(57)【要約】  本発明は、トランスフェリン融合タンパク質とＤＰＰ−ＩＶ阻害剤及び／又は中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害剤とを含む併用療法を提供する。トランスフェリン融合タンパク質は、糖尿病などの疾患の治療において有用な治療用ポリペプチド又はペプチドを含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のトランスフェリン（Ｔｆ）融合タンパク質及び少なくとも１種の第２の作用物質を投与するステップを含む、患者の疾患又は状態を治療する方法。
【請求項２】
前記第２の作用物質が、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤及び中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害剤からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔｆ融合タンパク質がＤＰＰ−ＩＶクリアランスの影響を受けやすい、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔｆ融合タンパク質が、ＤＰＰ−ＩＶクリアランスに感受性、抵抗性又は部分的に抵抗性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔｆ融合タンパク質が、Ｔｆ分子に融合された１種又は複数種のＧＬＰ−１ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔｆ融合タンパク質が、リンカーをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記リンカーが、ＰＥＡＰＴＤ又は（ＰＥＡＰＴＤ）２である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記融合タンパク質のＮ末端にある、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＬＰ−１ペプチドが、配列番号３２を有するＧＬＰ−１（７−３７）又はＧＬＰ−１（７−３６）（配列番号３２のアミノ酸１〜３０）である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＬＰ−１ペプチドが、Ａ８からＧへの変異によって改変された、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＬＰ−１ペプチドが、Ｋ３４からＡへの変異によって改変された、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧＬＰ−１ペプチドが、Ａ８からＧ及びＫ３４からＡへの変異によって改変された、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＧＬＰ−１ペプチドが、リンカー（ＰＥＡＰＴＤ）２を介して前記Ｔｆ分子に連結されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔｆ分子が、完全にグリコシル化されたＴｆ分子と比べて少ないグリコシル化を示すように改変された、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔｆ分子が、グリコシル化を示さないように改変された、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｔｆ分子が、グリコシル化を防止する少なくとも１つの変異を含むように改変された、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔｆ分子が、野生型Ｔｆ分子と比べてトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対して低い親和性を示すように改変された、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｔｆ分子が、ＴｆＲに結合しないように改変された、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔｆ分子が、野生型Ｔｆ分子と比べて鉄に対して低い親和性を示すように改変された、請求項５に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｔｆ分子が、鉄に結合しないように改変された、請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｔｆ分子が、ラクトフェリン又はメラノトランスフェリンである、請求項５に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患が代謝疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記代謝疾患が糖尿病前症、糖尿病又は肥満である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記糖尿病がＩＩ型糖尿病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患がうっ血性心不全である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記疾患が過敏性腸症候群又は消化不良である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
２種の第２の作用物質がある、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記２種の第２の作用物質がＤＰＰ−ＩＶ阻害剤及びＮＥＰ阻害剤である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記２種の第２の作用物質が同時に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３０】
前記トランスフェリン融合タンパク質及び前記１種又は複数種の第２の作用物質が逐次的に投与される、請求項１又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記トランスフェリン融合タンパク質及び前記１種又は複数種の第２の作用物質が同時に投与される、請求項１又は２９に記載の方法。
【請求項３２】
トランスフェリン（Ｔｆ）融合タンパク質及び少なくとも１種の第２の作用物質を含む組成物。
【請求項３３】
前記第２の作用物質が、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤及び中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害剤からなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記Ｔｆ融合タンパク質がＤＰＰ−ＩＶクリアランスの影響を受けやすい、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記Ｔｆ融合タンパク質が、ＤＰＰ−ＩＶクリアランスに感受性、抵抗性又は部分的に抵抗性である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
Ｔｆ融合タンパク質が、Ｔｆ分子に融合された１種又は複数種のＧＬＰ−１ペプチドを含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記Ｔｆ融合タンパク質がリンカーをさらに含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記リンカーが、ＰＥＡＰＴＤ又は（ＰＥＡＰＴＤ）２である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ＧＬＰ−１ペプチドが前記融合タンパク質のＮ末端にある、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ＧＬＰ−１ペプチドが、配列番号３２を有するＧＬＰ−１（７−３７）又はＧＬＰ−１（７−３６）（配列番号３２のアミノ酸１〜３０）である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ＧＬＰ−１ペプチドが、Ａ８からＧへの変異によって改変された、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ＧＬＰ−１ペプチドが、Ｋ３４からＡへの変異によって改変された、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ＧＬＰ−１ペプチドが、Ａ８からＧ及びＫ３４からＡへの変異によって改変された、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＧＬＰ−１ペプチドが、リンカー（ＰＥＡＰＴＤ）２を介して前記Ｔｆ分子に連結されている、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記Ｔｆ分子が、完全にグリコシル化されたＴｆ分子と比べて少ないグリコシル化を示すように改変された、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４６】
前記Ｔｆ分子が、グリコシル化を示さないように改変された、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４７】
前記Ｔｆ分子が、グリコシル化を防止する少なくとも１つの変異を含むように改変された、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４８】
前記Ｔｆ分子が、野生型Ｔｆ分子と比べてトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対して低い親和性を示すように改変された、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４９】
前記Ｔｆ分子が、ＴｆＲに結合しないように改変された、請求項３２に記載の組成物。
【請求項５０】
前記Ｔｆ分子が、野生型Ｔｆ分子と比べて鉄に対して低い親和性を示すように改変された、請求項３２に記載の組成物。
【請求項５１】
前記Ｔｆ分子が、鉄に結合しないように改変された、請求項３２に記載の組成物。
【請求項５２】
前記Ｔｆ分子が、ラクトフェリン又はメラノトランスフェリンである、請求項３２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
[0001]本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる２００４年８月３日に出願された米国特許仮出願第６０／５９８，０３１号の利益を主張する。
【０００２】
[0002]本出願は、２００３年３月４日に出願された米国特許出願第１０／３７８，０９４号の一部継続出願である、２００３年８月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０３／２６８１８の一部継続出願に関係し、これらのいずれもその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【発明の分野】
【０００３】
[0003]本発明は、治療的なｉｎ  ｖｉｖｏ実効半減期が延長したインスリン分泌促進ペプチドを含むトランスフェリン融合タンパク質に関係する。本発明はまた、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤及び／又は中性エンドペプチダーゼ阻害剤（ＮＥＰ）とインスリン分泌促進ペプチドを用いた併用療法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
プロテアーゼ
[0004]タンパク質分解酵素は、タンパク質の代謝回転及びプロセシングを調節することによって、細胞の増殖、分化及びシグナル伝達プロセスなどの生理学的プロセスを調節する際に重要な役割を果たしている。タンパク質分解酵素は、タンパク分解を通じて、重要な構造タンパク質、酵素及び調節タンパク質のレベルを制御する。増大又は低減された、未制御なタンパク質分解酵素活性が、炎症、癌、動脈硬化症及び変性障害を含めて、様々な疾患状態に関連づけられている。
【０００５】
[0005]国際生化学分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）は、ペプチド結合加水分解酵素のサブセット（サブクラスＥ．Ｃ３．４．）に対して「ペプチダーゼ」という用語の使用を推奨した。広く使用されているプロテアーゼという用語は、ペプチダーゼと同義である。ペプチダーゼは、２つのグループの酵素、すなわちエンドペプチダーゼ及びエキソペプチダーゼを含み、これらはタンパク質内部の箇所でペプチド結合を切断し、かつそれぞれＮ末端又はＣ末端のいずれかから逐次的にアミノ酸配列を除去する。プロテイナーゼという用語は、エンドペプチダーゼと同義である。タンパク質分解酵素は、触媒作用の機序に従って分類される。４種の機構的なクラス、すなわちセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及びメタロプロテアーゼがＩＵＢＭＢによって認識されている。
【０００６】
[0006]セリンプロテアーゼは、タンパク質切断のための活性触媒部位中にセリン残基を含む、タンパク質分解酵素の大きなファミリーである。これらは遍在し、ウイルス、細菌及び真核生物中で発見されている。セリンプロテアーゼは多様な基質特異性を有し、かつこれらの特異性に基づいてサブファミリーに細分され得る。セリンプロテアーゼには２０を超えるサブファミリーがあり、６種の群（ｃｌａｎ）（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＥ、ＳＦ及びＳＧ）に分類されている。
【０００７】
[0007]プロリルオリゴペプチダーゼは、ＳＣ群に分類されたセリンプロテアーゼである。これは、プロリン含有ペプチドをプロリン残基のカルボキシル側で加水分解する。おそらくは、これは、ペプチドホルモン及びニューロペプチドの成熟及び分解に関与しているようである（Ｗｉｌｋ他  １９８３年  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３３、２１４９〜２１５７頁）。プロリルオリゴペプチダーゼの例としては、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ（ＤＰＰ−ＩＩ）、線維芽細胞活性化タンパク質及びプロリルオリゴペプチダーゼが挙げられる。これらの酵素は、異なる特異性を示す。
【０００８】
[0008]プロリンは、多数のペプチドホルモン中に存在する。これは、これらのペプチドの立体構造及び安定性などの、これらのペプチドの構造的特性を決定し、非特異的なプロテアーゼによる分解を防いでいる。プロリン結合を攻撃するいくつかのペプチダーゼが存在する。これらのペプチダーゼは、Ｘ−Ｐｒｏ又はＰｒｏ−Ｘ結合の切断だけでなく、対応するアラニル結合の分解にも低い活性で関与している。プロリンを含む配列に対して著しく特異的な作用を有するペプチダーゼは、それらのうちのいくつかが天然ペプチド基質の生物活性の調節に関係があるとされているため、医薬品化学の魅力的な標的である。例えば、ＤＰＰ−ＩＶは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）レベルの調節を通じて糖尿病の治療に関係している。ＤＰＰ−ＩＶ活性は、関節リウマチ、多発性硬化症、グレーブス病及び橋本甲状腺炎、サルコイドーシス、並びに癌などの様々な疾患において増大している。ＤＰＰ−ＩＶ活性はまた、ＡＩＤＳ、ダウン症候群、食欲不振症／過食症、妊娠及び低ガンマグロブリン血症においても増大している。
【０００９】
ＤＰＰ−ＩＶを含むジペプチジルペプチダーゼ
[0009]ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質のＮ末端からのジペプチドの除去を触媒するペプチダーゼ活性である。一般に、ジペプチジルアミノペプチダーゼは、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の置換されていないＮ末端アミノ基からジペプチドＸＹ（式中、Ｘ及びＹは任意のアミノ酸残基を表す）を切断することができる。ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）の例としては、ジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰＰ−Ｉ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ（ＤＰＰ−ＩＩ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ（ＤＰＰ−ＩＩＩ）及びジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ−ＩＶ）が挙げられる。
【００１０】
[0010]カテプシンＣとしても知られているＤＰＰ−Ｉは、大半の組織で発現されるリソソームのシステインプロテアーゼである。ＤＰＰ−Ｉは、活性化型細胞障害性リンパ球の顆粒中でもっぱら発現される中性セリンプロテアーゼであるグランザイムのプロセシングに関係があるとされている。ＤＰＰ−ＩＩは、リソソーム中に存在するセリンプロテアーゼである。ＤＰＰ−ＩＶと同様に、これはプロリンを含有するペプチド結合を切断する。実際に、ＤＰＰ−ＩＩはＤＰＰ−ＩＶに類似した基質特異性を有するが、酸性ｐＨでのみ活性である。ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ（ＤＰＰ−ＩＩＩ）はメタロプロテアーゼである。
【００１１】
[0011]ＤＰＰ−ＩＶは、セリンプロテアーゼモチーフＧＷＳＹＧを含み、かつ広範な基質特異性を有するセリンプロテアーゼである。これは、アミノ末端から順にペプチドを加水分解して、アミノ酸を遊離させる。しかし、加水分解は、プロリンの手前のアミノ酸残基に到達すると終結する。結果として、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘ及びＹは任意のアミノ酸である）の結合を有するペプチドは切断されて、Ｘ−Ｐｒｏ及びＹ−を生じる。ＤＰＰ−ＩＶはまた、末端から２番目の位置にアラニンを有するジペプチドも切断すると考えられるが、プロリンを有するジペプチドより効果は低い（Ｙａｒｏｎ他、１９９３年  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：３１〜８１頁）。この酵素はまた、他の配列も切断すると考えられるが、効率はさらに低い。
【００１２】
[0012]ＤＰＰ−ＩＶは、ペプチド基質のＮ末端配列の末端から２番目の位置にプロリン又はアラニンを有する生物活性ペプチドのＮ末端からジペプチドを遊離させる際に極めて特異的であることが示された。ＤＰＰ−ＩＶに対する多数の潜在的なペプチド基質が同定された。ＤＰＰ−ＩＶ基質には、ペプチドホルモン及びケモカインが含まれる。いくつかのペプチドホルモンの例は、エンドモルフィン−２、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、ニューロペプチドＹ、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）及びサブスタンスＰであり、またいくつかのケモカインの例は、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＣＰ−２、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−２β、ＭＤＣ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２及びＭＣＰ−３である。ＤＰＰ−ＩＩは、ＤＰＰ−ＩＶとほぼ同一の基質特異性を有する。
【００１３】
ＤＰＰ−ＩＶ及び糖尿病
[0013]インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）は、現在、患者へのインスリン投与によって治療されている。非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）は、食事療法、インスリン分泌を促進するためのスルホニル尿素の投与によって、又はグルコース取込みを増加させるビグアナイドを用いて治療される。抵抗性の個体はインスリン療法を必要とすることがある。標準療法では、インスリンを毎日静脈注射する必要があり、これにより急性の症状が治療されると考えられるが、長期の療法は、血管疾患及び神経損傷をもたらす。移植などの現代的な方法は高価であり、かつ危険を伴う外科的介入を必要とする。したがって、極めて効果的で低コストの糖尿病治療の代替手段を開発することが必要とされている。
【００１４】
[0014]近年、血中グルコースレベルを低下させるための標的として、ＤＰＰ−ＩＶへの関心が高まってきた。対象の血中のＤＰＰ−ＩＶ酵素又はＤＰＰ−ＩＶ様酵素活性を妨害するために阻害剤を使用すると、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、又はその類似体などの内因性又は外因的に投与されたインスリン分泌促進ペプチドの分解が減少する。ＧＩＰ及びＧＬＰ−１は、膵臓によるグルコース誘導性のインスリン分泌を促進するホルモンであり、ＤＰＰ−ＩＶの基質である。具体的には、ＤＰＰ−ＩＶは、ＧＬＰ−１のアミノ末端のＨｉｓ−Ａｌａジペプチドを除去して、膵島からのグルコース依存性のインスリン分泌を誘発することができないＧＬＰ−１−（９−３６）−アミドを生成させるため、このようなＤＰＰ−ＩＶ又はＤＰＰ−ＩＶ様酵素活性をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害すると、哺乳類生物の病理学的状態において望まれない酵素活性が効果的に抑制されるであろう。
【００１５】
[0015]ＰＣＴ／ＤＥ９７／００８２０では、ＤＰＰ−ＩＶ又はＤＰＰ−ＩＶ様酵素活性の阻害剤としてアラニルピロリジド及びイソロイシルチアゾリジドを開示している。ＤＤ２９６０７５では、ピロリジド及びイソロイシルチアゾリジド塩酸塩を開示している。米国特許第６５４８４８１号では、アミノ酸とチアゾリジン又はピロリジン基とから形成されるジペプチド化合物並びにそれらの塩に類似した阻害剤を開示している。これらはＤＰＰ−ＩＶ活性の機能的阻害剤であるが、ある種の患者又は疾患のある種の形態においてこれらの阻害剤を使用することは、問題となる可能性がある。これは、この酵素が非常に多様な生物活性ペプチドの活性化又は不活性化を司っているため、すなわちＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が所望の標的ＧＩＰ及びＧＬＰ−１に対する特異性を欠くためである。
【００１６】
改変による治療用ペプチドの保護
[0016]ＧＩＰやＧＬＰ−１などの治療用タンパク質及びペプチドがタンパク質分解酵素によって切断されるのを防ぐ別の方法は、タンパク質分解酵素への曝露を阻止するためにそれらのタンパク質及びペプチド自体を改変することである。タンパク質改変は、治療用ポリペプチドの安定性、循環時間及び生物活性を増大させることが示されている。アミノ酸及びペプチドを改変するいくつかの一般的な方法は、参照により本明細書に組み入れられるＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．出版、ニューヨーク  １９８３年）において開示されている。また、参照により本明細書に組み入れられるＦｒａｎｃｉｓの総説論文（１９９２年  Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３；４〜１０頁（Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ、ロンドン））では、タンパク質改変及び融合タンパク質を説明している。
【００１７】
[0017]組換えＤＮＡ技術及び自動化技術の進歩に伴い、現在では、短い、中程度の又は長い改変タンパク質を大量に容易に調製することができる。自動化ペプチド合成機、固体樹脂技術又は組換え技術を用いて、多数の小型の改変ポリペプチドホルモンを合成することができる。例えば、ジペプチジルペプチダーゼの改変された基質、例えばＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ニューロペプチドＹ及びブラジキニンなどＤＰＰ−ＩＶの基質を、自動化ペプチド合成機を用いて大量に作製することができる。
【発明の概要】
【００１８】
[0018]本発明は、プロテアーゼ切断の影響を受けやすい治療用ペプチド又はタンパク質を含むトランスフェリン融合タンパク質を提供する。本発明はまた、プロテアーゼ切断に感受性、抵抗性、又は部分的に抵抗性である治療用ペプチド又はタンパク質を含むトランスフェリン融合タンパク質も提供する。プロテアーゼは、ＤＰＰ−ＩＶ又は中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）でよい。さらに、本発明は、トランスフェリン融合タンパク質と、それだけには限らないがＤＰＰ−ＩＶ及び／又はＮＥＰの阻害剤など第２の作用物質とを含む組成物も提供する。さらに、これらの組成物は、様々な疾患の治療において使用される薬剤組成物であり得る。
【００１９】
[0019]本発明は、様々な疾患の治療においてトランスフェリン融合タンパク質及び少なくとも１種の第２の作用物質を投与するステップを含む併用療法を提供する。トランスフェリン融合タンパク質は、１種又は複数種の第２の作用物質と同時に投与され得る。あるいは、トランスフェリン融合タンパク質は、第２の作用物質の投与の前又は後のいずれかに、逐次的に投与される。好ましくは、第２の作用物質は、ＤＰＰ−ＩＶ又はＮＥＰの阻害剤である。
【００２０】
[0020]本発明のＧＬＰ−１ペプチド部分は、それらがＤＰＰ−ＩＶ切断などのプロテアーゼ切断に対して部分的又は完全に抵抗性となるように、１つ又は複数の変異を含むように改変され得る。ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号３２）又はＧＬＰ−１（７−３６）（配列番号２のアミノ酸１〜３０）でよい。例えば、これらのペプチドは、Ａ８からＧ及び／又はＫ３４からＡへの変異によって改変することができる。
【詳細な説明】
【００２１】
１．概要
[0029]本発明は、一部には、より効果的で低コストの糖尿病の治療のための代替手段を開発する必要に基づいている。ＧＬＰ−１などのインスリン分泌促進ペプチドは、２型非インスリン依存性糖尿病、並びに糖尿病前症、代謝症候群及び肥満などの関連代謝障害を治療するための有望な治療用物質である。他の有用なインスリン分泌促進ペプチドとしては、エキセンディン３及びエキセンディン４が挙げられる。しかし、これらのインスリン分泌促進ペプチドは、急速な血清クリアランス及びタンパク質分解に主に起因して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血漿半減期が短い。ＧＬＰ−１の分解を司る酵素であるＤＰＰ−ＩＶを阻害するために、又はＧＬＰ−１を、その分解が減速され、同時に生物活性をなお維持するような方法で改変するために、多大な研究が行われた。これらの多大な努力にもかかわらず、長期に渡って活性を有するＧＬＰ−１は作製されなかった。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの作用のより長い持続期間を提供し、同時にそれらの低い毒性及び治療上の利点を維持するために、ＧＬＰ−１、エキセンディン３、エキセンディン４、及び他のインスリン分泌促進ペプチドを改変する必要がある。
【００２２】
２．定義
[0030]本明細書において使用される場合、「誘導体」という用語は、酵素を用いた又は用いない化学的手段による、例えばアルキル化、アシル化、エステル形成、又はアミド形成による、ペプチドの１つ又は複数のアミノ酸残基の改変を意味する。
【００２３】
[0031]本明細書において使用される場合、「から誘導される（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」という用語は、親分子から分子を得ること等の特定された供給源から分子を得ることを意味する。
【００２４】
[0032]本明細書において使用される場合、「ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性」という用語は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列のＮ末端からジペプチドを切断するペプチダーゼ活性を意味する。一般に、ジペプチジルアミノペプチダーゼは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の置換されていないＮ末端アミノ基からジペプチドＸＹ（式中、Ｘ又はＹは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選択される任意のアミノ酸残基を表し得るが、少なくともＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ及び／又はＧｌｙである）を切断することができる。好ましくは、Ｙは、Ｐｒｏ又はＡｌａである。Ｘ及びＹはすべて、異なるものでも同一のものでもよい。ジペプチジルアミノペプチダーゼの例としては、それだけには限らないが、ＤＰＰ−Ｉ、ＤＰＰ−ＩＩ、ＤＰＰ−ＩＩＩ及びＤＰＰ−ＩＶが挙げられる。
【００２５】
[0033]本明細書において使用される場合、「グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）」及び「ＧＬＰ−１誘導体」という用語は、一般に高血糖の間にインスリン分泌を刺激し、グルカゴン分泌を抑制し、（プロ）インスリン生合成を促進し、かつ胃内容排出及び酸分泌を減速させる腸ホルモンを意味する。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５５７４００８号において開示されているように、いくつかのＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１誘導体は、細胞によるグルコース取込みを促進するが、インスリン発現は刺激しない。
【００２６】
[0034]本明細書において使用される場合、「インスリン分泌促進ペプチド」という用語は、インスリン分泌促進活性を有するペプチドを意味する。インスリン分泌促進ペプチドは、インスリンホルモンの合成若しくは発現を促進する又はその促進を引き起こす。このようなペプチドとしては、グルカゴン様ペプチド１、エキセンディン３及びエキセンディン４などのペプチドの前駆体、類似体、断片、並びにインスリン分泌促進活性を有する他のペプチドが挙げられる。
【００２７】
[0035]本明細書において使用される場合、「製薬上許容される」とは、ヒトに投与された場合に生理学的に許容され、かつ胃の不調、めまいなどのようなアレルギー性又は類似した有害反応を通常はもたらさない材料及び組成物を意味する。通常、本明細書において使用される場合、「製薬上許容される」という用語は、連邦若しくは州政府の規制機関によって承認されていること、又は、動物において、より具体的にはヒトにおいて使用するために、米国薬局方若しくは一般に認識されている他の薬局方に記載されていることを意味する。
【００２８】
[0036]本明細書において使用される場合、「薬剤組成物」という用語は、必要に応じて、製薬上許容される担体又は希釈剤と共に作用物質を含む組成物を意味する。製薬上許容される担体及び添加剤は、薬剤化合物からの副作用が最小限に抑えられ、かつその化合物の能力が、治療が無効になる程度まで打ち消されることも阻害されることもないように、選択される。
【００２９】
[0037]本明細書において使用される場合、「生理学的に有効な量」とは、所望の対症的又は治療的効果を与えるために対象に送達される量である。この量は、各薬物及び最終的に承認された投薬量レベルに対して固有である。
【００３０】
[0038]本明細書において使用される場合、「治療有効量」とは、必要とする対象に投与された場合に、治療を実施するのに十分である改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの量を意味する。「治療有効量」に相当する改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの量は、使用される治療用タンパク質、病態又は疾患の重症度、並びに治療される対象の年齢及び体重に応じて変動するが、当業者なら、彼／彼女自身の知識及び本開示を考慮することにより、ごく普通に決定することができる。
【００３１】
[0039]本明細書において使用される場合、「治療用タンパク質」とは、１種又は複数種の治療活性及び／又は生物活性を有する、タンパク質、ポリペプチド、抗体、ペプチド断片又はその変異体を意味する。本発明に含まれる治療用タンパク質としては、それだけには限らないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体及び生物製剤が挙げられる。ペプチド、タンパク質及びポリペプチドという用語は、本明細書において同義的に使用される。さらに、「治療用タンパク質」という用語は、治療用タンパク質の内因性又は天然に存在する相関物を意味してもよい。「治療活性」を示すポリペプチド若しくはペプチド、又は「治療的に活性を有する」タンパク質とは、本明細書において説明する、又はそうでなければ当技術分野において公知である治療用タンパク質のうちの１種又は複数種など、治療用タンパク質に関連した１種又は複数種の公知の生物活性及び／又は治療活性を有する、ポリペプチド、ペプチド又はタンパク質を意味する。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、疾患、病態又は障害を治療、予防又は改善するのに有用なタンパク質、ポリペプチド又はペプチドである。このような疾患、病態又は障害は、ヒトにおけるものでも、ヒト以外の動物におけるもの、例えば獣医学用途でもよい。
【００３２】
[0040]本明細書において使用される場合、「治療」又は「治療すること」という用語は、本発明の化合物の任意の投与を意味し、以下のステップ、すなわち、（１）その疾患に罹患しやすい可能性があるが、その疾患の病状若しくは総体的症状をまだ経験も提示もしていない動物においてその疾患が発生するのを防止するステップ；（２）罹患した個体の病状若しくは総体的症状を経験若しくは提示している動物においてその疾患を抑制するステップ（すなわち、病状及び／若しくは総体的症状のさらなる発達を阻止するステップ）；又は（３）罹患した個体の病状若しくは総体的症状を経験若しくは提示している動物においてその疾患を改善するステップ（すなわち、病状及び／若しくは総体的症状を逆戻りさせるステップ）を含む。
【００３３】
[0041]本明細書において使用される場合、「生物活性」という用語は、生物学的機能を媒介する能力を意味する。「生物活性」には、機能的活性並びに構造的活性が含まれる。
【００３４】
[0042]本明細書において使用される場合、「対症的」という用語は、治癒に影響を及ぼさずに、疾患又は障害の症状を緩和又は軽減する能力を意味する。例えば、病態又は疾患を治癒させずに疼痛を軽減する作用物質は、対症的物質である。
【００３５】
[0043]本明細書において使用される場合、「予防の」という用語は、何か、特に疾患若しくは病態から防御し、又はそれらを予防する作用をすること等の防御効果を有することを意味する。
【００３６】
[0044]本明細書において使用される場合、「精製された」タンパク質又は核酸とは、細胞成分から分離されたタンパク質又は核酸を意味する。「精製された」タンパク質又は核酸は、天然には存在しない純度レベルまで精製されている。
【００３７】
[0045]本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な」タンパク質又は核酸という用語は、他のすべての細胞成分を欠いているタンパク質又は核酸調製物を意味する。
【００３８】
[0046]本明細書において使用される場合、「治療的な（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」という用語は、治癒的、回復推進的又は治療的効果を意味する。例えば、「治療用物質」又は「治療用組成物」は治癒的効果を有する。
【００３９】
３．特定の実施形態
ジペプチジルペプチダーゼ
[0047]ジペプチジルペプチダーゼは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の置換されていないＮ末端アミノ基からジペプチドを除去する加水分解酵素である。ジペプチジルペプチダーゼの例としては、それだけには限らないが、ＤＰＰ−Ｉ、ＤＰＰ−ＩＩ、ＤＰＰ−ＩＩＩ、ＤＰＰ−ＩＶ、アトラクチン及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）が挙げられる。このファミリーの、又は同様の機能を有するが構造の異なる新しい酵素が出現しつつある。
【００４０】
[0048]ジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰＰ−Ｉ）は、カテプシンＣとしても知られており、パパインファミリーに属するリソソームのシステインプロテアーゼである。ＤＰＰ−Ｉは、様々なペプチド及びタンパク質基質の遊離アミノ末端からジペプチドを逐次的に除去することができ、したがってエキソペプチダーゼ（具体的にはジペプチジルペプチダーゼ）の様式で作用する。断片化された結合がいずれかの側にプロリン残基を有する場合、又はＮ末端残基がリシン若しくはアルギニンである場合、切断は無効である。
【００４１】
[0049]ＤＰＰ−ＩＩは、リソソーム中に存在するセリンプロテアーゼであり、機能は不明である。ＤＰＰ−ＩＶと同様に、これはプロリンを含有するペプチド結合を主に切断する。実際には、ＤＰＰ−ＩＩはＤＰＰ−ＩＶと同様の基質特異性を有するが、酸性ｐＨでのみ活性である。哺乳動物のＤＰＰ−ＩＩ及びＤＰＰ−ＩＶは、阻害剤ピューロマイシン及びバシトラシンを用いて区別することができる。すなわち、ピューロマイシンはＤＰＰ−ＩＩのみを阻害すると考えられるのに対し、バシトラシンはＤＰＰ−ＩＶのみを阻害する（１９８８年  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、６６１３〜６６１８頁）。ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ（ＤＰＰ−ＩＩＩ）はメタロプロテアーゼである。ＤＰＰ−Ｖは、Ｎ末端のＸ−Ａｌａ、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ及びＳｅｒ−Ｔｙｒジペプチドを遊離させる。
【００４２】
[0050]ＤＰＰ−ＶＩＩは、静止細胞プロリンジペプチダーゼとしても知られており、プロリン特異的なジペプチダーゼである。ＤＰＰ−ＶＩＩ及びＤＰＰ−ＩＩは、ヒトＤＰＰ−ＶＩＩ及びラットＤＰＰ−ＩＩの配列比較（７８％一致）に基づいて、同一のプロテアーゼであることが示唆された（Ａｒａｋｉ他、２００１年  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２９、２７９〜２８８頁）。
【００４３】
[0051]ＤＰＰ−ＶＩＩＩは、ＤＰＰ−ＩＶ及びＦＡＰに相同な、ヒト由来ポストプロリンジペプチジルアミノペプチダーゼである（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃ．Ａ．他、２０００年  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７、６１４０頁）。ＤＰＰ−ＩＶと同様、ＤＰＰ−ＶＩＩＩは、遍在している。完全長のＤＰＰ−ＶＩＩＩ  ｃＤＮＡは、ＤＰＰ−ＩＶ及びＦＡＰに対して約２７％の同一性及び５１％の類似性を有する８８２アミノ酸のタンパク質をコードしているが、膜貫通ドメイン及びＮ結合型又はＯ結合型グリコシル化はコードしていない。精製された組換え型ＤＰＰ−ＶＩＩＩは、ＤＰＰ−ＩＶ基質のＡｌａ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ及びＧｌｙ−Ｐｒｏを加水分解した。したがって、組換え型ＤＰＰ−ＶＩＩＩは、ＤＰＰ−ＩＶ及びＦＡＰとポストプロリンジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を共有している。ＤＰＰ−ＶＩＩＩ酵素活性は中性の最適ｐＨを有し、これはそれが非リソソーム性であることと一致した。組織発現パターン及び基質におけるＤＰＰ−ＶＩＩＩとＤＰＰ−ＩＶの類似点により、ＤＰＰ−ＩＶに類似した、Ｔ細胞活性化及び免疫機能におけるＤＰＰ−ＶＩＩＩの潜在的な役割が示唆される。
【００４４】
[0052]Ｏｌｓｅｎ  Ｃ．他（２００２年  Ｇｅｎｅ  ２９９、１８５〜９３頁）は、ジペプチジルペプチダーゼ様タンパク質ＤＰＰ−ＩＸと名付けられた、新規のＤＰＰ−ＩＶ様分子の同定及び特性決定を報告している。ＤＰＰ−ＩＶと同様に、ＤＰＰ−ＩＸは、セリンプロテアーゼモチーフＧＷＳＹＧ（配列番号１１０）を含む。このモチーフが存在すること、並びにＤＰＰ−ＩＶにおいて触媒作用の３つ組を形成しているＳｅｒ、Ａｓｐ、及びＨｉｓ残基の順序及び間隔が保存されていることから、ＤＰＰ−ＩＸはＤＰＰ−ＩＶ遺伝子ファミリーに配置される。
【００４５】
[0053]アトラクチン（ＤＰＰＴ−Ｌ）は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏを加水分解することが報告されている１７５−ｋＤａの可溶性糖タンパク質である。アトラクチンは、ケルチ反復ドメインを含み、かつＤＰＰ−ＩＶ又は他の任意のペプチダーゼとも、有意な配列相同性を共有していない。線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）は、組織再構築の部位で発現されるプロリルオリゴペプチダーゼ遺伝子ファミリーの細胞表面結合型プロテアーゼである。
【００４６】
[0054]プロリンオリゴペプチダーゼ（ＰＯ）とも呼ばれるプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）は、ヒト子宮中のオキシトシン分解酵素としてＷａｌｔｅｒ及び共同研究者らによって最初に発見された（Ｗａｌｔｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７３、８２７〜８２９頁（１９７１年））。この酵素は、配列Ｘ−Ｐｒｏ−Ｙ（式中、Ｘは、ペプチド又はＮ末端で置換されたアミノ酸であり、かつＹは、ペプチド、アミノ酸、アミド又はアルコールである）を含むペプチド中のプロリンのカルボキシ側でペプチド結合を切断する（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３、３７０８〜３７１６頁（１９７９年））。この酵素は、プロリンのイミノ側のペプチド結合のトランス配置に対して高い特異性を有する（Ｌｉｎ＆Ｂｒａｎｄｔｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２、４４８０〜４４８５頁（１９８３年））。
【００４７】
[0055]プロリルオリゴペプチダーゼは、アンギオテンシンＩ及びアンギオテンシンＩＩを加水分解して、アンギオテンシン（１−７）の遊離をもたらす。アンギオテンシン（１−７）は、血管拡張活性を有し、かつ、特異的なＰＥＰ阻害剤と共にラットに注射することによって示されたように、記憶のプロセスに影響し得るバソプレシンの放出を調節する。この注射は、スコポラミン誘導性の健忘症を逆に戻す。この実験は、この酵素のあり得る生理的機能の証拠を提供する例であるだけでなく、さらに、ＰＥＰの阻害剤が記憶プロセスに影響し、かつ認知症を阻止し得るという仮説をもたらした（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ他  １９８７年  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏ−Ｄｙｎ．１０、７３０〜７３５頁）。
【００４８】
ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ−ＩＶ）及び基質
[0056]ＤＰＰ−ＩＶは、いくつかのペプチド及びホルモンの分解に関係があるとされている、遍在的に発現される分子である。様々なタイプのＤＰＰ−ＩＶが精製され、かつそれらの酵素学的諸特性が明らかにされた。例えば、ＤＰＰ−ＩＶは、ラット肝臓（Ｈｏｐｓｕ−Ｈａｖｕ  Ｖ．Ｋ．他、１９６６年  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．、７：１９７〜２０１頁）、ブタ腎臓（Ｂａｒｔｈ  Ａ．他、１９７４年  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３２：１５７〜１７４頁）、小腸（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  Ｂ．１９７８年  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９０：４８９〜４９８頁）、肝臓（Ｆｕｋａｓａｗａ  Ｋ．Ｍ．他  １９８１年  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、６５７：１７９〜１８９頁）、ヒト顎下腺（Ｏｙａ  Ｈ．他、１９７２年  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、２５８：５９１〜５９９頁）、ヒツジ腎臓（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ．他、１９７７年  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、４８５：３９１〜４０１頁；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ．他、１９７８年  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５３：３７０８〜３７１６頁）、又は微生物（Ｆｕｋｕｓａｗａ  Ｋ．Ｍ．１９８１年  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２１０：２３０〜２３７頁；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ．１９８２年  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９１：１８９９〜１９０６頁（１９８２年））から単離された。
【００４９】
[0057]ヒト免疫系において、ＤＰＰ−ＩＶは、活性化されたリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞）によって発現されるＴ細胞表面抗原ＣＤ２６と同一である。ＣＤ２６／ＤＰＰ−ＩＶは、固有のジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性及びアデノシンデアミナーゼＩ型（ＡＤＡ−１）に結合する能力を有するＩＩ型膜糖タンパク質である。これは、上皮細胞上で構成的に発現されているが、Ｔリンパ球上では厳密な細胞調節下で発現され、細胞が活性化されると発現が上方調節される。ＣＡ２６／ＤＰＰ−ＩＶは、その細胞外ドメイン中にジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性を有することが示されており（Ｈｅｇｅｎ他、１９９０年  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４４：２９０８〜２９１４頁；Ｕｌｍｅｒ他、１９９０年  Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：４２９〜４３５頁）、また、その同時刺激活性は、この酵素活性にある程度依存しているようである（Ｔａｎａｋａ他、１９９３年  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：４５８６〜４５９０頁）。ＤＰＰ−ＩＶは、ケモカイン機能の調節に関与しており、かつＨＩＶ感染において重要な役割を果たし得る。
【００５０】
[0058]米国特許第６２６５５５１号では、ヒト血清から単離された循環性の可溶型ＤＰＰ−ＩＶ／ＣＤ２６を開示している。血清型は、遍在する膜型に類似した酵素特性及び抗原性特性を共有している。しかし、いくつかの生化学的局面では、異なる差異が存在する。特に、循環血清型は、膜型の分子量が１０５ｋＤａであるのと対照的に、１７５ｋＤａの分子量を有し、かつＡＤＡ−１に結合しない。それでもなお、循環型は機能的なジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性を発現し、かつリコール抗原へのＴリンパ球応答を同時刺激する能力を保持している。
【００５１】
[0059]ＤＰＰ−ＩＶのタンパク質分解活性は、タンパク質のＣ末端に位置する約２００アミノ酸のひと続きの配列中に存在する。触媒残基（Ｓｅｒ−６２９、Ａｓｐ−７０８、Ｈｉｓ−７４０）は、キモトリプシンやサブチリシンなど古典的なセリンプロテアーゼとは異なる独特の順序で配列されている。プロリンに特異的なジペプチジルペプチダーゼ活性は、とりわけ、ＧＬＰ−１、神経伝達物質サブスタンスＰ、ヒト成長ホルモン放出因子、エリスロポイエチン、インターロイキン２及びその他多くを含む、多数の生理活性タンパク質及びポリペプチドの生物活性を改変する。潜在的なＤＰＰ−ＩＶ基質を表１、２、及び３に記載する。ＤＰＰ−ＩＶ切断に影響を及ぼすためにこれらのポリペプチドを調節することは、それだけには限らないが、糖尿病、炎症、血管疾患、自己免疫疾患、多発性硬化症、関節疾患、並びに良性及び悪性の細胞形質転換に関連した疾患を含めて、臨床状態の治療において有用となり得る。
【００５２】
【表１】
2008509153.tif 000002
【００５３】
【表２】
2008509153.tif 000003
【００５４】
[0060]本発明は、ＤＰＰ活性から基質を保護するために基質のＮ末端に１つ又は複数の付加的なアミノ酸を含む、ＤＰＰの改変された基質を利用してよい。本発明に従う改変のために好ましい基質を表３に開示する。
【００５５】
[0061]
【表３−１】
2008509153.tif 000004
【表３−２】
2008509153.tif 000005
【表３−３】
2008509153.tif 000006
【００５６】
[0062]改変用の基質は、アミノ末端にＸ−ＰｒｏＹ、Ｘ−Ａｌａ−Ｙ、Ｘ−Ｓｅｒ−Ｙ又はＸ−Ｇｌｙ−Ｙを含む。好ましくは、改変用の基質はＧＬＰ−１である。
【００５７】
ＤＰＰ活性から保護された改変ポリペプチド
[0063]本発明は、ポリペプチド基質をＤＰＰ活性から保護するためにＮ末端に１つ又は複数の付加的なアミノ酸を含む、ＤＰＰの改変ポリペプチド基質などの改変ポリペプチドを提供する。一実施形態では、これらの改変ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて、Ｎ末端に１つの付加的なアミノ酸を有する。別の実施形態では、これらの改変ポリペプチドは、Ｎ末端に５つの付加的なアミノ酸を有する。あるいは、これらの改変ポリペプチドは、Ｎ末端に１〜５つの付加的なアミノ酸を有する。２０種のアミノ酸のうちのいずれか１つがポリペプチド基質のＮ末端に付加されてよく、又は非天然アミノ酸が付加されてもよい。
【００５８】
[0064]投与後に循環中又はｉｎ  ｖｉｖｏの任意の場所で切断されるであろうペプチド結合を有する任意の薬学的ポリペプチドは、本発明によって与えられるＤＰＰ切断からの保護が理由となって、本発明にかかる改変による利益を受けるであろうことが予想される。
【００５９】
[0065]本発明のこの態様によれば、ジペプチジルペプチダーゼ活性の少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９９％を消失させることが可能である。本発明の方法を用いて、ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を完全に消失させることもまた可能である。
【００６０】
[0066]同様に、基質のジペプチジルペプチダーゼ感受性を、ジペプチジルペプチダーゼ感受性の少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９９％低減させることも可能である。本発明の方法を用いて、ジペプチジルアミノペプチダーゼ感受性を完全に消失させることもまた可能である。
【００６１】
[0067]本発明の改変されたポリペプチド又はペプチド基質は、部分的又は実質的にＤＰＰ活性から保護されているが、改変ポリペプチド基質は、それらの機能的活性及び効力の少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９９％保持していた。いくつかの場合では、機能的活性又は効力を低下させた改変されたポリペプチド又はペプチド基質が有用となる。例えば、改変されたポリペプチド又はペプチドがトランスフェリンなど別のポリペプチドに融合されて、血清安定性及びｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期の向上した融合タンパク質を形成する場合、機能的活性又は効力を低下させた改変ポリペプチド又はペプチド基質が有用となり得る。
【００６２】
[0068]他の場合では、改変されたポリペプチド又はペプチドは、改変されていないポリペプチド又はペプチドと比べて高い効力を有し得る。
【００６３】
[0069]本発明の改変ポリペプチド分子は、同じポリペプチドの非改変型と比べて、ジペプチジルペプチダーゼ切断から実質的に保護されている。この実質的な保護の能力は、非改変ポリペプチドに対して改変ポリペプチドを比較するのに使用されるアッセイによって変動し得る。しかし、実質的な保護を提示するために、改変ポリペプチドは、アッセイにおいてジペプチジルペプチダーゼ切断に対する検出可能レベルの抵抗性を提示する。このようなアッセイとしては、それだけには限らないが、Ｄｏｙｌｅ他（２００２年  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２、４４６２〜４４６８頁）、Ｏ’Ｈａｒｔｅ他（１９９９年  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８、７５８〜７６５頁）、及びＳｉｅｇｅｌ他（１９９９年  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ７９、９３〜１０２頁）に開示されているものなどが挙げられる。
【００６４】
[0070]ＤＰＰに対して安定化された本発明のポリペプチド基質はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＰＰの存在下において、安定化されていないポリペプチド基質よりも安定である。ＤＰＰに対して安定化された治療用ポリペプチド基質は、一般に、同一の配列からなる安定化されていないペプチドと比べて、長い活性半減期を有する。ペプチダーゼ安定性は、血清又は血液中の非改変ポリペプチド基質の半減期を、血清又は血液中の改変された対応する治療用ペプチドの半減期と比較することによって測定することができる。改変ペプチド及び非改変ペプチドの投与後に血清又は血液を試料採取し、かつペプチドの活性を測定することによって、半減期を測定することができる。活性の測定の他に、ＨＰＬＣ又は質量分析法によってポリペプチド基質の長さも測定することができる。
【００６５】
[0071]本発明はまた、ＤＰＰ切断から保護するために本発明に従って変更したアミノ末端を有し、かつポリペプチドの機能的活性にも効力にも影響を及ぼさない内部及び／又はＣ末端のアミノ酸の変更を有する、改変されたポリペプチド又はペプチドも提供する。これらの改変ポリペプチドは、通常は保存的アミノ酸置換である軽微なアミノ酸変化を有すると思われるが、非保存的置換もまた企図される。
【００６６】
[0072]本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドはまた、変更された機能的活性を有してもよい。例えば、機能的活性を増大させた改変されたポリペプチド又はペプチドが有用となり得る。あるいは、機能的活性を低減させた改変されたポリペプチド又はペプチドも使用され得る。したがって、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドはまた、機能的活性又は効力に影響を及ぼすアミノ酸変化も含む。例えば、機能的活性を変更されたＧＬＰ−１類似体は、ＤＰＰ切断から保護するためにそのアミノ末端を改変され得る。
【００６７】
[0073]保存的アミノ酸置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、ヒスチジンなど）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸など）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギンなど）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリンなど）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなど）、並びに小型アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニンなど）のグループ内のものなど同じグループ内で行われる置換である。
【００６８】
[0074]非保存的置換は、１つのグループのアミノ酸を別のグループのアミノ酸で置換することを包含する。例えば、非保存的置換は、疎水性アミノ酸を極性アミノ酸で置換することを含むと思われる。ヌクレオチド置換の概要については、例えばＦｏｒｄ他（１９９１年）、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．２：９５〜１０７頁を参照されたい。
【００６９】
[0075]本発明は、ポリペプチド又はペプチドの天然に存在する成熟型、ポリペプチドの対立形質／配列変異体、組換えによって誘導された天然に存在しないペプチドの変異体、並びにポリペプチド又はペプチドのオルソログ及びパラログなど、改変されたポリペプチド及びペプチドのアミノ酸配列の明らかな変異体を提供する。このような変異体は、組換え核酸技術及びタンパク質生化学の分野の当技術分野で公知の技術を用いて容易に作製することができる。このような変異体は、分子技術及び配列情報を用いて容易に同定／作製することができる。さらに、このような変異体は、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドに対する配列及び／又は構造の相同性に基づいて、他のペプチドから容易に区別することができる。
【００７０】
[0076]好ましくは、本発明の改変ペプチドは、ＧＬＰ−１、及びＮ末端に１つ又は複数の付加的なアミノ酸を含むその類似体である。
【００７１】
[0077]いくつかの場合では、ＤＰＰ−ＩＶなどのＤＰＰは、切断によってペプチドを不活性化する代わりに、ペプチドを活性化することがある。このような場合、ペプチドの改変は、ペプチド活性化を実質的に低減、遅延、又は防止し得るはずである。
【００７２】
改変ポリペプチドをコードする核酸
[0078]本発明は、ＤＰＰ切断から部分的又は実質的に保護されており、かつ機能的活性及び効力を有する改変されたポリペプチド及びペプチドをコードする核酸分子を提供する。一実施形態では、本発明によって提供される核酸分子は、野生型の非改変ポリペプチドと比べて、少なくとも１つの付加的なアミノ酸をそのＮ末端に有する改変されたポリペプチド及びペプチドをコードする。別の実施形態では、これらの核酸分子は、Ｎ末端に５つの付加的なアミノ酸を有する改変されたポリペプチド及びペプチドをコードする。あるいは、これらの核酸分子は、Ｎ末端に１〜５つの付加的なアミノ酸を有する改変されたポリペプチド及びペプチドをコードする。好ましくは、改変ＧＬＰ−１をコードする核酸分子は、そのＮ末端の１つ又は複数の付加的なアミノ酸をコードする配列を含む。
【００７３】
[0079]本発明の核酸分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、１本鎖及び２本鎖のデオキシリボ核酸の双方を含む。しかし、それらはまた、リボ核酸（ＲＮＡ）、並びにＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド２本鎖分子でもよい。企図される核酸分子には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びアンチセンス分子も含まれる。本発明の核酸分子には、改変ポリペプチドをコードする天然若しくは合成のＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はその相補鎖も含まれる。
【００７４】
[0080]野生型の非改変ポリペプチドと比べて、ＤＰＰ活性から部分的又は実質的に保護されているが、機能的活性及び／又は効力を有している改変ポリペプチドを構築するために、野生型の非改変ポリペプチドをコードする核酸を開始点として使用し、かつ所望の改変ポリペプチドをコードするように改変することができる。配列を付加し、又はあるポリペプチドをコードする核酸配列を変異させ、かつこれらの改変された配列によってコードされるポリペプチドの機能を確認するための多数の方法が公知である。
【００７５】
[0081]本発明はまた、ＤＰＰ切断から保護するために改変されたアミノ末端を有し、かつポリペプチドの機能的活性にも効力にも実質的に影響を及ぼさない内部及びＣ末端のアミノ酸の変更を有するポリペプチド及びペプチドをコードする核酸も提供する。これらの改変ポリペプチドは、通常は保存的アミノ酸置換である軽微なアミノ酸変化を有すると思われるが、非保存的置換もまた企図される。部位特異的変異誘発を達成するための技術を用いたヌクレオチド置換は、当技術分野において周知である。好ましくは、これらの核酸は、Ｎ末端に１つ又は複数の付加的なアミノ酸を有するＧＬＰ−１類似体をコードする。
【００７６】
[0082]当技術分野において公知のように、２種のポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の「類似性」は、一方のポリヌクレオチド又はポリペプチドのヌクレオチド又はアミノ酸配列及び保存されているヌクレオチド又はアミノ酸置換体を、第２のポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列と比較とすることによって測定される。同様に、２種のポリペプチド又は２種のポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度を意味する「同一性」も当技術分野において公知であり、これらの配列の２つの鎖を突き合わせた際の同一性によって測定される。同一性及び類似性の双方とも、容易に算出することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１年）。
【００７７】
[0083]２種のポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列間の同一性及び類似性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、「同一性」及び「類似性」という用語は当業者には周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１年；並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ.及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３頁（１９８８年））。２種の配列間の同一性又は類似性を測定するために一般に使用される方法としては、それだけに限らないが、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９４年、並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３頁（１９８８年）において開示されているものが挙げられる。
【００７８】
[0084]同一性を測定するための好ましい方法は、試験される２種の配列間に最大の一致を与えるように設計される。同一性及び類似性を測定するための方法は、コンピュータプログラムにおいて体系化されている。２種の配列間の同一性及び類似性を測定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、それだけには限らないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７頁（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５；４０３頁（１９９０年））が挙げられる。前述した類似性又は同一性の程度は、第１の配列の第２の配列からの派生を示す、２種の配列間の同一性の程度として測定される。２種の核酸配列間の同一性の程度は、ＧＣＧプログラムパッケージ中で提供されるＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４８：４４３〜４５３頁）など当技術分野において公知のコンピュータプログラムを用いて測定することができる。本発明のための２種の核酸配列間の同一性の程度を測定するために、以下の設定値でＧＡＰを使用する：ＧＡＰ生成ペナルティ５．０及びＧＡＰ伸長ペナルティ０．３。
【００７９】
コドン最適化
[0085]遺伝コードの縮重により、第１のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドと同一のアミノ酸配列を含む改変ポリペプチドをなお産生する、ポリペプチドのヌクレオチド配列の変形が可能となる。（その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５５４７８７１号において記載されている）「コドン最適化」として公知の手順により、そのような変更されたＤＮＡ配列を設計する手段が提供される。コドン最適化遺伝子の設計は、ある生物中でのコドン使用の頻度、最近接頻度、ＲＮＡ安定性、２次構造形成の可能性、合成経路、及びその遺伝子の予定されるその後のＤＮＡ操作を含めて、様々な因子を考慮に入れるべきである。特に、利用可能な方法を用いて、酵母発現系が使用される場合には酵母によって最も容易に認識されるものを用いて所与の融合タンパク質をコードするコドンを変更することができる。
【００８０】
[0086]遺伝コードの縮重により、同じアミノ酸配列が、多くの異なる方法でコードされ、かつ翻訳されることが可能となる。例えば、ロイシン、セリン、及びアルギニンは、それぞれ６種の異なるコドンによってコードされ、バリン、プロリン、トレオニン、アラニン、及びグリシンはそれぞれ４種の異なるコドンによってコードされている。しかし、このような同義コドンの使用頻度は、真核生物及び原核生物の間で、ゲノムによって変動する。例えば、哺乳動物間の同義コドンの選択パターンは非常に類似しているが、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、細菌（大腸菌など）、及び昆虫（キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）など）など進化的に離れた生物は、明らかに異なるパターンのゲノムコドン使用頻度を示す（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、８、４９〜６２頁（１９８０年）；Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、９、４３〜７４頁（１９８１年）；Ｍａｒｏｙａｍａ，Ｔ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４、１５１〜１９７頁（１９８６年）；Ａｏｔａ，Ｓ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６、３１５〜４０２頁（１９８８年）；Ｗａｄａ，Ｋ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９  補遺、１９８１〜１９８５頁（１９９１年）；Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２８５、１６５〜１６９頁（１９９１年））。コドン選択パターンのこれらの差異は、ペプチド伸長速度を調節することによって、個々の遺伝子の全般的な発現レベルに寄与しているようである（Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２８５、１６５〜１６９頁（１９９１年）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３、２８９５〜２８９８頁（１９８４年）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０７、３６５〜３７７頁（１９８９年）；Ｒａｎｄａｌｌ、Ｌ．Ｌ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７、３７５〜３７９頁（１９８０年）；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．Ｆ．、及びＹａｒｕｓ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０９、６５〜７７頁（１９８９年）；Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０、５４９〜５７６頁（１９８４年）、Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０、５４９〜５７６頁（１９８４年）；Ｇａｒｅｓｌ，Ｊ．Ｐ．、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．、４３、２１１〜２２５頁（１９７４年）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４６、１〜２１頁（１９８１年）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５１、３８９〜４０９頁（１９８１年））。
【００８１】
[0087]合成遺伝子のための好ましいコドン使用頻度は、組換えタンパク質発現のために使用されることが意図される細胞／生物の正確な（又はできるだけ密接に関連した）ゲノム、特に酵母種のものから導かれる核遺伝子のコドン使用を反映すべきである。上述したように、好ましい一実施形態では、改変ポリペプチドは、酵母発現のために本明細書において説明するような改変の前又は後にコドン最適化される。
【００８２】
ベクター
[0088]本発明において使用するための発現ユニットは、一般に、５’側から３’側の向きに作動可能に連結された、以下の要素、すなわち、転写プロモーター、分泌シグナル配列、改変ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、及び転写ターミネーターを含む。上述したように、改変されたポリペプチド及びペプチドの任意の配置を本発明のベクターにおいて使用してよい。適切なプロモーター、シグナル配列、及びターミネーターの選択は、選択された宿主細胞によって決定されることになり、かつ当業者には明らかと考えられ、以下により具体的に考察する。
【００８３】
[0089]本発明で使用するのに適する酵母ベクターは、米国特許第６２９１２１２号において記載されており、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１０３５〜１０３９頁、１９７８年）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈ他、Ｇｅｎｅ８；１２１〜１３３頁、１９７９年）、ｐＪＤＢ２４９及びｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：１０４〜１０８頁、１９７８年）、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｅＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、ｐＣ４、並びにそれらの誘導体が含まれる。有用な酵母プラスミドベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ラ・ホーヤ、ＣＡ９２０３７、米国）から入手可能なｐＲＳ４０３−４０６、ｐＲＳ４１３−４１６及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）ベクターも挙げられる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５及びｐＲＳ４０６は、酵母組込み型プラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、及びＵＲＡ３を組み入れている。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐｓ）である。
【００８４】
[0090]このようなベクターは一般に選択マーカーを含み、選択マーカーは、表現型アッセイが存在し、形質転換体の選択を可能にする、優性の表現型を示す多数の遺伝子のうちの１つでよい。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完し、抗生物質抵抗性を与え、又は細胞が特定の炭素供給源の利用を可能にさせるものであり、ＬＥＵ２（Ｂｒｏａｃｈ他、同書）、ＵＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ他、Ｇｅｎｅ８；１７、１９７９年）、ＨＩＳ３（Ｓｔｒｕｈｌ他、同書）、又はＰＯＴ１（Ｋａｗａｓａｋｉ及びＢｅｌｌ、ＥＰ１７１１４２）が挙げられる。他の適切な選択マーカーとしては、酵母細胞にクロラムフェニコール抵抗性を与えるＣＡＴ遺伝子が挙げられる。酵母において使用するのに好ましいプロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２５：１２０７３〜１２０８０頁、１９８０年；Ａｌｂｅｒ及びＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１；４１９〜４３４頁、１９８２年；Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４５９９３１１号）又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇ他、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ他（編）、３５５頁、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎ．Ｙ．、１９８２年；Ａｍｍｅｒｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２〜２０１頁、１９８３年）に由来するプロモーターが挙げられる。この点に関して、特に好ましいプロモーターは、ＴＰＩ１プロモーター（Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４５９９３１１号）及びＡＤＨ２−４Ｃ（米国特許第６２９１２１２号を参照されたい）プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ３０４：６５２〜６５４頁、１９８３年）である。発現ユニットは、転写ターミネーターも含んでよい。好ましい転写ターミネーターはＴＰＩ１ターミネーター（Ａｌｂｅｒ及びＫａｗａｓａｋｉ、同書）である。より好ましくは、プロモーターは、ＥＰ４３１８８０において開示されているＰＲＢ１プロモーターであり、かつターミネーターは、ＥＰ６００５７において開示されているＡＤＨ１ターミネーターであり、これらの文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００８５】
[0091]酵母の他に、本発明の改変されたポリペプチド及びペプチドは、糸状菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の種においても発現され得る。有用なプロモーターの例としては、ＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２０９３〜２０９９頁、１９８５年）やｔｐｉＡプロモーターなどのアスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）解糖系遺伝子に由来するものが挙げられる。適切なターミネーターの例はＡＤＨ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ他、同書）である。このような構成要素を利用する発現ユニットは、例えばアスペルギルスの染色体ＤＮＡ中に挿入することができるベクター中にクローニングすることができる。
【００８６】
[0092]本発明を実施する際に使用するための哺乳動物発現ベクターは、改変されたポリペプチド及びペプチドの転写を指示することができるプロモーターを含む。好ましいプロモーターとしては、ウイルスプロモーター及び細胞プロモーターが挙げられる。好ましいウイルスプロモーターとしては、アデノウイルス２に由来する主要後期プロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１３０４〜１３１９９頁、１９８２年）及びＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４〜８６４頁、１９８１年）が挙げられる。好ましい細胞プロモーターとしては、マウスのメタロチオネイン−１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２２；８０９〜８１４頁、１９８３年）及びマウスＶκ（米国特許第６２９１２１２号を参照されたい）プロモーター（Ｇｒａｎｔ他、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：５４９６頁、１９８７年）が挙げられる。特に好ましいプロモーターは、マウスＶＨ（米国特許第６２９１２１２号を参照されたい）プロモーターである。このような発現ベクターはまた、プロモーターから下流、かつ改変されたポリペプチド又はペプチドをコードしているＤＮＡ配列から上流に位置する、１組のＲＮＡスプライス部位も含み得る。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルス及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。
【００８７】
[0093]興味対象のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルもまた、発現ベクター中に含まれる。ポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来する初期又は後期のポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ、同書）、アデノウイルス５Ｅ１Ｂ領域及びヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏ他、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：３７１９〜３７３０頁、１９８１年）に由来するポリアデニル化シグナルが挙げられる。特に好ましいポリアデニル化シグナルは、ＶＨ（米国特許第６２９１２１２号を参照されたい）遺伝子ターミネーターである。発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位の間に位置した、アデノウイルス２の３分節リーダーなど非コード性のウイルスリーダー配列を含んでもよい。好ましいベクターは、ＳＶ４０エンハンサーやマウスμ（米国特許第６２９１２１２号を参照されたい）エンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ、Ｃｅｌｌ  ３３：７１７〜７２８頁、１９８３年）などのエンハンサー配列も含んでもよい。発現ベクターは、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする配列も含んでよい。
【００８８】
[0094]これらの発現ベクターはまた、後述するように、改変されたポリペプチド又はペプチドの半減期を向上させるために、第２のポリペプチド又はペプチド、例えばトランスフェリンに融合された本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを含む融合タンパク質を発現させるためにも使用される。同様に、改変されたポリペプチド又はペプチドは、その改変されたポリペプチド又はペプチドを発現及び遊離させるためにタグ及び／又は切断部位に融合してもよい。
【００８９】
形質転換
[0095]菌類を形質転換するための技術は文献において周知であり、例えばＢｅｇｇｓ（同書）、Ｈｉｎｎｅｎ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：１９２９〜１９３３頁、１９７８年）、Ｙｅｌｔｏｎ他、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１７４０〜１７４７頁、１９８４年）、及びＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ３０１：１６７〜１６９頁、１９８３年）によって説明されている。宿主細胞の遺伝子型は、一般に、発現ベクター上に存在する選択マーカーによって補完される遺伝的欠陥を含む。個々の宿主及び選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【００９０】
[0096]本発明の改変されたポリペプチド及びペプチドを含むクローン化ＤＮＡ配列は、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｃｅｌｌ  １４：７２５頁、１９７８年；Ｃｏｒｓａｒｏ及びＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３頁、１９８１年；Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６頁、１９７３年）によって、哺乳動物培養細胞中へ導入することができる。エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１〜８４５頁、１９８２年）又はリポフェクションなど哺乳動物細胞中にクローン化ＤＮＡ配列を導入するための他の技術も使用することができる。クローン化ＤＮＡを組み込んだ細胞を同定するために、選択マーカーが、興味対象の遺伝子又はｃＤＮＡと共にそれらの細胞中に一般に導入される。哺乳動物培養細胞において使用するのに好ましい選択マーカーとしては、ネオマイシン、ヒグロマイシン及びメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を与える遺伝子が挙げられる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーでもよい。好ましい増幅可能な選択マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子である。特に好ましい増幅可能なマーカーは、ＤＨＦＲｒ（米国特許第６２９１２１２号を参照されたい）ｃＤＮＡ（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ及びＬｅｖｉｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０：２４９５〜２４９９頁、１９８３年）である。選択マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙによる総説があり（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ストーナム（Ｓｔｏｎｅｈａｍ）、マサチューセッツ州）、かつ選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【００９１】
宿主細胞
[0097]本発明はまた、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを発現するように形質転換された細胞、好ましくは酵母細胞も含む。形質転換された宿主細胞それら自体に加えて、本発明はまた、栄養培地中の、それらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に均一な）培養物、又はモノクローナル培養物に由来する培養物も含む。ポリペプチドが分泌される場合、培地は、細胞と共に、又はそれらがろ過若しくは遠心分離で除去される場合には細胞を伴わずに、ポリペプチドを含む。
【００９２】
[0098]本発明を実施する際に使用するための宿主細胞としては、哺乳動物培養細胞、昆虫細胞、菌細胞、植物細胞、及び細菌細胞など、外因性ＤＮＡで形質転換又はトランスフェクトでき、培養状態で増殖させることができる真核細胞及びいくつかの場合では原核細胞が挙げられる。本発明の核酸配列を含むベクターは、ベクターが染色体構成要素として、又は自己複製する染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中へ導入される。核酸配列が細胞中で安定に維持されやすいため、組込みが有利であると一般にみなされる。宿主の染色体中へのベクターの組込みは、相同組換え又は非相同組換えによって起こり得る。
【００９３】
[0099]宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードしている遺伝子及びその供給源に大きく依存すると考えられる。宿主細胞は、単細胞の微生物、例えば原核生物でも、又は非単細胞の微生物、例えば真核生物でもよい。原核生物又は真核生物のいずれかを使用することができる。原核宿主細胞としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など一般に使用される細胞を使用することができる。
【００９４】
[00100]原核細胞が宿主細胞として使用される場合、宿主細胞中で複製可能なベクターが使用され得る。タンパク質合成を開始するために必要とされるプロモーター、ＳＤ配列（シャイン・ダルガルノ配列）、及び開始コドン（例えばＡＴＧ）が、ベクター中で本発明の遺伝子の上流で提供されて、その遺伝子の発現を促進するような発現プラスミドが、好ましくは使用され得る。上記のベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３など大腸菌に由来する一般に使用されるプラスミドが挙げられる。しかし、適用可能なベクターはこれらの例に限定されず、様々な公知のベクターも使用することができる。大腸菌を用いた発現系において使用可能な市販のベクターの例としては、ｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−Ｐ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが挙げられる。
【００９５】
[00101]真核宿主細胞の例としては、酵母細胞などが挙げられる。好んで使用される有頭動物細胞の例としては、ＣＯＳ細胞（サル由来の細胞）（１９８１年  Ｃｅｌｌ、２３、１７５頁）、チャイニーズハムスター卵巣細胞及びそれに由来するジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（１９８０年  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ．、７７、４２１６頁）などが挙げられ、また、好んで使用される酵母細胞の例としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが挙げられる。しかし、使用できる細胞はこれらの例に限定されない。好ましくは、酵母細胞が、改変されたポリペプチド又はペプチドを発現させるために使用される。
【００９６】
[00102]酵母の種（例えばサッカロマイセス種、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種）を含めて、菌細胞が本発明内で宿主細胞として使用され得る。本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを発現させるための宿主として、本発明を実施する際に有用であることが予想される、酵母を含む菌類の例は、ピキア（以前はハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）として分類されていた種を含む）、サッカロマイセス、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、分裂酵母、シテロマイセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバロマイセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、メツニコウィア（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ボトリオアスクス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ）、スポリジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、エンドミコプシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）などである。サッカロマイセス属菌の例は、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．イタリクス（ｉｔａｌｉｃｕｓ）、及びＳ．ロウキシイ（ｒｏｕｘｉｉ）である。クルイベロマイセス属菌の例は、Ｋ．フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、及びＫ．マルキシアヌス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）である。適切なトルラスポラ属菌は、Ｔ．デルブリュッキー（ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）である。ピキア属菌の例は、Ｐ．アングスタ（ａｎｇｕｓｔａ）（以前のＨ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、Ｐ．アノマラ（ａｎｏｍａｌａ）（以前のＨ．アノマラ）、及びＰ．パストリス（Ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００９７】
[00103]本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを作製するのに特に有用な宿主細胞は、メタノール資化性ピキア・パストリス（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎ他（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．６：６１９〜６２４頁）である。ピキア・パストリスは、そのアルコール酸化酵素プロモーターが単離かつクローン化されたため、異種タンパク質を作製するための優れた宿主となるように開発され、その形質転換は１９８５年に最初に報告された。Ｐ．パストリスは、グルコースが無い場合は炭素源としてメタノールを利用することができる。Ｐ．パストリス発現系では、メタノール代謝の第１段階を触媒する酵素であるアルコール酸化酵素の発現をコードする遺伝子を制御する、メタノール誘導性のアルコール酸化酵素（ＡＯＸ１）プロモーターを使用することができる。このプロモーターは、特性を決定され、かつ一連のＰ．パストリス発現ベクター中に組み込まれた。Ｐ．パストリス中で産生されるタンパク質は、通常正確に折り畳まれ、かつ培地中に分泌されるため、遺伝子操作されたＰ．パストリスの発酵は、大腸菌発現系の優れた代替手段となる。
【００９８】
[00104]酵母サッカロマイセス・セレビシエの株は、別の好ましい宿主である。好ましい実施形態では、酵母細胞、又はより具体的には、糖タンパク質のアスパラギン結合型グリコシル化のために必要な遺伝子に遺伝的欠陥を含むサッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞が使用される。多数の入手可能な酵母株が、グリコシル化又は過剰なマンノシル化を防止又は低減させるために改変されたが、このような欠陥を有するＳ．セレビシエ宿主細胞は、変異及び選択の標準技術を用いて調製することができる。
【００９９】
[00105]異種性タンパク質の産生を最適化するためには、宿主株が、タンパク質分解活性の低減をもたらすＳ．セレビシエｐｅｐ４変異（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：２３〜３３頁、１９７７年）などの変異を有することも好ましい。アスパルチルプロテアーゼヤプシン１（ＹＡＰ３）をコードしている遺伝子若しくはヤプシン２（ＭＫＣ７）をコードしている遺伝子、又はその双方に変異を有し（Ｃｏｐｌｅｙ他  １９９８年  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３０、１３３３〜１３４０頁）、その結果、塩基性残基を対象とするタンパク質分解活性が低減又は消失しているような宿主を使用することが特に有利である。他のプロテアーゼコード領域に変異を含む宿主株は、本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを大量に作製するのに特に有用である。
【０１００】
[00106]本発明のＤＮＡ構築体を含む宿主細胞は、適切な増殖培地中で増殖させられる。本明細書において使用される場合、「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖に必要とされる栄養素を含む培地を意味する。細胞増殖に必要とされる栄養素としては、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、無機物、及び増殖因子を挙げることができる。増殖培地では、一般に、例えば、薬物による選択、又はＤＮＡ構築体上の若しくはＤＮＡ構築体と共にトランスフェクトされた選択マーカーによって補完される必須栄養素の欠乏によって、ＤＮＡ構築体を含む細胞を選択する。例えば酵母細胞は、好ましくは、非アミノ酸窒素源、無機塩類、ビタミン、及び必須アミノ酸補給物を含む、既知組成培地中で増殖する。培地のｐＨは、好ましくは、２より大きく８未満のｐＨ、好ましくはｐＨ５．５〜６．５で維持される。安定なｐＨを維持するための方法には、好ましくはアンモニア、水酸化アンモニウム又は水酸化ナトリウムの添加による緩衝化及び恒常的なｐＨ制御が含まれる。好ましい緩衝剤としては、クエン酸、ホスファート、コハク酸及びＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州）が挙げられる。アスパラギン結合型グリコシル化に必要な遺伝子に欠陥を有する酵母細胞は、好ましくは、浸透圧安定剤を含む培地中で増殖する。好ましい浸透圧安定剤は、ソルビトールであり、０．１Ｍ〜１．５Ｍ、好ましくは０．５Ｍ又は１．０Ｍの濃度で培地中に追加される。
【０１０１】
[00107]哺乳動物培養細胞は一般に、市販の血清含有培地又は無血清培地中で増殖する。使用される個々の細胞系統に適した培地の選択は、当業者のレベルの範囲内である。トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、一定期間、通常１〜２日間、増殖させて、興味対象のＤＮＡ配列の発現を開始させる。次いで、安定的に選択マーカーを発現している細胞の増殖を選択するために、薬物選択を適用する。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクトした細胞の場合は、薬物濃度を段階的に上昇させ、コピー数の多いクローン化配列を選択し、それによって発現レベルを増大させてもよい。
【０１０２】
[00108]バキュロウイルス／昆虫細胞発現系も、本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを作製するのに使用してよい。「ＢａｃＰＡＫ（商標）」バキュロウイルス発現系（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）は、昆虫宿主細胞において高レベルで組換えタンパク質を発現する。標的遺伝子をトランスファーベクター中に挿入し、これを、直鎖状にしたＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡと共に昆虫宿主細胞中にトランスフェクトする。ＢａｃＰＡＫ６  ＤＮＡは、バキュロウイルスゲノムの不可欠な部分を欠いている。このＤＮＡがベクターと再結合すると、その不可欠な要素が修復され、標的遺伝子がバキュロウイルスゲノムに移入される。組み換え後に、数個のウイルスプラークを採取かつ精製し、組換え表現型を確認する。次いで、新規に単離した組み換えウイルスを増幅させ、かつ昆虫細胞培養物に感染させるのに使用して所望のタンパク質を大量に産生させることができる。
【０１０３】
分泌シグナル配列
[00109]「分泌シグナル配列」若しくは「シグナル配列」又は「分泌リーダー配列」という用語は同義的に使用され、かつ例えば、いずれもその全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６２９１２１２号及び米国特許第５５４７８７１号において説明されている。分泌シグナル配列若しくはシグナル配列又は分泌リーダー配列は、分泌ペプチドをコードしている。分泌ペプチドは、細胞からの成熟したポリペプチド又はタンパク質の分泌を指示する役割を果たすアミノ酸配列である。分泌ペプチドは一般に、疎水性アミノ酸のコアを特徴とし、かつ通常（それだけには限らないが）、新しく合成されたタンパク質のアミノ末端に存在する。分泌ペプチドは、分泌中に成熟タンパク質から切断されることが非常に多い。分泌ペプチドは、成熟タンパク質が分泌経路を通過するときに、シグナルペプチドがそれから切断され得るプロセシング部位を含んでいてもよい。プロセシング部位は、シグナルペプチド内部にコードされていてもよく、又は例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発によってシグナルペプチドに付加されてもよい。
【０１０４】
[00110]分泌ペプチドは、本発明の改変されたポリペプチド及びペプチドの分泌を指示するために使用してもよい。他の分泌ペプチドと組み合わせて使用され得る１つのこのような分泌ペプチドは、酵母バリア（Ｂａｒｒｉｅｒ）タンパク質の第３ドメインである。分泌シグナル配列若しくはシグナル配列又は分泌リーダー配列は、タンパク質の分泌をもたらす複雑な一連の翻訳後プロセシング段階に必要である。完全なシグナル配列が存在している場合には、発現されるタンパク質は、粗面小胞体の管腔に入り、次いでゴルジ体を通って分泌小胞に輸送され、最終的に細胞外へ輸送される。一般に、シグナル配列は、開始コドンのすぐ後に続き、かつ分泌されるタンパク質のアミノ末端のシグナルペプチドをコードしている。たいていの場合は、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる特異的なプロテアーゼによって切り離される。好ましいシグナル配列により、ウイルス、哺乳動物、又は酵母の発現ベクターを用いた組換えタンパク質発現のプロセシング及び搬出効率が改善される。好ましいシグナル配列は、哺乳動物又はヒトのトランスフェリンシグナル配列である。いくつかの場合では、天然基質のシグナル配列が、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを発現及び分泌させるために使用してもよい。シグナル配列の効率的な除去を確実にするために、いくつかの場合では、シグナル配列と成熟タンパク質の間に、そのＣ末端部分が酵母ｋｅｘ２ｐプロテアーゼなどのプロテアーゼに対する認識部位を含む短いプロペプチド配列を含むことが好ましいことがある。好ましくは、プロペプチド配列は、約２〜１２アミノ酸の長さ、より好ましくは約４〜８アミノ酸の長さである。このようなプロペプチドの例は、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、及びＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（それぞれ配列番号１１１〜１１４）である。
【０１０５】
ＤＰＰ切断から保護された改変ポリペプチド基質の作製
[00111]ＤＰＰ活性に対して部分的又は実質的に抵抗性である本発明の改変ポリペプチドは、標準的な合成方法、組換えＤＮＡ技術、又はペプチド及び融合タンパク質を調製する他の任意の方法によって調製してよい。
【０１０６】
[00112]固相ペプチド合成法は、以下の参考文献において一般に記載されている：Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８８８；２１４９頁、１９６３年；Ｂａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｅ．Ｇｒｏｓｓ及びＪ．Ｍｅｉｎｅｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、３：２８５頁（１９８０年）；Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７：９５７頁（１９８８年）。固相ペプチド合成法により、固体樹脂粒子に共有結合している伸長中のペプチド鎖へのアミノ酸の段階的付加を介して、所望の長さ及び配列のペプチドを作製することができる。この方法において自動合成を使用してもよい。
【０１０７】
[00113]上述したように、本発明の改変ポリペプチドはまた、それらのポリペプチドをコードする核酸配列を使用して、分子生物学技術によって得ることもできる。これらの配列は、ＲＮＡでもＤＮＡでもよく、また、制御配列に結合していても及び／又はベクター中に挿入されていてもよい。後者は次に宿主細胞、例えば細菌中にトランスフェクトされる。ベクターの調製及び宿主中でのそれらの産生又は発現は、従来の分子生物学及び遺伝子工学技術によって実施される。
【０１０８】
[00114]さらに、本発明の改変ポリペプチドは、市販の発現系において容易に合成されるＤＮＡ配列を用いた組換え技術によって作製することもできる。
【０１０９】
[00115]本発明の改変ポリペプチドは、（ａ）ポリペプチド産生の助けとなる条件下で宿主細胞を培養するステップ；及び（ｂ）ポリペプチドを回収するステップを含む組換え手段によって得ることができる。これらの細胞は、当技術分野において公知の方法を用いて、ポリペプチドの産生に適した栄養培地中で培養される。例えば、適切な培地中、かつポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にする条件下で実施される、実験室又は産業的な発酵槽における振とうフラスコ培養、小規模又は大規模の発酵（連続発酵、回分発酵、流加回分発酵、若しくは固層発酵を含む）によって、細胞を培養することができる。培養は、炭素及び窒素源並びに無機塩類を含む適切な栄養培地中で、当技術分野において公知の手順を用いて実施される（例えば、細菌及び酵母に関する参考文献；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．及びＬａＳｕｒｅ，Ｌ．編集、Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア、１９９１年を参照されたい）。適切な培地は、商業的供給業者から入手可能であり、又は（例えば米国微生物株保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログにおいて）公開されている組成に従って調製してもよい。改変ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合には、ポリペプチドを培地から直接回収することができる。改変ポリペプチドが分泌されない場合には、細胞可溶化液からそれを回収することができる。
【０１１０】
[00116]例として、改変されたポリペプチド又はペプチド融合タンパク質を含む、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際公開第００４４７７２号パンフレットにおいて開示されている発酵方法論によって作製することができる。
【０１１１】
[00117]これらの改変ポリペプチドは、それらのポリペプチドに対して特異的な当技術分野において公知の方法を用いて検出することができる。これらの検出方法には、特定の受容体に結合する、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成若しくは酵素基質の消失が含まれてよく、又は細胞ベースのアッセイにおける、特定の受容体の活性化の検出によることができる。例えば、酵素アッセイを使用して、改変ポリペプチドの活性を測定することができる。結果として生じる改変ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法によって回収することができる。例えば、改変ポリペプチドは、それだけには限らないが、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈降を含めて、従来の手順によって栄養培地から回収することができる。
【０１１２】
[00118]本発明のポリペプチドは、それだけには限らないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動的手順（例えば分取用等電点電気泳動）、示差的な溶解性（例えば硫安沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出を含めて、様々な手順によって精製することができる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ及びＬａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ編集、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、１９８９年を参照されたい）。
【０１１３】
融合タンパク質及びタンパク質複合体
[00119]本発明は、組換え手段又は共有結合によって異種分子に結合された、改変されたポリペプチド又はペプチドを提供する。異種分子、例えば血漿タンパク質への結合により改変されたポリペプチド又はペプチドの活性は、数日間から数週間延長する。いくつかの場合では、このような改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの投与の実施は、この期間の間に１回しか必要とされないことがある。活性化合物は主として大型分子に結合され、細胞内に取り込まれて他の生理学的プロセスを妨害する可能性が低いため、より高い特異性を実現させることができる。
【０１１４】
[00120]別の実施形態では、組換え手段によって本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを異種配列に結合させ、キメラ又は融合タンパク質を形成させることができる。このようなキメラ又は融合タンパク質は、ＤＰＰ切断から部分的又は実質的に保護され、改変されたポリペプチド又はペプチドに実質的に同種ではないアミノ酸配列を有する異種タンパク質に作動的に連結されている、改変されたポリペプチド又はペプチドを含む。「作動的に連結された」とは、改変されたポリペプチド又はペプチド及び異種タンパク質がインフレームで融合されていることを示す。異種タンパク質は、改変されたポリペプチド又はペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合させることができる。
【０１１５】
[00121]一実施形態では、融合タンパク質は、本発明の改変ポリペプチドそれ自体の活性に影響を及ぼさない。例えば、融合タンパク質としては、それだけには限らないが、酵素学的な融合タンパク質、例えばβ−ガラクトシダーゼ融合物、酵母２ハイブリッドＧＡＬ融合物、ポリＨｉｓ融合物、ＭＹＣタグ付き融合物、ＨＩタグ付き融合物、及びＩｇ融合物を挙げることができる。このような融合タンパク質、特にポリＨｉｓ融合物は、組換え改変ポリペプチドの精製を容易にすることができる。さらなる実施例では、融合タンパク質は、本発明の改変ペプチドと他の部分の間にアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、化学的又は酵素的切断後に本発明の改変ペプチドの遊離を可能にする認識配列を与える。ある種の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）では、異種シグナル配列を用いることによって、タンパク質の発現及び／又は分泌を増大させることができる。別の実施形態では、改変されたポリペプチド又はペプチドは、血漿タンパク質などその血清安定性を高め又は血清半減期を延長すると考えられる分子に融合される。好ましくは、改変ポリペプチド又はタンパク質は、血清アルブミン、免疫グロブリン又はＦｃドメインなどその一部分に融合される。より好ましくは、改変されたポリペプチド又はペプチドは、トランスフェリン、ラクトトランスフェリン、メラノトランスフェリン又はそれらのハイブリッドに融合される。このような融合タンパク質を作製するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第１０／２３１，４９４号及び第１０／３７８，０９４号、並びに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２６８１８によって提供される。
【０１１６】
[00122]これらの特許出願で考察されているように、改変されたポリペプチド又はペプチドに結合されるトランスフェリンを改変してもよい。それにより、低減されたグリコシル化が示され得る。改変されたトランスフェリンポリペプチドは、単一のトランスフェリンＮドメイン、単一のトランスフェリンＣドメイン、トランスフェリンのＮ及びＣドメイン、２つのトランスフェリンＮドメイン、並びに２つのトランスフェリンＣドメインからなる群から選択することができる。
【０１１７】
[00123]ＴｆのＣドメインが融合タンパク質の一部分である場合、２つのＮ結合型グリコシル化部位、すなわちＮ４１３及びＮ６１１（その全体が参照により本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ０３／２６８１８の配列番号３）に対応するアミノ酸残基を、酵母系での発現用に変異して、グリコシル化又は過剰なマンノシル化を防止し、かつ融合タンパク質及び／又は治療用タンパク質の血清半減期を延長することができる（アシアロ−Ｔｆ又は場合によってはモノアシアロ−Ｔｆ若しくはジシアロ−Ｔｆを生成させる）。Ｎ４１３及びＮ６１１に対応するＴｆアミノ酸の他に、グリコシル化を防止又は実質的に低減させるために、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の隣接残基に変異があってもよい。Ｆｕｎｋ他の米国特許第５９８６０６７号を参照されたい。ピキア・パストリスにおいて発現されたＴｆのＮドメインは、Ｓ３２で１つのヘキソースによってＯ結合型グリコシル化され、このようなグリコシル化を防止するためにも変異又は改変させ得ることもまた報告されている。
【０１１８】
[00124]したがって、本発明の一実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質は、それだけには限らないがＴｆのアシアロ型、モノシアロ型及びジシアロ型を含めて、グリコシル化の低減を示す改変されたトランスフェリン分子を含む。別の実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防止するように変異した組換えトランスフェリン変異体を含む。別の実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、完全にグリコシル化される組換えトランスフェリン変異体を含む。別の実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、Ａｓｎ４１３及びＡｓｎ６１１のうちの少なくとも１つ（その全体が参照により本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ０３／２６８１８の配列番号３）が、グリコシル化を生じないアミノ酸に変異している、グリコシル化を防止するように変異した組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含む。別の実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防止又は実質的に低減させるように変異した組換えヒト血清トランスフェリン変異体であって、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の隣接残基にそれらの変異があってもよい組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含む。さらに、グリコシル化は、セリン又はトレオニン残基を変異することによって低減又は防止してもよい。さらに、Ｘをプロリンに変更することによりグリコシル化が阻害されることが公知である。
【０１１９】
[00125]キメラ又は融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードしているＤＮＡ断片は、従来の技術に従ってインフレームで相互に連結される。別の実施形態では、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって、融合遺伝子を合成することができる。あるいは、アンカープライマーを用いて２つの連続した遺伝子断片の間に相補的なオーバーハングを生じさせ、その後にアニール及び再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成させる遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施することもできる（Ａｕｓｕｂｅｌ他  １９９２年  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）。さらに、融合部分（例えばＧＳＴタンパク質）を予めコードしている多くの発現ベクターが市販されている。融合部分が、改変されたポリペプチド又はペプチドにインフレームで連結されるように、改変されたポリペプチド又はペプチドをコードしている核酸をこのような発現ベクター中にクローニングすることができる。
【０１２０】
[00126]別の実施形態では、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、その安定性及びＤＰＰ活性からの保護を増大させるために、異種分子への共有結合を介して結合する。
【０１２１】
[00127]例として、改変されたポリペプチド又はペプチドは、連結基を伴って又は伴わずに、改変されたポリペプチド又はペプチドの反応性基と血液成分の間で形成される共有結合を介して血液成分に結合する。血液成分は、固定性でも可動性でもよい。固定性血液成分の例は、非可動性の血液成分であり、組織、膜受容体、間質タンパク質、フィブリンタンパク質、コラーゲン、血小板、内皮細胞、上皮細胞、並びにそれらに結合した膜及び膜性受容体、体細胞、骨格及び平滑筋細胞、ニューロン構成要素、骨細胞及び破骨細胞、並びにすべての身体組織、特に循環系及びリンパ系に関連したものが挙げられる。可動性の血液成分の例は、任意の長期間、通常は５分を超えない期間、より一般的には１分間、位置が固定されない血液成分である。これらの血液成分は、膜に結合しておらず、長期間、血液中に存在し、かつ少なくとも０．１μｇ／ｍｌの最小濃度で存在している。可動性の血液成分としては、血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＭやＩｇＧなどの免疫グロブリン、α１プロテアーゼ阻害因子、抗トロンビンＩＩＩ及びα２−抗プラスミンが挙げられる。可動性血液成分の半減期は、典型的には少なくとも約１２時間である。
【０１２２】
[00128]血液成分と改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの間の共有結合の形成は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで起こり得る。ｅｘ  ｖｉｖｏでの共有結合形成の場合、血液、血清、又は血液成分、例えばヒト血清アルブミン若しくはＩｇＧを含有する生理食塩水溶液に、改変されたポリペプチド又はペプチドを添加して、改変されたポリペプチド又はペプチドと血液成分の間の共有結合形成を可能にさせる。また、マレイミド又は同様に反応性の高い化学基で改変ポリペプチドペプチドを修飾し、かつ生理食塩水溶液中で血液成分と反応させてもよい。改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを血液成分と反応させて、改変されたポリペプチド又はペプチドの結合物を形成させた後に、その結合物を患者に投与してよい。あるいは、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドと血液成分の間でｉｎ  ｖｉｖｏで共有結合が形成するように、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを患者に直接投与してもよい。また、同じ反応を組換えタンパク質、例えばアルブミンを用いて実施してもよい。
【０１２３】
[00129]非特異的な改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの化学的に反応性の基がｉｎ  ｖｉｖｏで反応し得る様々な部位としては、細胞、特に赤血球細胞（赤血球）及び血小板、並びにＩｇＧ及びＩｇＭを含む免疫グロブリン、血清アルブミン、フェリチン、ステロイド結合タンパク質、トランスフェリン、チロキシン結合タンパク質、α−２−マクログロブリンなどのタンパク質が挙げられる。
【０１２４】
[00130]改変されたポリペプチド又はペプチドは、チオールに結合する反応性基を含んでもよく、又は含むように化学的に改変してもよい。本発明の一実施形態では、改変されたポリペプチド又はペプチドは、ポリエチレングリコールに結合してもよい。あるいは、改変されたポリペプチド又はペプチドは、ポリエチレングリコールで修飾された糖脂質又はポリエチレングリコールで修飾された脂肪酸に結合してもよい。
【０１２５】
[00131]一態様では、改変されたポリペプチド又はペプチドは、その安定性を改善するために脂肪酸又は脂肪酸誘導体に結合してもよい。脂肪酸の例としては、それだけには限らないが、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、及びステアリン酸が挙げられる。脂肪酸誘導体の例としては、エチルエステル、プロピルエステル、コレステリルエステル、補酵素Ａエステル、ニトロフェニルエステル、ナフチルエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリド、脂肪アルコール、脂肪アルコールアセタートなどが挙げられる。
【０１２６】
[00132]別の態様では、改変されたポリペプチド又はペプチドは、薬物親和性複合体（ＤＡＣ（商標））に作り変えてもよい。薬物親和性複合体は３つの部分を有する：すなわち、生物活性を担う薬物成分；その薬物成分を反応性化学基に結合させる連結部；及び、体内の特定の標的タンパク質への構築物の持続的結合を担う、連結部と反対の末端側にある反応性化学基である。例えば、Ｋｉｍ他（２００３年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（３）：７５１頁）では、ＧＬＰ−１−アルブミン薬物親和性複合体を開示している。Ｋｉｍ他は、アルブミンを結合したＤＡＣ：ＧＬＰ−１がＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）に結合し、その受容体を発現している異種性の線維芽細胞においてｃＡＭＰ形成を活性化したことを示している。これらの結果は、アルブミンを結合したＤＡＣ：ＧＬＰ−１が天然のＧＬＰ−１を擬態していることを示唆する。Ｋｉｍ他は、ＧＬＰ−１Ｒシグナル伝達をより長い時間活性化するための新しい手法を提供している。
【０１２７】
[00133]改変されたポリペプチド又はペプチドの薬物親和性複合体は、皮下注射によって投与されるように設計され、その後、ｉｎ  ｖｉｖｏで迅速かつ選択的にアルブミンに結合する。形成されたバイオコンジュゲートは、内因性のポリペプチド又はペプチドと同じ治療活性及び同様の効力を有するが、動物において、アルブミンのものにより近い薬物動態プロファイルを有する。
【０１２８】
薬剤組成物
[00134]本発明は、ＤＰＰ切断から部分的又は実質的に保護されているが機能的活性及び効力は実質的に保持している、改変された治療用ポリペプチド及びペプチドを含む薬剤組成物を提供する。このような薬剤組成物は、経口的に、血管内（ＩＶ）、動脈内（ＩＡ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内、経皮など非経口的に投与することができる。適切な場合には、輸注によって投与してもよい。いくつかの場合では、投与は経口、経鼻、直腸、経皮、又はエアロゾルでよく、その際、改変ポリペプチドは血管系に移行される。例えば、本発明の改変ポリペプチドをトランスフェリン部分に融合又は結合させると、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２６７７８において記載されているように、トランスフェリン受容体への結合を介して、その改変ポリペプチドの血管系への輸送又は血液脳関門を通過しての輸送が可能になる。通常、１回の注射が使用されるが、望ましいならば複数回の注射を用いてもよい。改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、注射器、トロカール、カテーテルなど任意の好都合な手段によって投与してよい。個々の投与様式は、単回ボーラス投与であるか持続投与であるかなど、投与される量に応じて変動すると考えられる。好ましくは血管内に投与され、この際、導入部位は本発明にとって重要ではないが、好ましくは血流が速い部位、例えば静脈内、末梢静脈、若しくは中心静脈である。より好ましくは、これらの薬剤組成物は、皮下投与される。投与が徐放技術又は保護マトリックスと一緒に行われる他の経路も使用してよい。目的は、改変された治療用ペプチド又はポリペプチドが、血液成分又は組織成分と反応することができるように、例えば血液中に効果的に分布されることである。
【０１２９】
[00135]一般に、本発明は、有効量の本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを、製薬上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤及び／又は担体と共に含む薬剤組成物を包含する。このような組成物は、様々な緩衝液内容物（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；界面活性剤や可溶化剤（例えばポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメルソール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）、及び増量物質（例えばラクトース、マンニトール）などの添加剤；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子状調製物又はリポソーム中への材料の組込みを含んでよい。ヒアルロン酸も使用してよく、これは、血液循環中での持続期間の延長を促進する効果を有し得る。このような組成物は、本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの放出速度、及びｉｎ  ｖｉｖｏでのクリアランス速度に影響し得る。例えば、参照により本明細書に組み入れられるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０年、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、イーストン、ペンシルバニア州、１８０４２）１４３５〜１７１２頁を参照されたい。
【０１３０】
[00136]例えば、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、例えば脱イオン水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、水性エタノール又は他のアルコール、血漿、タンパク質性の溶液、マンニトール、グルコース水溶液、アルコール、植物油など生理学的に許容される媒体中で投与され得る。含まれ得る他の添加剤としては、一般に約５〜１０の範囲のｐＨに媒体を緩衝化し、一般に濃度が約５０〜２５０ｍＭの範囲である緩衝剤、一般に濃度が約５〜５００ｍＭの範囲である塩、生理学的に許容される安定化剤などが挙げられる。特に注射用の生理学的緩衝液の例としては、ハンクス溶液及びリンガー溶液が挙げられる。経皮製剤は、胆汁酸塩やフシダートなどの浸透剤を含んでもよい。
【０１３１】
[00137]薬剤組成物は、錠剤若しくは糖衣錠、舌下錠、サシェ、パケット（ｐａｑｕｅｔ）、軟ゼラチンカプセル剤、坐剤、クリーム剤、軟膏、皮膚用ゲル剤、経皮デバイス、エアロゾル、飲用可能なアンプル及び注射用アンプルとして調製してもよい。これらの組成物は、液状形態で調製してもよく、又は保管及び輸送に便利な凍結乾燥形態など乾燥させた粉末でもよい。埋め込み可能な徐放製剤もまた、企図される。
【０１３２】
経口剤形
[00138]一実施形態では、本発明は、参照により本明細書に組み入れられるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０年）、第１８版、（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、イーストン、ペンシルバニア州、１８０４２）で一般的に記載されている経口固形剤形中に、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを含む薬剤組成物を提供する。固形剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ若しくはロゼンジ、カシェ剤、又はペレット剤が挙げられる。また、リポソーム又はプロテイノイドによるカプセル化を使用して、（例えば米国特許第４９２５６７３号において報告されているプロテイノイドマイクロスフェアとして）本発明の組成物を調製してもよい。リポソームによるカプセル化も使用することができ、かつ様々なポリマーでこれらのリポソームを誘導体化してもよい（例えば米国特許第５０１３５５６号）。治療用物質のために考え得る固形剤形は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ及びＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓによって編集されたＭａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９７９年）の１０章で説明されている。一般に、製剤は、改変された治療用ポリペプチド又はペプチド、並びに胃環境からの保護及び腸中での生物活性のある材料の放出を可能にさせる不活性成分を含む。
【０１３３】
[00139]必要であれば、経口送達が有効になるように、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを化学的に改変してもよい。一般に、企図される化学的改変は、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドそれ自体への少なくとも１つの部分の付加であり、前記部分により、胃又は腸から血流中への取込みが可能になる。また、その化合物の全般的な安定性の上昇及び身体中での循環時間の増大も望まれる。本発明において共有結合的に付加されたビヒクルとして有用な部分も、この目的のために使用してよい。このような部分の例としては、ＰＥＧ、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、並びにポリプロリンが挙げられる。例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ及びＤａｖｉｓ、Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ，Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ（１９８１年）、Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ及びＲｏｂｅｒｔｓ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、ニューヨーク州、３６７〜８３頁；Ｎｅｗｍａｒｋ他（１９８２年）、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５〜９頁を参照されたい。使用され得る他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）である。先に示したように、薬学的使用に好ましいのはＰＥＧ部分である。
【０１３４】
[00140]同様に、その全般的な安定性を上昇させ、又は経口送達を改善させるために、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを組換えによって別のポリペプチドに融合してもよい。例えば、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを、トランスフェリン、メラノトランスフェリン又はラクトフェリンに融合してよい。このような融合タンパク質を作製するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第１０／３７８，０９４号に記載されている。
【０１３５】
[00141]経口送達剤形の場合、本発明の治療用化合物の吸収を促進するための担体として、Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）など改変された脂肪アミノ酸の塩を使用することも可能である。ＳＮＡＣを用いたヘパリン製剤の臨床的有効性は、Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社によって実施された第２相臨床試験において実証された。その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５７９２４５１号「経口薬物送達組成物及び方法（Ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」を参照されたい。
【０１３６】
[00142]本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、粒径約１ｍｍの顆粒又はペレットの形態の微細な多粒子として製剤中に含めることができる。カプセル剤投与用の材料の製剤は、散剤、軽く圧縮された詰め物として、又はさらに錠剤としてでもよい。治療用物質は、圧縮によって調製され得る。
【０１３７】
[00143]着色剤及び矯味剤もすべて含まれ得る。例えば、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、（リポソーム若しくはマイクロスフェアによるカプセル化などによって）配合してよく、次いで、着色剤及び矯味剤を含有する冷蔵飲料など食用の製品内にさらに含めてよい。
【０１３８】
[00144]不活性な材料を用いて本発明の薬剤組成物を希釈しても、又はその体積を増加させてもよい。これらの希釈剤としては、炭水化物、特にマンニトール、ｃｃ−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、改変デキストラン及びスターチを挙げることができる。３リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含めて、いくつかの無機塩類も増量剤として使用してよい。いくつかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅｌｌである。
【０１３９】
[00145]治療用物質を固形剤形中に配合する際に、崩壊剤を含めてもよい。崩壊剤として使用される材料としては、それだけには限らないが、デンプンをベースとする市販の崩壊剤であるエクスプロタブ（Ｅｘｐｌｏｔａｂ）を含めて、デンプンが挙げられる。グリコール酸デンプンナトリウム、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、橙皮、酸性カルボキシメチルセルロース、天然のスポンジ及びベントナイトもすべて使用してよい。崩壊剤の別の形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。粉末状ゴムを崩壊剤及び結合剤として使用してよく、これらとしては、寒天、カラヤ又はトラガントなどの粉末状ゴムを挙げることができる。アルギン酸及びそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。
【０１４０】
[00146]改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを一緒にまとめて硬い錠剤を形成させるために、結合剤を使用してよく、アラビアゴム、トラガントゴム、デンプン及びゼラチンなど天然産物に由来する材料が挙げられる。他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）の双方とも、治療用物質を顆粒化するためにアルコール液剤中で使用することができる。
【０１４１】
[00147]製剤工程の進行中の粘着を防止するために、本発明の薬剤組成物の調剤中に潤滑剤を含めてもよい。改変された治療用ポリペプチド又はペプチドと金型壁の間の層として滑沢剤を使用してよく、これらとしては、それだけには限らないが、そのマグネシウム塩及びカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、植物油、並びにワックスを挙げることができる。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス（Ｃａｒｂｏｗａｘ）４０００及び６０００など可溶性の滑沢剤も使用してよい。
【０１４２】
[00148]調剤中の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの流動性を改善し得、かつ圧縮中の再配列を助けるための流動促進剤を添加してもよい。これらの流動促進剤としては、デンプン、タルク、発熱性シリカ及び含水シリコアルミナートを挙げることができる。
【０１４３】
[00149]本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの水性環境中への溶解を促進するために、湿潤剤として表面活性剤を添加してもよい。表面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤を挙げることができる。陽イオン性界面活性剤を使用してもよく、これらとしては塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムを挙げることができる。表面活性剤として製剤中に含めることができる有望な非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、スクロースの脂肪酸エステル、メチルセルロース、並びにカルボキシメチルセルロースである。これらの表面活性剤は、単独で又は異なる比率での混合物として、タンパク質又は誘導体の製剤中に存在することができる。
【０１４４】
[00150]改変された治療用ポリペプチド及びペプチドの取込みを向上させるための添加剤も製剤中に含めてよい。この特性を潜在的に有する添加剤は、例えば脂肪酸のオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。
【０１４５】
[00151]制御放出製剤もまた、望ましいことがある。本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、拡散又は浸出機序のいずれかによる放出を可能にする不活性なマトリックス、例えばゴム中に混和させることができる。緩徐に変質するマトリックス、例えばアルギナート、多糖も、製剤中に混和させてよい。本発明の化合物の制御放出の別の形態は、オロス（Ｏｒｏｓ）治療系（ＡｌｚａＣｏｒｐ．社）、すなわち水が浸入し、浸透圧作用によって単一の小さな孔から薬物を押し出すことを可能にする半透膜中に薬物が封入されている系に基づく方法による。一部の腸溶コーティングもまた、放出遅延効果を有している。
【０１４６】
[00152]他のコーティング剤を製剤用に使用してもよい。これらには、コーティングパン中で適用することができる様々な糖が含まれる。改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、フィルムコーティング錠中で与えることもでき、この場合に使用される材料は、２つのグループに分けられる。１つめは、非腸溶性の材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシ−メチルセルロースナトリウム、プロビドン、及びポリエチレングリコールが挙げられる。２つめのグループは、一般にフタル酸のエステルである腸溶性材料からなる。
【０１４７】
[00153]最適なフィルムコーティングを提供するために材料の混合物を使用してもよい。フィルムコーティングは、パンコーティング装置若しくは流動層中で、又は圧縮コーティングによって実施することができる。
【０１４８】
肺送達形態
[00154]別の実施形態では、本発明は、肺送達用の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを含む薬剤組成物も提供する。この薬剤組成物は、吸息の間に哺乳動物の肺に送達され、かつ肺の上皮層を通過して血流に入る。
【０１４９】
[00155]本発明は、それだけには限らないが、すべて当業者には良く知られているネブライザー、計量吸入器及び粉末吸入器を含めて、治療用製品を肺に送達するために設計された多様な機械器具の使用を提供する。本発明の実施に適した市販の器具のいくつかの具体的な例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．社（セントルイス、ミズーリ州）製のウルトラベント（Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ）ネブライザー；Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社（エングルウッド、コロラド州）製のアコーン（Ａｃｏｒｎ）ＩＩネブライザー；Ｇｌａｘｏ，Ｉｎｃ．社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ノースカロライナ州）製のベントリン（Ｖｅｎｔｏｌｉｎ）計量吸入器；及びＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．社（ベッドフォード、マサチューセッツ州）製のスピンバラー（Ｓｐｉｎｂａｌｅｒ）粉末吸入器である。
【０１５０】
[00156]このような器具はすべて、改変された治療用ポリペプチド及びペプチドの投薬に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤は、使用される器具のタイプに特異的であり、治療法に有用な希釈剤、補助剤及び／又は担体に加えて、適切な噴霧物質の使用を伴い得る。
【０１５１】
[00157]改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、最も有利には、遠位の肺への最も効果的な送達のために、平均粒径が１０μｍ未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの微粒子形態で調製されるべきである。
【０１５２】
[00158]製薬上許容される担体としては、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、及びソルビトールなどの炭水化物が挙げられる。製剤中で使用するための他の成分としては、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＣを挙げることができる。天然又は合成の表面活性剤を使用してよい。ＰＥＧも（タンパク質又は類似体の誘導体化におけるその使用は別としてさらに）使用してよい。シクロデキストランなどのデキストランも使用してよい。胆汁酸塩及び他の関連した促進物質も使用してよい。セルロース及びセルロース誘導体も使用してよい。緩衝製剤における使用などアミノ酸も使用してよい。
【０１５３】
[00159]また、リポソーム、マイクロカプセル若しくはマイクロスフェア、包接錯体又は他のタイプの担体の使用も企図される。
【０１５４】
[00160]ジェット式又は超音波式のネブライザーを用いて使用するのに適した製剤は、典型的には、溶液１ｍＬ当たり生物活性のあるタンパク質が約０．１〜２５ｍｇ含まれる濃度で水中に溶解された本発明の化合物を含む。この製剤はまた、（例えばタンパク質安定化及び浸透圧調節のために）緩衝剤及び単糖も含んでよい。ネブライザー製剤はまた、エアロゾルを形成する際の溶液の噴霧化によって引き起こされる、表面で誘発されるタンパク質の凝集を低減又は防止するために、表面活性剤も含んでよい。
【０１５５】
[00161]計量吸入器を用いた使用のための製剤は、一般に、表面活性剤の助けにより噴霧剤中に懸濁された本発明の化合物を含む、微粉砕された粉末を含む。噴霧剤は、トリクロロフルオルメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン、又はそれらの組合せを含めて、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン又は炭化水素などこの目的用に使用される任意の従来の材料でよい。適切な表面活性剤としては、トリオレイン酸ソルビタン及び大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸もまた、表面活性剤として有用となり得る。
【０１５６】
[00162]粉末吸入器から投薬するための製剤は、本発明の化合物を含む微粉砕された乾燥粉末を含み、かつラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース又はキシリトールなどの増量剤を、器具からの粉末の分散を促進する量、例えば製剤の約５０〜９０重量％の量で含んでもよい。
【０１５７】
経鼻送達形態
[00163]本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドの薬剤組成物の経鼻送達も企図される。経鼻送達は、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを鼻に投与した後にそのタンパク質が直接血流に移動することを可能にし、肺に製品を沈着させる必要が無い。経鼻送達用の製剤としては、デキストラン又はシクロデキストランを含むものが挙げられる。他の粘膜を通過する輸送を介した送達も開示される。
【０１５８】
投薬量
[00164]前述した状態の治療のための方法において使用される投与計画は、薬物の作用を変化させる様々な要因、例えば患者の年齢、状態、体重、性別及び食生活、感染症があればその重症度、投与時間、並びに他の臨床的要因を考慮して、主治医によって決定される。一般に、毎日の投薬量は、体重１キログラム当たり本発明の化合物０．０１〜１０００マイクログラム、好ましくは１キログラム当たり０．１〜１５０マイクログラムの範囲であるべきである。
【０１５９】
改変された治療用タンパク質を用いた疾患の治療
[00165]本発明は、様々な疾患の治療において使用することができる様々なトランスフェリン融合タンパク質を提供する。例えば、本発明の融合ポリペプチド又はペプチドを含む薬剤組成物は、それだけには限らないが、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、又は遊離脂肪酸若しくはグリセロールの高い血中レベル、高脂血症、肥満、Ｘ症候群、代謝異常症候群、炎症、糖尿病合併症、糖恒常性障害、耐糖能障害、ＩＩ型糖尿病、糖尿病前症、高トリグリセリド血症、アテローム性動脈硬化症、神経系障害、うっ血性心不全、消化不良及び過敏性腸症候群などの疾患を治療するのに使用することができる。改変されたポリペプチド及びペプチドは、ＣＮＳを活性化するため、又は手術後治療のためにＣＮＳに対する抗不安効果を誘導するのにも使用することができる。
【０１６０】
[00166]本発明の改変された治療用ポリペプチド及びペプチドは、トランスフェリン若しくは改変トランスフェリンに融合されており、又はＤＰＰ活性から部分的若しくは実質的に保護されているため、未改変の治療用ポリペプチド及びペプチドよりもｉｎ  ｖｉｖｏでより安定である。したがって、効果的な治療のために、より少量の分子を投与してよい。低投薬量では、場合によっては副作用が軽減され得る。
【０１６１】
[00167]一実施形態では、本発明の改変された治療用ポリペプチド及びペプチドを鎮静薬として使用してよい。したがって、本発明は、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドを用いた、中枢又は末梢の神経系の活動化増大をもたらす、異常を有する哺乳動物対象を鎮静させる方法を提供する。この方法は、対象に鎮静効果又は抗不安効果をもたらすのに十分な量の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを対象に投与するステップを含む。改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、脳室内に、経口的に、皮下に、筋肉内に又は静脈内に投与してよい。このような方法は、不安、運動障害、精神病、攻撃性、発作、パニック発作、ヒステリー及び睡眠障害などの神経系の状態を治療又は寛解させるのに有用である。
【０１６２】
[00168]さらに、本発明は、対象に活動化効果をもたらすのに十分な量の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドを対象に投与するステップを含む、哺乳動物対象の活動性を高める方法も包含する。この対象は、中枢又は末梢の神経系の活動化の低下をもたらす状態を有している。改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、中枢神経系の覚醒が有利となり得るいくつかの状態を挙げてみると、うつ病、分裂情動性障害、睡眠時無呼吸、集中力の乏しい注意欠陥障害、記憶力減退、健忘症及びナルコレプシーの治療又は改善に有用である。
【０１６３】
[00169]また、特定のタイプの手術、待期的腹部手術の後に起こるインスリン抵抗性は術後１日目に最も甚だしく、少なくとも５日間続き、かつ正常にするのに最長３週間を要することがある。したがって、術後の患者は、手術の外傷に続く一定期間、本発明の改変されたインスリン分泌促進ペプチドの投与を必要とし得る。したがって、本発明の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドは、手術後の治療のために利用することができる。患者は、手術が患者に実施される前の約１〜１６時間、患者の手術中、及び患者の手術後約５日以下の期間、本発明の改変されたインスリン分泌促進ペプチドを必要としている。
【０１６４】
[00170]さらに、インスリン分泌促進ペプチドなど本発明の改変された治療用ポリペプチド及びペプチドは、手術後治療における使用とは別に、インスリン抵抗性を治療するのに利用してもよい。インスリン抵抗性は、細胞表面受容体へのインスリンの結合の減少、又は細胞内代謝の変化に起因し得る。インスリン感受性の低下として特徴付けられる第１のタイプは、通常、インスリン濃度の上昇によって克服することができる。インスリン応答性の低下として特徴付けられる第２のタイプは、多量のインスリンによって克服することはできない。外傷に続いて起こるインスリン抵抗性は、インスリン抵抗性の程度に比例した用量のインスリンによって克服することができ、したがって、インスリン感受性の低下によって引き起こされるようである。
【０１６５】
[00171]好ましくは、本発明は、グルコース依存性、インスリン依存性、及びインスリン非依存性の機序を介して高血糖症を正常化するための改変されたインスリン分泌促進ペプチドを提供する。したがって、改変されたインスリン分泌促進ペプチドは、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の治療用の主要作用物質として有用である。本発明は、ペプチドの作用が血液のグルコース濃度に依存しており、したがって血糖降下の副作用のリスクが、現在の治療方法を用いた際のリスクより大幅に低減されているという点で、Ｉ型及びＩＩ型双方の糖尿病の患者の治療に特に適している。
【０１６６】
[00172]患者の血中グルコースレベルを正常化するのに効果的な改変されたインスリン分泌促進ペプチドの用量は、いくつかの要因に依存すると考えられ、例としては、それだけには限らないが、患者の性別、体重、及び年齢、血中グルコース調節不能の重症度、血中グルコース調節不能を引き起こしている原因、グルコース又は別の炭水化物供給源が同時に投与されるかどうか、投与経路及び生物学的利用能、体内での持続性、処方、並びに効力が挙げられる。
【０１６７】
[00173]好ましくは、インスリン分泌促進ペプチドなど本発明の改変された治療用ペプチドは、耐糖能障害、糖尿、高脂血症、代謝性酸性血症（ａｃｉｄｏｓｅｓ）、糖尿病、糖尿病性神経障害及び腎障害の治療用に使用される。より好ましくは、改変ペプチドは、ＩＩ型糖尿病の治療用の改変ＧＬＰ−１及びその類似体である。
【０１６８】
改変された治療用ポリペプチド及びペプチドの存在のモニタリング
[00174]改変された治療用ポリペプチド及びペプチドは、機能的活性を測定するためのアッセイ、ＨＰＬＣ−ＭＳ又はポリペプチド若しくはペプチドを標的とする抗体を用いて、モニターすることができる。例えば、改変された治療用ポリペプチド若しくはペプチドの活性及び／又は改変された治療用ポリペプチド若しくはペプチドの存在について、哺乳動物宿主の血液をモニターすることができる。様々な時点で宿主の血液の一部分又は試料を採取することによって、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドが、治療活性を有するのに十分な量で寿命の長い血液成分に結合されたかどうか、また、その後の血中の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドのレベルを測定することができる。望ましいならば、改変されたインスリン分泌促進ペプチドなど改変された治療用ポリペプチド又はペプチドがどの血液成分に結合しているかも測定することができる。
【０１６９】
[00175]例として、インスリン分泌促進活性に関するアッセイを、本発明の改変されたインスリン分泌促進ペプチドをモニターするのに使用してよい。本発明の改変されたインスリン分泌促進ペプチドは、未改変のインスリン分泌促進ペプチドのインスリン分泌促進活性に少なくとも等しいインスリン分泌促進活性を有する。改変されたインスリン分泌促進ペプチドのインスリン分泌促進特性は、改変ペプチドを動物細胞に与え、又はそのペプチドを動物に注射し、培地又はその動物の循環系中への免疫反応性インスリンの放出をそれぞれモニターすることによって測定することができる。免疫反応性インスリンの存在は、インスリンを特異的に検出することができるラジオイムノアッセイの使用によって検出される。ＩＲＩの存在を検出できる任意のラジオイムノアッセイを使用してよいが、その全体が参照により本明細書に組み入れられるＡｌｂａｎｏ，Ｊ．Ｄ．Ｍ．他、（１９７２年  Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７０：４８７〜５０９頁）のアッセイ法の改良法を用いることが好ましい。
【０１７０】
[00176]改変された治療用ポリペプチド又はペプチドのインスリン分泌促進特性はまた、膵臓灌流（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）によって測定することもできる（参照により本明細書に組み入れられるＰｅｎｈｏｓ，Ｊ．Ｃ．他  １９６９年  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １８：７３３〜７３８頁）。灌流を実施、改良、及び分析する様式は、参照により本明細書に組み入れられるＷｅｉｒ，Ｇ．Ｃ．他、（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔ．５４：１４０３〜１４１２頁（１９７４年）の方法に従う。
【０１７１】
[00177]当業者には周知であるように、質量分析法（ＭＳ）と連結されたＨＰＬＣを利用して、改変された治療用ポリペプチド及びペプチドの存在を解析することもできる。典型的には、０．１％ＴＦＡ／水や０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルなど２種の移動相が使用される。カラム温度、並びに勾配条件も変更することができる。
【０１７２】
[00178]改変された治療用ポリペプチド及びペプチドの存在をモニターするための別の方法は、それらの改変された治療用ポリペプチド及びペプチドに特異的な抗体を使用するものである。特定の改変された治療用ポリペプチド又はペプチドに対する特異性を有する、モノクローナル又はポリクローナルの抗体の使用は、このような問題を解決する助けとなり得る。抗体は、特定の改変された治療用ポリペプチド若しくはペプチドで、又はその作用物質の免疫原性断片若しくはその作用物質の抗原決定基に対応する合成免疫原で免疫された宿主から作製又は誘導することができる。好ましい抗体は、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドに対して高い特異性及び親和性を有すると考えられる。このような抗体は、酵素、蛍光色素、又は放射標識物質で標識することもできる。
【０１７３】
[00179]これらの抗体は、血流中の改変された治療用ポリペプチド及びペプチドの存在をモニターするために使用してもよい。血液及び／又は血清試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法によって解析してもよい。このような技術により、血液又は血清の解析をして、改変された治療用ポリペプチド又はペプチドの血液成分への結合を測定することが可能になる。
【０１７４】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）
[00180]組換えＤＮＡ技術を使用して、安定性及び生物活性の増大した新しい分子を作り出した。これらの分子は、免疫グロブリンのＦｃ部分、アルブミン、及びトランスフェリンなど天然に長い半減期を有する安定化タンパク質に融合された生物活性のあるタンパク質及びペプチドの組合せである。これらの融合分子は、融合されていない天然のタンパク質又はペプチド対応物よりはるかに長い薬物動態を有する活性部分の生物活性を保持している。薬物動態の上昇はまた、生物活性を改善し、望まれない副作用を低減させ、かつ患者に対する利便性を改善する。インターフェロン−アルブミン、インターフェロン−Ｆｃ、ＢＮＰ−アルブミン、ＧＬＰ−１−アルブミン、ＧＬＰ−１−トランスフェリンのようなこのような融合タンパク質の多くの例がある。
【０１７５】
[00181]融合タンパク質は安定かつ分解に対して抵抗性であるが、活性部分を分解する潜在的なプロテアーゼ機序が、分子の緩徐な不活性化をもたらし得る。具体的には、ＧＬＰ−１、ダイノルフィン（Ｂｅｒｍａｎ  ＹＬ、Ｊｕｌｉａｎｏ  Ｌ、Ｄｅｖｉ  ＬＡ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５年１０月６日；２７０：２３８４５〜５０頁）、エンケファリン（Ｇｕ  ＺＦ、Ｍｅｎｏｚｚｉ  Ｄ、Ｏｋａｍｏｔｏ  Ａ、Ｍａｔｏｎ  ＰＮ、Ｂｕｎｎｅｔｔ  ＮＷ  Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９３年１月；７８：３５〜４８頁）、ＢＮＰ、ＡＮＰ、アンギオテンシン、ブラジキニン、及びＰＹＹなどの多くのペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、中性エンドペプチダーゼなどのプロテアーゼに対して非常に感受性が高い。これらのプロテアーゼは、個別に又は組み合わせて、循環中のペプチドの急速な不活性化を引き起こす。アルブミン、Ｆｃ、及びトランスフェリンなどの大型タンパク質へのペプチドの融合は、プロテアーゼに対する著しい抵抗性を与える。しかし、プロテアーゼによる不活性化の影響を完全に排除することはできない。したがって、融合タンパク質及びプロテアーゼ阻害剤の組合せは、融合タンパク質単独よりも優れたＰＫ及びＰＤを有し得る。
【０１７６】
[00182]本発明は、プロテアーゼに抵抗性である治療用ペプチドを含むトランスフェリン融合タンパク質を提供する。好ましくは、本発明の改変された治療用ペプチドは、ＤＰＰ活性から部分的又は実質的に保護された、改変されたインスリン分泌促進ペプチドである。より好ましくは、改変されたインスリン分泌促進ペプチドは、改変ＧＬＰ−１ペプチド並びにその類似体及び断片である。改変ＧＬＰ−１ペプチド並びにその類似体及び断片は、糖尿病、具体的にはＩＩ型糖尿病を治療するのに有用である。野生型ＧＬＰ−１のＮ末端配列は、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕである。本発明の改変ＧＬＰ−１ポリペプチドは、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（配列番号１１５）、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（配列番号１１６）、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（配列番号８２）、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号８３）、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（配列番号８４）、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（配列番号８５）、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号８６）、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（配列番号；８７）、Ｈｉｓ−Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、及びＨｉｓ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）からなる群から選択されるＮ末端配列を含み得る。後述するように、プロテアーゼ分解を低減及び防止するために他の改変を行ってもよく、これらの分子を本発明の方法及び組成物において使用してもよい。さらに、任意のＧＬＰ−１部分又はＧＬＰ−１類似体、誘導体、若しくは模倣体を（融合タンパク質として）本発明の方法及び組成物において使用してもよい。
【０１７７】
[00183]ＧＬＰ−１のＮ末端に１つのアミノ酸を付加することにより、立体的な妨害が寄与して、ジペプチジルペプチダーゼがＧＬＰ−１の２番目のアミノ酸を切断するのを防止することができる。したがって、ＧＬＰ−１は機能的に活性なままであると考えられる。２０種のアミノ酸又は非天然アミノ酸のうちいずれか１つをＧＬＰ−１のＮ末端に付加してよい。ヒスチジンも、好ましいアミノ酸である。いくつかの場合では、非荷電又は正荷電アミノ酸を使用してよく、好ましくはグリシンなどより小型のアミノ酸が付加される。次いで、余分なアミノ酸を有する改変ＧＬＰ−１をトランスフェリンに融合させて、融合タンパク質を作製することができる。一実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、そのアミノ末端に少なくとも１つの付加的なアミノ酸を含むように改変される。別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、そのアミノ末端に少なくとも５つの付加的なアミノ酸を含むように改変される。あるいは、ＧＬＰ−１ペプチドは、そのアミノ末端に１〜５つの付加的なアミノ酸を含むように改変される。
【０１７８】
[00184]グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、いわゆる腸膵系（ｅｎｔｅｒｏｉｎｓｕｌａｒ  ａｘｉｓ）に属する、インスリン分泌を調節する胃腸管ホルモンである。腸膵系は、インスリンの早期かつ増強された放出を促進する、腸における栄養素の存在及び吸収に応答して胃腸管粘膜から放出されるホルモンの１群を指す。インスリン分泌に対する促進効果であるインクレチン効果は、正常な耐糖能のためにおそらく不可欠である。ＧＬＰ−１は、インクレチン効果を担っているため、生理的に重要なインスリン分泌促進ホルモンである。
【０１７９】
[00185]ＧＬＰ−１は、プログルカゴン遺伝子（Ｂｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９８３年、３０４；３６８〜３７１頁）の産生物である。これは、２種の最も主要な分子形態、すなわちＧＬＰ−１（７−３６）アミド及びＧＬＰ−１（７−３７）として、腸の内分泌細胞において合成される。このペプチドは、１９８０年代初期に、プログルカゴンのｃＤＮＡ及び遺伝子のクローニングに続いて最初に同定された。
【０１８０】
[00186]完全長ペプチドＧＬＰ−１（１−３７及び１−３６アミド）に対して実施され初期の研究により、大型のＧＬＰ−１分子は生物活性を欠いていることが結論づけられた。１９８７年に、３つの別個の研究グループが、最初の６つのアミノ酸を除去すると、生物活性の向上したＧＬＰ−１分子が生じることを実証した。
【０１８１】
[00187]ＧＬＰ−１のアミノ酸配列は、Ｓｃｈｍｉｄｔ他（１９８５年  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２８  ７０４〜７０７頁）によって開示されている。ヒトＧＬＰ−１は、回腸遠位部中のＬ細胞、膵臓中及び脳中において合成されるプレプログルカゴンに由来する３７アミノ酸残基のペプチドである。プレプログルカゴンのＧＬＰ−１（７−３６）アミド、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−２へのプロセシングは、主にＬ細胞において起こる。ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列は、配列番号３２（Ｘ＝Ｇｌｙ）、すなわち、
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙである。
ＧＬＰ−１（７−３６）アミドでは、末端のＧｌｙがＮＨ２に置き換えられている。
【０１８２】
[00188]ＧＬＰ−１様分子は、ＩＩ型（非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ））、かついくつかの場合にはさらにＩ型糖尿病に罹患しているヒト対象において抗糖尿病活性を有する。ＧＬＰ−１を用いた治療は、高いグルコースレベルでのみ、インスリン分泌及び生合成の増大、グルカゴン分泌の低減、胃内容排出の遅延などの活性を導き出し、したがって、インスリン又はスルホニル尿素より潜在的にはるかに安全な療法を提供する。患者の食後グルコースレベルは、適切なＧＬＰ−１療法を用いて正常レベルに近づけることができる。ＧＬＰ−１様分子がＩＩ型患者の膵臓β細胞機能を保護し、かつさらには修復する能力を有することを示唆する報告もある。
【０１８３】
[00189]ＧＬＰ−１（７−３４）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）及びＧＬＰ−１（７−３７）を含めて、そのアミノ末端に１つ又は複数のアミノ酸を付加することによって、任意のＧＬＰ−１配列を改変することができる。ＧＬＰ−１はまた、胃腸管に対して強力な作用を有する。生理的な量で注入されると、ＧＬＰ−１は、ペンタガストリンに誘導された胃酸分泌並びに食事に誘導された胃酸分泌を強力に阻害する（Ｓｃｈｊｏｌｄａｇｅｒ他、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．１９８９年、３５：７０３〜７０８頁；Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎ他、ＤｉｇＤｉｓ  Ｓｃｉ  １９９３年；３８：６６５〜６７３頁）。これはまた、胃内容排出速度及び膵臓酵素分泌を抑制する（Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎ他、Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  １９９３年；３８：６６５〜６７３頁）。炭水化物また脂質を含む溶液で回腸を灌流すると、胃及び膵臓の分泌及び運動性に対する同様の抑制効果をヒトにおいて誘導することができる（Ｌａｙｅｒ他、Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  １９９５年、４０：１０７４〜１０８２頁；Ｌａｙｅｒ他、Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  １９９３年、５４：３８５〜３８頁）。付随して、ＧＬＰ−１分泌が大いに刺激され、ＧＬＰ−１がこのいわゆる「回腸ブレーキ（ｉｌｅａｌ−ｂｒａｋｅ）」に少なくともある程度関与している可能性があることが推測された（Ｌａｙｅｒ他、Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  １９９３年、５４：３８５〜３８頁）。実際に、最近の研究では、生理学的に、ＧＬＰ−１の回腸ブレーキ効果は、膵島に対するその効果よりずっと重要である可能性があることが示唆されている。したがって、用量反応研究では、ＧＬＰ−１は、膵島分泌に影響するのに必要とされる速度と少なくとも同じくらい遅い注入速度で胃内容排出速度に影響を与える（Ｎａｕｃｋ他、Ｇｕｔ  １９９５年；３７（補遺２）：Ａ１２４頁）。
【０１８４】
[00190]ＧＬＰ−１は、食品摂取に対する影響を有するようである。ＧＬＰ−１の脳室内投与は、ラットにおいて食品摂取を著しく抑制する（Ｓｃｈｉｃｋ他、Ｄｉｔｓｃｈｕｎｅｉｔ他編、Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ＆Ｃｏｍｐａｎｙ  ｌｔｄ、１９９４年；３６３〜３６７頁；Ｔｕｒｔｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６年、３７９：６９〜７２頁）。この効果は極めて特異的であるようである。したがって、Ｎ末端を伸長されたＧＬＰ−１（１−３６アミド）は不活性であり、適切な用量のＧＬＰ−１アンタゴニストであるエキセンディン９−３９は、ＧＬＰ−１の効果を無効にする（Ｔａｎｇ−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９６年、２７１（４Ｐｔ２）：Ｒ８４８〜５６）。ＧＬＰ−１の急速な（Ａｃｕｔｅ）末梢投与はラットにおいて急速に（ａｃｕｔｅｌｙ）食品摂取を抑制しない（Ｔａｎｇ−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９６年、２７１（４Ｐｔ２）：Ｒ８４８〜５６；Ｔｕｒｔｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６年、３７９：６９〜７２頁）。しかし、腸のＬ細胞から分泌されるＧＬＰ−１が満腹シグナルとしても作用し得る可能性も依然としてある。
【０１８５】
[00191]糖尿病患者において、ＧＬＰ−１のインスリン分泌促進効果及び胃腸管に対するＧＬＰ−１の影響は維持されており（Ｗｉｌｌｍｓ他、Ｄｉａｂｅｔｅｌｏｇｉａ  １９９４年；３７、補遺１：Ａ１１８）、これは、食事に誘導されたグルコース量の逸脱を縮小するのに寄与し得るが、より重要なことには、食品摂取にも影響を及ぼし得る。ＧＬＰ−１を４ｎｇ／ｋｇ／分で１週間継続的に静脈内投与すると、顕著な副作用を伴わずに、ＮＩＤＤＭ患者における血糖コントロールを劇的に改善することが実証された（Ｌａｒｓｅｎ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９６年；４５、補遺２：２３３Ａ）。
【０１８６】
[00192]ＤＰＰ活性から部分的又は実質的に保護された改変ＧＬＰ−１及び改変ＧＬＰ−１類似体は、１型及び２型糖尿病並びに肥満の治療において有用である。
【０１８７】
[00193]本明細書において使用される場合、「ＧＬＰ−１分子」という用語は、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体、又はＧＬＰ−１誘導体を意味する。
【０１８８】
[00194]本明細書において使用される場合、「ＧＬＰ−１類似体」という用語は、ＧＬＰ−１と比べて１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、逆位、又は付加を有する分子として定義される。多くのＧＬＰ−１類似体が当技術分野において公知であり、例えば、ＧＬＰ−１（７−３４）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｇｌｎ９−ＧＬＰ１（７−３７）、Ｄ−Ｇｌｎ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｔｈｒ１６-Ｌｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、及びＬｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号７２）が挙げられる。米国特許第５１１８６６６号では、ＧＬＰ−１（７−３４）やＧＬＰ−１（７−３５）などＧＬＰ−１類似体の例を開示している。
【０１８９】
[00195]「ＧＬＰ−１誘導体」という用語は、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１類似体のアミノ酸配列を有するが、そのアミノ酸側鎖、α−炭素原子、末端アミノ基又は末端カルボン酸基の１つ又は複数の化学的改変をさらに有する分子として定義される。化学的改変としては、それだけには限らないが、化学的部分の付加、新しい結合の作製及び化学的部分の除去が挙げられる。
【０１９０】
[00196]本明細書において使用される場合、「ＧＬＰ−１に関連した化合物」という用語は、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体又はＧＬＰ−１誘導体の定義の範囲に入る任意の化合物を意味する。
【０１９１】
[00197]国際公開第９１／１１４５７号パンフレットでは、ＧＬＰ−１部分としても有用となり得る、活性なＧＬＰ−１ペプチド７−３４、７−３５、７−３６及び７−３７の類似体を開示している。
【０１９２】
[00198]ＥＰ０７０８１７９−Ａ２（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．）では、Ｎ末端のイミダゾール基及び場合によっては３４位のリシン残基に結合された非分枝状Ｃ６〜Ｃ１０アシル基を含む、ＧＬＰ−１類似体及び誘導体を開示している。
【０１９３】
[00199]ＥＰ０６９９６８６−Ａ２（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．）では、生物活性を有することが報告されている、いくつかのＧＬＰ−１のＮ末端切断型断片を開示している。
【０１９４】
[00200]米国特許第５５４５６１８号では、以下からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有する、本質的にＧＬＰ−１（７−３４）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）、若しくはＧＬＰ−１（７−３７）からなるＧＬＰ−１分子、又はそのアミド型、及び薬剤として許容されるその塩を開示している：（ａ）２６位及び／若しくは３４位のリシンをグリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、アルギニン、若しくはＤ−リシンで置換；又は３６位のアルギニンをグリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、リシン、若しくはＤ−アルギニンで置換（配列番号７３）；（ｂ）３１位のトリプトファンを酸化抵抗性のアミノ酸で置換（配列番号７４）；（ｃ）１６位のバリンをチロシンで置換；１８位のセリンをリシンで置換；２１位のグルタミン酸をアスパラギン酸で置換；２２位のグリシンをセリンで置換；２３位のグルタミンをアルギニンで置換；２４位のアラニンをアルギニンで置換；及び２６位のリシンをグルタミンで置換、のうちの少なくとも１つの置換（配列番号７５）；並びに（ｄ）８位のアラニンをグリシン、セリン、若しくはシステインで置換；９位のグルタミン酸をアスパラギン酸、グリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、若しくはフェニルアラニンで置換；１０位のグリシンをセリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、若しくはフェニルアラニンで置換；並びに１５位のアスパラギン酸をグルタミン酸で置換、のうちの少なくとも１つの置換（配列番号７６）；並びに（ｅ）７位のヒスチジンをグリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、若しくはフェニルアラニン、あるいはヒスチジンのＤ−若しくはＮ−アシル化型又はアルキル化型で置換（配列番号７７）；この際、（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）の置換において、置換されるアミノ酸は場合によってはＤ型でよく、かつ７位で置換されるアミノ酸は場合によってはＮアシル化型又はＮアルキル化型でよい。
【０１９５】
[00201]米国特許第５１１８６６６号では、インスリン分泌促進活性を有するＧＬＰ−１分子を開示している。このような分子は、アミノ酸配列Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＧＬＰ−１、７−３４、配列番号３２を参照されたい）又はＨｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（ＧＬＰ−１、７−３５、配列番号３２を参照されたい）を有するペプチド、及び前記ペプチドの誘導体からなる群から選択され、ここで、前記ペプチドは、前記ペプチドの薬剤として許容される酸付加塩；前記ペプチドの薬剤として許容されるカルボン酸塩；前記ペプチドの薬剤として許容される低級アルキルエステル；並びにアミド、低級アルキルアミド及び低級ジアルキルアミドからなる群から選択される、前記ペプチドの薬剤として許容されるアミドからなる群から選択される。
【０１９６】
[00202]米国特許第６２７７８１９号では、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体、及びＧＬＰ−１誘導体を患者に投与するステップを含む、心筋梗塞後の死亡率及び罹患率を減少させる方法を教示している。以下の構造式（配列番号＊＊）：Ｒ１−Ｘ１−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａ１ａ−Ａ１ａ−Ｌｙｓ−Ｘ３−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｒ２（配列番号７８）［式中、Ｒ１はＬ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジンからなる群から選択され；Ｘ１はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、及びα−メチル−Ａｌａからなる群から選択され；Ｘ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ及びＧｌｙからなる群から選択され；Ｘ３はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ及びＧｌｙからなる群から選択され；Ｒ２はＮＨ２及びＧｌｙ−ＯＨからなる群から選択される。ただし、ＧＬＰ−１類似体は、約６．０〜約９．０の範囲に等電点を有し、さらに、Ｒ１がＨｉｓであり、Ｘ１がＡｌａであり、Ｘ２がＧｌｕであり、Ｘ３がＧｌｕである場合、Ｒ２はＮＨ２でなければならない。］で表されるＧＬＰ−１類似体及び薬剤として許容されるその塩。
【０１９７】
[00203]Ｒｉｔｚｅｌ他（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９９８年、１５９：９３〜１０２頁）は、Ｎ末端から２番目のアラニンがセリンに置き換えられているＧＬＰ−１類似体の［Ｓｅｒ８］ＧＬＰ−１を開示している。この改変によってペプチドのインスリン分泌促進作用は弱まらなかったが、ＧＬＰ−１と比べて高い血漿安定性を有する類似体が生成された。
【０１９８】
[00204]米国特許第６４２９１９７号では、急性脳卒中又は出血後のＧＬＰ−１治療、好ましくは静脈内投与が、インスリン分泌を最適化し、脳の同化作用を増大させ、グルカゴンを抑制することによってインスリン有効性を高め、かつ重度の低血糖のリスクも他の有害な副作用も伴わずに正常血糖又は軽度の低血糖を維持するための手段を実現するため、理想的な治療となり得ることを教示している。本発明は、急性脳卒中又は出血後に、インスリン分泌を最適化し、グルカゴン拮抗作用を抑制することによってインスリン有効性を高め、かつ重度の低血糖のリスクを伴わずに正常血糖又は軽度の低血糖を維持するために、ＧＬＰ−１又は生物活性を有するその類似体で虚血性又は再灌流された脳を治療する方法を提供する。
【０１９９】
[00205]米国特許第６２７７８１９号では、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１誘導体及び薬剤として許容されるその塩からなる群から選択される化合物を、血中グルコースを正常化するのに効果的な用量で、必要とする患者に投与するステップを含む、心筋梗塞後の死亡率及び罹患率を減少させる方法を提供している。
【０２００】
[00206]米国特許第６１９１１０２号では、少なくとも４週間である、重量減少をもたらすのに効果的な期間、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド類似体（ＧＬＰ−１類似体）、グルカゴン様ペプチド誘導体（ＧＬＰ−１誘導体）又は薬剤として許容されるその塩を含む組成物を、体重の減少を引き起こすのに十分な用量で体重減少を必要とする対象に投与することによって、その対象の体重を減少させる方法を開示している。
【０２０１】
[00207]ＧＬＰ−１は、皮下投与後は十分に活性を有するが（Ｒｉｔｚｅｌ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １９９５年；３８：７２０〜７２５頁）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ様酵素による分解が主な原因で急速に分解される（Ｄｅａｃｏｎ他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １９９５年、８０；９５２〜９５７頁；Ｄｅａｃｏｎ他、１９９５年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４４：１１２６〜１１３１頁）。したがって、残念ながら、ＧＬＰ−１及びその類似体の多くのヒトにおける血漿半減期は短い（Ｏｒｓｋｏｖ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９３年；４２；６５８〜６６１頁）。したがって、ＧＬＰ−１（７−３７）に比べて長い作用プロファイルを有する、改変ＧＬＰ−１又はその類似体を提供することが本発明の目的である。ＧＬＰ−１（７−３７）より低いクリアランスを有するＧＬＰ−１及びその類似体の誘導体を提供することが本発明のさらなる目的である。さらに、改善された安定性を有する、改変されたＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１類似体を含む薬剤組成物を提供することも本発明の目的である。さらに、本発明は、それだけには限らないが、前述したものなどＧＬＰ−１に関連した疾患を治療するための、改変されたＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１類似体の使用も含む。
【０２０２】
[00208]本発明の一態様では、改変されたＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１類似体を含む薬剤組成物は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９８５年で記載されているような薬剤組成物を調製する確立された方法のうちのいずれかによって調製され得る。組成物は、全身的な注射又は輸注に適した形態でよく、したがって、滅菌水や等張性の生理食塩水若しくはグルコース溶液など適切な液体ビヒクルと共に調製してよい。これらの組成物は、当技術分野において周知の従来の滅菌技術によって滅菌してよい。結果として得られる水性液剤は使用するために容器に入れても、又は無菌条件下でろ過し、かつ凍結乾燥してもよく、凍結乾燥された調製物は投与の前に無菌の水溶液と混合される。組成物は、生理的条件に近づけるために、緩衝剤、等張化剤、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどのような製薬上許容される補助物質を必要に応じて含んでよい。
【０２０３】
[00209]本発明の改変されたＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１類似体は、経鼻、経皮、経肺又は直腸投与用に適合させてもよい。組成物中で使用される製薬上許容される担体又は希釈剤は、任意の従来の固形担体でよい。固形担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸である。同様に、担体又は希釈剤は、単独又はワックスと混合したモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなど、当技術分野において公知の任意の徐放物質を含んでもよい。
【０２０４】
[00210]徐放製剤の形態で本発明の組成物を提供することは、特に有利となり得る。したがって、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、若しくは乳酸／グリコール酸コポリマーなど製薬上許容される適切な生分解性ポリマーによってカプセル化された、又はそれらに分散された、改変されたＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１類似体を含むマイクロカプセル又は微粒子として組成物を調製してもよい。
【０２０５】
[00211]経鼻投与の場合、調製物は、エアロゾル適用のための液状担体、特に水性担体中に溶解又は懸濁された、改変されたＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１類似体を含んでよい。担体は、可溶化剤、例えばプロピレングリコール、表面活性剤、レシチン（ホスファチジルコリン）やシクロデキストリンなどの吸収促進物質又はパラベンなどの保存剤などの添加剤を含んでよい。
【０２０６】
[00212]一般に、本発明の改変されたポリペプチド又はペプチドは、単位投薬量当たりの製薬上許容される担体と共に、単位剤形で投薬される。
【０２０７】
[00213]さらに、本発明は、それだけには限らないが前述したもののような高いグルコースレベルを伴う疾患（代謝疾患）の治療において使用することができる医薬製品の製造のための、改変されたＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１類似体の使用も企図する。具体的には、本発明は、ＩＩ型糖尿病を含む糖尿病、肥満、重度の熱傷、並びにうっ血性心不全を含む心不全及び急性冠症候群の治療のための、改変されたＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１類似体の使用を企図する。
【０２０８】
[00214]本発明はまた、ＤＰＰ活性から部分的及び実質的に保護された、改変されたエキセンディン−３及びエキセンディン−４ペプチドも提供する。エキセンディン−３及びエキセンディン−４は、３９個のアミノ酸（２番目及び３番目の残基が異なる）を含むインスリン分泌促進ペプチドであり、ＧＬＰ−１に対して約５３％の相同性を有する。エキセンディン−３配列は、ＨＳＤＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号７９）であり、エキセンディン−４配列は、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８０）である。本発明はまた、エキセンディン−４（１−３１）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＹ（配列番号８１）などのアミノ酸配列を含む、改変されたエキセンディン−４断片も包含する。さらに、本発明は、エキセンディン−３及びエキセンディン−４ペプチドの改変類似体も含む。
【０２０９】
糖尿病、糖尿病前症、又は肥満を治療するための改変ＧＬＰ−１融合タンパク質又はコンジュゲート
[00215]改変ＧＬＰ−１は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの全般的な安定性を上昇させるために異種分子に融合してよい。改変ＧＬＰ−１は、組換え手段によって異種分子に融合させ、又は当技術分野において周知の方法によって異種分子に共有結合させることができる。改変ＧＬＰ−１は、例えば、血清アルブミンやトランスフェリンなどの血漿タンパク質、免疫グロブリン又はＦｃドメインなどその一部分に、融合又は共有結合させることができる。より好ましくは、改変されたポリペプチド又はペプチドは、トランスフェリン、ラクトトランスフェリン又はメラノトランスフェリンに融合される。このような融合タンパク質を作製するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第１０／３７８，０９４号によって提供される。
【０２１０】
[00216]より大きな物理的距離を提供し、かつそれらの融合タンパク質間により大きな空間的可動性を与え、それによって、例えばその同族受容体に結合するための治療用タンパク質の接近容易性を最大化するために、変動可能な長さのリンカーを介してＧＬＰ−１分子を異種タンパク質に結合させてよい。リンカーペプチドは、可撓性又はより硬いアミノ酸からなり得る。例えば、ポリグリシンストレッチのようなリンカーを使用してよい。リンカーは、約５０個、４０個、３０個、２０個、１０個又は５個未満のアミノ酸残基でよい。リンカーは、異種タンパク質及びＧＬＰ−１に、かつその間に共有結合的に連結され得る。好ましくは、リンカーは、１つのＳｅｒ残基、２つのＳｅｒ残基、ペプチドＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、ペプチドＰＥＡＰＴＤ、ペプチド（ＰＥＡＰＴＤ）２、ＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせたペプチドＰＥＡＰＴＴ、及びＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせたペプチド（ＰＥＡＰＴＤ）２でよい。これらのリンカーを使用して、ＧＬＰ−１をトランスフェリンに連結してよい。
【０２１１】
[00217]改変されたポリペプチド又はペプチドに結合されるトランスフェリンを改変してもよい。これは、グリコシル化の低減を示し得る。改変されたトランスフェリンポリペプチドは、単一のトランスフェリンＮドメイン、単一のトランスフェリンＣドメイン、トランスフェリンのＮ及びＣドメイン、２つのトランスフェリンＮドメイン、並びに２つのトランスフェリンＣドメインからなる群から選択することができる。
【０２１２】
[00218]前述したように、ＧＬＰ−１は、体内の重要な内分泌ホルモン系を活性化及び調節し、かつグルコースの代謝において極めて重要な管理的役割を果たしている。市場に出ている他のすべての糖尿病治療とは異なり、ＧＬＰ−１は、β細胞の増殖因子として作用してそれによって膵臓のインスリン分泌能力を改善することにより回復を推進する潜在能力、及び、感受性を改善してグルコースレベルをより安定にさせることによってより効率的に既存のインスリンレベルが作用するようにさせる潜在能力も有する。これにより、グルコースレベルを毎日モニターする負担が軽減され、かつ糖尿病に起因する血中グルコースの変動によって引き起こされる重篤な長期の副作用が潜在的に遅延される。さらに、ＧＬＰ−１は、食欲を減退させ、かつ体重を減少させることができる。肥満は、グルコース代謝の不十分な制御に特有の転帰であり、これは糖尿病の病態を悪化させる働きをするに過ぎない。
【０２１３】
[00219]、天然ＧＬＰ−１は血液循環中で急速に分解されるため（半減期は数分である）、その臨床応用は限られている。血液循環中で治療的レベルを維持するには、ポンプ又は貼付器具を用いて高用量を恒常的に投与することを要し、これは治療コストを増加させる。これは、特に、糖尿病を治療し、かつグルコースレベルをモニターするための他のすべての薬物療法と併用した長期連用には不都合である。改変ＧＬＰ−１融合タンパク質は、ＧＬＰ−１の活性を保持しているが、トランスフェリンの長い半減期（１４〜１７日）、溶解性及び体内分布特性を有している。これらの諸特性により、低コスト、小体積、月１回のｓ．ｃ．（皮下）注射が実現され得、このタイプの製品は、長期連用のために間違いなく必要とされている。
【０２１４】
[00220]改変ＧＬＰ−１は、その安定性を高めるために、血液成分に共有結合されてもよい。例えば、改変ＧＬＰ−１は、血清アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリン又は免疫グロブリンのＦｃ部分に共有結合させることができる。一実施形態では、改変ＧＬＰ−１は、脂肪酸又は脂肪酸誘導体に結合され得る。別の実施形態では、改変ＧＬＰ−１は、薬物親和性複合体（ＤＡＣ）に作り変えられ得る。先に考察したように、Ｋｉｍ他（２００３年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ５２（３）：７５１頁）は、ＧＬＰ−１−アルブミン薬物親和性複合体を開示している。Ｋｉｍ他は、アルブミンを結合されたＤＡＣ：ＧＬＰ−１が天然のＧＬＰ−１を擬態すること示している。Ｋｉｍ他は、ＧＬＰ−１Ｒシグナル伝達をより長い時間活性化するための新しい手法を提供している。
【０２１５】
[00221]皮下投与すると、ＤＡＣ：改変ＧＬＰ−１は、ｉｎ  ｖｉｖｏでアルブミンに急速かつ選択的に結合する。形成されたバイオコンジュゲートは、内因性のＧＬＰ−１と同じ治療活性及び同様の効力を有するが、アルブミンにより近い薬物動態プロファイルを有する。
【０２１６】
他の治療用物質と組み合わせた、改変ＧＬＰ−１及びその融合タンパク質
[00222]本発明の一態様では、本発明の改変ＧＬＰ−１ペプチド及びその融合タンパク質、例えばＧＬＰ−１−Ｔｆ融合タンパク質は、ＩＩ型糖尿病、肥満及び異常なグルコースレベルを伴う他の疾患又は状態を治療するために、「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）」（塩酸メトホルミン錠剤）や「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）ＸＲ」（塩酸メトホルミン徐放錠剤）など少なくとも１種の第２の治療用分子と組み合わせて使用される。
【０２１７】
[00223]「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）」及び「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）ＸＲ」は、ＩＩ型糖尿病の処置用の経口抗高血糖薬である。「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）ＸＲ」は、Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅの徐放製剤である。したがって、「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）ＸＲ」は、剤形から薬物が緩徐に放出されるため、１日１回服用してよい。「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）」は、身体による肝臓からのグルコース産生量を減らすのに寄与する。したがって、「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）」は、患者の血糖値レベルを制御するのに有効である。「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）」は、身体によるより多くのインスリン産生を引き起こさないため、低血中グルコース（低血糖）を引き起こすことはめったにない。
【０２１８】
[00224]「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）」はまた、ＩＩ型糖尿病に罹患している人々においてしばしば高い、脂肪性の血液成分であるトリグリセリド及びコレステロールを低下させるのにも寄与する。メトホルミンは、食欲を減退させ、人々がその医薬品を摂取し始めた場合には、数ポンドの減量に寄与することが示された。
【０２１９】
[00225]メトホルミンは、スルホニル尿素との併用治療、若しくはインスリンとの併用治療、又は単独療法としての（それだけによる）治療用に承認された。メトホルミンは、インスリン抵抗性患者の高血圧（国際公開第９１１２００３号パンフレット−Ｕｐｊｏｈｎ社）、（ｔ−ＰＡ−誘導体と組み合わせて）凝血塊を溶解するため（国際公開第９１０８７６３号パンフレット、国際公開第９１０８７６６号パンフレット、国際公開第９１０８７６７号パンフレット、及び国際公開第９１０８７６５号パンフレット−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）、虚血及び組織無酸素（ＥＰ２８３３６９−Ｌｉｐｈａ社）、アテローム性動脈硬化症（ＤＥ１９３６２７４−Ｂｒｕｎｎｅｎｇｒａｂｅｒ＆Ｃｏ．社、ＤＥ２３５７８７５−Ｈｕｒｋａ、及び米国特許第４２０５０８７号−ＩＣＩ社）など様々な心血管疾患を治療する際に使用することが提案された。さらに、冠血管拡張薬として、かつ血圧を低下させるために、プロスタグランジンに類似したシクロペンタン誘導体と組み合わせてメトホルミンを使用することも提案された（米国特許第４１８２７７２号−Ｈｏｅｃｈｓｔ社）。メトホルミンはまた、２−ヒドロキシ−３，３，３−トリフルオロプロピオン酸誘導体（米国特許第４１０７３２９号−ＩＣＩ社）、１，２−ジアリールエチレン誘導体（米国特許第４０６１７７２号−Ｈｏｅｃｈｓｔ社）、置換されたアリールオキシ−３，３，３-トリフルオロ−２−プロピオン酸、エステル及び塩（米国特許第４０５５５９５号−ＩＣＩ社）、置換されたヒドロキシフェニル−ピペリドン（米国特許第４０２４２６７号−Ｈｏｅｃｈｓｔ社）、並びに部分水素化１Ｈ−インデノ−［１，２Ｂ］−ピリジン誘導体（米国特許第３９８０６５６号−Ｈｏｅｃｈｓｔ社）と組み合わせて使用してコレステロールを低下させるのに使用することも提案された。
【０２２０】
[00226]Ｍｏｎｔａｎａｒｉ他（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２５巻、第１号１９９２年）は、５００ｍｇの量のメトホルミンを１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）使用すると、メトホルミン８５０ｍｇを１日３回（ｔ．ｉ．ｄ．）に類似した様式で虚血後の血流量を増加させたことを開示している。Ｓｉｒｔｏｒｉ他（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓ．Ｐｈａｒｍ．、６：９１４〜９２３頁、１９８４年）は、８５０ｍｇの量のメトホルミンを１日３回（ｔ．ｉ．ｄ．）使用すると、末梢血管疾患を有する患者の動脈流量を増加させたことを開示している。
【０２２１】
[00227]本発明は、本発明の改変ＧＬＰ−１又はその融合タンパク質をメトホルミンなど１種又は複数種の治療用物質と組み合わせて含む、様々な疾患の治療を提供する。一実施形態では、メトホルミンと組み合わせた改変ＧＬＰ−１又はその融合タンパク質は、糖尿病など異常な血中グルコースレベルを伴う疾患及び状態を治療するのに使用される。好ましくは、メトホルミンと組み合わせたＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質は、ＩＩ型糖尿病又は肥満を治療するのに使用される。
【０２２２】
[00228]本発明の改変ＧＬＰ−１及びその融合タンパク質と組み合わせて使用することができる他の治療用物質としては、それだけには限らないが、スルホニル尿素及びスルホニル尿素様の物質、チアゾリジンジオン、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）γ調節物質、ＰＰＡＲα調節物質、プロテインチロシンホスファターゼ−１Ｂ阻害剤、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性化因子、１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、グルコキナーゼ活性化因子、β−３アドレナリン作動薬、及びグルカゴン受容体アゴニストが挙げられる。
【０２２３】
ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤
[00229]ＤＰＰ−ＩＶの阻害剤は、ＤＰＰ−ＩＶによって媒介される様々な状態を処置する際に有望であることが示された。例えば、ＤＰＰ−ＩＶの阻害剤は、耐糖能異常の治療において、かつＩＩ型糖尿病や肥満など高血糖を伴う疾患において非常に有望なアプローチである。さらに、ＤＰＰ−ＩＶは、移植拒絶反応などの免疫応答においてある役割を果たしていることが示された（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９７年、６３（１０）：１４９５〜１５００頁）。したがって、ＤＰＰ−ＩＶは、移植拒絶反応を予防するのにも有用となり得る。また、ＤＰＰ−ＩＶの阻害剤は、肺の内皮ＤＰＰ−ＩＶが癌性細胞のフィブロネクチンに結合することによりそれらの細胞の転移が促進されるため、癌の治療及び癌転移の防止においても有用となり得る（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８年、２７３（３７）：２４２０７〜２４２１５頁）。ＤＰＰ−ＩＶは、同様に、歯周炎の病因において重要な役割を果たし（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２０００年、６８（２）、７１６〜７２４頁）、かつＧＬＰ−２、すなわち広範囲切除後の腸の復元を促進する因子の不活性化を司っていると考えられている。したがって、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、腸の復元においても有用な可能性がある。
【０２２４】
[00230]国際公開第９５／１５３０９号パンフレットでは、ＤＰＰ−ＩＶの阻害剤であり、したがっていくつかのＤＰＰ−ＩＶに媒介されたプロセスを処置するのに有用であるいくつかのペプチド誘導体を開示している。国際公開第９５／１３０６９号パンフレットでは、天然又は内因性の成長ホルモンの放出を刺激するのに有用であるいくつかの環状アミン化合物を開示している。欧州特許第５５５８２４号では、トロンビン時間を延長し、かつトロンビン及びセリンに関連したプロテアーゼを阻害するいくつかのベンゾイミダゾリル化合物を開示している。Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、第３２３巻、第１号、１４８〜１５４頁（１９９５年）では、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤として有用であるいくつかのアミノアシルピロリジン−２−ニトリルを開示している。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６６巻、２１０５〜２１１２頁（１９９６年）では、プロリルオリゴペプチダーゼを阻害するのに有用であるいくつかのＦｍｏｃ−アミノアシルピロリジン−２−ニトリルを開示している。Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ、第５０巻、第７号、１８２７〜１８３０頁（１９７７年）では、アミノヘキサペプチド、すなわちＺ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ｌｍＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ、及びそれに関連したアミノペプチドの合成を開示している。さらに、前記化合物の抗菌特性を検査した。国際公開第９０／１２００５号パンフレットでは、プロリルエンドペプチダーゼ活性を阻害し、したがって認知症又は健忘症を治療するのに有用であるいくつかのアミノ酸化合物を開示している。Ｄｅｒｗｅｎｔ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ９５：３０２５４８頁では、コリンエステラーゼ活性の低下に起因する状態を処置するのに有用な高い末梢選択性を有するコリンエステラーゼ活性化因子である、いくつかのＮ−（アリール（アルキル）カルボニル）置換された複素環系化合物を開示している。Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ８４：１７７６８９頁では、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を示すプロリン化合物の中間体として有用であるいくつかの１−アシル−ピロリジン−２−カルボニトリル化合物を開示している。Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ９６：１１６３５３頁では、様々な癌腫又は骨髄性白血病を治療するのに有用なＲａｓファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤であるいくつかの３−アミノ−２メルカプト−プロピル−プロリン化合物を開示している。国際公開第９５／３４５３８号パンフレットでは、ＤＰＰ−ＩＶを阻害し、したがって、ＤＰＰ−ＩＶ阻害によって寛解される状態を処置するのに有用である、いくつかのピロリジド、ホスホナート、アゼチジン、ペプチド及びアザプロリンを開示している。国際公開第９５／２９１９０号パンフレットでは、酵素ＤＰＰ−ＩＶに対する複数の提示を可能にし、かつそれに対する親和性を有するペプチドマトリックスによって支持された複数のＫＰＲ型の繰り返しパターンを特徴とするいくつかの化合物を開示しており、これらの化合物は細胞中へのＨＩＶの侵入を阻害する能力を示す。国際公開第９１／１６３��９号パンフレットでは、ＩＬ−２抑制によって媒介される自己免疫性の疾患及び状態を治療するのに有用なＤＰＰ−ＩＶ阻害剤であるいくつかのテトラペプチドボロン酸を開示している。国際公開第９３／０８２５９号パンフレットでは、ＩＬ−２抑制によって媒介される自己免疫性の疾患及び状態を治療するのに有用なＤＰＰ−ＩＶ阻害剤であるいくつかのポリペプチドボロン酸を開示している。国際公開第９５／１１６８９号パンフレットでは、ＨＩＶの細胞侵入を阻止するのに有用なＤＰＰ−ＩＶ阻害剤であるいくつかのテトラペプチドボロン酸を開示している。東ドイツ特許第１５８１０９号では、特にＤＰＰ−ＩＶ阻害剤として有用である、いくつかのＮ−保護されたペプチジル−ヒドロキサム酸及びニトロベンゾイルオキサミドを開示している。国際公開第９５／２９６９１号パンフレットでは、免疫系障害の治療において有用なＤＰＰ−ＩＶ阻害剤であるいくつかのジペプチドプロリンホスホナートを特に開示している。ドイツ特許ＤＤ２９６０７５では、ＤＰＰ−ＩＶを阻害するいくつかのアミノ酸アミドを開示している。Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１２９３巻、１４７〜１５３頁では、側鎖の改変がＤＰＰ−ＩＶ及びＰＥＰに触媒された加水分解に与える影響を研究するために、いくつかのジ及びトリペプチドｐ−ニトロアニリドの調製を開示している。Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第６巻、第１０号、１１６３〜１１６６頁（１９９６年）では、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤であるいくつかの２−シアノピロリジンを開示している。Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、第３９巻、２０８７〜２０９４頁（１９９６年）では、ＤＰＰ−ＩＶの阻害剤であるいくつかのプロリンボロン酸含有ジペプチドを開示している。Ｄｉａｂｅｔｅｓ、第４４巻、１１２６〜１１３１頁（１９９６年９月）は、糖尿病及び非糖尿病の対象に皮下又は静脈内の経路によって投与された場合にＧＬＰ−Ｉアミドが急速に分解されることを実証する研究を対象としている。
【０２２５】
[00231]米国特許第６７２７２６１号では、糖尿病、特に非インスリン依存性糖尿病、及び耐糖能障害などＤＰＰ−ＩＶに関連付けられている疾患の治療及び／又は予防のために有用な新規のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤としてピリド［２，１−ａ］イソキノリン誘導体を提供する。これらの化合物はまた、腸（Ｂｏｗｌ）疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病（ＭｏｒｂｕｓＣｒｏｈｎ）、肥満及び／又は代謝症候群の治療及び／又は予防にも有用である。
【０２２６】
[00232]米国特許第６７１６８４３号では、ＤＰＰ−ＩＶの阻害剤として有用なα−アミノ酸スルホニル化合物を提供する。
【０２２７】
[00233]米国特許第６６４５９９５号では、複素環中の窒素原子がアミド結合又はペプチド結合を介してアミノ酸又はアミノ酸誘導体に結合されている、２位置換の不飽和複素環系化合物を開示している。これらの化合物はＤＰＰ−ＩＶの強力かつ選択的な阻害剤であり、ＤＰＰ−ＩＶの阻害によって調節又は正常化され得る状態を治療する際に有効である。
【０２２８】
[00234]米国特許第６６１７３４０号では、Ｎ−（置換グリシル）ピロリジン、及びジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶの阻害における前記化合物の使用を開示している。米国特許第６１２４３０５号では、ＤＰＰ−ＩＶを阻害するＮ−（置換グリシル）−２−シアノピロリジンを開示している。これらの化合物は、ＤＰＰ−ＩＶによって媒介される状態を処置する際に効果的である。
【０２２９】
[00235]ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）製の化合物１−［［［２−［（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］アセチル］−２−シアノ−（Ｓ）−ピロリジン（ＮＶＰ  ＤＰＰ７２８）を４週間に渡って２型糖尿病患者９３名（ＨｂＡ１ｃ平均値７．４％）に投与すると、４週間の研究期間に渡って血漿グルコース、インスリン及びＨｂＡ１ｃのレベルが低下した（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２００２年、２５（５）：８６９〜８７５頁を参照されたい）。
【０２３０】
ＤＰＰ−ＩＶの阻害剤を用いた併用療法
[00236]一態様では、本発明は、様々な状態の処置のために１種又は複数種のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤と組み合わせた、治療用タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含むトランスフェリン融合タンパク質の使用を提供する。本発明は、トランスフェリン融合タンパク質及び１種又は複数種のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を含む薬剤組成物を提供する。その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第１０／３７８，０９４号で開示されているように、治療用タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに結合されるトランスフェリンは改変されてもよい。これは、グリコシル化の低減を示し得る。改変されたトランスフェリンポリペプチドは、単一のトランスフェリンＮドメイン、単一のトランスフェリンＣドメイン、トランスフェリンのＮ及びＣドメイン、２つのトランスフェリンＮドメイン、並びに２つのトランスフェリンＣドメインからなる群から選択することができる。トランスフェリンに結合される治療用タンパク質又はペプチドは、天然型でも改変型でもよい。好ましくは、トランスフェリン融合タンパク質は、米国特許出願第１０／３７８，０９４号で説明されているように、改変トランスフェリン分子に連結された、治療用ペプチドとしてのＧＬＰ−１を含む。さらに、本発明の併用療法は、ＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質、１種又は複数種のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、及び別の治療用分子を含む。このような分子は「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）」又は「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）ＸＲ」である。
【０２３１】
[00237]別の態様では、本発明は、１種又は複数種のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤と組み合わせた、ジペプチジルプロテアーゼ切断に抵抗性である改変されたタンパク質若しくはペプチド又はその融合タンパク質の使用を提供する。本発明は、改変されたタンパク質若しくはペプチド又はその融合タンパク質を、１種又は複数種のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤と組み合わせて含む薬剤組成物を開示する。好ましくは、改変ペプチドは改変ＧＬＰ−１であり、融合タンパク質は、改変ＧＬＰ−１／ｍＴｆタンパク質である。さらに、本発明の併用療法は、改変ＧＬＰ−１又は改変ＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質、１種又は複数種のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、及び「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）」や「Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）ＸＲ」など別の治療用分子も含む。
【０２３２】
[00238]ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、任意の関連疾患を治療するための本発明の方法において使用することができる。例えば、本明細書において説明するＧＬＰ−１−トランスフェリン融合タンパク質は、糖尿病前症、糖尿病、肥満又は糖尿病症状を治療するための１−［［［２−［（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］アセチル］−２−シアノ−（Ｓ）−ピロリジン（ＮＶＰ  ＤＰＰ７２８）などのＤＰＰ−ＩＶ阻害剤と併用することができる。これらの治療用物質は逐次的に又は同時に投与してよい。
【０２３３】
[00239]トランスフェリン融合タンパク質は、ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド（配列番号３２）又はＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド（配列番号３２のアミノ酸１〜３０）を含み得る。より好ましくは、ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド又はＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドは、Ａ８からＧ及びＫ３４からＡへの変異を含む。トランスフェリンタンパク質はまた、ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド又はＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドとトランスフェリン分子の間にリンカーを含んでもよい。好ましくは、リンカーは（ＰＥＡＰＴＤ）２ペプチドである。
【０２３４】
エンドペプチダーゼ阻害剤を用いた併用療法による、融合タンパク質の薬物動態及び薬力の向上
[00240]本発明はまた、中性エンドペプチダーゼ（ＮＢＰ）阻害剤及びトランスフェリン融合タンパク質を用いた併用療法も提供する。さらに、本発明はまた、ＮＢＰ阻害剤及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤並びにトランスフェリン融合タンパク質を用いた併用療法も含む。ＮＥＰ阻害剤及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、同時に又は逐次的に投与してよい。さらに、これらの阻害剤及びトランスフェリン融合タンパク質も、同時に又は逐次的に投与してよい。これらの阻害剤は、トランスフェリン融合タンパク質を投与する前又は後に投与してよい。
【０２３５】
[00241]トランスフェリン融合タンパク質は、ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド（配列番号３２）又はＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド（配列番号３２のアミノ酸１〜３０）を含む。より好ましくは、ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド又はＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドは、Ａ８からＧ及びＫ３４からＡへの変異を含む。トランスフェリンタンパク質はまた、ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド又はＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドとトランスフェリン分子の間にリンカーを含んでもよい。好ましくは、リンカーは（ＰＥＡＰＴＤ）２ペプチドである。
【０２３６】
[00242]エンケファリナーゼ、ネプリライシン及びアトリオペプチダーゼとしても公知の中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）は、脳、腎臓、肺、胃腸管、心臓及び末梢血管系を含めて多くの組織中に存在する膜結合型亜鉛メタロエンドペプチダーゼである。ＮＥＰは、循環しているナトリウム利尿ペプチドを分解し、それにより血管拡張、血圧及び血液量に対するそれらの影響を防ぐことによって、ナトリウム利尿ペプチドのクリアランスにおいて重要な役割を果たしている。ＮＥＰは、ナトリウム利尿ペプチドを分解及び不活性化することによって、高血圧、心不全及び腎不全に関連している。
【０２３７】
[00243]循環しているナトリウム利尿ペプチドを分解することに加えて、ＮＥＰは、循環しているブラジキニン；アドレノメデュリン、腎臓の血管拡張性かつナトリウム排泄増加性の利尿ペプチド；及び／又はウロジラチン、すなわちＡＮＰの腎臓型を含めて、他の血管拡張性物質も分解する。
【０２３８】
[00244]ＮＥＰは、血管収縮薬であるエンドセリンアイソフォームＥＴ１の分解にも関与しており、かつＥＴ−１の形成にも関与している可能性がある（Ｂｒｕｎｎｅｒ−Ｌａ  Ｒｏｃｃａ他、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１（２００１年）５１０〜５２０頁）。ＮＥＰはまた、強力な血管収縮薬であるアンギオテンシンＩＩ、エンドモルフィン、並びにブラジキニン、ＧＬＰ−１（Ｈｕｐｅ−Ｓｏｄｍａｎｎ，Ｋ．、ＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ｇ  Ｐ．、Ｂｒｉｄｅｎｂａｕｇｈ，Ｒ他  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９９５年；５８：１４９〜５６頁、Ｈｕｐｅ−Ｓｏｄｍａｎｎ，Ｋ、Ｇｏｅｋｅ，Ｒ．、Ｇｏｅｋｅ，Ｂ他  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９９７年；１８：６２５〜３２頁）、ＰＹＹ（Ｍｅｄｅｉｒｏｓ  ＭＤ、Ｔｕｒｎｅｒ  ＡＪ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９９４年５月；１３４（５）：２０８８〜９４頁）、及びグルカゴン（Ｔｒｅｂｂｉｅｎ  Ｒ他  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２００４年９月；２８７（３）：Ｅ４３１〜８）など代謝に関与しているいくつかのペプチドも分解する。
【０２３９】
[00245]ホスホラミドンやＮＥＰ／ＡＣＥ阻害剤などいくつかのＮＥＰ阻害剤（米国特許第５５０８２７２号で開示されているオマパトリラト、米国特許第５５５２３９７号で開示されているゲムパトリラト（ｇｅｍｐａｔｒｉｌａｔ）、米国特許第５４３０１４５号で開示されているサムパトリラト及びＭＤＬ１００２４０を含む）が、例えば高血圧及び心不全の単独治療処置用に有用であるとして文献で報告された。Ｎａｔｈｉｓｕｗａｎ他、「Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｖａｓｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｏｄａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ、第２２巻（１）、２７〜４２頁（２００２年）。カンドキサトリル及びエカドトリルは、心不全の将来の薬物として臨床試験が現在実施されている、２種の極めて特異的なＮＥＰ阻害剤である。どちらの化合物も、体内で代謝されて同種の活性を持つものになるプロドラッグである。カンドキサトリルは肝臓中で活性化されてカンドキサトリラトになるのに対し、エカドトリルはその同種の活性を持つＳ−チオルファンに変換される。
【０２４０】
[00246]ＡＣＥ／ＮＥＰ阻害剤の一部の例が、米国特許第５５０８２７２号、第５３６２７２７号、第５３６６９７３号、第５２２５４０１号、第４７２２８１０号、第５２２３５１６号、第５５５２３９７号、第４７４９６８８号、第５５０４０８０号、第５６１２３５９号、及び第５５２５７２３号、並びに欧州特許出願第０４８１，５２２号、第０５３４３６３  Ａ２号、第５３４，３９６号、及び第５３４，４９２号で開示されている。
【０２４１】
[00247]本発明は、様々な疾患又は状態を治療するための、トランスフェリン融合タンパク質並びにＤＰＰ−ＩＶ阻害剤及び又はＡＣＥ／ＮＥＰ阻害剤を含む併用療法を提供する。このような疾患又は状態としては、それだけには限らないが、糖尿病、好ましくはＩＩ型糖尿病、うっ血性心不全、肥満、高血圧及び過敏性腸症候群が挙げられる。
【０２４２】
トランスジェニック動物
[00248]ＤＰＰ活性から保護されている改変されたポリペプチド又はペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物の作製が、本発明の一実施形態において企図される。いくつかの実施形態では、高い安定性を有する改変されたポリペプチド又はペプチドを含む融合タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物が企図される。
【０２４３】
[00249]例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６２９１７４０号（２００１年９月１８日発行）；米国特許第６２８１４０８号（２００１年８月２８日発行）；及び米国特許第６２７１４３６号（２００１年８月７日発行）などいくつかの特許及び刊行物において、成功裡なトランスジェニック非ヒト動物作製が説明された。
【０２４４】
[00250]乳牛、ブタ、ヤギ、ウマ、ウシ及びヒツジを含む家畜化された哺乳動物などの動物の遺伝的性質を改変することができると、いくつかの商業的応用が可能となる。これらの応用には、大量の外因タンパク質を容易に回収される形態で発現する（すなわち、乳汁又は血液中への発現）動物の作製、体重増加、飼料効率、枝肉組成、乳汁産生又は産生量、耐病性及び特定の微生物による感染に対する抵抗性の増大した動物の作製、並びに向上した成長速度又は生殖能力を有する動物の作製が含まれる。ゲノム中に外因性ＤＮＡ配列を含む動物は、トランスジェニック動物と呼ばれる。
【０２４５】
[00251]トランスジェニック動物作製のために最も広く使用されている方法は、受精胚の前核中へのＤＮＡのマイクロインジェクションである（Ｗａｌｌ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：１１３頁［１９９２年］）。トランスジェニック動物作製のための他の方法としては、レトロウイルス又はレトロウイルスベクターによる胚の感染が挙げられる。野生型又は組換型のレトロウイルスによる着床前及び着床後の双方のマウス胚の感染が報告された（Ｊａｎｅｎｉｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７３：１２６０頁［１９７６年］；Ｊａｎｅｎｉｃｈ他、Ｃｅｌｌ  ２４：５１９頁［１９８１年］；Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７１５１頁［１９８４年］；Ｊａｈｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６９２７頁［１９８５年］；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６１４８〜６１５２頁［１９８５年］；Ｓｔｅｗａｒｔ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３８３〜３８８頁［１９８７年］）。
【０２４６】
[00252]胚をレトロウイルスに感染させるための代替手段は、マウス胚の卵割腔中へのウイルス又はウイルス産生細胞の注入である（Ｊａｈｎｅｒ，Ｄ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：６２３頁［１９８２年］）。妊娠中期のマウス胚の子宮内レトロウイルス感染を用いたマウスの生殖系列への導入遺伝子の導入が報告された（Ｊａｈｎｅｒ他、前掲［１９８２年］）。トランスジェニック動物を作製するための、レトロウイルス又はレトロウイルスベクターによるウシ胚及びヒツジ胚の感染が報告された。これらのプロトコールは、レトロウイルス粒子、又は受精卵若しくは初期胚の囲卵腔中にレトロウイルス粒子を落とす、増殖を抑制された（すなわちマイトマイシンＣ処理された）細胞のマイクロインジェクションを含む（ＰＣＴ国際出願国際公開第９０／０８８３２号パンフレット［１９９０年］；並びにＨａｓｋｅｌｌ及びＢｏｗｅｎ、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．、４０：３８６頁［１９９５年］）。ＰＣＴ国際出願国際公開第９０／０８８３２号パンフレットでは、２〜８細胞期のヒツジ胚の囲卵腔中への野生型ネコ白血病ウイルスＢの注入を記載している。注入を受けた胚に由来する胎児は、複数の組込み部分を含むことが示された。
【０２４７】
[00253]米国特許第６２９１７４０号（２００１年９月１８日発行）では、分裂中の細胞に形質導入するレトロウイルスベクター（例えばマウス白血病ウイルス［ＭＬＶ］に由来するベクター）を用いた、成熟前の卵母細胞及び成熟した未受精卵母細胞（すなわち受精前卵母細胞）中に外因性ＤＮＡを導入することによる、トランスジェニック動物の作製を記載している。この特許は、様々な組換えタンパク質のサイトメガロウイルスプロモーター駆動による発現、並びにマウス乳癌ＬＴＲによる発現のための方法及び組成物も記載している。
【０２４８】
[00254]米国特許第６２８１４０８号（２００１年８月２８日発行）では、胚性幹細胞を用いてトランスジェニック動物を作製するための方法を記載している。手短に言えば、胚性幹細胞は、トランスジェニック動物を作製するために、桑実胚と混合された細胞共培養において使用される。外来遺伝物質が、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション又はレトロウイルス送達によって、共培養の前に胚性幹細胞中に導入される。この様式でトランスフェクトされたＥＳ細胞は、ネオマイシンなどの選択マーカーによって遺伝子の組込みのために選択される。
【０２４９】
[00255]米国特許第６２７１４３６号（２００１年８月７日発行）では、始原生殖細胞を単離するステップ、これらの細胞を培養して始原生殖細胞に由来する細胞系統を作製するステップ、始原生殖細胞及び培養細胞系統の双方を形質転換するステップ、並びにこれらの形質転換された細胞及び細胞系統を用いてトランスジェニック動物を発生させるステップを含む方法を用いた、トランスジェニック動物の作製を記載している。トランスジェニック動物が生じる効率は大きく上昇し、それによって、トランスジェニック非げっ歯動物種を作製する際に相同組換えを使用することが可能になる。
【０２５０】
遺伝子療法
[00256]遺伝子療法のために本発明の改変されたポリペプチド又はペプチド構築物を使用することが、本発明の一実施形態において企図される。ポリペプチド又はペプチドは、Ｎ末端に１つ又は複数の付加的なアミノ酸を付加することによってＤＰＰ活性から保護されるように改変された。例えば、Ｎ末端に付加的なＨｉｓ残基を含むＧＬＰ−１をコードしている核酸構築物が、遺伝子療法のために提供される。また、改変ＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質をコードしている核酸構築物が、遺伝子療法のために提供される。本発明の改変ＧＬＰ−１構築物は、ＤＰＰ活性から保護されており、より安定であり、したがって、遺伝子療法の治療に理想的に適している。
【０２５１】
[00257]手短に言えば、細胞障害性リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）及びヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃ部分からなる可溶性融合タンパク質をコードしている遺伝子を含むアデノウイルスベクターの注射による遺伝子療法が、Ｉｊｉｍａ他（２００１年６月１０日）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（米国）１２／９：１０６３〜７７頁において最近示された。遺伝子療法のこの応用では、ＩＩ型コラーゲンに誘発される関節炎のマウスモデルが、ベクターの関節内注射によって首尾良く治療された。
【０２５２】
[00258]遺伝子療法は、米国特許第６２２５２９０号（２００１年５月１日発行）；米国特許第６１８７３０５号（２００１年２月１３日発行）；及び米国特許第６１４０１１１号（２０００年１０月３１日発行）を含めて、いくつかの米国特許においても記載されている。
【０２５３】
[00259]米国特許第６２２５２９０号では、哺乳動物対象の腸上皮細胞を、所望の治療効果を有するタンパク質を発現する遺伝子を作動的に組み込むように遺伝子改変する方法及び構築物を提供する。腸細胞の形質転換は、主として裸ＤＮＡから構成される調製物の投与によって達成され、このＤＮＡは経口投与され得る。経口又は他の胃腸管内の投与経路により、簡単な投与方法が実現し、同時に、裸核酸を使用することにより、遺伝子療法を遂行するためのウイルスベクター使用に関連する合併症が回避される。発現されたタンパク質は、胃腸管及び／又は血流中に直接分泌されて、治療効果のあるタンパク質血中レベルをもたらし、それによってそのタンパク質を必要とする患者を治療する。形質転換された腸上皮細胞は、特定のタンパク質の欠乏に関連した、又はタンパク質の過剰発現による治療が適用できる疾患に対する、短期又は長期の治療的回復を実現する。
【０２５４】
[00260]米国特許第６１８７３０５号では、脊椎動物、特に哺乳動物起源の細胞における遺伝子又はＤＮＡターゲティングの方法を提供する。手短に言えば、ＤＮＡは、相同組換え、又は初代細胞若しくは２次細胞のゲノムＤＮＡ中の予め選択された部位に導入されるＤＮＡのターゲティングによって、脊椎動物起源の初代細胞又は２次細胞中に導入される。
【０２５５】
[00261]米国特許第６１４０１１１号（２０００年１０月３１日発行）では、レトロウイルスの遺伝子療法ベクターを記載している。開示されているレトロウイルスベクターは、興味対象の遺伝子のための挿入部位を含み、かつ多種多様のトランスフェクトされた細胞型において興味対象の遺伝子に由来するタンパク質を高レベルで発現することができる。また、選択マーカーを欠き、したがって抗生物質などマーカー産物の同時発現を伴わない、様々な病態の治療におけるヒト遺伝子療法に適したレトロウイルスベクターも開示されている。これらのレトロウイルスベクターは、ある種のパッケージング細胞系統において使用するのに特に適している。レトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞のゲノム中への挿入が可能であるため、ヒト及び動物の遺伝病の遺伝子療法において使用するための特に有望な候補となっている。遺伝子療法は、典型的には、（１）新しい遺伝物質を患者細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで添加すること、又は（２）身体から患者細胞を取り出し、それらの細胞に新しい遺伝物質を添加し、かつ身体中にそれらを再導入すること、すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子療法を含む。レトロウイルスベクターを用いて様々な細胞において遺伝子療法を実施する方法の考察は、例えば、１９８９年９月１９日に発行された米国特許第４８６８１１６号、及び１９９０年１２月２５日に発行された第４９８０２８６号（上皮細胞）、１９８９年８月１０日に公開された国際公開第８９／０７１３６号パンフレット（肝細胞）、１９９０年７月２５日に公開されたＥＰ３７８５７６（線維芽細胞）、並びに１９８９年６月１５日に公開された国際公開第８９／０５３４５号パンフレット及び１９９０年６月２８日に公開された国際公開第９０／０６９９７号パンフレット（内皮細胞）において確認することができ、これらの開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５６】
[00262]さらなる説明をせずとも、当業者なら、前述の説明及び以下の例示的な実施例を用いて、特許請求される本発明を実施及び利用することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に示すが、開示の残りの部分を何らかの方法で限定するものとして解釈されるべきではない。本出願の全体を通して言及されるすべての論文、刊行物、特許、及び文書は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０２５７】
実施例１：ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ保護を有する改変ＧＬＰ−１
[00263]本実施例では、ＤＰＰ−ＩＶ活性から保護された改変ＧＬＰ−１ペプチドを説明する。標準的な固相Ｆｍｏｃ化学反応を用いて以下のペプチドを合成し、Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製し、かつ２２０ｎｍの吸光度により定量した。精製したペプチドを質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって解析した：
【化１】
2008509153.tif 000007
【０２５８】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ処理
[00264]等モル濃度の各ペプチド（６μＭ）を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）中の組換えヒトＤＰＰ−ＩＶ（１μｇ／μＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ミネソタ州）２μｇで処理した。ＤＰＰ−ＩＶを除いた対照反応を各ペプチドについて同時に設定した。これらの消化物を室温で２時間インキュベートし、２時間目にそれらの反応物を１ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を添加したクレブスリンガー緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、カマリロ、カリフォルニア州）中で１０倍に希釈した。次いで、後述するように、残存するＧＬＰ−１受容体活性化活性を測定するためにこれらのペプチドを解析した。
【０２５９】
環状ＡＭＰ刺激アッセイ
[00265]処理をする１日前に、ＣＨＯ−ＧＬＰ１Ｒ細胞（Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈ他、１９９７年  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２１２０１〜２１２０６頁）をＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ培地中に２×１０４細胞／ウェルの密度で４枚の９６ウェル組織培養プレートに播種した。翌日、細胞は概算の集密度６０〜８０％で均一に分布しているようであった。培養プレートへの播種後１日目に、細胞をクレブスリンガー緩衝液（ＫＲＢ）で２回洗浄し、続いてＫＲＢ中で３７℃、１時間インキュベートしてｃＡＭＰの細胞内レベルを低下させた。これに続いて、ＫＲＢ／ＩＢＭＸ中で１０分間インキュベートして、ｃＡＭＰを破壊する細胞内酵素を阻害した。各試験化合物の希釈物をＫＲＢ／ＩＢＭＸ中で調製し、かつＣＨＯ−ＧＬＰ１Ｒ細胞の３つのウェルを、ウェル当たり試験化合物５０μｌで３７℃、厳密に２０分間処理した。これらの培養物を氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄することによってこの処理を停止した。室温で１０分間、溶解緩衝液１Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社  ｃＡＭＰ  Ｂｉｏｔｒａｋ  ＥＩＡキット）０．１ｍｌを添加することによって溶解産物を調製した。次いで、ｃＡＭＰ  Ｂｉｏｔｒａｋ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、製品コードＲＰＮ２２５）をキットの取扱い説明書に従って用いて、各細胞抽出物の全体積を解析してｃＡＭＰ濃度を測定した。本発明のペプチドの方が、未改変の形態よりもＤＰＰ−ＩＶに対して抵抗性が高いことが判明した。
【０２６０】
活性型ＧＬＰ−１に特異的なＥＬＩＳＡ
[00266]あるいは、完全な活性型ＧＬＰ−１に特異的であり、かつＤＰＰ−ＩＶの作用が原因でＮ末端の２つのアミノ酸が除去されているＧＬＰ−１、すなわちＧＬＰ−１（９−３６又は９−３７）を認識しないＥＬＩＳＡ系（グルカゴン様ペプチド−１［活性］ＥＬＩＳＡキット［Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．社、セントチャールズ、ミズーリ州］）を用いて、本発明のＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１誘導体のＤＰＰ−ＩＶ分解を解析した。等モル濃度のＧＬＰ−１及びＨ−ＧＬＰ−１（１２００ｐＭ）を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）中の組換えヒトＤＰＰ−ＩＶ（２００ｎｇ／μＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ミネソタ州）で処理し、かつ、プロテアーゼ阻害剤を含む、キットと共に支給されるアッセイ緩衝液中に希釈することによって反応を停止させた。
【０２６１】
[00267]このキットは、抗ＧＬＰ−１モノクローナル抗体で被覆された９６ウェルのマイクロタイタープレートを含む。このプレートを洗浄し（プレート洗浄機、ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ、２５ｍＭホウ酸緩衝生理食塩水で４回）、次いでペプチド試料（３００ｐＭ及びプレートの下方への１０倍段階希釈）と共に室温で３時間インキュベートした。前述したように洗浄した後、（キットのすぐ使用できる構成要素として供給されている）アルカリ性ホスファターゼを結合させた抗ＧＬＰ抗体と共に室温で２時間、プレートをインキュベートした。洗浄後、４−メチルウンベリフェリルホスファート（ＭＵＰ）基質（５０ｍＭホウ酸（Ｂｏｒａｔｅ）ｐＨ９．５中の１：２００希釈物）をすべてのウェルに添加し、室温、暗所で３０分間インキュベートした。このプレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＭ蛍光プレートリーダー上で、励起波長３５５ｎｍ及び発光波長４６０ｎｍで読み取りした。Ｈ−ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１それ自体よりもモノクローナル抗体に結合しにくかったため、ＤＰＰ−ＩＶ処理後に残存している活性Ｈ−ＧＬＰ−１の濃度は、Ｈ−ＧＬＰ−１検量線を用いて決定した。図８は、Ｈ−ＧＬＰ−１の方が、ＤＰＰ−ＩＶの作用に対してＧＬＰ−１より実質的に抵抗性が高いことを示す。
【０２６２】
実施例２：改変ＧＬＰ−１融合タンパク質
[00268]本実施例では、改変トランスフェリン分子に融合された、ＤＰＰ−ＶＩ活性から保護された改変ＧＬＰ−１を含む、融合タンパク質を説明する。
【０２６３】
[00269]トランスフェリン分泌リーダーに続いてＧＬＰ−１及びトランスフェリンのＮ末端部分をコードする配列を構築するために、以下の重複するプライマーを設計した。
【化２】
2008509153.tif 000008
これらのプライマーの位置を以下に示す。
【化３】
2008509153.tif 000009
プライマー（８μＬ、濃度２０ｐｍｏｌ）を混合し、５分間６５℃まで加熱し、次いでアニーリング反応を起こさせ、室温までゆっくり放冷させた。
【０２６４】
[00270]アニーリング反応物にＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、室温でさらに２時間インキュベートした後、反応物１μＬを取り出し、ＰＣＲ反応で使用して、アウタープライマーＰ０２３６及びＰ０２５１を用いて完成された挿入物を増幅させた。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった。
９４℃で５分
９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分を２５サイクル
７２℃で７分
４℃で維持
【０２６５】
[00271]得られるＰＣＲ生成物をＡｆｌＩＩ及びＫｐｎＩで消化し、予めＡｆｌＩＩ及びＫｐｎＩで消化されたｐＲＥＸ００９４（図１）中に連結した。ライゲーションを用いて大腸菌を形質転換した。結果として生じるクローンに由来するＤＮＡの配列を決定し、ＡｆｌＩＩ／ＫｐｎＩ挿入物の長さが正確なクローンを選択し、ｐＲＥＸ０１９８と命名した（図２）。次に、ｐＲＥＸ０１９８をＮｏｔＩ及びＰｖｕＩで消化し、ｐＳＡＣ３５（図３）中に挿入して、ｐＲＥＸ０２４０（図４）を作製した。
【０２６６】
[00272]天然のトランスフェリン分泌リーダーとそれに続く改変トランスフェリン（ｍＴｆ）に融合されたＨ−ＧＬＰ−１（７−３６）をコードするプラスミドを作製するため、ｐＲＥＸ０１９８によってコードされた配列に余分なＮ末端ヒスチジンを付加するように、重複プライマーＰ０４２４及びＰ０４２５を設計した。
【化４】
2008509153.tif 000010
【０２６７】
[00273]これら２種の変異誘発性の重複プライマー及び２種のアウタープライマー、すなわちＰ０４２４とＰ００１２及びＰ０４２５とＰ００２５を別々の反応で用いる、最初のＰＣＲ反応用の鋳型としてｐＲＥＸ０１９８を使用した。次いで、これらの反応の生成物を、それらを結合させるために、アウタープライマーのみ、すなわちＰ００１２及びＰ００２５を用いる２ラウンド目のＰＣＲにおける鋳型として使用した。いずれのラウンドのＰＣＲ反応条件も、９４℃で１分間を１回、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間を２０回、及び終結させるために７２℃で７分間を１回であった。
【０２６８】
[00274]最終反応物から得たＰＣＲ生成物をＡｆｌＩＩ及びＫｐｎＩで消化し、ＡｆｌＩＩ／ＫｐｎＩで消化されたｐＲＥＸ００５２（図５）中に連結してｐＲＥＸ０３６７（図６）を作製した。余分なヒスチジンのためのコドンの挿入を確認するために、構築物のＤＮＡ配列を決定した。
【０２６９】
[00275]次いで、ｐＲＥＸ０３６７をＮｏｔＩ及びＰｖｕＩ（後者はアンピシリン耐性遺伝子を破壊するため）で消化し、予めＮｏｔＩで消化されたｐＳＡＣ３５中に連結してｐＲＥＸ０３６８（図７）を作製した。
【０２７０】
[00276]エレクトロポレーションによって、ｐＲＥＸ０３６８を宿主のサッカロミセス・セレビシエ株中に形質転換させ、かつ、緩衝化した最小培地プレート上でロイシン原栄養性に基づいて、形質転換されたコロニーを選択した。単独のコロニーを選択した後、酵母形質転換体を４０％トレハロース中に入れ、−７０℃で保存した。ｐＨ６．５に緩衝化した液状最小培地中での増殖、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡによる上清の解析によって、発現を測定した。
【０２７１】
[00277]その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２００３年３月４日に出願された米国特許出願第１０／３７８，０９４号で記載されているようにして、ＧＬＰ−１／ｍＴｆをコードしているプラスミド（ｐＲＥＸ０１００）及びＨ−ＧＬＰ−１／ｍＴｆをコードしているプラスミドを構築した。ＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質を作製するために、ＧＬＰ−１（７−３６）及びＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列を使用することができる。
【化５】
2008509153.tif 000011
【０２７２】
[00278]例えば、ＧＬＰ−１（７−３６）のペプチド配列を、酵母用に最適化されたＤＮＡ及びコドンに逆翻訳することができる。
【化６】
2008509153.tif 000012
【０２７３】
[00279]これらのプライマーは、アニーリング後に５’ＸｂａＩ及び３’ＫｐｎＩの付着末端を形成するように、かつＸｂａＩ／ＫｐｎＩで切断されたｐＲＥＸ００５２中への、リーダー配列の末端のちょうど５’側及びｍＴｆのＮ末端での直接的なライゲーションが可能となるように特異的に設計した。あるいは、他のベクター中にライゲーションするために他の付着末端を人工的に作製してもよい。
【化７】
2008509153.tif 000013
【０２７４】
[00280]アニーリング及びライゲーション後、クローンを配列決定して正確な挿入を確認した。このベクターをｐＲＥＸ００９４と呼んだ。ＮｏｔＩを用いてｐＲＥＸ００９４からカセットを切り取り、ＮｏｔＩで切断した酵母ベクターｐＳＡＣ３５中にサブクローニングして、ｐＲＥＸ００１０を作製した。
【０２７５】
[00281]次いで、このプラスミドを宿主のサッカロミセス酵母株中にエレクトロポレーションし、かつ最小培地プレート上でのロイシン原栄養性に基づいて形質転換体を選択した。液状最小培地中での増殖、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、及びＥＬＩＳＡによる上清の解析によって発現を測定した。
【０２７６】
[00282]ＧＬＰ−１／ｍＴｆ及びＨ−ＧＬＰ−１／ｍＴｆを発現させ、かつ陽イオン交換及び陰イオン交換クロマトグラフィーによって、標準条件下で増殖させた発酵培養物から精製した。
【０２７７】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ処理
[00283]等モル濃度のＧＬＰ−１／ｍＴｆ及びＨ−ＧＬＰ−１／ｍＴＦ（２μＭ）を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ溶液（ｐＨ８．０）中の組換えヒトＤＰＰ−ＩＶ（１μｇ／μＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で処理した。ＤＰＰ−ＩＶを除いた対照反応を各融合タンパク質について同時に設定した。これらの消化物を室温で２時間インキュベートし、２時間目にそれらの反応物を１ｍＭ  ＩＢＭＸ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を添加したクレブスリンガー緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）中で２０倍に希釈した。
【０２７８】
環状ＡＭＰ刺激アッセイ
[00284]処理をする１日前にＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ培地中に１×１０５細胞／ウェルの密度で、ＣＨＯ−ＧＬＰ１Ｒ細胞を組織培養プレート（２４ウェル）に播種した。翌日、細胞は概算の集密度６０〜８０％で均一に分布しているようであった。培養プレートへの播種後１日目に、細胞をクレブスリンガー緩衝液（ＫＲＢ）で２回洗浄し、続いてＫＲＢ中で３７℃、１時間インキュベートしてｃＡＭＰの細胞内レベルを低下させた。これに続いて、ＫＲＢ／ＩＢＭＸ中で１０分間インキュベートして、ｃＡＭＰを破壊する細胞内酵素を阻害した。各試験化合物の希釈物をＫＲＢ／ＩＢＭＸ中で調製し、かつＣＨＯ−ＧＬＰ１Ｒ細胞の３つのウェルをウェル当たり試験化合物０．１５ｍｌで３７℃、厳密に５０分間処理した。これらの培養物を氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄することによってこの処理を停止した。室温で１０分間、溶解緩衝液１Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社  ｃＡＭＰ  Ｂｉｏｔｒａｋ  ＥＩＡキット）０．２ｍｌを添加することによって溶解産物を調製し、次いで、ｃＡＭＰ  Ｂｉｏｔｒａｋ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をキットの取扱い説明書に従って用いて、各細胞抽出物の１００μｌを解析してｃＡＭＰ濃度を測定した。
【０２７９】
[00285]Ｈ−ＧＬＰ−１／ｍＴｆの方が、ＧＬＰ−１／ｍＴｆよりもＤＰＰ−ＩＶに対して抵抗性が高いことが判明した。
【０２８０】
実施例３：糖尿病治療用の改変ＧＬＰ−１／ｍＴｆ
[00286]本実施例において、本発明の改変ＧＬＰ−１／ｍＴｆは、糖尿病を治療するための治療用物質として使用される。ＩＩ型糖尿病の標準的な動物モデルであるズッカー（Ｚｕｃｋｅｒ）ラットに改変ＧＬＰ−１／ｍＴｆを投与する。ズッカーラットは、異常に高い血中グルコースレベルを有する。ＧＬＰ−１でこれらの動物を処置するとインスリン分泌が誘導され、血中グルコースが低下することが示された。
【０２８１】
[00287]ズッカーラットを一晩絶食させ、次いでＨ−ＧＬＰ−１又はトランスフェリンに融合させたＨ−ＧＬＰ−１（Ｈ−ＧＬＰ−１／ｍＴｆ）で処置する。Ｈ−ＧＬＰ−１又はＨ−ＧＬＰ−１／ｍＴｆの皮下注射後３０分に、これらの動物をグルコース負荷試験（ＧＴＴ）に供する。この試験のために、絶食させた動物にグルコース溶液（１．５ｍｇ／ｇ体重）を与え、かつ適切な時間間隔で血中グルコースを測定する。グルコース投与後すぐに、未処置の動物の血中グルコースレベルは上昇し、かつベースラインに向かってゆっくりと低下するのに対し、Ｈ−ＧＬＰ−１又はＨ−ＧＬＰ−１／ｍＴｆを注射された動物は、ＧＬＰ−１のインスリン分泌促進効果の寄与により、血中グルコースレベルのより速い正常化を示す。
【０２８２】
[00288]別の実験では、グルコース投与をせずに、改変されたＨ−ＧＬＰ−１又はＨ−ＧＬＰ−１／ｍＴｆを使用して、ズッカーラットの高い空腹時血糖を正常化する。未処置の動物では血中グルコースレベルが高いままであるのに対し、Ｈ−ＧＬＰ−１又は改変Ｈ−ＧＬＰ−１／ｍＴｆで処置した動物では有意な低下が認められる。
【０２８３】
実施例４：ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶからの保護を有する改変グルカゴン
[00289]本実施例では、ＤＰＰ−ＩＶ活性から保護された改変グルカゴン分子を説明する。
【０２８４】
[00290]標準的な固相Ｆｍｏｃ化学反応を用いて以下のペプチドを合成し、Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製し、かつ２２０ｎｍの吸光度により定量した。精製したペプチドを質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって解析した：
【化８】
2008509153.tif 000014
【０２８５】
[00291]前述したようにしてこれらのペプチドをＤＰＰ−ＩＶで前処理し、次いでクローン化されたグルカゴン受容体を発現する組換え細胞系統を用いて、グルカゴン受容体を活性化する能力について解析した。
【０２８６】
実施例５：ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶからの保護を有する改変ＧＩＰ
[00292]本実施例では、ＤＰＰ−ＩＶ活性から保護された改変ＧＩＰ分子を提供する。
【０２８７】
[00293]標準的な固相Ｆｍｏｃ化学反応を用いて以下のペプチドを合成し、Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって精製し、かつ２２０ｎｍの吸光度により定量した。精製したペプチドを質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって解析した：
【化９】
2008509153.tif 000015
【０２８８】
[00294]前述したようにしてこれらのペプチドをＤＰＰ−ＩＶで前処理し、次いでクローン化されたＧＩＰ受容体を発現する組換え細胞系統を用いて、ＧＩＰ受容体を活性化する能力について解析した。
【０２８９】
[00295]前述の考察及び実施例は特定の好ましい実施形態の詳細な説明を提示するに過ぎないことが理解されるべきである。したがって、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々な修正を行い、均等物を作製できることが当業者には明らかなはずである。本特許出願中で特定されるすべての学術論文、他の参考文献、特許、及び特許出願は、その全体が参照により組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０２９０】
【図１】ｐＲＥＸ００９４の制限酵素地図を示す図である。
【図２】プラスミドｐＲＥＸ０１９８の制限酵素地図を示す図である。
【図３】ｐＳＡＣ３５の制限酵素地図を示す図である。
【図４】プラスミドｐＲＥＸ０２４０の制限酵素地図を示す図である。
【図５】ｐＲＥＸ００５２の制限酵素地図を示す図である。
【図６】ｐＲＥＸ０３６７の制限酵素地図を示す図である。
【図７】ｐＲＥＸ０３６８の制限酵素地図を示す図である。
【図８】ＧＬＰ−１及びＨ−ＧＬＰ−１とＤＰＰ−ＩＶとのインキュベーションの経時変化を示すグラフである。グラフは、活性ＧＬＰ−１に特異的なＥＬＩＳＡによって測定した、残存する活性型完全長ペプチドの量を示す。
【図１】
2008509153.tif 000016
【図２】
2008509153.tif 000017
【図３】
2008509153.tif 000018
【図４】
2008509153.tif 000019
【図５】
2008509153.tif 000020
【図６】
2008509153.tif 000021
【図７】
2008509153.tif 000022
【図８】
2008509153.tif 000023
【配列表】
2008509153000001.xml
【国際調査報告】
2008509153.tif 000063
2008509153.tif 000064