(57)【要約】  本発明は、候補薬剤で患者の全血を刺激後に白血球で測定されるマーカーｍＲＮＡのレベルに基づいて個々の患者に対する薬剤プロトコルを選定する方法を開示する。薬剤に対する患者の反応性を測定する方法が開示され、これは７時間以内、当該薬剤に患者の全血を暴露すること；この暴露後に、血液細胞における薬剤の効果に関連するｍＲＮＡ量を測定すること；及び測定結果に基づいて薬剤に対する反応性を確認することを含み、当該ｍＲＮＡの量の変化が当該薬剤に対する患者の反応性を表す。血液細胞で測定されるｍＲＮＡ量を暴露前に細胞に存在するｍＲＮＡレベル又は対照ビヒクルに同じ期間暴露した細胞に存在するｍＲＮＡのレベルと比較することができる。本発明に有用なマーカーｍＲＮＡには、ｐ２１、ＢＡＸ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、及びＩＬ−２遺伝子の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡが含まれる。特に、癌患者又は疾病患者又は免疫抑制を要求する状態の患者にこの方法を用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤に対する患者の反応性を測定する方法であって、
７時間以内、患者の全血を薬剤に暴露すること；
暴露後に、血液細胞における該薬剤の効果に関連するｍＲＮＡの量を測定すること；及び
該測定の結果に基づいて該薬剤に対する反応性を確認すること
を含み、該ｍＲＮＡの量の変化が該薬剤に対する該患者の反応性を示す、方法。
【請求項２】
暴露前に、血液細胞に存在するｍＲＮＡの量を測定し、暴露前に測定したｍＲＮＡの量と暴露後に測定したｍＲＮＡの量とを比較することにより該ｍＲＮＡの量の変化を求める、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
７時間以内、患者の全血を対照ビヒクルに暴露すること；
暴露後に、該対照ビヒクルに暴露した全血における前記薬剤の効果に関連するｍＲＮＡの量を測定すること；
該対照ビヒクルの暴露後に得られた測定の結果を前記薬剤の暴露後に得られた測定の結果と比較して該薬剤に対する反応性を確認すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対照ビヒクルがリン酸緩衝生理食塩水及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記患者の全血を暴露することがヘパリンの添加を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
５時間以内、前記全血を刺激する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
２〜４時間、前記全血を刺激する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤の効果が血液細胞のアポトーシスである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍＲＮＡがＢｃｌ−２／Ｂａｘ遺伝子ファミリーの遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍＲＮＡがＢａｘ遺伝子産物をコードする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍＲＮＡがＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリーの遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｍＲＮＡがＰＵＭＡ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ及びＮＯＸＡ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤の効果が血液細胞における細胞周期停止である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｍＲＮＡがｐ２１遺伝子産物をコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
血液細胞における前記薬剤の第２の効果に関連する第２のｍＲＮＡの量を測定することをさらに含み、
前記薬剤の第１の効果が血液細胞のアポトーシスであり、第１のｍＲＮＡが前記ＰＵＭＡ遺伝子産物をコードし；
前記薬剤の第２の効果が血液細胞における細胞周期停止であり、第２のｍＲＮＡがｐ２１遺伝子産物をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤がエトポシド、ドキソルビシン、フルダラビン、ミトキサントロン、リツキシマブ、ビンデシン、ピラルビシン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ペプロマイシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、ダカルバジン、シクロホスファミド、及びパクリタキセルからなる群から選択される、請求項８又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者が白血病又は白血病性リンパ腫の患者である、請求項８、１３、又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者の全血を暴露することがレクチンによる刺激を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記レクチンがフィトヘマググルタニン−Ｐ及びヤマゴボウマイトジェンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤の効果がＩＬ−２転写の阻害である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｍＲＮＡがＩＬ−２遺伝子産物をコードする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤が免疫抑制剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤がシクロスポリンＡ及びタクロリムスからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｍＲＮＡがＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ由来の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
エトポシド、ドキソルビシン、フルダラビン、ミトキサントロン、リツキシマブ、ビンデシン、ピラルビシン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ペプロマイシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、ダカルバジン、シクロホスファミド、及びパクリタキセルからなる群から選択される薬剤に対する患者の反応性を測定する方法であって、
４時間以内、患者の全血を該薬剤に暴露すること；
４時間以内、患者の全血を対照ビヒクルに暴露すること；
前記暴露後に、血液細胞におけるｐ２１遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ、ＢＡＸ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ、及びＰＵＭＡ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること；
対照ビヒクルの暴露後に得られた測定の結果を該薬剤の暴露後に得られた測定の結果と比較すること；及び
該比較の結果に基づいて該薬剤に対する反応性を確認すること
を含み、該ｍＲＮＡの量の変化が該薬剤に対する患者の反応性を表す、方法。
【請求項２６】
シクロスポリンＡ及びタクロリムスからなる群から選択される薬剤に対する患者の反応性を測定する方法であって、
４時間以内、患者の全血を該薬剤及びレクチンに暴露すること；
４時間以内、患者の全血を対照ビヒクル及びレクチンに暴露すること；
前記暴露後に、血液細胞におけるＩＬ−２遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を測定すること；
対照ビヒクルの暴露後に得られた測定の結果と該薬剤の暴露後に得られた測定の結果とを比較すること；及び
該比較の結果に基づいて該薬剤に対する反応性を確認すること
を含み、該ｍＲＮＡの量の変化が該薬剤に対する患者の反応性を表す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、薬剤の投与を選定する方法に関する。この方法では、患者の全血を薬剤に暴露する。薬剤に暴露後、及び対照ビヒクルのみに暴露後、この薬剤の効果に結び付いたマーカーｍＲＮＡのレベルを白血球で測定する。薬剤暴露後のｍＲＮＡレベルを、対照ビヒクル暴露後の値、又は薬剤暴露前に測定した値と比較することによって、この薬剤が患者に効果的であるか否かを判定することが可能である。多くの考えられる治療薬剤に対して、患者の血液をスクリーニングすることによって、特定の患者に対して選定された最適化治療プロトコルを開発することが可能である。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００４年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／６２０，６０３号、２００５年２月１６日に出願された同第６０／６５３，５５７号及び２００５年６月８日に出願された同第６０／６８８，７４１号に対して優先権を主張する。
【０００３】
［配列リスト、表又はコンピュータープログラムリストの参照］
本出願は、別個の配列リストを含む。
【背景技術】
【０００４】
［関連技術の記載］
薬局方は、医者にほとんどの疾病に対する幾つかの考えられる治療剤を提供している。しかし、個々の治療剤の有効性は、患者ごとに大いに異なる。概して、特定の疾病に対してあまり効果的ではないとされる薬剤が、事実、この疾病に冒された特定の患者には非常に効果的であることがある。したがって医者及び患者にとって、どの薬剤又は薬剤の組み合わせがそれぞれの患者に最も適しているか、また副作用を引き起こすことなく最大限の効果を導くために、どのくらいの用量を個人に合わせて投与すべきかを予め決定することができることは非常に有益なことであろう。このような決定をする能力は、一般的に「個別的医療(tailored medicine)」と呼ばれるが、現在では一般に実用的なものではない。
【０００５】
個別的医療に対する最初のアプローチとして、血液中の薬剤濃度を測定することによる治療剤のモニタリングを試みられている。しかし得られた値は、それぞれの患者における薬剤の実質的な効果に必ずしも相関があるという訳ではない。別のアプローチは、薬剤代謝に関与する遺伝子の変異を同定するために、薬理遺伝学、又は薬剤毒性関連の遺伝子についての単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）情報を利用した遺伝子型決定に依存する。しかし、適切な遺伝子上の「ホットスポット」の発見及びこれらの特徴付けを目指すこのような研究は、多大な時間及び資源を要求する。さらに、薬剤代謝に関連する遺伝子は限られた数だけしか同定されていない。その上、同じ遺伝子又は他の関連遺伝子において未だ確認されていない他の変異の効果が、既知の変異から得られた機能障害を悪化させるか、又は改善させるかどうかは知られていない。
【０００６】
効果のないプロトコルを初めに選択した場合に非常に急速に疾患が進行する恐れのある癌の場合において、適切な治療レジメンを選択する必要性が特に深刻である。多くの抗癌剤が市販されている。薬剤の選択は癌細胞の型に基づいているので、個々の癌細胞を完全に特徴付けるために、広範囲に及ぶ細胞学試験が行なわれる。しかし、同じ細胞型の中であっても患者ごとのばらつきが存在し、患者が一度特定の薬剤に対して非反応性になると、積極的療法が中止される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性に関して、薬剤及びその組み合わせの広範囲に及ぶアレイをスクリーニングすることが可能であった場合、このような患
者に効果的な薬剤レジメンを特定することができる。
【０００７】
癌細胞を血液から単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの適切な抗癌剤あり又はなしで、培養培地に維持することができる。このようなアッセイは労働集約型操作ステップで２、３日を要するが、これらの人工培養条件がｉｎ  ｖｉｖｏでの薬剤感受性を反映することはめったにない。したがってこれらの原則に基づくアッセイは、日常的な臨床試験として適用されない。
【０００８】
多くの抗癌剤は、異常細胞の細胞周期の進行を止めるか、又はアポトーシスに入ることによって機能する。細胞周期停止に関連するとして知られている遺伝子はｐ２１である。さらに、細胞がアポトーシスを促進させると、幾つかのプロアポトーシスのｍＲＮＡを誘導することが知られている。これらは、特にＢａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ及びＢｃｌ−ＸＳからなる、いわゆるＢｃｌ−２／Ｂａｘファミリー遺伝子である。いわゆるＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバー等の切断型のＢａｘはまたプロアポトーシスであることも知られていて、特にこの群はＢｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、ＮＯＸＡ及びＰＵＭＡ（ｐ５３誘導性アポトーシス調節因子）からなる。これらの遺伝子は、ミトコンドリア膜と結合し、シトクロムｃの放出を制御することによってアポトーシスを調節する同様の構造モチーフを共有する。多くのプロアポトーシス遺伝子が同定されているが、全てがアポトーシスの発現に等しく重要であるかどうかは知られていない。組織又は細胞のタイプによって、又は刺激のタイプ又は程度によって、特定の遺伝子を優性的に発現することができる。代替的には、原因遺伝子が個体間で変化し得る。アポトーシスが発病に重大な役割を果たす場合に、優性の普遍的プロアポトーシスｍＲＮＡ又はこのようなｍＲＮＡの組を同定したとき、これらは癌及び炎症に対する一般的な薬剤標的として非常に有用であると考えられる。さらに、それらはアポトーシス関連疾病に対する普遍的な診断用ツールとして有用であると考えられる。
【０００９】
さらに、化学療法剤を固形癌に対して用いるとき、主要な考えられる副作用の１つは、白血球の抑制である。重症例では、この副作用は致命的である可能性がある。しかし残念ながら、どの患者で白血球抑制が起こるか、又は治療の間、いつ副作用が起こりやすいのかを予測することは不可能である。したがって、薬剤反応の個々のパターンの特定は診断目的に有用であるだけでなく、臨床試験の結果を改善するのに、また薬剤関連死の危険を低減することによって悪評を逃れるのにも有用である。これらの分野の改善は医薬産業にとって非常に価値のあるものである。
【００１０】
主な抗癌剤が静脈内で使用され、各薬剤の血液レベルが十分に特徴付けられているので、アプローチの１つとしては、薬剤の既知の効果を利用する細胞に基づいた機能的アッセイで、ｅｘ  ｖｉｖｏでの白血球毒性を検査することである。例えば、ブレオマイシン（ＢＬＭ）は、ＤＮＡ切断及び染色体切断によってヒトリンパ球におけるアポトーシスを誘導することが知られている。強力なトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるエトポシド（ＶＰ−１６）は、ヒトリンパ球におけるＤＮＡ鎖切断及びアポトーシスを誘導する。細胞に基づいた機能的アッセイは研究に広く使用されるが、このような試みが複雑である（大きな変動を伴い、定量が困難である）ために、個々の薬剤に対する反応性のある個体(responders)及び非反応性の個体(non-responders)を同定するのにこれらを使用することは臨床診療であまり認められていない。
【００１１】
また、組織移植及び骨髄移植した患者は生涯免疫抑制剤を使用しなければいけないので、これらの患者の間で薬剤を選定することの必要性が高まっている。シクロスポリンＡ（「ＣｓＡ」）及びタクロリムス（「ＦＫ」）がこれらの患者のマネージメントに関する優れた記録を示していることから、今では多くの他の疾患（特に、乾癬、炎症性腸疾患、及び腎炎症候群等）にこれらの薬剤が使用される。しかし、これらの薬剤の有効性は、個々
の患者間でも異なり、これらの２つの薬剤の１つに対してより良好な反応を示す患者もいる。これらの薬剤の一次作用がインターロイキン−２（ＩＬ−２）ｍＲＮＡの転写を阻害することであるので、リンパ球中のＩＬ−２  ｍＲＭＡのレベルを定量することは理にかなっている。しかし、主にｍＲＮＡを取り扱うことが難しいという理由で、用いられている方法は通常の臨床試験としては適切ではない。また、アッセイの多くの変動は患者ごとの変動を特定するのに適切ではない。
【発明の開示】
【００１２】
［発明の概要］
本発明は、候補薬剤で患者の全血を刺激した後に白血球で測定されるマーカーｍＲＮＡのレベルに基づいて個々の患者の薬剤プロトコルを選定する方法を開示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の一態様は、７時間以内、患者の全血を薬剤に暴露すること；暴露後に、血液細胞における薬剤の効果に関連するｍＲＮＡの量を測定すること；及び測定結果に基づいて薬剤に対する反応性を確認することを含み、ｍＲＮＡの量の変化が薬剤に対する患者の反応性を表す、方法を含む。
【００１４】
本方法の好ましい一つの実施の形態では、暴露前に、血液細胞に存在するｍＲＮＡの量を測定し、暴露前に測定したｍＲＮＡの量と暴露後に測定したｍＲＮＡの量とを比較することによりｍＲＮＡの量の変化を求める。
【００１５】
本方法の別の好ましい実施の形態では、７時間以内、患者の全血を対照ビヒクルに暴露し；暴露後に、対照ビヒクルに暴露した血液細胞における薬剤の効果に関連するｍＲＮＡの量を測定して；少なくとも一部分において、対照ビヒクルの暴露後に得られた測定結果を薬剤の暴露後に得られた測定結果と比較することによって、薬剤に対する反応性を確認する。好ましくは、この対照ビヒクルはリン酸緩衝生理食塩水及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される。
【００１６】
本方法の好ましい実施の形態では、患者の全血を暴露することがヘパリンの添加を含む。
【００１７】
本方法の好ましい実施の形態では、５時間以内、全血を刺激する。さらに好ましくは、２〜４時間以内、全血を刺激する。
【００１８】
本方法の好ましい実施の形態では、薬剤の効果は血液細胞のアポトーシスである。
【００１９】
本方法の好ましい実施の形態では、ｍＲＮＡがＢｃｌ−２／Ｂａｘ遺伝子ファミリーの遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択される。さらに好ましくは、このｍＲＮＡがＢａｘ遺伝子産物をコードする。
【００２０】
本方法の別の好ましい実施の形態では、ｍＲＮＡがＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリーの遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択される。さらに好ましくは、このｍＲＮＡがＰＵＭＡ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ及びＮＯＸＡ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択される。
【００２１】
本方法の好ましい実施の形態では、薬剤の効果が血液細胞における細胞周期停止であり、ｍＲＮＡがｐ２１遺伝子産物をコードする。
【００２２】
また、本方法の別の好ましい実施の形態では、血液細胞における薬剤の第２の効果に関
連する第２のｍＲＮＡの量を測定し、薬剤の第１の効果は血液細胞のアポトーシスであり、第１のｍＲＮＡがＰＵＭＡ遺伝子産物をコードし、薬剤の第２の効果が血液細胞における細胞周期停止であり、第２のｍＲＮＡがｐ２１遺伝子産物をコードする。
【００２３】
本方法の別の好ましい実施の形態では、薬剤がエトポシド、ドキソルビシン、フルダラビン、ミトキサントロン、リツキシマブ、ビンデシン、ピラルビシン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ペプロマイシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、ダカルバジン、シクロホスファミド、及びパクリタキセルから成る群から選択される。
【００２４】
本方法の別の好ましい実施の形態では、患者が白血病又は白血病性リンパ腫の患者である。
【００２５】
本方法の別の好ましい実施の形態では、患者の全血を暴露することがレクチンによる刺激を含む。さらに好ましくは、当該レクチンがフィトヘマググルタニン−Ｐ及びヤマゴボウマイトジェンからなる群から選択される。
【００２６】
本方法の別の好ましい実施の形態では、薬剤の効果がＩＬ−２転写の阻害であり、ｍＲＮＡがＩＬ−２遺伝子産物をコードする。
【００２７】
本方法の別の好ましい実施の形態では、薬剤が免疫抑制剤である。さらに好ましくは、薬剤がシクロスポリンＡ及びタクロリムスからなる群から選択される。
【００２８】
本方法の別の好ましい実施の形態では、ｍＲＮＡがＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ由来の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択される。
【００２９】
本発明の一態様は、エトポシド、ドキソルビシン、フルダラビン、ミトキサントロン、リツキシマブ、ビンデシン、ピラルビシン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ペプロマイシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、ダカルバジン、シクロホスファミド、及びパクリタキセルからなる群から選択される薬剤に対する患者の反応性を測定する方法を含み、この方法は、４時間以内、薬剤に患者の全血を暴露すること；４時間以内、患者の全血を対照ビヒクルに暴露すること；これらの暴露後に、血液細胞におけるｐ２１遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ、ＢＡＸ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ、及びＰＵＭＡ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること；対照ビヒクルの暴露後に得られた測定結果を薬剤の暴露後に得られた測定結果と比較すること；及び比較の結果に基づいた薬剤に対する反応性を確認することを含み、ｍＲＮＡの量の変化が薬剤に対する患者の反応性を表す、方法を含む。
【００３０】
本発明の一態様は、４時間以内、薬剤及びレクチンに患者の全血を暴露すること；４時間以内、患者の全血を対照ビヒクル及びレクチンに暴露すること；これらの暴露後に、血液細胞におけるＩＬ−２遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を測定すること；対照ビヒクルの暴露後に得られた測定結果を薬剤の暴露後に得られた測定結果と比較すること；及び比較の結果に基づいて薬剤に対する反応性を確認することを含み、ｍＲＮＡの量の変化が薬剤に対する患者の反応性を表す、方法を含む。
【実施例１】
【００３１】
白血病及びリンパ腫のために選定された薬剤投与におけるｐ２１／ＢＡＸの使用
本方法では、医薬の作用による白血球の細胞死がｐ２１  ｍＲＮＡ及びＢＡＸ  ｍＲＮＡの転写レベルに関連している。これらの２つのマーカーｍＲＮＡの中で、ｐ２１は細胞周期停止に関与し、ＢＡＸはアポトーシスの初期信号として誘導される。薬剤が癌細胞においてｐ２１を誘導する場合、この薬剤が細胞増殖抑制作用を発揮することを示している。一方、ＢＡＸを誘導する場合は、この薬剤が殺細胞作用を有することを示している。アポトーシスの進行中、多くの遺伝子が関与するが、これらの２つの初期遺伝子マーカーの発現は薬剤の細胞毒性作用を表す。
【００３２】
健常な成人及び２人の白血病性の非悪性ホジキンリンパ腫の患者から血液を得た。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）からＵ９３７、ＫＧ−１、及びＪｕｒｋａｔ細胞を入手し、１０％ウシ胎仔血清で補充されたＲＰＭＩ  １６４０中に維持した。これらの中で、Ｕ９３７細胞はヒト組織球性リンパ腫細胞株であり、ＫＧ−１細胞はヒト骨髄の骨髄性白血病細胞株であり、Ｊｕｒｋａｔ細胞は白血病由来のヒトＴ細胞リンパ芽球様細胞株である。無血清培地で細胞を懸濁し、３７℃で２時間、エトポシド（Sigma、ミズーリ州セントルイス）に暴露し、それからｐ２１を測定した。ヒトの試験では、３７℃で２時間、様々な抗癌剤で血液アリコートを刺激して、それからｐ２１  ｍＲＮＡ及びＢＡＸ  ｍＲＮＡを測定した。この研究で使用した抗癌剤は臨床剤であり、静脈内投与後３〜６時間、各薬剤の濃度を一般的な血液レベルまで調整した。使用した薬剤は、Ａｄｒｉａｃｉｎ（ドキソルビシン、協和続酵工業株式会社）、Ｆｌｕｄａｒａ（フルダラビン、Schering）、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎ（ミトキサントロン、Wyeth）、Ｖｅｐｅｓｉｄ（ＶＰ−１６、エトポシド、Bristol-Myers Squibb）、Ｒａｎｄａ（シスプラチン、日本化薬株式会社）、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、中外製薬株式会社）、Ｆｉｌｄｅｓｉｎ（ビンデシン、塩野義製薬株式会社）、Ｔｈｅｒａｒｕｂｉｃｉｎ（ピラルビシン、明治製菓株式会社）、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（カルボプラチン、Bristol）、及びＥｎｄｏｘａｎ（シクロホスファミド、塩野義製薬株式会社）であった。
【００３３】
ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを全血から調製した。簡潔に述べると、自家製の９６ウェルフィルタープレートを回収プレートの上に置いて、５ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）１５０μｌを加えた。４℃で１分間、１２０×ｇで遠心分離した後に、血液サンプル５０μｌを各ウェルに加え、直ちに４℃で２分間、１２０×ｇで遠心分離して、続いて、４℃で５分間、２，０００×ｇで一回遠心分離することによって、各ウェルをＰＢＳ３００μｌで洗浄した。それから、例えば、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン、４×ＳＳＣ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、及び１．７９１Ｍのチオシアン酸グアニジンを含み、１％の２−メルカプトエタノール（Bio Rad、米国カルフォルニア州ハーキュリーズ）、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Pierce、米国イリノイ州ロックフォード）、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（5 Prime Eppendorf/Brinkmann、米国ニューヨーク州ウェストベリー）、０．１ｍｇ／ｍｌのＥ．コリのｔＲＮＡ（Sigma）、表１で示される特定のリバースプライマーをそれぞれ１０ｍＭ含有するカクテル、及び標準的なＲＮＡ３４オリゴヌクレオチドで補充された、ストック溶解緩衝液６０μｌをフィルタープレートに加えて、その後３７℃で１０分間インキュベートした。それから、フィルタープレートをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、RNAture）の上に置いて、４℃で５分間、２，０００×ｇで遠心分離した。４℃で一晩保存した後に、マイクロプレートを単純な溶解緩衝液１００μｌで３回、続いて４℃で洗浄緩衝液（０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ）１５０μｌで３回洗浄した。１×ＲＴ緩衝液、それぞれ１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、４ユニットのｒＲＮａｓｉｎ、及び８０ユニットのＭＭＬＶ逆転写酵素（Promega）（プライマーなし）を含む緩衝液３０μｌを添加することによって、ｃＤＮＡを各ウェルで直接合成して、３７℃で２時間インキュベートした。特定のプライマー
でプライム化されたｃＤＮＡが溶液中に存在し、残留したオリゴ（ｄＴ）プライム化ｃＤＮＡはマイクロプレートに固定化された。ＴａｑＭａｎＰＣＲでは（図１、図３、図４）、得られたｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ABI）５μｌ、及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭの順方向プライマー及び逆方向プライマー、及び３〜６μＭのＴａｑＭａｎプローブ）１μｌを加えて、９５℃で１０分を１サイクル、続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び６０℃で１分を４５サイクルで、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（ABI）によってＰＣＲを行った。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲでは（図６を参照）、ｃＤＮＡを水で３〜４倍に希釈し、ｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移して、これにｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（BioRad、カルフォルニア州ハーキュリーズ）５μｌ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭの順方向プライマー及び逆方向プライマー）１μｌを加えて、９５℃で１０分を１サイクル、続いて９５℃で３０秒、及び６０℃で１分を４５サイクルで、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（ABI）によってＰＣＲを行った。各遺伝子を別々のウェルで増幅した。Ｃｔを解析用ソフトウェア（ＳＤＳ、ABI）で測定した。
【００３４】
血液細胞及び培養細胞においてｐ２１  ｍＲＮＡを誘導するのに用いられるエトポシドの適切な濃度を決定するために、健常な成人由来の血液サンプルを３７℃で２時間、様々な濃度の薬剤で刺激して、それからｐ２１  ｍＲＮＡのレベルを測定した。図１で示されるように、○（有意にｐ２１  ｍＲＮＡを発現しなかった）が健常な白血球において１０μＭのエトポシドで検出されたが、１００μＭではｐ２１は有意に発現した。しかしながら、これに対して、Ｕ９３７細胞を１０μＭのエトポシドに暴露したとき、この細胞ではわずかではあるが有意なｐ２１の発現が検出された（図１、●、矢印）。ＫＧ−１細胞（図１、▲）の薬剤感受性はヒト血液のものと同程度であり、１００μＭを使用したときでさえ、Ｊｕｒｋａｔ細胞はエトポシドに対して耐性があった（図１、◆）。これらの結果によって、ｐ２１  ｍＲＮＡの発現が薬剤毒性に対する有用なマーカーであり、１０μＭのエトポシドが感受性癌細胞の選択の手段であることが示される。
【００３５】
図１で示された結果によって、１０μＭのエトポシドが健常な血液とＵ９３７とを区別するためのカットオフ値であることが示された。培養細胞を使用して白血病を刺激するために、様々な量のＵ９３７を血液と混合し、１０μＭのエトポシドに暴露した。結果を図２に示す。血液とＵ９３７とを相互作用させないように、別々の試験管内でエトポシドに血液及び細胞を暴露して、フィルタープレートの同じウェルに加えた。また、Ｕ９３７における天然のｐ２１  ｍＲＮＡの発現を同定するために、対照として同量の未処理のＵ９３７を血液サンプルに添加した。この図では、□がＤＭＳＯ処理Ｕ９３７細胞を表し、◆が１０μＭのエトポシド処理Ｕ９３７細胞を表す。図２で示されるように、１，２５０個のＵ９３７細胞を血液１μＬに添加したとき（矢印）、有意な（ｐ＝０．０４）ｐ２１  ｍＲＮＡの発現が同定された。これらの結果によって、癌細胞集団が２０％（血液１μＬ、５，０００個の正常白血球につき、１，２５０個の癌細胞）と少ないとき、全血において癌細胞の薬剤感受性を同定することができることが示される。
【００３６】
図１、図２で示される結果を得た培養細胞条件は人為的なものであり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬剤作用を必ずしも反映しない。培養細胞の結果を解釈するのは困難である。対して、全血由来のデータは生理的条件に非常に近い条件で得られ、このようなデータは解釈が容易である。
【００３７】
図３において、種々の薬剤に対する、２人の白血病性リンパ腫の患者及び１人の健常な成人における薬剤誘導性のｐ２１  ｍＲＮＡ発現及びＢＡＸ  ｍＲＮＡ発現の結果が示される。この図では、ＡｄｒがＡｄｒｉａｃｉｎを表し（４００ｎＭ）、ＦｕｒがＦｌｕｄａｒａを表し（０．２μｇ／ｍｌ）、ＮｏｖがＮｏｖａｎｔｒｏｎを表し（１０ｎｇ／ｍ
ｌ）、ＶｅｐがＶｅｐｅｓｉｄを表し（５μｇ／ｍｌ）、ＲａｎがＲａｎｄａ（シスプラチン）を表し（１μｇ／ｍｌ）、ＲｉｔがＲｉｔｕｘａｎを表し（２００μｇ／ｍｌ）、ＦｉｄがＦｉｌｄｅｓｉｎを表し（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴｅｒがＴｈｅｒａｒｕｂｉｃｉｎを表し（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＰａｒがＰａｒａｐｌａｔｉｎを表し（５μｇ／ｍｌ）、ＥｎｄがＥｎｄｏｘａｎを表す（１μｇ／ｍｌ）。静脈内投与後１〜４時間の血液レベルに基づいて、これらの濃度を決定した。黒色のバーはｐ＜０．００１を表し、淡灰色のバーはｐ＜０．０５を表す。
【００３８】
健常な成人では、全ての薬剤がｐ２１  ｍＲＮＡ及びＢＡＸ  ｍＲＮＡを誘導できなかったが、血液をＴｈｅｒａｒｕｂｉｃｉｎ及びＰａｒａｐｌａｔｉｎで刺激したとき、患者１では、ｐ２１  ｍＲＮＡ及びＢＡＸ  ｍＲＮＡの両方の有意な誘導が示された。Ｅｎｄｏｘａｎもまた、ｐ２１  ｍＲＮＡを誘導した。患者２では、Ａｄｒｉａｃｉｎ及びＦｌｕｄａｒａによる有意なｐ２１  ｍＲＮＡの誘導、並びにＮｏｖａｎｔｒｏｎによるＢＡＸ  ｍＲＮＡの誘導が示された。Ｖｅｐｓｉｄは、患者２においてｐ２１  ｍＲＮＡ及びＢＡＸ  ｍＲＮＡの両方を誘導した。全血を試験しても、両方の患者で異型リンパ球の集団が８０％を超えていたので、これらの結果は悪性細胞によるものであった。図３で示された結果によって、１）この方法は全血における癌細胞に由来する遺伝子発現を同定するのに十分な感受性があること、及び２）これらの患者の癌細胞がＢ細胞由来のものであったとしても、薬剤反応性が広範囲にわたって変わることが示される。
【００３９】
図４によって、ＣＨＯＰ化学療法（シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ）、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｃｉｎ）、ビンクリスチン、及びプレドニソロン）及びその後の脾臓放射に対する反応性のない患者２のさらなる臨床経路が示され、連続血小板減少症が示された。しかし、この図で示されるように、Ｖｅｐｅｓｉｄ（ＶＰ−１６、エトポシド）を投与したとき、血小板数が大幅に増加した。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は血小板に対する機能を有さないので、血小板減少症の改善はエトポシドの作用に起因する。エトポシドは患者２でｐ２１  ｍＲＮＡ及びＢＡＸ  ｍＲＮＡの両方を誘導した唯一の薬剤であったので、これらの臨床結果によって、全血における薬剤誘導性のｐ２１  ｍＲＮＡ発現及びＢＡＸ  ｍＲＮＡ発現の測定が各患者に対して感受性のある薬剤の同定に有用であることが示される。
【００４０】
それぞれの場合において、全血における薬剤誘導性のｐ２１  ｍＲＮＡ発現及びＢＡＸ
ｍＲＮＡ発現を測定することによって、感受性のある薬剤を同定した。アッセイの変動が非常に小さく、開始材料が全血の三重アリコートであったので、この結果は統計的に有意であった。興味深いことに、感受性のある薬剤のリストは２人の患者間で異なっていたけれども、患者は両方ともＢ細胞の特性を伴う非ホジキンリンパ腫を有していた。これらの薬剤の選択は、このｍＲＮＡ試験なしでは達成することはできない。したがって、この試験は血液癌に対する薬剤を選定するための有力なツールになるだろう。
【００４１】
固形癌とは違い、血液癌は血液中に存在する。したがって、全血において各薬剤の許容最大濃度をｐ２１  ｍＲＮＡ誘導及びＢＡＸ  ｍＲＮＡ誘導に関して決定したが（図３、右側のパネル）、その一方で全血において単純に混合した候補薬剤によって、癌細胞に対する薬剤感受性を同定することができた（図３、左側のパネル及び中央のパネル）。さらに、潜在的な副次的効果を取り除くため、２時間だけこの薬剤をインキュベートする必要があった。ｐ２１発現及びＢＡＸ発現後にアポトーシスカスケードを下流で阻害することが可能であるが、ｐ２１発現及びＢＡＸ発現を誘導する薬剤はこれらの遺伝子のｍＲＮＡを誘導できない他の薬剤よりも有効である可能性が高い。この実施例の第２の患者が同定された薬剤に対して反応性があるという事実（図４）によって、本方法が将来の癌の化学療法のための選定医薬に有用であることが示される。
【実施例２】
【００４２】
白血病及びリンパ腫に対して選定された薬剤投与におけるｐ２１  ｍＲＮＡ及びＰＵＭＡ
ｍＲＮＡの使用
２００１年のほとんど同時期に３つの独立したグループによって、ＰＵＭＡ又はＢｃｌ−２結合成分３（ｂｂｃ３）が発見され、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＨＳＵ８２９８７、ＡＦ３３２５５８、及びＡＦ３５４６５６が与えられた。ＧｅｎＢａｎｋ情報によれば、これらの配列はそれぞれ、１９９６年１２月、２０００年１２月、及び２００１年３月に提出され、最も古いエントリーであるＵｎｉＧｅｎｅ（Ｈｓ．４６７０２０）はこの遺伝子の表記としてｂｂ３を使用した。多くの出版物では、ｂｂｃではなく、ＰＵＭＡ（アポトーシスのｐ５３調節因子）が使用されている。これは全ての細胞型において普遍的に発現するものではなく、ＵｎｉＧｅｎｅ（Ｈｓ．４６７０２０）の発現プロファイルデータによれば、血液、頸部、結腸、眼、腎臓、喉頭、肺、乳腺、卵巣、肌、小腸、胃、及び睾丸で発現する。また、ＰＵＭＡは、マウスにおける薬剤誘導性のアポトーシスの主要なメディエーターであることが報告されている。ＰＵＭＡは、各実験系で広く特徴付けられたが、未だにヒト血液の白血球におけるＰＵＭＡ  ｍＲＮＡと他のプロアポトーシスｍＲＮＡとの間に何ら関係性が示されていない。血液における初期アポトーシス信号の検出が、血液の疾病の患者それぞれに対して効果的な抗癌剤の同定のための新たな診断の開発につながることが期待されるので（図８を参照）、血液は特に重要である。さらに、固形癌に対する抗癌剤には、致命的になることもある白血球における幾つかの副作用を誘導するものもある。したがって、血液及び標的薬剤のｅｘ  ｖｉｖｏでのインキュベーションによって、個々の薬剤毒性を予測することができる。特定の薬剤に対して反応性のある個体又は非反応性の個体の同定は、薬剤の開発の進展に有用であると思われる。
【００４３】
通常、薬剤感受性の試験は、培養培地で懸濁し、ＣＯ2インキュベーターで数日間インキュベートして単離された単核白血球を使用して行われ、細胞死若しくはアポトーシス、又は同等の生物学的指標の確立を確認する。これらの条件が自然条件とは全く異なるので、この結果を解釈することは困難である。好適な薬剤の同定が患者の生活の質に必須であるものの、このことが薬剤感受性の試験が臨床診療には一般的ではないことの主な理由の１つである。本方法は、全血及び２〜４時間と短いインキュベーションを使用することによって、この問題を回避する。本方法は、ヒトの全血わずか５０μｌから任意のｍＲＮＡの絶対量を高感度に測定することが可能である。ハイスループットプラットホームが三重の全血サンプルの使用を可能にするので、結果は合理的な統計分析に基づき信頼できるものである。遺伝子型決定は、薬剤感受性のアッセイにおける新たな最新の傾向であるが、或る特定の遺伝子の１つ又は複数の位置での遺伝的多型又は遺伝変種に基づき結論に達することが困難であり、これは他の遺伝子の遺伝的多型又は遺伝変種が初めの異常を補うことができるか否かが知られていないからである。本方法は、ツールとして遺伝学を利用する表現型の試験を提供し、これらの問題を回避する。
【００４４】
薬剤誘導性のｐ２１及び／又はＰＵＭＡ  ｍＲＮＡの有意な誘導がこの系によって検出されるとき、これらの肯定的な結果によって、少なくともこの薬剤がｅｘ  ｖｉｖｏでの生理学的条件下での初期アポトーシスカスケードを開始するのに機能することが示される。この試験で肯定的な結果を示す薬剤は、否定的な結果を示すものより治療に関して良好な候補である可能性が高い。より確実に生理学的条件を再現するために、より短いインキュベーション期間を有するアッセイを使用して、各血液サンプルにおけるアポトーシスの最終的な確立を確認することができる。ｐ２１が細胞周期停止に反応性があり、ＰＵＭＡはプロアポトーシスであるので、これらの遺伝子の分析は薬剤の細胞増殖抑制作用及び殺細胞作用に対応するだろう。
【００４５】
以下の方法は、本発明の方法を実施する上で用いられた。
【００４６】
健常な成人のボランティア及び疾病患者から血液サンプルを得た。様々なＢａｘ関連遺伝子、およびアポトーシスの間に誘導されると報告された遺伝子を文献調査によって同定して、対応するＰＣＲプライマー及びＴａｑＭａｎプローブをＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Applied Biosystem、カルフォルニア州フォスターシティ）及びＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ（RNAture、カルフォルニア州アービン）で設計した。オリゴヌクレオチドはIDT（アイオワ州コーラルビル）で合成された。ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号及びプライマー配列を以下の表１にまとめる。
【００４７】
表１．遺伝子プライマー配列
【表１−１】
2008516636.tif 000002
【表１−２】
2008516636.tif 000003
【００４８】
８ウェルのストリップマイクロチューブに５０倍希釈濃度の薬剤又は対照（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はＤＭＳＯ）を１．４μｌ添加し、使用まで−２０℃で保存した。使用する化学物質は、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン（ＶＣＬ）、ミトキサントロン（ＭＩＴ）、アクラルビシン（ＡＣＲ）、ブレオマイシン（ＢＬＭ）、ダウノルビシン（ＤＮＲ）、ドキソルビシン（ＤＸＲ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、カルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、フルダラビン（ＦＤＢ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、シクロホスファミド（ＣＰＡ）（Sigma製、ミズーリ州セントルイス）、ピラルビシン（ＴＨＰ）、及びペプロマイシン（ＰＥＰ）（和光純薬工業株式会社製、日本国大阪）であった。ヘパリン処理された新鮮な全血数μｌを各ウェルに三重で添加し、蓋をして３７℃で２〜８時間インキュベートした。放射線処理のために、セシウム−１３７を特定の用量で使用して、血液を刺激した。各処理後、全血５０μｌを下記のようにフィルタープレートへ移した。
【００４９】
ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを全血から調製した。簡潔に述べると、自家製の９６ウェルフィルタープレートを回収プレートの上に置いて、５ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）１５０μｌを加えた。４℃で１分間、１２０×ｇで遠心分離した後に、血液サンプル５０μｌを各ウェルに加え、直ちに４℃で２分間、１２０×ｇで遠心分離し、続いて４℃で５分間、２，０００×ｇで一回遠心分離して各ウェルをＰＢＳ３００μｌで洗浄した。それから、例えば、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン、４×ＳＳＣ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、及び１．７９１Ｍのチオシアン酸グアニジンを含み、１％の２−メルカプトエタノール（Bio Rad、米国カルフォルニア州ハーキュリーズ）、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Pierce、米国イリノイ州ロックフォード）、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（5 Prime Eppendorf/Brinkmann、米国ニューヨーク州ウェストベリー）、０．１ｍｇ／ｍｌのＥ．コリのｔＲＮＡ（sigma）、表１で示される特定のリバースプライマーをそれぞれ１０ｍＭ含有するカクテル、及び標準的なＲＮＡ３４オリゴヌクレオチドで補充された、ストック溶解緩衝液６０μｌをフィルタープレートに加えて、３７℃で１０分間インキュベートした。それから、フィルタープレートをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、RNAture）の上に置いて、４℃で５分間、２，０００×ｇで遠心分離した。４℃で一晩保存した後に、マイクロプレートを単純な溶解緩衝液１００μｌで３回、続いて４℃で３回洗浄緩衝液（０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴ
Ａ）１５０μｌで洗浄した。１×ＲＴ緩衝液、それぞれ１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、４ユニットのｒＲＮａｓｉｎ、及び８０ユニットのＭＭＬＶ逆転写酵素（Promega）（プライマーなし）を含む緩衝液３０μｌを添加し、３７℃で２時間インキュベートすることによって、ｃＤＮＡを各ウェルで直接合成した。特定のプライマーでプライム化されたｃＤＮＡが溶液中に存在し、残留したオリゴ（ｄＴ）プライム化ｃＤＮＡがマイクロプレートに固定化された。ＴａｑＭａｎＰＣＲでは（図１、図３、図４）、得られたｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ABI）５μｌ、及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのファワードプライマー及びリバースプライマー、及び３〜６μＭのＴａｑＭａｎプローブ）１μｌを加えて、９５℃で１０分を１サイクル、続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び６０℃で１分を４５サイクルで、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（ABI）によってＰＣＲを行った。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲでは（図６を参照）、ｃＤＮＡを水で３〜４倍に希釈し、ｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移して、これにｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（BioRad、カルフォルニア州ハーキュリーズ）５μｌ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのファワードプライマー及びリバースプライマー）１μｌを加えて、９５℃で１０分を１サイクル、続いて９５℃で３０秒、及び６０℃で１分を４５サイクルで、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（ABI）によってＰＣＲを行った。各遺伝子を別々のウェルで増幅した。Ｃｔを解析用ソフトウェア（ＳＤＳ、ABI）で測定した。１×Ｒｔ緩衝液を陰性対照として使用したが、どのプライマー対もこれらの実験条件下で非特異的なプライマー二量体を生成しなかった。図８におけるＰＵＭＡに関して、オリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート上で固定化されたｃＤＮＡをｉＣｙｃｌｅｒ（BioRad）で直接増幅した。
【００５０】
市販のキット（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ、Gentra、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、処理あり又は処理なしでそれぞれ、全血３００μｌからゲノムＤＮＡを精製した。それから、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色した３．５％アガロース（３：１のＮｕＳｉｅｖｅ：アガロース、FMC、メイン州ロックランド）ゲル電気泳動法でＤＮＡを分析して、写真画像をＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ（Alpha Innotech、カルフォルニア州サンリアンドロ）で記録した。
【００５１】
アポトーシスを誘導するために、ヘパリン処理されたヒト全血を３０Ｇｙの電離放射線、２０μＭのブレオマイシン（ＢＬＭ）、又は１００μＭのエトポシド（ＶＰ−１６）でそれぞれ刺激した。１５〜２５Ｇｙの放射線を臨床的に使用して、輸血間の移植片対宿主病を防ぐためにドナーの白血球を死滅させる。ブレオマイシンは、ＤＮＡ切断及び染色体切断によって、ヒト白血球においてアポトーシスを誘導することが知られている。強力なトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるエトポシドはヒト白血球におけるＤＮＡ鎖切断及びアポトーシスを誘導する。疑似的な生理学的条件として、単核細胞を単離しないで、全血を使用した。図５の挿入図において示されるように、アポトーシスの典型的なサインであるＤＮＡの断片化を分析した。インキュベーション１日後、ゲノムＤＮＡを抽出し、臭化エチジウム染色を使用したアガロースゲル電気泳動法によって、ＤＮＡの断片化を分析した。レーン１は、１００ｂｐのＤＮＡラダー（最小表示：２００ｂｐ、Invitrogen、カルフォルニア州）を示す一方、レーン２〜６はそれぞれ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ、１００μＭのＶＰ−１６、２０μＭのＢＬＭ、及び３０Ｇｙの放射線での１日のインキュベーションを示し、レーン７は新鮮血の結果を示す（この図の「対照」）。この図で示されるように、ＤＮＡの断片化が観察された。
【００５２】
以下の方法を使用して、様々なｍＲＮＡの定量を行った。ヘパリン処理された全血のそれぞれ５０μｌの三重アリコートを９６ウェルフィルタープレートに加えて、白血球を捕捉した。このフィルタープレートを回収プレートの上に置いて、５ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）１５０μｌを加えた。４℃で１分間、１２０×ｇで遠心分離した後に、血液サンプ
ル５０μｌを各ウェルに加え、直ちに４℃で２分間、１２０×ｇで遠心分離して、続いて４℃で５分間、２，０００×ｇで一回遠心分離して各ウェルをＰＢＳ３００μｌで洗浄した。それから、例えば、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン、４×ＳＳＣ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、及び１．７９１Ｍのチオシアン酸グアニジンを含み、１％の２−メルカプトエタノール（Bio Rad、米国カルフォルニア州ハーキュリーズ）、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Pierce、米国イリノイ州ロックフォード）、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（5 Prime Epperndorf/Brinkmann、米国ニューヨーク州ウェストベリー）、０．１ｍｇ／ｍｌのＥ．コリのｔＲＮＡ（Sigma）、表１で示される特定のリバースプライマーをそれぞれ１０ｍＭ含有するカクテル、及び標準的なＲＮＡ３４オリゴヌクレオチドで補充されたストック溶解緩衝液６０μｌをフィルタープレートに加えて、３７℃で１０分間インキュベートした。それから、フィルタープレートをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、RNAture）の上に置いて、４℃で５分間、２，０００×ｇで遠心分離した。４℃で一晩保存した後に、マイクロプレートを単純な溶解緩衝液１００μｌで３回、続いて４℃で洗浄緩衝液（０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ）１５０μｌで３回洗浄した。１×ＲＴ緩衝液、それぞれ１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、４ユニットのｒＲＮａｓｉｎ、及び８０ユニットのＭＭＬＶ逆転写酵素（Promega）（プライマーなし）を含む緩衝液３０μｌを添加し、３７℃で２時間インキュベートすることによって、ｃＤＮＡを各ウェルで直接合成した。特定のプライマーでプライム化されたｃＤＮＡが溶液中に存在し、残留したオリゴ（ｄＴ）プライム化ｃＤＮＡがマイクロプレートに固定化された。ＴａｑＭａｎＰＣＲでは（図１、図３、図４）、得られたｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ABI）５μｌ、及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのファワードプライマー及びリバースプライマー、及び３〜６μＭのＴａｑＭａｎプローブ）１μｌを加えて、９５℃で１０分を１サイクル、続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び６０℃で１分を４５サイクルで、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（ABI）によってＰＣＲを行った。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲでは（図２を参照）、ｃＤＮＡを水で３〜４倍に希釈し、ｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移して、これにｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（BioRad、カルフォルニア州ハーキュリーズ）５μｌ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのファワードプライマー及びリバースプライマー）１μｌを加えて、９５℃で１０分を１サイクル、続いて９５℃で３０秒、及び６０℃で１分を４５サイクルで、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（ABI）によってＰＣＲを行った。各遺伝子を別々のウェルで増幅した。一定量のＰＣＲ産物を生成したＰＣＲサイクルをＣｔとして、刺激したサンプルのＣｔ値から非刺激サンプル（ＰＢＳ又はＤＭＳＯビヒクル）のＣｔ値を差し引いて、デルタＣｔ（ΔＣｔ）として結果を示した。Ｃｔは対数目盛りであるので、１ΔＣｔは、一般的に２倍又は１／２量を意味し、負のΔＣｔは発現の増大を意味する。分析用ソフトウェア（ＳＤＳ、ABI）でＣｔを決定した。また、このアッセイを確認するために、スパイクＲＮＡを定量した。１×Ｒｔ緩衝液を陰性対照として使用したが、どのプライマー対もこれらの実験条件下で非特異的なプライマー二量体を生成しなかった。図８におけるＰＵＭＡに関して、オリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート上で固定化されたｃＤＮＡをｉＣｙｃｌｅｒ（BioRad）で直接増幅した。
【００５３】
結果を図５に示す。この図では、３０Ｇｙの放射線（●）、２０μＭのＢＬＭ（▲）、１００μＭのＶＰ−１６（◆）、又は対応する対照○（放射線なし）、△（ＰＢＳ）、◇（ＤＭＳＯ）での刺激後にヘパリン処理された全血を３７℃で０〜８時間インキュベートした。対照ＲＮＡ３４（Ａ）、ｐ２１（Ｂ）、及びＰＵＭＡ（Ｃ）のＲＮＡレベルを上記のように定量して、デルタＣｔ（ΔＣｔ、Ｙ軸）を算出した。各データ点は、全血の三重アリコートから得られる平均±標準偏差であった。図５Ａで示されるように、スパイクＲＮＡ（ＲＮＡ３４）から得られるΔＣｔは全て、様々な刺激と対照との間が±１の範囲内
であった。このことにより、このアッセイは再現性があり、信頼できるものであったことが確認された。ｐ２１はＤＮＡ損傷の間、転写因子ｐ５３の活性化によって誘導されることが知られているので、実験条件を確認するのに使用した。何の刺激もなくとも、ｐ２１
ｍＲＮＡは増加したが、ｐ２１のレベルは全て、これらの３つの刺激後に有意に増大した（図５Ｂ）。ＶＰ−１６が約２〜４時間をピークに一時的な誘導を示したのに対し、血液を放射線又はＢＬＭで刺激したとき、ｐ２１のレベルは８時間連続して増大した（図５Ｂ）。目的が初期遺伝子マーカーを同定することであったので、インキュベーションを３７℃、４時間で固定した。それから、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲによって様々なプロアポトーシスｍＲＮＡをスクリーニングするのに、ｃＤＮＡを使用した。この様々なプロアポトーシスｍＲＮＡのスクリーニングの結果を図６に示す。この図では、３０Ｇｙの放射線（Ａ）、２０μＭのＢＬＭ（Ｂ）、若しくは１００μＭのＶＰ−１６（Ｃ）で、又はそれらなしで、３７℃で４時間、ヘパリン処理された全血を刺激し、それから様々なｍＲＮＡを定量した。各バーは、それぞれの人の全血の三重アリコートから得られたΔＣｔの平均±標準偏差であった（放射線に関して５（Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｗに関して３）、ＢＬＭ及びＶＰ−１６に関して３）。図６で示されるように、全ての試験した個体（放射線に関して５（Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｗに関して３）、ＢＬＭ及びＶＰ−１６に関して、それぞれ３）が、２より大きいΔＣｔで、有意なｐ２１の誘導を示した。また、Ｂａｘも誘導されたが、ΔＣｔはｐ２１のものより小さかった（図６）。さらに、本明細書で記載されている方法でＢＡＸを用いることはできるが、１個体又は２個体で誘導されなかったので、Ｂａｘは完全に信頼できるマーカーではなかった。ＰＵＭＡは、ｐ２１のｍＲＮＡと同様の結果を伴う最も優性なｍＲＮＡであり、全ての個体で反応が確認された（図６）。ＮＯＸＡもまた全ての個体で誘導されたが、誘導の程度はＰＵＭＡのものより小さかった（図６）。その結果、アポトーシスそれによる薬剤効果を表すのに測定されるマーカーの中で、本方法では、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、及びＢＡＸ全てを用いることができ、最も好ましいｍＲＮＡはＰＵＭＡである。これらのｍＲＮＡを用いたが、本発明はまた、上記のようなＢｃｌ−２／Ｂａｘファミリー及びＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２ファミリーの他のメンバーの使用も意図している。さらにまた、医薬に対する癌細胞の感受性を表す他のｍＲＮＡの使用も意図している。例えば、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＳ）サブファミリーＡ〜ＧのｍＲＮＡを使用することができる。これらの遺伝子が膜を通過する生体分子のトラフィッキング及び生態異物に対する宿主防御メカニズムに関与する膜トランスポータータンパク質をコードする。具体的には、この遺伝子としては、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２変異型１、ＡＢＣＡ２変異型２、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＡ５変異型１、ＡＢＣＡ５変異型２、ＡＢＣＡ６変異型１、ＡＢＣＡ６変異型２、ＡＢＣＡ７変異型１、ＡＢＣＡ７変異型２、ＡＢＣＡ８、ＡＢＣＡ９変異型１、ＡＢＣＡ９変異型２、ＡＢＣＡ１０、ＡＢＣＡ１２変異型１、ＡＢＣＡ１２変異型２、ＡＢＣＡ１３、ＡＢＣＢ１、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２変異型１、ＴＡＰ２変異型２、ＡＢＣＢ４変異型Ａ、ＡＢＣＢ４変異型Ｂ、ＡＢＣＢ４変異型Ｃ、ＡＢＣＢ５、ＡＢＣＢ６、ＡＢＣＢ７、ＡＢＣＢ８、ＡＢＣＢ９変異型１、Ａ��ＣＢ９変異型２、ＡＢＣＢ９変異型３、ＡＢＣＢ９変異型４、ＡＢＣＢ１０、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ１変異型１、ＡＢＣＣ１変異型２、ＡＢＣＣ１変異型３、ＡＢＣＣ１変異型４、ＡＢＣＣ１変異型５、ＡＢＣＣ１変異型６、ＡＢＣＣ１変異型７、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３変異型ＭＲＰ３、ＡＢＣＣ３変異型ＭＲＰ３Ａ、ＡＢＣＣ３変異型ＭＲＰ３Ｂ、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ５変異型１、ＡＢＣＣ５変異型２、ＡＢＣＣ６、ＡＢＣＣ８、ＡＢＣＣ９変異型ＳＵＲ２Ａ、ＡＢＣＣ９変異型ＳＵＲ２Ｂ、ＡＢＣＣ９変異型ＳＵＲ２Ａ−デルタ−１４、ＡＢＣＣ１０、ＡＢＣＣ１１変異型１、ＡＢＣＣ１１変異型２、ＡＢＣＣ１１変異型３、ＡＢＣＣ１２変異型Ａ、ＡＢＣＣ１２変異型Ｂ、ＡＢＣＣ１２変異型Ｃ、ＡＢＣＣ１２変異型Ｄ、ＡＢＣＣ１２変異型Ｅ、ＡＢＣＣ１３変異型１、ＡＢＣＣ１３変異型２、ＡＢＣＣ１３変異型３、ＡＢＣＣ１３変異型４、ＡＢＣＤ１、ＡＢＣＤ２、ＡＢＣＤ３、ＡＢＣＤ４変異型１、ＡＢＣＤ４変異型２、ＡＢＣＤ４変異型３、ＡＢＣＤ４変異型４、ＡＢＣＤ４変異型５、ＡＢＣＦ１変異型１、ＡＢＣＦ１変異型２、ＡＢＣＦ２変異型１、ＡＢＣＦ２変異型２、ＡＢＣＦ３、ＡＢＣＥ１、ＡＢＣＧ１変
異型１、ＡＢＣＧ１変異型２、ＡＢＣＧ１変異型３、ＡＢＣＧ１変異型４、ＡＢＣＧ１変異型５、ＡＢＣＧ１変異型６、ＡＢＣＧ１変異型７、ＡＢＣＧ２、ＡＢＣＧ４、ＡＢＣＧ５、及びＡＢＣＧ８が挙げられる。これらの中で、特に好ましいｍＲＮＡは、ビンブラスチンを基質とするＡＢＣＣ２遺伝子産物、及び癌多剤耐性に関与する候補タンパク質として同定されているＡＢＣＧ２遺伝子産物に関するｍＲＮＡである。
【００５４】
図６の結果を確認するために、図５で示されるのと同様の条件下でＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲによって、ＰＵＭＡをさらに特徴付けた。ｐ２１とは違い、３７℃で８時間のインキュベーションの間、ベースラインのＰＵＭＡ発現は変化しなかった（図５Ｃ）。刺激時に、ｐ２１と同様の動態を伴い、同程度でＰＵＭＡが迅速に誘導された（図５Ｃ）。また、図７では、ＲＮＡ３４、ｐ２１、及びＰＵＭＡに関して用量依存性を分析した。対照のＲＮＡ３４のΔＣｔは変化しなかった（図７）。図７では、０〜３０Ｇｙの放射線（Ａ）、０〜２０μＭのＢＬＭ（Ｂ）、又は０〜１００μＭのＶＰ−１６（Ｃ）で刺激後、ヘパリン処理された全血を３７℃で４時間インキュベートして、それから対照ＲＮＡ３４（○）、ｐ２１（▲）、及びＰＵＭＡ（●）を定量した。各データ点は、全血の三重アリコートから得られる平均±標準偏差であった。０．１（ＰＵＭＡ）〜１（ｐ２１）Ｇｙの放射線、０．１μＭのＢＬＭ、及び１００μＭのＶＰ−１６それぞれで、ｐ２１およびＰＵＭＡの有意な誘導が観察された（図７）。
【００５５】
循環白血球の大部分が白血病性である場合、白血病及びリンパ腫に関する薬剤感受性試験に薬剤誘導性の初期アポトーシス信号の検出を適用することができる。ｐ２１及びＰＵＭＡが異常な白血球並びに健常な個体の正常な白血球における良好なアポトーシスマーカーであるか否かを判定するために（図５〜図７）、臨床研究を行った。図８は、３つの臨床例：慢性リンパ性白血病（Ａ：ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（Ｂ：ＡＭＬ）、及び白血病性非ホジキンリンパ腫（Ｃ：ＮＨＬ）を示す。７０％を超える末梢血白血球が異型であった。ヘパリン処理された全血を様々な薬剤で３７℃で２時間インキュベートして、ＲＮＡ３４、ｐ２１、Ｂａｘ、及びＰＵＭＡを定量した。具体的には、ＣＬＬ（Ａ）、ＡＭＬ（Ｂ）、及びＮＨＬ（Ｃ）の患者由来のヘパリン処理された全血を様々な抗癌剤で３７℃で２時間インキュベートした。それから、ＲＮＡ３４（白棒グラフ）、ｐ２１（黒棒グラフ）、及びＰＵＭＡ（横線棒グラフ）ｍＲＮＡを上記のように定量した。各バーは、全血の三重アリコートから得られたΔＣｔの平均±標準偏差であった。使用された薬剤は、ビンブラスチン（ＶＬＢ、最終濃度１μＭ）、ビンクリスチン（ＶＣＬ、０．５μＭ）、ピラルビシン（ＴＨＰ、０．５μＭ）、ミトキサントロン（ＭＩＴ、０．１μＭ）、ペプロマイシン（ＰＥＰ、０．５μＭ）、アクラルビシン（ＡＣＲ、０．１μＭ）、ブレオマイシン（ＢＬＭ、０．５μＭ）、ダウノルビシン（ＤＮＲ、２．５μＭ）、ドキソルビシン（ＤＸＲ、１μＭ）、エトポシド（ＶＰ−１６、１０μＭ）、カルボプラチン（ＣＢＤＣＡ、１０μＭ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ、１０μＭ）、フルダラビン（ＦＤＢ、１μＭ）、メトトレキサート（ＭＴＸ、１０μＭ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、１０μＭ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ、１０μＭ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ、１０μＭ）、及びシクロホスファミド（ＣＰＡ、１μＭ）であった。臨床診療において、これらの薬剤を静脈内投与するので、用いられる全血実験は、実際の臨床状態のシミュレーションになる。ＲＮＡ３４（図８Ａ〜図Ｃ）及びＢＡＸ（データ図示せず）の結果は全て、１ΔＣｔより小さかった。図８Ａで示されるように、ＰＵＭＡがＭＩＴ及びＤＮＲによって誘導されたのに対して、ｐ２１はこのＣＬＬ患者においてこれらの任意の薬剤によっては誘導されなかった。図８Ｂでは、ＰＵＭＡの広い誘導がＴＨＰ、ＭＩＴ、ＰＥＰ、ＶＰ−１６、ＣＤＤＰ、ＦＤＢ、及びＭＴＸで確認されたのに対して、有意なｐ２１誘導はＶＬＢでのみ見られた。図８ＣのＮＨＬ患者は、ＴＨＰ、ＭＩＴ、ＶＰ−１６、及びＭＴＸに対する強いＰＵＭＡ反応を示したのに対し、ｐ２１反応は全て、２ΔＣｔ未満であった。これらの結果より、ＰＵＭＡが、正常な白血球とは違い、異常な白血球において機能的に反応性があり、一部の患者ではｐ２１より強い感受性があることが示唆された。
【００５６】
本実施例は、用いられる治療プロトコルにおける薬剤選択を選定するために、例えば、癌等を患う患者由来の血液を検査することを意図している。意図される方法において、血液を患者から採取し、意図する用量で治療プロトコルを考慮して特定の抗癌剤に暴露する。好適な抗癌剤には、癌の治療で処方される全ての薬剤が含まれ、意図される具体的な薬剤としては、エトポシド、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ピラルビシン、ミトキサントロン、ペプロマイシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、カルボプラチン、シスプラチン、フルダラビン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、ダカルバジン、シクロホスファミド、及び参照により本明細書に援用される、Katzung, Basic & Clinical Pharmacology (第８版、２００１年)、９２３〜９５８頁で説明される薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。それから、ｐ２１及びＰＵＭＡ（又は、代替的にＮＯＸＡ）のｍＲＮＡレベルを測定する。７時間以内の暴露後の測定が好ましい。４時間以内の暴露後の測定がより好ましい。２時間以内の暴露後の測定がさらにより好ましい。他の期間の暴露後の測定もまた意図されている。好適な測定方法としては、例えば、ＴａｑＭａｎシステム又はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎシステムを使用したリアルタイムＰＣＲ、又は当業者に既知のｍＲＮＡレベルの測定に関する他の任意のシステムが挙げられる。それから測定レベルを薬剤暴露前の血液におけるレベルと、又は好ましくは同じ時間、対照ビヒクルに患者の血液を暴露した対照サンプルと比較する。これらの対照ビヒクルには、ＤＭＳＯ及びＰＢＳ等の本方法での使用される薬剤が溶解されている溶剤が含まれる。治療プロトコルに対する個々の患者の血液の反応に応じて、用量を増減させることにより、又は使用する薬剤を変えることにより、用いられる実際のプロトコルを選定することができる。血液の癌の場合、この方法が癌性である循環血液細胞における治療レジメンの有効性に関する直接的なデータを提供するので、治癒率が最大限になるようにこの結果は利用される。固形癌の場合、毒性を最小限にする一方、腫瘍における治療効果を最大限にするように、特定のプロトコルに伴って起こる血液白血球の抑制等の副作用の危険性を判断するのに、この結果は使用される。
【実施例３】
【００５７】
白血球抑制の評価
健常なボランティア、又は白血病及びリンパ腫の患者から血液サンプルを得た。ヘパリン処理された全血それぞれ５０μＬの三重アリコートを特定期間、様々な濃度の抗癌剤（ＢＬＭ、ＶＰ−１６、及びタキソール）とインキュベートし、それからｍＲＮＡを精製して、ｃＤＮＡを合成し、上記のようにＴａｑＭａｎリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｐ２１、ＰＵＭＡ、及びＢＡＸのレベルを定量した。簡潔に述べると、それぞれの血液サンプルを９６ウェルフィルタープレートに加えて白血球を捕捉した。人工ＲＮＡ（ＲＮＡ３４）及び特定のプライマーのカクテルを含む溶解緩衝液をフィルタープレートに加えて、ハイブリダイゼーションのために、細胞溶解物をオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、RNAture、カルフォルニア州アービン）に移した。それから、さらにプライマーを加えることなく、オリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートでＤＮＡを合成し、３８４ウェルプレート（Applied Biosystems、カルフォルニア州フォスターシティ）でのＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲのために使用した。各アッセイ条件を確認するために、スパイクＲＮＡも定量した。プライマー及びプローブの配列をＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Applied Biosystems）及びＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ（RNAture）で設計した。使用した配列を以下の表２に示す。
【００５８】
表２．プライマーとプローブの配列
【表２】
2008516636.tif 000004
＊：５’−ＦＡＭ、３’−ＴＡＭＲＡ
【００５９】
オリゴヌクレオチドは、IDT（アイオワ州コーラルビル）で合成された。一定量のＰＣＲ産物が生成したＰＣＲサイクルをＣｔとし、また、刺激したサンプルのＣｔ値から非刺激サンプル（ＤＭＳＯ又はＰＢＳ等の対照ビヒクルのみに暴露した）のＣｔ値を差し引いて、デルタＣｔ（ΔＣｔ）を算出した。Ｃｔは、対数目盛りであるので、１ΔＣｔは、一般的に２倍又は１／２の量を意味し、負のΔＣｔは発現の増大を意味する。正確な統計分析のために（ステューデントｔ検定）、全血の三重アリコートを開始材料として使用した。ｐ２１は細胞周期停止に反応性があり、ＰＵＭＡがプロアポトーシスＢＨ３ドメインｏｎｌｙ遺伝子ファミリーに属するので、これらの遺伝子の分析は、各薬剤の細胞増殖抑制作用及び殺細胞作用に対応している。ＢＡＸ及びＢＨ３ドメインｏｎｌｙ遺伝子ファミリー内の多くのプロアポトーシス遺伝子の中で、ＰＵＭＡを上記の実施例２に開示されている結果に従って測定した。また、幾つかの場合にＢＡＸを測定した。
【００６０】
市販のキット（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ、Gentra、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、処理あり又は処理なしでそれぞれ全血３００μｌからゲノムＤＮＡを精製した。０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色した３．５％アガロース（３：１のＮｕＳｉｅｖｅ：アガロース、FMC、メイン州ロックランド）ゲル電気泳動法でＤＮＡを分析して、写真画像をＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ（Alpha Innotech、カルフォルニア州サンリアンドロ）で記録した。
【００６１】
ＶＰ−１６又はＢＬＭで１日全血を刺激したとき、アポトーシスの典型的なサインであるＤＮＡの断片化を確認した（図５Ａ、挿入図）。図５Ａで示されるように、スパイクＲＮＡから得られたΔＣｔは全て、様々な刺激と対照との間が＋１の範囲内であった。全血の三重アリコート内の変動もまた、１ΔＣｔ未満であった（図５Ａ〜図５Ｃ、誤差バー）。これらのデータによって、このアッセイは再現性があり、信頼できるものであったことが確認された。何の刺激もなくとも、ｐ２１  ｍＲＮＡは増加した。しかし、ＶＰ−１６又はＢＬＭでの刺激時には、ｐ２１のレベルは全て有意に増大した（図５Ｂ）。ＶＰ−１６が約２〜４時間をピークに一時的な誘導を示したのに対し、血液をＢＬＭで刺激したときは、ｐ２１レベル及びＰＵＭＡレベルが８時間連続して増大した（図５Ｂ）。上記で示されるｐ２１発現及びＰＵＭＡ発現におけるＶＰ−１６及びＢＬＭの用量反応曲線に従って、１０〜１００μＭのＶＰ−１６及び０．２〜２０μＭのＢＬＭをその後の研究に使用した。
【００６２】
図９Ａ及び図９Ｃでは、ビヒクル（ＤＭＳＯ）処理の血液サンプルのｐ２１（Ａ）又はＰＵＭＡ（Ｃ）のＣｔ値（ｘ軸）をＶＰ−１６で刺激した血液サンプルのＣｔ値（Ｙ軸）と比較した。この図では、ヘパリン処理された全血それぞれ５０μＬの三重アリコートを３７℃で２時間、１０μＭのＶＰ−１６（○）又は１００μＭのＶＰ−１６（●）とインキュベートした。それから、上記のようにｐ２１  ｍＲＮＡ（Ａ、Ｂ）及びＰＵＭＡ  ｍＲＮＡ（Ｃ、Ｄ）のレベルを測定した。Ａ及びＣでは、非刺激サンプルのＣｔ値（Ｘ軸）と刺激したサンプルのＣｔ値（Ｙ軸）とを比較した。点線は、非刺激サンプル及び刺激したサンプルが両方とも同じ値を示す線を表す。実線は各用量における回帰直線である。Ｂ及びＤでは、刺激したサンプルのＣｔ値から非刺激サンプルのＣｔ値を差し引いて、デルタＣｔ（ΔＣｔ）を算出した。この図では、○は非反応性のサンプル(non-responders)を表し、●は中程度の反応性のサンプル(responders)を表し（Ｂではｎ＝９、Ｄではｎ＝６）、▲は高い反応性のサンプルを表す。各データは各個体の全血の三重アリコートから得られる平均±標準偏差を表す。矢印１は１０μＭのＶＰ−１６でｐ２１の誘導を示した個体を表し、矢印２は１００μＭのＶＰ−１６でｐ２１誘導を示さなかった別の個体を表す。
【００６３】
図９Ａで示されるように、多くの場合、低用量（１０μＭ）のＶＰ−１６はｐ２１を誘導できなかった。しかし、１個体で、有意なｐ２１誘導を示した（図９Ａ、矢印１）。この回帰直線は、ｙ＝１．０５２９ｘ−１．７７１９（ｒ2＝０．８８３）であった。ＶＰ−１６用量を１００μＭまで増加させたとき、大部分の個体はｐ２１発現の増大を示した。しかし、１個体では全く誘導を示さなかった（図９Ａ：矢印２、図９Ｂ：○）。この回帰直線は、ｙ＝０．７９３６ｘ＋４．４２７（ｒ2＝０．７９０５）であった。また、ＶＰ−１６はｙ＝０．７５２９ｘ＋４．９１０８（ｒ2＝０．６２５）の回帰直線で１００μＭ（図９Ｃ）でＰＵＭＡを誘導した。興味深いことに、これらのデータを一度、図９Ｂ及び図９Ｄで示されるようにΔＣｔに変換すると、非反応性のサンプル（○：ｎ＝１）、中程度の反応性のサンプル（●：ｐ２１ではｎ＝９、ＰＵＭＡではｎ＝６）及び高い反応性のサンプル（▲：ｐ２１ではｎ＝２、ＰＵＭＡではｎ＝３）が同定された。
【００６４】
ＶＰ−１６に対して、ＢＬＭは、全ての場合において、０．２μＭと小さい濃度でｐ２
１及びＰＵＭＡ両方を誘導した（図１０Ａ、図１０Ｃ）。この図では、ヘパリン処理された全血５０μＬそれぞれの三重アリコートを３７℃で２時間、０．２μＭのＢＬＭ（△）、２μＭのＢＬＭ（◇）、又は２０μＭのＢＬＭ（●）とインキュベートした。それから、ｐ２１  ｍＲＮＡ（Ａ、Ｂ）及びＰＵＭＡ  ｍＲＮＡ（Ｃ、Ｄ）のレベルを上記のように決定した。Ａ及びＣでは、非刺激サンプルのＣｔ値（Ｘ軸）と刺激したサンプルのＣｔ値（Ｙ軸）とを比較した。点線及び実線は、図９と同じである。Ｂ及びＤでは、刺激したサンプルのＣｔ値から非刺激サンプルのＣｔ値を差し引いて、ΔＣｔを算出した。この図では、○は非反応性のサンプルを表し、●は中程度の反応性のサンプルを表し（Ｂではｎ＝２２、Ｄではｎ＝２０）、▲は高い反応性のサンプルを表す。各データは、各個体の全血の三重アリコートから得られる平均を表す。
【００６５】
０．２μＭのＢＬＭ、２μＭのＢＬＭ、及び２０μＭのＢＬＭにおけるｐ２１の回帰直線は、それぞれ、ｙ＝０．８４８７ｘ＋３．８２７５（ｒ2＝０．８３６７）、ｙ＝０．８０８２ｘ＋４．５１３（ｒ2＝０．８４４４）、及びｙ＝０．８１４６ｘ＋３．７１４７（ｒ2＝０．７５５２）であった。ＰＵＭＡの反応性は、ｐ２１のものと同程度であり、０．２μＭのＢＬＭ、２μＭのＢＬＭ、及び２０μＭのＢＬＭにおけるＰＵＭＡの回帰直線は、それぞれ、ｙ＝０．８３８７ｘ＋３．７４０９（ｒ2＝０．８６５４）、ｙ＝０．７９３ｘ＋４．４６８８（ｒ2＝０．７２５４）、及びｙ＝０．８７６４ｘ＋１．６３５３（ｒ2＝０．７５４６）であった（図１０Ｃ）。これらのデータをΔＣｔに変換したとき、非反応性のサンプル又は低反応性のサンプル（○：ｎ＝１）、中程度の反応性のサンプル（●：ｐ２１ではｎ＝２２及びＰＵＭＡではｎ＝２０）及び高い反応性のサンプル（▲：ｎ＝３）が同定された（図１０Ｂ及び図１０Ｄ）。
【００６６】
図１１は、ＶＰ−１６刺激及びＢＬＭ刺激両方に関して、ｐ２１及びＰＵＭＡを分析した場合をまとめている。この図では、図９〜図１０のデータを再びプロットして、ｐ２１（●）及びＰＵＭＡ（△）の反応性（Ａ）とＶＰ−１６（△）及びＢＬＭ（●）の反応性（Ｂ）とを比較した。点線は、図９及び図１０と同じである。各データは、各個体の全血の三重アリコートから得られる平均±標準偏差を表す。また、図１１Ａでは、ｐ２１で同定された高い反応性のサンプル及び低い反応性のサンプルをＰＵＭＡでも同程度の反応性のサンプルとして同定した。また同様に、図１１Ｂで示されるように、ＶＰ−１６に対して高い反応性のサンプル及び低い反応性のサンプルをＢＬＭに対して高い反応性のサンプル及び低い反応性のサンプルとして同定した。薬剤反応性の１日ごとの変動を分析するために、１〜３日で同じ個体由来の液体サンプルを採取して、実験を２回繰り返した。結果を図１２に示す。記号は各個体から得られる平均±標準偏差である。この図では、それぞれ、●は２μＭのＢＬＭ誘導性ｐ２１を表し、○は２μＭのＢＬＭ誘導性ＰＵＭＡを表し、◆は２０μＭのＢＬＭ誘導性ｐ２１を表し、◇は２０μＭのＢＬＭ誘導性ＰＵＭＡを表し、▲は１００μＭのＶＰ−１６誘導性ｐ２１を表し、△は１００μＭのＶＰ−１６誘導性ＰＵＭＡを表し、Ｘは対照の非刺激ＲＮＡ３４を表す。実線は、２つのデータが同じである線である。点線は、±０．５ΔＣｔである。図１２に示されるように、ｐ２１及びＰＵＭＡのＶＰ−１６誘導性の誘導及びＢＬＭ誘導性の誘導は２つのサンプル間で同等であり、変動は、＋０．５ΔＣｔの範囲内であった。
【００６７】
同様の方法論を異なる種類の抗癌剤であるタキソールに適用した。タキソールは、微小管に対して毒であり、タキソールのアポトーシス誘導がプロアポトーシスＢＡＫ及びＢＡＸの発現を増大することを示している。しかし、血液細胞におけるタキソールの効果は非常に弱く、ＩＣ50は１０ｍＭより大きい。本研究では、タキソールはまた１００μＭもの高い濃度であっても、全ての個体でｐ２１  ｍＲＮＡ及びＰＵＭＡ  ｍＲＮＡ両方を誘導することができなかった（図１３）。この図では、ヘパリン処理された全血５０μＬそれぞれの三重アリコートを３７℃で２時間、１０μＭのタキソール又は１００μＭのタキソールでインキュベートした。それから、ｐ２１及びＰＵＭＡを決定して、上記のようにΔ
Ｃｔを算出した。各データは、各個体の全血の三重アリコートから得られる平均を表す。１００μＭより大きいと血液レベルを超えるので、タキソールを１００μＭより大きい濃度では使用しなかった。
【００６８】
図１４はＢＡＸの発現とｐ２１及びＰＵＭＡの発現との比較を示す。この図では、１００μＭのＶＰ−１６（Ａ）又は２０μＭのＢＬＭ（Ｂ）で、又は処理なしで、ヘパリン処理された全血５０μＬそれぞれの三重アリコートを３７℃で２時間インキュベートした。それから、ＢＡＸ  ｍＲＮＡ、ｐ２１  ｍＲＮＡ、及びＰＵＭＡ  ｍＲＮＡを定量して、ΔＣｔを上記のように算出した。各データ点は、三重の測定から得られる平均であった。ＶＰ−１６及びＢＬＭに対するＢＡＸの反応性は、ｐ２１及びＰＵＭＡの反応性より有意に小さかった（ｐ＜０．０１）。図１５では、８０％を超える白血球が白血病性細胞であった白血病及びリンパ腫患者のＢＬＭ誘導性のｐ２１反応性と、健常なドナーにおけるＢＬＭ誘導性のｐ２１反応性とを比較した。この図では、１μＭのＢＬＭで又は処理なしで、ヘパリン処理された全血５０μＬそれぞれの三重アリコートを３７℃で２時間インキュベートした。それから、上記のようにｐ２１  ｍＲＮＡを定量した。８０％を超える白血球が癌細胞であった１３人の白血病及びリンパ腫患者のＣｔ値と２７人の健常なドナーの血液サンプル由来のΔＣｔ値とを比較した。各データ点は、三重の測定から得られる平均であった。興味深いことに、白血球及びリンパ腫集団におけるＢＬＭ反応性が健常な対照のＢＬＭ反応性より有意に小さく（ｐ＝０．０００００２）、このことはこれらの癌細胞がＢＬＭに耐性があることを示唆していた。このことは、ＢＬＭがこれらの疾病に対する薬剤の適切な選択ではないという事実を確認した。
【００６９】
本発明のｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現分析は、７０μＬと少ない全血（実際の量５０μＬ＋２０μＬのリザーブ）由来のアポトーシス関連のｍＲＮＡの薬剤誘導性の遺伝子発現を検出するのに十分感受性があり、これは１つの血管（６ｍＬ）から三重で、２８個のデータセットの分析を可能にする（６，０００／７０／３＝２８．６）。これは、３通りの用量（０．２〜１００μＭ）の３つの薬剤（ＶＰ−１６、ＢＬＭ、及びタキソール）に加えて非刺激の対照（ＶＰ−１６ではＤＭＳＯ、ＢＬＭ及びタキソールではＰＢＳ）を分析するのに必要なデータセットが１１個のみであるのに対して、十分すぎる数である。血清の実験とは違い、血液６ｍＬから採取した血清量が個体の間で異なる場合、全血実験は一定の血液量からの詳細な分析の設計を可能にする。従来のアッセイは単離された単核細胞を使用して、これらを人工培養培地で懸濁する。これらのアッセイは、細胞自体の分析のための優れた研究モデルであるが、概してヒトの生理的条件を理解するには避けることのできない、細胞間相互作用及び細胞と血漿との相互作用を無視している。ＡＣＤ及びＥＤＴＡが多くの生物活性に関する必須成分であるカルシウムをキレート化するので、ヘパリンは好ましい抗凝固剤である。
【００７０】
ｍＲＮＡ転写はタンパク質合成の上流事象であり、刺激後数時間以内に起こるので、より長期間のインキュベーションが要求されるタンパク質分析又は生物活性の測定よりも、ｍＲＮＡ分析はより生理学的条件に近い条件でできる。インキュベーションが長時間であればあるほど、より多くの副次的影響が発生する可能性がある。個体ごとの変動を考えるとき、このことは特に重要である。また、ｍＲＮＡ分析は、このアッセイをタンパク質分析又は細胞に基づく機能的アッセイより感受性にする遺伝子増幅技術を使用する利点を有し、少なくとも２０個の遺伝子の分析には全血５０μＬで十分である。
【００７１】
遺伝子発現の誘導又は抑制を分析するとき、遺伝子増幅技術は試験管における標的遺伝子の単一コピーを検出することができるが、アッセイの感受性は各データセットの変動に依存する。例えば、それぞれの場合で、２つのデータセットの変動係数（ＣＶ）が１０％である場合、統計的有意性を伴い、遺伝子発現の約２０％の変化を検出することができる。ＣＶが３０％になると、７０％を超える変化が統計的有意性に必要になる。ｅｘ  ｖｉ
ｖｏでの全血のアッセイはＣＶを増加させる多くの因子を伴う。例えば、粘性の全血のピペッティング、ＲＮＡ単離ステップ、ｃＤＮＡ合成反応及びＰＣＲ全てが変動を引き起こす。ＰＣＲが標的遺伝子を指数関数的に増幅させるので、任意のステップにおける小さな変動も、最終的には容認できないぐらい広くなる。さらに、ΔＣｔの変動が２つのアッセイの多重合計であるので、その変動はより大きくなる。全血の三重アリコートを開始材料として使用し、ΔＣｔを算出するときでさえ、本方法は極めて小さい変動を示している。結果として、これは、ｐ２１、ＰＵＭＡ、及びＢＡＸの薬剤誘導性の発現誘導の極めて小さい変化を同定することが可能である。
【００７２】
或る特定の薬剤（例えば、ＶＰ−１６及びＢＬＭ等）（図１３及び図１４）が、ｅｘ  ｖｉｖｏでの生理学的条件下でｐ２１及びＰＵＭＡを誘導する場合、このような薬剤が各個体において、陰性対照の薬剤（例えば、タキソール等）（図１３）よりも白血球の問題を引き起こす可能性があることが予想されている。とりわけ、１個体では、ＶＰ−１６濃度が１００μＭと高かったときでさえ、ｐ２１及びＰＵＭＡが誘導されなかった（図９）。この薬剤を用いた場合、このような個体では白血球抑制のリスクが低くなるだろう。また、癌細胞はＢＬＭに対してあまり反応性がない（図１５）。これらの非反応性のサンプル又は高い反応性のサンプルの同定がヒトにおける薬剤反応性及び薬剤耐性の分析を可能にし、これは動物細胞又は培養細胞を使用した実験に代えることはできない。
【実施例４】
【００７３】
癌治療の臨床結果
本発明の薬剤投与を選定する方法が臨床的に有用な結果をもたらしたことを示すために、白血病及びリンパ腫の様々な病態を患う９人の患者の研究において上記の方法を用いた。患者集団を以下の表３に示す。この表では、「ＦＬ」は濾胞性リンパ腫を表し、「ＭＣＬ」はマントル細胞リンパ腫を表し、「ＡＭＬ」は急性骨髄性白血病を表し（Ｍ２はこの段階を表す）、「Ｔ−」はＴ細胞系を表し、「ＡＬＬ」は急性リンパ芽球性白血病を表す。
【００７４】
表３．臨床患者の性質
【表３】
2008516636.tif 000005
【００７５】
患者の全血を以下の表４で挙げられた薬剤に暴露して、４時間の暴露後、上記のように
患者の白血球におけるｐ２１、ＢＡＸ、及び幾つかの場合、ＰＵＭＡのレベルを測定した。対照の血液サンプルを対照のビヒクル溶媒（表４で示される、ＤＭＳＯ又はＰＢＳ）のみに暴露して、上記のように測定したｍＲＮＡ値からＣｔ及びΔＣｔを得た。
【００７６】
表４．使用した抗癌剤
【表４−１】
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【表４−２】
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【００７７】
結果を図１６、図１７、および下記表５で示す。この図から見ることができるように、ｐ２１  ｍＲＮＡ又はＰＵＭＡ  ｍＲＮＡの増加を示す薬剤は患者ごとに大幅に異なる。比較的小さい患者集団では、ＢＡＸは概して誘導されなかったが、それでも本方法は、抗癌剤活性に関する可能性のあるマーカーとして、ＢＡＸ及びＢｃｌ−２／ＢＡＸファミリーの他のメンバーの測定を検討している。この図で示されるように、選択された患者における様々な薬剤による刺激の結果として、ｐ２１及びＰＵＭＡの両方がｍＲＮＡレベルの増大を示した。
【００７８】
表５.臨床結果
【表５】
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【００７９】
表５は、個々の有効性が本発明の方法により得られた結果によって示唆された薬剤（「感受性薬剤」）、又は他の薬剤のいずれかを使用した追加の治療の結果を示す。この表では、ＣＨＯＰがＣＰＡ、Ａｄｒｉａｃｉｎ（ＡＤＲ：ドキソルビシン）、ＶＣＲ、及びプレドニソロン（ＰＳＬ）での治療を表し、Ｒ−がリツキシマブを表し、ＣＯＰがＣＰＡ、ＶＣＲ、及びＰＳＬでの治療を表し、ＶＰがＶＤＳ及びＰＳＬでの治療を表し、ＲＩがＡｒａＣ、ＤＮＲ、ＭＩＴ、及びＶＰ−１６での治療を表し、ＣＡＧが低用量のＡｒａＣ、ＡＣＲ、及びＧ−ＣＳＦでの治療を表し、ＣＡが低用量のＡｒａＣ及びＡＣＲでの治療を表し、ＶＡが低用量のＡｒａＣ及び低用量のＶＰ−１６での治療を表す。ＶＤＳはビンデシンを表す。「評価」欄では、Ａは完全寛解を表し、Ｂは血液学試験結果の改善を表し、Ｃは何ら改善されていないことを表す。
【００８０】
幾人かの患者を一回よりも多く処理した。この表で示されるように、感受性薬剤での７種類の処理全てが、マーカーｍＲＮＡの増加及び良好な臨床結果をもたらした（この図で「＋／＋」で示される）。これらの中で、３つが完全寛解であった（「臨床結果」欄下の「Ａ」）。感受性薬剤の治療の恩恵を受けた２人の患者は、非感受性薬剤での標準的な薬剤治療に対して反応しなかった。非感受性の薬剤での６種類の処理の中で、１つだけが好都合な臨床結果をもたらした。残りは何の改善も示さなかった。
【００８１】
したがって本発明の方法は各患者に選定された薬剤プロトコルを提示し、これに従うと、支障なく処理された場合に完全寛解を半分含む、臨床結果の改善が得られた。このことは、本発明の方法がこれらの白血球内のマーカーｍＲＮＡのレベルの変化に表されるように、患者の病変した白血球の薬剤感受性に基づいて、個々の患者の癌症例における治療プロトコルを選定するのに有用であろう。
【００８２】
また、この結果によって、肯定的なｍＲＮＡの結果と良好な臨床結果との間の密接な相関関係が示される：一つを除いて全ての結果が、＋／＋又は−／−であった。この相関関係は、固形癌を化学療法で治療する場合に、この方法が治療プロトコルを選定し、白血球の抑制を回避するのにも有用でもあろうことを示唆する。白血球が、この全血アッセイ中に薬剤に応じてマーカーｍＲＮＡの有意な増加を示す場合には、白血球の抑制はこの薬剤
による治療中の患者の白血球の増殖停止又はアポトーシスに起因するものであると考えられる。
【実施例５】
【００８３】
免疫抑制のための薬剤投与の選定
健常な成人、乾癬患者（４）、再生不良性貧血患者（１）、ネフローゼ症候群患者（１）、及び骨髄移植した患者（２）から血液を得た。白血球数測定のために、採血時に、１つのＥＤＴＡチューブを臨床検査室に送り、１つのヘパリンチューブを氷上に保存した。３７℃で様々な期間、ＣｓＡの存在下、及び非存在下で、血液アリコートをフィトへムアグルチニン−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ）で刺激した。血液サンプル５０μＬをフィルタープレートの３つの異なるウェル（最初から三重）に加えて、８００×ｇで２分間の遠心分離によりこの膜上の白血球を計測した。遠心分離によってリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３００μＬで各ウェルを一回洗浄した後、上記の溶解緩衝液を各ウェルに加え、３７℃で１０分間インキュベートして、捕捉した白血球からｍＲＮＡを取り出した。それから、２，０００×ｇで５分間、遠心分離することによって、オリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、RNAture、カルフォルニア州アービン）に溶解物を移して、ハイブリダイゼーションのために４℃で一晩インキュベートした。溶解緩衝液１００μＬで３回、続いて洗浄緩衝液１５０μＬ（１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、及び０．５ＭのＮａＣｌ）で３回、各ウェルを洗浄した後、緩衝液、ヌクレオチド、特定のプライマーを有するカクテル、ＲＮａｓｉｎ、及びＭＭＬＶ逆転写酵素（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を添加することにより、各ウェルで、３７℃で２時間インキュベートし、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ（４μＬ）をサーマルサイクラー（ABI、ＰＲＩＳＭ  ７９００）を使用した３８４ウェルマイクロプレートでの最終量１０μＬにおけるＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲに使用した。
【００８４】
図１８は、健常な成人におけるＰＨＡ−ＰによるＩＬ−２  ｍＲＮＡの用量依存的な誘導の結果を示す。図１８で示されるように、ＩＬ−２  ｍＲＮＡは、５μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｐから増加して、４０μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｐを超えて定常期に達した（図１９）。図１９では、◆が４０μｇ／ｍＬを表す一方で、▲は１０μｇ／ｍＬのＣｓＡ濃度を表し、●は１００μｇ／ｍＬの濃度を表している。個々の変動を最小限にするために、続く分析では１００μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｐを用いた。長期間にわたるリンパ球芽球化現象の誘導のためにＰＨＡ−Ｐを使用した。ＰＨＡ−Ｐの作用が１０〜２０μｇ／ｍＬで最大限になり、より高い用量ではその活性が減少した。ＩＬ−２  ｍＲＮＡのデータは異なり、１００μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｐを使用したときでさえ、その活性は高く維持されていた（図１９）。ヤマゴボウマイトジェン等の他のレクチンを用いることもできる。培養培地で３〜５日かかるリンパ球芽球化アッセイとは違い、このｍＲＮＡアッセイは、全血で１〜２時間かかるだけである（図１９）。全血での短時間のインキュベーションは生理学的条件を擬態し、アッセイの変動を大幅に低減する。
【００８５】
健常なボランティアのヘパリン処理された全血を、３７℃で３０分間様々な濃度のＣｓＡでインキュベートし、１０μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｐによって、３７℃で２時間、ＩＬ−２  ｍＲＮＡを誘導した。図２０で示されるように、５０〜２，０００ｎｇ／ｍＬの用量依存的な様式で、ＣｓＡによりＩＬ−２  ｍＲＮＡの転写が阻害された。２，０００ｎｇ／ｍＬ  ＣｓＡによりＩＬ−２  ｍＲＮＡ発現はほぼ１００％阻害された（図２０）。図３では、ＣｓＡを血液サンプルに３０分添加し、その後ＰＨＡ−Ｐを添加した。ＣｓＡ及びＰＨＡ−Ｐを同時に添加したときも同程度の阻害が確認された（データは示さず）。さらに、１００μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｐを使用したときでさえ、ＣｓＡの阻害作用が維持された（図２１）。アッセイの変動を最小限にするために、本発明者らは続く実験に１００μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｐを使用した。
【００８６】
各実験に１〜５個の血液サンプルで１ヶ月の期間、１５人の健常なドナーで、図１９で示される実験を繰り返した。ＣｓＡの濃度は各サンプルで、０、１００、及び５００ｎｇ／ｍＬであった。図２２で示されるように、１５人の健常なドナー全てが４０％を超える有意な阻害を示した。興味深いことに、１００ｎｇ／ｍＬのＣｓＡで、健常なドナーを２つのグループに分けることができた：約１／３の高い反応性のサンプル（○）、及び２／３の低い反応性のサンプル（●）。これは、臨床的な実用性を表す：低い反応性のサンプルでは高用量のＣｓＡを与えることができるか、又はＦＫに切り替えることができ、高い反応性のサンプルでは低用量のＣｓＡを与えることで、任意の副作用の危険を減らすことができる。
【００８７】
次に、健常な成人とＣｓＡ又はＦＫを摂取している患者との間での比較が為された。この結果を図２３に示す。この図では、白血球数が患者間で大きく異なるので、ＩＬ−２  ｍＲＮＡ値を各サンプルの白血球の数で除した。この図では、●は健常な成人を表し、○はＣｓＡの患者を表し、△はＦＫの患者を表す。患者は以下の疾患を有する：１：骨髄移植した白血病、２：乾癬、３：再生不良性貧血、４：乾癬、５：乾癬、６：乾癬、７：骨髄移植した白血病、及び８：ネフローゼ症候群。ｘ軸はＰＨＡ−Ｐ刺激していないＩＬ−２  ｍＲＮＡの基準値であり、ｙ軸はＰＨＡ−Ｐ刺激後の値である。●は健常な成人のデータであり、○及び△はＣｓＡ又はＦＫの患者から得られたものであった。図２３で示されるように、低いベースラインＩＬ−２  ｍＲＮＡの患者が小さい誘導を示した。したがって、％変化を算出したとき、これらのグループの間に有意な違いが存在しない。しかし、図６で示されるように二次元グラフにデータを移すと、はっきりと患者のプロットを健常な成人のものと区別することができる。ベースラインＩＬ−２  ｍＲＮＡは、統計的有意性（ｐ＝０．００１）を伴って健常な成人及び患者それぞれにおいて、０．１６±０．１０及び０．０３±０．０３であった。ＰＨＡ−Ｐ刺激後のＩＬ−２  ｍＲＮＡは、統計的有意性（ｐ＝０．００７）で健常な成人及び患者それそれで、２６．６８±１２．０３及び１０．８６±１６．９７であった。患者のケース番号１が高いＰＨＡ−Ｐ反応性を伴う低いベースラインのＩＬ−２  ｍＲＮＡを示し、薬剤が他の患者に比べて有効ではなかったことを表した。患者ケース番号４は、健常な成人のより低い制限を有するものと同程度の反応性を示し、乏しい薬剤反応性を表した。薬剤反応性は各患者の複雑な生物活性の合計であるが、この機能反応性のアッセイは、臨床科医にこれらの患者のマネージメントに関する有用な情報を提供するであろう。
【００８８】
図２４Ａ及び図２４Ｂは、ベースライン（図２４Ａ）又はＰＨＡ−Ｐ刺激のＩＬ−２  ｍＲＮＡ（図２４Ｂ）とＣｓＡの血液レベルとの間の関係を示す。ｍＲＮＡの値を白血球数で除した。この図で示されるように、あまりはっきりした関係性は確認できなかった。高い反応性のサンプル及び低い反応性のサンプルが存在する場合（図２２）、これらの患者のＣｓＡの血液レベルが約１００ｎｇ／ｍＬであったので、この機能性のアッセイには、これらの２つの集団の間で区別することができる薬剤濃度の単純な測定による利点がある。
【００８９】
図２５は、ＦＫを用いた場合の結果を示す。集合サイズが小さいため、あまりはっきりとは結論付けられなかったが、この方法がさらにＦＫに有用であることが期待されている。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ヒト血液（○）及び培養ヒト白血球細胞における薬剤誘導性のｐ２１  ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。
【図２】健常な成人の血液５０μＬに混合したＵ９３７細胞由来のエトポシド誘導性のｐ２１  ｍＲＮＡを示すグラフである。
【図３】白血病性リンパ腫（左側、中央）及び健常な成人（右側）における薬剤誘導性のｐ２１  ｍＲＮＡ（上方）及びＢＡＸ  ｍＲＮＡ（下方）を示す棒グラフである。
【図４】図３の患者２の臨床経過を示す図である。
【図５】アポトーシスの初期遺伝子発現を示す図である。
【図６】様々なプロアポトーシスｍＲＮＡのスクリーニングの結果を示す図である。
【図７】用量反応の評価の結果を示す図である。
【図８】白血病患者及びリンパ腫患者における薬剤誘導性の遺伝子発現の評価の結果を示す図である。
【図９】ヒト全血におけるアポトーシス関連遺伝子のＶＰ−１６誘導性の発現を示す図である。
【図１０】ヒト全血におけるアポトーシス関連遺伝子のＢＬＭ誘導性の発現を示す図である。
【図１１】ｐ２１反応とＰＵＭＡ反応との比較及びＶＰ−１６反応とＢＬＭ反応との比較を示す図である。
【図１２】ｍＲＮＡレベルの測定の１日ごとの変動を示す図である。
【図１３】ヒト全血におけるアポトーシス関連遺伝子のタキソール誘導性の発現を示す図である。
【図１４】薬剤誘導性のＢＡＸ、ｐ２１、及びＰＵＭＡ発現の間の比較を示す図である。
【図１５】健常なドナー及び血液癌患者におけるＢＬＭ誘導性のｐ２１  ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図１６】多くの抗癌剤による癌患者の全血におけるｐ２１及びＢＡＸ  ｍＲＮＡ刺激の測定結果を示す図である。
【図１７】多くの抗癌剤による癌患者の全血におけるｐ２１、ＢＡＸ、及びＰＵＭＡ  ｍＲＮＡ刺激の測定結果を示す図である。
【図１８】ヘパリン処理された全血における白血球ＩＬ−２  ｍＲＮＡのＰＨＡ−Ｐ誘導性の誘導を示すグラフである。
【図１９】ヘパリン処理された全血におけるＰＨＡ−Ｐ誘導性の白血球ＩＬ−２  ｍＲＮＡの動態を示す図である。
【図２０】ＰＨＡ−Ｐ誘導性のＩＬ−２  ｍＲＮＡの発現に対するＣｓＡの用量依存的効果を示す図である。
【図２１】ＰＨＡ−Ｐ誘導性のＩＬ−２  ｍＲＮＡの発現に対するＣｓＡの効果を示す図である。
【図２２】健常なドナーの血液におけるＰＨＡ−Ｐ誘導性のＩＬ−２  ｍＲＮＡ発現での１００及び５００ｎｇ／ｍＬのＣｓＡに対する反応を示す図である。
【図２３】健常な成人とＣｓＡ又はＦＫを摂取していた患者との間の比較結果を示す図である。
【図２４Ａ】ＣｓＡのレベル（ｘ軸）とベースラインのＩＬ−２  ｍＲＮＡ値／白血球数との間の関係を示す図である。
【図２４Ｂ】ＣｓＡの血液レベル（ｘ軸）とＰＨＡ−Ａ後刺激（右側）との間の関係を示す図である。
【図２５Ａ】ＦＫの血液レベル（ｘ軸）とベースラインのＩＬ−２  ｍＲＮＡ値／白血球数との間の関係を示す図である。
【図２５Ｂ】ＦＫの血液レベル（ｘ軸）とＩＬ−２  ｍＲＮＡ値／ＰＨＡ−Ａ後刺激の白血球数との間の関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月5日(2007.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤に対する患者の反応性を測定する方法であって、
７時間以内、ｅｘ  ｖｉｖｏで患者の全血を薬剤に暴露すること；
暴露後に、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ遺伝子ファミリー、ＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリーおよびｐ２１からなる群より選択される、血液細胞における該薬剤の効果に関連する遺伝子のｍＲＮＡの量を測定すること；及び
該測定の結果に基づいて該薬剤に対する反応性を確認すること
を含み、該ｍＲＮＡの量の変化が該薬剤に対する該患者の反応性を示す、方法。
【請求項２】
暴露前に、血液細胞に存在するｍＲＮＡの量を測定し、暴露前に測定したｍＲＮＡの量と暴露後に測定したｍＲＮＡの量とを比較することにより該ｍＲＮＡの量の変化を求める、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
７時間以内、ｅｘ  ｖｉｖｏで患者の全血を対照ビヒクルに暴露すること；
暴露後に、該対照ビヒクルに暴露した全血における前記薬剤の効果に関連するｍＲＮＡの量を測定すること；
該対照ビヒクルの暴露後に得られた測定の結果を前記薬剤の暴露後に得られた測定の結果と比較して該薬剤に対する反応性を確認すること、
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記対照ビヒクルがリン酸緩衝生理食塩水及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記患者の全血を暴露することがヘパリンの添加を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
５時間以内、前記全血を刺激する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
２〜４時間、前記全血を刺激する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤の効果が血液細胞のアポトーシスである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ遺伝子ファミリー、ＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリーおよびｐ２１からなる群より選択される遺伝子がＢａｘ遺伝子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ遺伝子ファミリー、ＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリーおよびｐ２１からなる群より選択される遺伝子がＰＵＭＡ遺伝子及びＮＯＸＡ遺伝子からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤の効果が血液細胞における細胞周期停止である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
血液細胞における前記薬剤の第二の効果に関連する第二のｍＲＮＡの量を測定することをさらに含み、
前記薬剤の第一の効果が血液細胞のアポトーシスであり、第一のｍＲＮＡが前記ＰＵＭＡ遺伝子産物をコードし；
前記薬剤の第二の効果が血液細胞における細胞周期停止であり、第二のｍＲＮＡがｐ２１遺伝子産物をコードする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤がエトポシド、ドキソルビシン、フルダラビン、ミトキサントロン、リツキシマブ、ビンデシン、ピラルビシン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ペプロマイシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、ダカルバジン、及びパクリタキセルからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者が白血病又は白血病性リンパ腫の患者である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
エトポシド、ドキソルビシン、フルダラビン、ミトキサントロン、リツキシマブ、ビンデシン、ピラルビシン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ペプロマイシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、ダカルバジン、及びパクリタキセルからなる群から選択される薬剤に対する患者の反応性を測定する方法であって、
４時間以内、ｅｘ  ｖｉｖｏで患者の全血を該薬剤に暴露すること；
４時間以内、ｅｘ  ｖｉｖｏで患者の全血を対照ビヒクルに暴露すること；
前記暴露後に、血液細胞におけるｐ２１遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ、ＢＡＸ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ、及びＰＵＭＡ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること；
対照ビヒクルの暴露後に得られた測定の結果を該薬剤の暴露後に得られた測定の結果と比較すること；及び
該比較の結果に基づいて該薬剤に対する反応性を確認すること
を含み、該ｍＲＮＡの量の変化が該薬剤に対する患者の反応性を表す、方法。
【請求項１６】
シクロスポリンＡ及びタクロリムスからなる群から選択される薬剤に対する患者の反応性を測定する方法であって、
４時間以内、ｅｘ  ｖｉｖｏで患者の全血を該薬剤及びレクチンに暴露すること；
４時間以内、ｅｘ  ｖｉｖｏで患者の全血を対照ビヒクル及びレクチンに暴露すること；
前記暴露後に、血液細胞におけるＩＬ−２遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を測定すること；
対照ビヒクルの暴露後に得られた測定の結果と該薬剤の暴露後に得られた測定の結果とを比較すること；及び
該比較の結果に基づいて該薬剤に対する反応性を確認すること
を含み、該ｍＲＮＡの量の変化が該薬剤に対する患者の反応性を表す、方法。
【請求項１７】
薬剤に対する患者の反応性を測定する方法であって、
７時間以内、ｅｘ  ｖｉｖｏで患者の全血を該薬剤及びレクチンに暴露すること；
前記暴露後に、血液細胞における薬剤の効果に関連するｍＲＮＡの量を測定すること；及び
該測定の結果に基づいて該薬剤に対する反応性を確認すること
を含み、該ｍＲＮＡの量の変化が該薬剤に対する患者の反応性を表す、方法。
【請求項１８】
前記レクチンがフィトヘマググルタニン−Ｐ及びヤマゴボウマイトジェンからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記薬剤の効果がＩＬ−２転写の阻害である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｍＲＮＡがＩＬ−２遺伝子産物をコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤が免疫抑制剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤がシクロスポリンＡ及びタクロリムスからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
薬剤に対する患者の反応性を測定する方法であって、
７時間以内、ｅｘ  ｖｉｖｏで患者の全血を該薬剤に暴露すること；
前記暴露後に、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ由来の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択される、血液細胞における薬剤の効果に関連するｍＲＮＡの量を測定すること；及び
該測定の結果に基づいて該薬剤に対する反応性を確認すること
を含み、該ｍＲＮＡの量の変化が該薬剤に対する患者の反応性を表す、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明の一態様は、エトポシド、ドキソルビシン、フルダラビン、ミトキサントロン、リツキシマブ、ビンデシン、ピラルビシン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ペプロマイシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、ダ
カルバジン、及びパクリタキセルからなる群から選択される薬剤に対する患者の反応性を測定する方法を含み、この方法は、４時間以内、薬剤に患者の全血を暴露すること；４時間以内、患者の全血を対照ビヒクルに暴露すること；これらの暴露後に、血液細胞におけるｐ２１遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ、ＢＡＸ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ、及びＰＵＭＡ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡからなる群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること；対照ビヒクルの暴露後に得られた測定結果を薬剤の暴露後に得られた測定結果と比較すること；及び比較の結果に基づいた薬剤に対する反応性を確認することを含み、ｍＲＮＡの量の変化が薬剤に対する患者の反応性を表す、方法を含む。
【国際調査報告】
2008516636.tif 000047
2008516636.tif 000048