(57)【要約】  本発明は、免疫調節作用を有する複合ペプチド混合物、およびそれらを使用する方法に関する。本発明はさらに、複合ペプチド混合物を用いた免疫系の調節による疾患の治療を対象とする。本発明はまた、複合ペプチド混合物の特性を向上させる方法も対象とする。
2008500276.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さが８〜２０アミノ酸の範囲内である複数のペプチドを含む複合ペプチド混合物であって、
前記混合物が、ペプチド鎖の定められた位置である程度の多様性を有する複数のペプチドを含み、
少なくとも１つの定められた位置での多様性の程度が、少なくとも１つの他の定められた位置での多様性の程度と異なっており、
混合物の大部分において、ペプチドが、少なくとも４つの位置でＡ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない複合ペプチド混合物。
【請求項２】
少なくとも１つの位置で、混合物中の大部分のペプチドが１つまたは２つのアミノ酸をそれぞれ含み、他のアミノ酸を含まない、請求項１に記載のペプチド混合物。
【請求項３】
混合物中の少なくとも７５％のペプチドにおいて、前記の少なくとも４つの位置にあるアミノ酸が、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない、請求項１に記載のペプチド混合物。
【請求項４】
混合物中の少なくとも９０％のペプチドにおいて、前記の少なくとも４つの位置にあるアミノ酸が、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない、請求項１に記載のペプチド混合物。
【請求項５】
混合物中の少なくとも９５％のペプチドにおいて、前記の少なくとも４つの位置にあるアミノ酸が、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない、請求項１に記載のペプチド混合物。
【請求項６】
混合物中の実質的にすべてのペプチドにおいて、前記の少なくとも４つの位置にあるアミノ酸が、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない、請求項１に記載のペプチド混合物。
【請求項７】
混合物中の大部分のペプチドが、Ｎ末端アミノ酸でアセチル化されている、請求項１に記載のペプチド混合物。
【請求項８】
前記の少なくとも４つの位置のアミノ酸Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹが、次のモル比：約６：約２：約５：約１で存在する、請求項１に記載のペプチド混合物。
【請求項９】
少なくとも１つの位置で、混合物の大部分が、Ｉ、Ｌ、およびＶのすべてを含み、他のアミノ酸を含まないペプチドからなる、請求項１に記載のペプチド混合物。
【請求項１０】
少なくとも１つの位置で、混合物の大部分が、Ｈ、Ｒ、およびＫのすべてを含み、他のアミノ酸を含まないペプチドからなる、請求項１に記載のペプチド混合物。
【請求項１１】
少なくとも１つの位置で、混合物の大部分が、Ｋ、Ｈ、Ｒ、およびＶのすべてを含み、他のアミノ酸を含まないペプチドからなる、請求項１に記載のペプチド混合物。
【請求項１２】
長さが８〜２０アミノ酸の範囲内である複数のペプチドを含む複合ペプチド混合物であって、
前記混合物が、ペプチド鎖の定められた位置である程度の多様性を有する複数のペプチドを含み、
少なくとも混合物の大部分において、ペプチド中のアミノ酸が、以下の特定のアミノ酸すべてを含み、他のアミノ酸を含まない複合ペプチド混合物。
少なくとも４つの位置で、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹ；
少なくとも１つの位置で、Ｉ、Ｌ、およびＶ；
少なくとも１つの位置で、Ｈ、Ｒ、およびＫ；ならびに
少なくとも１つの位置で、Ｐ、およびＩ。
【請求項１３】
位置Ｐ１がＮ末端残基である、請求項１２に記載のペプチド混合物。
【請求項１４】
Ｎ末端残基がアセチル化されている、請求項１２に記載のペプチド混合物。
【請求項１５】
Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹが、位置Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６、および（存在する場合は）Ｐ９の少なくとも４つの位置で存在する、請求項１２に記載のペプチド混合物。
【請求項１６】
前記ペプチドの長さが少なくとも１０アミノ酸であり、
Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹが、位置Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６、およびＰ９のすべての位置に存在する、請求項１２に記載のペプチド混合物。
【請求項１７】
前記の少なくとも４つの位置のアミノ酸Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹが、次のモル比：約６：約２：約５：約１で存在する、請求項１２、１５、または１６のいずれか一項に記載のペプチド混合物。
【請求項１８】
少なくとも混合物の大部分において、ペプチド中のアミノ酸が、少なくとも１つの位置で、次の特定のアミノ酸：Ｋ、Ｈ、Ｒ、およびＶのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない、請求項１２に記載のペプチド混合物。
【請求項１９】
少なくとも混合物の大部分において、ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸がＰとＩの両方を含み、他のアミノ酸を含まない、請求項１２に記載のペプチド混合物。
【請求項２０】
混合物中の大部分のペプチドが、少なくとも１つの位置で、同じアミノ酸を有する、請求項１２に記載のペプチド混合物。
【請求項２１】
混合物中の実質的にすべてのペプチドが、少なくとも１つの位置で、選択された２つのアミノ酸のうちの何れか一方を有する、請求項１２に記載のペプチド混合物。
【請求項２２】
Ｎ末端アミノ酸がアセチル化されている、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載のペプチド混合物。
【請求項２３】
脊椎動物に複合ペプチド混合物を投与することにより疾患を治療するための薬剤の調製における複合ペプチド混合物の使用であって、
前記混合物が、ペプチド鎖の少なくとも４つの定められた位置それぞれで、程度が制約された多様性を有する複数のペプチドを含み、
少なくとも１つの定められた位置での制約された多様性の程度が、少なくとも１つの他の定められた位置での制約された多様性の程度と異なっている使用。
【請求項２４】
前記混合物中のペプチドの長さが約８〜約２０アミノ酸であり、
Ｎ末端のペプチドがアセチル化されている、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
少なくとも混合物の大部分において、ペプチド中のアミノ酸が、以下の特定のアミノ酸すべてを含み、他のアミノ酸を含まない、請求項２３に記載の使用。
少なくとも４つの位置で、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹ；
少なくとも１つの位置で、Ｉ、Ｌ、およびＶ；
少なくとも１つの位置で、Ｈ、Ｒ、およびＫ。
【請求項２６】
少なくとも混合物の大部分において、ペプチド中のアミノ酸が、以下の特定のアミノ酸すべてを含み、他のアミノ酸を含まない、請求項２５に記載の使用。
少なくとも１つの位置で、Ｋ、Ｈ、Ｒ、およびＶ。
【請求項２７】
少なくとも混合物の大部分において、ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸がＰとＩの両方を含み、他のアミノ酸を含まない、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
前記の少なくとも４つの位置のアミノ酸Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹが、次のモル比：約６：約２：約５：約１で存在する、請求項２５に記載の使用。
【請求項２９】
混合物中の大部分のペプチドが、少なくとも１つの位置で、同じアミノ酸を有する、請求項２５に記載の使用。
【請求項３０】
混合物中の実質的にすべてのペプチドが、少なくとも１つの位置で、同じアミノ酸を有する、請求項２５に記載の使用。
【請求項３１】
前記疾患が、多発性硬化症および実験的自己免疫性脳脊髄炎からなる群から選択される、請求項２５に記載の使用。
【請求項３２】
免疫細胞に複合ペプチド混合物を投与することにより前記細胞を刺激するための薬剤の調製における複合ペプチド混合物の使用であって、
前記混合物が、ペプチド鎖の少なくとも４つの定められた位置それぞれで、程度が制約された多様性を有する複数のペプチドを含み、
少なくとも１つの定められた位置での多様性の程度が、少なくとも１つの他の定められた位置での多様性の程度と異なっている使用。
【請求項３３】
程度が制約された多様性が、前記の定められた位置それぞれでの考えられるアミノ酸を、１０個未満のアミノ酸を含む、定められたアミノ酸リストに限定することによって作られる、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記免疫細胞の刺激がｉｎ  ｖｉｖｏで起こる、請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
前記投与ステップが、静脈内送達、筋肉内送達、胃腸管を介する送達、および経皮送達からなる群から選択される、請求項３２に記載の使用。
【請求項３６】
個体に複合ペプチド混合物を投与することにより抗原に対する免疫反応を抑制するための薬剤の調製における複合ペプチド混合物の使用であって、
前記複合ペプチド混合物が、ペプチド鎖の少なくとも１０個の定められた位置それぞれで、程度が制約された多様性を有する複数のペプチドを含み、
少なくとも１つまたは２つの定められた位置での多様性の程度が、少なくとも１つまたは２つの他の定められた位置での多様性の程度と異なっている使用。
【請求項３７】
前記免疫反応が自己免疫反応である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記抗原がミエリンに由来する、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記ペプチド複合混合物が、特定のアミノ酸を有する少なくとも１つの位置および２〜６個の考えられるアミノ酸を有する少なくとも１つの位置を含む、定められた長さおよび式のペプチドを含む、請求項３６に記載の使用。
【請求項４０】
前記ペプチド複合混合物が、より高度な多様性を有する複合混合物の多様性が低いサブセットである、請求項３６に記載の使用。
【請求項４１】
前記のより高度な多様性を有する複合混合物が、その式が表１に列挙された式からなる群から選択される混合物である、請求項３６に記載の使用。
【請求項４２】
前記ペプチド複合混合物の活性が、増殖アッセイ、サイトカインアッセイおよび５１Ｃｒ放出アッセイからなる群から選択されるアッセイによって評価される、請求項３６に記載の使用。
【請求項４３】
前記のミエリンタンパク質に対する自己免疫反応の抑制が、ＭＨＣ阻害、ＴＣＲ拮抗作用、耐性誘導、免疫偏移／バイスタンダー抑制、および中枢神経系内で発現するタンパク質に由来する抗原との交差反応性からなる群から選択されるメカニズムによる、請求項３８に記載の使用。
【請求項４４】
前記ミエリン抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、およびミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質からなる群から選択されるタンパク質に由来する、請求項３８に記載の使用。
【請求項４５】
前記抗原が、中枢神経系中に見られる細胞によって発現されるタンパク質に由来する、請求項３６に記載の使用。
【請求項４６】
免疫系細胞に複合ペプチド混合物を投与することにより前記免疫系細胞から抗炎症反応を誘導するための薬剤の調製における複合ペプチド混合物の使用であって、
前記複合ペプチド混合物が、ペプチド鎖の少なくとも１０個の定められた位置それぞれで、程度が制約された多様性を有する複数のペプチドを含み、
少なくとも１つまたは２つの定められた位置での制約された多様性の程度が、少なくとも他の定められた位置での多様性の程度と異なっている使用。
【請求項４７】
前記抗炎症反応が、Ｔｈ２／Ｔｈ３細胞活性の上方制御、およびＴｈ１細胞活性の下方制御からなる群から選択される免疫細胞活性の変化を含む、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記抗炎症反応が、細胞によるサイトカインの放出の増大を含み、
前記サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１３からなる群から選択される、請求項４６に記載の使用。
【請求項４９】
前記の抗炎症反応の誘導がｉｎ  ｖｉｖｏで起こる、請求項４６に記載の使用。
【請求項５０】
前記投与が、静脈内送達、筋肉内送達、胃腸管を介する送達、および経皮送達からなる群から選択される方法によって行われる、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
ミエリン抗原、共重合体または活性の混合物に対して反応性であるＴ細胞の受容体に対して高親和性の定められた式のペプチドリガンドを作製する方法であって、
表１に列挙された式からなる群から選択される式の複合ペプチド混合物のデコンボリューションを含む方法。
【請求項５２】
複合ペプチド混合物であって、
前記混合物が、長さが４〜１００アミノ酸残基である複数のペプチドを含み、
前記混合物が、ペプチド鎖の少なくとも１０個の定められた位置それぞれで、程度が制約された多様性を有し、
少なくとも１つの定められた位置での多様性の程度が、少なくとも１つの他の定められた位置での多様性の程度と異なっている複合ペプチド混合物。
【請求項５３】
程度が制約された多様性が、前記の定められた位置それぞれでの考えられるアミノ酸を、１０個未満のアミノ酸を含む、考えられるアミノ酸リストに限定することによって作られる、請求項５２に記載の複合ペプチド混合物。
【請求項５４】
前記の定められた位置のうち少なくとも２つについての考えられるアミノ酸のリストが、１、２、または３個のアミノ酸のみを含む、請求項５３に記載の複合ペプチド混合物。
【請求項５５】
混合物中の大部分のペプチドの長さが約４〜約３０アミノ酸残基である、請求項５２に記載の複合ペプチド混合物。
【請求項５６】
混合物中の大部分のペプチドは、長さが４アミノ酸残基以下しか違わない、請求項５２に記載の複合ペプチド混合物。
【請求項５７】
混合物中の大部分のペプチドがアセチル化されている、請求項５２に記載の複合混合物。
【請求項５８】
混合物中の１つのペプチドの少なくとも１つの位置が、Ｄ−アミノ酸によって占められている、請求項５２に記載の複合混合物。
【請求項５９】
ペプチド、ペプチド模倣物質、またはペプチドおよびペプチド模倣物質の複合混合物の生物学的特性を高める方法であって、
少なくとも１つの位置で前記複合混合物から多様性の程度が低下している、複雑性が低い一組の複合混合物を準備することと、
前記の複雑性が低い複合混合物それぞれ、および前記複合混合物をアッセイにおいて試験することと、
前記アッセイにおいて、前記複合混合物よりも高いまたは低い活性を有する、複雑性が低い複合混合物を同定することと、
前記複合ペプチド混合物の式中に、前記アッセイにおいて前記複合混合物よりも高いまたは低い活性を有する前記の複雑性が低い複合混合物の少なくとも１つの複雑性が低下する特徴を組み込むことによって前記複合混合物の生物学的特性を高めることと
を含む方法。
【請求項６０】
前記生物学的特性が、免疫系の活性を刺激する能力、および免疫系の活性を抑制する能力からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記の免疫系の活性が、免疫系細胞のクローン性増殖、免疫系細胞の分化、免疫系細胞の活性化、免疫系細胞のアネルギー状態の形成、免疫記憶細胞集団の形成、および免疫系細胞からのサイトカインの分泌からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記の複雑性が低い複合混合物が、混合物の式における１つ以上の位置の残基またはアミノ酸の同一性が１つの官能基またはアミノ酸に限定される混合物を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記の複雑性が低い複合混合物が、混合物の式における１つ以上の位置の残基またはアミノ酸の同一性が、前記のペプチド、ペプチド模倣物質、またはペプチドおよびペプチド模倣物質の複合混合物のその位置の式よりも多様性の低い式に限定される混合物を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記アッセイが、免疫細胞集団によるペプチド、ペプチド模倣物質、またはペプチドおよびペプチド模倣物質の認識のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、および生物に及ぼす混合物投与の影響のアッセイからなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記の生物に及ぼす混合物投与の影響のアッセイが、ＥＡＥマウスモデルでの疾患進行のアッセイである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記のペプチド、ペプチド模倣物質、またはペプチドおよびペプチド模倣物質の複合混合物の生物学的活性を高めることが、化合物の式における１つの位置のアミノ酸または残基の同一性をただ１つのアミノ酸または官能基に限定することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
長さが８〜２０アミノ酸の範囲内である複数のペプチドを含む複合ペプチド混合物であって、
前記混合物が、ペプチド鎖の定められた位置である程度の多様性を有する複数のペプチドを含み、
少なくとも混合物の大部分において、ペプチド中の１０個の連続したアミノ酸の同一性は、次の式：
ＦＷ−ＥＦ−ＥＫ−ＡＥＫ−ＡＫＹ−ＡＮＹ−ＡＮＹ−ＡＩＮＶ−ＡＳＶ−Ｙ；または
ＥＦＷＹ−ＥＦＩＶＷＹ−ＥＦＫＱ−ＡＥＫＱ−ＡＫＱＹ−ＡＮＱＹ−ＡＧＮＳＹ−ＡＧＩＮＳＶ−ＡＩＱＳＶ−ＩＫＲＳＶＹ
によって定められる複合ペプチド混合物。
【請求項６８】
９個の連続したアミノ酸残基の位置Ｐ１が、Ｎ末端のペプチドである、請求項６７に記載のペプチド混合物。
【請求項６９】
Ｎ末端アミノ酸がアセチル化されている、請求項６７に記載のペプチド混合物。
【請求項７０】
混合物中の大部分のペプチドが、少なくとも１つの位置で、同じアミノ酸を有する、請求項１２に記載のペプチド混合物。
【請求項７１】
混合物中の実質的にすべてのペプチドが、少なくとも１つの位置で、同じアミノ酸を有する、請求項１２に記載のペプチド混合物。
【請求項７２】
長さが８〜２０アミノ酸の範囲内である複数のペプチドを含む複合ペプチド混合物であって、
前記混合物が、ペプチド鎖の定められた位置である程度の多様性を有する複数のペプチドを含み、
少なくとも１つの定められた位置での多様性の程度が、少なくとも１つの他の定められた位置での多様性の程度と異なっており、
混合物の大部分において、ペプチドが、少なくとも１つ、且つ５つ以下の位置でＡ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない複合ペプチド混合物。
【請求項７３】
少なくとも１つの位置で、混合物中の大部分のペプチドが１つまたは２つのアミノ酸をそれぞれ含み、他のアミノ酸を含まない、請求項７２に記載のペプチド混合物。
【請求項７４】
混合物中の少なくとも７５％のペプチドにおいて、前記の少なくとも１つ、且つ５つ以下の位置のアミノ酸が、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない、請求項７２に記載のペプチド混合物。
【請求項７５】
混合物中の少なくとも９０％のペプチドにおいて、前記の少なくとも１つ、且つ５つ以下の位置のアミノ酸が、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない、請求項７２に記載のペプチド混合物。
【請求項７６】
混合物中の少なくとも９５％のペプチドにおいて、前記の少なくとも１つ、且つ５つ以下の位置のアミノ酸が、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない、請求項７２に記載のペプチド混合物。
【請求項７７】
混合物中の実質的にすべてのペプチドにおいて、前記の少なくとも１つ、且つ５つ以下の位置のアミノ酸が、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない、請求項７２に記載のペプチド混合物。
【請求項７８】
混合物中の大部分のペプチドが、Ｎ末端アミノ酸でアセチル化されている、請求項７２に記載のペプチド混合物。
【請求項７９】
前記の少なくとも１つ、且つ５つ以下の位置のアミノ酸Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹが、次のモル比：約６：約２：約５：約１で存在する、請求項７２に記載のペプチド混合物。
【請求項８０】
少なくとも１つの位置で、混合物の大部分が、Ｉ、Ｌ、およびＶのすべてを含み、他のアミノ酸を含まないペプチドからなる、請求項７２に記載のペプチド混合物。
【請求項８１】
少なくとも１つの位置で、混合物の大部分が、Ｈ、Ｒ、およびＫのすべてを含み、他のアミノ酸を含まないペプチドからなる、請求項７２に記載のペプチド混合物。
【請求項８２】
少なくとも１つの位置で、混合物の大部分が、Ｋ、Ｈ、Ｒ、およびＶのすべてを含み、他のアミノ酸を含まないペプチドからなる、請求項７２に記載のペプチド混合物。
【請求項８３】
前記生物学的特性が、疾患のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて測定される応答である、請求項５９に記載の方法。
【請求項８４】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏモデルが、不安、抑うつ、肥満、認知、神経障害、運動障害、または疼痛のモデルを含む群から選択される、請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００４年２月２日出願の米国仮特許出願第６０／５４１，３９７号に基づく優先権を主張するものであり、この仮出願は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、臨床的状況および実験的状況で使用するための免疫調節活性を有するペプチド混合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の慢性炎症性疾患であり、広範な単核細胞の浸潤および脱髄を特徴とする。その最終的な結果は、ミエリンおよび乏突起膠細胞に対して損傷が生じ、様々な程度の軸索破壊および神経障害の結果を伴う（Ｍａｒｔｉｎら、１９９２年；Ｎｏｓｅｗｏｒｔｈｙら、２０００年）。ＭＳの正確な原因は不明であるが、散在する炎症性の浸潤巣（特に単核細胞）を示す病変の検査（Ｌａｓｓｍａｎｎら、１９９１年；Ｒａｉｎｅ、１９９４年）、免疫調節または免疫抑制の後の肯定的な治療結果（Ｈｏｈｌｆｅｌｄ、１９９７年；ＢａｓｈｉｒおよびＷｈｉｔａｋｅｒ、１９９８年）、および疾患と主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ；ヒトではＨＬＡ）の遺伝的な関連（Ｅｂｅｒｓら、１９９６年；Ｈａｉｎｅｓら、１９９６年；Ｓａｗｃｅｒら、１９９６年）に基づいて、それは自己免疫疾患と考えられている。さらなる証拠は、ヒトの疾患と、ミエリンタンパク質で免疫した後に幾つかの種で誘発させることができるＭＳの動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（ＺａｍｖｉｌおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、１９９０年；Ｗｅｋｅｒｌｅら、１９９４年）の間の顕著な類似性に由来する。続いて起こり、未処置の動物に受動的に伝達されることができるＴ細胞媒介応答は、自己抗原特異的Ｔ細胞を、ＭＳと同様に、ＥＡＥに強く関係させる。
【０００４】
酢酸グラチラマー（ＧＡ）／共重合体１は、アラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）およびチロシン（Ｙ）からなり、Ａ／Ｋ／Ｅ／Ｙのモル比が４．５：３．６：１．５：１であり、平均の長さが４０〜１００ａａである合成ランダム配列ポリペプチドである（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、１９７１年）。ＭＢＰの脳炎誘発性の成分を模倣するために３０年以上前に開発されたが、それは、それよりも、齧歯類および霊長類で疾患を抑制し（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、１９７４年；Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、１９９６年）、さらに最近では、臨床試験において、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）患者で病状再燃の割合を低下させ、新たな病変の数を減少させることが見出された（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５年；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９８年）。ＧＡは、免疫調節性Ｔ細胞と相互作用して、ＭＳの根底にある炎症性免疫応答を抑制すると推測される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＧＡは、ＥＡＥを改善し、ＭＳの再発率を約３０％低下させることが示されており、このことから、再発寛解型ＭＳの治療薬として承認されるに至った（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、１９７１年；Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、１９７４年；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５年；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９８年；Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００年）。ＧＡは、大部分のＭＳ患者が非応答者であるが、安全であり、ある程度有効であることが示されている。しかしながら、より強力で有効な多発性硬化症の治療法の必要性が存在する。さらに、より多くの患者を治療するように、その治療法の治療範囲を拡大することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、生物学的活性を有する複合ペプチド混合物、およびそれらを使用する方法を対象とする。したがって、本発明の一態様では、長さが８〜２０アミノ酸の範囲内である複数のペプチドを含む複合混合物であって、ペプチドは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０残基の長さであり得、前記混合物が、ペプチド鎖の定められた位置である程度の多様性を有する複数のペプチドを含み、少なくとも１つの定められた位置での多様性の程度が、少なくとも１つの他の定められた位置での多様性の程度と異なっており、混合物の大部分において、ペプチドが、少なくとも４つの位置でＡ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない複合混合物が提供される。有利には、複合混合物は、少なくとも１つの位置で１つまたは２つのアミノ酸をそれぞれ含み、他のアミノ酸を含まない大部分のペプチドを含む。好ましくは、複合ペプチド混合物は、混合物中の７５％、９０％、９５％または実質的にすべてのペプチドにおいて、少なくとも４つの位置でＡ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含む。より有利には、ペプチド混合物は、混合物中の大部分のペプチドにおいて、少なくとも４つの位置でＡ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹが、およそ６：２：５：１の相対比率で認められる。好ましくは、混合物中の大部分のペプチドにおける少なくとも１つの位置は、次の群：
Ｈ、Ｒ、およびＫ；ならびに
Ｋ、Ｈ、ＲおよびＶ
のいずれかのアミノ酸すべてを含み、他は含まない。ペプチド混合物は、ＭＳなどの自己免疫疾患の少なくとも１種において、細胞性免疫応答を低下させることが好ましい。
【０００７】
本発明の他の実施形態は、長さが８〜２０アミノ酸の範囲内である複数のペプチドを含む複合ペプチド混合物であって、ペプチドは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０残基の長さであり得、前記混合物が、ペプチド鎖の定められた位置である程度の多様性を有する複数のペプチドを含み、少なくとも混合物の大部分において、ペプチド中のアミノ酸が、以下の特定のアミノ酸を含み、他のアミノ酸を含まない複合ペプチド混合物を特徴とする；
少なくとも４つの位置で、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹ；
少なくとも１つの位置で、Ｉ、Ｌ、およびＶ；
少なくとも１つの位置で、Ｈ、Ｒ、およびＫ；
少なくとも１つの位置で、Ｐ、およびＩ。
有利には、位置Ｐ１がＮ末端残基である。より有利には、Ｎ末端残基がアセチル化されている。好ましくは、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹが、位置Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６、および（存在する場合は）Ｐ９の少なくとも４つの位置で存在する。より好ましくは、ペプチドの長さが少なくとも１０アミノ酸であり、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹが、位置Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６、およびＰ９のすべての位置に存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも混合物の大部分において、ペプチド中のアミノ酸が、ペプチドの少なくとも１つの位置でＫ、Ｈ、Ｒ、およびＶのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも混合物の大部分において、ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸がＰとＩの両方を含み、他のアミノ酸を含まない。好ましくは、混合物中の大部分のペプチドが、少なくとも１つの位置で、同じアミノ酸を有する。より好ましくは、Ｎ末端アミノ酸がアセチル化されている。
【０００８】
本発明のさらなる実施形態は、疾患を治療する方法であって、脊椎動物に複合ペプチド混合物を投与することを含み、前記混合物が、ペプチド鎖の少なくとも４つの定められた位置それぞれで、程度が制約された多様性を有する複数のペプチドを含み、少なくとも１つの定められた位置での多様性の程度が、少なくとも１つの他の定められた位置での多様性の程度と異なっている方法を含む。好ましくは、前記混合物中のペプチドの長さが約８〜約２０アミノ酸であり、位置Ｐ１と称するＮ末端のペプチドが好ましくはアセチル化されている。いくつかの実施形態では、少なくとも混合物の大部分において、ペプチド中のアミノ酸が、以下の特定のアミノ酸すべてを含み、他のアミノ酸を含まない；
少なくとも４つの位置で、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＹ；
少なくとも１つの位置で、Ｉ、Ｌ、およびＶ；
少なくとも１つの位置で、Ｈ、Ｒ、およびＫ。
いくつかの実施形態では、少なくとも混合物の大部分において、ペプチド中のアミノ酸が、少なくとも１つの位置で、以下の特定のアミノ酸すべてを含み、他のアミノ酸を含まない；
Ｋ、Ｈ、Ｒ、およびＶ。
好ましくは、少なくとも混合物の大部分において、ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸がＰとＩの両方を含み、他のアミノ酸を含まない。有利には、混合物中の大部分のペプチドが、少なくとも１つの位置で、同じアミノ酸を有する。より有利には、混合物中の実質的にすべてのペプチドが、少なくとも１つの位置で、同じアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、その方法は、自己抗原に対するＴ細胞応答を低下させることによる自己免疫状態の治療を対象とする。好ましくは、その方法は、多発性硬化症または実験的自己免疫性脳脊髄炎の治療を含む。
【０００９】
一実施形態では、免疫細胞を刺激する方法であって、前記細胞に複合ペプチド混合物を投与することを含み、前記混合物が、ペプチド鎖の少なくとも４つの定められた位置それぞれで、程度が制約された多様性を有する複数のペプチドを含み、少なくとも１つの定められた位置での多様性の程度が、少なくとも１つの他の定められた位置での多様性の程度と異なっている方法が提供される。いくつかの実施形態では、程度が制約された多様性が、前記の定められた位置それぞれでの考えられるアミノ酸を、１０個未満のアミノ酸を含む、定められたアミノ酸リストに限定することによって作られる。いくつかの実施形態では、免疫細胞の刺激がｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。好ましくは、投与ステップが、静脈内送達、筋肉内送達、胃腸管を介する送達、または経皮送達による投与である。
【００１０】
他の実施形態は、抗原に対する免疫反応を抑制する方法であって、個体へのペプチド複合混合物の投与を含み、前記複合混合物が、ペプチド鎖の少なくとも１０個の定められた位置それぞれで、程度が制約された多様性を有する複数のペプチドを含み、少なくとも１つの定められた位置での多様性の程度が、少なくとも１つの他の定められた位置での多様性の程度と異なっている方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、免疫反応が自己免疫反応である。好ましくは、抗原がミエリンに由来する。有利には、ペプチド複合混合物が、特定のアミノ酸を有する少なくとも１つの位置および２〜６個の考えられるアミノ酸を有する少なくとも１つの位置を含む、定められた長さおよび式のペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチド複合混合物が、より多様な複合混合物のデコンボリューションに由来する。特定の実施形態では、より多様な複合混合物が、その式が表１に列挙された式からなる群から選択される混合物である。好ましくは、前記ペプチド複合混合物の活性が、増殖アッセイ、サイトカインアッセイおよび５１Ｃｒ放出アッセイからなる群から選択されるアッセイによって評価される。いくつかの実施形態では、ミエリンタンパク質に対する自己免疫反応の抑制が、ＭＨＣ阻害、ＴＣＲ拮抗作用、耐性誘導、免疫偏移／バイスタンダー抑制、および中枢神経系内で発現するタンパク質に由来する抗原との交差反応性からなる群から選択されるメカニズムによる。好ましくは、ミエリン抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、およびミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質からなる群から選択されるタンパク質に由来する。有利には、抗原が、中枢神経系中に見られる細胞によって発現されるタンパク質に由来する。
【００１１】
さらなる実施形態によれば、免疫系細胞から抗炎症反応を誘導する方法であって、免疫系細胞へのペプチド複合混合物の投与を含み、前記複合混合物が、ペプチド鎖の少なくとも１０個の定められた位置それぞれで、程度が制約された多様性を有する複数のペプチドを含み、少なくとも１つの定められた位置での多様性の程度が、少なくとも１つの他の定められた位置での多様性の程度と異なっている方法が提供される。好ましくは、抗炎症反応が、Ｔｈ２／Ｔｈ３細胞活性の上方制御、およびＴｈ１細胞活性の下方制御からなる群から選択される免疫細胞活性の変化を含む。より好ましくは、抗炎症反応が、細胞によるサイトカインの放出の増大を含み、前記サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗炎症反応の誘導がｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。有利には、投与が、静脈内送達、筋肉内送達、胃腸管を介する送達、または経皮送達によって行われる。
【００１２】
他の実施形態は、ミエリン抗原に対して反応性であるＴ細胞の受容体に対して高親和性の定められた式のペプチドリガンドを作製する方法であって、表１に列挙された式からなる群から選択される式のペプチド複合混合物のデコンボリューションを含む方法である。
【００１３】
さらなる実施形態では、複合ペプチド混合物であって、前記混合物が、長さが４〜１００アミノ酸残基である複数のペプチドを含み、前記混合物が、ペプチド鎖の少なくとも１０個の定められた位置それぞれで、程度が制約された多様性を有し、少なくとも１つの定められた位置での多様性の程度が、少なくとも１つの他の定められた位置での多様性の程度と異なっている複合ペプチド混合物が提供される。好ましくは、程度が制約された多様性が、前記の定められた位置それぞれでの考えられるアミノ酸を、１０個未満のアミノ酸を含む、考えられるアミノ酸リストに限定することによって作られる。より好ましくは、前記の定められた位置のうち少なくとも２つについての考えられるアミノ酸のリストが、１、２、または３個のアミノ酸のみを含む。有利には、混合物中の大部分のペプチドの長さが約４〜約３０アミノ酸残基である。より有利には、混合物中の大部分のペプチドは、長さが４アミノ酸残基以下しか違わない。いくつかの実施形態では、混合物中の大部分のペプチドがアセチル化されている。さらなる実施形態では、混合物中の１つのペプチドの少なくとも１つの位置が、Ｄ−アミノ酸によって占められることがある。
【００１４】
さらなる実施形態では、ペプチド、ペプチド模倣物質、またはペプチドおよびペプチド模倣物質の複合混合物の生物学的特性を高める方法であって、少なくとも１つの位置で前記複合混合物から多様性の程度が低下している、複雑性が低い一組の複合混合物を準備することと、前記の複雑性が低い複合混合物それぞれ、および前記複合混合物をアッセイにおいて試験することと、前記アッセイにおいて、前記複合混合物よりも高いまたは低い活性を有する、複雑性が低い複合混合物を同定することと、前記複合混合物の式中に、前記アッセイにおいて前記複合混合物よりも高いまたは低い活性を有する前記の複雑性が低い複合混合物の少なくとも１つの複雑性が低下する特徴を組み込むことによって前記複合混合物の生物学的特性を高めることとを含む方法が提供される。好ましくは、生物学的特性が、免疫系の活性を刺激する能力、または免疫系の活性を抑制する能力である。いくつかの実施形態では、免疫系の活性が、免疫系細胞のクローン性増殖、免疫系細胞の分化、免疫系細胞の活性化、免疫系細胞のアネルギー状態の形成、免疫記憶細胞集団の形成、および免疫系細胞からのサイトカインの分泌からなる群から選択される。有利には、複雑性が低い複合混合物が、混合物の式における１つ以上の位置の残基またはアミノ酸の同一性が１つの官能基またはアミノ酸に限定される混合物を含む。より有利には、複雑性が低い複合混合物が、混合物の式における１つ以上の位置の残基またはアミノ酸の同一性が、前記複合混合物のその位置の式よりも多様性の低い式に限定される混合物を含む。いくつかの実施形態では、アッセイが、免疫細胞集団によるペプチド認識のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、および生物に及ぼす混合物投与の影響のアッセイからなる群から選択される。好ましくは、生物に及ぼす混合物投与の影響のアッセイが、ＥＡＥマウスモデルでの疾患進行のアッセイである。いくつかの実施形態では、前記複合混合物の生物学的活性を高めることが、化合物の式における１つの位置の残基またはアミノ酸の同一性をただ１つの官能基またはアミノ酸に限定することを含む。いくつかの実施形態では、生物学的特性が、不安、抑うつ、肥満、認知、神経障害、運動障害、または疼痛のモデルを含む群から選択されるモデルを含む、疾患のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて測定される応答である。
【００１５】
さらなる実施形態によれば、長さが８〜２０アミノ酸の範囲内である複数のペプチドを含む複合ペプチド混合物であって、前記混合物が、ペプチド鎖の定められた位置である程度の多様性を有する複数のペプチドを含み、少なくとも混合物の大部分において、ペプチド中の９個の連続したアミノ酸の同一性は、次の式：
ＦＷ−ＥＦ−ＥＫ−ＡＥＫ−ＡＫＹ−ＡＮＹ−ＡＮＹ−ＡＩＮＶ−ＡＳＶ−Ｙ；または
ＥＦＷＹ−ＥＦＩＶＷＹ−ＥＦＫＱ−ＡＥＫＱ−ＡＫＱＹ−ＡＮＱＹ−ＡＧＮＳＹ−ＡＧＩＮＳＶ−ＡＩＱＳＶ−ＩＫＲＳＶＹ
によって定められる複合ペプチド混合物が提供される。いくつかの実施形態では、９個の連続したアミノ酸残基の位置Ｐ１が、Ｎ末端のペプチドである。好ましくは、Ｎ末端アミノ酸がアセチル化されている。有利には、混合物中の大部分のペプチドが、少なくとも１つの位置で、同じアミノ酸を有する。より有利には、混合物中の実質的にすべてのペプチドが、少なくとも１つの位置で、同じアミノ酸を有する。
【００１６】
さらなる実施形態によれば、長さが８〜２０アミノ酸の範囲内である複数のペプチドを含む複合ペプチド混合物であって、ペプチドは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０残基の長さであり得、前記混合物が、ペプチド鎖の定められた位置である程度の多様性を有する複数のペプチドを含み、少なくとも１つの定められた位置での多様性の程度が、少なくとも１つの他の定められた位置での多様性の程度と異なっており、混合物の大部分において、ペプチドが、少なくとも１つ、且つ５つ以下の位置でＡ、Ｅ、Ｋ、およびＹのすべてを含み、他のアミノ酸を含まない複合ペプチド混合物が提供される。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、長さが５〜２５アミノ酸の範囲内である複数のペプチドを含む複合ペプチド混合物であって、ペプチドは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５残基の長さ、あるいはこれらの長さの１つ以上の組み合わせであり得、前記混合物が、ペプチド鎖の定められた位置である程度の多様性を有するペプチドを含む複合ペプチド混合物を特徴とする。さらなる実施形態では、ペプチド混合物のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、およびＰ１０（それらが存在する限りで）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸からなる、定められたアミノ酸の群に限定される。定められたアミノ酸の群は、２０種の標準アミノ酸の任意の組み合わせを含むことができる。好ましくは、含むこともでき、あるいは任意の定められた位置から除くこともできるアミノ酸の特定の群には、次のアミノ酸の群：Ａ、Ｅ、Ｋ、Ｙ；Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｙ；Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｖ；Ｋ、Ｒ；Ｉ、Ｌ、Ｖ；Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ；Ｆ、Ｗ；Ｅ、Ｆ；Ｅ、Ｋ；Ａ、Ｅ、Ｋ；Ａ、Ｋ、Ｙ；Ａ、Ｎ、Ｙ；Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｖ；Ａ、Ｓ、Ｖ；Ｙ；Ｅ、Ｆ、Ｗ、Ｙ；Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｖ、Ｗ、Ｙ；Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｑ；Ａ、Ｅ、Ｋ、Ｑ；Ａ、Ｋ、Ｑ、Ｙ；Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｙ；Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｙ；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｖ；Ａ、Ｉ、Ｑ、Ｓ、Ｖ；Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｙ；Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｖ；Ｈ、Ｋ、Ｒ；Ｐ、Ｉ；Ａ；Ｅ；Ｋ；Ａ、Ｅ；Ａ、Ｋ；Ａ、Ｙ；Ｅ、Ｙ；Ｋ、Ｙ；Ａ、Ｅ、Ｙ；およびＥ、Ｋ、Ｙが含まれる。
【００１８】
任意の実施形態において、複合混合物中のペプチドは、わずか２アミノ酸の長さから、約１００アミノ酸もの長さまでであってよい。長さの範囲の下限は、約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５アミノ酸であることができる。長さの範囲の上限は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸であることができる。より好ましくは、長さは約５〜約１００、より好ましくは約５〜約９０、より好ましくは約５〜約８０、より好ましくは約５〜約７０、より好ましくは約５〜約６０、より好ましくは約５〜約５０、より好ましくは約５〜約４０、より好ましくは約５〜約３５、より好ましくは約５〜約３０、より好ましくは約５〜約２５、より好ましくは約８〜約２０の範囲であることができる。他の長さの範囲には、約１０〜約１００、より好ましくは約１０〜約９０、より好ましくは約１０〜約８０、より好ましくは約１０〜約７０、より好ましくは約１０〜約６０、より好ましくは約１０〜約５０、より好ましくは約１０〜約４０、より好ましくは約１０〜約３０、より好ましくは約１０〜約２０がある。他の長さの範囲には、約２０〜約１００、より好ましくは約２０〜約９０、より好ましくは約２０〜約８０、より好ましくは約２０〜約７０、より好ましくは約２０〜約６０、より好ましくは約２０〜約５０、より好ましくは約２０〜約４０、より好ましくは約２０〜約３０がある。本明細書において用いられる「約」とは、少数のアミノ酸、例えば１、２、３、４、または５アミノ酸の違いを指す。
【００１９】
任意の実施形態において、ペプチドは、複合ペプチド混合物が一部ペプチド模倣物質を含むように、１種以上のペプチド模倣物質が生成するように改質することができる。ペプチド模倣物質である複合混合物の部分は、複合混合物の５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または実質的にすべてであることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
免疫障害の治療の手法は、根底にある疾患のメカニズムの理解が進むにつれて変化してきた。多発性硬化症や慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の旧来の治療薬には、強力な抗炎症性ステロイド化合物および免疫抑制剤がある。これらの治療薬は全身作用があり、重い、受け入れ難い副作用を引き起こす。この１０年間で免疫細胞集団、その成熟およびシグナル伝達の理解が進み、疾患の細胞媒介物を特異的に標的とする、自己免疫疾患を抑制するための新たな治療が想定されている。
【００２１】
ＥＡＥモデルとＭＳ患者の両方における細胞免疫の研究から、自己反応性Ｔ細胞が、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の「免疫調節」ドメインであるＭＢＰ（８３−９９）など、限られた数の特定のペプチドに向けられることが示されている（Ｏｔａら、１９９０年；Ｍａｒｔｉｎら、１９９１年）。歴史的に、一般のＴ細胞もであるが、これらの自己反応性Ｔ細胞は、少数の抗原または単一のペプチドに対して極めて特異的であると考えられていた。理論的な考察（Ｍａｓｏｎ、１９９８年）と、Ｔ細胞クローン（ＴＣＣ）の優れた特異性を詳細に分析した明快な研究の両方から、１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によるペプチド／ＭＨＣ複合体の認識は当初考えられていたよりも幅広いことが明らかになっている（Ａｌｌｅｎ、１９９４年；Ａｓｈｔｏｎ−ＲｉｃｋａｒｄｔおよびＴｏｎｅｇａｗａ、１９９４年；ＫｅｒｓｈおよびＡｌｌｅｎ、１９９６年；ＧｅｒｍａｉｎおよびＳｔｅｆａｎｏｖａ、１９９９年）。これらの観察結果から、どのように中程度の親和性で認識される自己ペプチドが応答する胸腺細胞の正の選択を刺激するかが説明される点で胸腺の選択プロセスをよりよく理解するに至っただけでなく、さらに、どのように単一のまたは複数の位置で改変したペプチド、すなわち改変ペプチドリガンド（ＡＰＬ）が成熟Ｔ細胞において広範な機能的応答を誘発し、ＴＣＲアゴニスト、部分的アゴニストまたはアンタゴニストを作り出すことができるかが説明される。位置走査型コンビナトリアルライブラリー（ＰＳＣＬ）を使用したＭＢＰ（８７−９９）特異的ＴＣＣの研究から、最初に選択に使用したものとは全く異なる多数のウイルスエピトープならびに刺激ペプチドの同定が可能となった（Ｈｅｍｍｅｒら、１９９７年）。興味深いことに、自己反応性ＴＣＣの場合、この方法論は、はるかに高い刺激潜在性を有する抗原ペプチド、すなわちスーパーアゴニストの系統的な実証につながった（Ｈｅｍｍｅｒら、２０００年）。まとめると、これらの観察結果は、外的作用因子による、例えば分子模倣物質を媒介とする潜在的に自己反応性のＴ細胞クローンの活性化について重要な意味を有するだけでなく、おそらく末梢Ｔ細胞レパートリーを維持することに関連して遙かに重要である。
【００２２】
上述のように、ＡＰＬは、Ｔ細胞のエフェクター機能（増殖、サイトカイン産生、アポトーシス）を変える（ＫｅｒｓｈおよびＡｌｌｅｎ、１９９６年；Ｍａｄｒｅｎａｓら、１９９６年；ＧｅｒｍａｉｎおよびＳｔｅｆａｎｏｖａ、１９９９年）、またはバイスタンダー抑制を誘導するために、部分的アゴニストまたはアンタゴニストとして開発された。後者のメカニズムは、天然の抗原、例えばＭＢＰ（８３−９９）とは交差反応性であるが、Ｔｈ１が媒介する自己免疫疾患の場合はＩＬ−４やＩＬ−１３などの免疫調節性サイトカインを分泌するＡＰＬ特異的Ｔ細胞集団の発生に関連している。このＴ細胞集団は、天然の自己抗原が放出されたときに炎症活性を下方調節することができる。齧歯類でのｉｎ  ｖｉｖｏ研究およびＭＳ患者でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究から、そのようなＡＰＬによって誘導される弱いシグナルによりＴｈ２免疫調節性プロファイルへのサイトカインの偏向が生じ、齧歯類ＥＡＥにおける疾患も制限されることが示された（Ｗｉｎｄｈａｇｅｎら、１９９５年；Ｂｒｏｃｋｅら、１９９６年；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９７年；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９７年；Ｃｒｏｗｅら、２０００年）。しかしながら、ＭＢＰ（８３−９９）をベースとするＡＰＬを使用した臨床試験では、ＡＰＬが有効な自己抗原として働くこともできることが確認され、臨床試験は、ＡＰＬ治療が自己反応性ＭＢＰ特異的Ｔ細胞を活性化し、一部の患者において疾患の再発を引き起こし、他の患者においてはＡＰＬ誘導性の全身的な過敏症を生じさせたときに終了した（Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、２０００年；Ｋａｐｐｏｓら、２０００年）。このことは、単一のＡＰＬを抗原特異的免疫療法に使用すると、さらなる交差反応性の、したがって潜在的に病原性の自己反応性の集団の発生を回避することが困難であるかもしれないという懸念を起こさせた。ＭＳの広範な異質性と、疾患の進行に多数の自己抗原が関与していそうなこと（ＭＳ患者での関連はそれほど明らかでないが、マウスでエピトープの広がりが観察されている）とが相俟って、単一ＡＰＬ治療の治療潜在性は限定的であると思われる。
【００２３】
ＧＡは、平均分子サイズが４０〜１００アミノ酸の、特定の比率のアラニン、リシン、グルタミン酸およびチロシンからなるランダム共重合体である。ＧＡの免疫調節の正確なメカニズムは依然として完全には特徴付けられていないが、それは、ＭＨＣ阻害、ＴＣＲ拮抗作用、耐性誘導、免疫偏移／バイスタンダー抑制、およびＭＢＰとの交差反応性の組み合わせである可能性が最も高い。それぞれは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究からヒトにおいて示唆され、動物での研究においてｉｎ  ｖｉｖｏで実証されている（Ａｈａｒｏｎｉら、１９９７年、１９９８年；Ｍｉｌｌｅｒら、１９９８年；Ａｈａｒｏｎｉら、２０００年；Ｄｕｄａら、２０００年；Ｇｒａｎら、２０００年；Ｎｅｕｈａｕｓら、２００１年）。ＭＨＣクラスＩＩ分子（ヒトでのＤＲ、および齧歯類でのＩＡ）との効率のよい結合は、自己抗原とＭＨＣの相互作用を制限する（Ｒａｃｋｅら、１９９２年；Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９９年）、および／または、Ｔｈ２型のＴ細胞応答につながり、その結果として、病原性のＴｈ１型の応答のバイスタンダー抑制が生じ、したがってｉｎ  ｖｉｖｏで疾患が緩和される（Ｄｕｄａら、２０００年；Ｇｒａｎら、２０００年；Ｎｅｕｈａｕｓら、２０００年；Ｃｈｅｎら、２００１年）と仮定されている。
【００２４】
免疫系に対するその効果を可能にするＧＡの特性は、完全には解明されていない。おそらく、ＧＡのランダム性および複雑性が、交差反応性を介して刺激されるＴ細胞の範囲が広いことの原因である。ＧＡペプチドの組成およびサイズもまた、共重合体の活性のための重要なファクターであるようである。ＭＢＰで認められたものと同様の比率で同様のアミノ酸を組み込むと、このミエリン抗原とのＴ細胞の交差反応性が得られる。同時に、単一のペプチド種での反復免疫感作は共重合体を使用して行われることはありそうもないので、共重合体の配列のランダムな性質は、おそらく、単一の定められたＡＰＬの使用と比較して安全性の余裕を与える。アミノ酸のアラニン、グルタミン酸、リシンおよびチロシンは、複数のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子にとって重要なアンカー残基として働き、ＧＡペプチドの強いＭＨＣ結合の理由であり、その結合は、ＧＡポリペプチド鎖中にこれらのアミノ酸が繰り返し存在するために、複数の結合レジスターにおいて起こり得る。これらのＧＡの特性の最終的な結果は、多数のＴ細胞への高度の刺激、高い結合親和性、およびＭＨＣ部位からの抗原の転位である。さらに、典型的なＭＨＣペプチドリガンドに比較して大きいサイズのＧＡは、ＭＨＣクラスター形成につながることがあり、したがって自己抗原に応答するＴＣＲ認識およびシグナル伝達を妨げることがある。これらの独特の特性があるため、ＧＡは有効かつ安全である。しかしながら、ＧＡ混合物の性質は、そのメカニズムの系統的な研究を複雑にしている。
【００２５】
手近にある免疫調節機構を理解しようとする一方で、いくつかの研究は、新たな共重合体の開発でＧＡを改良しようと試みている。初期の実験では、ポリ−ＹＥＡＫのランダム混合物中に見られる多くの種類の共重合体の実質的に全てが、精製したクラスＩＩＭＨＣタンパク質に結合することができることが決定され、所定のポリペプチドがその近隣のもの以上でも以下でもなく有効であることが示唆された（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９９年）。構造的にＤＲ２のＰ１ポケットが小さすぎて疎水性のチロシン（Ｙ）残基が入ることができないという事実にも関わらず、ＧＡは、ＭＢＰ（８５−９９）とＨＬＡ−ＤＲ２の結合に有効に競合し、ＭＢＰ（８５−９９）に対するＤＲ２制限応答を妨げることができる（Ｋｒｉｅｇｅｒら、１９９１年）。しかしながら、後者の結論は、ＤＲ２ｂのＰ４位置は大きなチロシンが容易に入るが、一方で、ＤＲ１５ハプロタイプ由来の他のＤＲ２対立遺伝子であるＤＲ２ａでさえもＰ１ポケット位置中でＹを選択することを考慮に入れていない。その後、３アミノ酸のランダム共重合体のいくつかが、他の分子よりも、別個のＤＲ分子に高い親和性で結合することが見出された。例えば、ポリ−ＹＥＡＫおよびポリ−ＥＡＫは、他の３アミノ酸共重合体（ポリ−ＹＥＡ、ポリ−ＹＥＫ、およびポリ−ＹＡＫ）よりも優れたＤＲ２分子の結合剤であった（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９９年）。
【００２６】
ＧＡの複雑性を限定すると、ＧＡの個々の特性、およびＧＡの免疫調節効果に対するそれらの寄与の検討が可能になるであろう。研究者は、より小さな分子を用いることによって、および／または、疾患に関連するＭＨＣ分子と相互作用する特定の免疫優性Ｔ細胞エピトープにおいて見られる残基に基づいて共重合体を設計することにより効果を向上させることによって、ＧＡの複雑性を限定しようと努力した。ＭＢＰ（８５−９９）とＨＬＡ−ＤＲ分子であるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１の相互作用に基づいて、グルタミン酸（Ｅ）の代わりにＦ（フェニルアラニン）を導入して、長さが１４、３５または５０ａ．ａ．の新規ランダム４アミノ酸共重合体が作られた（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、２００２年）。ポリ−ＦＡＫとポリ−ＦＥＡＫの両方とも、ＭＢＰ（８５−９９）特異的、ＨＬＡ−ＤＲ２制限ＴＣＣ活性化の抑制においてＧＡよりも有効であった。ポリ−ＦＡＫおよびポリ−ＦＥＡＫはまた、ＧＡよりも効率よくＳＪＬマウス系統のＥＡＥを抑制した。他の研究では、ＨＬＡ−ＤＲ２分子の溝とのＭＢＰ（８５−９９）およびＧＡの結合について近年記載されたモチーフ、すなわちＰ２でＥ、Ｐ１でＫ、Ｐ１でＹおよびＡ、ならびにＰ２〜Ｐ１１でＡに基づいてペプチドが合成された。ある一定の１５ｍｅｒペプチドが、実際に、ＧＡよりも有効にＭＢＰ（８５−９９）とＨＬＡ−ＤＲ２分子の結合を阻害した。他の報告では、ＨＬＡ−ＤＲ２およびＭＢＰ８５−９９についてのＭＨＣ−ＴＣＲ結合モチーフに基づいて、重要なＭＨＣポケットと結合し、Ｔ細胞活性化を妨げるように設計された、反復した４アミノ酸（ａａ）配列の規則的なペプチドが記載されている（Ｒｕｉｚら、２００１年）。そのような配列の１つであるＥＹＹＫＥＹＹＫＥＹＹＫは、ＬｅｗｉｓラットのＥＡＥを改善することが見出された。しかしながら、免疫優性エピトープとＤＲ分子の結合ポケットの結合モチーフに従って作製された合成共重合体は、ＭＨＣとＴＣＲのペプチド相互作用の様相を明らかにすることができると思われるが、上述のように、単一のＡＰＬの使用は、ＭＳ治療についてのヒト臨床試験において問題があることが判明した（Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、２０００年；Ｋａｐｐｏｓら、２０００年）。
【００２７】
本発明者らは、特定の位置で定められたアミノ酸式および残基を含む、定められた長さのペプチド複合混合物（ＣＭ）を設計した。本発明のいくつかの実施形態では、特定の位置についての式および残基の定義は、公表されているクラスＩＩの結合モチーフによって導かれる（Ｖｏｇｔら、１９９４年；Ｋａｌｂｕｓら、２００１年）。これらのモチーフは、混合物ペプチドの特定の位置にあるどのアミノ酸がＭＳ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１０１またはＨＬＡ−ＤＲ２）およびＥＡＥ（ＩＡＳ）関連ＭＨＣ分子のポケットと特異的に相互作用できるかを示すものである。本発明のいくつかの実施形態では、完全にランダムな混合物とは異なり、定められた位置に重要なアミノ酸を導入することによって、混合物のサイズおよび複雑性を限定した。本発明のいくつかの実施形態は、位置走査型コンビナトリアルライブラリー（ＰＳＣＬ）アッセイに基づいて、ペプチドのアセチル化、長さおよびＭＨＣアンカー偏向の影響、ならびにＧＡ特異的ＴＣＣに刺激性であると判明したアミノ酸の寄与を研究するために設計された複合混合物を特徴とするものであった。ヒトまたはマウスの脾細胞に由来するＰＢＭＣにおいて著しい刺激潜在性を有しており、他のペプチド抗原との高度な交差反応性が示唆される、いくつかの混合物を作製した。これらの混合物の一部は、ミエリン抗原との交差反応性、およびＥＡＥの重症度の軽減における予防的効果を示した。
【００２８】
本発明の態様には、長さ４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸などの定められた長さの複合ペプチド混合物、あるいはこれらの長さの２つ以上を含むペプチドの組み合わせが含まれる。一部の混合物は、大部分の特定の長さのペプチドを含み、その混合物の残りが、異なる長さのペプチド、または２つ以上の異なる長さのペプチドを含むことがある。本発明の特定の態様では、複雑性がより低く、より構造的に限定された混合物の、自己免疫プロセスに関連した刺激性の特性、および可能であれば治療上の特性の両方を発揮する能力を試験するために、より短い複合ペプチド混合物が作製された。ペプチドの長さ、構造または組成を含む基本的なファクターの微細な変化が混合物の刺激潜在性および治療潜在性をどのように変えることができるかを研究するために、複雑性が限定された混合物が開発された。本発明のいくつかの態様では、混合物のペプチドがアセチル化されている複合ペプチド混合物が作製された。本発明の特定の態様では、アセチル化は、複合混合物中のペプチドの大部分（または、好ましくは少なくとも約７０％、８０％、９０％）のＮ末端で行われた。他の実施形態では、アセチル化は、複合混合物中に見られる実質的にすべてのペプチドのＮ末端で行われた。さらなる実施形態では、混合物中のペプチドは、Ｎ末端に位置しない、アセチル化されたアミノ酸残基を含む。
【００２９】
複合ペプチド混合物は式で記載することができ、その式は、他の位置と相対的な位置にどのアミノ酸が見られるかを示すことができる。式中の特定の位置は、単一のアミノ酸を含めて、所望のアミノ酸の任意のサブセットに限定することができる。特定の位置が複数のアミノ酸に限定される場合、一実施形態でその位置を占めるのに利用できる複数のアミノ酸は、実質的に等しく利用できる。いくつかの実施形態では、混合物のペプチドの特定の位置を占めることができるアミノ酸は、その位置を占めることができる他のアミノ酸と実質的に同数の混合物ペプチド中に見出される。いくつかの実施形態では、混合物のペプチドの間で、１つの位置で見られる、考えられるアミノ酸それぞれの量に対する比が存在することがある。混合物ペプチドの特定の位置で複数のアミノ酸を見出すことができるいくつかの実施形態では、その位置で異なるアミノ酸を含んでいるペプチドと比較して、その位置で１つの特定のアミノ酸を含んでいるペプチドが等しくない数で存在することがある。式中のアミノ酸の配列は、混合物中の大部分のペプチドのＮ末端から開始することがある。本発明のさらなる実施形態では、式中のアミノ酸の配列が、混合物の大部分のペプチドの全体的なペプチド配列内に含まれる（すなわち、式の残基のＮ末端にもＣ末端にもさらなるアミノ酸残基が存在する）こともあり、あるいは、混合物中の大部分のペプチドのペプチド配列のＮ末端またはＣ末端で見出されることもある。本発明の式は、式の多様性が変化するように操作することができる。本発明のいくつかの態様では、式は、式中の各位置について同じ群の考えられるアミノ酸を含む。本発明の他の態様では、式は、その位置について考えられるアミノ酸の同一性が、式の他の少なくとも１つの位置での考えられるアミノ酸の同一性と異なっている位置を少なくとも１つ含む。好ましくは、考えられるアミノ酸の同一性が同じでない少なくとも３つの位置、場合によっては４、５、６、７、８つ、またはそれ以上の位置が存在する。いくつかの実施形態では、２つ、または３つ、またはそれ以上の位置での考えられるアミノ酸の同一性は同じ（好ましくは制約された一組）であるが、その位置での考えられるアミノ酸は、ペプチド混合物中の残りの位置での考えられる一組のアミノ酸と異なっている。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態では、式中の３、４、５、６、７つ、またはそれ以上の位置は、（システインを除いた）１９種未満の考えられるアミノ酸、好ましくは１０種未満、８、７、６、または５種のアミノ酸しか含まないようにされる。同様に、いくつかの実施形態では、式の２、３、４、５、６つ、またはそれ以上の位置は、１〜４種のアミノ酸に限定され、好ましくは、少なくとも１つまたは２つのそのような位置での考えられるアミノ酸の組は、任意の他のそのような位置での考えられるアミノ酸と異なる。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態では、複合混合物中の大部分のペプチドは、本発明の式に従うアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる実施形態では、複合混合物中のペプチドの７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、実質的にすべて、または他の一部分は、本発明の式に従うアミノ酸配列を含む。
【００３２】
好ましい実施形態では、複合混合物は、免疫調節性の混合物であり、少なくとも１つの抗原に対する、好ましくは自己抗原に対する哺乳類の免疫反応に対して測定可能な効果を有する。
【００３３】
本発明の複合ペプチド混合物の式は、任意のアミノ酸またはアミノ酸類似物を指定することができる。本発明のいくつかの実施形態は、式中の大部分の位置で任意の２０種の標準アミノ酸を利用する。さらなる実施形態は、システイン以外の任意の標準アミノ酸に限定される。システインは、いくつかの実施形態では、ペプチドの二次構造の形成を防止するために、複合混合物ペプチド合成に利用されない。本発明のいくつかの実施形態では、非標準アミノ酸、または非天然アミノ酸の使用が想定される；Ｄ−アミノ酸などの分子構造が変化したアミノ酸、および非標準的な側鎖を有するアミノ酸が指定できる種類の分子の例である。アセチル化のように、標準アミノ酸の類似物を使用すると、分解に対する耐性、送達または区画化の向上、および免疫調節活性の増大などの有利な特性を複合混合物ペプチドに付与することができる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、複合混合物はペプチド模倣物質を含む。本明細書において用いられるように、ペプチド模倣物質とは、上記のアミノ酸類似物の１種以上の使用を含む、ペプチド類似物を指す。「アミノ酸」という用語は本明細書全体で使用されるが、ペプチドが改変される場合、「アミノ酸」はペプチド中のアミノ酸を置換した残基すべてを指すと理解される。例えば、ペプチドの以下の改変によってペプチド模倣物質が作製される：下記の式Ｉの（１）で示すように、１つ以上のアミド結合を還元してアミンにすることができる；（２）で示すように、１つ以上のアミド結合を官能化することができ、式中、Ｒ１は遊離アミンでの任意のアルデヒド、またはカルボン酸であることができる；あるいは、（３）および（４）で示すように、その主鎖に沿ってヘテロ環を作ることができる。これらの化合物は、分解などのペプチドの限界の一部を改善しつつ、ペプチド類似物の活性を模倣することができる。ペプチド模倣物質の例、およびそれらを作製できる方法は、Ｎｅｆｚｉら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，８：２２７３〜２２７８（１９９８）およびＮｅｆｚｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６９：３６０３〜３６０９（２００４）中に見ることができ、これらは両方とも、参照により、その全体が本明細書に組み込まれている。
【００３５】
【化１】
2008500276.tif 000003
【００３６】
複合ペプチド混合物の式は、特定の位置で、ある一定の数の考えられるアミノ酸が見られることを示している。その特定の位置は、絶対的な位置であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、混合物中の大部分のペプチドは、Ｐ４、すなわちＮ末端の残基から４番目の残基でＡ、Ｅ、ＫまたはＹの１つを含む。さらなる実施形態では、特定の指定された位置は、単に、他の指定された位置に対して相対的なものである。例えば、式は、混合物中の大部分のペプチドにおいて、Ａ、Ｅ、ＫまたはＹが位置Ｐ１およびＰ５で見られ、その一方で、Ｉ、ＬまたはＶが位置Ｐ６で見られることを示すことができる。この例では、Ｐ１は、Ｃ末端の任意の最後の５残基を除いて、そのペプチド中の残基いずれであってもよく；Ａ、Ｅ、ＫまたはＹはまた、Ａ、Ｅ、ＫまたはＹを含む１番目の位置からＣ末端の方にある４つの位置でも見られ；Ｉ、ＬまたはＶが、２番目のＡ、Ｅ、ＫまたはＹの位置の後ろにある次のＣ末端の位置で見られる。さらなる実施形態では、複合ペプチド混合物の式は、混合物のペプチド中の特定の数の位置で、ある一定の数の考えられるアミノ酸が見られることを示すが、相対的なまたは絶対的な位置の数の点から、この要件に合う特定の位置を指定しない。例えば、式は、混合物中の大部分のペプチドが、その位置で利用できるアミノ酸がＡ、Ｅ、ＫおよびＹである少なくとも４つの位置を含むことを示すことができる。この実施形態では、混合物中の大部分のペプチドは、その配列中で少なくとも４回、Ａ、Ｅ、ＫまたはＹを含むはずである。式は、特定のサブセットのアミノ酸を含んでいる位置の数、ペプチド中の絶対的な位置の点からの、または式中の他の位置と相対的な位置の点からの、そのサブセットを含んでいる特定の位置、あるいは、混合物中の大部分のペプチド、混合物中の実質的にすべてのペプチド、またはその一部のフラクションについての、式の指定のうち任意の２種または３種すべての組み合わせを指定することができる。本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の式は反復され、複合混合物の大部分のペプチド中の同じペプチド内で２回以上見ることができる。さらなる実施形態は、複合混合物中の大部分のペプチド中の１つのペプチド中で１回しか見られない１つ以上の式を特徴とするが、一方で、１つ以上の他の式は複合混合物中の大部分のペプチド中の同じペプチド中で２回以上見られる。本発明のいくつかの実施形態では、式は、ダッシュで分離して、順に群を列挙することにより、混合物ペプチドの実質的にすべて、または一部のフラクション中で見られる、考えられるアミノ酸の群の特定の順序を示す。
【００３７】
本発明のさらなる実施形態は、位置走査型コンビナトリアルライブラリー（ＰＳＣＬ）およびＧＡ特異的Ｔ細胞クローン（ＧＡ  ＴＣＣ）を利用した実験を通して考え出された式によって定められる複合混合物を特徴とする。ＰＳＣＬの使用は、当技術分野で周知の技術であり（総説については、Ｂｏｒｒａｓら、２００２年を参照のこと。これは、参照により、その全体が本明細書に組み込まれている。）、それを用いて、複合混合物の多様性を限定することができる。特定の式の複合混合物のために、混合物中の実質的にすべてのペプチドについて１つの位置でのアミノ酸の同一性が固定されているサブライブラリー混合物を作製する。一般的に、アミノ酸の同一性を、各位置で、システインでない１９種の標準アミノ酸の１つに固定することに対応して、各位置について１９種のサブライブラリー混合物を作製する。複合ペプチド混合物の式中の何れの数の位置についても、一連のサブライブラリー混合物を作製することができる。いくつかの実施形態では、サブライブラリー混合物はすべて、その位置でのアミノ酸の同一性が１つの特定のアミノ酸に固定されている１つ以上の位置を有する。他の実施形態では、特定の位置でのアミノ酸の同一性は、その位置でのアミノ酸を２〜１８種のアミノ酸から選択することができる式によって定められる。さらなる実施形態は、アミノ酸類似物の使用を想定するものである。各サブライブラリー混合物は、アッセイにおいて、活性について試験することができる。本発明の特定の実施形態では、ＧＡ  ＴＣＣを活性化する能力について、サブライブラリー混合物を試験した。この実施形態のいくつかでは、親の複合混合物の全体的な活性に対する、各位置の各アミノ酸の寄与を調べた。特定の位置のいくつかのアミノ酸は、アッセイにおいて、高いレベルの活性を示すことがある。ＰＳＣＬの使用を通して、ある位置から低活性のアミノ酸を除去することによって、高いレベルの活性を示す唯一のアミノ酸または複数のアミノ酸の選ばれたものを残しながら、複合ペプチド混合物を作製するために使用した式を変更することができる。変更した式を使用する複合ペプチド混合物は、多様性が低いことがある。混合物から低活性のペプチドを除去することにより作製された、多様性を低くした式では、単位ペプチド質量当たりの混合物の活性を増加させることができる。本発明のいくつかの実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方の多種多様な実験アッセイ技術を用いた試験に適合している。特定の実施形態では、サブライブラリー混合物の活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖のアッセイ、サイトカイン放出アッセイおよび／または５１Ｃｒ放出アッセイを用いて測定する。ＰＳＣＬ技術を使用して、複合ペプチド混合物の式中の１つ以上の位置について最も活性なアミノ酸残基を同定することができる。ある実施形態では、ＰＳＣＬ技術を使用して、Ｔ細胞集団の高活性ペプチドリガンドとして働く唯一のペプチドの定められた式を作る。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態では、複合ペプチド混合物中に見られるペプチドは、免疫系細胞と、その細胞の表面上の受容体タンパク質を通して相互作用する。免疫細胞表面受容体タンパク質と複合混合物ペプチドの相互作用によって、受容体タンパク質または受容体タンパク質の一部の構造の変化、受容体タンパク質の活性化状態の変化、あるいは同じ細胞の表面上または他の細胞上で他のタンパク質と相互作用する受容体タンパク質の能力の変化が起こることがある。いくつかの実施形態では、免疫細胞表面受容体と本発明の複合ペプチド混合物中に見られるペプチドとの相互作用は、その受容体の他のペプチドと相互作用する能力を低下させ、または実質的に消失させる。例えば、細胞表面上のペプチドとクラスＩＩＭＨＣ分子の相互作用はＭＨＣ遮断につながる可能性があり、ＭＨＣ分子と複合混合物ペプチドの相互作用が、同じＭＨＣ分子と結合する他のペプチドによるＴ細胞の活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、複合混合物中に見られるペプチドとＴ細胞受容体との相互作用はＴ細胞拮抗作用につながる可能性があり、正常に刺激性のペプチドの提示に対するＴ細胞受容体の応答が阻害される。特定の実施形態では、複合ペプチド混合物中に見られるペプチドの相互作用が、細胞レベルでの免疫系細胞の変化をもたらす。その相互作用は細胞を刺激して、活性にさせ、増殖させ、および／または、サイトカインおよびインターフェロンなどのシグナル伝達分子を分泌させることがある。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体と複合混合物中に見られるペプチドとの相互作用は、より成熟した型の細胞、例えば免疫記憶細胞集団への免疫細胞の分化をもたらす。本発明のペプチドに曝露された免疫系細胞の活性は、炎症の増大または軽減につながることがある。例えば、いくつかの実施形態では、複合ペプチド混合物中に見られるペプチドは、Ｔｈ２型およびＴｈ３型のＴ細胞の表面上の受容体と相互作用し、これらの細胞の増殖を刺激する。次いで、細胞は中枢神経系へ移動し、自己抗原により刺激されてＩＬ−４などの抗炎症性シグナル伝達分子を分泌する。抗炎症性サイトカインが存在すると、バイスタンダー抑制が起こり、中枢神経系における自己免疫性炎症性ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性が低下する。他の実施形態では、免疫細胞受容体タンパク質と複合ペプチド混合物中に見られるペプチドとの相互作用は、細胞活性の低下、またはアネルギー状態の形成をもたらす。ある状況、例えば特定のサイトカインに曝露されている間では、複合混合物中に見られるペプチドと細胞表面受容体の相互作用は、抗原ペプチドの長期Ｔ細胞耐性を生むことができる。特定の実施形態では、免疫細胞表面受容体と複合ペプチド混合物中に見られるペプチドとの相互作用は、特定の抗原への曝露に対する生物の反応など、免疫系の通常の状態の変化をもたらす。本発明のさらなる態様は、本発明の複合混合物中に見られるペプチドと免疫細胞表面受容体タンパク質の相互作用の結果としての自己免疫の低下を特徴とする。ある実施形態では、ペプチドと表面受容体タンパク質の相互作用は、中枢神経系で見られるタンパク質に由来する自己抗原に対する生物の反応レベルを低下させる。特定の実施形態では、この自己抗原はミエリンに由来し、その反応は自己免疫性炎症性反応である。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態では、複合ペプチド混合物は脊椎動物に投与される。脊椎動物へのペプチドの送達は、多数の送達形式のうちの１つ以上によって行うことができる。胃腸管を介する送達と同様に、本発明のある実施形態では、静脈内送達、筋肉内送達、経皮送達、および他の形式の非経口送達が特徴である。
【００４０】
特段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。当業者なら、本発明の実施において使用することができる、本明細書に記載されているものと同様の、または同等の多数の方法および材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載されている方法および材料に限定されるものではまったくない。本発明の目的上、いくつかの用語を以下に定義する。
【００４１】
「多様性」とは、所定の式または構造の複合混合物中に存在し得る、異なるペプチドの数を指す。他の混合物よりも多数のペプチドを含み得る複合混合物は、より多様であると言われる。複合混合物中の大部分のペプチドを定める式の変化は、新しい式に従って合成された複合混合物の「程度が制約された多様性」につながる可能性がある。新しい式によって生成した、考えられるペプチドの数が、古い式での考えられるペプチドの数より少ない場合、多様性は制約される。複合混合物の相対的な多様性は、標準アミノ酸１９種（システインを除いた標準アミノ酸２０種）のいずれか１種で、各ポリペプチド中の各位置を占めることができるランダムポリペプチド混合物と比較することもできる。任意のランダムポリペプチド混合物ペプチドの任意の位置で標準アミノ酸１９種のいずれかを有することがあり得ることは、この型の混合物が非常に高度な多様性を有することを意味する。複合混合物の相対的な多様性を比較することに加えて、複合混合物の特定の式から、考えられるペプチドの数を計算することにより、複合混合物の理論上の絶対的な多様性を算出することができる。例えば、混合物のペプチドにおける３つの位置それぞれを４種のアミノ酸のうちの１つで占めることができるトリペプチドの複合混合物は、４３、すなわち６４種の考えられるトリペプチドを含み得る。
【００４２】
「刺激指数」、またはＳＩとは、試験する刺激物に曝露されていない対照集団との関係での免疫細胞集団の刺激の測定値を指す。ＳＩは、次の式：
ＳＩ＝ｃｐｍ（Ａｇ）／ｃｐｍ（Ａｇなし）
によって得られる数として表すことができる。本発明のある実施形態では、複合混合物中に見られるペプチドによって刺激されるＴＣＣの活性、およびペプチドに曝露されていない対照ＴＣＣ培養物の活性を測定する。そして、その２つの測定値を組み合わせて、実験用Ｔ細胞集団が曝露されたペプチド混合物についての刺激指数とする。
【実施例】
【００４３】
以下の実施例は、本発明の様々な適用例を開示するものであり、本発明を限定するものでなく、むしろ例示するものである。
【００４４】
材料および方法
ペプチドおよび試薬：
他の箇所で最初に示したように、同時複数ペプチド合成法、メチル−ベンズヒドリルアミンポリスチレン樹脂、およびｔ−Ｂｏｃ保護Ｌ−アミノ酸によって、複合混合物（ＣＭ）（表１、下記）およびミエリンペプチドを合成した（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．、ＰＮＡＳ  ８２：５１３１〜５１３５、およびＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４２：３７４３〜３７７８、１９９９、この両方とも、参照により、その全体が本明細書に組み込まれている）。ミエリンペプチドプール：プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）ペプチド：ＰＬＰ８９〜１０６−ＧＦＹＴＴＧＡＶＲＱＩＦＧＤＹＫＴＴ、ＰＬＰ１３９〜１５４−ＨＣＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦＶＧＩ、ＰＬＰ１７８〜１９７−ＮＴＷＴＴＣＱＳＩＡＦＰＳＫＴＳＡＳＩＧ、ＰＬＰ１９０〜２０９−ＳＫＴＳＡＳＩＧＳＬＣＡＤＡＲＭＹＧＶＬ。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチド：ＭＢＰ１３〜３２−ＫＹＬＡＴＡＳＴＭＤＨＡＲＨＧＦＬＰＲＨ、ＭＢＰ８３〜９９−ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰ、ＭＢＰ１１１〜１２９−ＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧＦＧＹＧＧ、ＭＢＰ１３１〜１５５−ＡＳＤＹＫＳＡＨＫＧＬＫＧＶＤＡＱＧＴＬＳＫＩＦＫ、ＭＢＰ１４６〜１７０−ＡＱＧＴＬＳＫＩＦＫＬＧＧＲＤＳＲＳＧＳＰＭＡＲＲ。ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチド：ＭＯＧ１〜２０−ＣＱＦＲＶＩＧＰＲＨＰＩＲＡＬＶＧＤＥＶ、ＭＯＧ１１〜３０−ＰＩＲＡＬＶＧＤＥＶＥＬＰＣＲＩＳＰＧＫ、ＭＯＧ２１〜４０−ＥＬＰＣＲＩＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹ、ＭＯＧ３５〜５５−ＭＥＶＧＷＹＲＰＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ。２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰアーゼ）およびミエリン乏突起膠細胞塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）ペプチド：ＣＮＰアーゼ３４３〜３７３−ＥＶＧＥＬＳＲＧＫＬＹＳＬＧＮＧＲＷＭＬＴＬＡＫＮＭＥＶＲＡＩ、ＣＮＰアーゼ３５６〜３８８−ＧＮＧＲＷＭＬＴＬＡＫＮＭＥＶＲＡＩＦＴＧＹＹＧＫＧＫＰＶＰＴＱＧ、ＭＯＢＰ２１〜３９−ＦＳＩＨＣＣＰＰＦＴＦＮＮＳＫＫＥＩＶおよびＭＯＢＰ３１〜４９−ＦＬＮＳＫＫＥＩＶＤＲＫＹＳＩＣＫＳＧ。液体クロマトグラフィーシステムと連結したエレクトロスプレー質量分光光度計を用いて、ペプチドをキャラクタリゼーションした。酢酸グラチラマー（ＧＡ）／共重合体１／コパクソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）は、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｔｅｖａ  Ｍａｒｉｏｎ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、カンザスシティー、ミズーリ州）から購入した。ＰＬＰ１３９−１５１ペプチド（配列ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ）は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｐａｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（パロアルト、カリフォルニア州）によって合成された。ヒトＭＢＰは、以前に記載されている通りに調製した（Ｄｅｉｂｌｅｒら、１９７２年）。
【００４５】
【表１】
2008500276.tif 000004
【００４６】
患者および対照：
ＭＳ患者５名および健常ドナー９名から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。患者は、再発寛解型ＭＳに罹患しており、３１〜４１歳であった。患者２名は、インターフェロン−β療法中であり、残りの患者は採血時に治療を受けていなかった。それまで誰もＧＡを投与されていなかった。各患者および健常ドナー６名は、ＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ２ハプロタイプ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１０１）を発現していた。
【００４７】
Ｔ細胞増殖：
白血球フェレーシスからＰＢＭＣを単離し、９６ウェルＵ底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、ネーパーヴィル、イリノイ州）の中に、２×１０５細胞／ウェルで、完全Ｔ細胞培地（ＴＣＭ；２ｍＭのｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、それぞれ１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン、および５％のプールしたヒトＡＢ血清を含むイスコフ改変ダルベッコ培地［ＩＭＤＭ］）にそれを播種し、２０μｇ／ｍｌのＣＭおよびＧＡで刺激した。６日後、１００μｌの細胞懸濁液のサンプルをこのプレートから取り出し、１μＣｉ／ウェルのＨ３−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）を添加した新たなマイクロタイタープレートにそれを移し、１６時間後にそれを採取し、シンチレーションカウンター（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ、Ｗａｌｌａｃ、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）でカウントした。ヒト組換えインターロイキン（ＩＬ）−２（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ；米国国立癌研究所、ＮＩＨのＣ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ博士提供）を、新たなＴＣＭ中２０Ｕ／ｍｌの最終濃度で、元のプレートに添加し、よく分裂し二次増殖となるまで２〜３日毎にそれを補充した。ＩＬ−２を２〜３日休止した後、５０μｌの細胞懸濁液を別個の９６ウェルＵ底プレートの隣接したウェル中に移し、自己由来の照射（３０００ｒａｄ）ＰＢＭＣ２×１０５個を含むＴＣＭ１００μｌを、対照のウェル（抗原を含まない）にＸ−ｖｉｖｏ培地５０ｍｌ、およびＸ−ｖｉｖｏ培地中のＣＭ（２０μｇ／ｍｌ）５０μｌと共に添加した。元のプレートに、照射ＰＢＭＣ（上記のもの）、２０μｇ／ｍｌの抗原、および培養を維持するためのＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を入れた。二次刺激から４８時間後、プレートにチミジンを入れ、上記のように１６時間後にそれを採取し、カウントした。二次増殖と同様に、その後の刺激によって、個々のＣＭに特異的な系統が発生し、上記のような増殖アッセイにおいて、ミエリンペプチドプール（各ペプチド１０μｇ／ｍｌ）との交差反応性について試験した。
【００４８】
ＧＡ特異的Ｔ細胞クローンによって認識された重要なアミノ酸の同定：
健常ドナーからＧＡ特異的ＴＣＣを確立し、ＰＳＣＬで試験して、１０ｍｅｒペプチドの各位置での刺激性アミノ酸を同定し、それによって特異性が既知および未知のクローンに対する抗原を予測した。刺激潜在性の２つの閾値に基づいて、上記の「ペプチドおよび試薬」で記載したようにＣＭを作製した（表１、「ＧＡクローン駆動（ＧＡ  ｃｌｏｎｅ  ｄｒｉｖｅｎ）」）：ＧＡ  ＴＣＣ−１は、刺激指数（ＳＩ）が各位置での平均ＳＩより２倍大きい混合物の定められたアミノ酸を含み、ＧＡ  ＴＣＣ−２は、著しい刺激能（各位置での平均ＳＩより１．２倍大きいＳＩ）を有するアミノ酸すべて、したがって著しくより複雑な混合物を含んでいた。
【００４９】
マウスにおけるＣＭのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫原性：
６〜８週齢の雌ＳＪＬ／ＪマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から購入した。麻酔した未処置のＳＪＬマウスから脾細胞を分離し、または背中の４箇所に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、ミシガン州）中のＣＭまたはＧＡ２００μｇで免疫感作してから１０日後に、無菌的に脾臓を取り出し、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（カマリロ、カリフォルニア州）のＡＣＫ溶解緩衝液を用いて赤血球を溶解した。一次増殖では、９６ウェル丸底プレート（Ｎｕｎｃ、ロチェスター、ニューヨーク州）中に、４０、１０または２．５μｇ／ｍｌの種々のＣＭ、ＰＬＰ、またはＧＡの存在下で、マウス細胞培地［１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、トロント、オンタリオ州）、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）（すべてＢｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（ウォーカーズヴィル、メリーランド州）からのもの）を補充したＲＰＭＩ１６４０］に２×１０５細胞を播種した。未処置マウスまたは免疫感作マウスの実験において、それぞれ、６日後または３日後に、１μＣｉの３［Ｈ］−チミジン（Ｄｕｐｏｎｔ、ウィルミントン、デラウェア州）を添加して１晩置き、その後それを採取し、Ｔｒｉｌｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）でチミジンの取り込みをカウントした。
【００５０】
ＥＡＥの誘導：
動物実験は、ＮＩＨの動物の管理および使用の指針に従って行った。６〜８週齢の雌ＳＪＬマウスを、ヒト型結核菌Ｈ３７ＲＡを２ｍｇ／ｍｌまで補充した不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（どちらもＤｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのもの）中のＰＬＰ７５μｇで免疫感作した。ＣＭの予防的効果を試験するために、免疫感作に先立って、５００μｇのＣＭまたはＧＡをこのエマルジョン中に添加した。疾患の発症についてマウスを盲検評価し、試験後に臨床スコアを次の通りに割り当てた：０＝臨床的徴候なし；１＝尾の弛緩；２＝一方または両方の後肢の不全麻痺；３＝一方または両方の後肢の完全麻痺；４＝四肢不全麻痺または四肢完全麻痺；５＝瀕死。累積スコアは、初期の疾患の経過（０〜２４日）および残る疾患の経過（２４〜４５日）の間に各マウスで記録された個々のスコアの合計の平均値を表す。
【００５１】
データ分析：
ＡＮＯＶＡおよびチューキーの多重比較を用いて、ＣＭに対する、またはＭＢＰに対するＴ細胞系の増殖応答を比較して、刺激していない対照と比較した、抗原に対する有意な応答（ｐ＜０．０５）を決定した。有意差用のＡＮＯＶＡ、およびスチューデントｔ検定を用いて累積疾患スコアを比較して、疾患の初期の期間、さらにその後の再発の間中、ＣＭまたはＧＡで免疫感作した個々のマウスのスコアを、ＰＬＰだけを投与したマウスと比較した。
【００５２】
短い複合混合物はヒトにおいてもマウスにおいても刺激性である
小さい、限定されたペプチド混合物のＰＢＭＣを刺激する能力を評価し、この応答に対するアセチル化、ペプチドの長さおよびＭＨＣアンカー偏向の影響を試験するために、複合混合物（ＣＭ）を設計した。複雑性が最も大きい基礎の複合混合物は、システインを含まない１９種のアミノ酸（システインは二次構造の形成を避けるために除外した）のいずれも含む１０ｍｅｒである。改変は、刺激潜在性または治療潜在性に対するサイズおよび組成の影響を特徴付けるため、この基本構造に基づくものであった。ペプチドの各位置でのアミノ酸（ａａ）の数が減少するにつれて、ペプチド混合物の複雑性も低下する。抗原への一次曝露および二次曝露時の、またはマウス脾細胞を使用した一次増殖における、健常ドナー由来ＰＢＭＣとＭＳ由来ＰＢＭＣの両方の増殖応答を評価することによって、ＣＭの免疫原性を評価した。マウスおよび健常ドナーからの細胞を用いた予備実験では、１５ｍｅｒを除いて、アセチル化したＣＭはすべて、その非アセチル化対応物よりも刺激性であることが判明し（データは示さず）、したがって、アセチル化した１０ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、および２０ｍｅｒのみを使用して研究を続けた。健常ドナーにおいても（図１Ａ、Ｃ）、マウス脾細胞を用いても（図３Ａ）、１５〜２０ａａ（直鎖または分枝状、データは示さず）の長い混合物は、長さ１０〜１２ａａの短い混合物より低い頻度で、増殖応答を生じた。その後、この短く、ＭＳ患者において、またマウスでの治療実験においてもより刺激性のＣＭに実験の焦点を合わせた。健常ドナー９名（図１Ａ〜Ｂ）およびＭＳ患者５名（図２Ａ〜Ｂ）では、一次および二次増殖応答は、ポリペプチドＧＡで刺激した時に最も頻繁に認められ、このことはマウスの一次応答にも当てはまった。しかし、ＧＡよりも低いウェルの割合であったが、より長い２０ｍｅｒと比較して、ＡＥＫＹ１０−ＧＡ、ＡＥＫＹ１２および非Ａｃ−ＡＥＫＹ１５が有効であることから、混合物の長さが増大しても、必ずしも、その刺激潜在性が増大するわけではないことが示唆される。
【００５３】
ＭＨＣアンカーアミノ酸、ＭＨＣ偏向（ＭＨＣ  ｂｉａｓ）の組み込みはＣＭの刺激潜在性を増大させる
ＭＨＣアンカーａａの組み込みがこれらの化合物の刺激潜在性を増大させるかどうかを試験するために、ＨＬＡ−ＤＲ１５ハプロタイプ中で発現する２つのＨＬＡ−ＤＲ２対立遺伝子、すなわち、ＤＲＢ１＊１５０１またはＤＲ２ｂ、およびＤＲＢ５＊０１０１またはＤＲ２ａについて知られているＭＨＣアンカーの公表されているデータを使用して、ＡＥＫＹを基礎とするＣＭを設計した。基礎のＡＥＫＹ１０と比較して、ＨＬＡ−ＤＲ２ａアンカーまたはＨＬＡ−ＤＲ２ｂアンカーのいずれか一方を含むＡＥＫＹ１０は、健常ドナーと患者の両方において、有意により刺激性であった（図１Ｃ〜Ｄ、図２Ａ〜Ｂ）。ＨＬＡ−ＤＲ２＋の患者およびＨＬＡ−ＤＲ２＋の健常ドナーでこの結果を予想することはできたが、それは非ＤＲ２ドナーでも観察された（データは示さず）。多数のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子の特異性ポケット、例えばポケット１で類似したａａを共有することが、この観察結果の原因である可能性がある。
【００５４】
ＳＪＬマウス由来の脾臓では、ＩＡｓにとって重要なＭＨＣアンカーを適当なポケット中に導入すると（ＡＥＫＹ１０−ＩＡｓ）、または配列の外に導入しても（ＡＥＫＹ１０−ＩＡｓ−ｍｉｓ）、ＡＥＫＹ１０の刺激潜在性は著しく高められた（図３Ｂ）。ＩＡｓアンカーの著しい寄与は、ＧＡ由来のａａの偏向がなくてさえも、一度そのアンカーが導入されさえすれば、ランダムペプチド（１９ａ．ａ．）に応答して増殖が増大することによって更に強調された。興味深いことに、ＡＥＫＹ１０−ＤＲ２ｂも、マウスにおいて、偏向のないペプチド（ＡＥＫＹ１０）よりも著しく刺激性であった。
【００５５】
酢酸グラチラマー偏向はＣＭの刺激潜在性に必要でない
ＧＡの刺激性の性質は、しばしば、その独特の組成に帰せられる。したがって、ＧＡのモル比でのＡＥＫＹ１０は等モル比でのＡＥＫＹ１０よりも強い増殖応答を生じるが、等モル比でのＡＥＫＹ１０は１９ａ．ａ．１０よりも刺激性であった。しかしながら、そのようなＧＡのモル偏向は、特に二次増殖において、等モルのアセチル化ＡＥＫＹ１２、または非アセチル化ＡＥＫＹ１５に対する応答が高頻度であることにより明らかなように、より長いペプチドでは絶対的に必要ではなかった（図１および図２）。健常ドナーとＭＳ患者の両方において、ＡＥＫＹ１０−ＤＲ２ｂのＭＨＣ偏向は、等モル量でのＡＥＫＹ１０と比較して増大したＡＥＫＹ１０−ＧＡの刺激潜在性に匹敵し、それを上回りさえすることができた。注目すべきことに、この同じＤＲ２ｂ偏向がＩＡｓのＳＪＬマウスで観察された。さらに、１９ａ．ａ．１０中にＩＡｓのＭＨＣ偏向を導入することにより（図３Ａ〜Ｂ）、刺激潜在性がＡＥＫＹ１０−ＧＡと同等であり、ＡＥＫＹ１０−ＩＡｓより刺激性であるＣＭが作製され、このことから、ＧＡのａａ組成に関して相対的な必要条件があるに過ぎず、おそらくはＧＡ偏向ＣＭより良好なものも設計されるかもしれないことが再度強調される。
【００５６】
ＰＳＣＬは、潜在的なＴ細胞抗原を同定する貴重な手段であり、これをＧＡ特異的ＴＣＣとともに使用して、このクローンに刺激性であるペプチドまたは一組のペプチド中の各位置でのａａを同定した。各位置で潜在的に刺激性であるａａをすべて含む１つの混合物を設計した（そのＰＳＣＬにより各位置での平均ＳＩより１．２倍大きいＳＩが誘導された、ＧＡ−ＴＣＣ−２）。推定上、より高い活性化の閾値を有し、各位置で最も刺激性があるａａのみで構成され（ＧＡ−ＴＣＣ−１）、したがってＧＡ−ＴＣＣ−２より短い配列を含む、他の複雑性の低い混合物を作製した。これらの混合物は両方とも患者および健常ドナーにおいて非常に刺激性であったが（図１Ｃ〜Ｄ、図２Ａ〜Ｂ）、全体的にＧＡ−ＴＣＣ−２（最も複雑な混合物）がより刺激性であることが判明した。マウスでは、このより複雑なペプチドはまた、非常に刺激性であり（図３Ｂ）、他のＣＭより、またはＧＡさえよりもはるかに刺激性であった。特に、アラニン、グルタミン酸およびリシンは、これらのＧＡクローン「設計された」混合物中に頻繁に現われるが、直鎖状ペプチド中の定められた位置でそれらが存在することにより、ＡＥＫＹ１０−ＧＡ中に含まれるものより刺激性である配列を有するＣＭが生じると思われた。
【００５７】
ＣＭ特異的Ｔ細胞系はミエリンタンパク質に対する交差反応性を示す
ＧＡについて最も考えられる作用機構は、バイスタンダー抑制の誘導能を伴う。Ｔｈ２／Ｔｈ３免疫抑制性ＧＡ特異的Ｔ細胞は、ミエリンタンパク質を認識することが示されており、この交差反応性により、ミエリン分解の部位での免疫抑制性因子の放出と、それによるバイスタンダー抑制が可能となる。以前にはＣＮＳの自己免疫に関連させていたミエリンタンパク質またはペプチド全体を認識する能力について、健常ドナーと患者の両方から、ならびにＣＭで免疫感作したマウスから確立したＣＭ特異的系統を試験した。下記の表２は、ミエリンペプチドプールに対する増殖性のＣＭ特異的な交差反応性を示した一組のヒトＴ細胞系を示す。ほとんどの場合、ＣＭ特異的系統は、ミエリンタンパク質／ペプチドに応答する刺激指数が多くの場合より低い培養物を生成するために使用した元の抗原に対して最も応答性が高かった。患者での予備的データは、ＭＯＢＰまたはＭＢＰペプチドに対する交差反応性が優勢であることを示唆するが、この観察結果はさらなる研究を必要とする。
【００５８】
【表２】
2008500276.tif 000005
【００５９】
そうしなければ非常に低い頻度でしか存在しない可能性があるＣＭ特異的Ｔ細胞の研究を可能にするために、ＳＪＬマウスをＣＭで免疫感作し、１０日後に脾細胞を収集した。ＡＥＫＹ１０−ＧＡ、ＡＥＫＹ１２、ＡＥＫＹ１０−ＩＡｓ由来の細胞、そしてまたＧＡ免疫感作したマウスも、非常に高いＳＩで、その免疫抗原に応答したが、様々な程度で全ヒトＭＢＰとも交差反応した（図４）。ＣＦＡのみで免疫感作した脾臓のＭＢＰに対する応答はごくわずかであった（データは示さず）。特に、ヒトとマウスのＣＭ特異的Ｔ細胞系両方におけるミエリンタンパク質に対する交差反応性は、ＡＥＫＹ１０、１２または１５の混合物を基礎とするＣＭで最も多く観察され、増殖実験において最も刺激性があることが判明した。
【００６０】
ＥＡＥにおけるＣＭの予防的潜在性
ＣＭを単回投与でＰＬＰとともに送達して、ＳＪＬマウスにおけるＥＡＥの経過または重症度を変化させるこれらの化合物の予防的潜在性を試験した。表１中に列挙したＣＭそれぞれを、ＰＬＰ１３９−１５１およびＣＦＡとともに接種物に５００μｇ添加して、試験し、疾患の徴候について毎日マウスをモニターした。この単回投与では、ＡＥＫＹ１０−ＧＡおよびＡＥＫＹ１０−ＩＡｓが、疾患の最初の期間の間、累積疾患スコアを約半分低下させ（下記の表３、図５）、この結果はＧＡを用いて得られた結果と同様であった。興味深いことに、１９ａ．ａ．１０−ＩＡｓのＩＡｓ偏向は、マウス細胞に刺激性であるが、予防上有効でなく、このことから、予防的効果に影響を及ぼす上でのＡＥＫＹの一部の成分にとっての役割が示唆される。その刺激潜在性と同様に、ＡＥＫＹ１０と比較した、ＡＥＫＹ１０−ＧＡ中に導入されたＧＡモル偏向の予防的効果は、ＡＥＫＹ１０−ＩＡｓ中にＩＡｓアンカー偏向を導入することによって２倍にできた。ＡＥＫＹ１０−ＩＡｓおよびＧＡのみが、再発期の間中、累積的な疾患の経過を有意に軽減することができ、スコアを約３分の１低下させた。これらの化合物がマウスの増殖実験において最も刺激性があったが、ＡＥＫＹ１２またはＧＡ−ＴＣＣ−２１０を含む、他の非常に刺激性である混合物は、この投与では疾患の経過に対して効果がなかった（データは示さず）。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
ＰＳＣＬ関連技術を用いた混合物の式の最適化
本発明者らの位置走査技術の変法を用いて、表１の２種の複合混合物（下記にも示す）を最適化する。ＡＥＫＹ１０−ＩＡｓは、高度に複雑な混合物である１９ａ．ａ．１０−ＩＡｓ（３，３８７，３０３，４３２個のペプチドの混合物）と比較して複雑性が低い（２９４，９１２個のペプチドの混合物）。
【００６３】
【表４】
2008500276.tif 000007
【００６４】
これらのＣＭを最適化するために、通常位置走査を行う方法と同様にして、位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）５（ＴＣＲ結合に関与）および位置１または４（ＭＨＣ結合に関与）を定める。例えば、複合混合物ＡＥＫＹ１０−ＩＡｓについては、４０個の混合物を作製し、２０個は位置５をアミノ酸２０種のうちの１種で定め（サンプル１〜２０）、２０個は位置１または４を定める（サンプル２１〜４０）。サンプルの式を下記の表４に示す。他の実験では、結合において役割を果たすことが知られていない位置で置換を行う。
【００６５】
【表５】
2008500276.tif 000008
【００６６】
（複合混合物ＡＥＫＹ１０−ＩＡｓについての）これらの４０個のサンプルをＥＡＥモデルにおいてスクリーニングし、その活性を元のＣＭと比較することにより、位置１および５中に含まれるアミノ酸を同定する。これらの改変された複合混合物を作製し、ＥＡＥモデルにおいてスクリーニングして、その活性を確認する。その結果を用いて、混合物の活性を増大させるために、位置１および５中に含まれる代替のアミノ酸残基を有する複合ペプチド混合物の式を作成することができる。
【００６７】
１９ａ．ａ．１０−ＩＡｓなどのより複雑な複合混合物についても、この実験を行う（その実験は、他の複合混合物と並行して行うことができる）。２種類の複合混合物（複雑性が高いもの、および複雑性が低いもの）を改変することによって、ＥＡＥモデルにおける複合混合物の活性に対する複雑性の寄与を確証し、それを用いて、より高いレベルの活性を有する混合物を設計することができる。
【００６８】
これらの実験では、各ＣＭについてサンプル４０個、合計でサンプル８０個を使用する。これらのサンプルそれぞれについて、１０の異なるマウスＥＡＥモデル（マウス８００匹＋対照）で約２カ月間実験を行う。この実験で集められたデータに基づいて、元の複合混合物それぞれに由来する１〜３種の新たな複合混合物を合成し、合計６種の新たなサンプルについて、それぞれを１０の異なるマウスＥＡＥモデル（マウス６０匹＋対照）で約２カ月間スクリーニングする。
【００６９】
他の実験方法を用いて複合混合物ライブラリーをスクリーニングすることもできる。例えば、ＭＳ患者または健常ドナーから採血した血液からＰＢＭＣを単離することができる。この細胞は、次いで、ペプチドの様々な混合物に曝露した後の細胞の活性化または増殖のレベルを測定する実験で使用することができる。この実験の結果に基づいて、複雑性のレベルが低いまたは高い複合混合物ペプチドの式を作成することができる。いくつかの実施形態では、複合ペプチド混合物の式の再作成が２回以上行われ、混合物のペプチド内での特定の位置にあるアミノ酸の考えられる選択がますます限定されるようになる。いくつかの実施形態では、混合物のスクリーニングの結果、特定のペプチドの正確な式が選択される。
【００７０】
本発明で使用することができる他のスクリーニング法には、他の動物ベースの疾患モデルがある。例えば、実験動物の心血管系に及ぼす複合ペプチド混合物の影響を、動物を混合物に曝露した後、測定することができる。他のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングモデルには、暗がりにとどまる動物の傾向を測定するために設計された明／暗選択；恐怖および不安を高めるように設計された刺激に対する動物の反応を測定するために設計された高架式十字迷路；誘発した高熱下で動物の中核体温を測定するために設計されたストレス誘発性高熱；以前は電気ショックと対となっていた大きな騒音に対する反応を測定するために設計された恐怖増強性驚愕など、当技術分野で周知の不安および抑うつのモデルがある。他のスクリーニングモデルには、食物またはカロリー摂取を測定するために設計された肥満試験がある。認知のスクリーニングモデルには、学習した手がかりに基づいて隠された逃げ道を見つける動物の学習能力を測定するために設計されたモリス水迷路がある。神経障害または運動障害のスクリーニングモデルには、動物の前肢および後肢の握力試験、ならびに運動協調性および平衡性にアクセスするために使用されるロータロッドがある。他のスクリーニングモデルには、テールフリック、ホットプレートおよびプラスター、ならびに身もだえを含む疼痛のモデルがある。他のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングモデルは当業者に周知であり、それを使用して、複合ペプチド混合物をスクリーニングすることができる。
【００７１】
特定の混合物の効果に基づいて、多様性の低いまたは高い新たな混合物を調製することができる。
【００７２】
結論：
複雑性がより低く、より構造的に限定された混合物の、自己免疫プロセスに関連した刺激性の特性、および最終的には治療的な特性の両方を発揮する能力を試験するために、より短い複合ペプチド混合物が作製された。主に、その目的は、ペプチドの長さ、構造または組成を含む基本的なファクターの微細な変化、ならびに刺激潜在性および治療潜在性に対する関係を研究することを意図して、複雑性が限定された混合物を開発することである。いくつかの場合では、様々な長さのペプチドの刺激潜在性から、１０〜２０アミノ酸の範囲では、１０〜１２アミノ酸の短いペプチド、特にアセチル化された分子が健常ドナー、ＭＳ患者、およびＳＪＬマウス由来の全部のＴ細胞に対してはるかに刺激性であったことが示唆された。興味深いことに、ＡＥＫＹ１０−ＧＡ中でＥおよびＹに比べてＡおよびＫが多く存在すると、ＡＥＫＹ１０中の等モル比のａａより刺激性であった。ＡＥＫＹ１０中での富化を伴うＹの疎水性およびサイズは、相対的に結合が減少し、従って刺激潜在性が低くなることの原因となることがある。多数の報告が、ＧＡの大きなサイズが強い刺激潜在性の最終的な原因であることを提案しているが、本発明者らは、マウスとヒトの両方において、より小さなペプチドを用いた合理的な刺激指数を見出した。
【００７３】
ＣＭの刺激潜在性の最も著しい増大は、ＭＨＣ偏向をペプチドＡＥＫＹ１０または１９ａ．ａ．１０中に導入したときに起こった。これらのＣＭについての結合試験はまだ実施されていないが、そのデータは、ＤＲ２ａまたはＤＲ２ｂアンカー残基がこれらの１０ｍｅｒの刺激潜在性を高めることを反映するものである。患者または健常ドナーにおいてＤＲ２ａ対ＤＲ２ｂの偏向に起因する増大の間に有意差はなかったが、ＤＲ２ｂ偏向ＡＥＫＹ１０−ＤＲ２ｂは、ＩＡｓマウス集団においてはるかに刺激性であることが判明し、その一方で、ＤＲ２ａ偏向ＣＭに対する応答はごくわずかであった。これらのデータから、導入されたＭＨＣ偏向が、そのａａ組成により、または共通のアンカーを有することにより、異種間で効果をもたらす可能性があることが示唆される。表１を参照すると、Ｉ、ＬおよびＶが、ＤＲ２ｂおよびＩＡｓのアンカー残基としてＰ７で共有されていることが分かり、これにより、ＤＲ２ａ偏向ＣＭと比較して、またＩＡｓ偏向ＣＭと比較してさえも、ＳＪＬマウスにおいてＤＲ２ｂ偏向ＣＭの刺激潜在性が高いことが説明できる可能性がある。しかしながら、特にＨＬＡ／ＭＨＣクラスＩＩの結合用の溝がどちらかの末端で開放されており、複数のレジスターにおいて、異なるポケット中で特異的なａａとペプチドの結合が起こることがあるので、現在のところ、この推測が実際に正しいかどうかは分からない。
【００７４】
ＧＡ特異的ＴＣＣおよびＰＳＣＬに関係する研究は、ＧＡの刺激性の特性を駆動する重要な残基の同定、およびＧＡ特異的クローンによって認識されるＧＡ中の「理想的な抗原」の成分の特定に役立った。各位置でより多くのａａを含む混合物、したがってより複雑な混合物（ＧＡ−ＴＣＣ−２、ＧＡ−ＴＣＣ−１と比較して）は、（ＤＲ２＋だけでなく、すべてのＨＬＡ型の）健常ドナー、患者、およびマウス細胞での試験全体にわたって、より刺激性であった。
【００７５】
作用機構としてＧＡのペプチド結合に競合する能力に相当な考慮が払われているが、大量のＧＡがこれらの効果を媒介するのに必要であり、これらはおそらく決して到達されないので、この特性がｉｎ  ｖｉｖｏで作用することはありそうもないと思われる。バイスタンダー抑制は、より魅力的な免疫調節機構であり、いくつかのグループが、最近、バイスタンダー抑制がＧＡで処置された患者で実際に起こることを証明している（Ｄｕｄａら、２０００年；Ｇｒａｎら、２０００年；Ｎｅｕｈａｕｓら、２０００年；Ｃｈｅｎら、２００１年）。自己抗原ペプチドとの交差反応性は、概念上、重要なバイスタンダー抑制に必要な条件である。
【００７６】
ＭＨＣ偏向またはＰＳＣＬ駆動データを用いて開発された大部分のＣＭは、非常に刺激性であり、したがってＴＣＲ認識の退化を利用するものであった。しかしながら、ＣＭの刺激能は、ＥＡＥの累積的な重症度を軽減する効果へと直接に変換されなかった。実際、ＩＡｓ偏向１０ｍｅｒだけが、ＧＡまたはＧＡモル比偏向１０ｍｅｒのＡＥＫＹ１０−ＧＡで観察される疾患の軽減に匹敵した。ＧＡ−ＴＣＣ−２１０（ペプチド中の低い閾値のａａ）またはＡＥＫＹ１０−ＤＲ２ｂでの同時免疫感作は、培養中ではどちらも非常に刺激性であったが、これらの投与では疾患の経過に対して影響を及ぼさなかった。さらに、ＧＡおよびＡＥＫＹ１０−ＩＡｓだけが、最初およびその後の疾患の悪化の間中、全部の疾患スコアを有意に低下させることができた。脳炎誘発物質と同時に導入したときの、疾患の重症度の軽減におけるこれらの分子の有効性から、この特性が、脳炎誘発性ＰＬＰペプチドと同時免疫感作用のＣＭとの結合に単に競合するためであるかもしれないことが示唆される。
【００７７】
まとめると、本発明は、強力な多重抗原として働き、患者および健常者において多数のＴ細胞を刺激する短いペプチド複合混合物の調製について記載するものである。これらのペプチド混合物は、ＥＡＥにおける累積疾患スコアを有効に半減させることに加えて、ミエリンタンパク質およびペプチドに対する著しい交差反応性を有するＴ細胞系を生成した。本発明はまた、好ましくは複数の種にわたって、これらのペプチドの全体的な値に対する個々のａａの寄与を明らかにするためのＧＡ特異的クローンの使用をも包含する。これらのＣＭの単純で、よく定められた組成は、それらを、構造または組成の最も微妙な変化さえも許容することにより、混合物の効力を緩和することができる基本的なファクターを研究するための貴重な手段にする。本発明は、短いペプチド混合物が、Ｔ細胞の縮退を活用し、自己免疫疾患、癌に罹患した幅広い集団をターゲットとすることができ、あるいは感染症におけるワクチン設計に利用することができる免疫療法用の分子を研究し構築するための、将来のワクチンまたは薬物の設計の基盤として働く理想的なツールであることを提案する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ペプチドの長さおよび組成が複合混合物（ＣＭ）の刺激潜在性に影響を及ぼすことを示す図である。９名の健常ドナーからのＰＢＭＣで、一次増殖（Ａ、Ｃ）および二次増殖（Ｂ、Ｄ）の両方において、サイズおよび組成が異なるＣＭの刺激能を試験し、その応答の特異性を確認した。２０μｇ／ｍｌのＣＭまたはＧＡを１８ウェルそれぞれに添加し、陽性のウェル（ＳＩがバックグラウンド／対照のウェルで観察されたものの２倍より大きいＣＰＭのウェル）の％を全てのドナーからのプールしていたデータから決定した。図ＡおよびＢは、刺激潜在性に対するペプチドの長さの寄与を分析するものであり、図ＣおよびＤは、刺激潜在性に対するペプチドの組成またはＭＨＣ偏向の寄与を分析するものである。
【図２】ＣＭおよびＧＡに対するＭＳ患者のＰＢＭＣの増殖応答を示す図である。（Ａ）一次増殖および（Ｂ）二次増殖において、様々な長さおよび組成のＣＭの刺激能を試験し、その応答の特異性を確認した。５名のＭＳ患者からのＰＢＭＣを播種し、ドナー１名当たり１８ウェルで各ＣＭを試験した。５名の患者からのデータをプールし、バックグラウンド計数と比較して２より大きいＳＩでのＣＰＭを有する陽性のウェルの合計の％として示した。
【図３】ＣＭに対するＳＪＬマウス脾臓の一次増殖応答を示す図である。３つの異なった用量のＣＭ（４０、１０および２．５μｇ／ｍｌ）またはＧＡと共にマウス脾細胞を播種し、（Ａ）様々な長さまたは（Ｂ）特異なアンカー偏向のＣＭの刺激潜在性について試験した。抗原１つ当たり１８ウェルに播種し、２回の実験からのデータをプールした。陽性のウェルの％は、バックグラウンド／対照のウェルと比較して２より大きいＳＩでのＣＰＭのウェルの割合を表す。
【図４】ＭＢＰに対するＣＭ特異的系統の交差反応性を示す図である。ＳＪＬマウスをＣＭまたはＧＡで免疫感作して、ＭＢＰに対する交差反応性について評価するためのＣＭ特異的Ｔ細胞の数を増大させた。免疫感作してから１０日後にマウスから脾細胞を取り出し、Ｘ軸に示したμｇ／ｍｌの濃度の初期免疫抗原またはヒトＭＢＰと共に培養を開始した（１条件当たり６ウェル）。  ＊試験したウェルと、抗原が入っていない対照のウェルの増殖を比較したスチューデントｔ検定によるｐ＜０．０５。
【図５】ＣＭがＰＬＰ１３９−１５１誘導ＥＡＥの臨床的重症度を軽減することを示す図である。ＳＪＬマウスに７５μｇのＰＬＰ１３９−１５１ペプチドと、５００μｇのＣＭ、ＧＡ、あるいはＰＬＰを単独で皮下注射した。疾患の進行は、臨床症状の出現について盲検的にモニターした。結果は、平均１日スコアを表すものである。組み合わせられる２回の独立した同一の実験それぞれにおいて、１群当たり少なくとも５匹のマウスを使用した。最初の疾患の経過またはその後の再発の間のいずれかにおいて、ＰＬＰ単独と比較して疾患の重症度を有意に変化させたことが認められたＣＭのみを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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