(57)【要約】本発明は、Ｅimeria tenella 種の寄生体に属する新規接合子スポロキストタンパク質（ＥtＯs２２）、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含有するベクター、これらのベクターにより形質転換された細胞、該タンパク質に対する抗体、該ポリヌクレオチド、該タンパク質やそれらのフラグメント、上記ベクターまたは該タンパク質に対する抗体を含有するワクチンに関し、Eimeriaによる感染を処置するための活性な化合物を見出すためのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、およびEimeria感染の治療に適当である活性な化合物、の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号：１または３に記載の配列；または
ｂ）配列番号：１または３に記載の配列を有するポリヌクレオチドと、５０％以上の同一性を示すポリヌクレオチド；または
ｃ）ストリジェントな条件下で、配列番号：１または３に記載の配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
ｄ）配列番号：２に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
ｅ）配列番号：２に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと５０％以上の同一性を示すポリヌクレオチド；または
ｆ）ストリジェントな条件下で、配列番号：２に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
ｇ）遺伝子コードの縮重のために、配列番号：１に記載の配列を有するポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド；
ｈ）ａ）からｇ）に記載のポリヌクレオチドのフラグメントであって、少なくとも６ヌクレオチド長である、ポリヌクレオチド；
を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされ、少なくとも８アミノ酸長である、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ベクターまたは発現系。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターまたは発現系を担持する、宿主細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の宿主細胞を用いる請求項２に記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項６】
請求項２に記載のポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする、抗体。
【請求項７】
殺寄生虫薬として請求項６に記載の抗体の使用。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出するための方法であって、請求項１に記載のポリヌクレオチドが、生物学的サンプル由来の核酸物質とハイブリダイズされ、該ハイブリダイゼーションが検出される、方法。
【請求項９】
ハイブリダイゼーションがポリメラーゼ連鎖反応を用いて検出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが、請求項６に記載の抗体の結合によって検出される、請求項２に記載のポリペプチドを検出するための方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２に記載のポリペプチドを検出するための組成物であって、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６記載の抗体を含む、組成物。
【請求項１２】
ワクチンを産生するための、
ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；または
ｂ）請求項２に記載のポリペプチド；または
ｃ）請求項３に記載のベクターまたは発現系；または
ｄ）請求項６記載の抗体、の使用。
【請求項１３】
ａ）請求項２記載のポリペプチド；または
ｂ）請求項３に記載のベクター；または
ｃ）請求項６記載の抗体、を含むワクチン。
【請求項１４】
スポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢中にＥｔＯＳ２２タンパク質の活性を調節する活性な化合物を見出す方法であって、
ａ）試験物質がＥｔＯＳ２２ポリペプチドに特異的に結合し得る選択された条件で、試験されるべき活性な化合物を、請求項２に記載のＥｔＯＳ２２ポリペプチドと接触させる；および
ｂ）行われた該ポリペプチドへの特異的な結合を検出する；
工程を含み、
ポリペプチドに結合する活性を有する化合物がコクシジウム症を処置するための可能性のある活性な化合物として同定される方法。
【請求項１５】
スポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢中にＥｔＯＳ２２タンパク質の活性を調節する活性な化合物を見出すための方法であって、
ａ）試験物質がＥｔＯＳ２２ポリペプチドに特異的に結合し得る選択された条件で、試験されるべき活性な化合物を、請求項２に記載のＥｔＯＳ２２ポリペプチドと接触させる；および
ｂ）請求項２に記載のポリペプチド、またはＥｔＯＳ２２タンパク質の活性調節を検出する；
工程を含み、
活性を調節する活性を有する化合物が、コクシジウム症を処置するための可能性のある活性な化合物として同定される方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法のうちの一つを用いて見出され得る、活性な化合物。
【請求項１７】
スポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢中にＥｔＯＳ２２タンパク質の活性を調節する、活性な化合物。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の活性な化合物および医薬的に許容し得る添加剤を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
コクシジウム症を処置するための医薬品製造のための、スポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢中にＥｔＯＳ２２タンパク質の活性を調節する、活性な化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Eimeria tenella種の寄生体に属する新規接合子スポロキストタンパク質(ＥｔＯＳ２２)に関し、このタンパク質をコードしているポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含有するベクター、これらのベクターで形質転換された細胞、該タンパク質に対する抗体、該ポリヌクレオチド、該タンパク質、またはそれらのフラグメント、上記ベクターまたは該タンパク質に対する抗体を含むワクチンに関し、Eimeriaによる感染を処置するための活性な化合物を見い出すためのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、およびEimeria感染の治療に適当である活性な化合物、の使用に関する。
【０００２】
Eimeria属の寄生体は、順次有性および無性生殖の発生段階を生じる複雑なライフサイクルを持つ必須の細胞内にある原生動物である。Eimeria tenella生物体は、家畜用ニワトリ(Gallus domesticus)の盲腸中に生存し、ヒト病原体Toxoplasma gondii、Plasmodium falciparumおよびCryptosporidium parvumに近縁で、重要な動物病原体であるSarcocystis属、Neospora属、Babesia属およびTheileria属に関係する。LEVINE(1980)による原生動物の系統的分類によると、これらの属の代表的なものはアピコンプレックス門に属する。
【０００３】
Eimeria tenellaは、ヒナドリおよびメンドリの強力なフロア管理に関連する経済的に重要な問題となってきた疾患である、飼鳥類コクシジウム症の原因物である。コクシジウム症疾患の病態には、深刻な経済ダメージを引き起こし得る観血性下痢（bloody diarrheas）が含まれ、結果として、このメンドリの飼料摂取の減退および体重低下を引き起こす深刻な経済的ダメージを引き起こし得る。Eimeria tenellaとは異なり、他の６種類のEimeria種:Eimeria acervulina、Eimeriamaxima、Eimeria brunetti、Eimeria necatrixおよびEimeriapraecoxは家畜用メンドリ（domestic hen）における、コクシジウム症疾患の原因となる。
【０００４】
アピコンプレックス寄生体の感染形態(スポロゾイトやメロゾイト)は、他の胞子虫亜門とは明確に異なる特定の形態学的特性によって特徴付けられる。最も重要な特徴は、前方細胞腔での「アピカル・コンプレックス」の存在と考えられ、この複合体は、３つの分泌オルガネラ（ロプトリー、ミクロネームおよび密顆粒）と、また極輪およびペリクル下微小管を所有する構造を形成するコノイドも含まれる。
【０００５】
Eimeria tenellaは、家畜用メンドリ(Gallus gallus)においてモノキサン（monoxene）発生を経験する。寄生体は厳格な宿主特異性および細胞内編性である。増殖は、上皮細胞および盲腸の粘膜下組織で起こる。家畜用メンドリは、食料を探している時にEimeria tenellaに感染する。胞子形成した接合子が摂取され、砂嚢中で物理的処理された後、成熟した休眠スポロゾイトは、トリプシンおよび胆汁塩の影響下において小腸中のスチーダ小体（stieda body）と呼ばれているスポロキストから放出される。スポロゾイトは、移動性となり、寄生体を有する液胞を形成している間に盲腸中で宿主細胞にコロニーを形成する。寄生体を有する液胞は、リソソーム消化から細胞内寄生体を保護する。その保護中に、多核性シゾントが形成される。シゾゴニー(メロゴニー)は、寄生体の無性生殖を構成する。移動性メロゾイトは、ロゼットの形でシゾントを摘み出す（pincht）。それらが放出された後、メロゾイトは盲腸細胞付近でシゾントの３世代先までに定着する。急性感染中、シゾゴニーのサイクルは、腸の出血、体重低下を導き得る広範な腸損傷を生じさせ、重度な感染の場合では宿主を死亡させ得る。シゾゴニーのサイクルが終結するようになった後、ガモゴニーは、配偶子に成熟する多核性雄性ミクロガモントと単核性雌性マクロガモントの形成を開始する。雌性大配偶子は、好酸性の「全形成」体を含み、それは受精後、融合して接合子壁を作る。６日の前顕性時間が終了した後に、新しい接合子が分泌される。接合子の分泌と共に、この感染が終結し、宿主が種特異性免疫性を獲得する。
【０００６】
診断
メンドリでのコクシジウム症の種を、正確に、迅速にかつ安価に同定する能力は、感染の予防および処置のために可能性のある最も重要事である。現在、LongとReid(1982)の方法は、接合子形態(顕微鏡）、宿主特異性、腸における損傷の病状および前顕性時間に従って、メンドリにおいて７種のEimeriaを同定するために慣例的に使用されている。これに加えて、イソ酵素パターンの方法によって生物学的特徴分析を有効とする試みがある。この方法では、糖代謝酵素は、大部分の酵素図を構築するための遺伝的マーカーとして使用されている (JohnstonおよびFemando 1997)。経験は、従来的、形態学的な、描写方法または生物化学的方法のいずれかを用いる場合には、種の正確な判別は、不十分または部分的に達成され得るだけであることを示している。従って、組換えＤＮＡレベルで種を特徴づけ得ることが望ましい。非常に少ない相反する調査結果が、この分野では得られてきた(Comes et al. 1996)。Eimeria種の生物学的差違は、ＤＮＡ多形性の形態における遺伝的差違が様々な種において存在することによると示唆されている。多形性は、塩基変化(欠失、挿入)の結果として、または染色体再配列の結果として生じ得る。元々血縁分析のために開発されたＤＮＡフィンガー・プリント法において、変異性ＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され、放射性ＤＮＡプローブとハイブリダイズされ、ゲル電気泳動およびサザンブロット後に、オートラジオグラフィーで可視化される。この方法で作成されてきた遺伝子のフィンガー・プリント法は、生物の種および株を明白に区別するために使用され得る。ＲＡＰＤ−ＰＣＲ法「ランダムに増幅した多形性ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction）」は、この方法の簡略化を提供する。この方法は、ランダムヌクレオチド配列を有する１つのプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)において、ゲノムＤＮＡを増幅することを基にしている。アガロースゲル上で分離され、エチジウムブロマイドで染色された後、増幅されたＤＮＡセグメント(ＲＡＰＤ−ＰＣＲマーカー)から、特異的なバンドのパターンを得る。しかし、この方法は、互いに純粋株を区別するためだけに使用され得る。野外の単離物(様々なEimeria種の混合物)で種を同定するには、これらの技術は使用できない。技術の簡略化に加えて、より経済的な方法は、特異的な遺伝子配列を基にした特異的なプローブを見出すことであろう。すなわち、内部翻訳スペーサーＩＴＳ１(Schnitzler et al. 1998)およびＩＴＳ２(Gasser et al.2001)領域、さらにEimeria acervulina種虫抗原(EASZ 240/160)(Molloy et al. 1998)由来のリボゾームＤＮＡの既知配列(EllisおよびBumstead 1990)は、この目的のために使用される。
【０００７】
治療
年額少なくとも３００ミリオンＵＳドルにのぼる抗コクシジウム剤が、現在この疾患の治療に使用されている。ｌ９７０年以来、化学療法処置は、特にポリエステルイオノフォア、モネンシン、ナラシン、サリノマイシンおよびラサドヒドを用いて、実施されている。さらに、寄生体段階のＤＮＡ合成またはタンパク質合成を阻害する数多くの活性な化合物は、市場に存在している(Greif 2001)。しかし、本治療は、重大な問題および／または不利益をこうむる。メンドリにおいて深刻な薬物担持(食用組織中に残留する問題)および生態毒性/生態汚染(環境の)とは別に、薬剤耐性の進化が、抗コクシジウム症の処置に関する大きな問題と考えられている。シャトルまたはローテーションプログラムと言われるものを用い、そして新規の作用機構(Coombs 2002)に対する高額の探索によって進化する耐性に打ち勝つ試みがなされている。そのため、Eimeria感染を処置するための改善された活性な化合物およびこれらの活性な化合物を見出す方法を緊急に必要としている。
【０００８】
ワクチン接種
免疫予防(ワクチン接種)は、コクシジウム症の化学療法を処置するための非常に良好な代替法である。Eimeria種と接触する１つの病原体は、二次相同感染に対して実質的に完全な免疫性を導く(RoseおよびWakelin1990)。１日齢のヒナドリは、１６-２５日期間にわたる寄生体段階の連続投与により、Eimeria tenella、EimeriaacervulinaおよびEimeria maximaに対する天然の免疫性を誘導させる(StiffおよびBafundo 1993)。保護的配偶子母細胞抗原を用いて産卵メンドリを免疫化すると、ふ化したヒナドリでの免疫状態が改善される。このストラテジーは、「母系免疫化」(Wallach 1992)としてWallachによって開発された。
【０００９】
完全に毒性Eimeria株(接合子生ワクチン)を用いるワクチンプログラムは、市販品Immucox(登録商標)(Vetech Laboratories, Canada）および Coccivac（登録商標)(Sterwin Laboratories, USA）を用いて、現在実施されている。製品Paracox（登録商標)(Schering Plough, England) および Livacox(登録商標)(Williams 2002)は、漸先形毒性株と呼ばれるものに基にしている。ポリエステル耐性毒性生ワクチンは、最近市場に登場した(Vermeulen 2001)。全てにおいて、１３の接合子含有生ワクチンは、現在、メンドリにおけるコクシジウム症に対する免疫化用に登録されている(Chapman et al. 2002, Williams 2002)。
【００１０】
しかし、市場にでているこれら全てのワクチンは、製造コストが高いという経済的欠点および接合子の継代を必要とする家畜管理を欠点としてもつ。別の問題は、市場にでている生ワクチンが元の病原性の型に戻る変異をし得るということである。
【００１１】
そのため、好ましくは、生ワクチンでない利用し得る改良されたワクチンを作成することが、緊急に必要とされている。
【００１２】
保護的抗原と呼ばれるものを基にしている組換えワクチン(サブユニットワクチン)の遺伝子操作による開発は、全ての免疫化方法において「理想的なゴール」であると考えられている。保護的抗原は、病原体/宿主細胞相互作用中に、細胞認識、細胞接着および細胞侵入において重要な機能を有する寄生体中の構造的化合物であり、また、おそらくその機能は今までに知られていない他のタンパク質である。保護的なEimeria tenella抗原に対するこれまでの探索には、表面抗原、内部小器官抗原、また接合子、スポロゾイトおよびメロゾイトの勾配単離された器官抗体が包含される(Vermeulen,1998)。すでに既知のタンパク質についての遺伝子配列を念入りに探索するのとは別として、ＥＳＴ(発現された配列タグ)のランダム探索(Wang et al. 1999)またはファージ・ディスプレイライブラリー(Silva, A. et al. 2002)が、新規の遺伝子および標的を見出すために使用される。
【００１３】
Danforth ら(1985)は、組換えＤＮＡ技術を基にしてイン・ビトロでの６０-７０ｋＤａのEimeria tenella 抗原を初めて調製した。この実験から、いくつかの選択的なEimeria tenella 接合子抗原(Clark 1986, Crane et al. 1991, Bhogal et al. 1992, Eschenbacher et al. 1996)、Eimeria tenella 種虫抗原(Files et al. 1987, Miller et al. 1989)およびEimeria tenella メロゾイト抗原(Ko et al. 1990, Binger et al. 1993)が、組換的に調製された。Craneら(1991)は、組換えEimeria tenella 抗原を用いて、メンドリで４つのEimeria種に対する交差反応性保護を誘導した。しかし、組換え抗原を用いる免疫化に関する多くの試みにもかかわらず、これまで満足のいく結果は得られなかったが、そのことは以前には知られていなかった抗原およびそれら付随する遺伝子配列を同定する大きな必要性があるということを意味する(Jenkins 1998, Vermeulen 2001)。
【００１４】
本発明の説明
本発明は、Eimeria tenella種の寄生体由来の新規接合子スポロキスト（胞子嚢子）タンパク質(ＥｔＯＳ２２)に関する。
【００１５】
本発明は、このタンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。配列番号:１は、新規Eimeria tenella 接合子スポロキストタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する完全長mＲＮＡを示す。タンパク質(配列番号：２)をコードするオープン・リーディング・フレーム(ＯＲＦ)は、配列番号：３に示される。
【００１６】
さらに、本発明は、Eimeria tenella種の寄生体からの新規タンパク質ＥｔＯＳ２２が、スポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢に関与し、結果として寄生体のライフサイクルに重要であるという知見を基にしている。脱嚢は、ＥｔＯＳ２２に対する抗体によって阻害され得る。
【００１７】
ＥｔＯＳ２２は、１つのコードしているエキソンからなるイントロン欠損遺伝子である。５９４bpのサイズであるＥｔＯＳ２２遺伝子のＯＲＦは、ゲノムクローン２２５７２４２.c００７１０１０２１.Ｃontig1 (７１.８６４bp、ステータス:０３.０３.２００３)における２つのコピーに存在する。しかし、ＥｔＯＳ２２は、おそらく、Eimeria tenella ゲノムにおいて実質的には２以上のコピーを生じる。
【００１８】
本発明は、
ａ）配列番号：１または３に記載の配列を有するポリヌクレオチドと比べて、５０％、６０％、７０％または８０％、好ましくは８５％または９０％以上、特に好ましくは９５％、９７％以上の同一性を示すポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号：１または３に記載の配列を有するポリヌクレオチドと比べて、ストリジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号：２に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと比べて、５０％、６０％、７０％以上または８０％、好ましくは８５％以上または９０％、特に好ましくは９５％または９７％以上の同一性を示すポリヌクレオチド;
ｄ）ストリジェントな条件下で、配列番号：２に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｅ）遺伝子コードの縮重により、配列番号：１に記載のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド；および
ｆ）ａ）からｅ）に記載のポリヌクレオチドのフラグメントであって、少なくとも６個のヌクレオチドまたは８個のヌクレオチド長、好ましくは１０または２０個以上のヌクレオチド長、特に好ましくは５０個または１００個のヌクレオチド長、特に好ましくは２００個または５００個以上のヌクレオチド長であるポリヌクレオチド、
に関する。
【００１９】
配列配列番号：１または３を有するポリヌクレオチド、および上記ａ）からｆ）のポリヌクレオチドは、以下においてＥｔＯＳ２２ポリヌクレオチドと呼ぶ。
【００２０】
さらに、本発明は、ａ）からｆ）に記載の核酸によってコードされ、少なくとも８つのアミノ酸長であるポリペプチドに関する。このポリペプチド、および配列番号：２に記載のポリペプチドは、以下においてＥｔＯＳ２２ポリペプチドと呼ぶ。
【００２１】
本発明は、ａ）からｆ）に記載の少なくとも一つのポリヌクレオチドおよび発現制御配列を含有する、発現系またはベクターに関する。この発現系は、本発明のＥｔＯＳ２２ポリペプチドの発現を可能にする。
【００２２】
この関連において、ＥｔＯＳ２２の発現は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあるのが好ましい。ＢＧＨ(ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化シグナルは、順に転写を停止させ、mＲＮＡのポリアデニル化に関与する。
【００２３】
特に好ましい発現制御配列の例は、初期または後期ＳＶ４０またはアデノウイルスプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、主要なオペレーターおよびファージλのプロモーター領域、ｆｄエンベロープタンパク質の制御領域、３-ホスホグリセレート・キナーゼ・プロモーター、酸性ホスファターゼプロモーターおよび酵母α交配ファクタープロモーターである。
【００２４】
本発明は、上記ベクターまたは発現系を担持する宿主細胞に関する。
【００２５】
宿主細胞の好ましい例は、Ｅ.coli、Pseudomonas、Bacillus、Streptomyces、酵母細胞、ＣＨＯ細胞、ＲＩ.１細胞、Ｂ−Ｗ細胞、Ｌ−Ｍ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞およびＢＭＴ１０細胞、植物細胞、昆虫細胞および細胞培養中の哺乳動物細胞である。真核生物系の発現は、特に好ましくは、バキュロウイルス系、特に翻訳修飾後の導入が許容される系である。
【００２６】
本発明は、上記ＥｔＯＳ２２ポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。この関連において、その融合タンパク質は、融合タンパク質の付加的活性に関連する別のポリペプチド部分［例えば、β−ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、緑色蛍光性のタンパク質(ＧＦＰ)、自己蛍光性タンパク質、例えば青色蛍光性タンパク質(ＢＦＰ)、グルタチオンＳトランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルキシダーゼ(ＨＲＰ)およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)]を含み得る。さらに、または別のエピトープタグは、融合タンパク質の一部[例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素(ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグまたはチオレドキシン(Ｔｒｘ)タグ]を形成する。融合タンパク質は、マルトース-結合タンパク質(ＭＢＰ)、Ｓタグ、ＬｅｘＤＮＡ-結合ドメイン、ＧＡＬ４ＤＮＡ-結合ドメインまたはヘルペス単純ウイルス(ＨＳＶ)ＢＰ１６タンパク質も含みうる。
【００２７】
本発明は、適切な原核生物または真核生物発現系において、上記のとおりにＥｔＯＳ２２ポリペプチドまたは融合タンパク質の調製方法にも関する。この関連において、該発現は、上記のとおり、各ケースで適切である細胞系において、または適切な宿主細胞において、永続的または一時的に影響され得る。既知の宿主/ベクター系、例えば細菌類(例えば、Streptomyces spp.、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、Serratia marcescens、特にEscherichia coli)は、適当な原核生物発現系である。
【００２８】
本発明は、Eimeria属、好ましくはEimeria acervulina、Eimeria maxima、Eimeria brunetti、Eimeria necatrix、Eimeria praecoxおよび、特に好ましくはEimria tenellaの寄生体由来のポリヌクレオチドを検出するためのＥｔＯＳ２２ポリヌクレオチドの使用に関する。この関連において、本発明は、上記寄生体由来のポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るポリヌクレオチドに関する。本発明は、特にこれらのポリヌクレオチド：
ａ）ノーザンまたはサザンブロッド・アッセイにおけるプローブ、
ｂ）ミクロアレイまたはマクロアレイに結合されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、
ｃ）上記寄生体を診断するために使用されるＰＣＲまたは類似方法のためのプライマー、このプライマーおよびＰＣＲ技術を用いて、問題の寄生体のＤＮＡが特異的に同定され、増幅される、
の使用に関する。
【００２９】
本発明は、ＥｔＯＳ２２ポリペプチドのエピトープと特異的に反応する抗体に関する。
【００３０】
本発明は、特にＥｔＯＳ２２ポリペプチドのエピトープと特異的に反応するモノクローナル抗体に関する。
【００３１】
本発明は、殺寄生虫薬としての上記抗体の使用に関する。該抗体は、好ましくは、Ｅimeria感染の処置、特に好ましくはEimeria tenella感染の処置に使用される。上記抗体は、飼鳥類の感染を処置するために使用されるのが好ましく、ニワトリの感染を処置するために使用されるのが特に好ましい。
【００３２】
診断
さらに、本発明は、Eimeria感染、好ましくはEimeria tenella感染を診断するための、ＥｔＯＳ２２ポリヌクレオチドまたはＥｔＯＳ２２ポリペプチドに対する上記抗体の使用に関する。
【００３３】
本発明は、ＥｔＯＳ２２ポリヌクレオチドまたはＥｔＯＳ２２ポリペプチドに対する抗体、診断方法を実施するための指示書を含むキットにも関する。
【００３４】
ワクチン
本発明は、飼鳥類、好ましくはニワトリを免疫化するための免疫原組成物の調製方法にも関し、この組成物は、本発明の少なくとも１つの上記ＥｔＯＳ２２ポリペプチドまたは少なくとも１つの上記抗体を含む。
【００３５】
本発明は、宿主中の保護的免疫応答を活性化する目的のために宿主において投与されるべき免疫原組成物を調製するための上記ＥｔＯＳ２２ポリヌクレオチドの１つを含有する上記発現ベクターの使用に関し、この免疫応答は、Eimeria ＥｔＯＳ２２-相同性タンパク質に対するか、またはEimeria tenella ＥｔＯＳ２２タンパク質に対する。
【００３６】
本発明は、コクシジウム症に対するワクチンを調製するための上記ＥｔＯＳ２２ポリペプチドの使用に関する。
【００３７】
本発明は、
１.
ａ）ｉ．寄生体段階から単離される、または
ｉｉ．イン・ビトロで合成的に調製される、または
ｉｉｉ．組換えＤＮＡ技術を用いて調製される、
少なくとも１つの上記ＥｔＯＳ２２ポリペプチド、
または
ｂ）上記ＥｔＯＳ２２ポリペプチドの１つを含む、上記のような融合タンパク質、
を含む不活性化ワクチンに関し；
そのポリペプチドまたは融合タンパク質が、アミド化、カルボキシル化またはリン酸化の方法によってイン・ビボまたはイン・ビトロで修飾されることが可能である、
２．
ａ）好ましくは、ＥｔＯＳ２２ポリペプチドの長期合成および抗原提示を生じさせ、結果として免疫系が刺激される、上記ＥｔＯＳ２２ポリヌクレオチドの１つを含有する、自己複製ベクター（例えば、細菌、真菌またはウイルス）、または
ｂ）ＥｔＯＳ２２ポリヌクレオチドを含むプラスミド、または
ｃ）純粋なＥｔＯＳ２２ポリヌクレオチド(ネイキッドＤＮＡ）、
を含むベクターワクチンに関し；
３．
ａ）ＥｔＯＳ２２ポリペプチドの免疫原エピトープに対する抗体、または
ｂ）抗イディオタイプ抗体、即ち、ＥｔＯＳ２２ポリペプチドに結合する抗体のイディオタイプに対する抗体、
を含む受動ワクチンに関する。
【００３８】
スクリーニング方法：
本発明は、配列番号：２に記載のＥｔＯＳ２２ポリペプチドの機能を調節し、それによってEimeriaスポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢を調節する活性な化合物（例えば小器官分子、ペプチドまたは抗体）を同定するための方法に関する。調節の程度は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、特に好ましくは少なくとも３０％および特に好ましくは少なくとも５０％である。
【００３９】
また、本発明は、スポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢と関連してＥｔＯＳ２２タンパク質の活性を調節する活性な化合物を見出すための方法に関し、その方法では、
ａ）試験物質がＥｔＯＳ２２ポリペプチドに特異的に結合し得る選択された条件で、試験されるべき活性な化合物を、請求項２記載のＥｔＯＳ２２ポリペプチドと接触させる；および
ｂ）行われたポリペプチドへの特異的結合を検出する；
工程を含み、
該ポリペプチドに結合する活性を有する化合物が、コクシジウム症を処置するための可能性のある活性な化合物として同定される、
方法に関する。
【００４０】
また、本発明は、スポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢に関連のあるＥｔＯＳ２２タンパク質の活性を調節する活性な化合物を見出すための方法であって、
ａ）試験物質がＥｔＯＳ２２ポリペプチドと特異的に結合できる選択された条件で、試験されるべき活性な化合物を、請求項２に記載のＥｔＯＳ２２ポリペプチドと接触させる；および
ｂ）請求項２に記載のポリペプチド、またはＥｔＯＳ２２タンパク質の活性調節を検出する；
工程を含み、
該活性を調節する活性を有する化合物が、コクシジウム症を処置するための可能性のある活性な化合物として同定される、
方法に関する。
【００４１】
本発明は、コクシジウム症を処置するための活性な化合物を見出す方法に関し、この方法では、ＥｔＯＳ２２タンパク質は、アフィニティー選択および質量分析法を基にした化学化合物のライブラリィーをスクリーニングするためのその組換え形態で使用される。スポロゾイト生存のために重要であるが、知られていない機能を有する標的タンパク質についての阻害剤を見出す目的のために、タンパク質についてのアフィニティーに関する物質ライブラリィーを試験するスクリーニン法を使用することが可能である。あるスクリーニングの可能性は物質混合物からのアフィニティー選択に関するものであり、このリガンドは質量分析器でその後に検出される。このために、決まった物質混合物を使用して、そこから個々の物質を、質量検出の補助を用いて同定することが必要である。このため、組み合わせた合成物から調製された物質混合物は、このスクリーニング法に特に適当である。
【００４２】
アフィニティー選択において顕著な物質は、別の試験、例えばEimeria tenellaのイン・ビトロ試験に供される。
【００４３】
本発明は、上記方法を用いて同定され、Eimeriaスポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢を調節するために適当である、新規の活性な化合物に関する。新規の活性な化合物は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、特に好ましくは少なくとも３０％および、特に好ましくは少なくとも５０％まで脱嚢を調節する。
【００４４】
本発明は、Eimeriaスポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢を調節する新規の活性な化合物に関する。新規の活性な化合物は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、特に好ましくは少なくとも３０％および特別に好ましくは少なくとも５０％まで脱嚢を調節する。
【００４５】
本発明は、Eimeriaにより、好ましくは感染され得るまたは感染された飼鳥類、好ましくはニワトリの予防的または治療的処置のための医薬物を製造するため、上記方法のうちの一つを用いて同定された新規の活性な化合物の使用にも関する。本発明の医薬品は、上記方法のうちの一つを用いて同定された少なくとも一つの活性な化合物を含み、経皮的、非経口的または経腸的に投与され得る。
【００４６】
本発明は、コクシジウム症の予防または治療的処置のための医薬物を産生するために、Eimeriaスポロキスト由来のスポロゾイトの脱嚢を、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、特に好ましくは少なくとも３０％および特に好ましくは少なくとも５０％まで調節する新規の活性な化合物の使用に関する。好ましくは、Eimeriaに感染され得るかまたは感染された好ましくは飼鳥類、特に好ましくはニワトリを処置するための医薬物を産生するために、活性な化合物を使用することである。本発明の医薬物は、上記方法を用いて同定される少なくとも一つの活性な化合物を含み、経皮的、非経口的または経腸的に投与され得る。
【００４７】
医薬組成物
活性な化合物は、予防的および治療的の両方に使用され得る。
活性な化合物は、直接または適当な剤形のいずれかで経腸的に、非経口的に、経皮的にまたは経鼻的に使用され得る。
【００４８】
活性な化合物は、経腸的に、例えば経口的に、粉体、座剤、錠剤、カプセル、軟膏、液剤、粒剤、水薬、丸薬（boli）、医薬用食品または飲料水の形態で使用される。それらは、経皮的、例えば浸積（dipping）、噴霧、入浴、洗浄、注出（pouring-on）およびスポッティング（spotting）および散布(powdering)の形態で使用される。それらは、非経腸的、例えば注射(筋肉内、皮下内、静脈内または腹膜内)の形態で、またはインプラントの手段によって使用され得る。
【００４９】
適当な製剤は、溶液、例えば、注射溶液、経口溶液、経口投与後の希釈の為の濃縮物、皮膚上または体腔に使用するための溶液、プアオン剤（pour-on formulations）、ゲル；経口または皮膚および注射にも使用するためのエマルジョンや懸濁液；半固体調製物；活性な化合物を軟膏基剤中または水中油型または油中水型エマルジョン基材中に納めた調剤；固形製剤、例えば、粉末、使用前の混合物または濃縮物、粒剤、ペレット、錠剤、丸薬およびカプセル；エーロゾルおよび吸入物、および活性な化合物を含有する成型体である。
【００５０】
注射溶液は、静脈内、筋肉内および皮下投与される。注射溶液は、適当な溶媒中に活性な化合物を溶解して、適切な場合には、添加剤、例えば可溶化剤、酸、塩基、緩衝塩類、抗酸化剤および保存剤を添加して、投与される。該溶液は、滅菌濾過され、瓶に詰められる。
【００５１】
記載してもよい溶媒は、生理学的に許容される溶媒、例えば水、アルコール、例えばエタノール、ブタノール、ベンジルアルコールおよびグリセロール、炭化水素、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびＮ−メチルピロリドンおよびそれらの混合物である。
【００５２】
活性な化合物は、適切な場合には、注射に適当である生理学的に許容される植物性または合成油中に溶解され得る。記載してもよい可溶化剤とは、主要溶媒中で活性な化合物の溶解を促進するか、または沈殿を防止する溶媒である。例示するものは、ポリビニルピロリドン、ポリエトキシル化ヒマシ油およびポリエトキシル化ソルビタンエステルである。
【００５３】
保存剤は、ベンジルアルコール、トリクロロブタノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルおよびｎ−ブタノールである。
【００５４】
経口溶液は直接的に使用される。濃縮物は、使用濃度に予め希釈された後に、経口的に使用される。経口溶液および濃縮物は、注射溶液の場合において上記のとおりに調製され、滅菌操作を伴って分配できる。
【００５５】
皮膚に使用するための溶液は、点滴され、塗布され、塗られ、散布されるかまたは噴霧または浸積、洗浄によって適用される。これらの溶液は、注射溶液の場合には上記のとおり調製される。
【００５６】
調製中に、増粘剤を添加することは有利であり得る。増粘剤は、無機増粘剤（例えばベントナイト、コロイド状ケイ酸およびステアリン酸アルミニウム）、および有機増粘剤（例えば、セルロース誘導体、ポリビニルアルコールおよびそれらの共重合体、アクリレートおよびメタクリレート）である。
【００５７】
ゲルは、皮膚に適用されるか、皮膚に塗り付けられるか、体腔に導入される。ゲルは、軟膏様の粘稠度を有する透明な練薬を製造するために、注射溶液の場合に上記のとおりに調製された溶液に十分な増粘剤を添加することによって調製される。上記増粘剤は、増粘剤として使用される。
【００５８】
プアオン剤は、皮膚の決まった領域上に注ぎ出されるか、噴霧されて、その活性な化合物が皮膚に浸透して全身に作用するか体表面で送達される。
【００５９】
プアオン剤は、適当な皮膚許容溶媒または溶媒混合物中に、活性な化合物を溶解すること、懸濁することまたは乳化することによって調製される。他の補助物質、例えば染料、吸収促進物質、抗酸化剤、光安定化剤および接着剤が、適切な場合には添加される。
【００６０】
記載してもよい溶媒は、水、アルカノール、アルカノール、グリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、芳香族アルコール、例えばベンジルアルコール、フェニルエタノールおよびフェノキシエタノール、エステル類、例えば酢酸エチル、酢酸ブチルおよび安息香酸ベンジル、エーテル類、例えばアルキレングリコール アルキルエーテル、例えば、ジプロピレングリコールモノエチルエーテルおよびジエチレングリコールモノブチルエーテル、ケトン類、例えばアセトンおよびメチルエチルケトン、芳香族および/または脂肪族炭化水素、植物性または合成油、ＤＭＦ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンおよび２-ジメチル-４-オキシメチレン-１,３-ジオキソランである。
【００６１】
染料は、動物において使用するために認可され、かつ溶解され得るか懸濁され得るあらゆる染料である。
【００６２】
吸収促進物質の例は、ＤＭＳＯ、分散油（spreading oils）、例えばミリスチン酸イソプロピル、ジプロピレングリコールペラルゴネート、シリコン油、脂肪酸エステル、トリグリセリドおよび脂肪アルコールである。
【００６３】
抗酸化剤は、亜硫酸塩またはメタ重亜硫酸、例えば、メタ重亜硫酸カリウム、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキアニソールおよびトコフェロールである。
【００６４】
光安定化剤の例は、ベンゾフェノン類またはノバンチソリン酸（novantisolic acid）らの物質である。
【００６５】
接着剤の例は、セルロース誘導体、スターチ誘導体、ポリアクリレートおよび天然のポリマー、例えばアルギネートおよびゼラチンである。
【００６６】
エマルジョンは、経口的、経皮的または注射として使用され得る。エマルジョンは、油中水型または水中油型のいずれかである。それらは、疎水性相または親水性相のいずれかに活性な化合物を溶解すること、そしてこの層と他の層の溶媒とを適当な乳化剤を用いて均質化すること、適切である場合には、その他の補助物質、例えば染料、吸収促進物質、保存剤、抗酸化剤、光安定化剤および粘度促進物質を用いて調製される。
【００６７】
記載してもよい疎水性相(油)は、パラフィン油、シリコン油、天然植物油、例えばゴマ油、アーモンド油およびヒマシ油、合成トリグリセリド、例えばカプリル/カプリン酸ビグリセリド、Ｃ８−１２鎖長の植物脂肪酸または他の具体的に選択された天然脂肪酸を含有するトリグリセリド混合物、飽和または不飽和の部分的グリセリド混合物、あるいはヒドロキシル基含有脂肪酸、およびＣ８／Ｃ１０脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド；脂肪酸エステル、例えばステアリン酸エチル、ジ−ｎ−ブチリルアジペート、ヘキシルラウレートおよびジプロピレングリコールペラルゴネート、Ｃ１６-Ｃｌ８鎖長の飽和脂肪アルコールと中程度の鎖長の分枝脂肪酸とのエステル、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、Ｃ１２-Ｃｌ８鎖長の飽和脂肪アルコールのカプリル/カプリン酸エステル、イソプロピルステアレート、オレイルオレエート、オレイン酸デシル、オレイン酸エチル、乳酸エチル、ワックス状脂肪酸エステル、例えばフタル酸ジブチルおよびジイソプロピルアジペートおよび後者に関するエステル混合物、および脂肪アルコール、例えばイソトリデシルアルコール、２−オクチルドデカノール、セチルステアリルアルコールおよびオレイルアルコールのカプリル/カプリン酸エステル；脂肪酸、例えばオレイン酸およびその混合物である。
【００６８】
記載してもよい親水性相は、水およびアルコール、例えばプロピレングリコール、グリセロールおよびソルビトールおよびそれらの混合物である。
【００６９】
記載してもよい乳化剤は、非イオン性界面活性剤、例えばポリエトキシル化ヒマシ油、ポリエトキシル化ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノステアレート、グリセロールモノステアレート、ポリオキシステアリン酸エチルおよびアルキルフェニルポリグリコールエーテル；両性界面活性剤、例えばジ-Ｎａ Ｎ−ラウリル−β−イミノジプロピオネートまたはレシチン；アニオン界面活性剤、例えばＮａラウリルスルフェート、脂肪アルコールエーテルスルフェートおよびモノ/ジアルキルポリグリコールエーテルオルトリン酸エステルのモノエタノールアミン塩;カチオン性界面活性剤、例えばセチルトリメチル塩化アンモニウムである。
【００７０】
記載してもよい他の補助物質は、粘度を増加させ、エマルジョンを安定化する物質、例えばカルボキシルメチルセルロース、メチルセルロースおよび他のセルロースおよびスターチ誘導体、ポリアクリレート、アルギネート、ゼラチン、アラビアガム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、メチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸を含むコポリマー、ポリエチレングリコール、ワックス状およびコロイド状ケイ酸、または列挙した物質の混合物である。
【００７１】
懸濁液は、経口的または経皮的または注射用として使用され得る。それらは、湿潤剤、染料、吸収促進物質、保存剤、抗酸化剤および光安定化剤などの追加の補助物質の存在が適当である場合、活性な化合物を担体液体中に懸濁することによって調製され得る。
【００７２】
記載してもよい担体液体は、全て均質溶媒および溶媒混合物である。
【００７３】
記載してもよい湿潤剤（分散剤)は、前記した界面活性剤である。
【００７４】
記載してもよい他の補助物質は、前記したものである。
【００７５】
半固体調製物は経口的または経皮的に投与され得る。それらは、高い粘着性において、上記懸濁液およびエマルジョンとは非常に異なる。
【００７６】
固体調製物を調製するために、活性な化合物は、追加の補助物質の存在が適当である場合、適当な担体物質と混合されて、所望の形態となる。
【００７７】
記載してもよい担体物質は、全ての生理学的に許容される固体不活性物質である。これらの不活性物質は、無機物質または有機物質であり得る。無機物質の例は、塩化ナトリウム、炭酸塩、例えば炭酸カルシウム、酸化アルミニウム、ケイ酸、土類金属（earths）、沈殿状またはコロイド状シリコン二酸化物;およびホスフェートである。
【００７８】
有機物質の例は、糖、セルロース、食料類（food stuff）および食餌類、例えばミルク粉末、動物飼料、小麦および粗挽のコーンミールおよびスターチである。
【００７９】
補助物質とは、保存剤、抗酸化剤および染料であって、これらはすでに上記しているものである。
【００８０】
他の適当な補助物質は、滑沢剤（lubricants）ならびに流動調節剤(glidant)（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ベントナイト）、崩壊促進物質（例えば、スターチまたは橋かけ結合したポリビニルピロリドン）、結合剤（例えば、スターチ、ゼラチンまたは直鎖ポリビニルピロリドン）ならびに乾燥結合剤（例えば、微晶質セルロース）である。
【００８１】
相同配列
本発明は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、ＥｔＯＳ２２核酸およびＥｔＯＳ２２ポリペプチドと各々相同性であって、当業者に利用され得る方法を用いて容易に単離されうる関連（同族）生物由来のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
【００８２】
これらの方法には、縮重プライマーを用いるＰＣＲ、低ストリンジェントな条件でプローブとしてＥｔＯＳ２２を用いる遺伝子ライブラリーのスクリーニング、およびモノクローナル抗体Ｅ２Ｅ５（Samhronk-and Russell, 2001)を用いる発現ライブラリーのスクリーニングが含まれる。
【００８３】
本発明は、類似した、かつ当業者には明らかな方法で、相同なポリヌクレオチドまたはポリペプチドを基にした上記診断薬、診断方法、ワクチン、スクリーニング方法および治療剤に関する。
【００８４】
定義
理解を深めるために、発明の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲で使用される特定の単語および用語の意味は、下記で詳細に説明される。
【００８５】
「ポリヌクレオチド」または「複数のポリヌクレオチド」は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖および一本鎖ＲＮＡ、コード鎖または相補鎖のいずれかとして存在し得るcＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、小さな干渉ＲＮＡ(siＲＮＡ）、核酸アナログ、例えばペプチド核酸(ＰＮＡ)、ロックされた核酸(ＬＮＡ)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、これは、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホラミデート、ホスフェートエステル、カルバメート、アセトアミデート（acetamidate）、カルボキシルメチルエステル、カーボネートおよびホスフェートトリエステルなどによる非ホスホジエステル結合により、一つのヌクレオチドの５'末端を、もう一方のヌクレオチドの３’末端に共有結合することによって合成され得る、アンチセンスオリゴヌクレオチドを意味すると解される。
【００８６】
用語、「相同性」「同一性」および「類似性」は、２つのペプチドまたは２つの核酸分子またはポリヌクレオチド間の配列類似性を意味する。相同性は、一つの配列のある一つの位置と、もう一つの配列において同じ位置とを比較することによって決定されうる。比較している配列中のある位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占有されているなら、この２つの分子は、この位置で相同である。配列間の相同性の程度は、その配列が互いに共有する合同または相同な位置の数の関数である。「非相同配列」は、同一性が４０％以下であるが、好ましくは同一性が２５％以下である。相同性または同一性は、特にコンピュータープログラム、例えばＧＣＧプログラム[Devereux et al. (1983), Nucleic Acids Res. 12，387-395]を用いて確立され得る。
【００８７】
「相同性」は、ポリヌクレオチドセグメントが別のポリヌクレオチドとハイブリダイズし得る場合に存在し得る。
【００８８】
用語「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」は、一本鎖ポリヌクレオチドが、相補的なＤＮＡ鎖と塩基対をつくる過程を説明するものであって、一本鎖ポリヌクレオチドのその能力はハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー（緊縮性）に依存する。
【００８９】
用語「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション条件を示す。「高ストリンジェンシー」は、塩基対形成がより困難となる条件である。「低ストリンジェンシー」は、塩基対形成が容易である条件である。
【００９０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者にはよく知られており、例えばSambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, ２nd ed., 1989, pp. 9.50-9. 51に記載されている。
【００９１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を得るために、温度および塩濃度の組合せは、一般的には、ハイブリッドの算定融解温度、Ｔｍ以下の約１２-２０℃であるように選択されるべきである。当業者には、同一性が１％低下するごとに、二本鎖ＤＮＡのＴｍが１-１.５℃低下することが知られている[Bonner etal.,J. Mol. Biol. 81, 213 (1973)]。配列番号：１または３のいずれかに記載の配列を有するポリヌクレオチド、および配列番号：１または３に記載の配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９７％の同一であるポリヌクレオチドを含むハイブリドのＴｍは、例えばBolton and McCarthy's方程式[Proc,.48,1.3 90 (1962)]:Ｔｍ = 81.5℃−16.6(log10 [Na＋]) ＋ 0.41 (％Ｇ＋Ｃ）−0.63 (％ ホルムアルデヒド）−600/l；ｌ＝塩基におけるハイブリドの長さ、を用いて計算され得る。
【００９２】
ハイブリダイゼーション中のストリンジェントな洗浄条件は、例えば、４xＳＳＣ、６５℃、または５０％ホルムアルデヒド、４xＳＳＣ、４２℃、または０.５xＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、６５℃である。高ストリンジェントな洗浄条件は、例えば、０.２xＳＳＣ、６５℃である。
【００９３】
用語「プラスミド」は、染色体外遺伝要素を示す。本発明のために使用される本来のプラスミドは、市販購入し得るか、または自由に利用し得るか、あるいは既知の方法を用いるかかるプラスミドから誘導され得る。
【００９４】
用語「ベクター」は、宿主細胞中に外因性ポリヌクレオチドを導入するために使用されるポリヌクレオチドを説明する。ベクターは、１以上のポリペプチドをコードするヌクレオド配列を含有する。ベクターが含んでいる遺伝子の発現を制御し得るベクターを「発現ベクター」という。
【００９５】
用語「調節する」は、生化学的過程の、刺激および抑制または阻害の両方を示す。本発明の範囲内では、「調節する」または「調節」は、ＥｔＯＳ２２ポリペプチドの活性を阻害すること、または阻害または抑制を意味し、かかる活性は、スポロキスト由来のスポロゾイト脱嚢のために重要である。
【００９６】
実施例
細菌株およびベクター
細菌株
E.coli TOP10、化学的成分(Invitrogen, Groningen, NL)
Ｆ−ｍｃｒＡ Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC）Φ80 lacZΔM15 ΔlacX74 recAl deoR araD139Δ (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endAl nupG. 
E.coli TG1, エレクトロコンピータント (Stratagene, Heidelberg)]
supE thi-１Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5 (rk-mk-) [F' traD36 proABlaclqZΔM15] 
ベクター
pG8SAET (Jacobsson and Frykberg, 1998; Zhang et al., 1999)
pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Groningen, NL)
pcＤＮＡ3.1/V5-His-TOPO (Invitrogen, Groningen, NL)
【００９７】
実施例１
Eimeria tenellaからのゲノムＤＮＡ単離
ＤＮＡを、Blin and Stafford (1976)の方法を修飾した方法を用いて単離した。１x１０８の胞子形成した接合子を、３０００rpm、１０分(Heraeus MULTIFUGE 3L-R)で沈降させ、沈殿物の容量と同じガラスビーズ(0.45-0.5 mm)の容量を添加した。接合子およびスポロキスト殻を、最高速でボルテックスによる２分間の攪拌によって破砕し、該殻を顕微鏡下で確認した。次いでプロテイナーゼＫの１００μg/mlの濃度に調整した抽出緩衝液(５ml)(10 mM Tris-HCl pH 8.0; 0.1 M EDTA pH 8.0;0.5％ SDS;20μgのＲＮaseＡ/ml)を添加し、該混合物を一晩５６℃でインキュベートした。ＤＮＡを、Roti-Phenol(Roth, Karlsruhe）/クロロホルムで２回抽出し、クロロホルムで１回、その後、２容量の絶対エタノールおよび０.１容量の３Ｍ 酢酸ナトリウムを用いて沈殿させ、１３０００rpm Beckman JS13.1ローターの遠心分離に供して沈降させた。該沈降物を、７０％エタノールで２回洗浄し、空気中で乾燥させた；次いで、蒸留Ｈ２０(ｄＨ２Ｏ)に再懸濁させた後、このＤＮＡの濃度を、１％ＴＢＥアガロースゲルにおいて、１μgのEcoRI/HindIII-消化した＃ＤＮＡ(MBI Fermentas, St.Leon-Rot)との比較によって判断した。
【００９８】
実施例２
Eirneria renellaおよびヒナドリの盲腸(chick cecum)由来の全ＲＮＡの単離
全ＲＮＡを、"Invisorb ＲＮＡ kit II" (Invitek, Berlin-Buch)を用いて、３x１０７接合子またはヒナドリの盲腸(０.３g)から単離した。全ての手順工程を、ＲＮase-不含物質およびＤＥＰＣ(ジエチルピロカルボネート）処置溶液を用いて実施した。接合子をボルテックスによる攪拌により、溶菌緩衝液（５００μl）中でガラスビースを用いて破砕し、一方で腸組織を、溶菌溶液（２ml）中でＵltraturraxにより細く粉砕した。各ケースで該上清をＲＮＡの単離に使用し、全て次の処理ステップは製造業者の指示書に従った。次いで、ＤＥＰＣ Ｈ２０に溶解した全ＲＮＡを光化学的に決定した。
【００９９】
実施例３
プラスミドＤＮＡの調製
プラスミドＤＮＡを、E.coli TG1またはE.coli TOP10の培養物（５０ml）の一定量３mlから調製した。シングルコロニーを用いて、適切な抗生物質が添加されたＬＢ培地に接種し、培養液を２８０rpm、一晩３７℃で振とうしながらインキュベートした。The Nucleo Spin plasmid kit (Macherey-Ngel, Dueren)またはthe Plasmid Midi kit (Qiagen, Hilden)を、プラスミドを単離するために用いた。プラスミドＤＮＡを、各製造者指示書に従って精製した。
【０１００】
実施例４
核酸濃度の決定
核酸の濃度を、DU 640 分光光度計(Beckmann, Munich)で光度測定により決定した。その濃度および純度を、Sambrook ら(1989)によって説明されたとおりに計算した。サザンおよびノーザンブロッティングのためのプローブとして使用されるべき制限フラグメントを、EcoRI/Hind III-消化したλＤＮＡ（１μg）(MBI Fermentas, St.Leon-Rot)とそれらを比較することにより、１％ＴＢＥアガロースゲルにおいて評価した。
【０１０１】
実施例５
制限的および電気泳動的ＤＮＡ分離
ＤＮＡを、製造業者の指示書に従って、また関連酵素に対して推奨される緩衝液において、制限エンドヌクレアーゼを用いて限定した。原則として、インキュベーションは３時間３７℃であった。
【０１０２】
ＤＮＡフラグメントを水平のフラット・ベッド・チャンバー（flat bed chamber）において、Sambrookらの(1989)方法によって電気泳動的に分離した。これを行うために、０.６-２％アガロースゲルを使用して、０.５pgのエチジウムブロマイド/mlを添加したＴＢＥ緩衝液またはＴＡＥ緩衝液を用いて注いだ。エチジウムブロマイドで染色したＤＮＡ分子を、次いでトランスイルミネーター上で、同時に分離したＤＮＡ長標準物と比較した。１pgのpUC-Mixマーカーを、＜１kbのフラグメントに使用し、１μgのEcoRI/HindIII-消化したλＤＮＡを、より大きなフラグメントに使用した(双方、MBI Fermentas, St. Leon-Rotから入手)。
【０１０３】
実施例６
アガロースゲル由来の単離ＤＮＡフラグメント
ＤＮＡフラグメントを、アガラーゼ（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim)を用いるか、または１kit中のNucleospin Extract２ (Macherey-Nagel, Dueren)を用いて、同じ％のＴＡＥアガロースゲル中、ウィンドウ・ゲルとして注ぎ入れた低融点アガロース(Biozym, Hess.Oldendorf)を消化することによりアガロースゲルから単離した。両ケースにおいて、所望のフラグメントを、長波ＵＶ光の下で切出し、製造業者の指示書に従って単離した。ＤＮＡ濃度を決定するために、次いでサンプル量の１／１０をコントロールゲルで分離し、ＤＮＡ長標準物と比較して評価した。
【０１０４】
実施例７
E.coliの化学的形質転換
製造業者の指示書に従って、ケミカリー・コンピタントE. coli TOP10 (Invitrogen, Groningen, NL)を、組換えプラスミドを用いて形質転換した。形質転換細胞を選択寒天上に播種した後、一晩３７℃でインキュベートし、形質転換体を単離し、制限消化により分析した。
【０１０５】
実施例８
Eimeria tenellaゲノム発現ライブラリーの構築
ａ）ゲノムＤＮＡのフラグメント化（断片化）、およびブラント・エンド反応
Eimeria tenella ゲノムＤＮＡ（２５μｇ）を、４mlの容量中、１０ｘ３０秒４０％器具作業負荷でSonotrode MS73を用い、氷冷水浴中で冷却しながら、フラグメント化した。１００から８００bpのサイズであったこれらのフラグメントを沈殿させ、ｄＨ２０（６０μl）に再懸濁し、同じ％の低融点アガロース・ウィンドウを有する１.２％アガロースゲル、エチジウムブロマイド不含１.２％アガロースゲルにおいて分離した。アガラーゼ消化によって単離したフラグメントを、製造業者の指示書に従って、S-400 HR Microspin columns (Amersham Pharamacia Biotech, Freiburg)を通して精製した。
【０１０６】
次の反応混合物を、ブラント・エンド反応の為に調製した：精製ＤＮＡフラグメント（７５μl）、１ｍＭ ｄＮＴＰmix、１０ＵのAccuTherm ＤＮＡポリメラーゼ (GeneCraft, Munster)および１xAccuTherm 緩衝液を、ｄＨ２０を用いて１００μlまでにした。この反応混合物を７２℃で３０分間インキュベーションし、その後フェノール/クロロホルムを用いて抽出し、該フラグメントをｄＨ２０（１００μl）に再懸濁した。この懸濁液（２μl）を、濃度評価のためにテストゲルで分離した。
【０１０７】
ｂ）脱リン酸化ｐＧ８ＳＡＥＴ
ｐＧ８ＳＡＥＴ(２０μｇ)を、４０ＵのＳｎａＢＩ(Promega, Heidelberg)を用いて、３７℃で３時間インキュベートした。その後、４Ｕのエビ・アルカリ性ホスフェート(USB, Bad Homburg）を制限混合物に加え、全体を３７℃で一晩インキュベートした。６５℃で１０分間の熱不活性化後、直線化され、脱リン酸化されたベクターを、アガラーゼを用いる消化により０.８％低融点アガロース・ウィンドウゲルから単離した。
【０１０８】
ｃ）ＤＮＡのライゲーション
３００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼＨＣ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot)を用いて、１００μｌの全量で、ゲノムＤＮＡフラグメント（８μg）と直線化および脱リン酸化したｐＧ８ＳＡＥＴ（５g）を１６℃４８時間で連結させた。その後、このリガーゼを、６５℃で１０分間、熱不活性化し、組換えベクター分子をグリコーゲン（２０μg）を添加して沈殿させた。該沈殿物をｄＨ２０（１００μl）に再懸濁し、この懸濁液の１.５μlを各電気的形質転換に用いた。 
【０１０９】
ｄ）電気的形質転換 E.coli 
Ｅ.coli ＴＧ１の５０μl容量を、各々の場合で、０.１cmのエレクトロポーレーションキュベット(BIORAD, Munich)中、製造業者の指示書に従って、フィールド強度（１７kV/cm）、２００Ωおよび２５μＦで、Gene Pulser (BIorAD, Munich)において、ライゲーション混合物（１.５μl）を用いて電気的に形質転換させた。形質転換体の数を決定し、組換え細胞を、グリセロールストックの形態にて−８０℃で貯蔵した。
【０１１０】
寄生体の代表的なゲノムＤＮＡライブラリーを、ファージミドベクターｐＧ８ＳＡＥＴで構築した。このライブラリーは、Eimeria tenellaゲノムの７.３倍の提示を有する４５０bpの平均挿入サイズを有する４.７x１０６独立クローン(９５％組換え体)を含む。
【０１１１】
実施例９
ファージ・ディスプレイおよびフェーズパニング
ａ）組換えファージミドの調製および精製
各グリセロールストック（２００μl）を、アンプリコン含有ＬＢ培地(５０μg/ml)（２０ml）に接種し、この培養物を、３７℃２８０rpmで一晩インキュベートした。次いで、この培養物（１ ml）を使用してアンピシリン含有ＬＢ培地（１００ml）に接種し、この培養物をＯＤ６００＝０.５までインキュベートし、Ｒ４０８ヘルパーファージ(Promega, Heidelberg)（５００μl）(１x１０１１ pfu)で感染させた。３７℃２８０rpmでもう一晩インキュベーションした後、該細胞を、１０分５０００rpmで沈降させ、上清を滅菌濾過した；次いで、ファージミドを、Vivaspin 20 concentrators (Sartorius AG, Goettingen)を用いて製造業者の指示書に従って濃縮した。
【０１１２】
ｂ）コート化ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ
限外濾過(１００ｋＤａ MWCO)によって５０倍濃縮したモノクローナル抗体(Ｍａｂ)Ｅ２Ｅ５(Mouafo et al., 2002)のハイブリドーマ培養上清を、Corting Pan Mouse IgG DYNABEADS (Deutsche Dynal GmbH, Hamburg)をコーティングするために使用した。約５％Ｅ２Ｅ５ ＭＡｂ含量を有する濃縮した全タンパク質（２０μｇ）をＤＹＮＡＢＥＡＤＳのｍｇあたりに使用し、該混合物を回転させて４℃で一晩インキュベートした。未結合タンパク質および免疫グロブリンを、ＰＢＳ(ＮａＣｌ（８g）；ＫＣｌ(０.２g)；Ｎａ２ＨＰ０４（１g）x２Ｈ２０; ＮａＨ２ＰＯ４ｘＨ２０(０.１５g)；ＫＨ２ＰＯ４(０.２g)ｐＨ７.４を、Ｈ２０を用いて１ｌに調製した)／０.１％ＢＳＡで３回洗浄することによって除去して、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳを結合反応に使用した。
【０１１３】
ｃ）結合反応、洗浄ステップおよび溶出
結合反応において、表面上にＭａｂＥ２Ｅ５を有するか、または有さないＤＹＮＡＢＥＡＤＳ［５０μl(２x１０７)］を、ＰＢＳ／０.１％ ＢＳＡ（４００μl）中ファージミド濃縮物（２００μl）を用いて、４℃で一晩回転させながらインキュベートした。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳを１０回洗浄した後に、溶出緩衝液(５０ｍＭ クエン酸ナトリウム；１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４.５)（４００μｌ）で、１５分間回転しながらインキュベーションした後に、弱い結合ファージミドを除去し、溶出緩衝液(ｐＨ１.８)に溶出したファージを、中和化緩衝液(２Ｍ Ｔris-ＨＣl、pＨ８.６)（４０μｌ)で処理し、力価および再感染の決定に使用した。
ｄ）力価決定および再感染
各溶出物を、対数増殖期にあるE.coli TGl（１０ml）の再感染に使用した。３７℃、４０rpm、０.５時間でインキュベートした後、該細胞を沈降させ、次いでアンピシリン含有ＬＢ培地（４００μl）に再懸濁した；次いで、それらを力価決定および/または増幅のためにアンピシリン含有ＬＢ寒天プレートに播種した。フェーズパニングの次のラウンドのために、これらのプレートを、１８時間後にアンピシリン含有ＬＢ培地ですすぎ、微生物を、培養液（５０ml）中でＲ４０８ヘルパーファージ（１００μｌ）によって感染させた。３７℃、２８０rpm、一晩インキュベーションした後に、ファージミドを、記載したとおりに濃縮し、あらたに結合反応に使用した。
【０１１４】
ｅ）Ｅ-タグ 発現クローンの決定
Ｅ-タグ 発現クローンを単離する目的のために、約１００コロニー形成単位(cfu)をアンピシリン含有寒天プレートに播種し、続いて数回のフェーズパニングの後、ニトロセルロース膜(Schleicher and Schuell, Dassel)に移した。膜に付着している細胞を、一晩、溶菌緩衝液［１００ｍＭ Ｔris-ＨＣl、ｐＨ７.８；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＭｇＣl２；１.５％ ＢＳＡ;ＤＮaseＩ（１μg)/ml；リゾチーム（４０μg）/ml］（６ml）中で溶解し、その後細胞残留物を、ＰＢＳ／０.０５％ Tween-２０で３回洗浄して除去し、膜上の非特異的結合部位を、１時間、１xRotiBlock溶液(Roth,Karlsruhe）を用いたブロッキングにより飽和させた。次いで、該膜を、１:５００に１xRotiBlockで希釈したマウス抗Ｅタグ一次抗体(Amersham Pharmacia, Freiburg)と共に、室温で(２２℃）２時間インキュベートした。非結合抗体を、０.５時間、３回洗浄することで除去した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ)結合ヤギ抗マウスＩｇＧを、二次抗体として１:２０００希釈で使用した。さらに３回の洗浄工程後、該膜を、２分間、検出用緩衝液(１００ ｍＭ Ｔris-ＨＣl、ｐＨ９.５;１００ ｍＭ ＮａＣｌ)で平衡化し、結合二次抗体を、１:１００に検出用緩衝液で希釈したＣＤＰスター(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim)を用いて、化学ルミネセンスの発光により検出した。２-１０分間、２２℃で、ＥＣＬHyperfilm(Amersham Pharmacia, Freiburg)上で感光させた。
【０１１５】
ｆ）特異的に結合するクローンのＥ２Ｅ５ＭＡｂ富化とファージパニングとの比較
モノクローナル抗体(ＭＡｂ)Ｅ２Ｅ５を、Pan Mouse IgG DYNABEADSの表面に結合させ、ファージパニングに使用した。いずれの別の抗体も含まないPan Mouse IgG DYNABEADSをネガティブコントロールとして用いた。３回のファージパニングの後、ネガティブコントロールと比較して結合クローンが３６２倍多く含まれていた。Ｅタグを発現するこれらのクローンを、Ｅ２Ｅ５ＭＡｂを用いて、ウエスタン・ブロットにて分析した。単離した６２のＥ−タグ発現クローンの内、６つ(Ａ１４、Ａ１７、Ａ４５-Ａ４７およびＡ６２)を、ウエスタン・ブロットにおいてＥ２Ｅ５ＭＡｂによって認識した。検出された全ての融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて同じ移動挙動を示し、約１４ｋＤａの分子量を有した。これらの融合タンパク質は１２５ＡＡからなり、その４８ＡＡはクローン化「Ａ１７」挿入体に起因し得る。
【０１１６】
実施例１０
ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)
全てのＰＣＲを、MJ Research(Biozym, Hess. Oldendorf)のＰＴＣ−２００勾配サイクラーまたはＰＴＣ−１５０MiniCyclerにおいて実施した。
合成オリゴヌクレオチド(プライマー)
全てのＰＣＲプライマーを、ＭＷＧ Biotech (Ebersbach)により合成した。
【表１】
2008500003.tif 000002
【表２】
2008500003.tif 000003
【０１１７】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲは、全ＲＮＡ逆転写に続いて、配列特異的プライマーを用いて、ＤＮＡ配列を増幅する目的のためのＰＣＲを含む。ＲＴのための反応混合物の組成物は、全容量５０μｌで、次のとおりである；全ＲＮＡ（３.５μｇ）、８０ＵのＲＮasin リボヌクレアーゼ阻害剤(Promega, Heidelberg)、０.４ｍＭ ｄＮＴＰmix、５０ＵＡＭＶ逆転写酵素、１×ＡＭＶ緩衝液(全てRoche Molecular Biochemicals, Mannheimから)、５ｍＭＤＴＴおよび２.５μＭ cＤＮＡ合成を開始するための分子としてランダムヘキサマープライマー。２２℃１０分でのインキュベーションに続き、４２℃および５５℃で各々３０分間、cＤＮＡの合成に供した。酵素を、９５℃で５分間熱不活性化した。各逆転写について、２つの別の反応、すなわち各々逆転写酵素のない反応、ＲＮＡテンプレートのない反応を、ネガティブコントロールとして実施した。
【０１１８】
逆転写酵素反応物の１/１０容量を、ＰＣＲ用のテンプレートとして、全容量を５０μlとして使用した。０.４μＭの２つの配列特異的プライマーを用いる各ケースにおいて、下記ＰＣＲ系を、増幅のために製造業者の指示書に従って使用した:"Triple Master PCR system"(Eppendorf),"Platinum Pf x DNA ポリメラーゼ" (Invitrogen, Groningen, NL)および"High Fidelity PCR system"(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim)。９４℃２分での初期変性、１５秒９４℃での変性、３０秒６３℃でアニーリングおよび７２℃で２分の鎖伸張を含む３５サイクルに供した。７２℃１０分での末端伸張により、この反応を完了した。この反応の１／５容量を、コントロールのために、適切な％のＴＢＥアガロースゲルに分画した。
【０１１９】
ｂ）５'−および３'-ＲＡＣＥ-ＰＣＲ
胞子形成したEimeria tenella接合子からの全ＲＮＡを、５'−および３'-ＲＡＣＥ−ＰＣＲのための開始物質として用い、"５'/３'RACE kit"(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim)を用いて実施した。cＤＮＡ合成、テーリング反応(５'-RACEの場合にのみ）および配列特異的プライマーを用いるcＤＮＡの増幅を、製造業者の指示書に従って行った。次いで、これを、５'-ＲＡＣＥの場合において１つ、３'-ＲＡＣＥ、さらにネスティッドＰＣＲの場合において２つ、５'および３'末端の増幅を増加させるために供した。Ａ１７-max-６３１-lo(cＤＮＡ合成)、Ａ１７-max-５３３-lo(dA-末端cＤＮＡの増幅）およびＡ１７-１１２-lo(ネスティッドＰＣＲ)を、５'-ＲＡＣＥにおいて配列特異的プライマーとして使用し、一方３'-ＲＡＣＥにおいては、Ａ１７-max-９０-up(cＤＮＡ増幅）、Ａ１７-max-１５０-up(Ｆ’ネスティッドＰＣＲ)およびＡ１７-２２-up(２回目のネスティッドＰＣＲ)を配列特異的プライマーとして使用した。２％アガロースゲルで分離したＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物を、Chomczynski(1992)の方法を用いて、中性Hybond-N ナイロン膜(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)に転写し、放射性標識プローブとハイブリダイズさせ、次いでKodak Biomax MS Ｘ線フィルムで感光させて使用した。この方法で同定した特異的なＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物を、クローンとして発生させ、単離し、配列決定した。
【０１２０】
実施例１１
ＰＣＲ産物のクローニング
TOPO TA クローニングキットおよびpcＤＮＡ３.１/V5-His TOPO TA 発現キット(Invitrogen, Groningen, NL)を、ＰＣＲ産物のクローニングに使用した。ＰＣＲ産物を、１kit (Macherey-Nagel,Duren)中のthe NucleoSpin Extract２を用いて、アガロースゲルから単離し、５ＵのTaq ＤＮＡポリメラーゼ(Promega, Heidelberg)、１xTaq ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液および０.４ｍＭ ｄＮＴＰ mixと共に７２℃で０.５時間インキュベートした。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの末端トランスフェラーゼ活性により、３’末端でアデニル化したＰＣＲ産物を１kit中のNucleoSpin Extract２を用いて２回目に精製し、その後製造業者の指示書に従って、TOPO TA クローニングに使用した。
【０１２１】
実施例１２
ＤＮＡ配列分析
クローン化ＤＮＡを、Sangerら(1977)の鎖停止方法に従い、MWG Biotech (Ebersbach)を備えた自動化LI-COR 4000 ＤＮＡシークエンサーを用いて非放射性的に配列決定した。配列決定を、pG8SAET ベクター(MWG Biotech, Ebersberg)用の５'-IRD-800-結合プライマーおよび５'-IRD-800-結合標準プライマー(LI-COR Bioscience, Bad Homburg)を用いて行った。
【０１２２】
５'-IRD-800-結合プライマー
【表３】
2008500003.tif 000004
【０１２３】
ａ）サーモ・シーケナーゼ（Thermo sequenase）を用いる配列決定
サーモ・シーケナーゼ・プライマー・サイクル配列決定キット(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)および赤外蛍光染料IRD-800(MWG Biotech, Ebersbach)に結合させたプライマーを、配列決定反応に使用した。各反応について、プラスミドＤＮＡ(１.５μg)および５'-IRD-800-結合プライマー(１pmol/μl)（２-４μl）を、全容量（１３μl）に混合し、この混合物（３μl）を、各ケースにおいて、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴヌクレオドミックス各々３μｌに添加し、次いでこれらの混合物に各ケースで、鉱油（１０μｌ）で重層し。次いで、配列決定反応を、PTC １００サーモサイクラー(MJ Research, Biozym, Hess. Oldendorf)で行う。この反応において、２分間９４℃での変性、変性(９４℃、３０秒)、アニーリング(５５℃、３０秒)および鎖合成 (７２℃、１.５分)の３０サイクルに供した。反応を、ホルムアミド負荷緩衝液（６μl）を添加することによって停止させた。配列決定ゲル上で配列決定反応を行う直前に、該反応サンプルを７２℃で３分変性させ、その直後に、光から保護しながら氷上で貯蔵した。蛍光標識した鎖停止フラグメントを、１xＴＢＥ緩衝液、１５００Ｖおよび５０℃、８Ｍ 尿素を含有する修飾されたポリアクリルアミド(Ultra Pure Sequagel XR, National Diagnostics ; Atlanta, USA）からなる４０cm長、０.２５mm厚の６％ゲルにおいて分離し、リアルタイムでレーザー光電子増倍管ユニットを用いて、検出した。配列を、LI-COR ImagIR 4.0 software base (MWG Biotech, Ebersbach)を用いて分析した。
【０１２４】
ｂ）配列データのコンピューター分析
配列分析によって得たデータを、the Molecular BioComputing Suite (Muller etal., 2001)および配列3.0プログラムを用いて最初に処理し、導き出したタンパク質配列を決定した。ＢＬＡＳＴ(Altschul et al., 1990)およびｏｍｎｉＢＬＡＳＴプログラムをデータベース探索のために使用した、すなわち、ＥＭＢＬとSwiss Prot databaseにおいて既知配列と、Eimeria tenella genome project data(www.sanger. ac.uk/Proiects/E tenell/)との比較である。２以上のＤＮＡまたはタンパク質配列を、ＢＬＡＳＴ２配列(www. ncbi.nlm.nih.gov) (Tatusova and Madden, 1999)、ＣＬＵＳＴＡＬＷ(www. ebi. ac. uk) (Thompson et al., 1994)およびＤＩＡＬＩＧＮ(Morgenstern et al., 1998; 1999)プログラムを用いて並べた。さらに、このSignalP(www. cbs. dtu.dk/services/signalP/)(Nielsen etal., 1997)およびClone Manager５programを、シグナルペプチドを同定するために、各々クローニングおよび限定の計画をたてるために、そしてオープン・リーディング・フレームを探索するために、使用した。
【０１２５】
実施例１３
E. coli由来のタンパク質抽出物の調製
E.coli ＴＧ１（２ml）を、定常状態一晩培養物から沈降させ、ｄＨ２０で１回洗浄し、ｄＨ２Ｏ（３００μl）に再懸濁した。４xRotiLoad 緩衝液(Roth, Karlsruhe）（１００μｌ）を添加し、サンプルを５分間沸騰水中で変性させた。混合物中のゲノムＤＮＡを、短時間の超音波処置によってフラグメント化し、各ケースでこのサンプル（１０μｌ）を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で流した。
【０１２６】
実施例１４
ポリアクリルアミドゲル中でタンパク質を分離する電気泳動およびウェスタンブロッティング
ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Laemmli(1970)の方法を用いて、不連続なポリアクリルアミドゲルにおいて変性条件下でタンパク質抽出物を分離した。Mini-PROTEAN II電気泳動細胞装置(BIorAD, Munich)を、この目的のために使用した。この系において、ゲルサイズは８x１０cmであった。１５％ポリアクリルアミドを含有する分離ゲルを使用した。スタッキング・ゲルの濃度は、均一な４.５％ポリアクリルアミドであった。分離は、４０ｍＡ、約２-２.５時間で生じた。予め染色したＳＤＳ分子量マーカーミックス(Sigma, Deisenhofen)(５μl）を分子量標準として使用した。
【０１２７】
ｂ）ニトロセルロース膜上へのタンパク質の転写
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質を、セミドライ法(Kyhse-Anderson, 1984)を用いて、Protran BA85 ニトロセルロース膜(Schleicher and Schuell, Dassel)上にブロッティングした。この方法は、連続緩衝液系(Lihme andSchafer-Nielsen,1986)を使用し、ここで２つのグラファイトプレート(Biometra Fast Blot, Goettingen)の間にあるブロッティング緩衝液に浸したWhatman paper(Whatman Ltd., Maidstone, Englanｄ）の層は緩衝液貯蔵所として機能する。このタンパク質が、６０ｍＡの電流、２時間でＳＤＳポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜に転写された均質な電気的なフィールドは、これらのグラファイトプレートの間で生じる。転写を確認するために、ニトロセルロース膜を、ブロッティングの後にポンソーＳ(３％トリクロロ酢酸中０.２％ポンソーＳ）で可逆的に染色し、次いでdＨ２０を用いて再度脱染色した。
【０１２８】
ｃ）免疫検出
ニトロセルロース膜を、遠心分離チューブ(Falcon, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA）（５０ml）の内側に巻き付け、非特異的結合部位を飽和させるために、１xRotiBlock 溶液(Roth, Karlsruhe)(１０ｍｌ）を用いて回転させながら１時間インキュベートした。その後、このブロッキング溶液を、１xRotiBlock 溶液（１０ml）中、モノクローナル抗体Ｅ２Ｅ５(一次抗体)の５０倍濃縮ハイブリドーマ培養上清（５０μl）により置換した。２２℃で２時間インキュベートした後、該膜を、未結合の過剰な一次抗体を除くために、ＰＢＳ／０.０５％ Ｔween-２０で０.５時間、全て３回洗浄した。二次抗体、すなわち、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)(Jackson Immune Research Laboratories, West Grove, USA）と結合させ、１xRotiBlock溶液（１０ml）で１:４０００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧを、１時間の間添加した。次いで、膜を、ＰＢＳ／０.０５％Ｔween-２０を用いて全て０.５時間、３回再度洗浄した。ここで、結合抗体を、化学ルミネセンスを発生させた後にRoswellおよびWhite(1978)の方法で、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出系(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いて検出した。これに対して、検出試薬１および２の等量を混合し、膜に加えた(０.１２５ml/cm２)。１分後、液体を除去し、膜を１回、ＰＢＳ／０.０５％ Ｔween-２０で軽くすすいた；次いで２つの上部の透明なフィルムの間にそれを置いて、空気泡を取り除いた。ＥＣＬ Hyper film (Amersham Pharmacia, Freiburg)上で、２−５分、２２℃で感光させた。
【０１２９】
実施例１５
放射性標識ＤＮＡ
ＤＮＡの放射標識は、用いたプローブのサイズに依存する。ＤＮＡフラグメント＞８００bpを、FeinbergおよびVogelstein(1984)の方法に従って[α３２Ｐ]ｄＣＴＰを用いてランダムプライミングによって標識した。Megaprime DNA 標識キット(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)を、製造業者の指示書に従って、この標識化反応のために使用した。ＤＮＡ（４０ng）および５０μＣｉの[α３２Ｐ]ｄＣＴＰ(１０μＣｉ／l、比活性＞３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ)をアッセイあたりに使用した。
【０１３０】
非常に小さなＤＮＡフラグメント、例えばオリゴヌクレオドを、[γ３２Ｐ]ＡＴＰにて放射性標識した。この反応において、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot)は、ＤＮＡの５'ＯＨ基の[γ３２Ｐ]ＡＴＰの転写を触媒する。オリゴヌクレオチド（２０ng）および１００μＣｉ[γ３２Ｐ]ＡＴＰ(１０μＣｉ／ｌ、比活性＞４５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ)を使用した。標識化反応の最後で、組み込まれていないヌクレオチドを、１キット(Macherey-Nagel, Dueren)中のNucleoSpin extract２を用いて分離した。この方法で、標識し、精製したＤＮＡを１０分間変性させてハイブリダイゼーションに使用した。
【０１３１】
実施例１６
サザン・ブロッティング：膜へのＤＮＡの転写およびハイブリダイズ
この技術を用いて、中性Hybond-Nナイロン膜上に(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)ＰＣＲ産物およびゲノムＤＮＡの両方を転写する。ゲノムＤＮＡを、予め様々な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し(制限アッセイあたり１０μg)、２０ｍＶで０.６％、１４cm長のアガロースゲルで一晩分離した。ブロッティングを、Chomczynski (1992)の方法に従って実施し、下方キャピラリィーによって、２時間または終夜アルカリ性トランスファー緩衝液(３Ｍ ＮaＣl、８ｍＭ ＮａＯＨ、ｐＨ１１.４０-１１.４５)中で転写した。転写前に、ゲル中のＤＮＡを、１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.５Ｍ ＮａＯＨ中で１時間変性させ、次いでトランスファー緩衝液中で１０分間インキュベートした。転写がおこった後、該膜を、０.２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６.８)で１５分中和し、次いで８０℃で２０分間乾燥させた。膜上のＤＮＡを、ここで、放射性標識プローブと共にハイブリダイズに使用した。しかし、まずハイブリダイゼーション前に溶液中６０℃で３時間、膜をインキュベートした。次いで、この溶液を、ハイブリダイゼーション溶液に置き換えた。放射性標識プローブを加えた後に、ハイブリダイゼーションを一晩６０℃で行った。２０ｘＳＳＣストック溶液(３Ｍ ＮａＣｌ;０.３Ｍ クエン酸ナトリウム、Ｈ２０中、ｐＨ７.０）を、洗浄緩衝液に用いた。該膜を、２ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、３０分、そして１ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、３０分から２時間、連続的に洗浄した。該膜を、補力スクリーンを用いて−８０℃でKodak Biomax MS Ｘ線フィルム上で感光させた。
【０１３２】
実施例１７
ＲＮＡの電気泳動およびノーザンブロッティング
ＲＮＡを電気泳動するための方法の全工程を、０.１％ ＤＥＰＣで処理し、次いでオートクレブにかけた緩衝液を用いるＲＮＡseを含まない条件下で実施した。ＲＮＡを、グリオキサールおよびＤＭＳＯを用いて変性させ、次いでSambrook et al.(1989)に記載のとおりに電気泳動により分離した。脱イオン化した６Ｍグリオキサール（５.４μl）、ＤＭＳＯ（１６.０μl）および０.１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（３μl）(ｐＨ７.０)を、５.４μlであるＲＮＡ（２０pg）に添加し、全体を５０℃で１時間インキュベートした。その後、グリオキサール・ゲル・ローディング緩衝液(１０ｍＭ リン酸ナトリム、ｐＨ７.０；５０％ グリセロール；０.２５％ブロモフェノール・ブルー）（６μl）を氷上で添加した。該分離を、３-４Ｖ／ｃｍで、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.０)中で、１.２％アガロースゲルで行った。ＲＮＡを、下方キャピラリーブロッティング技術およびアルカリ性トランスファー緩衝液(３Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＮａＯＨ、ｐＨ１１.４０-１１.４５) (Chomczynski, 1992)を用いて、中性Hybond-N ナイロン膜(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)上にブロッティングした。該膜を、０.２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６.８)中で１５分中和し、最後に８０℃で２０分間乾燥させた。サイズを評価するために、EcoRI/HindIII消化したＤＮＡ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot)（１０μｇ）を、グリオキシル化し、ＲＮＡと共に平行して分離した。電気泳動の後、λＤＮＡを含有するレーンを、ゲルの残余物から分離し、グリオキサールを除去するために、５０ｍＭ ＮａＯＨ２０分洗浄し、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.０)で１５分中和し、最後に同じ緩衝液中でエチジウムブロマイド/ml(０.５μg)により染色した。ハイブリダイゼーションを、すなわち６５℃で、２回目の洗浄緩衝液として０.１ｘＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳを用いるさらなるストリジェントな条件以外はサザン・ブロッティングに記載のとおりに実施した。
【０１３３】
実施例１８
ＥtＯＳ２２cＤＮＡの配列決定
融合タンパク質がウェスタンブロッティングにおいてＥ２Ｅ５ＭＡｂによって認識したファージクローンを、ＤＮＡ配列決定を用いて分析した。この既知の配列（暗灰色の下線）を基にして、５'-および３'-ＲＡＣＥ-ＰＣＲを用い、この遺伝子の３'末端および主要な５'末端を増幅し、この５'-ＲＡＣＥは２２４bpまで５'末端を伸張させるために使用される。リーディングフレームが依然連続して残っている間に、オープン・リーディング・フレーム(ＯＲＦ)を開始する開始コドン(ＡＴＧ)が消失した。ＲＴ−ＰＣＲを使用してこの遺伝子の完全なＯＲＦを増幅させるために、２つの新しいプライマーを、Eimeria tenella genome projectのデータを基にして構築した：配列中に下線を引いたＡ１７-f-長さ-６４-upおよびＡ１７-f-長さ-１１７６-loが、１１０６bpのＰＣＲ産物を提供した。この方法で、完全なオープン・リーディング・フレームを増幅させた。該プライマーは、各々cＤＮＡの５'-ＵＴＲおよび３'-ＵＴＲにおいてハイブリダイズした。５'プライマーとＡＴＧ開始コドンの間に、上流ストップコドンが存在しており、これはＰＣＲ産物が完全なオープン・リーディング・フレームを含有することを確実にするものである。ＥｔＯＳ２２cＤＮＡは、５９４bpまたは１９８ＡＡのＯＲＦを所有し、ＴＡＡストップコドンによって位置６７７で終結する。３'-ＵＴＲは５０６bpを含む。図１は、ＥｔＯＳ２２に対してcＤＮＡの完全配列を提供する；しかし５'-ＵＴＲの長さは依然決定されていない。
【０１３４】
実施例１９
ＥｔＯＳ２２の特徴分析
シグナルＰ ＶＩ．１プログラム(Nielsen et al.,1997)により、タンパク質のＮ末端で１８ＡＡのシグナル ペプチドを同定した(配列中の淡灰色で線を引いた）。シグナルペプチドおよび成熟タンパク質の間の開裂部位は、おそらく、位置１８および１９(ＡＶＡ−ＡＤ）の間にある。結果的に、成熟タンパク質のサイズは１８０ＡＡである。これは、シグナルペプチドを持たない理論分子量２１０３９.７Ｄａか、またはシグナルペプチドを持つ２２８３０．９ Ｄａを示した。顕著な特徴は、前駆体タンパク質(または、成熟タンパク質で)中の特定のＡＡの頻度である：ヒスチジン(Ｈ)２３.２％ (２５.６％)、プロリン(Ｐ)１７.２％ (１８.９％)、アラニン(Ａ）８.６％、(６.7％)およびグルタアミン(Ｑ)７.６％(８.３％)。ヒスチジンおよびプロリンあわせて、タンパク質中全アミノ酸の４０％以上となる。
【０１３５】
実施例２０
Eimeria tenellaにおけるＥｔＯＳ２２の発現
Eimeria tenella中のＥｔＯＳ２２の発現パターンを分析することを目的として、配列特異的プライマーおよび放射性標識プローブを各々用いて、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザン・ブロッドを、対応する翻訳物を検出するために行った。４つの異なる寄生体段階（胞子形成した接合子、およびニワトリの感染後７２h、１３７hおよび１４８hの細胞内段階）から単離したcＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲに用い、これらの段階ごとの全ＲＮＡは感染したニワトリの盲腸から単離した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、１３７および１４８時間の感染後(ガモゴニー)、そして感染後７２時間(シゾゴニー)ではない接合子段階で、上手く増幅した。従って、この遺伝子は、７２時間感染後には依然として転写されず、転写は感染後１３７時間までに起こり、更に継続し、胞子形成した接合子(図２)でおこっている。
【０１３６】
ノーザンブロッティングから、１３７時間感染後に発現の顕著なピークが存在することが示された。この方法を用いた場合、１４８時間後および接合子において(図３)、ＥｔＯＳ２２mＲＮＡの転写を検出することは不可能に近いか、不可能であった。これに加えて、ノーザンブロッティングから、完全なＲＮＡ転写物のサイズが約１.１kbであるということが示された。これは、クローン生成したcＤＮＡのサイズと非常よく符号する。
【０１３７】
実施例２１
Eimeria tenellaにおける接合子胞子嚢子タンパク質(ＥｔＯＳ２２)の位置決定
ａ）免疫蛍光
３x１０７胞子形成した接合子を、１４０００rpm２分で沈降させ、１回ＰＢＳで洗浄した；次いで、それらを沈殿物の容量と同じガラスビーズ(０.４５-０.５mm)と共に、ボルテックスを用いて、サンプルに存在する接合子およびスポロキストの一部が破砕するまで、２分間激しく振とうした(顕微鏡下で確認した)。これらの細胞および細胞破砕物を沈降させ、次いで冷メタノール(−２０℃）に再懸濁し、その後それらを２２℃で１０分間 インキュベートした。別の洗浄ステップの後、それらを２２℃１０分間でＰＢＳ／０.１％ Triton Ｘ１００に再懸濁した。次いで、それらを、ＰＢＳを用いて完全に反復洗浄し、細胞物質中の非特異的結合部位を、２２℃１時間、ブロッキング緩衝液(ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ）中で、回転させながらインキュベーションして、飽和させた。その後、Ｅ２Ｅ５モノクローナル抗体(一次抗体)の５０倍濃縮したハイブリドーマ培養上清（２５μｌ）を、ブロッキング緩衝液（１ml）に添加し、該混合物を、回転させながら２時間インキュベートした。一次抗体の過剰量を、全０.５時間３回ＰＢＳで洗浄して除去し、細胞物質を、光から保護しながら１時間回転させながら、Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)(MoBiTec GmbH,Gppingen)二次抗体と共にインキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞ペレットを、Mowiol(Polyscience Inc., Niles, IL, USA）に再懸濁した；次いで、この懸濁液（１５μl）を、顕微鏡スライド上に置き、気泡を排除するためにカバースリップで覆い、４℃暗所で貯蔵した。
【０１３８】
ｂ）共焦点レーザー走査顕微鏡
Leica CLSM TCS NT 連結装置(Leica Lasertechnik, Heidelberg), Version １.５.４５１にあったZeiss IM 35 顕微鏡(Zeiss, Oberkochen)を、共焦点レーザー走査顕微鏡のために使用した。４８８nm波長でアルゴンレーザーを用いて、蛍光を発するようにAlexa 488 染料を刺激した。接合子およびスポロキストからの光学セクションのＺシリーズを、１.０２４ｘ１.０２４ピクセルの解像によってスキャンした。ウィンドウ版Adobe Photoshop ６.０およびCorel Draw １０.０を、結果を分析するために使用した。
【０１３９】
Eimeria tenella接合子(図５.１)およびスポロキスト(図５.２および５.３)中のＥｔＯＳ２２に対して記録した免疫蛍光を、まずMouafo et al. (2002)の試験で確認した。接合子の壁が、インタクトな接合子以外の破砕した接合子で染色されているという事実から、ＥｔＯＳ２２は細胞内壁に局在することが示唆される。これに加えて、明確な蛍光シグナルは、スポロキストのスチーダ小体の領域に見られた。この構造は、脱嚢、すなわちスポロキスト由来の２つのスポロゾイトの孵化（hatching）と密接な関連がある。すでに破砕されたスポロキストのみがこれらの蛍光シグナルを示すという事実は、ＥｔＯＳ２２は、スポロキストの内部に局在し、外側のスポロキスト殻の成分ではない、構造成分であることを示す。
【０１４０】
実施例２２
スポロゾイト脱嚢
新しい接合子を得るために、２−３週齢のヒナを、プロバングを用いて、約５０００胞子形成したEimeria tenella接合子により感染させた。感染後７日目に動物を屠殺し、盲嚢含有物を２％重クロム酸カリウム溶液中に回収した。約２８℃で攪拌している間に、この接合子は、４８時間以内に胞子形成した。スポロキストを得るために、接合子を、ポッター（Potter）を用いて粉砕した。これを行うために、約１.５mlの濃縮接合子懸濁液を、ポッター容器中でピペッティングし、全ての接合子が破砕されるまで(顕微鏡で確認した)１３００rpmで均質化した。
【０１４１】
遊離したスポロキストを、遠心分離用チューブ（５０ml）中に回収し(Falcon, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA）、２０００rpm１０分間遠心分離した。沈降物を、ＰＢＳ（２５ml）中に懸濁し、Baytril/ml (BAYER, Leverkusen)（１０μg）追加の存在下、４℃で一晩貯蔵した。次の朝に、懸濁液を沈降させ、スポロキストを、胆汁（１ml）および濾過滅菌したＰＢＳトリプシン（２０ml）からなる混合物中に再懸濁した。各ケースにおいて、Ｅ２Ｅ５モノクローナル抗体の５０倍濃縮したハイブリドーマ培養上清（１００μl）を添加するか、または添加していない混合物のアリコート（２ml）を、平行脱嚢実験のために使用した。これらの混合物を、温度４１.５℃に設定したインキュベーター内で５時間インキュベートした。続いて、Buerkerチャンバーを、両方の混合物の場合に、遊離スポロゾイトの数およびスポロキスト中の未孵化スポロゾイトを決定するために使用した。
【０１４２】
実施例２３
スポロゾイト脱嚢の阻害
脱嚢中のＥｔＯＳ２２の重要性を調査するために、平行脱嚢アッセイを、Ｅ２Ｅ５ＭＡｂの追加的存在下および非存在下で行った。次いで、孵化スポロゾイトおよび未孵化スポロゾイト含有スポロキストの数を、両方のアッセイ(各々２ml)で決定し、これらのデータを互いに比較した。孵化スポロゾイトの数は、各々コントロールおよびＭＡｂの存在では、９６x１０６および４.８x１０６であった。一方、未孵化スポロゾイト含有スポロキストの数は、２.０x１０５から２.２x１０６(図６)に増加した。未孵化スポロゾイト含有スポロキストが約１０倍増加したと同時に、遊離スポロゾイトが約半分まで低下したという事実は、ＥｔＯＳ２２の活性調節により、Eimeria tenella脱嚢を阻害に導くことを示し、結果的に、ＥｔＯＳ２２の活性を調節することはEimeria感染を処理するのに適切であり得る。
【０１４３】
実施例２４
細胞培養においてEimeria tenellaに対するアフィニティー単離物質の試験
イン・ビトロ試験は、一次腎臓細胞培養に対して有効であった。このため、１２日目の産卵型（laying-type）のチキン由来の腎臓組織を無菌解剖し、そこから単離した腎臓細胞を、９６ウェルプレートの単層組織培養において培養した。使用した栄養培地は、ＤＭＥＭ＋５％胎児子ウシ血清＋２％グルタミン＋２％非必須アミノ酸＋１％ＨＥＰＥＳ＋１％ピルビン酸ナトリウムである。２日間４２℃および５％ＣＯ２でインキュベートした後、組織培養物を、脱嚢したEimeria tenellaスポロゾイトにより感染させた。ＤＭＳＯ中ストック溶液濃度（２０mg/ml）から開始して、アフィニティー単離物質を、栄養培地で終濃度１０ppmまで希釈し、感染細胞培養に添加した。感染５日後に、培養物を顕微鏡で評価し、宿主細胞の状態、インタクトなシゾントおよび遊離メロゾイト(感染１２０時間後)の数を決定した。活性を次のように評価した：
【表４】
2008500003.tif 000005
【０１４４】
引例：
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【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、ＥｔＯＳ２２-ｃＤＮＡの場合に、ＤＮＡ配列を示し、導き出されたアミノ酸配列を示す。プライマーＡ１７-ｆ−長−６４upおよびＡ１７-ｆ−長−１１７６-lowは下線を引かれる。該シグナルペプチドは、薄い灰色で網掛けされる。フェーズパニングにおいて多く、５'-および３'-ＲＡＣＥ−ＰＣＲを行うために使用されたクローンの元々の配列は、暗灰色で網掛けされる。
【図２】図２は、ＥｔＯＳ２２の発現パターンを決定するためにＲＴ−ＰＣＲの使用を示す。各ケースにおいて、ｐＵＣ−Ｍｉｘマーカー(MBI Fermentas, St. Leon-Rot)（１μg）を、ＤＮＡ長標準(Ｍ)として使用される。非感染のヒナドリの盲腸(ui,)、７２、１３７および１４８時間感染後の(７２hpi、１３７hpiおよび１４８hpi)感染した雛ドリの盲腸および胞子形成接合子由来のｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。プライマーＡ１７-２２-upおよびＡ１７-１１２-lowを用いて増幅されたＰＣＲ産物は、９１bpのサイズ（Ａ）であり、一方でプライマーEtACTIN-upおよびEtACTIN-lowを用いて増幅されたＰＣＲ産物は３５０bpのサイズ(Ｂ)であった。逆転写酵素(ＲＴ)を含有し、ＲＮＡテンプレートを含有する反応混合物を、各ケースにおいてマーク(１)のレーンに流し、一方ＲＮＡテンプレートを含有するがＲＴを含まない反応混合物はマーク(２)のレーン、そしてＲＮＡテンプレートをいずれも含有しないがＲＴを含有する反応混合物を、マーク(３)のレーンにながした。
【図３】図３は、ＥｔＯＳ２２に対するノーザン・ブロット分析を示す。胞子形成した接合子(１)由来の全ＲＮＡ、感染１３７時間後(２)および１４８時間後(３)後の感染したヒナドリの盲腸の由来の全ＲＮＡ、またネガティブコントロール(４)として非感染したヒナドリの盲腸由来の全ＲＮＡを、ゲル電気泳動によって分離し、ブロッティングした。このブロッティングしたものを、位置３８５で開始する放射活性標識された３'-ＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物(８１６bp)とハイブリダイズした。
【図４】図４は、ＥｔＯＳ２２に対するゲノムサザンブロットを示す。ゲノムE.tenella ＤＮＡ（１０μｇ）を、ゲル−電気泳動で分離し、各レーンにブロッティングした。このＤＮＡを、次の制限エンドヌクレアーゼ：ＢｇｌＩ(１)、ＣｌａＩ(２)、ＫｐｎＩ(３)、ＡccＩ(４)、ＢｇｌＩＩ(５)、ＤｒａＩ(６)およびＭｖａＩ(７)を用いて、あらかじめ消化した。このブロッティングしたものを、位置１から位置１１０６(１１０６bp)までの放射活性標識されたＰＣＲ産物とハイブリダイズした。
【図５】図５.１−５.３は、Ｅ.tenella中のＥｔＯＳ２２に対する免疫蛍光を示す。ＭａｂＥｚＥｓ(マウスＩｇＧ２ａ）を一次抗体として使用し、一方ヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲート,Ａｌｅｘａ４８８を二次抗体として使用した。図は、空の接合子殻(５.１)、破砕したスポロキスト(５.２)、インタクトなスポロキスト(５.３)を示す。スチーダ小体の領域は矢印で示した。
【図６】図６は、ＥｔＯＳ２２がＥ.tenella脱嚢を阻害するための標的であることを示す。パラレル脱嚢実験の後、遊離スポロゾイトの数および孵化しないスポロゾイトを含有するスポロキストの数を、いずれの追加Ｍａｂ Ｅ２Ｅ５(コントロール)も含有しない実験混合物および追加のＭａｂＥ２Ｅ５を含有した実験混合物において、決定した。
【図１】
2008500003.tif 000006
2008500003.tif 000007
【図２】
2008500003.tif 000008
【図３】
2008500003.tif 000009
【図４】
2008500003.tif 000010
【図５】
2008500003.tif 000011
【図６】
2008500003.tif 000012
【配列表】
2008500003000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月28日(2006.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008500003000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月29日(2007.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号：１または３に記載の配列；または
ｂ）配列番号：１または３に記載の配列を有するポリヌクレオチドと、５０％以上の同一性を示すポリヌクレオチド；または
ｃ）ストリジェントな条件下で、配列番号：１または３に記載の配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
ｄ）配列番号：２に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
ｅ）配列番号：２に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと５０％以上の同一性を示すポリヌクレオチド；または
ｆ）ストリジェントな条件下で、配列番号：２に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
ｇ）遺伝子コードの縮重のために、配列番号：１に記載の配列を有するポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド；
ｈ）ａ）からｇ）に記載のポリヌクレオチドのフラグメントであって、少なくとも６ヌクレオチド長である、ポリヌクレオチド；
を含むポリヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
治療
年額少なくとも３００ミリオンＵＳドルにのぼる抗コクシジウム剤が、現在この疾患の治療に使用されている。ｌ９７０年以来、化学療法処置は、特にポリエーテルイオノフォア、モネンシン、ナラシン、サリノマイシンおよびラサドヒドを用いて、実施されてきた。さらに、寄生体段階のＤＮＡ合成またはタンパク質合成を阻害する数多くの活性な化合物は、市場に存在している(Greif 2001)。しかし、本治療は、重大な問題および／または不利益をこうむる。メンドリにおける深刻な薬物担持(食用組織中に残留する問題)および生態毒性/生態汚染(環境の)とは別に、薬剤耐性の進化が、抗コクシジウム症の処置に関する大きな問題と考えられている。シャトルまたはローテーションプログラムと言われるものを用い、そして新規の作用機構(Coombs 2002)に対する高額の探索によって進展する耐性に打ち勝とうとする試みがなされている。そのため、Eimeria感染を処置するための改善された活性な化合物およびこれらの活性な化合物を見出す方法を緊急に必要としている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
ワクチン接種
免疫予防(ワクチン接種)は、コクシジウム症の化学療法を処置するための非常に良好な代替法である。Eimeria種と接触する１つの病原体は、二次同種感染に対して実質的に完全な免疫性を導く(RoseおよびWakelin1990)。１日齢のヒナドリにおいて、１６-２５日期間にわたる寄生体段階の連続投与により、Eimeria tenella、EimeriaacervulinaおよびEimeria maximaに対する天然の免疫性が誘導される(StiffおよびBafundo 1993)。防護的生殖母細胞抗原で産卵メンドリを免疫化すると、ふ化したヒナドリでの免疫状態が改善される。このストラテジーは、「母系免疫化」(Wallach 1992)としてWallachによって開発された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
完全な毒性Eimeria株(接合子生ワクチン)を用いるワクチンプログラムは、市販品Immucox(登録商標)(Vetech Laboratories, Canada）および Coccivac（登録商標)(Sterwin Laboratories, USA）を用いて、現在実施されている。製品Paracox（登録商標)(Schering Plough, England) および Livacox(登録商標)(Williams 2002)は、漸先形毒性株と呼ばれるものに基にしている。ポリエーテル耐性毒性生ワクチンは、最近市場に登場した(Vermeulen 2001)。全体で１３の接合子嚢含有生ワクチンは、現在、メンドリにおけるコクシジウム症に対する免疫化用に登録されている(Chapman et al. 2002, Williams 2002)。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
防護抗原と呼ばれるものを基にしている組換えワクチン(サブユニットワクチン)の遺伝子操作による開発は、全ての免疫化方法において「理想的なゴール」であると考えられている。防護抗原は、病原体/宿主細胞相互作用中に、細胞認識、細胞接着および細胞侵入において重要な機能を有する寄生体中の構造的化合物であり、また、おそらく他のタンパク質のその機能は今までに知られていない。Eimeria tenella防護抗原に対するこれまでの探索には、表面抗原、内部小器官抗原、また接合子、スポロゾイトおよびメロゾイトの勾配単離された器官抗体が包含される(Vermeulen,1998)。すでに既知のタンパク質についての遺伝子配列の念入りな探索の他に、ＥＳＴ(発現された配列タグ)のランダム探索(Wang et al. 1999)またはファージ・ディスプレイライブラリー(Silva, A. et al. 2002)が、新規の遺伝子および標的を見出すために使用される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本発明は、宿主中の防護免疫応答を活性化する目的のために宿主において投与されるべき免疫原組成物を調製するための、上記ＥｔＯＳ２２ポリヌクレオチドの１つを含有する上記発現ベクターの使用に関し、この免疫応答は、Eimeria ＥｔＯＳ２２-相同性タンパク質に対するか、またはEimeria tenella ＥｔＯＳ２２タンパク質に対する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
ハイブリダイゼーション中のストリンジェントな洗浄条件は、例えば、４xＳＳＣ、６５℃、または５０％ホルムアミド、４xＳＳＣ、４２℃、または０.５xＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、６５℃である。高ストリンジェントな洗浄条件は、例えば、０.２xＳＳＣ、６５℃である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
ｃ）ＤＮＡのライゲーション
３００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼＨＣ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot)を用いて、１００μｌの全量で、ゲノムＤＮＡフラグメント（８μg）と直線化および脱リン酸化したｐＧ８ＳＡＥＴ（５μg）を１６℃４８時間で連結させた。その後、このリガーゼを、６５℃で１０分間、熱不活性化し、組換えベクター分子をグリコーゲン（２０μg）の添加により沈殿させた。該沈殿物をｄＨ２０（１００μl）に再懸濁し、この懸濁液の１.５μlを各電気的形質転換に用いた。 
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
実施例１８
ＥtＯＳ２２cＤＮＡの配列決定
ウェスタンブロッティングにおいてＥ２Ｅ５ＭＡｂによって認識されたファージクローンの融合タンパク質を、ＤＮＡ配列決定を用いて分析した。この既知の配列（暗灰色の下線）を基にして、５'-および３'-ＲＡＣＥ-ＰＣＲを用い、この遺伝子の３'末端および主要な５'末端を増幅し、この５'-ＲＡＣＥは２２４bpまで５'末端を伸張させるために使用される。リーディングフレームは依然連続して残っているが、オープン・リーディング・フレーム(ＯＲＦ)を開始する開始コドン(ＡＴＧ)が消失した。ＲＴ−ＰＣＲを使用してこの遺伝子の完全なＯＲＦを増幅させるために、２つの新しいプライマーを、Eimeria tenella genome projectのデータを基にして構築した：配列中に下線を引いたＡ１７-f-長さ-６４-upおよびＡ１７-f-長さ-１１７６-loが、１１０６bpのＰＣＲ産物を提供した。この方法で、完全なオープン・リーディング・フレームを増幅させた。該プライマーは、各々cＤＮＡの５'-ＵＴＲおよび３'-ＵＴＲにおいてハイブリダイズした。５'プライマーとＡＴＧ開始コドンの間に、上流ストップコドンが存在しており、これはＰＣＲ産物が完全なオープン・リーディング・フレームを含有することを確実にするものである。ＥｔＯＳ２２cＤＮＡは、５９４bpのＯＲＦまたは１９８ＡＡを所有し、ＴＡＡストップコドンによって位置６７７で終結する。３'-ＵＴＲは５０６bpを含む。図１は、ＥｔＯＳ２２に対してcＤＮＡの完全配列を提供する；しかし５'-ＵＴＲの長さは依然決定されていない。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
実施例２０
Eimeria tenellaにおけるＥｔＯＳ２２の発現
Eimeria tenella中のＥｔＯＳ２２の発現パターンを対応する翻訳物を検出する方法により分析することを目的として、各々配列特異的プライマーおよび放射性標識プローブを用いて、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザン・ブロッドを行った。４つの異なる寄生体段階（胞子形成した接合子、およびニワトリの感染後７２h、１３７hおよび１４８hの細胞内段階）から単離したcＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲに用い、これらの段階ごとの全ＲＮＡは感染したニワトリの盲腸から単離した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、感染後１３７および１４８時間(ガモゴニー)かつ接合子段階で上手く増幅したが、感染後７２時間(シゾゴニー)では増幅しなかった。従って、この遺伝子は、感染後７２時間ではいまだ転写されておらず、転写は、遅くとも感染後１３７時間からその後継続して胞子形成した接合子嚢(図２)においておこっている。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
ノーザンブロッティングから、１３７時間感染後に発現の顕著なピークが存在することが示された。この方法を用いた場合、１４８時間後および接合子において(図３)、ＥｔＯＳ２２mＲＮＡの転写を検出することは不可能に近いか、不可能であった。これに加えて、ノーザンブロッティングから、完全なｍＲＮＡ転写物のサイズが約１.１kbであるということが示された。これは、クローン生成したcＤＮＡのサイズと非常によく符号する。
【国際調査報告】
2008500003.tif 000023
2008500003.tif 000024
2008500003.tif 000025
2008500003.tif 000026