(57)【要約】  本発明では、治療の要素として使用するための有効な生物活性のある肝細胞増殖因子の識別法について示す。生物活性は、ｉ）損傷細胞の回復のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル、ならびに／あるいはｉｉ）Ｃ−ｍｅｔ受容体、抗ＨＧＦ抗体またはデキストランなどの多糖類に対して、ＳＰＲを使用する親和性測定またはエピトープマッピング、ならびに／あるいはｉｉｉ）発毛速度に関する動物モデルを使用して、測定することができる。同様に、これらの方法によって、身体の分泌物におけるＨＧＦの活性を評価することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生物活性の測定のための方法であって、ＨＧＦの生物活性が、
ｉ）損傷細胞の回復のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル、および／または
ｉｉ）ｃ−ｍｅｔ受容体、モノクローナル抗ＨＧＦ、ポリクローナル抗ＨＧＦおよび／または多糖類に対して、ＳＰＲを使用する親和性測定および／またはエピトープマッピング、ならびに／あるいは
ｉｉｉ）発毛速度に関する動物モデル
を使用して測定される方法。
【請求項２】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルｉ）がＣＣＬ５３．１細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｉｉ）の前記多糖類がデキストランである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記動物モデルｉｉｉ）がＣ５７／Ｂ６ブラックマウス系統である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＨＧＦの生物活性の測定が、例えば、生物活性のあるＨＧＦを含む医薬組成物の調製のための組換え技術による、バッチ生産後のＨＧＦの品質管理に使用される前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＨＧＦの生物活性の測定が、治療上活性のあるＨＧＦによる治療が必要な患者への投与前に、ＨＧＦ製剤の評価に使用される請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
外因性の治療上活性のあるＨＧＦの損傷部位への適用が必要かどうか判定するために、ＨＧＦの生物活性の測定が、病変部位の、例えば、潰瘍分泌物、尿、糞便、唾液、胸膜などの体組織または体液で内因性ＨＧＦの活性の評価に使用される請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＨＧＦの生物活性の測定が、さまざまなＨＧＦ関連疾患の診断をさらに正確にするために使用される請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記請求項のいずれかに記載のＨＧＦの生物活性に関する評価のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生物活性についての評価法に関する。本法は、例えば、組換え技術による、バッチ生産（batch production）後のＨＧＦの品質管理のため、およびＨＧＦ製剤の評価のために、治療の必要な患者への投与前に使用することができる。また、本評価法は、ＨＧＦ関連疾患の診断およびこれに続く治療選択を向上させるために使用することができる。したがって、本発明は、ＨＧＦの役割を評価するために、潰瘍分泌物、尿、糞便、唾液、胸膜における損傷部位の内因性ＨＧＦの活性を評価し、外因性ＨＧＦの損傷部位への適用が必要かどうかを判定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、細胞損傷に反応して分泌され、特定の器官の再生および創傷治癒のために重要と思われる増殖因子である（Arakaki Nら、 Hepatology 221, 1995）。ＨＧＦは、Ｈ鎖が約６０ｋＤａおよびＬ鎖が約３０ｋＤａのヘテロ二量体で、最初に、不活性前駆体として合成される（Miyazawa Kら、J Biol Chem 268, 1994）。この前駆体は、損傷器官で特定の活性化因子によって活性タンパク質へ切断される（Naka Dら、 J Biol Chem 276, 1992、Nishizaki Tら、J Am Coll Surg 181, 1995）。ＨＧＦは、内分泌作用だけでなく、パラクリン作用を有する（Yanagita K.ら、Biochem Biophys Res Commun 182, 1992、Kono Sら、Biochem Biophys Res Commun 186, 1992）。ＨＧＦの標的細胞は、完全に発育した上皮細胞である（Matsumoto K およびNakamura T. J Gastroenterology Hepatology 6, 1991）。ＨＧＦは、器官損傷部位において産生され、高濃度で存在する（Nayeri Fら、Scand J Infect Dis, 34, 2002）。我々は、以前に、様々な感染症でＨＧＦの全身的産生および局所産生について検討し、胃腸炎などの急性感染症の間に、高濃度の血清ＨＧＦを観察している（Nayeri Fら、Scand J Infect Dis, 34, 2002）。我々は、髄膜炎中に、ＨＧＦの全身的産生の亢進と同時に、脳脊椎液で高濃度のＨＧＦを発見した（Nayeri Fら、 J Infect Dis, 181, 2000）。肺炎患者における呼気凝縮物（exhaled breath condensate）中のＨＧＦ濃度の上昇（Nayeri Fら、Respir Med, 96, 2002）は、ＨＧＦの血清濃度とは相関がなく、肺炎中のＨＧＦの局所産生を示した。さらに、我々は、血清におけるＨＧＦの安定性について研究しており（Nayeri Fら、CYTOLIKE, 2002）、ＨＧＦが試料中（血清／血漿、糞便、呼気凝縮物）で非常に安定しており、数回にわたる凍結−解凍の繰り返し、異なる緩衝液または−２０℃での数年間の保管は、ＨＦＧ濃度に著しい影響を及ぼさないことを発見した。
【０００３】
ＨＧＦは多機能の増殖因子であり、ＨＧＦの再生特性は、肝臓（Ishikiら、1992）、腎臓（Igawaら、1993）、肺（Yanagitaら、1993）および敗血症中（Kondoら、1999）の動物モデルで研究されている。ＨＧＦの標的細胞に対する分裂促進作用が、組織再生および増殖を生じさせるには十分でないことが示唆されている。細胞遊走促進作用および形態形成作用などのＨＧＦの他の機能が再生過程を完了するために必要である（Montesanoら、1991）。ＨＧＦの切断種（truncated species）は、組織再生および修復の最終段階で、ＨＧＦの増殖促進作用に対するアンタゴニストとして機能する可能性があると仮定されている（Chanら、1991）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以前に我々は、外因性ＨＧＦ投与により、治療が困難な慢性の下肢潰瘍の患者を治癒することができることを示している（Nayeriら、Dermatological Treatment, 2002）。最近の二重盲検試験の間、我々は、後に欠陥があることが明らかになった市販の組換えＨＧＦを使用している。試験製剤における、この欠陥成分の使用により、潰瘍の十分な治癒が得られなかった。１年後、これらの患者の一部（ｎ＝４）に活性のある組換えＨＧＦを投与したところ、最初の１週間以内に、かれらの潰瘍に著明な治癒が見られた（表１）。感染症治療におけるＨＧＦの、将来の指標に加えて、抗生物質（ＥＰ０１９６３６４６．３として）の治療的可能性により、治療の要素として使用されるＨＧＦの生物活性について評価することは非常に重要である。
【０００５】
本発明は、生物学的生産物と共に、組換え製剤におけるＨＧＦ活性の評価法について部分的に述べる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本発明の目的は、体液で検出されるＨＧＦに加えて、組換えＨＧＦの生物活性の評価法を提供することである。
【０００７】
本発明のさまざまな他の目的および利点は、本発明の図および以下の記述から明らかになるであろう。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、活性ＨＧＦと相互に作用するＨＧＦ受容体を発現する上皮または内皮の細胞株を使用するＨＧＦ活性の評価のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルについて述べる。特に、マウス皮膚上皮細胞株（ＣＣＬ−５３．１）が使用される。他の実施形態では、本発明は、ＨＧＦの生物活性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価法に関する。ＨＧＦに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体による１つまたは複数の相互作用の生物活性に関する評価において、Ｃ−ｍｅｔ受容体および多糖類の特にデキストランを使用する。これらの相互作用の研究のために、多くの方法が利用可能で、当業者によく知られている。本発明の好ましい実施形態では、BIACORE（スウェーデン、ウプサラ）によって提供された器具を使用する。この技術は、表面プラズモン共鳴法に基づいており、多くの相互作用を並行して調べることができるという点で、非常に効果的である。しかし、もちろん、本発明による方法は、明確にするための記載が、この実施形態に焦点を合わせているとしても、特定の器具に限定されるものではない。
【０００９】
本発明の他の実施形態では、ＨＧＦの生物活性は、マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６）のｉｎ−ｖｉｖｏモデル利用する方法を使用して評価する。
【００１０】
さらなる実施形態では、本発明は、ＨＧＦの生物活性の評価用キットに関する。この種のキットでは、細胞株ＣＣＬ−５３．１は、培養細胞株が損傷し、損傷部位に向けた隣接細胞の運動性がＨＧＦの量および活性に用量依存的に関連する場合に使用する。各々の細胞に対する細胞の粘着性減少による形態形成変化、および細胞の細胞骨格特性の変化による損傷した無毛部位の増大に加えて、損傷部位への細胞の運動性の亢進が見られる。この反応は、ＨＧＦに特異的であって、抗ＨＧＦ抗体によって止めることができる。線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子およびケラチノサイト増殖因子の使用では、そのような影響を細胞に及ぼすことはない。不活性ＨＧＦまたは１ｎｇ／ｍＬより低い用量で活性ＨＧＦを使用することで、細胞の形態学的活性または細胞遊走促進活性を誘発することはない。
【００１１】
他の実施形態では、本発明は、ＨＧＦに対する少なくとも１つのリガンド（ポリクローナルまたはモノクローナルの抗ＨＧＦ抗体またはｃ−ｍｅｔプロトオンコジーン受容体）で固定化されるいくつかのチャネルを有するセンサチップ、および不活性デキストランを有する少なくとも１つのチャンネルからなるプラズモン共鳴バイオセンサー（BIACORE）法を使用するＨＧＦの生物活性評価のためのキットに関する。生物活性のあるＨＧＦは、デキストランおよびアルブミンにだけでなくそのリガンドに高い親和性を有し、一方、生物活性のないＨＧＦは、そのリガンドと相互に作用する場合と作用しない場合があり、デキストランまたはアルブミンとは相互に作用しない。
【発明の効果】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
ＨＧＦの変異体：
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、分子量が約９０ｋＤａの大きなタンパク質である。活性化されると、このタンパク質は、α鎖およびβ鎖に切断される。以前の試験は、ＨＧＦ分子内のＮ末端のヘアピンドメイン、最初のクリングルドメイン、２番目のクリングルドメインまたはセリンプロテイナーゼドメインの欠失が生物活性の全面的な喪失を招くことを示している（Matsumotoら、1991b）。ＨＧＦ分子のα鎖またはβ鎖のいずれかの欠失は、ＨＧＦの活性の完全な喪失を招く（Matsumotoら、1991）。ｃ−ｍｅｔ受容体結合ドメインは、ＨＧＦのα鎖のＮＨ２末端で同定されている（Mizunoら、1994）。また、ＨＧＦの受容体結合および活性で重要な役割を果たす２７残基のヘアピンループの三次元（３Ｄ）モデルは、タンパク質工学および核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術（Zhouら、1998）によって得られている。ドメイン欠失実験の結果および個々のドメインの３Ｄモデルの有用性と共に、ＨＧＦ配列の特徴から、いくつかの試験につながり、ここでは、特定の残基または残基のクラスターが、ＨＧＦ活性におけるこれらの役割を明らかにするために置換されている（Chirgadzeら、1998）。Lokkerら(1994)は、Ｎドメイン内で、受容体結合のために重要な残基について研究している。今まで、多くの個々および群の突然変異について、ヘアピンループ自体の範囲内で、受容体結合にとって重要な残基を特定できなかった。しかし、彼らは、ＮドメインのＣ末端（Ｈｉｓ−１１４、Ｇｌｕ−１１５、Ａｓｐ−１７１）に位置する残基のクラスターが、ＨＧＦの受容体結合および生物活性の両方に関わることを発見した（Lokkerら、1994）。また、彼らは、最初のクリングル内で、少なくとも７種のアミノ酸（Ａｒｇ−１９７、Ｇｌｕ−１８９、Ｔｙｒ−１９８、Ｇｌｕ−１９５、Ａｓｐ−１７１、Ｇｌｎ−１７３およびＳｅｒ−１６１）の置換が、ＨＧＦの受容体結合および生物活性に対して明らかな影響を有することを示している。最も大きな影響は、Ａｒｇ−１９７およびＧｌｕ−１５９の置換で見られ、受容体結合および生物活性が５０倍を超えて減少する（Lokkerら、1994）。ＨＧＦのセリンプロテイナーゼドメインにおけるいくつかの点変異（残基のＧｌｎ−５３４およびＴｙｒ−６７３が、活性セリンプロテイナーゼのＨｉｓおよびＳｅｒ残基に復帰した）は、受容体結合には影響を及ぼさないが、生物活性を著明に減少させた。同様の結果が、Ｖａｌ６９２Ｓｅｒの突然変異で得られた（Lokkerら、1992）。Ｃ末端のクリングル（クリングル４）とセリンプロテイナーゼドメインの間に位置するトリプシン様切断部位での重要な残基の突然変異は、ＨＧＦの単鎖前駆体型（ｐｒｏ−ＨＧＦ）の転換を消失させた。結果として生じる単鎖タンパク質は、ＨＧＦの受容体結合活性を維持するものの、標的細胞に対する生物活性を欠いていた（Lokkerら、1992、Nakaら、1992、Gakら、1992）。
【００１３】
ＨＧＦの生物活性についての評価の重要性
以前のパイロット研究では、高齢患者１１例を対象に、１９の慢性下肢潰瘍うちの１５に対して、局所にゲル状ＨＧＦを１日１回、７日間塗布した。全例が以前に従来の方法によって治療されており、彼らの下肢潰瘍は、１年から１４年の期間でやや安定した状態であった。アレルギー、不快感または疼痛に関するあらゆる徴候が毎日報告された。隣接する無傷の皮膚と比較して、潰瘍の微小循環灌流（microcirculation perfusion）について、（患者７例で）本研究の開始時、１週間後、および再度３カ月後にレーザードップラーによって測定した。また、潰瘍の大きさおよび特徴についても詳細に記録した。我々は、ＨＧＦの血管形成作用に反映する可能性がある微少循環灌流が、治療した潰瘍における潰瘍部位の縮小と統計的に有意な相関を示すことを観察した（ｒ＝０．９４、ｐ＜０．００２）。十分良好な治癒（８４〜１００％の領域縮小）または部分的治癒（５８〜５９％）が患者１１例中８例で認められた。
【００１４】
このパイロット研究中に観察された慢性下肢潰瘍に対する肝細胞増殖因子の正の効果を評価するために、患者２０例を対象にして、市販の組換えＨＧＦを使用した１週間の二重盲検プラセボ対照試験を開始した。本試験は、患者１２例の組み入れ後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより、使用されたタンパク質に欠陥があった（わずか１本の約６０〜６７ｋＤａの鎖が発見された）ことが明らかにされた時点で中断された。潰瘍部位由来の皮膚生検材料の免疫組織化学染色は、正常健常対照（ｎ＝１０）と比較して、患者（ｎ＝１２）では、ｃ−ｍｅｔ受容体の発現が有意に高いことを示した（ｐ＜０．００１）。市販の組換えＨＧＦを含む製剤を投与した患者（第１群、ｎ＝６）で、ｃ−ｍｅｔ発現が減少する傾向が観察されたが（タンパク質のｃ−ｍｅｔ受容体との相互作用を示している可能性がある）、本群と塩化ナトリウム製剤を投与した群（第２群、ｎ＝６）との間の差は有意ではなかった（表１）。第１群では、毛細管増殖の亢進が観察されたが（有意ではない）、劇的な臨床的改善が認められたのは、わずか１例に過ぎなかった。にもかかわらず、第１群の３例および第２群の２例が９カ月以内に治癒した。他の患者７例には、生物活性のある組換えＨＧＦによる治療を申し出て、４例（各群２例）が受け入れた（第３群）。これら当初不成功の全例において、潰瘍の状態の改善が、治療開始から１週間以内に観察された。潰瘍部位のｃ−ｍｅｔ発現が、患者２例で確認され、２例とも１週間の治療後に減少した。
【００１５】
我々は、生物活性のあるＨＧＦが慢性下肢潰瘍の治癒に対して、プラセボ効果によるものでない正の効果を有すると結論を下した。欠陥のある組換えＨＧＦと活性のある組換えＨＧＦの特性について、患者に対する治療効果を有するＨＧＦの生物活性型を特徴付けるために調査した。上記のように、ＨＧＦの分裂促進効果および細胞遊走促進効果は、効果的な治癒プロセスにとって必要とされる。
【００１６】
本発明は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおいてＨＧＦの免疫学的および生物学的特性を調査することによるＨＧＦの生物活性の測定について述べる。
【実施例】
【００１７】
本発明では、治療的処置用として適した生物活性のあるＨＧＦを定義するために、以下の基準を採用している。本発明の方法を使用することで、生物活性のあるＨＧＦは以下の通り。
【００１８】
・ＣＣＬ−５３．１モデルで、１８時間以内に少なくとも５０％の損傷部位の減少を引き起こすはずである。
【００１９】
・ＳＰＲベースの方法において、（２０μｇ／ｍＬ）ｃ−ｍｅｔプロトオンコジーンＨＧＦ受容体だけでなく、（５０μｇ／ｍＬ）固定モノクローナルおよびポリクローナル抗ＨＧＦ抗体に対して同等の親和性を有するはずである。
【００２０】
・ＳＰＲベースの方法において、モノクローナル抗ＨＧＦ抗体に対する親和性より低く、デキストランに対して陰性対照より高い親和性を有するはずである。この親和性は、試料にデキストランを添加すると、消失するはずである。
【００２１】
・免疫組織化学染色によって、またはマウスが無毛部位で完全な発毛を示す時間（１５日未満）を判定することによって判定して、ＨＧＦ治療（少なくとも１００ｎｇ／マウス／日を５日間）の１週間後、無毛部位から採取した皮膚生検材料で、ＰＣＮＡ発現によって判定したマウスの刈毛した皮膚部位より、２倍速い発毛を起こすはずである。
【００２２】
以下の実施例は、本発明の実施形態をさらに説明することを意図するものであって、決して本発明の範囲を制限することを意図していない。
【００２３】
（実施例１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマウスの損傷メラニン形成細胞の回復を加速する肝細胞増殖因子の効果）
以下の材料および条件を使用した。
【００２４】
細胞：マウスの皮膚由来のＣＣＬ−５３．１付着上皮細胞、メラニン形成細胞、黒色腫は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Tissue Cell Collection：ＡＴＣＣ、米国バージニア州Manassas）から入手し、継代数３〜３２で使用した。
【００２５】
増殖因子：組換え肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、好意によりT. Nakamura教授（日本、大阪）から寄贈された。また、ＨＧＦ（RD Systems、ロット：ＱＦ０３１０６２）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、RD Systems、ロット：ＥＸ１６４０１１）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、RD Systems、ロット：Ｄ３３２０７１）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ、RD Systems、ロット番号：Ｊ０１６４０２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ、RD Systems、ロット：ＨＬＭ１１４０３１）は市販のものを購入した。
【００２６】
Nakamura教授から入手した組換えＨＧＦは、患者の慢性潰瘍治療に非常に有効であることが示されたので（実施例４）、本研究では、生物活性のあるＨＧＦの陽性対照として使用している。
【００２７】
細胞培養：ＣＣＬ−５３．１細胞は、３７℃の５％ＣＯ２および９５％空気の雰囲気中で、１５％ウマ血清および２．５％ウシ胎児血清（Sigma-Aldrich、スウェーデン、ストックホルム）を補充したKaighn改変Ham’s Ｆ−１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ）で増殖した。細胞が集密に達した後、非酵素細胞解離液（non-enzymatic cell dissociation solution）（１×）（Sigma-Aldrich）により分離し、１５％ウマ血清および２．５％ウシ胎児血清を補充したＦ−１２Ｋ培地で懸濁し、２４ウェル培養プレート（Nunc Brand Products、デンマーク、ロスキレ（Roskilde））に播種し、集密に達するまで、同一条件下で２４〜４８時間培養した。
【００２８】
無血清培地：７５−ｃｍ２組織培養フラスコ（Nuncolone）で増殖させたＣＣＬ−５３．１細胞の集密状態の培養物をリン酸塩緩衝液（Sigma-Aldrich）で洗い、非酵素細胞解離液により分離し、無血清培地のNutridoma−ＮＳ培地（Roche Diagnostics Scandinavia AB、スウェーデン、ブロンマ（Bromma））で再懸濁し、２４ウェル培養プレートに播種し、集密に達するまで、上記と同一条件下で２４〜４８時間培養した。
【００２９】
損傷アッセイ：集密状態の単層を無菌のスチール器具によってこする。分離細胞をＰＢＳで洗い、ウェルに新鮮培地を加える。細胞に覆われていない正方形部分（ｍｍ２）を顕微鏡（オリンパス）で測定し、各ウェルに記録した。次に、ＨＧＦ（１、５、１０ｎｇ／ｍｌ）を細胞に加え、５％ＣＯ２を含む加湿した雰囲気において、３７℃でインキュベートした。２４および４８時間後、単層に覆われていない部分を再度測定し、記録した。実験は、３通り実施した。３通りの中央値を、１３の個別の実験の平均値の計算に使用した。ヘパリン（Leo Pharma AB、スウェーデン、マルメー（Malmo）、ＳＥ−２０１２４、Box404）を、異なる濃度（範囲１〜１００ＩＥ／ｍｌ）で、ＨＧＦ添加または不添加の傷つけた単層に加えた。
【００３０】
細胞増殖：ＣＣＬ−５３．１細胞は、２４ウェルプレートで、前述のようにウェルあたり１×１０６細胞の密度で培養した（細胞計数マルチサイザー［Cell Counter Multisizer］、KEBO Lab、スウェーデン、スパンガ（Spanga））。集密後、細胞を非酵素細胞解離培地（Sigma Aldrich）で分離した。ＤＮＡ合成は、３Ｈ−チミジンの取り込みを測定することによって判定した。分離ＣＣＬ−５３．１細胞は、２４ウェル培養プレートに播種し、１５％ウマ血清および２．５％ウシ胎児血清を補充したＦ−１２Ｋ培地で、２４時間培養した。その翌日、この培地を新鮮培地に変えて、ＨＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）を３つ一組のウェルに加え、同時に５０μｌの［メチル３Ｈ］チミジン（Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH、テュスクラン）を各ウェルに加えた。前述のように（Betsholtz CおよびWestermark 1984）ＤＮＡアッセイ法を実施する２４時間前に、細胞をインキュベートした。
【００３１】
遊走アッセイ：細胞は、集密になるまで、２４ウェルディッシュの底面に置かれた無菌の円形カバーガラス上で培養し、２４時間後に取り除き、新鮮培地５ｍｌを含むペトリ皿（Nuncolone）にさかさまにして置かれた。ＨＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）をペトリ皿に加え、５％ＣＯ２および９５％の空気の雰囲気において、夜間に３７℃でインキュベートした。次にペトリ皿を光学顕微鏡（オリンパス、東京）で検査し、ガラス周囲の細胞の遊走の長さを７つの部位で測定した。統計解析のために、７回の測定の中央値を、１０回の実験の中央値の平均算出に使用している。
【００３２】
細胞骨格および共焦点顕微鏡：細胞をカバーガラス上で培養した。前述のように、集密な単層を傷つけ、ＨＧＦ１０ｎｇ／ｍｌで２４時間インキュベートした。固定後（４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで、室温で３０分間）、細胞をＫＲＧで３回洗い、１単位のAlexa４８８−ファロイジン（Molecular Probes、オレゴン州）／２００μｌＫＲＧを、細胞入りの各ガラスに加えた。標識は、Bellydancer（Stovall Life Science INC、米国ノースカロライナ州Greensbro）上で、遮光下において、室温で２０分間継続した。標識後、Alexa４８８−ファロイジンは除去し、ガラスをＫＲＧで３×５分間洗い、ProLong（Molecular Probes、オレゴン州）にマウントした。細胞は、励起用の波長４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザーおよび×６０の対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．４）を使用したSarastro 2000共焦点レーザー走査顕微鏡（Molecular Dynamics、カリフォルニア州Sunnyvale）で調査した。一連の水平ｘ−ｙ断面（断面間１．４μｍの距離で）および垂直ｘ−ｚ断面を収集した。３Ｄルックスルー投射を異なる角度で実施し、９０度投射を使用して、対照とＨＧＦ処理細胞の高さを比較した。
【００３３】
免疫蛍光によるＣ−ｍｅｔ／ＨＧＦ／ＳＦ受容体の検出：前述のように、集密な単層を傷つけ、ＨＧＦ１０ｎｇ／ｍｌで２４時間インキュベートした。実験の日、細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳにより室温で３０分間固定した後、ＰＢＳで２回完全に洗浄し、抗体の非特異的結合を遮断するために、室温で１時間、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳからなるブロッキングバッファーでプレインキュベートした。次に、マウスＨＧＦ受容体（Sigma-Aldrich）の細胞外ドメインに対するウサギのポリクローナル抗体（ブロッキングバッファーで１：５０に希釈）により、室温で６０分間単層をインキュベートした。細胞を上記のように洗い、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５０）（Sigma-Aldrich）により標識した。室温で６０分間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、１７％ Gelvatol／ＰＢＳでマウントし、落射蛍光顕微鏡使用（epifluorescence microscopy）（Zeiss Axioskop）で検査した。
【００３４】
（実施例１ａ）：細胞増殖：対照およびＨＧＦ処理ウェルにおけるＣＰＭ（カウント／毎分）比は以下のようであった。２ｎｇＨＧＦ／対照＝１．１（０．９５〜１．２０）、５ｎｇＨＧＦ／対照＝１．１（１．０４〜１．１８）および１５ｎｇＨＧＦ／対照＝１．１５（０．９９〜１．２３）。したがって、上皮細胞株（ＣＣＬ−５３．１）における細胞増殖は、［３Ｈ］チミジン取り込み測定による評価で、組換えＨＧＦにより著しく増加しなかった。
【００３５】
（実施例１ｂ）：損傷部位の回復：損傷した単層の回復に対するＨＧＦの効果を、ｉｎ−ｖｉｔｒｏの損傷モデルを使用して評価した。むきだし部分は、２４時間および４８時間後に減少した。損傷時と２４時間後との測定されたむきだし部分の比は、ＨＧＦ処理の方が（損傷時＝１２５．２５±１０．０８ｍｍ２、２４時間後＝４６．７３±１１．０３ｍｍ２、比＝２．６５、ｐ＜０．０１、４８時間後＝１０．２６±４．７６ｍｍ２、比＝１１．９１）対照（損傷時＝１３３．７７±１１．７ｍｍ２、２４時間後＝１１２．２３±１１．１１ｍｍ２、比＝１．１５、４８時間後＝７５±１３．１７ｍｍ２、比＝２．４３）と比較して、有意に高かった（図１）。従来の培地または血清除去した培地との間に、ＨＧＦ添加後の損傷細胞の回復において有意差は認められなかった。上皮回復の有意な亢進が、低濃度（１ｎｇ／ｍｌ）のＨＧＦで観察された。１０ｎｇ／ｍｌまでのＨＧＦの用量増加は、さらなる回復の増進を引き起こした（対照と１ｎｇ／ｍｌの間でｐ＜０．０１、１ｎｇ／ｍｌと５ｎｇ／ｍｌの間でｐ＜０．０１、５ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌの間でｐ＝０．０５）（図２）。ＦＧＦ（１〜１５ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２〜６０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＤＧＦ（１〜３５ｎｇ／ｍｌ）、またはＦＧＦ／ＫＧＦ（１〜１５ｎｇ／ｍｌ）の添加は、損傷細胞の回復に有意な影響を及ぼさなかった。
【００３６】
ｃ−Ｍｅｔ受容体を、ウェル内で免疫蛍光によって視覚化した。ＨＧＦの添加後または未処理の対照において、損傷部から遠位の他の細胞と比較して、むきだし部位に隣接する細胞でのｃ−Ｍｅｔ発現における本法による有意差は認められなかった（図３）。
【００３７】
（実施例１ｃ）：細胞運動性：ＨＧＦ添加後のガラス層からの遊走距離（ｍｍ）について、未処理の対照と比較した。ＨＧＦ添加後の上皮細胞の遊走亢進が示された（ＨＧＦ処理ペトリ皿で平均１０．６±１．６６ｍｍ、対照で１．２±０．５１ｍｍ）（ｐ＜０．０１）（図４）。
【００３８】
（実施例１ｄ）：形態および細胞骨格：上皮細胞ＣＣＬ−５３．１の形態は、ＨＧＦ処理細胞において異なった。未処理のウェルでは、細胞は、より小さい細胞内空間で、円形の高密度の団集花序状に集まったが、ＨＧＦ処理ウェルでは、平らになり、広がった形態であった。共焦点顕微鏡技術によって作られる３Ｄ再構築によって、我々は、ＨＧＦ添加後のアクチン構造に著しい変化が認められ、未処理細胞と比較して、高密度の末梢構造でＦ−アクチンがより少ないことを発見した（図５および６）。
【００３９】
上記の例は、どの程度損傷したＣＣＬ−５３．１上皮細胞を、ＨＧＦの生物活性を検査するために用いることができるかを示している。生物活性のあるＨＧＦは、損傷後の損傷ＣＣＬ−５３．１上皮細胞の回復を用量依存的に亢進する。これらの結果は、ＨＧＦ処理後に細胞遊走促進効果が亢進し、最終的に、その結果として、細胞骨格構造が弱まることによって部分的に説明することができる。上記の知見は、活性ＨＧＦに特有であって、非活性ＨＧＦまたはＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＫＧＦは、細胞に対して同一な効果を誘発することができなかった。
【００４０】
（実施例２：表面プラズモン共鳴法（Biacore）によって示される生物活性のある肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の特性）
以下の材料および条件を使用した。
【００４１】
ＳＰＲ測定およびリガンド固定化手順。ＳＰＲ測定は、それぞれ４つおよび２つのフローセルを備えた全自動Biacore 2000測定器および半自動Bicaore Ｘ測定器（Biacore AB、スウェーデン、ウプサラ）によって、７６０ｎｍで実施した。フローセルの温度は、すべての実験で２５℃であった。使用した試料表面は、Biacore AB（スウェーデン、ウプサラ）から購入したカルボキシメチル化デキストランＣＭ５チップであった。デキストランヒドロゲルのカルボン酸基に対するリガンドの結合は、２００ｍＭ  ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド）および５０ｍＭ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を使用した従来のカルボジイミドの化学的作用によって実施した。活性化にかかる時間は７分で、２〜７分後にリガンドの注入を行った。残留する活性エステルの不活性化は、ｐＨ８．５のエタノールアミン／塩酸塩を７分注入することによって実施した。５μｌ／分の流速をすべての固定化の間に使用した。すべてのリガンドは、ｐＨ４．５の１０ｍＭアセテート緩衝液で希釈した（すなわち、タンパク質の等電点を下回るので、デキストランマトリックスとリガンドの間の静電的相互作用を亢進する）。モノクローナル抗ＨＧＦ（５００μｇ／ｍｌ）を１：１０に希釈し、およびポリクローナル抗ＨＧＦも。組換えＭｅｔプロトオンコジーン受容体（１００μｇ／ｍｌ）は１：５に希釈し、ＨＧＦ組換え体（５μｇ／ｍｌ）は１：３に希釈した。接触時間は、２分から７分の間で変えて、８，０００〜３０，０００ＲＵ（反応単位）の固定化レベルを得た。不活性化後、表面は、その後に、ｐＨ２．０の５ｍＭグリシン緩衝液と１Ｍ塩化ナトリウムを１分間、５回注入することにより洗浄した。フローセルの１つは、デキストランに対するＨＧＦの特異的な相互作用だけでなく、緩衝液および非特異的な相互作用による反応を監視するための基準として使用した。このフローセルは、固定化処置の間は、他のフローセルと同様に処理を行ったが、リガンドの固定化工程は除外した。
【００４２】
（実施例２ａ：デキストランに対するＨＧＦの結合）
生物活性のあるＨＧＦは、デキストランに対して高い親和性を持ち、試料へのデキストラン（０．０５％）添加により、固定化されたモノクローナルおよびポリクローナル抗ＨＧＦ抗体との、フローセルならびにデキストラン経路におけるシグナル応答が有意に減少した（ｐ＜０．０５）（図７および８）。
【００４３】
（実施例２ｂ：リガンドへの結合）
生物活性のあるＨＧＦは、生物活性のないＨＧＦと比較して、固定化されたモノクローナル抗ＨＧＦ抗体（ｐ＝０．００５）またはｃ−Ｍｅｔ受容体（ｐ＝０．０２）とのフローセルにおけるシグナル応答が有意に高い（図７および８）。
【００４４】
（実施例２ｃ：ＥＬＩＳＡとの相関）
免疫反応性ＨＧＦは、市販のキット（Quantikine HGF Immunoassy、R&D Systems Inc.、米国Minneapolis）を使用してＥＬＩＳＡによって判定した。生物活性のあるＨＧＦをＳＰＲによる判定を用いて検査すると、結果は、ＥＬＩＳＡによって測定した水準と有意に相関した。不活性ＨＧＦを使用すると、ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲの結果は相関しなかった。
【００４５】
（実施例２ｄ：固定化レベルを変える影響）
固定化されたモノクローナル抗ＨＧＦ抗体の量によるシグナル応答の影響について、異なる試料で測定した。固定化中に接触時間を増加することにより（１、５および１０分）固定化レベルを増やすことで、生物活性のあるＨＧＦを含むすべての試料の反応に有意な増加を生じた。流速を変更することでは（５、１０および１５μｌ／分）、試料の反応に有意な影響を及ぼさなかった。
【００４６】
上記の実施例は、生物活性のあるＨＧＦがデキストランに対して高い親和性を有すると思われ、これは細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン結合部位に対するそのような親和性に類似している可能性のあることを示している。これらの結合部位は、抗体結合エピトープと重複するか、デキストランと結合するとすぐに、ＨＧＦのコンホメーション変化を誘発し、この結果、立体的障害になり、したがって、抗体への結合を妨げる。
【００４７】
（実施例３：マウスの正常な無毛の皮膚に対する生物活性のある組換えヒト肝細胞増殖因子（ｒＨＧＦ）の局所投与の影響）
マウス１８匹（Ｃ５７／Ｂ６ブラック、１４〜１６週齢、体重２１〜２９ｇ、全マウスが雌）の背部を剪毛し、これにより、右側および左側に、２つの１×１ｃｍの部分ができた。次に、マウスを３群に割り付けた。第１群（ｎ＝６）は、０．７０μｇ／ｋｇ（１２〜１８ｎｇ／ｃｍ２無毛の皮膚）の組換えヒト肝細胞増殖因子（ｒＨＧＦ）を、右側に毎日５日間皮下に処置した。利用されたＨＧＦは、試験前にＣＣＬ−５３．１細胞の損傷分析（wound assay）に加えて、ＦＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって検査した。このＨＧＦ型は、ＳＰＲよる判定で、デキストランおよびＨＧＦに対する抗体に高い親和性を持ち、ＥＬＩＳＡによって得た濃度と相関した。組換えＨＧＦは、ＣＣＬ−５３．１細胞の損傷部位への用量依存的な遊走を引き起こした。この効果は、抗ＨＧＦ抗体によって停止させることができた。第２群（ｎ＝６）には、ＳＰＲによってデキストランに対する親和性が認められなかった組換えＨＧＦ  ０．７０μｇ／ｋｇを５日間皮下投与したが、損傷分析において、ＣＣＬ−５３．１の遊走は生じなかった。第３群（ｎ＝６）には、無菌の生理的塩化ナトリウムを５日間皮下投与した。本群は対照群とした。治療コース中または後に、非忍容性、または疾患の何らかの徴候はいずれの治療群においても示されなかった。治療下で、発毛におけるいくつかの有意差は、明らかに見られなかったが、我々は、１２日後、第１群のマウス５匹が、両側で完全に発毛したことを見て驚いた（図９）。第２群および第３群では、同じプロセスに非常に長い時間がかかった（２０〜３５日）。したがって我々は、マウスの正常な、無毛の皮膚に対する適量の生物活性のあるＨＧＦによる局所治療は、発毛を促進し、この局所治療が、問題のない動物では忍容性を有すると結論する。
【００４８】
（実施例４：静脈血流不全症患者の慢性下肢潰瘍に対する組換え肝細胞増殖因子の治療効果−症例報告）
最近のパイロット研究期間中に観察された慢性下肢潰瘍に対する肝細胞増殖因子の正の効果を評価するために、患者２０例を対象にして、市販の組換えＨＧＦを１週間使用する二重盲検プラセボ対照試験を開始した。本試験は、患者１２例の組み入れ後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより、使用されたタンパク質に欠陥があったことが明らかにされた時点で中断された。潰瘍部位由来の生検材料の免疫組織化学染色は、ＨＧＦ受容体（ｃ−ｍｅｔ）の発現が、塩化ナトリウム製剤を投与した患者（第２群、ｎ＝６）と比較して、市販の組換えＨＧＦを含む製剤を投与した患者（第１群、ｎ＝６）で有意ではないが減少することを示した。このことはタンパク質のｃ−ｍｅｔ受容体との相互作用を示す可能性がある。第１群で、毛細管増殖の増進が観察されたが、劇的な臨床的改善が認められたのは、わずか１例に過ぎなかった。にもかかわらず、第１群の３例および第２群の２例が９カ月以内に治癒した。他の患者７例には、生物活性のある組換えＨＧＦによる治療を申し出て、４例（各群２例）が受け入れた（第３群）。これら当初不成功の全例で、潰瘍の状態の改善が、治療開始から１週間以内に観察された。我々は、生物活性のあるＨＧＦが慢性下肢潰瘍の治癒に対して、プラセボ効果によるものでない正の効果を有すると結論を下した。
【００４９】
（実施例５：ＳＰＲによるＨＧＦエピトープマッピング）
（実施例５ａ：抗体親和性）
ＨＧＦ（Santa Cruz）に対するエピトープ特異的ないくつかの抗体をＳＰＲのフローセルに固定化することによって、我々は、生物活性のあるＨＧＦまたは生物的に不活性な組換えＨＧＦの多くの特性を判定することに成功している。
【００５０】
１−生物活性のあるＨＧＦは、ＨＧＦのα鎖およびβ鎖で異なるエピトープに対して一定の親和性を有する。
【００５１】
２−生物活性のないＨＧＦでは、Ｎ−１７（ヒト由来のＨＧＦαのＮ末端におけるペプチドマッピングに対する抗体）により固定化されたフローセルに対する親和性は、減少または無効になった。
【００５２】
Ｈ−１７０（ヒト由来のＨＧＦβのアミノ酸１〜１７０に対して作られる抗体）に対する親和性は減少した。
【００５３】
ｃ−ｍｅｔ受容体およびＨ−１４５（ヒト由来のＨＧＦαのアミノ酸３２〜１７６に対する抗体）の親和性は維持した。
【００５４】
（実施例５ｂ：ＨＧＦ受容体結合エピトープ）
ＳＰＲを使用して、我々は、ＨＧＦのｃ−ｍｅｔ受容体への結合において重要なエピトープを確認することに成功している。我々は、ＨＧＦがｃ−ｍｅｔ受容体と結合する時、Ｈ−１４５（ヒト由来のＨＧＦαのアミノ酸３２〜１７６に対する抗体）およびＣ−２０（ヒト由来のＨＧＦαのＣ末端におけるペプチドマッピングに対して作られた抗体）に結合するＨＧＦのエピトープが関与していることを明らかにしている。依然として、ＨＧＦがｃ−ｍｅｔ受容体と相互作用を持つ間に、Ｎ−１７（ヒト由来のＨＧＦαのＮ末端におけるペプチドマッピングに対する抗体）、Ｎ−１９（ヒト由来のＨＧＦβのＮ末端におけるペプチドマッピングに対する抗体）およびＨ−１７０（ヒト由来のＨＧＦβのアミノ酸１〜１７０に対して作られる抗体）と相互に作用する他のエピトープが利用可能である。
【００５５】
我々が試験した不活性ＨＧＦ組換え型において、エピトープに結合する受容体は、損傷がなかったが、α鎖のＮ−１７およびβ鎖のＨ−１７０と相互に作用するドメインは欠陥があった。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】傷害後の２４時間および４８時間以内の対照（単色）および活性ＨＧＦで治療した細胞における回復を示す図である。
【図２】異なるＨＧＦ濃度（１、５および１０ｎｇ／ｍｌ）および２４時間以内の回復の相違を示す図である。
【図３】免疫蛍光法によるＣＣＬ−５３．１細胞におけるｃ−Ｍｅｔ受容体の局在化を示す図である。本図で見られるように、免疫蛍光による受容体の提示で、生物活性のあるＨＧＦでの治療（Ａ）と対照（Ｂ）の間に相違が認められない。しかし、損傷したむきだし部分の減少が、（Ｂ）と比較して、（Ａ）で明白に見られる。
【図４】遊走アッセイを示す図である。右側の写真は、生物活性のあるＨＧＦの添加後の細胞の遊走を示し、左側の写真は、対照細胞を示している。矢印は、円形のカバーガラスの縁を示している。
【図５】アクチン構造のファロイジン染色後の対照（左側）と活性ＨＧＦ処理細胞（右側）を比較した共焦点顕微鏡写真および３Ｄルックスルー投射図（3D look-through projection）である。両群間の細胞壁径の差異に留意のこと。
【図６】生物活性のない細胞（左側）と対照細胞（右側）の間の形態学的相違を示す図である。
【図７】デキストラン（０．０５％）の添加前（左側の最初のシグナル）および添加後（２番目のシグナル）の生物活性のあるＨＧＦのＳＰＲ反応を示す図である。再生パルスは、各シグナルの後に観察される。
【図８】生物活性のあるＨＧＦおよび生物活性のないＨＧＦからのＳＰＲシグナル間の相違を示すヒストグラムである。
【図９】生物活性のあるＨＧＦを５日間皮下投与したマウス（左側および右側）および無菌塩化ナトリウムを５日間皮下注射した対照マウス（中央）の発毛の相違を示す図である。写真は、最初の注射の１２日後に撮影された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月25日(2007.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）試料が、生物活性があるまたはないＨＧＦを、包含するかどうかを測定するための方法であって、ＨＧＦの生物活性が、
ｉ）ＨＧＦの生物活性を陽性対照と比較する、損傷細胞の回復のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル、および／または
ｉｉ）ｃ−ｍｅｔ受容体、モノクローナル抗ＨＧＦ、ポリクローナル抗ＨＧＦおよび多糖類の使用からなる群から選択されるＨＧＦへの特異的リガンドを使用する、親和性測定および／またはエピトープマッピング
を使用して測定される方法。
【請求項２】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルｉ）がＣＣＬ５３．１細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｉｉ）の前記多糖類がデキストランである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＨＧＦの生物活性の測定が、例えば、生物活性のあるＨＧＦを含む医薬組成物の調製のための組換え技術による、バッチ生産後のＨＧＦの品質管理に使用される請求項１−２のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＨＧＦの生物活性の測定が、治療上活性のあるＨＧＦによる治療が必要な患者への投与前に、ＨＧＦ製剤の評価に使用される請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
外因性の治療上活性のあるＨＧＦの損傷部位への適用が必要かどうか判定するために、ＨＧＦの生物活性の測定が、病変部位の、例えば、潰瘍分泌物、尿、糞便、唾液、胸膜などの体組織または体液で内因性ＨＧＦの活性の評価に使用される請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＨＧＦの生物活性の測定が、さまざまなＨＧＦ関連疾患の診断をさらに正確にするために使用される請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記請求項のいずれかに記載のＨＧＦの生物活性に関する評価のためのキット。
【国際調査報告】
2008516629.tif 000011
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2008516629.tif 000016
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