(57)【要約】本発明は、IRES阻害活性を示す複素環式化合物を提供する。複素環式化合物は一般にアミド結合を通して共有結合している三つの反復C-C-Nサブユニット、および各サブユニットの中心炭素に連結している様々な側鎖の9員環である。本発明の化合物を含む製剤およびキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式の複素環式化合物：
2008516979.tif 000031
式中、nは1または2であり、
R1はヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチルまたはチオメチルであり、
R2およびR3はそれぞれ独立して
2008516979.tif 000032
であって、R4は水素、メチル、イソ-プロピル、イソ-ブチル、sec-ブチル、メチルチオエチル、ベンジル、CH2-連結4-ヒドロキシ-フェニル、CH2-連結インドール、ヒドロキシメチル、チオメチル、エタン酸アミド、プロパン酸アミド、エタン酸、プロパン酸、1-ヒドロキシエチル、4-アミノブタニル、4-(アミノイミノメチル)アミノプロピル、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、チオメチルまたはCH2-連結イミダゾールであり、
ただしCAS登録番号：209353-30-0、748142-25-8、591781-32-7、189179-32-6、189179-28-0、176703-10-9、176703-09-6、122886-11-7、107208-67-3、83797-39-1、81017-86-9、77782-99-1、135432-38-1、209353-31-1、または189179-39-3で表される化合物ではない。
【請求項２】
nは2であり、
R2は
2008516979.tif 000033
であり、
R4は水素、メチル、イソ-プロピル、イソ-ブチル、sec-ブチル、メチルチオエチル、ベンジル、CH2-連結4-ヒドロキシ-フェニル、CH2-連結インドール、ヒドロキシメチル、チオメチル、エタン酸アミド、プロパン酸アミド、エタン酸、プロパン酸、1-ヒドロキシエチル、4-アミノブタニル、4-(アミノイミノメチル)アミノプロピル、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、チオメチルまたはCH2-連結イミダゾールであり、
R3は
2008516979.tif 000034
であり、R5はイソ-プロピル、sec-ブチル、メチルチオエチル、ベンジル、CH2-連結4-ヒドロキシ-フェニル、CH2-連結インドール、プロパン酸アミド、または4-アミノブタニルである、請求項1記載の複素環式化合物。
【請求項３】
nは2であり、
R2は
2008516979.tif 000035
であり、
R4は水素、メチル、イソ-プロピル、イソ-ブチル、sec-ブチル、メチルチオエチル、ベンジル、CH2-連結4-ヒドロキシ-フェニル、CH2-連結インドール、ヒドロキシメチル、チオメチル、エタン酸アミド、プロパン酸アミド、1-ヒドロキシエチル、4-アミノブタニル、4-(アミノイミノメチル)アミノプロピル、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、チオメチルまたはCH2-連結イミダゾールであり、
R3は
2008516979.tif 000036
であり、R5はイソ-プロピルまたはCH2-連結インドールである、請求項2記載の複素環式化合物。
【請求項４】
下記の式の、IRES阻害活性を示す複素環式化合物：
シクロ[X1X2X3X4]
式中、X4は存在してもしなくてもよく、X1はSer、ThrもしくはCysアミノ酸であり、
X2、X3、およびX4は独立に任意の天然アミノ酸、またはβ-アラニン（β-Ala）、2,3-ジアミノプロピオン酸（Dpr）、4-アミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸（Aib）；ε-アミノヘキサン酸（Aha）；δ-アミノ吉草酸（Ava）；N-メチルグリシン、サルコシン（MeGly）、オルニチン（Orn）、シトルリン（Cit）、t-ブチルアラニン（t-BuA）、t-ブチルグリシン（t-BuG）、N-メチルイソロイシン（MeIle）、フェニルグリシン（Phg）、シクロヘキシルアラニン（Cha）、ノルロイシン（Nle）、2-ナフチルアラニン（2-Nal）、4-クロロフェニルアラニン（Phe(4-Cl)）、2-フルオロフェニルアラニン（Phe(2-F)）、3-フルオロフェニルアラニン（Phe(3-F)）、4-フルオロフェニルアラニン（Phe(4-F)）、ペニシラミン（Pen）、l,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸（Tic）、β-2-チエニルアラニン（Thi）、メチオニンスルホキシド（MSO）、ホモアルギニン（hArg）、N-アセチルリシン（AcLys）、2,3-ジアミノ酪酸（Dab）、2,4-ジアミノ酪酸（Dbu）、p-アミノフェニルアラニン（Phe(pNH2)）、N-メチルバリン（MeVal）、ホモシステイン（hCys）、p-メチルシステインおよびホモセリン（hSer）からなる群より選択される非天然アミノ酸であり、
化合物のアミノ酸はペプチド結合によって連結されており、
ただしCAS登録番号：209353-30-0、748142-25-8、591781-32-7、189179-32-6、189179-28-0、176703-10-9、176703-09-6、122886-11-7、107208-67-3、83797-39-1、81017-86-9、77782-99-1、135432-38-1、209353-31-1、または189179-39-3で表される化合物ではない。
【請求項５】
請求項1記載の複素環式化合物の治療上有効な量と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、ウイルス感染症を処置するための組成物。
【請求項６】
請求項5記載の組成物と、組成物を用いてウイルス感染症を処置するための説明書とを含む、ウイルス感染症を処置するためのキット。
【請求項７】
ウイルスIRESを請求項1記載の複素環式化合物と接触させて、該IRESからの翻訳を阻害する段階を含む、ウイルスのIRES仲介性翻訳の阻害法。
【請求項８】
ウイルスIRESが無細胞環境に存在する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
ウイルスIRESが細胞内に存在する、細胞を複素環式化合物と接触させる段階を含む請求項7記載の方法。
【請求項１０】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
IRESを請求項1記載の複素環式化合物と接触させて、該IRESからの翻訳を阻害する段階を含む、細胞のIRES仲介性翻訳の阻害法。
【請求項１２】
ウイルス感染細胞を請求項1記載の複素環式化合物と接触させて、該細胞におけるウイルス複製を阻害する段階を含む、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害法。
【請求項１３】
ウイルスがフラビウイルス科のウイルスである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスがC型肝炎ウイルス（HCV）である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
細胞がインビトロの細胞である、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
細胞がインビボの細胞である、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
細胞が哺乳動物対象から摘出された臓器内にある、請求項12記載の方法。
【請求項１８】
臓器が肝臓である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
ウイルス感染症に対して対象を処置するのに有効な量の請求項1記載の複素環式化合物を含む製剤を対象に投与する段階を含む、ウイルス感染症に対する対象の処置法。
【請求項２０】
対象がフラビウイルス科のウイルスに感染している、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
対象がHCVに感染している、請求項19記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、抗ウイルス剤としての活性を有するものを含む、複素環式化合物に関する。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本出願は2004年10月14日提出の米国特許仮出願第60/619,420号の優先権の恩典を主張し、この出願は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
C型肝炎ウイルス（HCV）感染は世界中の重要な臨床問題である。米国だけで、推定4百万人がHCVに慢性的に感染している。HCVは非A非B型肝炎の主要な病因物質で、感染した血液および血液製剤の輸血によって主に伝播される（Cuthbert et al., 1994, Clin. Microbiol. Rev. 7:505-532（非特許文献1）; Mansell et al., 1995, Semin. Liver Dis. 15:15-32（非特許文献2））。1990年代半ばに抗HCVスクリーニングが導入される前は、HCVは米国における輸血後の肝炎症例の80〜90％の原因であった。現在は、注射薬の使用がおそらくはHCV感染の最も一般的な危険因子で、この集団の約80％がHCVに対して血清陽性である。高いHCV感染率は出血障害または慢性腎不全を有する個人、すなわち血液および血液製剤に高頻度で曝露される群でも見られる。特定の例では、HCVは性的に伝播される。
【０００４】
HCV急性感染により、症例の約90％で持続性のウイルス複製が起こり、慢性肝炎に進行する。多くの患者にとって、慢性HCV感染は進行性肝臓損傷を引き起こし、肝硬変を発現する。攻撃的感染を有する患者では、肝硬変は二年という短期間に発現することもあるが、10〜20年の期間がより典型的である。慢性HCV患者の30〜50％で、肝臓損傷は肝細胞癌の発生へと進行しうる。一般に、肝細胞癌は出現が遅く、発生までに30年以上かかることもある（Bisceglie et al., 1995, Semin. Liver Dis. 15:64-69（非特許文献3））。疾患進行を決定する際のウイルスまたは宿主因子の相対的寄与は不明である。
【０００５】
C型肝炎は約9.5kbのポジティブセンス一本鎖RNAゲノムを含むエンベロープウイルスである。そのゲノムの構成およびビリオンの性質に基づき、HCVはペスティウイルスおよびフラビウイルスも含むフラビウイルス科の別の属として分類されている（Alter, 1995, Semin. Liver Dis. 15:5-14（非特許文献4））。ウイルスゲノムは長い5'非翻訳領域（UTR）、約3011アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする長い開いた読み枠、および短い3'UTRで構成される。5'UTRはHCVゲノムの最も高度に保存された部分で、ポリタンパク質翻訳の開始および制御のために重要である。
【０００６】
HCVゲノムの翻訳は内部リボソーム進入（internal ribosome entry）として知られるキャップ独立メカニズムによって開始される。このメカニズムは内部リボソーム進入部位（IRES）として知られるRNA配列へのリボソームの結合を含む（Sonenberg & Meerovitch, 1990（非特許文献5）に総説が掲載されている）。名前が示すとおり、これらはリボソームがウイルスRNAの5'-末端ではなく内部部位に結合できるようにする配列であり、いったん結合すると、リボソームはAUGイニシエーターコドンへと移動し、翻訳を始めることができる。最近、RNA偽結び目（pseudoknot）構造がHCV IRESの重要な構造要素であるとされている。したがって、IRES調節要素はウイルス翻訳および複製の重要な成分である。
【０００７】
HCVがウイルス持続性を確立し、高い率の慢性肝疾患を引き起こすメカニズムは解明されていない。これまでの抗ウイルス介入は、例えば、リバビリンおよびインターフェロン-アルファ（IFN-α）による単剤療法および併用療法に焦点を合わせていた。しかし、患者のかなりの部分はこれらの療法に不応性である。
【０００８】
したがって、新しい抗HCV剤およびHCV感染と戦うための新しい方法がおおいに必要とされている。本明細書に記載の発明はこれ、および他の必要を満たすものである。
【０００９】
【非特許文献１】Cuthbert et al., 1994, Clin. Microbiol. Rev. 7:505-532
【非特許文献２】Mansell et al., 1995, Semin. Liver Dis. 15:15-32
【非特許文献３】Bisceglie et al., 1995, Semin. Liver Dis. 15:64-69
【非特許文献４】Alter, 1995, Semin. Liver Dis. 15:5-14
【非特許文献５】Sonenberg & Meerovitch, 1990
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、IRES阻害活性を示す複素環式化合物を提供する。複素環式化合物は一般にアミド結合を通して共有結合している三つの反復C-C-Nサブユニット、および各サブユニットの中心炭素に連結している様々な側鎖の9員環である。
【００１１】
IRES阻害複素環式化合物は一般に下記の式で記載することができる：
2008516979.tif 000002
式中、nは1または2であり、
R1はヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチルまたはチオメチルであり、
R2およびR3は独立に
2008516979.tif 000003
であり、かつR4は水素、メチル、イソ-プロピル、イソ-ブチル、sec-ブチル、メチルチオエチル、ベンジル、CH2-連結4-ヒドロキシ-フェニル、CH2-連結インドール、ヒドロキシメチル、チオメチル、エタン酸アミド、プロパン酸アミド、エタン酸、プロパン酸、1-ヒドロキシエチル、4-アミノブタニル、4-(アミノイミノメチル)アミノプロピル、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、チオメチルまたはCH2-連結イミダゾールである。
【００１２】
本発明をより詳細に記載する前に、本発明は記載する特定の態様に限定されるものではなく、したがって、当然のことながら、変動しうることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において用いられる用語は特定の態様を記載することだけを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
【００１３】
値の範囲が示される場合、その範囲の上限と下限との間にある値はそれぞれ、文脈からそうでないことが明らかに示されていない限り、下限の単位の10分の1まで、特に開示されることが理解される。指定の範囲における任意の指定の値または間にある値と、その指定の範囲における任意の他の指定の値または間にある値との間の、より小さい範囲はそれぞれ、本発明に含まれる。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して範囲に含まれても、または除外されてもよく、指定の範囲において任意の特に除外される限界があるならば、限界のいずれか、または両方がより小さい範囲に含まれる場合、またはいずれも含まれない場合の各範囲も本発明に含まれる。指定の範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか、または両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００１４】
特に記載がない限り、本明細書において用いられるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本発明を実施または試験する際に、本明細書に記載のものと類似または同等のいかなる方法および材料も用いることができるが、例示的かつ好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書において言及されるすべての出版物は、それらが関連して引用される方法および/または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み入れられる。
【００１５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「a」、「an」および「the」は、文脈からそうでないことが明らかに示されていない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「候補物質（a candidate agent）」について述べる場合、複数のそのような候補物質を含み、「宿主細胞（the host cell）」について述べる場合、一つまたは複数の宿主細胞および当業者には公知のその等価物などへの言及を含む。
【００１６】
本明細書において論じられる出版物は、本出願の提出日よりも前に開示されたために提供するにすぎない。本明細書のいかなる開示も、先行発明によって本発明がそのような出版物に先立つ権利がないとの自認であると解釈されるべきではない。さらに、提供する出版物の日付は実際の出版日と異なることがあり、それらは独立に確認する必要がある。
【００１７】
定義
本明細書に記載のR基の構造を図1Aに示す。これらのR基それぞれの黒丸「●」は、複素環の構成員に一重共有結合で連結している炭素原子を示す。天然アミノ酸を図1Bに示す。図1Bは本明細書において用いうる天然アミノ酸の掌性を示す。
【００１８】
本明細書において用いられる「環式ペプチド」なる用語は、ペプチド結合（-(C=O)-(N-H)-）で相互に共有結合している天然アミノ酸からなる複素環式化合物を意味する。一般に、そのような複素環式化合物は共有結合により閉環された環であり、したがって3から4残基よりも多くを有するポリペプチドのシステイン間のジスルフィド結合によって形成されるような、「ループ構造」ではない。
【００１９】
「天然アミノ酸」なる用語は、20の遺伝的にコード可能なL異性体アミノ酸のいずれかを意味する（例えば、Principles of Biochemistry, Third Ed. Lehninger ed. (2000)の117〜119ページ、 Worth Publishers、NY参照）。20の天然アミノ酸はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンおよびチロシンである。本明細書における「遺伝的にコード可能な」とは、化合物を調製する方法に関して限定的であることはなく、むしろアミノ酸残基の構造についての好都合な言及である。したがって、本発明の複素環式化合物は細胞内で（例えば、インテイン系を用いて）、または合成的に（例えば、合成機または他の化学的手段を用いて）調製することができる。
【００２０】
便宜のために、アミノ酸は本明細書において標準の1または3文字記号で呼ぶ（例えば、Principles of Biochemistry, Third Ed. Lehninger ed. (2000)の118ページ、Worth Publishers、NY参照）。本発明の複素環式化合物の構造を、アミノ酸を示す1または3文字記号の列を用いて表す際、列の最初と最後のアミノ酸は一緒に共有結合していることが理解される。そのような分子は環状であるため、環式化合物はアミノ酸配列で表してもよく、この配列はその任意の点から書くことができる。例えば、アミノ酸配列「SAW」を有する環式ペプチドは配列「AWS」または「WSA」を有する環式ペプチドと同じであるが、構造「SWA」、「ASW」および「WAS」と同じではない。
【００２１】
環式ペプチドにおけるアミノ酸の順序は直鎖ペプチドのN-C規則に従い、環式ペプチドにおけるアミノ酸の順序は環式ペプチドの周りにNからCの順で記載する。すなわち、シクロ[X1X2X3]は、その主鎖が-N-C-(C=O)-の方向に配向されるように相互に連結している、3つの連続するアミノ酸X1、X2およびX3を含む環式ペプチドを記載する。特定の態様において、ペプチド結合で共有結合している3または4つのアミノ酸からなる複素環式化合物は、それぞれ式シクロ[X1X2X3]、またはシクロ[X1X2X3X4]を有すると言うことができ、ここでXはアミノ酸である（例えば、シクロ[SAW]）。
【００２２】
「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は、本出願の全体で交換可能に用いられ、少なくとも二つの共有結合しているアミノ酸を意味する。
【００２３】
「単離（した）」とは、記載した材料が最初に生成した（例えば、細胞内で）時に通常伴っている材料の少なくとも一部を伴っていないことを意味する。単離ペプチドは所与の試料中の全タンパク質の少なくとも約0.1重量％、少なくとも約0.5重量％、少なくとも約1重量％または少なくとも約5重量％を構成する。
【００２４】
「精製（した）」ペプチドとは、ペプチドを溶解しうる任意の溶媒を除いて、純度が少なくとも約50重量％（例えば、少なくとも約70重量％または少なくとも約90重量％）の化合物である。
【００２５】
「IRES阻害（の）」の文脈におけるような、「阻害（の）」とは、活性、例えば、IRES仲介性翻訳（すなわち、ウイルスまたは非ウイルスIRESによる翻訳開始の速度）を阻害する活性を有することを意味する。阻害化合物は一般に、あるアッセイで化合物非存在下で行った場合と比べて、少なくとも20％、例えば、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、約99％または100％まで活性を低下させる。一般に、興味対象化合物は、特定のアッセイにおいて約1mM以下の範囲のIC50を示すものである。より低いIC50、例えば、約100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、またはさらに低い範囲のIC50を示す化合物は、状態、例えば、HCV感染症を処置または予防するための治療薬または予防薬として特に有用である。または、活性化合物は約1mM以下の範囲のLD50（すなわち、ウイルス力価を50％低下させる化合物の濃度）を示すものである。より低いLD50、例えば、約100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、またはさらに低い範囲のLD50を示す化合物は、任意の状態、例えば、HCV感染症を処置または予防するための治療薬または予防薬として特に有用である。
【００２６】
「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、本明細書において交換可能に用いられ、所望の薬理および/または生理効果を得ることを意味する。効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に予防するという点から予防的であってもよく、かつ/または疾患および/もしくはウイルス感染症の影響を増強するなどの疾患の原因となる有害作用を部分的もしくは完全に治すという点から治療的であってもよい。本明細書において用いられる「処置すること」とは、脊椎動物、特に哺乳動物、中でもヒトの疾患を処置することを意味し、（a）疾患にかかりやすい可能性があるが、まだそれを有すると診断されていない対象において、疾患が発生するのを防止すること；（b）疾患を阻害する、すなわちその発生を阻止すること；または（c）疾患を軽減する、すなわち疾患の退行を引き起こすことを含む。
【００２７】
「有効量」、「治療量」、「治療上有効な量」などの用語は、処置を行うために十分、例えば、有益または所望の臨床結果を得るのに十分な量を記載するために、本明細書において交換可能に用いられる。有効量は1回または複数回で投与することができる。
【００２８】
用語の他の定義は本明細書の全体を通して現れる。
【００２９】
発明の詳細な説明
前述のとおり、本発明はIRES阻害活性を示す複素環式化合物を提供する。
【００３０】
IRES阻害複素環式化合物は一般に下記の式で記載することができる：
2008516979.tif 000004
式中、nは1または2であり、
R1はヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチルまたはチオメチルであり、
R2およびR3は独立に
2008516979.tif 000005
であって、R4は水素、メチル、イソ-プロピル、イソ-ブチル、sec-ブチル、メチルチオエチル、ベンジル、CH2-連結4-ヒドロキシ-フェニル、CH2-連結インドール、ヒドロキシメチル、チオメチル、エタン酸アミド、プロパン酸アミド、エタン酸、プロパン酸、1-ヒドロキシエチル、4-アミノブタニル、4-(アミノイミノメチル)アミノプロピル、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、チオメチルまたはCH2-連結イミダゾールである。
【００３１】
特定の態様において、
nは2であり、
R2は
2008516979.tif 000006
であり、
R4は水素、メチル、イソ-プロピル、イソ-ブチル、sec-ブチル、メチルチオエチル、ベンジル、CH2-連結4-ヒドロキシ-フェニル、CH2-連結インドール、ヒドロキシメチル、チオメチル、エタン酸アミド、プロパン酸アミド、エタン酸、プロパン酸、1-ヒドロキシエチル、4-アミノブタニル、4-(アミノイミノメチル)アミノプロピル、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、チオメチルまたはCH2-連結イミダゾールであり、
R3は
2008516979.tif 000007
であり、R5はイソ-プロピル、sec-ブチル、メチルチオエチル、ベンジル、CH2-連結4-ヒドロキシ-フェニル、CH2-連結インドール、プロパン酸アミド、または4-アミノブタニルである。
【００３２】
特定の態様において、
nは2であり、
R2は
2008516979.tif 000008
であり、
R4は水素、メチル、イソ-プロピル、イソ-ブチル、sec-ブチル、メチルチオエチル、ベンジル、CH2-連結4-ヒドロキシ-フェニル、CH2-連結インドール、ヒドロキシメチル、チオメチル、エタン酸アミド、プロパン酸アミド、1-ヒドロキシエチル、4-アミノブタニル、4-(アミノイミノメチル)アミノプロピル、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、チオメチルまたはCH2-連結イミダゾールであり、
R3は
2008516979.tif 000009
であり、R5はイソ-プロピルまたはCH2-連結インドールである。
【００３３】
特定の態様において、本発明の複素環式化合物は以下の化合物（それらの固有のCAS登録番号で表す）を含まない：三量体：209353-30-0および748142-25-8、ならびに四量体：591781-32-7、189179-32-6、189179-28-0、176703-10-9、176703-09-6、122886-11-7、107208-67-3、83797-39-1、81017-86-9、77782-99-1、135432-38-1、209353-31-1、および189179-39-3。
【００３４】
水素は例外として、本発明の環式化合物にR1、R4およびR5として存在しうる基の分子構造を図1Aに示す。図1Aに示す基それぞれにおいて、黒丸「●」で示す炭素原子は、9員複素環の構成員に一重共有結合で連結している炭素原子を示す。
【００３５】
特定の態様において、本発明はペプチド結合で互いに直接連結している3または4つのアミノ酸からなる複素環式化合物をさらに提供する。複素環式化合物の第一のアミノ酸の位置（前述のR1基を提供するアミノ酸に対応する）において、アミノ酸はセリン（ヒドロキシメチル基を提供する）、トレオニン（1-ヒドロキシエチル基を提供する）またはシステイン（チオメチル基を提供する）であってもよい。この第一のアミノ酸残基は、式シクロ[X1X2X3X4]（X4は存在してもしなくてもよい）のX1でも表される。
【００３６】
特定の態様において、本発明はペプチド結合で互いに直接連結している3または4つの天然アミノ酸からなる環式化合物を提供する。複素環式化合物の第一のアミノ酸の位置（前述のR1基を提供するアミノ酸に対応する）において、アミノ酸はセリン（ヒドロキシメチル基を提供する）、トレオニン（1-ヒドロキシエチル基を提供する）またはシステイン（チオメチル基を提供する）であってもよい。この第一のアミノ酸残基は、式シクロ[X1X2X3X4]（X4は存在してもしなくてもよい）のX1でも表される。
【００３７】
3つのアミノ酸からなる化合物の場合、環式化合物の第二のアミノ酸の位置（式IのR2基を提供するアミノ酸に対応する）において、アミノ酸はグリシン（水素基を提供する）、アラニン（メチル基を提供する）、バリン（イソ-プロピル基を提供する）、ロイシン（イソ-ブチル基を提供する）、イソロイシン（sec-ブチル基を提供する）、メチオニン（メチルチオエチル基を提供する）、フェニルアラニン（ベンジル基を提供する）、チロシン（CH2-連結4-ヒドロキシ-フェニル基を提供する）、トリプトファン（CH2-連結インドール基を提供する）、アスパラギン（エタン酸アミド基を提供する）、グルタミン（プロパン酸アミド基を提供する）、アスパラギン酸（エタン酸基を提供する）、グルタミン酸（プロパン酸基を提供する）、リジン（4-アミノブタニル基を提供する）、アルギニン（4-(アミノイミノメチル)アミノプロピル基を提供する）、ヒスチジン（CH2-連結イミダゾール基を提供する）、プロリン（アミノ酸のCと隣接するNとの間の直鎖C3H6リンカーを提供する）、セリン（ヒドロキシメチル基を提供する）、トレオニン（1-ヒドロキシエチル基を提供する）またはシステイン（チオメチル基を提供する）を含む任意のアミノ酸でありうる。特定の態様において、第二のアミノ酸のアミノ酸は酸性ではない（すなわち、負に荷電していない）任意のアミノ酸でありうる。この第二のアミノ酸残基は式シクロ[X1X2X3X4]（X4は存在してもしなくてもよい）のX2でも表される。
【００３８】
特定の態様において、3つのアミノ酸からなる本発明の化合物の第三のアミノ酸は、フェニルアラニン、イソロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、トレオニン、チロシン、バリンまたはトリプトファンでありうる。特定の態様において、本発明の化合物の第三位のアミノ酸はバリンまたはトリプトファンでありうる。この第三のアミノ酸残基は式シクロ[X1X2X3X4]（X4は存在してもしなくてもよい）のX3でも表される。
【００３９】
したがって特定の態様において、本発明の化合物は式：シクロ[X1X2X3X4]（式中、X4は存在してもしなくてもよく、X1は天然Ser、ThrもしくはCysアミノ酸であるか、または特定の態様において、表1に従って選択される非天然アミノ酸であり、X2、X3、およびX4は任意の天然アミノ酸または表1に従って選択される非天然アミノ酸であり、化合物のアミノ酸はペプチド結合によって連結されている）の複素環式化合物であると記載しうる。特定の態様において、複素環式化合物は式シクロ[X1X2X3]（式中、X1はSer、ThrもしくはCys、または表1に従って選択される非天然アミノ酸であり、X2は任意の天然アミノ酸または表1に従って選択される非天然アミノ酸であり、X3はPhe、Ile、Lys、Met、Gln、Tyr、ValもしくはTrpまたは表1に従って選択される非天然アミノ酸である）の化合物である。特定の態様において、複素環式化合物は式シクロ[X1X2X3]（式中、X1はSer、ThrもしくはCys、または表1に従って選択される非天然アミノ酸であり、X2はAspもしくはGluではない任意の天然アミノ酸または表1に従って選択される非天然アミノ酸であり、X3はValもしくはTrpまたは表1に従って選択される非天然アミノ酸である）の化合物である。X2のアミノ酸は、例えば、芳香族、無極性、脂肪族、塩基性または極性であってもよい。
【００４０】
特定の態様において、本発明のIRES阻害複素環式化合物は以下の環式アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む：シクロ[CAW]、シクロ[CMW]、シクロ[CWW]、シクロ[CYW]、シクロ[SAW]、シクロ[SFV]、シクロ[SFW]、シクロ[SIV]、シクロ[SIW]、シクロ[SKV]、シクロ[SLW]、シクロ[SMV]、シクロ[SMW]、シクロ[SVI]、シクロ[SVV]、シクロ[SVW]、シクロ[SWF]、シクロ[SWI]、シクロ[SWM]、シクロ[SWV]、シクロ[SWW]、シクロ[SWY]、シクロ[SYV]、シクロ[SYW]、シクロ[TCW]、シクロ[TFW]、シクロ[THW]、シクロ[TLW]、シクロ[TMF]、シクロ[TMV]、シクロ[TMW]、シクロ[TQW]、シクロ[TSW]、シクロ[TYW]、シクロ[SAV]、シクロ[SDV]、シクロ[SEV]、シクロ[SHV]、シクロ[STV]、シクロ[SAM]、シクロ[SAT]、シクロ[SAY]、シクロ[TAV]、シクロ[SAF]、シクロ[SAI]、シクロ[SAK]、シクロ[SAQ]、シクロ[SHW]、シクロ[SPW]、シクロ[SQW]、シクロ[SRW]、シクロ[STW]、シクロ[SNW]、シクロ[SSW]、シクロ[SCW]、シクロ[SEW]、シクロ[SGW]、シクロ[SDW]、シクロ[TAW]、シクロ[SWFR]、シクロ[SWFA]、シクロ[SWFK]、シクロ[SWFM]、シクロ[SWWR]、シクロ[SWYR]、シクロ[TWFR]およびシクロ[SFWR]。前述の化合物のアミノ酸は天然、または非天然アミノ酸であってもよく、表1に従って選択されてもよい。前述の化合物の構造を以下の表3に示す。
【００４１】
【表３】
2008516979.tif 000010
2008516979.tif 000011
2008516979.tif 000012
2008516979.tif 000013
2008516979.tif 000014
2008516979.tif 000015
2008516979.tif 000016
2008516979.tif 000017
2008516979.tif 000018
2008516979.tif 000019
2008516979.tif 000020
2008516979.tif 000021
2008516979.tif 000022
2008516979.tif 000023
2008516979.tif 000024
2008516979.tif 000025
2008516979.tif 000026
【００４２】
本発明のIRES阻害化合物は、インテイン系（Kinsella et al. J Biol Chem. 2002 277:37512-8によって記載されたものと類似）を用いて哺乳動物細胞内で環式ペプチドのライブラリを作ること、およびそれらの環式ペプチドがIRES調節レポータータンパク質の発現を低下させるかどうかを調べることを含む細胞スクリーニングアッセイで発見された。
【００４３】
本発明のIRES阻害化合物は、IRES仲介性翻訳を阻害するが、5'キャップ細胞非翻訳領域（UTR）、例えば、特にヒトUTRなどの哺乳動物UTRに連結しているレポーターの発現をあまり阻害しない化合物を同定するために設計されたアッセイにより評価して、IRES特異的である。したがって、本発明のIRES阻害化合物はIRES含有ウイルスのタンパク質翻訳を阻害するが、キャップ細胞mRNAからの細胞コードタンパク質の翻訳は阻害しない。したがって、本発明の化合物を用いて、IRESを含むそれらのウイルスの複製を阻害することもできる。そのようなIRES含有ウイルスには下記が含まれるが、それらに限定されるわけではない：ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス）、HIV、A型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびフラビウイルス科のウイルス（すなわち、フラビウイルス科に属するウイルス、例えば、フラビウイルス、ペスチウイルスおよびヘパシウイルスで、黄熱病ウイルス（YFV）；1〜4型デングを含むデングウイルス；日本脳炎ウイルス；マレー谷脳炎ウイルス；セントルイス脳炎ウイルス；西ナイルウイルス；ダニ媒介性脳炎ウイルス；C型肝炎ウイルス（HCV）；クンジンウイルス；中欧脳炎ウイルス；ロシア春夏脳炎ウイルス；ポワッサンウイルス；キャサヌール森林病ウイルス；およびオムスク出血熱ウイルス）。
【００４４】
HCVは本発明において特に興味が持たれる。本発明によって企図されるHCVは任意の遺伝子型（例えば、遺伝子型1、2、3、4、5、6など）、ならびにHCV遺伝子型のサブタイプ（例えば、1a、1b、2a、2b、3aなど）のものであってもよい。現在、HCV遺伝子型1は通常処置するのが最も難しく、HCV遺伝子型1および遺伝子型1のサブタイプは、特に興味深い。さらに関連して興味が持たれるのは、例えば、IFN-α単剤療法、IFN-α併用療法などのHCV療法に失敗した患者の処置である。処置失敗患者には、治療にまったく応答しない患者（「非応答者」）ならびに最初は応答して、その後再発する患者（「再発者」）が含まれる。
【００４５】
以下の明細書はHCVに特に言及するが、そのような言及は明確を期すためのものであって、本発明を以下により詳細に記載するHCVに関連しての使用に限定することを意図するものではない。前述のとおり、本発明は、任意のフラビウイルス科のウイルスまたは、例えば、ピコルナウイルスなどのIRESをコードする任意のウイルスに適用することができる。
【００４６】
天然アミノ酸を含むIRES阻害複素環式化合物に加えて、非天然アミノ酸を含むIRES阻害複素環式化合物、ならびにアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を含む複素環式化合物も企図される。
【００４７】
非天然アミノ酸を含むIRES阻害複素環式化合物は、前述の複素環式化合物と実質的に同じ構造および/または機能的特徴を有する。非天然アミノ酸を含む本発明のIRES阻害複素環式化合物は、完全に天然アミノ酸の合成、非天然類縁体からなってもよく、または天然および非天然アミノ酸の両方を含むキメラ分子であってもよい。本発明のIRES阻害複素環式化合物は、置換がペプチドのIRES阻害活性を実質的に変えない限り、任意の量の天然アミノ酸置換（特に保存的アミノ酸置換）を組み込んでいてもよい。
【００４８】
特定のIRES阻害複素環式化合物が本発明の範囲内であるかどうかを調べるために必要なものは、日常的実験だけである。
【００４９】
非天然アミノ酸を含む本発明のIRES阻害複素環式化合物は一般に、a）天然アミド結合（「ペプチド結合」）以外の残基連結；および/またはb）天然アミノ酸の代わりの非天然アミノ酸を含む、非天然成分の任意の組み合わせを含む。
【００５０】
本発明の組成物において用いうるアミド結合（すなわち、ーC(=O)-NH-）以外のアミノ酸残基連結には下記が含まれるが、それらに限定されることはない：ケトメチレン結合（例えば、-C(=O)-CH2-）、アミノメチレン結合（CH2-NH）、エチレン結合（-C2H4-）、オレフィン結合（ーCH=CH-）、エーテル結合（-CH2-O-）、チオエーテル結合（-CH2-S-）、テトラゾール結合（CN4-）、ならびにチアゾール、レトロアミド、チオアミド、およびエステル結合。そのような「代用」ペプチド結合は当技術分野において周知であり（例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, A Peptide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NY参照）、本明細書において容易に用いられる。記載を容易にするために、そのような連結は通常の「ペプチド」または「アミノ」結合構造：-C(=O)-NH-を持たないかもしれないが、これらの連結も本明細書において「ペプチド」または「アミノ」結合と呼んでもよい。
【００５１】
さらに、前述のとおり、前述の例示的IRES阻害複素環式化合物のアミノ酸は、置き換わるアミノ酸が置き換えられるアミノ酸と類似の性質（サイズ、極性、疎水性など）を有するかぎり、次のいずれかで置き換えられてもよい：a）非天然アミノ酸またはb）異なる天然アミノ酸。すなわち、前述の任意の複素環式化合物の任意の天然アミノ酸は、同じクラスの異なる天然アミノ酸または非天然アミノ酸で置き換えられてもよく、ここで天然および例示的非天然アミノ酸は表1に従って分類される。特定の場合には、本発明の複素環式化合物の特定の位置は複素環式化合物の活性にとって必須ではないこともある。これらの場合、必須ではないアミノ酸を、複素環式化合物の生化学的性質（例えば、溶解性または透過性など）を改善する、または抗力を高める他のアミノ酸またはリンカー部分で置換してもよい。
【００５２】
前述のとおり、本発明の特定の化合物は一つまたは複数の（例えば、一つ、二つまたは三つの）非天然アミノ酸を含んでいてもよい。式Iの化合物のアミノ酸側鎖は天然アミノ酸の側鎖（図1Bに示すとおり）でありうることが理解される。特定の態様において、本発明の環式ペプチドのアミノ酸は、表1に示す一つまたは複数の非天然アミノ酸の側鎖を含んでいてもよい。例えば、R4またはR5はノルロイシンの側鎖であってもよく、これは当技術分野において周知のブタニル残基である。表1に示すアミノ酸の構造は周知である。
【００５３】
【表１】
2008516979.tif 000027
【００５４】
表1の非天然アミノ酸は以下のとおりに略記する；β-アラニン（β-Ala）および2,3-ジアミノプロピオン酸（Dpr）、4-アミノ酪酸などの他のアミノ酸；α-アミノイソ酪酸（Aib）；ε-アミノヘキサン酸（Aha）；δ-アミノ吉草酸（Ava）；N-メチルグリシンまたはサルコシン（MeGly）；オルニチン（Orn）；シトルリン（Cit）；t-ブチルアラニン（t-BuA）；t-ブチルグリシン（t-BuG）；N-メチルイソロイシン（MeIle）；フェニルグリシン（Phg）；シクロヘキシルアラニン（Cha）；ノルロイシン（Nle）；2-ナフチルアラニン（2-Nal）；4-クロロフェニルアラニン（Phe(4-Cl)）；2-フルオロフェニルアラニン（Phe(2-F)）；3-フルオロフェニルアラニン（Phe(3-F)）；4-フルオロフェニルアラニン（Phe(4-F)）；ペニシラミン（Pen）；l,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸（Tic）；β-2-チエニルアラニン（Thi）；メチオニンスルホキシド（MSO）；ホモアルギニン（hArg）；N-アセチルリシン（AcLys）；2,3-ジアミノ酪酸（Dab）；2,4-ジアミノ酪酸（Dbu）；p-アミノフェニルアラニン（Phe(pNH.sub.2)）；N-メチルバリン（MeVal）；ホモシステイン（hCys）およびホモセリン（hSer）。
【００５５】
表1に示すアミノ酸の各クラスを以下により詳細に論じる。
【００５６】
疎水性アミノ酸は、Eisenberg et al. (1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142)の標準化コンセンサス疎水性尺度によるゼロよりも大きい疎水性を示すアミノ酸である。天然疎水性アミノ酸の例には、Pro、Phe、Trp、Met、Ala、Gly、Tyr、Ile、LeuおよびValが含まれる。非天然疎水性アミノ酸の例にはt-BuAが含まれる。
【００５７】
芳香族アミノ酸は、少なくとも一つの芳香環または芳香族複素環を含む側鎖を有する疎水性アミノ酸である。芳香環または芳香族複素環は、-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-NO、-NH2、-NHR、-NRR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NRRなどの一つまたは複数の置換基を含んでいてもよく、ここでRはそれぞれ独立に(C1-C6)アルキル、置換(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルケニル、置換(C1-C6)アルケニル、(C1-C6)アルキニル、置換(C1-C6)アルキニル、(C5-C20)アリール、置換(C5-C20)アリール、(C6-C26)アルカリール、置換(C6-C26)アルカリール、5〜20員ヘテロアリール、置換5〜20員ヘテロアリール、6〜26員アルクヘテロアリールまたは置換6〜26員アルクヘテロアリールである。天然芳香族アミノ酸の例には、Phe、TyrおよびTrpが含まれる。一般に見られる非天然のコードされる芳香族アミノ酸には、フェニルグリシン、2-ナフチルアラニン、β-2-チエニルアラニン、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-e-3-カルボン酸、4-クロロ-フェニルアラニン、2-フルオロフェニルアラニン、3-フルオロフェニルアラニンおよび4-フルオロフェニルアラニンが含まれる。非天然アミノ酸の芳香環には、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル、およびピリジル芳香環が含まれる。
【００５８】
非極性アミノ酸は、生理的pHで非荷電で、2個の原子によって共有される電子対が一般にそれらの2個の原子それぞれによって等しく保持されている結合を有する側鎖（すなわち、側鎖は極性ではない）を有する疎水性アミノ酸である。天然非極性アミノ酸の例には、Gly、Leu、Val、Ile、AlaおよびMetが含まれる。非天然非極性アミノ酸の例には、Chaが含まれる。
【００５９】
脂肪族アミノ酸は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸である。天然脂肪族アミノ酸の例には、Ala、Leu、ValおよびIleが含まれる。非天然脂肪族アミノ酸には、Nleが含まれる。
【００６０】
親水性アミノ酸は、Eisenberg et al. (1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142)の標準化コンセンサス親水性尺度によるゼロ未満の親水性を示すアミノ酸である。天然親水性アミノ酸の例には、Thr、His、Glu、Asn、Gln、Asp、Arg、SerおよびLysが含まれる。天然親水性アミノ酸の例には、GetおよびhCysが含まれる。
【００６１】
酸性アミノ酸は、7未満の側鎖pK値を有する親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は典型的には、水素イオンの欠損により、生理的pHで負に荷電した側鎖を有する。天然酸性アミノ酸の例には、AspおよびGluが含まれる。
【００６２】
塩基性アミノ酸は、7よりも大きい側鎖pK値を有する親水性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は典型的には、ヒドロニウムイオンの連合により、生理的pHで正に荷電した側鎖を有する。天然塩基性アミノ酸の例には、Arg、LysおよびHisが含まれる。非天然塩基性アミノ酸の例には、非環式アミノ酸のオルニチン、2,3-ジアミノプロピオン酸、2,4-ジアミノ酪酸およびホモアルギニンが含まれる。
【００６３】
極性アミノ酸は、生理的pHで非荷電であるが、2個の原子によって共有される電子対がそれらの原子の一方によってより密接に保持されている結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸である。天然極性アミノ酸の例には、Ser、Thr、AsnおよびGlnが含まれる。非天然極性アミノ酸の例には、シトルリン、N-アセチルリシンおよびメチオニン スルホキシドが含まれる。
【００６４】
アミノ酸残基Cysは他のCys残基または他のスルファニル含有アミノ酸とジスルフィド結合を形成する能力を有する。Cysは本発明の目的のために極性親水性アミノ酸として分類される。典型的には、システイン様アミノ酸は一般に少なくとも一つのチオール（SH）基を含む側鎖を有する。遺伝的にコードされるシステイン様アミノ酸の例には、Cysが含まれる。非遺伝的にコードされるシステイン様アミノ酸の例には、ホモシステインおよびペニシラミンが含まれる。
【００６５】
本発明の複素環式化合物の任意の特定の残基を反対の掌性のアミノ酸で置き換えることもできる。したがって、L-立体配置の任意の天然アミノ酸を同じまたは類似の化学構造であるが、反対の掌性の、一般にD-アミノ酸と呼ばれるアミノ酸で置き換えることができる。
【００６６】
当業者であれば理解されると思われるとおり、本発明の環式ポリペプチドにおいて、そのポリペプチドのIRES阻害活性を変えることなく、保存的アミノ酸置換を行うことができる。表2に行いうる例示的アミノ酸置換を示す。
【００６７】
【表２】
2008516979.tif 000028
【００６８】
特定の態様において、本発明の複素環式化合物のアミノ酸を、置き換えられたアミノ酸の間隔を保存する有機リンカーによって置き換えてもよい。
【００６９】
本発明のIRES阻害複素環式化合物は細胞内で、例えば、周知のインテインによる方法を用いて調製してもよい。例えば、米国特許出願第20040014100号、Camarero and Muir (J. Am. Chem. Soc. 1999 121:5597-5598)、Iwai and Pluckthun (FEBS Lett. 1999 459:166-172)、Evans, et al. (J. Biol. Chem. 1999 274:18359-18363)；Scott et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 1999 96:13638-13643)およびKinsella et al. (J. Biol. Chem. 2002 277:37512-8)はそれぞれ、本発明の環式ポリペプチドを細胞内で調製しうる、インテインによる方法を記載し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
または、本発明のIRES阻害複素環式化合物は、標準の化学合成を用いて、例えば、Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc. 1964 85:2149)の固相ペプチド合成法により、科学的に調製してもよい。標準の溶液法も用いることができる(例えば、Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984)およびBodanszky, Peptide Chemistry, Springer-Verlag, Berlin (1993)参照）。本発明のバイオポリマーは、Creighton (1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y.)またはHunkapiller et al. (Nature, 310:105-111 (1984))の方法により科学的に合成することができる。いったん生成した後、直鎖ペプチドを公知の化学を用いて環化することができる。
【００７１】
特定の態様において、本発明のIRES阻害複素環式化合物は、直鎖ペプチドを合成的に調製し、インテインの二つのドメインに連結し、無細胞反応で環化する、半合成手段を用いて調製してもよい。これらの方法は2004年5月24日提出の「METHODS FOR CYCLIZING SYNTHETIC POLYMERS」なる表題の米国特許仮出願第60/574,238号に記載されており、この出願はその全体が鎖本明細書に組み込まれる。
【００７２】
製剤および投与経路
本明細書に記載の化合物は、投与に適した様々な様式で製剤することができる。一般に、これらの化合物は薬学的に許容される賦形剤との組み合わせで、同じまたは別の製剤中で提供される。多様な薬学的に許容される賦形剤は当技術分野において公知で、本明細書において詳細に論じる必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A. Gennaro (2000) 「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins；およびHandbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.を含む様々な出版物に詳細に記載されている。
【００７３】
媒体、補助剤、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、pH調節および緩衝剤、張性調節剤、安定化剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質は、一般に容易に入手可能である。
【００７４】
いくつかの態様において、物質は、例えば、水性または非水性製剤中で、別々または組み合わせで製剤され、この製剤は緩衝剤をさらに含んでいてもよい。適当な水性緩衝剤には、濃度が5mMから100mMまで変動する酢酸、コハク酸、クエン酸、およびリン酸緩衝液が含まれるが、それらに限定されることはない。いくつかの態様において、水性緩衝剤は等張溶液を提供する試薬を含む。そのような試薬には、塩化ナトリウム、および糖類、例えば、マンニトール、デキストロース、スクロースなどが含まれるが、それらに限定されることはない。いくつかの態様において、水性緩衝剤は、ポリソルベート20または80などの非イオン性界面活性剤をさらに含む。
【００７５】
任意に製剤は保存剤をさらに含んでいてもよい。適当な保存剤には、ベンジルアルコール、フェノール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムなどが含まれるが、それらに限定されることはない。多くの場合に、製剤は約4℃で保存する。製剤は凍結乾燥してもよく、その場合、製剤は一般にスクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、マンニトールなどの凍結保護物質を含む。凍結乾燥製剤は、室温であっても、長期間保存することができる。
【００７６】
本発明の方法において、活性物質は所望の治療効果をもたらすことができる任意の好都合な手段を用いて宿主に投与してもよい。したがって、物質は治療的投与のために様々な製剤中に組み込むことができる。特に、本発明の物質は、適当な、薬学的に許容される担体または希釈剤との組み合わせにより、薬学的組成物へと製剤することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルなどの、固体、半固体、液体または気体剤形の製剤へと調合してもよい。
【００７７】
薬学的剤形において、物質はそれらの薬学的に許容される塩の形で投与してもよく、または単独もしくは他の薬学的に活性な化合物との適当な連合、ならびに組み合わせで用いてもよい。下記の方法および賦形剤は単に例示のためのものであり、決して限定的ではない。
【００７８】
物質は、植物もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールなどの水性または非水性溶媒中に、望まれる場合には可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤および保存剤などの通常の添加物と共に、溶解、懸濁または乳化することにより、注射用製剤に調合することもできる。
【００７９】
経口製剤のために、物質は単独または適当な添加物、例えばラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプンなどの通常の添加物；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤；タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；および望まれる場合には希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および着香剤との組み合わせで用いて、錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を形成することができる。
【００８０】
さらに、物質は、乳化剤または水溶性基剤などの様々な基剤と混合することにより、坐剤を形成することもできる。本発明の化合物は坐剤によって直腸に投与することもできる。坐剤は体温では溶解するが、室温では固化する、カカオ脂、カーボワックスおよびポリエチレングリコールなどの媒体を含むことができる。物質は、例えば、物質を経時的に所望の量（例えば、所望の治療上の、または他の有益な効果を提供するのに有効な量）で放出するための、徐放性または制御放出製剤で提供することもできる。
【００８１】
それぞれの用量単位、例えば、茶さじ量、大さじ量、錠剤または坐剤が一つまたは複数の阻害剤を含む組成物のあらかじめ決められた量を含む、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤などの経口または直腸投与用の単位剤形を提供してもよい。同様に、注射または静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、生理食塩水または別の薬学的に許容される担体中の溶液としての組成物中に阻害剤を含んでいてもよい。
【００８２】
本明細書において用いられる「単位剤形」とは、ヒトおよび動物対象のための単位用量として適当な、物理的に分離した単位であって、それぞれ所望の効果を生じるのに十分な量で計算された物質のあらかじめ決められた量を、薬学的に許容される希釈剤、担体または媒体と共に含む単位を意味する。本発明において用いるための単位剤形の明細は、用いる特定の化合物および達成される効果、宿主における各化合物に関連する薬力学などに依存する。
【００８３】
特に興味が持たれる剤形には、静脈内または経口投与を行うのに適した剤形、ならびに鼻または肺経路（例えば吸入）による、例えば一定用量吸入器などの使用による送達を提供するための剤形が含まれる。
【００８４】
一般に、本発明において用いるための物質は、非経口または経腸剤形のいずれか、通常は経腸製剤、特に経口製剤で製剤する。本発明において用いるための物質は、例えば、皮下、皮内、腹腔内、静脈内、または筋肉内注射による非経口投与用に製剤する。投与は、例えば、経腸、経口、口腔内、直腸、経皮、気管内、吸入（例えば、米国特許第5,354,934号参照）などによって達成してもよい。
【００８５】
IRES阻害環式化合物の使用法
本発明は、ウイルスIRES仲介性翻訳の阻害法もさらに提供する。これらの方法は一般に、ウイルスIRESをIRESによって仲介される翻訳を阻害するのに有効な量の前述のIRES阻害複素環式化合物と接触させる段階を含む。
【００８６】
この方法は、例えば、網状赤血球溶解産物を用いるインビトロ翻訳システムを用いての無細胞システムを用いて実施してもよい。これらの方法の詳細については、例えば、Jang et al (J. Virol. 1989 63:1651-1660)、Shih (J Virol. 1979 30:472-80)およびTsukiyama-Kohara et al (J Virol. 1992 66:1476-83)を参照されたい。または、本発明の方法は細胞、特に哺乳動物宿主細胞を用いて実施してもよい。これらの態様において、方法は一般に、細胞を前述の複素環式化合物と接触させて、IRESからの翻訳開始を阻害する段階を含む。
【００８７】
これらの態様のいずれにおいても、IRESは天然ウイルス（例えば、HCV）ゲノムまたはその任意の人工レプリコンによってコードされてもよく、それを用いて生成することもできる。しかし、特定の態様において、IRESを、それが自然には連結しないポリペプチドコード配列に操作可能に連結（すなわち、その翻訳を開始）してもよい。例えば、IRESを、発光または発色タンパク質をコードするポリヌクレオチドなどの、光学検出可能なレポータータンパク質コード配列に操作可能に連結してもよい。
【００８８】
前述のとおり、特定の態様において、方法は細胞環境で実施してもよい。細胞はインビトロ（例えば、培養細胞）、エクスビボ（例えば、摘出肝などの哺乳動物対象から摘出した無傷の臓器内）、またはインビボ（例えば、ウイルス感染症の動物モデル、例えばHCVの動物モデル、または哺乳動物対象内）であってもよい。IRESは野生型ウイルス、その人工レプリコンによって、または例えばIRES依存性レポータータンパク質をコードする組み替え核酸を用いて生成してもよい。そのような核酸は、レトロウイルスベクターによる形質移入を含む、様々な手段を用いて細胞に導入することができる。
【００８９】
同様に、本発明は、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害法も提供する。一般に、これらの方法は、細胞を細胞内のウイルス複製を阻害するのに有効な量の本発明の複素環式化合物と接触させる段階を含む。
【００９０】
一般に、方法はIRES含有ウイルスまたはそのモデル、例えば、HCVまたはそのモデル（例えば、HCVサブゲノムレプリコン；Lim, Virology. 2002 303 (1):79-99）に感染した細胞を前述の複素環式化合物と接触させる段階と、ウイルス複製を阻害する段階とを含む。ここでも、細胞はインビトロ、エクスビボまたはインビボの細胞でありうる。
【００９１】
特定の態様において、本発明の方法はレプリコン細胞においてHCV複製を阻害する段階を含んでいてもよい。本発明の化合物を用いうるHCV複製アッセイは、Lohmann et al (1999 Science 258:110-113)、国際公法第03/040112号および国際公開広報第2004018463号に記載されている。他の態様は、Fournier et al, (1998 J. Gen. Virol. 79:2367-2374)に記載のHCV感染および複製アッセイを用いてもよい。
【００９２】
一般に、前述の複素環式化合物は、標準のレプリコンコロニー形成アッセイを用い、物質非存在下での対照と比べて、約20％まで、約30％まで、約40％まで、約50％まで、約80％まで、約90％まで、または約95％以上、ウイルス複製を低下させることになる。
【００９３】
本発明のいくつかの態様において、物質をIRES含有ウイルスにすでに感染している細胞と接触させるか、または特定の他の態様において、物質をIRES含有ウイルス感染前の細胞と接触させる。これらの態様において、本発明の複素環式化合物は、例えば、細胞の生存力を高め、さらなるウイルス感染に対する細胞の「保護」を提供するため、または、例えば、宿主においてIRES含有ウイルスから正常な移植肝を保護するために、予防薬として投与してもよい。
【００９４】
前述のいずれにおいても、ウイルスまたはそのレプリコンは、フラビウイルス科のウイルス、例えばHCVを含む、任意のIRES含有ウイルスでありうる。
【００９５】
前述の方法のいくつかはHCVの非ヒト動物モデルで実施してもよい。哺乳動物、特にマウス、サル、ラット、ネコ、イヌ、モルモット、チンパンジーなどを用いる多くのそのような動物モデルは当業者には公知である。マウスモデル、特にPCT国際公開広報第01/67854に記載のHCVのマウスモデルを用いてもよい。他のモデルには、HCVに感染したヒト肝細胞の免疫不全マウスの肝臓への移植を記載している、国際公開広報第99/16307号およびGalun et al. J. Infect. Dis. 172:25-30 (1995)；HCV感染造血細胞のSCIDマウスへの腹腔内注射を記載している、Bronowicki et al. Hepatology 28:211-8 (1998)；およびHCVゲノムに対するマウス形質転換体を記載しているLerta et al. Hepatology 28 (4Pt2) :498A (1998)に記載のものが含まれる。
【００９６】
多くの態様において、本発明の物質の投与後に、動物が示す病原体の症状（例えば、病原体感染細胞の生存力、病変、出血、挫傷、力価、ALT、感染細胞数）が本発明の物質を投与していない動物に比べて、20％まで、50％まで、70％まで、80％まで、90％まで、95％まで、98％まで、さらに99％または99.5％まで低下する。他の態様において、本発明の物質の投与後に、動物が示す病原体の症状（例えば、CD4数、ALTまたはHAAT活性など）が本発明の物質を投与していない動物に比べて、20％まで、50％まで、70％まで、80％まで、90％まで、95％まで、98％まで、さらに99％または99.5％まで増大する。
【００９７】
多くの態様において、血液試料を動物から採取し、ウイルス、細胞、タンパク質、または分子などの血中生成物のレベル（例えば、ウイルス力価、ウイルスゲノム、ウイルスmRNA、CD4数またはHAAT活性など）を試験する。他の態様において、組織の試料を試験動物から採取し、症状（例えば、細胞死、病変、ウイルス力価など）を測定する。
【００９８】
キット
前述の方法の一つまたは複数を実施するための、試薬およびそのキットも提供される。本発明の試薬およびそのキットは大きく変動する。典型的には、キットは少なくとも前述のIRES阻害複素環式化合物を含む。本発明のキットは、一つまたは複数の追加の試薬、例えば、ペプチド（例えば、これが乾燥型である場合）を溶解するための薬学的に許容される賦形剤およびペプチドを哺乳動物対象、例えばヒトに投与するための他の試薬を含んでいてもよい。
【００９９】
前述の成分に加えて、本発明のキットは本発明の方法を実施するための説明書をさらに含むことができる。これらの説明書は本発明のキットにおいて様々な形式で存在し、その一つまたは複数はキット内にあってもよい。これらの説明書が存在しうる一つの形式は、キットの包装、添付文書などの中の適当な媒体または基体、例えば情報が印刷される紙片上の印刷情報としてである。さらに別の手段は、情報が記録されている、コンピュータで読み込み可能な媒体、例えば、ディスケット、CDなどである。存在しうるさらに別の手段は、離れた場所で情報にアクセスするための、インターネットを介して利用することができるウェブサイトアドレスである。任意の好都合な手段をキットに入れることができる。
【０１００】
有用性
本発明は、対象のウイルス感染症処置において用いられる。特に、本発明は、哺乳動物対象のIRES含有ウイルス（例えば、HCV）感染の処置において用いられる。この文脈において、処置は感染対象のウイルス負荷の低減（例えば、ウイルス負荷またはウイルス力価の低減）を含みうる。本発明は、感受性対象におけるウイルス感染症の症状または疾患のリスクを予防または低減することも企図する。この後者の範疇における対象の例には、臓器移植受容者（例えば、肝移植、骨髄または他の免疫細胞移植など）が含まれるが、必ずしもそれらに限定されるわけではない。特に興味深いのは、ウイルス感染症を除去し、供与肝の再感染のリスクを下げるための治療として肝移植を受ける対象、および免疫無防備状態またはそれ以外の免疫不全対象（例えば、自己免疫疾患、AIDS、遺伝的欠陥などによる）を含む、慢性ウイルス感染症を有する対象の処置である。
【０１０１】
本発明の処置のために企図される特定の例示的細胞内病原体感染には、C型肝炎ウイルス（HCV遺伝子型1、2、3などを含むHCV）に関連する感染が含まれるが、必ずしもそれらに限定されるわけではない。
【０１０２】
ウイルスは毒性、潜伏、もしくは弱毒型、またはそれらの型の組み合わせで存在しうる。対象は症候性または無症候性でありうる。
【０１０３】
一つの態様において、患者に移植する肝臓を移植前に本発明の物質で処理する。他の態様において、感染患者の肝臓を患者から摘出し、本発明の物質で処理し、患者に戻す。
【０１０４】
様々な宿主（ここで「宿主」なる用語は本明細書において「対象」および「患者」なる用語と交換可能に用いられる）を、本発明の方法に従って処置することができる。一般にはそのような宿主は「哺乳動物（mammals）」または「哺乳類（mammalian）」であり、ここでこれらの用語は、食肉目（例えば、イヌおよびネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、および霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む、哺乳綱の生物を記載するために広く用いられている。多くの態様において、宿主はヒトであると考えられる。
【０１０５】
本発明の物質は、単独の活性物質として、例えば、リバビリンおよび/またはリバビリン誘導体、IFN-α（例えば、IFN-α2a、IFN-α2b、PEG-IFN-α2a、PEG-IFN-α2b、コンセンサスIFN（例えば、登録商標INFERGEN）、PEG化コンセンサスIFN）、逆転写酵素阻害剤（例えば、AZT、ddI、ddC、d4T、3TO、FTC、DAPD、1592U89またはCS92を含むジデオキシヌクレオチド）などの一つまたは複数の他の薬物；ならびに9-(2-ヒドロキシエトキシメチル)グアニン（アシクロビル）、ガンシクロビルまたはペンシクロビル、インターロイキンIIなどの他の物質との組み合わせ（すなわち、それらとの「カクテル」として）で（一緒または逐次）、あるいは適当な場合には骨髄もしくはリンパ球移植片またはリンパ球の数および/もしくは機能を高める、レバミゾールもしくはチモシンなどの他の薬物を含む他の免疫調節物質と共に投与することができる。
【０１０６】
前述の記載は単に本発明の原理を例示するにすぎない。当業者であれば、本明細書において明確に記載または示していないが、本発明の原理を具現し、その精神および範囲内に含まれる、様々な改変を考案可能であることが理解されると思われる。さらに、本明細書において引用するすべての例および条件についての文言は、主に読者が本発明の原理と、技術を推進するために発明者らが提供した概念を理解するのを助けるためのものであって、そのような特に引用した例および条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、局面、および態様、ならびにその特定の実施例を述べる、本明細書におけるすべての言明は、その構造および機能的等価物の両方を含むことが意図される。加えて、そのような等価物は現在公知の等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち構造にかかわらず、同じ機能を実施する、任意の開発要素を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書において示し、記載する例示的態様に限定されることを意図していない。そうではなく、本発明の範囲および精神は添付の特許請求の範囲によって具現される。
【０１０７】
実施例
以下の実施例は、当業者に本発明をいかにして調製し、使用するかの完全な開示および記載を提供するために示すものであり、発明者らが自分たちの発明と見なすものの範囲を限定する意図はなく、また、以下の実験が実施した実験のすべて、または唯一のものであるとする意図もない。
【０１０８】
本発明をその特定の態様に関して記載してきたが、当業者であれば、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行ってもよく、等価物で置き換えてもよいことを理解すべきである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成物、工程、工程の一つまたは複数の段階に合わせるために、本発明の目的、精神および範囲に対して多くの改変を行ってもよい。そのような改変はすべて、本発明の範囲内であることが意図される。
【０１０９】
実施例1
スクリーニング法
環式3量体および4量体のライブラリ（すなわち、3または4アミノ酸残基を含む環式ペプチドのライブラリ）を生成する細胞を、ライブラリ作成のために異なるオリゴヌクレオチドを用いる以外は、Kinsellaら（J Biol Chem. 2002 277:37512-8）と同じ方法を用いて作成した。このライブラリからのクローンを、図2に示すアッセイでスクリーニングして、IRES阻害化合物を同定した。
【０１１０】
要約すると、ライブラリの各ペプチドが固定のSer、ThrまたはCys残基（1位）を含み、残りの残基を無作為化するように、別々の環式3量体および環式4量体ライブラリを作成した。ライブラリ作成のために、配列
2008516979.tif 000029
の変性オリゴヌクレオチドをプライマー
2008516979.tif 000030
にアニーリングし、Expand PCRキット（Roche Molecular Biochemicals）を用いて伸長した。二本鎖DNA挿入断片を消化し、DnaBO-e-BFPのBclI/DrdI部位（ACUC）に挿入した。プラスミドライブラリをLB+amp寒天培地上で増幅させるためにElectroMAX DH10Bコンピテント大腸菌（Invitrogen）に電気穿孔した。図2に示すとおり、個々のライブラリメンバーは青色蛍光タンパク質（BFP）、インテインのCおよびN末端ドメイン、ならびに環化するペプチドを含む融合タンパク質をコードする。インテインの発現をBFP発現を検出することにより検出した。インテイン（およびインテインによって産生される環式ペプチド）の発現は、外因性ドキシサイクリンの添加により抑制される。3量体ライブラリを作成する際に用いるインテイン骨格の接合部のアミノ酸配列はVal-His-Asn-X3または4-Cys-Ile-Ser（X3または4は3または4つの近接アミノ酸である）である。
【０１１１】
感染性レトロウイルス粒子を、各ライブラリ15□gの約5×106 Phoenix-Aパッケージング細胞への形質移入により生成した（Swift et al, (1999). Current Protocols in Immunology Vol. 10.17C, pp. 1-17, Freeman, New Yorkに記載のとおり）。次いで、得られた各レトロウイルス粒子ライブラリを用いて5×106 BJAB-S3A11レポーター細胞を感染させ、FACSによる選別を行ってHCV-IRESレポーター排出量が低下した細胞を単離した。
【０１１２】
詳細には、図2を参照して、アッセイに用いる細胞はIRES依存性レポーターシステムを含んでいた。IRES依存性レポーターシステムは、二重機能レポータータンパク質をコードするRNAに操作可能に連結された、HCV IRESを含むRNAの転写を推進するCMVプロモーターを含む。二重機能レポータータンパク質の翻訳はIRESの活性に依存する。二重機能レポーター、HBEGF-GFPの発現は、HBEGF（ジフテリア毒素受容体）およびGFP（緑色蛍光タンパク質）の両方の発現を引き起こす。HBEGFの発現により細胞はジフテリア毒素に対して感受性となり、GFP発現を蛍光検出器でモニターすることができる。同じく細胞内に存在するのは、5'キャップ依存性翻訳（ほとんどの細胞タンパク質が通常翻訳されるメカニズム）の活性をアッセイするための制御レポーターシステムである。制御レポーターシステムは、RFP（赤色蛍光タンパク質）をコードするRNAに操作可能に連結された、5'キャップ依存性UTRを含むRNAの転写を推進するCMVプロモーターを含む。RFPの翻訳は5'キャップ依存性UTRの活性に依存する。
【０１１３】
環式化合物ライブラリおよび前述のレポーターシステムの両方を含む細胞をまず、ジフテリア毒素への曝露後の生存についてスクリーニングし、次いで、RFP発現に比べてGFP発現が低下した細胞を同定するためにFACSによるスクリーニングを行った。細胞を増殖させ、レプリカ培養し、dox（100ng/ml）存在下または非存在下で4日間培養した。プレートをIL-4で刺激し、GFP発現（RFPと比較して）をフローサイトメトリーでモニターした。ペプチドのIRES阻害活性を、ペプチド陽性細胞（「ペプチドpos+」細胞、すなわち、doxと接触していない細胞）のGFP発現の幾何平均の、ペプチド陰性細胞（「ペプチドpos-」細胞、すなわち、doxと接触した細胞）のGFP発現の幾何平均に対する比を計算することにより評価する。
【０１１４】
1.19以下の比は、特定の環式ペプチドが有意な活性を持たないことを示すが、少なくとも1.20のスコアは、特定の環式ペプチドが有意なIRES阻害活性を有することを示す。スコアの高い環式ペプチドほど高いIRES阻害活性を有する。
【０１１５】
いくつかのIRES阻害ペプチドが同定された。これらのIRES阻害環式ペプチドのアミノ酸配列は、これらのペプチドをコードする核酸の配列決定により明らかとなった。
【０１１６】
スクリーニングアッセイにより、下記のアミノ酸配列を有する環式ペプチドは有意なIRES阻害活性を有すると同定された：シクロ-CAW（1.37）、シクロ-CMW（1.29）、シクロ-CWW（1.41）、シクロ-CYW（1.3）、シクロ-SAW（1.21）、シクロ-SFV（1.33）、シクロ-SFW（1.55）、シクロ-SIV（1.4）、シクロ-SIW（1.36）、シクロ-SKV（1.38）、シクロ-SLW（1.27）、シクロ-SMV（1.36）、シクロ-SMW（1.28）、シクロ-SVI（1.28）、シクロ-SVV（1.64）、シクロ-SVW（1.3）、シクロ-SWF（1.33）、シクロ-SWI（1.36）、シクロ-SWM（1.22）、シクロ-SWV（1.83）、シクロ-SWW（2.37）、シクロ-SWY（1.38）、シクロ-SYV（1.4）、シクロ-SYW（1.64）、シクロ-TCW（1.48）、シクロ-TFW（1.75）、シクロ-THW（1.49）、シクロ-TLW（1.2）、シクロ-TMF（1.37）、シクロ-TMV（1.56）、シクロ-TMW（2.1）、シクロ-TQW（1.7）、シクロ-TSW（1.25）およびシクロ-TYW（2.23）。これらの環式ペプチドは接合部の配列Val-His-Asn-X1X2X3-Cys-Ile-Ser（X1 X2 X3は環式ペプチドのアミノ酸である）を有するインテインによって産生された。
【０１１７】
特定の例示的ペプチドのアミノ酸配列および構造、ならびにIRES阻害活性を示す例示的FACS結果を図3に示す。
【０１１８】
下記の3量体ペプチドも抗IRES活性を有すると同定された：シクロ-SAV（2.65）、シクロ-SDV（1.23）、シクロ-SEV（1.93）、シクロ-SHV（1.91）、シクロ-STV（2.24）、シクロ-SAM（1.36）、シクロ-SAT（1.21）、シクロ-SAY（1.95）およびシクロ-TAV（2.00）。これらの3量体ペプチドは、ライブラリを生成するために用いたインテイン骨格に比べて、突然変異配列を有するインテイン骨格によって産生された。これらのペプチドそれぞれについて、突然変異体骨格の接合部の配列はVal-His-Tyr-X1X2X3-Cys-Ile-Ser（X1、X2およびX3は環式ペプチドのアミノ酸である）である。インテイン骨格におけるこのアミノ酸変化の重要性は不明である。
【０１１９】
加えて、下記の3量体ペプチドも抗IRES活性を有すると同定された：シクロ-SAF（1.88）、シクロ-SAI（1.30）、シクロ-SAK（1.3）、シクロ-SAQ（1.4）、シクロ-SHW（2.26）、シクロ-SPW（2.28）、シクロ-SQW（2.20）、シクロ-SRW（2.14）、シクロ-STW（2.12）、シクロ- SNW（2.10）、シクロ-SSW（2.05）、シクロ-SCW（2.01）、シクロ-SEW（2.00）、シクロ-SGW（1.94）、シクロ-SDW（1.85）、およびシクロ-TAW（5.09）。これらの3量体ペプチドは、ライブラリを生成するために用いたインテイン骨格に比べて、突然変異配列を有するインテイン骨格によって産生された。これらのペプチドそれぞれについて、突然変異体骨格の接合部の配列はVal-His-Asn-X1X2X3-Trp-Ile-Ser（X1、X2およびX3は環式ペプチドのアミノ酸である）である。インテイン骨格におけるこのアミノ酸変化の重要性は不明である。
【０１２０】
下記の4量体ペプチドは抗IRES活性を有すると同定された：シクロ-SWFR（1.44）、シクロ-SWFA（1.31）、シクロ-SWFK（1.58）、シクロ-SWFM（1.31）、シクロ-SWWR（2.03）、シクロ-SWYR（1.49）、シクロ-TWFR（1.56）およびシクロ-SFWR（1.49）。これらの4量体ペプチドは、ライブラリを生成するために用いたインテイン骨格に比べて、突然変異配列を有するインテイン骨格によって産生された。これらのペプチドそれぞれについて、突然変異体骨格の接合部の配列はVal-His-Asn-X1X2X3X4-Cys-Ser（X1、X2、X3およびX4は環式ペプチドのアミノ酸である）である。インテイン骨格におけるこのアミノ酸変化の重要性は不明である。
【０１２１】
各アミノ酸配列の後の括弧内に示す数は前述のIRES阻害活性比である。
【０１２２】
実施例2
細胞からのペプチドの単離
HCV IRES FACSアッセイにおいてプラスの点数がついたライブラリメンバーを、Gluthione-S-トランスフェラーゼ（GST)）（Pfizer/Pharmacia, New York, NY）へのインフレームC末端融合物としてpGEX4T-1発現ベクターにサブクローニングした。DNAをBL21細菌（Stratagene, La Jolla, CA）に形質転換し、細胞を100μgアンピシリンを含むTerrific Broth 250ml中、37℃で600nmの光学濃度が0.8になるまで培養した。0.5mM イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）（Stratagene, La Jolla, CA）を加えて発現を誘導し、細胞を16℃でさらに12時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、細胞ペレットに1×Complete Protease Inhibitor Cocktail（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を補足した氷冷リン酸緩衝化食塩水（PBS）10mlを重層した。細胞を3回の-80℃での凍結-解凍サイクルにかけ、次いでパワーレベル5に設定した550 Sonic Dismembrator（Fisher Scientific, Hampton, NH）で2分間超音波処理した。細胞片を遠心分離により除去し、清澄上清をMicrocon YM-3再生セルロース3000 Nominal Molecular Weight Limit（NMWL）遠心分離フィルター（Millipore, Bedford, MA）を通してろ過した。ろ過した溶解産物をMDS Sciex QStar pulsar QqTOF質量分析計へのC18カラム逆相クロマトグラフィによりさらに分離した。MS（図4および6）およびMS/MSスペクトル（図5および7）を予想される環式ペプチドに対応する質量について調べた。
【０１２３】
図4および5は細胞抽出物中のシクロ[TMW]（419.1747）の予想分子量を有する化合物（丸または四角で囲み）を示す。図6および7は細胞抽出物中のシクロ[SPD]（300.12）の予想分子量を有する化合物を示す。
【０１２４】
実施例3
N-ブタノールを用いてのペプチドの単離
HCV IRES FACSアッセイにおいてプラスの点数がついたライブラリメンバーを、Gluthione-S-トランスフェラーゼ（GST)）（Pfizer/Pharmacia, New York, NY）へのインフレームC末端融合物としてpGEX4T-1発現ベクターにサブクローニングした。DNAをBL21細菌（Stratagene, La Jolla, CA）に形質転換し、細胞を100μgアンピシリンを含むTerrific Broth 250ml中、37℃で600nmの光学濃度が0.8になるまで培養した。0.5mM イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）（Stratagene, La Jolla, CA）を加えて発現を誘導し、細胞を16℃でさらに12時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、細胞ペレットに1×Complete Protease Inhibitor Cocktail（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を補足した氷冷リン酸緩衝化食塩水（PBS）10mlを重層した。細胞を3回の-80℃での凍結-解凍サイクルにかけ、次いでパワーレベル5に設定した550 Sonic Dismembrator（Fisher Scientific, Hampton, NH）で2分間超音波処理した。細胞片は除去せず、PBSを加えて最終量を250mlとした。全細胞溶解産物を等量のトルエン（250ml）と混合し、2分間激しく振盪し、次いで遠心分離にかけて相を分離した。水相を除去し、次いで追加の新鮮トルエン250mlで二回目の抽出を行った。両方の250mlトルエン画分を一つの容器に合わせ、減圧下（約10mmHg）で乾燥するまで蒸発させ、残留材料を出発溶媒（トルエン）2mlに再懸濁した。次いで、残った水相をそれぞれクロロホルムおよびn-ブタノールの両方でさらに水相抽出を行った。これらの抽出の方法は、乾燥n-ブタノール画分をn-ブタノールの出発抽出溶媒の代わりに精製水2mlに再懸濁した以外は、トルエンの場合に用いた方法と同じであった。目的のペプチドを他のタンパク質および細胞成分からn-ブタノールを用いて精製した。試料を超音波処理し、次いで遠心分離にかけて、不溶沈殿物を除去した。抽出物20μlをC18逆相カラムにロードし、60分間のアセトニトリル/水2〜60％の勾配（0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を含む）にかけた。移動相を1ml画分に回収し、凍結乾燥し、66.9％水、33％メタノール、0.1％酢酸100μlに再懸濁した。個々の画分をWaters/Micromass Q-TOF1質量分析計で分析した。この方法を図8に例示する。
【０１２５】
図9に示すとおり、c[TMW]発現細菌から逐次連続抽出した溶解産物は、419.2147にc[TMW]（C20H26N4O4S1 +H）に対応する分子イオンを含む単一の画分、No.51を生じた。観察された419.2147の質量は419.1747のc[TMW]の予想理論分子イオン質量によく一致していた。
【０１２６】
前述の議論から本発明はIRES仲介性翻訳を阻害するための重要な新手段を提供することが明らかである。IRES仲介性翻訳は広範な有害性の高いウイルスの発現に必要とされるため、前述の化合物はそれらのウイルスに対する有効な抗ウイルス薬として用いることができる。さらに、前述の化合物は環式であるため、それらの立体配座は制約されており、したがって直鎖ペプチドに比べて、他の分子への結合における高い特異性と親和性を示す。さらに、前述の環式ペプチドは直鎖ペプチドよりも細胞内および保存中により安定であると考えられ、宿主免疫系による認識を回避し、細胞の血漿膜を通過するのに十分小さいと思われる。したがって、本発明の方法および組成物は、研究、医学、治療および他の適用を含む、様々な異なる適用例で用いられる。したがって、本発明は当技術分野へのおおいなる貢献である。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
本発明は、添付の図面を共に読めば、前述の詳細な説明から最もよく理解される。一般的実施に従い、図面の様々な特徴は一定の比率で縮尺されていないことを強調する。一方、様々な特徴の寸法は明確のために任意に拡大または縮小している。図面には以下の図が含まれる。
【０１２８】
【図１】図1Aは、本明細書において用いることができるR基の分子構造を示す図である。図1Bは、図1AのR基を含む20の天然アミノ酸の分子構造を示す図である。
【図２】図2は、環式ペプチド機能を評価するために用いる方法を模式的に示す図である。
【図３】図3は、本発明の例示的ペプチドのFACSデータを示すグラフである。
【図４】図4は、細胞から単離したc[TMW]の質量分析データを示すグラフである（MSモード）。
【図５】図5は、細胞から単離したc[TMW]の質量分析データを示すグラフである（MS/MSモード）。
【図６】図6は、細胞から単離したc[SPD]の質量分析データを示すグラフである（LC/MSモード）。
【図７】図7は、細胞から単離したc[SPD]の質量分析データを示すグラフである（LC/MS/MSモード）。
【図８】図8は、n-ブタノールを用いて本ペプチドを単離する方法を模式的に示す図である。
【図９】図9は、n-ブタノール抽出により細胞から単離したc[TMW]の質量分析データを示すグラフである。
【図１Ａ−１】
2008516979.tif 000037
【図１Ａ−２】
2008516979.tif 000038
【図１Ｂ】
2008516979.tif 000039
【図２】
2008516979.tif 000040
【図３−１】
2008516979.tif 000041
【図３−２】
2008516979.tif 000042
【図４】
2008516979.tif 000043
【図５】
2008516979.tif 000044
【図６】
2008516979.tif 000045
【図７】
2008516979.tif 000046
【図８】
2008516979.tif 000047
【図９】
2008516979.tif 000048
【国際調査報告】
2008516979.tif 000049