が最も好ましい。好ましくは、これは、特定のキナーゼ阻害剤を使用することによって達成する。
【０１０２】
しかし、リン酸化は多くの細胞活性化に共通の方法であるので、一般的な脱リン酸化剤の使用は有害であるかもしれない。
【０１０３】
したがって、Ｔｙｒ５７７または細胞質タンパク質ＳｈｃまたはＳＨＩＰ−２の等価物の結合を阻害する、Ｔｙｒ５７７または等価物の拮抗剤を利用することも好ましい。これらの分子を使用することによって、リン酸化および創傷治癒のための細胞成長および増殖の増加において手助けすることができる次の事象の阻害を標的にし、具体的に方向付づけることができる。
【０１０４】
さらに他の本発明の態様では、細胞成長を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｔｙｒ５７７残基または等価物を有するβｃを含む受容体をもつ細胞を提供することと；Ｔｙｒ５７７または等価物のリン酸化を誘発することと；
前記細胞を前記化合物に曝露することと；
細胞のコロニー形成を評価することとを含む方法が提供される。
【０１０５】
本発明のこの態様は、Ｔｙｒ５７７または等価物は、より大きなコロニーに導く細胞成長および生存の誘発の中核を成し、リン酸化の阻害は細胞生存を増やすこととより大きなコロニーを産生することを必要とするという発見を利用している。化合物がコロニー形成を増やし、誘発されたリン酸化の効果を覆すと化合物は成長促進特性を有すると推定できる。
【０１０６】
細胞は前記造血細胞が好ましい。
本発明は、増殖性疾患のモデルとして使用してもよい。結合性モチーフと細胞質タンパク質との間の相互作用が与えられると、相互作用の任意の部分がモニターされ、問題の細胞と正常細胞との間のいかなる異常も検出される。モデルの態様は、チロシン残基のリン酸化能力を分析してもよく、あるいはＳｈｃおよびＳＨＩＰ−２のそれぞれの細胞質タンパク質とチロシンとの間の相互作用を分析してもよい。
【０１０７】
モデルは上記した造血細胞の基づくのが好ましい。しかし、モチーフを含む他の任意の細胞を使用してもよい。細胞は、モデルが基礎とするＴｙｒ５７７または等価物を含むＧＭ−ＣＳＦ受容体を有することがさらに好ましい。
【０１０８】
文献、行為、材料、装置および製品などの検討は、本発明の内容を提供する目的のためだけに、本明細書に含まれる。これら事柄のどれも全て、従来技術のを形成し、あるいは本願の各請求項の優先日前にオーストラリアに存在したような、本発明に関連する分野における共通の一般的知識であるとは示唆されていないし、意味されてもいない。
【０１０９】
本発明で使用された操作の実施例をさらに詳しく記載する。しかし、以下の記載は、説明のためだけにあるものであり、上記した本発明の普遍性を限定するように解釈すべきでないことは、理解されるべきである。
【実施例】
【０１１０】
（実施例１）
Ｙ５７７Ｆ変異は、ＧＭ−ＣＳＦに応答する数多くのコロニーの増大へと導く。
（ａ）細胞ラインおよびプライマリーの細胞
先に記載されたネズミ因子性細胞ラインＣＴＬ｛Ｌｅ，Ｓｔｏｍｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．２０００  ４１３５／ｉｄ｝を、増殖試験のために使用した。これらの細胞は、１０％胎仔牛血清（ＦＣＳ）および大腸菌発現システムから産生されたネズミＩＬ−２とともにＲＰＭＩ−１６４０中に維持された。
【０１１１】
Ｐｓｉ−２エコトロピックレトロウイルス含有細胞｛Ｍａｎｎ，  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，
ｅｔ  ａｌ．  １９８３  ３８８８／ｉｄ｝を１０％ＦＣＳが添加されたＤＭＥＭ中に維持した。細胞のトランスフェクトプールを選択し、４００μｇ／ｍｌのジェネテシン硫酸塩（Ｇ４１８）が加えられた上記の溶媒中で維持され、野生型または変異体ｈβｃを含むＲｕｆＮｅｏレトロウイルスベクター｛Ｒａｙｎｅｒ＆Ｇｏｎｄａ１９９４  ４１３６／ｉｄ｝でトランスフェクトした。
【０１１２】
ネズミの胎児肝臓細胞を、共通β鎖（βｃ）とＩＬ−３−特異性β鎖（βＩＬ−３）｛Ｓｃｏｔｔ，Ｒｏｂｂ，ｅｔ  ａｌ２０００  ２９６０／ｉｄ｝の両方のために、ノックアウトマウスからｄｐｃ１３．５で収穫した。１５％ＦＣＳが補給されたＩＭＤＭ中でこれらの細胞を培養した。
（ｂ）ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体を発現するマウス細胞の産生
ＣＴＬ−ＥＮまたはネズミの胎児肝臓細胞を処理し、レトロウィルス形質導入システムを使用して、ＧＭ−ＣＳＦ受容体のαおよびβ鎖を発現させた。
【０１１３】
レトロウィルス粒子を産生するため、プラスミド骨格をｐＲＵＦｎｅｏにおける基礎とし、ＧＭ−ＣＳＦ受容体サブユニットを複数のクローン部位にクローン化した。さらに、ＩＲＥＳを挿入し、単感染事象において両受容体サブユニットの発現を可能にした。プロデューサ細胞株が、リン酸カルシウムトランスフェクション、次いでＦＡＣＳによってｐｓｉ−２細胞中で産生され、両受容体サブユニットの高発現を有する細胞株が作成された。
【０１１４】
標的細胞（ＣＴＬまたは胎児肝臓）を照射ｐｓｉ−２細胞と４８時間共培養し、次いで採取し、さらに新しい培地を加えて２４時間培養した。免疫蛍光分析を使用して、ＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖に特異的なビオチン化抗体で形質導入レベルを評価し、ストレプトアビジン−ＰＥ５０００〜１００００個の細胞を、コールターエピックスＸＬを使用して分析した。
（ｃ）コロニーアッセイ
未成熟細胞のＧＭ−ＣＳＦへの応答は、コロニー形成アッセイを使用して、分析した。胎児肝臓細胞は形質導入され、ＧＭ−ＣＳＦ受容体の発現は、上記のように定量化した。コロニー形成細胞は、二重層寒天アッセイを使用して分析した。プレートは、図に示すサ
イトカインを含む０．５％寒天（ディフコ）を補給されたＩＭＤＭを含む下部層を持つ。上部層は、０．３％寒天中、１００，０００個／皿の濃度の形質導入された細胞を加えた。全ての培地は、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加された１０％熱不活性化ＦＣＳ（ＪＲＨバイオサイエンス）とを含んでいた。
【０１１５】
サイトカインは全てＰＢＳ中に希釈され、ＰＢＳのコントロールだけが各アッセイに加えられ、コロニーがサイトカイン刺激に応答して形成されことを検証した。
【０１１６】
さらに、アッセイは全て、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびエリスロポエチン（４Ｕ／ｍｌ）の反応混液で構成される一般的な刺激物を含んでいた。
【０１１７】
プレートを３７℃で５％ＣＯ２下１４日間培養し、倒立顕微鏡を使用して、コロニーを数えた。
【０１１８】
図１はＧＭ−ＣＳＦ受容体が形質導入された胎児肝臓からのコロニー形成を示す。１００，０００個の細胞を３５ｍｍ皿中１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦで平板培養した。３７℃で５％ＣＯ２下１４日間培養した後、コロニー数を数えた。図は各々３枚のプレートを用いた９つの別々の試験からのデータを示す。平均および標準偏差を図中に記載する。
【０１１９】
（実施例２）
Ｙ５７７Ｆ点変異は野生型ＧＭ−ＣＳＦ受容体β鎖より大きなコロニーを生じさせることができる。
【０１２０】
図２は、実施例１で示したアッセイの２からのコロニーを、それらの全体サイズに従って分析した。染色された皿を１）２ｍｍを超えるコロニー、２）１ｍｍと２ｍｍとの間、３）１ｍｍ未満のコロニーの３つのグループに分類した。データは、各グループに関しコロニーの合計に対する比率として表し、図２は平均値と標準偏差を示す。
【０１２１】
（実施例３）
β鎖のＹ５７７Ｆ変異体で形質導入された胎児肝臓細胞はＧＭ−ＣＳＦの全濃度でより多数のコロニーを形成する。
【０１２２】
上で報告したより高い濃度に加えて、サイトカインのより低い濃度に対する細胞の応答を評価するために、ＧＭ−ＣＳＦの滴定を使用した。図３はより多数のコロニーが存在することを示す。
【０１２３】
（実施例４）
コロニー形成の前に７日間または１４日間培養した細胞のデルタアッセイ
（ａ）デルタアッセイ
細胞を上記したように平板培養した０日目、またはＧＭ−ＣＳＦ中またはＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＧ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の反応混液中で７日間または１４日間培養する延長したコロニーアッセイを行った。７日目または１４日目、細胞を正確に上記したようにコロニーアッセイにおいて平板培養した。全コロニーを３７℃５％ＣＯ２の１４日培養の後に数えた。
（ｂ）コロニー形成前の７日間
寒天中で平板培養する前に、細胞をＧＭ−ＣＳＦか反応混液を補給された液体培地中で７日間培養した。ＧＭ−ＣＳＦ中および図４ａ中の成長グループからわかるように、Ｘ軸上のＧＭに表されているように、Ｙ５７７Ｆグループは、野生型受容体に比べて反応混液刺激に対するより大きな応答がある。応答は、平板培養前に７日間反応混液中で成長した
細胞に関しても同様である。
（ｃ）コロニー形成前の１４日間
寒天中で平板培養する前に、細胞をＧＭ−ＣＳＦか反応混液を補給された液体培地中で１４日間培養した。ＧＭ−ＣＳＦ中および図４ｂ中の成長グループからわかるように、Ｘ軸上のＧＭに表されているように、Ｙ５７７Ｆグループは、野生型受容体に比べて反応混液刺激に対するより大きな応答がある。ＧＭ−ＣＳＦではなく反応混液に対する応答も、平板培養前に１４日間反応混液中で成長させた細胞のこのグループはより大きい。
【０１２４】
（実施例５）
Ｙ５７７がフェニルアラニンに変異する場合、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体を発現するＣＴＬ細胞は、ＧＭ−ＣＳＦに対するより大きな応答を持つ。
（ａ）増殖アッセイ
野生型または変異体ＧＭ−ＣＳＦ受容体β鎖を発現するＣＴＬ細胞の増殖応答を、連続的に希釈された量のＧＭ−ＣＳＦで刺激された１０００個の細胞のマイクロウェルアッセイ中で計測した。ＣＴＬ細胞はＩＬ−２中で成長するが、先に記載されたように、増殖アッセイが始まる前２４時間は、成長因子を与えなかった｛Ｓｕｎ，Ｗｏｏｄｃｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．１９９６  ３１８８／ｉｄ｝。３Ｈ−チミジン導入は液体シンチレーションによって測定した。
【０１２５】
図５は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体で形質導入されたＣＴＬ細胞の増殖アッセイを示す。細胞には２４時間サイトカインを与えず、次いで、ヒトＧＭ−ＣＳＦまたはネズミＩＬ−２の滴定で４８時間刺激した。増殖を３Ｈ−チミジン導入および液体シンチレーションによって計測して定量した。Ｙ５７７Ｆは、ＩＬ−２ではなくＧＭ−ＣＳＦへの応答に関し、野生型β鎖と比べた時、ＥＤ５０の減少が明らかに見ることができる。
【０１２６】
最後に、本明細書で概要を述べた本発明の範囲を逸脱しない限り、種々のほかの変形および／または変更がなされてもよいことは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】Ｙ５７７Ｆ変異がＧＭ−ＣＳＦに応答してコロニーの数を増やすことになることを示す。
【図２】Ｙ５７７Ｆ点変異が野生型ＧＭ−ＣＳＦ受容体β鎖に比べて、より大きいコロニーを生じさせることができることを示す。
【図３】ＧＭ−ＣＳＦの全濃度でのコロニーの数がより多いβ鎖型のＹ５７７Ｆ変異体で形質導入された胎児肝臓細胞を示す。
【図４ａ】コロニー形成の前に７日間培養された細胞のデルタアッセイを示す。
【図４ｂ】コロニー形成の前に１４日間培養された細胞のデルタアッセイを示す。
【図５】図５ａ、５ｂは、Ｙ５７７がフェニルアラニンに変異を起こす時、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体を発現するＣＴＬ細胞がＧＭ−ＣＳＦに対しより大きな応答を有することを示す。
【図６】βｃのアミノ酸配列を示す。
【図１】
2008500954.tif 000007
【図２】
2008500954.tif 000008
【図３】
2008500954.tif 000009
【図４ａ】
2008500954.tif 000010
【図４ｂ】
2008500954.tif 000011
【図５】
2008500954.tif 000012
【図６】
2008500954.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月6日(2007.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質タンパク質に結合することができる結合性モチーフであって、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンまたはその等価物である）からなるモチーフ。
【請求項２】
細胞質タンパク質に結合することができる受容体分子の結合性モチーフであって、モチーフは、アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンまたはその等価物である）からなるモチーフ。
【請求項３】
以下を含む群から選択される受容体に由来する請求項１または２に記載の結合性モチーフ。
（１）  ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体
（２）  ＩＬ６ヒトインターロイキン−６受容体β鎖前駆体（ＩＬ−６Ｒ−β）
（３）  ＬＥＰＲヒトレプチン受容体前駆体（ＬＥＰ−Ｒ）（ＯＢ受容体）（ＯＢ−Ｒ）．
（４）  ＴＮＲ２ヒト腫瘍壊死因子受容体２前駆体（腫瘍壊死因子）
（５）  ＶＧＲ１ヒト血管内皮成長因子受容体１前駆体
（６）  ＴＲＫ３ヒト受容体タンパク質−チロシンキナーゼＴＫＴ前駆体（ＥＣ２．７．１．１１２）
（７）  Ｑ０１９７４タンパク質−チロシンキナーゼ膜貫通型受容体ＲＯＲ２前駆体
（８）  ＦＧＲ１ヒト塩基性線維芽細胞成長因子受容体１前駆体（ＢＦＧＦ−Ｒ）
（９）  Ｑ１５４２６タンパク質−チロシンフォスファターゼ、受容体型、Ｈ前駆体（ＥＣ３．１．３．４８）
（１０）  ＰＴＰＭヒトタンパク質−チロシンフォスファターゼミュー前駆体（ＥＣ３．１．３．４８）（Ｒ−ＰＴＰ−ＭＵ）
（１１）  ＰＤＧＳヒトα血小板由来成長因子受容体前駆体（ＥＣ２．７．１．１１２）
（１２）  ＦＧＲ４ヒト線維芽細胞成長因子受容体４前駆体（ＦＧＦＲ−４）（ＥＣ２．７．１．１１２）
（１３）  ＦＧＲ２ヒト線維芽細胞成長因子受容体２前駆体（ＦＧＦＲ−２）（ＥＣ２．７．１．１１２）
（１４）  Ｑ１３６３５パッチタンパク質相同体（ＰＴＣ）
（１５）  ＭＡＮＲヒトマクロファ−ジマンノース受容体前駆体．
（１６）  ＬＲＰ２ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２前駆体（メガリン）
（１７）  ＩＤＤヒト統合膜タンパク質ｄｇｃｒ２／ｉｄｄ前駆体（ＫＩＡＡ０１６３）（１８）  ＡＭＦＲヒト自己分泌運動性因子受容体前駆体（ＡＭＦ受容体）（ｇｐ７８）（１９）  ＡＣＨ５ヒト神経細胞アセチルコリン受容体タンパク質、α−５鎖前駆体
（２０）  ＫＫＩＴヒト：幹細胞成長因子受容体（癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼキット）（Ｃ−ＫＩＴ）（ＣＤ１１７抗原）
（２１）  ＴＰＯＲヒト：トロンボポイエチン受容体前駆体（ＴＰＯ−Ｒ）（骨髄増殖性白血病タンパク質（Ｃ−ＭＰＬ）．ＴＰＯＲまたはＭＰＬ．
（２２）  ＴＰＯＲマウス：トロンボポイエチン受容体前駆体（ＴＰＯ−Ｒ）（骨髄増殖性白血病タンパク質）（Ｃ−ＭＰＬ）．ＴＰＯＲまたはＭＰＬ．
（２３）  アセチルコリンＲ
（２４）  アセチルコリンＲα−５
（２５）  Ｃ−Ｃケモカイン受容体６
（２６）  ミドルＴ抗原
（２７）  インテグリンα１
（２８）  ＦＧＦＲ２（ＫＧＦ  Ｒ）
（２９）  ＦＧＦＲ１（ｆｌｇ）
（３０）  ＦＧＦＲ５
（３１）  Ｅｒｂ４
（３２）  ワクシニアウィルスタンパク質Ａ３６Ｒ
（３３）  マクロファ−ジマンノースＲ（ＭＲＣ１）
（３４）  ＬＤＬＲ
（３５）  ＶＬＤＬ（ラット）
（３６）  ＬＲＰ１低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１
（３７）  インテグリンβ１
（３８）  インテグリンβ７
（３９）  インテグリンβ３
（４０）  インテグリンβ５
（４１）  インテグリンβ６
（４２）  Ｇ−ＣＳＦＲ１（第２）
（４３）  Ｇ−ＣＳＦＲ１
（４４）  ｇ−ｃｓｆ−ｒ
（４５）  ＩＬ−６Ｂ（ｇｐ１３０）
（４６）  レプチンＲ
（４７）  プロラクチンＲ
（４８）  インシュリンＲ
（４９）  ｉｒｓ−１
（５０）  ＩＧＦＩ  Ｒ
（５１）  ｆｌｔ３Ｒ
（５２）  ＶＥＧＦＲ２（ＦＬＫ１）
（５３）  ＰＤＧＦ  Ｒ−α
（５４）  ＩＬ−９Ｒ
（５５）  βＲ
またはこれらの機能的等価物または類似体。
【請求項４】
以下を含む群から選択される配列に由来する請求項１〜３のいずれか１つに記載の結合性モチーフまたはその等価物。
【表１】
2008500954.tif 000014
【請求項５】
以下を含む群から選択される配列を有する請求項１〜４のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【表２】
2008500954.tif 000015
【請求項６】
配列がサイトカイン受容体に由来する請求項１〜５のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項７】
受容体がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体である請求項１〜６のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項８】
配列が共通β鎖（βｃ）を含む請求項１〜７のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項９】
Ｔｙｒ残基が共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である請求項１〜８のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項１０】
Ｔｙｒ残基に等価な残基における変性を有する請求項１〜９のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項１１】
Ｔｙｒ残基に等価な残基がＰｈｅ残基で置換されている請求項１〜１０のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項１２】
１４−３−３タンパク質、Ｓｈｃ、ＳＨＩＰ−２、プロリルイソメラーゼのＷＷ−ドメイン、Ｐｉｎ１およびユビキチンリガーゼ、ＮＥＤＤ４を含む群から選択される細胞質タンパク質に結合する請求項１〜１１のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項１３】
細胞質タンパク質がＳｈｃまたはＳＨＩＰ−２である請求項１〜１２のいずれか１つに記載の結合性モチーフ。
【請求項１４】
細胞内で活性を調節する方法であって、
細胞質タンパク質に結合しうる結合性モチーフを修飾することを含み、モチーフは、下記アミノ酸配列：
Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｙ
（式中、Ｘは任意の残基であり、Ｙはチロシンである）からなるモチーフである方法。
【請求項１５】
細胞内で活性を調節する方法であって、
請求項１〜１３のいずれか１つに記載の結合性モチーフを修飾することを含む方法。
【請求項１６】
活性化がモチーフのＴｙｒのリン酸化の修飾の導入によって調節される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞活性を阻害する請求項１５または１６に記載の方法であって、モチーフのＴｙｒのリン酸化の減少または阻害を含む方法。
【請求項１８】
前記Ｔｙｒを変異、置換または欠失するか、前記細胞を前記Ｔｙｒのリン酸化を阻害する拮抗剤で処理するか、前記細胞を前記Ｔｙｒのリン酸化を阻害するためのキナーゼ阻害剤で処理するかの、いずれかによってリン酸化を減少させる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＴｙｒはＰｈｅで置換される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
リン酸化が細胞をリン酸化剤で処理することによって増加される請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
リン酸化剤がキナーゼである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞内で活性を阻害する請求項１５に記載の方法であって、モチーフへの細胞質タンパク質のモチーフへの結合の阻害を含む方法。
【請求項２３】
細胞質タンパク質が、１４−３−３タンパク質、Ｓｈｃ、ＳＨＩＰ−２、プロリルイソメラーゼのＷＷ−ドメイン、Ｐｉｎ１およびユビキチンリガーゼ、ＮＥＤＤ４を含む群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞質タンパク質がＳｈｃである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞活性を活性化する請求項１４〜１６，２０〜２４のいずれか１つに記載の方法であって、モチーフのＴｙｒのリン酸化を誘発することを含む方法。
【請求項２６】
細胞活性が、細胞生存、増殖、分化、有糸分裂誘発、形質転換、細胞遊走、運動能、増強された食作用、増強された細菌殺菌、スーパーオキシドの産生および細胞毒性を含む群から選択される請求項１４〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
細胞活性が細胞生存もしくは増殖である請求項１４〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
細胞が造血細胞である請求項１４〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
増殖を増大させる請求項２７記載の方法であって、Ｔｙｒのリン酸化を阻害することを含む方法。
【請求項３０】
増殖を阻害する請求項２７に記載の方法であって、Ｔｙｒのリン酸化を誘発することを含む方法。
【請求項３１】
細胞成長を増加する請求項２７に記載の方法であって、Ｔｙｒの活性化を阻害することを含む方法。
【請求項３２】
創傷の治癒用の医薬の存在下での、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の結合性モチーフのＴｙｒの活性化の阻害剤としての使用。
【請求項３３】
阻害剤が、Ｔｙｒのリン酸化を阻害する請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
Ｔｙｒが共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である請求項３２または３３に記載の使用。
【請求項３５】
共通β鎖（βｃ）がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体のそれである請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
細胞成長を促進する化合物のスクリーニング方法であって、
Ｔｙｒ５７７残基または等価物を有するβｃを含む受容体をもつ細胞を得ることと；
請求項１〜１３のいずれか１つに記載の結合性モチーフ中のＴｙｒまたは等価物のリン酸化を誘発することと；
前記細胞を前記化合物に曝露することと；
細胞のコロニー形成を評価することとを含む方法。
【請求項３７】
Ｔｙｒが共通β鎖（βｃ）のＴｙｒ５７７に等価である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
共通β鎖（βｃ）がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体のそれである請求項３７に記載の使用。
【国際調査報告】
2008500954.tif 000016
2008500954.tif 000017
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