(57)【要約】本明細書中に記載されているのは、１つ以上の呼吸器系病原体に由来する１つ以上のタンパク質に対する免疫反応を刺激するための、組成物および方法である。具体的には、本発明は、１つ以上の呼吸器系病原体に由来する１つ以上の抗原を発現する、アルファウイルスレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、およびアルファウイルスレプリコン粒子に関する。また、本発明は、これら免疫原性組成物を作製し使用する方法にも関する。
2008500399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子であって、以下:
（ｉ）呼吸器系病原体に由来する少なくとも１つの免疫原性タンパク質をコードする第１の異種核酸、および
（ｉｉ）呼吸器系病原体に由来する少なくとも１つの免疫原性タンパク質をコードする第２の異種核酸
を含み、該第１および第２の異種核酸が、ともに同一のパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、同一のＲＳウイルス（ＲＳＶ）、または同一のＳＡＲＳウイルスに由来する免疫原性タンパク質をコードする場合には、該組成物は、該第２の異種核酸を含む第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子をさらに含む、第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子；ならびに
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤
を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子が、前記第１および第２の異種核酸をコードする、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物であって、前記第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子が、前記第１の異種核酸配列を含み、該第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子が、前記第２の異種核酸を含む、免疫原性組成物。
【請求項４】
前記呼吸器系病原体が、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、ヒトメタニューモウイルス、およびＳＡＲＳウイルスからなる群から選択されるウイルスである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記呼吸器系病原体が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、型別不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽菌）、およびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（レジオネラ症）からなる群から選択される細菌である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記第１の異種核酸が、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、およびＮ９からなる群から選択されるインフルエンザウイルス亜型に由来する、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼタンパク質をコードする、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記第１の異種核酸が、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼタンパク質をコードし、前記アルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子が、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質をコードする第２の異種核酸をさらに含む、請求項４または請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記第２の異種核酸が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、およびＨ１５からなる群から選択されるインフルエンザウイルス亜型に由来する赤血球凝集素タンパク質をコードする、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記第１の異種核酸が、第１のアルファウイルスサブゲノム接合部プロモーターと作動可能に連結していて、前記第２の異種核酸が、第２のアルファウイルスサブゲノム接合部プロモーターと作動可能に連結している、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記第１または第２の異種核酸が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に相当する核酸をさらに含む、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記第１の異種核酸が、インフルエンザウイルスのタンパク質をコードし、前記第２の異種核酸が、ＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質をコードする、請求項１、請求項２、請求項３、および請求項４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記第１の異種核酸が、パラインフルエンザウイルスのタンパク質をコードし、前記第２の異種核酸が、ＲＳウイルスのタンパク質をコードする、請求項１、請求項２、請求項３、および請求項４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記第１の異種核酸が、ＲＳウイルスのタンパク質をコードし、前記第２の異種核酸が、ヒトメタニューモウイルスのタンパク質をコードする、請求項１、請求項２、請求項３、および請求項４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
インフルエンザウイルスのタンパク質をコードする前記第１または第２の異種核酸が、赤血球凝集素タンパク質をコードする配列、ノイラミニダーゼタンパク質をコードする配列、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする配列、およびマトリックスタンパク質をコードする配列からなる群から選択される、請求項１、請求項２、請求項３、および請求項４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
ＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質をコードする前記第１または第２の異種核酸が、スパイクタンパク質をコードする核酸、エンベロープタンパク質をコードする核酸、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸、およびマトリックスタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される、請求項１、請求項２、請求項３、および請求項４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ヒトメタニューモウイルスのタンパク質をコードする前記第１または第２の異種核酸が、糖タンパク質Ｇをコードする核酸、融合タンパク質をコードする核酸、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸、およびマトリックスタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される、請求項１、請求項２、請求項３、および請求項４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
パラインフルエンザウイルスのタンパク質をコードする前記第１または第２の異種核酸が、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質をコードする核酸、融合タンパク質をコードする核酸、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸、およびマトリックスタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される、請求項１、請求項２、請求項３、および請求項４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
ＲＳウイルスのタンパク質をコードする前記第１または第２の異種核酸が、糖タンパク質Ｇをコードする核酸、融合タンパク質をコードする核酸、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸、およびマトリックスタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される、請求項１、請求項２、請求項３、および請求項４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子が、シンドビスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、およびロス川ウイルスからなる群から選択される１つ以上のアルファウイルスに由来するものである、請求項１〜請求項１９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子が、シンドビスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、およびロス川ウイルスからなる群から選択される１つ以上のアルファウイルスに由来するものである、請求項１〜請求項１９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記免疫原性組成物が凍結乾燥されている、請求項１〜請求項２１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
哺乳動物において免疫反応を刺激する方法であって、請求項１〜請求項２２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を該哺乳動物に投与して免疫反応を生じさせることを含む方法。
【請求項２４】
第２の免疫原性組成物を哺乳動物に投与する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法であって、該第２の免疫原性組成物が
ａ）前記異種核酸と実質的に同じ源に由来するタンパク質、ポリペプチド、または該タンパク質もしくは該ポリペプチドの一部、および
ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤
を含む、方法。
【請求項２５】
第２の免疫原性組成物を投与する前記工程が、アジュバントを投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の免疫原性組成物が、さらにアジュバントを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１または第２の免疫原性組成物が、筋肉内、鼻腔内、皮下、皮内、気管内、および経口からなる群から選択される経路によって投与される、請求項２３〜請求項２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
第２の免疫原性組成物を投与する第２の工程をさらに含む、請求項２３に記載の免疫反応を刺激する方法であって、該第２の免疫原性組成物が
ａ）前記異種核酸と実質的に同じ源に由来するタンパク質、ポリペプチド、または該タンパク質もしくは該ポリペプチドの一部をコードする、非アルファウイルス由来のウイルスベクター、および
ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤
を含む、方法。
【請求項２９】
第２の免疫原性組成物を投与する第２の工程をさらに含む、請求項２３に記載の免疫反応を刺激する方法であって、該第２の免疫原性組成物が
ａ）前記異種核酸と実質的に同じ源に由来するタンパク質、ポリペプチド、または該タンパク質もしくは該ポリペプチドの一部をコードする、弱毒化ウイルス、および
ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤
を含む、方法。
【請求項３０】
請求項１〜請求項２２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
【請求項３１】
ａ）実質的に精製された不活化パラインフルエンザウイルスの調製物、
ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤、および
ｃ）ＭＦ５９またはＬＴＫ６３から選択されるアジュバント
を含む、免疫原性組成物。
【請求項３２】
前記アジュバントがＭＦ５９である、請求項３１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
哺乳動物において免疫反応を刺激する方法であって、請求項３１または請求項３２に記載の免疫原性組成物を該哺乳動物に投与して免疫反応を生じさせることを含む方法。
【請求項３４】
前記免疫原性組成物が、筋肉内、鼻腔内、皮下、皮内、気管内、および経口からなる群から選択される経路によって投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
免疫原性組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）インフルエンザウイルスに由来する第１の免疫原性ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１の異種核酸を含む第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤
を含む、免疫原性組成物。
【請求項３６】
赤血球凝集素タンパク質、ヌクレオカプシド、マトリックスタンパク質、および第２のノイラミニダーゼタンパク質からなる群から選択される、インフルエンザウイルス由来の第２の免疫原性タンパク質をコードする第２の異種核酸をさらに含む、請求項３５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
前記第２の免疫原性タンパク質が、１つ以上のパンデミックなインフルエンザウイルス株またはパンデミックである可能性があるインフルエンザウイルス株に由来する赤血球凝集素タンパク質である、請求項３６に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
前記第２の免疫原性タンパク質が、１つ以上のインターパンデミックなインフルエンザウイルス株に由来する赤血球凝集素タンパク質である、請求項３６に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
前記第２の免疫原性タンパク質が、１つ以上のパンデミックなインフルエンザウイルス株またはパンデミックである可能性があるインフルエンザウイルス株と、１つ以上のインターパンデミックなインフルエンザウイルス株との組み合わせに由来する赤血球凝集素タンパク質である、請求項３６に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
前記第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子が、前記第２の異種核酸を含む、請求項３６〜請求項３９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子が、前記第２の異種核酸を含む、請求項３６〜請求項３９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
前記呼吸器系病原体がインフルエンザウイルスであり、前記第１の異種核酸が、第１のインフルエンザウイルス株に由来する赤血球凝集素タンパク質をコードし、前記第２の異種核酸が、第２のインフルエンザウイルス株に由来する赤血球凝集素タンパク質をコードする、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
１つ以上の更なるインフルエンザウイルス株に由来する１つ以上の更なる免疫原性タンパク質をコードする１つ以上の更なる異種核酸をさらに含む、請求項４２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
前記赤血球凝集素タンパク質が、１つ以上のパンデミックなインフルエンザウイルス株またはパンデミックである可能性があるインフルエンザウイルス株に由来する、請求項４２または請求項４３に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
前記赤血球凝集素タンパク質が、１つ以上のインターパンデミックなインフルエンザウイルス株に由来する、請求項４２または請求項４３に記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
前記赤血球凝集素タンパク質が、１つ以上のパンデミックなインフルエンザウイルス株またはパンデミックである可能性があるインフルエンザウイルス株と、１つ以上のインターパンデミックなインフルエンザウイルス株との組み合わせに由来する、請求項４２または請求項４３に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般に、呼吸器系病原体に対する免疫反応を刺激するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、呼吸器系病原体に由来する１つ以上の抗原を発現するアルファウイルスレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、アルファウイルスレプリコン粒子に関する。本明細書に記載された組成物は、１つ以上の呼吸器系病原体に対する（例えば、予防的および／または治療的な）免疫反応を生じさせるのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
アルファウイルスは、トガウイルス科の一連の遺伝的、構造的、および血清学的に近縁の節足動物媒介性ウイルスを含む。シンドビスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、ロス川ウイルス（ＲＲ）、およびベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルスなど、少なくとも２６種の既知のウイルスおよびウイルス亜型がアルファウイルス属に分類されている。
【０００３】
シンドビスウイルスは、トガウイルス科アルファウイルス属のプロトタイプメンバーである。その複製戦略は多様な培養細胞において十分に特徴付けられており、他のアルファウイルスのモデルとなっている。要するに、シンドビスのゲノムは（他のアルファウイルス同様）、キャップされ、ポリアデニル化され、また、ウイルスにコードされたカプシドタンパク質殻内に含まれる、約１２ｋｂの単鎖のプラスセンスＲＮＡ分子である。ヌクレオカプシドは宿主に由来する脂質エンベロープでさらに囲まれており、その中に２個のウイルス特異的糖タンパク質Ｅ１およびＥ２が挿入され、細胞質尾部によってヌクレオカプシドに固定されている。特定のアルファウイルス（例えばＳＦＶ）は、さらに、Ｅ２前駆タンパク質ＰＥ２の切断産物である別のタンパク質Ｅ３を保持している。
【０００４】
ウイルス粒子が標的細胞に吸着し、浸透し、そしてヌクレオカプシドを脱殻してウイルスのゲノムＲＮＡを細胞質中に放出すると、ウイルスゲノムの５’末端の３分の２のところから翻訳される４種のアルファウイルスの非構造タンパク質（ｎｓＰ）およびその前駆体によって複製過程が媒介される。次に、完全長マイナス鎖ＲＮＡが合成されて、さらに別のプラス鎖ゲノムＲＮＡ、およびサブゲノム接合部プロモーターから内部的に開始されて大量に発現される２６ＳサブゲノムＲＮＡを合成するための鋳型が提供される。アルファウイルス構造タンパク質は、ゲノムの３’末端側の３分の１に相当するサブゲノム２６ＳＲＮＡから翻訳され、ｎｓＰｓのように、翻訳後に加工されて個々のタンパク質、カプシド、Ｅ１およびＥ２（ｐＥ２）になる。
【０００５】
呼吸器系ウイルス病原体において、アルファウイルスレプリコンベクターに基づくワクチンを、インフルエンザ（ＦＬＵ）、呼吸器系合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）のような呼吸器系ウイルスに対する免疫反応を刺激する手段として利用するための、さまざまな方法が開示されてきた。より具体的には、ＦＬＵに関するいくつかの研究では、各研究が、単一のＨＡ抗原または単一のＮＰ抗原を発現するレプリコンベクターの使用のみに取り組んできた（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７参照）。
【０００６】
免疫反応を刺激するために、ＨＡまたはＮＰ以外の代替的ＦＬＵ抗原をコードする遺伝子を組み込む、アルファウイルスに基づく戦略を使うこと、または、１個より多いＦＬＵ抗原をコードする遺伝子を組み込む、アルファウイルスに基づく免疫原性組成物またはワクチンを使うことは記載されていない。したがって、これらの不十分な点に対処する改良型アルファウイルスベースのＦＬＵワクチンに対する需要が存在する。
【０００７】
ＲＳＶに対するワクチン戦略として、Ｇ抗原またはＦ抗原を発現するアルファウイルスベクターが検討されてきた（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、非特許文献８、非特許文献９）。ＰＩＶに関しても同様に、ＨＮ抗原またはＦ抗原を発現するベクターが提案されてきた（特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０）。しかし、ＨＮ、Ｇ、またはＦ以外の代替的ＲＳＶ抗原またはＰＩＶ抗原を組み込んで免疫反応を刺激する、アルファウイルスに基づく戦略を使うこと、または、複数のＲＳＶ抗原またはＰＩＶ抗原を組み合わせる、アルファウイルスベースの免疫原性組成物またはワクチンを使うことは記載されていない。
【特許文献１】米国特許第６０６０３０８Ａ号明細書
【特許文献２】米国特許第６４２８３２４Ｂ１号明細書
【特許文献３】米国特許第６４７５７８０Ｂ１号明細書
【特許文献４】国際公開第９９１１８０８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９９２５８５８号パンフレット
【特許文献６】米国特許第６０６０３０８Ａ号明細書
【特許文献７】米国特許第６４２８３２４Ｂ１号明細書
【特許文献８】米国特許第６４７５７８０Ｂ１号明細書
【特許文献９】国際公開第９９１１８０８号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第９９２５８５８号パンフレット
【非特許文献１】Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅら，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００４年，第２２巻，ｐ．１１０４−１３
【非特許文献２】Ｂｅｒｇｌｕｎｄら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９９年，第１７巻，ｐ．４９７−５０７
【非特許文献３】Ｂｅｒｇｌｕｎｄら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８年，第１６巻，ｐ．５６２−５６５
【非特許文献４】Ｐｕｓｈｋｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７年，第２３９巻，ｐ．３８９−４０１
【非特許文献５】Ｚｈｏｕら，ＰＮＡＳ，１９９５年，第９２巻，ｐ．３００９−３０１３
【非特許文献６】Ｖｉｇｎｕｚｚｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，２００１年，第８２巻，ｐ．１７３７−１７４７
【非特許文献７】Ｓｃｈｕｌｔｚ−Ｃｈｅｒｒｙら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００年，第２７８巻，ｐ．５５−５９
【非特許文献８】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏ．，２０００年，第２９巻，ｐ．２４７−２５３
【非特許文献９】Ｆｌｅｅｔｏｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２００１年，第１８３巻，ｐ．１３９５−１３９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ウイルス、細菌および真菌などの呼吸器系病原体に対する免疫反応をより効果的に刺激する手段として、アルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物およびレプリコン粒子を作製して使用する組成物および方法、ならびに、このようなアルファウイルスベースのベクターを含むワクチンに対する需要が依然として存在している。さらに、１つより多い呼吸器系病原体（例えば、混合免疫原またはワクチン）に対する免疫反応を刺激する手段として、アルファウイルスレプリコンベクターおよびレプリコン粒子を効果的に組み合わせるか、または共発現構築物として作製して使用する組成物および方法、ならびに、そのようなアルファウイルスベースのレプリコンを含むワクチンに対する需要が依然として存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
呼吸器系ウイルス、細菌および真菌など、呼吸器系病原体は、アルファウイルスレプリコンベクターベースのワクチン法に適した標的である。呼吸器系ウイルス病原体は、例えば、インフルエンザウイルス（ＦＬＵ）、呼吸器系合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）などを含むことができる。
【００１０】
このようにレプリコンベースの方法の主要な商業的用途は人間用予防ワクチンであるが、本発明はまた、獣医学的用途のために同様の戦略を使うことをも意図しており、上記のウイルス群から多数の動物呼吸器系ウイルス病原体が、例えばウシ、ウマ、ブタ、家禽、イヌおよびネコなどにおいて同定されて、その特性が明らかにされている。獣医学分野における非限定的な呼吸器系ウイルス病原体の具体例としては、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、鳥感染性気管支炎ウイルス、ウシＲＳウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、馬ヘルペスウイルス、ウシ鼻気管炎ウイルス、イヌジステンパーウイルス、およびネコカリシウイルスなどが挙げられる。
【００１１】
本発明は、呼吸器系病原体に由来する１個以上の異種ポリペプチドをコードするアルファウイルスレプリコンベクター、アルファウイルスベクター構築物およびアルファウイルスレプリコン粒子を含む組成物、および、これらのレプリコンベクター、ベクター構築物およびレプリコン粒子を作製し、使用する方法を含む。特定の実施形態において、該アルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子は、１つ以上の呼吸器系病原体に由来するタンパク質の組み合わせをコードする２つ以上の異種配列を含んでいる。
【００１２】
１つの態様において、アルファウイルスベクター構築物または粒子は、呼吸器系病原体に由来するタンパク質をコードする第１の異種核酸を含んでいる。特定の実施形態において、呼吸器系病原体は、例えばインフルエンザ（ＦＬＵ）のようなウイルスを含んでおり、異種核酸は赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質またはノイラミダーゼ（ＮＡ）タンパク質をコードする。
【００１３】
別の態様において、本明細書に記載されている免疫原性組成物は、病原体のさまざまな株に由来する同一のタンパク質（例えば、大流行を起こしているか、起こす可能性がある株など、さまざまな株に由来するＦＬＵのＨＡ型タンパク質）をコードする異種配列、同一の病原体の異なるタンパク質（例えば、ＦＬＵのＨ１およびＨ２タンパク質、またはＲＳＶのＧタンパク質およびＦタンパク質）をコードする異種配列、異なる病原体の同じタンパク質（例えば、ＦＬＵノイラミニダーゼおよびＰＩＶノイラミニダーゼ）コードする異種配列、および／または、異なる病原体の異なるタンパク質をコードする異種配列などが含まれるが、これらに限定されない異種配列の組み合わせを含む。本明細書中に例示された組み合わせは例示に過ぎず、タンパク質の任意の組み合わせを利用できるものと理解されるべきである。
【００１４】
さらに、任意の数のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、または粒子を用いて１つ以上の異種配列を担持することが可能である。特定の実施形態において、該異種配列は、同一のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、または粒子上に含まれている。例えば、１つ以上のインフルエンザ抗原（例えば、ＮＡタンパク質および／またはＨＡタンパク質）は、本明細書に記載されているような１つのアルファウイルス構築物または粒子によってコードされうる。複数の抗原が含まれている場合、それらの抗原は複数のパンデミックな（またはパンデミックとなる可能性のあるウイルス）、および／またはインターパンデミック（ｉｎｔｅｒｐａｎｄｅｍｉｃ）な（「年間流行性（ａｎｎｕａｌ）」とも呼ばれる）インフルエンザ株に由来している可能性がある。組成物は、潜在的なパンデミックに対する予防的および／または治療的な免疫反応を被験体に生じさせる上で、および／または、複数の株に対して有効なワクチンを提供するために、有用である。本明細書に記載されている組成物は、従来の卵を用いるＦＬＵワクチン（典型的には３種の抗原に限定され、また、卵の供給によっても制限される）よりも多様な抗原を含んでいるため、より優れた防御を提供することができる。さらに、本明細書に記載されている組成物は、より多様な抗原を含むことができるため、例えば抗原シフトに対して毎年ｆｌｕワクチンを組成変更する必要を減少させるか排除する。高齢、若年、または免疫低下している個体などにおいても、より高い効能が、本発明に係る組成物によってもたらされる可能性がある。
【００１５】
他の実施形態において、別々のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、または粒子に１つ以上の異種配列が（例えば、第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、または粒子内に１つ以上の異種配列、ならびに第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物または粒子上に１つ以上の異種配列が）含まれている。
【００１６】
このように、本明細書に記載されている組成物が、１つ以上の呼吸器系病原体に由来する複数の抗原タンパク質（例えば、複数のパンデミックおよび／またはインターパンデミックなＦＬＵ抗原）を含みうることによって、既述のものよりも多様な株および病原体に対する免疫反応を生じさせることが可能であることが明らかになろう。また、本明細書に記載されている組成物は、さらに１種以上の免疫原性組成物で追加免疫投与する前に初回刺激投与する場合などがあるが、そのような場合に限定されず、多様な組み合わせで使用可能であることも明らかになろう。
【００１７】
特定の実施形態において、本明細書に記載されている組成物は初回刺激投与として、および追加免疫として使用されるタンパク質として使われる。追加免疫投与のタンパク質は、異種配列によってコードされる１つ以上のタンパク質、および／または別のタンパク質を含むことができる。例えば、多数の（パンデミックおよび／またはインターパンデミックの）抗原性ＦＬＵタンパク質をコードする異種配列を含む本明細書記載の組成物を、１種以上のＦＬＵタンパク質（例えば、従来型の３抗原ＦＬＵワクチン）を投与する前に１回以上投与してもよい。
【００１８】
あるいは、本明細書に記載されている組成物を初回刺激および追加免疫に使用してもよい。例えば、パンデミック株に由来する多数の抗原ＦＬＵタンパク質をコードする異種配列を含む本明細書記載の組成物を、インターパンデミック株に由来する多数の抗原ＦＬＵタンパク質をコードする異種配列を含む本明細書記載の組成物よりも前に投与してもよい。
【００１９】
本明細書に記載した任意の実施形態において、１回以上初回刺激した後、１回以上追加免疫することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
したがって、本発明は以下の番号付けされた実施形態を含むが、それらに限定されない。
１．（ａ）インフルエンザウイルスノイラミニダーゼタンパク質をコードする異種核酸を含むアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
２．ノイラミニダーゼタンパク質をコードする上記の核酸が、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、およびＮ９からなる群から選択されたインフルエンザウイルス亜型に由来するものである、実施形態１に記載された免疫原性組成物。
３．上記アルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子が、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質をコードする異種核酸をさらに含む、実施形態１に記載された免疫原性組成物。
４．赤血球凝集素タンパク質をコードする上記核酸がＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、およびＨ１５からなる群から選択されたインフルエンザウイルス亜型に由来する、実施形態３に記載された免疫原性組成物。
５．ノイラミニダーゼタンパク質をコードする上記核酸が第１のアルファウイルスサブゲノム接合部プロモーターと作動可能に連結し、また赤血球凝集素タンパク質をコードする上記核酸が第２のアルファウイルスサブゲノム接合部プロモーターと作動可能に連結している、実施形態３に記載された免疫原性組成物。
６．上記異種核酸が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に相当する核酸をさらに含む、実施形態３に記載された免疫原性組成物。
７．（ａ）パラインフルエンザウイルス赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１の異種核酸、およびパラインフルエンザウイルス融合タンパク質をコードする第２の異種核酸を含むアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む免疫原性組成物。
８．赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質をコードする上記核酸が第１のアルファウイルスサブゲノム接合部プロモーターと作動可能に連結し、融合タンパク質をコードする上記核酸が第２のアルファウイルスサブゲノム接合部プロモーターと作動可能に連結している、実施形態７に記載された免疫原性組成物。
９．上記核酸が配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に相当する核酸をさらに含む、実施形態７に記載された免疫原性組成物。
１０．（ａ）呼吸器系合胞体ウイルス糖タンパク質Ｇをコードする第１の異種核酸、および呼吸器系合胞体ウイルス融合タンパク質をコードする第２の異種核酸を含み、該第１および第２の異種核酸が配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている、アルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、ならびに（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
１１．（ａ）ヒトメタニューモウイルス糖タンパク質をコードする異種核酸を含むアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
１２．（ａ）インフルエンザウイルスタンパク質をコードする第１の異種核酸、およびＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質、呼吸器系合胞体ウイルスのタンパク質、パラインフルエンザウイルスのタンパク質およびヒトメタニューモウイルスのタンパク質からなる群から選択された１つのタンパク質をコードする第２の異種核酸を含むアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
１３．上記第２の異種核酸がＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質をコードする、実施形態１２の免疫原性組成物。
１４．（ａ）パラインフルエンザウイルスのタンパク質をコードする第１の異種核酸、および、呼吸器系合胞体ウイルスのタンパク質、ＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質およびヒトメタニューモウイルスのタンパク質からなる群から選択された１つのタンパク質をコードする第２の異種核酸を含むアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
１５．上記第２の異種核酸が呼吸器系合胞体ウイルスのタンパク質をコードする、実施形態１４の免疫原性組成物。
１６．（ａ）呼吸器系合胞体ウイルスのタンパク質をコードする第１の異種核酸、および、ヒトメタニューモウイルスのタンパク質、パラインフルエンザウイルスのタンパク質およびＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質からなる群から選択された１つのタンパク質をコードする第２の異種核酸を含むアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
１７．上記第２の異種核酸がヒトメタニューモウイルスのタンパク質をコードする、実施形態１６の免疫原性組成物。
１８．（ａ）インフルエンザウイルスのタンパク質をコードする異種核酸を含む第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、（ｂ）ＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質、呼吸器系合胞体ウイルスのタンパク質、パラインフルエンザウイルスのタンパク質およびヒトメタニューモウイルスのタンパク質からなる群から選択された１つのタンパク質をコードする異種核酸を含む第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｃ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
１９．上記第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子がＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質をコードする、実施形態１８の免疫原性組成物。
２０．（ａ）パラインフルエンザウイルスのタンパク質をコードする異種核酸を含む第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、（ｂ）呼吸器系合胞体ウイルスのタンパク質、ＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質およびヒトメタニューモウイルスのタンパク質からなる群から選択された１つのタンパク質をコードする異種核酸を含む第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｃ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
２１．上記第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子が呼吸器系合胞体ウイルスのタンパク質をコードする、実施形態２０の免疫原性組成物。
２２．（ａ）呼吸器系合胞体ウイルスのタンパク質をコードする異種核酸を含む第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、（ｂ）ヒトメタニューモウイルスのタンパク質、パラインフルエンザウイルスのタンパク質およびＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質からなる群から選択された１つのタンパク質をコードする異種核酸を含む第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｃ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
２３．上記第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子がヒトメタニューモウイルスのタンパク質をコードする、実施形態２２の免疫原性組成物。
２４．（ａ）インフルエンザウイルスのタンパク質をコードする第１の異種核酸を含む第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、（ｂ）インフルエンザウイルスタンパク質をコードする第２の異種核酸であって、上記第１の異種核酸とは異なる第２の異種核酸を含む、第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｃ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
２５．（ａ）パラインフルエンザウイルスのタンパク質をコードする第１の異種核酸を含む第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、（ｂ）パラインフルエンザウイルスタンパク質をコードする第２の異種核酸であって、上記第１の異種核酸とは異なる第２の異種核酸を含む、第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｃ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
２６．（ａ）呼吸器系合胞体ウイルスのタンパク質をコードする第１の異種核酸を含む第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、（ｂ）呼吸器系合胞体ウイルスのタンパク質をコードする第２の異種核酸であって、上記第１の異種核酸とは異なる第２の異種核酸を含む、第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｃ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
２７．（ａ）ＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質をコードする第１の異種核酸を含む第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、（ｂ）ＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質をコードする第２の異種核酸であって上記第１の異種核酸とは異なる第２の異種核酸を含む、第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｃ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
２８．（ａ）ヒトメタニューロウイルスのタンパク質をコードする第１の異種核酸を含む第１のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、（ｂ）ヒトメタニューロウイルスのタンパク質をコードする第２の異種核酸であって上記第１の異種核酸とは異なる第２の異種核酸を含む、第２のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｃ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
２９．（ａ）インフルエンザウイルスのタンパク質をコードする第１の異種核酸、および上記第１の異種核酸とは異なる、インフルエンザウイルスのタンパク質をコードする上記第２の異種核酸を含むアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、またはレプリコン粒子、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
３０．さらにアジュバントを含む、実施形態１〜２９のいずれかに記載された免疫原性組成物。
３１．インフルエンザウイルスのタンパク質をコードする上記核酸が、赤血球凝集素タンパク質をコードする配列、ノイラミニダーゼタンパク質をコードする配列、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする配列、およびマトリックスタンパク質をコードする配列からなる群から選択される、実施形態１２、１８、２４および２９のいずれかに記載された免疫原性組成物。
３２．ＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質をコードする上記核酸が、スパイクタンパク質をコードする核酸、エンベロープタンパク質をコードする核酸、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸、およびマトリックスタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される、実施形態１２、１３、１４、１６、１８、１９、２０、２２、および２７のいずれかに記載された免疫原性組成物。
３３．ヒトメタニューロウイルスのタンパク質をコードする上記核酸が、糖タンパク質Ｇをコードする核酸、融合タンパク質をコードする核酸、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸、およびマトリックスタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される、実施形態１２、１４、１６、１７、１８、２０、２２、２３、および２８のいずれかに記載された免疫原性組成物。
３４．パラインフルエンザウイルスのタンパク質をコードする上記核酸が、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質をコードする核酸、融合タンパク質をコードする核酸、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸、およびマトリックスタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される、実施形態１２、１４、１６、１８、２０、２２、および２５のいずれかに記載された免疫原性組成物。
３５．呼吸器系合胞体ウイルスのタンパク質をコードする上記核酸が、糖タンパク質Ｇをコードする核酸、融合タンパク質をコードする核酸、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸、およびマトリックスタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される、実施形態１２、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、および２６のいずれかに記載された免疫原性組成物。
３６．上記のアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物、およびレプリコン粒子が、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、およびロス川ウイルスからなる群から選択された１つ以上のアルファウイルスに由来する、実施形態１〜２９のいずれかに記載された免疫原性組成物。
３７．上記免疫原性組成物が凍結乾燥されている、実施形態１〜２９のいずれかに記載された免疫原性組成物。
３８．哺乳動物において免疫反応を刺激する方法であって、実施形態１〜３０に記載された免疫原性組成物を該哺乳動物に投与して免疫反応を生じさせることを含む方法。
３９．（ａ）上記異種核酸と実質的に同じ源に由来するタンパク質、ポリペプチド、またはその一部、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む第２の免疫原性組成物を投与する第２の工程をさらに含む、実施形態３８に記載された免疫反応を活性化させる方法。
４０．第２の免疫原性組成物を投与する上記第２の工程がアジュバントを投与することをさらに含む、実施形態３９に記載された方法。
４１．筋肉内、鼻腔内、皮下、皮内、気管内、および経口から選択された経路で上記免疫原性組成物が投与される、実施形態３８に記載された方法。
４２．（ａ）異種核酸と実質的に同じ源に由来するタンパク質、ポリペプチド、またはその一部をコードする、非アルファウイルス由来のウイルス性ベクター、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む第２の免疫原性組成物を投与する第２の工程をさらに含む、実施形態３８に記載された免疫反応を刺激する方法。
４３．（ａ）異種核酸と実質的に同じ源に由来するタンパク質、ポリペプチド、またはその一部をコードする、弱毒化ウイルス、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む第２の免疫原性組成物を投与する第２の工程をさらに含む、実施形態３８に記載された免疫反応を刺激する方法。
４４．実施形態１〜３７のいずれかにおけるような免疫原性組成物を含むワクチン。
４５．（ａ）実質的に精製され不活性化されたパラインフルエンザウイルスの調製物、（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤、および（ｃ）アジュバントを含む免疫原性組成物。
４６．上記アジュバントがＭＦ５９、ＬＴＫ６３、およびミョウバンからなる群から選択される、実施形態４５に記載された免疫原性組成物。
４７．（ａ）実質的に精製され不活性されたパラインフルエンザウイルスの調製物、（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤、および（ｃ）アジュバントを含むパラインフルエンザウイルスワクチン。
４８．上記アジュバントがＭＦ５９、ＬＴＫ６３、およびミョウバンからなる群から選択される、実施形態４５に記載されたワクチン。
４９．哺乳動物中において免疫反応を刺激する方法であって、実施形態４５に記載された免疫原性組成物、または実施形態４７に記載されたワクチンを上記哺乳動物に投与して、免疫反応を生じさせることを含む方法。
５０．上記の免疫原性組成物またはワクチンが、筋肉内、鼻腔内、皮下、皮内、気管内、および経口からなる群から選択された経路で投与される、実施形態４９に記載された方法。
【００２１】
本発明の上記およびその他の態様および実施形態は、以下の詳細な説明、添付の図面、および、特定の手順または組成物（例えば、プラスミド、配列など）をより詳細に説明する本明細書に記載されたさまざまな参考文献を参照すれば明らかになろう。
【００２２】
（詳細な説明）
本発明は、呼吸器系病原体をコードする少なくとも１つの異種核酸を含むアルファウイルスレプリコンベクター、アルファウイルスベクター構築物、またはアルファウイルスレプリコン粒子を含む免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物（例えばワクチン）は、被験体に投与して免疫反応を生じさせるのに有用である。
【００２３】
本発明の実施には、別段の記載がない限り、当分野における技術に含まれる、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法が利用される。このような技術は文献において十分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ．（Ｒｅａｍら編，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），第２版（ＮｅｗｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ編，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）；ＰｅｔｅｒｓらＤａｌｒｙｍｐｌｅ，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版），Ｆｉｅｌｄｓら（編），Ｂ．Ｎ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照。
【００２４】
本明細書に引用されたすべての出版物、特許および特許出願は、前掲のものも後掲のものも、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００２５】
本明細書において、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容から別段であることが明確に示されない限り複数形も意味する。したがって、例えば、「１個の粒子」に言及することは２個以上のその粒子の混合物を含む。
【００２６】
本発明を説明する前に、本明細書中以下で使用されるいくつかの用語の定義を示す。
【００２７】
１個の「核酸」分子は、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡ、真核生物のｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列も含むことができるが、これらに限定されない。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基アナログのいずれかを含む配列をも含み、本来の配列に対する欠失、付加および置換などの改変（性質において一般に保存的である）を含む。これらの改変は、部位特異的突然変異によるなど、計画的なものであってもよく、または偶発的なものであってよい。ポリヌクレオチドの改変は、例えば、宿主細胞中でのポリペプチド産物の発現が促進されるなど、いくつもの効果を生じうる。
【００２８】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の多量体を意味し、その生成物の最短のものに限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義に含まれる。完全長タンパク質もそれらのフラグメントもこの定義に含まれる。また、これらの用語は、ポリペプチドの発現後の修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明の目的にとって、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、本来の配列に対する欠失、付加および置換などの（性質において一般に保存的である）改変を含むタンパク質を意味する。これらの改変は、部位特異的突然変異によるなど、計画的なものであってもよく、または、そのタンパク質を産生する宿主の突然変異、またはＰＣＲ増幅によるエラーによるものなど、偶発的なものであってもよい。さらに、次の効果の１つ以上をもつ改変が行われてもよい。すなわち、毒性の減少、細胞のプロセシングの促進（例えば、分泌、抗原提示など）、ならびにＢ細胞および／またはＴ細胞に対する提示の促進。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書においては同義的に使われ、アミノ酸残基の任意の多量体を意味する。これらの用語は、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などを包含する。このようなポリペプチドは天然源に由来し得、合成され得、または組換え技術によって作出することが可能である。また、これらの用語は、ポリペプチドが発現後に修飾されること、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども含む。
【００２９】
本明細書中で定義されるポリペプチドは一般に２０個の天然アミノ酸
【００３０】
【化１】
2008500399.tif 000003
からなり、いくつかの既知のアミノ酸アナログであって、天然および合成のアナログの任意のもの、例えば、ホモイソロイシン、アサロイシン（ａｓａｌｅｕｃｉｎｅ）、２−（メチレンシクロプロピル）グリシン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−（プロプ−１−エニル）システイン、ホモセリン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ホモアルギニン、３−（３−カルボキシフェニル）アラニン、シクロヘキシルアラニン、ミモシン、ピペコリン酸、４−メチルグルタミン酸、カナバニン、２，３ジアミノプロピオン酸などを含むこともできるが、これらに限定されない。本発明において利用されるポリペプチド剤のさらなる例を後述する。
【００３１】
「野生型」のポリペプチド、ポリペプチド剤またはポリペプチド薬とは、天然のポリペプチド配列（および、場合によっては、それに対応する２次構造）を意味する。「単離された」または「精製された」タンパク質またはポリペプチドとは、天然では、通常そのタンパク質が関与している生体そのものから切り離して分離したタンパク質のことである。この用語がさまざまなレベルの純度のタンパク質を示すのは明らかである。典型的には、精製タンパク質を含む組成物は、組成物中の全タンパク質の少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４０〜５０％、より好ましくは少なくとも約７５〜８５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％以上が問題のタンパク質となっている組成物である。
【００３２】
「作動可能に連結した」とは、記載された成分が、それらの通常の機能を行うことができるよう配置されている要素の並び方を意味する。したがって、コード配列に作動可能に連結した所定のプロモーターは、適当な酵素が存在すると、コード配列の発現をもたらすことができる。このプロモーターは、コード配列の発現を指令する機能をもつかぎり、コード配列と接触している必要はない。したがって、例えば、未翻訳であるが転写済みの介在配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在しても、コード配列およびプロモーター配列は、依然コード配列と「動作可能に連結」しているものとみなされ得る。
【００３３】
アミノ酸配列の「類似性」を測定する技術は、当技術分野で周知である。通常、「類似性」は、アミノ酸が同一であるか、電荷または疎水性など、類似した化学的および／または物理的な特性をもつ場合に、適当な位置にある２つ以上のポリペプチドのアミノ酸同士の正確な比較を意味する。そして、比較されたポリペプチド配列間で、いわゆる「パーセント類似性」が決定され得る。
【００３４】
核酸配列およびアミノ酸配列の同一性を測定する技術も、当技術分野で周知であり、その遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を（通常はｃＤＮＡ中間体を介して）決定し、それによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、および、これを第２のアミノ酸配列と比較することを含む。通常、「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列のそれぞれヌクレオチド同士またはアミノ酸同士が、正確に対応することを意味する。
【００３５】
２つ以上のポリヌクレオチド配列は、その「同一率（％）」を決定して比較することができる。２つ以上のアミノ酸配列も同様に、その「同一率（％）」を決定して比較することができる。核酸配列であってもペプチド配列であっても、２つの配列の同一率（％）は、通常、２つの整列された配列の間で正確に一致する数を、短い方の配列の長さで除してから１００を乗じた数であると説明されている。核酸配列の近似的なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって得られる。このアルゴリズムを拡張し、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５補遺３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって標準化されたスコアマトリクス法（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）を用いてペプチド配列にも使うことができる。核酸およびペプチド配列に関するこのアルゴリズムの実行法は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＢｅｓｔＦｉｔユーティリティーアプリケーションによって提供されている。この方法のデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）に記載されている。配列間の同一率（％）または類似率（％）を計算するための、他の同等に適切なプログラムも一般的に当業者に知られている。
【００３６】
例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一率（％）は、デフォルトのスコア表および６ヌクレオチド位置のギャップペナルティーを用い、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを利用して決定することができる。本発明に関連して同一率（％）を確認する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが版権を所有し、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から頒布されているＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを用いることである。この一式のパッケージから、デフォルトパラメーターをスコア表に使用して（例えば、ギャップオープンペナルティーを１２、ギャップエクステンションペナルティーを１、ギャップを６にして）、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを利用することができる。生成されたデータから、「マッチ」値が「配列の同一性」を反映している。デフォルトパラメーターを用いて使われ得るＢＬＡＳＴアラインメントプログラムなど、配列間の同一率（％）または類似率（％）を計算するための別の適当なプログラムも、当技術分野において一般的に公知である。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは以下のデフォルトパラメーターで用いられ得る。遺伝子コード＝標準；フィルタ＝無；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列、ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥによる、データベース＝非重複，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳物＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、インターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴに見つけることができる。
【００３７】
当業者は、適切な検索パラメーターを容易に決定して、上記のプログラムにおいて所定の配列に使うことができる。例えば、検索パラメーターは問題の配列のサイズによって変わる可能性がある。したがって、例えば、本明細書の代表的な実施形態は、以下のようなＸ個の連続したヌクレオチドを有する単離ポリヌクレオチドを含むであろう。すなわち、（ｉ）Ｘ個の連続したヌクレオチドが、本明細書に記載された配列のいずれかに由来するＹ個の連続したヌクレオチドと少なくとも約５０％の同一性をもち、（ｉｉ）ＸはＹと等しく、かつ、（ｉｉｉ）Ｘは６ヌクレオチド以上５０００ヌクレオチド以下、好ましくは８ヌクレオチド以上５０００ヌクレオチド以下、より好ましくは１０〜１２ヌクレオチドから５０００ヌクレオチド以下、およびさらに好ましくは１５〜２０ヌクレオチドから本明細書に記載された完全長配列に存在するヌクレオチド数以下であり、上記の範囲内のすべての整数値を含む。
【００３８】
２個の核酸フラグメントは、本明細書に記載されているように「選択的にハイブリダイズ」すると考えられている。２個の核酸分子間の配列同一性の程度が、このような分子間のハイブリダイゼーション現象の効率および強さに影響する。部分的に同一性がある核酸配列は、完全に同一な配列が標的分子にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害しようとする。完全に同一である配列によるハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイを利用して評価することができる（例えば、サザーンブロット法、ノーザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーションなど。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。このようなアッセイは選択性の程度を変えながら、例えば、条件を低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーへと変えながら行うことができる。低ストリンジェンシー条件を使用する場合には、部分的な配列同一性すらない（非特異的結合事象がなければ、２次プローブが標的とハイブリダイズしないような）２次プローブ（例えば、標的分子との配列同一性が約３０％未満のプローブ）を利用して、非特異的結合が存在しないことを測定することができる。
【００３９】
ハイブリダイゼーションに基づく検出システムを利用する場合、標的の核酸配列に相補的な核酸プローブを選択して、次に、適切な条件を選んで、プローブと標的配列とが互いに「選択的にハイブリダイズ」、すなわち結合して、ハイブリッド分子を形成する。「中度のストリンジェントな」条件で標的配列に選択的にハイブリダイズできる核酸分子は、一般的に、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの長さがあり、選択された核酸プローブの配列との配列同一率が少なくとも約７０％である標的核酸配列を検出することが可能な条件下で選択的にハイブリダイズすることが可能である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、通常、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの長さがあり、選択された核酸プローブの配列と配列同一率が約９０〜９５％より高い標的核酸配列の検出が可能である。プローブおよび標的が特定の配列の同一性をもっている場合、プローブ／標的のハイブリダイゼーションにとって有用なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野公知の方法で決定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ参照）。
【００４０】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件について、数多くの同等の条件を用いて、例えば、下記の要素を変えて、具体的なストリンジェンシーを確立することができることが当技術分野で周知である。すなわち、プローブ配列および標的配列の長さと性質、さまざまな配列の塩基組成、塩およびその他のハイブリダイゼーション溶液組成物の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、およびポリエチレングリコール）の有無、ハイブリダイゼーション反応の温度および時間のパラメーター、ならびに、種々の洗浄条件などの要素。特定のハイブリダイゼーション条件の組の選択は、当技術分野で標準的な以下の方法に従って行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。
【００４１】
「由来する」という用語は、ある分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）のウイルス源を確認するために使われる。第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチド、そのｃＤＮＡ、その相補配列の一領域と同一または実質的に同一な塩基対配列を有する場合、または上記のような配列同一性を示す場合には、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチド「に由来する」ものである。したがって、ウイルスの配列またはポリヌクレオチドが、（ｉ）ある特定のウイルス配列と同一または実質的に同一の配列をもつか、または（ｉｉ）上記のように、そのウイルスのポリペプチドに対して配列同一性を示せば、そのウイルスの配列またはポリヌクレオチドは、特定のウイルス（例えば、種）に「由来している」。
【００４２】
（ｉ）第１のポリペプチドが、第２のポリヌクレオチドに由来する第１のポリヌクレオチドによってコードされているか、または、（ｉｉ）上記のように、その第２のポリペプチドに配列同一性を示す場合には、第１のポリペプチドは第２のポリペプチドに由来するものである。したがって、ウイルスのポリペプチド（タンパク質）が、（ｉ）特定のウイルスのポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ウイルスポリヌクレオチド）によってコードされているか、または（ｉｉ）上記のように、そのウイルスのポリペプチドに対して配列同一性を示せば、そのウイルスのポリペプチド（タンパク質）は、特定のウイルスに「由来している」。
【００４３】
ポリヌクレオチド分子もポリペプチド分子も、物理的にウイルスに由来することが可能であり、あるいは、例えば、既知の配列に基づいて組換え技術によって、もしくは合成法によって作出することが可能である。
【００４４】
「異種」という用語は相対的な用語で、核酸に関して使われると、該核酸が、天然では互いに同じ関係の中には存在しない２個以上の部分配列を含むことを示す。したがって、本件では、呼吸器系ウイルスのタンパク質をコードする核酸は、それが含まれているアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物またはレプリコン粒子の配列に対して異種である。
【００４５】
「サブゲノムＲＮＡ」は、それが由来したゲノムＲＮＡより小さな長さまたはサイズのＲＮＡ分子を意味する。サブゲノムＲＮＡは、ゲノムＲＮＡまたはその相補配列の内側に配列が存在する内部プロモーターから転写される。好ましい実施形態において、サブゲノムＲＮＡはアルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、または欠損ヘルパー構築物から産生され、１つ以上のアルファウイルスの構造タンパク質、または目的とするその他の異種配列をコードする。通常、サブゲノムＲＮＡは、５’または３’末端の非翻訳領域と、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームとをもつ典型的なｍＲＮＡに類似している。
【００４６】
本明細書において使用される、「ベクター構築物」という語句は、一般的に、目的とする核酸配列または遺伝子の発現を指令することができる任意の集合体を意味する。ベクター構築物は、一般的に、転写プロモーター／エンハンサー、すなわち遺伝子座を画定する要素、または選択的スプライシング、核ＲＮＡのエクスポート、メッセンジャーの翻訳後修飾、またはタンパク質の転写後修飾など別の手段によって遺伝子発現を調節する他の要素を含む。さらに、ベクター構築物は、通常、転写されると、目的とする配列または遺伝子と動作可能に連結して、翻訳開始配列の働きをする配列を含む。また、ベクター構築物は、場合によっては、ポリアデニル化を指令するシグナル、選択マーカー、ならびに１個以上の制限部位、および翻訳終結配列を含むことも可能である。ベクター構築物の例としては、ＲＮＡベクター構築物のｃＤＮＡ相補配列を含むＥＬＶＩＳベクター、ＲＮＡベクター構築物自体、アルファウイルスベクター構築物、ＣＭＶベクター構築物などがある。
【００４７】
「アルファウイルスベクター構築物」は、目的とする配列または遺伝子の発現を指令する能力がある集合体を意味する。このようなベクター構築物は、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始させる能力がある５’配列（５’保存ヌクレオチド配列要素（ＣＳＥ）、または、５’シス複製配列とも呼ばれる）、ならびに、発現すると生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（３’ＣＳＥ、または、３’シス複製配列とも呼ばれる）、および、場合によってはポリアデニル化部位から成る。さらに、ベクター構築物はウイルスサブゲノム「接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）」プロモーター、１つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその一部に由来する配列、ウイルス様粒子（例えば、レプリコン粒子）を産生するのに十分な大きさの外来の核酸分子、インビトロまたはインビボ（例えば、真核細胞の内部）においてｃＤＮＡからウイルスＲＮＡの合成を開始させることができる５’側プロモーター、発現される異種配列、および異種配列を挿入するための１個以上の制限部位を含むこともできる。
【００４８】
「アルファウイルスＲＮＡレプリコンベクター」、「ＲＮＡレプリコンベクター」、「レプリコンベクター」または「レプリコン」は、標的細胞内部にある、インビボで自己増幅または自己複製を指令することができるＲＮＡ分子を意味する。自己増幅を指令するには、ＲＮＡ分子はＲＮＡ増幅を触媒するのに必要な酵素（例えば、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードしなければならず、また、コードされた酵素によって認識されて利用される、複製に必要とされるシスＲＮＡ配列も含まなければならない。アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンは、以下の順序の要素を含まなければならない。すなわち、非構造タンパク質に仲介される増幅に必要とされる５’側ウイルス配列または５’側細胞配列（５’ＣＳＥ、すなわち５’シス複製配列、または、複製のためにシスで必要とされる５’側ウイルス配列、またはアルファウイルスの転写を開始させる能力のある５’配列とも呼ばれる）、発現すると生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、および非構造タンパク質に仲介される増幅に必要とされる３’側ウイルス配列または３’側細胞配列（３’ＣＳＥ、すなわち複製のためにシスで必要とされる３’側ウイルス配列、またはアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列とも呼ばれる）。アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンは、例えば、いくつかの実施形態において、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を増加もしくは減少させるため、または、欠損ヘルパーまたは構造タンパク質発現カセットとの相同性を低下させるために改変することが可能なＩＲＥＳもしくはウイルス（例えば、アルファウイルス）サブゲノムプロモーター（例えば、接合部プロモーター）など、１つ以上の異種配列を発現させる手段、および発現されるべき１つ以上の異種配列を含むことができる。また、レプリコンは、例えば、１つ以上のポリペプチド（例えば、タンパク質をコードする遺伝子または３’側の隣接遺伝子）および／またはポリアデニル化部位をコードする１つ以上の異種配列など、さらに別の配列を含むこともできる。このレプリコンは、アルファウイルスの構造タンパク質（カプシド、Ｅ２、Ｅ１）の全部をコードする配列を含んではならない。レプリコンベクターによって発現され得る異種配列の非限定的な例は、例えば、米国特許第６，０１５，６８６号に記載されおり、その全体が参照されて本明細書に組み込まれているが、例えば、抗原、リンフォカイン、サイトカインなどを含む。
【００４９】
「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」は、ウイルス粒子（ビリオン）の中にヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡまたはゲノムＲＮＡ）を組み込むことに関与する、シスとして機能する配列を意味する。多数のウイルス由来型パッケージングシグナルが説明されてきた。例えば、Ｙｏｕｉｌ．Ｒ．ら，（２００３）Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １４（１０）：１０１７−１０３４；Ｂｅａｓｌｅｙ  ＢＥら（２００２）Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６（１０）：４９５０−４９６０；Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔら（２００３）Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７７（１９）：１０５７５−１０５８３参照。
【００５０】
「組換えアルファウイルス粒子」または「レプリコン粒子」は、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンを含むビリオン様の構造単位を意味する。一般に、組換えアルファウイルス粒子またはレプリコン粒子は、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープおよびＲＮＡベクターレプリコンを含む。好ましくは、組換えアルファウイルス粒子は、アルファウイルスによってコードされるエンベロープ糖タンパク質が埋め込まれた、宿主細胞に由来する原形質膜などの脂質二重層の内部に含まれるヌクレオカプシド構築物を含む。また、この粒子は、アルファウイルスが由来した粒子の向性を指令する他の成分（例えば、標的要素、その他のウイルス構造タンパク質、またはその他のレセプター結合リガンド）も含むことができる。
【００５１】
「アルファウイルス構造タンパク質発現カセット」は、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質を発現することができるベクター構築物を意味する。アルファウイルス構造タンパク質発現カセットは、トランスで供給される生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質に反応して、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質のＲＮＡを増幅もしくは複製、および発現することができる「欠損ヘルパー構築物」であってもよい。欠損したヘルパー構築物は、一般的に、以下の順序に並んだ要素を含む。すなわち、５’側の増幅またはシス複製配列、ウイルスサブゲノム接合部プロモーター、発現すると１つ以上の生物学的に活性なアルファウイルス構造タンパク質（例えば、Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、Ｅ１）をコードする配列、３’側の増幅またはシス複製配列、およびポリアデニル化部位。また、欠損ヘルパー構築物は、インビトロまたはインビボ（例えば、真核細胞内）においてｃＤＮＡからウイルスＲＮＡ合成を開始させる能力がある５’プロモーター、転写の終結を調節する３’側配列、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセッシング配列、選択マーカーをコードする配列、および／または核外移行シグナルを含むこともできる。欠損ヘルパー構築物は、４つの機能的アルファウイルス非構造タンパク質のすべてをコードしてはならない。
【００５２】
「非構造タンパク質に仲介される増幅に必要とされる５’側ウイルス配列または細胞配列」および「非構造タンパク質に仲介される増幅に必要とされる５’側配列」および「増幅配列」および「５’側増幅配列」および「５’ＣＳＥ」および「複製のためにシスで必要とされる５’側ウイルス配列」および「アルファウイルスの転写を開始させる能力のある５’側配列」という用語は同義的に使われ、ウイルスまたはウイルス由来のベクターがプラス鎖ＲＮＡを合成する認識部位を提供する機能的要素を意味する。したがって、それは、ウイルスまたはベクター内部に含まれる実際の配列の相補配列であって、マイナス鎖ＲＮＡコピーの３’末端に相当する配列であり得、この３’末端には非構造タンパク質であるレプリカーゼ複合体、および、場合によっては付加的な宿主細胞因子が結合し、そこからプラス鎖ＲＮＡの転写が開始される。多様な配列が、例えば、アルファウイルス５’末端非翻訳領域（ＮＴＲ）および、例えばヌクレオチド２１０、２５０、３００、３５０、４００、または４５０までの配列などのその他の隣接配列を含む、増幅配列として利用されている。あるいは、例えばシンドビス（ＳＩＮ）ベクターの場合には、ｔＲＮＡアスパラギン（ｔＲＮＡａｓｐ）（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら，米国特許第５，０９１，３０９号）に対する非アルファウイルスのヌクレオチド１０〜７５が使われている。
【００５３】
本明細書において使用される、「５’側改変増幅配列」は、上記で定義された増幅配列を含むヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）分子であって、この増幅配列の一次構造（配列）が、既知の増幅シグナルと比較して改変（例えば、置換、付加、欠失）されているため、改変された配列がパッケージングシグナルとしては不完全であるが、それらの増幅（複製）機能を維持している分子を意味する。例えば、改変された増幅配列は、一次配列レベルでパッケージングシグナルとの相同性が減少しているが、二次構造は本来の増幅配列の相同性のままのものを含むことが可能である。改変された増幅配列は、二次構造および／またはシスに機能する増幅能力が維持されるかぎり、付加的配列をさらに含むことができる。
【００５４】
「３’側隣接遺伝子（３’Ｐｒｏｘｉｍａｌ  Ｇｅｎｅ）」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、レプリコンベクター、真核レイヤードベクター開始システム（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｌａｙｅｒｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）、欠損ヘルパーＲＮＡ、または構造タンパク質発現カセットの内部に含まれ、別の要素に対して特定の位置内に存在するヌクレオチド配列を意味する。この３’側隣接遺伝子の位置は、非構造タンパク質に仲介される増幅（上記）に必要な３’側配列について決定されるはずであるが、ここで、３’側隣接遺伝子は、この要素の５’側（上流）で直前にあるタンパク質コード配列である。
【００５５】
「ウイルスサブゲノムプロモーター」という用語は、必要とされるウイルスまたは細胞のポリメラーゼならびに他の因子とともに、ゲノム長未満のＲＮＡ分子の転写を可能にするウイルス起源の配列を意味する。アルファウイルス（アルファウイルスの）サブゲノムプロモーターまたはアルファウイルス（アルファウイルスの）サブゲノム接合部プロモーターに関して、この配列は、一般的に、非構造タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と構造タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）との間の領域に由来しており、通常、サブゲノムｍＲＮＡの転写を調節する。典型的には、アルファウイルスサブゲノムプロモーターは、プロモーターに関連した活性のほとんどを提供するコア配列、およびプロモーターに関連した活性をさらに促進する近傍部位（例えば、拡張型プロモーターまたは天然プロモーター）から成る。サブゲノムプロモーターは、ウイルスまたはベクターの内部に含まれる実際の配列の相補配列であって、マイナス鎖ＲＮＡのコピー内の領域に対応していて、プラス鎖サブゲノムｍＲＮＡの転写開始を促す、相補配列であってもよい。例えば、アルファウイルスのプロトタイプであるシンドビスウイルスの場合、通常のサブゲノム接合部プロモーターは、典型的にほぼヌクレオチド番号７５７９から始まり、少なくともヌクレオチド番号７６１２まで続く（おそらくそれ以降も）。最低でも、ヌクレオチド７５７９〜７６０２が、サブゲノムフラグメントの転写に必要なコア配列の機能を果たすと考えられている。
【００５６】
「非構造タンパク質の仲介による増幅に必要とされる３’側ウイルス配列または細胞配列」または「非構造タンパク質に仲介される増幅に必要とされる３’側配列」という用語は、３’ＣＳＥ、または３’側シス複製配列、または複製のためにシスで必要とされる３’ウイルス配列、またはアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列と同義的に使われる。この配列は、マイナス鎖ＲＮＡの合成によってウイルスまたはウイルス由来のベクターが複製（増幅）を開始する認識部位を提供する機能的要素である。多様な配列がこの機能のために利用される。例えば、この配列は、例えば、ＳＩＮなどをもち、ヌクレオチド１１，６４７から１１，７０３までを含む、完全なアルファウイルスの３’末端非翻訳領域（ＮＴＲ）、または、認識配列としての機能は依然として維持する切断型３’ＮＴＲ領域（例えば、ヌクレオチド１１，６８４から１１，７０３）を含み得る。これに関連して利用することができる配列の別例は、マイナス鎖ＲＮＡの合成を開始させる能力と同様の機能を維持している非アルファウイルスの配列またはその他の配列などである（例えば、Ｇｅｏｒｇｅら，（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９７７６−９７８５に記載される配列）が、これらに限定されるものではない。
【００５７】
「安定的形質転換」は、核酸分子が生細胞に導入されて、その核酸分子が連続的な細胞分裂周期を介して長期または永久に子孫細胞中に維持されることを意味する。この核酸分子は、いずれかの細胞区画（核、ミトコンドリア、または細胞質などが挙げられるが、これらに限定されない）中で維持され得る。好ましい実施形態において、核酸分子は核の中に維持される。維持は、染色体内部（組み込み）でも、エピソーム事象として染色体外でも可能である。
【００５８】
「アルファウイルスパッケージング細胞株」は、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含み、アルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、真核細胞レイヤードベクター開始システム（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号）、または組換えアルファウイルス粒子が導入されると、組換えアルファウイルス粒子を産生する細胞をいう。親細胞は哺乳動物起源または非哺乳動物起源であってよい。好ましい実施形態の範囲内において、パッケージング細胞株は、構造タンパク質発現カセットによって安定的に形質転換される。
【００５９】
「真核レイヤードベクター開始システム」は、目的とする配列または遺伝子の発現を指令することができる集合体を意味する。真核レイヤードベクター開始システムは、インビボ（すなわち真核細胞内）でｃＤＮＡからＲＮＡの合成を開始させることができる５’側プロモーター、および、真核細胞において自己複製を指令し、異種配列を発現させることができる核酸ベクター配列（例えば、ウイルスベクター）を含まなければならない。好ましくは、この核酸ベクター配列は、アルファウイルス由来の配列であり、非構造タンパク質に仲介される増幅に必要とされる５’側のウイルス配列または細胞配列（５’ＣＳＥ、または５’シス複製配列、または複製のためにシスで必要とされる５’側のウイルス配列、またはアルファウイルスの転写を開始させることができる５’配列とも呼ばれる）、ならびに、発現すると生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、および非構造タンパク質に仲介される増幅に必要とされる３’側のウイルス配列または細胞配列（３’ＣＳＥ、または複製のためにシスにおいて必要とされる３’側のウイルス配列または細胞配列、またはアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列とも呼ばれる）から成る。さらに、このベクター配列は、例えば、いくつかの実施形態において、ウイルスによるサブゲノムフラグメントの転写を妨げたり、増加させたり、または減少させたりするため、または欠損ヘルパーもしくは構造タンパク質発現カセットとの相同性を低下させるために改変することが可能なウイルス（例えば、アルファウイルス）のサブゲノムプロモーター（例えば、接合部プロモーター）などの異種配列を発現させる手段、および発現させようとする１つ以上の異種配列を含むことができる。好ましくは、異種配列はタンパク質をコードする遺伝子を含み、この遺伝子はベクター配列内部にある３’側隣接遺伝子である。また、真核レイヤードベクター開始システムは、ポリアデニル化配列、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセッシング配列、核外移行シグナル、および転写終結配列も含むことができる。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡからのベクター核酸配列のインビボ合成は、誘導型プロモーターを用いて調節することができる。または、サブゲノムの発現は、翻訳調節因子または修飾された非構造タンパク質を利用して誘導可能である。
【００６０】
「病原体」は、疾患と関連しているか、それを引き起こす任意の生体を意味する。したがって、「呼吸器系病原体」という用語は、呼吸によって伝染するか、気道における疾病に関連するか、その原因となる病原体生物を意味する。呼吸器系病原体は当技術分野で公知であり、本明細書記載のウイルス、細菌、寄生生物および真菌を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して、体液性および／または細胞性の抗原特異的反応を起こさせる、１つ以上の（線状型、立体構造型または両型の）エピトープを含む分子を意味する。この用語は、用語「免疫原」と同義的に使われる。通常、１つのエピトープは約３〜１５個、一般には約５〜１５個のアミノ酸を含む。１個のＢ細胞エピトープは、通常約５個のアミノ酸であるが、３〜４個のアミノ酸ほど小さくてもよい。ＣＴＬエピトープなど、Ｔ細胞エピトープは、少なくとも約７〜９個のアミノ酸を含み、ヘルパーＴ細胞エピトープは少なくとも約１２〜２０個のアミノ酸を含むものである。通常、エピトープは、約７個〜１５個のアミノ酸、例えば９個、１０個、１２個または１５個のアミノ酸を含むものである。「抗原」という用語は、サブユニット抗原（すなわち、天然において抗原が会合しているそのままの生体から分離され、切り離された抗原）、ならびに、死滅したか、弱毒化されたか、または不活性化された細菌、ウイルス、真菌、寄生生物またはその他の微生物、ならびに、細胞表面レセプターの細胞外ドメイン、およびＴ細胞エピトープを含む可能性のある細胞内部位などの腫瘍抗原を意味する。抗イディオタイプ抗体などの抗体、またはそれらのフラグメント、および、抗原または抗原決定基を模倣することができる合成ペプチドミモトープも、本明細書における抗原の定義にも含まれうる。同様に、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫応用法など、インビボで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも本明細書の抗原の定義に含まれる。
【００６２】
所定のタンパク質のエピトープは、当技術分野で周知である、任意の数のエピトープマッピング技術を利用して同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，編，１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ参照。例えば、線状エピトープは、例えば、固定支持体上で、タンパク質分子の一部に相当する多数のペプチドを合成しながら、それらのペプチドが支持体に付着している間に、ペプチドを抗体と反応させることによって決定することができる。このような技術は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅａｙら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：７０９−７１５に記載さており、これらはすべて、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００６３】
同様に、立体構造型エピトープは、例えば、ｘ線結晶解析および核磁気共鳴によるなど、アミノ酸の空間的立体配置を測定して容易に同定される。例えば、前出のＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照。
【００６４】
以下でさらに詳細に説明するように、本発明の目的にとって、抗原は数種の既知のウイルス、細菌、寄生生物および真菌のいずれにも由来することができる。また、この用語は、免疫反応が望まれる任意の他の抗原も意図している。さらに、本発明の目的にとって、「抗原」は、本明細書で定義されているように、タンパク質が免疫学的反応を誘導する能力を維持するかぎり、天然の配列に対する（通常、性質において保存的な）欠失、付加および置換などの改変を含むタンパク質を意味する。これらの改変は、部位特異的突然変異によるような意図的なものであっても、抗原を産生する宿主の突然変異によるなど、偶発的なものであってもよい。
【００６５】
抗原または組成物に対する「免疫学的反応」は、被験体において、目的とする組成物に存在する抗原に対して体液性および／または細胞性の免疫反応が発生することである。本発明の目的にとって、「体液性免疫反応」は、分泌性（ＩｇＡ）分子またはＩｇＧ分子など、抗体分子によって仲介される免疫反応を意味するが、「細胞性免疫反応」は、Ｔリンパ球および／またはその他白血球によって仲介される免疫反応である。細胞性免疫反応の１つの重要な態様は、細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的反応を含む。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質と一緒に提示され、細胞表面上で発現するペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内の微生物の破壊、またはそれら微生物に感染した細胞の溶解を誘導・促進するのを助ける。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的反応を含む。ヘルパーＴ細胞は、この機能を刺激するのを助けるよう作用し、また、非特異的エフェクター細胞の活性を、ＭＨＣ分子と一緒にペプチド抗原をその表面上に提示する細胞に対して集中させる。「細胞性免疫反応」は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞に由来する白血球細胞など、活性化Ｔ細胞および／またはその他の白血球細胞によって産生されるサイトカイン、ケモカインおよび他の同類の分子の産生も意味する。さらに、ケモカイン反応は、投与された抗原に反応して、さまざまな白血球細胞または内皮細胞によって誘導されうる。
【００６６】
細胞性免疫反応を誘導する組成物またはワクチンは、ＭＨＣ分子とともに抗原を細胞表面に提示して、脊椎動物である被験体を感作する働きをすることができる。細胞媒介性免疫反応は、表面に抗原を提示する細胞またはその周辺に向けられている。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球を産生させて、免疫された宿主を将来防御することが可能となる。
【００６７】
特定の抗原が細胞媒介性免疫反応を刺激する能力は、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによるか、または、感作された被験体内の抗原に対して特異的なＴリンパ球をアッセイするなど、多数のアッセイによって測定することが可能である。このようなアッセイは当技術分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６参照。細胞媒介性免疫反応を測定する最近の方法は、Ｔ細胞集団による細胞内サイトカインもしくはサイトカイン分泌の測定（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ技術による）、またはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定（例えば、四量体技術による）によるものが含まれる（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．，およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）：１３６７−１３７１，１９９８、Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．，ら．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５−２１，１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５，１９９７による概説）。
【００６８】
したがって、本明細書において、免疫学的反応はＣＴＬを刺激し、および／またはヘルパーＴ細胞の産生または活性化を刺激するものであってよい。ケモカインおよび／またはサイトカインの産生も刺激されうる。また、目的とする抗原は、抗体媒介性免疫反応を誘導する。よって、免疫学的反応は以下の効果の１つ以上を含みうる。すなわち、Ｂ細胞による抗体（例えば、ＩｇＡまたはＩｇＧ）の産生；および／または、目的とする組成物またはワクチンの中に存在する１つまたは複数の抗原を特異的に指向するサプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、またはヘルパーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの反応は、感染性を中和し、および／または抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に防御をもたらすように機能する。このような反応は、当技術分野で周知の標準的な免疫アッセイ法および中和アッセイ法を利用して測定することができる。
【００６９】
「免疫原性組成物」は、組成物が被験体に投与されると、被験体の中で、目的とする抗原性分子に対する体液性および／または細胞性および／または粘膜性の免疫反応が生じる抗原性分子（または抗原性分子をコードするヌクレオチド配列）を含む組成物である。免疫原性組成物は、注射、吸入、経口、経鼻またはその他のいずれかの非経口または粘膜（例えば、直腸内または膣内）の投与経路などによって、レシピエントである被験体に直接導入することができる。
【００７０】
「サブユニットワクチン」は、ウイルス、細菌、寄生生物または真菌など、目的とする病原体由来の抗原に由来するか、または相同である、１つ以上の選択された抗原を含むが、すべての抗原は含まないワクチン組成物を意味する。このような組成物は、実質的には、無処理の病原細胞または病原性粒子、あるいは、このような細胞または粒子の溶解物を含まない。したがって、「サブユニットワクチン」は、病原体に由来する、少なくとも部分的に精製された（好ましくは実質的に精製された）免疫原性ポリペプチド、またはそのアナログから調製することができる。サブユニットワクチンに含まれる抗原を得る方法は、したがって、標準的な精製技術、組換え産生法、または合成製造法を含むことができる。
【００７１】
（アルファウイルスの構築物および粒子）
本明細書記載の免疫原性組成物は、１つ以上のアルファウイルス構築物、レプリコンベクター、またはレプリコン粒子を含み、各構築物または粒子は、呼吸器系病原体に由来するタンパク質をコードする１つ以上の配列を含む。
【００７２】
アルファウイルス属の数種のメンバーが、ワクチンおよび治療的用途に使うために、「レプリコン」発現ベクターとして開発されている。レプリコンベクターは、ＤＮＡベクター構築物、ＲＮＡレプリコンベクター、および組換えレプリコン粒子など、いくつかの方式のいずれかで利用することができる。このようなレプリコンベクターは、例えば、ＳＩＮ（Ｘｉｏｎｇら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１１８８−１１９１；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９；Ｈａｒｉｈａｒａｎら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９５０−９５８；Ｐｏｌｏら（１９９９）ＰＮＡＳ  ９６：４５９８−４６０３）、セムリキ森林熱ウイルス（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：５６２−５６５）、ＶＥＥ（Ｐｕｓｈｋｏら（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：３８９−４０１）、および複数のアルファウイルスに由来するキメラ（米国特許第６３７６２３６Ｂ１号、ＷＯ２００２０９９０３５、Ｐｅｒｒｉら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０３９４−１０４０３）などのアルファウイルスに由来している。
【００７３】
一般に言えば、アルファウイルスレプリコン粒子は、自己複製アルファウイルスベクターまたは「レプリコン」核酸を含むウイルス様の粒子を意味する。レプリコン粒子自体は、一般に複製不能または「不完全」であると考えられており、すなわち、パッケージングのために必要な１つ以上の構造タンパク質をコードする遺伝子が欠失しているために、宿主細胞がレプリコン粒子に感染しても、子孫レプリコン粒子は生じない。長年の間、組換えウイルス粒子、組換えアルファウイルス粒子、アルファウイルスレプリコン粒子およびレプリコン粒子など、レプリコン粒子を説明するためにいくつかの同義語が現れてきた。しかし、本明細書において、これらの用語はすべて、アルファウイルス由来のＲＮＡベクターレプリコンを含むビリオン様のユニットを意味する。さらに、これらの用語は総称的にベクター、ベクター構築物または遺伝子運搬ベクターと呼ばれる。
【００７４】
広範な文献によって、現在では、予防的または治療的な用途など、免疫反応を刺激するためのアルファウイルス由来のレプリコンベクター（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、粒子）の有用性が実証されている（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，同書；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら，同書；Ｈａｒｉｈａｒａｎら，同書；Ｐｕｓｈｋｏら，同書；Ｐｏｌｏら，同書ｄ；Ｄａｖｉｓら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３７１−３７８；ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４３４−４３９；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：４９７−５０７；Ｋｉｒｍａｎら（２００３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：５７５−５７９；Ｐａｓｅｔｔｉら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：５２０９−５２１７；Ｖａｊｄｙら（２００１）Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１８４：１６１３−１６１６；Ｐｅｒｒｉら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０３９４−１０４０３参照）。本発明は、抗原特異的免疫反応を刺激し、防御ワクチンのモダリティーを提供するための手段として、ヒトまたは動物の呼吸器系病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌）に由来する１つ以上の抗原を発現させるアルファウイルスレプリコンベクターを誘導および利用することを意図するものである。
【００７５】
アルファウイルスベクター構築物の典型的な「レプリコン」の構成（図１）は、上記ならびに米国特許第５７８９２４５号、第５８４３７２３号、第５８１４４８２号、および第６０１５６９４号、ＷＯ００／６１７７２、ＷＯ０２／９９０３５で詳細に説明されているように、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始させる５’側配列、アルファウイルスの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、隣接する異種核酸配列の発現を指令するウイルスサブゲノム接合部プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ認識配列および、好ましくはポリアデニル化部位を含む。同じ要素を定義する他の用語も、当技術分野で公知である。
【００７６】
本発明のもののように、アルファウイルスベクターは、ＲＮＡとしてインビボにおいて直接投与するために使用され得るか、または、しばしば、インビボでのワクチンおよび治療用に、プラスミドベースのｃＤＮＡ（例えば、真核レイヤードベクター開始システム）として送達されるが、アルファウイルスのＲＮＡレプリコンベクターまたはレプリコンＲＮＡは、まず、アルファウイルス構造タンパク質（例えば、カプシドタンパク質およびエンベロープ糖タンパク質）を含むウイルス様粒子の中にまずパッケージされる。その構造のため、ベクターレプリコンは、組換えアルファウイルスレプリコン粒子の中にパッケージするのに必要なこれらのアルファウイルス構造タンパク質を発現しない。したがって、レプリコン粒子を産生させるには、構造タンパク質をトランスで提供しなければならない（図１）。
【００７７】
パッケージングは、インビトロ転写されたレプリコンと欠損ヘルパーＲＮＡの同時形質転換（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，１９９１；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６，１９９３；Ｆｒｏｌｏｖら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２８１９−２８２９，１９９７；Ｐｕｓｈｋｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：３８９−４０１，１９９７；米国特許第５，７８９，２４５号および第５，８４２，７２３号）、またはプラスミドＤＮＡベースのレプリコンと欠損ヘルパー構築物の同時形質転換（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６）などの一時的な方法、および安定したパッケージング細胞株（ＰＣＬ）へのアルファウイルスレプリコンの導入（Ｐｏｌｏら，ＰＮＡＳ  ９６：４５９８−４６０３，１９９９；米国特許第５，７８９，２４５号、第５，８４２，７２３号、第６，０１５，６９４号；ＷＯ９７３８０８７、ＷＯ９９１８２２６）など、さまざまな方法で行うことができる。
【００７８】
トランスパッケージング法によって、１つ以上の構造タンパク質遺伝子を（例えば、弱毒化変異体などのアルファウイルス改変体の配列を組み込むために（米国特許第５，７８９，２４５号、第５，８４２，７２３号、第６，０１５，６９４号））改変した後、最終的なレプリコン粒子中に改変された構造タンパク質を組み込むことが可能になる。さらに、このようなパッケージングによって、ベクター構築物のものとは異なる第２のアルファウイルスに由来する構造タンパク質を用いて、第１のアルファウイルスに由来するベクター構築物またはＲＮＡレプリコンをパッケージすることによって、アルファウイルスレプリコン粒子全部を改変することが可能になる（ＷＯ９５／０７９９４；Ｐｏｌｏら，１９９９，同書；Ｇａｒｄｎｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７４：１１８４９−１１８５７，２０００；Ｐｅｒｒｉら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０３９４−１０４０３）。
【００７９】
（Ａ．アルファウイルスのレプリコンおよび粒子）
上記のように、本明細書に記載されたレプリコン粒子は、一般的には、１つ以上のポリヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡレプリコン）を含む。レプリコン粒子中に存在するときは、これらのポリヌクレオチドは、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質によって囲まれて（相互作用して）いる。本発明を実施する際に使用することができるポリヌクレオチド配列および構造タンパク質の非限定な例が本明細書に記載されている。
【００８０】
（Ａ．１．ヌクレオチド成分）
本明細書記載の粒子、ベクターおよびレプリコンは、一般的には、コード配列および非コード配列である、さまざまな核酸配列を含む。本明細書記載の組成物が、通常、完全なアルファウイルスゲノムに満たないものを含む（例えば、アルファウイルスのゲノムに含まれるコード配列および／または非コード配列の全部に満たないものを含む）ことは明らかであろう。
【００８１】
（Ａ．２．非コードポリヌクレオチド成分）
本明細書記載の粒子およびレプリコンは、一般的には、（例えば、構造または非構造の）ポリペプチドをコードする配列、および、制御因子などの非コード配列を含む。非コード配列の非限定な例は、非構造タンパク質に仲介される増幅に必要な５’側配列、異種ヌクレオチド配列を発現させるための手段、および非構造タンパク質に仲介される増幅に必要な３’側配列（米国特許第５，８４３，７２３号、第６，０１５，６９４号、第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ特許公開ＷＯ９７／３８０８７、ＷＯ００／６１７７２）を含む。本明細書の教示内容から、本明細書に記載された１つ、２つ以上、または全部の配列が、本明細書記載の粒子、ベクター、および／またはレプリコンに含まれることが可能であり、さらに、本明細書の教示内容に従って使用するために、これらの配列の１つ以上を改変するか、そうでなければ操作することが可能であることが明らかであろう。
【００８２】
このように、本明細書記載のポリヌクレオチドは、代表的に、非構造タンパク質に仲介される増幅に必要な５’側配列を含む。適当な５’側配列の非限定な例には、天然型アルファウイルスの５’側末端、非天然型ＤＩアルファウイルスの５’末端、および細胞ＲＮＡ由来の配列（例えば、ｔＲＮＡ要素）などの制御要素を含む（例えば、Ｍｏｎｒｏｅら，ＰＮＡＳ  ８０：３２７９−３２８３，１９８３）。
【００８３】
また、ポリヌクレオチド配列は、通常、異種ヌクレオチド配列（例えば、ポリペプチドをコードする配列）を発現させるための手段も含む。このような手段の非限定例は、プロモーターなどの制御因子など、例えば、相同ウイルス由来の天然型アルファウイルスサブゲノムプロモーター、異種ウイルス由来の天然型アルファウイルスサブゲノムプロモーター、（相同または異種の）コアアルファウイルスサブゲノムプロモーター、コアサブゲノムプロモーターから上流または下流の最小配列、コアまたは天然型のサブゲノムプロモーターの突然変異／欠失／付加、非アルファウイルス由来の親和的サブゲノムプロモーター（例えば、植物ウイルス）、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および／またはリボソームリードスルー因子（例えば、ＢｉＰ）などを含む。
【００８４】
非構造タンパク質に仲介される増幅に必要とされる、適当な３’側配列の非限定例は、天然型アルファウイルスの３’末端、非天然ＤＩアルファウイルスの３’末端、および上記の配列の突然変異、欠失、または付加を含む配列などの制御要素を含む。
【００８５】
（Ａ．３．コード配列）
また、本明細書記載の組成物は、さまざまなアルファウイルスポリペプチド、例えば、アルファウイルスの１つ以上の非構造ポリペプチド（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）または構造ポリペプチド（例えば、カプシド、エンベロープ糖タンパク質）をコードする１つ以上の配列を含むことも可能である。
【００８６】
Ｓｔｒａｕｓｓら（１９８４），前出，に記載されているように、野生型ＳＩＮゲノムは、５’キャップおよび３’末端ポリ（Ａ）部位を除いて、長さが１１，７０３ヌクレオチドある。５’末端キャップの後ろには、５９個のヌクレオチドの５’側非翻訳核酸があり、その後、非構造ポリペプチドをコードし、単一のオパール終止コドン以外に開放されている７５３９ヌクレオチドのリーディングフレームが続いている。非構造タンパク質をコードする配列と構造タンパク質をコードする配列を分ける接合部にある４８個の非翻訳塩基の後ろに、構造タンパク質をコードする、長さ３７３５ヌクレオチドのオープンリーディングフレームがある。最後に、３’側非翻訳領域は、長さ３２２ヌクレオチドである。非構造タンパク質は、ゲノムＲＮＡから２つのポリプロテイン前駆体として翻訳される。第１のものはｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３を含み、長さが１８９６アミノ酸であり、１８９７位のオパールコドンで終結する。オパールコドンのリードスルーによって長さ２５１３アミノ酸の第２のポリプロテイン前駆体が産生されると、第４の非構造タンパク質であるｎｓＰ４が産生され、その後、翻訳後に切断される。
【００８７】
野生型アルファウイルスゲノムも、構造タンパク質をコードする配列を含む。ＳＩＮにおいて、構造タンパク質は、７５９８位のヌクレオチドから始まり、長さが４１０６ヌクレオチドであり（ポリ（Ａ）部位を除く）、ゲノムＲＮＡの３’末端と同じところで終結するサブゲノムメッセージから翻訳される。非構造タンパク質と同様に、構造タンパク質も、切断されるとヌクレオカプシドタンパク質、および２つの内在性膜糖タンパク質、ならびに、成熟型ビリオンには存在しない２つの低分子ペプチドを産生するポリプロテイン前駆体として翻訳される。このように、本発明のレプリコン、粒子およびベクターは、１つ以上のアルファウイルスに由来する１つ以上のコード配列を含むことが可能である。
【００８８】
（Ｂ．アルファウイルス構造タンパク質）
アルファウイルスレプリコンまたはベクターのポリヌクレオチド成分を取り囲む（場合によっては相互作用する）構造タンパク質は、カプシドタンパク質とエンベロープタンパク質の両方を含むことができる。ほとんどの場合、ポリヌクレオチド成分は、ヌクレオカプシドを形成するカプシドタンパク質の複数のコピーに囲まれている。次に、ヌクレオカプシドは、好ましくは、エンベロープ糖タンパク質を含む脂質エンベロープによって囲まれている。アルファウイルスのカプシドタンパク質およびエンベロープ糖タンパク質は、Ｓｔｒａｕｓｓら（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５８：４９１−５６２に一般的に説明されている。カプシドタンパク質は、アルファウイルスの構造ポリプロテインのＮ末端タンパク質であり、ポリプロテインからのプロセッシングの後、アルファウイルスＲＮＡおよび別のカプシドタンパク質単量体と相互作用して、ヌクレオカプシド構築物を形成する。アルファウイルスのエンベロープ糖タンパク質（例えば、Ｅ２、Ｅ１）は、レセプター結合、および標的細胞への進入に機能的に関与する表面「スパイク」としてエンベロープをもつ粒子から突き出ている。
【００８９】
（Ｃ．アルファウイルスレプリコン粒子の作製法）
本発明に係るアルファウイルスレプリコン粒子は、公開された多様な方法を利用して産生することができる。そのような方法は、例えば、インビトロ転写されたレプリコンと１つ以上の欠損ヘルパーＲＮＡとの同時形質転換（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，１９９１；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６，１９９３；Ｆｒｏｌｏｖら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２８１９−２８２９，１９９７；Ｐｕｓｈｋｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：３８９−４０１，１９９７；米国特許第５，７８９，２４５号および第５，８４２，７２３号）、またはプラスミドＤＮＡベースのレプリコンと欠損ヘルパー構築物との同時形質転換（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６）などの一時的なパッケージング法、および安定したパッケージング細胞株（ＰＣＬ）へのアルファウイルスレプリコンの導入（Ｐｏｌｏら，ＰＮＡＳ  ９６：４５９８−４６０３，１９９９；米国特許第５，７８９，２４５号、第５，８４２，７２３号、第６，０１５，６９４号；ＷＯ９７／３８０８７、ＷＯ９９／１８２２６、ＷＯ００／６１７７２、ＷＯ００／３９３１８、およびＷＯ０１／９２５５２）などを含む。その他の産生方法は、非欠損型ヘルパーベースのＲＮＡ、またはＤＮＡ構造タンパク質発現カセットであって、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質を作動可能にコードするものの使用を含む（米国特許第５、７８９、２４５号、第５、８４２、７２３号、第６、０１５、６９４号；ＷＯ９７／３８０８７、ＷＯ９９／１８２２６、ＷＯ００／６１７７２、ＷＯ００／３９３１８、ＷＯ０１／９２５５２、ＷＯ２００４０８５６６０Ａ２、ＷＯ２００３０２３０２６Ａ１）。
【００９０】
好ましい実施形態において、レプリコン粒子産生のために、安定したアルファウイルスパッケージング細胞株が利用される。ＰＣＬを、インビトロで転写されたレプリコンＲＮＡで形質転換するか、プラスミドＤＮＡベースのレプリコン（例えば、ＥＬＶＩＳベクター）で形質転換するか、またはレプリコン粒子のシードストックに感染させてから、培養上清中で高力価のパッケージされたレプリコン粒子を産生するのに十分な条件下で、それに十分な時間インキュベートすることができる。特に好ましい実施形態において、ＰＣＬを２段階のプロセスで利用するが、第１の段階として、ＰＣＬをプラスミドＤＮＡベースのレプリコンで形質転換してレプリコン粒子のシードストックを産生させる。次に、第２段階では、ＰＣＬの新鮮な培養物にシードストックを感染させて、ずっと大きなレプリコン粒子のストックを作製する。このような感染は、ＭＯＩ＝０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、３、５、または１０など、さまざまな感染多重度（ＭＯＩ）を用いて行うことができる。好ましくは、感染は低いＭＯＩ（例えば、１未満）で実施される。シードストックに感染したＰＣＬからレプリコン粒子を１０８感染単位（ＩＵ）／ｍｌを超える力価で、時間をかけて採取することができる。さらに、低多重感染を繰り返すことによって、レプリコン粒子を、さらに大量の無処理ＰＣＬ培養物の中で引き続き継代すると、同一の高力価をもつ商業規模の調製物が得られる。重要なことには、「分断」された構造遺伝子構成のＰＣＬを用いて、検出可能な汚染性ＲＣＶを含まないレプリコン粒子ストックを生産することができる。
【００９１】
アルファウイルスレプリコン粒子の大規模な産生は、バイオリアクターを利用して行われる。好ましくは、バイオリアクターは外部コンポーネントバイオリアクターであり、基質に付着した細胞の大量培養、増殖および工程を調節するための集積モジュール式バイオリアクターシステムである。細胞（例えば、アルファウイルスパッケージング細胞）の付着および増殖は、組織培養処理された表面をもつ容器またはチャンバー内で行われ、これらの細胞は、細胞産生能を向上させるために新鮮な培地に入れられる。気体、温度、ｐＨ、グルコースなどのパラメーターについて観察および調整が行われて、潅流ポンプを利用して粗ベクターを採取する。典型的には、外部バイオリアクターの個々のコンポーネントは、（すなわち、チューブを介して）連結している外部モジュールを分離する。外部コンポーネントは、ポンプ、容器、酸素供給装置、培養モジュール、およびその他の非標準的な部品であってよい。外部コンポーネントバイオリアクターの代表例は、ＣｅｌｌＣｕｂｅ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ）である。
【００９２】
本明細書記載の外部コンポーネントバイオリアクターを使うことに加え、いくつかの場合には、アルファウイルスレプリコン粒子の産生のために、従来からの撹拌槽バイオリアクターを使うことができる。撹拌槽バイオリアクター内では、アルファウイルスパッケージング細胞は基質に付着していなくても（例えば、懸濁液中で浮動していても）、基質（例えば、ポリディスク、マイクロキャリアーまたはマクロキャリアー、ビーズ）に付着していてもよい。あるいは、中空糸培養系（Ｈｏｌｌｏｗ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いることも可能である。懸濁液適合型細胞を利用するも可能である。
【００９３】
集菌後、キメラアルファウイルスレプリコン粒子を含む粗培養上清を、採取物を（例えば、孔径０．２μＭ、０．４５μＭ、０．６５μＭ、０．８μＭの）フィルタに通して、清澄化することができる。場合によっては、濾過して大きな細胞片を除去する前に、粗上清を低速遠心分離にかけてもよい。１つの実施形態の範囲内で、クロマトグラフィーによる精製工程の前か後に、エンドヌクレアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ），Ｓｉｇｍａ＃Ｅ８２６３）をアルファウイルスレプリコン粒子の調製物に添加して外来性核酸を分解する。さらに、この調製物は、周知の方法の１つ（例えば、接線流濾過法）を用いて精製の前に濃縮され得る。
【００９４】
粗製または清澄化されたアルファウイルスレプリコン粒子を、クロマトグラフィー技術（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）によって濃縮および精製することができる。２つ以上のこのような精製法を連続して行うことも可能である。好ましい実施形態において、テンタクルイオン交換樹脂などのイオン交換樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフィーの少なくとも１工程が行われ、そして、サイズ排除クロマトグラフィーの少なくとも１工程が行われる。要するに、清澄化アルファウイルスレプリコン粒子の濾液を、荷電したイオン交換基質または樹脂（例えば、陽イオンまたは陰イオンの交換）を含むカラムに充填することができる。この基質または樹脂は、架橋されたアガロース、架橋されたポリスチレン、架橋されたスチレン、親水性ポリエーテル樹脂、アクリル樹脂、およびメタクリル酸ベースの樹脂など（しかしこれらに限定されない）、多様な物質で構成されうる。イオン交換体の成分は、スルフォプロピル陽イオン交換体、カルボキシメチル陽イオン交換体、スルホン酸交換体、スルホン酸メチル陽イオン交換体、およびＳＯ３−交換体から成るリストから選択された１つの陽イオン交換体を含むことができるが、これらに限定されるものではない。別の実施態では、イオン交換体の成分は、ＤＥＡＥ，ＴＭＡＥおよびＤＭＡＥから成るリストから選択された１つの陰イオン交換体を含むことができるが、これらに限定されるものではない。最も好ましくは、イオン交換クロマトグラフィーは、テンタクル陽イオン交換体を用いて行われるが、ここでイオン交換樹脂は、ＳＯ３−陽イオン交換体（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＤＭＳＯ３−）をもつメタクリル酸ベースの樹脂である。
【００９５】
レプリコン粒子はイオン交換樹脂に結合してから、塩（例えば、２５０ｍＭ以下のＮａＣｌ）を含む緩衝液で１回以上洗浄することができる。そして、レプリコン粒子を、塩濃度を上げた緩衝液を用いて、精製された形でカラムから溶離することができる。好ましい実施形態において、塩濃度は少なくとも３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭである。溶離は、好ましくは２８０ｎｍにて分光光度計でモニターされ得るが、レプリコン滴定アッセイ、発現転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＴＯＥ）アッセイ、クーマシーブルー染色またはウエスタンブロッティングによるタンパク質ゲル解析も可能である。
【００９６】
次に、より高い塩濃度の溶離緩衝液を、例えば、適当な水性溶液で希釈したり、粒子を含む溶離液を分子排除カラムに通したりして、より望ましい緩衝液と交換することができる。さらに、分子サイズ排除カラムを使うことで、場合によっては、さらに精製することができる。例えば、１つの実施形態において、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００またはＳ−４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーを、緩衝液交換として、また、イオン交換カラムから溶離されたレプリコン粒子を含む画分をさらに精製するために使用することが可能である。この特定の樹脂を用いると、通常、レプリコン粒子は、後期の空隙容量に溶離されるが、混入物質のいくつかは分子量が小さいためカラムにより長く保持されるために、純度のレベルの改善を示す。しかし、異なった組成の代替的樹脂を、サイズ排除同様に利用して、ほぼ同じか、よりよい結果が得られるかもしれない。これらの方法では、レプリコン粒子が基質に入り込むことができるため、より長く保持される、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００など大きなサイズの樹脂が組み込まれて、分画を可能にするであろう。
【００９７】
当業者は、レプリコンＲＮＡの許容性細胞への導入を、例えば、ＲＮＡ（例えば、インビトロで転写されたＲＮＡ）のトランスフェクションまたはエレクトロポレーション、細胞内におけるＤＮＡからのＲＮＡ転写（例えば、真核レイヤードベクター開始システム）、またはウイルスもしくはウイルス様の粒子（例えば、レプリコン粒子）による輸送のような種々の手段によって行うことができ、また、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする欠損ヘルパーＲＮＡまたはｍＲＮＡを許容性細胞内に導入することも、例えば、ＲＮＡ（例えば、インビトロで転写されたＲＮＡ）のトランスフェクションまたはエレクトロポレーション、または細胞内におけるＤＮＡからのＲＮＡ転写（例えば、構造タンパク質発現カセット）など、多様な手段で行うことができることを、容易に理解できよう。
【００９８】
（Ｄ．不活化ウイルス）
本発明は、不活化（または死滅させた）ウイルス（例えばＰＩＶ）を含む組成物、およびそれらを作製する方法を含む。不活化ウイルス組成物は予防用ワクチンとして使用することができる。好ましくは、不活化ウイルスワクチン組成物は、対数で約４〜８のプラーク形成単位（ＰＦＵ）、またはミリリットルあたり対数で約４〜８の組織培養感染価５０（ＴＣＩＤ５０）のウイルス力価に等しい量の不活化ウイルスを含む。さらにより好ましくは、この不活化ウイルスワクチン組成物は、対数で約５〜９のプラーク形成単位（ＰＦＵ）、またはミリリットルあたり対数で約５〜９の組織培養感染価５０（ＴＣＩＤ５０）のウイルス力価に等しい量の不活化ウイルスを含む。このワクチン組成物は、霊長類において免疫学的反応を起こすのに十分な量ウイルス抗原を含む。
【００９９】
ウイルスを不活化または死滅させて、ウイルスが哺乳動物の細胞に感染する能力を破壊する方法は当技術分野で公知である。このような方法は化学的または物理的手段を含む。ウイルス（例えば、ＰＩＶ）を不活化させる化学的手段は、有効量の以下の因子の１つ以上のものでウイルスを処理することを含む。すなわち、界面活性剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、β−プロピオラクトン、またはＵＶ光。不活化のためのさらに別の化学的手段は、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、またはこれらのいずれかを組み合わせたもので処理することを含む。その他にウイルスを不活化させる方法、例えば、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはガンマ線照射などが当技術分野で公知である。
【０１００】
例えば、β−プロピオラクトンを、０．０１〜０．５％、好ましくは０．５％〜０．２％、さらに好ましくは０．０２５〜０．１％などの濃度で使用することが可能である。ウイルス増殖に使用した容器から前記培養上清を回収する前か後に、回収前に細胞に結合したウイルスを放出させるための細胞破壊工程とともに、またはその工程なしで、ウイルスを含む培養上清（ウイルス材料）に不活性化剤を添加する。さらに、前記培養上清を凍結貯蔵し、解凍した後、または細胞混入物質を除去するための１回以上の精製工程の後に、不活化剤を添加してもよい。ｐＨの酸性方向への有害な遷移を水酸化ナトリウム（例えば、１ＮのＮａＯＨ）または重炭酸ナトリウムの溶液で調節しつつ、ウイルス材料にβプロピオラクトンを添加する。不活化剤とウイルス材料の混合物を、４℃〜３７℃の温度で、好ましくは１２〜７２時間のインキュベーション時間でインキュベートする。
【０１０１】
使用可能な別の不活化剤は、バイナリーエチルアミンである。等容積の０．２モルの臭化水素酸ブロモエチルアミン溶液、および０．４モルの水酸化ナトリウム溶液を混合して、６０分間約３７℃でインキュベートする。生じた環化不活化剤がバイナリーエチルアミンであって、容積対容積で、０．５〜４パーセント、好ましくは１〜３パーセントでウイルス材料に添加される。不活化ウイルス材料を約４℃〜３７℃で２４〜７２時間、周期的に撹拌しながら保持した。このインキュベーションの最後に、１モルの無菌チオ硫酸ナトリウム溶液２０ｍｌを添加して確実にＢＥＩを中和する。
【０１０２】
１つの実施形態において、本発明は、ウイルスの不活化剤への曝露を最大にし、かつ、温度感受性ウイルス粒子が高温に長期間曝露されることを最小限に抑えるように設計されている不活性化法を含む。本発明は、ウイルスを（ＢＰＬなどの）不活化剤に冷蔵温度で１２〜２４時間曝露してから、３時間だけ温度を上昇させて、残留する不活化剤を加水分解する不活性化法を含む。好ましくは、冷蔵温度は０℃から８℃の間であり、より好ましくは約４℃である。好ましくは、上昇温度は３３℃から４１℃の間であり、より好ましくは約３７℃である。
【０１０３】
不活化ウイルス材料の希釈サンプルまたは未希釈サンプルを、感受性細胞（組織）培養物（例えば、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＶＥＲＯ）に添加して、不活化されていないウイルスを検出する。培養細胞を複数回継代して、例えば、細胞変性効果（ＣＰＥ）および抗原検出（例えば、ウイルスに特異的な蛍光抗体結合体を介する）など、多様な方法のいずれかに基づいてウイルスの存在を検査する。このような検査によって、ウイルスが完全に不活性化したことを判定することが可能になる。
【０１０４】
不活性化用のウイルスまたはアルファウイルスベクターは、一般的に哺乳動物細胞培養物中で培養するか増殖させる。細胞培養物は、付着して増殖する細胞であっても、または懸濁液中で増殖する細胞であってもよい。好ましくは、細胞は哺乳動物起源であるが、鳥類（例えば、メンドリ胚細胞（ＣＥＦ細胞）などのメンドリの細胞、ＥＢ４５細胞）、両生類、爬虫類、昆虫、または魚類に由来するものであってもよい。哺乳動物細胞源は、ヒトまたは非ヒト霊長類（例えば、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）、ヒト胚性腎臓細胞（２９３細胞、典型的には剪断されたアデノウイルス５型ＤＮＡによって形質転換されている）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、サル腎臓由来のＶＥＲＯ細胞）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＭＤＣＫ３３０１６、ＷＯ９７／３７００１に記載されているように寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２２１９）、ネコ、および齧歯動物（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆなどのハムスター細胞、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞））などであるが、これらに限定されず、例えば、成体期、新生児期、胎児期、胚芽期など、多様な発育段階から得ることが可能である。好ましくは、本発明のウイルスはＬＬＣ−ＭＫ２、ＶＥＲＯ細胞または胎児アカゲサル腎臓細胞において増殖させる。
【０１０５】
上記細胞型の培養条件がさまざまな出版物において十分に説明されており、あるいは、例えばＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）のカタログおよび付加的文献に記載されているように、培養培地、補助剤、および条件を商業的に購入することができる。いくつかの実施形態において、本明細書記載の方法で使用される宿主細胞は、血清および／またはタンパク質を含まない培地で培養される。本発明に関しては、培地は、ヒトまたは動物起源の血清に由来する添加物が存在せず、無血清培地と呼ばれる。タンパク質非含有とは、タンパク質、増殖因子、その他のタンパク質添加物、および非血清タンパク質を排除した、細胞増殖が起こる培養を意味するものとする。このような培養物中で増殖する細胞は、当然ながらタンパク質そのものを含む。既知の無血清培地は、イスコブの培地、ウルトラＣＨＯ培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。通常の血清含有培地は、イーグル基本培地（ＢＭＥ）または最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）などであり、これらは、通常、最大１０％のウシ胎児血清または同様の添加物とともに使用される。場合によっては、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）を、血清含有補助剤なしで使用してもよい。ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＨＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のようなタンパク質非含有培地、ＰｒｏＣＨＯ  ４ＣＤＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＳＭＩＦ  ７（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの化学的に定義された培地、およびプリマクトン（Ｐｒｉｍａｃｔｏｎｅ）、ペプチケース（Ｐｅｐｔｉｃａｓｅ）、またはＨｙＰｅｐ（登録商標）（すべてＱｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより）などのマイトジェン性ペプチド、またはラクトアルブミンの加水分解物（Ｇｉｂｃｏおよび他の製造業者）も従来技術において十分に公知である。植物の加水分解物に基づいた培地添加物には、ウイルス、マイコプラズマまたは未知の感染因子の混入を排除できるという特別な利点がある。
【０１０６】
所望の用途に用いられる細胞培養条件（温度、細胞密度、ｐＨ値など）は、本発明に従って使用される細胞株の適合性によって広い範囲にわたって多様であり、ウイルスまたはベクターの増殖に必要なものにも合わせることが可能である。
【０１０７】
不活化ウイルスの精製法は当技術分野で公知であり、例えば、勾配遠心分離、超遠心分離、連続流超遠心分離、および、例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および液体アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーの１個以上を含むことができる。ＪＰ  Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ“Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｖｉｒｕｓｓｉｍｐｆｓｔｏｆｆｅｎ  ａｕｓ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ”Ｃｈａｐｔｅｒ  ４．２  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅ（Ｏ．ＫａｙｓｅｒおよびＲＨ  Ｍｕｅｌｌｅｒ編）Ｗｉｓｓｅｎｓｈａｆｔｌｉｃｈｅ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｈａｆｔ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，２０００参照。また、Ｏ’Ｎｅｉｌら，“Ｖｉｒｕｓ  Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂａｓｅｄ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９３）１１：１７３−１７７；Ｐｒｉｏｒら，“Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＩＶ−１”，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）３０−５２；およびＭａｊｈｄｉら，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｌｋ  Ｃａｌｖｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｒｒｈｅａ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）３５（１１）：２９３７−２９４２も参照。
【０１０８】
本発明で使うのに適した精製法の他の例は、ポリエチレングリコール沈殿法または硫酸アンモニウム沈殿法（Ｔｒｅｐａｎｉｅｒら，“Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ，ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｏｒ  ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８１）３（４）：２０１−２１１；Ｈａｇｅｎら，“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｐａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ＶＡＱＴＡ，ａ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ（１９９６）１２：４０６−４１２；およびＣａｒｌｓｓｏｎら，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９４）４７：２７−３６参照）、ならびに超遠心分離法および精密濾過法（Ｐａｙら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）６０：１７１−１７４；Ｔｓｕｒｕｍｉら，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓ  ｏｆ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｕｐｒａｍｍｏｎｉｕｍ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ（ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＢＭＭ  ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ）  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｍｏｖａｌ”Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９０）２２（１２）：１０８５−１１００；およびＭａｋｉｎｏら，“Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｃｅｌｌｕｏｓｅ  ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ，ＢＭＭ”；Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）１３９（１−２）：８７−９６参照）を含む。
【０１０９】
好ましくは、ウイルスは、イオン交換クロマトグラフィーなど、クロマトグラフィーを利用して精製される。クロマト精製によって、ウイルスを含む懸濁液を大量に作製することが可能になる。目的とするウイルス産物を、単純な吸着／脱離のメカニズムによってクロマト培地と相互作用させることができるため、１回の充填で大量のサンプルを処理することができる。吸着剤に親和性をもたない混入物質はカラムを通過しない。よって、ウイルス材料は、濃縮された形で溶離される。
【０１１０】
本発明で使用される好ましい陰イオン交換樹脂はＤＥＡＥ、ＥＭＤ  ＴＭＡＥなどである。好ましい陽イオン交換樹脂は、スルホン酸によって修飾された表面を含むことができる。１つの実施形態において、第１の工程では強力な陰イオン交換樹脂（すなわち、ＥＭＤ  ＴＭＡＥ）、そして第２の工程ではＥＭＤ−ＳＯ３（陽イオン交換樹脂）を含むイオン交換クロマトグラフィーを用いて、ウイルスを精製する。さらなる精製を行うために、金属結合アフィニティークロマトグラフィー工程を任意で含んでもよい（例えば、ＷＯ９７／０６２４３参照）。
【０１１１】
本発明において使用される好ましい樹脂は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤである。このメタクリル酸ベースの合成樹脂は、共有結合で結合した、長い線状多量体の鎖（いわゆる「テンタクル」）をもっている。この「テンタクルの化学作用」によって、立体的に接触可能な大量のリガンドが立体的障害なしに生体分子と結合することが可能となる。この樹脂は圧力安定性も向上している。
【０１１２】
カラムベースの液体アフィニティークロマトグラフィーは、本発明で使用される別の好ましい精製法である。この精製法において利用される樹脂の一例は、Ｍａｔｒｅｘ（登録商標）Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（登録商標）硫酸（ＭＣＳ）である。ＭＣＳは、セルロースの６位に低濃度の硫酸エステル官能基をもつ、排除限界３，０００ダルトンの剛球体（直径約４５〜１０５μｍ）セルロース基質（その孔構造により巨大分子が排除される）から成る。官能性リガンド（硫酸エステル）は、比較的高度に分散するため、ほとんどの可溶性タンパク質をビーズ表面に吸着させるには不十分な陽イオン電荷密度を示す。したがって、典型的なウイルス貯留に存在するタンパク質のバルク（細胞培養上清、すなわち発熱物質およびほとんどの混入タンパク質、ならびに核酸および内毒素）をカラムから洗浄して、結合ウイルスのある程度の精製が達成される。
【０１１３】
不活化ウイルスを精製するために利用される、さらに別の精製法は、核酸分解剤、好ましくは、ＤＮａｓｅ活性およびＲＮａｓｅ活性をもつヌクレアーゼなどの核酸分解酵素、または、例えば、霊菌に由来する、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）として市販されているエンドヌクレアーゼ、陰イオン官能基をもつ膜吸着剤（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標））、または、陰イオン官能基（例えば、ＤＥＡＥまたはＴＭＡＥ）を用いる追加的なクロマトグラフィー工程を含む。超濾過／透析濾過および最終的な除菌工程を、精製法に加えることも可能である。好ましくは、精製は、１つ以上の核酸分解酵素によってウイルス調製物を処理することを含む。これらの酵素は、ウイルス精製工程における宿主細胞核酸レベルを低下させるために利用され得る。細胞培養において利用される核酸分解酵素は当技術分野で公知であり、例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を含む。
【０１１４】
本発明の精製ウイルス調製物は、細胞または細胞培養物に由来する混入タンパク質を実質的に含まず、好ましくはウイルス抗原１μｇあたり細胞核酸約５０ｐｇ未満を含む。さらに好ましくは、精製ウイルス調製物は約２０ｐｇ未満、さらに好ましくは約１０ｐｇ未満を含む。ウイルスサンプル中の宿主細胞核酸レベルの測定法は、当技術分野で公知である。ＷＨＯまたはＦＤＡのような監督機関によって承認または推奨されている標準化法が好ましい。
【０１１５】
本発明は、予防に効果的な量のウイルス抗原、好ましくはエンベロープ糖タンパク質またはその免疫原性フラグメントを含む不活化ワクチン組成物を含む。ウイルス抗原は、好ましくは、投与量あたり抗原０．１〜５０μｇ、さらに好ましくは０．３〜３０μｇの濃度で存在する。さらに好ましくは、抗原は投与量あたり約１５μｇである。
【０１１６】
１つの実施形態において、より低濃度のウイルス抗原が本発明の不活化ワクチン組成物において使用される。このような低濃度ワクチンは、必要に応じて、抗原に対する宿主の免疫反応を高めるアジュバントを含むこともできる。このような「低投与量」ワクチンにおいては、ウイルス抗原は、好ましくは投与量あたり抗原１５μｇ未満（すなわち、投与量あたり抗原１０、７．５，５または３μｇ未満）の濃度で存在する。
【０１１７】
本発明の不活化ワクチン調製物は、不活化ウイルス調製物の中で免疫原性タンパク質の完全性を保存するための安定剤をさらに含むことができる。ワクチンで使用するのに適した安定剤は当技術分野で公知であり、例えば、緩衝液、糖、糖アルコール、およびアミノ酸を含むことができる。安定化緩衝液は、好ましくは生理学的ｐＨ領域に調整され、リン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ＴＥ（トリス／ＥＤＴＡ）、ＴＥＮ（トリス／ＮａＣｌ／ＥＤＴＡ）およびアール（Ｅａｒｌｅ’ｓ）食塩水を含むことができる。安定化糖は、例えば、スクロース、グルコース、フルクトース、デキストラン、デキストラン硫酸、およびトレハロースの１つ以上を含むことができる。安定化糖アルコールは、例えば、キシリット／キシリトール、マンニット／マンニトール、ソルビット／ソルビトール、およびグリセロールを含むことができる。本発明で使用するのに適したアミノ酸は、例えば、Ｌグルタミン、アルギニン、システイン、およびリジンを含む。本発明において使用できる別の安定剤は、酒石酸、プルロニックＦ６８、およびＴｗｅｅｎ８０を含む。
【０１１８】
本発明の不活化ウイルス調製物に使用され得るウイルス単離株は、例えば、精製された（例えば、プラーク精製された）臨床サンプル由来、または既知の保存株（例えば、ＡＴＣＣ）由来など、多様な源から得ることができる。ウイルスを単離する方法は当技術分野で公知である。
【０１１９】
（呼吸器系病原体）
本明細書記載の組成物および方法は、このように、ウイルス、真菌および／または細菌などの１つ以上の呼吸器系病原体由来のタンパク質をコードする核酸配列を含むアルファウイルスレプリコンベクター、ベクター構築物またはレプリコン粒子を含む。本発明の目的では、事実上いかなるポリペプチドまたはポリヌクレオチドも利用することができる。
【０１２０】
抗原は、数種の既知の呼吸器系病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌）のいずれかに由来することができ、これらに対する免疫応答が望まれる。さらに、本発明の目的にとって、「抗原」は、タンパク質が免疫応答を誘導する能力を維持するかぎり、天然配列に対する（天然においては一般に保存的な）欠失、付加および置換などの改変を含むタンパク質を意味する。これらの改変は、部位特異的突然変異によるなど、計画的なものであってもよく、または、抗原を産生する宿主の突然変異によるなど偶発的なものであってよい。
【０１２１】
抗原は単独または任意の組み合わせで利用することができる。組み合わせは、同一病原体に由来する複数の抗原、異なる病原体に由来する複数の抗原、または同一の病原体および異なる病原体に由来する複数の抗原を含みうる。したがって、さまざまな呼吸器系ウイルス性病原体由来のウイルス抗原を、同一組成物に含むこともできるか、または同一被験体に別々に投与することも可能である。
【０１２２】
抗原を併用して免疫応答を起こすことは一般的に好ましい。核酸は、同一の呼吸器系病原体に由来する免疫原性タンパク質をコードするか、または、代替的に異なる呼吸器系病原体に由来する免疫原性タンパク質をコードすることができる。免疫原性タンパク質をコードする核酸が同一の呼吸器系病原体に由来していれば、その核酸が、さまざまなアルファウイルスベクターまたは粒子に含まれていることが好ましいが、必ずしも必要ではない。さらに、核酸が同一の呼吸器系病原体に由来する免疫原性タンパク質をコードする場合、該核酸は同一株または異なる株に由来することが可能である。
【０１２３】
このように、本明細書記載の免疫原性組成物およびワクチンは、呼吸器系病原体に対して、より最適または完全な防御を提供すること、および防御的免疫応答の幅を広げることを意図するものである。
【０１２４】
本発明のウイルス性呼吸器系病原体の非限定的な例は、オルソミキソウイルス科（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１９９８，Ｐｌｏｔｋｉｎ  ＆  Ｍｏｒｔｉｍｅｒ編（ＩＳＢＮ０−７２１６−１９４６−０）の１９章に記載されているように、Ａ型、Ｂ型およびＣ型インフルエンザウイルスなど）、パラミクソウイルス科（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１９９８，Ｐｌｏｔｋｉｎ  ＆  Ｍｏｒｔｉｍｅｒ編（ＩＳＢＮ０−７２１６−１９４６−０）の９〜１１章に記載されているようにパラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、ヒトメタニューモウイルスなど）、コロナウイルス科（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス、Ｒｏｔａら，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３９４−１３９９）、ピコルナウイルス科（例えば、ライノウイルス）インフルエンザウイルス（Ｋａｗａｏｋａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０），１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら，“Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ”ｐ．１２７−１６８．Ｉｎ：Ｐ．ＰａｌｅｓｅらＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）などである。
【０１２５】
本発明の細菌性呼吸器系病原体の非限定的な例は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア菌）、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）（例えば、糖類またはタンパク質抗原、特に肺炎球菌由来の糖類）、型別不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（インフルエンザ菌）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽菌）、およびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（レジオネラ・ニューモフィラ菌）（レジオネラ症）などである。
【０１２６】
真菌性呼吸器系病原体の非限定的な例は、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ（バレー熱の病原因子）、クリプトコッカス菌（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ（クリプトコッカス・ネオフォルマンス））、およびカンジダ菌（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（カンジダ・アルビカンス））およびアスペルギルス菌などである。
【０１２７】
（Ａ．ＲＳウイルス）
ＲＳウイルスは、１歳未満の乳児および小児の気管支炎および肺炎の最も一般的な原因である。ほとんどの場合、発熱、鼻水、咳、時として喘鳴を伴って病気が始まる。最初のＲＳＶ感染で、乳児および幼児の２５％〜４０％が気管支炎または肺炎の兆候または症状を示し、０．５％〜２％が入院を要する。ほとんどの小児が８〜１５日で治癒する。ＲＳＶ感染のために入院した小児の大部分は、生後６ヶ月未満である。ＲＳＶは、通常は中程度ないし重度の風邪様の症状を伴いながら、一生感染を繰り返しもするが、重度の下部気道疾患があらゆる年齢、特に高齢においてか、または心臓、肺もしくは免疫系に欠陥のある人々に発生し得る。
【０１２８】
ＲＳＶは、パラミクソウイルス科に属するマイナス鎖の単鎖ＲＮＡウイルスであり、表面に存在する付着糖タンパク質（Ｇ）および融合タンパク質（Ｆ）の「スパイク」など、ワクチン用途のために、十分に特徴付けられた標的抗原を複数持っている（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：３１６３−３１６６）。Ｇ抗原およびＦ抗原に加えて、本発明において有用なポリペプチドをコードする他のＲＳＶ遺伝子は、マトリックスタンパク質（Ｍ）、ＳＨタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、Ｐ、Ｌ、Ｍ２−１およびＭ２−２を含む（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ７４５６８およびＮＣ００１７８１；Ｗｅｒｔｚ，ら１９８５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４０７５−４０７９；Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２６２３−２６２８；Ｊｏｈｎｓｏｎら，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５６２５−５６２９；Ｃｏｌｌｉｎｓら，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７６８３−７６８７；Ｃｏｌｌｉｎｓら，（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０１５−３０２０参照）。
【０１２９】
（Ｂ．パラインフルエンザ）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）は、幼児の下部気道疾患の一般的な原因としてはＲＳＶに劣る。ＲＳＶ同様、ＨＰＩＶは一生感染を繰り返すことができ、通常は上部気道疾患（風邪および／または咽喉炎）によって顕在化する。ＨＰＩＶはまた、繰り返し感染することにより、特に老人および免疫系不全患者に、深刻な下部気道疾患（例えば、肺炎、気管支炎、および気管支梢炎）を引き起こし得る。
【０１３０】
４種類のＨＰＩＶのそれぞれは、異なる臨床的特徴および疫学的特徴を持っている。ＨＰＩＶ−１およびＨＰＩＶ−２の最も明確な臨床的特徴はクルップ（すなわち、喉頭気管気管支炎）であり、ＨＰＩＶ−１は小児のクルップの主な原因であるが、ＨＰＩＶ−２は頻繁には検出されない。ＨＰＩＶ−１およびＨＰＩＶ−２はともに、他の上部および下部気道の疾患を引き起こすことがある。ＨＰＩＶ−３は、喉頭気管梢炎および肺炎と関連していることがよくある。ＨＰＩＶ−４は、おそらく重度の疾病を引き起こすことがないので、まれにしか検出されない。
【０１３１】
ＰＩＶは、パラミクソウイルス科に属するマイナス鎖の単鎖ＲＮＡウイルスであり、それらの表面に融合糖タンパク質（Ｆ）、および赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質の「スパイク」を有する。４種の血清型ＨＰＩＶ（１〜４）と２種の特殊型（４ａおよび４ｂ）がある。Ｆ抗原およびＨＮ抗原に加えて、本発明において有用なポリペプチドをコードするその他のＰＩＶ遺伝子は、マトリックスタンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシド（ＮＰ）、燐タンパク質（Ｐ）、Ｌ、修飾タンパク質Ｖ、Ｃ、Ｄ、Ｗ、Ｘ、およびＩを含む（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号＃Ｚ１１５７５、ＮＣ００１７９６、ＡＦ５３３０１２、およびＵ５１１１６、ならびにＳｔｏｋｅｓら，１９９２  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２５：９１−１０３参照）。
【０１３２】
（Ｃ．ヒトメタニューモウイルス）
ヒトメタニューモウイルスは、ＲＳウイルスと同じパラミクソウイルス科の亜科の肺炎ウイルス属に属する、最近発見された呼吸器系病原体である。ＨＭＰＶは、２０年間にわたって小児から採集された鼻咽頭吸引液サンプル中に２００１年にオランダで最初に認められた。以来、世界各国で同定されている。最近のＨＭＰＶ調査報告によれば、呼吸器系疾患で入院するＨＭＰＶ感染小児は、ＲＳＶ感染小児と同様、気管支梢炎および肺炎との臨床診断をしばしば受ける。ＨＭＰＶ感染小児の臨床症状は、乾性咳嗽、鼻づまり、および喘鳴を含んでいた。最も一般的に報告された、胸部エックス線の異常は、肺炎の指標である両側浸潤影であった。最近の研究では、小児のヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）感染を、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）感染と同じような重症度の呼吸器系疾病に関連付けている。
【０１３３】
ＲＳＶおよびＰＩＶと同様に、ＨＭＰＶは、エンベロープＧ糖タンパク質（Ｇ）および融合タンパク質（Ｆ），マトリックスタンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ），ＳＨタンパク質、Ｐ、Ｌ、およびＭ２など、本明細書記載の免疫原性組成物において有用な複数の抗原標的をもつ（例えば、Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７：７１９−７２４：およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３７１３３７；Ｃｒｏｗｅ（２００４）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．，２３：Ｓ２１５−２２１参照）。
【０１３４】
（Ｄ．ＳＡＲＳ）
重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）は、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）と呼ばれるコロナウイルスによって引き起こされるウイルス性呼吸器系疾患である。ＳＡＲＳは、２００３年２月にアジアで初めて報告された。その後数ヶ月間にわたって、２００３年のＳＡＲＳの世界的集団発生が抑え込まれるまで、この病気は北アメリカ、南アメリカ、ヨーロッパ、およびアジアの２４より多い国々に拡大した。世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、２００３年の集団発生期間中に、全世界で総計８，０９８人がＳＡＲＳにより病気になった。そのうち７７４人が死亡した。一般的に、ＳＡＲＳは、高熱（１００．４°Ｆ（＞３８．０℃）よりも高い体温）とともに始まる。この他の症状は、頭痛、全身の不快感および身体の痛みを含み得る。また、発症時には軽度の呼吸器症状を示す人もいる。患者の約１０パーセント〜２０パーセントが下痢を有する。２〜７日後、ＳＡＲＳ患者は乾いた咳をするようになる。ほとんどの患者は肺炎に罹る。
【０１３５】
他のコロナウイルスのように、ＳＡＲＳ−ＣｏＶはスパイク糖タンパク質（Ｓ）など、複数の抗原標的をもつ大型のプラス鎖ＲＮＡウイルスである（Ｓｏｎｇら，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１０３２８−１０３３５）。本発明にとって有用なポリペプチドをコードするＳＡＲＳ−ＣｏＶ遺伝子は、例えばスパイク糖タンパク質（Ｓ）、Ｅ、Ｍ、Ｎ、ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ、および機能があまり分かっていない比較的小型の多様なタンパク質を含む（Ｒｏｔａら，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３９４−１３９９；Ｍａｒｒａら，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３９９−１４０４；Ｒｕａｎら，２００３，Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：１７７９−１７８５；Ｅｉｃｋｍａｎｎら，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：１５０４−１５０５）。ＳＡＲＳポリペプチドも、ＷＯ０４／０９２３６０に記載されている。
【０１３６】
（Ｅ．インフルエンザ）
インフルエンザウイルスは３つの異なる型、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型を含む。Ａ型インフルエンザウイルスは、ウイルスの表面上の２個のタンパク質、赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて亜型に分けられる。１５の異なるＨＡ亜型および９の異なるＮＡ亜型がある。これらのウイルスは、その表面タンパク質に従って分類される。例えば、「Ｈ７Ｎ２ウイルス」は、血球凝集素７タンパク質およびノイラミニダーゼ２タンパク質をもつＡ型インフルエンザの亜型を表す。野生のトリは、Ａ型インフルエンザウイルスのすべての亜型の天然宿主である。Ｂ型インフルエンザおよびＡ型インフルエンザの特定の亜型（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２およびＨ３Ｎ２）は、通常はヒトの間を循環していて、毎年病気の流行を引き起こす。Ｃ型インフルエンザウイルスは穏やかなので、流行を引き起こさない。Ａ型ウイルスが、歴史的にインフルエンザの大流行の原因であった。
【０１３７】
インフルエンザウイルスは、大流行しているヒト株、新たに大流行するヒト株、および今後大流行するヒト株を含む。大流行の発生を引き起こす可能性のあるインフルエンザ株の特徴は以下である：（ａ）現在循環しているヒト株における赤血球凝集素と比較して新しい赤血球凝集素を含む。すなわち、１０年以上にわたりヒト集団において明らかにならなかったもの（例えば、Ｈ２）、またはヒト集団においてはまれにしか見られず（例えば、一般的に、トリ集団のみに見出されるＨ５、Ｈ７またはＨ９）、その結果、ヒト集団が、その株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブになっている；（ｂ）ヒト集団において水平に伝染し得る；および（ｃ）ヒトに対して病原性である。
【０１３８】
単純なインフルエンザ疾患は、全身および呼吸器の兆候および症状（例えば、発熱、筋肉痛、頭痛、重度の倦怠感、乾性咳嗽、喉頭炎、および鼻炎）の突然の発症という特徴がある。中耳炎、吐き気、および嘔吐も、小児のインフルエンザ疾患について一般的に報告されている。インフルエンザが原因となる呼吸器系疾患は、症状だけで、他の呼吸器系病原体が原因となった疾患と区別するのは難しい。大多数の人々にとって、インフルエンザ疾患は、一般的に、数日後には消散するが、咳および倦怠感が２週間よりも長く持続し得る。ある特定の人々の間では、インフルエンザは、基礎的な医学的状態（例えば、肺または心臓疾患）を悪化し得、２次的な細菌性肺炎または１次的なインフルエンザウイルス性肺炎を発症させ得るか、他のウイルス性または細菌性病原体との同時感染の一部として生じ得る。インフルエンザに感染した幼児は、高熱を伴う細菌性敗血症に似た初期症状を有し得、インフルエンザで入院した小児の２０％以下が熱性発作を起こすことがある。インフルエンザ感染は、脳障害、横断性脊髄炎、ライ症候群、筋炎、心筋炎、心膜炎とも関連している。
【０１３９】
インフルエンザによる合併症、入院、および死亡のリスクは、６５歳以上の人々、幼児、および任意の年齢の特定の基礎的健康状態を有する人々（Ｐｅｒｓｏｎｓ  ａｔ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ参照）では、健康な年長児および若年成人よりも高い。インフルエンザに関連した死亡は、肺炎ならびに心肺状態およびその他慢性疾患の悪化に起因し得る。高齢者が、肺炎およびインフルエンザが原因となる死亡の９０％以上を占めている。
【０１４０】
通常は人に感染するインフルエンザウイルスに加えて、通常人々に感染するインフルエンザウイルスとは一般的に遺伝子的に区別可能であり、家禽にさまざまな程度の病気を引き起こすトリインフルエンザウイルスも本発明において意図されている。トリインフルエンザに感染しているトリは、唾液、鼻腔分泌物および糞便でウイルスを撒き散らす。感受性のトリが汚染された排泄物に接触すると疾患が広がる。Ａ型トリインフルエンザは、通常はヒトに感染しないが、ヒトに感染した数件の例、およびトリインフルエンザの大発生が１９９７年以来報告されている。トリインフルエンザのヒト感染のほとんどの事例は、感染した家禽または汚染表面との接触が原因と考えられている。ヒトに感染したと報告されているトリインフルエンザの一例はＨ７インフルエンザウイルスであるが、このウイルスはトリの間では世界的に循環していて、特に、ニワトリその他の家禽など、飼われているトリに対して致死性となり得る。しかしながら、２００３年に、Ａ（Ｈ７Ｎ７）型インフルエンザが数箇所の飼育場の家禽において発生したことを、オランダが報告した。後に、ブタおよびヒトの間での感染が報告された。全部で８３人が、この家禽での発生に関連したＨ７Ｎ７インフルエンザウイルスに感染したことが確認された。これらの症例はほとんど家禽の作業員の間で発生した。デラウエア州も、家禽にＡ（Ｈ７Ｎ２）型トリインフルエンザが発生したことを報告した。感染した家禽は処分されているところであり、防疫対策が策定されている。このＨ７Ｎ２型ウイルスはＨ７Ｎ７型ウイルスと著しく異なっている。アジア諸国ではトリ集団の間で、タイおよびベトナムではヒトで、Ａ（Ｈ５Ｎ１）型インフルエンザの発生が現在起こりつつある。これまでに、Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスは、１９９７年に香港で（１８例）、また２００３年に中国に旅をした香港の２人にヒトの病気を引き起こした。本発明の好ましいＦＬＵ抗原は、表面糖タンパク質赤血液凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む。
【０１４１】
例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、またはＨ１５の各赤血球凝集素、ならびにＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、およびＮ９の各ノイラミニダーゼをもつ亜型（例えば、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ８の各株）をもつ亜型など、さまざまなインフルエンザ亜型が、本発明によって意図された標的抗原の供給源である。本発明の抗原をコードするＦＬＵ遺伝子は、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオカプシド（ＮＰ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１）、イオンチャンネルタンパク質（Ｍ２）、ＮＳ１、ＮＳ２、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡを含む（Ｌａｍｂら，２００１，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ＫｎｉｐｅらＨｏｗｌｅｙ，編，ｐｐ．１４８７−１５３２，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓらＷｉｌｋｉｎｓ；Ｗｒｉｇｈｔら，２００１，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ＫｎｉｐｅらＨｏｗｌｅｙ，編，ｐｐ．１５３３−１５７９，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓらＷｉｌｋｉｎｓを参照）。
【０１４２】
上記のように、１つ以上のインフルエンザタンパク質（抗原）が、本明細書に記載されている１つ以上のアルファウイルスの構築物または粒子によってコードされうる。特定の実施形態において、本明細書に記載されているのは、１つのＦＬＵ抗原（ＨＡおよび／またはＮＡ）を含む第１のアルファウイルスの構築物または粒子を含む組成物である。または、他の実施形態において、免疫原性組成物は、抗原が、パンデミックな、またはパンデミックである可能性のある複数のインフルエンザ株に由来する場合、複数のインフルエンザ抗原（例えば、ＨＡおよび／またはＮＡ）を（同一の粒子または異なった構築物または粒子の中に）含む。この組成物は、パンデミックな、またはパンデミックである可能性のあるインフルエンザ株、およびインターパンデミックなインフルエンザ株による感染に対する防御的および治療的な免疫応答を被験体に生じさせるため、または、「汎用」ｆｌｕワクチンを提供するために使用される。
【０１４３】
抗原が、パンデミックな、またはパンデミックである可能性のある複数のインフルエンザ株に由来する場合、複数のインフルエンザタンパク質（抗原）を、複数のインフルエンザ抗原（例えば、ＨＡおよび／またはＮＡ）を（同一の粒子または異なった構築物もしくは粒子の中で）コードしている１つ以上のアルファウイルスの構築物または粒子によってコードすることができる。この組成物は、パンデミックな、またはパンデミックである可能性のあるインフルエンザ株による感染に対する防御的および／または治療的な免疫応答を被験体に生じさせるため、または、「汎用」パンデミックなｆｌｕワクチンを提供するために使用される。
【０１４４】
同様に、インターパンデミックなインフルエンザ株に由来する複数のＦＬＵタンパク質（例えば、ＮＡおよび／またはＨＡタンパク質）をコードする配列を（同一の粒子または異なる構築物または粒子の中に）含む１つ以上の構築物または粒子を、（卵の供給によって制限される）従来型卵ベースのＦＬＵワクチンよりも広範囲の抗原をもつ免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を提供するため、または毎年再処方される必要がなく、および／もしくは、抗原不連続変異を抑制するのに役立つ汎用ワクチンを提供するために作製することができる。
【０１４５】
（Ｆ．細菌性呼吸器系病原体）
免疫原性タンパク質をコードする核酸を得ることができる呼吸器系細菌性病原体は、以下のものを含むが、これらに限定されない：結核菌（例えば、リポタンパク質、ＬＰＳ、ＢＣＧ抗原、抗原８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ）の融合タンパク質、および／または、必要に応じて陽イオン性脂質小胞に処方されるＥＳＡＴ−６（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００４  Ｏｃｔｏｂｅｒ；７２（１０）：６１４８）、結核菌（Ｍｔｂ）イソクエン酸脱水素酵素に関連した抗原（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４  Ａｕｇ  ２４；１０１（３４）１２６５２）、および／またはＭＰＴ５１抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００４  Ｊｕｌｙ；７２（７）：３８２９）；ジフテリア菌、百日咳菌、肺炎連鎖球菌（例えば、糖またはタンパク質の抗原、特に肺炎連鎖球菌由来の糖）、型別不能ヘモフィルスインフルエンザ菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（例えば、外膜タンパク質抗原（ＨＭＷ−ＯＭＰ）、Ｃ抗原、および／またはＬＰＳ）；緑膿菌（例えば、内毒素Ａ、Ｗｚｚタンパク質、緑膿菌ＬＰＳ、より具体的にはＰＡＯ１（Ｏ５血清型）から単離されたＬＰＳ、および／または、外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ）などの外膜タンパク質（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１  Ｍａｙ；６９（５）：３５１０−３５１５））；炭疽菌（例えば、Ａ成分（致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ））由来の炭疽菌抗原（任意には解毒されている）で、両者とも防御的抗原（ＰＡ）として知られる共通Ｂ成分を共有し得る）；および／またはレジオネラ・ニューモフィラ菌（レジオネラ症）：Ｌ．ニューモフィラ抗原−必要に応じて、破壊されたａｓｄ遺伝子をもつ細胞株に由来する（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９８  Ｍａｙ；６６（５）：１８９８）。
【０１４６】
特に参照されていない場合、本発明のさらなる細菌性抗原は、上記のいずれかの莢膜抗原、多糖類抗原、またはタンパク質抗原である。また、さらなる細菌性抗原は、外膜小胞（ＯＭＶ）調製物も含むことができる。さらに、抗原は、上記の細菌のいずれかの生の型、弱毒化された型、分割された型、および／または精製された型を含む。本発明の細菌または微生物に由来する抗原は、グラム陰性またはグラム陽性、および好気性または嫌気性であり得る。
【０１４７】
さらに、上記の細菌由来の糖類（多糖類、ＬＰＳ、ＬＯＳまたはオリゴ糖類）のいずれも、キャリアタンパク質（例えばＣＲＭ１９７）などの別の因子または抗原と結合体化することができる。このような結合体化は、米国特許第５，３６０，８９７号およびＣａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８４  Ｍａｙ；６２（５）：２７０−５に記載されているように、糖類のカルボニル部分の還元性アミノ化によってもたらされる、タンパク質上のアミノ基への直接的な結合体化であってもよい。または、この糖類は、例えば、スクシンアミドまたは、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９６およびＣＲＣ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９３に記載されている他の連結によって、リンカーを介して結合体化することができる。
【０１４８】
（Ｇ．真菌性呼吸器系病原体）
免疫原性タンパク質をコードする核酸が由来し得る真菌性呼吸器系病原体は、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：バレー熱の病原因子（抗原−２またはプロリン富化抗原（Ａｇ２／ＰＲＡ）（Ｓｉｌｖａ，ら，（２００５）ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  ４３（３）：３９３−８））であるＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉを含むコクシジオイデス種、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（例えば、クリプトコッカス抗原（Ｌｉａｗ，ら，（１９９８）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３（６）：１５８８−９１））などのクリプトコッカス菌、カンジダ菌（例えば、カンジダ・アルビカンス）、およびアスペルギルス菌。
【０１４９】
免疫原性タンパク質をコードする核酸が由来することのできる呼吸器系真菌抗原は、吸入または感作の後に呼吸器系疾患を引き起こす真菌抗原を含む。
【０１５０】
（Ｈ．併用）
上記したように、免疫原性組成物は、好ましくは、少なくとも１つの呼吸器系病原体に由来する２つ以上の免疫原性タンパク質をコードする核酸を含む。この免疫原性組成物は、本明細書記載のタンパク質の任意の組み合わせを含むことができる。さらに、免疫原性タンパク質をコードする核酸は、例えば、免疫原性タンパク質がＰＩＶ、ＲＳＶまたはＳＡＲＳに由来している場合、さまざまなアルファウイルスベクター構築物またはレプリコン粒子に含まれうる。例えば、該組成物が、同一または異なったＰＩＶタンパク質をコードする２つの核酸を含む場合、この２つの核酸は別のアルファウイルス構築物または粒子に含まれているのが好ましくあり得る。同様に、組成物が、同一または異なったＳＡＲＳタンパク質、あるいは同一または異なったＲＳＶタンパク質をコードする２つの核酸を含んでいる場合、この２つの核酸が、別のアルファウイルス構築物または粒子に含まれているのが好ましくあり得る。
【０１５１】
また、本発明は、同一のアルファウイルスベクター構築物またはレプリコン粒子に含まれる複数の免疫原性タンパク質をコードする核酸も包含する。
【０１５２】
（Ｈ．細胞株）
呼吸器系病原体に由来する抗原は、例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、バキュロウイルス、細菌、および酵母で用いられる系など、当該分野において知られたさまざまな発現系において産生することができる。このような発現系では、一般的には、免疫原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドが使用される。このような配列は、本明細書記載のアミノ酸配列を翻訳するなど、分子生物学の標準的技術を利用して得られる。したがって、本発明は、本発明のウイルス性抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。さらに、本発明のウイルス性抗原は合成化学法によって（少なくとも部分的に、好ましくは全部を）製造することができる。
【０１５３】
バキュロウイルス系など、昆虫細胞の発現系は当業者に知られており、例えば、ＳｕｍｍｅｒｓらＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系用の材料および方法は、キットの形で購入可能であり、とりわけＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡから購入可能である。鳥類細胞の発現系も当業者に知られており、例えば、米国特許第５，３４０，７４０号、第５，６５６，４７９号、第５，８３０，５１０号、第６，１１４，１６８号、および第６，５００，６６８号、欧州特許第ＥＰ０７８７１８０Ｂ号、欧州特許出願第ＥＰ０３２９１８１３．８号、ＷＯ０３／０４３４１５，およびＷＯ０３／０７６６０１に記載されている。同様に、細菌および哺乳動物細胞の発現系も当該分野において知られており、例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒ，ら，編，１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。
【０１５４】
上記の系で使用される多数の適当な宿主細胞も知られている。例えば、哺乳動物の細胞株は当該分野において既知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、などがあるが、これらに限定されない）が挙げられる。細胞の哺乳動物の供給源としては、ヒトまたは非ヒト霊長類（例えば、その全体が参照として本明細書に援用される、ＷＯ０１／３８３６２およびＷＯ０２／４０６６５に記載されており、また、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０号としても保管されているＰＥＲＣ．６細胞、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）、アカゲザル胎児の肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１６０）、ヒト胚腎細胞（２９３細胞、一般的には、剪断されたアデノウイルス５型のＤＮＡによって形質転換されている）、サルの腎臓に由来するＶＥＲＯ細胞）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌの腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞、ＷＯ９７／３７００１に記載されているように、寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２２１９の、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＭＤＣＫ３３０１６）、ネコ、および齧歯類（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞などのハムスター細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞））が挙げられるが、これらに限定されず、例えば、成体、新生児、胎児、および胚など、多様な発生段階から得ることも可能である。
【０１５５】
細胞の鳥類の供給源としては、ニワトリ細胞（例えば、ニワトリ胚性幹細胞（例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、大腸菌、枯草菌、および連鎖球菌などの細菌宿主は、本発現構築物に用途を見いだすであろう。本発明において有用な酵母宿主としては、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターとともに使われる昆虫細胞としては、とりわけ、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【０１５６】
（薬学的組成物）
また、本発明は、本明細書に記載されているアルファウイルスのレプリコン粒子、ベクターおよび／またはレプリコンならびに不活化ウイルスのいずれかを、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤とともに含む薬学的組成物も提供する。本発明は、不活化ウイルスに関する上記の手順が、アルファウイルスベクター（例えば、レプリコン粒子）にも適用可能であり得ると考えている。特定の好ましい実施形態の範囲内で、十分な量の処方用緩衝液を、精製されたレプリコン粒子に添加して水性懸濁液を作成する。好ましい実施形態において、処方用緩衝液は、水の中に糖類および緩衝化成分を含み、１つ以上のアミノ酸または高分子量の構造添加物も含むことができる。処方用緩衝液は、十分な量を添加して、構成物質の望ましい最終濃度に達して、レプリコン粒子を最小限に希釈する。そして、この水性懸濁液を、好ましくは−７０℃で貯蔵するか、直ちに乾燥させる。
【０１５７】
水性懸濁液は、周囲温度で凍結乾燥または蒸発によって乾燥することができる。要するに、凍結乾燥法は、水性懸濁液を気体転移温度より下、または水性懸濁液の共晶融点より下に冷却し、冷却された懸濁液から昇華によって水分を取り除いて、凍結乾燥したレプリコン粒子を形成する工程を含む。１つの実施形態に範囲内において、処方された組み換えウイルスのアリコートを、凍結乾燥器（Ｓｕｐｅｒｍｏｄｕｌｙｏ１２Ｋ）に取り付けられたＥｄｗａｒｄｓ  Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ  Ｃｈａｍｂｅｒ（３段棚式ＲＣ３Ｓユニット）に容れる。Ｐｈｉｌｌｉｐｓら，（Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １８：４１４，１９８１）によって説明されている多段階凍結乾燥法を用いて、処方されたレプリコン粒子を、好ましくは−４０℃〜−４５℃の温度で凍結乾燥する。得られた組成物は、凍結乾燥されたレプリコン粒子の重量の１０％未満の水分を含む。いったん凍結乾燥されると、以下により詳細に論じるように、レプリコン粒子は安定し、−２０℃〜２５℃で保存することができる。蒸発法では、水を周囲温度で蒸発させて水性懸濁液から取り除く。１つの実施形態の範囲内では、水分は、水性懸濁液が予熱気体流に送出される噴霧乾燥法によって取り除かれるが、水性懸濁液は予熱気体流に送出されると、通常、水分が懸濁液の小滴から急速に蒸発する。いったん水分を取り除かれると、組み換えウイルスは安定し、−２０℃〜２５℃で保存することができる。
【０１５８】
処方に用いられる水溶液は、好ましくは、糖類、緩衝成分、および水を含む。また、この溶液は、１つ以上のアミノ酸および高分子量の構造添加剤も含み得る。この成分の組み合わせを、凍結、およびまた凍結乾燥、または蒸発によって乾燥すると、レプリコン粒子の活性を保存するように作用する。好ましい糖類はラクトースであるが、スクロース、マンニトール、グルコース、トレハロース、イノシトール、フルクトース、マルトースまたはガラクトースなど、他の糖類も使用可能である。特に好ましいラクトース濃度は、３〜４重量％の濃度である。
【０１５９】
高分子量の構造添加剤は、粒子が凍結中に凝集するのを防止するのに役立ち、凍結乾燥状態または乾燥状態において構造的な支持をもたらす。本発明の文脈内で、構造添加剤は、５０００Ｍ．Ｗ．よりも大きければ、「高分子量」であると見なされる。好ましい高分子量構造添加剤はヒト血清アルブミンである。しかし、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、デキストラン、セルロース、ゼラチン、またはポビドンなど、他の物質も使用可能である。ヒト血清アルブミンの特に好ましい濃度は０．１重量％である。
【０１６０】
緩衝成分は、比較的一定のｐＨを維持して、溶液を緩衝化するよう作用する。好ましくは７．０と７．８の間である、所望のｐＨ範囲に応じて、多様な緩衝剤が用いることができる。適当な緩衝剤は、リン酸塩緩衝剤およびクエン酸塩緩衝剤などである。さらに、水溶液は、最終的な処方レプリコン粒子を適当な等浸透圧塩濃度に調整するために使われる中性塩を含むことが好ましい。適当な中性塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化マグネシウムなどである。好ましい塩は塩化ナトリウムである。凍結乾燥または脱水された本発明のレプリコン粒子は、多様な物質を利用して再構成され得るか、好ましくは、水を利用して再構成される。特定の場合において、最終処方物を等浸透圧にする希釈食塩水も利用され得る。
【０１６１】
（Ａ．アジュバント）
本発明の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）は、他の免疫調節因子と組み合わせて投与され得る。具体的には、組成物は、通常、アジュバントを含む。本発明で利用されるアジュバントは、下記に示されたものの１つ以上を含むが、これらに限定されない。
【０１６２】
（Ａ．無機物含有組成物）
本発明において、アジュバントとして使用するのに適した無機物含有組成物は、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機物塩などである。本発明は、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトリン酸塩）、硫酸塩などの無機塩（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ．編  ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．Ｐｌｅｎｕｍの８章および９章参照）、または、さまざまな無機化合物の混合物（例えば、必要に応じて、リン酸塩を過度に含む、リン酸塩アジュバントと水酸化物アジュバントとの混合物）を含み、これらの化合物は任意の適当な形状（例えば、ゲル、結晶、非結晶など）を取り、かつ、塩に吸着していることが好ましい。無機物含有組成物は、金属塩の粒子としても処方することができる（ＷＯ００／２３１０５）。
【０１６３】
アルミニウム塩は、Ａｌ３＋の投与量が投与１回あたり０．２ｍｇから１．０ｍｇになるよう、本発明のワクチンに含まれ得る。
【０１６４】
１つの実施形態において、アルミニウムベースのアジュバントは、ミョウバン（硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２））、または、リン酸緩衝液中で抗原をミョウバンと混合してから、水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムなどの塩基で滴定および沈殿することにより、インサイチュで形成される誘導体などのミョウバン誘導体である。
【０１６５】
本明細書記載の免疫原性組成物とともに使用される、別のアルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）３）または結晶オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）であり、これは約５００ｍ２／ｇの表面積をもつ、優れた吸着剤である。あるいは、水酸化アルミニウムアジュバントの水酸基の数個または全部の代わりにリン酸基を含む、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ４）またはアルミニウムヒドロキシホスフェートが提供される。本明細書において提供される、好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは、酸性、塩基性および中性の媒体中で非晶性かつ可溶性である。
【０１６６】
別の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムをともに含む。これらのより具体的な実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムを水酸化アルミニウムより多く含む（例えば、水酸化アルミニウムに対するリン酸アルミニウムの重量比は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１または９：１より大きい）。さらに具体的には、ワクチン中のアルミニウム塩が、ワクチン投与１回分あたり０．４〜１．０ｍｇ、またはワクチン投与１回分あたり０．４〜０．８ｍｇ、またはワクチン投与１回分あたり０．５〜０．７ｍｇ、またはワクチン投与１回分あたり約０．６ｍｇで存在する。
【０１６７】
通常、好ましいアルミニウムベースのアジュバント、または複数のアルミニウムベースのアジュバントの比率（例えば、水酸化アルミニウムに対するリン酸アルミニウムの比率）は、抗原がアジュバントとして望ましいｐＨで反対の電荷を帯びるように、分子間の静電気引力を最適化することによって選択する。例えば、リン酸アルミニウムアジュバント（ｉｅｐ＝４）は、ｐＨ７．４でリゾチームを吸着するが、アルブミンは吸着しない。アルブミンが標的ならば、水酸化アルミニウムアジュバントが選択される（ｉｅｐ＝１１．４）。あるいは、リン酸で水酸化アルミニウムを前処理すると、その等電点が低下して、より塩基性の抗原にとって好ましいアジュバントとなる。
【０１６８】
（Ａ．油エマルジョン）
アジュバントとして利用するのに適した油エマルジョン組成物としては、ＭＦ５９（マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いてサブミクロン粒子に処方された５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５）など、スクアレン−水エマルジョンが挙げられる。ＷＯ９０／１４８３７参照。また、Ｐｏｄｄａ，“Ｔｈｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ：ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２６７３−２６８０，Ｆｒｅｙ，ら，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ａ  ｎｏｎ−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｅｌｄｅｒｌｙ  ａｄｕｌｔｓ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：４２３４−４２３７も参照。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤＴＭインフルエンザウイルスの３価性サブユニットワクチンにおけるアジュバントとして使用されている。
【０１６９】
本明細書記載の免疫原性組成物とともに使用するのに特に好ましいアジュバントは、サブミクロン油中水型エマルジョンである。本明細書で使用するのに好ましいサブミクロン油中水型エマルジョンは、さまざまな量のＭＴＰ−ＰＥを任意に含むスクアレン／水エマルジョンである（例えば、４〜５％ｗ／ｖのスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０ＴＭ（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、および／または０．２５〜１．０％のＳｐａｎ８５ＴＭ（トリオレイン酸ソルビタン）、ならびに、必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラミン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含むサブミクロン油中水型エマルジョン（例えば、「ＭＦ５９」（国際出願番号ＷＯ９０／１４８３７、米国特許第６，２９９，８８４号および第６，４５１，３２５号、ならびにＯｔｔ，ら，“ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．２７７−２９６）として知られるサブミクロン油中水型エマルジョン））。ＭＦ５９は、４〜５％ｗ／ｖのスクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０ＴＭ、および０．５％ｗ／ｖのＳｐａｎ８５ＴＭを含み、モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを用いて処方されてサブミクロン粒子に処方した、さまざまな量のＭＴＰ−ＰＥを任意に含む。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、投与１回あたり約０〜５００μｇ、より好ましくは投与１回あたり０〜２５０μｇ、最も好ましくは投与１回あたり０〜１００μｇの量で存在させることができる。本明細書中において、「ＭＦ５９−０」という用語は、ＭＴＰ−ＰＥを欠く、上記のサブミクロン油中水型エマルジョンを意味するが、ＭＦ５９−ＭＴＰという用語は、ＭＴＰ−ＰＥを含む処方物を意味する。例えば、「ＭＦ５９−１００」は、投与１回量あたり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含む、等々である。本明細書で使用するための別のサブミクロン油中水型エマルジョンであるＭＦ６９は、４．３％ｗ／ｖのスクアレン、０．２５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０ＴＭ、および０．７５％ｗ／ｖのＳｐａｎ８５ＴＭ、ならびに任意にＭＴＰ−ＰＥを含む。さらに別のサブミクロン油中水型エマルジョンは、ＳＡＦとしても知られるＭＦ７５であり、１０％ｗ／ｖのスクアレン、０．４％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０ＴＭ、５％ｗ／ｖのプルロニックでブロックされた多量体Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、マイクロ流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅ）されてサブミクロンのエマルジョンになる。ＭＦ７５−ＭＴＰは、投与１回量あたり１００〜４００μｇのＭＴＰ−ＰＥなどのＭＴＰを含むＭＦ７５処方物をいう。
【０１７０】
サブミクロン油中水型エマルジョン、その製造方法、および、組成物中で使用するためのムラミルペプチドなどの免疫刺激因子が、国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７ならびに米国特許第６，２９９，８８４号および第６，４５１，３２５号に詳細に記載されている。
【０１７１】
完全フロイトアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。
【０１７２】
（Ｂ．サポニン処方物）
サポニン処方物も、アジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花にも存在するステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の不均質なグループである。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮から単離されたサポニンは、アジュバントとして広く研究されてきた。また、サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（Ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライズベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））からも商業的に得られ得る。サポニンのアジュバント処方物は、ＱＳ２１などの精製された処方物、およびＩＳＣＯＭなどの脂質処方物などである。
【０１７３】
サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製されてきた。これらの技術を利用して、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃなど、特定の精製画分が同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１を製造する方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン処方物は、コレステロールなどのステロールを含むこともできる（ＷＯ９６／３３７３９参照）。
【０１７４】
サポニンおよびコレステロールの組み合わせを用いて、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる固有の粒子を形成することができる。また、ＩＳＣＯＭは、一般的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含む。既知のいずれのサポニンもＩＳＣＯＭに使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ、およびＱＨＣの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、さらに、ＥＰ０１０９９４２、ＷＯ９６／１１７１１およびＷＯ９６／３３７３９にも記載されている。任意には、ＩＳＣＯＭは追加的な界面活性剤を含まなくてもよい。ＷＯ００／０７６２１参照。
【０１７５】
サポニンベースのアジュバントの開発に関する概説が、Ｂａｒｒ，ら，“ＩＳＣＯＭｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｓａｐｏｎｉｎ  ｂａｓｅｄ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：２４７−２７１に見出され得る。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，ら，“Ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｏｒａｌｌｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｓａｐｏｎｉｎ  ａｎｄ  ＩＳＣＯＭ  ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：３２１−３３８も参照。
【０１７６】
（Ｃ．ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ））
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本発明においてアジュバントとして利用され得る。これらの構造体は一般に、必要に応じてリン脂質と混合または処方されている、ウイルスに由来する１つ以上のタンパク質を含む。これらは一般に、非病原性、非複製性であり、通常、天然のウイルスゲノムを全く含まない。ウイルスタンパク質は組み換え生成され得るか、完全なウイルスから単離され得る。ビロソームまたはＶＬＰにおいて使用するのに適した、これらウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアまたはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（例えば、コートタンパク質）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポソンＴｙタンパク質ｐ１）に由来するタンパク質などである。ＶＬＰは、さらにＷＯ０３／０２４４８０、ＷＯ０３／０２４４８１、およびＮｉｉｋｕｒａら，“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ａｎ  Ｏｒａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ”，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００２）２９３：２７３−２８０；Ｌｅｎｚら，“Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ａｃｕｔｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）５２４６−５３５５；Ｐｉｎｔｏ，ら，“Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）−１６Ｌ１  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ  Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＨＰＶ−１６Ｌ１  Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）１８８：３２７−３３８；およびＧｅｒｂｅｒら，“Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ａｒｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  ｗｈｅｎ  Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ  Ｅｎｔｅｒｔｏｘｉｎ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｒ１９２Ｇ  ｏｒ  ＣｐＧ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）７５（１０）：４７５２−４７６０で検討されている。ビロソームは、さらに、例えば、Ｇｌｕｃｋら，“Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０：Ｂ１０−Ｂ１６で検討されている。免疫増強性再構成インフルエンザビロソーム（ＩＲＩＶ）は、鼻腔内に投与される３価のＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ生成物｛Ｍｉｓｃｈｌｅｒ  ＆  Ｍｅｔｃａｌｆｅ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０  Ｓｕｐｐｌ  ��：Ｂ１７−２３｝およびＩＮＦＬＵＶＡＣ  ＰＬＵＳＴＭ生成物においてサブユニット抗原送達系として利用されている。
【０１７７】
（Ｄ．細菌性または微生物性の誘導体）
本発明において利用されるのに適したアジュバントには、以下のような細菌性または微生物性の誘導体がある。
【０１７８】
（１）腸内細菌性リポ多糖体（ＬＰＳ）の非毒性誘導体
このような誘導体は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）などである。３ｄＭＰＬは、４、５または６個のアシル化鎖をもつ３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。好ましい「小粒子」型の３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡがＥＰ０６８９４５４に開示されている。このような「小粒子」の３ｄＭＰＬは、０．２２ミクロン膜で濾過して滅菌できるほど小さい（ＥＰ０６８９４５４参照）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体は、モノホスホリルリピドＡの模倣体、例えばＲＣ−５２９など、リン酸アミノアルキルグルコサミニド誘導体などである。Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ９：２２７３−２２７８参照。
【０１７９】
（２）リピドＡ誘導体
リピドＡ誘導体は、例えば、ＯＭ−１７４など、大腸菌に由来するリピドＡの誘導体などである。ＯＭ−１７４は、例えばＭｅｒａｌｄｉら，“ＯＭ−１７４，  ａ  Ｎｅｗ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ，  Ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｗｉｔｈ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ２４２−３１０  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：２４８５−２４９１；およびＰａｊａｋ，ら，“Ｔｈｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ＯＭ−１７４  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：８３６−８４２に記載されている。
【０１８０】
（３）免疫刺激オリゴヌクレオチド
本発明においてアジュバントとしての利用に適する免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ（非メチル化シトシンとそれに続くグアノシンを含み、リン酸エステル結合によって連結された配列）を含むヌクレオチド配列などである。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む、細菌の２本鎖ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示されている。
【０１８１】
ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／アナログを含むことができ、２本鎖でも１本鎖でもよい。必要に応じて、グアノシンは、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンなどのアナログと置換されていてもよい。可能なアナログ置換の例に関しては、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ら，“Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｔｉｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ：ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ”，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）３１（９）：２３９３−２４００；ＷＯ０２／２６７５７およびＷＯ９９／６２９２３参照。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、さらに、Ｋｒｉｅｇ，“ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ：ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ？”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）９（７）：８３１−８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，ら，“Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｎｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ＣｐＧ  ＤＮＡ”，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）３２：１７９−１８５；ＷＯ９８／４０１００，米国特許第６，２０７，６４６号，第６，２３９，１１６号および米国特許第６，４２９，１９９号で検討されている。
【０１８２】
ＣｐＧ配列は、ＧＴＣＧＴＴモチーフ、またはＴＴＣＧＴＴモチーフなど、ＴＬＲ９に対し指向することが可能である。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ら，“Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＣｐＧ  ＤＮＡｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ  ３）：６５４−６５８参照。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮなど、Ｔｈ１免疫応答を誘導するのに特異的であり得るか、または、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなど、Ｂ細胞反応を誘導するのにより特異的であり得る。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ら，“ＣｐＧ−Ａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１０  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｄｒｉｖｅｄ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０（８）：４０６１−４０６８；Ｋｒｉｅｇ，“Ｆｒｏｍ  Ａ  ｔｏ  Ｚ  ｏｎ  ＣｐＧ”，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）２３（２）：６４−６５およびＷＯ０１／９５９３５で論じられている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０１８３】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端がレセプターを認識しやすいように構築されている。任意には、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が、３’末端で結合して、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成することができる。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ら，“Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”，ＢＢＲＣ（２００３）３０６：９４８−９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ら，“Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＣｐＧ  ＤＮＡｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ３）：６６４−６５８；Ｂｈａｇａｔら，“ＣｐＧ  ｐｅｎｔａ−  ａｎｄ  ｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ”ＢＢＲＣ（２００３）３００：８５３−８６１およびＷＯ０３／０３５８３６参照。
【０１８４】
（４）ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの無毒化誘導体
細菌性ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの無毒化された誘導体は、本発明においてアジュバントとして使用することができる。好ましくは、このタンパク質は、大腸菌（すなわち、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。無毒化ＡＤＰリボシル化毒素を粘膜アジュバントとして使用することが、ＷＯ９５／１７２１１に記載されており、非経口アジュバントとしてはＷＯ９８／４２３７５に記載されている。好ましくは、このアジュバントは、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴＲ１９２Ｇなどの無毒化ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの無毒化された誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２をアジュバントとして使用することが、以下の参考文献に見出され得る。Ｂｅｉｇｎｏｎ，ら，“Ｔｈｅ  ＬＴＲ７２  Ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  Ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｏ  Ｅｌｉｃｉｔ  ＣＤ４＋Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅ  Ｇａｍｍａ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｆｔｅｒ  Ｃｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎｔｏ  Ｂａｒｅ  Ｓｋｉｎ”，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）７０（６）：３０１２−３０１９；Ｐｉｚｚａ，ら，“Ｍｕｃｏｓａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｎｏｎ  ｔｏｘｉｃ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ＬＴ  ａｎｄ  ＣＴ  ａｓ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２５３４−２５４１；Ｐｉｚｚａ，ら，“ＬＴＫ６３  ａｎｄ  ＬＴＲ７２，  ｔｗｏ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｒｅａｄｙ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００）２９０（４−５）：４５５−４６１；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら，“Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ  Ｅｘｏｔｏｘｉｎｓ，  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ａｎｄ  Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０００）６８（９）：５３０６−５３１３；Ｒｙａｎら，“Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ  Ｔｏｘｉｎ  Ａｃｔ  ａｓ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎａｓａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  Ａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｎｔｏｘｉｃ  ＡＢ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ２  Ｃｅｌｌｓ”Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）６７（１２）：６２７０−６２８０；Ｐａｒｔｉｄｏｓら，“Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ＬＴＫ６３  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ  ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）６７（３）：２０９−２１６；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら，“Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ａｓ  ｓａｆｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｎｇ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００３）２（２）：２８５−２９３；およびＰｉｎｅら，（２００２）“Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ａ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＬＴＫ６３）”Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２）８５（１−３）：２６３−２７０。アミノ酸置換の数的な参照については、好ましくは、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５）１５（６）：１１６５−１１６７に示されたＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【０１８５】
（Ｅ．生体接着剤および粘膜接着剤）
生体接着剤および粘膜接着剤も、アジュバントとして使用することができる。適当な生体接着剤は、エステル化されたヒアルロン酸ミクロスフィア（Ｓｉｎｇｈら（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅ．７０：２６７−２７６）、またはポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体などの粘膜接着剤などである。キトサン、およびその誘導体も、アジュバントして使用できる。例えば、ＷＯ９９／２７９６０参照。
【０１８６】
（Ｆ．微粒子）
微粒子もアジュバントとして利用され得る。ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）を用いた、生物分解性で無毒性の物質（例えば、ポリ（□−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトン）から形成される微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、および最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、必要に応じて、（例えば、ＳＤＳによって）負に帯電した表面、または（例えば、ＣＴＡＢなどの陽イオン性界面活性剤によって）正に帯電した表面をもつように処理される。
【０１８７】
（Ｇ．リポソーム）
アジュバントとして利用するのに適したリポソーム処方物の例は、米国特許第６，０９０，４０６号、米国特許第５，９１６，５８８号およびＥＰ０６２６１６９に記載されている。
【０１８８】
（Ｈ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物）
本明細書記載の免疫原性組成物とともに利用するのに適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルなどである。ＷＯ９９／５２５４９。このような処方物はさらに、オクトキシノールと混合したポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）、および、例えば、オクトキシノールのような少なくとも１つの付加的非イオン性界面活性剤と混合したポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）を含む。
【０１８９】
好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される。すなわち、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１９０】
（Ｉ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖら，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｂｙ  ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９８）１９（１−３）：１０９−１１５およびＰａｙｎｅら，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ”，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ（１９９８）３１（３）：１８５−１９６に記載されている。
【０１９１】
（Ｊ．ムラミルペプチド）
本明細書において、アジュバントとして利用するのに適したムラミルペプチドの例は、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）などである。
【０１９２】
（Ｋ．イミダゾキノリン化合物）
本明細書において、アジュバントとして利用するのに適したイミダゾキノリン化合物の例は、イミキモド、およびそのアナログなどであり、さらに、Ｓｔａｎｌｅｙ，“Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ”Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ（２００２）２７（７）５７１−５７７；Ｊｏｎｅｓ，“Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ”，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ（２００３）４（２）：２１４−２１８；および米国特許第４，６８９，３３８号、第５，３８９，６４０号、第５，２６８，３７６号、第４，９２９，６２４号、第５，２６６，５７５号、第５，３５２，７８４号、第５，４９４，９１６号、第５，４８２，９３６号、第５，３４６，９０５号、第５，３９５，９３７号、第５，２３８，９４４号、および第５，５２５，６１２号に記載されている。
【０１９３】
（Ｌ．チオセミカルバゾン化合物）
すべて本発明においてアジュバントとして利用するのに適した、チオセミカルバゾン化合物の例、および、化合物を処方、製造、スクリーニングする方法は、ＷＯ０４／６０３０８に記載されたものなどである。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−●などのサイトカインを産生させるためにヒト末梢血単核細胞を刺激するのに特に有効である。
【０１９４】
（Ｍ．トリプタントリン化合物）
すべて本発明においてアジュバントとして利用するのに適した、トリプタントリン化合物の例、および化合物を処方、製造、スクリーニングする方法は、ＷＯ０４／６４７５９に記載されたものなどである。トリプタントリン化合物は、ＴＮＦ−●などのサイトカインを産生させるためにヒト末梢血単核細胞を刺激するのに特に有効である。
【０１９５】
本発明は、上記に特定したアジュバントの１つ以上の態様を組み合わせたものを含むことができる。例えば、以下のアジュバント組成物を本発明において使用することができる。
【０１９６】
（１）サポニンおよび油中水型エマルジョン（ＷＯ９９／１１２４１）；
（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３参照）；
（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（ＷＯ９８／５７６５９）
（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または油中水型エマルジョンとの組み合わせ（欧州特許出願０８３５３１８、０７３５８９８および０７６１２３１参照）；
（６）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦであって、マイクロ流動化処理されてサブミクロンエマルジョンになっているか、ボルテックス処理されて粒子サイズのより大きいエマルジョンになったもの。
【０１９７】
（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、ならびに、モノホスホリリピドＡ（ＭＰＬ）、ジミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）；および
（８）１つ以上の無機物塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（例えば、３ｄＰＭＬ）。
【０１９８】
（９）１つ以上の無機物塩（例えば、アルミニウム塩）＋免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）。
【０１９９】
（Ｎ．ヒト免疫調節因子）
本発明においてアジュバントとしての利用に適したヒト免疫調節因子には、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−□）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などのサイトカインが含まれる。
【０２００】
アルミニウム塩およびＭＦ５９は、注射可能なインフルエンザワクチンとともに使われる好ましいアジュバントである。細菌性毒素および生体接着剤は、粘膜投与ワクチン（例えば、経鼻投与ワクチン）とともに利用される好ましいアジュバントである。
【０２０１】
上記の特許、特許出願および刊行物の記事のすべての内容は、あたかもその全体が本明細書に示されるように、参考として本明細書に援用される。
【０２０２】
（応用）
アルファウイルスレプリコン、レプリコン粒子およびベクター構築物を用いて、例えば、免疫応答を活性化する、呼吸器系病原体由来の抗原をコードする異種配列を含む、多様なヌクレオチド配列を送達することができる。上記のヌクレオチド配列は、既述されたものなどであり、保存株から得ることができ、公開配列を利用してウイルスＲＮＡまたは他のＲＮＡから容易にクローニングされ得るか、または、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．のＤＮＡ合成装置（例えば、ＡＰＢ  ＤＮＡ合成装置モデル３９２（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））で合成され得る。
【０２０３】
また、本発明は、これらの選択された異種配列を、ワクチンまたは治療薬として使用するために温血哺乳動物（例えばヒトなどの哺乳動物、またはその他の温血動物、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、またはマウス）に送達する方法を提供し、この方法は、選択された異種配列を発現させることができる、本明細書に記載したようなレプリコン粒子、レプリコンベクター、ベクター構築物、または真核レイヤードベクター開始システムを哺乳動物に投与する工程を含む。送達は、さまざまな経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、経口、鼻腔内）によることが可能である。
【０２０４】
本発明のアルファウイルスレプリコン粒子を作製する好ましい方法は、混入する自己複製能をもつウイルス（ＲＣＶ）が生成される可能性を最小にするための当該分野において既知の技術を利用しなければならないことに留意されるべきである。このような方法の１つが、「分断型」構造タンパク質発現カセットを含む欠損ヘルパーまたはＰＣＬを利用することである（米国特許第５，７８９，２４５号、第６，２４２，２５９号、第６，３２９，２０１号参照）。これに関して、アルファウイルスの構造タンパク質遺伝子を、別々の発現構築物に分けて（例えば、カプシドを糖タンパク質から分けて）、発現された構造タンパク質の完全に相補的な配列を再生させる組み換えがほとんど起こらないようにする。
【０２０５】
以下の実施例は、本発明をさらに十分に説明するために記載されている。さらに、これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を提供するが、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０２０６】
（実施例１）
インフルエンザウイルスのＨＡ抗原、ＮＡ抗原、またはＮＰ抗原をコードする遺伝子を含むアルファウイルスレプリコンベクターの構築
インフルエンザウイルス株であるＡ／パナマ／２００７／９９Ｒｅｓｖｉｒ−１７（Ｈ３Ｎ２）（２０００年から２００３年の生産のための推奨ワクチン株）およびＷＳ／３３（Ｈ１Ｎ１）をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ：ＮＩＢＳＣ，  Ｈｅｒｄｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）から入手した。ウイルスのシードストックから、またはこれらのウイルスに感染した卵の尿膜腔液のいずれかから、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）のウイルスＲＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。そして、これらのインフルエンザウイルスＲＮＡを逆転写用の鋳型として以下のとおり用いた。
【０２０７】
１μｌのＲＮＡを、全量１２μｌの中で２０ｎｇのプライミング用オリゴヌクレオチド（表１）にアニールさせた。モロニーマウス白血病ウイルスに由来し、ＲＮａｓｅＨ活性を含まない２００ユニットの逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅＨ−，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、および製造業者が推奨する反応条件を用いて、２０μｌ容量中で第１鎖ＤＮＡを合成した。反応混合液を４２℃で６０分間置いた後、９５℃で３０分間変性させた。インフルエンザウイルス株Ａ／ＨＫ／２１３／０３（Ｈ５Ｎ１）の相補的ＤＮＡ配列は、ＮＩＢＳＣのＲｏｂｅｒｔ  Ｎｅｗｍａｎ博士から提供された。
【０２０８】
５０μｌの反応混合液の中で、６０ユニットの熱安定性ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって１μｌのｃＤＮＡからＰＣＲにより、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、および核タンパク質（ＮＰ）をコードするＤＮＡ配列を別々に増幅した。５’側および３’側の各ＰＣＲプライマーは、クローニング目的のための人工的な制限酵素部位を含んでいる。さらに、５’側プライマーは、真核細胞の中で目的遺伝子を効率的に翻訳するため、遺伝子の開始コドンの直前に正規のコザック配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ、配列番号：１）を含んでいる。ＰＣＲ（９５℃で４５秒間の変性工程、６０℃で４５秒間のアニーリング工程、および７２℃で９０秒間の伸長工程）を３０サイクル行った後、さらに生成物を７２℃で７分間インキュベートした。その後、この反応液に、４μｌの１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および２μｌの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（５ユニット／μｌ）を加えて３７℃で１５分間インキュベートした。
【０２０９】
このＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）で精製して、塩類、および取り込まれなかったモノヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを除去した。パンデミックウイルス株（Ｈ５）の赤血球凝集素遺伝子以外の増幅フラグメントを以下のようにクローニングした。ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで制限酵素消化した後、予想されたサイズのＤＮＡフラグメント（赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、および核タンパク質について、それぞれ１．７ｋｂ、１．４ｋｂ、および１．５ｋｂ）を分取用アガロースゲル電気泳動によって単離した。回収されたＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳベクター（ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ消化ずみ）に連結させ、ＸＬ−１０大腸菌コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に形質転換した。Ｈ５のｃＤＮＡフラグメントをＡｓｃＩおよびＮｏｔＩで消化した後、分取用アガロースゲル電気泳動を行った。精製されたＨ５フラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＳａｌＩ部位をＡｓｃＩ部位に変更しておいたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳベクターに連結させ、ＸＬ−１０大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。単一の大腸菌コロニーから数個のｃＤＮＡクローンを単離して、増幅されたＤＮＡフラグメントに人為的変異が導入されていないことを確認した。
【０２１０】
次に、各インフルエンザ遺伝子を、以下の通りにアルファウイルスレプリコンベクターにサブクローニングした（図２）。Ｒｅｓｖｉｒ−１７（Ｈ３およびＮ２）の赤血球凝集素およびノイラミニダーゼの遺伝子フラグメント（ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから切り出して、シンドビスウイルスのレプリコンのバックボーンであるＳＩＮＣＲ（Ｇａｒｄｎｅｒら，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１８４９−１１８５７）のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位の中にサブクローニングした。ＶＥＥ／ＳＩＮレプリコンベクターのバックボーンであるｐＶＣＲｃｈｉｍ２．１（Ｐｅｒｒｉら，２００３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０３９４−１０４０３）にＨ３フラグメントをサブクローニングするために、まずこのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローンをＳａｌＩで消化し、クレノウフラグメントで平滑末端化し、ＮｏｔＩ制限によって切り出した。単離したＨ３フラグメントを、ＡｓｃＩ部位を平滑末端化しておいたｐＶＣＲｃｈｉｍ２．１に移入した。ＷＳ／３３の赤血球凝集素（Ｈ１）、ノイラミニダーゼ（Ｎ１）、および核タンパク質（ＷＮＰ）の遺伝子をｐＶＣＲｃｈｉｍ２．１ベクターにサブクローニングするため、挿入部位の一方にあるＳａｌＩ認識配列をＳａｌＩ制限によってＡｓｃＩに変更し、突出末端をｄＮＴＰとクレノウフラグメントで充填して、ＡｓｃＩリンカーと連結させた。
【０２１１】
ＡｓｃＩで広範囲に消化してから、ＤＮＡフラグメントを分取用アガロースゲル電気泳動によって単離した。回収したＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己連結させて、ＸＬ−１０大腸菌細胞に導入した。形質転換された大腸菌クローン由来のプラスミドＤＮＡをＡｓｃＩ／ＮｏｔＩによる二重制限に付した。ＡｓｃＩ／ＮｏｔＩ二重消化によってＨ５フラグメントを直接精製した。分取用アガロースゲル電気泳動によって、ベクターＤＮＡから挿入フラグメントを分離した。精製されたＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、（ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩで消化した）ｐＶＣＲｃｈｉｍ２．１ベクターに連結した。挿入配列と連結したすべてのｐＶＣＲｃｈｉｍ２．１ベクターを、ＸＬ−１  ｂｌｕｅ大腸菌電気的コンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に形質転換した。
【０２１２】
その他のインフルエンザウイルス遺伝子を、本明細書に提示された教示内容を用いて、当業者によって同様にして作成することができる。さらに、当然のことながら、過度の実験を要せずに、他のアルファウイルスに由来する類似したアルファウイルスベクター構築物で容易に代替することが可能である。
【０２１３】
表１に、ＰＣＲおよび逆転写に用いられたさまざまなプライマーの配列を示す。
【０２１４】
【表１】
2008500399.tif 000004
（実施例２）
インフルエンザウイルス抗原をコードする遺伝子を少なくとも２つ含むアルファウイルスレプリコンベクターの構築
例えば、バイシストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）構築物（図２）のように、同一のレプリコンベクターの中に少なくとも２つの別々に抗原をコードする遺伝子を含むさらなるレプリコンベクターを作成した。特に、代表的な例では、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列（Ｄｕｌｅ，ら，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：６１２６）を用いて、赤血球凝集素抗原およびノイラミニダーゼ抗原の両方を同時発現させた。
【０２１５】
このＩＲＥＳを、ＩＲＥＳを含むプラスミド（ｐＩＲＥＳ）、および表１に示したプライマーを用いて、ＰＣＲによって人工クローニング部位を付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。ＨＡ１をコードするＡｓｃＩ−ＣｌａＩフラグメント、およびＮＡ１をコードするＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、同じ制限部位を用いて、新しく構築したＩＲＥＳプラスミドにサブクローニングした。ＡｓｃＩ／ＮｏｔＩ二重制限によって３．６ｋｂのフラグメントが得られたが、これは、Ｈ１、ＩＲＥＳ、およびＮ１配列をこの順序で含んでいる。このフラグメントを分取用アガロースゲル電気泳動によって精製し、他のモノシストロン性（ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｍｉｃ）構築物と同じ方法で、（ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩで消化した）ｐＶＣＲｃｈｉｍ２．１ベクターにサブクローニングした。
【０２１６】
また、第２の（例えば、重複した）アルファウイルスサブゲノム接合部プロモーターを用いて、以下のように、またＰＩＶ遺伝子について後述するようにして、第２のインフルエンザウイルス遺伝子を発現させた。より具体的には、ＦＬＵＮＡのみを発現する上記ベクター構築物を、アルファウイルスサブゲノムプロモーターおよびＮＡ遺伝子を含むフラグメントをＰＣＲ増幅するための鋳型として用いた。以下に示すオリゴヌクレオチドＩＮ−ＦおよびＩＮ−Ｒを、標準的な条件下でＰＣＲプライマーとして用いた。
ＩＮ−Ｆ
【０２１７】
【化２】
2008500399.tif 000005
（配列番号：１６）
ＩＮ−Ｒ
【０２１８】
【化３】
2008500399.tif 000006
（配列番号：ｌ７）
このＰＣＲ生成物を精製し、ＮｏｔＩで消化し、これもＮｏｔＩで消化された、ＨＡのみを発現するアルファウイルスベクターに連結して、２つのＦＬＵ遺伝子の発現をもたらす重複サブゲノムプロモーターをもつバイシストロン性ＨＡ＋ＮＡ構築物を作成した。
【０２１９】
ＦＬＵのＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子の両方を発現するレプリコンベクターに加えて、本発明では、例えば、ＨＡ＋ＮＰ、ＮＡ＋ＮＰ、ＨＡ＋Ｍ、ＮＡ＋Ｍなど、ＦＬＵ遺伝子の別の組合せで代替することも可能である。ＦＬＵ遺伝子は、例えば、主に上記のトリ株（例えば、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９）に由来するものなど、任意のＦＬＵウイルス供給源から得ることが可能である。また、当然ながら、過度の実験を要せずに、当業者により、同様の方法で、他のアルファウイルスに由来する類似した多シストロン性（例えば、バイシストロン性）アルファウイルスベクター構築物を容易に構築することも可能である。
【０２２０】
（実施例３）
１つ以上のインフルエンザウイルス抗原を発現するアルファウイルスレプリコン粒子の作製
上記および当分野において使用されている、いくつもの利用可能な方法（例えば、インビトロで転写された欠損ヘルパーＲＮＡとのＲＮＡの同時形質転換法、パッケージング細胞株への導入）を用いて、上記のレプリコン構築物を含むアルファウイルスレプリコン粒子を調製する。
【０２２１】
特に、上記のレプリコンベクターを含むインフルエンザウイルス遺伝子をインビトロで転写して、Ｐｅｒｒｉら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０３９４−１０４０３）に記載されているようなレプリコン粒子を作製した。レプリコン粒子を細胞培養上清として回収し、濾過により清澄化し、イオン交換クロマトグラフィー（ＷＯ０１９２５５２）を行い、さらに濾過を行い、精製されたレプリコン粒子物質を薬学的に受容可能な希釈剤に処方した。基本的に、米国特許第６０１５６９４号、第５７８９２４５号、第５８４３７２３号、第６４５１５９２号；Ｐｅｒｒｉら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０３９４−１０４０３）；Ｐｏｌｏら上記；ＷＯ０１９２５５２）に記載されているようにして、当該分野における標準的な技術を用いて、レプリコン粒子の力価の測定、およびレプリコンを受容可能なウイルスが存在しないことの判定を行った。
【０２２２】
培養細胞の感染後の抗原の発現を、適当な抗原特異的抗体を用いた免疫染色によって確認した。ここで、図１１を見ると、１つ以上のインフルエンザ抗原を発現するアルファウイルス粒子による細胞の感染後の抗原発現を測定するために行われた蛍光活性化細胞選別研究の結果が示されている。
【０２２３】
図１１は、培養細胞に感染させると、上記した２つの異なるバイシストロン性アルファウイルスレプリコン（一方は配列内リボソーム進入部位であるＩＲＥＳをもち、もう一方は、重複したアルファウイルスサブゲノムプロモーターであるｓｇｐをもつ）構造物からＦＬＵのＨＡ抗原およびＮＡ抗原が発現することを実証している。本明細書で提示した教示内容に基づいて、免疫原組成物またはワクチン組成物として利用するために、ＦＬＵ抗原の別の組合せをバイシストロン性構造物で同じように発現させることができる。また、本発明は、免疫原組成物またはワクチン組成物において２つ以上の異なったレプリコン粒子を（例えば、さまざまなＦＬＵ抗原を発現する）組み合わせること、およびそのような組合せを用いて免疫応答を刺激する方法も意図している。このような組み合わせの非限定的な例としては、例えば、ＦＬＵ  ＨＡをコードする粒子＋ＦＬＵ  ＮＡをコードする粒子、ＦＬＵ  ＨＡをコードする粒子＋ＦＬＵ  ＮＰをコードする粒子、ＦＬＵ  ＮＡをコードする粒子＋ＦＬＵ  ＮＰをコードする粒子、ＦＬＵ  ＮＡをコードする粒子＋ＦＬＵ  Ｍをコードする粒子、第１の株のＦＬＵ  ＨＡ＋ＮＡの両方をコードする粒子＋第２の株のＦＬＵ  ＨＡをコードする粒子など挙げられる。
【０２２４】
（実施例４）
ヒトパラインフルエンザウイルスのＨＮ抗原またはＦ抗原をコードする遺伝子を含むアルファウイルスレプリコンベクターの作製
ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ｈＰＩＶ３）の融合タンパク質（Ｆ）を発現するアルファウイルスレプリコン粒子を作製するために、Ｆのオープンリーディングフレーム（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ１１５７５のゲノム配列のｎｔ４６９０〜ｎｔ５５８９；およびＳｔｏｋｅｓ，ら，１９９２，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２５（１−２），９１−１０３）を、標準的な市販の遺伝子合成技術によって２重鎖ＤＮＡ分子として合成し、その配列を確認し、そして、合成された遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによってｐＵＣ１８ベクターにクローニングした。
【０２２５】
合成の間、ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流にＡｓｃＩ制限部位およびコザックコンセンサス配列を付加し、ＮｏｔＩを終止コドンのすぐ下流に付加した。そして、Ｆ遺伝子を含むプラスミドをＡｓｃＩおよびＮｏｔＩで消化して、Ｆ遺伝子をＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１レプリコンバックボーンにサブクローニングして、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＦＰＩＶ３を作製した（図３）。
【０２２６】
本発明のエンベロープ糖タンパク質の切断型（このタンパク質が分泌型となるように、膜貫通アンカー領域の全部または一部（および、場合によっては細胞質尾部）を欠失している）も作製される。例えば、ＰＩＶのＦ遺伝子を、膜アンカー領域（アミノ酸残基４９４−５１６）が除去されるよう改変する。より具体的には、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＦＰＩＶ３中で、都合のよい制限部位であるＸｂａＩとＮｏｔＩの間（最後の７３アミノ酸残基をコードする領域）にあるＦ遺伝子のセグメントを、膜貫通アンカーに相当する２２アミノ酸残基が欠失していて、かつ、クローンをスクリーニングするために都合のよい制限部位（ＳｃａＩ）を付加するサイレント変異を有する、このフラグメントを再生させる重複オリゴヌクレオチドによって作製されたＤＮＡフラグメントで置換する。以下のオリゴヌクレオチドを用いる：
ＴＭ−Ｆ１（配列番号：１８）：
【０２２７】
【化４】
2008500399.tif 000007
ＴＭ−Ｒ１（配列番号：１９）：
【０２２８】
【化５】
2008500399.tif 000008
ＴＭ−Ｆ２（配列番号：２０）：
【０２２９】
【化６】
2008500399.tif 000009
ＴＭ−Ｒ２（配列番号：２１）：
【０２３０】
【化７】
2008500399.tif 000010
供給業者の推奨するとおりに、各個のオリゴの１００ｎＭ溶液を得るためにオリゴヌクレオチドを再構成する。フラグメントを組み立てるために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、１ｍＭ  ｒＡＴＰ、水、および１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を、最終反応容量５００μｌで含む１本の反応用チューブの中で各オリゴを１００ピコモルずつ混合する。リン酸化反応を３７℃で３０分間進行させ、その時点で反応液にさらに１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを補充して、さらに３０分間反応を続けさせる。
【０２３１】
反応の終わりに、大量の水を含むビーカーの中で混合液を含むチューブを９５℃で５分間加熱して、酵素、およびすでにアニールし得たあらゆるＤＮＡ鎖を変性させる。そして、このビーカーを熱源から外し、相補的なオリゴヌクレオチドが完全な２重鎖ＤＮＡにアニールするよう周囲温度までゆっくり冷却させる。
【０２３２】
冷却したところで、０．２ｐｍｏｌｅの反応済み物質を、予めＸｂａＩとＮｏｔＩで消化しておいた１００ｐｍｏｌｅのＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＦＰＩＶ３ＤＮＡと連結し、アルカリホスファターゼ処理して、（１２ｋｂのバンドを）ゲル精製する。ライゲーションしたものを標準的な方法によってコンピテントな細菌に形質転換し、形質転換体を解析して、適当な末端酵素部位があるか、挿入配列のサイズ、挿入配列の重複の証拠、および方向性について調べる。次に、数個の陽性の形質転換体を無作為に選んで配列を確認する。どんな配列の誤りも、標準的な部位特異的変異誘発法によって正すことができる。また、標準的なＰＣＲ法、プライマーとして下記のオリゴヌクレオチド、および鋳型としてＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＦＰＩＶ３を用いることによって、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部の両方が欠失した構築物を作製する。
ＰＩＶｆ：
【０２３３】
【化８】
2008500399.tif 000011
（配列番号：２２）
ＰＩＶｒ：
【０２３４】
【化９】
2008500399.tif 000012
（配列番号：２３）
次に、切断型Ｆ遺伝子のＰＣＲ産物を標準的な技術を用いて、全長ＰＩＶ  Ｆ遺伝子の代わりにＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＦＰＩＶ３の中に置換する。
【０２３５】
Ｆと同様に、ｈＰＩＶ３のＨＮ抗原を発現するアルファウイルスレプリコン粒子を作製するために、ＨＮのオープンリーディングフレーム（ゲノム配列のｎｔ６８０６〜ｎｔ８５２４）も、当該分野において公知の標準的な市販の技術を用いて合成し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによってｐＵＣ１８にクローニングした。この場合、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限部位およびコザックコンセンサス配列も付加した。そして、このプラスミドをＡｓｃＩおよびＮｏｔＩで消化してＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１にクローニングしてＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＨＮＰＩＶ３を作製した（図３）。標準的な方法を用いてＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＨＮＰＩＶ３の鋳型から合成したインビトロ転写ＲＮＡによるＢＨＫ細胞のトランスフェクションによってＨＮの発現を確認した後、不活性化ＰＩＶ３ウイルスに対して生じたＰＩＶ特異的ポリクローナル抗血清を用いてウエスタンブロット解析を行った。
【０２３６】
これも当然ながら、別のＰＩＶ遺伝子を使用することも可能であり、また、別のアルファウイルスに由来する類似したモノシストロン性またはバイシストロン性のアルファウイルスベクター構築物も過度の実験を要せずに、同様の方法で当業者によって容易に構築することが可能である。また、下記でＲＳＶ遺伝子について説明されているような標準的なＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、アルファウイルスベクターのバックボーンにクローニングするためにＰＩＶ遺伝子を作製することもできる。
【０２３７】
（実施例５）
ヒトパラインフルエンザウイルスのＨＮ抗原およびＦ抗原の両方を同時に発現するアルファウイルスレプリコンベクターの作製
ｈＰＩＶ３のＨＮおよびＦ抗原を同時発現するアルファウイルスレプリコンベクターを、例えば、ＩＲＥＳ−バイシストロン性構築物（上記）として、または、二重のサブゲノムプロモーター構築物（これも上記）として、複数の方法で構築することができる（図３）。
【０２３８】
具体的には、ＨＮ抗原を第１のアルファウイルスサブゲノムプロモーターから発現させ、Ｆ抗原を第２のアルファウイルスサブゲノムプロモーターから発現させる。このような構築物は、構築物ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＦＰＩＶ３またはＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＦｄｌＳＰＰＩＶ３（上記）由来のＦのオープンリーディングフレームとアルファウイルスのサブゲノムプロモーターを既に含むカセットとして、Ｆ遺伝子をクローニングすることによって容易に作成される。
【０２３９】
これらの構築物を、ＭｓｃＩ（転写開始点から−８２の所に位置する）またはＳｗａＩ（転写開始点から−５６６の所に位置する）の単一の制限酵素によって消化し、ＮｏｔＩリンカーを連結させ、ＮｏｔＩで消化し、ゲル精製してから、予めＮｏｔＩおよびアルカリホスファターゼで処理しておいたＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＨＮＰＩＶ３に連結させる。そして、ＡｓｃＩなど、１．７ｋｂ（ＭｓｃＩ−ＮｏｔＩカセット）または２．２ｋｂ（ＳｗａＩ−ＮｏｔＩカセット）を解離する適当な制限酵素消化によって、挿入配列が存在すること、および正しい方向性をもつことについて形質転換体をスクリーニングする。あるいは、上記したような標準的なＰＣＲ法を用いて、同じ構築を行うことも可能である。
【０２４０】
（実施例６）
１つ以上のパラインフルエンザウイルス抗原を発現するアルファウイルスレプリコン粒子の製造
上記および当分野において使用されている、いくつもの利用可能な方法（例えば、１つ以上のインビトロで転写された欠損ヘルパーＲＮＡとのレプリコンＲＮＡの同時形質転換法、パッケージング細胞株へのレプリコン導入）を用いて、上記のレプリコン構築物を含むアルファウイルスレプリコン粒子を調製することが可能である。例えば、実施例４および５に記載されたパラインフルエンザウイルスのＨＮ遺伝子を含むレプリコンベクターを、インビトロで転写して、Ｐｅｒｒｉら，２００３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０３９４−１０４０３）に記載されているようなレプリコン粒子を製造するために使用した。
【０２４１】
細胞培養上清からレプリコン粒子を回収して、濾過によって清澄化し、イオン交換クロマトグラフィー（ＷＯ０１９２５５２）を行い、さらに濾過工程を行い、精製されたレプリコン粒子物質を薬学的に受容可能な希釈剤に処方した。当該分野において標準的な技術（例えば、米国特許第６０１５６９４号、第５７８９２４５号、第５８４３７２３号、第６４５１５９２号；Ｐｅｒｒｉら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０３９４−１０４０３；Ｐｏｌｏら上記；ＷＯ０１９２５５２を参照）を用いて、レプリコン粒子の力価の測定、およびレプリコンを受容可能なウイルスが混入していないことの判定を行った。培養細胞に感染させた後、適当な抗体による免疫染色およびウエスタンブロットによってＰＩＶ抗原の発現を確認した。
【０２４２】
（実施例７）
ＲＳウイルスのＧ抗原およびＦ抗原をコードする遺伝子を含むアルファウイルスレプリコンベクターの作製
ＲＳＶの融合糖タンパク質（Ｆ）を発現するアルファウイルスレプリコンベクターを構築するために、Ｆのオープンリーディングフレームを、標準的な市販の遺伝子合成技術によって２重鎖ＤＮＡ分子として、ヒトＡ２株（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ７４５６８のｎｔ５６６１〜ｎｔ７３８２のゲノム配列；Ｗｅｒｔｚ，ら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，４０７５−４０７９）から作製し、その配列を確認し、そして、合成した遺伝子を、Ｒｅｔｒｏｇｅｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるｐＵＣ１８ベクターにクローニングした。
【０２４３】
合成の間、ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流にＡｓｃＩ制限部位およびコザックコンセンサス配列を付加し、ＮｏｔＩを終止コドンのすぐ下流に付加した。そして、Ｆ遺伝子を含むプラスミドをＡｓｃＩおよびＮｏｔＩで消化して、Ｆ遺伝子をＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１レプリコンのバックボーンにサブクローニングして、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＦＲＳＶを作製した（図４）。
【０２４４】
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）のＧ付着タンパク質を発現するアルファウイルスレプリコンベクターを以下のように作製する。Ｇタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、例えば、Ａ２株（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ７４５６８；Ｗｅｒｔｚ，ら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，４０７５−４０７９）などのヒト単離体から作製する。ＲＳＶに感染した細胞から抽出したポリＡ  ｍＲＮＡ（Ｔｒｉａｚｏｌ、ＢＲＬで抽出し、その後Ｏｌｉｇｏｔｅｘ、Ｑｉａｇｅｎで抽出した）を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ予備増幅キット（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）およびポリｄＴオリゴヌクレオチドを用いた逆転写によって、９００ヌクレオチドの遺伝子（ゲノム配列のｎｔ４６９０〜ｎｔ５５８９）のｃＤＮＡを作製する。そして、このｃＤＮＡを、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）またはＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および下記のオリゴヌクレオチドを用い、標準的な３段階ＰＣＲ増幅法（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル）によって増幅させる：
ＲＳＶ−Ｇｆ：
【０２４５】
【化１０】
2008500399.tif 000013
（配列番号：２４）
ＲＳＶ−Ｇｒ：
【０２４６】
【化１１】
2008500399.tif 000014
（配列番号：２５）
ＲＳＶ−Ｇｆオリゴヌクレオチドは、好都合な制限部位ＡｓｃＩ、続いて開始ＡＴＧの上流にあるコザックコンセンサス配列を含む。ＲＳＶ−Ｇｒオリゴヌクレオチドは、制限部位ＮｏｔＩを含む。増幅後、ＤＮＡフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩによって消化してゲル精製する。次に、このフラグメントを、予めＡｓｃＩおよびＮｏｔＩで消化し、エビ由来アルカリホスファターゼで処理し、０．７％アガロースゲルから精製しておいたＶＣＲ  Ｃｈｉｍ２．１レプリコンベクターＤＮＡに連結して、構築物ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＧＲＳＶを作製する（図４）。同様に、Ｆタンパク質をコードするｃＤＮＡ（ゲノム配列のｎｔ５６６１〜ｎｔ７３８２）を、前記実施例に記載したようにして、例えばＡ２株のような、ヒトまたは動物（家畜）の単離体から作製する。このｃＤＮＡを、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）またはＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および下記のオリゴヌクレオチドを用い、標準的な３段階ＰＣＲ増幅法（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル）によって増幅する：
ＲＳＶ−Ｆｆ：
【０２４７】
【化１２】
2008500399.tif 000015
（配列番号：２６）
ＲＳＶ−Ｆｒ：
【０２４８】
【化１３】
2008500399.tif 000016
（配列番号：２７）。
【０２４９】
ＲＳＶ−Ｆｆオリゴヌクレオチドは、好都合な制限部位ＡｓｃＩ、続いて開始ＡＴＧのすぐ上流にあるコザックコンセンサス配列を含む。ＲＳＶ−Ｇｒオリゴヌクレオチドは、制限部位ＮｏｔＩを含む。そして、増幅されたフラグメントを、前記実施例に記載されたように処理し、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１にクローニングして、構築物ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＦＲＳＶを作製する（図４）。あるいは、ＰＩＶ遺伝子について上記したように、ＲＳＶのＧ遺伝子を商業的に合成することも可能である。
【０２５０】
本発明の呼吸器系ウイルス病原体のエンベロープ糖タンパク質（例えば、ＲＳＶ  Ｆ）の切断型（この糖タンパク質が分泌型となるように膜貫通アンカー領域の全部または一部（および、場合によっては細胞質尾部）を欠失している）も、標準的な分子生物学の技術を用いて当業者によって作製することも可能である。本発明のエンベロープ糖タンパク質遺伝子に対するその他の改変も考えられ、例えば、５’末端非翻訳領域の欠失または置換、異種リーダー配列の取り込みなど、容易に置換することができる。
【０２５１】
同様にして、隣接するＡｓｃＩ部位およびＮｏｔＩ部位をもつＲＳＶのＭ２−１配列を商業的に合成して、ＶＲＣ−Ｃｈｉｍ２．１のバックボーンにクローニングする。
【０２５２】
このライゲーションによって生じる形質転換体を、まず、適当なクローニング部位の存在、挿入配列のサイズ、および挿入配列の重複の証拠について解析する。数個ｓの陽性の形質転換体を無作為に選んで配列の確認を行なう。
【０２５３】
（実施例８）
ＲＳウイルスのＧ抗原およびＦ抗原の両方を同時に発現するアルファウイルスレプリコンベクターの構築
ＲＳＶのＧ抗原とＦ抗原との両方、またはＦもしくはＧのいずれかと別の抗原（例えば、Ｍ２−１）とを同時発現するアルファウイルスレプリコンベクターを、例えば、ＩＲＥＳ−バイシストロン性構築物（上記）として、または、二重のサブゲノムプロモーター構築物（これも上記）として、複数の方法で構築する（図４）。
【０２５４】
１つの代表的な例では、Ｇ抗原を第１のアルファウイルスサブゲノムプロモーターから発現させ、Ｆ抗原を、同じレプリコンベクターの中にある第２のアルファウイルスサブゲノムプロモーターから発現させる。この構築物は、Ｆのオープンリーディングフレーム、および上記のＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＦＲＳＶのアルファウイルスサブゲノムプロモーターを含むカセットとしてＦ遺伝子配列をクローニングすることによって容易に作成される。
【０２５５】
この構築物を、ＭｓｃＩ（転写開始点から−８２の所に位置する）またはＳｗａＩ（転写開始点から−５６６の所に位置する）の単一の制限酵素で消化し、ＮｏｔＩリンカーに連結させ、ＮｏｔＩで消化し、ゲル精製してから、予めＮｏｔＩおよびアルカリホスファターゼで処理しておいたＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＧｈＲＳＶに連結させる。そして、ＡｓｃＩなど、１ｋｂ（ＭｓｃＩ−ＮｏｔＩカセット）または１．５ｋｂ（ＳｗａＩ−ＮｏｔＩカセット）を解離する適当な制限酵素消化によって、挿入配列が存在すること、および正しい方向性をもつことについて形質転換体をスクリーニングする。
【０２５６】
また、本発明は、別のアルファウイルスに由来する類似した単一またはバイシストロン性のアルファウイルスベクター構築物を、本明細書で提示した教示内容を用いて、同様の方法で当業者によって容易に構築することが可能であるとも考える。
【０２５７】
（実施例９）
１つ以上のＲＳウイルス抗原を発現するアルファウイルスレプリコン粒子の製造
上記および当分野において使用されている、いくつもの利用可能な方法（例えばインビトロで転写された欠損ヘルパーＲＮＡとのＲＮＡの同時形質転換法、パッケージング細胞株への導入法）を用いて、上記のレプリコン構築物を含むアルファウイルスレプリコン粒子を調製することが可能である。例えば、ＲＳウイルスのＧ遺伝子を含むレプリコンベクターは、インビトロで転写して、Ｐｅｒｒｉら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０３９４−１０４０３）に記載されているようなレプリコン粒子を製造するために使用する。トランスフェクトされた細胞培養上清を回収してレプリコン粒子を得、濾過によって清澄化し、イオン交換クロマトグラフィー（ＷＯ０１９２５５２）を行い、さらなる濾過工程を行い、精製されたレプリコン粒子物質を薬学的に受容可能な希釈剤に処方した。当該分野において標準的な技術（米国特許第６０１５６９４号、第５７８９２４５号、第５８４３７２３号、第６４５１５９２号；Ｐｅｒｒｉら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０３９４−１０４０３；Ｐｏｌｏら上記；ＷＯ０１９２５５２）を用いて、レプリコン粒子の力価の測定、およびレプリコンを受容可能なウイルスが混入していないことの判定を行う。抗原発現の確認は、レプリコン粒子による培養細胞の感染後、免疫染色、またはその他適当な技術により行う。
【０２５８】
（実施例１０）
ヒトメタニューモウイルスのＧ抗原をコードする遺伝子を含むアルファウイルスレプリコンベクターの構築
ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）の付着タンパク質（Ｇ）を発現するアルファウイルスレプリコンベクターを構築するために、前記実施例に記載されているような感染培養物から抽出されたＲＮＡ上でのＲＴ−ＰＣＲによって、Ｇタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、例えば、単離体００−１（Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎら  ２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７：７１９−７２４、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号＃ＡＦ３７１３３７）などのヒトウイルス単離体から作製する。以下のように、ＰＣＲ増幅するための正方向オリゴヌクレオチドは、ＡｓｃＩ部位およびコザックコンセンサス配列を含み、逆方向オリゴは、ＮｏｔＩ部位を含む。
ＨＭＰＶ−Ｇｆ：
【０２５９】
【化１４】
2008500399.tif 000017
（配列番号：２８）
ＨＭＰＶ−Ｇｒ：
【０２６０】
【化１５】
2008500399.tif 000018
（配列番号：２９）。
【０２６１】
そして前記実施例に記載したように、増幅したフラグメントを処理して、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１にクローニングし、レプリコンＶＣＲＣｈｉｍ２．１−ＧＨＭＰＶを作製する。このベクターを含むレプリコン粒子を上記したように作出する。
【０２６２】
（実施例１１）
ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原をコードする遺伝子を含むアルファウイルスレプリコンベクターの構築
ＳＡＲＳウイルスのスパイク遺伝子は、その全体（全長のスパイクタンパク質をコードする）または、例えば、コードされるスパイクタンパク質が全長よりも短くなる（例えば、膜貫通領域および細胞質尾部の欠失）よう、配列の欠失もしくは切断を含む改変型をアルファウイルスレプリコンベクターの中に取り込むことができる。例えば、スパイク遺伝子を全長遺伝子として、標準的なＲＴ−ＰＣＲ条件によってＶＣＲ−ｃｈｉｍ２．１ベクター（ＷＯ０２／９９０３５）にクローニングすることが可能である。標準的なＲＴ−ＰＣＲにおける逆転写工程には、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ予備増幅キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および以下のプライマーを用いる：
Ｓｐ−ＲＴ−Ｒ
【０２６３】
【化１６】
2008500399.tif 000019
（配列番号：３０）
増幅工程には、ｃＤＮＡポリメラーゼアドバンテージキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）および以下のプライマーを用いる：
Ｓｐ−Ｆ−ＢｂｖＣＩ
【０２６４】
【化１７】
2008500399.tif 000020
（配列番号：３１）
Ｓｐ−Ｒ−ＮｏｔＩ
【０２６５】
【化１８】
2008500399.tif 000021
（配列番号：３２）。
【０２６６】
正方向プライマーは、スパイク遺伝子の翻訳効率を最適化するためにＡＴＧコドンの前にｃｃａｃｃ配列（Ｋｏｚａｋ，１９９１，ＪＢＣ  １９８６７−７０）が含まれるよう設計する。また、ＰＣＲ増幅遺伝子を後でクローニングするため、この正方向プライマーはＢｂｖＣＩ制限部位を含み、逆方向プライマーはＮｏｔＩ制限部位を含む。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋヌクレオチド除去キット（ＱＩＡｇｅｎ）を用いて精製し、ＢｂｖＣＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡｇｅｎ）でゲル精製して、同じ酵素で予め消化しておいたプラスミドＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１に連結させる。
【０２６７】
配列決定してＳＡＲＳスパイク配列を含むクローンを確認し、新たな構築物をＶＣＲＣｈｉｍ２．１−ＳＡＲＳｓｐｉｋｅと呼ぶ。
【０２６８】
ＶＥＥｒｅｐ／ＳＩＮｅｎｖ−ＳＡＲＳｓｐｉｋｅレプリコン粒子を作製するために、プラスミドＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＳＡＲＳｓｐｉｋｅ、ＶＣＲ−ＤＨ−Ｓｃａｐ（ＷＯ０２／９９０３５）、およびＶＣＲ−ＤＨ−Ｓｇｌｙｄ１１６０（ＷＯ０２／９９０３５）を制限酵素ＰｍｅＩで直鎖化して、既述したようにインビトロ転写に用いた（Ｐｏｌｏら，１９９９，ＰＮＡＳ  ９６：４５９８−６０３、ＷＯ０２／９９０３５）。転写産物を、既述したようにＢＨＫ細胞に同時トランスフェクトする（（Ｐｏｌｏら，１９９９，ｉｂｉｄ，ＷＯ０２／９９０３５）。トランスフェクトした細胞を３４℃でインキュベートし、エレクトロポレーションから２０時間後および３０時間後に上清を回収し、遠心分離によって清澄化し、既述したようにクロマトグラフィーによって精製する（ＰＣＴ  ＷＯ０１／９２５５２）。
【０２６９】
精製したＶＥＥｒｅｐ／ＳＩＮｅｎｖ−ＳＡＲＳｓｐｉｋｅまたはＶＥＥｒｅｐ／ＳＩＮｅｎｖ−ＧＦＰ（ＷＯ０２／９９０３５）レプリコン粒子をＢＨＫ細胞に一晩感染させて、レプリコン粒子ベクターからのＳＡＲＳスパイクタンパク質の発現を確認した。さらにまた、ＢＨＫ細胞を、インビトロで転写されたＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＳＡＲＳｓｐｉｋｅレプリコンＲＮＡにより並行してトランスフェクションさせた。感染およびトランスフェクションから１６時間後に、細胞を溶解し、溶解物のサンプルを、ＳＡＲＳウイルスのスパイクタンパク質を認識する抗体を用いるウエスタンブロットによって解析して発現を確認した。
【０２７０】
（実施例１２）
不活化ＰＩＶワクチンの製造
ＰＩＶ３株ＪＳを用いてＬＬＣ−ＭＫ２細胞に感染させ、感染から９６時間後に回収した培地上清を０．２μｍフィルタで清澄化および濾過した。約４５０ｍｌの回収した培地を、陽イオン交換樹脂であるＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）  ＥＭＤＳＯ３−（Ｍ）（ｓ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）、ＥＭ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含む１０ｍｌのカラムに適用した。このカラムを、０．５ＮのＮａＯＨ、その後１０カラム容量のＷＦＩで消毒し、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０で平衡化した。
【０２７１】
清澄化した上清を１１５ｃｍ／時の流速でカラムに通した。このカラムを約４０カラム容量の平衡バッファーで洗浄した。１０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０を含む約２０ｍｌのバッファーを適用して１段階溶出を行った。２８０ｎｍにおける吸光度に基づく溶出ピークを１２５ｍＭ塩化ナトリウム、および４０ｍｇ／ｍｌラクトースに希釈した。
【０２７２】
β−プロピオラクトン（カタログ番号：Ｐ１４２４、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ．，Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡ）を添加して、ＰＩＶ３の不活化をもたらした。まず、β−プロピオラクトンのストック溶液を高度精製水で１：２００に希釈した後、ゆっくりと一滴ずつ、１：２０００の濃度までウイルス保存液に直接希釈した。この溶液を慎重に混合して、４℃で一晩インキュベートした。３７℃で４時間インキュベートしてβ−プロピオラクトンの不活化を行った。
【０２７３】
不活化の効果を評価するために、不活化ウイルスのアリコートをＬＬＣ−ＭＫ２細胞に対して連続希釈して７日間インキュベートした。細胞障害効果（ＣＰＥ）によって測定したところ、不活化サンプルにおいてウイルスは検出されなかった。β−プロピオラクトンで不活化したウイルスの全タンパク質濃度をＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）によって０．５ｍｇ／ｍｌであると推定した。筋肉内および鼻腔内での免疫化を用いて、マウスおよびハムスターの両方における不活化ウイルスの免疫原性を確認した。鼻腔内免疫化の１回用量は５μｇのβ−プロピオラクトン不活化ウイルスおよび１０μｇのＬＴＫ６３アジュバントからなり、全容量は、マウスについて０．０３ｍｌ、またハムスターについては０．１ｍｌであった。筋肉内免疫化の用量は、免疫化直前に０．０５ｍｌのラクトースバッファーに希釈してから、等量のＭＦ５９アジュバントと緩やかに転倒混合した５μｇのβ−プロピオラクトン不活化ウイルスを含んだ。マウスおよびハムスターの両方に対する筋肉内免疫化の全容量は０．１ｍｌであった。
【０２７４】
（実施例１３）
アルファウイルスレプリコン粒子ワクチンを用いたインフルエンザウイルス特異的免疫応答の刺激
ＦＬＵ抗原特異的免疫応答の刺激を示すために、ＨＡ抗原を発現するＳＩＮレプリコン粒子を用いて、市販のサブユニットＦＬＵワクチン抗原と並行してＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。レプリコン粒子およびタンパク質を筋肉内に２回投与し、各免疫後に標準的なＥＬＩＳＡアッセイによってＨＡ特異的な血清抗体応答を測定した。
【０２７５】
２．５μｇ／ｍｌの１価サブユニットインフルエンザワクチン調製物（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｓ．ｒ．ｌ．，Ｉｔａｌｙ）を含むＰＢＳ溶液によって、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）平底プレートを４℃で一晩コーティングした。そして、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を補充したＰＢＳ（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。ウェルを洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔ中５％（ｗ／ｖ）のドライミルクを用いて、３７℃で１時間、非特異的な結合をブロックした。サンプル血清を、ＰＢＳ−Ｔで１：５０から開始して３倍に連続希釈した。希釈した血清により３７℃で９０分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
【０２７６】
さらに、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで希釈したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスのＩｇ、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ２ａ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．，ＡＬ）により３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで入念に洗浄した後、色素−基質溶液である、ジエタノールアミン中１ｍｇ／ｍｌのパラニトロフェニルホスフェートを各ウェルに１００μｌ加えた。そして、２０分後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）を用いて、４０５ｎｍでプレートを読み取った。力価を計算するために、カットオフ値を、ＰＢＳコントロールの光学密度（ＯＤ）の平均値にそれらの標準偏差の３倍を足したものと定義した。そして、抗体力価を、カットオフ値のＯＤを生じさせるサンプルの希釈度として計算した。図６に示すように、ＳＩＮレプリコン粒子は、テストした両方の用量で非常に有効であって、市販のタンパク質ベースのワクチンよりも強い免疫原性を持っていた。
【０２７７】
３つの異なったマウス系統で行われた別の実験でも同様の結果を確認した。増強されたＥＬＩＳＡ（結合）抗体力価に加えて、さらに重要なことに、ＳＩＮレプリコン粒子は、赤血球凝集素阻害アッセイによって測定したところ、より大量の中和抗体を産生した（図７）。免疫されたマウスの血清に、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１：５０または１：１００に希釈した試験用ノイラミニダーゼ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｌｉｅｄｅｒｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を４倍容量加えてノイラミニダーゼにより処理し、３７℃で一晩インキュベートした。ノイラミニダーゼを不活化するために、３血清容量分の２．５％クエン酸ナトリウム溶液を加えて、温水槽中５６℃で３０分間インキュベートした。２血清容量分のＰＢＳを更に加えて、アッセイを行う前に希釈度を１：１０に調整した。２５μｌの連続２倍希釈した血清を、Ｖ字底の９６ウェルプレートに分注した。４赤血球凝集素ユニットを含む、同じ容量のウイルス溶液（ＲＥＳＶＩＲ−１７）を加えて血清を希釈した。
【０２７８】
室温で６０分インキュベートした後、５０μｌのニワトリ赤血球懸濁液（０．５％）を加えて、室温でさらに６０分間インキュベートした。赤血球凝集を阻害する最も高い血清の希釈度を視覚的に判定した。このアッセイを二連で行い、平均希釈度をＨＩ力価とした。
【０２７９】
ＨＡを発現するＳＩＮ由来レプリコン粒子を、ＨＡを発現するＶＥＥ／ＳＩＮキメラレプリコン粒子と比較して、相対的な免疫原性を測定した（図８）。１０６個、１０５個、または１０４個のレプリコン粒子の投与量でマウスを２回免疫した。１回目および２回目の免疫後に得られた血清サンプルを上記したようにＥＬＩＳＡで解析した。ＳＩＮレプリコン粒子は、市販のサブユニットワクチン抗原よりも免疫原性が高かったが、ＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子は、さらに高いレベルの免疫原性を示した。ＦＬＵ  ＨＡを発現するＶＥＥ／ＳＩＮ粒子についても、アカゲザルにおける免疫原性を評価したところ、ＨＩ力価に基づいて、顕著なレベルのＦＬＵ中和抗体を誘導することが示された（図１０）。
【０２８０】
（実施例１４）
インフルエンザウイルス抗原を発現するアルファウイルスレプリコン粒子によって免疫された動物におけるインフルエンザウイルス曝露に対する防御
６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。曝露に用いるインフルエンザウイルスＷＳ／３３をインビボで滴定して、無処理のマウスに対する致死用量を決定した。免疫には、１０６個の投与量のＦＬＵ  ＨＡまたはＦＬＵ  ＮＡのいずれかを発現するレプリコン粒子、または３μｇの赤血球凝集素を含むＦＬＵサブユニットワクチン調製物（１価、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）の再集合体）を容量５０μｌのＰＢＳに入れ、前脛骨筋に投与して各群のマウス（１０匹／群）に受容させた。マウスを３週間おきに２回免疫した。２回目に免疫してから２週間後、マウスを生ＷＳ／３３インフルエンザウイルスに曝露した。２０μｌ（各鼻孔に対して１０μｌ）の上記尿膜腔液をＰＢＳで１０００倍に希釈し（約１００ＬＤ５０）、麻酔なしで鼻腔内に投与して、上気道にウイルスを感染させた。
【０２８１】
曝露した日から２週間動物の死亡率をモニタリングした。図９に示すように、ＦＬＵ  ＨＡまたはＦＬＵ  ＮＡのいずれかを発現するアルファウイルスレプリコン粒子ベースのワクチンは、鼻腔内ＦＬＵウイルス曝露に対する完璧な防御をもたらした。また、ＨＡまたはＮＡを発現する組成物は、例えば、１０４個以下などのレプリコン粒子の非常に低い免疫用量でも、鼻腔内からのＦＬＵ曝露に対して高度の防御を示した（図２１）。
【０２８２】
単一のＦＬＵ抗原を発現するレプリコン粒子ベースのＦＬＵワクチンに加えて、１つより多いＦＬＵ抗原（ＨＡ＋ＮＡ、上記参照）を発現するレプリコン粒子調製物も、鼻腔内曝露モデルにおいて高度の防御を示した（図２２）。
【０２８３】
本発明は、タンパク質ベースのワクチン処方物（例えば、市販のサブユニットまたは分割ワクチン）によって、アルファウイルスレプリコンで免疫された温血哺乳動物を「追加免疫」することによって、上記アルファウイルスレプリコン粒子ベースのＦＬＵワクチンの任意のものに対する免疫原性応答をさらに促進することができると考えていることに留意しなければならない。これは、（例えば、Ｈ３、Ｈ１を含む）一般的なインターパンデミックなＦＬＵ感染またはワクチン接種に以前曝露されていて、それらから生じる既存の抗体レベルがほとんど効果がない可能性のある、（例えば、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９を含む）トリＦＬＵウイルスによるヒト感染によって生じるＦＬＵの流行に対して特に魅力的な方法となり得る。
【０２８４】
（実施例１５）
ＨＮ抗原を発現するアルファウイルスレプリコン粒子ワクチンを用いたパラインフルエンザウイルス特異的免疫応答の刺激
本明細書において既述したように、アルファウイルスレプリコン粒子は、温血哺乳動物に投与した後、さまざまな呼吸器系病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌など）に対する免疫応答を刺激するために利用することができる。
【０２８５】
ＰＩＶのＨＮ抗原を発現するＳＩＮまたはＶＥＥ／ＳＩＮのキメラレプリコン粒子を、実施例４に記載したように、ＢＡＬＢ／ｃマウスで評価した。ＩＭ経路、ＩＮ経路、またはＩＮ後ＩＭ経路によってマウスを２回免疫し、２回目の免疫後ＥＬＩＳＡアッセイによって血清抗体を測定した（図１２）。この免疫原性実験では、さらに別の群も、さまざまな経路で不活化ＰＩＶワクチンによって免疫した。ＥＬＩＳＡのため、パラインフルエンザウイルス３型の等級２抗原（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．カタログ番号１２３０６５）でＩｍｍｕｌｏｎ  Ｉｂ  ＥＬＩＳＡプレートを、２５ｎｇ／ウェルの濃度で一晩（４℃）コーティングした。ＰＢＳ中０．５％カゼイン、５％ヤギ血清により、３７℃で１時間ブロッキングして、非特異的結合を除去した。
【０２８６】
試験血清を０．５％カゼインに連続希釈し、３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳで洗浄してから、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ（ＣａｌＴａｇ）のいずれかにより３７℃で１時間インキュベートした。ＴＭＢによって免疫複合体を検出し、４５０ｎｍで読み取った。
【０２８７】
結果は、いずれの経路、または経路の組み合わせ（ＩＮ（鼻腔内）の後ＩＭ（筋肉内））でも、レプリコン粒子の免疫原性を示しており、また、ＩＭまたはＩＮ／ＩＭ投与後の不活化ＰＩＶワクチンの免疫原性も示している。次に、ＰＩＶ  ＨＮを発現するＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子の用量を、１０７個、１０６個、および１０５個という範囲にわたる粒子について試験した（図１３）。各用量とも、高度に免疫原性であることが示された。
【０２８８】
不活化ＰＩＶワクチンを、（実施例１２に記載されたように）アジュバントが存在する場合と存在しない場合とで、さまざまな経路によってさらに特徴付けた。実施例１４に示したように、アジュバント（ＭＦ５９）を加えると、ＩＭ送達された不活化ＰＩＶワクチンの免疫原性は強化された。ＬＴＫ６３アジュバントとともにＩＮ投与され、その後ＭＦ５９とともにＩＭ投与された不活化ＰＩＶも、強い抗体応答を誘導した。
【０２８９】
（実施例１６）
ＰＩＶワクチンの有効性：鼻腔内曝露からの動物の防御
マウスの免疫原性実験に加えて、本発明のＰＩＶワクチンをワクチンの効力について評価した。文献に記載されているように（例えば、Ｏｔｔｏｌｉｎｉら，２００２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８６：１７１３−１７１７；Ｔａｏら，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１１００−１１０８；Ｂｒｉｄｅａｕら，１９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４：４７１−４７７；Ｄｕｒｂｉｎら，２０００，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：２４６２−２４６９；Ｐｅｎｎａｔｈｕｒら，２００３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８４：３２５３−３２６１参照）、ウイルス曝露の後、防御を測定した。ハムスターの曝露モデルでは、鼻腔内曝露後、ヒトＰＩＶ３ウイルスは増殖感染して、ハムスターの肺および鼻甲介の中で複製する。ＰＩＶ曝露ウイルスが、免疫された動物のこれらの組織の中で顕著に複製できにくくなることから明らかなように、有効なワクチンは、鼻腔内曝露からの防御をもたらす。
【０２９０】
８匹のハムスターからなる群を、ＭＦ５９中５μｇの用量のＢＰＬ不活化ＰＩＶで２回ＩＭ免疫するか、または、ＰＩＶ  ＨＮを発現する１０７個のＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子によってＩＭで２回免疫するか、または、１回はＩＮで、その後ＩＭで１回免疫した。コントロール群には、ワクチン抗原を含まない希釈剤のみを投与した。３週間の間を置いてワクチン接種を行い、各免疫から２週間後、ＰＩＶ特異的抗体の誘導について血清を調べた。図１５および１６に示すように、レプリコン粒子もアジュバント化された不活化ＰＩＶワクチンも、高レベルのＰＩＶ抗体を誘導した。２回目に免疫してから３週間後、全ての動物をＰＩＶウイルスに鼻腔内曝露した。曝露後４日目に動物を殺処理して、肺および鼻甲介におけるＰＩＶ曝露ウイルスの力価を測定した。
【０２９１】
図１７に示すように、レプリコン粒子および不活化ＰＩＶワクチンは、上気道および下気道の両方をウイルス曝露から完全に防御した。ＰＩＶ３感染からの上下両気道組織の防御（肺だけなど、単に１つの組織だけではない）は、これらのモデルにおける有効性の重要な決定要因および指標である。
【０２９２】
これらのハムスターにおける有効性実験を拡充するために、アルファウイルスレプリコン粒子ベースのＰＩＶワクチン、非経口のＩＭ経路、および粘膜のＩＮ経路を比較した。６匹のハムスターからなる群を、ＩＭ注射またはＩＮ液摘投与によって、３週間おきにＶＥＥ／ＳＩＮ−ＨＮレプリコン粒子（１０７ＩＵ）で２回免疫した。図２３に示すように、ＩＮ経路でもＩＭ経路でも、免疫後２週間でＰＩＶ３特異的抗体応答を生じさせたことが明らかである。以前、レプリコン粒子によるＩＭ免疫で確認されているように、ＩＭまたはＩＮで免疫した群をその後曝露したところ、鼻腔内ＰＩＶ３曝露後、上部気道（鼻）および下部気道（肺）の両組織がウイルス複製から完全に防御されることが実証された（図２３）。
【０２９３】
このように、アルファウイルスレプリコン粒子を用い、非経口または粘膜のいずれかからの投与によって、呼吸器系病原体（例えば、ウイルス）に対する免疫応答を生じさせ得る。
【０２９４】
（実施例１７）
ＨＮ抗原およびＦ抗原を同時発現するアルファウイルスレプリコン粒子ワクチンを用いたパラインフルエンザウイルス特異的免疫応答の刺激
本明細書において既述したように、複数の抗原を同時発現するレプリコン粒子は、温血哺乳動物に投与した後、パラインフルエンザウイルスに対する免疫応答を刺激するために利用することができる。
【０２９５】
実施例５および６に記載したように、ＰＩＶのＨＮ抗原およびＦ抗原の両方を同時発現するレプリコン粒子を、ヒトにおける臨床評価に先立って、上記したような多数の動物モデルにおいて、免疫原性および有効性について評価する。
【０２９６】
例えば、ＩＭ、ＩＮ、ＳＣ、ＩＤ、ＩＮ後ＩＭなど、さまざまな経路のいずれかによって処方物を投与する。レプリコン粒子を、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、または１０８感染ユニット（ＩＵ）の投与量で１回以上送達する。結合抗体（ＥＬＩＳＡ）および／または中和抗体（ＨＩアッセイ法）の標準的測定法によって免疫原性を測定し、文献に記載されているようにして（例えば、Ｏｔｔｏｌｉｎｉら，２００２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８６：１７１３−１７１７；Ｔａｏら，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１１００−１１０８；Ｂｒｉｄｅａｕら，１９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４：４７１−４７７；Ｄｕｒｂｉｎら，２０００，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：２４６２−２４６９；Ｐｅｎｎａｔｈｕｒら，２００３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８４：３２５３−３２６１参照）、ウイルスに曝露した後、防御を判定することができる。
【０２９７】
（実施例１８）
Ｇ抗原およびＦ抗原を同時発現するアルファウイルスレプリコン粒子ワクチンを用いたＲＳウイルス特異的免疫応答の刺激
レプリコン粒子は、温血哺乳動物に投与した後、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に対する免疫応答を刺激するために使用することができる。例えば、実施例８および９に記載したように、ＲＳＶのＧ抗原およびＦ抗原の両方を同時発現するレプリコン粒子を、ヒトにおける臨床評価に先立って、多数の動物モデル（例えば、マウス、コットンラット、サル）で評価する。例えば、ＩＭ、ＩＮ、ＳＣ、ＩＤ、ＩＮ後ＩＭなど、さまざまな経路のいずれかによって処方物を投与する。レプリコン粒子を、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、または１０８感染ユニット（ＩＵ）の投与量で１回以上送達する。結合抗体（ＥＬＩＳＡ）および／または中和抗体の標準的測定法によって免疫原性を測定し、文献に記載されているようにして（例えば、Ｐｒｉｎｃｅら，２００１，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２８８１−２８８８；Ｌｉら，２０００，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６９：５４−６５参照）、ウイルスに曝露した後、防御を判定することができる。
【０２９８】
（実施例１９）
Ｇ抗原を発現するアルファウイルスレプリコン粒子ワクチンを用いたヒトメタニューモウイルス特異的免疫応答の刺激
レプリコン粒子は、温血哺乳動物に投与した後、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）に対する免疫応答を刺激するために使用される。例えば、実施例１０に記載したように、ＨＭＰＶのＧ抗原を発現するレプリコン粒子を、ヒトにおける臨床評価に先立って、多数の動物モデル（例えば、マウス、コットンラット、フェレット、サル）で評価する。
【０２９９】
例えば、ＩＭ、ＩＮ、ＳＣ、ＩＤ、ＩＮ後ＩＭなど、さまざまな経路のいずれかによって処方物を投与する。レプリコン粒子を、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、または１０８感染ユニット（ＩＵ）の投与量で１回以上送達する。結合抗体（ＥＬＩＳＡ）および／または中和抗体の標準的測定法によって免疫原性を測定し、標準的なウイルス曝露を行った後、防御を判定することができる。
【０３００】
（実施例２０）
２つの抗原を同時発現するアルファウイルスレプリコン粒子ワクチンを用いた複数の呼吸器系ウイルス病原体に対する免疫応答の刺激
アルファウイルス由来の構築物および上記教示内容、多数のさらなるバイシストロン性構築物を構築する（図５）。これらの構築物は、上記したウイルス、細菌、および／または真菌の病原体など、１つより多い呼吸器系病原体に由来するタンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。このような構築物は、好ましくは、異種配列（抗原コード配列）の同時発現を行なう手段として、重複したサブゲノムプロモーターまたはＩＲＥＳ要素（既述）を使用することに基づく。
【０３０１】
本発明は、併用免疫原およびワクチンとして、さまざまな病原体由来の抗原をコードするこのような構築物を使用することを意図している。このような構築物の非限定的な例には、例えば、ＲＳＶのタンパク質をコードする遺伝子＋ＰＩＶのタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＰＩＶ  ＨＮ＋ＲＳＶ  Ｆ）、ＲＳＶのタンパク質をコードする遺伝子＋ヒトメタニューモウイルスのタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＲＳＶ  Ｇ＋ＨＭＰＶ  Ｇ）、ＦＬＵのタンパク質をコードする遺伝子＋ＳＡＲＳウイルスのタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＵ  ＨＡ＋ＳＡＲＳ  スパイク）、ＳＡＲＳウイルスのタンパク質をコードする遺伝子＋ＨＭＰＶのタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＳＡＲＳスパイク＋ＨＭＰＶ  Ｆ）などを発現するアルファウイルスレプリコン構築物が挙げられる。このような物質の構築、製造、および試験は、上記した開示内容に基づき、当業者によって容易に行うことができる。
【０３０２】
アルファウイルスレプリコンベクターがＰＩＶ抗原（例えば、ＨＮ糖タンパク質）およびＲＳＶ抗原（例えば、Ｆ糖タンパク質）の両方を発現するよう構築されているＰＩＶ／ＲＳＶ併用ワクチンを作製した。より具体的には、上記既述したレプリコンベクター構築物ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＨＮＰＩＶ３を、ＲＳＶのＦ糖タンパク質を同時発現するよう、さらに改変した。Ｆ糖タンパク質を、鋳型であるＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＦＲＳＶ（これも上記した）と以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、標準的な条件下でＰＣＲによって、アルファウイルスサブゲノムプロモーターとともに増幅した。
ＳＧＰ−正方向
【０３０３】
【化１９】
2008500399.tif 000022
（配列番号：３３）
ＲＳＶ  Ｆ−逆方向
【０３０４】
【化２０】
2008500399.tif 000023
（配列番号：３４）
ＲＳＶのＦ遺伝子に作動可能に結合したアルファウイルスサブゲノム接合部プロモーターを含むＰＣＲフラグメントをＮｏｔＩで消化して、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＨＮＰＩＶ３（これもＮｏｔＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理した）に連結して、バイシストロン性構築物のＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＨＮＰＩＶ３−ｓｇｐ−ＦＲＳＶを作出した。
【０３０５】
このバイシストロン性アルファウイルスレプリコンベクターを用いて、レプリコン粒子ベースのＰＩＶ／ＲＳＶ併用ワクチン調製物（ＶＥＥ／ＳＩＮ−ＨＮＰＩＶ３−ｓｇｐ−ＦＲＳＶと命名）を作製し、適当な抗原特異的抗体を用いた免疫染色によってＲＳＶ  ＦおよびＰＩＶ  ＨＮの両抗原の発現を確認した。
【０３０６】
ここで、図２４を見ると、レプリコンベクターによって２つの異種抗原が細胞内で発現することを示す、蛍光活性化細胞選別研究の結果が示されている。細胞を回収し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＰｈａｒＭｉｇｅｎ＃５５４７２２）で固定および透過処理して、二連のサンプルを、ＲＳＶ特異的抗体（ヤギ抗ＲＳＶ−ＦＩＴＣ結合体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ．より）またはＰＩＶ特異的抗体（ハムスター抗ＰＩＶ３一次抗体、その後、ヤギ抗ハムスター−Ａｌｅｘａ４８８結合体、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃより）のいずれかとインキュベートした。図２４は、バイシストロン性アルファウイルスレプリコンベクターからのＰＩＶ３  ＨＮおよびＲＳＶ  Ｆの発現を示している。
【０３０７】
これらのレプリコン粒子ワクチン調製物は、上記したように、免疫原性および有効性について適当な動物モデルで評価することができる。
【０３０８】
免疫原性組成物またはワクチン組成物として使用するために、本明細書に提示された教示内容に基づいて、呼吸器系病原体由来の他の抗原の組み合わせを、バイシストロン性構造物で同じように発現させることができる。
【０３０９】
（実施例２１）
さまざまな抗原を発現するアルファウイルスレプリコン粒子の少なくとも２つの集団を含むワクチンを用いた複数の呼吸器系病原体に対する免疫応答の刺激
上記したような第１の呼吸器系病原体に由来する１つ以上のポリペプチド抗原をコードするレプリコンベクター粒子を、１つより多い疾患を予防するのに有用な免疫原性組成物として、上記したような第２の呼吸器系病原体に由来する１つ以上のポリペプチド抗原をコードするレプリコン粒子と組み合わせることができる。このような併用ワクチンは、少なくとも２つのこのようなレプリコン粒子の集団、３つ以上のレプリコン粒子の集団、および４つ以上のレプリコン粒子の組み合わせなど、多岐にわたる異なった組み合わせを含むことが可能である。
【０３１０】
さらに、本発明では、別々の呼吸器系ウイルス病原体の抗原をコードする少なくとも２つのレプリコン粒子を含む本発明の免疫原性組成物は、単一の抗原または複数の抗原（例えば、バイシストロン性、図２〜５参照）を発現するレプリコン粒子を含むことも可能であると考える。非限定的な例には、例えば、ＲＳＶのタンパク質をコードする遺伝子＋ＰＩＶのタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＰＩＶ  ＨＮ＋ＲＳＶ  Ｆ）、ＲＳＶのタンパク質をコードする遺伝子＋ヒトメタニューモウイルスのタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＲＳＶ  Ｇ＋ＨＭＰＶ  Ｇ）、ＦＬＵのタンパク質をコードする遺伝子＋ＳＡＲＳウイルスのタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＦＬＵ  ＨＡ＋ＳＡＲＳスパイク）、ＳＡＲＳウイルスのタンパク質をコードする遺伝子＋ＨＭＰＶのタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＳＡＲＳスパイク＋ＨＭＰＶ  Ｆ）などが挙げられる。
【０３１１】
他の非制限的な例には、ＰＩＶ  ＨＮを発現するアルファウイルスレプリコン粒子＋ＲＳＶ  Ｇを発現するレプリコン粒子、ＰＩＶ  ＨＮを発現するレプリコン粒子＋ＨＭＰＶ  Ｇを発現するレプリコン粒子、ＦＬＵ  ＨＡを発現するレプリコン粒子＋ＳＡＲＳ  Ｓを発現するレプリコン粒子、ＦＬＵ  ＨＡを発現するレプリコン粒子＋ＨＭＰＶ  Ｇを発現するレプリコン粒子、ＳＡＲＳ  Ｓを発現するレプリコン粒子＋ＨＭＰＶ  Ｇを発現するレプリコン粒子、ＰＩＶのＨＮおよびＦを同時発現するレプリコン粒子＋ＲＳＶのＧおよびＦを同時発現するレプリコン粒子などを含む免疫原性組成物が挙げられる。このような免疫原性組成物は、適当な動物モデルにおいて、上記に詳述したように免疫原性および有効性について評価を行うことができる。
【０３１２】
特に、異なった呼吸器系病原体の抗原を発現するレプリコン粒子の少なくとも２つの集団の混合物を含む免疫原性組成物が、コードされた複数の抗原のそれぞれに対する強力な免疫応答を、干渉することなく誘導することを実証するため、本発明者らは、上記の２つのウイルス病原体由来のタンパク質を評価した。ＰＩＶ／ＦＬＵ混合ワクチン調製物を作製するため、ＦＬＵ  ＨＡを発現するＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子を、ＰＩＶ  ＨＮを発現するＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子と混合した（図１８、１９、および２５）。
【０３１３】
この混合ワクチンによる抗体誘導を、ＦＬＵ  ＨＡのみ、またはＰＩＶ−ＨＮのみを発現するレプリコン粒子によるヘッド・ツー・ヘッド（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）の動物実験で比較した。図１８および２５に示されているように、レプリコン粒子ベースのＰＩＶ／ＦＬＵ混合ワクチンは、ＰＩＶ  ＨＮのみを発現するレプリコン粒子に匹敵するレベルでＰＩＶ特異的抗体を誘導した。同じＰＩＶ／ＦＬＵ混合ワクチンも、ＦＬＵ  ＨＡのみを発現するレプリコン粒子に匹敵するレベルでＦＬＵ  ＨＡ抗体を誘導した（図１９）。
【０３１４】
ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質をコードするアルファウイルスレプリコン粒子（ＶＥＥ／ＳＩＮ−ＦＲＳＶ）、およびＰＩＶ３  ＨＮ糖タンパク質をコードするアルファウイルスレプリコン粒子（ＶＥＥ／ＳＩＮ−ＨＮＰＩＶ３）の組み合わせを含む免疫原性ワクチン組成物を、上記したＰＩＶおよびＲＳＶの各ワクチン成分を用いて作製した。適当な抗原特異的抗体を用いて、ＲＳＶ  ＦおよびＰＩＶ  ＨＮの両抗原の発現を免疫染色により確認した。
【０３１５】
図２４は、蛍光活性化細胞選別研究の結果を示しており、混合したレプリコンベクターによる細胞内での２つの抗原の発現を実証している。細胞を回収し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＰｈａｒＭｉｇｅｎ＃５５４７２２）で固定および透過処理して、二連のサンプルを、ＲＳＶ特異的抗体（ヤギ抗ＲＳＶ−ＦＩＴＣ結合体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ．より）またはＰＩＶ特異的抗体（ハムスター抗ＰＩＶ３一次抗体、その後、ヤギ抗ハムスター−Ａｌｅｘａ４８８結合体、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃより）のいずれかとインキュベートした。図２４に示されたとおり、ＰＩＶ３  ＨＮもＲＳＶ  Ｆも、アルファウイルスレプリコンベースのＰＩＶ／ＲＳＶ混合ベクターから発現した。
【０３１６】
これらのレプリコン粒子ワクチン調製物を、上記したように、免疫原性および有効性について適当な動物モデルで評価する。
【０３１７】
これらの結果は、ウイルスなどの呼吸器系病原体に対する混合ワクチンの土台として、アルファウイルスレプリコン粒子が有用であることを示している。呼吸器系病原体のその他の抗原も、本明細書に提示された教示内容に基づいて、免疫原性組成物またはワクチン組成物として利用するために、レプリコン粒子をこのように組み合わせて、同じように発現させることができる。
【０３１８】
さらに、図２０に示されているとおり、このような混合ワクチンは、必ずしも、レプリコン粒子の混合物として同時送達する必要はない。むしろ、第１の抗原（本実施例ではＳＡＲＳスパイク）を発現するレプリコン粒子を投与し、第２の抗原（本実施例ではＦＬＵ  ＨＡ）を発現するレプリコン粒子で免疫することができ、ＦＬＵ  ＨＡをコードするレプリコン粒子で無処理のマウスにワクチン接種したときと比較しても、第２のコードされた抗原に対する応答を阻害することはない。
【０３１９】
本明細書における数値範囲の記載は、単に、該範囲に含まれる各個の数値を個別に記載する簡略な方法として用いるものであり、別段の記載がない限り、各個の数値は、それぞれ個別に記載されているものとして本明細書に組み込まれる。本明細書に記載された方法はすべて、本明細書に別段の記載がないか、または、明らかに文脈上矛盾しない限り、任意の適当な方法で実施し得る。本明細書に記載されたいかなる例示、または例示的言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより分かりやすくするためのものであり、別途記載された発明の範囲に制限を付すものではない。
【０３２０】
本明細書に開示した発明の代替的要素または実施形態をグループ化したことを制限と解してはならない。各グループの構成要素を、個別に、または本明細書に記載されたグループの他の構成要素または他の要素とともに参照および記載することも可能である。便宜上および／または特許性の観点から、あるグループの１つ以上の構成要素を、あるグループに組み入れ得るか、または除き得ることも想定される。このような組み入れや削除が行われると、本明細書は、その改変されたグループを含むと見なされるため、本明細書において用いられるすべてのマーカッシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）グループの記載を満たす。
【０３２１】
本発明の好適な実施形態が、発明者が認識する本発明を実施するための最良の形態を含め本明細書に記載されている。当然ながら、それらの好適な実施形態を変更することも、上記記載を読めば、当業者には明らかとなろう。本発明者らは、当業者が、適当な変更を採用することを予想し、また、本発明が、本明細書に具体的に記載された以外の方法で実施されることも意図している。したがって、本発明は、適用法令で認められているとおり、本明細書に記載された内容を改変したもの、およびそれと同等のものを含む。さらに、上記要素の任意の組み合わせで、それに対しあらゆる可能な変更が加えられたものも、本明細書に別段の記載がないか、または、明らかに文脈上矛盾しない限り、本発明に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０３２２】
【図１】アルファウイルスレプリコン粒子を作製するために用いられた代表的なアルファウイルスレプリコンベクターおよびパッケージング要素の一般的な配置を示す略図である。
【図２】１種以上のインフルエンザウイルス抗原をコードする代表的なアルファウイルスレプリコンベクターの略図である。
【図３】１種以上のパラインフルエンザウイルス抗原をコードする代表的なアルファウイルスレプリコンベクターの略図である。
【図４】１種以上の呼吸器系合胞体ウイルス抗原をコードする代表的なアルファウイルスレプリコンベクターの略図である
【図５】少なくとも２つの異なる呼吸器系ウイルス病原体から選択された抗原をコードする代表的なアルファウイルスレプリコンベクターの略図である。
【図６】アルファウイルスレプリコン粒子で免疫されたマウスにおけるＦＬＵ  ＨＡ特異的抗体の力価を、従来型ＨＡサブユニットワクチン抗原と比較して示すグラフである。
【図７】アルファウイルスレプリコン粒子で免疫されたマウスにおける（ＨＩ力価として測定された）ＦＬＵ特異的中和抗体を、ＨＡサブユニットワクチン抗原と比較して示すグラフである。
【図８】ＦＬＵ  ＨＡ抗原を発現するＳＩＮレプリコン粒子およびＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子のさまざまな投与量の免疫原性を比較するグラフである。
【図９】ＦＬＵのＨＡまたはＮＡを発現するアルファウイルスレプリコン粒子で免疫した後の鼻腔内ＦＬＵウイルス曝露からのマウスの防御を示すグラフである。
【図１０】ＦＬＵ  ＨＡ抗原を発現するＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子で免疫されたアカゲザルにおけるＦＬＵ中和抗体の誘導を示すグラフである。
【図１１】重複サブゲノムプロモーターまたはＩＲＥＳ要素を利用して、バイシストロン性のＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子からのＦＬＵのＨＡおよびＮＡの二重発現を示すグラフである。
【図１２】ＰＩＶのＨＮ抗原を発現するレプリコン粒子で、ＩＭ、ＩＮ、またはＩＮ後ＩＭによって免疫されたマウスにおけるＰＩＶ特異的抗体反応の誘導を示すグラフである。
【図１３】ＨＮを発現するアルファウイルスレプリコン粒子の投与量を減らしながら免疫したマウスにおけるＰＩＶ抗体反応の誘導を示すグラフである。
【図１４】アジュバント（ＭＦ５９またはＬＴＫ６３）とともに、またはアジュバントなしで、およびＩＭによって、またはＩＮ後ＩＭによって投与した場合、不活化ＰＩＶワクチンで免疫されたマウスにおけるＰＩＶ特異的抗体反応の誘導を示すグラフである。
【図１５】ＨＮを発現するＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子、または、不活化ＰＩＶワクチンによって、ＭＦ５９アジュバントとともに１回免疫したハムスターにおけるＰＩＶ抗体反応の誘導を実証するグラフである。
【図１６】ＨＮを発現するＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子、または、不活化ＰＩＶワクチンによって、ＭＦ５９アジュバントとともに２回免疫したハムスターにおけるＰＩＶ抗体反応の誘導を実証するグラフである。
【図１７】ＨＮ抗原を発現するＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子、または、不活化ＰＩＶワクチンによって、ＭＦ５９アジュバントとともに免疫した後の鼻腔内ＰＩＶ曝露からハムスターが防御されたことを実証する表である。
【図１８】アルファウイルスレプリコン粒子ベースのＰＩＶ／ＦＬＵ混合ワクチンによる免疫後のＰＩＶ特異的抗体反応の誘導を示すグラフである。
【図１９】アルファウイルスレプリコン粒子ベースのＰＩＶ／ＦＬＵ混合ワクチンによる免疫後のＦＬＵ特異的抗体反応の誘導を示すグラフである。
【図２０】ＳＡＲＳ−Ｓタンパク質を発現するアルファウイルスレプリコン粒子、およびＦＬＵのＨＡタンパク質を発現するアルファウイルスレプリコン粒子で順次免疫されたマウスにおける、ＳＡＲＳおよびＦＬＵの特異的抗体反応の誘導を示すグラフである。
【図２１】パネルＡおよびＢは、ＦＬＵのＨＡまたはＮＡを発現するアルファウイルスレプリコン粒子を低投与量にして免疫した後の鼻腔内ＦＬＵウイルス曝露からのマウスの防御を示すグラフである。
【図２２】ＨＡ抗原およびＮＡ抗原の両方を発現するアルファウイルスレプリコン粒子ワクチン調製物で免疫した後の鼻腔内ＦＬＵウイルス曝露からのマウスの防御を表わすグラフである。
【図２３】図２３Ａは、ハムスターにおける、ＰＩＶ３のＨＮ抗原を発現するアルファウイルスレプリコン粒子ワクチンをＩＭまたはＩＮによって投与した場合の免疫原性と、その結果得られた、これらワクチン投与された動物の、ＰＩＶ３ウイルスによる鼻腔内曝露からの完全な防御を示すグラフである。図２３Ｂは、図２３Ａのグラフに示された結果を示す表である。
【図２４】バイシストロン性アルファウイルスレプリコン粒子からのＰＩＶ３  ＨＮおよびＲＳＶ  Ｆの二重発現、およびそれぞれ別個にＰＩＶ  ＨＮとＲＳＶ  Ｆとを発現するレプリコン粒子を混合したものからのＰＩＶ３  ＨＮおよびＲＳＶ  Ｆの二重発現を示すグラフである。
【図２５】アルファウイルスレプリコン粒子ベースのＰＩＶ／ＦＬＵ混合ワクチンによる免疫後のＰＩＶ特異的抗体反応の誘導を示すグラフである。
【図１】
2008500399.tif 000024
【図２】
2008500399.tif 000025
【図３】
2008500399.tif 000026
【図４】
2008500399.tif 000027
【図５】
2008500399.tif 000028
【図６】
2008500399.tif 000029
【図７】
2008500399.tif 000030
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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