(57)【要約】本発明は稲で分離された開花時期及び／または幹伸張調節因子ＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２、ＯｓＣＯＬ４及びＯｓＣＯＬ８からなる群の中で選択された遺伝子と、前記遺伝子を含むＤＮＡ構造体、前記ＤＮＡ構造体に形質転換された遺伝子導入植物体及び前記遺伝子を利用して植物の開花時期及び／または幹伸張を調節する方法に関し、本発明を通じて多様な植物の開花時期と幹伸張を調節することによって多様な農業的利益を図ることができる。【選択図】なし
2008525013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７の塩基配列を有するＣドメインコーディング序列を含む３’末端が除去された切頭ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１の塩基配列を有するＯＳＣＯＬ４遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する稲の開花時期調節因子。
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有し、開花促進活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の稲の開花時期調節因子。
【請求項３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１の塩基配列を有するＯＳＣＯＬ４遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有し、開花抑制活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の稲の開花時期調節因子。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７の塩基配列を有するＣドメインコーディング序列を含む３’末端が除去された切頭ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子を有し、短日条件下では開花促進活性を有し、長日条件下では開花抑制活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の稲の開花時期調節因子。
【請求項５】
単子葉植物の開花時期調節因子、前記単子葉植物での稲のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７の塩基配列を有するＣドメインコーディング序列を含む３’末端が除去された切頭ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１の塩基配列を有するＯＳＣＯＬ４遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子に相応する遺伝子を有することを特徴とする開花時期調節因子。
【請求項６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子を有することを特徴とする稲の幹伸張調節因子。
【請求項７】
請求項１の開花時期調節因子から生産される蛋白質で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１８からなる群の中で選択されたアミノ酸序列を有することを特徴とする開花時期調節蛋白質。
【請求項８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７の塩基配列を有するＣドメインコーディング序列を含む３’末端が除去された切頭ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１の塩基配列を有するＯＳＣＯＬ４遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体で、
前記開花時期調節因子は植物で作用可能なストロングプロモーターと作動可能に連結されたり、植物で作用可能なエンハンサーと作動可能に連結されて過発現が誘導されたり、植物遺伝子内に挿入可能な外来遺伝子または内生トランスポゾンが挿入されたり、前記序列が全部または一部変更されて機能喪失が誘導されたものであることを特徴とするＤＮＡ構造体。
【請求項９】
前記開花時期調節因子が玉蜀黍ユビキチン（ｕｂｉ）プロモーターと作動可能に連結されて過発現が誘導されたものであることを特徴とする、請求項８に記載のＤＮＡ構造体。
【請求項１０】
前記開花時期調節因子がプロモーター領域に挿入されたＴ-ＤＮＡ内の３５Ｓエンハンサーによって過発現が誘導されたものであることを特徴とする、請求項８に記載のＤＮＡ構造体。
【請求項１１】
前記開花時期調節因子の特定領域にＴ-ＤＮＡまたは内生トランスポゾンが挿入されて機能喪失が誘導されたものであることを特徴とする、請求項８に記載のＤＮＡ構造体。
【請求項１２】
前記開花時期調節因子が全部または一部変更されて機能喪失が誘導されたものであることを特徴とする 請求項８に記載のＤＮＡ構造体。
【請求項１３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子を含み、前記ＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子が第４イントロンにＴ-ＤＮＡが挿入されて機能喪失が誘導されたものであることを特徴とする、請求項８に記載のＤＮＡ構造体。
【請求項１４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１の塩基配列を有するＯＳＣＯＬ４遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子を含み、前記開花時期調節因子が第１エクソンまたは３’ＵＴＲ領域にＴ-ＤＮＡが挿入されて機能喪失が誘導されたものであることを特徴とする、請求項８に記載のＤＮＡ構造体。
【請求項１５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７の塩基配列を有するＣドメインコーディング序列を含む３’末端が除去された切頭ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１の塩基配列を有するＯＳＣＯＬ４遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換された遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞で、
前記ＤＮＡ構造体に含まれている開花時期調節因子は植物で作用可能なストロングプロモーターと作動可能に連結されたり、植物で作用可能なエンハンサーと作動可能に連結されて過発現が誘導されたり、植物遺伝子内に挿入可能な外来遺伝子または内生トランスポゾンが挿入されたり、前記序列が全部または一部変更されて機能喪失が誘導され開花が促進されたり抑制された遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞。
【請求項１６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換され、前記開花時期調節因子が玉蜀黍ユビキチン（ｕｂｉ）プロモーターと作動可能に連結されて過発現が誘導されたものであるために開花が促進されたことを特徴とする、請求項１５に記載の遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞。
【請求項１７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換され、前記開花時期調節因子がプロモーター領域に挿入されたＴ-ＤＮＡ内の３５Ｓエンハンサーによって過発現が誘導されたものであるために開花が促進されたことを特徴とする、請求項１５に記載の遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞。
【請求項１８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換され、前記開花時期調節因子が特定領域にＴ-ＤＮＡまたは内生トランスポゾンが挿入されて機能喪失が誘導されたものであるために開花が抑制されたことを特徴とする、請求項１５に記載の遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞。
【請求項１９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換され、前記開花時期調節因子が全部または一部変更されて機能喪失が誘導されたものであるために開花が抑制されたことを特徴とする、請求項１５に記載の遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞。
【請求項２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子を有する開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体に形質転換され、前記ＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子が第４イントロンにＴ-ＤＮＡが挿入されて機能喪失が誘導されたものであるか、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体に形質転換され、前記開花時期調節因子が第１エクソンまたは３’ＵＴＲ領域にＴ-ＤＮＡが挿入されて機能喪失が誘導されたものであるために開花が抑制されたことを特徴とする、請求項１５に記載の遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞。
【請求項２１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ４遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体に形質転換され、前記開花時期調節因子がストロングプロモーターと作動可能に連結されたり、プロモーター領域にエンハンサーを有する植物遺伝子内に挿入可能な外来遺伝子が挿入されることによって過発現が誘導されたものであるために開花が抑制されたことを特徴とする、請求項１５に記載の遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞。
【請求項２２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ４遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体に形質転換され、前記開花時期調節因子が特定位置にＴ-ＤＮＡまたは内生トランスポゾンが挿入されたり、序列の全部または一部が変更されて機能喪失が誘導されたものであるために開花が促進されたことを特徴とする、請求項１５に記載の遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞。
【請求項２３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７の塩基配列を有するＣドメインコーディング序列を含む３’末端が除去された切頭ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子を有する開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体に形質転換され、Ｃドメインの部分が除去されたＯｓＭＡＤＳ１４部分蛋白質が過発現されて開花が促進されたことを特徴とする、請求項１５に記載の遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞。
【請求項２４】
前記植物が稲であることを特徴とする、請求項１５乃至２３のいずれかに記載の遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞。
【請求項２５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７の塩基配列を有するＣドメインコーディング序列を含む３’末端が除去された切頭ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１の塩基配列を有するＯＳＣＯＬ４遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子を、
植物で作用可能なストロングプロモーターと作動可能に連結させたり、植物で作用可能なエンハンサーと作動可能に連結させて過発現を誘導したり、
植物遺伝子内に挿入可能な外来遺伝子または内生トランスポゾンを挿入させたり、前記序列が全部または一部を変形させて機能喪失を誘導して植物の開花を促進させたり抑制させることを特徴とする植物の開花調節方法。
【請求項２６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子を、
玉蜀黍ユビキチン（ｕｂｉ）プロモーターと作動可能に連結させて過発現を誘導させることで開花を促進させることを特徴とする、請求項２５に記載の植物の開花調節方法。
【請求項２７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子のプロモーター領域にＴ-ＤＮＡを挿入させ、前記挿入されたＴ-ＤＮＡ内の３５Ｓエンハンサーによって過発現を誘導させることによって開花を促進させることを特徴とする、請求項２５に記載の植物の開花調節方法。
【請求項２８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子の特定領域にＴ-ＤＮＡまたは内生トランスポゾンを挿入させて機能喪失を誘導させることによって開花を抑制させることを特徴とする、請求項２５に記載の植物の開花調節方法。
【請求項２９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７の塩基配列を有するＯｓＴＲＸ１遺伝子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９の塩基配列を有するＯｓＶＩＮ２遺伝子、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子の塩基配列全部または一部を変形させて機能喪失を誘導することによって開花を抑制させることを特徴とする、請求項２５に記載の植物の開花調節方法。
【請求項３０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子の第４イントロンにＴ-ＤＮＡを挿入させて機能喪失を誘導させたり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子の第１エクソンまたは３’ＵＴＲ領域にＴ-ＤＮＡを挿入させて機能喪失を誘導させることによって開花を抑制させることを特徴とする、請求項２５に記載の植物の開花調節方法。
【請求項３１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ４遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子をストロングプロモーターと作動可能に連結させたり、プロモーター領域にエンハンサーを有する植物遺伝子内挿入可能な外来遺伝子を挿入させて過発現を誘導させることで開花を抑制させることを特徴とする、請求項２５に記載の植物の開花調節方法。
【請求項３２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１の塩基配列を有するＯｓＣＯＬ４遺伝子からなる群の中で選択された遺伝子を有する開花時期調節因子の特定位置にＴ-ＤＮＡまたは内生トランスポゾンを挿入させたり、序列の全部または一部が結実させて機能喪失を誘導することによって開花を促進させることを特徴とする、請求項２５に記載の植物の開花調節方法。
【請求項３３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１５の塩基配列を有するＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のＣドメインコーディング序列を含む３’末端を除去してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１８のアミノ酸序列を有するＣドメイン部位が除去されたＯｓＭＡＤＳ１４蛋白質を過発現させることによって開花を促進させることを特徴とする、請求項２５に記載の植物の開花時期調節方法。
【請求項３４】
前記植物が稲であることを特徴とする、請求項２５乃至３３のいずれか１項に記載の植物の開花調節方法。
【請求項３５】
植物細胞を準備し、
前記植物細胞を請求項８乃至１４のいずれか１項に記載されたＤＮＡ構造体に形質転換させ、
前記得られた形質転換細胞を培養する段階を含む、
開花時期が調節された遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞の製造方法。
【請求項３６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１のＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子の発現を過発現させたり機能喪失させる段階を含む植物の幹伸張調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は稲の開花時期及び／または幹伸張に関与する調節因子、前記遺伝子を利用して形質転換された遺伝子導入植物及び、前記調節因子を利用して植物の開花時期及び／または幹伸張を調節する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物の発達過程は栄養生長と生殖生長に区分され、多様な開花信号を受けて前記２種類生長間の転換が行われる。このような開花信号には光周期、光強度のような環境的要因と植物体内の遺伝的要因など、多様な要素が影響を与える（Ｄｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８;Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。このような生長転換結果、多様な形態的変化が起こるが、これは科学的観点から興味深い主題である。それだけでなく、開花調節から得られる経済的効用によって開花関連機序は多く研究されてきた。
特に、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ：日本名はシロイヌナズナ）をモデルにした分子遺伝学的研究は開花調節遺伝子の機能と、これら相互間の関連性を理解させ、これを通じて開花信号経路を具体的に明らかにした。アラビドプシスの場合、光、温度、光周期などのような外部信号と、栄養状態、ホルモンなどのような内部信号が開花に関与し、開花経路は、おおよそ、光周期経路、春化経路、ジベレリン（ＧＡ、ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ）経路、内在的経路に分かれる。
【０００３】
これに反し、稲においては開花時期が主に光周期経路と内在的経路によって調節されると思われている（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。最近、稲における光周期経路に関与するものと推定される幾つかの遺伝子が分離され、稲での光周期経路の輪郭がある程度明らかになった（Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．,２００１、Ｍｏｕｒａｄｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００２）。まず、光周期敏感性を調節する幾つかの特定遺伝子座が同定されたが、Ｓｅ（Ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）１（Ｓｅ１）、Ｓｅ３-Ｓｅ７及びＥＥ１-Ｅ３等がそれである（Ｐｏｏｎｙａｒｉｔ ｅｔ ａｌ．,１９８９、Ｓａｎｏ,１９９２、Ｔｓａｉ,１９９５、Ｙｏｋｏｏ ｅｔ ａｌ．,１９８０、Ｙｏｋｏｏ ａｎｄ Ｏｋｕｎｏ,１９９３）。また、分子水準マーカを使用する量的形質遺伝子座分析（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ（ＱＴＬ）ａｎａｌｙｓｅｓ）によって出穂期（ｈｅａｄｉｎｇ  ｄａｔｅ）に関する数十個の遺伝子座を検出したが、出穂期１（Ｈｄ１）、出穂期６（Ｈｄ６）、出穂期３ａ（Ｈｄ３ａ）等のような遺伝子が分離された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．,１９９５、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．,１９９６,１９９８、Ｍａｈｅｓｗａｒａｎ ｅｔ ａｌ．,２０００、Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．,１９９７、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．,１９９５）。前記遺伝子のうち、Ｓｅ５、Ｈｄ１、Ｈｄ６、Ｈｄ３ａ遺伝子はそれぞれアラビドプシスの長い胚軸１（ＬＯＮＧ  ＨＹＰＯＣＯＴＹＬ１：ＨＹ１）、ＣＯＮＳＴＡＮＳ（ＣＯ）、カゼインキナーゼ２（ＣＡＳＥＩＮ  ＫＩＮＡＳＥ２：ＣＫ２）、ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳＴ（ＦＴ）に相応する遺伝子で、アラビドプシスの遺伝子と類似な生化学的機能を担当すると予想される。
【０００４】
しかし、前記稲の遺伝子とアラビドプシスの遺伝子は光周期に対して相異なる反応を示す場合がある。アラビドプシスのＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子は日長を認識して開花時期を誘導する開花促進遺伝子である。稲にもＣＯＮＳＴＡＮＳと相同性のある遺伝子が存在し、そのうちＨｄ１（出穂期１：ｈｅａｄｉｎｇ  ｄａｔｅ１）という遺伝子が稲の開花時期を調節する。稲のＨｄ１遺伝子はｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒドメインと核位置化信号を含む蛋白質をコーディングする遺伝子で、短日（ＳＤ）条件でＨｄ３ａ遺伝子の発現を増加させて開花を促進するが、長日（ＬＤ）条件ではむしろＨｄ３ａ遺伝子の発現を阻害して開花を抑制することが明らかになった（Ｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．,２００２）。これに反し、前記Ｈｄ１に対応するアラビドプシスのＣＯ遺伝子は長日条件でＦＴ（稲のＨｄ３ａに当る）の発現を増加させて開花促進子として作用するが、短日条件で開花抑制者として作用しない（Ｐｕｔｔｅｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．,１９９５）。このように植物種に応じる相異なる光周期反応に対する分子水準の理解は短日植物と長日植物の差が理解できる糸口を提供することと予測される。
【特許文献１】特開２００２−１５３２８３（特許文献２の優先権基礎出願）
【特許文献２】米国特許７，１９６，２４６（特許文献１に対応させて翻訳に利用）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在まで稲において前記で提示したような幾つかの開花関連遺伝子が明らかになったが、その数は制約的であり、アラビドプシスと区別される稲特異的遺伝子についても知らされたことがあまりない。また、長日条件特異的開花調節因子や他の開花経路の内在的経路を調節する遺伝子についても知らされたことがない。開花時期が植物の耕作時期及び耕作地域を決める時に非常に重要で、開花時期を調節することで莫大な農業的利益が得られることを考慮する時、稲の開花時期調節経路を明らかにし、これに関与する遺伝子を探索するための努力が切実に要求される。
これに本発明者らは追加的に稲で開花調節遺伝子を同定し、その特性を究明した。公知されていない開花調節因子が発見されただけでなく、稲でその機能が特異に分化した結果も得ることができた。
【０００６】
このような要求に応じるために本発明は、稲における開花時期調節に関与する遺伝子を明らかにし、これらの作用条件を探して稲の開花時期を調節することによって農業的利益を追求することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような目的を達成するために、本発明者らは稲のＴ-ＤＮＡ挿入突然変異株から開花時期が促進されたり遅延された変異株を選抜して遺伝子を分析し、アラビドプシスのＡＧＬ２０、ＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子などのような開花時期調節因子に相応する遺伝子を含む開花調節因子を分離し、追加的な形質転換分析によってこれら遺伝子の機能と作用条件を究明して本発明を完成した。また、前記遺伝子のうちの一部は稲の幹伸張を促進することが明らかになった。また、前記遺伝子は稲だけでなく、とうもろこし、麦、小麦などのような発生的類似性を有する他の単子葉植物にも類似な作用が行われると予想される。
より具体的には、本発明は１）開花時期及び／または幹伸張調節因子、２）前記調節因子からコーディングされる開花時期調節蛋白質、３）前記調節因子の過発現または機能喪失が誘導される構造体、４）前記過発現または機能喪失が誘導される構造体によって形質転換される遺伝子導入植物体、植物の一部または植物細胞、４）前記遺伝子導入植物の製造方法、及び５）前記調節因子を使用して開花時期及び／または幹伸張を調節する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
まず、本発明は開花時期及び／または幹伸張の調節機序に関与する調節因子を提供する。
Ｔ-ＤＮＡを標識として挿入させた遺伝子導入植物体の中で開花時期が遅れたり速くなるなど、開花時期に変化がある個体を選別してＴ-ＤＮＡ挿入部位の隣接部位遺伝子序列を分析して次のような幾つかの開花時期調節因子を捜し出した。
このように発見された開花時期調節因子のうちの１つが稲のＭＡＤＳボックス遺伝子のうちの１つであるＯｒｙｚａ ｓｔａｖｉｓ ＭＡＤＳ５０（以下、“ＯｓＭＡＤＳ５０”と言う）で、その序列をＳＥＱＩＤＮＯ:１として示した。
【０００９】
前記調節因子は従来のＮＣＢＩ（米国国立Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースに登録されていた登録（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号ＡＢ００３３２８に対して特異な２対のプライマーを利用したＰＣＲ反応によって分離し、その序列を分析して“Ｏｒｙｚａ ｓｔａｖｉｓ ＭＡＤＳ５０”（以下、“ＯｓＭＡＤＳ５０”と言う）と命名された。前記ＯｓＭＡＤＳ５０は稲のＭＡＤＳボックス含有遺伝子のうちの１つで、典型的なＭＩＫＣ（（ＭＡＰＳ、Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ、ケラチン類（Ｋｅｒａｔｉｎ−ｌｉｋｅ）及びＣ-末端領域）-ｔｙｐｅ ＭＡＤＳボックス遺伝子である。前記ＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子のゲノム ＤＮＡ序列はＡＣ０９８６９５で登録されている。前記ＯｓＭＡＤＳ５０は３番染色体に存在し、７個のエクソンと６個のイントロになり（図２ａ参照、ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ ｅｔ ａｌ．,２０００、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．,２００３））、同じＭＡＤＳボックス遺伝子などでＯｓＭＡＤＳ５６と最も相同性が高いことが明らかになった（６０．８％）。
【００１０】
前記ＯｓＭＡＤＳ５０はアラビドプシスに存在するＣＯ１過発現抑制因子／ＡＧＡＭＯＵＳ-ＬＩＫＥ２０（ＳＯＣ１／ＡＧＬ２０）遺伝子の稲におけるｏｒｔｈｏｌｏｇとしての役割を果たす、稲での開花促進因子であることが明らかになった。このようなＯｓＭＡＤＳ５０の開花促進効果は、Ｔ-ＤＮＡ挿入などでＯｓＭＡＤＳ５０機能が失われたＯｓＭＡＤＳ５０ ノックアウト（ＫＯ）個体、またはＯｓＭＡＤＳ５０部位または前記遺伝子のＭＡＤＳボックスのＭ、Ｉ、Ｋ及びＣドメインのうちの全部または一部が除去されたＯｓＭＡＤＳ５０ＲＮＡｉ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）個体または前記ドメインの中の一部または全部がｎｔ置換などによって変形された個体で開花時期が遅延する反面、植物で作用可能なストロングプロモーター（例えば、アクチンプロモータ（ａｃｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、チトクロームＣ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ）、玉蜀黍ユビキチン（ｍａｉｚｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ：ｕｂｉ）プロモータなど）によるＯｓＭＡＤＳ５０の過発現個体（ｕｂｉ:ＯｓＭＡＤＳ５０）ではカルス段階から極端に速い開花が進められるという事実から分かる。
【００１１】
本発明において、特定遺伝子の過発現はアクチンプロモータ、チトクロームＣ、ユビキチン（ｕｂｉ）プロモータ（Ｐｕｂｉ）等のような植物で作用可能なストロングプロモーターを作動可能に連結するか、適切な位置にエンハンサーを含むＤＮＡ断片を挿入して行うことができ、特定遺伝子の機能喪失はＴ-ＤＮＡのような植物ゲノム内挿入が可能な外来遺伝子またはＴＯＳ１７のような内生トランスポゾンを利用したり、エックス線やガンマ線などを注射して突然変異を誘発したり、ＲＮＡｉまたはａｎｔｉ-ｓｅｎｓｅ方法を利用して行うことができる。このような遺伝子過発現または機能喪失方法は本発明の遺伝子に一般に適用される。
【００１２】
このようなＯｓＭＡＤＳ５０ＫＯ個体またはＯｓＭＡＤＳ ＲＮＡｉ個体と、ｕｂｉ:ＯｓＭＡＤＳ５０個体のＲＴ-ＰＣＲ分析によってＯｓＭＡＤＳ５０が稲の開花機序に関与するＯｓＭＡＤＳ１、ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＭＡＤＳ１５、ＯｓＭＡＤＳ１８及びＨｄ３ａ遺伝子のｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ役割を果たすことが明らかになった。このような結果は前記遺伝子ＯｓＭＡＤＳ５０が単独及び直接的に稲の開花に影響を与えることではなく、開花機序に関与する多様な遺伝子を調節することによってより根源的に開花時期を調節することを示す。
【００１３】
また、ＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子の機能が失われた個体で野生型と比較して顕著な幹伸張を示すことを観察して、前記遺伝子が開花時期だけでなく幹伸張調節にも関与することを確認した。つまり、ＯｓＭＡＤＳ５０機能が失われた個体は前記のように開花は遅延された反面、節間伸張が増加した表現型を示すことを発見して、前記遺伝子が開花調節だけでなく幹伸張調節にも影響を与えることを確認した。
【００１４】
また、ＯｓＭＡＤｓ５０機能が失われた個体は長日条件下でだけ開花時期を遅延させることが明らかになり、ＯｓＭＡＤＳ５０は長日条件下で作用する開花促進因子であることを確認した。
【００１５】
また、前記ＯｓＭＡＤｓ５０遺伝子の他にも、過発現または機能喪失によって開花時期に影響を与える遺伝子として、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＴＲＸ１及びＯｓＶＩＮ２遺伝子を分離した。
【００１６】
ＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子は従来ＮＣＢＩデータベースにＡＢ００３３２７という番号で登録されているが（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３）、器官別発現様相のみ報告され、その機能については知られていない（Ｓｈｉｎｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．,１９９９）。前記ＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子のゲノムＤＮＡ序列はＡＰ００８２０７で登録されている。本発明では過発現または機能喪失変異時に開花時期が変化する遺伝子として前記遺伝子を探索してＰＣＲによって分離した。本発明において、ＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子は過発現時に自然条件下で１乃至２週程度開花を促進させ、機能喪失されたノックアウト個体は短日条件で開花を遅延させることが示され（図１１参照）、前記遺伝子もやはり開花時期調節因子であることを確認した。
【００１７】
また、本発明者らは過発現または機能喪失変異時に開花時期が変化する遺伝子で、ＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子を分離同定してＮＣＢＩデータベースに登録番号ＡＹ３４５２２４で登録した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５）。前記遺伝子のゲノムＤＮＡ序列はＡＣ０９２６９７で登録されている。本発明において、ＯｓＭＡＤＳ５６過発現形質転換体は自然条件で開花時期が１乃至２週程度遅れた。日長を調節した後、育てた時には、短日条件では開花時期が変化せず、長日条件でだけ１ヶ月だけ開花時期が遅れた（図１２参照）。
【００１８】
Ｔ-ＤＮＡ挿入による機能喪失によって開花時期が変化する他の遺伝子として、ＯｓＴＲＸ１遺伝子とＯｓＶＩＮ２遺伝子を発見し、これらの塩基配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７（ＯｓＴＲＸ１）とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９（ＯｓＶＩＮ２）に示した。前記遺伝子のゲノムＤＮＡ序列はそれぞれＡＰ００８２１５（ＯｓＴＲＸ１）とＡＰ００８２０８（ＯｓＶＩＮ２）で登録されている。本発明において、ＯｓＴＲＸ１ノックアウト個体は自然条件下で開花時期を１ヶ月以上遅延させ、ＯｓＶＩＮ２ノックアウト個体は長日条件では３２日程度、短日条件では１０日程度開花時期を遅延させることが示され、これら遺伝子もまた開花時期調節因子であることを確認した（図１３参照）。
【００１９】
また、Ｔ-ＤＮＡ挿入によって開花時期を変化させる他の遺伝子として、ＯｓＣＯＬ４（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＣＯＮＳＴＡＮＳ Ｌｉｋｅ ４）遺伝子を発見した。前記ＯｓＣＯＬ４遺伝子は稲ゲノムプロジェクトによってその序列が公開され（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１）、稲に存在するアラビドプシスＣＯＮＳＴＡＮＳ類似遺伝子として知られているが、まだその機能については明らかになったことがない遺伝子である。前記遺伝子のゲノムＤＮＡ序列はＡＰ００４０６３で登録されている。
【００２０】
本発明において、ＯｓＣＯＬ４遺伝子の過発現などの機能活性化を誘導する時、野生型に比べて開花時期が１５日以上遅れる表現型を示し（図１４参照）、ＯｓＣＯＬ４遺伝子の機能喪失突然変異を誘導する時、野生型に比べて開花時期が１０日程度促進されることを確認してＯｓＣＯＬ４遺伝子の開花抑制因子としての機能を明らかにした。前記ＯｓＣＯＬ４遺伝子は開花抑制作用のみを有し、幹伸張などの稲の栄養状態には影響を与えないことが確認された。また、前記ＯｓＣＯＬ４遺伝子に対して日長に応じた開花時期を調査した時、過発現個体は長日、短日に関係なく野生型に比べて開花時期が遅れ、機能喪失突然変異は長日、短日に関係なく開花時期が速くなることを確認し、前記ＯｓＣＯＬ４遺伝子は長日または短日条件の影響を受けずに稲の開花を抑制する因子であることを確認した。
【００２１】
本発明の具体的な例において、ＯｓＣＯＬ４遺伝子の機能活性化はＴ-ＤＮＡがＯｓＣＯＬ４遺伝子のプロモーター領域に挿入された場合、Ｔ-ＤＮＡ内の３５Ｓエンハンサーによって誘発されたり（図１５及び１６参照）、Ｐｕｂｉと作動可能に連結されて誘発されることができ（図１７参照）、ＯｓＣＯＬ４遺伝子の機能喪失はＴ-ＤＮＡがＯｓＣＯＬ４遺伝子の最初のエクソンまたは３’ＵＴＲ領域に挿入されて誘発されることもできる（図１８参照）。
【００２２】
植物の開花時期調節因子の中で開花を促進する遺伝子は多く知られているが、開花を抑制する遺伝子は多く知られていないことを考慮する時、ＯｓＭＡＤＳ５６及びＯｓＣＯＬ４のように開花を抑制する役割を果たす開花調節因子の発見は非常に価値のあることである。植物の開花時期を操り上げるために開花促進因子を過多発現するように形質転換された形質転換体に比べて開花抑制因子の機能抑制変異体がより安定的に遺伝されることができ、ＯｓＣＯＬ４の機能抑制突然変異は形質転換以外の方法（稲の内生トランスポゾンであるＴｏｓ１７による突然変異など）でも作ることができるので、遺伝子変形食品（ＧＭＯ）の問題点を避けられると言う長所がある。
【００２３】
また、他の開花調節因子として稲に存在するＣＯＮＳＴＡＮＳ類似遺伝子のうちの１つであり、小麦での春化処理による開花時期を調節するＶＲＮ２遺伝子とも類似なＯｓＣＯＬ８（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＣＯＮＳＴＡＮＳ Ｌｉｋｅ ８）が開花時期を調節することを発見した。この遺伝子もまた稲ゲノムプロジェクトによってその序列はすでに知られているが（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３）、その機能は明らかになっていなかった。前記遺伝子のゲノムＤＮＡ序列はＡＣ０７９８７４で登録されている。本発明ではＣｏｌ８遺伝子の機能喪失個体を試験した結果、長日条件では開花時期が野生型と別に差がなかったが、短日条件では開花時期が遅れたことを確認し、前記ＯｓＣＯＬ８遺伝子が短日条件下で開花を促進する植物の開花時期調節因子であることを確認した。
【００２４】
本発明の稲の開花時期調節因子は個別的にも作用するが、相互相反したり、類似な作用を行う調節因子の共同作用によってその機能が相殺または増幅されてより効果的に開花時期を調節することができる。
【００２５】
また、前記遺伝子の他にも開花時期調節遺伝子としてＯｓＭＡＤＳ１４を分離した。前記遺伝子のゲノムＤＮＡ序列とｃＤＮＡ序列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６に示した。アラビドプシスのＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）遺伝子は花器官形成と開花時期調節に関与することで、稲でＡＰ１類似遺伝子が少なくとも４個存在すると知られている。これらは各々ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＭＡＤＳ１５、ＯｓＭＡＤＳ１８及びＯｓＭＡＤＳ２０遺伝子として命名されている。この中でＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子はＯｓＭＡＤＳ６と言う蛋白質と相互結合するパートナーとして最初にクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）され、過多発現によって開花が促進されると知られているが、具体的な作用形態及び作用条件などは明らかになっていない。
【００２６】
本発明では前記ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のＴ-ＤＮＡまたはＴｏｓ１７挿入突然変異を分析した結果、開花時期及び花発達などに特別な変化がないことを観察した（図２１参照）。このような結果はＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子の他の遺伝子が過剰（redundant）に作用することを暗示する。ＯｓＭＡＤＳ１４の場合、ＭＡＤＳボックス内に存在するＭ、Ｉ、Ｋ（ＫＩ、ＫＩＩ、ＫＩＩＩ、ＫＩＶ）及びＣドメインの中でＣドメインを含む末端部位が除去された部分蛋白質を過多発現させた結果、短日条件では開花時期が一ケ月程度速くなり、長日条件では開花時期が２週程度遅れた結果を得た。前記Ｃドメインが除去された部分ＯｓＭＡＤＳ１４蛋白質はＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のＣドメインコーディング序列を含む３’末端領域を除去して発現させることによって得られ、本発明の具体例ではＫドメインコーディング序列とＣドメインコーディング序列の間にｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎを挿入して得た。このようにＣドメインコーディングの部分が除去されたＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子序列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７に示し、これから得られるＣドメインが除去されたＯｓＭＡＤＳ１４部分蛋白質の序列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１８に示した。このような結果はＯｓＭＡＤＳ１４のＣ末端部位除去の部分蛋白質が短日条件で開花時期を促進し、長日条件で開花時期を促進する遺伝子と相互作用して開花を抑制することを示す。
【００２７】
稲は単子葉植物で、とうもろこし、小麦など他の単子葉植物での稲のＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２、ＯＳＣＯＬ４及びＯｓＣＯＬ８に対応する遺伝子また開花時期及び／または幹伸張の調節因子としての役割を果たすと予測される。
【００２８】
また、本発明はこのようなＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、Ｃドメインコーディング序列を含む３’末端部位が除去された切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２、ＯＳＣＯＬ４及びＯｓＣＯＬ８遺伝子によってコーディングされる開花時期調節蛋白質を提供する。前記開花時期調節蛋白質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１８からなる群の中で選択されたいずれか１つのアミノ酸序列を有するものであってもよい。
【００２９】
また、本発明は過発現または機能喪失が誘導された開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体を提供する。
【００３０】
本発明のＤＮＡ構造体は機能が失われたＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＴＲＸ１またはＯｓＶＩＮ２遺伝子を含むことができる。より具体的には、本発明のＤＮＡ構造体は外来遺伝子挿入などによって誘導されたＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＴＲＸ１またはＯｓＶＩＮ２遺伝子のノックアウト変異株を含むことができる。例えば、ＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＴＲＸ１またはＯｓＶＩＮ２遺伝子内部の特定位置にＴ-ＤＮＡのように植物細胞染色体内挿入が可能なＤＮＡ切片が挿入されてノックアウトされた変異株を含むことができる。特に、ＯｓＭＡＤＳ５０の場合、６個のイントロンのうちの第４イントロンにＴ-ＤＮＡが挿入されていることができる（図２ａ参照）。また、本発明のＤＮＡ構造体はＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１またはＯｓＭＡＤＳ５６全長遺伝子のうちの一部、好ましくは少なくともＭＡＤＳボックスを含む部分が除去されたり、ｎｔ置換などによって変更したものを含み、ＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６またはＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子の機能が喪失されることができる。
【００３１】
また、本発明のＤＮＡ構造体は過発現されたＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＴＲＸ１またはＯｓＶＩＮ２遺伝子を含むことができる。本発明の具体的な例において、前記ＤＮＡ構造体はアクチンプロモータ、チトクロームＣプロモータ、玉蜀黍ユビキチン（ｕｂｉ）プロモータのような植物で作用可能なストロングプロモーターと作動可能に連結されてＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＴＲＸ１またはＯｓＶＩＮ２遺伝子の過発現が誘導されたものであり得る。
【００３２】
また、本発明のＤＮＡ構造体はＣドメインコーディング序列を含む３’末端部位が除去されてＣドメインが除去されたＯｓＭＡＤＳ１４部分蛋白質を生産する切頭 ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子を含むことができる。前記Ｃドメインコーディング序列を含む３’末端部位が除去された切頭 ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子はこのような植物で作用可能なストロングプロモーターと作動可能に連結されて過発現が誘導されたものであり得る。
【００３３】
また、本発明のＤＮＡ構造体は過発現されたＯｓＣＯＬ４遺伝子を含むことができる。本発明の具体的な例において、ＯｓＣＯＬ４遺伝子はアクチンプロモータ、チトクロームＣプロモータ、玉蜀黍ユビキチン（ｕｂｉ）プロモータのようなストロングプロモーターと作動可能に連結されたり、またはＴ-ＤＮＡのような植物遺伝子内挿入可能な遺伝子がプロモーターに挿入されて前記挿入遺伝子内のエンハンサー（例えば、Ｔ-ＤＮＡの３５Ｓエンハンサー）によって過発現が誘導されたものであり得る。また、本発明のＤＮＡ構造体は機能喪失されたＯｓＣＯＬ４遺伝子を含むことができる。本発明の具体例において、前記ＯｓＣＯＬ４遺伝子は特定位置にＴ-ＤＮＡのような植物遺伝子内挿入可能な遺伝子が挿入されて機能が喪失されたものであってもよく、より具体的には、Ｔ-ＤＮＡが最初のエクソンまたは３’ＵＴＲ領域に挿入されたものであってもよい。
【００３４】
また、本発明のＤＮＡ構造体は過発現されたＯｓＣＯＬ８遺伝子を含むことができる。本発明の具体例において、ＯｓＣＯＬ８遺伝子は玉蜀黍ユビキチン（ｕｂｉ）プロモータのようなストロングプロモーターと作動可能に連結されて過発現が誘導されたものであり得る。また、本発明のＤＮＡ構造体は機能喪失されたＯｓＣＯＬ８遺伝子を含むことができる。本発明の具体例において、前記ＯｓＣＯＬ４遺伝子は特定位置にＴ-ＤＮＡのような植物遺伝子内挿入可能な遺伝子が挿入されて機能が喪失されたものであることができ、より具体的には、Ｔ-ＤＮＡが第１エクソン領域に挿入されたものであり得る。
【００３５】
また、本発明は前記のような開花時期調節因子の過発現または機能喪失が直接的に誘導されたり、過発現または機能喪失が誘導された開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換された遺伝子導入植物体、植物の一部または植物細胞を提供する。このような植物体、植物の一部または植物細胞の形質転換に使用されるベクターの種類には特別な制限がなく、植物の形質転換に通常使用されるベクターを使用することができ、より具体的には、ｐＧＡ１６１１類のバイナリーベクターを使用することができる。
【００３６】
より具体的には、本発明の遺伝子導入植物体、植物の一部または植物細胞は、前記のような方法によってＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子の過発現が直接誘導されたり、過発現が誘導されたＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換されて開花が促進されたものであることもできる。また、本発明の遺伝子導入植物体、植物の一部または植物細胞は、このような方法によってＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子の機能喪失が直接誘導されたり、機能喪失されたＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換されて開花が遅れたことであることもできる。また、本発明の遺伝子導入植物体、植物の一部または植物細胞は、このような方法によってＯｓＭＡＤＳ５６またはＯｓＣＯＬ４遺伝子の過発現が直接誘導されたり、過発現されたＯｓＭＡＤＳ５６またはＯｓＣＯＬ４遺伝子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換されて開花が遅れたものであり得る。
【００３７】
また、本発明の遺伝子導入植物体、植物の一部または植物細胞は、このような方法によってＯｓＭＡＤＳ５６またはＯｓＣＯＬ４遺伝子の機能喪失が直接誘導されたり、機能喪失されたＯｓＭＡＤＳ５６またはＯｓＣＯＬ４遺伝子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換されて開花が促進されたものであり得る。
【００３８】
また、本発明の遺伝子導入植物体、植物の一部または植物細胞はＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のＣドメインコーディングの部分が除去された遺伝子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換されてＣドメインが除去されたＯｓＭＡＤＳ１４部分遺伝子を生産し、長日条件では開花が遅れ、短日条件では開花が促進されたものであることができる。
【００３９】
また、本発明の遺伝子導入植物体、植物の一部または植物細胞は、このような方法によってＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子の機能が喪失されたり、機能喪失されたＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換されて野生型と比較して顕著な幹伸張を示すものであり得る。
また、本発明は前記のような調節因子を過発現または機能喪失を誘導して開花時期及び／または幹伸張を調節する方法を提供する。
【００４０】
本発明の開花時期調節方法はＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子の機能を喪失させて開花を遅延させるものであり得る。具体的には、本発明の開花時期調節方法は外来遺伝子挿入または遺伝子結実などによってＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子の機能喪失を直接誘導したり、植物を機能喪失が誘導されたＯｓＭＡＤＳＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子を含むＤＮＡ構造体を使用して形質転換させることによって開花を遅延させる方法であり得る。例えば、前記ＯｓＭＡＤＳＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子の機能喪失は前記遺伝子内部の特定位置にＴ-ＤＮＡのように植物細胞染色体内挿入可能なＤＮＡ断片が挿入されることによって誘導できる。例えば、ＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子の場合、６個のイントロンのうちの第４イントロンにＴ-ＤＮＡを挿入したり、ＯｓＣＯＬ８遺伝子の場合には、第１エクソンにＴ-ＤＮＡを挿入して機能を喪失させることができる。
【００４１】
また、前記ＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子の機能喪失は前記遺伝子の全部または一部が除去されて誘導されたものであり得る。例えば、ＯｓＭＡＤＳＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５０またはＯｓＭＡＤＳ５１の場合、少なくともＭＡＤＳボックス部位を除去して機能を喪失させることができる。
【００４２】
本発明の開花時期調節方法は植物を前記のような方法で機能が失われたＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子を含むＤＮＡ構造体によって形質転換させることによって、前記植物の開花を遅延時期は方法であり得る。
【００４３】
また、本発明は前記のようにＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子内部に外来遺伝子を挿入したり、一部または全部除去させることによって機能を喪失させ、植物の幹伸張を促進させる方法を提供する。
【００４４】
また、本発明の開花時期調節方法はＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子を過発現させることによって開花を促進させることであってもよい。例えば、本発明の開花調節方法はＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子を植物で作動可能なストロングプロモーターと作動可能に連結させることによって前記遺伝子を過発現させて植物の開花を促進させるものであり得る。また、本発明の開花調節方法はこのようなストロングプロモーターと作動可能に連結されて過発現が誘導されたＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２またはＯｓＣＯＬ８遺伝子を含むＤＮＡ構造体を使用して植物体を形質転換させることによって開花を促進させる方法であり得る。前記ストロングプロモーターとしてアクチンプロモータ、チトクロームＣプロモータ、玉蜀黍ユビキチン（ｕｂｉ）プロモータなどを使用することができる。
【００４５】
また、本発明の開花時期調節方法はＯｓＭＡＤＳ５６またはＯｓＣＯＬ４遺伝子を過発現させて開花を抑制したり、機能を喪失させて開花を促進させることによって開花時期を調節することであってもよい。
【００４６】
より具体的には、本発明の開花時期調節方法はストロングプロモーターと作動可能に連結されたり、プロモーター領域にエンハンサーを有する植物遺伝子内挿入可能な外来遺伝子が挿入されることによってＯｓＭＡＤＳ５６またはＯｓＣＯＬ４遺伝子を過発現させて開花を抑制することであり得る。例えば、本発明の開花時期調節方法は玉蜀黍ユビキチン（ｕｂｉ）プロモーターと作動可能に連結させて発現を誘導することによってＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子を過発現させたり、ＯｓＣＯＬ４遺伝子のプロモーター領域にＴ-ＤＮＡを挿入してＴ-ＤＮＡ内の３５ＳエンハンサーによってＯｓＣＯＬ４遺伝子を過発現させて植物の開花を抑制させることであり得る。また、本発明の開花時期調節方法は前記のような方法で過発現が誘導されたＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子またはＯｓＣＯＬ４遺伝子を含むＤＮＡ構造体を使用して植物体を形質転換させることによって植物の開花を抑制することであり得る。
【００４７】
また、本発明の開花時期調節方法はＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のＣドメインコーディング序列を含む３’末端部位を除去し、Ｃドメインが除去されたＯｓＭＡＤＳ１４部分蛋白質を過発現させることによって、長日条件では開花を遅延させ、短日条件では開花を促進させることであり得る。
【００４８】
また、本発明の開花時期調節方法は遺伝子内特定部位に植物遺伝子内挿入可能な外来遺伝子挿入によってＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子またはＯｓＣＯＬ４遺伝子を機能喪失させることによって開花を促進することであり得る。より具体的には、本発明の開花調節方法はＯｓＣＯＬ４遺伝子の第１エキソンまたは３’ＵＴＲ領域にＴ-ＤＮＡを予め挿入し、前記ＯｓＣＯＬ４遺伝子を機能喪失させることによって、植物の開花を促進させることであり得る。
【００４９】
また、本発明の開花調節方法は前記のように機能が失われたＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子またはＯｓＣＯＬ４遺伝子を含むＤＮＡ構造体を使用して植物を形質転換させることによって植物の開花を促進させることであり得る。
【００５０】
また、本発明の開花時期調節方法はＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子を過発現させて、短日条件下では開花を促進させ、長日条件下では開花を遅延させることであり得る。前記ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子の過発現はＣ末端部位を除去して得られたＯｓＭＡＤＳ１４部分蛋白質を過多発現させることによって得られる。
【００５１】
また、本発明はこのような過発現または機能喪失された開花時期調節因子を含むＤＮＡ構造体を利用して形質転換させることによって、開花時期が調節された遺伝子導入植物、植物の一部または植物細胞を製造する方法を提供する。本発明の製造方法は植物細胞を準備する段階;前記のようなＤＮＡ構造体を使用して準備された植物細胞を形質転換させる段階;及び前記形質転換された細胞を培養する段階を含む。前記開花時期調節因子はＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２、ＯｓＣＯＬ４及びＯｓＣＯＬ８遺伝子からなる群の中で選択され、前記方法によって過発現されたり機能喪失されたものである。前記形質転換された植物細胞は細胞で培養されたり、通常の組織分化誘導方法を利用して特定組織で分化されたり、個体で発生することができる。
【００５２】
本発明による開花時期調節方法及び遺伝子導入植物の製造方法は稲以外のとうもろこし、小麦などの他の単子葉植物に適用でき、各植物でのこのような稲のＯｓＭＡＤＳ５０、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＴＲＸ１、ＯｓＶＩＮ２、ＯｓＣＯＬ４及びＯｓＣＯＬ８遺伝子に相応する遺伝子を利用して適用することができる。
【００５３】
（実施例１：Ｔ-ＤＮＡが挿入された突然変異体から開花時期が変わった突然変異体選抜１）
ＴｉプラスミドバイナリーベクターｐＧＡ２１４４（Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．, ＴｈｅＰｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０００）２２（６）、５６１-５７０）を利用して稲細胞（童真稲の種子から誘導されたカルス）を処理してＴ-ＤＮＡが挿入された第１世代（Ｔ１）突然変異株を得た。前記ＴｉプラスミドバイナリーベクターｐＧＡ２１４４を利用した処理は前記“Ｊｅｏｎｅｔａｌ．２０００ｂ”の記載に従った。つまり、アグロバクテリアと稲のカルスを共培養させてＴ-ＤＮＡを植物体内に送信させ、抗生剤を利用して転送された細胞を選別して再分化させる方法で行った。得られた２９３３個のＴ１突然変異株を畑に展開させて第２世代（Ｔ２）遺伝子導入植物体を得て、これらの中で開花時期において変化を示した突然変異株を選別した。他の遺伝子導入植物の平均開花時期と比較して２週間以上差がある２５植物体を観察し、この中で１６植物体は早期開花し、９細胞株は開花が遅れた。
【００５４】
図１はＯｓＭＡＤＳ５０にＴ-ＤＮＡが挿入されたＯｓＭＡＤＳ５０ノックアウト（ＫＯ）個体と野生型（ＷＴ）個体間の表現型を比較した写真で、ＷＴ植物体（Ｗ／Ｗ）が開花した時を撮影し、まだＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ植物体（Ｔ／Ｔ）は開花していないことが分かる。
【００５５】
突然変異が誘導された遺伝子を分析するために、制限酵素としてゲノムＤＮＡを切断した後、両端を接合させて２回にわたってＰＣＲを通じてＴ-ＤＮＡが挿入された周辺序列を明らかにする“Ａｎｅｔａｌ． ２００３”に報告されたｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲ方法を利用してＴ-ＤＮＡが挿入された部位の隣接部位序列を分析し、米国国立バイオテクノロジーセンター（ＮＣＢＩ）データベースを利用してＴ-ＤＮＡの挿入位置を確認した。その結果、図１の右側に現れた個体（ｌｉｎｅ ０-１５３-４３）での回復序列はＭＡＤＳボックス含有遺伝子であるＯｓＭＡＤＳ５０で、Ｔ-ＤＮＡの挿入位置はＯｓＭＡＤＳ５０の第４イントロンであることが確認された（図２ａ参照）。前記ＯｓＭＡＤＳ５０はアラビドプシスでの開花促進因子であるＳＯＣ１／ＡＧＬ２０と５０．６％の序列相同性を示し、稲に存在する３６ＭＩＫＣ（ＭＡＰＳ, Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ, Ｋｅｒａｔｉｎ-ｌｉｋｅ, ａｎｄ Ｃ-ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ）-ｔｙｐｅ ＭＡＤＳボックス蛋白質の中でＯｓＭＡＤＳ５６と最も高い相同性を示し（６０．８％）、とうもろこし（ｍａｉｚｅ）ZｍＭＡＤＳ１（７５．２％）、タバコＴｏｂＭＡＤＳ１（５１．１％）及びマスタードＳａＭＡＤＳＡ（５０．０％）とも相同性を示す。前記に記載された相同性は全長蛋白質序列を整列して計算したものである。
【００５６】
図１に示されているように、野生型対照群（Ｗ／Ｗ）に比べてＯｓＭＡＤＳ５０にＴ-ＤＮＡが挿入された個体（Ｔ／Ｔ）で開花時期が１ヶ月だけ遅れた。ＯｓＭＡＤＳ５０に誘導された突然変異による開花遅延は前記遺伝子がアラビドプシスの開花調節因子であるＡＧＬ２０に相応すると予測される因子であることを考える時、意味のある結果であると言える。
【００５７】
図２Ａに示したように、ＭＡＤＳボックス含有遺伝子であるＯｓＭＡＤＳ５０は３番染色体に位置し、典型的なＭＩＫＣ-ｔｙｐｅＭＡＤＳボックス蛋白質をコーディングするもので、７個のエクソンと６個のイントロンで構成される。本実施例によってＴ-ＤＮＡが挿入された個体においてＴ-ＤＮＡは第４イントロンに挿入され、Ｔ-ＤＮＡでのベータ-グルクロ二ダーゼ（ｂｅｔａ-ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ、ｇｕｓ）遺伝子の転写方向はＯｓＭＡＤＳ５０の転写方向と反対方向であった。
【００５８】
図２Ａに示されているように、ＯｓＭＡＤＳ５０とＴ-ＤＮＡに位置するプライマーを使用してＰＣＲし、Ｔ２植物体の遺伝子型を決めた。プライマーＦ２（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｉ ｒｅｇｉｏｎ:５'-ａａａｇｃｔｇａｃｇｃｔｇａｔｇｇｔｔｔ-３'、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２３）とＲ１（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ａｔ ３'ＵＴＲ:５'-ｔｔｇｇｇｔａｃｃｇ ａｇａｔｃｃａｇｃｔ ｔａｔｔｃｃｔｇｇ-３'、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２２）を使用してＰＣＲし、正常なＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子（Ｗ）の増幅を確認し、プライマーＦ２とＲ２（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｈｐｈ）ｇｅｎｅ ｉｎ Ｔ-ＤＮＡ:５'-ａｔｃｃａｇａｃｔｇ ａａｔｇｃｃｃａｃａｇ-３'、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２４）を使用してＰＣＲし、Ｔ-ＤＮＡが挿入されたＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子（Ｔ）の増幅を確認した。
【００５９】
その結果、１３植物体の中で３個体がＴ-ＤＮＡ挿入体に対して同型接合性（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｉｃ、Ｔ／Ｔ）であった（図２Ｂ、サンプル４、１０及び１３）。これら植物体は全て植えた後、約９９日後に開花した。反面、異形接合体（Ｗ／Ｔ）または野生型（Ｗ／Ｗ）の植物体は植えた後、約７３日後に開花した。
【００６０】
図２はＯｓＭＡＤＳ５０の概略図で、Ｔ-ＤＮＡ挿入位置及びＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ子孫の遺伝子型を示す。図２ＡはＯｓＭＡＤＳ５０及びＴ-ＤＮＡ挿入の構造を示すもので、７個のエクソン（満たされた四角）と６個のイントロン（満たされた四角の間の線）を示す。図２ＡにＭ、Ｉ、Ｋ、Ｃで示された部位はエクソンを示す。Ｋ部位は４個のエクソンで構成され、他の部位はそれぞれ１つのエクソンを含む。Ｔ-ＤＮＡは第４イントロンに挿入されている。矢印はプライマーを示す。Ｆ１は５‘ＵＴＲの正方向プライマー、Ｆ２はＩ部位の正方向プライマー、Ｒ１は３’ＵＴＲの逆方向プライマー、Ｒ２はＴ-ＤＮＡのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺伝子内の逆方向プライマーである。
【００６１】
図２ＢはＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ子孫の遺伝子型を示す図面である。Ｔ-ＤＮＡが挿入されていない場合には、Ｆ２とＲ１プライマーが１．６ｋｂゲノムＤＮＡに増幅される。Ｔ-ＤＮＡが挿入されると２つのプライマーの間の長さが長すぎて増幅できなくなる。また、Ｔ-ＤＮＡが第４イントロンに挿入されると、Ｆ２プライマーとＲ２プライマーは約２ｋｂバンドに増幅される。サンプル２、３、５、１１及び１２は単にゲノムＤＮＡだけ増幅されたので、ＷＴ（Ｗ／Ｗ）であることが分かり;サンプル４、１０及び１３は開花が遅延された突然変異体から収穫されたもので、２ｋｂバンドにのみ増幅されて同型接合体（Ｔ／Ｔ）であることが分かり;他のサンプルは２つのバンドとも増幅されて異形接合体（Ｗ／Ｔ）であることが分かる。植えた後、出穂期までの時日を各植物体別に示した。
【００６２】
前記から分かるように、、開花遅延植物体の場合には全てＴ-ＤＮＡが挿入されたＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子のみを有し（Ｔ／Ｔ）、開花が正常な植物体は正常なＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子（Ｗ）を少なくとも１つ有していることを確認した。したがって、開花遅延突然体がＴ-ＤＮＡの挿入によって誘導されたことを証明することができる。
【００６３】
（実施例２：ＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子の分離）
前記から分離したＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子の序列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１に示した。前記ＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子は従来ＮＣＢＩデータベースにＡＢ００３３２８と言う番号で登録されている。しかし、器官別発現様相のみ報告され、その機能については知られていない（Ｓｈｉｎｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．, １９９９）。これに本発明者らは特異な二対のプライマーをデザインしてＰＣＲを通じてこの遺伝子を分離した後、ＯｓＭＡＤＳ５０と命名した。最初のＰＣＲではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１９（Ｆ１:ｆｏｒｗａｒｄ ａｔ ５'ＵＴＲ:５'-ａｔｃａａｇｃｔｔｔ ａｃｇｇｃｃａａａｃ ｃｃｔａｃａｇｃ-３'）とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２０（Ｒ１:ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ａｔ ３’ＵＴＲ:５'-ｔｔｇｇｇｔａｃｃｇ ａｔｇｇｇｔａｇｔｇ ｇａｇｔｃｔｇｃ-３'）の序列を有するプライマーで遺伝子を増幅し、第２ＰＣＲでは増幅された産物の内側に位置するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２１（５'-ａｔｃａａｇｃｔｔｇ ｔｔｇｇｔｔｃａｔｃ ｇｇｃｇａｔｃｇ-３'）とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２２（５'-ｔｔｇｇｇｔａｃｃｇ ａｇａｔｃｃａｇｃｔ ｔａｔｔｃｃｔｇｇ-３'）に相当するプライマーを利用して最初の産物を鋳型にして増幅した。Ｓ１１９０５の全コーディング部位と隣接した部位を含むＰＣＲ増幅産物をＨｉｎｄＩＩＩ-ＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ）で切断してｐＢｌｕｅｓｒｉｐｔＳＫ（-）ベクター（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、シーケンシング機械（ＡｂＩ３１００）で塩基配列を決めた後、この遺伝子をＯｓＭＡＤＳ５０と命名した。この遺伝子は染色体３番の短いアーム（ｓｈｏｒｔ ａｒｍ）に位置するＡＰ００４３２２で登録されたクローンに含まれ、この位置はＨｄ９と知られた突然変異と一致した（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．, ２０００）。
【００６４】
（実施例３：ＯｓＭＡＤＳ５０ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）形質転換体分析）
ＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子発現の抑制によって遅れた開花表現型が誘発されるかどうかを確認するために、図３Ａに示したようにＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ個体を製作し、これを利用して遺伝子導入植物を生成した。ＭＡＤＳボックス領域を除いたＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子をＧＵＳ遺伝子を介して互いに反対方向にｐＢｌｕｅｓｒｉｐｔＳＫ（-）ベクター（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、これをｐＧＡ１６１１ベクター（ＡＹ３７３３３８）の玉蜀黍ユビキチンプロモーター（Ｐｕｂｉ）とｎｏｓターミネーター（Ｔｎｏｓ）の間に挿入した。全８２個のＴ１形質転換体を分析した結果、７６個体で１ヶ月またはそれ以上開花時期が遅れることを観察することができた（図３Ｂ）。６個体は野生型の対照群と類似に植えた後、７４〜７８日が経過した後に開花し、８個体は１４０日が過ぎても開花しなかった。このような結果はＯｓＭＡＤＳ５０が重要な開花促進因子であることを証明する。
【００６５】
このような開花遅延表現型の他にも、本実施例の遺伝子導入植物は伸張された節間をさらに多く有する。これと対照的に、大部分のＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ植物は６個（２３．５％）乃至７個（６２．７％）の伸張した節間を有し、一部は８個（１３．７％）まで有した。反面、対照群（ＣＯＮ）と野生型（ＷＴ）の幹が主に５〜６個の伸張された節間を有すると確認された。したがって、ＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ個体は開花遅延と共に形質転換体の幹伸張が促進される効果を有すると言うことが分かる。
【００６６】
図３はＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ構造体の概略図と前記ＲＮＡｉ構造体を発現する遺伝子導入植物の表現型を示す図面である。図３ＡはＯｓＭＡＤＳ５０の２つのＩＫＣ部位の間に挿入されたＧＵＳスペーサを有するＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ構造体を示す図面である。前記構造体をｍａｉｚｅｕｂｉプロモーター（Ｐｕｂｉ）とｎｏｓターミネーター（Ｔｎｏｓ）の間に挿入した。図３ＢはＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉＴ１遺伝子導入植物での出穂期までの日数の頻度分布、つまり、移植時期から開花まで必要な日数を示す。ＷＴと他の遺伝子導入対照群植物体は植えた後、７４乃至７８で開花した。９個の変異株は植えた後、１４０日までも開花していないことが分かる。ｂｒｏｋｅｎ ｂａｒはＸ軸上の２つの数値間の大きな差を示す。図３ＣはＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ植物体とＷＴ対照群の伸張された節間個数比率を示す。平均値はそれぞれＷＴ（６３）、遺伝子導入対照群（１５２）、ＯｓＭＡＤＳ５０ＲＮＡ１幹（１０２）であった。Ｙ軸は伸張された節間を有する幹の相対的比率を示すもので範囲は４から８までである。
【００６７】
ＲＮＡゲルブロット分析によってＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ転写体が遅れた開花表現型を示す遺伝子導入植物に高い水準で存在することが確認された。発現程度が非常に高いためにブロットでの内部ＯｓＭＡＤＳ５０転写体水準を可視化することが非常に難しい。したがって、ＲＴ-ＰＣＲ分析を使用してＯｓＭＡＤＳ５０発現の抑制を確認した（図４Ｂ）。遅れた開花遺伝子導入植物において、転写体水準（Ｆ１／Ｒ１によって確認された）は顕著に減少した。このような結果はＯｓＭＡＤＳ５０の発現減少が稲での遅れた開花を招くと言うことを示す。ＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ植物体９及び１０が植物体６乃至８より遅く開花したので、遅れた開花程度はＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ水準と比例する。
【００６８】
図４はＯｓＭＡＤＳ５０ＲＮＡ干渉効果を分析した図面で、ＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ植物体内のＯｓＭＡＤＳ５０の内部水準を示す。図４ＡはＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ構造体を発現する遺伝子導入植物でのＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ転写体とＯｓＭＡＤＳ５０に対するＲＮＡゲルブロット分析を示すもので、ＲＮＡ干渉形質転換体（ＲＮＡｉ ｔｒａｓｇｅｎｉｃｓ）でＲＮＡ干渉遺伝子（ＲＮＡｉ）が強く発現していることを示す。しかし、内在的に発現されるＯｓＭＡＤＳ５０（ｓｅｎｓｅ）が阻害するかどうかは確実でない。５個のＷＴ植物体（１-５）と５個の独立的遺伝子導入植物体（６-１０）を試験した。遺伝子導入植物体６、７、８、９及び１０はそれぞれ植えた後、１１１、１１５、１１５、１３０及び１３５日目に開花した。対照群としてｒＲＮＡ水準を観察した（下側）。ＲＮＡｉはＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ転写体:ｓｅｎｓｅは内部ＯｓＭＡＤＳ５０転写体である。図４ＢはＷＴ植物体（１-５）と遺伝子導入植物体（６-１０）でのＯｓＭＡＤＳ５０とＯｓＭＡＤＳ５０ ＲＮＡｉ転写体に対するＲＴ-ＰＣＲ分析を示す図面である。ＲＮＡゲルブロット分析のために分離された同一なＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成した。全長ＯｓＭＡＤＳ５０の検出のために使用したプライマー対は図２Ａに示したようなＦ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）／Ｒ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５）であった。対照群としてアクチンを使用した。ＯｓＭＡＤＳ５０とアクチンを増幅させるためにＰＣＲをそれぞれ２６回と２３回行った。プライマーＦ１とＲ１を利用したＲＴ-ＰＣＲ結果は内在的に発現されるＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子がＲＮＡ干渉形質転換体で発現が阻害したことを示した。
【００６９】
（実施例４：ＯｓＭＡＤＳ５０過発現形質転換体分析）
ＯｓＭＡＤＳ５０の開花時期に対する機能的役割をさらに調べるために、図５Ａに示されているようにＯｓＭＡＤＳ５０のセンス構造体を過発現する遺伝子導入稲植物を製作し、玉蜀黍ユビキチン（ｕｂｉ）プロモーターを使用して構成性発現を誘導した。つまり、ＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子のコーディング領域全体をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３の序列を有するプライマーに増幅した後、ＨｉｎｄＩＩＩ-Ａｓｐ７１８（Ｒｏｃｈｅ）で切断してｐＢｌｕｅｓｒｉｐｔＳＫ（-）ベクター（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングして塩基配列を確認し、ｐＧＡ１６１１ベクター（ＡＹ３７３３３８）のｕｂｉｑｕｉｔｉｎプロモーターとｎｏｓターミネーターの間に挿入した。
【００７０】
遺伝子導入ｃａｌｌｉが発芽誘導培地（ｓｈｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ、ＭＳＲ ｍｅｄｉａ）上にトランスファーされる時、再分化されたＴ１個体のうちの約２０％が類似花器官、例えば、内頴（ｐａｌｅａ）／外頃（ｌｅｍｍａ）（図５Ｂ）、雌しべ（ｓｔｉｇｍａｓ）（図５Ｂ）、雄しべ（ｓｔａｍｅｎｓ）（図５ｃ）、子房（ｏｖａｒｉｅｓ）（図５ｃ）及び花房（ｐａｎｉｃｌｅｓ）（図５Ｄ）等の構造で発生した。全ての花器官を含む小穂（小さい穂状花）を観察した。ｃａｌｌｉの約８０％が芽で発生したことにもかかわらず、これらのうちの２／３は極度の矮小症と葉身（ｌｅａｆ ｂｌａｄｅ）の成長欠乏を示した（図５Ｅ）。これら植物は結局死んだ。残存する１／３の芽は正常植物体として発生した。これらのうちの一部は対照群より早く開花し、残りはＷＴ植物体と同じ時期に開花した。
遺伝子導入ｃａｌｌｉで観察される花器官類似構造が実質的に生殖可能であるかどうかを知るために、花特異的ＭＡＤＳボックス遺伝子ＯｓＭＡＤＳ３とＯｓＭＡＤＳ４の転写体水準を測定した。前者はＣ機能遺伝子（Ｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅ、雄しべ及び雌しべ発達に関与）であり、後者はＢ機能遺伝子（Ｂ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅ、萼と雄しべ発達に関与）である。これら遺伝子をｕｂｉ:ＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子導入ｃａｌｌｉから発生する花器官で特異に発現したが、これは前記器官が本物であることを示す。
【００７１】
図５はｕｂｉ:ＯｓＭＡＤＳ５０植物を分析した結果である。図５ＡはＯｓＭＡＤＳ５０センス構造体の概略図である（Ｐｕｂｉ:ｍａｉｚｅ ｕｂｉ ｐｒｏｍｐｔｅｒ、Ｔｎｏｓ:ｎｏｓ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）。図５Ｂはｐａｌｅａ／ｌｅｍｍａ（ｐ／ｌ）類似構造体とｓｔｉｇｍａ（ｓ）類似構造体を有する再生産された芽を示す。図５Ｃはｓｔａｍｅｎ（ｓｔ）類似構造体とｓｔｉｇｍａ類似構造体を有する再生産された芽を示す。図５Ｄはｐａｎｉｃｌｅ（ｐ）類似構造体を有する再生産された芽を示す。図５Ｅは矮小症と葉身成長欠乏を見せる再生産された芽を示す。図５Ｆは花器官類似構造でのＯｓＭＡＤＳ３とＯｓＭＡＤＳ４の発現様相（ｐｏｒｔｒａｉｔ）を示す（対照群葉:ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒで形質転換された葉;５０Ｓ葉:ＯｓＭＡＤＳ５０を過発現する遺伝子導入葉;５０Ｓ花:ＯｓＭＡＤＳ５０を過発現する花器官類似構造体）。アクチンを対照群として使用した。ＲＴ-ＰＣＲを通じて調べた結果、前記類似花器官５０Ｓ花で花器官特異的に発現されるＯｓＭＡＤＳ３とＯｓＭＡＤＳ４の発現が増進されることが確認された。対照群葉（ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｅａｖｅｓ）と形質転換体の葉（５０Ｓ ｌｅａｖｅｓ）ではこれら遺伝子の発現が検出されなかった。
【００７２】
（実験例１：ＯｓＭＡＤＳ５０を含む開花調節因子の発現分析）
ＲＮＡゲルブロット分析によってＯｓＭＡＤＳ５０が大部分の器官で多様に発現することが確認された（図６Ａ）。分析のために選択した器官は実生の根（ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｒｏｏｔ）、実生の地上部（ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｓｈｏｏｔ）、９-１０葉期の葉身（Ｙｏｕｎｇ ＬＢ）、８０日目の葉身（ＬＢ ８０ ＤＡＰ）、１０５日目の葉身（ＬＢ １０５ ＤＡＰ）、１０５日目の初葉の葉身（ＦＬ １０５ ＤＡＰ）と２ｃｍ以下の花房（Ｐａｎｉｃｌｅ<２ｃｍ）、１０〜２０ｃｍの花房（Ｐａｎｉｃｌｅ １０-２０ｃｍ）の全８種類である。前記遺伝子は種子段階では低い水準に検出され、植物体の成長と伴って転写が増加した。幼い花房で最初に低い発現を示し、この器官が成長しながら持続的に減少した。葉器官では強く発現した。葉発達段階別に４発生段階における葉のＲＴ-ＰＣＲ分析によって前記ＲＮＡゲルブロット分析を確認した（図６Ｂ）。ＯｓＭＡＤＳ５０転写体が４段階全てで検出され、２０日目の植物と比較して４９日目の植物で増加した発現水準を示した。Ｈｄ３ａ、ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＭＡＤＳ１５及びＯｓＭＡＤＳ１８のような他の開花調節因子転写体の発現も８０日目のまで漸進的に増加する様相を示した。
【００７３】
図６はＯｓＭＡＤＳ５０と他の開花調節子の発現様相を示す図面である。図６ＡはＲＮＡゲルブロット分析を示し、各サンプルに使用された全ＲＮＡ量は１５ｕｇで、ＯｓＭＡＤＳ５０のＫＣ部位がプローブ役割を果たした。下側は対照群として使用されたｒＲＮＡである。左側から発芽後７日目の実生の根と実生の地上部、９-１０葉期の幼い葉身（ＬＢｓ）（植えた後、経過日（ＤＡＰ）:３５日）、ＬＢｓ８０ＤＡＰ、ＬＢｓ １０５ ＤＡＰ、ｆｌａｇ ＬＢｓ １０５ ＤＡＰ、長さが２ｃｍより短い花房、長さが１０乃至２０ｃｍである花房。植物体は９０ＤＡＰに開花した。図６Ｂは多様な発生段階における推定開花時期調節因子のＲＴ-ＰＣＲ分析結果を示した図面である。ＷＴ植物をグロースチャンバー でＳＤ条件（１０ｈ明期／１４ｈ暗期、３０℃）下で育て、ＬＢを２０、４９、８０、１１３ＤＡＰでサンプリングした。全てのサンプルを照明をつけた後６時間目に収穫した。開花日は８７日目であった。
前記のような発現分析によって前記遺伝子が植物発生の初期に作用し、栄養器官でより多く発現され、花器官形成の間には非常に低い水準まで減少していることが分かる。
【００７４】
（実験例２：ＯｓＭＡＤＳ５０突然変異体と過多発現体でＯｓＭＡＤＳ５０を含む開花調節因子の発現分析）
ＯｓＭＡＤＳ５０の役割をさらに調べるために、ＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ突然変異株と過多発現体で開花調節因子の発現変化を分析してその結果を図７に示した。実施例１で得られたＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ個体で２つの光周期経路で開花時期を調節するｈｄ１、ｈｄ３ａ及びＯｓＧＩに対してＲＴ-ＰＣＲ反応を行った。また、４個のＭＡＤＳボックス遺伝子（ＯｓＭＡＤＳ１、ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＭＡＤＳ１５及びＯｓＭＡＤＳ１８）に対する調査を行った。その結果、これらもまた光周期経路に関与すると推定された。前記調査において、Ｈｄ１とＯｓＧＩの発現はＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ個体で変化がなかった。Ｈｄ３ａ転写体はＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ突然変異体で検出されなかったが、これはＨｄ３ａがＯｓＭＡＤＳ５０の下流に位置することを暗示する。ＯｓＭＡＤＳ１８転写体における減少程度は他の遺伝子の減少程度だけ顕著でなかったにもかかわらず、全てのＯｓＭＡＤＳボックス遺伝子の発現水準はＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ突然変異体で顕著に減少した。
【００７５】
再分化されたｕｂｉ:ＯｓＭＡＤＳ５０植物体の葉における調節遺伝子の発現程度を試験した（図７ｃ）。これら植物体は再生産培地に移された後、数週日目に開花した。ＫＯ植物体と対照的にＯｓＭＡＤＳ１４とＯｓＭＡＤＳ１８転写体の水準はｕｂｉ:ＯｓＭＡＤＳ５０植物体では増加した反面、ＯｓＭＡＤＳ１、ＯｓＧＩ及びＨｄ１では明確な変化がなかった。ＯｓＭＡＤＳ１５とＨｄ３ａの発現水準は非常に低いため、これらの転写体における変化が測定できなかった。
【００７６】
図７はＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ葉とｕｂｉ:ＯｓＭＡＤＳ５０葉でのＭＡＤＳボックス遺伝子と光周期経路遺伝子の発現様相を示す図面である。図７ＡはＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ葉でのＲＴ-ＰＣＲ分析結果を示す。植えた後、７３日目の日出２時間前にＫＯ植物体から葉身を収穫した。ＲＴ-ＰＣＲの後、特定プローブを使用してＤＮＡゲルブロット分析を行った。２つの独立的なＷＴ分離個体（ｓｅｇｒｅｇａｎｔ）と２つの独立的なＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ植物体を試験した。図７ＢはＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ植物体でのＲＴ-ＰＣＲ結果の概略図である。ＤＮＡバンド強度を測定してアクチン転写体水準に対して正常化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）。示された結果はそれぞれの植物体に対する３回の独立的な試験の平均値である。２つのＷＴと２つのＫＯ植物体の平均値を示した。Ｂａｒｓ、ＳＤｓ．図７Ｃはｕｂｉ:ＯｓＭＡＤＳ５０植物体の発現様相を示した図面である。ＯｓＭＡＤＳ５０を過発現する遺伝子導入植物と対照群植物から葉身をサンプリングし、定量的ＲＴ-ＰＣＲ分析によって遺伝子の転写体水準を測定した。示されたデータは２乃至３個の独立的サンプル、Ｃｏｎ:ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒに形質転換されたＴ１対照群;と５０Ｓ:ｕｂｉ:ＯｓＭＡＤＳ５０葉の平均値である。Ｂａｒｓ、ＳＤｓ．ＰＣＲプライマーと各遺伝子の増幅回数を表１に示した。
【表１】
2008525013.tif 000003
【００７７】
つまり、ＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ突然変異株でＲＴ-ＰＣＲを行った結果、ＯｓＭＡＤＳ１、ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＭＡＤＳ１５、ＯｓＭＡＤＳ１８、Ｈｄ３ａの発現が野生型（ＷＴ）と比較した時に顕著に低くなることが観察された反面、Ｈｄ１またはＯｓＧＩの発現には差がなく、ＯｓＭＡＤＳ５０過多発現体ではＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＭＡＤＳ１８の発現は増加したが、ＯｓＭＡＤＳ１、ＯｓＭＡＤＳ１５、Ｈｄ３ａ、Ｈｄ１、ＯｓＧＩの発現には特別な差がなかった。このような結果を総合してみる時、ＯｓＭＡＤＳ５０はＯｓＭＡＤＳ１４やＯｓＭＡＤＳ１５のような開花調節因子の上位でこれらの発現を調節するが、Ｈｄ１またはＯｓＧＩとは独立的にまたは下位で機能すると推定される。
【００７８】
（実験例３：光条件に応じたＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ個体での開花時期分析）
光条件を変化させながら、実施例１で得られたＴ-ＤＮＡが挿入されたＴ１から分離された独立した２つのＴ２ ＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯライン（それぞれ５０ＫＯ２３及び５０ＫＯ２４と言う）と野生型個体（対照群）の開花時期を観察した。光条件は短日条件（ＳＤ:１０ｈ Ｌ／１４ｈ Ｄ）と長日条件（ＬＤ:１４ｈ Ｌ／１０ｈ Ｄ）にした。このような観察結果を図８に示した。図８に示されているように、短日条件下では対照群とＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ個体の開花時期が大きな差を見せなかった。しかし、長日条件下で対照群は７８日頃に開花したが、ＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ個体は１４０日が過ぎても開花しなかった。つまり、開花時期調節因子ＯｓＭＡＤＳ５０は長日条件下で作用する調節因子であることが分かった。
【００７９】
（実験例４：ＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ個体での開花時期調節因子の発現パターン分析）
植えた後、６０日目に実施例１で得られたＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ個体と野生型個体（対照群）の葉身をサンプリングした。前記のサンプルにおけるＯｓＭＡＤＳ５０以外の他の開花時期調節因子、ＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＭＡＤＳ１８、Ｈｄ３ａ、Ｈｄ１及びＯｓＧＩの発現を分析して図９に示した。図９に示されているように、長日条件下でＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ個体のＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＭＡＤＳ１８及びＨｄ３ａの機能が阻害された反面、Ｈｄ１とＯｓＧＩの発現は大きな差がなかった。したがって、ＯｓＭＡＤＳ５０はＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＭＡＤＳ１８及びＨｄ３ａのような他の開花時期調節因子の上流に位置すると言うことが分かった。
【００８０】
（実施例５：ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＴＲＸ１及びＯｓＶＩＮ２遺伝子の分離）
実施例１に記載されたような原理で製作したＴ-ＤＮＡを標識とした個体の中でＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＴＲＸ１及びＯｓＶＩＮ２遺伝子にＴ-ＤＮＡが挿入されたラインをそれぞれ分離した。
【００８１】
まず、ＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子を序列分離同定してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２に示した。前記ＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子は従来ＮＣＢＩデータベースにＡＢ００３３２７という番号でそれぞれ登録されているもので、器官別発現様相のみ報告され、その機能については知られていない（Ｓｈｉｎｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．, １９９９）。これに本発明者らはＰＣＲを通じて前記遺伝子を分離して機能を明らかにした。
また、ＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子の序列を分離及び同定してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３に示した。前記遺伝子は本発明者らがＰＣＲ方法を通じて分離してＮＣＢＩデータベースにＡＹ３４５２２４と言う登録番号で登録した。
追加的に、ＯｓＴＲＸ１とＯｓＶＩＮ２遺伝子の塩基配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５に示した。
【００８２】
（実験例５：ＯＳＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５１、ＯｓＭＡＤＳ５６、ＯｓＴＲＸ１及びＯｓＶＩＮ２遺伝子過発現形質転換体及び機能喪失形質転換体の開花時期分析）
前記実施例５から分離された遺伝子の開花時期に対する機能的役割をさらに調査するために、ＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子とＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子のセンス構造体を過発現する遺伝子導入稲植物を本実験室で製作したｐＧＡ１６１１ベクター（ＡＹ３７３３３８）を使用して製作し、玉蜀黍ユビキチン（ｕｂｉ）プロモーターを使用して構成性発現を誘導した（図５Ａ参照）。その結果、ＯｓＭＡＤＳ５１過発現形質転換体は自然条件で１乃至２週程度開花時期が速くなった反面、ＯｓＭＡＤＳ５６過発現形質転換体は自然条件で開花時期が１乃至２週程度遅れた（図１２参照）。
【００８３】
光条件を短日条件（ＳＤ:１０ｈ Ｌ／１４ｈ Ｄ）と長日条件（ＬＤ:１４ｈ Ｌ／１０ｈ Ｄ）にして実験した場合、興味深くＯｓＭＡＤＳ５１ ＫＯ植物体は短日条件でのみ開花時期が１ヶ月程度遅れ（図１１参照）、ＯｓＭＡＤＳ５６過多発現体は長日条件でのみ開花時期が遅れた（図１２参照）。ＯｓＭＡＤＳ５６の場合、２つの独立的な形質転換個体（それぞれ８番と１０番に命名）について実験を行った。また、自然条件でＯｓＭＡＤＳ５１ＫＯ植物体は老化が遅延する表現型が観察された。
一方、ＯｓＴＲＸ１とＯｓＶＩＮ２を前記のＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ個体製作法と同様な方法でノックアウトさせてＯｓＴＲＸ１ＫＯ個体とＯｓＶＩＮ２ＫＯ個体を得た。ＯｓＴＲＸ１ＫＯ個体は自然条件で開花時期が１ヶ月以上遅れ（図１０参照）、ＯｓＶＩＮ２ＫＯ個体は長日条件では３２日程度、短日条件では１０日程度開花時期が遅延された（図１３参照）。
【００８４】
（実施例６：ＯｓＣＯＬ４遺伝子の分離）
稲の開花時期を調節する遺伝子を探すためにアクティベーションタギングベクター（ｐＧＡ２７１５;Ｊｏｅｎｇ ｅｔ ａｌ, Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ, Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００２, Ｖｏｌ． １３０, ｐｐ．１６３６-１６４４）が挿入された突然変異稲集団で開花時期が変わる個体を選別した。そのうち１Ｂ-００７３５と命名されたラインはワイルドタイプに比べて開花時期が１５日以上遅れる表現型を示した（図１４参照）。前記突然変異体の遺伝型を分析した結果、Ｔ-ＤＮＡがＯｓＣＯＬ４遺伝子のプロモーター領域に挿入され、Ｔ-ＤＮＡ内の３５ＳエンハンサーによってＯｓＣＯＬ４遺伝子が過多発現されることが分かった（図１５及び１６参照）。前記ＯｓＣＯＬ４遺伝子内のＴ-ＤＮＡの挿入位置とＴ-ＤＮＡ内部の３５Ｓエンハンサーの作用は図１５に示す通りである。このような結果に基づいて、開花調節因子として前記ＯｓＣＯＬ４遺伝子を分離して塩基配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６に示した。
【００８５】
（実験例６：ＯｓＣＯＬ４遺伝子の過発現及び機能喪失形質転換体の開花時期分析）
前記のように、Ｔ-ＤＮＡがＯｓＣＯＬ４遺伝子のプロモーター領域に挿入され、Ｔ-ＤＮＡ内の３５ＳエンハンサーによってＯｓＣＯＬ４遺伝子が過多発現された形質転換体で開花遅延表現型が現れた。また、このようなＯｓＣＯＬ４遺伝子の過発現（アクティベーションタギング）による開花遅延はＯｓＣＯＬ４遺伝子がストロングプロモーターであるｐＵｂｉと作動可能に連結されて過発現する形質転換植物体で２週程度開花が遅れることを観察して再確認することができた（図１７参照）。図１７で、Ａｃｔ１は対照群として使用された稲のアクチン遺伝子を示す。
これに反し、ＯｓＣＯＬ４遺伝子が機能を喪失した時には開花が２週程度促進される表現型を観察した（図１８参照）。前記のようなＯｓＣＯＬ４遺伝子の機能喪失突然変異はＴ-ＤＮＡがＯｓＣＯＬ４遺伝子の第１エクソンに挿入された個体（図１８のＯｓＣＯＬ４-１）と３’ＵＴＲに挿入された個体（図１８のＯｓＣＯＬ４-２）で全て確認された。
一方、日長に応じる開花時期を調査した時、ＯｓＣＯＬ４遺伝子のアクティベーションタギング個体は長日、短日に関係なく野生型に比べて開花時期が遅れた反面、機能喪失突然変異個体は長日、短日に関係なく開花時期が速くなった（図１９参照）。図１９で、‘ＯｓＣＯＬ４-Ｄ’はＯｓＣＯＬ４のアクティベーションタギング突然変異体を意味する。
【００８６】
（実施例７：ＯｓＣＯＬ８遺伝子の分離）
ＯｓＣＯＬ８遺伝子は稲に存在するＣＯＮＳＴＡＮＳ類似遺伝子のうちの１つであり、小麦で春化処理による開花時期を調節するＶＲＮ２遺伝子と類似なもので、本発明のＴ-ＤＮＡ挿入個体分析によって前記Ｔ-ＤＮＡが挿入されることによって開花時期が変化する遺伝子のうちの１つに分離され、その序列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７に示した。
【００８７】
（実験例７：ＯｓＣＯＬ８遺伝子の機能喪失形質転換体の開花時期分析）
ＯｓＣＯＬ８遺伝子による開花時期調節を知るために、ＯｓＣＯＬ８の第１エクソンにＴ-ＤＮＡが挿入された突然変異体を分析した結果、長日条件では開花時期が野生型と類似な反面、短日条件では開花が遅れることを確認した（図２０参照）。したがって、ＯｓＣＯＬ８は短日条件で開花を促進する遺伝子として機能をすると予測される。
【００８８】
（実施例８：ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子の分離）
アラビドプシスの花器官形成と開花時期調節に関与するＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）遺伝子の類似遺伝子が稲に４種存在すると知られ、それぞれＯｓＭＡＤＳ１４、ＯｓＭＡＤＳ１５、ＯｓＭＡＤＳ１８及びＯｓＭＡＤＳ２０と命名されている。この中でＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子はＯｓＭＡＤＳ６と言う蛋白質と相互結合するパートナーとして最初にクローニングされたが、具体的な機能が明らかになっていない。本実施例では前記ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子にＴ-ＤＮＡなどが挿入された場合に開花時期が変化することを観察して開花調節因子としてＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子を分離し、その塩基配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８に示した。
【００８９】
（実験例８：ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子の機能喪失及び過発現穴質転換体の開花時期分析）
前記ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子内部にＴ-ＤＮＡまたはＴｏｓ１７が挿入突然変異を分析した結果、開花時期及び花発達などに特別な変化はなかった（図２１参照）。前記ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子内部のＴ-ＤＮＡまたはＴｏｓ１７の挿入位置は図２１に示す通りである。このような結果はＯｓＭＡＤＳ１４以外の他の遺伝子が過剰に作用することを暗示する。
ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子の最後のＫドメイン（ＫＩＶ）とＣドメインの間にストップコドンを人為的に挿入した遺伝子をｐＧＡ１６１１（ＡＹ３７３３３８）ベクターに導入してＣドメインを含む末端部位が除去されたＯｓＭＡＤＳ１４部分蛋白質の過多発現誘導した。このように、Ｃドメインを含む末端部位が除去されたＯｓＭＡＤＳ１４部分蛋白質を過多発現させた結果、短日条件では開花時期が１ヶ月程度速くなり、長日条件では開花時期が２週程度遅れたことが観察された。このような結果は３’領域が除去されたＯｓＭＡＤＳ１４の部分遺伝子を過多発現させることによって短日条件で開花時期を促進させ、長日条件では開花時期を促進する遺伝子と相互作用して開花を抑制する効果が得られることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ＯｓＭＡＤＳ５０にＴ-ＤＮＡが挿入された結果形成された突然変異体（Ｔ／Ｔ）を対照群（Ｗ／Ｗ）と共に示したものである。
【図２】ＯｓＭＡＤＳ５０突然変異体の発生原因、遺伝子型、開花時期を示す図で、（ａ）ＯｓＭＡＤＳ５０の構造と、この遺伝子上にＴ-ＤＮＡが挿入された位置、（ｂ）Ｔ-ＤＮＡ挿入機能損失突然変異体第２世代の表現型と遺伝子型を調べた結果である。
【図３】ＯｓＭＡＤＳ５０ＲＮＡ干渉ベクターに形質転換された植物体を分析した結果を示す図で、（ａ）ＯｓＭＡＤＳ５０ＲＮＡ干渉ベクターの構造、（ｂ）第１世代（Ｔ１）稲個体の開花時期分布、（ｃ）Ｔ１稲個体の伸張した節間数の分布を示したものである。
【図４】ＯｓＭＡＤＳ５０ＲＮＡ干渉効果を分析した図で、（ａ）内在的に発現するＯｓＭＡＤＳ５０と外部から導入されたＲＮＡ干渉用遺伝子の発現様相に対するＲＮＡゲルブロット（ＲＮＡ ｇｅｌ ｂｌｏｔ）結果、（ｂ）内在的に発現するＯｓＭＡＤＳ５０に対するＲＴ-ＰＣＲ結果を示したものである。
【図５】ＯｓＭＡＤＳ５０過多発現体を分析した結果で、（ａ）ＯｓＭＡＤＳ５０過多発現ベクターの構造、（ｂ）〜（ｅ）第１世代稲個体の表現型、（ｆ）類似花器官でＯｓＭＡＤＳ３とＯｓＭＡＤＳ４の発現を示したものである。
【図６】ＯｓＭＡＤＳ５０と他の開花調節因子の発現を分析した結果で、（ａ）ＯｓＭＡＤＳ５０の器官別発現様相、（ｂ）葉発達別開花調節因子の発現様相を示したものである。
【図７】ＯｓＭＡＤＳ５０突然変異体と過多発現体で開花調節因子の発現変化を分析した結果で、（ａ）ＯｓＭＡＤＳ５０突然変異体でＲＴ-ＰＣＲ結果、（ｂ）（ａ）から得られた結果、（ｃ）ＯｓＭＡＤＳ５０過多発現体でＲＴ-ＰＣＲ結果を図式化したものである。
【図８】長日及び短日条件下でのＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ（ノックアウト）個体の開花時期を示すグラフである。
【図９】ＯｓＭＡＤＳ５０ ＫＯ個体での開花時期調節因子の発現パターンを示すものである。
【図１０】ＯｓＴＲＸ１ＫＯ個体の開花遅延表現型を示す写真である。
【図１１】ＯｓＭＡＤＳ５１ＫＯ個体の開花遅延を示すグラフである。
【図１２】ＯｓＭＡＤＳ５６過発現個体の開花遅延を示すグラフである。
【図１３】ＯｓＶＩＮ２ＫＯ個体の開花遅延を示すグラフである。
【図１４】ＯｓＣＯＬ４過発現個体の開花遅延表現型を示す写真である。
【図１５】ＯｓＣＯＬ４プロモーター領域に３５Ｓエンハンサーを有するＴ-ＤＮＡが挿入されたことを示す模式図である。
【図１６】ＯｓＣＯＬ４遺伝子の過発現の姿を示す電気泳動写真である。
【図１７】ＯｓＣＯＬ４遺伝子の過発現形質転換体の開花が遅延された様相を示す写真である。
【図１８】ＯｓＣＯＬ４遺伝子の機能喪失形質転換体の開花が促進された様相を示す写真である。
【図１９】ＯｓＣＯＬ４遺伝子の機能喪失形質転換体の短日、長日及び自然条件下での開花促進様相を示すグラフである。
【図２０】ＯｓＣＯＬ８遺伝子の機能喪失形質転換体の短日条件及び長日条件下での開花時期変化を示すグラフである。
【図２１】Ｔ-ＤＮＡが挿入されたＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子の様相とその発現様相を示す写真である。
【図２２】ＯｓＭＡＤＳ５０遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）を示すものである。
【図２３】ＯｓＭＡＤＳ５１遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３）を示すものである。
【図２４】ＯｓＭＡＤＳ５６遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５）を示すものである。
【図２５】ＯｓＴＲＸ１遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７）を示すものである。
【図２６】ＯｓＶＩＮ２遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９）を示すものである。
【図２７】ＯｓＣＯＬ４遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１）を示すものである。
【図２８】ＯｓＣＯＬ８遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３）を示すものである。
【図２９Ａ】ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のゲノム塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１５）を示すものである。
【図２９Ｂ】ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のゲノム塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１５）を示すものである。
【図２９Ｃ】ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のゲノム塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１５）を示すものである。
【図２９Ｄ】ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のゲノム塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１５）を示すものである。
【図２９Ｅ】ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のゲノム塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１５）を示すものである。
【図２９Ｆ】ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のゲノム塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１５）を示すものである。
【図３０Ａ】ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６）を示すものである。
【図３０Ｂ】ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列の中でＣドメインコーディング序列を含む３’末端部位が除去された切頭 ＯｓＭＡＤＳ１４遺伝子の塩基序列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７）を示すものである。
【図１】
2008525013.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2008525013.tif 000018
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2008525013.tif 000024
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2008525013.tif 000028
【図２６】
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【図２７】
2008525013.tif 000030
【図２８】
2008525013.tif 000031
【図２９Ａ】
2008525013.tif 000032
【図２９Ｂ】
2008525013.tif 000033
【図２９Ｃ】
2008525013.tif 000034
【図２９Ｄ】
2008525013.tif 000035
【図２９Ｅ】
2008525013.tif 000036
【図２９Ｆ】
2008525013.tif 000037
【図３０Ａ】
2008525013.tif 000038
【図３０Ｂ】
2008525013.tif 000039
【配列表】
2008525013000001.app
【国際調査報告】
2008525013.tif 000040
2008525013.tif 000041
2008525013.tif 000042
2008525013.tif 000043