(57)【要約】  本発明は、樹状細胞のような抗原提示細胞中のサイトカインシグナル伝達調節物質による抗原提示の調節に関する。本発明は、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１〜７、ＣＩＳ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）若しくはＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙ）のようなサイトカインシグナル伝達調節物質の調節による抗原提示の調節方法を提供する。本発明は、抗原提示がサイトカインシグナル伝達調節物質の調節により高められるワクチンおよび治療法を提供する。本発明はまた、自己腫瘍抗原の提示に頼る腫瘍のワクチン接種方法における自己寛容を破壊するための機構も提供する。
2008522951.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫細胞の免疫能を高めるための組成物であって、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ）、ＳＨ２含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）若しくは活性化型ＳＴＡＴのタンパク質インヒビター（ＰＩＡＳ）のいずれか１種若しくはそれ以上のインヒビターを含んでなり、前記インヒビターが前記細胞中での負の調節経路を妨害する、上記組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記インヒビターが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチドおよび小分子よりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、前記インヒビターがｓｉＲＮＡである、上記組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物であって、前記ｓｉＲＮＡが、二本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドよりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の組成物であって、前記ｓｉＲＮＡが化学的に合成される、上記組成物。
【請求項６】
生理学的に許容できる担体をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、前記生理学的に許容できる担体がリポソームである、上記組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、前記インヒビターが、発現ベクターにクローン化された単離されたポリヌクレオチドによりコードされる、上記組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、前記発現ベクターが、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクター、細菌ベクターおよび哺乳動物ベクターよりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の組成物であって、前記発現ベクターが、前記単離されたポリヌクレオチドの宿主細胞のゲノム中への組込みを助長する組込みシグナル配列をさらに含んでなる、上記組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、前記ＳＯＣＳが、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７、およびサイトカインで誘導可能なＳＨ２ドメイン含有タンパク質（ＣＩＳ）よりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の組成物であって、前記ＳＨＰがＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２よりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物であって、前記ＰＩＡＳが、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙよりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物であって、最低１個のエピトープを有する抗原をさらに含んでなり、前記エピトープが哺乳動物において免疫応答を導き出すことが可能である、上記組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物であって、前記抗原が発現ベクターにより発現される、上記組成物。
【請求項１６】
請求項１４に記載の組成物であって、前記抗原が単離されたポリペプチドである、上記組成物。
【請求項１７】
請求項１４に記載の組成物であって、前記最低１個のエピトープが哺乳動物においてＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を誘導する、上記組成物。
【請求項１８】
請求項１４に記載の組成物であって、前記最低１個のエピトープが哺乳動物においてＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導する、上記組成物。
【請求項１９】
請求項１４に記載の組成物であって、前記最低１個のエピトープが哺乳動物においてＢ細胞応答を誘導する、上記組成物。
【請求項２０】
請求項１４に記載の組成物であって、前記抗原が疾患と関連する、上記組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物であって、前記疾患が、感染性疾患、癌および自己免疫疾患よりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項２２】
請求項２０に記載の組成物であって、前記抗原が感染性疾患と関連する、上記組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物であって、前記感染性疾患が、ウイルス、細菌、真菌および原生動物よりなる群から選択される病原性微生物により引き起こされる、上記組成物。
【請求項２４】
請求項１４に記載の組成物であって、前記抗原がウイルス遺伝子によりコードされる、上記組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物であって、前記ウイルス遺伝子が、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマウイルスおよびヘルペスウイルスよりなる群から選択されるウイルス由来である、上記組成物。
【請求項２６】
請求項２４に記載の組成物であって、前記抗原が、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子、およびＢ型肝炎ウイルスコア抗原遺伝子よりなる群から選択されるウイルス遺伝子によりコードされる、上記組成物。
【請求項２７】
請求項２４に記載の組成物であって、前記抗原が、ヒト免疫不全ウイルスのＥｎｖ  ｇｐ１６０遺伝子、Ｇａｇ遺伝子、Ｐｏｌ遺伝子、Ｒｅｖ遺伝子、Ｔａｔ遺伝子、Ｖｉｆ遺伝子およびＮｅｆ遺伝子よりなる群から選択されるウイルス遺伝子によりコードされる、上記組成物。
【請求項２８】
請求項２４に記載の組成物であって、前記抗原が、パピローマウイルスＥ７遺伝子およびパピローマウイルスＥ６よりなる群から選択されるウイルス遺伝子によりコードされる、上記組成物。
【請求項２９】
請求項２５に記載の組成物であって、前記抗原が、単純疱疹ウイルス１型、単純疱疹ウイルス２型、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７およびヒトヘルペスウイルス８よりなる群から選択されるヘルペスウイルス由来のウイルス遺伝子によりコードされる、上記組成物。
【請求項３０】
請求項２１に記載の組成物であって、前記癌が、乳癌、子宮頚癌、黒色腫、腎癌および前立腺癌よりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項３１】
請求項１４に記載の組成物であって、前記抗原が過剰発現される腫瘍関連抗原、精巣腫瘍抗原、変異した腫瘍関連抗原、分化腫瘍関連抗原チロシナーゼ、ＭＡＲＴ、ｔｒｐ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ１００、ＨＥＲ−２、ＲａｓおよびＰＳＡよりなる群から選択される腫瘍関連抗原である、上記組成物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の組成物であって、前記腫瘍関連抗原が、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＣＡＳＰ、ＣＤＫ、Ｒａｓ、ｐ５３、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＭＵＣ、ＴＷ１、ＰＡＰ、スルビビン、テロメラーゼ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ、ＴＲＰ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＬＡＧＥ／ＮＹ−ＥＳＯ、ＲＡＧＥ、ＳＳＸ−２、ＣＤ１９およびＣＤ２０よりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項３３】
請求項２０に記載の組成物であって、前記疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬およびクローン病よりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項３４】
サイトカイン若しくはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストをさらに含んでなる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の組成物であって、前記サイトカイン若しくはＴＬＲアゴニストが発現ベクターにより発現される、上記組成物。
【請求項３６】
請求項３４に記載の組成物であって、前記ＴＬＲアゴニストが単離されたポリペプチドである、上記組成物。
【請求項３７】
請求項３４に記載の組成物であって、前記サイトカインが単離されたポリペプチドである、上記組成物。
【請求項３８】
請求項３４に記載の組成物であって、前記サイトカインが、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３よりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項３９】
請求項１に記載の組成物であって、さらに、前記インヒビターがヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）シグナル伝達の阻害を抑制する、上記組成物。
【請求項４０】
請求項１に記載の組成物であって、さらに、前記インヒビターがＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達の阻害を抑制する、上記組成物。
【請求項４１】
請求項１に記載の組成物であって、さらに、前記インヒビターがＮＦ−κＢシグナル伝達の阻害を抑制する、上記組成物。
【請求項４２】
請求項１に記載の組成物であって、さらに、前記インヒビターが抗原受容体シグナル伝達の阻害を抑制する、上記組成物。
【請求項４３】
細胞の免疫能を高めるための組成物であって、インヒビターをコードする第一のポリヌクレオチド（前記インヒビターは前記細胞中でのサイトカインシグナル伝達の調節物質を阻害するものである）、および最低１個のエピトープを有する抗原をコードする第二のポ
リヌクレオチド（前記最低１個のエピトープが哺乳動物における免疫応答を誘導するものである）を含んでなるベクターを含んでなる、上記組成物。
【請求項４４】
請求項４３に記載の組成物であって、前記サイトカインシグナル伝達調節物質が、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１〜７、ＣＩＳ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）ならびにＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙ）よりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項４５】
請求項４３に記載の組成物であって、前記インヒビターが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチドおよび小分子よりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項４６】
請求項４３に記載の組成物であって、前記ベクターが、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクター、細菌ベクターおよび哺乳動物ベクターよりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項４７】
細胞の免疫能を高めるための組成物であって、インヒビターをコードする第一のポリヌクレオチド（前記インヒビターは前記細胞中でのサイトカインシグナル伝達の調節物質を阻害するものである）、およびサイトカイン若しくはＴＬＲアゴニストをコードする第二のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる、上記組成物。
【請求項４８】
請求項４７に記載の組成物であって、サイトカインをコードする前記第二のポリヌクレオチドが、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３よりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項４９】
サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを含んでなる細胞。
【請求項５０】
請求項４９に記載の細胞であって、前記サイトカインシグナル伝達調節物質が、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１〜７、ＣＩＳ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）ならびにＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙ）よりなる群から選択される、上記細胞。
【請求項５１】
請求項４９に記載の細胞であって、前記インヒビターが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチドおよび小分子よりなる群から選択される、上記細胞。
【請求項５２】
請求項４９に記載の細胞であって、細胞が、ＡＰＣ、樹状細胞、単球／マクロファージ、Ｔ細胞およびＢ細胞よりなる群から選択される免疫細胞である、上記細胞。
【請求項５３】
請求項５２に記載の細胞であって、Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞および制御性Ｔ細胞である、上記細胞。
【請求項５４】
最低１個のエピトープを有する抗原をさらに含んでなり、前記エピトープが哺乳動物において免疫応答を導き出すことが可能である、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５５】
サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターをさらに含んでなる、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５６】
サイレンスした（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）細胞の生成方法であって、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターと細胞を接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法であって、前記サイトカインシグナル伝達調節物質が、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１〜７、ＣＩＳ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）ならびにＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙ）よりなる群から選択される、上記方法。
【請求項５８】
請求項５６に記載の方法であって、前記インヒビターが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチドおよび小分子よりなる群から選択される、上記方法。
【請求項５９】
サイレンスかつパルスした細胞の生成方法であって、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターと細胞を接触させること、およびさらに最低１個のエピトープを有する抗原と前記細胞を接触させることを含んでなり、前記エピトープが哺乳動物において免疫応答を導き出すことが可能である、上記方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、前記サイトカインシグナル伝達調節物質が、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１〜７、ＣＩＳ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）ならびにＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙ）よりなる群から選択される、上記方法。
【請求項６１】
請求項５９に記載の方法であって、前記インヒビターが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチドおよび小分子よりなる群から選択される、上記方法。
【請求項６２】
哺乳動物において免疫応答を導き出す方法であって、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを含んでなる組成物をそれの必要な哺乳動物に投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法であって、前記サイトカインシグナル伝達調節物質が、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１〜７、ＣＩＳ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）ならびにＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙ）よりなる群から選択される、上記方法。
【請求項６４】
請求項６２に記載の方法であって、前記インヒビターが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチドおよび小分子よりなる群から選択される、上記方法。
【請求項６５】
哺乳動物において免疫応答を導き出す方法であって、サイレンスした細胞を含んでなる組成物をそれの必要な哺乳動物に投与することを含んでなり、前記サイレンスした細胞がサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを含んでなる、上記方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載の方法であって、前記サイトカインシグナル伝達調節物質が、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１〜７、ＣＩＳ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）ならびにＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙ）よりなる群から選択される、上記方法。
【請求項６７】
請求項６５に記載の方法であって、前記インヒビターが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチドおよび小分子よりなる群から選択される、上記方法。
【請求項６８】
請求項６５に記載の方法であって、前記サイレンスした細胞が、それの必要な哺乳動物に前記サイレンスした細胞を投与する前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原と接触される、上記方法。
【請求項６９】
請求項６５に記載の方法であって、前記サイレンスした細胞が、それの必要な哺乳動物への前記サイレンスした細胞の投与後にｉｎ  ｖｉｖｏで抗原と接触される、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトにおける不十分な抗原提示ならびに自然および適応免疫の活性化は、多くの病原性感染症および悪性細胞増殖を制御および消失することのヒト免疫系の失敗をもたらす。慢性感染症および癌のための成功裏の治療的ワクチンおよび免疫療法は、それらの病状と関連する攻撃的抗原を制御かつ消失することが可能である活発な免疫応答を誘導するための効率的な手段のための新たなアプローチの開発に左右される。
【０００２】
抗原を認識するＴ細胞の能力は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ若しくはＭＨＣ  ＩＩいずれかのタンパク質との抗原の会合に依存する。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣ−Ｉタンパク質とともに提示される抗原に応答する。従って、ウイルスに感染した細胞を死滅させるべきである細胞傷害性Ｔ細胞は、該細胞が適切なＭＨＣ−Ｉタンパク質もまた発現しない場合にその細胞を死滅させることができない。ヘルパーＴ細胞はＭＨＣ−ＩＩタンパク質を認識する。ヘルパーＴ細胞活性は、一般に、抗原提示細胞上の抗原の認識および「自己」ＭＨＣ−ＩＩタンパク質のこれらの細胞上での存在の双方に依存する。自己ＭＨＣタンパク質を伴う抗原の認識のための要件はＭＨＣ拘束と呼ばれる。ＭＨＣ−Ｉタンパク質は事実上全部の有核細胞の表面上で見出される。ＭＨＣ−ＩＩタンパク質は、脾のマクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞ならびに皮膚のランゲルハンス細胞を包含するある種の細胞の表面上で見出される。
【０００３】
哺乳動物における免疫応答の装備における決定的な一段階は、ＭＨＣ−ＩＩに拘束された外因性抗原を認識するＣＤ４＋  ヘルパーＴ細胞の活性化である。これらの抗原は、樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞中の細胞エンドソーム経路で捕捉かつプロセシングされる。エンドソームおよびリソソーム中で、抗原は小型の抗原ペプチドにプロセシングされ、それらがゴルジ区画でＭＨＣ−ＩＩに複合体形成して抗原−ＭＨＣ−ＩＩ複合体を形成する。この複合体が細胞表面上で発現され、その発現がＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化を誘導する。
【０００４】
哺乳動物における効果的な免疫応答の誘導における他の決定的な事象は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化を必要とする。ＣＤ８＋  細胞は、所望のタンパク質が、ＭＨＣ−Ｉ抗原と複合体形成されているプロセシングされたタンパク質として細胞表面上に提示されるような様式で細胞により送られる（ｒｏｕｔｅｄ）場合に活性化される。Ｂ細胞は、ＭＨＣタンパク質に対する必要性を伴わずにそれらの表面免疫グロブリン（ＩｇＭおよびＩｇＤ）を介して抗原と相互作用し得る。しかしながら、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化は免疫系の全部の武器を刺激する。活性化に際して、ＣＤ４＋  Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）はインターロイキンを産生する。これらのインターロイキンは免疫系の他の武器を活性化するのを助ける。例えば、ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞が抗体を産生するのを助けるインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−５（ＩＬ−５）；ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化するインターロイキン−２（ＩＬ−２）；ならびにマクロファージを活性化するγインターフェロンを産生する。ＭＨＣ−ＩＩに拘束された抗原を認識するヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞およびＢ細胞の活性化およびクローン増殖において中心的な役割を演じているため、抗原に応答してのヘルパーＴ細胞の活性化の初期事象が、その抗原に向けられた効果的な免疫応答の誘導に決定的に重要である。リソソームの膜貫通型タンパク質由来の配列を使用してヘルパーＴ細胞活性化を刺激する試みが報告されている。しかしながら、これらの試みは、試験されている哺乳動物におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＢ細胞に関して効果的な免疫応答の誘導をもたらさなかった。
【０００５】
免疫応答においてＴ細胞が演じる決定的な役割に加え、ＤＣが同等に重要である。ＤＣは、自己抗原に対する免疫寛容の維持ならびに自然および適応免疫の活性化において重要な調節的役割を有する専門の抗原提示細胞である（非特許文献１；非特許文献２）。ＤＣが微生物産物のような炎症前刺激に遭遇する場合に、細胞表面で発現される抗原ペプチドを負荷されたＭＨＣ分子および共刺激分子を上方制御することにより、該細胞の成熟過程が開始される。成熟および局所リンパ節へのホーミング後に、ＤＣは免疫学的シナプスを形成することによりＴ細胞との接触を確立し、そこでＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共刺激分子が、接着分子により囲まれる中心領域に集合する（非特許文献３）。一旦活性化されれば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は数世代の間自律的に増殖し得、そしてさらなる抗原刺激を伴わずに細胞傷害機能を獲得し得る（非特許文献４；非特許文献５）。従って、ＤＣにより提供されるペプチド−ＭＨＣ複合体（シグナル１）および共刺激分子（シグナル２）のレベルおよび持続時間が、抗原特異的Ｔ細胞応答の大きさおよび運命を決定するために不可欠であると提案されている（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００６】
腫瘍ワクチンを開発するための大きな努力は、抗腫瘍免疫を高める一手段としてＤＣの成熟および共刺激を促進することを試みた。しかしながら、自己腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する免疫の誘導は、固有の阻害機構（それらの多くは定義されるべきままである）により制限されている。既知の一阻害機構が、ＤＣ若しくは他の細胞上のＢ７ファミリー分子との細胞−細胞接触を介するエフェクターＴ細胞活性化の大きさを制御するために、Ｔ細胞上の細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）および関連分子により使用される。ＤＣの成熟は、自己寛容の維持から免疫の誘導への決定的なスイッチとしてはたらく。しかしながら、成熟抗原提示ＤＣが、それらが成熟の点を超えて適応免疫の大きさおよび持続時間を制御することを可能にするとみられる負の調節機構を有するかどうかは不明なままである。
【０００７】
サイトカインは、複数の免疫細胞機能の調節に決定的に関与している（非特許文献８；非特許文献９）。ＤＣは、リポ多糖（ＬＰＳ）のような保存された微生物構造を認識するｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を使用して、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）シグナル伝達経路を活性化することによりＤＣ成熟を促進する（非特許文献１０）。ＮＦ−κＢファミリーメンバーが、その後、ＩＬ−１２のような炎症前サイトカインの発現を媒介して、自然および適応免疫の誘導をもたらす（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。ＤＣ成熟後に、サイトカイン産生および細胞内シグナル伝達経路が、過度の自己免疫活性化を制限しつつ、外来抗原に対する有益な免疫応答を促進するようしっかりと調節されると考えられている。しかしながら、これらの経路の特異的なフィードバック阻害機構および自己抗原特異的免疫応答の生じる制御の重要性は、不十分に定義されたままである。
【０００８】
ＳＯＣＳ１は、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５を包含する多様なサイトカインによるシグナル伝達の誘導可能な負のフィ―ドバック調節物質である（非特許文献１３；非特許文献１４）。ＳＯＣＳ１は、擬似基質インヒビターとしての上流のヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）の活性化ループに結合しかつ／若しくはプロテアソーム分解のためＪＡＫを標的とすることにより、複数の転写のシグナルトランスデューサーおよび活性化物質（ＳＴＡＴ）シグナル伝達経路を抑制する（非特許文献１３；非特許文献１４）。ＳＯＣＳ１はまた、そのＳＯＣＳボックス領域によるユビキチン媒介性のタンパク質分解のためｐ６５タンパク質の標的を定めることにより、ＮＦ−κＢシグナル伝達も阻害する（非特許文献１５）。ＳＯＣＳ１欠損（−／−）マウスは、主として自由なサイトカインシグナル伝達の結果として、重症の全身性炎症ならびにＴおよびＮＫＴ細胞の異常な活性化を伴う新生児として死亡する（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。ＤＣ中でのＳＯＣＳ１の機能についてはほとんど知られていないとは言え、最近の研究は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）中でのシグナル伝達の制御におけるＳＯＣＳ１の役割を示唆している（非特許文献１３；非特許文献１９）。マクロファージ中でのＳＯＣＳ１発現はＬＰＳ若しくはＣｐＧ−ＤＮＡ刺激により誘導され、また、ＳＯＣＳ１−／−マウスは、それらの野性型同腹子がそうであるよりＬＰＳで誘導されるショックに対しより感受性である（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）。さらに、ＳＯＣＳ１−／−バックグラウンドでＴおよびＢ細胞中でのＳＯＣＳ１発現が回復されたマウスからのＳＯＣＳ１−／−  ＤＣは、ＩＦＮγおよびＬＰＳに対し反応亢進性であり、同種異系Ｔ細胞増殖を誘発し、そしてＢ細胞の異常な増殖および自己反応性抗体の産生を誘導する（非特許文献１９）。
【０００９】
ＤＣ中でのＳＯＣＳ１の機能についてはほとんど知られていないとはいえ、最近の研究は、サイトカインシグナル伝達経路の調節におけるＳＯＣＳ１の役割の役割を示した。例えば、ＳＯＣＳ１−／−  ＤＣがより成熟した表現型を表し、そしてシグナル伝達のためＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４と相互作用するリポ多糖（ＬＰＳ）に対し反応亢進性であることが観察されたことが示されている。ＳＯＣＳ１−／−  ＤＣが自己反応性抗体の産生を誘導したこともまた観察された。これらの観察結果は、おそらくＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路およびＴＬＲ／ＮＦ−κＢ経路を制御することによる、ＳＯＣＳ１がＤＣの負の調節で果たす可能な役割を言外にほのめかした。
【００１０】
哺乳動物における免疫応答を刺激するための免疫療法においてＤＣを使用するための多くの試みがなされた。これらの努力において、ＤＣは、それらに抗原を負荷し、そしてそれらが癌患者で抗腫瘍免疫を刺激するようにｅｘ  ｖｉｖｏの情況でそれらを成熟させることにより操作した。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と闘うための免疫療法の使用に関して、有効なヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ワクチンは未だ出現していない。従って、哺乳動物における疾患の処置のため免疫応答を導き出す効率的かつ指向された手段に対する、当該技術分野で長年の切実なニーズが存在する。本発明はこのニーズを満たす。
【非特許文献１】Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８、Ｎａｒｕｔｅ  ３９２：２４５−５２
【非特許文献２】Ｓｔｅｉｎｍａｎら、２００３、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：６８５−７１１
【非特許文献３】Ｄｕｓｔｉｎら、２０００、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２３−９
【非特許文献４】Ｋａｅｃｈら、２００１、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４１５−２２
【非特許文献５】ｖａｎ  Ｓｔｉｐｄｏｎｋら、２００１、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４２３−９
【非特許文献６】Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、２００１、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４８７−９２
【非特許文献７】Ｇｅｔｔら、２００３、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３５５−６０
【非特許文献８】Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒら、２００３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１１４１−５１
【非特許文献９】Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：６８４２−９
【非特許文献１０】Ａｋｉｒａら、２００４、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：４９９−５１１
【非特許文献１１】Ｂｅｕｔｌｅｒら、２００３、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１６９−１７６
【非特許文献１２】Ｊａｎｅｗａｙら、２００２、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：１９７−２１６
【非特許文献１３】Ｋｕｂｏら、２００３、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１１６９−７６
【非特許文献１４】Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２００４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５０３−２９
【非特許文献１５】Ｒｙｏら、２００３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１２：１４１３−２６
【非特許文献１６】Ｍａｒｉｎｅら、１９９９、Ｃｅｌｌ  ９８：６０９−１６
【非特許文献１７】Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９９９、Ｃｅｌｌ  ９８：５９７−６０８
【非特許文献１８】Ｎａｋａら、２００１、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４：５３５−４５
【非特許文献１９】Ｈａｎａｄａら、２００３、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：４３７−５０
【非特許文献２０】Ｃｒｅｓｐｏら、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４９：９９−１０４
【非特許文献２１】Ｄａｌｐｋｅら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：７０８２−９
【非特許文献２２】Ｎａｋａｇａｗａら、２００２、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：６７７−８７
【非特許文献２３】Ｋｉｎｊｙｏら、２００２、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：５８３−９１
【発明の開示】
【００１１】
［発明の要約］
本発明は、免疫細胞の免疫能を高めるための組成物を包含する。好ましくは、該組成物は、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ）、ＳＨ２含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）若しくは活性化型ＳＴＡＴのタンパク質インヒビター（ＰＩＡＳ）のいずれか１種若しくはそれ以上のインヒビターを含んでなる。より好ましくは、該インヒビターは前記細胞中で負の調節経路を妨害する。
【００１２】
特定の一態様において、インヒビターは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチドおよび小分子よりなる群から選択される。好ましくは、インヒビターはｓｉＲＮＡである。
【００１３】
さらなる一局面において、ｓｉＲＮＡは、二本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドよりなる群から選択される。
【００１４】
なお別の局面において、ｓｉＲＮＡは化学的に合成される。
【００１５】
本発明の別の態様は、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを含んでなる組成物を包含し、該組成物は生理学的に許容できる担体をさらに含んでなる。好ましくは、生理学的に許容できる担体はリポソームである。
【００１６】
別の態様において、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターは、発現ベクターにクローン化された単離されたポリヌクレオチドによりコードされる。該発現ベクターは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクター、細菌ベクターおよび哺乳動物ベクターよりなる群から選択される。別の局面において、発現ベクターは、単離されたポリヌクレオチドの宿主細胞のゲノム中への組込みを助長する組込みシグナル配列をさらに含んでなる。
【００１７】
本発明はまた、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ）のインヒビター
も包含し、ＳＯＣＳは、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７、およびサイトカインで誘導可能なＳＨ２ドメイン含有タンパク質（ＣＩＳ）よりなる群から選択される。
【００１８】
別の局面において、本発明はＳＨ２含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）のインヒビターを包含し、ＳＨＰはＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２よりなる群から選択される。
【００１９】
さらなる一局面において、本発明は活性化型ＳＴＡＴのタンパク質インヒビター（ＰＩＡＳ）のインヒビターを包含し、ＰＩＡＳは、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙよりなる群から選択される。
本発明はまた、免疫細胞の免疫能を高めるための組成物も包含し、該組成物は最低１個のエピトープを有する抗原をさらに含んでなる。好ましくは、エピトープは哺乳動物において免疫応答を導き出すことが可能である。別の局面において、エピトープは哺乳動物においてＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を誘導する。なお別の局面において、エピトープは哺乳動物においてＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導する。さらなる一局面において、エピトープは哺乳動物においてＢ細胞応答を誘導する。
【００２０】
別の態様において、抗原は発現ベクターにより発現される。さらなる一局面において、抗原は単離されたポリペプチドである。
【００２１】
なお別の態様において、抗原は疾患と関連する。好ましくは、疾患は、感染性疾患、癌および自己免疫疾患よりなる群から選択される。
【００２２】
一局面において、感染性疾患は、ウイルス、細菌、真菌および原生動物よりなる群から選択される病原性微生物により引き起こされる。
【００２３】
別の態様において、抗原はウイルス遺伝子によりコードされる。好ましくは、ウイルス遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマウイルスおよびヘルペスウイルスよりなる群から選択されるウイルス由来である。
【００２４】
一局面において、抗原は、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子、およびＢ型肝炎ウイルスコア抗原遺伝子よりなる群から選択されるウイルス遺伝子によりコードされる。
【００２５】
別の局面において、抗原は、ヒト免疫不全ウイルスのＥｎｖ  ｇｐ１６０遺伝子、Ｇａｇ遺伝子、Ｐｏｌ遺伝子、Ｒｅｖ遺伝子、Ｔａｔ遺伝子、Ｖｉｆ遺伝子およびＮｅｆ遺伝子よりなる群から選択されるウイルス遺伝子によりコードされる。
【００２６】
さらなる一局面において、抗原は、パピローマウイルスＥ７遺伝子およびパピローマウイルスＥ６よりなる群から選択されるウイルス遺伝子によりコードされる。
【００２７】
なお別の局面において、抗原は、単純疱疹ウイルス１型、単純疱疹ウイルス２型、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７およびヒトヘルペスウイルス８よりなる群から選択されるヘルペスウイルス由来のウイルス遺伝子によりコードされる。
【００２８】
一態様において、抗原は癌と関連し、癌は、乳癌、子宮頚癌、黒色腫、腎癌および前立腺癌よりなる群から選択される。
【００２９】
さらなる一局面において、腫瘍関連抗原は、過剰発現される腫瘍関連抗原、精巣腫瘍抗
原、変異した腫瘍関連抗原、分化腫瘍関連抗原チロシナーゼ、ＭＡＲＴ、ｔｒｐ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ１００、ＨＥＲ−２、ＲａｓおよびＰＳＡよりなる群から選択される。
【００３０】
なお別の局面において、腫瘍関連抗原は、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＣＡＳＰ、ＣＤＫ、Ｒａｓ、ｐ５３、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＭＵＣ、ＴＷ１、ＰＡＰ、スルビビン、テロメラーゼ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ、ＴＲＰ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＬＡＧＥ／ＮＹ−ＥＳＯ、ＲＡＧＥ、ＳＳＸ−２、ＣＤ１９およびＣＤ２０よりなる群から選択される。
【００３１】
別の態様において、抗原は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬およびクローン病よりなる群から選択される疾患と関連する。
【００３２】
本発明はまた、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビター、および免疫応答を導き出すことが可能な最低１個のエピトープを有する抗原を含んでなり、かつ、サイトカイン若しくはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストをさらに含んでなる組成物も包含する。
【００３３】
一局面において、サイトカイン若しくはＴＬＲアゴニストは発現ベクターにより発現される。好ましくは、サイトカイン若しくはＴＬＲアゴニストは単離されたポリペプチドである。
【００３４】
別の局面において、サイトカインは、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３よりなる群から選択される。
【００３５】
本発明はまた、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを含んでなる組成物も包含し、該インヒビターはヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）シグナル伝達の阻害を抑制する。
【００３６】
別の態様において、組成物は、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを含んでなり、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達の阻害を抑制する。
【００３７】
なお別の態様において、組成物は、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを含んでなるは、ＮＦ−κＢシグナル伝達の阻害を抑制する。
【００３８】
本発明は、細胞の免疫能を高めるための組成物を包含し、該組成物は、インヒビターをコードする第一のポリヌクレオチド（該インヒビターは前記細胞中でのサイトカインシグナル伝達の調節物質を阻害し）、および最低１個のエピトープを有する抗原をコードする第二のポリヌクレオチド（最低１個のエピトープが哺乳動物における免疫応答を誘導する）を含んでなるベクターを含んでなる。
【００３９】
本発明はまた、細胞の免疫能を高めるための組成物も包含し、該組成物は、インヒビターをコードする第一のポリヌクレオチド（さらに、該インヒビターは前記細胞中でのサイトカインシグナル伝達の調節物質を阻害し）、およびサイトカインをコードする第二のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる。好ましくは、サイトカインをコードする第二のポリヌクレオチドは、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３よりなる群から選択される。
【００４０】
本発明はまた、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを含んでなる細胞も
包含する。好ましくは、該細胞は、ＡＰＣ、樹状細胞、単球／マクロファージ、Ｔ細胞およびＢ細胞よりなる群から選択される免疫細胞である。
【００４１】
別の局面において、細胞は最低１個のエピトープを有する抗原をさらに含んでなり、最低１個のエピトープは哺乳動物において免疫応答を導き出すことが可能である。
【００４２】
なお別の局面において、細胞は、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターをさらに含んでなる。
【００４３】
本発明はまた、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターと細胞を接触させることを含んでなる、サイレンスした（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）細胞の生成方法も包含する。
【００４４】
別の態様において、本発明は、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターと細胞を接触させること、およびさらに最低１個のエピトープを有する抗原と該細胞を接触させることを含んでなる、サイレンスしかつパルスした細胞の生成方法も包含し、最低１個のエピトープは哺乳動物において免疫応答を導き出すことが可能である。
【００４５】
本発明はまた、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを含んでなる組成物をそれの必要な哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物において免疫応答を導き出す方法も包含する。
【００４６】
本発明の別の態様は、サイレンスした細胞を含んでなる組成物をそれの必要な哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物において免疫応答を導き出す方法を包含し、該サイレンスした細胞はサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを含んでなる。好ましくは、サイレンスした細胞は、それの必要な哺乳動物にサイレンスした細胞を投与する前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原と接触される。別の局面において、サイレンスした細胞はまた、それの必要な哺乳動物へのサイレンスした細胞の投与後にｉｎ  ｖｉｖｏで抗原と接触され得る。
【００４７】
［発明の詳細な記述］
本発明は、免疫細胞中のサイトカインシグナル伝達調節物質を調節することにより免疫細胞の免疫能を高めることに関する。本発明は、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ）、ＳＨ２含有リン酸（ＳＨＰ）若しくは活性化型ＳＴＡＳのタンパク質インヒビター（ＰＩＡＳ）のような、サイトカインシグナル伝達調節物質の調節により免疫細胞における抗原提示を調節するための組成物および方法を提供する。本発明は、免疫細胞の免疫能がサイトカインシグナル伝達調節物質の調節により高められるワクチンおよび治療法を提供する。加えて、本発明は、腫瘍ワクチン接種における自己寛容を破壊するための機構もまた提供する。従って、本発明は、細胞の免疫刺激能力を高めることにより免疫細胞中の負の調節性シグナル伝達経路を妨害するという治療上の利点を提供する。
【００４８】
定義
本明細書で使用されるところの以下の用語のそれぞれは、本節でそれと関連づけられる意味するところを有する。
【００４９】
冠詞「ａ」および「ａｎ」（ある）は、該冠詞の文法上の目的語の１つ若しくは１つ以上（すなわち最低１つ）を指すために本明細書で使用する。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」（ある要素）は１つの要素若しくは１つ以上の要素を意味している。
【００５０】
「約」という用語は、当業者により理解されることができ、そしてそれが使用される文脈で若干の程度変動することができる。
【００５１】
「同種異系の」は、同一種の異なる動物由来の移植片を指す。
【００５２】
「同種異系抗原」は、レシピエントにより発現される抗原と異なる抗原である。
【００５３】
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、抗原上の特定の１エピトープに特異的に結合することが可能である免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然の供給源若しくは組換え供給源由来の無傷の免疫グロブリンであり得、また、無傷の免疫グロブリンの免疫活性部分であり得る。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体（Ｈａｒｌｏｗら、１９８８；Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８；Ｂｉｒｄら、１９８８）を包含する多様な形態で存在しうる。
【００５４】
本明細書で使用されるところの「抗原」若しくは「Ａｇ」という用語は、免疫応答を惹起する分子と定義する。この免疫応答は、抗体産生、若しくは特異的な免疫学的に適格な細胞の活性化のいずれか、または双方を伴いうる。当業者は、事実上全部のタンパク質若しくはペプチドを包含するいかなる巨大分子も抗原としてはたらき得ることを理解するであろう。さらに、抗原は組換え若しくはゲノムＤＮＡ由来であり得る。当業者は、免疫応答を導き出すタンパク質をコードするヌクレオチド配列若しくは部分的ヌクレオチド配列を含んでなるいかなるＤＮＡも、従って、その用語が本明細書で使用されるところの「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原は、ある遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解するであろう。本発明は、限定されるものでないが１種以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を挙げることができること、および、これらのヌクレオチド配列は所望の免疫応答を導き出すために多様な組合せで配置されることが容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原は「遺伝子」によりコードされることが全く必要でないことを理解するであろう。抗原は合成されて生成され得るか、若しくは生物学的サンプル由来であり得ることが容易に明らかである。こうした生物学的サンプルは、限定されるものでないが、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞若しくは生物学的液体を挙げることができる。
【００５５】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）はＴ細胞を活性化することが可能である細胞であり、そして、限定されるものでないが単球／マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）を挙げることができる。
【００５６】
「樹状細胞」若しくは「ＤＣ」という用語は、リンパ系若しくは非リンパ系組織中で見出される形態上類似の細胞型の多様な集団のいかなるメンバーも指す。これらの細胞は、それらの際だった形態、高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ発現を特徴とする。ＤＣは多数の組織供給源から単離し得る。ＤＣは、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞を感作するための高い能力を有し、そしてｉｎ  ｓｉｔｕでＴ細胞への抗原の提示で非常に有効である。抗原はＴ細胞の発達および免疫寛容の間に発現される自己抗原、ならびに正常な免疫過程の間に存在する外来抗原でありうる。
【００５７】
本明細書で使用されるところの「活性化ＤＣ」は、抗原でパルスされかつ免疫細胞を活性化することが可能となったＤＣである。
【００５８】
本明細書で使用されるところの「成熟ＤＣ」という用語は、高レベルのＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）分子を発現する樹状細胞と定義する。対照的に、未熟樹状細胞は低レベルのＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）分子を発現するが、しかし抗原を取り込む大きな能力を有する。
【００５９】
「抗原負荷ＡＰＣ」若しくは「抗原パルスＡＰＣ」は、抗原に曝露されかつ該抗原により活性化されたＡＰＣを包含する。例えば、ＡＰＣは例えば抗原の存在下での培養の間にｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡｇ負荷されたようになりうる。ＡＰＣはまた、抗原への曝露によりｉｎ  ｖｉｖｏでも負荷されうる。
【００６０】
「抗原負荷ＡＰＣ」は、伝統的に２つの方法、すなわち（１）抗原ペプチドとして知られる小型ペプチドフラグメントをＡＰＣの外側に直接「パルスする」か；若しくは（２）ＡＰＣを全タンパク質若しくはタンパク質粒子とともにインキュベートし、それらはその後該ＡＰＣにより取り込まれる、の１つで調製する。これらのタンパク質はＡＰＣにより小型ペプチドフラグメントに消化され、そして最終的にはＡＰＣ表面上に輸送かつ提示される。加えて、抗原負荷ＡＰＣは、抗原をコードするポリヌクレオチドを該細胞に導入することによってもまた生成させ得る。
【００６１】
本明細書で使用されるところの「サイレンスしたＡＰＣ」若しくは「サイレンスしたＤＣ」という用語は、本発明のサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターに曝露されたそれぞれＡＰＣ若しくはＤＣを指す。インヒビターは好ましくはｓｉＲＮＡの形態にある。インヒビターは、限定されるものでないがＳＯＣＳ、ＳＨＰ、ＰＩＡＳなどを挙げることができるサイトカインシグナル伝達調節物質を阻害することが可能である。サイレンスしたＡＰＣは、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターで処理されていないそれ以外は同一のＡＰＣと比較した場合に、高められた免疫能を有する。
【００６２】
「アンチセンス」は、とりわけ、ポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列、若しくは非コーディング鎖に実質的に相同である配列を指す。本明細書で定義されるところのアンチセンス配列は、ポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分にのみ相補的であることは必要ではない。アンチセンス配列は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上で指定される制御配列に相補的であることができ、その制御配列はコーディング配列の発現を制御する。
【００６３】
本明細書で使用されるところの「自己免疫疾患」という用語は、自己免疫応答から生じる障害と定義する。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過度の応答の結果である。自己免疫疾患の例は、限定されるものでないが、とりわけ、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害性表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギラン・バレ症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎を挙げることができる。
【００６４】
本明細書で使用されるところの「自己の」という用語は、それが後に個体に再導入されるはずである同一個体由来のいかなる物質も指すことを意味している。
【００６５】
本明細書で使用されるところの「癌」という用語は、異常な細胞の急速かつ制御されない増殖を特徴とする疾患と定義する。癌細胞は局所で、若しくは血流およびリンパ系により身体の他の部分に広がり得る。多様な癌の例は、限定されるものでないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などを挙げることができる。
【００６６】
「サイトカインシグナル伝達調節物質」若しくは「サイトカインのシグナル伝達（ｓｉ
ｇｎａｌｉｎｇ）の調節物質」若しくは「サイトカインのシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）の調節物質」は、細胞中でのサイトカインのシグナル伝達の伝達経路を負に調節することが可能であるタンパク質を指す。限定されるものでないがサイトカインシグナル伝達の調節物質は、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ１〜ＳＯＣＳ７、サイトカインで誘導可能なＳＨ２ドメイン含有タンパク質（ＣＩＳ））、ＳＨ２含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）および活性化型ＳＴＡＴのタンパク質インヒビター（ＰＩＡＳ）を挙げることができる。
【００６７】
本明細書で使用されるところの「ＤＮＡ」という用語はデオキシリボ核酸と定義する。
【００６８】
「ドナー抗原」は、レシピエントに移植されるべきドナー組織により発現される抗原を指す。
【００６９】
「レシピエント抗原」は、ドナー抗原に対する免疫応答の標的を指す。
【００７０】
本明細書で使用されるところの「エフェクター細胞」は、抗原に対する免疫応答を媒介する細胞を指す。エフェクター細胞の一例は、限定されるものでないがＴ細胞およびＢ細胞を挙げることができる。
【００７１】
「コードすること」は、ヌクレオチド（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の定義された配列若しくはアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する、生物学的過程での他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型としてはたらく、遺伝子、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、ならびにそれら由来の生物学的特性を指す。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞若しくは他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合に、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列に同一でありかつ通常配列表に提供されるコーディング鎖、および遺伝子若しくはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コーディング鎖双方を、その遺伝子若しくはｃＤＮＡのタンパク質若しくは他の産物をコードすると称し得る。
【００７２】
本明細書で使用されるところの「内因性の」は、生物体、細胞、組織若しくは系からの、若しくはそれらの内側で産生されるいかなる物質も指す。
【００７３】
本明細書で使用されるところの「外因性の」という用語は、生物体、細胞、組織若しくは系から導入されるか若しくはそれらの外側で産生されるいかなる物質も指す。
【００７４】
本明細書で使用されるところの「エピトープ」という用語は、Ｂおよび／若しくはＴ細胞応答を誘導する免疫応答を導き出し得る抗原上の小型の化学分子と定義する。抗原は１個若しくはそれ以上のエピトープを有し得る。大部分の抗原は多くのエピトープを有する。すなわちそれらは多価である。一般に、エピトープは大きさが大まかに５アミノ酸および／若しくは糖である。当業者は、一般に、分子の特定の直線的配列よりもむしろ全体的な三次元構造が抗原特異性の主たる基準であり、そして従って１エピトープを別のものと識別することを理解している。
【００７５】
本明細書で使用されるところの「発現」という用語は、そのプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／若しくは翻訳と定義する。
【００７６】
本明細書で使用されるところの「発現ベクター」という用語は、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。いくつかの場合、ＲＮＡ分子は、その後タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドに翻訳さ
れる。他の場合は、これらの配列は翻訳されない（例えばアンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどの製造において）。発現ベクターは、多様な制御配列（特定の宿主生物体での効果的に連結されたコーディング配列の転写およびおそらく翻訳に必要な核酸配列を指す）を含有し得る。転写および翻訳を支配する制御配列に加え、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を同様に供する核酸配列を含有しうる。
【００７７】
本明細書で使用されるところの「ヘルパーＴ細胞」という用語は、その第一の機能が他のＢおよびＴリンパ球ならびに若しくはマクロファージの活性化および機能を促進することであるエフェクターＴ細胞と定義する。大部分のヘルパーＴ細胞はＣＤ４  Ｔ細胞である。
【００７８】
本明細書で使用されるところの「異種の」という用語は、異なる種由来であるＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列またはタンパク質と定義する。
【００７９】
本明細書で使用されるところの「相同な」は、２種のポリマー分子間、例えば２種の核酸分子、例えば２種のＤＮＡ分子若しくは２種のＲＮＡ分子間、または２種のポリペプチド分子間のサブユニット配列の類似性を指す。２種の分子の双方中の１サブユニット位置が同一の単量体サブユニットにより占有される場合、例えば、２種のＤＮＡ分子のそれぞれ中のある位置がアデニンにより占有される場合には、それらはその位置で相同である。２配列間の相同性は、一致するか若しくは相同な位置の数の直接の関数であり、例えば、２種の化合物の配列中の位置の半分（例えば長さ１０サブユニットのポリマー中の５位置）が相同である場合には、該２配列は５０％相同であり、位置の９０％すなわち１０のうち９が一致しているか若しくは相同である場合は、該２配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。
【００８０】
本明細書で使用されるところの「相同性」は「同一性」と同義に使用される。
【００８１】
本明細書で使用されるところの「免疫原」は、哺乳動物において体液性抗体および／若しくは細胞媒介性の免疫応答を刺激若しくは誘導することが可能である物質を指す。
【００８２】
本明細書で使用されるところの「免疫グロブリン」若しくは「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能するタンパク質の一分類と定義する。タンパク質のこの分類に包含される５種のメンバーはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥである。ＩｇＡは、唾液、涙液、母乳、胃腸分泌物、ならびに呼吸および尿生殖器系の粘液分泌物のような身体の分泌物中に存在する主要な抗体である。ＩｇＧは最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは大部分の哺乳動物において一次免疫応答で産生される主免疫グロブリンである。それは凝集、補体固定および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、そして細菌およびウイルスに対する防御で重要である。ＩｇＤは、既知の抗体機能を有しないが、しかし抗原受容体としてはたらきうる免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンへの曝露に際して肥満細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことにより即時型過敏反応を媒介する免疫グロブリンである。
【００８３】
「単離された核酸」は、天然に存在する状態でそれに隣接している配列から分離されている核酸セグメント若しくはフラグメント、すなわち、該フラグメントに通常隣接する配列、すなわちそれが天然に存在するゲノム中で該フラグメントに隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを指す。該用語はまた、細胞中でそれに天然に付随する核酸すなわちＲＮＡ若しくはＤＮＡ、またはタンパク質に天然に付随する他の成分から実質的に精製された核酸にも当てはまる。該用語は、従って、例えば、ベクター、自律複製プラスミド若しくはウイルス、または原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれて
いるか、あるいは他の配列に依存しない別個の分子として（すなわちＰＣＲ若しくは制限酵素消化により製造されたｃＤＮＡまたはゲノム若しくはｃＤＮＡフラグメントとして）存在する、組換えＤＮＡを包含する。それはまた、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも包含する。
【００８４】
本発明の情況において、普遍的に存在する核酸塩基の以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、そして「Ｕ」はウリジンを指す。
【００８５】
本明細書で使用されるところの「主要組織適合遺伝子複合体」若しくは「ＭＨＣ」という用語は、組織適合性のもっとも重要な決定子の１つである、その多くが抗原提示に関与する進化的に関係する細胞表面タンパク質をコードする遺伝子の特定の一集団と定義する。クラスＩ  ＭＨＣ若しくはＭＨＣ−Ｉは主としてＣＤ８  Ｔリンパ球への抗原提示で機能する。クラスＩＩ  ＭＨＣ若しくはＭＨＣ−ＩＩは主としてＣＤ４  Ｔリンパ球への抗原提示で機能する。
【００８６】
本明細書で使用されるところの「調節する」という用語は、生物学的状態のいかなる変化、すなわち増大、減少なども指すことを意味している。例えば、「調節する」という用語は、限定されるものでないがＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡの転写、ＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡの安定性、ＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡの翻訳、ＳＯＣＳ１ポリペプチドの安定性、ＳＯＣＳ１の翻訳後修飾、若しくはそれらのいずれかの組合せを挙げることができる、ＳＯＣＳ１の発現若しくは活性を正に若しくは負に調節する能力を指す。さらに、調節するという用語は、限定されるものでないが樹状細胞の免疫能と関連するＳＯＣＳ１の活性を挙げることができる、活性の増大、減少、遮蔽、変化、無効化若しくは回復を指すのに使用し得る。「調節する」という用語はまた、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７、ＣＩＳ、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）、若しくは関係するいかなる他の活性にも当てはまりうる。
【００８７】
別の方法で指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンでありかつ同一アミノ酸配列をコードする全部のヌクレオチド配列を包含する。タンパク質若しくはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という句は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいずれかのバージョンでイントロン（１個若しくは複数）を含有しうる程度までイントロンもまた包含しうる。
【００８８】
本明細書で使用されるところの「ポリヌクレオチド」という用語はヌクレオチドの鎖と定義する。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。従って、本明細書で使用されるところの核酸およびポリヌクレオチドは互換性である。当業者は、核酸が単量体の「ヌクレオチド」にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであるという一般的知識を有する。該単量体のヌクレオチドはヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドは、限定されるものでないが、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびＰＣＲＴＭなどを使用する組換えライブラリー若しくは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段を挙げることができる、当該技術分野で利用可能ないずれかの手段により得られる全部の核酸配列を、限定されるものでないが挙げることができる。
【００８９】
本明細書で使用されるところの「ポリペプチド」という用語は、定義された配列を通常有するアミノ酸残基の鎖と定義する。本明細書で使用されるところのポリペプチドという用語は、「ペプチド」および「タンパク質」という用語を相互に包括する。
【００９０】
「増殖」は、類似の形態の実体の再生若しくは増加、例えば細胞の増殖を指すのに本明細書で使用する。すなわち、増殖はより多数の細胞の産生を包含し、そして、とりわけ、細胞の数を単純に計数すること、細胞中への３Ｈ−チミジンの取り込みを測定することなどにより測定し得る。
【００９１】
本明細書で使用されるところの「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成機構若しくは導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列と定義する。
【００９２】
本明細書で使用されるところの「プロモーター／制御配列」という用語は、プロモーター／制御配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味している。いくつかの例において、この配列はコアプロモーター配列であることができ、また、他の例において、この配列は、エンハンサー配列、および遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節エレメントもまた包含しうる。プロモーター／制御配列は、例えば組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものでありうる。
【００９３】
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコード若しくは指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結される場合に、細胞のほとんどの若しくは全部の生理学的条件下で該細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００９４】
「誘導可能な」プロモーターは、遺伝子産物をコード若しくは指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結される場合に、実質的に、プロモーターに対応する誘導物質が細胞中に存在する場合にのみ、該細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００９５】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコード若しくは指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結される場合に、実質的に、細胞が該プロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、該細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００９６】
本明細書で使用されるところの「ＲＮＡ」という用語はリボ核酸と定義する。
【００９７】
本明細書で使用されるところの「組換えＤＮＡ」という用語は、異なる供給源からのＤＮＡの片を結合することにより製造されるＤＮＡと定義する。
【００９８】
本明細書で使用されるところの「組み換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡの方法を使用することにより製造されるポリペプチドと定義する。
【００９９】
本明細書で使用されるところの「自己抗原」という用語は、宿主の細胞若しくは組織により発現される抗原と定義する。自己抗原は腫瘍抗原でありうるが、しかし、ある態様においては、正常および腫瘍双方の細胞中で発現される。当業者は、自己抗原が細胞中で過剰発現されうることを容易に理解するであろう。
【０１００】
本明細書で使用されるところの「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。実質的に精製された細胞はまた、その天然に存在する状態でそれに通常伴う他の細胞型から分離された細胞も指す。いくつかの場合には、実質的に精製された細胞の集団は細胞の均質な集団を指す。他の例において、本用語は、単に、それらの天然の状態でそれらが通常伴う細胞から分離された細胞を指す。いくつかの態様において、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される。他の態様において、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されない。
【０１０１】
本明細書で使用されるところの「Ｔ細胞」という用語は、多様な細胞媒介性の免疫反応
に参画する胸腺由来細胞と定義する。
【０１０２】
本明細書で使用されるところの「Ｂ細胞」という用語は骨髄および／若しくは脾由来の細胞と定義する。Ｂ細胞は、抗体を産生するプラズマ細胞に発達し得る。
【０１０３】
本明細書で使用されるところの「治療上有効な量」は、組成物を投与する哺乳動物に有益な効果を提供するのに十分な治療的組成物の量である。
【０１０４】
本明細書で使用されるところの「トランスフェクトされた」若しくは「形質転換された」若しくは「形質導入された」という用語は、外因性の核酸を宿主細胞中に移入若しくは導入する過程を指す。「トランスフェクトされた」若しくは「形質転換された」若しくは「形質導入された」細胞は、外因性の核酸でトランスフェクト、形質転換若しくは形質導入されたものである。該細胞は初代被験体細胞およびその子孫を包含する。
【０１０５】
本明細書で使用されるところの「転写制御下」若しくは「効果的に連結される」という句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するためにポリヌクレオチドに関して正しい場所および方向にあることを意味している。
【０１０６】
本明細書で使用されるところの「ワクチン」という用語は、哺乳動物への物質の投与後に免疫応答を惹起するのに使用される物質と定義する。
【０１０７】
「ベクター」は、単離された核酸を含んでなりかつ該単離された核酸を細胞の内部に送達するのに使用し得る組成物である。限定されるものでないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性若しくは両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを挙げることができる多数のベクターが当該技術分野で既知である。従って、「ベクター」という用語は、自律複製するプラスミド若しくはウイルスを包含する。該用語は、例えばポリリシン化合物、リポソームなどのような、細胞中への核酸の移入を容易にするプラスミド以外およびウイルス以外の化合物を包含するともまた解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、限定されるものでないがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを挙げることができる。
【０１０８】
本明細書で使用されるところの「ウイルス」という用語は、全細胞内で複製することが可能である、外側の脂質エンベロープを伴う若しくは伴わないタンパク質コート中に封入された核酸（ＲＮＡ若しくはＤＮＡ）よりなる粒子と定義する。
【０１０９】
「異種の」は、異なる種の動物由来の移植片を指す。
【０１１０】
記述
哺乳動物におけるサイトカインシグナル伝達に基づく制御されないシグナル伝達は破滅的な生物学的結果を有し得る。従ってシグナル伝達経路は多様なレベルでしっかりと制御されている。限定されるものでないがサイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ）、ＳＨ２含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）および活性化型ＳＴＡＴのタンパク質インヒビター（ＰＩＡＳ）を挙げることができる多様な型のサイトカインシグナル伝達の調節物質が存在する。
【０１１１】
サイトカインシグナル伝達の誘導可能なインヒビターはサイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ）タンパク質であり、それらの８種のファミリーメンバー、すなわちＳＯＣＳ１〜ＳＯＣＳ７およびサイトカインで誘導可能なＳＨ２ドメイン含有タンパク質（ＣＩＳ）が存在する。ＳＯＣＳタンパク質はサイトカイン受容体若しくは会合したＪ
ＡＫを認識し、そしてシグナル伝達の直接の妨害およびユビキチン媒介性のプロテオソーム分解への受容体複合体のターゲッティングの双方により、シグナル伝達を減弱する。
【０１１２】
限定されるものでないが（ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）を挙げることができるＳＨＰタンパク質は構成的に発現され、そして、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）およびその受容体のようなシグナル伝達中間体を脱リン酸化することによりサイトカインシグナル伝達を減弱し得る。限定されるものでないがＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙを挙げることができる、活性化型ＳＴＡＴのタンパク質インヒビター（ＰＩＡＳ）ファミリーのメンバーもまた構成的に発現され、そしてＳＴＡＴ活性を抑制することによりシグナル伝達を減弱する。ユビキチン様タンパク質による修飾の過程はＳＴＡＴ活性のＰＩＡＳ媒介性の抑制に関わる。
【０１１３】
本発明は、サイトカインシグナル調節物質のこれらの型のいずれか１種若しくはそれ以上の阻害が治療的利益を提供するという発見に関する。従って、本発明は、免疫細胞中でのサイトカインシグナル伝達調節物質を調節してそれにより免疫細胞の免疫能を高めるための組成物および方法を含んでなる。該組成物は以下、すなわちサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビター、抗原、サイレンスした免疫細胞、パルスした細胞、抗原でパルスしたサイレンスした免疫細胞、サイトカインなどの最低１種若しくはそれ以上のいかなる組合せも包含する。該組成物はｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化および／若しくはｅｘ  ｖｉｖｏ治療のためのワクチンでありうる。
【０１１４】
本発明は、ＡＰＣ中の決定的な制御点を不能にすることによりワクチンの効力を高めるための包括的手段としてサイレンスしたＡＰＣを提供する。本発明のサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビター若しくはサイレンスしたＡＰＣでのワクチン接種は抗原特異的免疫を高める。サイトカインシグナル伝達調節物質のサイレンシングは、抗原を提示する免疫原性のＡＰＣがｉｎ  ｖｉｖｏで抗原特異的Ｔ細胞を持続的に刺激することを可能にするからである。本発明の一態様において、サイレンスしたＡＰＣは、ＡＰＣ成熟および制御性Ｔ細胞抑制を阻害する炎症前サイトカインの産生を高めることにより、制御性Ｔ細胞のスイッチを切ることが可能である。
【０１１５】
サイレンスしたＡＰＣを生成することに加え、本発明はまた、サイレンスした細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）も包含する。本開示は、本発明の方法を使用してサイレンスしたＣＴＬが高められた細胞溶解活性を表すことを示す。高められた細胞溶解活性を有するＣＴＬは細胞療法および／若しくはワクチン接種において治療的利益を提供する。
調節物質のインヒビター
本明細書の開示に基づき、本発明は、サイトカインシグナル伝達調節物質を阻害するための包括的概念を包含し、その際に該調節物質は免疫応答に関するシグナル伝達経路を調節することを伴う。
【０１１６】
一態様において、本発明は免疫細胞の免疫能を高めるための組成物を含んでなる。該組成物は、以下の調節物質、すなわちＳＯＣＳ、ＳＨＰ若しくはＰＩＡＳのいずれか１種若しくはそれ以上のインヒビターを含んでなる。本発明の別の局面において、該組成物は細胞中の負の調節経路を妨害する。
【０１１７】
サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを含んでなる組成物は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチドおよび小分子よりなる群から選択される。
【０１１８】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、細胞中のサイトカインシグナル伝達調
節物質のｍＲＮＡおよび／若しくはタンパク質レベルを低下させるための一方法が、調節物質をコードする核酸の発現を低下若しくは阻害することによることを認識するであろう。従って、細胞中のサイトカインシグナル伝達調節物質のタンパク質レベルは、例えばアンチセンス分子若しくはリボザイムのような、遺伝子発現を阻害する若しくは低下させる分子若しくは化合物を使用してもまた低下させ得る。
【０１１９】
好ましい一態様において、調節配列はプラスミドベクターにより発現されるアンチセンス核酸配列である。アンチセンス発現ベクターを使用して哺乳動物細胞若しくは哺乳動物それ自身をトランスフェクトし、それにより細胞中のサイトカインシグナル伝達調節物質の所望のインヒビターの低下された内因性発現を引き起こす。しかしながら、本発明は、アンチセンス分子での細胞のトランスフェクションによりサイトカインシグナル伝達調節物質の発現を阻害することに制限されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、限定されるものでないが、リボザイムの使用、非機能的サイトカインシグナル伝達調節物質（すなわちトランスドミナントネガティブ変異体）の発現、および細胞内抗体の使用を挙げることができる、細胞中でのタンパク質の発現若しくは活性を阻害するための当該技術分野で既知の他の方法を包含する。
【０１２０】
アンチセンス分子および遺伝子発現を阻害するためのそれらの使用は当該技術分野で公知である（例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ中、Ｃｏｈｅｎ、１９８９を参照されたい）。アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に対し、その用語が本明細書の別の場所で定義されるところの相補的であるＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２６２：４０）。細胞中で、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、それにより遺伝子の翻訳を阻害する。
【０１２１】
遺伝子の翻訳のアンチセンス阻害方法の使用は当該技術分野で既知であり、そして例えばＭａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ（１９８８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：２８９）に記述されている。こうしたアンチセンス分子は、Ｉｎｏｕｅ、１９９３、米国特許第５，１９０，９３１号明細書により教示されるところのアンチセンス分子をコードするＤＮＡを使用する遺伝子発現を介して細胞に提供しうる。
【０１２２】
あるいは、本発明のアンチセンス分子を合成で作成しかつその後細胞に提供しうる。約１０ないし約３０の間、およびより好ましくは約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。それらは容易に合成されかつ標的細胞に導入されるためである。本発明により企図される合成アンチセンス分子は、未改変オリゴヌクレオチドに比較して改良された生物学的活性を有する、当該技術分野で既知のオリゴヌクレオチド誘導体を包含する（米国特許第５，０２３，２４３号明細書を参照されたい）。
【０１２３】
遺伝子発現を阻害するためのリボザイムおよびそれらの使用もまた当該技術分野で公知である（例えば、Ｃｅｃｈら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７４７９−１７４８２；Ｈａｍｐｅｌら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：４９２９−４９３３；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際特許公開第ＷＯ  ９２／０７０６５号明細書；Ａｌｔｍａｎら、米国特許第５，１６８，０５３号明細書を参照されたい）。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似の様式で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の改変により、分子はＲＮＡ分子中の特定のヌクレオチド配列を認識しかつそれを切断するように工作し得る（Ｃｅｃｈ、１９８８、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．２６０：３０３０）。このアプローチの大きな一利点は、リボザイムが配列特異的であるという事実である。
【０１２４】
リボザイムの２種の基本的な型、すなわちテトラヒメナ型（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５）およびハンマーヘッド型が存在する。テトラヒメナ型リボザイムは長さ４塩基である配列を認識する一方、ハンマーヘッド型リボザイムは長さ１１〜１８塩基の塩基配列を認識する。配列が長くなるほど、配列が標的ｍＲＮＡ種中に独占的に存在するであろう見込みが大きくなる。結果、ハンマーヘッド型リボザイムは、特定のｍＲＮＡ種を不活性化するためにテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、また、１８塩基の認識配列は、多様な無関係のｍＲＮＡ分子内に無作為に存在しうるより短い認識配列より好ましい。
【０１２５】
サイトカインシグナル伝達調節物質の発現を阻害するために有用なリボザイムは、限定されるものでないがＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１〜７、ＣＩＳ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）ならびにＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙ）を挙げることができる本発明の所望のサイトカインシグナル伝達調節物質のｍＲＮＡ配列に相補的である基本的リボザイム構造に標的配列を組み込むことにより設計しうる。所望のサイトカイン調節物質を標的とするリボザイムは、商業的に入手可能な試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して合成しうるか、若しくはそれらはそれらをコードするＤＮＡから遺伝子的に発現させうる。
【０１２６】
本発明の別の局面において、サイトカインシグナル伝達調節物質は、該サイトカインシグナル伝達調節物質を不活性化かつ／若しくは隔絶する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）方法により阻害し得る。であるから、サイトカインシグナル伝達調節物質の効果を阻害することは、トランスドミナントネガティブ変異体を使用することにより達成し得る。あるいは、そうでなければサイトカインシグナル伝達調節物質に対するアンタゴニストとして既知の、所望のサイトカイン調節物質に特異的な細胞内抗体を使用しうる。一態様において、アンタゴニストは、サイトカインシグナル伝達調節物質の結合パートナーを妨害しかつそれにより対応する野性型のサイトカインシグナル伝達調節物質と競合するという所望の特性を有するタンパク質および／若しくは化合物である。別の態様において、アンタゴニストは、サイトカインシグナル伝達調節物質を妨害しかつそれにより該サイトカインシグナル伝達調節物質を隔絶するという所望の特性を有するタンパク質および／若しくは化合物である。
【０１２７】
小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、目的の遺伝子若しくはポリヌクレオチドを標的とする一組のヌクレオチドを含んでなるＲＮＡ分子である。本明細書で使用されるところの「ｓｉＲＮＡ」という用語は、限定されるものでないが、（ｉ）二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、（ｉｉ）一本鎖ポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）こうしたポリヌクレオチドが１、２、３、４若しくはそれ以上のヌクレオチドの変化若しくは置換をその中に有する（ｉ）若しくは（ｉｉ）いずれかのポリヌクレオチドを挙げることができる、全部の形態のｓｉＲＮＡを包含する。
【０１２８】
二本鎖ポリヌクレオチドの形態のｓｉＲＮＡは、長さが約１８塩基対、約１９塩基対、約２０塩基対、約２１塩基対、約２２塩基対、約２３塩基対、約２４塩基対、約２５塩基対、約２６塩基対、約２７塩基対、約２８塩基対、約２９塩基対若しくは約３０塩基対を含んでなる。該二本鎖ｓｉＲＮＡはサイトカインシグナル伝達調節物質の発現および／若しくは活性を妨害することができる。。
【０１２９】
一本鎖ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子若しくはポリヌクレオチドを標的とするＲＮＡポリヌクレオチド配列の一部分を含んでなる。一本鎖ｓｉＲＮＡは、長さが約１８ヌクレオチ
ド、約１９ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２１ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２３ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約２７ヌクレオチド、約２８ヌクレオチド、約２９ヌクレオチド若しくは約３０ヌクレオチドのポリヌクレオチドを含んでなる。一本鎖ｓｉＲＮＡは、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１〜ＳＯＣＳ７、ＣＩＳ）、ＳＨＰ、ＰＩＡＳのような標的ポリヌクレオチド若しくはそれらのバリアントの発現および／若しくは活性を妨害することが可能である。一本鎖ｓｉＲＮＡはまた、相補配列にアニーリングして、サイトカインシグナル伝達調節物質の発現および／若しくは活性を妨害することが可能であるｄｓＲＮＡをもたらすことも可能である。
【０１３０】
なお別の局面において、ｓｉＲＮＡは二本鎖若しくは一本鎖いずれかのポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドを含んでなり、該ｓｉＲＮＡは１、２、３、４若しくはそれ以上のヌクレオチドの変化若しくは置換をその中に有する。
【０１３１】
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、転写後の遺伝子サイレンシング機構を介して起こると一般に考えられるＲＮＡ活性を妨害するＲＮＡ核酸分子である。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、好ましくは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含んでなるが、しかしそのように制限されることを意図しておらず、そして一本鎖ＲＮＡを含みうる（例えばＭａｒｔｉｎｅｚら、２００２  Ｃｅｌｌ  １１０：５６３−７４を参照されたい）。本発明に包含されるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、ヌクレオチド（リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドまたは双方の組合せ）および／あるいは本明細書に提供されるところのヌクレオチドアナログ（例えば典型的に５’から３’のホスホジエステル結合にあるオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドなど）の他の天然に存在する、組換えの、若しくは合成の一本鎖若しくは二本鎖ポリマーを含みうる。従って、相補ヌクレオチドの塩基対形成の十分に確立された原理を考えれば、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの転写を指図することが可能なＤＮＡ配列として本明細書に開示されるある種の例示的配列が、対応するＲＮＡ配列およびそれらの相補物を記述することもまた意図していることが認識されるであろう。
【０１３２】
ｓｉＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼプロモーターのプロモーターを含有するＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ若しくは合成）を鋳型として使用して転写されうる。例えば、プロモーターはＵ６プロモーター若しくはＨ１  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであり得る。あるいは、ｓｉＲＮＡは合成で派生されるＲＮＡ分子でありうる。ある態様において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは平滑端を有しうる。ある他の態様において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの少なくとも一方の鎖は、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのいずれかの鎖の３’端に「突出する」（すなわち相対する鎖の相補塩基と塩基対形成しない）最低１、および好ましくは２ヌクレオチドを有する。本発明の好ましい一態様において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド二重鎖の各鎖は３’端に２ヌクレオチドの突出を有する。該２ヌクレオチドの突出は、好ましくはチミジンジヌクレオチド（ＴＴ）であるが、しかし、他の塩基、例えばＴＣジヌクレオチド若しくはＴＧジヌクレオチド、またはいずれかの他のジヌクレオチドもまた含みうる。突出ジヌクレオチドは、干渉を標的とするポリヌクレオチドの配列の５’端の２ヌクレオチドに相補的であってもまたよい。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの３’端の論考については、例えば第ＷＯ  ０１／７５１６４号明細書を参照されたい。
【０１３３】
好ましいｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、約１８〜３０ヌクレオチド塩基対、好ましくは約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６若しくは約２７塩基対、および他の好ましい態様においては約１９、約２０、約２１、約２２若しくは約２３塩基対、または約２７塩基対の二本鎖ポリヌクレオチドを含んでなり、ここで「約」の使用は、ある態様においておよびある条件下で、選択されたポリペプチドの発現を妨害することが可能である機能的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを生じさせうるプロセッ
シング的（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）切断段階が絶対的に効率的ではないかもしれないことを示す。これゆえに、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、該ｓｉＲＮＡのプロセシング、生合成若しくは人工的合成での変動性の結果として、１、２、３、４若しくはそれ以上の塩基対だけ長さが（例えばヌクレオチド挿入若しくは欠失により）異なりうる１種若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド分子を包含しうる。本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、特定の配列と１、２、３若しくは４ヌクレオチドで（例えば転移若しくは塩基移行を包含するヌクレオチド置換により）異なることにより変動性を表すポリヌクレオチド配列もまた含みうる。これらの差違は、分子の長さ、二本鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖に存するか若しくはアンチセンス鎖に存するかに依存して、特定のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列のヌクレオチド位置のいずれでも起こりえる。ヌクレオチドの差違は二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖で見出されることがあり、ここで置換ヌクレオチドが典型的に水素結合の塩基対形成を生じるとみられる相補ヌクレオチドは必ずしも対応して置換されなくてもよい。好ましい態様において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは特定のヌクレオチド配列に関して均一である。
【０１３４】
本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドは、ある態様においては、典型的にはスペーサー配列により分離される（例えば約１８〜３０ヌクレオチドの）一本鎖オリゴヌクレオチドフラグメントおよびその逆相補物を含んでなる一本鎖ポリヌクレオチド由来でありうる。あるこうした態様により、スペーサーの切断が該一本鎖オリゴヌクレオチドフラグメントおよびその逆相補物を提供し、その結果、それらはアニーリングして、場合によってはいずれか若しくは双方の鎖の３’端および／若しくは５’端からの１、２、３若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加若しくは除去をもたらしうる付加的なプロセシング段階で本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを形成しうる。ある態様において、スペーサーは、スペーサーの切断、および場合によってはいずれか若しくは双方の鎖の３’端および／若しくは５’端からの１、２、３、４若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加若しくは除去をもたらしうるその後のプロセシング段階の前に、該フラグメントおよびその逆相補物がアニーリングしかつ（例えばヘアピンポリヌクレオチドのような）二本鎖構造を形成することを可能にする長さのものである。スペーサー配列は、従って、二本鎖核酸にアニーリングされる場合にｓｉＲＮＡポリヌクレオチドをもたらす、２個の相補ポリヌクレオチド配列の領域間に存する、本明細書で提供されるところのいかなるポリヌクレオチド配列でもありうる。好ましくは、スペーサー配列は最低４ヌクレオチドを含んでなる。ある態様において、スペーサーは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜７０、７１〜９０、９１〜１１０、１１１〜１５０、１５１〜２００若しくはそれ以上のヌクレオチドを含みうる。スペーサーにより分離される２個の相補ヌクレオチド配列を含んでなる単一ヌクレオチド鎖由来のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの例が記述されている（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、２００２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０；Ｐａｄｄｉｓｏｎら、２００２  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１６：９４８：Ｐａｕｌら、２００２  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８；Ｇｒａｂａｒｅｋら、２００３  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３４：７３４−４４）。
【０１３５】
ポリヌクレオチドバリアントは、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの活性が実質的に消失されないような１個若しくはそれ以上の置換、付加、欠失および／若しくは挿入を含有しうる。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの活性に対するヌクレオチド内容のいずれかのこうした変化の影響は、一般に、本明細書の別の場所に記述されるとおり評価しうる。バリアントは、好ましくは、天然のＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１〜ＳＯＣＳ７、ＣＩＳ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）若しくはＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘおよびＰＩＡＳｙ）をコードするポリヌクレオチド配列の一部分に最低約７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％若しくは８９％の同一性、およびより好ましくは最低約９０％、９２％、９５％、９６％若しくは９７％の同一性を表す。同一性パーセントは、当業者に公知のコンピュータアルゴリズムを使用することを包含するいずれかの方法を使用して、該ポリヌクレオチドの配列を標的ポリヌクレオチドの対応する部分と比較することにより容易に決定しうる。これらはＡｌｉｇｎ若しくはＢＬＡＳＴアルゴリズムを包含する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９）。
【０１３６】
ある種のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドバリアントは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部分に実質的に相同であり得る。これらのポリヌクレオチドバリアント由来の一本鎖ポリヌクレオチドは、適度にストリンジェント条件下で、標的ポリペプチドをコードする天然に存在するＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列にハイブリダイズすることが可能である。標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に適度にストリンジェント条件下で検出可能にハイブリダイズするｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、特定の標的ポリヌクレオチドに相補的である最低１０の連続するヌクレオチド、より好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０の連続するヌクレオチドを包含するヌクレオチド配列を有しうる。ある好ましい態様において、こうしたｓｉＲＮＡ配列（若しくはその相補物）は、発現の妨害が望ましい標的ポリペプチドをコードする単一の特定のポリヌクレオチドに独特であることができる。ある他の態様において、該配列（若しくはその相補物）は、ポリペプチド発現の妨害が望ましい標的ポリペプチドをコードする２種若しくはそれ以上の関連するポリヌクレオチドにより共有されうる。
【０１３７】
適する適度なストリンジェント条件は、例えば、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中でポリヌクレオチドを前洗浄すること；５０℃〜７０℃、５×ＳＳＣで１〜１６時間（例えば一夜）ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせること；次いで、０．０５〜０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣの１種若しくはそれ以上のそれぞれで２２〜６５℃で２４〜４０分間、ポリヌクレオチドを１若しくは２回洗浄することを包含する。付加的なストリンジェント条件には、ハイブリダイゼーション条件は、５０〜６０℃で０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中１５〜４０分間の１回の付加的な洗浄を包含しうる。当業者は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェント条件の変動が、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄段階に使用される時間、温度および／若しくは溶液の濃度を変えることにより達成されうることを理解するであろう。適する条件は、部分的に、使用されるプローブ、およびブロットされるプロバンド（ｐｒｏｂａｎｄ）核酸サンプルの特定のヌクレオチド配列にもまた依存しうる。従って、適してストリンジェント条件は、ポリヌクレオチドの所望の選択性が同定される場合に、ある他の発端体配列にハイブリダイズしない一方で１種若しくはそれ以上のある発端体配列にハイブリダイズするその能力に基づいて、過度の実験を伴わずに容易に選択され得ることが認識されるであろう。
【０１３８】
本発明の配列特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、いくつかの基準の１個若しくはそれ以上を使用して設計しうる。例えば、目的のポリペプチドをコードする配列に同一の約２１の連続するヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを設計するため、該ポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレームを、以下の特徴、すなわち（１）およそ１：１の、しかし２：１若しくは１：２を超えないＡ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ比；（２）５’端のＡＡジヌクレオチド若しくはＣＡジヌクレオチド；（３）５５℃未満の温度で融解する内的ヘアピンループ；（４）３７℃未満の温度で融解するホモダイマー（（３）および（４）で記述されるところの融解温度の計算は当業者に既知のコンピュータソフトウェアを使用して決定し得る）；（５）いずれかの他の既知のポリヌクレオチド配列に存在するとして同定されていない最低１６の連続するヌクレオチドの配列、の１種若しくはそれ以上を有する約２１塩基配列長さについて走査しうる。あるいは、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列は、多様な供給元、例えばＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ．ＴＭ．（ワシントン州シアトル）；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（コロラド州ラファイエット）；Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（テキサス州オースチン）；およびＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州バレンシア））から商業的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して設計しかつ選ぶことができる。Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２０００  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５：１８８−２００；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−９８もまた参照されたい。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはその後、当該技術分野で既知かつ本明細書の別の場所に記述される方法に従って、標的ポリペプチドの発現を妨害する能力について試験しうる。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの有効性の決定は、標的ポリペプチドの発現を妨害するその能力の考慮のみならず、しかしまた該ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが宿主細胞に対し毒性であるかどうかも包含する。例えば、所望のｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉活性を表すとみられ、かつまた望ましくない生物学的結果を表すとみられない。望ましくない生物学的結果の一例は、宿主細胞中への該ｓｉＲＮＡの導入の結果として細胞死が望ましくない細胞のアポトーシスである。
【０１３９】
本開示に基づき、本発明のｓｉＲＮＡが、多様な程度までの標的ポリペプチド発現のサイレンシングを遂げうることが認識されるはずである。ｓｉＲＮＡは、従って最初にそれらの有効性について試験されなければならない。ｓｉＲＮＡの選択を、標的ポリペプチドの発現を妨害若しくは調節する所定のｓｉＲＮＡの能力に基づきそれから行う。従って、所望の標的ポリペプチドの発現を妨害することが可能である特定のｓｉＲＮＡポリペプチド配列の同定は、各ｓｉＲＮＡの製造および試験を必要とする。各ｓｉＲＮＡの試験方法および本発明での使用のための適するｓｉＲＮＡの選択は本明細書で実施例に完全に示している。タンパク質発現を妨害する全部のｓｉＲＮＡが生理学上重要な効果を有することができるわけではないため、本開示はまた、本発明のｓｉＲＮＡを使用しての標的タンパク質発現の妨害のレベルが臨床上適切な意義を有するかどうかを決定するための多様な生理学的に関連するアッセイもまた示す。
【０１４０】
当業者は、遺伝暗号の縮重の結果として多くの異なるヌクレオチド配列が同一のポリペプチドをコードしうることを容易に認識するであろう。すなわち、あるアミノ酸は数種の異なるコドンの１種によりコードされることができ、そして、当業者は、特定の一ヌクレオチド配列が別のものと異なる一方で、該ポリヌクレオチドが実際には同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードしうることを容易に決定し得る。であるから、コドン使用頻度の差違により変動するポリヌクレオチドを、本発明によりとりわけ企図している。
【０１４１】
ｓｉＲＮＡのポリヌクレオチドは、とりわけ望ましいｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの製造に有用である多様な技術のいずれを使用して製造してもよい。例えば、ポリヌクレオチドは適する細胞若しくは組織型から調製したｃＤＮＡから増幅しうる。こうしたポリヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅しうる。このアプローチを使用して、配列特異的プライマーを本明細書に提供される配列に基づき設計し、また、購入若しくは直接合成しうる。プライマーの増幅された一部分を使用して、適するＤＮＡライブラリーから公知の技術を使用して完全長遺伝子若しくはその所望の一部分を単離しうる。ライブラリー（ｃＤＮＡ若しくはゲノム）は、増幅に適する１種若しくはそれ以上のポリヌクレオチドプローブ若しくはプライマーを使用してスクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きなポリヌクレオチド配列を包含するように大きさ選択する。ランダムプライムドライブラリーもまた、遺伝子の５’および他の上流領域を同定するために好ましいことができる。ゲノムライブラリーはイントロンおよび伸長する５’配列を得るために好ましい。本発明により企図されるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列のライブラリーからもまた選択しうる。
【０１４２】
ハイブリダイゼーション技術のため、部分的ポリヌクレオチド配列を、公知の技術を使用して（例えばニックトランスレーション若しくは３２Ｐでの末端標識により）標識しうる。細菌若しくはバクテリオファージライブラリーをその後、標識プローブを伴う変性細菌コロニー（若しくはファージプラークを含有する菌叢）を含有するフィルターへのハイブリダイゼーションによりスクリーニングしうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、２００１を参照されたい）。ハイブリダイズするコロニー若しくはプラークを選択かつ増殖させ、そしてＤＮＡをさらなる分析のため単離する。
【０１４３】
あるいは、部分的ｃＤＮＡ配列から完全長のコーディング配列を得るための多数の増幅技術が当該技術分野で既知である。こうした技術内で、増幅は一般にＰＣＲを介して実施される。１種のこうした技術が「ｃＤＮＡ端の迅速増幅」すなわちＲＡＣＥとして既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、２００１を参照されたい）。
【０１４４】
標的ポリペプチドの発現を妨害するのに有用な多数の特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列が、本明細書に包含される実施例、図面および配列表に提示される。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、一般に、例えば固相化学合成を包含する当該技術分野で既知のいずれの方法によっても製造しうる。ポリヌクレオチド配列の改変は、オリゴヌクレオチド指向性の部位特異的突然変異誘発のような標準的突然変異誘発技術を使用してもまた導入しうる。さらに、ｓｉＲＮＡは、それらの安定性および／若しくは送達特性を向上させるように化学的に改変若しくは他の分子と複合させうる。本発明の一局面として、１個若しくはそれ以上のリボース糖がそれらから除去されている本明細書に記述されるところのｓｉＲＮＡが包含される。
【０１４５】
あるいは、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、適するＤＮＡ配列（例えば標的ポリペプチド若しくはその所望の一部分をコードするポリヌクレオチド配列）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏ転写により生成させうるが、但し、該ＤＮＡは適するＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＴ７、Ｕ６、Ｈ１若しくはＳＰ６のような、とは言え他のプロモーターが同等に有用でありうる）とともにベクターに組み込まれる。加えて、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、所望のｓｉＲＮＡがｉｎ  ｖｉｖｏで生成されるような転写（および場合によっては適切なプロセシング段階）を支援するＤＮＡ配列（例えば本明細書に提供されるところの組換え核酸構築物）がそうであろうように、哺乳動物に投与しうる。
【０１４６】
一態様において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド（該ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは標的ポリペプチドの発現を妨害することが可能である）を、サイレンスした細胞を生成させるのに使用し得る。生物学的供給源とある時間接触される場合に標的ポリペプチドの発現の有意の減少をもたらすいかなるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドも、本発明に包含される。好ましくは、該減少は、該ｓｉＲＮＡの非存在下で検出される標的ポリペプチドの発現のレベルに関して約１０％より大きく、より好ましくは約２０％より大きく、より好ましくは約３０％より大きく、より好ましくは約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％若しくは約９８％より大きい。好ましくは、細胞中のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの存在は、いかなる望ましくない毒性の効果、例えば、アポトーシスがＲＮＡ干渉の所望の結果でない細胞のアポトーシス若しくは死ももたらさないか若しくは引き起こさない。
【０１４７】
別の態様において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、生物学的供給源とある時間接触される場合に標的ポリペプチドの発現の有意の減少をもたらす。好ましくは、該減少は、該ｓｉＲＮＡの非存在下で検出される標的ポリペプチドの発現レベルに関して、約１０％〜２０％、より好ましくは約２０％〜３０％、より好ましくは約３０％〜４０％、より好ましくは約４０％〜５０％、より好ましくは約５０％〜６０％、より好ましくは約６０％〜７０％、より好ましくは約７０％〜８０％、より好ましくは約８０％〜９０％、より好ましくは約９０％〜９５％、より好ましくは約９５％〜９８％である。好ましくは、細胞中のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの存在は、いかなる望ましくない毒性の効果ももたらさないか若しくは引き起こさない。
【０１４８】
なお別の態様において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、生物学的供給源とある時間接触される場合に標的ポリペプチドの発現の有意の減少をもたらす。好ましくは、該減少は、該ｓｉＲＮＡの非存在下で検出される標的ポリペプチドの発現レベルに関して、約１０％若しくはそれ以上、より好ましくは約２０％若しくはそれ以上、より好ましくは約３０％若しくはそれ以上、より好ましくは約４０％若しくはそれ以上、より好ましくは約５０％若しくはそれ以上、より好ましくは約６０％若しくはそれ以上、より好ましくは約７０％若しくはそれ以上、より好ましくは約８０％若しくはそれ以上、より好ましくは約９０％若しくはそれ以上、より好ましくは約９５％若しくはそれ以上、より好ましくは約９８％若しくはそれ以上である。好ましくは、細胞中のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの存在は、いかなる望ましくない毒性の効果ももたらさないか若しくは引き起こさない。
【０１４９】
であるから、本発明は、配列番号１〜３、２１〜２３および２７〜５６に例示されるところのｓｉＲＮＡのようなｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含んでなる。配列番号１〜３および２１〜２３は、それぞれ、ＳＯＣＳ１のネズミおよびヒトのｓｉＲＮＡの候補配列の配列である。配列番号２７〜３２、３３〜３８、３９〜４４、４５〜５０および５１〜５６は、それぞれＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ、ＰＩＡＳｙおよびＳＨＰ−１のヒトｓｉＲＮＡの候補配列の配列である。ｓｉＲＮＡの配列を図３０に描く。サイトカインシグナル伝達の多様な調節物質のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、当業者に既知のコンピュータ化されたデータベースで見出しうる。１つのこうしたデータベースは国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。これらの既知の遺伝子の核酸配列は、本明細書に開示される技術を使用して、若しくは当業者に既知であろういずれかの技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１）により増幅し、本明細書に開示される配列と結合（例えば連結し）かつ／若しくは発現させうる。核酸はｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系で発現させうるとは言え、好ましい態様において、核酸はｉｎ  ｖｉｖｏ複製および／若しくは発現のためのベクターを含んでなる。
【０１５０】
ｓｉＲＮＡの改変
本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの生成後に、当業者は、該ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが治療的化合物として該ｓｉＲＮＡを改良するように改変し得るある特徴を有することができることを理解するであろう。従って、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート、若しくは他の結合すなわちメチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステルなどを包含するようにそれを改変することにより分解に抵抗するようさらに設計しうる（例えば、Ａｇｒｗａｌら、１９８７  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８：３５３９−３５４２；Ｓｔｅｃら、１９８５  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２６：２１９１−２１９４；Ｍｏｏｄｙら、１９８９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：４７６９−４７８２；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、１９８９  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１４：９７−１００；Ｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃｏｈｅｎ編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン中ｐｐ．９７−１１７（１９８９）を参照されたい）。
【０１５１】
本発明のいかなるポリヌクレオチドも、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその安定性を増大させるようにさらに改変しうる。可能な改変は、限定されるものでないが、５’および／若しくは３’端での隣接配列の付加；バックボーン中のホスホジエステル結合よりむしろホスホロチオエート若しくは２’Ｏ−メチルの使用；ならびに／またはイノシン、ケオシンおよびワイブトシンなど、ならびにアセチル、メチル、チオならびに他の修飾された形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのような非伝統的塩基の包含を挙げることができる。
【０１５２】
ベクター
他の関連する局面において、本発明はインヒビターをコードする単離された核酸を包含し、該インヒビター、好ましくはｓｉＲＮＡは、該核酸が該核酸によりコードされるタンパク質の発現を指図することが好ましくは可能であるようなプロモーター／制御配列を含んでなる核酸に操作可能に連結されているサイトカインシグナル伝達調節物質を阻害する。従って、本発明は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）に記述されるもののような、細胞中での外因性ＤＮＡの同時の発現を伴う細胞中への外因性ＤＮＡの導入のための発現ベクターおよび方法を包含する。
【０１５３】
別の局面において、本発明はｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含んでなるベクターを包含する。好ましくは、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは標的ポリペプチドの発現を阻害することが可能であり、該標的ポリペプチドはＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１〜７、ＣＩＳ）、ＳＨＰ若しくはＰＩＡＳよりなる群から選択される。所望のポリヌクレオチドのベクター中への取り込みおよびベクターの選択は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記に記述されるとおり当該技術分野で公知である。
【０１５４】
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは多数の型のベクターにクローン化し得る。しかしながら、本発明はいずれかの特定のベクターに制限されると解釈されるべきでない。代わりに、本発明は、容易に入手可能かつ／若しくは当該技術分野で公知である夥しいベクターを包含すると解釈されるべきである。例えば、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、限定されるものでないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを挙げることができるベクターにクローン化し得る。特定の目的のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよび配列決定ベクターを包含する。
【０１５５】
特定の態様において、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクターおよび哺乳動物細胞ベクターよりなる群から選択される。上で論考された組成物の少なくとも一部若しくは全部を含んでなる多数の発現ベクター系が存在する。原核生物および／若しくは真核生物ベクターに基づく系を、ポリヌクレオチド若しくはそれらのコグネイトのポリペプチドを産生するための本発明での使用に使用し得る。多くのこうした系が商業的にかつ広範に入手可能である。
【０１５６】
さらに、発現ベクターはウイルスベクターの形態で細胞に提供しうる。ウイルスベクター技術は当該技術分野で公知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７）、ならびに他のウイルス学および分子生物学の手引書に記述されている。ベクターとして有用であるウイルスは、限定されるものでないがレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを挙げることができる。一般に、適するベクターは、最低１種の生物体中で機能的な複製起点、プロモーター配列、便宜的な制限エンドヌクレアーゼ部位および１種若しくはそれ以上の選択可能なマーカーを含有する。（例えば、第ＷＯ  ０１／９６５８４号明細書；第ＷＯ  ０１／２９０５８号明細書；および米国特許第６，３２６，１９３号明細書を参照されたい。
【０１５７】
ｓｉＲＮＡの発現のため、各プロモーター中の最低１モジュールが、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を定めるよう機能する。これの最良の既知の例はＴＡＴＡボックスであるが、しかし、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０遺伝子のプロモーターのような、ＴＡＴＡボックスを欠く数種のプロモーターにおいては、開始部位それ自身の上にある別個の要素が、開始の場所を固定するのに役立つ。
【０１５８】
付加的なプロモーター要素、すなわちエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に配置されるとは言え、多数のプロモーターが開始部位の下流の機能的要素を同様に含有することが最近示された。プロモーター要素間の間隔は頻繁に柔軟性であり、その結果、プロモーター機能は、要素が相互に関して反転若しくは移動されている場合に保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいては、プロモーター要素間の間隔を、活性が減少し始める前に５０ｂｐ離れてまで増大させ得る。プロモーターに依存して、個々の要素は、転写を活性化するために協同的に若しくは独立してのいずれでも機能し得るようである。
【０１５９】
プロモーターは、コーディングセグメントおよび／若しくはエキソンの上流に配置される５’非コーディング配列を単離することにより得られるであろうとおり、遺伝子若しくはポリヌクレオチド配列と天然に会合しているものでありうる。こうしたプロモーターは「内因性」と称され得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流若しくは上流のいずれかに配置されるポリヌクレオチド配列と天然に会合しているものでありうる。あるいは、組換え若しくは異種プロモーター（その天然の環境で該ポリヌクレオチド配列と通常は会合していないプロモーターを指す）の制御下にコーディングポリヌクレオチドセグメントを配置することにより、ある種の利点を獲得することができる。組換え若しくは異種エンハンサーは、その天然の環境でポリヌクレオチド配列と通常会合していないエンハンサーもまた指す。こうしたプロモーター若しくはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター若しくはエンハンサー、およびいずれかの他の原核生物、ウイルス若しくは真核生物細胞から単離されたプロモーター若しくはエンハンサー、ならびに、「天然に存在し」ない、すなわち発現を変える多様な転写制御領域の多様な要素および／若しくは変異体を含有するプロモーター若しくはエンハンサーを包含しうる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成で製造することに加え、配列は、本明細書に開示される組成物とともに、組換えクローニングおよび／若しくはＰＣＲＴＭを包含する核酸増幅技術を使用して製造しうる（米国特許第４，６８３，２０２号明細書、米国特許第５，９２８，９０６号明細書）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などのような核以外の小器官内での配列の転写および／若しくは発現を指図する制御配列を同様に使用し得ることが企図されている。
【０１６０】
当然、発現に選択した細胞型、小器官および生物体中でのＤＮＡセグメントの発現を効果的に指図するプロモーターおよび／若しくはエンハンサーを使用することが重要であることができる。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組合せの使用方法を知っている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１）を参照されたい。使用されるプロモーターは、構成的、組織特異的、誘導可
能、ならびに／または、組換えタンパク質および／若しくはペプチドの大スケール生産で有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指図するのに適切な条件下で有用でありうる。プロモーターは異種であっても若しくは内因性であってもよい。
【０１６１】
本明細書に提示される実験実施例で例示されるプロモーター配列は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに効果的に連結されたいかなるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現も駆動することが可能な、強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、限定されるものでないがＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、限定されるものでないがアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよび筋クレアチンプロモーターを挙げることができるヒト遺伝子プロモーターを挙げることができる、他の構成的プロモーター配列もまた使用しうる。さらに、本発明は構成的プロモーターの使用に制限されるべきでない。誘導可能なプロモーターもまた本発明の一部として企図している。本発明での誘導可能なプロモーターの使用は、こうした発現が望ましい場合にそれが効果的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現のスイッチを入れる、若しくは発現が望ましくない場合に該発現のスイッチを切ることが可能な分子スイッチを提供する。誘導可能なプロモーターの例は、限定されるものでないがメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを挙げることができる。さらに、本発明は組織特異的プロモーターの使用を包含し、このプロモーターは所望の組織中でのみ活性である。組織特異的プロモーターは当該技術分野で公知であり、そして、限定されるものでないがＨＥＲ−２プロモーターおよびＰＳＡ関連プロモーター配列を挙げることができる。
【０１６２】
ｓｉＲＮＡの発現を評価するために、細胞中に導入されるべき発現ベクターは、ウイルスベクターによりトランスフェクト若しくは感染されことが探求される細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれかまたは双方もまた含有し得る。他の態様において、選択可能なマーカーは別個の一片のＤＮＡ上で運搬されかつコトランスフェクション手順で使用されうる。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子の双方は、宿主細胞中での発現を可能にするために適切な制御配列と隣接させうる。有用な選択可能なマーカーは当該技術分野で既知であり、そして例えばｎｅｏなどのような抗生物質耐性遺伝子を包含する。
【０１６３】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、および制御配列の機能性を評価するために使用する。容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子が当該技術分野で公知である。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物体若しくは組織中に存在しないか若しくはそれらにより発現されず、かつ、何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によりその発現が明示されるタンパク質をコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、該ＤＮＡをレシピエント細胞に導入した後の適した時点でアッセイする。
【０１６４】
適するレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、若しくは緑色蛍光タンパク質遺伝子を包含しうる（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉら、２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４７９：７９−８２を参照されたい）。適する発現系は公知であり、そして公知の技術を使用して調製しうるか、若しくは商業的に得ることができる。ユニークな内的制限部位を使用して、若しくはユニークでない制限部位の部分消化により、内的欠失構築物を生成させうる。構築物をその後、高レベルのｓｉＲＮＡポリヌクレオチドおよび／若しくはポリペプチド発現を表す細胞にトランスフェクトしうる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’隣接領域をもつ構築物をプロモーターと同定する。こうしたプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結することができ、そしてプロモーターに駆動される転写を調節する能力について剤を評価するのに使用しうる。
【０１６５】
サイレンスされた免疫細胞の生成
一態様において、本発明は細胞中へのサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを発現するための細胞に基づく系を提供する。細胞に基づく系は「サイレンスした細胞」を指し、細胞、およびインヒビターを発現するための発現ベクターを含んでなる。しかしながら、本発明は、発現ベクターを含んでなる細胞に制限されるべきでなく、しかしむしろ、本発明のサイレンスした細胞は、本発明のいかなる型のインヒビター、すなわち化学合成したｓｉＲＮＡで改変した細胞も包含すると解釈されるべきである。いかなる場合にも、インヒビターを含んでなるサイレンスした細胞は、該インヒビターでそのようにサイレンスされていないそれ以外は同一の細胞に比較して、高められた免疫能を有する。サイレンスした細胞は、単独で若しくは他の治療とともにの哺乳動物レシピエントへの投与に適する。
【０１６６】
本発明は、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを含んでなる細胞を包含する。該インヒビターは、限定されるものでないがＳＯＣＳ、ＳＨＰ若しくはＰＩＡＳを挙げることができるサイトカインシグナル伝達調節物質を阻害することが可能である。一局面において、細胞は、インヒビターをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターでトランスフェクトし得る。該ポリヌクレオチドは細胞に組込まれる必要はない。別の局面において、細胞はベクターでトランスフェクトされる必要は全くなく、しかしむしろ、細胞はベクターから発現されないインヒビターに曝露される。こうしたインヒビターの一例は、化学合成したｓｉＲＮＡである。
【０１６７】
発現ベクターの情況において、ベクターは、当該技術分野のいずれかの方法により宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母若しくは昆虫細胞に容易に導入し得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的若しくは生物学的手段により宿主細胞に移入し得る。本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターの導入は、サイトカインシグナル伝達調節物質に関してサイレンスした細胞を生じることが容易に理解される。
【０１６８】
宿主細胞中へのポリヌクレオチドの物理的導入方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子照射、微小注入、電気穿孔などを包含する。ベクターおよび／若しくは外因性核酸を含んでなる細胞の製造方法は当該技術分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）中を参照されたい。
【０１６９】
宿主細胞中への目的のポリヌクレオチドの生物学的導入方法はＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を包含する。ウイルスベクター、およびとりわけレトロウイルスベクターは、遺伝子の哺乳動物、例えばヒト細胞中への最も広範に使用される挿入方法となった。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純疱疹ウイルスＩ型、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなど由来であり得る。例えば米国特許第５，３５０，６７４号および同第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
【０１７０】
宿主細胞中へのポリヌクレオチドの化学的導入手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル
、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを包含する脂質に基づく系のようなコロイド分散系を包含する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの送達ベヒクルとしての使用のための好ましいコロイド系はリポソーム（すなわち人工的膜小胞）である。こうした系の製造および使用は当該技術分野で公知である。
【０１７１】
宿主細胞中に外因性核酸を導入するため、もしくは本発明のインヒビターに細胞を別の方法で曝露するのに使用される方法に関係なく、宿主細胞中での組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために多様なアッセイを実施しうる。こうしたアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に公知の「分子生物学的」アッセイ；例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）若しくは本発明の範囲内にある剤を同定するために本明細書に記述されるアッセイにより特定のペプチドの存在若しくは非存在を検出することのような「生化学的アッセイ」を包含する。
【０１７２】
サイレンスした細胞を生成させるため、いかなるＤＮＡベクター若しくは送達ベヒクルも、所望のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを免疫細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで移入するために利用し得る。ウイルス以外の送達系を利用する場合には、好ましい送達ベヒクルはリポソームである。前述の送達系およびプロトコルは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版、ｐｐ  １−３５（２００２）およびＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｖｏｌ．７、Ｍｕｒｒａｙ編、ｐｐ  ８１−８９（１９９１）に見出し得る。
【０１７３】
脂質製剤の使用を、本発明のサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターの宿主細胞中への導入（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏ）に企図している。本発明の特定の一態様において、インヒビターは脂質と会合させうる。脂質と会合したインヒビターは、リポソームの水性の内部に被包化されうるか、リポソームの脂質二重層内に散在されうるか、リポソームおよびオリゴヌクレオチド双方と会合する連結分子を介してリポソームに結合されうるか、リポソーム中に捕捉されうるか、リポソームと複合体形成されうるか、脂質を含有する溶液中に分散されうるか、脂質と混合されうるか、脂質と結合されうるか、懸濁剤として脂質中に含有されうるか、ミセルを含有しうるか若しくはそれと複合体形成されうるか、または別の方法で脂質と会合されうる。本発明の脂質、脂質／ｓｉＲＮＡ若しくは脂質／発現ベクター会合組成物は溶液中のいずれか特定の構造に制限されない。例えば、それらは二層構造中に、ミセルとして、若しくは「崩壊した」構造を伴い存在しうる。それらはまた、単純に溶液中に散在されて、おそらく大きさ若しくは形状いずれかが均一でない凝集物も形成しうる。
【０１７４】
脂質は、天然に存在するか若しくは合成の脂質でありうる脂肪性物質である。例えば、脂質は、細胞質中に天然に存在する脂肪の液滴、ならびに、長鎖脂肪族炭化水素ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのようなそれらの誘導体を含有する当業者に公知である化合物の分類を包含する。
【０１７５】
リン脂質は、本発明のリポソームを調製するために使用することができ、そして正味の正、負若しくは中性の電荷を運搬しうる。リン酸ジアセチルを使用してリポソームに負の電荷を賦与し得、また、ステアリルアミンを使用してリポソームに正の電荷を賦与し得る。リポソームは１種若しくはそれ以上のリン脂質から作成し得る。
【０１７６】
中性に荷電した脂質は、電荷をもたない脂質、実質的に荷電していない脂質、若しくは等数の正および負の電荷をもつ脂質混合物を含み得る。適するリン脂質は、ホスファチジルコリンおよび当業者に公知である他者を包含する。
【０１７７】
本発明の使用に適する脂質は商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から得ることができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）はＫ  ＆  Ｋ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ニューヨーク州プレインビュー）から得られ；コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）はＣｈａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから得られ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（アラバマ州バーミンガム）から得ることができる。クロロホルム若しくはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は約−２０℃で保存し得る。好ましくは、クロロホルムはメタノールより容易に蒸発されるため、それを唯一の溶媒として使用する。
【０１７８】
卵若しくはダイズホスファチジルコリン、脳ホスファチジン酸、脳若しくは植物のホスファチジルイノシトール、心カルジオリピンおよび植物若しくは細菌のホスファチジルエタノールアミンのような天然の供給源からのリン脂質は、好ましくは、生じるリポソームの不安定性および漏出性のため、主ホスファチド（すなわち総ホスファチド組成の５０％若しくはそれ以上を構成する）として使用されない。
【０１７９】
「リポソーム」は、封入された脂質二重層若しくは凝集物の生成により形成される多様な単および多層脂質ベヒクルを包含する包括的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内的水性媒体をもつ小胞構造を有することを特徴としうる。多層リポソームは水性媒体により分離される複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水性溶液中に懸濁される場合に自発的に生じる。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再配列を受け、そして脂質二重層間に水および溶解された溶質を捕捉する（ＧｈｏｓｈとＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。しかしながら、本発明は、通常の小胞構造と異なる溶液中の構造を有する組成物もまた包含する。例えば、脂質は、ミセル構造をとりうるか、若しくは単に脂質分子の不均一な凝集物として存在しうる。リポフェクタミン−核酸複合体もまた企図している。
【０１８０】
リン脂質は、水に対する脂質のモル比に依存して、水中に分散された場合にリポソーム以外の多様な構造を形成し得る。低い比ではリポソームは好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および／若しくは二価陽イオンの存在に依存する。リポソームはイオン性および／若しくは極性物質に対し低浸透性を示し得るが、しかし、上昇された温度では、それらの浸透性を顕著に変える相転移を受ける。相転移は、ゲル状態として知られる緊密に充填された秩序正しい構造から、液体状態として知られるゆるく充填されたより少なく秩序だった構造への変化を伴う。これは、特徴的相転移温度で起こりかつ／またはイオン、糖および／若しくは薬物に対する浸透性の増大をもたらす。
【０１８１】
リポソームは、４種の異なる機構、すなわち、マクロファージおよび／若しくは好中球のような細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性および／若しくは静電力、ならびに／または細胞表面の成分との特異的相互作用のいずれかによる細胞表面への吸着；リポソーム内容の細胞質中への同時の放出を伴う、リポソームの脂質二重層の形質膜への挿入による形質細胞膜との融合；ならびに／あるいはリポソーム内容物のいかなる会合も伴わない細胞および／若しくは細胞内膜へのリポソーム脂質の移行、ならびに／またはその逆による形質細胞膜との融合、を介して細胞と相互作用する。リポソームの処方を変動させることは、どの機構が作動するかを変え得るとは言え、１種以上が同時に作動しうる。
【０１８２】
リポソーム媒介性のオリゴヌクレオチド送達およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの外来ＤＮＡの発現は非常に成功裏であった。Ｗｏｎｇら（１９８０）は、培養ニワトリ胚、ＨｅＬａお
よび肝腫細胞における外来ＤＮＡのリポソーム媒介性の送達および発現の実現可能性を示した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は静脈内注入後のラットにおける成功裏のリポソーム媒介性の遺伝子移入を達成した。
【０１８３】
本発明のある態様において、脂質は血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と会合しうる。これは、細胞膜との融合を容易にしかつリポソームで被包化したＤＮＡの細胞進入を促進することが示された（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。他の態様において、脂質は核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体形成しうるか、若しくはそれとともに使用しうる（Ｋａｔｏら、１９９１）。なおさらなる態様において、脂質はＨＶＪおよびＨＭＧ−１双方と複合体形成しうるか、若しくはそれとともに使用しうる。こうした発現ベクターがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチドの移入および発現で成功裏に使用されたため、その結果それらは本発明に応用可能である。細菌のプロモーターをＤＮＡ構築物中で使用する場合、適切な細菌のポリメラーゼをリポソーム内に包含することもまた望ましいことができる。
【０１８４】
本発明で使用されるリポソームは多様な方法により作成し得る。リポソームの大きさは合成方法に依存して変動する。水性溶液中に懸濁されたリポソームは、一般に、脂質二重層分子の１個若しくはそれ以上の同心円状の層を有する球状小胞の形状にある。各層は式ＸＹにより表される分子の平行な列よりなり、式中Ｘは親水性部分でありかつＹは疎水性部分である。水性懸濁液中では、親水性部分が水層と接触して留まる傾向がありかつ疎水性領域が自己会合する傾向があるような同心円状の層が配置される。例えば、水層がリポソーム内およびリポソームを伴わずの双方で存在する場合、脂質分子は、配置ＸＹ−ＹＸのラメラとして知られる二層を形成しうる。脂質の凝集物は、１個以上の脂質分子の親水性および疎水性部分が相互と会合したようになる場合に生じうる。これらの凝集物の大きさおよび形状は、溶媒の性質および溶液中の他の化合物の存在のような多くの異なる変数に依存することができる。
【０１８５】
本発明の範囲内のリポソームは既知の実験室技術に従って製造し得る。好ましい一態様において、リポソームは、容器、例えばガラス製ナス形フラスコ中でリポソ―ム脂質を溶媒中に混合することにより製造する。容器はリポソームの期待される懸濁液の容量より１０倍より大きい容量を有すべきである。ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒を陰圧下およそ４０℃で除去する。溶媒は通常、リポソームの所望の容量に依存して約５分ないし２時間以内に除去される。組成物を真空下にデシケーター中でさらに乾燥し得る。乾燥した脂質は、一般に、時間とともに劣化する傾向のため、約１週後に廃棄する。
【０１８６】
乾燥した脂質は、全部の脂質薄膜が再懸濁されるまで振とうすることにより、滅菌の発熱性物質を含まない水中およそ２５〜５０ｍＭのリン脂質で水和し得る。水性リポソームをその後アリコートに分離し、それぞれをバイアルに入れ、真空下で凍結乾燥かつ封止し得る。
【０１８７】
代替において、リポソームは他の既知の実験室手順、すなわち、Ｂａｎｇｈａｍら（１９６５）（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）の方法；Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編（１９７９）ｐｐ．２８７−３４１（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるところのＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓの方法；ＤｅａｍｅｒとＵｓｔｅｒ、１９８３（その内容は引用することにより組み込まれる）の方法；およびＳｚｏｋａとＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、１９７８により記述されるところの逆相蒸発法に従って製造し得る。前述の方法は、水性物質を捕捉するそれらのそれぞれの能力およびそれらのそれぞれの水性空間対脂質比が異なる。
【０１８８】
上述されたとおり製造した乾燥した脂質若しくは凍結乾燥したリポソームを脱水し、そして阻害性ペプチドの溶液中で再構成し、かつ、適する溶媒、例えばＤＰＢＳで適切な濃度に希釈しうる。混合物をその後ボルテックス混合機で活発に振とうする。被包化されない核酸を、２９，０００×ｇでの遠心分離により除去し、そしてリポソームペレットを洗浄する。洗浄したリポソームを、適切な総リン脂質濃度、例えば約５０〜２００ｍＭで再懸濁する。被包化された核酸の量を標準的方法により測定し得る。リポソーム製剤に被包化された核酸の量の測定後に、リポソームを適切な濃度に希釈し、そして使用まで４℃で保存しうる。
【０１８９】
活性化（パルス）免疫細胞の生成
本発明は、抗原で曝露若しくは別の方法で「パルスし」かつ抗原におよび活性化した細胞を包含する。例えば、ＡＰＣは、例えば抗原の存在下でのｅｘ  ｖｉｖｏの培養によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで、若しくは抗原への曝露によりｉｎ  ｖｉｖｏで抗原を負荷されたようになりうる。
【０１９０】
当業者は、ＡＰＣが、ＡＰＣの表面上のその抗原の提示を促進するのに十分な時間、ＡＰＣを抗原に曝露する様式で「パルスし」得ることもまた容易に理解するであろう。例えば、ＡＰＣは、抗原ペプチドとして知られる小型のペプチドフラグメントの形態の抗原に曝露させ得、ＡＰＣの外側で直接「パルス」されるか（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、１９９４）；または、ＡＰＣはその後ＡＰＣにより摂取される全タンパク質若しくはタンパク質粒子とともにインキュベートし得る。これらの全タンパク質はＡＰＣにより小型のペプチドフラグメントに消化され、そしてついにはＡＰＣ表面上に運搬かつ提示される（Ｃｏｈｅｎら、１９９４）。ペプチドの形態の抗原は、本明細書に記述される標準的な「パルス」技術により細胞に曝露させうる。
【０１９１】
いずれかの特定の論理により束縛されることを願わないが、外来若しくは自己抗原の形態の抗原は、該抗原の免疫原性の形態を保持するために本発明のＡＰＣによりプロセシングされる。免疫原性の形態の抗原は、免疫細胞、例えばＴ細胞により認識かつそれらを刺激し得る抗原の形態を生じさせるための断片化による抗原のプロセシングを暗示する。好ましくは、こうした外来若しくは自己抗原はＡＰＣによりペプチドにプロセシングされるタンパク質である。ＡＰＣにより産生される関連ペプチドを、免疫原性組成物としての使用のため抽出かつ精製しうる。ＡＰＣによりプロセシングされたペプチドは、ＡＰＣによりプロセシングされたタンパク質に対する免疫寛容を誘導するのにもまた使用しうる。
【０１９２】
自己免疫疾患は、別名自己抗原として知られる「自己タンパク質」、すなわち個体中に存在すなわち内因性である自己抗原に向けられる免疫応答から生じると考えられる。自己免疫応答では、これらの「自己タンパク質」がＴ細胞に提示され、Ｔ細胞を「自己反応性」にさせる。本発明の方法により、ＡＰＣを抗原でパルスして関連する「自己ペプチド」を産生させる。関連する自己ペプチドは各個体について異なる。ＭＨＣ産物は高度に多形であり、そして各個々のＭＨＣ分子が多様なペプチドフラグメントを結合しうるからである。「自己ペプチド」およびサイトカインシグナル伝達のインヒビターのアゴニストをその後使用して、競合するペプチドを設計し得るか、若しくは処置の必要な個体における自己タンパク質に対する免疫寛容を誘導し得る。
【０１９３】
別名本発明の「パルスＡＰＣ」として知られる、抗原で活性化したＡＰＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかでの抗原へのＡＰＣの曝露により製造する。ＡＰＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏでパルスする場合、ＡＰＣを培養皿にプレーティングし、そして十分な量の抗原にかつ抗原をＡＰＣに結合させるのに十分な時間、曝露する。ＡＰＣへの抗原の結合を達成するのに必要な量および時間は、当該技術分野で既知の、若しくは本明細書に別の方法で開示される方法を使用することにより決定しうる。当業者に既知の他の
方法、例えばイムノアッセイ若しくは結合アッセイを使用して、抗原への曝露後のＡＰＣ上での抗原の提示を検出しうる。
【０１９４】
本発明のさらなる一態様において、ＡＰＣを、該ＡＰＣによる特定のタンパク質の発現を見込むベクターでトランスフェクトしうる。ＡＰＣにより発現されるタンパク質はその後プロセシングされかつＭＨＣ受容体上で細胞表面上に提示されうる。トランスフェクトしたＡＰＣは、その後、ベクターによりコードされるタンパク質に対する免疫応答を生じさせるための免疫原性組成物として使用しうる。
【０１９５】
本明細書の別の場所で論考されるとおり、ベクターは、それに対する免疫原性応答が望ましいタンパク質をコードかつ発現する特定のポリヌクレオチドを包含するように製造しうる。好ましくは、細胞を感染させるのにレトロウイルスベクターを使用する。より好ましくは、細胞を感染させるのにアデノウイルスベクターを使用する。
【０１９６】
本発明の別の態様において、ベクターは、ＡＰＣ上の受容体により認識されるタンパク質若しくはその部分をコードするようにウイルスベクターを改変することにより、ＡＰＣを標的とすることができ、それにより、該ベクターによるＡＰＣ受容体の占有が、該ウイルスベクターの核酸によりコードされる抗原のプロセシングおよび提示を見込むベクターのエンドサイトーシスを開始することができる。該ウイルスにより送達される核酸は、ＡＰＣ上で発現される場合に、その後プロセシングされかつＡＰＣ上のＭＨＣ受容体に提示されるウイルスタンパク質をコードするウイルスにとって天然でありうる。
【０１９７】
本明細書の別の場所で論考されるとおり、多様な方法を、宿主細胞中にポリヌクレオチドをトランスフェクトするために使用し得る。該方法は、限定されるものでないがリン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子照射、微小注入、電気穿孔、コロイド分散系（すなわち巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを包含する脂質に基づく系）を挙げることができる。
【０１９８】
別の局面において、抗原をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローン化し得、そして該ベクターをＡＰＣに導入して活性化したＡＰＣを別の方法で生成させ得る。細胞中に核酸を導入する多様な型のベクターおよび方法が本明細書の別の場所で論考されている。例えば、抗原をコードするベクターは、当該技術分野のいずれの方法により宿主細胞に導入してもよい。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的若しくは生物学的手段により宿主細胞に移入し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）中を参照されたい。抗原をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターの導入がパルスした細胞を生じることが容易に理解される。
【０１９９】
本発明は、限定されるものでないが、タンパク質、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡの形態の全抗原をＡＰＣに負荷することを挙げることができる、ＡＰＣの多様なパルス方法を包含する。しかしながら、本発明は、ＡＰＣをパルスするのに使用される特定の形態の抗原に制限されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、抗原負荷ＡＰＣを生成させるための当該技術分野で既知の他の方法を包含する。好ましくは、ＡＰＣを定義された抗原をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトする。その配列が既知である遺伝子産物に対応するｍＲＮＡは、適切なプライマー、および転写反応と組み合わせた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで迅速に生成し得る。ｍＲＮＡでの
ＡＰＣのトランスフェクションは、パルスしたＡＰＣを生成させるための他の抗原負荷技術を上回る利点を提供する。例えば、微量の組織、例えば腫瘍組織からのＲＮＡを増幅する能力は、ワクチン接種のためのＡＰＣの使用を多数の患者に拡大する。
【０２００】
抗原はウイルス、真菌若しくは細菌由来でありうる。抗原は自己抗原、若しくは感染性疾患、癌、自己免疫疾患よりなる群から選択される疾患と関連する抗原でありうる。
【０２０１】
ワクチンとして有用であるべき抗原組成物について、抗原組成物は細胞、組織若しくは哺乳動物（例えばヒト）において該抗原に対する免疫応答を誘導しなければならない。本明細書で使用されるところの「免疫学的組成物」は、抗原（例えばペプチド若しくはポリペプチド）、抗原をコードする核酸（例えば抗原発現ベクター）、抗原若しくは細胞成分を発現若しくは提示する細胞を含みうる。特定の態様において、抗原組成物は、本明細書に記述されるいずれかの抗原の全部若しくは一部、またはその免疫学的機能的同等物を含んでなるか、若しくはコードする。他の態様において、抗原組成物は、付加的な免疫刺激剤若しくはこうした剤をコードする核酸を含んでなる混合物にある。免疫刺激剤は、限定されるものでないが、付加的な抗原、免疫調節物質、抗原提示細胞若しくはアジュバントを挙げることができる。他の態様において、付加的な抗原（１種若しくは複数）の１種若しくはそれ以上を、いずれかの組合せの抗原若しくは免疫刺激剤に共有結合する。ある態様において、抗原組成物はＨＬＡアンカーモチーフアミノ酸に複合されるか、若しくはそれらを含んでなる。
【０２０２】
本発明のワクチンは、核酸および／若しくは細胞成分のその組成が変動しうる。制限しない一例において、抗原をコードする核酸はアジュバントとともにもまた処方しうる。もちろん、本明細書に記述される多様な組成物が付加的な成分をさらに含みうることが理解されるであろう。例えば、１種若しくはそれ以上のワクチン成分を脂質若しくはリポソーム中に含みうる。別の制限しない例において、ワクチンは１種若しくはそれ以上のアジュバントを含みうる。本発明のワクチンおよびその多様な成分は、本明細書に開示されるか若しくは本開示に照らして当業者に既知であろうところのいずれの方法により製造かつ／若しくは投与してもよい。
【０２０３】
本発明の抗原組成物は、限定されるものでないが固相合成による化学合成、およびＨＰＬＣによる化学反応の他の産物からの精製、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系若しくは生存細胞中での本発明の抗原を含んでなるペプチド若しくはポリペプチドをコードする核酸配列（例えばＤＮＡ配列）の発現による産生を挙げることができる、当該技術分野で公知である方法により作成しうることが理解される。加えて、抗原組成物は生物学的サンプルから単離された細胞成分を含み得る。好ましくは、抗原組成物は、単離かつ１種若しくはそれ以上の望ましくない小分子量の分子を除去するために徹底的に透析され、かつ／または所望のベヒクルへのより容易な処方のため凍結乾燥される。付加的なアミノ酸、突然変異、化学修飾、およびワクチン成分中で作成されるこうした同様のもの（あれば）は、好ましくはエピトープ配列の抗体認識を実質的に妨害しないことができることがさらに理解される。
【０２０４】
本発明の１個若しくはそれ以上の抗原決定子に対応するペプチド若しくはポリペプチドは、一般に長さ最低５若しくは６アミノ酸残基であるべきであり、そして、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５若しくは約５０残基などまで含有しうる。ペプチド配列は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ（カリフォルニア州フォスターシティ）から入手可能なもののような自動ペプチド合成機を使用するペプチド合成のような、当業者に既知の方法により合成しうる。
【０２０５】
より長いペプチド若しくはポリペプチドは、例えば組換え手段によってもまた製造しうる。ある態様において、本明細書に記述される抗原組成物および／若しくは成分をコードする核酸を使用して、例えば本発明の多様な組成物および方法のためｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで抗原組成物を製造しうる。例えば、ある態様において、抗原をコードする核酸は、例えば組換え細胞中のベクターに含まれる。該核酸を発現させ、抗原の配列を含んでなるペプチド若しくはポリペプチドを産生させうる。該ペプチド若しくはポリペプチドは細胞から分泌されうるか、または細胞の一部として若しくはそれ内に含まれうる。
【０２０６】
ある態様において、免疫応答は、抗原をコードする核酸で哺乳動物をトランスフェクト若しくはそれを接種することにより促進しうる。標的哺乳動物内に含まれる１個若しくはそれ以上の細胞は、その場合、該哺乳動物への核酸の投与後に該核酸によりコードされる配列を発現する。ワクチンは、例えば抗原のペプチド若しくはポリペプチド配列の全部若しくは一部をコードする核酸（例えばｃＤＮＡ若しくはＲＮＡ）の形態にもまたありうる。該核酸によるｉｎ  ｖｉｖｏでの発現は、例えば、プラスミド型ベクター、ウイルスベクター、若しくはウイルス／プラスミド構築物ベクターによることができる。
好ましい局面において、核酸は、適切な抗原若しくはその免疫学的機能的同等物をコードする配列の全部若しくは一部をコードするコーディング領域を含んでなる。もちろん、該核酸は、限定されるものでないが１種若しくはそれ以上の免疫調節物質若しくはアジュバントを含んでなるものを挙げることができる付加的な配列を含むことができかつ／若しくはコードしうる。
【０２０７】
腫瘍関連抗原
本発明の情況において、「腫瘍抗原」若しくは「過剰増殖性障害抗原」若しくは「過剰増殖性障害と関連する抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通である抗原を指す。ある局面において、本発明の過剰増殖性障害抗原は、限定されるものでないが原発性若しくは転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頚癌、膀胱癌、腎癌、ならびに乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌などのような腺癌を挙げることができる癌由来である。
【０２０８】
一態様において、本発明の腫瘍抗原は、哺乳動物の癌腫瘍由来の腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）により免疫学的に認識される１種若しくはそれ以上の抗原性癌エピトープを含んでなる。
【０２０９】
悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原としてはたらき得る多数のタンパク質を発現する。これらの分子は、限定されるものでないが、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびＧＰ  １００、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のような組織特異的抗原を挙げることができる。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２のような形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のなお別の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のような癌胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍に独特である真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３７のようなＢ細胞分化抗原はＢ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原の数種（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ  １９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、制限された成功を伴い、モノクローナル抗体での受動免疫療法の標的として使用されている。
【０２１０】
腫瘍抗原およびその抗原性癌エピトープは、初代臨床単離物、細胞株などのような天然の供給源から精製かつ単離しうる。癌ペプチドおよびそれらの抗原エピトープは、当該技術分野で既知の化学合成若しくは組換えＤＮＡ技術によってもまた得ることができる。化
学合成の技術は、Ｓｔｅｗａｒｄら（１９６９）；Ｂｏｄａｎｓｋｙら（１９７６）；Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ（１９８３）；およびＳｃｈｒｏｄｅｒら（１９６５）に記述されている。さらに、Ｒｅｎｋｖｉｓｔら（２００１）に記述されるとおり、当該技術分野で既知の多数の抗原が存在する。以下の表は、腫瘍抗原によりコードされるＴ細胞で規定される（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｄｅｆｉｎｅｄ）エピトープを記述し、そしてＴ細胞（細胞傷害性ＣＤ８＋若しくはヘルパーＣＤ４＋のいずれか）により認識される腫瘍抗原のみを列挙する。アナログ若しくは人工的に改変したエピトープは列挙されないとは言え、当業者は当該技術分野の標準的な手段によりそれらを得る若しくは生成させる方法を認識している。抗体により同定されかつＳｅｒｅｘ技術（Ｓａｈｉｎら（１９９７）およびＣｈｅｎら（２０００）を参照されたい）により検出されるところの他の抗原は、ルートヴィヒ癌研究所（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のデータベースで同定される。
【０２１１】
微生物抗原
微生物抗原は起源がウイルス、細菌若しくは真菌でありうる。感染性ウイルスの例は：レトロウイルス科（例えばＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ若しくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩともまた称される）のようなヒト免疫不全ウイルス；およびＨＩＶ−ＬＰのような他の単離物：ピコルナウイルス科（例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（例えば胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えばウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えばデングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えばパラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えばハンターンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えばレオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；ならびにイリドウイルス科（例えばアフリカ豚コレラウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば海綿状脳症の病因病原体、Ｄ型肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ非Ｂ肝炎の病原体（クラス１＝内的感染する；クラス２＝非経口感染する（すなわちＣ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）を包含する。
【０２１２】
感染性細菌の例は：ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア  ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｅｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ミコバクテリア・スピーシーズ（例えばヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス  アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌属（ヴィリダンス群）、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス  ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌属（嫌気性スピーシーズ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）スピーシーズ、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）スピーシーズ、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム属（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）スピーシーズ、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター  アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ  ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）スピーシーズ、フゾバクテリウム  ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシラス  モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フランベジアトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）およびイスラエル放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）を包含する。
【０２１３】
感染性真菌の例は：クリプトコッカス  ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ  カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ
ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス  イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ
ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス  デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ
ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）を包含する。熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびトキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｒａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）を包含する他の感染性生物体（すなわち原生動物）も挙げられる。
【０２１４】
サイレンスかつパルスした免疫細胞
別の態様において、細胞を培養物、組織、器官若しくは生物体から単離しかつ細胞ワクチンとして哺乳動物に投与しうる。従って、本発明は「細胞ワクチン」を企図している。もちろん、該細胞は、免疫調節物質若しくはアジュバントのような１種若しくはそれ以上の付加的なワクチン成分もまた発現しうる。該ワクチンは細胞の全部若しくは一部を含みうる。好ましい一態様において、本発明の細胞ワクチンはヒトＡＰＣを含んでなり、また、より好ましい一態様において、ＡＰＣはＤＣである。
【０２１５】
細胞ワクチンは、その免疫能を高めるように本発明によりサイレンスしたＡＰＣから構成され得る。サイレンスしたＡＰＣをその後、抗原をコードする核酸とともにトランスフェクトして抗原負荷細胞を生成させ得る。別の局面において、サイレンスしたＡＰＣは、抗原を含んでなる免疫刺激性タンパク質でパルスして抗原負荷細胞を生成させ得る。本開示に基づき、サイレンスしたＡＰＣをいずれかの型の抗原を使用するいずれかの方法によりパルスして抗原を負荷し得る。加えて、ＡＰＣは、本発明のインヒビターでのＡＰＣのサイレンシング前、それと同時に若しくは後に、いずれかの方法によりパルスし得る。
【０２１６】
本明細書の別の場所に開示されるとおり、細胞は多様な方法を使用して抗原でパルスし得る。本発明の抗原は最低１個のエピトープを含有し、前記エピトープは哺乳動物において免疫応答を導き出すことが可能である。一態様において、抗原は発現ベクターにより発現される。別の態様において、抗原は単離されたポリペプチドである。好ましくは、抗原
は、感染性疾患、癌および自己免疫疾患よりなる群から選択される疾患と関連する。本発明の細胞をパルスするのに有用な多数の好ましい抗原を本明細書の別の場所に開示する。抗原は以下、すなわち腫瘍ライセート、タンパク質、ペプチド、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ベクターから発現された、リポソームなどの最低１種若しくはそれ以上の形態であり得る。
【０２１７】
サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターでサイレンスしたＡＰＣは、強調された免疫能を有し、そして従って高められた免疫応答、すなわち抗原を提示しかつそれに対する免疫応答を活性化する高められた能力を導き出す。本発明によりサイレンスかつパルスしたＡＰＣは、エフェクターＴ細胞を刺激し、そしてサイレンスしていないそれ以外は同一のＡＰＣに比較してそれに対する抗原に対する改良された免疫応答を導き出すことが可能である。
【０２１８】
治療上の応用
本発明は、ＡＰＣのような免疫細胞の免疫能を高めるのに有用な組成物を包含する。ＡＰＣにより提示される抗原に対する応答は、当該技術分野で公知の方法を使用して、細胞傷害性Ｔ細胞応答、ヘルパーＴ細胞応答、および／若しくは抗原に対する抗体応答の誘導をモニターすることにより測定しうる。
【０２１９】
本発明は、抗原組成物と１個若しくはそれ以上のリンパ球を接触させる段階を含んでなる、哺乳動物における免疫応答を高める方法を包含し、該抗原はＡＰＣのような免疫細胞により提示される。本開示に基づき、ＡＰＣをサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターへの曝露によりサイレンスし得、その際にインヒビターへの曝露は該ＡＰＣの免疫能を高める。ＡＰＣは、ＡＰＣを別の方法でパルスするための抗原組成物とのＡＰＣの曝露の前、それと同時に若しくは後に、本明細書に開示される方法を使用してサイレンスし得る。
【０２２０】
高められた免疫応答は能動若しくは受動免疫応答でありうる。該応答は、樹状細胞、Ｂ細胞若しくは単球／マクロファージのようなＡＰＣを哺乳動物（例えば患者）から得、その後抗原組成物を含んでなる組成物でパルスし（免疫細胞を別の方法でサイレンスするためのサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターへの細胞の曝露の前、それと同時に若しくは後に）、そしてその後該ＡＰＣをそれの必要な患者に投与する、養子免疫療法アプローチの一部となりうる。
【０２２１】
該組成物は以下、すなわちサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビター、抗原、サイレンスした免疫細胞、パルスした細胞、および抗原でもまたパルスされるサイレンスした免疫細胞の最低１種若しくはそれ以上のいかなる組合せも包含する。該組成物は、哺乳動物におけるｅｘ  ｖｉｖｏ免疫化および／若しくはｉｎ  ｖｉｖｏ治療のためのワクチンでありうる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０２２２】
ｅｘ  ｖｉｖｏ免疫化に関して、以下、すなわちｉ）細胞のサイレンシング、ｉｉ）細胞のパルス、若しくはｉｉｉ）細胞のサイレンシングおよびパルスの最低１種が、該細胞を哺乳動物に投与する前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで発生する。本発明の免疫細胞（すなわちＡＰＣ）を、該免疫細胞をパルスするための抗原でのＡＰＣの処理の前、それと同時に若しくは後に、本明細書の別の場所に開示される方法を使用してサイレンスし得ることが認識されるべきである。
【０２２３】
別の態様において、サイレンスしたＡＰＣは、抗原への事前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ曝露を伴わずに、それを必要とする患者に投与し得る。すなわち、本発明は、細胞のパルスが患者中でｉｎ  ｖｉｖｏで起こる、患者へのサイレンスしたＡＰＣの投与を包含する。
【０２２４】
なお別の態様において、パルスしたＡＰＣは、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターへの細胞の事前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ曝露を伴わずに、それの必要な患者に投与し得る。すなわち、本発明は、細胞のサイレンシングが患者中でｉｎ  ｖｉｖｏで起こる、患者へのパルスしたＡＰＣの投与を包含する。
【０２２５】
ｅｘ  ｖｉｖｏ処置は当該技術分野で公知であり、そして下により完全に論考する。簡潔には、細胞を哺乳動物（好ましくはヒト）から単離し、そして、本明細書に開示されるサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを発現するベクター若しくはいずれかの他の形態のサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビター（すなわち化学合成したｓｉＲＮＡ）でサイレンス（すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入若しくはトランスフェクト）する。サイレンスした細胞を哺乳動物レシピエントに投与して治療上の利益を提供し得る。哺乳動物レシピエントはヒトであることができ、また、そのようにサイレンスした細胞はレシピエントに関して自己であり得る。あるいは、細胞はレシピエントに関して同種異系、同系若しくは異種であり得る。
【０２２６】
造血幹および前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖の手順は米国特許第５，１９９，９４２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されており、本発明の細胞に適用し得る。他の適する方法が当該技術分野で既知であり、従って、本発明は細胞のいずれかの特定のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖方法に制限されない。簡潔には、ＤＣのｅｘ  ｖｉｖｏ培養および増殖は：（１）末梢血収集物若しくは骨髄外植体から、哺乳動物からのＣＤ３４＋造血幹および前駆細胞を収集すること；ならびに（２）こうした細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させることを含んでなる。米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記述される細胞増殖因子に加え、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドのような他の因子を該細胞の培養および増殖に使用し得る。
【０２２７】
細胞の集団からＣＤ３４＋造血幹若しくは前駆細胞を同定かつ分離するための多様な細胞選択技術が既知である。例えば、モノクローナル抗体（若しくは他の特定の細胞結合タンパク質）を、幹若しくは前駆細胞上で見出されるマーカータンパク質若しくは表面抗原タンパク質に結合させるのに使用し得る。造血幹細胞の数種のこうしたマーカー若しくは表面抗原（すなわちｆｌｔ−３、ＣＤ３４、Ｍｙ−１０およびＴｈｙ−１）が当該技術分野で既知である。
【０２２８】
収集したＣＤ３４＋細胞を適するサイトカインとともに培養する。ＣＤ３４＋細胞をその後分化させ、そして樹状系統の細胞に委任させる（ｃｏｍｍｉｔ）。これらの細胞は、ＣＤ１ａ、ＨＬＡ  ＤＲ、ＣＤ８０および／若しくはＣＤ８６のような樹状細胞に特徴的なマーカーを使用して、フローサイトメトリー若しくは類似の手段によりさらに精製する。ＤＣの培養物の単離後、細胞を本発明の方法により改変し得る。あるいは、前駆細胞を、ＤＣ様細胞に分化される前に改変し得る。
【０２２９】
ｅｘ  ｖｉｖｏ免疫化に関して細胞に基づくワクチンを使用することに加え、本発明は、患者中の抗原に向けられた免疫応答を導き出すためのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のための組成物および方法もまた提供する。
【０２３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化に関して、本発明は、ＡＰＣ中の決定的な制御点を不能にすることによるワクチンの効力を高めるための包括的な手段としてサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターの使用を提供する。であるから、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化に有用なワクチンは最低１種のインヒビター成分を含んでなり、該インヒビター成分はサイトカインシグナル伝達調節物質を阻害することが可能である。別の局面において、該ワクチンはインヒビター成分および抗原成分の双方を含んでなり、該抗原成分は哺乳動物で免疫応答を導き出すことが可能である。
【０２３１】
ｖｉｖｏ免疫化に関して、患者から得られる細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクト若しくは形質導入して、別の方法でサイレンスした細胞を生成させる。細胞はサイトカイン調節物質のインヒビターを発現するベクターでｉｎ  ｖｉｖｏでサイレンスする。あるいは、細胞は、いずれかの他の形態の、ベクターにより発現されない本明細書に開示されるサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビター（すなわち化学合成したｓｉＲＮＡ）を使用してサイレンスする。ｉｎ  ｖｉｖｏでのサイレンスした細胞の生成方法は本明細書の別の場所に論考する。
【０２３２】
ワクチンの別の局面は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞をパルスするのに有用な抗原成分を包含する。いかなる抗原も、本発明のサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターとともに投与し得る。細胞は、インヒビターを含んでなるワクチンでの細胞のサイレンシングの前、それと同時に若しくはその後に、本明細書の別の場所で論考されるところのいかなる方法を使用してもパルスし得る。細胞が同時にパルスかつサイレンスされるべきである場合には、哺乳動物をインヒビターおよび抗原双方を含んでなる単一のワクチンで免疫し得ることが容易に認識される。あるいは、哺乳動物は２種の別個のワクチン（一方はインヒビターを含んでなりかつ第二のワクチンは抗原を含んでなる）で免疫し得る。
【０２３３】
本発明は癌および感染性疾患のためのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化を包含する。一態様において、障害若しくは疾患は、単独の、若しくは患者で抗原に対する免疫応答を生成させるための抗原とともにのｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ投与により処置し得る。本開示に基づけば、抗原性製剤とともにのサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターの投与は、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターの使用を伴わないそれ以外は同一のワクチン接種プロトコルの効力を高める。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わないが、患者での抗原に対する免疫応答は（１）投与されるｓｉＲＮＡ組成物、（２）投与の期間、用量および頻度、（３）患者の全身状態、ならびに適切な場合は（４）投与される抗原組成物に依存する。
【０２３４】
一態様において、哺乳動物は、腫瘍特異的抗原を発現するある型の癌を有する。本発明により、腫瘍特異的抗原配列成分を含んでなる免疫刺激タンパク質を作成し得る。こうした場合、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを、免疫刺激タンパク質とともにそれの必要な患者に投与して、例えば該腫瘍特異的抗原を発現する癌細胞若しくは充実性腫瘍の増殖の遅延若しくは減少、または癌細胞の総数若しくは総腫瘍量の減少により明示される、該患者にとって改良された治療転帰をもたらす。
【０２３５】
関連する一態様Ｎｉｏｉｔｅ、患者は、特定の一抗原、例えばウイルス抗原の発現と関連づけられる、ウイルス、細菌、真菌若しくは他の型の感染症を有すると診断された。本発明により、該抗原、例えばＨＩＶ特異的抗原よりなる配列成分を含んでなる免疫刺激タンパク質を作成しうる。こうした場合、サイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターを、該免疫刺激タンパク質とともにそれの必要な患者に投与して、患者内の原因となる感染性病原体の増殖の遅延、および／若しくは特定の感染性疾患と典型的に関連づけられる検出可能な症状の減少若しくはその排除により明示されるところの、該患者にとって改良された治療転帰をもたらす。
【０２３６】
いずれの状況でも、障害若しくは疾患を、それの必要な患者への抗原とともにのサイトカインシグナル伝達調節物質のインヒビターの投与により処置し得る。本発明は、患者での抗原に対する保護的なＤＣに誘導される免疫応答を生成させるための手段を提供する。本開示に基づけば、当業者は、炎症前サイトカイン（すなわちＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγなど）を、サイトカインシグナル伝達調節物質ワクチンのインヒビターの効力を増大させるために、本明細書に開示される処置レジメンに追加し得る
ことを認識するであろう。
【０２３７】
投薬量および製剤（製薬学的組成物）
本発明は、治療薬、例えばｓｉＲＮＡの投与により、哺乳物における疾患、例えばＨＩＶ感染症、癌などを処置することを予見する。本発明の治療薬の投与は、例えばレシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的であるか若しくは予防的であるか、および当業者に既知の他の要因に依存して、連続的であっても間欠的であってもよい。本発明の剤の投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続的であっても、若しくは、一連の間隔を空けられた用量であってもよい。局所および全身双方の投与を企図している。投与される量は、限定されるものでないが、選ばれた組成物、特定の疾患、哺乳動物の重量、身体状態および齢、ならびに予防が達成されるべきであるか若しくは治療が達成されるべきであるかを挙げることができる多様な要因に依存して変動することができる。こうした要因は、当該技術分野で公知である動物モデル若しくは他の試験系を使用して、臨床家により容易に決定され得る。
【０２３８】
ｓｉＲＮＡの投与は、ｓｉＲＮＡをコードする核酸分子の投与により達成しうる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，５８０，８５９号明細書、Ｐａｒｄｏｌｌら、１９９５；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら  １９９５；Ｍｏｌｌｉｎｇ  １９９７；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら  １９９５；Ｙａｎｇら  ＩＩ；Ａｂｄａｌｌａｈら  １９９５を参照されたい）。核酸の製薬学的製剤、投薬量および投与経路は、全般として、例えばＦｅｌｇｎｅｒら、上記に開示されている。
【０２３９】
下で論考されるとおり場合によっては持続放出のために処方しうる本発明の治療薬（１種若しくは複数）を有する１種若しくはそれ以上の適する単位投薬形態物（例えば微小被包化を使用する、第ＷＯ  ９４／０７５２９号明細書および米国特許第４，９６２，０９１号明細書（それらの開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）は、静脈内および筋肉内径路、ならびに疾患に罹った組織への直接注入によるを包含する非経口を包含する多様な経路により投与し得る。例えば治療薬は腫瘍中に直接注入しうる。製剤は、適切な場合は別個の単位投薬形態物で便宜的に提示することができ、また、薬学に公知の方法のいずれにより製造してもよい。こうした方法は、治療薬を液体担体、固体マトリックス、半固形担体、微粉化した固体担体若しくはそれらの組合せとの連合にもたらす段階、およびその後、必要な場合は生成物を所望の送達系に導入若しくは造形する段階を包含しうる。
【０２４０】
本発明の治療薬を投与のため調製する場合、それらは、好ましくは、製薬学的製剤若しくは単位投薬形態物を形成するように、製薬学的に許容できる担体、希釈剤若しくは賦形剤と組合せる。こうした製剤中の総有効成分は該製剤の０．１から９９．９重量％までを包含する。「製薬学的に許容できるもの」は、製剤の他の成分と適合性でありかつそのレシピエントに対し有害でない担体、希釈剤、賦形剤および／若しくは塩である。投与のための有効成分は、散剤若しくは顆粒剤；溶液、懸濁剤若しくは乳剤として存在しうる。
【０２４１】
本発明の治療薬を含有する製薬学的製剤は、公知かつ容易に入手可能な成分を使用して、当該技術分野で既知の手順により製造し得る。本発明の治療薬はまた、例えば筋肉内、皮下若しくは静脈内経路による非経口投与に適切な溶液としても処方し得る。
【０２４２】
本発明の有効成分の製薬学的製剤はまた、水性若しくは無水の溶液若しくは分散剤の形態、または、あるいは、乳剤若しくは懸濁剤の形態も取り得る。
【０２４３】
従って、治療薬は（例えば注入、例えばボーラス注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）若しくは連続注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）による）非経口投与のため処方することができ、また、ア
ンプル、充填済みシリンジ、小容量の注入容器若しくは添加された保存剤を含む多用量容器中の単位投薬形態物で提示しうる。有効成分は、油性若しくは水性ベヒクル中の懸濁剤、溶液若しくは乳剤のような形態をとることができ、そして、懸濁化剤、安定剤および／若しくは分散助剤のような処方剤を含有しうる。あるいは、有効成分は、使用前に適するベヒクル、例えば滅菌の発熱性物質を含まない水での構成のため、無菌固体の無菌単離、若しくは溶液からの凍結乾燥により得られる粉末の形態にありうる。
【０２４４】
各投薬形態物の個々のエアゾル用量に含有される有効成分（１種若しくは複数）の単位含有量は、それ自体が特定の適応症若しくは疾患を処置するための有効量を構成する必要がないことが認識されるであろう。必要な有効量は複数の投薬量単位の投与により達成され得るためである。さらに、有効量は、投薬形態物中の用量未満を個別に若しくは一連の投与のいずれかで使用して達成しうる。
【０２４５】
本発明の製薬学的製剤は、任意の成分として、当該技術分野で公知である型の製薬学的に許容できる担体、希釈剤、可溶化剤若しくは乳化剤および塩を包含しうる。本発明の製薬学的製剤で有用である担体および／若しくは希釈剤の特定の制限しない例は、水、およびリン酸緩衝生理的食塩水溶液ｐＨ７．０〜８．０のような、生理学的に許容できる緩衝生理的食塩水溶液である。
【０２４６】
本発明の発現ベクター、形質導入した細胞、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（有効成分）は、生物体の身体中の該剤の作用部位との有効成分の接触を生じさせるいずれかの手段により、多様な疾患状態を処置するため処方かつ投与し得る。それらは、個々の治療的有効成分若しくは治療的有効成分の組合せのいずれかとして、医薬品とともにの使用に利用可能ないずれかの慣習的手段により投与し得る。それらは単独で投与し得るが、しかし、一般には、選ばれた投与経路および標準的な製薬学的実務に基づき選択される製薬学的担体とともに投与される。
【０２４７】
一般に、水、適する油、生理的食塩水、水性デキストロース（ブドウ糖）および関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールのようなグリコールが、非経口溶液の適する担体である。非経口投与のための溶液は、有効成分、適する安定剤、および必要な場合は緩衝物質を含有する。単独若しくは組合せのいずれかの硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム若しくはアスコルビン酸のような抗酸化剤が適する安定剤である。クエン酸およびその塩、ならびにエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）もまた使用される。加えて、非経口溶液は、塩化ベンザルコニウム、メチル若しくはプロピルパラベンおよびクロロブタノールのような保存剤を含有し得る。適する製薬学的担体は、この分野の標準的参照教科書、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記述されている。
【０２４８】
本発明の有効成分は、哺乳動物、およびとりわけヒトでの使用に適する製薬学的に許容できる組成物に懸濁されるように処方しうる。こうした製剤は、米国特許第４，０８２，７３５号；同第４，０８２，７３６号；同第４，１０１，５３６号；同第４，１８５，０８９号；同第４，２３５，７７１号；および同第４，４０６，８９０号明細書に記述されるムラミルジペプチド誘導体（ＭＤＰ）若しくはアナログのようなアジュバントの使用を包含する。有用である他のアジュバントは、ミョウバン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、リピドＡ、トレハロースジミコレートおよび臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、フロイントのアジュバントならびにＩＬ−１２を包含する。他の成分は、非イオン性界面活性剤ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｒ））、およびスクアレンのような代謝可能な油（米国特許第４，６０６，９１８号明細書）を包含しうる。
【０２４９】
加えて、標準的な製薬学的方法を使用して作用の持続時間を制御し得る。これらは当該技術分野で公知であり、そして制御放出製剤を包含し、また、適切な巨大分子、例えばポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース若しくはプロタミン硫酸を包含し得る。巨大分子の濃度ならびに取り込みの方法を、放出を制御するために調節し得る。加えて、剤を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）若しくはエチレンビニルアセテートコポリマーのようなポリマー物質の粒子中に取り込み得る。取り込まれることに加え、これらの剤はまた、化合物をマイクロカプセル中に捕捉するのにも使用し得る。
【０２５０】
従って、本発明の製薬学的組成物は、特定の効果を達成するために、哺乳動物の身体中で多様な経路を介してかつ多様な部位に送達しうる（例えばＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１ａ；Ｊａｆｆｅら、上記；Ｂｅｒｋｎｅｒ、上記を参照されたい）。当業者は、１種以上の経路を投与に使用し得るとは言え、特定の一経路が別の経路より即時かつより効果的な反応を提供し得ることを認識するであろう。局所若しくは全身送達は、体腔中への製剤の塗布若しくは滴下、エアゾルの吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）若しくは吸入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）、または筋肉内、静脈内、腹腔、皮下、皮内ならびに局所投与を含んでなる非経口導入を含んでなる投与により達成し得る。
【０２５１】
本発明の有効成分は単位投薬形態物で提供し得、各投薬単位、例えば茶さじ一杯、錠剤、溶液若しくは坐剤は、単独若しくは他の有効成分との適切な組合せの予め決められた量の組成物を含有する。本明細書で使用されるところの「単位投薬形態物」という用語は、ヒトおよび哺乳動物被験体の単位投薬量として適する物理的に別個の単位を指し、各単位は、適切な場合は製薬学的に許容できる希釈剤、単体若しくはベヒクルとともに所望の効果を生じさせるのに十分な量で計算された、予め決められた量の単独若しくは他の有効成分と組合せの本発明の組成物を含有する。本発明の単位投薬形態物の仕様は、達成されるべき特定の効果、および特定宿主中での製薬学的組成物と関連する特定の薬動力学に依存する。
【０２５２】
本明細書に記述されるこれらの方法は決して包括的でなく、そして、特定の応用へのさらなる適合方法が当業者に明らかであろう。さらに、組成物の有効量は、所望の効果を発揮することが既知の化合物への類似によりさらに近似させ得る。
【０２５３】
遺伝子治療の投与
当業者は、細胞中にベクターを投与するのに多様な送達方法を利用しうることを認識している。例は：（１）電気穿孔法（電気）、遺伝子銃（物理的力）のような物理的手段を利用するか若しくは大量の液体を適用する（圧）方法；および（２）前記ベクターをリポソーム、凝集タンパク質若しくは輸送分子のような別の実体と複合体形成させる方法を包含する。
【０２５４】
さらに、実際の用量およびスケジュールは、該組成物が他の製薬学的組成物とともに投与されるかどうかに依存して、若しくは、薬物動態、薬物の体内動態および代謝の個体間の差違に依存して変動し得る。同様に、量は、利用される特定の細胞株に依存して（例えば細胞表面上に存在するベクター受容体の数、若しくは遺伝子移入に使用される特定のベクターのその細胞株中で複製する能力に基づき）ｉｎ  ｖｉｔｒｏの応用で変動し得る。さらに、細胞あたりに添加されるべきベクターの量は、ベクターに挿入される治療的遺伝子の長さおよび安定性、ならびにまた配列の性質とともに変動することがありそうであることができ、そしてとりわけ、経験的に決定される必要があるパラメータであり、かつ、本発明の方法に固有でない要因（例えば合成に伴う費用）により変わり得る。当業者は、特定の状況の要件に従っていかなる必要な調節も容易に行い得る。
【０２５５】
治療薬を含有する細胞は、自殺遺伝子、すなわち細胞を破壊するのに使用し得る産物をコードする遺伝子もまた含有しうる。多くの遺伝子治療の情況において、宿主の細胞中で治療目的上遺伝子を発現することが可能であるがしかしまた随意に宿主細胞を破壊する能力も有することが望ましい。治療薬は、その発現が活性化物質化合物の非存在下で活性化されない自殺遺伝子に連結し得る。剤および自殺遺伝子双方が導入された細胞の死が望ましい場合に、活性化物質化合物を細胞に投与し、それにより自殺遺伝子の発現を活性化しかつ該細胞を死滅させる。使用しうる自殺遺伝子／プロドラッグの組合せの例は、単純疱疹ウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）およびガンシクロビル、アシクロビル；酸化還元酵素およびシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼおよび５−フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジレートキナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）およびＡＺＴ；ならびにデオキシシチジンキナーゼおよびシトシンアラビノシドである。
【０２５６】
本明細書に記述されるこれらの方法は決して包括的でなく、そして特定の応用へのさらなる適合方法が当業者に明らかであろう。さらに、組成物の有効量は、所望の効果を発揮することが既知の化合物への類似によりさらに近似させ得る。
【０２５７】
〔実施例〕
本発明は、今や以下の実施例に関して記述される。これらの実施例は具体的説明の目的上のみ提供され、そして、本発明はこれらの実施例に制限されず、しかしむしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかである全部の変形物を包含する。
【０２５８】
本明細書に開示される実験は、多様な癌および感染性病原体に対する有効なワクチンの開発のためにＤＣを活用するため、ＤＣによる抗原提示の調節を探求するために実施した。本明細書に開示される結果は、免疫細胞における阻害物質を阻害するとして別の方法で既知の負の調節経路を妨害することが、その免疫刺激能力を高めることを示す。細胞の免疫能を強化するため阻害物質を阻害するという概念は、より効果的なワクチンの新規開発方法としてはたらく。
【０２５９】
本明細書に開示される実験で使用した材料および方法を今や記述する。
ｓｉＲＮＡオリゴによるＤＣのトランスフェクション
骨髄ＤＣは、製造元のプロトコル（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、カリフォルニア州サンディエゴに従ってＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒを使用して、２１塩基対のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＴＴ−３’；配列番号３）でもまたトランスフェクトした。簡潔には、２０μＭのオリゴヌクレオチドの溶液３μｌを、３μｌのＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ試薬および９４μｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０に添加した。混合物を２５℃で３０分間インキュベートし、その後１００μｌのＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ／オリゴヌクレオチド混合物を骨髄ＤＣの各ウェルに添加し、そして３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後に、２０％ＦＢＳを補充した５００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０を骨髄ＤＣに添加した。
【０２６０】
レンチウイルスベクターでの骨髄由来ＤＣの形質導入
マウス骨髄由来ＤＣを、当該技術分野で既知の方法を使用して調製した。簡潔には、マウス骨髄を肋骨から洗い流し、ナイロンメッシュを通過させ、そして塩化アンモニウムで赤血球を枯渇させた。ＲＰＭＩ−１６４０で徹底的に洗浄した後に、細胞を、１０％ＦＢＳ、ｍＧＭ−ＣＳＦ／ｍｌ（２０ｎｇ／ｍｌ）および組換えマウスＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ロッキーヒル）を補充した２．５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０とともに培養した。培養第２および４日に上清を除去し、そして２０ｎｇ／ｍｌのｒｍＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−４を含有する新鮮培地と交換した。全部の培養物は５％加湿ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。
非接着顆粒球を培養４８時間後に除去しかつ新鮮培地を添加した。培養７日後、８０％超の細胞が、ＦＡＣＳにより決定されるとおり、特徴的なＤＣ特異的マーカーを発現した。マウス骨髄由来ＤＣ（培養第５ないし７日）の形質導入は、５μｇ／ｍｌのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）の添加を伴い２４ウェルプレートで実施した。ＤＣを洗浄し、そして４００μｌの無血清ＲＰＭＩ  １６４０中２×１０５細胞／ウェルの濃度で２４ウェルプレート中にプレーティングした。細胞は、５×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で、多様な感染多重度（ＭＯＩ）を伴うレンチウイルスベクターに曝露させた。形質導入８時間後に細胞をＰＢＳで洗浄し、そして新鮮な組織培地中でさらにインキュベートした。
【０２６１】
サイトカインおよびウエスタンブロッティング
多様なサイトカインのレベルを、製造元の説明書に従ってＥＬＩＳＡ分析（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州リンカーンパーク）を使用し、細胞培養物の上清を使用し定量した。ウエスタンブロット分析のため、２９３Ｔ細胞を、１０：１の比のマウスＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ若しくは無関係なＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを発現するｐＳＵＰＥＲベクター、およびＦＬＡＧ標識ＳＯＣＳ１ベクターでコトランスフェクトした。細胞を４８時間後に収集しかつＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ）への転写後に、サンプルを、抗Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）若しくはアクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州サンタクルズ）抗体でのウエスタンブロッティング、次いでＥＣＬ−Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ）での検出により分析した。フィルムをデンシトメーターＳＩで走査し、そしてＳＯＣＳ−１／アクチンのバンドをＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で定量した。ＳＯＣＳ１バンドの強度をβ−アクチンのバンドの強度に対し正規化した。
【０２６２】
ＳＯＣＳ１の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
トランスフェクトしたマウスＢＭ−ＤＣ中でのＳＯＣＳ１の相対的発現を、定量的リアルタイムＰＣＲにより評価した。全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して、３．５〜５×１０５のＢＭ−ＤＣから抽出した。各サンプルについて１．０μｇの全ＲＮＡを、ランダムへキサマープライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ第一鎖合成キット（Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて逆転写した。リアルタイム５’−ヌクレアーゼ蛍光発生性ＰＣＲ分析を、鋳型として反応あたり５ｎｇの出発ＲＮＡ原料の同等物を用いる２０μｌの四重の反応で、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティ）で実施した。マウスＳＯＣＳ１（６ＦＡＭ）および１８Ｓリボソーム対照（ＶＩＣ）の予め開発された（ｐｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）プライマー／プローブ組をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティから購入した（ＳＯＣＳ１のプライマー、５’−ＡＣＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＧＣＧＡＣ−３’；配列番号１２、および５’−ＡＡＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＧＣＴＧＡＧＣ−３’；配列番号１３、ならびにハイブリダイゼーションプローブ、６ＦＡＭ−ＴＣＧＣＣＡＡＣＧＧＡＡＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＧ−ＴＡＭＲＡ；配列番号１４）。ＰＣＲパラメータは、ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティ）について推奨されたとおりであり、ＳＯＣＳ１および１８Ｓの反応は別個のチューブで実施した。ＳＯＣＳ１レベルを１８Ｓ  ｒＲＮＡに対し正規化した。擬似トランスフェクトしかつ刺激したＢＭ−ＤＣの対照値に関するＳＯＣＳ１の発現を、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃｔ法（Ｌｉｖａｋら、２００１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８）を使用して計算した。
【０２６３】
ＯＴ−Ｉ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
脾をＯＴ−Ｉマウスから収集し、プールしかつ破壊して単細胞懸濁液を得た。ＣＤ８＋
ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州オーバーン）を使用する陰性染色により収集した。簡潔には、細胞を、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＤＸ５、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）およびＴｅｒ−１１９に特異的なビオチン標識抗体で被覆した。抗ビオチン磁性ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州オーバーン）を細胞に添加し、それをＭＡＣＳ磁石に取付けた分離カラムに渡した。カラムに結合しなかった細胞を収集し、そしてＦＡＣＳにより決定されたとおり９５％超がＣＤ８＋であった。合計５×１０４の精製ＣＤ８＋  ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞および３×１０３の未熟ＤＣを、１０％ＦＣＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳならびに５μＭ  ２−ＭＥを補充した２００μｌのＲＰＭＩ  １６４０培地中で、丸底９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに入れた。増殖を、培養の最後の８時間のウェルあたり１μＣｉの［３Ｈ］ＴｄＲの添加により２日後に測定した。三重の測定を行い、そして三重の実験を代表する。ＯＴ−Ｉ／ＤＣ共培養物中のサイトカイン分泌を、指定されたサイトカインについてのＥＬＩＳＡ分析（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を使用して測定した。
【０２６４】
フローサイトメトリー分析
細胞を、ＦＣγ受容体を前阻害した後に、０．１％ＮａＮ３および２％ＦＣＳを含有するＰＢＳ中で、ＦＩＴＣ、ＰＥ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）若しくはＰｅｒＣｐ結合ｍＡｂで染色した。マウスＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ８（５３−６．７）、ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、ＣＤ４０（３／２３）、ＣＤ８０（１６−１０Ａ１）、ＣＤ８６（ＧＬ１）に特異的なラットｍＡｂ、およびマッチさせたアイソタイプ対照を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼから購入した。染色した細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州リンカーンパーク）フローサイトメーターおよびＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェアで分析した。
【０２６５】
四量体染色
Ｈ２−Ｋｂ／卵アルブミン四量体アッセイを使用して、卵アルブミン特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を検出した。免疫したマウスからの脾細胞若しくはＴ細胞を、ＤＣ免疫化後異なる日に、抗ＣＤ８α−ＦＩＴＣおよびＨ２−Ｋｂ／卵アルブミン（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）−ＰＥ四量体；配列番号１１（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）で二重染色した。四量体染色は、製造元の説明書に従い、１０６細胞あたり１μｇの抗ＣＤ８αおよび１０μｌの卵アルブミン四量体を用いて、４℃で１時間行った。
【０２６６】
エリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）
ＣＴＬペプチドをＣＤ８＋  Ｔ細胞刺激に使用した。ヒトＣＤ２０分子からの無関係のペプチドもまた陰性対照として使用した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ  ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）若しくはＭＡＣＳ  ＣＤ８（Ｌｙ−２）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州オーバーン）を使用することにより脾細胞から単離した。
【０２６７】
ＣＴＬおよびＮＫアッセイ
ＣＤ８＋  ＣＴＬ応答を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激した脾細胞の標的細胞を溶解する能力を測定する標準的なクロム放出アッセイで評価した。免疫したマウスからプールした脾細胞を、ペプチドを含有するＲＰＭＩ−１６４０中ｉｎ  ｖｉｔｒｏで４〜６日間再刺
激した。標的細胞および対照細胞を５１Ｃｒクロム酸ナトリウム溶液で９０分間標識した。多様な数のエフェクター細胞を、９６ウェルＶ字型底プレート（２００μｌ／ウェル）中で一定数の標的細胞（１×１０４／ウェル）とともに３７℃で３時間インキュベートした。三重の培養物からの上清（１００μｌ）を収集した。溶解パーセントを、（実験放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）×１００として計算した。ＮＫ細胞は、１×１０６細胞／ｍｌを５００Ｕ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−２とともに培養することにより、マウスの脾細胞から生成させた。ＮＫ細胞による溶解に高度に感受性であるＹＡＣ−１細胞を５１Ｃｒとともに３７℃で１時間インキュベートし、洗浄し、そして１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。ＮＫ細胞を、多様なＥ：Ｔ細胞比を得るように三重で標的細胞に添加した。インキュベーション後にプレ―トを遠心分離し、そして、上清液体中の放射活性をガンマカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フラートン）でカウントした。
【０２６８】
ＤＣ免疫化および腫瘍モデル
骨髄由来ＤＣ（第５日の骨髄培養物）を、５のＭＯＩのＬＶ−ＳＣＯＳ１−ｓｉＲＮＡ若しくはＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで形質導入した。ＤＣをその後、卵アルブミンタンパク質若しくはＴＲＰ２ペプチドで８時間パルスし、ＰＢＳで３回洗浄し、そして培養物中で追加の３６時間後に免疫化に使用した。いくつかの実験については、抗原パルスＤＣをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で２４時間刺激し、ＰＢＳで洗浄し、そしてその後Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に足蹠を介して注入した。治療モデルにおいて、ＥＧ７若しくはＢ１６腫瘍細胞（２．５ないし５×１０５）を、同系のＣ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下で（ｓ．ｃ．）注入した。腫瘍接種後多様な日にマウスを群に無作為に分割し、そして５０μｌの抗原でパルスし形質導入したＤＣ若しくはＰＢＳ対照を注入した。数匹のマウスで、ワクチン接種後指定された日にＬＰＳを腹腔内で（ｉ．ｐ．）投与した。腫瘍体積を週２若しくは３回、カリパスを用いて測定した。
【０２６９】
統計学的解析
統計学的解析のため、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用し、また、９５％信頼限界を、ｐ＜０．０５と定義される有意であるために採用した。結果は典型的に平均±標準誤差として提示する。
【０２７０】
本実施例に提示される実験の結果を今や記述する。
【実施例１】
【０２７１】
ネズミのＳＯＣ−１  ｓｉＲＮＡの同定および分析
コンピュータプログラムを使用して、マウスＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ配列、すなわちＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ１（ＣＣＴＴＣＣＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＧＡ；配列番号１）、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ２（ＣＡＧＴＣＧＣＣＡＡＣＧＧＡＡＣＴＧＣ；配列番号２）およびＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ３（ＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＴＴ；配列番号３）を選択した。全部の標的配列をＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔのクエリにかけて、他の既知の遺伝子に対する相同性の欠如を確認した。フォワードおよびリバースオリゴを、９ｎｔのスペーサーにより分離されるセンスおよびアンチセンスの１９ｎｔの標的配列をコードするように設計した。この中核的ｓｉＲＮＡ配列を、Ｈ１  ＲＮＡ転写開始および５Ｔターミネーター配列により隣接させ、また、アニーリングに際して５’のＢｇｌＩＩおよび３’のＨｉｎｄＩＩＩ適合性のオーバーハングを組み込んだ。ＤＮＡに基づくｓｉＲＮＡ発現ベクターｐＳＵＰＥＲ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３）は、ｓｉＲＮＡのｄｅ  ｎｏｖｏ合成を指図するのにＨ１−ＲＮＡプロモーターを使用する。合成しかつアニーリングしたオリゴヌクレオチド対を、ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳＵＰＥＲベクターにクローン化した。陽性のクローンを制限消化により同定し、そしてＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２７２】
マウスＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡのためのレンチウイルスベクターの生成および製造
この研究で使用したＨＩＶ移入ベクターはｐＴＲＩＰ  ΔＵ３  ＣＭＶ  ｅＧＦＰであり、内的サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含んでなり、また、転写活性の配列を除去する３’末端反復配列（ＬＴＲ）のＵ３領域中の４００ｂｐの欠失で自己不活性化する（ＳＩＮベクター）。レンチウイルス移入ベクターｐＴＲＩＰΔＵ３  ＣＭＶ  ＧＦＰは、元のｐＨＲ’バックボーンのユニークなＣｌａＩ部位に中央のポリプリン区域（ｔｒａｃｔ）（ｃＰＰＴ）および中央の終止配列（ＣＴＳ）を包含する１７８ｂｐのフラグメントを含有する。ｐＴＲＩＰΔＵ３ＣＭＶ  ＧＦＰを、Ｈ１  ＲＮＡプロモーターからのｓｉＲＮＡの発現、および二シストロン性のブラストサイジン抵抗性／ｅＹＦＰ選択マーカーの共発現のため改変した。クローニングに適合させかつ天然のＣＭＶプロモーターを除去するために、ｐＴＲＩＰベクターの中央ポリプリン区域／中央終止配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）を、プライマー（５’−ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＴＧＧＣ−３’；配列番号４および５’−ＣＴＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＣＣＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’；配列番号５）を使用してＰＣＲ増幅して、クローニングのための５’−ＥｃｏＲＩおよび３’−ＢａｍＨＩ部位を挿入した。ｃＰＰＴ−ＣＴＳ  ＰＣＲ産物をその後ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化し、そしてＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＴＲＩＰΔＵ３ＣＭＶ  ＧＦＰベクターに再挿入した。マーモット転写後調節エレメント（ｗＰＲＥ）配列を、プライマー（５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡ−３’；配列番号６および５’−ＧＡＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧ−３’；配列番号７）を使用してｐＢＳ−ＳＫ−ＷＰＲＥからＰＣＲ増幅して、５’−ＸｈｏＩ／ＳａｌＩおよび３’ＫｐｎＩ部位を付加した。ＷＰＲＥフラグメントをその後ＸｈｏＩ／ＫｐｎＩで消化し、そして改変したｐＴＲＩＰΔＵ３ＣＭＶ  ＧＦＰバックボーンに挿入してｐＴＲＩＰ−Ｗを生成させた。ｓｉＲＮＡおよび二シストロン性選択マーカーのカセットを、ｐＴＲＩＰ−Ｗへの移入のため最初にｐＳＵＰＥＲバックボーンで集成した。二シストロン性選択マーカーＣＭＶ−ＢｌａｓｔｉＲ−ＩＲＥＳ−ｅＹＦＰ（ＢＹ）を、プライマー（５’−ＣＡＧＴＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＣＡＴＴＡＧ−３’；配列番号８および５’−ＣＡＧＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧ−３’；配列番号９）を使用してプラスミドＰＹＡＰ６からＰＣＲ増幅して、５’−ＣｌａＩおよび３’−ＳａｌＩ部位を組み込んだ。ＰＣＲ産物をＣｌａＩおよびＳａｌＩで消化し、その後、ＣｌａＩ／ＳａｌＩで消化したｐＳＵＰＥＲベクターに連結して、Ｈ１−ＲＮＡプロモーターおよびｐＳＵＰＥＲ  ＭＣＳの３’端にＢＹマーカーを付加し、ｐＳＵＰＥＲ−ＢＹを生成させた。ｐＳＵＰＥＲ−ＢＹをその後ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化し、そしてｐＴＲＩＰ−Ｗバックボーンに連結してｐＴＲＩＰ−Ｈ１−ＢＹ−Ｗを生成させた。
【０２７３】
ｈｒＧＦＰ若しくはＳＯＣＳ１（３）  ｓｉＲＮＡヘアピン配列を含有するその後のｐＳＵＰＥＲベクターを、ｐＴＲＩＰ−Ｈ１−ＢＹ−Ｗ中への挿入のためＢｓｔＢＩおよびＣｌａＩで消化して、ｐＴＲＩＰ−ｈｒＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＢＹ−Ｗ（ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ）およびｐＴＲＩＰ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＢＹ−Ｗ（ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ）を生成させた。最終的な３９０ｂｐのスペーサーフラグメントを最終のベクターのＣｌａＩ部位に挿入して、ｓｉＲＮＡの終止配列にＣＭＶプロモーターの開始から間隔をあけた。全部のベクターをＤＮＡ配列決定（Ｌｏｎｅ  Ｓｔａｒ  Ｌａｂｓ、米国テキサス州ヒューストン）により確認した。
【０２７４】
組換えのシュードタイピングしたレンチウイルスベクターを、２９３Ｔ細胞中への３種のプラスミドのコトランスフェクションにより生成した。ＨＩＶ由来のパッケージング構築物ｐＣＭＶΔＲ８．９はＨＩＶ−１  ｇａｇ、およびｐｏｌ前駆体、ならびに調節タンパク質ｔａｔおよびｒｅｖをコードする。水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇ（ＶＳ
Ｖ−Ｇ）をプラスミドｐＭＤ．Ｇから発現させた。シュードタイピングしたレンチウイルスは、ｐＣＭＶΔＲ８．９、ｐＭＤ．ＧおよびレンチウイルスｐＴＲＩＰ  ｓｉＲＮＡ移入ベクターでの２９３Ｔ細胞の一過性リン酸カルシウムコトランスフェクションにより生じさせた。トランスフェクションの６０ないし７２時間後に、４℃で２時間の５０，０００×ｇでの超遠心により上清を濃縮した。ウイルスペレットをＲＰＭＩに再懸濁し、そして将来の研究のため−８０℃で凍結させた。ウイルス力価は、２９３Ｔ細胞を、濃縮したウイルスの連続希釈および８μｇ／ｍｌのＰｏｌｙｂｒｅｎｅとともに６時間インキュベートすること、次いで７２ないし９６時間後のｅＹＦＰ陽性細胞を決定するための蛍光標示式細胞分種（ＦＡＣＳ）分析により測定した。ベクターの力価は後に続くとおり、すなわち力価＝Ｆ×２×Ｃ０／Ｖ×Ｄ（式中、Ｄはウイルス希釈係数であり、Ｖは接種物の容量であり、ＦはｅＹＦＰ陽性２９３Ｔ細胞の頻度であり、そしてＣ０は接種時点での標的細胞の数である）計算した。
【実施例２】
【０２７５】
ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒを用いてのＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡでのネズミＢＭ−ＤＣのトランスフェクションおよびＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡの下方制御
ＤＣによる抗原提示のＤＯＣＳ１調節を検討するため、ＳＯＣＳ１を特異的に下方制御する小分子緩衝ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、下述されるとおり最初に同定した。
【０２７６】
合成ｓｉＲＮＡオリゴ二重鎖を、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＩＬ−４の存在下でＧｅｎＰｏｒｔｅｒにより８３％のトランスフェクション効率でマウス骨髄細胞由来ＤＣにｅｘ  ｖｉｖｏで効率的にトランスフェクトした。簡潔には、骨髄ＤＣを、製造元のプロトコルに従いＧｅｎＰｏｒｔｅｒを使用して、２１塩基対のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＴＴ−３’；配列番号３）でトランスフェクトした。３μｌの２０μＭオリゴヌクレオチドを、３μｌのＧｅｎＰｏｒｔｅｒ試薬および９４μｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０に添加し、そして２５℃で３０分間インキュベートし、その後、１００μｌのＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ／オリゴヌクレオチド混合物を骨髄ＤＣの各ウェルに添加しかつ３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後に、５００μｌ／ウェルの２０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０を骨髄ＤＣに添加した。本開示に基づき、合成ｓｉＲＮＡリゴは、生理学的に許容できる担体の情況で細胞に送達され得る。許容できる担体の一例はリポソームである。
【０２７７】
図１Ａは、ＳＯＣＳ１が、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡを発現するベクターで形質導入した細胞中で下方制御されることを示す。簡潔には、２９３Ｔ細胞を、１０：１の比のマウスＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ若しくは無関係なＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを発現するｐＳＵＰＥＲ（ｐＳＵＰ）ベクター、およびＦＬＡＧ標識ｍＳＯＣＳ１発現ベクターで、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒを使用してコトランスフェクトし、そして４８時間後にウエスタンブロッティングにかけた。ＳＯＣＳ１のバンドの強度をβ−アクチンのバンドのものに対して正規化し、そして相対強度（比）を示す。ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡと呼称されるＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ３（５’−ＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＴＴ−３’；配列番号３）をその後の研究で使用した。
【０２７８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイにより確認されるとおり、ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした全ＤＣ集団におけるＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡのレベルは、ＳＯＣＳ１を下方制御し得ないＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ変異体でトランスフェクトしたＤＣ中のレベルと比較しておよそ６０％、特異的に低下した（図１Ｂ）。加えて、ＳＯＣＳ１発現はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの骨髄ＤＣ培養の間および成熟後により高かったことが観察された。
【０２７９】
ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣが、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの
ような炎症前サイトカインの高められた分泌（図２）、ならびに刺激に際してのＳＴＡＴ１、Ｉ−κＢおよびＪＮＫの高められたリン酸化により示されるとおり、ｓｉＲＮＡ変異体を用いたＤＣがそうであったよりもＬＰＳ若しくはＩＦＮ−γに対しより応答性であったこともまた観察された。図１Ｂは、３回の独立した実験の１つからの２４時間のＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）若しくはＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）に応答してｓｉＲＮＡオリゴ若しくは擬似トランスフェクトしたＤＣにより分泌されたサイトカインのレベルを描く。該ｓｉＲＮＡ変異体（５’−ＡＣＴＡＴＣＴＡＡＧＴＴＡＣＴＡＣＣＣＣＴＴ−３’；配列番号１０）はＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ３配列中に４個の突然変異を含有する。
【０２８０】
これらのデータは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路およびＴＬＲ／ＮＦ−κＢ経路の調節におけるＳＯＣＳ１の報告された関与（Ｈａｎａｄａら  ２００３、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：４３７−４５０；Ｃｈｏｎｇら、２００３、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：４７５−４８７）と一致する。ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣは、ＩＦＮ−γおよびＬＰＳ刺激の前若しくは後のいずれかに、ｓｉＲＮＡ−ＤＣ変異体が示したよりもわずかにより成熟した表現型を示した。双方のトランスフェクトしたＤＣは擬似トランスフェクトしたＤＣよりも成熟しており、ｓｉＲＮＡによるＩＦＮ遺伝子の非特異的活性化の影響を反映しうる。
【実施例３】
【０２８１】
ウイルスベクターでのネズミＢＭ−ＤＣのトランスフェクション
ＳＯＣＳ１がｉｎ  ｖｉｖｏでＤＣの抗原提示を負に調節するかどうかを評価するため、ＳＯＣＳ  ｓｉＲＮＡ若しくは対照の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｓｉＲＮＡを、ＤＣを安定にトランスフェクトすることが可能であり（Ｒｕｂｉｎｓｏｎら、２００３、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６；Ｓｃｈｒｏｅｒｓら、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６：４５１−４５９）、その結果ＳＯＣＳ１サイレンシングの効果をより確実に評価し得るレンチウイルスベクター（ＬＶ）にクローン化した。２種の構築物、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡおよびＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを生成し、双方は本明細書の別の場所に記述される方法により黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）マーカー（図３）を含有する。ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ若しくはＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡベクターいずれかでの骨髄由来ＤＣ（８０％超がＣＤ１１ｃ＋）の形質導入は、５８〜６３％のＹＦＰについて陽性の培養細胞を慣例に生じた。ｓｉＲＮＡオリゴでトランスフェクトしたＤＣでの以前の観察結果と一致して、全形質導入ＤＣ集団でより低レベルのＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡ、およびＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣと比較してのＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの刺激に際しての炎症前サイトカインの高められた分泌が観察された。形質導入したＤＣでのＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡのレベルを測定するため、ＹＦＰ＋で形質導入したＤＣを、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して単離し、そしてＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡの相対的発現をその後、リアルタイム定量的ＰＣＲにより測定した。ＹＦＰ＋のＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ集団でのＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡのレベルは、擬似形質導入したＤＣでのレベルに比較して約９０％より低かったことが観察された。ＬＰＳ刺激を伴い若しくは伴わずのいずれかでＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡおよびＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで形質導入したＤＣは、匹敵するレベルのＣＤ８６およびＣＤ４０発現を示した。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わないが、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが擬似ＤＣよりも高レベルのＣＤ８６およびＣＤ４０をもたらしたという観察結果は、ｓｉＲＮＡおよびレンチウイルス形質導入による非特異的活性化の影響によることがありそうであると考えられる。
【実施例４】
【０２８２】
マウスＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより誘導されるＯＶＡ特異的ＣＴＬおよび抗腫瘍活性
次の一連の実験は、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のＤＣ刺激がＳＯＣＳ
１により調節されるかどうかを試験するために実施した。未熟ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ、若しくは成熟させるためさらに刺激されていないｓｉＲＮＡ変異体ＤＣを、卵アルブミン−Ｉペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；配列番号１１）でパルスし、そして卵アルブミン特異的ＴＣＲ  Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ）と共培養した場合、ＯＴ−Ｉ細胞は、ｓｉＲＮＡ−ＤＣ変異体共培養物中よりもＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ共培養物中でより増殖した（図４Ａ）。これらのデータと一致して、より高レベルの炎症前サイトカインがＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ１−ＤＣ共培養中物で分泌された（図４Ｂ）。加えて、これらの細胞を示すＣＴＬアッセイは、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣとの共培養後に卵アルブミン＋同系ＥＧ７細胞に対するより活発な細胞傷害性を示し、ＳＯＣＳ１が抗原特異的Ｔ細胞のＤＣ刺激の調節に寄与することを示した。
【０２８３】
ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原特異的応答を刺激するＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの能力を、ｅｘ  ｖｉｖｏ成熟の非存在下に卵アルブミンでパルスし形質導入したＤＣでマウスを直接免疫することにより、次に試験した。四量体染色は、全ＣＤ８＋  Ｔ細胞の２．３％が、それぞれＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ若しくは擬似ＤＣで免疫したマウスでのわずか０．６４％および０．４３％と比較して、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫したマウスで、卵アルブミン四量体について陽性であったことを示した（図５Ａ）。ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ若しくはＬＶ−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ−ＤＣの間の表面成熟マーカーには小さな差違しか存在しないため、これらのデータは、増大したＤＣ成熟がＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの機能的効力に寄与する単独の要因でなかったことを示唆する。免疫したマウスでのＣＤ８＋  Ｔ細胞の機能の状態を、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してさらに評価した。未熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫したマウスは、それぞれ未熟な擬似ＤＣ若しくはＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣを与えたものでの１および１８個のスポットと比較して、２×１０５のＣＤ８＋  Ｔ細胞あたり６８個のＩＦＮγ＋スポットを有した（図５Ｂ）。これらの結果は、未熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣを与えたマウスからの脾細胞の卵アルブミン＋標的細胞に対するより強力な細胞傷害性を示すＣＴＬアッセイと一致した（図５Ｃ）。未熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化は、観察可能な強力な抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔヘルパー応答もまた誘導した。従って、ＳＯＣＳ１サイレンシングは、未熟な抗原提示ＤＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原特異的ＣＤ８＋  ＣＴＬ応答を刺激することが可能な免疫原性状態を獲得することを可能にした。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わないが、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣは前もっての成熟を伴わずに適応免疫を刺激するため、ＳＯＣＳ１はＤＣの免疫寛容誘発状態の維持において調節的役割を演じていると考えられる。
【０２８４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの成熟ＤＣのＳＯＣＳ１媒介性の調節
以下の実験は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣによるＣＴＬ応答の予備刺激が、前もっての成熟を伴わずに内因性の環境刺激に応答してのＤＣの高められた成熟に由来したかどうかを検討するために実施した。卵アルブミンでパルスしたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣをｅｘ  ｖｉｖｏでＬＰＳで２４時間最初に成熟させ、そしてその後マウスにそれらを投与する前に３回洗浄した。ＬＰＳで成熟させたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは、成熟させたＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣのものに匹敵する成熟表現型を示し、そして、双方のＤＣはｅｘ  ｖｉｖｏ成熟の非存在下でＤＣより強力にＣＴＬを刺激した。しかしながら、成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは、卵アルブミン四量体染色により示されるとおり、抗原特異的ＣＴＬの誘導において、成熟させたＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣよりなお明瞭に優れていた（図５Ａ）。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイもまた、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでの高められた卵アルブミン特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示し（図５Ｂ）、ＳＯＣＳ１サイレンシングが、内因性の環境刺激に対する成熟させたＤＣのより大きな応答性を可能にし、高められたＣＴＬ応答に至ることを示唆した。
【０２８５】
さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ試験において、１日前に未熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫したマウスにＬＰＳを１回注入した。この刺激は、未熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでＣＴＬ応答を有意に（Ｐ＜０．０１）後押しした（ＣＤ８＋  Ｔ細胞中で７．８７％の卵アルブミン四量体＋）が、しかし未熟ＤＣ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡマウスでより少なく効果的であった（ＣＤ８＋  Ｔ細胞中で０．６４％の卵アルブミン四量体＋）（図６Ａ）。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＬＰＳ刺激後の未熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでの高められた卵アルブミン特異的ＣＴＬ応答が、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより確認された（図６Ｂ）。
【０２８６】
環境刺激に応答しての成熟させたＤＣのシグナル伝達がＴ細胞予備刺激においてある役割を演じているかどうかを試験するため、ｅｘ  ｖｉｖｏで成熟させたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで１日前に免疫したマウスに、ＬＰＳを１回若しくは反復して注入した。ＬＰＳ注入は、成熟させたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでのＣＴＬ応答を有意に（Ｐ＜０．０１）後押しし、Ｔ細胞応答を刺激するための成熟させたＤＣのシグナル伝達の重要性を示した（図６Ｃおよび６Ｄ）。さらに、ＬＰＳ注入は、成熟させたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫したマウスでの卵アルブミン特異的ＣＴＬ応答を後押しするのにより効果的であった。
【０２８７】
反復ＬＰＳ刺激に対するＤＣ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡの応答性を直接検査するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内毒素免疫寛容を発生させるＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣおよびＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力を評価した。ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは、高レベルの炎症前サイトカインを産生することにより反復ＬＰＳ刺激になお強く応答したが、しかしＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣはせず、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが刺激に継続的に応答することを示唆した。加えて、天然の危険分子として機能する熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のような内因性刺激に対するＤＣ応答性の閾値が、ＳＯＣＳ１サイレンシングにより低下した。
【０２８８】
一緒にすれば、これらのデータは、ＤＣ中のＳＯＣＳ１のサイレンシングがＤＣ応答性の閾値を低下させかつ未熟および成熟させた抗原提示ＤＣが内因性刺激に継続的に応答することを可能にして、高められた抗原特異的ＣＴＬ応答をもたらすことがありそうであることを示す。この機構は、成熟させたＤＣによる抗原提示の程度、およびこれゆえに適応免疫の大きさの制御におけるＳＯＣＳ１の決定的な役割を強調する。
ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣ免疫化のｉｎ  ｖｉｖｏ刺激による増強
サイトカイン若しくはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストでのｉｎ  ｖｉｖｏ刺激がＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの効力をさらに高める得かどうかを検討するため、ＯＶＡでパルスしたＤＣ−ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡで免疫したマウスに、ＬＰＳ（３０μｇ／マウス）、ＣｐＧ（６０μｇ／マウス）、ポリＩ：Ｃ（５０μｇ／マウス）、抗ＣＤ４０（１００μｇ／マウス）、若しくはＩＦＮ−ｇ（１μｇ／マウス）をｉ．ｐ．で１日１回３連続日注入した。これらの刺激がＤＣ−ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡマウスにより誘導されるＣＴＬ応答を優先的に後押ししたことが観察された（図６Ｅ）。これらの結果は、多くの刺激が、ＬＰＳに加え、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの免疫化の効力をさらに高め得ることを示す。
【０２８９】
ＤＣ中のＳＯＣＳ１サイレンシングによる抗腫瘍免疫の増強
ＤＣ抗原提示におけるＳＯＣＳ１の観察された調節的役割は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが、より強力な抗原特異的抗腫瘍免疫を誘導して、予め確立された腫瘍増殖の制御に至りうるかどうかの検討を促した。ｅｘ  ｖｉｖｏ成熟の非存在下での卵アルブミンでパルスしたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化は、ｅｘ  ｖｉｖｏ成熟の非存在下の卵アルブミンでパルスしたＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ若しくは擬似ＤＣ
を与えたマウスでの腫瘍増殖の穏やかな低下と対照的に、試験した全部のマウスで、予め確立された卵アルブミン＋  ＥＧ７腫瘍の増殖を完全に阻害した（図７Ａ）。ｉｎ  ｖｉｖｏ抗体ブロッキング実験は、抗ＣＤ８抗体ブロッキングが、卵アルブミンでパルスしたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘導された抗腫瘍活性を消失させ（図７Ｂ）、抗腫瘍応答におけるＣＤ８＋  ＣＴＬの決定的な役割を示したが、しかし抗ＣＤ４はしなかったことを示した。
【０２９０】
ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ二重鎖でトランスフェクトしたＤＣが高められた抗腫瘍活性を有するかどうかを試験するため、ＤＣをＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ二重鎖若しくは対照オリゴ二重鎖でトランスフェクトした。マウスの群をその後、ＯＶＡ若しくはＴＣ−１腫瘍ライセートでパルスした、トランスフェクトしたＤＣで免疫した。パルスしたＤＣでのマウスの免疫化後に、マウスをＬＰＳ（３０μｇ／マウス）でｉｎ  ｖｉｖｏで３回刺激した。ＤＣ免疫の２週後に、免疫したマウスをＯＶＡ＋  ＥＧ７腫瘍若しくはＴＣ−１腫瘍で攻撃した。高められた抗腫瘍活性がＥＧ７およびＴＣ−１双方の腫瘍モデルで観察された（図７Ｃおよび７Ｄ）。さらに、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＴＣ−１腫瘍ライセートでパルスしたＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴＤＣで免疫したマウスで、高められた腫瘍特異的ＣＴＬ応答を示した（図７Ｅ）。
【０２９１】
ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣは自己腫瘍関連抗原に対する免疫応答を高め得るかどうかをさらに試験した。これらの実験のため、弱く免疫原性のＢ１６黒色腫細胞中で天然に発現されるネズミのメラノサイト分化抗原、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）２を使用した。Ｃ５６ＢＬ／６マウスにＢ１６腫瘍細胞を接種し、そして３日後、ｅｘ  ｖｉｖｏでＬＰＳで刺激したＴＲＰ２ペプチドでパルスした成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ若しくはＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで１回処理した。成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは、予め確立されたＢ１６腫瘍の増殖を効果的に阻害した一方、成熟ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣはいかなる阻害効果も有しなかった（図８Ａ）。高められた抗腫瘍活性は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＣＴＬアッセイにより検出されるとおり、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでの強力なＴＲＰ２特異的ＣＴＬ応答と相関した（図８Ｂおよび８Ｃ）。活発なＮＫ活性は成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣを与えたマウスでのみ検出された。卵アルブミン＋のＥＧ７腫瘍での結果と対照的に、未熟なＴＲＰ２パルスしたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化は、Ｂ１６腫瘍に対する有意の（Ｐ＞０．０５）阻害効果を生じさせることに失敗し、ＤＣの完全な成熟および成熟後の継続的シグナル伝達が効果的な抗腫瘍免疫を生成させるのに必要とされることを示唆した。外来抗原（卵アルブミン）に対するＣＴＬ応答に対するＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ形質導入の非特異的刺激効果が一貫して観察された。しかしながら、該非特異的刺激効果は自己抗原（ＴＲＰ２）に対するＣＴＬ応答を高めるのに不十分であった。
【０２９２】
ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化により誘導される可能な有害な自己免疫の病状を検査した。ＴＲＰ２でパルスした、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣで免疫したマウスの色素脱失（白斑）が観察された。しかしながら、卵アルブミン若しくはＴＲＰ２でパルスしたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫した２００以上のマウスで、免疫化後３か月まで、他の明らかな毒性は観察されなかった。免疫したマウスの全部の主要な器官および組織の組織学的分析は病理学的炎症を示さず、また、免疫組織化学的染色は腎におけるＩｇＧ若しくはＩｇＭ沈着を示さなかった。ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）および抗ｄｓＤＮＡのレベルはＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣおよび擬似ＤＣマウスで比較可能であった。これらのデータは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ免疫化がマウスで病理学的炎症を引き起こさないことを示唆する。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わないが、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣは、予め確立された弱く免疫原性の腫瘍の増殖を阻害することが可能な、効果的な抗原特異的抗腫瘍免疫を誘導する強く高められた能力を有すると考えられる。
【０２９３】
ＳＯＣＳ１のサイレンシングはＤＣによる抗原提示および抗原特異的抗腫瘍免疫を高める
本明細書に提示される結果は、ＤＣの刺激能力および適応免疫の大きさがＤＣ中でＳＯＣＳ１により決定的に調節されることを示す。抗原提示ＤＣ中のＳＯＣＳ１をサイレンシングすることは抗原特異的抗腫瘍免疫を強く高める。ＳＯＣＳ１は、ＤＣによる抗原提示および適応免疫の大きさを質的および量的に制御するための阻害機構を表す。
【０２９４】
本開示は、成熟させたＤＣによる抗原提示の程度の調節におけるＳＯＣＳ１の決定的な役割を示し、これゆえに、適応免疫の大きさおよび持続時間をＤＣに制御させる調節機構を示す。ＤＣの免疫寛容誘発状態の維持におけるＳＯＣＳ１の重要性は、野性型ＣＤと対照的に、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが、ｅｘ  ｖｉｖｏ成熟の必要の非存在下にｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞応答を刺激する刺激性抗原提示能力を与えられるため、本明細書で例示される。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わないが、ＤＣ中のＳＯＣＳ１が適応免疫の大きさを制御する正確な機構は、抗原ペプチド提示、共刺激／共阻害、ならびにサイトカイン、微生物産物およびおそらくまた細胞と細胞の接触での刺激に応答してのサイトカイン産生に関しての成熟ＤＣのシグナル伝達および出力の調節を必要とすると考えられる。
【０２９５】
成熟ＤＣは、一般に、制限された数の研究に基づき寿命が短いと考えられる。しかしながら、信頼できる遺伝子の方法を使用する最近の研究は、成熟抗原提示ＤＣの寿命が以前に推測されたよりはるかにより長く、ｉｎ  ｖｉｖｏで２週持続し、成熟ＤＣによる抗原提示の程度の調節の必要性および重要性を裏付けることを示している。
【０２９６】
本発明は、ＤＣ中の決定的な抑制機構を不能にすることにより腫瘍ワクチンの効力を高めるための包括的手段としてのＤＣ中のＳＯＣＳ１サイレンシングの新規原理に関する。ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣを用いるワクチン接種は、抗原特異的抗腫瘍免疫を強く高める。ＳＯＣＳ１サイレンシングが、抗原を提示する免疫原性ＤＣがｉｎ  ｖｉｖｏで抗原特異的Ｔ細胞を持続的に刺激することを可能にするからである。ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣは、ＤＣ成熟、および制御性Ｔ細胞抑制を阻害するＩＬ−６のような炎症前サイトカインの産生を高めることにより、制御性Ｔ細胞のスイッチを切ることが可能である。
【０２９７】
Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４の阻害は免疫寛容を効果的に破壊しかつ腫瘍ワクチンの効力を高めるが、しかし、患者において重度の非特異的自己免疫性炎症を引き起こす。抗原提示レベルでＤＣ中のＳＯＣＳ１を標的とすることにより、より抗原特異的な抗腫瘍応答を達成し得る。第一に、腫瘍関連抗原が豊富に負荷されている、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣでの免疫化は、エフェクターＣＴＬへのＣＴＬＡ−４のターゲッティング（生存正常組織に対し自己反応性Ｔ細胞を不可避的に活性化するアプローチ）と対照的に、抗原特異的免疫を誘導しうる。第二に、残余のＳＯＣＳ１レベルを伴う部分的にＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの使用は、重度の自己免疫性炎症を引き起こさないかもしれない。ヘテロ接合性のＳＯＣＳ１＋／−マウスは自己免疫性の炎症の兆候を示さないか、若しくは軽度にのみ示すからである。加えて、ＳＯＣＳ１−／−マウスで見られる重度の自己免疫性炎症は、ＤＣでのみならず、しかしまたＴおよびＮＫＴ細胞のような免疫細胞の他の系統でもＳＯＣＳ１の完全な欠乏を必要とする。本明細書に提示される結果は、抗原提示および適応免疫の量的および質的な調節を理解するためのみならず、しかしまたＤＣの刺激性の潜在能力を高めることによる癌および感染性疾患に対する効果的なワクチンの開発のための洞察も提供する。
【実施例５】
【０２９８】
マウスＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより誘導されるＴＲＰ２特異的ＣＴＬおよび抗腫瘍活性
本開示は、成熟ＤＣ中でＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡで低下させたＳＯＣＳ１発現を発現するレンチウイルスベクターが、自己抗原特異的ＣＴＬ応答の大きさを増大させ得ることを示す。マウスメラノサイト分化抗原、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）を、この研究のモデル自己抗原として使用した。ＴＲＰ２は、それが正常なメラノサイトおよび弱く免疫原性のＢ１６黒色腫細胞の双方で天然に発現され、かつ、複数のＭＨＣクラスＩエピトープがＴＲＰ２中で同定されている（ｖａｎ  Ｅｌｓａｓら、２００１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：４８１−９）ために使用した。
【０２９９】
本実施例に提示される実験で使用した材料および方法を今や記述する。
マウス／動物モデル
４ないし６週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６、ＣＤ４  ＫＯ、ＣＤ８  ＫＯ若しくはｐ３５（ＩＬ−１２）ＫＯマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メーン州ベンハーバー）から購入し、そして、ベイラー医科大学（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（米国テキサス州ヒューストン）の無菌マウス施設で施設のガイドラインに従い維持した。
【０３００】
ペプチド
Ｈ２−Ｋｂ拘束性ＴＲＰ２ａ（ＶＹＤＦＦＶＷＬ；配列番号１５）およびＴＲＰ２ｂ（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ；配列番号１６）（ｖａｎ  Ｅｌｓａｓら、２００１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：４８１−９）、ならびに対照Ｈ２−Ｋｂ拘束性ＯＶＡ−Ｉ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；配列番号１１）は、Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）により合成かつＨＰＬＣにより＞９５％純度まで精製した。全部のペプチドは、無エンドトキシンＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）での最終希釈前にＤＭＳＯに溶解した。
【０３０１】
レンチウイルスベクターでのＢＭ由来ＤＣの形質導入
組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡおよびＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ）は、本明細書の別の場所に記述されるとおり製造し、滴定し、そしてＤＣを形質導入するのに使用した。
【０３０２】
サイトカインＥＬＩＳＡおよびエリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ
多様な炎症前サイトカインのレベルを、ＥＬＩＳＡ分析のためのＤＣ培養物の上清（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州リンカーンパーク）を使用し、製造元の説明書に従って、指定された時間点および指定された刺激を伴い、定量した。単離したＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋  Ｔ細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、Ｈｕａｎｇら、２００３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７３２１−９に記述されたとおり実施した。Ｈ２−Ｋｂ／ＴＲＰ２クラスＩペプチドをマウスＣＤ８＋  Ｔ細胞刺激に使用した。ＯＶＡからの無関係なペプチドもまた陰性対照として使用した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ  ＣＤ８（Ｌｙ−２）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州オーバーン）を使用することにより脾細胞から単離した。
【０３０３】
フローサイトメトリー分析
細胞は、０．１％ＮａＮ３および２％ＦＣＳを含有するＰＢＳ中でＦＩＴＣ若しくはＰＥ  ｍＡｂで染色した。マウスＣＤ８（５３−６．７）、ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、ＣＤ４０（３／２３）、ＣＤ８０（１６−１０Ａ１）、ＣＤ８６（ＧＬ１）、ＯＸ４０Ｌ（ＲＭ１３４Ｌ）若しくはＰＤＬ１（ＭＩＨ５）に特異的な抗体、およびマッチさせたアイソタイプ対照は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ニュージャージー州フランクリンレイクス）若しくはｅＢｉｏｓｃｅｎｃｅ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。染色した細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州リンカーンパーク、ニュージャージー州フランクリンレイクス）フローサイトメーターで分析した。
【０３０４】
四量体染色
Ｈ２−Ｋｂ／ＴＲＰ２−ＰＥ四量体アッセイを使用して、ＴＲＰ２特異的マウスＣＤ８＋  Ｔ細胞を検出した。ＴＲＰ２−四量体は、ベイラー医科大学（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＴｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（米国テキサス州ヒューストン）で合成した。免疫したマウスからの脾細胞を、抗ＣＤ８α−ＦＩＴＣ／抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰおよびＨ２−Ｋｂ／ＴＲＰ２−ＰＥで共染色した。四量体染色は、製造元の説明書に従い、１０６細胞あたり１μｇの抗ＣＤ８α−ＦｉｔｃおよびＴＲＰ２−ＰＥ四量体の１００倍希釈を用いて４℃で１時間行った。
【０３０５】
ＤＣ免疫化および腫瘍マウス試験
ＢＭ由来ＤＣ（第４〜５日のＢＭ培養物）を、本明細書の別の場所に記述されるとおり、５のＭＯＩのＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ若しくはＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで形質導入した。簡潔には、ＤＣをペプチドで２０時間パルスし、ＰＢＳで３回洗浄し、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）若しくはＴＮＦα（５００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）で２４時間刺激し、ＰＢＳで３回洗浄し、そしてその後、Ｃ５７ＢＬ／６、ＣＤ８  ＫＯ、ＣＤ４  ＫＯ若しくはｐ３５  ＫＯマウスに後足蹠を介して注入した。治療モデルにおいては、Ｂ１６腫瘍細胞（２．５×１０５）を同系マウスの右脇腹に皮下で（ｓ．ｃ．）注入して腫瘍モデルを確立した。腫瘍接種後３日に、マウスを群に無作為に分割し、そして、３０μｌのペプチドでパルスし（５０μｇ／ｍｌ）形質導入したＤＣ（１．５×１０６）若しくはＰＢＳ対照を注入した。若干のマウスでは、ＬＰＳ（３０μｇ／マウス）若しくは組換えのネズミＩＬ−１２タンパク質（１μｇ／マウス、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）を、ＤＣワクチン接種後指定された日に腹腔内に（ｉ．ｐ．）投与した。腫瘍体積は、実験が完了するまで２日おきにカリパスで測定した。
【０３０６】
ＣＴＬアッセイ
ＣＤ８＋  ＣＴＬ応答を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激した脾細胞の標的細胞を溶解する能力を測定する標準的クロム放出アッセイ（Ｈｕａｎｇら、２００３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７３２１−９）で評価した。２〜３回免疫したマウスからプールした脾細胞を、Ｈ２−Ｋｂ／ＴＲＰ２ペプチドを含有するＲＰＭＩ−１６４０中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで４〜６日間再刺激した。ＴＲＰ２＋の標的Ｂ１６細胞（Ｈ２−Ｋｂ）および対照ＥＧ．７細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）を、５１Ｃｒクロム酸ナトリウム溶液で３７℃で振とうしながら９０分間標識した。多様な数のエフェクター細胞を、一定数の標的細胞（５×１０４／ウェル）とともに９６ウェルＵ字型底プレート（２００μｌ／ウェル）中３７℃で４時間インキュベートした。三重の培養物からの上清を収集しかつ分析した。溶解パーセントを、（実験放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）×１００として計算した。
【０３０７】
統計学的解析
統計学的解析にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用し、また、９５％信頼限界を、ｐ＜０．０５と定義される有意であるために採用した。結果は典型的に平均±標準誤差（ＳＥ）として提示する。
【０３０８】
本実施例で提示される実験の結果を今や記述する。
ＳＯＣＳ１により拘束される成熟ＤＣ中でのシグナル伝達は、自己抗原特異的ＣＴＬ応答および免疫寛容の大きさを制御する。
【０３０９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ｅｘ  ｖｉｖｏでＬＰＳで成熟させた、ＴＲＰ２ペプチドでパルスし形質導入したＤＣで免疫した。免疫したマウスをその後、ＬＰＳの存在若しくは非存在下でｉｎ  ｖｉｖｏで１若しくは３回刺激し、そしてＴＲＰ２特異的ＣＴＬ応答を、四量体分析を使用して測定した。ＬＰＳは、それが誘導する炎症前サイトカインの大きな数（その多くはＳＯＣＳ１により調節される）ならびにＮＦ−κＢ（ｐ６５）シグナル伝達の直接調節におけるＳＯＣＳ１の報告された役割（Ｒｙｏら、２００３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１２：１４１３−２６）のため、ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激に選んだ。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＰＳ刺激の非存在下で、全ＣＤ８＋  Ｔ細胞の５．１％が、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスでのわずか３．１％と比較して、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスでＴＲＰ２−四量体について陽性であった（図９Ａ）。１若しくは３回のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＬＰＳ刺激で、ＴＲＰ２−四量体について陽性のＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率は、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスで実質的に増大した（それぞれ９．７％および１９．４％）が、しかし、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスでは概して不変であった（それぞれ３．０％および４．０％）（図９Ａ）。一致して、ＣＴＬアッセイ（図９Ｃ）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳＰＯＴが類似の結果を示した。さらに、白斑（外被の白化、色素脱失および／若しくは脱毛）が、ＬＰＳと共注入した、ＴＲＰ２ペプチドでパルスしたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスの大部分で免疫化後３か月に明らかであり（図９Ｂ）、宿主メラノサイト中で通常発現されるＴＲＰ２に対する自己寛容の破綻を示す。対照的に、白斑は、反復したｉｎ  ｖｉｖｏ  ＬＰＳ投与を伴ってさえ、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスのいずれでも観察されず、自己抗原に対する免疫寛容を維持するためのＤＣにおけるＳＯＣＳ１の決定的な役割を示唆した。これらの結果は、成熟抗原提示ＤＣでのシグナル伝達がＣＴＬ応答の大きさおよび自己寛容を制御すること、ならびに成熟ＤＣのシグナル伝達がＳＯＣＳ１により厳密に拘束されることを示す。
【０３１０】
ＳＯＣＳ１拘束性シグナル伝達は、自己寛容を破壊しかつ効果的な抗腫瘍免疫を誘導するＤＣの能力を制御する
腫瘍ワクチン接種の主目的は、腫瘍細胞上で優先的に発現される自己抗原に対する強い適応免疫応答を誘導することにより自己寛容を破壊することである。自己抗原特異的ＣＴＬ応答の大きさおよび自己寛容の調節におけるＳＯＣＳ１の観察された役割は、効果的な抗腫瘍免疫を誘導する成熟ＤＣの能力がＳＯＣＳ１発現により制御されるかどうかの検討を促した。これを試験するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６腫瘍細胞を皮下に接種し、そして３日後、ＬＰＳでｅｘ  ｖｉｖｏで成熟させたＴＲＰ２でパルスし形質導入したＤＣで１回免疫した。図１０Ａは、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ免疫化単独が、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ免疫化に比較してＢ１６腫瘍の増殖を有意に阻害することが可能であった（Ｐ＜０．０１）ことを示す。しかしながら、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスの５０％が、腫瘍接種３０日後に＞１，５００ｍｍ３の腫瘍量のため最終的に死亡した。炎症前シグナルを高めることによりＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスでマウスの生存が向上され得るかどうかを決定するため、マウスをＤＣ免疫化１日後にＬＰＳでｉｎ  ｖｉｖｏで１回刺激した。免疫化プロトコルへのＬＰＳ刺激の追加は、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスでＢ１６腫瘍の増殖を実質的に阻害した（図１０Ｂ）。これは、ＬＰＳで刺激しないマウスと比較して腫瘍量の低下を示さなかった、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣおよび擬似形質導入したＤＣ対照と対照的であった（図１０Ａおよび１０Ｂを比較されたい）。ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ免疫化およびＬＰＳ攻撃の組合せはまた、マウス生存を６０日超の間１００％に劇的に増大させた（図１０Ｃ）。高められた抗腫瘍活性は、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスでの強力なＴＲＰ２特異的ＣＴＬ活性と相関した（図１０Ｄ）。ＣＤ４およびＣＤ８ノックアウト（ＫＯ）マウスをＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫することにより、抗腫瘍活性がＣＤ８＋およびＣＤ４＋双方の細胞を必要とすることがさらに示されたが、とは言え弱い抗腫瘍活性が免疫したＣＤ４  ＫＯマウスで観察された（図１０ｂ〜１０Ｄ）。集合的に、これらの結果は、成熟ＤＣにおけるＳＯＣＳ１拘束性のシグナル伝達が、免疫寛容を破壊しかつ効果的な抗腫瘍免疫を誘導するそれらの能力を制御すること、および、通常ＳＯＣＳ１により調節される付加的な炎症前シグナルが、予め確立された腫瘍量を制御する誘導された抗腫瘍免疫応答の能力をさらに増大させ得ることを示す。
【０３１１】
自己寛容および抗腫瘍免疫の制御におけるＳＯＣＳ１拘束性シグナル３の決定的な役割
ＳＯＣＳ１が、抗原ペプチド／ＭＨＣの提示、共刺激ならびに／若しくはサイトカインのシグナル伝達および分泌を調節することにより成熟ＤＣのシグナル伝達および出力に影響することがありそうである。以下の実験は、これら３種のシグナル（１種若しくは複数）のいずれが、自己抗原特異的ＣＴＬ応答および抗腫瘍免疫の制御のためにＳＯＣＳ１により主に調節されるかを検討するために着手した。
【０３１２】
ＳＯＣＳ１サイレンシングが共刺激分子（シグナル２）の発現に影響するかどうかを最初に試験した。フローサイトメトリーアッセイにより、ＬＰＳで誘導される成熟の前および後双方で、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ上に、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ上でのものと比較して、検出不可能な若しくはわずかにのみ高められた表面レベルの共刺激／阻害分子（Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０若しくはＰＤＬ  １）が存在したことが一貫して観察された（図１１Ａ）。比較可能なレベルのＭＨＣ−ＩおよびＩＩ分子は、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣおよびＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ上でもまた検出された。
【０３１３】
抗腫瘍免疫の誘導におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞の重要性を考え、ＭＨＣ−Ｉ拘束性ペプチドの免疫原性（ＴＣＲ親和性）がｉｎ  ｖｉｖｏでＳＯＣＳ１拘束性の抗原提示で重要な役割を演じているかどうかをさらに検討した。高親和性の形態（ＴＲＰ２ｂ）および低親和性の形態（ＴＲＰ２ａ）のＴＲＰ２  ＣＴＬペプチドが以前に同定された（ｖａｎ  Ｅｌｓａｓら、２００１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：４８１−９）ため、双方のＴＲＰ２ペプチドを使用して、シグナル１の強度が、形質導入したＤＣの抗腫瘍免疫応答を誘導する能力に影響し得るかどうかを試験した。図１１Ｂは、ＴＲＰ２ｂペプチドを負荷したＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣはわずかな抗腫瘍活性（統計学的に有意でない）を示したとは言え、低（ＴＲＰ２ａ）若しくは高親和性（ＴＲＰ２ｂ）いずれかのペプチドを負荷した成熟ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣは、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＬＰＳ刺激でＢ１６腫瘍退縮を誘導することが不可能であったことを示す。対照的に、低若しくは高いずれかの親和性のＴＲＰ２ペプチドを負荷した双方のＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ群が腫瘍増殖を効果的に阻害した。免疫したマウスでのＴＲＰ２特異的ＣＴＬ活性を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してもまた検討した。図１１Ｃは、高親和性ペプチドを負荷したＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣが、低親和性ペプチドを負荷したＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣが誘導したよりも強いＩＦＮγ応答を誘導したことを示す。しかしながら、低若しくは高いずれかの親和性のペプチドを負荷した双方のＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ群は、高親和性ペプチドを負荷したＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣよりはるかにより強いＩＦＮγ応答を誘導し（Ｐ＜０．０１）、それは観察された抗腫瘍活性と一致する（図１１Ｂ）。加えて、低若しくは高親和性のペプチドを負荷したＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣは同様のＩＦＮγ応答を誘導した（図１１Ｃ）。
【０３１４】
これらの実験の結果は、ＳＯＣＳ１サイレンシングが、成熟の存在若しくは非存在下でＤＣ上の共刺激／阻害分子（シグナル２）ならびにＭＨＣ−ＩおよびＩＩ分子の発現に対し有意の影響を有さず；また、高若しくは低いずれかの親和性のＴＲＰ２ペプチド（シグナル１）を負荷した成熟ＤＣは、ＳＯＣＳ１がサイレンスされない限り強力なＩＦＮγ応答および抗腫瘍免疫の誘導において無効であることを示す。
【実施例６】
【０３１５】
マウスＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡＤＣにより誘導されるＣＴＬおよび抗腫瘍活性のｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−１２増強
樹状細胞（ＤＣ）による細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答の開始は十分に研究されているとは言え、自己寛容の維持若しくは破綻の調節の機構は乏しく定義されているままである。本実施例において、成熟野性型ＤＣではなく、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ）１をサイレンスした成熟ＤＣが、とりわけ微生物産物若しくはＩＬ−１２でｉｎ  ｖｉｖｏ刺激される場合に自己寛容の破壊において有効であることを示す。本明細書に開示される実験は、抗原提示ＤＣにより提供される、抗原親和性（シグナル１）および共刺激分子のレベル（シグナル２）ではなくＳＯＣＳ１拘束性のシグナル３（ＩＬ−１２）が自己寛容を厳密に制御することを示す。さらに、本開示は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが自己抗原に対する強力な免疫応答を誘導して、予め確立されたＢ１６腫瘍の増殖を阻害することを示す。さらに、ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣは、溶解性エフェクター機能をもつ自己抗原特異的ヒトＣＴＬを完全に活性化する優れた能力を有し、このＳＯＣＳ１サイレンシングのアプローチの橋渡し的（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）な可能性を暗示している。
【０３１６】
自己抗原特異的ＣＴＬの活性化および免疫寛容の制御におけるＳＯＣＳ１拘束性シグナル３のありそうな重要性は、成熟ＤＣ中でＳＯＣＳ１により調節される重要なサイトカイン（１種若しくは複数）の同定を促した。ＣＴＬ活性化に影響することが既知の数種の候補炎症前サイトカインの重要性は、最初に、ＳＯＣＳ１サイレンシングとともにＤＣワクチン接種に多様な遺伝子的にホモ接合性のＫＯマウス由来のＤＣを使用することにより試験した。ＩＬ−１２（ｐ３５−／−）ＫＯマウスからのＤＣを免疫化に使用した場合、ＴＲＰ２ペプチドを負荷したｐ３５−／−  ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣは、Ｂ１６腫瘍の増殖をもはや阻害しないことが観察され（図１２Ａ〜１２Ｂ）、腫瘍退縮に対するＳＯＣＳ１拘束性かつＤＣが産生するＩＬ−１２の決定的な役割を示唆した。ＳＯＣＳ１拘束性ＤＣの機能におけるＩＬ−１２の役割をさらに決定するため、ｐ３５−／−  ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより誘導されるＣＴＬ応答を評価した。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬアッセイを使用して、ｐ３５−／−  ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣが、野性型ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣと比較して、ＴＲＰ２特異的ＣＴＬ応答を誘発する有意に低下された能力を有したことが観察された（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。加えて、ＬＰＳでのｉｎ  ｖｉｖｏ刺激は、ＴＲＰ２−四量体分析により測定されるとおり、ｐ３５−／−  ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより誘導されるＣＴＬ応答を後押しするのに失敗した（図９Ａ）。興味深いことに、抗原提示ＤＣにより産生されるＩＬ−１２の不可欠な役割と対照的に、野性型ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したＩＬ−１２（ｐ３５−／−）ＫＯマウスは、活発な抗腫瘍免疫およびＣＴＬ応答もまた誘導することが観察され、常在宿主細胞により産生されるＩＬ−１２が自己抗原特異的ＣＴＬ応答の誘導に必要とされないことを示した（図１２Ａ〜１２Ｄ）。一緒にすれば、これらの結果は、抗原提示ＤＣにより産生されるＳＯＣＳ１拘束性のＩＬ−１２が、強力なＴＲＰ２特異的ＣＴＬ応答およびＢ１６腫瘍根絶を誘導するのに重要であることを示す。
【０３１７】
ｗｔ  ＤＣによる一過性かつ低産生に対するＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣによるＩＬ−１２およびＩＬ−１２に誘導されるサイトカインの持続性かつ高められた産生
ＤＣは、ＬＰＳのような微生物産物およびＣＤ４０連結に応答して有意の量のＩＬ−１２を産生する（Ｓｃｈｕｌｚら、２０００、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：４５３−６２）。ＤＣによるＩＬ−１２産生は、成熟の誘導後の短い時間（８〜１６時間）に厳密に制限され（Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐら、２０００、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：３１１−６）、そしてＳＯＣＳ１により調節される（Ｅｙｌｅｓら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４３７３５−４０）。適応免疫の調節におけるＳＯＣＳ１拘束性のＩＬ−１２の同定された重要な役割を考え、免疫寛容を破壊しかつＴＲＰ２に対する効果的な抗腫瘍免疫応答を誘導するＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣの能力に緊密に関係しうるＤＣによるＩＬ−１２産生の強さおよび持続時間に対するＳＯＣＳ１サイレンシングの影響を検査した。
【０３１８】
図１３Ａは、有意に増大されたレベルのＩＬ−１２（ｐ７０）が、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ
ＤＣおよび擬似形質導入したＤＣと比較して、ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０  ｍＡｂでの連続刺激に応答してＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより７２時間にわたり産生されたことを示す。元の刺激の除去にもかかわらずＩＬ−１２レベルを維持するＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣの能力を、その後、それらをＬＰＳ／抗ＣＤ４０で２４時間刺激すること、およびその後、ＬＰＳを含有しなかった新鮮培地中でＤＣを新たな培養プレートに移すことにより検査した。図１３Ｂは、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣおよび擬似形質導入したＤＣが刺激に際して一過性にのみＩＬ−１２を産生した一方、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣは刺激の除去にもかかわらず有意により高レベルのＩＬ−１２を持続的に産生したことを示す。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わないが、ＬＰＳ／抗ＣＤ４０の除去後のＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣによるＩＬ−１２の持続性かつ高められた産生は、元の刺激および／またはおそらくＩＬ−１２若しくは他のＤＣに分泌される炎症前サイトカインによるオートクリン／パラクリン刺激により誘導されるシグナル伝達経路の持続的活性化によるとみられる。これらの結果は、ＳＯＣＳ１サイレンシングが、ＤＣが刺激に応答して持続的かつ増大したレベルのＩＬ−１２を産生することを可能にすることを示し、それは、免疫寛容を破壊しかつ予め確立された腫瘍を根絶するＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの能力の責任を負うとみられる。
【０３１９】
ＳＯＣＳ１は、ＩＬ−１２および他のサイトカインのシグナル伝達を媒介するＪａｋ／Ｓｔａｔ経路の決定的な調節物質である（Ｋｕｂｏら、２００３、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１１６９−７６；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２００４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５０３−２９）ため、次の一組の実験は、ＤＣでのＳＯＣＳ１サイレンシングが、それら自身とおそらく他の近隣のＤＣの間のサイトカインフィードバックループの発生によりサイトカイン産生を増大させるのかどうかを試験するために着手した。これを取り扱うため、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣによる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αおよびＩＬ−６の産生を測定した。（ＴＮＦ）αおよびＩＬ−６は、これらのサイトカインがＩＬ−１２刺激により誘導されることが既知であるために試験した（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉら、２００３、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１３３−４６）。
【０３２０】
図１３Ｃは、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣが、低レベルのＴＮＦαおよびＩＬ−６を一過性にのみ産生したＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣおよび擬似形質導入したＤＣと対照的に、元の刺激の除去後により高レベルのＴＮＦαおよびＩＬ−６を持続的に産生したことを示す。フィードバックループの発生のためのＩＬ−１２の重要性をさらに決定するため、ｐ３５−／−  ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣおよびｗｔ  ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣによるＴＮＦαおよびＩＬ−６産生を比較した。図１３Ｄは、ｐ３５−／−  ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣが増大されかつ持続的な量のＴＮＦαおよびＩＬ−６を産生することがもはや可能でなかったことを示し、ＩＬ−１２のフィードバックがＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣによるＴＮＦαおよびＩＬ−６産生の重要な誘導因子であることを示す。これらのデータは、ＳＯＣＳ１サイレンシングが、ＤＣ中の決定的なシグナル伝達の抑制機構を無効にし、従って、それらがＩＬ−１２のみならず、しかしまた高められたフィードバックループを介してＩＬ−１２に誘導される炎症前サイトカインに連続的に応答しかつそれらを産生することを可能にすることを示す。本明細書に開示される結果は、白斑、およびＢ１６腫瘍細胞に対する効果的な抗腫瘍免疫の双方を誘導するＴＲＰ２を負荷したＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣの能力を説明するありそうな機構を提供する。
【０３２１】
自己寛容を破壊するＤＣの能力を制御するためのＳＯＣＳ１拘束性ＩＬ−１２シグナル伝達の重要性
自己腫瘍関連抗原に対する強力なＣＴＬ応答を誘導するＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ
の能力は、ＳＯＣＳ１シグナル伝達戦略の治療的応用を示唆する。患者での刺激としてのＬＰＳの臨床使用は毒性でありすぎるため、そのシグナル伝達がＳＯＣＳ１により調節されるＩＬ−１２がＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣの効力の増強においてもまた有効であるかどうかを評価した。
【０３２２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６腫瘍細胞を接種し、そして３日後、組換えマウスＴＮＦαでｅｘ  ｖｉｖｏで成熟させた、ＴＲＰ２でパルスし形質導入したＤＣでマウスを１回免疫した。ＤＣ免疫化後に、レシピエントマウスを低用量の組換えマウスＩＬ−１２（１μｇ／マウス）で３回ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激した。図１４Ａは、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスでのＢ１６腫瘍の増殖が効率的に阻害されたことを示す。対照的に、ＩＬ−１２を用いるｉｎ  ｖｉｖｏ投与でのＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ免疫化は、ＰＢＳ対照と比較して、腫瘍増殖に対する影響をほとんど有しなかった。抗腫瘍活性は、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより示されるとおり、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスでの増大したＴＲＰ２特異的ＣＴＬ活性と相関した（図１４Ｂ）。以前の観察結果（図１０Ａ）と一致して、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＩＬ−１２刺激の非存在下でのＴＰＲ２でパルスしＴＮＦαで成熟させたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣでの免疫化は、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ対照に比較して増大した抗腫瘍活性もまた示した。
【０３２３】
これらの結果は、ＩＬ−１２のｉｎ  ｖｉｖｏ投与が、ありそうにはＩＬ−１２およびＩＬ−１２に誘導されるサイトカインの高められたシグナル伝達により、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの免疫刺激能力を有意に高めるが、しかし野性型ＤＣはしないことを示す。これらの結果は、ＩＬ−１２のようなサイトカインの全身濃度でなく、抗原提示ＤＣ中のＳＯＣＳ１拘束性のサイトカインシグナル伝達が、自己腫瘍関連抗原に対する効果的な抗腫瘍免疫を誘導するために重要であることをさらに暗示する。
【０３２４】
白斑以外の明らかな毒性は、免疫化６か月後まで、ＬＰＳ若しくはＩＬ−１２いずれかと共注入した、ＴＲＰ２でパルスしたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣマウスで観察されなかった。免疫したマウスの全部の主要な器官および組織の組織学的分析は、病理学的炎症を示さなかった。ＩｇＧおよび抗ｄｓＤＮＡのレベルは、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣおよび擬似ＤＣマウス中で比較可能であった。これらのデータは、ＴＲＰ２でパルスしたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ免疫化がマウスで病理学的炎症を引き起こさないことを示唆する。
【０３２５】
ＳＯＣＳ１拘束性のシグナル３の強さはＣＴＬの活性化、免疫寛容および抗腫瘍免疫を制御する。
本明細書に開示される結果は、腫瘍ワクチンの開発のための意義深い意味を有するはずである、成熟ＤＣによるＣＴＬ応答の調節への新たな洞察を提供する。成熟は未熟な免疫寛容誘発状態から、成熟した免疫原性状態へのＤＣの移行の制御点であることが既知である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−５２；Ｓｔｅｉｎｍａｎら、２００３、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：６８５−７１１）。抗原提示ＤＣとＴ細胞の間の最初の接触（シグナル１および２）の強さがＣＴＬ応答の大きさおよび運命を決定すると考えられている。成熟ＤＣは、制限された数の研究（Ｐｏｒｇａｄｏｒら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８８：１０７５−８２；Ｉｎｇｕｌｌｉら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２１３３−４１；Ｒｕｅｄｌら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４９１０−６）に基づけば短命であると考えられるためである。しかしながら、信頼できる遺伝子の方法を使用するより最近の研究は、成熟抗原提示ＤＣの寿命が以前に推定されたよりはるかに長く、ｉｎ  ｖｉｖｏで２週持続することを示し（Ｇａｒｇら、２００３、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：９０７−１２）、Ｔ細胞での初期活性化（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）後の成熟ＤＣの可能な調節性の役割を示唆した。
【０３２６】
本結果は、ＳＯＣＳ１によりしっかりと拘束される成熟ＤＣ中での炎症前シグナル伝達が自己抗原特異的ＣＴＬ応答の大きさを決定的に制御することを示す。これは、ＣＴＬ応答が少なくとも２つのレベル、すなわちＣＴＬ応答の開始に必要とされるＤＣ成熟、ならびに、その大きさがＳＯＣＳ１発現により調節される、成熟させたＤＣのそれら自身およびＣＴＬとの進行中のサイトカインシグナル伝達でＤＣにより制御されることを示す。本結果は、さらに、ＤＣおよび多様な免疫細胞のそれらの周囲の環境と、サイトカインおよび微生物産物の組成／濃度の間の動的な相互作用をさらに暗示し、この相互作用は、自己寛容の維持若しくは破綻、および従って自己抗原特異的ＣＴＬ応答の運命を集合的に決定する。
【０３２７】
本明細書に開示される結果は、自己寛容の維持若しくは破綻の新規調節機構を示す。ＤＣにより提供される、ペプチド親和性および共刺激分子のレベルではなく、ＳＯＣＳ１拘束性のシグナル３（ＩＬ−１２）が、自己寛容を決定的に制御することが見出された。Ｔ細胞のＤＣ媒介性の活性化若しくは過剰活性化に対するサイトカインの重要性は、自己免疫疾患（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、２００４、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０：５３９−５０）および他のモデル（Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒら、２００３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１１４１−５１；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：６８４２−９）の多数の研究で暗示されている。
【０３２８】
ｗｔ  ＤＣによるＩＬ−１２のようなサイトカインの産生は一過性であり、そして本明細書および他者の研究（Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐら、２０００、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：３１１−６）が示すとおり、刺激に際してＳＯＣＳ１により阻害される。ｗｔ  ＤＣと対照的に、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが、ＤＣ中のＪａｋ／Ｓｔａｔシグナル伝達経路の誘導可能なフィードバック阻害物質を無効にした後にこの経路により複雑なオートクリン（およびおそらく同様にパラクリン）シグナル伝達ループを形成することにより、初期刺激に応答して有意に高められたＩＬ−１２およびＩＬ−１２に誘導されるサイトカインレベルを連続的に生じさせ得ることが観察された。一致して、低用量のＩＬ−１２を用いるｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、ｗｔ  ＤＣではなくＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの自己寛容を破壊する能力を効果的に高めることが見出された。
【０３２９】
集合的に、これらの結果は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより産生されるＩＬ−１２およびＩＬ−１２に誘導されるサイトカインの連続的かつ高められた産生およびシグナル伝達が、自己寛容の破壊および高められた抗腫瘍ＣＴＬ応答において重要な役割を演じていることがありそうであることを示す。本結果は、ＤＣ中でのＳＯＣＳ１による刺激性シグナル伝達の細胞内阻害が自己寛容の維持に寄与することをさらに示唆する。ＳＯＣＳ１は、そのＳＯＣＳボックス領域によりユビキチン媒介性のタンパク質分解にｐ６５タンパク質の標的を定めることによりＮＦ−κＢシグナル伝達を直接阻害することが見出された（Ｒｙｏら、２００３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１２：１４１３−２６）とは言え、Ｇｉｎｇｒａｓらは、ＳＯＣＳ１が、タイプＩ  ＩＦＮのシグナル伝達を阻害することにより、ＬＰＳ誘発性の毒性についてマクロファージでのＴＬＲシグナル伝達を間接的に調節することを報告した（Ｇｉｎｇｒａｓら、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５４７０２−７）。タイプＩ  ＩＦＮシグナル伝達によるＬＰＳ誘発性の毒性と異なり、本明細書の結果は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより誘導されるＣＴＬ応答がＩＬ−１２により主に媒介されることを示す。本明細書の結果はまた、ＬＰＳに応答してのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣによるＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１２のような多様なサイトカインの高められた産生も示す。
【０３３０】
本研究は、自己腫瘍関連抗原に対する効果的な抗腫瘍免疫を誘導するためにＤＣ中のＳＯＣＳ１をサイレンシングする必要性を示す。ＤＣワクチンは、近年１，０００例超の患
者が関与した９８の公表されたＤＣワクチンの臨床試験で明示されたとおり（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、２００４、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９０９−１５）、腫瘍ワクチン接種のための最も有望な戦略の１つと見られている。主として多様なアプローチによるＤＣの抗原提示および成熟を促進することを目的としたこれらの試みは、非常に低い客観的臨床奏功率を伴う、大きく失望させるものである（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、２００４、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９０９−１５）。本明細書のデータは、高親和性ペプチドを負荷したｗｔ  ＤＣが、ＬＰＳ若しくはＩＬ−１２でのｉｎ  ｖｉｖｏ刺激後でもなお自己寛容を破壊することがなお不可能であったことを示す。本明細書の結果は、従って、現在記述されている腫瘍ワクチンの全般的無効性（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、２００４、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９０９−１５）を説明するとみられ、また、ＤＣの抗原提示および成熟を促進する現在の戦略とともにＳＯＣＳ１のような決定的なシグナル伝達阻害物質をサイレンシングすることを介して、より効果的な腫瘍ワクチンを開発するための新たな途を提供しうる（Ｇｉｌｂｏａ、２００４、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ４：４０１−１１；Ｙｏｕら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４５８１−４５９２；Ｓｏｉｆｆｅｒら、２００３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１：３３４３−５０；Ｐａｒｄｏｌｌ、２００２、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２２７−３８）。
【０３３１】
抗原負荷ＤＣにより誘導される抗原特異的免疫応答を特異的に高める能力を伴う、本ＳＯＣＳ１サイレンシングのアプローチは、生存組織および器官に対するものを包含する自己反応性Ｔ細胞を無差別的に過剰活性化するエフェクターＴ細胞上のＣＴＬ４を系統的に阻害するというアプローチ（Ｈｏｄｉら、２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  １００：４７１２−７；Ｐｈａｎら、２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  １００：８３７２−７）より魅力的でもまたありうる。要約すれば、腫瘍ワクチンを高めるための集中的な努力が抗原親和性／用量および共刺激の改良を焦点としてきたことを考えれば、本研究で見出されたＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの自己寛容および高められた免疫刺激能力を調節するための新たな機構は、腫瘍に対する自己寛容の拘束を破壊するための一般に許容できる新規ワクチン接種戦略を提供するはずである。
【実施例７】
【０３３２】
マウスＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより誘導されるＨＩＶ特異的抗体およびＣＴＬ応答
本実施例は、宿主の天然の免疫阻害物質を阻害することにより抗ＨＩＶ免疫応答を誘導するための代替の一戦略を示す。本研究は、ＤＣ中のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の負の調節物質ＳＯＣＳ１が、ＨＩＶ特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のみならずしかしまた抗体の応答も制御することを示す。ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣはＨＩＶエンベロープ媒介性の抑制に対し抵抗性であり、かつ、均衡の取れたメモリーＨＩＶエンベロープ特異的抗体およびＣＴＬ応答をマウスで効果的に誘導する。本開示は、宿主の免疫阻害物質を阻害することによりＨＩＶ特異的抗体およびＣＴＬ応答を導き出すための最初の試みを表す。
【０３３３】
本実施例に提示される実験で使用する材料および方法を今や記述する。
レンチウイルスベクターでのＢＭ由来ＤＣの形質導入
組換えレンチウイルスベクター、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡおよびＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡは、本明細書の別の場所に記述されるとおり製造し、滴定し、そしてＤＣを形質導入するのに使用した。
【０３３４】
サイトカインおよび抗体のＥＬＩＳＡアッセイ
細胞培養物上清中のサイトカインレベルは、製造元の説明書に従ってＥＬＩＳＡ分析（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州リンカーンパーク）により定量した。ｇｐ１２０特異的抗体およびサブクラスの力価を決定するため、ｇｐ１２０タンパク質（炭酸緩衝液［ｐＨ９．６］中５μｇ／ｍｌ）を４℃で一夜被覆し、ウェルにＰＢＳ−５％ＦＢＳ中の血清の１２倍連続希釈を室温で１時間添加した。８回の洗浄後に、ビオチニル化抗マウス抗体（抗マウスＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ若しくはＩｇＧ３）をウェルに室温で１時間添加した。ストレプトアビジン−ＨＲＰをペルオキシダーゼ基質として使用した。反応を５０μｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により停止した。光学密度をＢｉｏ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｄｅｒ上で４５０ｎｍで読み取った。結果は、ｙ軸上の光学密度（ＯＤ）値およびｘ軸上の希釈−１（ｄｉｌｕｔｉｏｎ−１）を伴う散乱プロットから決定される終点力価の逆数（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｔｉｔｅｒ）として表し、ｘ軸の目盛りは対数であった。データをプロットした後に、対数曲線の当てはめを各個々の一連の希釈に適用し、そして曲線の当てはめが正負のカットオフ値と交差する点を決定した。該カットオフ値は、対照マウス血清からの全希釈の平均（＋３ＳＤ）として各抗体アイソタイプについて計算した。各実験で試験した全サンプルは同時にアッセイした。
【０３３５】
Ｔ細胞エリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ
単離したＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋  Ｔ細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、本明細書の別の場所に記述されるとおり実施した。
【０３３６】
Ｂ細胞単離およびｇｐ１２０抗体産生Ｂ細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中の脾から調製した単細胞懸濁液を、プラスチック皿上で５％ＣＯ２中３７℃で１時間プレーティングして接着性マクロファージを除去した。非接着細胞を抗Ｔｈｙ１．２およびウサギ補体で３７℃で４５分間処理してＴ細胞を溶解した。残存するＢ細胞の純度は通常９０％を超えた。Ｂ細胞ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、以前に記述された変法（Ｌｅ  Ｂｏｎら、２００１、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４：４６１−７０２３）により実施した。簡潔には、９６ウェルのニトロセルロース製プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＰＩ）をＰＢＳ中ｇｐ１２０で一夜被覆した。プレートをＰＢＳで６回洗浄し、そして１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０で３７℃で２時間ブロッキングした。単離したＢ細胞をウェルに接種し（５×１０５細胞／ウェル）、そして５％ＣＯ２中３７℃で２０時間インキュベートした。細胞をその後、ＰＢＳ  ０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）での６回の洗浄により除去した。０．５％ＦＢＳを含有するＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈したビオチニル化抗マウスＩｇＧ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｇｅｎ）を添加し、そして混合物を３７℃で２時間インキュベートした。アビジン：ビオチニル化酵素複合体（ＡＢＣ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州バーリンゲーム）を追加の１時間添加した。抗ｇｐ１２０  ＩｇＧを、ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール；Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）との４分の反応後に検出した。結果は、ＫＳ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ４．３ソフトウェアを使用して、自動化ＥＬＩＳＰＯＴ読み取り装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．ニューヨーク州ソーンウッド）を用い、ＺｅｌｌＮｅｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州ニューヨーク）により評価された。
【０３３７】
ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
トランスフェクトしたマウスＢＭ−ＤＣ中のＳＯＣＳ１の相対的発現を定量的リアルタイムＰＣＲにより評価した。全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用してＤＣから抽出し、そして各サンプルについて１．０μｇの全ＲＮＡを、ランダムへキサマープライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ第一鎖合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて逆転写した。リアルタイム５’−ヌクレアーゼ蛍光発生ＰＣＲ分析を、鋳型として反応あたり５ｎｇの出発ＲＮＡ原料の同等物を用いる２０μｌの四重の反応で、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ配列検出装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティ）で実施した。以下のプライマーをＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬに使用した：ＢＡＦＦ、センス５’−ＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＣＡＴＧＴＣＡＴＣＣＡ−３’（配列番号１７）およびアンチセンス５’−ＧＧＣＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＣＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号１８）；ＡＰＲＩＬ、センス５’−ＴＣＡＣＡＡＴＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＡＴＣ−３’（配列番号１９）およびアンチセンス５’−ＴＧＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２０）。１８ＳのＴａｑＭａｎプローブ、フォワードおよびリバースプライマーはＴａｑｍａｎげっ歯類１８Ｓ対照試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティ）から得た。ＰＣＲパラメータは、ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティ）について推奨されたものであり、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬおよび１８Ｓの反応は個別のチューブで実施した。ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬレベルを１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化した一方、ＢＡＦＦ若しくはＡＰＲＩＬ発現（擬似トランスフェクトし刺激したＤＣの対照値に関して）はＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃｔ法（Ｌｉｖａｋら、２００１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−８）により計算した。
【０３３８】
ＣＴＬアッセイ
ＣＤ８＋  ＣＴＬ応答は、標的細胞を溶解するｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激した脾細胞の能力を測定する、本明細書の別の場所に記述されるところの標準的クロム放出アッセイで評価した。免疫したマウスからプールした脾細胞を、ｇｐ１２０タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで４〜６日間再刺激した。２０μｇ／ｍｌのｇｐ１２０タンパク質で一夜パルスした標的細胞を、５１Ｃｒクロム酸ナトリウム溶液で９０分間標識した。異なる数のエフェクター細胞を、９６ウェルＶ字型底プレート（２００μｌ／ウェル）中で一定数の標的細胞（１×１０４／ウェル）とともに３７℃で３時間インキュベートした。三重の培養物からの上清（１００μｌ）を収集した。細胞溶解パーセントを、（実験放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）×１００として計算した。
【０３３９】
ＴおよびＢ細胞増殖アッセイ
本明細書の別の場所に記述されるとおり単離したＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋  Ｔ細胞（ウェルあたり１×１０６）およびＢ細胞（ウェルあたり１×１０５）を、９６ウェルプレートの三重のウェルで完全培地中で多様な刺激の存在若しくは非存在下に培養した。培養第４日に、ウェルを１μＣｉの［３Ｈ］−チミジンで１６時間パルスした。プレートをその後収集し、そして、取り込まれた［３Ｈ］−チミジンをＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ、Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して測定した。
【０３４０】
ＤＣ免疫化
骨髄由来ＤＣ（第５日のＢＭ培養物）を、本明細書の別の場所に記述されるとおり、５のＭＯＩのＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ若しくはＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで形質導入した。
【０３４１】
本実施例で提示される実験の結果を今や記述する。
ＤＣ中のＳＯＣＳ１サイレンシングはＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的抗体応答を高める
抗ＨＩＶ抗体応答を誘導するＤＣの能力に対するＳＯＣＳ１サイレンシングの影響を最初に検討した。ＨＩＶ  Ｅｎｖは細胞性および中和抗体双方の応答を誘導し得るため、この試験でそれを使用した。トランスフェクトした細胞中で約９０％のＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡを下方制御する能力をもつＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡを発現する組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ）および対照ベクター（ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ）を、本明細書の別の場所に記述されるとおり生成させた。マウス骨髄（ＢＭ）由来ＤＣを、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ若しくはＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで形質導入し、
組換えＨＩＶ  ｇｐ１２０タンパク質を負荷し、そしてｅｘ  ｖｉｖｏでＬＰＳで成熟させた。マウスの群をその後、形質導入したＤＣで１週間隔で２回免疫し、次いで各ＤＣ免疫化後にｉｎ  ｖｉｖｏでＬＰＳ刺激した。ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激は、それが、本明細書の別の場所で開示されるとおり、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより誘導される腫瘍関連抗原に対するＣＴＬ応答をさらに高め得るという観察結果に基づいて使用した。図１５Ａは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが、対照のＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが導き出したよりも有意により確実なｇｐ１２０特異的ＩｇＭおよびＩｇＧ応答を導き出したことを示す。
【０３４２】
そのプロファイルが独特な免疫学的状態を表す多様な抗体サブクラスの産生は、ＣＤ４＋  Ｔヘルパー（Ｔｈ）１およびＴｈ２分極性サイトカインならびにＴｈ細胞機能に依存する（Ａｌｌｅｎら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：３８７−９２）。図１５Ｂは、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスの対応するサブクラスに比較して、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫したマウスでの全部のＩｇＧサブクラスのＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的抗体力価の劇的な増大を示す。Ｅｎｖ特異的抗体サブクラスのプロファイルは、Ｔｈ２応答の産物ＩｇＧ１、およびＴｈ１応答と関連するサブクラスＩｇＧ２ａの混合した応答を示し、Ｔｈ１およびＴｈ２に依存する免疫応答の双方がＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘導されたことを示した。類似の結果が反復実験で得られた。中和アッセイは、マウスがＨＩＶ中和活性の信頼できる試験に適切な種でない（Ｂｕｒｔｏｎら、２００４、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２３３−６）ため、実施しなかった。ＳＯＣＳ１サイレンシングが、他の株のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質および卵アルブミン（ＯＶＡ）のような抗原に対する抗体応答を高めたことがさらに観察された。これらの結果は、全ＩｇＧサブクラスを包含するＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的抗体応答がＤＣ中のＳＯＣＳ１のサイレンシングにより劇的に高められ、抗原特異的抗体応答の制御におけるＤＣ中のＳＯＣＳ１の決定的な役割を暗示することを示す。
【０３４３】
ＤＣ中のＳＯＣＳ１のサイレンシングはＨＩＶ  ｇｐ１２０特異的ＣＴＬ応答を高める
以下の実験は、ＳＯＣＳ１サイレンシングがＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＴＬ応答を高め得るかどうかを評価するために実施した。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色およびＣＴＬアッセイを使用して、免疫したマウスでのＣＤ８＋  Ｔ細胞の機能の状態を試験した。ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでのｇｐ１２０でパルスした標的細胞に対するＣＴＬ活性は、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでのものより有意により強力であった（Ｐ＜０．０１）（図１５Ｃ）。これらのアッセイで検出されたＣＴＬ活性はｇｐ１２０特異的であった。ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからの脾細胞は、ｇｐ１２０でパルスしていない標的細胞に対するいかなる明らかなＣＴＬ活性も欠いていたからである。一致して、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫したマウスで、それぞれ、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでの１９１個のスポットと比較して、５×１０５のＣＤ８＋  Ｔ細胞あたり３６３個のＩＦＮγ＋のスポットが検出された（図１５Ｄ）。ＩＦＮ−γでの脾細胞の細胞内染色も、ＬＶ−ＳＯＣＳ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでのＩＦＮ−γ＋  Ｔ細胞のより高い比率を示した。一緒にすれば、これらの結果はＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣで免疫したマウスでのＨＩＶ  Ｅｎｖに対する均衡がとれかつ高められた抗体およびＣＴＬ応答を示し、ＤＣ中のＳＯＣＳ１が体液性および細胞性双方の免疫を決定的に調節していることを示唆する。
【０３４４】
ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより誘導される混合した高められたＴｈ１およびＴｈ２応答
いずれかの特定の論理により束縛されることを願わないが、Ｔｈ１対Ｔｈ２応答のプログラミングにおけるサイトカインの役割（ＭａｃＤｏｎａｌｄら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：３１２７−３０；Ｇｏｒら、２００３、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：５０３−５）を考えれば、ＳＯＣＳ１サイレンシングがＤＣによるサイトカインの産生を調節することによりＣＴＬおよび抗体応答に影響を及ぼしうることが考えられる。図１６Ａは、ＬＰＳでの刺激後のＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣと比較したＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより産生されるＴｈ１に分極した応答を促進するＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦαのレベルの有意の増大を示す。興味深いことに、Ｔｈ２に分極した応答を促進するＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の有意の増大もまた、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣで見られた（Ｐ＜０．０１）。ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより産生されるＴｈ１およびＴｈ２を促進するサイトカイン双方のより高いレベルは、ＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＴＬおよび抗体応答の双方を誘導する、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの高められた能力を説明しうる。
【０３４５】
本結果に基づけば、ＤＣ中のＳＯＣＳ１サイレンシングは抗体およびＣＴＬ応答を明瞭に促進した。以下の実験は、抗体およびＣＴＬ応答の誘導に緊密に関与するＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＤ４＋  Ｔｈ応答もまたＳＯＣＳ１サイレンシングにより高められるかどうかを扱う。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、免疫したマウスからＣＤ４＋マイクロビーズを使用して単離し、そして多様なアッセイを使用して分析した。図１６Ｂに描かれるとおり、ｇｐ１２０特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の頻度は、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでよりもＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで有意により高かった。３Ｈ−チミジン取り込みアッセイは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのＣＤ４＋  Ｔ細胞が、ｇｐ１２０でパルスしたＤＣでの刺激に応答して、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのものよりも活発に増殖したことを示した（図１６Ｃ）。ｇｐ１２０でパルスしたＤＣでの刺激後にＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスから単離したＣＤ４＋  Ｔ細胞により産生されたサイトカインプロファイルの分析は、Ｔｈ１分極性（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦα）ならびにＴｈ２分極性（ＩＬ−４およびＩＬ−１０）双方のサイトカインの増大されたレベルを示した（図１６Ｄ）。これらの結果は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが、ＨＩＶ  Ｅｎｖに対する高められた混合したＴｈ１およびＴｈ２応答を誘導することを示し、それは図１５Ｂの混合したｇｐ１２０特異的ＩｇＧサブクラスのプロファイルと矛盾しない。
【０３４６】
ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣによる高められたｇｐ１２０特異的Ｂ細胞活性化
ＤＣは、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー、ＡＰＲＩＬ（増殖誘導性リガンド）およびＢＡＦＦ（Ｂリンパ球刺激物質、ＢＬｙＳとしてもまた知られる）を産生することによりＢ細胞の増殖、成熟およびクラススイッチ組換えを直接誘発することが示されている（Ｂａｌａｚｓら、２００２、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：３４１−５２；Ｌｉｔｉｎｓｋｉｙら、２００２、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：８２２−９；ＭａｃＬｅｎｎａｎら、２００２、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：２３５−８）。従って、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用するＤＣによるＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの産生に対するＳＯＣＳ１サイレンシングの影響を評価した。ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは、ＳＯＣＳ１−／−  ＤＣ中のＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの増大された発現（Ｈａｎａｄａら、２００３、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：４３７−５０）と一致して、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが発現したよりも高レベルのＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦ  ｍＲＮＡを、ＬＰＳ刺激に際して発現した。
【０３４７】
ｇｐ１２０特異的Ｂ細胞の活性化を高めるＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの能力を試験するため、抗ｇｐ１２０  ＩｇＧ特異的Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを使用して、免疫したマウスでの抗ｇｐ１２０  ＩｇＧ産生Ｂ細胞の頻度を直接検査した。抗ｇｐ１２０
ＩｇＧ産生Ｂ細胞の頻度は、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでよりＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで有意により高かった（Ｐ＜０．０１）（図１７Ｂ）。ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのＢ細胞と比較してより高い比率のＢ細胞が、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで高レベルのＣＤ６９、ＣＤ４０およびＣＤ８６を特徴とする活性化表現型を表した。加えて、免疫したマウスの脾からのＢ細胞を精製しかつ多様な刺激で刺激した。図１７Ｃは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのＢ細胞が、抗ＣＤ４０およびＩＬ−４で共刺激した場合に、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのＢ細胞が増殖したよりも活発に増殖したことを示す。興味深いことに、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのＢ細胞はＩＬ−４若しくは抗ＣＤ４０のみに強く応答したがしかしＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのものはせず、増大した数のＢ細胞がＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化によりｉｎ  ｖｉｖｏですでに活性化されたことを示唆した。ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのＢ細胞が、多様な刺激に応答して、より高レベルのＩＬ−６、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αを包含する多様なサイトカインを産生したこともまた観察された（図１７Ｄ）。集合的に、これらの結果は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが高められたレベルのＢリンパ球刺激物質（ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬ）ならびにＴｈ２分極性サイトカインを産生し、ＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的Ｂ細胞およびＴｈ細胞のより効果的な活性化に至ることを示唆する。
【０３４８】
ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより誘導される長期のＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＴＬおよび抗体応答
ＤＣ中のＳＯＣＳ１サイレンシングが一次ＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＴＬおよび抗体応答を高めることを示したため、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣがメモリーＨＩＶ特異的ＣＴＬおよび抗体応答を誘導しうるかどうかをさらに評価した。図１８Ａは、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫したマウスが、免疫化後６か月に非常に低レベルのｇｐ１２０特異的抗体を有した一方、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスはそれらの血清中のｇｐ１２０特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体の有意の力価をなお保持したことを示す。追加免疫後１週に、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスは、２×１０５の抗ｇｐ１２０  ＩｇＧ１および１×１０５の抗ｇｐ１２０  ＩｇＧ２の平均力価を伴う強い復活（ｒｅｃａｌｌ）抗体応答を示した一方、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスは、３×１０３のＩｇＧ１および４×１０２のＩｇＧ２の平均力価を伴う不十分な復活抗体応答を示した。これらのデータは、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣに比較して、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の力価のそれぞれ約６４および２５５倍の増大を表すことを示す。
【０３４９】
メモリーＨＩＶ特異的ＣＴＬおよびＴｈの維持を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、ｇｐ１２０特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を検査することにより評価した。図１８Ｂは、免疫化後６か月に、強いｇｐ１２０特異的ＣＴＬ応答がＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで検出されたが、しかしＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでされなかったことを示す（ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで５×１０５のＣＤ８＋  Ｔ細胞あたり２４９のＩＦＮγスポット対ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで３のＩＦＮγスポット）。活発なｇｐ１２０特異的ＣＴＬ応答が、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで追加免疫により迅速に誘導されたが、しかしＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスではされなかった（追加免疫後第７日に、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで５×１０５のＣＤ８＋  Ｔ細胞あたり４４６のＩＦＮγスポット対ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで１６のＩＦＮγスポット）（図１８Ｂ）。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞内ＩＦＮ−γおよび表面ＣＤ４４メモリーマーカーの共染色もまた、免疫化後６か月に、ＬＶ−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスと比較してＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでより高い比率のＣＤ４４ｈｉおよびＩＦＮγ＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を示した（図１８Ｃ）。同様に、ｇｐ１２０特異的ＣＤ４＋  Ｔｈ応答は、免疫化後６か月にＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで維持かつ迅速に誘導された（追加免疫７日後に、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで５×１０５のＣＤ４＋  Ｔ細胞あたり３９１のＩＦＮγスポット対ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで３７のＩＦＮγスポット）（図１８Ｄ）。従って、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣでの免疫化は、長期のＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＴＬ、Ｔｈおよび抗体応答を効果的に誘導する。
【０３５０】
明らかな毒性は、ｇｐ１２０でパルスしたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化したマウスで、免疫化後７か月まで観察されなかった。免疫したマウスの全部の主要な器官および組織の組織学的分析は病理学的炎症を示さなかった。ＩｇＧおよび抗ｄｓＤＮＡのレベルはＤＣ−ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡおよび擬似ＤＣマウスで比較可能であった。これらのデータは、ｇｐ１２０でパルスしたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ免疫化がマウスで病理学的炎症を引き起こさないことを示唆する。
【０３５１】
ＨＩＶ  Ｅｎｖ媒介性の免疫抑制に対するＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの抵抗性
ｇｐ１２０タンパク質を包含するＨＩＶウイルスは、炎症前サイトカインを産生しかつＴ細胞を刺激するＤＣの能力を抑制し得る（Ｆａｎｔｕｚｚｉら、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：９７６３−７２；Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．１０１：７６６９−７４；Ｂａｒｒｏｎら、２００３、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８７：２６−３７；Ｐａｃａｎｏｗｓｋｉら、２００１、Ｂｌｏｏｄ  ９８：３０１６−２１）。以下の実験は、ＳＯＣＳ１サイレンシングによるＤＣの高められた活性化が、ＤＣのサイトカイン産生および免疫刺激能力に対するｇｐ１２０タンパク質の阻害効果を克服しうるかどうかを評価するために着手した。ＤＣ由来ＩＬ−１２が二重の役割、すなわち、Ｔｈ１発生を駆動すること、ならびに体液性応答を発生させるためにＢ細胞に直接シグナル伝達すること、を演じることが見出された（Ｄｕｂｏｉｓら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：２２２３−３１；Ｄｕｂｏｉｓら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：９４１−５１；Ｓｋｏｋら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：４２８４−９１）ために、ＩＬ−１２をこれらの実験の代表的サイトカインとして選択した。
【０３５２】
図１９Ａに示されるとおり、ＬＶ−ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ−ＤＣは、ｇｐ１２０タンパク質の存在下でＬＰＳに応答する能力を保持した。対照的に、ＬＰＳ刺激に対するＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの応答はｇｐ１２０タンパク質の存在により激しく損なわれた。ｇｐ１２０媒介性の抑制に対するＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの感受性をｉｎ  ｖｉｖｏでさらに検討した。マウスを、ｅｘ  ｖｉｖｏでのｇｐ１２０タンパク質の前処理を伴い若しくは伴わず、ＯＶＡでパルスし形質導入したＤＣで免疫した。ｇｐ１２０タンパク質への前曝露は、ＯＶＡ特異的抗体応答を誘導するＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力に対する明らかな影響を有さず（図１９Ｂおよび１９Ｃ）、また、それはＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘導されるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋  ＣＴＬおよびＣＤ４＋  Ｔｈ応答も損なわなかった（Ｐ＞０．０５）（図１９Ｄおよび１９Ｅ）。しかしながら、こうした前処理は、ＯＶＡ特異的抗体およびＣＴＬ応答を誘導するＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力を有意に低下させた（Ｐ＜０．０５）（図１９Ｂから１９Ｅ）。これらの結果は、ＳＯＣＳ１サイレンシングが、ありそうにはＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの高められたサイトカイン産生および過剰活性化状態により（Ｈａｎａｄａら、２００３、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：４３７−５０）、ＨＩＶ  ｇｐ１２０媒介性の抑制に対しＤＣを抵抗性にすることを示す。
【実施例８】
【０３５３】
ＨＩＶ特異的抗体およびＣＴＬ応答を高めるためのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＤＮＡワクチン接種
本実施例は、ＨＩＶ  ＤＮＡワクチン接種の効力がＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）ＤＮＡとの共免疫化により有意に高められることを示す。本研究は、より効果的なＨＩＶワクチンを開発するための新たな途を提示する、宿主の免疫阻害物質を阻害することによりＨＩＶ特異的抗体およびＣＴＬ応答を導き出すための最初の試みを表す。
【０３５４】
本実施例で提示される実験で使用する材料および方法を今や記述する。
ＤＮＡワクチン接種
ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ発現ベクターを本明細書の別の場所に以前に記述されたとおり生成させた。ＨＩＶ  Ｅｎｖレトロゲン（ｒｅｔｒｏｇｅｎ）発現ベクターを生成させるため、ｇｐ１４０ＣＦプラスミドを、ＨＩＶ  Ｅｎｖの分泌を助長するためにＨＩＶ  ｇｐ１６０（コドン使用頻度を至適化したＪＲＦＬ）のｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位およびｇｐ４１の融合ドメインを欠失させることにより最初に構築した。結果として生じるｐＣＭＶ／Ｒ−ｇｐ１４０ＣＦ−Ｆｃレトロゲンベクターは、ＣＭＶプロモーターの制御下にＩｇＧ  Ｆｃフラグメントに融合されたｇｐ１４０ＣＦ遺伝子を含有する。組換えｇｐ１２０（ＪＦＲＬ）タンパク質をＣＨＯ細胞から産生し、そしてＮＩＨ  ＡＩＤＳ研究・参照プログラム（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ）により提供された。無エンドトキシンＤＮＡをＱｉａｇｅｎキットを用いて調製し、１μｇ／μｌの最終濃度で無エンドトキシンＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、ミズーリ州セントルイス）に再懸濁し、そして注入に使用するまで−２０℃で保存した。ワクチン接種予定日に、５０μｇのｇｐ１４０ＣＦ−Ｆｃ  ＤＮＡ若しくは２００μｇのｇｐ１４０ＣＦ−Ｆｃ  ＤＮＡ（５０μｇ）およびｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ発現体ＤＮＡ（１５０μｇ）の混合物を、各マウスの四頭筋にｉ．ｍ．注入した（Ｈａｕｓｅｒら、２００４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：９２４−３２；Ｙｏｕら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：３７０４−１１）。免疫したマウスをその後、各ＤＮＡ免疫化後第１、３および５日にＬＰＳ（３０μｇ／マウス）（ＩＰ）で３回処理した。
【０３５５】
本実施例に提示される実験の結果を今や記述する。
【０３５６】
ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡとの共免疫化により高められるＨＩＶ  ＤＮＡワクチンの効力
ＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＴＬおよび抗体応答双方を高める、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの能力は、本ＳＯＣＳ１サイレンシングのアプローチがＨＩＶ  ＤＮＡワクチン接種の効力の向上において有用でありうることを示唆した。抗原のＤＣターゲッティングおよびＭＨＣ提示を高めるのに受容体媒介性のエンドサイトーシスを使用する「レトロゲン」免疫化戦略を、Ｈａｕｓｅｒら、２００４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：９２４−３２およびＹｏｕら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：３７０４−１１に従って使用した。簡潔には、ｇｐ１４０ＣＦレトロゲンを、ｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位およびｇｐ４１の融合ドメインを欠失したｇｐ１４０ＣＦ遺伝子にＩｇＧ  Ｆｃフラグメントをインフレームで融合することにより生成させた。結果として生じるｇｐ１４０ＣＦ−Ｆｃ融合タンパク質が、ｇｐ１４０ＣＦ−Ｆｃベクターでトランスフェクトした細胞から発現かつ分泌された。
【０３５７】
ＤＮＡワクチン接種に対するＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡの効果を試験するために、マウスに、ｇｐ１４０ＣＦ−Ｆｃ  ＤＮＡのみ、若しくはｇｐ１４０ＣＦ−Ｆｃ  ＤＮＡおよびｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ発現体ＤＮＡの混合物を週１回３週注入し、そしてその後、ＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的免疫応答について１週後にマウスをモニターした。高められたＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的抗体力価が、ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡで共免疫したマウスで明らかであった（図２０Ａ）。ＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＴＬ応答は、ＣＴＬおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより示されるとおり、ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡの共注入により有意に高められた（図２０Ｂおよび２０Ｃ）。さらに、ＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＤ４＋  Ｔｈ応答が、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡの共注入により高められた（図２０Ｄ）。サイトカインでの細胞内染色もまた、ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡで共免疫したマウスでの高められたｇｐ１２０特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を示した。これらの結果は、ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１  ｓｉ
ＲＮＡ  ＤＮＡの共免疫化が、免疫したマウスでのコトランスフェクトした抗原提示細胞の高められた免疫刺激能力によりＨＩＶ  ＤＮＡワクチン接種の効力を高めることを示す。従って、本明細書に提示されるＳＯＣＳ１サイレンシングの戦略は、ｅｘ  ｖｉｖｏのＤＣに基づくおよびｉｎ  ｖｉｖｏのワクチン接種の設定に応用可能である。
【０３５８】
ＤＣ中の天然の免疫阻害物質の阻害に基づく代替のかつ効果的なＨＩＶワクチン接種の一アプローチ
本開示は、ＤＣ中の負のシグナル伝達調節物質ＳＯＣＳ１のサイレンシングがマウスでＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的抗体およびＣＴＬ応答双方の劇的な増強をもたらすことを示す。ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより誘導されるＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的抗体およびＣＴＬ応答双方が長期間持続することが観察された。加えて、該結果は、ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡでの共免疫化がＨＩＶ  ＤＮＡワクチン接種の効力を有意に高めることを示した。従って、ＨＩＶに対する均衡の取れたメモリー体液性および細胞性応答を、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣで誘導し得、そしてこのＳＯＣＳ１サイレンシングの戦略は治療的および予防的双方のＨＩＶワクチン接種の設定に応用可能である。
【０３５９】
体液性応答の誘導におけるＤＣの役割は、伝統的に、Ｔ細胞とＢ細胞の間の同族の相互作用を刺激するＣＤ４＋  Ｔｈの結果として見られていた。しかしながら、体液性応答の刺激におけるＤＣの直接の役割がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで報告されている（Ｄｕｂｏｉｓら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：９４１−５１３８；Ｉｎａｂａら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ８０：６０４１−５）。注目すべきことに、ＤＣはＣＤ４０で活性化したＢ細胞の増殖および抗体産生双方を強く高めることが見出された（Ｄｕｂｏｉｓら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：９４１−５１）。抗原を負荷したＤＣでの免疫化は保護的体液性応答を誘導し得る（Ｆｌａｍａｎｄら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：６０５−１０）。本明細書の結果は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが、Ｔｈ２分極性サイトカイン、ならびに、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣで免疫したマウスで見られる高められたＴｈおよびＢ細胞活性化の原因であることがありそうであるＢリンパ球刺激性サイトカイン（ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬ）の産生を高めることを示す。本知見は、ＳＯＣＳ１−／−  ＤＣがＢ細胞の異常な増殖および自己反応性抗体産生を誘導するという以前の報告（Ｈａｎａｄａら、２００３、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：４３７−５０）により裏付けられる。これゆえに、本研究は、ＨＩＶ特異的抗体応答の制御におけるＤＣ中のＳＯＣＳ１の決定的な役割を示し、かつ、ＳＯＣＳ１のサイレンシングをＨＩＶ  Ｅｎｖ以外の抗原に対する抗体応答を後押しするのに包括的に使用し得ることを暗示する。
【０３６０】
本研究の重要な一知見は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが、ＨＩＶ感染を予防若しくは制御するために望ましいとみられる（Ｂｕｒｔｏｎら、２００４、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２３３−６；ＭｃＭｉｃｈａｅｌら、２００３、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：８７４−８０；Ｎａｂｅｌ、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１００２−７；Ｌｅｔｖｉｎら、２００２、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：７３−９９；Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ、２００４、Ｎａｔ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１９９−２１０；Ｉｍａｍｉら、２００２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：９０１１−２３；Ｌｅｔｖｉｎら、２００３、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：８６１−６）均衡の取れたメモリーＨＩＶ−Ｅｎｖ特異的抗体およびＣＴＬ応答を誘導することである。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わないが、ＳＯＣＳ１サイレンシングが均衡の取れたメモリー体液性および細胞性応答を誘導する機構（１種若しくは複数）は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣおよびｇｐ１２０特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞によるＴｈ１およびＴｈ２分極性サイトカインの混合したパターンの産生を伴いうる。これらの結果は、ウイルスのような多くの病原体に対し天然に生成される混合した抗体およびＣＴＬ応答と矛盾せず（Ａｌｌｅｎら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：３８７−９２）、Ｔｈ１およびＴｈ２分極が相互に排他的でないことを示す（Ｇｏｒら、２００３、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：５０３−５；Ｃｏｌｏｎｎａ、２００１、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：８９９−９００）。
【０３６１】
ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路のフィードバック阻害物質としてのＳＯＣＳ１の機能は多様なサイトカインにより使用され、また、ＴＬＲシグナル伝達経路の調節に直接若しくは間接的に関与する（Ｂａｅｔｚら、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５４７０８−１５；Ｇｉｎｇｒａｓら、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５４７０２−７）。本明細書の結果は、ＬＰＳに応答してのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣによるＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１２のような多様なサイトカインの高められた産生を一貫して示した。ＬＰＳ−ＴＬＲシグナル伝達は、オートクリンおよびパラクリン様式で機能し得る多くの炎症サイトカインを包含する多彩なＮＦ−κＢ応答性遺伝子を活性化する（Ｂａｅｔｚら、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５４７０８−１５；Ｇｒｏｈｍａｎｎら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：３１５−２３；Ｐａｎら、２００４、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．９４：１４１−５１）。ＳＯＣＳ１がＴＬＲシグナル伝達の減弱に間接的に関与するという事実を鑑みれば、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の決定的な抑制機構を無効化することは、サイトカインがオートクリン若しくは／およびパラクリン刺激ループを確立することを可能にして、サイトカイン産生の低下でなく増強に至るはずである。サイトカインおよびサイトカイン受容体ノックアウトマウスの使用を伴う本明細書に開示される結果は、オートクリンサイトカイン刺激ループが、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣによるサイトカインの過剰産生に寄与することを示唆する。
【０３６２】
ＤＣの機能的欠陥および枯渇はＨＩＶに感染した個体で一般的であり、ありそうには進行性の免疫不全に寄与する。ＨＩＶ  ｇｐ１２０タンパク質は、炎症前サイトカインを産生しかつＴ細胞を刺激するＤＣの能力を抑制し得る（Ｆａｎｔｕｚｚｉら、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：９７６３−７２；Ｃａｒｂｏｎｎｅｉｌら、２００４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：７８３２−４０）。ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣは、炎症前サイトカインの高められた産生およびＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの過剰活性化状態により（Ｈａｎａｄａら、２００３、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：４３７−５０）ＨＩＶ  ｇｐ１２０媒介性の抑制に抗することが示された。この知見は、免疫抑制されたＨＩＶに感染した個体で使用しうる治療的ＨＩＶワクチンの開発にとりわけ関連する（Ｌｕら、２００４、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：１３５９−１３６５）。
【０３６３】
ここで記述されるワクチン接種戦略は、ＤＣ中の宿主の免疫阻害物質を阻害することにより抗ＨＩＶ免疫応答を高めるための最初の努力を表す。自然免疫はＨＩＶ−１感染の制御において無効であるため、宿主の免疫阻害物質を無効にすることは、効果的な抗ＨＩＶ免疫応答を生成させるのに決定的に重要でありうる。しかしながら、ＨＩＶ特異的免疫応答の単なる増強は保護的ＨＩＶ抗体およびＣＴＬ応答の誘導に至らないことがある。この点に関して、本戦略は、ＤＮＡワクチンおよびＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡの共免疫化により示されるところの現在利用可能なワクチンとの組み合わせ免疫化のための機会を提供する。改良されたＨＩＶ免疫原および送達系（Ｂｕｒｔｏｎら、２００４、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２３３−６；Ｙａｎｇら、２００２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４６３４−４２）とともに使用される場合に、このワクチン接種のアプローチは、ドミナントのエピトープに対してのみならずしかしまた弱く免疫原性すなわち潜在性のそれでもなお保護的エピトープに対しての弱い保護的免疫応答を高めるか、若しくはより広範かつより強い応答を生成させるための新たな途を提供しうる。要約すれば、本開示は、ＨＩＶ特異的抗体およびＣＴＬ応答双方を高めるためのＤＣ中の宿主のシグナル伝達阻害物質を阻害するという原理を示し、保護的抗ＨＩＶ応答をサルおよび究極的にヒトで本戦略により誘導し得るかどうかを決定するためのさらなる検討を要請する。加えて、このＳＯＣＳ１サイレンシングの戦略は、他の病原体に対する免疫応答を高めるのにも使用し得る。
【実施例９】
【０３６４】
ヒトＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡの同定および分析
コンピュータプログラムを使用して、ヒトＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ配列、すなわちｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ１（ＣＡＣＧＣＡＣＵＵＣＣＧＣＡＣＡＵＵＣ．ｄＴ．ｄＴ；配列番号２１）、ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ２（ＵＵＣＣＧＵＵＣＧＣＡＣＧＣＣＧＡＵＵ．ｄＴ．ｄＴ；配列番号２２）およびｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ３（ＧＡＧＣＵＵＣＧＡＣＵＧＣＣＵＣＵＵＣ．ｄＴ．ｄＴ；配列番号２３）を選択した。全部の標的配列をＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔクエリにかけて、他の既知の遺伝子に対する相同性の欠如を確認した。「．ｄＴ．ｄＴ」という呼称はｓｉＲＮＡ標的配列のすぐ下流のポリｄＴ配列を指す。
【実施例１０】
【０３６５】
ヒト単球ＤＣのＧｅｎＰｏｒｔｅｒでのトランスフェクション
ヒトＤＣの調節におけるヒトＳＯＣＳ１の役割を検討するため、ヒトＳＯＣＳ１を特異的に下方制御する能力をもつ小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を最初に同定した。コンピュータプログラムを使用して、ヒトＳＯＣＳ１および２９３Ｔ細胞を標的とするｓｉＲＮＡ配列を選択した。各合成ヒトＳＯＣＳ−１−ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖をその後、ｆｌａｇ標識ヒトＳＯＣＳ１発現とともに１０：１の比でＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒトランスフェクション試薬を使用して２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を収集し、そして本明細書の別の場所に記述されるところのウエスタンブロッティングにより分析した。
【０３６６】
図２１Ａは、ヒトＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ１がヒトＳＯＣＳ１発現を効率的に下方制御したことを示す。ｓｉＲＮＡによるヒトＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡの下方制御の特異性を、スクランブル型ｓｉＲＮＡ１オリゴヌクレオチド二重鎖のＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡを下方制御することの不能により確認した。ヒトＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ１を、従ってさらなる研究に選択した。合成ｓｉＲＮＡ二重鎖を、ヒト単球由来のＤＣにＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒにより８５．５％のトランスフェクション効率を伴いトランスフェクトした（図２１Ｂ）。定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイにより確認されるとおり、ｈＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ１二重鎖でトランスフェクトした全ＤＣ集団のｈＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡのレベルは、擬似トランスフェクトしたＤＣでのレベルに比較しておよそ６０％特異的に低下した（図２１Ｃ、ｐ＜０．０１）。該ｓｉＲＮＡの効率およびＳＯＣＳ１  ＲＮＡの減少は、全マウス骨髄由来ＤＣ集団中のマウスＳＯＣＳ１を標的とした合成ｓｉＲＮＡ二重鎖を使用する実験で観察されたものと同様である。
【０３６７】
ヒトＤＣ中のヒトＳＯＣＳ１の相対的発現を本明細書の別の場所に記述されるところの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより評価した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティからのヒトＳＯＣＳ１の予め開発されたプライマー／プローブ組（プライマー、５’−ＴＴＴＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＣＧＧＧＡＡ−３’；配列番号２４および５’−ＣＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣ−３’；配列番号２５、ならびにプローブ、６ＦＡＭ−ＡＴＧＧＣＣＴＣＧＧＧＡＣＣＣＡＣＧＡＧ−ＴＡＭＲＡ；配列番号２６）を使用した。
【０３６８】
ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの特徴付け
次の一組の実験は、ヒトＳＯＣＳ１がＤＣ上の共刺激分子の発現を調節しているかどうかをフローサイトメトリー分析により評価するために実施した。ヒトＳＯＣＳ１のフローサイトメトリー分析は、本明細書の別の場所に記述されるところのネズミのＳＯＣＳ１の評価において使用したものに従って後に続いた。ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣおよび対照のｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ変異体でトランスフェクトしたＤＣが、ネズミのＤＣでの観察結果と一致して、ＬＰＳで誘導した成熟前および後に代表的共刺激分子のそれらの発現のわずかな差違のみ示したことが観察された（図２２Ａ）。比較可能なレベルのＭＨＣ−ＩおよびＩＩ分子もまた、ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣおよび変異体ｓｉＲＮＡ  ＤＣ上で検出された。対照的に、ｈＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣは、ＩＬ−１２、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αのような炎症前サイトカインの劇的に高められた分泌により示されるとおり、ｓｉＲＮＡ変異体でトランスフェクトしたヒトＤＣがそうであったよりも、ＬＰＳでの刺激に対しより応答性であったことが観察された（図２２Ｂおよび２２Ｃ）。
【０３６９】
ヒトＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡを発現する組換えアデノウイルスベクターの生成
ＡｄＥａｓｙ系（Ｅ１およびＥ３欠失Ａｄ（５）；Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州パロアルト）を使用して、複製欠損アデノウイルスを構築かつ生成した。シャトルベクターＡｄ−ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡを、Ｈ１−ヒトＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡフラグメントをＡｄＥａｓｙベクターに挿入することにより構築した（図２８）。ヒトＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡの挿入をＤＮＡ配列決定により確認した。組換えアデノウイルスＡｄ−ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡをその後、製造元の説明書（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州パロアルト）に従って生成した。組換えアデノウイルスを、製造元の説明書（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州パロアルト）に従って２９３細胞中で産生かつ滴定した。組換えＡｄ（５）ウイルスがヒト単球由来ＤＣをトランスフェクトすることが可能であったことが観察された。
【実施例１１】
【０３７０】
ヒトＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより刺激されるＭＡＧＥ３特異的ＣＴＬ応答
以下の実験は、ヒトＤＣの免疫刺激能力の調節におけるヒトＳＯＣＳ１の役割を検討するために着手した。本実施例で提示される結果は、ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが微生物産物での刺激に対し機能亢進性でありかつ自己抗原特異的ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激する高められた刺激性能力を有することを示す。重要なことには、ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣは、天然の抗原を発現するヒト腫瘍細胞に対する活発な溶解活性を有するＣＴＬを完全に活性化することが可能であるが、しかし野性型ＤＣは可能でない。また、ＣＴＬを刺激するヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの能力はＩＬ−１２産生およびシグナル伝達のＳＯＣＳ１拘束により制御されることがありそうであると考えられる。これらの結果は、負に調節するヒトＤＣ中でのヒトＳＯＣＳ１の決定的な役割を示し、かつ、ヒト患者のためのより効果的な腫瘍ワクチンを開発するための本ＳＯＣＳ１サイレンシングのアプローチの橋渡し的な可能性を暗示する。
【０３７１】
本明細書に開示される実験で使用する材料および方法を今や記述する。
ペプチド
ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＭＡＧＥ３  ＣＴＬペプチド（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ；配列番号２７）（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎら、１９９４、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２４：３０３８−４３）および対照のＨ−２Ｋｂ拘束性ＯＶＡ−１（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；配列番号１１）は、Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ（米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）により合成かつＨＰＬＣにより＞９５％純度まで精製された。ペプチドを、無エンドトキシンＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）での最終希釈前にＤＭＳＯに溶解した。
ヒトＳＯＣＳ１発現のウエスタンブロット分析
２９３Ｔ細胞を、本明細書の別の場所で論考されるとおり、１０：１の比の合成ヒトＳＯＣＳ−１−ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖（２１ｂｐ）若しくは無関係のオリゴ二重鎖、およびｆｌａｇ標識ヒトＳＯＣＳ１発現ベクター（ｐＣＭＶ−ｈＳＯＣＳ１）で、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ試薬を使用してコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ）への転写後に、サンプルを抗Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）若しくはアクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州サンタクルズ）抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析し、次いでＥＣＬ−Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ）で検出した。フィルムをデンシトメーターＳＩで走査し、そしてＳＯＣＳ−１／アクチンのバンドをＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で定量化した。ＳＯＣＳ１のバンドの強度をβ−アクチンのバンドの強度に対し正規化した。
【０３７２】
ヒトＳＯＣＳ１発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
ヒトＤＣ中のヒトＳＯＣＳ１の相対的発現を、本明細書の別の場所で論考されるところの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより評価した。
ヒト単球由来ＤＣのトランスフェクションおよびヒトＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ予備刺激
ＰＢＭＣ由来のヒトＤＣは、Ｓｃｈｒｏｅｒｓら、２００３、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎ．Ｒｅｓ．９：４７４３−４７５５；およびＳｃｈｒｏｅｒｓら、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６：４５１−９に記述されるとおり生成かつ培養した。ヘパリン処置血をＨＬＡ−Ａ２＋の健康志願者から収集した。ＨＬＡタイピングはＰＣＲ−ＳＳＰ−ＤＮＡに基づく手順（Ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｉｓｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、テキサス州ヒューストン）により実施した。ＰＢＭＣを無血清ＤＣ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、イリノイ州アンティオキア）に再懸濁し、そして加湿５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。プラスチックに接着する細胞画分を、１０００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）および１０００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）を含む無血清ＤＣ培地中で培養した。第５若しくは６日に、製造元の説明書に従ってＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒを使用して１２０ｎＭのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドで単球由来ＤＣをトランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＣをその後ＭＡＧＥ３ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）で一夜パルスした。２４ウェルプレートのウェルあたり合計１×１０６のヒトＴ細胞を、５％ＡＢヒト血清、ｒｈＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）およびＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）を補充した０．５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中で、５×１０４のＭＡＧＥ３でパルスしトランスフェクトしたＤＣと共培養した（２０：１）。共培養したＴ細胞を、共培養の第７日に、自己ＭＡＧＥ３でパルスしトランスフェクトしたＤＣで１回再刺激した。いくつかの実験については、抗ヒトＩＬ−１２（ｐ７０）抗体（２０μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）をＤＣおよびＴ細胞の共培養物に３日ごとに添加した。共培養の２週後に、Ｔ細胞を免疫アッセイに使用した。
【０３７３】
サイトカインのＥＬＩＳＡおよびエリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ
多様な炎症前サイトカインのレベルを、指定された時間点にかつ指定された刺激を伴い、製造元の説明書に従って、ＥＬＩＳＡ分析（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州リンカーンパーク）のためのＤＣ培養物の上清を使用して定量した。ヒト末梢リンパ球のＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、本明細書の別の場所に記述されるとおり実施した。
【０３７４】
フローサイトメトリー分析
細胞を、０．１％ＮａＮ３および２％ＦＣＳを含有するＰＢＳ中のＦＩＴＣ若しくはＰＥ  ｍＡｂで染色した。ヒトＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６に特異的な抗体およびマッチさせたアイソタイプ対照はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼから購入した。染色された細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州リンカーンパーク）フローサイトメーターで分析した。
【０３７５】
四量体染色
ヒトＭＡＧＥ３／ＨＬＡ−Ａ２四量体は、ベイラー医科大学（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＴｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（米国テキサス州ヒューストン）で合成した。ヒト末梢血リンパ球若しくは共培養物中のリンパ球を、抗ｈＣＤ８α−ＦＩＴＣ／抗ｈＣＤ３−ＰｅｒＣＰおよびＭＡＧＥ３−ＰＥ四量体で共染色した。四量体染色は、製造元の説明書に従い、１０６細胞あたり１μｇの抗ＣＤ８α、およびＭＡＧＥ３−ＰＥ四量体の１００倍希釈を用い４℃で１時間行った。
【０３７６】
ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスのＤＣ免疫化
４ないし６週齢の雌性ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（米国メーン州）から購入し、そしてベイラー医科大学（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（米国テキサス州ヒューストン）の無菌マウス施設で施設のガイドラインに従って維持した。マウスＢＭ由来ＤＣをＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスから調製し、そして本明細書の別の場所に記述されるとおり、５のＭＯＩの組換えレンチウイルスベクターＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ若しくはＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで形質導入した。ＤＣをその後ＭＡＧＥ３ペプチドで２０時間パルスし、ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＴＮＦα（５００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）で２４時間刺激した。ＤＣをその後、後足蹠を介してＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに注入した。若干のマウスでは、ＤＣワクチン接種後の指定された日に、ＬＰＳ（３０μｇ／マウス）若しくは組換えネズミＩＬ−１２（１μｇ／マウス、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ロッキーヒル）を腹腔内に（ｉ．ｐ．）投与した。
【０３７７】
ＣＴＬアッセイ
ＣＤ８＋  ＣＴＬ応答は、本明細書の別の場所に開示されるところの標的細胞を溶解するｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激した脾細胞の能力を測定する標準的クロム放出アッセイで評価した（Ｈｕａｎｇら、２００３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７３２１−９）。２〜３匹の免疫したマウスからプールした脾細胞を、ＭＡＧＥ３ペプチドを含有するＲＰＭＩ−１６４０中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで４〜６日間再刺激した。ヒトＭＡＧＥ３＋、ＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫細胞（ＳＫ−Ｍｅｌ−３７）および対照のヒトＭＡＧＥ３＋、ＨＬＡ−Ａ２−黒色腫細胞（ＮＡ−６−Ｍｅｌ）を５１Ｃｒクロム酸ナトリウム溶液で３７℃で９０分間標識した。多様な数のエフェクター細胞を、９６ウェルＵ字型底プレート（２００μｌ／ウェル）中一定数の標的細胞（５×１０４／ウェル）と３７℃で４時間インキュベートした。三重の培養物からの上清を収集しかつ分析した。溶解パーセントは（実験放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）×１００として計算した。
【０３７８】
本実施例に提示される実験の結果を今や記述する。
【０３７９】
ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの、抗原特異的ＣＴＬ応答を刺激する高められた免疫刺激能力
次の一組の実験は、サイレンスしたヒトＳＯＣＳ１が自己抗原特異的ＣＴＬの予備刺激においてヒトＤＣの刺激能力を高め得るかどうかを評価するために着手した。成人ヒト精巣および黒色腫細胞で発現されることが既知の胎児性腫瘍抗原、ヒトＭＡＧＥ３由来のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチド（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎら、１９９４、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２４：３０３８−４３）をモデルヒト自己抗原として使用した。ＨＬＡ−Ａ２＋の健康志願者からのヒト単球由来ＤＣをｈＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、そしてその後ＭＡＧＥ３ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）で一夜パルスした。ウェルあたり合計１×１０６の自己ヒトＴ細胞を、ＴＮＦα（成熟刺激）（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）の存在下で、５×１０４のＭＡＧＥ３でパルスしトラ
ンスフェクトしたＤＣと共培養した（２０：１）。共培養したＴ細胞を、共培養の第７日に、自己ＭＡＧＥ３でパルスしトランスフェクトしたＤＣで１回再刺激した。共培養の２週後に、Ｔ細胞を免疫アッセイに使用した。ＭＡＧＥ３ペプチドでパルスしたｈＳＯＣＳ
ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣとの共培養物中で、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の１３．９％が、ＭＡＧＥ３でパルスしたｍｕｔ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ若しくは擬似ＤＣとの共培養物中でのそれぞれわずか５．４％および４．３％と比較して、ＭＡＧＥ３−四量体について陽性であった（図２３Ａ）。同一ドナーからのナイーブな（未刺激）初代ヒトリンパ球の四量体染色は、低レベルの陽性ＭＡＧＥ３四量体染色を示した（ＣＤ８＋  Ｔ細胞の０．５％）。一致して、細胞内ＩＦＮγ染色（図２３Ｂ）は、ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣが、ＭＡＧＥ３ペプチドでパルスしたｍｕｔ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ（ＩＦＮγ＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の６．９％）若しくは擬似ＤＣ（ＩＦＮγ＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の５．７％）と比較して、ＭＡＧＥ３特異的ＣＴＬ応答を実質的に改善した（ＩＦＮγ＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の１１．１８％）ことを示した。さらに、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（図２３Ｃ）は、増大した数のＭＡＧＥ３特異的ＣＴＬがｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより活性化されたことを示した。ＨＬＡ−Ａ２＋ドナーからの反復実験は同様の結果を示した。初代ヒトＴ細胞の大部分は、抗原でパルスされないＤＣとの２週の共培養後に死亡した。集合的に、これらの結果は、ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが自己抗原特異的ＣＴＬを刺激する高められた免疫刺激能力を有することを示す。
【０３８０】
ＣＴＬ予備刺激におけるＳＯＣＳ１拘束性のＩＬ−１２の決定的な役割
ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣは、微生物産物での刺激に応答して、高められた量のＩＬ−１２（ＣＴＬ応答の活性化で重要なサイトカイン）を産生する（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ、２００３、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１３３−４６）ため、また、ＩＬ−１２シグナル伝達はＳＯＣＳ１により拘束される（Ｅｙｌｅｓら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４３７３５−４０）ため、ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣによるＣＴＬの刺激におけるＩＬ−１２の役割を検査した。従って、抗ヒトＩＬ−１２抗体を、Ｔ細胞およびＭＡＧＥ３でパルスしトランスフェクトしたＤＣの共培養物に３日ごとに添加した。図２３Ａから２３Ｃは、抗ＩＬ−１２（ｐ７０）抗体を使用するＩＬ−１２の阻害が、四量体染色、細胞内ＩＦＮγ染色およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより示されるとおり、ＭＡＧＥ３特異的ＣＴＬを刺激するｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣの高められた能力を無効にしたことを示す。
【０３８１】
ヒト化ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスを使用して、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより誘導される高められたＣＴＬ応答におけるＩＬ−１２の役割をさらに試験した。ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスのＢＭ由来ＤＣを、ネズミのＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡを発現する組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ−ｍＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ）若しくは対照ベクターＬＶ−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡで形質導入し、そしてＡ２拘束性ＭＡＧＥ３ペプチドでパルスした。ＴＮＦαでの成熟後に、形質導入したＤＣを、ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスに足蹠を介して１週間隔で２回投与した。各ＤＣ免疫化後に、マウスをＬＰＳ若しくは低用量の組換えＩＬ−１２サイトカインのいずれかでｉｎ  ｖｉｖｏで３回刺激した。ＬＰＳは、それが誘導する多数の炎症前サイトカイン（それらの多くはＳＯＣＳ１により調節される）のため、およびＮＦ−κＢ（ｐ６５）シグナル伝達の調節におけるＳＯＣＳ１の可能な直接的な役割（Ｒｙｏら、２００３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：１４１３−２６）のために使用した。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＩＬ−１２刺激で、２×１０５のＴ細胞あたり２３９のＩＦＮγ＋のスポットが、ＭＡＧＥ３でパルスしたＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスでの２×１０５のＴ細胞あたりわずか１０のＩＦＮγ＋スポットと比較して、ＭＡＧＥ３でパルスしたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ
ＤＣで免疫したマウスで検出された（図２４）。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＬＰＳ刺激はまた、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより誘導されるＣＴＬ応答も優先的に高めた（ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでの２×１０５のＴ細胞あたり６３のＩＦＮγ＋スポット対
ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで２×１０５のＴ細胞あたり２４のＩＦＮγ＋スポット）（図２４）。しかしながら、ＩＬ−１２刺激は、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫したマウスでＭＡＧＥ３特異的ＣＴＬ応答を後押しするためにＬＰＳ刺激より効果的であった（Ｐ＜０．０１）。ＩＬ−１２のこの優れた刺激能力は、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ経路によりＩＬ−１２刺激を直接調節するＳＯＣＳ１の能力、ならびにＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスで活性化されたＣＴＬに対するＩＬ−１２の直接の効果（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ、２００３、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１３３−４６）によることがありそうである。一緒にすれば、これらの結果は、ＳＯＣＳ１が抗原提示細胞中のＩＬ−１２のシグナル伝達を拘束するというさらなる証拠を提供する。これらの結果はまた、サイトカインに基づく腫瘍療法の有効性の決定におけるサイトカインシグナル伝達の重要性も強調する。
ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより活性化したヒトＣＴＬは腫瘍溶解性エフェクター機能を有するが、しかし野性型ＤＣにより活性化したＣＴＬは有しない。
【０３８２】
自己腫瘍関連抗原ＭＡＧＥ３に特異的な活性化したＴ細胞が腫瘍溶解性エフェクター機能を有するかどうかを決定するため、天然のＭＡＧＥ３＋ヒト腫瘍細胞をＣＴＬアッセイの標的細胞として使用した。ＭＡＧＥ３でパルスしたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ若しくはｍｕｔ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより活性化したヒトＴ細胞は、ＭＡＧＥ３ペプチドでパルスしたＭＡＧＥ３＋  ＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫細胞（ＳＫ−Ｍｅｌ−３７）を容易に死滅させた。しかしながら、ＭＡＧＥ３でパルスしたｍｕｔ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより活性化したヒトＴ細胞は、ＭＡＧＥ３でパルスしていない天然のＳＫ−Ｍｅｌ−３７細胞に対する弱い細胞溶解活性のみ示した（図２５）。対照的に、ＭＡＧＥ３でパルスしたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより活性化したＴ細胞は、ＭＡＧＥ３でパルスしていない天然のＳＫ−Ｍｅｌ−３７細胞に対する強い細胞溶解活性をなお有した（図２５）。ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣとの共培養物中のＴ細胞の腫瘍溶解活性は、抗ｈＩＬ−１２抗体処理により有意に損なわれた。ＭＡＧＥ３でパルスしたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより活性化したヒトＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２陰性のＭＡＧＥ３＋黒色腫細胞（ＮＡ−６−Ｍｅｌ）に対しバックグラウンドの細胞溶解活性を有したのみであったため、該腫瘍溶解活性はＣＴＬにより特異的に媒介された。多様なドナーからの反復実験は同様の結果を示した。
【０３８３】
上の観察結果を確認するために、ＭＡＧＥ３でパルスしたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ若しくはＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスからのＴ細胞の腫瘍溶解活性を試験した。図２６は、ＭＡＧＥ３でパルスしたｍＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したトランスジェニックマウスからのＴ細胞が、天然のＭＡＧＥ３＋  ＨＬＥ−Ａ２陽性黒色腫細胞ＳＫ−Ｍｅｌ−３７に対する活発な細胞溶解活性を有したことを示す。対照的に、ＭＡＧＥ３でパルスしたＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したトランスジェニックマウスからのＴ細胞は、図２５で示される結果と一致して、天然の黒色腫細胞に対する弱い細胞溶解活性を有したのみであった。さらに、低用量の組換えＩＬ−１２でのｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が、ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより誘導されるＣＴＬ応答を有意に高めたが、しかしＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより誘導されるＣＴＬ応答は高めなかったことが観察された（図２６）。一緒にすれば、本明細書の結果は、ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが、ありそうには抗原提示細胞によるＩＬ−１２の高められた産生およびシグナル伝達により、天然の腫瘍細胞に対する活発な溶解性エフェクター機能を有するＣＴＬを完全に活性化する独特の能力を有することを示す。
【０３８４】
ヒトのＳＯＣＳをサイレンスしたＤＣによる自己抗原特異的ヒトＣＴＬの完全な活性化
本開示は、ヒトＤＣ中のヒトＳＯＣＳ１の調節性の役割を示し、かつ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路のインヒビターによりサイレンシングすることによるヒトＤＣの免疫刺激能力を高めるための代替の一戦略を提供する。本明細書に開示される結果は、抗原特
異的ＣＴＬを刺激するヒトＤＣの免疫刺激能力の負の調節におけるヒトＳＯＣＳ１の決定的な役割を示す。ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣは、天然の抗原を発現する腫瘍細胞に対する確実な溶解機能を有するヒトＣＴＬを完全に活性化する独特の能力を有する。ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣのＣＴＬを刺激する能力は、ＩＬ−１２の産生およびシグナル伝達のＳＯＣＳ１拘束により制御されることがありそうである。従って、本開示は、より有効な腫瘍ワクチンを開発するためのこの一般に応用可能なＳＯＣＳ１サイレンシングのアプローチの橋渡し的な可能性を示す。
【０３８５】
本発明のＳＯＣＳ１サイレンシングのアプローチは、腫瘍関連抗原を負荷したＤＣにより誘導される抗原特異的免疫応答を高める能力を有する。過去１０年間の腫瘍免疫学の大きな進歩は、多数のヒト腫瘍特異的若しくは関連抗原の同定および検証であった（Ｖａｎ
ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅら、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：６８４−９３）。従って、腫瘍関連抗原を負荷した、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣでのワクチン接種は、抗原特異的抗腫瘍応答を誘導するためのＣＴＬ上のＣＴＬＡ４をブロックすることよりも魅力的であろう。ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの免疫化の使用は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが重篤な自己免疫性炎症を引き起こさないかもしれないために、付加的な治療上の利益を提供する。ヘテロ接合性のＳＯＣＳ１＋／−マウスが自己免疫性炎症の兆候を示さないか若しくは軽度の兆候のみ示すからである。さらに、ＳＯＣＳ１−／−マウスで見られる重篤な自己免疫性炎症は、ＤＣ中でのみならずしかしまたＴおよびＮＫＴ細胞のような免疫細胞の他の系統でのＳＯＣＳ１の完全な欠乏を必要とする（Ｋｕｂｏら、２００３、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１１６９−７６；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２００４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５０３−２９；Ｍｅｔｃａｌｆら、２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：８４３６−４１；Ｃｈｏｎｇら、２００３、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１８：４７５−８７；Ｈａｎａｄａら、２００３、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：４３７−５０；Ｋｉｎｊｙｏら、２００２、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：５８３−９１）。
【０３８６】
腫瘍ワクチンの有効性を高めるための多数の努力は、腫瘍関連抗原の親和性／用量（シグナル１）および共刺激分子媒介性のシグナル２のレベルの改良に集中した（Ｇｉｌｂｏａ、２００４、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ４：４０１−１１；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、２００４、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９０９−１５）。本開示は、ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの抗原特異的ＣＴＬを刺激する優れた能力が、ＩＬ−１２の高められた産生およびシグナル伝達（シグナル３）によることがありそうであることを示す。この結論は、以下の観察結果、すなわち１）ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣは、微生物産物での刺激に応答して高められたレベルのＩＬ−１２を産生する；２）ＩＬ−１２の抗体ブロッキングはヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの免疫刺激能力を損なう；および３）低用量のＩＬ−１２のｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより誘導される抗原特異的ＣＴＬ応答を劇的に高めるが、しかし野性型ＤＣにより誘導される応答はしない、に基づく。これらの結果は、Ｅｙｌｅｓ，Ｊ．Ｌ．ら（Ｅｙｌｅｓら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４３７３５−４０）および本明細書の別の場所に開示される結果による、ＩＬ−１２シグナル伝達のネズミのＳＯＣＳ１の調節の知見により裏付けられる。
【０３８７】
サイトカインはＣＴＬを活性化するためにＤＣにより提供される第三のシグナルとして提案されている（Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒら、２００３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１１４１−５１）。サイトカイン産生およびシグナル伝達は、過剰の自己免疫活性化を制限しつつ、外来抗原に対する免疫応答を活性化するためにしっかりと調節される（Ｄａｒｎｅｌｌら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１４１５−２１）。サイトカインは一般的にＪＡＫを活性化し、それはその後サイトカイン受容体の細胞質ドメインをリン酸化して、転写のシグナル伝達物質および活性化物質（ＳＴＡＴ）のメンバーのドッキング部位を創製する（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２００４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５０３−２９）。サイトカインはまた、フィードバックインヒビターとしてＳＯＣＳ１の発現を上方制御し、それはその後ＤＣによる炎症前サイトカインの産生およびシグナル伝達のスイッチを切り、従って進行中の免疫応答を減弱させかつ自己寛容を維持する（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２００４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５０３−２９）。ＳＯＣＳ１は、そのＳＨ２ドメインを介して擬似基質阻害物質としてＪＡＫ活性化ループに特異的に結合しかつＪＡＫ２の標的をユビキチン依存性のタンパク質分解に向けることにより、ＳＴＡＴを抑制する（Ｋｕｂｏら、２００３、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１１６９−７６；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２００４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５０３−２９）。一緒にすれば、本明細書に開示される結果は、ＣＴＬ応答の大きさの決定における、抗原提示細胞中でＳＯＣＳ１により拘束されるＩＬ−１２の産生およびシグナル伝達の決定的な重要性を示す。
【０３８８】
この研究の重大な一知見は、ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣが、活発な溶解性エフェクター機能を伴い自己反応性Ｔ細胞を完全に活性化する独特の能力を有することである。自己抗原特異的Ｔ細胞が、四量体染色およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイのような多様な免疫アッセイにより測定されるとおり、ＤＣワクチン接種若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ感作により活性化され得ることが、臨床試験および実験室の研究で頻繁に観察されている。しかしながら、こうした活性化したＴ細胞は、人工的抗原でパルスした腫瘍細胞若しくは自己抗原を発現するよう遺伝子的に改変した腫瘍細胞を効率的に死滅させ得るとは言え、それらは通常、現在の腫瘍ワクチンの乏しい有効性の主理由であると考えられている、天然の腫瘍細胞に対する弱い細胞溶解活性を示す（Ｚａｋｓら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：４９０２−８；Ｙｕら、２００２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：２８９−９４）。本明細書に開示される結果は、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより提供される持続性かつ高められた抗原提示／刺激が、自己反応性の低親和性Ｔ細胞を完全に活性化しかつそれらに天然の腫瘍細胞に対する活発な溶解性エフェクター機能を与えるために必要とされうることを示唆している。
【実施例１２】
【０３８９】
ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ二重鎖はタンパク質免疫化を高める。
ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ二重鎖でのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化がタンパク質免疫化を高め得るかどうかを試験するため、１）ＢＣＧを伴うＯＶＡタンパク質での免疫化により誘導されるＣＴＬ応答を、２）ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ二重鎖リポソーム、およびＢＣＧを伴うＯＶＡタンパク質での共免疫化と比較した。マウスの群を、１週間隔で２回、足蹠を介して、ＯＶＡタンパク質およびＢＣＧの混合物、ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ二重鎖リポソームならびにＯＶＡタンパク質およびＢＣＧの混合物で免疫したか、若しくはＯＶＡタンパク質およびＢＣＧならびにＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ二重鎖リポソームの混合物を共注入した。第二の免疫化の２週後、細胞内サイトカイン染色およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＩＦＮγ）が、ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ二重鎖で共免疫したマウスでより強力なＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答が誘導されたことを示したことが観察された（図２７Ａおよび２７Ｂ）。
【実施例１３】
【０３９０】
ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＣＴＬは高められた細胞溶解活性を有する。
Ｔ細胞中のＳＯＣＳ１がＣＴＬ活性の調節においてある役割を演じているかどうかを検討するため、ＯＴ−Ｉトランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、メーン州バーハーバー）から単離した１個のＯＶＡエピトープに特異的なトランスジェニックＴＣＲを有するＣＤ８＋  ＯＴ−Ｉ細胞を、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒを使用してＳＯＣＳ１若しくは変異体ｓｉＲＮＡオリゴでトランスフェクトした。トランスフェクトしたＯＴ−Ｉ細胞を、さらなる刺激を伴わずにＣＴＬアッセイに使用した。ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡオリゴでトランスフェクトしたＯＴ−Ｉは、変異体ｓｉＲＮＡオリゴでトランスフェクトしたＯＴ−Ｉ細胞と比較して、同系のＯＶＡ陽性ＥＧ７細胞に対する高められた細胞溶解活性を有したことが観察された（図２９）。この結果は、Ｔ細胞中のＳＯＣＳ１サイレンシングがそれらの細胞溶解活性を高めることを示す。
【０３９１】
本明細書で引用される各およびすべての特許、特許出願および公開の開示はここにそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０３９２】
本発明は特定の態様に関して開示された一方、本発明の他の態様および変形物が、本発明の真の技術思想および範囲から離れることなく当業者により考案されうることが明らかである。付属として付けられる請求の範囲は、全部のこうした態様および同等な変形物を包含すると解釈されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０３９３】
本発明を具体的に説明する目的上、本発明のある態様を図面に描く。しかしながら、本発明は該図面に描かれる態様の正確な配置および手段に制限されない。
【図１】図１Ａおよび１Ｂを含んでなる、ＳＯＣＳ１の発現がＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡにより下方制御されることを示す一連の図である。図１ＡはマウスＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡとともにコトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のウエスタンブロットアッセイを描く。図１Ｂは、ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡとともにオリゴでトランスフェクトしたＤＣの定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを描く。
【図２】ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣが、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αのような炎症前サイトカインの高められた分泌により示されるとおり、ｓｉＲＮＡ変異体でトランスフェクトしたＤＣがそうであったよりＬＰＳ若しくはＩＦＮ−γに対しより応答性であったことを示す図である。
【図３】組換えレンチウイルスベクター；ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡおよびＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡの図解である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂを含んでなる、ＳＯＣＳ１が抗原特異的ＣＴＬをｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激するＤＣの能力を負に調節することを示す一連の図である。図４Ａは、卵アルブミン特異的ＴＣＲ  Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ）が、ｓｉＲＮＡ−ＤＣ変異体共培養物中でよりもＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ共培養物中でより増殖したという事実を描く。これらのデータと矛盾せず、より高レベルの炎症前サイトカインがＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ共培養物中で分泌された（図４Ｂ）。
【図５】図５Ａから５Ｃを含んでなる、ＳＯＣＳ１が抗原特異的Ｔ細胞応答をｉｎ  ｖｉｖｏで刺激するＤＣの能力を負に調節することを示す一連の図である。図５Ａは、全部のゲートしたＣＤ８＋  Ｔ細胞集団でのＨ２−Ｋｂ／卵アルブミン−ＰＥ四量体＋Ｔ細胞の比率を示す。図５Ｂはインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを描く。図５Ｃは、未熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣを与えたマウスからの脾細胞の卵アルブミン＋標的細胞に対するより強力な細胞傷害性を示すＣＴＬアッセイを描く。
【図６】図６Ａから６Ｅを含んでなる、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＬＰＳ刺激がＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより誘導されるＣＴＬ応答を強く高めたことを示す一連の図である。図６ＡはゲートしたＣＤ８＋  Ｔ細胞中の卵アルブミン−ＰＥ四量体陽性Ｔ細胞の比率を描く。図６Ｂは、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＬＰＳ誘発性の成熟を伴わない卵アルブミンでパルスし形質導入したか若しくは擬似ＤＣで免疫し、次いでｉｎ  ｖｉｖｏ  ＬＰＳ刺激したマウスでのＣＤ８＋  Ｔ細胞のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ数を描く。図６Ｃおよび図６Ｄは、成熟させたＤＣで免疫し、次いでｉｎ  ｖｉｖｏ  ＬＰＳ刺激したマウスでのＣＤ８＋  Ｔ細胞のそれぞれ卵アルブミン−ＰＥ四量体＋の比率およびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ数を描く。図６Ｅは、多様なサイトカインおよびＴＬＲアゴニストでのｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣによるＣＴＬ応答（ＥＬＩＳＰＯＴ）を高めることを示す。
【図７】図７Ａから７Ｅを含んでなる、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより誘導される高められた抗腫瘍免疫を示す一連の図である。図７Ａは、卵アルブミンでパルスしたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化が、予め確立された卵アルブミン＋  ＥＧ７腫瘍の増殖を阻害したという事実を描く。図７Ｂは、抗ＣＤ８抗体が卵アルブミンでパルスしたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘導される抗腫瘍活性を消失させたが、しかし抗ＣＤ４抗体はしなかったという事実を描く。図７Ｃから７Ｅは、マウスでのＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ二重鎖でトランスフェクトしたＤＣによる高められた抗腫瘍活性を描く。
【図８】図８Ａから８Ｃを含んでなる、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣによる自己腫瘍関連抗原に対する高められたＣＴＬ応答を示す一連の図である。図８は、成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが予め確立されたＢ１６腫瘍の増殖を効果的に阻害した一方、成熟ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣはいかなる観察可能な阻害効果も有しなかったという事実を描く。図８Ｂおよび図８Ｃは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでの強力なＴＲＰ２特異的ＣＴＬ応答のそれぞれＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬアッセイを描く。
【図９】図９Ａから９Ｃを含んでなる、ＳＯＣＳ１により拘束される成熟ＤＣのシグナル伝達が自己抗原に対するＣＴＬ応答および抗腫瘍免疫を制御することを示す一連の画像である。図９Ａは、免疫化２週後のマウスでの脾細胞のＣＤ８＋  Ｔ細胞中のＨ２−Ｋｂ−ＴＲＰ２−ＰＥ四量体陽性Ｔ細胞の比率を描く。図９Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＬＰＳ刺激を１回若しくは３回受領する、ＴＲＰ２ａでパルスしたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫したマウスでの免疫化３か月後の代表的な白斑を描く。図９Ｃは、免疫したマウスの群からプールした脾細胞のＴＲＰ２＋  Ｂ１６（上図）、およびＴＲＰ２ａペプチドでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激後にＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫した野性型マウスの脾細胞のＴＲＰ２−  ＥＧ．７標的細胞（下図）に対する細胞傷害性を描く。
【図１０】図１０Ａから１０Ｄを含んでなる、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ免疫化による予め確立されたＢ１６腫瘍の根絶を示す一連の図である。図１０Ａおよび１０ＢはそれぞれＬＰＳのｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を伴わないおよび伴う野性型マウスでの腫瘍増殖曲線を描く。図１０Ｃは、６０日間モニターしたマウスの生存パーセントを描く。図１０Ｄは、ＬＰＳを共注入しかつＴＲＰ２ａペプチドの刺激にかけた免疫したマウスのプールした脾細胞から単離したＣＤ８＋  Ｔ細胞のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを描く。
【図１１】図１１Ａから１１Ｃを含んでなる、低若しくは高親和性ペプチドいずれかでパルスしたＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより誘導される強力なＣＴＬ応答および抗腫瘍活性を示す一連の図である。図１１Ａは、ＬＰＳ刺激を伴わない（図１１Ａ−１）若しくは伴う（図１１Ａ−２）形質導入したＤＣ上の共刺激／阻害分子のフローサイトメトリー分析を描く。図１１Ｂは、低若しくは高親和性ペプチドでパルスしたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣによる予め確立されたＢ１６腫瘍の根絶を描く。図１１Ｃは、ＴＲＰ２ａ若しくはＴＲＰ２ｂペプチドで刺激した、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定されるところの抗原特異的ＣＴＬ応答の比較を描く。
【図１２】図１２Ａから１２Ｄを含んでなる、ＩＬ−１２  ＫＯ  ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ−ＤＣによる効果的な抗腫瘍応答の誘導の欠如を示す一連の図である。図１２Ａおよび図１２Ｂはそれぞれ腫瘍体積および生存を描く。図１２ＣはＴＲＰ２ａペプチドでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後のＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを描く。図１２Ｄは、ＴＲＰ２＋  Ｂ１６標的細胞を使用する、ＴＲＰ２ａペプチドでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後のＣＴＬアッセイを描く。
【図１３】図１３Ａから１３Ｄを含んでなる、ＳＯＣＳ１がＤＣによるＩＬ−１２およびＩＬ−１２に誘導されるサイトカイン産生を制御することを示す一連の図である。図１３Ａは、ＬＰＳおよびプレート被覆した抗ＣＤ４０  ｍＡｂでの連続的刺激に応答してＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより分泌されるＩＬ−１２のレベルを描く。図１３Ｂは、最初の２４時間の刺激後のこれらの刺激の除去が続くＩＬ−１２レベルを描く。図１３Ｃは、２４時間のＬＰＳおよびプレート被覆した抗ＣＤ４０  ｍＡｂでの刺激、次いで刺激の除去に応答してＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより分泌されるＴＮＦαおよびＩＬ−６のそのレベルを描く。図１３Ｄは、ＬＰＳおよびプレート被覆した抗ＣＤ４０  ｍＡｂでの連続的刺激に応答してｐ３５−／−若しくはｗｔ  ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより分泌されるＴＮＦαおよびＩＬ−６のレベルを描く。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂを含んでなる、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＩＬ−１２投与がＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの免疫化を高めることを示す一連の図である。図１４Ａはｉｎ  ｖｉｖｏ  ＩＬ−１２投与により高められる抗腫瘍活性を描く。図１４ＢはＩＬ−１２による高められたＴＲＰ２特異的ＣＴＬ応答を描く。
【図１５】図１５Ａから１５Ｄを含んでなる、ＤＣ中のＳＯＣＳ１のサイレンシングによりｇｐ１２０特異的抗体およびＣＴＬ応答が高められることを示す一連の図である。図１５Ａは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが、対照ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが導き出したよりも有意により確実なｇｐ１２０特異的ＩｇＭおよびＩｇＧ応答を導き出したことを示す。図１５Ｂは、ＬＶ−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでの対応するサブクラスと比較しての、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫したマウスでの全ＩｇＧサブクラスのＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的抗体力価の劇的な増大を示す。図１５Ｃは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでのｇｐ１２０でパルスした標的細胞に対するＣＴＬ活性が、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでのものより有意により強力であったことを示す。図１５Ｄは、ＬＶ−ＳＯＣＳ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでのＩＦＮ−γ＋  Ｔ細胞のより高い比率を示す。
【図１６】図１６Ａから１６Ｄを含んでなる、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣによるＴｈ１およびＴｈ２極性化サイトカイン双方の高められた産生を示す一連の図である。図１６Ａは、ＬＰＳでの刺激後のＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣと比較してのＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより産生されたＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦαのレベルを描く。図１６Ｂはｇｐ１２０特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の頻度を描く。図１６Ｃは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのＣＤ４＋  Ｔ細胞が、ｇｐ１２０でパルスしたＤＣでの刺激に応答して、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣからのものより活発に増殖したことを具体的に説明する。図１６Ｄは、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣ中のＴｈ１極性化（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦα）ならびにＴｈ２極性化（ＩＬ−４およびＩＬ−１０）双方のサイトカインの増大されたレベルを示す。
【図１７】図１７Ａから１７Ｄを含んでなる、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣによる高められたｇｐ１２０特異的Ｂ細胞活性化を示す一連の図である。図１７ＡはＬＰＳ刺激に際してのＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦ  ｍＲＮＡの発現レベルを描く。図１７Ｂは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣおよびＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでの抗ｇｐ１２０  ＩｇＧ産生Ｂ細胞の頻度を描く。図１７Ｃは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのＢ細胞が、抗ＣＤ４０およびＩＬ−４で共刺激した場合に、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのＢ細胞が増殖したよりも活発に増殖したことを描く。図１７Ｄは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのＢ細胞が、多様な刺激に応答して、より高レベルのＩＬ−６、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αを包含する多様なサイトカインを産生したことを描く。
【図１８】図１８Ａから１８Ｂを含んでなる、ＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣにより誘導される長期のｇｐ１２０特異的抗体およびＣＴＬ応答を示す一連の図である。図１８Ａは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫したマウスと比較した、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫したマウスでのｇｐ１２０特異的抗体を描く。図１８Ｂは、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスと比較した、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでのｇｐ１２０特異的ＣＴＬ応答を具体的に説明する。図１８Ｃは、免疫化後６か月の、ＬＶ−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスと比較した、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスでのＣＤ４４ｈｉおよびＩＦＮγ＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率を具体的に説明する。図１８Ｄは、ｇｐ１２０特異的ＣＤ４＋  Ｔｈ応答が、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスで免疫化後６か月に維持されかつ迅速に誘導されたことを具体的に説明する。
【図１９】図１９Ａから１９Ｅを含んでなる、ＨＩＶ  Ｅｎｖ媒介性の免疫抑制に対するＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの抵抗性を示す一連の図である。図１９Ａは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ−ＤＣがｇｐ１２０タンパク質の存在下でＬＰＳに応答する能力を保持したことを具体的に説明する。ｇｐ１２０タンパク質への前曝露は、ＯＶＡ特異的抗体応答を誘導するＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力に対する明らかな影響を有さず（図１９Ｂおよび１９Ｃ）、また、それはＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘導されるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋  ＣＴＬおよびＣＤ４＋  Ｔｈ応答も損なわなかった（図１９Ｄおよび１９Ｅ）。
【図２０】図２０Ａから２０Ｄを含んでなる、ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡによるＨＩＶ  ＤＮＡワクチンの増強を示す一連の図である。図２０Ａは、ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡで共免疫したマウスでのＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的抗体力価の増強を描く。図２０Ｂおよび２０Ｃは、ＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＴＬ応答が、それぞれＣＴＬおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより示されるとおり、ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡの共注入により有意に高められたことを具体的に説明する。図２０Ｄは、ＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＤ４＋  Ｔｈ応答が、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡの共注入により高められたという事実を描く。
【図２１】図２１Ａから２１Ｃを含んでなる、ヒト単球由来ＤＣ中のヒトＳＯＣＳ１のサイレンシングを示す一連の図である。図２１Ａは、ヒトＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡがヒトＳＯＣＳ１発現を効率的に下方制御したことを具体的に説明する。図２１Ｂは、ヒト単球由来のＤＣへの合成ｓｉＲＮＡ二重鎖のトランスフェクション効率を具体的に説明する。図２１Ｃは、ｈＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ二重鎖でトランスフェクトした全ＤＣ集団のｈＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡのレベルを描く。
【図２２】図２２Ａから２２Ｃを含んでなる、ヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣを特徴づける一連の図である。図２２Ａは示されたヒトＳＯＣＳ１のフローサイトメトリー分析を描く。図２２Ｂおよび２２Ｃは、ｓｉＲＮＡ変異体でトランスフェクトしたヒトＤＣに比較しての、ｈＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたヒトＤＣ中のＩＬ−１２、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αのような炎症前サイトカインの分泌のレベルを具体的に説明する。
【図２３】図２３Ａから２３Ｃを含んでなる、抗原特異的ＣＴＬ応答を刺激するヒトのＳＯＣＳ１をサイレンスしたＤＣの高められた免疫刺激能力を示す一連の図である。ＭＡＧＥ３−ＰＥ四量体＋  Ｔ細胞の比率（図２３Ａ）、ゲートしたＣＤ３＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞集団での細胞内ＩＦＮγ＋  Ｔ細胞の比率（図２３Ｂ）、ならびにＩＦＮ−γ＋  ＥＬＩＳＰＯＴ数（図２３Ｃ）を、異なるＨＬＡ−Ａ２＋ドナーを使用する４回の独立の実験の１つから示す。
【図２４】ヒト化ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスでの高められたヒトＭＡＧＥ３特異的ＣＴＬ応答を描く図である。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂを含んでなる、ヒトＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより活性化されたヒトＣＴＬの腫瘍溶解活性を示す一連の図である。抗ヒトＩＬ−１２抗体の非存在若しくは存在下にＭＡＧＥ３でパルスしたｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ若しくは対照ＤＣおよび自己Ｔ細胞の２週共培養後のヒトＭＡＧＥ３＋、ＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫細胞（ＳＫ−Ｍｅｌ−３７）（図２５Ａ）および対照のヒトＭＡＧＥ３＋、ＨＬＡ−Ａ２−黒色腫細胞（ＮＡ−６−Ｍｅｌ）（図２５Ｂ）に対する細胞溶解活性を、４回の独立の実験の１つから示す。
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂを含んでなる、免疫したＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスの活性化されたＣＴＬの腫瘍溶解活性を示す一連の図である。ヒトＳＫ−Ｍｅｌ−３７細胞（図２６Ａ）および対照のヒトＨＬＡ−Ａ２−  ＮＡ−６−Ｍｅｌ細胞（図２６Ｂ）に対する細胞傷害性を、ＭＡＧＥ３ペプチドで５日間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激後に測定し、そして３回の実験の１つから提示する。
【図２７】図２７Ａおよび２８Ｂを含んでなる、ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ二重鎖での共免疫化がｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質免疫化を増強することを示す一連の図である。
【図２８】ヒトＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡを発現する複製欠損アデノウイルスベクターの図解を描く図である。図２８は、Ａｄ−ヒトＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡによるヒトＤＣのトランスフェクションもまた示す。
【図２９】Ｔ細胞のＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ二重鎖トランスフェクションによる高められたＣＴＬ活性を描く図である。
【図３０】ｓｉＲＮＡ候補の核酸配列を描く図である。
【図１Ａ】
2008522951.tif 000003
【図１Ｂ】
2008522951.tif 000004
【図２】
2008522951.tif 000005
【図３】
2008522951.tif 000006
【図４Ａ−４Ｂ】
2008522951.tif 000007
【図５Ａ】
2008522951.tif 000008
【図５Ｂ】
2008522951.tif 000009
【図５Ｃ】
2008522951.tif 000010
【図６Ａ】
2008522951.tif 000011
【図６Ｂ】
2008522951.tif 000012
【図６Ｃ】
2008522951.tif 000013
【図６Ｄ】
2008522951.tif 000014
【図６Ｅ】
2008522951.tif 000015
【図７Ａ】
2008522951.tif 000016
【図７Ｂ】
2008522951.tif 000017
【図７Ｃ】
2008522951.tif 000018
【図７Ｄ】
2008522951.tif 000019
【図７Ｅ】
2008522951.tif 000020
【図８Ａ】
2008522951.tif 000021
【図８Ｂ】
2008522951.tif 000022
【図８Ｃ】
2008522951.tif 000023
【図９Ａ】
2008522951.tif 000024
【図９Ｂ】
2008522951.tif 000025
【図９Ｃ】
2008522951.tif 000026
【図１０Ａ】
2008522951.tif 000027
【図１０Ｂ】
2008522951.tif 000028
【図１０Ｃ】
2008522951.tif 000029
【図１０Ｄ】
2008522951.tif 000030
【図１１Ａ−１】
2008522951.tif 000031
【図１１Ａ−２】
2008522951.tif 000032
【図１１Ｂ】
2008522951.tif 000033
【図１１Ｃ】
2008522951.tif 000034
【図１２Ａ】
2008522951.tif 000035
【図１２Ｂ】
2008522951.tif 000036
【図１２Ｃ】
2008522951.tif 000037
【図１２Ｄ】
2008522951.tif 000038
【図１３Ａ】
2008522951.tif 000039
【図１３Ｂ】
2008522951.tif 000040
【図１３Ｃ】
2008522951.tif 000041
【図１３Ｄ】
2008522951.tif 000042
【図１４Ａ】
2008522951.tif 000043
【図１４Ｂ】
2008522951.tif 000044
【図１５Ａ】
2008522951.tif 000045
【図１５Ｂ】
2008522951.tif 000046
【図１５Ｃ】
2008522951.tif 000047
【図１５Ｄ】
2008522951.tif 000048
【図１６Ａ−１】
2008522951.tif 000049
【図１６Ａ−２】
2008522951.tif 000050
【図１６Ｂ】
2008522951.tif 000051
【図１６Ｃ】
2008522951.tif 000052
【図１６Ｄ】
2008522951.tif 000053
【図１７Ａ】
2008522951.tif 000054
【図１７Ｂ】
2008522951.tif 000055
【図１７Ｃ】
2008522951.tif 000056
【図１７Ｄ】
2008522951.tif 000057
【図１８Ａ】
2008522951.tif 000058
【図１８Ｂ】
2008522951.tif 000059
【図１８Ｃ】
2008522951.tif 000060
【図１８Ｄ】
2008522951.tif 000061
【図１９Ａ】
2008522951.tif 000062
【図１９Ｂ】
2008522951.tif 000063
【図１９Ｃ】
2008522951.tif 000064
【図１９Ｄ】
2008522951.tif 000065
【図１９Ｅ】
2008522951.tif 000066
【図２０Ａ】
2008522951.tif 000067
【図２０Ｂ】
2008522951.tif 000068
【図２０Ｃ】
2008522951.tif 000069
【図２０Ｄ】
2008522951.tif 000070
【図２１Ａ】
2008522951.tif 000071
【図２１Ｂ】
2008522951.tif 000072
【図２１Ｃ】
2008522951.tif 000073
【図２２Ａ】
2008522951.tif 000074
【図２２Ｂ】
2008522951.tif 000075
【図２２Ｃ】
2008522951.tif 000076
【図２３Ａ】
2008522951.tif 000077
【図２３Ｂ】
2008522951.tif 000078
【図２３Ｃ】
2008522951.tif 000079
【図２４】
2008522951.tif 000080
【図２５Ａ】
2008522951.tif 000081
【図２５Ｂ】
2008522951.tif 000082
【図２６Ａ】
2008522951.tif 000083
【図２６Ｂ】
2008522951.tif 000084
【図２７Ａ】
2008522951.tif 000085
【図２７Ｂ】
2008522951.tif 000086
【図２８】
2008522951.tif 000087
【図２９】
2008522951.tif 000088
【図３０】
2008522951.tif 000089
【配列表】
2008522951000001.xml