(57)【要約】  本発明は薬剤耐性微生物及び細胞を処置するのに有用な組成物と、前記組成物を同定及び使用する関連方法を提供する。更に、本発明は抗生物質や化学療法薬等の抗微生物及び細胞傷害性物質に対する薬剤耐性及び薬剤感受性の両者の微生物及び細胞の感受性を増強するのに有用な組成物を含む。更に、これらの組成物の同定方法と、薬剤耐性及び薬剤感受性の両者の疾患及び症状の治療におけるこれらの物質の使用方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物又は細胞を抗微生物又は細胞傷害性化合物に対して感受性化する物質の同定方法であって、
（ａ）２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関連するポリペプチドと結合するか又はその活性を阻害する能力について１種以上の候補物質をスクリーニングする段階と；
（ｂ）段階（ａ）で同定された候補物質が微生物又は細胞を抗微生物又は細胞傷害性化合物に対して感受性化する物質であると同定する段階を含むことにより、微生物又は細胞を抗微生物又は細胞傷害性化合物に対して感受性化する物質を同定する前記方法。
【請求項２】
（ｃ）段階（ｂ）で同定された物質の誘導体又はアナログを生成する段階と；
（ｄ）前記誘導体又はアナログが抗微生物又は細胞傷害性化合物に対する微生物又は細胞の感受性を増強するか否かを判定する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗微生物又は細胞傷害性物質に対する微生物又は細胞の感受性を増強する化合物の同定方法であって、
（ａ）微生物又は細胞を抗微生物又は細胞傷害性物質の存在下で候補化合物と接触させる段階と；
（ｂ）候補化合物で処理していない微生物又は細胞に比較して抗微生物又は細胞傷害性物質に対する前記微生物又は細胞の感受性が増加したか否かを判定する段階を含み、
感受性が増加したならば、候補化合物が抗微生物又は細胞傷害性物質に対する微生物又は細胞の感受性を増強すると判断する前記方法。
【請求項４】
抗微生物又は細胞傷害性物質によるＳＯＳ応答の誘導を阻害する化合物の同定方法であって、
（ａ）ＳＯＳ応答経路の活性化により発現を誘導されるレポーターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物又は細胞を亜致死量の抗微生物又は細胞傷害性物質と接触させる段階と；
（ｂ）候補化合物で処理していない前記ポリヌクレオチドを含む微生物又は細胞に比較して段階（ａ）に従って候補化合物と接触させた微生物又は細胞でレポーターポリペプチドの発現が低下するか否かを判定する段階を含み、
レポーター遺伝子の発現が低下したならば、化合物が抗微生物又は細胞傷害性物質によるＳＯＳ応答の誘導を阻害すると判断する前記方法。
【請求項５】
前記方法が複数の別個の微生物又は細胞集団を異なる候補化合物と接触させる段階を含む請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が候補化合物のライブラリーの高スループットスクリーニングにより実施される請求項３又は４に記載の方法。
【請求項７】
化合物がＤＮＡ修復、組換え、又は複製に関連するポリペプチドの活性又は発現を阻害するか否かを判定する段階を更に含む請求項３又は４に記載の方法。
【請求項８】
薬剤耐性微生物又は細胞に対して細胞傷害性の物質の同定方法であって、
（ａ）２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関連するポリペプチドと結合するか又はその活性を阻害する能力について１種以上の候補物質をスクリーニングする段階と；
（ｂ）段階（ａ）で同定された候補物質が薬剤耐性微生物又は細胞に対して細胞傷害性の物質であると同定する段階を含むことにより、薬剤耐性微生物又は細胞に対して細胞傷害性の物質を同定する前記方法。
【請求項９】
（ｃ）段階（ｂ）で同定された物質の誘導体又はアナログを生成する段階と；
（ｄ）前記誘導体又はアナログが薬剤耐性微生物又は細胞に対して細胞傷害性であるか否かを判定する段階を更に含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物がグラム陽性菌又はグラム陰性菌である請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物又は細胞が多剤耐性である請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
抗微生物又は細胞傷害性化合物の活性の増強方法であって、２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関連するポリペプチドの活性を阻害する物質と前記抗微生物又は細胞傷害性化合物を併用投与する段階を含む前記方法。
【請求項１３】
抗微生物又は細胞傷害性化合物の投与前、投与と同時、又は投与後に前記物質を投与する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
微生物又は細胞の成長又は増殖の抑制方法であって、２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関連するポリペプチドの活性を阻害する物質を前記微生物又は細胞に投与する段階を含む前記方法。
【請求項１５】
前記微生物又は細胞が薬剤耐性である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が多剤耐性である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
微生物又は細胞を抗微生物又は細胞傷害性化合物に対して感受性化する方法であって、２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関連するポリペプチドの活性を阻害する物質と前記微生物又は細胞を接触させる段階を含む前記方法。
【請求項１８】
前記薬剤と接触させる前、接触と同時又は接触後に前記微生物又は細胞を前記物質と接触させる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
１種以上の抗微生物化合物に対して耐性の微生物に感染する危険があるか、感染していると診断されたか、又は感染している疑いのある対象に前記物質を投与する請求項１２、１４又は１７に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍をもつ危険があるか、腫瘍をもつと診断されたか、又は腫瘍をもつ疑いのある対象に前記物質を投与する請求項１２、１４又は１７に記載の方法。
【請求項２１】
微生物に感染した対象の治療方法であって、
（ａ）前記微生物が抗微生物化合物に対する耐性に関連する遺伝子に突然変異を含むか否かを判定する段階と；
（ｂ）前記微生物が抗微生物化合物に対する耐性に関連する遺伝子に突然変異を含む場合には、２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関連するポリペプチドの活性を阻害する物質を前記対象に投与する段階を含む前記方法。
【請求項２２】
微生物による薬剤耐性獲得の抑制方法であって、前記薬剤による治療中に２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関連するポリペプチドの活性を阻害する物質と前記微生物を接触させる段階を含み、前記物質が耐性付与遺伝子の伝達を阻害する前記方法。
【請求項２３】
前記伝達が相同組換え又は接合伝達により生じる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗微生物又は細胞傷害性化合物の治療指数の増加方法であって、２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関連するポリペプチドを阻害する物質と抗微生物又は細胞傷害性化合物を併用投与する段階を含む前記方法。
【請求項２５】
前記物質を抗微生物又は細胞傷害性化合物と合剤化する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物が抗生物質又は化学療法薬である請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが相同組換え、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換え、ＲｅｃＦＯＲによる相同組換え、非相同組換え、非相同末端結合、組換え依存性複製フォーク修復、及び／又はプライモソームリアセンブリに関連している請求項１、８、１２、１４、又は１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドがＲｅｃＢ、ＲｅｃＡ、ＰｒｉＡ、ＤＮＡ−ＰＫ、Ｋｕ７０、及びＫｕ８６から構成される群から選択される請求項１、８、１２、１４、又は１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗微生物化合物又は薬剤がフルオロキノロンである請求項１、３、８、又は１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記フルオロキノロンがシプロフロキサシン、レボフロキサシン、オフロキサシン、シノキサシン、ナリジクス酸、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、スパルフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、パズフロキサシン、エンロフロキサシン、エノキサシン、ペフロキサシン、バロフロキサシン、クリナフロキサシン、及びジフロキサシンから構成される群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞傷害性化合物がトポイソメラーゼ毒である請求項１、８、又は１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記候補物質が小分子、ペプチド又はそのミメティック、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体又はそのフラグメントから構成される群から選択される請求項１、８、１２、１４、又は１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記スクリーニングが全細胞を使用して実施される請求項１又は８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記活性がエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、χ切断、１本鎖ＤＮＡのＲｅｃＡコーティング、ヘリカーゼ、ＡＴＰアーゼ、ＤＮＡ結合、及びポリメラーゼ活性から構成される群から選択される請求項１又は８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
段階（ａ）の前記スクリーニングが微生物の突然変異体株を使用して実施される請求項１又は８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記突然変異体又は突然変異がｐａｒ及びｇｙｒ遺伝子とそのホモログ及びオーソログから構成される群から選択される遺伝子に突然変異を含む請求項１、３、８、１４、又は１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記微生物がシプロフロキサシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；レボフロキサシン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｖｉｒｉｄａｎｓ群、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；スルファメトキサゾール・トリメトプリム耐性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．Ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；アンピシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、及びＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；オキサシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びコアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ；ペニシリン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＶｉｒｉｄａｎｓ群；ピペラシリン・タゾバクタム耐性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；セフェピム耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；セフォタキシム耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；セフトリアキソン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；ゲンタマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；クラリスロマイシン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、及びＶｉｒｉｄａｎｓ群；エリスロマイシン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、及びＶｉｒｉｄａｎｓ群；テイコプラニン耐性Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ；バンコマイシン耐性Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ及びＥ．ｆａｅｃｉｕｍ；並びにイミペネム耐性Ａｃｉｎｏｂａｃｔｅｒ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから構成される群から選択される細菌である請求項８、１４、又は１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
抗微生物又は細胞傷害性化合物と、２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関連するポリペプチドの活性を阻害する物質を含むキット。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが相同組換え、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換え、ＲｅｃＦＯＲによる相同組換え、非相同組換え、非相同末端結合、組換え依存性複製フォーク修復、又はプライモソームリアセンブリに関連している請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記ポリペプチドがＲｅｃＢ、ＲｅｃＡ、ＰｒｉＡ、ＤＮＡ−ＰＫ、Ｋｕ７０、及びＫｕ８から構成される群から選択される請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
前記抗微生物化合物がフルオロキノロンである請求項３８に記載のキット。
【請求項４２】
前記細胞傷害性化合物がトポイソメラーゼ毒である請求項３８に記載のキット。
【請求項４３】
前記物質が小分子、ペプチド及びそのミメティック、抗体及びそのフラグメント、ポリペプチド、並びにポリヌクレオチドから構成される群から選択される請求項３８に記載のキット。
【請求項４４】
抗微生物又は細胞傷害性化合物に対する微生物又は細胞の感受性を増強する化合物の製造方法であって、
（ａ）化合物のライブラリーをスクリーニングし、２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関連するポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する段階と；
（ｂ）同定された化合物を誘導体化する段階と；
（ｃ）２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関連するポリペプチドの活性を阻害する能力について誘導体化した化合物を試験する段階と；
（ｄ）誘導体化した化合物を製造する段階を含むことにより、
抗微生物又は細胞傷害性化合物に対する微生物又は細胞の感受性を増強する化合物を製造する前記方法。
【請求項４５】
抗微生物又は細胞傷害性化合物と、２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関連するポリペプチドを阻害する物質を含有する組成物。
【請求項４６】
前記抗微生物化合物がフルオロキノロンである請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記細胞傷害性化合物がトポイソメラーゼ毒である請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
前記物質が小分子、ペプチド及びそのミメティック、抗体及びそのフラグメント、ポリペプチド、並びにポリヌクレオチドから構成される群から選択される請求項４５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、米国仮特許出願第６０／６６８，７３７号（出願日２００５年４月５日）の優先権を主張し、同仮出願の内容全体を参考資料として本明細書に組込む。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は薬剤耐性微生物及び細胞の処置に有用な組成物及び方法に関する。これらの組成物及び方法は抗微生物及び細胞傷害性物質に対する微生物及び細胞の感受性を増加するのにも有用であり、従って、薬剤感受性及び薬剤耐性の両者の感染症及び疾患（例えば腫瘍）の治療にも有用である。
【背景技術】
【０００３】
薬剤耐性は近代医療において拡大し続けている問題であり、細菌感染症、ウイルス感染症、原生動物感染症、真菌感染症、及び癌等の各種症状の治療を妨げている。例えば、抗生物質耐性の世界的出現はこれらの薬剤の発見に伴う人類の健康の劇的な進歩を白紙に戻す恐れがある。薬剤耐性細菌のクローン拡散と細菌間の耐性因子の水平伝達の結果、過去２０年間に薬剤耐性細菌の出現頻度は劇的に増加している。
【０００４】
抗生物質薬剤耐性が特に急性である結核は全人類の３分の１が感染しており、その大半は開発途上国民である。医療機関は新規抗生物質の創製に努めると共に既存抗生物質の使用を制限することによりこの問題に対抗している。しかし、耐性株の蔓延は拡大し続けるので、このアプローチでは所期効果が得られていない。
【０００５】
感染個体の潜在数、治療中に生じる耐性進化と共に抗生物質の使用が持続的に不適切になる可能性、及び耐性株の持続的伝染により、耐性の進化はバイオテロ攻撃の場合に特に問題になると予想される。更に警戒すべき事態は入手可能な全抗生物質に耐性となるように組換えられた炭疽菌やペスト菌株等の薬剤耐性致死性微生物の放出である。このような致死性株は作製可能であり、実際に既に存在すると考えられる。従って、これらの脅威に対する有効な防衛手段を開発することが絶対に不可欠である。
【０００６】
薬剤耐性はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等のウイルスや原生動物をはじめとする他の微生物でも問題である。実際に、ＨＩＶ薬剤耐性は急速に蔓延しつつある。１９９６年〜１９９９年のＨＩＶ感染患者のある調査によると、患者の約７８％が少なくとも１種類の薬剤に耐性のウイルスを保有し、５１％が２種類の薬剤に耐性のウイルスを保有し、１８％が３種類の薬剤に耐性のウイルスを保有していた。従って、ＨＩＶ薬剤治療は耐性進化に対応するように常に進化する必要がある。同様に、近年ではＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の薬剤耐性もマラリア防除で最大の問題の１つとなっている。アルテミシニンとその誘導体を除く全マラリア治療薬についてｉｎ  ｖｉｖｏ耐性が報告されている。薬剤耐性のこのような持続的増加により、次第に高価で副作用の強い薬剤の使用が必要になる。
【０００７】
薬剤耐性は癌治療中にも問題となる。全癌患者のほぼ半数が主に外科手術、放射線療法及び／又は化学療法を併用していると推定される。しかし、癌によっては化学療法でしか治療できないものもあり、その場合には、患者の５人に１人しか長期生存できない。この低い結果の最大の原因は薬剤耐性であると考えられ、腫瘍は入手可能な薬剤に本来耐性であるか、あるいは本来感受性であるが、治療中に耐性を生じて最終的に再増殖する（Ａｌｌｅｎ  ＪＤら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２，２２９４−２２９９（２００２））。
【非特許文献１】Ａｌｌｅｎ  ＪＤら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２，２２９４−２２９９（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
薬剤耐性微生物及び細胞に対して細胞増殖抑制性及び殺細胞性をもつ化合物と、微生物及び細胞を既存薬剤に対して感受性化する化合物と、薬剤耐性に至る突然変異プロセスを阻害する化合物と、耐性因子の水平伝達を防止する化合物と、薬剤耐性疾患及び症状を治療及び予防すると共に、薬剤感受性及び薬剤耐性感染症及び疾患の治療及び予防における前記化合物の効力を増強するために前記化合物を同定及び使用する方法が大いに必要とされていることは明白である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はＤＮＡ修復及び複製経路が微生物及び細胞の薬剤耐性及び薬剤感受性の出現と維持に基本的な役割を果たしていることを立証する。本発明は微生物及び細胞の薬剤耐性の処置と薬剤感受性の増加に有用な各種方法及び関連組成物を提供する。一般に、本発明の方法及び組成物はＤＮＡ修復、複製経路、又は組換えの阻害剤（「阻害剤」）の同定、阻害剤と抗微生物又は細胞傷害性化合物を含有する組成物、並びに微生物及び細胞の薬剤耐性を処置し、微生物及び細胞の薬剤感受性を増強し、微生物感染症及び癌を治療するための阻害剤の使用方法に関連する。本発明の阻害剤は一般に抗微生物又は細胞傷害性物質に対する微生物又は細胞の感受性を増強することができるか、あるいは薬剤耐性微生物又は細胞に対して細胞傷害性である。
【００１０】
本発明の阻害剤は任意微生物又は細胞（哺乳動物細胞を含む）のＤＮＡ修復、複製、又は組換え経路（又は前記経路に関連するポリペプチド）を標的とする。特定経路としては２本鎖ＤＮＡ切断修復及び複製フォーク停止レスキュー又は修復経路か挙げられる。２本鎖ＤＮＡ切断修復経路の例としてはＲｅｃＢＣＤによる相同組換えやＲｅｃＦＯＲによる相同組換え等の相同組換えと、非相同組換え又は末端結合が挙げられる。複製フォーク停止レスキュー及び修復経路の例としては組換え依存性フォーク修復、複製再開、及びプライモソームリアセンブリ、並びに相同又は非相同組換えが挙げられる。従って、特定ポリペプチドターゲットとしてはＤＮＡ修復又は複製経路に関連する任意ポリペプチドが挙げられ、例えばＲｅｃＡ、ＲｅｃＢ、ＰｒｉＡ、ＤＮＡ−ＰＫ、Ｋｕ７０、及びＫｕ８６が挙げられる。阻害剤はＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドの活性又は発現を阻害することが可能な任意型の分子とすることができ、小分子、ペプチド又はそのミメティック、ポリヌクレオチド（例えばアンチセンス及びＲＮＡｉ）、及びポリペプチド（例えば抗体）が挙げられる。阻害することができる特定活性としては、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ活性に加え、χ配列認識及びＲｅｃＡ機能（例えばＤＮＡ上のフィラメント形成やヘリカーゼ／ＡＴＰアーゼ活性）が挙げられる。
【００１１】
阻害剤の同定方法はＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドと結合するか又はその活性を阻害する能力に基づくことができる。一般に、阻害剤の同定方法は、（ａ）ＤＮＡ修復、複製、又は組換えに関連するポリペプチドと結合するか又はその活性を阻害する能力について１種以上の候補物質をスクリーニングする段階と；（ｂ）段階（ａ）で同定された候補物質が微生物もしくは細胞を抗微生物もしくは細胞傷害性化合物に対して感受性化するか又は薬剤耐性微生物もしくは細胞を死滅させる物質であると同定する段階を含む。方法は更に、（ｃ）段階（ｂ）で同定された物質の誘導体又はアナログを生成する段階と；（ｄ）前記誘導体又はアナログが抗微生物もしくは細胞傷害性化合物に対する微生物もしくは細胞の感受性を増強するか否か又は薬剤耐性微生物もしくは細胞を死滅させるか否かを判定する段階を含む。このような方法は例えば単離ポリペプチド、細胞抽出液、又は全細胞を使用して、各種結合又は活性アッセイの任意のものを使用して実施することができる。
【００１２】
抗微生物又は細胞傷害性化合物の活性の増強方法として、抗微生物又は細胞傷害性化合物を阻害剤と併用投与する段階を含む方法が提供される。阻害剤は抗微生物又は細胞傷害性物質の投与前、投与中、又は投与後に投与することができる。前記阻害剤及び物質は微生物感染症又は腫瘍患者に投与することができる。更に、本発明は微生物又は細胞の成長又は増殖の抑制方法として、阻害剤を微生物又は細胞に投与する段階を含む方法を含む。本発明の関連方法は微生物又は細胞を抗微生物又は細胞傷害性化合物に対して感受性化する方法として、前記微生物又は細胞を阻害剤と接触させる段階を含む方法を含む。
【００１３】
本発明は（ａ）微生物が抗微生物化合物に対する耐性に関連する遺伝子に突然変異を含むか否かを判定し；（ｂ）微生物が抗微生物化合物に対する耐性に関連する遺伝子に突然変異を含む場合には、阻害剤を患者に投与することにより、微生物に感染した患者の処置に診断又は治療用として使用することができる。所定側面では、突然変異遺伝子はｐａｒＣ又はｇｙｒＡ又はそのホモログとすることができる。
【００１４】
本発明は更に微生物による薬剤耐性獲得の抑制方法として、前記薬剤による治療中に微生物を阻害剤と接触させる段階を含み、阻害剤が例えば相同組換え又は接合伝達により耐性付与遺伝子の伝達を阻害する方法を含む。
【００１５】
本発明は更に本発明の方法を実施するのに適した組成物及びキットを含む。前記組成物及びキットは一般に抗微生物又は細胞傷害性化合物と阻害剤を含む。抗微生物又は細胞傷害性化合物と阻害剤は別々又は混合して（例えば錠剤として）製剤化することができる。更に、阻害剤を含有する本発明の組成物は例えば非経口及び経口投与等の任意公知投与経路に合わせて製剤化することができる。
【００１６】
本発明は更に阻害剤の製造方法として、（ａ）化合物のライブラリーをスクリーニングし、ＤＮＡ修復、複製又は組換えに関連するポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する段階と；（ｂ）同定された化合物を誘導体化する段階と；（ｃ）ＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドの活性を阻害する能力について誘導体化した化合物を試験する段階と；（ｄ）誘導体化した化合物を製造する段階を含む方法を含む。
【００１７】
阻害剤の別の用途は抗微生物又は細胞傷害性化合物を阻害剤と併用投与することにより、抗微生物又は細胞傷害性化合物の治療指数を増加するか又は全身毒性を低下させることである。
【００１８】
本発明の方法及び組成物は公知であるか又はまだ発見されていない任意抗微生物又は細胞傷害性物質又は化合物（即ち薬剤）に適用することができ、ＤＮＡ損傷を誘発するか又はＤＮＡ複製、修復もしくは組換えを抑制することにより作用するものが挙げられる。更に、本発明の方法及び組成物は耐性が既に出現している薬剤でも、耐性がまだ出現していない薬剤でも使用することができる。特定抗微生物及び細胞傷害性物質の例としてはフルオロキノロンとトポイソメラーゼ毒が挙げられる。
【００１９】
更に、本発明の方法及び組成物は任意種の微生物又は細胞に適用することができ、例えば細菌、真菌、及び哺乳動物細胞（例えば腫瘍細胞）を含む真核細胞が挙げられる。細菌はグラム陽性でもグラム陰性でもよく、特定細菌種としては限定されないが、シプロフロキサシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；レボフロキサシン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｖｉｒｉｄａｎｓ群、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；スルファメトキサゾール・トリメトプリム耐性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．Ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；アンピシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、及びＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；オキサシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びコアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ；ペニシリン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＶｉｒｉｄａｎｓ群；ピペラシリン・タゾバクタム耐性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；セフェピム耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；セフォタキシム耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；セフトリアキソン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；ゲンタマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；クラリスロマイシン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、及びＶｉｒｉｄａｎｓ群；エリスロマイシン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、及びＶｉｒｉｄａｎｓ群；テイコプラニン耐性Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ；バンコマイシン耐性Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ及びＥ．ｆａｅｃｉｕｍ；並びにイミペネム耐性Ａｃｉｎｏｂａｃｔｅｒ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は薬剤耐性微生物及び細胞が非致死濃度のフルオロキノロンの存在下で生存するためにはＤＮＡ修復又は複製経路が必要であり、例えば大腸菌蛋白ＲｅｃＡ、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）、又はＰｒｉＡ、又はそのホモログ等のＤＮＡ修復に関与するポリペプチドの活性を阻害すると、抗微生物又は細胞傷害性物質又は化合物の存在下で薬剤耐性細胞の増殖が低下及び／又は死滅が増加するという驚くべき発見を含む。更に、本発明の所定側面は、ＤＮＡ修復及び複製に関与するポリペプチドの活性を阻害すると、抗微生物及び細胞傷害性物質に対する薬剤耐性及び薬剤感受性の両者の細胞の感受性が増加するという関連発見に基づく。
【００２１】
これらの発見に鑑み、本発明は１種以上のＤＮＡ修復又は複製経路を阻害する化合物及び組成物と、前記組成物を同定し、例えば微生物感染症及び腫瘍の治療で使用する関連方法を提供する。本発明の化合物及び組成物は微生物又は他の細胞（哺乳動物細胞を含む）でＤＮＡ修復又は複製経路の１種以上のポリペプチド成分の活性又は発現を直接又は間接的に阻害する。ＤＮＡ修復又は複製経路を阻害することにより、本発明の化合物は抗微生物又は細胞傷害性物質に対して細胞及び微生物を感受性化する。更に、本発明の化合物はその生存にＤＮＡ修復又は複製経路を必要とする薬剤耐性微生物及び細胞を死滅させるか又はその増殖を低下させるのに有効である。
【００２２】
多数の抗微生物及び細胞傷害性物質はＤＮＡ複製もしくは修復を妨害するか、又はＤＮＡ損傷を誘発することにより直接又は間接的に機能する。抗微生物及び細胞傷害性物質により誘発される２種の主要形態のＤＮＡ損傷は（１）２本鎖ＤＮＡ切断と、（２）複製フォーク停止である。
【００２３】
例えば、フルオロキノロン（ＦＱ）（例えばシプロフロキサシン）は細菌ＩＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼ、即ちｇｙｒＡ及びｇｙｒＢによりコードされるＤＮＡジャイレースとｐａｒＣ及びｐａｒｅによりコードされるトポイソメラーゼＩＶを妨害することにより機能する（Ｄｒｌｉｃａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｚｈａｏ，Ｘ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６１：３７７−３９２（１９９７）。これらのトポイソメラーゼはいずれも蛋白架橋ＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）を形成し、ＤＮＡ鎖トポロジーを操作し、最後にＤＮＡの末端を再結合することにより機能する。シプロフロキサシンと他のＦＱは蛋白架橋ＤＳＢ中間体と可逆的に結合し、ＤＮＡ末端の再結合を抑制する。ＤＮＡ複製が共有結合ＤＮＡ−蛋白複合体（Ｋｈｏｄｕｒｓｋｙ，Ａ．Ｂ．ａｎｄ  Ｃｏｚｚａｒｅｌｌｉ，Ｎ．Ｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３：２７６６８−２７６７７（１９９８））により抑制され、自殺蛋白（Ｄｒｌｉｃａ  ａｎｄ  Ｈｏｏｐｅｒ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  Ａｃｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ，Ｄ．Ｃ．Ｈｏｏｐｅｒ  ａｎｄ  Ｅ．Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ編）の誘導により潜在的に抑制される場合には、トポイソメラーゼがＤＮＡ末端を再結合せずにＤＮＡから解離し、遊離ＤＳＢが形成される結果として細胞死を引き起こす（Ｄｒｌｉｃａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｚｈａｏ，Ｘ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６１：３７７−３９２（１９９７））。
【００２４】
更に、所定の他の抗微生物及び細胞傷害性物質（例えばトリメトプリム）は１本鎖と２本鎖の両者のＤＮＡ切断を伴う「チミン飢餓死」と呼ばれるプロセスでチミン生合成を妨害することによりＤＮＡ損傷を誘発する。チミン飢餓により損傷したＤＮＡは組換え修復を含むＤＮＡ修復プロセスの基質である。ｒｅｃＢＣ（Ｄ）組換え修復遺伝子の突然変異はチミン飢餓死に対する感受性を増加する（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：５９１−６２５（１９９８））。
【００２５】
更に、先天性免疫系により産生される一酸化窒素や酸素ラジカル等のＤＮＡ損傷剤の作用によりｉｎ  ｖｉｖｏ感染中に細菌ゲノムにＤＳＢが生じる（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍ．１４；３２３−３５０，１９９７）。一酸化窒素に暴露された大腸菌の生存には組換え修復が不可欠であることが示されており（Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：１３１−１３８，２００１）、ＲｅｃＢＣＤ経路はサルモネラのビルレンスに絶対に不可欠であることが示されている（Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：５９２−５９５，２００２）。従って、ＲｅｃＡ又はＲｅｃＢＣ阻害剤はフルオロキノロンばかりでなく、先天性免疫系により産生される一酸化窒素や酸素ラジカルの作用により病原生物にＤＳＢが生じる細菌感染症を治療するために使用される大半又は全ての抗生物質の活性を増加すると考えられる。
【００２６】
特定理論に結び付ける意図はないが、本発明は微生物及び細胞が抗微生物及び細胞傷害性物質により誘発されるＤＮＡ損傷（例えば２本鎖ＤＮＡ切断や複製フォーク停止）を修復するために各種ＤＮＡ修復経路を利用し、その結果、微生物又は細胞は抗微生物及び細胞傷害性物質の存在下で生存できることを立証する。従って、細胞をＤＮＡ修復又は複製経路の阻害剤で処置すると、抗微生物又は細胞傷害性物質（例えばＤＮＡ損傷を誘発するか又はＤＮＡ複製もしくは修復を妨害するもの）に対するその感受性が増強する。
【００２７】
従って、本発明の化合物及び方法は任意微生物又は細胞（例えば哺乳動物細胞）で任意ＤＮＡ修復又は複製経路を標的として使用することができる。微生物及び細胞は非組換え経路に加え、各種ＤＮＡ修復メカニズム及び経路（例えば相同及び非相同組換えによる経路）をもつ。これらのＤＮＡ修復経路はＤＮＡ複製等の正常細胞プロセス中と、抗微生物及び細胞傷害性化合物等のＤＮＡ損傷剤に応答して利用される。
【００２８】
２本鎖ＤＮＡ切断の修復は場合により、相同組換え（例えばＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換えやＲｅｃＦＯＲによる相同組換え）による２本鎖切断修復、非相同組換えによる２本鎖ＤＮＡ切断修復、及び非相同末端結合により実施される。更に、複製フォーク停止修復又はレスキューは場合により、組換え依存性複製フォーク修復やプライモソームリアセンブリにより実施される。ＤＮＡ合成中に、染色体上の複製フォーク進行はＤＮＡ傷害、ＤＮＡ二次構造、又はＤＮＡ結合蛋白により妨げられる可能性がある。複製フォークの進行の妨害により、再配置が誘導されるか及び／又は相同組換えが生存に必須になることが細菌からヒトに至る全生物で報告されている。
【００２９】
微生物及び細胞（哺乳動物細胞を含む）により利用されるＤＮＡ修復及び複製経路は当分野で詳細に定義されており、これらのプロセス及び経路に関与するポリペプチドの宿主は同定されている。本発明はこのようなポリペプチドの任意のものの活性及び／又は発現を低下させることにより、限定されないが、本明細書に具体的に記載する経路等の前記任意ＤＮＡ修復又は複製経路を阻害する化合物及び関連方法を想定する。
【００３０】
細菌（並びに他の微生物及び細胞）は数種のＤＮＡ修復経路を使用して低濃度ＤＳＢに応答する。細菌集団中の有意百分率の細胞の場合のように相同ＤＮＡが存在する場合には、細菌はＲｅｃＢＣ（Ｄ）又はＲｅｃＦＯＲによるＨＲ等の相同組換え（ＨＲ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１６，８１−９８）によりＤＳＢを修復することができる。
【００３１】
大腸菌では、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）がＨＲの一端を担っている。このヘテロ三量体蛋白複合体はＲｅｃＢ、ＲｅｃＣ、及びＲｅｃＤの会合により形成される。しかし、ＲｅｃＤは少なくとも数種のＨＲ（例えばシプロフロキサシンにより誘導されるもの）に不可欠であると思われるので、この複合体をＲｅｃＢＣ（Ｄ）と言う。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）ヌクレアーゼ／ヘリカーゼはＤＳＢに負荷すると同時にＲｅｃＡを新生３’−オーバーハングの１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に負荷しながら２本鎖を分解し、巻き戻す。こうして、ＲｅｃＡは相同配列へのｓｓＤＮＡの鎖侵入を助長するフィラメントを形成し、最終的に合成依存性鎖アニーリング、又はＤＳＢ修復様メカニズムにより無傷染色体を復元する（Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１７：３１８−２１（２００１））。
【００３２】
他の例では、ＲｅｃＦ、ＲｅｃＯ、及びＲｅｃＲから構成されるヘテロ三量体蛋白複合体であるＲｅｃＦＯＲがＨＲの一端を担っている。この経路では、ＲｅｃＦはＲｅｃＡをｓｓＤＮＡに負荷するのを助長し、ＲｅｃＯとＲｅｃＲは補助的役割を果たすと思われる。この経路はシプロフロキサシンに応答してＨＲを誘導する可能性は低いと思われ、一般にｓｂｃＡ、ｓｂｃＢ、及びｓｂｃＣにおける付加突然変異に関連しているが、ＵＶ感受性と「チミン飢餓死」の根底にある損傷のプロセシングに関与する経路である。
【００３３】
更に、細菌（並びに他の微生物及び細胞）はＤＮＡに結合した低濃度蛋白に応答することにより、ＨＲの変形である組換え依存性複製フォーク修復によりＤＮＡ複製を抑制する（ＭｃＧｌｙｎｎ，Ｐ．，Ｌｌｏｙｄ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｍａｒｉａｎｓ，Ｋ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．，９８：８２３５−８２４０（２００１））。例えば、シプロフロキサシン等のフルオロキノロンによるＩＩ型トポイソメラーゼの阻害の１例として、複製フォークはフルオロキノロン：トポイソメラーゼ：ＤＮＡ複合体に出会うと停止する。図１に示すように、これらのフォーク停止は組換え依存性複製フォーク修復により修復される。フォーク停止は恐らくＲｅｃＧ（Ｒｏｂｕ，Ｍ．Ｅ．，Ｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｃｏｘ，Ｍ．Ｍ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７９：１０９７３−１０９８１（２００４）及びＭｃＧｌｙｎｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ，Ｒ．Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ，１８：４１３−４１９（２００２））により復帰し、ホリデイジャンクション様構造を形成し、ＲｕｖＣ（Ｌｏｖｅｔｔ，Ｓ．Ｔ．，Ｈｕｒｌｅｙ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｕｔｅｒａ，Ｖ．Ａ．Ｊｒ，Ａｕｂｕｃｈｏｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｌｅｂｅｄｅｖａ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６０：８５１−９（２００２））により認識及び開裂され、２本鎖末端（ＤＳＥ）とニックの入った２本鎖デュプレクスを生じる。ＤＳＥをＲｅｃＢＣ（Ｄ）でプロセシングした後、ニックの入った２本鎖の相同領域に侵入するＲｅｃＡ−ｓｓＤＮＡフィラメントが形成される。こうして形成されたＤループ構造は新しい複製フォークの主要鎖合成となるものを開始することが可能なプライマーを結合した鋳型を含む。組換え依存性複製フォーク修復プロセスにおける重要な段階は複製再開、又はプライモソーム複合体により開始されるプライモソームリアセンブリである。プライモソームはＤｎａＧプライマーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＣ、及びＤｎａＴから構成される。
【００３４】
これらの修復ストラテジーはその多くがＲｅｃＢＣ（Ｄ）ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ複合体の機能に強く依存しており、ＤＮＡ損傷を誘発する低濃度の抗微生物及び細胞傷害性物質（例えばシプロフロキサシン）の存在下で細菌生存を可能にすると考えられている。高濃度に対する耐性には染色体遺伝子における複数の段階的突然変異が必要である（Ｄｒｌｉｃａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｚｈａｏ，Ｘ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６１：３７７−３９２（１９９７）；Ｇｉｂｒｅｅｌ，Ａ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：３２７６−３２７８（１９９８）；Ｋａａｔｚ，Ｇ．Ｗ．，Ｓｅｏ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｒｕｂｌｅ，Ｃ．Ａ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７：１０８６−１０９４（１９９３）；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６９４２−６９４９（１９９０）；Ｐｏｏｌｅ，Ｋ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：２２３３−２２４１（２０００）；Ｋｅｒｎ，Ｗ．Ｖ．，Ｏｅｔｈｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｊｅｌｌｅｎ−Ｒｉｔｔｅｒ，Ａ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｌｅｖｙ，Ｓ．Ｂ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：８１４−８２０（２０００）；及びＦｕｋｕｄａ，Ｈ．，Ｈｏｒｉ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：１９１７−１９２２（１９９８））。確かに、ほぼ全細菌シプロフロキサシン耐性は染色体遺伝子における突然変異に起因する（Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｉｎ，Ｙ．Ｆ．，Ｒｉｃｃｉ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｐｉｄｄｏｃｋ，Ｌ．Ｊ．Ｖ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０：２３８０−２３８６（１９９６）；Ｄｅｇｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１：１６０９−１６１１（１９９７）；Ｋａｎｅｍａｔｓｕ，Ｅ．，Ｄｅｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｙａｓｕｄａ，Ｍ．，Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｎｏ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｋａｗａｄａ，Ｙ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：４３３−４３５（１９９８）；及びＷａｎｇ，Ｔ．，Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓａｔｏ，Ｋ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２３６−２４０（１９９８））。他の合成及び半合成抗生物質（例えばリファンピシン）でも同様である。試験された多数の耐性例のうちで、プラスミド導入による臨床ＦＱ耐性は一度だけ報告されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．Ｌ．，Ａｌｏｎｓｏ，Ａ．，Ｇｏｍｅｚ−Ｇｏｍｅｚ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂａｑｕｅｒｏ，Ｆ．，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，ｐ．４２（１９９８））。しかし、プラスミドだけでは低レベルのシプロフロキサシン耐性しか生じず、高い臨床関連耐性を達成するためにはやはり染色体突然変異が必要であった。
【００３５】
シプロフロキサシン（及び他のＦＱ）耐性を付与する突然変異の多くの位置と性質が決定されており、「キノロン耐性決定領域」（ＱＲＤＲ）に存在する。耐性を付与する主要な突然変異はシプロフロキサシンの２個の分子ターゲットをコードする２個の遺伝子に存在し、例えばＤＮＡジャイレースのαサブユニットをコードするｇｙｒＡ遺伝子（一般に、大腸菌、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、肺炎桿菌、及びＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ等のグラム陰性菌における主要ターゲット）又はトポイソメラーゼＩＶのサブユニットをコードするｐａｒＣ遺伝子（一般に、黄色ブドウ球菌、肺炎球菌、及び腸球菌等のグラム陽性菌における主要ターゲット）が挙げられる。しかし、最高耐性は両方の遺伝子における突然変異と、外膜透過性又は活性排出システムによる排出に作用する遺伝子における突然変異の組み合わせにより付与される（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｔ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１：２５４０−２５４３（１９９７））。
【００３６】
ｇｙｒＡ及び／又はｐａｒＣ遺伝子のＱＲＤＲはトポイソメラーゼのＤＮＡ結合部位に対応するので、シプロフロキサシン結合の阻止に加え、突然変異はＤＮＡ結合も妨害する。特定理論に結び付ける意図はないが、本発明によると、これらの突然変異は更に開裂したＤＮＡ鎖を再結合する前にトポイソメラーゼをＤＮＡから早期解離させる可能性があると考えられる。従って、これらの突然変異はＨＲにより修復しなければならないＤＳＢを形成することによりこれらの突然変異をもつ細胞にハンディを与え、生存可能にするためにこれらの遺伝子をＲｅｃＢＣ（Ｄ）依存性にすると思われる。これはジャイレース活性低下により非許容温度での低濃度キノロン処理に類似するｇｙｒＡの温度感受性対立遺伝子が非許容温度で生存可能にするためにＲｅｃＡとＲｅｃＢＣ（Ｄ）に強く依存することを立証しているＧａｒｉらのデータに一致する（Ｇａｒｉ，Ｅ．，Ｂｏｓｓｉ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｆｉｇｕｅｒｏａ−Ｂｏｓｓｉ  Ｎ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５９：１４０５−１４１４（２００１））。
【００３７】
重要な点として、ＦＱ選択に応答して高頻度で突然変異されるｇｙｒＡ（即ちＳ８３及びＤ８７）及びｐａｒＣ（即ちＳ８０）の特定残基はグラム陰性菌とグラム陽性菌の両者で類似している。従って、大腸菌について本明細書に記載する知見は他の細菌種にも一般化できる。
【００３８】
従って、上記に概説したように、本発明の各種側面は抗生物質耐性に関連する突然変異（例えばｇｙｒＡ及びｐａｒＣ突然変異）をもつ大腸菌が生存のために２本鎖ＤＮＡ切断修復及び複製フォーク停止修復経路（例えばＲｅｃＢＣ（Ｄ）によるＨＲに基づくＤＮＡ修復）を利用するという発見を１つの基礎とする。単一の分子解釈に結び付けるものではないが、これらの突然変異は抗生物質耐性を付与する一方でそれによりコードされる酵素がその正常機能を行う能力を低下させると考えられる。従って、本発明はジャイレース及びトポイソメラーゼＩＶ活性（例えば薬剤耐性に関連する活性）の低下した微生物及び細胞が生存するためにはＨＲに基づくＤＮＡ修復及び複製再開経路が重要であることを立証する。更に、本発明の所定側面はフルオロキノロン濃度が低くても（即ちＭＩＣ又はＭＢＣ以下）細菌が生存するためにはＲｅｃＢＣ（Ｄ）によるＨＲと複製再開（例えばプライモソームリアセンブリ）が重要であるという関連発見に基づき、２本鎖ＤＮＡ切断修復（例えばＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換え）、又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復（例えば組換え依存性複製フォーク修復及びプライモソームリアセンブリ）の阻害が細菌を所定抗微生物剤に対して高感受性にすることを立証する。
【００３９】
実施例のセクションに詳細に記載するように、本発明の根底にある基本的発見はまずモデル生物大腸菌を使用してジャイレース、相同組換え酵素、及びシプロフロキサシンの相互依存性を調査することにより行われた。例えば、実施例４に詳述するように、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）の温度感受性突然変異体を含む株を使用し、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）活性が低下すると、薬剤耐性細胞は薬剤に対する感受性が増すことを実証した。更に、ｒｅｃＡ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＧ又はｐｒｉＡ、ｒｕｖＡ、ｒｕｖＢもしくはｒｕｖＣに突然変異体を含む大腸菌株もフルオロキノロンに対して感受性を増した（実施例１及び２）。
【００４０】
当然のことながら、大腸菌におけるこれらの知見はこの細菌種に限定されない。例えば緑膿菌、サルモネラ菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ又は炭疽菌等の他の各種細菌種はｒｅｃＢＣ（Ｄ）ホモログを含む。従って、ＤＮＡ修復又は複製経路（例えばＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換え又は複製再開）の阻害剤をシプロフロキサシンもしくは他のＦＱ、又は他のＤＮＡ損傷剤と併用して処置すると、このようなＤＮＡ損傷剤に耐性となるように進化しているか又はそのように組換えられているかに関係なく、これらの株も死滅すると思われる。更に、ＤＮＡ修復又は複製の阻害剤はこれらの種も抗微生物剤に対して感受性化すると思われる。
【００４１】
更に、これらの発見は細菌で最初に行われたが、哺乳動物を含む他の細胞や生物にも明白に適用可能である。ＤＮＡ修復及び複製経路の基本メカニズムと所定成分は一般に細菌から真核細胞まで保存されている。更に、薬剤作用メカニズムと薬剤耐性獲得及び維持メカニズムも細菌から真核細胞まで共通している。従って、薬剤耐性微生物に対抗し、薬剤感受性を増強するメカニズムを本明細書では細菌について例示するが、広範な微生物及び哺乳動物細胞を含む真核細胞に適用可能である。
【００４２】
他方、別の側面では、真核生物と細菌又は他の病原体の間の活性及び物性の相違を使用して細菌又は他の感染物質に特異的又は優先的な阻害剤を開発することができる。これは患者（例えばヒト又は他の哺乳動物患者）で例えば細菌、ウイルス又は他の病原体に起因する疾患を治療するために投与される阻害剤に関して有益である。病原体修復及び複製経路で患者細胞と異なる活性を示す阻害剤は患者修復及び複製経路に対して同様の活性を示す阻害剤よりも副作用（例えば望ましくない患者細胞傷害性）が少ないと思われる。従って、一般に、ターゲット病原生物に対する活性が患者細胞に対する活性と異なるものについて阻害剤をスクリーニングすることができる。ターゲット病原生物に対する活性が患者細胞に対する活性と異なる阻害剤、例えば患者細胞に対する活性よりも高い阻害剤が好ましい阻害剤である。
【００４３】
薬剤耐性に関連する突然変異の存在下あるいはＤＮＡ複製もしくは修復を妨害するか又はＤＮＡ損傷を誘発する薬剤の存在下で細胞生存の維持におけるＤＮＡ修復及び複製経路の基礎的役割が本発明により発見されたが、多数の細胞種（例えば細菌、真菌及び哺乳動物細胞）におけるこれらの経路とその成分に関する知識とこの発見を総合すると、多様な薬剤耐性微生物及び細胞を処置すると共に各種微生物及び細胞（哺乳動物細胞を含む）の薬剤感受性を増強するために本発明の化合物及び方法を適用するための確実な科学的基礎が得られる。
【００４４】
実際に、トポイソメラーゼの活性低下は原核生物に加え、真核生物でもＨＲ依存性の増加につながることが示されている。ＨＲはモデル生物Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅで広く研究されている。ＤＳＢの場合には、（Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０及びＸｒｓ２から構成される）ＭＲＸ複合体はまずＴｅｌ１チェックポイントキナーゼと結合した後にＸｒｓ２とＴｅｌ１の相互作用によりこれを動員する。ＭＲＸ複合体は電離放射線に応答して発生するもの等の「汚染」ＤＳＥをプロセシングし、エンドヌクレアーゼ活性に起因するものをプロセシングしないことが必要である。その後、ＭＲＸ複合体は解離し、未知ヌクレアーゼにより５’−３’切除が開始し、Ｓ期の間にＲａｄ５２により置換されるまで３’−オーバーハングの完全性を維持するように機能する複製蛋白Ａ（ＲＰＡ）で覆われた３’−オーバーハングを生じる。Ｒａｄ５２は１本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、遺伝子変換（ＧＣ）、及び切断により誘導される組換え（ＢＩＲ）において中心的な役割を果たす。露出したｓｓＤＮＡオーバーハングが十分な相同性を含む場合には、Ｒａｄ５２は恐らくそのホモログＲａｄ５９と共にＳＳＡによる修復を助長する。ＧＣとＢＩＲについては、Ｒａｄ５２は細菌組換えメディエーターＲｅｃＡのホモログであるＲａｄ５１をＤＳＥに動員し、相同２本鎖の鎖侵入と同時に同一極性の鎖置換を触媒する（置換構造又はＤループと呼ぶ中間体を形成する）。侵入鎖は相同配列を使用してＤＮＡ合成を開始し、最終的に切断部位に無傷の配列を形成するか又は進行性複製フォークを復元する。Ｒａｄ５４、Ｒａｄ５５、及びＲａｄ５７の活性は必要ない場合もあるが、恐らくＲａｄ５２−ｓｓＤＮＡ核蛋白フィラメントの安定化を助長することにより、最も効率的な形態のＨＲを媒介すると思われる。ヘリカーゼＳｒｓ２及びＳｇｓ１は適切な組換え中間体の形成を助長するか、及び／又は組換え依存性ＤＮＡ複製後にこれらの中間体の分解を助長すると考えられる。
【００４５】
哺乳動物細胞では、ＨＲは複製フォーク阻止又は停止修復の重要なメカニズムであり、２本鎖ＤＮＡ切断の修復に重要な役割を果たすと考えられる。従って、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５５、ＢＲＡＣＡ１、及びＢＲＡＣＡ２等の蛋白の阻害剤はＤＮＡ損傷剤であるトポイソメラーゼ毒や、複製フォーク阻止をもたらす他の物質と相乗作用すると予想される。例えばＲＮＡｉに基づくメカニズムによるこれらの蛋白の産生阻害も同様の効果があると思われる。
【００４６】
当然のことながら、全てのＤＮＡ修復経路がＨＲにより媒介されるわけではない。本発明の付加側面は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は非相同組換え（ＮＨＲ）が哺乳動物におけるＤＳＢ修復の主要メカニズムであるという認識に基づく。ＮＨＥＪは一般にＤＳＢに対してマイクロホモロジー（約２〜２０塩基）をもつ領域のマイクロホモロジー検索を実施し、ＮＨＲ反応で傷害を修復することによりＤＳＢを修復する。この経路の主要成分はＤＮＡ蛋白キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）、Ｋｕ７０及びＫｕ８６蛋白、並びにＸＲＣＣ４蛋白である。Ｋｕ蛋白はＤＮＡの２本鎖末端と高親和性で結合してＤＮＡ−ＰＫを動員するヘテロ二量体ヘリカーゼを形成する。その後、ＫｕはＤＮＡを巻き戻し、ホモロジー依存性又はホモロジー非依存性経路により修復を促進する（Ｒａｔｈｍｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃｈｕ，ＤＮＡ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｒｅａｋ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６又はＮｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｈｏｅｋｓｔｒａ，Ｍ．Ｆ．ｉｎ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９８）。ＸＲＣＣ４、Ｋｕ８６又はＤＮＡ−ＰＫを欠失する細胞は電離放射線に高感受性である。
【００４７】
これは哺乳動物におけるＤＳＢ修復の主要経路であるので、この経路の蛋白阻害剤がＤＳＢを誘発するＤＮＡ損傷剤に対して細胞を高感受性化すると予想される。特定理論に限定するものではないが、Ｋｕ蛋白（Ｋｕ７０及びＫｕ８６）、ＤＮＡ−ＰＫ又はＸＲＣＣ４の阻害剤は哺乳動物細胞をＤＮＡ損傷剤に対して感受性化すると考えられるので、治療感受性を増強するため又は耐性細胞を死滅させるために、ＤＮＡ損傷を生じる治療レジーム（例えば化学療法薬や電離放射線による治療）と併用することができる。
【００４８】
更に、トポイソメラーゼ毒に応答して突然変異を蓄積しているトポイソメラーゼはこのような突然変異体トポイソメラーゼをもつ細胞でＤＳＢと複製フォーク停止レベルの増加によりＤＳＢと複製フォーク停止を修復するメカニズムへの依存性が増加しているという認識を真核生物に一般化することができる。この点については、このような効果は大きいと予想されるため、そのトポイソメラーゼに体細胞選択突然変異をもつ真核細胞は該当修復経路を阻害する薬剤に対して感受性である。
【００４９】
薬剤感受性及び耐性におけるＤＮＡ修復及び複製経路の役割に関する基礎的発見に鑑み、本発明は限定されないが、２本鎖ＤＮＡ切断修復及び複製フォーク停止レスキュー又は修復に関するもの等のＤＮＡ修復及び複製経路を阻害するための組成物及び方法と、前記阻害剤の新規使用法を提供する。本発明の組成物は多様なＤＮＡ修復又は複製阻害剤を含み、例えば本明細書に記載する任意ＤＮＡ複製又は修復経路又はメカニズムの阻害剤が挙げられ、その全てがＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドの１種以上の活性を阻害するために使用することができる。更に、これらの組成物は薬剤耐性微生物及び細胞をを駆除するため、並びに抗微生物及び細胞傷害性物質（例えば抗生物質及び化学療法薬）に対する感受性及び耐性細胞の感受性を増強するために使用することができる。
【００５０】
本発明の組成物及び方法は多様な薬剤耐性微生物及び細胞（例えば細菌、ウイルス、真菌、原生動物及び高等生物（例えば哺乳動物）の真核細胞）に適用可能である。更に、本発明は限定されないが、ＤＮＡ複製もしくは修復経路の細胞成分を標的とするか又はＤＮＡ損傷を誘発するもの等の多様な抗微生物及び細胞傷害性物質又は化合物に直接又は間接的に適用可能である。
【００５１】
以下の定義は本発明の記載に使用する用語をより明確に定義することを目的とする。本明細書で使用する以下の用語は以下のように定義される。
【００５２】
「ＤＮＡ修復又は複製」とは任意生物又は細胞（例えば微生物及び哺乳動物細胞）でＤＮＡ修復又は複製に関与する全生体プロセス及び経路を意味する。このようなプロセス及び経路としては限定されないが、相同組換えによるＤＮＡ修復、組換え依存性ＤＮＡ複製、ＤＮＡ２本鎖切断修復、複製フォーク停止の修復又は回復、複製再開、プライモソームリアセンブリ、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換え、ＲｅｃＦＯＲによる相同組換え、非相同組換え、非相同末端結合、１本鎖アニーリング、遺伝子変換、及び切断により誘導される組換えが挙げられ、これらの用語は当分野で一般に理解され、本明細書に記載する通りである。
【００５３】
「２本鎖ＤＮＡ切断修復」は２本鎖ＤＮＡ切断修復に関与する全生体経路又はプロセスを含み、限定されないが、相同組換えによる経路（例えばＲｅｃＢＣ（Ｄ）によるＨＲ及びＲｅｃＦＯＲによるＨＲ）、非相同組換え経路（例えば非正統的組換え（ＩＲ））、及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が挙げられる。
【００５４】
「複製フォーク停止レスキュー又は修復」とは複製フォーク停止、阻止又は崩壊の修復に関与する全生体経路又はプロセスを意味し、限定されないが、複製再開、組換え依存性複製フォーク修復、及びプライモソームリアセンブリが挙げられる。
【００５５】
「相同組換え」は高い配列類似度をもつＤＮＡ配列間の相互又は非相互組換えである。相同組換えは全細胞種で各種機能に重要である。相同組換えは必ずしも限定されないが、ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ２本鎖切断、及びＤＮＡポリメラーゼ複製フォーク停止又は崩壊の修復に重要である。細菌では、相同組換えは抱合の一部でもあり、バクテリオファージ複製に必要である。高等生物では、対立遺伝子の再配置の原因となる減数分裂期クロスオーバーに重要であると共に、適正な染色体分配に必要である。酵母では交配型スイッチング、所定の哺乳動物抗体遺伝子レパートリーではダイバーシティの生成、マラリア等の多くの生物にはエピトープクラススイッチングに重要である。
【００５６】
「相同組換えによるＤＮＡ修復」とは相同組換えを伴う任意ＤＮＡ修復経路を意味し、例えば組換え依存性ＤＮＡ複製、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換え、及びＲｅｃＦＯＲによる相同組換えが挙げられる。
【００５７】
「組換え依存性ＤＮＡ複製」とはＤＮＡ組換え及び複製の両者を伴うＤＮＡ修復経路を意味する。一般に、これはポリメラーゼ基質がホリデイジャンクションや置換ループ（Ｄループ）等の組換え中間体であるＤＮＡ複製を伴う。ＤループはＤＮＡ複製のプライマーとして機能するＤＮＡ鎖が十分な配列相同性をもつ２本鎖ＤＮＡ領域に鎖侵入する結果として得られる組換え中間体である。従って、ＤＳＢ修復では、ＤＮＡの新たに生成された３’末端はＤＳＢの領域で配列情報を回復することができる。このプロセスは一般に大腸菌では（必ずしもそれのみではないが）ＲｅｃＢＣ（Ｄ）と組換えメディエーターＲｅｃＡ（大腸菌以外の細菌ではそのホモログ）により媒介され、真核生物ではＭｒｅ１１、Ｒａｄ５０、Ｘｒｓ２と組換えメディエーター蛋白Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ５５、Ｒａｄ５７、Ｒａｄ５９、Ｓｒｓ２、及びＳｇｓ１により媒介される。
【００５８】
「組換え依存性複製フォーク修復」とは複製フォーク停止、阻止又は崩壊を修復又は再開するためのメカニズムで相同組換えを伴うものを意味する。
【００５９】
「複製再開」、又はプライモソーム複合体により開始されるプライモソームリアセンブリは組換え依存性複製フォーク修復プロセスにおける重要な段階である。プライモソームはＤＮＡＧプライマーゼ、ＤＮＡＢヘリカーゼ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＣ、及びＤｎａＴから構成される。
【００６０】
「非相同末端結合」はマイクロホモロジー（約２〜約２０塩基対）の要件で別のＤＳＢと結合することによりＤＳＢを修復するプロセスである。哺乳動物非相同末端結合に関与するポリペプチドとしては例えばＤＡＮ−ＰＫ、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、及びＸＲＣＣ４が挙げられる。
【００６１】
「非相同組換え」とは非相互組換えイベント、例えばＮＨＥＪが２個のＤＳＢと結合する場合を意味する。
【００６２】
本明細書で使用する「微生物」とは顕微鏡又は顕微鏡以下の寸法の任意生物を意味し、例えば細菌、真菌、ウイルス、及び原生動物と、他の小生物（例えば所定の真菌及び線虫）か挙げられる。
【００６３】
Ａ．阻害剤
本発明は上記経路等のＤＮＡ修復及び複製経路が限定されないが、抗生物質や化学療法薬等の抗微生物及び細胞傷害性物質又は化合物に対する細胞応答に関与していることを立証する。更に、本発明はＤＮＡ修復及び複製経路が薬剤耐性と薬剤感受性の両者に基礎的役割を果たしており、ＤＮＡ修復又は複製経路の阻害により薬剤感受性を増強すると共に薬剤耐性微生物及び細胞を死滅させることができることを立証する。更に、ＤＮＡ修復及び複製経路は薬剤耐性に関連する突然変異誘発に関与している。従って、本発明はＤＮＡ修復又は複製経路の阻害の結果として薬剤感受性が増強し、薬剤耐性細胞が死滅し、突然変異誘発とそれに伴う薬剤耐性の出現が抑制されることを立証する。
【００６４】
より一般には、ＤＮＡ修復及び複製経路のモジュレーターは（阻害剤であるかアクチベーターであるかに拘わらず）薬剤感受性を増強又は抑制し、薬剤耐性細胞の死滅又は保護を強化し、及び／又は突然変異誘発とそれに伴う薬剤耐性の出現を抑制又は強化する。便宜上、以下の記載は阻害剤を対象とするが、当然のことながら、モジュレーター一般についても同様のことが当てはまる。
【００６５】
従って、本発明の組成物及び方法はＤＮＡ修復もしくは複製経路、又は前記経路に関連するポリペプチドの全阻害剤に関する。従って、本発明の特定側面では、阻害剤は２本鎖ＤＮＡ切断の修復に関連する経路を標的とするか、又は阻害剤は複製フォーク停止の修復に関連する経路を標的とする。
【００６６】
特定態様では、本発明の阻害剤は２本鎖ＤＮＡ切断修復に関連する修復又は複製経路を標的とする。２本鎖ＤＮＡ切断修復に関連する所定のより特定的な態様では、阻害剤は相同組換え、非相同組換え又は非相同末端結合を標的とする。相同組換えの特定態様としては限定されないが、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換え及びＲｅｃＦＯＲによる相同組換えが挙げられる。
【００６７】
他の態様では、本発明の阻害剤は複製フォーク停止レスキュー又は修復に関連する修復又は複製経路を標的とする。複製フォーク停止レスキュー又は修復の特定態様としては限定されないが、組換え依存性複製フォーク修復及び複製再開（又はプライモソームリアセンブリ）が挙げられる。
【００６８】
所定態様では、阻害剤は相同組換えを伴うＤＮＡ複製又は修復経路に関連するポリペプチドを標的とする。他方、他の態様では、阻害剤は相同組換えを伴わないＤＮＡ修復又は複製経路に関連するポリペプチドを標的とする。相同組換え又は非相同組換えに関連する１種以上のポリペプチドの活性を低下させる本発明の阻害剤は「リコンビニサイド（ｒｅｃｏｍｂｉｎｉｃｉｄｅｓ：組換え抑制剤）」と言うことができる。特定態様では、本発明はＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換え、ＲｅｃＦＯＲによる組換え、相同組換えによるＤＮＡ修復、組換え依存性複製フォーク修復、複製再開又はプライモソームリアセンブリ、遺伝子変換、１本鎖アニーリング、切断により誘導される組換え、及び／又は非相同末端結合、並びにこれらの経路のいずれかに関連するポリペプチドの阻害剤に関する。本明細書で使用するＤＮＡ修復又は複製なる用語は限定されないが、これらの生体経路の全てを含む。
【００６９】
一般に、阻害剤はＤＮＡ修復又は複製経路に関連する１種以上のポリペプチドの活性又は発現を低下させることにより作用する。各種態様では、阻害剤はポリペプチドの１種以上の活性を阻害剤の不在下の活性に比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％低下させる。特定態様では、阻害剤はポリペプチドの発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％低下させる。所定態様では、阻害剤は標的ポリペプチド又は標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合する。
【００７０】
阻害剤は例えばＤＮＡ修復又は複製に必要なポリペプチドの活性又は発現を低下させることにより直接作用することもできるし、例えばＤＮＡ修復又は複製を阻止するポリペプチドの活性又は発現を増加することにより間接的に作用することもできる。
【００７１】
所定態様では、本発明はＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換え又は他の生物及び細胞における類似生体経路の阻害剤に関する。従って、特定態様では、阻害剤はＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換えに関連するポリペプチド（例えばＲｅｃＢ、ＲｅｃＡ、ＰｒｉＡ、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ＲｅｃＧ、ＲｅｃＣ、ＲｅｃＤ、ＲｅｃＦ、ＵｖｒＤ、もしくはＲｅｐヘリカーゼ、又はその変異体、ホモログ、もしくはオーソログ）の１種以上の生化学、酵素又は生物活性を低下させる。
【００７２】
１態様では、阻害剤はＲｅｃＢＣ（Ｄ）の１種以上の活性を低下させる。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）は２本鎖切断に起因するＤＮＡ末端をプロセシングする多機能酵素複合体である。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）は３種のポリペプチドサブユニットＲｅｃＢ、ＲｅｃＣ及びＲｅｃＤのヘテロ三量体複合体である。この複合体は相同組換えに関与するヌクレアーゼ及びヘリカーゼ活性の両者を含む。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）はヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、及びＡＴＰアーゼ活性の３種の異なる活性をもつ。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）は２本鎖をその成分鎖に分離すると同時に組換えホットスポット（χ部位）に出会うまで消化する両極性ヘリカーゼとして作用する。その後、ヌクレアーゼ活性は低下し、ＲｅｃＡはＤＮＡの３’テールに負荷される。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）の酵素活性における各サブユニットの役割を検討する試験によると、ヌクレアーゼ活性にはＲｅｃＤが必要であることが判明した。ヌクレアーゼ活性の活性部位はＲｅｃＢドメインにあることが知られているが、ＲｅｃＤから分離されると不活性になる。ＲｅｃＢＣはヘリカーゼ活性と同時にＡＴＰアーゼ活性をもつ。従って、各種態様では、阻害剤はＲｅｃＢＣ（Ｄ）のヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、又はＡＴＰアーゼ活性の１種以上を低下させる。
【００７３】
関連態様では、阻害剤はＲｅｃＢ、ＲｅｃＣ、又はＲｅｃＤの任意の１種以上の活性を低下させる。夫々ＲｅｃＢ又はＲｅｃＤのヘリカーゼ又はクレアーゼ活性を選択的にノックアウトする点突然変異が同定された。ヌクレアーゼ活性の活性部位はＲｅｃＢドメイン内にあることが示されているが、ＲｅｃＤから分離されると不活性になると考えられる。ピリドキサルリン酸はＲｅｃＢＣ（Ｄ）のＤＮＡ結合部位を標的とすることが示されており、バクテリオファージλによりコードされるγ蛋白は明らかにＲｅｃＤとの相互作用によりＲｅｃＢＣのヌクレアーゼ活性を阻害することが分かった。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）のヘリカーゼ活性はＲｅｃＢ（ＲｅｃＢ  Ｋ２９Ｑ）又はＲｅｃＤ（ＲｅｃＤ  Ｋ１７７Ｑ）の突然変異により低下する（Ｄｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ８９３−８９７（２００３）及びＴａｙｌｏｒ  Ａ．Ｆ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  ８８９−８９３（２００３））。従って、特定態様では、阻害剤はアミノ酸残基Ｋ２９を含むＲｅｃＢの領域又はアミノ酸残基Ｋ１７７を含むＲｅｃＤの領域と結合するか又は結合を妨害する。特定態様では、阻害剤はＲｅｃＢヘリカーゼ活性を低下させる。
【００７４】
ＤＮＡと結合したＲｅｃＢＣ（Ｄ）の結晶構造が最近決定され、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）内の機能領域及び部位が同定された（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｍ．Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１５７−８（２００４））。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）はＤＮＡ２本鎖をその成分鎖に分割し、組換えホットスポット（χ部位）に出会うまで消化する両極性ヘリカーゼである。その後、ヌクレアーゼ活性は低下し、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）はＤＮＡの３’テールにＲｅｃＡを負荷する。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）がＤＮＡ基質に結合すると、ＤＮＡ２本鎖はＲｅｃＣサブユニットを通って分割され、各々異なるヘリカーゼモーターサブユニットを向いた別々の鎖をもつフォークを形成する。鎖は複合体内のトンネルを通り、いずれもＲｅｃＢのヌクレアーゼドメインに隣接して突出する。３’テールがこれらのトンネルの１個を通ると、２本鎖ＤＮＡではＲｅｃＣによるχ配列の認識メカニズムが得られる。このトンネルの通過はヌクレアーゼ活性がどのように制御されるかを示唆している。所定態様では、阻害剤はＲｅｃＢＣ（Ｄ）の機能領域又はその近傍に結合することにより、機能活性を阻害する。機能領域の例としては、例えばχ切断部位、複合体内のトンネル、及びｒｅｃＢのヌクレアーゼドメインが挙げられる。例えば、所定態様では、阻害剤は標的機能領域と結合するように構造的に配置される。機能領域の結晶構造が入手可能であるならば、所定態様では、阻害剤のコグネイト結合領域の構造的配置を推測することができる。特定態様では、阻害剤はＲｅｃＢのエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ活性のいずれかの活性を低下させる。
【００７５】
別の態様では、阻害剤はＲｅｃＡの１種以上の活性を低下させる。ＲｅｃＡ蛋白はｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡの相補領域の対合を触媒したので、相同組換えプロセスにおける必須酵素である。ＲｅｃＡモノマーはまず重合してｓｓＤＮＡの周囲に螺旋状フィラメントを形成する。このプロセスの間にＲｅｃＡはｓｓＤＮＡを軸方向塩基対当たり１．６オングストローム延長する。その後、２本鎖ＤＮＡがポリマーに結合する。結合したｄｓＤＮＡは部分的に巻き戻され、ｓｓＤＮＡと２本鎖ＤＮＡの塩基対合を助長する。ｓｓＤＮＡがｄｓＤＮＡのある領域とハイブリダイズすると、２本鎖ＤＮＡは更に巻き戻され、交叉点移動が可能になる。ＲｅｃＡはＡＴＰの結合部位をもち、ＤＮＡ鎖をＲｅｃＡフィラメントから遊離するためにはその加水分解が必要である。ＲｅｃＡによる交叉点移動にもＡＴＰ結合が必要であるが、このプロセスではＡＴＰの非加水分解性アナログをＡＴＰに置換することができるため、ヌクレオチド結合だけで交叉点移動を促進するＲｅｃＡフィラメントの構造変化が得られると考えられる。従って、１態様では、阻害剤はＡＴＰと結合するか、ＡＴＰとＲｅｃＡ  ＡＴＰ結合部位の結合を阻害するか、ＲｅｃＡと１本鎖ＤＮＡの結合を阻害する。従って、阻害剤はＲｅｃＡのＡＴＰアーゼ又はＤＮＡ結合活性を低下させることができる。
【００７６】
他の態様では、阻害剤はＲｕｖＣ、ＲｕｖＡＢ又はそのサブユニットの１種以上の活性を低下させる。これらの蛋白はヘリカーゼ及び交叉点移動機能の両者をコードする。野生型ＲｕｖＢの存在下で突然変異体ＲｕｖＢドメインを導入すると交叉点移動は阻止されるが、ＡＴＰ加水分解は阻止されない。
【００７７】
別の態様では、阻害剤はＲｅｃＧの１種以上の活性を低下させる。ＲｅｃＧはホリデイジャンクションの交叉点移動を促進するヘリカーゼである。活性形態はモノマーであると考えられる。Ｋ３０２をＡ又はＲに置換した突然変異体ＲｅｃＧはヘリカーゼ活性をもたないことが判明した。ＲｅｃＧはＲｕｖＡＢと並行して機能すると思われる。ｒｅｃＧが欠失すると大腸菌はシプロフロキサシンに対して高感受性になる（実施例１）。
【００７８】
別の態様では、阻害剤はＲｅｃＦの１種以上の活性を低下させる。ＲｅｃＦはＤＮＡとＡＴＰの両者と結合するが、明確な酵素活性は決定されていない。特定理論に結び付ける意図はないが、ＲｅｃＡの過剰発現はＲｅｃＦ欠失を補償したので、ＲｅｃＦは複製フォーク停止を維持し、ＲｅｃＡの負荷を助長するように機能するものと考えられる。
【００７９】
別の態様では、阻害剤はＵｖｒＤヘリカーゼの１種以上の活性を低下させる。ＵｖｒＤはＲｅｃＡ核蛋白フィラメントを分解する。ＵｖｒＤはＵＶ修復に役割をもち、ＵＶ傷害を含む１２ｎｔ長ＤＮＡセグメントをＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ及びＵｖｒＣの共働作用によるその切断後に除去することができる（Ｏｒｒｅｎ  ＤＫら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：７８０−７８８（１９９２））。ＵｖｒＤはミスマッチ修復に関与しており、間違ったヌクレオチドを含むＤＮＡセグメントの除去をＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ及びＭｕｔＨの共働作用によるその切断後に促進する（Ｍｏｄｒｉｃｈ  Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５９−１９６０（１９９４））。ＵｖｒＤは酵母Ｓｒｓ２ヘリカーゼに類縁である。
【００８０】
付加態様では、阻害剤は組換え依存性フォーク修復又は複製再開に関連する１種以上のポリペプチド（例えばプライモソームの成分）の活性又は発現を低下させる。従って、特定態様では、阻害剤はＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＣ、又はＤｎａＴの活性又は発現を低下させる。プライモソームの阻害剤は複製フォーク停止修復の阻止により細胞をフルオロキノロンに対して高感受性化する。活性プライモソームの形成を阻止するか又はプライモソームの活性を阻害する阻害剤はフォーク停止修復を阻止又は低下させるので、リファンピンや複製フォーク阻止（リファンピンの場合には転写複合体停止）を生じるそのアナログ等の他の物質に対して細胞を高感受性化する。
【００８１】
１態様では、阻害剤はＰｒｉＡの１種以上の活性を低下させる。ＰｒｉＡは大腸菌でＤＮＡ合成を開始するためのシステムの主要成分である。ヌル突然変異体は相同組換えを欠損しており、放射線やフリーラジカル等の化学的又は物理的突然変異原に対して高感受性である。ＰｒｉＡはＡＴＰアーゼ、ヘリカーゼ及びプライマーゼ活性をもつことが知られている。プライマーゼ活性を維持しながらヘリカーゼを不活化する単一点突然変異Ｋ２３０Ｒによりこれらの２つの機能を分離することができる。各種態様では、阻害剤はＰｒｉＡヘリカーゼ、プライマーゼ、又はＡＴＰアーゼ活性の活性を低下させる。
【００８２】
上記のように、ＲｅｃＦＯＲによるＨＲはＵＶ感受性と「チミン飢餓死」の根底にある損傷の重要な修復経路である。従って、この経路の阻害剤は単独で使用してもよいが、薬剤耐性微生物及び細胞の生存性を低下させ、薬剤耐性及び薬剤感受性細胞の両者の感受性を増強するために、これらの経路に作用するＤＮＡ損傷剤（例えばトリメトプリムやアミノプテリン）や、ＲｅｃＦＯＲ経路によりプロセシングされる損傷を誘発するＦＱ類の薬剤のメンバーと併用することもできる。従って、付加態様では、本発明の阻害剤はＲｅｃＦＯＲ経路の１種以上のポリペプチド（例えばＲｅｃＦ、ＲｅｃＡ、ＲｅｃＯ、及びＲｅｃＲ）の活性又は発現を低下させる。特定態様では、阻害剤はｓｂｃＡ、ｓｂｃＢ、又はｓｂｃＣの突然変異の存在下でＲｅｃＦＯＲ経路の活性を低下させる。
【００８３】
更に、チミン飢餓により損傷したＤＮＡは組換え修復の基質である。ｒｅｃＢＣ（Ｄ）組換え修復遺伝子における突然変異はチミン飢餓死に対する感受性を増加する（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：５９１−６２５（１９９８））。従って、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）やＲｅｃＡ等の組換え酵素の阻害剤は本発明によると、細菌及び他の微生物をチミン飢餓又はチミン代謝拮抗薬（例えばトリメトプリム）に対して高感受性化すると考えられる。
【００８４】
大腸菌ｍａｚＥＦ自殺カセットはチミン飢餓死を調節すると報告されている（Ｊ．Ｂａｄ．１８５：１８０３−１８０７（２００３））。この自殺カセットは毒素（ＭａｚＦと抗毒素（ＭａｚＥ））から構成される。チミン飢餓、トリメトプリムやスルホンアミドによるチミン代謝拮抗、又はリファンピン、クロラムフェニコールもしくはスペクチノマイシン等の抗生物質による治療等の種々のストレスがこの自殺モジュールをトリガーする。この自殺モジュールはキノロン等の他の抗生物質の殺傷メカニズムにも関与していると考えられる。従って、例えばＭａｚＥ発現もしくは活性を阻害するか又はＭａｚＦ活性もしくは発現を増強することによりこのトリガーのバランスをＭａｚＦ過剰に傾ける阻害剤（例えば小分子）はこれらの抗生物質による殺傷に対して細菌を高感受性化する。従って、特定態様では、本発明の阻害剤はＭａｚＦの活性を増強することによりＭａｚＥの活性又は発現を直接又は間接的に低下させる。
【００８５】
関連態様では、阻害剤は別の微生物又は真核細胞でＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドの発現又は活性を低下させる。例えば、特定態様では、阻害剤は本明細書に具体的に記載する任意ポリペプチドのホモログ又は機能的に類似するポリペプチドであるポリペプチドを標的とし、例えばグラム陽性菌（例えば炭疽菌）におけるＡｄｄＡＢ複合体が挙げられる。
【００８６】
阻害剤は他の態様では哺乳動物ＤＮＡ修復又は複製経路の１種以上の成分を標的とする。このような経路としてはＨＲ及び非ＨＲ経路（例えばＮＨＥＪ又はＮＨＲ）が挙げられる。従って、特定態様では、阻害剤は哺乳動物ＤＮＡ修復経路に関連するポリペプチド（例えばＤＮＡ−ＰＫ、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、又はＸＲＣＣ４）の活性又は発現を低下させる。
【００８７】
所定態様では、阻害剤は哺乳動物ＤＮＡ修復又は複製経路に関連するポリペプチド（例えばＭＲＸ複合体の成分（即ちＭｒｅ１１、Ｒａｄ５０、及びＸｒｓ２）、Ｔｅｌ１、複製蛋白Ａ、Ｒａｄ５９、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ５５、Ｒａｄ５７、Ｓｒｓ２、又はＳｇｓ１）の活性又は発現を低下させる。阻害剤は他の哺乳動物ポリペプチド（例えばＢＲＣＡ１やＢＲＣＡ２）の１種以上の活性又は発現を阻害することもできる。
【００８８】
阻害剤は阻害する酵素、生化学、又は生物活性の種類に基づいて特性決定することができる。従って、各種態様では、阻害剤はエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＡＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ＤＮＡ結合、又はポリメラーゼ活性を低下又は阻害する。
【００８９】
一般に、阻害剤は天然に存在するものでも天然に存在しないものでもよい。更に、阻害剤は単離形態でも精製形態でもよく、更に前駆体形態（例えば活性阻害剤を生成するように代謝される形態）で存在することもできる。当業者に自明の通り、阻害剤は種々の面でポリペプチド阻害特性を保持できることが各々示されている多種多様な分子の任意のものとすることができる。例えば、各種態様では、阻害剤は核酸、ポリペプチド、ペプチド、ペプチドミメティック、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）、抗体、ファージ、ファージミド、又は大小有機もしくは無機分子を含む。阻害剤は更にこれらの類の分子の任意のものの塩、プロドラッグ、誘導体、ホモログ、アナログ及びフラグメントを含む。
【００９０】
特定阻害剤に関する以下の記載に例証するように、多種多様の分子を阻害剤として使用することができる。当業者に自明の通り、ＤＮＡ修復及び複製に関連するポリペプチド成分は多数の異なるメカニズムによる阻害することができる。例えば、ポリペプチドの機能領域と結合してその機能を阻害する抗体又はそのフラグメントを作製できることは一般に認められている。同様に、当然のことながら、標的ポリペプチドの発現を有効に防止するアンチセンス及びＲＮＡｉ試薬も作製できる。従って、当業者に自明の通り、本発明の阻害剤はその特定構造特性ではなく、その阻害機能に基づいて広義に定義することができる。実際に、従来同定されているＲｅｃＢ阻害剤には分子ピリドキサルリン酸やλｇａｍポリペプチド（即ち、例えばλγ蛋白とそのホモログ、ファージＴ７遺伝子５．９とそのホモログ、Ｐ２２ファージにコードされるＡｂｃ１及びＡｂｃ２とそのホモログ）があり、非常に多様な分子がＲｅｃＢ機能の有効な阻害剤として機能できることが明らかである。
【００９１】
所定態様では、阻害剤はある種の微生物又は細胞においてＤＮＡ修復、組換え、又は複製に関連するポリペプチドの発現又は活性を低下させるが、別の種では低下させない。例えば、阻害剤は微生物ではＤＮＡ修復又は複製経路を阻害できるが、哺乳動物細胞では作用しない。このような阻害剤は哺乳動物における微生物感染症を治療するのに好ましいと思われる。
【００９２】
１．ポリヌクレオチド阻害剤
所定態様では、阻害剤はＤＮＡ修復又は複製に関連する１種以上の経路及び／又はポリペプチドを阻害することが可能なポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチド組成物としてはゲノム配列、コーディング配列、相補配列、ゲノム外のプラスミドにコードされる配列、線状又は環状ポリヌクレオチド、並びに蛋白、ポリペプチド、ペプチド等を発現するか又は発現するように適応させることができるベクター及びより小型の組換え遺伝子セグメントが挙げられる。このようなポリヌクレオチドは天然から単離したものでもよいし、合成修飾したものでもよい。本発明のポリヌクレオチドは１本鎖（コーディング又はアンチセンス鎖）でも２本鎖でもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ又は合成）分子でもＲＮＡ分子でもよい。各種態様において、ポリヌクレオチド阻害剤は２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復に関与するポリペプチド（例えばＲｅｃＢ、ＲｅｃＡ、ＰｒｉＡ、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｅｃＧ、ＲｅｃＡ、ＲｅｃＣ、及びＲｅｃＦ）の発現を特異的に阻害するように設計されたアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、又はＲＮＡ干渉試薬である。更に、特定態様では、本明細書に記載する各種ポリヌクレオチド阻害剤の任意のものは２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復経路の成分（例えばＲｅｃＡ、ＲｅｃＢ、ＲｅｃＣ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、又はＲｕｖＦ）をコードする遺伝子の領域に対応するか又は相補的なポリヌクレオチド配列を含む。
【００９３】
ａ．アンチセンス
１態様では、阻害剤はＤＮＡ修復又は複製経路の成分に対するアンチセンスＲＮＡである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは蛋白合成の有効な標的阻害剤であることが立証されているので、標的遺伝子により蛋白合成を特異的に阻害するために使用することができる。アンチセンス阻害の例は核蛋白サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体及びヒトＥＧＦで立証されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１５４４−６（１９８８）；Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ａｈｍｅｄ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ．１：２２５−３２（１９８９）；Ｐｅｒｉｓら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５７：３１０−２０（１９９８）；米国特許第５，８０１，１５４号；米国特許第５，７８９，５７３号；米国特許第５，７１８，７０９号及び米国特許第５，６１０，２８８号）。
【００９４】
従って、所定態様では、本発明はＤＮＡ修復もしくは複製に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と特異的に結合することができる任意配列、又はその相補配列の全部又は一部を含むオリゴヌクレオチド配列の提供方法に関する。１態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡ又はその誘導体を含む。別の態様では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ又はその誘導体を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート修飾主鎖を含む修飾ＤＮＡでもよい。更に、オリゴヌクレオチド配列はペプチド核酸又はその誘導体を含むことができる。いずれの場合も、好ましい組成物は標的遺伝子又はポリヌクレオチド配列の１個以上の部分に相補的、より好ましくは完全に相補的な配列領域を含む。
【００９５】
アンチセンス分子の作製方法は当分野で公知であり、ＤＮＡ修復又は複製経路の成分をコードする遺伝子を標的とするアンチセンス分子を作製するように容易に応用することができる。例えば、アンチセンス分子は化学的に合成することもできるし、適切なベクターから発現させることもできる。所与配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は選択した標的配列の分析と、二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、及び相対安定性の決定に基づいて実施される。アンチセンス組成物は二量体、ヘアピン、又は宿主細胞でｍＲＮＡとの特異的結合を低下又は阻止する他の二次構造を形成しにくいことに基づいて選択することができる。ｍＲＮＡの特に好ましい標的領域としてはＡＵＧ翻訳開始コドン又はその近傍の領域と、ｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的な配列が挙げられる。これらの二次構造分析と標的部位選択検討は例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのｖ．４及び／又はＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５アルゴリズムソフトウェアを使用して実施することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９−４０２）。
【００９６】
ＭＰＧ（２７残基）と呼ばれる短いペプチドベクターを利用するアンチセンス送達法も考えられる。ＭＰＧペプチドはＨＩＶ  ｇｐ４１の融合配列に由来する疎水性ドメインと、ＳＶ４０  Ｔ−抗原の核局在配列に由来する親水性ドメインを含む（Ｍｏｒｒｉｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７  Ｊｕ１  １５；２５（１４）：２７３０−６）。ＭＰＧペプチドの数個の分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドを覆い、培養哺乳動物細胞に１時間未満で比較的高い効率（９０％）で送達できることが立証されている。更に、ＭＰＧとの相互作用によりヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性と原形質膜通過能のいずれも著しく増加する。
【００９７】
ｂ．リボザイム
本発明の方法の別の態様によると、ＤＮＡ修復又は複製に関与するポリペプチドをコードする標的遺伝子又はポリヌクレオチド配列の発現を阻害するためにリボザイム分子を使用する。リボザイムは核酸を部位特異的に開裂するＲＮＡ−蛋白複合体である。リボザイムはエンドヌクレアーゼ活性をもつ特異的触媒ドメインをもつ（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８４：８７８８−９２（１９８７）；Ｆｏｒｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ  ４９：２１１−２０（１９８７））。少なくとも６種の基本種の天然酵素ＲＮＡが記載されている。いずれも生理的条件下でトランスのＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒することができる（従って他方のＲＮＡ分子を開裂することができる）。一般に、酵素核酸はまず標的ＲＮＡと結合することにより作用する。このような結合は標的ＲＮＡを開裂するように作用する分子の酵素部分に近接して保持された酵素核酸の標的結合部分を介して行われる。従って、酵素核酸はまず標的ＲＮＡを認識した後に相補的塩基対合により結合し、正しい部位と結合すると、標的ＲＮＡを切断するように酵素として作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的開裂により、ＲＮＡはコードされる蛋白を合成できなくなる。酵素核酸はそのＲＮＡ標的と結合してこれを開裂した後、このＲＮＡから離れて別の標的を探し、新たな標的との結合及び開裂を繰返すことができる。
【００９８】
発現の阻害に影響を与えるために必要なリボザイム濃度は一般にアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度よりも低いので、リボザイムの酵素性質は（核酸分子が単に核酸標的と結合してその翻訳を阻止する）アンチセンス技術等の多数の技術よりも有利であると思われる。この利点はリボザイムの酵素作用能に反映する。従って、１個のリボザイム分子で多数の標的ＲＮＡ分子を開裂することができる。更に、リボザイムは高度に特異的な阻害剤であり、阻害特異性は標的ＲＮＡとの結合の塩基対合メカニズムだけでなく、標的ＲＮＡ開裂メカニズムにも依存する。開裂部位の近傍のシングルミスマッチ、又は塩基置換でリボザイムの触媒活性を完全に失わせることができる。アンチセンス分子に同様のミスマッチがあってもその作用は阻止されない（Ｗｏｏｌｆら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９：７３０５−９（１９９２））。従って、リボザイムの作用特異性は同一ＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用特異性よりも大きい。
【００９９】
酵素核酸分子は例えばハンマーヘッド、ヘアピン、δ肝炎ウイルス、グループＩイントロンもしくはＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と共同）又はＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡモチーフで形成することができる。ハンマーヘッドモチーフの特定例はＲｏｓｓｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：４５５９−６５（１９９２）に記載されている。ヘアピンモチーフの例はＨａｍｐｅｌら（ヨーロッパ特許出願公開第ＥＰ０３６０２５７号）、Ｈａｍｐｅｌ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：４９２９−３３（１９８９）；Ｈａｍｐｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２９９−３０４（１９９０）及び米国特許第５，６３１，３５９号に記載されている。δ肝炎ウイルスモチーフの１例はＰｅｒｒｏｔｔａ  ａｎｄ  Ｂｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１１８４３−５２  （１９９２）により記載されており；ＲＮａｓｅＰモチーフの１例はＧｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら，Ｃｅｌｌ  ３５：８４９−５７（１９８３）により記載されており；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフはＣｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ  ６：６８５−９６（１９９０）；Ｓａｖｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８８：８８２６−３０（１９９１）；Ｃｏｌｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：２７９５−９（１９９３））により記載されており；グループＩイントロンの１例は米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。本発明により使用される酵素核酸分子の重要な特徴は標的遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡ領域の１個以上に相補的な特異的基質結合部位をもつ点と、ＲＮＡ開裂活性を分子に与えるヌクレオチド配列をその基質結合部位の内側又はその周囲にもつ点である。従って、リボザイム構築物は本明細書に記載する特定モチーフに限定する必要がない。
【０１００】
リボザイム活性はリボザイム結合アームの長さを変えるか又は血清リボヌクレアーゼにより分解しないように修飾し（酵素ＲＮＡ分子の糖部分に実施可能な各種化学修飾について記載している例えばＰＣＴ公開ＷＯ９２／０７０６５号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１５１８７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０３１６２号；ヨーロッパ特許出願公開第９２１１０２９８．４号；米国特許第５，３３４，７１１号；及びＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１３６８８号参照）、細胞内におけるその効力を増加するように修飾し、ＲＮＡ合成時間を短縮すると共に化学要件を軽減するようにステムＩＩ塩基を除去したリボザイムを化学的に合成することにより最適化することができる。
【０１０１】
ｃ．ＲＮＡｉ分子
ＤＮＡ修復又は複製に関連する遺伝子を含む該当遺伝子又はポリヌクレオチドの発現を妨害するために、ＲＮＡｉ分子を使用するＲＮＡ干渉法も使用することができる。最初に記載されたＲＮＡｉ分子はＲＮＡセンス鎖とＲＮＡアンチセンス鎖の両者を含むＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであったが、現在ではＤＮＡセンス：ＲＮＡアンチセンスハイブリッド、ＲＮＡセンス：ＤＮＡアンチセンスハイブリッド、及びＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドがＲＮＡｉを媒介できることが立証されている（Ｌａｍｂｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ａ．Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４：１１１−１１９（２００３））。従って、本発明はこれらの異なる型の２本鎖分子の任意のものを含むＲＮＡｉ試薬の使用を含む。更に、当然のことながら、ＲＮＡｉ試薬は各種形態で使用し、細胞に導入することができる。従って、本明細書で使用するＲＮＡｉ試薬とは細胞でＲＮＡｉ応答を誘導することが可能な全試薬を意味し、限定されないが、２本の別々の鎖、即ちセンス鎖とアンチセンス鎖を含む２本鎖ポリヌクレオチド、２本鎖領域を形成する相補配列のヘアピンループを含むポリヌクレオチド（例えばｓｈＲＮＡｉ分子）、及び単独又は別のポリヌクレオチドと共に２本鎖ポリヌクレオチドを形成することが可能な１種以上のポリヌクレオチドを発現する発現ベクターが挙げられる。
【０１０２】
１特定態様では、ＤＮＡ修復又は複製に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを標的とし、その分解を誘導するｄｓＲＮＡ分子を微生物又は細胞に導入する。厳密なメカニズムは本発明には必須でないが、ｄｓＲＮＡと標的遺伝子の会合はｄｓＲＮＡと実際及び／又は予想ｍＲＮＡ転写産物の相同性により決定されると考えられる。この会合はｄｓＲＮＡの標的遺伝子破壊能にも影響すると考えられる。ｄｓＲＮＡ法及び試薬は例えばＰＣＴ出願ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／６８８３６、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０２／４４３２１、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／９６５８４、及びＷＯ０１／７５１６４に記載されている。
【０１０３】
本発明によると、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを細胞又は生物に導入することにより、２本鎖ＲＮＡによる遺伝子及び核酸発現抑制を実施することができる。長いｄｓＲＮＡ分子について上述したように、３０ヌクレオチド長未満のｄｓＲＮＡは非特異的遺伝子抑制を誘導しないと思われる。実際に、ｓｉＲＮＡを細胞に直接導入すると、哺乳動物細胞でＲＮＡｉをトリガーすることができる（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８（２００１））。更に、哺乳動物細胞における抑制はＲＮＡレベルで生じ、標的遺伝子に特異的であり、ＲＮＡと蛋白抑制の間に強い相関があった（Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４６−９７４７（２００１））。更に、ＨｅＬａ  Ｓ３、ＣＯＳ７、２９３、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ−２９、ＣＨＯ−ＫＩ及びＭＣＦ−７細胞を含む多様な細胞株がある程度のｓｉＲＮＡサイレンシングに対して感受性であることが判明した（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．ら，ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ  ９（１）：１−７，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ（９／１／０２）で閲覧可能）。
【０１０４】
ＲＮＡｉ試薬は当分野で公知の手順に従って容易に製造することができる。有効なｓｉＲＮＡ分子の構造特性は同定されている。Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８（２００１）及びＥｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら，ＥＭＢＯ  ２０：６８７７−６８８８（２００１）。従って、当業者に自明の通り、特定遺伝子又は転写産物を標的とするために多種多様なｓｉＲＮＡ分子を使用することができる。所定態様では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は１６〜３０又は１８〜２５ヌクレオチド長（範囲内の各整数を含む）である。１態様では、ｓｉＲＮＡは２１ヌクレオチド長である。所定態様では、ｓｉＲＮＡは０〜７ヌクレオチド３’オーバーハング又は０〜４ヌクレオチド５’オーバーハングをもつ。１態様では、ｓｉＲＮＡ分子は２個のヌクレオチド３’オーバーハングをもつ。１態様では、ｓｉＲＮＡは２１ヌクレオチド長で２個のヌクレオチド３’オーバーハングをもつ（即ちセンス鎖とアンチセンス鎖の間に１９ヌクレオチド相補領域を含む）。所定態様では、オーバーハングはＵＵ又はｄＴｄＴ  ３’オーバーハングである。一般に、１塩基対ミスマッチでもサイレンシングを低下させることが示されているので、ｓｉＲＮＡ分子は標的ＤＮＡ分子の１本の鎖に完全に相補的である。他の態様では、ｓｉＲＮＡは例えば、２’−デオキシ又は２’−Ｏ−メチル修飾等の修飾主鎖組成物をもつことができる。しかし、好ましい態様では、ｓｉＲＮＡの鎖全体は２’デオキシ又は２’−Ｏ−修飾塩基をもたない。
【０１０５】
１態様では、ｓｉＲＮＡ標的部位はＡＡジヌクレオチド配列の出現について標的ｍＲＮＡ転写産物配列を走査することにより選択される。各ＡＡジヌクレオチド配列は３’側に隣接する約１９ヌクレオチドと共に潜在的ｓｉＲＮＡ標的部位となる。１態様では、調節領域と結合する蛋白はｓｉＲＮＰエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害する可能性があるので、ｓｉＲＮＡ標的部位は５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）又は開始コドンの近傍領域（約７５塩基以内）に位置しないことが好ましい（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８（２００１）；Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７−６８８８（２００１））。更に、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍからＮＣＢＩサーバー上で閲覧可能なＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５等の適切なゲノムデータベースと潜在的標的部位を比較し、他のコーディング配列と有意相同性をもつ潜在的標的配列を排除することができる。
【０１０６】
本発明により遺伝子又は核酸発現を阻害又はノックダウンするためにはショートヘアピンＲＮＡも使用することができる。ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は標的遺伝子の発現を配列特異的に低下させることが可能なヘアピンＲＮＡの１形態である。ショートヘアピンＲＮＡは一般に細胞環境で安定であり、分解しにくいので、遺伝子発現抑制においてｓｉＲＮＡよりも有利であると思われる。このようなショートヘアピンＲＮＡによる遺伝子サイレンシング（ＳＨＡＧｇｉｎｇとも言う）は各種正常及び癌細胞株や、マウス及びヒト細胞等の哺乳動物細胞で機能することが立証されている。Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．ら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８−５８（２００２）。更に、組換えｓｈＲＮＡをコードする染色体遺伝子をもつトランスジェニック細胞株が作製されている。これらの細胞はｓｈＲＮＡを構成的に合成することにより、子孫細胞に伝達されると思われる長期又は構成的遺伝子サイレンシングを助長する。Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１４４３−１４４８（２００２）。
【０１０７】
ＳｈＲＮＡはステムループ構造を含む。所定態様では、一般に１９〜２９ヌクレオチド長、又はその範囲内の任意数の可変ステム長を含む。所定態様では、ヘアピンは１９〜２１ヌクレオチドステムを含み、他の態様では、ヘアピンは２７〜２９ヌクレオチドステムを含む。所定態様では、ループ寸法は４〜２３ヌクレオチド長であるが、サイレンシング活性を有意に変化させない限り、ループ寸法は２４ヌクレオチド以上でもよい。ＳｈＲＮＡ分子は効力を低下しない限り、ミスマッチを含むことができ、例えばｓｈＲＮＡステムの２本の鎖の間にＧ−Ｕミスマッチを含む。実際に、所定態様では、ｓｈＲＮＡは例えば細菌で増殖中にヘアピンを安定化させるためにヘアピンステムに１又は数個のＧ−Ｕ対を含むように設計される。他方、標的ｍＲＮＡと結合するステムの部分（アンチセンス鎖）とｍＲＮＡの間には一般に相補性が必要であり、この領域に１塩基対でもミスマッチがあると、サイレンシングは得られない。５’及び３’オーバーハングはｓｈＲＮＡ機能に必須ではないと思われるので必要ないが、存在していてもよい（Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６（８）：９４８−５８）。
【０１０８】
ｄ．発現構築物
所定態様では、阻害剤を発現構築物で細胞に導入する。所定態様では、発現構築物を細胞で一過性発現させ、他の態様では、細胞ゲノムに安定的に組込む。更に、当然のことながら、遺伝コードの固有縮重により実質的に同一又は機能的に等価のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列又はその変異体を作製することができ、これらの配列を使用して所与ポリペプチドを発現させることもできる。
【０１０９】
該当ポリヌクレオチド又はポリペプチド（例えばＲｅｃＢＣによる相同組換えの阻害剤）をコードする配列と適切な転写及び翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを作製するためには当業者に周知の方法を使用することができる。これらの方法としてはｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。このような技術は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２０００及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．と全最新補遺に記載されている。１態様では、本発明の発現構築物はＲｅｃＢ遺伝子の領域に対応するポリヌクレオチド配列を含む。
【０１１０】
発現ベクターに存在する調節配列としては転写及び翻訳を実施するために宿主細胞蛋白と相互作用するベクターの非翻訳領域（例えばエンハンサー、プロモーター、５’及び３’非翻訳領域）が挙げられる。このようなエレメントはその強度と特異性を変えることができる。利用するベクターシステムと細胞に応じて、任意数の適切な転写及び翻訳エレメント（例えば構成的及び誘導プロモーター）を使用することができる。
【０１１１】
哺乳動物細胞では、哺乳動物遺伝子又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが一般に好ましく、多数のウイルス発現システムが一般に入手可能である。例えば、アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合には、後期プロモーターと３部分リーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体に該当ポリペプチドをコードする配列をライゲーションすることができる。感染宿主でポリペプチドを発現させることが可能な生存ウイルスを得るためにはウイルスゲノムの非必須Ｅ１又はＥ３領域への挿入を使用することができる（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９（１９８４））。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー等の転写エンハンサーを使用して哺乳動物宿主細胞での発現を増加させることもできる。
【０１１２】
本発明のベクターは当分野で利用可能な任意手段により細胞に導入され、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスフェクション、感染、リポフェクション、遺伝子銃、及びレトロトランスポジションが挙げられる。一般に、ベクターを細胞に導入する適切な方法はベクターの種類及び細胞の種類と当分野で広く入手可能な教示に基づいて当業者により容易に決定される。
【０１１３】
所定態様では、本発明はＤＮＡ修復又は複製阻害剤の条件付き発現を可能にする。各種条件付き発現システムが当分野で公知であり、細胞と動物の両者で使用するのに利用可能であり、本発明はＤＮＡ修復又は複製に関与するポリペプチドの発現又は活性を調節するために任意前記条件付き発現システムの使用を意図する。本発明の１態様では、例えば、分子の発現をＲＥＶ−ＴＥＴシステムの制御下におくことができる。このシステムの成分と遺伝子発現を制御するためのこのシステムの使用方法は文献に詳細に記載されており、テトラサイクリンにより制御されるトランスアクチベーター（ｔＴＡ）や逆ｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を発現するベクターが市販されている（例えばｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ及びｐｔＴＡ−２／３／４ベクター，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。このようなシステムは例えば、米国特許第５６５０２９８号、６２７１３４８号、５９２２９２７号、及び関連特許に記載されており、その内容全体を参考資料として組込む。
【０１１４】
特定態様では、ウイルス又はバクテリオファージベクターを使用して阻害剤を細胞に送達する。多様なウイルス発現システムが当分野で公知であり、入手可能であり、その全てを本発明により使用することができる。１具体的態様では、レトロウイルスが遺伝子送達システムの簡便で有効なプラットフォームとなる。当分野で公知の技術を使用して選択ヌクレオチド配列をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。その後、組換えウイルスを単離し、対象に送達することができる。多数の具体的レトロウイルスシステムが記載されている（例えば米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４（１９９０）；Ｓｃａｒｐａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：８４９−８５２（１９９１）；Ｂｕｒｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７（１９９３）；及びＢｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９（１９９３））。
【０１１５】
更に、多数の具体的アデノウイルス系システムも記載されている。宿主ゲノムに組込むレトロウイルスと異なり、アデノウイルスは染色体外に維持されるので、挿入突然変異誘発に関連する危険が最少になる（Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｂｅｔｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１（１９９３）；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７１７−７２９（１９９４）；Ｓｅｔｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０（１９９４）；Ｂａｒｒら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−５８（１９９４）；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２９（１９８８）；及びＲｉｃｈら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３））。
【０１１６】
各種アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムもポリヌクレオチド送達用に開発されている。ＡＡＶベクターは当分野で周知の技術を使用して容易に作製することができる。例えば米国特許第５，１７３，４１４号及び５，１３９，９４１号；国際公開第ＷＯ９２／０１０７０号及びＷＯ９３／０３７６９号；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６（１９８８）；Ｖｉｎｃｅｎｔら，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０））；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９（１９９２）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９（１９９２）；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９（１９９４）；及びＺｈｏｕら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５（１９９４）参照。
【０１１７】
遺伝子導入により本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達するために有用なその他のウイルスベクターとしてはワクシニアウイルスや鶏痘ウイルス等のポックスファミリーウイルスから誘導されるものが挙げられる。更に、本発明はレンチウイルスの使用も想定した。
【０１１８】
上記及び他の公知ウイルス送達システムに関するその他の具体的情報は例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３１７−３２１（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６−１０３（１９８９）；Ｆｉｅｘｎｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７−２１（１９９０）；米国特許第４，６０３，１１２号、４，７６９，３３０号、及び５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ  ２，２００，６５１；ＥＰ  ０，３４５，２４２；ＷＯ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２７，１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｋｏｌｌｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１５−２１９（１９９４）；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４９８−１１５０２（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８−２８４８（１９９３）；並びにＧｕｚｍａｎら，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２−１２０７（１９９３）に記載されている。
【０１１９】
所定の関連態様では、本発明は遺伝子ノックアウト又はノックダウンによりＤＮＡ修復又は複製に関与するポリペプチドの活性を阻害することを意図する。遺伝子ノックアウト方法は当分野で広く知られ、利用可能であり、ノックアウト及びノックダウン標的ベクターの作製及び使用方法も公知であり、例えばｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）に記載されている。
【０１２０】
別の態様では、本発明は遺伝子変換によりＤＮＡ修復又は複製経路のポリペプチド成分の活性を阻害することを意図する。従って、所定態様では、本発明のベクターは２個のリコンビナーゼ認識部位を含む。これらのリコンビナーゼ認識部位はＤＮＡ修復又は複製に関与するポリペプチドをコードする遺伝子の領域に対応する配列の両側にあることが好ましい。好ましい態様では、リコンビナーゼ認識部位はこの配列のリコンビナーゼによる欠失を誘導するように配置される。
【０１２１】
適切なリコンビナーゼ部位としては夫々ｆｌｐ及びｃｒｅリコンビナーゼにより認識されるＦＲＴ部位とｌｏｘＰ部位が挙げられる（米国特許第６，０８０，５７６号、５，４３４，０６６号、及び４，９５９，３１７号参照）。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ及びＦｌｐ−ＦＲＴリコンビナーゼシステムはリコンビナーゼ酵素と、特定リコンビナーゼにより特異的に認識されるＤＮＡ小配列の２つの基本エレメントから構成される。どちらのシステムも標的部位の方向と位置に応じて関連ＤＮＡの欠失、挿入、逆位、又は転位を媒介することができる。リコンビナーゼシステムは米国特許第６，０８０，５７６号、５，４３４，０６６号、及び４，９５９，３１７号に開示されており、遺伝子破壊又は置換のためのリコンビナーゼシステムの使用方法はＪｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｓｔｒｉｃｋｌｅｔｔ，Ｐ．Ｋ．ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ｋｕｈｎ，Ｒ．ＩＮ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＦＯＲ  ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＡＬ  ＧＥＮＥ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ（１９９７），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１２２】
ＣｒｅとＦｌｐの代表的な最小標的部位は各々３４塩基対長であり、当分野で公知である。ＤＮＡセグメント上の２個の標的部位の相対方向はリコンビナーゼにより触媒される修飾の型を決定し、部位が同一方向の場合にはその間のＤＮＡの切り出しを生じ、逆方向の場合にはその間のＤＮＡの逆位を生じる。所定態様では、突然変異リコンビナーゼ部位を使用して組換えイベントを不可逆的にすることができる。例えば、各リコンビナーゼ標的部位は単独の場合には組換え効率をさほど低下させないが、両方の突然変異が存在する場合にはリコンビナーゼをほぼ不活化する別の突然変異を含むことができる。組換え後に、再生されたリコンビナーゼ部位は両方の突然変異を含み、その後の組換えは有意に阻害される。本発明で有用なリコンビナーゼとしては限定されないが、Ｃｒｅ及びＦｌｐとその機能的変異体（例えば、Ｆ７０Ｌ突然変異を含むＦｌｐＬや、Ｐ２Ｓ、Ｌ３３Ｓ、Ｙ１０８Ｎ、及びＳ２９４Ｐ突然変異を含むＦｌｐｅ）が挙げられる。
【０１２３】
２．ポリペプチド阻害剤
所定態様では、本発明の阻害剤はポリペプチド又は関連分子（例えばペプチドミメティック）である。本明細書で使用するポリペプチドなる用語はペプチド及び任意長のポリペプチドを含む。ポリペプチドは天然アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、又はその組み合わせを含むことができる。これらのポリペプチド阻害剤もＤＮＡ修復又は複製経路の成分を標的とし、各種手段により作用することができる。所定態様では、これらの阻害剤はＤＮＡ修復もしくは複製又はＤＮＡ修復に関与するポリペプチドの一部に対応する。
【０１２４】
１態様では、ＤＮＡ修復又は複製に関与するポリペプチドのドミナントネガティブ阻害剤の過剰発現により前記ポリペプチドの活性を変化させる。ドミナントネガティブ阻害剤は一般にポリペプチドの突然変異体形態であり、例えば結合パートナー又は基質との結合を競合することにより、野生型ポリペプチドの活性を低下又は阻止する。所定態様では、ドミナントネガティブ阻害剤は野生型ポリペプチドのフラグメントである。ドミナントネガティブ突然変異体の例としては例えば１本鎖ＤＮＡと結合することができないＲｅｃＡ突然変異体や、ＲｅｃＢＣＤの特定機能又は結合ドメインが挙げられる。
【０１２５】
ポリペプチド阻害剤は更に変異体、アナログ、及び誘導体を含む。本明細書で使用する「アナログ」なる用語は本明細書に記載するポリペプチド又は核酸と同一構造又は機能（例えば標的との結合）を保持する組成物を意味する。アナログの例としてはペプチドミメティック、ペプチド核酸、大小有機又は無機化合物、並びに本明細書に記載するポリペプチド又は核酸の誘導体及び変異体が挙げられる。本明細書で使用する「誘導体」又は「変異体」なる用語は１個以上のアミノ酸又は核酸欠失、付加、置換又は側鎖修飾により天然ポリペプチド又は核酸と相違するペプチド又は核酸を意味する。所定態様では、変異体は野生型ポリペプチドに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の配列一致度をもつ。アミノ酸置換としてはあるアミノ酸を別の天然又は非標準アミノ酸残基で置換する変異が挙げられる。このような置換は「保存的」として分類することができ、その場合には、ポリペプチドに含まれるあるアミノ酸残基を極性、側鎖官能価又はサイズに関して類似特徴の別の天然アミノ酸で置換する。
【０１２６】
本発明に含まれる置換は「非保存的」でもよく、その場合には、ペプチドに存在するあるアミノ酸残基を別の群に由来する天然アミノ酸等の異なる性質をもつアミノ酸で置換（例えば荷電又は疎水性アミノ酸をアラニンで置換）するか、あるいは、天然アミノ酸を非標準アミノ酸で置換する。アミノ酸置換は保存的であることが好ましい。
【０１２７】
アミノ酸置換は一般に単一残基であるが、塊状又は分散を問わずに複数残基でもよい。付加は１個以上の低下又は非標準アミノ酸残基の付加を含む。欠失は１個以上のアミノ酸残基の欠失を含む。
【０１２８】
所定態様では、ペプチド誘導体はアミノ酸の１個以上が側鎖修飾されているペプチドを含む。本発明により意図される側鎖修飾の例としては、アルデヒドとの反応後にＮａＢＨ４で還元する還元的アルキル化；メチルアセトイミデートによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアナートによるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水琥珀酸と無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；及びピリドキサール−５−リン酸によるリジンのピリドキシル化後にＮａＢＨ４で還元する等のアミノ基修飾が挙げられる。他の各種修飾が当分野で公知であり、利用可能である。例えば、所定態様では、例えばＤ−アミノ酸又はＰＥＧ−末端を使用して放出又は分解を遅らせるようにペプチド又はペプチドミメティックを修飾する。利用可能な方法を使用して（例えば直交シンテターゼと、直交ｔＲＮＡと、セレクーコドンを含むコーディング核酸を含む細胞又は他の翻訳系を使用して）多様な非天然アミノ酸をポリペプチドに組込むこともできる。この技術については、例えば各々その内容全体を参考資料として組込むＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５），Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６（３）：２２７−２３８（２００５）；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９（６）：５４８−５５４；及びＷａｎｇら，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ，ｅｐｕｂ  Ｊａｎ  １３，２００６参照。非天然アミノ酸を使用して蛋白機能、半減期、取り込み、二次分子に対する反応性等を変化させることができる。
【０１２９】
本発明は全種のペプチドミメティック（「ペプチドミメティクス」）も含む。ペプチドミメティクスとはポリペプチド構造の１種以上の性状に似た分子を意味する。本発明により意図される３種のペプチドミメティックの特定例としては、タイプＩミメティック（アミド結合ミメティックであり、遷移状態イソステア、アミド主鎖イソステア、β鎖ミメティック及びβターンミメティックが含まれる）；タイプＩＩミメティック（同一機能を生じるが、受容体の同一場所に結合しない機能的ミメティック）；及びタイプＩＩＩミメティック（ペプチドの結合相互作用に類似する非ペプチドトポグラフィックミメティック）が挙げられる。
【０１３０】
ポリペプチドとその誘導体及びアナログの合成は当業者に公知である。所定態様では、本発明のペプチド又はペプチドミメティクスは基質結合部位の内側にフィットすることが好ましい。従って、所定態様では、本発明のペプチド又はペプチドミメティックは約６０オングストローム未満、約４５オングストローム未満、約３０オングストローム未満、又は約１５オングストローム未満である。
【０１３１】
別の態様では、本発明の阻害剤は進化型ファージペプチドリガンド又は別のファージから誘導される蛋白である。標的と結合するペプチド及びポリペプチドを同定するための各種ファージディスプレイ法が当分野で公知であり、利用可能である。（例えばＣｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，２６６）参照）。
【０１３２】
ａ．抗体阻害剤
本発明の阻害剤は更にＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドに特異的な抗体、又はその抗原結合フラグメントを含む。特定態様では、本発明の阻害剤はＲｅｃＡ、ＲｅｃＢ、ＰｒｉＡ、Ｋｕ８６、Ｋｕ７０、又はＤＮＡ−ＰＫと特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０１３３】
抗体、又はその抗原結合フラグメントは（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ内で）検出可能なレベルでポリペプチドと反応し、同様の条件下で無関係のポリペプチドと検出可能に反応しない場合に、ポリペプチドと「特異的に結合する」、「免疫学的に結合する」、及び／又は「免疫反応性」であると言う。抗体は結合親和性が少なくとも１×１０−７Ｍ又は、好ましくは、少なくとも１×１０−８Ｍであるときに標的ポリペプチドと特異的に結合するとみなす。本発明の抗体としては限定されないが、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）抗体、１本鎖、Ｆａｂフラグメント及びｓｃＦｖフラグメントが挙げられる。
【０１３４】
抗体は当業者に公知の各種技術の任意のものにより製造することができる。例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８参照。一般に、抗体は細胞培養技術により作製することができ、例えば当分野で公知の従来技術を使用するか、あるいは組換え抗体を作製できるように適切な細菌又は哺乳動物細胞宿主に抗体遺伝子をトランスフェクションすることによりモノクローナル抗体を作製する方法が挙げられる。該当抗原ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）の技術とその改良方法を使用して製造することができる。
【０１３５】
Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全に動物又はヒトに由来するものでもよいし、定常領域がヒト免疫グロブリンの定常領域に由来し、可変領域が親マウスＭＡｂに由来するようなキメラ形態でもよい。あるいは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが動物ＭＡｂに由来し、定常領域と可変領域のフレームワーク領域がヒトに由来するように、Ｆｖ、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ’）２をヒト化してもよい。これらのキメラ及びヒト化フラグメントはその対応する完全動物フラグメントよりも免疫原性が低いため、特に長期間のｉｎ  ｖｉｖｏ使用に適している。キメラ及びヒト化抗体の作製方法は当分野で周知である（例えば、夫々米国特許第４，８１６，５６７号、国際出願第ＷＯ８４／０３７１２号参照）。
【０１３６】
所定態様では、本発明の抗体阻害剤はイントラボディである。「細胞内抗体」ないし「イントラボディ」は親モノクローナル抗体に由来する１本鎖抗体であり、軽鎖と重鎖の可変領域をフレキシブルペプチドリンカーにより結合したものである。こうして得られた組換え遺伝子産物は標的抗原と結合してこれを中和させるという親抗体の能力を維持する。本明細書で使用するイントラボディは標的蛋白に結合する限り、モノクローナル、１本鎖抗体、Ｖ領域等を含む。完全イントラボディ配列を発現プラスミドにコードすることができ、プラスミドを細胞にトランスフェクションすると、イントラボディ蛋白の細胞内発現と、その細胞内蛋白抗原の中和が得られる。イントラボディはＭａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１１−１５（１９９７）及びＰｅｒｓｉｃ，Ｌ．ら，Ｇｅｎｅ  １８７：１−８（１９９７）をはじめとする各種論文に概説及び記載されている。
【０１３７】
細胞内抗体は各種用途に利用されており、研究用試薬のみならず治療用分子としても利用されている。当初は、細胞内蛋白の活性を特異的に阻止するために細胞の細胞質に抗体をマイクロインジェクションしていた。抗体操作技術の最近の進歩により、（１）モノクローナル抗体の抗原結合ドメインを例えば１本鎖Ｆｖフラグメント又はＦａｂフラグメントとして組換え発現させることができ；（２）適切な発現システムを使用することにより、哺乳動物細胞を含む各種細胞でこれらのフラグメントを発現させることができるという２つの重要な成果が得られた。
【０１３８】
異なるシグナル配列を提供することにより、異なる亜細胞区画に対する組換え抗体を作製することができる。疎水性哺乳動物リーダー配列を抗体フラグメントのＮ末端に結合すると、分子は細胞外環境に分泌される。リーダー配列を含む抗体フラグメントのＣ末端にＥＲ保持シグナル（例えばＫＤＥＬ）を付加すると、小胞体の内腔に保持される。ＥＲ保持シグナルの代わりにＣ末端タイプ２膜貫通ドメインを使用し、抗体フラグメントを原形質膜に導くと、細胞表面ディスプレイが得られる。更に、ミトコンドリアリーダー配列（例えばチトクロムＣオキシダーゼサブユニットＶＩＩＩのリーダー配列）を使用することによりミトコンドリアに対する抗体フラグメントを作製することもできる。細胞質発現はシグナル又はリーダー配列を含まない抗体フラグメントの発現により実施される。例えばＳＶ４０ラージＴ抗原（ＰＫＫＫＲＫＶ）に由来する核内局在配列をＮ又はＣ末端に融合することによりこれらのフラグメントを核に導入することができる。
【０１３９】
抗体フラグメントの細胞内発現の重要な問題は機能分子の集合である。抗体ドメインはドメイン間ジスルフィド結合により安定化されるので、機能的集合には酸化性媒体が必要である。この環境は例えば分泌経路に存在し、この経路に対する抗体は一般に機能的抗体分子に集合する。ジスルフィド結合の形成はミトコンドリアに対するｓｃＦｖフラグメントについても報告されている。他方、細胞質と核は還元性媒体をもち、この区画における機能分子の形成は廃止又は低下する。しかし、細胞質と核における組換え抗体フラグメントの機能的発現について諸グループが報告している。最近明らかになったシステイン残基をもたない機能的抗体フラグメントの組換えはこれらの区画における抗体フラグメントの機能的発現を改善するのに役立つであろう。
【０１４０】
イントラボディはＨＩＶの外側表面に突出する糖蛋白であるｇｐ１２０を有効に中和できることが立証されている。このようなイントラボディの１つはｓＦｖ１０５であり、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を認識するヒトモノクローナル抗体の改変形であり、感染プロセスで重要な役割を果たす。その糖蛋白コートを取り除いた「裸の」ＨＩＶは新しい細胞に感染することができない。更に、感染ＣＤ４細胞の表面のｇｐ１２０の発現を阻止することにより、ｓＦｖ１０５は広範な細胞死をトリガーする致死細胞クラスターである合胞体の形成を抑制する。
【０１４１】
３．小細胞阻害剤
本発明の阻害剤は更に大小無機又は有機分子を含む。所定態様では、阻害剤は有機小分子、又はその誘導体もしくはアナログである。好ましい態様では、本発明の阻害剤は微生物又は細胞に浸透又は侵入することができる。従って、１態様では、好ましい阻害剤は細菌浸透性である。他の態様では、阻害剤は受動的拡散又は能動的輸送（例えば受容体による取り込み）により微生物又は細胞に侵入することができる。
【０１４２】
所定態様では、阻害剤は保護基を含む。「保護基」なる用語は少なくとも所定の反応性部分をブロックし、保護基が除去（又は「開裂」）されるまで前記基が化学反応に加わらないようにする化学部分を意味する。ブロッキング／保護基の例は例えばＧｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９に記載されている。
【０１４３】
任意阻害剤は１個以上のキラル中心をもつことができ、各中心はＲ又はＳ配置で存在することができる。本発明の阻害剤は全ジアステレオマー、エナンチオマー、及びエピマー体と適当なその混合物を含む。立体異性体は所望により、例えば、キラルクロマトグラフィーカラムによる立体異性体の分離等の当分野で公知の方法により得ることができる。阻害剤は更に任意阻害剤のＮ−オキシド、結晶体（多形体とも言う）、及び医薬的に許容可能な塩と、活性代謝産物を含む。全互変異性体が本明細書に記載する阻害剤の範囲に含まれる。更に、本明細書に記載する阻害剤は非溶媒和形態で存在することもできるし、水、エタノール等の医薬的に許容可能な溶媒との溶媒和形態で存在することもできる。本明細書に記載する阻害剤の溶媒和形態も本発明に含まれる。
【０１４４】
１特定態様では、小分子阻害剤はＲｅｃＢ、ＲｅｃＡ、又はＰｒｉＡと結合する。本発明の特定阻害剤はこれらの分子の任意のもので同定された機能部位又はその近傍に結合し、例えばＲｅｃＢのχ切断部位、ヘリカーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン、トンネル領域、ＰｒｉＡのヘリカーゼ、プライマーゼ、もしくはＡＴＰアーゼドメイン、又はＲｅｃＡのＤＮＡ結合ドメインが挙げられる。
【０１４５】
Ｂ．医薬組成物及びキット
本発明はＤＮＡ修復又は複製阻害剤の製剤も含む。製剤は一般に特定用途に適応させ、例えば患者に投与するのに適した医薬組成物が挙げられ、即ち生理的に適合可能である。従って、阻害剤の組成物は多くの場合には更に１種以上の緩衝液又はキャリヤーを含有する。本発明の任意組成物又は製剤では、阻害剤を例えば塩、薬剤、プロドラッグ、又は代謝産物として製剤化することができる。
【０１４６】
更に、本発明の組成物は医薬として有効な緩衝液又はキャリヤーを含むことができる。本明細書で使用する「医薬的に許容可能なキャリヤー」は本発明の阻害剤を微生物、動物又はヒトに送達するための医薬的に許容可能な溶剤、懸濁剤又はビークルである。キャリヤーは例えば気体、液体又は固体とすることができ、予定投与方法を考慮して選択される。
【０１４７】
キャリヤーの一般例としては緩衝液（例えば中性緩衝食塩水又はリン酸緩衝食塩水）、炭水化物（例えばグルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン）、マンニトール、蛋白、ポリペプチド又はアミノ酸（例えばグリシン）、酸化防止剤、静菌剤、キレート剤（例えばＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、製剤をレシピエントの血液に等張、低張又はやや高張にする溶質、懸濁剤、増粘剤及び／又は防腐剤が挙げられる。
【０１４８】
経口医薬製剤の医薬的に許容可能なキャリヤーの例としてはラクトース、スクロース、ゼラチン、寒天及びバルク粉末が挙げられる。所定態様では、本発明の医薬組成物は経口投与用錠剤又はカプセル剤として製剤化される。このような錠剤又はカプセル剤は特定放出特性に合わせて製剤化することができる（例えば長期放出カプセル剤）。本発明の組成物がＤＮＡ修復又は複製阻害剤と別の抗微生物又は細胞傷害性物質を併有する特定態様では、組成物は混合物又は多層として製剤化することができ、例えば抗微生物又は細胞傷害性物質を阻害剤にカプセル封入してもよいし、逆にしてもよい。別の態様では、本発明の医薬組成物は２種以上の本発明の阻害剤を含有する。
【０１４９】
適切な液体キャリヤーの例としては水、医薬的に許容可能な油脂、アルコール又は他の有機溶剤（エステルを含む）、エマルション、シロップ又はエリキシル剤、懸濁液、溶液及び／又は懸濁液、非発泡顆粒から再構成された溶液及び／又は懸濁液、並びに発泡顆粒から再構成された発泡製剤が挙げられる。このような液体キャリヤーは例えば適切な溶剤、防腐剤、乳化剤、懸濁剤、希釈剤、甘味剤、増粘剤、及び溶解剤を添加することができる。好ましいキャリヤーは食用油（例えばコーン油又はキャノーラ油）である。ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ）も好ましいキャリヤーである。
【０１５０】
局所製剤用の医薬的に許容可能なキャリヤーの例としては軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ジェル、スプレー、エアゾール又は油が挙げられる。あるいは、製剤は経皮パッチ又は包帯（例えば活性成分（例えば阻害剤及び／又は第２の治療薬）と場合により１種以上のキャリヤー又は希釈剤を含浸させた包帯）でもよい。局所製剤は活性成分を皮膚又は他の患部に吸収又は浸透し易くする化合物を加えることができる。このような皮膚浸透促進剤の例としてはジメチルスルホキシドと関連アナログが挙げられる。経皮送達システム形態で投与する所定態様では、製剤投与は投与レジメン期間を通して断続的よりも連続的とする。
【０１５１】
非経口投与に適した製剤としては、所期レシピエントの血液に等張の水性及び非水性製剤と、１種以上の臓器の血液成分に化合物を標的化するように設計された懸濁系を含むことができる水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は１回使い切り又は複数回投与用密閉容器（例えばアンプル又はバイアル）の形態とすることができる。上記のような滅菌散剤、顆粒剤及び錠剤から即席注射溶液及び懸濁液を調製してもよい。非経口及び静脈内製剤にはミネラルや、選択する注射又は送達システムの種類に適合可能にするための材料を添加することができる。
【０１５２】
非経口投与用として一般に使用されている医薬的に許容可能なキャリヤーとしては水、適当な油、食塩水、デキストロース水溶液（グルコース）、又は関連糖溶液及びグリコール（例えばプロピレングリコール又はポリエチレングリコール）が挙げられる。非経口投与用溶液には活性成分の水溶性塩と、適当な安定剤と、必要に応じて緩衝物質、酸化防止剤（例えば亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、又はアスコルビン酸単独又は併用）、及び適切な安定剤を加えることが好ましい。クエン酸塩とナトリウムＥＤＴＡもキャリヤーとして使用することができる。更に、非経口溶液は塩化ベンズアルコニウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、又はクロロブタノール等の防腐剤を加えてもよい。適切な医薬キャリヤーはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，前出に記載されている。
【０１５３】
本発明は更に当分野の慣用方法による獣医学投与用に製剤化された阻害剤も意図する。
【０１５４】
本明細書に記載する阻害剤は例えば石鹸、洗濯用洗剤、シャンプー、食器洗浄用石鹸、練り歯磨き、及び他のハウスクリーニング洗剤等の洗浄剤と併用して工業用に製剤化することもできる。
【０１５５】
本発明の組成物及び医薬製剤は当分野で公知の任意手段により生物に投与することができる。本発明の組成物及び医薬製剤をヒト等の動物に投与するための経路としては非経口、静脈内、筋肉内、経口、吸入、局所、経膣、経直腸、鼻腔内、口腔、経皮、点眼薬、又は埋め込み型レザバー外部ポンプもしくはカテーテルが挙げられる。
【０１５６】
注射用製剤は液体溶液もしくは懸濁液；注射前に液体に溶解もしくは懸濁するのに適した固体形態；又はエマルション等の慣用形態で製造することができる。医薬的に許容可能な適切なキャリヤーと上記のような他の選択成分を使用して当分野で公知の技術により滅菌注射用懸濁液を製剤化することが好ましい。
【０１５７】
非経口投与は多数の任意方法で実施することができるが、シリンジ、カテーテル、又は同等の装置を使用して本明細書に記載する製剤の非経口投与を実施することが好ましい。活性剤が実質的に血流全体を循環するように製剤を全身注射することができる。
【０１５８】
また、製剤を標的部位に局所注射してもよく、例えばＤＮＡ修復又は複製を使用する経路の阻害が所望される特定身体部分に注射することができる。注射による局所投与の利点は活性剤（例えば阻害剤及び／又は他の治療薬）への全身暴露を制限又は回避する点である。なお、本発明の関連では、局所投与なる用語は局部投与を意味し、例えば身体の一部に通じる血管への送達によりこの部分に製剤を投与することを意味する。局所送達は直接、例えば腫瘍内とすることができる。局所送達はほぼ直接、即ち病変内又は腹腔内でもよく、即ち阻害剤が所望薬理活性を示すように腫瘍又は感染部位に十分近接する領域に送達してもよい。従って、局所送達が所望される場合には、医薬製剤を病変内、腫瘍内、又は腹腔内に送達することが好ましい。
【０１５９】
所定態様では、医薬製剤は単位剤形である。このような剤形では、適量の活性成分を含有する単位用量に組成物を分割する。単位剤形はパッケージ製剤とすることができ、個別量の製剤、例えばバイアル又はアンプルに個装した錠剤、カプセル剤、及び散剤をパッケージに含む。単位剤形はカプセル剤、カシェ剤、もしくは錠剤でもよいし、適当な個数のこれらのパッケージ形態の任意のものでもよい。
【０１６０】
本発明の医薬組成物は一般に処方用量を患者に投与後に治療又は予防効果を達成するために十分な量の阻害剤を含有する。実際の有効量は治療する症状、投与経路、症状を治療するために使用される薬剤治療、及び患者の病歴により異なる。有効量の決定は当業者が十分に実施可能である。ヒトで使用する有効量は動物モデルから決定することができる。例えば、動物で有効であることが認められた循環濃度を達成するようにヒト用量を決定することができる。阻害剤を別の治療薬（例えば抗生物質、抗腫瘍薬、抗ウイルス薬、抗原生動物薬等の抗微生物又は細胞傷害性物質又は化合物）と合剤化する場合には、阻害剤の有効量を変えることができる。
【０１６１】
特定態様では、活性成分（例えば阻害剤又は第２の治療薬）の有効量は患者体重１ｋｇ当たり活性剤約０．０００１ｍｇ〜約５００ｍｇ、より好ましくは患者体重１ｋｇ当たり活性剤約０．００１〜約２５０ｍｇ、更に好ましくは患者体重１ｋｇ当たり活性剤約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ、更に好ましくは患者体重１ｋｇ当たり活性剤約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇ、最も好ましくは患者体重１ｋｇ当たり活性剤約１ｍｇ〜約１５ｍｇである。重量百分率で換算すると、活性剤（例えば阻害剤又は第２の治療薬）の医薬製剤は好ましくは約０．０００１重量％〜約１０重量％、より好ましくは約０．００１重量％〜約１重量％、より好ましくは約０．０１重量％〜約０．５重量％を含有する。
【０１６２】
所定態様では、ＤＮＡ修復又は複製阻害剤を含有する本発明の組成物及び製剤は更に１種以上の付加治療薬、好ましくは例えば抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗原生動物薬、及び／又は抗腫瘍薬等の抗微生物又は細胞傷害性化合物又は物質を含有する。更に、ＤＮＡ修復又は複製阻害剤を含有する組成物を１種以上の付加治療薬と併用投与することができる。
【０１６３】
各種態様では、ＤＮＡ修復及び複製阻害剤を付加治療薬と合剤化する。付加治療薬を微生物、細胞又は患者に投与する前、それと同時又はその後に阻害剤を微生物、細胞又は患者に投与することができる。
【０１６４】
所定態様では、本発明の組成物は抗生物質を更に含有するか又は抗生物質と併用投与する。ＤＮＡ修復又は複製阻害剤と合剤化又は併用投与することができる抗生物質の例としてはアミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、セフェム、糖ペプチド、フルオロキノロン／キノロン、マクロリド、オキサゾリジノン、ペニシリン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、及びテトラサイクリンが挙げられる。各種関連態様では、本発明の組成物は抗腫瘍薬、抗ウイルス薬及び／又は抗マラリア薬を更に含有するか、又はこれらと併用投与する。同様に、特定態様では、本発明の組成物は２種以上の本発明の阻害剤を単独で含有するか、又は抗生物質、抗腫瘍薬、抗ウイルス薬、又は抗マラリア薬等の付加治療薬と共に含有する。
【０１６５】
アミノグリコシドはグラム陰性菌に対して有効であることが分かっている抗生物質群である。アミノグリコシドは合併症を伴う尿路感染症、敗血症、腹膜炎及び他の重症腹腔内感染症、重症骨盤内炎症性疾患、心内膜炎、マイコバクテリア感染症、新生児敗血症、並びに各種眼感染症を治療するために使用される。グラム陽性菌とグラム陰性菌の両者に対応するためにペニシリン及びセファロスポリンと併用することが多い。アミノグリコシドの例としてはアミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネトロマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、及びネオマイシンか挙げられる。
【０１６６】
カルバペネムはグラム陽性菌、グラム陰性菌、及び嫌気性微生物を防除するために使用される類の広域抗生物質である。カルバペネムは静脈内投与用に利用可能であるので、経口薬では十分に対応できない重症感染症に使用される。例えば、カルバペネムは下気道感染症、尿路感染症、腹腔内感染症、産婦人科及び分娩後感染症、敗血症、骨及び関節感染症、皮膚及び皮膚構造感染症、並びに髄膜炎等の重症単独又は混合細菌感染症を治療するために使用することが多い。カルバペネムの例としてはイミペネム／シラスタチンナトリウム、メロペネム、エルタペネム、及びパニペネム／ベタミプロンが挙げられる。
【０１６７】
セファロスポリンとセフェムはグラム陽性菌、グラム陰性菌、及びスピロヘータ感染症を治療するために使用される広域抗生物質である。セフェムは次世代セファロスポリンとみなされ、新薬はグラム陰性菌に対して強力であり、旧薬はグラム陽性菌に対して良好である。セファロスポリンとセフェムは一般にペニシリンアレルギーに代用され、一般尿路感染症及び上気道感染症（例えば咽頭炎及び扁桃腺炎）を治療するために使用することができる。セファロスポリンとセフェムは中耳炎、所定の皮膚感染症、気管支炎、下気道感染症（肺炎）、及び骨感染症（所定部分）を治療するためにも使用され、外科予防の好適抗生物質である。セファロスポリンの例としてはセフィキシム、セフポトキシム、セフチブテン、セフジニル、セファクロル、セフプロジル、ロラカルベフ、セファドロキシル、セファレキシン、及びセフラジネゼが挙げられる。セフェムの例としてはセフェピム、セフピロム、セフタジジム５水和物、セフタジジム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフォタキシム、セフテラム、セフォチアム、セフロキシム、セファマンドール、セフロキシムアキセチル、セフォテタン、セファゾリンナトリウム、セファゾリン、セファレキシンが挙げられる。
【０１６８】
フルオロキノロン／キノロンはグラム陰性菌感染症を治療するために使用される抗生物質であるが、所定の新薬はグラム陽性菌と嫌気性生物に対する活性をもつ。フルオロキノロン／キノロンは尿路感染症、性感染症（例えば淋病、クラミジア尿道炎／子宮頸管炎、骨盤内炎症性疾患）、グラム陰性菌胃腸感染症、軟組織感染症、眼感染症、皮膚感染症、副鼻腔炎、外科手術部位感染症、及び気道感染症（例えば気管支炎、肺炎、及び結核）等の症状を治療するために使用することが多い。フルオロキノロン／キノロンは多剤耐性結核、発熱性好中球減少癌患者、及び潜在炭疽病等の症状を治療するためにも他の抗生物質と併用される。フルオロキノロン／キノロンの例としてはシプロフロキサシン、レボフロキサシン、オフロキサシン、シノキサシン、ナリジクス酸、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン、モキシフロキサシン、スパルフロキサシン、ゲミフロキサシン、及びパズフロキサシンが挙げられる。非フッ素化キノロン、ＰＧＥ９２６９３２及びＰＧＥ９５０９９２４（Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｅ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１６５１−７（２００２））や、シプロフロキサシンダイマー（Ｇｏｕｌｄ，Ｋ．Ａ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：２１０８−１５（２００４））等の他のキノロンも最近記載されている。しかし、所定のフルオロキノロンは副作用により広く利用できない。例えば、スパルフロキサシンは光線高感受性症の発生率が高く、グレパフロキサシンはＱＴｃ延長に結び付けられ、ロメフロキサシンは光線高感受性症の発生率が高い。
【０１６９】
糖ペプチドはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）等の他の抗生物質に耐性の細菌を治療するために使用される抗生物質である。ペニシリンアレルギー患者にも使用される。糖ペプチドの例としてはバンコマイシン、テイコプラニン、及びダプトマイシンが挙げられる。
【０１７０】
マクロリドは広域抗生物質であり、ペニシリンとセファロスポリンの主要代用薬である。マクロリドは気道感染症（例えば中耳炎、慢性副鼻腔炎、気管支炎、咽頭炎、肺炎、扁桃腺炎、及び連鎖球菌性咽頭炎）、性感染症（例えば子宮頸管や尿路の感染症、男性性器潰瘍、梅毒）、及び日和見感染症（例えば肺炎及びトリ結核菌（ＭＡＣ）感染症）を治療するために使用することが多い。マクロリドの例としてはエリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、アキシスロマイシン、ジリスロマイシン、トロレアンドマイシン、オレアンドマイシン、ロキシスロマイシン、及びテリスロマイシンが挙げられる。
【０１７１】
オキサゾリジノンは一般にグラム陽性菌感染症を治療するために投与される。カルバペネムはグラム陽性菌、グラム陰性菌、及び／又は嫌気性生物を治療するために使用される。オキサゾリジノンは耐性が出現した細菌に対して他の抗生物質類の代用薬として一般に使用される。オキサゾリジノンの例としてはリネゾリドが挙げられる。
【０１７２】
ペニシリンはグラム陽性菌、グラム陰性菌、及びスピロヘータ感染症を治療するために使用される広域抗生物質である。ペニシリンで治療されることが多い症状としては肺炎球菌性及び髄膜球菌性髄膜炎、皮膚感染症、耳感染症、呼吸器感染症、尿路感染症、急性副鼻腔炎、肺炎、及びライム病が挙げられる。ペニシリンの例としてはペニシリン、アモキシシリン、アモキシシリン−クラブラン酸、アンピシリン、チカルシリン、ピペラシリン−タゾバクタム、カルベニシリン、ピペラシリン、メゾシリン、ベンザチンペニシリンＧ、ペニシリンＶカリウム、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、及びジクロキサシリンが挙げられる。
【０１７３】
ストレプトグラミンは既存抗生物質の効力が低下した細菌耐性に対応して開発された抗生物質である。ストレプトグラミンは非常に小分類の薬剤であり、現状では非常に高価である。ストレプトグラミンの例としてはキヌプリスチン／ダフォプリスチンとプリスチナマイシンが挙げられる。
【０１７４】
スルホンアミドは有害イベントとそれに対する細菌耐性の増加により使用頻度が減っている広域抗生物質である。スルホンアミドはリウマチ熱の再発、尿路感染症、気管及び肺感染症予防、旅行者下痢症、百日咳、髄膜炎菌症、性感染症、トキソプラズマ症、及び鼻炎を治療するために一般に使用される。スルホンアミドの例としてはコトリモキサゾール、スルファメトキサゾールトリメトプリム、スルファジアジン、スルファドキシン、及びトリメトプリムが挙げられる。
【０１７５】
テトラサイクリンはグラム陽性菌、グラム陰性菌、及び／又はスピロヘータ感染症を治療するために使用することが多い広域抗生物質である。テトラサイクリンは慢性気管支炎及び腹膜炎、尿路感染症、リケッチア、クラミジア、淋病、ライム病、及び歯周病等の混合感染症を治療するために使用することが多い。テトラサイクリンは梅毒治療におけるペニシリン代用薬であり、座瘡や炭疽病の治療にも使用される。テトラサイクリンの例としてはテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、及びドキシサイクリンが挙げられる。
【０１７６】
本発明で意図される他の抗生物質（上記と重複するものもある）としては、アブリファム；アクロフロキサシン；アプテシン、アモキシシリン＋クラブロン酸；アミカシン；アパルシリン；アプラマイシン；アストロマイシン；アルベカシン；アスポキシシリン；アジドジリン；アジスロマイシン；アズロシリン；アズトレオナム；バシトラシン；ベンザシンペニシリン；ベンジルペニシリン；クラリスロマイシン、カルベンシリン；セファクロル；セファドキシル；セファレキシン；セファマンドール；セファパリン；セファトリジン；セファゾリン；セフブペラゾン；セフカペン；セフジニル；セフジトレン；セフェピム；セフェタメト；セフィキシム；セフメタゾール；セフミノクス；セフォペラゾン；セフォラニド；セフォタキシム；セフォテタン；セフォチアム；セフォキシチン；セフピミゾール；セフピラミド；セフドキシム；セフプロジル；セフラジン；セフロキサジン；セフスロジン；セフタジジム；セフトリアキソン；セフロキシム；セファレキシン；クロラムフェニコール；クロロテトラサイクリン；シクラシリン；シノキサシン；シプロフロキサシン；クラリスロマイシン；クレミゾールペニシリン；クレオシン、クレオシン−Ｔ、クリンダマイシン；クロキサシリン；コリファム；ダプトマイシン；ダプトマイシン；デメクロサイクリン；デスキノロン；ジベカシン；ジクロキサシリン；ジリスロマイシン；ドキソサイクリン；エノキサシン；エピシリン；エリスロマイシン；エタンブトール；ゲミフロキサシン；フェナムピシン；フィナミシナ；フレロキサシン；フロモキセフ；フルクロキサシリン；フルメキン；フルリスロマイシン；ホスホマイシン；ホスミドマイシン；フシジン酸；ガチフロキサシン；ゲミフロキサシン；ゲンタマイシン；イミペネム；イミペネム＋シリスタチン合剤；イセパマイシン；イソニアジド；ジョサマイシン；カナマイシン；カスガマイシン；キタサマイシン；カルリファム、ラタモキセフ；レボフロキサシン、レボフロキサシン；リンコマイシン；リネゾリド；ロモフロキサシン；ロラカルベフ；ライムサイクリン；メシリナム；メロペネム；メタサイクリン；メチシリン；メトロニダゾール；メズロシリン；ミデカマイシン；ミノサイクリン；ミオカマイシン；モキシフロキサシン；ナフシリン；ナフシリン；ナリジクス酸；ネオマイシン；ネチルマイシン；ノルフロキサシン；ノボビオシン；オフラキサシン；オレアンドマイシン；オキサシリン；オキソリン酸；オキシテトラサイクリン；パロマイシン；パズフロキサシン；ペフロキサシン；ペニシリンｇ；ペニシリンｖ；フェネチシリン；フェノキシメチルペニシリン；ピペミジン酸；ピペラシリン；ピペラシリン＋タゾバクタム合剤；ピロミジン酸；プロカインペニシリン；プロピシリン；ピリメタミン；リファジン；リファブチン；リファミド；リファンピン；リファマイシンｓｖ；リファペンテン；リフォマイシン；リマクタン、ロファクト；ロキタマイシン；ロリテトラサイクリン；ロキシスロマイシン；ルフロキサシン；シタフロキサシン；スパルフロキサシン；スペクチノマイシン；スピラマイシン；スルファジアジン；スルファドキシン；スルファメトキサゾール；シソマイシン；ストレプトマイシン；スルファメトキサゾール；スルフィソキサゾール；キヌプリスタン−ダルフォプリスタン；テイコプラニン；テリスロマイシン；テモシリン；ガチフロキサシン；テトラサイクリン；テトロキソプリム；テリスロマイシン；チアムフェニコール；チカルシリン；チゲサイクリン；トブラマイシン；トスフロキサシン；トリメトプリム；トリメトレキセート；トロバフロキサシン；バンコマイシン；ベルダマイシン；アジスロマイシン；及びリネゾリドが挙げられる。
【０１７７】
所定態様では、本発明の阻害剤はＤＮＡ損傷を誘発するか又はＤＮＡ複製もしくは修復を阻害することによりその効果を発揮する薬剤に対して耐性の微生物又は細胞を処置するために使用するか、あるいは前記薬剤と併用する。同様に、本発明の阻害剤はＤＮＡ損傷を誘発するか又はＤＮＡ複製もしくは修復を阻害することによりその効果を発揮する薬剤に対して細胞を感受性化するためにも使用される。各種抗微生物剤及び化学療法薬がこのようなメカニズムに関与することが知られている。例えば、スルホンアミドは葉酸の使用を妨げ、細菌複製を抑制する。また、本明細書に記載するように、フルオロキノロンはＤＮＡジャイレースとトポイソメラーゼＩＶを標的とすることによりＤＮＡ複製を抑制する。更に、所定のＤＮＡ損傷剤（例えばトリメトプリムやアミノプテリン）はＤＮＡ感受性又は「チミン飢餓死」に結び付けられるＤＮＡ損傷を誘発する。
【０１７８】
本明細書に記載するように、本発明の所定方法では、薬剤耐性微生物又は細胞を処置するためにＤＮＡ修復もしくは複製又はフォーク修復に関連するポリペプチドの阻害剤を使用する。各種薬剤耐性微生物が当分野で同定され、公知である。例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性腸球菌、及びフルオロキノロン耐性緑膿菌は有意耐性の問題がある。メチシリン感受性黄色ブドウ球菌、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ／ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＥ．ｃｏｌｉ等の各種微生物ではフルオロキノロン耐性が報告されている。耐性は臨床的に高レベルの耐性を生じるために単独突然変異で十分であった種（例えば黄色ブドウ球菌や緑膿菌）で最初に出現した（Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．７：３３７−４１（２００１））。その後、臨床的に高い耐性で多重突然変異が一般に認められる細菌（例えばＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）で耐性が出現した。
【０１７９】
広域耐性を示す細菌株の１例は肺炎球菌である。耐性はペニシリンに対して３４％、マクロリドに対して２０〜３０％、テトラサイクリンに対して１７％、トリメトプリム−スルファメトキサゾールに対して３６％、フルオロキノールに対して３％であり、２２％多剤耐性である（Ｄｏｅｍ，Ｇ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５：１７２１−１７２９（２００４）；Ｊａｃｏｂｓ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ３５：５６５−５６９（２００２）；Ｈｏｂａｎ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ３２：５８１−５８３（２００１））。フルオロキノロン耐性肺炎球菌の出現率は現在低いが、肺炎球菌のフルオロキノロン耐性株の例が認められている。
【０１８０】
多数の他の広く使用されている抗微生物剤（例えばペニシリン、エリスロマイシン、レボフロキサシン及びテリスロマイシン）に対する耐性も益々増加しつつある。更に、院内及び他の施設における緑膿菌感染症の発生率は増加しつつあり、現在全院内感染症の１０％を上回っているように、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの耐性株は依然として問題があることが明らかである。現在Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに対して有効であるとみなされている抗生物質は数種（例えば各種フルオロキノロン、ゲンタマイシン及びイミペネム）に過ぎず、これらの抗生物質でも全株に有効なわけではない。例えば、現在利用可能な抗生物質プロトコールによるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染症の治療が無益であることは嚢胞性線維症患者のほぼ全員が有効に治療することができない薬剤耐性株に最終的に感染するという劇的結果から明らかである。
【０１８１】
公知薬剤耐性の例としては、シプロフロキサシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；レボフロキサシン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｖｉｒｉｄａｎｓ群、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；スルファメトキサゾール・トリメトプリム耐性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．Ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；アンピシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、及びＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；オキサシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びコアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ；ペニシリン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＶｉｒｉｄａｎｓ群；ピペラシリン・タゾバクタム耐性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；セフェピム耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；セフォタキシム耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；セフトリアキソン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；ゲンタマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｏｂａｃｔｅｒ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；クラリスロマイシン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、及びＶｉｒｉｄａｎｓ群；エリスロマイシン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、及びＶｉｒｉｄａｎｓ群；テイコプラニン耐性Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ；バンコマイシン耐性Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ及びＥ．ｆａｅｃｉｕｍ；並びにイミペネム耐性Ａｃｉｎｏｂａｃｔｅｒ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが挙げられるが、以上の例に止まらない。
【０１８２】
所定態様では、本発明の組成物は更に抗真菌薬を含有するか又は抗真菌薬と併用投与する。各種抗真菌薬が存在する。抗真菌薬の例としては限定されないが、アリルアミン及び他の非アゾール系エルゴステロール生合成阻害剤、代謝拮抗薬、アゾール、グルカン合成阻害剤、ポリエン、並びに他の種々の全身抗真菌薬が挙げられる。
【０１８３】
所定態様では、本発明の組成物は更に抗ウイルス薬を含有するか又は抗真菌薬と併用投与する。抗ウイルス薬の例としては限定されないが、単純ヘルペス角結膜炎の局所療法で使用されるイドクスウリジン（ＩＤＵ）；例えばＨＳＶ感染の治療に使用されるビダラビン（アデニンアラビノシド，ａｒａ−Ａ）；ＤＮＡ合成を妨害し、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に起因する原発性角結膜炎や再発性角膜炎の治療に有効なチミジンアナログであるトリフルリジン（トリフルオロチミジン）；ヘルペスやサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対する活性をもつプリンヌクレオシドアナログであるアシクロビル；活性抗ウイルスペンシクロビルのプロドラッグであり、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、及びＨＢＶを治療するために使用されるファムシクロビル；ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ウイルスＤＮＡポリメラーゼを阻害するグアノシンアナログであるペンシクロビル；バラシクロビル；ＣＭＶを含む全ヘルペスウイルスとＨＩＶ及びＣＭＶ網膜炎に対して使用されるガンシクロビル；ウイルス特異的ＤＮＡポリメラーゼや逆転写酵素を阻害する無機ピロリン酸塩の有機アナログであるフォスカルネット；多くのＲＮＡ及びＤＮＡウイルスの複製を抑制するグアノシンアナログであるリバビリン；主にインフルエンザＡ予防及び治療に使用され、ワクチンからの免疫発生を妨害するアマンタジン及びリマンタジン；ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、アデノウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、及びヒトポリオーマウイルス等の広域ウイルスや、オリゴヌクレオチド、免疫グロブリン（例えば高度免疫ＣＭＶイムノグロブリン）及びインターフェロンに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害活性をもつヌクレオチドアナログであるシドフォビル（シトシン；ＨＰＭＰＣ）が挙げられる。
【０１８４】
所定態様では、本発明の組成物は更に抗腫瘍薬又は化学療法用化合物を含有するかあるいはこれらと併用投与される。特定態様では、抗腫瘍薬はＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ複製を抑制する物質、又はトポイソメラーゼ毒である。アントラサイクリン、アムサクリン及びエリプチシンはトポイソメラーゼＩＩ毒として作用するインターカレート剤の例である。カンプトテシンとＶＭ２６（テニポシド）はＤＮＡトポイソメラーゼＩ及びトポイソメラーゼＩＩを夫々標的とする代表的ＤＮＡトポイソメラーゼ毒である。カンプトテシン（ＣＰＴ）化合物としては各種２０（Ｓ）−カンプトテシン、２０（Ｓ）カンプトテシンアナログ、及び２０（Ｓ）−カンプトテシン誘導体が挙げられる。本発明の関連で使用する場合のカンプトテシンとしては植物アルカロイド２０（Ｓ）−カンプトテシン、置換及び非置換カンプトテシン、並びにそのアナログが挙げられる。カンプトテシン誘導体の例としては限定されないが、９−ニトロ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、９−アミノ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、９−メチル−カンプトテシン、９−クロロカンプトテシン、９−フルオロ−カンプトテシン、７−エチルカンプトテシン、１０−メチルカンプトテシン、１０−クロロ−カンプトテシン、１０−ブロモ−カンプトテシン、１０−フルオロ−カンプトテシン、９−メトキシ−カンプトテシン、１１−フルオロ−カンプトテシン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、１０，１１−エチレンジオキシカンプトテシン、及び７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシンが挙げられる。カンプトテシンのプロドラッグとしては限定されないが、米国特許第５，７３１，３１６号に記載されているようなエステル化カンプトテシン誘導体、例えば２０−Ｏ−プロピオン酸カンプトテシン、２０−Ｏ−酪酸カンプトテシン、２０−Ｏ−吉相酸カンプトテシン、２０−Ｏ−ヘプタン酸カンプトテシン、２０−Ｏ−ノナン酸カンプトテシン、２０−Ｏ−クロトン酸カンプトテシン、２０−Ｏ−２’，３’−エポキシ−酪酸カンプトテシン、２０−Ｏ−酢酸ニトロカンプトテシン、２０−Ｏ−プロピオン酸ニトロカンプトテシン、及び２０−Ｏ−酪酸ニトロカンプトテシンが挙げられる。２０（Ｓ）−カンプトテシンの特定例としては９−ニトロカンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシ−２０（Ｓ）カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、又は７、９、１０、１１、もしくは１２位のうちの少なくとも１個を置換された別の置換カンプトテシンが挙げられる。これらのカンプトテシンは場合により置換されていてもよい。
【０１８５】
本発明の阻害剤と合剤化又は併用投与することができる抗腫瘍薬の他の例としてはアシビシン；アクラルビシン；塩酸アゴダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アムボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アンスラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾドマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィドジメシラート；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブリキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチメル；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴル；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシラート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシラート；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；ズアゾマイシン；エダトレキセート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エチオダイズド油；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロキスリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イフォスファミド；イルモホシン；インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトトレキセートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；パーホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；塩化ストロンチウムｓｒ  ８９；スロフェヌル；タリソマイシン；タキサン；タキソイド；テコガランナトリウム；テガフル；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；塩酸トポテカン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトトレキセート；グルクロン酸トリメトトレキセート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；及び塩酸ゾルヒシンが挙げられる。本明細書に開示するか又は当分野で公知の他の抗腫瘍薬も本発明により意図される。
【０１８６】
本発明は１種以上のＤＮＡ修復又は複製阻害剤を含むキットも含む。キットは更に１種以上の付加治療化合物（抗微生物又は細胞傷害性物質又は化合物、例えば抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗原生動物薬等の抗微生物薬、又は例えば化学療法薬等の細胞傷害性物質）を含むことができる。
【０１８７】
一般に、本発明のキットはその１個に本発明の阻害剤を収容した１個以上のバイアル又は容器と、キットの使用説明書を含む。例えば、説明書は使用する特定阻害剤、投与用量、使用頻度及び期間、並びに投与方法について個人に指示することができる。バイアルは医薬製剤として阻害剤を収容していることが好ましい。所定態様では、キットは局所又は全身投与用に製剤化された阻害剤の１個以上のバイアルを含む。所定態様では、付加バイアルに別の治療薬（例えば抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗腫瘍薬、又は抗原生動物薬）を含む。阻害剤と第２の治療薬は投与前に混合してもよいし、別々に投与してもよい。
【０１８８】
上記のように、本発明の阻害剤は微生物及び細胞を抗微生物及び細胞傷害性物質に対して感受性化する。従って、本発明の阻害剤を使用すると、抗微生物又は細胞傷害性物質の使用量が阻害剤の不在下で治療又は予防効果に必要な用量よりも少なくてすむ。原則的に、本発明の阻害剤を他の治療剤又は治療薬と併用すると、治療剤又は治療薬のＭＩＣは低下する。
【０１８９】
従って、本発明は抗微生物及び細胞傷害性物質（限定されないが、本明細書に記載する抗生物質や化学療法薬）の使用量を当分野で従来使用されているか又は有効であることが示されている量よりも少なくすることができる。これは高用量の活性剤に伴う副作用を減らし、抗微生物及び細胞傷害性物質治療に伴う費用を低減するという点で明らかに有利である。従って、所定状況では、本発明の阻害剤と併用投与（投与前又は投与後を含む）すると、従来は副作用や高費用の可能性により１個以上の患者集団での使用に利用できないか又は推奨できなかった抗微生物又は細胞傷害性物質を使用できるようになる。更に、従来予想されなかった用途（例えば潜在的副作用の危険を冒すほど重篤ではないとみなされた症候や、従来はもっと安価な代替治療法を選択していた症候）にも抗微生物又は細胞傷害性物質を使用できるようになる。更に、使用量が少量ですむので、所定薬剤を小児患者にも使用し易くなる。例えば、フルオロキノロン（例えばシプロフロキサシン）は軟骨損傷の恐れがあるため、小児患者では一般に使用されない。低用量を本発明の阻害剤と併用すれば、このような薬剤を小児患者でも使用できる。同様に、本発明によると、効力に必要な用量では望ましくない毒性プロフィルをもつため、従来は使用されていなかった薬剤を使用できるようになる。必要用量が減るので、毒性プロフィルを許容可能なレベルまで下げることができる。
【０１９０】
従って、キットが付加活性剤又は治療剤を含むか、あるいは方法が付加活性剤又は治療剤を投与することを含む本発明のキット及び方法の所定態様では、キット又は方法は当分野で従来使用されているよりも少量の付加活性剤又は低単位用量形態の前記付加活性剤を含む。
【０１９１】
本発明は更に本発明の阻害剤の生産方法及び製造方法を含む。１態様では、抗微生物又は細胞傷害性化合物に対する微生物又は細胞の感受性を増強する化合物の製造方法は、化合物のライブラリーをスクリーニングし、２本鎖ＤＮＡ切断修復又は複製フォーク停止修復に関連するポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する段階と、同定された化合物を製造する段階を含む。他の態様では、前記方法は、同定された化合物を誘導体化する段階と、ＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドの活性を阻害する能力について誘導体化した化合物を試験する段階を更に含む。
【０１９２】
別の態様では、薬剤耐性微生物に対して抗微生物性の化合物の製造方法は、化合物のライブラリーをスクリーニングし、ＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する段階と、誘導体化した化合物を製造する段階を含む。他の態様では、前記方法は、同定された化合物を誘導体化する段階と、ＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドの活性を阻害する能力について誘導体化した化合物を試験する段階を更に含む。
【０１９３】
本発明の他の態様は薬剤耐性腫瘍細胞に対して細胞傷害性の化合物の製造方法として、化合物のライブラリーをスクリーニングし、組換え依存性ＤＮＡ修復に関連するポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する段階と、同定された化合物を製造する段階を含む。この場合も、前記方法は、同定された化合物を誘導体化する段階と、組換え依存性ＤＮＡ修復に関連するポリペプチドの活性を阻害する能力について誘導体化した化合物を試験する段階を更に含む。
【０１９４】
Ｃ．阻害剤の同定方法
薬剤耐性微生物及び細胞の耐性が出現するためにはＤＮＡ修復又は複製経路が必要であるという発見は、薬剤耐性微生物及び細胞の生存を低下させ、及び／又は抗微生物薬及び化学療法薬に対する微生物及び細胞の感受性を増加させるのに有用なＤＮＡ修復又は複製阻害剤の同定方法の基礎となる。これらの方法は１種以上の候補阻害剤を試験するため、又は化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。
【０１９５】
所定態様では、相同組換えを阻害する化合物及び組成物の同定方法は本明細書に記載する任意ポリペプチド等のＤＮＡ修復又は複製に関与するポリペプチドと結合するか又はその活性を阻害する阻害剤の同定に基づく。特定態様では、ポリペプチドはＲｅｃＢ、ＲｅｃＡ、又はＰｒｉＡである。ポリペプチドと結合する分子の同定方法は当分野で広く利用可能であり、公知である。特定ポリペプチドと特異的に結合する能力を測定するために分子をスクリーニング又は試験する方法については、当分野で利用可能な一般知識に基づき、スクリーニングする特定分子種に鑑みて当業者に十分に認識されよう。
【０１９６】
１態様では、本発明は抗微生物化合物の抗微生物活性（又は化学療法薬の抗腫瘍活性）を増加する物質を同定する一般方法として、（ａ）ＲＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドと結合する能力について１種以上の候補物質をスクリーニングする段階と；（ｂ）前記ポリペプチドと結合する１種以上の物質を同定する段階を含む方法を提供する。
【０１９７】
別の態様では、本発明は薬剤耐性微生物又は細胞に対して抗微生物性又は細胞傷害性の物質を同定する一般方法として、（ａ）ＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドと結合する能力について１種以上の候補物質をスクリーニングする段階と；（ｂ）前記ポリペプチドと結合する１種以上の物質を同定する段階を含む方法を提供する。
【０１９８】
１態様では、阻害剤は分子又は化合物（例えば小分子）のライブラリーをスクリーニングすることにより同定される。このようなライブラリーとライブラリーのスクリーニング方法は当分野で公知であり、生物ライブラリー、天然物ライブラリー、空間的にアドレス可能な並列固相又は溶液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法が挙げられる。生物ライブラリーアプローチは主にポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４種のアプローチは化合物のポリペプチド、非ペプチドオリゴマー又は小分子ライブラリーに適用可能である。Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５参照。所定態様では、ライブラリーのスクリーニングは複数化合物（例えば小分子、ポリペプチド、又は抗体）の試験を同時に可能にするアレー又はマイクロアレーを使用して実施される。特定態様では、スクリーニングは高スループットスクリーニングである。
【０１９９】
１態様では、阻害剤は自動リガンド同定システム（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；本明細書では「ＡＬＩＳ」と言う）を使用して同定される。例えば米国特許第６，７２１，６６５号、６，７１４，８７５号、６，６９４，２６７号、６，６９１，０４６号、６，５８１，０１３号、６，２０７，８６１号、及び６，１４７，３４４号参照。ＡＬＩＳは該当蛋白（例えばＲｅｃＢ，ＰｒｉＡ，又はＲｅｃＡ）と結合する小分子の同定用の高スループット技術である。蛋白と強く結合したことが判明した小分子をその後、前記蛋白の生化学活性を阻害する能力について試験することができる。
【０２００】
従って、所定態様では、標的蛋白（例えばＲｅｃＢ，ＲｅｃＡ，又はＰｒｉＡ）を小分子のプールと混合する。好ましくは、＞１，０００プールを使用し、より好ましくは＞２，０００プールを使用し、より好ましくは＞３，０００プールを使用し、又はより好ましくは＞１０，０００プールを使用する。各プールは「マスコード化」された約１，０００種の化合物、より好ましくは約２，５００種の化合物、又はより好ましくは約５，０００種の化合物を含み、即ちその質量と化学ライブラリーの情報のみを使用してその厳密な分子構造を決定することができる。
【０２０１】
小分子と蛋白を混合し、平衡させる（３０分間室温でインキュベートする）。混合物を迅速に冷却して結合複合体をトラップし、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に付す。該当蛋白と強く結合する小分子はＳＥＣ中に蛋白と共に排除される。質量分析を実施し、蛋白に結合することが判明した全小分子の質量を測定する。これらの質量の測定により、小分子の分子構造を迅速に決定することができる。
【０２０２】
所定態様では、このようなスクリーニング方法はＤＮＡ修復又は複製経路の成分と結合する能力に基づいて同定された物質が抗微生物化合物の抗微生物活性を増加する能力又は化学療法用化合物の細胞傷害活性を増加する能力について試験する段階を更に含む。他の態様では、このようなスクリーニング方法はＤＮＡ修復又は複製経路の成分と結合する能力に基づいて同定された物質を薬剤耐性微生物又は細胞に対する抗微生物活性又は細胞傷害活性について試験する段階を更に含む。
【０２０３】
別の態様では、ファージディスプレイ法を使用してＤＮＡ修復又は複製経路のポリペプチド成分と結合するペプチド又はポリペプチドを同定する。
【０２０４】
他の関連態様では、ＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドの１種以上の酵素又は生物活性を妨害する能力に基づいてＤＮＡ修復又は複製の阻害剤を同定する。各種態様では、このようなポリペプチドはＲｅｃＢＣ（Ｄ）のヘリカーゼ、ＡＴＰアーゼ、もしくはヌクレアーゼ活性、又はＰｒｉＡもしくはＲｕｖＡＢのヘリカーゼ活性の１種以上を含む。各種ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが公知であり、ヘリカーゼ、ＡＴＰアーゼ、及びヌクレアーゼ活性を測定するために利用可能であり、任意のものを本発明により使用することができる。所定態様では、組換えにより作製されたＤＮＡ修復又は複製（例えばＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換え）に関与するポリペプチドを使用してこのようなアッセイを実施する。このようなポリペプチドは個別に使用することもできるし（例えばＲｅｃＢ、ＲｅｃＡ、又はＰｒｉＡ）、併用することもできる（例えばＲｅｃＢＣ（Ｄ））。
【０２０５】
他の態様では、ＤＮＡ修復又は複製の阻害剤を同定するための機能アッセイは全細胞アッセイを含む。例えば、１態様では、トポイソメラーゼ（例えばトポイソメラーゼ毒）を標的とする薬剤等の抗微生物薬又は化学療法薬に対して細胞を感受性化するＤＮＡ修復又は複製の阻害剤を同定するために全細胞スクリーニングを実施する。更に、所定態様では、ＤＮＡ修復又は複製の阻害剤の同定方法は、潜在的阻害剤、又はそのライブラリーをスクリーニングし、野生型大腸菌とＳ８３Ｌ及びｐａｒＣ突然変異の一方又は両方を含む大腸菌の両者を抗生物質に対して感受性化する阻害剤を同定する段階を含む。
【０２０６】
本発明の全細胞アッセイは限定されないが、ＤＮＡ修復又は複製に関連する特定経路又はポリペプチドを標的とする阻害剤を同定するように設計されたものである。より正確に言うと、所定態様では、本発明の全細胞アッセイは抗微生物又は細胞傷害性物質に対する微生物又は細胞の感受性を増強する能力に直接基づいて阻害剤を同定するために使用される。同定された阻害剤がＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドの活性又は発現を阻害する能力は別のアッセイで確認することができる。
【０２０７】
例えば、特定態様では、哺乳動物細胞をトポイソメラーゼ毒に対して高感受性化する阻害剤を小分子ライブラリーの標準ＨＴＳスクリーニングにより同定する。これらの物質のターゲットは標準化学ゲノム法により同定される。同定された標的に標準ＳＡＲ及び最適化スキームを実施する。特定態様では、このようなスクリーニングはそのトポイソメラーゼに突然変異をもつ細胞を使用して実施される（ｇｙｒＡでの合成致死性スクリーニングとほぼ同様）。他の態様では、突然変異体トポイソメラーゼをもつ細胞を元のトポイソメラーゼ毒に対して高感受性化する阻害剤を同定するためにこのようなスクリーニングを使用する。
【０２０８】
抗微生物又は細胞傷害性化合物に対する微生物又は細胞の感受性を増強する化合物を同定するための全細胞スクリーニングの１特定態様では、方法は微生物又は細胞を抗微生物又は細胞傷害性物質の存在下で候補化合物と接触させる段階と、その後、候補化合物で処理していない微生物又は細胞に比較して抗微生物又は細胞傷害性物質に対する前記微生物又は細胞の感受性が増加したか否かを判定する段階を含む。感受性が増加したならば、候補化合物が抗微生物又は細胞傷害性物質に対する微生物又は細胞の感受性を増強すると判断する。
【０２０９】
これらの方法は任意微生物又は細胞と、任意抗微生物又は細胞傷害性物質（例えば本明細書に記載するもの）を使用して実施することができる。特定態様では、方法はフルオロキノロン（例えばシプロフロキサシン）を使用して実施される。
【０２１０】
特定態様では、方法はＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドをコードする遺伝子に突然変異（例えばｇｙｒＡのＳ８３もしくはＤ８７又はｐａｒＣのＳ８０の突然変異）を含む微生物又は細胞を使用して実施される。
【０２１１】
全細胞スクリーニングの別の特定態様では、本発明は抗微生物又は細胞傷害性物質により誘導されるＳＯＳ応答経路、突然変異誘発、及び／又は薬剤耐性の誘導を阻害する化合物の同定方法を含み、前記方法はＳＯＳ経路誘導レポーター遺伝子を含む微生物又は細胞を亜致死量の抗微生物又は細胞傷害性物質の存在下で候補化合物と接触させる段階と、候補化合物で処理していない前記ポリヌクレオチドを含む微生物又は細胞に比較して候補化合物と接触させた微生物又は細胞でレポーターポリペプチドの発現が低下するか否かを判定する段階を含む。レポーター遺伝子の発現が低下したならば、化合物は抗微生物又は細胞傷害性物質に対する微生物又は細胞の感受性を増強すると判断する。
【０２１２】
レポーター遺伝子構築物は一般に誘導プロモーターを含み、レポーターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。各種レポーターポリペプチド当分野で公知であり、利用可能であり、例えばルシフェラーゼが挙げられる。本発明のこの側面の１態様では、ＳＯＳ経路誘導プロモーター配列はＳＯＳ経路活性化に応答して誘導されることが知られている遺伝子（例えばエラープローンポリメラーゼ遺伝子）のプロモーター又はエンハンサー配列の一部を含む。
【０２１３】
本明細書に記載する機能アッセイ及び全細胞アッセイの各種態様は同定された阻害剤が初期アッセイで使用したものに由来する微生物又は細胞でＤＮＡ修復、組換え、又は複製経路を低減又は阻害するか否かを判定する段階を含む。例えば、１態様では、細菌ＤＮＡ修復、組換え、又は複製の阻害剤を同定するために初期アッセイを実施する。同定された阻害剤を次に、哺乳動物細胞で関連経路を阻害する能力についてアッセイする。このような方法を利用して哺乳動物患者の感染症を治療するために特に有用な微生物又は細胞特異的阻害剤を同定することができる。
【０２１４】
全細胞スクリーニングアッセイは候補化合物ライブラリーを使用して実施することができ、例えば蛍光プレートリーダー装置を使用して同時にアッセイ可能な複数ウェルを含むマイクロタイタープレートの使用等の高スループット法を使用して実施することができる。
【０２１５】
所定態様では、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）ヘリカーゼ又は加水分解活性を妨害又は低下する能力に基づいてＲｅｃＢＣ（Ｄ）の阻害剤を同定する。特定態様では、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性を試験する。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）の二重酵素活性（即ちＡＴＰ加水分解とＤＮＡ巻き戻し）により、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を決定するための２種の異なるアッセイが得られる。ＡＴＰ加水分解酵素はＰｉ、ＡＤＰ、及びＨ＋を生成する。これらの種の各々の形成をモニターするための技術が開発されている。例えば、１つの技術は酵素ピルビン酸キナーゼを使用してＡＤＰをＡＴＰに逆変換し、この過程でホスホエノールピルビン酸からピルビン酸を生成する。第２の酵素であるＬ−乳酸脱水素酵素はＮＡＤＨを使用してピルビン酸を乳酸に変換し、それに伴う３４０ｎｍの吸光度の低下は標準プレートリーダーで容易にモニターされる（Ｋｉｉｎｉｔｓａ，Ｋ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２１：２６６−２７１（２００３））。
【０２１６】
ヘリカーゼ活性のより直接的な観測手段はフルオロフォア−クエンチャー対で相補鎖を標識したＤＮＡ基質を使用する方法である。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）によるＤＮＡの巻き戻しに伴い、２個のプローブ間の距離が増加するにつれて蛍光が著しく増加する（Ｌｕｃｉｕｓ，Ａ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３９：７３１−７５０（２００４））。
【０２１７】
温度感受性突然変異ｐａｒＥ１０（Ｔｓ）をもつ大腸菌株はトポイソメラーゼＩＶが不活性な非許容温度で生存するためにＰｒｉＡに依存する（Ｍｉｃｈｅｌら，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８６：１１９７−１１９９，２００４）。従って、非許容温度でこの株を死滅させる分子をスクリーニングすることによりＰｒｉＡ（又は修復経路の他の段階）の阻害剤を同定することができる。
【０２１８】
温度感受性ｇｙｒＡ２０８又はｇｙｒＢ６５２突然変異をもつＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株は生存のためにＲｅｃＢＣ（Ｄ）機能に依存する（Ｂｏｓｓｉら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．２１：１１１−１２２，１９９６）。これらはｇｙｒＡ  ＦＱ耐性突然変異の表現型に類似すると考えられる。従って、所定態様では、この株に致死性の小分子について非許容温度でスクリーニングすることにより阻害剤を同定する。
【０２１９】
細胞増殖を抑制するか又は細胞を抗生物質治療（例えばフルオロキノロン治療）に対して感受性化する分子についてＧｙｒＡのＦＱ結合部位にｇｙｒＡＳ８３Ｌ又は他の突然変異をもつ大腸菌をスクリーニングすることにより阻害剤を同定することができる。
【０２２０】
他の態様では、分子構造のリアルな三次元モデルを作成する分子モデリングソフトウェアツールを使用してＤＮＡ修復又は複製（例えばＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換え）（並びに他の相同及び非相同組換え経路）の阻害剤を同定する。このような方法としては例えば分子グラフィクス（即ち３Ｄ表示）やコンピューター化学（例えば物理化学的性質の計算）の使用が挙げられる。
【０２２１】
分子モデリングを使用すると、適正な薬剤設計プログラムは異なる薬剤様化合物のどの集合が酵素の活性部位に合致するかを予測することができ、その結合コンホメーションをコンピューター調節することにより、どの化合物が実際に活性部位によく合致するかを決定することができる。Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂａｉｎｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｒｏｍ  Ａ  ｔｏ  Ｚ，第２版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８，２５９頁参照。
【０２２２】
分子モデリングに関する基礎情報は当分野で公知であり、入手可能である。例えばＭ．Ｓｃｈｌｅｃｈｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＰＣ，１９９８；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｇａｎｓら，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，１９９６，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．；Ｎ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎ（編），Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，１９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びＷ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，１９９６参照。分子モデリングに関する詳細な情報を提供する米国特許としては、米国特許第６，０９３，５７３号；６，０８０，５７６号；５，６１２，８９４号；５，５８３，９７３号；５，０３０，１０３号；４，９０６，１２２号；及び４，８１２，１２号が挙げられる。
【０２２３】
例えば、１態様では、分子モデリング及びドッキング法を使用して仮想化合物ライブラリーから候補結合剤を選択できるように当分野で周知の方法によりＲｅｃＢＣ（Ｄ）の三次元構造を使用する（Ｓｉｎｇｅｌｔｏｎ，Ｍ．Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１８７−９３（２００４））。特定態様では、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）の特定領域（例えばχ切断部位、「トンネル」を形成する領域、又はヌクレアーゼ活性、例えばエキソヌクレアーゼもしくはエンドヌクレアーゼに必要な領域）と結合する候補結合剤を選択する。
【０２２４】
本発明によると、ＤＮＡ修復又は複製に関連するポリペプチドと結合し、その分子構造が決定されているか又は予想することができる化合物（例えば阻害剤）を設計及び選択するために分子及びコンピューターモデリング技術を使用することができる。
【０２２５】
本発明によると、ＤＮＡ修復又は複製の非競合的阻害剤として作用する化合物を設計することもできる。これらの阻害剤は例えばＲｅｃＡ又はＲｅｃＢの活性部位の全体又は一部と結合することができる。同様に、ＲｅｃＡ又はＲｅｃＢの原子座標を使用して（別の化学物質と結合しているか否かに関係なく）ＲｅｃＡ又はＲｅｃＢと結合し、ＲｅｃＡ又はＲｅｃＢを阻害する非競合的阻害剤を設計することもできる。
【０２２６】
上述したように、ＤＮＡ基質と結合したＲｅｃＢＣ（Ｄ）の結晶構造は決定されている（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｍ．Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１８７−９３（２００４）。更に、ＲｅｃＡポリペプチドの結晶構造も決定されている（Ｘｉｎｇ，Ｘ．ａｎｄ  Ｂｅｌｌ，Ｃ．Ｅ．Ｊ．，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３４２：１４７１−８５（２００４））。これらの構造からその機能を妨害するように標的化することができる重要な機能ドメインに関して予測できると共に、阻害剤の分子モデリングの基礎が得られる。従って、関連結晶構造情報から阻害剤の構造特徴を決定することができる。
【０２２７】
他の態様では、本発明によると、ＤＮＡ修復又は複製に関与するポリペプチド（例えばＲｅｃＢ、ＰｒｉＡ、又はＲｅｃＡ）と完全又は部分的に結合することにより、相同組換え、非相同組換え、又は複製フォーク停止修復を阻止することができる化学物質、薬剤、又は化合物について小分子データベースをコンピュータースクリーニングすることができる。このスクリーニング技術では、このような物質又は化合物が結合部位と合致する品質を形状相補性又は推定相互作用エネルギーにより判断することができる。Ｍｅｎｇ，Ｅ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｏｍａ．Ｃｈｅｍ．，１３：５０５−５２４（１９９２）参照。
【０２２８】
ＤＮＡ修復又は複製に関与するポリペプチド（例えばＲｅｃＢ、ＰｒｉＡ、又はＲｅｃＡ）と結合するか又はその１種以上の活性を阻害する本発明の化合物を設計するには、一般に２つの因子を考慮する必要がある。第１に、化合物は標的ポリペプチドと物理的に会合できなければならない。化合物と標的ポリペプチドの会合に重要な非共有的分子相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス及び疎水性相互作用が挙げられる。第２に、化合物は標的ポリペプチドとの会合を可能にするコンホメーションをとることができなければならない。化合物の所定部分は標的ポリペプチドとのこの会合に直接関与しないが、これらの部分は分子のコンホメーション全体にはまだ影響をもっている可能性がある。これは効力にも有意影響を与える可能性がある。このようなコンホメーション要件としては総合三次元構造と標的ポリペプチドの活性部位の全部又は一部に対する化学物質又は化合物の方向あるいは標的ポリペプチドと直接相互作用する数種の化学物質を含む化合物の官能基間の間隔が挙げられる。
【０２２９】
ＤＮＡ修復又は複製に及ぼす化合物の潜在的阻害又は結合効果はその実際の合成の前にコンピューターモデリング技術を使用することにより分析することができる。所与化合物の理論構造から標的ポリペプチドとの間に潜在的会合が認められない場合には、化合物の合成と試験を実施しない。他方、コンピューターモデリングにより強い相互作用の可能性が示唆される場合には、分子を合成し、標的ポリペプチドと結合し、ＤＮＡ修復又は複製（例えば相同組換えやフォーク修復）に関連する活性を阻害する能力について試験することができる。こうして、不活性化合物の合成を避けることができる。
【０２３０】
当業者は標的ポリペプチドと会合する能力について化学物質フラグメント、化合物、又は薬剤をスクリーニングするために数種の方法の１つを使用することができる。この方法はまず例えば、実際又は予想構造情報に基づいて同定された標的ポリペプチドの活性部位を目視確認する。次に、選択された化学物質、化合物、又は薬剤を標的ポリペプチドの個々の結合ポケットの内側に種々の方向に配置するか又はドッキングすることができる。ドッキングはＱｕａｎｔａやＳｙｂｙｌ等のソフトウェアを使用した後にＣＨＡＲＭＭやＡＭＢＥＲ等の標準分子力学力場によるエネルギー最小化と分子力学法を使用することにより実施することができる。
【０２３１】
専門コンピュータープログラムも化学物質選択法に役立つ。これらのプログラムとしては限定されないが、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，ＰＪ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：８４９−８５７（１９８５））（ＧＲＩＤはＯｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能である）；ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ，Ａ．ら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９９１）Ｖｏｌ．１１，２９−３４）（ＭＣＳＳはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓから入手可能である）；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ  Ａ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ，“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｏｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ”  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８，１９５−２０２（１９９０））（ＡＵＴＯＤＯＣＫはＳｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能である）；ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１：２６９−２８８（１９８２））（ＤＯＣＫはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能である）が挙げられる。
【０２３２】
適切な化学物質、化合物、又は薬剤が選択されたら、単一化合物又は阻害剤に組み立てることができる。組み立てはコンピュータースクリーン上に表示された三次元画像で標的ポリペプチドの原子座標に対してフラグメントの相互関係を目視確認することにより進めることができる。その後、ＱｕａｎｔａやＳｙｂｙｌ等のソフトウェアを使用してマニュアルでモデル構築を行う。
【０２３３】
当業者が個々の化学物質、化合物、又は薬剤を結合するのに役立つ有用なプログラムとしては限定されないが、ＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｐ．Ａ．ら，“ＣＡＶＥＡＴ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”．Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ”，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂ．，Ｒｏｙａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，７８：８２−１９６（１９８９））（ＣＡＶＥＡＴはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能である）；ＭＡＣＣＳ−３Ｄ（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆ．）等の３Ｄデータベースシステムが挙げられる。この分野はＭａｒｔｉｎ，Ｙ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：２１４５−２１５４（１９９２）に記載されている。更に、ＨＯＯＫ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．から入手可能）も挙げられる。
【０２３４】
上記のように阻害剤を一度に化学部分１個ずつ段階的に設計する代わりに、空の結合部位又は場合により公知阻害剤の所定部分を使用して阻害剤を全体として又は「ｄｅ  ｎｏｖｏ」設計することもできる。これらの方法としては、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｈ．−Ｊ．，Ｊ．ＣｏｍＲ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ  ６：６１−７８（１９９２））（ＬＵＤＩはＢｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能である）；ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．ａｎｄ  Ａ．Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４７：８９８５（１９９１））（ＬＥＧＥＮＤはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．から入手可能である）；及びＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から入手可能）が挙げられる。
【０２３５】
他の分子モデリング技術も本発明により利用することができる。例えばＣｏｈｅｎ，Ｎ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３：８８３−８９４（１９９０）参照。Ｎａｖｉａ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２０２−２１０（１９９２）も参照。
【０２３６】
上記方法により化合物を設計又は選択したら、化合物がＤＮＡ修復又は複製経路の成分と結合してその活性を阻害することができる効率をコンピューター評価により試験し、最適化することができる。有効なＤＮＡ修復又は複製阻害剤はその結合状態と遊離状態の間のエネルギー差が比較的小さい（即ち結合の歪みエネルギーが小さい）ことが好ましい。従って、最も有効な阻害剤は好ましくは結合の歪みエネルギーが約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ以下、又はより好ましくは７ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ以下となるように設計すべきである。
【０２３７】
上記のように阻害剤が最適選択又は設計されたら、次にその結合特性を改善又は改変するようにその原子又は側鎖のいくつかを置換することができる。一般に、初期置換は保存的であり、例えば置換基は元の基とほぼ同一寸法、形状、疎水性及び電荷をもつ。当然のことながら、このような置換が特定該当用途に望ましい場合を除き、コンホメーションを変化させることが当分野で知られている成分は避けるべきである。次に、上記に詳述した同一コンピューター法によりこのような置換化合物が標的ポリペプチドの三次元構造に合致する効率を分析することができる。
【０２３８】
Ｄ．使用方法
本発明はＤＮＡ修復又は複製経路が薬剤耐性微生物及び細胞の生存に利用されることを立証する。更に、本発明はＤＮＡ修復又は複製の阻害剤が抗微生物薬及び化学療法薬に対する微生物及び細胞の感受性を増加することも立証する。従って、本発明は薬剤耐性微生物及び細胞を死滅させること又は抗微生物薬及び化学療法薬（限定されないが、本明細書に開示する任意薬剤）に対する微生物及び細胞の感受性を増加することに関連する各種目的におけるＤＮＡ修復又は複製阻害剤の使用を含む。
【０２３９】
１態様では、本発明は微生物又は細胞を抗微生物薬又は化学療法薬に対して感受性化する方法を含む。本方法は微生物又は細胞をＤＮＡ修復又は複製阻害剤と接触させる段階を含む。１関連態様では、抗微生物又は細胞傷害性物質の殺微生物又は細胞傷害活性を増加する方法はＤＮＡ修復又は複製阻害剤と抗微生物又は細胞傷害性物質に微生物又は細胞を接触させる段階を含む。
【０２４０】
本明細書の随所に記載するように、本発明の所定用途では、阻害剤を抗微生物もしくは細胞傷害性物質と併用して対象に投与するか又は微生物もしくは細胞と接触させる。これは同時に実施してもよいし、併用する物質を投与又はこれと接触させる前後のどちらに阻害剤を投与又は接触させてもよい。
【０２４１】
本発明の方法は微生物又は細胞を薬剤に対して感受性化するために使用することができるので、関連態様では、本発明は薬剤をＤＮＡ修復又は複製阻害剤と併用する場合に用量を低減できるように、薬剤の最低阻害濃度（ＭＩＣ）を低下させる方法及び薬剤の治療指数を変動させる方法を含む。
【０２４２】
望ましくない作用を生じる薬剤用量と所望効果を生じる用量の比は治療指数であり、薬剤の選択性を表し、従って、その有用性を表す。当然のことながら、単一薬剤は所望薬剤作用に対してその望ましくない作用の各々に１個ずつと、薬剤が２種以上の作用をもつ場合にはその所望効果の各々に１個ずつの多数の治療指数をもつ可能性がある。従って、本発明の阻害剤を薬剤と併用して薬剤に対する微生物又は細胞の感受性を増強し、こうして所望効果に必要な薬剤用量を低減することにより、本発明は治療指数の増加方法を提供する。
【０２４３】
一般に、例えばＤＮＡ修復又は複製阻害剤の存在下又は不在下で物質のＭＩＣを測定する等の当分野で日常的に利用可能な方法を使用して物質（即ち薬剤）の殺微生物又は細胞傷害活性の増加を測定する。各種態様では、阻害剤は物質の殺微生物又は細胞傷害活性を少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍又は１００倍に増加する。関連態様では、阻害剤は物質のＭＩＣを少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％低下させる。他の態様では、阻害剤は阻害剤の不在下で使用される用量よりも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％低い用量で患者を治療できるように、物質の治療指数を変動させる。
【０２４４】
従って、本発明は更に微生物感染症と診断されたか又はその疑いのある対象の治療方法として、適切な抗微生物剤を対象に本発明の阻害剤と併用投与することを含む方法を提供する。特定態様では、従来（即ち本発明の阻害剤の不在下で）使用されていた用量よりも低用量で抗微生物剤を投与する。
【０２４５】
同様に、他の関連態様では、本発明は腫瘍をもつと診断されたか又はその疑いのある対象の治療方法として、適切な化学療法薬を対象に本発明の阻害剤と併用投与することを含む方法を更に提供する。特定態様では、従来（即ち本発明の阻害剤の不在下で）使用されていた用量よりも低用量で化学療法薬を投与する。
【０２４６】
本発明は微生物感染症と診断されたか又はその危険のある対象の治療方法として、ＤＮＡ修復又は複製阻害剤を前記患者に投与することを含む方法を更に含む。関連態様では、阻害剤を抗微生物薬と併用投与する。
【０２４７】
更に、本発明は腫瘍をもつと診断されたか又はその疑いのある対象の治療方法として、ＤＮＡ修復又は複製阻害剤を前記患者に投与することを含む方法を含む。関連態様では、阻害剤を化学療法薬と併用投与する。
【０２４８】
抗微生物薬又は化学療法薬の活性の増加又は増強に関連する本明細書に記載する方法は本発明の阻害剤の不在下で有効であると従来立証されている用量よりも使用量を減らすことができる。このような用量の低減は副作用軽減や費用軽減等の有意利点がある。従って、所定態様では、本発明の方法は従来使用されているよりも低用量の抗微生物薬又は化学療法薬を使用して実施される。更に、特定態様では、本発明の方法は副作用が大きいか又は費用が高いために一般に使用されない抗微生物薬又は化学療法薬を使用して実施される。例えば、スパルフロキサシンは光線高感受性症の発生率が高く、グレパフロキサシンはＱＴｃ延長に結び付けられ、ロメフロキサシンは光線高感受性症の発生率が高い。
【０２４９】
本発明は更に薬剤耐性微生物及び細胞の防除方法を提供する。このような方法は薬剤耐性微生物及び細胞を増殖抑制するため又は死滅させるために使用することができる。方法の特定用途に応じて、方法は一般にＤＮＡ修復もしくは複製阻害剤を対象に投与する段階又は薬剤耐性微生物もしくは細胞をＤＮＡ修復もしくは複製阻害剤と接触させる段階を含む。１態様では、阻害剤を抗微生物又は細胞傷害性物質と併用投与する。例えば、本明細書に開示するか又は開示しないが、当分野で公知の他の任意抗生物質と本発明の阻害剤を併用することができる。所定態様では、リファンピン、オキサゾリジノン（例えばリネゾリド）、キノロン、フルオロキノロン（例えばシプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、オフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン）、マクロリド（例えばアジスロマイシン及びクラリスロマイシン）、又は次世代セファロスポリン（例えばセファクロル、セファドロキシル、セファゾリン、セフィキシム、セフォキシチン、セフプロジル、セフタジジム、セフロキシム、及びセファレキシン）と阻害剤を併用する。
【０２５０】
本発明の阻害剤は対象の体内又は体表に位置する微生物又は細胞に投与、提供又は接触させることができる。例えば、微生物感染症又は腫瘍をもつ対象に阻害剤を提供することができる。あるいは、対象の体内又は体表に存在する微生物又は細胞と阻害剤を接触させてもよい。例えば、食品表面等の固体表面の微生物を処置するか又は死滅させるために阻害剤を使用することもできるし、飲食品や薬剤又は化粧品中の微生物を処置するか又は死滅させるか又は増殖予防するために阻害剤を使用することもできる。
【０２５１】
各種態様では、本発明の方法は本明細書に記載する全種を含む多様な微生物及び細胞の任意のものに適用される。
【０２５２】
所定態様では、本発明の方法は細菌に適用される。特定態様では、細菌はグラム陽性又はグラム陰性である。他の態様では、細菌は１種以上の抗生物質に感受性又は耐性である。特定態様では、細菌はＩＩ型トポイソメラーゼをコードする遺伝子（例えばジャイレース又はトポイソメラーゼ遺伝子）に１カ所以上の突然変異を含み、前記突然変異は薬剤耐性に関連する。所定抗生物質（例えばキノロン）の蛋白ターゲットはＩＩ型トポイソメラーゼ（ＤＮＡジャイレース及びトポイソメラーゼＩＶ）である。ＤＮＡジャイレースとトポイソメラーゼＩＶは夫々前者の場合にはｇｙｒＡ及びｇｙｒＢ遺伝子によりコードされ、後者の場合にはｐａｒＣ及びｐａｒＥ遺伝子によりコードされる２個のＡサブユニットと２個のＢサブユニットをもつ四量体酵素である。これらの遺伝子にはキノロン耐性の獲得に関連する突然変異が位置するキノロン耐性決定領域（ＱＲＤＲ）と呼ばれる領域が存在する。耐性獲得に重要な役割を果たすとして同定されている特定遺伝子はｇｙｒＡ及びｐａｒＣ遺伝子のＱＲＤＲに位置する。薬剤耐性に関連するとして同定されている特定突然変異としては、例えばＧｙｒＡのアミノ酸残基Ｓｅｒ９１及びＡｓｐ９５とＰａｒＣのＧｌｕ９１及びＳｅｒ８７の突然変異が挙げられる。更に、ＧｙｒＡのＳｅｒ９１及びＡｓｐ９５の二重突然変異とＰａｒＣのＧｌｕ９１又はＳｅｒ８７の突然変異により、有意高レベル薬剤耐性が生じる。
【０２５３】
従って、特定態様では、本発明の方法はｇｙｒＡに１カ所以上の突然変異（例えばＳｅｒ９１及び／又はＡｓｐ９５）をもつか又はｐａｒＣに１カ所以上の突然変異（例えばＧｌｕ９１及び／又はＳｅｒ８７）をもつ細菌の処置に適用される。１特定態様では、細菌はＧｙｒＡに１カ所以上の突然変異とＰａｒＣに１カ所以上の突然変異をもち、限定されないが、本明細書に記載する特定突然変異が挙げられる。
【０２５４】
これに関連して、本発明は薬剤耐性微生物（例えば細菌）の存在を診断し、微生物が薬剤耐性を獲得しているか否かを判定し、微生物（又は微生物に感染した患者）の適切な治療処置を決定する方法として、微生物における薬剤耐性に関連する突然変異の存在を判定する段階を含む方法を含む。突然変異の存在は当分野で日常的に使用されている各種公知方法（例えばＰＣＲ分析）により容易に判定することができる。ｇｙｒＡ及びｐａｒＣにおける突然変異を検出する高速ＰＣＲミスマッチ法は例えばＺｉａｎｇ，Ｙ．Ｚ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，４９：５４９−５５２（２００２）に記載されている。特定態様では、本発明は薬剤耐性微生物の処置方法として、耐性に関連する１カ所以上の突然変異の存在を判定する段階と、突然変異が存在する場合には、ＤＮＡ修復又は複製阻害剤を微生物に投与する段階を含む方法を提供する。阻害剤は別の抗微生物剤の存在下で投与してもよいし、不在下で投与してもよい。
【０２５５】
本発明の方法により処置される細菌の例としては限定されないが、Ｂａｃｉｃｃｉｓ  Ａｎｔｒａｃｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｃｈｏｔｔｍｕｌｌｅｒｉ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｈｉｒｓｈｆｅｌｄｉｉ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ；Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ；Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ；Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ；Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｋａｒｉ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉｉ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｐｔｉｃｕｍ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ；Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｅｇｙｐｔｕｓ；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｉｓ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ種；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ；Ｐｒｏｔｅｕｓ種；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ；Ｓｐｉｒｒｉｌｕｍ  ｍｉｎｕｓ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ；Ｂｒｕｃｅｌｌａ種；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｈｅｒｍｓｉｉ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｔｕｒｉｃａｔａｅ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌；バンコマイシン耐性腸���菌；及び多剤耐性菌（例えば２種以上、３種以上、４種以上、又は５種以上の異なる薬剤に対して耐性の細菌）が挙げられる。
【０２５６】
所定態様では、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）やバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）等の既に薬剤耐性の細菌株を処置するために本発明の阻害剤を使用し、限定されないが、本明細書に記載する他の任意薬剤耐性株が挙げられる。
【０２５７】
従って、本発明の阻害剤は多様な細菌感染症及び症状を治療するために使用することができ、腹腔内感染症、耳感染症、胃腸感染症、骨、関節、及び軟組織感染症、副鼻腔感染症、皮膚細菌感染症、肺細菌感染症、尿路感染症、呼吸器感染症、副鼻腔炎、性感染症、眼科感染症、結核、肺炎、ライム病、及びレジオネラ症が挙げられる。従って、上記症状及び細菌感染に起因する他の症状の任意のものを本発明の組成物により予防又は治療することができる。
【０２５８】
特定態様では、本発明の方法は任意分類の尿路感染症（ＵＴＩ）と、任意微生物に起因するＵＴＩを治療するために使用される。これらの例としては限定されないが、合併症を伴わないＵＴＩ（８５％が大腸菌に起因し、その他がＳ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ種、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種に起因）；大腸菌、緑膿菌、及び腸球菌等のグラム陰性菌に関連する合併症を伴うＵＴＩ；再発性ＵＴＩ（８０％が先行感染から単離される生物と異なる生物に起因し、残りの２０％が恐らく治療後の同一生物感染の持続による再発である）が挙げられる。大腸菌はＵＴＩから単離される最も一般的な細菌であり、市中感染の約８０％を占め、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓが約１０％を占める。入院患者では、大腸菌が症例の約５０％を占め、グラム陰性種Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ及びＳｅｒｒａｔｉａが約４０％を占め、グラム陽性球菌Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種（例えばｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ及びａｕｒｅｕｓ）が残りの大半を占める。
【０２５９】
本発明の態様の特定例では、阻害剤は単独又はレボフロキサシンと併用して呼吸器連鎖球菌感染症；単独又はシプロフロキサシンと併用して呼吸器又は尿路緑膿菌感染症；あるいは単独又はシプロフロキサシンと併用して尿路大腸菌感染を治療するために使用される。
【０２６０】
特定態様では、本発明の阻害剤は生物戦争で使用される微生物を処置するために使用される。生物戦争及びバイオテロはヒト、動物又は植物に死や疾病を生じるようなウイルス、細菌、真菌及び毒素の意図的又はその疑いのある使用として定義されている。これらの各種生物戦争剤のうち、細菌とウイルスは主に比較的生産と伝染が容易であることと、医療処置が不足していることから危害が広がる恐れが最も大きい。生物戦争剤として適しているとみなされる公知ウイルスの例としては特に天然痘ウイルスと出血熱ウイルス（例えばエボラウイルス）が挙げられる。生物戦争剤として適しているとみなされる公知ウイルスの数は現在限られているが、遺伝子操作又は他の操作により多くのウイルスが利用可能になると思われる。Ｋｏｓｔｏｆｆ，Ｒ．Ｎ．Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １５：６（２００１）参照。このような新規ウイルス剤はワクチンや検出及び治療法が存在しない可能性があるため、特に脅威である。
【０２６１】
本発明により処置することができる生物戦争細菌及び胞子の例としては限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｏｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｋａｒｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｃａｎａｄａ、及びＣｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉが挙げられる。
【０２６２】
本発明により処置することができる酵母及び他の真菌の例としては限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、Ｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種（例えばＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、及びＣ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＳｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉが挙げられる。
【０２６３】
本発明の方法及び組成物により治療することができるウイルス感染症としては、ＤＮＡ及びＲＮＡ両者ウイルスに起因するものが挙げられる。ＤＮＡウイルスとしては２本鎖ＤＮＡゲノム（例えば天然痘）又は１本鎖ＤＮＡゲノム（例えばアデノ随伴ウイルス）を含むものが挙げられる。ＲＮＡウイルスとしてはアンチセンスＲＮＡ（例えばエボラ）、センスＲＮＡ（例えばポリオウイルス）、又は２本鎖ＲＮＡ（例えばレオウイルス）を含むゲノムをもつもの、及びレトロウイルス（例えばＨＩＶ−１）が挙げられる。本発明により治療することができるＤＮＡウイルス及び関連疾患の例としては、痘瘡（天然痘）；単純ヘルペス（通称ヘルペス）、ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ（水痘、帯状疱疹）、エプスタインバールウイルス（単核症、バーキットリンパ腫）、ＫＳＨＶ（カポジ肉腫）、及びサイトメガロウイルス（失明）等のヘルペスウイルス；アデノウイルス；並びにＢ型肝炎が挙げられる。ＲＮＡウイルスの例としてはポリオウイルス、ライノウイルス、風疹、黄熱、西ナイルウイルス、デング、ウマ脳炎、Ａ型及びＣ型肝炎、呼吸器多核体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、並びにタバコモザイクウイルスが挙げられる。ＲＮＡウイルスは例えば、麻疹、流行性耳下腺炎、狂犬病、エボラ、及びインフルエンザ等の本発明により治療することができる各種ヒト疾患に関与している。本発明により治療されるウイルス感染症は特定細胞又は組織に局在するものでもよいし、全身性でもよい。更に、これらのウイルス感染症は溶菌性でも潜伏性でもよい。
【０２６４】
従って、本発明の組成物及び方法は限定されないが、皮膚炭疽、吸入炭疽、胃腸炭疽、院内Ａ群連鎖球菌感染症、Ｂ群連鎖球菌性疾患、髄膜炎菌性疾患、ブラストミセス症、連鎖球菌性肺炎、ボツリヌス症、ブレイナード下痢症、ブルセラ症、肺ペスト、カンジダ症（口腔咽頭、侵襲性、及び性器を含む）、薬剤耐性肺炎球菌性疾患、大腸菌感染症、鼻疽、ハンセン病（癩病）、コレラ、野兎病、ヒストプラスマ症、レジオネラ症、レプトスピラ症、リステリア症、類鼻疽、トリ型結核菌群、マイコプラズマ肺炎、結核、消化性潰瘍性疾患、ノカルジア症、クラミジア肺炎、オウム病、サルモネラ症、細菌性赤痢、スポロトリクス症、連鎖球菌性咽頭炎、中毒性ショック症候群、トラコーマ、旅行者下痢症、腸チフス、潰瘍性疾患、及び水由来疾患等の疾患を治療するために使用することができる。
【０２６５】
本発明の方法及び組成物は重症出血熱に至る恐れのある全身性ウイルス感染症を治療するために使用することもできる。多くのウイルス感染症は出血性合併症を伴う恐れがあるが、数種のＲＮＡウイルスは感染すると常に血管症状とウイルス性出血熱を生じる。公知ウイルス性出血熱としては、エボラ出血熱，マールブルグ病、ラッサ熱、アルゼンチン出血熱、及びボリビア出血熱が挙げられる。これらの疾患の病因物質としては、夫々エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス、及びマチュポウイルスが挙げられる。
【０２６６】
ウイルス性出血熱にはフィロウイルス（例えばエボラ、マールブルグ、及びレストン）、アレナウイルス（例えばラッサ、フニン、及びマチュポ）、及びブンヤウイルスを含む各種ウイルスが関与している。更に、例えばリフトバレー熱ウイルス等のフレボウイルスもウイルス性出血熱の病因物質として同定されている。パラミクソウイルスはフィロウイルスと進化の点で近縁である（Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｈ．ら，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  ７：８１−１００（１９９３））ので、パラミクソウイルス、特に呼吸器多核体ウイルスも出血熱及び付随する炎症の病因物質に挙げられる。更に、ヒトで出血熱の原因となる他のウイルスは以下のウイルス群：トガウイルス（チクングニヤ）、フラビウイルス（デング熱、黄熱病、キャサヌール森林病、オムスク出血熱）、ナイロウイルス（クリミア・コンゴ出血熱）及びハンタウイルス（腎臓症候群、流行性腎症を伴う出血熱）に属するとして特徴付けられている。更に、１９９３年の米国西南部のハンタウイルス肺症候群発生の病因としてシンノンブルウイルスが同定された。
【０２６７】
他の態様では、本発明の阻害剤を抗ウイルス薬と併用し、限定されないが、ＡＺＴ；ガンシクロビル；塩酸バラシクロビル（Ｖａｌｔｒｅｘ（登録商標））；βインターフェロン；シドフォビル；Ａｍｐｌｉｇｅｎ（登録商標）；ペンシクロビル（Ｄｅｎａｖｉｒ（登録商標））、フォスカルネット（Ｆｏｓｃａｖｉｒ（登録商標））、ファムシクロビル（Ｆａｍｖｉｒ（登録商標））、アシクロビル（Ｚｏｖｉｒａｘ（登録商標））、及び本明細書に記載する他の任意抗ウイルス薬が挙げられる。
【０２６８】
本発明の方法により処置することができるウイルスの例としては限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；インフルエンザ；トリインフルエンザ；エボラ；鶏痘；ポリオ；天然痘；狂犬病；呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）；感冒ウイルス；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）；ラッサ熱（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科）、エボラ出血熱（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科）、ハンタウイルス肺症候群（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ科）、及び汎流行インフルエンザ（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科）が挙げられる。
【０２６９】
別の例では、クロロキン；ピリメタミン；メフロキンヒドロキシクロロキン；メトロニダゾール；アトバコン；イミドカルブ；Ｍａｌａｒｏｎｅ（登録商標）；フェベンダゾール；メトロニダゾール；Ｉｖｏｍｅｃ（登録商標）；ヨードキノール；ジロキサニドフロエート；及びロニダゾールから構成される群から選択される抗原生動物薬と阻害剤を併用する。
【０２７０】
本発明の方法を使用して処置される原生動物の例としては限定されないが、Ａｃａｎｔｈａｍｅｂａ；Ａｃｔｉｎｏｐｈｒｙｓ；Ａｍｏｅｂａ；Ａｎｉｓｏｎｅｍａ；Ａｎｔｈｏｐｈｙｓａ；Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ；Ｂｉｃｏｓｏｅｃａ；Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ；Ｃｏｄｏｎｅｌｌａ；Ｃｏｌｅｐｓ；Ｃｏｔｈｕｒｉｎａ；Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ  Ｄｉｆｆｌｕｇｉａ；Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（アメーバ症とアメーバ赤痢の原因）；Ｅｎｔｏｓｉｐｈｏｎ；Ｅｐａｌｘｉｓ；Ｅｐｉｓｔｙｌｉｓ；Ｅｕｇｌｙｐｈａ；Ｆｌｕｋｅｓ；Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉａ；鉤虫Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種；Ｍａｙｏｒｅｌｌａ；Ｍｏｎｏｓｉｇａ；Ｎａｅｇｌｅｒｉａ；Ｈａｒｔｍａｎｎｅｌｌａ；Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ；Ｐａｒｕｒｏｌｅｐｔｕｓ；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種（マラリアの原因）（例えばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ（免疫不全患者の肺炎の一般的な原因）；ｍｉｃｒｏｆｉｌａｒｉａｅ；Ｐｏｄｏｐｈｒｙａ；Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｈｒｙｓ；Ｒｈｙｎｃｈｏｍｏｎａｓ；Ｓａｌｐｉｎｇｏｅｃａ；Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ；Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ；Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ；Ｓｔｅｎｔｏｒ；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ；Ｓｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ；サナダムシ；Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ種（例えばＴｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒｉｓ及びＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ（膣感染症の原因））；Ｔｙｐａｎｏｓｏｍａ種；及びＶｏｒｔｉｃｅｌｌａが挙げられる。
【０２７１】
他の態様では、イミダゾール（例えばクロトリマゾール、ミコナゾール、エコナゾール、ケトナゾール、オキシコナゾール、スルコナゾール）、シクロピロックス、ブテナフィン、及びアリルアミンから構成される群から選択される抗真菌薬と本発明の阻害剤を併用する。
【０２７２】
本発明の方法により阻害剤（＋／−抗真菌薬）で治療することができる真菌感染症の例としては限定されないが、白癬、水虫、いんきん、及びカンジダ症が挙げられる。
【０２７３】
特定態様では、本発明は薬剤耐性の増加と共に再出現した表１に示す感染症の予防及び治療を意図する。
【０２７４】
【表１】
2008536495.tif 000002
【０２７５】
上述したように、本明細書に記載する細菌経路と同等の経路が真核細胞に存在することも知られている。従って、所定態様では、本発明の阻害剤は例えば哺乳動物細胞等の真核細胞を処置するために使用される。１態様では、薬剤耐性腫瘍を治療するために阻害剤を使用する。別の態様では、薬剤感受性又は薬剤耐性腫瘍を治療するために阻害剤を化学療法薬と併用する。阻害剤は良性腫瘍と悪性腫瘍の両者を治療又は予防するために使用することができる。
【０２７６】
本発明の組成物及び方法により治療可能又は予防可能な癌の例としては限定されないが、乳癌；皮膚癌；骨癌；前立腺癌；肝臓癌；肺癌；脳腫瘍；咽頭癌；胆嚢癌；膵臓癌；直腸癌；副甲状腺癌；甲状腺癌；副腎癌；神経組織癌；頭頸部癌；結腸癌；胃癌；気管支癌；腎臓癌；基底細胞癌；潰瘍型及び乳頭型の両者の扁平上皮癌；転移性皮膚癌；骨肉腫；ユーイング肉腫；細網細胞肉腫；骨髄腫；巨細胞腫；小細胞肺癌；胆石；島細胞腫；原発性脳腫瘍；急性及び慢性リンパ細胞腫及び顆粒細胞腫；ヘアリー細胞白血病；腺腫；過形成；髄様癌；褐色細胞腫；粘膜神経腫；腸管神経節細胞腫；増殖性角膜神経腫；マルファン症候群様腫瘍；ウィルムス腫瘍；セミノーマ；卵巣腫瘍；平滑筋腫；子宮頸部異形成及びｉｎ  ｓｉｔｕ癌；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；軟組織肉腫；悪性カルチノイド；局所皮膚損傷；菌状息肉腫；横紋筋肉腫；カポジ肉腫；骨原性及び他の肉腫；悪性高カルシウム血症；腎細胞癌；真性赤血球増加症；腺癌；多形性膠芽腫；白血病（急性骨髄性白血病を含む）；リンパ腫；悪性黒肉腫；扁平上皮癌；慢性骨髄性リンパ腫；胃腸管間質腫瘍；及び黒肉腫が挙げられる。
【０２７７】
上記特定具体的態様に示したように、ＤＮＡ複製又は修復経路を標的とする抗微生物薬又は化学療法薬（例えばフルオロキノロン）とＤＮＡ複製及び修復阻害剤を併用することができる。他方、本発明によると、異なるメカニズムにより作用する物質に対する感受性を増強するためにＤＮＡ修復又は複製の阻害剤を使用することもできると考えられる。ＤＮＡ修復及び複製の阻害剤は基本的細胞プロセスを標的とするので、一般に微生物及び細胞に相当の打撃を与え、従って、他の経路を標的とする物質とも相乗作用又は共働する。例えば、ＲｅｃＢの阻害剤はＳＯＳ経路に媒介されるＲｅｃＡ遺伝子発現の誘導を阻止する。従って、本発明の方法はＤＮＡ修復又は複製経路に作用する物質及び各種細胞ターゲットに作用する物質に適用可能である。
【実施例１】
【０２７８】
亜致死量のシプロフロキサシンに対する感受性の増加を示すＲｅｃＡ、ＲｅｃＢ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＲｕｖＢ及びＲｕｖＣ突然変異体
各種突然変異の効果を試験することによりシプロフロキサシン耐性の媒介におけるＤＮＡ組換え及び修復経路の各種成分の関与を検討した。このＫ−１２株は大腸菌ゲノム配列決定プロジェクトで使用されたので、大腸菌株ＭＧ１６５５を遺伝子バックグラウンドとして実験を実施した。ＰＣＲによる遺伝子置換を使用して表２に示す株を作製した。Ｍｕｒｐｈｙ，ＫＣら，Ｇｅｎｅ  ２０００，２４６：３２１−３３０参照。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼと標準サイクリングパラメーターを使用してＰＣＲ反応を実施したＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して新鮮な細菌一晩培養液からゲノム鋳型ＤＮＡを作製した。
【０２７９】
プライマー５’−ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＣＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＴＣ及び５’−ＣＧＡ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＡＧＣ  ＣＧＣを使用してｐＵＣ４ＫプラスミドからカナマイシンカセットをＰＣＲ増幅した。各遺伝子からの遺伝子特異的成分をＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅し、上流５００塩基対を含み、最初の２〜３個のコドンを含む「Ｎフラグメント」と、最後の２〜３個のコドンを含み、下流５００塩基対を含む「Ｃフラグメント」の２個のＰＣＲ産物を得た。Ｎフラグメントの３’末端とＣフラグメントの５’末端に相同２０塩基対とカナマイシンカセット末端に相補的な２０塩基対テールを含むプライマーを使用することによりその内側部位にカナマイシンカセット配列の逆相補配列を含むようにフラグメント末端を操作した。
【０２８０】
【表２】
2008536495.tif 000003
【０２８１】
全長遺伝子特異的破壊カセットを作製するために、等容量のＮフラグメント、Ｃフラグメント及びカナマイシンカセット反応産物をＰＣＲ反応で混合した。このＰＣＲ反応の条件は下流プライマーを制限量で使用した以外は標準通りとした。過剰の上流プライマーは第２のＰＣＲ反応中に消費される。ＮフラグメントとＣフラグメントの相補配列がカナマイシンカセットのプライマーとして作用した結果、約５００塩基対の上流配列と、ノックアウトされた遺伝子に対して逆方向のカナマイシンカセットと、５００塩基対の下流配列を含む最終産物が得られた。
【０２８２】
（ｉ）ＭＧ−ＤＹ３２９株へのゲノム挿入と、（ｉｉ）Ｐ１により欠失カセットをＭＧ１６５５に導入する２段階でＭＧ１６５５におけるゲノム欠失株の作製を実施した。第１段階では、λファージレッド遺伝子をもつＭＧ１６５５の誘導体である組換え亢進大腸菌株ＭＧ−ＤＹ３２９［Ｙｕ，Ｄら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２０００）９７：５９７８−５９８３］に線状ＤＮＡフラグメント（ＰＣＲ産物）をエレクトロポレーションした。この株は線状ＰＣＲ産物を受容し、高い効率でゲノムに組込んだ。ＤＹ３２９を４２℃で増殖させることにより組換え遺伝子を活性化させ、コンピテント細胞を−８０℃で保存した。コンピテント細胞を所望カナマイシンカセットで形質転換し、ｋａｎ形質転換細胞を３０℃で選択した。
【０２８３】
ＭＧ−ＤＹ３２９は細胞を非組換え亢進バックグラウンドに戻すためにλファージレッド遺伝子を容易に除去できるように構築されたが、遺伝子特異的破壊をＭＧ−ＤＹ３２９からＭＧ１６５５に移すためにＰ１形質導入を使用した。ＭＧ１６５５はＭＧ−ＤＹ３２９よりも「野生型」に近いバックグラウンドを提供するので、結果の解釈が簡単になる。ＰＣＲにより遺伝子欠失を確認した。
【０２８４】
ΔｌａｃＺ株は対照として作製した。ΔｌａｃＺ株は野生型増殖及び突然変異（＋／−１．１５倍）を示したので、本明細書では「野生型」と呼ぶ。
【０２８５】
【表３】
2008536495.tif 000004
【０２８６】
野生型及び突然変異体株のシプロフロキサシンＭＩＣを測定し、表３に示す（ＷＴ  ｇｙｒＡの欄）。野生型のＭＩＣは液体培地中３５ｎｇ／ｍｌであった。固体培地では、４０ｎｇ／ｍｌシプロフロキサシンはプレーティングから２４時間以内に細胞の９９％を死滅させた（図３）。欠失の大半はＭＩＣに殆ど又は全く影響がなかった。
【０２８７】
しかし、驚くべきことに、ΔｒｅｃＡ及びΔｒｅｃＢ株のＭＩＣは５ｎｇ／ｍｌに過ぎず、これらの株のシプロフロキサシン感受性が野生型に比較して増加していることが分かった（但し、どちらもシプロフロキサシンの不在下では実質的に野生型の生存を示した）。更に、暴露前又は暴露後のシプロフロキサシン耐性突然変異体はΔｒｅｃＡ又はΔｒｅｃＢ株のＳＬＡＭアッセイで観察されず（データ示さず；実施例２参照）、これらの欠失はシプロフロキサシン耐性の出現又は維持を妨げることが分かった。
【０２８８】
他方、ｒｅｃＤの欠失は薬剤感受性（表３及び図２）、突然変異率、又は突然変異スペクトルに殆ど又は全く影響がなかった。この結果はＲｅｃＢＣがＤＳＥをもつことができ、ＲｅｃＤヘリカーゼの不在下でＲｅｃＡをｓｓＤＮＡに負荷することができるという事実に一致する。
【０２８９】
ＲｅｃＧ、ＲｕｖＢ、及びＲｕｖＣは複製フォーク停止の復帰及び／又はＨＲ中間体のプロセシングに関与することが知られているので、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）とＲｅｃＡによる組換え前後の可能な段階をΔｒｅｃＧ、ΔｒｕｖＢ、及びΔｒｕｖＣ株で試験した。ＲｅｃＧ、ＲｕｖＢ、又はＲｕｖＣを欠失させた場合には、シプロフロキサシンの不在下では生存率の有意低下を生じなかったが、ΔｒｅｃＡ株とΔｒｅｃＢ株ほどではないが、薬剤に対する高い感受性を示した（表３及び図２）。また、ΔｒｅｃＡ株及びΔｒｅｃＢ株と同様に、シプロフロキサシン暴露前後のいずれもΔｒｅｃＧ、ΔｒｕｖＢ、及びΔｒｕｖＣ株のＳＬＡＭアッセイ（図３；実施例２参照）からシプロフロキサシン耐性突然変異体は単離されなかった。更に、Ｐ１形質導入によりｇｙｒＡ（Ｓ８３Ｌ）バッククラウンドでｒｅｃＧ、ｒｕｖＢ、及びｒｕｖＣを欠失させることは可能であったが、これらの３種の二重突然変異体は合成異常があり、夫々の単独突然変異体に比較してフィラメント化が増し、ｇｙｒＡ（Ｓ８３Ｌ）親株に比較してシプロフロキサシンＭＩＣか低下した（表３）。これらの結果は、シプロフロキサシン又はシプロフロキサシン耐性を付与する所定のジャイレース突然変異の存在下ではＲｅｃＧ、ＲｕｖＡＢ、及びＲｕｖＣの機能が必要であることを立証するものである。
【０２９０】
シプロフロキサシンに応答して連続的ＤＮＡ合成の再開が必要であるか否かを調べるために、ΔｐｒｉＡ株を試験した。ｐｒｉＡの欠失の結果、シプロフロキサシン感受性は著しく増加し（ＭＩＣ＜１ｎｇ／ｍｌ）、薬剤に応答して複製再開が不可欠であることが判明した（図２）。シプロフロキサシン暴露前後に突然変異体は単離されず、ｇｙｒＡ（Ｓ８３Ｌ）ΔｐｒｉＡ二重突然変異体を作製することはできなかった。
【０２９１】
これらの試験の予想外の結果から、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）によるＨＲはジャイレース機能の低下した薬剤耐性株の生存に重要なＤＮＡ修復プロセスで重要な役割を果たすことと、ＤＮＡ修復及び複製経路の阻害は野生型株よりも細菌のシプロフロキサシン感受性を増すことが立証された。更に、シプロフロキサシンに応答して複製再開が不可欠であり、耐性を付与するジャイレース突然変異の効果を許容するのに役割を果たし得ることも判明した。従って、これらの知見から、シプロフロキサシンに起因するＤＮＡ損傷の修復にはＲｅｃＢＣ（Ｄ）と２本鎖切断修復又は複製フォーク停止レスキューもしくは修復経路の他の成分が必要であることが立証された。従って、これらの試験によると、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）及びＲｅｃＡはＰｒｉＡ、ＲｅｃＧ、ＲｕｖＢ、及びＲｕｖＣと同様に感受性及び耐性株の両者の処置における重要なターゲットであることが判明し、感受性株と耐性株の両者の薬剤感受性を増加し、最終的にこれらの株の生存率を低下させるか又はこれらの株を死滅させるためにこれらのポリペプチド（又は２本鎖ＤＮＡ切断修復、複製再開もしくはフォーク修復に関与する他のポリペプチド）の阻害剤を使用できることが立証された。
【実施例２】
【０２９２】
シプロフロキサシン感受性とシプロフロキサシン耐性出現能の決定における各種遺伝子の役割
同一遺伝子機能低下株が得られたので、図３に示すようなストレス生活適応的突然変異（ＳＬＡＭ）アッセイに基づくプロトコールを使用してシプロフロキサシン（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手）に応答する突然変異を調べた。カナマイシン３０μｇ／ｍＬを添加したプレートから選択した各株のコロニー５個をＬＢ中、２４時間３７℃で増殖させた。各培養液の希釈液を２本ずつ調製し、ＬＢプレートにプレーティングして生存細胞数を測定した。
【０２９３】
突然変異をアッセイするために、シプロフロキサシン３５ｎｇ／ｍＬを添加したＬＢプレートに各培養液１５０μＬを２本ずつプレーティングした。また、「生存」実験で使用するために更に５枚のプレートに各株からの培養液１５０μＬを２本ずつプレーティングした（下記参照）。使用したシプロフロキサシン濃度はＭＧ１６５５親株の模擬実験に基づき、シプロフロキサシン３５ｎｇ／ｍＬで突然変異依存的増殖が最大になったことから選択した。プレーティング後１３日間２４時間おきにコロニーを計数して記録し、各株１０個までの代表的コロニーを１５％グリセロールにストックし、再構成実験（下記参照）に備えて−８０℃で保存した。更に、プレート上に残存しているシプロフロキサシン感受性細胞数を測定するために、平行「生存」実験を実施した。「生存」実験プレートは全可視コロニーを切り出し、９ｍｇ／ｍＬ食塩水に残存寒天を回収し、得られた溶液の希釈液をＬＢにプレーティングして生存細胞数を調べることにより特定時点で代表的プレートを回収した以外はＳＬＡＭプレートと全く同様に処理した。
【０２９４】
１３日後に再構成実験（Ｂｕｌｌ，ＨＪら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００１）９８：８３３４−８３４１；及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＳＭ，（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２：５０４−５１５）を実施し、単離した耐性コロニーのうちのどのコロニーが抗生物質暴露後に誘導突然変異により耐性を生じたかを調べた。初期実験中に単離したコロニー懸濁液ストックを使用してＬＢ  １ｍＬに接種し、３７℃で一晩増殖させた。得られた培養液を次に希釈し、ＬＢとシプロフロキサシン３５ｎｇ／ｍＬを添加したＬＢに２本ずつプレーティングし、コロニー形成までに経過した時間を記録し、初期実験と比較した。初期実験よりも再構成実験中のほうが短時間で増殖したコロニーのみが誘導突然変異を獲得した、即ち抗生物質暴露後に出現したとみなした。シプロフロキサシンを添加したＳＬＡＭプレート上の誘導突然変異体コロニー数と「生存」実験からの生存細胞数を使用して生存細胞当たりの誘導突然変異率を計算した。
【０２９５】
これらの実験からのデータを表４に示す。表から明らかなように、シプロフロキサシン耐性への突然変異頻度はｐｏｌＢΔ（ＰｏｌＩＩ欠失株）；ｄｉｎＢΔ（ＰｏｌＩＶ欠失株）；ｕｍｕＤＣΔ（ＰｏｌＶ欠失株）、及びｌｅｘＡ（Ｉｎｄ−）（自己開裂できないため、株は非誘導性になる）を含む数種の株で有意に低下することが判明した。単独突然変異から最大の効果が認められたのはＬｅｘＡ（Ｉｎｄ−）株であり、シプロフロキサシン耐性出現頻度は２桁以上低下した（厳密な量は抗生物質濃度に依存する）。観測された効果は臨床耐性として考えると著しく大きい。臨床関連の高耐性には複数の独立した突然変異が必要である（Ｄｒｌｉｃａ，Ｋ．ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９７）６１：３７７−３９２；Ｇｉｂｒｅｅｌ，Ａ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９９８）４２：３２７６−３２７８；Ｋａａｔｚ，ＧＷ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９９３）３７：１０８６−１０９４；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９９０）１７２：６９４２−６９４９；Ｐｏｏｌｅ，Ｋ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２０００）４４：２２３３−２２４１；Ｋｅｒｎ，ＷＶ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２０００）４４：８１４−８２０；Ｆｕｋｕｄａ，Ｈ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９９８）４２：１９１７−１９２２参照）が、これらの実験の耐性は単独突然変異しか必要としない（配列決定によりｇｙｒＡ遺伝子であることが確認された）。
【０２９６】
【表４】
2008536495.tif 000005
【０２９７】
ΔｌａｃＺ株は対照として作製し、全ての場合に野生型増殖及び突然変異（±１．１５倍）を示した。他の株は抗生物質の存在下の生存と耐性進化における組換えとＳＯＳ応答の関与を試験するために作製し、特性決定した。
【０２９８】
ｌａｃ対立遺伝子に導入された突然変異には組換え依存性複製再開が重要であると思われたので、シプロフロキサシンに応答するその役割を試験した（図４）。ｐｒｉＡの蛋白産物はレプリソーム蛋白の再負荷により複製フォーク崩壊後の複製再開を助長するが、このｐｒｉＡを欠失させると、抗生物質感受性が著しく増加し（ＭＩＣ＜１ｎｇ／ｍｌシプロフロキサシン）、この薬剤に応答して複製再開が必要であると思われた。この株はシプロフロキサシンに対して高感受性のままであるので、（ΔｐｒｉＡ株で共通の）可能なサプレッサー突然変異の存在下でもこの結論は妥当である。ｒｅｃＡとｒｅｃＢは組換えに必要な蛋白をコードする。ΔｒｅｃＡ株とΔｒｅｃＢ株はシプロフロキサシンの不在下でほぼ野生型増殖を示したが、どちらも抗生物質に高感受性であった。組換え中間体のプロセシングに関与する対応蛋白を欠失するΔｒｅｃＧ、ΔｒｕｖＢ、及びΔｒｕｖＣ株もシプロフロキサシンの不在下では目立った増殖低下を示さず、ΔｒｅｃＡ株とΔｒｅｃＢ株ほどではないが、高い薬剤感受性を示した。シプロフロキサシンに対する高い感受性によりこれらの株では暴露後の突然変異率を測定できない（耐性コロニーを単離できなかった）が、これらの実験で使用した低濃度でもシプロフロキサシンの存在下で組換え依存性複製再開は不可欠になることが判明した。他方、ｒｅｃＤの欠失は抗生物質感受性や突然変異率に影響がなく、シプロフロキサシンにより誘導されるＤＮＡ損傷の修復にχ配列の切除は不可欠ではないと思われる。ｌｅｘ４（Ｓ１１９Ａ）株はほぼ野生型のシプロフロキサシン感受性を示し、この低濃度では薬剤に対する応答としてＳＯＳ応答の誘導は不要であると思われる。他方、細菌が３５ｎｇ／ｍＬシプロフロキサシンに対する耐性を生じた頻度はこの株では約１００分の１に低下した（データ示さず）。これらの知見から、ＲｅｃＡ、ＲｅｃＢ、ＲｅｃＧ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ及びＰｒｉＡはシプロフロキサシン、他のキノロン、及び他のＤＮＡ損傷剤に対して細菌を高感受性化する薬剤の開発の魅力的なターゲットであることが明らかである。
【実施例３】
【０２９９】
ＲｅｃＢの欠失はＦＱ及びＦＱｒ株の両者をシプロフロキサシンに対して感受性化する。
ＦＱｒ  ｇｙｒＡ突然変異体におけるｒｅｃＢ突然変異の効果を調べるために、ｒｅｃＢ遺伝子をｇｙｒＡ  ＦＱｒ突然変異体から欠失させ、これらの株のシプロフロキサシン応答をアッセイした（表５）。ｒｅｃＢの欠失はＰ１形質導入を使用し、２種の異なる株バックグラウンドにｇｙｒＡ−Ｓ８３Ｌを含むものとｇｙｒＡ−Ｄ８７Ｇを含むものとのｇｙｒＡ  ＦＱｒ突然変異をもつ株にｒｅｃＢ：：Ｋｍｒ対立遺伝子を導入することにより実施した。
【０３００】
特筆すべき点として、ｇｙｒＡ  ＦＱｒ突然変異体株の各々からｒｅｃＢを欠失させると、これらの株はシプロフロキサシンに対して再び有意に感受性になり、株バックグラウンドと特定ｇｙｒＡ＊突然変異に応じて５〜８倍になることが判明した。更に、野生型ＦＱ感受性株からｒｅｃＢを欠失させると、株の感受性は約８倍になった。これらの結果を総合すると、ＲｅｃＢ阻害剤をフルオロキノロン抗生物質と併用すると、ＦＱ感受性及びＦＱ耐性感染症の両者に対して有効な併用療法となることが明らかである。
【０３０１】
【表５】
2008536495.tif 000006
【０３０２】
興味深いことに、ΔｒｅｃＢ株をＰ１ドナーとして使用すると、一般Ｐ１形質導入効率は対照ドナーの約１０分の１になることが判明した。また、ｇｙｒＡ  ＦＱｒ（ｇｙｒＡ＊）突然変異体株への一般Ｐ１形質導入効率は対照レシピエントの約２０分の１であった。これらの要因を総合すると、ｇｙｒＡ＊バックグラウンドへのΔｒｅｃＢ対立遺伝子の導入効率は著しく低下したが、依然として形質導入コロニーが得られた。
【０３０３】
観測された形質導入効率が非常に低かったので、各ΔｒｅｃＢ  ｇｙｒＡ＊株の遺伝子型を確認するために数種の手順を採用した。３種の方法を使用してΔｒｅｃＢ対立遺伝子の存在を確認した。まず、推定ΔｒｅｃＢ株とｒｅｃＢ＋対照からｒｅｃＢ遺伝子座をＰＣＲ増幅しようと試みた。ｒｅｃＢ＋遺伝子座は全ｒｅｃＢ＋親株からＰＣＲ増幅されたが、推定ΔｒｅｃＢ株から産物は増幅されなかった。第２に、ΔｒｅｃＢ株をＰ１プラークアッセイで試験した。ｒｅｃ＋株はＰ１プラーク形成を助長することができるが、ｒｅｃ株（ΔｒｅｃＢ株を含む）はできないことが判明した。この知見に一致して、Ｐ１は推定ΔｒｅｃＢ形質導入株にプラークを形成することができなかった、第３に、推定ΔｒｅｃＢ形質導入株のマイトマイシンＣ  ＭＩＣは親ΔｒｅｃＢ株に一致した（ｒｅｃＢ＋株の約８分の１）。
【０３０４】
全株からのキノロン耐性決定領域（ＱＲＤＲ）のＰＣＲ増幅と配列決定によりｇｙｒＡ＊  ＦＱｒ突然変異の存在を更に確認した。遺伝子型は全ての場合に予想通りであった。これらのΔｒｅｃＢ  ｇｙｒＡ＊株のシプロフロキサシンＭＩＣを親ΔｒｅｃＢ株に比較すると、同様にｇｙｒＡ＊突然変異の存在が示唆された（表５）。
【実施例４】
【０３０５】
温度感受性ＲｅｃＢ及びＲｅｃＣ突然変異体はシプロフロキサシン感受性の増加を示す。
安定的シプロフロキサシン耐性の維持におけるＲｅｃＢＣ（Ｄ）の役割を更に実証するために、低濃度（３５ｎｇ／ｍｌ）シプロフロキサシンに対する耐性を生じた株についてＲｅｃＢＣ（Ｄ）活性の阻止による生物学的影響を試験した。
【０３０６】
温度感受性ＲｅｃＢ突然変異を含むＳＫ１１９株（Ｋｕｓｈｎｅｒ，Ｓ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２１３（１９７４））で原則的にＣｉｒｚら（係属中の公開公報）の記載に従い、図３に示すようにストレス生活適応的突然変異（ＳＬＡＭ）アッセイを実施した。要約すると、シプロフロキサシン３５ｎｇ／ｍｌを添加したＬＢプレート８枚の各々に３本の別々の培養液からの細胞１×１０７個を撒いた。プレートを５日間３０℃でインキュベートした。この間に、寒天プレートから３ｍｍプラグを切り出すことにより６個のコロニーを釣菌し、１５％グリセロール１ｍｌに最懸濁した。シプロフロキサシン３５ｎｇ／ｍｌを添加した新しいプレートにこの再懸濁液１０μｌをストリーキングした。これらの６種のシプロフロキサシン耐性株と親株の各々からシングルコロニーを釣菌し、記載されているようにＭＩＣを測定した（Ｃｉｒｚら，係属中の公開公報）。
【０３０７】
ＮａＣｌの存在下又は不在下で３０℃と４３℃の４種の異なる条件下でＭＩＣを試験した。ＮａＣｌ含有培地はＨ２Ｏ（ｐＨ７．０）１Ｌ中、バクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇから構成した。ＮａＣｌ不含培地はＮａＣｌを添加しない点以外は同一組成とした。温度感受性表現型は低塩条件下でしか観測されないので、これらの４種の条件を試験した（Ｋｕｓｈｎｅｒ，Ｓ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｐ１２１３（１９７４））。図５に示すように、これらの株のＭＩＣは高濃度塩の存在下では許容温度と非許容温度で５０〜１５０ｎｇ／ｍｌであった。他方、非許容温度で低塩では、全６種の株のＭＩＣは１ｎｇ／ｍｌまで激減した。
【０３０８】
これらの試験から明らかなように、これらの株は亜致死濃度のシプロフロキサシンに耐性であるためにはＲｅｃＢ活性の存在に高度に依存する。更に、これらのデータから、安定的シプロフロキサシン耐性の維持にはＲｅｃＢＣ（Ｄ）と相同組換え又は組換え依存性ＤＮＡ複製経路の他の成分が必要であり、従って、これらの成分は耐性株の治療用新規薬剤の開発における重要なターゲットであることが立証された。
【実施例５】
【０３０９】
ＲｅｃＢＣ又はＲｅｃＢＣＤの小分子阻害剤を同定する標的法
原則的に米国特許第６，７２１，６６５号、６，７１４，８７５号、６，６９４，２６７号、６，６９１，０４６号、６，５８１，０１３号、６，２０７，８６１号、及び６，１４７，３４４号に記載されているように、自動リガンド同定システム（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＬＩＳ）を使用して組換えＲｅｃＢＣ（Ｄ）（「ＲｅｃＢＣ（Ｄ）」とは任意指定段階でＲｅｃＢＣ又はＲｅｃＢＣＤをスクリーニングできることを意味する）との結合能について化合物ライブラリーをスクリーニングすることによりＲｅｃＢＣ（Ｄ）の小分子阻害剤を同定する。ＡＬＩＳは該当蛋白と結合する小分子を同定するための高スループット技術である。
【０３１０】
この技術を使用し、その質量（及びライブラリーに存在する化合物の情報）に基づいて決定することができる明確な分子構造を各々もつ約５，０００種の化合物を各々含む化合物プール５，０００個と、組換えにより作製し、精製したＲｅｃＢＣ（Ｄ）を混合する。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）蛋白とこれらの化合物を室温で３０分間混合して結合させる。次に混合物を迅速に冷却して結合複合体をトラップし、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に付す。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）と強く結合してＳＥＣ中にＲｅｃＢＣ（Ｄ）と共に排除される小分子を次に質量分析に付し、その質量を決定する。次に各化合物の質量を使用してその分子構造を決定する。次に、対応する構造を再合成し、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）との結合能を結合アッセイで確認する。
【０３１１】
確認された結合剤を次にヘリカーゼアッセイで試験し、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）により媒介されるヘリカーゼ活性の阻害剤を同定する（Ｎａｔｕｒｅ．２００３  Ｊｕｎ  １９；４２３（６９４２）：８８９−９３；Ｅｇｇｌｅｓｔｏｎ  ＮＡＲ  ２４：１１７９−１１８６，１９９６）。ＲｅｃＢＣＤ複合体は５’−３’（ＲｅｃＤ）及び３’−５’（ＲｅｃＢＣ）ヘリカーゼの両者をコードする。ｒｅｃＤ突然変異体は依然として組換え能が高く、ＦＱに対して高感受性化されない（実施例１）。他方、ｒｅｃＢ突然変異体はＦＱに対して高感受性化され（実施例１）、ＨＲ欠損である。従って、所定態様では、ＲｅｃＢＣの阻害剤が望ましい。Ｋ１７７Ｑ突然変異はＲｅｃＤのヘリカーゼ活性を無効にすることが示されているので、ヘリカーゼアッセイは精製ＲｅｃＢＣヘリカーゼフラクション又はＲｅｃＢＣ（Ｄ）（ｒｅｃＤ  Ｋ１７７Ｑ）突然変異体を使用して実施する。ＲｅｃＢＣヘリカーゼ活性の阻害剤として同定された化合物をＳＡＲに付し、種々の効力をもつ構造的に多様なアナログを同定する。
【０３１２】
ＲｅｃＢＣ（Ｄ）と結合するとして同定された化合物群を大腸菌ＭＧ１６５５の野生型ｇｙｒＡ及び突然変異体ｇｙｒＡ（Ｓ８３Ｌ）株でシプロフロキサシン感受性を増加する能力について試験する。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）と結合するとして同定された化合物の各種量の存在下又は不在下でこれらの株の各々をシプロフロキサシン３５ｎｇ／ｍｌで処理し、ＭＩＣを測定する。ＭＩＣ値の低下した化合物がＲｅｃＢ活性を阻害する化合物であるとして同定される。細胞浸透性が低いか又は流出ポンプにより化合物が効率的に排出されることに起因する疑陽性を避けるために、これらのアッセイは例えば突然変異又は阻害剤の添加により細胞浸透性を助長すると共に流出ポンプの活性を低下する株と条件を使用して実施する。
【０３１３】
当分野で公知の各種技術を使用してこれらの化合物のアナログ及び誘導体を合成し、原則的にＡｎｄｅｓ  ａｎｄ  Ｃｒａｉｇ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１６６５−７０（２００２））に記載されているように、ｉｎ  ｖｉｖｏ大腿部チャレンジモデルを使用してそれらがＭＩＣ値を低下させる能力について更に試験する。要約すると、感染の４日前にシクロホスファミド１５０ｍｇ／ｋｇと感染の２４時間前にシクロホスファミド１００ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射することにより、特定病原体をもたない６週齢雌ＣＤ−１マウスを好中球減少症にする（好中球数＜１００／ｍｍ３）。新たにプレーティングした細菌から接種したミューラーヒントン（ＭＨ）ブロス培養液を対数期（ＯＤ５８０約０．３）まで増殖させ、ＭＨブロスで１０倍に希釈する。ハロタンで麻酔したマウスに希釈ブロス培養液０．１ｍｌ容量を注射することにより大腿部感染を生じる。感染の２時間後（０時点と定義する）から開始して、各種量の試験化合物の存在下又は不在下でシプロフロキサシン０．５ｍｇ／ｋｇを１２時間おきに３日間皮下注射によりマウスに投与する。各試験時点で２匹ずつ屠殺して両大腿部を摘出し、ホモジナイズする。ＭＨ寒天とシプロフロキサシン約１０〜８０ｎｇ／ｍｌを添加したＭＨ寒天に大腿部ホモジネートの希釈系列をプレーティングする。２４時間後に、可視コロニーを計数し、プレートから切り出し、生存シプロフロキサシン耐性細胞の合計数を測定する。残りの寒天を食塩水中でホモジナイズし、希釈系列をＬＢ寒天に２本ずつプレーティングし、存在する生存シプロフロキサシン感受性細胞の合計数を測定する。シプロフロキサシン耐性又は感受性生存細胞数の減少した化合物がＲｅｃＢＣ活性を阻害する化合物として同定され、シプロフロキサシン耐性株を処置するのに有用である。
【実施例６】
【０３１４】
活性に基づく阻害剤同定方法
ＲｅｃＢＣ（Ｄ）ＡＴＰアーゼ活性を阻害する能力に基づいてＲｅｃＢの小分子阻害剤を同定する。組換えＲｅｃＢＣ（Ｄ）ＡＴＰアーゼ活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用してＲｅｃＢＣ（Ｄ）活性を阻害する能力について小分子ライブラリーをスクリーニングする。
【０３１５】
要約すると、蛋白が天然ヘテロ三量体を形成するように、Ｈｉｓタグ付きＲｅｃＣ又は野生型ＲｅｃＣと野生型ＲｅｃＢ及びＲｅｃＤポリペプチドを細菌発現ベクターからの大腸菌中で同時発現させる。あるいは、アッセイを該当特定活性に集中するために、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）又はＲｅｃＢＣ（Ｄ）（Ｋ１７７Ｑ）等の突然変異体複合体を発現させ、精製する。次に、Ｎｉ−アフィニティーカラムを使用するか又はヘテロ三量体を維持する他の確立条件下でこれらのヘテロ二量体又はヘテロ三量体を精製する。ＲｅｃＢＣ（Ｄ）の組換え発現は従来、Ａｍｕｎｄｓｅｎ，Ｓ．Ｋ．ら，ＰＮＡＳ：７３９９−７４０４（２０００）及びＤｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ：８９３−８９７（２００３）に記載されている。
【０３１６】
基本的にＮｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２８：２３２４（２０００）に記載されているように、３２Ｐ−ＡＴＰをＮＡＤＨ酸化と併用してＡＴＰ加水分解を測定することによりＲｅｃＢＣ（Ｄ）ＡＴＰアーゼ活性を測定する。原則的に、精製Ｈｉｓタグ付きＲｅｃＢＣＤを３２Ｐ−ＡＴＰ、ｄｓＤＮＡ、（ＮＨ４）２ＭｏＯ４、及びマラカイトグリーンと共にインキュベートする。次に６６０ｎｍ吸光度の測定によりＮＡＤＨ酸化に基づいてＡＴＰ加水分解を測定する。
【０３１７】
ＲｅｃＢＣ（Ｄ）ＡＴＰアーゼ活性の阻害剤を同定するために、９６ウェルプレートを使用する高スループットフォーマットのＡＴＰ加水分解アッセイとＮＡＤＨ酸化を併用して小分子をスクリーニングする。組換えＲｅｃＢＣ（Ｄ）を適当な基質と共に各ウェルに導入する。更に、各小分子のプールを各プールに加え（但し、対照ウェルには小分子を加えない）、ＮＡＤＨ酸化を測定する。ＮＡＤＨ酸化の低下を示すウェルがＲｅｃＢＣ（Ｄ）ＡＴＰアーゼ活性を阻害する小分子を含むとして同定される。次に、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）ＡＴＰアーゼ活性を阻害する能力についてこれらのウェルに含まれる小分子を個々に再スクリーニングする。
【０３１８】
次に、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）ＡＴＰアーゼ活性を阻害するとして同定された化合物を大腸菌の野生型ｇｙｒＡ及び突然変異体ｇｙｒＡ（Ｓ８３Ｌ）株でシプロフロキサシン感受性を増加する能力について試験する。これらの株の各々を各種量の化合物の存在下又は不在下でシプロフロキサシン３５ｎｇ／ｍｌで処理し、ＭＩＣを測定する。ＭＩＣ値の低下した化合物がシプロフロキサシン感受性を増加する化合物であるとして同定される。
【０３１９】
当分野で公知の各種技術を使用してこれらの化合物のアナログ及び誘導体を合成し、上記のように、ｉｎ  ｖｉｖｏ大腿部チャレンジモデルでそれらがＭＩＣ値を低下させる能力について更に試験する。
【０３２０】
これらの方法は枯草菌と炭疽菌におけるＡｄｄＡＢ遺伝子産物や肺炎球菌のＲｅｘＡＢ蛋白等のＲｅｃＢＣＤホモログの阻害剤を得るためにも使用される。
【実施例７】
【０３２１】
シプロフロキサシン耐性ペスト菌の生存能を低下させるＲｅｃＢＣ阻害剤
上記実施例に示した大腸菌データは、臨床単離株にフルオロキノロン耐性を付与するペスト菌トポイソメラーゼｇｙｒＡ、及びｐａｒＣの突然変異もＲｅｃＢＣ（Ｄ）によりコードされる組換え機序の阻害と併用した場合にペスト菌に致死性になることを示唆している。この仮説はＦＱｒ突然変異と共にＲｅｃＢＣ（Ｄ）欠失をもつ突然変異体ペスト菌株を作製し、この株の生存率とシプロフロキサシンＭＩＣを試験することにより確認されよう。この仮説によると、ＦＱｒ株におけるｒｅｃＢＣの欠失は細胞死を招き、ＭＩＣにより測定した場合にシプロフロキサシン効力の有意増加をもたらす。本試験はペスト菌がＦＱｒを生じた後にＲｅｃＢＣ（Ｄ）による相同組換えに絶対的に依存し、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）の阻害剤をシプロフロキサシンと併用すると耐性ペスト菌に有効な抗生物質となるという仮説を直接検討する。
【０３２２】
ＦＱｒ突然変異体ペスト菌からＲｅｃＢＣ（Ｄ）を欠失させるのは非常に危険なため、二重突然変異体株の直接作製は不可能な場合がある。この場合には、代替ストラテジーを利用し、プラスミド安定性アプローチを使用してこれらの突然変異の合成致死性（併用致死性）を立証する。要約すると、機能的ＲｅｃＢＣを発現するプラスミド（不安定なレプリコンをもつ）をＦＱｒ突然変異体ペスト菌株に導入した後、ＲｅｃＢＣ遺伝子を染色体から欠失させる。ＦＱｒ突然変異体がＲｅｃＢＣ機能の欠失により合成致死性になるならば、不安定なプラスミドが二重突然変異体株に維持される。
【０３２３】
同様のアプローチを使用して炭疽菌等の他の該当種におけるＲｅｃＢＣ（又はそのホモログ）とｇｙｒＡの突然変異の相互作用を試験する。
【実施例８】
【０３２４】
ＲｅｃＢＣ（Ｄ）の小分子阻害剤を同定するための高スループットスクリーニング法
小分子ライブラリーの高スループットスクリーニングアッセイを使用してＲｅｃＢヘリカーゼの小分子阻害剤を同定する。要約すると、ＲｅｃＢＣ（Ｄ）蛋白を組換え発現させ、従来記載されているように精製する。これらの組換え蛋白をマルチウェルプレートで各種小分子に暴露し、ｄｓＤＮＡ基質、ｄｓＤＮＡ特異的色素、及びＡＴＰの添加によりそのヘリカーゼ活性を測定する。阻害剤の不在下では、ＲｅｃＢＣはｄｓＤＮＡを巻き戻してｓｓＤＮＡを生じると同時に蛍光シグナルが低下する。蛍光シグナルは標準プレートリーダーを使用してリアルタイム又は所定終点でモニターする。従って、ＲｅｃＢＣヘリカーゼ活性を阻害する小分子は蛍光増加を生じるものとして同定される。
【０３２５】
ｇｙｒＡの単独点突然変異Ｓ８３Ｌはシプロフロキサシンに対する高レベル耐性を大腸菌に付与する。正常よりも高い膜透過性に加えてこの突然変異をもつ株を使用し、シプロフロキサシンの損傷作用に対して細菌を感受性化する小分子を同定する。これはＲｅｃＢＣを阻害することにより、突然変異体ジャイレースとシプロフロキサシンにより必要とされるＤＮＡ修復プロセスを阻止する化合物を表す。この株の最低阻害濃度よりも僅かに低い用量のシプロフロキサシンを添加したマルチウェルプレートで透過性ｇｙｒＡＳ８３Ｌ株を増殖させる。阻害剤の不在下では、細菌は増殖し、吸光度プレートリーダーを使用して６００ｎＭの光散乱をモニターすることにより容易に観測される光学密度を生じる。小分子ライブラリーをこれらのプレートに加えると、ＲｅｃＢＣを標的とする場合には増殖率が低下し、それに応じてＯＤ６００も低下する。野生型大腸菌又は他の耐性株等の代替株バックグラウンドで同様のスクリーニングを実施し、膜透過性又は阻害剤の蓄積を阻止するポンプの変動を考慮する。
【０３２６】
上記高スループットスクリーニングのいずれかで同定された化合物を更に各種方法により特性決定する。シプロフロキサシンの存在下と不在下で一連の化合物濃度で増殖を観察することにより推定ＲｅｃＢＣ（Ｄ）阻害剤のＭＩＣを測定する。スクリーニングで使用した株と同様であるが、ｒｅｃＢ遺伝子を欠失する株を使用してシプロフロキサシン感受性化効果の特異性を試験することにより、化合物の非特異的毒性を除外する。逆に、遺伝子の付加コピー又は強力なプロモーターの挿入によりＲｅｃＢ活性を増幅すると、亜致死濃度のシプロフロキサシンで死滅を確認するために必要な化合物量が増加すると思われる。同様の方法を使用して、作用メカニズムがこの経路に他の論理的ターゲット（例えばＲｅｃＡ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＲｕｖＢ又はＲｕｖＣ）を含むか否かを試験することができる。
【０３２７】
数種の異なるｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子試験の任意のものを使用してＲｅｃＢＣ（Ｄ）機能を評価する。まず、Ｈｆｒ（高組換え頻度）ドナー株からレシピエントに遺伝子マーカーを伝達する能力を阻害剤の存在下で試験する。このプロセスは相同組換えを必要とするため、組換え欠損株はＦによる伝達能が著しく低い（〜５００倍）。従って、このアッセイは広いダイナミックレンジによりｒｅｃＢ阻害を測定することができる。第２に、遺伝子２に突然変異させたＴ４バクテリオファージ（Ｔ４  ｇｐ２−）は注入後のウイルスＤＮＡの消化により野生型大腸菌で複製できないが、ｒｅｃＢＣ又はｒｅｃＤ欠損株では効率的に複製することができる。従って、阻害剤で処理した大腸菌でＴ４  ｇｐ２−ファージが複製する能力を測定することにより、ＲｅｃＢ阻害をアッセイする。液体培養での細菌溶菌によるＯＤ６００の低下を追跡するか、又は組換えＴ４ファージで蛍光もしくは比色マーカーを使用することにより、Ｔ４  ｇｐ２−ファージ複製をモニターする。最後に、Ｐ１ファージはＲｅｃＢＣ突然変異体大腸菌にプラークを形成することができないという知見から明らかなように、大腸菌がバクテリオファージＰ１に感染するには機能的ＲｅｃＢＣ酵素が必要である。従って、Ｔ４  ｇｐ２−について上述したと同様にＰ１ファージが大腸菌で複製する能力を測定することによりＲｅｃＢＣ阻害をアッセイする。
【実施例９】
【０３２８】
ＲｅｃＢＣ（Ｄ）の阻害剤は耐性大腸菌のシプロフロキサシン感受性を増加する。
ＲｅｃＢの阻害が既に耐性の細菌をシプロフロキサシンに対して有意に感受性化するモデルを試験するために、λｇａｍ蛋白の効果を試験した。この蛋白は感染中にファージゲノムを開裂しないように大腸菌ＲｅｃＢを阻害するためにλファージにより使用される。大腸菌におけるｇａｍ過剰発現を試験するためのアラビノース誘導発現システムを作製するために、λファージに由来するｇａｍ遺伝子をＰＳ６２７５株からＰＣＲ増幅し、ベクターｐＢａｄＡｓｓのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングし、ベクターｐＲＴＣ００４５を得た。ｐＲＴＣ００４５とその対応する空のベクター対照（ｐＢａｄＡｓｓ）を各々大腸菌株ＲＴＣ００８６、ＲＴＣ０１１０及びＲＴＣ００１３に形質転換し、合計６株を得た（表６）。
【０３２９】
【表６】
2008536495.tif 000007
【０３３０】
緑膿菌におけるｇａｍ過剰発現を試験するためのアラビノース誘導発現システムを作製するために、ｐＢａｄＡｓｓとｐＲＴＣ００４５に由来するａｒａＣ遺伝子、ｐＢａｄプロモーター、ｇａｍ遺伝子又は空のインサート対照、及びｒｎｎＢターミネーター領域をＰＣＲ増幅し、ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−４のＡｐａＩ／ＸｂａＩ部位に各々クローニングし、夫々ベクターｐＲＴＣ−００４９及びｐＲＴＣ−００５０を得た。両者ベクターを大腸菌株Ｓ１７−１に形質転換し、接合伝達により緑膿菌株ＡＴＣＣ２７８５３、ＲＴＣ１０１３及びＲＴＣ１０１２に導入し、６株を得た（表７）。
【０３３１】
【表７】
2008536495.tif 000008
【０３３２】
大腸菌でシプロフロキサシン効力に及ぼすｇａｍ過剰発現の影響を調べるために、６株の各々について一晩培養液をＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌ中で増殖させた。９６ウェルプレートにＬＢ  １５０μｌ＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌを加え、＋／−シプロフロキサシン、＋／−アラビノースで出発細菌約５×１０４ＣＦＵを接種した。プレートを無菌通気性フィルターで覆い、１８．５時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後にＯＤ６５０を９６ウェルプレートリーダーで読み取り、これを使用してｇａｍの存在下と不在下におけるシプロフロキサシンＩＣ５０、ＩＣ９０、及びＭＩＣを決定した（表８）。
【０３３３】
【表８】
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【０３３４】
λｇａｍの過剰発現の結果、シプロフロキサシンＩＣ５０は野生型大腸菌（ＲＴＣ０１４２株）とｇｙｒＡ（Ｓ８３Ｌ）突然変異を含む大腸菌（ＲＴＣ０１４４株）の両者でその空のベクター対照株（夫々ＲＴＣ０１４１及びＲＴＣ０１４３株）に比較して約５〜８分の１に低下した。他方、ＲｅｃＢターゲットを欠失する株（ＲＴＣ０１４８株）でλｇａｍを過剰発現させても空の対照ベクター株（ＲＴＣ０１４７）に比較して株のシプロフロキサシン感受性に何の影響もなかった。
【０３３５】
緑膿菌でシプロフロキサシン効力に及ぼすλｇａｍ過剰発現の影響を調べるために、６株の各々について一晩培養液をＬＢ＋カルベニシリン３５０μｇ／ｍｌ中で増殖させた。９６ウェルプレートにＬＢ  １５０μｌ＋カルベニシリン３５０μｇ／ｍｌを加え、＋／−シプロフロキサシン、＋／−アラビノースで出発細菌約５×１０４ＣＦＵを接種した。プレートを無菌通気性フィルターで覆い、１８．５時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後にＯＤ６５０を９６ウェルプレートリーダーで読み取り、これを使用してｇａｍの存在下と不在下におけるシプロフロキサシンＩＣ５０、ＩＣ９０、及びＭＩＣを決定した（表９）。
【０３３６】
【表９】
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【０３３７】
緑膿菌では、λｇａｍの過剰発現の結果、シプロフロキサシンＭＩＣは野生型緑膿菌（ＲＴＣ１０１７株）とｇｙｒＡ（Ｓ８３Ｌ）突然変異を含む緑膿菌（ＲＴＣ１０１８株）の両者でその空のベクター対照株（夫々ＲＴＣ１０１４及びＲＴＣ１０１５株）に比較して約２〜４分の１に低下した。他方、ＲｅｃＢターゲットを欠失する株（ＲＴＣ１０１９株）でλｇａｍを過剰発現させても空の対照ベクター株（ＲＴＣ１０１６）に比較して株のシプロフロキサシン感受性に何の影響もなかった。
【実施例１０】
【０３３８】
複製再開阻害剤は野生型及びＦＱ耐性大腸菌のシプロフロキサシン感受性を増加する。
ＦＱによるＩＩ型トポイソメラーゼの阻害の１例として、複製フォークはＦＱ：トポイソメラーゼ：ＤＮＡ複合体に出会うと停止する。これらのフォーク停止は組換え依存性フォーク修復により修復する必要がある。このプロセスの必須段階はプライモソームにより誘導される複製再開である。従って、プライモソームの阻害剤はフォーク停止の修復を阻止することにより、細胞をＦＱに対して高感受性化する。プライモソームはＤｎａＧプライマーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＣ及びＤｎａＴから構成される。機能的プライモソームの形成を妨げる阻害剤はフォーク停止の修復を阻止することにより、ＦＱ及び他の物質（例えばリファンピンや複製フォーク阻止（リファンピンの場合には転写複合体停止）を生じるそのアナログ）に対して細胞を高感受性化する。
【０３３９】
プライモソームの成分をターゲットとして使用する以外は原則的に実施例３に概説したように、ターゲットスクリーニングを使用して阻害剤を同定する。φＸ１７４  ＤＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｓｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｓｂｓｃｏｎ／２００４／ｐｏｓｔｅｒｓ／０４０６２９１７０３５２．ｈｔｍ）又は他のグラム陽性菌由来基質（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｓｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｓｂｓｃｏｎ／２００４／ｐｏｓｔ／ｐｏｓｔｅｒｓ／０４０６２９１６５０５６．ｈｔｍ）等のｓｓＤＮＡ鋳型での複製再開等のＨＴＳ活性スクリーニングにより更に阻害剤を同定する。その後、ＦＱ及び他のＤＮＡ損傷剤に対して細菌を高感受性化する能力について同定後の阻害剤を試験する。
【実施例１１】
【０３４０】
野生型及びＦＱ耐性細菌をＦＱに対して高感受性化する付加ターゲットの発見
大腸菌をプラットフォームとして使用し、野生型及びＦＱｒ細菌をシプロフロキサシンに対して感受性化する付加ターゲットをスクリーニングし、確認する。このようなターゲットは突然変異させた場合にｇｙｒＡ及び／又はｐａｒＣにＦＱｒを付与する突然変異により合成致死性（併用致死性）となるか、ＦＱｒ突然変異体をシプロフロキサシンに対して再感受性化するか、又は野生型細菌をシプロフロキサシンに対して高感受性化する遺伝子である。これらの遺伝子によりコードされる蛋白の阻害剤が同定されたら、ＦＱ抗生物質との併用療法用に開発する。
【０３４１】
ＦＱｒ  ｇｙｒＡ突然変異体により合成致死性となる遺伝子を同定するために、可動性転位因子も導入したＦＱｒ  ｇｙｒＡ突然変異体株に機能的ｇｙｒＡを発現する不安定なプラスミドと比色マーカー（例えばＬａｃＺ）を導入する。トランスポゾンを移動させ、ゲノム全体で遺伝子をランダムに破壊する。トランスポゾンがＦＱｒ  ｇｙｒＡ突然変異体の生存に必要な遺伝子を破壊するならば、野生型ｇｙｒＡ蛋白を発現するプラスミドはＬａｃＺのコロニーセクタリングアッセイにより判断した場合に必須で安定になる（Ｂｅｒｎｈａｒｔら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：１２５５−１２６９，２００４）。あるいは、外向き誘導転写プロモーターをもつ転位因子を使用してＦＱｒ  ｇｙｒＡ突然変異体により合成致死性となる遺伝子を同定する（Ｊｕｄｓｏｎ．Ｎ，Ｍｅｋａｌａｎｏｓ  ＪＪ．ＴｎＡｒａＯｕｔ，ａ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｓ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００  Ｊｕｌ；１８（７）：７４０−５．ＰＭＩＤ：１０８８８８４１）。上記のように、このトランスポゾンを少量のインデューサーの存在下でＦＱｒ  ｇｙｒＡ突然変異体株内を移動させ、トランスポゾン挿入の結果として低濃度のインデューサーの存在下でゆっくり増殖する（小コロニー）が、インデューサーの不在下では増殖しないことにより合成致死性突然変異を同定する。トランスポゾンインサートの両側のゲノム領域を配列決定することにより、これらの合成致死性突然変異で破壊された遺伝子を同定する。
【０３４２】
ＦＱｒ突然変異体をシプロフロキサシンに対して再感受性化するターゲットを同定するために、上記突然変異体プールをシプロフロキサシン高感受性についてスクリーニングする。また、野生型細菌をシプロフロキサシンに対して高感受性化するターゲットを同定するために、上記トランスポゾンを野生型バックグラウンドに移動し、突然変異体プールをシプロフロキサシン高感受性についてスクリーニングする。
【実施例１２】
【０３４３】
哺乳動物細胞をＤＮＡ損傷剤に対して高感受性化する物質
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は非相同組換え（ＮＨＲ）は哺乳動物におけるＤＳＢ修復の主要メカニズムである。この経路は一般にＤＳＢに対してマイクロホモロジー（約３〜１０塩基）をもつ領域のマイクロホモロジー検索を実施し、ＮＨＲ反応で傷害を修復することによりＤＳＢを修復する（Ｒａｔｈｍｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃｈｕ，ＤＮＡ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｒｅａｋ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６  ｏｆ  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｈｏｅｋｓｔｒａ，Ｍ．Ｆ．ｉｎ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９８）。この経路の主要成分はＤＮＡ蛋白キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）、Ｋｕ７０及びＫｕ８６蛋白、並びにＸＲＣＣ４蛋白である。Ｋｕ蛋白はＤＮＡの２本鎖末端と高親和性で結合してＤＮＡ−ＰＫを動員するヘテロ二量体ヘリカーゼを形成する。その後、ＫｕはＤＮＡを巻き戻し、ホモロジー依存性又はホモロジー非依存性経路により修復を促進する（Ｒａｔｈｍｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃｈｕ，ＤＮＡ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｒｅａｋ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６  ｏｆ  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｈｏｅｋｓｔｒａ，Ｍ．Ｆ．ｉｎ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９８）。ＸＲＣＣ４、Ｋｕ８６又はＤＮＡ−ＰＫを欠失する細胞は電離放射線に高感受性である。これは哺乳動物におけるＤＳＢ修復の主要経路であるので、この経路の蛋白阻害剤がＤＳＢを誘発するＤＮＡ損傷剤に対して細胞を高感受性化すると予想される。従って、Ｋｕ蛋白（Ｋｕ７０及びＫｕ８６）、ＤＮＡ−ＰＫ又はＸＲＣＣ４の阻害剤は哺乳動物細胞をＤＮＡ損傷剤に対して感受性化すると考えられるので、化学療法薬や電離放射線による治療等のＤＮＡ損傷を生じる治療レジームと併用するのに有益な薬剤であると思われる。
【０３４４】
Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＤＮＡ−ＰＫ、及びＸＲＣＣ４の阻害剤を同定するために、実施例５に記載した方法を原則的に記載通りに使用し、これらの蛋白の結合剤と阻害剤を同定する。Ｃｈｕ（ＥＭＢＯ  Ｊ．２００２  Ｊｕｎ  １７；２１（１２）：３１９２−２００．）により開発されたアッセイ等の非相同末端結合アッセイを使用し、無細胞アッセイでこの反応の機能的阻害剤をスクリーニングする。その後、放射線や化学療法用ＤＮＡ損傷剤に対して細胞を高感受性化するアナログを哺乳動物細胞でスクリーニングする。
【実施例１３】
【０３４５】
ｒｅｃＢ遺伝子の欠失は複数細菌種をシプロフロキサシンに対して感受性化する。
大腸菌におけるｒｅｃＢ突然変異のシプロフロキサシン感受性化効果が他の細菌にも当てはまることを確認するために、ｒｅｃＢ遺伝子を各種細菌種から欠失させ、得られた株のシプロフロキサシン感受性をアッセイした。大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）、肺炎桿菌（ＡＴＣＣ４３８１６）、緑膿菌（ＡＴＣＣ２７８５３）、炭疽菌（Ｓｔｅｒｎｅ）、及び黄色ブドウ球菌（ＮＡＲＳＡ７７）で標準技術を使用してｒｅｃＢの欠失を実施した。ノックアウトのゲノム構造をＰＣＲにより確認した。野生型及びｒｅｃＢ突然変異体株の両者でシプロフロキサシンＭＩＣを測定した（表１０）。
【０３４６】
【表１０】
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【０３４７】
試験した各細菌種からｒｅｃＢを欠失させると、株は有意にシプロフロキサシン感受性になり、特定種に応じて４〜１６倍になった。これらの結果から、ｒｅｃＢはシプロフロキサシン等のフルオロキン抗生物質に対する細菌感受性において重要な役割を果たすことが判明し、ＲｅｃＢ阻害剤をフルオロキン抗生物質と併用すると、広範な細菌感染症の治療に有効な併用療法となることが明らかである。
【実施例１４】
【０３４８】
ｒｅｃＢの欠失は動物モデルで肺炎桿菌のシプロフロキサシン感受性を増加する。
ｒｅｃＢ欠失の効果を検討するために、肺炎桿菌感染の免疫コンピテントマウス大腿部感染モデルを使用してシプロフロキサシン用量応答試験を実施した。マウスの大腿部に野生型又はΔｒｅｃＢ肺炎桿菌株１〜３×１０７ＣＦＵを接種した後、シプロフロキサシン０．０６４〜１５ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量を２４時間おきに分けてｔ＝０及び２４時間にマウスに投与した。食塩水を投与した動物はｔ＝−２及び０時間、食塩水又はシプロフロキサシンを投与した動物は２４及び４８時間に微生物アッセイにより大腿部の細菌濃度を測定した。−２、０、２４、及び４８時間に生体適応度を測定した。シプロフロキサシン用量（ｍｇ／ｋｇ／日）に対する４８時間終点のｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇ大腿部の代表的グラフを図６に示す。
【０３４９】
図６のグラフから明らかなように、試験した全シプロフロキサシン用量でｒｅｃＢ突然変異体のＣＦＵは野生型株に比較して大幅に低下している。これはｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られるシプロフロキサシン感受性がｉｎ  ｖｉｖｏでもシプロフロキサシン治療に対する感受性の増加として発現されることを示している。これらの試験から、ｒｅｃＢを欠失させるとｉｎ  ｖｉｖｏでシプロフロキサシン感受性が増加し、肺炎桿菌がより有効に死滅することが明らかであり、肺炎桿菌及び他の細菌感染症を治療するためにＲｅｃＢヘリカーゼの阻害剤をフルオロキノロンと有効に併用できることが判明した。更に、野生型肺炎桿菌に比較してｒｅｃＢ突然変異体の死滅が増加したことから、このような併用療法の結果、治療が困難な感染症の治癒を早め、良好な効力が得られると思われる。
【実施例１５】
【０３５０】
細胞をシプロフロキサシンに対して感受性化するｒｅｃＢ阻害剤の同定
高スループットスクリーニング法を利用して細菌のシプロフロキサシン感受性を増強するＲｅｃＢＣ（Ｄ）の小分子阻害剤を同定した。要約すると、６５０，０００種の化合物の潜在的ライブラリー（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から約１１０，０００種の合成化合物を含むライブラリーを選択した。膜透過性にした大腸菌をマルチウェルプレートで最低阻害濃度（ＭＩＣ）の約０．５倍のシプロフロキサシンの存在下で増殖させ、これらの化合物をスクリーニングした。透過性強化はＩｐｘＡ（必須遺伝子であるが、低形質対立遺伝子をもつ細胞による脂質Ａ産生量の量的減少により外膜が著しく脆化する結果、小分子透過性が増加する）の低形質対立遺伝子を利用して実施した。次に、ｒｅｃＢ又はｐｒｉＡ突然変異で合成致死性になることが示されている非必須ヘリカーゼであるｒｅｐの欠失を含む同一遺伝子型株で（抗生物質をシプロフロキサシン感作剤から区別するために）シプロフロキサシンの存在下と不在下で活性化合物を再アッセイした。これらのフィルターを通過した活性化合物を次に（野生型透過性をもつ大腸菌への侵入能を評価するために）大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５Δｒｅｐを死滅させる能力について試験した。
【０３５１】
０．５×及び０．１×ＭＩＣの両者を測定することにより判定した場合にシプロフロキサシン感受性化を示す化合物約４０種が初期スクリーニングで同定された。これらの化合物は複数の構造骨格を示した。所定化合物は細菌浸透性の低減を示したが、これらの全化合物は細胞侵入を助長する条件下で細菌のシプロフロキサシン感受性を増強することができた。
【０３５２】
少なくとも７０％のＴａｎｅｍｏｔｏ類似性をもつアナログを同定するためにライブラリーの残りの６４０，０００種の分子で構造検索を実施した結果、更に１０５２種の化合物が得られ、類似の構造及び化学的性質をもつアナログで有効な骨格を拡大することが可能になった。これらの化合物を上記に概説したスクリーニングカスケードに付した。多数の化合物が同定され、以下に詳述する式Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩの化合物により表されるものを含む数種の別個の骨格構造が判明した。
【０３５３】
同定された化合物の１例を式Ｉａとして以下に示すが、この式は一般式としてＩｂに示す骨格に該当し、式中、Ｒは水素、ハロ、シアノ、リン酸、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アミノアルキル、シアノアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシハロアルキル、アルキルスルホン酸、チオスルホン酸、アルキルチオスルホン酸、チオアルキル、アルキルチオ、アルキルチオアルキル、アルキルアリール、カルボニル、アルキルカルボニル、ハロアルキルカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アルキルアミノチオカルボニル、ハロアルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノアルキルチオ、ヒドロキシアルキルチオ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、スルホン酸、スルホン酸アルキルエステル、チオ硫酸、又はスルホンアミドである。
【化１】
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式Ｉａの化合物は大腸菌のシプロフロキサシン感受性を増強し、２５μＭシプロフロキサシンのシプロフロキサシン反応性はＭＩＣが１０倍になった。シプロフロキサシン感受性を増強する他のアナログも同定された。
【０３５４】
別の同定された骨格構造を一般式ＩＩａに示し、式中、どちらか一方のＡは窒素であり、他方のＡは炭素である。この骨格構造をもつ特定同定化合物を式ＩＩｂ及びＩＩｃに示す。
【化２】
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これらの各化合物は２５μＭシプロフロキサシン活性が増加した。
【０３５５】
スクリーニング中に同定された別の骨格を式ＩＩＩに示す特定同定化合物により表す。この骨格の化合物もシプロフロキサシン感受性の増加を示した。
【化３】
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【０３５６】
上記スクリーニングの結果、細胞をシプロフロキサシンに対して感受性化する構造的に異なる各種化合物が同定され、これらの化合物はｒｅｃＢ又はｐｒｉＡの阻害剤である。これらの試験から明らかなように、本発明の方法は細菌のフルオロキノロン感受性を増強する化合物を同定するために有効に使用することができる。更に、著しく異なる構造骨格をもつ各種化合物が細菌のフルオロキノロン感受性を増強する機能特性を共有することも判明した。
【０３５７】
本明細書に記載及び／又は出願データシートに記載した上記全米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許文献はその内容全体を参考資料として本明細書に組込む。
【０３５８】
以上から自明の通り、本発明の特定態様を例証の目的で記載したが、本発明の精神と範囲から逸脱せずに各種変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０３５９】
【図１】シプロフロキサシンに対する細菌応答の図である。相同配列の不在下では、遊離２本鎖切断（ＤＳＢ）はヌクレアーゼ及びポリメラーゼ依存性非正統的組換え（ＩＲ，経路Ａ）により修復される。適切な相同配列と機能的相同組換えシステムの存在下では、遊離ＤＳＢは複製依存性組換え（ＲＤＲ，経路Ｂ）により修復することができる。複製フォークに遊離ＤＳＢが生じた場合には、この経路は複製フォークの修復にも機能することができる。最後に、複製フォーク阻害は組換え依存性複製フォーク修復（経路Ｃ）により修復される。
【図２】シプロフロキサシン４０ｎｇ／ｍｌを添加した固体培地に各種組換え突然変異体をプレーティング後の指定時点に残存する生存細胞数（ＬＢ上のコロニー形成単位）を示すグラフ。ＬＢ上の生存細胞数を測定する前にシプロフロキサシン含有一次選択プレートから可視コロニーを切り出した。
【図３】ストレス生活適応的突然変異（ＳＬＡＭ）アッセイ。
【図４】シプロフロキサシン４０ｎｇ／ｍＬを添加した固体培地に野生型及び突然変異体株をプレーティング後の指定時点に残存する生存細胞数を示すグラフ。（Ａ）シプロフロキサシンに対して高感受性の組換え突然変異体及び（Ｂ）野生型感受性をもつ組換え突然変異体。数値は１日当たりの生存細胞数を表し、誤差線は少なくとも３回の独立した測定からの標準偏差を表す。ＬＢ上の生存細胞数を測定する前にシプロフロキサシン含有一次選択プレートから可視コロニーを切り出した。
【図５】ＳＫ１１９に由来する各種シプロフロキサシン耐性株の許容及び非許容条件下における最低阻害濃度（ＭＩＣ）を示すグラフ。ＳＫ１１９は温度感受性ｒｅｃＢ対立遺伝子をもつ大腸菌株である（Ｋｕｓｈｎｅｒ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔ．１２０：１２１３−１２１８，１９７４）。ＳＫ１１９は野生型ＳＫ１１９を表し；１、３、５、６、及び８は各々実施例４に記載するように許容温度で選択した別々のシプロフロキサシン耐性突然変異体株を表す。
【図６】マウス大腿部感染モデルでｒｅｃＢ欠失が肺炎桿菌のシプロフロキサシン感受性に及ぼす影響を示すグラフ。グラフは各種シプロフロキサシン用量で肺炎桿菌の野生型又はｒｅｃＢ突然変異体株に感染させた動物におけるｌｏｇ  ｃｆｕ／ｇ大腿筋を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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