(57)【要約】【課題】活性化可能な遊離型ＰＳＡの検出方法、並びに、前立腺の良性病状及び前立腺ガンの診断におけるその使用の提供。【解決手段】本発明は、前立腺の良性病状又は前立腺ガンのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける診断方法であって、前立腺の良性病状又は前立腺ガンに罹患していることが疑われる患者由来の生物学的試料中で、活性化可能な遊離型ＰＳＡを検出する工程を含むことを特徴とする方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺の良性病状又は前立腺ガンのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける診断方法であって、
前立腺の良性病状又は前立腺ガンに罹患していることが疑われる患者由来の生物学的試料中で、活性化可能な遊離型ＰＳＡを検出する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
以下の工程：
ｉ）活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーを、前立腺の良性病状又は前立腺ガンに罹患していることが疑われる患者由来の生物学的試料と接触させる工程、
ｉｉ）活性化可能な遊離型ＰＳＡが前記結合パートナーに捕獲されたことを実証する工程、
ｉｉｉ）同一の個体から採取した同じ性質の試料中に存在する、前記活性化可能な遊離体以外の形態のＰＳＡの量に対する、工程ｉｉ）で検出された活性化可能な遊離型ＰＳＡの量の比を算出する工程、並びに、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で決定した比の値と、使用する比の種類及び個々の病状の検出限界の典型に従って選択された所定のしきい値とを比較することにより、患者が前立腺ガンと前立腺の良性病状とのいずれに罹患しているかを決定する工程：
を含むことを特徴とする請求項１に記載の、前立腺の良性病状又は前立腺ガンの診断方法。
【請求項３】
工程ｉ）で使用される前記結合パートナーは、配列番号１の配列により模倣されるエピトープを認識可能である
ことを特徴とする請求項２に記載の、前立腺の良性病状又は前立腺ガンの診断方法。
【請求項４】
工程ｉ）で使用される前記結合パートナーは、抗体又は抗体断片である
ことを特徴とする請求項２又は３に記載の、前立腺の良性病状又は前立腺ガンの診断方法。
【請求項５】
活性化可能な遊離型ＰＳＡが前記結合パートナーに捕獲されたことの実証は、検出パートナーを使用する、好ましくは抗総ＰＳＡ抗体を使用する間接的検出により実施される
ことを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の、前立腺の良性病状又は前立腺ガンの診断方法。
【請求項６】
活性化可能な遊離型ＰＳＡが前記結合パートナーに捕獲されたことの実証は、免疫精製されかつ活性化された、活性化可能な遊離型ＰＳＡの酵素活性を決定することにより実施される
ことを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の、前立腺の良性病状又は前立腺ガンの診断方法。
【請求項７】
活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーに加えて、ＰＳＡの酵素活性を増強可能な抗体を使用する
ことを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項に記載の、前立腺の良性病状又は前立腺ガンの診断方法。
【請求項８】
前記比の算出に使用される、活性化可能な遊離体以外のＰＳＡの形態は、不活性な遊離型ＰＳＡ、又は、切断されて変性した遊離型ＰＳＡである
ことを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載の、前立腺の良性病状又は前立腺ガンの診断方法。
【請求項９】
以下：
−活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナー、及び、
−活性化可能な遊離体以外のＰＳＡの形態のアッセイ手段：
を含むことを特徴とする、前立腺ガン又は前立腺の良性病状の診断用キット。
【請求項１０】
前記結合パートナーは、配列番号１の配列により模倣されるエピトープを認識可能であり、好ましくは抗体又は抗体断片である
ことを特徴とする請求項９に記載の診断用キット。
【請求項１１】
前記手段は抗体又は抗体断片である
ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の診断用キット。
【請求項１２】
活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナー、及び、活性化可能な遊離型ＰＳＡからなる複合体。
【請求項１３】
前記結合パートナーは、配列番号１の配列により模倣されるエピトープを認識可能である
ことを特徴とする請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
活性化可能な遊離型ＰＳＡが活性化されている
ことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の複合体。
【請求項１５】
以下の工程：
ｉ）活性化可能な遊離型ＰＳＡに非特異的に結合可能な結合パートナーを、前立腺の良性病状又は前立腺ガンに罹患していることが疑われる患者由来の生物学的試料と接触させる工程、
ｉｉ）活性化可能な遊離型ＰＳＡの活性化後に、活性化可能な遊離型ＰＳＡの酵素活性を決定することによって、活性化可能な遊離型ＰＳＡが前記結合パートナーに捕獲されたことを実証する工程、
ｉｉｉ）同一の個体から採取した同じ性質の試料中に存在する、活性化可能な遊離体以外の形態のＰＳＡの量に対する、工程ｉｉ）で検出された活性化可能な遊離型ＰＳＡの量の比を算出する工程、並びに、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で決定した比の値と、使用する比の種類及び個々の病状の検出限界の典型に従って選択された所定のしきい値とを比較することにより、患者が前立腺ガンと前立腺の良性病状とのいずれに罹患しているかを決定する工程：
を含むことを特徴とする請求項１に記載の、前立腺の良性病状又は前立腺ガンの診断方法。
【請求項１６】
活性化可能な遊離型ＰＳＡの活性化を、ＰＳＡの酵素活性を増強可能な抗体を使用して実施する
ことを特徴とする請求項１５に記載の、前立腺の良性病状又は前立腺ガンの診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺ガンの診断に関する。詳細には、本発明は、前立腺の良性病状又は前立腺ガンに罹患していることが疑われる患者において、前立腺特異的抗原（すなわちＰＳＡ）の活性化可能な遊離体を特異的に認識可能な結合パートナーを使用することにより、上記病状を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＳＡは、おそらく不活性なチモーゲン体の形態でヒト前立腺の腺上皮により産生され（非特許文献１）、活性体の形態で精液中に分泌される（非特許文献２）。精液中におけるＰＳＡの生物学的活性は、精嚢により分泌される主要タンパク質の、タンパク質分解による断片化が限定されていることに関連する（非特許文献２〜４）。
【０００３】
ＰＳＡは前立腺ガンの主要なマーカーであり、西欧諸国において男性６人中１人が生涯に前立腺ガンに罹る。カリクレインファミリーに属するこのプロテアーゼは主に前立腺上皮から分泌され、患者において、精液中に濃度０．５〜５ｍｇ／ｍｌで見られ、血清中にその１００万分の１の低濃度で見られる。従って、ＰＳＡは通常、血清中において濃度２．５ｎｇ／ｍｌ未満で見られる。しかし、この濃度は、前立腺ガンが存在する場合、及び、良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）又は急性前立腺炎等の良性の変性が存在する場合に、原則として著しく増加する。
【０００４】
ＰＳＡのタンパク質配列が決定されている。ＰＳＡは、アミノ酸２３７個のグリコタンパク質である（非特許文献５）。
【０００５】
血清ＰＳＡの濃度を測定して、これをしきい値（４ｎｇ／ｍｌ）と比較することからなる診断方法が提案されている。しかし、この診断方法では、４人中３人の患者を誤診することになるため、不都合であるということに留意すべきである。更に、この方法では、治療できる可能性があるために診断が特に望まれる早期段階（腺ガンに限定されるガンの症例の３０〜４５％を占める）を診断することが不可能である。この方法が比較的不十分であるということについては論文（非特許文献６）にも報告されており、上記論文は、前立腺ガンを早期にスクリーニングするためには、しきい値が４ｎｇ／ｍｌ未満でなければならないと記載している。
【０００６】
更に、血清中において、ＰＳＡは、α−１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）及び１’α−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）等のプロテアーゼ阻害剤と会合することが分かっている。この会合により、論文（非特許文献７）に示されるように、ＰＳＡのキモトリプシン活性の不活性化が生じる。また、この会合から、血清中に存在するＰＳＡが遊離体（すなわち、非会合体）と複合体（すなわち、会合体）のいずれであるかを示すことも可能となった。従って、診断の特異性の改善にあたり、総ＰＳＡに対する遊離型ＰＳＡの比を使用することが提案されている。
【０００７】
例えば、特許文献１は、生検を行わない前立腺ガンの診断方法を記載する。この方法は、患者の血清又は血液中における総ＰＳＡ量を測定することからなる。この値が２．５〜２０ｎｇ／ｍｌである場合には、遊離型ＰＳＡの濃度についても測定する。次いで、総ＰＳＡに対する遊離型ＰＳＡの比を算出する。この比が７％未満である場合、前立腺ガンであると診断する。
【０００８】
しかし、Ｌｅｉｎらの発表（非特許文献８）に示されるように、前立腺ガンの診断においてしきい値を７％とすることについては、多くの著者が異議を唱えている。この発表は総説（非特許文献９）中に記載されており、この中で、上記の比によって前立腺ガンとＢＰＨとを体系的に区別するのは難しいと記載されている。
【０００９】
上記理由により、本出願人は、特許文献２において、遊離型ＰＳＡのうちＰＳＡの切断体が血清中に存在することに焦点を当てた。ガン又はＢＰＨに罹患した患者における血清ＰＳＡの分子形態を二次元電気泳動（化学発光の検出に関連する）によりマッピングすることにより、ＰＳＡの全ての形態（すなわち、切断体及び複合体を含めた遊離体）を観察した。
【００１０】
前立腺ガンに罹患した患者由来の血清の電気泳動結果は比較的同一で、遊離型ＰＳＡの非切断体を実質的に示し、一方、ＢＰＨに罹患した個体由来の血清の電気泳動結果は、比較的高い割合の遊離体の切断体、及び、切断体を含まず塩基性がわずかに強いスポットを含む可能性がある。従って、ＢＰＨに罹患した患者における、血清中の総ＰＳＡに対する血清中の遊離型ＰＳＡの比の増加は、実質的に、（酵素的に不活性であり得るためにＡＣＴに結合できない可能性のある）遊離型ＰＳＡの切断体の存在、及び、（不活性なチモーゲン体ＰＳＡに関連する可能性のある、）活性遊離型ＰＳＡよりもわずかに塩基性の強い遊離型ＰＳＡの存在に関連すると考えられる。
【００１１】
これらの観察に関して、本出願人は、遊離型ＰＳＡの切断体及び／又は非切断体を二次元電気泳動で分離した後に定量することを含む、前立腺ガンの診断方法、並びに、上記値の使用による診断の確立について以前に述べた。
【００１２】
しかし、上記方法は、診断を改善し得うるが、二次元電気泳動を使用する必要がある。結果として、上記方法は極めてコストがかかり、かつ、操作時間が長くなる。
【００１３】
上記の操作を避けるため、特許文献３は、不活性な遊離型ＰＳＡを特に標的とする新規抗体、及び、前立腺の良性病状又は前立腺ガンの診断方法におけるその使用について記載する。
【特許文献１】ＷＯ９７／１２２４５号公報
【特許文献２】ＷＯ００／０２０５２号公報
【特許文献３】ＷＯ０１／７７１８０号公報
【非特許文献１】Ｌｕｎｄｗａｌｌら．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９８７
【非特許文献２】Ｌｉｌｊａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９８５
【非特許文献３】Ｌｉｌｊａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９８７
【非特許文献４】Ｍｃ  Ｇｅｅら．Ｂｉｏｌ．ｒｅｐｒｏｄ．１９８８
【非特許文献５】“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃＤＮＡ”，Ｌｕｎｄｗａｌｌ  Ａ．，Ｌｉｌｊａ  Ｈ．，１９８７．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２１４：３１７−３２２
【非特許文献６】“Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｅｎ  Ｗｉｔｈ  Ｓｅｒｕｍ  ＰＳＡ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ２．６  ｔｏ  ４．０  ｎｇ／ｍｌ  ａｎｄ  Ｂｅｎｉｇｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ”、Ｃａｔａｌｏｎａら，ＪＡＭＡ，１４  Ｍａｉ  １９９７−Ｖｏｌ．２７７，Ｎｏ．１８
【非特許文献７】“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｕｌｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”、Ａ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．Ｌａｕｒｅｌｌ，Ｈ．Ｌｉｌｊａ，１９９０  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９４：７５５−７６３
【非特許文献８】“Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ＰＳＡ／ｔｏｔａｌ  ＰＳＡ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ：ｗｈｉｃｈ  ｃｕｔｏｆｆ  ｓｈｏｕｌｄ  ｂｅ  ｕｓｅｄ？”
【非特許文献９】Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１６（１），４５−４９，１９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本出願人は、患者由来の生物学的試料中に、遊離型ＰＳＡの中でも、チモーゲン体（ＰｒｏＰＳＡ）ではないが活性化可能な（すなわち、プロテアーゼ阻害剤との反応性を潜在的に有する）新規形態のＰＳＡが存在し、かつ、この活性化可能な遊離型ＰＳＡの検出によって、前立腺の良性病状に罹患した個体と前立腺ガンに罹患した個体とを、優れた特異性及び感度で識別する診断が可能になることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、本発明の目的は、前立腺の良性病状又は前立腺ガンのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける診断方法であって、前立腺の良性病状又は前立腺ガンに罹患していることが疑われる患者由来の生物学的試料中で、活性化可能な遊離型ＰＳＡを検出する工程を含むことを特徴とする方法である。
【００１６】
患者の精液又は血清等の生体液中に存在するＰＳＡの種々の形態の名称は、著者によって様々であることが多い。しかし、総ＰＳＡは２つの形態、すなわち遊離体（遊離型ＰＳＡ）及びＡＣＴ等のプロテアーゼ阻害剤と複合体化した形態（ＰＳＡ複合体）として存在するという考えで一致している。また、遊離型ＰＳＡはその大きさによって命名することもできる：ＰｒｏＰＳＡの形態で産生される場合、更なるアミノ酸（７個又は５個又は４個又は２個）を有する。そのため、チモーゲンＰＳＡ又はＰｒｏＰＳＡ−７、ＰｒｏＰＳＡ−５等と呼ばれる。このｐｒｏＰＳＡは、成熟により更なるアミノ酸を消失した後、完全体又は部分体のいずれかになり得る。後者の場合、ＰＳＡの分断体又は切断体という。遊離型ＰＳＡの完全体は変性（グリコシル化又は脱グリコシル化）される可能性もあり、この場合、変性体と呼ばれる。従って、遊離型ＰＳＡには、チモーゲンＰＳＡ、変性していても変性していなくてもよいＰＳＡの完全体、及び、ＰＳＡの切断体が含まれる。
【００１７】
ＰＳＡの種々の遊離体又は複合体は、活性体及び不活性体とも呼ばれる。用語「活性体」は、ＡＣＴ等のプロテアーゼ阻害剤に結合可能な形態を意味するものである。用語「不活性体」は、このような結合能力を有さない形態を意味するものである。ＰＳＡ複合体は、既に阻害剤に結合しているために不活性であることが知られている。また、遊離型ＰＳＡの切断体及び遊離型ＰＳＡの変性体は阻害剤に結合する能力を有さないために不活性である。最後に、阻害剤のチモーゲン体は不活性である。そして、他の遊離型ＰＳＡは活性である。これらの活性体は精液又はＬｎＣａＰ細胞系の上清中に存在するが、プロテアーゼ阻害剤と複合体化しているために血清中には存在しないと一般的に考えられている。
【００１８】
本出願人は、予想外にも、これらの遊離体の中でも、患者の生物学的試料中には、活性化可能な遊離体（すなわち、血清中でプロテアーゼ阻害剤に結合し得る形態）が存在し、この活性化可能な遊離体が活性化された後で上記の結合が可能であることを本明細書中に示した。また、この活性化可能な遊離型ＰＳＡをアッセイすることにより、前立腺ガン又はＢＰＨに罹患した患者の診断が可能になることも示した。
【００１９】
本出願人は、理論上は、この活性化可能な遊離型ＰＳＡは、活性化されると、ＡＣＴと複合体化する形態のＰＳＡと同等になると考える。この活性化可能な遊離体は、ＡＣＴ結合部位を閉じ込めたＰＳＡの「閉鎖」体であり、その活性化により、「閉鎖」体を「開放」体に転換して結合部位を解放可能である。
【００２０】
本発明の診断方法は、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナー又は活性化可能な遊離型ＰＳＡに非特異的に結合可能な結合パートナーのいずれかを用いて実施することができる。
【００２１】
従って、第一の実施形態によれば、本発明は、前立腺の良性病状又は前立腺ガンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法であって、以下の工程：
ｉ）活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーを、前立腺の良性病状又は前立腺ガンに罹患していることが疑われる患者由来の生物学的試料と接触させる工程、
ｉｉ）活性化可能な遊離型ＰＳＡが上記結合パートナーに捕獲されたことを実証する工程、
ｉｉｉ）同一の個体から採取した同じ性質の試料中に存在する、上記活性化可能な遊離体以外の形態のＰＳＡの量に対する、工程ｉｉ）で検出された活性化可能な遊離型ＰＳＡの量の比を算出する工程、並びに、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で決定した比の値と、使用する比の種類及び個々の病状の検出限界の典型に従って選択された所定のしきい値とを比較することにより、患者が前立腺ガンと前立腺の良性病状とのいずれに罹患しているかを決定する工程：
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００２２】
本出願人は、予想外にも、本発明の目的に好適な結合パートナーの中でも、配列番号１（ＤＴＰＹＰＷＧＷＬＬＤＥＧＹＤ）の配列により模倣されるエピトープを認識する結合パートナーが、血清中で、この活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的かつ効果的に結合し得、かつ、遊離型ＰＳＡの変性体若しくは切断体又はＰｒｏＰＳＡのいずれにも結合しないこと、並びに、この特異性によって、感度及び特異性が非常に高い前立腺関連病状診断方法の取得が可能になることを発見した。
【００２３】
本発明の方法を実施する生物学的試料は、ＰＳＡを含む傾向がある任意の生物学的試料である。このような試料の例としては、精液、血液、血清、血漿及び尿を挙げることができ、血清及び血漿が特に好ましい。
【００２４】
本発明の目的に好適な、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーとしては、例えば、抗体、抗体断片及びミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）が挙げられ、また、この能力を有することが当業者に公知である任意のパートナーも挙げられる。
【００２５】
用語「抗体断片」は、本願において一般的に、起源の抗体の特異性（本願の場合、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合する能力）を保持した任意の抗体断片、詳細には、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２型の断片を意味するものである。また、本願において、用語「抗体」は、許容される場合には抗体断片も意味する。
【００２６】
本発明の目的のために有用な抗体としては、特に、精製ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２７】
ポリクローナル抗体の調製及びモノクローナル抗体の調製は、当業者に広く公知であり、以下に、この調製の原理を説明する。
【００２８】
ポリクローナル抗体の取得は、対象である少なくとも１つの標的抗原で動物を免疫し、続いて、上記動物の血清試料を採取し、（特に、上記抗体によって特異的に認識される抗原（特に、対象である標的抗原）を付着させたカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって）他の血清成分から上記抗体を分離し、所望の抗体を精製した状態で回収することによって実施できる。
【００２９】
モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術により取得可能であり、その一般的な原理を以下に挙げる。
【００３０】
まず動物を、一般的にはマウス（又は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける免疫の場合は培養細胞）を、対象である標的抗原で免疫する。これにより、Ｂリンパ球が上記抗原に対する抗体を産生できる。次に、このような抗体産生リンパ球を「不死」筋腫細胞（例示におけるマウス細胞）と融合させ、ハイブリドーマを作成する。こうして得られた異種細胞混合物から、特定の抗体を産生でき、かつ、無限に増殖できる細胞を選択する。ハイブリドーマをそれぞれクローンの形態で複製し、それぞれにモノクローナル抗体を作成させ、所望の腫瘍抗原に対する認識特性を（例えば、ＥＬＩＳＡによって、一次元若しくは二次元イムノブロッティングによって、免疫蛍光法によって、又は、バイオセンサーの使用によって）試験することができる。こうして選択したモノクローナル抗体をその後、（特に、上述のアフィニティークロマトグラフィー法によって）精製する。
【００３１】
用語「ミモトープ」は、上記エピトープと特異的に相互作用するコンフォメーションを模倣することができる任意の合成又は組み換えペプチドを意味するものである。
【００３２】
好ましい実施形態によれば、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーは、以下の条件のうち少なくとも１つを満たす：
−配列番号１の配列により模倣されるエピトープを認識可能である；
−抗体又は抗体断片である。
【００３３】
本発明の目的に好適な結合パートナーにより認識される配列番号１の配列は、ＰＳＡのコンフォメーション性エピトープを模倣する。
【００３４】
本発明の目的に好適な、配列番号１の配列により模倣されるエピトープを認識可能な抗体の例には、Ｍｉｃｈｅｌ  Ｓ．ら，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５（５）：６３８−６５０に記載の抗体５Ｄ３Ｄ１１が挙げられる。本発明の方法においてこの特定の抗体を使用するということは予想していなかった、というのは、この文献が、この抗体はＰＳＡの酵素活性を阻害することによりＡＣＴの結合を阻害可能であること；言い換えれば、ＰＳＡの「開放」された活性な遊離体のみに結合可能であることを示しているからである。本願においては、本出願人は、これが、活性化可能な遊離体、すなわち「閉鎖した」形態にも結合可能であることについても示した。
【００３５】
活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナー、及び、活性化可能な遊離型ＰＳＡからなる複合体は新規であり、これらもまた本発明の目的を構成する。
【００３６】
一実施形態によれば、本発明の複合体の、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な上記結合パートナーは、配列番号１の配列により模倣されるエピトープを認識可能な結合パートナーである。
【００３７】
本発明の診断方法の第二の工程は、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な上記結合パートナーが上記活性化可能な遊離型ＰＳＡを捕獲したことを実証することからなる。
【００３８】
この工程は、上記結合パートナーと上記活性化可能な遊離型ＰＳＡとの間の結合を検出することにより、又は、上記結合パートナーによって免疫捕獲された上記活性化可能な遊離型ＰＳＡを溶出した後に、直接実施することができる。上記活性化可能な遊離型ＰＳＡを上記結合パートナーによって免疫捕獲した後に溶出したものを、活性化可能な遊離型ＰＳＡの免疫精製物と呼ぶ。
【００３９】
活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な上記結合パートナーにより免疫捕獲された活性化可能な遊離型ＰＳＡの溶出は、ｐＨショック等の当業者に公知の任意の溶出方法により実施することができる。例えば、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）を使用する酸性ショックが好ましく用いられる。
【００４０】
上記活性化可能な遊離型ＰＳＡの捕獲の検出は、免疫精製されているか否かにかかわらず、免疫アッセイの分野で公知の直接的検出及び間接的検出等の検出手段により実施することができる。
【００４１】
間接的検出（すなわち、検出パートナーによる検出）の場合、活性化可能な遊離型ＰＳＡに結合可能な検出パートナーが使用される。この検出パートナーは、活性化可能な遊離型ＰＳＡが免疫精製されていない場合に工程ｉ）で使用される結合パートナーにより使用されるエピトープとは異なるエピトープに結合する。この目的に好適な検出パートナーとしては、抗総ＰＳＡ抗体等の抗体を挙げることができ、これは本発明の一実施形態を構成する。
【００４２】
工程ｉ）で使用される上記結合パートナーにより使用されるエピトープとは異なるエピトープを認識可能なこのような抗ＰＳＡ抗体の例は、上述のＭｉｃｈｅｌ  Ｓ．らによる論文（１９９９）に記載されている。
【００４３】
これらの検出パートナーは、予め標識しておいてもよい。
【００４４】
用語「標識する」は、検出可能なシグナルを直接的に又は間接的に発生することが可能な標識の付加を意味するものである。上記標識としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
・比色分析、蛍光又は発光により、検出可能なシグナルを発生する酵素（例、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、
・発色団（例、発光又は色素化合物）、
・放射性分子（例、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ）、
・蛍光分子（例、フルオレセイン、ローダミン、アレクサ（ａｌｅｘａ）又はフィコシアニン）、及び、
・粒子（例、金粒子、磁性ラテックス粒子又はリポソーム）。
【００４５】
例えば、他のリガンド／抗リガンド対による間接的標識システムも使用可能である。上記リガンド／抗リガンド対は当業者に周知のものであって、例えば、以下の対から形成されるものを挙げることができる：ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、及び、ポリヌクレオチド／このポリヌクレオチドに相補的な配列。この場合、結合パートナーに結合するのはリガンドである。抗リガンドは、上記段落に記載した標識により直接的に検出可能であってよい、又は、リガンド／抗リガンドによりそれ自身が検出可能であってよい。
【００４６】
上記の間接的システムは、特定の条件下でシグナルの増幅を生じることとなる。このシグナル増幅技術は当業者に周知のものであって、本出願人の先行特許出願ＦＲ９８／１００８４又はＷＯ９５／０８０００号公報又は論文Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，（１９９７），４５：４８１−４９１が参照され得る。
【００４７】
上記結合パートナーにより活性化可能な遊離体の捕獲の直接的な検出（すなわち、検出パートナーによらない検出）は、例えば、血漿共鳴法、又は、導電性高分子を有する導電体上でのサイクリックボルタンメトリーにより実施することができる。
【００４８】
直接的検出は、ＰＳＡの活性体の酵素活性の特異性によって実施することもできる。この場合、活性化可能な遊離型ＰＳＡの活性化を、適切ならば免疫精製後に実施することが推奨されるであろう。実際に、この活性化可能な遊離体の活性化により、酵素基質に結合する部位が解放され、次いで、この部位が酵素基質と反応することが可能になる。従って、検出は、免疫精製されかつ活性化された遊離型ＰＳＡの酵素活性を決定することにより実施され、このことは、本発明の特定の一実施形態を構成する。
【００４９】
本発明の目的に好適な酵素基質の例としては、キモトリプシン型プロテアーゼ活性を有することが明らかであって当業者に広く公知である任意の基質が挙げられる。このような基質は、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能である。これらは、ＰＳＡにより認識され、かつ、切断されたペプチド配列から構成されており、この配列は発色団基又は蛍光団基に結合するものである。
【００５０】
活性化可能な遊離型ＰＳＡの活性化は、以下の方法のうち少なくとも１つにより実施することができ：
−上記活性化可能な形態を、少なくとも０．１５Ｍ、好ましくは少なくともｌＭ、より好ましくは上限２Ｍの高い塩濃度を有する媒体と接触させる方法、
−活性化可能な遊離型ＰＳＡの免疫精製物を、ＰＳＡの酵素活性を増強可能な抗体に結合させる方法：、
これらの２つの方法は、任意の順序で、別々に実施することも、同時又は連続的に実施することも可能である。
【００５１】
高い塩濃度を有する媒体としては、例えば、１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む培地が挙げることができ、ＰＳＡの酵素活性を増加させることが可能な抗体としては、抗体８Ｇ８Ｆ５（ビオメリュー社，フランス）が挙げることができる。
【００５２】
これらの抗体の、ＰＳＡの酵素活性を増強可能な特定の特性のために、これらを本発明の方法に使用することにより、上記方法の感度を改善することが可能になる。
【００５３】
従って、一実施形態によれば、本発明の方法は、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーに加えて、ＰＳＡの酵素活性を増強可能な抗体、特に抗体８Ｇ８Ｆ５を使用することを特徴とする。
【００５４】
このＰＳＡの酵素活性を増強可能な抗体は、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーを使用して活性化可能な遊離型ＰＳＡを免疫精製する場合、ＥＬＩＳＡアッセイにおける捕獲パートナーとして使用することができる。これはまた、特に、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーを捕獲パートナーとして使用する場合、検出パートナーとしても使用することができる。
【００５５】
配列番号１の配列により模倣されるエピトープを認識可能な結合パートナー等の活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナー、及び、活性化可能な遊離型ＰＳＡを活性化したものからなる複合体もまた新規であり、本発明の特定の一実施形態を構成する。
【００５６】
本発明の方法において、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合する、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーは、そのままの状態で使用することができる、又は、そうでない場合には、特に、固相支持体に付着したかつ／若しくは標識に結合した形態で使用することができる。
【００５７】
これらの結合パートナーの固相支持体への付着とは周知である。支持体は、吸着特性を有するか又はカップリング剤に付着可能な任意の生物由来の又は合成の固相材料から作製することができる。材料は公知であり、文献に記載されている。吸着によりこれらの結合パートナーを付着可能な固相材料の中でも、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等を挙げることができる。カップリング剤を用いた共有結合によりこれらの結合パートナーを付着可能にする材料の中でも、特に、デキストラン、セルロース等を挙げることができる。支持体は、例えば、円盤、管、ビーズ、ティック（ｔｉｃｋ）又は板の形状であってよく、特にマイクロタイタープレートの形状であってよい。
【００５８】
結合パートナーの標識への結合によれば、上述するように、直接検出の実施も可能であろう。この標識は、上記したとおりである。
【００５９】
結合パートナーが支持体に結合していない場合、又は、活性化可能な遊離型ＰＳＡが免疫精製される場合、本発明の方法は捕獲パートナーも使用することができる。前者の場合、この捕獲パートナーは、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーにより認識されるエピトープとは異なるエピトープに結合し得る。
【００６０】
捕獲パートナーの例としては、上記の抗ＰＳＡ抗体が挙げられる。
【００６１】
本発明の方法において、活性化可能な遊離型ＰＳＡをアッセイするために捕獲パートナー及び検出パートナーの両方を使用する場合、これらのパートナーは別々のエピトープに結合し、これらのエピトープは、活性化可能な遊離型ＰＳＡが免疫精製されていない場合に、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーにより認識されるエピトープとは異なるエピトープである。
【００６２】
ＰＳＡの活性化可能な形態の種々のパートナーを使用して、活性化可能な遊離型ＰＳＡが上記結合パートナーにより捕獲されたことを実証する方法は、当業者に広く公知である。例えば、ＥＬＩＳＡ法等のサンドウィッチ方法、及び、競合アッセイ法等を挙げることができる。
【００６３】
本発明の方法の工程ｉｉｉ）は、同一の個体から採取した同じ性質の試料中に存在する、上記活性化可能な形態以外の形態のＰＳＡの量に対する、工程ｉｉ）で検出された活性化可能な遊離型ＰＳＡの量の比を算出する工程からなる。
【００６４】
「同一の個体から採取した同じ性質の試料」との表現は、同じ標本の２つの画分、又は、２つの異なる標本由来であるが同じ性質を有すると考えられる２つの試料（例えば血清試料）のいずれかを意味するものである。
【００６５】
活性化可能な遊離型ＰＳＡ以外の形態としては、特に、ＰＳＡ複合体、総ＰＳＡ、総遊離型ＰＳＡ、遊離型ＰＳＡのチモーゲン体、遊離型ＰＳＡの変性体、遊離型ＰＳＡの切断体、及び、それらの組み合わせ、すなわち、全ての活性な又は不活性な、遊離型又は複合体のＰＳＡが挙げられる。
【００６６】
これらの種々の形態それぞれについてのアッセイ、特に特異的抗体を使用する上記アッセイが周知である。
【００６７】
ＰＳＡ複合体は、例えば、ＷＯ９８／２２５０９号公報に記載の抗体を用いてアッセイされる。
【００６８】
総ＰＳＡは、例えば、Ｈ．Ｎａｇａｓａｋｉら（１９９９），Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：４４８６−４９６に記載の抗体を用いてアッセイされる。
【００６９】
遊離型ＰＳＡの種々の形態に結合可能な他の抗体としては総遊離型ＰＳＡが挙げられ、これは、中外製薬（日本）、ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ社（エミリービル，カリフォルニア州）及びＥｕｒｏｍｅｄｅｘ  ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社（スワンプスコット，マサチューセッツ州）により販売されている。
【００７０】
定量は、上記の免疫反応の検出を実証する方法（サンドウィッチ法等）を用いて公知の様式で実施され、例えば、標識化による方法である場合、標識の量を決定することにより実施される。
【００７１】
当然のことながら、測定量の比較を意図する場合には、これらの値は比較が可能であるべきである。言い換えれば、上記測定値は、試料と同じ光学希釈率又は濃度と、及び、同じ体積と関連しているべきである。
【００７２】
本発明の方法の工程ｉｉｉ）で算出することができる種々の比は、以下から選択することができる：
−活性化可能な遊離型ＰＳＡの量／ＰＳＡの総量、
−活性化可能な遊離型ＰＳＡの量／遊離型ＰＳＡの総量、
−活性化可能な遊離型ＰＳＡの量／ＰＳＡ複合体の量、
−活性化可能な遊離型ＰＳＡの量／遊離型ＰＳＡの切断体の量、
−活性化可能な遊離型ＰＳＡの量／遊離型ＰＳＡのチモーゲン体の量、
−活性化可能な遊離型ＰＳＡの量／遊離型ＰＳＡの変性体の量、
−活性化可能な遊離型ＰＳＡの量／（遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡのチモーゲン体）の量、
−活性化可能な遊離型ＰＳＡの量／（遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡの切断体）の量、
−活性化可能な遊離型ＰＳＡの量／不活性な遊離型ＰＳＡ（チモーゲン、変性及び切断）の量、
−これらの比の逆数、又は、
−これらの比の組み合わせ。
【００７３】
好ましい比は、（遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡの切断体）の量に対する活性化可能な遊離型ＰＳＡの量の比、又は、不活性な遊離型ＰＳＡの量に対する活性化可能な遊離型ＰＳＡの量の比である。
【００７４】
本発明の特定の一実施形態によれば、本発明の方法の工程（ｉｉｉ）において、比の算出に使用される活性化可能な遊離体以外の形態のＰＳＡの形態は、遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡの切断体又は不活性な遊離型ＰＳＡである。
【００７５】
上記算出は、以下のように明白に実施される：
−個体から採取した生物学的試料中の活性化可能な遊離型ＰＳＡの量は、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーを用いて上記のように評価される、
−ＰＳＡの総量、遊離型ＰＳＡの総量、ＰＳＡ複合体の量、遊離型ＰＳＡのチモーゲン体の量、遊離型ＰＳＡの切断体の量、遊離型ＰＳＡの変性体の量、遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡの切断体の量、遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡのチモーゲン体の量、及び、不活性な遊離型ＰＳＡの量から選択される量のうちの１つ、又は、それらの組み合わせを、同一の個体から採取した同じ性質を有する試料について評価する、かつ、
−上記比又は上記逆数比又は上記比の組み合わせを決定する。
【００７６】
本発明の方法の工程ｉｖ）は、工程ｉｉｉ）で決定した比の値と、使用する比の種類及び個々の病状の検出限界の典型に従って選択された所定のしきい値とを比較することにより、患者が前立腺ガンと前立腺の良性病状とのいずれに罹患しているかを決定することからなる。
【００７７】
一般的に、免疫アッセイの結果は、使用する抗体の特異性及び親和性に大きく依存すること、並びに、これらの特性は、これらの抗体を用いて測定した値に影響を及ぼすことが知られている。従って、正確なしきい値を得るのは不可能であり、また、使用される各抗体に好適なしきい値は、単純な常套の実験により個々の場合毎に決定することができると想定される。
【００７８】
本明細書中でいう用語「しきい値」とは、不連続な値、又は、不確定な領域に対応する値の範囲であることが明瞭に理解されるであろう。当然のことながら、測定値が不確定な範囲に含まれる場合、又は、不連続な値であればしきい値に非常に近い場合は、決定的な結論に到達するのは不可能であるため、更に調査を実施するべきである。
【００７９】
当然のことながら、特定の種類の比についてしきい値が決定されている場合は、それから他の種類の比に対応するしきい値を推定することが可能である。
【００８０】
活性化可能な遊離型ＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡの切断体）の比又は活性化可能な遊離型ＰＳＡ／不活性な遊離型ＰＳＡの比を考慮する場合、上記比を用いて得られたしきい値を超える比を有する患者は、前立腺ガンであると診断することができ、このしきい値未満の比を有する患者は、ＢＰＨ又は他の非ガン性の前立腺病状（「正常な患者」）であると診断することができる。
【００８１】
一般的に、活性化可能な遊離型ＰＳＡの量が算出された比の分子である場合、上記比を用いて得られたしきい値を超える比を有する患者は前立腺ガンと診断され、このしきい値未満の比を有する患者は、ＢＰＨ又は他の非ガン性前立腺病状（「正常な患者」）であると診断されるであろう。一方、活性化可能な遊離型ＰＳＡの量が算出された比の分母である場合、上記比を用いて得られたしきい値未満の比を有する患者は前立腺ガンと診断され、このしきい値を超える比を有する患者は、ＢＰＨ又は他の非ガン性前立腺病状（「正常な患者」）であると診断されるであろう。
【００８２】
本発明の方法の実施にあたって、本発明の目的は、以下：
−活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナー、好ましくは、配列番号１の配列により模倣されるエピトープを認識可能な結合パートナー、より好ましくは抗体又は抗体断片、及び、
−活性化可能な遊離体以外のＰＳＡの形態、好ましくは抗体又は抗体断片のアッセイ手段：
を含むことを特徴とする、前立腺ガン又は前立腺の良性病状の診断用キットである。
【００８３】
上記キットに使用することができる上記手段は、定量が望まれる形態のＰＳＡのアッセイについて上記したとおりである。
【００８４】
本発明の方法は、活性化可能な遊離型ＰＳＡに非特異的に結合可能な結合パートナーを用いて実施することもできる。
【００８５】
上記パートナーは、特に活性化可能な遊離型ＰＳＡを含む総ＰＳＡと結合可能なパートナーであってよい。このようなパートナーの例としては、抗体、抗体断片及びミモトープを挙げることができ、また、上記したように、この能力を有することが当業者に公知である任意のパートナー、特に抗体１１Ｅ５Ｃ６（Ｍｉｃｈｅｌら，１９９９，上記）も挙げることができ、そのコンフォメーション性エピトープはＰＳＡのＣ末端領域を含む（Ｍｉｃｈｅｌ  Ｓら，２００１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，１４：４０６−４１３）。
【００８６】
活性化可能な遊離型ＰＳＡに非特異的に結合可能なこの結合パートナーは、活性化可能な遊離型ＰＳＡに特異的に結合可能な結合パートナーと共に、上記の本発明の方法において（すなわち、遊離型ＰＳＡの免疫精製用の捕獲パートナー等として）使用することができる。
【００８７】
しかし、この特定の一実施形態において、活性化可能な遊離型ＰＳＡの検出は、ＰＳＡの活性体の酵素活性の特異性を用いて実施しなければならない。この場合、活性化可能な遊離型ＰＳＡを活性化させることが推奨される。なぜなら、この活性化可能な遊離体の活性化により、酵素基質に結合する部位が解放され、次いで、これが上記酵素基質と反応することが可能になる。従って、検出は、活性化された遊離型ＰＳＡの酵素活性を決定することにより実施される。
【００８８】
従って、この実施形態によれば、本発明は、以下：
ｉ）活性化可能な遊離型ＰＳＡに非特異的に結合可能な結合パートナーを、前立腺の良性病状又は前立腺ガンに罹患していることが疑われる患者由来の生物学的試料と接触させる工程、
ｉｉ）活性化可能な遊離型ＰＳＡの活性化後に、活性化可能な遊離型ＰＳＡの酵素活性を決定することによって、活性化可能な遊離型ＰＳＡが上記結合パートナーに捕獲されたことを実証する工程、
ｉｉｉ）同一の個体から採取した同じ性質の試料中に存在する、活性化可能な遊離体以外の形態のＰＳＡの量に対する、工程ｉｉ）で検出された活性化可能な遊離型ＰＳＡの量の比を算出する工程、並びに、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で決定した比の値と、使用する比の種類及び個々の病状の検出限界の典型に従って選択された所定のしきい値とを比較することにより、患者が前立腺ガンと前立腺の良性病状とのいずれに罹患しているかを決定する工程：
からなる工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の前立腺の良性病状又は前立腺ガンの診断方法に関する。
【００８９】
活性化可能な遊離型ＰＳＡの活性化は、以下の方法のうち少なくとも１つにより実施することができ：
−上記活性化可能な形態を、上記のように少なくとも０．１５Ｍ、好ましくは少なくともｌＭ、より好ましくは上限２Ｍの高い塩濃度を有する媒体と接触させる方法、
−活性化可能な遊離型ＰＳＡを、ＰＳＡの酵素活性を増強可能な抗体、特に抗体８Ｇ８Ｆ５に結合させる方法：、
これらの２つの方法は、任意の順序で、別々に実施することも、同時又は連続的に実施することも可能である。
【００９０】
ＰＳＡの酵素活性を増強可能なこれらの抗体の特異性によって、これらを本発明の方法において使用することにより上記方法の感度を改善することが可能となり、これは好ましい一実施形態を構成する。
【００９１】
従って、この実施形態によれば、本発明の方法は、活性化可能な遊離型ＰＳＡに非特異的に結合可能な結合パートナーに加えて、ＰＳＡの酵素活性を増強可能な抗体、特に抗体８Ｇ８Ｆ５を使用することを特徴とする。
【００９２】
これに関し、ＰＳＡの酵素活性を増強可能なこの抗体は、生物学的試料由来の、特異的又は非特異的に予め免疫精製された活性化可能な遊離型ＰＳＡの捕獲パートナーとして、アッセイにおいて使用することができる。従って、抗体に捕獲された後で活性化された遊離型ＰＳＡは、その酵素活性により検出することができ、この酵素活性は蛍光基質の加水分解速度から測定可能である。速度の流れは、蛍光単位で表すことができる。ＰＳＡの量における相関は、活性なＰＳＡの量について定めた標準曲線から得ることができる。
【００９３】
この特定の実施形態の工程ｉ）〜ｉｖ）は、上記に記載の例外を除いては、上述したとおりである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９４】
本発明は、以下の実施例及び付随の図面１〜６からより詳細に理解されるであろう。これら実施例は説明のために記載するものであって、何ら限定を意図するものではない。
【００９５】
図１は、抗体５Ｄ３Ｄｌｌ（写真Ａ）で、６Ｃ８Ｄ８（写真Ｂ）で及び１１Ｅ５Ｃ６（写真Ｃ）で免疫精製されたＬＮＣａＰ細胞の培地上清由来のＰＳＡ  ０．５μｇを用いて得られた３つの二次元電気泳動ゲルの写真を示す。
【００９６】
図２は、抗体５Ｄ３Ｄｌｌで予め免疫精製され、かつ、総ＰＳＡについてアッセイした精子ＰＳＡを用いて得られたＰＳＡ濃度に対する蛍光を示す標準的なグラフを示す。
【００９７】
図３は、前立腺ガンに罹患し、放射線療法（ＲＴ）、ホルモン療法（ＨＴ）又は前立腺切除（ＰＲ）により治療された患者由来の血清、ガンに罹患しているが治療が知られていない患者（その他）由来の血清、良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）に罹患した患者由来の血清、及び、正常な患者（ＰＮ）由来の血清について本発明の方法で得られた「活性化可能なＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの切断体＋遊離型ＰＳＡの変性体）」比の値（グラフのパートＡ）、並びに、これらの同じ血清について、先行技術の方法に従って得られた「遊離型ＰＳＡ／総ＰＳＡ」比の値（グラフのパートＢ）を示すグラフである。
【００９８】
図４は、「遊離型ＰＳＡ／総ＰＳＡ」比が０．１５〜０．２５である血清中で本発明の方法を用いて得られた「活性化可能なＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの切断体＋遊離型ＰＳＡの変性体）」比の値を示すグラフであり、上記血清は、前立腺ガンに罹患し、放射線療法（ＲＴ）、（ＲＴ）ホルモン療法（ＨＴ）又は前立腺切除（ＰＲ）により治療された患者由来の血清、ガンに罹患しているが治療が知られていない患者（その他）由来の血清、良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）に罹患した患者由来の血清、及び、正常な患者（ＰＮ）由来の血清である。
【００９９】
図５は、総ＰＳＡ量が２．５ｎｇ／ｍｌ未満である、前立腺ガンに罹患した患者由来の血清及び良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）に罹患した患者由来の血清について、「活性化可能なＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの切断体＋遊離型ＰＳＡの変性体）」比の値を示すグラフである。
【０１００】
図６は、前立腺ガンに罹患した患者由来の血清及び良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）に罹患した患者由来の血清について、活性化可能なＰＳＡの検出用の抗体として抗体５Ｄ５Ａ５又は抗体１１Ｅ５Ｃ６を用いて得られた「活性化可能なＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの切断体＋遊離型ＰＳＡの変性体）」比の値を示すグラフである。
【実施例１】
【０１０１】
＜ＬＮＣａＰ上清を使用する活性化可能な遊離型ＰＳＡの検出＞
１．１  ＬＮＣａＰ上清の調製
ＬＮＣａＰ細胞系を用い、以下の論文に記載の技術に従ってＰＳＡを合成した：“ＬＮＣａＰ  Ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｂｏｔｈ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｚｙｍｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｉｎａｃｔｉｖｅ，ｆｒｅｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ”、Ｅ．Ｃｏｒｅｙら，１９９８，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３５：１３５−１４３，“Ａｎｄｒｏｇｅｎ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ，ＬＮＣａＰ，Ｐｒｏｄｕｃｅ  ｂｏｔｈ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  ｍａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｎｃａｔｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｓｏｆｏｒｍ”、Ａ．Ｈｅｒｒａｌａら，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：３２９−３３５，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｌｉｇｒａｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ｆＰＳＡ）  ｆｒｏｍ  ＬＮＣａＰ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆＰＳＡ  ｆｒｏｍ  ＬＮＣａＰ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｐｌａｓｍａ”、Ｊ．Ｔ．Ｗｕら，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１２：６−１３。
【０１０２】
上記のようにしてＬＮＣａＰ細胞系により産生されたＰＳＡは、遊離型ＰＳＡから構成される。更に、上記系の培養は、ＡＣＴを含む胎児ウシ血清の存在下で実施するため、一定の割合のＰＳＡ−ＡＣＴ複合体が存在する可能性もある。
【０１０３】
１．２  上清中における遊離型ＰＳＡの結合抗体による結合
配列番号１により模倣されるエピトープを認識する結合パートナーである抗体５Ｄ３Ｄ１１、又は、上記エピトープを認識しない結合パートナーである抗体６Ｄ８Ｃ８（Ｍｉｃｈｅｌ  Ｓ．ら，１９９９，上記）のいずれかを使用する。
【０１０４】
結合は、以下のように実施する：
抗体５Ｄ３Ｄｌｌ又は６Ｃ８Ｄ８を、当業者に周知の、製造者提供の通常のプロトコルに従って、ＣＮＢｒ活性化セファロース樹脂支持体（ファルマシア社）に付着させた。結合比は、膨潤した樹脂１ｍｌ当たり５ｍｇとした。５ｍｇの抗体に付着した１ｍｌの樹脂を、約５００μｇの総ＰＳＡを含む２００ｍｌのＬＮＣａＰ細胞上清のプールに接触させ、Ｖｉｄａｓ検出装置（総ＰＳＡキット、ビオメリュー社，フランス）を用いてアッセイした。アフィニティーカラムを２回通過させた後、結合していないＰＳＡを含む部分（Ｆ１と呼ぶ）を保存し、抗体が結合したＰＳＡを、０．ｌＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）で溶出し、引き続いて、２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を用いてｐＨ７．２に中和した。このように、遊離型ＰＳＡを得、抗体５Ｄ３Ｄ１１又は抗体６Ｃ８Ｄ８を用いて免疫精製した。
【０１０５】
１．３  抗体５Ｄ３Ｄ１１又は６Ｃ８Ｄ８で免疫精製した後の上清中の遊離型ＰＳＡのアッセイ
１．３．１．  二次元電気泳動による分析
免疫精製によって得られた種々の画分に含まれるＰＳＡを、二次元電気泳動及びウエスタンブロッティングにより分析した。
【０１０６】
一次元目における分離の間、デポジット試験片（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙ−ｓｔｒｉｐ  ｐＨ３−１０，１８ｃｍ，非線形、ファルマシア社）上に固定されたｐＨ勾配を使用する等電電気泳動（ＩＥＦ）により、変性及び還元条件下で等電点（ｐＩ）に従ってタンパク質を移動させる。０．５μｇのＰＳＡを、１０％のＳＤＳ及び２．３％のＤＴＴ（ジチオ−１，４−トレイトール）を含む溶液１０μｌに添加し、この混合物を、９６℃で５分間加熱した。次いで、この試料を、膨潤液（８．３Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、１００ｍＭのＤＴＴ、２％のＳｅｒｖａｌｙｔ  ４−９、１ｍｇ／ｍｌのＯｒａｎｇｅ  Ｇ）を用いて５００μｌにし、試験片と、長さ２０ｃｍのガラス試験管中で接触させた。次いで、全体をパラフィン油で覆い、一晩インキュベートした。１００〜３５００Ｖで直線的に増加する電圧下で８時間分離を実施し、６０００Ｖにおける泳動工程を８０〜１００ｋＶｈ実施した。
【０１０７】
次いで、個々の等電点に泳動されたタンパク質を、その大きさに従って、ＳＤＳ電気泳動により、大型で均一の１２％アクリルアミドゲル上でゲル１枚当たり４０ｍＡで５〜６時間かけて、通常のタンパク質電気泳動技術によって第二の次元で分離した。
【０１０８】
第二の次元における分離後に得られたゲルを、ＣＡＰＳ／メタノール緩衝液（３−［シクロヘキシルアミノ］−ｌ−プロパンスルホン酸）中においてＰＶＤＦ膜（ポリビニリデントリフルオライド；ミリポア）上に、一晩かけて電流１Ａで、温度を１５℃に維持しながらブロットした。膜を、一晩４℃で、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び５％の乾燥スキムミルクを含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）中に浸した。抗ＰＳＡ抗体１３Ｃ９Ｅ９（ＰＳＡの全形態を検出するために以前に同定されている（Ｃｈａｒｒｉｅｒ  Ｊ．Ｐ．ら，２００１，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２，１８６１−１８６６））を、浸漬用溶液（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、膜に添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、膜を浸漬用溶液で３回（５分）洗浄し、ペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体複合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，アメリカ合衆国）を接触させ、浸漬用溶液で５０００倍に希釈した。次いで、これを室温で１時間インキュベートし、浸漬用溶液中で３回洗浄した。化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて、膜をＦｌｕｏｒ  Ｓ中でインキュベートすることにより免疫反応を検出し、画像取得を（試料によって１分〜１時間かけて）実施した。次いで、得られた画像を、Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｓｔソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて加工した。
【０１０９】
これらのゲルの写真を図１に示すが、写真Ａは抗体５Ｄ３Ｄ１１を使用した場合に対応し、写真Ｂは抗体６Ｃ８Ｄ８を使用した場合に対応し、写真Ｃは比較用の抗総ＰＳＡ抗体である抗体１１Ｅ５Ｃ６を使用した場合に対応する（Ｍｉｃｈｅｌ  Ｓ．ら，１９９９，上記）。
【０１１０】
この図は、抗体５Ｄ３Ｄｌｌで免疫精製されたＰＳＡは、抗総ＰＳＡ抗体１１Ｅ５Ｃ６で免疫精製されたＰＳＡと比較して、切断体又は分断体をほとんど含まないことを示す。一方、これらの形態は、６Ｃ８Ｄ８抗体で免疫精製されたＰＳＡ中には、大幅に多く存在する。
【０１１１】
１．３．３  ＰＳＡのＮ末端配列決定によるＰＳＡの免疫精製物のチモーゲン体及び成熟体の特徴付け
抗体５Ｄ３Ｄ１１又は６Ｃ８Ｄ８で免疫精製された５〜８μｇの細胞ＰＳＡを、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分離に供し、当業者に周知の技術に従って、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜上にブロッティングした。ＰＳＡバンドを、３％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）中に溶解した０．２５％のＰｏｎｃｅａｕ  Ｒｅｄ  Ｓ溶液で染色し、ＰＳＡの成熟体（約３０ＫＤａ）に対応するバンドを切り出し、Ｐｒｏｃｉｓｅ  ２９２Ａｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によるＥｄｍａｎ分解に供した。
【０１１２】
得られた結果は、抗体５Ｄ３Ｄｌｌで免疫精製されたＰＳＡは成熟体（ＩＶＧＧ．．．）のみを含んでいたが、抗体６Ｃ８Ｄ８で免疫精製されたＰＳＡは、成熟体、並びに、ｐｒｏＰＳＡ（−７）及びｐｒｏＰＳＡ（−５）を含んでいたことを示す。
【０１１３】
１．３．４  細胞ＰＳＡの免疫精製物の酵素活性の測定
Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｂｌａｃｋ  ＥＬＩＳＡプレート（蛍光検出と適合）のウェルを、ストレプトアビジンを１０μｇ／ｍｌで炭酸緩衝液中に溶解した溶液（ｐＨ９．６）１００μｌ中で、３７℃において２時間かけて被覆し、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で、３７℃で２時間ブロット（ｂｌｏｔ）した。ウェルをＴＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した後、ＴＢＳ−ＢＳＡで１０μｇ／ｍｌに希釈したビオチン化抗総ＰＳＡ抗体を１００μｌ添加した。抗総ＰＳＡ抗体は、ＰＳＡの酵素活性を変化させない抗体１１Ｅ５Ｃ６（Ｍｉｃｈｅｌ  Ｓ．ら，１９９９、上記）、又は、抗体８Ｇ８Ｆ５（ビオメリュー社，フランス）のいずれでもよい。
【０１１４】
３７℃において２時間インキュベートした後、ウェルを、ＴＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＴＢＳ−ＢＳＡで２．５μｇ／ｍｌに希釈した抗体５Ｄ３Ｄｌｌ又は６Ｃ８Ｄ８で免疫精製されたＰＳＡを添加し、４℃において一晩インキュベートした。次いで、ウェルをＴＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎで再び洗浄し、上記ＴＢＳ−ＢＳＡ（０．１５ＭのＮａＣｌを含む）又はＮａＣｌ濃度を１．５Ｍに増加させたＴＢＳ−ＢＳＡのいずれかを用いて１５分インキュベートした。次いで、ウェルを空にし、０．１５Ｍ又は１．５ＭのＮａＣｌを含むＴＢＳ−ＢＳＡで３００μＭに希釈した１００μｌの蛍光基質Ｍｕ−ＨＳＳＫＬＱ−ＡＦＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、ＩＣＮの子会社）と接触させた。次いで、酵素速度を、３７℃において２時間（励起３９０ｎｍ、発光５１０ｎｍ；１分間につき１回測定）、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。ＰＳＡの酵素活性は、得られた曲線の勾配に対応する。
【０１１５】
結果を以下の表１に示す。
【０１１６】
【表１】
2008509379.tif 000002
【０１１７】
酵素活性は、蛍光単位×１０００／分で表す。
【０１１８】
この表は、抗体５Ｄ３Ｄ１１で免疫精製したＰＳＡが検出可能な酵素活性を有することを示す。この活性は、１．５Ｍ  ＮａＣｌの存在下で増加する。抗体８Ｇ８Ｆ５によるＰＳＡの捕獲によっても、ＰＳＡの酵素活性は増加する。
【０１１９】
一方では、抗体６Ｃ８Ｄ８で免疫精製されたＰＳＡは１．５Ｍ  ＮａＣｌ及び抗体８Ｇ８Ｆ５の存在下で検出可能な活性をほとんど有さず、このことは、ＰＳＡのこの免疫精製物が活性化可能ではないことを示す。
【０１２０】
この実施例は、ＬＮＣａＰ細胞中のＰＳＡの活性遊離体の中でも、本発明の方法により検出可能な活性化可能な遊離体が見出されることを示す。
【実施例２】
【０１２１】
＜前立腺ガンを有する患者由来の血清を使用する活性化可能な遊離型ＰＳＡの検出＞
用いた血清のプールは、前立腺ガンを有する患者由来の血清３０種から構成される。このプールのＰＳＡ濃度：総ＰＳＡ：７１ｎｇ／ｍｌ；遊離型ＰＳＡ：１２ｎｇ／ｍｌ（Ｖｉｄａｓ装置を用いて決定した）。
【０１２２】
２．１．  血清の免疫精製
パラグラフ１．２に記載の樹脂を、抗体５Ｄ３Ｄ１１及び６Ｃ８Ｄ８を付着させた固相支持体として使用する。この樹脂５０μｌを、上記血清のプール１ｍｌに４℃において撹拌しながら一晩接触させる。次いで、チューブを遠心分離し、結合していないＰＳＡを含む画分を保存し、樹脂をＰＢＳ−０．５％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し（洗浄画分は合わせて保存する）、次いで、抗体５Ｄ３Ｄ１１又は６Ｃ８Ｄ８を結合したＰＳＡを、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む２００μｌの０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．２）で５分間溶出し、２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）でｐＨ７．２に中和した。
【０１２３】
２．１．  血清から免疫精製したＰＳＡの酵素活性の測定
Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｂｌａｃｋ  ＥＬＩＳＡプレート（蛍光検出と適合）のウェルを、ストレプトアビジンを１０μｇ／ｍｌで炭酸緩衝液中に溶解した溶液（ｐＨ９．６）１００μｌを用いて、３７℃において２時間かけて「被覆」し、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）２ｍｇ／ｍｌを含むＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて３７℃において２時間ブロッキングした。ウェルをＴＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した後、ＴＢＳ−ＢＳＡ中に１０μｇ／ｍｌに希釈したビオチン化抗総ＰＳＡ抗体１００μｌを添加した。抗総ＰＳＡ抗体は、以下であってよい：
・ＰＳＡの酵素活性を変化させない１１Ｅ５Ｃ６、又は、
・捕獲したＰＳＡの酵素活性を増加させる抗体８Ｇ８Ｆ５。
【０１２４】
３７℃において２時間インキュベートした後、ウェルをＴＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎで洗浄し、抗体５Ｄ３Ｄ１１又は６Ｃ８Ｄ８を用いて血清から免疫精製したＰＳＡ１００μｌを添加し、４℃において一晩インキュベートした。次いで、ウェルをＴＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎで再び洗浄し、ＮａＣｌ濃度を１．５Ｍに増加させたＴＢＳ−２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡで１５分間インキュベートした。次いで、ウェルを空にし、ＴＢＳ−ＢＳＡで４００μＭに希釈した、１．５ＭのＮａＣｌを含む蛍光基質Ｍｕ−ＫＧＩＳＳＱＹ−ＡＦＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、ＩＣＮの子会社）１００μｌに接触させた。次いで、酵素速度を、３７℃において２時間（励起３９０ｎｍ、発光５１０ｎｍ；１分間につき１回測定）、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。ＰＳＡの酵素活性は、得られた曲線のフロー（ｆｌｏｗ）に対応する。
【０１２５】
結果を以下の表２に示す。
【０１２６】
【表２】
2008509379.tif 000003
【０１２７】
酵素活性は、蛍光単位×１０００／分で表す
【０１２８】
＊血清から直接（免疫精製なしで）測定した活性は実際よりも少なく見積もられる、というのは、活性化ＰＳＡは血清ＡＣＴと速やかに複合体を形成するからである。
【０１２９】
この表は、血清から免疫精製したＰＳＡについて酵素活性の測定が可能であること；従って、血清は活性化可能な遊離型ＰＳＡを含むことを示す。
【０１３０】
抗体５Ｄ３Ｄ１１で免疫精製されたＰＳＡと、抗体６Ｃ８Ｄ８で免疫精製されたＰＳＡとの間には顕著な活性の差異が常に明確に認められ、このことは、抗体５Ｄ３Ｄ１１が、活性化可能な遊離型ＰＳＡを特異的に認識することを示す。
【実施例３】
【０１３１】
＜ＢＰＨと前立腺ガンとを識別するための診断試験における抗体５Ｄ３Ｄ１１の使用＞
アッセイには、適切なアッセイ試薬を含むように適合しているＶｉｄａｓ装置を、供給元（ビオメリュー社，フランス）の指示に従って使用する。
【０１３２】
３．１  患者由来の血清における活性化可能なＰＳＡのアッセイ
抗体５Ｄ３Ｄ１１を、サンドウィッチアッセイにおいて捕獲抗体として使用する。捕獲したＰＳＡを、アルカリホスファターゼに結合させた抗総ＰＳＡ抗体５Ｄ５Ａ５を用いて検出する。このプロトコルもまた上記したとおりである。
【０１３３】
アッセイの標準化を、供給元の推奨に従い、抗体５Ｄ３Ｄｌｌで免疫精製して総ＰＳＡに対してアッセイした精子ＰＳＡを用いて実施した。アッセイの検出限界は、活性ＰＳＡ／ｍｌ当たり０．０５ｎｇ／ｍｌである。０〜１．５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲の標準化曲線を、図２に示す。この曲線は直線に近いものであり、配列番号１の配列により模倣されるエピトープを認識する結合パートナーを使用してアッセイすると活性化可能な遊離型ＰＳＡを良好な感度で検出可能であることを示す。
【０１３４】
３．２  患者由来の血清中の（遊離型ＰＳＡの切断体＋遊離型ＰＳＡの変性体）のアッセイ
抗遊離型ＰＳＡ抗体６Ｃ８Ｄ８を、不活性な遊離型ＰＳＡを血清上で捕獲するための捕獲抗体として用いたこと、並びに、アルカリホスファターゼに結合した抗総ＰＳＡ抗体ｌｌＥ５Ｃ６を、（この場合、遊離型ＰＳＡの切断体及び遊離型ＰＳＡの変性体を認識する）検出抗体として用いたこと以外は、上記手順を繰り返した。
【０１３５】
３．３  前立腺ガンとＢＰＨとをより良好に識別するための、活性ＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの切断体＋遊離型ＰＳＡの変性体）比の使用
ＰＳＡを含む、患者由来の血清１７７種を用いて遡及的（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ）研究を実施した。これらの血清は以下に対応する：
−ＰＳＡの総量、腫瘍の進行度、Ｇｌｅａｓｏｎスコア、及び、引き続いて実施される治療（放射線療法、ホルモン療法、前立腺切除又は未知）についての情報を入手可能であるかどうか、が明確に同定された８９の前立腺ガン、
−６５の良性の前立腺肥大、
−２３の正常な前立腺（ＰＳＡ量が２．５ｎｇ／ｍｌより大きいが、生検は陰性である）。
【０１３６】
上記アッセイを用いて得られた活性化可能な遊離型ＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡの切断体）の比を、血清上で算出し、これらの値を、図３のパートＡ中のグラフに表した。
【０１３７】
図３のパートＡに示すように、ＰＳＡの総量が２．５〜１０ｎｇ／ｍｌである血清に対してしきい値を０．６６とし、活性化可能なＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの切断体＋遊離型ＰＳＡの変性体）の比により、２２／３３のガン（６７％）、１９／１９の正常な前立腺（１００％）及び２７／２８のＢＰＨ（９６％）を特徴付けることが可能である。
【０１３８】
比較のため、２つのＶｉｄａｓキット（総ＰＳＡキット及び遊離型ＰＳＡキット、ビオメリュー社，フランス）を用いて、供給元の推奨に従って、遊離型ＰＳＡ／総ＰＳＡ比を算出する。
【０１３９】
結果を図３のグラフのパートＢに示す。このパートＢは、不特定の領域が０．１５〜０．２５の値に存在することを示す。
【０１４０】
３．４．  本発明の方法の感度
３．４．１  先行技術の方法の不特定の領域に含まれる血清について
先行技術の方法を用いて得られた不特定の領域の血清２８種について、本発明の方法に従って得られた、活性化可能な遊離型ＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡの切断体）の比の値を、図４に示す。
【０１４１】
この図は、遊離型ＰＳＡ／総ＰＳＡの比が０．１５〜０．２５である血清、すなわち、公知の方法ではガンとＢＰＨとを識別できない血清について、活性化可能なＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの切断体＋遊離型ＰＳＡの変性体）の比が、１３／１５のガン（８０％）、７／７のＢＰＨ（１００％）及び６／６の正常な前立腺（１００％）を特徴付けることが可能であることを示す。
【０１４２】
３．４．２  ＰＳＡ量が２．５ｎｇ／ｍｌ未満である血清について
ＰＳＡ量が２．５ｎｇ／ｍｌ未満のガンに罹患した患者（１１名）又はＢＰＨに罹患した患者（９名）由来の血清２０種を選択し、活性化可能な遊離型ＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡの切断体）の比の値を図５に示す。
【０１４３】
この図は、ＰＳＡ量が２．５ｎｇ／ｍｌ未満の血清についても、活性化可能なＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡの切断体）の比を用いた前立腺ガンとＢＰＨとの識別が有効であることを示す。
【０１４４】
３．５  検出抗体の修飾
血清８種（５種の血清は前立腺ガンに罹患した患者由来であり、３種の血清はＢＰＨに罹患した患者由来である）を用いて、抗体１１Ｅ５Ｃ６（Ｍｉｃｈｅｌ  Ｓ．ら，１９９９、上記）を検出抗体として用いた以外は、上記手順を繰り返した。
【０１４５】
結果を図６に示すが、活性化可能なＰＳＡを検出するための抗体として抗体５Ｄ５Ａ５を用いた、活性化可能な遊離型ＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡの切断体）の比の値を、曲線のパートＡに示し、抗体１１Ｅ５Ｃ６を検出抗体として用いた以外は同じ血清について得られた、活性化可能な遊離型ＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの変性体＋遊離型ＰＳＡの切断体）の比の値を、パートＢに示す。
【０１４６】
この図は、どの検出抗体を使用したかにかかわらず明確なしきい値が存在し、かつ、しきい値は検出に用いた抗体に応じて変化することを示す。
【実施例４】
【０１４７】
＜生物学的試料中で活性化可能な遊離型ＰＳＡに非特異的に結合可能な結合パートナーを使用する、活性化可能な遊離型ＰＳＡの検出＞
１．  用いた試料
ＬｉｅｇｅのＣＨＵ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ］から入手した、又は、リヨンのｈｏｐｉｔａｌ  ｄｅｓ  Ａｒｍｅｅｓ，Ｄｅｓｇｅｎｅｔｔｅｓ［Ｄｅｓｇｅｎｅｔｔｅｓ  Ｍｉｌｉｔａｒｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ］から入手した、ＰＳＡの総濃度が１５７〜３．８ｎｇ／ｍｌである９種の別個の血清を用いた。
【０１４８】
２．  抗体１１Ｅ５Ｃ６を使用するＰＳＡの免疫精製
２．１．  抗体のビーズとのカップリング
ストレプトアビジンで予め被覆したビーズ１０８個（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｄｙｎａｌ社）、すなわちビーズ溶液１５０μｌ、をチューブの中に入れ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  ＢＳＡ）に０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０を添加したもの（緩衝液Ｄ＋０．５％  Ｔ）５００μｌで３回洗浄した。溶液を均一な状態で維持するために、洗浄は毎回、室温において５分間、回転盤上で行った。
【０１４９】
１０８個のビーズと、５００μｌの抗体１１Ｅ５Ｃ６（ビオメリュー社  マルシー，フランス）２０μｇ／ｍｌ（すなわち、抗体１０μｇ）とを、緩衝液Ｄ＋０．０５％  Ｔ中で、室温において３０分間、回転盤上でカップリングさせた。カップリングさせた後、５μｌの１０ｍＭビオチンを５００μｌの抗体溶液に添加し、室温において３０分間、回転盤上でインキュベートした。
【０１５０】
次いで、ビーズを、５００μｌの緩衝液Ｄ＋０．５％  Ｔを用いて、回転盤上で室温において５分間洗浄し、過剰なビオチン及び抗体を除去した。
【０１５１】
２．２．  ＰＳＡ結合
ＰＳＡを含む１ｍｌの試料（コントロールとして使用される希釈した精子のＰＳＡ又は血清のいずれか）を、ビーズ１０８個を入れたチューブの中に入れ、４℃において一晩インキュベートした。
【０１５２】
このインキュベート後、結合していないＰＳＡを回収し、アッセイすることによってＰＳＡの残存量を決定した。
【０１５３】
次いで、非特異的に結合したタンパク質を脱離させるために、濃度０．５％のＴｗｅｅｎ２０を有する緩衝液Ｄ５００μｌを用いて、洗浄を３回実施した。
【０１５４】
２．３．  溶出
ＰＳＡを、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−グリシン（ｐＨ２．２）１００μｌを用いて、室温において５分間溶出させた。ｐＨが酸性だと、ＰＳＡ−Ａｂ結合の切断が生じる。溶液が酸性であるためにタンパク質が変性するのを避け、かつ、その酵素活性を保持するため、回収した溶出液を、１１μｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．６）を用いて中和した。
【０１５５】
３．  遊離型ＰＳＡ及び総ＰＳＡについての試料のアッセイ
このアッセイは、ＶＩＤＡＳ装置（ビオメリュー社，マルシー，フランス）を用い、総ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）及び遊離型ＰＳＡ（ＦＰＳＡ）を測定するアッセイキットを用いて、供給元の推奨及び以下のプロトコルに従って実施した：総ＰＳＡ又は遊離型ＰＳＡのそれぞれに対する特異的抗体をチップに付着させる。２種のアッセイにおいて、検出抗体は、アルカリホスファターゼに結合した抗体１１Ｅ５Ｃ６であり、この抗体は基質の加水分解により生成物が生じる反応を触媒し、その蛍光は４５０ｎｍで発光し、測定される。
【０１５６】
アッセイ１回につき２００μｌの試料が必要であり、この試料をバーの中に配置し、結果は１時間で得られる。ＴＰＳＡアッセイは、ＰＳＡ感度が０．０７ｎｇ／ｍｌであり、ＰＳＡを上限１００ｎｇ／ｍｌまで検出することができる。ＦＰＳＡアッセイは、ＰＳＡ感度が０．０５ｎｇ／ｍｌであり、ＰＳＡを上限１０ｎｇ／ｍｌまで検出することができる。
【０１５７】
４．  ＰＳＡの酵素活性の測定
４．１  捕獲抗体の付着
ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈したストレプトアビジン１００μｌで被覆し、３７℃において２時間インキュベートした。次いで、非特異的な付着を避け、これによりバックグラウンドノイズを抑制するために、ＢＳＡを２ｍｇ／ｍｌ添加した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５（ＴＢＳ））２５０μｌ（ＴＢＳ＋ＢＳＡ）にウェルを浸した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ＋０．０５％  Ｔ）を含むＴＢＳ中で３回洗浄した後、１００μｌのビオチン化抗体８Ｇ８Ｆ５（ビオメリュー社，マルシー，フランス）を１０μｇ／ｍｌで添加し、３７℃において２時間インキュベートした。この工程の後、ＴＢＳ＋０．０５％  Ｔ中で３回洗浄した。
【０１５８】
４．２．  ＰＳＡのインキュベート
ＴＢＳ＋ＢＳＡで希釈した８５μｌのＰＳＡ（精子ＰＳＡ又は血清の免疫精製物）をウェル中に添加し、４℃において一晩インキュベートした。次いで、ウェルをＴＢＳ＋０．０５％  Ｔ中で３回洗浄することによって、結合していないＰＳＡを除去することができた。次いで、酵素を、ＮａＣｌを１．５Ｍで添加した基質ＴＢＳ＋ＢＳＡ  １００μｌを用いて、３７℃において１５分間インキュベートした。
【０１５９】
４．３．  視覚化及びアッセイ
基質ＫＧＩＳＳＱＹ−ＡＦＣを、ＮａＣｌを１．５Ｍで添加したＴＢＳ＋ＢＳＡで希釈した。次いで、この希釈基質１００μｌをウェルに添加し、３７℃においてインキュベートした。発光した蛍光を、３７℃において２時間、１分毎に、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ装置（ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍ社）を用いて測定した。
【０１６０】
酵素の酵素活性を、速度の勾配を算出することにより決定し、これを蛍光単位×１０００／分で表した。
【０１６１】
５．  結果
結果を、以下の表３に示す。
【０１６２】
【表３】
2008509379.tif 000004
【０１６３】
これらの血清の中でも、前立腺ガンに罹患していることが確認された患者由来の血清１及び血清９は、本発明の方法によってもまた前立腺ガンに罹患していることが確認される。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】抗体５Ｄ３Ｄｌｌ（写真Ａ）で、６Ｃ８Ｄ８（写真Ｂ）で及び１１Ｅ５Ｃ６（写真Ｃ）で免疫精製されたＬＮＣａＰ細胞の培地上清由来のＰＳＡ  ０．５μｇを用いて得られた３つの二次元電気泳動ゲルの写真を示す。
【図２】抗体５Ｄ３Ｄｌｌで予め免疫精製され、かつ、総ＰＳＡについてアッセイした精子ＰＳＡを用いて得られたＰＳＡ濃度に対する蛍光を示す標準的なグラフを示す。
【図３】前立腺ガンに罹患し、放射線療法（ＲＴ）、ホルモン療法（ＨＴ）又は前立腺切除（ＰＲ）により治療された患者由来の血清、ガンに罹患しているが治療が知られていない患者（その他）由来の血清、良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）に罹患した患者由来の血清、及び、正常な患者（ＰＮ）由来の血清について本発明の方法で得られた「活性化可能なＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの切断体＋遊離型ＰＳＡの変性体）」比の値（グラフのパートＡ）、並びに、これらの同じ血清について、先行技術の方法に従って得られた「遊離型ＰＳＡ／総ＰＳＡ」比の値（グラフのパートＢ）を示すグラフである。
【図４】「遊離型ＰＳＡ／総ＰＳＡ」比が０．１５〜０．２５である血清中で本発明の方法を用いて得られた「活性化可能なＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの切断体＋遊離型ＰＳＡの変性体）」比の値を示すグラフであり、上記血清は、前立腺ガンに罹患し、放射線療法（ＲＴ）、（ＲＴ）ホルモン療法（ＨＴ）又は前立腺切除（ＰＲ）により治療された患者由来の血清、ガンに罹患しているが治療が知られていない患者（その他）由来の血清、良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）に罹患した患者由来の血清、及び、正常な患者（ＰＮ）由来の血清である。
【図５】総ＰＳＡ量が２．５ｎｇ／ｍｌ未満である、前立腺ガンに罹患した患者由来の血清及び良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）に罹患した患者由来の血清について、「活性化可能なＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの切断体＋遊離型ＰＳＡの変性体）」比の値を示すグラフである。
【図６】前立腺ガンに罹患した患者由来の血清及び良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）に罹患した患者由来の血清について、活性化可能なＰＳＡの検出用の抗体として抗体５Ｄ５Ａ５又は抗体１１Ｅ５Ｃ６を用いて得られた「活性化可能なＰＳＡ／（遊離型ＰＳＡの切断体＋遊離型ＰＳＡの変性体）」比の値を示すグラフである。
【図１】
2008509379.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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