(57)【要約】生体分子を結合させるためのポリマー被覆基体およびその製造方法と使用方法がここに開示されている。
2008522164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の連結層、および第１のポリマーを含む基体であって、前記第１のポリマーが、前記基体に生体分子を結合させることのできる官能基一種類以上を含み、前記連結層が前記基体に結合しており、該連結層が前記第１のポリマーを前記基体に結合させることを特徴とする基体。
【請求項２】
前記第１の連結層が、直鎖または分岐アミノシラン、アミノアルコキシシラン、アミノアルキルシラン、アミノアリールシラン、アミノアリールオキシシラン、またはそれらの誘導体または塩から誘導されることを特徴とする請求項１記載の基体。
【請求項３】
前記第１の連結層が、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（ベータ−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（ベータ−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ’−（ベータ−アミノエチル）−３−アミノプロピルメトキシシラン、またはアミノプロピルシルセスキオキサンから誘導されることを特徴とする請求項１記載の基体。
【請求項４】
前記第１のポリマーが少なくとも一種類のアミン反応性基を含むことを特徴とする請求項１記載の基体。
【請求項５】
前記第１のポリマーが、無水マレイン酸および第１のモノマーから誘導されたコポリマーを含むことを特徴とする請求項１記載の基体。
【請求項６】
前記第１のポリマーが、ポリ（酢酸ビニル−マレイン酸無水物）、ポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物）、ポリ（イソブチレン−ａｌｔ−マレイン酸無水物）、ポリ（マレイン酸無水物−ａｌｔ−１−オクタデセン）、ポリ（マレイン酸無水物−ａｌｔ−１−テトラデセン）、ポリ（マレイン酸無水物−ａｌｔ−メチルビニルエーテル）、ポリ（トリエチレングリコールメチルビニルエーテル−ｃｏ−マレイン酸無水物）、またはそれらの組合せを含むことを特徴とする請求項１記載の基体。
【請求項７】
前記第１のポリマーがポリ（エチレン−ａｌｔ−マレイン酸無水物）であることを特徴とする請求項１記載の基体。
【請求項８】
前記第１のポリマーに生体分子が結合されることを特徴とする請求項１記載の基体。
【請求項９】
前記生体分子が、天然または合成のオリゴヌクレオチド、天然または修飾／遮断されたヌクレオチド／ヌクレオシド、核酸（ＤＮＡ）または（ＲＮＡ）、天然または修飾／遮断されたアミノ酸を含むペプチド、抗体、ハプテン、生物学的リガンド、膜タンパク質、脂質膜、小分子、または細胞を含むことを特徴とする請求項８記載の基体。
【請求項１０】
前記基体がマイクロプレートまたはスライドであることを特徴とする請求項１記載の基体。
【請求項１１】
基体を調製する方法であって、（１）第１の連結層の化合物を前記基体に結合させ、（２）該第１の連結層の化合物に第１のポリマーを結合させる各工程を有してなる方法。
【請求項１２】
リガンドのアッセイを行う方法であって、（１）前記リガンドを、第１の連結層、第１のポリマー、および生体分子を含む基体に接触させる工程であって、前記連結層が前記第１のポリマーを前記基体に結合させ、前記生体分子が前記第１のポリマーに結合しており、前記リガンドが、接触工程後に前記基体上の前記生体分子に結合している工程、および（２）前記結合したリガンドを検出する工程を有してなる方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、ここに引用する、２００４年１１月２４日に出願された、「Polymer-Coated Substrates For Binding Biomolecules And Methods Of Making And Using Thereof」と題する米国特許出願第１０／９９６９５２号の恩恵を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、生体分子を結合させるためのポリマー被覆基体およびその製造方法と使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
標識に依存しない検出（ＬＩＤ:label independent detection）プラットホーム（例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または共鳴格子センサ）を用いたアッセイは、一般に、(i)センサ表面への結合パートナー（一般に、タンパク質）の内の１つの固定化、および(ii)固定化されたタンパク質へのリガンド（薬物、タンパク質、オリゴヌクレオチドなど）の結合の二工程手法を用いて行われる。従来、生体分子の表面への結合は、反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルに対する表面上のカルボン酸基の活性化を含み、次いで、このエステルは、関心のあるタンパク質のアミノ基に結合される。この方法は、うまく用いられており、それぞれのＬＩＤプラットホームについて、バイアコア(BIacore)社、アフィニティー・バイオセンサーズ(Affinity Biosensors)社、およびアーティフィシャル・センシング・インストルメンツ(Artificial Sensing Instruments)社により商業化されている。効果的ではあるけれども、その活性化工程には時間がかかり、いくぶん毒性の化学物質の取扱いと使用が伴う。
【０００４】
この手法に代わる代替案は、「予め活性化された」化学物質の使用を伴う。例えば、生体分子を結合するために、アルデヒド基を有する表面が用いられてきた。しかしながら、得られるシッフ塩基を安定化させるために、結合後に還元工程が必要である。エポキシドおよびイソシアネート官能基を持つ表面も用いられてきた。しかしながら、エポキシド基は、反応するのが比較的遅く、したがって、強塩基性条件下では長いインキュベーション時間が必要であり、一方で、イソシアネート基は、極めて反応性であり、貯蔵安定性の問題がある。これらの問題のために、ＬＩＤプラットホームのための予め活性化された化学物質の報告はわずかしかない。実際には、バイアコア社、アフィニティー・バイオセンサーズ社、およびアーティフィシャル・センシング・インストルメンツ社の、最も普及しているＬＩＤプラットホームを提供しているこれら三社のいずれも、予め活性化された化学物質を有するセンサを提供していない。
【０００５】
マレイン酸無水物は、アミノ基などの求核基と容易に反応する。小分子、ＤＮＡ、糖類、およびペプチドの固定化のための無水マレイン酸コポリマー層による表面修飾が記載されているが（１〜９；非特許文献１〜９）、マレイン酸無水物の加水分解安定性はむしろ不十分であり（１０；非特許文献１０）、この理由のために、それらは幅広く用いられていない。マレイン酸無水物の加水分解安定性は、疎水性側鎖（例えば、スチレン）と共重合したときに、増加させることができる。しかしながら、これにより、生体分子の表面への非特異的結合に関する問題が生じる。このことは、質量分析法などのいくつかの用途にとっては利点であるかもしれないが、これはＬＩＤにとっては問題である。
【特許文献１】米国特許第５４３６１６１号明細書
【非特許文献１】"Immobilization of Protein Ligands with Methyl Vinyl Ether Maleic- Anhydride Copolymer," Journal of Chromatography, 1992, 597, 123-128
【非特許文献２】"Immobilization of Saccharides and Peptides on 96-Well Microtiter Plates Coated with Methyl Vinyl Ether-Maleic Anhydride Copolymer," Anal. Biochem., 1998, 260, 96-102
【非特許文献３】"Surface Modification via Reactive Polymer Interlayers," Langmuir 1996, 12, 2514-2518
【非特許文献４】"Thin Polymer Layers as Supports for Hippocampal Cell Cultures," Langmuir, 1998, 14, 3030-3035.
【非特許文献５】(5) "Surface Esterification of Poly(Ethylene-alt-Maleic Anhydride) Copolymer," J. Phys. Chem. B, 2000, 104, 10608-10611
【非特許文献６】"Solventless Attachment of Long-Chain Molecules to Poly(ethylene-alt-maleic anhydride) Copolymer Surfaces," J. Phys. Chem. B, 1998, 102, 5500-5502
【非特許文献７】Oligonucleotide Synthesis on Maleic Anhydride Copolymers Covalently Bound to Silica Spherical Support and Characterization of the Obtained Conjugates," Journal of Applied Polymer Science, 1998, 70, 2487-2497
【非特許文献８】"Oligonucleotide-Polymer Conjugates: Effect of the Method of Synthesis on Their Structure and Performance in Diagnostic Assays," Bioconjugate Chemistry, 2000, 11, 795-804
【非特許文献９】"Covalent Immobilization of Biological Molecules to Maleic Anhydride and Methyl Vinyl Ether Copolymers-A Physico-Chemical Approach," Journal of Applied Polymer Science, 1999, 71, 927-936
【非特許文献１０】"Studies on Cyclic Anhydrides. IV. Rate Constants for the Hydrolysis of Some Cyclic Anhydrides Exhibiting Ring Strain," Acta Chem. Scand., 1972, 26, 16- 26
【非特許文献１１】"Immobilization of Proteins to a Carboxymethyldextran-Modified Gold Surface for Biospecific Interaction Analysis in Surface Plasmon Resonance Sensors, " Johnsson et al, Anal. Biochem., 1991, 198, 268-277
【非特許文献１２】"A Novel Hydrogel Matrix on Gold Surfaces in Surface Plasmon Resonance Sensors for Fast and Efficient Covalent Immobilization of Ligands," Lofas and Johnsson, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1990, 1526-1528
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般に、生体特異性の厳密な要件を必要とするＬＩＤ検出には特有の問題がある。検体溶液中に「遮断薬」（例えば、ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）を含ませることは望ましくない。何故ならば、特異的（検体による）結合および非特異的（遮断薬による）結合の両方が、界面屈折率の変化に寄与し、それゆえ、見分けがつかなくなるであろう。この問題は、錯体試料が用いられる場合、または検体に混ざりものがある場合、悪化するだけである。タンパク質の固定化のための無水物に関する懸念は、ポリマー中の他の基（例えば、スチレン、エチレン、メチルビニルエーテルなど）の影響および残留負電荷の形成による非特異的結合である。これらの理由のために、ＬＩＤのために無水物ポリマーを使用することの実現可能性は、潜在的に懸念されている。この懸念は、無水物基の潜在的な安定性の問題と相まって、ＬＩＤ用途のための無水物コポリマーの使用が、現在知られていない、または従来技術に記載されていない理由の１つである。本発明には、マレイン酸無水物をどのようにＬＩＤアッセイにうまく使用できるかが記載されている。ポリマーにおける側鎖および固定化条件を適切に選択することによって、結合アッセイは、十分な加水分解安定性を維持しながら、高い特異性で実施できる。さらに、本発明には、無水マレイン酸コポリマーの表面上の多くの生体分子の固定化は、酸性（ｐＨ＜７）条件下で行うことができ、このとき、より一般的なペプチド結合条件（ｐＨ７〜９）に対して、加水分解安定性が増し、タンパク質の結合量が増すという利点がある。
【０００７】
３Ｄマトリクスを用いた固定化により、生体分子の多量の固定化が可能になり、それゆえ、結合のための部位を多数形成できる。カルボキシメチルデキストランなどのヒドロゲルは最も一般的である（３２〜３４；特許文献１および非特許文献１１および１２）。ヒドロゲルに関する懸念は、表面に近接したヒドロゲル内の結合部位への大きな検体分子の分割である。蛍光顕微鏡検査法などの技法による従来の検出と比較して、表面から離れた結合信号は、ＬＩＤ検出に関するエバネッセント(evanescent)電磁場の指数関数的性質のために、急速に減衰する。ここに記載したポリマー表面は、ヒドロゲルほど厚くなく、それゆえ、固定化は界面近くで生じ、これにより、その後の結合研究中の分割に関する問題を回避することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一種類以上の異なる生体分子に結合することができる一種類以上のポリマーにより被覆された基体およびその製造方法と使用方法がここに記載されている。被覆基体を使用する方法には、従来技術より優れた利点が数多くある。例えば、その基体は、活性化する必要がなく、これにより、ユーザの時間、費用、および複雑さが減る。さらに、被覆基体を製造する方法により、その基体の大量生産が可能になる。一般に、その被覆基体は安定であり、結合能力がほとんどまたは全く損なわれずに、長期間（約６ヶ月）に亘り貯蔵できる。その上、被覆基体は、酸性条件下で加水分解するのが遅く、これにより、例えば、無水物ポリマーなどのポリマーに関する従来技術の技法を用いて記載されてきていない条件下での様々な生体分子の結合が可能になる。
【０００９】
生体分子を結合するためのポリマー被覆基体およびその製造方法と使用方法がここに記載されている。ここに記載された材料、方法、および製品の利点は、一部は、以下の説明に述べられており、または以下に記載する態様を実施することにより分かるであろう。以下に記載された利点は、特に、添付の特許請求の範囲に指摘された要素と組合せにより、実現され、達成される。先に一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示であり、説明のためだけであり、制限ではないことが理解されよう。
【００１０】
本明細書に包含されその一部を構成する添付の図面は、以下に説明するいくつかの態様を示す。これらの図面は、ここに記載された材料、製品、および方法の典型的な実施の形態を示すだけであり、したがって、それらの範囲の制限と考えられるべきではないことが理解されよう。
【００１１】
本発明の材料、製品、および／または方法を開示し、記載する前に、以下に記載される態様は、特定の化合物、合成方法、または使用に限られず、それらはもちろん様々であってよいことが理解されよう。ここに用いられる用語法は、特定の態様を説明する目的のためだけであり、制限が意図されていないのが理解されよう。
【００１２】
本明細書および特許請求の範囲において、以下の意味を持つように定義された多数の用語を挙げておく。
【００１３】
この明細書全体に亘り、文脈が他に要求していない限り、「含む(cpmprise)」という用語、または「含む(comprises)」または「含む(comprising)」などの変形は、述べられた整数または工程、もしくは整数または工程の群を含むことを意味しており、任意の他の整数または工程、もしくは整数または工程の群を排除することを意味していないことが理解されよう。
【００１４】
本明細書および特許請求の範囲に用いられているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに示していない限り、複数の対象も含むことに留意すべきである。それゆえ、例えば、「１つの（ａ）薬剤キャリヤ」の言及は、二つ以上のそのようなキャリヤの混合物などを含む。
【００１５】
「随意的な」または「必要に応じて」は、その後に記載された出来事や状況が起こり得ても得なくても差し支えないこと、およびその記載が、その出来事や状況が生じる場合と、生じない場合とを含むことを意味する。
【００１６】
範囲は、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、としてここに表現されている。そのような範囲が表現されている場合、別の態様は、ある特定の値から、および／または他の特定の値まで、を含む。同様に、値が、「約」という先行詞により、近似として表されている場合、特定の値は別の態様を形成することが理解されよう。さらに、各々の範囲の端点は、他の端点に関連して、および他の端点とは関係なくの両方で有意であることが理解されよう。
【００１７】
成分の質量パーセントは、特に別記されていない限りは、その成分が含まれる配合物または組成物の総質量に基づく。
【００１８】
「接触する」は、少なくともある物質の別の物質への密接な物理的接触による曝露の例を意味する。
【００１９】
開示された方法の生成物および組成物のために用いられる、それと共に用いられる、その調製に用いられる、またはそれら自体である化合物、組成物、および成分が開示されている。これらと他の材料がここに開示されており、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物の様々な個々のおよび集合的な組合せと順列の特定の参照は明白に開示されていなくてもよいが、各々は、具体的に考えられ、ここに記載されることが理解される。例えば、多数の異なるポリマーおよび生体分子が開示され論じられている場合、特に別記されていないかぎり、そのポリマーおよび生体分の各々と全ての組合せおよび順序が具体的に考えられる。それゆえ、分子Ａ，ＢおよびＣの部類が開示され、同様に分子Ｄ，ＥおよびＦの部類が開示され、分子の組合せの例Ａ−Ｄが開示されている場合、各々が個々に挙げられていなくても、各々は、個々と集合的に考えられる。それゆえ、この例において、組合せＡ−Ｅ，Ａ−Ｆ，Ｂ−Ｄ，Ｂ−Ｅ，Ｂ−Ｆ，Ｃ−Ｄ，Ｃ−Ｅ，およびＣ−Ｆの各々が、具体的に考えられ、Ａ，ＢおよびＣ；Ｄ，ＥおよびＦの開示から開示されたと考えるべきであり、その例が組合せＡ−Ｄである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも、具体的に考えられ、開示されている。それゆえ、例えば、Ａ−Ｅ，Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅの部分群が、具体的に考えられ、Ａ，ＢおよびＣ；Ｄ，ＥおよびＦの開示から開示されたと考えるべきであり、その例の組合せがＡ−Ｄである。この概念は、以下に限られないが、開示された組成物を製造し、使用する方法の工程を含む、この開示の全ての態様に適用される。それゆえ、実施できる様々な追加の工程がある場合、これらの追加の工程の各々は、開示された方法の任意の特定の実施の形態または実施の形態の組合せにより実施することができると理解され、そのような組合せの各々は、具体的に考えられ、開示されていると考えるべきであると理解される。
【００２０】
Ｉ．  被覆基体
生体分子を結合するためのポリマー被覆基体がここに記載されている。ある態様において、第１の連結層(tie layer)および第１のポリマーを含む基体であって、第１のポリマーが、生体分子を基体に結合させられる１つ以上の官能基を含み、連結層が基体に結合されており、連結層が第１のポリマーを基体に結合させている基体がここに記載されている。
【００２１】
ある態様において、連結層は基体の外面に結合されている。基体に関して「外面」という用語は、露出されており、操作を行うことのできる基体の領域のことである。例えば、接触の際に溶媒または試薬と接触することのできる基体の任意の表面が、基体の外面と考えられる。ここに使用できる基体としては、以下に限られないが、マイクロプレートまたはスライドが挙げられる。ある態様において、基体がマイクロプレートである場合、ウェルの数およびウェルの容積は、分析の規模および範囲に応じて様々である。
【００２２】
ある態様において、基体は、プラスチック、ポリマーまたはコポリマー物質、セラミック、ガラス、金属、結晶質材料、貴金属または半貴金属、金属酸化物または非金属酸化物、遷移金属、またはそれらの任意の組合せを含む。さらに、基体は、任意の検出装置内に配置できるように構成することができる。ある態様において、センサを、基体の底部／下側に組み込んで、その後の検出に使用できる。これらのセンサとしては、以下に限られないが、光学格子、プリズム、電極および石英結晶微量天秤が挙げられる。検出方法としては、蛍光、燐光、化学発光、屈折率、質量、電気化学が挙げられる。ある態様において、基体は、コーニング(Corning)ＬＩＤマイクロプレートである。
【００２３】
ここに記載された基体は、基体に結合した連結層を有している。ここに用いられる「結合した」という用語は、２つの成分または化合物の間の任意の化学的相互作用である。第１の連結層の化合物が基体に結合されたときに形成され得る化学的相互作用のタイプは、基体の材料および第１の連結層を生成するのに用いられる化合物に応じて、様々であろう。ある態様において、第１の連結層は、基体に共有結合および／または静電結合し得る。ある態様において、第１の連結層が基体に静電結合している場合、第１の連結層を製造するのに用いられる化合物は正に荷電しており、基体の外面は、第１の連結層と基体の外面が静電結合を形成するように正味の負の電荷が存在するように処理される。別の態様において、第１の連結層の化合物は、基体の外面と共有結合を形成できる。例えば、基体の外面は、第１の連結層の化合物と共有結合を形成できる基があるように誘導体化できる。
【００２４】
ある態様において、第１の連結層は、一種類以上の反応性官能基を含む化合物から誘導される。第１の連結層に関して「誘導される」という語句は、ここでは、基体に結合したときに、第１の連結層の化合物の得られた残基または断片として定義される。その官能基により、第１のポリマーが第１の連結層に結合することができる。ある態様において、第１の連結層の化合物の官能基としては、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アクリル酸、有機酸および無機酸、エステル、無水物、アルデヒド、エポキシド、その誘導体または塩、もしくはそれらの組合せが挙げられる。ある態様において、第１の連結層は、直鎖または分岐アミノシラン、アミノアルコキシシラン、アミノアルキルシラン、アミノアリールシラン、アミノアリーロキシシラン、またはその誘導体または塩から誘導される。さらなる態様において、第１の連結層は、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（ベータ−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（ベータ−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ’−（ベータ−アミノエチル）−３−アミノプロピルメトキシシラン、またはアミノプロピルシルセスキオキサンから誘導される。別の態様において、第１の連結層は、例えば、ポリリシンまたはポリエチレンイミンなどのポリアミンから誘導される。
【００２５】
別の態様において、第１の連結層は自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を含む。ある態様において、基体表面が金から構成されている場合、ＳＡＭはアミン末端アルカンチオールを含む。この態様において、自己組織化単分子層は１１−メルカプトウンデシルアミンを含む。
【００２６】
基体に生体分子を結合できる一種類以上の官能基を含む第１のポリマーが第１の連結層に結合される。第１のポリマーまたはここに記載した任意のポリマーの「官能基」により、第１のポリマーの第１の連結層または生体分子への結合が可能になる。同様に、第１または第２の連結層に存在する官能基により、第１のポリマーまたは第２のポリマーの、それぞれ、第１または第２の連結層への結合が可能になる。第１のポリマーまたはそれに続くポリマーは、一種類以上の異なる官能基を有することができる。ある第１のポリマーが、基体の外面に結合され、同様に第１の連結層にも結合されることも考えられる。あるいは、第１のポリマーが、基体の外面に接触しており、それでもまだ第１の連結層に結合されていてもよい。ある態様において、第１のポリマーは、第１の連結層に共有結合および／または静電結合されていても差し支えない。二種類以上の異なる第１のポリマーが第１の連結層に結合していても差し支えないとも考えられる。
【００２７】
第１のポリマーは、第１のポリマーを第１の連結層に結合させるのに用いられる技法に応じて、水溶性であっても、水不溶性であっても差し支えない。第１のポリマーは、線状または非線状のいずれであっても差し支えない。例えば、第１のポリマーが非線状である場合、第１のポリマーは樹枝状ポリマーである。第１のポリマーはホモポリマーであってコポリマーであっても差し支えない。
【００２８】
ある態様において、第１のポリマーは、求核攻撃を受けやすい求電子基を少なくとも一種類含む。理論に拘束することを意図するものではないが、第１の連結層が、ポリマーの求電子基と反応して共有結合を形成する求核基を有する場合、第１のポリマーに負の電荷が生成される。次いで、第１のポリマーにある負の電荷は、第１のポリマーと、生体分子、第２の連結層、または第２のポリマーとの間の静電結合の形成を促進できる。これらの全てが以下に詳しく論じられている。あるいは、第１のポリマーに存在する一種類以上の求電子基は、生体分子、第２の連結層、または第２のポリマーと共有結合を形成できる。生体分子が第１のポリマーに結合される場合、ポリマーに特別な側鎖（例えば、エチレングリコール）が存在することは、生体分子の第１のポリマーへの非特異的結合を防ぐのに役立ち得る。
【００２９】
ある態様において、第１のポリマーは少なくとも一種類のアミン反応性基を含む。「アミン反応性基」という用語は、アミン基と反応して新たな共有結合を形成できる任意の基である。そのアミンは、第１級、第２級、または第３級アミンであって差し支えない。ある態様において、アミン反応性基としては、エステル基、エポキシド基、またはアルデヒド基が挙げられる。別の態様において、アミン反応性基は無水物基である。
【００３０】
ある態様において、第１のポリマーは、マレイン酸無水物および第１のモノマーから誘導されたコポリマーを含む。この態様において、第１のポリマー中のマレイン酸無水物の量は、第１のモノマーの化学量論（すなわち、モル量）で、５％から５０％、５％から４５％、５％から４０％、５％から３５％、５％から３０％、５％から２５％、１０％から５０％、１５％から５０％、２０％から５０％、２５％から５０％、または３０％から５０％である。ある態様において、選択された第１のモノマーにより、第１のポリマー中のマレイン酸無水物基の安定性が改善される。別の態様において、第１のモノマーにより、生体分子の基体への非特異的結合が減少する。さらなる態様において、第１のポリマー中のマレイン酸無水物の量は、第１のモノマーの化学量論で約５０％である。別の態様において、第１のモノマーとしては、スチレン、テトラデセン、オクタデセン、メチルビニルエーテル、トリエチレングリコールメチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、ジビニルベンゼン、エチレン、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ピロリドン、重合可能なオリゴ（エチレングリコール）またはオリゴ（エチレンオキシド）、またはそれらの組合せが挙げられる。
【００３１】
ある態様において、第１のポリマーは、ポリ（酢酸ビニル−マレイン酸無水物）、ポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物）、ポリ（イソブチレン−ａｌｔ−マレイン酸無水物）、ポリ（マレイン酸無水物−ａｌｔ−１−オクタデセン）、ポリ（マレイン酸無水物−ａｌｔ−１−テトラデセン）、ポリ（マレイン酸無水物−ａｌｔ−メチルビニルエーテル）、ポリ（トリエチレングリコールメチルビニルエーテル−ｃｏ−マレイン酸無水物）、またはそれらの組合せを含む。別の態様において、第１のポリマーはポリ（エチレン−ａｌｔ−マレイン酸無水物）である。
【００３２】
第１の連結層に結合する第１のポリマーの量は、第１の連結層、第１のポリマーの選択、および基体の意図する使用に応じて様々であって差し支えない。ある態様において、第１のポリマーは少なくとも一種類の単分子層を含む。別の態様において、第１のポリマーは、約１０Åから約２，０００Åの厚さを有する。別の態様において、第１のポリマーの厚さは、１０Å、２０Å、４０Å、６０Å、８０Å、１００Å、１５０Å、２００Å、３００Å、４００Å、または５００Åの下限値と、７５０Å、１，０００Å、１，２５０Å、１，５００Å、１，７５０Å、または２，０００Åの上限値を有し、ここで、厚さ範囲を形成するために、任意の下限値を任意の上限値と組み合わせることができる。
【００３３】
ある態様において、第１の連結層はアミノプロピルシルセスキオキサンであり、第１のポリマーはポリ（エチレン−ａｌｔ−マレイン酸無水物）である。
【００３４】
別の態様において、基体はさらに第２の連結層および第２のポリマーを含み、ここで、第２の連結層は第１のポリマーに結合され、第２のポリマーは第２の連結層に結合される。先に記載した第１の連結層の化合物のいずれを第２の連結層の化合物として用いても差し支えない。第２の連結層の第１のポリマーへの結合の性質および第２のポリマーの第２の連結層への結合の性質は、材料の選択に応じて様々である。第２の連結層は、第１のポリマーに共有結合または静電結合されていて差し支えない。あるいは、第２のポリマーは、第２の連結層に共有結合または静電結合されていて差し支えない。ある態様において、第２の連結層は第１のポリマーに共有結合されており、第２のポリマーは第２の連結層に共有結合されている。第１のポリマーが第１の連結層に一旦結合されたら、多数の連結層とポリマー層を第１のポリマーに施しても差し支えないと考えられる。
【００３５】
第１と第２の連結層は、同じ化合物から調製しても異なる化合物から調製しても差し支えない。同様に、第１と第２のポリマーは、同じであっても異なっていても差し支えない。基体の意図する使用に応じて、多数の連結層とポリマー層を第１のポリマーに結合しても差し支えないと考えられる。
【００３６】
ある態様において、第２の連結層はポリアミンまたはポリオールから誘導される。例えば、第２の連結層は、エチレンジアミン、エチレングリコール、またはオリゴエチレングリコールジアミンであって差し支えない。別の態様において、第２の連結層はジアミン、トリアミン、またはテトラアミンから誘導される。
【００３７】
上述した第１のポリマーのいずれを第２のポリマーとして使用しても差し支えない。ある態様において、第２のポリマーは、例えば、エステル基、エポキシド基、アルデヒド基、または無水物基などのアミン反応性基を少なくとも一種類含む。別の態様において、第２のポリマーは、ポリマレイン酸無水物、またはマレイン酸無水物から誘導されたコポリマーを含む。
【００３８】
第１のポリマー（またはその後のポリマー層）の結合前またはその後に、第１のポリマー（またはその後のポリマー層）にリンカーを必要に応じて結合させても差し支えない。「リンカー」という用語は、ポリマー層に結合でき、例えば、生体分子などの別の分子と配位または結合することのできる基を少なくとも一種類有する任意の化合物である。配位の機構は、例えば、ルイス酸／塩基相互作用、ブレンステッド酸／塩基相互作用、イオン結合、共有結合、または静電相互作用によるものであって差し支えない。ある態様において、リンカーは、生体分子中に存在する親和性タグ（例えば、ヘキサヒスチジンタグ）と配位するリガンドを有する。例えば、リンカーは、ヒスチジンタグ付きタンパク質を捕獲するために、金属イオン（例えば、Ｃｕ，Ｃｏ，Ｎｉ）と結合する、キレートを形成する、または配位するリガンドであって差し支えない。ある態様において、リンカーはＮ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸を含む。あるいは、リンカーは、生体分子と水素結合を形成する基を有していても差し支えない。別の態様において、リンカーは、抗原を認識する抗体であっても差し支えない。別の態様において、リンカーは、ビオチン化された化合物を捕獲するためのストレプトアビジンであっても差し支えない。さらに別の態様において、リンカーは、ジスルフィド交換反応により生体分子を捕獲するためのチオール基またはジスルフィド基を含有しても差し支えない。あるいは、リンカーは、システインなどのチオール基によりタンパク質と結合するための、チオールに対して反応性の基（例えば、マレイミド基）を含有しても差し支えない。別の態様において、リンカーは、ペプチド配列ＲＧＤなどの、細胞の凝着／結合を促進する基を有していても差し支えない。リンカーは、例えば、共有結合または静電相互作用などの任意の化学的相互作用によりポリマー層に結合していても差し支えない。
【００３９】
一種類以上の異なる生体分子を基体に結合させて、様々なバイオセンサを製造することが考えられる。ある態様において、生体分子は、第１のポリマー（またはその後のポリマー層）に共有結合または静電結合していて差し支えない。生体分子は、共有結合または非共有結合により、別の分子への特異的な親和性を示してもよい。ここにおいて有用な生体分子の例としては、以下に限られないが、天然または合成のオリゴヌクレオチド、天然または修飾／遮断されたヌクレオチド／ヌクレオシド、核酸（ＤＮＡ）または（ＲＮＡ）、天然または修飾／遮断されたアミノ酸を含むペプチド、抗体、ハプテン、生物学的リガンド、膜タンパク質、脂質膜、例えば、薬物などの小さな製薬分子、または細胞が挙げられる。
【００４０】
ある態様において、生体分子はタンパク質であって差し支えない。例えば、タンパク質としては、ペプチド、タンパク質またはペプチドの断片、膜結合タンパク質、または核タンパク質が挙げられる。タンパク質は、どのような長さのものであっても差し支えなく、一種類以上のアミノ酸またはその変種を含んでも差し支えない。タンパク質は、分析の前に、プロテアーゼ切断などにより断片化されていても差し支えない。分析すべきタンパク質試料に細分化または分離を行って、試料の複雑さを減少させても差し支えない。断片化および細分化を同じアッセイにおいて一緒に用いても差し支えない。そのような断片化および細分化は、タンパク質の分析を単純にし、拡張できる。
【００４１】
ある態様において、生体分子のポリマー層ーの結合後であって、リガンド結合アッセイの前に、ポリマーの表面にある荷電残基のブロッキングを行って、静電相互作用による表面とリガンドとの間の非特異的結合相互作用を最小にすることができる。ここに用いた「リガンド」は、固定化された生体分子または化合物と相互作用するまたは結合する任意の遊離した生体分子（例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、細菌、細胞）または化学化合物（例えば、薬物、小分子など）である。不適切に遮断を行うと、リガンドの非特異的結合のレベルが高くなり、結果の分析が難しくなる。ある態様において、遮断薬は、ポリマー層の表面を、それ自体で良好な非特異的結合特性を持つ荷電されたポリマーまたは化合物と接触させることによって、ポリマー層に結合される。荷電された化合物は、反対の電荷の基体表面を打ち消す。言い換えれば、その化合物は基体の影響を中和するまたはマスキングする。ある態様において、例えば、デキストラン（例えば、ＤＥＡＥデキストラン）などの正の電荷を有する化合物は、タンパク質の、負に荷電された無水物修飾表面への非特異的結合を減少させることができる。
【００４２】
II．  被覆基体を調製する方法
（１）第１の連結層の化合物を基体に結合させ、（２）第１のポリマーを第１の連結層の化合物に結合させる各工程を有してなる、基体を製造する方法がここに記載されている。この方法では、第１のポリマーの第１の連結層への結合が後に続く、基体への第１の連結層の連続結合が考えられる。あるいは、第１のポリマーを第１の連結層に結合させ、その後、第１の連結層／第１のポリマーを基体に結合させることが考えられる。
【００４３】
第１の連結層および第１のポリマーは、当該技術分野において公知の技法を用いて基体に結合させることができる。例えば、基体を、第１の連結層の化合物または第１のポリマーの溶液中に浸漬しても差し支えない。別の態様において、第１の連結層の化合物または第１のポリマーを基体に、吹き付け、蒸着、スクリーン印刷、またはロボット式にピンプリントまたはスタンプしても差し支えない。これは、完全に組み立てられた基体にまたは底部挿入体（例えば、マイクロプレートを形成するための穴あきプレートに底部挿入体を取り付ける前に）いずれに行っても差し支えない。第１のポリマー層（およびその後のポリマー層）の厚さは、基体の意図する使用に応じて様々であって差し支えない。それゆえ、異なる技法を用いて、ポリマー層の厚さを変えることができる。
【００４４】
第１のポリマーを第１の連結層に結合させた後、同様の技法を用いて、第２の連結層の化合物を第１のポリマーに結合させ、その後、第２のポリマーを第２の連結層の化合物に結合させても差し支えない。上述したのと同様に、第２の連結層および第２のポリマーは、当該技術分野において公知の技法を用いて、第１のポリマーに、連続してまたは同時に結合させても差し支えない。他の態様において、先に概説した技法を用いて、リンカーまたは遮断薬を第１のポリマー（またはその後のポリマー層）に結合させても差し支えない。
【００４５】
第１のポリマーまたはその後のポリマー層を一旦基体に結合させたら、先に示した技法を用いて、ポリマー層に一種類以上の生体分子を結合させることができる。生体分子をポリマー層に結合させる反応速度は一般に速い。ある態様において、生体分子は、約１時間、３０分間または１５分間で、十分な量で基体に結合される。
【００４６】
ポリマー層に結合させられる生体分子の量は、例えば、生体分子のサイズおよび等電点に応じて、様々であり得る。被覆基体の加水分解安定性のために、生体分子は、そうでなければ可能ではなかったであろう様々な条件下でポリマー層に結合させられる。例えば、ここに記載した被覆基体は、酸性条件下で多くのタンパク質に結合できる。ある態様において、生体分子は、生体分子の等電点未満の約０．５から１のｐＨで第１のポリマーに結合される。
【００４７】
III．  使用方法
生体活性物質のアッセイを行う方法であって、（１）リガンドを、第１の連結層、第１のポリマー、および生体分子を含む基体に接触させる工程であって、第１の連結層が第１のポリマーを基体に結合させており、生体分子が第１のポリマーに結合しており、リガンドが接触工程後に生体分子に結合される工程、および（２）結合したリガンドを検出する工程を有してなる方法がここに記載されている。
【００４８】
一種類以上の生体分子が結合されている、ここに記載された基体のいずれを用いて、リガンドを結合させ、最終的に、結合したリガンドを検出しても差し支えない。リガンドの基体への結合は、生体分子とリガンドとの間の化学的相互作用を含むが、相互作用はある程度、ポリマー層とリガンドとの間で生じることも可能である。生体分子とリガンドとの間の相互作用の性質は、選択されたリガンドおよび生体分子に応じて様々である。ある態様において、生体分子とリガンドとの間の相互作用により、静電結合、水素結合、疎水結合、または共有結合が形成される可能性がある。別の態様において、生体分子とリガンドとの間で、静電相互作用が生じ得る。
【００４９】
リガンドは、任意の天然に生じたまたは合成の化合物であって差し支えない。基体上の生体分子に結合できるリガンドの例としては、以下に限られないが、薬物、オリゴヌクレオチド、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、ハプテン、または小分子（例えば、製薬）が挙げられる。先に記載した生体分子のいずれもが、ここに記載した方法のためのリガンドであり得る。ある態様において、一種類以上のリガンドの溶液を調製し、マイクロプレートの外面に結合した生体分子を有する１つ以上のウェルに添加する。この点に関して、異なる生体分子を、マイクロプレートの異なるウェルに結合させることができると考えられる。それゆえ、異なる生体分子およびリガンドの間の多数の異なる相互作用を検出することが可能である。ある態様において、タンパク質をマイクロプレート上に固定化して、タンパク質と第２のタンパク質または小分子との間の相互作用を調査することもできる。あるいは、小分子を、ここに記載した技法を用いてマイクロプレート上に固定化して、小分子と第２の小分子またはタンパク質との間の相互作用を調査することもできる。ある態様において、基体がマイクロプレートである場合、アッセイは、高速大量処理アッセイであり得る。
【００５０】
リガンドが基体上の生体分子に一旦結合したら、結合したリガンドが検出される。ここに記載された基体の利点の内の１つは、リガンドの非特異的結合が減少することである。
【００５１】
ある態様において、結合したリガンドは、検出目的のために標識付けられる。使用する検出技法に応じて、ある態様において、リガンドは、検出前に、検出可能なトレーサで標識付けることができる。リガンドと検出可能なトレーサとの間の相互作用は、以下に限られないが、共有結合、イオン相互作用、またはルイス酸−ルイス塩基相互作用を含む、任意の化学的または物理的相互作用を含み得る。ここに用いられる「検出可能なトレーサ」とは、（１）上述したリガンドと相互作用できる基を少なくとも一種類有し、（２）当該技術分野において公知の技法を用いて検出可能な基を少なくとも一種類有する任意の化合物として定義される。ある態様において、リガンドは、固定化前に標識付けることができる。別の態様において、リガンドは、固定化された後に標識付けることができる。検出可能なトレーサの例としては、以下に限られないが、蛍光トレーサおよび酵素トレーサが挙げられる。
【００５２】
別の態様において、結合したリガンドの検出は、以下に限られないが、蛍光、燐光、化学発光、生物発光、ラマン分光法、光散乱分析、質量分析などを含む他の技法、および当業者に一般に知られている他の技法により行うことができる。
【００５３】
ある態様において、固定化されたリガンドは、標識に依存しない検出またはＬＩＤにより検出される。ＬＩＤの例としては、以下に限られないが、表面プラズモン共鳴または共鳴導波路格子（例えば、コーニングＬＩＤシステム）が挙げられる。従来技術において実施されているように、ＬＩＤのための基体には制限がある。ラベルフリー検出プラットホームを用いたアッセイは一般に、(i)センサの表面上の結合パートナー（一般に、タンパク質）の１つの固定化、および(ii)リガンド（例えば、薬物、タンパク質、オリゴヌクレオチドなど）の固定化されたタンパク質への結合の２工程手法を用いて行われる。従来、生体分子の表面への結合は、反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルに対する、表面のカルボン酸基の活性化を含み、次いで、これらのエステルは、関心のあるタンパク質のアミノ基に結合される。この方法は、うまく用いられており、それぞれのＬＩＤプラットホームについて、バイアコア社、アフィニティー・バイオセンサーズ社、およびアーティフィシャル・センシング・インストルメンツ社により商業化されている。活性化工程は、効果的ではあるけれども、時間がかかり、いくぶん毒性のある化学物質の取扱いと使用を含む。この手法に対する代替案は、「予め活性化された」化学物質の使用を含む。例えば、アルデヒド基を有する表面を用いて、生体分子を結合させる。しかしながら、それにより生じたシッフ塩基を安定化させるために、結合後に還元工程が必要である。エポキシド官能基およびイソシアネート官能基を有する表面も用いられてきた。しかしながら、エポキシド基は、反応するのが比較的遅く、それゆえ、塩基性の強い条件下では長いインキュベーション時間が必要であり、一方で、イソシアネート基は、極めて反応性が高く、したがって、貯蔵安定性の問題がある。ここに記載した被覆基体は、現行のＬＩＤプラットホーム技術の制限に対処する。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例は、当業者に、ここに説明され特許請求の範囲に記載された材料、製品、および方法がどのように製造され、評価されるかの完全な開示と説明を提供するように述べられたものであり、純粋な例示を意図したものであって、発明者等が本発明と見なす範囲を制限することは意図されていない。数（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にするように努力したが、ある程度の誤差および偏差が生じているかもしれない。別記しない限り、部は質量部であり、温度は℃で表されているかまたは周囲温度であり、圧力は大気圧またはその辺りである。反応条件には多数の変動および組合せがある。例えば、成分の濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力および記載したプロセスから得られる生成物の純度および出力を最適化するのに使用できる他の反応範囲および条件がある。そのようなプロセス条件を最適化するのには、適度な日常的な実験しか必要ない。
【００５５】
Ａ．  被覆表面の調製
図１に示され、以下に詳しく説明する２工程修飾手法を用いて、表面（ガラス、無機酸化物、および金を含む）を無水マレイン酸コポリマーで修飾した。
【００５６】
無機酸化物上のＥＭＡ
材料
裸のガラススライドまたはコーニングＧＡＰＳスライド
アミノプロピルシルセスキオキサン（「ＡＰＳ」）（Ｇｅｌｅｃｔカタログ＃ＷＡＳ−９９１１）
ポリ（エチレン−ａｌｔ−マレイン酸無水物）（「ＥＭＡ」）（Ａｌｄｒｉｃｈカタログ＃１８，８０５−０）
Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）
イソプロパノール（ＩＰＡ）（低含水量）
無水エタノール
５０ｍｌのガラス染色ビン
手法
（コーニングＧＡＰＳスライドを使用する場合、工程１〜２は省く）
１．  ５分間に亘りＯ2プラズマチャンバ（１Ｔ、２５０ワット）内で処理することによって、裸のガラススライドを洗浄する。あるいは、３分間に亘りＵＶオゾンチャンバ内でスライドを処理する。
【００５７】
２．  ５０ｍｌのガラス染色ビン内で、スライドを、１０分間に亘り５％（体積／体積）のアミノプロピルシルセスキオキサンの水溶液と反応させ、スライドを水で濯ぎ、次いで、エタノールで濯ぎ、窒素で乾燥させる。
【００５８】
３．  スライドを、５０ｍｌのガラス染色ビン内の１０％ＭＰＳ：９０％ＩＰＡ中１ｍｇ／ｍｌのＥＭＡと１０分間に亘り反応させる。１００％ＮＭＰ中にＭＥＡを１０ｍｇ／ｍｌで溶解させ、ついで、ＩＰＡで１０倍に希釈する（希釈を行うときに、ＮＭＰをＩＰＡに添加することが重要である。そうしないと、沈殿物が形成されるであろう）。１０分後、表面をエタノールで濯ぎ、窒素で乾燥させる。
【００５９】
４．  使用するまで、室温でデシケータ内にスライドを貯蔵する。
【００６０】
金上のＥＭＡ
材料
バイアコアの裸のＡｕセンサチップ
１１−メルカプトウンデシルアミン（Ｄｏｊｉｎｄｏ）
ポリ（エチレン−ａｌｔ−マレイン酸無水物）（「ＥＭＡ」）（Ａｌｄｒｉｃｈカタログ＃１８，８０５−０）
Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）
イソプロパノール（ＩＰＡ）（低含水量）
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
無水エタノール
手法
１．  裸の金チップをエタノールと水で濯ぐことにより洗浄し、窒素流の下で乾燥させる。
【００６１】
２．  チップを１１−メルカプトウンデシルアミンの１ｍＭエタノール溶液中に１時間に亘り浸漬し、チップをエタノールと水で濯ぎ、窒素流の下で乾燥させる。
【００６２】
３．  スライドを、１０％ＮＭＰ：９０％ＩＰＡまたは１００％ＤＭＳＯ中のＥＭＡの１ｍｇ／ｍｌ溶液と１０分間に亘り反応させる。１０分後、チップをエタノールで濯ぎ、窒素で乾燥させる。
【００６３】
ポリ（トリエチレングリコールメチルビニルエーテル−ｃｏ−マレイン酸無水物）（「ＰＥＧ−ＭＡ」）の合成
ポリ（トリエチレングリコールメチルビニルエーテル−ｃｏ−マレイン酸無水物）（「ＰＥＧ−ＭＡ」）を、マレイン酸無水物およびトリエチレングリコールメチルビニルエーテルのフリーラジカル重合により合成した。５０ｍｌの丸底フラスコに、１．０１８ｍｌのトリエチレングリコールメチルビニルエーテル、５２０ｍｇのマレイン酸無水物、３ｍｇのＡＩＢＮ、および７ｍｌのトルエンを装填した。この混合物を６３℃で一晩反応させた。エーテルからの沈殿によりポリマーを単離した。ＦＴＩＲ分析により、反応がうまくいったことが確認された。アミンを有する表面（例えば、アミノプロピルシルセスキオキサンで修飾されたガラス／シリコンまたは１１−メルカプトウンデシルアミンで誘導体化された金チップ）を、０．１％（体積／体積）のトリエチルアミンを有するメチルエチルケトン中のポリマーの１０ｍｇ／ｍｌ溶液中に３０〜６０分間浸漬することによって、ＰＥＧ−ＭＡで修飾した。チップをメチルエチルケトンとエタノールで濯ぎ、窒素流の下で乾燥させた。
【００６４】
Ｂ．  無水マレイン酸コポリマー表面の特徴付け
偏光解析法：  偏光解析法を用いて、ポリ（マレイン酸無水物−ａｌｔ−メチルビニルエーテル）（ＭＡＭＶＥ）の、金上のアミンを有する自己組織化単分子層（ＳＡＭ）への結合、およびアミンを有する分子の反応性表面へのその後の結合を特徴付けた。ＭＡＭＶＥと反応した後の、異なる官能基を有するＳＡＭの厚さの増加が下に表で表されている（表１）。試験した表面の中で、アミン基を有するＳＡＭのみが、厚さの増加を示した。ポリマーが、表面に平行なポリマー主鎖で固定化されている場合、厚さの予測される増加は約６〜７Åであり、これは、観察された厚さの増加に相当する。ポリマーの単分子層がＳＡＭに共役(conjugated)して、櫛状構造を形成すると仮定された。
【表１】
2008522164.tif 000003
【００６５】
無水物修飾表面に結合する量を調査するために、基体を、１．５時間に亘りウンデシルアミン（「ＵＡ」、１０ｍＭ）のＤＭＳＯ溶液中に浸漬した。ＵＡによる誘導体化後、表面の厚さは約５Å増加した（表１）。ウンデシルアミンの密集した単分子層は約１７Åの偏光厚さを与えるであろう。したがって、観察された厚さの増加は、表面の約３０％の被覆率に相当する。
【００６６】
ＭＡＭＶＥのアミン−ＳＡＭへの結合が共有結合か静電結合かを決定するために、観察された厚さの増加が可逆的であるか否かを調べる実験を行った。不可逆的な厚さの増加は共有結合を示唆し、反対に、可逆的な厚さの増加は、非共有結合を示唆するであろう。酸性緩衝液（ｐＨ３）による洗浄後、基体の厚さの減少は見られなかった。別の実験において、ＭＡＭＶＥを、アンモニア溶液中で一晩撹拌することによって、加水分解した。この加水分解したポリマーが、アミンを有するＳＡＭに吸着されることにより厚さが増加し、これは約８．６Åに相当した。この吸着はおそらく、負に荷電したポリマーと、正に荷電した表面との間の静電的相互作用によるものであろう。しかしながら、ウンデシルアミンとの反応後に、厚さはさらに増加しなかった。さらに、その表面を酸性緩衝液（ｐＨ３）中に浸漬したら、厚さが大幅に減少した。このｐＨでは、加水分解したポリマーのカルボン酸基に陽子が加えられて、カルボキシル基を形成し、これは、表面へのポリマーの親和性を著しく減少させ、脱着の原因となるであろう。
【００６７】
無機酸化物上の偏光解析法：  偏光解析法を用いて、異なる無機酸化物が被覆されたシリコンウェハーへのポリ（エチレン−ａｌｔ−マレイン酸無水物）（ＥＭＡ）の結合を特徴付けた。ＥＭＡの結合の前に、先のセクションＡに記載したように、基体を、アミノプロピルシルセスキオキサン（ＡＰＳ）の連結層で修飾した。表２は、これらの実験の結果を要約しており、他の基体に対して、ＳｉＯ2上に著しく多くＥＭＡが堆積したことを示している。データの分析により、ＥＭＡ層の厚さは、ＡＰＳ連結層の厚さ（量）により変動し、ＳｉＯ2が最も厚いＡＰＳ層を有したことを示している。ＡＰＳ層を持たないＳｉＯ2表面上で行われた対照実験は、偏光厚さの増加は示さず、ＥＭＡが、接着層のない表面には接着しないことが示された。これらの実験において、全ての基体の被覆のために、たった一組の条件（ＳｉＯ2のために最適化された）を用い、他の基体上のＡＰＳの厚さを増加させるためには、何の試行も行わなかったことに留意されたい。ＥＭＡの堆積に用いた溶媒の性質には、ＥＭＡ層の厚さへの影響があった。特に、混合ＮＭＰ／ＩＰＡ溶媒を用いたら、ＥＭＡ層は、ＤＭＳＯから堆積された層の２倍の厚さになった（表３参照）。これらの二種類の溶媒系を用いて調製した試料に激しい（ＤＭＳＯ中１６時間の浸漬）洗浄工程を施した。表４に示されているように、ＤＭＳＯから調製された試料について、偏光厚さには実質的な変化は観察されず、ＥＭＡは表面に共有結合したことを示唆している。ＮＭＰ／ＩＰＡを用いて調製した試料については、約３０％の厚さの減少が観察された。ＮＭＰ／ＩＰＡ溶媒を用いた場合、ＡＰＳ層のない基体にも、ある程度ＥＭＡは結合した（表３参照）。しかしながら、この材料は、ＤＭＳＯ中の長期の浸漬後に除去された。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【００６８】
加水分解安定性：  一連の実験を行って、異なる無水マレイン酸コポリマーの薄膜の加水分解安定性を評価した。コーニングＧＡＰＳスライドを、以下のポリマーの内の１つで誘導体化した：ＥＭＡ、ポリ（マレイン酸無水物−ａｌｔ−１−オクタデセン）（「ＯＭＡ」）、ポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物）（「ＳＭＡ」）、ＭＡＭＶＥ、またはポリ（トリエチレングリコールメチルビニルエーテル−ｃｏ−マレイン酸無水物）（「ＰＥＧ−ＭＡ」）。１２ウェルのガスケットをスライドに貼り付け、様々な期間に亘り、各ウェルで緩衝液（ｐＨ７．４）をインキュベートした。次いで、最初にビオチン−ＰＥＯ−アミンを表面に固定化し、その後、Ｃｙ３−ストレプトアビジンの溶液によるインキュベーションを行う、単純な蛍光結合アッセイを行った。反応性のマレイン酸無水物基のどの相当な量の加水分解も、インキュベーション時間の関数としての蛍光信号の系統的減少により示されるであろう。一次加水分解反応を仮定すると、インキュベーション時間に対するｌｎ（蛍光信号）のプロットにより、速度定数の負の逆数と等しい傾斜を持つ直線が生成されるはずである。図２は、ＥＭＡおよびＳＭＡの薄膜について代表的なプロットを示しており、表５は、試験した各無水マレイン酸コポリマーの観察された半減期を要約している。これらのデータは、側鎖の性質がマレイン酸無水物の加水分解安定性に影響を与えることを示している。例えば、疎水性のスチレン側鎖を有するＳＭＡは、ＥＭＡに対して、著しく長い半減期を有する。疎水性オクタデセン側鎖を有するＯＭＡコポリマーが、ＳＭＡと同じ加水分解安定性を示さないという事実は、ポリマー繰り返し単位（交互対ブロック）の立体障害および／または性質も、コポリマーの加水分解安定性に役割を果たすであろうことを示唆している。
【表５】
2008522164.tif 000007
【００６９】
第２の一連の実験において、ＥＭＡ上の膜のグレージング角ＦＴＩＲ測定を行って、ｐＨの関数としてＥＭＡの加水分解安定性を直接的かつより定量的にモニタした。具体的には、時間の関数としてのマレイン酸無水物のカルボニルバンドの減少を用いて、加水分解半減期を決定した。測定は、Ｈａｒｒｉｃｋ  Ｓｅａｇｕｌｌグレージング角付属部品を備えたＮｉｃｏｌｅｔ  Ｎｅｘｕｓ  ４７０  ＦＴＩＲ分光計を用いて、低放射率(low-e)ガラス製顕微鏡スライド（ケブリー・テクノロジーズ(Kevley Technologies)社）で行った。表６は、これらの実験の結果を示している。ＥＭＡの半減期は、ｐＨ５では、ｐＨ７．４から９．２でと比較して、著しく長いことに留意されたい。ｐＨ７．４でＥＭＡについて得られた表５および６の結果を比較すると、蛍光データおよびＦＴＩＲデータは比較的良好に一致していることが示される。
【表６】
2008522164.tif 000008
【００７０】
グレージング角ＦＴＩＲも用いて、相対湿度の関数としてのＥＭＡの薄膜の加水分解安定性をモニタした。これらの実験は、ＥＭＡの薄膜が１００％の相対湿度（２３℃）で約６時間の半減期を有することを示した。この半減期は、より典型的な周囲条件下（約６５％の相対湿度）でより長くなるであろうことが予測される。
【００７１】
貯蔵安定性：  ＧＡＰＳスライド上のＥＭＡ薄膜の貯蔵安定性を、４ヶ月の期間に亘り評価した。一組のＥＭＡスライドを調製し、室温で乾燥した状態で貯蔵した。貯蔵時間の関数としての蛍光アッセイの性能を評価した。このアッセイは、一連の希釈（２００ｎＭ〜５μＭ）におけるビオチン−ＰＥＯ−アミンの固定化と、その後の、所定の（１００ｎＭ）濃度のＣｙ３−ストレプトアビジンによるインキュベーションからなった。反応性のマレイン酸無水物基の任意の著しい加水分解の量は、貯蔵時間の関数としての蛍光信号の系統的減少により示されるであろう。これらの実験の結果の分析（図３参照）は、試験した４ヶ月間に亘り性能の著しい低下は示さず、使用した比較的単純な貯蔵条件が効果的であったことを示している。
【００７２】
Ｃ．  結合アッセイ
一連の実験を行って、標識を用いない結合アッセイについて、無水マレイン酸コポリマーで修飾した表面の有用性を示した。これらの実験は、バイアコア表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはコーニングＬＩＤ検出のいずれかを用いた。
【００７３】
小分子／タンパク質
小分子／タンパク質結合アッセイにおけるＥＭＡの性能を、ビオチン／ストレプトアビジン・モデルシステムおよびコーニングＬＩＤ検出を用いて試験した。ビオチンは、各ウェルを３０分間に亘りホウ酸緩衝液中のビオチン−ＰＥＯ−アミンの１０μＭ溶液、７５μｌと共にインキュベーションすることによって、コーニングＬＩＤマイクロプレートの列Ａ〜Ｇに固定化し、列Ｈは、負の対照として働くように、エタノールアミン（ホウ酸緩衝液中２００ｍＭ、ｐＨ９）と反応させた。このプレートをＬＩＤ機器にドッキングさせ、ストレプトアビジン（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１００ｎＭ）の結合を、図４Ａに示すように、時間の関数としてモニタした。約３％の標準偏差で、６つのウェルについて、４６５ｐｍの平均応答が観察された。データの分析により、エタノールアミンで誘導体化されたウェル（列Ｈ）においては結合が観察されなかったので、ストレプトアビジンの結合は特異的であることが示された。
【００７４】
二種類の異なる無水マレイン酸コポリマー、ＭＡＭＶＥおよびスチレンマレイン酸無水物（ＳＭＡ）上に固定化されたリガンドに対するタンパク質の結合も調査した。これらの実験にはバイアコアＳＰＲ検出を用い、ここでは、ビオチンは、各表面上に５−（ビオチンアミド）ペンチルアミンの溶液を注ぐことによって、それらの表面に固定化された。次いで、ストレプトアビジン（１μＭ）またはＢＳＡ（特異性を試験するための対照として）の溶液を表面に注いだ。図４Ｂは、ＭＡＭＶＥおよびＳＭＡ上に固定化されたビオチン基に対するストレプトアビジンおよびＢＳＡの結合の量を示している。これらのデータは、ＭＡＭＶＥ上に固定化されたビオチン基に対するストレプトアビジンの結合が特異的であったことを示している。またこれらのデータは、スチレン側鎖を有する表面上のタンパク質の非特異的結合の量は、メチルエーテルを有する表面上のものよりも著しく多かったことも示している。疎水性芳香族基を有するものなどの表面に対するタンパク質の非特異的結合は十分に記載されており、−ＯＣＨ3基を有する表面の非特異的吸着に対する不活性も観察されてきた（１３）。
【００７５】
小分子／小分子
小分子／小分子の相互作用をモニタするための無水マレイン酸コポリマーの有用性を実証するために、薬物のバンコマイシン（１４８６Ｄａ）の特異的結合および競合的阻害を、ペプチド配列Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａを有するマレイン酸無水物修飾表面上で評価した（バンコマイシンは、グラム陽性細菌細胞壁のＣ−末端Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ基に結合し、細胞壁合成を阻害する抗生物質である）。実験は、ＥＭＡまたはポリ（トリエチレングリコール−ｃｏ−マレイン酸無水物）（「ＰＥＧ−ＭＡ」）のいずれかにより修飾された金センサチップを用いて、バイアコア２０００  ＳＰＲ機器で行った。比較のために、バイアコアのＣＭ５表面上で行った。図５は、それぞれ、ＣＭ５およびＥＭＡ上に固定化されたＬｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａに対するバンコマイシンの結合に関するセンサグラムを示している。この図から分かるように、結合の量は分量依存性であった。データのスキャッチャード分析により、それぞれ、０．２８μＭおよび０．３４μＭのＫｄ値が観察された（表７参照のこと）。これらの結果は、溶液中で測定されたこれらの化合物に関して文献に報告された約１μＭのＫｄに似ている（１２）。
【表７】
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【００７６】
相互作用の特異性を試験するために、様々な濃度のペプチド配列Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａの存在下での所定の（５μＭ）濃度のバンコマイシンと表面がインキュベーションされた競合結合アッセイを行った。図６に示されているように、バンコマイシンの結合は、ペプチドの添加によって、分量依存性の様式で阻害され、バンコマイシンの結合が特異的であることを示唆した。試験した両方の無水マレイン酸コポリマー表面は、９０％より大きい結合特異性を示した。このアッセイにおける非特異的結合の量は、ＥＭＡに対してＰＥＧ−ＭＡでは約１／２未満であった。この観察は、オリゴ（エチレングリコール）基がタンパク質の非特異的結合を効果的に阻害することが示された事実とつじつまが合う（１３）。同様の競合的阻害実験を、ＥＭＡが被覆されたコーニングＬＩＤマイクロプレートに行った（図７参照）。これらの研究は、バンコマイシン結合信号が、過剰の（２５０μＭ）のＬｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａの存在下で８３％減少したことを示した。
【００７７】
タンパク質／タンパク質
様々なサイズおよび等電点（ｐＩ）のタンパク質をＥＭＡ上に固定化できることを実証するために、コーニングＬＩＤプラットホームで実験を行った。合計で７種類の異なるタンパク質（リゾチーム、キモトリプシノゲン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ミオグロビン、ストレプトアビジン、およびヒトＩｇＧ）を試験した（表８参照）。図８は、緩衝液のｐＨの関数としての、結合したタンパク質の相対量（共鳴信号におけるｐｍシフトに関して表されている）のプロットを示している。７種類の異なるｐＨ値で良好なレベルの固定化が達成されたが、一般に、タンパク質のｐＩの約０．５〜１単位未満のｐＨの固定化緩衝液を用いたほうが、高いレベルの固定化が達成された。この観察は、タンパク質（そのｐＩ未満で正に荷電された）は、表面（無水マレイン酸の加水分解から生じたカルボン酸基の存在のために負の荷電された）と強力に相互作用する静電濃度効果とつじつまが合い、それによって、結合効率が向上する。
【表８】
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【００７８】
固定化されるタンパク質の量へのタンパク質濃度の影響を調査するために、ＥＭＡが被覆されたマイクロプレートを用いたコーニングＬＩＤ実験も行った。この研究のために選択されたタンパク質は、ＨＳＡおよびＩｇＧであった。最大の結合のために最適化されたｐＨの緩衝液中で、０〜１２８μｇ／ｍｌの濃度を試験した。結合は１５分間に亘り行われ、その後、緩衝液による洗浄を行い、ホウ酸緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ９）中２００ｍＭのエタノールアミン中で５分間インキュベーションした。このエタノールアミン洗浄工程を用いて、ｉ）任意の残留する反応性無水マレイン酸基を不活性化し、ｉｉ）表面から非特異的に結合したタンパク質を除去する。図９は、濃度の関数としてのＨＳＡおよびＩｇＧの固定化に関する代表的なデータを示している。約３０μｇ／ｍｌの濃度で飽和被覆率に到達した。ＨＳＡまたはＩｇＧとのインキュベーションの前にエタノールアミンにより遮断された対照ウェルは低レベルの結合を示し、ＥＭＡに対するタンパク質の結合は共有結合であることを示唆し、ＥＭＡに対するタンパク質の非特異的結合は低かったことを実証した。
【００７９】
タンパク質−タンパク質相互作用の代表例として、抗体−抗体アッセイを選択した。具体的には、ポリクローナルウサギＩｇＧをコーニングＬＩＤマイクロプレートの多数のウェル内に固定化し、負の対照として、追加のウェルをＢＳＡまたはエタノールアミン（ＥＡ）で誘導体化した。ポリクローナル抗ウサギ（「抗−ウサギ」）抗体の溶液を各ウェルについてインキュベーションし、コーニングＬＩＤプラットホームを用いて、結合の量を定量化した。図１０は、その結果の要約を示している。固定化されたウサギＩｇＧに対する抗−ウサギ抗体の結合について、高い信号が観察された。結合の量は、約４％のＣＶで再現性があった。ウサギＩｇＧを有するウェルの抗−マウス抗体によるインキュベーションにより、非常に低レベルの結合が生じた。抗−ウサギ抗体の溶液が、一般的なタンパク質（ＢＳＡ）を有するウェルまたはエタノールアミンで遮断されたウェルとインキュベーションしたときに、あったとしても、極わずかな結合しか観察されなかった。これらのデータは、抗−ウサギ／ウサギ結合相互作用が非常に特異的であること、およびＥＭＡ表面が最小量の非特異的結合を示すことを実証している。
【００８０】
タンパク質／小分子
タンパク質に対する小分子の結合を検出する能力は、薬物発見用途にとって非常に興味深いものである。ｉ）無水マレイン酸コポリマーにより修飾された表面上に固定化されたタンパク質が、その官能性を維持し、小分子結合アッセイのために使用できること、ｉｉ）ＥＭＡに対する小分子の非特異的結合が低いことを実証するために、実験を行った。これらの研究に２つのモデルシステム：ストレプトアビジンに対するフルオレセイン−ビオチンまたはビオチンの結合、およびヒト血清アルブミンに対する薬物の結合を選択した。
【００８１】
ウェルを酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ５．５）中２５μｇ／ｍｌのタンパク質の溶液と１５分間に亘りインキュベーションすることによって、ＥＭＡ被覆ＬＩＤマイクロプレート上にストレプトアビジンを固定化した。負の対照として、追加のウェルをエタノールアミンにより遮断した。ＬＩＤ機器内において、小分子のフルオレセイン−ビオチン（「Ｆｌ−ビオチン」、８３１Ｄａ）の結合を時間の関数としてモニタした。ＰＢＳ中のＦｌ−ビオチンの１００ｎＭ溶液を各ウェル中に導入し、数分間に亘り結合させた。図１１はその結果のプロットを示している。このデータは、負の対照のウェルから応答を引くことによって、バルク屈折率の影響について補正されている。フルオレセイン−ビオチンの結合について、２００より大きい信号対雑音比で、４８ｐｍ±２ｐｍの応答が観察された。図１２は、小分子ビオチンについて行った類似の実験の結果を示している。ストレプトアビジンを含んでいなかった負の対照のウェル（ウェルＨ）に対して、正の対照のウェル（Ｂ〜Ｆ）は、約５０の信号対雑音比で、ビオチンの結合について約５ｐｍの応答を示した。この実験をプレートの各カラムについて繰り返し、同様の結果が得られた。これらの結果は、小分子結合実験を、ＥＭＡ上に固定化したタンパク質について行えることを実証している。
【００８２】
別の一連の実験において、ＥＭＡが被覆された９６ウェルマイクロプレート上に固定化されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、血液中の薬物の輸送に関与するタンパク質）に対する薬物のジギトキシン（７６５Ｄａ）およびワルファリン（３０８Ｄａ）の結合を、ＬＩＤ検出を用いて測定した。ＨＳＡは、ウェルを酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ５．５）中６０μｇ／ｍｌのタンパク質の溶液と１５分間に亘りインキュベーションすることによって、センサの表面に固定化した。負の対照として、追加のウェルをエタノールアミンにより遮断した。ＰＢＳ緩衝液および水と完全に洗浄した後、ウェルを１０分間に亘りエタノールアミン（２００ｍＭ、ｐＨ９．２）とインキュベーションすることによって、残留反応器を遮断した。プレートをＬＩＤ機器にドッキングさせ、緩衝溶液（９７％ＰＢＳ／３％ＤＭＳＯ）の１００μｌ／ウェルで平衡にした。緩衝水溶液（９７％ＰＢＳ／３％ＤＭＳＯ）中１００μｌのジギトキシン（２００μＭ）を各ウェルに添加し、よく混合し、数分間に亘り結合させた。図１３Ａに示されているように、ＨＳＡが固定化されていない負の対照のウェル（ＧおよびＨ）に対して、正の対照のウェル（Ａ〜Ｆ）は、約１０ｐｍの応答において再現性のあるシフトを示した。別の組の実験において、ジギトキシンの結合は、分量依存性であり、飽和可能であることが示された（図１３Ｂ参照）。６μＭほど低い濃度（ＨＳＡに対するジギトキシンの結合について報告された平衡解離定数（Ｋｄ）に基づいて、結合部位の約３０％が占められるであろうことを意味する）もうまく検出された。データのスキャッチャード分析により１６μＭのＫｄが示され、これは報告された１６．５μＭのＫｄと良好に一致している。
【００８３】
同様の組の実験を、薬物のワルファリンを用いて行った。図１４Ａに示されているように、３つの負の対照のウェル（Ｂ〜Ｄ）に対して、４つの正の対照のウェル（Ｅ〜Ｈ）において約３ｐｍの応答が観察された。対照実験において、ワルファリンの溶液の代わりに、緩衝液ブランクが各ウェル中に導入された。図１４Ｂに示されているように、正の対照のウェルと負の対照のウェルとの間には、応答に著しいシフトは観察されなかった。
【００８４】
最後の実証において、ＥＭＡ上に固定化されたヒト血清アルブミンに対する薬物のワルファリン（３０８Ｄａ）およびナプロキセン（２３０Ｄａ）の結合プロファイルを、ＳＰＲ検出を用いて測定した。これらの実験は、ＥＭＡが被覆された金チップ上で行われ、他のどこかに記載されたものと同じ様式で行われた（１４）。図１５は、薬物濃度の関数としての薬物結合信号のプロットであり、両方の薬物の結合が分量依存性であることを示している。ヒト血清アルブミンを含んでいない負の対照のＥＭＡ表面に対する取るに足らない量の薬物の結合により証拠付けられるように、相互作用の特異性は良好である。ワルファリンの結合は、ナプロキセンに対して高い信号レベルで生じ、これは、ワルファリンが、ナプロキセンに対して、高い分子量およびわずかに高い親和性を有するという事実につじつまが合う。データのスキャッチャード分析により、ナプロキセンおよびワルファリンについて、それぞれ、約８μＭおよび約３μＭの解離定数が示された。バイアコアのＣＭ５表面で行った同様の実験により、それぞれ、約７．５μＭおよび約４．５μＭの解離定数が得られた。これらのデータは、文献に報告されたデータとつじつまが合い、精密な結合データがＥＭＡ被覆表面に得られることを実証している。
【００８５】
Ｄ．  遮断薬の使用
タンパク質／リガンドの表面への共有結合後、表面上の残留反応基の遮断は、タンパク質−タンパク質および／またはリガンド受容体相互作用の研究において重要な工程である。不適切な遮断が行われると、表面への非特異的結合が高レベルで生じ、不可能ではないにしろ、結果の分析が難しくなり得る。例えば、活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）に基づく表面は通常、エタノールアミンにより遮断されて、アミド結合を形成し、それによって、電気的に中性の親水性表面が生成される。これとは反対に、無水物基のアミンとの反応は、開環機構を介して進行し、ここでは、アミド結合とカルボン酸結合の両方が形成され、負に荷電した表面が生成される（約４より大きいｐＨで）。その結果、エタノールアミンまたは同様の試薬による遮断は、あるアッセイやアッセイ条件にとっては不十分であるかもしれない。無水物修飾表面にとっての静電遮断薬の新規の使用が開発された。具体的には、ポリ（マレイン酸無水物−ａｌｔ−メチルビニルエーテル）により修飾された表面に対するタンパク質の非特異的結合を減少させるには、ジエチルアミンエチル（ＤＥＡＥ）デキストランが特に有効である。
【００８６】
静電遮断薬としてのＤＥＡＥデキストランの使用を実証するために、１１−メルカプトウンデシルアミン（ＭＵＡＭ）の自己組織単分子層に結合したポリ（マレイン酸無水物−ａｌｔ−メチルビニルエーテル）の薄層（約１．５ｎｍ）を含有する、化学修飾された金表面を調製した。バイアコア２０００表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）機器中にドッキングし、緩衝液で平衡にした後、これらの表面をエタノールアミンと反応させ、次いで、２分間に亘り、ｉ）エタノールアミン、ｉｉ）正に荷電したデキストランであるＤＥＡＥデキストラン、ｉｉｉ）負に荷電したデキストランであるカルボキシメチルデキストラン、またはｉｖ）荷電されていない天然のデキストランのいずれかにより遮断した。各表面に結合したタンパク質の量を、７分間に亘りその表面上にタンパク質の溶液（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中、各々１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、リゾチーム、コンカナバリンＡ、およびウシ血清アルブミン）を注ぐことにより決定した（バイアコア機器について、１０００ＲＵは、吸着したタンパク質、約１ｎｇ／ｍｍ2に相当する）。この注ぎ後、系を緩衝液に戻し、２〜２０分間に亘り洗浄した。図１６は、この実験の結果を示している。エタノールアミンで遮断した表面のみが、多量のタンパク質と結合したことに留意されたい。これとは反対に、ＤＥＡＥ−デキストランにより遮断した表面は、実質的にほとんど結合を示していない。具体的には、２分間の緩衝液による洗浄後、エタノールアミンにより遮断された表面は約３．１ｎｇ／ｍｍ2（３，１００ＲＵ）のタンパク質と結合し、一方で、ＤＥＡＥ−デキストランにより遮断された表面は、たった約０．７４ｎｇ／ｍｍ2（７４０ＲＵ）のタンパク質しか結合しなかった。同程度の量のタンパク質が、カルボキシメチルデキストランまたは天然のデキストランのいずれかにより遮断された表面に結合し、これらのデキストランは表面には結合しないこと、およびポリマー表面とＤＥＡＥデキストランとの間の相互作用は静電的であることを示唆している。非特異的に結合したタンパク質は、５分間に亘るエタノールアミンの溶液（１５０ｍＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ９中２００ｍＭ）への表面の曝露により除去されるであろう。この洗浄工程は効果的であるが、その使用は、低結合親和性相互作用には適してないであろう。したがって、まず第一に（事後の非特異的結合種の除去とは反対に）、非特異的結合の防止が好ましいであろう。
【００８７】
ＤＥＡＥ−デキストランなどの高分子遮断薬の使用に関する懸念の１つは、検体が、固定化された標的に結合する能力に干渉する可能性である。この問題に対処するために、ヒトＩｇＧが、ポリ（トリ（エチレングリコールメチルビニルエーテル）−ａｌｔ−マレイン酸無水物）修飾金表面に固定化されたＳＰＲ実験を行った。この固定化後、フローチャンネル１（ＦＣ１）をＥＡで遮断し、フローチャンネル２（ＦＣ２）をＥＡ＋ＤＥＡＥデキストランで遮断した。次いで、両方のチャンネルに抗−ＩｇＧの溶液を注いだ。図１７から分かるように、同程度の量の抗−ＩｇＧが両方のチャンネルに結合し、ＤＥＡＥデキストランがＩｇＧ／抗−ＩｇＧ結合に干渉しないことを示した。
【００８８】
この明細書全体に亘り、様々な出版物が参照されている。これらの出版物の全部の開示は、ここに記載された化合物、組成物および方法をより十分に記載するために、この明細書に参照により含まれる。
【００８９】
ここに記載した材料、方法、および製品に様々な改変および変更を行うことができる。ここに記載した材料、方法、および製品の他の態様は、ここに記載した材料、方法、および製品の実施および明細書の検討から明らかである。明細書および実施例は例示と考えられることが意図されている。
【００９０】
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【００９１】
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【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】無水マレイン酸コポリマーで表面を誘導体化するために用いられる２工程修飾手法を示す概略図
【図２】二種類の異なる無水マレイン酸コポリマーに関する加水分解時間の関数としての蛍光信号（Ｃｙ３−ストレプトアビジン、ビオチン−アミンアッセイから）をプロットしたグラフ
【図３】ポリ（エチレン−ａｌｔ−マレイン酸無水物）により被覆されたスライド上の貯蔵安定性実験の結果を示すグラフ。このデータは、ＥＭＡは、室温で乾燥状態で貯蔵されたときに、少なくとも４ヶ月に亘り安定であることを示している。
【図４Ａ】ＥＭＡ被覆ＬＩＤマイクロプレート上で行ったコーニングＬＩＤ（マイクロプレートに基づく、導波路共鳴格子検出プラットホーム）アッセイ（固定化されたビオチン−アミン基へのストレプトアビジンの結合）の結果を示すグラフ
【図４Ｂ】ＭＡＭＶＥおよびＳＭＡ被覆金チップ上の結合の特異性を比較したＳＰＲ実験の結果を示すグラフ
【図５】ＳＰＲ検出を用いてバイアコアＣＭ５およびＥＭＡ被覆金チップ上で行ったバンコマイシン結合実験の結果を示すグラフ
【図６】ＳＰＲ検出を用いてＥＭＡ被覆金チップ上で行った競合的阻害結合実験の結果を示すグラフ
【図７】コーニングＬＩＤ検出を用いてＥＭＡ被覆金チップ上で行った競合的阻害結合実験の結果を示すグラフ
【図８】ＥＭＡ被覆マイクロプレート上のコーニングＬＩＤ検出を用いて測定した、６種類の異なるタンパク質に関する固定化ｐＨの関数としてのＥＭＡ上に固定化されたタンパク質の相対量を示すグラフ
【図９】タンパク質濃度の関数としてのＥＭＡ被覆マイクロプレート上に固定化されたタンパク質の相対量を示すグラフ
【図１０】ＥＭＡ被覆ＬＩＤマイクロプレート上で行った抗体−抗体結合アッセイの結果を示すグラフ
【図１１】ストレプトアビジンを有するＥＭＡ被覆ＬＩＤマイクロプレートへのフルオレセイン−ビオチンの結合のコーニングＬＩＤ検出を示すグラフ
【図１２】ＥＭＡ上に固定化されたストレプトアビジンへのビオチンの結合のコーニングＬＩＤ実験の結果を示すグラフ
【図１３】Ａは、ＥＭＡ上に固定化されたヒト血清アルブミンへの薬物ジギトキシンの結合のコーニングＬＩＤ実験の結果を示すグラフ。Ｂは、ジギトキシンの一連の結合滴定の結果を示すグラフ
【図１４】Ａは、ＥＭＡ上に固定化されたヒト血清アルブミンへの薬物ワルファリンの結合のコーニングＬＩＤ実験の結果を示すグラフ。Ｂは、ワルファリンが緩衝剤のブランクと置き換えられた陰性の対照実験の結果を示すグラフ
【図１５】表面プラズモン共鳴検出を用いたＥＭＡ上に固定化されたヒト血清アルブミンへの薬物結合実験の結果を示すグラフ
【図１６】エタノールアミン（ＥＡ）および様々なデキストランにより遮断された無水マレイン酸コポリマーにより修飾された金表面へのタンパク質の非特異的結合を調査するＳＰＲ実験の結果を示すグラフ。ＤＥＡＥ−デキストランにより遮断された表面のみが、タンパク質の結合に対して著しく増加した抵抗を示す。
【図１７】エタノールアミンまたはＤＥＡＥ−デキストランにより遮断された、ＩｇＧが固定化された表面への抗−ＩｇＧの結合を比較するＳＰＲ実験の結果を示すグラフ。この実験は、ＤＥＡＥ−デキストランは、抗−ＩｇＧ結合を干渉しないことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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