【事件の表示】
　特許第２９８６７７８号「水系中のレジオネラ属菌の除菌方法」の請求項１ないし３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２９８６７７８号の請求項１ないし３に係る特許を維持する。
【理　由】
〔一〕　本件特許は、平成１０年（１９９８）６月１５日に出願され（特願平１０−１６７５９３号、優先権主張日　平成９年６月１３日）、平成１１年１０月１日に特許権の設定の登録がされ（特許第２９８６７７８号。請求項数　３）、平成１１年１２月６日にその特許掲載公報が発行されたものである。
　そして、平成１２月６月６日に、本件特許は、本件特許の願書に添付された明細書（以下では、本件特許明細書という。）の特許請求の範囲の請求項１から同３までの各請求項の発明は、（イ）特許法第２９条第１項第３号に規定する発明に該当し、同条同項の規定に違反して、また、（ロ）特許法第２９条第２項の規定に違反して、さらに、（ハ）特許法第３６条第４項及び同第６項に規定する要件を満たしていない出願に対して特許されたものであるから、本件特許は取り消すべきであるとの特許異議の申立てがされた。
　当審は、平成１２年９月１３日付けで、上記（ロ）の理由による特許取消理由通知をし、あわせて、本件特許権者に審尋した。本件特許権者は、平成１２年１１月２７日に、この取消理由に対して特許異議意見書を、上記審尋に対して回答書を提出するとともに、本件特許明細書の訂正を請求した。
　当審は、さらに、平成１３年３月９日付けで取消理由を通知し、本件特許権者は、平成１２年１１月２７日付けの訂正請求書を取り下げるとともに、平成１３年３月１５日に訂正請求書を提出した。以下では、この訂正請求書による訂正を本件訂正という。
　
〔二〕　本件訂正請求の成否
（１）　訂正の内容
（イ）　訂正事項ａ
　本件特許明細書の特許請求の範囲の記載を下記のとおり訂正する。
　「【請求項１】　レジオネラ属菌とアメーバとが共存している水系に、１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加することにより水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満とするアメーバを殺滅することが可能な薬剤を１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加した後、該水系に前記アメーバを殺滅することが可能な薬剤を補充して、水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満に維持することにより、レジオネラ属菌を除菌することを特徴とする水系中のレジオネラ属菌の除菌方法。
　【請求項２】　前記アメーバを殺滅することが可能な薬剤が、ヒノキチオール化合物、またはグルタルアルデヒドである、請求項１に記載の水系中のレジオネラ属菌の除菌方法。
　【請求項３】　前記アメーバがアカントアメーバである、請求項１又は２に記載の水系中のレジオネラ属菌の除菌方法。」
（ロ）　訂正事項ｂ
　本件特許明細書の段落【0008】の記載を下記のように訂正する。
　「【課題を解決するための手段】上記のような本発明の目的は、レジオネラ属菌とアメーバとが共存している水系に、１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加することにより水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満とするアメーバを殺滅することが可能な薬剤を１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加した後、該水系に前記アメーバを殺滅することが可能な薬剤を補充して、水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満に維持することにより、レジオネラ属菌を除菌することを特徴とする水系中のレジオネラ属菌の除菌方法によって達成することができる。」と訂正する。
（ハ）　訂正事項ｃ
　本件特許明細書の段落【0009】中の「アメーバーを殺滅可能な薬剤」を「アメーバを殺滅することが可能な薬剤」と訂正する。
　
（２）　訂正の適法性
（イ）　訂正事項ａの点
（イ−１）　訂正事項ａは、本件特許明細書の特許請求の範囲の請求項１の（α）「水系に対してアメーバを殺滅可能な薬剤を、水系中のアメーバ数が１００ｍＬ当たり１０個未満となる濃度になるように、添加する」の記載を
（β）「水系に１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加することにより水系のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満とするアメーバを殺滅することが可能な薬剤を１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加した後、」（γ）「該水系に前記アメーバを殺滅することが可能な薬剤を補充して、水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満に維持する」と訂正するものであるから、アメーバを殺滅することが可能な薬剤の添加量を１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度に限定し、その後、さらにアメーバを殺滅することが可能な薬剤を補充するように限定したものであるから、本件訂正は、訂正事項ａの点で、特許請求の範囲を減縮することを目的としている。
（イ−２）　本件特許明細書の段落【0012】には、「水系中でのアメーバ数を、１００ｍＬ当たり１０個未満にまで低下させたのち、必要に応じて少量の薬剤を水系に補充することにより、水系中のアメーバ数が１００ｍＬ当たり１０個以上とならないように維持することが望ましい」と記載されていたのであるから、上記（β）と（γ）とを引き続き実施することは、本件特許明細書に記載されていたことであり、本件訂正は、その訂正事項ａの点で、本件特許明細書の記載事項の範囲内でする訂正である。
（イ−３）　本件訂正は、その訂正事項ａの点で、本件特許明細書の段落【0007】に記載されたという目的｛下記〔三〕（ロ）参照｝を何ら変更するものではないから、特許請求の範囲を実質上拡張するものでもなく、変更するものでもない。
　
（ロ）　訂正事項ｂの点
（ロ−１）　本件訂正は、訂正事項ｂの点で、訂正事項ａの訂正にともない、明りょうでない記載を釈明することを目的とする訂正である。
（ロ−２）　上記（イ−２）及び（イ−３）で、訂正事項ａについて述べた理由と同一の理由によって、本件訂正は、その訂正事項ｂの点で、本件特許明細書の記載事項の範囲内で、かつ、特許請求の範囲を実質上拡張するものでも、変更するものでもない。
　
（ハ）　訂正事項ｃの点
　本件訂正は、その訂正事項ｃの点で、明りょうでない記載を釈明することを目的とする訂正であって、かつ、本件特許明細書の記載事項の範囲内で、かつ、特許請求の範囲を実質上拡張するものでも、変更するものでもない。
　
（ニ）　以上（イ）及び（ロ）によれば、本件訂正は、適法な訂正であって、認めるべきものである。
　以下では、訂正された本件特許明細書を単に本件特許明細書という。
　
〔三〕　本件特許明細書の記載
（イ）【0001】、【発明の属する技術分野】
　「本発明は冷凍装置の循環冷却水や２４時間風呂の循環温水などの、冷温水系あるいは蓄熱水系などにおける細菌類、特にレジオネラ属菌を除菌し、且つその増殖を防止する方法に関する。」
（ロ）【0007】、【発明が解決しようとする課題】
「　本発明は、水系におけるレジオネラ属菌、特にアメーバなどとの共存状態におけるレジオネラ属菌の、増殖を防止するための有効な手段がなかったことに鑑み、かかる水系中、特にアメーバ共存水系中のレジオネラ属菌を効果的に除菌する方法を提供することを目的とするものである。」
（ハ）【0011】、【発明の実施の形態】の一部
　「本発明の水系中のレジオネラ属菌の除菌方法に用いられる、アメーバを殺滅可能な薬剤であるヒノキチオール化合物やグルタルアルデヒドなどは、例えば水系に対して１〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲、更に好ましくは１０〜５００ｍｇ／Ｌの範囲となるように添加し、かかる薬剤を含有する水を系内に循環させることにより、水系中の微生物を殺滅し、系内の洗浄を行う方法を用いることができる。」
（ニ）【0012】、【発明の実施の形態】の一部
　「　このようにして水系中でのアメーバ数を、１００ｍＬ当たり１０個未満にまで低下させたのち、必要に応じて少量の薬剤を水系に補充することにより、水系中のアメーバ数が１００ｍＬ当たり１０個以上とならないように維持することことが望ましい。」
（ホ）【0026】、【実施例】の一部
　「表４のデータに基づいて考察した結果、アメーバ数が多い水系ではレジオネラ属菌の増殖している場合が多く、アメーバ数が１０個／１００ｍＬ未満の水系では、レジオネラ属菌が１００個／１００ｍＬ以上の例がないところから、アメーバを完全に殺滅できないと、レジオネラ属菌の除菌も困難ではないかと考えるに至った。」
（ヘ）【0032】、（第１実施例）の一部
　「表５の結果から、イソチアゾロン化合物は、表２よりレジオネラ属菌を殺菌する能力があることが明らかであるが、アメーバを完全に殺滅することが困難であって、レジオネラ属菌が短時間に再生して増殖を開始することが分かる。これに対して表６をみると、イソチアゾロン化合物と同様にレジオネラ属菌を殺菌する能力があることが、表２より明らかなヒノキチオールを、前記のイソチアゾロン化合物と同濃度で使用すると、アメーバを完全に殺滅することができ、また一旦殺菌されたレジオネラ属菌は容易に増殖しないことがわかる。」
（ト）【0039】、【発明の効果】
　「本発明は、水系中にアメーバを殺滅できる薬剤を添加することにより、水系中のレジオネラ属菌を殺菌するもので、従来のレジオネラ属菌用の殺菌剤では除菌できなかったようなアメーバ共存下の水系中のレジオネラ属菌を、効果的に除菌することができるという効果がある。」
　
〔四〕　引例の記載
　ただし、以下の摘示文中、「・・・」の部分は、当審が転記を省略した部分である。
（１）「MICROBIOLOGY　and　IMMUNOLOGY」、vol.３５　No.９、１９９１（特許異議申立人が提示した甲第１号証。以下では、引例１という。）
（イ）　７９６頁、５〜７行
　「第１条件下では（Ｇ−２４）、塔を実験の始めだけ洗浄した。第２条件下では（Ｇ−１８）、塔を最終濃度約０．１％のグルタルアルデヒドで一度処理したが、レジオネラの生育可能数は１０３ＣＦＵ／１００ｍｌまで増加した。」
（ロ）　７９８頁、３〜９行
　「殺微生物処理を受けていない、Ｇ−２４冷却塔（図２）の水中では、洗浄後１週間では微生物の生育可能数は低い。しかし、２週間後には、従属栄養菌の生育可能数は、１０４〜１０７ＣＦＵ／ｍｌの範囲で増加した。バクテリアの成長にしたがって、原生動物の成育可能数は１０２〜１０３ＭＰＮ／１００ｍｌの範囲であった。」
（ハ）　７９８頁、１８〜２１行
　「Ｇ−１８冷却塔（図２）の場合は、グルタルアルデヒド添加直後に棲息していた微生物は検出水準より低い水準に減少した。しかし、添加後２週間内に、レジオネラを含むこれらの微生物群のサイズは以前と同じ水準に復帰した。」
（ニ）　７９９頁、４〜８行
　「冷却塔で実際に殺微生物剤を使用するためには、次の要素を考慮すべきであろう。すなわち、１）効力、２）持続性、３）二次的環境汚染の危険、４）冷却塔の腐食、及び５）操業コスト。グルタルアルデヒドのような殺菌剤は、微生物を殺す点では効果的であるが、持続性を欠いている。さらに、それらの毒性は、頻回使用では注意を要する。」
　
（２）　「平成６年度　ヒューマンサイエンス基礎研究事業　官民共同プロジェクト研究報告　第４分野　健康保持の基礎としての生体防御機構の解明」（平成７年１１月２０日、財団法人　ヒューマンサイエンス振興財団発行）（特許異議の申立人が提示した甲第２号証。以下では、引例２という。）
（イ）　１６２頁、下から７〜４行、「２、　研究目的」の一部
　「しかし、本属菌は寄生性で、単独では増殖できず、外界ではアメーバ類やその他の細菌捕食性原生動物に寄生、人体内でも同様に貪食細胞中で増殖するものである。従って、上述の冷却水など実際の感染源となっている水系にはアメーバ等の宿主となり得る原生動物が繁殖していることを前提として考えなくてはならない。」
（ロ）　１６３頁、５〜９行、「２、　研究目的」の一部
　「しかしながら、その対策の一つとして冷却水への殺菌剤の添加が行われているものの、実験室内で有効性が認められた薬剤が実際の冷却塔で効果を発揮しない場合も数多く認められている。この様な現象は、１）薬剤の有効濃度の維持が不十分なため、２）薬剤を作用させる冷却水のｐＨ調整不備、あるいは３）バイオフィルム形成による薬剤浸透不備などの要因が考えられる。また、４）レジオネラ菌がアメーバに寄生することによって直接的な薬剤の侵襲を免れている可能性も考慮する必要があろう。」
（ハ）　１６４頁、「４−１−２、アメーバ類の検出状況」の項
　「　冷却水から分離されたアメーバ類は多種類で８科におよんだ。全体での検出率は９０％であった。なかでもバールカンフィア（５３．３％）、ハルトマネラ（６２．８％）、バンネラ（４９．４％）あるいはフェキシフェラ（３４．４％）が高率に検出された（表５）。
　薬剤処理の有無とアメーバ類の検出率を表６に示したが、薬剤添加の有無にかかわらず９５．５％および８４．４％といずれも高い検出率であった。３−２、アメーバ類の生息とレジオネラ属菌の検出率
　アメーバ類とレジオネラ属菌の検出率の関係を図３に示した。今回の試験水からは高頻度にアメーバ類が検出されたため、両者の関係が必ずしも判然としないが、アメーバの検出された水系におけるレジオネラ属菌の検出率は４２．５％（６９／１６２）で、アメーバ類が検出されなかった検体中のレジオネラ属菌の検出率は１６．７％と低かった。ちなみにレジオネラ属菌が検出された水系においてアメーバが検出されなかった例は僅かに３ヶ所にすぎなかった。」
（ニ）　１６５頁、１０〜１２行、「５、考察」の一部
　「　環境中でレジオネラ属菌に増殖の場を与えているのはアメーバなどの細菌捕食性の原生動物類で、水系におけるこれら宿主動物の繁殖がレジオネラ属菌の増殖には必須である。中でも、アメーバ類は水系の生物学的汚染のごく初期から出現することからレジオネラ属菌との関係で重要と考えられる。」
（ホ）　１６５頁、２４〜２９行、「５，考察」の一部
　「　現在、薬剤処理を行っているもに拘らず、レジオネラ属菌が検出される冷却水が約２５％存在しており（図１）、こうした冷却水系に対しては、殺菌剤の残留濃度管理、投入濃度、頻度の調整等の使用ソフト面からの改善を行い増殖抑制率を上げていく必要が有るとともにアメーバ類に着目した処理対応も必要である。現行の薬剤処理はレジオネラの宿主であるアメーバ類に対する増殖抑制は考慮されていないからである。通常の薬剤処理を行なった場合もアメーバ類に寄生しているレジオネラ属菌に対して殺菌の効果が行き届かず、充分な処理効果が得られない事も充分に考えられるところである。」
（ヘ）　１６５頁、下から６行〜１６６頁、１行、「５、考察」の一部
　「ヒドラジンは最も一般的に用いられる殺菌剤であるが、今回の試験の結果ではレジオネラに対しては殺菌効果が期待できないものと判断された。然るに、実際にヒドラジンを添加している冷却水系に於いてはレジオネラ属菌の検出率は低下することが知られている。このことからヒドラジンが藻類を主体とするスライムの抑制とともに、アメーバ類の生育環境を破壊していることが考えられ、今後の研究課題である。
新規な殺菌剤である、ポリ−オキシエチレン（ジメチルイミニオ）エチレン（ジメチルイミニオ）エチレンジクロライドもヒドラジンと同様、レジオネラに対する直接的な殺菌効果は無いが、安全性が高い薬剤であり、アメーバ類の生育環境を破壊することによってレジオネラ属菌の増殖を抑制する効果が期待でき、今後の研究課題である。」
　
（３）　「呼吸」、Ｖｏｌ．４ Ｎｏ．１０（１９８５．１０）（特許異議の申立人が提示した甲第３号証。以下では、引例３という。）、１２４６頁右欄、８〜１１行
（イ）　「　レジオネラ属菌が定着している冷却塔水や環境水からレジオネラを排除することはできない。冷却塔水では共生生物を少なくすることが有効ではないかと想像されるが、市販の殺藻剤の効果は期待できない。」
　
（４）　「岐阜大学医学部紀要」、第３７巻第５号（平成元年９月、岐阜大学医学部）（特許異議の申立人が提示した甲第４号証。以下では、引例４という。）
（イ）　９５４頁右欄、６〜１２行
　「 冷却塔１１基を用いたモデル実験では、３％Ｈ２Ｏ２を主成分とした洗浄剤あるいは、２％グルタールアルデヒドでの洗浄処理は非常に有効であったが、処理後に何の処置も施さなければ、約１〜２週間で処理前の状態まで菌数が復活するので、これによてlegionellaeを完全に除去することは出来ないと考えられる（図４−ａ，４−ｃ，４−ｄ）。」
（ロ）　９５４頁右欄、下から８行〜９５５頁左欄、４行
　「　Legionella属菌は、水中のFischerella属のような藍藻類と共生し、またAcanthamoeba、Naegleriaのような原生動物の細胞内に寄生して増殖することが確認されているため、冷却塔水中の原生動物や藻類の生態もこの菌の汚染と密接な関連があると思われる。特に、冷却塔の内部に形成される藻類や微生物の膜（algal-bacterial mat）は、legionellaeの汚染巣になっている可能性が強く、・・・。また、殺菌剤も原生動物や藻類の細胞内に浸透するか否かでlegionellaeの除去効果を左右すると思われる。」
　
（５）　「Applied and Environmental Microbiology」Volume ５８ number８（AUGUST １９９２）（特許異議の申立人が提示した甲第５号証。以下では、引例５という）。
（イ）　２４２０頁、要約の項
　「　Acanthamoeba polyphagaの細胞内で生育し、それからポリヘキサメチレン　ビグアニド（PHMB）、ベンズイソチアゾロン（BIT）、及び５−クロロ−Ｎ−メチルイソチアゾロン（CMIT）にさらされたLegionella pneumophilaに関して、生存試験を行った。鉄が十分な条件及び鉄不足条件下でのL. pneumophilaの感受性をも決定した。BITは、細胞成長に対して相対的に非効果的・・・であった。３種全部の殺微生物剤の活性は、アメーバ中で生育したL. pneumophilaに対しては、非常に低下した。PHMB（１×MIC）は、ブイヨン中で生育した株に対して6時間内で99.99％の生育可能数減少となり、24時間では検出可能な生存数はないが、アメーバ中で生育した細胞に対しては、６時間及び24時間で、それぞれ90及び99.9％にすぎない。A. polyphagaに対しても、これら３種の殺微生物剤の抗微生物性を決定した。BIT処理系から回復した大多数のアメーバは、あったとしても少数しかCMIT処理及びPHMB処理後に生き残れない。この研究は、L. pneumophilaの生理状態及び対抗微生物剤感受性に関するアメーバ内生育の広範な効果だけでなく、PHMBが効果的な水処理に対する潜在的な殺微生物剤であることも明らかにしている。この点で、PHMBは、その推奨使用濃度以下で宿主アメーバ及びL. pneumophilaの両者に対して重要な活性をもっている。」
（ロ）２４２０頁右欄、７〜１１行
　「われわれは、この微生物の、チオール反応性イソチアゾロン殺微生物剤（８）及び細胞壁を害する（６，１７）ポリヘキサメチレン　ビグアニド（PHMB）に対する感受性に対する、鉄欠乏及び細胞内成長の効果を別々に評価した。」
（ハ）２４２４頁左欄、下から１１行〜同右欄、最終行、DISCUSSIONの項の一部
　「奇妙なことに、水泳プールの衛生のために日常的に使用されている薬剤であるPHMBは、アメーバ内生育レジオネラに対してだけでなく、アメーバに対しても、効果的である。そのような効果は、PHMBの推奨使用レベルの10％（10μg/ml）の濃度で実証できる。これらの結果は、Kilvingoton（２１）が観察した結果と同様である。イソチアゾロン系殺微生物剤は、その毒性のために、その適用性及びヒトが触れるかも知れない濃度に制限がある。PHMBは、そうではなく、相対的に無毒性であり、最近は眼鏡レンズ用の溶液の保存剤として使用されるものである。・・・。
　・・・。ことに、これらのデータは、PHMBはすべての生理状態のレジオネラ及び宿主アメーバに対して有益な活性を有する、水処理用の潜在的な殺微生物剤であることを示している。」
　
（６）　「平成８年度　ヒューマンサイエンス基礎研究事業　官民共同プロジェクト研究報告　第５分野　健康保持の基礎としての生体防御機構の解明」（平成９年７月３日、財団法人　ヒューマンサイエンス振興財団）（特許異議の申立人が提示した甲第６号証。以下では、引例６という。）（当審注。　この刊行物は、本件特許の出願の優先権主張日の後に頒布された刊行物である。）
（イ）　１５５頁、「アメーバとLegionellaの相関」の項の一部
　「いずれかの宿主アメーバが検出された３２検水のうちの２６例から同菌が分離された。一方、アメーバが検出されなかった７浴用水では１例から分離されたにすぎなかった。表−４には試料中の菌数分布とアメーバの検出の関係を示した。」
　
（７）　「検査と技術」、ｖｏｌ．２６ ｎｏ．３（１９９８．３）（特許異議の申立人が提示した甲第７号証。以下では、引例７という。）
（イ）　２４７頁左欄、１０〜１７行、「４．感染媒体（ベクター）としてのアメーバ」の項の一部
　「　ところで、図３にもあるように、宿主アメーバ内で増殖するレジオネラは、結果的に多数の菌が細胞の食胞にパックされた状態になる。その菌数は径５μｍの食胞でおよそ１，２００程度になるという。この数はエアロゾルとして実験的にモルモットに感染されたときのＬＤ５０１，０００ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）に匹敵する。すなわち、菌が充満したアメーバ１つを吸い込むことで感染が成立する計算になる。」
　
〔五〕　特許を維持する理由
（１）　特許法第２９条第１項第３号及び同条第２項の要件
（１−１）　引例１から引例７（引例６を除く。）までの各引例には、レジオネラ属菌がアメーバに寄生しているから、レジオネラ属菌を除菌するためにには、宿主のアメーバを除去する必要があることが記載されている｛上記〔四〕（１）〜（５）及び（７）参照｝が、アメーバを殺滅することが可能な薬剤によって、そのレジオネラ属菌を殺菌する活性の有無にかかわらず、レジオネラ属菌を除菌するために必要な具体的条件は記載されていない。
　ただ、引例１には、冷却塔水を殺微生物剤（例えば、最終濃度約０．１％のグルタルアルデヒド）で一度処理すると、レジオネラ属菌及び微生物の生育可能な数は減少することが記載され｛上記〔四〕（１）（イ）〜同（ハ）参照｝、また、引例１の７９８頁の図２によれば、このとき、アメーバ数が急激に０近くに減少していることが認められるから、引例１の記載から、約０．１％濃度のグルタルアルデヒドによって、「水系中のアメーバ数が１００ｍＬ当たり１０個未満となる」ようにすることができることはわかる。
　しかしながら、引例１の上記図２によれば、１週間後にはアメーバ菌数が１００程度に増加し、２週間後には１０００以上に増加しているから、グルタルアルデヒドを０．１％程度（当審注。　約１０００ｍｇ／Ｌに相当する。）加えても、それだけでは、レジオネラ属菌を除菌できないこともまたわかる。
　しかるに、本件特許の特許請求の範囲の請求項１の発明（以下では、本件特許発明１という。）は、「レジオネラ属菌とアメーバとが共存している水系に、」「アメーバを殺滅することが可能な薬剤（例えば、グルタルアルデヒド、ヒノキチオール）を１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加」すること、また、その後、「水系に前記アメーバを殺滅することが可能な薬剤を補充して、水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満に維持することにより、レジオネラ属菌を除菌する」ものであるところ、引例１から引例７（引例６を除く。）までのいずれの引例にも、レジオネラ属菌を除菌するためには、アメーバを殺滅することが可能な薬剤を最大濃度でも５００ｍｇ／Ｌまで添加し、かつ、アメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満に維持するようにすればよいことは示唆されていない。
　そして、本件特許発明１は、レジオネラ属菌を除菌することができるという、優れた効果を奏したものと認めることができる。
　そうすると、本件特許発明１は、引例１から引例５まで、及び引例７の各引例に記載されている発明でもないし、これらの発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができた発明であるとは認められない。
　
（１−２）　本件特許明細書の請求項２及び同３の構成は、同１の構成を引用するものであるから、同２及び同３の構成の発明についても、本件特許発明１についてした上記（１）の判断と同様の判断となる。
　
（２）　特許法第３６条の要件
　引例６及び引例７には、アメーバを殺滅しても、必ずしもレジオネラ属菌を除菌できない場合があることがごく一般的に指摘されているだけであるから、これらの刊行物の記載を根拠に、本件特許明細書に本件特許発明１を実施できるように説明されていないとすることはできない。
　
〔六〕　当審は、本件特許を他に取り消すべき理由を発見しない。
　したがって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年４月１８日（２００１．４．１８）
【訂正の要旨】
（訂正請求の要旨）
（イ）　訂正事項ａ
　特許請求の範囲を減縮することを目的として、本件特許明細書の特許請求の範囲の記載を下記のとおり訂正する。　
　「【請求項１】　レジオネラ属菌とアメーバとが共存している水系に、１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加することにより水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満とするアメーバを殺滅することが可能な薬剤を１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加した後、該水系に前記アメーバを殺滅することが可能な薬剤を補充して、水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満に維持することにより、レジオネラ属菌を除菌することを特徴とする水系中のレジオネラ属菌の除菌方法。
　【請求項２】　前記アメーバを殺滅することが可能な薬剤が、ヒノキチオール化合物、またはグルタルアルデヒドである、請求項１に記載の水系中のレジオネラ属菌の除菌方法。
　【請求項３】　前記アメーバがアカントアメーバである、請求項１又は２に記載の水系中のレジオネラ属菌の除菌方法。」
（ロ）　訂正事項ｂ
　明りょうでない記載を釈明することを目的として、本件特許明細書の段落【０００８】の記載を下記のように訂正する。
　「上記のような本発明の目的は、レジオネラ属菌とアメーバとが共存している水系に、１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加することにより水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満とするアメーバを殺滅することが可能な薬剤を１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加した後、該水系に前記アメーバを殺滅することが可能な薬剤を補充して、水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満に維持することにより、レジオネラ属菌を除菌することを特徴とする水系中のレジオネラ属菌の除菌方法によって達成することができる」と訂正する。
（ハ）　訂正事項ｃ
　明りょうでない記載を釈明することを目的として、本件特許明細書の段落【０００９】中の「アメーバーを殺滅可能な薬剤」を「アメーバを殺滅することが可能な薬剤」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
水系中のレジオネラ属菌の除菌方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　レジオネラ属菌とアメーバとが共存している水系に
、１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加することにより水系のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満とする
することが
１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で
した後、該水系に前記アメーバを殺滅することが可能な薬剤を補充して、水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満に維持することにより、
　【請求項２】　前記アメーバを殺滅
することが
　【請求項３】　前記アメーバがアカントアメーバである、請求項１又は２に記載の水系中のレジオネラ属菌の除菌方法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明は冷凍装置の循環冷却水や２４時間風呂の循環温水などの、冷温水系あるいは蓄熱水系などにおける細菌類、特にレジオネラ属菌を除菌し、且つその増殖を防止する方法に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　空調設備や冷蔵あるいは冷凍庫などに用いられる冷凍装置では、熱交換を効率的に行なうために、開放型の冷却塔などを用いて冷却した循環水を利用することが多い。また２４時間風呂などでは加温した温水を濾過器を通しながら循環している。かかる循環水中には外部から微生物などが入り込んで増殖し易く、スライムなどによる熱交換器の熱交換効率の低下や、濾過器の詰まりなどの障害を起こすほか、病原細菌、特にレジオネラ属菌などが増殖して飛散すると、特殊な肺炎たとえば在郷軍人病やポンチアック熱のような病気の原因となる。
　【０００３】
　このような微生物による問題の対策として、循環水系に抗菌剤を注入して細菌類の増殖を抑制する方法や、装置内を機械的に清掃洗浄しあるいは洗浄剤を用いて洗浄する方法などが用いられてきた。そして従来から、レジオネラ属菌を防除する殺菌剤として、例えば、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンなどのインチアゾロン系化合物や、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール（一般名：ブロノポール）などのニトロアルコール系化合物等、種々の化合物が提案されている。しかしこれら従来から提案された薬剤は、実験室内では有効な殺菌性能を示しても、実際に稼働している水系に使用してみると、必ずしも十分な効果が得られないことが多かった。
　【０００４】
　ところで自然界におけるレジオネラ属菌は、アメーバなどの細菌捕食性原生動物等に捕食されてもなお寄生して繁殖し、共生することが知られている。しかしこのようなアメーバなどとレジオネラ属菌との共生関係が、レジオネラ属菌の殺菌剤抵抗性にどのように影響するかについては、明らかではなかった。
　【０００５】
　一方、ヒノキチオールが抗菌活性を有することは良く知られており、従来から食品の保存剤（例えば特開昭５９−２２４６７号など）、化粧品や医薬品などの保存用添加剤（例えば特開平５−２１４３６４号、特開平７−９７６００号、特開平７−１３８１５５号、特開平７−１７３０５３号、特開平８−５９４１９号、特開平９−１２４２３号など）、植物の病害予防剤（例えば特開昭５１−２２８１９号、特開昭６４−９０１０２号、特開昭６４−９０１０３号、特開昭６４−９０１０４号、特開平４−１８２４０８号など）、生花、野菜、果物などの鮮度保持剤（例えば特開平５−４６７８号、特開平５−２２１８０７号など）等として用いることが、それぞれ提案されている。
　【０００６】
　そしてまた、抗微生物剤（例えば特開平３−７７８０１号）、外用の殺菌消毒剤（例えば特開平６−２７９２７１号、特開平７−５３３６０号、特開平７−５３３６９号、特開平７−６９８７３号など）、抗ウイルス剤（特開平８−２５９４３９号）等として用いる提案や、排水口用除菌剤として用いる提案（特開平９−２０６０４号）もあるが、水系中の細菌を除去するために用いるという提案はなかった。
　【０００７】
　【発明が解決しようとする課題】
　本発明は、水系におけるレジオネラ属菌、特にアメーバなどとの共存状態におけるレジオネラ属菌の、増殖を防止するための有効な手段がなかったことに鑑み、かかる水系中、特にアメーバ共存水系中のレジオネラ属菌を効果的に除菌する方法を提供することを目的とするものである。
　【０００８】
　【課題を解決するための手段】
　上記のような本発明の目的は、レジオネラ属菌とアメーバとが共存している水系に
、１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で添加することにより水系のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満とする
することが
１０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で
した後、該水系に前記アメーバを殺滅することが可能な薬剤を補充して、水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満に維持することにより、
　【０００９】
　【発明の実施の形態】
　本発明において用いられるアメーバを殺滅
することが
　【００１０】
　本発明の水系中のレジオネラ属菌の除菌方法に用いられるヒノキチオール化合物としては、精製されたヒノキチオールのほか、未精製のヒノキチオールや、ヒノキチオールを含むヒノキ油やヒバ油などの精油などを用いることもでき、また化学的に合成したヒノキチオール（即ち、２−ヒドロキシ−４−イソプロピル−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）を用いてもよい。これらのヒノキチオール化合物は単独で用いてもよいほか、例えばシクロデキストリンなどとの包接化合物の形態で用いることもできる。また更に好ましいヒノキチオール化合物として、ヒノキチオールの例えばナトリウム、カリウムなどの塩、あるいはヒノキチオールの、例えば銅や亜鉛、銀などの金属錯体があり、これらの金属塩や金属錯体は昇華性が抑制されていて安定でもあるので、効果が優れているほか取扱上でも有利である。
　【００１１】
　本発明の水系中のレジオネラ属菌の除菌方法に用いられる、アメーバを殺滅可能な薬剤であるヒノキチオール化合物やグルタルアルデヒドなどは、例えば水系に対して１〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲、更に好ましくは１０〜５００ｍｇ／Ｌの範囲となるよう添加し、かかる薬剤を含有する水を系内に循環させることにより、水系中の微生物を殺滅し、系内の洗浄を行う方法を用いることができる。
　【００１２】
　このようにして水系中でのアメーバ数を、１００ｍＬ当たり１０個未満にまで低下させたのち、必要に応じて少量の薬剤を水系に補充することにより、水系中のアメーバ数が１００ｍＬ当たり１０個以上とならないように維持することが望ましい。この際、アメーバを殺滅可能な薬剤を添加すると共に、レジオネラ属菌を殺菌可能な薬剤を併せて添加してもよい。
　【００１３】
　本発明の水系中のレジオネラ属菌の除菌方法に従って、レジオネラ属菌とアメーバとが共存している水系中にアメーバを殺滅可能な薬剤を添加することによって、水系中のアメーバ数を１００ｍＬ当たり１０個未満に低下させると、レジオネラ属菌はアメーバとの共生が実質的に不能となるため、水系中のレジオネラ属菌の数も減少し、効果的に除菌されるに至る。
　【００１４】
　【実施例】
（第１参考例）
　表１に示した配合組成を有するＢＣＹＥα平板培地上に、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）を接種して３６℃で２日間培養した。
　【００１５】
　【表１】
　
ＢＣＹＥα平板培地
純水　　　　　　　　　　１０００　　　ｍＬ
酵母エキス　　　　　　　　　１０．０　ｇ
ＡＣＥＳバッファー　　　　　１０．０　ｇ
Ｌ−システイン１塩酸塩　　　　０．４　ｇ
可溶性ピロ燐酸鉄　　　　　　　０．２５ｇ
αケトグルタル酸　　　　　　　１．０　ｇ
活性炭粉末　　　　　　　　　　１．５　ｇ
寒天　　　　　　　　　　　　１５　　　ｇ
ｐＨ　　　　　　　　　　　　　６．９
　【００１６】
　次に、ヒノキチオール化合物として、ヒノキチオール、ヒノキチオールのナトリウム塩、及びヒノキチオールの銅錯体を用意し、またイソチアゾロン系化合物を含む薬剤として、ローム・アンド・ハース社のＫＡＴＨＯＮ　ＷＴ（１０．１％の５−クロロ−２−メチル−４−インチアゾリン−３−オンと３．８％の２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンとを含む薬剤）、及び２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール（一般名：ブロノポール）を用意した。
　【００１７】
　そして、前記の培養レジオネラをｐＨ７の燐酸緩衝液に１０４個／ｍＬオーダーとなるように接種したのち、その液の一部をＢＣＹＥα平板培地に塗布し、３６℃で５日間培養後のコロニー数をカウントすることにより、生菌数を測定したところ、２．９×１０４個／ｍＬであることを確認した。次いでこの液をそれぞれの培養フラスコに分けて入れ、殺菌剤無添加のものと、上記の各殺菌剤をそれぞれ１、５及び１０ｍｇ／Ｌの濃度となるよう添加したものとを調製し、３７℃で２４時間振盪培養したのち、それぞれの生菌数（個／ｍＬ）を上記と同様にして測定した。こうして得た培養後の生菌数の値を、表２に示した。
　【００１８】
　【表２】
　【００１９】
　表２の結果から、ヒノキチオール化合物、イソチアゾロン化合物、及びブロノポールは、いずれもレジオネラに対して優れた殺菌力を示すことが分かる。
　【００２０】
（第２参考例）
　日本国内で稼働中の、空調装置などの６０施設の冷却水系から試験水をそれぞれ採取し、これらの試験水中のレジオネラ属菌数とアメーバ数を、それぞれ後記の試験方法に従って測定し、それらの分布を調査した結果を表４に示した。
　なお、これらの冷却水系の４９か所では、何らかの微生物防除剤を使用していた。
　【００２１】
（レジオネラ属菌の検出試験方法）
　試料水４００ｍＬを６０００ｒｐｍ、３０分間の冷却遠心沈殿処理により１００倍に濃縮し、５０℃、２０分間の加熱処理をする。その後、その５０μＬを表３に示した配合組成を有するＷＹＯα培地に塗布し、３７℃で好気的に培養する。培養７日目にコロニーの状況からレジオネラ属菌と判断されたコロニーを数個釣菌して、各コロニー毎にＢＣＹＥα平板培地と５％血液寒天培地の２種類の培地に植え継ぎ、３７℃で好気的に培養する。培養２日目にＢＣＹＥα平板培地に生育し、５％血液寒天培地に生育しなかったコロニーを、Ｌ−システイン要求性からレジオネラ属菌と確定し、ＷＹＯα培地上の同種のコロニー数を計数する。この方法による検出限界は、２０個／１００ｍＬである。
　【００２２】
　【表３】
　
ＷＹＯα培地
純水　　　　　　　　　　１０００　　　ｍＬ
酵母エキス　　　　　　　　　１０．０　ｇ
ＡＣＥＳバッファー　　　　　１０．０　ｇ
Ｌ−システイン１塩酸塩　　　　０．４　ｇ
可溶性ピロ燐酸鉄　　　　　　　０．２５ｇ
αケトグルタル酸　　　　　　　１．０　ｇ
グリシン　　　　　　　　　　　３．０　ｇ
アンホテリシンＢ　　　　　　８０．０　ｍｇ
ポリミキシンＢ　　　１０００００　　　Ｕ
バンコマイシン　　　　　　　　５．０　ｍｇ
活性炭粉末　　　　　　　　　　１．５　ｇ
寒天　　　　　　　　　　　　１５．０　ｇ
ｐＨ　　　　　　　　　　　　　６．９
　【００２３】
（アメーバの検出試験方法）
　試料水５０ｍＬを、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、約１ｍＬに濃縮する。この濃縮水１ｍＬを後記の方法で調製した大腸菌塗布寒天培地上に拡げ、液が流れない程度に風乾した後、乾燥を防ぐために非透湿性袋内に入れて密封し、３０℃で培養して２週間観察を続ける。そして、寒天上のアメーバのコロニー及びプラークの数を計測すると共に、倒立位相差顕微鏡で形態の観察を行い、アメーバ種の同定を行う。なお、この方法による検出限界は、２個／１００ｍＬである。
　【００２４】
（大腸菌塗布寒天培地の調製方法）
　細菌分析用寒天を濃度が１．５％（Ｗ／Ｖ）となるようにイオン交換水に溶かし、１２１℃、１５分間の滅菌後、径９０ｍｍの滅菌シャーレに１５〜２０ｍＬ分注して寒天平板を作成する。次いで、別途に標準寒天平板培地で培養した大腸菌を適当な量採取し、滅菌イオン交換水に懸濁して濃厚な大腸菌懸濁液を作成し、これを６０℃、１時間加熱処理した後、滅菌イオン交換水でＯＤが０．５となるよう希釈する。そして、この液０．３ｍＬを前記の寒天平板の全面に塗布して、大腸菌が寒天の表面に固定される程度に乾燥させ、大腸菌塗布寒天培地を調製する。
　【００２５】
　【表４】
　【００２６】
　表４のデータに基づいて考察した結果、アメーバ数が多い水系ではレジオネラ属菌の増殖している場合が多く、アメーバ数が１０個／１００ｍＬ未満の水系では、レジオネラ属菌が１００個／１００ｍＬ以上の例がないところから、アメーバを完全に殺滅できないと、レジオネラ属菌の除菌も困難ではないかと考えるに至った。
　【００２７】
（第１実施例）
　空調装置に組み込まれた循環水冷却塔（冷凍能力が３冷凍トン、保有水量１００Ｌ、１日に８時間運転）から試料水を採取し、前記のアメーバの検出試験方法に従ってアメーバの数を計測すると共に、アメーバ種の同定を行った。その結果、アメーバ数は４８００個／１００ｍＬであり、アメーバ種として、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ（ＡＣ））、ハルトマネラ（Ｈａｒｔｍａｎｎｅｌｌａ（ＨＴ））、バンネラ（Ｖａｎｎｅｌｌａ（ＶＮ））、バルカンフィーダ（Ｖａｈｌｋａｍｐｆｉｉｄａｅ（ＶＫ））、フェキシリフェラ（Ｖｅｘｉｌｌｉｆｅｒａ（ＶＸ））を検出した（＋）。またヌクレリア（Ｎｕｃｌｅａｒｉａ（ＮＣ））は検出されなかった（−）。
　また別途に採取した水試料について、前記のレジオネラ属菌の検出試験方法に従って、レジオネラ属菌の存在を調べたところ、生菌数が９．６×１０３個／１００ｍＬであった。
　【００２８】
　この循環水中に、前記のイソチアゾロン化合物（ＫＡＴＨＯＮ　ＷＴ）を、１００ｍｇ／Ｌの濃度となるように添加して稼働運転を継続し、レジオネラ属菌数とアメーバ数、及びアメーバの種類の経日変化を調べた。これらの結果を表５に示したが、一時的にレジオネラ属菌数とアメーバ数の減少が認められたものの、菌数は再び増加に転じ、完全な除菌はできなかった。
　【００２９】
　【表５】
　【００３０】
　そこで、レジオネラ属菌数が６．６×１０３個／１００ｍＬに戻った循環水中に、前記のヒノキチオールを、１００ｍｇ／Ｌの濃度となるように添加して稼働運転を継続し、レジオネラ属菌数とアメーバ数、及びアメーバの種類の経日変化を調べた。その結果を表６に示したが、レジオネラ属菌数とアメーバ数は共に減少し続け、３日後にはほぼ完全に除菌できた。
　【００３１】
　【表６】
　【００３２】
　表５の結果から、イソチアゾロン化合物は、表２よりレジオネラ属菌を殺菌する能力があることが明らかであるが、アメーバを完全に殺滅することが困難であって、レジオネラ属菌が短期間に再生して増殖を開始することが分かる。これに対して表６をみると、インチアゾロン化合物と同様にレジオネラ属菌を殺菌する能力があることが、表２より明らかなヒノキチオールを、前記のインチアゾロン化合物と同濃度で使用すると、アメーバを完全に殺滅することができ、また一旦殺菌されたレジオネラ属菌は容易に増殖しないことがわかる。
　【００３３】
（第２実施例）
　連続２４時間運転で、冷却水の濃縮倍数を５倍に保つようにブロー水量と補給水量を制御（従って、添加薬剤の半減期は、薬剤の分解その他の損失がないとして、約１．７日である。）している、空調装置の水系に組み込まれた循環水冷却塔（冷凍能力が１０００冷凍トン、保有水量１００ｍ３、）から、運転中に採取した試料水について、レジオネラ属菌数とアメーバ数、及びアメーバの種類を、前記と同様な方法により調べた。そして、水系に前記のインチアゾロン化合物（ＫＡＴＨＯＮ　ＷＴ）を、５０ｍｇ／Ｌの濃度となるように添加して稼働運転を継続し、レジオネラ属菌数とアメーバ数、及びアメーバの種類の経日変化を調べた。その結果を表７に示したが、一時的にレジオネラ属菌数とアメーバ数の減少が認められたものの、菌数は再び増加に転じ、除菌はできなかった。
　【００３４】
　【表７】
　【００３５】
　また、レジオネラ属菌数やアメーバ数が増加した循環水中に、前記のブロノポールを、３０ｍｇ／Ｌの濃度となるように添加して稼働運転を継続し、レジオネラ属菌数とアメーバ数、及びアメーバの種類の経日変化を調べた。その結果を表８に示したが、一時的にレジオネラ属菌数とアメーバ数の減少が認められたものの、菌数は再び増加に転じ、除菌はできなかった。
　【００３６】
　【表８】
　【００３７】
　その後、レジオネラ属菌数やアメーバ数が増加した循環水中に、グルタルアルデヒドを２００ｍｇ／Ｌの濃度となるように添加して稼働運転を継続、更に５０日後にグルタルアルデヒドを５０ｍｇ／Ｌの濃度となるように添加して、レジオネラ属菌数とアメーバ数、及びアメーバの種類の経日変化を調べた。そして、レジオネラ属菌、アメーバとも一旦死滅したのち再び増加するまでの経過を、表９に示した。その結果、アメーバを完全に殺滅すると、レジオネラ属菌も共に除菌でき、その効果は長期間維持されることが分かった。
　【００３８】
　【表９】
　【００３９】
　【発明の効果】
　本発明は、水系中にアメーバを殺滅できる薬剤を添加することにより、水系中のレジオネラ属菌を殺菌するもので、従来のレジオネラ属菌用の殺菌剤では除菌できなかったようなアメーバ共存下の水系中のレジオネラ属菌を、効果的に除菌することができるという効果がある。