(57)【要約】  本発明は、一般的に、心不全に関し、そして具体的には、心不全患者由来のリンパ球におけるβ−アドレナリン受容体キナーゼ（βＡＲＫ１）レベルを監視することによって、心不全患者を評価する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における心臓β−アドレナリン受容体キナーゼ（βＡＲＫ１）レベルを監視する方法であって、前記患者のリンパ球におけるβＡＲＫ１レベルを監視することを含み、βＡＲＫ１のリンパ球レベルにおける改変が、前記患者の心臓βＡＲＫ１レベルにおける改変の指標となる、前記方法。
【請求項２】
前記リンパ球におけるβＡＲＫ１のレベルが、前記リンパ球におけるβＡＲＫ１タンパク質レベルをアッセイすることによって決定される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記βＡＲＫ１タンパク質レベルがＥＬＩＳＡによってアッセイされる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記βＡＲＫ１タンパク質レベルが、βＡＲＫ１特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングによってアッセイされる、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記リンパ球におけるβＡＲＫ１のレベルが、前記リンパ球におけるβＡＲＫ１  ｍＲＮＡレベルをアッセイすることによって決定される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記βＡＲＫ１  ｍＲＮＡレベルが定量的ＲＴ−ＰＣＲによってアッセイされる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記患者が心不全を患っている、請求項１記載の方法。
【請求項８】
心不全を患っている患者における心臓機能を監視する方法であって、第一の時点および第二の時点での、前記患者のリンパ球におけるβＡＲＫ１のレベルを比較することを含み、前記の第一の時点に比較した前記の第二の時点でのリンパ球βＡＲＫ１レベルにおける減少が、前記の第二の時点での前記患者における心臓機能の改善の指標となり、そして前記の第一の時点に比較した前記の第二の時点でのリンパ球βＡＲＫ１レベルにおける上昇が、前記の第二の時点での前記患者における心臓機能の減少の指標となる、前記方法。
【請求項９】
前記の第一の時点および第二の時点が、それぞれ、心不全に関する前記患者の治療の前および後であり、前記の第一の時点に比較した前記の第二の時点での前記リンパ球βＡＲＫ１レベルの変化の欠如または上昇が、前記治療に対する反応の欠如の指標となる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
患者におけるβＡＲＫ１活性の心臓レベルを監視する方法であって、前記患者のリンパ球におけるβＡＲＫ１活性レベルを監視することを含み、βＡＲＫ１活性のリンパ球レベルにおける改変が、前記患者のβＡＲＫ１活性の心臓レベルにおける改変の指標となる、前記方法。
【請求項１１】
前記患者が心不全を患っている、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
心不全を患っている患者における心臓機能を監視する方法であって、第一の時点および第二の時点での、前記患者のリンパ球におけるβＡＲＫ１活性のレベルを比較することを含み、前記の第一の時点に比較した前記の第二の時点でのリンパ球βＡＲＫ１活性レベルにおける減少が、前記の第二の時点での前記患者における心臓機能の改善の指標となり、そして前記の第一の時点に比較した前記の第二の時点でのリンパ球βＡＲＫ１活性レベルにおける上昇が、前記の第二の時点での前記患者における心臓機能の減少の指標となる、前記方法。
【請求項１３】
前記の第一の時点および第二の時点が、それぞれ、心不全に関する前記患者の治療の前および後であり、前記の第一の時点に比較した前記の第二の時点での前記リンパ球βＡＲＫ１活性の変化の欠如または上昇が、前記治療に対する反応の欠如の指標となる、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年１１月８日出願の仮出願第６０／６２５，７１９号から優先権を主張し、該出願の内容は本明細書に援用される。
【０００２】
本出願は、一般的に、心不全に関し、そして具体的には、心不全患者由来のリンパ球におけるβ−アドレナリン受容体キナーゼ（βＡＲＫ１またはＧＲＫ２）レベルを監視することによって、心不全患者を評価する方法に関する。
【技術背景】
【０００３】
背景
β−アドレナリン受容体（βＡＲ）は、心臓変力性および変時性の交感神経系調節を直接仲介する。成人心筋細胞は、主にβ１−およびβ２−ＡＲを発現し、β１−ＡＲが最も豊富なサブタイプである（＞７５％）（Ｂｒｏｄｄｅ，  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ９１：３５−４０（１９９６））。アゴニスト結合後、どちらのサブタイプも、主に、Ｇタンパク質Ｇｓに共役し、心筋細胞において、アデニリルシクラーゼの活性化および第二メッセンジャーｃＡＭＰ産生の増進を導く（Ｓｔｉｌｅｓら，  Ｃａｒｄｉａｃ  ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．  ３５：１４９−６４（１９８４））。慢性ヒト心不全（ＨＦ）において、心室機能の悪化は、β１−ＡＲ密度の減少および残りのβＡＲの機能的脱共役の両方を含む、心臓βＡＲシグナル伝達の改変と関連する（Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：２０６−１２（２００２））。この後者の現象は、脱感作として知られ、そしてＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）キナーゼ（ＧＲＫ）によるアゴニスト占有βＡＲのリン酸化によって誘発される（Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：２０６−１２（２００２））。β１−およびβ２−ＡＲはどちらも、ＧＲＫによってリン酸化可能であり、そして心臓において、主なＧＲＫは、βＡＲキナーゼ（βＡＲＫ１）としても知られる、ＧＲＫ２であるようである（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，  Ｃｅｌｌ．  ７４：４０９−１２（１９９３））。
【０００４】
βＡＲＫｌ（またはＧＲＫ２）は、活性化ヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧβγサブユニットへの結合を通じて膜に局在する細胞質ゾル酵素である（Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：２０６−１２（２００２）、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，  Ｃｅｌｌ．  ７４：４０９−１２（１９９３）、Ｐｉｅｒｃｅら，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３：６３９−５０（２００２））。該キナーゼは、該キナーゼの心筋過剰発現を伴うトランスジェニックマウスにおいて立証されるように、心臓βＡＲシグナル伝達および機能の調節において、役割を果たす（Ｋｏｃｈら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１３５０−３（１９９５））。これらのマウスにおいて、βＡＲ刺激に反応したｃＡＭＰ産生および心臓収縮性は、βＡＲＫ１が３〜４倍増加すると、有意に減少した（Ｋｏｃｈら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１３５０−３（１９９５））。さらに、βＡＲＫ１活性または発現が心臓において減少したマウスにおける研究によって、βＡＲシグナル伝達および心臓機能の増加が示された（Ｋｏｃｈら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１３５０−３（１９９５）、Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：１８１８０−４（１９９８））。これらの研究は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、心臓βＡＲシグナル伝達にβＡＲＫ１レベルが決定的に依存していることを証明した最初のものであった。ヒトＨＦにおいて、ならびに動物モデルにおいて、βＡＲＫ１の心筋発現および活性の特徴的な上昇があるため、βＡＲＫ１の心筋レベルは、能動的に制御されているようである（Ｕｎｇｅｒｅｒら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８７：４５４−６３（１９９３）、Ｕｎｇｅｒｅｒら，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ７４：２０６−１３（１９９４）、Ｍａｕｒｉｃｅら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７６：Ｈ１８５３−６０（１９９９）、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  ３３：４０２−７（１９９９）、Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９５：７０００−５（１９９８）、Ｐｉｎｇら，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７３：Ｈ７０７−１７（１９９７）、Ｈａｒｒｉｓら，  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ９６：３６４−８（２００１））。βＡＲＫ１のこの増加（２〜３倍）は、障害が起こった心筋に見られるβＡＲ脱感作増進の原因となるようである（Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９５：７０００−５（１９９８）、Ｐｉｎｇら，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７３：Ｈ７０７−１７（１９９７）、Ｈａｒｒｉｓら，  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ９６：３６４−８（２００１）、Ｗｈｉｔｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ．  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９７：５４２８−３３（２０００））。βＡＲＫｌは、β−アレスチンとしてヒトＨＦにおいて改変される、主なβＡＲ制御分子であるようであり、そしてＧＲＫ３は、衰えつつあるヒト心臓において改変されない（Ｕｎｇｅｒｅｒら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８７：４５４−６３（１９９３）、Ｕｎｇｅｒｅｒら，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ７４：２０６−１３（１９９４））。心筋における別の主なＧＲＫであるＧＲＫ５は、いくつかの動物モデルにおいて、上方制御されることが示されてきているが、ヒトＨＦでは研究されてきていない（Ｐｉｎｇら，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７３：Ｈ７０７−１７（１９９７）、Ｖｉｎｇｅら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２８１：Ｈ２４９０−９（２００１））。
【０００５】
βＡＲシグナル伝達の分子異常のヒトＨＦ病因への関連性、およびおそらくより重要なことにはＨＦ転帰への関連性は、完全には理解されていない。βＡＲシグナル伝達の重要な側面は、循環白血球におけるシステムの特性が、固形組織において観察されるものを正確に映し出すようであることである。これは、１９８６年（Ｂｒｏｄｄｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：１５８４−５（１９８６））に、心臓において最初に観察され、そして多くの他の報告もまた、リンパ球システムを用いて、βＡＲシグナル伝達を研究し、そして心臓βＡＲシステムに対する推定を行ってきている（Ｂｒｉｓｔｏｗら，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  ７０：Ｓ１０５−１３（１９９２）、Ｊｏｎｅｓら，  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ８：５６２−６（１９８６）、Ｓｕｎら，  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ２４：１６５４−９（１９９６）、Ｄｚｉｍｉｒｉら，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２３：４９８−５０２（１９９６））。
【０００６】
最近、実験モデルにおいて、多くのデータが集積してきており、このことから、衰えつつある心筋におけるβＡＲＫ１発現および活性の増加が、ＨＦの病因に寄与しうることが示唆される（Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：２０６−１２（２００２））。本発明は、少なくとも部分的に、ヒトＨＦの発展および重症度における、心臓βＡＲシグナル伝達およびβＡＲＫ１活性の価値を調べるために設計された研究から生じる。これらの研究は、血液および心臓（右心房）βＡＲＫ１レベルが直接の様式で相関することを立証している。本発明は、したがって、リンパ球βＡＲＫ１含量および活性を監視することによって、ＨＦ重症度を評価する方法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＨＦ患者のリンパ球におけるβＡＲＫ１レベルを監視することによって、こうした患者の状態を評価する方法に関する。リンパ球におけるβＡＲＫ１レベルの上昇は、心臓βＡＲＫ１レベルの上昇と相関し、そして望ましくない予後と関連する。
【０００８】
本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、リンパ球βＡＲＫ１レベルを測定することによって、ＨＦ患者を評価する方法に関する。本発明は、血液および心臓βＡＲＫ１レベル、ならびにＧＲＫ活性が、直接の様式で相関することを立証する研究から生じる。したがって、リンパ球βＡＲＫ１含量は、心臓βＡＲＫ１レベルを監視し、そして心筋βＡＲシグナル伝達およびＨＦ重症度の指標を提供する、より容易にアクセス可能な手段として働きうる。βＡＲＫ１レベルおよび／または活性を監視して、ＨＦにおける療法の進行を監視することも可能であり、βＡＲＫ１レベルの上昇は、βＡＲ反応性の減少およびＨＦ患者の好ましくない予後と関連する。
【００１０】
本発明にしたがって、患者からリンパ球を収集し、そしてβＡＲＫ１タンパク質レベル、ＧＲＫ活性および／またはβＡＲＫ１  ｍＲＮＡ含量に関してアッセイしてもよい。より具体的には、患者血液を収集し、そして例えばＥＤＴＡを用いて抗凝固処理してもよい。Ｆｉｃｏｌｌ勾配（Ｃｈｕａｎｇら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：６８８６−６８９２（１９９２））、または他の好適な手段によって、リンパ球を単離してもよい。次いで、リンパ球をさらにプロセシングするか、または凍結保存（例えば−８０℃）してもよい。
【００１１】
多様な方法のいずれを用いて、βＡＲＫ１タンパク質レベルを決定してもよい。例えば、リンパ球をプロセシングして、そして界面活性剤含有緩衝液を用いて溶解してもよく（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：１７８３−１７８９（１９９８））、そしてβＡＲＫ１特異的抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を用いたＥＬＩＳＡ技術（Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：８８７５−８８８５（１９９９））またはウェスタンブロッティングによって、細胞質ゾル抽出物中のβＡＲＫ１タンパク質レベルを検出してもよい。適切な抗体の例には、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カタログ番号ＳＣ−５６１）のポリクローナル抗体（Ｃ−２０）および例えばβＡＲＫ１のカルボキシル末端内のエピトープに対して作製されたモノクローナル抗体（Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：７６４９（１９９６））が含まれる。こうした抗体は、例えば、Ｕｐｓｔａｔｅ（例えばクローンＣ５／１、カタログ番号０５−４６５）を通じて、商業的に入手可能である。例えばＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて、生じたオートラジオグラフィーフィルムをスキャンすることによって、免疫反応性βＡＲＫ１の定量化を達成してもよい。あるいは、標準的増強化学発光を用いて、βＡＲＫ１の視覚化を達成してもよく（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：１７８３−１７８９（１９９８））、このためのキットが商業的に入手可能である。βＡＲＫ１タンパク質レベルを決定する他のアプローチには、ＥＬＩＳＡ法および免疫蛍光法（Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：８８７５−８８８５（１９９９））が含まれる。上記でリンパ球の使用に言及しているが、βＡＲＫ１レベルは、潜在的に、血清を用いて測定可能である。
【００１２】
βＡＲＫ１タンパク質レベルに加えて、細胞抽出物において、細胞質ゾルＧＲＫ活性もまたアッセイ可能である（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：１７８３−１７８９（１９９８））。任意の好適な手段が使用可能であるが、好ましいのは、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いた、ロドプシンが豊富な桿体外部セグメント膜の光依存性リン酸化に基づくアッセイである（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：１７８３−１７８９（１９９８）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３３：３９６−４０１（１９９９）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３８：５５−６０（２００１）、Ｃｈｏｉら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：１７２２３−１７２２９（１９９７））。可溶性ＧＲＫ活性は、主にβＡＲＫ１活性に相当する。（Ｄｅ  Ｂｌａｓｉら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：２０３−２１０（１９９５）もまた参照されたい。）ロドプシンに加えて、適切なペプチド基質を用いて、ＧＲＫ２活性をアッセイしてもよい（Ｐｉｔｃｈｅｒら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：２４９０７−２４９１３（１９９６））。
【００１３】
上述のように、本発明の方法はまた、リンパ球におけるβＡＲＫ１  ｍＲＮＡレベルの測定に基づいてもよい。ノーザンブロット分析（例えば、Ｄｅ  Ｂｌａｓｉら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：２０３−２１０（１９９５）を参照されたい）またはＳＹＢＲ緑色蛍光方法論を用いたリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｏｓｔら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ，  印刷中（２００４年１２月））を含む、多様なアプローチのいずれを用いて、βＡＲＫ１  ｍＲＮＡを測定してもよい。
【００１４】
前述の記載を読むことによって、患者スクリーニングの初期段階に、本アプローチを用いることが可能であることが認識されるであろうし、この場合、患者リンパ球に存在するβＡＲＫ１タンパク質、ｍＲＮＡおよび／または活性レベルを、対照（非疾患）レベルに比較する。入手可能なデータは、βＡＲＫ１タンパク質の正常（対照）レベルがおよそ１００ｎｇ／ｍｌ全血であることを示す。対照レベルを超えた約５０％以上の増加は、「高い」と見なされうる。実際には、βＡＲＫ１レベルを患者のベースライン心臓機能と相関させてもよい。本方法を用いて、多様な措置（例えば薬剤措置）開始後の異なる時点で、βＡＲＫ１タンパク質、ｍＲＮＡおよび／または活性のリンパ球レベルを比較することによって、患者の状態を追跡する（例えば療法介入後）こともまた可能である。したがって、本発明は、療法（例えばＡＣＥ阻害剤、ＡＴ１アンタゴニスト、およびβ遮断剤の使用）およびβＡＲシグナル伝達に対する方法（βＡＲ遮断を含む）の効果を監視する方法を提供する。機会があったら（心臓手術中など）、心筋組織試料を採取して、血液および組織βＡＲＫ１レベル間の相関を確実にしてもよい。
【００１５】
以下の実施例に提示するデータは、ヒト心臓におけるβＡＲ機能不全の設定におけるβＡＲＫ１の非常に重要な関連性を立証する。具体的には、データは、血液試料におけるβＡＲＫ１測定を用いて、心筋におけるこのＧＲＫの相対的発現レベルを監視可能であることを示す。さらに、ヒトＨＦ患者におけるリンパ球βＡＲＫ１含量および活性は、疾患重症度とともに進むようであり、そしてしたがって予後に役立つ。
【００１６】
本発明の特定の側面を、以下の限定されない実施例に、より詳細に記載しうる。
【実施例】
【００１７】
（実施例１）
実験詳細
研究集団
患者の３群を研究した。第一の群は、重度の機能悪化のため、心臓移植を受けた２４人の患者からなり、そして表１に示す臨床特性を提示した（第１群）。第二の群には、多様な度合いの心臓機能不全を持ち、集中治療室に入院した５５人の患者が含まれた（第３群）。この群の中で、１０人の患者が予定心臓手術を受けた（表１、第２群）。すべての処置を、施設指針にしたがって行った。
表１：本研究で分析した患者の臨床特性
【００１８】
【表１】
2008519283.tif 000002
【００１９】
心筋試料
虚血性または拡張型心筋症のため、ＨＦである２４人の患者から、心臓移植中に、衰えつつある心臓由来の、血液緩衝心臓麻痺後の貫壁性左心室（ＬＶ）組織（≒２グラム湿重量）標本を得た。心臓手術（大動脈冠動脈バイパス移植または弁膜置換）を受けた第２群の患者から、右心耳（≒２００ｍｇ湿重量）もまた得た。除去後直ちに、すべての標本を氷冷生理食塩水に入れ、リンスし、液体窒素中で凍結し、そして−８０℃で保存した。
末梢リンパ球試料
血液を収集し、そしてＥＤＴＡで抗凝固処理した。第２群の患者では、手術前日に血液を収集した。ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１０７７（Ｓｉｇｍａ）を用いたＦｉｃｏｌｌ勾配によってリンパ球を単離し、凍結し、そしてアッセイの日まで−８０℃で保存した（Ｂｒｉｓｔｏｗら，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  ７０：Ｓ１０５−１３（１９９２）、Ｓｕｎら，  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ２４：１６５４−９（１９９６））。
βＡＲ密度および膜アデニリルシクラーゼ活性アッセイ
先に記載されるように、心筋生検から未精製心筋膜を、またはリンパ球を調製した（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ９８：１７８３−９（１９９８）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  ３３：３９６−４０１（１９９９））。非選択的βＡＲリガンド［１２５Ｉ］−ＣＹＰとの放射リガンド結合によってβＡＲ密度を測定し、そして基底条件下、または１００μｍｏｌ／ｌイソプロテレノール（ＩＳＯ）もしくは１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＦおよびｃＡＭＰの存在下で、標準法を用いて、膜アデニリルシクラーゼ活性およびｃＡＭＰを定量化した（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ９８：１７８３−９（１９９８）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  ３３：３９６−４０１（１９９９））。
タンパク質イムノブロッティング
先に記載されるように、免疫沈降（ＩＰ）後、界面活性剤で可溶化した心臓抽出物を用いて、βＡＲＫ１の心筋レベルの免疫検出を行った（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ９８：１７８３−９（１９９８）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  ３３：３９６−４０１（１９９９））。モノクローナル抗ＧＲＫ２／ＧＲＫ３抗体（Ｃ５／１、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用い、その後、特異的βＡＲＫｌ（ＧＲＫ２）ポリクローナル抗体（Ｃ−２０、（カタログ番号ＳＣ−５６１））Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたウェスタンブロッティングを用いて、ＩＰを行った（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：１７８３−９（１９９８）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３３：３９６−４０１（１９９９）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３８：５５−６０（２００１））。オートラジオグラフィーフィルムをスキャンして、そしてＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いることによって、免疫反応βＡＲＫ１の定量化を行った（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３８：５５−６０（２００１））。
ＧＲＫ活性アッセイ
２ｍｌの氷冷界面活性剤不含溶解緩衝液中での、心臓組織またはリンパ球のホモジナイズを通じて、抽出物を調製した。遠心分離によって細胞質ゾル分画および膜分画を分離し、そして［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、ロドプシンが豊富な桿体外部セグメント膜の光依存性リン酸化によって、細胞質ゾル分画中の可溶性ＧＲＫ活性を評価した（１００〜１５０μｇのタンパク質）（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ９８：１７８３−９（１９９８）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  ３３：３９６−４０１（１９９９）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３８：５５−６０（２００１）、Ｃｈｏｉら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：１７２２３−１７２２９（１９９７））。可溶性ＧＲＫ活性は、主にβＡＲＫ１活性に相当し、そしてβＡＲＫ１発現における変化は、βＡＲシグナル伝達改変と相関する（Ｃｈｏｉら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：１７２２３−１７２２９（１９９７））。
統計分析
Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳｙｓｔａｔ  ７．０ソフトウェアを用いて、統計分析を行った。値を平均±ＳＥＭとして示す。群を比較するため、スチューデントの対応のないｔ検定を用いた。線形回帰検定の分析を用いて、変数間の相関を研究した。Ｆ検定のｐ値が０．０５未満であった場合、相関を有意と見なした。順方向段階的逐次重回帰分析における係数としてこれらを用いて、アデニリルシクラーゼ活性に対するβＡＲ密度およびＧＲＫ活性の影響もまた計算した。
結果
衰えつつあるヒト心筋におけるβ−アドレナリンシグナル伝達
移植中に心臓組織を得た患者（第１群）の臨床特性を表１に列挙する。これらの衰えつつある心臓試料由来の細胞質ゾル抽出物におけるβＡＲＫ１発現および活性をまず評価し、そしてβＡＲＫ１タンパク質およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＲＫ活性の間に直接相関があることが見出された（Ｒ＝０．６０９、ｐ＜０．０５；ｎ＝２４）（図１Ａ）。動物における実験研究によって、心筋βＡＲＫ１のレベルが、心臓におけるβＡＲシグナル伝達に非常に影響を及ぼしうることが示されているため（Ｋｏｃｈら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１３５０−１３５３（１９９５）、Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：１８１８０−１８１８４（１９９８））、心膜におけるβＡＲ仲介アデニリルシクラーゼおよび細胞質ゾルβＡＲＫ１活性の間の関係を評価した。同じ衰えつつある心臓生検において、βＡＲ密度およびｃＡＭＰ産生の間の関係もまた評価した。まず、可溶性ＧＲＫ活性およびβＡＲ反応性の間に、有意な逆相関が見出された。図１Ｂが立証するように、ＧＲＫ活性がより大きいと、ＩＳＯが刺激するアデニリルシクラーゼ活性によって測定した際のβＡＲシグナル伝達は抑制される。さらに、予測されるであろうように、ＩＳＯが仲介するｃＡＭＰ産生および心筋βＡＲ密度間に、陽性相関が見られた（図１Ｃ）。したがって、βＡＲ密度およびＧＲＫ活性は、どちらも、線形回帰分析によって示されるように、ｃＡＭＰ産生に有意に影響を及ぼす（Ｆ＝３１．８６１、ｐ＜０．００１；βＡＲ密度：Ｔ：６，２８５、ｐ＜０．００１；ＧＲＫ活性：Ｔ：−３，３１１、ｐ＜０．００５）。
【００２０】
改変された心筋β−アドレナリンシグナル伝達が、ヒトＨＦの転帰に何らかの関係を有するかどうか、そしてβＡＲＫ１活性が疾患の重症度に関連しうるかどうかを検証するため、ＨＦの最初の診断から、心臓移植またはＬＶ補助デバイスの埋め込み（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）の介入が行われるまでの間の多様な時点で、ＬＶ生検における可溶性ＧＲＫ活性を測定し、そして患者におけるレベルを比較した。この分析に用いた集団は、ＨＦの迅速な発展（＜２年）を有した第１群の１５人の患者からなった（表１）。より長い病歴を持つ患者で起こっていた可能性がある適応機構のいかなる混乱効果も回避するため、恣意的にこの時間枠を選択した。この群内で、５人の患者が診断後７ヶ月以内に介入を必要とし、そしてこれらの患者では、心臓可溶性ＧＲＫ活性（４６±１０ｆｍｏｌ  Ｐｉ／ｍｇタンパク質／分）は、最初のＨＦ診断後７〜２４ヶ月の間に介入を有した残りの１０人の患者由来の心筋抽出物で見られたもの（３０±２ｆｍｏｌ  Ｐｉ／ｍｇタンパク質／分）より有意に高かった（ｐ＜０．００５、ｔ検定）。興味深いことに、これらの同じ２群において、心筋βＡＲ密度（４１±１３ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質対３８±４ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質）またはアデニリルシクラーゼ活性に相違はなかった。したがって、小試料サイズが比較的小さく、そしてカットオフ条件を事後に選択したが、これらのデータによって、心臓βＡＲＫ１がβＡＲ密度または共役よりも、疾患重症度および／または予後のリスクのより適切な予測因子であり得ることが示唆される。
ＨＦにおける末梢リンパ球中のβ−アドレナリンシグナル伝達
試験した仮説は、白血球におけるβＡＲシステム、および特にβＡＲＫ１が、衰えつつある心筋で見られるものの代理として使用可能であるかどうかであった。ＧＲＫ活性に関して心臓および末梢リンパ球間のいかなる相関も検証するため、第２群の患者（表１）中の患者に由来する、手術生検由来の右心耳およびリンパ球におけるβＡＲＫ１発現を測定した。これらの患者は、冠動脈疾患のための手術または弁膜置換を受け、そして一般的に、ＮＹＨＡクラス１〜３のＨＦにあった。図２Ａに示すように、心筋およびリンパ球βＡＲＫ１発現間に直接相関が見られ、このＧＲＫのリンパ球レベルが心臓発現を正確に映し出すことが示された。具体的には、心筋においてβＡＲＫ１レベルが上昇すると、これはまた、リンパ球抽出物においても明らかである。この例を、図２Ｂで、異なる疾患重症度の２人のＨＦ患者において示す。
【００２１】
この観察に基づいて、正常から有意に抑制されたもの（心エコー検査によって評価されるもの）に渡る、異なる度合いの心臓機能を持つ多数の患者に、リンパ球βＡＲＫ１発現およびＧＲＫ活性分析を広げた。これらの患者の特性（第３群）を表１に列挙する。ＬＶ駆出率（ＬＶＥＦ、％）を可溶性リンパ球ＧＲＫ活性に対してプロットすることによって、リンパ球βＡＲＫ１含量が心臓機能に相関するかどうかに具体的に取り組んだ。図３Ａに示すように、これらの５５人の患者の血液において、ＬＶＥＦおよびβＡＲＫ１活性間には、統計的に有意な逆相関がある。これは、この群を４５％ＬＶＥＦの機能カットオフで２群に分けると、より明らかに見られうる。ＬＶ機能がより劣った患者由来の白血球において、細胞質ゾルＧＲＫ活性は、有意により高い（図３Ｂ）。同様に、ＮＹＨＡ機能クラスとともに、ＧＲＫ活性の段階的増加が観察された（図３Ｃ）。運動耐容性、特定の薬剤処置または心臓機能の他の測定値など、これらの患者におけるすべての他の変数を考慮に入れずに、ＬＶＥＦの使用は、より低い心室機能を持つ患者において、末梢リンパ球において測定可能である、心臓βＡＲＫ１活性がより高いレベルであることを示すようである。
【００２２】
要約すると、上記研究は、ヒトＨＦにおけるＧＲＫ、βＡＲＫ１（またはＧＲＫ２）の役割に重点を置き、そして３つの主要な新規の観察を提供する：１）衰えつつあるヒト心臓において、心臓βＡＲＫ１レベルの増加が、βＡＲシグナル伝達の減少と相関するという立証；２）心臓βＡＲＫ１レベルおよびＧＲＫ活性が、末梢リンパ球を用いて監視可能であるという直接の立証；および３）βＡＲＫ１増加が、迅速に進行するＨＦおよび有害な臨床的転帰と関連しうるという示唆。これらのデータは、この疾患に関する初期スクリーニング中、ＨＦ患者におけるこのＧＲＫの血液レベルを測定する際の有用性を示す。
【００２３】
動物モデルにおけるいくつかの研究は、βＡＲシグナル伝達の脱共役およびＨＦの開始にβＡＲＫ１が関与する機構の完全な分析を提供した（Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：２０６−１２（２００２））。対照的に、外植時の衰えつつあるヒト心臓由来の死体解剖標本におけるβＡＲＫ１のレベル増加を記載したのは２つの研究のみであった（Ｕｎｇｅｒｅｒら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８７：４５４−６３（１９９３）、Ｕｎｇｅｒｅｒら，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ７４：２０６−１３（１９９４））。外植時に採取された同様のＬＶ生検からβＡＲＫ１およびβＡＲシグナル伝達を評価することによって、βＡＲＫ１およびＧＲＫ活性、ならびにβＡＲシグナル伝達間に逆相関が見出された。これは、βＡＲ刺激に反応して、心筋βＡＲ密度および心臓ｃＡＭＰ産生間に直接の相関があるという、現存の知識と同調する、重要な情報である。これらのデータによって、ヒト心臓において、βＡＲ機能不全の設定における、βＡＲＫ１の非常に重要な関連性が示唆される。βＡＲシグナル伝達に関与する重要な制御プロセスは、受容体脱感作および内在化であり、これらはβＡＲＫ１または他のＧＲＫによるβＡＲリン酸化によって誘発される（Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：２０６−１２（２００２）、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，  Ｃｅｌｌ．  ７４：４０９−１２（１９９３）、Ｐｉｅｒｃｅら，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３：６３９−５０（２００２））。シクラーゼ阻害性Ｇタンパク質Ｇｉのαサブユニット（Ｇαｉ）の上方制御、およびアデニリルシクラーゼアイソフォームの発現改変など、他の機構もまた、ＨＦにおけるβＡＲ機能不全に寄与可能であることもありうる（Ｂｒｉｓｔｏｗ，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ２２：６１Ａ−７１Ａ（１９９３））。しかし、衰えつつある心臓において、βＡＲ反応性およびＧＲＫ活性の間に有意な逆相関が見られるという事実から、βＡＲＫ１がヒト心筋βＡＲ制御および機能において、非常に重要な役割を果たすようである。
【００２４】
該研究のさらなる重要な発見は、リンパ球および心臓（右心耳）βＡＲＫ１発現および活性間に直接の相関があるという立証である。したがって、血液試料中のβＡＲＫ１の測定を用いて、心筋におけるこのＧＲＫの相対的発現レベルを監視してもよい。ヒトにおいては容易にアクセス可能でない心臓における、薬剤または疾患が誘導するβＡＲ変化を監視するために、リンパ球を使用可能であるという仮説は、Ｂｒｏｄｄｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：１５８４−５（１９８６））によって最初に提唱され、そして他の研究者によってさらに認識された（Ｆｅｌｄｍａｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７９：２９０−４（１９８７））。ＨＦ患者のリンパ球におけるβＡＲシグナル伝達の構成要素を監視するのが有用であることは、いくつかのグループによって提唱されてきているが、リンパ球において、Ｇタンパク質、βＡＲ密度およびｃＡＭＰを測定する最終的な有用性に関しては、データが相反している（Ｂｒｏｄｄｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：１５８４−５（１９８６）、Ｆｅｌｄｍａｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７９：２９０−４（１９８７）、Ｍａｉｓｅｌら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８１：１１９８−２０４（１９９０）、Ｇｒｏｓら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９９：２０８７−９３（１９９７））。ＧＲＫに関しては、リンパ球βＡＲＫ１増加が、高血圧を含む特定の心臓血管病変に特徴的であることを裏付ける証拠が提示されてきており、心臓およびリンパ球βＡＲシステム間の表現型相互存在（ｉｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｃｅ）を裏付ける（Ｆｅｌｄｍａｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７９：２９０−４（１９８７）、Ｍａｉｓｅｌら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８１：１１９８−２０４（１９９０）、Ｇｒｏｓら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９９：２０８７−９３（１９９７））。本研究は、このシステムを用いて、重要なβＡＲ制御分子βＡＲＫ１およびその関連する可溶性ＧＲＫ活性を研究可能であるという新規発見を提供することによって、このシナリオを増強する。さらに、ヒトＨＦ患者におけるリンパ球βＡＲＫ１含量および活性は、疾患重症度とともに進みうるようである。現在のデータは、個々の患者の転帰の予測因子として、リンパ球ＧＲＫ監視を使用することを支持しないが、ＨＦ患者の初期スクリーニングおよび追跡調査において、研究するのに潜在的に有用なマーカーではあるようである。
【００２５】
リンパ球および心筋のβＡＲシステムにおける同様の改変の原因となる機構は不確かである。Ｂｒｏｄｄｅおよびその同僚の最近のデータ（Ｗｅｒｎｅｒら，  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ９６：２９０−８（２００１））によって、動物において心臓βＡＲＫ１を減少させ、そしてシグナル伝達を増加させる処置である、ＨＦにおけるβＡＲ遮断（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ９８：１７８３−９（１９９８））はまた、リンパ球におけるカテコールアミンに対する機能的および免疫反応も増加させうることが示される（Ｗｅｒｎｅｒら，  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ９６：２９０−８（２００１））。これらのリンパ球におけるβＡＲシステムを通じたシグナル伝達は、心臓機能に対する効果に関わらず増加した（Ｗｅｒｎｅｒら，  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ９６：２９０−８（２００１））。これらのデータは、リンパ球および心臓におけるＧＲＫシステムが同様の方式で制御されるという概念を裏付ける。慢性的なカテコールアミン曝露が、βＡＲ下方制御などのβＡＲシグナル伝達異常を誘導し、そしてＨＦが循環ノルエピネフリン増加と関連することが知られる（Ｂｒｉｓｔｏｗ，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ２２：６１Ａ−７１Ａ（１９９３）、Ｈａｓｋｉｎｇら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ７３：６１５−２１（１９８６））。重要なことに、交感神経系によってＨＦ患者における免疫反応が調節されることも可能であり、そして根底にある機構は、β２−ＡＲに関与するようであり（Ｍｕｒｒａｙら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８６：２０３−１３（１９９２））、これはＨＦ患者において増加している、エピネフリン刺激を通じて起こりうる（Ｋａｙｅら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６９：Ｈ１８２−８（１９９５））。心筋βＡＲＫ１は、慢性的なアドレナリン活性化に反応して上方制御される（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ９８：１７８３−９（１９９８）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  ３３：３９６−４０１（１９９９）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３８：５５−６０（２００１）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３８：２５５−６０（２００１））ため、１つの可能性は、循環カテコールアミン（すなわちノルエピネフリンおよびエピネフリン）増加が、リンパ球および心臓の両方において、β１−およびβ２−ＡＲ刺激の手段を通じて、βＡＲＫ１発現増加を誘発しうることである。しかし、心臓および循環白血球におけるβＡＲの慢性的なカテコールアミン活性化の遮断が、実際にβＡＲＫ１発現に影響を及ぼしうるのかどうかを決定するため、βＡＲアンタゴニストで処置されているＨＦ患者において、この仮説をさらに調べる必要がある。これらのさらなる臨床研究はまた、リンパ球βＡＲＫ１活性および心筋アドレナリン反応性の間の関係をよりよく定義するためにも、重要であろう。興味深いことに、これは、慢性的にカルベジロールおよびアテノロールに曝露されたマウスの心臓において（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ９８：１７８３−９（１���９８））、そしてβ−遮断剤で処置されたＨＦブタにおいて（Ｐｉｎｇら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：１２７１−８０（１９９５））、当てはまることが示されてきている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、β−遮断剤が、βＡＲＫ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方の減少を通じて、βＡＲＫ１発現を減少させることが示唆される（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ９８：１７８３−９（１９９８））。
【００２６】
ＨＦの動物モデルにおいて、心臓ＧＲＫ活性上方制御がしばしば観察される（Ｍａｕｒｉｃｅら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７６：Ｈ１８５３−６０（１９９９）、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  ３３：４０２−７（１９９９）、Ｒｏｃｋｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９５：７０００−５（１９９８）、Ｐｉｎｇら，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７３：Ｈ７０７−１７（１９９７）、Ｈａｒｒｉｓら，  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ９６：３６４−８（２００１）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３８：５５−６０（２００１）、Ａｋｈｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９４：１２１００−５（１９９７）、Ａｓａｉら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０４：５５１−８（１９９９）、Ｃｈｏら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：２２２５１−６（１９９９））が、常にではない（Ｄｏｒｎら，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５７：２７８−８７（２０００））。この観察は、ＨＦにおけるこのキナーゼの示差的な役割を示唆しうる。本研究において、心臓の性能（すなわちＬＶＥＦ）の減少は、βＡＲＫ１レベル増加と一貫しては関連しないことが観察された。しかし、データによって、虚血性患者におけるように、βＡＲＫ１およびＨＦにおけるより負の転帰の間に相関がある可能性があり、より高い心臓ＧＲＫ活性が、より迅速に進行するＨＦと関連したことが示される。ヒトにおけるこれらの発見は、トランスジェニックマウスにおける最近の研究と一致し、この中で、βＡＲＫ１発現および活性の増加は、重症の心筋症および早期死亡と関連した（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３８：５５−６０（２００１））。βＡＲＫ１が、疾患重症度を予測するため、ヒトＨＦにおいて監視されるべき分子を代表する事例は、おそらく、ＮＹＨＡ  ＨＦクラスが上昇するのに伴って、βＡＲＫ１が、有意にそして進行性により高くなるという発見に、最適に例示される。これは、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）に関して示されてきたものと類似である（Ｌｅｅら，  Ｊ．  Ｃａｒｄ  Ｆａｉｌｕｒｅ  ８：１４９−５４（２００２））。重要なことに、ＢＮＰ同様、リンパ球におけるβＡＲＫ１発現および活性は、ヒトＨＦに関する、新規で、そして容易にアクセス可能なバイオマーカーに相当する。総合すると、データによって、リンパ球βＡＲＫ１レベルの測定は、ＨＦ患者の評価において有用であることが示される。より大きい集団が関与する研究を用いて、ＨＦにおけるβＡＲＫ１の予測的役割を明確にすることも可能である。
【００２７】
（実施例２）
ＬＶ機械的補助デバイス（ＬＶＡＤ）の埋め込みのための手術を受けた患者の心臓の使用を伴う研究を行った。これらの患者は、典型的には、数ヶ月以内に心臓移植を経験し、そしてしたがって、負荷軽減（ｕｎｌｏａｄｉｎｇ）前および後の心臓試料を得ることも可能である。重要なことに、「移植物への架橋」としてのＬＶＡＤ使用は、衰えつつある心筋の回復を導くことが示されてきており、このプロセスは、逆リモデリングと称される（Ｚａｆｅｉｒｉｄｉｓら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：６５６−６６２（１９９８））。先の研究が、βＡＲ反応性改善を含む、ＬＶＡＤ後の逆リモデリングに特徴的なものとして、心臓構造および機能の正常化を示した（Ｚａｆｅｉｒｉｄｉｓら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：６５６−６６２（１９９８））ため、βＡＲＫ１がこのプロセスに関与しうると推測された。ＬＶＡＤ前および後のヒトＬＶ試料において、心臓βＡＲＫ１  ｍＲＮＡ、タンパク質およびＧＲＫ活性が測定されてきている。対の試料を用いることによって、ＬＶＡＤ補助前および補助後の同じ心臓において、βＡＲＫ１を特異的に調べることが可能である。最初の結果は、負荷軽減期間後、衰えつつある心臓において、βＡＲＫ１が減少することを明らかに示す（図４）。
【００２８】
ウェスタンブロットに示すように（図４Ａ）、ＬＶＡＤ前のβＡＲＫ１タンパク質の量は可変であるものの、ＬＶＡＤが仲介する負荷軽減後、有意な減少がある。これらの患者におけるＬＶＡＤ使用の平均の長さは２ヶ月であった。ＳＹＢＲ（登録商標）緑色蛍光方法論を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、βＡＲＫ１  ｍＲＮＡを定量化し、そしてこれもまた、ヒトＨＦにおいて、負荷軽減後、βＡＲＫ１発現の有意な減少を示した（図４Ｂ）。βＡＲＫ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質はどちらも、およそ５０％減少した。
【００２９】
心臓ＧＲＫ活性およびβＡＲシグナル伝達を、ヒトＨＦ  ＬＶＡＤ前および後の試料の対のセットでも調べ、そして予備的結果を図５に示す。ｍＲＮＡおよびタンパク質結果と一致して（図５）、ＧＰＣＲ基質ロドプシンに対する可溶性心臓ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＲＫ活性は、ＬＶＡＤ後のＬＶで有意に減少した（図５Ａ）。心臓抽出物において、可溶性ＧＲＫ活性はほぼもっぱらβＡＲＫ１由来であることが先に立証された（Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：１７８３−１７８９（１９９８））。より低いβＡＲＫ１活性は、これらの試料中の膜ＩＳＯ刺激ＡＣ活性が有意に改善するため、負荷軽減後の筋細胞回復に役割を果たすようである（図５Ｂ）。したがって、外植された衰えつつあるヒト心臓において、上述するように（図１Ａ）、心臓ＧＲＫ活性、ならびにβＡＲシグナル伝達および反応性の間には、逆相関がある。
【００３０】
ＬＶＡＤ処置患者の血液において見られるβＡＲＫ１のレベルが、心臓レベルと相関するかどうか、そしてリンパ球βＡＲＫ１を用いて、ＬＶＡＤ後の機能的改善を監視可能であるかどうか、または機械的負荷軽減後の心筋回復を予測するのを補助可能であるかどうかを決定することもまた望ましい。βＡＲＫ１は、ＬＶＡＤ患者由来の調製されたリンパ球において測定され始めている。ＬＶＡＤ埋め込み前に、そして次いで、再び、外植および心臓移植時に、患者から血液試料およびリンパ球を得た。ＬＶＡＤ患者試料２セットにおける予備的結果を図６Ａに示す。心臓βＡＲＫ１タンパク質同様、βＡＲＫ１のリンパ球レベルは、ＬＶＡＤ補助２ヶ月までに実質的に減少する。
【００３１】
最後に、ＨＦの動物モデルにおける多くの研究が、βＡＲＫ１同様、ＧＲＫ５もまた上方制御され、そしてしたがって、心臓シグナル伝達および機能において役割を果たすことも可能であり、そしてＨＦにおいて重要でありうることを示してきている。ＧＲＫ５発現レベルを、ＬＶＡＤ前および後の１５対の心臓試料で測定し、そして負荷軽減後のＧＲＫ５タンパク質レベルの改変は見出されなかった（図６Ｂ）。リアルタイムＰＣＲもまた、ＬＶＡＤ後、ＧＲＫ５発現レベルの改変をまったく示さなかった。これらの結果は、βＡＲＫ１が心臓βＡＲシグナル伝達および機能の制御に関与する非常に重要なＧＲＫであり、そしてＨＦにおいて重要であるという結論を裏付ける。
【００３２】
要約すると、上記データによって、衰えつつあるヒト心臓において、ＬＶＡＤ補助は、βＡＲＫ１  ｍＲＮＡ、タンパク質、およびＧＲＫ活性のレベル減少と関連することが立証され、これは、これらの患者のリンパ球において再現可能であり、そして衰えつつある心臓の機械的負荷軽減後のβＡＲシグナル伝達回復および逆リモデリングのありうる機構を提供する。
【００３３】
上に引用されるすべての文書および他の情報供給源は、その全体が本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１Ａ〜１Ｃ。（図１Ａ）ロドプシンのｉｎ  ｖｉｔｒｏリン酸化によって測定される可溶性ＧＲＫ活性、およびタンパク質イムノブロッティングによって検出されるβＡＲＫ１発現の間の直接相関を示すグラフ。（図１Ｂ）可溶性ＧＲＫ活性、および外植された衰えつつあるヒト心臓由来のＬＶ生検由来の心膜におけるアデニリルシクラーゼ活性のイソプロテレノール（ＩＳＯ）刺激の間の逆相関を示すグラフ。基底刺激を超えるＩＳＯ反応％によって、アデニリルシクラーゼ活性をプロットする（ｎ＝２４、ｐ＜０．０５）。（図１Ｃ）同じ試料における類似のアプローチを用いて、βＡＲ密度およびβＡＲシグナル伝達間で直接相関が観察された（基底刺激を超えるＩＳＯ刺激アデニリルシクラーゼ活性、ｎ＝２４、ｐ＜０．０００１）。
【図２】図２Ａおよび２Ｂ。（図２Ａ）ＨＦ患者の心臓（右心房生検）における、およびリンパ球における、βＡＲＫ１発現間の直接相関を示すグラフ。タンパク質イムノブロッティングによってβＡＲＫ１発現を評価し、そしてデータを恣意的濃度測定単位で表した。（図２Ｂ）異なる度合いの心室機能不全を持つ、同じセットのヒト患者（＃３７および＃５３）に由来する、リンパ球抽出物および右心耳由来抽出物における、βＡＲＫ１発現を示すタンパク質イムノブロット由来の代表的なオートラジオグラフ。
【図３】図３Ａ〜３Ｃ。（図３Ａ）ＨＦ患者において評価される、可溶性ＧＲＫ活性および心臓機能（ＬＶ駆出率（ＥＦ）％）の逆の関係を示すグラフ（ｎ＝５５、ｐ＜０．０２）。（図３Ｂ）４５％ＬＶＥＦのカットオフを用いて、５５人のＨＦ患者を２群に分けた。減少した心臓機能を示したものはまた、より高いリンパ球可溶性ＧＲＫ活性を有した。＊、ｐ＜０．０５（対応のないスチューデントｔ検定）。（図３Ｃ）ＮＹＨＡ  ＨＦクラスにしたがって患者を層別化すると、リンパ球可溶性ＧＲＫ活性において、有意でそして進行性の増加があった。
【図４】図４Ａおよび４Ｂ。衰えつつあるヒトＬＶ由来の対の試料をＬＶＡＤ埋め込み時およびそれに続く心臓移植時に得て、そしてβＡＲＫ１タンパク質（図４Ａ）およびｍＲＮＡ（図４Ｂ）を測定した（ｎ＝１２）。（図４Ａ）代表的なウェスタンブロットをともに示した、ＬＶＡＤ前（コア）および後（ＬＶ）試料におけるβＡＲＫ１イムノブロッティングの結果（平均±ＳＥＭ）。（＋）対照は精製βＡＲＫ１である。＊、Ｐ＜０．００５、対ＬＶＡＤ前値。（図４Ｂ）ＳＹＢＲ（登録商標）緑色蛍光方法論を用いた、同じ試料（ｎ＝１２）のリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ。＊、Ｐ＜０．０５、対ＬＶＡＤ前値（対応のあるスチューデントｔ検定）。
【図５】図５Ａおよび５Ｂ。（図５Ａ）心臓試料ＬＶＡＤ前および後（ｎ＝４対）で見られる心臓可溶性ＧＲＫ活性（平均±ＳＥＭ）。記載されるように可溶性心臓溶解物を精製し、そして［３２Ｐ−ＡＴＰ］およびＧＰＣＲロドプシン（Ｒｈｏ）が豊富な精製桿体外部セグメント膜とインキュベーションした（Ｃｈｏｉら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：１７２２３−１７２２９（１９９７）、Ｉａｃｃａｒｉｎｏら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：１７８３−１７８９（１９９８））。差し込み図に示すのは、ゲル電気泳動後の、Ｒｈｏへのリン光体取り込みのオートラジオグラフィーである。＊、Ｐ＜０．０５、対ＬＶＡＤ前値（ｔ検定）。（図５Ｂ）対のＬＶＡＤ前および後のＬＶ試料由来の心臓溶解物における膜ＡＣ活性（ｎ＝４）。示したデータは、βＡＲ反応性における有意な増加を示す基底活性を超えた％ＩＳＯ刺激の平均±ＳＥＭである。Ｐ＜０．０５、対ＬＶＡＤ前。
【図６】図６Ａおよび６Ｂ。（図６Ａ）ＬＶＡＤ埋め込み前（前）および外植後（後）、２人の患者から得た血液試料におけるリンパ球βＡＲＫ１タンパク質レベル。上部ウェスタンの平均データをヒストグラムに示す。精製βＡＲＫ１は（＋）対照である。（図６Ｂ）対の試料、ＬＶＡＤ前（コア）および後（ＬＶ）における心臓ＧＲＫ５タンパク質レベル。データは、スキャンしたウェスタンブロットの相対的濃度測定単位の試料ｎ＝１５対の平均±ＳＥＭである。精製ＧＲＫ５を（＋）対照とした、代表的なイムノブロットを差し込み図に示す。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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