(57)【要約】  NGRモチーフを含むペプチドのアミド分解産物を含み、αvβ3インテグリンを選択的に阻害するペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
NGRモチーフを含むペプチドのアミド分解生成物を含み、αvβ3インテグリンを選択的に阻害するペプチド。
【請求項２】
NGRモチーフを含むペプチドのアミド分解生成物を含み、内皮細胞がビトロネクチンと接着するのを阻害するペプチド。
【請求項３】
細胞外マトリックスタンパク質又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含むペプチド。
【請求項４】
フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン又はラミニン又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
フィブロネクチン又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
フィブロネクチンのFN-I5、FN-I7、FN-II1若しくはFN-III9モジュール又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
フィブロネクチンのFN-I5モジュール又はその断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む請求項６記載のペプチド。
【請求項８】
フィブロネクチンのFN-I7モジュール又はその断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む請求項６記載のペプチド。
【請求項９】
配列XNGRX’を含むペプチドのアミド分解生成物を含むペプチドであって、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される前記ペプチド。
【請求項１０】
CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, CVLNGRMEC, CNGRC, CNGRCG, LNGRE, YNGRT, LQCICTGNGRGEWKCE, LQCISTGNGRGEWKCE, CICTGNGRGEWKC, CISTGNGRGEWKC, MRCTCVGNGRGEWTCY, MRCTSVGNGRGEWTCY CTCVGNGRGEWTC及びCTSVGNGRGEWTCから選択される配列を含んでなるペプチドのアミド分解生成物を含むペプチド。
【請求項１１】
環状CVLNGRMEC、線状CNGRC、環状CNGRC、線状CNGRCG又は環状CNGRCGを含むペプチドのアミド分解生成物を含むペプチドである、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
NGRモチーフ又は細胞外マトリックスタンパク質又はそれらの断片若しくは誘導体を含んでなるペプチドの熱処理により入手しうる、請求項１〜１１のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項１３】
isoDGRモチーフを含むペプチド。
【請求項１４】
配列XisoDGRX’を含み、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される、請求項１３記載のペプチド。
【請求項１５】
CisoDGRCVSGCAGRC, isoDGRAHA, GisoDGRG, CVLisoDGRMEC, CisoDGRC, CisoDGRCG, LisoDGRE, YisoDGRT, LQCICTGisoDGRGEWKCE, LQCISTGisoDGRGEWKCE, CICTGisoDGRGEWKC, CISTGisoDGRGEWKC, MRCTCVGisoDGRGEWTCY, MRCTSVGisoDGRGEWTCY, CTCVGisoDGRGEWTC又はCTSVGisoDGRGEWTCから選択される配列を含む、請求項１３又は１４記載のペプチド。
【請求項１６】
シクロCVLisoDGRMEC、線状CisoDGRC、環状CisoDGRC、線状CisoDGRCG又は環状CisoDGRCGを含む請求項１５記載のペプチド。
【請求項１７】
LisoDGRモチーフを含むペプチド。
【請求項１８】
配列XLisoDGRX’を含み、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される、請求項１７記載のペプチド。
【請求項１９】
CLisoDGRCVSGCAGRC, LisoDGRAHA, GLisoDGRG, CVLLisoDGRMEC, CLisoDGRC, CLisoDGRCG, LLisoDGRE, YLisoDGRT, LQCICTGLisoDGRGEWKCE LQCISTGLisoDGRGEWKCE, CICTGLisoDGRGEWKC, CISTGLisoDGRGEWKC, MRCTCVGLisoDGRGEWTCY, MRCTSVGLisoDGRGEWTCY CTCVGLisoDGRGEWTC 及びCTSVGLisoDGRGEWTCから選択される配列を含む、請求項１７又は１８記載のペプチド。
【請求項２０】
シクロCVLLisoDGRMEC、線状CLisoDGRC、環状CLisoDGRC、線状CLisoDGRCG又は環状CLisoDGRCGを含む、請求項１９記載のペプチド。
【請求項２１】
DDGRモチーフを含むペプチド。
【請求項２２】
配列XDDGRX’を含み、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される、請求項２１記載のペプチド。
【請求項２３】
CDDGRCVSGCAGRC, DDGRAHA, GDDGRG, CVLDDGRMEC, CDDGRC, CDDGRCG, LDDGRE, YDDGRT, LQCICTGDDGRGEWKCE, LQCISTGDDGRGEWKCE, CICTGDDGRGEWKC, CISTGDDGRGEWKC, MRCTCVGDDGRGEWTCY, MRCTSVGDDGRGEWTCY, CTCVGDDGRGEWTC及びCTSVGDDGRGEWTCから選択される配列を含む、請求項２１又は２２記載のペプチド。
【請求項２４】
シクロCVLDDGRMEC、線状CDDGRC、環状CDDGRC、線状CDDGRCG又は環状CDDGRCGから選択される配列を含む、請求項２３記載のペプチド。
【請求項２５】
細胞外マトリックスタンパク質又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項１３〜２４のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項２６】
フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン又はラミニン又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項２５記載のペプチド。
【請求項２７】
フィブロネクチン又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項２６記載のペプチド。
【請求項２８】
フィブロネクチンのFN-I5、FN-I7、FN-II1若しくはFN-III9モジュール又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項２７記載のペプチド。
【請求項２９】
フィブロネクチンのFN-I5モジュール又はその断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項２８記載のペプチド。
【請求項３０】
フィブロネクチンのFN-I7モジュール又はその断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項２８記載のペプチド。
【請求項３１】
αvβ3インテグリンを選択的に阻害する、請求項２〜３０のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項３２】
内皮細胞がビトロネクチンと接着するのを阻害する、請求項１又は３〜３１のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項３３】
腫瘍増殖を阻害する、請求項１〜３２のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項３４】
血管新生を阻害する、請求項１〜３３のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項３５】
さらなる治療薬を含まない、請求項１〜３４のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項３６】
さらなる治療薬が抗癌ペプチドである、請求項３５記載のペプチド。
【請求項３７】
さらなる治療薬がサイトカインである、請求項３５又は３６記載のペプチド。
【請求項３８】
DGRモチーフのG及びR残基を含むターンを含む、請求項１〜３７のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項３９】
最大で350アミノ酸を含む、請求項１〜３８のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項４０】
最大で100アミノ酸を含む、請求項１〜３９のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項４１】
最大で50アミノ酸を含む、請求項１〜４０のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項４２】
最大で25アミノ酸を含む、請求項１〜４１のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項４３】
最大で15アミノ酸を含む、請求項１〜４２のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項４４】
NGRモチーフを含むペプチドの代謝により形成された場合以外のペプチドである、請求項１〜４３のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれか１項記載のペプチドと、薬剤、サイトカイン、サイトカイン断片、毒素、アポトーシス性ペプチド、生物反応修飾剤、放射性核種、ウイルス粒子、遺伝子又は造影化合物とを含む複合生成物。
【請求項４６】
請求項１〜４４のいずれか1項記載の有効量のペプチド又は請求項４５記載の複合生成物を含む医薬組成物。
【請求項４７】
製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を共に含む、請求項４６記載の組成物。
【請求項４８】
対応するNGRモチーフを有するペプチドを本質的に含まない、請求項４６又は４７記載の組成物。
【請求項４９】
注射用溶液又は懸濁液又は注入用液体の形態である、請求項４６〜４８のいずれか1項記載の組成物。
【請求項５０】
リポソームの形態である、請求項４９記載の組成物。
【請求項５１】
αvβ3が関与する障害に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、請求項１〜４４のいずれか１項記載のペプチド、請求項４５記載の複合生成物又は請求項４６〜５０のいずれか１項記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５２】
骨粗しょう症、関節炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性、再発狭窄症又は血管腫から選択されるαvβ3が関与する障害に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、請求項１〜４４のいずれか１項記載のペプチド、請求項４５記載の複合生成物又は請求項４６〜５０のいずれか１項記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５３】
骨粗しょう症、関節炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性、再発狭窄症又は血管腫に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、請求項１〜４４のいずれか１項記載のペプチド、請求項４５記載の複合生成物又は請求項４６〜５０のいずれか１項記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５４】
骨粗しょう症に罹患した患者を治療又は診断する方法である、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
関節炎に罹患した患者を治療又は診断する方法である、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
糖尿病性網膜症に罹患した患者を治療又は診断する方法である、請求項５３記載の方法。
【請求項５７】
黄斑変性に罹患した患者を治療又は診断する方法である、請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
再発狭窄症に罹患した患者を治療又は診断する方法である、請求項５３記載の方法。
【請求項５９】
血管腫に罹患した患者を治療又は診断する方法である、請求項５３記載の方法。
【請求項６０】
癌に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、請求項１〜４４のいずれか１項記載のペプチド、請求項４５記載の複合生成物又は請求項４６〜５０のいずれか１項記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項６１】
癌が固形癌を含む、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
癌が肺癌、膵臓癌、乳癌、結腸癌、喉頭癌又は卵巣癌である、請求項６０又は６１記載の方法。
【請求項６３】
請求項１〜４４のいずれか1項記載のペプチドとサイトカインとの複合生成物。
【請求項６４】
サイトカインとNGRモチーフのアミド分解生成物を含む標的部分との複合生成物。
【請求項６５】
サイトカインとDGRモチーフを含む標的部分との複合生成物。
【請求項６６】
DGR がisoDGRである、請求項６５記載の複合生成物。
【請求項６７】
DGR がDDGRである、請求項６５記載の複合生成物。
【請求項６８】
DGR がLisoDGRである、請求項６５記載の複合生成物。
【請求項６９】
サイトカインがTNF、IFNγ、IL-12、IP-10、IL-7又はEMAP IIである、請求項６３〜６８のいずれか１項記載の複合生成物。
【請求項７０】
サイトカインがTNF又はIFNγである、請求項６３〜６８のいずれか1項記載の複合生成物。
【請求項７１】
サイトカインがTNFα又はTNFβである、請求項７０記載の複合生成物。
【請求項７２】
標的部分は配列XDGRX’を含み、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される、請求項６４〜７１のいずれか１項記載の複合生成物。
【請求項７３】
標的部分がCDGRCVSGCAGRC, DGRAHA, GDGRG, CVLDGRMEC, CDGRC, CDGRCG, LDGRE, YDGRT, LQCICTGDGRGEWKCE, LQCISTGDGRGEWKCE, CICTGDGRGEWKC, CISTGDGRGEWKC, MRCTCVGDGRGEWTCY, MRCTSVGDGRGEWTCY, CTCVGDGRGEWTC又はCTSVGDGRGEWTCから選択される、請求項６４〜７２のいずれか１項記載の複合生成物。
【請求項７４】
標的部分がシクロCVLDGRMEC、線状CDGRC、環状CDGRC、線状CDGRCG及び環状CDGRCGから選択される、請求項７３記載の複合生成物。
【請求項７５】
サイトカインがポリエチレングリコール又はアシル基で誘導体化される、請求項６３〜７４のいずれか１項記載の複合生成物。
【請求項７６】
サイトカインが抗体、抗体フラグメント、及びビオチンからなる群から選択される化合物とさらに結合し、前記抗体又はそれらの断片が腫瘍抗原、腫瘍血管新生マーカー又は細胞外マトリックス成分からなる群から選択される化合物に対するものである、請求項６３〜７５のいずれか１項記載の複合生成物。
【請求項７７】
サイトカインがTNFであり、標的部分並びに、抗体及び抗体フラグメント及びビオチンからなる群から選択される化合物の両方と結合した、請求項７６記載の複合生成物。
【請求項７８】
NGRモチーフを含むペプチドの代謝によりin vivoで形成された場合以外である、請求項６３〜７７のいずれか1項記載の複合生成物。
【請求項７９】
有効量の請求項６３〜７８のいずれか１項記載の複合生成物と、製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を共に含む医薬組成物。
【請求項８０】
注射用溶液もしくは懸濁液又は注入用液体の形態である、請求項７９記載の組成物。
【請求項８１】
リポソームの形態である、請求項８０記載の組成物。
【請求項８２】
TNFと請求項１〜４４のいずれか１項記載のペプチドとの有効量の複合生成物、及び有効量のIFNγ又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項８３】
TNFとNGRモチーフのアミド分解生成物を含んでなる標的部分との有効量の複合生成物、及び有効量のIFNγ又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項８４】
TNFとDGRモチーフを含む標的部分との有効量の複合生成物、及び有効量のIFNγ又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項８５】
DGR がisoDGRである、請求項８４記載の組成物。
【請求項８６】
DGR がDDGRである、請求項８４記載の組成物。
【請求項８７】
isoDGRがLisoDGRである、請求項８６記載の組成物。
【請求項８８】
製薬上許容できる担体及び賦形剤を共に含む、請求項８２〜８７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８９】
TNFがTNFα又はTNFβである、請求項８２〜８８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９０】
標的部分は配列XDGRX’モチーフを含み、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される、請求項８２〜８９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９１】
標的部分がCDGRCVSGCAGRC, DGRAHA, GDGRG, CVLDGRMEC, CDGRC, CDGRCG, LDGRE, YDGRT, LQCICTGDGRGEWKCE, LQCISTGDGRGEWKCE, CICTGDGRGEWKC, CISTGDGRGEWKC, MRCTCVGDGRGEWTCY, MRCTSVGDGRGEWTCY, CTCVGDGRGEWTC及びCTSVGDGRGEWTCからなる群から選択される、請求項８２〜９０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９２】
標的部分がシクロCVLDGRMEC、線状CDGRC、環状CDGRC、線状CDGRCG及び環状CDGRCGからなる群から選択される、請求項９１記載の組成物。
【請求項９３】
TNFがポリエチレングリコール又はアシル基で誘導体化される、請求項８２〜９２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９４】
TNFが抗体、抗体フラグメント、及びビオチンからなる群から選択される化合物とさらに結合し、前記抗体又はその断片が腫瘍抗原、腫瘍血管新生マーカー又は細胞外マトリックス成分からなる群から選択される化合物に対するものである、請求項８２〜９３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９５】
TNFが標的部分並びに抗体、抗体フラグメント、及びビオチンからなる群から選択される化合物の両方と結合した、請求項９４記載の組成物。
【請求項９６】
注射用溶液もしくは懸濁液又は注入用液体の形態である、請求項８２〜９５のいずれか1項記載の組成物。
【請求項９７】
リポソームの形態である、請求項８２〜９６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９８】
請求項４６〜５０及び請求項７９〜９７のいずれか１項記載の組成物であって、別の抗癌剤又は腫瘍診断用造影化合物をさらに含む前記組成物。
【請求項９９】
他の抗がん剤がドキソルビシン、メルファラン、シスプラチン、ゲムシタビン又はタキソールである、請求項９８記載の組成物。
【請求項１００】
αvβ3が関与する障害に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、請求項６３〜７８のいずれか１項記載の複合生成物、又は請求項７９〜９９のいずれか１項記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１０１】
骨粗しょう症、関節炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性、再発狭窄症又は血管腫から選択されるαvβ3が関与する障害に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、請求項６３〜７８のいずれか１項記載の複合生成物、又は請求項７９〜９９のいずれか１項記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１０２】
骨粗しょう症、関節炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性、再発狭窄症又は血管腫に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、請求項６３〜７８のいずれか１項記載の複合生成物、又は請求項７９〜９９のいずれか１項記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１０３】
骨粗しょう症に罹患した患者を治療又は診断する方法である、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０４】
関節炎に罹患した患者を治療又は診断する方法である、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０５】
糖尿病性網膜症に罹患した患者を治療又は診断する方法である、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０６】
黄斑変性に罹患した患者を治療又は診断する方法である、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０７】
再発狭窄症に罹患した患者を治療又は診断する方法である、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０８】
血管腫に罹患した患者を治療又は診断する方法である、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０９】
癌に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、請求項６３〜７８のいずれか１項記載の複合生成物、又は請求項７９〜９９のいずれか１項記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１０】
癌が固形癌を含む、請求項６０記載の方法。
【請求項１１１】
癌が肺癌、膵臓癌、乳癌、結腸癌、喉頭癌又は卵巣癌である、請求項１０９又は１１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生と関連がある疾患及び癌の治療に使用され得る新規ペプチドに関する。より具体的には、本発明は細胞外マトリックスペプチド及びその誘導体に関し、また特に、DGRモチーフ及びその異性体を含むペプチドに関する。本発明は、修飾されたサイトカインにも関し、特に、血管新生性血管へ「帰巣(homing)」することができるサイトカイン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックスは、細胞及び組織挙動の重要な調節因子である。フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン及びラミニンのような細胞外マトリックスタンパク質は、血管新生、細胞遊走、組織修復、癌細胞の分化、血小板凝集、並びに免疫系細胞及び神経突起の標的部位への帰巣といった多くの医学的に重要な生物学的現象を制御する多数の細胞受容体に結合する。細胞外マトリックスと結合する受容体の重要なファミリーは、インテグリンである。
【０００３】
フィブロネクチンは、インテグリン結合に関与する大きな細胞外マトリックス糖タンパク質(〜450 KDa)である。それらは、２つのほぼ同一のジスルフィド結合したサブユニットから構成され、各サブユニットはFN-I、FN-II及びFN-III反復と称される３種類の反復相同性モジュールからなる。さらに、代わるものとしてスプライスされたモジュール、いわゆるEDA、EDB及びIIICSも存在し得る(Mohri, 1997、Pankov及びYamada, 2002)。１つのモジュール又はモジュール群は、硫酸化グリコサミノグリカン、DNA、ゼラチン、ヘパリン及びフィブリンを含む多種多様な分子に対する結合部位を含み得る(Mohri, 1997、Pankov及びYamada, 2002、Yamada, 1989)。さらに、フィブロネクチンは公知の細胞表面インテグリン受容体の約半分に対する結合部位を含む(Johanssonら, 1997、Plowら, 2000)。特に、FN-III10反復はα3β1、α5β1、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α8β1及びαIIbβ3インテグリンを結合することができるRGD部位を含むのに対し、FN-III9反復はRGDと協同してα5β1とαIIbβ3を結合させるいわゆる「共働部位」PHSRNを含む(Buskら, 1992; Dedhar及びGray, 1990; Gardner及びHynes, 1985; Johanssonら, 1997; Pankov及びYamada, 2002; Plowら, 1985; Pytelaら, 1985; Smithら, 1990; Takadaら, 1987; Vogelら, 1990; Weinackerら, 1994)。FN-III14-IIICS領域は、LDVモチーフの存在で特性付けられる３つの部位(いわゆるCS1、CS5及びH1)並びにα4β1とα4β7の認識に関与する付属のREDV及びIDA部位を含む(Johanssonら, 1997; Pankov及びYamada, 2002)。そのうえ、FN-III5反復は、α4β1 とα4β7を結合するKLDAPT配列を含み(Moyanoら, 1997)、FN-I1-9及びFN-II1-2はこれに限定されないが、α5β1と相互作用することができる部位を含む(Hockingら, 1998)。
【０００４】
ヒトフィブロネクチンの一次及び三次構造解析により、このタンパク質は２つのGNGRGループをFN-I5及びFN-I7モジュール内に配置するように含み、該ループはウシ、マウス、ラット、両生類及び魚類で保存されていることが示された(Di Matteoら)。２つの保存性の低いNGR部位も、ヒトFN-II1及びFN-III9内にさらに存在する。最近の実験研究で、NGRモチーフを含むペプチドは、α5β1及びαvβ1が仲介するフィブロネクチンへの細胞接着を阻害できることが示された(Koivunenら, 1993)。
【０００５】
細胞表面に固定されたインテグリン及び細胞外マトリックス成分の相互作用は、新生児の発育並びに組織炎症、関節炎、癌増殖、糖尿病性網膜症、網膜の新血管形成による黄斑変性及びそのような状態を含む多岐にわたる臨床疾患の発病機序における重要なプロセスである血管新生と関連している。αvβ3インテグリン（ビトロネクチン受容体）は血管新生において重大な役割を果たすことが知られている(Hynes, 2002)。このインテグリンと細胞外マトリックスタンパク質の相互作用を阻害することができる化合物は、血管新生及び癌増殖を阻害することが知られている(Brooksら, 1994; Brooksら, 1995; Friedlanderら, 1995; Friedlanderら, 1996; Hammesら, 1996)。しかしながら、これらの阻害剤に関わる問題点は、多くのインテグリン種とのその交差反応性にある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生物学的過程及び疾患の発症における細胞外マトリックスの役割に対する意識の増大に鑑みれば、この領域を標的とする新規治療のニーズは依然としてある。本発明は、このニーズに向けられている。
【０００７】
いくつかのサイトカインの抗腫瘍活性が周知であり、開示されている。いくつかのサイトカインが既に、ヒトにおける治療に使用されている(Fiersら, 1995)。例えば、インターロイキン-2(IL-2)及びインターフェロンα(IFNα)のようなサイトカインは、腎転移性癌、ヘアリー細胞白血病、カポジ肉腫、メラノーマ、多発性骨髄腫等のような多種多様な癌腫に罹患した患者において、ポジティブな抗腫瘍活性を示している。IFNβ、腫瘍壊死因子(TNF)α、TNFβ、IL-1、4、6、12、15及びコロニー刺激因子(CFS)のような他のサイトカインは、いくつかのタイプの腫瘍に対し一定の抗腫瘍活性を示すので、さならる研究の対象となっている。
【０００８】
一般に、サイトカインの治療上の使用はその全身毒性が理由で非常に制限されている。TNFは、例えばいくつかの腫瘍において出血性壊死を誘発する能力(Carswellら, 1975)及び様々な腫瘍系統におけるin vitro細胞毒性効果(Helsonら, 1975)が初めに発見されたが、その後、過剰産生条件の場合には人体に危険な影響を及ぼし得る強力な前炎症誘発活性を有することが証明された(Traceyら, 1993)。
【０００９】
この全身毒性が、ヒトに対し薬理活性がある量のサイトカインを使用する上で根本的な問題となるので、その治療効果を維持しつつ、このクラスの生物学的エフェクターの毒性作用を低減させることを目的として、新規誘導体及び治療戦略が現在評価されている。例えば、WO01/61017はTNF又はIFNγとCD13受容体のリガンドとの複合生成物(conjugation product)を開示しており；WO03/093478はサイトカインと腫瘍標的部分との複合体を含む医薬組成物を開示し、該サイトカインはネガティブフィードバック機構を誘導しない量で存在しており；またWO03/092737は様々なサイトカインと腫瘍標的部分との複合体を開示する。本発明は、治療能のある新規サイトカイン複合体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
アスパラギン(N)のアミド分解（deamidation）（非酵素性のタンパク質翻訳後修飾）は、一般にタンパク質の老化と関連した有害な事象と見られている。この出願では、、アスパラギンをアスパラギン酸とイソアスパラギン酸に非酵素的にアミド分解することを基礎とした非一般的なメカニズムを介して、細胞外マトリックスのアスパラギン-グリシン-アルギニン(NGR)配列が内皮細胞の接着を促すことができ、新しい細胞接着モチーフを生じさせることができることが示される。特に、このアミド分解は「機能の獲得」と関連し；内皮細胞がビトロネクチンと接着するのを阻害することができるアミド分解した断片は、αvβ3インテグリンを阻害し、腫瘍増殖を抑制することが示される。
【００１１】
特に、本発明者らは、LisoDGR及びDDGR異性体が、他の異性体の形態よりも増強した細胞接着結合及び抗癌特性を示すことを示す。これは、驚くべきことに、ペプチドの大部分がアスパラギン酸のL鏡像異性体を含むことを示している。遺伝子発現により産生されたペプチドは全て、L鏡像異性体を含むだろう。
【００１２】
本発明者らはまた、アミド分解したNGRペプチドと結合したサイトカインが驚くべき活性を有することを発見した。本発明者らは、アミノペプチダーゼ-N受容体(CD13)の修飾リガンド等のNGRモチーフを含むリガンドと結合させることにより、特定のサイトカインの治療指数を顕著に改善することができ、その免疫治療特性を増強できることを既に見出していた。CD13は様々な生物種で高度に保存された150 kDaの膜貫通糖タンパク質である。これは正常細胞だけでなく、骨髄腫瘍系統、血管新生内皮及び幾つかの内皮で発現している。CD13受容体は通常「NGR」受容体として同定され、そのペプチドリガンドはアミノ酸の「NGR」モチーフを共有する。驚くべきことに、NGRモチーフ内のアスパラギニル(Asn又N)残基を、アミド分解によりアスパルチル(Asp又はD)残基、すなわち「DGR」モチーフに変更した改変リガンドを用いて、同程度の結果又は現実に改善された結果がもたらされ得ることを驚くべきことに現在見出している。そのように修飾したCD13受容体のリガンドと結合したTNF、及びIFNγは、個々に有効用量を下回る用量で同時投与しても有効な抗腫瘍活性を認め得るように、相乗的に作用し得る。さらに、修飾されたTNFと、メファラン又はドキソルビシン又はシスプラチン又はゲムシタビン又はタキソールのような別の抗腫瘍剤との併用による抗癌活性は、IFNγの投与により増大することを見出した。
【００１３】
発明の供述
本発明の第１態様では、NGRモチーフを含んでなるペプチドのアミド分解生成物(deamidation product)を含み、αvβ3インテグリンを選択的に阻害するペプチドが提供される。
【００１４】
本発明の別の態様では、NGRモチーフを含むペプチドのアミド分解生成物を含み、内皮細胞がビトロネクチンと接着するのを阻害するペプチドが提供される。
【００１５】
本発明の別の態様では、これに限定されないが、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン又はラミニン又はそれらの断片又は誘導体のような細胞外マトリックスタンパク質のアミド分解生成物を含んでなるペプチドが提供される。好ましくは、該断片はアミド分解したマトリックスタンパク質の少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、又は100連続アミノ酸を含み、また好ましくは前記タンパク質のアミド分解したNGRモチーフを含む。
【００１６】
好ましくは、該ペプチドはフィブロネクチンのアミド分解生成物、より好ましくはフィブロネクチンのFN-I5、FN-I7、FN-II1又はFN-III9モジュールのアミド分解生成物、より好ましくはフィブロネクチンのFN-I5モジュールのアミド分解生成物若しくはそれらの断片や誘導体、又はフィブロネクチンのFN-I7モジュールのアミド分解生成物若しくはそれらの断片や誘導体を含む。好ましくは、該断片はフィブロネクチンの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、又は100連続アミノ酸を含み、また好ましくは前記タンパク質のアミド分解したNGRモチーフを含む。
【００１７】
１実施形態において、ペプチドは細胞外マトリックスタンパク質又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物からなる。
【００１８】
本発明の別の態様では、配列XNGRX’を含むペプチドのアミド分解生成物が提供され、ここでXはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、またX’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される。
【００１９】
好ましくは、該ペプチドはCNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、CVLNGRMEC、CNGRC、CNGRCG、LNGRE、YNGRTLQCICTGNGRGEWKCE、LQCISTGNGRGEWKCE、CICTGNGRGEWKC、CISTGNGRGEWKC、MRCTCVGNGRGEWTCY、MRCTSVGNGRGEWTCY、CTCVGNGRGEWTC及びCTSVGNGRGEWTCから選択される配列を含むペプチドのアミド分解生成物を含む。
【００２０】
１実施形態において、該ペプチドはCNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、CVLNGRMEC、CNGRC、CNGRCG、LNGRE、YNGRTLQCICTGNGRGEWKCE、LQCISTGNGRGEWKCE、CICTGNGRGEWKC、CISTGNGRGEWKC、MRCTCVGNGRGEWTCY、MRCTSVGNGRGEWTCY、CTCVGNGRGEWTC及びCTSVGNGRGEWTCから選択される配列を有するペプチドのアミド分解生成物からなる。
【００２１】
好ましくは、ペプチドはシクロCVLNGRMEC、線状CNGRC、環状CNGRC、線状CNGRCG及び環状CNGRCGから選択される配列を含むペプチドのアミド分解生成物を含む。
【００２２】
１実施形態において、ペプチドはシクロCVLNGRMEC、線状CNGRC、環状CNGRC、線状CNGRCG及び環状CNGRCGから選択される配列を有するペプチドのアミド分解生成物からなる。
【００２３】
本発明の別の態様では、DGRモチーフを含み、αvβ3インテグリンを選択的に阻害するペプチドが提供される。
【００２４】
本発明の別の態様では、DGRモチーフを含み、内皮細胞がビトロネクチンと接着するのを阻害するペプチドが提供される。
【００２５】
好ましくは、該ペプチドは配列XDGRX’を含み、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される。
【００２６】
好ましくは、該ペプチドはCDGRCVSGCAGRC、DGRAHA、GDGRG、CVLDGRMEC、CDGRC、CDGRCG、LDGRE、YDGRT、LQCICTGDGRGEWKCE、LQCISTGDGRGEWKCE、CICTGDGRGEWKC、CISTGDGRGEWKC、MRCTCVGDGRGEWTCY、MRCTSVGDGRGEWTCY、CTCVGDGRGEWTC又はCTSVGDGRGEWTCから選択される配列を含み、より好ましくはシクロCVLDGRMEC、線状CDGRC、環状CDGRC、線状CDGRCG及び環状CDGRCGから選択される配列を含む。
【００２７】
１実施形態において、該ペプチドはCDGRCVSGCAGRC、DGRAHA、GDGRG、CVLDGRMEC、CDGRC、CDGRCG、LDGRE、YDGRT、LQCICTGDGRGEWKCE、LQCISTGDGRGEWKCE、CICTGDGRGEWKC、CISTGDGRGEWKC、MRCTCVGDGRGEWTCY、MRCTSVGDGRGEWTCY、CTCVGDGRGEWTC又はCTSVGDGRGEWTCから選択される配列、より好ましくはシクロCVLDGRMEC、線状CDGRC、環状CDGRC、線状CDGRCG及び環状CDGRCGから選択される配列からなる。
【００２８】
本発明の別の態様では、isoDGRモチーフを含むペプチドが提供される。
【００２９】
好ましくは、該ペプチドは配列XisoDGRX’を含み、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、またX’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される。
【００３０】
好ましくは、該ペプチドはCisoDGRCVSGCAGRC、isoDGRAHA、GisoDGRG、CVLisoDGRMEC、CisoDGRC、CisoDGRCG、LisoDGRE、YisoDGRT、LQCICTGisoDGRGEWKCE、LQCISTGisoDGRGEWKCE、CICTGisoDGRGEWKC、CISTGisoDGRGEWKC、MRCTCVGisoDGRGEWTCY、MRCTSVGisoDGRGEWTCY、CTCVGisoDGRGEWTC又はCTSVGisoDGRGEWTCから選択される配列、より好ましくはシクロCVLisoDGRMEC、線状CisoDGRC、環状CisoDGRC、線状CisoDGRCG及び環状CisoDGRCGから選択される配列を含む。
【００３１】
１実施形態において、CisoDGRCVSGCAGRC、isoDGRAHA、GisoDGRG、CVLisoDGRMEC、CisoDGRC、CisoDGRCG、LisoDGRE、YisoDGRT LQCICTGisoDGRGEWKCE、LQCISTGisoDGRGEWKCE、CICTGisoDGRGEWKC、CISTGisoDGRGEWKC、MRCTCVGisoDGRGEWTCY、MRCTSVGisoDGRGEWTCY、CTCVGisoDGRGEWTC及びCTSVGisoDGRGEWTCから選択される配列、より好ましくはシクロCVLisoDGRMEC、線状CisoDGRC、環状CisoDGRC、線状CisoDGRCG及び環状CisoDGRCGから選択される配列からなる。
【００３２】
本発明の別の態様では、LisoDGRモチーフを含むペプチドが提供される。
【００３３】
好ましくは、該ペプチドは配列XLisoDGRX’を含み、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される。
【００３４】
好ましくは、該ペプチドはCLisoDGRCVSGCAGRC、LisoDGRAHA、GLisoDGRG、CVLLisoDGRMEC、CLisoDGRC、CLisoDGRCG、LLisoDGRE、YLisoDGRT、LQCICTGLisoDGRGEWKCE、LQCISTGLisoDGRGEWKCE、CICTGLisoDGRGEWKC、CISTGLisoDGRGEWKC、MRCTCVGLisoDGRGEWTCY、MRCTSVGLisoDGRGEWTCY、CTCVGLisoDGRGEWTC及びCTSVGLisoDGRGEWTCから選択される配列、より好ましくはシクロCVLLisoDGRMEC、線状CLisoDGRC、環状CLisoDGRC、線状CLisoDGRCG及び環状CLisoDGRCGから選択される配列を含む。
【００３５】
１実施形態において、該ペプチドはCLisoDGRCVSGCAGRC、LisoDGRAHA、GLisoDGRG、CVLLisoDGRMEC、CLisoDGRC、CLisoDGRCG、LLisoDGRE、YLisoDGRT、LQCICTGLisoDGRGEWKCE、LQCISTGLisoDGRGEWKCE、CICTGLisoDGRGEWKC、CISTGLisoDGRGEWKC、MRCTCVGLisoDGRGEWTCY、MRCTSVGLisoDGRGEWTCY、CTCVGLisoDGRGEWTC及びCTSVGLisoDGRGEWTCから選択される配列、より好ましくはシクロCVLLisoDGRMEC、線状CLisoDGRC、環状CLisoDGRC、線状CLisoDGRCG及び環状CLisoDGRCGから選択される配列からなる。
【００３６】
本発明の別の態様では、DDGRモチーフを含むペプチドが提供される。
【００３７】
好ましくは、該ペプチドは配列XDDGRX’を含み、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される。
【００３８】
好ましくは、該ペプチドはCDDGRCVSGCAGRC、DDGRAHA、GDDGRG、CVLDDGRMEC、CDDGRC、CDDGRCG、LDDGRE、YDDGRT、LQCICTGDDGRGEWKCE、LQCISTGDDGRGEWKCE、CICTGDDGRGEWKC、CISTGDDGRGEWKC、MRCTCVGDDGRGEWTCY、MRCTSVGDDGRGEWTCY、CTCVGDDGRGEWTC及びCTSVGDDGRGEWTCから選択される配列、より好ましくはシクロCVLDDGRMEC、線状CDDGRC、環状CDDGRC、線状CDDGRCG及び環状CDDGRCGから選択される配列を含む。
【００３９】
１実施形態において、該ペプチドはCDDGRCVSGCAGRC、DDGRAHA、GDDGRG、CVLDDGRMEC、CDDGRC、CDDGRCG、LDDGRE、YDDGRT、LQCICTGDDGRGEWKCE、LQCISTGDDGRGEWKCE、CICTGDDGRGEWKC、CISTGDDGRGEWKC、MRCTCVGDDGRGEWTCY、MRCTSVGDDGRGEWTCY、CTCVGDDGRGEWTC及びCTSVGDDGRGEWTCから選択される配列、より好ましくはシクロCVLDDGRMEC、線状CDDGRC、環状CDDGRC、線状CDDGRCG及び環状CDDGRCGから選択される配列からななる。
【００４０】
１実施形態において、isoDGRモチーフ、LisoDGRモチーフ又はDDGRモチーフを含んでなるペプチドは、これに限定されないが、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン又はラミニン、より好ましくはフィブロネクチンのアミド分解生成物、より好ましくはフィブロネクチンのFN-I5、FN-I7、FN-II1又はFN-III9モジュールのアミド分解生成物若しくはそれらの断片や誘導体のような細胞外マトリックスタンパク質のアミド分解生成物を含む。
【００４１】
好ましくは、該断片は細胞外マトリックスタンパク質若しくはモジュールの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、又は100連続アミノ酸を含む。
【００４２】
好ましくは、本発明のペプチドはαvβ3インテグリンを選択的に阻害し、かつ/又は内皮細胞がビトロネクチンと接着するのを阻害する。好ましくは、該ペプチドはαvβ3を阻害するが、αvβ5、α5β1及びα1β1を阻害しない。
【００４３】
好ましくは、αvβ3阻害について該ペプチドのIC50は0.5μM未満であり、好ましくは0.2μM未満である。好ましくは、IC50の測定に使用されるアッセイは、「材料及び方法」に記載のとおり、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体を用いて測定される。好ましくは、αvβ5及び/又はα5β1及び/又はα1β1についての該ペプチドのIC50は、1.0μMより高く、より好ましくは2.0μMより高く、3.0μMより高く、4.0μMより高い。
【００４４】
好ましくは、本発明のペプチドは癌増殖を阻害する。
【００４５】
好ましくは、本発明のペプチドは血管新生を阻害する。
【００４６】
１実施形態において、本発明のペプチドは抗癌剤又はサイトカインを含む治療薬をさらに含まない。
【００４７】
好ましくは、本発明のペプチドはDGRモチーフのG及びR残基を含むターンを含む。
【００４８】
１実施形態において、本発明のペプチドは最大で350、100、50、25、15、10又は5アミノ酸を含む。
【００４９】
本発明の別の態様では、本発明のペプチドを含む複合生成物が提供される。好ましくは、複合生成物は、本発明のペプチドと、薬剤、サイトカイン、サイトカイン断片、毒素、アポトーシス性ペプチド、生物反応修飾剤、放射性核種、ウイルス粒子、遺伝子又は造影化合物とのものである。１実施形態において、薬剤はドキソルビシン、メルファラン、シスプラチン、ゲムシタビン、タキソールのような抗癌剤である。
【００５０】
本発明の別の態様では、製薬上有効量の本発明のペプチド又は複合生成物(conjugation product)を含んでなり、好ましくは製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００５１】
好ましくは、該組成物はNGRモチーフを有するペプチド又は複合体を本質的に含まない。特に、該組成物がアミド分解したペプチドを含む場合、好ましくは、該組成物は本質的にペプチド前駆体、すなわち本質的に出発材料を含まない。好ましくは、組成物のペプチド又は複合体は40、30、20、15、10、5、3又は1％未満の出発材料を含む。
【００５２】
好ましくは、DGRモチーフを含むペプチド及び複合体を含んでなる本発明の組成物は、DGRモチーフに対応するNGRモチーフを含む対応ペプチド及び複合体を実質的に含まない。好ましくは、総ペプチド(すなわち、DGR及びNGRを含有するペプチド）に対するDGR含有ペプチドの割合は、60％より高く、より好ましくは70％より高く、より好ましくは80％より高く、より好ましくは85％より高く、より好ましくは90％より高く、より好ましくは95％より高く、より好ましくは97％より高く、より好ましくは99％w/wより高い。
【００５３】
本発明の組成物は、注射用溶液もしくは懸濁液又は注入用液体の形態をとり得る。
【００５４】
本発明の組成物は、リポソームの形態をとり得る。
【００５５】
本発明の別の態様では、これに限定されないが、骨粗しょう症、関節炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性、再発狭窄症又は血管腫のようなαvβ3が関与する障害に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、本発明のペプチド、複合生成物又は医薬組成物を投与することを含む前記方法が提供される。
【００５６】
本発明の別の態様では、骨粗しょう症、関節炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性、再発狭窄症又は血管腫に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、本発明のペプチド、複合生成物又は医薬組成物を投与することを含む前記方法が提供される。
【００５７】
本発明の別の態様では、これに限定されないが肺癌、膵臓癌、乳癌、結腸癌、喉頭癌又は卵巣癌のような癌に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、本発明のペプチド、複合生成物又は医薬組成物を投与することを含む前記方法が提供される。
【００５８】
本発明の別の態様では、本発明のペプチドとサイトカインとの複合生成物が提供される。
【００５９】
本発明の別の態様では、サイトカインと、NGRモチーフのアミド分解生成物を含んでなる標的部分との複合生成物が提供される。
【００６０】
本発明の別の態様では、サイトカインと、これに限定されないがCDGRCVSGCAGRC、DGRAHA、GDGRG、CVLDGRMEC、CDGRC、CDGRCG、LDGRE、YDGRT、LQCICTGDGRGEWKCE、LQCISTGDGRGEWKCE、CICTGDGRGEWKC、CISTGDGRGEWKC、MRCTCVGDGRGEWTCY、MRCTSVGDGRGEWTCY、CTCVGDGRGEWTC又はCTSVGDGRGEWTCを含むDGRモチーフを含んでなる標的部分との複合生成物、より好ましくはサイトカインと、シクロCVLDGRMEC、線状CDGRC、環状CDGRC、線状CDGRCG又は環状CDGRCGとの複合生成物が提供される。好ましくは、DGRモチーフはisoDGRモチーフであり、より好ましくはLisoDGRである。１実施形態において、DGRモチーフはDDGRである。
【００６１】
本発明の複合体で使用されるサイトカインとしては、これに限定されないが、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、2、4、6、7、12、15、EMAPII、血管内皮増殖因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF又はケモカインが挙げられる。好ましくは、複合体のサイトカインはTNF、IFNγ、IL-12、IP-10、IL-7又はEMAPIIから選択される。より好ましくは、サイトカインはTNF、IFNγ又はIL-12から選択される。
【００６２】
好ましくは、TNFはTNFα又はTNFβである。
【００６３】
１実施形態において、サイトカインはポリエチレングリコール又はアシル基で誘導体化される。
【００６４】
別の実施形態では、サイトカインは抗体、抗体フラグメント、及びビオチンからなる群から選択される化合物とさらに結合し、前記抗体又はその断片は腫瘍抗原、腫瘍血管新生マーカー又は細胞外マトリックス成分からなる群から選択される化合物と結合する。
【００６５】
別の実施形態では、サイトカインがTNFであり、標的部分並びに、抗体及び抗体フラグメント及びビオチンからなる群から選択される化合物の両方と結合する。
【００６６】
本発明の別の態様では、有効量の本発明のTNFの複合生成物、及び有効量のIFNγ又はそれをコードするポリヌクレオチドを含んでなる医薬組成物が提供される。
【００６７】
好ましくは、本発明のペプチド又は複合体は、NGRモチーフを含むペプチド又は複合体の代謝によりin vivoで形成された場合以外のものである。
【００６８】
本発明の別の態様では、熱処理により入手可能な本発明のペプチド又は複合体が提供される。
【００６９】
本発明の組成物はこれに限定されないが、ドキソルビシン又はメルファラン又はシスプラチン又はゲムシタビン又はタキソール又は腫瘍診断用造影(imaging)化合物のような別の抗癌剤をさらに含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
詳細な説明
本発明の様々な好ましい特徴及び実施形態を以下に記載するが、これらの例により限定されるものではない。
【００７１】
本発明の実施には、別途規定しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学に関する当業者の能力範囲内の従来技術が適用されるであろう。そのような技術は文献で説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch及びT. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第２版, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M.ら(1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, 及び16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree及びA. Kahn, 1996, DNA単離及びシークエンシング:必須技術, John Wiley & Sons; J. M. Polak及びJames O’D. McGee, 1990, In Situハイブリダーゼーション: 原理及び実務; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, オリゴヌクレオチド合成: 実践的なアプローチ, Irl Press; 及びD. M. J. Lilley及びJ. E. Dahlberg, 1992, 酵素学の方法(Methods of Enzymology): DNA構造 Part A: 酵素学における方法,DNAの合成及び物理的解析, Academic Pressを参照されたい。これらの一般テキストのそれぞれが、引用により本明細書に取り込まれるものとする。
【００７２】
DGRモチーフ
アスパラギン酸が、様々な構造異性体の形態、すなわちイソアスパラギン酸として存在し得ることは周知である(図14参照)。
【００７３】
アスパラギン酸及びイソアスパラギン酸はそれぞれキラル分子であり、これらの様々な異性体はL-Asp (LD)、LisoAsp (LisoD)、DAsp (DD)及びDisoAsp (DisoD）と表され、ここでLisoD及びDisoDはイソアスパラギン酸の鏡像異性体を示し、またLD及びDDはアスパラギン酸の鏡像異性体を示す。
【００７４】
従来技術ではDGRと称する場合、基本的にLDGRを意味するが、本発明で使用される場合、用語DGRはDD及び/又はLisoD又はそれらの混合物を含むDGRモチーフを表し、それらはさらにLD及びDisoDを含み得る。好ましくは、DGRは対応するNGRモチーフのアミド分解により生成する。１実施形態において、DGRモチーフは少なくとも10 w/w％のLisoDGRを含む。別の実施形態において、DGRモチーフは少なくとも10 w/w％のDDGRを含む。
【００７５】
isoDGRモチーフを含むペプチド又は標的部分は、DGRモチーフが実質的にisoDGRの形態をとるペプチド又は標的部分を意味する。「実質的に」は、総DGR含有ペプチド又は標的部分に対するisoDGRモチーフ含有ペプチド又は標的部分のw/w％が、55％より高く、より好ましくは60％より高く、より好ましくは65％より高く、より好ましくは70％より高く、より好ましくは75％より高く、より好ましくは80％より高く、より好ましくは85％より高く、より好ましくは90％より高く、より好ましくは95％より高く、より好ましくは97％より高く、より好ましくは99％より高いことを意味する。isoDGRはL/DisoDの両方の鏡像異性体を含み得るが、好ましくは少なくとも5、より好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも30、より好ましくは少なくとも40、より好ましくは少なくとも50 w/w％のLisoDを含む。
【００７６】
LisoDGRモチーフを含むペプチド又は標的部分は、DGRモチーフが実質的にLisoDGRの形態をとるペプチド又は標的部分を意味する。「実質的に」は、総DGR含有ペプチド又は標的部分に対するLisoDGRモチーフを含むペプチド又は標的部分のw/w％が、55％より高く、より好ましくは60％より高く、より好ましくは65％より高く、より好ましくは70％より高く、より好ましくは75％より高く、より好ましくは80％より高く、より好ましくは85％より高く、より好ましくは90％より高く、より好ましくは95％より高く、より好ましくは97％より高く、より好ましくは99％より高いことを意味する。
【００７７】
DDGRモチーフを含んでなるペプチド又は標的部分は、DGRモチーフが実質的にDDGRの形態をとるペプチド又は標的部分を意味する。「実質的に」は、総DGR含有ペプチド又は標的部分に対するDDGRモチーフを含むペプチド又は標的部分のw/w％が、55％より高く、より好ましくは60％より高く、より好ましくは65％より高く、より好ましくは70％より高く、より好ましくは75％より高く、より好ましくは80％より高く、より好ましくは85％より高く、より好ましくは90％より高く、より好ましくは95％より高く、より好ましくは97％より高く、より好ましくは99％より高いことを意味する。
【００７８】
本発明のDGRモチーフは好ましくは、G及びR残基を含むターン(turn)を含む。DGRモチーフが対応するNGRモチーフのアミド分解により得られる場合、NGRモチーフはG及びR残基を含んでなるターンを含むことが好ましい。NGRモチーフを含む線状及び環状ペプチドの構造-活性の相関関係、並びに、腫瘍に標的指向するそれらの性質は、Colomboら, J. Biol. Chem., 2002, 49, 47891-47897で考察されている。動物モデルで行った実験では、GNGRG及びCNGRCは両方とも、TNFを腫瘍に標的指向可能にすることが示された。環状CNGRCの分子力学シュミレーションでは、ジスルフィド架橋の形成により安定化した残基Gly3-Arg4が関与する湾曲した幾何学配置の存在が示された。ジスルフィド結合で拘束されない同一のペプチドの分子力学シュミレーションにより、最も密でかつ熱力学的に良好な立体構造が、残基Gly3-Arg4を含むβターンの存在で特性付けられることが示された。これらの結果は、NGRモチーフが線状ペプチド内でβターンを形成する強力な性質を有することを示唆しており、CNGRCよりも低い程度にも関わらず、GNGRGペプチドがTNFを腫瘍に標的指向させることができるという知見を説明し得る。
【００７９】
フィブロネクチンドメインのFN-I5の立体構造解析では、GNGRGモチーフは、水及び受容体に接近できるような露出ループを形成することが示された(図1B参照)。フィブロネクチンNGRモチーフの仮の分子としてこの出願で使用される隣接システイン(CNGRC)を有するNGRペプチドの分子力学シュミレーションでは、その構造がFNループのものと重ね合わさることが示された(Di Matteoら, 2002)。
【００８０】
アミド分解(deamidation)
アスパラギン残基のアミド分解により、イソアスパラギン酸及びアスパラギン酸への転換が生じる。このプロセスを図14に示す。
【００８１】
本明細書に記載のアミド分解は、当業者により容易に特定される任意の好適な条件下で実施し得る。本発明のアミド分解はin vitroで実施される。
【００８２】
１実施形態において、アミド分解はNGR含有ペプチドを加熱することにより行われる。必要温度はペプチドの厳密な性質により異なり、当業者により容易に決定される。好ましくは、該温度はアスパラギン残基のアミド分解を誘導するためには十分であるが、ペプチドを分解又は損傷させるほどは高くない。好適な温度は、例えば25〜50、30〜40又は35〜40℃であり得る。
【００８３】
アミド分解は、塩基条件下、通常約pH8で、ペプチドをインキュベートすることによっても実施され、例えば重炭酸アンモニウム溶液中でインキュベートすることによっても実施することもできる。塩基条件の厳密な性質は、ペプチドの厳密な性質に応じて変化し得るが、当業者であれば容易に決定することができる。好ましくは、塩基条件はアスパラギン残基のアミド分解を誘導するのに十分であるが、残存するペプチドを変性又は損傷させないような条件である。好適な塩基条件は、例えば、pHが7.5〜9.0、8.0〜9.0又は8.0〜8.5の範囲であり得る。
【００８４】
好ましい実施形態では、アミド分解は塩基性溶媒中で加熱することにより行われる。
【００８５】
ペプチド
本明細書で使用される用語「ペプチド」は、ポリペプチド及びタンパク質を含む。用語「ポリペプチド」には、一本鎖ポリペプチド分子だけでなく、それぞれの構成ポリペプチドが共有結合又は非共有結合手段により結合した多重ポリペプチド複合体が含まれる。用語「ポリペプチド」には、2以上のアミノ酸長のペプチド、通常5、10、20、30、40、50又は100より多いアミノ酸を有するペプチドが含まれる。
【００８６】
本発明のペプチドは、患者へ治療的に投与され得る。天然アミノ酸だけからは構成されず、例えば、免疫原性を低下させるため、患者体内における循環半減期を長くするため、アベイラビリティーを向上させるため、かつ/又は効果及び/又は特性を増強するために、修飾されたペプチドを使用するのが好ましい。
【００８７】
数多くの手法がペプチドを治療に使用できるように修飾するため用いられてきた。１つの手法は、ペプチド又はタンパク質を、ポリエチレングリコール(PEG)及びポリプロピレングリコール(PPG)のような様々なポリマーと結合させることである。例えば米国特許第5,091,176号、第5,214,131号及び第5,264,209号を参照されたい。
【００８８】
天然アミノ酸を、様々な非コード化アミノ酸又は修飾アミノ酸（例えばD-アミノ酸及びN-メチルアミノ酸）で置換することにより、ペプチドを修飾することもできる。
【００８９】
別の手法は、N-スクシンイミジル-3-(2ピリジルジチオ)プロピオネート、スルホスクシンイミジル-6-[3-(2ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート、及びスルフォサクシンイミジル-6-[3-(2ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエートのような二官能性架橋剤を用いることである(米国特許第5,580,853号を参照されたい)。
【００９０】
立体構造的に拘束された本発明のペプチド誘導体を使用することが好ましい場合がある。立体構造の拘束とは、ペプチドから推定される三次元形状の安定性及び好適な立体配座を意味する。立体構造の拘束には、局所的拘束、例えばペプチド内の単一残基のコンホメーション移動を制限すること;位置拘束、例えば幾つかの２次構造単位を形成し得る残基の１群のコンホメーション移動を制限すること;及び広域の拘束、例えばペプチド構造全体の拘束、が含まれる。
【００９１】
ペプチドの活性な立体配座は、環化のように共有結合を用いた修飾によるか、γラクタム若しくは他のタイプの架橋を取り込むことにより安定化され得る。例えば、側鎖を環化させることにより、L-γラクタム部分を相互作用部位の片側で形成するような骨格とすることができる。一般には、Hrubyら, Synthetic Peptidesに記載の「合成ペプチドの応用」:ユーザーガイド: 259-345 (W. H. Freeman & Co. 1992)を参照されたい。環化は、例えばシステイン架橋の形成、それぞれの末端アミノ酸のアミノ末端基及びカルボキシ末端基の結合、又はLys残基のアミノ基若しくは関連する相同体とAsp、Glu若しくは関連する相同体のカルボキシル基との結合によって得られる。ヨード酢酸無水物を用いて、ポリペプチドのαアミノ基とリジン残基のεアミノ基を結合させることもできる。Wood及びWetzel, 1992, Int'l J. Pepetide Protein Res. 39: 533-39を参照されたい。
【００９２】
US 5,891,418に記載の別の手法は、ペプチド構造中に金属イオン複合体骨格を含ませるものである。通常、好ましい金属-ペプチド骨格は、複合体化する所与の金属イオンの配位球体が必要とする特定の配位基の数に基づいて定まる。一般に、有用であり得る金属イオンのほとんどは、配位数が４〜６である。ペプチド鎖中の配位基の性質は本来、アミン、アミド、イミダゾール、又はグアニジノ官能基に含まれる窒素原子;チオール又はジスルフィドの硫黄原子;及びヒドロキシ、フェノール、カルボニル、又はカルボキシル官能基の酸素原子を含む。さらに、ペプチド鎖又はそれぞれのアミノ酸は、例えば、オキシム、ヒドラジノ、スルフヒドリル、ホスフェート、シアノ、ピリジノ、ピペリジノ又はモルホリノのような配位基を含むように化学的に修飾され得る。ペプチド構築物は線状又は環状をとり得るが、線状構築物が通常は好ましい。小さな線状ペプチドの一例はGly-Gly-Gly-Glyであり、骨格内に4個の窒素を含み、配位数４の金属イオンと複合体化することができる(N4複合体系)。
【００９３】
治療用ペプチドの性質を改善するさらなる方法では、非ペプチド擬似体が使用される。多種多様な有用な技術を用いることにより、ペプチドの精密な構造を解明することができる。当該技術には、アミノ酸シークエンシング、Ｘ線結晶解析法、質量分析測定法、核磁気共鳴スペクトル法、コンピュータ支援分子モデリング、ペプチドマッピング、及びこれらの組合せが含まれる。ペプチドの構造解析は一般に、ペプチドのアミノ酸配列、ならびに、その原子成分の三次元位置決定を含む膨大なデータをもたらす。この情報をもとに、非ペプチド擬似体は、治療活性を得るために必要な化学官能基を有するが、より安定で、例えば生物学的にアミド分解され難いように設計され得る。この方法の例は、US 5,811,512に提示される。
【００９４】
本発明の治療用ペプチドの化学合成に関する方法は、上記文献で開示されており、Borgia及びFields, 2000, TibTech 18: 243-251でも総説され、そこに含まれる参考文献中に詳細が記載されている。
【００９５】
ペプチド変異体、誘導体及び断片
本発明のアミノ酸配列に関して用語「変異体」又は「誘導体」には、該配列から、又は該配列に、１(又は１より多い)アミノ酸を任意に置換、変異、改変、置換、欠失又は付加したものが含まれ、これによって、その結果得られたアミノ酸配列は、標的活性を有し、好ましくは配列表に示したポリペプチドの活性の少なくとも25〜50％の活性を有し、より好ましくは少なくとも実質的に同一活性を有する。
【００９６】
したがって、配列は本発明での使用のために改変され得る。通常、改変では配列の活性が維持される。したがって、１実施形態において、アミノ酸置換は改変した配列が少なくとも約25〜50％、又は実質的に同一活性を保持するように、例えば１、２又は３〜１０、２０又は３０置換され得る。しかしながら、代替の実施形態では、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の改変を意図的に行い、ポリペプチドの生物学的活性を低下させる場合がある。例えば、標的分子への結合性を維持するが、機能性エフェクタードメインを持たない末端切断型ポリペプチドが有用であり得る。
【００９７】
一般に、好ましくは変異体又は誘導体のアミノ酸残基の20％、10％又は5％未満が配列表に示した対応する領域と比べ改変される。アミノ酸置換は、非天然の類縁体の使用を含むことが可能であり、これによって、例えば治療的に投与されたポリペプチドの血漿半減期を長くすることができ得る(治療用のペプチド誘導体の産生についての更なる詳細は下記を参照されたい)。
【００９８】
保存的置換は、例えば下表のとおり行い得る。第２カラムの同じ欄のアミノ酸及び好ましくは第３カラムの同じ行のアミノ酸は、互いに置換され得る:
2008525424.tif 000002
本発明のポリペプチドには、上記のポリペプチド断片及びそれらの変異体、例えば該ポリペプチド断片配列の断片、も含まれる。好ましい断片には、エピトープ又は結合ドメインを含むものが含まれる。好適な断片は、少なくとも約5アミノ酸長、例えば10、12、15又は20アミノ酸長であろう。それらは200、100又は50未満のアミノ酸長もとり得る。タンパク質のポリペプチド断片及びそれらのアレル変異体及び種変異体は、保存的置換を含む1以上の(例えば、2、3、5、又は10)の置換、欠失又は挿入を含み得る。例えば組換え技術により置換、欠失及び/又は挿入される場合、好ましくは配列表で示されたアミノ酸残基の20％、10％又は5％以下のアミノ酸残基が改変される。
【００９９】
本発明のポリペプチド及び複合体は、通常、例えば下記のような組換え技術により作製される。しかしながら、それらは固相合成のような当業者に周知の技術を利用する合成方法でも作製され得る。ペプチドの化学合成についての様々な技術は、Borgia及びFields, 2000, TibTech 18: 243-251で総説され、そこに含まれる参考文献中に詳細が記載されている。
【０１００】
ポリヌクレオチド
本発明で使用されるポリヌクレオチドは、本発明のペプチド及び複合体をコードする核酸配列を含む。特に、該ポリヌクレオチドはNGRモチーフを含んでなるペプチド前駆体又は複合体をコードし得、これはアミド分解により、対応するDGRモチーフを含むペプチド及び複合体となる。
【０１０１】
当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果、多数の異なるポリヌクレオチドが同一のポリペプチドをコードできることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、慣用技術を用いて本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を与えることなくヌクレオチドを置換して、本発明のポリペプチドが発現されうる特定の宿主生物でのコドン使用頻度を反映し得ることを理解するであろう。
【０１０２】
本発明のポリヌクレオチドは、DNA又はRNAを含み得る。それらは一本鎖又は二本鎖であり得る。それらは、その中に合成又は改変したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの改変が当技術分野では知られている。これらは、分子の3'末端及び/又は5'末端にアクリジン鎖又はポリリジン鎖が付加されたメチルホスホネート及びホスホロチオエート骨格を含む。本発明の目的において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、本発明の技術分野で利用可能な任意の方法により改変され得ることが理解される。
【０１０３】
そのような改変は、ポリヌクレオチドのin vivo活性又は寿命を増強するように行われ得る。
【０１０４】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製ベクターに挿入することができる。該ベクターを使用して、適合する宿主細胞内で核酸を複製し得る。したがって、さらなる実施形態において本発明は、本発明のポリヌクレオチドの複製ベクターへの導入、該ベクターの適合する宿主細胞への導入、及びベクターの複製をもたらす条件下での宿主細胞の増殖により、本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収され得る。好適な宿主細胞は、E. coliのような細菌、酵母菌、哺乳類細胞株及び他の真核細胞株、例えば昆虫Sf9細胞を含む。
【０１０５】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞を利用してコードする配列の発現をもたらすことが可能な調節配列にベクター中で機能的に連結される。すなわち該ベクターは発現ベクターである。用語「機能的に連結される」とは、記載の成分が意図した様式でそれらが機能しうるような関係にあることを意味する。コードする配列に「機能的に連結された」調節配列は、コードする配列が調節配列と適合する条件下で発現されるように結合される。
【０１０６】
調節配列は、例えば転写調節因子をさらに付加することにより、調節配列により指示される転写レベルが転写調節因子に対してより反応性をもつように改変され得る。
【０１０７】
下記のとおり、本発明のベクターで好適な宿主細胞を形質転換し、又は本発明のベクターを宿主細胞にトランスフェクトさせて、本発明のタンパク質の発現がもたらされ得る。このプロセスは、該タンパク質をコードするコード配列を有するベクターにより発現がもたらされる条件下で、上記のとおり発現ベクターで形質転換させた宿主細胞を培養すること、及び発現したタンパク質を回収することを任意で含み得る。
【０１０８】
ベクターは、複製起点、任意で該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター及び任意でプロモーターの調節因子を伴い提供される例えばプラスミド又はウイルスベクターであり得る。ベクターは、1以上の選択的マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、哺乳類ベクターではネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。ベクターは、例えば宿主細胞をトランスフェクト又は形質転換させるのに使用され得る。
【０１０９】
本発明のタンパク質をコードする配列と機能的に連結された調節配列は、プロモーター/エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む。これらの調節配列は、その中で発現ベクターを使用しうるように設計された宿主細胞と適合するように選択され得る。用語「プロモーター」は当技術分野で周知であり、サイズ及び複雑度が、最小限のプロモーターから、上流エレメント及びエンハンサーを含むプロモーターにいたる範囲の核酸領域を包含する。
【０１１０】
プロモーターは通常、哺乳類細胞で機能するプロモーターから選択されるが、原核性プロモーター及び他の真核細胞で機能するプロモーターも使用され得る。プロモーターは通常、ウイルス性又は真核性遺伝子のプロモーター配列に由来する。例えば、プロモーターは、その中で発現が生じる細胞のゲノム由来のプロモーターであり得る。真核性プロモーターに関して、該プロモーターはユビキタス様式(例えば、a-アクチン、b-アクチン、チューブリンのプロモーター)又は組織特異的な様式(例えば、ピルビン酸キナーゼの遺伝子のプロモーター)で機能するプロモーターであり得る。所定の細胞に特異的な組織特異的なプロモーターも使用され得る。それらは、特定刺激に反応するプロモーター、例えばステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターでもあり得る。ウイルス性プロモーターも使用され得、例えばモロニーマウス白血病ウイルス長末端反復(MMLV LTR)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター又はヒトサイトメガロウイルス(CMV)IEプロモーターが使用され得る。
【０１１１】
プロモーターは、異種遺伝子の発現レベルを細胞の寿命の間中、調節しうるように誘導性を有することも有利である。誘導性を有するとは、プロモーターを利用して得られる発現レベルを調節できることを意味する。
【０１１２】
さらに、任意のこれらのプロモーターは、さらなる調節配列、例えばエンハンサー配列を付加することにより改変され得る。キメラプロモーターは、上記２以上の異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むものとしても使用され得る。
【０１１３】
本発明のベクター及びポリヌクレオチドは、ベクター/ポリヌクレオチドの複製及び/又は本発明のポリヌクレオチドによりコードされる発明のタンパク質の発現を目的として、宿主細胞に導入され得る。本発明のタンパク質は、宿主細胞として原核細胞を使用して産生され得るが、真核細胞、例えば酵母菌、昆虫又は哺乳類細胞、特に哺乳類細胞を使用することが好ましい。
【０１１４】
本発明のベクター/ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、形質転換及びエレクトロポレーションのような当技術分野で公知の様々な技術を使用して好適な宿主細胞に導入され得る。本発明のベクター/ポリヌクレオチドを動物に投与するためには、幾つかの技術、例えばレトロウイルス、ヘルペス単純ウイルス及びアデノウイルスのような組換えウイルスベクターによる感染、核酸の直接注入及びバイオリスティック形質転換が当技術分野では知られている。本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を使用して、本発明の複合体を発現し得る。宿主細胞は、本発明のポリペプチド及び複合体を発現させる好適な条件下で培養され得る。本発明の生成物の発現は、発現を開始するための刺激を必要とし、継続的に産生される又は誘導できるように構成的であり得る。誘導性発現では、タンパク質産生を開始するために、例えば誘導性物質（例えばデキサメタゾン又はIPTG）の培地への添加が必要とされ得る。
【０１１５】
複合体
本発明は、これに限定されないが、薬剤、サイトカイン、毒素、アポトーシス性ペプチド、放射性核種、ウイルス粒子、遺伝子若しくは造影化合物を含む少なくとも１つの他の物質と結合する本発明のペプチド又は標的部分を含み、遺伝子融合又は化学カップリングを介して形成された分子である複合体に関する。本発明の複合体で使用されるサイトカインは、これに限定されないが、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、2、4、6、7、12、15、EMAP II、血管内皮増殖因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF又はケモカインである。
【０１１６】
複合体は、これらのタンパク質、直接合成されたタンパク質、及び架橋剤により予形成した配列を結合させた共役タンパク質、をコードするDNA分子の遺伝子発現により、ペプチド又は標的部分がポリペプチド骨格を介して前記剤に結合された融合タンパク質を含む。該用語は、本明細書において凝集体のような会合体を含む意味でも使用される。
【０１１７】
ペプチド又は標的部分は、前記剤に直接結合することができるし、又は単一のアミノ酸(例えば、G (グリシン))、アミノ酸配列又は6-アミノカプリル-N-ヒロドキシスクシンイミドのような有機残基であり得るスペーサーを介して間接的に結合することができる。
【０１１８】
１実施形態では、ペプチド又は標的部分はサイトカインN-末端又はC-末端と結合することにより、改変されたサイトカインとその受容体との結合におけるいかなる干渉も最小化される。あるいは、該ペプチド又は標的部分は、分子上に天然に存在し得るか又は遺伝子操作技術を用いて人工的に挿入され得るアミド結合又はカルボキシ結合の受容体であるアミノ酸残基と結合することができる。
【０１１９】
１実施形態では、ペプチドリガンドはサイトカインN-末端又はC-末端と結合することにより、改変されたサイトカインとその受容体との結合におけるいかなる干渉も最小化される。あるいは、該ペプチドは、分子上に天然に存在し得るか又は遺伝子操作技術を用いて人工的に挿入され得るアミド結合又はカルボキシ結合の受容体であるアミノ酸残基と結合することができる。改変されたサイトカインは、好ましくはペプチドをコードする5'-連続配列を含むcDNAを使用して調製される。
【０１２０】
好ましい実施形態では、TNFと、CDGRC、CisoDGRC、CLisoDGRC又はCDDGRCペプチドとの複合生成物が提供される。好ましくは、TNFのアミノ末端はペプチドと、好ましくはスペーサー基を介して結合される。好ましくは、スペーサー基はG(グリシン)である。
【０１２１】
別の好ましい実施形態では、IFNγと、CDGRC、CisoDGRC、CLisoDGRC又はCDDGRCペプチドとの複合生成物が提供される。好ましくは、TNFのアミノ末端はペプチドと、好ましくはスペーサー基を介して結合される。好ましくは、スペーサー基はG(グリシン)である。
【０１２２】
別の好ましい実施形態では、IL-12と、CDGRC、CisoDGRC、CLisoDGRC又はCDDGRCペプチドとの複合生成物が提供される。好ましくは、TNFのアミノ末端はペプチドと、好ましくはスペーサー基を介して結合される。好ましくは、スペーサー基はG(グリシン)である。
【０１２３】
TNF/DGR複合体の治療指数は、２つのTNF受容体、p75TNFR及びp55TNFRのうち１つと選択的に結合することができるTNFの突然変異型を用いることによりさらに改良することができる。前記TNF突然変異体は、部位特異的突然変異誘発法により取得することができる(Loetscherら, 1993、Van Ostadeら, 1993)。
【０１２４】
本発明の修飾サイトカインの薬物動態は、サイトカイン自身の血漿半減期を延長させるように、ポリエチレングリコール誘導体を調製することにより、改善することができる。
【０１２５】
二官能性誘導体
本発明のさらなる実施形態は、本発明のペプチド又は複合体が、腫瘍抗原に対する抗体若しくはそのフラグメント、又は他の腫瘍血管新生マーカー（例えばαvインテグリン、メタロプロテアーゼ又は血管増殖因子）、又は細胞外マトリックス成分に対する抗体若しくはそのフラグメント（例えば抗テナシン抗体又は抗フィブロネクチンEDBドメイン）と結合される二官能性誘導体により提供される。TNFと、胃腺癌及び卵巣腺癌で発現される腫瘍関連性TAG72抗原に対するmAbのヒンジ領域との融合産物の調製が、最近報告されている(Yangら, 1995)。
【０１２６】
本発明のさらなる実施形態は、ビオチン/アビジン系で腫瘍をプレターゲティングすることにより提供される。この手法により、三元複合体が、腫瘍抗原部位上で異なるステージにおいて、1) ビオチン化mAb、2) アビジン(又はストレプトアビジン)及び3) 本発明のペプチド又は複合体とビオチンにより形成され取得される。プレターゲティング方法により、免疫複合体による従来の標的化と比べ、遊離活性分子に対する標的に帰巣した活性分子の割合を実際に増加させることができ、そのために治療毒性が低減されることが数多くの論文で証明された(Colomboら, 1993、Modoratiら, 1994、Paganelliら, 1995, 1991)。ビオチン化TNFを用いたこの方法により、in vitro細胞毒性を誘導し、かつ正常TNFが不活性な条件下で腫瘍細胞の増殖を低下させることができたという望ましい結果を得た(Moroら, 1997; Gasparriら, 1999)。プレターゲティング方法は、腫瘍抗原と修飾サイトカインに同時に結合する二特異性抗体を利用する2段階手順で実施することもできる。癌胎児性抗原及びTNFに対する二特異性抗体の使用が、最近ではTNFの腫瘍プレターゲティング手段として報告されている(Robertら, 1996)。
【０１２７】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明のペプチド(例えば、DGRを含むペプチド)及び抗体又はそのフラグメントの両方と、異なるTNFサブユニット上で(ビオチン-アビジン架橋を介して直接的又は間接的に）結合したTNF分子を含み、ここで該抗体又はそのフラグメントは腫瘍細胞又は腫瘍間質のほかの成分（例えば、テナシン及びフィブロネクチンEDBドメイン）上で発現する抗原に対するものである。これにより、修飾サイトカインの腫瘍帰巣特性はさらに改善され、腫瘍の微小環境下で３量体-単量体-３量体トランジションを介して後者の放出を遅くすることができる。過去の研究が示すとおり、実際にTNF複合体の修飾サブユニットを標的複合体から解離させることができ、また非修飾の３量体TNF分子を形成するように再結合させることができ、こうして該サブユニットは腫瘍の微小環境内で拡散する。生理活性TNFの放出は、ターゲティング後24〜48時間内に生じることが示されている(Cortiら, 1998)。
【０１２８】
細胞外マトリックス
本明細書で使用される用語「細胞外マトリックス成分」(ECM)とは、組織の細胞外空間を占有する分子を意味する。
【０１２９】
１実施形態において、ECM成分はフィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン又はラミニンから選択される。好ましいECM成分は、フィブロネクチンのFN-I5、FN-I7、FN-II1若しくはFN-III9モジュール、又はその断片である。好ましくは、該断片はNGRモチーフ、又はこれがアミド分解したDGRモチーフを含む。
【０１３０】
本発明のECMの好ましい成分は、内皮細胞の接着の増加、及び/又は、アスパラギン残基のアミド分解後のインテグリン(例えば、αvβ3)結合の増加のような改変した特性を示すものである。特に好ましいECM成分は、DGR、好ましくはLisoDGR又はDDGRへアミド分解するNGRモチーフを含むものである。
【０１３１】
サイトカイン
新生細胞への薬剤透過は、固形癌化学療法の有効性について重要である。固形癌内の癌細胞に到達するためには、化学療法薬を血管内に入れ、血管壁を通過させ、最終的には間質を介して移動させる必要がある。異種腫瘍の灌流、血管透過性及び細胞密度、並びに間質圧の増大は、薬剤の新生細胞への透過を制限し、その結果として化学療法の有効性を制限し得る重大な障壁となり得る。したがって、これらの因子への作用効果を有するサイトカインが、本発明では有用である。本発明で使用され得るサイトカインは、これに限定されないが、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、2、4、6、7、12、15、IP-10、EMAP II、血管内皮増殖因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF又はケモカインである。
【０１３２】
TNF
TNFは炎症性サイトカインとして作用し、内皮のバリア機能の改良を誘導し、腫瘍間質圧を低下させ、さらに化学療法薬の透過性及び腫瘍血管障害を増大させる効果を有する。
【０１３３】
腫瘍壊死分子が存在することは、癌患者が時折、細菌感染後に腫瘍の自然消失を示すことが観察された際に、初めて示唆された。1960年代の後続の研究は、細菌産物に応答して作られた宿主関連性（又は内因性）メディエーターが、観察された効果の原因であるらしいことを示した。1975年には、細菌により誘導された循環因子がマウスの皮膚に移植された腫瘍に対し強力な抗癌活性を有することが示された。この因子は、腫瘍壊死因子(TNF)と呼ばれ、その後単離され、クローン化され、免疫調節及び炎症に関連する分子ファミリーのプロトタイプであることがわかった。TNFの受容体及びTNFスーパーファミリーのほかのメンバーも、関連タンパク質のスーパーファミリーを構成する。
【０１３４】
TNF-関連リガンドは通常、いくつかの共通の特徴を共有する。これらの特徴には、高程度のアミノ酸(aa）配列全体の相同性は含まれない。神経増殖因子(NGF)及びTNF-βを除き、全てのリガンドは短い細胞質セグメント(10-80アミノ酸残基)及び比較的長い細胞外領域(140-215アミノ酸残基)を含むII型膜貫通タンパク質(細胞外C末端)として合成される。NGFは構造的にはTNFと関連しないが、TNFRSF低親和性NGF受容体(LNGFR)への結合能を持つことだけを理由にこのスーパーファミリーに含められる。NGFは古典的なシグナル配列ペプチドを有し、分泌される。TNF-βは対照的に、十分に分泌されるにも関わらず、II型膜貫通タンパク質と非常に関連性のある一次構造を有する。TNF-βは、非機能性又は非効率な膜貫通セグメントを含むII型タンパク質とみなすことができる。一般に、TNFSFメンバーは３量体構造を形成し、その単量体はそれらをツーシート構造に配向するβストランドから構成される。これらの分子をが３量体構造となることにより、TNSF及びTNFRSFスーパーファミリーのリガンド及び受容体は、シグナル伝達の間に「クラスター化」されることが示唆される。
【０１３５】
TNF-α：ヒトTNF-αは、233アミノ酸残基の膜貫通タンパク質又は可溶性タンパク質のいずれかとして存在する非グリコシル化ポリペプチドである。26 kDaの細胞膜結合タンパク質として発現される場合、TNF-αは29アミノ酸残基細胞質ドメイン、28アミノ酸残基膜貫通セグメント、及び176アミノ酸残基細胞外領域から構成される。可溶性タンパク質は、85 kDaのTNF-α変換酵素(TACE)を介したタンパク質分解切断により形成され、17 kDaのホモ３量体として正常に循環する157アミノ酸残基分子を生じさせる。
【０１３６】
TNF-β/LT-α: TNF-βは、リンホトキシン-α(LT-α)としても知られ、TNF-αと同時にクローニングされた分子である。TNF-βは、171アミノ酸残基の25 kDaのグリコシル化ポリペプチドとして循環するにも関わらず、194アミノ酸残基長であるより大きな形態が発見されている。ヒトTNF-β cDNAは、205アミノ酸残基(マウスでは202アミノ酸)のオープンリーディングフレームをコードし、また推定では分泌中に幾つかのタイプのタンパク質分解プロセスが生じる。TNF-αと同様に、循環TNF-βは非共有結合した３量体として存在し、TNF-αと同一の受容体に結合することが知られている。
【０１３７】
１実施形態において、TNFはTNF受容体の１つに選択的に結合することができるTNFの変異体型である(Loetscher Hら(1993) J Biol Chem 268:26350-7、Van Ostade Xら(1993) Nature 361:266-9)。
【０１３８】
ヒトにおけるボーラス静注TNFの最大耐用量は218-410μg/m2であり(Frakerら, 1995)、動物での有効用量より約１０倍低い。マウスモデルで得たデータに基づくと、少なくとも10倍の高用量がヒトで抗癌効果をもたらすのに必要とされると考えられる(Schraffordt Koopsら, 1998)。温熱単離肢灌流(hyperthermic isolated-limb perfusion)に関する初めての臨床試験では、メルファランとインターフェロンγの併用により、ユニークな用量4 mgのTNFに匹敵する高反応率が得られた(Lienardら, 1992)。他の研究では、インターフェロンγを省略でき、また、より低用量のTNFでも十分に治療反応を誘導できることが示された(Hillら, 1993; Eggermontら, 1996)。該２つのサイトカインは、内皮細胞で相乗作用効果を発揮するので、これらを組合せ選択的にターゲティングすれば、より強力な抗癌活性が得られると考えられ、すなわち同一のサイトカインを組み合わせた癌療法で通常直面する全身毒性の問題点を克服することができる。そのうえ、TNFは血管内皮細胞のバリア機能を低下させることができ、これにより大分子の透過性を増大させることが知られている。本発明の修飾TNF分子を用いた治療が低毒性であることと、腫瘍血管の帰巣特性を利用すれば、これを代わりに適用することにより、治療又は診断目的のいずれかのために他の化合物の腫瘍血管への透過性を増大させることができる。例えば、修飾TNFを使用すれば腫瘍の放射免疫シンチグラフィー又は放射線免疫治療における放射性標識した抗体又はホルモン(腫瘍造影化合物)の腫瘍による取り込みを増大させることができる。あるいは、化学療法薬、抗毒素、薬剤若しくは遺伝子を運搬するリポソーム、又は他の抗癌薬剤の取り込みを増大させ、その抗腫瘍効果を増強することもできる。
【０１３９】
多くの他の炎症性サイトカインも、内皮血管透過性を増大させる性質を有しており、本発明ではそのようなサイトカインを、そのようなサイトカインの発現を増大する薬剤とともに適用できることが理解されるであろう。炎症性サイトカインは、前炎症性サイトカインとしても知られる、数多くの5 kDa〜70 kDaの分子量のポリペプチド及び糖タンパク質である。それらは、炎症性応答に対し刺激効果を有する。もっとも重要な炎症性サイトカインは、TNF、IL-1、IL-6及びIL-8である。
【０１４０】
炎症性サイトカインに分類される幾つかのサイトカインの表を下記に示す：
2008525424.tif 000003
TGF-β: 形質転換成長因子、LIF: 白血病抑制因子、OSM: オンコスタチン M、CNTF: 毛様体神経栄養因子、PF-4: 血小板因子4、PBP: 血小板塩基性タンパク質、NAP-2: 好中球活性化タンパク質2、β-TG: β-トロンボグロブリン、MIP: マクロファージ炎症性タンパク質、MCP: 単球化学誘因性タンパク質。
【０１４１】
炎症性応答のアップレギュレーションは、IL-11、IFN-α、IFN-βによってもなされ、特に、ケモカインスーパーファミリーのメンバーによってもなされる。幾つかの状況において、TGF-βは、好中球、Tリンパ球及び不活性単球への化学誘因性効果を含む炎症性活性をいくつか有する。
【０１４２】
IFN-γ
T-リンパ球及びナチュラルキラー細胞により主として産生される多面発現性(pleiotropic)サイトカインであるインターフェロン-γ(IFNγ）(Farrarら, 1993; Boehmら, 1997)は、抗癌反応を促進できることが膨大な証拠により示唆される(Curnisら, 2005)。例えば、IFNγは多くの腫瘍細胞型に対し増殖抑制作用及び前アポトーシス性作用を誘導することができ、腫瘍血管新生を阻害し、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージを活性化して、様々な腫瘍細胞標的を殺傷することができる。IFNγは、CD4+Tヘルパー細胞の重要な調節因子でもあり、重要な生理学的マクロファージ活性化因子であって、癌及び内皮細胞でのMHC-I及びIIの発現を増大させることができる。腫瘍間質内で、IFNγはIP-10(IFN-誘導性タンパク質10)、血管抑制タンパク質並びにリンパ球及び単球のための化学誘因性因子を含むサイトカイン及びケモカインの分泌を誘導することができる。腫瘍浸潤マクロファージにより産生されたIFNγが、腫瘍血管の崩壊に役立つことを示唆する証拠が得られている。内皮細胞と、IFNγ及び腫瘍壊死因子-α(TNF)とを結合させる治療は、腫瘍血管の崩壊において重要と思われる相乗作用性の細胞毒性をもたらす。IFNγは、様々な細胞型のTNF-受容体の発現だけでなく、活性化マクロファージによるTNF産生を増大させることもできる。腫瘍血管系及び免疫系細胞でのこれらの効果の結果として、IFNγは定着した腫瘍に対する炎症性／免疫応答を活性化することができ、癌増殖を阻害することができる。
【０１４３】
IFNγは、２つの非共有結合したポリペプチドサブユニットのホモ２量体として存在する。野生型ヒトIFNγ(huIFNG)の１次配列は、Grayら, 1982; Tayaら,1982; Devosら, 1982; 及びRinderknechtら, 1984により、またEP 77670、EP 89676及びEP 110044にて報告された。huIFNGの3D構造は、Ealickら, 1991により報告された。
【０１４４】
IL-12
インターロイキン12(IL-12)は、ナチュラルキラー細胞刺激因子(「NKSF」)又は細胞毒性リンパ球成熟因子(「CLMF」)とも言われ、広範囲の疾患において役割を果たす強力な免疫調節性分子である。ヒトIL-12は、独自の構造及び多面発現効果を有するサイトカインとして特性付けられている(Kobayashiら, 1989; Sederら, 1993; Lingら, 1995; Podlaskiら, 1992)。IL-12は、免疫応答及び炎症性応答が関与する数種の疾患と関連する病態において、重要な役割を果たす。IL-12、その生物学的活性、及び疾患におけるその役割のレビューは、Gatelyら,1998で参照することができる。in vivoにおけるIL-12の重要な役割は、ナチュラルキラー(NK)細胞及びＴ細胞の両方によるIFNγの産生を誘導することができる能力である。
【０１４５】
構造的には、IL-12は35 kDaサブユニット(p35)と40 kDaサブユニット(p40)がいずれもジスルフィド架橋により互いに連結されたヘテロ２量体タンパク質(「p70サブユニット」と呼ばれる)である。ヘテロ２量体タンパク質は、単球、マクロファージ及び樹状細胞のような抗原提示細胞により主に産生される。これらの細胞型も、p70サブユニットと比べp40サブユニットを過剰に分泌する。
【０１４６】
IL-2
IL-2/IL-2R系は免疫応答及び炎症性応答を仲介する中心的役割を担うため、該系のモニタリング及び取り扱いが診断及び治療上重要であることは明らかである。IL-2は、腫瘍攻撃性LAK及びTIL(腫瘍-浸潤リンパ球)細胞の増殖及び活性を刺激する能力があるので、抗がん剤として有望である。しかしながら、IL-2の毒性に関する問題が未だに危惧され、長所の調査が続けられている。本発明は、この問題を解決しようとするものである。
【０１４７】
IL-15
インターロイキン15(IL-15)は、IL-2と多くの生物学的特性を共有するが、アミノ酸配列の相同性を欠く新規サイトカインである。IL-15は、マウスT細胞株CTLL-2上でのその分裂促進活性を基礎として、サル腎上皮細胞株(CVI/EBNA)により調整された培地で初めて同定された。IL-15は、T細胞増殖を刺激するヒト成人T細胞白血病細胞株 (HuT-102)により産生されたサイトカインとして独立に発見され、そしてIL-Tと称された。T細胞、NK細胞、LAK細胞及びTILの刺激因子としてのその活性のために、IL-2は最近、臨床試験において癌及びウイルス感染の治療でのその潜在的有用性が試験されている。IL-15は同様の生物学的活性があるので、同様の治療可能性を有するはずである。
【０１４８】
ケモカイン
ケモカインは、白血球の輸送、リクルーティング及び再循環において機能する大部分が小さな分泌タンパク質のスーパーファミリーである。それらは、アレルギー反応、感染性疾患及び自己免疫疾患、血管新生、炎症、癌増殖、並びに造血細胞発達のような多くの病態生理学的プロセスにおいても重要な役割を果たす。これらのタンパク質の約80％が、その成熟型において66〜78アミノ酸(aa)を有する。残りは、タンパク質コアの上流に生じるさらなるアミノ酸を有するより大きなものか、又は伸長したC-末端セグメントの一部である。全てのケモカインは、受容体と結合した７つの膜貫通ドメインG-タンパク質を介してシグナリングする。少なくとも17の公知のケモカイン受容体があり、異なるケモカインのうち幾つかは同一の受容体を介してシグナリングすることができるので、これらの受容体の多くは差がない結合特性を示す。
【０１４９】
ケモカインは、保存的アミノ酸配列モチーフに基づいてサブファミリーに分けられる。殆どのファミリーメンバーは、２つの分子内ジスルフィド結合を形成する少なくとも４つの保存的システイン残基を有する。そのサブファミリーは、最初の２つのシステイン残基の位置によって規定される：
・αサブファミリーはCXCケモカインとも呼ばれ、最初の２つのシステイン残基を離隔する１つのアミノ酸を有する。このグループは、最初のシステイン残基の直前にglu-leu-arg(ELR)アミノ酸モチーフを有するか、有さないかにより、さらに亜分割することができる。現在のところ、５つのCXC-特異的受容体があり、それらはCXCR1〜CXCR5と称される。このELR+ケモカインはCXCR2と結合し、一般に、好中球化学誘因性物質及び活性化因子として作用する。ELR-ケモカインはCXCR3〜5と結合し、リンパ球上で最初に作用する。本明細書記載の時点で、選択的スプライシングにより幾つかの付加的な多様性が得られたCXCケモカインをコードする14種類の異なるヒト遺伝子が、科学文献で報告されている。
【０１５０】
・βサブファミリーはCCケモカインとも呼ばれ、最初の２つのシステインはアミノ酸を介在せずに互いに隣接している。現在のところ、24種類の異なるヒトβサブファミリーメンバーがある。このグループに対する受容体は、CCR1〜CCR11と称される。様々なCCファミリーメンバーの標的細胞は、ほとんどのタイプの白血球を含む。
【０１５１】
・α及びβサブファミリーのいずれにも属さないケモカイン相同性を有する２つの公知のタンパク質がある。リンホタクチンは、第１及び第３のシステインがないγクラス（Cケモカイン）の唯一のメンバーである。リンホタクチン受容体は、XCR1と称される。フラクタルキンはδクラス(CX3Cケモカイン)の唯一の公知なメンバーであり、最初の２つのシステイン残基の間に３つの介在するアミノ酸を有する。この分子は、N-末端ケモカインドメインが長いムチン様ストークと融合した膜貫通タンパク質であり、ケモカインの間で特有のものである。フラクタルキン受容体は、CX3CR1として知られる。
【０１５２】
VEGF
本発明は、血管内皮増殖因子(VEGF)にも適用できる。血管新生とは、現存する血管系からの新しい血管の発生過程である。血管新生は、胚発生、組織の正常な成長、創傷治癒、女性の生殖周期（すなわち、排卵、月経、胎盤形成）で重要な役割を果たすだけでなく、多くの疾患において主要な役割を果たす。腫瘍は新しい血管供給を進めなければ、数ミリメートルサイズも成長できないので、特に癌において注目されてきた。血管新生は、腫瘍細胞の転移の拡大及び成長についても不可欠である。
【０１５３】
内皮細胞において、最も重要な成長及び生存因子の１つはVEGFである。VEGFは、血管新生及び内皮細胞増殖を誘発し、また血管形成の調節において重要な役割を果たす。VEGFは、45 kDaのホモ２量体として分泌されるヘパリン-結合糖タンパク質である。通常、内皮細胞以外のほとんどのタイプの細胞は、それ自身がVEGFを分泌する。最初に発見されたVEGF、すなわちVEGF-Aは血管透過性を増大させるので、血管透過性因子として知られていた。さらに、一部では、内皮細胞中で酸化窒素シンターゼを刺激することにより、VEGFは血管拡張を引き起こす。VEGFは細胞遊走を刺激したり、アポトーシスを阻害することもできる。VEGF-Aには、幾つかのスプライス変異体が存在する。主なものには、121、165、189及び206アミノ酸(aa)が含まれ、それぞれが特定のエキソン付加を含んでいる。
【０１５４】
EMAP II
内皮細胞単球活性化ポリペプチドII(EMAP-II)は、腫瘍血管の発達における抗血管新生因子であるサイトカインであり、癌増殖を強力に阻害する。組換えヒトEMAP-IIは、166アミノ酸残基を含む18.3 kDaのタンパク質である。EMAPIIは、内皮血管透過性を増大させることもわかっている。
【０１５５】
PDGF
血小板由来増殖因子(PDGF)アンタゴニストは、一般的な固形癌において広範囲の抗癌剤の薬剤取り込み及び治療効果を増大し得ると言われてきた。PDGFは、30kDaのサイトカインであり、創傷時に血小板により放出され、近くの細胞を刺激して成長させ、該創傷を修復する。
【０１５６】
PD-ECGF
その名が示すとおり、血小板由来内皮細胞増殖因子(PD-ECGF)は、内皮細胞で有糸分裂を誘発する能力に基づいて血小板より最初に単離された。その関連タンパク質はグリオスタチンである。
【０１５７】
抗体
本明細書で使用される場合、「抗体」とは免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にコードされる1以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼを用いた消化により産生されたよく特性付けられたフラグメントを含む数多くのフラグメントとして、存在し得る。様々な抗体フラグメントは、インタクトな抗体の消化の観点から規定され、当業者であれば、抗体フラグメントが化学的に又は組換えDNA方法を利用することにより新たに合成され得ることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用される用語「抗体」は、抗体全体の改変により産生された又は組換えDNA方法を用いて新たに合成された抗体フラグメントも含む。用語「抗体」を使用する場合に含まれる抗体フラグメントは、これに限定されないが、Fab、Fab'、F (ab')2、scFv、Fv、dsFv diabody、及びFd断片を含む。
【０１５８】
本発明は、表面タンパク質に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体も提供する。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を産生するプロセスをさらに提供する。
【０１５９】
ポリクローナル抗体が望ましい場合、選択した哺乳動物(例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等)が、（１又は複数の）エピトープを有する免疫原性ポリペプチドで免疫される。免疫した動物から血清を回収し、公知の手順に従い処理する。エピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が他の抗原に対する抗体を含む場合には、ポリクローナル抗体を免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。そのような抗体を作製し得るために、本発明は、動物又はヒトでの免疫原として使用するため、別のポリペプチドにハプテン化された本発明のポリペプチド又はその断片も提供する。
【０１６０】
ポリペプチド内の結合細胞表面エピトープに対するモノクローナル抗体は、当業者により容易に産生され得る。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を作製する一般的方法は、周知である。不死化抗体産生細胞株は、細胞融合により作製することができ、また発癌性DNAを伴うBリンパ球の直接形質転換、又はエプスタイン-バーウイルス（Epstein-Barr virus）によるトランスフェクションのような他の技術によっても作製することができる。エピトープに対し産生されたモノクローナル抗体のパネルを用いて、様々な特性について、すなわちアイソタイプ及びエピトープ親和性について、スクリーニングすることができる。
【０１６１】
代替技術としては、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングを含み、この場合、例えばファージは、多種多様な相補鎖決定領域（CDR）を有するファージコートの表面上でscFv断片を発現する。この技術は当技術分野で周知である。
【０１６２】
この発明の目的において、用語「抗体」は、特に定義しない限り、標的抗原に対しその結合活性を保持する全抗体のフラグメントを含む。上記のとおり、そのようなフラグメントはFv、F(ab')及びF(ab')2フラグメントだけでなく、一本鎖抗体(scFv)も含む。そのうえ、抗体及びそのフラグメントは、例えばEP-A-239400に記載のヒト化抗体であり得る。
【０１６３】
剤
本明細書で使用される場合、用語「剤」はこれに限定されないが、天然又は非天然の任意の好適な起源から取得又は産生され得る検査化合物のような化合物を含む。剤は、ペプチドのほか、小有機分子及び特に新規リード(lead)化合物のような他の化合物を含み得る化合物のライブラリーから設計又は取得され得る。例えば、剤は天然物、生体高分子、又は細菌、菌類若しくは動物(特に哺乳類)細胞や組織のような生体材料から作製された抽出物、有機又は無機分子、合成検査化合物、準合成検査化合物、構造又は機能性擬似体、ペプチド、ペプチド擬似体、誘導体化検査化合物、全タンパク質から切断したペプチド、又は(例えばペプチド合成機を用いるような）合成技術により若しくは組換え技術により合成したペプチドやその組合せ、組換え検査化合物、天然又は非天然の検査化合物、融合タンパク質又はその等価物及び変異体、誘導体若しくはその組合せであり得る。
【０１６４】
剤は、アミノ酸配列又はその化学誘導体であり得る。その物質は、有機化合物又は他の化学物質でもあり得る。剤はヌクレオチド配列、例えばセンス配列又はアンチセンス配列でさえあり得る。
【０１６５】
医薬製剤
本発明は、個体を治療するための医薬組成物も提供し、ここで該組成物は治療上有効量の本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、複合体及び薬剤の組合せを含む。
【０１６６】
isoDGRモチーフを含むペプチド又は複合体を含む本発明の組成物は、ほかの形態のDGRを含むペプチド又は複合体を実質的に含まない。実質的に含まないとは、組成物中に存在するisoDGR含有ペプチド又は複合体（すなわち、DGRモチーフがすべてisoDGR形態である場合のペプチド又は複合体）の、組成物中に存在する総DGR含有ペプチド又は複合体（すなわち、全異性体形態）に対するw/w％が50％より高く、より好ましくは55％より高く、より好ましくは60％より高く、より好ましくは65％より高く、より好ましくは70％より高く、より好ましくは75％より高く、より好ましくは80％より高く、より好ましくは85％より高く、より好ましくは90％より高く、より好ましくは95％より高く、より好ましくは97％より高く、より好ましくは99％より高いことを意味する。
【０１６７】
LisoDGRモチーフを含むペプチド又は複合体を含む本発明の組成物は、他の形態のDGRを含むペプチド又は複合体を実質的に含まない。実質的に含まないとは、組成物中に存在するLisoDGR含有ペプチド又は複合体（すなわち、DGRモチーフがすべてLisoDGR形態である場合のペプチド又は複合体）の、組成物中に存在する総DGR含有ペプチド又は複合体（すなわち、全異性体形態）に対するw/w％が50％より高く、より好ましくは55％より高く、より好ましくは60％より高く、より好ましくは65％より高く、より好ましくは70％より高く、より好ましくは75％より高く、より好ましくは80％より高く、より好ましくは85％より高く、より好ましくは90％より高く、より好ましくは95％より高く、より好ましくは97％より高く、より好ましくは99％より高いことを意味する。
【０１６８】
DDGRモチーフを含むペプチド又は複合体を含む本発明の組成物は、他の形態のDGRを含むペプチド又は複合体を実質的に含まない。実質的に含まないとは、組成物中に存在する DDGR含有ペプチド又は複合体（すなわち、DGRモチーフがすべてDDGR形態である場合のペプチド又は複合体）の、組成物中に存在する総DGR含有ペプチド又は複合体（すなわち、全異性体形態）に対するw/w％が50％より高く、より好ましくは55％より高く、より好ましくは60％より高く、より好ましくは65％より高く、より好ましくは70％より高く、より好ましくは75％より高く、より好ましくは80％より高く、より好ましくは85％より高く、より好ましくは90％より高く、より好ましくは95％より高く、より好ましくは97％より高く、より好ましくは99％より高いことを意味する。
【０１６９】
医薬組成物はヒト又は動物用であり得る。通常、医師が個々の被験体にとって最適であろう実用量を決定するであろう。また、該用量は年齢、体重、特定個体の反応に応じて変更しえる。
【０１７０】
該組成物は、製薬上許容できる担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを任意で含み得る。医薬担体、賦形剤又は希釈剤は、意図する投与経路及び標準的な医薬実務に基づき選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として、或いはこれらに加えて、任意の好適な（１つ又は複数の）結合剤、（１つ又は複数の）滑沢剤、（１つ又は複数の）懸濁化剤、（１つ又は複数の）被覆剤、（１つ又は複数の）可溶化剤、及び標的部位へのウイルスの進入を補助又は増加させ得る他の担体物質（例えば、脂質デリバリーシステム)を含み得る。好適な担体及び希釈剤は、等張生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水を含む。賦形剤の詳細については、「The Handbook of Pharmaceutical Excipients」,第２版, Eds Wade & Weller, American Pharmaceutical Associationで参照することができる。
【０１７１】
適当な場合には、医薬組成物は吸入、坐剤又は膣坐剤の形態、ローション、液剤、クリーム、軟膏又は散剤の形態での局所投与、皮膚パッチの使用、でんぷん又はラクトースのような賦形剤を含む錠剤の形態での経口投与、カプセル又は腔坐剤単独若しくは賦形剤との混合物、又は着香料若しくは着色料を含むエリキシル剤、液剤や懸濁剤の形態のうち、任意の1以上により投与され得、或いは非経口的に、例えば洞内投与(intracavernosally)、静脈内投与、筋肉内投与又は皮下投与により注射することができる。非経口投与では、組成物は他の基質（例えば血液と等張な溶液を作製するのに十分な塩又は単糖）を含み得る滅菌水溶液の形態で使用するのが最適であり得る。バッカル剤又は舌下剤での投与では、組成物は従来の製法で製剤することができる錠剤又はロゼンジ剤の形態で投与され得る。
【０１７２】
経口投与又は非経口投与用の製剤が好ましい。非経口投与用の製剤には、注射用溶液又は懸濁液及び注入用液体が含まれる。非経口形態の調製では、有効量の活性成分が滅菌担体中で溶解又は懸濁され、任意で可溶化剤、等張剤、保存剤、安定剤、乳化剤又は分散剤のような賦形剤が添加され、そして次に密封バイアル又はアンプル中に分配されるであろう。
【０１７３】
組成物は、毎日、毎週又は毎月の投与により、所望の日用量を提供するように製剤化され得る。組成物は、より少ない頻度（例えば、2、4、6、8、10又は12時間毎）で投与するのに好都合なように製剤化され得ることが理解されるであろう。
【０１７４】
ポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド/ベクターは、好ましくは宿主細胞ゲノムと相同性のあるフランキング配列をさらに含む裸の核酸構築物として直接投与され得る。
【０１７５】
哺乳類細胞による裸の核酸構築物の取り込みは、幾つかの公知のトランスフェクション技術、例えばトランスフェクション剤の使用を含むものにより増大しうる。これらの物質の例には、カチオン剤(例えば、リン酸カルシウム及びDEAE-デキストラン)及びリポフェクタント(例えば、lipofectamTM及びtransfectamTM)が含まれる。通常、核酸構築物はトランスフェクション剤と混合され、組成物を産生する。
【０１７６】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチド又はベクターは製薬上許容できる担体又は希釈剤と組み合わせて、医薬組成物を製造する。好適な担体及び希釈剤は、等張生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水を含む。組成物は、非経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、眼内投与又は経皮投与のために製剤化され得る。
【０１７７】
本明細書に記載の投与経路及び用法用量は、特定の患者及び状態に対する最適な投与経路や用法用量を当業者が容易に決定できるように、手引としてのみ意図される。
【０１７８】
ペプチド、特にサイトカインはリポソーム形態での調製により、それらの生物学的活性を改善することができる。実際に、TNFアミノ基のアシル化は、in vitroでの生物学的活性を失うことなくその疎水性の増加を誘導することが観察されている。そのうえ、脂質と結合したTNFは、in vitroでの細胞毒性、in vivoでの免疫調節作用及び毒性低下に影響を受けないことが報告されている(Debら, 1989, 1990)。
【０１７９】
好ましくは、本発明のDGRモチーフを含むペプチド及び複合体を含んでなる本発明の組成物は、対応するNGRモチーフを含む対応するペプチド及び複合体を実質的に含まない。好ましくは、総ペプチド(すなわち、DGR及びNGR含有ペプチド)に対するDGR含有ペプチドの割合は60％より高く、より好ましくは70％より高く、より好ましくは80％より高く、より好ましくは85％より高く、より好ましくは90％より高く、より好ましくは95％より高く、より好ましくは97％より高く、より好ましくは99％ w/wより高い。
【０１８０】
治療
本発明のペプチド、複合体及び組成物が、治療上の処置で使用され得る。
【０１８１】
本明細書で参照される全ての治療には、根治治療、姑息的治療及び予防治療が含まれると理解される。
【０１８２】
本発明の多くの実施形態において、治療される患者は望ましくはヒト患者であるが、本発明の原理によれば本発明は全ての哺乳動物について有効であり、用語「患者」にはそれらが含まれることが意図されると理解される。この点において、哺乳動物には、血管新生と関連がある疾患の治療が望まれる任意の哺乳類種、特に農業用及び家畜用哺乳動物種が含まれると解される。
【０１８３】
１実施形態において、ペプチド、複合体又は医薬組成物は、これに限定されないが肺癌、膵臓癌、乳癌、結腸癌、喉頭癌又は卵巣癌を含む癌を治療又は予防するために使用され得る。好ましくは、該癌には固形癌が含まれる。
【０１８４】
別の実施形態では、ペプチド及び/又は複合体を使用して、αvβ3発現と関連がある疾患など血管新生と関連がある疾患を治療又は予防し得る。
【０１８５】
血管新生とは、新たに発達しつつある血管が組織へと成長するのに関与する組織の血管新生プロセスであり、新血管形成とも称される。該プロセスは、内皮細胞及び平滑筋細胞の浸潤により媒介される。該プロセスは３つの方法のうちいずれか１つで進行すると考えられており、すなわち、血管は既存の血管から芽生えることができ、血管の新たな発達は前駆細胞から生じ得（血管形成）、又は既存の小血管の直径が拡張され得る(Bloodら, 1990)。
【０１８６】
血管新生が重要と思われる様々な疾患は、血管新生疾患と称され、これに限定されないが、免疫性炎症及び非免疫性炎症のような炎症性障害、関節炎、不適切又は不適当な血管浸潤と関係がある障害（糖尿病性網膜症、黄斑変性、血管新生緑内障、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化症プラークにおける毛細血管の増殖及び骨粗しょう症など）、並びに癌と関連がある障害（固形癌、固形癌転移、血管線維腫、水晶体後方線維増殖、血管腫、カポジ肉腫、及び癌増殖を支持するために新血管形成を必要とするような障害など）がある。
【０１８７】
したがって、病変組織において血管新生を阻害する方法は、疾患の症状を改善し、疾患によっては疾患の治癒に貢献することができる。
【０１８８】
別の関連する実施形態において、治療対象となる組織は、糖尿病性網膜症、黄斑変性又は血管新生緑内障に罹患した患者の網膜組織であり、阻害対象となる血管新生は、網膜組織の新血管形成が存在する網膜組織の血管新生である。
【０１８９】
関連するさらなる実施形態において、治療対象となる組織は、固形癌、転移癌、皮膚癌、乳癌、血管腫又は血管線維腫及び類似の癌に罹患した患者の腫瘍組織であり、阻害対象となる血管新生は、腫瘍組織の新血管形成が存在する腫瘍組織の血管新生である。本発明方法により治療することができる典型的な固形癌の組織には、肺、膵臓、乳房、結腸、喉頭、卵巣、及び類似の組織が含まれる。典型的な腫瘍組織の血管新生、及びその阻害については、実施例に記載されている。
【０１９０】
癌増殖において新血管形成は重要な役割を果たすので、腫瘍組織の血管新生の阻害は特に好ましい実施形態である。腫瘍組織で新血管が形成されなければ、腫瘍組織は必要な栄養を得られず、成長が遅れ、さらなる成長が中断され、消退し、最終的に壊死して腫瘍を殺生する結果となる。
【０１９１】
該方法は転移形成に対しても、特に効果がある。というのも、(1) 転移形成において、転移性癌細胞が原発腫瘍から外へでることを可能とするためには、原発腫瘍の血管新生を必要とし、また(2)第２の部位で定着するためには、転移の成長を支持する新血管の形成が必要だからである。
【０１９２】
関連する実施形態において、本発明は、固形癌に対して実施される、および、転移癌の定着を調節することを目的とする従来の化学療法のような他の療法との併用実施が意図される。腫瘍組織は毒性攻撃に対抗して、血管新生を誘導することにより腫瘍組織へ血液供給及び栄養を供給して再生しようとするので、何度も化学療法レジメンを実施した後に血管新生を阻害するのが好ましいが、血管新生阻害剤の投与は通常、化学療法と同時又は化学療法の後に実施される。さらに、転移に対する予防法として、固形癌を切除した術後に本発明の血管新生阻害方法を行うことが好ましい。
【０１９３】
本発明方法が腫瘍の新血管形成の阻害に適用される限りにおいて、該方法を適用して腫瘍組織の成長を阻害し、腫瘍の転移形成を阻害し、さらに定着した腫瘍を消退させることもできる。
【０１９４】
再発狭窄症とは、経皮経管冠動脈形成術を施した部位における平滑筋細胞(SMC)の遊走及び増殖プロセスであり、血管形成術の成功を妨げるものである。再発狭窄症におけるSMCの遊走及び増殖は、本発明方法により阻害される血管新生のプロセスとみなすことができる。したがって、本発明は、血管形成術を受けた患者おいて、本発明方法で血管新生を阻害することにより、再発狭窄症を抑制することも意図する。
【０１９５】
本発明のペプチド、複合体及び医薬組成物は、併用製剤、別々の製剤又は逐次製剤として使用することができ、さらに他の診断用物質又は治療用物質と併用することができる。
【０１９６】
TNF/IFNの組合せ
本発明の別の態様は、改変したTNFとIFNγの組合せの使用に関する。この組合せは、併用製剤、別々の製剤又は連続製剤として使用することができる。有利には、該組合せは、癌の治療又は診断において、ドキソルビシン及びメファランのような他の診断用物質又は治療用物質とも併用される。したがって、本発明は修飾TNFとIFNγの組合せ、及び場合により別の腫瘍診断用物質又は抗癌治療物質を含む医薬組成物を提供する。さらに、この組合せは併用製剤、別々の製剤又は逐次製剤として使用することができる。
【０１９７】
国際特許公開第WO03/093478号によると、ピコグラム用量のサイトカインを標的送達すると、化学療法薬の透過性が増強し、化学療法薬の治療指数が向上するという新規かつ驚くべき方策がもたらされることがわかる。国際特許公開第WO03/093478号は、その全体が引用により本明細書に取り込まれるものとする。より詳細には、本発明者らは、腫瘍、及び腫瘍血管系を含む腫瘍関連環境、への非常に低用量のサイトカインの送達が、ネガティブフィードバック機構を回避し、かつ、薬剤-透過障壁を変更する能力を保持する新しいアプローチを提示することを見出した。
【０１９８】
本発明のこの態様の１実施形態において、本発明の複合体は0.5〜500 ng/kgの範囲、好ましくは1〜50 ng/kgの範囲、より好ましくは5〜15 ng/kgの範囲の用量で投与され得る。
【０１９９】
本発明のこの態様の他の実施形態では、IFNγと組み合わせた本発明の複合体を含んでなる医薬組成物が提供され、ここで複合体は、複合体又はその代謝物が治療を受ける被験体の血漿中で約35,000 ng/日以下、好ましくは約3,500 ng/日以下、より好ましくは約1,000ng/日以下の量でもたらされるように与えられる。
【０２００】
上記用量は70 kgの被験体に対する用量を表す。当業者であれば、70 kgを超える重量のある被験体について記載の用量を容易に変更することができるであろう。
【０２０１】
本明細書に記載の投与経路及び用法用量は、特定の患者及び状態に対する最適な投与経路や用法用量を当業者が容易に決定できるように、手引としてのみ意図される。
【実施例】
【０２０２】
次の実施例は、本発明をさらに説明する。
【０２０３】
[実施例１]実施例１〜７の材料及び方法。
【０２０４】
細胞株及び試薬
マウスRMAリンパ腫細胞及びEA.hy926細胞(ヒト肺癌A549細胞と融合したヒト内皮細胞)を既報のとおり培養した(Curnisら, 2005; Ljunggren及びKarre, 1985)。クリスタルバイオレット(Fluka Chemie); ウシ血清アルブミン(BSA)、ヤギ抗ウサギIgGセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体、FN-70 KDa、FN-45 KDa及びFN-30 KDa断片(Sigma); レトロネクチン(Takara Biomedicals)。ヒトαvβ3、αvβ5、α5β1及びα1β1インテグリン(Immunological Sciences); ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ (Societa Prodotti Antibiotici)。
【０２０５】
組換えFN-I4-5とFN-I4-5SGSの調製及び特性付け
ヒトフィブロネクチンI型の第4-5反復(FN-I4-5; フィブロネクチンの残基184-273)をコードするcDNAを、RT-PCRによりMSR-3-mel細胞の全RNA(Tanzarellaら, 1999)から次のプライマーを用いて調製した: 5’-CTGGATCCGAGAAGTGTTTTGATCATGCTGCTGGG(フォワード)及び5’-TATATTAAGCTTTCAGTGCCTCTCACACTTCC(リバース)。NGRをSGS(FN-I4-5SGS)で置換したコントロール断片を、PCRによりFN-I4-5 プラスミドで上記フォワードプライマー及び次のリバースプライマーを用いて作製した:5’-TATATTAAGCTTTCAGTGCCTCTCACACTTCCACTCTCCACTGCCGCTG。増幅した断片をpRSET-Aプラスミド (Invitrogen)にクローニングし、BL21(DE3)pLysS E.coli細胞内で(N-末端にHis-タグを有する)可溶性タンパク質として発現させ、そして金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより細胞抽出物から精製した。
【０２０６】
合成ペプチドの調製及び特性付け 
様々な(ビオチン化及び非ビオチン化)ペプチドを、Applied Biosystemモデル433Aペプチド合成装置を用いて化学合成により調製した。明示した場合を除き、L-立体配置のアミノ酸を使用した。ヒトフィブロネクチンI型の第5反復(FN-I5)、すなわち成熟タンパク質の230-274残基(受託番号P02751, Swiss-Prot)に相当する合成ペプチドも、N-末端にアセチル-グリシンを付加し、Asp250の代わりにGlu250に置換させ合成した。FN-I5中のCys258-Cys270及びCys231-Cys260(図１参照)間のジスルフィド形成を促すために、Cys258及びCys270を（側鎖の脱保護及びレジンからの切断後に、トリフルオロ酢酸により除去することができる）S-トリチル基で保護した。ここで、Cys231及びCys260は(ヨウ素での処理により除去できる)S-アセトアミドメチル基で保護した。ペプチドのRP-HPLC精製後に、Cys258-Cys270のジスルフィド架橋を20μmolのペプチドを8％ DMSO(pH 7) 300 ml中で(室温で一晩)インキュベートすることにより形成させた。その後、ペプチドをRP-HPLCにより精製し、凍結乾燥させた。第２のCys231-Cys260ジスルフィド架橋を形成させるため、13.5μmolのペプチドを80％ v/v酢酸 67 ml中に溶解させ、さらに1 Nの塩酸0.135 mlと混合した。その後、2 mlのメタノールで溶解した21 mgのヨウ素を、撹拌しながらペプチド溶液に加えた。90分後に、1 mmolのアスコルビン酸を、ヨウ素を消去するために加えた。その後、ペプチドをRP-HPLCにより精製した。
【０２０７】
全てのペプチドを滅菌水で溶解させた後、-20℃で一定分量ずつ保存した。ペプチドの純度は、RP-HPLCで分析した。全てのペプチド調製物における遊離スルヒドリル基は、エルマン試薬(Pierce, Rockford, Illinois）による滴定で確認した結果、0.1％未満であった。ペプチドの同一性は、MALDI-TOF又はESI-MS質量分光分析により確認した。この実験を通じて使用したペプチドの分子量は、予想値とほぼ同じであった。FN-I5のESI-MS分析は、アセトアミドメチル基が取り除かれていないFN-I5に相当する144 Daの追加成分が存在することを示した。
【０２０８】
CNGRC-TNF、CDGRC-TNF及びCNGRC-TNF1-11複合体の調製及び特性付け
マウスTNF及びCNGRC-TNF(CNGRCGのC末端で融合したマウスTNFからなる)を、記載のとおり(Curnisら, 2000)組換えDNA技術により調製した。CDGRC-TNF(CDGRCGのC末端で融合したマウスTNFからなる)をコードするcDNAを、PCRによりCNGRC-TNFプラスミド(Curnisら, 2000)を用い、次のプライマーを用いて調製した: 5’-CACCATGGGCAACGGCCGTGGCGGCGTC(フォワード); 5’-TCAGGATCCTCACAGGGCAATGATCCCAAAGTAGAC(リバース)。増幅したcDNAをpET101/D-TOPOプラスミド(Invitrogen)にクローニングし、BL21(DE3) E.coli細胞(Novagen)内で発現させ、アフィニティークロマトグラフィーにより可溶性p75-TNF受容体-セファロース上で、概ねCNGRC-TNFについて既に報告されているとおり(Colomboら, 2002)、細胞抽出物から精製した。CNGRC-TNF及びCDGRC-TNFは両方とも、既報のとおり(Curnisら, 2000)、再ホールディング手順に供した。
【０２０９】
タンパク質の純度及び同一性は、SDS-PAGE、エレクトロスプレー質量分析及びゲル濾過クロマトグラフィーにより確認した。L-Mマウス線維芽細胞を用いる標準的細胞溶解アッセイ(Cortiら, 1994)により測定したCNGRC-TNF及びCDGRC-TNFのin vitro細胞溶解活性は、それぞれ2.96 (±0.56)×108 U/mg及び2.59 (±0.69)×108 U/mgであった。(TNF活性のない)NGR-TNFのN-末端配列に相当するCNGRC-TNF1-11及びCARAC-TNF1-11ペプチドは、上記のとおり化学合成により調製した。
【０２１０】
フィブロネクチン断片及びペプチドの促進老化(熱処理)
フィブロネクチン断片、ペプチド及びペプチド-TNF複合体を0.1 M重炭酸アンモニウム緩衝液（pH 8.5）に溶解し、37℃で16時間インキュベートし、そして解析まで-20℃で保管した。これらの産物は、以下「熱処置した」ものと称する。
【０２１１】
イソアスパラギン酸(isoAsp)の定量
未処理及び「熱処理した」CNGRC-TNFとペプチド中のIsoAsp含有量を、ISOQUANTTMイソアスパラギン酸検出キット(Promega)を用いて定量した。
【０２１２】
細胞接着アッセイ及びPIMT処置
未処理及び「熱処理した」フィブロネクチン断片、ペプチド及びペプチド-TNF複合体を所望の濃度で、150 mM塩化ナトリウム、50 mMリン酸ナトリウム(pH 7.3)で溶解し、そして96-ウェル ポリ塩化ビニルマイクロタイタープレート(Falcon, Becton Dickinson)に加えた。4℃で一晩インキュベーションした後、プレートを洗浄し、0.1％BSA(40000細胞/ウェル)を含むDMEM中にEA.hy926細胞を播種し、37℃、5％CO2下で２〜３時間インキュベートした。接着細胞を記載（Curinsら, 2005）のとおり固定しクリスタルバイオレットで染色した。
【０２１３】
様々なフラグメントの前接着特性に対するプロテインL-isoAsp/D-AspO-メチルトランスフェラーゼ(PIMT)の効果を次のとおり調べた。すなわち、マイクロタイタープレートを上記のとおり様々な産物で被覆し、0.9％塩化ナトリウムで洗浄した。その後、各ウェルを150 mMの塩化ナトリウム、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.8)及び5μlのPIMT溶液(IsoQuant イソアスパラギン酸検出キット, Promegaから得た)中で0.02 mMのS-アデノシル-L-メチオニンを含有する溶液45μlで満たし(最終体積50μl/ウェル)、37℃で16時間インキュベートした。インキュベーション後に、プレートを0.9％塩化ナトリウムで洗浄し、細胞接着アッセイを上記のとおり実施した。
【０２１４】
ペプチド及びタンパク質のインテグリンへの結合
Ca2+及びMg2+を含むリン酸緩衝生理食塩水(DPBS, Cambrex)内にヒトαvβ3、αvβ5、α5β1及びα1β1インテグリンを含む溶液0.5-2μg/mlを、96-ウェルポリ塩化ビニルマイクロタイタープレートに加え(50μl/ウェル)、4℃で一晩インキュベートした。全ての後続のステップは室温で実施した。プレートをDPBSで洗浄し、3％BSAを含むDPBSでさらにインキュベートした(200μl/ウェル、1時間)。その後、プレートを洗浄し、CNGRC-TNF又はTNF溶液(5μg/ml、3％BSA-DPBS中50μl/ウェル)で満たし、２時間インキュベートした。DPBSで洗浄後、各ウェルは精製したウサギ抗マウスTNF IgGと共に、1％正常ヤギ血清を含む3％BSA-DPBS中でインキュベートした(10μg/ml、50μl/ウェル、1時間)。続いて、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ複合体を同一の緩衝液中でインキュベートした(50μl/ウェル、1時間)。結合したペルオキシダーゼは、o-フェニレンジアミン発色基質を添加することにより検出した。
【０２１５】
ビオチン化ペプチド(CNGRC-TNF1-11、CARAC-TNF1-11及びFN-I5)の精製したインテグリンへの結合は、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体を用いて調べた。複合体は、3％BSAを含むDPBS中で0.03ユニットのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ(結合能: 1ユニット当たり1μgビオチンのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ)を加えて、様々な量(0.5〜1g)の熱処理したビオチン化ペプチドと混合することにより調製した(最終容量15μl）。複合体は、3％BSA-DPBSで希釈し(1:500)、上記のとおりインテグリンで被覆したマイクロタイタープレートへ添加し、さらに室温で2時間インキュベートした。DPBSで洗浄後、結合ペルオキシダーゼを上記のとおり発色反応により検出した。各アッセイは、３回実施した。
【０２１６】
In vivo試験
動物モデル試験は、San Raffaele H Scientific Instituteの倫理委員会の承認を得て、規定のガイドラインに従い実施した。体重16〜18 gのC57BL/6Nマウス(Charles River Laboratories, Calco, Italy)に対し、7×104のRMA生細胞を左脇腹に皮下注射してチャレンジした。4日後から、マウスを200μgの熱処理したFN-I5 (100μl)を含有する0.9％塩化ナトリウム溶液(腹腔内注射)で毎日処置した。癌増殖は、既に記載されているとおり(Gasparriら, 1999)、ノギスで腫瘍を測定することによりモニターした。動物は、腫瘍が直径1.0〜1.3 cmに到達する前に犠牲にした。腫瘍サイズは平均±SEとして示す(5動物/群)。
【０２１７】
[実施例２]フィブロネクチン断片の促進老化は、NGR-依存性接着部位を産生する
NGRモチーフを含む天然、組換え及び合成フィブロネクチン断片へのEA.hy926細胞の接着を調べた。始めに、次に示すフィブロネクチンのタンパク質分解断片について調べた。a) FN-I1-9及びFN-II1-2反復を含むFN-70 KDa；b) FN-I1-5反復を含むFN-30 KDa；c) FN-I6-9及びFN-II1-2を含むFN-45 KDa(概略図に関しては図１参照）。全ての断片が、マイクロタイタープレートへの吸着後、細胞接着及び拡張を誘導し(図2)、これらの領域内に前接着部位が存在することが示された。
【０２１８】
FN-I5反復におけるNGRモチーフの役割を調べるために、その後、FN-I5、FN-I4-5及びFN-I4-5SGS断片の前接着特性を分析した。FN-I4-5SGS断片はNGR(残基263-265)がSGSで置換された変異体に相当する。組換えFN-I4-5はSGS変異体ではないが、細胞接着を促進した(図3A)。0.1 M重炭酸アンモニウム緩衝液（pH 8.5）中、37℃で16時間これらの断片をインキュベートした際(以下、この処理を「熱処理」と呼ぶ）、FN-I4-5SGSではなくFN-I4-5への細胞接着の増加を観察した(図3A)。このことは、細胞接着部位は何らかの形でNGR配列と関係しており、促進老化(accelerated aging)により生じたことを示した。同様の結果が合成FN-I5についても得られた(図3B）。
【０２１９】
NGRモチーフがこの現象を媒介するのに十分であったのか調べるため、NGRモチーフを含む短いペプチドの前接着特性を熱処理の前後で調べた。NGRトリペプチドは、マイクロタイタープレートに抱き寄せられたり結合したりしそうにないので、2つの隣接システインを導入した。隣接システインを使用する理由は、分子力学シュミレーションによりCNGRCペプチドの予測立体構造がFN-I5反復のGNGRGループのものと類似するという事実に基づくためである(Colomboら, 2002)。さらに、このペプチドをTNF(CNGRC-TNF)又はTNFのはじめの11残基(TNF活性を欠くCNGRC-TNF1-11)と融合させ、マイクロタイタープレートへ吸着できるようにした。予想どおり、CNGRC-TNFの熱処理は細胞接着を増加させた(図3C)。TNF単独では、熱処理の前後いずれでも接着を観察しなかった(データは示していない)。同様に、CARAC-TNF1-11（コントロールペプチド）ではなくCNGRC-TNF1-11の熱処理は細胞接着を増加させた(図3C右)。
【０２２０】
これらの結果は、NGRモチーフは熱処理後に細胞接着を促進するのに十分であるという仮説を支持する。興味深いことに、組換えDNA技術により調製したCDGRC-TNF複合体は、熱処理後でも（示していない）完全に不活性であり（図3D)、Asnが活性増強に関して決定的な残基であることが示唆された。結論として、これらの結果は、FN-I5中のNGRモチーフのAsn残基と関連する構造変化が何らかの形で前接着部位の形成に導くことを示す。
【０２２１】
[実施例３]NGRのアミド分解は細胞接着の増加と関連する
Asn残基は、特に次にGlyが続く場合、生理的なpHで非酵素的にアミド分解され得ることがよく知られている(Robinson及びRobinson、2001; Robinsonら、2004; Stephenson及びClarke, 1989; Tyler-Cross及びSchirch, 1991)。L-立体配置が優位であるにも関わらず、この反応はAsp又はisoAsp、L-Asp (LD)、L-isoAsp(LisoD)、D-Asp(DD)、及びD-isoAsp(DisoD)の形成を導く(Geiger及びClarke, 1987)。そのため、FN-I5、CNGRC-TNF及びCNGRCペプチドの分子量は熱処理後、約1 Da増加することが質量分析解析によりわかった。さらに、CNGRC-TNFのisoAsp分析では、熱処理後に0.5 pmolを超えるisoAsp/molのCNGRC-TNFサブユニットの存在が示された。
【０２２２】
熱処理後に増強されたFN-I5の接着特性がNGRのアミド分解に依存したかどうかを評価するために、「熱処理した」FN-I5及びCNGRC-TNFを、プロテインL-isoAsp及びD-Asp残基をL-Aspへ転換する酵素であるプロテイン-L-isoAsp/D-Asp-O-メチルトランスフェラーゼ(PIMT)とともに、インキュベートした(Aswad, 1984; Gallettiら, 1988; Lowenson及びClarke, 1992; McFadden及びClarke, 1987; Murray及びClarke, 1984)。PIMTは、熱処理したFN-I5及びCNGRC-TNFの前接着活性をほぼ完全に阻害した(図4A)。そのうえ、この酵素による処理は、天然のFN-30 KDa(図4B)及びFN-45 KDa断片(データは示さず)の前接着特性を部分的に阻害した。このことは、天然のフィブロネクチン断片においてもAsnのアミド分解が生じ得ることを示す。この反応の選択性を評価するために、RGDを介して細胞接着を促進することが知られているFN断片であるレトロネクチンに対するPIMTの効果も評価した（図１参照）。予想通り、このケースでは、熱処理後に阻害は観察さなかった(図4B)。逆に、このケースでは、少量ではあるが明らかな細胞接着の増大を観察した。RGDもisoAspの形成や機能欠損を伴ってAsp残基を異性化できることから、全体としては予想できないことではなかった(Geiger及びClarke, 1987; Lanthier及びDesrosiers, 2004; Reissner及びAswad, 2003; Stephenson及びClarke, 1989)。したがって、このケースでは、PIMTはRGDを「修復」し、細胞接着を増加させることが予想される。結論として、これらの結果はRGDの異性化とは対照的に、NGRのアミド分解は細胞接着アッセイにおいて「機能の獲得」と関連することを示す。
【０２２３】
[実施例４]NGRアミド分解の反応速度
NGRの安定性、並びにpH 7.3(DMEM)及びpH 8.5(重炭酸アンモニウム)でのLisoDGR又はDDGR形成の反応速度をその後調べた。この目的のため、CNGRCGVRYペプチド(NGR-pepと呼ぶ)を合成し、37℃でインキュベーションする前後に逆相HPLCで解析した。カラム吸着できるように、残基GVRYをCNGRCのC-末端に付加した。さらに、Nの代わりにそれぞれD、D-D、L-isoD、D-isoD及びSが存在すること以外は、NGR-prepと同一配列に相当するDGR-pep、D-DGR-pep、isoDGR-pep、D-isoDGR及びSGR-pepと呼ばれる5種類のペプチドを、調製した。主なクロマトグラフピーク(ピーク1)の高さから見積もったNGR-pepのpH 7.3及び8.5での半減期は、それぞれ約4及び2時間であった(図5Aの挿入図)。アミド分解生成物に相当するペプチドは、これらの条件下で安定であった(図5B)。
【０２２４】
ピークの同定のために、また、測定された半減期が他の構造変化でによるものではなく、Asnのアミド分解に相当することを立証するために、新鮮なNGR-pep又はDGR-pep又はisoDGR-pepペプチドをスパイクし熱処理したNGR-prepペプチドを分析した。この結果から、NGR-pepのインキュベーション後に観察したピーク1、2及び3は、それぞれNGR-pep、DGR-pep及isoDGR-pepペプチドに対応することがわかった。注目すべきことに、NGR-pepは水中で保存した場合、1週間を超えて37℃で安定であった。
【０２２５】
[実施例５]αvβ3はDisoDGR及びDDGRモチーフの受容体である
熱処置したFN-I5、CNGRC-TNF及び短いペプチドと、精製したαvβ3、αvβ5、α5β1及びα1β1インテグリンとの結合を、その後、マイクロタイタープレート上に吸着したインテグリンを用いた直接かつ競合的なEILSAにより調べた。
【０２２６】
全ての（熱処理した）NGR含有分子についてαvβ3との結合を観察したが、他のインテグリンとの結合については、ほんのわずかであるか、又は全く観察されなかった（図6A及びB)。熱処理したTNFとの結合やコントロールCARAC-TNF1-11ペプチドとの結合は観察されず(図6A及びB）、NGRが重要であることが示唆された。注目すべきは、おそらくは調製及び/又はアッセイインキュベーションの過程で生じるアミド分解のために、程度は低いが、熱処理前であってもCNGRC-TNFとαvβ3の結合を観察したことである（データは示さず）。
【０２２７】
インテグリン結合についてFN-I5のNGRループの重要性を検証するために、組換えFN-I4-5及びFN-I4-5SGS(NGRを含まない)を用いて競合的結合実験を行った。予想どおり、NGRを有する断片のみが、FN-I5がαvβ3と結合するのと競合することができた(図6C)。結合の競合は、FN-I5の256-271ループ全体に相当するペプチド（図1C参照）でも観察されたが、GNGRG部位のスクランブル配列を有するコントロールペプチドでは観察されなかった（図6C）。
【０２２８】
したがって、この結合はDDGR-pep及びisoDGR-pep (EC50:0.1μM)及び熱処理したFN-I5(EC50:0.4μM)と効果的に競合するが、DisoDGR-pep又はDGR-pep、NGR-pep、SGR-pep (EC50 :10μMを超える)との効果的な競合は少ない(図7)。
【０２２９】
isoDGR-pep又はDDGR-pepペプチドはこのアッセイ条件下で安定であることを考慮すると、これらの結果はisoDGR-pep又はDDGR-pepがαvβ3の新しいリガンドの原動力となることを示唆する。
【０２３０】
[実施例６]FN-I5におけるインテグリン結合部位形成の反応速度
FN-I5におけるインテグリン結合部位の反応速度を調べるために、37℃、DMEM中で異なる時間をかけてインキュベートした様々な用量のFN-I5を用いた競合的結合実験をさらに行った。興味深いことに、インキュベーション時間に対して阻害濃度(IC50)をプロットすると、最大の競合的結合活性にはインキュベーション開始から24-48時間後に達する(半減期3.4時間)ことを確認した(図7B)。この値は、上記のNGR-pepのアミド分解の半減期と非常によく対応しており、熱処理したFN-I5のインテグリン結合特性は実際にNGR-アミド分解と関連したという概念をさらに支持する。
【０２３１】
[実施例７]アミド分解したFN-I5断片は、マウスモデルにおいてビトロネクチンとのin vitro細胞接着及び癌増殖を阻害する
αvβ3インテグリン（ビトロネクチン受容体）は血管新生において重要な役割を果たすことがよく知られている(Hynes, 2002)。このインテグリンとECMタンパク質との相互作用を阻害可能な化合物は、血管新生及癌増殖を阻害することが知られている(Brooksら, 1994; Brooksら, 1995; Friedlanderら, 1995; Friedlanderら, 1996; Hammesら, 1996)。アミド分解したFN-I5断片は、EA.hy926細胞とビトロネクチンとの接着を阻害できることが観察された(図8A)。そのうえ、この断片をRMAリンパ腫担持マウスに毎日投与した場合、癌増殖をin vivoで顕著に阻害した(図8B)。これらの結果は、FNのアミド分解断片が細胞接着及び腫瘍生物学において役立ち得ることを示す。
【０２３２】
[実施例８]NGR-TNFのアミド分解型の単離
マウスCys-Asp-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF (DGR-TNF)及びCys-isoAsp-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF (isoDGR-TNF)を調製するために、E. coli細胞中でCys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF (NGR-TNF)をクローン化し、発現させ、この産物からアミド分解型を精製した（産生過程において自然に産生させた）。
【０２３３】
記載のとおり(Curnisら, 2000)、NGR-TNFをコードするcDNA(CNGRCGのC-末端で融合したTNFから構成される)をE.coli細胞を用いた組換えDNA技術により始めに調製し、精製した。この調製物からアミド分解型を単離するために、C-4カラム(高多孔性逆相カラム, 250×4.6 mm, Biorad)を用いた逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)によるさらなる精製ステップを次のとおり実施した。移動相A; 5％アセトニトリル水溶液を含む5 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.8）；移動相B；70％アセトニトリル水溶液を含む5 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.8）; 0％Bで10分間、30％Bで5分間、線形勾配30-65％Bで35分間、100％Bで10分間、0％Bで10分間、流速2 ml/分。溶出液は214nm及び280nmで測定した(HPLC, LC-126 nM, Beckman Coulter)。NGR-TNFのRP-HPLはF2及びF4と称される主要ピークを表し、F1及びF3と称される２つのマイナーピークを表した(図9)。これらのピークにおけるアミド分解型の存在は、これらのフラクションにおけるisoAsp量を測定することにより同定した。結果は、F2がF4よりもはるかに多くのisoAspを含むことを示した(表1)。
【０２３４】
F2及びF4をRP-HPLCにより再びクロマトグラフィーしたところ、分離後でも保持時間が変化しないことを示し、これは当該産物が安定であったことを示す。非還元SDS-PAGEのクーマシー染色では、F2及びF4産物のいずれもが17-18 kDaの主要なバンドを示し、TNF単量体であると予想された(図10挿入図)。
【０２３５】
F2及びF4の生化学的及び生物学的特性をさらに特性付けた(表1)。エレクトロスプレー質量分析解析は、F2の分子量がF4の分子量よりも1 Da大きいことを示した。さらに、F2及びF4のL-M細胞に対する細胞溶解活性は同等であった。この結果は、isoAsp含有量に関するデータと併せると、F2がNGR-TNFのアミド分解型に相当することを示す。
【０２３６】
アミド分解がN-末端CNGRCドメイン内で生じるかどうかを評価するために、Edman分解法によりN末端の配列分析を実施した(データは示さない)。その結果から、Asn2の代わりにAsp2を検出したことから、アミド分解がN-末端で生じたことを確認した。このこと及び上記データは、F2がisoDGR-TNF(75％)及びDGR-TNFの混合物であり、２位にイソアスパルチル残基及びアスパルチル残基を有することを示している。
【０２３７】
その後、F2のin vivo抗癌特性を、RMAリンパ腫モデルを用いて調べた。動物実験は、San Raffaele H Scientific Instituteの倫理委員会の承認を得て、規定のガイドラインに従い実施した。体重16〜18 gのC57BL/6マウス(Charles River Laboratories, Calco, Italy)に対し、7×104のRMA生細胞を左脇腹に皮下注射してチャレンジした。10日後、マウスを0、25又は100 pgのF2 (100μl)で処理し、続いて2時間後、メルファラン(Glaxo Welcome Operations, Dartford, Great Britain) (100μl中50μg)を投与した。全ての薬剤を100μg/mlのエンドトキシンを含まないヒト血清アルブミン(Farma-Biagini SpA, Lucca, Italy)を含む0.9％塩化ナトリウムで希釈し、腹腔内投与した。癌増殖は、前記のとおり、ノギスで腫瘍を測定することにより毎日モニターした。動物は、腫瘍が直径1.0〜1.3 cmに達する前に犠牲にした。腫瘍サイズは平均±SEとして示す(5動物/群)。
【０２３８】
この結果は、非常に低用量(25 pg)のF2がメルファランと併用投与された場合に、抗癌効果を誘導することができることを示した(図11)。 
[実施例９]NGR-TNFの0.1 M重炭酸アンモニウム緩衝液処理によるisoDGR-TNF/DGR-TNFの調製
緩衝液の組成、イオン強度、pH及び温度は、Asn残基のアミド分解/異性化の割合を増加させることができる。したがって、F2(iDGR-TNF/DGR-TNF)の迅速調製法を開発するために、NGR-TNFを0.1 M重炭酸アンモニウム緩衝液（pH 8.5）で希釈し、37℃で様々な時間インキュベートした。熱処理したNGR-TNFをRP-HPLCにより分析した。図12は、当該処理後にF4が急速にF2へ変換されたことを示す。特に、処理後4時間では細胞溶解活性が失われておらず、この工程をisoDGR-TNF/DGR-TNFを産生するのに利用することができることを示している。
【０２３９】
[実施例１０]組換えDNA技術によるDGR-TNFの調製
DGR-TNF（CDGRCGのC末端で融合したマウスTNF）をコードするcDNAを、次のプライマーを用いてNGR-TNFプラスミド上でPCRにより取得した:
5’ CACCATGTGCGACGGCCGTTGCGGC 3’ (5’プライマー);
5’ CTGGATCCTCACAGAGCAATGATCCCAAAG ’3 (3’プライマー)。プライマーは両方とも、pET101/D-TOPOプラスミド発現キット(Invitrogen)で、ディレクショナルクローニングできるように設計した。5'プライマー内の下線部の配列は、ディレクショナルクローニングを可能とするために必要な配列及び3’プライマーが終止コドン（下線部）を含む場合の翻訳開始コドンを含む。PCR反応及びクローニング手順は、製造業者の指示書が薦めるとおりに実施した。DGR-TNF cDNAをBL21(DE3) E.coli細胞(Novagen)内で発現させ、可溶性p75-TNF受容体-セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞抽出物から次のとおり精製した。すなわち、購入可能な組換えp75-TNF受容体(Embrel)10 mgと、2.5 mlの活性化-CH-セファロース(Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany)とを製造業者の指示書のとおりに結合させた。カラムを100 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で十分に洗浄し、DGR-TNF粗抽出液をローディングし、2 mM EDTA(pH 8.0)を含む20 mM Tris-HCl緩衝液で希釈し、7 M尿素、100 mM Tris-HCl（pH 8.0）を含む溶出液で脱着させた。DGR-TNFをその後、引用文献(1)に記載のとおり再ホールディングした。簡潔にいうと、変性した産物を2.33 M尿素、100 mM Tris-HCl(pH 8.0)に対し4℃で140分間透析し、次に1.55 M尿素、100 mM Tris-HCl(pH 8.0)で140分間透析し、さらに1 M尿素、100 mM Tris-HCl(pH 8)で140分間透析した。最終的に、該産物は100 mM Tris-HCl(pH 8.0)に対して48時間透析した。該産物は、13000×gで遠心分離し(10分間、4℃)、10 KDaカットオフ濾紙を通して限外濾過により濃縮した。精製及び再ホールディングステップで用いた全ての溶液は、滅菌したエンドトキシンを含まない水(S.A.L.F. Laboratorio Farmacologico SpA, Bergamo, Italy)を用いて調製した。タンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイ試薬(Pierce, Rockford, Illinois)を用いて測定した。タンパク質の純度及び同一性は、SDS-PAGE、エレクトロスプレー質量分析(ESI-MS)及び分析用ゲル濾過クロマトグラフィーにより確認した。この結果は、産物を同定して確認した（データは示していない）。DGR-TNFのin vitro細胞溶解活性(2.5×108 U/mg)をL-Mマウス線維芽細胞を用いる標準的細胞溶解アッセイにより測定した。
【０２４０】
DGR-TNFのRP-HPLCは、この保持時間がNGR-TNFから得られたF2のものと類似していることを示した(図13)。
【表１】
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【０２４１】
上記明細書で述べた全ての刊行物は、引用により本明細書に取り込まれるものとする。本発明に記載の方法や系（システム）について、本発明の範囲と思想から逸脱しない範囲で、様々な変形及び変更が可能であることは、当業者にとって明らかである。本発明は、特に好ましい実施形態に関連して説明されているが、請求される本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと理解されるべきである。実際に、本発明を実施するために記載された、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者には自明である形態の様々な変形が、特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０２４２】
参考文献
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【０２４３】
2008525424.tif 000006
【０２４４】
2008525424.tif 000007
【０２４５】
2008525424.tif 000008
【０２４６】
2008525424.tif 000009
【０２４７】
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【０２４８】
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【０２４９】
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【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】フィブロネクチン断片の概略図、三次元構造及び１次配列。(A)各断片及びフィブロネクチンサブユニットにおける反復を模式的に示す: I型反復(長方形);II型反復(楕円形);III型反復(正方形)。NGR及びRGD配列を含んでなるモジュールを示す。カテプシン(FN-70 KDa)又はカテプシン-トリプシン(FN-45及びFN-30 KDa)を用いたタンパク質分解により得られた天然の断片を模式的に示す。レトロネクチン、組換えFN-I4-5断片、及び合成FN-I5も示す。(B)FN-I4-5(タンパク質データバンクコード: 1FBR.pdb)の三次元PDB構造。NGRモチーフの側鎖(Asn263、Gly264及びArg265)を示す。(C)合成FN-I5及びループ-GNGRG及びループ-RGGNGペプチドの１次配列、及びFN-I7及びループ-GNGRGペプチド(「方法」を参照)。
【図２】天然のフィブロネクチン断片の細胞接着を促進する特性。天然のタンパク質分解断片(FN-70 KDa、FN-45 KDa及びFN-30 KDa)で被覆されたマイクロタイタープレートは、内皮EA.hy926細胞の接着を促進する。
【図３】FN断片の促進老化は、前接着特性を増強する。促進老化の前後でのEA.hy926細胞の、様々なペプチド及びタンパク質で被覆したマイクロタイタープレート上の接着。促進老化は、0.1 M重炭酸アンモニウム緩衝液（pH 8.5）中で、37℃で16時間インキュベーション(「熱処理」)することにより実施した。組換えFN-I4-5又はコントロールタンパク質(FN-I4-5 (SGS)) (A)、合成FN-I5 (B)、組換えNGR-TNF、CNGRCG-TNF1-11 及びコントロールCARACG-TNF1-11ペプチド(C)、DGR-TNF(D)に接着させた。熱処置した(37℃)及び未処理の(-20℃)産物は、マイクロタイターウェルのプラスチック表面上に吸着させた（4℃で一晩)。30μg/mlの熱処置したFN-I5若しくはBSA(Bの右)、又は10μg/mlの組換えNGR-TNF若しくはDGR-TNF(Cの右)で被覆されたウェルの顕微鏡写真（200倍）。細胞接着アッセイを「材料及び方法」の欄に記載のとおり行った。
【図４】FN断片の前接着特性は、PIMTにより阻害される。マイクロタイタープレートは、熱処置したFN-I5若しくはNGR-TNF(A)、又は天然のFN-30 KDa、FN-45 KDa若しくはレトロネクチン(RN)(B)で被覆した。吸着されたタンパク質はその後、37℃で、16時間PIMT酵素で処理した。インキュベーション後、酵素溶液は洗浄により除去した。EA.hy926細胞接着アッセイをその後、「材料及び方法」の欄に記載のとおり行った。
【図５】NGR、DGR及びisoDGRモチーフの安定性。37℃で4時間、0.1 M重炭酸アンモニウム緩衝液（pH 8.5）(A及びB)中、及びDMEM（pH 7.3）(A, 挿入図)中でインキュベーションした前後の、NGR-pep及びその合成アミド分解生成物(DGR-pep及びisoDGR-pep)のRP-HPLC分析。RP-HPLCをC-18カラム(PepMap C18, PerSeptive Biosystem）上で次のとおり行った: 緩衝液A, 0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液; 緩衝液B, 95％アセトニトリル、0.1％ TFA; 0％ Bで10分間、線形勾配20-40％ Bで30分間、100％ Bで10分間; 0％ Bで15分間(流速0.5 ml/分)。ピーク1、2及び3は、表示のペプチド(C)と等量で２時間インキュベーションした後、NGR-pepを固定(spiking)することにより確認した。NGR-pep (ピーク1)は、急速にDGR-pep(ピーク2)及びisoDGR-pep(ピーク3) (半減期2〜4時間)に相当する化合物に転換する。
【図６】促進老化後にαvβ3インテグリンと結合したNGRモチーフを含むFN-I5及びペプチド。(A)熱処置したCNGRC-TNF及びTNFと、精製したヒトインテグリンで被覆された固相との結合。単一濃度(5μg/ml)又は様々な濃度(挿入図)のCNGRC-TNF及びTNFを使用した。結合は、「材料及び方法」の欄に記載のとおり、抗TNF抗体を用いて検出した。(B)ビオチン化したCNGRC-TNF1-11、CARAC-TNF1-11及びFN-I5(ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼで複合体化した)と精製したヒトインテグリンとの結合。結合は、o-フェニレンジアミンを用いた発色性反応により検出した。(C) αvβ3で被覆したプレートに対する、熱処理の前後での様々な量のFN-I4-5若しくはFN-I4-5SGS(上のパネル)又はFN-I5のNGRループ(残基258-271)に対応するペプチド(下のパネル)と、ビオチン化FN-I5/ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体との競合的結合。
【図７】αvβ3に対するNGR-TNFとNGR-prepの競合的結合、及びαvβ3に対するそのアミド分解生成物の競合的結合。ビオチン化NGR-TNF (4μg/ml)を表示した様々な量のペプチドと混合し、さらにαvβ3で被覆されたプレートに添加し、材料及び方法の欄に記載のとおり結合を検出した。IC50は非線形勾配分析によりGraphPad Prism softwareを用いて測定した。FN-I5のアミド分解の反応速度は、インキュベーション時間に対し阻害濃度(IC50)をプロットすることにより決定した。棒はそれぞれ定量したIC50の信頼区間を表す。
【図８】アミド分解したFN-I5断片は、ビトロネクチンのin vitro細胞接着及びマウスモデルにおける癌増殖を阻害する。(A) EA.hy926細胞のビトロネクチンへの接着の熱処置したFN-I5による阻害。ビトロネクチン(3μg/ml)をマイクロタイタープレートに吸着させ、細胞接着アッセイを材料及び方法の欄に記載のとおり行った。(B)「熱処理した」FN-I5をRMA-腫瘍担持マウスに反復投与した場合の抗癌効果。動物(5匹/群)は、「熱処置した」FN-I5 (腹腔内投与)200μgを用いて、腫瘍移植の4日後から開始して表示の時間(矢印)に処置された。* p=0.0003：14日目、２テールド(two tailed)t-検定による統計解析。
【図９】NGR-TNFのRP-HPLC分析。NGR-TNFのRP-HPLCは、２つの主要ピークF2及びF4、並びに２つのマイナーピークF1及びF3を示した。これらのピークにおけるアミド分解型の存在は、これらのフラクションにおけるisoAspの量を測定することにより同定した。結果は、F2がF4よりもはるかに多くのisoAspを含むことを示した。
【図１０】F2及びF4のRP-HPLC及びSDS-PAGE。A) F2及びF4のRP-HPLCによる再クロマトグラフィーは、分離後でも保持時間が変化しないことを示した。B) 非還元SDS-PAGEのクーマシー染色では、F2及びF4産物の両方において、TNF単量体であると予想される17-18 kDaの主要なバンドを示した。
【図１１】RMAリンパ腫モデルにおけるF2の抗癌活性。２つの実験を実施した（実験１及び実験２)。体重16〜18 gのC57BL/6マウス(Charles River Laboratories, Calco, Italy)に対し、7×104のRMA生細胞を左脇腹に皮下注射してチャレンジした。10日後、マウスを0、25又は100 pgのF2(100μl)で処理し、続いて2時間後メルファランを投与(100μl中50μg）した。腫瘍サイズは、平均±SE(5動物/群)として示す。
【図１２】様々な時間で37℃、重炭酸アンモニウム（pH 8.5）中で処理した後のNGR-TNFのRP-HPLC。NGR-TNFを0.1 M重炭酸アンモニウム緩衝液（pH 8.5）で希釈し、さらに37℃で様々な時間インキュベートした。熱処置したNGR-TNFをRP-HPLCにより解析した。
【図１３】組換えDGR-TNFとNGR-TNFのRP-HPLC(A)及びSDS-PAGE(B)。
【図１４】アスパラギンのアミド分解。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月22日(2007.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
NGRモチーフを含むペプチドのアミド分解生成物を含み、αvβ3インテグリンを阻害するペプチド。
【請求項２】
NGRモチーフを含むペプチドのアミド分解生成物を含み、内皮細胞がビトロネクチンと接着するのを阻害するペプチド。
【請求項３】
細胞外マトリックスタンパク質又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含むペプチド。
【請求項４】
フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン又はラミニン又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
フィブロネクチンのFN-I5、FN-I7、FN-II1若しくはFN-III9モジュール、又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
配列XNGRX’を含むペプチドのアミド分解生成物を含むペプチドであって、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される前記ペプチド。
【請求項７】
CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, CVLNGRMEC, CNGRC, CNGRCG, LNGRE, YNGRT, LQCICTGNGRGEWKCE, LQCISTGNGRGEWKCE, CICTGNGRGEWKC, CISTGNGRGEWKC, MRCTCVGNGRGEWTCY, MRCTSVGNGRGEWTCY CTCVGNGRGEWTC及びCTSVGNGRGEWTCから選択される配列を含んでなるペプチドのアミド分解生成物を含むペプチド。
【請求項８】
シクロCVLNGRMEC、線状CNGRC、環状CNGRC、線状CNGRCG又は環状CNGRCGを含んでなるペプチドのアミド分解生成物を含む、請求項７記載のペプチド。
【請求項９】
NGRモチーフ又は細胞外マトリックスタンパク質又はそれらの断片若しくは誘導体を含んでなるペプチドの熱処理により入手しうる、請求項１〜８のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項１０】
isoDGRモチーフを含むペプチド。
【請求項１１】
配列XisoDGRX’を含み、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
CisoDGRCVSGCAGRC, isoDGRAHA, GisoDGRG, CVLisoDGRMEC, CisoDGRC, CisoDGRCG, LisoDGRE, YisoDGRT, LQCICTGisoDGRGEWKCE, LQCISTGisoDGRGEWKCE, CICTGisoDGRGEWKC, CISTGisoDGRGEWKC, MRCTCVGisoDGRGEWTCY, MRCTSVGisoDGRGEWTCY, CTCVGisoDGRGEWTC又はCTSVGisoDGRGEWTCから選択される配列を含む、請求項１０又は１１記載のペプチド。
【請求項１３】
シクロCVLisoDGRMEC、線状CisoDGRC、環状CisoDGRC、線状CisoDGRCG又は環状CisoDGRCGを含む、請求項１２記載のペプチド。
【請求項１４】
isoDGRがLisoDGRである、請求項１０〜１３のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項１５】
DDGRモチーフを含むペプチド。
【請求項１６】
配列XDDGRX’を含み、XはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される、請求項１５記載のペプチド。
【請求項１７】
CDDGRCVSGCAGRC, DDGRAHA, GDDGRG, CVLDDGRMEC, CDDGRC, CDDGRCG, LDDGRE, YDDGRT, LQCICTGDDGRGEWKCE, LQCISTGDDGRGEWKCE, CICTGDDGRGEWKC, CISTGDDGRGEWKC, MRCTCVGDDGRGEWTCY, MRCTSVGDDGRGEWTCY, CTCVGDDGRGEWTC及びCTSVGDDGRGEWTCから選択される配列を含む、請求項１５又は１６記載のペプチド。
【請求項１８】
シクロCVLDDGRMEC、線状CDDGRC、環状CDDGRC、線状CDDGRCG又は環状CDDGRCGから選択される配列を含む、請求項１７記載のペプチド。
【請求項１９】
細胞外マトリックスタンパク質又はその断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項１０〜１８記載のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項２０】
フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン又はラミニン又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項１９記載のペプチド。
【請求項２１】
フィブロネクチンのFN-I5、FN-I7、FN-II1若しくはFN-III9モジュール又はそれらの断片若しくは誘導体のアミド分解生成物を含む、請求項２０記載のペプチド。
【請求項２２】
癌増殖を阻害する、請求項１〜２１のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項２３】
血管新生を阻害する、請求項１〜２２のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項２４】
さらなる治療薬を含まない、請求項１〜２３のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項２５】
さらなる治療薬が抗癌ペプチドである、請求項２４記載のペプチド。
【請求項２６】
さらなる治療薬がサイトカインである、請求項２４又は２５記載のペプチド。
【請求項２７】
DGRモチーフのG及びR残基を含むターンを含む、請求項１〜２６のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項２８】
最大で350のアミノ酸を含む、請求項１〜２７のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項２９】
NGRモチーフを含むペプチドの代謝により形成された場合以外のペプチドである、請求項１〜２８のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項記載のペプチド及び薬剤、サイトカイン、サイトカイン断片、毒素、アポトーシス性ペプチド、生物反応修飾剤、放射性核種、ウイルス粒子、遺伝子又は造影化合物を含む複合生成物。
【請求項３１】
有効量の請求項１〜２９のいずれか1項記載のペプチド又は請求項３０記載の複合生成物を含む医薬組成物。
【請求項３２】
製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を共に含む、請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
対応するNGRモチーフを有するペプチドを本質的に含まない、請求項３１又は３２記載の組成物。
【請求項３４】
請求項１〜２９のいずれか1項に記載のペプチドとサイトカインとの複合生成物。
【請求項３５】
サイトカインと、NGRモチーフのアミド分解生成物を含む標的部分との複合生成物。
【請求項３６】
サイトカインと、DGRモチーフを含む標的部分との複合生成物。
【請求項３７】
DGR がisoDGRである、請求項３６記載の複合生成物。
【請求項３８】
DGR がDDGRである、請求項３６記載の複合生成物。
【請求項３９】
DGR がLisoDGRである、請求項３６記載の複合生成物。
【請求項４０】
標的部分が配列XDGRX’を含み、ここでXはL、V、A、C、G、Y、P、H、K、Q及びIからなる群から選択され、X’はC、G、H、L、E、T、Q、R、S及びPからなる群から選択される、請求項３５〜３９のいずれか１項記載の複合生成物。
【請求項４１】
標的部分がCDGRCVSGCAGRC, DGRAHA, GDGRG, CVLDGRMEC, CDGRC, CDGRCG, LDGRE, YDGRT, LQCICTGDGRGEWKCE, LQCISTGDGRGEWKCE, CICTGDGRGEWKC, CISTGDGRGEWKC, MRCTCVGDGRGEWTCY, MRCTSVGDGRGEWTCY, CTCVGDGRGEWTC又はCTSVGDGRGEWTCから選択される、請求項３５〜４０のいずれか１項記載の複合生成物。
【請求項４２】
標的部分がシクロCVLDGRMEC、線状CDGRC、環状CDGRC、線状CDGRCG及び環状CDGRCGから選択される、請求項４１記載の複合生成物。
【請求項４３】
サイトカインがポリエチレングリコール又はアシル基で誘導体化される、請求項３４〜４２のいずれか１項記載の複合生成物。
【請求項４４】
サイトカインが抗体、抗体フラグメント及びビオチンからなる群から選択される化合物とさらに結合し、前記抗体又はそのフラグメントが腫瘍抗原、腫瘍血管新生マーカー又は細胞外マトリックス成分からなる群から選択される化合物に対するものである、請求項３４〜４３のいずれか１項記載の複合生成物。
【請求項４５】
サイトカインがTNFであり、かつ、標的部分並びに、抗体及び抗体フラグメント及びビオチンからなる群から選択される化合物の両方と結合している、請求項４４記載の複合生成物。
【請求項４６】
NGRモチーフを含むペプチドの代謝によりin vivoで形成された場合以外のものである、請求項３４〜４５のいずれか１項記載の複合生成物。
【請求項４７】
サイトカインがスペーサーを介してペプチド又は標的部分と結合している、請求項３４〜４６のいずれか１項記載の複合生成物。
【請求項４８】
スペーサーがグリシン(G)である、請求項４７記載の複合生成物。
【請求項４９】
サイトカインがTNF、IFNγ、IL-12、IP-10、IL-7又はEMAP IIである、請求項３４〜４８のいずれか1項記載の複合生成物。
【請求項５０】
サイトカインがTNF又はIFNγである、請求項３４〜４８のいずれか1項記載の複合生成物。
【請求項５１】
サイトカインがTNFである、請求項５０記載の複合生成物。
【請求項５２】
サイトカインがTNFα又はTNFβである、請求項５１記載の複合生成物。
【請求項５３】
有効量の請求項３４〜５２のいずれか１項記載の複合生成物と、製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を共に含む医薬組成物。
【請求項５４】
TNFと請求項１〜３０のいずれか１項記載のペプチドとの有効量の複合生成物、及び有効量のIFNγ又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項５５】
有効量の請求項５１又は５２記載の複合生成物、及び有効量のIFNγ又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項５６】
注射用溶液もしくは懸濁液又は注入用液体の形態である、請求項３１〜３３又は５３〜５５のいずれか1項記載の組成物。
【請求項５７】
リポソームの形態である、請求項３１〜３３又は５３〜５６のいずれか1項記載の組成物。
【請求項５８】
別の抗癌剤又は腫瘍診断用造影化合物をさらに含む、請求項３１〜３３又は５３〜５７のいずれか1項記載の組成物。
【請求項５９】
別の抗癌剤がドキソルビシン、メルファラン、シスプラチン、ゲムシタビン、又はタキソールである、請求項５８記載の組成物。
【請求項６０】
αvβ3が関与する障害に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、請求項１〜２９のいずれか１項記載のペプチド、請求項３０若しくは３４〜５２のいずれか1項記載の複合生成物、又は請求項３１〜３３若しくは５３〜５９のいずれか1項記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項６１】
骨粗しょう症、関節炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性、再発狭窄症又は血管腫に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、請求項１〜２９のいずれか１項記載のペプチド、請求項３０若しくは３４〜５２のいずれか1項記載の複合生成物、又は請求項３１〜３３若しくは５３〜５９のいずれか1項記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項６２】
癌に罹患した患者を治療又は診断する方法であって、請求項１〜２９のいずれか１項記載のペプチド、請求項３０若しくは３４〜５２のいずれか1項記載の複合生成物、又は請求項３１〜３３若しくは５３〜５９のいずれか1項記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項６３】
癌が固形癌を含む、請求項６２記載の方法。
【国際調査報告】
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