(57)【要約】  本発明は、（ｉ）緑色蛍光タンパク質と、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）緑色蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含有するＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／Ｅ認識配列を含むＳＮＡＰ−２５の一部分と、を含むＳＮＡＰ−２５基質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子を提供する。さらに本明細書では、（ｉ）蛍光タンパク質と、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含有するクロストリジウム毒素認識配列と、を含むタグ付き毒素基質をコードするヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）配列を含有する核酸分子が提供される。
2008509667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定する方法であって、
（ａ）サンプル中にクロストリジウム毒素が存在するときに蛍光切断産物が生成されるように、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件下の溶液相中で、
（ｉ）蛍光タンパク質、
（ｉｉ）親和性対の第１のパートナー、および
（ｉｉｉ）前記蛍光タンパク質と前記親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列、
を含むタグ付き毒素基質を前記サンプルで処理するステップ、
（ｂ）前記処理済サンプルを親和性対の第２のパートナーと接触させ、それにより前記親和性対の第１および第２のパートナーを含む安定な複合体を形成するステップ、および
（ｃ）前記処理済サンプル中の前記蛍光切断産物の存在または量をアッセイし、それによりクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定するステップ、
を含む方法。
【請求項２】
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光タンパク質がＧＦＰである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記親和性対の第１のパートナーが、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化配列、ストレプトアビジン、Ｓペプチド、Ｓタンパク質、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｃ−ｍｙｃおよびＡＵ１の群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記親和性対の第１のパートナーがヒスチジンタグである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記認識配列がボツリヌス毒素認識配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ボツリヌス毒素認識配列が、ＳＮＡＰ−２５の一部分を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＳＮＡＰ−２５の一部分が、配列番号：９０の残基１３４−２０６である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記認識配列が、ＢｏＮＴ／Ａ認識配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＢｏＮＴ／Ａ認識配列がＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＧｌｎ−Ａｒｇを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記認識配列が、ＢｏＮＴ／Ｂ認識配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＢｏＮＴ／Ｂ認識配列がＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＧｌｎ−Ｐｈｅを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記認識配列が、ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列がシンタキシンの少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＬｙｓ−Ａｌａを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列がＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＡｒｇ−Ａｌａを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ｄ認識配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＢｏＮＴ／Ｄ認識配列がＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＬｙｓ−Ｌｅｕを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ｅ認識配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＢｏＮＴ／Ｅ認識配列がＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＡｒｇ−Ｉｌｅを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ｆ認識配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＢｏＮＴ／Ｆ認識配列がＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＧｌｎ−Ｌｙｓを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ｇ認識配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＢｏＮＴ／Ｇ認識配列がＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＡｌａ−Ａｌａを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記認識配列がＴｅＮＴ認識配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴｅＮＴ認識配列がＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＧｌｎ−Ｐｈｅを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記基質が、少なくとも１ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記基質が、少なくとも１００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記基質が、少なくとも１０００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記親和性対の第２のパートナーが固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記親和性対の第２のパートナーがコバルト（Ｃｏ２＋）を含む、請求項１または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記親和性対の第２のパートナーがニッケル（Ｎｉ２＋）を含む、請求項１または２９に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｄ）の前に、前記蛍光切断産物を前記安定な複合体から分離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記分離が、前記処理済サンプルをカラムにアプライすることを含み、ここで、前記親和性対の第２のパートナーが前記カラムに固定化される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記分離が、前記処理済サンプルをフィルタープレートにアプライすることを含み、ここで、前記親和性対の第２のパートナーが前記フィルタープレートに固定化される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
（ｅ）前記処理済サンプル中の切断されていないタグ付き毒素基質の量をアッセイするステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルが、単離クロストリジウム毒素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記サンプルが、単離クロストリジウム軽鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプルが、処方クロストリジウム毒素製品である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記処方製品が、処方ＢｏＮＴ／Ａ製品である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記サンプルが、組換え発現クロストリジウム毒素を含有する完全または部分的に精製された細胞抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
（ｉ）緑色蛍光タンパク質、
（ｉｉ）親和性対の第１のパートナー、および
（ｉｉｉ）前記緑色蛍光タンパク質と前記親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含むＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／Ｅ認識配列を含むＳＮＡＰ−２５の一部分、
を含むＳＮＡＰ−２５基質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項４２】
前記親和性対の第１のパートナーが、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化配列、ストレプトアビジン、Ｓペプチド、Ｓタンパク質、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｃ−ｍｙｃおよびＡＵ１の群から選択される、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項４３】
前記親和性対の第１のパートナーが前記ヒスチジンタグである、請求項４２に記載の核酸分子。
【請求項４４】
ＳＮＡＰ−２５の前記一部分が、配列番号：９０の残基１３４−２０６を含む、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項４５】
ＳＮＡＰ−２５の前記一部分が、配列番号：９０の残基１３４−２０６である、請求項４４に記載の核酸分子。
【請求項４６】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ａ認識配列である、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項４７】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列である、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項４８】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ｅ認識配列である、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項４９】
前記基質が、少なくとも１ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断可能である、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項５０】
前記基質が、少なくとも１００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断可能である、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項５１】
前記基質が、少なくとも１０００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断可能である、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項５２】
（ｉ）蛍光タンパク質、
（ｉｉ）親和性対の第１のパートナー、および
（ｉｉｉ）前記蛍光タンパク質と前記親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列、
を含むタグ付き毒素基質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項５３】
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の群から選択される、請求項５２に記載の核酸分子。
【請求項５４】
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項５３に記載の核酸分子。
【請求項５５】
前記親和性対の第１のパートナーが、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化配列、ストレプトアビジン、Ｓペプチド、Ｓタンパク質、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｃ−ｍｙｃおよびＡＵ１の群から選択される、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５６】
前記親和性対の第１のパートナーがヒスチジンタグである、請求項５５に記載の核酸分子。
【請求項５７】
前記認識配列がボツリヌス毒素認識配列である、請求項５２に記載の核酸分子。
【請求項５８】
前記ボツリヌス毒素認識配列が、ＳＮＡＰ−２５の一部分を含む、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項５９】
ＳＮＡＰ−２５の前記一部分が、配列番号：９０の残基１３４−２０６である、請求項５８に記載の核酸分子。
【請求項６０】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ａ認識配列である、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項６１】
前記ＢｏＮＴ／Ａ認識配列がＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＧｌｎ−Ａｒｇを含む、請求項６０に記載の核酸分子。
【請求項６２】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ｂ認識配列である、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項６３】
前記ＢｏＮＴ／Ｂ認識配列がＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＧｌｎ−Ｐｈｅを含む、請求項６２に記載の核酸分子。
【請求項６４】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列である、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項６５】
前記ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列がシンタキシンの少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＬｙｓ−Ａｌａを含む、請求項６４に記載の核酸分子。
【請求項６６】
前記ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列がＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＡｒｇ−Ａｌａを含む、請求項６４に記載の核酸分子。
【請求項６７】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ｄ認識配列である、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項６８】
前記ＢｏＮＴ／Ｄ認識配列がＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＬｙｓ−Ｌｅｕを含む、請求項６７に記載の核酸分子。
【請求項６９】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ｅ認識配列である、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項７０】
前記ＢｏＮＴ／Ｅ認識配列がＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＡｒｇ−Ｉｌｅを含む、請求項６９に記載の核酸分子。
【請求項７１】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ｆ認識配列である、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項７２】
前記ＢｏＮＴ／Ｆ認識配列がＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＧｌｎ−Ｌｙｓを含む、請求項７１に記載の核酸分子。
【請求項７３】
前記認識配列がＢｏＮＴ／Ｇ認識配列である、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項７４】
前記ＢｏＮＴ／Ｇ認識配列がＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＡｌａ−Ａｌａを含む、請求項７３に記載の核酸分子。
【請求項７５】
前記認識配列がＴｅＮＴ認識配列である、請求項５２に記載の核酸分子。
【請求項７６】
前記ＴｅＮＴ認識配列がＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含み、前記６つの連続残基がＧｌｎ−Ｐｈｅを含む、請求項７５に記載の核酸分子。
【請求項７７】
前記基質が、少なくとも１ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断可能である、請求項５２に記載の核酸分子。
【請求項７８】
前記基質が、少なくとも１００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断可能である、請求項５２に記載の核酸分子。
【請求項７９】
前記基質が、少なくとも１０００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断可能である、請求項５２に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年８月２８日に出願された米国特許出願第０９／９４２，０９８号の一部継続出願であり、参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は一般的にはプロテアーゼアッセイに関し、より具体的には、ボツリヌス毒素および破傷風毒素などのクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性をアッセイするための組換え産生基質および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
破傷風、およびまれではあるが致死的な疾患となる可能性のなるボツリヌス中毒症の神経麻痺症候群は、クロストリジウム属の細菌によって産生される神経毒素により引き起こされる。これらのクロストリジウム神経毒素は、神経細胞に対し非常に強くまた特異的な毒であり、ボツリヌス毒素のヒト致死量はマイクログラムのオーダーである。従って、飲食物に存在するボツリヌス毒素が微量であっても公衆衛生を害し、それは厳しい試験を通して回避されなければならない。
【０００４】
しかしながら、それらの潜在的に有害な作用にも関わらず、低用量に制御されたボツリヌス神経毒素は治療薬として使用され成功を収めている。これらの毒素は、様々な局所または分節的失調、斜視、およびコリン作動性神経終末活性の可逆的抑制が望まれる他の症状の治療管理に使用されている。ヒトにおけるボツリヌス神経毒素の確立された治療的使用には、例えば、眼瞼痙攣、半側顔面痙攣、喉頭発生障害、局所多汗症、流涎、口顎ジストニア、頚部ジストニア、斜頚、斜視、肢ジストニア、職業性痙攣およ筋波動症の処置が含まれる(Rossetto et al, Toxicon 39:27-41 (2001))。例えば、少量のＢｏＮＴ／Ａの痙攣組織への筋肉内注射は、脳障害、脊髄障害、脳卒中、多発性硬化症および脳性麻痺による痙縮の処置に効果的に用いられる。クロストリジウム毒素のさらなる可能性ある臨床学的使用は、今でも調査されている。
【０００５】
食料品中の少量のボツリヌス毒素に関する潜在的危険性および的確な医薬製剤を調製する必要性がある場合、現在食品および医薬品業界の両方においてボツリヌス神経毒素についてのアッセイが用いられている。食品業界では、新しい食品包装方法の有効性を確認し、食品の安全性を保証するために、ボツリヌス神経毒素に対するアッセイが要求される。さらに、ボツリヌス毒素の臨床上の用途は増加しており、医薬品調製および品質管理のためのボツリヌス神経毒素活性に対する的確なアッセイが必要とされる。両業界において、現在マウス致死性試験がボツリヌス毒素活性をアッセイするのに使用されている。残念なことに、このアッセイにはいくつかの欠点がある：多数の実験動物が必要とされることによる費用；特異性の欠如；および大きな動物集団を使用しない場合に不正確なアッセイとなる可能性。
【０００６】
従って、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性をアッセイするための新規な材料および方法が必要とされる。本発明は、この要求を満たし、その上関連する利点を提供する。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、（ａ）サンプル中にクロストリジウム毒素が存在するときに蛍光切断産物が生成されるように、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件下の溶液相中で、（ｉ）蛍光タンパク質と、（ｉｉ）親和性対（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｕｐｌｅ）の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列と、を含有するタグ付き毒素基質をサンプルで処理することと、（ｂ）処理済サンプルを親和性対の第２のパートナーと接触させ、それにより親和性対の第１および第２のパートナーを含有する安定な複合体を形成することと、（ｄ）処理済サンプル中の蛍光切断産物の存在または量をアッセイし、それによりクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定することとによって、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定する方法を提供する。１つの実施形態では、蛍光切断産物の存在または量をアッセイする前に、蛍光切断産物は安定な複合体から分離される。
【０００８】
また本発明は、（ｉ）緑色蛍光タンパク質と、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）緑色蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含有するＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／Ｅ認識配列を含むＳＮＡＰ−２５の一部分と、を含むＳＮＡＰ−２５基質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子も提供する。本発明はさらに、（ｉ）蛍光タンパク質と、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含有するクロストリジウム毒素認識配列と、を含むタグ付き毒素基質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、全ての血清型のボツリヌス毒素および破傷風毒素を含むクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定するために有用なＳＮＡＰ−２５基質およびタグ付き毒素基質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、一つには、同族のクロストリジウム毒素に対する結合親和性を高めることが可能なより長い毒素認識配列を有する組換えＳＮＡＰ−２５基質およびタグ付き毒素基質を都合良く調製するために使用することができるという理由で貴重である。このような組換えＳＮＡＰ−２５基質およびタグ付き毒素基質は、動物に頼ることのない簡単なスクリーニングアッセイにおいて利用することができ、未精製およびバルクサンプル、ならびに高純度の二鎖（ｄｉｃｈａｉｎ）毒素または単離クロストリジウム毒素軽鎖を分析するために有用である。さらに本明細書において開示されるように、本発明の核酸分子から調製される組換えＳＮＡＰ−２５基質およびタグ付き毒素基質を使用して、低ピコモル濃度のＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅを検出し、低ナノモル濃度のＢｏＮＴ／Ｃを検出することができる。
【００１０】
本発明はさらにクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定する方法を提供し、該方法は、敏感、迅速、および高スループットであり得るという点で有利であり、溶液相のタンパク質分解反応を可能にする。他のアッセイとは違って、本発明の方法はその同族の毒素に対して良好な親和性を有するクロストリジウム毒素基質の分析を組み合わせており、その結果、毒素のプロテアーゼ活性が溶液相中でアッセイされる構成の高感度アッセイが得られ、毒素活性の動態学的分析が可能になる。米国特許第６，７６２，２８０号明細書に記載されるような別のアッセイは、毒素に対して良好な結合親和性を有するものではあるが、固定化基質に依存していた。さらなるアッセイは高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分離に依存しており、そのため高スループット構成に従わない（米国特許第５，９６５，６９９号明細書）か、あるいは比較的乏しい結合特性を有する短いペプチド基質に頼った、より低感度のアッセイ（例えば、アン（Ａｎｎｅ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９１：２５３−２６１頁（２００１年）を参照）であった。
【００１１】
従って本発明は、一つには、（ｉ）緑色蛍光タンパク質と、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）緑色蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含有するＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／Ｅ認識配列を含むＳＮＡＰ−２５の一部分と、を含有するＳＮＡＰ−２５基質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子を提供する。本発明の核酸分子において、親和性対のコードされた第１のパートナーは、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化配列、ストレプトアビジン、Ｓペプチド、Ｓタンパク質、もしくはＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｔｉｎｉｎ）、ｃ−ｍｙｃまたはＡＵ１エピトープなどのエピトープであり得るが、限定はされない。１つの実施形態では、親和性対のコードされた第１のパートナーは、ヒスチジンタグである。
【００１２】
本発明の核酸分子において、コードされたＳＮＡＰ−２５基質は、切断部位を含有するＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／Ｅ認識配列を有するＳＮＡＰ−２５の様々な部分のいずれかを含むことができる。このようなＳＮＡＰ−２５の部分は、例えば、配列番号：９０の残基１３４−２０６、もしくは本明細書中で開示されるかまたは当該技術分野において既知である別のＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／Ｅ認識配列および切断部位を含むことができる。１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも１ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断されるＳＮＡＰ−２５基質をコードするヌクレオチド配列を含む。もう１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも１００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断されるＳＮＡＰ−２５基質をコードするヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも１０００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断されるＳＮＡＰ−２５基質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
本発明はさらに、（ｉ）蛍光タンパク質と、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含有するクロストリジウム毒素認識配列と、を含有するタグ付き毒素基質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子を提供する。タグ付き毒素基質をコードする核酸分子において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質であり得るが、限定はされない。１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、緑色蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
このような核酸分子において、親和性対の様々な第１のパートナーは、コードされたタグ付き毒素基質内に取り込まれ得る。非限定的な例として、コードされたタグ付き毒素基質は、親和性対の第１のパートナーとして、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化配列、ストレプトアビジン、Ｓペプチド、Ｓタンパク質、もしくはＦＬＡＧ、赤血球凝集素、ｃ−ｍｙｃまたはＡＵ１エピトープなどのエピトープを含むことができる。さらに、コードされたクロストリジウム毒素認識配列は、配列番号：９０の残基１３４−２０６、もしくは例えば本明細書中で開示されるかまたは当該技術分野において既知である認識配列のうちの１つのようなＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／ＧまたはＴｅＮＴ認識配列などのＳＮＡＰ−２５の一部分であり得るが、限定はされない。
【００１５】
さらに、本発明の核酸分子は、低いまたは高い活性を有する同族のクロストリジウム毒素によって切断可能なタグ付き毒素基質をコードするヌクレオチド配列を含有する。１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも１ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断可能なタグ付き毒素基質をコードする。もう１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも１００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断可能なタグ付き毒素基質をコードする。さらにもう１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも１０００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断可能なタグ付き毒素基質をコードする。
【００１６】
本発明はさらに、（ｉ）遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含有するクロストリジウム毒素認識配列と、を含むタグ付き毒素基質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子を提供する。本発明の核酸分子において、遺伝的にコードされた検出可能なマーカーは、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは蛍光タンパク質であり得るが、限定はされない。
【００１７】
親和性対の様々な第１のパートナーはどれも、本発明の核酸分子によってコードされたタグ付き毒素基質において、遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと組み合わせることができる。親和性対のコードされた第１のパートナーは、例えば、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ＢｉｒＡｓｐなどのビオチン化配列、ストレプトアビジン、Ｓペプチド、Ｓタンパク質、もしくはＦＬＡＧ、赤血球凝集素、ｃ−ｍｙｃまたはＡＵ１エピトープなどのエピトープであり得る。１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、親和性対の第１のパートナーとしてヒスチジンタグを含むタグ付き毒素基質をコードする。
【００１８】
さらに、様々なコードされたクロストリジウム毒素認識配列はいずれも、本発明の核酸分子によってコードされたタグ付き毒素基質において、遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと組み合わせることができる。このようなクロストリジウム毒素認識配列としてはボツリヌス毒素認識配列があるが、これに限定されない。非限定的な例として、コードされたタグ付き毒素基質において、遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと組み合わせられるクロストリジウム毒素認識配列は、配列番号：９０残基１３４−２０６、もしくは本明細書中で開示されるかあるいは当該技術分野において既知である認識配列のうちの１つのようなＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／ＧまたはＴｅＮＴ認識配列などのＳＮＡＰ−２５の一部分であり得る。
【００１９】
本発明の核酸分子は、低いまたは高い活性を有する同族のクロストリジウム毒素によって切断されるタグ付き毒素基質をコードすることができる。１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも１ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断可能なタグ付き毒素基質をコードする。その他の実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも１００ナノモル／分／ミリグラムの毒素、または少なくとも１０００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断可能なタグ付き毒素基質をコードする。
【００２０】
さらに、本明細書では、（ｉ）緑色蛍光タンパク質と、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）緑色蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含有するＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／Ｅ認識配列を含むＳＮＡＰ−２５の一部分と、を含むＳＮＡＰ−２５基質が提供される。親和性対の様々な第１のパートナーはどれも本発明のＳＮＡＰ−２５基質において有用である。非限定的な例として、親和性対の第１のパートナーは、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化配列、ストレプトアビジン、Ｓペプチド、Ｓタンパク質、もしくはＦＬＡＧ、赤血球凝集素、ｃ−ｍｙｃまたはＡＵ１エピトープなどのエピトープであり得る。１つの実施形態では、本発明は、親和性対の第１のパートナーがヒスチジンタグであるＳＮＡＰ−２５基質を提供する。
【００２１】
本発明のＳＮＡＰ−２５基質は、対応する切断部位を含有するＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／Ｅ認識配列を含むＳＮＡＰ−２５の一部分を取り込む。１つの実施形態では、本発明のＳＮＡＰ−２５基質は、配列番号：９０の残基１３４−２０６を含む。さらなる実施形態では、本発明のＳＮＡＰ−２５基質は、ＢｏＮＴ／Ａ認識配列、ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列、またはＢｏＮＴ／Ｅ認識配列を含む。さらに、本発明のＳＮＡＰ−２５基質は、少なくとも１ナノモル／分／ミリグラムの毒素、少なくとも１００ナノモル／分／ミリグラムの毒素、あるいは少なくとも１０００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断可能であるが、限定はされない。
【００２２】
さらに、本明細書では、（ｉ）蛍光タンパク質と、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含有するクロストリジウム毒素認識配列と、を含むタグ付き毒素基質が提供される。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含むが限定はされない、様々な蛍光タンパク質はどれも本発明のタグ付き毒素基質内に取り込むことができる。１つの実施形態では、本発明のタグ付き毒素基質は、緑色蛍光タンパク質を含む。親和性対の様々な第１のパートナーはどれも本発明のタグ付き毒素基質において有用である。非限定的な例として、タグ付き毒素基質は、親和性対の第１のパートナーとして、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化配列、ストレプトアビジン、Ｓペプチド、Ｓタンパク質、もしくはＦＬＡＧ、赤血球凝集素、ｃ−ｍｙｃまたはＡＵ１エピトープなどのエピトープを含むことができる。１つの実施形態では、本発明は、親和性対の第１のパートナーがヒスチジンタグであるタグ付き毒素基質を提供する。
【００２３】
ボツリヌス毒素認識配列を含むがこれに限定されない様々な認識配列が、本発明のタグ付き毒素基質において有用であることは理解される。１つの実施形態では、本発明は、認識配列が、限定はされないが配列番号：９０の残基１３４−２０６などのＳＮＡＰ−２５の一部分を含むタグ付き毒素基質を提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、認識配列が、限定はされないがＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続残基（ここで、６つの連続残基は配列Ｇｌｎ−Ａｒｇを包含する）を含むＢｏＮＴ／Ａ認識配列などのＢｏＮＴ／Ａ認識配列であるタグ付き毒素基質を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、認識配列が、限定はされないがＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基（ここで、６つの連続残基は配列Ｇｌｎ−Ｐｈｅを包含する）を含むＢｏＮＴ／Ｂ認識配列などのＢｏＮＴ／Ｂ認識配列であるタグ付き毒素基質を提供する。さらにもう１つの実施形態では、本発明は、認識配列が、限定はされないがシンタキシンの少なくとも６つの連続残基（ここで、６つの連続残基は配列Ｌｙｓ−Ａｌａを包含する）を含むＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列、あるいはＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続残基（ここで、６つの連続残基は配列Ａｒｇ−Ａｌａを包含する）を含むＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列などのＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列であるタグ付き毒素基質を提供する。さらにもう１つの実施形態では、本発明は、認識配列が、限定はされないがＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基（ここで、６つの連続残基は配列Ｌｙｓ−Ｌｅｕを包含する）を含むＢｏＮＴ／Ｄ認識配列などのＢｏＮＴ／Ｄ認識配列であるタグ付き毒素基質を提供する。
【００２４】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、認識配列が、限定はされないがＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続残基（６つの連続残基は配列Ａｒｇ−Ｉｌｅを包含する）を含むＢｏＮＴ／Ｅ認識配列などのＢｏＮＴ／Ｅ認識配列であるタグ付き毒素基質を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、認識配列が、限定はされないがＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基（６つの連続残基は配列Ｇｌｎ−Ｌｙｓを包含する）を含むＢｏＮＴ／Ｆ認識配列などのＢｏＮＴ／Ｆ認識配列であるタグ付き毒素基質を提供する。本発明はさらに、認識配列が、限定はされないがＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基（６つの連続残基は配列Ａｌａ−Ａｌａを包含する）を含むＢｏＮＴ／Ｇ認識配列などのＢｏＮＴ／Ｇ認識配列であるタグ付き毒素基質を提供する。さらにもう１つの実施形態では、本発明は、認識配列が、限定はされないがＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基（６つの連続残基は配列Ｇｌｎ−Ｐｈｅを包含する）を含むＴｅＮＴ認識配列などのＴｅＮＴ認識配列であるタグ付き毒素基質を提供する。
【００２５】
本発明のタグ付き毒素基質は、高いまたは低い活性で切断することができる。１つの実施形態では、本発明のタグ付き毒素基質は、少なくとも１ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断することができる。もう１つの実施形態では、本発明のタグ付き毒素基質は、少なくとも１００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断することができる。またさらなる実施形態では、本発明のタグ付き毒素基質は、少なくとも１０００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断することができる。
【００２６】
破傷風およびボツリヌス神経毒素はクロストリジウム属によって産生され、破傷風およびボツリヌス中毒症の神経麻痺症候群を引き起こす。破傷風神経毒素が主にＣＮＳシナプスに作用する一方、ボツリヌス神経毒素は末梢性に作用する。クロストリジウム神経毒素は近似した細胞中毒機序を共用し、神経伝達物質の放出を抑制する。ジスルフィド結合した二つのポリペプチド鎖より構成されるこれらの毒素において、大きい方のサブユニットは、神経特異的結合および小さい方のサブユニットの細胞質内へのトランスロケーションに関与する。神経細胞内におけるトランスロケーションおよび還元の後、小さい方の鎖が、神経細胞細胞質におけるニューロエキソサイトーシスに関与するタンパク質成分に特異的なプロテアーゼ活性を示す。クロストリジウム毒素の標的であるＳＮＡＲＥタンパク質は、様々な非神経細胞タイプにおけるエキソサイトーシスに共通している；神経細胞と同様にこれらの細胞において、軽鎖プロテアーゼ活性がエキソサイトーシスを阻害する。
【００２７】
破傷風およびボツリヌス神経毒素Ｂ、Ｄ、Ｆ、およびＧは、ＶＡＭＰ（ｓｙｎａｐｔｏｂｒｅｖｉｎ）を特異的に認識するが、これは神経毒素によって異なる結合の所で切断されるシナプス小胞膜内在性タンパク質である。ボツリヌスＡおよびＥ神経毒素は、シナプス前膜のタンパク質であるＳＮＡＰ−２５を、そのタンパク質のカルボキシ末端部分における二つの相異なる部位で特異的に認識および切断する。ボツリヌス神経毒素Ｃは、ＳＮＡＰ−２５に加えて、神経細胞膜タンパク質であるシンタキシンを切断する。三つのクロストリジウム神経毒素標的タンパク質は酵母からヒトまで保存されているが、切断部位および毒素感受性は必ずしも保存されていない（以下参照；Humeau et al., Biochimie 82:427 446 (2000); Niemann et al., Trends in Cell Biol. 4:179 185 (1994); および Pellizzari et al., Phil. Trans. R. Soc. London 354:259-268 (1999))も参照）。
【００２８】
天然の破傷風およびボツリヌス神経毒素は、リーダー配列のない１５０ｋＤａの不活性ポリペプチド鎖として産生される。これらの毒素は、露出したプロテアーゼ感受性ループのところで細菌または組織プロテイナーゼによって切断され、活性二鎖毒素を生成し得る。天然のクロストリジウム毒素は、重鎖（Ｈ、１００ｋＤａ）および軽鎖（Ｌ、５０ｋＤａ）を架橋する鎖間ジスルフィド結合を一つ含む；このような架橋は、細胞外に加えられた毒素の神経毒性にとって重要である(Montecucco and Schiavo, Quarterly Rev. Biophysics 28:423-472 (1995)。
【００２９】
図１に示すように、クロストリジウム毒素は三つの別個の５０ｋＤａドメインに折り畳まれているようであり、各ドメインは別個の機能的役割を有する。図２に描かれるように、クロストリジウム毒素の細胞中毒機序は４つの異なる段階より成る：（１）結合、（２）内在化、（３）膜トランスロケーション、および（４）酵素的標的修飾。重鎖のカルボキシ末端部分（ＨＣ）は神経特異的結合において機能し、一方Ｈ鎖のアミノ末端部分（ＨＮ）は、膜トランスロケーションにおいて機能する。Ｌ鎖は、細胞内触媒活性に関与する(Montecucco and Schiavo, 前述, 1995)。
【００３０】
８種類のヒトクロストリジウム神経毒素のアミノ酸配列は、対応する遺伝子に由来している(Neimann, ”Molecular Biology of Clostridial Neurotoxins” in Sourcebook of Bacterial Protein Toxins Alouf and Freer (Eds.) pp. 303-348 London: Academic Press 1991)。Ｌ鎖およびＨ鎖は、それぞれおよそ４３９および８４３残基より構成されており、相同性あるセグメントが、ほとんどまたは全く類似しない領域によって隔てられている。Ｌ鎖の最も良く保存された領域は、アミノ末端部分（１００残基）および中心領域（ＴｅＮＴの残基２１６−２４４に相当）、および鎖間ジスルフィド結合を形成している二つのシステインである。この２１６−２４４の領域は、亜鉛−エンドペプチダーゼに特徴的なHis-Glu-X-X-His結合モチーフを含む。
【００３１】
重鎖は軽鎖ほどよくは保存されておらず、ＨＣのカルボキシ末端部分（ＴｅＮＴの残基１１４０−１３１５に相当）が最も変化に富んでいる。このことは、ＨＣドメインが神経終末への結合に関与していること、および異なる神経毒素は異なる受容体に結合しているようであるという事実と一致する。多くの血清型特異的抗体が重鎖決定基を認識することは驚くべきことではない。
【００３２】
クロストリジウム毒素のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の比較により、それらが共通の先祖遺伝子に由来することがわかる。クロストリジウム神経毒素遺伝子の拡散は、これら遺伝子が移動性の遺伝子エレメント上に位置することよって促進されている可能性がある。以下にさらに述べるように、７種類のボツリヌス毒素を含むクロストリジウム神経毒素の配列変異体が当業界で知られている。例えば図５から図７、および Humeau et al., 前述, 2000 参照。
【００３３】
前述のように、クロストリジウム神経毒素の本来の標的は、ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５、およびシンタキシンを含む。図３に示すように、ＶＡＭＰはシナプス小胞膜に結合しており、一方ＳＮＡＰ−２５およびシンタキシンは標的膜に結合している（図３参照）。ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／ＥはＳＮＡＰ−２５をカルボキシ末端領域において切断してそれぞれ９または２６アミノ酸残基を放出し、ＢｏＮＴ／Ｃ１もまたＳＮＡＰ−２５をカルボキシ末端付近で切断する。ボツリヌス血清型ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｇ、および破傷風毒素は、ＶＡＭＰの保存された中心部分に作用し、ＶＡＭＰのアミノ末端部分を細胞質中へ放出する。ＢｏＮＴ／Ｃ１は、シンタキシンを細胞膜内側膜表面付近の単一の部位で切断する。従ってＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、およびＴｅＮＴの作用により、ＶＡＭＰまたはシンタキシンの細胞質内ドメインの大部分が放出されるが、一方ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ1またはＢｏＮＴ／Ｅのタンパク分解によっては、ＳＮＡＰ−２５の小さな部分しか放出されない (Montecucco and Schiavo, 前述, 1995)。
【００３４】
膜貫通セグメントを欠く約２０６残基のタンパク質であるＳＮＡＰ−２５は、神経細胞膜の細胞質内表面に結合している（図３、Hodel et al., Int. J. Biochemistry and Cell Biology 30:1069-1073 (1998)も参照）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａから哺乳類まで高度に保存されたホモログに加えて、ＳＮＡＰ−２５関連タンパク質はまた酵母からも単離されている。ＳＮＡＰ−２５は発生中の軸索伸長に必要であり、また成熟神経系における神経終末可塑性にとって必要な可能性がある。ヒトにおいては、発生中に二つのアイソフォームが相異なるかたちで発現する；アイソフォームａは、胎児段階の初期に構成的に発現し、一方アイソフォームｂは出生時に現れ成年期に主に発現する。ＳＮＡＰ−２３のようなＳＮＡＰ−２５アナログもまた、神経系外部、例えば膵臓細胞に発現している。
【００３５】
ＶＡＭＰは約１２０残基のタンパク質であり、正確な長さは種およびアイソタイプに依存する。図３に示すように、ＶＡＭＰは短いカルボキシ末端セグメントを小胞内腔内に含むが、一方でその分子のほとんどは細胞質に露出している。プロリンリッチアミノ末端３０残基は種およびアイソフォーム間で相違するが、ＶＡＭＰの中心部分（残基３０−９６）は高度に保存されており、荷電および親水性残基に富み、かつ高度に保存された既知の切断部位を含む。ＶＡＭＰは、シナプトフィジンとともにシナプス小胞膜上に結合している。
【００３６】
ヒト、ラット、ウシ、Ｔｏｒｐｅｄｏ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、酵母、イカおよびＡｐｌｙｓｉａホモログを含む（これらに限定されない）、様々なＶＡＭＰの種ホモログが当業界において知られている。さらに、ＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２およびセルブレビンを含む、多数のＶＡＭＰアイソフォームが同定されており、かつ非神経細胞において非感受性型が同定されている。ＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２の分布は相異なる細胞タイプにおいて様々であるが、ＶＡＭＰはすべての脊椎動物組織において存在するようである。チキンおよびラットＶＡＭＰ−１は、ＴｅＮＴまたはＢｏＮＴ／Ｂによって切断される。これらのＶＡＭＰ−１ホモログは、ＴｅＮＴまたはＢｏＮＴ／Ｂ切断部位において、ヒトまたはマウスＶＡＭＰ−１ではグルタミンが存在する場所にバリンを有する。置換はＢｏＮＴ／Ｄ、／Ｆ、または／Ｇには影響せず、それらはＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２を同様の率で切断する。
【００３７】
シンタキシンは神経細胞膜の細胞膜内側表面上に位置し、カルボキシ末端セグメントを介して膜に固定されており、そのタンパク質のほとんどが細胞質に露出している。シンタキシンは、シナプス前膜の活性領域にカルシウムチャンネルと共に局在する。さらに、シンタキシンは、細胞膜と小胞の間に機能的架橋を形成するＳＳＶ膜タンパク質であるシナプトタグミンと相互作用する。様々なシンタキシンアイソフォームが同定されている。幾分長さの異なる二つのアイソフォーム（２８５残基および２８８残基）が神経細胞において同定されており（アイソフォーム１Ａおよび１Ｂ）、アイソフォーム２、３、４、および５は他の組織に存在する。これらアイソフォームはＢｏＮＴ／Ｃ１に対する感受性が様々であり、シンタキシン １Ａ、１Ｂ、２および３アイソフォームが本毒素によって切断される。
【００３８】
上記のように、本発明のＳＮＡＰ−２５基質は、（ｉ）緑色蛍光タンパク質と、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）緑色蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含有するＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／Ｅ認識配列を含むＳＮＡＰ−２５の一部分とを含む。本発明のタグ付き毒素基質は、（ｉ）蛍光タンパク質と、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含有するクロストリジウム毒素認識配列とを含む。
【００３９】
ＳＮＡＰ−２５基質は、一つには、緑色蛍光タンパク質を含む。本明細書で用いられる場合、「緑色蛍光タンパク質」という用語は「ＧＦＰ」と同義語であり、特定の波長の光を吸収して、５２０〜５６５ｎｍの範囲の波長の光エネルギーを発するタンパク質を意味する。本発明において有用な緑色蛍光タンパク質には、Ａ．ビクトリア（Ａ．Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オワンクラゲ）ＧＦＰ（配列番号：９８）またはその相同体などの野生型緑色蛍光タンパク質と、野生型緑色蛍光タンパク質の天然に存在する変異体および遺伝子操作された変異体、ならびに５２０〜５６５ｎｍの範囲の光を発する能力を保持するその活性断片とが含まれるが、限定はされない。非限定的な例として、「緑色蛍光タンパク質」という用語は、促進されたフルオロフォア形成を実証する野生型Ａ．ビクトリアＧＦＰのＧＦＰのＳｅｒ６５Ｔｈｒ変異体（ハイム（Ｈｅｉｍ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：６６３（１９９５年））と、野生型ＧＦＰの大小の吸収ピークを４８９ｎｍにおける単一の吸収ピークに変換して、より明るい緑色蛍光タンパク質を生じる、Ｓｅｒ６５のＴｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＣｙｓまたはＬｅｕへの置換を含有するＧＦＰ変異体（ハイムら、上記、１９９５年）と、野生型ＧＦＰの温度感受性を軽減するＰｈｅ６４ＬｅｕなどのＧＦＰ変異体（ツィン（Ｔｓｉｅｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９（１９９８年））と、高濃度における二量体化を克服するＧＦＰのＡｌａ２０６Ｌｙｓ、Ｌｅｕ２２１Ｌｙｓ、およびＰｈｅ２２３Ａｒｇ変異体（ツァハリアス（Ｚａｃｈａｒｉａｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：９１３頁（２００２年））と、哺乳類細胞における発現のためのコドン最適化とＳｅｒ６５ＴｈｒおよびＰｈｅ６４Ｌｅｕ置換とを組み合わせて明るく安定な変異体をもたらす高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）（コーマック（Ｃｏｒｍａｃｋ）ら、Ｇｅｎｅ  １７３：３３（１９９６年））とを含む。１つの実施形態では、本発明において有用な緑色蛍光タンパク質は、野生型Ａ．ビクトリアＧＦＰ（配列番号：９８）と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有する。その他の実施形態では、本発明において有用な緑色蛍光タンパク質は、野生型Ａ．ビクトリアＧＦＰ（配列番号：９８）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性を有する。さらなる実施形態では、本発明において有用な緑色蛍光タンパク質は、野生型Ａ．ビクトリアＧＦＰ（配列番号：９８）に対して最大でも１０のアミノ酸置換を有する。またさらなる実施形態では、本発明において有用な緑色蛍光タンパク質は、野生型Ａ．ビクトリアＧＦＰ（配列番号：９８）に対して最大でも１、２、３、４、５、６、７、８または９のアミノ酸置換を有する。
【００４０】
タグ付き毒素基質は、一つには、蛍光タンパク質を含む。本明細書で用いられる場合、「蛍光タンパク質」という用語は、特定の波長の光エネルギーを吸収して、より長い波長の光エネルギーを発するタンパク質を意味する。本発明において有用な蛍光タンパク質は、野生型蛍光タンパク質と、海洋生物に由来するものなどの蛍光タンパク質の天然に存在する変異体および遺伝子操作された変異体とを包含するが、限定はされない。
【００４１】
タグ付き毒素基質において有用な蛍光タンパク質は、野生型Ａ．ビクトリアタンパク質、ならびにＡ．ビクトリアタンパク質の天然に存在する変異体および遺伝子操作された変異体などのＡ．ビクトリア由来の蛍光タンパク質（ＡＦＰ）を含むが、限定はされない。このような蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を含むが、これらに限定されない。ここで、蛍光の色は発光される光の波長に依存し、緑色蛍光タンパク質は５２０〜５６５ｎｍの範囲の光を発し、シアン蛍光タンパク質は５００〜５２０ｎｍの範囲の光を発し、青色蛍光タンパク質は４５０〜５００ｎｍの範囲の光を発し、黄色蛍光タンパク質は５６５〜５９０ｎｍの範囲の光を発し、そして以下にさらに説明される赤色蛍光タンパク質は６２５〜７４０ｎｍの範囲の光を発する。さらに、本発明において有用な蛍光タンパク質は、例えば、限定はされないが、励起または発光波長の変化、明るさ、ｐＨ耐性、安定性またはフルオロフォア形成速度の増強、光活性化、もしくはオリゴマー化または光退色の低減などの特性の改善のために遺伝子操作されたものを含む。また、本発明において有用な蛍光タンパク質は、野生型コドンを、蛍光タンパク質を含むＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質を発現する働きをする細胞においてより効率的に利用される他のコドンに変換することによって、タンパク質の発現の改善のために操作され得る。
【００４２】
本発明において有用な蛍光タンパク質は、紫色、青色、シアン、緑色、黄色、オレンジ色および赤色を含む様々なスペクトルで発光するものを包含する。また、以下にさらに説明されるように、本発明において有用な蛍光タンパク質は、ＧＦＰのランダム変異誘発によって産生された青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）およびシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ならびに合理的に設計された黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を含むが、これらに限定されない。ＢＦＰはＧＦＰに対するＴｙｒ６６Ｈｉｓ置換を有し、これは吸収スペクトルを３８４ｎｍのピークにシフトさせ、４４８ｎｍで発光する（ハイムら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１２５０１（１９９４年））。ＢＦＰよりも明るく光安定性であるＣＦＰは、Ｔｙｒ６６Ｔｒｐ置換のために、ＢＦＰとＥＧＦＰとの中間の吸収／発光スペクトル範囲を有する（ハイムら、上記、１９９４年、ハイムおよびツィン、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２（１９９６年）およびエレンバーグ（Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５：８３８（１９９８年））。「ＣＧＦＰ」として知られるＴｈｒ２０３ＴｙｒのＣＦＰ変異体は、ＣＦＰとＥＧＦＰとの中間の励起および発光波長を有する。合理的に設計されたＹＦＰは、緑色蛍光タンパク質に関してレッドシフトした吸収および発光スペクトルを有する（オルモ（Ｏｒｍｏ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：１３９２（１９９６年）、ハイムおよびツィン、上記、１９９６年）。ＹＦＰ変異体「シトリン（Ｃｉｔｒｉｎｅ）」（ＹＦＰ−Ｖａｌ６８Ｌｅｕ／Ｇｌｎ６９Ｍｅｔ、グリースベック（Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２９１８８−２９１９４頁（２００１年））と、「ビーナス（Ｖｅｎｕｓ）」（ＹＦＰ−Ｐｈｅ４６Ｌｅｕ／Ｐｈｅ６４Ｌｅｕ／Ｍｅｔ１５３Ｔｈｒ／Ｖａｌ１６３Ａｌａ／Ｓｅｒ１７５Ｇｌｙ）、極めて明るく、成熟の速いＹＦＰ（ナガイ（Ｎａｇａｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：８７−９０頁（２００２年））とを含むが限定はされない様々なＹＦＰ変異体は、改善された特性を示す。例えばＧＦＰまたは他の天然に存在する蛍光タンパク質に由来するこれらおよび様々な他の蛍光タンパク質も、本発明において有用である得ることは当業者には理解される。例えば、リピンコット−シュワルツ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：８７頁（２００３年）、およびチャン（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３：９０６−９１８頁（２００２年）を参照されたい。
【００４３】
また本発明において有用な蛍光タンパク質は、真核細胞または組織に由来するサンプルからのバックグラウンド蛍光を低減または除去するために有用であり得る赤色または遠赤色蛍光タンパク質などの長波長の蛍光タンパク質でもよい。このような赤色蛍光タンパク質には、ｄｓＲｅｄ（ＤｓＲｅｄ１またはｄｒＦＰ５８３、マッツ（Ｍａｔｚ）ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：９６９−９７３（１９９９年））、ｄｓＲｅｄ２（テルスキク（Ｔｅｒｓｋｉｋｈ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：７６３３−７６３６頁（２００２年））、Ｔ１（ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州パロアルトのクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ベビス（Ｂｅｖｉｓ）およびグリック（Ｇｌｉｃｋ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：８３−８７頁（２００２年））、およびｄｓＲｅｄ変異体ｍＲＦＰ１（キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：７８７７−７８８２頁（２００２年））を含むが限定はされない、ディスコソマ・ストリアタ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ）タンパク質の天然に存在する形態および遺伝子改変された形態が含まれる。このような赤色蛍光タンパク質にはさらに、ＨｃＲｅｄ（ガルスカヤ（Ｇｕｒｓｋａｙａ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５０７：１６頁（２００１年））などのヘテラクティス・クリスパ（Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ  ｃｒｉｓｐａ）タンパク質の天然に存在する形態および遺伝子改変された形態が含まれる。
【００４４】
タグ付き毒素基質において有用な蛍光タンパク質は、Ａ．ビクトリアおよび他の腔腸海洋生物などの海洋種を含む様々な種のいずれにも由来することができる。有用な蛍光タンパク質は、狭い励起（４９８ｎｍ）および発光（５０９ｎｍ）ピークを有する二量体レニラ・ムレリ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉ）ＧＦＰなどのレニラ・ムレリ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉ）由来の蛍光タンパク質（ピール（Ｐｅｅｌｅ）ら、Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．５０７−５１９頁（２００１年））と、ＤｓＲｅｄタンパク質、例えばａｓＦＰ５９５などのアネモニア・スルカタ（Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａ）蛍光タンパク質（ルキャノフ（Ｌｕｋｙａｎｏｖ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２５８７９−２５８８２頁（２０００年））と、ディスコソマ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）蛍光タンパク質、例えばｄｓＦＰ５９３などのディスコソマ・ストリアタ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ）赤色蛍光タンパク質（フラトコフ（Ｆｒａｄｋｏｖ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４７９：１２７−１３０頁（２０００年））と、ＨｃＲｅｄおよびＨｃＲｅｄ−２Ａなどのヘテラクティス・クリスパ（Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ  ｃｒｉｓｐａ）蛍光タンパク質（ガルスカヤ（Ｇｕｒｓｋａｙａ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５０７：１６−２０頁（２００１年））と、ｅｑＦＰ６１１などの赤色蛍光タンパク質を含むエンタクメアエ・クアドリカラー（Ｅｎｔａｃｍｅａｅ  ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒ）蛍光タンパク質（ビーデンマン（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１１６４６−１１６５１頁（２００２年））とを包含するが、限定はされない。上記の天然に存在する蛍光タンパク質および操作された蛍光タンパク質の相同性の種を含むこれらおよび他の多くの蛍光タンパク質が、本発明の核酸分子によってコードされる組換えタグ付き毒素基質において有用であり得ることは、当業者には理解される。蛍光タンパク質の細菌、哺乳類および他の発現に適した発現ベクターは、ＢＤバイオ・サイエンシーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（カリフォルニア州パロアルト）を含む様々な商業的供給源から入手可能である。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、「蛍光切断産物」という用語は、タグ付き毒素基質の蛍光タンパク質を含有する部分を意味し、この部分は、クロストリジウム毒素切断部位におけるタンパク質分解によって生成される。定義によると、「蛍光切断産物」は、親和性対の第１のパートナーを含まない。
【００４６】
さらに本明細書では、遺伝的にコードされた検出可能なマーカーを含むタグ付き毒素基質が提供される。本明細書で用いられる場合、「遺伝的にコードされた検出可能なマーカー」という用語は、マーカーを含有する基質または切断産物の相対量を容易に決定できるような特性を有するタンパク質を意味する。このような遺伝的にコードされた検出可能なマーカーは、クロストリジウム毒素を含有するサンプルで処理されるタグ付き毒素基質中にマーカーが含まれるときに、検出可能な切断産物を生成する。酵素と、テトラシステインモチーフと、蛍光、生物発光、化学発光および他の発光タンパク質と、ハプテンと、単鎖抗体とを含むがこれらに限定されない様々な遺伝的にコードされた検出可能なマーカーはどれも、本発明において有用である。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、「検出可能な切断産物」という用語は、遺伝的にコードされた検出可能なマーカーを含有する、タグ付き毒素基質の部分を意味し、この部分は、クロストリジウム毒素切断部位におけるタグ付き毒素基質のタンパク質分解によって生成される。
【００４８】
検出可能な切断産物の相対量が、遺伝的にコードされた検出可能なマーカーに適切なシステムまたは装置を用いて決定されることは当業者には理解される。例としては、分光光度計を用いて、遺伝的にコードされた色素生産性のマーカーを含有するタグ付き毒素基質から生成される色素生産性の検出可能な切断産物をアッセイすることができ、蛍光光度計を用いて、遺伝的にコードされた蛍光マーカーを含有するタグ付き毒素基質から生成される蛍光性の検出可能な切断産物をアッセイすることができ、そしてルミノメーターを用いて、遺伝的にコードされた発光マーカーを含有するタグ付き毒素基質から生成される発光性の検出可能な切断産物をアッセイすることができる。
【００４９】
遺伝的にコードされた様々な検出可能なマーカーはどれも、タグ付き毒素基質において有用である。１つの実施形態では、遺伝的にコードされた検出可能なマーカーは、限定はされないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、β−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｕｒｏｎｉｄａｓｅ）（ＧＵＳ）、グルコースオキシダーゼまたはβ−ラクタマーゼなどの酵素である。非限定的な例として、ホースラディッシュペルオキシダーゼを含有する検出可能な切断産物の相対量は、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの色素生産性基質を用いて決定することができ、過酸化水素の存在下で４５０ｎｍにおける吸収を測定することにより検出可能な可溶性産物がもたらされる。検出可能なアルカリホスファターゼ含有切断産物の相対量は、ｐ−ニトロフェニルホスフェートなどの色素生産性基質を用いて決定することができ、４０５ｎｍにおける吸収を測定することによって容易に検出可能な可溶性産物がもたらされる。検出可能なルシフェラーゼ含有切断産物の相対量は、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋および分子酸素の存在下で基質としてルシフェリンを用いて決定することができる（ブロンシュテイン（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：１６９−１８１頁（１９９４年））。そして、検出可能なβ−ガラクトシダーゼ含有切断産物の相対量は、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）などの色素生産性基質を用いて検出することができ、４１０ｎｍにおける吸収を測定することによって検出可能であるか、あるいは例えば１，２−ジオキセタン基質を用いる化学ルミネッセンスによって検出可能な可溶性産物がもたらされる（ブロンシュテインら、上記、１９９４年）。同様に、検出可能なウレアーゼ含有切断産物の相対量は、尿素−ブロモクレゾールパープル（ミズーリ州セントルイスのシグマ・イムノケミカルズ（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））などの基質を用いて決定することができる。そして、検出可能なβ−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｕｒｏｎｉｄａｓｅ）（ＧＵＳ）含有切断産物の相対量は、例えばＸ−Ｇｌｕｃなどのβ−グルクロニド（ｇｌｕｃｏｕｒｏｎｉｄｅ）基質を用いる比色分析アッセイか、例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（４−ＭＵＧ、ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）ら、上記、１９８７年）を用いる蛍光アッセイか、あるいは例えばアダマンチル１，２−ジオキセタンアリールグルクロニド（ｇｌｕｃｏｕｒｏｎｉｄｅ）基質（ブロンシュテインら、上記、１９９４年）を用いる化学発光アッセイで決定することができる。同じようにして、例えば、検出可能なβ−ラクタマーゼ含有切断産物の相対量は、例えば蛍光基質エステルを用いる蛍光アッセイで決定することができる（ズロカルニク（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：８４−８８頁（１９９８年））。また、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、分子生物学におけるカレント・プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・ウィリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、２０００年も参照されたい。
【００５０】
また、タグ付き毒素基質において有用な遺伝的にコードされた検出可能なマーカーは、限定はされないが、蛍光性エクオリア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）、レニラ・ムレリ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉ）、アネモニア・スルカタ（Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａ）、ディスコソマ・ストリアタ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ）、ヘテラクティス・クリスパ（Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ  ｃｒｉｓｐａ）、およびエンタクメアエ・クアドリカラー（Ｅｎｔａｃｍｅａｅ  ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒ）蛍光タンパク質の天然に存在する変異体または遺伝子操作された変異体などの蛍光タンパク質でもよい。本発明において有用な蛍光タンパク質はさらに、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質でもよいが、限定はされない。本発明において有用な様々な蛍光タンパク質は上記に記載されており、さもなければ当該技術分野において既知である。例えば、チャンら、上記、２００２年と、フォーク（Ｆａｌｋ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：３９９−４０４頁（２００２年）と、セルビン（Ｓｅｌｖｉｎ）、上記、２０００年と、マハジャン（Ｍａｈａｊａｎ）ら、上記、１９９９年とを参照されたい。
【００５１】
また、本発明において有用な遺伝的にコードされた検出可能なマーカーは、テトラシステインモチーフでもよい。本発明において有用な例示的なテトラシステインモチーフには、配列Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（配列番号：９９）またはＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（配列番号：１００）が含まれるが、限定はされない。二ヒ素（ｂｉａｒｓｅｎｉｃａｌ）試薬と組み合わせられると、還元されたテトラシステインモチーフは、結合体の各ヒ素原子がモチーフ内のシステイン対と協働的に結合した蛍光複合体を形成する。従って、テトラシステインモチーフ含有切断断片の相対量は、レゾルフィンに基づく赤色標識（ＲｅＡｓＨ−ＥＤＴ２）、フルオレセイン砒素らせん結合剤（ＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２）または二ヒ素（ｂｉａｒｓｅｎｉｃａｌ）タンパク質ＣＨｏＸＡｓＨ−ＥＤＴ２などの二ヒ素タンパク質と組み合わせられたときに蛍光性の共有結合性複合体を形成するその能力によって決定することができる（アダムス（Ａｄａｍｓ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：６０６３−６０７６頁（２００２年）、およびチャンら、上記、２００２年）。これらおよび他の二ヒ素タンパク質は、本発明の方法においてテトラシステインモチーフ含有切断断片の相対量を決定するために有用であることが理解される。
【００５２】
また、本発明において有用な遺伝的にコードされた検出可能なマーカーは、ハプテンまたは単鎖抗体でもよい。以下に開示されるような商業的に入手可能な抗体と合わせて検出可能であり、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｃ−ｍｙｃ、６−ＨＩＳおよびＡＵ１ハプテンを含むがこれらに限定されない様々な遺伝的にコードされたハプテンが当該技術分野において知られている。当該技術分野においてよく知られている手順を用いて、ハプテンを含有する検出可能な切断断片の相対量は、標識化抗ハプテン抗体または標識化二次抗体を用いて決定することができる。非限定的な例として、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、ハプテンを含有する検出可能な切断産物の相対量を決定するために有用であり得る。タグ付き毒素基質が、遺伝的にコードされた検出可能なハプテンであるマーカーを含む場合、このようなハプテンが親和性対の第１および第２のパートナーとは異なるように選択されることは当業者により理解される。さらに、酵素と、テトラシステインモチーフと、蛍光、生物発光、化学発光および他の発光のタンパク質と、ハプテンと、単鎖抗体とを含むがこれらに限定されないこれらおよび様々な他のよく知られた遺伝的にコードされた検出可能なマーカーが、本発明のタグ付き毒素基質において有用であり得ることは当業者により理解される。
【００５３】
ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、親和性対の第１のパートナーを含む。本明細書で用いられる場合、「親和性対（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｕｐｌｅ）」という用語は、安定な非共有結合性の結合を形成することができる第１および第２のパートナーを意味する。本発明において有用な親和性対は、ヒスチジンタグ−金属、結合タンパク質−配位子、ビオチン化配列−ストレプトアビジン、ストレプトアビジン−ビオチン、Ｓペプチド−Ｓタンパク質、抗原−抗体、または受容体−配位子であり得るが、限定はされない。
【００５４】
上記のように、親和性対の第１のパートナーは、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質内に含まれる。特に、ＳＮＡＰ−２５基質は、緑色蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在するＢｏＮＴ／Ａ、／Ｃ１または／Ｅ切断部位を含有する。従って、切断部位におけるタンパク質分解の際、緑色蛍光タンパク質は、親和性対の第１のパートナーを含有するＳＮＡＰ−２５基質の一部分から分離される。同様に、タグ付き毒素基質は、蛍光タンパク質または他の遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、親和性対の第１のパートナーとの間に介在するクロストリジウム毒素切断部位を含有する。従って、タグ付き毒素基質の切断部位におけるタンパク質分解の際、蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーは、親和性対の第１のパートナーを含有するタグ付き毒素基質の一部分から分離される。さらに以下に記載されるように、本発明の方法は、非切断基質と、親和性対の第１のパートナーを含有する処理済サンプルの他の成分とから、蛍光または別の検出可能な切断産物（親和性対の第１のパートナーを欠いている）を分離するために、処理済サンプルを親和性対の第２のパートナーと接触させることによって実施することができる。
【００５５】
ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、クロストリジウム毒素認識配列を含む。本明細書で用いられる場合、「クロストリジウム毒素認識配列」という用語は、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適切な条件下でクロストリジウム毒素によって切断容易な結合における検出可能なタンパク質分解のために十分な近接または非近接の認識エレメントもしくはその両方を有する切断容易な結合を意味する。
【００５６】
ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質において、切断部位は、緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、親和性対の第１のパートナーとの間に「介在する」。従って、切断部位は、緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、親和性対の第１のパートナーとの間に位置するので、切断部位におけるタンパク質分解は、親和性対の第１のパートナーを欠いた蛍光または他の検出可能な切断産物と、親和性対の第１のパートナーを含む基質の残りの部分とをもたらす。クロストリジウム毒素認識配列の全てまたは一部だけが、緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、親和性対の第１のパートナーとの間に介在し得ることは理解される。
【００５７】
ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、親和性対の第１のパートナーとの間に位置するクロストリジウム毒素切断部位を含有する。１つの実施形態では、緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーは切断部位のアミノ末端に位置するが、親和性対の第１のパートナーは切断部位のカルボキシ末端に位置する。もう１つの実施形態では、緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーは切断部位のカルボキシ末端に位置するが、親和性対の第１のパートナーは切断部位のアミノ末端に位置する。
【００５８】
クロストリジウム毒素は、特異的かつ別個の切断部位を切断する。ＢｏＮＴ／ＡはＧｌｎ−Ａｒｇ結合を切断する；ＢｏＮＴ／ＢおよびＴｅＮＴはＧｌｎ−Ｐｈｅ結合を切断する；ＢｏＮＴ／Ｃ１はＬｙｓ−ＡｌａまたはＡｒｇ−Ａｌａ結合を切断する；ＢｏＮＴ／ＤはＬｙｓ−Ｌｅｕ結合を切断する；ＢｏＮＴ／ＥはＡｒｇ−Ｉｌｅ結合を切断する；ＢｏＮＴ／ＦはＧｌｎ−Ｌｙｓ結合を切断する；およびＢｏＮＴ／ＧはＡｌａ−Ａｌａ結合を切断する（表1参照）。標準的命名法において、クロストリジウム毒素切断部位の周辺の配列はＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’と示され、Ｐ１−Ｐ１’が切断容易な結合を表す。Ｐ１またはＰ１’部位、または両方を、天然の残基に代えて別のアミノ酸または模擬アミノ酸に置換できることが理解される。例えば、ＢｏＮＴ／Ａ基質は、Ｐ１位置（Ｇｌｎ）がアラニン、２−アミノ酪酸またはアスパラギン残基に改変され、調製されており、これらの基質は、Ｐ１−Ａｒｇ結合においてＢｏＮＴ／Ａによって加水分解される(Schmidt and Bostian, J. Protein Chem. 16:19-26 (1997))。置換は、切断容易な結合、例えばＢｏＮＴ／Ａの切断容易な結合のＰ１位置に導入することができるが、検出可能なタンパク分解にとってＰ１’残基の保存が通常重要であることは理解される(Vaidyanathan et al., J. Neurochem. 72:327-337 (1999)。従って、特定の態様において本発明は、クロストリジウム毒素によって切断される標的タンパク質の天然の残基と比較してＰ１’残基が改変または置換されていない、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質を提供する。別の態様において本発明は、クロストリジウム毒素によって切断される標的タンパク質の天然の残基と比較してＰ１が改変または置換されている、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質を提供する；そのような基質はＰ１およびＰ１’残基の間のペプチド結合切断に対する感受性を保持している。
【表１】
2008509667.tif 000003
【００５９】
ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰおよびシンタキシンは、αヘリカル構造をとると予想される領域内に位置する短いモチーフを共有する。このモチーフは、本神経毒素に感受性のある動物に発現するＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰおよびシンタキシンアイソフォーム中に存在する。それに対し、これらの神経毒素に対して抵抗性のあるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよび酵母ホモログ、およびエキソサイトーシスに関与しないシンタキシンアイソフォームは、これらＶＡＭＰおよびシンタキシンタンパク質のαヘリカルモチーフ領域中に配列変動を含む。
【００６０】
αヘリカルモチーフの複数の反復が、クロストリジウム毒素による切断に感受性のあるタンパク質に存在する：ＳＮＡＰ−２５において４つのコピーが天然に存在する；ＶＡＭＰにおいて二つのコピーが天然に存在する；およびシンタキシンにおいて二つのコピーが天然に存在する（図４Ａ参照）。さらに、αヘリカルモチーフの特異的配列に相当するペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ およびｉｎ ｖｉｖｏにおいて神経毒性活性を阻害することができ、このようなペプチドは異なる神経毒素を交差阻害することができる。さらに、このようなペプチドに対して作られた抗体は、この三つの標的タンパク質の間で交差反応でき、このことは、このαヘリカルモチーフがタンパク質表面上に露出し、三つの標的タンパク質各々において良く似た構造をとっていることを意味している。これらの知見と一致して、ＳＮＡＰ−２５特異的、ＶＡＭＰ特異的およびシンタキシン特異的神経毒素は、同じ結合部位に対し競合することによって互いに交差阻害する。これらの結果は、クロストリジウム毒素認識配列が、要すれば、αヘリカルモチーフを少なくとも一つ含むことができることを意味する。しかしながら、ＢｏＮＴ／Ａ基質として機能するがαヘリカルモチーフを欠く１６ｍｅｒおよび１７ｍｅｒ基質によって証明されるように、αヘリカルモチーフはクロストリジウム毒素による切断に必ずしも必要ではないことは認識される。
【００６１】
ある態様において本発明は、クロストリジウム毒素認識配列が単一のαヘリカルモチーフを含むＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質を提供する。別の態様において本発明は、クロストリジウム毒素認識配列が二つまたはそれ以上のαヘリカルモチーフを含むＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質を提供する。限定ではなく例示として、ＢｏＮＴ／ＡまたはＢＯＮＴ／Ｅ認識配列は、Ｓ４αヘリカルモチーフを単独で、または一つまたはそれ以上の更なるαヘリカルモチーフと組み合わせて含むことができる；ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢＯＮＴ／Ｇ、およびＴｅＮＴ認識配列は、Ｖ２αヘリカルモチーフを単独で、または一つまたはそれ以上のαヘリカルモチーフと組み合わせて含むことができる；ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列は、Ｓ４αヘリカルモチーフを単独で、または一つまたはそれ以上のαヘリカルモチーフと組み合わせて、またはＸ２αヘリカルモチーフを単独で、または一つまたはそれ以上のαヘリカルモチーフと組み合わせて含むことができる；ＢｏＮＴ／ＤまたはＢｏＮＴ／Ｆ認識配列は、Ｖ１αヘリカルモチーフを単独で、または一つまたはそれ以上のαヘリカルモチーフと組み合わせて含むことができる（図４Ａ参照）。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、「Ａ血清型ボツリヌス毒素認識配列」なる用語は、「ＢｏＮＴ／Ａ認識配列」と同義語であり、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に適した条件下、ＢｏＮＴ／Ａによって切断容易な結合におけるタンパク分解を検出可能とするのに十分な、その切断容易な結合および近接もしくは非近接またはその両方の認識エレメントを意味する。ＢｏＮＴ／Ａによって切断される切断容易な結合は、例えば、Ｇｌｎ−Ａｌａである。
【００６３】
様々なＢｏＮＴ／Ａ認識配列が当業界においてよく知られている。ＢｏＮＴ／Ａ認識配列は、例えば、ヒトＳＮＡＰ−２５の残基１３４−２０６または残基１３７−２０６を有することができる(Ekong et al., 前述, 1997; U.S. Patent No. 5,962,637)。ＢｏＮＴ／Ａ認識配列はまた、配列Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (配列番号： 27)またはその模擬ペプチド（ヒトＳＮＡＰ−２５の残基１９０−２０２に相当）; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (配列番号： 28) またはその模擬ペプチド（ヒトＳＮＡＰ−２５の残基１８７−２０１に相当）; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (配列番号： 29) またはその模擬ペプチド（ヒトＳＮＡＰ−２５の残基１８７−２０２に相当）; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met Leu (配列番号： 30) またはその模擬ペプチド（ヒトＳＮＡＰ−２５の残基１８７−２０３に相当）; Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (配列番号： 31) またはその模擬ペプチド（ヒトＳＮＡＰ−２５の残基１８６−２０２に相当）; またはAsp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (配列番号： 32) またはその模擬ペプチド（ヒトＳＮＡＰ−２５の残基１８６−２０３に相当）を含むことができるが、これらに限定されない。例えば、Schmidt and Bostian, J. Protein Chem. 14:703 708 (1995); Schmidt and Bostian, 前述, 1997; Schmidt et al., FEBS Letters 435:61-64 (1998); and Schmidt and Bostian, U.S. Patent No. 5,965,699)参照。要すれば、近似するＢｏＮＴ／Ａ認識配列は、別のＢｏＮＴ／Ａ感受性ＳＮＡＰ−２５アイソフォームまたはマウス、ラット、ゴールドフィッシュまたはゼブラフィッシュＳＮＡＰ−２５のようなホモログの対応する（相同性ある）セグメントから調製することができ、または、本明細書に開示される、または当業界において（例えばU.S. Patent No. 5,965,699に）記載される、いずれかのペプチドであってよい。
【００６４】
ＢｏＮＴ／Ａ認識配列は、Ａ血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに一致してよく、またはＢｏＮＴ／Ａ感受性タンパク質のセグメントに実質的に近似してもよい。表２に描かれるように、ＢｏＮＴ／Ａによる切断に感受性のある様々な天然タンパク質が当業界において知られており、例えば、ヒト、マウス、およびラットＳＮＡＰ−２５、ゴールドフィッシュＳＮＡＰ−２５ＡおよびＳＮＡＰ−２５Ｂを包含する。従って、本発明のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質に有用なＢｏＮＴ／Ａ認識配列は、例えば、ヒトＳＮＡＰ−２５、マウスＳＮＡＰ−２５、ラットＳＮＡＰ−２５、ゴールドフィッシュＳＮＡＰ−２５Ａまたは２５Ｂ、またはＢｏＮＴ／Ａによる切断に感受性のある別の天然タンパク質の、セグメントと一致してよい。さらに、ＢｏＮＴ／Ａによって切断される本来のＳＮＡＰ−２５アミノ酸配列を比較すると、そのような配列は完全には保存されていないことがわかり（表２および図５参照）、このことは、天然ＢｏＮＴ／Ａ感受性ＳＮＡＰ−２５配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変が本発明のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質において許容されることを意味している。
【表２−１】
2008509667.tif 000004
【表２−２】
2008509667.tif 000005
【００６５】
本発明のＢｏＮＴ／Ａ認識配列を含むＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、ＢｏＮＴ／Ａによって切断される天然配列と比較して、一つまたは複数の改変を有することができる。例えば、ヒトＳＮＡＰ−２５の残基１８７−２０３に相当する１７ｍｅｒと比較して、Ａｓｐ１９３のＡｓｎとの置換により、タンパク分解の相対率が０．２３になる；Ｇｌｕ１９４のＧｌｎとの置換により、相対率は２．０８になる；Ａｌａ１９５の２−アミノ酪酸との置換により、相対率が０．３８となる；そしてＧｌｎ１９７のＡｓｎ、２−アミノ酪酸、またはＡｌａとの置換により、相対率がそれぞれ０．６６、０．２５、または０．１９となる（表３参照）。その上、Ａｌａ１９９と２−アミノ酪酸との置換により、相対率は０．７９となる；Ｔｈｒ２００のＳｅｒまたは２−アミノ酪酸との置換により、相対率はそれぞれ０．２６または１．２０となる；Ｌｙｓ２０１のＡｌａとの置換により、相対率は０．１２になる；そしてＭｅｔ２０２のＡｌａまたはノルロイシンとの置換により、相対率はそれぞれ０．３８または１．２０になる。Schmidt and Bostian, 前述, 1997参照。これらの結果は、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質において、天然の毒素感受性配列と比較して様々な残基が置換可能であることを意味している。ＢｏＮＴ／Ａの場合、これらの結果は、Ｇｌｕ１９４、Ａｌａ１９５、Ｇｌｎ１９７、Ａｌａ１９９、Ｔｈｒ２００およびＭｅｔ２０２、Ｌｅｕ２０３、Ｇｌｙ２０４、Ｓｅｒ２０５、およびＧｌｙ２０６を含む（ただしこれらに限定されない）残基およびＧｌｎ−Ａｒｇの切断容易な結合からもっと離れている残基が、本発明のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質を生産するため置換可能であること、を意味している。このような基質は、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に適した条件下、ＢｏＮＴ／Ａのよって、その切断容易な結合において検出可能にタンパク分解される。つまり、理解されるように、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、要すれば、天然ＳＮＡＰ−２５配列に対する一つまたはいくつかのアミノ酸置換、付加、欠失を含むことができる。ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質はまた、所望によりカルボキシ末端アミドを含むことができる。
【表３】
2008509667.tif 000006
【表４−１】
2008509667.tif 000007
【表４−２】
2008509667.tif 000008
【表４−３】
2008509667.tif 000009
【表５】
2008509667.tif 000010
【００６６】
本明細書で用いる場合、「Ｂ血清型ボツリヌス毒素認識配列」なる用語は、「ＢｏＮＴ／Ｂ認識配列」と同義語であり、適した条件下、ＢｏＮＴ／Ｂによって切断容易な結合におけるタンパク分解を検出可能とするのに十分な、その切断容易な結合および近接または非近接認識エレメントを意味する。ＢｏＮＴ／Ｂによって切断される切断容易な結合は、例えば、Ｇｌｎ−Ｐｈｅである。
【００６７】
様々なＢｏＮＴ／Ｂ認識配列が当業界においてよく知られており、あるいは平凡な方法によって規定できる。そのようなＢｏＮＴ／Ｂ認識配列は、例えば、ヒトＶＡＭＰ−１またはヒトＶＡＭＰ−２のようなＶＡＭＰタンパク質の親水性コアのいくつかまたは全てに相当する配列を含むことができる。ＢｏＮＴ／Ｂ認識配列は、ヒトＶＡＭＰ−２（配列番号：４）の残基３３−９４、残基４５−９４、残基５５−９４、残基６０−９４、残基６５−９４、残基６０−８８または残基６５−８８、またはヒトＶＡＭＰ−１（配列番号９６）の残基６０−９４を含み得るが、これらに限定されない(例えば Shone ら、Eur. J. Biochem. 217: 965-971 (1993) および 米国特許番号5,962,637参照)。要すれば、別のＢｏＮＴ／Ｂ感受性ＶＡＭＰアイソフォームまたはヒトＶＡＭＰ−１またはラットもしくはチキンＶＡＭＰ−２のようなホモログの対応する（相同性ある）セグメントから、近似するＢｏＮＴ／Ｂ認識配列を調製できる。
【００６８】
つまり、ＢｏＮＴ／Ｂ認識配列は、Ｂ血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに一致してよく、またはＢｏＮＴ／Ｂ感受性タンパク質のそのようなセグメントに実質的に近似してもよい。表４に描かれるように、ＢｏＮＴ／Ｂによる切断に感受性のある様々な天然タンパク質が当業界において知られており、例えば、ヒト、マウス、およびウシＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−２、ラットセルブレビン、チキンＶＡＭＰ−２、ＴｏｒｐｅｄｏＶＡＭＰ−１、ウニＶＡＭＰ、Ａｐｌｙｓｉａ ＶＡＭＰ、イカＶＡＭＰ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＶＡＭＰ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｎ−ｓｙｂ、およびヒルＶＡＭＰを含む。つまり、本発明のタグ付き毒素基質に有用なＢｏＮＴ／Ｂ認識配列は、例えば、ヒトＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、マウスＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ウシＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−２、ラットセルブレビン、チキンＶＡＭＰ−２、ＴｏｒｐｅｄｏＶＡＭＰ−１、ウニＶＡＭＰ、ＡｐｌｙｓｉａＶＡＭＰ、イカＶＡＭＰ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＶＡＭＰ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｎ−ｓｙｂ、ヒルＶＡＭＰ、またはＢｏＮＴ／Ｂによる切断に感受性のある別の天然タンパク質の、セグメントと一致してよい。さらに、表４に示すように、ＢｏＮＴ／Ｂによって切断される本来のＶＡＭＰアミノ酸配列を比較すると、そのような配列は完全には保存されていないことがわかり（図６も参照）、このことは、天然ＶＡＭＰ配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変がＢｏＮＴ／Ａ認識配列を含むタグ付き毒素基質において許容されることを意味している。
【００６９】
本明細書で用いる場合、「Ｃ１血清型ボツリヌス毒素認識配列」なる用語は、「ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列」と同義語であり、適した条件下、ＢｏＮＴ／Ｃ１によって切断容易な結合におけるタンパク分解を検出可能とするのに十分な、切断容易な結合および近接または非近接認識エレメントを意味する。ＢｏＮＴ／Ｃ１によって切断される切断容易な結合は、例えば、Ｌｙｓ−ＡｌａまたはＡｒｇ−Ａｌａである。
【００７０】
ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列は、Ｃ１血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに一致してよく、またはＢｏＮＴ／Ｃ１感受性タンパク質のセグメントに実質的に近似してもよい。表５に示されるように、ＢｏＮＴ／Ｃ１による切断に感受性のある様々な天然タンパク質が当業界において知られており、例えば、ヒト、ラット、マウス、およびウシシンタキシン １Ａまたは１Ｂ、ラットシンタキシン２および３、ウニシンタキシン、Ａｐｌｙｓｉａ シンタキシン １、イカシンタキシン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｄｓｙｎｔ1、およびヒルシンタキシン １を含む。つまり、本発明のタグ付き毒素基質に有用なＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列は、例えば、ヒト、ラット、マウス、またはウシシンタキシン １Ａまたは１Ｂ、ラットシンタキシン２、ラットシンタキシン３、ウニシンタキシン、Ａｐｌｙｓｉａ シンタキシン １、イカシンタキシン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｄｓｙｎｔ1、およびヒルシンタキシン １、またはＢｏＮＴ／Ｃ１による切断に感受性のある別の天然タンパク質の、セグメントと一致してよい。さらに、ＢｏＮＴ／Ｃ１によって切断される本来のシンタキシンアミノ酸配列を比較すると、そのような配列は完全には保存されていないことがわかり（表５および図７も参照）、このことは、天然ＢｏＮＴ／Ｃ１感受性シンタキシン配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変がＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列を含むタグ付き毒素基質において許容されることを意味している。
【００７１】
様々な天然ＳＮＡＰ−２５タンパク質もまたＢｏＮＴ／Ｃ１による切断に感受性があり、それには、ヒト、マウス、およびラットＳＮＡＰ−２５、ゴールドフィッシュＳＮＡＰ−２５Ａおよび２５Ｂ、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよひヒルＳＮＡＰ−２５が含まれる。従って、本発明のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質に有用なＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列は、例えば、ヒト、マウス、またはラットＳＮＡＰ−２５、ゴールドフィッシュＳＮＡＰ−２５Ａまたは２５Ｂ、ＴｏｒｐｅｄｏＳＮＡＰ−２５、ゼブラフィッシュＳＮＡＰ−２５、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、ヒルＳＮＡＰ−２５またはＢｏＮＴ／Ｃ１による切断に感受性のある別の天然タンパク質の、セグメントと一致してよい。天然シンタキシン配列の変異体に関して前述されているように、ＢｏＮＴ／Ｃ１によって切断される本来のＳＮＡＰ−２５アミノ酸配列と比較すると、顕著な配列変動性があることがわかり（表２および図５も参照）、このことは、天然ＳＮＡＰ−２５配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変が本発明のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質において許容されることを意味している。
【００７２】
「Ｄ血清型ボツリヌス毒素認識配列」なる用語は、「ＢｏＮＴ／Ｄ認識配列」と同義語であり、適した条件下、ＢｏＮＴ／Ｄによって切断容易な結合におけるタンパク分解を検出可能とするのに十分な、切断容易な結合および近接もしくは非近接またはその両方の認識エレメントを意味する。ＢｏＮＴ／Ｄによって切断される切断容易な結合は、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｅｕである。
【００７３】
様々なＢｏＮＴ／Ｄ認識配列が当業界でよく知られており、あるいは平凡な方法で規定できる。ＢｏＮＴ／Ｄ認識配列は、例えばラットＶＡＭＰ−２（配列番号：７、Yamasaki ら、J. Biol. Chem. 269:12764 12772 (1994)）の残基２７−１１６、残基３７−１１６、残基１−８６、残基１−７６または残基１−６９を含むことができる。従って、ＢｏＮＴ／Ｄ認識配列は、例えばラットＶＡＭＰ−２（配列番号：７）の残基２７−６９または残基３７−６９を含むことができる。要すれば、別のＢｏＮＴ／Ｄ感受性ＶＡＭＰアイソフォームまたはヒトＶＡＭＰ−１またはヒトＶＡＭＰ−２のようなホモログの、対応する（相同性ある）セグメントから、近似のＢｏＮＴ／Ｄ認識配列を調製できる。
【００７４】
ＢｏＮＴ／Ｄ認識配列は、Ｄ血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに一致してよく、またはＢｏＮＴ／Ｄ感受性タンパク質のセグメントに実質的に近似してもよい。表５に示されるように、ＢｏＮＴ／Ｄによる切断に感受性のある様々な天然タンパク質が当業界において知られており、例えば、ヒト、マウス、およびウシＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２、ラットセルブレビン、チキンＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＶＡＭＰ−１、Ａｐｌｙｓｉａ ＶＡＭＰ、イカＶＡＭＰ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｙｂおよびｎ−ｓｙｂおよびヒルＶＡＭＰを含む。つまり、本発明のタグ付き毒素基質に有用なＢｏＮＴ／Ｄ認識配列は、例えば、ヒトＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、マウスＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ウシＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ラットセルブレビン、チキンＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＶＡＭＰ−１、ＡｐｌｙｓｉａＶＡＭＰ、イカＶＡＭＰ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｙｂまたはｎ−ｓｙｂ、ヒルＶＡＭＰ、またはＢｏＮＴ／Ｄによる切断に感受性のある別の天然タンパク質の、セグメントと一致してよい。さらに、上記表５に示されるように、ＢｏＮＴ／Ｄによって切断される本来のＶＡＭＰアミノ酸配列の比較により、顕著な配列変動性が明らかとなり（図６も参照）、このことは、天然ＢｏＮＴ／Ｄ感受性ＶＡＭＰ配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変が本発明のタグ付き毒素基質において許容されることを意味している。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「Ｅ血清型ボツリヌス毒素認識配列」なる用語は、「ＢｏＮＴ／Ｅ認識配列」と同義語であり、適した条件下、ＢｏＮＴ／Ｅによって切断容易な結合におけるタンパク分解を検出可能とするのに十分な、切断容易な結合および近接または非近接認識エレメントを意味する。ＢｏＮＴ／Ｅによって切断される切断容易な結合は、例えば、Ａｒｇ−Ｉｌｅである。
【００７６】
当業者は、ＢｏＮＴ／Ｅ認識配列が、Ｅ血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに一致してよく、またはＢｏＮＴ／Ｅ感受性タンパク質のセグメントに実質的に近似してもよいことを認識している。ＢｏＮＴ／Ｅによる切断に感受性のある様々な天然タンパク質が当業界で知られており、例えば、ヒト、マウスおよびラットＳＮＡＰ−２５、マウスＳＮＡＰ−２３、チキンＳＮＡＰ−２５、ゴールドフィッシュＳＮＡＰ−２５ＡおよびＳＮＡＰ−２５Ｂ、ゼブラフィッシュＳＮＡＰ−２５、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＳＮＡＰ−２５およびヒルＳＮＡＰ−２５（表２参照）が含まれる。つまり、本発明のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質に有用なＢｏＮＴ／Ｅ認識配列は、例えば、ヒトＳＮＡＰ−２５、マウスＳＮＡＰ−２５、ラットＳＮＡＰ−２５、マウスＳＮＡＰ−２３、チキンＳＮＡＰ−２５、ゴールドフィッシュＳＮＡＰ−２５ＡまたはＳＮＡＰ−２５Ｂ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＳＮＡＰ−２５、ヒルＳＮＡＰ−２５、またはＢｏＮＴ／Ｅによる切断に感受性のある別の天然タンパク質の、セグメントと一致してよい。さらに、上記表２および図５に示されるように、ＢｏＮＴ／Ｅによって切断される本来のＳＮＡＰ−２３およびＳＮＡＰ−２５のアミノ酸配列を比較すると、そのような配列は完全には保存されていないことがわかり、このことは、天然ＢｏＮＴ／Ｅ感受性ＳＮＡＰ−２３またはＳＮＡＰ−２５配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変が本発明のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質において許容されることを意味している。
【００７７】
本明細書で用いる場合「Ｆ血清型ボツリヌス毒素認識配列」なる用語は、「ＢｏＮＴ／Ｆ認識配列」と同義語であり、適した条件下、ＢｏＮＴ／Ｆによって切断容易な結合におけるタンパク分解を検出可能とするのに十分な、切断容易な結合および近接または非近接認識エレメントを意味する。ＢｏＮＴ／Ｆによって切断される切断容易な結合は、例えば、Ｇｌｎ−Ｌｙｓである。
【００７８】
様々なＢｏＮＴ／Ｆ認識配列が当業界でよく知られており、あるいは平凡な方法で規定できる。ＢｏＮＴ／Ｆ認識配列は、例えばラットＶＡＭＰ−２（配列番号：７、Yamasaki et al., 前述, 1994）の残基２７−１１６、残基３７−１１６、残基１−８６、残基１−７６または残基１−６９を含むことができる。ＢｏＮＴ／Ｆ認識配列はまた、例えばラットＶＡＭＰ−２（配列番号：７）の残基２７−６９または残基３７−６９残基を含むことができる。近似のＢｏＮＴ／Ｆ認識配列は、要すれば、別のＢｏＮＴ／Ｆ感受性ＶＡＭＰアイソフォームまたはヒトＶＡＭＰ−１またはヒトＶＡＭＰ−２のようなホモログの、対応する（相同性ある）セグメントから調製できることは理解される。
【００７９】
ＢｏＮＴ／Ｆ認識配列は、Ｆ血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに一致してよく、またはＢｏＮＴ／Ｆ感受性タンパク質のセグメントに実質的に近似してもよい。ＢｏＮＴ／Ｆによる切断に感受性のある様々な天然タンパク質が当業界において知られており、例えば、ヒト、マウス、およびウシＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２、ラットセルブレビン、チキンＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＶＡＭＰ−１、Ａｐｌｙｓｉａ ＶＡＭＰ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｙｂおよびヒルＶＡＭＰを含む（表５参照）。つまり、本発明のタグ付き毒素基質に有用なＢｏＮＴ／Ｆ認識配列は、例えば、ヒトＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、マウスＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ウシＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ラットセルブレビン、チキンＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＶＡＭＰ−１、Ａｐｌｙｓｉａ ＶＡＭＰ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｙｂ、ヒルＶＡＭＰ、またはＢｏＮＴ／Ｆによる切断に感受性のある別の天然タンパク質の、セグメントと一致してよい。さらに、上記表５に示されるように、ＢｏＮＴ／Ｆによって切断される本来のＶＡＭＰアミノ酸配列を比較すると、そのような配列は完全には保存されておらず（図６も参照）、このことは、天然ＢｏＮＴ／Ｆ感受性ＶＡＭＰ配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変がＢｏＮＴ／Ｆ認識配列を含むタグ付き毒素基質において許容されることを意味している。
【００８０】
本明細書で用いる場合「Ｇ血清型ボツリヌス毒素認識配列」なる用語は、「ＢｏＮＴ／Ｇ認識配列」と同義語であり、適した条件下、ＢｏＮＴ／Ｇによって切断容易な結合におけるタンパク分解を検出可能とするのに十分な、切断容易な結合および近接もしくは非近接またはその両方の認識エレメントを意味する。ＢｏＮＴ／Ｇによって切断される切断容易な結合は、例えば、Ａｌａ−Ａｌａである。
【００８１】
ＢｏＮＴ／Ｇ認識配列は、Ｇ血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに一致してよく、またはそのようなＢｏＮＴ／Ｇ感受性セグメントに実質的に近似してもよい。上記表５に示されるように、ＢｏＮＴ／Ｇによる切断に感受性のある様々な天然タンパク質が当業界において知られており、例えば、ヒト、マウス、およびウシＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２、ラットセルブレビン、チキンＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＶＡＭＰ−１、を含む。従って、本発明のタグ付き毒素基質に有用なＢｏＮＴ／Ｇ認識配列は、例えば、ヒトＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、マウスＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ウシＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ラットセルブレビン、チキンＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＶＡＭＰ−１、またはＢｏＮＴ／Ｇによる切断に感受性のある別の天然タンパク質の、セグメントと一致してよい。さらに、上記表５に示されるように、ＢｏＮＴ／Ｇによって切断される本来のＶＡＭＰアミノ酸配列を比較すると、そのような配列は完全には保存されておらず（図６も参照）、このことは、天然ＢｏＮＴ／Ｇ感受性ＶＡＭＰ配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変がＢｏＮＴ／Ｇ認識配列を含むタグ付き毒素基質において許容されることを意味している。
【００８２】
「破傷風毒素認識配列」なる用語は、適した条件下、破傷風毒素によって切断容易な結合におけるタンパク分解を検出可能とするのに十分な、切断容易な結合および近接または非近接認識エレメントを意味する。ＴｅＮＴによって切断される切断容易な結合は、例えば、Ｇｌｎ−Ｐｈｅであり得る。
【００８３】
様々なＴｅＮＴ認識配列が当業界でよく知られており、あるいは平凡な方法で規定でき、ヒトＶＡＭＰ−１またはヒトＶＡＭＰ−２のようなＶＡＭＰタンパク質の親水性コアのいくつかまたは全てに相当する配列を含む。ＴｅＮＴ認識配列は、例えばヒトＶＡＭＰ−２（配列番号：４、Cornille ら、Eur. J. Biochem. 222:173-181 (1994); Foranら、Biochem. 33: 15365-15374 (1994)）の残基３３−９４、ラットＶＡＭＰ−２（配列番号：７、Yamasaki et al., 前述, 1994）の残基５１−９３または残基１−８９、またはヒトＶＡＭＰ−１（配列番号９６）の残基３３−９４を含むことができる。ＴｅＮＴ認識配列はまた、例えばヒトＶＡＭＰ−２（配列番号：４）の残基２５−８６、残基３３−８６、または残基５１−８６を含むことができる。近似のＴｅＮＴ認識配列は、要すれば、別のＴｅＮＴ感受性ＶＡＭＰアイソフォームまたはヒトＶＡＭＰ−１またはウニまたはＡｐｌｙｓｉａ ＶＡＭＰのようなホモログの、対応する（相同性ある）セグメントから調製できることは理解される。
【００８４】
つまり、ＴｅＮＴ認識配列は、破傷風毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに一致してよく、またはＴｅＮＴ感受性タンパク質のセグメントに実質的に近似してもよい。上記表５に示されるように、ＴｅＮＴによる切断に感受性のある様々な天然タンパク質が当業界において知られており、例えば、ヒト、マウス、およびウシＶＡＭＰ−１およびＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−２、ラットセルブレビン、チキンＶＡＭＰ−２、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＶＡＭＰ−１、ウニＶＡＭＰ、Ａｐｌｙｓｉａ ＶＡＭＰ、イカＶＡＭＰ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＶＡＭＰ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｎ−ｓｙｂおよびヒルＶＡＭＰを含む。従って、本発明のタグ付き毒素基質に有用なＴｅＮＴ認識配列は、例えば、ヒトＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、マウスＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ウシＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、ラットＶＡＭＰ−２、ラットセルブレビン、チキンＶＡＭＰ−２、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＶＡＭＰ−１、ウニＶＡＭＰ、Ａｐｌｙｓｉａ ＶＡＭＰ、イカＶＡＭＰ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＶＡＭＰ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｎ−ｓｙｂ、ヒルＶＡＭＰまたはＴｅＮＴによる切断に感受性のある別の天然タンパク質のセグメントと一致してよい。さらに、ＴｅＮＴによって切断される本来のＶＡＭＰアミノ酸配列を比較すると、そのような配列は完全には保存されていないことがわかり（表５および図６）、このことは、天然ＴｅＮＴ感受性ＶＡＭＰ配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変がＴｅＮＴ認識配列を含むタグ付き毒素基質において許容されることを意味している。
【００８５】
上記のことを考慮して、ＳＮＡＰ−２５基質内に含まれる「ＳＮＡＰ−２５の一部分」、またはタグ付き毒素基質内に含まれる「クロストリジウム毒素認識配列」が、全長のＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰまたはシンタキシンよりも短いＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰまたはシンタキシンのセグメントに相当し得ることは明らかである。特定の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ認識配列は、最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０のＳＮＡＰ−２５の連続残基と相同性であり、ここで連続残基は、切断部位Ｇｌｎ−Ａｒｇを含む。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ認識配列は、ヒトＳＮＡＰ−２５（配列番号：２）または別のＳＮＡＰ−２５の最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０の連続残基と、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有することができ、ここで連続残基は、切断部位Ｇｌｎ−Ａｒｇを含む。
【００８６】
その他の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ｂ認識配列は、最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０のＶＡＭＰの連続残基と相同性であり、ここで連続残基は、切断部位Ｇｌｎ−Ｐｈｅを含む。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ｂ認識配列は、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号：９６）またはヒトＶＡＭＰ−２（配列番号：４）または別のＶＡＭＰの最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０の連続残基と、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有することができ、ここで連続残基は、切断部位Ｇｌｎ−Ｐｈｅを含む。
【００８７】
さらなる実施形態では、ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列は、最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０のシンタキシンの連続残基と相同性であり、ここで連続残基は、切断部位Ｌｙｓ−Ａｌａを含む。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列は、ヒトシンタキシン１Ａ（配列番号：２１）またはヒトシンタキシン−１Ｂまたは別のシンタキシンの最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０の連続残基と、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有することができ、ここで連続残基は、切断部位Ｌｙｓ−Ａｌａを含む。
【００８８】
またさらなる実施形態では、ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列は、最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０のＳＮＡＰ−２５の連続残基と相同性であり、ここで連続残基は、切断部位Ａｒｇ−Ａｌａを含む。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列は、ヒトＳＮＡＰ−２５（配列番号：２）または別のＳＮＡＰ−２５の最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０の連続残基と、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有することができ、ここで連続残基は、切断部位Ａｒｇ−Ａｌａを含む。
【００８９】
さらなる実施形態では、ＢｏＮＴ／Ｄ認識配列は、最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０のＶＡＭＰの連続残基と相同性であり、ここで連続残基は、切断部位Ｌｙｓ−Ｌｅｕを含む。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ｄ認識配列は、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号：９６）またはヒトＶＡＭＰ−２（配列番号：４）または別のＶＡＭＰの最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０の連続残基と、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有することができ、ここで連続残基は、切断部位Ｌｙｓ−Ｌｅｕを含む。
【００９０】
その他の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ｅ認識配列は、最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０のＳＮＡＰ−２５の連続残基と相同性であり、ここで連続残基は、切断部位Ａｒｇ−Ｉｌｅを含む。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ｅ認識配列は、ヒトＳＮＡＰ−２５（配列番号：２）または別のＳＮＡＰ−２５の最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０の連続残基と、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有することができ、ここで連続残基は、切断部位Ａｒｇ−Ｉｌｅを含む。
【００９１】
さらなる実施形態では、ＢｏＮＴ／Ｆ認識配列は、最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０のＶＡＭＰの連続残基と相同性であり、ここで連続残基は、切断部位Ｇｌｎ−Ｌｙｓを含む。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ｆ認識配列は、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号：９６）またはヒトＶＡＭＰ−２（配列番号：４）または別のＶＡＭＰの最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０の連続残基と、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有することができ、ここで連続残基は、切断部位Ｇｌｎ−Ｌｙｓを含む。
【００９２】
またさらなる実施形態では、ＢｏＮＴ／Ｇ認識配列は、最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０のＶＡＭＰの連続残基と相同性であり、ここで連続残基は、切断部位Ａｌａ−Ａｌａを含む。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ｇ認識配列は、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号：９６）またはヒトＶＡＭＰ−２（配列番号：４）または別のＶＡＭＰの最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０の連続残基と、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有することができ、ここで連続残基は、切断部位Ａｌａ−Ａｌａを含む。
【００９３】
またさらなる実施形態では、ＴｅＮＴ認識配列は、最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０のＶＡＭＰの連続残基と相同性であり、ここで連続残基は、切断部位Ｇｌｎ−Ｐｈｅを含む。非限定的な例として、ＴｅＮＴ認識配列は、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号：９６）またはヒトＶＡＭＰ−２（配列番号：４）または別のＶＡＭＰの最大でも１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、４０、２０または１０の連続残基と、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有することができ、ここで連続残基は、切断部位Ｇｌｎ−Ｐｈｅを含む。
【００９４】
もう１つの実施形態では、クロストリジウム毒素認識配列は、米国特許第７，７６２，２８０号明細書に記載される基質配列以外の配列である。さらなる実施形態では、クロストリジウム毒素認識配列は、ＳＮＲＴＲＩＤＥＡＮＱＲＡＴＲＭＬＧ（配列番号：１０９）、ＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＱＡＧＡＳＱＦＥＴＳＡＡＫＬＫＲＫＹＷＷＫＮＬＫ（配列番号：１１０）、ＡＱＶＤＥＶＶＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲ  ＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＱＡＧＡＳ（配列番号：１１１）、ＮＫＬＫＳＳＤＡＹＫＫＡＷＧＮ  ＮＱＤＧＶＶＡＳＱＰＡＲＶＶＤＥＲＥＱＭＡＩＳＧＧＦＩＲＲＶＴＮＤＡＲＥＮＥＭＤＥＮＬＥＱＶＳＧＩＩＧＮＬＲＨ  ＭＡＬＤＭＧＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲＩＭＥＫＡＤＳＮＫＴＲＩＤＥＡＮＱＲＡＴＫＭＬＧＳＧ（配列番号：１１２）、またはＮＫＬＫＳＳＤＡＹＫＫＡＷＧＮＮＱＤＧＶＶＡＳＱＰＡＲＶＶＤＥＲＥＱＭＡ  ＩＳＧＧＦＩＲＲＶＴＮＤＡＲＥＮＥＭＤＥＮＬＥＱＶＳＧＩＩＧＮＬＲＨＭＡＬＤＭＧＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲＩＭＥＫＡＤＳＮＫＴＲＩ  ＤＥＡＮＱＡＡＴＫＭＬＧＳＧ（配列番号：１１３）以外の配列である。
【００９５】
またＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、同一または異なるクロストリジウム毒素に対して１つまたは多数のクロストリジウム毒素切断部位を含有することができる。１つの実施形態では、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、単一の切断部位を含有する。もう１つの実施形態では、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、同じクロストリジウム毒素に対して多数の切断部位を有する。これらの切断部位は、同一または異なるクロストリジウム毒素認識配列内に取り込むことができる。さらなる実施形態では、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、同じ緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、親和性対の第１のパートナーとの間に介在する同じクロストリジウム毒素に対する多数の切断部位を有する。ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、同一または異なる緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、親和性対の第１のパートナーとの間に介在する、例えば、２つ以上、３つ以上、５つ以上、７つ以上、８つ以上、または１０以上の、同じクロストリジウム毒素に対する切断部位を含有することができる。またＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、同一または異なる緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、親和性対の第１のパートナーとの間に介在する、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の、同じクロストリジウム毒素に対する切断部位を有することができる。
【００９６】
またＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、異なるクロストリジウム毒素に対して多数の切断部位を含有することができる。１つの実施形態では、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、同じ緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、親和性対の第１のパートナーとの間に全てが介在する、異なるクロストリジウム毒素に対する多数の切断部位を含む。ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、同じ緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、親和性対の第１のパートナーとの間に全てが介在する、例えば、２つ以上、３つ以上、５つ以上、または１０以上の、異なるクロストリジウム毒素に対する切断部位を含有することができる。またＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、緑色蛍光タンパク質または蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカー、および親和性対の第１のパートナーの少なくとも２つの異なるペアの間に介在する、例えば、２つ以上、３つ以上、５つ以上、または１０以上の、異なるクロストリジウム毒素に対する切断部位を含有することができる。特定の実施形態では、クロストリジウム基質は、異なるクロストリジウム毒素に対する２、３、４、５、６、７、８、９または１０の切断部位を有し、切断部位は、緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカー、および親和性対の第１のパートナーの同一または異なるペアの間に介在する。多数の切断部位を有するＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、以下のクロストリジウム毒素：ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／ＧおよびＴｅＮＴの任意の組み合わせに対して、２、３、４、５、６、７または８の切断部位の任意の組み合わせを有し得ることが理解される。
【００９７】
緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカー、親和性対の第１のパートナー、およびクロストリジウム毒素認識配列に加えて、ＳＮＡＰ−２５基質またはタグ付き毒素基質は、所望される場合には１つまたは複数のさらなる成分を含み得ることが理解される。一例として、本発明のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質には、ＧＧＧＧＳ（配列番号：８４）などのフレキシブルスペーサー配列が含まれ得る。ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質はさらに、以下の：カルボキシ末端システイン残渣、免疫グロブリンヒンジ領域、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドリンカー、ペプチドまたはペプチド模倣ヘアピンターン、親水性配列、もしくはＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の溶解性または安定性を促進する別の成分または配列のうちの１つまたは複数を含むことができるが、限定はされない。
【００９８】
さらに、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰまたはシンタキシンタンパク質に関して、あるいは蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーまたは親和性対の第１のパートナーを含有しない同様のペプチドまたはペプチド模倣物に関して、低減または増大された速度で切断可能である。ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／ＧまたはＴｅＮＴ基質などのＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、例えば、ヒトＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰまたはシンタキシンの、それ以外は同一条件下における初期加水分解速度の少なくとも５％である初期加水分解速度で切断することができ、ここでＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質、およびＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰまたはシンタキシンはそれぞれ、１６μＭの濃度で存在する。
【００９９】
ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質がＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／Ｅ認識配列を含む場合には、基質は、例えば、それぞれＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／ＥによるヒトＳＮＡＰ−２５の、それ以外は同一条件下における初期加水分解速度の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、または３００％である初期加水分解速度で切断することができ、ここで基質およびヒトＳＮＡＰ−２５はそれぞれ、１６μＭの濃度で存在する。その他の実施形態では、このような基質は、それぞれＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／ＥによるヒトＳＮＡＰ−２５の、それ以外は同一条件下における初期加水分解速度の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、または３００％である初期加水分解速度で切断され、ここでＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質、およびヒトＳＮＡＰ−２５はそれぞれ、２００μＭの濃度で存在する。
【０１００】
同様に、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質がＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＦまたはＢｏＮＴ／Ｇ認識配列を含む場合には、基質は、例えば、それぞれＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＦまたはＢｏＮＴ／ＧによるヒトＶＡＭＰ−２の、それ以外は同一条件下における初期加水分解速度の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、または３００％である初期加水分解速度で切断することができ、ここで本発明の基質およびヒトＶＡＭＰ−２はそれぞれ、１６μＭの濃度で存在する。その他の実施形態では、このような基質は、それぞれＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＦまたはＢｏＮＴ／ＧによるヒトＶＡＭＰ−２の、それ以外は同一条件下における初期加水分解速度の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、または３００％である初期加水分解速度で切断され、ここでＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質、およびヒトＶＡＭＰ−２はそれぞれ、２００μＭの濃度で存在する。
【０１０１】
タグ付き毒素基質がＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列を含む場合には、基質は、ＢｏＮＴ／Ｃ１によるヒトシンタキシンの、それ以外は同一条件下における初期加水分解速度の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、または３００％である初期加水分解速度で切断することができ、ここでタグ付き毒素基質およびヒトシンタキシンはそれぞれ、１６μＭの濃度で存在する。その他の実施形態では、このような基質は、ＢｏＮＴ／Ｃ１によるヒトシンタキシンの、それ以外は同一条件下における初期加水分解速度の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、または３００％である初期加水分解速度で切断され、ここでタグ付き毒素基質およびヒトシンタキシンはそれぞれ、２００μＭの濃度で存在する。
【０１０２】
「ターンオーバー数」という用語またはｋｃａｔは、毒素−基質複合体の分解の速度である。ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、同じ条件下で同じクロストリジウム毒素で切断される場合のヒトＳＮＡＰ−２５、ヒトＶＡＭＰ−２またはヒトシンタキシン標的タンパク質のｋｃａｔと比較して低減または増大されたｋｃａｔで切断することができる。ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、例えば、約０．００１〜約４０００秒−１のｋｃａｔで切断することができる。１つの実施形態では、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、約１〜約４０００秒−１のｋｃａｔで切断される。その他の実施形態では、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、５秒−１、１０秒−１、２５秒−１、５０秒−１、１００秒−１、２５０秒−１、５００秒−１、または１０００秒−１よりも小さいｋｃａｔを有する。またＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、例えば、１〜１０００秒−１、１〜５００秒−１、１〜２５０秒−１、１〜１００秒−１、１〜５０秒−１、１０〜１０００秒−１、１０〜５００秒−１、１０〜２５０秒−１、１０〜１００秒−１、１０〜５０秒−１、２５〜１０００秒−１、２５〜５００秒−１、２５〜２５０秒−１、２５〜１００秒−１、２５〜５０秒−１、５０〜１０００秒−１、５０〜５００秒−１、５０〜２５０秒−１、５０〜１００秒−１、１００〜１０００秒−１、１００〜５００秒−１、または１００〜２５０秒−１の範囲のｋｃａｔを有することができる。ターンオーバー数、ｋｃａｔが過剰の基質が存在する標準の定常状態の条件下でアッセイされることは当業者には理解される。
【０１０３】
ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質における緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカー、および親和性対の第１のパートナーの選択および配置の際には、いくつかの考慮すべき事項があることは、当業者には理解される。これらの要素は通常、クロストリジウム毒素への基質の結合、またはクロストリジウム毒素によるタンパク質分解に対する妨害を最小限にするように配置される。従って、緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカー、および親和性対の第１のパートナーは、例えば、結合のために重要な結合相互作用および非結合相互作用の破壊を最小限にするように、そして立体障害を最小限にするように選択および配置することができる。
【０１０４】
ＶＡＭＰ基質およびＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖（ＬＣ／Ｂ）の複合体において、水素結合アクセプターまたはドナーを含有する側鎖を有するほぼ全てのＶＡＭＰ残基は、ＬＣ／Ｂと水素結合された。従って、所望される場合には、毒素による切断に敏感な未変性タンパク質における水素結合の可能性と比較して、例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎ残基による水素結合の可能性が基質において減少されずに、本発明のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質を調製可能であることが理解される。従って、特定の実施形態では、本発明は、対応するボツリヌス毒素または破傷風毒素による切断に敏感な未変性タンパク質と比較して、水素結合の可能性が基質において減少されないＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質を提供する。
【０１０５】
また本発明は、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定するためのキットも提供する。キットは、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質をバイアルまたは他の容器中に含有する。キットは一般に使用説明書も含む。１つの実施形態では、本発明のキットはさらに、ポジティブコントロールとして、限定はされないが組換え毒素軽鎖などの、キット内に含まれるＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質を切断することができる既知の量のボツリヌス毒素または破傷風毒素を含む。もう１つの実施形態では、キットはＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質を含有し、そしてさらに、ポジティブコントロールとして蛍光または他の方法で検出可能な切断産物を含む。本発明のキットは、任意に、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適したバッファーを有する容器を含んでもよい。上記のように、本発明の方法は、タグ付き毒素基質の組み合わせと共に実施することができる。従って、１つの実施形態では、本発明は、少なくとも２つの異なるタグ付き毒素基質を含む、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定するためのキットを提供する。
【０１０６】
さらに、本明細書では、（ａ）サンプル中にクロストリジウム毒素が存在するときに蛍光切断産物が生成されるように、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件下の溶液相中で、（ｉ）蛍光タンパク質と、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列と、を含有するタグ付き毒素基質をサンプルで処理することと、（ｂ）処理済サンプルを親和性対の第２のパートナーと接触させ、それにより親和性対の第１および第２のパートナーを含有する安定な複合体を形成することと、（ｃ）処理済サンプル中の蛍光切断産物の存在または量をアッセイし、それによりクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定することとによって、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定する方法が提供される。１つの実施形態では、本発明の方法は、蛍光切断産物の存在または量をアッセイする前に、安定な複合体から蛍光切断産物を分離することによって実施される。緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質を含むが限定はされない様々な蛍光タンパク質が、本発明の方法において有用であり得る。１つの実施形態では、本発明の方法は、緑色蛍光タンパク質を含有するタグ付き毒素基質を用いて実施される。本発明の方法において有用な親和性対の第１のパートナーは、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化配列、ストレプトアビジン、Ｓペプチド、Ｓタンパク質、もしくはＦＬＡＧ、赤血球凝集素、ｃ−ｍｙｃまたはＡＵ１エピトープなどのエピトープを包含するが、これらに限定されない。
【０１０７】
本発明の方法は、様々などんなサンプル中のクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定するためにも有用であり得る。このようなサンプルには、清澄化および他の未精製細胞ライセート、未変性および組換えの単離クロストリジウム毒素、単離クロストリジウム毒素軽鎖、ＢＯＴＯＸなどの処方クロストリジウム毒素製品、ならびに生の、調理済み、半調理済み、そして加工された食料および飲料を含む食品が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明の方法では、タグ付き毒素基質は、溶液相中でサンプルにより処理される。タグ付き毒素基質に関して本明細書で用いられる場合、「溶液相中」という用語は、基質が可溶性であり、ビーズ、カラムまたは皿などの固体支持体に拘束または固定化されていないことを意味する。
【０１０９】
本明細書で用いる場合、「試料」なる用語は、活性クロストリジウム毒素、または軽鎖あるいはそのタンパク分解活性フラグメントを含む、または含む可能性のある、生物学的物質を意味する。従って、試料なる用語は、精製または半精製クロストリジウム毒素；天然または非天然配列を有する組換え単鎖または二鎖毒素；複数のクロストリジウム毒素種またはサブタイプに由来する構造エレメントを含むキメラ毒素；天然または非天然配列を有する組換え毒素軽鎖；バルク毒素；製剤化製品；細胞、または未精製、分画化または半精製細胞溶解物であって、例えば限定ではないが、クロストリジウム毒素またはその軽鎖をコードする組換え核酸を含むように設計された動物、昆虫、細菌その他の細胞；細菌、バキュロウィルスおよび酵母溶解物；生、調理済、半調理済または加工済食物；飲物；動物飼料；土壌試料；水試料； 池堆積物；ローション；化粧品；および臨床製剤を包含するが、これらに限定されない。さらに、試料なる用語は組織試料を包含し、それは哺乳類試料、および霊長類およびヒト試料（これらに限定されない）を含み、またさらに、例えば幼児腸試料のような腸試料および傷から得られた試料を包含することが理解される。従って本発明の方法は、限定はされないが、以下ものに有用であり得ることが理解される：食物または飲物中のクロストリジウム毒素プロテアーゼ活性のアッセイ；ヒトまたは動物（例えば、クロストリジウム毒素にさらされたもの、または１つまたはそれ以上のクロストリジウム毒性症状を有するもの）由来の試料のアッセイ；クロストリジウム毒素の生産および精製中の活性の追跡、あるいは製剤化クロストリジウム毒素製品（医薬品および化粧品を含む）のアッセイ。
【０１１０】
本発明の方法は、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性を有するいずれのタンパク質または分子をアッセイするのにも適しており、例えばクロストリジウム毒素の神経細胞に結合する能力、または膜を越えて取り込まれる、あるいは転位される能力に依存しないことを当業者は理解している。従って、本発明の方法は、クロストリジウム毒素軽鎖単独のクロストリジウム毒素プロテアーゼ活性のアッセイにも適しており、また、単鎖または二鎖ヘテロ毒素のアッセイに有用であるが、重鎖の存在は必要としない。さらに、本発明の方法は、本来の、および組換えクロストリジウム毒素（例えば膵臓腺房細胞または他の非神経細胞を標的とするよう設計されたクロストリジウム毒素）を含む、非神経クロストリジウム毒素に適用可能である。
【０１１１】
アッセイされるクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に応じて、本発明の方法に含まれるタグ付き毒素基質は、様々なクロストリジウム毒素認識配列のうちの１つを取り込み得る。本発明の方法は、例えば、限定はされないが配列番号：９０の残基１３４−２０６またはＳＮＡＰ−２５の別の部分などのボツリヌス毒素認識配列と共に実施することができる。また本発明の方法は、例えば、限定はされないがＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続残基を含有するＢｏＮＴ／Ａ認識配列などのＢｏＮＴ／Ａ認識配列と共に実施することもでき、ここで６つの連続残基は、配列Ｇｌｎ−Ａｒｇを包含する。さらに、本発明の方法は、限定はされないがＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含むＢｏＮＴ／Ｂ認識配列などのＢｏＮＴ／Ｂ認識配列と共に実施することができ、ここで６つの連続残基は、配列Ｇｌｎ−Ｐｈｅを包含する。またさらなる実施形態では、本発明の方法は、認識配列が、限定はされないがシンタキシンの少なくとも６つの連続残基（ここで６つの連続残基は、配列Ｌｙｓ−Ａｌａを包含する）を含むＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列、あるいはＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続残基（ここで６つの連続残基は、配列Ａｒｇ−Ａｌａを包含する）を含むＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列などのＢｏＮＴ／Ｃ１認識配列であるタグ付き毒素基質と共に実施される。
【０１１２】
また本発明の方法は、限定はされないが、ＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含むＢｏＮＴ／Ｄ認識配列などのＢｏＮＴ／Ｄ認識配列と共に実施することができ、ここで６つの連続残基は、配列Ｌｙｓ−Ｌｅｕを包含する。本発明の方法はさらに、限定はされないが、ＳＮＡＰ−２５の少なくとも６つの連続残基を含むＢｏＮＴ／Ｅ認識配列などのＢｏＮＴ／Ｅ認識配列と共に実施することができ、ここで６つの連続残基は、配列Ａｒｇ−Ｉｌｅを包含する。さらに、本発明の方法は、限定はされないが、ＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含むＢｏＮＴ／Ｆ認識配列などのＢｏＮＴ／Ｆ認識配列と共に実施することができ、ここで６つの連続残基は、配列Ｇｌｎ−Ｌｙｓを包含する。本発明の方法はさらに、限定はされないが、ＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含むＢｏＮＴ／Ｇ認識配列などのＢｏＮＴ／Ｇ認識配列と共に実施することができ、ここで６つの連続残基は、配列Ａｌａ−Ａｌａを包含する。さらなる実施形態では、本発明の方法は、ＶＡＭＰの少なくとも６つの連続残基を含むＴｅＮＴ認識配列などのＴｅＮＴ認識配列と共に実施され、ここで６つの連続残基は、配列Ｇｌｎ−Ｐｈｅを包含する。
【０１１３】
本発明の方法では、基質は、様々な活性のいずれかで切断することができる。１つの実施形態では、本発明の方法は、基質が少なくとも１ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断されるような条件下で、タグ付き毒素基質と共に実施される。もう１つの実施形態では、本発明の方法は、基質が少なくとも１００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断されるような条件下で、タグ付き毒素基質と共に実施される。さらなる実施形態では、本発明の方法は、基質が少なくとも１０００ナノモル／分／ミリグラムの毒素の活性で切断されるような条件下で、タグ付き毒素基質と共に実施される。
【０１１４】
コバルト（Ｃｏ２＋）およびニッケル（Ｎｉ２＋）を含むがこれらに限定されない様々な第２のパートナーはどれも本発明において有用である。さらに、親和性対の第２のパートナーは、任意に、例えばカラムまたはフィルタープレートに固定化することができる。さらに、本発明の方法は、任意に、処理済サンプル中の切断されていないタグ付き毒素基質の量をアッセイするステップを含んでもよい。様々なサンプルはどれも、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定するための本発明の方法においてアッセイすることができると理解される。本発明の方法に従ってアッセイされるサンプルは、任意の血清型の単離クロストリジウム毒素と、単離クロストリジウム軽鎖と、処方ＢｏＮＴ／Ａを含むがこれに限定されない処方クロストリジウム毒素製品と、１つまたは複数の組換え発現クロストリジウム毒素を含有する完全または部分的に精製された細胞抽出物とを包含するが、限定はされない。
【０１１５】
本発明の方法では、様々な手段を用いて、親和性対の第１および第２のパートナーを含有する安定な複合体から、蛍光または別の方法で検出可能な切断産物を分離することができる。分離は、一般に、親和性対の第１のパートナーを含有する処理済サンプル内の成分に対する親和性対の第２のパートナーの特異的な結合によって実行される。上記のように、定義により、蛍光または別の方法で検出可能な切断産物は親和性対の第１のパートナーを含有せず、従って、第１のパートナーを含有する処理済サンプル内の全ての成分から容易に分離することができる。さらに下記のように、蛍光のまたは別の方法で検出可能な切断産物は、金属キレートアフィニティクロマトグラフィを含むがこれらに限定されない様々な手段のいずれかを用いて、安定な複合体から分離される。
【０１１６】
本発明の方法では、金属キレート、免疫親和性および他のタイプのアフィニティ精製技法を含むアフィニティ精製を用いて、蛍光または別の方法で検出可能な切断産物を分離することができる。１つの実施形態では、親和性対の第１のパートナーは、ヒスチジンタグである。もう１つの実施形態では、親和性対の第１のパートナーは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である。さらにもう１つの実施形態では、親和性対の第１のパートナーはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。さらにもう１つの実施形態では、親和性対の第１のパートナーは、異種エピトープである。
【０１１７】
本発明の方法では、親和性対の第２のパートナーは、任意に、固体支持体に取り付けることができる。本明細書で用いられる場合、「固体支持体」という用語は、第２のパートナーが共有結合され得る不溶性の支持材料を意味する。固体支持体という用語は、親和性ビーズまたはゲルを含む親和性マトリックスと、変性ポリスチレンを含む樹脂と、デキストランおよび磁性ビーズなどのビーズと、アガロースおよびセファロースなどの炭水化物ポリマーとを含むが、限定はされない。
【０１１８】
親和性対の第１のパートナーがヒスチジンタグである場合には、金属キレートアフィニティクロマトグラフィ（ＭＣＡＣ）は、蛍光または別の方法で検出可能な切断産物を分離するために有用であり得る。本明細書で用いられる場合、「ヒスチジンタグ」という用語は、通常溶媒にさらされる約６〜１０のヒスチジン残基の連続系列を意味する。１つの実施形態では、本発明のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、６Ｘ−ＨＩＳタグＨＨＨＨＨＨ（配列番号：９５）を含む。もう１つの実施形態では、本発明のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、１０Ｘ−ＨＩＳタグＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号：１０８）を含む。
【０１１９】
金属キレートクロマトグラフィは、オースベルら、上記、１０．１５、付録４１に記載され、そして本明細書中の実施例ＩＩで例示されるように、当該技術分野においてよく知られている。本発明において有用な金属親和性タグには、例えば、天然の金属結合部位の天然または合成模倣物であり得る金属親和性ペプチドが含まれるが、限定はされない。様々な金属親和性ペプチドおよび他の金属親和性タグは、例えば、エンゼルバーガー（Ｅｎｚｅｌｂｅｒｇｅｒ）ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．８９８：８３−９４頁（２０００年）に記載されるように当該技術分野において知られており、６Ｘ−ＨＩＳ、７Ｘ−ＨＩＳ、８Ｘ−ＨＩＳ、９Ｘ−ＨＩＳおよび１０Ｘ−ＨＩＳタグ（モハンティ（Ｍｏｈａｎｔｙ）およびウェイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３３：３１１−３２５頁（２００４年）、ならびにグリシャマー（Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ）およびタッカー（Ｔｕｃｋｅｒ）、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１１：５３−６０頁（１９９７年））が含まれるが、限定はされない。金属キレートアフィニティ精製において、親和性対の第２のパートナーは、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、銅イオン（Ｃｕ２＋）またはコバルトイオン（Ｃｏ２＋）などの金属イオンである。非限定的な例として、本発明の方法は、セファロース、例えばセファロースＣＬ−６Ｂなどのビーズか、樹脂か、あるいはイミノ二酢酸（ＩＤＡ）またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）によって固定化されたニッケルまたは他の金属イオンを含有する別の固体支持体を用いて実施することができる。ヒスチジンタグ−金属親和性対を含有する安定な複合体から、蛍光または別の方法で検出可能な切断断片（ヒスチジンまたは他の金属親和性タグを含有しない）を分離することに続いて、安定な複合体は任意に、酸性バッファーまたはイミダゾールを含有するバッファーを用いて、固体支持体から溶出させることもできる。以下にさらに記載されるように、ヒスチジンタグも免疫親和性分離のために有用であり得ることは、当業者により理解される。
【０１２０】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／グルタチオンも、本発明の方法において有用な親和性対であり得る。この場合、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼは、親和性対の第１のパートナーとして、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質内に取り込まれる。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）およびバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）などの微生物におけるＧＳＴ含有ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の発現のためのベクターは、当該技術分野においてよく知られている。このようなベクターはｐＧＥＸシリーズのベクターを含み、ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンシーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびアマシャム・ファルマシア・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ニュージャージー州ピスカタウェイ）などの供給元から市販されている。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが親和性対の第１のパートナーである本発明の方法では、蛍光または別の方法で検出可能な切断断片（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含有しない）は、親和性対の第２のパートナーとしてグルタチオンを用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含有するサンプル内の成分から分離することができる。例えばアガロースまたは他のビーズに結合されたグルタチオンは、シグマ（ＳＩＧＭＡ）、アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンシーズおよび他の供給元から市販されている。遊離グルタチオンは、任意に、ＧＳＴ−グルタチオンを含有する安定な複合体をビーズまたは他の固体支持体から放出する働きをする。グルタチオンを用いるアフィニティクロマトグラフィは、例えばスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｍｅｔｈｏｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：２２０−２２９頁（１９９３年）、またはオースベル、上記、２０００年（１６．７章を参照）に記載されるように当該技術分野においてよく知られている。
【０１２１】
マルトース結合タンパク質／マルトースも、本発明の方法において有用な親和性対であり得る。本質的に、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、大腸菌のｍａｌＥ遺伝子によってコードされる。親和性対の第１のパートナーとしてマルトース結合タンパク質を含有するＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の発現のためのベクターが市販されている。このようなベクターは、ｐＭＡＬ−ｃ２ｅ、−ｃ２ｇおよび−ｃ２ｘ、ならびにｐＭＡＬ−ｐ２ｅ、−ｐ２ｇおよびｐ２ｘなどのｐＭＡＬベクターを含み、例えばニュー・イングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州ビバリー）などの供給元から市販されている。１つの実施形態では、親和性対の第２のパートナーは、マルトースサブユニットからなる多糖類であるアミロースである。非限定的な例として、本発明の方法は、アミロースで誘導体化され、ニュー・イングランド・バイオラボズから市販されているアガロース樹脂などのアミロース樹脂を用いて実施することができる。従って、マルトース結合タンパク質が親和性対の第１のパートナーである本発明の方法では、蛍光または別の方法で検出可能な切断断片（マルトース結合タンパク質を含有しない）は、アミロースまたは別のマルトースを含有する第２のパートナーを用いて、マルトース結合タンパク質を含有する処理済サンプル内の成分から分離することができる。所望される場合には、１０ｍＭの遊離マルトースを含有するカラムバッファーなどの遊離マルトースを用いて、アミロース樹脂に結合した安定な複合体を溶出させることができる。マルトースアフィニティクロマトグラフィ法はルーチン的であり、例えばオースベル上記、２０００年（１６．６章）に記載されるように当該技術分野においてよく知られている。
【０１２２】
ビオチン−ストレプトアビジン親和性システムも、本発明の方法において有用であり得る。非限定的な例として、８アミノ酸ストレプトアビジンタグが当該技術分野において知られおり（シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）およびスケラ（Ｓｋｅｒｒａ）、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．６：１０９−１２２頁（１９９３年））、市販されている（シグマ−ジェノシス（ＳＩＧＭＡ−Ｇｅｎｏｓｙｓ））。
【０１２３】
また本発明の方法は、親和性対の第１のパートナーとして異種エピトープを含有するＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質と共に実施することができる。このような異種エピトープは、蛍光または別の方法で検出可能な切断産物を分離するための便利な手段を提供する。エピトープに関連して本明細書で用いられる場合、「異種」という用語は、融合蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーをコードする遺伝子、ならびにクロストリジウム毒素認識配列をコードする遺伝子とは異なる遺伝子に由来するエピトープを意味する。従って例えば、本発明のＦＬＡＧ−ＳＮＡＰ２５−ＧＦＰタグ付き毒素基において、「ＦＬＡＧ」成分は、ＳＮＡＰ−２５をコードする遺伝子に由来しない異種エピトープである。様々な異種エピトープが当該技術分野においてよく知られており、ＦＬＡＧエピトープＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号：９１、チュベット（Ｃｈｕｂｅｔ）およびブリザード（Ｂｒｉｚｚａｒｄ）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０：１３６−１４１頁（１９９６年））、赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号：９２）、ｃ−ｍｙｃエピトープＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号：９３）、ＡＵ１エピトープＤＴＹＲＹＩ（配列番号：９４）、および６−ＨＩＳエピトープＨＨＨＨＨＨ（配列番号：９５）が含まれるが、これらに限定されない。これらのおよび他の異種エピトープが、本発明の基質および方法における親和性対の第１のパートナーとして有用であり得ることは当業者には理解される。
【０１２４】
非限定的な例として、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、親和性対の第１のパートナーとしてＦＬＡＧタグＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号：９１）を含むことができる。基質はルーチン的な分子法によって産生することができ、得られる検出可能な切断産物の相対量は、例えばイーストマン・コダーック（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）（ニューヨーク州ロチェスター）またはバークリー・アンチボディ・カンパニー（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ＢａｂＣＯ、カリフォルニア州リッチモンド）から市販されている抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いて決定される。同様に、赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号：９２）は本発明のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質内に操作することができ、対応する検出可能な切断断片の相対量は、ＢａｂＣＯ（ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ））またはサンタ・クルズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から入手される抗ＨＡ抗体または抗血清を用いて検出される。ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質内にｃ−ｍｙｃエピトープＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号：９３）を同じように操作することができ、対応する検出可能な切断産物の相対量は、ＢａｂＣＯ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニア州サンディエゴ）、ロシュ・ダイアグノスティックス、シグマ（ミズーリ州セントルイス）およびサンタ・クルズ・バイオテクノロジーなどの供給元から市販されている抗体または抗血清を用いて決定することができる。親和性対の第１のパートナーとして有用なさらなる異種エピトープには、ＢａｂＣＯから入手可能なモノクローナル抗体によって認識されるＡＵ１タグＤＴＹＲＹＩ（配列番号：９４）と、ＢａｂＣＯ、インビトロジェン、シグマ、サンタ・クルズ・バイオテクノロジーおよび他の商業的供給元から入手可能な抗体および抗血清によって認識される６−ＨＩＳタグＨＨＨＨＨＨ（配列番号：９５）とが含まれるが、限定はされない。これらのおよび他の異種エピトープが、本発明の方法において蛍光または別の方法で検出可能な切断産物を分離するために便利に使用され得ることは当業者には理解される。
【０１２５】
親和性対の第１のパートナーが異種エピトープである場合には、本発明の方法では、一般に免疫沈降または別の免疫親和性分離手順を用いて蛍光または別の方法で検出可能な切断産物を分離する。免疫沈降において、親和性対の第１のパートナーを認識する抗体は、限定はされないがタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ−アガロースビーズまたはセファロースなどの沈降可能なマトリックスに取り付けられる。低速遠心分離を実行して固相マトリックスおよび異種エピトープを含有する結合成分を分離することができ、未結合タンパク質は洗浄によって除去される。様々な免疫沈降プロトコルはルーチン的であり、例えばハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレイン（Ｌａｎｅ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８８年）ならびにオースベル、上記、２０００年（特に１０章、付録４８および２０章、付録４６を参照）に記載されるように、当該技術分野においてよく知られている。親和性対の第１のパートナーが、限定はされないがＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｃ−ｍｙｃ、ＡＵ１または６−ＨＩＳエピトープなどのよく知られた異種エピトープである場合には、エピトープに特異的に結合する抗体または抗血清は、通常、上記のようにＢａｂＣＯ、インビトロジェン、ロシュ・ダイアグノスティックス、シグマおよびサンタ・クルズ・バイオテクノロジーなどの供給元から市販されている。またこれらのおよび他の異種エピトープに対する抗体は、例えばハーローおよびレイン、上記、１９８８年に記載されるようにルーチン的な方法によって調製することもできる。
【０１２６】
蛍光または別の方法で検出可能な切断産物の免疫親和性分離において有用な抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体プールであり、そしてさらに、少なくとも約１×１０５Ｍ−１である親和性対の第１のパートナーに対する特異的結合活性を保持する抗体の抗原結合断片であり得る。非限定的な例として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片などの抗体断片は親和性対の第１のパートナーに対する特異的結合活性を保持することができ、従って、本発明において有用であり得る。さらに、免疫親和性分離は、最低でも１つのＶＨおよび１つのＶＬドメインを含有する天然に存在しない抗体または断片、例えば親和性対の第１のパートナーに特異的に結合するキメラ抗体、ヒト化抗体または単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）と共に実行することができる。このような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構成するか、組換えで産生するか、あるいはボレベック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第２版）ニューヨーク：オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９５年）に記載されるように、例えば可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって得ることができる。所望される場合には、抗体は、免疫親和性分離のために固体支持体に取り付けることができる。このような固体支持体には、不溶性の大きい細孔径のクロマトグラフィーマトリックスであるセファロースが含まれるが、限定はされない。１つの実施形態では、抗体は、セファロースＣＬ−４Ｂ、４％架橋アガロースに取り付けられる。例えば、高いまたは低いｐＨへの短時間の曝露を用いて、溶出を実行することができる（オースベル、上記、１０．１１Ａ章、２０００年）。
【０１２７】
以下でさらに説明されるように、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した様々な条件が、本発明の方法において有用である。例えば、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、基質の少なくとも１０％が切断されるように提供することができる。同様に、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が切断されるように、あるいはＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の１００％が切断されるように提供することができる。１つの実施形態では、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、アッセイが線形であるように選択される。もう１つの実施形態では、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の少なくとも９０％が切断されるように提供される。さらなる実施形態では、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の最大でも２５％が切断されるように提供される。またさらなる実施形態では、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の最大でも５％、１０％、１５％または２０％が切断されるように提供される。
【０１２８】
本発明の方法では、サンプルは、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件下、溶液相中でＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質で処理される。クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した例示的な条件は当該技術分野においてよく知られており、そしてさらに、ルーチン的な方法によって決定することができる。例えば、ハリス（Ｈａｌｌｉｓ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：１９３４−１９３８頁（１９９６年）と、エコング（Ｅｋｏｎｇ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：３３３７−３３４７頁（１９９７年）と、ショーン（Ｓｈｏｎｅ）ら、国際公開第９５／３３８５０号パンフレットと、シュミットおよびボスティアン（Ｂｏｓｔｉａｎ）、上記、１９９５年と、シュミットおよびボスティアン、上記、１９９７年と、シュミットら、上記、１９９８年と、シュミットおよびボスティアン、米国特許第５，９６５，６９９号明細書とを参照されたい。クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、一つには、アッセイされている特定のクロストリジウム毒素のタイプまたはサブタイプおよび毒素調製の純度に依存し得ると理解される。クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、一般に、通常はｐＨ５．５〜９．５の範囲、例えばｐＨ６．０〜９．０の範囲、ｐＨ６．５〜８．５の範囲またはｐＨ７．０〜８．０の範囲において、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓまたはナトリウムホスフェートなどのバッファーを含む。またクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、例えば二鎖毒素がアッセイされている場合には、所望によりジチオスレイトール、β−メルカプトエタノールまたは別の還元剤を含むこともできる（エコングら、上記、１９９７年）。１つの実施形態では、条件は０．０１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲のＤＴＴを含み、他の実施形態では、条件は、０．１ｍＭ〜２０ｍＭ、１〜２０ｍＭ、または５〜１０ｍＭの範囲のＤＴＴを含む。所望される場合には、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質を添加する前に、単離クロストリジウム毒素またはサンプルは、還元剤、例えば１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）と共に約３０分間プレインキュベートすることができる。
【０１２９】
クロストリジウム毒素は亜鉛メタロプロテアーゼであり、通常は１〜５００μＭの範囲、例えば５〜１０μＭの範囲である塩化亜鉛または酢酸亜鉛などの亜鉛源は、所望される場合には、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件の一部として含まれ得る。ＥＤＴＡなどの亜鉛キレート剤は、一般には、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性をアッセイするためのバッファーから排除されることは当業者には理解される。
【０１３０】
クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、任意に、例えばウシ血清アルブミンの代わりに使用することができるトゥイーン（ＴＷＥＥＮ）−２０などの洗剤を含むことができる。トゥイーン−２０は、例えば、０．００１％〜１０％（ｖ／ｖ）のトゥイーン−２０の範囲、または０．０１％〜１．０％（ｖ／ｖ）のトゥイーン−２０の範囲で提供することができる。１つの実施形態では、トゥイーン−２０は、０．１％（ｖ／ｖ、実施例ＩＩを参照）の濃度で提供される。
【０１３１】
またクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、所望される場合には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むことができる。含まれる場合には、ＢＳＡは通常、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲で提供される。１つの実施形態では、ＢＳＡは、１ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれる。例えば、シュミットおよびボスティアン、上記、１９９７年を参照されたい。もう１つの実施形態では、ＢＳＡは、０．１％（ｖ／ｖ、実施例ＩＩを参照）の濃度で含まれる。
【０１３２】
本発明の方法において、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の量は変化され得る。ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質は、例えば、１μＭ〜５００μＭ、１μＭ〜５０μＭ、１μＭ〜３０μＭ、５μＭ〜２０μＭ、５０μＭ〜３．０ｍＭ、０．５ｍＭ〜３．０ｍＭ、０．５ｍＭ〜２．０ｍＭ、または０．５ｍＭ〜１．０ｍＭの濃度で供給することができる。ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の濃度もしくはサンプルの量が、所望される場合には、アッセイが線形であるように制限され得ることは当業者には理解される。１つの実施形態では、本発明の方法は、１００μＭ未満のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質濃度に依存している。さらなる実施形態では、本発明の方法は、５０μＭ未満または２５μＭ未満のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質濃度に依存している。さらなる実施形態では、本発明の方法は、１０μＭ〜２０μＭのＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質濃度に依存している。所望される場合には、線形のアッセイは、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質と、緑色蛍光タンパク質または蛍光タンパク質または遺伝的にコードされた検出可能なマーカーが欠けている対応する「非標識化」基質とを混合することによって実行することもできる。適切な希釈は、例えば対応の非標識化基質中のＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の連続的な希釈物を調製することによって決定することができる。
【０１３３】
本発明の方法でアッセイされる精製または部分的に精製されたクロストリジウム毒素の濃度は、一般に、約０．１ｐＭ〜１００ｎＭ、例えば１ｐＭ〜２０００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜５０ｐＭ、１〜２００ｎＭ、１〜１００ｎＭまたは３〜１００ｎＭの毒素の範囲であり、例えば、精製した未変性または組換え軽鎖または二鎖毒素、もしくはヒト血清アルブミンおよび賦形剤を含有する処方クロストリジウム毒素製品であり得る。特定の実施形態では、精製または部分的に精製された組換えＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖または二鎖もしくは処方毒素製品の濃度は、１ｐＭ〜２０００ｐＭ、１０ｐＭ〜２０００ｐＭ、２０ｐＭ〜２０００ｐＭ、４０ｐＭ〜２０００ｐＭ、または１ｐＭ〜２００ｐＭの範囲である。さらなる実施形態では、精製または部分的に精製された組換えＢｏＮＴ／Ｃ軽鎖または二鎖もしくは処方毒素製品の濃度は、１〜２００ｎＭ、４〜１００ｎＭ、１０〜１００ｎＭまたは４〜６０ｎＭの範囲である。精製または部分的に精製されたクロストリジウム毒素の濃度が、アッセイされる毒素の血清型と、毒素の純度、阻害性成分の存在およびアッセイ条件とに依存し得ることは当業者には理解される。精製、部分精製または未精製サンプルが、標準曲線に対してクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性をアッセイするために便利な範囲内で希釈され得ることは、さらに理解される。同様に、毒素プロテアーゼ活性のためのアッセイが線形であるように、所望される場合にはサンプルは希釈され得ることが理解される。
【０１３４】
またクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は一般に、例えば、約２０℃〜約４５℃の範囲、例えば２５℃〜４０℃の範囲、または３５℃〜３９℃の範囲の温度を含む。アッセイ体積は、多くの場合、約５〜約２００μｌの範囲、例えば約１０μｌ〜１００μｌの範囲または約０．５μｌ〜１００μｌの範囲であるが、ナノリットルの反応体積も本発明の方法と共に使用することができる。またアッセイ体積は、例えば、１００μｌ〜２．０ｍｌの範囲、または０．５ｍｌ〜１．０ｍｌの範囲でもよい。
【０１３５】
アッセイ時間は当業者により適切に変更可能であり、一般に、一つにはクロストリジウム毒素の濃度、純度および活性に依存する。アッセイ時間は、一般に、約１５分〜約５時間の範囲で変更されるが、限定はされない。非限定的な例として、例示的なアッセイ時間には、例えば、３７℃で３０分間、４５分間、６０分間、７５分間または９０分間のインキュベーションが含まれる（実施例ＩＩＩを参照）。特定の実施形態では、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％が切断される。さらなる実施形態では、プロテアーゼ反応は、ＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の５％、１０％、１５％、２０％、２５％または５０％より多くが切断される前に停止される。プロテアーゼ反応は、一般に基質内の蛍光タンパク質または他の検出可能なマーカーによって決まる適切な試薬によって終了させることができる。非限定的な例として、ＧＦＰ含有基質に基づくプロテアーゼ反応は、実施例ＩＩの場合のように、例えば１〜２Ｍの最終濃度まで塩化グアニジウムなどの終結試薬を添加することによって終了させることができる。またプロテアーゼ反応は、Ｈ２ＳＯ４の添加、約０．５〜１．０Ｍのホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０〜９．５の添加、あるいは亜鉛キレート剤の添加によって終了させることができる。所望される場合には、処理済サンプルを親和性対の第２のパートナーと接触させる前にプロテアーゼ反応が終了され得ることは当業者には理解される。
【０１３６】
非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａプロテアーゼ活性などのクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、１０〜１６μＭの基質と共に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１０μＭのＺｎＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、および０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン−２０を含有するバッファー中、３７℃で９０分間のインキュベーションであり得る（実施例ＩＩを参照）。所望される場合には、ＢｏＮＴ／Ａ、特に二鎖ＢｏＮＴ／Ａは、基質の添加の前に、ジチオスレイトールと共に例えば２０または３０分間プレインキュベートすることができる。さらに非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａプロテアーゼ活性に適した条件は、５ｍＭのジチオスレイトールなどの還元剤を含有する３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、ならびに２５μＭの塩化亜鉛（約７ｎＭ、シュミットおよびボスティアン、上記、１９９７年）などの亜鉛源のようなバッファー中、３７℃におけるインキュベーションであり得る。また、サンプルがＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質で処理される場合には、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲のＢＳＡ、例えば１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡが含まれてもよい（シュミットおよびボスティアン、上記、１９９７年）。またさらなる非限定的な例として、クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性、例えばＢｏＮＴ／Ｂ活性に適した条件は、１０μＭの塩化亜鉛、１％ウシ胎児血清および１０ｍＭのジチオスレイトールと共に５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中、３７℃で９０分間のインキュベーションである（ショーン（Ｓｈｏｎｅ）およびロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２５：２６３−２７０頁（１９９４年）、ハリス（Ｈａｌｌｉｓ）ら、上記、１９９６年）か、あるいは例えば、任意に０．２％（ｖ／ｖ）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含む１０ｍＭのジチオスレイトールと共に４０ｍＭのナトリウムホスフェート、ｐＨ７．４中、３７℃で２時間のインキュベーション（ショーン（Ｓｈｏｎｅ）ら、上記、１９９３年）であり得る。破傷風毒素のプロテアーゼ活性または他のクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性に適した条件は、例えば、２５μＭペプチド基質と共に、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２および１００ｍＭのＮａＣｌ中、３７℃で２時間のインキュベーション（コルニーユ（Ｃｏｒｎｉｌｌｅ）ら、上記、１９９４年）であり得る。
【０１３７】
クロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を決定するための本発明の方法では、サンプルは、（ｉ）蛍光タンパク質または他の遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、（ｉｉ）親和性対の第１のパートナーと、（ｉｉｉ）蛍光タンパク質と親和性対の第１のパートナーとの間に介在する切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列と、を含有するタグ付き毒素基質で処理される。所望される場合には、第２のタグ付き毒素基質が含まれてもよく、この第２の基質は、第２の蛍光タンパク質または他の遺伝的にコードされた検出可能なマーカーと、第２の親和性対の第１のパートナーと、第１のクロストリジウム毒素認識配列内の第１の切断部位を切断する毒素とは異なるクロストリジウム毒素によって切断される第２の切断部位を含む第２のクロストリジウム毒素認識配列とを含有する。第２の基質内の蛍光タンパク質または他の遺伝的にコードされた検出可能なマーカーおよび親和性対の第１のパートナーは、第１の基質内のものと同一でもよいし異なっていてもよい。このようにして、単一のサンプルを多数のクロストリジウム毒素の存在について便利にアッセイすることができる。
【０１３８】
クロストリジウム毒素の任意の組み合わせ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のクロストリジウム毒素をアッセイ可能であることが理解される。例えば、ＴｅＮＴ、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｇのうちの２、３、４、５、６、７または８つの任意の組み合わせをアッセイすることができる。例えば、同じ蛍光または他の遺伝的にコードされた検出可能なタンパク質と、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／ＦまたはＢｏＮＴ／Ｇ認識配列に隣接する親和性対の同じ第１のパートナーとをそれぞれが含有する７つの基質は、処理済サンプルを親和性対の第２のパートナーと接触させる前に、ボツリヌス毒素のプロテアーゼ活性に適した条件下、溶液相中でサンプルにより処理することができる。蛍光切断産物の存在は、少なくとも１つのボツリヌス毒素のクロストリジウム毒素のプロテアーゼ活性を示す。このようなアッセイは、例えば、任意のボツリヌス毒素の存在について食品サンプルまたは組織サンプルをアッセイするために有用であり、所望される場合には、個々のボツリヌス毒素またはボツリヌス毒素の特定の組み合わせについての１つまたは複数のその後のアッセイと組み合わせることができる。
【０１３９】
もう１つの実施形態では、２つ以上の異なるタグ付き毒素基質を用いて、２つ以上の異なるクロストリジウム毒素について単一のサンプルがアッセイされ、各基質は、異なる蛍光タンパク質または他の遺伝的にコードされた検出可能なマーカーを含有する。多数の基質の使用は、例えば米国特許第６，１８０，３４０号明細書に記載されるように、アッセイのダイナミックレンジを拡大するために有用であり得る。多数のタグ付き毒素基質の使用の一例として、緑色蛍光タンパク質およびＢｏＮＴ／Ａ認識配列を含有する第１のタグ付き毒素基質と、赤色蛍光タンパク質およびＢｏＮＴ／Ｂ認識配列を含有する第２のタグ付き毒素基質とを用いて、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂプロテアーゼ活性について単一のサンプルをアッセイすることができる。所望される場合には、２つの基質が、ヒスチジンタグなどの親和性対の同じ第１のパートナーを用いることもできる。処理済サンプルを親和性対の第２のパートナーと接触させ、蛍光切断産物を安定な複合体から分離した後、緑色蛍光切断産物はＢｏＮＴ／Ａプロテアーゼ活性を示し、赤色蛍光切断産物はＢｏＮＴ／Ｂプロテアーゼ活性を示し、そして緑色および赤色の両方の蛍光切断産物は、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂ切断産物を示す。
【０１４０】
また本発明の方法において多数の基質を使用して、アッセイの範囲を拡大することができる。例えば、少なくとも２つのタグ付き毒素基質が異なる希釈で一緒に使用され、基質が異なる蛍光タンパク質または他の遺伝的にコードされた検出可能なマーカーを有し、従って、別個に検出可能であるが、同じクロストリジウム毒素の認識配列を有する。１つの実施形態では、異なる蛍光タンパク質または他の遺伝的にコードされた検出可能なマーカーを有しその他の点では同一のタグ付き毒素基質が異なる希釈で一緒に使用され、本発明の方法のダイナミックレンジが拡大される。
【０１４１】
本発明の方法において、１つまたは複数のコントロールが任意に用いられてもよい。コントロール基質は通常、１つまたは複数のクロストリジウム毒素を含有する定義されたサンプルで処理された同じＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質か、いずれのサンプルでも処理されていない同じＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質か、あるいはＳＮＡＰ−２５またはタグ付き毒素基質の切断不能な形態である。本発明の方法において様々なコントロール基質が有用であり、コントロール基質がポジティブコントロール基質またはネガティブコントロール基質であり得ることは当業者には理解される。コントロール基質は、例えば、活性クロストリジウム毒素を含有しない同様のサンプルと接触されるか、あるいはどのサンプルとも接触されない同様または同一の基質などのネガティブコントロールであり得る。蛍光または別の方法で検出可能な切断産物と同様または同一のコントロール切断産物も本発明の方法において有用であり得る。
【０１４２】
本発明の方法は自動化することができ、さらに例えば、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルプレートを用いて高スループットまたは超高スループット形式で構成することができると理解される。一例として、蛍光発光は、９６ウェルプレートアッセイ用に設計されたモレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）ＦＬＩＰＲ計測システム（モレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を用いて検出することができる（シュレイダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １：７５−８０頁（１９９６年））。ＦＬＩＰＲは、水冷式の４８８ｎｍアルゴンイオンレーザー（５ワット）またはキセノンアークランプと、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラを有する半共焦点型（ｓｅｍｉｃｏｎｆｏｃａｌ）光学系とを用いて、プレート全体を照射および画像形成する。ＦＰＭ−２の９６ウェルプレートリーダ（フォーリー・コンサルティング・アンド・リサーチ（Ｆｏｌｌｅｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、イリノイ州ラウンドレイク）も、本発明の方法で蛍光発光を検出する際に有用であり得る。ＥＣＬＩＰＳＥキュベットリーダー（バリアン−ケーリー（Ｖａｒｉａｎ−Ｃａｒｙ、カリフォルニア州ウォールナットクリーク）、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘＧＥＭＩＮＩ  ＸＳ（モレキュラー・デバイシーズ）および例えばパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）からの他のシステムなど、適切な分光学的適合性を有するこれらのおよび他の自動化システムが、本発明の方法において有用であり得ることは当業者には理解される。
【０１４３】
以下の実施例は本発明を説明するが限定はしないことが意図される。
【実施例】
【０１４４】
実施例Ｉ
組換えＧＦＰ−ＳＮＡＰ−２５基質の発現および特徴付け
この実施例では、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）およびＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）−ＧＦＰ基質、ならびに改変された切断部位を含有するコントロール基質の発現のためのプラスミドの構成が記載される。
【０１４５】
同じ成分を含有するが反対の配向で存在する２つのＧＦＰ基質を設計および発現させた。各基質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、マウスＳＮＡＰ−２５残基１３４−２０６、およびポリヒスチジン親和性タグ（６ｘＨｉｓ）からなる融合タンパク質であり、各成分はペプチドリンカーによって分離された。以下にさらに記載されるように、ＧＦＰおよびポリヒスチジンタグがＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）の反対の末端に融合されるように基質を設計した。融合タンパク質基質をＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５およびＳＮＡＰ２５−ＧＦＰと命名した。
【０１４６】
Ａ．ｐＱＥ５０／ＢｉｒＡＳＮＡＰ（１２８−２０６）の構成
ドリー（Ｄｏｌｌｙ）教授により提供されるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子の３’末端でフレームに挿入された全長マウスＳＮＡＰ−２５遺伝子（ＧＳＴ−ＳＮＡＰ２５（１−２０６））を含有するｐＴ２５ＦＬプラスミドからＳＮＡＰ−２５配列を得た（オサリバン（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３６８９７−３６９０４頁（１９９９年））。ｐＴ２５ＦＬからのＳＮＡＰ−２５配列は第２の発現ベクター内に取り込まれ、これは、ＳＮＡＰ−２５の残基１３４−２０６のＮ末端に融合されたビオチン化のためのＢｉｒＡｓｐシグナル配列およびポリヒスチジン親和性タグ（ＢｉｒＡｓｐ−ｐｏｌｙＨｉｓ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）、「ＢＡ−ＳＮＡＰ」で表す）を有するように設計された。ＰＣＲプライマー５’−ＧＣＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＣＧＡ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴＧ−３’（配列番号：１０４、アンチセンス）および５’−ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  ＧＣＣ−３’（配列番号：１０１、センス）を用いるｐＴ２５ＦＬプラスミドの適切な領域のＰＣＲ増幅によって、ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）をコードするＤＮＡ配列を生成し、Ｂｇｌ  ＩＩ制限部位を含有するＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）ＰＣＲ産物（ＰＣＲ産物Ａ）を産生した。
【０１４７】
２０ｂｐの相補領域を含有する合成オリゴヌクレオチド配列番号：１０２および１０３を用いて、ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）配列の上流およびフレーム内における融合のために、ＢｉｒＡｓｐ配列、ビオチン化のための天然基質、およびポリヒスチジン親和性タグを操作した。これらのオリゴヌクレオチド、５’−ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＧＡＧ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＡＴＣ−３’（配列番号：１０２、センス、下線のＳａｃＩＩ部位）および５’−ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＣＡＣ  ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＡＡＧ  Ａ−３’（配列番号：１０３、アンチセンス）をアニールし、一本鎖オーバーハングをＰＣＲ増幅で充填して、ＰＣＲ産物Ｂをもたらした。
【０１４８】
ＰＣＲ産物Ａで表されるＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）、ＰＣＲ産物Ｂで表されるＢｉｒＡｓｐおよびポリヒスチジンのためのコード配列を含有する２つの二本鎖ＰＣＲ産物を変性およびアニールした。２つの遺伝子断片における２０ｂｐの相補配列は、ＰＣＲプライマー配列番号：１０１および配列番号：１０３においてイタリック体で示される）。ＰＣＲによるオーバーハングの充填の後、産物をプライマー配列番号：１０２および配列番号：１０４で増幅した。ＢｉｒＡｓｐ−ｐｏｌｙＨｉｓ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）をコードする得られたＰＣＲ産物（「ＢＡ−ＳＮＡＰ」と命名される）をＳａｃＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ｐＱＢＩ２５ｆＡ２ベクターに結合された単離遺伝子挿入断片をＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩで消化して、プラスミドｐＮＴＰ１２（ＢＡ−ＳＮＡＰを含有するｐＱＢＩ２５ｆＡ２）をもたらした。
【０１４９】
大腸菌からの発現および精製のために、ＢＡ−ＳＮＡＰ遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａプラスミド（アマシャム・ファーマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））に転移させた。ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩでの消化によってＢＡ−ＳＮＡＰ遺伝子をｐＮＴＰ１２から単離した後、ゲル精製を行った。別個に、ｐＴｒｃ９９ＡプラスミドをＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化し、単離ベクターをＢＡ−ＳＮＡＰ遺伝子に結合させて、プラスミドｐＮＴＰ１４（ＢＡ−ＳＮＡＰを含有するｐＴｒｃ９９Ａ）をもたらした。
【０１５０】
プラスミドｐＱＥ−５０にＢＡ−ＳＮＡＰ遺伝子をクローン化するために、プライマー配列番号：１０４およびプライマー配列番号：１０５（５’−ＣＧＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ−３’（センス、下線のＢｇｌＩＩ部位））を用いてｐＮＴＰ１４からＡ−ＳＮＡＰ断片をＰＣＲ増幅した。ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩでの消化の後、増幅ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化済みのベクターｐＱＥ−５０内に結合させた。ＢＡ−ＳＮＡＰを含有するｐＱＥ５０を表す得られたプラスミドは、ｐＮＴＰ２６と命名した。
【０１５１】
Ｂ．ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−２５発現ベクターの構成
以下に記載されるようにベクターｐＱＢＩ  Ｔ７−ＧＦＰ（カリフォルニア州カールズバッドのクアンタム・バイオテクノロジーズ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を改変することによって、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質基質をコードするプラスミドを調製した。プラスミドマップは、以下の図８Ａおよび９Ａに示される。ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）およびＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）−ＧＦＰ基質の核酸および予測アミノ酸配列はそれぞれ、図８Ｂおよび９Ｂに示される。
【０１５２】
プラスミドｐＱＢＩ  ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）を、次のとおりに２相で構成した。まず、ベクターｐＱＢＩ  Ｔ７−ＧＦＰをＰＣＲ改変して、ＧＦＰ−コード配列の３’末端の終止コドンを除去して、ＧＦＰをＳＮＡＰ−２５断片から分離するペプチドリンカー部分のコード配列を挿入した。第２に、ＳＮＡＰ−２５（１３４−２０６）遺伝子に５’融合したペプチドリンカーの残りのコード配列、および遺伝子の３’に融合した６ｘＨｉｓ親和性タグを取り込むように設計されたＰＣＲプライマーを用いて、ＳＮＡＰ−２５（１３４−２０６）をコードするＤＮＡ断片をｐＮＴＰ２６からＰＣＲ増幅した。結果として生じるＰＣＲ産物を上記の改変ｐＱＢＩベクターにクローン化しして、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）−６ｘＨｉｓの発現のためのｐＱＢＩ  ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）プラスミドをもたらした（図８Ａを参照）。
【０１５３】
プラスミドｐＱＢＩ  ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）−ＧＦＰを以下のとおりに構成した。ＢｉｒＡｓｐビオチン化配列、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ親和性タグ、およびＳＮＡＰ２５残基１３４−２０６を含有するＰＣＲ増幅遺伝子をｐＱＢＩ  Ｔ７−ＧＦＰにサブクローン化することによって、図９Ｂに示されるプラスミドｐＱＢＩ  ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）−ＧＦＰを構成した。ＢｉｒＡｓｐ全体、６ｘＨｉｓ、およびｐＮＴＰ２６からのＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）遺伝子を、増幅遺伝子の融合タンパク質リンカー３’のコード配列を取り込み、ＧＦＰ遺伝子の５’末端への融合を容易にするように設計されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、図９Ｂに示されるようなＢｉｒＡｓｐ−６ｘＨｉｓ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）−リンカー−ＧＦＰの発現のための単一の遺伝子をもたらした。
【０１５４】
Ｃ．ＳＮＡＰ−２５／ＧＦＰ発現ベクター変異体をコードするベクターの構成
Ａｒｇ１９８ＡｌａおよびＡｒｇ１８０Ａｓｐ類似体を作成するためのベクターｐＱＢＩ  ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）の改変は、プライマー５’−ＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧＣＴＧ−３’（配列番号：１０６、「ＳＮＡＰ２５（Ｒ１９８Ａ）」）および５’−ＣＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＣＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧ−３’（配列番号：１０７、「ＳＮＡＰ２５（Ｒ１８０Ｄ）」）をその相補配列と共に用いて実施された。
【０１５５】
各プライマー対に対して、５μＬの１０×Ｐｆｕバッファー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）、１μＬのｄＮＴＰｓ（それぞれ１２．５ｍＭ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン）、１μＬのＰｆｕターボ（Ｔｕｒｂｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン、ホットスタート付加）を含有する６つの５０μＬのＰＣＲ反応物を構築し、テンプレートＤＮＡの濃度を変え（１０〜１００ｎｇのｐＱＢＩ  ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５１３４−２０６）、各プライマーは０．２μＭの最終濃度であった。ヌクレアーゼを含まない水で、反応物を５０μＬの最終体積にした。９５℃で２分間のインキュベーションに続いて、２５サイクルの増幅（９５℃で１分間、６０℃で３０秒間、そして７２℃で１２分間）を実施した後、最終の７２℃で７分間の伸展を行った。
【０１５６】
サーモサイクリングに続いて、１μＬのＤｐｎＩ制限酵素（ストラタジーン）を各反応物に添加し、３７℃で１時間インキュベートして、テンプレートＤＮＡを消化した。ＱＩＡクイックキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア）によって反応物を精製し、アガロースゲル電気泳動法によって分析した。１つを除く全ての反応物が全長プラスミドを産生した。候補プラスミドの配列決定によって、１つのＡｒｇ１８０Ａｓｐ変異体と、所望の変化を含有する２つのＡｒｇ１９８Ａｌａ変異体とが明らかになった。
【０１５７】
Ｄ．ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質の発現および精製
上記の発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウィスコンシン州マディソン、またはインビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）、もしくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する大腸菌ＢＬ２１−コドン・プラス（登録商標）（ＤＥ３）−ＲＩＬ細胞（ストラタジーン）に形質転換した。形質転換した細胞を３７℃で一晩ＬＢ（ａｍｐ）プレート上に選択した。単一のコロニーを用いて、１〜３ｍＬのスターターカルチャーをインキュベートし、次にこれを用いて０．５〜１．０Ｌの培養物をインキュベートした。Ａ５９５が０．５〜０．６に到達するまで、振とうさせながら３７℃で多量の培養物を成長させ、この時点でインキュベータから取り出し、短時間で冷却させた。１ｍＭのＩＰＴＧによるタンパク質発現の誘発後、ＧＦＰ部分のフォールディングを容易にするために、１６℃で一晩振とうさせながらｐＱＢＩ  ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）プラスミドからＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質を発現させた。発現培養物の２５０ｍＬのアリコートからの細胞を遠心分離（３０分、６，０００×ｇ、４℃）によって捕集し、必要になるまで−８０℃で貯蔵した。
【０１５８】
以下のように、ＩＭＡＣ精製と、イミダゾールを除去するためのその後の脱塩ステップとを含む２段階手順によって基質を４℃で精製し、通常１５０ｍｇ／Ｌよりも多い精製基質をもたらした。７〜１２ｍＬのカラム結合バッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭのイミダゾール）中に、２５０ｍＬの培養物からの細胞ペレットをそれぞれ再懸濁し、超音波処理（３８％振幅の１０秒パルスにおいて１分４０秒）により溶解し、遠心分離（１６０００ｒｐｍ、４℃、１時間）によって清澄化した。４カラム体積の無菌ｄｄＨ２Ｏおよび４カラム体積のカラム結合バッファーで洗浄することによって、親和性樹脂（細胞ペレットあたり３〜５ｍＬのタロン・スーパーフロー（Ｔａｌｏｎ  ＳｕｐｅｒＦｌｏｗ）Ｃｏ２＋）を、ガラスまたは使い捨てのカラム支持体（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））中で平衡にした。（１）ライセートを樹脂に添加し、緩やかに振動させながら１時間の水平のインキュベーションによってバッチを結合するか、あるいは（２）ライセートを鉛直カラムにアプライし、重力流によりゆっくりとカラムに入らせるか、２つの方法のうちの１つで清澄化ライセートをカラムにアプライした。バッチ結合の後にだけ、カラムを直立にし、溶液を排出し、捕集し、そしてもう一度樹脂を通過させた。いずれも場合にも、ライセートがアプライされた後、４〜５カラム体積のカラム結合バッファーでカラムを洗浄した。いくつかの場合には、１〜２カラム体積のカラム洗浄バッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２０ｍＭのイミダゾール）でカラムをさらに洗浄した。１．５〜２．０カラム体積のカラム溶出バッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２５０ｍＭのイミダゾール）でタンパク質を溶出させ、これは、〜１．４ｍＬの留分に捕集された。緑色の留分を合わせ、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０サイズ排除カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））および１０ｍＬ／分の流速の冷却した融合タンパク質脱塩バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、４℃）の無勾配移動相を用いるＦＰＬＣ（バイオラド・バイオロジック・デュオロジック（ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ＤｕｏＬｏｇｉｃ）、ＱｕａｄＴｅｃ紫外可視検出器）によって脱塩した。脱塩したタンパク質を単一の留分として捕集して、アポロ（Ａｐｏｌｌｏ）２０ｍＬ濃縮器（ＱＭＷＬ１０ｋＤａ、オービタル・バイオサイエンシーズ（Ｏｒｂｉｔａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））において濃縮し、バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）タンパク質アッセイを用いて濃度を決定した。ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質は、サイズ排除クロマトグラフィで実証されるように単量体であった。次に、タンパク質溶液を５００μＬのアリコートに分割し、液体窒素で急速冷凍して−８０℃で貯蔵した。いったん解凍したら、作業用アリコートを４℃で貯蔵し、光から保護した。
【０１５９】
Ｅ．ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質の特徴付け
図１０Ａ〜１０Ｃに示されるように、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５のＱ１９７−Ｒ１９８の切断容易な結合に対するＡ型毒素の特異性は、ｒＬＣ／Ａにより切断される基質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析によって検証した。同様に、ＢｏＮＴ／ＥによるＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５のタンパク質分解が、期待されるＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−１８０）産物をもたらすことを実証した（図１０Ｄ〜１０Ｆ）。これらの結果は、ＧＦＰおよびヒスチジンタグを含有する合成基質、ならびにクロストリジウム毒素認識配列および切断部位を含有するＳＮＡＰ−２５の一部分が、関連のクロストリジウム毒素に有効な基質であり得ることを実証する。
【０１６０】
ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅタンパク質分解反応物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を以下のように実施した。ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５１３４−２０６基質（０．４ｍｇ／ｍＬ）を、毒素反応バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０μＭのＺｎＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ）中で、単鎖の未変性ＢｏＮＴ／Ｅ（５０．０μｇ／ｍＬ）、またはｒＬＣ／Ａ（０．１μｇ／ｍＬ）のいずれかと合わせた。反応物を３７℃でインキュベートし、０、５、１０、１５、３０、および６０分間のインキュベーション後にアリコートを取り出し、ゲルローディングバッファーに添加することによって失活させた。反応混合物は、サイプロ・ルビー（Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ）（バイオラド）により染色してＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＭＯＰＳ）によって分析するか、あるいはニトロセルロース膜に移してＧＦＰ、ＳＮＡＰ２５１３４−１９７またはＳＮＡＰ２５１３４−１８０に特異的な抗体で探査した。
【０１６１】
Ｆ．活性な組換えＢｏＮＴＡ型およびＥ型を含有する細胞ライセートの発現および同定
未精製の清澄化ＢＬ２１−コドン・プラス細胞ライセートを以下のように調製した。化学的にコンピテントな大腸菌ＢＬ２１−コドン・プラス（登録商標）（ＤＥ３）−ＲＩＬ細胞（ストラタジーン）をｐＥＴベクターで形質転換して、カナマイシン耐性を提供し、ＬＢ／ｋａｎ（５０μｇ／ｍＬ）プレートに広げ、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーから成長させた３ｍＬの培養物を用いて、１７５ｍＬの培養物をインキュベートした。これは、３７℃で振とうさせながら一晩インキュベートした。細胞を遠心分離によってペレットにし、１０ｍＬの２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４中に再懸濁し、超音波処理（３８％振幅の１０秒パルスにおいて１分４０秒）によって溶解した。ライセートを遠心分離（１６，０００ｒｐｍ、４℃、１時間）により清澄化し、０．４ｍＬのアリコートに分割し、液体窒素で急速冷凍して、−８０℃で貯蔵した。バイオラドタンパク質アッセイによって、清澄化ライセートのタンパク質含量は０．７ｍｇ／ｍＬであると決定した。
【０１６２】
トップ１０細胞ライセートを以下のように調製した。ジョアンヌ・ワン（Ｊｏａｎｎｅ  Ｗａｎｇ）により、アンピシリン耐性大腸菌ＴＯＰ１０細胞（インビトロジェン）の２０ｍＬ培養物が提供された。細胞を遠心分離によりペレットにし、２ｍＬのＤＴＴを含まない毒素反応バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン−２０、１０μＭのＺｎＣｌ２）中に再懸濁した。細胞を超音波処理（３８％振幅の１０秒パルスにおいて１分４０秒）により溶解した。遠心分離（１４０００ｒｐｍ、４℃、３０分）によりライセートを清澄化する前に、２つの２００μＬアリコートを回収した。作業用アリコート以外の全ての未精製の清澄化ライセートを液体窒素で急速冷凍し、−８０℃で貯蔵した。
【０１６３】
活性ＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ｅの遺伝子を潜在的にコードするプラスミドで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一のコロニーを用いて、１．０ｍＬの培養物を、オーバーナイト・エクスプレス（Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）ＴＭ自己誘導培地（ノバジェン）中でインキュベートし、ＢｏＮＴ／Ａ培養物は１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有し、ＢｏＮＴ／Ｅ培養物は、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有した。膜の蓋を備えたセーフロック（Ｓａｆｅ−Ｌｏｃｋ）チューブ（２ｍＬ、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ニューヨーク州ウェストベリー）を用いた。サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）Ｒ（エッペンドルフ）において３７℃、１４００ｒｐｍで、濁るまで（Ａ型では約３時間、そしてＥ型では７時間）培養物を成長させ、この時点で温度を低下させ、培養物を１６℃で一晩インキュベートした。遠心分離（６，０００×ｇ、４℃で１５分）により細胞を捕集し、必要とされるまで−８０℃で貯蔵した。
【０１６４】
活性毒素を発現する培養物を同定するために、清澄化細胞ライセートを調製し、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイにおいて試験した。細胞ペレットを氷上で解凍し、それぞれを、２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼヌクレアーゼと、Ａ型の細胞ペレットでは１．２ＫＵ／ｍＬのｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（登録商標）および１×プロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｃｏｃｋｔａｉｌ）ＩＩＩとを含有する５００μＬのバグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）（登録商標）タンパク質抽出試薬（４つの試薬は全てノバジェンから）で溶解した（サーモミキサーＲにおいて２３℃、３００ｒｐｍで２０分間）。遠心分離（１６０００ｒｐｍ、４℃において２０分間）によってライセートを清澄化し、上澄み溶液を新しい微量遠心管に移した。アッセイ反応物は、総体積５０μＬの毒素反応バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１０μＭのＺｎＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン−２０）中に、１０μＬの清澄化ライセートおよび１０μＭ（Ａ型）または１５μＭ（Ｅ型）のＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質を含有した。２つのコントロール反応物を構築し、それぞれがライセートの代わりにｄＨ２Ｏを含有し、１つは０．０１μｇ／ｍＬの最終濃度のｒＬＣ／Ｅを含有した。全ての反応物を３通り構築し、３７℃で４０分間（Ａ型反応）または１時間（Ｅ型反応）インキュベートした。反応を失活させ、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイの一般的な手順で以下に記載されるように加工した。
【０１６５】
実施例ＩＩ
ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５の蛍光放出アッセイ
この実施例では、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）の特異的なタンパク質分解と、蛍光放出アッセイを用いたタンパク質分解の定量化とが記載される。
【０１６６】
Ａ．ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５の蛍光放出アッセイの概観
ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５の蛍光放出アッセイの概要は、図１０Ｇに示される。反応混合物の加工は、エンドペプチダーゼ生成ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−１９７）切断産物からの未反応ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５の固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）分離を容易にするポリヒスチジン親和性タグの存在に依存した。概観として、処理済基質を以下のように加工した。まず、適切な軽鎖（亜鉛メタロプロテアーゼ）または予め低減されたボツリヌス神経毒素（血清型Ａ、Ｃ、またはＥ）に基質を添加することによって溶液相反応を開始させた。以下にさらに記載される条件下における所望される時間のインキュベーションに続いて、１〜２Ｍの最終濃度まで塩化グアニジウムを添加することによって、反応を失活させた。反応の終了後、未反応基質を、ＩＭＡＣ樹脂上のエンドペプチダーゼ生成ＧＦＰ含有産物（ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−１９７））から分離した。ポリヒスチジンタグ付き種を結合するためにＣｏ２＋樹脂を含有するスピンカラムまたは９６ウェルのフィルタープレートに反応混合物をアプライした。タンパク質分解によってポリヒスチジン親和性タグから解放されるＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−１９７）断片は、第１の「フロースルー」留分において樹脂を通過するが、未反応基質は樹脂に結合したままである。フロースルー留分の捕集に続いて、樹脂をバッファーで洗浄して、未反応ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質をイミダゾールで溶出させる前に、残留ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−１９７）を除去した。ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−１９７）切断産物およびＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質の両方の捕集は、蛍光による産物および未反応基質の両方の定量化を容易にする。次に、エンドペプチダーゼ産物（および、所望される場合には未反応基質）の相対蛍光を毒素濃度に対してプロットすることができる。
【０１６７】
Ｂ．溶液相クロストリジウムタンパク質分解反応
クロストリジウム毒素のプロテアーゼ反応を以下のように実行した。毒素、組換え毒素、または組換えＬＣ／ＡまたはＬＣ／Ｅを、２×毒素反応バッファー（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２または７．４、２０μＭのＺｎＣｌ２、２０ｍＭのＤＴＴ、０．２％（ｖ／ｖ）のＢＳＡまたはトゥイーン−２０）で所望の反応濃度の２倍に希釈し、最終反応体積の半分に等しいアリコートで黒色ｖ底９６ウェルプレート（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）、ニュージャージー州クリフトン）または微量遠心管に添加した。それぞれの軽鎖または毒素サンプルを３７℃で２０分間プレインキュベートした。反応の開始前に、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質を無菌ｄｄＨ２Ｏで所望の反応濃度の２倍に希釈し、３７℃に温めた。最終反応体積の半分に等しいアリコートでそれぞれのウェルまたは管に基質を添加することによって反応を開始させた。標準反応における基質の最終濃度は、１０〜１６μＭであった。反応容器を密封し、光から保護し、３７℃でインキュベートした。インキュベーション時間は、経時的反応がしばしばより長い時間かかったことを除いて通常９０分であり、反応を３通り実行した。インキュベーション時間の最後、または特定の時点で、８Ｍのグアニジン塩酸塩を１〜２Ｍの最終濃度まで添加することによって反応または反応アリコートを失活させ、続いて、以下のように加工した。
【０１６８】
Ｃ．蛍光切断産物の分離
サンプルを以下のように加工し、全てのステップは、−１５ｉｎＨｇにおける溶出のためにＵｎｉＶａｃ（登録商標）真空マニホールド（ワットマン）を用いて手動で実施するか、あるいはフィルタープレートへの樹脂の添加を除いて、Ｂｉｏｍｅｋ−ＦＸ液体ハンドリングシステム（ベックマン／コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ）、カリフォルニア州フラートン）において実施した。９６ウェルフィルタープレート（４００μＬまたは８００μＬのウェル、０．４５μｍのフィルター、ロングドリップ、イノベーティブマイクロプレート（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）、マサチューセッツ州チコピー）内の必要とされる数のウェルに、７５μＬのタロン（Ｔａｌｏｎ）ＴＭスーパーフロー（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）Ｃｏ２＋親和性樹脂（ベクトン・ディッキンンソン・バイオサイエンシーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を負荷した。樹脂貯蔵バッファーを真空除去し、４カラム体積のｄｄＨ２Ｏおよび４カラム体積のアッセイリンスバッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で洗浄することによって樹脂を条件付けた。使用する直前に、アッセイリンスバッファーの最後のアリコートを樹脂から溶出させた。
【０１６９】
グアニジン塩酸塩で失活させた後、条件付けされたＣｏ２＋樹脂を含有するフィルタープレートウェルに反応溶液を移し、室温で１５分間インキュベートした。次に、反応溶液を溶出させ、黒色平底９６ウェルプレート（ＢＤファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））に捕集し、樹脂床をさらに２回通過させ、最後の通過の後に捕集した。次に各樹脂床を２×１３５μＬのアッセイリンスバッファーで洗浄し、これを、ＧＦＰ産物を含有する溶出反応溶液を含有するプレート内に溶出させた。
【０１７０】
いくつかの場合には、樹脂床を３×２５０μＬのアッセイリンスバッファーで洗浄した後に未反応基質を捕集した。次に、２６０μＬのアッセイ溶出バッファー５００（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのイミダゾール）により未反応基質を樹脂床から溶出させ、黒色平底９６ウェルプレート（ＢＤファルコン）に捕集した。スペクトラマックス・ジェミニ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ）ＸＳ分光光度計（モレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、λＥｘ４７４ｎｍ、λＥｍ５０９ｎｍ、４９５ｎｍカットオフフィルター）を用いて、反応フロースルーおよびイミダゾール溶出溶液の蛍光を定量化した。
【０１７１】
Ｄ．ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５蛍光放出アッセイの結果
ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５蛍光放出アッセイの結果は、以下に要約される。未反応の出発材料を容易に測定する能力は、反応の内部コントロールを提供し、基質が産物に完全に転換されることを実証するのに役立った（一例として図１１Ｃを参照）。組換え軽鎖Ａ型（ｒＬＣ／Ａ）ならびにボツリヌス神経毒素血清型ＡおよびＥのタンパク質分解活性をピコモル濃度で検出した。また、血清型Ｃが活性のための膜の存在を必要とし、概して乏しいインビトロ活性を有するという文献報告（バイディアナサン（Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７２：３２７−３３７頁（１９９９年）、フォラン（Ｆｏｒａｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：２６３０−２６３６頁（１９９６年）、ブラージ（Ｂｌａｓｉ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：４８２１−４８２８頁（１９９３年））と一致して、ＢｏＮＴ／Ｃ複合体の酵素活性は低ナノモル濃度で検出した。
【０１７２】
組換えＡ型軽鎖（ｒＬＣ／Ａ）活性
図１１Ａに示されるにようにＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５蛍光放出アッセイによりｒＬＣ／Ａの活性を効率的に測定した。基質濃度が１６μＭである反応では、９〜１，２５０ｐＭの濃度範囲におけるｒＬＣ／Ａは、７３０から２４，０００を超える相対蛍光単位（ＲＦＵ）を有する反応産物をもたらした。図１１Ａにおいてさらに実証されるように、３６ｐＭのｒＬＣ／Ａ濃度において顕著なシグナルを測定した。
【０１７３】
１５０ｋＤａのＢｏＮＴ／Ａ（純粋なＡ）毒素活性
また、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５蛍光放出アッセイにより未変性のＢｏＮＴ／Ａ毒素の活性を効率的に測定した（図１１Ｂを参照）。基質濃度が１６μＭである反応では、１７〜１，０００ｐＭの濃度範囲における未変性の純粋なＢｏＮＴ／Ａは、４，６００からほとんど２４，０００の相対蛍光単位を有する反応産物をもたらした。図１１Ｂは、さらに、１７ｐＭの純粋なＢｏＮＴ／Ａ濃度において顕著なシグナルが測定されたことを示す。
【０１７４】
９００ｋＤａのＢｏＮＴ／Ａ（バルク）毒素活性
ＢｏＮＴ／Ａ複合体は、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質の切断に非常に効率的であり、６ｐＭのバルクのＢｏＮＴ／Ａ毒素複合体は、バックグラウンドの１９倍であるシグナルをもたらした（図１１Ｃを参照）。基質濃度が１６μＭである反応では、３〜８９ｐＭの濃度範囲におけるＢｏＮＴ／Ａは、２，６００から６０，０００を超える（相対蛍光単位）を有する反応産物をもたらした（図１１Ｃ）。
【０１７５】
１４６ｋＤａのＢｏＮＴ／Ｅ（純粋なＥ）毒素活性
ＢｏＮＴ／Ａとは違って、単鎖（ＳＣ）ＢｏＮＴ／Ｅは、クロストリジウムによって、活性化二鎖形態を形成するように切れ目を入れられない。未変性の単鎖ＢｏＮＴ／Ｅ毒素の活性化は、トリプシンでの毒素の外因的な処理によって達成することができる。図１２Ａおよび１２Ｂにそれぞれ示されるように、未変性の単鎖および二鎖ＢｏＮＴ／ＥはいずれもＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質を切断した。二鎖形態をもたらすための単鎖ＢｏＮＴ／Ｅのトリプシンニッキングは、血清型Ｅのタンパク質分解活性を実質的に増大させる。
【０１７６】
図１２Ａに示されるように、基質濃度が１６μＭである反応では、２〜２１ｎＭの濃度範囲における未変性の単鎖ＢｏＮＴ／Ｅは、約３，８００〜２２，０００の相対蛍光単位を有する反応産物をもたらした。図１２Ｂに示されるように、同じ反応条件下の未変性の二鎖ＢｏＮＴ／Ｅの特異的な活性ははるかに大きかった。１７〜１，５４６ｐＭの濃度範囲では、二鎖ＢｏＮＴ／Ｅは、約１，２００〜１９，０００の相対蛍光単位を有する反応産物をもたらした。
【０１７７】
ＢｏＮＴ／Ｃ複合体の活性
上記のように、ＢｏＮＴ／Ｃは、インビボでシンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５の両方を切断することがわかっており、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ基質内のＢｏＮＴ／Ｃ切断部位は、ＳＮＡＰ２５のＡｒｇ１９８−Ａｌａ１９９に存在する。ＢｏＮＴ／Ｃ複合体とのインキュベーションによってＧＦＰ−ＳＮＡＰ基質をＣ型の基質としてアッセイした。図１２Ｃに示されるように、ＧＦＰ−ＳＮＡＰは、ＢｏＮＴ／Ｃ活性を検出することができるが、、ＢｏＮＴ／Ａまたは／Ｅ活性ほど容易には検出されない。基質濃度が１６μＭである反応では、血清型Ｃの乏しいインビトロ活性の文献報告、およびＢｏＮＴ／Ｃが効率的な酵素活性のために膜の存在を必要とし得るという報告（バイディアナサンら、上記、１９９９年、フォランら、上記、１９９６年、ブラージら、上記、１９９３年）と一致して、４〜６０ｎＭの濃度範囲における未変性のＢｏＮＴ／Ｃは、約３，８００〜２２，０００の相対蛍光単位を有する反応産物をもたらした。
【０１７８】
実施例ＩＩＩ
組換えＧＦＰ−ＳＮＡＰ−２５基質によるアッセイ条件の変化
この実施例では、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５蛍光放出アッセイの変化および最適化が記載される。
【０１７９】
Ａ．アッセイの最適化：ＢＳＡ対トゥイーン−２０
初めに、タンパク質キャリア／安定剤としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する毒素反応バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１０μＭのＺｎＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、および０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中で、ＧＦＰ−ＳＮＡＰアッセイを実行した。いくつかのボツリヌス神経毒素アッセイのための反応バッファーは、ＢＳＡではなく洗剤トゥイーン−２０を含有する。ＢｏＮＴ反応に対するこれらのタンパク質安定剤の影響を比較する研究によって、血清型Ａ、Ｃ、およびＥは全て、ＢＳＡと比べて０．１％（ｖ／ｖ）のトゥイーン−２０の存在下で著しく高い活性を有することが明らかになった。これらの結果は、ＢＳＡの代わりにトゥイーン−２０を使用すると、ＢｏＮＴ／Ａ、／Ｃおよび／Ｅの活性がより高くなることを示す。
【０１８０】
Ｂ．アッセイの最適化：ｐＨ
プロテアーゼ反応バッファーのｐＨを７．０〜８．２の範囲内で変化させた。バルクＡ毒素はｐＨ７．２において最も活性であったが、Ｅ型二鎖はｐＨ７．０において最も活性であった。ＧＦＰ融合タンパク質基質の蛍光は酸性条件下で失活されるので、７よりも低いｐＨ値はアッセイしなかった（エコングら、Ｄｅｖ．Ａｎｉｍａｌ  Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．２７：１０３９−１０４４頁（１９９７年））。バルクＡ毒素の活性は、高ｐＨで最も効率的なプロセス（ハリス（Ｈａｌｌｉｓ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：１９３４−１９３８頁（１９９６年））で、複合体からの毒素および軽鎖の放出に依存することがわかっているが、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質で得られる結果は、合成遺伝子から発現されるｒＬＣ／Ａの最適なｐＨはｐＨ７．２であり、この最適条件の両側で活性はかなり急速に降下することを示すことと一致する。対照的に、Ｅ型毒素のｐＨの優先度はバルクＡほど顕著ではなく、Ｅ型活性は、ｐＨ８．２でも完全には除去されなかった。
【０１８１】
バルクＡ毒素および純粋なＥ二鎖毒素のｐＨプロファイルを以下のように決定した。記載される点を除いて、上記のＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイの一般的な手順に従って、最適な毒素反応ｐＨを決定した。７つの２×毒素反応バッファー溶液をｐＨ７．００、７．２０、７．４１、７．６０、７．８０、８．０１、および８．２４において調製した。これらのバッファーを用いて毒素希釈物を調製した。毒素の最終反応濃度は、８９ｐＭの未変性ＢｏＮＴ／Ａ複合体および２０３ｐＭの未変性の純粋なＥ二鎖であった。９０分のインキュベーション後に反応を失活させた。
【０１８２】
Ｃ．アッセイの最適化：ジチオスレイトール依存性
バルクＡ毒素を用いて、１０ｍＭのジチオスレイトールとのプレインキュベーション時間が不足すると、単に、切断産物の産生が遅くなることを観察した。対照的に、ジチオスレイトールがないと、活性は本質的に完全に失われる。
【０１８３】
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）依存性についてのバルクＢｏＮＴ／Ａ毒素のＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５経時的アッセイは、以下のように実施した。以下の点を除いて、上記のＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイの一般的な手順に従って、バルクＡ活性のＤＴＴへの依存性およびプレインキュベーション時間の必要性を試験した。バルクＡ毒素の最初の希釈は、ＤＴＴを用いずに２×毒素反応バッファー中で行った。この溶液からアリコートを取り出して、一方はＤＴＴを含有する毒素反応バッファー中、他方はＤＴＴを含まない同じバッファー中において、さらなる希釈物を調製した。バッファー溶液を予め３０℃に温めた。４つのタイプの反応と、１つの基質のみのコントロールとを、それぞれ３通り構築した。２つの反応セットはＤＴＴを含有し、２つは含有せず、それぞれのタイプの１つのセットだけは反応の開始前に３０℃で２０分間プレインキュベートした。バルクＡをストック溶液から移してから、「プレインキュベーションなし」反応の開始までに経過した時間は１．５分であった。基質のみのコントロール反応はＤＴＴを含有しなかったが、プレインキュベートした。最終反応体積は４００μＬであり、４４ｐＭのバルクＡおよび１６μＭのＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質を含有した。５０μＬのアリコートを各反応から取り出し、１５、３０、４５、６０、および９０分の時点で２０μＬのグアニジンＨＣｌで失活させた。
【０１８４】
Ｄ．切断容易な結合が変化した突然変異体ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質を用いて実証された毒素切断の特異性
上記のように、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイにおいて使用される融合タンパク質基質は、ＳＮＡＰ−２５の残基１３４−２０６を含有する。ＢｏＮＴ／Ａは、残基Ａｌａ１９７とＡｒｇ１９８の間でＳＮＡＰ−２５を切断するが、ＢｏＮＴ／Ｃは、残基Ａｒｇ１９８とＡｌａ１９９の間の近接ペプチド結合を切断する。Ａｒｇ１９８のアラニンへの転換は、特定のアッセイ（シュミットら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４３５：６１−６４頁（１９９８年））において検出可能なＢｏＮＴ／Ａによる加水分解を排除し、またおそらくＢｏＮＴ／Ｃによるタンパク質分解も排除することが示されている。従って、Ａｒｇ１９８からＡｌａへの変化が部位特異的変異誘発によりＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質内に導入されて、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（Ｒ１９８Ａ）で示されるコントロール融合タンパク質が作成された。
【０１８５】
ＢｏＮＴ／Ｅの切断部位は、残基Ａｒｇ１８０とＩｌｅ１８１の間に存在するが、単一残基の突然変異が、加水分解を排除することは示されていない。変化によって導入される電荷の反転および立体的な差異の理由から、可能性のあるコントロール基質としてＡｒｇ１８０のアスパラギン酸塩への突然変異を選択した。この突然変異を含有するＧＦＰ−ＳＮＡＰ基質類似体は、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ（Ｒ１８０Ｄ）で示される。
【０１８６】
標準ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）基質について本質的に上記で記載されたとおりに、融合タンパク質基質突然変異体Ｒ１９８Ａ＃２、Ｒ１９８Ａ＃４およびＲ１８０Ｄを発現および精製した。次に、比較的高い濃度の毒素（４．５ｎＭのｒＬＣ／Ａ、６．８ｎＭの未変性の純粋なＥ二鎖、および６０ｎＭのＢｏＮＴ／Ｃ複合体）と共に、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイ条件下で突然変異体基質を試験した。図１３において実証されるように、高い毒素濃度にもかかわらず、ｒＬＣ／ＡによるＲ１９８Ａ突然変異体の切断は実質的に存在せず、さらに、ＢｏＮＴ／Ｃ複合体による切断は、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質で見られるレベルの約１４％（〜４×バックグラウンドシグナルと言い換えることができる）まで低減された。切断容易な結合の部位において基質に導入される立体的な差異および電荷の反転にもかかわらず、シグナルは１１×バックグラウンドシグナルよりも大きいままであったが、Ｒ１８０Ｄ突然変異体のＢｏＮＴ／Ｅによるタンパク質分解は、標準基質タンパク質分解の約１５％まで著しく低減された。
【０１８７】
Ｅ型毒素によるＲ１８０Ｄタンパク質分解の分析を繰り返して、結果が再現可能であることを確認し、Ａｓｐ１８０／Ｉｌｅ１８１結合における切断を検証した。反応産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、Ｒ１８０Ｄ突然変異体はＥ型により部分的に切断され、産生されたより大きい断片は、標準ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質のタンパク質分解によって産生されるものと同じ見かけ上の分子量を有することが確認された。
【０１８８】
毒素タンパク質分解実験に加えて、基質のトリプシン消化を実施した。ＧＦＰはプロナーゼ以外のプロテアーゼに耐性であることが示されている（米国特許第５，９６５，６９９号明細書）ので、基質のＧＦＰ部分はインタクトのままであることが期待された。期待されたとおり、ＧＦＰの本質的に全ては、トリプシン消化により放出された。
【０１８９】
ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質のトリプシン消化を以下のとおりに実施した。スピンカラムおよびフィルター（３５μｍ細孔径、モビテック（ＭｏＢｉＴｅｃ）、独国ゲッティンゲン）を５μＬのアガロースビーズ結合トリプシン（２４．１Ｕ／ｍＬの充填ゲル、シグマ）で充填した。融合タンパク質基質（ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５および突然変異体Ｒ１９８Ａ＃４およびＲ１８０Ｄ）を消化バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ）中で３０μｇ／１５μＬの濃度に希釈した。反応を２通り実行し、トリプシンゲルを含有するスピンカラムに１５μＬの基質溶液を添加することによって開始した。３０℃で１時間のインキュベーションの後、反応産物を遠心分離により溶出させ、１．７ｍＬの微量遠心管に捕集した。各樹脂床を４０μＬの消化バッファーで洗浄し、これを溶出させ、反応溶液と同じ管に捕集した。次に、上記のフィルター−プレート加工方法に従ってサンプルを加工した。
【０１９０】
Ｅ．未精製ライセート中の内在性プロテアーゼによる融合タンパク質基質の切断
基質突然変異体Ｒ１８０ＤおよびＲ１９８Ａは、細胞ライセートにおける毒素活性を内在性プロテアーゼのタンパク質分解活性と区別するために、基質コントロールとしての役割を果たす。本質的に、ライセートにおける非毒素タンパク質分解は、コントロール基質からのシグナルに反映され得るが、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５シグナルは、毒素および内在性プロテアーゼの合わせた活性を反映し得る。
【０１９１】
２つのタイプの大腸菌細胞からのライセートをアッセイした。１つ目は、ＢＬ２１−コドン・プラス（登録商標）（ＤＥ３）−ＲＩＬからのライセートであり、ｒＬＣ／Ａおよび融合タンパク質基質を発現するように形質転換されたプロテアーゼ欠損細胞株であった。毒素の代わりに５μＬまたは２０μＬのいずれかの清澄化ライセートを含有させた点を除いて、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイ条件を模倣するように反応を構築した。図１４Ａに示されるように、基質のいずれかのタンパク質分解がわずかに存在した。Ｒ１８０Ｄを含有する反応のシグナルだけが、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイにおいて通常見られるバックグラウンドシグナルを上回る。プロテアーゼ欠損のないトップ１０（登録商標）細胞からの細胞ライセートもアッセイした。これらの実験では、２０μＬの清澄化ライセートが含有され、この場合も加水分解のレベルは無視できる程度であった（図１４Ｂ）。これらの結果は、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質のタンパク質分解がクロストリジウム毒素に特異的であり、細胞ライセート（ｃｅｌｌ  ｌｙｓｔａｔｅ）に内在性の他のプロテアーゼによるものではないことを示す。
【０１９２】
未精製の清澄化細胞ライセートにおける融合タンパク質基質のタンパク質分解を以下のように実施した。大腸菌ＢＬ２１−コドン・プラス（登録商標）（ＤＥ３）−ＲＩＬ細胞（ストラタジーン）または大腸菌トップ１０細胞（インビトロジェン）からの５μＬまたは２０μＬの未精製の清澄化ライセートを含有する反応を構築し、ＧＦＰ基質（ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５、Ｒ１９８Ａ、またはＲ１８０Ｄ）を１６μＭの最終濃度まで添加することによって開始させた。２×毒素反応バッファー（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２０μＭのＺｎＣｌ２、２０ｍＭのＤＴＴ、０．２％（ｖ／ｖ）のトゥイーン−２０）で基質希釈物を調製し、最終濃度がおよそ１×毒素反応バッファーになるように、さらに５μＬの２×毒素反応バッファーを各反応に含有させた。全ての場合において、最終反応体積は５０μＬであり、反応は３通り実行した。コントロール反応では、細胞ライセートの代わりに無菌ｄｄＨ２Ｏを含有させた。反応を３７℃で１時間インキュベートし、１５μＬの８Ｍのグアニジン塩酸塩で失活させ、上記のフィルター−プレート加工方法に従って加工した。
【０１９３】
Ｆ．ｒＬＣ／Ａの動態学的データ
ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５蛍光放出アッセイがＫＭに隣接する基質濃度範囲にわたって敏感であるかどうか、そして必要とされる基質濃度が標準の加工条件下で適応され得るかどうかを決定するために、いくつかの反応および加工条件を探索した。基質濃度の範囲にわたって単一の毒素濃度で一連の経時的アッセイを実行することによってデータを得た。反応の長さおよび樹脂体積などの反応条件および加工の詳細は、アッセイ間で変更した。これらの初期試験では、全ての反応は１７８ｐＭのｒＬＣ／Ａを含有し、基質濃度は、２．５〜８０μＭで変化させた。
【０１９４】
動態学的分析方法には、データのプロットへの曲線の非線形フィッティングと、これらの曲線からの初期基質速度の決定と、最後に、ｖｍａｘおよびＫｍの推定のために基質濃度に対して初期速度をプロットすることとが含まれた。初期プロットは、この毒素濃度において４．６μＭの予備Ｋｍ値を提供する（図１５および１６）。あるいは、アッセイはこの基質濃度において何度も実行され得る。
【０１９５】
公知のＡ型毒素の速度定数は表６に示されており、そのほとんどはＨＰＬＣに基づくアッセイを用いて決定されたものである。
【表６】
2008509667.tif 000011
【０１９６】
０．０１μｇ／ｍＬ（０．１８ｎＭ）の最終毒素濃度を用いて、動態学的分析のためのｒＬＣ／Ａの経時的アッセイを実施したが、基質濃度は、２．５〜８０μＭで変化させた。ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイの一般的な手順に基づいて記載されるようにそれぞれの基質濃度で、３つの反応と、１〜３つの基質のみのコントロールを構築し、反応を２〜７時間インキュベートした。４分の時点から開始して、反応の経過と共に５０μＬ（８０μＭ基質反応では３０μＬ）のアリコートを回収し、２０μＬの８Ｍのグアニジン塩酸塩で失活させた。ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイの一般的な手順に基づいて、失活させたサンプルを上記のように加工した。
【０１９７】
Ｇ．単一のＢＯＴＯＸ（登録商標）バイアルのＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５蛍光放出アッセイ
上記の結果から、ＧＦＰ−ＳＮＡＰアッセイは、単一のＢＯＴＯＸ（登録商標）バイアルの内容物をアッセイするのに十分に敏感である。しかしながら、ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、上記の標準条件下でＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５基質を著しくは切断しなかった。特に、ＢＯＴＯＸ（登録商標）には、塩含量（〜０．８８ｍｇのＮａＣｌ／バイアル）および多量のＨＳＡ（〜０．５ｍｇ／バイアル）が存在する。塩を除去するための透析ステップは、結果的にバックグラウンド蛍光を増大させ、著しいタンパク質分解を生じなかった。タンパク質分解またはＨｉｓタグ付き種の精製樹脂への結合を妨害し得るＨＳＡを除去するために、１００，０００ＭＷＣＯ膜を有するテフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）被覆された透析ユニットを用いてＢＯＴＯＸ（登録商標）バイアル内容物を透析した。バイアルの内容物を１００μＬのｄＨ２Ｏ中に再懸濁し、透析に続いて、１００％の毒素がバイアルから移され、透析後に回収されたと仮定して、最終反応のそれぞれにバイアルからの約１／５の毒素を含有させた。２つのバイアルの内容物を全部で６つの反応においてアッセイし、プラセボコントロールバイアルも３通りにアッセイした。図１７に示されるように、ＢＯＴＯＸ（登録商標）シグナルは、バックグラウンドの１５倍で容易に検出可能であった。これらの結果は、処方ＢＯＴＯＸ（登録商標）産物の高ＮａＣｌおよびＨＳＡ含量がＧＦＰ−ＮＡＰ２５蛍光放出アッセイを妨害し得ることを示す。これらの結果はさらに、透析または別の方法によるＮａＣｌおよびヒト血清アルブミンの除去の後に、本明細書に開示されるＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５蛍光放出アッセイを用いてＢＯＴＯＸ（登録商標）または他の処方毒素産物をアッセイ可能であることを示す。
【０１９８】
ＢＯＴＯＸ（登録商標）のＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイを以下のとおりに実施した。ＢＯＴＯＸ（登録商標）の２つのバイアルの内容物を、それぞれ１００μＬの無菌ｄＨ２Ｏ中に溶解し、同じ透析ユニット（ファースト・スピン・ダイアライザー（Ｆａｓｔ  Ｓｐｉｎ  Ｄｉａｌｉｚｅｒ）、ハーバード・アパレイタス（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）、１００，０００ＭＷＣＯ）に移した。単一のプラセボバイアルの内容物も１００μＬの無菌ｄＨ２Ｏ中に溶解し、同じタイプだがより小さい体積の透析ユニットに移した。２×１ＬのＢＯＴＯＸ透析バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１０μＭのＺｎＣｌ２）に対して毒素溶液を透析し、プラセボ溶液を２×５００ｍＬのＢＯＴＯＸ透析バッファーに対して透析し、全透析時間は室温で１時間であった。透析に続いて、１４０μＬのＢＯＴＯＸ溶液を、３０℃に予め温めた３５μＬのＢＯＴＯＸ反応バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１０μＭのＺｎＣｌ２、０．１７％（ｖ／ｖ）のトゥイーン−２０、１６ｍＭのＤＴＴ）と合わせた。８０μＬのプラセボ溶液を２０μＬのＢＯＴＯＸ反応バッファーと合わせた。両方の溶液を３０℃で２０分間プレインキュベートした。ＢＯＴＯＸ反応バッファーでＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５希釈物（４０μＭまで）を調製した。２５μＬのＢＯＴＯＸまたはプラセボ溶液のいずれかを２５μＬの基質溶液と合わせることによって反応を開始させた。６つのＢＯＴＯＸ反応および３つのプラセボコントロール反応を開始させ、３０℃で３時間５分インキュベートした。２０μＬの８Ｍのグアニジン塩酸塩で反応を失活させ、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイの上記の一般的な手順に記載されるように加工した。
【０１９９】
上記で括弧内あるいは別の形で提供され、以前に記載されていてもいなくても、全ての雑誌の記事、参考文献および特許の引用は、その全体が参照によって本明細書中に援用される。
【０２００】
本発明は上記で提供された例に関して説明されたが、本発明の趣旨から逸脱することなく様々な変更が成され得ることは理解されるべきである。従って本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】図１は、クロストリジウム神経毒素の活性化の推定構造および仮定機序の図を示す。毒素は、ループによってつながった三つの５０ｋＤａドメインより成る、１５０ｋＤａの単一ポリペプチド鎖として生産できる。選択的タンパク分解切断が、ジスルフィド結合した二つの鎖：５０ｋＤａのＬ鎖および１００ｋＤａのＨ鎖（ＨＮおよびＨＣと示される二つのドメインより構成される）を生成することにより該毒素を活性化する。三つのドメインは別個の働きをする：重鎖のＣ末ドメイン（ＨＣ）は、細胞結合において機能し、一方重鎖のＮ末ドメイン（ＨＮ）は、エンドソームから細胞質へのトランスロケーションを可能にする。細胞内におけるジスルフィド結合の還元に続き、Ｌ鎖の亜鉛−エンドペプチダーゼ活性が発生する。
【図２】図２は、中枢および末梢神経における破傷風およびボツリヌス毒素活性に必要な４つの段階の図を示す。
【図３】図３は、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰおよびシンタキシンの細胞膜における細胞内局在および切断部位を示す。ＶＡＭＰはシナプス小胞膜に結合し、一方ＳＮＡＰ−２５およびシンタキシンは標的細胞膜に結合している。ＢｏＮＴ／Ａおよび／ＥはＳＡＮＰ−２５をＣ末端付近で切断し、９または２６残基をそれぞれ放出する。ＢｏＮＴ／Ｂ、／Ｄ、／Ｆ、／ＧおよびＴｅＮＴは、ＶＡＭＰの中心保存部分（ドット）に作用し、ＶＡＭＰのアミノ末端部分を細胞質に放出する。ＢｏＮＴ／Ｃ１は、カルボシキ末端でＳＮＡＰ−２５を切断し、同様にシンタキシンを細胞質内膜表面近くの単一の部位で切断する。ＢｏＮＴ／Ｂ、／Ｃ１、／Ｄ、／Ｆ、／ＧおよびＴｅＮＴの作用により、ＶＡＭＰまたはシンタキシンの細胞内ドメインの大部分が放出されるが、一方ＢｏＮＴ／Ａ、／Ｃ１、または／Ｅによる選択的タンパク分解よっては、ＳＮＡＰ−２５のほんの小さな部分しか放出されない。
【図４Ａ】図４Ａは、ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５およびシンタキシンの神経毒素認識モチーフを示す。斜線ボックスは、三つのクロストリジウム毒素の標的に共通するモチーフの存在および部分を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５およびシンタキシンの神経毒素認識モチーフを示す。認識部位は、疎水性残基（「ｈ」）；負の電荷を帯びたＡｓｐまたはＧｌｕ残基（「−」）および極性残基（「ｐ」）；「ｘ」はいずれかのアミノ酸を示す。本モチーフは、ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５およびシンタキシンのα‐ヘリカル構造をとると予想される領域に含まれる。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５およびシンタキシンの神経毒素認識モチーフを示す。α‐ヘリカル構造における本モチーフを上から見た図が示される。負の電荷を帯びた残基が一方の面にならび、一方疎水性残基は第二の面に並ぶ。
【図５】図５は、様々なＳＮＡＰ−２５タンパク質のアライメントを示す。ヒトＳＮＡＰ−２５（配列番号：２）ジーンバンクアクセション g4507099、関連ヒトＳＮＡＰ−２５配列 g2135800も参照）；マウスＳＮＡＰ−２５（配列番号：１２、ジーンバンクアクセション G6755588）;Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＳＮＡＰ−２５ (配列番号：１３、ジーンバンクアクセション g548941）; ゴールドフィッシュＳＡＮＰ−２５（配列番号：１４、ジーンバンクアクセション g2133923);ウニＳＮＡＰ−２５（配列番号：１５、ジーンバンクアクセション g2707818）およびチキンＳＮＡＰ−２５（配列番号：１６、ジーンバンクアクセション g481202）が描かれている。
【図６】図６は、様々なＶＡＭＰタンパク質のアライメントを示す。ヒトＶＡＭＰ−１ (配列番号：９６; ジーンバンクアクセション g135093); ヒトＶＡＭＰ−２ (配列番号： ４; ジーンバンクアクセション g135094); マウスＶＡＭＰ−２ (配列番号：１７; ジーンバンクアクセション g2501081); ウシＶＡＭＰ (配列番号：１８; ジーンバンクアクセション g89782); カエルＶＡＭＰ (配列番号：１９; ジーンバンクアクセション g6094391);およびウニＶＡＭＰ (配列番号：２０; ジーンバンクアクセション g5031415)が描かれている。
【図７】図７は、様々なシンタキシンタンパク質のアライメントを示す。ヒトシンタキシン １Ａ (配列番号：２１; ジーンバンクアクセション g15079184), ヒトシンタキシン １Ｂ２ (配列番号：２２; ジーンバンクアクセション g15072437), マウスシンタキシン １Ａ (配列番号：２３; ジーンバンクアクセション g15011853), Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ シンタキシン １Ａ (配列番号：２４; ジーンバンクアクセション g2501095); Ｃ. ｅｌｅｇａｎｓ シンタキシン Ａ (配列番号：２５; ジーンバンクアクセション g7511662) およびウニシンタキシン(配列番号：２６; ジーンバンクアクセション g13310402)が描かれている。
【図８Ａ】図８Ａは、プラスミドｐＱＢＩ  ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）の概略図を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）−６ＸＨＩＳの核酸およびアミノ酸配列（配列番号：８５および８６）を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、プラスミドｐＱＢＩ  ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）−ＧＦＰの概略図を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、６ＸＨＩＳ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）−ＧＦＰの核酸およびアミノ酸配列（配列番号：８７および８８）を示す。
【図１０】図１０は、ｒＬＣ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅのタンパク質分解反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を示す。Ａ、ＢおよびＣはｒＬＣ／Ａのタンパク質分解反応を示し、Ｄ、ＥおよびＦはＢｏＮＴ／Ｅのタンパク質分解反応を示す。Ａ：ｒＬＣ／Ａと共に０、５、１０、１５、３０および６０分間インキュベートしたサンプルのサイプロ・ルビー（Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ）染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。Ｂ：抗ＧＦＰ一次抗体で探索するウエスタンブロットを示す。Ｃ：ＳＮＡＰ２５１９７タンパク質分解産物のＣ末端に特異的な抗体で探索するウエスタンブロットを示す。タンパク質バンドは、完全なＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）部分では２０６、およびｒＬＣ／Ａ加工されたＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−１９７）では１９７であると同定した。Ｄ：ＢｏＮＴ／Ｅと共に０、５、１０、１５、３０および６０分間インキュベートしたサンプルのサイプロ・ルビー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。Ｅ：抗ＧＦＰ一次抗体で探索するウエスタンブロットを示す。Ｆ：ＳＮＡＰ２５１８０タンパク質分解産物のＣ末端に特異的な抗体で探索するウエスタンブロットを示す。２０６であると同定されたタンパク質バンドは、完全なＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）部分を表し、１８０であると同定されたタンパク質バンドは、ＢｏＮＴ／Ｅ加工されたＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−１８０）を表す。Ｇ：ＧＦＰ−ＳＮＡＰ蛍光放出アッセイの概要図を示す。
【図１１Ａ】図１１は、組換え軽鎖、未変性およびバルクＡ毒素のエンドペプチダーゼ活性を示す。図１１Ａは、組換えＡ型軽鎖のエンドペプチダーゼ活性を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、組換え軽鎖、未変性およびバルクＡ毒素のエンドペプチダーゼ活性を示す。図１１Ｂは、未変性ＢｏＮＴ／Ａ二鎖毒素のエンドペプチダーゼ活性を示す。
【図１１Ｃ】図１１は、組換え軽鎖、未変性およびバルクＡ毒素のエンドペプチダーゼ活性を示す。図１１Ｃは、バルクＡ毒素のエンドペプチダーゼ活性を示す。
【図１２Ａ】図１２は、未変性ＢｏＮＴ／Ｅ単鎖、未変性ＢｏＮＴ／Ｅ二鎖およびＢｏＮＴ／Ｃ複合体のエンドペプチダーゼ活性を示す。図１２Ａは、未変性単鎖ＢｏＮＴ／Ｅ毒素のエンドプロテアーゼ活性を示す。
【図１２Ｂ】図１２は、未変性ＢｏＮＴ／Ｅ単鎖、未変性ＢｏＮＴ／Ｅ二鎖およびＢｏＮＴ／Ｃ複合体のエンドペプチダーゼ活性を示す。図１２Ｂは、未変性ＢｏＮＴ／Ｅ二鎖（ＤＣ）のエンドプロテアーゼ活性を示す。
【図１２Ｃ】図１２は、未変性ＢｏＮＴ／Ｅ単鎖、未変性ＢｏＮＴ／Ｅ二鎖およびＢｏＮＴ／Ｃ複合体のエンドペプチダーゼ活性を示す。図１２Ｃは、ＢｏＮＴ／Ｃ複合体のエンドペプチダーゼ活性を示す。
【図１３】図１３は、ＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５（１３４−２０６）融合タンパク質基質、ならびに切断容易な結合に突然変異Ｒ１９８ＡおよびＲ１８０Ｄを含有する基質類似体のタンパク質分解を示す。
【図１４Ａ】図１４は、未精製細胞ライセートを用いた融合タンパク質基質のタンパク質分解を示す。図１４Ａは、コドン・プラス（Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ）（登録商標）細胞ライセートを示す。
【図１４Ｂ】図１４は、未精製細胞ライセートを用いた融合タンパク質基質のタンパク質分解を示す。図１４Ｂは、ネガティブコントロールのトップ（ＴＯＰ）１０（登録商標）細胞ライセートを示す。
【図１５】図１５は、ｒＬＣ／Ａの動態学的分析のために収集されたデータの代表例を示す。左のグラフは、７時間の反応の間に収集されたデータに適合された非線形曲線を示す。右のグラフは非線形プロットの最初の線形部分を示し、これらの線の傾きは、規定の基質濃度における初期反応速度（ＲＦＵ／分）である。
【図１６】図１６は、１７８ｐＭのｒＬＣ／Ａ活性の予備データのプロットを示し、Ｋｍが約４．６μＭであることが示される。
【図１７】図１７は、２本のＢＯＴＯＸ（登録商標）バイアルのＧＦＰ−ＳＮＡＰ２５アッセイを示す。
【図１】
2008509667.tif 000012
【図２】
2008509667.tif 000013
【図３】
2008509667.tif 000014
【図４Ａ】
2008509667.tif 000015
【図４Ｂ】
2008509667.tif 000016
【図４Ｃ】
2008509667.tif 000017
【図５】
2008509667.tif 000018
【図６】
2008509667.tif 000019
【図７】
2008509667.tif 000020
【図８Ａ】
2008509667.tif 000021
【図８Ｂ】
2008509667.tif 000022
【図９Ａ】
2008509667.tif 000023
【図９Ｂ】
2008509667.tif 000024
【図１０】
2008509667.tif 000025
【図１１Ａ】
2008509667.tif 000026
【図１１Ｂ】
2008509667.tif 000027
【図１１Ｃ】
2008509667.tif 000028
【図１２Ａ】
2008509667.tif 000029
【図１２Ｂ】
2008509667.tif 000030
【図１２Ｃ】
2008509667.tif 000031
【図１３】
2008509667.tif 000032
【図１４Ａ】
2008509667.tif 000033
【図１４Ｂ】
2008509667.tif 000034
【図１５】
2008509667.tif 000035
【図１６】
2008509667.tif 000036
【図１７】
2008509667.tif 000037
【配列表】
2008509667000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月12日(2007.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008509667000001.app
【国際調査報告】
2008509667.tif 000073
2008509667.tif 000074
2008509667.tif 000075
2008509667.tif 000076