(57)【要約】【解決手段】  本発明は、アルファ−葉酸レセプターと特異的に結合する新規モノクローナル抗体に関連するものである。一部の実施形態において、前記抗体は葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）の生物活性を阻害するものである。前記抗体は、特定の癌、特に卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、若しくは脳腫瘍などの、アルファ−葉酸レセプター（"ＦＲ−α"）の細胞表面の発現が増加した癌の治療に有益である。前記発明はまた、モノクローナル抗体、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体などの抗体派生物、抗体断片を発現する細胞、及び抗体、派生物、及び断片を使用して癌を検出及び治療する方法に関連するものである。【選択図】      図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する精製された抗体。
【請求項２】
請求項１の抗体において、前記抗体は、ＦＲ−αの生物活性を阻止するものである。
【請求項３】
請求項１の抗体において、前記抗体は、ＦＲ−α産生細胞の抗体依存性細胞傷害を誘導するものである。
【請求項４】
請求項１の抗体において、前記抗体の親和力は、少なくとも約１×１０−７Ｍである。
【請求項５】
請求項１の抗体であって、この抗体は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を含む重鎖を有するものである。
【請求項６】
請求項１の抗体であって、この抗体は、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有するものである。
【請求項７】
請求項５の抗体であって、この抗体は、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有するものである。
【請求項８】
請求項１の抗体において、前記抗体は、細胞毒性物質と結合されるものである。
【請求項９】
請求項１の抗体を発現する細胞。
【請求項１０】
葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体を発現する細胞において、前記細胞は、ＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しないものである細胞。
【請求項１１】
葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドであって、前記重鎖は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を有するものであるポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１のポリヌクレオチドにおいて、このポリヌクレオチドは、配列ＩＤ番号７の核酸配列を有するものである。
【請求項１３】
葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドにおいて、前記軽鎖は、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を有するものであるポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３のポリヌクレオチドであって、このポリヌクレオチドは、配列ＩＤ番号８の核酸配列を有するものである。
【請求項１５】
ＦＲ−αと特異的に結合する抗体の軽鎖をさらにコードする請求項１１のポリヌクレオチドにおいて、前記軽鎖は、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を有するものである。
【請求項１６】
請求項１５のポリヌクレオチドであって、このポリヌクレオチドは、配列ＩＤ番号８の核酸配列を有するものである。
【請求項１７】
葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを有するベクターにおいて、前記重鎖は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を有するものであるベクター。
【請求項１８】
葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを有するベクターにおいて、前記軽鎖は、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を有するものであるベクター。
【請求項１９】
葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドにおいて、前記重鎖は配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を有するものであるポリヌクレオチドと、葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドにおいて、前記軽鎖は配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を有するものであるポリヌクレオチドとを有するベクター。
【請求項２０】
請求項１５のポリヌクレオチドを有するベクター。
【請求項２１】
葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドにおいて、前記重鎖は配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を有するものであるポリヌクレオチドと、葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを有する発現細胞において、前記軽鎖は配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を有するものであるポリヌクレオチドとを有する発現細胞。
【請求項２２】
葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体の重鎖と、葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドとを有する発現細胞において、前記重鎖は配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を有するものであり、前記軽鎖は配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を有するものである発現細胞。
【請求項２３】
請求項１７のベクターを有する発現細胞。
【請求項２４】
請求項１８のベクターを有する発現細胞。
【請求項２５】
請求項１９のベクターを有する発現細胞。
【請求項２６】
請求項２０のベクターを有する発現細胞。
【請求項２７】
葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体を有する薬剤組成物において、前記組成物は、ＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しないものである薬剤組成物。
【請求項２８】
請求項２７の薬剤組成物において、前記抗体は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を含む重鎖を有するものである。
【請求項２９】
請求項２７の薬剤組成物において、前記抗体は、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有するものである。
【請求項３０】
請求項２７の薬剤組成物において、前記抗体は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有するものである。
【請求項３１】
請求項２７の薬剤組成物において、前記抗体は、ＦＲ−αの生物活性を阻止するものである。
【請求項３２】
請求項２７の薬剤組成物において、前記抗体のＦＲ−αに対する結合親和力は、少なくとも約１×１０−７Ｍである。
【請求項３３】
請求項２７の薬剤組成物において、この薬剤組成物はさらに、細胞毒性物質を有するものである。
【請求項３４】
請求項３３の薬剤組成物において、前記抗体は、前記細胞毒性物質と結合されるものである。
【請求項３５】
請求項２７の薬剤組成物において、この薬剤組成物はさらに、抗葉酸複合体を有するものである。
【請求項３６】
葉酸レセプター−αと特異的に結合する抗体を産生する方法であって、この方法は、請求項２３の細胞を培養する工程を有するものである。
【請求項３７】
葉酸レセプター−αと特異的に結合する抗体を産生する方法であって、この方法は、請求項２４の細胞を培養する工程を有するものである。
【請求項３８】
葉酸レセプター−αと特異的に結合する抗体を産生する方法であって、この方法は、請求項２５の細胞を培養する工程を有するものである。
【請求項３９】
葉酸レセプター−αと特異的に結合する抗体を産生する方法であって、この方法は、請求項２６の細胞を培養する工程を有するものである。
【請求項４０】
葉酸レセプター−αと特異的に結合する抗体を産生する方法であって、この方法は、請求項９の細胞を培養する工程を有するものである。
【請求項４１】
葉酸レセプター−αと特異的に結合する抗体を産生する方法であって、この方法は、請求項１０の細胞を培養する工程を有するものである。
【請求項４２】
抗体産生細胞を作り出す方法であって、前記方法は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列をコードする核酸配列と、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列とを有する細胞のミスマッチ修復を阻害する工程と、葉酸レセプター−アルファ（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体を産生する細胞を選択する工程とを有するものであり、前記細胞によって産生された実質的に全ての抗体は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有するものである方法。
【請求項４３】
請求項４２の方法において、前記ミスマッチ修復を阻害する工程は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブな阻害物質を前記細胞に導入する工程を有するものである。
【請求項４４】
請求項４２の方法において、前記細胞は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する前記抗体を少なくとも約９０重量％有する抗体を産生するものである。
【請求項４５】
請求項４２の方法において、この方法はさらに、前記細胞の遺伝的安定性を回復する工程を有するものである。
【請求項４６】
請求項４２の方法に従って産生した細胞。
【請求項４７】
葉酸レセプター−αと特異的に結合する抗体を産生する方法であって、この方法は、請求項４６の細胞を培養する工程を有するものである。
【請求項４８】
葉酸レセプター−アルファ（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体を発現し、更にＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しない細胞を作り出す方法であって、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む細胞のミスマッチ修復を阻害する工程と、少なくとも約１×１０−７Ｍの結合親和力を有する葉酸レセプターアルファ（ＦＲ−α）と特異的に結合する抗体を発現する細胞を選択する工程とを有する方法。
【請求項４９】
請求項４８の方法において、前記ミスマッチ修復を阻害する工程は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブな阻害物質を前記細胞に導入する工程有するものである。
【請求項５０】
請求項４８の方法において、この方法はさらに、前記細胞の遺伝的安定性を回復する工程を有するものである。
【請求項５１】
請求項４８の方法に従って産生した細胞。
【請求項５２】
葉酸レセプター−αと特異的に結合する抗体を産生する方法であって、請求項５１の細胞を培養する工程を有する方法。
【請求項５３】
ＦＲ−αの増加した発現と関連する異型細胞の成長を阻害する方法であって、この方法は、請求項２７の薬剤組成物をそのような異型細胞を保持する患者に投与する工程を有するものである。
【請求項５４】
請求項５３の方法において、前記異型細胞は、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、若しくは脳腫瘍細胞である。
【請求項５５】
請求項５３の方法において、前記異型細胞は、卵巣癌細胞である。
【請求項５６】
請求項５３の方法において、前記患者は、ヒトの患者である。
【請求項５７】
請求項５３の方法において、前記薬剤組成物は、少なくとも１つの細胞毒性物質を含むものである。
【請求項５８】
請求項５７の方法において、前記細胞毒性物質は、前記薬剤組成物の抗体と結合されるものである。
【請求項５９】
請求項５３の方法において、この方法はさらに、前記患者に抗葉酸化合物を投与する工程を有するものである。
【請求項６０】
その表面に葉酸レセプター−アルファ（ＦＲ−α）が存在する異型細胞を検出する方法であって、前記細胞をＦＲ−αと特異的に結合する抗体と接触させる工程と、前記抗体の前記細胞への結合を確定する工程とを有する方法。
【請求項６１】
請求項６０の方法において、前記抗体は、前記ＦＲ−αの生物活性を阻止するものである。
【請求項６２】
請求項６０の方法において、前記抗体は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を有する重鎖を有するものである。
【請求項６３】
請求項６０の方法において、前記抗体は、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖を有するものである。
【請求項６４】
請求項６０の方法において、前記抗体は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を有する重鎖と配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有するものである。
【請求項６５】
請求項６０の方法において、前記細胞に前記抗体を接触させる前記工程は、ＦＲ−α結合競合物がない時に生じるものである。
【請求項６６】
請求項６０の方法において、前記癌細胞は、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、若しくは脳腫瘍細胞である。
【請求項６７】
請求項６０の方法において、前記癌細胞は、卵巣癌細胞である。
【請求項６８】
請求項６０の方法において、前記抗体は、検出可能な標識で標識化されたものである。
【請求項６９】
請求項６０の方法であって、この方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記癌細胞を検出する工程を有するものである。
【請求項７０】
請求項６０の方法であって、この方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで前記癌細胞を検出する工程を有するものである。
【請求項７１】
葉酸レセプター−α（ＦＲ−α）の増強された発現と関連する異型細胞の成長を阻害する方法であって、ＦＲ−αと特異的に結合する抗体を含む組成物を前記異型細胞を保持した患者に投与する工程を有する方法。
【請求項７２】
請求項７１の方法において、前記抗体は、ＦＲ−α産生細胞上のＦＲ−αの生物活性を阻止するものである。
【請求項７３】
請求項７１の方法において、前記組成物は、ＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しないものである。
【請求項７４】
請求項７１の方法において、前記抗体は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を含む重鎖を有するものである。
【請求項７５】
請求項７１の方法において、前記抗体は、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有するものである。
【請求項７６】
請求項７１の方法において、前記抗体は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列含む重鎖と、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有するものである。
【請求項７７】
請求項７１の方法において、前記異型細胞は、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、若しくは脳腫瘍細胞である。
【請求項７８】
請求項７１の方法において、前記異型細胞は、卵巣癌細胞である。
【請求項７９】
請求項７１の方法において、前記患者は、ヒトの患者である。
【請求項８０】
請求項７１の方法において、前記抗体は、細胞毒性物質と結合するものである。
【請求項８１】
請求項７１の方法において、前記患者はさらに、少なくとも１つの抗葉酸化合物を投与されるものである。
【請求項８２】
癌を有する患者を治療する方法であって、この方法は、前記患者に請求項２７の薬剤組成物を投与する工程を有するものである。
【請求項８３】
請求項８１の方法において、前記癌は、上皮性癌である。
【請求項８４】
請求項８１の方法において、前記癌は、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、若しくは脳腫瘍細胞である。
【請求項８５】
請求項８１の方法において、前記癌は、卵巣癌である。
【請求項８６】
請求項８１の方法において、前記患者は、ヒトの患者である。
【請求項８７】
請求項８１の方法において、前記薬剤組成物は、少なくとも１つの細胞毒性物質を含むものである。
【請求項８８】
請求項８７の方法において、前記細胞毒性物質は、前記薬剤組成物の抗体と結合するものである。
【請求項８９】
請求項８１の方法であって、この方法はさらに、前記患者に抗葉酸複合体を投与する工程を有するものである。
【請求項９０】
請求項８１の方法において、前記薬剤組成物は、前記抗葉酸複合体を有するものである。
【請求項９１】
キットであって、葉酸レセプター−アルファ（ＦＲ−α）と特異的に結合し、さらにＦＲ−αの生物活性を阻止する抗体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年２月１２日に出願された米国仮出願第６０／５４４，３６４号に対して優先権を主張しており、その全体の開示は、この参照により本明細書に組み込まれるものである。
【０００２】
本発明は、アルファ−葉酸レセプター（"ＦＲ−α"）と特異的に結合する精製された新規モノクローナル抗体及びその組成物に関連するものである。一部の実施形態において、本発明の抗体は、ＦＲ−αの生物活性を阻止する。本発明の抗体及び組成物は、特定の癌、特に卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、若しくは脳腫瘍など、アルファ−葉酸レセプターの細胞表面の発現が増強した癌の治療に有益である。本発明はまた、モノクローナル抗体、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体などの抗体派生物、抗体断片を発現しているハイブリドーマ細胞、モノクローナル抗体、派生物及び断片を発現している哺乳類細胞、本発明の精製した抗体の組成物、及び本発明の抗体、派生物、断片、及び組成物を使用して癌を検出及び治療する方法に関連するものである。
【背景技術】
【０００３】
ヒト細胞膜葉酸結合タンパク質（ｈｕｍａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｏｌａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）には、α、β、及びγの三つの主要なアイソフォームが存在する。α及びβアイソフォームは、約７０％のアミノ酸配列の相同性を有しており、いくつかの葉酸に対するそれらの立体特異性においては劇的に異なる。正常組織は一般的に低量から中程度量のＦＲ−βを発現するが、この両アイソフォームは胎児及び成体組織で発現されている。しかし、ＦＲ−αは正常上皮細胞で発現され、多様な癌腫中で頻繁に著しく増加される（Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  ７３（９）：２４３２−２４４３；Ｒｅｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３１１０−３１１４；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５１：５３２９〜５３３８；Ｃｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５１：６１２５〜６１３２；Ｗｅｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５２：３３９６−３４０１；Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．  １４２：５５７−５６７；Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＡＰＭＩＳ  １０２：４１３−４１９；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８（Ｓｕｐｐｌ．）：８９〜９５；Ｍｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３９：２９７−３０３；及びＶｅｇｇｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｔｕｍｏｒｉ  ７５：５１０−５１３）。ＦＲ−αは、卵巣癌の９０％以上で過剰発現されている（Ｓｕｄｉｍａｃｋ  ａｎｄ  Ｌｅｅ（２０００）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４１（２）：１４７−６２）。ＦＲ−αは、一般的にＧＰＩアンカーを介して細胞膜に付着している。ＧＰＩアンカーは、オリゴ糖及びイノシトールリン脂質を含む。
【０００４】
１９８７年にＭｉｏｔｔｉらは、ヒト卵巣癌細胞上の抗原を認識する３つの新しいモノクローナル抗体を報告した（Ｍｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３９（３）：２９７〜３０３）。それらのうちの１つは、絨毛癌細胞の表面上の３８ｋＤａタンパク質を認識するＭＯｖ１８と名付けられた。ＭＯｖ１８はマウスＩｇＧ１カッパー抗体であり、卵巣癌細胞株のＩＧＲＯＶ１の特異的細胞溶解を媒介する。Ａｌｂｅｒｔｉら（（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７１（３）：１０５１−１０５５）は、ＭＯｖ１８によって認識された抗原はＧＰＩ連結性タンパク質であったことを示した。その後、これはヒト葉酸結合タンパク質として同定された（Ｃｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１（２２）：６１２５−６１３２）。Ｔｏｍａｓｓｅｔｔｉらは、ＭＯｖ１８はＩＧＲＯＶ１細胞中で葉酸結合タンパク質の可溶型及びＧＰＩアンカー型を認識することを示した（Ｔｏｍａｓｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１７（１〜２）：１４３−１４６）。その後の研究によって、キメラ化ＭＯｖ１８抗体を作り出すために、マウスＭＯｖ１８の可変領域とヒトＩｇＧ１（カッパー）の定常領域を組み合わした。前記キメラ化抗体は、１０〜１００倍低い抗体濃度で高水準及びより特異的なＩＧＲＯＶ１細胞の溶解を媒介した（Ｃｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４（９）：２４４８〜２４５５）。３８ｋＤａ抗原は、ＦＲ−αの単量体型であるように思われる。
【０００５】
米国特許第５，９５２，４８４号公報は、３８ｋＤａタンパク質（ＦＲ−α）と結合するヒト化抗体を記載している。前記抗体はＬＫ２６と名付けられた。最初のマウスモノクローナル抗体は欧州特許出願第８６１０４１７０．５号（欧州特許第０１９７４３５号として公開され、米国特許第４，８５１，３３２号公報として米国で交付された）にＲｅｔｔｉｎｇによって記載された。
【０００６】
卵巣癌は、婦人科悪性腫瘍の理由から主な死亡原因である。化学療法は推奨された治療法であり、いくつかの成功を享受しているが、５年生存率は未だに４０％以下である。
【０００７】
癌の抗体治療における困難な問題は、多くの場合、抗体の標的が癌組織と同様に正常組織によっても発現されていることである。従って、癌細胞を死滅させるために使用された抗体は正常細胞にも悪影響を及ぼす。特異な標的若しくは癌組織で選択的に発現する標的を見つけることは、困難であることが多くの癌で証明されている。選択的に発現する標的及びそのような標的の生物活性を阻止する能力の同定は、癌治療に効果的である可能性がある。そのようなものとして、卵巣癌及び他のＦＲ−が関連する癌のための、正常組織との反応性をなくす若しくは最小化する、より効果的な抗体治療が必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一部の実施形態において、本発明は、ＦＲ−αと特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、好ましくはＦＲ−αの生物活性を阻止する。一部の実施形態において、本発明は、抗体産生細胞及びＦＲ−αと特異的に結合する抗体の組成物を提供し、前記細胞及び組成物は、実質的にＦＲ−α結合競合物を含まない。一部の実施形態において、実質的に本発明の抗体を含む抗体を産生する抗体産生細胞が提供される。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍ、さらに最も好ましくは少なくとも約１×１０−１０Ｍの結合親和力でＦＲ−αと結合する。
【０００９】
ＦＲ−αを過剰発現している腫瘍は、例えば四量体のようなＦＲ−αの多量体型の形成を助ける傾向にあることが発見されている。いかなる特定の理論によっても束縛されることなく、ＦＲ−αの多量体型の形成は、腫瘍細胞表面上においてより多量なＦＲ−αが蓄積されるために、質量効果によって促進される。以前は、他の研究者らが、それらの疎水性尾部を介してＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ミセルに挿入されたＦＲ−αを表したゲルろ過アッセイでにおいて、ＦＲ−αのより高分子量の種を発見したのみである（Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ１７（４）：４１５−４２７）。一部の実施形態において、本発明は、ＦＲ−αの多量体型と特異的に結合し、単量体型とは結合しない抗体を提供する。
【００１０】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、（ａ）抗体ＬＫ２６によって結合したエピトープ以外のＦＲ−αのエピトープと結合し、（ｂ）抗体ＬＫ２６よりも高い親和力でＦＲ−αと結合し、（ｃ）ＦＲ−αの多量体型と結合するために抗体ＬＫ２６と競合し、その結果ＦＲ−αの生物活性を阻止し、及び／若しくは、（ｄ）ＬＫ２６に対して精製される。
【００１１】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、ジスルフィド依存エピトープを認識する。
【００１２】
本発明の一部の実施形態において、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体と関連する。一部の実施形態において、前記重鎖は配列ＩＤ番号６のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
一部の実施形態において、本発明の抗体は配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。本発明の一部の実施形態において、前記抗体は配列ＩＤ番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。
【００１４】
本発明はさらに、配列ＩＤ番号５若しくは配列ＩＤ番号６のアミノ酸配列を含む重鎖及び、配列ＩＤ番号２若しくは配列ＩＤ番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体を提供する。本発明の抗体は、好ましくは配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を含む重鎖及び、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有し、より好ましくは配列ＩＤ番号６のアミノ酸配列を含む重鎖及び、配列ＩＤ番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。本発明の一部の実施形態において、前記抗体の重鎖は、配列ＩＤ番号７のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされている。本発明の一部の実施形態において、前記抗体の軽鎖は、配列ＩＤ番号８のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされている。
【００１５】
本発明の抗体は、これに限られるものではないが、ヒト−マウスキメラ抗体を含むキメラ抗体であっても良い。本発明の抗体はまた、ヒト化抗体である可能性がある。本発明はまた、ハイブリドーマ細胞を含む本発明の抗体を発現する細胞、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、本発明をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のベクターを含む発現細胞を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＦＲ−αと特異的に結合する抗体を産生する方法を提供する。一部の実施形態において、前記方法は、本発明の抗体産生細胞を培養する工程を有する。本発明の細胞は昆虫細胞若しくは動物細胞、好ましくは哺乳類細胞であっても良い。
【００１７】
本発明はさらに、異型細胞を持つ患者に本発明の抗体を含む組成物を投与することを有するＦＲ−αの発現増加に伴う異型細胞の成長を阻害する方法を提供する。前記抗体は、好ましくはＦＲ−αの生物活性を阻止する。前記方法は、これに限られるものではないが、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、若しくは脳腫瘍などの、多様な異型症状に使用される。好ましい実施形態において、前記患者はヒトの患者である。一部の実施形態において、前記抗体は、これに限られるものではないが、放射性核種、毒素、化学療法薬などの細胞毒性物質と結合する。一部の実施形態において、前記抗体は、抗葉酸剤と同時に投与される。前記抗葉酸剤及び本発明の抗体は、同時に若しくは一斉に（つまり、一緒に）或いは任意の順序で投与されても良い。
【００１８】
本発明はまた、ＦＲ−α、好ましくは哺乳類のＦＲ−αと特異的に結合するモノクローナル抗体を使用して、癌細胞の成長を減退させる方法を提供する。本発明の方法は、ヒトを含む哺乳類において、癌細胞の成長及び癌の進行を調節するために使用されても良い。阻害され得る癌細胞は、これに限られるものではないが、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、若しくは脳腫瘍など、正常ヒト組織対して増加したＦＲ−αの発現を有するすべての癌細胞を含む。
【００１９】
また、本発明によって、本発明の抗体の組成物が提供される。好ましい実施形態において、前記組成物は、実質的に純粋である。実質的に純粋な本発明の抗体の組成物は、本発明の抗体の重量に対して、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは約１００％含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書において参照される、参照研究、特許、特許出願、及びＧｅｎＢａｎｋデータベース配列の登録番号を含む科学文献は、当業者の知識を確立し、この結果、各々が具体的及び個別に参照によって組み込まれるように、それら全てが同程度に参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書において引用された任意の参照と、本明細書の具体的な教示との間においていかなる不一致があっても、後者を支持することで解決されるだろう。同様に、当技術分野で理解された単語若しくは語句の定義とこの明細書で具体的に教示された単語若しくは語句の定義との間においていかなる不一致があっても、後者を支持することで解決されるだろう。
【００２１】
当業者に知られている組換えＤＮＡ技術の一般的な原理を説明している標準的な参照研究は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  ２Ｄ  ＥＤ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬＡｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）；  Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  （１９９５）；  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｅｄ．，  ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９１）を含む。
【００２２】
本明細書において使用される"エピトープ"という用語は、モノクローナル抗体が特異的に結合する抗原の一部を指す。
【００２３】
本明細書において使用される"立体構造エピトープ"という用語は、連続した一連のアミノ酸以外の抗原のアミノ酸の間での空間的な関係によって形成された非連続のエピトープを指す。
【００２４】
本明細書において使用される"多量体"という用語は、２若しくはそれ以上の同一或いはほぼ同一の構成単位の集団を指す。ここで使用されたように、"四量体"という用語は、４つの同一或いはほぼ同一の構成単位の集団を指す。
【００２５】
本明細書において使用される"単量体"という用語は、他の構成単位と集団を組み立てる、完全なタンパク質の１個の構成単位を指す。
【００２６】
本明細書において使用される"ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける異型細胞の成長の阻害"という用語は、培養液中で少なくとも約５％、好ましくは約１０％、より好ましくは約２０％、より好ましくは約３０％、より好ましくは約４０％、より好ましくは約５０％、より好ましくは約６０％、より好ましくは約７０％、より好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、より好ましくは約９９％、最も好ましくは１００％の腫瘍細胞数が減少することを意味する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞成長の阻害は、ＧＥＯ細胞ソフトアガーアッセイなど、当技術分野で知られているアッセイによって測定される可能性がある。
【００２７】
本明細書において使用される"ｉｎ  ｖｉｖｏでの異型細胞の成長の阻害"という用語は、動物で少なくとも約５％、好ましくは約１０％、より好ましくは約２０％、より好ましくは約３０％、より好ましくは約４０％、より好ましくは約５０％、より好ましくは約６０％、より好ましくは約７０％、より好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、より好ましくは約９９％、最も好ましくは１００％の腫瘍細胞数が減少することを意味する。ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞成長の調節は、例えば、これに限られるものではないが、固形腫瘍の反応評価基準（ｔｈｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ：ＲＥＣＩＳＴ）パラメーター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍを通してオンラインで利用可能）の使用など、当技術分野で知られるアッセイによって測定される可能性がある。
【００２８】
本明細書において使用される"異型細胞"という用語は、これに限られるものではないが、軟寒天（ｓｏｆｔ  ａｇａｒ）中における成長、接触阻害の欠如、無血清での細胞周期休止の失敗、及び免疫不全マウスに注射したときの腫瘍の形成など、異常な成長特性を示す細胞を指す。異型細胞は、これに限られるものではないが、腫瘍、過形成、及び類似のものを含む。
【００２９】
"抑制"という用語は、生物が異常な病気に罹る若しくは進展する可能性を減少させることを指す。
【００３０】
"治療"という用語は、治療効果を有し、さらに生物の異常な病気を少なくとも部分的に軽減する若しくは排除することを指す。治療は、腫瘍成長の阻害、阻害された腫瘍成長の維持、及び回復の誘導を含む。
【００３１】
"治療効果"という用語は、異常な病気の阻害を指す。治療効果は、異常な状態の１若しくはそれ以上の症状をある程度軽減する。異常な症状の治療に関して、治療効果は、次の１若しくはそれ以上を指しても良い。（ａ）細胞の増殖、成長、及び／若しくは分化の増加若しくは減少、（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍細胞の成長の阻害（即ち、遅延若しくは停止）、（ｃ）細胞死の促進、（ｄ）変性の阻害、（ｅ）異常な症状に伴う１若しくはそれ以上の症状をある程度軽減すること、及び（ｆ）細胞の集団の作用を増強すること。本明細書において記述されたモノクローナル抗体及びその派生物は、単独で、若しくは本発明の組成物の複合体或いは付加された成分と組み合わせて治療効果を達成する。
【００３２】
本明細書において使用される"癌の進行を阻害する"という用語は、未処理癌細胞の末期疾患に向かうことを調節すること関連して、末期の癌に向かう腫瘍性疾患の調節を遅らせる治療活動を指す。
【００３３】
本明細書において使用される"ＦＲ−αの生物活性を阻止する"とは、葉酸のＦＲ−αへの結合の阻止、細胞による葉酸の吸収を阻止、若しくは葉酸によって引き起こされる細胞のシグナル伝達を阻害する本発明の抗体（若しくはその断片）の能力を指す。
【００３４】
本明細書において使用される"約"という用語は、許容範囲内での規定値の近似値を指す。好ましくは、前記範囲は、規定値の＋／−５％である。
【００３５】
本明細書において使用される"腫瘍性疾患"という用語は、組織の細胞の異常増殖によって特徴付けられた状態を指す。
【００３６】
本明細書において使用される"野生型"という用語は、例えば、本発明の抗体の重鎖若しくは軽鎖の天然のコード化核酸配列若しくはアミノ酸配列のような天然配列を指す。本発明の野生型配列の例は、配列ＩＤ番号１〜８の配列を含む。
【００３７】
本明細書において使用される"ＦＲ−α結合競合物"という用語は、本発明の抗体をコードする核酸の異常な転写、及び本発明の抗ＦＲ−α抗体の生物学的特性（例えば、抗原結合親和力、ＦＲ−αの生物活性を阻止する能力）を有さない本発明の抗体の異常な転写産物を指す。例えば、異常な転写は、欠失、フレームシフト、ナンセンス突然変異、若しくはミスセンス突然変異を含む。異常な転写産物の例は、選択的スプライス変異であっても良い。ＦＲ−α結合競合物の例は、配列ＩＤ番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗体である。
【００３８】
【化１】
2008500025.tif 000003
【００３９】
前記ＦＲ−α結合競合物の軽鎖は、配列ＩＤ番号２５の核酸配列を有する核酸によってコードされている。
【００４０】
【化２】
2008500025.tif 000004
【００４１】
本明細書において使用される"精製した"という用語は、"実質的に純粋な"形態で存在するために、天然では結び付くであろう他のタンパク質若しくは核酸から十分に分離している状態を意味する。"精製した"とは他の化合物若しくは物質との人工或いは合成混合物、又は、例えば、不完全な精製、安定剤の添加、若しくは例えば免疫原性製剤或いは薬剤的に容認された製剤中の配合剤などによって存在する可能性がある基礎活性を妨害しない不純物の存在を除外することを意味してはいない。"精製した"抗体は、好ましくはＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しない抗体を意味する。"実質的に純粋な"という用語は、任意の物質（例えば、核酸、タンパク質など）の重量に対して少なくとも約５０〜６０％含むことを意味する。より好ましくは、前記製剤は、任意化合物の重量に対して少なくとも約７５％を含み、最も好ましくは、任意化合物の重量に対して約９０〜９５％含むものである。純度は任意物質にふさわしい方法によって測定される（例えば、クロマトグラフ法、アガロース若しくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣアッセイ、及び類似のもの）。
【００４２】
本明細書において使用される"ＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しない"という用語は、ＦＲ−α結合競合物の重量に対して約５０％以下、より好ましくは約４０％以下、より好ましくは約３０％以下、より好ましくは約２０％以下、より好ましくは約１０％以下、より好ましくは約５％以下、より好ましくは約１％以下、より好ましくは約０．５％以下、及び最も好ましくは約０％を有する状態を指す。
【００４３】
抗体
本発明の抗体は、葉酸レセプター−アルファ（ＦＲ−α）と特異的に結合する。一部の実施形態において、本発明の抗体は、ＦＲ−αの単量体型と特異的に結合する。一部の実施形態において、本発明の抗体は、ＦＲ−αの多量体型（例えば、四量体型）と特異的に結合し、ＦＲ−αの単量体型と結合しない。本発明の好ましい抗体は、ＦＲ−αの生物活性を阻止する。好ましい実施形態において、前記抗体は、ＦＲ−αを持った細胞上のＦＲ−αの生物活性を阻止する。本発明の抗体は、好ましくはＦＲ−αを持った細胞の抗体依存性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）を誘導する。ＦＲ−αを持った細胞の例は、これに限られるものではないが、卵巣癌、乳癌、脳腫瘍、腎臓癌、大腸癌、子宮体癌細胞を含むものである。
【００４４】
好ましい抗体及び本発明の方法の使用に適した抗体は、例えば、完全ヒト抗体、ヒト抗体ホモログ、ヒト化抗体ホモログ、キメラ抗体ホモログ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦ（ｖ）抗体断片、１本鎖抗体、及び抗体重鎖或いは軽鎖のモノマー若しくはダイマー、又はその混合物を含む。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００４５】
本発明の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（そのサブタイプも同様）型を含む任意のアイソタイプの無傷の免疫グロブリンを含むものであっても良い。前記抗体は、好ましくは無傷のＩｇＧ、及びより好ましくはＩｇＧ１を含む。前記免疫グロブリンの軽鎖は、カッパー若しくはラムダであっても良い。前記軽鎖は好ましくはカッパーである。
【００４６】
本発明の抗体は、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ｖ）断片、重鎖モノマー若しくはダイマー、軽鎖モノマー若しくはダイマー、１つの重鎖及び１つの軽鎖から成るダイマー、及び類似のものなど、抗原結合特異性を保持している無傷の抗体の部分を含む。従って、抗原結合断片は、上述の抗体由来の完全長二量体若しくは三量体ポリペプチドと同様に、それ自体で有益である。
【００４７】
"キメラ抗体"は、免疫グロブリンの軽鎖、重鎖、若しくは両方のヒンジ及び定常領域の全体若しくは一部が、他の動物免疫グロブリンの軽鎖若しくは重鎖からの対応する領域と置換される、組換えＤＮＡ技術によって産生された抗体である。この方法において、もとのモノクローナル抗体の抗原結合部位は、他種の抗体の基幹に移植される。欧州特許第ＥＰ０２３９４００号に記載されたＷｉｎｔｅｒらのある取り組みは、例えばヒトの重鎖及び軽鎖免疫グロブリンの可変領域ドメインからのＣＤＲｓをマウスの可変領域ドメインからのＣＤＲｓへと置換するように、ある種の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を他種のものへと置換することを記載している。このように変化した抗体は、続いて、ヒト免疫グロブリンの定常領域と結合し、抗原に得意的である置換されたマウスＣＤＲｓを除いてはヒトである抗体を形成する。抗体のＣＤＲ領域を移植する方法は、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６において見出される。
【００４８】
ヒトの治療物質としてのげっ歯類のモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）の直接的な使用によって、げっ歯類由来の抗体を用いて治療したかなりの数の患者において生じるヒト抗げっ歯類抗体（"ＨＡＲＡ"）（例えば、ヒト抗マウス抗体（"ＨＡＭＡ"））反応をもたらした（Ｋｈａｚａｅｉ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５：４２−５２）。少量のマウスアミノ酸配列を含むキメラ抗体は、ヒトで免疫反応を誘発するという問題を回避すると信じられている。
【００４９】
ＨＡＲＡ反応の問題を回避するために抗体を改良したことによって、"ヒト化抗体"の開発に至った。ヒト化抗体は、抗原結合に要求されないヒト免疫グロブリンの軽鎖若しくは重鎖の少なくとも１つのアミノ酸が、ヒト以外の哺乳類の免疫グロブリンの軽鎖若しくは重鎖からの対応するアミノ酸と置換される、組換えＤＮＡ技術によって産生される。例えば、前記免疫グロブリンがマウスのモノクローナル抗体の場合、抗原結合に要求されない少なくとも１つのアミノ酸は、その位置の対応するヒト抗体上に存在するアミノ酸を使用して置換される。いかなる特定の動作理論によっても束縛されることなく、モノクローナル抗体の"ヒト化"によって、異質の免疫グロブリン分子に対するヒト免疫グロブリン反応性を阻害すると考えられている。
【００５０】
限定しない例として、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植を実施する方法は、標的抗原（例えば、ＦＲ−α）と結合する目的の抗体のマウスの重鎖及び軽鎖の配列を決定すること、ＣＤＲのＤＮＡ配列を遺伝子操作をすること、及び部位特異的突然変異誘発法によって対応するヒトＶ領域にそれらのアミノ酸配列を与えることによって実施される可能性がある。好ましいアイソタイプのヒトの定常領域の遺伝子断片が付加され、さらに"ヒト化"重鎖及び軽鎖遺伝子が哺乳類細胞において共発現され、可溶性ヒト化抗体を産生する。標準的な発現細胞は、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞である。キメラ抗体を作り出す適切な方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３〜３２７；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１００２９；及びＯｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：３８３３などにおいて見出される可能性がある。
【００５１】
Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３及び国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号は、ヒト化抗体の調製を記載している。ヒト及びマウスの可変フレームワーク領域が、最適のタンパク質の配列ホモロジーに選ばれた。マウスの可変領域の三次構造をコンピュータでモデル化し、相同ヒトフレームワークの上に重ねることによって、アミノ酸残基とマウスＣＤＲｓとの最適な相互作用を示した。これは、（ＣＤＲが移植されたキメラ抗体を作る上で一般的に減少する）抗原に対する改善された結合親和力を有する抗体の進歩をもたらした。ヒト化抗体を作る別の取り組みは、当技術分野で知られており、例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔ（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１に記載されている。
【００５２】
"１本鎖抗体"は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖断片が操作されたアミノ酸の全長を介してＦｖ領域と繋がる組換えＤＮＡ技術によって形成された抗体を指す。１本鎖抗体を作り出す多様な方法が知られており、米国特許第４，６９４，７７８号公報；Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４４２；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４５４；Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８〜１０４１に記載されているものを含む。
【００５３】
本発明の抗体は、単独若しくは細胞毒性物質との免疫複合体として使用されても良い。一部の実施形態において、前記薬剤は化学療法薬である。一部の実施形態において、前記物質は、これに限られるものではないが、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１、及びホウ素−１０若しくはアクチニドなどの核分裂性核種を含む放射性同位体である。他の実施形態において、前記物質は、これに限られるものではないが、リシン、改変シュードモナスエンテロトキシンＡ、カリケアマイシン、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、及び類似のものを含む、毒性若しくは細胞毒性の薬物である。そのような物質に対して抗体及び抗体断片を複合させる方法は、文献において知られている。
【００５４】
本発明の抗体は、例えば、共有結合が前記抗体のそのエピトープに対する結合の妨げにならないように、前記抗体への任意のタイプの分子の共有結合によって改変された派生物を含む。適切な派生物の例は、これに限られるものではないが、フコシル化抗体及び断片、グリコシル化抗体及び断片、アセチル化抗体及び断片、ペグ化抗体及び断片、リン酸化抗体及び断片、及びアミド化抗体及び断片を含む。本発明の抗体とその派生物は、既知の保護／封鎖基、タンパク質分解的切断、細胞のリガンド若しくは他のタンパク質との結合、及び類似のものによってそれら自体が誘導体化されても良い。本発明の一部の実施形態において、前記抗体の少なくとも１つの重鎖はフコシル化されている。一部の実施形態において、前記フコシル化はＮ連結性である。いくつかの好ましい実施形態において、前記抗体の少なくとも１つの重鎖はフコシル化されたＮ連結性オリゴ糖を含む。
【００５５】
本発明の抗体は、本発明の抗体の生物学的な特性（例えば、ＦＲ−αの生物活性の阻止、結合親和力）を残している１若しくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、若しくは交換を有する変異体を含む。当業者であれば、１若しくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、若しくは交換を有する変異体を産生できる。それらの変異体は、とりわけ（ａ）１若しくはそれ以上のアミノ酸残基が保存若しくは非保存アミノ酸と置換される変異体、（ｂ）１若しくはそれ以上のアミノ酸がポリペプチドに付加される若しくはポリペプチドから取り除かれる変異体、（ｃ）１若しくはそれ以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、及び（ｄ）前記ポリペプチドが融合パートナー、タンパク質タグ、若しくは他の化学的部分などの、他のペプチド若しくはポリペプチドと融合し、それは例えば、抗体のためのエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分、及び類似のものなどポリペプチドに対して有益な特性を与える変異体である。本発明の抗体は、１つの種からのアミノ酸残基が保存若しくは非保存部位のどちらかにおいて他種の対応する残基と置換される変異体を含む。他の実施形態において、非保存部位のアミノ酸残基は、保存若しくは非保存残基と置換される。遺伝的（抑制、欠失、突然変異など）、化学的、及び酵素技術を含む、このような変異体を得るための技術は、当業者に知られている。本発明の抗体は抗体断片も含む。"断片"は、好ましくは少なくとも約４０、より好ましくは少なくとも約５０、より好ましくは少なくとも約６０、より好ましくは少なくとも約７０、より好ましくは少なくとも約８０、より好ましくは少なくとも約９０、及びより好ましくは少なくとも約１００のアミノ酸の長さであり、さらに例えば、ＦＲ−αの生物学的活性及び／若しくはＦＲ−α結合親和力を阻止する能力など、完全長配列の一部の生物活性若しくは免疫学的活性を残しているポリペプチド配列を指す。
【００５６】
本発明はまた、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、若しくは脳腫瘍患者の末梢血単核細胞由来の抗体などの完全ヒト抗体も包含する。そのような細胞は、例えばＦＲ−αに対する完全ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を形成するために、ミエローマ細胞と融合されても良い。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体は、配列ＩＤ番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。
【００５８】
【化３】
2008500025.tif 000005
【００５９】
一部の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。
【００６０】
【化４】
2008500025.tif 000006
【００６１】
一部の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列ＩＤ番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。
【００６２】
【化５】
2008500025.tif 000007
【００６３】
配列ＩＤ番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体もまた、本発明の範囲内である。
【００６４】
【化６】
2008500025.tif 000008
【００６５】
本発明の一部の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を含む重鎖を有する。
【００６６】
【化７】
2008500025.tif 000009
【００６７】
本発明の一部の好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖は、配列ＩＤ番号６のアミノ酸配列を含む。
【００６８】
【化８】
2008500025.tif 000010
【００６９】
本発明の一部の実施形態において、前記抗体は、配列ＩＤ番号４、５、若しくは６のアミノ酸配を含む重鎖、及び配列ＩＤ番号１、２、若しくは３のアミノ酸配を含む軽鎖を有する。より好ましい実施形態において、前記抗体は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。本発明の一部の実施形態において、前記抗体は、配列ＩＤ番号６のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列ＩＤ番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。
【００７０】
本発明の抗体は、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ毒性研究で実証されているように、好ましくは非毒性である。
【００７１】
本発明の抗体及びその派生物は、１×１０−２以下の解離定数（Ｋｄ）を含む結合親和力を有する。一部の実施形態において、Ｋｄは１×１０−３以下である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−４以下である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−５以下である。さらに他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−６以下である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−７以下である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−８以下である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−９以下である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−１０以下である。さらに他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−１１以下である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−１２以下である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−１３以下である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−１４以下である。さらに他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−１５以下である。
【００７２】
いかなる特定の理論によっても束縛されることなく、本発明の一部の実施形態の抗体は、前記抗体の両"腕"（Ｆａｂ断片）が多量体を構成する個々のＦＲ−α分子と結合するときに、前記抗体の増加した結合力のためにＦＲ−αの多量体型の結合において特に有益である。これは抗体の解離（Ｋｄ）の減少、及び実際の親和力の全体的な増加を導く。
【００７３】
核酸
本発明はまた、本発明の抗ＦＲ−α抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖をコードする核酸を含む。本明細書において使用される"核酸"若しくは"核酸分子"は、１本鎖若しくは２本鎖のどちらかの任意のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子を指し、さらに１本鎖の場合、直線状若しくは環状のどちらかの形態のその相補配列の分子を指す。核酸分子を議論する場合、特定の核酸分子の配列若しくは構造は、５’から３’方向において配列が提供されるという通常の約束事に従って本明細書において記載される可能性がある。本発明の一部の実施形態において、核酸は"単離"されている。この用語はＤＮＡに適用される場合、その由来生物の自然発生的なゲノムの中で直接的に接触している配列から分離したＤＮＡ分子を指す。例えば、"単離された核酸"は、プラスミド若しくはウイルスベクターのようなベクターに挿入された、又は原核の若しくは真核の細胞或いは宿主生物のゲノムＤＮＡの中に組み込まれたＤＮＡ分子を含んでも良い。ＲＮＡに適用する場合、"単離された核酸"という用語は、上記に定義されるように単離されたＤＮＡ分子によってコードされたＲＮＡ分子を主に指す。また、前記用語は、その自然状態（即ち細胞若しくは組織中）においては関連する他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子を指す。単離された核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡのどちらか）はさらに、生物学的若しくは人工的手法によって直接産生された分子、及びその産生物の間に存在する他の成分から分離した分子を意味するものであっても良い。
【００７４】
本発明の核酸は、本発明の核酸に対して少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、及び最も好ましくは少なくとも約９８％のホモロジーを有する核酸を含む。特定の配列を参照する場合の"類似パーセント"、"同一パーセント"、及び"ホモロジーパーセント"という用語は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐｒｏｇｒａｍにおいて記載されているように使用される。本発明の核酸はまた、相補的核酸も含む。一部の例において、前記配列は、整列させた場合には完全に相補的（不一致なく）である。他の例において、前記配列において最大約２０％の不一致がある可能性がある。
【００７５】
本発明の核酸はまた、本発明の核酸の断片も含む。"断片"は、好ましくは少なくとも約１０核酸の長さ、より好ましくは約４０核酸、最も好ましくは約１００核酸の長さの核酸配列を指す。"断片"はまた、１若しくはそれ以上の欠失、挿入、若しくは置換を含む少なくとも約１００の連続ヌクレオチドの伸展を意味する可能性がある。"断片"はまた、遺伝子の暗号配列全体を意味し、５’及び３’非翻訳領域を含むものであっても良い。
【００７６】
コードされた抗体の軽鎖は、好ましくは配列ＩＤ番号１、２、若しくは３のアミノ酸配列を含む。コードされた抗体の重鎖は、好ましくは配列ＩＤ番号４、５、若しくは６のアミノ酸配列を含む。本発明の一部の実施形態において、抗体の重鎖は配列ＩＤ番号７のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【００７７】
【化９】
2008500025.tif 000011
【００７８】
本発明の一部の実施形態において、抗葉酸レセプター−α抗体の軽鎖は配列ＩＤ番号８の核酸配列によってコードされる。
【００７９】
【化１０】
2008500025.tif 000012
【００８０】
本発明の一部の実施形態において、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖の両方をコードする核酸配列が提供される。例えば、本発明の核酸は、配列ＩＤ番号１、２、若しくは３のアミノ酸配列をコードする核酸配列、及び配列ＩＤ４、５、若しくは６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【００８１】
本発明の核酸はベクターにクローン化され得るものである。"ベクター"は、他のゲノム配列若しくは分子（ＤＮＡ若しくはＲＮＡのどちらか）が、加えられた配列若しくは分子の複製をもたらすために挿入されるプラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、人工の染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ）、若しくはウイルスのようなレプリコンである。"レプリコン"は、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、人工の染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ）、若しくはウイルスなど、任意の遺伝的分子であり、主として自らの制御下で複製する能力を持つ。レプリコンはＲＮＡ若しくはＤＮＡのどちらかであっても良く、１本鎖若しくは２本鎖であっても良い。一部の実施形態において、発現ベクターは、構成的に活性なプロモーター部分（これに限られるものではないが、例えばＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子、若しくはＬＴＲ配列など）、若しくは例えばステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの核酸の発現が調節できる誘導性プロモーター配列を含み、前記核酸の発現は制御され得るものである。本発明の発現ベクターはさらに、例えば内部リボソーム侵入部位のような調節配列を含む。前記発現ベクターは、例えばトランスフェクションによって細胞内に導入される。
【００８２】
ＦＲ−αの抗体産生方法
本発明はまた、ＦＲ−αと特異的に結合するモノクローナル抗体の産生方法も提供する。本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される。ＦＲ−αに対する抗体を作り出す１つの計画は、ＦＲ−αの免疫動物を含む。一部の実施形態において、動物はＦＲ−αの単量体型若しくは多量体型の免疫を持つ。そのような免疫を持つ動物はタンパク質に対する抗体を産生するものである。標準的な方法は、これに限られるものではないが、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｉｅｒ  &  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７参照）；トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ，Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，１９８５，ｐｐ．７７−９６参照）を含むモノクローナル抗体の開発で知られている。
【００８３】
ＦＲ−αは、細胞から、若しくはタンパク質の単離及び精製に対する様々な既存技術を使用した組換えシステムから精製される得るものである。例えば、これらの方法に限られるものではないが、ＦＲ−αは、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、前記タンパク質をメンブレン上にブロットすることによって、前記タンパク質の見かけ上の分子量に基づいて単離され得るものである。その後、ＦＲ−αと一致する適切な大きさのバンドは、メンブレンから切り取られ、免疫原として動物に直接、若しくは前記メンブレンからのタンパク質の第一抽出或いは溶出によって使用され得るものである。別の例として、前記タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）のみによって、若しくは他の単離及び精製方法の組み合わせによって単離され得るものである。
【００８４】
本発明はまた、ＦＲ−αの多量体型に特異的に結合するモノクローナル抗体の産生方法を提供する。例えば四量体などの多量体のＦＲ−αは、細胞から、若しくはタンパク質の単離及び精製に対する様々な既知技術を使用した組換えシステムから単離され得るものである。例えば、これらの方法に限られるものではないが、多量体のＦＲ−αは、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、前記タンパク質をメンブレン上にブロットすることによって、前記タンパク質の見かけ上の分子量に基づいて単離され得るものである。その後、ＦＲ−αと一致する適切な大きさのバンドは、前記メンブレンから切り取られ、免疫原として動物に直接、若しくはメンブレンからのタンパク質の第一抽出或いは溶出によって使用され得るものである。別の例として、前記タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーのみによって、若しくは他の単離及び精製方法の組み合わせによって単離され得るものである。
【００８５】
他の精製方法が、Ｚｏｌａ，  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ    ＡＮＤ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳ  （ＢＡＳＩＣＳ：  ＦＲＯＭ  ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ  ＴＯ  ＢＥＮＣＨ）  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｌｔｄ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２０００；  ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１，  "Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，"  Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｂｅｔｈｅｌｌ，  Ｅｄｓ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００；  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  （ＳＰＲＩＮＧＥＲ  ＬＡＢ  ＭＡＮＵＡＬ．），  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，  Ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ２００１などの標準的な参照文章で利用できる。
【００８６】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体精製に関しては、動物は一般的にＦＲ−α若しくはＦＲ−αの免疫原タンパク質で免疫性を与えられる。この抗原は一般的に免疫原性を促進させるためにアジュバントと組み合わされる。アジュバントは免疫化に使用される種に従って変化する。アジュバントの例は、これらに限られるものではないが、フロイントの完全アジュバント（"ＦＣＡ"）、フロイントの不完全アジュバント（"ＦＩＡ"）、鉱物性のゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌ）、多価陰イオン）、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン（"ＫＬＨ"）、ジニトロフェノール（"ＤＮＰ"）、及びカルメット−ゲラン桿菌（"ＢＣＧ"）とコリネバクテリウムパルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）のような潜在的に有益なヒトアジュバントを含む。このようなアジュバントもまた当技術分野で周知である。
【００８７】
免疫化は、既知手段を使うことで達成される。用法及び抗体化法が、その免疫状態、体重、及び／若しくは計算された表面積など、免疫化された動物の種に依存する。通常、血清は免疫哺乳類からサンプリングされ、例えば下記のように適切なスクリーニングアッセイを使用して抗ＦＲ−α抗体の測定が行われる。
【００８８】
ヒト化抗体を産生する共通の方法は、ＭＡｂ（げっ歯類の宿主を免疫化することによって産生される）由来のＣＤＲ配列のヒトＩｇ基幹への移植、及びＣＨＯ細胞によって分泌される機能的Ａｂを次々に産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）対立遺伝子ゲン特異的ヒスタミンの放出を阻害する抗ＩｇＥモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ＩｇＥ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．）  Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０７：４１２−４１３）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へのキメラ遺伝子のトランスフェクションである。本出願に記載されている方法がまた、Ｉｇ遺伝子での遺伝子変化を起こさせること、若しくはげっ歯類の細胞株、植物、酵母及び原核生物などの宿主細胞に導入されたキメラＩｇに有益である（Ｆｒｉｇｅｒｉｏ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  植物の混合免疫グロブリンの集合、分泌、及び液胞輸送（Ａｓｓｅｍｂｌｙ，  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｖａｃｕｏｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２３：１４８３−１４９４）。
【００８９】
免疫動物由来の脾細胞は、脾細胞（抗体産生Ｂ細胞を含む）をミエローマ株のような不死化細胞株と融合させることによって不死化され得るものである。一般的に、ミエローマ細胞株は脾細胞ドナーと同種由来である。ある実施形態において、不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地（"ＨＡＴ培地"）に感受性である。一部の実施形態において、前記ミエローマ細胞は、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）感染に陰性である。好ましい実施形態において、前記ミエローマ細胞は、ＨＡＴ感受性、ＥＢＶ陰性、及びＩｇ発現陰性である。いかなる適切なミエローマであっても使用され得る。マウスハイブリドーマはマウスミエローマ細胞株（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１，  Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、若しくはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ株）を使用して作られ得る。それらのマウスミエローマ株が、ＡＴＣＣから利用できる。このようなミエローマ細胞は、ドナー脾細胞のポリエチレングリコール（"ＰＥＧ"）、好ましくは分子量１５００のポリエチレングリコール（"ＰＥＧ１５００"）と融合される。融合の結果生じたハイブリドーマ細胞は、未融合及び非生産的に融合したミエローマ細胞を死滅させるＨＡＴ培地で選抜される。未融合脾細胞が、培地内で短期間に死滅する。一部の実施形態では、前記ミエローマ細胞は、免疫グロブリン遺伝子を発現しない。
【００９０】
下記のようなスクリーニングアッセイによって検出された目的の抗体を産生するハイブリドーマは、培養若しくは動物内で抗体を産生するために使用され得るものである。例えば、前記ハイブリドーマ細胞は、前記ハイブリドーマ細胞が前記培地にモノクローナル抗体を分泌するのに十分な条件下及び十分な時間、栄養倍地中で培養され得る。このような技術及び培地は、当技術分野で周知である。また、前記ハイブリドーマ細胞は、非免疫動物の腹膜に注入され得る。前記細胞は腹膜腔で増殖し、前記抗体を分泌し、これが腹水として蓄積する。前記腹水は、モノクローナル抗体の豊富な源として注射器で腹膜腔から回収され得る。
【００９１】
ヒト抗体を産生する別の限定しない方法は、米国特許第５，７８９，６５０号公報に記述されており、不活性化された状態のそれら自らの内生免疫グロブリン遺伝子を用いて、他種（例えばヒト）の抗体を産生する遺伝子組換え哺乳類を記載している。異種の抗体の遺伝子は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされている。再編成されていない免疫グロブリンをコードしている領域を含む導入遺伝子は、ヒト以外の動物に導入される。結果として生じる遺伝子組換え動物は、遺伝子組換え免疫グロブリン配列の機能上の再編成、及びヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる多様なアイソタイプの抗体のレパートリーの産生を可能にする能力を持つ。遺伝子組換え動物由来のＢ細胞は、その後不死化細胞株（例えばミエローマ細胞）との融合を含むいかなる多様な方法によっても免疫化される。
【００９２】
ＦＲ−αに対する抗体はまた当業者に周知の多様な技術を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて調整され得る。例えば、これらの方法に限られるものではないが、ＦＲ−αに対する完全ヒトモノクローナル抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−ｐｒｉｍｅｄヒト脾細胞を使用することによって準備され得る（Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：８６−９５）。
【００９３】
また、例えば本発明の抗体は、"レパートリー・クローニング（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ）"によって準備され得る（Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：２４３２−２４３６；及びＨｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌａｒ  （１９９１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４１：２２７−２３６）。さらに、米国特許第５，７９８，２３０号公報は、エプスタイン・バー・ウイルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現するエプスタイン・バー・ウイルスの感染によって不死化されたヒトＢ抗体産生Ｂ細胞由来のヒトモノクローナル抗体の調整についてを記載する。不死化に必要なＥＢＮＡ２は、その後不活性化され、抗体力価が増大する。
【００９４】
他の実施形態において、ＦＲ−αに対する抗体は、末梢血単核細胞（"ＰＢＭＣｓ"）のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける免疫化によって形成される。これは、例えば文献（Ｚａｆｉｒｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００：１８１−１９０）に記載された方法の使用など、当業者に周知のいかなる方法によっても達成され得るものである。
【００９５】
本発明の抗体産生細胞の生成方法はまた、宿主細胞の保存されたミスマッチ修復（ＭＭＲ）工程を巧みに利用することによって、超易変抗体産生細胞を作り上げる方法も提供する。そのような遺伝子のドミナントネガティブな対立遺伝子は、細胞若しくは遺伝子組換え動物に導入された場合、ＤＮＡ修復の効果を軽減させ、その結果、前記細胞若しくは動物の超易変を提供することによって、自然突然変異の比率を増加させる。これに限られるものではないが、ハイブリドーマ、Ｉｇの軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を導入された哺乳類細胞、１本鎖抗体をコードする遺伝子を導入された哺乳類細胞、Ｉｇ遺伝子を導入された真核細胞など、抗体産生細胞におけるＭＭＲの阻止は、抗体産生が増進されたクローンを導く細胞、抗体結合の増加などの生化学的特性が増進した遺伝子操作された抗体を含む細胞、実質的に本発明の抗体のみを含む抗体を産生する細胞、及び／若しくはＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しない細胞の範囲内で、前記突然変異の比率を増進できる。ミスマッチ校正とも呼ばれるＭＭＲの工程は、細菌から哺乳類細胞に渡って、細胞のタンパク質複合体によって実行される。ＭＭＲ遺伝子は、そのようなミスマッチ修復複合体の１つのタンパク質をコードする遺伝子である。いかなる特定の作用メカニズムの理論によっても束縛されるものではないが、ＭＭＲ複合体は、ヌクレオチド塩基の非相補的な対の結果、ＤＮＡヘリックスのひずみを検出すると考えられている。新しいＤＮＡ鎖の非相補的な塩基は切り取れられ、切り取られた塩基は、古いＤＮＡ鎖と相補的な適切な塩基に置き換えられる。この方法において、細胞は、ＤＮＡ複製の誤りの結果として生じる多くの突然変異を排除する。
【００９６】
ドミナントネガティブな対立遺伝子は、同じ細胞中に野生型対立遺伝子が存在しても、ＭＭＲの不完全な表現型を引き起こす。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブな対立遺伝子の例は、コドン１３４に短縮型変異を持つヒト遺伝子ｈＰＭＳ２−１３４である。前記変異は、１３４番目のアミノ酸の位置にこの遺伝子の産生物に異常な終結を引き起こし、その結果、Ｎ末端１３３アミノ酸を含む短縮されたポリペプチドをもたらす。そのような突然変異は、ＤＮＡ複製後の細胞に蓄積する突然変異の比率の増加を引き起こす。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブな対立遺伝子の発現は、野生型対立遺伝子が存在しても、ミスマッチ修復活性の欠陥をもたらす。そのような効果を生み出すいずれの対立遺伝子がこの発明において使用され得る。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブな対立遺伝子は、ヒト、動物、酵母、若しくは他の生物の細胞から入手することができる。そのような対立遺伝子は、不完全なＭＭＲ活性の細胞をスクリーニングすることによって同定される。癌を有する動物若しくはヒト由来の細胞は、不完全なミスマッチ修復に対してスクリーニングをされ得る。結腸癌患者由来の細胞が特に有益である可能性がある。ＭＭＲタンパク質をコードする任意の細胞由来のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくはｍＲＮＡは、野生型配列由来の変異に対して分析され得る。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブな対立遺伝子は、例えば、ｈＰＭＳ２−１３４対立遺伝子若しくは他のＭＭＲ遺伝子の変異体を産生することによるなど、人工的にも作り出される。部位特異的突然変異誘発の多様な技術が使用され得る。天然又は人工的に関わらず、超易変な細胞若しくは動物を生み出す時の使用に対して、そのような対立遺伝子の適合性は、ドミナントネガティブな対立遺伝子であるか否かを確定するために、１若しくはそれ以上の野生型対立遺伝子が存在下において対立遺伝子によって引き起こされるミスマッチ修復活性を検証することによって評価される。タンパク質若しくは核酸配列のミスマッチ修復の例は、マウスＰＭＳ２（配列ＩＤ番号９及び１０）、ヒトＰＭＳ２（配列ＩＤ番号１１及び１２）、ヒトＰＭＳ１（配列ＩＤ番号１３及び１４）、ヒトＭＳＨ２（配列ＩＤ番号１５及び１６）、ヒトＭＬＨ１（配列ＩＤ番号１７及び１８）、及びヒトＰＭＳ２−１３４（配列ＩＤ番号１９及び２０）を含む。
【００９７】
ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブな対立遺伝子が導入された細胞は、超易変となる。これは、そのような細胞若しくは動物の自然突然変異率が、そのような対立遺伝子を持たない細胞若しくは動物と比べて上昇していることを意味する。自然突然変異率の上昇度は、正常な細胞若しくは動物の少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、若しくは１０００倍である可能性がある。これに限られるものではないが、メタンスルホン酸塩、ジメチルスルホン酸塩、０６−メチルベンザジン（０６−ｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚａｄｉｎｅ）、ＭＮＵ、ＥＮＵ、などの化学的突然変異誘発物質の使用は、ＭＭＲ不全それのみの割合よりもさらに１０から１００倍の割合の上昇させるために、ＭＭＲ不全細胞において使用される。
【００９８】
本発明の１つの観点によると、ＭＭＲタンパク質のドミナントネガティブ型をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入される。好ましくは、前記細胞は抗ＦＲ−α抗体を産生する。一部の実施形態において、前記細胞は、配列ＩＤ番号４、５、若しくは６のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列ＩＤ番号１、２、若しくは３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体を産生する。一部の好ましい実施形態において、前記細胞は、配列ＩＤ番号７のヌクレオチド配列、及び／若しくは配列ＩＤ番号８のヌクレオチド配列含む核酸を有する。ドミナントネガティブなＭＭＲ遺伝子は、例えば、ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＭＬＨ１、若しくはＭＳＨ２などのＭＭＲ複合体の一部のタンパク質をコードする、いずれのドミナントネガティブな対立遺伝子になることができる。ドミナントネガティブな対立遺伝子は、自然に生じるか、若しくは研究室において作られ得る。前記ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは化学合成されたポリヌクレオチドの形である。
【００９９】
前記ポリヌクレオチドは、構成的に活性なプロモーター断片（これに限られるものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子、若しくはＬＴＲ配列）、若しくはステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのドミナントネガティブなＭＭＲ遺伝子の発現が調節される誘導性プロモーター配列を含む発現ベクターに導入される。前記ポリヌクレオチドは、トランスフェクションによって細胞に導入され得る。
【０１００】
本発明の他の観点によると、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子、一組のＩｇ遺伝子、若しくはＩｇ遺伝子の全体或いは一部を含むキメラ遺伝子は、ＭＭＲ不全細胞宿主に導入され、前記細胞は培養され、新しい表現型及び／若しくは遺伝子型を持つクローンに関してスクリーニングされる。ＭＭＲ不全細胞は、ヒト、霊長類、哺乳類、げっ歯類、植物、酵母、若しくは原核生物界のものであっても良い。新しい表現型、若しくは遺伝子型を持つ細胞のＩｇをコードする遺伝子は、それぞれのクローンから単離され、遺伝的に安定な細胞（即ち、正常なＭＭＲを持つ細胞）に導入され、常にＩｇを産生する細胞を提供する。前記Ｉｇ遺伝子を単離する方法は当業者に周知のいかなる方法であってもよい。前記Ｉｇをコードする単離されたポリヌクレオチドの導入は、Ｉｇをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターのトランスフェクションを含む当業者に周知の方法を使用して行われてもよいが、これに限られるものではない。Ｉｇ遺伝子、一組のＩｇ遺伝子、若しくはＩｇ遺伝子の全体或いは一部を含むキメラ遺伝子をＭＭＲ不全宿主細胞に導入する代わりの方法として、細胞の超易変を提供するために、ドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子をコードする遺伝子と同時にそのようなＩｇ遺伝子を遺伝的に安定な細胞に導入しても良い。
【０１０１】
トランスフェクションは、ポリヌクレオチドを細胞に導入するための任意の工程である。前記トランスフェクションの工程は、例えば遺伝子治療のためのベクターを使用して生きている動物で実行されても良く、或いは、例えば培養中の１若しくはそれ以上の単離された細胞の懸濁液を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行しても良い。前記細胞は、例えば、ヒト若しくは他の霊長類、哺乳類若しくは他の脊椎動物、無脊椎動物、及び原生動物、酵母、若しくは細菌などの単細胞生物を含む真核細胞のいかなる型であってもよい。
【０１０２】
一般的に、トランスフェクションは、細胞の懸濁液、又は単細胞を使用して実行されても良いが、導入細胞が成長し且つ活用され得るように処理した細胞若しくは組織の十分な分画が前記ポリヌクレオチドを組み込んでいるのであれば、他の方法も利用可能である。前記ポリヌクレオチドのタンパク質生成物は、一時的に若しくは安定的に前記細胞内で発現され得るものである。トランスフェクションの技術はよく知られている。ポリヌクレオチド導入に利用可能な技術は、これに限られるものではないが、エレクトロポレーション、形質導入、細胞融合、塩化カルシウムの使用、及び目的の細胞との融合のための脂質と併せたポリヌクレオチドのパッケージングを含む。一旦、細胞にＭＭＲ遺伝子が導入されると、前記細胞は培養液中で成長し培養され得る。トランスフェクションが安定している場合、前記遺伝子は多くの細胞世代に一貫したレベルで発現され、細胞株が生じる。
【０１０３】
望ましい表現型若しくは特徴を同定した後、生物は遺伝的に安定化され得る。ドミナントネガティブな対立遺伝子を発現している細胞は、その後この細胞が遺伝的に安定となり異常に高い割合で突然変異が蓄積することがないように、ドミナントネガティブな対立遺伝子が誘導性の場合は働きを失い細胞などから排除されることにより、"治癒"される。
【０１０４】
実質的に本発明の抗ＦＲ−α抗体のみを産生する細胞、若しくはＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しない細胞は、本明細書において記載された抗体特異性を測定する方法に従って、クローニング及び増大させるために選択される。そのような方法の例は、図４に図示されている。
【０１０５】
本発明の抗体をコードする核酸は、組換え的に発現され得る。本発明の発現細胞は、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞など、既知の任意の昆虫発現細胞株を含む。発現細胞株はまた、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞などの酵母細胞株であっても良い。前記発現細胞はまた、例えば、ハイブリドーマ細胞（例えば、ＮＳ０細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベイビーハムスター腎細胞、ヒト胚腎臓株２９３、正常イヌ腎細胞株、正常ネコ腎細胞株、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ＣＯＳ細胞、非発癌性マウス筋芽Ｇ８細胞、線維芽細胞株、ミエローマ細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ３１細胞、マウスセルトリ細胞、ヒト子宮頸癌細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞などの哺乳類細胞であっても良い。本発明の核酸は、例えば、トランスフェクションによって細胞に導入されても良い。組み換えによって発現された抗体は、前記細胞の成長培地から回収されても良い。
【０１０６】
本発明の一実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける免疫化の手順は、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＭＳ２−１３４、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ３、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３、ＭＬＨ４、ＭＬＨ５、ＭＬＨ６、ＰＭＳＬ９、ＭＳＨ１、及びＭＳＨ２などのミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブな対立遺伝子が、脾細胞の融合の後にハイブリドーマ細胞へ導入されるか、或いは融合前にミエローマ細胞へ導入されるものであるハイブリドーマ細胞の直接的な変化によって補われる。ドミナントネガティブ突然変異を含む細胞は超易変となり、未導入の対照細胞よりも高い割合で突然変異が蓄積する。突然変異細胞の集まりは、例えば、ＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しないクローン、高アフィニティー抗体を産生するクローン、高力価抗体を産生するクローン、若しくは一定の状況下でとても成長の早い或いは良いクローンに対してスクリーニングされ得る。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブな対立遺伝子を使用して超易変細胞を作り出す技術は望ましいものであり、例えば、米国特許第６，８０８，８９４号公報に記載されている。また、ミスマッチ修復は、２００２年７月１８日に公開されたＮｉｃｏｌａｉｄｅｓらによる国際公報第ＷＯ  ０２／０５４８５６号"ミスマッチ修復の化学的阻害物質（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ）"において記載されているミスマッチ修復の化学的阻害物質を使用することによって阻害され得る。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブな対立遺伝子、若しくはミスマッチ修復の化学的阻害物質を使用した抗体の増強技術は、クローン化免疫グロブリン遺伝子を発現している哺乳類発現細胞にも適用され得る。ドミナントネガティブな対立遺伝子を発現している細胞は、前記細胞が遺伝的に安定となりその後異常に高い割合で突然変異が蓄積することがないように、ドミナントネガティブな対立遺伝子が誘導性の場合は働きを失い細胞などから排除されることにより、"治癒"される。
【０１０７】
抗体特異性のスクリーニング
ＦＲ−αに特異的に結合する抗体のスクリーニングは、マイクロタイタープレートがＦＲ−αでコーティングされた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して達成され得る。一部の実施形態において、陽性反応を示すクローン由来のＦＲ−αに結合する抗体はさらに、例えば、他の葉酸レセプターアイソフォームでコーティングされたマイクロタイタープレートを使用して、ＦＲ−β及び／若しくはＦＲ−γなどの他の葉酸レセプターアイソフォームに対するＥＬＩＳＡ法を基にした分析の反応性についてスクリーニングされる。葉酸レセプターの他のアイソフォームと反応する抗体を産生するクローンは除外され、ＦＲ−αのみと反応する抗体を産生するクローンは、さらに増大及び発達するために選択され得る。ＦＲ−αに対する抗体の反応性の確認は、例えば、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、若しくは脳腫瘍細胞由来のタンパク質、及び精製されたＦＲ−αと他の葉酸レセプターアイソフォームとをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で流し、続いてメンブレンにブロットするウェスタンブロットアッセイを使用して達成され得る。その後前記メンブレンは抗ＦＲ−α抗体を用いてプローブされ得る。ＦＲ−αにはあり他の葉酸レセプターアイソフォームにはない反応性は、ＦＲ−αに対する反応性の特異性を裏付けるものである。
【０１０８】
一部の実施形態において、抗ＦＲ−α抗体の結合親和力が測定される。本発明の抗体は、好ましくは少なくとも約１×１０−７Ｍ、より好ましくは少なくとも約１×１０−８Ｍ、より好ましくは少なくとも約１×１０−９Ｍ、及び最も好ましくは少なくとも約１×１０−１０ＭのＦＲ−αに対する結合親和力を有する。本発明の好ましい抗体産生細胞は、実質的に少なくとも約１×１０−７Ｍ、より好ましくは少なくとも約１×１０−８Ｍ、より好ましくは少なくとも約１×１０−９Ｍ、及び最も好ましくは少なくとも約１×１０−１０ＭのＦＲ−αに対する結合親和力を有する抗体のみを産生する。本発明の好ましい組成物は、実質的に少なくとも約１×１０−７Ｍ、より好ましくは少なくとも約１×１０−８Ｍ、より好ましくは少なくとも約１×１０−９Ｍ、及び最も好ましくは少なくとも約１×１０−１０ＭのＦＲ−αに対する結合親和力を有する抗体のみを含む。
【０１０９】
一部の実施形態において、陽性反応を示すクローン由来の多量体型のＦＲ−αと結合する抗体はさらに、単量体型のＦＲ−αでコーティングされたマイクロタイタープレートを使用して、単量体型のＦＲ−αに対するＥＬＩＳＡ法を基にした分析の反応性についてスクリーニングされる。単量体型のＦＲ−αと反応する抗体を産生するクローンは除外され、多量体型のみと反応する抗体を産生するクローンは、さらに増大及び発達するために選択される。多量体型のＦＲ−αに対する抗体の反応性の確認は、例えば、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、若しくは脳腫瘍細胞由来のタンパク質、及び精製された多量体と単量体のＦＲ−αとを還元性及び非還元性の条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流した後、メンブレンにブロットするウェスタンブロットアッセイを使用して達成され得る。その後前記メンブレンは抗多量体ＦＲ−α抗体を用いてプローブされ得る。非還元性条件下で適切な大きさの多量体型のＦＲ−αにはあり（還元性及び非還元性条件下で）３８ｋＤａのＦＲ−αにはない反応性は、多量体型のＦＲ−αに対する反応性の特異性を裏付けるものである。
【０１１０】
本発明の抗体は、好ましくはＦＲ−αを有する細胞において、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導する。ＡＤＣＣアッセイは当業者に周知である。本発明の方法は、許容範囲である抗原結合活性（低ナノモル解離定数（ｌｏｗ  ｎａｎｏｍｏｌａｒ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ））と産生速度（>１０ｐｇ／細胞／日）とを有する最適化ヒト化抗ＦＲ−α抗体の良好な産生を可能にする。標的としてヒト卵巣癌細胞、及び効果細胞として末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を用いたＡＤＣＣアッセイは、対照ＩｇＧ１／κ抗体によって媒介される溶解がわずか６％であったのに対して、ＣＨＯ細胞で産生された本発明の２００ｎｇ／ｍｌの抗体は、標的細胞の３２％の溶解を媒介したことを示した（両側Ｔ検定＝０．０００８）。
【０１１１】
抗ＦＲ−α抗体産生細胞
本発明の抗体産生細胞は、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞など既知の任意の昆虫発現細胞株を含む。前記発現細胞株はまた、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞などの酵母細胞株であっても良い。前記発現細胞株はまた、例えば、ハイブリドーマ細胞（例えば、ＮＳ０細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベイビーハムスター腎細胞、ヒト胚腎臓株２９３、正常イヌ腎細胞株、正常ネコ腎細胞株、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ＣＯＳ細胞、非発癌性マウス筋芽Ｇ８細胞、線維芽細胞株、ミエローマ細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ３１細胞、マウスセルトリ細胞、ヒト子宮頸癌細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞などの哺乳類細胞であっても良い。
【０１１２】
一部の実施形態において、本発明の抗体産生細胞は、ＦＲ−αと特異的に結合する抗体を産生する。前記細胞は、好ましくはＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しないものである。好ましい実施形態において、前記抗体産生細胞は、ＦＲ−α結合競合物を、約１０重量％以下、好ましくは約５重量％以下、より好ましくは約１重量％以下、より好ましくは約０．５重量％以下、より好ましくは約０．１重量％以下、及び最も好ましくは約０重量％含む。一部の好ましい実施形態において、前記抗体産生細胞によって産生された抗体は、ＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しないものである。好ましい実施形態において、前記抗体産生細胞によって産生された抗体は、ＦＲ−α結合競合物を、約１０重量％以下、好ましくは約５重量％以下、より好ましくは約１重量％以下、より好ましくは約０．５重量％以下、より好ましくは約０．１重量％以下、及び最も好ましくは約０重量％含む。本発明の好ましい抗体産生細胞は、実質的に少なくとも約１×１０−７Ｍ、より好ましくは少なくとも約１×１０−８Ｍ、より好ましくは少なくとも約１×１０−９Ｍ、及び最も好ましくは少なくとも約１×１０−１０ＭのＦＲ−αに対する結合親和力を有している抗体のみを産生する。
【０１１３】
抗体精製
抗体精製の方法は当業者に周知である。本発明の一部の実施形態において、抗体精製方法は、ろ過、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、及び濃縮を含む。前記ろ過の工程は、好ましくは限外ろ過、及びより好ましくは限外ろ過とダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を含む。ろ過は、好ましくは少なくとも約５〜５０倍、より好ましくは１０〜３０倍、及び最も好ましくは１４〜２７倍で行われる。アフィニティーカラムクロマトグラフィーは、例えば、ＰＲＯＳＥＰアフィニティークロマトグラフィー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して行われても良い。好ましい実施形態において、前記アフィニティークロマトグラフィーの工程は、ＰＲＯＳＥＰ−ＶＡカラムクロマトグラフィーを含む。溶出液は、溶媒洗剤で洗浄されるものであっても良い。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＳＰ−セファロース陽イオン交換クロマトグラフィーを含むものであっても良い。陰イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、これに限られるものではないが、Ｑセファロース高速流陰イオン交換を含むものであっても良い。前記陰イオン交換の工程は好ましくは非結合であり、それによってＤＮＡ及びＢＳＡを含む混入物質の除去が可能である。前記抗体産物は、好ましくは例えばＰａｌｌ  ＤＶ２０  Ｎａｎｏｆｉｌｔｅｒを使用してナノサイズでろ過される。前記抗体産物は例えば限外ろ過及びダイアフィルトレーションを用いて濃縮されても良い。前記方法はさらに、凝集体を除去するためにサイズ排除クロマトグラフィーの工程を含むものであっても良い。
【０１１４】
抗体の薬剤組成物
本発明の他の観点は、本発明の抗ＦＲ−α抗体の薬剤組成物を特徴付ける。前記薬剤組成物は、患者の腫瘍細胞の成長を阻害若しくは軽減するために使用され得る。抗体の前記組成物は、好ましくはＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しないものである。特定の実施形態において、前記薬剤組成物は、注射若しくは注入による投与用に処方されている。
【０１１５】
本発明の薬剤組成物はさらに、化学療法若しくは細胞毒性物質を含むものであっても良い。一部の実施形態において、前記抗体は化学療法若しくは細胞毒性物質と接合される。適切な化学療法若しくは細胞毒性物質は、ラジオアイソトープに限られるものではないが、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１、及びホウ素−１０若しくはアクチニドなどの核分裂性核種を含む、ラジオアイソトープを含むがこれらに限られるものではない。他の実施形態において前記物質は、これらに限られるものではないが、リシン、改変シュードモナスエンテロトキシンＡ、カリケアマイシン、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル及び類似のものを含む毒性若しくは細胞毒性の物質である。本発明の薬剤組成物は、これらに限られるものではないが、５−フルオロ−２’−デオキシ−ウリジン−５’−モノリン酸塩（ＦｄＵＭＰ）、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、ＺＤ１８４３Ｕ８９、ＺＤ９３３１、ＡＧ３３７、及びＰＴ５２３を含む、抗葉酸複合体を含むものであっても良い。
【０１１６】
本発明の薬剤組成物は、薬剤的に許容可能なキャリアー若しくは媒体と共に処方されて得る。適切な許容可能なキャリアーは、水、ＰＢＳ、食塩水（リンガー溶液など）、アルコール、油、ゼラチン、及びラクトース、アミロース、若しくはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリジンを含む。そのような製剤は滅菌されても良く、必要に応じて例えば滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、及び着色剤などの助剤と混合されても良い。本発明における使用に適した薬剤キャリアーは当業者に周知であり、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ）に記載されている。
【０１１７】
キット
本発明のさらに別の観点によると、キットは、患者における腫瘍細胞の成長を阻害若しくは軽減するために提供される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異型細胞の存在を確認するためのキットもまた提供される。
【０１１８】
本発明のキットは、本発明の抗体若しくは抗体組成物、及び患者において腫瘍細胞の成長を阻害若しくは軽減する方法、或いは例えば生体試料中の異型細胞の存在を確認する方法においてキットを使用するための使用説明書を含む。前記キットは、少なくとも１つの化学療法若しくは細胞毒性試薬を含む。前記キットは抗葉酸化合物を含むものであっても良い。前記キットは少なくとも１つの診断試薬を含むものであっても良い。診断試薬の例は、これらに限られるものではないが、例えば、放射性、蛍光、若しくは色素体の物質（例えば１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ）など、検出可能な標識である。検出可能な標識は酵素を含むものであっても良い。前記キットは、例えば注射など、抗体或いは抗体組成物を投与するための使用説明書及び／若しくは方法を含む。
【０１１９】
異型細胞を検出する方法
本発明の方法は、これらに限られるものではないが、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、若しくは脳腫瘍細胞を含む表面上にＦＲ−αが存在している異型若しくは癌細胞を検出する方法を含む。前記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生体試料、若しくはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて行われ得る。本発明による異型細胞を検出する方法は、本発明の抗ＦＲ−α抗体を生体サンプルと接触させること、若しくは本発明の抗ＦＲ−α抗体を患者へ投与することを含むものであり、前記抗体は、例えばこれらに限られるものではないが、放射性、蛍光、若しくは色素体の物質（例えば１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ）などの検出可能な標識で標識化され、細胞への前記抗体の結合を確認する。前記検出可能な標識は酵素であっても良い。
【０１２０】
腫瘍細胞の成長を軽減する方法
本発明の方法は、ＦＲ−αの増加した発現と関連した腫瘍性状態を有すると認定されたヒト及び非ヒト動物における使用に適している。本発明の恩恵を受ける非ヒト動物は、ペット、外来種（例えば動物園の動物）、及び家畜を含む。好ましくは、非ヒト動物は哺乳類である。
【０１２１】
本発明は、正常組織と関連する腫瘍内でのＦＲ−αの増加した発現によって際立てられた異型疾患を有すると認定されたヒト若しくは動物の患者における使用に適しているそのような患者がそのような状態に対する治療を必要としていると認定された時点で、本発明の方法が前記状態の効果治療に適用されても良い。治療され得る腫瘍は、これらに限られるものではないが、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、子宮体癌、脳腫瘍、卵管癌、若しくは子宮腫瘍、及び特定の白血病細胞を含む。一部の実施形態において、前記腫瘍はシスプラチン耐性である。
【０１２２】
抗体及びその派生物の本発明における使用は、カプセル、タブレット、水性懸濁液、溶液、若しくは類似のものなど、任意の許容可能な投薬形態で経口的に投与されても良い。前記抗体及びその派生物はまた、これらに限られるものではないが、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、関節注射、滑液注射、胸骨注射、鼻腔内注射、局所注射、髄膜注射、肝内注射、病巣内注射、及び頭蓋内注射、若しくは注入技術を含む非経的な方法で投与され手も良い。一般的に前記抗体は、例えば注射によるなど静脈内若しくは腹腔内である。
【０１２３】
本発明の抗体及び派生物は、単独で、若しくは例えばリン酸緩衝生理食塩水などのアジュバント、媒体、及び賦形剤を含む薬剤的に許容可能なキャリアーと一緒に投与され得る。
【０１２４】
本発明の抗体及び派生物はまた、癌治療に使用される１若しくはそれ以上の抗葉酸化合物と一緒に投与される。抗葉酸化合物は、これらに限られるものではないが、５−フルオロ−２’−デオキシ−ウリジン−５’−一リン酸（ＦｄＵＭＰ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、Ｌ−５−ホルミルテトラヒドロ葉酸（"ロイコボリン"）、Ｎ−［５−（Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イル−メチル）−アミノ）−２−テニル］］−Ｌ−グルタミン酸（"ＺＤ１６４９"；"トムドックス"としても知られる）（Ｊａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５５７９−５５８６）、Ｎ−（４−（２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−ピロロ［２，３−Ｄ］ピリミジン−５−イル）−エチル）−ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン酸（"多数標的抗葉酸"（ＭＴＡ）；"ＬＹ２３１５１４"、"ＡＬＩＭＴＡ"、及び"ペメトレキセド"としても知られる)（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．３５：４４５０−４４５４；Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：１１１６−１１２３）、（Ｓ）−２−（５）−（（（１，２−ジヒドロ−３−メチル−１−オキソベンゾ（ｆ）キナゾリン−９−イル）−メチル）−アミノ）−オキソ−２−イソインドリニル）−グルタル酸（"ＧＷ１８４３Ｕ８９"）（Ｈａｎｌｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｏｎｅ（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３３０１−３３０６）、（２Ｓ）−２−｛Ｏ−フルオロ−ｐ−［Ｎ−（２，７−ジメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル−メチル）−Ｎ−プロップ(ｐｒｏｐ）−２−イニル）アミノ］ベンズアミド｝−４−（テトラゾル−５−イル）−酪酸（"ＺＤ９３３１"）（Ｊａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ３：９１１−９２１）、３，４−ジヒドロ−アミノ−６−メチル−４−オキソ−５−（４−ピリジルチオ）−キナゾリン（"ＡＧ３３７"；"チミタック（Ｔｈｙｍｉｔａｑ）"としても知られる）（Ｗｅｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７：５０９−５１７、Ｒａｆｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．１６：１３３１−１３４１）、及びＮα−（４−アミノ−４−デオキシプテロイル）−Ｎδ−（ヘミフタロイル−Ｌ−オルニチン）（"ＰＴ５２３"）（Ｒｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：７８３−７９１、Ｒｏｗｏｗｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．６：３２９−３５２）を含む。抗葉酸化合物は、本発明の抗ＦＲ−α抗体の前後、若しくは同時に投与される。投与される抗葉酸化合物の量は、現在使用されている用量、若しくは患者にどんな悪影響も生じることなく、減少した腫瘍成長、或いは腫瘍除去を達成することに基づいて、医師によって容易に測定され、増加又は減少され得る。
【０１２５】
有効量は様々な要因に依存する。体重、治療の目的、最大耐量、用いられた特定の処方、投与経路、及び類似のものなどの多様なパラメーターに従って、任意の患者への用量を調整することは技量を持った医師の権限範囲内である。一般的に、前記抗体若しくはその派生物の用量レベルは、１日あたり約５．８８ｍｇ／ｍ２〜約２９４．１２ｍｇ／ｍ２（即ち、１０から５００ｍｇの抗体）が適している。一部の実施形態において、前記抗体若しくはその派生物の前記用量は１日あたり約２９．４１ｍｇ／ｍ２〜約１７６．４７ｍｇ／ｍ２（即ち５０〜３００ｍｇの抗体）である。他の実施形態において、前記用量は１日あたり約５８．８２ｍｇ／ｍ２〜約１４７．０６ｍｇ／ｍ２（即ち、１００〜２５０ｍｇの抗体）である。さらに他の実施形態において、前記用量は１日で約８８．２４ｍｇ／ｍ２〜約１１７．６５ｍｇ／ｍ２（即ち、１５０〜２００ｍｇの抗体）である。投薬は、ボーラス若しくは注入であっても良い。用量は、１日に１回、若しくは１日に複数回与えられる。さらに用量はある期間に複数回与えられても良い。一部の実施形態において、前記用量は１〜１４日間与えられる。一部の実施形態において、前記抗体若しくはその派生物は、腹腔内に約１０〜５００ｍｇの１回用量として与えられる。他の実施形態において、前記抗体若しくはその派生物は、静脈内に約５０〜３００ｍｇ提供される。さらに他の実施形態において、前記抗体若しくはその派生物は、少なくとも約１μｇ／ｍｌの血漿中濃度が維持されるように提供される。
【０１２６】
効果的な治療は様々な方法で見極められ得る。１つの実施形態において効果的な治療は、腫瘍成長の進行遅延によって測定される。他の実施形態において効果的な治療は、腫瘍の縮小（即ち、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍを通してオンラインで利用可能な、固形腫瘍の反応評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）を使用して測定された腫瘍の大きさの減少）によって特徴付けられる。他の実施形態において効果的な治療は、腫瘍の転移の阻害によって特徴付けられる。さらに他の実施形態において効果的な治療は、健康が改善した患者の体重増加、体力の回復、痛みの減少、成長、及び自覚症状などの兆候を含む患者の増加した健康によって測定される。
【０１２７】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されたものであり、それらを限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１２８】
実施例
実施例１  抗ＦＲ−α抗体産生細胞の生成
マウス抗体ＬＫ２６は、絨毛癌細胞株Ｌｕ−７５（ｃ）に対してもたらされた。ＬＫ２６は、米国特許第６，１２４，１０６号公報の方法に従ってＣＤＲ移植によってヒト化し、ＮＳ０細胞株で発現するＩｇＧ１（ＩｇＧ１／κサブタイプ）を産出した。前記ＮＳ０細胞株にｈＰＭＳ２−１３４発現プラスミドを導入した。ＭＭＲ遺伝子は、哺乳類のポリアデニル化信号が後を続くクローニング部位の上流に伸長因子プロモーターを含む、ｐＥＦ発現ベクター内にクローニングした。このベクターはまた、このプラスミドを保持する細胞の選択を可能にするＮＥＯｒ遺伝子を含む。簡単に言えば、細胞に、製造者プロトコール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、ポリリポソームを使用して、細胞にそれぞれ１μｇのベクターを導入した。その後細胞を１０日間０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中で選択し、Ｇ４１８耐性細胞を遺伝子発現の分析のために全体的に集めた。ｐＥＦコンストラクトは、ポリリンカークローニング部位の５’末端と並列されているエキソン２からＥＦ遺伝子のエキソン１を分割するイントロンを含む。これは、高速な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が、スプライシング産物を発現する細胞をスクリーニングすることを可能にしている。細胞を単離し、それらのＲＮＡを以前に報告された（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  Ｎ．Ｃ．，  Ｋｉｎｚｌｅｒ，  Ｋ．Ｗ．，  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，８．（１９９５）ＰＭＳ２の５’領域の分析が、異種転写産物、及び新規オーバーラップ遺伝子を明らかにする（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＰＭＳ２  ｒｅｖｅａｌｓ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２９：３２９−３３４）トリゾール方法を使用して抽出した。
【０１２９】
重鎖ＲＮＡは、フォワードプライマー（５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣ−３’（配列ＩＤ番号２１））、及びリバースプライマー（５’−ＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＴＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＴＡ−３’（配列ＩＤ番号２２））を使用して逆転写した。軽鎖ＲＮＡは、配列ＩＤ番号２１のフォワードプライマー及びリバースプライマー（５’−ＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴ−３’（配列ＩＤ番号２３））を使用して逆転写した。ＰＣＲ反応は、高品質のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて実行した。ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを用いてダイジェスト（ｄｉｇｅｓｔ）し、真核性発現ベクターｐＥＦ４（軽鎖）及びｐＥＦ６（重鎖）の同じ制限部位にクローニングした。ベクターｐＥＦ４（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）は、真核細胞の安定的な形質転換体の選択に用いるゼオチン耐性遺伝子を持つ５．８ｋｂのベクターである。ｃＤＮＡ挿入物はｈＥＦ−イントロン１の下流にクローニングし、その転写は、ヒトＥＦ１アルファプロモーターによって制御される。ｃＤＮＡ挿入物の下流は、転写物の効果的なポリアデニル化を可能にしているＢＧＨポリアデニル化信号である。ベクターｐＥＦ６（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）は、ｐＥＦ４と類似しているが、ゼオチン耐性遺伝子の代わりにブラストサイジン耐性遺伝子を持つ。ｃＤＮＡ挿入物の両鎖の配列を確認した。
【０１３０】
完全長ヒト化抗ＦＲ−α抗体の重鎖及び軽鎖をコードする得られたｃＤＮＡは、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）細胞に導入した。製造者試用説明書に従って、ＦＵＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に各プラスミド０．５マイクログラムを導入した。細胞をＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中に保持した。ゼオチン（２００マイクログラム／ミリリットル）及びブラストサイジン（５マイクログラム／ミリリットル）を用いて安定した細胞株を選択した。抗体の発現は、抗ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによって確認した。安定に導入された細胞の集団は、制限された希釈によってクローニングした１つの細胞であり、高発現細胞株を選択した。高力価を二次及び三次スクリーニングで確認した。前記細胞株は、無血清培地（ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩの後ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２）に適応させた。抗体産生はＥＬＩＳＡによって確認した。前記細胞株はまた、２日目にダイズ加水分解パルスと共に８ｍＭ  Ｌ−グルタミンを加えた無タンパク質培地（ＣＤ９４１１１；Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に適応させた。細胞は液体窒素を使用して保存した。前記細胞は、ＦＡＣＳ分析によって測定した場合、選択培地の不在下において少なくとも１３代は安定であった。細胞分泌は、ＥＬＩＳＡによって測定した場合、少なくとも２０代は安定であった。大規模な抗体産生が可能である。例えば、抗体は、１５Ｌ、７０Ｌ、及び３４０Ｌの大きさのバイオリアクターで産生した。
【０１３１】
実施例２  抗体産生クローンを同定するスクリーニング方法、及び抗ＦＲ−α抗体の特徴付け
この文書の範囲内にある方法の適用は、例えば、これらに限られるものではないが、配列ＩＤ番号２、若しくは３のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列ＩＤ番号５、若しくは６のアミノ酸配列を含む重鎖とを有する抗体を含む本発明のＦＲ−α抗体など、ＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しない細胞、若しくは実質的に標的免疫グロブリンのみを産生する細胞を作り出すためのＭＭＲ不全免疫グロブリン産生細胞の使用である。図４は、高親和性ＭＡｂｓを産生するクローンを同定するためのスクリーニング手順の要点を述べている。分析はプレート酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の使用することによって、高親和性ＭＡｂｓを産生するクローンをスクリーニングする。１つの免疫グロブリン産生細胞を含む９６ウェルプレートは０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を加えた成長培地中で培養し、クローンが発現ベクターを保持することを確保した。プレートをｈＩｇＧプレートＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングし、これによって９６ウェルプレートはＦＲ−αでコーティングした。また、前記プレートは、抗ＦＲ−α抗体に対する特定の抗体でコーティングした。免疫グロブリン産生細胞がヒトではない場合の別の方法として、前記プレートを抗ヒトＩｇＧ１抗体でコーティングした。プレートをカルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ−／−）で３回洗浄し、５％ドライミルクを含む１００μｌｓのＰＢＳ−／−中で室温で１時間ブロッキングした。ウェルをすすぎ、それぞれの細胞クローンからの条件培地の１：５の希釈液を含む１００μｌｓのＰＢＳ溶液で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−／−で３回洗浄し、抗ヒトＩｇＧ抗体などの二次抗体と結合したヒツジ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ(ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ)の１：３０００希釈液を含む５０μｌｓのＰＢＳ溶液において１時間室温でインキュベートした。その後プレートをＰＢＳ−／−で３回洗浄し、５０μｌｓのＴＭＢ−ＨＲＰ基質（ＢｉｏＲａｄ）において１５分間室温でインキュベートし、各クローンによって産生された抗体の量を検出した。５０μｌｓの５００ｍＭ重炭酸ナトリウムを加えて反応を停止させ、ＢｉｏＲａｄプレートリーダーを用いてＯＤ４１５ｎｍで分析した。その後バックグランド細胞（ベクターのみを持つコントロール細胞；ドミナントネガティブなミスマッチ修復対立遺伝子を含まないコントロール細胞）より増した信号を提示するクローンを単離し、３回の実験のＥＬＩＳＡデータのさらなる特徴付け及び確認のために、１０ｍｌの培地に展開した。ＥＬＩＳＡはまた、同じクローンからの条件培地（ＣＭ）上で行い、各ウェルの条件培地内の全Ｉｇ産物を測定した。増加したＥＬＩＳＡの信号を産生し、増加した抗体価を有するクローンは、さらにその後ＦＲ−α結合競合物が実質的に存在しない変異体に対して分析した。ＥＬＩＳＡによって測定されるより高いＯＤ値を産生するクローンは、さらに、ＦＲ−α結合競合物の欠如を確認するためにに遺伝子レベルで分析し、従って強いＥＬＩＳＡ信号が得られた。簡単に言えば、１００，０００細胞を集菌し、上述したようにトリアゾールの方法を使用してＲＮＡを抽出した。��ＮＡは、製造者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）による提案のようにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩを使用して逆転写し、可変軽鎖及び重鎖内に含まれる抗原結合部位をＰＣＲ増幅した。
【０１３２】
変性オリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲ反応は、９４℃３０秒、５２℃１分、及び７２℃１分を３５サイクルで実行した。生成物をアガロースゲルで分析した。予想分子量のの生成物をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ  １０１）によってゲルから精製し、Ｔ−ｔａｉｌｅｄベクターにクローニングし、さらに配列を決定し、可変軽鎖及び重鎖の配列を同定した。その後野生型配列が確定した後、陽性クローンのＲＴ−ＰＣＲ増幅のために非変性プライマーを作成した。重鎖及び軽鎖の両方を増幅し、ゲル精製し、さらに対応するセンス及びアンチセンスプライマーを使用して配列決定した。ＲＴ−ＰＣＲ生成物の配列によって、ＰＣＲ誘導性突然変異が原因ではない内生免疫グロブリン遺伝子の代表的な配列データが与えられた。その後クローンからの配列を野生型配列と比較した。
【０１３３】
本発明の方法によって、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗ＦＲ−α抗体が得られた。前記抗体のモル吸光係数（ε）は、ｐＨ７．２ｎｏ２０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中の抗体の７．４１ｍｇ．ｍｌ溶液の２８０ｎｍの吸収の測定によって４３，３２０と測定された。
【０１３４】
分子量１３５ｋＤまでの１つの主要なバンドは、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥの抗体の分離上で観測された。分子量５５ｋＤまで及び分子量２５ｋＤまでの２つのバンドは、還元状態で観測された。純度は、コロイドクーマシーブルー染色ゲルの濃度測定分析によって確かめ、還元条件下で約９９．５％以上、及び非還元条件下で約９９％以上であると分かった。
【０１３５】
非還元ゲルで分離されるポリペプチドをプローブするために使用した場合、ウェスタンブロット分析によって、前記抗体がＦＲ−αを発現すると知られている細胞株から用意された溶解物の分子量３５ｋＤまでの１本のポリペプチドを検出でき、抗原（１２０５Ｌｕ）を発現しない細胞株の溶解物では検出できないことを証明した。前記抗体はまた、Ｎ連結性オリゴ糖を取り除くためのＰＮＧａｓｅ  Ｆを持つ抗原の治療の後でさえ、ＫＢ細胞から分泌された可溶性ＦＲ−αを検出することができた。
【０１３６】
本発明の抗体及び精製したＦＲ−αの間の動的及び定常状態の結合定数は、表面プラズモン共鳴分光法によって測定した。オンレート（ｋａ）は（２．２５±０．０２）Ｍ−１ｓ−１と測定され、オフレート（ｋｄ）は（５．０２±０．０８）ｓ−１と測定された。２．２３ｎＭの定常状態の解離定数（ＫＤ）を計算した。
【０１３７】
実施例３  抗体の多量体型ＦＲ−αへの結合
モノクローナル抗体のＦＲ−αの四量体型への結合をウェスタンブロットによって示した。簡単に言えば、ＳＫ−Ｏｖ−３及びＩＧＲＯＶ腫瘍細胞をヌードマウスにおいて増殖して摘出した。腫瘍組織は、Ｄｏｕｎｃｅ組織ホモジナイザーで２ｍｌ１５〜２０のストロークでＲＩＰＡバッファーに溶解した。不溶性物質を遠心分離によって取り除き、上澄みの総タンパク質をＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを使用して測定した。異なる実験では、５μｇ若しくは２０μｇのタンパク質のいずれかを非還元状況下で４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＭＥＳ）に流した。電気泳動したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。前記膜をＢｌｏｔｔｏ（５％ｍｉｌｋ、０．０５％ＴＢＳ−Ｔ）でブロッキングした。ＬＫ２６ハイブリドーマ細胞からの培地の上澄みの１：１００希釈物、及び０．１％ＮａＮ３の全濃度は、一次抗体としてＢｌｏｔｔｏ阻止溶液に直接加え、前記膜を一晩中インキュベートした。前記膜を０．０５％ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、Ｂｌｏｔｔｏ阻止溶液中の二次抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識化されたヒツジα−マウスＩｇＧ（重鎖及び軽鎖））を加えた。前記膜は、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ＥＣＬ試薬を使用して現像した。結果は図１に示した（レーン１、ＳＫ−Ｏｖ−３；レーン２、ＩＧＲＯＶ）。この結果は、ＦＲ−αを過剰発現する特定の腫瘍が単量体ＦＲ−α以上の多量体ＦＲ−αの産生を助けることを示唆する。この発見は、腫瘍組織を破壊するためのＦＲ−αの四量体型を特異的に認識するモノクローナル抗体によって有効利用され、一方で正常細胞（一般的にＦＲ−αの単量体型を発現する）は無傷に残される。
【０１３８】
実施例４  大腸菌におけるＦＲ−αの発現
ＦＲ−αの発現はまた大腸菌において評価した。簡単に言えば、ヒスチジンタグ（ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲ−α）を持つＦＲ−αのコード配列を含むプラスミドを大腸菌細胞に導入した。プラスミドｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲ−αを含む大腸菌の培養液をＯＤ６００＝１．０まで培養した。その後、アラビノースを終濃度０．２％まで添加し、図２で示される時点において検体を採取した。２５ｍｌの４×ＬＤＳ検体バッファーを６５ｍｌ培養液に加えることによって大腸菌溶解物を調整した。ＪＡＲ細胞は、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖した。前記培地を前記細胞から除去し、ＲＩＰＡバッファーを培養プレートに直接加え、ＪＡＲ細胞抽出対照に対して前記細胞を溶解するために播種した。検体を４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（ＭＥＳ）上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。ＴＢＳＴ＋５％ｍｉｌｋ中で一晩ブロッキングした後、前記膜をｍＡｂ  ＬＫ２６の１：１０００希釈物を１時間、その後二次抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合したヒツジα−マウスＩｇ）の１：１００００希釈物を１時間プローブした。５分の暴露の後、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌフェムトを用いて抗体の検出を行った。結果を図２に示す（レーン１、大腸菌＋ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲａ、１８０分誘導；レーン２、大腸菌＋ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲａ、９０分誘導；レーン３、大腸菌＋ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲａ、６０分誘導；レーン４、大腸菌＋ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲａ、３０分誘導；レーン５、大腸菌＋ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲａ、１５分誘導；レーン６、大腸菌＋ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ−ｈＦＲａ、未誘導；レーン７、ＪＡＲ細胞抽出）。
【０１３９】
実施例５  人工のサンプル調合ではない多量体型のＦＲ−α
Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ１７（４）：４１５−４２７に記述されるように、ＦＲ−αの多量体がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ミセル中の人工的な集合体ではないことを証明するため、腫瘍の抽出物を１×ＲＩＰＡ（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ＝７．２）、若しくは１×ＰＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸化リム、ｐＨ＝７．２）のいずれかを用いて希釈した。すべての検体に対して、１ｕｇ／ｕｌのストックＩＧＲＯＶ抽出物を使用した。希釈後、４×ＬＤＳ検体バッファーを各検体に加えて１×の終濃度にした。前記検体をＭＥＳランニングバッファーで４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に添加した。電気泳動の後、前記タンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。移したタンパク質を含む膜をＢｌｏｔｔｏ（５％脱脂乳、１×ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で室温で４８時間ブロッキングした。前記膜を一次抗体（１ｕｇ／ｍｌ  ＬＫ２６抗体）と共にインキュベートした後洗浄することよって現像し、そして二次抗体（Ｂｌｏｔｔｏ中のＨＲＰ結合ヒツジα−マウスＩｇＧ）と共にインキュベートした。さらなる洗浄工程の後、前記膜をＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ＥＣＬ試薬を用いて現像し、１分間暴露した。結果を図３に示した（ｌａｎｅ１、ＰＢＳの１：１００希釈；ｌａｎｅ２、ＰＢＳの１：５０希釈；ｌａｎｅ３、ＰＢＳの１：２５希釈；ｌａｎｅ４、ＰＢＳの１：１０希釈；ｌａｎｅ５、ＲＩＰＡの１：１００希釈；ｌａｎｅ６、ＲＩＰＡの１：２５希釈；ｌａｎｅ７、ＲＩＰＡの１：１０希釈；Ｍ、分子量マーカー、ｌａｎｅ８、ＲＩＰＡの１：１希釈）。矢印は単量体（１×）及び四量体（４×）を指し示す。未処理物はＦＲ−αの四量体を崩壊させた。この結果は、ＦＲ−αを過剰発現する特定の腫瘍が従来は人工のゲルろ過サンプル調合としてのみ示されたＦＲ−αの多量体型を発現することを指し示す。
【０１４０】
実施例６  ＡＤＣＣ活性のための細胞のスクリーニング
ｈＰＭＳ−１３４を発現するｍＡｂ産生細胞は、ライミング希釈によってサブクローン化し、平底９６ウェルプレートに播種した。播種密度は、単一クローン性に近づけるために、プレートにつき４０個のシングル細胞コロニーとなるように実験的に決定した。
【０１４１】
前記クローンは、実験的に決定される日数培養することができ、その後ＡＤＣＣ活性を媒介できる十分量の抗体を産生した。インキュベーションの期間の最後に、各クローン／ウェルからの５０μｌの条件培地をＥＬＩＳＡによる抗体濃度の算定のために使用し、さらに同じクローン／ウェルからの５０μｌの条件培地をＡＤＣＣアッセイに利用した。簡単に言うと、例えば、坑卵巣癌ｍＡｂは、アッセイの前日に完全成長培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０）の平底９６ウェルマイクロプレートに３０，０００細胞／ウェルの密度で播種した標的細胞、ＳＫＯＶ３（１から２０代、ＡＴＣＣから手に入れた）との結合に使用した。次の日、前記完全培地を１００μｌのＣＨＯ−ＣＤ無血清培地に置き換え、５０μｌの抗体を含む条件培地を標的細胞に加えて３７℃で２０分間インキュベートした。その後、２×１０５のエフェクター細胞を含む１００μｌの無血清培地を各ウェルに加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５〜６時間インキュベートした。プレートを簡単に遠心分離器にかけ、１００μｌの上澄みを各ウェルから収集してＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。１００μｌのＬＤＨ基質（Ｒｏｃｈｅ）を上澄みに加え、室温で１０分間インキュベートした。ＬＤＨ活性は、溶解標的細胞から放出されたＬＤＨ酵素の量に比例する。４９０μｍの光学密度（ＯＤ４９０）を分光光度法により取得し、細胞毒性の割合を公式（（サンプルＯＤ４９０−自然ＯＤ４９０）／（最大ＯＤ４９０−自然ＯＤ４９０）×１００％を用いて測定し、ここで‘自然’＝エフェクター細胞若しくは抗体が欠如した中での標的細胞の溶解、及び‘最大’＝２％Ｔｒｉｔｏｎがあるときの標的細胞の溶解、である。１００ｎｇ／ｍｌの関連抗体（精製したタンパク質Ａ、親抗体）によって誘発した細胞毒性は、ポジティブコントロールとして使用した。非特異性細胞毒性は、１００ｍｇ／ｍｌの正常ヒトＩｇＧ１を使用して観察した。％細胞毒性を各ウェル／クローンごとの抗体の濃度で割ることによって得た割合（即ち、割合＝５０（％）／１００（ｎｇ／ｍｌ）＝０．５）は、リードクローンを選択するための基準として設定した。リードクローンを５０ｍｌ培養液に展開し、抗体を記述したようにタンパク質Ａアフィニティーカラムによってそれらの条件培地から精製した。リードクローンによって産生された抗体のＡＤＣＣ活性は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度を使用して親抗体と比較した。
【０１４２】
選択的ＡＤＣＣアッセイにおいて、ＡＤＣＣを産生するための抗体の能力は、ＳＫＯＶ−３、ＩＧＲＯＶ−１、及び標的細胞として１２０５Ｌｕ（ネガティブコントロール）、及び正常献血者からのＰＢＭＣｓを使用して評価した。抗体は、１０マイクログラム／ミリリットルの濃度で試験した。エフェクター細胞として使用した献血者のＰＢＭＣｓを融解し、培地（１０％ＦＣＳを加えたＩＭＤＭ）中に一晩置いた。前記細胞を１０７細胞／ミリリットルの濃度で培地中に再懸濁した。標的細胞として使用した腫瘍細胞を培養フラスコから分離し、１００マイクロリットル中の１０６個の細胞は、１００ｕＣｉ（３．７ＭＢｑ）５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で３７℃２時間標識化した。細胞を５ミリリットルの培地で３回洗浄し、１０５細胞／ミリリットルの濃度で培地中に再懸濁した。５０マイクロリットルの腫瘍細胞をＶ底９６ウェルプレートに播種した。細胞をテスト抗体若しくはコントロール抗体を含む５０マイクロリットルの培地中でインキュベートした。３７℃３０分のインキュベート後、５０マイクロリットルのＰＢＭＣｓは、多様な標的−エフェクター細胞比率（１：０、１：２５、１：５０、及び１：１００）でＶ底ウェルプレートに播種し、前記プレートをさらに３７℃で１８時間インキュベートした。上澄み中の５１Ｃｒの放出は、ＬＫＢ−ガンマ計測器で測定した。それぞれの測定は３回行った。放出の割合は以下のように定義した。
【０１４３】
【数１】
2008500025.tif 000013
【０１４４】
特異的放出の割合は以下のように定義した。
【０１４５】
【数２】
2008500025.tif 000014
【０１４６】
【表１】
2008500025.tif 000015
【０１４７】
【表２】
2008500025.tif 000016
【０１４８】
【表３】
2008500025.tif 000017
【０１４９】
【表４】
2008500025.tif 000018
【０１５０】
ヒト卵巣癌細胞を標的細胞として、及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）をエフェクター細胞として使用したＡＤＣＣアッセイは、抗ＦＲ−α抗体が腫瘍細胞株ＳＫＯＶ−３の死滅を媒介することを示した。ＩＧＲＯＶ−１は非常に急速に凝集し、細胞集塊を形成する傾向にあった。前記細胞株は、ＰＢＭＣのみによる死滅に感受性であった。コントロール抗体はまた、いくつかの死滅を媒介した。抗体は、ＩＧＲＯＶ−１の死滅を媒介した。
【０１５１】
実施例７  抗ＦＲ−α抗体を使用した免疫組織化学アッセイ
組織準備。ヒト組織検体は検視解剖若しくは生体検査で得た。試験に用いた組織は、副腎、血液細胞（顆粒球、リンパ球、単球、血小板）、血管（内皮）、骨髄、脳（大脳（皮質）、小脳）、胸（乳腺）、目、胃腸管（結腸（大腸）、食道、小腸、胃）、心臓、腎臓（糸球体、細管）、肝臓、肺、リンパ節、卵巣及び卵管（輸卵管）、膵臓、副甲状腺、末梢神経、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、脊髄、脾臓、横紋（骨格）筋、睾丸、胸腺、甲状腺、扁桃腺、尿管、膀胱、子宮（体（子宮内膜）、頸部）、卵巣癌（癌細胞）、卵巣癌（間質線維芽細胞）を含むものであった。新鮮な未固定の組織検体を鋳型の中に設置し、ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．包埋剤の中のドライアイス上で冷凍した。組織検体を断片化し、アセトンを用いて室温で１０分間固定した。組織は、染色まで−７０℃以下に保存した。染色の直前に、スライドを１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。
【０１５２】
抗体準備。抗体は、１マイクログラム／ミリリットル及び２５マイクログラム／ミリリットルである２つの濃度で組織検体に利用した。。
【０１５３】
一次抗体のないアッセイをアッセイコントロールとして使用した。マウス抗フルオレセインを二次抗体として使用した。ヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＧＳＭＩｇＧ）−ペルオキシダーゼポリマーを三次抗体として使用した。３、３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を基質色原体として使用した。
【０１５４】
免疫組織化学アッセイ。間接的な免疫ペルオキシダーゼの手順によって行った。アセトン／ホルマリン−固定低温切開片は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ［０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２］）で２回すすいだ。内生ペルオキシダーゼは、Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｋｉｔのペルオキシダーゼ溶液で５分間インキュベートすることによって阻止した後、リン酸緩衝生理食塩水で２回すすいだ。スライドは、非特異的結合を減少するように設計されているタンパク質ブロック（リン酸緩衝生理食塩水、０．５％カゼイン、５％ヒトガンマグロブリン、及び１ｍｇ／ｍｌ熱凝集ＨｕＩｇＧ（５ｍｇ／ｍｌ溶液で６３℃２０分間加熱し、室温で冷却することによって準備した））で２０分間処理した。前記タンパク質ブロックの後、一次抗体（抗ＦＲ−α抗体、ネガティブコントロール抗体（ＨｕＩｇＧ１或いはＭｓＩｇＧ１）、若しくはなし）を室温で１時間施した。未結合の二次抗体（マウス抗−フルオレセイン）は３０分間施した。スライドは、ＰＢＳで２回すすぎ、ペルオキシダーゼで標識化されたヒツジ抗−マウスＩｇＧポリマー（Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いて３０分間処理し、ＰＢＳで２回すすぎ、基質色原体（ＤＡＢ；Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ）を用いて８分間処理した。スライドは、水ですすぎ、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバースリップをかけた。
【０１５５】
結果。抗ＦＲ−α抗体は、両方の抗体濃度でポジティブコントロールとして、特異的及び強度にヒト卵巣癌細胞（ＨＴ１６２）を染色した。抗ＦＲ−α抗体は、卵巣癌（間質線維芽細胞）と反応しなかった（ネガティブコントロール）。ネガティブコントロール抗体ＨｕＩｇＧ１及びＭｓＩｇＧ１は、ポジティブ若しくはネガティブコントロール細胞と特異的に反応しなかった。一次抗体を染色反応から除いた場合、いかなる組織を用いても反応性がないこと観測された。表１参照。
【０１５６】
【表５】
2008500025.tif 000019
【０１５７】
本発明の抗体は、卵巣癌組織の間質線維芽細胞と反応しない（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。免疫組織化学及び組織分布分析に対する同様な結果は、カニクイザル及びヒトにおいて本発明の抗体を用いて得られた（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。ポジティブ結合は、カニクイザルの腎臓皮質（尿細管、及び集合管）及び上皮、管状（膜、細胞質／細胞質顆粒）、及びｕｃｔｕｌｅｓ（膜、細胞質）において見られた（データは示していない）。
【０１５８】
正常ヒト組織において、抗ＦＲ−α抗体特異的染色は、尿細管上皮（腎臓）、細気管支上皮（肺）；肺細胞（肺）；卵管の上皮；及び膵臓の管及び延性上皮において、両方の抗体濃度で観測された。
【０１５９】
腫瘍性ヒト組織では、抗ＦＲ−α抗体特異的染色は、卵巣癌組織、子宮体癌組織、及び腎臓癌組織で観測された。卵巣及び腎臓癌組織の染色は、膜及び細胞質で発生した（データは示していない）。
【０１６０】
これらの結果は、文献（Ｗｅｉｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：３８６９−３８７６（２００１））において報告されたＦＲ−αの分布と一致する。
【０１６１】
要約すると、ＦＲ−αは、正常細胞において発現が高い割合で制限され、卵巣腫瘍の大部分において高確率に発現する糖タンパク質である。本発明の抗ＦＲ−α抗体は、ＡＤＣＣを誘導することが可能であり、従って、卵巣癌を含む多様な癌の治療のための本発明の抗体の優れた薬剤候補の抗体を作成することができる。
【０１６２】
実施例８  受容体結合活性
腫瘍抗原に対する非結合治療用モノクローナル抗体の作用の主要な様式の１つは、免疫エフェクター集団の腫瘍細胞への補充を通ずるものである（Ｃｌｙｎｅｓ  Ｒ，Ｔａｋｅｃｈｉ  Ｙ，Ｍｏｒｏｉ  Ｙ，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  Ａ，Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８  Ｊａｎ  ２０；９５（２）：６５２−６；Ｃｌｙｎｅｓ  ＲＡ，Ｔｏｗｅｒｓ  ＴＬ，Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０００  Ａｐｒ；６（４）：４４３−６）。高親和性抗体は同じ抗原を認識する低親和性対応物と比べて、腫瘍細胞に対してより効果的な免疫エフェクターの補充を示すように、任意の抗体が免疫エフェクター細胞を腫瘍細胞へ補充することができるという能力は、腫瘍細胞表面の同族抗原に対する抗体の親和性によって影響を受けるということが推測される。限られた報告であるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて（Ａｌｓｍａｄｉ，０．ａｎｄ  Ｔｉｌｌｅｙ，ＳＡ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８  Ｊａｎ；７２（１）：２８６−２９３；ＭｃＣａｌｌ，ＡＭ．，Ｓｈａｈｉｅｄ，Ｌ．，Ａｍｏｒｏｓｏ，ＡＲ．，Ｈｏｒａｋ，ＥＭ．，Ｓｉｍｍｏｎｓ，ＲＨ．，Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｕ．，Ａｄａｍｓ，ＧＰ．，Ｓｃｈｉｅｒ，Ｒ．，Ｍａｒｋｓ，ＪＤ．，Ｗｅｉｎｅｒ，ＬＭ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｍａｙ  １５；１６６（１０）：６１１２−７）、及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて（Ｖｅｌｄｅｒｓ，ＭＰ，ｖａｎ  Ｒｈｉｊｎ，ＣＭ．，Ｏｓｋａｍ，ＧＪ．，Ｗａｒｎａａｒ，ＳＯ．ａｎｄ  Ｌｉｔｖｉｎｏｖ，ＳＶ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；７８（４）：４７６〜４８３）このような関係の実証が、限られた中で報告されている。そのような相互関係が存在の有無を決定するために、表面プラスモン共鳴分光計によって抗−ＦＲ−α抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性及びこれらの抗体の親和性を関連抗体に対して比較した。
【０１６３】
表面プラスモン共鳴分光計は、異なる屈折率の２つの媒体間の境界線にある導電性フィルムにおける電子（表面プラスモン）を有する全反射（ＴＩＲ）条件下、光子によって生じた電場（エバネセント波）の短範囲（〜１５０ｎｍ）相互作用を利用するものであり、前記媒体の１つは、ＣＭ−デキストランと共役したアルカンリンカーでコーティングされた薄い金層（導電性フィルム）である。前記ＣＭ−デキストラン表面は、フローセルへ約１００〜１５０ｎｍ突出している拡張ハイドロゲルを溶液中で形成し、前記ＣＭ−デキストラン層上に存在するカルボキシル基への共有結合固定化によって選択されたリガンドでさらに誘導体化され得る。エバネセント波の前記金層との相互作用を可能にするために必要な角度は、ＴＩＲを観察するのに必要な角度に依存し、言い換えると、チップの表面での厚み或いは質量に依存する。従って、この機器は、前記固定化リガンドと相互作用する分析物がフローセルへ注入された場合に観察されるような、チップの表面での質量の変化を長期間観察することを可能にする。分析物の注入がバッファーの注入後の場合、我々は、前記結合（前記分析物の注入の間）及び前記結合の解離段階（バッファー注入の間）の両方を追跡することができる。従って、動的オン−レート（Ｋａ）及びオフ−レート（Ｋｄ）、及び定常状態平衡定数（Ｋａ及びＫｄ）を推測することができる。
【０１６４】
可溶性分泌型の抗原は、標的細胞の無血清培養上清から、フェニルセファロース（高サブ）を通じたクロマトグラフィー、次にＳセファロースファストフロー（Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）上のイオン交換によって精製される。簡易には、分泌抗原を含有する培養上清を、更なる塩類が存在しないフェニルセファロース（高サブ）カラムへ添加した。ＨＩＣ  Ａ（２０ｍＭ  Ｋリン酸塩  ｐＨ７．２）における粗洗浄、次にＨＩＣバッファーにおける０〜２０ｍＭ  ＣＨＡＰＳのリニアー勾配を用いて結合抗原の溶出によって、非連結タンパク質を除去した。ピーク抗ＦＲ−α抗体含有画分を貯蔵し、１Ｍクエン酸で酸性化（ｐＨ５．５）し、次にＳセファロース陽イオン交換カラムへ供した。ＩＥＸバッファー（２０ｍＭ  Ｋリン酸塩、ｐＨ５．５）で洗浄した後、ＩＥＸバッファー中０〜１Ｍ  ＮａＣｌのリニアー勾配を用いて結合抗原を溶出した。ピーク画分を貯蔵し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮し、ＰＢＳに対して透析した。抗原調合液の純度に基づいて、共有結合的に連結した葉酸セファロース樹脂上における更なる親和性クロマトグラフィー工程が必要となる可能性がある（Ｓａｄａｓｉｖａｎ，Ｅ．，ｄａ  Ｃｏｓｔａ，Ｍ．，Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，ＳＰ．ａｎｄ  Ｂｒｉｎｋ，Ｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９８７；（９２５）：３６〜４７）。
【０１６５】
分析するための抗体は、組換えタンパク質Ａセファロース樹脂（ＲＰＡ−セファロース、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上における親和性クロマトグラフィーによる１回の工程で精製した。組織培養上清を含有する免疫グロブリン（Ｉｇ）は、１０ｍｇ／ｍｌの樹脂に対してＩｇ／ｍｌ樹脂値で、ＲＰＡ−セファロースカラムへ重力を利用して添加した。ＰＢＳでの粗洗浄、次に０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．６を用いた溶出によって非結合タンパク質を除去した。画分を１Ｍ  Ｔｒｉｓで中和した。ピーク画分を貯蔵し、１０００容量のＰＢＳに対して透析した。Ｉｇ濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）及びＩｇ−特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。
【０１６６】
精製した抗原は、カップリングバッファー（１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．０）中に希釈し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−［ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）の混合物を用いたアミノカップリングによって、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）のフローセル上に固定化し、ＣＭ５センサーチップの表面に接着したＣＭ−デキストランハイドロゲルにおけるカルボキシル基を活性化した。活性化された非誘導体化カルボキシル基は、１Ｍエタノールアミンでクエンチした。クエンチされたＣＭ−デキストラン表面から成る抗原の非存在において活性化された基準フローセルは、全ての測定を規準化するために使用した。未精製ｍＡｂ−含有培養上清、或いは精製ｍＡｂ調合液は、動的アッセイに対して３０μｌ／分の流速、定常状態親和性ランキング実験に対して５μｌ／分の流速で、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＯＨ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ−２０、ｐＨ７．４）を用いて注入した。Ｂｉａｃｏｒｅ解析におけるその使用の前に、１０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、精製されたｍＡｂ標品をＨＢＳ−ＥＰに対して透析した。組織培養上清を含有する検体のために、ＢＳＡ及び可溶性ＣＭ−デキストランを各最終濃度である１％及び１ｍｇ／ｍｌ添加した。前記表面の再生は、１００μｌ／分の流速で、５０ｍＭ  ＮａＯＨを３０秒間注入することによって達成した。データ解析は、Ｂｉａ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて行った。動的データは、シンプル１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルに一致した。ランキング実験のため、検体の異なる濃度におけるＲｅｑ対Ｃのプロットから得られたＫＤ値によって順位を決定した。
【０１６７】
実施例９  ヒト腫瘍異種移植モデルにおける抗体の評価
ＳＫＯＶ−３腫瘍細胞株は、培養及び腫瘍異種移植片の両細胞においてＦＲ−αを発現することが示されていた。抗体は、マウスのＳＫＯＶ−３細胞の腫瘍異種移植モデルを用いてｉｎ  ｖｉｖｏにおいて評価した。パクリタキセルをポジティブコントロールとして使用した。ネガティブコントロールは、非特異的マウスＩｇＧに適合したアイソタイプ、及び溶媒コントロールであった。ネガティブコントロールに対する抗体による腫瘍増殖の阻害は、前記抗体が卵巣癌の治療に有益であることの指標である。前記抗体は、好ましくは少なくとも約５８％の腫瘍増殖阻害を示すものである。
【０１６８】
実施例１０  増殖阻害実験
スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）テスト（Ｋｅｅｐｅｒｓら（（１９９１）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２７：８９７−９００によって修飾されたように、Ｓｈｅｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：１０７−１１２）は、抗葉酸化合物を用いた治療に対する癌細胞の感受性における抗体治療の効果をテストするために使用した。簡潔には（Ｂａｃｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７：７７１〜７７８に記載されたように）、細胞を９６ウェルフラット−ボトムプレート（三つ組）における１００μｌ培養液（テストするために選択されたそれぞれの特定細胞株に対する使用が適しているもの）中で播種した。播種密度は、使用した細胞種に従って変わるが、例えば大腸癌細胞では８，０００細胞／ウェル、頭頚部の扁平上皮癌細胞では１５，０００細胞／ウェルとする。前記細胞は、１〜１００μｇ／ｍｌの抗葉酸受容体抗体の存在下で培養した。２４時間後、培養液を含む薬剤１００μｌを添加し、細胞をさらに７２時間培養した。５−フルオロ−２’−デオキシ−ウリジン−５’−１リン酸（ＦｄＵＭＰ）、ロイコボリン、ＺＤ１６４９、ＭＴＡ、ＧＷ１８４３Ｕ８９、ＺＤ９３３１、ＡＧ３３７、及びＰＴ５２３などの薬剤濃度の範囲は、１×１０−５〜１×１０−１１Ｍであった。５−ＦＵは、１０μＭロイコボリンの存在下或いは非存在下で１×１０−４〜１×１０−１０Ｍの範囲でテストした。薬剤への暴露の７２時間後、前記細胞はトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で固定し、ＳＲＢタンパク質色素で染色した。結果は、Ｐｅｔｅｒｓら（（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５４：４５０〜４５５）によって報告された以下の公式に従って、薬剤暴露期間の最初と最後での光学密度（ＯＤ５４０）における違いに基づいた対照増殖％として示した。
【０１６９】
【数３】
2008500025.tif 000020
【０１７０】
ＩＣ５０値は、未処理対照細胞の値と比較して細胞増殖の５０％減少と対応する薬剤濃度として定義された吸収値に基づいて計算した。
【０１７１】
実施例１１  抗葉酸抗体及び抗葉酸化合物の組み合わせ
併用治療のために、卵巣癌細胞に対する上述したアッセイ及び本発明のモノクローナル抗体を用いて、有効性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定した。当業者であればｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性アッセイから用量を想定し、患者における有効な範囲を決定することが可能である。さらに、投与として当技術分野で許容されている抗体の用量は様々な葉酸阻害剤として許容され、最少量で最大限の利益を達成するように調節されている用量と適合可能である。当業者であればこれらの用量を調節し、ルーチン実験、特に上で提供された抗体に対する用量のガイダンスによって、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける効果を決定するために記載されたアッセイによって望ましい効果を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１は、ＦＲ−αの多量体型及び単量体型を示している腫瘍細胞のウェスタンブロットを示したものである。
【図２】図２は、ＦＲ−αが発現した大腸菌のウェスタンブロットを示したものである。
【図３】図３は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が存在若しくは欠如溶液に溶けたＦＲ−αのウェスタンブロットを示したものである。
【図４】図４は、本発明の抗体産生細胞を同定するためのスクリーニング方法を例示したものである。
【図５Ａ】図５Ａは、配列ＩＤ番号３のアミノ酸配列を有する本発明の抗ＦＲ−α抗体の軽鎖の配列アライメント及び、配列ＩＤ番号２４のアミノ酸配列を有する異常翻訳産物の軽鎖を例示したものである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、配列ＩＤ番号８の配列を有する本発明の抗ＦＲ−α抗体の軽鎖の核酸配列の配列アライメント及び、配列ＩＤ番号２５の配列を有する異常翻訳産物をコードする核酸配列を例示したものである。
【図１】
2008500025.tif 000021
【図２】
2008500025.tif 000022
【図３】
2008500025.tif 000023
【図４】
2008500025.tif 000024
【図５Ａ】
2008500025.tif 000025
【図５Ｂ】
2008500025.tif 000026
【配列表】
2008500025000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月23日(2007.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
【図１】図１は、ＦＲ−αの多量体型及び単量体型を示している腫瘍細胞のウェスタンブロットを示したものである。
【図２】図２は、ＦＲ−αが発現した大腸菌のウェスタンブロットを示したものである。
【図３】図３は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が存在若しくは欠如溶液に溶けたＦＲ−αのウェスタンブロットを示したものである。
【図４】図４は、本発明の抗体産生細胞を同定するためのスクリーニング方法を例示したものである。
【図５Ａ】図５Ａは、配列ＩＤ番号３のアミノ酸配列を有する本発明の抗ＦＲ−α抗体の軽鎖の残基１〜６０の配列アライメント及び、配列ＩＤ番号２４のアミノ酸配列を有する異常翻訳産物の軽鎖の残基１〜６０を例示したものである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、配列ＩＤ番号８の配列を有する本発明の抗ＦＲ−α抗体の軽鎖の核酸配列の配列アライメント及び、配列ＩＤ番号２５の配列を有する異常翻訳産物をコードする核酸配列を例示したものである。
【国際調査報告】
2008500025.tif 000062
2008500025.tif 000063
2008500025.tif 000064
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