(57)【要約】  新規なＳＴＥＡＰ−１タンパク質及びその変異体に結合する抗体及びそれに由来する分子が開示され、ここでＳＴＥＡＰ−１は正常な成人組織中で組織特異的な発現を示し、表Ｉに列挙された癌において異常に発現する。従って、ＳＴＥＡＰ−１は癌に対する診断、予後、予防及び／又は治療標的を提供する。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子又はその断片、又はそのコードタンパク質、又はその変異体、又はその断片は、体液性又は細胞性免疫応答を誘発させるために使用することができる：ＳＴＥＡＰ−１と反応性である抗体又はＴ細胞は能動又は受動免疫において使用することができる。
2008509880.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質（配列番号）に特異的に結合する抗原結合部位を含む抗体又はその断片。
【請求項２】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体又は断片。
【請求項３】
抗体がＸ９２．１．３０．１．１（１）と命名され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５８０２が付与された請求項２に記載の抗体又は断片。
【請求項４】
抗体がＸ１２０．５４５．１．１と命名され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５８０３が付与された請求項２に記載の抗体又は断片。
【請求項５】
モノクローナル抗体がヒト化抗体である請求項２に記載の抗体又は断片。
【請求項６】
断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＳｆｖ断片である請求項１に記載の抗体又は断片。
【請求項７】
抗体がヒト抗体である請求項１に記載の抗体又は断片。
【請求項８】
抗原結合部位がマウス抗原結合ドメインである請求項１に記載の抗体又は断片。
【請求項９】
組換え的に産生される請求項１に記載の抗体又は断片。
【請求項１０】
組換えタンパク質が抗原結合領域を含む請求項９に記載の抗体又は断片。
【請求項１１】
抗体が検出可能なマーカー、毒素、又は治療剤に結合されている請求項１に記載の抗体又は断片。
【請求項１２】
検出可能なマーカーが放射性同位元素、金属キレート剤、酵素、蛍光化合物、生物発光化合物又は化学発光化合物である請求項１１に記載の抗体又は断片。
【請求項１３】
放射性同位元素が、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔ、１２５Ｉ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１３Ｂｉ、３２Ｐ、又はＬｕを含む請求項１２に記載の抗体又は断片。
【請求項１４】
毒素が、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メイタンシノイド、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レトストリクトシン( retstrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)、クリシン(curicin)、クロチン(crotin)、カリケアマイシン、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害剤、グルココルチコイド、オーリスタチン、オーロマイシン(auromycin)、イットリウム、ビスマス、コンブレスタチン、デュオカルマイシン類、ドロスタチン、ｃｃ１０６５、又はシスプラチンを含む請求項１１に記載の抗体又は断片。
【請求項１５】
抗原結合部位が図２（配列番号）のタンパク質のアミノ酸内のエピトープに特異的に結合する請求項１に記載の抗体又は断片。
【請求項１６】
請求項２に記載のモノクローナル抗体を産生するトランスジェニック動物。
【請求項１７】
請求項２に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１８】
請求項２に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１９】
重鎖と軽鎖の可変ドメインを含む単鎖である請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１に記載の抗体又は断片をヒト単位投薬形態で含有する薬学的組成物。
【請求項２１】
生物学的試料中におけるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の存在を検出するためのアッセイにおいて、請求項１に記載の抗体に試料を接触させ、試料中のＳＴＥＡＰ−１タンパク質（配列番号）の結合を検出することを含むアッセイ。
【請求項２２】
患者においてＳＴＥＡＰ−１タンパク質（配列番号）を発現する細胞の成長を阻害する方法において、
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む単鎖モノクローナル抗体をコードするベクターを上記患者に投与することを含み、該ベクターが単鎖モノクローナル抗体コード配列を癌細胞に送達させ、コードされた単鎖抗体がそこに細胞内発現される方法。
【請求項２３】
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質（配列番号）を発現する細胞に細胞傷害薬又は診断薬を送達させる方法において、
請求項１に記載の抗体又は断片に結合した細胞傷害薬又は診断薬を提供して、抗体・薬剤又は断片・薬剤コンジュゲートを形成し；
細胞を抗体・薬剤又は断片・薬剤コンジュゲートにさらすことを含む方法。
【請求項２４】
細胞傷害薬又は診断薬が、検出可能なマーカー、毒素、及び治療剤からなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
検出可能なマーカーが放射性同位元素、金属キレート剤、酵素、蛍光化合物、生物発光化合物又は化学発光化合物である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
放射性同位元素が、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔ、１２５Ｉ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１３Ｂｉ、３２Ｐ、又はＬｕを含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
毒素が、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メイタンシノイド、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レトストリクトシン( retstrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)、クリシン(curicin)、クロチン(crotin)、カリケアマイシン、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害剤、グルココルチコイド、オーリスタチン、オーロマイシン(auromycin)、イットリウム、ビスマス、コンブレスタチン、デュオカルマイシン類、ドロスタチン、ｃｃ１０６５、又はシスプラチンを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
生物学的試料中におけるＳＴＥＡＰ−１タンパク質（配列番号）を検出する方法において、
生物学的試料とコントロール試料を提供し；
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に特異的に結合する請求項１に記載の抗体に生物学的試料とコントロール試料を接触させ；
生物学的試料とコントロール試料中に存在するＳＴＥＡＰ−１タンパク質と抗体との物質の複合体の量を決定することを含む方法。
【請求項２９】
表Ｉに列挙された癌に罹患しているか、罹患が疑われる患者から生物学的試料とコントロール試料を採取することを更に含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
図２に記載のタンパク質をコードする核酸に対応するＳＴＥＡＰ−１ｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）又はその部分配列を含み、ここで部分配列が１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５の連続ＲＮＡヌクレオチド長であり、ｍＲＮＡコード配列の少なくとも一部分に相補的であり非相補的である配列を含む組成物。
【請求項３１】
細胞増殖を調節する分子を同定する方法において、
（ａ）（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）図３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）図３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列の断片
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む系に分子を導入し；又は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、又は（ｉｖ）のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含む系に被験分子を導入し；
（ｂ）分子とヌクレオチド配列又はタンパク質の間における相互作用の有無を決定し、
分子とヌクレオチド配列又はタンパク質の間における相互作用の存在が、細胞増殖を調節する分子として上記分子を同定する方法。
【請求項３２】
系がインビボである請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
系がインビトロである請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
分子が、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
分子が、図２に記載のタンパク質をコードする核酸に対応するＳＴＥＡＰ−１ｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）又はその部分配列を含み、ここで部分配列が１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５の連続ＲＮＡヌクレオチド長であり、ｍＲＮＡコード配列の少なくとも一部分に相補的であり非相補的である配列を含む組成物である請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
患者における癌を治療する方法において、癌であると診断された患者に請求項３１に記載の方法によって同定された分子を投与し、それによって分子が患者における癌を抑制し又は遅らせる方法。
【請求項３７】
癌が表Ｉに記載の癌である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
表Ｉに列挙された癌を治療するための治療薬を同定する方法において、
（ａ）（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）図３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）図３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列の断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む系に分子を導入し；又は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、又は（ｉｖ）のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含む系に被験分子を導入し；
（ｂ）分子とヌクレオチド配列又はタンパク質の間における相互作用の有無を決定し、
分子とヌクレオチド配列又はタンパク質の間における相互作用の存在が、表Ｉに列挙された組織の癌を治療するための治療薬として上記分子を同定する方法。
【請求項３９】
系がインビトロである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
系がインビボである請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
分子が、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
分子が、図２に記載のタンパク質をコードする核酸に対応するＳＴＥＡＰ−１ｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）又はその部分配列を含み、ここで部分配列が１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５の連続ＲＮＡヌクレオチド長であり、ｍＲＮＡコード配列の少なくとも一部分に相補的であり非相補的である配列を含む組成物である請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
患者における癌を治療する方法において、癌であると診断された患者に請求項３８に記載の方法によって同定された分子を投与し、それによって分子が患者における癌を抑制し又は遅らせる方法。
【請求項４４】
癌が表Ｉに記載の癌である請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（連邦政府支援研究下でなされた発明に対する権利の陳述）
適用なし。
【０００２】
（発明の分野）
ここに記載される発明は、ＳＴＥＡＰ−１というタンパク質に結合する抗体、並びにその結合断片及びそれから改変された分子に関する。本発明は更にＳＴＥＡＰ−１を発現する癌の治療において有用な診断、予防及び治療方法と組成物に関する。
【０００３】
（発明の背景）
癌は、冠疾患につぐ第２のヒト死亡原因である。全世界で何百万もの人々が毎年癌で死亡している。米国だけでも、米国癌学会（American Cancer Society）によって報告されているように、癌は毎年５０万人を遙かに超える人々の死亡原因であり、毎年１２０万を越える新たな症例が診断されている。心疾患による死亡が顕著に減少しているのに、癌による死亡は一般に増加の傾向にある。来世紀の初頭には癌は死亡の第一の原因になると予想されている。
全世界で数種の癌が主要な死亡原因として突出している。特に、肺、前立腺、乳房、大腸、膵臓、卵巣及び膀胱の癌腫が癌による死亡の主要な原因である。これらの癌腫と実際には全ての他の癌腫は、共通の致死的特徴を共有している。極く僅かな例外はあるが、癌腫から起因する転移性疾患は致命的である。更に、最初はその原発性癌に対して生存した癌患者の場合でも、その生活が劇的に変化したことを共通の経験が示している。多くの癌患者は、再発又は治療の失敗の可能性の認識によって駆り立てられる強い不安を経験している。多くの癌患者は、治療後に肉体的衰弱を経験している。更に、多くの癌患者が再発を経験している。
【０００４】
全世界で、前立腺癌は、男性において４番目に最も一般的な癌である。北米と北欧では、遙かに最も一般的な男性の癌であり、男性の癌による死亡の２番目の原因である。米国だけでも、肺癌のみについで、３００００人を軽く超える男性がこの疾患で毎年死亡している。これらの数字の大きさにもかかわらず、転移性前立腺癌に対する有効な治療法は未だ存在していない。外科的前立腺切除、放射線療法、ホルモンアブレーション療法、去勢手術及び化学療法が主要な治療法であり続けている。不幸にも、これらの治療法は、多くの場合有効でなく、望ましくない結果をしばしば伴う。
診断現場においては、初期段階の局在的腫瘍を正確に検出することができる前立腺腫瘍マーカーがないので、局在的腫瘍は依然としてこの疾患の診断と管理に大きな限界を残している。血清の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）アッセイは非常に有用なツールであるが、しかしながら、その特異性と一般的利用性は、幾つかの重大な点が欠如していると広く考えられている。
【０００５】
前立腺癌に対する更なる特異的マーカーの同定における進歩は、マウスにおける疾患の異なる病期を再現し得る前立腺癌異種移植片の産生により改善されてきた。ＬＡＰＣ（Los Angeles Prostate Cancer）異種移植片は、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおける継代を生き延び、アンドロゲン依存性からアンドロゲン非依存性への移行の模倣能を示した前立腺癌異種移植片である（Klein等, 1997, Nat. Med. 3:402）。更に近年同定された前立腺癌マーカーには、ＰＣＴＡ−１（Su等, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7252）、前立腺特異膜（ＰＳＭ）抗原（Pinto等, Clin Cancer Res 1996 Sep 2(9): 1445-51）、ＳＴＥＡＰ（Hubert等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999 Dec 7; 96(25): 14523-8）及び前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Reiter等, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735）。
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡ及びＰＳＣＡのような以前に同定されたマーカーは、前立腺癌を診断し、治療する努力を容易にしたが、診断と治療を更に改善するために前立腺癌及び関連する癌に対する更なるマーカー及び治療標的を同定することが必要である。
【０００６】
腎臓細胞癌腫（ＲＣＣ）は、成人の悪性疾患のおよそ３％に及ぶ。腺腫が直径２から３ｃｍに一旦達すると、悪性疾患の潜在性がある。成人において、２つの主な悪性腎臓腫瘍は、腎臓細胞腺癌と腎盂又は尿管の移行性細胞癌である。腎臓細胞腺癌の発生数は、米国で２９０００症例を超え、１９９８年にこの疾患で１１６００人を超える患者が死亡したと推定される。転移性細胞癌は、余り頻繁ではなく合衆国において１年あたり約５００症例ほどの発生数である。
手術は、長い年月にわたり腎臓細胞腺癌に対する第一の治療法であった。最近まで、転移性疾患は、あらゆる全身性治療をもってしても難治性であった。全身性治療、特に免疫治療における最近の進歩に伴ない、転移性腎臓細胞癌は、反応に耐久性があると思われる適切な患者では攻撃的にアプローチされ得る。それにもかかわらず、これらの患者に対する有効な治療の必要性がなおも存在している。
【０００７】
合衆国における癌の全ての新しい症例のうち、膀胱癌は、男性で約５％（５番目の一般的な新生物）、女性で３％（８番目の一般的な新生物）を占める。発生数は穏やかに増加し、高齢の人口の増加と一致する。１９９８年には、男性での３９５００症例と女性での１５０００症例を含め、推定５４５００症例が存在した。合衆国における年齢調整された発病率は、男性で１０００００人当たり３２人、女性で１０００００人当たり８人である。３：１の歴史的な男性／女性比は、女性における喫煙パターンに関連して減少しうる。１９９８年に膀胱癌で推定１１０００人（男性７８００人と女性３９００人）が死亡した。膀胱癌発病率及び死亡率は、年齢と共に大きく増加し、集団がより高齢化すると問題も増加する。
殆どの膀胱癌は膀胱中で再発する。膀胱癌は、膀胱の経尿道的切除術（ＴＵＲ）と膀胱内化学療法又は免疫療法との併用療法で管理される。膀胱癌の多病巣性の性質及び再発性の性質はＴＵＲの限界を指摘する。殆どの筋肉侵襲性癌はＴＵＲ単独では治癒されない。根治的膀胱切除術と尿路変更術は癌を切除するための最も効果的な手段であるが、尿の機能及び性的機能に否定できない影響を及ぼす。膀胱癌患者に有益な治療法の多大な必要性がなおも存在している。
【０００８】
合衆国において２０００年には９３８００症例の大腸癌及び３６４００症例の直腸癌を含め、推定１３０２００症例の結腸直腸癌が生じた。結腸直腸癌は、男性及び女性における三番目に一般的な癌である。発生率は、１９９２−１９９６年の間に有意に減少していた（１年あたり−２．１％）。調査は、これらの減少はスクリーニングの増加及びポリープ除去の増加によるもので、これが侵襲性の癌へのポリープの進行を防止することを示唆している。２０００年には、推定５６３００人の死亡者（４７７００人が大腸癌、８６００人が直腸癌）が存在し、合衆国の癌死亡者全体の約１１％を占めた。
現在、手術が、結腸直腸癌と広がってはいない癌の治療のための最も一般的な形態であり、これはしばしば治癒的である。化学療法、又は化学療法と放射線照射の併用は、その癌が腸壁に深く穿刺しているか又はリンパ節まで広がっている殆どの患者に対して手術の前もしくは後に提供される。永久的な人工肛門形成（身体の排泄物の除去のための腹部開口部の形成）は大腸癌の場合に時折必要とされ、直腸癌については頻繁に必要とされる。結腸直腸癌についての効果的な診断及び治療方法の必要性がなおも存在している。
【０００９】
２０００年には、肺癌及び気管支癌の推定１６４１００の新たな症例が存在し、合衆国の癌診断全体の１４％を占めた。肺癌及び気管支癌の発生率は、１９８４年の１０００００人中８６．５人の高さから１９９６年の７０．０人へと、男性では有意に減少している。１９９０年代は、女性の間での増加率は低くなり始めた。１９９６年では、女性での発生率は１０００００人中４２．３人である。
肺癌及び気管支癌は、２０００年に推定１５６９００人の死亡者を生じ、全ての癌死亡者の２８％を占めた。１９９２年〜１９９６年の間、肺癌による死亡率は、男性の間で有意に減少した（１年当たり−１．７％）一方で、女性についての死亡率は依然として有意に増加している（１年当たり０．９％）。１９８７年以来、より多くの女性が乳癌よりも肺癌で毎年死亡しており、４０年よりも長期にわたって女性における癌による死の主な原因であった。肺癌発生率及び死亡率の減少は、過去３０年にわたる喫煙率の減少に起因している可能性が高い；しかしながら、女性の間での喫煙パターンの減少は、男性の減少に遅れている。成人におけるタバコの使用の減少は鈍くなっているが、若者におけるタバコの使用は再び増加していることは懸念される。
【００１０】
肺癌及び気管支癌の治療法の選択肢は、癌の型と病期によって決定され、選択肢としては、手術、放射線療法及び化学療法が挙げられる。多くの局在化した癌について、手術は、通常選択される治療法である。該疾患は、通常、発見されるまでに広がっているので、放射線療法及び化学療法がしばしば手術と組み合わせて必要とされる。化学療法単独又は放射線療法と組み合わせた化学療法は、小細胞肺癌に対して選択される治療法であり；この治療法では、多くの割合の患者が寛解を経験し、これは長く持続する場合もある。しかし、肺癌及び気管支癌に対する効果的な治療及び診断アプローチ法の必要性がなおも存在している。
【００１１】
乳癌の推定１８２８００の新しい侵襲性症例が２０００年に米国の女性の間で生じると予測された。更に、乳癌の約１４００の新しい症例が、２０００年に男性において診断されると予測された。１９８０年代において毎年約４％増加した後、女性における乳癌発生率は、１９９０年代に１０００００症例当たり約１１０．６症例に頭打ちとなった。
米国だけで、２０００年に乳癌により推定４１２００人の死亡者が存在した（４０８００人が女性、４００人が男性）。乳癌は、女性における癌による死亡の２番目に主要なものである。最も最近のデータによれば、死亡率は、１９９２〜１９９６年の間に有意に減少しており、白人と黒人双方の若い女性の間で最も大きく減少していた。これらの減少は、おそらくは早期発見と治療法の改善の結果であった。
【００１２】
医療環境と患者の好みを考慮すると、乳癌の治療法には、腫瘤摘出術(lumpectomy)（腫瘍の局所的な切除）及び脇下リンパ節の切除；乳房切除（乳房の外科的切除）及び脇下リンパ節の切除；放射線療法；化学療法；又はホルモン療法が含まれうる。しばしば、２つ以上の方法が併用される。多数の研究が、初期段階の疾患について、腫瘤摘出術に加えた放射線療法後の長期生存率は、変更された根本的な乳房切除後の生存率に同様である。復元技術における顕著な進歩は、乳房切除後の乳房復元について幾つかの選択肢を提供している。近年、このような復元は、乳房切除と同時に行われている。
十分な量の周囲の正常な乳房組織を伴う非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）の局所切除は、ＤＣＩＳの局所的な再発を防ぎ得る。乳房への放射線照射及び／又はタモキシフェンによって、残っている乳房組織に発生するＤＣＩＳの機会が低減され得る。ＤＣＩＳは未治療のままであると発達して浸潤性乳癌になり得るので、これは重要である。しかしながら、これらの治療法については深刻な副作用又は後遺症が残る。従って、効果的な乳癌治療法の必要性が存在する。
【００１３】
２０００年には米国において推定２３１００の卵巣癌の新症例が存在した。卵巣癌は女性における全ての癌の４％に匹敵し、婦人科癌では第２位に位置付けられている。１９９２〜１９９６年の間、卵巣癌の発症率は有意に低下した。卵巣癌の結果、２０００年には推定１４０００人が死亡した。卵巣癌は、女性生殖系の他のどの癌よりも多い死亡者を生じる。
手術、放射線療法、及び化学療法が、卵巣癌に対する治療選択肢である。手術には、通常、卵巣の一方か両方の切除、ファローピウス管の切除（卵管卵巣摘出術）、及び子宮の切除（子宮摘出術）が挙げられる。幾つかの非常に初期の腫瘍では、特に子供を持つことを望む若い女性において、関与する卵巣のみが除去される。進行した疾患では、全ての腹腔内の疾患を除去して化学療法の効力を増大させることが試みられる。卵巣癌に対する効果的な治療選択肢について重要な必要性がなおも存在している。
【００１４】
２０００年に米国では推定２８３００の膵臓癌の新症例が存在した。過去２０年間にわたって、膵臓癌の割合は男性においては減少している。女性における割合は、おおよそ一定のままであるが、減少し始めているかもしれない。膵臓癌は、２０００年に米国において推定２８２００の死者を出した。過去２０年間にわたって、男性における致死率は僅かであるが有意に減少している（１年間で約−０．９％）一方、女性においては割合が僅かに上昇した。
手術、放射線療法、及び化学療法が膵臓癌に対する治療選択肢である。これらの治療選択肢は、多くの患者において生存を長期化し及び／又はその症状を軽減し得るが、殆どの場合、治癒をもたらすようではない。癌の更なる治療及び診断選択肢に対する多大な必要性が存在する。これらには、治療モダリティとしての抗体、ワクチン及び小分子が含まれる。また、これらのモダリティを、診断、検出、モニターの研究ツールとして、また更には癌の治療と研究の全分野における技術水準として使用する必要性がある。
【００１５】
（発明の概要）
本発明はＳＴＥＡＰ−１タンパク質及びＳＴＥＡＰ−１タンパク質のポリペプチド断片に結合する抗体並びにその結合断片及びそれから設計された分子を提供する。ここで使用される場合、ＳＴＥＡＰ−１という用語は８Ｐ１Ｄ４と同義である。本発明はポリクローナル及びモノクローナル抗体、マウス及び他の哺乳動物抗体、キメラ抗体、ヒト化及び完全なヒト抗体、及び検出可能なマーカーもしくは治療剤で標識された抗体を含む。ある実施態様では、図２の全核酸配列がコードされるわけではなく、及び／又は図２の全アミノ酸配列が調製されるわけではないことが仮定される。ある実施態様では、図２の全核酸配列がコードされ、及び／又は図２の全アミノ酸配列が調製され、その何れかがそれぞれのヒト単位投薬形態にある。
本発明は様々な生物学的試料中におけるＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド及びタンパク質の存在及び状況を検出する方法、並びにＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を同定する方法を更に提供する。この発明の実施態様は癌のような成長調節異常のある形態を持っているか持っていることが疑われる組織又は血液試料中におけるＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物をモニターする方法を提供する。
【００１６】
本発明は、ＳＴＥＡＰ−１の転写、翻訳、プロセシング又は機能を阻害することを目的とする治療法並びに癌ワクチンを含む、表Ｉに列挙した組織の癌のようなＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を治療するための様々な免疫原性又は治療組成物及び方策を更に提供する。一側面では、本発明は、ヒト患者においてＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を治療するための組成物及びそれを含む方法を提供し、ここで、その組成物は、ヒトへの使用に適した担体とＳＴＥＡＰ−１の産生又は機能を阻害する一又は複数の薬剤のヒト単位用量を含有する。好ましくは、担体はヒトに独特の担体である。本発明の他の側面では、薬剤はＳＴＥＡＰ−１タンパク質と免疫反応性である部分である。そのような部分の非限定的な例には、限定されるものではないが、抗体（例えば単鎖、モノクローナル、ポリクローナル、ヒト化、キメラ、又はヒト抗体）、その機能的均等物（天然に生じるか合成かを問わず）、及びその組み合わせが含まれる。抗体は診断又は治療部分にコンジュゲートされうる。他の側面では、薬剤はここに定義したような小分子である。
【００１７】
他の側面では、薬剤はＳＴＥＡＰ−１に対するＣＴＬ反応をヒトにおいて誘発するＨＬＡクラスＩ分子に結合する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む一又は複数のペプチド及び／又はＨＴＬ反応をヒトにおいて誘発するＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープを含む一又は複数のペプチドを含む。本発明のペプチドは同じ又は一以上の別個のポリペプチド分子上にあってもよい。本発明の更なる側面では、薬剤は、上に記載した一又は複数のＣＴＬ又はＨＴＬ反応刺激ペプチドを発現する一又は複数の核酸分子を含む。本発明の更に他の側面では、一又は複数の核酸分子は上に記載したようなＳＴＥＡＰ−１と免疫学的に反応性である部分を発現しうる。一又は複数の核酸分子はまたＳＴＥＡＰ−１の産生を阻害する分子でありうるか、それをコードする。そのような分子の非限定的な例には、限定するものではないが、ＳＴＥＡＰ−１の産生に必須のヌクレオチド配列に相補的なもの（例えばＳＴＥＡＰ−１産生に必須のヌクレオチド二重螺旋と三重螺旋を形成するアンチセンス配列又は分子）又はＳＴＥＡＰ−１ｍＲＮＡを溶解するのに効果的なリボザイムが含まれる。
【００１８】
本発明の他の実施態様は、次のプロファイルの一、二、三、四、又は五を有するペプチド領域又はそのペプチド領域をコードするオリゴヌクレオチドを含む抗体エピトープである：
ｉ）図５の親水性度(Hydrophilicity)プロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９に等しいかそれより大きい値を有するか、又は１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３のタンパク質の完全長まで任意の自然数で増加する、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸のペプチド領域；
ｉｉ）図６のヒドロパシー(Hydropathicity)プロファイルにおいて、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１に等しいかそれより小さい値を有するか、又は０．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３のタンパク質の完全長まで任意の自然数で増加する、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸のペプチド領域；
ｉｉｉ）図７の露出残基パーセント(Percent Accessible Residues)プロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９に等しいかそれより大きい値を有するか、又は１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３のタンパク質の完全長まで任意の自然数で増加する、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸のペプチド領域；
ｉｖ）図８の平均フレキシビリティ(Average Flexibility)プロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９に等しいかそれより大きい値を有するか、又は１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３のタンパク質の完全長まで任意の自然数で増加する、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸のペプチド領域；
ｖ）図９のβターン(Beta-turn)プロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９に等しいかそれより大きい値を有するか、又は１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３のタンパク質の完全長まで任意の自然数で増加する、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸のペプチド領域。
【００１９】
本発明は、表Ｉに列挙された癌において過剰発現されることが見出されたＳＴＥＡＰ−１と命名された遺伝子にも関する。正常組織におけるＳＴＥＡＰ−１遺伝子発現のノーザンブロット発現分析は、成人組織における限定された発現パターンを示す。ＳＴＥＡＰ−１のヌクレオチド（図２）及びアミノ酸（図２及び図３）配列を提供する。正常成人組織におけるＳＴＥＡＰ−１の組織関連プロファイルは、表Ｉに列挙した組織において観察された過剰発現とあわせ、ＳＴＥＡＰ−１が少なくとも幾つかの癌において異常に過剰発現し、よって、表Ｉで列挙されたもののような組織の癌に対する有用な診断、予防、予後診断及び／又は治療標的となることを示している。
本発明は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子、ｍＲＮＡ及び／又はコード配列の全体又は一部分に対応するか又は相補的である、好ましくは単離形態のポリヌクレオチドで、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質及び４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２５を超える連続アミノ酸の断片をコードするポリヌクレオチド；少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００又は１００を超える連続アミノ酸のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質、並びにペプチド／タンパク質自体；ＳＴＥＡＰ−１遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列又はそれらの一部に対して相補的であるか又は少なくとも９０％の相同性を有するＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及び関連分子、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、及びＳＴＥＡＰ−１遺伝子、ｍＲＮＡ又はＳＴＥＡＰ−１コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む。ＳＴＥＡＰ−１をコードするｃＤＮＡ及び遺伝子を単離するための手段もまた提供される。ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子、このような分子で形質転換又は形質導入された細胞、及びＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の発現のための宿主−ベクター系もまた提供される。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
（セクションの概要）
Ｉ．）定義
ＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド
ＩＩ．Ａ．）ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドの用途
ＩＩ．Ａ．１．）遺伝的異常のモニタリング
ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンスの実施態様
ＩＩ．Ａ．３．）プライマー及びプライマー対
ＩＩ．Ａ．４．）ＳＴＥＡＰ−１コード核酸分子の単離
ＩＩ．Ａ．５．）組換え核酸分子及び宿主−ベクター系
ＩＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質
ＩＩＩ．Ａ．）モチーフ保有タンパク質の実施態様
ＩＩＩ．Ｂ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の発現
ＩＩＩ．Ｃ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の修飾
ＩＩＩ．Ｄ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の用途
ＩＶ．）ＳＴＥＡＰ−１抗体
Ｖ．）ＳＴＥＡＰ−１細胞免疫応答
ＶＩ．）ＳＴＥＡＰ−１トランスジェニック動物
ＶＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１の検出方法
ＶＩＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１関連遺伝子とその産物の状態をモニタリングするための方法
ＩＸ．）ＳＴＥＡＰ−１と相互作用する分子の同定
Ｘ．）治療法及び組成物
Ｘ．Ａ．）抗癌ワクチン
Ｘ．Ｂ．）抗体ベース治療法の標的としてのＳＴＥＡＰ−１
Ｘ．Ｃ．）細胞免疫応答の標的としてのＳＴＥＡＰ−１
Ｘ．Ｃ．１．ミニ遺伝子ワクチン
Ｘ．Ｃ．２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドの組み合わせ
Ｘ．Ｃ．３．ＣＴＬペプチドとＴ細胞プライミング剤の組み合わせ
Ｘ．Ｃ．４．ＣＴＬペプチド及び／又はＨＴＬペプチドでパルスされたＤＣを含むワクチン組成物
Ｘ．Ｄ．）養子免疫療法
Ｘ．Ｅ．）治療又は予防目的のためのワクチンの投与
ＸＩ．）ＳＴＥＡＰ−１の診断及び予後的実施態様
ＸＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１タンパク質機能の阻害
ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体でのＳＴＥＡＰ−１の阻害
ＸＩＩ．Ｂ．）組換えタンパク質でのＳＴＥＡＰ−１の阻害
ＸＩＩ．Ｃ．）ＳＴＥＡＰ−１の転写又は翻訳の阻害
ＸＩＩ．Ｄ．）治療方策に対する一般的考慮事項
ＸＩＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１モジュレータの同定、特徴付け及び用途
ＸＩＶ．）ＲＮＡｉ及び小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の治療用途
ＸＶ．）キット／製造品。
【００２１】
（Ｉ．）定義：
他の定義がなされていない限り、ここで使用される当該分野の全ての用語、記号、及び他の科学的用語又は専門用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。ある場合には、一般的に理解される意味の用語を、明確さ及び／又は即時の参照のためにここで定義するが、ここにこのような定義を含むことは、当該分野で一般的に理解される定義に対して実質的な差異を表すとは必ずしも解釈されるべきでない。ここに記載されるか又は参照される技術及び手順の多くは、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2版(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている、広範囲に利用されている分子クローニング方法論におけるように、一般的に十分に理解され、当業者によって、常套的な方法論を用いて一般的に使用される。適切な場合には、市販のキット及び試薬の使用に関する手順は、特段の説明がない場合は、製造業者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従って一般的に実施される。
【００２２】
「進行した前立腺癌」、「局所的に進行した前立腺癌」、「進行した疾患」及び「局所的に進行した疾患」なる用語は、前立腺嚢を通じて拡大した前立腺癌を意味し、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＵＡ）系下でのステージＣの疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔ系下でのステージＣ１〜Ｃ２の疾患、及びＴＮＭ（腫瘍、節、転移）系下でのステージＴ３〜Ｔ４及びＮ＋の疾患を含むことを意味する。一般に、外科手術は、局所的に進行した疾患を有する患者については推奨されず、これらの患者は、臨床的に局在した（器官に限定された）前立腺癌を有している患者と比較して、実質的にあまり好ましくない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の外側縁を超えるしこり、あるいは前立腺の基部の上部の非対称性又はしこりの明白な証拠によって、臨床的に同定される。局所的に進行した前立腺癌は、現在は、腫瘍が前立腺嚢に侵入又は浸潤するか、外科的な縁にまで伸びるか、又は精嚢に侵入する場合には、根治的な前立腺切除後に病理学的に診断される。
【００２３】
「天然のグリコシル化パターンを改変する」とは、ここでの目的では、天然配列ＳＴＥＡＰ−１に見出される一以上の糖鎖部分を欠失させること（元のグリコシル化部位を除去することによるか、又は化学的手段及び／又は酵素的手段によってグリコシル化を除去することによるかの何れかで）、及び／又は天然配列ＳＴＥＡＰ−１に存在しない一以上のグリコシル化部位を付加することを意味するものである。更に、この用語は、存在している様々な糖鎖部分の性質及び割合の変化を含む天然タンパク質のグリコシル化の定量的変化を含む。
「アナログ（類似体）」なる用語は、別の分子と構造的に類似するか、又は類似するか又は対応する特性を共有する分子（例えば、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質）を意味する。例えば、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアナログは、ＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合する抗体又はＴ細胞によって特異的に結合され得る。
【００２４】
「抗体」なる用語は、他の定義を明確に記載しない限り、最も広義に使用される。従って、「抗体」は、天然に生じるか、又は一般的なハイブリドーマ技術によって産生されるモノクローナル抗体のように人工的でありうる。抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体並びにこれらの抗体の抗原結合ドメイン及び／又は一以上の相補性決定領域を含む断片を含む。ここで用いられる場合、「抗体」なる用語は、ＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合する、及び／又は所望の生物学的活性を示す抗体又はその断片の任意の形態を意味し、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、及びＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合し及び／又は所望の生物学的活性を示す限りは抗体断片を包含する。任意の特異的抗体がここに提供される方法及び組成物に使用できる。従って、一実施態様では、「抗体」なる用語は、組み合わさって標的抗原に対する特異的結合部位を形成する軽鎖免疫グロブリンからの少なくとも一の可変領域と重鎖分子からの少なくとも一の可変領域を含む分子を包含する。一実施態様では、抗体はＩｇＧ抗体である。例えば、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体である。本方法及び組成物において有用な抗体は、細胞培養、ファージ、又は限定するものではないがウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、エイプを含む様々な動物において産生させることができる。従って、一実施態様では、本発明の抗体は哺乳動物の抗体である。ファージ技術は最初の抗体を単離し又は改変された特異性又は親和性特性を持つ変異体を産生するために使用することができる。そのような技術は常套的なものであり当該分野でよく知られている。一実施態様では、抗体は、当該分野で知られた組換え手段によって産生される。例えば、組換え抗体は抗体をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを宿主細胞に形質移入することによって産生させることができる。一又は複数のベクターを用いて、宿主細胞において少なくとも一のＶＬ及び一のＶＨ領域を発現するＤＮＡ配列を形質移入することができる。抗体産生及び生産の組換え手段の例示的な記述は、Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997)；Shephardら, MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000)；Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993)； CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, 最新版)にある。本発明の抗体を、所望の機能の媒介における抗体の更なる効果を増大させるために組換え手段によって修飾することができる。よって、組換え手段を使用して置換によって抗体を修飾することができることも本発明の範囲にある。典型的には、置換は保存的置換である。例えば、抗体の定常領域における少なくとも一のアミノ酸を異なった残基で置換することができる。例えば米国特許第５６２４８２１号、米国特許第６１９４５５１号、出願番号ＷＯ９９５８５７２；及びAngalら, Mol. Immunol. 30 : 105-08 (1993)を参照のこと。アミノ酸における修飾にはアミノ酸の欠失、付加、置換が含まれる。ある場合には、そのような変化は、例えば補体依存性細胞傷害性のような望まれない活性を低���させるために行われる。しばしば、抗体は、検出可能なシグナルをもたらす物質を共有結合により又は非共有結合により結合させることにより標識される。非常に広範な標識と結合技術が知られており、科学文献と特許文献の双方において広く報告されている。これらの抗体は正常な又は欠陥性ＳＴＥＡＰ−１への結合についてスクリーニングすることができる。例えば、ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996)を参照のこと。所望の生物学的活性を持っている適切な抗体は、限定するものではないが、増殖、遊走、接着、軟寒天増殖、血管形成、細胞間連絡、アポトーシス、輸送、シグナル伝達を含むインビトロアッセイ、及び腫瘍成長の阻害のようなインビボアッセイで同定することができる。ここで提供される抗体はまた診断用途に有用であり得る。捕獲又は非中和抗体については、それらは抗原のレセプター結合又は生物学的活性を抑制することなく特異的抗原に結合する能力についてスクリーニングできる。中和抗体については、抗体は競合結合アッセイにおいて有用であり得る。それらはまたＳＴＥＡＰ−１又はそのレセプターを定量するために使用することもできる。
【００２５】
「抗体断片」は、その標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部分（すなわち、抗原結合領域）として定義される。一実施態様では、これは、単一の抗ＳＴＥＡＰ−１抗体及びそのクローン（アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体を含む）及びポリエピトープ特異性を有する抗ＳＴＥＡＰ−１抗体組成物を特に包含する。本方法及び組成物の抗体はモノクローナル又はポリクローナルでありうる。抗体はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖可変領域等々を含む抗原結合抗体断片の形態であり得る。無傷の分子の断片は当該分野でよく知られ酵素消化及び組換え手段を含む方法を使用して産生させることができる。
ここで使用される場合、「抗原」の任意の形態を、ＳＴＥＡＰ１に特異的な抗体を産生するために使用することができる。よって、誘発抗原は単一のエピトープ、複数のエピトープ、又はタンパク質全体を単独で又は当該分野で知られている一又は複数の免疫原性向上剤との組み合わせでありうる。誘発抗原は単離された全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば抗原の少なくとも一部を形質移入した細胞での免疫化）、又は可溶型タンパク質（例えばタンパク質の細胞外ドメイン部分のみでの免疫化）でありうる。抗原は遺伝的に改変された細胞において産生されうる。抗原をコードするＤＮＡはゲノム又は非ゲノム（例えばｃＤＮＡ）であり得、細胞外ドメインの少なくとも一部をコードする。ここで用いられる場合、「部分」という用語は、必要に応じて、対象の抗原の免疫原性エピトープを構成する最小数のアミノ酸又は核酸を意味する。限定するものではないがアデノウイルスベクター、プラスミド、及び非ウイルスベクター、例えば陽イオン性脂質を含む、対象の細胞の形質転換に好適な任意の遺伝子ベクターを用いることができる。一実施態様では、ここでの方法及び組成物の抗体は対象のＳＴＥＡＰ−１の細胞外ドメインの少なくとも一部分に特異的に結合する。
【００２６】
ここで提供される抗体又はその抗原結合断片は「生理活性剤」に結合されうる。ここで使用される場合、「生理活性剤」という用語は抗原に結合し、及び／又は細胞死滅毒素を亢進する所望の生物学的効果を亢進し及び／又は媒介する任意の合成され又は天然に生じる化合物を意味する。
一実施態様では、本発明において有用な結合断片は生物学的に活性な断片である。ここで使用される場合、「生物学的に活性な」という用語は、所望の抗原エピトープに結合し生物学的効果を直接的に又は間接的に奏することができる抗体又は抗体断片を意味する。直接的効果には、限定するものではないが、成長シグナルの調節、刺激、及び／又は阻害、抗アポトーシスシグナルの調節、刺激、及び／又は阻害、アポトーシス又は壊死シグナルの調節、刺激、及び／又は阻害、ＡＤＣＣカスケードの調節、刺激、及び／又は阻害、及びＣＤＣカスケードの調節、刺激、及び／又は阻害が含まれる。
「二重特異的」抗体もまた本方法及び組成物において有用である。ここで使用される場合、「二重特異的抗体」なる用語は少なくとも二つの異なった抗原エピトープに対して結合特異性を有する抗体、典型的にはモノクローナル抗体を意味する。一実施態様では、エピトープは同じ抗原由来である。他の実施態様では、エピトープは二つの異なった抗原由来である。二重特異的抗体を製造する方法は当該分野で知られている。例えば、二重特異的抗体は、二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を使用して組換え的に製造することができる。例えば、Milsteinら, Nature 305:537-39 (1983)を参照。あるいは、二重特異的抗体は化学的結合を使用して調製することができる。例えば、Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48 (1993), Gruberら, J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照。
【００２７】
ここでのモノクローナル抗体には、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか相同である一方、鎖の残りが他の種由来の又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが標的抗原に特異的に結合し及び／又は所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。
「コドン最適化配列」なる用語は、約２０％未満の使用頻度を有する任意のコドンを置換することによって特定の宿主種について最適化されているヌクレオチド配列を意味する。偽ポリアデニル化配列の除去、エキソン／イントロンスプライシングシグナルの除去、トランスポゾン様反復の除去及び／又はコドン最適化に加えてＧＣ含量の最適化によって、所定の宿主種中での発現について最適化されているヌクレオチド配列をここで「発現増強配列」と称する。
「コンビナトリアルライブラリ」は、試薬のような多くの化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることによって化学合成か又は生物学的合成の何れかによって産生される多様な化学的化合物の集合である。例えば、直鎖状コンビナトリアル化学ライブラリー、例えばポリペプチド（例えばムテイン）ライブラリーは、所定の化合物長さ（つまり、ポリペプチド化合物中のアミノ酸数）に対してあらゆる可能な方法でアミノ酸と呼ばれる化学的ビルディングブロックの集合を組み合わせることによって形成される。数多くの化学的化合物が化学的ビルディングブロックのコンビナトリアル混合によって合成される（Gallopら, J. Med. Chem. 37(9): 1233-1251 (1994)）。
【００２８】
コンビナトリアルライブラリーの調製とスクリーニングは当業者によく知られている。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、限定されるものではないが、ペプチドライブラリー（例えば米国特許第５０１０１７５号, Furka, Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991), Houghtonら, Nature, 354:84-88 (1991)）、ペプトイド類（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９７３５)、コード化ペプチド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオ−オリゴマー（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５２８８５１４号）、ダイバーサマー（diversomers）、例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチド（Hobbsら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913(1993)）、ビニル性ポリペプチド（Hagiharaら, J. Amer. Chem.Soc. 114:6568 (1992)）、β−Ｄ−グルコーススカフォールディングを持つ非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmannら, J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)）、小化合物ライブラリーの類似有機合成（Chenら, J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)）、オリゴカルバネート(oligocarbarnates)（Choら, Science 261:1303 (1993)）、及び／又はペプチジルホスホネート（Campbellら, J. Org. Chem. 59: 658 (1994)）が含まれる。一般には、Gordonら, J. Med. Chem. 37: 1385 (1994)、核酸ライブラリー（例えばStratagene, Corp.参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第５５３９０８３号参照）、抗体ライブラリー（例えばVaughnら, Nature Biotechnology 14 (3): (1996),及びＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照）、炭水化物ライブラリー（例えばLiang ら, Science 274: 1520-1522 (1996),及び米国特許第５５９３８５３号）、及び小有機分子ライブラリー（例えばベンゾジアゼピン, Baum, C&EN, Jan 18, page 33 (1993)；イソプレノイド類、米国特許第５５６９５８８号；チアゾリジノン類及びメタチアザノン類、米国特許第５５４９９７４号；ピロリジン類、米国特許第５５２５７３５号及び同第５５１９１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５５０６３３７号；ベンゾジアゼピン類、米国特許第５２８８５１４号等々）を参照のこと。
【００２９】
コンビナトリアルライブラリーの調製のための装置は商業的に入手できる（例えば357 NIPS, 390 NIPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A, Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050, Plus, Millipore, Bedford, NIAを参照）。多くのよく知られたロボット利用システムもまた液相化学に対して開発されている。これらのシステムには、自動化ワークステーション、例えば武田化学工業株式会社(大阪,日本)によって開発された自動合成装置及びロボットアームを利用するロボットシステム(Zymate H, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.)で、化学者による手作業の合成操作を模倣するものが含まれる。上記装置の何れも本発明での使用に適している。これらの装置の性質と（必要に応じて）ここで検討されたようにして操作することができるようにこれらの装置の改造を実施することは当該分野の当業者に明らかであろう。また、数多くのコンビナトリアルライブラリーがそれ自体商業的に利用できる（例えばComGenex, Princeton, NJ; Asinex, Moscow, RU; Tripos, Inc., St. Louis, MO; ChemStar, Ltd, Moscow, RU; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences,Columbia,.MD;等々を参照）。
【００３０】
ここで使用される場合、「保存的置換」とは、当業者に知られており、得られる分子の生物学的活性を改変することなく一般に実施することができるアミノ酸の置換を意味する。当業者は、一般に、ポリペプチドの非本質的な領域における一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に改変するものではないことを理解している（例えば、Watsonら, MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224 (4版1987)を参照）。そのような例示的置換は好ましくは表ＩＩＩ（ａ−ｂ）に記載のものに従ってなされる。例えば、そのような変化には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、及びロイシン（Ｌ）をこれら疎水性アミノ酸の任意の他のものの代わりに；アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）の代わりに、またその逆；グルタミン（Ｑ）をアスパラギン（Ｎ）の代わりに、またその逆；及びセリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）の代わりに、またその逆に置換することが含まれる。他の置換もまた、特定のアミノ酸の環境及びタンパク質の三次元構造におけるその役割に応じて、保存的と考えることができる。例えば、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）は、アラニン（Ａ）とバリン（Ｖ）のように、しばしば交換可能であり得る。メチオニン（Ｍ）は、比較的疎水性であるが、しばしばロイシン及びイソロイシンと、時々バリンと、交換可能でありうる。リジン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の顕著な特徴がその電荷であり、これら二つのアミノ酸残基の異なるｐＫは重要ではない位置においてしばしば交換可能である。更に他の変化が特定の環境において「保存的」であると考えることができる（例えばここの表ＩＩＩ（ａ）；13-15頁 "Biochemistry" 2版. Lubert Stryer編(Stanford University)；Henikoffら, PNAS 1992 Vol 8910915-10919；Leiら, J Biol Chem 1995 May 19; 270 (20):11882-6を参照）。他の置換もまた許容され、経験的に又は既知の保存的置換に従って決定することができる。
【００３１】
「細胞傷害剤」という用語は、細胞の発現活性、細胞の機能を阻害するか又は防止し、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位元素化学療法剤及び毒素、例えば、細菌、真菌、植物又は動物起源の小分子毒素又は酵素的に活性な毒素で、断片及び／又はその変異体を含むものを含むことが意図される。細胞傷害剤の例には、限定されるものではないが、アウリスタチン(auristatin)、アウリスタチンｅ、アウロマイシン（auromycin）、メイタンシノイド、イットリウム、ビスマス、リシン、リシンＡ鎖、コンブレスタチン（combrestatin）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、ドロスタチン（dolostatin）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、α−サルシン（sarcin）、ゲロニン（gelonin）、ミトゲリン（mitogellin）、レトストリクトシン（retstrictocin）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（curicin）、クロチン（crotin）、カリケアマイシン、サパオナリア・オフィシナリス(Sapaonaria officinalis)インヒビター、及びグルココルチコイド、及び他の化学療法剤、並びに放射性同位元素、例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２又はＢｉ２１３、Ｐ３２及びＬｕ１７７を含むＬｕの放射性同位元素。抗体はまたプロドラッグをその活性形態に変換し得る抗癌プロドラッグ活性化酵素と結合され得る。
【００３２】
ここで使用される場合、「ダイアボディ(diabodies)」とは、二つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片であって、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む断片を意味する。同じ鎖の二つのドメイン間において対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを他の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位をつくる。ダイアボディは例えば欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)に更に十分に記載されている。
「遺伝子産物」は、ここではペプチド／タンパク質又はｍＲＮＡを示すために使用される。例えば、「本発明の遺伝子産物」を、ここではしばしば「癌アミノ酸配列」、「癌タンパク質」、「表Ｉに列挙された癌のタンパク質」、「癌ｍＲＮＡ」、「表Ｉに列挙された癌のｍＲＮＡ」等々という。一実施態様では、癌タンパク質は図２の核酸によってコードされる。癌タンパク質は断片であり得、あるいは図２の核酸によってコードされる全長タンパク質でありうる。一実施態様では、癌アミノ酸配列は同一性又は類似性を決定するために使用される。他の実施態様では、配列は図２の核酸によってコードされるタンパク質の天然に生じる対立遺伝子変異体である。他の実施態様では、配列はここに更に記載される配列変異体である。
【００３３】
「ヘテロ結合体(heteroconjugate)」抗体は本方法及び組成物において有用である。ここで使用される場合、「ヘテロ結合体抗体」は二つの共有的に結合した抗体を意味する。そのような抗体は、架橋剤の使用を含む合成タンパク質化学における既知の方法を使用して調製することができる。例えば米国特許第４６７６９８０号を参照のこと。
特定の核酸又はタンパク質産物の存在、不存在、定量、又は他の性質に対する「ハイスループットスクリーニング」アッセイは当業者によく知られている。同様に、結合アッセイ及びレポーター遺伝子アッセイが同様によく知られている。よって、例えば米国特許第５５５９４１０号はタンパク質のハイスループットスクリーニング法を開示している；米国特許第５５８５６３９号は核酸結合（つまりアレイ）に対するハイスループットスクリーニング法を開示している；一方、米国特許第５５７６２２０号及び第５５４１０６１号はリガンド／抗体結合に対するハイスループットスクリーニング法を開示している。
また、ハイスループットスクリーニングシステムが商業的に利用できる（例えばAmersham Biosciences, Piscataway, NJ; Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA等々を参照）。これらのシステムは、典型的には、全ての試料及び試薬の分注、液体分配、時間指定インキュベーション、アッセイの検出器のマイクロプレートの最終読み取りを含む全手順を自動化している。これらの設定可能なシステムは高速及び迅速なスタートアップ並びに高度の柔軟性とカスタマイズ化を提供する。このようなシステムの製造者は様々なハイスループットシステムに対する詳細なプロトコルを提供する。よって、例えば、Zymark社は、遺伝子転写、リガンド結合等々の変化を検出するためのスクリーニングシステムを記載している技術会報を提供している。
【００３４】
「ホモログ」という用語は、例えば、対応する位置で同じか又は類似である化学残基の配列を有することによって、別の分子と相同性を示す分子をいう。
一実施態様では、ここで提供される抗体は「ヒト抗体」である。ここで使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖及び重鎖配列の本質的に配列全体がヒト遺伝子由来である抗体を意味する。一実施態様では、ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞技術（例えばKozborら, Immunol. Today 4: 72 (1983)を参照）、ＥＢＶ形質転換技術（例えば、Coleら MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96 (1985)を参照）、又はファージディスプレイ（例えばMarksら, J. Mol. Biol. 222:581(1991)参照）を使用して調製される。特定の実施態様では、ヒト抗体はトランスジェニックマウスにおいて産生される。ヒト抗体を部分的ないしは完全に調製する技術は当該分野で知られており、任意のそのような方法を使用することができる。特に好ましい一実施態様では、完全にヒトの抗体配列を、ヒト重鎖及び軽鎖抗体遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて作成することができる。ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウス及びその子孫を調製する例示的な記載は出願ＷＯ０２／４３４７８及び米国特許第６６５７１０３号(Abgenix)に見出される。所望の抗体を産生するトランスジェニックマウス由来のＢ細胞をついで融合させて、抗体の連続生産のためのハイブリドーマ細胞株を製造することができる。例えば米国特許第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；５６３３４２５号；第５６６１０１６号；及び第５５４５８０６号；及びJakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998)；Greenら, J. Exp. Med. 188:483-95 (1998)を参照のこと。
【００３５】
「ヒト白血球抗原」又は「ＨＬＡ」は、ヒトのクラスＩ又はクラスＩＩの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質である（例えばStitesら, IMMUNOLOGY, 8版, Lange Publishing, Los Altos, CA (1994)を参照）。
ここで使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト（例えばマウス）抗体並びにヒト抗体由来の配列を含む抗体の形態を意味する。そのような抗体は非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。一般に、ヒト化抗体は、高頻度可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンのものである少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は場合によっては免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。例えばCabillyの米国特許第４８１６５６７号；Queenら(1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033；及びANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press 1996)を参照のこと。
ポリヌクレオチドの文脈において使用される「ハイブリダイズ(hybridize)」、「ハイブリダイズする(hybridizing)」、「ハイブリダイズする(hybridizes)」等は、一般的なハイブリダイゼーション条件、好ましくは、例えば５０％のホルムアミド／６×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中でのハイブリダイゼーションを指すことが意味され、ここで、ハイブリダイゼーションの温度は３７℃を超え、０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄の温度は５５℃以上である。
【００３６】
「単離された」又は「生物学的に純粋な」という語句は、その天然状態で見出されるような物質に通常伴う構成成分を実質的に又は本質的に含んでいない物質をいう。従って、本発明に係る単離ペプチドは、好ましくはインサイツ環境においてペプチドに通常付随する物質を含まない。例えば、ポリヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子以外の遺伝子に対応するか又は相補的であるか、あるいはＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物又はその断片以外のポリペプチドをコードする汚染ポリヌクレオチドから実質的に分離される場合、「単離される」と言われる。当業者であれば、単離されたＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを得るために核酸単離手順を直ぐに利用できる。タンパク質は、例えば、物理的、機械的又は化学的方法が、タンパク質に通常付随する細胞の成分からＳＴＥＡＰ−１タンパク質を除去するするために利用される場合、「単離された」と言われる。当業者であれば、単離されたＳＴＥＡＰ−１タンパク質を得るために標準的な精製方法を直ぐに利用できる。あるいは、単離されたタンパク質は、化学的手段によって調製され得る。
好適な「標識」には放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子等々が含まれる。そのような標識の使用を教唆する特許には米国特許第３８１７８３７号；第３８５０７５２号；第３９３９３５０号；第３９９６３４５号；第４２７７４３７号；第４２７５１４９号；及び第４３６６２４１号が含まれる。また、ここで提供される抗体はフルオロボディの抗原結合成分として有用であり得る。例えば、Zeytunら, Nat. Biotechnol. 21:1473-79 (2003)を参照のこと。
【００３７】
「哺乳動物」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物に分類される任意の生物をいう。本発明の一実施態様では、哺乳動物はマウスである。本発明の別の実施態様では、哺乳動物はヒトである。
「転移性前立腺癌」及び「転移性疾患」という用語は、局所的なリンパ節又は離れた部位まで広がった前立腺癌を意味し、ＡＵＡ系下でのステージＤの疾患及びＴＮＭ系下でのステージＴ×Ｎ×Ｍ＋を含むことを意味する。局所的に進行した前立腺癌の症例と同様に、外科手術は一般的には転移性疾患を有している患者に対しては意図されず、ホルモン（アンドロゲンの切除）治療が好ましい治療法である。転移性前立腺癌を有している患者は、最終的には、治療開始の１２〜１８ヶ月以内にアンドロゲン治療不応性状態を発症する。これらのアンドロゲン治療不応性の患者の略半分が、その状態の発症後６ヶ月以内に死亡する。前立腺癌転移の最もよくある部位は骨である。前立腺癌の骨転移は、しばしば、骨溶解ではなく骨芽細胞性（すなわち、正味の骨形成を生じる）である。骨転移は、脊椎に最も頻繁に見出され、大腿骨、骨盤、胸郭、頭蓋骨、及び上腕骨が続く。他の一般的な転移部位としてはリンパ節、肺、肝臓及び脳が挙げられる。転移性前立腺癌は、典型的には、開放性又は腹腔鏡による骨盤リンパ腺切除、全身の放射性核種スキャン、骨格のレントゲン撮影、及び／又は骨の病変の生検によって、診断される。
【００３８】
ここで使用される「モジュレータ」又は「試験化合物」又は「薬剤候補」又は文法的均等物は、癌表現型又は癌配列、例えば核酸又はタンパク質配列の発現、又は癌配列の効果（例えばシグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質相互作用等々）を直接的に又は間接的に改変する能力について試験される任意の分子、例えばタンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖類、ポリヌクレオチド等々を記述する。一側面では、モジュレータは本発明の癌タンパク質の効果を中和する。「中和」とは、細胞に対する結果的な効果と共に、タンパク質の活性が阻害され又はブロックされることを意味する。他の側面では、モジュレータはタンパク質のレベルを正常化することによる本発明の遺伝子及びその対応するタンパク質の効果を無効にする。好適な実施態様では、モジュレータは、発現プロファイル、又はここに提供される発現プロファイル核酸又はタンパク質、又は下流のエフェクター経路を改変する。一実施態様では、モジュレータは癌表現型を例えば正常な組織フィンガープリントまで抑制する。他の実施態様では、モジュレータは癌表現型を誘導する。一般に、複数のアッセイ混合物を異なった薬剤濃度で並行に処理して様々な濃度に対する差次的な応答を得る。典型的には、これらの濃度の一つが負のコントロールとなり、つまりゼロ濃度又は検出レベル以下である。
【００３９】
モジュレータ、薬剤候補又は試験化合物は無数の化学クラスを包含するが、典型的には、それらは有機分子、好ましくは１００を越え約２５００ダルトン未満の分子量を有する小有機分子である。好適な小分子は２０００未満、又は１５００未満又は１０００未満又は５００Ｄ未満である。候補薬剤はタンパク質との構造的相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含み、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボニル基、好ましくは官能化学基の少なくとも二つを含む。候補薬剤はしばしば上記官能基の一又は複数と置換される環状炭素又はヘテロ環状構造及び／又は芳香族又は多環芳香族構造を含む。モジュレータはまた生体分子、例えばペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド類、プリン類、ピリミジン類、その誘導体、構造的類似体又は組み合わせを含む。特に好適なものはペプチドである。モジュレータの一クラスは、例えば約５から約３５アミノ酸のペプチドであり、約５から約２０アミノ酸が好ましく、約７から約１５が特に好ましい。好ましくは、癌調節性タンパク質は可溶型であり、非膜貫通領域を含み、及び／又は溶解性を補助するためにＮ末端Ｃｙｓを有する。一実施態様では、断片のＣ末端はフリーの酸として維持され、Ｎ末端はフリーのアミンであり、つまりシステインへのカップリングに役立つ。一実施態様では、本発明の癌タンパク質はここで検討される免疫原性剤に結合される。一実施態様では、癌タンパク質はＢＳＡに結合される。例えば好適な長さの本発明のペプチドは、より長いペプチド／タンパク質をつくるために互いに又は他のアミノ酸に結合させることができる。調節性ペプチドは、上で概説したような天然に生じるタンパク質の消化物、ランダムペプチド、又は「偏った(biased)」ランダムペプチドであり得る。好適な実施態様では、ペプチド／タンパク質ベースのモジュレータは、ここで定義したような抗体及びその断片である。
【００４０】
癌のモジュレータはまた核酸であり得る。核酸調節剤は天然に生じる核酸、ランダム核酸、又は「偏った」ランダム核酸でありうる。例えば、原核生物又は真核生物のゲノムの消化物を、タンパク質に対して上で概説したものと同様のアプローチ法で使用することができる。
「モノクローナル抗体」という用語は、ここで使用される場合、実質的に同種抗体の集団から得られる抗体、すなわち、少量で存在しうる可能な天然に生じる変異を除いて同一である集団を含む個々の抗体をいう。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原エピトープに対するものである。これに対して、一般的な（ポリクローナル）抗体調製物は典型的には異なったエピトープに対する（又はそれに特異的な）多数の抗体を含む。一実施態様では、ポリクローナル抗体は、複数の抗原エピトープを含む単一の抗原内に異なったエピトープ特異性、親和性、又は結合活性を持つ複数のモノクローナル抗体を含む。「モノクローナル」という修飾語は抗体の実質的に同質の集団から得られているという抗体の特性を示し、何らかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると見なされてはならない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature 256: 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって製造することができ、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照）によって製造することができる。「モノクローナル抗体」はまた例えばClacksonら, Nature 352: 624-628 (1991)及びMarksら, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)によって記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。これらのモノクローナル抗体は通常は少なくとも約１μＭのＫｄ、より一般的には少なくとも約３００ｎＭ、典型的には少なくとも約３０ｎＭ、好ましくは少なくとも約１０ｎＭ、より好ましくは少なくとも約３ｎＭ又はそれより良いＫｄで結合し、これは通常ＥＬＩＳＡで測定される。
【００４１】
ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の生物学的モチーフとしての「モチーフ」は、タンパク質の一次配列の一部を形成するアミノ酸の任意のパターンで、特定の機能（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用等）、又は修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化又はアミド化）、又は局在化（例えば分泌配列、核局在化配列等）に関連するもの、あるいは体液性であろうと細胞性であろうと免疫原性と関連する配列をいう。モチーフは、一般的に特定の機能又は性質に相関する所定の位置に隣接するか、又は整列し得るかの何れかでありうる。ＨＬＡモチーフの文脈で、「モチーフ」とは、特定のＨＬＡ分子によって認識される定まった長さのペプチド、通常は、クラスＩ ＨＬＡモチーフに対する約８〜約１３のアミノ酸、及びクラスＩＩ ＨＬＡモチーフに対する約６〜約２５のアミノ酸からのペプチドのパターンをいう。ＨＬＡ結合に対するペプチドモチーフは、典型的には各ヒトＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる各タンパク質について異なり、一次及び二次アンカー残基のパターンにおいて異なる。
「薬学的な賦形剤」は、アジュバント、担体、ｐＨ調整及び緩衝剤、等張剤、湿潤剤、保存料等々のような物質を含む。
「薬学的に許容可能な」とは、非毒性、不活性及び／又はヒト又は他の哺乳動物に生理学的に適合する組成物をいう。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドの何れか、あるいはヌクレオチドの何れかの型の修飾形態で、少なくとも１０個の塩基又は塩基対の長さのヌクレオチドのポリマー型を意味し、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの一本鎖及び二本鎖型を含むことを意味する。当該分野で、この用語は、必要であれば、しばしば「オリゴヌクレオチド」と相互交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、ここに開示されたヌクレオチド配列を含み得、ここで、例えば図２に示されるようなチミジン（Ｔ）はまたウラシル（Ｕ）であり得る：この定義は、ＤＮＡ及びＲＮＡの化学構造の違い、特にＲＮＡの４つの主な塩基のうち一つが、チミジン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）であるという知見に関する。
「ポリペプチド」という用語は、少なくとも約４、５、６、７、又は８アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書を通して、アミノ酸に対する標準的な３文字又は１文字表記が使用される。当該分野では、この用語は、しばしば「ペプチド」又は「タンパク質」と交換可能に使用される。
【００４３】
ＨＬＡの「一次アンカー残基」は、免疫原性ペプチド及びＨＬＡ分子との間に接触点を提供すると理解されるペプチド配列に沿う特定の位置のアミノ酸である。１から３、通常２つの、定まった長さのペプチド内の一次アンカー残基は一般に免疫原性ペプチドに対する「モチーフ」を定める。これらの残基は、ＨＬＡ分子のペプチド結合グルーブと、結合グローブの特異的ポケットに埋め込まれるそれらの側鎖と密に嵌まることが理解される。一実施態様では、例えば、ＨＬＡクラスＩ分子に対する一次アンカー残基は、本発明に従って、（アミノ末端位置から）２位に、カルボキシ末端位置の残基ペプチドエピトープ８位、９位、１０位、１１位又は１２位に位置する。あるいは、他の実施態様では、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドの一次アンカー残基は、ペプチドの末端ではなく、互いに離間しており、ここで、ペプチドは一般に少なくとも９アミノ酸長である。各モチーフ及びスーパーモチーフに対する一次アンカー位置は、表ＩＶ（ａ）に示される。例えば、アナログペプチドは表ＩＶに示される一次及び／又は二次アンカー位置における特定の残基の存在又は非存在を変更することによって作製され得る。このようなアナログは、特定のＨＬＡモチーフ又はスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性及び／又は集団適用範囲を調節するために使用される。
「放射性同位元素」には、限定されるものではないが、次のものが含まれる（非限定的な例示的な用途もまた表ＩＶ（Ｉ）に示す）。
【００４４】
核酸及びタンパク質に適用されるここでの「ランダム化」又は文法的等価物は、各核酸及びペプチドが本質的にランダムなヌクレオチド及びアミノ酸からそれぞれなることを意味する。これらのランダムなペプチド（又はここで検討した核酸）は任意の位置に任意のヌクレオチド又はアミノ酸を導入することができる。合成方法を設計してランダム化タンパク質又は核酸を産生することができ、配列の長さにわたって可能な組み合わせの全て又は殆どの形成を可能にし、よって、ランダム化された候補生物活性タンパク質様薬剤のライブラリーを形成する。
一実施態様では、ライブラリーは「完全にランダム化」され、何れの位置にも配列優先性又は不変性はない。他の実施態様では、ライブラリーは「偏ったランダム」ライブラリーである。つまり、配列内のある位置は一定に保持され、あるいは限られた数の可能性から選択される。例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸残基は、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った（小さいか大きい）残基、核酸結合ドメインの生成、システインの生成について、架橋、ＳＨ−３ドメインのプロリン、リン酸化部位のセリン、スレオニン、チロシン又はヒスチジン等々、又はプリン等々の、定まったクラス内でランダム化される。
【００４５】
「組換え」ＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、インビトロでの分子操作に供されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。
ここで使用される場合、「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」又は「単鎖」抗体は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を意味し、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するようにするポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメイン間に更に含む。ｓＦｖの概説に対しては、Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg及びMoore編 Springer-Verlag, New York, 269-315頁(1994)を参照のこと。
「小分子」の非限定的な例には、ＳＴＥＡＰ−１に結合又は相互作用する化合物、ホルモン、神経ペプチド、ケモカイン、臭気剤、リン脂質、及び結合し、好ましくはＳＴＥＡＰ−１タンパク質機能を阻害するその機能等価物を含むリガンドが挙げられる。このような非限定的な小分子は、好ましくは約１０ｋＤａ未満の分子量、より好ましくは約９、約８、約７、約６、約５又は約４ｋＤａ以下の分子量を有する。所定の実施態様では、小分子は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質と物理的に会合するか、又は結合し；天然に生じる代謝経路には見出されず；及び／又は非水溶液よりも水溶液により可溶性である。
【００４６】
ここで使用される場合、「特異的」という用語は標的抗原エピトープに対する抗体の選択的結合をいう。抗体は、与えられた一連の条件下で無関係な抗原又は抗原混合物への結合と適切な抗原への結合を比較することにより結合特異性につき試験することができる。抗体が無関係な抗原又は抗原混合物に対してよりも適切な抗原に少なくとも２、５、７、及び好ましくは１０倍強く結合するならば、それは特異的であると考えられる。一実施態様では、特異的抗体はＳＴＥＡＰ−１抗原にだけ結合するが無関係の抗原には結合しないものである。他の実施態様では、特異的抗体は、ヒトＳＴＥＡＰ−１抗原に結合するが、ＳＴＥＡＰ−１抗原と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸相同性を持つ非ヒトＳＴＥＡＰ−１抗原に結合しないものである。他の実施態様では、特異的抗体はヒトＳＴＥＡＰ−１抗原に結合しマウスＳＴＥＡＰ−１抗原に結合するが、ヒト抗原への結合度合いがより高いものである。他の実施態様では、特異的抗体は、ヒトＳＴＥＡＰ−１抗原に結合し霊長類ＳＴＥＡＰ−１抗原に結合するが、ヒト抗原への結合度合いがより高いものである。他の実施態様では、特異的抗体は、ヒトＳＴＥＡＰ−１抗原に結合し任意の非ヒトＳＴＥＡＰ−１抗原に結合するが、ヒト抗原又は任意のその組み合わせへの結合度合いがより高いものである。
【００４７】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、一般に、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とする一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、それらの融解温度以下の環境下に相補鎖が存在する場合、変性された核酸配列が再度アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間での所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用できる相対温度は高くなる。その結果、より高い相対温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向がある一方、より低い温度は、あまりそうではないことになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００４８】
「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェントな条件」は、ここで定義される場合は、これらに限定されないが、（１）洗浄のために低いイオン強度及び高温、例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を使用する；（２）変性剤、例えばホルムアミドをハイブリダイゼーション中に使用する、例えば、０．１％のウシの血清アルブミンを含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有するｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、４２℃；又は（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子のＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃で、そして５０％のホルムアミド中で５５℃で洗浄し、ついで５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシーの洗浄が続く。「中程度のストリンジェントな条件」は、これらに限定されないが、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載され、上に記載されたものよりも低ストリンジェントな洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントな条件の例は、１％のウシ血清アルブミン、０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、及び７％のＳＤＳ５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）を含有する溶液中での６５℃での一晩のインキュベーションと、続く２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中５０℃での、及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中５０℃でのフィルターの洗浄である。当業者であれば、プローブ長などの因子に順応させるために必要に応じて、温度、イオン強度等を如何にして調節するかは理解しているであろう。
【００４９】
ＨＬＡ「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子によって特異的に共有されるペプチド結合である。異なった族集団におけるＨＬＡスーパータイプの全体的な表現型頻度は表ＩＶ（ｆ）に示す。様々なスーパータイプの非限定的構成物は次の通りである：
A2： A*0201, A*0202, A*0203, A*0204,A* 0205, A*0206, A*6802, A*6901, A*0207 
A3： A3, A11, A31, A*3301, A*6801, A*0301, A*1101, A*3101 
B7： B7, B*3501-03, B*51, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*6701, B*7801, B*0702, B*5101, B*5602 
B44： B*3701, B*4402, B*4403, B*60(B*4001), B61 (B*4006) 
A1：A*0102, A*2604, A*3601, A*4301, A*8001 
A24： A*24, A*30, A*2403, A*2404, A*3002, A*3003 
B27： B*1401-02, B*1503, B*1509, B*1510, B*1518, B*3801-02, B*3901, B*3902, B*3903-04, B*4801-02, B*7301, B*2701-08 
B58： B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, B58 
B62： B*4601, B52, B*1501 (B62), B*1502 (B75), B*1513 (B77)
異なったＨＬＡスーパータイプの組み合わせによって得られる計算された集団適用範囲は表ＩＶ（ｇ）に記載される。
【００５０】
ここで使用される場合、「治療する」又は「治療的な」及び文法的に関連する用語は、疾患の任意の結果の任意の改善、例えば、延長した生存、より少ない罹患率、及び／又は代替的な治療形式の副産物である副作用の低減を意味する；当該分野では直ぐに理解されるように、疾患の完全な撲滅は好ましいが治療行為では必要とされない。
「トランスジェニック動物」（例えばマウス又はラット）は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は、動物に導入されたか、又は出生前、例えば胚の段階で動物の先祖に導入された。「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組込まれるＤＮＡである。
ここで使用される場合、ＨＬＡ又は細胞性免疫応答「ワクチン」は、本発明の一又は複数のペプチドを含むか又はコードする組成物をいう。このようなワクチンの多数の実施態様が存在し、例えば一又は複数の別個のペプチドのカクテル；ポリエピトープペプチドに含まれる本発明の一又は複数のペプチド；あるいはこのような個々のペプチド又はポリペプチド、例えばポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子をコードする核酸である。「一又は複数のペプチド」は、１〜１５０又はそれ以上、例えば、本発明の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、もしくは１５０以上のペプチドの任意の全整数単位を含みうる。ペプチド又はポリペプチドは、必要に応じ、例えば、脂質化、標的化配列又は他の配列の付加によって改変され得る。本発明のＨＬＡクラスＩペプチドは、細胞傷害性Ｔリンパ球及びヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を促進させるために、ＨＬＡクラスＩＩペプチドと混合され又は連結され得る。ＨＬＡワクチンはまたペプチドパルス抗原提示細胞、例えば樹状細胞を含み得る。
【００５１】
「変異体」なる用語は、記載される型又は基準からの変異を示す分子、例えば、特に記載されるタンパク質（例えば、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質）の対応部分に一又は複数の異なるアミノ酸残基を有するタンパク質をいう。アナログは、変異体タンパク質の例である。スプライシングアイソフォーム及び単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は変異体の更なる例である。
本発明の「ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質」には、ここで具体的に同定されたもの、並びに対立遺伝子変異体、ここで概説される方法又は当該分野で直ぐに利用可能な方法に従って過度の実験をすることなく、単離／産生され、特徴付けられ得る保存的置換変異体、アナログ及びホモログが含まれる。異なるＳＴＥＡＰ−１タンパク質又はその断片の部分を組合わせる融合タンパク質、並びにＳＴＥＡＰ−１タンパク質及び異種ポリペプチドの融合タンパク質もまた含まれる。そのようなＳＴＥＡＰ−１タンパク質は、本発明のタンパク質であるＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質、又はＳＴＥＡＰ−１として集合的に称される。「ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質」という用語は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２５以上のアミノ酸；又は少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３３０、３３５、３３９もしくはそれ以上のアミノ酸の、ポリペプチド断片又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列を意味する。
【００５２】
ＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド）
本発明の一側面では、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子、ｍＲＮＡ及び／又はコード配列の全て又は一部に対応するか又は相補的な、好ましくは単離形態の、ポリヌクレオチドであって、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びその断片、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及び関連分子、ＳＴＥＡＰ−１の遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド又はその一部、及びＳＴＥＡＰ−１遺伝子、ｍＲＮＡ、もしくはＳＴＥＡＰ−１コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド（集合的に「ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド」）を含むものが提供される。このセクションにおいて参照される場合、全ての例において、Ｔは、図２においてＵでもあり得る。
【００５３】
ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドの実施態様には、図２に示される配列を有するＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド、図２に示されるようなＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド配列（ここで、ＴはＵである）；図２に示されるような配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続ヌクレオチド；又は図２に示される配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１０個連続するヌクレオチド（ここで、ＴはＵである）が含まれる。例えば、ＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチドの実施態様は、限定するものではないが、次のものを含む：
（Ｉ）図２に示される配列を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＩ）図２Ａに示される配列の、ヌクレオチド残基番号６６からヌクレオチド残基番号１０８５（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＩＩ）図２Ｂに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＶ）図２Ｃに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号９４４（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（Ｖ）図２Ｄに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（必要に応じて終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＶＩ）図２Ｅに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＶＩＩ）図２Ｆに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＶＩＩＩ）図２Ｇに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＸ）図２Ｈに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（Ｘ）図２Ｉに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＩ）図２Ｊに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＩＩ）図２Ｋに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＩＩＩ）図２Ｌに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＩＶ）図２Ｍに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこの配列からなるか、又はこの配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＶ）図２Ｎに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、又はこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＶＩ）図２Ｏに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこの配列からなるか、又はこの配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＶＩＩ）図２Ｐに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこの配列からなるか、又はこの配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＶＩＩＩ）図２Ｑに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６からヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこの配列からなるか、又はこの配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＩＸ）図２Ａ〜Ｑに示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％相同なＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸ）図２Ａ〜Ｑに示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一なＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＩ）その特定の内容が出典明示により完全にここに援用される２００２年９月０６日出願の米国特許出願第１０／２３６８７８号に記載の表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及びＸＸＩＩ〜ＬＩに示される少なくとも一のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＩ）図５の親水性度（Hydrophilicity）プロファイルにおいて０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ａのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、３３９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＩＩ）図６のヒドロパシー（Hydropathicity）性プロファイルにおいて０．５未満の値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ａのペプチドの、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、３３９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＶ）図７の露出残基パーセントプロファイルにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ａのペプチドの、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、３３９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＶ）図８の平均フレキシビリティプロファイルにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ａのペプチドの、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、３３９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＶＩ）図９のβ−ターンプロファイルにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ａのペプチドの、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、３３９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＶＩＩ）図５の親水性度プロファイルにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｂ及び３Ｄのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、２５８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＶＩＩＩ）図６のヒドロパシー性プロファイルにおいて０．５未満の値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｂ及び３Ｄのペプチドの、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、２５８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＸ）図７の露出残基パーセントプロファイルにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｂ及び３Ｄのペプチドの、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、２５８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＸ）図８の平均フレキシビリティプロファイルにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｂ及び３Ｄのペプチドの、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、２５８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＩ）図９のβ−ターンプロファイルにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｂ及び３Ｄのペプチドの、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、２５８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＩＩ）図５の親水性度プロファイルにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｃのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、２８２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＩＩＩ）図６のヒドロパシー性プロファイルにおいて０．５未満の値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｃのペプチドの、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、２８２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＩＶ）図７の露出残基パーセントプロファイルにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｃのペプチドの、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、２８２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＶ）図８の平均フレキシビリティプロファイルにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｃのペプチドの、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、２８２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＶＩ）図９のβ−ターンプロファイルにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｃのペプチドの、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、２８２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＶＩＩ）（Ｉ）〜（ＸＸＸＶＩ）の何れか一のポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＶＩＩＩ）（Ｉ）〜（ＸＸＸＶＩＩ）の何れか一のポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＩＸ）（Ｉ）〜（ＸＸＸＶＩＩＩ）の何れかによってコードされるペプチド；及び
（ＸＬ）薬学的賦形剤と共に、及び／又はヒトの単位用量形態での、（Ｉ）〜（ＸＸＸＶＩＩＩ）の何れかのポリヌクレオチド又は（ＸＸＸＩＸ）のペプチドを含有する組成物；
（ＸＬＩ）ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を調節する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＶＩＩＩ）の何れかのポリヌクレオチド又は（ＸＸＸＩＸ）のペプチド又は（ＸＬ）の組成物を使用する方法；
（ＸＬＩＩ）ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を有する個体を診断し、予防し、予知し、又は治療する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＶＩＩＩ）の何れかのポリヌクレオチド又は（ＸＸＸＩＸ）のペプチド又は（ＸＬ）の組成物を使用する方法；
（ＸＬＩＩＩ）ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞で表Ｉに列挙した組織の癌からの細胞を有する個体を診断し、予防し、予知し、又は治療する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＶＩＩＩ）の何れかのポリヌクレオチド又は（ＸＸＸＩＸ）のペプチド又は（ＸＬ）の組成物を使用する方法；
（ＸＬＩＶ）癌を診断し、予防し、予知し、又は治療する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＶＩＩＩ）の何れかのポリヌクレオチド又は（ＸＸＸＩＸ）のペプチド又は（ＸＬ）の組成物を使用する方法；
（ＸＬＶ）表Ｉに列挙された組織の癌を診断し、予防し、予知し、又は治療する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＶＩＩＩ）の何れかのポリヌクレオチド又は（ＸＸＸＩＸ）のペプチド又は（ＸＬ）の組成物を使用する方法；
（ＸＬＶＩ）ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞のモジュレータを同定し又は特徴付ける方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＶＩＩＩ）の何れかのポリヌクレオチド又は（ＸＸＸＩＸ）のペプチド又は（ＸＬ）の組成物を使用する方法。
【００５４】
ここで使用する場合、ある範囲は、その全単位位置の全てを具体的に開示しているものと理解される。
ここに開示される発明の典型的な実施態様には、ＳＴＥＡＰ−１のｍＲＮＡ配列の特定の部分をコードするＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド（及びこのような配列に相補的なもの）、例えばそのタンパク質及び／又はその断片をコードするもの、例えば次のものが含まれる：
（ａ）ＳＴＥＡＰ−１変異体１の、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３３０、３３９又はそれ以上の連続アミノ酸；他の変異体に関連する最大の長さは：変異体２、２５８アミノ酸；変異体３、２８２アミノ酸、及び変異体４、２５８アミノ酸である）
【００５５】
例えば、ここに開示される本発明の代表的な実施態様には以下のものが含まれる：図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸１から約アミノ酸１０をコードするポリヌクレオチド及びコードされたペプチド自体、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸１０から約アミノ酸２０をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸２０から約アミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸３０から約アミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸４０から約アミノ酸５０をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸５０から約アミノ酸６０をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸６０から約アミノ酸７０をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸７０から約アミノ酸８０をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸８０から約アミノ酸９０をコードするポリヌクレオチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸９０から約アミノ酸１００をコードするポリヌクレオチドで、約１０アミノ酸の増分で、図２又は図３に記載されるカルボキシル末端のアミノ酸で終端するもの。従って、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の１００からカルボキシル末端アミノ酸までの、アミノ酸のアミノ酸配列の（約１０アミノ酸の）部分をコードするポリヌクレオチドは、本発明の実施態様である。ここで、各特定のアミノ酸位置は、±５アミノ酸残基の位置を開示することが理解される。
【００５６】
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の比較的長い部分をコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲内である。例えば、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質又はその「変異体」の、約アミノ酸１（又は２０又は３０又は４０など）から約アミノ酸２０（又は３０又は４０又は５０など）をコードするポリヌクレオチドは、当該分野でよく知られている様々な技術によって産生され得る。これらのポリヌクレオチド断片は、図２に示されるようにＳＴＥＡＰ−１配列の任意の部分を含み得る。
ここに開示される発明の更なる例示的実施態様には、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質又は「変異体」配列内に含まれる生物学的モチーフの一又は複数をコードするＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド断片が含まれ、これには、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及びＸＸＩＩ〜ＬＩに記載されたＳＴＥＡＰ−１タンパク質又は「変異体」のモチーフ担持部分配列の一又は複数を含む。他の実施態様では、本発明の典型的なポリヌクレオチド断片は、既知の分子に対して相同性を示すＳＴＥＡＰ−１タンパク質又は変異体の領域の一又は複数をコードする。本発明の他の実施態様では、典型的なポリヌクレオチド断片は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質又は変異体のＮ−グリコシル化部位、ｃＡＭＰ依存性及びｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位又はＮ−ミリストイル化部位及びアミド化部位の一又は複数をコードし得る。
【００５７】
その親タンパク質、例えば、変異体１、変異体２等々に対する、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及び表ＸＸＩＩ〜ＬＩ（集合的に、ＨＬＡペプチド表）に記載の任意のペプチドの出発位置を決定するために、次の３因子が言及されることに留意：特定の変異体、ＨＬＡペプチド表中のペプチドの長さ、及び表ＬＩＩに列挙された検索ペプチド。一般に、独自の検索ペプチドが、特定の変異体に対するＨＬＡペプチドを得るために使用される。その各親分子に対する各検索ペプチドの位置は表ＬＩＩに列挙される。従って、検索ペプチドが位置「Ｘ」で開始する場合、それらの親分子中のＨＬＡペプチドの実際の位置を得るために、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及び表ＸＸＩＩ〜ＬＩ中の各位置に「Ｘ−１」の値を加えなければならない。例えば、特定の検索ペプチドがその親分子の位置１５０で開始する場合、親分子中のアミノ酸の位置を計算するために、１５０−１、すなわち１４９を、各ＨＬＡペプチドのアミノ酸位置に加えなければならない。
【００５８】
ＩＩ．Ａ．）ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドの用途
ＩＩ．Ａ．１．）遺伝子異常のモニタリング
前の段落のポリヌクレオチドは多数の異なる特定の用途を有する。ヒトＳＴＥＡＰ−１遺伝子は、「ＳＴＥＡＰ−１の染色体マッピング」と題した実施例に記載される染色体位置にマッピングされる。例えば、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子はこの染色体にマッピングされるので、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の異なる領域をコードするポリヌクレオチドは、この染色体位置の細胞発生異常、例えば、様々な癌に関連するとして同定された異常を特徴付けるために使用される。ある遺伝子では、再配列を含む様々な染色体異常が多数の異なる癌における頻繁な細胞発生的異常として同定されている（例えば、Krajinovicら, Mutat.Res.382(3-4):81-83(1998)；Johanssonら, Blood 86(10):3905-3914(1995)及びFingerら, P.N.A.S.85(23):9158-9162(1988)を参照）。従って、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、悪性の表現型に寄与し得るＳＴＥＡＰ−１をコードする染色体領域における細胞発生的異常を説明するために使用され得る、以前に可能であったツールよりも正確な新たなツールを提供する。この文脈において、これらのポリヌクレオチドは、より微妙であまり一般的でない染色体異常を同定するために、染色体スクリーニングの感受性を拡大することに関して当該分野における必要性を満たす（例えば、Evansら, Am.J.Obstet.Gynecol 171(4):1055-1057(1994)を参照）。
【００５９】
更に、ＳＴＥＡＰ−１は、前立腺癌及び他の癌において高度に発現されることが示されているので、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドは、正常組織対癌性組織におけるＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状況を評価する方法において使用される。典型的には、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の特定の領域、例えば、一又は複数のモチーフを含む領域における乱れ（例えば、抗原の喪失などを生じる欠失、挿入、点変異又は改変）の存在を評価するために使用される。例示的なアッセイには、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ及び一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）分析（例えば、Marrogiら, J.Cutan.Pathol.26(8):369-378(1999)を参照）の両方が含まれ、これらは両方とも、タンパク質内のこれらの領域を調べるために、タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを利用する。
【００６０】
ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンス実施態様
ここに開示される本発明の他の具体的に考えられる核酸関連実施態様は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイム及びアンチセンス分子、並びに天然供給源由来であるか合成であるかにかかわらず、代替的骨格に基づく核酸分子又は代替的塩基を含む核酸分子であり、ＳＴＥＡＰ−１のＲＮＡ発現又はタンパク質発現を阻害し得る分子が含まれる。例えば、アンチセンス分子は、塩基対依存的な形でＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合するペプチド核酸（ＰＮＡ）又は非核酸分子、例えばホスホロチオエート誘導体を含む、ＲＮＡ又は他の分子であり得る。当業者は、ここに開示されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド配列を使用して、これらのクラスの核酸分子を容易に獲得し得る。
アンチセンス技術は、細胞内に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外因性オリゴヌクレオチドの投与を伴う。「アンチセンス」なる用語は、このようなオリゴヌクレオチドがその細胞内標的、例えばＳＴＥＡＰ−１に相補的であるという事実を意味する。例えば、Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989；及びSynthesis 1:1-5(1988)を参照のこと。本発明のＳＴＥＡＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドには、誘導体、例えばＳ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体又はＳ−オリゴ、Jack Cohen（前出）を参照）が含まれ、これは、増強された癌細胞増殖阻害作用を示す。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、リン酸基の非架橋酸素原子が硫黄原子によって置換されているオリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電子アナログである。本発明のＳ−オリゴは、硫黄転移試薬である３Ｈ-１,２-ベンゾジチオール-３-オン-１,１-ジオキシドでの対応するＯ−オリゴの処理によって調製され得る。例えば、Iyer,R.P.ら, J.Org.Chem.55:4693-4698(1990)；及びIyer,R.P.ら, J.Am.Chem.Soc.112:1253-1254(1990)。本発明の更なるＳＴＥＡＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドには、当該分野で知られているモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる（例えば、Partridgeら, 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6:169-175を参照）。
【００６１】
本発明のＳＴＥＡＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＳＴＥＡＰ−１ゲノム配列又は対応するｍＲＮＡの最初の１００個の５’側コドン又は最後の１００個の３’側コドンに相補的であり、これらと安定にハイブリダイズするＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。絶対的な相補性は必要ないが、高度な相補性が好ましい。この領域に相補的なオリゴヌクレオチドの使用によって、ＳＴＥＡＰ−１のｍＲＮＡへの選択的なハイブリダイゼーションが可能になるが、プロテインキナーゼの他の調節サブユニットを特定するｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションは可能にならない。一実施態様では、本発明のＳＴＥＡＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ−１のｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を有するアンチセンスＤＮＡ分子の１５から３０マーの断片である。任意には、ＳＴＥＡＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ−１の最初の１０個の５’側コドン又は最後の１０個の３’側コドン中の領域に相補的な３０マーのオリゴヌクレオチドである。あるいは、アンチセンス分子は、ＳＴＥＡＰ−１の発現の阻害においてリボザイムを使用するように改変される（例えば、L.A.Couture & D.T.Stinchcomb;Trends Genet 12:510-515(1996)を参照）。
【００６２】
ＩＩ．Ａ．３．）プライマー及びプライマー対
本発明のこれらのヌクレオチドの更に特定の実施態様には、プライマー及びプライマー対が含まれ、これらは、本発明のポリヌクレオチド又はその任意の特定の部分の特異的増幅を可能にし、また本発明の核酸分子又はその任意の部分に選択的にか又は特異的にハイブリダイズするプローブが含まれる。プローブは、検出可能なマーカー、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤又は酵素で標識され得る。このようなプローブ及びプライマーは、試料中のＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドの存在を検出するため、またＳＴＥＡＰ−１タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として使用される。
このようなプローブの例には、図２に示されるヒトＳＴＥＡＰ−１のｃＤＮＡ配列の全て又は一部を含むポリヌクレオチドが含まれる。ＳＴＥＡＰ−１のｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマー対の例はまた実施例に記載される。当業者によって理解されるように、非常に多数の異なるプライマー及びプローブが、ここで提供される配列に基づいて調製され得、ＳＴＥＡＰ−１のｍＲＮＡを増幅及び／又は検出するために有効に使用され得る。
【００６３】
本発明のＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドは、様々な目的のために有用であり、その用途には、限定するものではないが、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子、ｍＲＮＡもしくはその断片の増幅及び／又は検出のためのプローブ及びプライマー；前立腺癌及び他の癌の診断及び／又は予後についての試薬；ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの発現を指示し得るコード配列；ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の発現及び／又はＳＴＥＡＰ−１転写物の翻訳を調節又は阻害するためのツール；及び治療剤としての使用が含まれる。
本発明は、天然に存在する供給源、例えば、ヒト又は他の哺乳動物由来のＳＴＥＡＰ−１核酸配列又はＳＴＥＡＰ−１関連核酸配列を同定及び単離するための、ここで記載される任意のプローブの使用、並びに単離された核酸配列自体で、これは、使用されるプローブ中に見出される配列の全て又はほとんどを含むものを含む。
【００６４】
ＩＩ．Ａ．４．）ＳＴＥＡＰ−１コード核酸分子の単離
ここに記載されるＳＴＥＡＰ−１のｃＤＮＡ配列は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、並びにＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物ホモログ、選択的スプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子変異体及びＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の突然変異型をコードする他のポリヌクレオチドの単離、並びにＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質のアナログをコードするポリヌクレオチドの単離を可能にする。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子をコードする全長ｍＲＮＡを単離するために使用され得る様々な分子クローニング方法がよく知られている（例えば、Sambrook, J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989；Current Protocols in Molecular Biology.Ausubelら編, Wiley and Sons, 1995を参照）。例えば、λファージクローニング方法は、市販のクローニング系（例えば、Lambda ZAP Express, Stratagene）を使用して、簡便に使用され得る。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子のｃＤＮＡを含むファージクローンは、標識ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡ又はその断片を用いて探索することによって、同定され得る。例えば、一実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１のｃＤＮＡ（例えば図２）又はその一部を合成することができ、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子に対する重複及び全長ｃＤＮＡを取ってくるためのプローブとして使用され得る。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子自体は、ゲノムＤＮＡライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などを、ＳＴＥＡＰ−１のＤＮＡのプローブ又はプライマーを用いてスクリーニングすることによって、単離され得る。
【００６５】
ＩＩ．Ａ．５．）組換え核酸分子及び宿主−ベクター系
本発明はまたＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド、その断片、アナログ、又はホモログを含む組換えＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子で、限定するものではないが、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、並びに当該分野でよく知られた様々なウイルスベクター及び非ウイルスベクターを含むもの、及びこのような組換えＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子で形質転換又は形質移入された細胞を提供する。このような分子を産生する方法はよく知られている（例えば、上掲のSambrookら, １９８９を参照）。
本発明は更に、適切な原核生物又は真核生物宿主細胞中にＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド、その断片、アナログ、又はホモログを含む組換えＤＮＡ分子を含む宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例には、酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞、例えば、哺乳動物細胞又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞又はＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞のようなバキュロウイルス感染性細胞）が含まれる。適切な哺乳動物細胞の例には、様々な前立腺癌細胞株、例えばＤＵ１４５及びＴｓｕＰｒ１、他の形質移入可能又は形質導入可能な前立腺癌細胞株、一次細胞（ＰｒＥＣ）、及び組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多くの哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞）が含まれる。より詳細には、ＳＴＥＡＰ−１のコード配列を含むポリヌクレオチド、又はその断片、アナログ、もしくはホモログは、当該分野で常套的に使用され、広範に知られている多数の宿主−ベクター系を用いて、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質又はその断片を産生するために使用され得る。
【００６６】
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質又はその断片の発現に適切な広範な範囲の宿主−ベクター系が利用可能である（例えば、上掲のSambrookら, 1989；上掲のCurrent Protocols in Molecular Biology, 1995を参照）。哺乳動物での発現に好ましいベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Invitrogen）及びレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Mullerら, 1991, MCB 11:1785）が挙げられるがこれらに限定されない。これらの発現ベクターを用いて、ＳＴＥＡＰ−１を、例えば２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、及びＴｓｕＰｒ１を含む幾つかの前立腺癌細胞株及び非前立腺細胞株において発現させることができる。本発明の宿主−ベクター系は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質又はその断片の産生に有用である。このような宿主−ベクター系は、ＳＴＥＡＰ−１及びＳＴＥＡＰ−１変異もしくはアナログの機能的性質を研究するために使用することができる。
組換えヒトＳＴＥＡＰ−１タンパク質又はそのアナログもしくはホモログもしくは断片は、ＳＴＥＡＰ−１関連ヌクレオチドをコードする構築物でトランスフェクトされた哺乳動物細胞により産生され得る。例えば、２９３Ｔ細胞は、ＳＴＥＡＰ−１又はその断片、アナログ、もしくはホモログをコードする発現プラスミドでトランスフェクトされ得、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質が２９３Ｔ細胞中で発現され、組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質が、標準的な精製方法（例えば、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を用いるアフィニティー精製）を用いて単離される。他の実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１コード配列は、レトロウイルスベクターｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏ中にサブクローニングされ、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞株を確立するために、様々な哺乳動物細胞株、例えばＮＩＨ３Ｔ３、ＴｓｕＰｒ１、２９３及びｒａｔ−１を感染するために使用される。当該分野でよく知られた様々な他の発現系もまた使用され得る。ＳＴＥＡＰ−１コード配列に読み枠を一致させて連結されるリーダーペプチドをコードする発現構築物を、分泌形態の組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質の産生に使用することができる。
【００６７】
ここで議論されるように、遺伝子コードの重複性は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子配列におけるバリエーションを許容する。特に、特定の宿主種が、しばしば特定のコドン優先性を有することが当該分野で知られており、従って、開示された配列を、所望の宿主で優先されるよう適合し得る。例えば、好ましいアナログコドン配列は、典型的には、より高頻度のコドンと置き換えられた稀なコドン（すなわち、所望の宿主の既知の配列において約２０％未満の使用頻度を有するコドン）を有する。特定種に対するコドン優先性は、例えばインターネット、例えばURL.dna.affrc.go.jp/~nakamura/codon.htmlで利用可能なコドン使用表を用いることによって算出される。
更なる配列の改変は、細胞性宿主におけるタンパク質発現を増強することが知られている。これらには、偽ポリアデニル化シグナルをコードする配列の除去、エキソン／イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、及び／又は遺伝子発現に対して有害な他のこのような十分特徴付けられた配列が挙げられる。配列のＧＣ含量は、その宿主細胞において発現される既知の遺伝子を参照して算出される、所定の細胞性宿主について平均的なレベルに調整される。可能な場合、配列は、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避するよう改変される。他の有用な改変としては、Kozak, Mol.Cell Biol., 9: 5073-5080 (1989)に記載されるような、オープンリーディングフレームの開始点での翻訳開始コンセンサス配列の付加が挙げられる。当業者であれば、真核生物リボソームが５’近位のＡＵＧコドンで排他的に翻訳を開始するという一般規則が、稀な条件下でのみ排除されることを理解する（例えば、Kozak PNAS 92 (7): 2662-2666, (1995)及びKozak NAR 15 (20): 8125-8148 (1987)を参照）。
【００６８】
ＩＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質
本発明の他の側面はＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を提供する。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の特定の実施態様は、図２又は図３、好ましくは図２Ａに示されるヒトＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸配列の全て又は一部を有するポリペプチドを包含する。あるいは、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の実施態様は、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸配列中に変更を有する変異体、ホモログ、又はアナログポリペプチドを包含する。
【００６９】
ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの実施態様には、図２に示される配列を有するＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド、図２に示されるＳＴＥＡＰ−１のペプチド配列で、ＴがＵであるもの；図２に示される配列を有するポリペプチドの少なくとも１０連続ヌクレオチド；又は図２に示される配列を有するポリペプチドの少なくとも１０連続ヌクレオチドで、ＴがＵであるものが挙げられる。例えば、ＳＴＥＡＰ−１ペプチドの実施態様は、限定されないが、以下のものを包含する：
（Ｉ）図２Ａ〜Ｑ又は図３Ａ〜Ｄに示されるアミノ酸配列を含むか、この配列から本質的になるか、又はこの配列からなるタンパク質；
（ＩＩ）図２Ａ〜Ｑ又は図３Ａ〜Ｄに示される全アミノ酸配列に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％相同なＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質；
（ＩＩＩ）図２Ａ〜Ｑ又は図３Ａ〜Ｄに示される全アミノ酸配列に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一なＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質；
（ＩＶ）その特定の内容が出典明示によりここに援用される２００２年９月０６日出願の米国特許出願第１０／２３６８７８号に記載されているような、表Ｖ〜ＬＩに示される少なくとも一つのペプチドを含むタンパク質で、必要に応じて、図２のタンパク質全体ではないもの；
（Ｖ）集合的に、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに示される少なくとも一つのペプチドを含むタンパク質で、集合的に、このペプチドはまた表ＸＸＩＩ〜ＬＩにも示され、必要に応じて、図２のタンパク質全体ではないもの；
（ＶＩ）表Ｖ〜ＬＩに示されるペプチドから選択される少なくとも２つのペプチドを含むタンパク質で、必要に応じて、図２のタンパク質全体ではないもの；
（ＶＩＩ）集合的に、表Ｖ〜ＬＩに示されるペプチドから選択される少なくとも２つのペプチドを含むタンパク質で、必要に応じて、タンパク質は、図２のアミノ酸配列由来の連続配列ではない；
（ＶＩＩＩ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに示されるペプチドから選択される少なくとも一つのペプチド；及び表ＸＸＩＩ〜ＬＩに示される少なくとも一つのペプチドを含むタンパク質で、但し、このタンパク質は、図２のアミノ酸配列由来の連続配列ではない；
（ＩＸ）図５の親水性度プロファイルにおいて、０．５より高い値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ３３９まで任意の自然数きざみで増える、図３Ａのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（Ｘ）図６のヒドロパシー性プロファイルにおいて、０．５未満の値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ３３９まで任意の自然数きざみで増える、図３Ａのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＩ）図７の露出残基パーセントプロファイルにおいて、０．５より高い値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ３３９まで任意の自然数きざみで増える、図３Ａのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＩＩ）図８の平均フレキシビリティプロファイルにおける、０．５より高い値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ３３９まで任意の自然数きざみで増える、図３Ａのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＩＩＩ）図９のβ−ターンプロファイルにおける、０．５より高い値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ３３９まで任意の自然数きざみで増える、図３Ａのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＩＶ）図５の親水性度プロファイルにおいて、０．５より高い値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ２５８まで任意の自然数きざみで増える、図３Ｂ又は３Ｄのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＶ）図６のヒドロパシー性プロファイルにおいて、０．５未満の値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ２５８まで任意の自然数きざみで増える、図３Ｂ又は３Ｄのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＶＩ）図７の露出残基パーセントプロファイルにおいて、０．５より高い値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ２５８まで任意の自然数きざみで増える、図３Ｂ又は３Ｄのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＶＩＩ）図８の平均フレキシビリティプロファイルにおける、０．５より高い値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ２５８まで任意の自然数きざみで増える、図３Ｂ又は３Ｄのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＶＩＩＩ）図９のβ−ターンプロファイルにおける、０．５より高い値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ２５８まで任意の自然数きざみで増える、図３Ｂ又は３Ｄのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＩＸ）図５の親水性度プロファイルにおいて、０．５より高い値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ２８２まで任意の自然数きざみで増える、図３Ｃのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＸ）図６のヒドロパシー性プロファイルにおいて、０．５未満の値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ２８２まで任意の自然数きざみで増える、図３Ｃのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＸＩ）図７の露出残基パーセントプロファイルにおいて、０．５より高い値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ２８２まで任意の自然数きざみで増える、図３Ｃのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＸＩＩ）図８の平均フレキシビリティプロファイルにおける、０．５より高い値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ２８２まで任意の自然数きざみで増える、図３Ｃのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＸＩＩＩ）図９のβ−ターンプロファイルにおける、０．５より高い値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、それぞれ２８２まで任意の自然数きざみで増える、図３Ｃのタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＸＩＶ）集合的に、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及びＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも２回現れるペプチド；
（ＸＸＶ）集合的に、表ＶＩ〜ＸＶＩＩＩ及びＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも３回現れるペプチド；
（ＸＸＶＩ）集合的に、表Ｖ〜ＸＸＶＩＩＩ及びＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも４回現れるペプチド；
（ＸＸＶＩＩ）集合的に、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及びＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも５回現れるペプチド；
（ＸＸＶＩＩＩ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩにおいて少なくとも１回現れ、表ＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも１回現れるペプチド；
（ＸＸＩＸ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩにおいて少なくとも１回現れ、表ＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも２回現れるペプチド；
（ＸＸＸ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩにおいて少なくとも２回現れ、表ＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも１回現れるペプチド；
（ＸＸＸＩ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩにおいて少なくとも２回現れ、表ＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも２回現れるペプチド；
（ＸＸＸＩＩ）以下の特徴の１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つを含むペプチド、又はこのようなペプチドをコードするオリゴヌクレオチド：
ｉ）図５の親水性度プロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するか又は１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３におけるそのタンパク質の全長まで任意の自然数きざみで増える、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；
ｉｉ）図６のヒドロパシー性プロファイルにおいて、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１以下の値を有するか又は０．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３におけるそのタンパク質の全長まで任意の自然数きざみで増える、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；
ｉｉｉ）図７の露出残基パーセントプロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するか又は１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３におけるそのタンパク質の全長まで任意の自然数きざみで増える、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；
ｉｖ）図８の平均フレキシビリティプロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するか又は１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３におけるそのタンパク質の全長まで任意の自然数きざみで増える、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；あるいは
ｖ）図９のβ−ターンプロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するか又は１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３におけるそのタンパク質の全長までの任意の自然数きざみで増える、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；
（ＸＸＸＩＩＩ）薬学的賦形剤と共に、及び／又はヒトの単位用量形態での、（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＩ）のペプチド又はその抗体又は結合領域を含有する組成物；
（ＸＸＸＩＶ）ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を調節する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＩ）のペプチド又はその抗体又は結合領域又は（ＸＸＸＩＩＩ）の組成物を使用する方法；
（ＸＸＸＶ）ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を有する個体を診断し、予防し、予知し、又は治療する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＩ）のペプチド又はその抗体又は結合領域又は（ＸＸＸＩＩＩ）の組成物を使用する方法；
（ＸＸＸＶＩ）ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞で表Ｉに列挙した組織の癌からの細胞を有する個体を診断し、予防し、予知し、又は治療する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＩ）のペプチド又はその抗体又は結合領域又は（ＸＸＸＩＩＩ）の組成物を使用する方法；
（ＸＸＸＶＩＩ）癌を診断し、予防し、予知し、又は治療する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＩ）のペプチド又はその抗体又は結合領域又は（ＸＸＸＩＩＩ）の組成物を使用する方法；
（ＸＸＸＶＩＩＩ）表Ｉに列挙された組織の癌を診断し、予防し、予知し、又は治療する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＩ）のペプチド又はその抗体又は結合領域又は（ＸＸＸＩＩＩ）の組成物を使用する方法；
（ＸＸＸＩＸ）ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞のモジュレータを同定し又は特徴付ける方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＩ）のペプチド又はその抗体又は結合領域又は（ＸＸＸＩＩＩ）の組成物を使用する方法。
【００７０】
ここで使用する場合、ある範囲は、その全単位位置の全てを具体的に開示しているものと理解される。
ここに開示される発明の典型的な実施態様には、ＳＴＥＡＰ−１のｍＲＮＡ配列の特定の部分をコードするＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド（及びこのような配列に相補的なもの）、例えばそのタンパク質及び／又はその断片をコードするもの、例えば次のものが含まれる：
（ａ）ＳＴＥＡＰ−１変異体１の、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３３０、３３９又はそれ以上の連続アミノ酸；他の変異体に関連する最大の長さは：変異体２、２５８アミノ酸；変異体３、２８２アミノ酸、及び変異体４、２５８アミノ酸である。
【００７１】
一般に、ヒトＳＴＥＡＰ−１の天然に生じる対立遺伝子変異体は、高度の構造同一性及び相同性（例えば、９０％以上の相同性）を共有する。典型的には、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の対立遺伝子変異体は、ここに記載されるＳＴＥＡＰ−１配列中に保存的アミノ酸置換を含むか、又はＳＴＥＡＰ−１のホモログにおいて対応する位置からのアミノ酸の置換を含む。ＳＴＥＡＰ−１対立遺伝子変異体の一つのクラスは、特定のＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の少なくとも小領域と高度の相同性を共有するが、その配列由来の根本的な逸脱、例えば非保存的置換、切断、挿入、又はフレームシフトを更に含むタンパク質である。タンパク質配列の比較では、用語、類似性、同一性、及び相同性は、各々、遺伝学の分野で理解される通りの明確な意味を有する。更に、オルソロジー及びパラロジーは、ある生物における所定のタンパク質ファミリーのメンバーの、他の生物における同じファミリーのメンバーに対する関係を記述する重要な概念であり得る。
アミノ酸略号は表ＩＩに提供される。保存的アミノ酸置換は、しばしば、そのタンパク質のコンホメーション又は機能の何れも変更することなくタンパ ク質中でなされ得る。本発明のタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の保存的置換を含み得る。
【００７２】
ここに開示される発明の実施態様には、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の広範な様々な当該分野で受け入れられる変異体又はアナログ、例えばアミノ酸挿入、欠失及び置換を有するポリペプチドが含まれる。ＳＴＥＡＰ−１変異体は、当該分野で知られた方法、例えば、部位特異的変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ変異誘発を用いて作製され得る。部位特異的変異誘発（Carterら, Nucl. Acids Res.,13:4331(1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)）、カセット変異誘発（Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)）、制限選択変異誘発（Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)）又は他の公知の技術が、ＳＴＥＡＰ−１変異体ＤＮＡを産生するために、クローニングしたＤＮＡについて実施され得る。
スキャンニングアミノ酸分析はまた特異的な生物学的活性、例えばタンパク質−タンパク質相互作用に関連する連続配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのに使用できる。比較的小さい中性のアミノ酸が、好ましいスキャンニングアミノ酸に含まれる。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインが含まれる。アラニンは、典型的にはこの群の中で好ましいスキャンニングアミノ酸であるが、それは、アラニンが、β炭素の後ろの側鎖を排除し、変異体の主鎖のコンホメーションを変更する可能性がより低いからである。アラニンは最も一般的なアミノ酸であるのでまた典型的に好ましい。更に、アラニンは、埋もれた位置及び露出位置の両方においてよく見出される（Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co. , N. Y.)；Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)）。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合、等比体積のアミノ酸が使用できる。
【００７３】
ここで定義される場合、ＳＴＥＡＰ−１変異体、アナログ、又はホモログは、図３のアミノ酸配列を有するＳＴＥＡＰ−１タンパク質と「交差反応性」である少なくとも一つのエピトープを有するという特徴的な特性を有する。この文で使用される場合、「交差反応性」は、ＳＴＥＡＰ−１変異体に特異的に結合する抗体又はＴ細胞がまた図３に示されるアミノ酸配列を有するＳＴＥＡＰ−１タンパク質に特異的に結合することを意味する。ポリペプチドは、出発ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に特異的に結合する抗体又はＴ細胞により認識され得る如何なるエピトープも含まない場合、図３に示すタンパク質の変異体でなくなる。当業者であれば、タンパク質を認識する抗体が、変動するサイズのエピトープに結合し、連続かそうでないかを問わず、約４又は５アミノ酸のオーダーの一群が、最小エピトープにおけるアミノ酸の典型的な数とみなされることが分かるであろう。例えば、Nair ら, J. Immunol 2000 165 (12): 6949-6955；Hebbesら, Mol Immunol (1989) 26(9):865-73；Schwartzら, J Immunol (1985) 135(4):2598-608を参照。
【００７４】
他のクラスのＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質変異体は、図３のアミノ酸配列又はその断片と、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％以上の類似性を共有する。他の特定のクラスのＳＴＥＡＰ−１タンパク質変異体又はアナログは、ここに記載されるか又は当該分野で現在知られているＳＴＥＡＰ−１の生物学的モチーフの一又は複数を含む。従って、最初の断片に対して変更された機能的（例えば免疫原性）特性を有するＳＴＥＡＰ−１断片（核酸又はアミノ酸）のアナログが本発明に包含される。現在の又は当該分野の技術の一部となるモチーフが図２又は図３の核酸配列又はアミノ酸配列に適用されることが理解される。
ここで議論されるように、請求項に記載の発明の実施態様は、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の全長より短いアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。例えば、本発明の代表的な実施態様は、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の任意の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上の連続アミノ酸を有するペプチド／タンパク質を含む。
【００７５】
更に、ここに開示される本発明の代表的な実施態様は、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の全体を通して、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約１〜アミノ酸約１０からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約１０〜アミノ酸約２０からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約２０〜アミノ酸約３０からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約３０〜アミノ酸約４０からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約４０〜アミノ酸約５０からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約５０〜アミノ酸約６０からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約６０〜アミノ酸約７０からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約７０〜アミノ酸約８０からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約８０〜アミノ酸約９０からなるポリペプチド、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約９０〜アミノ酸約１００からなるポリペプチド等を含む。更に、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約１（又は２０又は３０又は４０など）〜アミノ酸約２０（又は１３０又は１４０又は１５０など）からなるポリペプチドが、本発明の実施態様である。この段落における開始及び停止位置は、特定の位置並びにプラスマイナス５残基の位置を意味することが理解される。
ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質は、標準的なペプチド合成技術を用いるか又は当該分野でよく知られている化学切断方法を用いて産生される。あるいは、組換え方法を、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質をコードする核酸分子を産生するのに使用できる。一実施態様では、核酸分子は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質（又はその変異体、ホモログ、又はアナログ）の定まった断片を産生する手段を提供する。
【００７６】
ＩＩＩ．Ａ．）モチーフ保有タンパク質の実施態様
本明細書中に開示される本発明の更なる例示の実施態様は、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド配列中に含まれる１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドを包含する。様々なモチーフが当該分野で公知であり、タンパク質は、多くの公に利用可能なインターネットサイト（例えば、ＵＲＬアドレス：pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq- search/struc-predict.html;psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; cbs.dtu.dk/;ebi.ac.uk/interpro/scan.html; expasy.ch/tools/scnpsit1.html;EpimatrixTM and EpimerTM, Brown University, brown.edu/Research/TB-HIV＿Lab/epimatrix/epimatrix.html;及びBIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.）により、このようなモチーフの存在について評価できる。
全てのＳＴＥＡＰ−１変異体タンパク質のモチーフ保有部分配列は、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及びＸＸＩＩ〜ＬＩに記載され同定される。
表ＩＶ（ｈ）は、ｐｆａｍサーチ（ＵＲＬアドレスpfam.wustl.edu/を参照）に基づく幾つかの頻繁に生じるモチーフを示す。表ＩＶ（ｈ）のカラムは、（１）モチーフ名の略称、（２）モチーフファミリーの異なるメンバー間で見出された同一性％、（３）モチーフ名又は記述、及び（４）最も一般的な機能を列挙し；位置情報は、そのモチーフが位置に関連性がある場合に含まれる。
【００７７】
上で議論された一又は複数のＳＴＥＡＰ−１モチーフを含むポリペプチドは、上で議論されたＳＴＥＡＰ−１モチーフが増殖調節不全に関連するという知見から、またＳＴＥＡＰ−１が特定の癌で過剰発現されるため、悪性の表現型の特異的な特徴を解明するのに有用である（例えば、表Ｉを参照）。カゼインキナーゼＩＩ、ｃＡＭＰ及びｃａｍｐ依存性プロテインキナーゼ、及びプロテインキナーゼＣは、例えば、悪性の表現型の発生に関連することが知られている酵素である（例えば、Chenら, Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998)；Gaiddonら, Endocrinology 136 (10): 4331-4338 (1995)；Hallら, Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996)；Peterzielら, Oncogene 18 (46): 6322-6329 (1999)及びO'Brian, Oncol. Rep. 5 (2): 305-309 (1998)を参照）。更に、グリコシル化及びミリストイル化の両方は、癌及び癌の進行にも関連するタンパク質修飾である（例えば、Dennisら, Biochem. Biophys. Acta 1473(1):21-34 (1999)；Rajuら, Exp. Cell Res.235(1): 145-154 (1997)を参照）。アミド化は、癌及び癌の進行にも関連する別のタンパク質修飾である（例えばTrestonら, J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (13): 169-175 (1992)を参照）。
他の実施態様では、本発明のタンパク質は、当該分野で認知された方法に従って同定された一又は複数の免疫反応性エピトープ、例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及びＸＸＩＩ〜ＬＩに示されるペプチドを含む。ＣＴＬエピトープは、特定のＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得るＳＴＥＡＰ−１タンパク質中のペプチドを同定するための特定のアルゴリズムを用いて決定され得る（例えば、表ＩＶ：EpimatrixTM及びEpimerTM, Brown University, URL brown.edu/Research/TB-HIV＿Lab/epimatrixlepimatrix.html；及びBIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/.）。更に、ＨＬＡ分子に対して十分な結合親和性を有し、免疫原性エピトープであることに相関するペプチドを同定するための方法が当該分野でよく知られており、過度の実験を行うことなく実施される。また、免疫原性エピトープであるペプチドを同定する方法が、当該分野でよく知られており、インビトロ又はインビボの何れかで、過度の実験を行わずに実施される。
【００７８】
免疫原性を調節するために、そのようなエピトープのアナログを作製するための原理もまた当該分野で知られている。例えば、ＣＴＬ又はＨＴＬモチーフ（例えば、表ＩＶのＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩモチーフ／スーパーモチーフを参照）を有するエピトープを用いて開始する。該エピトープは、特定の位置の一つのアミノ酸を置換し、それをその位置に特定された別のアミノ酸で置き換えることにより、アナログ化される。
例えば、表ＩＶに定義される残基に基づいて、好適な残基のような任意の任意の他の残基に有利となるように、有害な残基を置換し得るか；優先性の低い残基を好適な残基で置換し得るか；又は天然に生じる好適な残基を他の好適な残基で置換することができる。置換は、ペプチド中の主要なアンカー位置又は他の位置で生じ得る；例えば表ＩＶを参照のこと。
様々な参考文献が、対象のタンパク質並びにそのアナログにおけるエピトープの同定及び産生に関する技術を反映している。例えば、Chesnutらの国際公開第９７／３３６０２；Sette, Immunogenetics 1999 50(3-4): 201-212；Setteら, J. Immunol.2001166(2): 1389-1397；Sidneyら, Hum. Immunol. 1997 58 (1):12-20；Kondoら, Immunogenetics 1997 45(4): 249-258；Sidneyら, J. Immunol. 1996 157(8):3480-90；及びFalkら, Nature 351: 290-6 (1991)；Huntら, Science 255:1261-3 (1992)；Parkerら, J. Immunol. 149:3580-7 (1992)；Parkerら, J. Immunol. 152: 163-75 (1994)）；Kastら, 1994 152(8): 3904-12；Borras-Cuestaら, Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278；Alexanderら, J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633；Alexanderら, PMID: 7895164, UI: 95202582；O'Sullivanら, J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669；Alexanderら, Immunity 1994 1(9): 751-761及びAlexanderら, Immunol. Res. 1998 18 (2): 79-92を参照のこと。
【００７９】
本発明の関連実施態様は、表ＩＶ（ａ）、ＩＶ（ｂ）、ＩＶ（ｃ）、ＩＶ（ｄ）、及びＩＶ（ｈ）に示される異なるモチーフ、及び／又は表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及びＸＸＩＩ〜ＬＩの一又は複数の予測ＣＴＬエピトープ、及び／又は表ＸＬＶＩＩＩ〜ＬＩの一又は複数の予想ＨＴＬエピトープ、及び／又は当該分野で知られた一又は複数のＴ細胞結合モチーフの組合わせを含むポリペプチドを包含する。好ましい実施態様は、該ポリペプチドのモチーフ内又は介在配列内の何れにも、挿入、欠失又は置換を含まない。また、これらのモチーフの何れかの側に、多くのＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸残基の何れかを含む実施態様が、（例えば、モチーフが位置するポリペプチド構造のより大きな部分を含むために）所望されうる。典型的には、モチーフの何れかの側のＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸残基の数は、約１〜約１００アミノ酸残基の間、好ましくは５〜約５０アミノ酸残基の間である。
ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質は、多くの形態、好ましくは、単離形態で具体化される。精製されたＳＴＥＡＰ−１タンパク質分子は、抗体、Ｔ細胞又は他のリガンドへのＳＴＥＡＰ−１の結合を障害する他のタンパク質又は分子を実質的に含まない。単離及び精製の性質及び程度は、意図される用途に依存する。ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の実施態様は、精製されたＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質及び機能的な可溶性ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を含む。一実施態様では、機能的な可溶性ＳＴＥＡＰ−１タンパク質又はその断片は、抗体、Ｔ細胞又は他のリガンドによって結合される能力を維持する。
【００８０】
本発明はまた図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の生物学的に活性な断片を含むＳＴＥＡＰ−１タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、出発ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に関連するエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発する能力；このような抗体によって結合される能力；ＨＴＬ又はＣＴＬの活性化を誘発する能力；及び／又は、この出発タンパク質にもまた特異的に結合するＨＴＬ又はＣＴＬによって認識される能力のような、出発ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の特性を示す。
特に興味深い構造を含むＳＴＥＡＰ−１関連ポリペプチドは、例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ又はＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の方法を含む当該分野でよく知られている様々な分析技術を使用して、又は免疫原性に基づいて、予測及び／又は同定され得る。このような構造を含む断片は、サブユニット特異的抗ＳＴＥＡＰ−１抗体もしくはＴ細胞の産生、又はＳＴＥＡＰ−１に結合する細胞因子の同定に特に有用である。例えば、親水性度プロファイルが作製され得、免疫原性ペプチド断片は、Hopp, T. P.及びWoods, K. R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 78: 3824-3828の方法を使用して同定され得る。ヒドロパシープロファイルが作製され得、免疫原性ペプチド断片は、Kyte, J. and Doolittle,R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132の方法を使用して、同定され得る。露出残基パーセント（％）のプロファイルが作製され得、免疫原性ペプチド断片は、Janin J., 1979, Nature 277: 491-492の方法を使用して、同定され得る。平均フレキシビリティプロファイルが作製され得、Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255の方法を使用して、免疫原性ペプチド断片が同定され得る。β−ターンプロファイルが作製され得、免疫原性ペプチド断片は、Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294の方法を使用して、同定され得る。
【００８１】
ＣＴＬエピトープは、特定化されたＨＬＡ対立遺伝子に必要に応じて結合し得るＳＴＥＡＰ−１タンパク質内のペプチドを同定するために、特定のアルゴリズムを使用して（例えば、ワールドワイドなウェブＵＲＬsyfpeithi.bmi-heidelberg.com/のＳＹＦＰＥＩＴＨＩサイト；表ＩＶ（Ａ）〜（Ｅ）の列挙；ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭ及びＥｐｉｍｅｒＴＭ、Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＲＬ（brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html）；及びＢＩＭＡＳ，ＵＲＬ bimas.dcrt.nih.gov/を使用することによって）決定され得る。この例示において、ヒトＭＨＣクラスＩ分子の文脈で示されるＳＴＥＡＰ−１由来のペプチドエピトープ、例えば、ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２４、Ｂ７及びＢ３５が予測された（例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ、表ＸＸＩＩ〜ＬＩを参照）。すなわち、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の完全なアミノ酸配列と他の変異体の関連部分、つまり、ＨＬＡクラスＩ予測については、点変異の何れかの側の９個の隣接した残基を、またＨＬＡクラスＩＩ予測については、点変異の何れかの側の１４個の隣接した残基を、Bioinformatics and Molecular Analysis Section（ＢＩＭＡＳ）ウェブサイトに見出されるＨＬＡペプチドモチーフ検索アルゴリズムに入力し、ＵＲＬ syfpeithi.bmi-heidelberg.com/のＳＹＦＰＥＩＴＨＩサイトを加えて、使用した。
【００８２】
ＨＬＡペプチドモチーフ検索アルゴリズムは、ＨＬＡクラスＩ分子、特にＨＬＡ−Ａ２のグルーブにおける特定のペプチド配列の結合に基づいてＫｅｎ・Ｐａｒｋｅｒ博士によって開発された（例えば、Falkら, Nature 351:290-6(1991)；Huntら, Science 255:1261-3(1992)；Parkerら, J. Immunol. 149:3580-7(1992)；Parkerら, J. Immunol. 152:163-75(1994)を参照）。このアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２並びに多数の他のＨＬＡクラスＩ分子への予測される結合についての完全なタンパク質配列から、８マー、９マー、及び１０マーのペプチドを位置付けしランク付けすることを可能にする。多数のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、８マー、９マー、１０マー又は１１マーである。例えば、クラスＩ ＨＬＡ−Ａ２について、エピトープは、好ましくは、２位にロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）を含み、Ｃ末端にバリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）を含む（例えば、Parkerら, J. Immunol. 149:3580-7(1992)を参照）。ＳＴＥＡＰ−１予測結合ペプチドの選択結果は、ここの表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及び表ＸＸＩＩ〜ＬＩに示される。表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及び表ＸＸＩＩ〜ＸＬＶＩＩにおいて、選択された候補物である、各ファミリーメンバーについての９マー及び１０マーが、それらの位置、各特定のペプチドのアミノ酸配列、及び推定結合スコアと共に示される。表ＸＬＶＩＩＩ〜ＬＩにおいて、選択された候補物である、各ファミリーメンバーについての１５マーが、それらの位置、各特定のペプチドのアミノ酸配列、及び推定結合スコアと共に示される。この結合スコアは、３７℃、ｐＨ６．５においてペプチドを含む複合体の解離の推定半減時間に対応する。最も高い結合スコアを有するペプチドは、最長の期間にわたって細胞表面上でＨＬＡクラスＩに最も強く結合され、Ｔ細胞認識のための最良の免疫原性標的を表すと予測される。
【００８３】
ＨＬＡ対立遺伝子へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２上でのＨＬＡ発現を安定化させることによって評価できる（例えば、Xueら, Prostate 30:73-8(1997)及びPeshwaら, Prostate 36:129-38(1998)を参照）。特定のペプチドの免疫原性は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞の存在下におけるＣＤ＋８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激することによってインビトロで評価され得る。
ＢＩＭＡＳ部位、ＥｐｉｍｅｒＴＭ部位及びＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭ部位によって予測されるか、又は当該分野で利用可能であるか又は表ＩＶに示されるように技術の一部となる、ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩモチーフによって特定される（あるいは、ワールドワイドなウェブサイトＵＲＬ syfpeithi.bmi-heidelberg.com/、又はBIMAS,bimas.dcrt.nih.gov/）を使用して決定される）、あらゆるエピトープは、本発明に従って、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に「適用」されることになることが理解されるべきである。この文脈において使用される場合、「適用される」とは、例えば、可視によってか、又は当該分野における当業者によって理解される、コンピューターベースのパターン認定法によって、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質が評価されることを意味する。ＨＬＡクラスＩモチーフを保有する、８、９、１０もしくは１１のアミノ酸残基のＳＴＥＡＰ−１タンパク質のあらゆる部分配列、又はＨＬＡクラスＩＩモチーフを保有する９以上のアミノ酸残基の部分配列は、本発明の範囲内である。
【００８４】
ＩＩＩ．Ｂ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の発現
以下の実施例において記載される実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１は、市販の発現ベクター、例えば、Ｃ末端６×Ｈｉｓ及びＭＹＣタグ（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ，Invitrogen又はＴａｇ５，GenHunter Corporation, Nashville TN）を用いてＳＴＥＡＰ−１をコードするＣＭＶ駆動発現ベクターでトランスフェクトした細胞（例えば２９３Ｔ細胞）中で簡便に発現され得る。Ｔａｇ５ベクターは、ＩｇＧＫ分泌シグナルを提供し、これを使用して、トランスフェクト細胞中の分泌されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の産生を容易にし得る。培地中の分泌されたＨＩＳタグＳＴＥＡＰ−１は、例えば標準的技術を使用するニッケルカラムを使用して精製できる。
【００８５】
ＩＩＩ．Ｃ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の修飾
ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の改変、例えば、共有結合的修飾は、本発明の範囲に含まれる。共有結合的修飾の一つのタイプは、ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の選択される側鎖又はＮ末端もしくはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることを含む。本発明の範囲に含まれるＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、本発明のタンパク質の天然のグリコシル化パターンを改変することを含む。ＳＴＥＡＰ−１の共有結合改変の他のタイプは、ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドを、様々な非タンパク様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうちの１つに、米国特許第４６４０８３５号；同第４４９６６８９号；同第４３０１１４４号；同第４６７０４１７号；同第号４７９１１９２号又は同第４１７９３３７号に記載される形で連結させることを含む。
【００８６】
本発明のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質はまた別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＳＴＥＡＰ−１を含むキメラ分子を形成するように改変され得る。このようなキメラ分子は、化学的に又は組換え的に合成され得る。キメラ分子は、別の腫瘍関連抗原又はその断片に融合された本発明のタンパク質を有し得る。あるいは、本発明に係るタンパク質は、ＳＴＥＡＰ−１配列（アミノ酸又は核酸）の断片の融合体を含み得、その結果、その長さを通して、図２又は図３に示されるアミノ又は核酸配列に直接的には相同しない分子が作製される。このようなキメラ分子は、ＳＴＥＡＰ−１の複数の同じ部分配列を含み得る。キメラ分子は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質とポリヒスチジンエピトープタグの融合体を含み得、これは、固定化ニッケルが選択的に結合し得るエピトープに、サイトカイン又は増殖因子を提供する。エピトープタグは一般にＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端に位置せしめられる。代替の実施態様では、キメラ分子は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質と免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含み得る。二価の形態のキメラ分子（「イミノアドヘシン」とも呼ばれる）について、このような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。このＩｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも一つの可変領域の代わりに、ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメインを欠失又は不活性化した）型の置換を含む。好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧＩ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、例えば１９９５年６月２７日発行の米国特許第５４２８１３０号を参照のこと。
【００８７】
ＩＩＩ．Ｄ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の用途
本発明のタンパク質は、多くの異なる特定の用途を有する。ＳＴＥＡＰ−１が前立腺癌及び他の癌において高度に発現されるので、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質は、癌組織に対して正常な組織におけるＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態を評価する方法において使用され、それによって悪性表現型が明らかになる。典型的には、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の特定の領域由来のポリペプチドが、それらの領域（例えば、一又は複数のモチーフを含む領域）における混乱（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価するために使用される。例示的なアッセイは、癌性組織に対して正常な組織におけるこの領域の特徴を評価するか、又はエピトープに対する免疫応答を惹起させるために、抗体又はＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド配列に含まれる一又は複数の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＴ細胞標的ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を利用する。あるいは、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質において一又は複数の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を使用して、ＳＴＥＡＰ−１の領域と相互作用する因子をスクリーニングする。
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質断片／部分配列は、ドメイン特異的抗体（例えば、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の細胞外又は細胞内エピトープを認識する抗体）を作製し特徴付けるのに、またＳＴＥＡＰ−１又はその特定の構造ドメインに結合する薬剤又は細胞因子を同定するために、そして限定されないが診断アッセイ、癌ワクチン及びそのようなワクチンを調製する方法を含む様々な治療及び診断状況において、特に有用である。
【００８８】
ＳＴＥＡＰ−１遺伝子、又はそれらのアナログ、ホモログもしくは断片によってコードされるタンパク質は、限定されないが抗体の産生及びＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物に結合するリガンド及び他の薬剤及び細胞構成物を同定するための方法を含む様々な用途を有している。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質又はその断片に対して産生される抗体は、診断及び予後アッセイ、及びＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現によって特徴付けられるヒト癌、例えば表Ｉに列挙されるような癌の管理における画像化法に有用である。このような抗体は、細胞内で発現され得、このような癌を有する患者の治療方法において使用され得る。ＳＴＥＡＰ−１関連核酸又はタンパク質はまたＨＴＬ又はＣＴＬ応答を生じさせるのに使用される。
限定されないが様々なタイプの放射免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞化学方法等々を含むＳＴＥＡＰ−１タンパク質の検出に有用な様々な免疫学的アッセイが使用される。抗体は、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞を検出し得る免疫学的画像化試薬として（例えば、放射シンチグラフィー（radioscintigraphic）画像化方法において）、標識され使用され得る。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質はまたここで更に記載されるように癌ワクチンを作製するのに特に有用である。
【００８９】
ＩＶ．）ＳＴＥＡＰ−１抗体
本発明の他の側面は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質に結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質に特異的に結合し、生理学的条件下ではＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質ではないタンパク質又はペプチドには結合しない（又は弱く結合する）。この場合、生理学的条件の例には、１）リン酸緩衝生理食塩水；２）２５ｍＭのトリスと１５０ｍＭのＮａＣｌを含むトリス緩衝生理食塩水；又は通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）；４）ヒト血清のような動物血清；又は５）１）から４）の何れかの組み合わせが含まれ；これらの反応は好ましくはｐＨ７．５で起こり、あるいはｐＨ７．０〜８．０の範囲、又はあるいはｐＨ６．５〜８．５の範囲で起こる；またこれらの反応は４℃から３７℃の間の温度で起こる。例えば、ＳＴＥＡＰ−１に結合する抗体は、それらのホモログ又はアナログのようなＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質に結合し得る。
本発明のＳＴＥＡＰ−１抗体は、癌（例えば、表Ｉを参照）の診断アッセイ及び予後アッセイ、及び画像化法において特に有用である。同様に、このような抗体は、ＳＴＥＡＰ−１がまた他の癌において発現されるか又は過剰発現される程度まで、これらの他の癌の治療、診断及び／又は予後に有用である。更に、細胞内で発現される抗体（例えば単鎖抗体）は、ＳＴＥＡＰ−１の発現が関与する癌、例えば進行性又は転移性前立腺癌又は他の進行性又は転移性癌の処置において治療的に有用である。
本発明はまたＳＴＥＡＰ−１タンパク質及び変異ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の検出及び定量化に有用な様々な免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイは、適切な場合、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を認識し結合し得る一又は複数のＳＴＥＡＰ−１抗体を含み得る。これらのアッセイは、限定されないが様々なタイプの放射免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）等を含む、当該分野でよく知られた様々な免疫学的アッセイ態様内で実施される。
【００９０】
本発明の免疫学的非抗体アッセイはまたＴ細胞免疫原性アッセイ（阻害性又は刺激性）並びに主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）結合アッセイも含む。
また、ＳＴＥＡＰ−１を発現する前立腺癌及び他の癌を検出し得る免疫学的画像化法もまた本発明によって提供され、これらには、限定されないが、標識ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用する放射シンチグラフィー画像化法が含まれる。このようなアッセイは、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌、例えば前立腺癌の検出、モニタリング、及び予後において臨床的に有用である。
ＳＴＥＡＰ−１抗体はまたＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を精製するための方法、及びＳＴＥＡＰ−１ホモログ及びＳＴＥＡＰ−１関連分子を単離するための方法に使用される。例えば、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を精製する方法は、固体マトリクスに結合しているＳＴＥＡＰ−１抗体を、溶解物又はＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を含有する他の溶液と共に、ＳＴＥＡＰ−１抗体がＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質に結合することが可能な条件下でインキュベートし；該固体マトリクスを洗浄して不純物を取り除き；及び結合している抗体からＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を溶出させることを含む。本発明に係るＳＴＥＡＰ−１抗体の他の用途には、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体を産生することが含まれる。
【００９１】
抗体を調製するための様々な方法が当該分野でよく知られている。例えば、抗体は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質、ペプチド、又は断片を使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって、単離又は免疫結合体化形態で、調製され得る（Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Harlow及びLane編 (1988)；Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)）。また、ＳＴＥＡＰ−１ ＧＳＴ融合タンパク質のようなＳＴＥＡＰ−１融合タンパク質もまた使用され得る。特定の実施態様では、図２又は図３のアミノ酸配列の全て又は大部分を含むＧＳＴ融合タンパク質が生成され、ついで、これを免疫原として使用して、適切な抗体を産生する。他の実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質が合成され、免疫原として使用される。
また、当該分野で知られている裸のＤＮＡ免疫技術が使用され（精製されたＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質又はＳＴＥＡＰ−１発現細胞を用いてあるいは用いないで）、そのコードされた免疫原に対する免疫応答を生じせしめる（総説としては、Donnellyら, 1997, Ann. Rev. Immunol. 15:617-648を参照のこと）。
【００９２】
図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸配列を分析して、抗体を作製するための、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の特定の領域を選択し得る。例えば、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の疎水性分析及び親水性分析を使用して、ＳＴＥＡＰ−１構造における親水性領域を同定する。免疫原構造を示すＳＴＥＡＰ−１タンパク質の領域、並びに他の領域及びドメインは、当該分野で知られている様々な他の方法、例えばＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ又はＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析法を使用して、直ぐに同定できる。親水性度プロファイルは、Hopp, T.P. 及びWoods, K. R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 78:3824- 3828の方法を使用して作成できる。ヒドロパシープロファイルは、Kyte, J.及びDoolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105- 132の方法を使用して作成できる。露出残基パーセント（％）プロファイルは、JaninJ., 1979, Nature 277:491-492の方法を使用して作成できる。平均フレキシビリティプロファイルは、Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255の方法を使用して作成できる。βターンプロファイルは、Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294の方法を使用して作成できる。従って、これらのプログラム又は方法の何れかによって同定される各領域は本発明の範囲内である。ＳＴＥＡＰ−１抗体を産生するための方法は、ここで提供される実施例によって更に例示する。免疫原として使用するためのタンパク質又はポリペプチドを調製するための方法は、当該分野でよく知られている。担体、例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨ又は他の担体タンパク質とタンパク質の免疫原性結合体を調製するための方法もまた当該分野でよく知られている。ある状況では、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接コンジュゲーション法が使用され；他の例では、Pierce Chemical Co., Rockford, ILによって供給されるもののような結合試薬が有効である。ＳＴＥＡＰ−１免疫原の投与は、しばしば、当該分野で理解されるように、適切な期間にわたって適切なアジュバントを使用して注射することによって行われる。免疫化スケジュールの間、抗体力価をとって抗体生成の妥当性を決定できる。
【００９３】
ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体は、当該分野でよく知られている様々な手段によって産生できる。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術、又は一般に知られているように、抗体産生Ｂ細胞を不死化する変更法を修正法を用いて調製される。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原がＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質である免疫アッセイによってスクリーニングされる。適切な不死化細胞培養物が同定されると、この細胞を増殖させ、インビトロ培養物又は腹水の何れかから抗体を産生できる。
本発明の抗体又は断片はまた組換え手段によっても産生できる。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域はまた複数の種由来のキメラ又は相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体として産生できる。ヒト化又はヒトＳＴＥＡＰ−１抗体もまた産生でき、これは治療的状況下での使用に適している。非ヒト抗体ＣＤＲの一又は複数を、対応するヒト抗体配列と置換することによる、マウス及び他の非ヒト抗体をヒト化するための方法はよく知られている（例えば、Jonesら, 1986, Nature 321: 522-525；Riechmannら, 1988, Nature 332: 323-327；Verhoeyenら, 1988, Science 239:1534-1536を参照）。Carterら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285及びSimsら, 1993, J. Immunol. 151: 2296もまた参照のこと。
【００９４】
完全なヒトモノクローナル抗体を産生するための方法としては、ファージディスプレイ方法及びトランスジェニック方法が挙げられる（概説については、Vaughanら, 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539を参照）。完全なヒトＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体は、大きなヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を使用するクローニング技術を使用して産生できる（Griffiths及びHoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M.編, Nottingham Academic, 45-64頁(1993)；Burton及びBarbas, Human Antibodies from combinatorial libraries.同上, 65-82頁）。完全なヒトＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体はまた１９９７年１２月３日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３（Kucherlapati及びJakobovitsら）に記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る（Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (4)；２０００年１２月１９日発行の米国特許第６１６２９６３号；２０００年１１月１２日発行の米国特許第６１５０５８４号；及び２０００年９月５日発行の米国特許第６１１４５９８号もまた参照）。この方法は、ファージディスプレイ技術で必要とされるインビトロ操作を回避し、高い親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
【００９５】
ＳＴＥＡＰ−１抗体のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質との反応性は、必要に応じてＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞又はそれらの抽出物を使用する、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、及びＦＡＣＳ分析を含む多数のよく知られた方法によって確立できる。ＳＴＥＡＰ−１抗体又はそれらの断片は、検出可能なマーカーで標識され得るか、又は第二の分子に結合され得る。適切な検出可能なマーカーには、限定されないが、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤又は酵素が含まれる。更に、２つ以上のＳＴＥＡＰ−１エピトープに特異的な二重特異性抗体は、当該分野で一般に知られている方法を使用して産生される。ホモダイマー抗体もまた当該分野で知られている架橋技術によって産生できる（例えば、Wolffら, Cancer Res. 53: 2560-2565）。
一実施態様では、本発明は、２００４年２月０６日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209）に寄託され、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５８０２及びＰＴＡ−５８０３が付与されたマウスハイブリドーマＸ９２．１．３０．１．１（１）及びマウスハイブリドーマＸ１２０．５４５．１．１として同定されたモノクローナル抗体を提供する。
【００９６】
Ｖ．）ＳＴＥＡＰ−１細胞免疫応答
Ｔ細胞が抗原を認識する機序は解明されている。本発明の有効なペプチドエピトープワクチン組成物は、世界中の集団の非常に広範なセグメントにおいて治癒的又は予防的免疫応答を誘導する。細胞免疫応答を誘導する本発明の組成物の価値及び効能の理解のために、免疫学関連技術の簡単な総説を記載する。
ＨＬＡ分子とペプチド抗原との複合体は、ＨＬＡ拘束Ｔ細胞によって認識されるリガンドとして作用する（Buus, S.ら, Cell 47:1071, 1986；Babbitt, B. P.ら, Nature 317:359, 1985；Townsend, A.及びBodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989；Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol. 11:403, 1993）。単一のアミノ酸が置換された抗原アナログの研究及び内因性結合した天然にプロセシングされたペプチドの配列決定を通して、ＨＬＡ抗原分子への特異的結合に必要なモチーフに対応する重要な残基が同定されており、表ＩＶに記載する（例えば、Southwoodら, J. lmmunol. 160:3363, 1998；Rammenseeら, Immunogenetics 41:178, 1995；Rammenseeら, SYFPEITHI, URL(134.2.96.221/scripts.hiaserver.dii/home.htm)のワールドワイドなウェブ経由でアクセス可；Sette, A.及びSidney, J. Curr. Opin. lmmunol 10:478, 1998；Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994；Sette, A.及びGrey, H. M., Curr. Opin. Immunol. 4: 79,1992；Sinigaglia, F.及びHammer, J. Curr. Biol. 6:52, 1994；Ruppertら, Cell 74:929-937, 1993；Kondoら, J.lmmunol 155:4307-4312, 1995；Sidneyら, J. Immunol. 157:3480-3490, 1996；Sidneyら, Human Immunol. 45: 79-93, 1996；Sette, A.及びSidney, J. Immunogenetics 1999 Nov; 50(3-4):201-12, Reviewを参照）。
【００９７】
更に、ＨＬＡ−ペプチド複合体のＸ線結晶学的分析は、対立遺伝子特異的態様でペプチドリガンドにより保有される残基を収容するＨＬＡ分子のペプチド結合間隙／溝部内のポケットを明らかにし；ついで、これらの残基が、それらが存在するペプチドのＨＬＡ結合能を決定する（例えば、Madden, D.R. Annu. Rev. Immunol.13:587, 1995；Smithら, Immunity 4:203, 1996；Fremontら, Immunity 8:305, 1998；Sternら, Structure 2:245, 1994；Jones, E.Y. Curr. Opin. Immunol.9:75, 1997；Brown, J. H.ら, Nature 364:33, 1993；Guo, H. C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8053, 1993；Guo, H. C.ら, Nature 360:364, 1992；Silver, M. L.ら, Nature 360:367, 1992；Matsumura, M.ら, Science 257:927, 1992；Maddenら, Cell 70:1035, 1992；Fremont, D. H.ら, Science 257: 919, 1992；Saper, M. A., Bjorkman, P. J.及びWiley, D. C., J. Mol. Biol. 219: 277, 1991を参照）。
従って、クラスＩ及びクラスＩの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフ、又はクラスＩもしくはクラスＩＩのスーパーモチーフの定義は、特定のＨＬＡ抗原への結合と相関するタンパク質内の領域の同定を可能にする。
よって、ＨＬＡモチーフ同定のプロセスによって、エピトープベースのワクチンの候補が同定されている；このような候補は、エピトープとその対応するＨＬＡ分子との会合の結合親和性及び／又は期間を決定するために、ＨＬＡ−ペプチド結合アッセイにより更に評価され得る。これらのワクチン候補の中から、集団適用範囲及び／又は免疫原性の点で好ましい特徴を有するエピトープを選択するために、更なる確証実験が行われうる。
【００９８】
以下のものを含む様々な方策を、細胞免疫原性を評価するために使用できる：
１）正常な個体由来の一次Ｔ細胞培養物の評価（例えば、Wentworth, P. A.ら, Mol. Immunol. 32:603,1995；Celis, E.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2105, 1994；Tsai, V.ら, J. lmmunol 158:1796, 1997；Kawashima, I.ら, Human Immunol. 59:1,1998を参照）。この手順は、抗原提示細胞の存在下で、インビトロで数週間の期間にわたって、正常な被験体由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を試験ペプチドで刺激することを含む。このペプチドに特異的なＴ細胞は、この時間の間に活性化され、例えば、ペプチドで感作された標的細胞を含むリンホカイン又は５１Ｃｒ放出アッセイを使用して検出される。
２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫（例えば、Wentworth, P. A.ら, J. lmmunol. 26:97,1996；Wentworth, P. A.ら, Int. Immunol. 8:651, 1996；Alexander, J.ら, J. Immunol 159:4753, 1997を参照）。例えば、このような方法では、不完全フロイントアジュバント中のペプチドがＨＬＡトランスジェニックマウスに皮下投与される。免疫後数週間で、脾細胞が取出され、試験ペプチドの存在下で、約１週間インビトロ培養される。ペプチド特異的Ｔ細胞は、例えば、ペプチドで感作された標的細胞及び内因的に生成された抗原を発現する標的細胞を含む、５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、検出される。
【００９９】
３）効果的にワクチン接種された免疫個体及び／又は慢性的に病気の患者の何れか由来のリコールＴ細胞応答の証明（例えば、Rehermann, B.ら, J. Exp. Med. 181:1047, 1995；Doolan, D. L.ら, Immunity 7:97, 1997；Bertoni, R.ら, J. Clin. Invest.100:503,1997；Threlkeld, S. C.ら, J. Immunol. 159:1648, 1997；Diepolder, H. M.ら, J. ViroL 71:6011, 1997を参照）。従って、リコール応答は、疾患のために抗原に晒され、よって「自然に」免疫応答を生じた被験体由来のＰＢＬ、又は抗原に対してワクチン接種された患者由来のＰＢＬを培養することによって、検出される。被験体由来のＰＢＬは、試験ペプチド＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で１〜２週間、インビトロで培養され、「未刺激」Ｔ細胞と比較して「メモリー」Ｔ細胞の活性化を可能にする。この培養期間の最後に、Ｔ細胞活性が、ペプチドで感作した標的を含む５１Ｃｒ放出、Ｔ細胞増殖又はリンホカイン放出を含むアッセイを使用して、検出される。
【０１００】
ＶＩ．）ＳＴＥＡＰ−１トランスジェニック動物
ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質をコードする核酸はまたトランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物の何れかを作製するために使用され得、この動物は、ついで、治療に有用な試薬の開発及びスクリーニングにおいて有用である。確立された技術によって、ＳＴＥＡＰ−１をコードするｃＤＮＡが、ＳＴＥＡＰ−１をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。ついで、このクローン化されたゲノム配列は、ＳＴＥＡＰ−１をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。トランスジェニック動物、特に、マウス又はラットのような動物を作製するための方法は、当該分野で一般的になっており、例えば、１９８８年４月１２日発行の米国特許第４７３６８６６号及び１９８９年９月２６日発行の同第４８７０００９号に記載されている。典型的には、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーを用いるＳＴＥＡＰ−１導入遺伝子組込みのために標的化される。
ＳＴＥＡＰ−１をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物は、ＳＴＥＡＰ−１をコードするＤＮＡの発現を増加する効果を試験するために使用できる。このような動物は、例えば、その過剰発現に関連する病理学的状態からの防御を付与すると考えられる試薬に対するテスター動物として使用できる。本発明のこの側面では、動物は、試薬で処置され、この導入遺伝子を有する未処置の動物と比較して減少した病理学的状態の発生率が、この病理学的状態に対する潜在的な治療的介入を示す。
【０１０１】
あるいは、ＳＴＥＡＰ−１の非ヒトホモログは、ＳＴＥＡＰ−１「ノックアウト」動物を構築するために使用され得、このＳＴＥＡＰ−１「ノックアウト」動物は、ＳＴＥＡＰ−１をコードする内在性遺伝子と、この動物の胚性細胞に導入されたＳＴＥＡＰ−１をコードする改変されたゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、ＳＴＥＡＰ−１をコードする欠損遺伝子又は改変された遺伝子を有する。例えば、ＳＴＥＡＰ−１をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って、ＳＴＥＡＰ−１をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。ＳＴＥＡＰ−１をコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失され得るか、又は別の遺伝子、例えば組込みをモニタリングするために使用され得る選択マーカーをコードする遺伝子で置換され得る。典型的には、数キロベースの改変されていない隣接ＤＮＡ（５’末端と３’末端の両方）がベクター中に含められる（例えば、相同組換えベクターの記述については、Thomas及びCapecchi, Cell, 51:503 (1987)を参照）。そのベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、この導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Liら, Cell, 69: 915 (1992)を参照）。ついで、その選択された細胞は、動物（例えば、マウス又はラット）の胚盤胞に注入され、凝集キメラが形成される（例えばBradley,  Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson編(IRL, Oxford, 1987), 113-152頁を参照）。キメラ胚は、ついで、適切な偽妊娠雌性代理母動物に移植され得、該胚が出産されて「ノックアウト」動物が作製される。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを有する子孫が、標準的な技術によって同定され得、全ての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を育種させるために使用され得る。ノックアウト動物は、例えば、特定の病理学的状態に対して防御する能力について、又はＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの非存在に起因する病理学的状態の発症について、特徴付けできる。
【０１０２】
ＶＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１の検出のための方法
本発明の他の側面は、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド及びＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を検出するための方法、並びにＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を同定するための方法に関する。ＳＴＥＡＰ−１の発現プロファイルは、ＳＴＥＡＰ−１を、転移した疾患についての診断マーカーにする。従って、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態は、進行した病期の疾患に対する感受性、進行速度及び／又は腫瘍の攻撃性を含む様々な因子を予測するために有用な情報を提供する。ここで詳細に検討するように、患者の試料中のＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態は、免疫組織化学分析法、様々なノーザンブロット技術（インサイツハイブリダイゼーションを含む）、ＲＴ−ＰＣＲ分析法（例えば、レーザー捕捉微小解剖試料について）、ウェスタンブロット分析法及び組織アレイ分析法を含む、当該分野でよく知られている様々なプロトコルによって分析できる。
より詳細には、本発明は、生物学的試料、例えば、血清、骨、前立腺及び他の組織、尿、精液、細胞調製物等々中のＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドの検出のためのアッセイを提供する。検出可能なＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドには、例えば、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子又はその断片、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ、選択的スプライス変異体ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ、及びＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子が含まれる。ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを増幅し、及び／又はＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドの存在を検出するための多数の方法が、当該分野でよく知られており、本発明のこの側面の実施において用いることができる。
【０１０３】
一実施態様では、生物学的試料中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも一つのプライマーを使用して、逆転写によりこの試料からｃＤＮＡを生成し；センス及びアンチセンスプライマーとしてＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを使用して、このようにして生成されたｃＤＮＡを増幅して、その中のＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡを増幅し；その増幅されたＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡの存在を検出することを含む。場合によっては、増幅されたＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡの配列が決定され得る。
他の実施態様では、生物学的試料中のＳＴＥＡＰ−１遺伝子を検出する方法は、第１に、試料からゲノムＤＮＡを単離し；センス及びアンチセンスプライマーとしてＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを使用して、単離されたゲノムＤＮＡを増幅し；この増幅されたＳＴＥＡＰ−１遺伝子の存在を検出することを含む。任意の数の適切なセンス及びアンチセンスプローブの組合せが、ＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド配列から設計でき（例えば、図２を参照の）、この目的のために使用できる。
本発明はまた組織又は他の生物学的試料、例えば、血清、精液、骨、前立腺、尿、細胞調製物等の中のＳＴＥＡＰ−１タンパク質の存在を検出するためのアッセイを提供する。ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を検出するための方法もまた知られており、これには、例えば、免疫沈降法、免疫組織化学分析法、ウェスタンブロット分析法、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどが含まれる。例えば、生物学的試料中のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の存在を検出する方法は、第１に、試料と、ＳＴＥＡＰ−１抗体、そのＳＴＥＡＰ−１反応性断片、又はＳＴＥＡＰ−１抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質とを接触させ；ついで、試料中のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の結合を検出することを含む。
【０１０４】
ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を同定するための方法もまた本発明の範囲内である。一実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、細胞中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの存在を検出することを含む。細胞中の特定のｍＲＮＡを検出するための方法はよく知られており、例えば、相補的ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、標識されたＳＴＥＡＰ−１リボプローブを使用するインサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及び関連の技術）及び様々な核酸増幅アッセイ（例えば、ＳＴＥＡＰ−１に対して特異的な相補的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ、及び他の増幅型検出方法、例えば、分枝状ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）が含まれる。あるいは、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、この細胞中に存在するか又はこの細胞により分泌されるＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の存在を検出することを含む。タンパク質の検出のための様々な方法が、当該分野でよく知られており、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の検出のために、またＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を発現する細胞の検出のために用いられる。
ＳＴＥＡＰ−１発現分析はまたＳＴＥＡＰ−１遺伝子発現を調節する因子を同定し評価するためのツールとして有用である。例えば、ＳＴＥＡＰ−１発現は、前立腺癌において有意にアップレギュレートされ、表Ｉに列挙される組織の癌において発現される。癌細胞におけるＳＴＥＡＰ−１発現又はＳＴＥＡＰ−１過剰発現を阻害する分子又は生物学的因子の同定は、治癒的価値を有する。例えば、このような因子は、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション又は抗体結合によりＳＴＥＡＰ−１発現を定量するスクリーニングを使用することによって同定できる。
【０１０５】
ＶＩＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１関連遺伝子及びその産物の状態をモニターするための方法
腫瘍形成は、細胞増殖が次第に調節不全になり、細胞が正常な生理学的状態から前癌状態まで進行し、ついで癌状態まで進行する多段階プロセスであることが知られている（例えば、Alersら, Lab Invest. 77 (5): 437-438 (1997)及びIsaacsら, Cancer Surv. 23:19-32 (1995)を参照）。この点では、生物学的試料を調節不全性の細胞増殖の証拠（例えば、癌における異常なＳＴＥＡＰ−１発現）について試験することにより、癌のような病理学的状態が、治療選択肢がより制限される段階まで進行する前、及び／又は予後が悪化する前に、このような異常な生理学を早期に検出することが可能になる。このような検査において、対象の生物学的試料中のＳＴＥＡＰ−１の状態が、例えば、対応する正常な試料（例えば、病理により影響を受けていない個体又は代替の別の個体由来の試料）中のＳＴＥＡＰ−１の状態と比較され得る。生物学的試料中のＳＴＥＡＰ−１の状態における（正常な試料と比較した場合の）変化は、調節不全性の細胞増殖の証拠を提供する。病理により影響を受けていない生物学的試料を正常な試料として使用することに加えて、所定の規範値、例えば、ｍＲＮＡ発現の所定の正常なレベル（例えば、Greverら, J. Comp.Neurol. 1996 Dec 9; 376 (2):306-14及び米国特許第５８３７５０１号を参照）が、試料中のＳＴＥＡＰ−１の状態を比較するために使用され得る。
【０１０６】
この文脈中の「状態」なる用語は、当該分野で認められた意味に従って使用され、遺伝子及びその産物の状況(condition)又は状態(state)を意味する。典型的には、当業者は、多数のパラメーターを使用して、遺伝子及びその産物の状況又は状態を評価する。これには、限定されないが、発現された遺伝子産物の位置（ＳＴＥＡＰ−１発現細胞の位置を含む）、並びに発現された遺伝子産物（例えば、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチド及びポリペプチド）のレベル及び生物学的活性が含まれる。典型的には、ＳＴＥＡＰ−１の状態における変化は、ＳＴＥＡＰ−１及び／又はＳＴＥＡＰ−１発現細胞の位置における変化、及び／又はＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ及び／又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現の増加を含む。
試料中のＳＴＥＡＰ−１の状態は、限定されないが、免疫組織化学分析、インサイツハイブリダイゼーション、レーザー捕捉微小解剖試料に対するＲＴ−ＰＣＲ分析、ウェスタンブロット分析法及び組織アレイ分析法を含む当該分野でよく知られている多数の手段によって分析され得る。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子及び遺伝子産物の状態を評価するための代表的なプロトコルは、例えば、Ausubelら編, 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting)及び18 (PCR Analysis)に見出される。従って、生物学的試料中のＳＴＥＡＰ−１の状態は、限定されないが、ゲノムサザン分析法（例えば、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子中の攪乱を試験するため）、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡのノーザン分析法及び／又はＰＣＲ分析法（例えば、ポリヌクレオチド配列又はＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの発現レベルにおける変化を試験するため）、及びウェスタン分析法及び／又は免疫組織化学分析法（例えば、ポリペプチド配列における変化、試料内のポリペプチドの局在化における変化、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現レベルにおける変化、及び／又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質とポリペプチド結合パートナーとの会合を試験するため）を含む、当業者により使用される様々な方法によって評価される。検出可能なＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドには、例えば、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子又はその断片、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ、選択的スプライシング変異体、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ、及びＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子又は組換えＲＮＡ分子が含まれる。
【０１０７】
ＳＴＥＡＰ−１の発現プロファイルは、それを局所及び／又は転移した疾患のための診断マーカーにし、生物学的試料の増殖又は腫瘍の可能性についての情報を提供する。特に、ＳＴＥＡＰ−１の状態は、特定の疾期、病気の進行、及び／又は腫瘍攻撃性に対する感受性を予測するために有用な情報を提供する。本発明は、ＳＴＥＡＰ−１の状態を決定するため、及び表Ｉに列挙される組織の癌のようなＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を診断するための方法及びアッセイを提供する。例えば、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡは、前立腺及び正常な前立腺組織に対する他の癌において高度に発現されるので、生物学的試料中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの転写物又はタンパク質のレベルを評価するアッセイは、ＳＴＥＡＰ−１調節不全に関連する疾患を診断するために使用され得、適切な治療選択肢を定める際に有用な予後情報を提供し得る。
ＳＴＥＡＰ−１の発現状態は、形成異常、前癌性及び癌性細胞の存在、段階及び位置を含み、疾患の様々な段階に対する感受性を予測し、及び／又は腫瘍の進行を評価するための情報を提供する。更に、発現プロファイルは、それを、転移した疾患のための画像化試薬として有用にする。その結果、本発明の一側面は、癌のように調節不全を生じた細胞増殖により特徴付けられる病理に罹患したか又は罹患した疑いのある個体から得られるような生物学的試料においてＳＴＥＡＰ−１の状態を検査するための様々な分子予後及び診断法に関する。
【０１０８】
上記のように、生物学的試料中のＳＴＥＡＰ−１の状態は、当該分野でよく知られている多数の手順により試験できる。例えば、体内の特定の位置から得られた生物学的試料におけるＳＴＥＡＰ−１の状態は、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞（例えば、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ又はタンパク質を発現する細胞）の存在又は非存在についてこの試料を評価することにより試験され得る。生物学的試料におけるＳＴＥＡＰ−１の状態におけるそのような変化は、しばしば調節不良細胞増殖に関連しているので、例えばＳＴＥＡＰ−１発現細胞が、そのような細胞（例えば、リンパ節）を通常含まない生物学的試料において見出される場合、この検査は、調節不良細胞増殖の証拠を提供し得る。特に、調節不良細胞増殖の一つの指標は、起源器官（例えば、前立腺）から身体の異なる部位（例えば、リンパ節）への癌細胞の転移である。この文脈において、調節不良細胞増殖の証拠は重要であるが、例えば、潜在性リンパ節転移は、前立腺癌を有する患者の実質的な割合で検出され得、そのような転移は、疾患の進行の既知の前兆に関係しているからである（例えば、Murphyら, Prostate 42 (4): 315-317 (2000)；Suら, Semin. Surg. Oncol.18(1): 17-28(2000)及びFreemanら, J Urol 1995 Aug 154(2 Pt 1 ):474-8）を参照）。
【０１０９】
一側面では、本発明は、調節不全細胞増殖に関連する疾患（例えば、過形成又は癌）を有することが疑われる個体由来の細胞により発現されるＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態を決定し、ついでこのようにして決定した状態を、対応する正常な試料中のＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態と比較することによって、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供する。正常な試料と比較して、試験試料中の異常なＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の存在は、個体の細胞内の調節不全細胞増殖の存在の指標を提供する。
他の側面では、本発明は、対応する正常な細胞又は正常な組織における発現レベルと比較して、試験細胞試料又は試験組織試料中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の有意な増加を検出することを含む、個体における癌の存在を決定する際に有用なアッセイを提供する。例えば、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの存在は、限定されないが表Ｉに列挙される組織を含む組織において評価され得る。これらの組織の何れかにおける有意なＳＴＥＡＰ−１発現の存在は、癌の発症、存在及び／又は重篤度を示すために有用であるが、対応する正常な組織は、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡを発現しないか、これを低レベルでしか発現しないからである。
【０１１０】
関連の実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１の状態は、核酸レベルでよりもむしろタンパク質レベルで決定される。例えば、このような方法は、試験組織試料中の細胞により発現されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のレベルを決定し、このように決定されたレベルを、対応する正常な試料において発現されるＳＴＥＡＰ−１のレベルと比較することを含む。一実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学方法を使用して、評価される。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現を検出し得るＳＴＥＡＰ−１抗体又はＳＴＥＡＰ−１結合対が、この目的のために、当該分野でよく知られている様々なアッセイ様式で使用される。
更なる実施態様では、生物学的試料中のＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド配列及びＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の状態が、これらの分子の構造における混乱を同定するために、評価され得る。これらの混乱には、挿入、欠失、置換などが含まれうる。このような評価は、有用であるが、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列における混乱は、増殖調節不全性の表現型と関連する多数のタンパク質において観察されるためである（例えば、Marrogiら, 1999, J. Cutan. Pathol. 26 (8):369-378を参照）。例えば、ＳＴＥＡＰ−１の配列における変異は、腫瘍の存在又は助長作用を示し得る。従って、このようなアッセイは、ＳＴＥＡＰ−１における変異が潜在的な機能喪失又は腫瘍増殖の増加を示す場合、診断的及び予測的価値を有する。
【０１１１】
ヌクレオチド及びアミノ酸配列における混乱を観察するための広範な様々なアッセイが当該分野でよく知られている。例えば、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の核酸又はアミノ酸配列のサイズ及び構造は、ここで検討されるノーザン、サザン、ウェスタン、ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定プロトコルにより観察される。また、ヌクレオチド及びアミノ酸配列における混乱を観察するための他の方法、例えば一本鎖高次構造多型分析が、当該分野でよく知られている（例えば、１９９９年９月７日発行の米国特許第５３８２５１０号及び１９９５年１月１７日発行の同第５９５２１７０号を参照）。
更に、生物学的試料中のＳＴＥＡＰ−１遺伝子のメチル化状態を試験できる。遺伝子の５’調節領域中のＣｐＧアイランドの異常な脱メチル化及び／又は過剰メチル化が、しばしば、不死化細胞及び形質転換細胞において生じ、様々な遺伝子の変化した発現を生じ得る。例えば、πクラスのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（正常な前立腺において発現されるが、前立腺癌の９０％より多くにおいては発現されないタンパク質）のプロモーター過剰メチル化は、この遺伝子の転写を永久的に止めるようであり、前立腺癌において最も頻繁に検出されるゲノム変化である（De Marzoら, Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)）。また、この変化は、高度な前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）の症例のうちの少なくとも７０％において存在する（Brooksら, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7: 531-536）。別の例では、ＬＡＧＥ−Ｉ腫瘍特異的遺伝子の発現（これは、正常な前立腺においては発現されないが、前立腺癌の２５〜５０％において発現される）は、リンパ芽球細胞においてデオキシ−アザシチジンにより誘導され、これは、腫瘍発現が脱メチル化に起因することを示唆している（Letheら, lnt. J. Cancer 76 (6): (1998)）。遺伝子のメチル化状態を試験するための様々なアッセイが、当該分野でよく知られている。例えば、サザンハイブリダイゼーションアプローチでは、メチル化されたＣｐＧ部位を含む配列を切断できないメチル化感受性制限酵素を使用して、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を評価し得る。また、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、所定の遺伝子のＣｐＧアイランド中に存在する全てのＣｐＧ部位のメチル化状態を迅速にプロファイルし得る。この手順は、亜硫酸水素ナトリウム（これはメチル化されていない全てのシトシンをウラシルに変換する）により先ずＤＮＡを改変し、続いてメチル化されていないＤＮＡに対してメチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを使用して増幅することを含む。メチル化干渉を含むプロトコルはまた例えばCurrent Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubelら編, 1995に見出すことができる。
【０１１２】
遺伝子増幅は、ＳＴＥＡＰ−１の状態を評価するための更なる方法である。遺伝子増幅は、ここに提供される配列に基づいて、例えば、適切に標識されたプローブを使用して、ｍＲＮＡの転写を定量するための一般的なサザンブロット法又はノーザンブロット法（Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーションによって試料中で直接測定される。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識する抗体が使用される。ついで、抗体は標識され、アッセイが実施され、そこで、二重鎖は表面に結合され、その結果、表面上で二重鎖が形成されると、その二重鎖に結合した抗体の存在が検出できる。
生検組織又は末梢血が、例えば、ノーザン、ドットブロット又はＲＴ−ＰＣＲ分析法を使用して、癌細胞の存在について簡便にアッセイされ、ＳＴＥＡＰ−１発現が検出され得る。ＲＴ−ＰＣＲ増幅可能なＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの存在は、癌の存在の指標を提供する。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは当該分野でよく知られている。末梢血中の腫瘍細胞のためのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、多数のヒト固形腫瘍の診断及び管理における使用について、現在評価されている。前立腺癌の分野では、これらのアッセイには、ＰＳＡ及びＰＳＭを発現する細胞の検出のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイが含まれる（Verkaikら, 1997, Urol. Res. 25: 373-384；Ghosseinら, 1995, J. Clin. Oncol. 13:1195-2000；Hestonら, 1995, Clin. Chem. 41:1687-1688）。
【０１１３】
本発明の更なる側面は、発症中の癌に対して個体が有する感受性の評価である。一実施態様では、癌に対する感受性を予想するための方法は、組織試料中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質（その存在は、癌に対する感受性を示す）を検出することを含み、ここで、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ発現の程度は、感受性の程度と相関する。特定の実施態様では、前立腺又は他の組織中のＳＴＥＡＰ−１の存在が試験され、ここで、この試料中のＳＴＥＡＰ−１の存在は、前立腺癌感受性（又は前立腺腫瘍の発症もしくは存在）の指標を提供する。同様に、生物学的試料中のＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド配列及びＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の完全性を評価して、これらの分子の構造における混乱（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得る。試料中のＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の一又は複数の混乱の存在は、癌感受性（又は腫瘍の発症もしくは存在）の指標である。
本発明はまた腫瘍の攻撃性を評価するための方法を含む。一実施態様では、腫瘍の攻撃性を評価するための方法は、腫瘍細胞によって発現されるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質のレベルを決定し、このように決定したレベルを、同じ個体もしくは正常な組織参照試料から採取した対応する正常な組織において発現されるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質のレベルと比較することを含み、ここで正常な試料に対する腫瘍試料におけるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現の程度が攻撃性の程度を示す。特定の実施態様では、腫瘍の攻撃性は、ＳＴＥＡＰ−１が腫瘍細胞において発現される程度を決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、より攻撃性の腫瘍を示す。他の実施態様は、ＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド及びアミノ酸の分子構造における混乱（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するための、生物学的試料中のこのＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド及びアミノ酸の配列の完全性の評価である。一又は複数の混乱の存在は、より攻撃性の腫瘍を示す。
【０１１４】
本発明の他の実施態様は、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察するための方法に関する。一実施態様では、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察するための方法は、腫瘍の試料中の細胞により発現されるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質のレベルを決定し、このようにして決定されたレベルを、異なる時間に同じ個体から採取した同等な組織試料において発現されるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質のレベルと比較することを含み、ここで、経時的な腫瘍試料におけるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現の程度は、癌の進行についての情報を提供する。特定の実施態様では、癌の進行は、腫瘍細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現を経時的に決定することにより評価され、ここで経時的に増加した発現は、癌の進行を示す。また、生物学的試料中のＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド配列及びＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の完全性を評価して、これらの分子の構造における混乱（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得、ここで、一又は複数の混乱の存在は、癌の進行を示す。
上記の診断アプローチ法は、当該分野で知られている様々な予後及び診断プロトコルの何れか一つと組み合わされ得る。例えば、本発明の他の実施態様は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の発現及びＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の発現（又はＳＴＥＡＰ−１遺伝子及びＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物における混乱）と、組織試料の状態を診断及び予想するための手段としての悪性腫瘍に関連する因子との間の同時発生を観察するための方法に関する。悪性腫瘍に関連する様々な因子（例えば、悪性腫瘍に関連する遺伝子の発現（例えば、前立腺癌についてのＰＳＡ、ＰＳＣＡ及びＰＳＭの発現など）、並びに肉眼で見える細胞学的知見）が、使用され得る（例えば、Bockingら, 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88；Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26 (2):223-9；Thorsonら, 1998, Mod. Pathol. 11(6):543-51；Baisdenら, 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8):918-24を参照）。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の発現及びＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の発現（又は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子及びＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物における混乱）と、悪性腫瘍に関連する別の因子との間の同時発生を観察するための方法は、例えば、疾患と同時に生じる一連の特定の因子の存在は、組織試料の状態を診断し予測するために重要な情報を提供するため、有用である。
【０１１５】
一実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の発現とＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の発現（又は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子及びＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物における混乱）と、悪性腫瘍に関連する他の因子との間の同時発生を観察するための方法は、組織試料中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ及びＳＴＥＡＰ−１タンパク質の過剰発現を検出し、組織試料中のＰＳＡ ｍＲＮＡ又はＰＳＡタンパク質の過剰発現（又はＰＳＣＡ発現もしくはＰＳＭ発現）を検出し、及びＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡもしくはＳＴＥＡＰ−１タンパク質の過剰発現と、ＰＳＡ ｍＲＮＡもしくはＰＳＡタンパク質の過剰発現（又はＰＳＣＡ発現もしくはＰＳＭ発現）との同時発生を観察することを含む。特定の実施態様では、前立腺組織におけるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ及びＰＳＡ ｍＲＮＡの発現が検査され、ここで、この試料中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ過剰発現とＰＳＡ ｍＲＮＡ過剰発現との同時発生は、前立腺癌の存在、前立腺癌感受性又は前立腺腫瘍の発症もしくは状態を示す。
ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現を検出及び定量するための方法がここに記載されており、標準的な核酸及びタンパク質の検出技術及び定量技術は、当該分野でよく知られている。ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの検出及び定量するための標準的方法には、標識ＳＴＥＡＰ−１リボプローブを使用するインサイツハイブリダイゼーション、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロット及び関連する技術、ＳＴＥＡＰ−１に対して特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析、及び他の増幅型検出方法、例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなどが含まれる。特定の実施態様では、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ発現を検出し定量する。限定されないがここに具体的に記載される様々なプライマーセットを含む、ＳＴＥＡＰ−１を増幅し得る任意の数のプライマーを、この目的のために使用し得る。特定の実施態様では、野生型ＳＴＥＡＰ−１タンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を、生検組織の免疫組織化学アッセイにおいて使用し得る。
【０１１６】
ＩＸ．）ＳＴＥＡＰ−１と相互作用する分子の同定
ここに開示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質及び核酸配列は、当業者が、ＳＴＥＡＰ−１と相互作用するタンパク質、小分子及び他の薬剤、並びに様々な分野で受け入れられたプロトコルの何れか一つを介して、ＳＴＥＡＰ−１によって活性化される経路を同定することを可能にする。例えば、いわゆる相互作用トラップ系（「２ハイブリッドアッセイ」とも呼ばれる）の一つを利用し得る。このような系では、分子は、レポーター遺伝子の発現を指示する転写因子と相互作用し、再構成し、そこでレポーター遺伝子の発現をアッセイする。他の系は、真核生物転写活性化因子の再構築を介して、インビボでタンパク質−タンパク質相互作用を同定する（例えば、１９９９年９月２１日に発行された米国特許第５９５５２８０号、１９９９年７月２０日に発行された同第５９２５５２３号、１９９８年１２月８日に発行された同第５８４６７２２号、及び１９９９年１２月２１日に発行された同第６００４７４６号を参照）。アルゴリズムもまたタンパク質機能のゲノムベースの予測のために当該分野で利用可能である（例えば、Marcotteら, Nature 402: 4 November 1999, 83-86を参照）。
あるいは、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために、ペプチドライブラリをスクリーニングし得る。このような方法では、ＳＴＥＡＰ−１に結合するペプチドは、アミノ酸のランダムな又は制御された収集物をコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。このライブラリーによってコードされたペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、ついで、このバクテリオファージ粒子は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に対してスクリーニングされる。
【０１１７】
従って、例えば、治療、予後又は診断薬のような様々な広範の用途を有するペプチドは、予想されるリガンド又はレセプター分子の構造について以前の情報は何もなしで同定される。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る、典型的なペプチドライブラリ及びスクリーニング方法は、例えば１９９８年３月３日に発行された米国特許第５７２３２８６号及び１９９８年３月３１日に発行された同第５７３３７３１号で開示される。
あるいは、ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞株は、ＳＴＥＡＰ−１によって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定するために使用される。このような相互作用は、免疫沈降技術（例えば、Hamilton B.J.ら Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261: 646-51を参照）を使用して試験され得る。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質は、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用するＳＴＥＡＰ−１発現細胞株から免疫沈降され得る。あるいは、Ｈｉｓ−ｔａｇに対する抗体は、ＳＴＥＡＰ−１及びＨｉｓ−ｔａｇ（上記のベクター）の融合物を発現するように操作された細胞株中で使用され得る。この免疫沈降複合体は、ウェスタンブロッティング、タンパク質の３５Ｓ−メチオニン標識、タンパク質のマイクロシークエンシング、銀染色及び２次元ゲル電気泳動のような手順によってタンパク質会合に対して試験され得る。
【０１１８】
ＳＴＥＡＰ−１と相互作用する小分子及びリガンドは、このようなスクリーニングアッセイの関連する実施態様を介して同定され得る。例えば、リン酸化及び脱リン酸化を媒介するＳＴＥＡＰ−１の能力に干渉する分子を含む小分子により、タンパク質機能との干渉が、細胞サイクル、第２メッセンジャーシグナル伝達、又は腫瘍形成の調節の指標としてのＤＮＡ又はＲＮＡとの相互作用として機能することが同定され得る。同様に、ＳＴＥＡＰ−１関連イオンチャネル、タンパク質ポンプ、又は細胞連絡機能を調節する小分子を、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を有するタンパク質を処理するために、同定し使用する（例えば、Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes  2版, Sinauer Assoc., Sunderland, MA, 1992）。更に、ＳＴＥＡＰ−１機能を調節するリガンドは、ＳＴＥＡＰ−１に結合し、レポーター構築物を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。典型的な方法は、例えば、１９９９年７月２７日に発行された米国特許第５９２８８６８号において検討されており、少なくとも一つのリガンドが小分子であるハイブリッドリガンドを形成するための方法を含む。例示の実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１の融合タンパク質及びＤＮＡ結合タンパク質を発現するために操作された細胞を使用して、ハイブリッドリガンド／小分子の融合タンパク質及びｃＤＮＡライブラリー転写活性化タンパク質を同時発現する。該細胞は、その発現が、第１融合タンパク質及び第２融合タンパク質の互いに隣接して調整されるレポーター遺伝子を更に含み、これはハイブリッドリガンドが、両方のハイブリッドタンパク質の標的部位に結合する場合のみ生じる事象である。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞を選択し、未知の小分子又は未知のリガンドを同定する。この方法は、ＳＴＥＡＰ−１を活性化又は阻害する調節因子を同定する手段を提供する。
【０１１９】
この発明の実施態様は、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列と相互作用する分子をスクリーニングする方法を含み、該方法は、分子集団とＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列とを接触させ、分子集団とＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列とを、相互作用を容易にする条件下で相互作用させ、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定し、ついで、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列と相互作用しない分子を、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸と相互作用する分子から分離することを含む。特定の実施態様では、該方法は、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列と相互作用する分子を精製し、特徴付けし及び同定することを更に含む。同定された分子は、ＳＴＥＡＰ−１によって実施される機能を調節するために使用され得る。好ましい実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列は、ペプチドライブラリーと接触される。
【０１２０】
Ｘ．治療方法及び組成物
限定されたセットの組織において正常に発現されるが、表Ｉに列挙されたもののような癌においても発現されるタンパク質としてのＳＴＥＡＰ−１の同定により、多数の治療アプローチをそのような癌の処置に開く。
留意することは、標的の抗腫瘍治療法は、標的タンパク質が正常な組織、更には生存に重要な正常な器官組織で発現されるときでさえ、有用であることである。生存に重要な器官は生命を維持するのに必要なものであり、例えば心臓又は大腸である。生存に重要ではない器官は取り除いても個体がなおも生存できるものである。生存に重要ではない器官は卵巣、乳房、前立腺である。
例えば、ハーセプチン（登録商標）はＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、及びｅｒｂ−ｂ−２として様々に知られているタンパク質と免疫反応性である抗体からなるＦＤＡ承認医薬である。それはジェネンテック社により市販されており、商業的に成功した抗腫瘍剤となっている。ハーセプチン（登録商標）の売り上げは２００２年にはほぼ４億ドルに達した。ハーセプチン（登録商標）はＨＥＲ２陽性転移性乳癌の治療薬である。しかしながら、ＨＥＲ２の発現はそのような腫瘍に限られていない。同じタンパク質は多くの正常な組織において発現する。特に、ＨＥＲ２／ｎｅｕは正常な腎臓及び心臓に存在していることが知られており、よってこれらの組織はハーセプチンの全てのヒトレシピエント中に存在している。正常な腎臓におけるＨＥＲ２／ｎｅｕの存在はまたLatif, Z.ら, B. J. U. International (2002) 89:5-9によって確認されている。（腎細胞癌がハーセプチンのような抗ＨＥＲ２抗体の好適な用途であるかどうかを評価した）この文献に示されているように、タンパク質もｍＲＮＡも良性腎組織において産生されている。留意すべきことは、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質は良性腎組織において強く過剰発現されていたことである。ＨＥＲ２／ｎｅｕが心臓や腎臓のような生存に重要な組織で発現されているという事実にかかわらず、ハーセプチンは非常に有用なＦＤＡ承認の商業的に成功した薬剤である。心臓組織に対するハーセプチンの効果、つまり「心毒性」は単に治療の副作用である。患者がハーセプチンだけで治療された場合、有意な心毒性は非常に僅かな割合の患者に起こるのみであった。心毒性を最小にするため、ＨＥＲ２／ｎｅｕでの治療のためにより厳格なエントリー要件が存在する。心臓状態に対する素因のような因子が、治療が始まりうる前に評価される。
特に留意すべきことは、腎臓組織は正常な発現を示すことが示され、場合によっては心臓組織よりも更に高い発現であるけれども、腎臓にはハーセプチンの有意な副作用が全くないことである。更に、ＨＥＲ２が発現される正常な組織の多様なアレイのなかで、副作用の発現は非常に少ない。心臓組織だけが認識できる副作用を顕しただけである。ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現が特に顕著な腎臓のような組織は如何なる副作用の元にもならなかった。
【０１２１】
更に、好ましい治療効果が、上皮細胞成長因子（ＥＧＦＲ）を標的とする抗腫瘍治療法に見出されている；Ｅｒｂｉｔｕｘ（ImClone）。ＥＧＦＲはまた多くの正常な組織中で発現される。抗ＥＧＦＲ治療薬の使用後に正常な組織での副作用は非常に限られていた。ＥＧＦＲ治療で生じる一般的な副作用は、治療を受ける患者の１００％において観察される深刻な皮膚発疹である。
よって、正常な組織、また生存に重要な正常な組織さえでの標的タンパク質の発現は、タンパク質がまた過剰発現する所定の腫瘍に対する治療薬としてのタンパク質に対する標的薬剤の有用性を無効にするものではない。例えば、生存に重要な器官における発現はそれ自体またそれだけで致命的ではない。また、前立腺や卵巣のようになくてもよいと思われる器官は、死亡率に影響を及ぼすことなく取り除くことができる。最後に、ある種の生存に重要な器官は、免疫特権のため正常な器官の発現に影響されない。免疫特権の器官は血液器官障壁によって血液から保護されており、よって免疫療法によって接近できない器官である。免疫特権の器官の例は脳と精巣である。
従って、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の活性を阻害する治療的アプローチ法は、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌の患者に有用である。これらの治療的アプローチ法は一般に３通りの部類に入る。第一の部類は、ＳＴＥＡＰ−１が腫瘍細胞成長の阻害又は遅延化を生じるかその死滅化を誘導する腫瘍細胞成長に関連しているので、ＳＴＥＡＰ−１機能を調節する。第二の部類は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質のその結合対又は他のタンパク質との結合又は会合を阻害する様々な方法を含む。第三の部類はＳＴＥＡＰ−１遺伝子の転写又はＳＴＥＡＰ−１のｍＲＮＡの翻訳を阻害する様々な方法を含む。
【０１２２】
Ｘ．Ａ．）抗癌ワクチン
本発明は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質又はＳＴＥＡＰ−１関連核酸を含む癌ワクチンを提供する。ＳＴＥＡＰ−１の発現に鑑みて、癌ワクチンは、非標的組織に対して最小の効果又は効果を生じさせないでＳＴＥＡＰ−１発現癌を予防及び／又は処置する。抗癌治療薬としての、細胞媒介性体液性免疫応答を生じるワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野でよく知られており、ヒトＰＳＭＡ及び齧歯類ＰＡＰ免疫原を使用して前立腺癌において利用されている（Hodgeら, 1995, Int. J. Cancer 63: 231-237；Fongら, 1997, J.immunol. 159:3113-3117）。
このような方法は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質、又はＳＴＥＡＰ−１コード核酸分子及びＳＴＥＡＰ−１免疫原（これは、典型的には多数のＴ細胞エピトープ又は抗体を含む）を発現し提示し得る組換えベクターを利用することによって直ぐに実施され得る。当業者であれば、免疫反応性エピトープの送達のための広範な様々なワクチン系が当該分野でよく知られていることが分かる（例えば、Herylnら, Ann Med 1999 Feb 31(1):66-78；Maruyamaら, Cancer Immunol Immunother 2000 Jun 49(3):123-32を参照）。簡単に述べると、哺乳動物において、免疫応答（例えば、体液性免疫応答及び／又は細胞媒介免疫応答）を生じるこのような方法は、以下の工程を含む：免疫反応性エピトープ（例えば、図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質、又はそのアナログもしくはホモログ中に存在するエピトープ）に哺乳動物の免疫系を曝露し、その結果、この哺乳動物に、エピトープに対して特異的な免疫応答を生じさせる（例えば、このエピトープを特異的に認識する抗体を生じさせる）工程。好ましい方法では、ＳＴＥＡＰ−１免疫原は、生物学的モチーフを含む。例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及びＸＸＩＩ〜ＬＩ、又は図５、図６、図７、図８、及び図９に示されるＳＴＥＡＰ−１由来のあるサイズ範囲のペプチドを参照）。
【０１２３】
全ＳＴＥＡＰ−１タンパク質、免疫原性領域又はそのエピトープを、様々な手段によって組み合わせ、送達できる。このようなワクチン組成物は、例えば、リポペプチド（例えば、Vitiello, A.ら, J. Clin. Invest. 95: 341, 1995）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）マイクロカプセル中にカプセル化されたペプチド組成物（例えば、Eldridgeら, Molec. Immunol. 28: 287-294, 1991；Alonsoら, Vaccine 12:299-306, 1994；Jonesら, Vaccine 13: 675-681, 1995を参照）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含められたペプチド組成物（例えば、Takahashiら, Nature 344:873-875,1990；Huら, Clin Exp Immunol. 113: 235-243,1998を参照）、多抗原ペプチド系（ＭＡＰ）（例えば、Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988；Tam, J. P., J. Immunol. Methods 196: 17-32, 1996を参照）、多価ペプチドとして処方されたペプチド；弾道送達系において使用するためのペプチド、典型的には結晶化ペプチド、ウイルス送達ベクター（Perkus, M. E.ら, Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E.編, 379頁, 1996；Chakrabarti, S.ら, Nature 320: 535, 1986；Hu, S.L.ら, Nature 320:537, 1986；Kieny, M.-P.ら, AIDS Bio/Technology 4:790, 1986; Top, F. H.ら, J. Infect. Dis. 124:148, 1971；Chanda, P. K.ら, Virology 175:535, 1990）、ウイルス又は合成由来の粒子（例えば、Kofler, N.ら, J. lmmunol. Methods, 192:25, 1996；Eldridge, J.H.ら, Sem. Hematol. 30:16, 1993；Falo, L. D., Jr.ら, Nature Med. 7: 649, 1995）、アジュバント（Warren, H. S. , Vogel, F. R.,及びChedid, L. A. Annu. Rev. Immunol. 4: 369, 1986；Gupta, R. K.ら, Vaccine 11:293, 1993）、リポソーム（Reddy, R.ら, J. Immunol. 148:1585, 1992；Rock, K. L., Immunol. Today 17:131, 1996）又は裸のもしくは粒子吸収ｃＤＮＡ（Ulmer, J. B.ら, Science 259:1745, 1993；Robinson, H.L., Hunt, L.A.,及びWebster, R. G., Vaccine 11:957, 1993；Shiver, J. W.ら, Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E.編, 423頁, 1996；Cease, K.B.,及びBerzofsky, J.A., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994及びEldridge, J. H.ら, Sem. Hematol. 30:16, 1993）。レセプター媒介ターゲティングとしても知られている毒素標的送達技術、例えば、Avant Immunotherapeutics社（Needham, Massachusetts）のものもまた使用され得る。
ＳＴＥＡＰ−１に関連する癌の患者において、本発明のワクチン組成物はまた癌のために使用される他の治療法、例えば、手術、化学療法、薬物治療、放射線治療等で、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ等の免疫アジュバントとの併用を含むものと合わせて使用され得る。
【０１２４】
細胞ワクチン
ＣＴＬエピトープは、対応するＨＬＡ対立遺伝子に結合するＳＴＥＡＰ−１タンパク質内のペプチドを同定するための特定のアルゴリズムを使用して決定され得る（例えば表ＩＶ；ＥｐｉｍｅｒＴＭ及びＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭ，Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html）；及びＢＩＭＡＳ（URL bimas.dcrt.nih.gov/;SYFPEITHI URL syfpeithi.bim-heidelberg.com/）を参照）。好ましい実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１免疫原は、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及びＸＸＩＩ〜ＬＩに示される配列、又はＨＬＡクラスＩモチーフ／スーパーモチーフ（例えば、表ＩＶ（Ａ）、表ＩＶ（Ｄ）、又は表ＩＶ（Ｅ））によって特定された８個、９個、１０個もしくは１１個のアミノ酸のペプチド、及び／又はＨＬＡクラスＩＩモチーフ／スーパーモチーフ（例えば、表ＩＶ（Ｂ）、又は表ＩＶ（Ｃ））を含む少なくとも９個のアミノ酸のペプチドのような、当該分野でよく知られている技術を使用して同定される一又は複数のアミノ酸配列を含む。当該分野で理解されているように、ＨＬＡクラスＩ結合溝は、本質的に、閉鎖して終わり、その結果、特定のサイズ領域のみのペプチドが、溝に適合し、結合され得、一般に、ＨＬＡクラスＩエピトープが、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸長である。これに対して、ＨＬＡクラスＩＩ結合溝は、本質的に、開放して終わり、従って、約９個以上のアミノ酸のペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって結合され得る。ＨＬＡクラスＩとＨＬＡクラスＩＩとの間の結合溝の差異のために、ＨＬＡクラスＩモチーフは、長さ特異的であり、つまり、クラスＩモチーフの２位が、このペプチドのアミノからカルボキシル方向の第２アミノ酸である。クラスＩＩモチーフのアミノ酸位置は、互いに対してのみ相対し、全体のペプチドに対して相対しておらず、つまり、更なるアミノ酸は、モチーフ保有配列のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に付着され得る。ＨＬＡクラスＩＩエピトープは、しばしば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５アミノ酸長、又は２５アミノ酸長より長い。
【０１２５】
哺乳動物において免疫反応を生じさせるための非常に多様な方法が当該分野で知られている（例えばハイブリドーマ産生の第一工程として）。哺乳動物において免疫反応を生じさせるための方法は、哺乳動物の免疫系を、タンパク質（例えばＳＴＥＡＰ−１タンパク質）上の免疫原性エピトープにさらし、免疫反応を生じさせることを含む。典型的な実施態様は、十分な量の少なくとも一のＳＴＥＡＰ−１Ｂ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ又はそのアナログに宿主を接触させ、その少なくとも一の周期間隔の後に、ＳＴＥＡＰ−１Ｂ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ又はそのアナログに宿主を再接触させることにより、宿主においてＳＴＥＡＰ−１への免疫反応を生じさせる方法からなる。特定の実施態様は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質又は人工多重エピトープペプチドに対する免疫反応を生じさせる方法であって、ワクチン調製物中のＳＴＥＡＰ−１免疫原（例えばＳＴＥＡＰ−１タンパク質又はそのペプチド断片、ＳＴＥＡＰ−１融合タンパク質又はアナログ等）をヒト又は他の哺乳動物に投与することを含む方法からなる。典型的には、そのようなワクチン調製物は適切なアジュバント（例えば米国特許第６１４６６３５号を参照）又は普遍的ヘルパーエピトープ、例えばＰＡＤＲＥＴＭペプチド（Epimmune Inc., San Diego, CA；例えばAlexanderら, J. Immunol.2000 164(3); 164(3): 1625-1633；Alexanderら, Immunity 1994 1 (9): 751-761及びAlexanderら, Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92を参照）を含む。代替法は、ＳＴＥＡＰ−１免疫原をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を個体の身体の筋肉又は皮膚にインビボ投与することによって、ＳＴＥＡＰ−１免疫原に対して個体に免疫反応を生じさせることを含み、上記ＤＮＡ配列はＤＮＡ配列の発現を制御する調節配列に作用可能に結合し；ＤＮＡ分子は細胞によって取り上げられ、ＤＮＡ配列は細胞で発現され、免疫反応は免疫原に対して生じせしめられる（例えば米国特許第５９６２４２８号を参照）。場合によっては、アニオン性脂質；サポニン；レクチン；エストロゲン化合物；ヒドロキシル化低級アルキル；ジメチルスルホキシド；及び尿素のような遺伝子ワクチン促進剤もまた投与される。また、標的抗原に対する反応を生じさせるために、ＳＴＥＡＰ−１を模倣する抗イディオタイプ抗体を投与することができる。
【０１２６】
核酸ワクチン
本発明のワクチン組成物は、核酸媒介モダリティを含む。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを患者に投与することができる。遺伝子免疫法は、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌細胞に対して、予防的又は治癒的な体液性及び細胞性免疫応答を生じさせるために用いることができる。ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質／免疫原をコードするＤＮＡを含む構成物及び適切な調節配列は、個体の筋肉又は皮膚に直接注射され得、その結果、筋肉又は皮膚の細胞は、この構築物を取り込み、コードされたＳＴＥＡＰ−１タンパク質／免疫原を発現する。あるいは、ワクチンは、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を含む。ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質免疫原の発現は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を保有する細胞に対して予防的又は治癒的な体液性及び細胞性免疫の発生を生じる。当該分野で知られている様々な予防的又は治癒的な遺伝子免疫技術を使用できる（概説については、インターネットアドレスgenweb.comで公開されている情報及び文献を参照）。核酸ベースの送達は、例えば、Wolffら, Science 247:1465(1990)及び米国特許第５５８０８５９号；同第５５８９４６６号；同第５８０４５６６号；同第５７３９１１８号；同第５７３６５２４号；同第５６７９６４７号；国際公開第９８／０４７２０号に記載されている。ＤＮＡベースの送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介）送達、カチオン性脂質複合体、及び粒子媒介送達（「遺伝子銃」）又は圧力媒介送達（例えば、米国特許第５９２２６８７号を参照）が含まれる。
【０１２７】
治癒的又は予防的な免疫の目的のために、本発明のタンパク質は、ウイルスベクター又は細菌ベクターを介して発現され得る。本発明の実施に使用され得る様々なウイルス遺伝子送達系には、限定されないが、ワクシニア、鶏痘、カナリア痘、アデノウイルス、インフルエンザ、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、及びシンドビスウイルス（例えば、Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658-663；Tsangら J. Natl. Cancer Inst. 87: 982-990 (1995)を参照）が含まれる。非ウイルス送達系もまた抗腫瘍応答を誘導するために患者に、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質をコードする裸のＤＮＡを（例えば筋内又は皮内で）導入することにより利用され得る。
ワクチンウイルスは、例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとして使用される。宿主への導入の際に、組換えワクチンウイルスは、タンパク質免疫原性ペプチドを発現し、それによって、宿主免疫応答を惹起する。免疫プロトコルにおいて有用なワクチンベクター及び方法は、例えば、米国特許第４７２２８４８号に記載されている。他のベクターは、ＢＣＧ（Bacille Calmette Guerin）である。ＢＣＧベクターは、Stoverら, Nature 351:456-460(1991)に記載されている。本発明のペプチドの治癒的投与又は免疫のために有用な非常に多様な他のベクター、例えば、アデノ及びアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等は、ここの記載から当業者に明らかである。
よって、遺伝子送達系は、ＳＴＥＡＰ−１関連核酸分子を送達するために使用される。一実施態様では、全長ヒトＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡが使用される。他の実施態様では、特定の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及び／又は抗体エピトープをコードするＳＴＥＡＰ−１核酸分子が用いられる。
【０１２８】
エキソビボワクチン
様々なエキソビボストラテジーを利用して免疫応答を発生させることができる。一つのアプローチ法は、患者の免疫系に対してＳＴＥＡＰ−１抗原を提示する樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）の使用を含む。樹状細胞はＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子、Ｂ７−同時刺激、及びＩＬ−１２を発現し、よって高度に特異的な抗原提示細胞である。前立腺癌において、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドを用いて適用される自己樹状細胞が、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために、フェーズＩ臨床試験において使用される（Tjoaら, 1996, Prostate 28:65-69; Murphyら, 1996, Prostate 29: 371-380）。従って、樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子の場合においてＳＴＥＡＰ−１ペプチドをＴ細胞に提示するために使用され得る。一実施態様では、自己樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ及び／又はＩＩ分子に結合し得るＳＴＥＡＰ−１ペプチドでパルスされる。他の実施態様では、樹状細胞は、完全ＳＴＥＡＰ−１タンパク質でパルスされる。更に他の実施態様は、例えば、アデノウイルス（Arthurら, 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17-25）、レトロウイルス（Hendersonら, 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡ形質移入（Ribasら, 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869）、又は腫瘍誘導ＲＮＡ形質移入（Ashleyら, 1997, J. Exp. Med.186:1177-1182）など、当該分野で知られている様々な実行ベクターを使用する樹状細胞中で、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の過剰発現を操作することを含む。ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞はまた免疫調節因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように操作され、免疫剤として使用され得る。
【０１２９】
Ｘ．Ｂ．）抗体ベースの治療のための標的としてのＳＴＥＡＰ−１
ＳＴＥＡＰ−１は、抗体ベースの治療ストラテジーのための魅力的な標的である。多数の抗体ストラテジーが、細胞外及び細胞内分子の両方を標的とするために当該分野で知られている（例えば、補体及びＡＤＣＣ媒介殺傷並びに細胞内抗体の使用を参照）。ＳＴＥＡＰ−１は、対応する正常細胞に対する様々な系統の癌細胞によって発現されるので、免疫活性組成物を非標的器官及び組織に結合することによって生じる、毒性、非特異的及び／又は非標的効果のない優れた感受性を示すＳＴＥＡＰ−１免疫活性組成物の全身投与を調製する。ＳＴＥＡＰ−１のドメインと特異的に反応性の抗体は、毒素又は治療剤との結合体としてか、又は細胞増殖又は機能を阻害し得る裸の抗体としての何れかで、ＳＴＥＡＰ−１発現癌を全身的に処置するために有用である。
ＳＴＥＡＰ−１抗体は、抗体がＳＴＥＡＰ−１に結合し、例えば結合パートナーとの相互作用のような機能を調節し、その結果、腫瘍細胞の破壊を媒介し、及び／又は腫瘍細胞の増殖を阻害するように、患者に導入され得る。このような抗体が治癒的効果を奏する機序には、補体媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害、ＳＴＥＡＰ−１の生理学的機能の調節、リガンド結合又はシグナル伝達経路の阻害、腫瘍細胞分化の調節、腫瘍脈管形成因子プロファイルの改変、及び／又はアポトーシスが含まれうる。具体例には非ホジキンリンパ腫のためのリツキサン（登録商標）、転移性乳癌のためのハーセプチン（登録商標）、及び結腸直腸癌のためのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）が含まれる。
【０１３０】
当業者であれば、抗体が、免疫原性分子、例えば、図２又は図３に示されるＳＴＥＡＰ−１配列の免疫原性領域を特異的に標的としこれに結合するために使用され得ることを理解する。更に、当業者であれば、抗体を細胞傷害性薬剤に結合させることは常套的であることを理解する（例えば、Sleversら Blood 93: 11 3678-3684 (June 1,1999)を参照）。細胞傷害性及び／又は治療剤は、例えば、その細胞によって発現される分子（例えば、ＳＴＥＡＰ−１）に対して特異的な抗体にそれらを結合等させることによって、細胞に直接送達され、該細胞傷害性薬剤は、その細胞上においてその既知の生物学的効果（つまり、細胞傷害性）を奏する。
細胞を殺傷するために抗体−細胞傷害性薬剤結合体を使用する多種多様な組成物及び方法が当該分野で知られている。癌の場合、典型的な方法は、発現されたか、結合に接近可能か、又は細胞表面上に局在化されたマーカー（例えば、ＳＴＥＡＰ−１）に結合するターゲティング剤（例えば、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体）に連結された選択された細胞傷害性薬剤及び／又は治療剤を含む生物学的に有効な量の結合体を、腫瘍を有する哺乳動物に投与することを含む。典型的な実施態様は、細胞傷害性及び／又は治療薬剤を細胞発現ＳＴＥＡＰ−１に送達する方法であって、ＳＴＥＡＰ−１エピトープに免疫特異的に結合する抗体に細胞傷害性薬剤を結合させ、抗体薬剤結合体に細胞を曝露することを含む方法である。他の例示的な実施態様は、転移癌を患ったと疑われる個体を治療する方法であって、細胞傷害性及び／又は治療薬剤に結合された治療的有効量の抗体を含む薬学的組成物を前記個体に非経口的に投与する工程を含む方法である。
【０１３１】
抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用する癌免疫療法は、限定されないが、結腸癌（Arlenら, 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138）、多発性骨髄腫（Ozakiら, 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenariら, 1997, Blood 90: 2437-2444）、胃癌（Kasprzykら, 1992, Cancer Res. 52:2771-2776）、Ｂ細胞リンパ腫（Funakoshiら, 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101）、白血病（Zhongら, 1996, Leuk. Res. 20:581-589）、結腸直腸癌（Mounら, 1994, Cancer Res. 54: 6160-6166；Veldersら, 1995, Cancer Res. 55: 4398-4403）、及び乳癌（Shepardら, 1991, J. Clin. Immunol.11:117-127）を含む他の型の癌の治療に成功裏に使用されている様々なアプローチ法に従ってなすことができる。幾つかの治療アプローチ法は、毒素及び放射線同位元素への裸の抗体の結合、例えば、抗ＣＤ２０抗体へのＹ９１又はＩ１３１の結合（例えば、ZevalinTM, IDEC Pharmaceuticals Corp.又はBexxarTM Coulter Pharmaceuticals）を含む一方、他のアプローチは、抗体と他の治療剤（例えば、ハーセプチンＴＭ（トラスツズマブ（trastuzuMAb）とパクリタキセル（ジェネンテック社））との同時投与を含む。抗体は、治療剤に結合され得る。前立腺癌の治療のために、例えば、ＳＴＥＡＰ−１抗体が、照射、化学療法又はホルモン除去と組み合わせて、投与され得る。また、抗体は、カリケアマイシン（例えば、MylotargTM, Wyeth-Ayerst, Madison, NJ, 抗腫瘍抗菌性カリケアマイシンに結合された組換えヒト化ＩｇＧ４κ抗体）又はメイタンシノイド（例えば、タキサンベースの腫瘍活性化プロドラック、ＴＡＰ、プラットホーム、ImmunoGen, Cambridge, MA、また米国特許第５４１６０６４号を参照）又はオーリスタチン(Auristatin)Ｅ（Seattle Genetics）のような毒素に結合され得る。
【０１３２】
ＳＴＥＡＰ−１抗体療法は、癌の全てのステージに対して有用であるが、抗体療法は、進行癌又は転移癌において特に適切であり得る。本発明の抗体療法を用いた治療は、一又は複数ラウンドの化学療法を受けている患者に示される。あるいは、本発明の抗体療法は、化学療法処置を受けていない患者のために、化学療法レジメン又は放射線レジメンと組み合わせられる。更に、抗体療法は、特に、あまり十分にはその化学療法薬剤の毒性を許容しない患者について、減少した投薬量の併用化学療法の使用を可能にし得る。Ｆａｎら（Cancer Res. 53:4637-4642,1993）、Ｐｒｅｗｅｔｔら（International J. of Onco. 9:217-224, 1996）、及びＨａｎｃｏｃｋら（Cancer Res. 51: 4575-4580, 1991）は、化学療法剤と併用しての様々な抗体の使用を記載する。
ＳＴＥＡＰ−１抗体療法は、癌の全てのステージに対して有用であるが、抗体療法は、進行癌又は転移癌において特に適切であり得る。本発明の抗体療法を用いた治療は、一又は複数ラウンドの化学療法を受けている患者に示される。あるいは、本発明の抗体療法は、化学療法処置を受けていない患者のために、化学療法レジメン又は放射線レジメンと組み合わせられる。更に、抗体療法は、特に、あまり十分にはその化学療法薬剤の毒性を許容しない患者について、減少した投薬量の併用化学療法の使用を可能にし得る。
【０１３３】
癌患者は、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的ＳＴＥＡＰ−１画像化、又はＳＴＥＡＰ−１発現の存在及び程度を信頼性をもって示し得る他の技術を使用して、ＳＴＥＡＰ−１発現の存在及びレベルについて評価し得る。腫瘍生検又は外科的生検の免疫組織化学分析が、この目的のために好ましい。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は当該分野でよく知られている。
前立腺癌及び他の癌を処置する抗ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体には、その腫瘍に対する強力な免疫応答を示し得るもの、又は直接的に細胞傷害性であり得る抗体が含まれる。この点、抗ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、補体媒介性細胞傷害又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の何れかの機構によって、腫瘍細胞溶解を惹起し得、これらの機構の両方が、補体タンパク質上のエフェクター細胞Ｆｃレセプター部位との相互作用のために、その免疫グロブリン分子の無傷のＦｃ部分を必要とする。更に、腫瘍増殖に対する直接の生物学的効果を奏する抗ＳＴＥＡＰ−１ ＭＡｂが、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を治療するのに有用である。直接的に細胞傷害性ＭＡｂが作用する機構には、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍脈管形成因子プロファイルの調節、及びアポトーシスの誘導が含まれる。特定の抗ＳＴＥＡＰ−１ ＭＡｂが抗腫瘍効果を奏する機構は、当該分野で一般的に知られているように、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体媒介性細胞溶解などの細胞死を評価する任意の数のインビトロアッセイを使用して、評価される。
【０１３４】
ある患者において、マウス又は他の非ヒトモノクローナル抗体、あるいはヒト／マウスキメラＭＡｂの使用が、非ヒト抗体に対する中程度から強力な免疫応答を誘導し得る。これは、循環からの抗体のクリアランスと減少した効力をもたらす。最も深刻な場合において、このような免疫応答は、潜在的に腎不全を引き起こし得る免疫複合体の広範な形成をもたらし得る。従って、本発明の治療法の実施に使用される好ましいモノクローナル抗体は、高い親和性で標的ＳＴＥＡＰ−１抗原に特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すか又は全く抗原性を示さない完全にヒトであるか又はヒト化されているかの何れかであるものである。
本発明の治療法は、単一の抗ＳＴＥＡＰ−１ ＭＡｂの投与並びに異なるＭＡｂの組み合わせ又はカクテルの投与を考える。このようなＭＡｂカクテルは、それらが、異なるエピトープを標的とするＭＡｂ含むか、異なるエフェクター機構を使用し、又は免疫エフェクター機能性に依存するＭＡｂと直接細胞傷害性ＭＡｂを組み合わせるので、所定の利点を有し得る。組み合わせたこのようなＭＡｂは、相乗的治療効果を奏し得る。また、抗ＳＴＥＡＰ−１ ＭＡｂの投与は、様々な化学療法薬剤、アンドロゲン遮断薬、免疫調節因子（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）、手術又は放射線を含むがこれらに限定されない、他の治療剤と同時に投与され得る。抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂは、その「裸（naked）」の形態又は非結合形態で投与され得るし、又はそれらに結合した治療剤を有し得る。
【０１３５】
抗ＳＴＥＡＰ−１抗体製剤は、腫瘍細胞に抗体を送達し得る任意の経路を介して投与され得る。投与の経路には、限定されないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内などが含まれる。治療は、一般的に、典型的には約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、静脈内（ＩＶ）注射のような受容可能な投薬経路を介しての抗ＳＴＥＡＰ−１抗体調製物の繰り返しの投与を含む。一般に、１週間に１０〜１０００ｍｇのＭＡｂの範囲の用量が効果的であり十分に許容され得る。
転移性乳癌の治療におけるハーセプチンＴＭＭＡｂを用いる臨床経験に基づいて、抗ＳＴＥＡＰ−１ ＭＡｂ調製物の約４ｍｇ／ｋｇ患者体重（ＩＶ）の初回負荷用量に引き続いて、約２ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）の毎週の用量が、受容可能な投薬レジメンを示す。好ましくは、この初回負荷用量が、９０分以上の注入として投与される。その初回用量が十分に許容された場合、周期的維持用量が、３０分以上の注入として投与される。当業者が理解するように、様々な因子が、特定の場合における理想的な用量レジメンに影響し得る。このような因子には、例えば、使用されるＡｂ又はＭＡｂの結合親和性及び半減期、患者におけるＳＴＥＡＰ−１発現の程度、循環する放出ＳＴＥＡＰ−１抗原の程度、所望される安定状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、及び本発明の治療方法と組み合わせて使用される化学療法剤又は他の因子の影響並びに特定の患者の健康状態が含まれる。
【０１３６】
場合によっては、患者は、最も有効な投与レジメンなどの決定を補助するために、所定の試料中のＳＴＥＡＰ−１のレベル（例えば、循環するＳＴＥＡＰ−１抗原及び／又はＳＴＥＡＰ−１発現細胞のレベル）について評価されるべきである。このような評価はまた治療を通じて目的のものをモニタリングするために使用され、他のパラメーター（例えば、膀胱癌治療における尿細胞学及び／又はＩｍｍｕｎｏＣｙｔレベル、あるいは、類推して、前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）の評価と組合せて治療的成功を評価するために有用である。
抗イディオタイプ抗ＳＴＥＡＰ−１抗体はまた抗癌療法において、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を発現する細胞に対して免疫応答を惹起するワクチンとして使用され得る。特に、抗イディオタイプ抗体の産生は当該分野で周知であり；この方法は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を産生するように直ぐに適合され得る（例えば、Wagnerら, 1997, Hybridoma 16: 33-40；Foonら, 1995, J. Clin. Invest. 96: 334-342；Herlynら, 1996, Cancer Immunol. Immunother. 43: 65-76を参照）。このような抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
【０１３７】
Ｘ．Ｃ．） 細胞免疫応答に対する標的としてのＳＴＥＡＰ−１
ここに記載される免疫原的に有効量の一又は複数のＨＬＡ結合ペプチドを含むワクチン及びワクチンを調製する方法は、本発明の更なる実施態様である。更に、本発明に係るワクチンは、特許請求の範囲に記載のペプチドの一又は複数の組成物を包含する。ペプチドは、ワクチン中に個々に存在し得る。あるいは、ペプチドは、同じペプチドの複数コピーを含むホモポリマーとして、又は様々なペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、増加した免疫学的反応の利点を有し、異なるペプチドエピトープがポリマーを構成するために使用される場合、免疫応答を標的化する病原性生物又は腫瘍関連ペプチドの異なる抗原決定基と反応する抗体及び／又はＣＴＬを誘導する更なる能力を有する。該組成物は、抗原の天然に生じる領域であり得るか、又は例えば、組換えによりもしくは化学合成によって調製され得る。
本発明のワクチンと共に使用され得る担体は当業者によく知られており、例えば、サイログロブリン、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸、例えばポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などを含む。ワクチンは、生理学的に許容可能（すなわち、受容可能）な希釈剤、例えば水、又は生理食塩水、好ましくは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。ワクチンはまた典型的にはアジュバントを含む。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、又はミョウバンのようなアジュバントは、当該分野でよく知られている物質の例である。更に、ここで開示されるように、ＣＴＬ応答は、本発明のペプチドを脂質、例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）に結合させることによって、初回刺激され得る。更に、アジュバント、例えば合成シトシン−ホスホロチオール化グアニン含有（ＣｐＧ）オリゴヌクレオチド）は、ＣＴＬ応答を１０〜１００倍増加させることが見出された（例えば、Davila及びCelis, J. Immunol. 165: 539-547 (2000)を参照）。
【０１３８】
注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸内、髄腔内、又は他の適切な経路による、本発明に係るペプチド組成物での免疫時に、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な大量のＣＴＬ及び／又はＨＴＬを産生することによってワクチンに応答する。その結果、宿主は、ＳＴＥＡＰ−１抗原を発現するか又は過剰発現する細胞の後期発生に少なくとも部分的に免疫されるか、あるいは抗原が腫瘍関連であった場合、少なくとも幾つかの治療的利益を導く。
幾つかの実施態様では、クラスＩペプチド成分を、標的抗原に対する中和抗体及び／又はヘルパーＴ細胞応答を誘導するか又は促進する成分と組み合わせることが望ましい場合がある。このような組成物の好ましい実施態様は、本発明に係るクラスＩ及びクラスＩＩエピトープを含む。このような組成物の代替の実施態様は、交差反応性ＨＴＬエピトープ、例えば、ＰＡＤＲＥＴＭ（Epimmune, San Diego, CA）分子（例えば米国特許第５７３６１４２号に記載）と共に、本発明に係るクラスＩエピトープ及び／又はクラスＩＩエピトープを含む。
本発明のワクチンはまた抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞（ＤＣ）を、本発明のペプチドを提示するためのビヒクルとして含み得る。樹状細胞を動員し、収集し、これによって、樹状細胞の負荷をインビトロで生じさせた後に、ワクチン組成物が、インビトロで作製され得る。例えば、樹状細胞は、例えば、本発明に係るミニ遺伝子でトランスフェクトされるか、又はペプチドでパルスされる。ついで、樹状細胞は、インビボで免疫応答を惹起するために患者に投与され得る。ワクチン組成物（ＤＮＡベース又はペプチドベースの何れか）はまた樹状細胞動員と共にインビボ投与され得、これによって、樹状細胞の負荷がインビボで生じる。
【０１３９】
好ましくは、次の原理が、ワクチンでの使用のためのポリエピトープ組成物中への封入のために、あるいはワクチンに含まれるべき、及び／又は例えばミニ遺伝子のような核酸によってコードされるべき別々のエピトープを選択するために、エピトープのアレイを選択する場合に利用される。次の原理のそれぞれが選択を行うためにバランスをとられることが好ましい。所定のワクチン組成物に組み込まれる複数のエピトープは、エピトープが由来する天然抗原において連続した配列であり得るが、そうである必要はない。
１．）投与時に、腫瘍クリアランスと相関することが観測された免疫応答を模倣するエピトープが選択される。ＨＬＡクラスＩでは、これには、少なくとも一つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する３〜４エピトープが含まれる。ＨＬＡクラスＩＩでは、類似の原理が用いられる；また、３〜４エピトープが、少なくとも一つのＴＡＡから選択される（例えば、Rosenbergら, Science 278: 1447-1450を参照）。一つのＴＡＡからのエピトープは、一又は複数の更なるＴＡＡからのエピトープと組み合わせられて使用され得、頻繁に発現されるＴＡＡの様々な発現パターンを有する腫瘍を標的化するワクチンを産生する。
２．）免疫原性と相関することが確証された必須の結合親和性を有するエピトープが選択される：ＨＬＡクラスＩでは、５００ｎＭ以下、しばしば、２００ｎＭ以下のＩＣ５０；及びクラスＩＩでは、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０。
【０１４０】
３．）十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、又は対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイが、広い集団適用範囲をもたらすように選択される。例えば、少なくとも８０％の集団適用範囲を有することが好ましい。当該分野で知られている統計的評価法であるモンテカルロ解析を使用して、集団適用範囲の幅又は冗長性を評価し得る。
４．）癌関連抗原由来のエピトープを選択する場合、患者は天然のエピトープに対して耐性を発生し得るため、アナログを選択することがしばしば有用である。
５．）「ネステッドエピトープ」と呼ばれるエピトープが特に関連する。ネステッドエピトープは、少なくとも２つのエピトープが所定のペプチド配列で重複する場合に生じる。ネステッドペプチド配列は、Ｂ細胞エピトープ、ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩエピトープを含み得る。ネステッドエピトープを提供する場合、一般的な目的は、配列当たり最大数のエピトープを提供することである。よって、一側面は、ペプチド中のアミノ末端エピトープのアミノ末端及びカルボキシル末端エピトープのカルボキシル末端よりも長いペプチドを提供することを避けることである。多重エピトープ配列、例えばネステッドエピトープを含む配列を提供する場合、病理学的な又は他の有害な生物学的特性を有さないことを保証するために、配列をスクリーニングすることが一般的に重要である。
【０１４１】
６．）ポリエピトープタンパク質を作製する場合、又はミニ遺伝子を作製する場合、目的は、対象のエピトープを包含する最も小さいペプチドを作製することである。この原理は、ネステッドエピトープを含むペプチドを選択する場合に用いられる原理と同じではない場合、類似する。しかし、人工ポリエピトープペプチドでは、サイズ最小化の目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープ間に任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対してバランスがとられる。例えば、スペーサーアミノ酸残基は、接合エピトープ（免疫系によって認識され、標的抗原に存在せず、エピトープの人工並置によってのみ作製されるエピトープ）を避けるために、又はエピトープ間の切断を容易にし、それによって、エピトープ提示を増強するために導入され得る。接合エピトープは、レシピエントが、その非ネイティブなエピトープに対する免疫応答を生成し得るから、一般には避けられるべきである。「優性エピトープ」である接合エピトープが特に関心が高い。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少され又は抑制される強い応答を生じうる。
７．）同じ標的タンパク質の複数の変異体の配列が存在する場合、潜在的なペプチドエピトープはまたそれらの保存性に基づいて選択され得る。例えば、保存性についての基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体又はクラスＩＩ結合ペプチドの９マーのコア全体が、特定のタンパク質抗原について評価される配列の指定された割合で保存されることを定め得る。
【０１４２】
Ｘ．Ｃ．１． ミニ遺伝子ワクチン
多重エピトープの同時送達を可能にする多くの異なるアプローチが利用可能である。本発明のペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施態様である。ミニ遺伝子中への封入のためのエピトープは、好ましくは、前のセクションに記載されたガイドラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の一又は複数の多重エピトープを含むペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。
多重エピトープミニ遺伝子の使用は、以下及びIshiokaら, J. Immunol. 162:3915-3925, 1999；An, L.及びWhitton, J. L., J. Virol. 71:2292, 1997；Thomson, S. A.ら, J. Immunol. 157:822, 1996；Whitton, J. L.ら, J. Virol. 67:348, 1993；Hanke, R.ら, Vaccine 16:426, 1998に記載される。例えば、ＳＴＥＡＰ−１由来のスーパーモチーフ保有エピトープ及び／又はモチーフ保有エピトープをコードする多重エピトープＤＮＡプラスミド、ＳＴＥＡＰ−１由来のＰＡＤＲＥ（登録商標）ユニバーサルヘルパーＴ細胞エピトープ又は多重ＨＴＬエピトープ（例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ及びＸＸＩＩ〜ＬＩを参照）、及び小胞体トランスロケーションシグナル配列が操作され得る。ワクチンはまた他のＴＡＡ由来のエピトープを含みうる。
多重エピトープミニ遺伝子の免疫原性は、試験されるエピトープに対してＣＴＬ誘導応答の大きさを評価するためにトランスジェニックマウスで確認され得る。更に、インビボのＤＮＡコードエピトープの免疫原性は、ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトされた標的細胞に対する特定のＣＴＬ株のインビトロ応答と相関し得る。従って、これらの実験は、ミニ遺伝子が、１．）ＣＴＬ応答を生じること、及び２．）誘導されたＣＴＬが、コードされたエピトープを発現する細胞を認識することの両方に役立つことを示し得る。
【０１４３】
例えば、ヒト細胞における発現のために選択されたエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、エピトープのアミノ酸配列は逆翻訳され得る。ヒトコドン使用頻度表は、各アミノ酸に対するコドン選択の指針のために使用され得る。これらのエピトープコードＤＮＡ配列は、直接隣接し得、その結果、翻訳された場合に、連続したポリペプチド配列が作製される。発現及び／又は免疫原性を最適化するために、更なるエレメントが、ミニ遺伝子設計に組み込まれ得る。ミニ遺伝子配列に逆翻訳され得、含まれ得るアミノ酸配列の例には以下のものが含まれる：ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、抗体エピトープ、ユビキチン化シグナル配列、及び／又は小胞体標的化シグナル。また、ＣＴＬ及びＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、ＣＴＬ又はＨＴＬエピトープに隣接する合成（例えば、ポリ−アラニン）又は天然に存在する隣接配列を含ませることによって改善され得る；エピトープを含むこれらのより大きなペプチドは、本発明の範囲内である。
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることによってＤＮＡに変換され得る。重複オリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）は、よく知られた技術を使用して、適切な条件下で合成され、リン酸化され、精製され、アニールされ得る。オリゴヌクレオチドの末端は、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、結合され得る。ついで、エピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子は、所望の発現ベクターにクローン化され得る。
【０１４４】
当業者によく知られている標準的な調節配列は、好ましくは、標的細胞中での発現を確実にするためにベクターに含まれる。数個のベクターエレメントが望ましい：ミニ遺伝子挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター；十分な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；大腸菌複製起点；及び大腸菌選択マーカー（例えば、アンピシリン又はカナマイシン耐性）。多くのプロモーター、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターがこの目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列については、例えば米国特許第５５８０８５９号及び同第５５８９４６６号を参照。
更なるベクター改変はミニ遺伝子発現及び免疫原性を最適化するために所望され得る。幾つかの場合、イントロンは、効率的な遺伝子発現に必要とされ、一又は複数の合成イントロン又は天然に生じるイントロンが、ミニ遺伝子の転写領域に組み込まれ得る。ｍＲＮＡ安定化配列及び哺乳動物細胞における複製のための配列を含ませることもまたミニ遺伝子発現を増加するために考慮され得る。
ひとたび発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポリリンカー領域にクローン化される。このプラスミドは、適切な大腸菌株に形質転換され、ＤＮＡは標準的な技術を使用して調製される。ミニ遺伝子の方向及びＤＮＡ配列、並びにベクターに含まれる全ての他のエレメントは、制限マッピング及びＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正しいプラスミドを有する細菌細胞は、マスター細胞バンク及び作業細胞バンクとして保存され得る。
【０１４５】
また、免疫刺激配列（ＩＳＳ又はＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性においてある役割を果たすようである。これらの配列は、免疫原性を増強することが望まれる場合に、ミニ遺伝子コード配列の外側で、ベクターに含まれ得る。
幾つかの実施態様では、ミニ遺伝子コードエピトープ及び第２タンパク質（免疫原性を増強又は減少するために含まれる）の両方の産生を可能にするバイシストロン性発現ベクターが使用され得る。同時発現される場合に免疫応答を有利に増強し得るタンパク質又はポリペプチドの例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、同時刺激分子、又は、ＨＴＬ応答について、ｐａｎ−ＤＲ結合タンパク質（PADRETM, Epimmne, San Diego, CA）が含まれる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内標的化シグナルに結合され得、発現されるＣＴＬエピトープから別々に発現され得る；これは、ＣＴＬエピトープとは異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの方向付けを可能にする。必要とされる場合、これは、ＨＴＬエピトープにＨＬＡクラスＩＩ経路へのより効率的な進入を促進し得、それによって、ＨＴＬ誘導を改善する。ＨＴＬ誘導又はＣＴＬ誘導と対照的に、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現によって免疫応答を特異的に減少させることは、特定の疾患において有益であり得る。
【０１４６】
プラスミドＤＮＡの治療的な量は、例えば、大腸菌での発酵、続く精製によって産生され得る。作業細胞バンクからのアリコートを使用して、増殖培地に播種し、周知技術に従って振盪フラスコ又はバイオリアクターで飽和まで増殖される。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ社（Valencia, California）によって供給される固相アニオン交換樹脂のような標準的な生物分離技術を使用して精製され得る。必要な場合、スーパーコイルＤＮＡは、ゲル電気泳動又は他の方法を使用して、開環状及び線形形態から単離され得る。
精製プラスミドＤＮＡは、様々な製剤を使用して注射のために調製され得る。これらのうち最も簡単なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での凍結乾燥ＤＮＡの再構成である。「裸のＤＮＡ」として知られているこのアプローチ法は、臨床試験における筋肉内（ＩＭ）投与のために現在使用されている。ミニ遺伝子ＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大にするために、精製プラスミドＤＮＡを製剤化するための代替方法が望ましい場合がある。様々な方法が記載され、新規な技術が利用可能となり得る。カチオン性脂質、糖脂質、及び膜融合リポソームもまた製剤で使用され得る（例えば、ＷＯ９３／２４６４０；Mannino及びGould-Fogerite, BioTechniques 6 (7): 682 (1988)；米国特許第５２７９８３３号；ＷＯ９１／０６３０９；及びFelgnerら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987)を参照）。また、保護的な相互作用性非凝縮化合物（ＰＩＮＣ）として集合的に呼ばれるペプチド及び化合物もまた安定性、筋肉内分散性、あるいは特定の器官又は細胞型への輸送のような変数に影響するように精製プラスミドＤＮＡに複合体化され得る。
【０１４７】
標的細胞感作は、ミニ遺伝子コードＣＴＬエピトープの発現及びＨＬＡクラスＩ提示のための機能性アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミドＤＮＡは、標準的なＣＴＬクロム放出アッセイのための標的として適切な哺乳動物細胞株に導入される。使用される形質移入方法は最終製剤に依存する。エレクトロポレーションは、「裸の」ＤＮＡのために使用され得る一方、カチオン性脂質は、直接的なインビトロ形質移入を可能とする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドは、蛍光細胞分離分析装置（ＦＡＣＳ）を使用して、トランスフェクトされた細胞の濃縮を可能にするために同時トランスフェクトされ得る。ついで、これらの細胞は、クロム−５１（５１Ｃｒ）標識され、エピトープ特異的ＣＴＬ株に対する標的細胞として使用され；５１Ｃｒ放出によって検出される細胞溶解は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの産生及びＨＬＡ提示の両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価するためのアッセイを使用して同様な形で評価され得る。
【０１４８】
インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ製剤の機能試験についての第２のアプローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを、ＤＮＡ産物を用いて免疫する。用量及び投与経路は製剤依存性である（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてＩＭ、脂質複合化ＤＮＡについて腹腔内（ｉ．ｐ．））。免疫の２１日後、脾細胞を収集し、試験される各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間、再刺激する。その後、ＣＴＬエフェクター細胞について、標準的技術を使用して、ペプチド負荷５１Ｃｒ標識標的細胞の細胞溶解についてのアッセイを行う。ミニ遺伝子コードエピトープに対応するペプチドエピトープを負荷されたＨＬＡによって感作された標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボ導入についてのＤＮＡワクチン機能を実証する。ＨＴＬエピトープの免疫原性は、トランスジェニックマウスにおいて類似の方法で確認される。
あるいは、核酸は、例えば、米国特許第５２０４２５３号に記載されるように、弾道的送達を使用して投与され得る。この技術を使用して、ＤＮＡのみから構成される粒子が投与される。更なる代替の実施態様では、ＤＮＡは、例えば金粒子のような粒子に接着され得る。
ミニ遺伝子はまた当該分野でよく知られている他の細菌又はウイルス送達系を使用して送達され得、例えば、本発明のエピトープをコードする発現構築物が、ワクシニアのようなウイルスベクターに組み込まれ得る。
【０１４９】
Ｘ．Ｃ．２． ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組み合わせ
本発明のＣＴＬペプチドを含むワクチン組成物は、所望の性状、例えば、改善された血清半減期、広げられた集団適用範囲、又は増強された免疫原性を提供するために改変され、例えば、アナログ化され得る。
例えば、ペプチドがＣＴＬ活性を誘導する能力は、ペプチドを、Ｔヘルパー細胞応答を誘導し得る少なくとも一つのエピトープを含む配列に連結することによって増強され得る。ＣＴＬペプチドは直接Ｔヘルパーペプチドに連結され得るが、しばしば、ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体はスペーサー分子によって連結される。スペーサーは、典型的には、比較的小さな中性の分子、例えば、アミノ酸又はアミノ酸模倣物で、生理学的条件下で実質的に荷電していないものから構成される。スペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、あるいは非極性アミノ酸又は中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。存在していてもよいスペーサーが同じ残基から構成される必要はなく、従って、ヘテロ又はホモオリゴマーであり得ることが理解される。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１つ又は２つの残基、より通常には、３〜６個の残基、しばしば、１０以上の残基である。ＣＴＬペプチドエピトープは、ＣＴＬペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかにおいて、直接的又はスペーサーを介しての何れかで、Ｔヘルパーペプチドに連結され得る。免疫原性ペプチド又はＴヘルパーペプチドの何れかのアミノ末端はアシル化され得る。
ある実施態様では、Ｔヘルパーペプチドは、遺伝的に多様な集団の大部分に存在するＴヘルパー細胞によって認識されるペプチドである。これは、多く、ほとんど、又は全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドを選択することによって達成され得る。多くのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するこのようなアミノ酸の例は、破傷風トキソイドの８３０〜８４３位ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（配列番号６４）、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の３７８〜３９８位ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号６５）、及び連鎖球菌１８ｋＤタンパク質の１１６〜１３１位ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ（配列番号６６）のような抗原由来の配列を含む。他の例には、ＤＲ １−４−７スーパーモチーフ、又はＤＲ３モチーフの何れかを有するペプチドが含まれる。
【０１５０】
あるいは、天然に見出されないアミノ酸配列を使用して、緩いＨＬＡ拘束態様で、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することが可能である（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７７０７を参照）。Ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープ（例えば、PADRETM, Epimmune, Inc., San Diego, CA）と呼ばれるこれらの合成化合物は、大部分のＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に最も優先的に結合するように設計される。例えば、式：ＸＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＸ（配列番号６７）（ここで「Ｘ」は、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、又はチロシンの何れかであり、ａは、Ｄ−アラニン又はＬ−アラニンの何れかである）を有するｐａｎ−ＤＲ結合エピトープペプチドは、大部分のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合し、それらのＨＬＡ型に関わりなく、大部分の個体由来のＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することが見出されている。ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープの代替物は、全て「Ｌ」天然アミノ酸を含み、エピトープをコードする核酸の形態で提供され得る。
ＨＴＬペプチドエピトープはまたそれらの生物学的特性を変更するために改変され得る。例えば、これらは、プロテアーゼに対するそれらの耐性を増加し、よって、それらの血清半減期を延長するためにＤ−アミノ酸を含むように改変され得るか、あるいはこれらは、それらの生物学的活性を増加させるために、脂質、タンパク質、炭水化物のような他の分子に結合され得る。例えば、Ｔヘルパーペプチドは、アミノ末端又はカルボキシル末端の何れかにおいて一又は複数のパルミチン酸に結合され得る。
【０１５１】
Ｘ．Ｃ．３．ＣＴＬペプチドとＴ細胞プライミング剤との組合せ
幾つかの実施態様では、本発明の薬学的組成物中に、Ｂリンパ球又はＴリンパ球をプライミングする少なくとも一つの成分を含めることが望ましい場合がある。脂質は、ＣＴＬをインビボでプライミングし得る薬剤として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のε−アミノ基及びα−アミノ基に結合され得、ついで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどのような一又は複数の連結残基を介して免疫原性ペプチドに連結され得る。ついで、脂質化ペプチドは、ミセル又は粒子で直接的に投与され得るか、リポソームに組み込まれ得るか、又は例えば不完全フロイントアジュバントのようなアジュバント中で乳化され得るかの何れかで投与され得る。好ましい実施態様では、特に有効な免疫原性組成物は、Ｌｙｓのε−アミノ基及びα−アミノ基に結合されたパルミチン酸を含み、これは、免疫原性ペプチドのアミノ末端に、例えばＳｅｒ−Ｓｅｒのような連結を介して結合される。
ＣＴＬ応答の脂質プライミングの他の例として、大腸菌リポタンパク質、例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）が、適切なペプチドに共有結合される場合、ウイルス特異的ＣＴＬをプライミングするために使用され得る（例えば、Deresら, Nature 342:561, 1989を参照）。本発明のペプチドは、例えば、Ｐ３ＣＳＳに結合され得、リポペプチドは、標的抗原に対する免疫応答を特異的にプライミングするために個体に投与され得る。更に、中和抗体の導入がまたＰ３ＣＳＳ結合エピトープを用いてプライミングされ得るので、２つのこのような組成物は、体液性及び細胞媒介応答の両方をより効率的に惹起するように組み合わせることができる。
【０１５２】
Ｘ．Ｃ．４．ＣＴＬ及び／又はＨＴＬペプチドでパルスされたＤＣを含むワクチン組成物
本発明に係るワクチン組成物の実施態様は、患者血液由来のＰＢＭＣ、又はそれら由来の単離されたＤＣに対する、エピトープ保有ペプチドのカクテルのエキソビボ投与を含む。ＤＣの収集を容易にする医薬、例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ（Pharmacia-Monsanto, St. Louis, MO）又はＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４が使用され得る。ＤＣをペプチドでパルスした後、患者に再注入する前に、未結合ペプチドを除去するためにＤＣを洗浄する。この実施態様では、ワクチンは、それらの表面にＨＬＡ分子を複合体化したパルスされたペプチドエピトープを提示するペプチドパルス化ＤＣを含む。
ＤＣは、ペプチドのカクテルを用いてエキソビボでパルスされ得、これらのうちの幾つかは、ＳＴＥＡＰ−１に対するＣＴＬ応答を刺激する。場合によっては、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）ペプチド、例えば天然又は人工の緩い拘束性ＨＬＡクラスＩＩペプチドが、ＣＴＬ応答を促進するために含められ得る。よって、本発明に係るワクチンは、ＳＴＥＡＰ−１を発現するか又は過剰発現する癌を治療するために使用される。
【０１５３】
Ｘ．Ｄ．養子免疫療法
抗原性ＳＴＥＡＰ−１関連ペプチドは、エキソビボでＣＴＬ及び／又はＨＴＬ応答もまた惹起するために使用される。得られるＣＴＬ又はＨＴＬ細胞は、他の一般的な形式の治療に応答しないか、又は本発明に係る治療ワクチンペプチド又は核酸に応答しない患者の腫瘍を治療するために使用され得る。特定の抗原に対するエキソビボＣＴＬ又はＨＴＬ応答は、組織培養物中において、患者の又は遺伝的に適合性のＣＴＬ又はＨＴＬ前駆細胞を、例えば樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）の供給源及び適切な免疫原性ペプチドと共にインキュベートすることによって誘導される。前駆細胞が活性化され、効果細胞に増殖する適切なインキュベーション時間（典型的には約７〜２８日）後に、細胞は、患者に注入して戻され、そこで、それらは、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を破壊する（ＣＴＬ）か、又は破壊を促進する（ＨＴＬ）。トランスフェクトされた樹状細胞はまた抗原提示細胞として使用され得る。
【０１５４】
Ｘ．Ｅ．治療又は予防目的のためのワクチンの投与
本発明の薬学的及びワクチン組成物は、典型的にはＳＴＥＡＰ−１を発現するか又は過剰発現する癌を治療及び／又は予防するために使用される。治療用途では、ペプチド及び／又は核酸組成物は、抗原に対して有効なＢ細胞応答、ＣＴＬ及び／又はＨＴＬ応答を誘発し、症状及び／又は合併症を治癒するかあるいは少なくとも部分的に停止又は遅延させるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効用量」として定義される。この使用のための有効量は、例えば、投与される特定の組成物、投与方法、処置される疾患の病期及び重篤度、患者の体重及び全身健康状態、並びに処方する医師の判断に依存する。
薬学的組成物について、本発明の免疫原性ペプチド、又はそれらをコードするＤＮＡは、一般的に、ＳＴＥＡＰ−１を発現する腫瘍を既に有する個体に投与される。ペプチド又はそれらをコードするＤＮＡは、個々に、又は一又は複数のペプチド配列の融合物として投与され得る。患者は、必要に応じて、別個に又は例えば外科手術のような他の治療と共に、免疫原性ペプチドを用いて処置され得る。
治療的使用のために、投与は、一般的に、ＳＴＥＡＰ−１関連癌の最初の診断時に開始すべきである。これは、少なくとも症状が実質的に停止するまで、またその後の一定期間の間、用量をブーストすることによって続けられる。患者に送達されるワクチン組成物の実施態様（すなわち、限定されないが、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニ遺伝子、又はＴＡＡ特異的ＣＴＬ又はパルスされた樹状細胞のような実施態様を含む）は、疾患の病期又は患者の健康状態に従って、変化し得る。例えば、ＳＴＥＡＰ−１を発現する腫瘍を有する患者では、ＳＴＥＡＰ−１特異的ＣＴＬを含むワクチンは、代替の実施態様よりも進行した疾患を有する患者において腫瘍細胞を殺す際に、より有効であり得る。
【０１５５】
細胞傷害性Ｔ細胞応答を効率的に刺激するのに十分な投与様式によって送達されるペプチドエピトープの量を提供することが一般的に重要である；ヘルパーＴ細胞応答を刺激する組成物はまた本発明のこの実施態様に従って与えられ得る。
最初の治療的免疫化のための投薬量は、一般的に、下限値が約１、５、５０、５００、又は１，０００μｇであり、かつ上限値が約１００００；２００００；３００００；又は５００００μｇである単位用量範囲にある。ヒトのための投薬量値は、典型的には、７０ｋｇの患者当たり、約５００μｇから約５０，０００μｇの範囲である。数週間から数ヶ月にわたるブーストレジメンに従って、約１．０μｇから約５００００μｇの間のブースト投薬量のペプチドが、患者の血液から得られたＣＴＬ及びＨＴＬの比活性を測定することによって決定される患者の応答及び状態に依存して投与され得る。投与は、少なくとも臨床的症状又は実験室の試験によって、新生物形成が排除されるか又は減少することを示すまで、またその後の一定期間続けられるべきである。投薬量、投与の経路、及び用量スケジュールは、当該分野で知られている方法論に従って調整される。
ある実施態様では、本発明のペプチド及び組成物は、重篤な疾患状態、すなわち、生命を脅かすか又は潜在的に生命を脅かす状態で使用される。そのような場合、本発明の好ましい組成物では、外来性物質が最小量でありペプチドが比較的非毒性の性質である結果、これらの述べられた投薬量と比較して大幅に過剰のこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、また治療する医師によって望ましいと感じられうる。
【０１５６】
本発明のワクチン組成物はまた純粋に予防薬剤として使用され得る。一般的に、初回の予防免疫のための投薬量は、一般に、低い値が約１、５、５０、５００又は１０００μｇであり高い値が約１００００；２００００；３００００；又は５００００μｇである単位投薬量範囲である。ヒトのための投薬量の値は、典型的には７０ｋｇの患者当たりで約５００μｇから約５００００μｇの範囲である。これに続いて、初回のワクチン投与から約４週間後から６ヵ月後の定まった間隔で、約１．０μｇから約５００００μｇの間のペプチドのブースト投薬量が投与される。ワクチンの免疫原性は、患者の血液試料から得られるＣＴＬ及びＨＴＬの比活性を測定することによって評価され得る。
治療的処置のための薬学的組成物は、非経口、局所的(topical)、経口、経鼻、クモ膜下腔内、又は局部的(local)投与（例えば、クリーム又は局所的軟膏として）のために意図される。好ましくは、この薬学的組成物は、非経口的（例えば、静脈内、皮下的、皮内、又は筋内）に投与される。従って、本発明は、受容可能な担体、好ましくは水性担体中に溶解又は懸濁された免疫原性ペプチドの溶液を含む、非経口投与のための組成物を提供する。
様々な水性担体、例えば、水、緩衝化水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等を使用することができる。これらの組成物は、従来からのよく知られている滅菌技術によって滅菌され得るか、又は濾過滅菌され得る。得られた水溶液は、使用のためにその状態のままでパッケージされるか、又は凍結乾燥され得、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と合わせられる。
【０１５７】
組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に受容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝化剤、張度調整剤、湿潤剤、防腐剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含み得る。
医薬製剤中の本発明のペプチドの濃度は、広範に変わり得、すなわち、重量で、約０．１％未満から、通常は、約２％であるかもしくは少なくとも約２％から、２０％〜５０％ほど多くまで、又はそれより多くまで変動し得、選択された特定の投与様式に従って、主に流体容量、粘度などにより選択される。
組成物のヒト単位用量形態は、典型的には、ヒト単位用量の受容可能な担体（一実施態様では水性担体）を含む薬学的組成物中に含められ、ヒトへのこのような組成物の投与のために使用されることが当業者に知られている容量／量で投与される（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17版, A. Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1985を参照）。例えば、初回免疫のためのペプチド用量は、７０ｋｇの患者について、約１〜約５００００μｇ、一般的には１００〜５０００μｇであり得る。例えば、核酸については、初回免疫は、裸の核酸の形態で発現ベクターを使用して実施され得、複数の部位に０．５〜５ｍｇの量でＩＭ（又はＳＣもしくはＩＤ）投与され得る。核酸（０．１〜１０００μｇ）もまた遺伝子銃を使用して投与され得る。３〜４週間のインキュベーション期間後に、ついで、ブースター用量が投与される。ブースターは、５×１０７〜５×１０９ｐｆｕの用量で投与される組換え鶏痘ウイルスであり得る。
【０１５８】
抗体について、処置は一般に静脈内注射（ＩＶ）のような受容可能な投与経路を介して、典型的には約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体調製物を反復投与することを含む。一般には、１週間あたり１０〜５００ｍｇ ＭＡｂの範囲の用量が有効であり、十分に許容される。更に、抗ＳＴＥＡＰ−１ ＭＡｂ調製物を、ＩＶで約４ｍｇ／ｋｇ患者体重の初回負荷用量で与え、ついで毎週、ＩＶで約２ｍｇ／ｋｇの用量を与えることは、受容可能な投薬レジメンを表す。当業者に理解されるように、様々な要因が、特定の場合における理想的な用量に影響を及ぼし得る。このような要因としては、例えば、組成物の半減期、Ａｂの結合親和性、物質の免疫原性、患者におけるＳＴＥＡＰ−１の発現程度、循環している放出ＳＴＥＡＰ−１抗原の程度、所望される定常状態の濃度レベル、処置の頻度、及び本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法剤又は他の薬剤の影響、並びに特定の患者の健康状態が挙げられる。非限定的な好ましいヒト単位用量は、例えば５００μｇ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜５０ｍｇ、５０ｍｇ〜１００ｍｇ、１００ｍｇ〜２００ｍｇ、２００ｍｇ〜３００ｍｇ、４００ｍｇ〜５００ｍｇ、５００ｍｇ〜６００ｍｇ、６００ｍｇ〜７００ｍｇ、７００ｍｇ〜８００ｍｇ、８００ｍｇ〜９００ｍｇ、９００ｍｇ〜１ｇ又は１ｍｇ〜７００ｍｇである。ある実施態様では、用量は、２〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にあり、例えば、１〜３ｍｇ／ｋｇ体重の週間用量で続けるもの；０．５ｍｇ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｇ／ｋｇ体重で、例えば、週間用量によって２、３又は４週間続けるもの；０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重で、例えば、週間用量によって２、３又は４週間続けるもの；毎週２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００ｍｇ ｍ２体面積；毎週１〜６００ｍｇ ｍ２体面積；毎週２２５〜４００ｍｇ ｍ２体面積；これらの用量は２、３、４、５、６、７、８、９、１９、１１、１２週かそれ以上の週、週間用量で続けられ得る。
【０１５９】
一実施態様では、ポリヌクレオチドのヒト単位投薬形態は、任意の治療的効果を与える適切な投薬量範囲又は有効量を含む。当業者に理解されるように、治療的効果は、ポリヌクレオチドの配列、ポリヌクレオチドの分子量、及び投与経路を含む多数の要因に依存する。投薬量は、一般的に、症状の重篤度、患者の病歴などのような、当該分野で知られている様々なパラメーターに従って、医師又は他の医療専門家により選択される。一般的には、約２０塩基のポリヌクレオチドについて、投薬量範囲は、例えば、約０．１、０．２５、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００又は５００ｍｇ／ｋｇのような独立して選択される下限から、その下限よりも大きな約６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００又は１００００ｍｇ／ｋｇの独立して選択される上限までの中から選択され得る。例えば、用量は、以下のほぼ何れかであり得る：０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜５００ｍｇ／ｋｇ、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５００〜５０００ｍｇ／ｋｇ、又は５００〜１００００ｍｇ／ｋｇ。一般的に、非経口的な投与経路は、増加する長さのポリヌクレオチドの場合のように、疾患組織に対するより直接的な適用と比較して、より多い用量のポリヌクレオチドを必要としうる。
【０１６０】
一実施態様では、Ｔ細胞のヒト単位投薬形態は、任意の治療的効果を与える適切な投薬量範囲又は有効量を含む。当業者に理解されるように、治療的効果は、多数の要因に依存する。投薬量は、一般的に、症状の重篤度、患者の病歴などのような当該分野で知られている様々なパラメーターに従って、医師又は他の医療専門家により選択される。用量は、約１０４細胞〜約１０６細胞、約１０６細胞〜約１０８細胞、約１０８細胞〜約１０１１細胞、又は約１０８細胞〜約５×１０１０細胞であり得る。用量はまた約１０６細胞／ｍ２〜約１０１０細胞／ｍ２、又は約１０６細胞／ｍ２〜約１０８細胞／ｍ２であり得る。
本発明のタンパク質及び／又はそのタンパク質をコードする核酸はまたリポソームを介して投与され得、それらはまた１）リンパ系組織のような特定組織へのタンパク質の標的化；２）疾患細胞に対する選択的な標的化；又は、３）ペプチド組成物の半減期の増加に役立ちうる。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散体、ラメラ層などが含まれる。これらの調製物において、送達されるペプチドは、単独であるいはリンパ系細胞に分散しているレセプターに結合する分子、例えばＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体と組み合わせて又は他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と組み合わせて、リポソームの一部として取り込まれる。よって、本発明の所望のペプチドを充填しているか又は施されているかの何れかのリポソームは、リンパ系細胞の部位に向けられ、そこで、リポソームがついでペプチド組成物を送達する。本発明に従って使用するためのリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、これは一般的に中性及び負に荷電したリン脂質及びステロール、例えばコレステロールを含む。脂質の選択は、一般的に、例えばリポソームサイズ、酸不安定性及び血流中でのリポソームの安定性を考慮して導かれる。リポソームを調製するためには、例えば、Szokaら, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980)、及び米国特許第４２３５８７１号、同第４５０１７２８号、同第４８３７０２８号、及び同第５０１９３６９号に記載されているように、様々な方法が利用可能である。
【０１６１】
免疫系の細胞を標的化するために、リポソームに取り込まれるべきリガンドとしては、例えば、所望される免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体又はその断片が挙げられ得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、静脈内、局部的、局所的等、とりわけ投与様式、送達されるペプチド、及び処置される疾患の病期に従って変動する用量で、投与され得る。
固形組成物の場合、一般的な非毒性の固形担体を使用することができ、これには、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。経口投与の場合、薬学的に受容可能な非毒性の組成物は、任意の通常使用される賦形剤、例えば先に列挙された担体などと、一般的に１０〜９５％の活性成分、つまり、本発明の一又は複数のペプチドを、より好ましくは２５％〜７５％の濃度で導入することによって、形成される。
エアロゾル投与の場合、免疫原性ペプチドは、好ましくは、界面活性剤及び噴霧剤と共に細かく分割された形態で供給される。ペプチドの典型的な割合は、約０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは、約１％〜１０％である。当然ながら、界面活性剤は非毒性でなければならず、好ましくは、噴霧剤に可溶性でなければならない。このような薬剤の代表例は、脂肪族多価アルコール又はその環状無水物との、約６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック(olesteric)酸、及びオレイン酸のエステル及び部分エステルである。混合エステル、例えば混合グリセリド又は天然のグリセリドが使用され得る。界面活性剤は、その組成物の約０．１重量％〜２０重量％、好ましくは、約０．２５〜５％を構成し得る。組成物の残りは通常、噴霧剤である。担体もまた例えば鼻腔内送達のためのレシチンの場合のように、所望に応じて含まれ得る。
【０１６２】
ＸＩ．）ＳＴＥＡＰ−１の診断及び予後実施態様
ここで開示されるように、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド、ポリペプチド、反応性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、反応性ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）及び抗ポリペプチド抗体は、癌のような調節不全性の細胞増殖と関連した状態、特に、表Ｉに列挙された癌（例えば、その組織発現の特異的パターン並びに例えば「正常組織、及び患者標本におけるＳＴＥＡＰ−１の発現分析」と表題を付けられた実施例に記載されているある種の癌におけるその過剰発現の両方を参照）を検査するよく知られている診断的アッセイ、予後的アッセイ、及び治療的アッセイにおいて使用される。
ＳＴＥＡＰ−１は、前立腺関連抗原であるＰＳＡに類似し得、ＰＳＡは、前立腺癌の存在を同定及びモニターするために数年間にわたり医療従事者により使用されてきた原型マーカーである（例えば、Merrillら, J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000)；Polascikら, J. Urol. Aug; 162(2):293-306 (1999)及びFortierら, J. Nat. Cancer Inst. 91(19): 1635- 1640 (1999)を参照）。ｐ５３及びＫ−ｒａｓを含む様々な他の診断マーカーもまた同様の状況下で使用される（例えば、Tulchinskyら, Int J Mol Med 1999 Jul 4(1):99-102及びMinimotoら, Cancer Detect Prev 2000; 24(1):1-12を参照）。従って、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド及びＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド（並びにこれらの分子の存在を同定するために使用されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドプローブ及び抗ＳＴＥＡＰ−１抗体）並びにそれらの特性に関するこの開示により、当業者は、例えば、癌に関連した状態を検査することに対する様々な診断アッセイにおいて使用される方法と類似した方法においてこれらの分子を利用することが可能となる。
【０１６３】
ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド、ポリペプチド、反応性Ｔ細胞及び抗体を利用する診断方法の典型的な実施態様は、例えばＰＳＡポリヌクレオチド、ポリペプチド、反応性Ｔ細胞及び抗体を用いる十分に確立された診断アッセイからの方法と類似する。例えば、ＰＳＡ過剰発現又は前立腺癌転移をモニターする方法において、ＰＳＡ ｍＲＮＡの存在及び／又はレベルを観察するために、ＰＳＡポリヌクレオチドを、プローブ（例えばノーザン分析では、例えば、Shariefら, Biochem. Mol. Biol. lnt. 33 (3):567-74(1994)を参照）及びプライマー（例えば、ＰＣＲ分析では、例えば、Okegawaら, J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)を参照）として使用するように、ここで記載されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ−１過剰発現又はこの遺伝子を発現する前立腺癌及び他の癌の転移を検出するために同じ様式で利用され得る。あるいは、ＰＳＡポリペプチドを使用してＰＳＡに特異的な抗体を生成し、ついで、該抗体を、ＰＳＡタンパク質の過剰発現（例えば、Stephanら, Urology 55 (4):560-3 (2000)を参照）又は前立腺細胞の転移（例えば、Alanenら, Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)を参照）をモニターする方法においてＰＳＡタンパク質の存在及び／又はレベルを観察するために使用し得るように、ここに記載されるＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドは、ＳＴＥＡＰ−１の過剰発現又はこの遺伝子を発現する前立腺細胞及び他の癌細胞の転移を検出する際に使用するための抗体を生成するために使用され得る。
特に、転移は、元々の器官（例えば肺又は前立腺等）から身体の異なる領域（例えばリンパ節）への癌細胞の移動を含むので、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを発現する細胞の存在について生物学的試料を検査するアッセイが、転移の証拠を提供するために使用され得る。例えば、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞を通常含まない組織（リンパ節）由来の生物学的試料が、それぞれリンパ節及び骨の転移から単離された異種移植片のＬＡＰＣ４及びＬＡＰＣ９に見られるＳＴＥＡＰ−１発現のような、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞を含むことが見出さる場合、この発見は転移を示す。
【０１６４】
あるいは、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、例えば、通常ＳＴＥＡＰ−１を発現しないか又は異なるレベルでＳＴＥＡＰ−１を発現する生物学的試料中の細胞が、ＳＴＥＡＰ−１を発現するか又はＳＴＥＡＰ−１の増加した発現を有することが見出された場合（例えば、表Ｉに列挙された癌及び添付の図面に示される患者試料などにおけるＳＴＥＡＰ−１の発現を参照）、癌の証拠を提供するために使用され得る。このようなアッセイにおいて、当業者は、（ＳＴＥＡＰ−１に加えて）第二の組織制限マーカー、例えばＰＳＡ、ＰＳＣＡなどの存在について生物学的試料を試験することによって、転移の補足的な証拠を生み出すことを更に所望し得る（例えば、Alanenら, Pathol. Res. Pract. 192 (3): 237 (1996)を参照）。
組織切片内のＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの存在を同定するための免疫組織化学の使用はその組織内のある細胞の改変状態を示しうる。癌細胞において発現されるポリペプチドに局在化する抗体の能力は疾患の存在、疾患段階、進行及び／又は腫瘍攻撃性の診断方法であることは当該分野ではよく知られている。そのような抗体は、対応する非悪性腫瘍組織と比較して、癌細胞内でのポリペプチドの改変された分布をまた検出することができる。
ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド及び免疫原性組成物はまた疾患状態における改変された細胞内タンパク質局在化の現象に鑑みて有用である。正常状態から疾患状態への細胞の変化は細胞形態の変化を引き起こし、細胞内タンパク質局在化／分布の変化にしばしば関連している。例えば、正常細胞において極性化した形で発現される細胞膜タンパク質は疾患において改変され得、全細胞表面にわたって非極性的なタンパク質の分布を生じる。
【０１６５】
疾患状態における改変された細胞内タンパク質局在化の現象は免疫組織化学的手段の使用によってＭＵＣ１及びＨｅｒ２タンパク質の発現で証明された。正常な上皮細胞は、糖タンパク質の幾らかの核上局在化に加えて、ＭＵＣ１の典型的な尖端分布を有している一方、悪性腫瘍病巣はしばしば非極性染色パターンを証明している（Diazら, The Breast Journal, 7; 40-45 (2001)；Zhangら, Clinical Cancer Research, 4; 2669-2676 (1998)：Caoら, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45:1547-1557 (1997)）。また、正常な乳房上皮はＨｅｒ２タンパク質に対して陰性か又は基底面分布のみを示す一方、悪性腫瘍細胞は全細胞表面にわたってタンパク質を発現しうる（De Potterら, International Journal of Cancer, 44; 969-974 (1989)：McCormickら, 117; 935-943 (2002)）。あるいは、タンパク質の分布は表面のみの分布から疾患状態での散在性細胞質発現を含むまで改変されうる（Diazら, The Breast Journal, 7: 40-45 (2001)）。
免疫組織化学的方法によって検出される細胞内のタンパク質の局在化／分布の改変はまたある種の治療モダリティの好適性に関して貴重な情報を提供する。この最後の点は、タンパク質が正常組織中で細胞内性でありうるが悪性腫瘍細胞では細胞表面である状況によって例証され；細胞表面の位置は抗体ベースの診断及び治療レジメンに細胞を好ましく適したものにする。そのようなタンパク質局在化がＳＴＥＡＰ−１に対して生じる場合、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質及びそれに関連した免疫応答が非常に有用である。従って、２４Ｐ４Ｃ１２に対して細胞内タンパク質局在化の改変が生じたかどうかを決定する能力はＳＴＥＡＰ−１タンパク質及びそれに関連した免疫応答を非常に有用なものにする。ＳＴＥＡＰ−１組成物の使用は当業者が重要な診断的及び治療的決定をするのを可能にする。
ＳＴＥＡＰ−１に特異的な免疫組織化学試薬は、ＳＴＥＡＰ−１が通常は産生されない組織にポリペプチドが現れる場合に、ＳＴＥＡＰ−１を発現する腫瘍の転移物を検出するのにもまた有用である。
よって、ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド及びそれに対する免疫応答から生じる抗体は、当業者に知られている診断、予後、予防及び／又は治療目的のような様々な重要な内容で有用である。
【０１６６】
ＰＳＡポリヌクレオチド断片及びＰＳＡポリヌクレオチド変異体が、ＰＳＡをモニターする方法における使用のために当業者によって利用されるように、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド断片及びＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレチド変異体は類似の様式で使用される。特に、ＰＳＡをモニターする方法において使用される典型的なＰＳＡポリヌクレオチドは、ＰＳＡ ｃＤＮＡ配列の断片から構成されるプローブ又はプライマーである。これを例証すると、ＰＳＡポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために使用されるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応において機能するように、全ＰＳＡ配列よりも短い配列を含まなくてはならない。このようなＰＣＲ反応の場合、当業者は、一般に、対象のポリヌクレオチドの異なる部分を増幅するために又は増幅反応を最適化するためにプライマーとして使用され得る様々な異なるポリヌクレオチド断片を作製する（例えば、Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25 (3): 472-476, 478-480 (1998)；Robertsonら, Methods Mol. Biol. 98: 121-154 (1998)を参照）。このような断片の使用の更なる例示は、「正常組織、及び患者被験体標本におけるＳＴＥＡＰ−１の発現分析」と表題を付けられた実施例に提供され、ここで、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド断片は、癌細胞におけるＳＴＥＡＰ−１ ＲＮＡの発現を示すためのプローブとして使用される。また、変異体ポリヌクレオチド配列は、典型的には、ＰＣＲ分析及びノーザン分析において、対応するｍＲＮＡについてのプライマー及びプローブとして使用される（例えば、Sawaiら, Fetal Diagn. Ther. 1996 Nov-Dec 11 (6):407-13及びCurrent Protocols In Molecular Biology, Volume 2, Unit 2, Frederick M. Ausubelら編, 1995)を参照）。ポリヌクレオチド断片及び変異体は、それらが、高ストリンジェンシー条件下で、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、図２に示されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド又はその変異体）に結合し得る場合に有用である。
【０１６７】
更に、抗体によって認識され得るエピトープを含むＰＳＡポリペプチド又はそのエピトープに特異的に結合するＴ細胞が、ＰＳＡをモニターする方法において使用される。ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド断片及びポリペプチドアナログ又は変異体もまた同様の様式で使用され得る。ポリペプチド断片又はポリペプチド変異体を使用して抗体（例えば、抗ＰＳＡ抗体又はＴ細胞）を産生するこの実施は、開業医によって使用されている融合タンパク質のような広範な様々な系と共に当該分野の技術において典型的である（例えば、Current Protocols In Molecular Biology, Volume 2, Unit 16, Frederick M. Ausubelら編, 1995を参照）。この場合、各エピトープは、抗体又はＴ細胞と反応性である構造体を提供するように機能する。典型的には、当業者は、対象のポリペプチドの異なる部分に特異的な免疫応答を生じさせるために使用され得る様々な異なるポリペプチド断片を生成する（例えば、米国特許第５８４０５０１号及び米国特許第５９３９５３３号を参照）。例えば、ここで検討されるＳＴＥＡＰ−１の生物学的モチーフ又は当該分野で利用可能なモチーフに基づいて当業者により容易に同定されるモチーフ保有部分配列を含むポリペプチドを利用することが好適であり得る。ポリペプチド断片、変異体又はアナログは、典型的には、これらが標的ポリペプチド配列（例えば、図３に示されるＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド）に特異的な抗体又はＴ細胞を生成し得るエピトープを含む限りにおいて、この場合に有用である。
【０１６８】
ここに示されるように、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド及びポリペプチド（並びに、これらの分子の存在を同定するために使用されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドプローブ及び抗ＳＴＥＡＰ−１抗体又はＴ細胞）は、表Ｉに列挙されたもののような癌の診断においてそれらを有用なものとする特異的特性を示す。前立腺癌のような、ここに記載の疾患状態の存在又は発症を評価するために、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の存在を測定する診断アッセイは、ＰＳＡを用いて非常に首尾よく行われているように、予防的な測定又は更なるモニタリングのための患者を同定するために使用される。更に、これらの物質は、例えば、前立腺起源の転移の明確な診断がＰＳＡのみについての試験に基づいてなすことはできず（例えば、Alanenら, Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)を参照）、その結果、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド及びポリペプチド（並びにこれらの分子の存在を同定するために使用されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドプローブ及び抗ＳＴＥＡＰ−１抗体）のような物質が、前立腺起源の転移を確認するために使用されることが必要である場合、ＰＳＡに対して類似した特徴又は補足的な特徴を有する分子についての当該分野での必要性を満たす。
【０１６９】
最後に、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、ここに開示されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子がマッピングされる染色体領域（以下の「ＳＴＥＡＰ−１の染色体マッピング」と題された実施例を参照）における発癌遺伝子関連染色体異常の同定におけるそれらの使用のような多くの他の用途を有する。更に、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、ここに開示されるＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質及びポリヌクレオチドは、未知の由来の組織の法医学的分析におけるそれらの使用のような他の有用性を有する（例えば、Takahama K Forensic Sci Int 1996 Jun 28;80 (1-2): 63-9）を参照）。
また、本発明のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質又はポリヌクレオチドを使用して、ＳＴＥＡＰ−１の過剰発現により特徴付けられる病理学的状態を治療し得る。例えば、図２もしくは図３のアミノ酸配列もしくは核酸配列、又は何れかの断片を使用して、ＳＴＥＡＰ−１抗原に対する免疫応答を生じさせうる。ＳＴＥＡＰ−１と反応する抗体又は他の分子を使用して、この分子の機能を調節し得、それにより治療的恩恵を提供しうる。
【０１７０】
ＸＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１タンパク質機能の阻害
本発明は、ＳＴＥＡＰ−１のその結合パートナーへの結合を阻害するため又は他のタンパク質とのその結合を阻害するための様々な方法及び組成物並びにＳＴＥＡＰ−１機能を阻害するための方法を含む。
【０１７１】
ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体でのＳＴＥＡＰ−１の阻害
一アプローチにおいて、ＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞へと遺伝子移入技術を介して導入される。従って、そのコードされた単鎖抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は細胞内で発現され、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に結合し、それによりその機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法はよく知られている。「細胞内抗体(intrabody)」としても知られているこのような細胞内抗体は、その細胞内の特定の区画に特異的に標的化され、その処置の阻害活性が焦点をあわせられる場所に対する制御をもたらす。この技術は、当該分野で成功裏に適用されている（概説としては、Richardson及びMarasco, 1995, TIBTECH vol.13を参照）。細胞内抗体は、他の豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている（例えば、Richardsonら, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141；Beerliら, 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936；Deshaneら, 1994, Gene Ther.1: 332-337を参照）。
【０１７２】
単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドにより連結された重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含み、単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体は、その軽鎖定常領域に連結された単鎖可変領域断片として発現される。よく知られている細胞内輸送シグナルが、細胞内抗体を所望の細胞内区画に対して正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えポリヌクレオチドベクター中に操作される。例えば、小胞体（ＥＲ）に標的化された細胞内抗体は、リーダーペプチドを組み込むように、また必要に応じて、Ｃ末端ＥＲ保持シグナル、例えばＫＤＥＬアミノ酸モチーフを組み込むように、操作される。核において活性を発揮することが意図される細胞内抗体は、核局在化シグナルを含むように操作される。脂質部分が、形質膜の細胞質ゾル側に細胞内抗体をつなぐために、その細胞内抗体に連結される。細胞内抗体はまた細胞質ゾルにおいて機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質ゾル細胞内抗体を使用して、細胞質ゾル内に因子を隔離し、それによりそれらの因子がその天然での細胞中の目的場所に輸送されることを防止する。
【０１７３】
一実施態様では、細胞内抗体を使用して、核内のＳＴＥＡＰ−１を捕捉し、それにより核内でその活性を妨げる。核標的化シグナルが、所望の標的化を達成するために、このようなＳＴＥＡＰ−１細胞内抗体中に操作される。このようなＳＴＥＡＰ−１細胞内抗体は、特定のＳＴＥＡＰ−１ドメインに特異的に結合するように設計される。他の実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に特異的に結合する細胞質ゾル細胞内抗体を使用して、ＳＴＥＡＰ−１が核に近づくことを妨げ、それにより、それが核内において何らかの生物学的活性を発揮することを妨げる（例えば、ＳＴＥＡＰ−１が他の因子と転写複合体を形成するのを妨げる）。
このような細胞内抗体の発現を特定の細胞に特異的に向けるために、その細胞内抗体の転写は、適切な腫瘍特異的プロモーター及び／又はエンハンサーの調節制御下に配される。細胞内抗体の発現を前立腺に特異的に標的化するために、例えば、ＰＳＡプロモーター及び／又はプロモーター／エンハンサーが利用され得る（例えば、１９９９年７月６日に発行の米国特許第５９１９６５２号を参照）。
【０１７４】
ＸＩＩ．Ｂ．）組換えタンパク質でのＳＴＥＡＰ−１の阻害
他のアプローチにおいて、組換え分子は、ＳＴＥＡＰ−１に結合し、それによりＳＴＥＡＰ−１の機能を妨げる。例えば、このような組換え分子は、ＳＴＥＡＰ−１が、その結合パートナーに接近／結合すること、又は他のタンパク質に結合することを防止又は阻害する。このような組換え分子は、例えば、ＳＴＥＡＰ−１特異的抗体分子の反応性部分を含み得る。特定の実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１結合パートナーのＳＴＥＡＰ−１結合ドメインは、二量体融合タンパク質へと操作され、これによって融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結された２つのＳＴＥＡＰ−１リガンド結合ドメインを含む。このようなＩｇＧ部分は、例えば、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとヒンジ領域を含み得るが、ＣＨ１ドメインは含まない。このような二量体融合タンパク質は、ＳＴＥＡＰ−１の発現と関連する癌に罹患している患者に可溶性型で投与され、それにより二量体融合タンパク質はＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合し、ＳＴＥＡＰ−１の結合パートナーとの相互作用をブロックする。このような二量体融合タンパク質は更に既知の抗体連結技術を使用して多量体タンパク質へと組み合わされる。
【０１７５】
ＸＩＩ．Ｃ．）ＳＴＥＡＰ−１の転写又は翻訳の阻害
本発明はまたＳＴＥＡＰ−１遺伝子の転写を阻害するための様々な方法及び組成物を含む。同様に、本発明はまたＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するための方法及び組成物を提供する。
一アプローチにおいて、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の転写を阻害する方法は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子をＳＴＥＡＰ−１アンチセンスポリヌクレオチドと接触させることを含む。他のアプローチでは、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡをアンチセンスポリヌクレオチドと接触させることを含む。他のアプローチでは、ＳＴＥＡＰ−１特異的リボザイムが、ＳＴＥＡＰ−１メッセージを切断し、それにより翻訳を阻害するために使用される。このようなアンチセンスに基づく方法及びリボザイムに基づく方法はまたＳＴＥＡＰ−１遺伝子の調節領域、例えばＳＴＥＡＰ−１プロモーターエレメント及び／又はエンハンサーエレメントに向けることができる。同様に、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子転写因子を阻害し得るタンパク質が、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの転写を阻害するために使用される。上述の方法において有用な様々なポリヌクレオチド及び組成物が上に記載されている。転写及び翻訳を阻害するためのアンチセンス分子及びリボザイム分子の使用は当該分野でよく知られている。
ＳＴＥＡＰ−１の転写活性化を妨害することによりＳＴＥＡＰ−１の転写を阻害する他の因子もまたＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を処置するために有用である。同様に、ＳＴＥＡＰ−１のプロセシングに干渉する因子は、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を処置するために有用である。このような因子を利用する癌の処置方法もまた本発明の範囲内である。
【０１７６】
ＸＩＩ．Ｄ．）治療ストラテジーに対する一般的考慮
遺伝子移入及び遺伝子治療の技術が、ＳＴＥＡＰ−１を合成している腫瘍細胞に治療用ポリヌクレオチド分子（すなわち、アンチセンス、リボザイム、細胞内抗体をコードするポリヌクレオチド、及び他のＳＴＥＡＰ−１阻害分子）を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが当該分野で知られている。ＳＴＥＡＰ−１アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＳＴＥＡＰ−１の転写に干渉し得る因子などをコードする組換えベクターが、このような遺伝子治療アプローチを使用して標的腫瘍細胞に送達され得る。
上の治療的アプローチは、広範な様々な外科的、化学療法的又は放射線療法レジメンの何れか一つと組み合わされ得る。本発明の治療的アプローチは、全患者に対し、また特に、化学療法剤の毒性に十分に耐性がない患者に対して利点となる、化学療法（又は他の療法）の減少した投薬量の使用及び／又は低頻度の投与の使用を可能にし得る。
特定の組成物（例えば、アンチセンス、リボザイム、細胞内抗体）、又はこのような組成物の組合せの抗腫瘍活性は、様々なインビトロ及びインビボアッセイ系を使用して評価され得る。治療的活性を評価するインビトロアッセイには、細胞増殖アッセイ、軟寒天アッセイ及び腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、治療組成物が結合パートナーへのＳＴＥＡＰ−１の結合を阻害する度合いを決定し得る結合アッセイなどが含まれる。
【０１７７】
インビボでは、ＳＴＥＡＰ−１治療用組成物の効果は適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、ヒト前立腺癌の外植片又は継代された異種移植片組織が、免疫無防備状態の動物、例えばヌード又はＳＣＩＤマウスに導入されている異種間前立腺癌モデルが使用され得る（Kleinら, 1997, Nature Medicine 3: 402-408）。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１６６２８及び米国特許第６１０７５４０号は、原発性腫瘍の発生、微小転移、及び疾患の後期段階に特徴的な骨芽細胞転移の形成を反復し得るヒト前立腺癌の様々な異種移植片モデルを記載している。効力は、腫瘍形成の阻害、腫瘍後退又は転移などを測定するアッセイを使用して予測され得る。
アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイが治療用組成物の評価において有用である。一実施態様では、治療用組成物で処置された腫瘍保有マウス由来の異種移植片は、アポトーシス性病巣の存在について試験され得、未処置のコントロール異種移殖片保有マウスと比較され得る。アポトーシス性病巣が処置マウスの腫瘍に見出される度合いが、組成物の治療的効力の指標を提供する。
前述の方法の実施に使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適切な担体を含有する薬学的組成物に製剤化され得る。適切な担体には、治療用組成物と組み合わされる場合に、その治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、患者の免疫系と一般に無反応性である任意の物質が含まれる。例には、限定されないが、任意の多数の標準的な薬学的担体、例えば、滅菌リン酸緩衝生理食塩水溶液、静菌水などが含まれる（一般には、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, A. Osal.編 1980を参照）。
【０１７８】
治療用製剤は、可溶化され、腫瘍部位に治療用組成物を送達し得る任意の経路を介して投与され得る。潜在的に効果的な投与経路には、限定されないが、静脈内、非経口、腹腔内、筋内、腫瘍内、皮内、器官内、同所性などが含まれる。静脈内注射に好ましい製剤は、保存静菌水、滅菌非保存水の溶液中及び／又は注射用０．９％滅菌塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含むポリビニルクロリド製又はポリエチレン製のバッグに希釈された治療用組成物を含む。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され、滅菌粉末として、好ましくは減圧下で保存され得、ついで注射する前に、静菌水（例えば、ベンジルアルコール保存料を含む）又は滅菌水中で再構成され得る。
前述の方法を使用する癌の治療のための投薬量及び投与プロトコルは、方法及び標的の癌と共に変動し、一般に当該分野で理解される多数の他の因子に依存する。
【０１７９】
ＸＩＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１のモジュレーターの同定、特徴付け及び使用
モジュレーターを同定し使用する方法
一実施態様では、特定の発現プロファイルを誘導し又は抑制し、特定の経路を抑制し又は誘導し、好ましくはそれによる関連表現型を生じるモジュレーターを同定するためにスクリーニングが実施される。他の実施態様では、特定の状態において重要な差次的に発現される遺伝子を同定し、増加であれ減少であれ、個々の遺伝子の発現を改変するモジュレーターを同定するためにスクリーニングが実施される。他の実施態様では、差次的に発現された遺伝子の発現産物の生物学的機能を変化させるモジュレーターを同定するためにスクリーニングが実施される。再び、特定の状態において遺伝子の重要性を同定し、遺伝子産物に結合し及び／又はその生物学的活性を変化させるモジュレーターを同定するためにスクリーニングが実施される。
また、スクリーニングは候補薬剤に応答して誘導される遺伝子に対してなされている。モジュレーター（正常な発現パターンに導く癌発現パターンを抑制するもの、又は正常な組織におけるように遺伝子の発現に導く癌遺伝子のモジュレーター）を同定した後、薬剤に応答して特異的に調節される遺伝子を同定するためにスクリーニングがなされる。正常な組織と薬剤処置癌組織との発現プロファイルを比較すると、正常組織又は癌組織において発現されないが、薬剤処置組織中では発現される遺伝子及びその逆の遺伝子が明らかになる。これらの薬剤特異的配列を同定し、癌遺伝子又はタンパク質に対してここに記載された方法によって使用する。特に、これらの配列とそれらがコードするタンパク質は薬剤処置細胞を作製し又は同定する際に使用される。また、抗体を薬剤誘導タンパク質に対して産生し、処置された癌組織試料に新規治療法を標的化するために使用する。
【０１８０】
モジュレーター関連の同定及びスクリーニングアッセイ：
遺伝子発現関連アッセイ
本発明のタンパク質、核酸、及び抗体をスクリーニングアッセイで使用する。癌関連タンパク質、抗体、核酸、これらの配列を含む修飾タンパク質及び細胞を、例えば「遺伝子発現プロファイル」、ポリペプチドの発現プロファイル又は生物学的機能の改変に関する薬剤候補の効果を評価する等、スクリーニングアッセイに使用する。一実施態様では、好ましくはハイスループットスクリーニング法との関連で、候補薬剤での処置後に発現プロファイル遺伝子をモニタリングできるように、発現プロファイルを使用する（例えば、Davis, GFら, J Biol Screen 7: 69 (2002)；Zlokarnikら, Science 279: 84-8 (1998)；Heid, Genome Res 6:986- 94,1996）。
癌タンパク質、抗体、核酸、改変タンパク質及び天然又は改変された癌タンパク質又は遺伝子を含む細胞をスクリーニングアッセイで使用する。つまり、本発明は本発明の癌タンパク質の生理学的機能又は癌表現型を調節する組成物をスクリーニングする方法を含む。これは、遺伝子自体について、又は「遺伝子発現プロファイル」又は生物学的機能に対する薬剤候補の効果を評価することによって、なされる。一実施態様では、発現プロファイルは、好ましくはハイスループットスクリーニング法との関連で、候補薬剤での処置後にモニタリングを可能にするために使用される。上掲のZlokamikを参照。
【０１８１】
本発明の遺伝子及びタンパク質に対して様々なアッセイが実施される。アッセイは個々の核酸又はタンパク質レベルで実施される。つまり、癌においてアップレギュレートされる特定の遺伝子を同定した後、遺伝子発現を調節する能力又は本発明の癌タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングする。この場合での「調節(モジュレーション)」は遺伝子発現の増加又は減少を含む。調節の好ましい量は、正常組織対癌になっている組織における遺伝子発現の元々の変化に依存し、少なくとも１０％、好ましくは５０％、より好ましくは１００−３００％の変化であり、ある実施態様では３００−１０００％又はそれ以上である。よって、遺伝子が正常組織と比較して癌組織中で４倍の増加を示せば、約４倍の減少がしばしば望まれる；同様に、正常組織と比較した癌組織中での１０倍の減少は、試験化合物による１０倍の発現増加の目標値がしばしば望まれる。癌に見られる遺伝子発現のタイプを悪化させるモジュレーターはまた、例えば更なる分析におけるアップレギュレートされた標的として、有用である。
遺伝子発現の量は、核酸プローブ及び遺伝子発現レベルの定量化を使用してモニターされ、又は別に、遺伝子産物自体が、例えば癌タンパク質の抗体の使用と標準的な免疫学的検定法によってモニターされる。
【０１８２】
遺伝子発現を改変する化合物を同定するための発現モニタリング
一実施態様では、遺伝子発現モニタリング、つまり発現プロファイルは、多くの実在物について同時にモニターされる。そのようなプロファイルは典型的には図２の遺伝子の一又は複数を含むであろう。この実施態様では、例えば癌核酸プローブをバイオチップに取り付けて、特定の細胞における癌配列を検出し定量する。別法では、ＰＣＲを使用できる。よって、一連の、例えば複数ウェルのマイクロタイタープレートを、所望のウェルにプライマーを分配して使用することができる。ついで、ＰＣＲ反応を行わせて各ウェルを分析することができる。
発現モニタリングは、一又は複数の癌関連配列、例えば図２に示したポリヌクレオチド配列の発現を改変する化合物を同定するために実施される。一般に、試験モジュレーターを、分析前に細胞に加える。更に、スクリーンは、癌を調節し、本発明の癌タンパク質を調節し、本発明の癌タンパク質に結合し、又は本発明の癌タンパク質と抗体又は他の結合パートナーの結合を妨害する薬剤を同定するためにまた設けられる。
一実施態様では、ハイスループットスクリーニング法は非常に多数の潜在的な治療用化合物（候補化合物）を含むライブラリーを提供することを含む。そのような「コンビナトリアル化学ライブラリー」をついで一又は複数のアッセイにおいてスクリーニングして所望の特徴的働きを示すライブラリーメンバー（特定の化学種又はサブクラス）を同定する。このようにして同定された化合物はスクリーニングのための化合物として又は治療薬として一般的な「リード化合物」となりうる。
ある実施態様では、潜在的なモジュレーターのコンビナトリアルライブラリーを、癌ポリペプチドに結合するか又は活性を調節する能力についてスクリーニングする。常套的に、有用な性質を持つ新しい化学物質は、例えば阻害活性のようなある所望の性質又は活性を持つ化学的化合物（「リード化合物」と呼ばれる）を同定し、リード化合物の改変体をつくり、その改変体化合物の性質及び活性を評価することによって産生される。しばしば、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法がそのような分析に用いられる。
【０１８３】
上述のように、遺伝子の発現モニタリングは候補モジュレーター（例えばタンパク質、核酸又は小分子）を試験するために使用される。候補薬剤を添加し細胞を所定期間インキュベートした後、分析されるべき標的配列を含む試料を例えばバイオチップに加える。
必要とされる場合、標的配列は既知の方法を使用して調製される。例えば試料は、ＰＣＲのような増幅及び／又は精製を適宜伴って、既知の溶解バッファー、電気泳動等々を使用して細胞を溶解するために処理される。例えばヌクレオチドに共有的に結合させられた標識を伴ってインビトロ転写が実施される。一般に、核酸はビオチン−ＦＩＴＣ又はＰＥで、又はｃｙ３又はｃｙ５で標識される。
標的配列は、プローブへの標的配列の特異的な結合を検出する手段を提供するために、例えば蛍光、化学発光、化学的、又は放射性シグナルで標識することができる。標識はまたアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素であり得、これは適切な基質と共に提供されると検出される生成物を生成する。あるいは、酵素に結合するが酵素によって触媒又は改変されない酵素阻害剤のような標識は標識された化合物又は小分子である。標識はまた例えばストレプトアビジンに特異的に結合するビオチン又はエピトープタグのような部分又は化合物でありうる。ビオチンの例では、ストレプトアビジンが上述のようにして標識され、それによって、結合した標的配列の検出可能なシグナルをもたらす。未結合の標識ストレプトアビジンは通常は分析前に除かれる。
当業者によって理解されるように、これらのアッセイは直接ハイブリダイゼーションアッセイであり得、又は米国特許第５６８１７０２号；同第５５９７９０９号；同第５５４５７３０号；同第５５９４１１７号；同第５５９１５８４号；同第５５７１６７０号；同第５５８０７３１号；同第５５７１６７０号；同第５５９１５８４号；同第５６２４８０２号；同第５６３５３５２号；同第５５９４１１８号；同第５３５９１００号；同第５１２４２４６号；及び同第５６８１６９７号において一般に概説されているように、複数のプローブの使用を含む「サンドウィッチアッセイ」を含み得る。この実施態様では、一般に、標的核酸が上で概説したようにして調製され、ついで複数の核酸プローブを含むバイオチップに、ハイブリダイゼーション複合体の生成を可能にする条件下で加えられる。
【０１８４】
上で概説した高、中程度及び低ストリンジェンシー条件を含む、様々なハイブリダイゼーション条件が本発明において使用される。アッセイは標的の存在下でのみ標識プローブハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にするストリンジェンシー条件下で一般に行われる。ストリンジェンシーは、限定されないが、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、有機溶媒濃度等々を含む熱力学的変数であるステップパラメータを変更することによって制御できる。これらのパラメータはまた米国特許第５６８１６９７号に一般に概説されているように、非特異的結合を制御するために使用することもできる。よって、非特異的結合を減少させるより高いストリンジェンシー条件で所定の工程を実施することが望ましい場合がある。
ここで概説された反応は様々な方法で達成することができる。反応の成分は、同時に、又は異なった順序で逐次添加することができ、好適な実施態様を以下に概説する。また、反応は様々な他の試薬を含みうる。これらには、最適なハイブリダイゼーション及び検出を容易にし、及び／又は非特異的又はバックグラウンドの相互作用を減少させるために使用できる塩、バッファー、ニュートラルなタンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤等々が含まれる。アッセイの効率を改善等する試薬、例えばプロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤等々を、試料調製方法及び標的の純度に応じて、適宜用いることもできる。アッセイデータは、個々の遺伝子の発現レベル、及び遺伝子発現プロファイルを形成する状態間におけるような発現レベルの変化を決定するために解析される。
【０１８５】
生物学的活性関連アッセイ
本発明は本発明の癌関連遺伝子又はタンパク質の活性を調節する化合物を同定又はスクリーニングする方法を提供する。該方法は、上で定義した試験化合物を、本発明の癌タンパク質を含む細胞に加えることを含む。細胞は本発明の癌タンパク質をコードする組換え核酸を含む。他の実施態様では、候補薬剤のライブラリーを複数の細胞で試験する。
一側面では、アッセイは、例えばホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、活動電位、化学療法剤を含む薬物、放射線、発癌物質、又は他の細胞（つまり細胞間接触）のような生理学的シグナルの存在又は不存在又は過去の又は続く暴露下で評価される。他の例では、測定は、細胞周期プロセスの異なった段階でなされる。このようにして、本発明の遺伝子又はタンパク質を調節する化合物が同定される。薬理学的活性を持つ化合物は本発明の癌タンパク質の活性を亢進又は妨害することができる。ひとたび同定されれば、類似の構造を評価して化合物の重要な構造的特徴を同定する。
一実施態様では、癌細胞分裂を調節（例えば阻害）する方法が提供される；該方法は癌モジュレーターの投与を含む。他の実施態様では、癌を調節（例えば阻害）する方法が提供される；該方法は癌モジュレーターの投与を含む。更なる実施態様では、癌を持つ細胞又は個体を治療する方法が提供される；該方法は癌モジュレーターの投与を含む。
一実施態様では、本発明の遺伝子を発現する細胞の状態を調節する方法が提供される。ここで使用される場合、状態は、細胞の成長、増殖、生存、機能、アポトーシス、老化、位置、酵素活性、シグナル伝達等々のような当該分野で受け入れられているパラメータを含む。一実施態様では、癌インヒビターは上で検討した抗体である。他の実施態様では、癌インヒビターはアンチセンス分子である。様々な細胞成長、増殖、及び転移アッセイが、ここに記載されるように、当業者に知られている。
【０１８６】
モジュレーターを同定するためのハイスループットスクリーニング
好適なモジュレーターを同定するためのアッセイがハイスループットスクリーニングに適している。よって、好適なアッセイは癌遺伝子の転写の亢進又は阻害、ポリペプチドの発現の阻害又は亢進、及びポリペプチド活性の阻害又は亢進を検出する。
一実施態様では、ハイスループットスクリーニング法で評価されるモジュレーターはタンパク質で、しばしば天然に生じるタンパク質又は天然に生じるタンパク質の断片である。よって、例えばタンパク質を含む細胞抽出物、又はタンパク質様細胞抽出物のランダム又は指示された消化物が使用される。この実施態様において特に好適なものは細菌、真菌、ウイルス、及び哺乳動物タンパク質のライブラリーであり、後者のものが好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。特に有用な試験化合物は、標的が属するタンパク質のクラスに向けられ、例えば酵素に対する基質、又はリガンドとレセプターである。
【０１８７】
モジュレーターを同定し特徴付けるための軟寒天増殖及びコロニー形成の使用
正常な細胞は付着し増殖するための固形基質を必要とする。細胞が形質転換されると、細胞はこの表現型を失い基質から離脱して増殖する。例えば、形質転換された細胞は撹拌懸濁液培地中で又は半固体培地、例えば半固体又は軟寒天中に懸濁されて増殖しうる。形質転換された細胞は、癌抑制遺伝子で形質転換された場合、正常な表現型を再生させ得、もう一度、付着し増殖するための固形基質を必要とする。アッセイにおける軟寒天増殖又はコロニー形成は、宿主細胞で発現されると異常な細胞増殖及び形質転換を阻害する癌配列のモジュレーターを同定するために使用される。モジュレーターは、固体又は寒天のような半固体培地に懸濁して増殖する宿主細胞の能力を減じ又はなくする。
懸濁液アッセイでの軟寒天増殖又はコロニー形成のための技術はFreshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3版, 1994)に記載されている。また上掲のGarkavtsevら(1996)の方法セクションを参照のこと。
【０１８８】
モジュレーターを同定し特徴付けるための接触阻害及び増殖密度制限の評価
正常細胞は典型的にはそれらが他の細胞に接触するまで細胞培養中で平坦で系統的なパターンで増殖する。細胞が互いに接触すると、それらは接触阻害され、増殖を停止する。しかしながら、形質転換された細胞は、接触阻害されず、混乱した病巣において高密度になるまで増殖し続ける。よって、形質転換された細胞は対応する正常細胞よりも高い飽和密度まで増殖する。これは、病巣中の細胞又は細胞の混乱した単層の形成によって形態学的に検出される。あるいは、飽和密度での(３Ｈ)−チミジンでの標識インデクスを用いて、成長の密度制限を測定し、同様にＭＴＴ又はアラマーブルーアッセイが細胞の増殖能とそれに影響を及ぼすモジュレーターの能力を明らかにする。上掲のFreshney (1994)を参照。形質転換細胞は、腫瘍抑制遺伝子で形質転換されると、正常な表現型を再生し得、接触阻害され、低密度まで成長する。
このアッセイにおいて、飽和密度での(３Ｈ)−チミジンでの標識インデクスは成長の密度制限を測定する好適な方法である。形質転換された宿主細胞は癌関連配列で形質転換され、非制限培地条件で飽和密度にて２４時間成長させられる。(３Ｈ)−チミジンで標識した細胞の割合は取り込まれたｃｐｍによって決定される。
接触非依存性成長を用いて、異常な細胞増殖及び形質転換に導いた癌配列のモジュレーターを同定する。モジュレーターは接触非依存性成長を減少させ又は排除し、細胞を正常な表現型に戻す。
【０１８９】
モジュレーターを同定し特徴付けるための成長因子又は血清依存性の評価
形質転換細胞はその正常な対応細胞よりも低い血清依存性を有している（例えばTemin, J. Natl. Cancer Inst. 37: 167-175 (1966)；Eagleら, J. Exp. Med 131:836-879 (1970)；上掲のFreshneyを参照）。これは、部分的には、形質転換細胞による様々な成長因子の放出のためである。成長因子の程度又は形質転換宿主細胞の血清依存性はコントロールのものと比較することができる。例えば、成長因子又は細胞の血清依存性は本発明の癌関連配列を調節する化合物を同定し特徴付ける方法においてモニターされる。
【０１９０】
モジュレーターを同定し特徴付ける腫瘍特異的マーカーレベルの使用
腫瘍細胞は正常な対応細胞よりも増加量のある種の因子（以降「腫瘍特異的マーカー」という）を放出する。例えば、プラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）は正常な脳細胞からよりも高いレベルでヒト神経膠腫から放出される（例えばGullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cancer, pp. 178-184 (Mihich編 1985)を参照）。同様に、腫瘍血管新生因子（ＴＡＦ）は腫瘍細胞においてその正常な対応細胞よりも高いレベルで放出される。例えばFolkman, Angiogenesis and Cancer, Sem Cancer Biol. (1992)を参照。一方、ｂＦＧＦは内皮腫瘍から放出される（Ensoli, Bら）。
これらの因子の放出を測定する様々な技術が上掲のFreshney (1994)に記載されている。またUnklessら, J. Biol. Chem. 249: 4295-4305 (1974)；Strickland及びBeers, J. Biol. Chem. 251:5694-5702 (1976)；Whurら, Br. J. Cancer 42: 305 312 (1980)；Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cancer, pp.178-184 (Mihich編 1985)；Freshney, Anticancer Res. 5: 111-130 (1985)を参照。例えば、腫瘍特異的マーカーレベルは本発明の癌関連配列を調節する化合物を同定し特徴付ける方法においてモニターされる。
【０１９１】
モジュレーターを同定し特徴付けるためのマトリゲル中への侵襲性
マトリゲル又は細胞外マトリックス成分中への侵襲の度合いは、癌関連配列を調節する化合物を同定し特徴付けるためのアッセイとして使用することができる。腫瘍細胞は悪性腫瘍とマトリゲル又はある種の他の細胞外マトリックス成分中への細胞の侵襲との間の正の相関を示している。このアッセイでは、腫瘍原性細胞が通常は宿主細胞として使用される。これらの宿主細胞中での腫瘍抑制遺伝子の発現が宿主細胞の侵襲を減少させる。上掲のCancer Res. 1999; 59: 6010; Freshney (1994)を使用することができる。簡単に説明すると、宿主細胞の侵襲のレベルは、マトリゲル又はある種の他の細胞外マトリックス成分で被覆したフィルターを使用して測定する。ゲル中への浸透又はフィルターの遠位側への浸透は侵襲性と評価され、移動した細胞の数と距離によって組織学的に評価され、又は１２５Ｉで細胞を前もって標識し、フィルターの遠位側又は皿の底での放射性をカウントすることによって、測定される。上掲のFreshney (1984)を参照。
【０１９２】
モジュレーターを同定し特徴付けるための腫瘍増殖のインビボ評価
細胞増殖に対する癌関連配列の効果が、トランスジェニック又は免疫抑制生物において試験される。トランスジェニック生物は当該分野で受け入れられた様々な方法で調製される。例えば、癌遺伝子が破壊され、又は癌遺伝子が挿入されたノックアウトトランスジェニック生物、例えばマウスのような哺乳動物が作製される。ノックアウトトランスジェニックマウスは、相同組換えを介して内因性癌遺伝子部位中へマーカー遺伝子又は他の異種性遺伝子を挿入することにより作製される。そのようなマウスはまた内因性癌遺伝子を癌遺伝子の突然変異型と置換することにより、又は例えば発癌物質への暴露によって、内因性癌遺伝子を変異させることによって作製することができる。
トランスジェニックキメラ動物、例えばマウスを調製するために、ＤＮＡ構築物を胚性幹細胞の核中に導入する。新たに操作した遺伝子的病巣を含む細胞を宿主マウス胚中に注射し、その胚をレシピエント雌中に再移植する。これらの胚の幾つかが、幾らかが突然変異細胞株から由来する生殖細胞を有するキメラマウスに発育する。従って、キメラマウスを飼育することによって、導入した遺伝子的病巣を含む新しいマウス系統を得ることができる（例えばCapecchiら, Science 244: 1288 (1989)を参照）。キメラマウスは、２００２年４月２日発行の米国特許第６３６５７９７号；２０００年８月２２日発行の米国特許第６１０７５４０号；Hoganら, Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)及びTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson編, IRL Press, Washington, D. C., (1987)に従って誘導することができる。
【０１９３】
あるいは、様々な免疫抑制又は免疫不全宿主動物を使用することができる。例えば、遺伝的な胸腺欠損「ヌード」マウス（例えばGiovanellaら, J. Natl. Cancer Inst. 52: 921 (1974)参照）、ＳＣＩＤマウス、胸腺切除マウス、又は照射マウス（例えば、Bradleyら, Br. J. Cancer 38: 263 (1978)；Selbyら, Br. J. Cancer 41:52 (1980)）を宿主として使用することができる。同質遺伝子宿主中に注射された移植可能な腫瘍細胞（典型的には約１０６細胞）が、症例の高割合で浸潤性腫瘍をつくりだす一方、類似の由来の正常細胞はそうではない。浸潤性腫瘍を生じた宿主において、癌関連配列を発現する細胞を皮下的に又は同所的に注射する。ついで、マウスを、コントロールグループと、（例えばモジュレーターで処置した）処置実験グループを含むグループに分離する。適切な時間、好ましくは４−８週後、腫瘍成長を測定（例えば体積又はその最も大なる寸法、又は重さ）し、コントロールと比較する。（例えばステューデントＴ検定を使用する）統計的に有意な減少を有する腫瘍は阻害された成長を有していると言われる。
【０１９４】
モジュレーターを同定し特徴付けるためのインビトロアッセイ
調節活性を有する化合物を同定するためのアッセイはインビトロで実施することができる。例えば、癌ポリペプチドを潜在的なモジュレーターに先ず接触させ、適切な時間、例えば０．５から４８時間、インキュベートする。一実施態様では、癌ポリペプチドレベルは、タンパク質又はｍＲＮＡのレベルを測定することによりインビトロで決定される。タンパク質のレベルは、癌ポリペプチド又はその断片に選択的に結合する抗体を用い、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ等のようなイムノアッセイを使用して測定される。ｍＲＮＡの測定の場合、増幅、例えばＰＣＲ、ＬＣＲを用いるもの、又はハイブリダイゼーションアッセイ、例えばノーザンハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼ保護、ドットブロッティングが好ましい。タンパク質又はｍＲＮＡのレベルは、ここに記載されるように、直接的又は間接的に標識された検出薬剤、例えば蛍光的に又は放射性標識された核酸、放射性又は酵素的に標識された抗体等々を使用して検出される。
【０１９５】
あるいは、レポーター遺伝子系は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ＣＡＴ、又はＰ−ｇａｌのようなレポーター遺伝子に作用可能に結合した癌タンパク質プロモータを使用して案出することができる。レポーター構築物は典型的には細胞中に形質移入される。潜在的なモジュレーターでの処置後、レポーター遺伝子の転写、翻訳、又は活性の量は、当業者に知られた標準的な技術に従って測定される（上掲のDavis GF；Gonzalez, J.及びNegulescu, P. Curr. Opin. Biotechnol. 1998: 9:624）。
上で概説したように、インビトロスクリーニングは個々の遺伝子及び遺伝子産物についてなされる。つまり、特定の状態において重要な特定の差次的に発現される遺伝子を同定した後、その遺伝子又はその遺伝子産物自体の発現のモジュレーターのスクリーニングが実施される。
一実施態様では、特異的遺伝子の発現のモジュレーターのスクリーニングが実施される。典型的には、一つだけ又は数個の遺伝子の発現が評価される。他の実施態様では、スクリーンを設計して差次的に発現されるタンパク質に結合する化合物を先ず見出す。ついで、これらの化合物を、差次的に発現された活性を調節する能力について評価する。更に、ひとたび最初の候補化合物が同定されると、変異体を、構造活性関係をより良好に評価するために更にスクリーニングすることができる。
【０１９６】
モジュレーターを同定し特徴付けるための結合アッセイ
本発明に係る結合アッセイにおいて、本発明の精製された又は単離された遺伝子産物が一般に使用される。例えば、本発明のタンパク質に対して抗体が産生され、イムノアッセイを実施してタンパク質の量及び／又は位置が決定される。あるいは、癌タンパク質を含む細胞がアッセイにおいて使用される。
よって、該方法は本発明の癌タンパク質とリガンドのような候補化合物を組み合わせ、本発明の癌タンパク質に対する化合物の結合を決定することを含む。好適な実施態様は、ヒト癌タンパク質を用いる；ヒト疾患の動物モデルもまた開発し使用することができる。また、他の類似の哺乳動物タンパク質もまた当業者に理解されるように使用することができる。更に、ある実施態様では、変異体又は誘導体癌タンパク質が使用される。
一般に、本発明の癌タンパク質又はリガンドは不溶性支持体に非拡散的に結合される。支持体は、例えば単離された試料受け領域を有するもの（マイクロタイタープレート、アレイ等々）でありうる。不溶性支持体は組成物が結合しうる任意の組成で製作され得、可溶性物質から直ぐに分離され、スクリーニング方法全体と適合性等がある。そのような支持体の表面は固形又は多孔性で、任意の簡便な形状であり得る。
【０１９７】
好適な不溶性支持体の例には、マイクロタイタープレート、アレイ、膜及びビーズが含まれる。これらは典型的にはガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、多糖、ナイロン、ニトロセルロース、又はテフロンＴＭ等々から製作される。マイクロタイタープレート及びアレイは、少量の試薬と試料を用いて多数のアッセイを同時に実施することができるので、特に簡便である。支持体へ組成物を結合させる特定の方法は、それが試薬及び本発明の方法全体と適合性があり、組成物の活性を維持し、非拡散性であるかぎり、重要ではない。好適な結合方法には、タンパク質を支持体に付着させる場合でのリガンド結合部位又は活性化配列を立体的にブロックしない抗体の使用、「粘着性」又はイオン性支持体への直接結合、化学的架橋、表面上でのタンパク質又は薬剤の合成等々が含まれる。支持体へのタンパク質又はリガンド／結合剤の結合後、過剰な未結合物質を洗浄により除去する。ついで、試料受け領域は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又は他の無毒のタンパク質又は他の部分と共にインキュベーションしてブロックすることができる。
本発明の癌タンパク質が支持体にひとたび結合すると、試験化合物がアッセイに加えられる。あるいは、候補結合薬剤が支持体に結合され、ついで本発明の癌タンパク質が加えられる。結合薬剤には、特異的抗体、化学ライブラリーのスクリーニングで同定される非天然結合薬剤、ペプチドアナログ等々が含まれる。
【０１９８】
特に興味深いものは、ヒト細胞に対して低毒性である薬剤を同定するためのアッセイである。増殖アッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、標識インビトロタンパク質間結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合のためのイムノアッセイ、機能アッセイ（リン酸化アッセイ等々）等々を含む非常に様々なアッセイを使用することができる。
本発明の癌タンパク質への試験化合物（リガンド、結合薬剤、モジュレーター等々）の結合の測定は多くの方法で行うことができる。試験化合物を標識し、例えば、本発明の癌タンパク質の全て又は一部を固体支持体に付着させ、標識された候補化合物（例えば蛍光標識）を加え、過剰の試薬を洗い流し、標識が固体支持体上に存在しているかどうかを決定することにより、結合を直接決定することができる。様々なブロック及び洗浄工程を適宜用いることができる。
ある実施態様では、成分の一つだけが標識され、例えば本発明のタンパク質又はリガンドが標識される。あるいは、一を越える成分が異なった標識で標識され、例えばタンパク質がＩ１２５で、化合物がフルオロフォアで標識される。近接試薬、例えばクエンチング又はエネルギー移動試薬がまた有用である。
【０１９９】
モジュレーターを同定し特徴付けるための競合結合
一実施態様では、「試験化合物」の結合は「競合体(competitor)」を用いた競合結合アッセイによって決定される。「競合体」は標的分子（例えば本発明の癌タンパク質）に結合する結合部分である。競合体には、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンド等の化合物が含まれる。ある状況下では、試験化合物と競合体との競合結合が試験化合物を置換する。一実施態様では、試験化合物は標識される。試験化合物、競合体、又は双方の何れかが結合を可能にするのに十分な時間、タンパク質に加えられる。インキュベーションは最適な活性を容易にする温度で、典型的には４℃と４０℃の間で実施される。インキュベーション時間は、例えば迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために、典型的には最適化される；典型的にはゼロと１時間の間で十分である。過剰な試薬は一般に取り除かれ又は洗い流される。ついで、第二成分が加えられ、結合を示す標識された成分の存在又は不存在が追跡される。
一実施態様では、競合体が最初に加えられ、次に試験化合物が加えられる。競合体の置換は、試験化合物が癌タンパク質に結合しており、よって癌タンパク質に結合し、その活性を潜在的に調節可能であることの指標である。この実施態様では、何れかの成分を標識可能である。よって、例えば、競合体が標識される場合、試験後の化合物洗浄液中での標識の存在は試験化合物による置換を示す。あるいは、試験化合物を標識する場合、支持体上の標識の存在は置換を示す。
他の実施態様では、試験化合物が最初に添加され、インキュベーションと洗浄がなされ、競合体が添加される。競合体による結合がないことは、試験化合物が競合体よりも高い親和性で癌タンパク質に結合することを示している。よって、試験化合物が標識される場合、競合体の結合の欠如と共に、支持体上の標識の存在は、試験化合物が本発明の癌タンパク質に結合し、よってそれを潜在的に調節することを示している。
【０２００】
従って、競合結合法は本発明の癌タンパク質の活性を調節可能である薬剤を同定するための差次的スクリーニングを含む。この実施態様では、該方法は第一試料中で癌タンパク質と競合体を組み合わせることを含む。第二試料は試験化合物、癌タンパク質及び競合体を含む。競合体の結合は双方の試料に対して決定され、二つの試料間の変化又は結合差が、癌タンパク質に結合しその活性を潜在的に調節可能な薬剤の存在を示している。つまり、競合体の結合が第一試料に対して第二試料において異なっている場合は、薬剤は癌タンパク質に結合可能である。
あるいは、差次的スクリーニングを使用して、天然癌タンパク質に結合するが改変された癌タンパク質には結合できない薬剤候補を同定する。例えば、癌タンパク質の構造をモデル化し、合理的薬物設計で使用して、その部位と相互作用する薬剤、部位修飾タンパク質に一般には結合しない薬剤を合成する。更に、天然癌タンパク質の活性に影響を及ぼすそのような薬剤候補をまたそのようなタンパク質の活性を亢進又は減少させる何れかの能力について薬剤をスクリーニングすることによって同定される。
ポジティブコントロール及びネガティブコントロールをスクリーニングアッセイで使用することができる。好ましくは、コントロール及び試験試料は統計的に有意な結果を得るために少なくとも三組で実施される。全ての試料のインキュベーションはタンパク質への薬剤の結合を可能にするのに十分な時間、生じる。インキュベーション後、試料は洗浄されて非特異的に結合した物質が除かれ、結合した一般に標識された薬剤の量が測定される。例えば、放射標識が用いられる場合、試料はシンチレーションカウンターでカウントして結合化合物の量を決定できる。
様々な他の試薬をスクリーニングアッセイに含めることができる。これらには、最適なタンパク質間結合を容易にし、及び／又は非特異的又はバックグラウンドの相互作用を減少させるために使用される塩、バッファー、ニュートラルなタンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤等々のような試薬が含まれる。アッセイの効率を改善等する試薬、例えばプロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤等々を使用することもできる。成分の混合物は必要な結合をもたらす順序で添加される。
【０２０１】
本発明のタンパク質をダウンレギュレートさせるか又は阻害するためのポリヌクレオチドの使用
癌のポリヌクレオチドモジュレーターは、国際公開第９１／０４７５３号に記載されているように、リガンド結合分子と結合体を形成することによって標的ヌクレオチド配列を含む細胞中に導入することができる。好適なリガンド結合分子には、限定されるものではないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合するか、又はセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその結合した型の細胞中への侵入をブロックする能力を実質的に妨害しない。あるいは、癌のポリヌクレオチドモジュレーターは、国際公開第９０／１０４４８号に記載されているように、例えばポリヌクレオチド-脂質複合体の形成によって、標的核酸配列を含む細胞中に導入できる。またアンチセンス分子又はノックアウト及びノックインモデルの使用は、治療方法に加えて、上で検討したスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
【０２０２】
インヒビター及びアンチセンスヌクレオチド
ある実施態様では、癌関連タンパク質の活性が、アンチセンスポリヌクレオチド又は阻害性低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、つまりコードｍＲＮＡ核酸配列、例えば本発明の癌タンパク質、ｍＲＮＡ、又はその部分配列に相補的で、好ましくは特異的にハイブリダイズ可能な核酸の使用によって、ダウンレギュレートされ又は完全に阻害される。ｍＲＮＡへのアンチセンスポリヌクレオチドの結合はｍＲＮＡの翻訳及び／又は安定性を減少させる。
本発明の場合、アンチセンスポリヌクレオチドは天然に生じるヌクレオチド、又は天然に生じるサブユニット又はその密接なホモログから形成した合成種を含みうる。アンチセンスポリヌクレオチドはまた改変された糖部分又は糖間結合を有しうる。これらの例はホスホロチオエート及び当該分野での使用が知られている他の硫黄含有種である。アナログは、それらが効果的に機能して本発明のヌクレオチドとハイブリダイズする限り、この発明に包含される。例えば、Isis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA；Sequitor, Inc., Natick, MAを参照。
そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは組換え手段を使用して直ぐに合成することができ、又はインビトロで合成することができる。そのような合成のための装置は、Applied Biosystemsを含む幾つかの製造元から販売されている。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドの調製もまた当業者にはよく知られている。
ここで使用されるアンチセンス分子にはアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。センスオリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖への結合によって転写をブロックするために用いることができる。アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドは癌分子に対する標的ｍＲＮＡ（センス）又はＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合可能な一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡの何れか）を含む。本発明によれば、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは一般に少なくとも約１２のヌクレオチド、好ましくは約１２から３０ヌクレオチドの断片を含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡに基づいて、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は例えばStein及びCohen（Cancer Res. 48: 2659 (1988及びvan der Krolら(BioTechniques 6: 958 (1988)）に記載されている。
【０２０３】
リボザイム
アンチセンスポリヌクレオチドに加えて、リボザイムを、癌関連ヌクレオチド配列を標的化し、その転写を阻害するために使用することができる。リボザイムは他のＲＮＡ分子を触媒的に切断するＲＮＡ分子である。グループＩリボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピンリボザイム、リボヌクレアーゼＰ、及びアックスヘッド(axhead)リボザイムを含む異なった種類のリボザイムが開示されている（異なったリボザイムの性質の一般的な概説については、例えばCastanottoら, Adv. in Pharmacology 25: 289-317 (1994)を参照）。
ヘアピンリボザイムの一般的特徴は例えばHampelら, Nucl. AcidsRes. 18:299-304 (1990)；欧州特許出願公開第０３６０２５７号；米国特許第５２５４６７８号に記載されている。調製方法は当業者によく知られている（例えば国際公開第９４／２６８７７号；Ojwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6340-6344 (1993)；Yamadaら, Human Gene Therapy 1:39-45 (1994)；Leavittら, Proc. Natl. Acad Sci. USA 92: 699- 703 (1995)；Leavittら, Human Gene Therapy 5:1151-120 (1994)；及びYamadaら, Virology 205:121-126 (1994)を参照）。
【０２０４】
表現型スクリーニングにおけるモジュレーターの使用
一実施態様では、試験化合物が、関連した癌発現プロファイルを有する癌細胞の集団に投与される。ここでの「投与」又は「接触」は、取り込み及び細胞内作用によろうと、又は細胞表面での作用であろうと、モジュレーターが細胞に作用できるように、モジュレーターが細胞に加えられることを意味する。ある実施態様では、タンパク質様剤（つまりペプチド）をコードする核酸が、アデノウイルス又はレトロウイルス構築物のようなウイルス構築物中に入れられ、ペプチド剤の発現が達成されるように細胞に加えられる。例えばＰＣＴ ＵＳ９７／０１０１９。調節可能な遺伝子療法系もまた使用できる。モジュレーターがひとたび細胞に投与されると、細胞は望まれれば洗浄され、所定期間好ましくは生理学的条件下でインキュベートされる。ついで、細胞は収集され、新しい遺伝子発現プロファイルが生成される。よって、例えば癌組織は、癌表現型を調節し、例えば誘導又は抑制する薬剤についてスクリーニングされる。発現プロファイルの少なくとも一つの遺伝子、好ましくは多くのものの変化が、その薬剤が癌活性に効果を有することを示している。同様に、生物学的機能又はシグナル伝達経路の変化はモジュレーター活性の指標である。癌表現型に対するそのようなシグネーチャーを定義することによって、表現型を変化させる新規な薬剤に対するスクリーンが案出される。このアプローチでは、薬物標的は既知である必要はなく、元の遺伝子／タンパク質発現スクリーニングプラットフォームに提示される必要はないし、標的タンパク質の転写物のレベルを変化させる必要もない。モジュレーター阻害機能は代用マーカーとなる。
上に概説したように、遺伝子又は遺伝子産物を評価するためにスクリーニングがなされる。つまり、特定の差次的に発現した遺伝子を特定の状態において重要であると同定すると、遺伝子の発現又は遺伝子産物自体の何れかのモジュレーターのスクリーニングが実施される。
【０２０５】
本発明のペプチドに影響を及ぼすためのモジュレーターの使用
癌ポリペプチドの活性又は癌表現型の測定は様々なアッセイ法を使用して実施される。例えば、癌ポリペプチドの機能に対するモジュレーターの効果は上述のパラメータを調べることによって測定される。活性に影響を及ぼす生理学的変化が、この発明のポリペプチドに対する試験化合物の影響を評価するために使用される。機能の結果が無傷の細胞又は動物を使用して決定されると、例えば固形腫瘍に関連した癌の場合に、腫瘍増殖、腫瘍転移、新血管新生、ホルモン放出、既知と未特徴付けの双方の遺伝子マーカーに対する転写変化（例えばノーザンブロットによる）、細胞成長又はｐＨ変化のような細胞代謝における変化、及びｃＧＮＩＰのような細胞内二次メッセンジャーの変化のような様々な効果を評価することができる。
【０２０６】
癌関連配列を同定し特徴付ける方法
様々な遺伝子配列の発現が癌と相関している。従って、突然変異体又は変異体癌遺伝子に基づく疾患が決定される。一実施態様では、本発明は、変異体癌遺伝子を含む細胞を同定する方法、例えば細胞中の少なくとも一の内因性癌遺伝子の配列の全て又は一部の存在を決定する方法を提供する。これは任意の数のシークエンシング技術を使用して達成される。本発明は個体の癌遺伝子型を同定する方法、例えば個体中での本発明の少なくとも一の遺伝子の配列の全て又は一部を決定する方法を含む。これは個体の少なくとも一つの組織中、例えば表Ｉに記載の組織中で一般的になされ、多くの組織又は同じ組織の異なった試料の評価を含みうる。該方法は、ファミリーメンバー、相同性、突然変異体又は変異体の存在を決定すために既知の癌遺伝子、つまり野生型遺伝子と、配列決定した遺伝子の配列を比較することを含みうる。ついで、遺伝子の全て又は一部の配列を既知の癌遺伝子の配列と比較して、何らかの差異が存在するかを決定することができる。これは、ＢＬＡＳＴ、Ｂｅｓｔｆｉｔ等のような任意の数の既知の相同性プログラムを使用してなされる。患者の癌遺伝子と既知の癌遺伝子との間での配列における差の存在は、ここで概説したように、疾患状態又は疾患状態の性向と相関する。
好適な実施態様では、癌遺伝子が、ゲノム中の癌遺伝子のコピー数を決定するためにプローブとして使用される。癌遺伝子は癌遺伝子の染色体の局在を決定するためにプローブとして使用される。染色体の局在のような情報は、特に転座のような染色体異常等が癌遺伝子座において同定される場合、診断又は予後を提供する際に用途が見出される。
【０２０７】
ＸＩＶ．）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のＲＮＡｉ及び治療的使用
本発明はｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、特にＳＴＥＡＰ−１コード領域又は５”ＵＴＲ領域の断片を少なくとも包含する二重鎖ＲＮＡ、又はＳＴＥＡＰ−１配列に特異的な任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドにまた関する。一実施態様では、そのようなオリゴヌクレオチドはＳＴＥＡＰ−１の機能を解明するために使用されるか、又はＳＴＥＡＰ−１機能又は発現のモジュレーターをスクリーニングし又は評価するために使用される。他の実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１の遺伝子発現は、ｓｉＲＮＡ形質移入を使用して減少させられ、内在的に抗原を発現する形質転換癌細胞の増殖能を有意に減少させる；特異的ＳＴＥＡＰ−１ｓｉＲＮＡで処置した細胞は、増殖能の減少に相関する例えば細胞生存率の代謝読み取りによって測定した生存率減少を示す。よって、ＳＴＥＡＰ−１ｓｉＲＮＡ組成物はＳＴＥＡＰ−１タンパク質の核酸ＯＲＦ配列又はその部分配列に対応するｓｉＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）を含み；これらの部分配列は一般に５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３５を越える連続ＲＮＡヌクレオチド長であり、ｍＲＮＡコード配列の少なくとも一部に相補的及び非相補的な配列を含む。好適な実施態様では、部分配列は１９−２５ヌクレオチド長であり、最も好ましくは２１−２３ヌクレオチド長である。
ＲＮＡ干渉はインビトロ及びインビボでの遺伝子サイレンシングへの新規なアプローチ法であり、よって低分子二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は貴重な治療剤である。特異的な遺伝子活動をサイレンシングさせるｓｉＲＮＡの力は動物疾患モデルに今もたらされており、ヒトにおいても同様に使用される。例えば、特定の標的に対してのｓｉＲＮＡを持つマウス中へのｓｉＲＮＡの溶液の水力学的注入が治療的に効果的であることが証明されている。
【０２０８】
Songらによる先駆的な研究は、完全に天然の核酸の一つのタイプである低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が更なる化学的修飾を伴わないでさえ治療剤となることを示している（Song, E.ら "RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis" Nat. Med. 9(3): 347-51 (2003)）。この研究は、動物中へのｓｉＲＮＡの注入が疾患を軽減するという最初のインビボでの証拠を提供した。その例では、著者はＦＡＳタンパク質（炎症応答の間に過剰に活性化されると肝細胞及び他の細胞に死を誘導する細胞死レセプター）をサイレンシングさせるように設計されたｓｉＲＮＡの注射をマウスに与えた。翌日、Ｆａｓに特異的な抗体を動物に与えた。コントロールマウスは数日以内に急性肝不全で死亡したのに対して、ｓｉＲＮＡ処置マウスの８０％以上が深刻な疾患を免れ生存した。その肝細胞の約８０％から９０％が裸のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを取り込んだ。更に、ＲＮＡ分子は、３週間後に効果を失う前、１０日の間、機能した。
ヒトの治療に使用する場合、ｓｉＲＮＡは長く持続するＲＮＡｉ活性を誘導する効果的な系によって送達される。臨床的使用に対する主要な警告はｓｉＲＮＡを適切な細胞に送達することである。肝細胞は外因性ＲＮＡに特に受容性であると思われる。今日、肝臓は核酸分子及びウイルスベクターによって直ぐに標的とされうる器官であるので、肝臓中に位置する標的は魅力的である。しかしながら、他の組織及び器官標的もまた好ましい。
細胞膜を横断する移行を促進する化合物とのｓｉＲＮＡの製剤は治療においてｓｉＲＮＡの投与を改善するために使用される。ヌクレアーゼに耐性があり、血清安定性を有している化学的に改変された合成ｓｉＲＮＡはＲＮＡｉ効果の同時の亢進期間を有しており、更なる実施態様である。
よって、ｓｉＲＮＡ技術は、表１に列挙したもののような、癌患者へのＳＴＥＡＰ−１に対するｓｉＲＮＡ分子の送達によるヒトの悪性腫瘍のための治療法である。ｓｉＲＮＡのそのような投与はＳＴＥＡＰ−１を発現する癌細胞の成長を低減に導き、悪性腫瘍に関連する罹患率及び／又は死亡率を減少させる抗腫瘍療法を提供する。
遺伝子産物ノックダウンの治療方法の効果はインビトロ又はインビボで測定した場合に有意である。インビトロでの効果は、インビトロ法がＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現の減少を検出するために使用される場合、癌患者のバイオプシーのアリコートに又は培養中の細胞（上述）にｓｉＲＮＡを適用することによって直ぐに証明可能である。
【０２０９】
ＸＶ．）キット／製造品
ここに記載される実験室、予後、予防、診断及び治療用途における使用に対して、キットは本発明の範囲内である。このようなキットは、キャリア、パッケージ、又はバイアル、チューブなどのような一又は複数の容器を収容するように区画化されている容器を含み得、各容器は、ここに記載された用途のような、用途に対する指示を含むラベル又は挿入物と共に、本方法において使用される別個のエレメントの一つを含む。例えば、容器は、検出可能に標識されているか又は標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれ本発明のタンパク質又は遺伝子もしくはメッセージに特異的な抗体又はポリヌクレオチドであり得る。本方法が標的核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットはまたこの標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを含む容器を有しうる。キットは、レポーター分子、例えば、酵素、蛍光又は放射性同位元素標識に結合されたレポーター、例えば、アビジン又はストレプトアビジンのようなビオチン結合タンパク質を含む容器を有し得る。キットは、図２もしくは図３のアミノ酸配列又はそのアナログ、あるいはそのようなアミノ酸配列をコードする核酸分子の全て又は一部を含み得る。
【０２１０】
本発明のキットは、典型的には上述の容器及び商業的及び使用者の立場から所望される物質を含む一又は複数の他の容器を含み、この物質には、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ；キャリアー、パッケージ、容器、バイアル及び／又は内容物及び／もしくは使用説明書を列挙するチューブラベル、及び使用説明書を有するパッケージ挿入物が含まれる。
ラベルは、組成物が特定の治療又は非治療用途、例えば、予後、予防、診断又は実験室用途に使用されることを示すために容器上に又は容器と共にあり得、インビボ用途又はインビトロ用途、例えば上記用途の何れかについての指示もまた示し得る。指示及び／又は他の情報はまたキットと共に又はキット上に含まれる挿入物又はラベルに含まれ得る。ラベルは容器上に又は容器に付随して存在しうる。ラベルは、ラベルを形成する文字、数又は他の符号が容器自体に成形され又はエッチングされている場合、容器上にあり得；ラベルは、それがパッケージ挿入物のように容器をまた保持する容器(レセプタクル)又はキャリアー内に存在する場合、容器に付随しうる。ラベルは、組成物が表Ｉに記載の組織の異常増殖のような症状の診断、処置、予防又は予後のために使用されることを示しうる。
「キット」及び「製造品」という用語は、同義語として使用され得る。
【０２１１】
本発明の他の実施態様では、アミノ酸配列、小分子、核酸配列、及び／又は抗体のような組成物、例えば、表Ｉに示される組織の異常増殖の診断、予後、予防及び／又は処置に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、典型的には、少なくとも一つの容器と少なくとも一つのラベルを含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ及び試験管が含まれる。容器は、様々な材料、例えば、ガラス、金属又はプラスチックにより形成され得る。容器は、アミノ酸配列、小分子、核酸配列、細胞集団及び／又は抗体を保持し得る。一実施態様では、容器は、細胞のｍＲＮＡ発現プロファイルを試験する際に使用するためのポリヌクレオチドを、この目的に使用される試薬と共に保持する。他の実施態様では、容器は、細胞及び組織中におけるＳＴＥＡＰ−１のタンパク質発現の評価に使用されるか、又は関連する実験室、予後、診断、予防及び治療目的のための抗体、その結合断片又は特異的結合タンパク質を含む；そのような用途に対する説明書及び／又は指示書は、これらの目的に使用される試薬及び他の組成物又はツールがそうであるように、そのような容器上に又は容器と共に含められうる。他の実施態様では、容器は、関連する説明書及び／又は指示書と共に細胞性又は体液性免疫応答を誘発するための物質を含む。他の実施態様では、容器は子孫免疫治療法のための物質、例えば細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）又はヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）を、関連の説明書及び／又は指示書と共に含む；そのような目的に使用される試薬及び他の組成物又はツールもまた含められうる。
【０２１２】
容器は、あるいは、症状を処置、診断、予後又は予防するに効果的な組成物を保持し得、滅菌アクセス口を有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる）。組成物中の活性薬剤は、ＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合しＳＴＥＡＰ−１の機能を調節し得る抗体であり得る。
製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及び／又はデキストロース液を含有する第二の容器を更に含みうる。製造品は、商業的及び使用者の立場から所望される他の物質であって、他の緩衝液、希釈液、フィルター、スターラー、針、シリンジ、及び／又は使用のための説明書及び／又は指示書を有するパッケージ挿入物を含むものを更に含みうる。
【実施例】
【０２１３】
本発明の様々な側面を以下の幾つかの実施例によって更に記載し例証するが、これらの実施例は何れも本発明の範囲を限定するものではない。
【０２１４】
実施例１：ＳＴＥＡＰ−１遺伝子のｃＤＮＡ断片のＳＳＨ生成単離
（材料及び方法）
（ＬＡＰＣ異種移植片）
ＬＡＰＣ異種移植片を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓａｗｙｅｒｓ博士（ＵＣＬＡ）から入手し、記載されているようにして（Kleinら, 1997, Nature Med. 3: 402-408；Craftら, 1999, Cancer Res. 59: 5030-5036）生成した。アンドロゲン依存性及び非依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片（それぞれＬＡＰＣ−４ ＡＤ及びＡＩ）及びＬＡＰＣ−９異種移植片（それぞれＬＡＰＣ−９ ＡＤ及びＡＩ）をそれぞれ無傷の雄ＳＣＩＤマウス又は去勢した雄において増殖させ、レシピエント雄に小組織塊として継代させた。ＬＡＰＣ−４ ＡＩ異種移植片は、ＬＡＰＣ−４ ＡＤ腫瘍から取り出し、ＬＡＰＣ−９ ＡＩ異種移植片は、ＬＡＰＣ−９ ＡＤ腫瘍から取り出した。ＡＩ異種移植片を生成するために、ＬＡＰＣ ＡＤ腫瘍を有する雄マウスを去勢し、２〜３ヶ月間飼育した。ＬＡＰＣ腫瘍が再増殖した後、この腫瘍を採集し、去勢雄ＳＣＩＤマウスにおいて又は雌ＳＣＩＤマウスにおいて継代させた。
ＬＡＰＣ−４ ＡＤ異種移植片は、以下のように脛骨内で増殖した。皮膚下で増殖したＬＡＰＣ−４ ＡＤ異種移植片腫瘍組織を、この組織を１×Ｉｓｃｏｖｅｓ培地に浸しながら、１〜２ｍｍ３の切片に細かく切断した。ついで、切り刻んだ組織を、１．３Ｋｒｐｍで４分間遠心分離し、この上清を、１０ｍｌの氷冷１×Ｉｓｃｏｖｅｓ培地中に再懸濁させ、１．３Ｋｒｐｍで、４分間遠心分離した。ついで、そのペレットを、１％プロナーゼＥを含む１×Ｉｓｃｏｖｅｓ中に再懸濁し、穏やかな揺らし攪拌を行いながら、室温で２０分間インキュベートした後に氷上で２〜４分間インキュベートした。濾液を、１．３Ｋｒｐｍで４分間遠心分離し、プロナーゼを、１０ｍｌのＩｓｃｏｖｅｓ中での再懸濁及び再遠心分離によって、吸引されたペレットから除去した。ついで、細胞の凝集塊を、ＰｒＥＧＭ培地に播き、一晩増殖させた。ついで、この細胞を収集し、濾過し、２×ＲＰＭＩで洗浄し、カウントした。約５００００個の細胞を、氷上で、当容量の氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合し、２７ゲージ針を介してＳＣＩＤマウスの近位脛骨幹端に、外科的に注射した。１０〜１２週間後、骨髄において増殖したＬＡＰＣ−４腫瘍を回収した。
【０２１５】
（細胞株及び組織）
ヒト細胞株（例えば、ＨｅＬａ）をＡＴＣＣから入手し、５％ウシ胎仔血清を有するＤＭＥＭ中に維持した。ＲＮＡ及びタンパク質分析のためのヒト組織を、ＵＣＬＡ（Los Angeles, CA）のＨｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＨＴＲＣ）及びＱｕａｌＴｅｋ社（Santa Barbara, CA）から得た。
【０２１６】
（ＲＮＡ単離）
腫瘍組織及び細胞株をＴｒｉｚｏｌ試薬（Life Technologies, Gibco BRL）において１０ｍｌ／ｇ組織又は１０ｍｌ／１０８細胞で用いてホモジナイズし、総ＲＮＡを単離した。ポリＡ ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎの Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ Ｍｉｎｉキット及びＭｉｄｉキットを用いて総ＲＮＡから精製した。総ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、分光光度計分析（Ｏ．Ｄ．２６０／２８０ｎｍ）によって定量し、ゲル電気泳動によって分析した。
【０２１７】
（オリゴヌクレオチド）
以下のＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを使用した。
DPNCDN(cDNA合成プライマー)：
5'TTTTGATCAAGCTT303' (配列番号６８)
アダプター１：
5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3' (配列番号６９)
3'GGCCCGTCCTAG5' (配列番号７０)
アダプター２：
5'GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3' (配列番号７１)
3'CGGCTCCTAG5' (配列番号７２)
ＰＣＲプライマー１：
5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' (配列番号７３)
ネステッドプライマー(ＮＰ)１：
5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3' (配列番号７４)
ネステッドプライマー(ＮＰ)２：
5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3' (配列番号７５)
【０２１８】
（抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション）
抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を使用して、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）と比較して、アンドロゲン依存性前立腺癌で上方制御され得る遺伝子に対応するｃＤＮＡを同定した。
ＬＡＰＣ−４ ＡＤ異種移植片に対応する二本鎖ｃＤＮＡ（テスター）及びＢＰＨ組織に対応する二本鎖ｃＤＮＡ（ドライバー）を、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ及びプライマーとして１ｎｇのオリゴヌクレオチドＲＳＡＣＤＮを使用して、上述のようにして、異種移植片及びＢＰＨ組織から単離した２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成した。第一鎖合成及び第二鎖合成を、このキットの使用者マニュアルのプロトコル（CLONTECH Protocol No. PT1117-1, Catalog No. K1804-1）に記載のようにして実施した。この得られたｃＤＮＡを、ＲｓａＩで３７℃で３時間消化した。消化したｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿した。
ドライバーｃＤＮＡ（ＢＰＨ）を、４：１比で、ＲｓａＩ消化したＢＰＨ ｃＤＮＡとマウス肝臓由来の消化したｃＤＮＡとを合わせることによって生成し、マウス遺伝子が、このテスターｃＤＮＡ（ＬＡＰＣ−４ ＡＤ）から差し引かれることを確実にした。
【０２１９】
テスターｃＤＮＡ（ＬＡＰＣ−４ ＡＤ）を、５μｌの水中に１μｌのＲｓａＩ消化したＬＡＰＣ−４ ＡＤ ｃＤＮＡ（４００ｎｇ）を希釈することにより生成した。ついで、この希釈したｃＤＮＡ（２μｌ、１６０ｎｇ）を、４００ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、総容量１０μｌで、１６℃で一晩、別個の連結反応液中で、２μｌのアダプター１及びアダプター２（１０μＭ）に連結した。連結を、１μｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡで、７２℃で５分間加熱して終結させた。
第一のハイブリダイゼーションを、１．５μｌ（６００ｎｇ）のドライバーｃＤＮＡを、１．５μｌ（２０ｎｇ）のアダプター１を連結したテスターｃＤＮＡ及びアダプター２を連結したテスターｃＤＮＡを含む２つの各チューブに添加することにより実施した。４μｌの最終容量で、試料に鉱油を重層し、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ サーマルサイクラー中で、９８℃で１．５分間変性し、ついで、６８℃で８時間ハイブリダイズさせた。次いで、この２つのハイブリダイゼーション物を、更なる１μｌの新鮮な変性ドライバーｃＤＮＡと一緒に混合し、６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。ついで、この第二のハイブリダイゼーション物を、２００μｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ中で希釈し、７０℃で７分間加熱し、−２０℃で貯蔵した。
【０２２０】
（ＳＳＨから生成した遺伝子断片のＰＣＲ増幅、クローニング、及び配列決定）
ＳＳＨ反応から生じる遺伝子断片を増幅するために、２つのＰＣＲ増幅を行った。第一のＰＣＲ反応では、１μｌの希釈した最終ハイブリダイゼーション混合物を、最終容量２５μｌ中の１μｌのＰＣＲプライマー１（１０μＭ）、０．５μｌ ｄＮＴＰミックス（１０μＭ）、２．５μｌの１０×反応緩衝液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）及び０．５μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に添加した。ＰＣＲ１を、以下の条件を用いて実施した：７５℃で５分、９４℃で２５秒、次いで９４℃で１０秒、６６℃で３０秒、７２℃で１．５分を２７サイクル。５つの別の第一のＰＣＲ反応を、各実験について行った。産物をプールし、水で１：１０に希釈した。第二のＰＣＲ反応については、このプールし希釈した第一のＰＣＲ反応物からの１μｌを、プライマーＮＰ１及びＮＰ２（１０μＭ）をＰＣＲプライマー１の代わりに使用したことを除き、ＰＣＲ１について用いた反応混合物と同じ反応混合物に添加した。ＰＣＲ２を、９４℃で１０秒、６８℃で３０秒、７２℃で１．５分を１０〜１２サイクル用いて実施した。これらのＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
これらのＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａベクタークローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ２．１に挿入した。形質転換した大腸菌を、青／白及びアンピシリン選択に供した。白色コロニーを拾い、９６ウェルプレート中に並べ、液体培養中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、ＰＣＲ増幅を、ＰＣＲ１の条件並びにプライマーとしてＮＰ１及びＮＰ２を用いて、１ｍｌの細菌培養物に対して実施した。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
細菌クローンを、９６ウェル形式で２０％グリセロール中に貯蔵した。プラスミドＤＮＡを調製し、配列決定し、ＧｅｎＢａｎｋ、ｄｂＥＳＴ及びＮＣＩ−ＣＧＡＰデータベースの核酸相同性検索に供した。
【０２２１】
（ＲＴ−ＰＣＲ発現分析）
第一鎖ｃＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステムを用いるオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライミングによって、１μｇのｍＲＮＡから生成した。製造者プロトコルを使用し、これには、４２℃で５０分間の逆転写酵素とのインキュベーション、それに続く、３７℃で２０分間のＲＮＡｓｅ Ｈ処理を含んでいた。反応を完了した後、この容量を、正規化の前に水で２００μｌに増大させた。１６の異なる正常ヒト組織からの第一鎖ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した。
【０２２２】
複数の組織からの第一鎖ｃＤＮＡの正規化を、プライマー５’ａｔａｔｃｇｃｃｇｃｇｃｔｃｇｔｃｇｔｃｇａｃａａ３’（配列番号７６）及び５’ａｇｃｃａｃａｃｇｃａｇｃｔｃａｔｔｇｔａｇａａｇｇ３’（配列番号７７）を用いてβアクチンを増幅することにより実施した。第一鎖ｃＤＮＡ（５μｌ）を、０．４μＭプライマー、０．２μＭ各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）及び１×Ｋｌｅｎｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む総容量５０μｌで増幅した。１８、２０及び２２サイクルで、５μｌのＰＣＲ反応物を取り出し、アガロース電気泳動のために使用した。ＰＣＲを、以下の条件下で、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーを用いて実施した：初期変性は９４℃で１５秒間であり、続いて９４℃で１５、６５℃で２分、７２℃で５秒を１８、２０、及び２２サイクル。７２℃での最終伸長を、２分間行った。アガロースゲル電気泳動後、複数の組織からの２８３ｂｐのβアクチンバンドのバンド強度を、目視検査によって比較した。２２サイクルのＰＣＲ後に全ての組織において等しいβアクチンバンド強度を生じるように、第一鎖ｃＤＮＡの希釈倍率を算定した。２２サイクルのＰＣＲ後に全ての組織において等しいバンド強度を達成するには、３回の正規化が必要であった。
【０２２３】
ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の発現レベルを決定するために、５μｌの正規化した第一鎖ｃＤＮＡを、以下のプライマー対を用いる２５、３０、及び３５サイクルの増幅を用いるＰＣＲによって分析した：
5' ACT TTG TTG ATG ACC AGG ATT GGA 3'（配列番号７８）
5' CAG AAC TTC AGC ACA CAC AGG AAC 3'（配列番号７９）
半定量発現分析を、軽度のバンド強度を与えるサイクル数でのＰＣＲ産物を比較することにより達成した。
【０２２４】
（結果）
幾つかのＳＳＨ実験を、上述の材料及び方法に記載のように行い、これらのＳＳＨ実験は、多数の候補遺伝子断片クローンの単離を導いた。全ての候補クローンを配列決定し、対応する遺伝子の正体に関する情報を提供するため及び示差的な発現について特定の遺伝子を分析するための決定を導くことを補助するために、主な公的な遺伝子データベース及びＥＳＴデータベース中の全配列に対する相同性分析に供した。一般に、これらの検索したデータベースの何れかにおいて如何なる公知の配列とも相同性を有さず、従って新規な遺伝子を表すと考えられる遺伝子断片、並びに以前に配列決定された発現配列タグ（ＥＳＴ）に対して相同性を示す遺伝子断片を、ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はノーザン分析によって差次的発現分析に供した。
ＳＴＥＡＰ−１と命名したｃＤＮＡクローンの１つは、４３６ｂｐの長さであり、ＮＣＩ−ＣＧＡＰ腫瘍遺伝子データベースにおいてＥＳＴ配列に対する相同性を示した。その後、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡを、このｃＤＮＡを使用して単離し、ＳＴＥＡＰ−１と改名した。ＳＴＥＡＰ−１ｃＤＮＡヌクレオチド配列は、図１に示されるように、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１５０〜５８５に対応する。２８Ｐ３Ｅ１と名付けた、別のクローンは、５６１ｂｐの長さであり、ＮＣＩ−ＣＧＡＰ腫瘍遺伝子データベース又は他のデータベースにおいて、多くのＥＳＴ配列に対する相同性を示した。この２８Ｐ３Ｅ１配列の一部（３５６ｂｐ）は、ヒト胎児組織由来のＥＳＴと同一である。全長ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡを得てそして配列決定した後に、このクローンはまたＳＴＥＡＰ−１（より詳細には、図１に示されるＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド配列の残基６２２から３’末端まで）に対応することが明らかとなった。
【０２２５】
実施例２：全長ＳＴＥＡＰ−１をコードするｃＤＮＡの単離
４３６ｂｐのＳＴＥＡＰ−１遺伝子断片（「ＳＴＥＡＰ−１遺伝子のｃＤＮＡ断片のＳＳＨ生成単離」と題した実施例を参照）を使用して、８Ｐ１Ｄ４／ＳＴＥＡＰ−１遺伝子をコードする更なるｃＤＮＡを単離した。簡潔に説明すると、正常なヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、この４３６ｂｐのＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡから作製した標識プローブを用いてスクリーニングした。陽性クローンの一つであるクローン１０は、１１９５ｂｐの長さであり、３３９アミノ酸のタンパク質をコードし、ヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列は、如何なる既知のヒト遺伝子に対してもタンパク質に対しても有意な相同性を保持しなかった（国際出願ＷＯ９８／５３０７１に記載されたラット腎臓損傷タンパク質に対する相同性）。このコードされるタンパク質は、少なくとも６つの推定膜貫通モチーフを含み、これは、細胞表面配向性を示す。これらの構造的特徴によって、「前立腺の６つの膜貫通上皮抗原（Six Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate）」にちなんでＳＴＥＡＰと命名した。
引き続く更なるＳＴＥＡＰタンパク質の同定によって、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物を「ＳＴＥＡＰ−１」と改名した。このＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡの配列及びコードされるアミノ酸配列を、図２Ａ〜Ｑに示す。ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡクローン１０を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」）（10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA）に、プラスミドＳＴＥＡＰ−１クローン１０．１として、１９９８年８月２６日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号９８８４９を付与された。このＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡクローンは、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩの二重消化（５’末端でＥｃｏＲＩ、３’末端でＸｂａＩ）を使用して、このプラスミドから切り出され得る。
【０２２６】
実施例３：ＳＴＥＡＰ−１の染色体マッピング
染色体の位置決定は、疾患の病因における遺伝子と関連し得る。蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ヒト／ハムスター放射線ハイブリッド（ＲＨ）パネル（Walterら, 1994; Nature Genetics 7: 22; Research Genetics, Huntsville Al）、ヒト−齧歯類体細胞ハイブリッドパネル、例えばCoriell Institute (Camden, New Jersey)から入手可能なもの、及び配列決定されマッピングされたゲノムクローンに対するＢＬＡＳＴ相同性を利用するゲノムビュアー（NCBI, Bethesda, Maryland）を含む幾つかの染色体マッピングアプローチが利用可能である。
ＳＴＥＡＰ−１は、ＳＴＥＡＰ−１配列及びＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴツール（ワールドワイドウェブ（.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hsにある）を使用して染色体７ｑ２１にマッピングされ得る。
【０２２７】
実施例４：ＳＴＥＡＰ−１の発現分析
胃癌患者標本におけるＳＴＥＡＰ−１の発現を、図１４（ａ）〜（ｅ）に示す。図１４（ａ）ＲＮＡを、正常胃（Ｎ）及び１０個の異なる胃癌患者標本（Ｔ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを用いるノーザンブロットを、ＳＴＥＡＰ−１配列を用いてプローブした。結果は、胃腫瘍組織における約１．６ｋｂのＳＴＥＡＰ−１の強力な発現を示す。下のパネルは、ＲＮＡ試料の品質を示すブロットの臭化エチジウム染色を表す。
図１４（ｂ）は、ＳＴＥＡＰ−１が直腸癌患者組織において発現したことを示す。ＲＮＡを、正常直腸（Ｎ）、直腸癌患者腫瘍（Ｔ）、及び直腸癌転移物（Ｍ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡを有するノーザンブロットを、ＳＴＥＡＰ−１配列を用いてプローブした。結果は、直腸癌患者組織におけるＳＴＥＡＰ−１の強力な発現を示す。下のパネルは、ＲＮＡ試料の品質を示すブロットの臭化エチジウム染色を表す。
【０２２８】
ＲＴ−ＰＣＲによるＳＴＥＡＰ−１の発現は、ＳＴＥＡＰ−１が、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において強力に発現することを示した（図１４（ｃ））。第１鎖ｃＤＮＡを、ＨＵＶＥＣ細胞、ＬＡＰＣ−４ＡＤ及びＬＡＰＣ−９ＡＤの前立腺癌異種移植片、並びにヒト脳組織から調製した。アクチン及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを使用して、ＰＣＲによって、正規化を実施した。ＳＴＥＡＰ−１に対するプライマーを使用する半定量的ＰＣＲを、２７及び３０サイクルの増幅において実施した。コントロールとして、アクチンに対するプライマーを使用するＰＣＲを示す。結果は、前立腺癌異種移植片組織において検出される発現に類似する、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の強力な発現を示す。ＨＵＶＥＣ細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現は、標的化ＳＴＥＡＰ−１がまた、腫瘍の新生血管生成の内皮細胞を標的とし得ることを示す。図１４（ｄ）にはＲＴ−ＰＣＲアガロースゲルの写真を示す。図１４（ｅ）において、ＰＣＲ産物をＡｌｐｈａｌｍａｇｅｒソフトウェアを使用して定量した。結果は、試験した全ての正常組織のなかで正常な前立腺におけるＳＴＥＡＰ−１の発現の強さを示している。ＳＴＥＡＰ−１発現の上方制御が、前立腺癌プール、膀胱癌プール、腎臓癌プール、大腸癌プール、肺癌プール、卵巣癌プール、及び乳癌プールにおいて検出された。ＳＴＥＡＰ−１の強い発現が癌転移物プール、前立腺癌異種移植片プール、及びリンパ節への前立腺転移物において検出された。
【０２２９】
リンパ腫患者標本におけるＳＴＥＡＰ−１の発現（図１４（ｆ））。第１鎖ｃＤＮＡを、リンパ腫患者標本のパネルから調製した。アクチンに対するプライマーを使用して、ＰＣＲによって、正規化を実施した。ＳＴＥＡＰ−１に対するプライマーを使用する半定量的ＰＣＲを、２６及び３０サイクルの増幅で実施した。試料をアガロースゲル上に流し、Ａｌｐｈａｌｍａｇｅｒソフトウェアを使用してＰＣＲ産物を定量した。発現は、シグナルがそれぞれ増幅の２６又は３０サイクルで検出された場合に強い又は中程度と記録し、増幅の３０サイクルでさえシグナルが検出されない場合にはなしと記録した。結果は、試験した１１の腫瘍標本のうち８（７２．７％）においてＳＴＥＡＰ−１の発現を示している。
【０２３０】
実施例５：ＳＴＥＡＰ−１のスプライシング変異体
転写産物変異体は、選択的転写又は選択的スプライシングによって生じる同一遺伝子からの成熟ｍＲＮＡの変異体である。選択的転写産物は、同一遺伝子からの転写産物であるが、異なる点で転写を開始する。スプライシング変異体は、同一転写産物から異なってスプライシングされたｍＲＮＡ変異体である。真核生物において、複数エキソンの遺伝子が、ゲノムＤＮＡから転写される場合、最初のＲＮＡがスプライシングされて、エキソンのみを有しアミノ酸配列への翻訳に使用される機能的ｍＲＮＡが産生される。従って、所定の遺伝子は、ゼロから多くの選択的転写産物を有し得、各転写産物は、ゼロから多くのスプライシング変異体を有し得る。各転写産物変異体は、独特のエキソン構成を有し、本来の転写産物由来の異なるコード部分及び／又は非コード部分（５’末端又は３’末端）を有し得る。転写産物変異体は、同一又は同様の機能を有する同一又は異なるタンパク質をコードしても、異なる機能を有するタンパク質をコードしてもよく、同一の時点で同一組織に発現しても、同一の時点で異なる組織に発現しても、異なる時点で同一の組織に発現しても、異なる時点で異なる組織に発現してもよい。転写産物変異体によりコードされるタンパク質は、同様の又は異なる細胞又は細胞外局在化、例えば細胞内に対して分泌型を有し得る。
【０２３１】
転写産物変異体は、当該分野において受け入れられた様々な方法によって同定される。例えば、選択的な転写産物及びスプライシング変異体は、全長クローニング実験によって、又は全長転写産物及びＥＳＴ配列の使用によって、同定される。第１に、全てのヒトＥＳＴを、互いに直接的又は間接的に同一性を示すクラスターにグループ化した。第２に、同一クラスター中のＥＳＴを更に、サブクラスターにグループ化し、コンセンサス配列に集合させた。オリジナルの遺伝子配列を、コンセンサス配列又は他の全長配列と比較する。各コンセンサス配列は、その遺伝子についての潜在的なスプライシング変異体である（例えば、Kan, Z.ら, Gene structure prediction and alternative splicing analysis using genomically aligned ESTs, Genome Research, 2001 May,11 (5):889-900を参照）。全長クローンではない変異体が同定された場合でさえ、その変異体のその部分は、当該分野において知られている技術を使用する抗原生成及び全長スプライシング変異体の更なるクローニングに非常に有用である。
更に、ゲノム配列に基づいて転写産物変異体を同定するコンピュータープログラムが当該分野において利用可能である。ゲノムベースの転写産物変異体同定プログラムとしては、ＦｇｅｎｅｓＨ（A. Salamov及びV. Solovyev, "Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA, " Genome Research. 2000 April; 10(4):516-22)；Grail (URL compbio.ornLgov/Grail-bin/EmptyGraiIForm）及びＧｅｎＳｃａｎ（URL genes.mit.edu/GENSCAN.html）が挙げられる。スプライシング変異体同定プロトコルの一般的検討については、例えば、Southan, C., A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 2001 Jun 8; 498 (2-3):214-8；de Souza, S. J.ら, Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc. Natl Acad Sci U S A. 2000 Nov 7; 97(23):12690-3を参照。
【０２３２】
転写産物変異体のパラメーターを更に確認するために、様々な技術、例えば全長クローニング、プロテオミックバリデーション（proteomic validation）、ＰＣＲベースの確認、及び５’ＲＡＣＥ確認などが当該分野において利用可能である（例えば、プロテオミックバリデーション：Brennan, S.O.ら, Albumin banks peninsula: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry, BiochemBiophys Acta. 1999 Aug 17;1433(1-2):321-6；Ferranti Pら, Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(s1)-casein, Eur J Biochem. 1997 Oct 1;249(1):1-7。ＰＣＲベースの確認：Wellmann Sら, Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology, Clin Chem. 2001 Apr;47 (4):654-60；Jia, H.P.ら, Discovery of new human betadefensins using a genomics-based approach, Gene. 2001 Jan 24; 263 (1-2):211-8。ＰＣＲベース及び５’ＲＡＣＥ確認：Brigle, K. E.ら, Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 1997 Aug 7; 1353(2): 191-8を参照のこと）。
【０２３３】
ゲノム領域が癌において調節されることは、当該分野において知られている。遺伝子がマッピングされるゲノム領域が特定の癌において調節される場合、その遺伝子の選択的な転写産物又はスプライシング変異体もまた調節される。ＳＴＥＡＰ−１は癌に関連する特定の発現プロファイルを有するということがここに開示される。ＳＴＥＡＰ−１の選択的な転写産物及びスプライシング変異体はまた、同一又は異なる組織における癌に関与し得、従って腫瘍関連マーカー／抗原となる。
ＳＴＥＡＰ−１ｖ．１と示される本来の転写物のエキソン組成は、表ＬＩＩＩに示される。全長遺伝子及びＥＳＴ配列を使用して、２つの転写変異体を同定し、ＳＴＥＡＰ−１ｖ．２及びｖ．３と名付けた。ＳＴＥＡＰ−１ｖ．１と比較して、転写変異体ＳＴＥＡＰ−１ｖ．２は、図１１に示すように、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１のイントロン４がスプライシングされておらず、変異体ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．３は、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１のイントロン４から１つの更なるエキソンがスプライシングにより失われている。理論的には、空間的順番でのエキソンの異なる組合わせ、例えばエキソン２及び３の各々は、潜在的スプライシング変異体である。図１１は、転写変異体のエキソンの模式的整列を示す。
【０２３４】
実施例６：ＳＴＥＡＰ−１の単一ヌクレオチド多型
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、特定の位置でのヌクレオチド配列中の単一塩基対変異である。ゲノムの任意の所定の点で、可能性のある４つの塩基対（Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｇ／Ｃ及びＴ／Ａ）が存在する。遺伝子型は、個体のゲノム中の一又は複数の位置の特定の塩基対配列をいう。ハプロタイプは、しばしば、一つの遺伝子の場合でか又は幾つかの密接に連鎖した遺伝子の場合で、同一のＤＮＡ分子（又は、高等生物における同一の染色体）上の一より多い位置の塩基対配列をいう。ｃＤＮＡ上に生じるＳＮＰは、ｃＳＮＰと呼ばれる。これらのｃＳＮＰは、その遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸を変化させ、よってそのタンパク質の機能を変化させ得る。幾つかのＳＮＰは、遺伝的疾患を生じる；他のＳＮＰは、表現型における定量的改変及び個体での食餌及び薬物を含む環境因子に対する反応に寄与する。よって、ＳＮＰ及び／又は対立遺伝子の組合わせ（ハプロタイプと呼ばれる）は、遺伝的疾患の診断、薬物反応及び投薬量の決定、疾患に応答性の遺伝子の同定、及び個体間での遺伝的関係の分析を含む多くの用途を有する（P. Nowotny, J. M. Kwon及びA. M. Goate, "SNP analysis to dissect human traits," Curr. Opin. Neurobiol. 2001 Oct; 11(5):637-641；M. Pirmohamed及びB. K. Park, "Genetic susceptibility to adverse drug reactions, "Trends Pharmacol. Sci. 2001 Jun; 22(6):298- 305；J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai及びA. Roses,"The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes, "Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1):39-47；R. Judson, J. C. Stephens及びA. Windemuth, "The predictive power of haplotypes in clinical response, " Pharmacogenomics. 2000 Feb. ; 1(1):15-26）。
【０２３５】
ＳＮＰは、当該分野において受容された様々な方法（P. Bean, "The promising voyage of SNP target discovery, "Am. Clin. Lab. 2001 Oct-Nov; 20 (9):18-20; K. M. Weiss, "In search of human variation, "Genome Res. 1998 Jul; 8 (7):691-697; M. M. She, "Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies, " Clin. Chem. 2001 Feb; 47 (2):164-172）によって同定される。例えば、ＳＮＰは、ゲルベースの方法、例えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）及び変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）によって多型を示すＤＮＡ断片を配列決定することによって同定される。これらはまた異なる個体からプールされたＤＮＡ試料の直接配列決定によって、又は異なるＤＮＡ試料からの配列を比較することによって、見出され得る。公的データベース及び私的データベースにおける配列データ迅速な蓄積を用いて、コンピュータープログラム（Z. Gu, L. Hillier 及びP. Y. Kwok, "Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace," Hum. Mutat. 1998; 12(4):221-225）を使用して配列を比較することによってＳＮＰが見出され得る。ＳＮＰが確認され得、個々の遺伝型又はハプロタイプは、直接配列決定及びハイスループットマイクロアレイを含む様々な方法によって決定され得る（P. Y. Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms, "Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2: 235-258；M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines及びA. Duesterhoeft, "High-throughput SNP genotyping with the Masscode system," Mol. Diagn. 2000 Dec; 5(4):329-340）。
【０２３６】
上述の方法を使用して、１４のＳＮＰを、ＳＴＥＡＰ−１ｖ．２と命名したクローンＧＴＨ９由来の転写物中、６０２位（Ｃ／Ｇ）、３８６位（Ｃ／Ｔ）、１０８７位（Ｔ／Ｇ）、１４４７位（Ｔ／Ｃ）、１６２１位（Ａ／Ｔ）、１６２５位（Ｇ／Ｔ）、１７１６位（Ｃ／Ａ）、２３５８位（Ｃ／Ｔ）、２６４６位（Ｔ／Ｇ）、２８５９位（Ｔ／Ｇ）、２９０８位（Ａ／Ｔ）、３００６位（Ｇ／Ｃ）、３１０７位（Ｃ／Ｔ）、及び３１８０位（Ａ／Ｔ）に同定した。選択的な対立遺伝子を有する転写物又はタンパク質を、それぞれ変異体ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．４、ｖ．５、ｖ．６、ｖ．７、ｖ．８、ｖ．９、ｖ．１０、ｖ．１１、ｖ．１２、ｖ．１３、ｖ．１４、ｖ．１５、ｖ．１６及びｖ．１７と名付けた。図１０は、ＳＮＰ変異体の模式的整列を示す。図１２は、ヌクレオチド変異体に対応するタンパク質変異体の模式的整列を示す。ＳＮＰのこれらの対立遺伝子は、ここで別々に示されるが、異なる組み合わせ（ハプロタイプ）、及びＳＮＰの配列背景を含む転写変異体の何れか一つ（例えば、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１及びｖ．３）において生じ得る。例えば、最初の２つのＳＮＰは、同じ位置でＳＴＥＡＰ−１ ｖ．３上にもあったが、それぞれ５７２位及び３５６位では、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１上にあった。
【０２３７】
実施例７：原核生物系での組換えＳＴＥＡＰ−１の産生
原核生物細胞において組換えＳＴＥＡＰ−１及びＳＴＥＡＰ−１変異体を発現させるために、全長又は部分長のＳＴＥＡＰ−１及びＳＴＥＡＰ−１変異体ｃＤＮＡ配列を、当該分野において知られている様々な発現ベクターの何れか一つにクローニングする。ＳＴＥＡＰ−１由来の全長ｃＤＮＡ、又は任意の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれより多くの連続アミノ酸、変異体、もしくはそのアナログを使用する。
Ａ．インビトロ転写及び翻訳構築物
ｐＣＲＩＩ：  ＲＮＡインサイツ研究のためのＳＴＥＡＰ−１のセンス及びアンチセンスＲＮＡプローブを作製するために、ＳＴＥＡＰ−１ｃＤＮＡの全体又は断片の何れかをコードするｐＣＲＩＩ構築物（Invitrogen, Carlsbad, CA）を作製する。ｐＣＲＩＩベクターは、挿入物に隣接して、ＲＮＡインサイツハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして使用するためのＳＴＥＡＰ−１ ＲＮＡの転写を誘導するＳｐ６プロモーター及びＴ７プロモーターを有する。これらのプローブを、ＲＮＡレベルでのＳＴＥＡＰ−１の細胞発現及び組織発現を分析するために用いる。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子のｃＤＮＡアミノ酸コード領域を表す転写ＳＴＥＡＰ−１ ＲＮＡを、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を合成するためのTnTTM Coupled Reticulolysate System（Promega, Crop., Madison, WI）のようなインビトロでの翻訳系において用いる。
【０２３８】
Ｂ．細菌構築物
ｐＧＥＸ構築物：  グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質に融合されている組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質を細菌中で産生するために、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡ又は変異体の全て又は一部を、ｐＧＥＸファミリーのＧＳＴ−融合ベクター（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）中にクローニングする。これらの構築物は、アミノ末端で融合したＧＳＴ及びカルボキシル末端の６個のヒスチジンのエピトープ（６Ｘ Ｈｉｓ）を有する組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列の制御された発現を可能にする。このＧＳＴ及び６Ｘ Ｈｉｓタグは、適切なアフィニティーマトリクスを用いる、誘導された細菌からの組換え融合タンパク質の精製を可能にし、抗ＧＳＴ抗体及び抗Ｈｉｓ抗体を用いる融合タンパク質の認識を可能にする。６Ｘ Ｈｉｓタグは、例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端のクローニングプライマーへ６つのヒスチジンコドンを付加することにより作製される。タンパク質切断部位、例えばｐＧＥＸ−６Ｐ−１中のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭ認識部位を用いて、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質からＧＳＴタグの切断を可能にし得る。アンピシリン耐性遺伝子及びｐＢＲ３２２起源は、大腸菌中でのｐＧＥＸプラスミドの選択及び維持を可能にする。
【０２３９】
ｐＭＡＬ構築物：  マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合された組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質を細菌中で産生するために、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全て又は一部を、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ及びｐＭＡＬ−ｐ２Ｘベクター（New England Biolabs, Beverly, MA）へとクローニングすることによりＭＢＰ遺伝子に融合する。これらの構築物は、アミノ末端で融合したＭＢＰ及びカルボキシル末端の６Ｘ Ｈｉｓエピトープを有する組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列の制御された発現を可能にする。このＭＢＰ及び６Ｘ Ｈｉｓタグは、適切なアフィニティーマトリクスを用いる誘導された細菌からの組換え融合タンパク質の精製を可能にし、抗ＭＢＰ抗体及び抗Ｈｉｓ抗体を用いる融合タンパク質の認識を可能にする。６Ｘ Ｈｉｓエピトープタグは、３’クローニングプライマーへの６つのヒスチジンコドンの付加により作製される。Ｘａ因子認識部位は、ＳＴＥＡＰ−１からのｐＭＡＬタグの切断を可能にする。ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘベクター及びｐＭＡＬ−ｐ２Ｘベクターは、それぞれ、細胞質又は周辺質において組換えタンパク質を発現するように最適化される。周辺質発現は、ジスルフィド結合を有するタンパク質の折畳みを増大させる。
【０２４０】
ｐＥＴ構築物：  細菌細胞中でＳＴＥＡＰ−１を発現させるために、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全て又は一部を、ｐＥＴファミリーのベクター（Novagen, Madison, WI）へとクローニングする。これらのベクターは、可溶性を増大させるタンパク質、例えばＮｕｓＡ及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）、及び組換えタンパク質の精製及び検出を補助するエピトープタグ（例えば、６Ｘ Ｈｉｓ及びＳ−タグＴＭ）への融合を伴って及び伴わないで、細菌中での組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質の緊密に制御された発現を可能にする。例えば、構築物を、ｐＥＴ ＮｕｓＡ融合系４３．１を利用して作製して、その結果、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の領域を、ＮｕｓＡへのアミノ末端融合物として発現する。
【０２４１】
Ｃ．酵母構築物：
ｐＥＳＣ構築物：  組換えタンパク質の産生及び機能研究のために、酵母種パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）においてＳＴＥＡＰ−１を発現させるために、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全て又は一部を、その各々が４つの選択マーカー、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、及びＵＲＡ３の一つを含むｐＥＳＣファミリーのベクター（Stratagene, La Jolla, CA）へとクローニングする。これらのベクターは、同じ酵母細胞中にＦｌａｇＴＭ又はＭｙｃエピトープタグの何れかを含む２つまでの異なる遺伝子又はクローン化された配列の同じプラスミドからの、制御された発現を可能にする。この系は、ＳＴＥＡＰ−１のタンパク質−タンパク質相互作用を確認するために有用である。更に、酵母における発現は、真核生物細胞において発現される場合に見出される翻訳後修飾に類似の翻訳後修飾、例えばグリコシル化及びリン酸化を生じる。
【０２４２】
ｐＥＳＰ構築物：  酵母種サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）においてＳＴＥＡＰ−１を発現させるために、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全て又は一部を、ｐＥＳＰファミリーのベクターにクローニングする。これらのベクターは、アミノ末端又はカルボキシル末端の何れかで、組換えタンパク質の精製を補助するＧＳＴへ融合されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列の制御された高レベル発現を可能にする。ＦｌａｇＴＭエピトープタグは、抗ＦｌａｇＴＭ抗体を用いる組換えタンパク質の検出を可能にする。
【０２４３】
実施例８：高等真核生物系での組換えＳＴＥＡＰ−１の産生
Ａ．哺乳動物構築物：
真核生物細胞において組換えＳＴＥＡＰ−１を発現させるために、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡ配列の全長又は部分長を、当該分野で知られている様々な発現ベクターの何れか一つへとクローニングし得る。ＳＴＥＡＰ−１の次の領域の一又は複数が、これらの構築物において発現される：ＳＴＥＡＰ−１ｖ．１、ｖ．４のアミノ酸１〜３３９、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２のアミノ酸１〜２５８、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．３のアミノ酸１〜２８２、；又はＳＴＥＡＰ−１由来の任意の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０又はそれ以上の連続するアミノ酸、これらの変異体もしくはアナログ。ある実施態様では、特定の位置でアミノ酸をコードするＳＴＥＡＰ−１の特定の変異体の領域が発現され、これは、その位置で見いだされる任意の他の変異体のアミノ酸とは異なる。他の実施態様では、その変異体に特有の配列内に部分的に又は全体的に存在するＳＴＥＡＰ−１の変異体の領域が発現される。
構築物は、２９３Ｔ細胞のような広範な様々な哺乳動物細胞の何れか一つへとトランスフェクトされ得る。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞溶解産物は、ここに記載される、抗ＳＴＥＡＰ−１ポリクローナル血清を用いてプローブされ得る。
【０２４４】
ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ構築物：  哺乳動物細胞においてＳＴＥＡＰ−１を発現させるために、ＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦ又はその一部を、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ（Invitrogen, Carlsbad, CA）へとクローン化する。タンパク質発現を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びＳＰ１６翻訳エンハンサーから誘導する。この組換えタンパク質は、アミノ末端に融合されたＸｐｒｅｓｓＴＭ及び６つのヒスチジン（６Ｘ Ｈｉｓ）エピトープを有する。このｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘベクターはまたラージＴ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製及び単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を亢進するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列を含む。ゼオシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子及びＣｏｌＥ１起源は、大腸菌におけるプラスミドの選択及び維持を可能にする。
【０２４５】
ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物：  哺乳動物細胞においてＳＴＥＡＰ−１を発現させるために、コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を有するＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦを又はその一部を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ（Invitrogen, Carlsbad, CA）へとクローニングした。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから誘導される。この組換えタンパク質は、カルボキシル末端に融合されたｍｙｃエピトープ及び６Ｘ Ｈｉｓエピトープを有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターはまたラージＴ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製及び単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子を用い得るが、これは、ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子及びＣｏｌＥ１起源は、大腸菌におけるプラスミドの選択及び維持を可能にするからである。
【０２４６】
ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ構築物：  哺乳動物細胞においてＳＴＥＡＰ−１を発現し、蛍光を用いる組換えタンパク質の検出を可能にするために、コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を有するＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦ又はその一部を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（Invitrogen, CA）へとクローン化する。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから誘導される。組換えタンパク質は、非侵襲的にインビボでの検出及び細胞生物学研究を容易にする、カルボキシル末端に融合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯベクターはまたラージＴ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製及び単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子及びＣｏｌＥ１起源は、大腸菌におけるプラスミドの選択及び維持を可能にする。アミノ末端ＧＦＰ融合物を有する更なる構築物は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の全体の長さにわたるｐｃＤＮＡ３．１／ＮＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯにおいて作製される。
【０２４７】
ＰＡＰｔａｇ：  ＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦ又はその一部を、ｐＡＰｔａｇ−５（GenHunter Crop. Nashville, TN）へとクローン化する。この構築物は、アミノ末端にＩｇＧκシグナル配列を融合しながら、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質のカルボキシル末端のアルカリホスファターゼ融合物を作製する。アミノ末端ＩｇＧκシグナル配列とアルカリホスファターゼがＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ末端に融合されている構築物もまた作製される。得られた組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の培地への分泌に最適化され、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質と相互作用するリガンド又はレセプターのようなタンパク質を同定するために用いられ得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導され、組換えタンパク質はまた検出及び精製を容易にするカルボキシル末端で融合されたｍｙｃエピトープ及び６Ｘ Ｈｉｓエピトープを含む。ベクター中に存在するゼオシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子は大腸菌中のプラスミドの選択を可能にする。
【０２４８】
ｐｔａｇ５：  ＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦ又はその部分を、ｐＴａｇ−５へとクローン化した。このベクターは、ｐＡＰｔａｇに類似するが、アルカリホスファターゼ融合物を含まない。この構築物は、アミノ末端ＩｇＧκシグナル配列、並びに検出及びアフィニティー精製を容易にするカルボキシル末端のｍｙｃエピトープタグ及び６Ｘ Ｈｉｓエピトープタグを有するＳＴＥＡＰ−１タンパク質を産生した。得られた組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質を、トランスフェクトした哺乳動物細胞の培地への分泌のために最適化し、免疫原、又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質と相互作用するリガンド又はレセプターのようなタンパク質を同定するためのリガンドとして用いた。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導した。ベクターに存在するゼオシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子は大腸菌中のプラスミドの選択を可能にする。
【０２４９】
ＰｓｅｃＦｃ：  ＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦ、又はその部分をまたｐｓｅｃＦｃへとクローン化した。このｐｓｅｃＦｃベクターをヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ）Ｆｃ（ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域）をｐＳｅｃＴａｇ２（Invitrogen, California）へとクローニングすることにより構築した。この構築物は、Ｎ末端にＩｇＧκシグナル配列を融合しながら、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質のカルボキシル末端のＩｇＧ１ Ｆｃ融合物を作製する。マウスＩｇＧ１ Ｆｃ領域を利用するＳＴＥＡＰ−１融合物もまた用いる。得られた組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質を、トランスフェクトした哺乳動物細胞の培地への分泌について最適化し、免疫原として又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質と相互作用するリガンド又はレセプターのようなタンパク質を同定するために用い得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導される。ベクター中に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子は、大腸菌中のプラスミドの選択を可能にする。
【０２５０】
ｐＳＲα構築物：  ＳＴＥＡＰ−１を構成的に発現する哺乳動物細胞株を作製するために、ＳＴＥＡＰ−１のＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦ又はその一部を、ｐＳＲα構築物へとクローン化した。両栄養性レトロウイルス及びエコトロピックレトロウイルスを、それぞれ、２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング株へのｐＳＲα構築物の形質移入、又はｐＳＲα及びヘルパープラスミド（欠失したパッケージング配列を含む）の２９３細胞への同時形質移入により作製した。このレトロウイルスを、様々な哺乳動物細胞株を感染させるために用いて、クローン化された遺伝子であるＳＴＥＡＰ−１の宿主細胞株への組み込みを生じた。タンパク質発現は、長い末端反復配列（ＬＴＲ）から誘導される。ベクター中に存在するネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子及びＣｏｌＥ１起源は、大腸菌中のプラスミドの選択及び維持を可能にする。その後、このレトロウイルスベクターを、例えば、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＴｓｕＰｒｌ細胞、２９３細胞、又はｒａｔ−１細胞を用いる、様々な細胞株の感染及び産生のために用いた。
更なるｐＳＲα構築物を、抗Ｆｌａｇ抗体を用いる検出を可能にするために、ＳＴＥＡＰ−１配列のカルボキシル末端に、ＦＬＡＧＴＭタグのようなエピトープタグを融合して作製する。例えば、ＦＬＡＧＴＭ配列５’ｇａｔ ｔａｃ ａａｇ ｇａｔ ｇａｃ ｇａｃ ｇａｔ ａａｇ３’（配列番号８０）を、ＯＲＦの３’末端のクローニングプライマーに付加する。更なるｐＳＲα構築物を、全長ＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ末端及びカルボキシル末端のＧＦＰ及びｍｙｃ／６Ｘ Ｈｉｓ融合タンパク質の両方を産生させるために作製した。
【０２５１】
更なるウイルスベクター：  更なる構築物を、ＳＴＥＡＰ−１のウイルス媒介送達及び発現のために作製する。ＳＴＥＡＰ−１の高レベル発現につながる高ウイルス力価は、アデノウイルスベクター及びヘルペスアンプリコンベクターのようなウイルス送達系において達成される。ＳＴＥＡＰ−１コード配列又はその断片は、ＰＣＲにより増幅され、ＡｄＥａｓｙシャトルベクター（Stratagene）へとサブクローニングされる。組換え及びウイルスパッケージングを、アデノウイルスベクターを作製するための製造業者の指示書に従って実施する。あるいは、ＳＴＥＡＰ−１コード配列又はその断片を、ＨＳＶ−１ベクター（Imgenex）へとクローニングして、ヘルペスウイルスベクターを作製する。その後、このウイルスベクターを、ＰＣ３、ＮＩＨ ３Ｔ３、２９３又はｒａｔ−１細胞のような様々な細胞株の感染のために用いる。
【０２５２】
調節された発現系：  哺乳動物細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現を制御するために、ＳＴＥＡＰ−１のコード配列又はその部分を、Ｔ−Ｒｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）、及びｔｉｇｈｔｌｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｃｄｙｓｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Stratagene）のような調節された哺乳動物発現系へとクローニングする。これらの系は、組換えＳＴＥＡＰ−１の時間依存効果及び濃度依存効果の研究を可能にする。その後、これらのベクターは、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、２９３細胞、又はｒａｔ−１細胞のような様々な細胞株におけるＳＴＥＡＰ−１の発現を制御するために用いられる。
【０２５３】
Ｂ．バキュロウイルス発現系
バキュロウイルス発現系において組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質を産生するために、ＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦ又はその部分を、Ｎ末端にＨｉｓタグを提供するバキュロウイルス移入ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ ４．５（Invitrogen）へとクローニングする。すなわち、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＳＴＥＡＰ−１は、ヘルパープラスミドｐＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Invitrogen）を用いて、ＳＦ９（Spodoptera frugiperda）昆虫細胞へと同時トランスフェクトされて、組換えバキュロウイルスを作製する（詳細は、Invitrogenの指示マニュアルを参照）。ついで、バキュロウイルスを、細胞上清から収集し、プラークアッセイにより精製する。
ついで、組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質を、精製したバキュロウイルスを用いるＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（Invitrogen）の感染により作製する。組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質を、抗ＳＴＥＡＰ−１又は抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出し得る。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を、精製し、様々な細胞ベースのアッセイにおいて、又はＳＴＥＡＰ−１に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作製するための免疫原として用い得る。
【０２５４】
実施例９：抗原性プロフィール及び二次構造
図５（ａ）〜９（ａ）及び５（ｂ）〜９（ｂ）は、それぞれ、ＳＴＥＡＰ−１変異体１及び３の５つのアミノ酸プロファイルを図示するものであって、各々の評価は、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバのワールドワイドなウェブのＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト（URL www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）にアクセスすれば可能である。
これらのプロファイル：図５（ａ）及び（ｂ）、親水性（Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828）；図６（ａ）及び（ｂ）、ヒドロパシー（Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132）；図７（ａ）及び（ｂ）、露出残基パーセント（Janin J., 1979 Nature 277:491-492）；図８（ａ）及び（ｂ）、平均フレキシビリティ（Bhaskaran R.及びPonnuswamy P.K. 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255）；図９（ａ）及び（ｂ）、βターン（Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294）；及び場合によっては、例えば、ＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトにあるような、当該分野で利用可能な他のものを用いてＳＴＥＡＰ−１タンパク質の抗原領域を同定した。ＳＴＥＡＰ−１の上記アミノ酸プロファイルの各々を、分析のために次のＰｒｏｔＳｃａｌｅパラメーターを用いて作成した：１）ウィンドウサイズ９；２）ウィンドウセンターと比較したウィンドウエッジの１００％ウェイト；及び３）０と１との間にあるように正規化されたアミノ酸プロファイル値。
親水性（図５（ａ）及び（ｂ））、ヒドロパシー（図６（ａ）及び（ｂ））及び露出残基パーセント（図７（ａ）及び（ｂ））プロファイルを使用して、親水性アミノ酸のストレッチ（すなわち、ヒドロパシープロファイル及び露出残基プロファイルで０．５より大きい値と、ヒドロパシープロファイルで０．５より小さい値）を決定した。そのような領域は、水性環境に曝される可能性があり、タンパク質表面上に存在する可能性があり、よって例えば抗体による免疫認識に利用可能である。
【０２５５】
平均フレキシビリティ（図８（ａ）及び（ｂ））及びβターン（図９（ａ）及び（ｂ））プロファイルは、二次構造、例えば、βシート及びαヘリックスにおいて拘束されていないアミノ酸（すなわち、βターンプロファイル及び平均フレキシビリティプロファイルで０．５より大きい値）のストレッチを決定する。そのような領域はまたタンパク質の露出した部分である可能性がより高く、よって例えば抗体による免疫認識に利用可能である。
例えば、図５（ａ）及び（ｂ）、図６（ａ）及び（ｂ）、図７（ａ）及び（ｂ）、図８（ａ）及び（ｂ）、及び／又は図９（ａ）及び（ｂ）に記載のプロファイルにより示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質及び変異体タンパク質の抗原性配列を使用して、ペプチドか又はペプチドをコードする核酸の何れかの免疫原を調製して、治療用及び診断用の抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を産生する。免疫原は、図２及び３に列挙されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質変異体由来の任意の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、又は５０個より長い連続アミノ酸、又はそれをコードする対応の核酸であり得る。特に、本発明のペプチド免疫原は、図５（ａ）及び（ｂ）の親水性度プロファイルにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む任意の整数増分にて図２及び３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；図６（ａ）及び（ｂ）のヒドロパシープロファイルにおいて０．５未満の値を有するアミノ酸位置を含む任意の整数増分にて図２及び３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；図７（ａ）及び（ｂ）の露出残基パーセントプロファイルにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む任意の整数増分にて図２及び３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；図８（ａ）及び（ｂ）の平均フレキシビリティプロファイルにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む任意の整数増分にて図２及び３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；及び図９（ａ）及び（ｂ）のβ−ターンプロファイルにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む任意の整数増分にて図２及び３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域を含み得る。本発明のペプチド免疫原はまた上記の何れかをコードする核酸をまた含み得る。
【０２５６】
本発明の全ての免疫原、ペプチド又は核酸は、ヒト単位投薬形態で具体化でき、又はヒトの生理に適合性がある薬学的賦形剤を含む組成物に含有せしめられうる。
ＳＴＥＡＰ−１変異体１及び変異体３の二次構造、すなわち、αヘリックス、伸長鎖、及びランダムコイルの予想される存在及び位置は、ワールドワイドなウェブ（.expasy.ch./tools/）にあるＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバからアクセスされるＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Guermeur, 1997, http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を使用して、それぞれの一次アミノ酸配列から推定される。該分析は、ＳＴＥＡＰ−１変異体１が、６４．６０％のαヘリックス、４．７２％の伸長鎖、及び３０．６８％のランダムコイルから構成されることを示す（図１３ａ）。ＳＴＥＡＰ−１変異体２は、６２．７９％のαヘリックス、３．１０％の伸長鎖、及び３４．１１％のランダムコイルから構成される（図１３ｂ）。ＳＴＥＡＰ−１変異体３は、５８．８７％のαヘリックス、５．３２％の伸長鎖、及び３５．８２％のランダムコイルから構成される（図１３ｃ）。
ＳＴＥＡＰ−１変異体中の膜貫通ドメインの潜在的存在の分析を、ワールドワイドなウェブ（.expasy.ch./tools/）にあるＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバからアクセスされる様々な膜貫通推定アルゴリズムを使用して実施した。図示されるのは、ＴＭｐｒｅｄプログラム（図１３ｄ）及びＴＭＨＭＭプログラム（図１３ｅ）を使用する６つの膜貫通ドメインの存在及び位置を示す変異体１の分析結果を使用した６つの膜貫通ドメインの存在及び位置を示す変異体１の分析の結果である。また示されるのは、ＴＭｐｒｅｄ（図１３ｆ）を使用した４つの膜貫通ドメイン及びＴＭＨＭＭ（図１３ｇ）を使用した３つの膜貫通ドメインの存在及び位置を示す変異体２の分析の結果である。変異体３の分析は、ＴＭｐｒｅｄ（図１３ｈ）を使用する４つの膜貫通ドメイン及びＴＭＨＭＭ（図１３ｉ）を使用する３つの膜貫通ドメインの位置を予測する。各プログラムの結果、つまり、膜貫通ドメインをコードするアミノ酸は、表ＸＸにまとめる。
【０２５７】
実施例１０：ＳＴＥＡＰ−１ポリクローナル抗体の産生
ポリクローナル抗体を、例えば、免疫化剤及び所望される場合はアジュバントの一又は複数回の注射によって、哺乳動物において惹起し得る。典型的には、その免疫化剤及び／又はアジュバントは、複数回の皮下注射又は腹腔内注射によって哺乳動物に注射される。全長ＳＴＥＡＰ−１タンパク質での免疫化に加えて、アミノ酸配列分析に基づいて、抗原性で免疫される宿主の免疫系による認識に利用可能な特徴を含む免疫原の設計において、コンピューターアルゴリズムが用いられる（「抗原性プロファイルと二次構造」と題した実施例を参照）。そのような領域は、親水性で、可撓性であり、β−ターン立体配座の状態であり、そのタンパク質の表面に露出していることが予想される（例えば、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質変異体１及び３のそのような領域を示すアミノ酸プロファイルについて、図５（ａ）及び（ｂ）、図６（ａ）及び（ｂ）、図７（ａ）及び（ｂ）、図８（ａ）及び（ｂ）、及び／又は図９（ａ）及び（ｂ）を参照）。
例えば、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質変異体の親水性、可撓性、β−ターン領域を含むＳＴＥＡＰ−１細菌組換え融合タンパク質又はペプチドを、ニュージーランドホワイトウサギにおいてポリクローナル抗体を、又は「ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の産生」と題された実施例に記載されているモノクローナル抗体を産生させるための抗原として使用する。例えば、そのような領域には、限定するものではないが、ＳＴＥＡＰ−１変異体１、２及び３のアミノ酸１〜４０、アミノ酸１４３〜１６５、アミノ酸１８０〜２２０、ＳＴＥＡＰ−１変異体１のアミノ酸３１２〜３３９、及びＳＴＥＡＰ−１変異体３のアミノ酸２５０〜２８２が含まれる。免疫される哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質にその免疫化剤を結合させることが有用である。そのような免疫原性タンパク質の例としては、限定されるものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、及びダイズトリプシンインヒビターが含まれる。一実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１変異体３のアミノ酸２５０〜２８２をコードするペプチドをＫＬＨに結合させる。ついでこのペプチドを免疫原として使用する。あるいは、免疫化剤は、ＳＴＥＡＰ−１変異体タンパク質、そのアナログ又は融合タンパク質の全てもしくは一部を含み得る。例えば、ＳＴＥＡＰ−１変異体１アミノ酸配列は、当該分野でよく知られている様々な融合タンパク質パートナー、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びＨＩＳタグ融合タンパク質の何れか一つに、組換えＤＮＡ技術を使用して融合され得る。他の実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１変異体１のアミノ酸２５０〜２８２は、組換え技術とｐＧＥＸ発現ベクターを使用してＧＳＴに融合され、発現され、精製され、ウサギを免疫するために使用される。そのような融合タンパク質は適切なアフィニティーマトリックスを使用して誘導した細菌から精製する。
【０２５８】
使用し得る他の組換え細菌融合タンパク質には、マルトース結合タンパク質、ＬａｃＺ、チオレドキシン、ＮｕｓＡ、又は免疫グロブリン定常領域が含まれる（「原核生物系におけるＳＴＥＡＰ−１の産生」と題したセクション及びCurrent Protocols In Molecular Biology, Volume 2, Unit 16, Frederick M. Ausubelら編, 1995；Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N., 及びLedbetter, L.(1991) J. Exp. Med. 174, 561-566を参照）。
細菌由来融合タンパク質に加えて、哺乳動物により発現されるタンパク質抗原もまた使用される。これらの抗原は、哺乳動物発現ベクター、例えばＴａｇ５及びＦｃ融合ベクターから発現させられ（「真核生物系における組換えＳＴＥＡＰ−１の産生」と題したセクションを参照）、天然タンパク質に見出されるグリコシル化のような翻訳後修飾を保持する。一実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１変異体１のアミノ酸１８５〜２１８を、Ｔａｇ５哺乳動物分泌ベクター中にクローニングし、２９３Ｔ細胞中で発現させた。その組換えタンパク質を、その組換えベクターを安定して発現する２９３Ｔ細胞の組織培養上清から金属キレートクロマトグラフィーによって精製した。ついで、精製Ｔａｇ５ ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を免疫原として使用する。
この免疫化プロトコルの間、宿主動物の免疫応答を増強するアジュバント中に抗原を混合又は乳化させることが有用である。アジュバントの例には、限定されるものではないが、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）が含まれる。
【０２５９】
典型的なプロトコルでは、ウサギに、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に混合したＫＬＨに結合した２００μｇまで、典型的には１００〜２００μｇの融合タンパク質又は融合ペプチドを先ず皮下免疫する。その後、ウサギに、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の２００μｇまで、典型的には１００〜２００μｇの免疫原を、２週間ごとに皮下注射する。各免疫の約７〜１０日後に試験採血を行い、ＥＬＩＳＡにより抗血清の力価をモニターするために使用する。
免疫血清、例えばＳＴＥＡＰ−１変異体１タンパク質のＧＳＴ融合体から取り出したウサギ血清の反応性及び特異性を試験するために、全長ＳＴＥＡＰ−１変異体１ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３．１ｍｙｃ−ｈｉｓ発現ベクター（Invitrogen；「真核生物系における組換えＳＴＥＡＰ−１の産生」と題した実施例を参照）中にクローニングする。２９３Ｔ細胞中にその構築物を形質移入した後、細胞溶解物を、抗ＳＴＥＡＰ−１血清及び抗Ｈｉｓ抗体（Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA）でプローブし、ウェスタンブロット技術を使用して変性ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に対する特異的反応性を決定する。また、２９３Ｔ細胞及び他の組換えＳＴＥＡＰ−１発現細胞に対する蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー及び免疫沈降により、免疫血清を試験し、天然タンパク質の特異的認識を決定する。ＳＴＥＡＰ−１を内因的に発現する細胞を使用したウェスタンブロット、免疫沈降、蛍光顕微鏡、及びフローサイトメトリー技術もまた実施して反応性及び特異性を試験する。
【０２６０】
ＳＴＥＡＰ−１変異体融合タンパク質、例えばＧＳＴ及びＭＢＰ融合タンパク質で免疫したウサギに由来する抗血清を、融合パートナーを単独で又は無関係な融合タンパク質の何れかの場合に含むアフィニティーカラムに通すことにより、融合パートナー配列に対して反応性である抗体を除去することによって精製する。例えば、ＧＳＴ−ＳＴＥＡＰ−１変異体１融合タンパク質から誘導された抗血清を、最初に、ＡｆｆｉＧｅｌマトリックス（BioRad, Hercules, Calif.）に共有結合させたＧＳＴタンパク質のカラムに通すことによって、精製する。ついで、抗血清を、ＡｆｆｉＧｅｌマトリクスに共有結合させたＭＢＰ融合タンパク質からなるカラムを通過させることによってアフィニティー精製する。ついで、血清を、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより更に精製してＩｇＧ画分を単離する。他のＨｉｓタグ化抗原及びペプチドで免疫したウサギ由来の血清並びに融合パートナー除去血清を、元のタンパク質免疫原又は遊離ペプチドからなるカラムマトリックスを通すことによってアフィニティー精製する。
【０２６１】
実施例１１：ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の産生
一実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１変異体に対する治療的ＭＡｂは、ＳＴＥＡＰ−１変異体に結合し、内部移行し、ＳＴＥＡＰ−１変異体の生物学的機能を破壊し又は調節する、各変異体タンパク質に対して特異的でるか又は変異体の間で共通する配列に対して特異的であるエピトープと反応するもの、例えば、リガンド及び結合パートナーとの相互作用を破壊するものを含む。そのようなＭＡｂの産生のための免疫原には、細胞外ドメイン又はＳＴＥＡＰ−１タンパク質変異体配列全体、機能的モチーフを含むことが予想される領域、及びアミノ酸配列のコンピューター分析から抗原性であると推定されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質変異体の領域をコードするか又は含むように設計された免疫原が含まれる（例えば、図５（ａ）−（ｂ）、図６（ａ）−（ｂ）、図７（ａ）−（ｂ）、図８（ａ）−（ｂ）、又は図９（ａ）−（ｂ）、及び「抗原性プロファイル及び二次構造」と題した実施例を参照）。免疫原には、ペプチド、組換え細菌タンパク質、及び哺乳動物に発現されるＴａｇ５タンパク質及びヒト及びマウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質が含まれる。また、ｐＴＡＧ５細胞、高レベルの各々のＳＴＥＡＰ−１変異体、例えば２９３Ｔ−ＳＴＥＡＰ−１変異体１又は３Ｔ３、ＲＡＴ、又は３００．１９−ＳＴＥＡＰ−１変異体１マウスＰｒｅ−Ｂ細胞を発現するように操作されたｐＴＡＧ５細胞をコードするＤＮＡベクターを使用して、マウスを免疫する。
【０２６２】
ＳＴＥＡＰ−１変異体に対するＭＡｂを産生するために、マウスを、典型的には、完全フロイントアジュバント中に混合した１０〜５０μｇのタンパク質免疫原又は１０７個のＳＴＥＡＰ−１発現細胞で、先ず腹腔内に（ＩＰ）又は足蹠に免疫する。使用される他のアジュバントの例はＴｉｔｅｒｍａｘ（Sigma）及びＩｍｍｕｎｅａｓｙ（Qiagen）である。ついで、マウスを、典型的には、不完全フロイントアジュバント中に混合した１０〜５０μｇのタンパク質免疫原又は１０７個の細胞で、２〜４週間ごとに引き続きＩＰ免疫する。あるいは、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバントを免疫化に使用する。上記のタンパク質及び細胞ベースの免疫ストラテジーに加えて、ＳＴＥＡＰ−１変異体配列をコードする哺乳動物発現ベクターを使用してプラスミドＤＮＡの直接注射によりマウスを免疫するＤＮＡベースの免疫プロトコルを使用する。例えば、ＳＴＥＡＰ−１変異体１のアミノ酸１８５〜２１８を、Ｔａｇ５哺乳動物分泌ベクター中にクローニングし、組換えベクターを免疫原として使用する。他の例では、同じアミノ酸を、ＳＴＥＡＰ−１変異体１配列がアミノ末端でＩｇＫリーダー配列に融合し、カルボキシ末端でヒト又はマウスＩｇＧ Ｆｃ領域のコード配列に融合しているＦｃ−融合分泌ベクター中にクローニングさせた。ついで、この組換えベクターを免疫原として使用した。プラスミド免疫プロトコルを、同じベクターから発現された精製タンパク質と、それぞれのＳＴＥＡＰ−１変異体を発現する細胞と組み合わせて、使用した。他の例では、アミノ酸２５０〜２８２をコードするペプチドを使用してＳＴＥＡＰ−１変異体３に対するモノクローナル抗体を産生する。そのペプチドをＫＬＨに結合させ、免疫原として使用する。遊離ペプチドに対するＥＬＩＳＡを用いて免疫反応性クローンを同定する。全長ＳＴＥＡＰ−１変異体１タンパク質に対するモノクローナル抗体の反応性と特異性は、組換え及び内因性発現ＳＴＥＡＰ−１変異体１細胞の双方を使用するフローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、免疫沈降によってモニターされる。
【０２６３】
免疫プロトコルの間に、試験採血を、注射の７〜１０日後に行って、免疫応答の力価及び特異性をモニターする。ひとたび適切な反応性及び特異性が、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、蛍光顕微鏡、及びフローサイトメトリー分析により測定されて得られれば、ついで、融合物及びハイブリドーマの産生を、当該分野でよく知られている確立された手順（例えば、Harlow及びLane, 1988を参照）を用いて実施する。
ＳＴＥＡＰ−１変異体１特異的モノクローナル抗体の結合親和性は標準的な技術を使用して決定した。親和性の測定はエピトープ結合に対する抗体の強さを定量し、当業者に理解されるように、どのＳＴＥＡＰ−１変異体モノクローナル抗体が診断又は治療用途に好ましいかを定めるのを補助するために使用される。ＢＩＡｃｏｒｅ系（Uppsala, Sweden）は結合親和性の測定のための好適な方法である。ＢＩＡｃｏｒｅ系は表面プラズモン共鳴法（SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23: 1；Morton及びMyszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268）を使用して、生体分子相互作用をリアルタイムでモニターする。ＢＩＡｃｏｒｅ分析は簡便には会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数及び親和性定数を生じる。
他のＳＴＥＡＰ−１変異体に特異的なモノクローナル抗体を産生するためには、変異体に独特なアミノ酸配列をコードするように免疫原を設計する。一実施態様では、ＳＴＥＡＰ−１変異体に特有のアミノ酸をコードするペプチドを合成し、ＫＬＨに結合させ、免疫原として使用する。他の実施態様では、変異体中での選択的スプライシングにより生成される独特の配列を包含するペプチド又は細菌融合体タンパク質を作製する。ついで、それぞれの変異体特異的抗原を認識し細胞中で発現される全長変異体タンパク質をまた認識するハイブリドーマを選択する。そのような選択には、ウェスタンブロッティング、免疫沈降及びフローサイトメトリーのようなイムノアッセイが利用される。
【０２６４】
一実施態様では、本発明はＸ９２．１．３０．１．１（１）（ａ．ｋ．ａ．Ｍ２／９２．３０）及びＸ１２０．５４５．１．１（ａ．ｋ．ａ．Ｍ２．１２０．５４５）と命名したモノクローナル抗体を提供する。Ｍ２／９２．３０及びＭ２／１２０．５４５は細胞表面ＳＴＥＡＰ−１と反応し結合することが同定され示されている（図１５及び１８を参照）。図１６は、抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂ Ｍ２／９２．３０が膀胱及び前立腺癌異種移植片細胞に発現される内因性細胞表面ＳＴＥＡＰ−１に結合することを示している。また、Ｍ２／９２．３０は図１７に示すようにマウスＳＴＥＡＰ−１と反応し結合する。
Ｘ９２．１．３０．１．１（１）（ａ．ｋ．ａ．Ｍ２／９２．３０）及びＸ１２０．５４５．１．１（ａ．ｋ．ａ．Ｍ２．１２０．５４５）と命名された抗体は（フェデラルエクスプレス経由で）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）, P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108に２００４年２月０６日に送り、それぞれＰＴＡ−５８０２及びＰＴＡ−５８０３の受託番号があてがわれた。
Ｍ２／Ｘ９２．３０及びＭ２／Ｘ１２０．５４５抗体をクローニングするために、次のプロトコルを使用した。ハイブリドーマ細胞はＴｒｉｚｏｌ試薬(Life Technologies, Gibco BRL)で溶解させた。全ＲＮＡを精製し定量した。第一ストランドｃＤＮＡは、Gibco-BRL Superscript Preamplification系を使用するオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライミングで全ＲＮＡから産生した。ＰＣＲ産物はｐＣＲＳｃｒｉｐｔベクター(Stratagene, La Jolla)にクローニングした。幾つかのクローンを配列決定し、可変重鎖（「ＶＨ」）及び可変軽鎖（「ＶＬ」）領域を決定した。Ｍ２／Ｘ９２．３０及びＭ２／Ｘ１２０．５４５可変重鎖及び軽鎖領域の核酸及びアミノ酸配列を図１９（ａ）〜１９（ｄ）及び図２０（ａ）〜（ｅ）に列挙する。
【０２６５】
実施例１２：ＳＴＥＡＰ−１抗体の特徴付け
Ａ．細胞表面結合
ＳＴＥＡＰ−１抗体のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質との反応性は、必要に応じてＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞又はその抽出物を使用するウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、及びＦＡＣＳ分析を含む多くのよく知られた手段によって確立することができる。図１５は抗ＳＴＥＡＰ−１ ＭＡｂＭ２／９２．３０（１０ｕｇ／ｍｌ）で染色したコントロール又はＳＴＥＡＰ−１を安定に発現する組換え３Ｔ３及びＲａｔ−１細胞のＦＡＣＳ分析を示し、細胞表面結合ＭＡｂをヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次試薬を用いて検出した。ついで、染色された細胞をＦＡＣＳ分析にかけた。それぞれのコントロール細胞と比較したＲａｔ１−ＳＴＥＡＰ−１及び３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞の蛍光シフトによって示されているように、Ｍ２／９２．３０は細胞表面ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合する。
また、ＵＧＢ１膀胱癌細胞及びＬＡＰＣ９前立腺癌細胞を１０ｕｇ／ｍｌのＭＡｂＭ２／９２．３０又はコントロール抗ＫＬＨ ＭＡｂで染色した。表面結合ＭＡｂ９２．３０をヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次Ａｂで検出した。ついで染色された細胞をＦＡＣＳ分析にかけた。これらの結果は、抗ＳＴＥＡＰ−１ ＭＡｂ Ｍ２／９２．３０が膀胱及び前立腺癌異種移植片細胞に発現された内因性細胞表面ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合することを証明している（図２１）。
ＳＴＥＡＰ−１ Ｍ２／９２．３０がまたマウスＳＴＥＡＰ−１タンパク質に結合することが示されている（図１７を参照）。この実験において、２９３Ｔ細胞に、マウスＳＴＥＡＰ１ｃＤＮＡをコードするｐＣＤＮＡ３．１又は空のベクターの何れかを一過性に形質移入した。４８時間後、細胞を収集し、抗ＳＴＥＡＰ１ Ｍ２／９２．３０（１０ｕｇ／ｍｌ）で染色し、細胞表面結合ＭＡｂ９２．３０をヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次試薬で検出した。ついで、細胞をＦＡＣＳ分析にかけた。ＳＴＥＡＰ１ Ｍ２／９２．３０はＳＴＥＡＰ−１を発現した２９３Ｔ細胞に特異的に結合することが示された。
【０２６６】
ＳＴＥＡＰ−１ Ｍ２／１２０．５４５はまたＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合することが示されている（図１８を参照）。３Ｔ３−ｎｅｏ（パネルＡ、塗り潰したヒストグラム）及び３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ１細胞（パネルＡ、塗り潰していないヒストグラム）及びＲａｔ１−ｎｅｏ（パネルＢ、塗り潰したヒストグラム）及びＲａｔ１−ＳＴＥＡＰ細胞（パネルＢ、塗り潰していないヒストグラム）をＭＡｂ Ｍ２／１２０．５４５（１０ｕｇ／ｍｌ）で染色し、表面結合ＭＡｂをヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次Ａｂで検出した。ついで、細胞をＦＡＣＳ分析にかけた。３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ１及びＲａｔ１−ＳＴＥＡＰ１細胞のそれぞれのｎｅｏコントロールと比較した蛍光シフトによって示されるように、ＭＡｂ Ｍ２／１２０．５４５は細胞表面ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合する。パネルＣでは、ＬＮＣａＰ細胞をＭＡｂ Ｍ２／１２０．５４５又はコントロール抗ＫＬＨ ＭＡｂの何れかで染色し、上記のようにしてＦＡＣＳ分析にかけた。パネルＤでは、Ｍ２／１２０．５４５染色ＬＮＣａＰ細胞の蛍光顕微鏡が明るい細胞表面蛍光を示す。
Ｍ２／９２．３０及びＭ２／１２０．５４５の反応性及び特異性をまた免疫沈降によって決定した。図２５は３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ１及び３Ｔ３−ｎｅｏ細胞をＲＩＰＡバッファー（２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．４；１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、及びプロテアーゼインヒビターカクテル）に溶解させたことを示している。細胞可溶化物をプロテインＧセファロースビーズで前もって清澄化し、ついで５ｕｇのＭＡｂ Ｍ２／９２．３０又はＭ２／１２０．５４５と共に室温で２時間インキュベートした。プロテインＧビーズを添加し混合物を１時間更にインキュベートした。免疫複合体を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファーに溶解させた。ついで溶解させた試料を、ウサギ抗ＳＴＥＡＰｐＡｂを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析にかけた。ＳＴＥＡＰ１を形質移入した２９３Ｔ細胞の全細胞可溶化物をまたポジティブコントロールとして流した。〜３７ｋＤの免疫反応バンドが３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ１細胞由来の試料のみに見られ、Ｍ２／９２．３０及びＭ２／１２０．５４５ＭＡｂ双方によるＳＴＥＡＰ１の特異的免疫沈降を示している。
【０２６７】
Ｂ．ＳＴＥＡＰ−１抗体内部移行
モノクローナル抗体を用いる特定の細胞標的に対する毒素の送達に基づく免疫療法は悪性腫瘍の治療におけるモダリティーであると考えられる。一般原理は、正常組織に対して標的細胞上に独特に発現し又は過剰発現している抗原又はレセプターに結合する分子を用いて癌細胞まで毒素又は抗新生物薬を送達することである。
免疫毒素は毒素に共有的に結合した細胞選択的リガンド（通常はモノクローナル抗体又はサイトカイン）からなる。細胞表面レセプターとの抗体又はリガンドの相互作用は内部移行を惹起する。定まった細胞内小胞コンパートメントにおいて、毒素部分がサイトゾルに逃れ、そこでそれは細胞死に至る重要な細胞機能を触媒的に改変する。Frankel AE., Increased Sophistication of Immunotoxins, Clinical cancer research 8: 942-944, (2002)及びAllen TM, Ligand-Targeted Therapeutics in Anti-cancer Therapy. Nature Reviews. 2: 750-760, (2002)を参照。
サポリンは、大リボソームＲＮＡ中の特定のアデニン残基のインビトロ脱プリンを触媒するリボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）である。Endo Yら, Mechanism of Action of the Toxin Lectin Ricin on Eukaryotic Cells；The Site and Characteristics of the Modification in 28S RNA Caused by the Toxin, J. Biol. Chem. 262,5908-5912, (1987)。それは適切なキャリアー分子と複合化しない場合には通常は細胞に入ることはできない。腫瘍抗原を認識するモノクローナル抗体へのサポリンの共有的結合は、癌細胞選択性を有し内部移行もする免疫毒素をつくり出す。Flavell, DJ, Sapoin Immunotoxins, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 234: 51-61, (1998)及びFlavell DJら, Therapy of Human T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia with a Combination of Anti-CD7 and Anti-CD38-Saporin Immunotoxins is Significantly Better than Therapy with Each Individual Immunotoxins. Br. J. Cancer 84: 571-578, (2001)を参照。これらの分子は白血病及び多発性骨髄腫のためのフェーズＩの臨床試験に最近入った。Foon KA. Monoclonal Antibody Therapies for Lymohomas. Cancer J. 6: 273-278, (2000)。
【０２６８】
ＳＴＥＡＰ１ Ｍ２／９２．３０の内部移行は図２２に示す。この実験では、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ１細胞をＭ２／１２０．５４５ＭＡｂ（１０ｕｇ／ｍｌ）で４℃にて染色し、洗浄し、ついでヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次Ａｂと共にインキュベートした。細胞の半分を３０分間３７℃に移動し、他の半分を４℃に維持した。ついで、各処置からの細胞について蛍光顕微鏡観察を実施した。４Ｃのままの細胞は細胞表面の周縁に明るい染色を示した。３７℃に移した細胞は細胞周縁の染色の消失とキャップ形成と内部移行を示す点状で凝集した蛍光の出現を示した。
ＳＴＥＡＰ１ Ｍ２／１２０．５４５ＭＡｂによるＳＴＥＡＰ−１の内部移行は図２３に示す。ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ１細胞をＭ２／１２０．５４５ＭＡｂ（１０ｕｇ／ｍｌ）で４Ｃにて染色し、洗浄し、ついでヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次Ａｂと共にインキュベートした。細胞の半分を３０分間３７Ｃに移動し、他の半分を４Ｃに維持した。ついで、各処置からの細胞について蛍光顕微鏡観察を実施した。４Ｃのままの細胞は明るい「輪状の」細胞表面蛍光を示した。３７Ｃに移した細胞は「輪状の」細胞表面蛍光の消失とキャップ形成と内部移行を示す点状で凝集した蛍光の出現を示した。
【０２６９】
免疫毒素送達のための適切な抗体候補を選択するための一つのアプローチは、薬剤又は毒素分子と結合させた二次抗体での死滅を用いる。二次結合抗体を一次抗体上に抱き合わせ、適切な細胞内コンパートメントに内部移行し輸送（トラフィック）する一次抗体の評価を可能にする。ひとたび結合体が内部移行すると、サポリンが標的薬剤から離脱しリボソームを不活性化して標的細胞を除去する。Kohls MD及びLappi DA. MAb-ZAP: A Tool for Evaluating Antibody Efficacy for Use in an Immunotoxin. Bio Techniques.28(1): 162-165 (2000)。
上記のアプローチを用いて適切な抗体候補を選択するために、二次免疫毒素の抗マウスＩｇＧ−サポリン結合体（Advanced Targeting Systems, San Diego, CA）を使用し、マウスＳｔｅａｐ−１Ｍ２／１２０．５４５がＬＮＣａＰ細胞の細胞表面上のＳｔｅａｐ−１の発現を介して標的細胞に入ることを証明した。次のプロトコルを使用した。ＬＮＣａｐ細胞を９６ウェルプレートに５０００細胞／９０μｌ／ウェルで播種し、一晩インキュベートした。第二の免疫毒素結合体（抗マウスＩｇＧ−サポリン及び抗ヤギＩｇＧ−サポリン）及び抗マウスＩｇＧを、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を含む細胞培地で作製した。１０μｌを各ウェルに添加した。一次抗体は１−１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加する。プレートを７２時間インキュベートし、生存率をＭＴＴアッセイで決定した。図２４の結果は、ＬＮＣａｐ細胞が抗マウスＩｇＧ−サポリンの存在下で死んだことを示している。二次抗体単独（抗マウスＩｇＧ）でも又は非特異的二次抗体結合体（抗ヤギＩｇＧサポリン）でも効果は検出されなかった。１μｇ／ｍｌまで試験した一次抗体（Ｍ２／１２０．５４５）単独の場合に毒性は観察されなかった。
【０２７０】
実施例１３：ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ結合アッセイ
精製ＨＬＡ分子を使用するＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ結合アッセイを、開示されたプロトコル（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／２０１２７及びＷＯ９４／０３２０５；Sidneyら, Current Protocols in Immunology 18.3.1(1998)；Sidneyら, J. Immunol. 154:247 (1995)；Setteら, Mol. Immunol. 31:813 (1994)）に従って実施する。簡単に述べると、精製ＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）を、様々な非標識ペプチドインヒビター及び１〜１０ｎＭの記載されたような１２５Ｉ放射標識プローブペプチドと共にインキュベートする。インキュベーション後、ＭＨＣ−ペプチド複合体を、ゲル濾過により遊離ペプチドから分離し、結合したペプチドの画分を測定する。典型的には、予備実験において、各ＭＨＣ調製物を、固定量の放射標識ペプチドの存在下で力価決定し、全放射能の１０〜２０％を結合するのに必要なＨＬＡ分子の濃度を決定する。その後の全ての阻害及び直接結合アッセイを、これらのＨＬＡ濃度を使用して実施する。
これらの条件下では［標識］＜［ＨＬＡ］かつＩＣ５０≧［ＨＬＡ］であるので、測定したＩＣ５０値は、真のＫＤ値の妥当な近似である。ペプチドインヒビターを、典型的には、１２０μｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験し、完全に独立した２回から４回の実験において試験する。異なる実験において得られたデータの比較を可能にするために、相対的結合数を、阻害についてのポジティブコントロールのＩＣ５０を、試験した各ペプチド（典型的には、放射標識プローブペプチドの非標識型）についてのＩＣ５０で除することにより、各ペプチドについて計算する。データベース目的のため、また実験間比較のために、相対的結合値を集計する。ついで、これらの値を、阻害についてのポジティブコントロールのＩＣ５０ｎＭを、対象のペプチドの相対的結合によって除することにより、ＩＣ５０ｎＭ値へと変換して戻し得る。このデータ集計方法は正確であり、異なる日に試験したペプチド又は異なるロットの精製ＭＨＣを用いて試験したペプチドを比較しているため一貫性がある。
上に概説したような結合アッセイを使用して、ＨＬＡスーパーモチーフ及び／又はＨＬＡモチーフ保有ペプチドを分析し得る（表ＩＶを参照）。
【０２７１】
実施例１４：「ミニ遺伝子」多重エピトープＤＮＡプラスミドの構築
この実施例は、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築を検討する。ミニ遺伝子プラスミドは、当然、ここに記載される様々な構造のＢ細胞、ＣＴＬ及び／又はＨＴＬのエピトープ又はエピトープアナログを含み得る。
ミニ遺伝子発現プラスミドは、典型的には、複数のＣＴＬ及びＨＴＬペプチドエピトープを含む。本実施例では、ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３、−Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ及びＨＬＡ−Ａ１及び−Ａ２４モチーフ保有ペプチドエピトープを、ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープ及び／又はＤＲ３エピトープと組み合わせて使用する。ＳＴＥＡＰ−１由来のＨＬＡクラスＩスーパーモチーフ又はモチーフ保有ペプチドエピトープを、複数のスーパーモチーフ／モチーフが提示されて広範な集団の範囲を確実にするように選択する。同様に、ＨＬＡクラスＩＩエピトープを、広範な集団範囲をもたらすように、ＳＴＥＡＰ−１から選択する。つまり、ＨＬＡ ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ保有エピトープ及びＨＬＡ ＤＲ−３モチーフ保有エピトープの両方を、ミニ遺伝子構築物に含有させるために選択する。選択されたＣＴＬ及びＨＴＬエピトープを、ついで、発現ベクターにおける発現のためにミニ遺伝子へと組み込む。
このような構築物は、ＨＴＬエピトープを小胞体に向ける配列を更に含み得る。例えば、Ｉｉタンパク質が、当該分野において記載されるように一又は複数のＨＴＬエピトープに融合され得、ここでＩｉタンパク質のＣＬＩＰ配列は除去され、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ配列と置換される結果、ＨＬＡクラスＩＩエピトープが小胞体に向けられ、そこで、エピトープがＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。
【０２７２】
この実施例はミニ遺伝子保有発現プラスミドの構築のために使用される方法を例示する。ミニ遺伝子組成物に使用され得る他の発現ベクターは当業者に利用可能でかつ知られている。
この実施例のミニ遺伝子ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列及びコンセンサスマウスκＩｇ軽鎖シグナル配列と、それに続くここに開示される原理に従い選択されるＣＴＬ及び／又はＨＴＬエピトープを含む。その配列は、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｙｃ−ＨｉｓベクターによりコードされるＭｙｃ及びＨｉｓの抗体エピトープタグに融合したオープンリーディングフレームをコードする。
例えば１５ヌクレオチドがオーバーラップしている平均約７０ヌクレオチド長であり得るオーバーラップオリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製する。該オリゴヌクレオチドは、選択されたペプチドエピトープ並びに適切なリンカーヌクレオチド、Ｋｏｚａｋ配列、及びシグナル配列をコードする。最終の多重エピトープミニ遺伝子を、ＰＣＲを用いる３セットの反応においてオーバーラップオリゴヌクレオチドを伸長することによって構築する。Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ ９６００ ＰＣＲ機を用い、合計３０サイクルを、以下の条件を用いて実施する：９５℃で１５秒、（各々のプライマー対の最も低い計算値Ｔｍより５℃低い）アニーリング温度で３０秒、７２℃で１分間。
【０２７３】
例えば、ミニ遺伝子を以下のように調製する。第一のＰＣＲ反応で、各々５μｇの２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、伸長する：８つのオリゴヌクレオド、すなわち、４対のプライマーを使用する実施例では、オリゴヌクレオチド１＋２、３＋４、５＋６、及び７＋８を、Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液（１×＝１０ｍＭ ＫＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−クロリド（ｐＨ ８．７５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、各々０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、及び２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μｌの反応物中で混合する。全長二量体産物をゲル精製し、１＋２及び３＋４の産物、及び５＋６及び７＋８の産物を含む２つの反応物を混合し、アニーリングし、１０サイクルにわたり伸長する。ついで、２つの反応物の半分を混合し、隣接するプライマーを添加して、全長の産物を増幅する前に５サイクルのアニーリング及び伸長を実施した。この全長産物をゲル精製し、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、個々のクローンを配列決定によりスクリーニングする。
【０２７４】
実施例１５：プラスミド構築物及びそれが誘導する免疫原性の程度
プラスミド構築物、例えば、先の実施例に従い構築されたプラスミドが誘導し得る免疫原性の程度を、エピトープ発現核酸構築物を用いてＡＰＣを形質導入又はトランスフェクトした後、ＡＰＣによるエピトープ提示を決定することによりインビトロで確認する。このような研究は「抗原性」を決定し、ヒトＡＰＣの使用を可能とする。該アッセイは、細胞表面上のエピトープ−ＨＬＡクラスＩ複合体の密度を定量することによってＴ細胞により認識される場合にＡＰＣにより提示されるエピトープの能力を決定する。定量は、ＡＰＣから溶出されたペプチドの量を直接測定することにより実施することができる（例えば、Sijtsら, J. Immunol. 156:683-692, 1996；Demotzら, Nature 342:682-684, 1989を参照）か；又はペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合体の数を、罹患したか又はトランスフェクトされた標的細胞により誘導された溶解又はリンホカインの放出の量を測定し、ついで等価なレベルの溶解又はリンホカインの放出を得るために必要なペプチドの濃度を決定することにより、評価することができる（例えば、Kageyamaら, J. Immunol. 154:567-576, 1995を参照）。
あるいは、免疫原性は、マウスへのインビボでの注射と、引き続くＣＴＬ及びＨＴＬ活性のインビトロでの評価を介して確認され、ここで活性は、例えばAlexanderら, Immunity 1:751-761, 1994に詳述されるようにそれぞれ細胞傷害性及び細胞増殖性アッセイを用いて分析される。
【０２７５】
例えば、少なくとも一つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドを含むＤＮＡミニ遺伝子構築物がＣＴＬをインビボで誘導する能力を確認するために、例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスを、１００μｇの裸のｃＤＮＡを用いて筋肉内で免疫する。ｃＤＮＡ免疫により誘導されたＣＴＬのレベルを比較する手段として、コントロール群の動物もまたミニ遺伝子によりコードされる単一ポリペプチドとして合成された複数のエピトープを含む実際のペプチド組成物そのものを用いて免疫する。
免疫した動物由来の脾臓細胞を、各々の組成物（ミニ遺伝子においてコードされるペプチドエピトープ又はポリエピトープペプチド）をそれぞれ用いて２回刺激し、ついで５１Ｃｒ放出アッセイにおいてペプチド特異的な細胞傷害性活性についてアッセイする。その結果は、Ａ２拘束エピトープに対するＣＴＬ応答の大きさを示し、よってミニ遺伝子ワクチン及びポリエピトープワクチンのインビボでの免疫原性を示す。
従って、ミニ遺伝子が、ポリエピトープペプチドワクチンが誘発するように、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドエピトープに対して免疫応答を誘発することが見いだされる。ＨＬＡ−Ａ３及びＨＬＡ−Ｂ７のモチーフ又はスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するために他のＨＬＡ−Ａ３及びＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて同様の分析もまた実施され、それにより、該ミニ遺伝子が、提供されたエピトープに対する適切な免疫応答を誘発することもまた見出される。
【０２７６】
クラスＩＩエピトープをコードするミニ遺伝子がＨＴＬをインビボで誘導する能力を確認するために、ＤＲトランスジェニックマウスにか、又は適切なマウスＭＨＣ分子と交叉反応するエピトープについては、例えば、Ｉ−Ａｂ拘束マウスに、１００μｇのプラスミドＤＮＡを筋肉内免疫する。ＤＮＡ免疫により誘導されたＨＴＬのレベルを比較する手段として、コントロール動物の群も、フロイントの完全アジュバンド中に乳化した実際のペプチド組成物で免疫する。ＣＤ４＋Ｔ細胞、すなわちＨＴＬを、免疫した動物の脾臓細胞から精製し、各々の組成物（ミニ遺伝子中にコードされるペプチド）のそれぞれを用いて刺激する。ＨＴＬ応答を、３Ｈ−チミジン取り込み増殖アッセイを用いて測定する（例えば、Alexanderら, Immunity 1:751-761, 1994を参照）。該結果は、ＨＴＬ応答の大きさを示し、よって、このミニ遺伝子のインビボでの免疫原性を実証する。
【０２７７】
先の実施例に記載されるようにして構築されたＤＮＡミニ遺伝子をまたプライムブーストプロトコルを用いてブースト剤と組み合わせたワクチンとして確認することができる。該ブースト剤は、組換えタンパク質（例えば、Barnettら, Aids Res. and Human Retroviruses 14, Supplement 3:S299-S309, 1998）又は例えば、対象の完全なタンパク質をコードするミニ遺伝子もしくはＤＮＡを発現する組換えワクチン（例えば、Hankeら, Vaccine 16:439-445, 1998；Sedegahら, Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:7648-53, 1998；Hanke及びMcMichael, Immunol. Letters 66:177-181, 1999；及びRobinsonら, Nature Med. 5:526-34, 1999を参照）からなり得る。
【０２７８】
例えば、プライムブーストプロトコルに使用されるＤＮＡミニ遺伝子の効果を最初にトランスジェニックマウスにおいて評価する。この実施例では、Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスを、少なくとも一つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを含む免疫原性ペプチドをコードする１００μｇのＤＮＡミニ遺伝子でＩＭ免疫する。インキュベーション期間（３〜９週間の範囲）の後、マウスを、ＤＮＡミニ遺伝子によりコードされるものと同じ配列を発現する１０７ｐｆｕ／マウスの組換えワクシニアウイルスを用いてＩＰブーストする。コントロールマウスを、ミニ遺伝子配列を伴わない１００μｇのＤＮＡもしくは組換えワクシニアを用いるか、又はこのミニ遺伝子をコードするＤＮＡを用いるが、ワクシニアブーストを伴わずに免疫する。２週間の更なるインキュベーション期間の後、該マウス由来の脾臓細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチド特異的な活性について直ちにアッセイする。更に、脾臓細胞を、ミニ遺伝子中にコードされるＡ２拘束ペプチドエピトープ及び組換えワクシニアを用いてインビトロで刺激し、ついでα、β及び／又はγＩＦＮ ＥＬＩＳＡにおいてペプチド特異的な活性についてアッセイする。
プライムブーストプロトコルに利用されるミニ遺伝子が、ＤＮＡ単独よりＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドに対して高い免疫応答を誘発することが見出される。そのような分析をまたＨＬＡ−Ａ３又はＨＬＡ−Ｂ７のモチーフ又はスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するためにＨＬＡ−Ａ１１又はＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて実施し得る。ヒトにおけるプライムブーストプロトコルの使用を、「プライムブーストプロトコルを用いるＣＴＬ応答の誘導」と題した実施例において以下に記載する。
【０２７９】
実施例１６：複数の抗原由来のポリエピトープワクチン組成物
本発明のＳＴＥＡＰ−１ペプチドエピトープを、他の標的腫瘍関連抗原由来のエピトープと組み合わせて使用して、ＳＴＥＡＰ−１及びそのような他の抗原を発現する癌の予防及び治療に有用なワクチン組成物を作製する。例えば、ワクチン組成物を、ＳＴＥＡＰ−１由来の複数のエピトープ並びにＳＴＥＡＰ−１発現に関連する標的の癌でしばしば発現される腫瘍関連抗原を組み込む単一のポリペプチドとして提供し得るか、又は一又は複数の別個のエピトープのカクテルを含む組成物として投与し得る。あるいは、該ワクチンを、ミニ遺伝子構築物として、又はインビトロでペプチドエピトープを充填した樹状細胞として投与し得る。
【０２８０】
実施例１７：免疫応答を評価するためのペプチドの使用
本発明のペプチドは、ＳＴＥＡＰ−１に対する特異的抗体、ＣＴＬ又はＨＴＬの存在についての免疫応答を分析するために使用することができる。そのような分析は、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３〜２１０６、１９９８に記載されるようにして実施し得る。この実施例では、本発明に係るペプチドを、免疫原としてではなく診断目的又は予防目的のための試薬として使用する。
この実施例では、高度に感受性のヒト白血球抗原四量複合体（「四量体」）を、例えば、疾患の異なる病期又はＡ＊０２０１モチーフを含むＳＴＥＡＰ−１ペプチドを含む免疫後でのＨＬＡ Ａ＊０２０１陽性個体由来のＳＴＥＡＰ−１ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１特異的ＣＴＬ頻度の縦断解析のために使用する。四量複合体を、記載されるようにして（Museyら, N. Engl. J. Med. 337:1267, 1997）合成する。簡単に述べると、精製したＨＬＡ重鎖（この実施例におけるＡ＊０２０１）及びβ２−ミクログロブリンを、原核生物発現系によって合成する。その重鎖を、膜貫通−細胞質ゾルテールの欠失及びＢｉｒＡ酵素ビオチン化部位を含む配列のＣＯＯＨ末端付加により修飾する。重鎖、β２−ミクログロブリン、及びペプチドを、希釈により再折り畳みをする。その４５ｋＤの再折り畳み産物を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーを用いて単離し、ついでビオチン（Sigma, St. Louis, Missouri）、アデノシン５’三リン酸及びマグネシウムの存在下でＢｉｒＡによりビオチン化する。ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体を、１：４のモル比で添加し、四量体産物を１ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。得られた産物を四量体フェコエリトリンと称する。
【０２８１】
患者の血液試料の分析のために、約１００万のＰＢＭＣを、３００ｇで５分間遠心分離し、５０μｌの冷リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁する。三色分析を、抗ＣＤ８−トリカラー、及び抗ＣＤ３８と共に四量体−フィコエリトリンを用いて実施する。ＰＢＭＣを、氷上で四量体及び抗体と共に３０〜６０分間インキュベートし、ついでホルムアルデヒド固定の前に２回洗浄する。９９．９８％より多くのコントロール試料を含むようにゲートを適用する。四量体についてのコントロールは、Ａ＊０２０１陰性の個体とＡ＊０２０１陽性の罹患していないドナーの両方を含む。ついで、この四量体を用いて染色された細胞の百分率をフローサイトメトリーによって決定する。該結果は、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ拘束ＣＴＬ含有細胞の数を示し、これによりＳＴＥＡＰ−１エピトープに対する免疫応答の程度、よって、ＳＴＥＡＰ−１への曝露の状態、又は予防的応答もしくは治療的応答を誘発するワクチンへの曝露の状態を直ぐに示す。
【０２８２】
実施例１８：プライム追加免疫プロトコルを用いる免疫応答の誘導
「プラスミド構築物及びそれが誘導する免疫原性の程度」と題した実施例において上述したような、トランスジェニックマウスにおけるＤＮＡワクチンの有効性を確認するために使用される原理に対して基礎となる原理に類似するプライム追加免疫プロトコルをまたヒトにワクチンを投与するために使用できる。このようなワクチンレジメンは、例えば、裸のＤＮＡの最初の投与と、続いて、そのワクチンをコードする組換えウイルス、又はアジュバント中で投与される組換えタンパク質／ポリペプチドもしくはペプチド混合物の投与を用いる追加投与を含み得る。
例えば、最初の免疫を、発現ベクター、例えば、「「ミニ遺伝子」多重エピトープＤＮＡプラスミドの構築」と題した実施例において構築されたもののような発現ベクターを、複数の部位で０．５〜５ｍｇの量でＩＭ（又はＳＣ又はＩＤ）投与される裸の核酸の形態で用いて実施し得る。核酸（０．１〜１０００μｇ）をまた遺伝子銃を用いて投与し得る。３〜４週間のインキュベーション期間の後、追加用量をついで投与する。この追加用量は、５×１０７ｐｆｕ〜５×１０９ｐｆｕの用量で投与される組換え鶏痘ウイルスであり得る。代替的な組換えウイルス、例えば、ＭＶＡ、カナリア痘、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルスをまた追加投与のために使用し得るか、又はポリエピトープタンパク質もしくはこれらのペプチドの混合物を投与し得る。ワクチン有効性の評価のために、免疫前並びに最初のワクチン及びワクチンの追加用量の投与後間隔を空けて患者の血液サンプルを得る。抹消血液単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により新鮮なヘパリン化血液から単離し、凍結培地中にアリコート化し、凍結保存する。試料をＣＴＬ及びＨＴＬ活性についてアッセイする。
該結果の分析は、ＳＴＥＡＰ−１に対する治療的又は保護的免疫を達成するのに十分な強さの応答が生じることを示している。
【０２８３】
実施例１９：相補ポリヌクレオチド
ＳＴＥＡＰ−１コード配列又はその任意の部分に相補的な配列を使用して、天然に生じるＳＴＥＡＰ−１の発現を検出、減少、又は阻害する。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用が記載されるが、本質的には同じ手段が、より小さいか又はより大きい配列断片で使用される。適切なオリゴヌクレオチドは、例えば、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウエア（National Biosciences）及びＳＴＥＡＰ−１のコード配列を使用して設計される。転写を阻害するために、相補オリゴヌクレオチドを、最も独特な５’配列から設計し、コード配列へのプロモーターの結合を防止するために使用する。翻訳を阻害するために、相補オリゴヌクレオチドを設計して、ＳＴＥＡＰ−１をコードする転写産物へのリボソーム結合を阻止する。
【０２８４】
実施例２０：ＳＴＥＡＰ−１特異的抗体を使用する天然に生じるか又は組換えのＳＴＥＡＰ−１の精製
天然に生じるか又は組換えのＳＴＥＡＰ−１は、ＳＴＥＡＰ−１に特異的な抗体を使用して、免疫親和性クロマトグラフィーによって実質的に精製される。免疫親和性カラムを、活性化されたクロマトグラフィー樹脂、例えば、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Amersham Pharmacia Biotech）に抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を共有的に結合させることによって構築する。その結合後、樹脂をブロックし、製造者の指示書に従って洗浄する。
ＳＴＥＡＰ−１を含む培地を、免疫親和性カラムを通過させ、そのカラムをＳＴＥＡＰ−１を優先的に吸着する条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度緩衝液）で洗浄する。そのカラムを、抗体／ＳＴＥＡＰ−１の結合を妨害する条件下（例えば、ｐＨ２〜ｐＨ３の緩衝液、又は高濃度のカオトロープ、例えば、尿素又はチオシアネートイオン）で溶出し、ＧＣＲ．Ｐを収集する。
【０２８５】
実施例２１：ＳＴＥＡＰ−１と相互作用する分子の同定
ＳＴＥＡＰ−１、又は生物学的に活性なその断片を、１２１ １ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬で標識する。（例えば、Boltonら (1973) Biochem. J. 133: 529を参照。）マルチウエルプレートのウェル中に先に並べられた候補分子を、標識ＳＴＥＡＰ−１と共にインキュベートし、洗浄し、標識ＳＴＥＡＰ−１複合体を有する任意のウェルをアッセイする。異なる濃度のＳＴＥＡＰ−１を使用して得られたデータを使用して、ＳＴＥＡＰ−１の数、親和性、及びＳＴＥＡＰ−１と候補分子との会合の値を算出する。
【０２８６】
実施例２２：ＳＴＥＡＰ−１腫瘍増殖促進に対するインビボアッセイ
腫瘍細胞増殖に対するＳＴＥＡＰ−１タンパク質の効果を、ＳＴＥＡＰ−１を発現している又は欠損している細胞の腫瘍発生及び増殖の評価によってインビボで評価する。例えば、ＳＣＩＤマウスに、ｔｋＮｅｏ空ベクター又はＳＴＥＡＰ−１を含む１×１０６個の３Ｔ３又は前立腺癌細胞株（例えば、ＰＣ３細胞）の何れかを各側腹部に皮下注射する。以下の少なくとも２つのストラテジーを使用し得る：（１）ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２２１１５０４）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノム又は異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター（但し、これらのプロモーターは宿主細胞系と適合性である）から得られる構築プロモーターのようなプロモーターの制御下での構成的ＳＴＥＡＰ−１の発現、及び（２）誘導性ベクター系、例えば、エクジソン、テトラサイクリンなどの制御下での調節された発現（但し、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合性である）。ついで、腫瘍体積を、明らかな腫瘍の出現の際にキャリパー測定によってモニターし、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞がより早い速度で増殖する場合に、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞によって産生される腫瘍が改変された病原力（例えば、増強された転移、血管新生、化学療法薬物に対する減少した応答性）の特徴を裏付けるか否かを決定するため経時的に追跡する。
加えて、マウスに１×１０５個の同じ細胞を同所移植して、ＳＴＥＡＰ−１が、前立腺における局所増殖に対して効果を有するか、ＳＴＥＡＰ−１が、細胞がリンパ節、及び骨に特異的に転移する能力に影響を及ぼすか否かを決定し得る（Miki Tら, Oncol Res. 2001;12:209；Fu Xら, Int J Cancer. 1991, 49:938）。骨腫瘍形成及び増殖に対するＳＴＥＡＰの効果は、前立腺腫瘍細胞を脛骨内に注射することによって評価し得る。
このアッセイはまた候補治療組成物、例えば、ＳＴＥＡＰ−１細胞内抗体、ＳＴＥＡＰ−１アンチセンス分子及びリボザイムのＳＴＥＡＰ−１阻害効果を決定するために有用である。
【０２８７】
実施例２３：インビボでの前立腺腫瘍のＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体媒介性阻害
癌組織及び表面局在化におけるＳＴＥＡＰ−１の有意な発現は、正常組織におけるその制限された発現と共に、ＳＴＥＡＰ−１を、抗体治療の優れた標的にする。同様に、ＳＴＥＡＰ−１は、Ｔ細胞ベースの免疫治療のための標的である。よって、ヒト前立腺癌異種移植マウスモデルにおける抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂの治療的効果を、例えば、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１及び３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ−１のような組換え細胞株（例えば、Kaighn, M.E.ら, Invest Urol, 1979. 17 (1): 16-23を参照）、並びに例えばＬＡＰＣ９ＡＤのようなヒト前立腺異種移植モデル（Saffranら PNAS1999, 10:1073-1078）を使用することにより評価する。
腫瘍増殖及び転移形成に対する抗体効果は、例えばマウス同所性前立腺癌異種移植片モデルで研究される。該抗体は、この実施例において検討されるように、未結合であるか、あるいは当該分野において理解されるようなモダリティーと組み合わせられうる。抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂは、肺及び前立腺異種移植片の両方の形成を阻害する。抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂはまた確立された同所性腫瘍の増殖を遅らせ、腫瘍保有マウスの生存を延長させる。これらの結果は、局在的段階及び進行した段階の前立腺癌の治療における抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂの有用性を示す（例えば、Saffran, D.ら, PNAS 10: 1073-1078又はワールドワイドウェブURL pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698を参照）。
抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂの投与は、確立された同所性腫瘍増殖を遅らせ、離れた部位への転位を阻害し、腫瘍保有マウスの生存の有意な延長を生じる。これらの研究は、ＳＴＥＡＰ−１が、免疫治療のための魅力的な標的であることを示し、局所性及び転移性の前立腺癌の処置のための抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂの治療可能性を示す。この実施例は、ＳＣＩＤマウス中で増殖されるヒト前立腺腫瘍異種移植片の増殖を阻害するために、非結合ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体が有効であることを示し；従って、このような有効なモノクローナル抗体の組合わせがまた有効である。
【０２８８】
複数の非結合ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂを使用する腫瘍阻害
材料及び方法
ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体：
モノクローナル抗体は、「ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の産生」と題した実施例に記載されるように、ＳＴＥＡＰ−１に対して産生される。該抗体は、ＳＴＥＡＰ−１に結合するそれらの能力について、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、及び免疫沈降によって特徴付けられる。ＥＬＩＳＡ及びウェスタン分析によって測定されるような抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂについてのエピトープマッピングデータは、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質上のエピトープを認識する。これらの抗体での前立腺癌組織及び細胞の免疫組織化学分析が実施される。
モノクローナル抗体が、プロテインＧセファロースクロマトグラフィーによって腹水又はハイブリドーマ組織培養上清から精製され、ＰＢＳに対して透析され、フィルター滅菌され、−２０℃で貯蔵される。タンパク質測定をＢｒａｆｏｒｄアッセイ（Bio-Rad, Hercules, CA）によって実施する。治療モノクローナル抗体又は個々のモノクローナル抗体の混合物を含むカクテルを調製し、ＵＭ−ＵＣ３及びＣａＬｕ１の腫瘍異種移植片の皮下的又は同所的注射を受けるマウスの処置のために使用する。
【０２８９】
細胞株及び異種移植片
前立腺癌細胞株ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞株並びに線維芽細胞株ＮＩＨ ３Ｔ３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を、Ｌ−グルタミン及び１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中及びＤＭＥＭ中のそれぞれに維持する。
ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１及び３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞集団を、Hubert, R. S.ら, Proc Natl Acad SciUSA, 1999.96(25): 14523に記載されるようにして、レトロウイルス遺伝子移入によって産生する。
野生型アンドロゲンレセプターを発現し、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を産生するＬＡＰＣ−９異種移植片を、皮下トロカール移植により、６〜８週齢の雄性ＩＣＲ重篤複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Taconic Farms）において継代する（Craft, N.ら, Nat Med. 1999, 5:280）。ＬＡＰＣ−９腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を、Ｃｒａｆｔらに記載されるようにして調製する。
【０２９０】
異種移植片マウスモデル
皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍を、雄ＳＣＩＤマウスの右脇腹に、マトリゲル（Collaborative Research）と１：１希釈で混合された１×１０６個の細胞を注射することによって作り出す。腫瘍形成に対する抗体効果を試験するため、すなわち、抗体注射を、腫瘍細胞注射と同じ日に開始する。コントロールとして、マウスに、精製マウスＩｇＧ（ＩＣＮ）もしくはＰＢＳ；又はヒト細胞中に発現されない無関係の抗原を認識する精製モノクローナル抗体の何れかを注射する。予備研究では、腫瘍増殖についてマウスＩｇＧ又はＰＢＳの間に差異は見られない。腫瘍サイズはノギス測定によって決定され、腫瘍体積は、長さ×幅×高さから算出される。１．５ｃｍよりも大きい直径の皮下腫瘍を有するマウスを屠殺する。
同所性の注射を、ケタミン／キシラジンを使用することによって、麻酔下で実施する。前立腺同所性研究のために、前立腺を曝露するために背部を切開し、マトリゲルと混合されたＬＡＰＣ又はＰＣ３腫瘍細胞（５×１０５個）を１０μｌ容量で前立腺カプセルに注射する。腫瘍成長をモニターするために、マウスを触診し、ＰＳＡレベルを測定するために毎週採血する。ｉ．ｐ注射される抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂ又はコントロールＭＡｂを用いて、該マウスを適切な処置のためにグループに分ける。
【０２９１】
抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂはＳＴＥＡＰ−１発現異種移植癌腫瘍の増殖を阻害する
腫瘍形成に対する抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂの効果を、ＬＮＣａＰ及びＬＡＰＣ９同所性モデルを使用して試験する。皮下腫瘍モデルと比較して、同所性モデルは、マウスの前立腺における腫瘍細胞の直接的な注射を必要とし、局所的腫瘍増殖、遠位部位への転移の発達、マウスの健康の悪化、及びそれに続く死を、それぞれ生じる（上掲のSaffran, D.ら, PNAS）。該特徴は、同所性モデルをより代表的なヒトの疾患進行のモデルとし、臨床的に関連する終点におけるＭＡｂの治療効果を我々が追跡することを可能にした。
従って、腫瘍細胞をマウス前立腺に注射し、２日後、該マウスを２つのグループに分けて以下のいずれかで処理する：ａ）２００〜５００μｇの抗ＳＴＥＡＰ−１Ａｂ、又はｂ）ＰＢＳを２〜５週間の間、１週間に３度。
同所性癌モデルの主要な利点は、転移の発生を研究するための能力である。確立された同所性腫瘍を保有するマウス中の転移の形成は、腫瘍特異的細胞表面タンパク質、例えば、前立腺癌に対する抗ＣＫ−２０に対する抗体を使用して肺切片に対するＩＨＣ分析によって研究される（Lin Sら, Cancer Detect Prev. 2001;25:202）。
【０２９２】
異種移植癌モデルの他の利点は、新血管新生及び新脈管形成を研究し得る能力である。腫瘍増殖は、新しい血管の発生に部分的に依存している。毛細血管系及び発生している血管網は宿主起源であるが、新脈管構造の開始及び構築は、異種移植腫瘍によって調節される（Davidoff AMら, Clin Cancer Res. 2001; 7:2870; Solesvik Oら, Eur J Cancer Clin Oncol. 1984, 20:1295）。新血管新生に対する抗体及び低分子の効果は、当該分野で知られている手順、例えば、腫瘍組織及びそれらを囲む微小環境のＩＨＣ分析に従って試験する。
樹立された同所性腫瘍を保有するマウスは、４週間にわたって抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂ又はＰＢＳの何れかの１０００μｇ注射を投与される。両グループのマウスは、高い腫瘍組織量を確立し得、マウスの肺における高頻度の転移形成を確実にする。ついで、マウスを殺傷し、それらの膀胱、肝臓、骨及び肺を、ＩＨＣ分析によって腫瘍細胞の存在について分析する。これらの研究は、異種移植片マウスモデル中の前立腺癌の発生及び進行に対する抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の広範な抗腫瘍効果を証明する。抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、腫瘍形成を阻害し、既に確立された腫瘍の増殖を遅らせ、処置されたマウスの生存を延長させる。更に、抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂは、大きい腫瘍負担の存在下でさえも局所的な前立腺腫瘍の遠位部位への拡散に対して劇的な阻害効果を証明する。よって、抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂは、主要な臨床的に関連する終点（腫瘍増殖）、生存の延長、及び健康に対して効果的である。
【０２９３】
マウスのヒト前立腺癌異種移植片の増殖に対するＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂの効果
５〜６週齢の雄ＩＣＲ−ＳＣＩＤマウス（Charles River Laboratory, Wilmington, MA）を使用した。該マウスを、NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに記載のプロトコルを使用して管理環境下に維持した。ＬＡＰＣ−９ＡＤアンドロゲン依存性ヒト前立腺癌腫瘍を用いて、異種移植片モデルを樹立した。ＳＣＩＤマウスに定期的に維持された保存腫瘍を無菌的に切開し、分割し、プロナーゼを使用して消化した（Calbiochem, San Diego, CA）。得られた細胞懸濁液を３７℃でインキュベートして、均質な単細胞懸濁液を得た。
ＳＴＥＡＰ−１ Ｍ２／９２．３０及びＭ２／１２０．５４５を１００μｇ及び５００μｇの２種の異なった用量で試験した。ＰＢＳ及び抗ＫＬＨ ＭＡｂをコントロールとして使用した。研究コホートは各グループ１０匹で６グループから構成された。ＭＡｂを、腫瘍細胞の注射と同じ日に始めて、毎週２回のＩＰ投薬を全体で１２用量行った。
腫瘍サイズは週２回のノギスでの測定によってモニターした。最長寸法（Ｌ）とそれに直交する寸法（Ｗ）をとって、式：Ｗ２×Ｌ／２を使用して腫瘍体積を計算した。各動物に対して処置４０日での血清中ＰＳＡ濃度を市販のＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。クラスカル・ワリス検定法及びマン・ホイットニーＵ検定法を用いてグループ間の腫瘍成長及びＰＳＡレベルの差を評価した。全ての検定はａ＝０．０５で両側であった。
図２６及び図２７にまとめた実験の結果は、ＳＴＥＡＰ−１Ｍ２／９２．３０及びＭ２／１２０．５４５が用量依存的にヒト前立腺癌異種移植片の成長を有意に遅延させることを示している。
【０２９４】
実施例２４：ヒトにおける抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の治療的及び診断用使用
抗ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体は、ヒトにおける診断目的、予防目的、予後目的及び／又は治療目的のために、安全かつ有効に使用される。抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂを有する癌組織及び癌異種移植のウェスタンブロット及び免疫組織化学的分析は、癌において強く広範な染色を示すが、正常組織においては、それより有意に低いか、又は検出できないレベルである。癌及び転移性疾患におけるＳＴＥＡＰ−１の検出は、ＭＡｂが診断及び／又は予後の指標として有用であることを証明する。従って、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を、診断用途、例えば、腎臓生検標本の免疫組織化学に使用し、癌が疑われている患者から癌を検出する。
フローサイトメトリーによって測定されるように、抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂは癌細胞に特異的に結合する。よって、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、ＳＴＥＡＰ−１の発現を示す局在化した転移性癌の検出のために、診断全身画像化適用、例えば、放射性免疫シンチグラフィー及び放射性免疫治療（例えば、Potamianos S.ら Anticancer Res 20 (2A):925-948 を参照）において使用される。ＳＴＥＡＰ−１の細胞外ドメインの細胞外環境への分断又は放出、例えば、アルカリホスホジエステラーゼＢ１０（Meerson, R., Hepatology 27:563-568 (1998)）に見られるものは、疑われる患者からの血清及び／又は尿試料中の抗ＳＴＥＡＰ−１抗体によりＳＴＥＡＰ−１の診断的検出を可能にする。
【０２９５】
ＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合する抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌の治療のための治癒的用途において使用する。抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、非結合モダリティーとして、また抗体が当該分野で良く知られている様々な治療又は画像化モダリティー、例えばプロドラッグ、酵素又は放射性同位元素の一つと結合される結合形態として、使用される。前臨床試験において、非結合抗ＳＴＥＡＰ−１抗体及び結合抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を、ＳＣＩＤマウス癌異種移植モデル、例えば腎臓癌モデルＡＧＳ−Ｋ３及びＡＧＳ−Ｋ６（例えば、「インビボにおける膀胱腫瘍及び肺腫瘍のＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体媒介性阻害」と題した実施例を参照））における腫瘍予防及び増殖阻害の効果について試験する。非結合抗ＳＴＥＡＰ−１抗体及び結合抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の何れかが、単独で又は以下の実施例で記載される他の治療法と組み合わせて、ヒト臨床試験における治療モダリティーとして使用される。
【０２９６】
実施例２５：インビボでのヒト抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の使用を介するヒト癌の治療及び診断に対するヒト臨床試験
ＳＴＥＡＰ−１上のエピトープを認識する本発明に係る抗体を使用し、表Ｉに列挙した所定の腫瘍の治療に使用する。ＳＴＥＡＰ−１発現レベルを含む多数の因子に基づいて、例えば表Ｉに列挙されるもののような腫瘍が、現在では好ましい用途である。これらの用途の各々に関連して、３つの臨床アプローチが首尾よく遂行される。
Ｉ）補助的療法：補助的療法において、化学療法薬剤もしくは抗新生物薬剤及び／又は放射線療法と組み合わせて抗ＳＴＥＡＰ−１抗体により患者を治療する。原発性癌の標的、例えば表Ｉに列挙される癌を、標準的な第１及び第２の系統の治療法に抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を付加して標準プロトコル下で治療する。プロトコルの設計は、腫瘍塊の減少並びに標準的化学療法の通常用量を減少させる能力によって評価される有効性に取り組む。これらの投薬量減少により、化学療法剤の用量関連毒性を減少させることによる更なる及び／又は延長された治療が可能になる。抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を、幾つかの補助的臨床試験において、化学療法薬剤又は抗新生物薬剤であるアドリアマイシン（進行前立腺癌）、シスプラチン（進行頭及び頸部及び肺癌）、タキソール（乳癌）、及びドキソルビシン（前臨床）と組み合わせて使用する。
【０２９７】
ＩＩ）単剤療法：腫瘍の単剤療法における抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の使用に関連して、該抗体を、化学療法剤又は抗新生物薬剤を用いることなく患者に投与する。一実施態様では、単剤療法は、広範な転移性癌の末期癌患者において臨床的に実施される。患者は、ある程度の疾患安定性を示す。試験は、癌性腫瘍の不応性患者で効果を示す。
ＩＩＩ）画像化剤：放射性核種（例えば、ヨウ素又はイットリウム（Ｉ１３１、Ｙ９０））の抗ＳＴＥＡＰ−１抗体への結合を介して、放射標識された抗体を、診断及び／又は画像化剤として利用する。このような役割において、標識された抗体は、固形腫瘍、並びにＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞の転移性病巣の双方に局在化する。画像化剤としての抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の使用に関連して、該抗体を、外科手術前スクリーニング及び術後フォローアップの双方の場合に、固形腫瘍の外科的処置の補助として使用し、腫瘍が残っているか、及び／又は再発しているか否かを決定する。一実施態様では、（１１１Ｉｎ）−ＳＴＥＡＰ−１抗体を、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を有する患者におけるフェーズＩのヒト臨床試験において画像化剤として使用する（類似のものとして、例えば、Divgiら, J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991)を参照）。患者を標準的な前方及び後方からのガンマカメラによりフォローする。結果は原発性病巣及び転移性病巣が同定されたことを示す。
【０２９８】
投与の用量及び経路
当業者によって理解されるように、用量の考慮事項は、臨床にある類似の製品との比較を通じて決定できる。よって、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、５〜４００ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で投与することができ、例えば安全性研究との関連で、より低い用量も使用しうる。標的に対する既知の抗体の親和性に対する抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の親和性は、類似の用量レジメンを決定するために当業者によって使用される一パラメータである。更に、完全ヒト抗体である抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、キメラ抗体と比較して、より遅いクリアランスを有する；従って、このような完全ヒト抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を用いた患者への投薬は、おそらく５０〜３００ｍｇ／ｍ２の範囲とより低いが、それでもなお効果的である。ｍｇ／ｋｇでの一般的な用量の測定とは対照的に、ｍｇ／ｍ２単位の用量は、表面積に基づく測定値であり、幼児から成人まで全てのサイズの患者を含むように設計される簡便な用量測定値である。
３つの別個の送達アプローチが抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の送達に対して有用である。一般的な静脈内送達は、多くの腫瘍に対する一つの標準的送達法である。しかし、腹膜腔における腫瘍、例えば、卵巣、胆管、他の管などの腫瘍との関連で、腹腔内投与は、腫瘍での高用量の抗体を得るのに好ましく、また抗体クリアランスを最小にすることが証明され得る。同様に、所定の固形癌は、領域灌流に適した脈管構造を有する。領域灌流により、腫瘍部位に対する高用量の抗体を可能にし、抗体の短期間クリアランスを最小にし得る。
【０２９９】
臨床開発計画（ＣＤＰ）
概説：ＣＤＰは、補助的療法、単剤療法との関連で、また造影剤としての、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の処置を追跡し開発する。試験は、最初に安全性を実証し、その後反復用量で効力を確認する。試験は、標準的な化学療法を、標準的な治療法＋抗ＳＴＥＡＰ−１抗体と比較する非盲検である。理解されるように、患者の登録との関連で利用され得る一つの基準は、生検によって決定されるような、患者の腫瘍中でのＳＴＥＡＰ−１の発現レベルである。
任意のタンパク質又は抗体注入ベースの治療の場合のように、安全性の考慮は、主に以下に関連する：（ｉ）サイトカイン放出症候群、すなわち、低血圧、発熱、震え、悪寒；（ｉｉ）物質に対する免疫応答の発生（すなわち、患者による抗体療法に対するヒト抗体の発生、又はＨＡＨＡ応答）；及び（ｉｉｉ）ＳＴＥＡＰ−１を発現する正常細胞に対する毒性。標準的な試験及び追跡を、これらの安全性の考慮の各々をモニタリングするために利用する。抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、ヒト投与の際に安全であることが見出される。
【０３００】
実施例２６：ヒト臨床試験：ヒト抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を用いる単剤療法
抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、上で考察した補助的試験との関連で安全であり、フェーズＩＩヒト臨床試験は、単剤療法に対する有効性及び最適な投薬を確認する。このような試験が達成され、上述の補助的試験に対して、患者が抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の用量を受けると同時に化学療法を受けないという例外下で、同じ安全性及び結果の分析を必要とする。
【０３０１】
実施例２７：ヒト臨床試験：抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を用いる診断的画像化
繰り返すと、上で考察した補助的療法が上で考察した安全性の判定基準内で安全であるので、ヒト臨床試験は診断的造影剤としての抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の使用に関して行われる。このプロトコルは、当該分野で記載されるものと実質的に類似の形式で設計される（例えば、Divgiら, J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991)）。この抗体は、診断モダリティーとして使用される場合、安全性と有効性の双方が見出される。
【０３０２】
実施例２８：ヒト抗ＳＴＥＡＰ−１抗体及び化学療法剤、放射線、及び／又はホルモン除去療法でのヒト臨床試験補助治療
第Ｉ期のヒト臨床試験を、例えば、表Ｉに列挙される組織の癌のような固形腫瘍の処置に関連して、ヒト抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の６の静脈内用量の安全性を評価するために開始する。この研究では、ここに記載された抗新生物又は化学療法又はホルモン除去剤、例えば、限定されないが、シスプラチン、トポテカン、ドキソルビシン、アドリアマイシン、タキソール、Ｌｕｐｒｏｎ、Ｚｏｌａｄｅｘ、Ｃａｓｏｄｅｘ、Ａｎａｎｄｒｏｎなどに対する補助的療法として利用される場合、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の単一用量の安全性を評価する。試験設計は、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の６の単一用量の送達を含み、抗体の投薬量は、以下のスケジュールに従う処置の過程にわたってほぼ約２５ｍｇ／ｍ２から約２７５ｍｇ／ｍ２まで増大させる：
０日    ７日    １４日    ２１日    ２８日    ３５日
ＭＡｂ用量      ２５    ７５    １２５    １７５    ２２５    ２７５
mg/m2   mg/m2    mg/m2     mg/m2     mg/m2    mg/m2
化学療法        ＋      ＋        ＋        ＋        ＋        ＋
(標準用量)
【０３０３】
抗体及び化学治療剤のそれぞれの投与後、患者を１週間密接にフォローする。特に、上述の安全性の懸念：（ｉ）サイトカイン放出症候群、すなわち、低血圧、発熱、震え、悪寒；（ｉｉ）その物質に対する免疫原性応答の発生（すなわち、ヒト抗体治療剤に対する患者によるヒト抗体の発生、又はＨＡＨＡ応答）；及び（ｉｉｉ）ＳＴＥＡＰ−１を発現する正常細胞に対する毒性について、患者を評価する。標準的な試験及び追跡試験を利用して、これらの安全性の懸案のそれぞれをモニターする。患者はまた臨床結果について、特に、ＭＲＩ又は他の画像化によって証明される腫瘍塊の低減について、評価される。
抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、安全かつ有効であることが実証され、臨床試験フェーズＩＩは該有効性を確認し、最適な投薬を絞り込む。
【０３０４】
実施例２９：潜在的なシグナル伝達経路の同定及び確認
多くの哺乳動物のタンパク質は、シグナル伝達分子と相互作用し、シグナル伝達経路の調節に関与することが報告されている（J Neurochem. 2001; 76:217-223）。特に、フィブロネクチンは、細胞有糸分裂を制御するＭＡＰＫシグナル伝達カスケードと関連している（Jiang F, Jia Y, Cohen I. Blood. 2002, 99:3579）。また、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質は、特異的なシグナル伝達カスケードとの関連を示す幾つかのリン酸化部位を含む（表ＸＸＩを参照）。免疫沈降及びウェスタンブロッティング技術を使用して、ＳＴＥＡＰ−１と結合し、シグナル伝達事象を媒介するタンパク質を同定する。例えば、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ等のリン脂質経路、ＦＡＫ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ−１、β−カテニン等を含む接着及び遊走経路、並びにＥＲＫ、ｐ３８などのような有糸分裂／生存カスケードを含む、癌の生物学において役割を果たすことが知られている幾つかの経路（Cell Growth Differ. 2000, 11:279；J Biol Chem. 1999, 274:801；Oncogene. 2000, 19:3003, J. Cell Biol. 1997, 138:913）が、ＳＴＥＡＰ−１によって調節され得る。ＳＴＥＡＰ−１の発現が、さもなければ休止ＰＣ３細胞において活性ではない特異的シグナル伝達経路を調節するのに十分であるかどうかを決定するために、ｐ３８ＭＡＰＫカスケードの活性化に対するこれらの遺伝子の効果を、前立腺癌細胞株ＰＣ３において調べた。ｐ３８キナーゼの活性化は、チロシン及びセリン残基についてのそのリン酸化に依存する。リン酸化ｐ３８は、ホスホ−ｐ３８ＭＡｂによって非リン酸化状態から区別され得る。このホスホ特異的Ａｂを用いて、操作されたＰＣ３細胞株におけるｐ３８のリン酸化状態を研究した。
【０３０５】
ＰＣ３細胞にネオマイシン耐性遺伝子を単独に又はｐＳＲαベクター中ＳＴＥＡＰ−１を形質移入した。細胞を０．５％ＦＢＳ中で一晩成長させた後、１０μｇ／ｍｌのＭＥＫインヒビターＰＤ９８０５８を伴うか伴わないで、１０％ＦＢＳで５分間刺激した。細胞可溶化物を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗ホスホ−ＥＲＫ（Cell Signaling）及び抗ＥＲＫ（Zymed）でウェスタンブロットした。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞にネオマイシン耐性遺伝子を単独に又はｐＳＲαベクター中ＳＴＥＡＰ−１を形質移入した。細胞をＭＥＫインヒビターを用いないで上述のようにして処理した。また、ＮＩＨ−３Ｔ３−Ｎｅｏ細胞を１０ｍｇ／ｍｌのサリチル酸ナトリウムで処理した。ＳＴＥＡＰ−１の発現は血清中でＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２のリン酸化を誘導し、上流のＭＥＫキナーゼインヒビターＰＤ９８０５８によって阻害された。
別のセットの実験では、有糸分裂ＭＡＰＫ経路、すなわち、ＥＲＫカスケードを活性化するために前立腺癌細胞株ＰＣ３におけるＳＴＥＡＰ−１の発現が十分であることを調べた。ＥＲＫの活性化は、チロシン及びセリン残基でのそのリン酸化に依存する。リン酸化ＥＲＫは、ホスホ−ＥＲＫ ＭＡｂにより非リン酸化状態とは区別され得る。このホスホ特異的Ａｂを用いて、操作されたＰＣ３細胞株におけるＥＲＫのリン酸化状態を研究した。Ｒａｓの活性化形態を発現するＰＣ３細胞をポジティブコントロールとして使用した。
その結果は、コントロールｎｅｏ遺伝子の発現はＥＲＫリン酸化に対して効果を有さないが、ＰＣ３細胞でのＳＴＥＡＰ−１の発現は、ＥＲＫリン酸化における増加を誘導するのに十分であることを示している（図２８）。これらの結果を、抗ＥＲＫウェスタンブロッティングを用いて確証し、これは、ＳＴＥＡＰ−１によるＥＲＫ経路の活性化を確認する。
【０３０６】
ＦＢＳはレセプター媒介ＥＲＫ活性化に寄与し得る幾つかの成分を含むので、我々は、低いレベル及び至適レベルのＦＢＳ中でのＳＴＥＡＰ−１の効果を調べた。ｎｅｏ又はＳＴＥＡＰ−１を発現するＰＣ３細胞を、０．１％又は１０％何れかのＦＢＳ中で一晩増殖させた。細胞は抗ホスホ−ＥＲＫウェスタンブロッティングによって分析した。この実験は、ＳＴＥＡＰ−１が０．１％ＦＢＳ中でＥＲＫのリン酸化を誘導することを示し、ＳＴＥＡＰ−１の発現が、更なる刺激の不在下でＥＲＫシグナル伝達カスケードの活性化を誘導するのに十分であることを確認する。
ＳＴＥＡＰ−１が細胞内で既知のシグナル伝達経路を直接的又は間接的に活性化することを確認するために、個々の遺伝子を発現する細胞中で、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）ベースの転写レポーターアッセイを実施する。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に存在する既知の転写因子に対するコンセンサス結合部位を含む。レポーター及びこれらの関連転写因子、シグナル伝達経路、及び活性化刺激の例を、以下に列挙する。
【０３０７】
１．ＮＦｋＢ−ｌｕｃ、ＮＦｋＢ／Ｒｅｌ；Ｉｋ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；増殖／アポトーシス／ストレス
２．ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；増殖／分化
３．ＡＰ−１−ｌｕｃ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；増殖／アポトーシス／ストレス
４．ＡＲＥ−ｌｕｃ、アンドロゲンレセプター；ステロイド／ＭＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
５．ｐ５３−ｌｕｃ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
６．ＣＲＥ−ｌｕｃ、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；増殖／アポトーシス／ストレス
７．ＴＣＦ−ｌｕｃ、ＴＣＦ／Ｌｅｆ；β−カテニン、接着／浸潤。
遺伝子媒介性効果は、ｍＲＮＡ発現を示す細胞中でアッセイできる。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、脂質媒介性形質移入（TFX-50, Promega）によって導入し得る。細胞抽出物をルシフェリン基質と共にインキュベートすることによって、相対的な転写活性の指標であるルシフェラーゼ活性を測定し、その反応の発光をルミノメーターでモニターする。
ＳＴＥＡＰ−１によって活性化されるシグナル伝達経路をマッピングし、治療標的の同定と確認のために使用する。ＳＴＥＡＰ−１が細胞シグナル伝達に関与する場合、それは、診断、予後、予防及び／又は治療目的の標的として使用される。
【０３０８】
実施例３０：小分子輸送及び細胞間情報交換におけるＳＴＥＡＰ−１の関与
細胞間情報交換は、双方とも腫瘍形成及び腫瘍増殖の間に調節不全となる器官の完全性及び恒常性を維持するのに必須である。細胞間連絡は、２つのタイプのアッセイを使用して測定できる（J. Biol. Chem. 2000, 275:25207）。第１のアッセイでは、蛍光色素が負荷された細胞を未標識レシピエント細胞の存在下でインキュベートし、細胞集団を蛍光顕微鏡下で調べる。この定性的アッセイは、隣接する細胞間の色素の交換を測定する。第２のアッセイ系では、ドナー及びレシピエント細胞集団を上記のように処理し、レシピエント細胞集団の定量測定をＦＡＣＳ分析によって行う。これらの２つのアッセイ系を使用して、ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を、ＳＴＥＡＰ−１を発現しないコントロールと比較し、ＳＴＥＡＰ−１が細胞間情報交換を増強することが見出される。図２９は、ＳＴＥＡＰ−１が、隣接細胞間での小分子カルセインの移動を媒介し、それにより、前立腺癌細胞における細胞間情報交換を調節することを証明している。この実験では、レシピエントＰＣ３細胞をデキストラン−テキサスレッドで標識し、ドナーＰＣ３細胞をカルセインＡＭ（緑色）で標識した。ドナー（緑色）及びレシピエント（赤色）細胞を３７℃で同時培養し、テキサスレッド及びカルセインの同時局在化について顕微鏡によって分析した。その結果は、ＰＣ３コントロール細胞（検出可能なＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現なし）がカルセイン移動をほとんど示さないのに対し、ＳＴＥＡＰ−１の発現は、細胞間での低分子の移動を可能にし、それにより開始時に赤色のレシピエント細胞が、褐色がかった色になり、赤色及び緑色分子が同時局在化することを示す。ＳＴＥＡＰ−１により媒介された細胞間情報交換を調節する小分子及び／又は抗体は、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌に対する治療薬として使用される。図３０は、ＳＴＥＡＰ−１の発現が、小分子の移動が生じるために、ドナー及びレシピエント集団の両方において必要であることを証明している。この実験では、ＰＣ３細胞にネオマイシン耐性遺伝子を単独に又はｐＳＲαベクター中ＳＴＥＡＰ−１を形質移入した。レシピエント細胞は１ｍｇ／ｍｌのデキストラン−テキサスレッドで標識し、ドナー細胞は２．５μｇ／ｍｌのカゼインＡＭで標識した。ドナー（緑色）及びレシピエント（赤色）細胞を３７℃で１８〜２４時間同時培養し、蛍光染料の同時局在化について顕微鏡によって分析した。上方パネル：光学顕微鏡；下方パネル：ＵＶ蛍光。左パネル：ＰＣ３−Ｎｅｏ細胞がドナーとレシピエントの双方であった。中央パネル：ＰＣ３−Ｎｅｏ細胞がドナー細胞で、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１がレシピエントであった。右パネル：ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞がドナーとレシピエントの双方であった。ＳＴＥＡＰ−１がドナーとレシピエントの双方で発現されたときのみ、細胞間情報交換が検出された。
【０３０９】
該結果は、コントロールＰＣ３及びＰＣ３細胞の同時培養が、カルセイン移動を媒介しないことを示す。同様に、コントロールＰＣ３及びＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１の同時インキュベーションは、カルセインの移動を可能にしない。しかし、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１ドナー及びＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１レシピエント細胞の同時培養は、同じ細胞における緑色及び赤色色素の同時局在化によって示されるように、小分子移動を媒介する。まとめると、図２９及び３０に示されたデータは、ＳＴＥＡＰ−１が、小分子移動を媒介し、ギャップ接合部に機能が類似する細胞間連絡チャネルを形成することにより、細胞間情報交換を調節することを証明する。
また、ギャップ結合に対するＳＴＥＡＰ−１ Ｍ２／１２０．５４５の効果を確認した（図３１参照）。この実験では、ＰＣ３細胞にネオマイシン耐性遺伝子を単独に又はｐＳＲαベクター中ＳＴＥＡＰ−１を形質移入した。レシピエント細胞は１ｍｇ／ｍｌのデキストラン−テキサスレッドで標識し、ドナー細胞は２．５μｇ／ｍｌのカゼインＡＭで標識した。ドナー（緑色）及びレシピエント（赤色）細胞を３７℃で１８〜２４時間同時培養し、蛍光染料の同時局在化について顕微鏡によって分析した。全ての実験において、同じ細胞をドナー及びアクセプターとして使用した。播種前に細胞を示した量のＳＴＥＡＰ−１／１２０．５４５ＭＡｂと共に１０分間インキュベートし、ＭＡｂを分析前２４時間の間培養中に維持した。ＳＴＥＡＰ−１／１２０．５４５は用量依存的な形でＳＴＥＡＰ−１媒介ギャップ結合を減少させる。該結果は、ＳＴＥＡＰ−１／１２０．５４５は用量依存的な形でＳＴＥＡＰ−１媒介ギャップ結合を減少させることを示している。
よって、ＳＴＥＡＰ−１は、細胞間情報交換及び低分子輸送において機能するので、それは、診断的、予後的、予防的及び／又は治療的目的のための標的又はマーカーとして使用される。
【０３１０】
実施例３１：ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術は、腫瘍学に関連した様々な細胞アッセイに対して実行される。ＲＮＡｉは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって活性化される転写後遺伝子サイレンシング機構である。ＲＮＡｉは特異的ｍＲＮＡ分解を誘導し、タンパク質の発現と、続く遺伝子機能の変化を招く。哺乳動物細胞では、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれるこれらのｄｓＲＮＡは、分解をターゲットにしているＲＮＡｉ経路を活性化させる正しい組成、特に所定のｍＲＮＡを有している。Elbashir S.M.ら, Duplexes of 21-nucleotide RNAs Mediate RNA interference in Cultured Mammalian Cells, Nature 411(6836):494-8 (2001)を参照。よって、ＲＮＡｉ技術は標的遺伝子をサイレンシングするために哺乳動物において成功裏に使用される。
【０３１１】
細胞増殖制御の喪失は癌性細胞の特徴であり、よって、細胞生存／増殖アッセイにおけるＳＴＥＡＰ−１の役割を評価することは関連している。従って、ＲＮＡｉを用いてＳＴＥＡＰ−１抗原の機能を調査した。ＳＴＥＡＰ−１に対するｓｉＲＮＡを産生するために、臨界分子パラメータ（Ｇ：Ｃ量、融解温度等）を示し、細胞に導入されたときにＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現レベルを有意に低減させる能力を有しているオリゴヌクレオチドを予想するアルゴリズムを使用した。従って、ＳＴＥＡＰ−１ｓｉＲＮＡに対する一つの標的配列は、5' AAGCTCATTCTAGCGGGAAAT 3' （配列番号８１）である。この実施例に従って、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の核酸ＯＲＦ配列又はその部分配列に対応するｓｉＲＮＡ（二本鎖、低分子干渉ＲＮＡ）を含むＳＴＥＡＰ−１ｓｉＲＮＡ組成物が使用される。よって、このようにして使用されるｓｉＲＮＡ部分配列は一般に５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３５より多い連続ＲＮＡヌクレオチド長である。これらのｓｉＲＮＡ配列はｍＲＮＡコード配列の少なくとも一部分に相補的及び非相補的である。好適な実施態様では、部分配列は１９〜２５ヌクレオチド長で、最も好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長である。好適な実施態様では、これらのｓｉＲＮＡはタンパク質を発現する細胞においてＳＴＥＡＰ−１抗原のノックダウンを達成し、以下に記載されるような機能的効果を有している。
選択されたｓｉＲＮＡ（ＳＴＥＡＰ−１．ｂオリゴ）を生存／増殖ＭＴＳアッセイ（細胞代謝活性を測定）において数多くの細胞株で試験した。テトラゾリウムベースの比色アッセイ（つまりＭＴＳ）は、生細胞を排他的に検出するが、これは生存細胞は代謝的に活性であり、よってテトラゾリウム塩を着色ホルマザン化合物に還元することができるが；死滅細胞はそうではないからである。更に、このＳＴＥＡＰ−１．ｂオリゴはタンパク質を発現する細胞においてＳＴＥＡＰ−１抗原のノックダウンを達成し、次のプロトコルを用いて以下に記載したような機能的効果を有していた。
【０３１２】
哺乳動物ｓｉＲＮＡ形質移入：  ｓｉＲＮＡ形質移入の前の日に、生存／ＭＴＳアッセイのために８０μｌ中（９６ウェルプレート形態）２×１０３細胞／ウェルで培地（１０％ＦＢＳｗ／ｏ抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０）に異なった細胞株を播種した。ＳＴＥＡＰ−１特異的ｓｉＲＮＡオリゴと並行して、次の配列をコントロールとして各実験に含めた：ａ）リポフェクタミン２０００（Invitrogen, Carlsbad, CA）
アニールバッファー（ｓｉＲＮＡなし）を伴うモック形質移入細胞；ｂ）ルシフェラーゼ−４特異的ｓｉＲＮＡ（標的配列：5'-AAGGGACGAAGACGAACACUUCTT-3'）（配列番号８２）；及びｃ）Ｅｇ５特異的ｓｉＲＮＡ（標的配列：5'-AACTGAAGACCTGAAGACAATAA-3'）（配列番号８３）。ＳｉＲＮＡは１０ｎＭ及び１μｇ／ｍｌのリポフェクタミン２０００最終濃度で使用した。
手順は次の通りであった：  ｓｉＲＮＡを最初にＯＰＴＩＭＥＭ（無血清形質移入培地, Invitrogen）に０．１ｕＭμＭ（１０倍濃縮）で希釈し、室温で５〜１０分インキュベートした。リポフェクタミン２０００を形質移入全数に対して１０μｇ／ｍｌ（１０倍濃縮）で希釈し、室温で５〜１０分インキュベートした。希釈した１０倍濃縮リポフェクタミン２０００の適切量を希釈した１０倍濃縮ｓｉＲＮＡと１：１で混合し、２０〜３０”室温でインキュベートした（５倍濃縮形質移入液）。２０μｌの５倍濃縮形質移入液をそれぞれの試料に加え、分析前に９６時間３７℃でインキュベートした。
【０３１３】
ＭＴＳアッセイ：  ＭＴＳアッセイは、テトラゾリウム化合物［３-(４,５-ジメチルチアゾール-２-イル)-５-(３-カルボキシメトキシフェニル)-２-(４-スルホフェニル)-２Ｈ-テトラゾリウム、分子内塩；ＭＴＳ（ｂ）］及び電子結合試薬（エト硫酸フェナジン；ＰＥＳ）に基づく化学的感受性、細胞傷害性又は増殖アッセイにおいて生存細胞数を決定するための比色法ある。アッセイは、培養ウェルに少量の溶液試薬を直接添加し、１〜４時間インキュベートし、９６ウェルプレートリーダーで４９０ｎｍにおける吸光度を記録することによって実施した。４９０ｎｍ吸光度の量によって測定した着色ホルマザン産物の量は培地中の生存細胞の数及び／又はミトコンドリア活性に直接比例している。
細胞中のＳＴＥＡＰ−１の機能に取り組むために、内在的に発現するＳＴＥＡＰ−１細胞株をトランスフェクトすることによってＳＴＥＡＰ−１をサイレンシングした。図３２に示されるように、ＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２リン酸化は共に１０％血清によって誘導され、Ｍ２／９２．３０ＭＡｂ及びＳＴＥＡＰ−１に対するｓｉＲＮＡによって阻害された。この実験では、ＰＣ３細胞に、ネオマイシン耐性遺伝子を単独で又はｐＳＨαベクター中ＳＴＥＡＰ−１及びＭＡｂを形質移入した。ＲＮＡｉノックダウンでは、ＰＣＥ−ＳＴＥＡＰ−１細胞に、ＳＴＥＡＰ−１に対するｓｉＲＮＡを含むｐＰＵＲ−Ｕ６−２７−ＳＴＥＡＰ−１ベクターを安定に形質移入した。細胞を０．１％のＦＢＳ中で３７℃にて１８時間飢餓させ、１０μｇ／ｍｌのＭ２／９２．３０ＭＡｂを伴わないか伴って１０分間氷上に配し、３分間室温に戻した後、１０％ＦＢＳで５分間刺激した。細胞をＲＩＰＡバッファーに可溶化させ、全細胞可溶化物を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ウェスタンブロッティングによりタンパク質を検出した。ホスホ−ＥＲＫをウサギ抗血清（Cell Signaling）で検出し、ＥＲＫをウサギ抗ＥＲＫ（Zymed）で検出した。ＳＴＥＡＰ−１をヒツジ抗ＳＴＥＡＰ−１で検出し、アクチンを抗アクチンＭＡｂ（Santa Cruz）で検出した。
加えて、図３３に示されるように、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞中に安定に発現された特異的ＳＴＥＡＰ−１ＲＮＡｉはＳＴＥＡＰ−１誘導細胞間情報交換を減少させる。この実験では、ＰＣ３細胞に、ネオマイシン耐性遺伝子を単独で又はｐＳＲαベクター中ＳＴＥＡＰ−１を形質移入した。ＲＮＡｉノックダウンでは、ＰＣＥ−ＳＴＥＡＰ−１細胞に、空ベクター又はＳＴＥＡＰ−１に対するｓｉＲＮＡを含むｐＰＵＲ−Ｕ６−２７−ＳＴＥＡＰ−１ベクターを安定に形質移入した。レシピエント細胞を１ｍｇ／ｍｌのデキストラン−テキサスレッドで標識し、ドナー細胞を２．５μｇ／ｍｌのカルセインＡＭで標識した。ドナー（緑色）及びレシピエント（赤色）細胞を３７℃で１８〜２４時間同時培養し、蛍光染料の同時局在化について顕微鏡によって分析した。全ての実験において、同じ細胞をドナー及びアクセプターとして使用した。
【０３１４】
本発明の他の実施態様は、ＳＴＥＡＰ−１関連細胞増殖を分析する方法であり、増殖のマーカーとしてのＤＮＡ合成の測定である。標識されたＤＮＡ前駆体（つまり、３Ｈ−チミジン）を使用し、ＤＮＡへのその取り込みを定量する。ＤＮＡ中への標識前駆体の取り込みは培養中に生じる細胞分裂の量に直接比例する。細胞増殖を測定するために使用される他の方法は、クローン原性アッセイの実施である。これらのアッセイでは、定まった数の細胞を適切な基質上に播種し、ｓｉＲＮＡ処置後の所定の成長期間後に形成されたコロニー数をカウントする。
ＳＴＥＡＰ−１癌標的バリデーションにおいて、アポトーシス及び細胞周期プロファイリング研究に細胞生存／増殖分析を補完することが考えられる。アポトーシスプロセスの生化学的特徴は、細胞が死ぬようにする不可逆的な事象であるゲノムＤＮＡ断片化である。細胞中の断片化されたＤＮＡを観察する方法は、アポトーシス細胞の細胞質中におけるヒストン複合体化ＤＮＡ断片（モノ−及びオリゴ−ヌクレオソーム）の富化を測定するイムノアッセイ（つまり細胞死検出ＥＬＩＳＡ）によるヒストン複合体化ＤＮＡ断片の免疫学的検出である。このアッセイは細胞を前もって標識することを必要とせず、インビトロで増殖しない細胞（つまり新鮮に単離された腫瘍細胞）中のＤＮＡ分解を検出することができる。
【０３１５】
アポトーシス細胞死を惹起するための最も重要なエフェクター分子はカスパーゼである。カスパーゼは、活性化されるとアスパラギン酸残基のカルボキシ末端部位で数多くの基質を切断し、活性化時に非常に早期段階のアポトーシスを媒介するプロテアーゼである。全てのカスパーゼは酵素前駆体として合成され、活性化はアスパラギン酸残基での切断を含む。特に、カスパーゼ３はアポトーシスの細胞性事象の開始において中心的な役割を担っていると思われる。カスパーゼ３の活性化を決定するためのアッセイはアポトーシスの初期の事象を検出する。ＲＮＡｉ処置の後に、アポトーシス細胞に見出される産物（つまりＰＡＲＰ）のタンパク分解切断又は活性なカスパーゼ３の存在のウェスタンブロット検出はアポトーシスの活性な誘導を更に支持している。アポトーシスを生じる細胞性機構は複雑であるので、それぞれ利点と制約を有している。他の基準／エンドポイント、例えば細胞形態、染色体凝縮、膜小疱形成、アポトーシス体の考慮は、アポトーシスのような細胞死を更に支援する。細胞成長を調節する遺伝子標的の必ずしも全てが抗アポトーシスではないので、透過処理細胞のＤＮＡ量を測定してＤＮＡ量プロファイル又は細胞周期プロファイルを得る。アポトーシス細胞の核は細胞質へ漏れ出ているため、含むＤＮＡは少ない（サブＧ１集団）。また、ＤＮＡ染色（つまり、ヨウ化プロピジウム）の使用はまたＧ０／Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍにおける異なった量のＤＮＡの存在のため細胞集団において細胞周期の異なったフェーズをまた区別する。これらの研究では亜集団を定量することができる。
ＳＴＥＡＰ−１遺伝子に対して、ＲＮＡｉの研究は癌経路における遺伝子産物の寄与の理解を容易にする。そのような活性なＲＮＡｉ分子は活性な抗腫瘍治療薬であるＭＡｂをスクリーニングするアッセイを同定する用途を有する。更に、ｓｉＲＮＡは、表１に列挙されたものを含む幾つかの癌タイプの悪性成長を低減させるために癌患者に治療剤として投与される。ＳＴＥＡＰ−１が細胞生存、細胞増殖、腫瘍形成又はアポトーシスにある役割を果たす場合、それは診断、予後、予防及び／又は治療目的の標的として使用される。
【０３１６】
実施例３２：ＳＴＥＡＰ−１機能の調節
イオン輸送は、細胞増殖細胞内透過性、分子輸送及びシグナル伝達を調節する重要な役割を果たし（Minke B.Cell Mol Neurobiol. 2001, 21:629；Golovinaら, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001, 280:H746）、これらは、新生物状態に特に関連する機能である。細胞間情報交換は、恒常性、細胞増殖、及び細胞死を調節し（Evans WH, Martin PE, Mol. Membr Biol. 2002 19:121；Carruba Gら, Ann NY Acad Sci. 2002, 963:156）、これらは、新生物状態に特に関連する機能である。
コントロール細胞株及びＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞株を用いて、ＳＴＥＡＰ−１機能のインヒビターを同定する。例えば、ＰＣ３及びＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞を、ＭＡｂ又は小分子インヒビターの存在下及び不在下でインキュベートできる。これらのＭＡｂ又は小分子インヒビターの効果を、上述のイオン流出、細胞情報交換、増殖及びシグナル伝達アッセイを用いて調べる。
【０３１７】
トランスポーターにより媒介されるシグナル伝達及び生物学的結果は、レセプター及びリガンド結合の阻害、イオンアンタゴニスト、タンパク質相互作用、イオン及び小分子輸送の調節等を含む様々な機構を通じて媒介され得る（Tang Wら, Front Biosci 2002, 7:1583）。コントロール細胞株及びＳＴＥＡＰ−１発現細胞株を用いて、ＳＴＥＡＰ−１機能のモジュレーター（インヒビター又はエンハンサー）を同定する。例えば、ＰＣ３細胞及びＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞を、ＭＡｂ又は小分子モジュレーターの存在又は不在下でインキュベートする。ここに開示されたＳＴＥＡＰ−１の機能に鑑みて、本発明の場合に使用されるイオンチャネルブロッカーであるモジュレーターには、アミロジピン、アズレン、ジヒドロピリジン、チアニン、ニフェジン、ベラパミル及びそれらの誘導体のような化合物が含まれ（Tanaka Y, Shigenobu K, Cardiovasc Drug Rev. 2001 19:297；Djuric D, Mitovic V, Jakovljevic V. Arzneimittelforschung. 2002, 52:365；Kourie JI, Wood HB. Prog Biophys Mol Biol. 2000;73:91）；また、本発明の場合に使用される細胞情報交換のインヒビターであるモジュレーターには、βグリシルレチン酸、レチノイド、ＴＰＡのような化合物が含まれる（Krutovskikh VAら, Oncogene. 2002, 21:1989；Rudkinら, J Surg Res. 2002, 103:183；Ruch Jら, J Cell Biochem. 2001, 83:163）。従って、ＭＡｂ又は小分子インヒビターの効果を、上記実施例に記載のイオン流出、細胞情報交換、増殖及びシグナル伝達アッセイを用いて調べる。
ＭＡｂ及び小分子が、ＳＴＥＡＰ−１の輸送及び腫瘍形成機能を調節し、例えば、阻害する場合、それらは、診断的、予後的、予防的及び／又は治療的目的のために使用される。
【０３１８】
この出願の全体を通して、様々なウェブサイトのデータコンテンツ、刊行物、特許出願及び特許を参照する。（ウェブサイトは、そのUniform Resource Locator、つまりＵＲＬによって、ワールドワイドウェブ上のアドレスで参照される。）これらの文献の各々の開示は出典明示によりその全体をここに援用する。
本発明は、ここに開示される実施態様によって範囲が限定されるべきでなく、その実施態様は、本発明の個々の局面の一つの例示として意図され、また任意の機能的な均等物も本発明の範囲内である。ここに記載される変形に加えて、本発明のモデル及び方法に対する様々な変形が、先の説明及び教示から当業者に明らかになり、本発明の範囲内に入ることが同様に意図される。このような変形又は他の実施態様は、本発明の真の範囲及び精神から逸脱することなく実施することができる。
【０３１９】
表：
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【０３２０】
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【０３２１】
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【０３２２】
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【０３２３】
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【図面の簡単な説明】
【０３２４】
【図１】４３６ヌクレオチドのＳＴＥＡＰ−１ ＳＳＨ配列。
【図２Ａ】ＳＴＥＡＰ−１変異体１（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１」又は「ＳＴＥＡＰ−１変異体１」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ａに示す。開始メチオニンには下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６６〜１０８５にまたがる。
【図２Ｂ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体２（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｂに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｂ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体２（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｂに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｃ】ＳＴＥＡＰ−１変異体３（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．３」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｃに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜９４４にまたがる。
【図２Ｄ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体４（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．４」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｄに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｄ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体４（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．４」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｄに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｅ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体５のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．５」とも呼ぶ）を図２Ｅに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｅ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体５のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．５」とも呼ぶ）を図２Ｅに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｆ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体６（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．６」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｆに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｆ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体６（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．６」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｆに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｇ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体７（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．７」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｇに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｇ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体７（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．７」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｇに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｈ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体８（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．８」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｈに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｈ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体８（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．８」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｈに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｉ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体９（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．９」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｉに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｉ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体９（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．９」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｉに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｊ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体１０（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１０」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｊに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｊ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体１０（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１０」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｊに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｋ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体１１（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１１」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｋに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｋ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体１１（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１１」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｋに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｌ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体１２（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１２」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｌに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｌ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体１２（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１２」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｌに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｍ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体１３（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１３」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図２Ｍに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｍ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体１３（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１３」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図２Ｍに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｎ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体１４（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１４」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｎに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｎ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体１４（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１４」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｎに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｏ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体１５（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１５」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図２Ｏに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｏ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体１５（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１５」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図２Ｏに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｐ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体１６（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１６」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｐに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｐ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体１６（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１６」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｐに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｑ−１】ＳＴＥＡＰ−１変異体１７（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１７」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｑに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。ここで用いられる場合、そうでないことが文脈から明らかでない限り、ＳＴＥＡＰ−１と言うと、図１０、１１及び／又は１２に示すものを含め、その全ての変異体を包含する。
【図２Ｑ−２】ＳＴＥＡＰ−１変異体１７（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１７」とも呼ぶ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を図２Ｑに示す。開始メチオニンのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。ここで用いられる場合、そうでないことが文脈から明らかでない限り、ＳＴＥＡＰ−１と言うと、図１０、１１及び／又は１２に示すものを含め、その全ての変異体を包含する。
【図３Ａ】ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１のアミノ酸配列を図３Ａに示す；これは３３９アミノ酸を有する。ここで用いられる場合、そうでないことが文脈から明らかでない限り、ＳＴＥＡＰ−１と言うと、図１０、１１及び／又は１２に示すものを含め、その全ての変異体を包含する。
【図３Ｂ】ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２のアミノ酸配列を図３Ｂに示す；これは２５８アミノ酸を有する。ここで用いられる場合、そうでないことが文脈から明らかでない限り、ＳＴＥＡＰ−１と言うと、図１０、１１及び／又は１２に示すものを含め、その全ての変異体を包含する。
【図３Ｃ】ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．３のアミノ酸配列を図３Ｃに示す；これは２８２アミノ酸を有する。ここで用いられる場合、そうでないことが文脈から明らかでない限り、ＳＴＥＡＰ−１と言うと、図１０、１１及び／又は１２に示すものを含め、その全ての変異体を包含する。
【図３Ｄ】ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．４のアミノ酸配列を図３Ｄに示す；これは２５８アミノ酸を有する。ここで用いられる場合、そうでないことが文脈から明らかでない限り、ＳＴＥＡＰ−１と言うと、図１０、１１及び／又は１２に示すものを含め、その全ての変異体を包含する。
【図４Ａ】ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１とマウスＴＮＦα誘発性脂肪関連タンパク質（ｇｉ／１６９０５１３３）とのアミノ酸配列整列を図４Ａに示す。
【図４Ｂ】ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１とラットｐＨｙｄｅタンパク質（ｇｉ／２１７１７６６５／）とのアミノ酸配列整列を図４Ｂに示す。
【図４Ｃ】図４ＣはＳＴＥＡＰ−１と前立腺のマウス６回膜貫通上皮抗原（ｇｉ｜２０８２０４９２｜）との相同性を示す。
【図５Ａ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にあるＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトでアクセスしたＨｏｐｐ及びＷｏｏｄｓの方法（Hopp T.P.,Woods K.R.,1981.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:3824-3828）の方法を用いてコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定したＳＴＥＡＰ−１変異体１のアミノ酸親水性度プロファイル。
【図５Ｂ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にあるＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトでアクセスしたＨｏｐｐ及びＷｏｏｄｓの方法（Hopp T.P.,Woods K.R.,1981.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:3824-3828）の方法を用いてコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定したＳＴＥＡＰ−１変異体３のアミノ酸親水性度プロファイル。
【図６Ａ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にあるＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトでアクセスしたＫｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Kyte J.,Doolittle R.F.,1982.J.Mol.Biol.157:105-132）を用いたコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定したＳＴＥＡＰ−１変異体１のアミノ酸ヒドロパシープロファイル。
【図６Ｂ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にあるＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトでアクセスしたＫｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Kyte J.,Doolittle R.F.,1982.J.Mol.Biol.157:105-132）を用いたコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定したＳＴＥＡＰ−１変異体３のアミノ酸ヒドロパシープロファイル。
【図７Ａ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にあるＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトでアクセスしたＪａｎｉｎの方法（Janin J.,1979 Nature 277:491-492）を用いてコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定したＳＴＥＡＰ−１変異体１のアミノ酸露出残基パーセントプロファイル。
【図７Ｂ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にあるＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトでアクセスしたＪａｎｉｎの方法（Janin J.,1979 Nature 277:491-492）を用いてコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定したＳＴＥＡＰ−１変異体３のアミノ酸露出残基パーセントプロファイル。
【図８Ａ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にあるＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトでアクセスしたＢｈａｓｋａｒａｎ及びＰｏｎｎｕｓｗａｍｙの方法（Bhaskaran R., 及びPonnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res.32: 242-255）を用いてコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定したＳＴＥＡＰ−１変異体１の平均フレキシビリティアミノ酸プロファイル。
【図８Ｂ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にあるＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトでアクセスしたＢｈａｓｋａｒａｎ及びＰｏｎｎｕｓｗａｍｙの方法（Bhaskaran R., 及びPonnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res.32: 242-255）を用いてコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定したＳＴＥＡＰ−１変異体３の平均フレキシビリティアミノ酸プロファイル。
【図９Ａ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にあるＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトでアクセスしたＤｅｌｅａｇｅ及びＲｏｕｘの方法（Deleage,G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294）を用いてコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定したＳＴＥＡＰ−１変異体１のβ−ターンアミノ酸プロファイル。
【図９Ｂ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にあるＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトでアクセスしたＤｅｌｅａｇｅ及びＲｏｕｘの方法（Deleage,G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294）を用いてコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定したＳＴＥＡＰ−１変異体３のβ−ターンアミノ酸プロファイル。
【図１０Ａ】ＳＴＥＡＰ−１のＳＮＰ変異体の模式的整列。変異体ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．４〜ｖ．１７は、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２と比較して１ヌクレオチドが相違する変異体である。これらのＳＮＰ変異体は別々に示されているが、これらはまた任意の組み合わせで、またその塩基対を含む任意の転写産物変異体（例えば、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１及びｖ．３）において生じ得る。番号は、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２のものに対応する。黒い四角は、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２と同じ配列を示す。ＳＮＰをこの四角の上に示す。
【図１０Ｂ】ＳＴＥＡＰ−１のＳＮＰ変異体の模式的整列。変異体ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．４〜ｖ．１７は、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２と比較して１ヌクレオチドが相違する変異体である。これらのＳＮＰ変異体は別々に示されているが、これらはまた任意の組み合わせで、またその塩基対を含む任意の転写産物変異体（例えば、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１及びｖ．３）において生じ得る。番号は、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２のものに対応する。黒い四角は、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２と同じ配列を示す。ＳＮＰをこの四角の上に示す。
【図１１】ＳＴＥＡＰ−１の転写産物変異体のエキソン構成。この図は、ポリＡテールを含まない転写産物変異体の構造を示す。変異体ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１、ｖ．２及びｖ．３は、同じエキソン２及びエキソン３を共有する転写産物変異体である。ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１の第１エキソンは、他の２つの転写産物変異体の第１エキソンよりも５’末端において３０塩基短い。ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２の第４エキソンは、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１のエキソン４、イントロン４及びエキソン５の組み合わせと同じである。ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１と比較して、変異体ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．３は、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１のイントロン４からスプライシングされた更なるエキソンを有している。イントロン及びエキソンの長さは比例していない。
【図１２】ＳＴＥＡＰ−１のタンパク質変異体の模式的整列。タンパク質変異体は、ヌクレオチド変異体に対応する。図１０におけるヌクレオチド変異体ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．５〜ｖ．１７は、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２と同じタンパク質をコードする。図１１に示されるような転写産物変異体ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１及びｖ．３から翻訳されたタンパク質は、アミノ酸Ｆ（Ｐｈｅ）又はＬ（Ｌｅｕ）を１６９位に含み得る。１アミノ酸の相違を四角の上に示した。黒い四角は、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１と同じ配列を表す。塗りつぶしたパターンの異なる四角は異なる配列を示す。四角の下の数字は、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１に対応する。
【図１３Ａ】ＳＴＥＡＰ−１タンパク質変異体に対する二次構造及び膜貫通ドメインの推定。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質変異体１（配列番号４６）（図１３ａ）の二次構造を、ワールドワイドウェブの（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）にあるＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーからアクセスした、ＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Guermeur,1997, http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を用いて推定した。この方法は、αヘリックス、伸長鎖、及びランダムコイルの存在及び位置を、一次タンパク質配列から推定する。所定の二次構造におけるタンパク質のパーセントもまた列挙する。
【図１３Ｂ】ＳＴＥＡＰ−１タンパク質変異体に対する二次構造及び膜貫通ドメインの推定。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質変異体２（配列番号４７）（図１３ｂ）の二次構造を、ワールドワイドウェブの（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）にあるＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーからアクセスした、ＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Guermeur,1997, http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を用いて推定した。この方法は、αヘリックス、伸長鎖、及びランダムコイルの存在及び位置を、一次タンパク質配列から推定する。所定の二次構造におけるタンパク質のパーセントもまた列挙する。
【図１３Ｃ】ＳＴＥＡＰ−１タンパク質変異体に対する二次構造及び膜貫通ドメインの推定。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質変異体３（配列番号４８）（図１３ｃ）の二次構造を、ワールドワイドウェブの（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）にあるＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーからアクセスした、ＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Guermeur,1997, http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を用いて推定した。この方法は、αヘリックス、伸長鎖、及びランダムコイルの存在及び位置を、一次タンパク質配列から推定する。所定の二次構造におけるタンパク質のパーセントもまた列挙する。
【図１３Ｄ−Ｅ】図１３（ｄ）：ＴＭＢＡＳＥを利用するＨｏｆｍａｎｎ及びＳｔｏｆｆｅｌのＴＭｐｒｅｄアルゴリズム（K.Hofmann, W.Stoffel. TMBASE-A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993）に基づく、ＳＴＥＡＰ−１変異体１の膜貫通領域の存在確率及び配向の模式図（図１３（ｄ））。図１３（ｅ）：Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、及びＫｒｏｇｈのＴＭＨＭＭアルゴリズム（Erik L.L.Sonnhammer, Gunnar von Heijne,及びAnders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc.of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, 175-182頁, J.Glasgow, T.Littlejohn, F.Major, R.Lathrop, D.Sankoff, 及びC.Sensen編, Menlo Park, CA:AAAI Press, 1998）に基づく、ＳＴＥＡＰ−１変異体１の膜貫通領域の存在確率並びに細胞外及び細胞内配向の模式図（図１３（ｅ））。ＴＭｐｒｅｄアルゴリズム及びＴＭＨＭＭアルゴリズムは、ワールドワイドウェブの（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）にあるＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーからアクセスされる。
【図１３Ｆ−Ｇ】図１３（ｆ）：ＴＭＢＡＳＥを利用するＨｏｆｍａｎｎ及びＳｔｏｆｆｅｌのＴＭｐｒｅｄアルゴリズム（K.Hofmann, W.Stoffel. TMBASE-A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993）に基づく、ＳＴＥＡＰ−１変異体２の膜貫通領域の存在確率及び配向の模式図（図１３（ｆ））。図１３（ｇ）：Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、及びＫｒｏｇｈのＴＭＨＭＭアルゴリズム（Erik L.L.Sonnhammer, Gunnar von Heijne,及びAnders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc.of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, 175-182頁, J.Glasgow, T.Littlejohn, F.Major, R.Lathrop, D.Sankoff, 及びC.Sensen編, Menlo Park, CA:AAAI Press, 1998）に基づく、ＳＴＥＡＰ−１変異体２の膜貫通領域の存在確率並びに細胞外及び細胞内配向の模式図（図１３（ｇ））。ＴＭｐｒｅｄアルゴリズム及びＴＭＨＭＭアルゴリズムは、ワールドワイドウェブの（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）にあるＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーからアクセスされる。
【図１３Ｈ−Ｉ】図１３（ｈ）：ＴＭＢＡＳＥを利用するＨｏｆｍａｎｎ及びＳｔｏｆｆｅｌのＴＭｐｒｅｄアルゴリズム（K.Hofmann, W.Stoffel. TMBASE-A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993）に基づく、ＳＴＥＡＰ−１変異体３の膜貫通領域の存在確率及び配向の模式図（図１３（ｈ））。図１３（ｇ）：Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、及びＫｒｏｇｈのＴＭＨＭＭアルゴリズム（Erik L.L.Sonnhammer, Gunnar von Heijne,及びAnders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc.of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, 175-182頁, J.Glasgow, T.Littlejohn, F.Major, R.Lathrop, D.Sankoff, 及びC.Sensen編, Menlo Park, CA:AAAI Press, 1998）に基づく、ＳＴＥＡＰ−１変異体３の膜貫通領域の存在確率並びに細胞外及び細胞内配向の模式図（図１３（ｉ））。ＴＭｐｒｅｄアルゴリズム及びＴＭＨＭＭアルゴリズムは、ワールドワイドウェブの（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）にあるＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーからアクセスされる。
【図１４Ａ】胃癌患者標本におけるＳＴＥＡＰ−１の発現。ＲＮＡを正常な胃（Ｎ）及び１０の異なる胃癌患者標本（Ｔ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを有するノーザンブロットをＳＴＥＡＰ−１配列でプローブした。結果は、胃腫瘍組織における約１．６ｋｂ ＳＴＥＡＰ−１の強い発現を示す。下のパネルは、このブロットの臭化エチジウム染色を表し、ＲＮＡ試料の品質を示す。
【図１４Ｂ】直腸癌患者標本におけるＳＴＥＡＰ−１の発現。ＲＮＡを正常な直腸（Ｎ）、直腸がん患者腫瘍（Ｔ）、及び直腸癌転移物（Ｍ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡを有するノーザンブロットをＳＴＥＡＰ−１配列でプローブした。結果は、直腸癌患者組織におけるＳＴＥＡＰ−１の強い発現を示す。下のパネルは、このブロットの臭化エチジウム染色を表し、ＲＮＡ試料の品質を示す。
【図１４Ｃ】ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＳＴＥＡＰ−１の発現。第１鎖ｃＤＮＡを、ＨＵＶＥＣ細胞、ＬＡＰＣ−４ＡＤ前立腺癌異種移植片及びＬＡＰＣ−９ＡＤ前立腺癌異種移植片、並びにヒト脳組織から調製した。アクチン及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いたＰＣＲによって正規化を行った。ＳＴＥＡＰ−１に対するプライマーを用いた半定量的ＰＣＲを、増幅の２７サイクル目及び３０サイクル目で行った。コントロールとして、アクチンに対するプライマーを用いたＰＣＲを（Ｂ）に示す。結果は、前立腺癌異種移植片組織において検出された発現と同様に、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の強い発現を示す。ＨＵＶＥＣ細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現は、標的ＳＴＥＡＰ−１がまた腫瘍の新脈管構造の内皮細胞を標的化し得ることを示す。
【図１４Ｄ−Ｅ】正常及び癌組織におけるＳＴＥＡＰ−１の発現。第１鎖ｃＤＮＡを、正常組織（膀胱、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、前立腺、脾臓、骨格筋、精巣、膵臓、大腸及び胃）、及び患者癌標本のプール（前立腺癌プール、膀胱癌プール、腎臓癌プール、大腸癌プール、肺癌プール、卵巣癌プール、乳癌プール、癌転移物プール、膵臓癌プール、前立腺癌異種移植プール、及びリンパ節への前立腺転移物プール）から調製した。アクチンに対するプライマーを用いたＰＣＲによって正規化を行った。ＳＴＥＡＰ−１に対するプライマーを用いた半定量的ＰＣＲを、増幅の２７サイクル目及び３０サイクル目で行った。ＲＴ−ＰＣＲアガロースゲルの写真を図１４Ｄに示す。図１４Ｅでは、Ａｌｐｈａｌｍａｇｅｒソフトウェアを使用してＰＣＲ産物を定量した。結果は、試験した全ての正常細胞のなかで正常な前立腺においてＳＴＥＡＰ−１の強い発現を示す。ＳＴＥＡＰ−１のアップレギュレーションを、前立腺癌プール、膀胱癌プール、腎臓癌プール、大腸癌プール、肺癌プール、卵巣癌プール、乳癌プール、及び膵臓癌プールにおいて検出した。ＳＴＥＡＰ−１の強い発現を、癌転移物プール、前立腺癌異種移植プール、及びリンパ節への前立腺転移物プールにおいて検出した。
【図１４Ｆ】リンパ腫患者標本におけるＳＴＥＡＰ−１の発現。第１鎖ｃＤＮＡを、リンパ腫患者標本パネルから調製した。アクチンに対するプライマーを用いたＰＣＲによって正規化を行った。ＳＴＥＡＰ−１に対するプライマーを用いた半定量的ＰＣＲを、増幅の２７サイクル目及び３０サイクル目で行った。試料をアガロースゲル上に流し、ＰＣＲ産物を、Ａｌｐｈａｌｍａｇｅｒソフトウェアを使用して定量した。発現は、シグナルが増幅のそれぞれ２６又は３０サイクル目で検出された場合に強い又は中程度と記録し、増幅の３０サイクル目でさえシグナルが検出されたかった場合になしと記録した。結果は、試験した１１の腫瘍標本のうち８（７２．７％）においてＳＴＥＡＰ−１の発現を示す。
【図１５】ＭＡｂ Ｍ２／９２．３０によるＳＴＥＡＰ−１の特異的細胞表面染色。左パネル：抗ＳＴＥＡＰ ＭＡｂ Ｍ２／９２．３０（１０μｇ／ｍｌ）で染色したＳＴＥＡＰ−１（暗いライン）か又はコントロールネオマイシン耐性遺伝子（明るいライン）を安定に発現する組換え３Ｔ３及びＲａｔ１細胞のＦＡＣＳ分析で、細胞表面結合ＭＡｂを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次試薬を用いて検出した。ついで、染色した細胞についてＦＡＣＳ分析を実施した。各コントロール細胞と比較したＲａｔ１−ＳＴＥＡＰ１及び３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ１細胞の蛍光シフトによって示されるように、ＭＡｂ Ｍ２／９２．３０は細胞表面ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合する。右パネル：ＭＡｂ Ｍ２／９２．３０で染色した３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ１細胞の蛍光顕微鏡で明るい細胞表面蛍光を示す。
【図１６】ＳＴＥＡＰ１ Ｍ２／９２．３０ＭＡｂはヒト前立腺癌異種移植片の細胞表面ＳＴＥＡＰ−１を認識する。ＬＡＰＣ９前立腺癌を１０ｕｇ／ｍｌのＭＡｂ Ｍ２／９２．３０又はコントロール抗ＫＬＨ ＭＡｂで染色した。表面結合ＭＡｂを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次試薬を用いて検出した。ついで、染色した細胞についてＦＡＣＳ分析を実施した。これらの結果は、抗ＳＴＥＡＰ−１ ＭＡｂ Ｍ２／１２０．５４５が前立腺癌異種移植細胞に発現した内因性細胞表面ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合することを証明している。
【図１７】ＳＴＥＡＰ１ Ｍ２／９２．３０ＭＡｂはマウスＳＴＥＡＰ−１を認識する。２９３Ｔ細胞に、マウスＳＴＥＡＰ１ｃＤＮＡをコードするｐＣＤＮＡ３．１か又は空ベクターを一過性に形質移入した。２日後、細胞を収集し、抗ＳＴＥＡＰ１ ＭＡｂ Ｍ２／９２．３０（１０ｕｇ／ｍｌ）で染色し、細胞表面結合ＭＡｂを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次Ａｂを用いて検出した。ついで、細胞についてＦＡＣＳ分析を実施した。空ベクターを形質移入した細胞と比較したマウスＳＴＥＡＰ１を形質移入した２９３Ｔ細胞の蛍光シフトによって示されるように、ＭＡｂ Ｍ２／９２．３０はマウスＳＴＥＡＰ１タンパク質に特異的に結合する。
【図１８】ＳＴＥＡＰ１／１２０．５４５ＭＡｂは細胞表面ＳＴＥＡＰ−１を認識する。パネルＡ及びパネルＢ。３Ｔ３−ｎｅｏ（Ａ、ヒストグラム）及び３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ１細胞（Ａ、白抜きのヒストグラム）及びＲａｔ１−ｎｅｏ（Ｂ、塗り潰したヒストグラム）及びＲａｔ１−ＳＴＥＡＰ細胞（Ｂ、白抜きのヒストグラム）をＭＡｂ Ｍ２／１２０．５４５（１０ｕｇ／ｍｌ）で染色し、表面結合ＭＡｂを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次Ａｂを用いて検出した。ついで、細胞についてＦＡＣＳ分析を実施した。各ｎｅｏコントロールと比較した３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ１及びＲａｔ１−ＳＴＥＡＰ１細胞の蛍光シフトによって示されるように、ＭＡｂ Ｍ２／１２０．５４５は細胞表面ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合する。パネルＣ。ＬＮＣａＰ細胞をＭＡｂ Ｍ２／１２０．５４５か又はコントロール抗ＫＬＨ ＭＡｂで染色し、上のようにしてＦＡＣＳ分析を実施した。パネルＤ。ＬＮＣａＰで染色したＭ２／１２０．５４５の蛍光顕微鏡で明るい細胞表面蛍光を示す。これらの結果は、Ｍ２／１２０．５４５ＭＡｂがＬＮＣａＰ細胞の内因性細胞表面ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合することを証明している。
【図１９Ａ】図１９（ａ）はＭ２／Ｘ９２．３０ＶＨクローン＃２のｃＤＮＡ配列（配列番号４９）及びアミノ酸配列（配列番号５０）である。
【図１９Ｂ】図１９（ｂ）はＭ２／Ｘ９２．３０ＶＬクローン＃２のｃＤＮＡ配列（配列番号５１）及びアミノ酸配列（配列番号５２）である。
【図１９Ｃ】図１９（ｃ）はＭ２／Ｘ９２．３０ＶＬクローン＃６のｃＤＮＡ配列（配列番号５３）及びアミノ酸配列（配列番号５４）である。
【図１９Ｄ】図１９（ｄ）はＭ２／Ｘ１２０．５４５ＶＬクローン＃８のｃＤＮＡ配列（配列番号５５）及びアミノ酸配列（配列番号５６）である。
【図２０Ａ】図２０ａはＭ２／Ｘ９２．３０ＶＨクローン＃２のアミノ酸配列（配列番号５８）である。
【図２０Ｂ】図２０ｂはＭ２／Ｘ９２．３０ＶＬクローン＃２のアミノ酸配列（配列番号５８）である。
【図２０Ｃ】図２０ｃはＭ２／Ｘ９２．３０ＶＬクローン＃６のｃＤＮＡ配列（配列番号５９）及びアミノ酸配列（配列番号６０）である。
【図２０Ｄ】図２０ｄはＭ２／Ｘ９２．３０ＶＬクローン＃２（配列番号６１）とＭ２／Ｘ９２．３０ＶＬクローン＃６（配列番号６２）のアミノ酸配列整列である。
【図２０Ｅ】図２０ｅはＭ２／Ｘ１２０．５４５ＶＬクローン＃８のアミノ酸配列（配列番号６３）である。シグナルペプチドの配列には下線を付す。
【図２１】ＳＴＥＡＰ１Ｍ２／９２．３０ＭＡｂはヒト前立腺及び膀胱癌異種移植片上の細胞表面ＳＴＥＡＰ−１を認識する。ＵＧＢ１膀胱癌細胞（左パネル）及びＬＡＰＣ９前立腺癌細胞（右パネル）を１０ｕｇ／ｍｌのＭＡｂ Ｍ２／９２．３０かコントロール抗ＫＬＨ ＭＡｂで染色した。表面結合ＭＡｂを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次Ａｂを用いて検出した。ついで、細胞についてＦＡＣＳ分析を実施した。これらの結果は、抗ＳＴＥＡＰ１ ＭＡｂ Ｍ２／９２．３０が、膀胱及び前立腺癌異種移植細胞において発現される内因性細胞表面ＳＴＥＡＰ１に特異的に結合することを証明している。
【図２２】ＳＴＥＡＰ１／９２．３０ＭＡｂによるＳＴＥＡＰ−１の内部移行。３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ１細胞を４ＣにてＭ２／９２．３０ＭＡｂ（１０ｕｇ／ｍｌ）で染色し、洗浄した後、４Ｃでヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次Ａｂと共にインキュベートした。細胞の半分を３０分間３７Ｃに移し、残りの半分を４Ｃに残した。ついで、各処理後の細胞について蛍光顕微鏡で観察した。４Ｃのままの細胞は明るい「輪状」の細胞表面蛍光を示した。３７Ｃに移した細胞は「輪状」の細胞表面蛍光の喪失と、キャップ形成と内部移行を示す点状で集合した蛍光の出現を示した。
【図２３】ＳＴＥＡＰ１ Ｍ２／１２０．５４５ＭＡｂによるＳＴＥＡＰ−１の内部移行。ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ１細胞を４ＣにてＭ２／１２０．５４５ＭＡｂ（１０ｕｇ／ｍｌ）で染色し、洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次Ａｂと共にインキュベートした。細胞の半分を３０分間３７Ｃに移し、残りの半分を４Ｃに残した。ついで、各処理後の細胞について蛍光顕微鏡で観察した。４Ｃのままの細胞は明るい「輪状」の細胞表面蛍光を示した。３７Ｃに移した細胞は「輪状」の細胞表面蛍光の喪失と、キャップ形成と内部移行を示す点状で集合した蛍光の出現を示した。
【図２４】ＳＴＥＡＰ−１の内部移行。抗マウスＩｇＧ−サポリン結合体（Advanced Targeting Systems, San Diego, CA）を使用して、マウスＳｔｅａｐ−１ Ｍ２／１２０．５４５がＬＮＣａＰ細胞の表面上でのＳｔｅａｐ−１の発現を介して標的細胞に入ることを証明した。次のプロトコルを使用した。ＬＮＣａＰ細胞を９６ウェルプレートに５０００細胞／９０μｌ／ウェルで播き、一晩インキュベートした。二次免疫毒素結合体（抗マウスＩｇＧ−サポリン及び抗ヤギＩｇＧ−サポリン）又は抗マウスＩｇＧを細胞培養培地で調製し１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を得た。一次抗体を１〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加した。プレートを７２時間インキュベートし、生存率をＭＴＴアッセイによって測定した。結果は、ＬＮＣａＰ細胞がＭ２／１２０．５４５及び抗マウスＩｇＧ−サポリンの存在下で死滅することを示している。二次抗体単独（抗マウスＩｇＧ）又は非特異的二次抗体結合体（抗ヤギＩｇＧサポリン）では効果は検出されなかった。一次抗体（Ｍ２／１２０．５４５）単独で１μｇ／ｍｌまでの試験では毒性は観察されなかった。
【図２５】抗ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂ Ｍ２／９２．３０及びＭ２／１２０．５４５によるＳＴＥＡＰ１の免疫沈降。３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ１及び３Ｔ３−ｎｅｏ細胞をＲＩＰＡバッファー（２５ｍＭのトリス−Ｃｌ ｐＨ７．４；１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のトリトンＸ−１００、０．５％のデオキシコール酸、０．１％のＳＤＳ、及びプロテアーゼインヒビターのカクテル）に溶解させた。細胞溶解物をプロテインＧセファロースビーズで前もって清澄にした後、室温で２時間、５ｕｇのＭＡｂ Ｍ２／９２．３０又はＭ２／１２０．５４５と共にインキュベートした。プロテインＧビーズを加え、混合物を更に１時間インキュベートした。免疫複合体を洗浄しＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファーに溶解させた。ついで、溶解させた試料について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット分析を、ウサギ抗ＳＴＥＡＰ ｐＡｂを使用して実施した。ＳＴＥＡＰ１を形質移入した２９３Ｔ細胞の全細胞可溶化物をまたポジティブコントロールとして処理した。〜３７ｋＤの免疫活性バンドが３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ１由来の試料においてのみ見られたが、これはＭ２／９２．３０及びＭ２／１２０．５４５双方のＭＡｂによるＳＴＥＡＰ１の特異的免疫沈降を示している。
【図２６】マウス中のＬＡＰＣ９ヒト前立腺癌異種移植片の成長に対するＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂの効果。ＳＴＥＡＰ−１ Ｍ２／９２．３０及びＭ２／１２０．５４５を、１００μｇ及び５００μｇの二つの異なった用量で試験した。ＰＢＳ及び抗ＫＬＨ ＭＡｂをコントロールとして使用した。研究コホートを各グループ１０匹のマウスで６グループから構成した。腫瘍細胞注射と同じ日から開始し、ＭＡｂを全体で１２用量、毎週２回腹腔内投与した。最長寸法（Ｌ）とそれに直交する寸法（Ｗ）をとって次式を用いて腫瘍体積を計算した：Ｗ２ｘＬ／２。各動物に対して処置４０日目における血清中ＰＳＡ濃度を、市販ＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。クラスカル・ワリス検定及びマン・ホイットニーＵ検定を使用して、グループ間の腫瘍成長とＰＳＡ濃度レベルの差異を評価した。全ての検定はα＝０．０５で両側とした。データは、ＳＴＥＡＰ−１ Ｍ２／９２．３０及びＭ２／１２０．５４５が用量依存的腫瘍においてヒト前立腺異種移植片の成長を有意に遅延させることを示している。
【図２７】マウス中のＬＡＰＣ９ヒト前立腺癌異種移植片の成長に対するＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂの効果。ＳＴＥＡＰ−１ Ｍ２／９２．３０及びＭ２／１２０．５４５を、１００μｇ及び５００μｇの二つの異なった用量で試験した。ＰＢＳ及び抗ＫＬＨ ＭＡｂをコントロールとして使用した。研究コホートを各グループ１０匹のマウスで６グループから構成した。腫瘍細胞注射と同じ日から開始し、ＭＡｂを全体で１２用量、毎週２回腹腔内投与した。最長寸法（Ｌ）とそれに直交する寸法（Ｗ）をとって次式を用いて腫瘍体積を計算した：Ｗ２ｘＬ／２。各動物に対して処置４０日目における血清中ＰＳＡ濃度を、市販ＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。クラスカル・ワリス検定及びマン・ホイットニーＵ検定を使用して、グループ間の腫瘍成長とＰＳＡ濃度レベルの差異を評価した。全ての検定はα＝０．０５で両側とした。データは、ＳＴＥＡＰ−１ Ｍ２／９２．３０及びＭ２／１２０．５４５が用量依存的腫瘍においてヒト前立腺異種移植片の成長を有意に遅延させることを示している。
【図２８】ＳＴＥＡＰ−１はＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２リン酸化を誘導した。左パネル：ＰＣ３細胞にネオマイシン耐性遺伝子を単独で又はｐＳＲαベクター中ＳＴＥＡＰ−１を形質移入した。細胞を０．５％ＦＢＳ中一晩成長させた後、１０μｇ／ｍｌのＭＥＫインヒビターＰＤ９８０５８と共に又はこれを伴わないで５分間１０％ＦＢＳで刺激した。細胞可溶化物を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し抗ホスホ−ＥＲＫ（Cell Signaling）及び抗ＥＲＫ（Zymed）を用いてウェスタンブロットを実施した。右パネル：ＮＩＨ−３Ｔ３細胞にネオマイシン耐性遺伝子を単独で又はｐＳＲαベクター中ＳＴＥＡＰ−１と共に形質移入した。細胞は上の通りであるがＭＥＫインヒビターなしで処理した。また、ＮＩＨ−３Ｔ３−Ｎｅｏ細胞を１０ｍｇ／ｍｌのサリチル酸ナトリウムで処理した。ＳＴＥＡＰ−１の発現は血清中におけるＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２のリン酸化を誘導し、上流のＭＥＫキナーゼインヒビターＰＤ９８０５８によって阻害された。
【図２９】ＳＴＥＡＰ−１は細胞間連絡を媒介する。ＰＣ３細胞にネオマイシン耐性遺伝子を単独で又はｐＳＲαベクター中ＳＴＥＡＰ−１又はコントロール遺伝子を形質移入した。レシピエント細胞を１ｍｇ／ｍｌデキストラン−テキサスレッドで標識し、２．５μｇ／ｍｌカルセインＡＭで標識した。ドナー（緑）及びレシピエント（赤）細胞を３７℃で１８〜２４時間、同時培養し、蛍光染料の共存について顕微鏡で分析した。左パネル：ＰＣ３−Ｎｅｏ細胞をドナーとレシピエントの双方として使用した。中央パネル：ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞をドナーとレシピエントの双方として使用した。右パネル：ＰＣ３−コントロール細胞をドナー及びレシピエントの双方として使用した。ＳＴＥＡＰ−１はデキストラン−テキサスレッドを含む細胞へのカルセインの移動を誘導したが、これはＳＴＥＡＰ−１が細胞間連絡を容易にすることを示している。
【図３０】細胞連絡はドナー及びレシピエント細胞でのＳＴＥＡＰ−１の発現を必要とする。ＰＣ３細胞にネオマイシン耐性遺伝子を単独で又はｐＳＲαベクター中ＳＴＥＡＰ−１を形質移入した。レシピエント細胞を１ｍｇ／ｍｌデキストラン−テキサスレッドで標識し、ドナー細胞を２．５μｇ／ｍｌカルセインＡＭで標識した。ドナー（緑）及びレシピエント（赤）細胞を３７℃で１８〜２４時間、同時培養し、蛍光染料の共存について顕微鏡で分析した。上方パネル：光学顕微鏡；下方パネル：ＵＶ蛍光。左パネル：ＰＣ３−Ｎｅｏ細胞はドナーとレシピエントの双方であった。中央パネル：ＰＣ３−Ｎｅｏがドナー細胞で、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１がレシピエントであった。右パネル：ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１がドナーとレシピエントの双方であった。ＳＴＥＡＰ−１がドナーとレシピエントの双方に発現された場合のみ、細胞間連絡が検出された。
【図３１】ギャップ結合に対するＳＴＥＡＰ−１／１２０．５４５ＭＡｂの効果。ＰＣ３細胞にネオマイシン耐性遺伝子を単独で又はｐＳＲαベクター中ＳＴＥＡＰ−１を形質移入した。レシピエント細胞を１ｍｇ／ｍｌデキストラン−テキサスレッドで標識し、ドナー細胞を２．５μｇ／ｍｌカルセインＡＭで標識した。ドナー（緑）及びレシピエント（赤）細胞を３７℃で１８〜２４時間、同時培養し、蛍光染料の共存について顕微鏡で分析した。全ての実験において、同じ細胞をドナーとアクセプターとして使用した。細胞を、播種前１０分間、示した量のＳＴＥＡＰ−１／１２０．５４５ＭＡｂと共にインキュベートし、分析前２４時間培養液中に維持した。ＳＴＥＡＰ−１／１２０．５４５は用量依存的な形でＳＴＥＡＰ−１媒介ギャップ結合を低減させる。
【図３２】ＳＴＥＡＰ−１ＭＡｂ及びＲＮＡｉによるＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２リン酸化の阻害。ＰＣ３細胞にネオマイシン耐性遺伝子を単独で又はｐＳＲαベクター中ＳＴＥＡＰ−１及びＭＡｂを形質移入した。ＲＮＡｉノックダウンに対して、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞に、ＳＴＥＡＰ−１に対してｓｉＲＮＡを含むｐＰＵＲ−Ｕ６−２７−ＳＴＥＡＰ−１ベクターを安定に形質移入した。細胞を３７℃で１８時間０．１％ＦＢＳ中で飢餓させ、１０μｇ／ｍｌのＭ２／９２．３０ＭＡｂと共に又はそれなしに１０分間氷上に置き、３分間室温にした後、５分間１０％ＦＢＳで刺激した。細胞をＲＩＰＡバッファー中で可溶化させ、全細胞可溶化物を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、タンパク質をウェスタンブロットによって検出した。ホスホ−ＥＲＫをウサギ抗血清（Cell Signaling）で検出し、ＥＲＫをウサギ抗ＥＲＫ（Zymed）で検出した。ＳＴＥＡＰ−１をヒツジ抗ＳＴＥＡＰ−１で検出し、アクチンを抗アクチンＭＡｂ（Santa Cruz）で検出した。ＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２リン酸化は共に１０％血清によって誘導され、Ｍ２／９２．３０ＭＡｂ及びＳＴＥＡＰ−１に対するｓｉＲＮＡによって阻害された。
【図３３】細胞間連絡に対するＳＴＥＡＰ−１ＲＮＡｉの効果。ＰＣ３細胞にネオマイシン耐性遺伝子を単独で又はｐＳＲαベクター中ＳＴＥＡＰ−１を形質移入した。ＲＮＡｉノックダウンに対して、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞に、ＳＴＥＡＰ−１に対してｓｉＲＮＡを含むｐＰＵＲ−Ｕ６−２７−ＳＴＥＡＰ−１ベクター又は空ベクターを安定に形質移入した。レシピエント細胞を１ｍｇ／ｍｌデキストラン−テキサスレッドで標識し、ドナー細胞を２．５μｇ／ｍｌカルセインＡＭで標識した。ドナー（緑）及びレシピエント（赤）細胞を３７℃で１８〜２４時間、同時培養し、蛍光染料の共存について顕微鏡で分析した。全ての実験において、同じ細胞をドナー及びアクセプターとして使用した。ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ１細胞中に安定して発現される特異的ＳＴＥＡＰ１ＲＮＡｉがＳＴＥＡＰ１誘導細胞間連絡を低減させる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ−１】
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【図２Ｄ−２】
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【図２Ｅ−１】
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【図２Ｅ−２】
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【図２Ｆ−１】
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【図２Ｆ−２】
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【図２Ｇ−１】
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【図２Ｇ−２】
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【図２Ｈ−１】
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【図２Ｈ−２】
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【図２Ｉ−１】
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【図２Ｉ−２】
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【図２Ｊ−１】
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【図２Ｊ−２】
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【図２Ｋ−１】
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【図２Ｋ−２】
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【図２Ｌ−１】
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【図２Ｌ−２】
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【図２Ｍ−１】
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【図２Ｍ−２】
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【図２Ｎ−１】
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【図２Ｎ−２】
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【図２Ｏ−１】
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【図２Ｏ−２】
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【図２Ｐ−１】
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【図２Ｐ−２】
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【図２Ｑ−１】
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【図２Ｑ−２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ−Ｅ】
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【図１３Ｆ−Ｇ】
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【図１３Ｈ−Ｉ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ−Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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