(57)【要約】  ニトロ置換スクアラインレポーター色素、並びに、ニトロレダクターゼ酵素活性及びニトロレダクターゼ遺伝子発現を細胞アッセイにおいて検出するためにそのような色素を使用する方法が開示される。本発明の色素は構造式（Ｉ）を有し、式中、Ｚ１及びＺ２は独立にフェニル又はナフチル環系を表し、Ｘ及びＹは、酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び式（Ａ）の基から選択され、Ｒ１及びＲ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ、−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６及びＷ基から選択され（式中、ＰはＣＯＯＲ７、ＳＯ３−及びＯＨから選択され、Ｗは一置換又は二置換ニトロベンジルであり、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｐは１〜３の整数である。）、Ｒ３及びＲ４は、水素、ＮＯ２、ハロゲン、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りであり、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択され、Ｒ５はＣ１〜Ｃ６アルキルであって、ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りである。）、ＳＯ３−又はＯＨで適宜置換されていてもよく、Ｒ１基、Ｒ２基、Ｒ３基及びＲ４基の少なくとも１つが１個以上のＮＯ２基を含む。ニトロレダクターゼ酵素活性及びニトロレダクターゼ遺伝子発現に対する効果を測定すべき試薬のスクリーニング法も提供される。【化１】2008500828.tif 000036【化２】2008500828.tif 000037【選択図】  図１
2008500828.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物中のニトロレダクターゼ酵素活性を検出する方法であって、当該方法が、
ｉ）ニトロレダクターゼ活性を促進する条件下で組成物を色素分子と混合する段階と、
ｉｉ）ニトロレダクターゼ活性の尺度としての、上記色素分子の光学的性質の変化を測定する段階と
を含み、上記色素分子が、１個以上のＮＯ２基を含むスクアライン色素であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記組成物が１以上の細胞又は細胞抽出物を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該方法が、ニトロレダクターゼ酵素活性に対する効果を測定すべき試薬の存在下で実施される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
ｉ）ニトロレダクターゼをコードする配列と作用可能に連結した発現調節配列を含む核酸分子を形質移入した宿主細胞を色素分子と接触させる段階と、
ｉｉ）ニトロレダクターゼ活性の尺度としての、上記色素分子の光学的性質の変化を測定する段階とを含む方法であって、上記色素が、１個以上のＮＯ２基を含むスクアライン色素であることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記光学的性質の変化が色素分子の蛍光強度の増大であり、当該増大がニトロレダクターゼ活性の尺度としての、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記スクアライン色素が次の式（Ｉ）のものである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【化１】
2008500828.tif 000025
式中、
Ｒ３は環構造Ｚ１に結合しており、Ｒ４は環構造Ｚ２に結合しており、
Ｚ１及びＺ２は独立にフェニル又はナフチル環系を表し、
Ｘ及びＹは同一又は異なるもので酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び次式の基から選択され、
【化２】
2008500828.tif 000026
Ｒ１基及びＲ２基は独立にＣ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ、−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６及びＷ基から選択され（式中、ＰはＣＯＯＲ７、ＳＯ３−及びＯＨから選択され、Ｗは一置換又は二置換ニトロベンジルであり、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｐは１〜３の整数である。）、
Ｒ３基及びＲ４基は独立に水素、ＮＯ２、ハロゲン、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りであり、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択され、
Ｒ５はＣ１〜Ｃ６アルキルであって、ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りである。）、ＳＯ３−又はＯＨで適宜置換されていてもよく、
Ｒ１基、Ｒ２基、Ｒ３基及びＲ４基の少なくとも１つが１個以上のＮＯ２基を含む。
【請求項７】
前記色素が細胞透過性であるか、或いは細胞透過性にされる、請求項４乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記スクアライン色素のＲ１基及びＲ２基の一方又は両方がＷ基（Ｗは上記で定義した通りである。）である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記スクアライン色素が、以下の式の色素から選択される化合物である、請求項８記載の方法。
【化３】
2008500828.tif 000027
式中、
Ｘ及びＹは同一又は異なるもので酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び次式の基から選択され、
【化４】
2008500828.tif 000028
（式中、Ｒ５は上記で定義した通りである。）、
Ｒ１基及びＲ２基の少なくともいずれかがＷ基（Ｗは上記で定義した通りである。）であり、
残りのＲ１基又はＲ２基があれば、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ及び−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６から選択され（式中、ＰはＣＯＯＲ７、ＳＯ３−及びＯＨから選択され、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｐは１〜３の整数である。）、
Ｒ３基及びＲ４基は独立に水素、ハロゲン、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りであり、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択される。
【請求項１０】
Ｒ１基及びＲ２基の一方が、以下の基から選択されるＷから選択され、
【化５】
2008500828.tif 000029
残りのＲ１基又はＲ２基がメチル及びエチルから選択されるか、或いは−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ７ 基（式中、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、好ましくは５又は６である。）である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｗが次式の基であり、
【化６】
2008500828.tif 000030
残りのＲ１基又はＲ２基が上記で定義した通りである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記スクアライン色素のＲ３基及びＲ４基の一方又は両方がＮＯ２である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記スクアライン色素が以下の式の化合物である、請求項１２記載の方法。
【化７】
2008500828.tif 000031
式中、
Ｘ及びＹは同一又は異なるもので酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び次式の基から選択され、
【化８】
2008500828.tif 000032
（式中、Ｒ５は上記で定義した通りである。）
Ｒ１基又はＲ２基は独立にＣ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ及び−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６から選択され（式中、ＰはＣＯＯＲ７、ＳＯ３−及びＯＨから選択され、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｐは１〜３の整数である。）、
Ｒ３基及びＲ４基の少なくともいずれかがＮＯ２であり、
残りのＲ３基又はＲ４基があれば、水素、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択される。
【請求項１４】
ニトロレダクターゼ遺伝子発現に対する効果を測定すべき試薬のスクリーニング方法であって、当該方法が、
ａ）請求項４乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法を上記試薬の非存在下及び存在下で実施する段階と、
ｂ）試薬の非存在下及び存在下でのニトロレダクターゼ遺伝子発現量を測定する段階とを含み、
上記試薬の非存在下及び存在下でのニトロレダクターゼ遺伝子発現量の差が、ニトロレダクターゼ遺伝子発現に対する上記試薬の効果の指標となる、方法。
【請求項１５】
ニトロレダクターゼ遺伝子発現に対する効果を測定すべき試薬のスクリーニング方法であって、
ａ）請求項４乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法を上記試薬の存在下で実施する段階と、
ｂ）ニトロレダクターゼ遺伝子発現量を、試薬の非存在下でのニトロレダクターゼ遺伝子発現量についての対照値と比較する段階と
を含む方法。
【請求項１６】
前記対照値がデータベースその他の電子的フォーマットに電子的に記憶される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
以下の式の色素から選択される化合物。
【化９】
2008500828.tif 000033
式中、
Ｘ及びＹは同一又は異なるもので酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び次式の基から選択され、
【化１０】
2008500828.tif 000034
Ｒ１基及びＲ２基は独立にＣ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ、−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６及びＷ基から選択され（式中、ＰはＣＯＯＲ７、ＳＯ３−及びＯＨから選択され、Ｗは一置換又は二置換ニトロベンジルであり、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｐは１〜３の整数である。）、
Ｒ３基及びＲ４基は独立に水素、ＮＯ２、ハロゲン、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択され、
Ｒ５はＣ１〜Ｃ６アルキルであって、ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りである。）、ＳＯ３−又はＯＨで適宜置換されていてもよく、
Ｒ１基、Ｒ２基、Ｒ３基及びＲ４基の少なくとも１つが１個以上のＮＯ２基を含む。
【請求項１８】
Ｒ１基及びＲ２基の一方が次式の基であり、
【化１１】
2008500828.tif 000035
残りのＲ１基又はＲ２基が、メチル、エチル及び−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ７ 基（式中、Ｒ７は上記で定義した通りであり、ｎは１〜１０の整数である。）から選択される、請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
残りのＲ１基又はＲ２基が−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＲ７基及び−（ＣＨ２）６−ＣＯＯＲ７基（式中、Ｒ７は上記で定義した通りである。）から選択される、請求項１８記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１基及びＲ２基が独立にＣ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ７及び−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６から選択され（式中、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎ及びｐは上記で定義した通りである。）、
Ｒ３基及びＲ４基の少なくともいずれかがＮＯ２であり、
残りのＲ３基又はＲ４基が水素、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りであり、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択される、請求項１７記載の化合物。
【請求項２１】
ニトロレダクターゼ酵素活性の検出及び／又は測定用の基質としての、請求項１７乃至請求項２０のいずれか１項記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素アッセイの分野に関する。具体的には、本発明は、ニトロレダクターゼ酵素アッセイ、並びに細胞系中のニトロレダクターゼ酵素活性及びニトロレダクターゼ遺伝子発現を測定するための新規レポーター色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
レポーター遺伝子技術は、シグナル伝達及び遺伝子発現に関連する細胞事象をモニターするため広く使用されている。レポーター遺伝子の発現に共役した転写調節が、多種多様な細胞事象をモニターするため日常的に使用されている。レポーター遺伝子アッセイを確立するために、レポーター遺伝子がプロモーターの転写制御下又は最小限のプロモーターを備えるエンハンサーの転写制御下に置かれる。レポーターは、増殖抑制化合物（例えば、抗生物質など）に対する耐性を付与する選択マーカーを典型的には含有する好適なプラスミドベクターに挿入される。ベクターＤＮＡが、標準的な実験室手法を用して細胞に導入される。好適なアゴニストの添加によって、細胞のシグナル伝達経路にスイッチが入り、転写因子の活性化及び遺伝子発現がもたらされる。レポーター遺伝子技術の総説は、Ｎａｙｌｏｒ他によって、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９９）、５８、７４９〜７５７に示される。
【０００３】
細胞に基づく蛍光性の遺伝子レポーター系が記載されており、これは、細菌のニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）と、酵素の基質として機能する細胞透過性のニトロ置換消光型（又は非蛍光性）シアニン色素（これは以下の化合物（ｉ）として示される）とを用いるアッセイである（米国特許出願公開第２００３／０１８６３４８号、Ｔｈｏｍａｓ，Ｎ．他）。
【０００４】
【化１】
2008500828.tif 000003
原形質膜を通しての能動的拡散による基質の細胞取り込みは、潜在的極性官能基を遮蔽するためのエチルエステル基の使用によって促進された。細胞ヒドロラーゼによるこのエステル基の細胞内切断によって、生細胞の内部における基質が保持される。ニトロレダクターゼを発現する細胞に基質を加えると、ニトロ基がヒドロキシルアミンに還元され、蛍光放射が増大する。消光型シアニン色素の構造に依存して、ＮＴＲ反応の生成物からの蛍光放射が、広い波長域、典型的には５００ｎｍ〜９００ｎｍで生じる。長波長側での放射は、バックグラウンド蛍光の回避及び生物学的システムでの感度の増大に好都合である。
【０００５】
レポーター構築物から発現した野生型ニトロレダクターゼは宿主細胞の細胞質に局在化する（Ｓｐｏｏｎｅｒ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００１）、９３、１２３〜３０）。アッセイからの最大のシグナル出力を達成するためには、基質がニトロレダクターゼによる活性化のために利用できるように、基質をレポーター酵素と同じ細胞区画（即ち、宿主細胞の細胞質内）に局在化させることが望ましい。基質分子上の親水性の基、又は、基質分子に結合している親水性の基を遮蔽することによって、膜透過性の化合物が得られる。さらに、そのような遮蔽基は、基質を細胞内（好ましくは、細胞の細胞質内）で生じさせるために細胞内で基質から切断されるように設計することができる。ニトロ置換シアニン色素を細胞の細胞質に比較的均一に送達できるようにするための遮蔽方法論は、完全に成功しているとは立証されていない。蛍光顕微鏡を使用した、細胞透過性の消光型シアニン色素（Ｃｙ−Ｑ）誘導体の細胞内での局在化の研究では、内部の細胞膜及びオルガネラ（主として、細胞のミトコンドリア）に対する基質のある程度の局在化が示されている。親油性で、カチオン性のニトロ置換シアニン色素基質のミトコンドリア内での蓄積には、プローブの蛍光の増大が伴い、また、この蓄積はＮＴＲアッセイにおけるバックグランド蛍光の増大をもたらしている。従って、より低いバックグランド蛍光、改善された蛍光シグナル及び細胞分布を示すＮＴＲ基質として使用される新規且つ改善された試薬が求められている。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１８６３４８号明細書
【特許文献２】欧州特許第６４５６８０号明細書
【特許文献３】ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９７／４０１０４号明細書
【非特許文献１】Ｎａｙｌｏｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９９）、５８、７４９〜７５７
【非特許文献２】Ｓｐｏｏｎｅｒ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００１）、９３、１２３〜３０
【非特許文献３】Ｊａｎｓｅｎ，Ａ．Ｂ．Ａ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｔ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２１２７〜２１３２（１９６５）
【非特許文献４】Ｄａｅｈｎｅ，Ｗ．他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１３、６９７〜６１２（１９７０）
【非特許文献５】Ｍａｄｈｕ他、Ｊ．Ｏｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）、１４、５、ｐｐ３８９〜３９９
【非特許文献６】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、ｐｐ．１４．５〜１４．２０
【非特許文献７】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、ｐｐ．１６．５６〜１６．５７
【非特許文献８】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、ｐｐ．１６．３０〜１６．４６
【非特許文献９】Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９５）、３１Ａ、２３６２〜７０
【非特許文献１０】Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第２版、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．、１９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
バックグランド蛍光が低く、蛍光シグナル及び細胞分布の改善されたＮＴＲ基質として使用される新規な改良試薬に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
スクアリリウム（スクアライン）色素は、全体的な電気的中性を有する一群の色素であり、一例が以下の化合物（ｉｉ）として示される。
【０００８】
【化２】
2008500828.tif 000004
ニトロ置換スクアライン色素は、電子写真画像化プロセスに使用される近赤外吸収性の添加剤として欧州特許第６４５６８０号（Ｂｕｇｎｅｒ  Ｄ．他）から知られている。ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９７／４０１０４号（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＡＬ他）は、スクアライン色素、及び、スクアライン色素と生物学的分子（例えば、ペプチド、タンパク質及びヌクレオドなど）との付加物を開示する。色素は電子供与性置換基及び電子吸引性置換基（例えば、ニトロ）で置換し得る。しかし、ニトロ置換色素の蛍光特性は開示されていない。本発明者らは、今回、ニトロ基を含有する消光型スクアライン色素が、スクアライン色素の光学的性質の変化（好ましくは、スクアライン色素の蛍光放射の変化）をもたらすニトロ基の還元を介してニトロレダクターゼに対する効果的な基質であること見いだした。ニトロレダクターゼ活性を測定するためのアッセイにおけるニトロ置換スクアライン色素の使用は、従来のＮＴＲ基質を用いるアッセイの場合よりも大きい感度及び低いバックグランド蛍光をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の第１の態様では、組成物中のニトロレダクターゼ酵素活性を検出する方法であって、
ｉ）ニトロレダクターゼ活性を促進する条件下で組成物を色素分子と混合する段階と、
ｉｉ）ニトロレダクターゼ活性の尺度としての、上記色素分子の光学的性質の変化を測定する段階とを含み、
上記色素分子が、１個以上のＮＯ２基を含むスクアライン色素であることを特徴とする方法が提供される。
【００１０】
一実施形態では、ニトロレダクターゼ酵素活性が検出される組成物は１個以上の細胞又は細胞抽出物を含む。細胞はエクスビボでも、インビボでもよい。例えば、細胞は標準的な実験室条件のもとで培養してもよいし、組成物は動物の生細胞であってもよい。
【００１１】
別の実施形態では、当該方法は、ニトロレダクターゼ酵素活性に対する効果を測定すべき試薬の存在下で実施される。
【００１２】
本発明の第２の態様では、
ｉ）ニトロレダクターゼをコードする配列と作用可能に連結した発現調節配列を含む核酸分子を形質移入した宿主細胞を色素分子と接触させる段階と、
ｉｉ）ニトロレダクターゼ活性の尺度としての、上記色素分子の光学的性質の変化を測定する段階とを含み、
上記色素分子が、１個以上のＮＯ２基を含むスクアライン色素であることを特徴とする方法が提供される。
【００１３】
色素分子において測定される光学的性質は、好適には、色素に対する酵素の作用の結果としての蛍光放射の増大が存在するように蛍光放射強度である。例えば、組成物を第１の波長（好適には、色素の励起極大）で励起することができ、蛍光放射強度を、酵素反応の生成物の放射極大に対応する第２の波長で測定することができる。色素分子の励起及び蛍光放射の測定もまた、放射シグナルを最大にし、励起シグナル及び放射シグナルを区別するように、ある範囲の様々な波長にわたって可能である。或いは、光学的性質における測定された変化は、ニトロレダクターゼ酵素の作用の前後における色素の蛍光寿命の変化であってもよい。蛍光寿命の変化はまた、酵素反応の生成物を、基質として使用されている色素分子から区別するために使用することができる。さらなる代替として、光学的性質の変化は、生成物の吸収極大に対する色素分子の吸収極大の変化であってもよい。好ましい実施形態では、光学的性質の変化は色素分子の蛍光強度の増大であり、その増大はニトロレダクターゼ活性の量の尺度となる。
【００１４】
好適には、第１の態様及び第２の態様によるスクアライン色素は次の式（Ｉ）の化合物である。
【００１５】
【化３】
2008500828.tif 000005
式中、
Ｒ３は環構造Ｚ１に結合しており、Ｒ４は環構造Ｚ２に結合しており、
Ｚ１及びＺ２は独立にフェニル又はナフチル環系を表し、
Ｘ及びＹは同一又は異なるもので酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び次式の基から選択され、
【００１６】
【化４】
2008500828.tif 000006
Ｒ１基及びＲ２基は独立にＣ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ、−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６及びＷ基から選択され（式中、ＰはＣＯＯＲ７、ＳＯ３−及びＯＨから選択され、Ｗは一置換又は二置換ニトロベンジルであり、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｐは１〜３の整数である。）、
Ｒ３基及びＲ４基は独立に水素、ＮＯ２、ハロゲン、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りであり、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択され、
Ｒ５はＣ１〜Ｃ６アルキルであって、ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りである。）、ＳＯ３−又はＯＨで適宜置換されていてもよく、
Ｒ１基、Ｒ２基、Ｒ３基及びＲ４基の少なくとも１つが１個以上のＮＯ２基を含む。
【００１７】
好適には、式（Ｉ）のスクアライン色素は対イオンを含んでいてもよく、対イオンは、色素発色団又は置換基の形式荷電を釣り合わせる正イオンでも負イオンでもよい。対イオンの性質は本発明では重要でなく、多くの公知のイオンのいずれか（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、トリフルオロ酢酸塩（Ｆ３Ｃ−ＣＯ２−）、過塩素酸塩（ＣｌＯ４−）、Ｂｒ−又はＩ−など）でよい。
【００１８】
好適には、式（Ｉ）の色素に含まれる１個以上のニトロ基は環構造Ｚ１及び環構造Ｚ２に直接に結合することができる。この実施形態では、スクアライン色素のＲ３基及びＲ４基の一方又は両方がＮＯ２である。代わりの実施形態では、上記クアライン色素のＲ１基及びＲ２基の一方又は両方がＷ基（Ｗは上記で定義した通りである。）である。スクアライン色素はさらに、芳香族環構造に結合した１個又は２個のニトロ基で適宜置換されていてもよい。
【００１９】
好ましい様々な実施形態では、本発明の方法において用いられるスクアライン色素は細胞に対して透過性である。これらの実施形態では、Ｒ１基、Ｒ２基、Ｒ３基及びＲ４基の１個以上が細胞膜透過性の基を含む。膜透過性化合物は、より疎水性の化合物を提供するために親水性の基を遮蔽することによって作製することができる。遮蔽基は、由来する基質を細胞内で生じさせるために細胞内で基質から切断されるように設計することができる。基質はその膜透過性誘導体よりも親水性であるので、細胞内に捕捉される。好適な細胞膜透過基を、哺乳動物の内因性の細胞内エステラーゼによって容易に切断されるアセトキシメチルエステル（Ｊａｎｓｅｎ，Ａ．Ｂ．Ａ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｔ．Ｊ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２１２７〜２１３２（１９６５）；及び、Ｄａｅｈｎｅ，Ｗ．他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１３、６９７〜６１２（１９７０））、及び、ピバロイル基（Ｍａｄｈｕ他、Ｊ．Ｏｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）、１４、５、ｐｐ３８９〜３９９）から選択することができる。だが、他の好適な基が当業者によって認識される。
【００２０】
一実施形態では、スクアライン色素のＲ１基及びＲ２基の一方又は両方がＷ基（Ｗは上記で定義した通りである。）である。本発明の方法のこの実施形態では利用される具体的なスクアライン色素は、以下の式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）及び式（ＩＶ）の色素から選択されるスクアライン色素である。
【００２１】
【化５】
2008500828.tif 000007
式中、
Ｘ及びＹは同一又は異なるもので酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び次式の基から選択され、
【００２２】
【化６】
2008500828.tif 000008
（式中、Ｒ５は上記で定義した通りである。）、
Ｒ１基及びＲ２基の少なくともいずれかがＷ基（Ｗは上記で定義した通りである。）であり、
残りのＲ１基又はＲ２基があれば、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ及び−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６から選択され（式中、ＰはＣＯＯＲ７、ＳＯ３−及びＯＨから選択され、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｐは１〜３の整数である。）、
Ｒ３基及びＲ４基は独立に水素、ハロゲン、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りであり、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択される。
【００２３】
この実施形態では、好ましくは、Ｒ１基及びＲ２基の一方は、以下の基から選択されるＷから選択され、
【００２４】
【化７】
2008500828.tif 000009
残りのＲ１基又はＲ２基がメチル及びエチルから選択されるか、或いは−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ７ 基（式中、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、好ましくは５又は６である。）である。特に好ましい実施形態では、Ｗは次式の基であり、
【００２５】
【化８】
2008500828.tif 000010
残りのＲ１基又はＲ２基は上記で定義した通りである。
【００２６】
代わりの実施形態では、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）及び式（ＩＶ）によるスクアライン色素のＲ３基及びＲ４基の一方又は両方がＮＯ２である。この実施形態では、Ｘ及びＹは同一又は異なるもので酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び次式の基から選択され、
【００２７】
【化９】
2008500828.tif 000011
（式中、Ｒ５は上記で定義した通りである。）、
Ｒ１基又はＲ２基は独立にＣ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ及び−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６から選択され（式中、ＰはＣＯＯＲ７、ＳＯ３−及びＯＨから選択され、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｐは１〜３の整数である。）、
Ｒ３基及びＲ４基の少なくともいずれかがＮＯ２であり、
残りのＲ３基又はＲ４基があれば、水素、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択される。
【００２８】
好ましい実施形態では、Ｘ及びＹは、酸素、硫黄及び次式の基から選択される。
【００２９】
【化１０】
2008500828.tif 000012
式中、Ｒ５はメチルである。
【００３０】
好ましいＣ１〜Ｃ４アルキル基はメチル及びエチルから選択される。特に好ましい−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７は−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＲ７基及び−（ＣＨ２）６−ＣＯＯＲ７基（式中、Ｒ７は上記で定義した通りである。）から選択される。
【００３１】
ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される。
【００３２】
第３の態様では、ニトロレダクターゼ遺伝子発現に対する効果を測定すべき試薬のスクリーニング方法が提供される。この方法は、ａ）本発明の方法を上記試薬の非存在下及び存在下で実施する段階と、ｂ）上記試薬の非存在下及び存在下でのニトロレダクターゼ遺伝子発現量を測定する段階とを含み上記試薬の非存在下及び存在下でのニトロレダクターゼ遺伝子発現量の差が、ニトロレダクターゼ遺伝子発現に対する上記試薬の効果の指標である。
【００３３】
代わりの態様では、試薬のスクリーニング方法は、ａ）第２の態様による方法を上記試薬の存在下で行い、ｂ）ニトロレダクターゼ遺伝子発現量を、上記試薬の非存在下でのニトロレダクターゼ遺伝子発現量についての対照値との比較によって実施することができる。対照値はデータベースその他の電子的フォーマットに電子的に記憶できる。
【００３４】
様々な酵素遺伝子を哺乳動物細胞においてレポーター遺伝子として使用するための様々な方法が周知である（総説については、Ｎａｙｌｏｒ  Ｌ．Ｈ．（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、５８、７４９〜７５７を参照のこと）。レポーター遺伝子は、遺伝子の生成物が他の細胞タンパク質の存在下で測定可能であることを可能にするように選択され、宿主細胞における遺伝子発現の変化に応答し得る選択された調節配列の制御下で細胞に導入される。典型的な調節配列には、ホルモンに対して応答し得る調節配列、セカンドメッセンジャー、並びに、細胞の他の制御因子及びシグナル伝達因子が含まれる。例えば、７回膜貫通受容体に結合するアゴニストは、ｃＡＭＰ応答エレメント、ＮＦＡＴ、ＳＲＥ及びＡＰ１を含む様々なプロモーターエレメントを調節することが知られている。ＭＡＰキナーゼの活性化はＳＲＥの調節を生じさせ、これにより、Ｆｏｓ及びＪｕｎの転写を生じさせる。ＤＮＡの損傷はＤＮＡ修復酵素及び腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の転写の活性化を生じさせる。適切な調節配列の選択によって、レポーター遺伝子を、研究中の選択された調節配列を伴う細胞プロセスに対する添加された薬剤の効果をアッセイするために使用することができる。
【００３５】
レポーターとしての使用のために、ニトロレダクターゼ遺伝子を周知の方法によって単離することができ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によるｃＤＮＡライブラリーからの増幅によって単離することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、ｐｐ．１４．５〜１４．２０）。単離されると、ニトロレダクターゼ遺伝子は、研究中の遺伝子調節配列との連係及びその制御下での哺乳動物プロモーターとの使用のために好適なベクターに挿入することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、ｐｐ．１６．５６〜１６．５７）。ニトロレダクターゼレポーター配列及び関連する調節配列を含有するベクターは、その後、周知の技術を使用してトランスフェクションによって宿主細胞に導入することができ、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はリン酸カルシウムの使用によって宿主細胞に導入することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、ｐｐ．１６．３０〜１６．４６）。様々な他の好適な技術が当業者に周知である。ニトロレダクターゼは、この様式で発現させられたとき、細胞に保持されることが示されている（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９５）、３１Ａ、２３６２〜７０を参照のこと）。
【００３６】
本発明の方法は、生物種（例えば、ヒト、齧歯類、サル）、組織源（例えば、脳、肝臓、肺、心臓、腎臓、皮膚、筋肉）及び細胞タイプ（例えば、上皮細胞、内皮細胞）に関して任意の認められている供給源に由来する細胞タイプを含めて、標準的な組織培養用のプラスチック器具で培養できる任意の接着性の細胞タイプで使用することができる。様々な確立されたプロトコルを多様な細胞タイプの培養のために利用することができる（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第２版、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．、１９８７）を参照のこと）。選択された宿主細胞株は無菌の組織培養用の処理済みディッシュに接種され、好適な培地において、典型的には、１０％のウシ胎児血清＋２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地において５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃でインキュベーションされる。プラスミドベクターの哺乳動物細胞へのトランスフェクションを、周知の方法を使用して、例えば、カチオン性脂質、リン酸カルシウム及びエレクトロポレーションの使用によって達成することができる。トランスフェクション効率が、再現性のあるデータが得られることを確実にするために試験に先立ってそれぞれの細胞株について最適化されることが勧められる。ニトロレダクターゼの一過性発現が、典型的には、トランスフェクション後の２４時間〜７２時間でアッセイされる。調製されたニトロレダクターゼ遺伝子レポーターＤＮＡ／トランスフェクション試薬複合体がそれぞれのディッシュに滴下様式で加えられる。ディッシュの内容物が注意深く混合され、少なくとも４時間インキュベーションされる。５％ＣＯ２の加湿雰囲気における３７℃での一晩のインキュベーションが好都合である。インキュベーション後、培地がそれぞれのディッシュから除かれ、細胞の単層物が無菌のリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。トランスフェクションされた細胞をトランスフェクションディッシュにおいてそのままアッセイすることができ、或いはトランスフェクションされた細胞の懸濁物を作製するために、細胞をそれぞれのディッシュから剥がし、プールすることができる。ニトロレダクターゼの一過性発現が、典型的には、トランスフェクション後の２４時間〜７２時間でアッセイされる。
【００３７】
本発明による典型的なアデノウイルス型ＮＴＲ遺伝子レポーターアッセイにおいて、選択された宿主細胞株はウイルス形質導入に先立って２４時間継代培養され、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で一晩インキュベーションされる。細胞が、トリプシンを用いて剥がされ、各フラスコに由来する細胞が、細胞の懸濁物を作製するためにプールされる。懸濁状態の細胞が、好適な組織培養用の処理済みフラスコの底を覆うための十分な体積の完全培地において所定の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスと一緒にされ、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で一晩インキュベーションされる。細胞が、形質導入された細胞の懸濁物を作製するために剥がされる（トリプシン）。
【００３８】
好適には、ニトロレダクターゼ含有ベクターは、遺伝子レポーターアッセイに使用される一過性の細胞及び安定な細胞の両方を作製するために使用することができる。安定な細胞株を作製するために、好適な試薬（例えば、抗生物質Ｇ４１８など）を用いた選択が必要である。この手法によれば、細胞は、低密度で、好適には１００〜２００で好適なディッシュに接種されなければならず、また、選択剤を培地に加えなければならない。選択剤の最適な濃度は、細胞タイプ及び所要の成長速度に依存して変化し、好適には、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの間の濃度で添加される。
【００３９】
ニトロレダクターゼ活性に対する試薬の効果のアッセイのために、細胞がマイクロウェルプレートのウェルに、好ましくは、２４ウェル、９６ウェル、３８４ウェル又はより高密度のウェル（例えば、１５３６ウェル）を有するマイクロタイタープレートのウェルに分注される。３７℃での一晩のインキュベーションの後、培地が除かれ、試薬が血清非含有培地において加えられる。血清非含有培地のみを含有するウェルが対照として使用される。インキュベーション後、ニトロレダクターゼの基質が添加され、蛍光シグナルの増大が、好適な蛍光計又は画像化システムを使用して経時的に測定される。
【００４０】
研究中の調節配列による細胞応答を活性化する試薬の活性をアッセイするために、ニトロレダクターゼレポーターで形質移入した細胞が試薬とインキュベーションされ、その後、細胞透過性のスクアライン色素基質（例えば、１個以上のＮＯ２基を含むスクアライン色素など）が加えられる。増大した蛍光を放射する形態への色素基質の変換に要する適切な期間の後、細胞からの蛍光放射が、好適な蛍光計又は画像化システムを使用して、選択されたスクアライン色素について適切な波長で測定される。
【００４１】
典型的には、遺伝子レポーターアッセイが、レポーター遺伝子の検出のために、「停止された」条件のもとで、例えば、細胞の溶解のもとで行われる。従って、反応を所定の時間進行させ、その後、停止試薬（通常的には、界面活性剤）で停止させることが可能である。停止試薬の一例がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００であり、これは、細胞膜を破壊し、酵素活性を放出させるために使用される。加えて、細胞を、標準的な試薬（例えば、ホルムアルデヒドなど）を使用して「固定処理」することができ、ニトロレダクターゼ反応の生成物を細胞内に保持することができる。これは、読み取りのための好適な時間が得られるまで、アッセイプレートの保存を可能にする。
【００４２】
アッセイは、ニトロレダクターゼ活性に対する試薬の活性を測定するために一定の形式にされる場合、アッセイは基質の蛍光の連続測定のもとで実施できる。この形式では、基質の蛍光放射強度が連続的に変化する。反応の経時変化が得られ、速度論的研究がリアルタイムで可能となる。放射された蛍光の測定値を、試薬にさらされていない対照細胞からの蛍光測定値と比較することができ、調節配列で調節される遺伝子発現に対する試薬の効果が存在する場合、その効果は、対照細胞での蛍光に対する試験細胞での蛍光の比率から求められる。
【００４３】
蛍光強度の変化の測定を、光電子増倍管を検出器として含む装置（例えば、“Ｕｌｔｒａ”蛍光計（Ｔｅｃａｎ））を使用して、又は、マイクロタイタープレートのウェルのすべてを画像化するための電荷結合デバイス（ＣＣＤ）画像化装置（例えば、走査画像化装置又は領域画像化装置など）によって行うことができる。ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒＴＭシステムは、高密度のマイクロタイタープレートの蛍光画像化を１回の走査で可能にするＣＣＤカメラを特徴とする。画像化は定量的且つ迅速であり、画像化用途のために好適な計測は、現在では、マルチウェルプレートの全体を同時に画像化することができる。或いは、細胞を、ＩＮＣｅｌｌＴＭ１０００  Ａｎａｌｙｚｅｒ又はＩＮＣｅｌｌＴＭ３０００  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して「生細胞」形式で画像化することができる。この形式では、好適な細胞マーカー（例えば、還元された基質の蛍光放射とは異なり、識別可能である蛍光放射波長を有する細胞質ゾル蛍光標識、核蛍光標識又は膜蛍光標識など）を細胞に導入しなければならない。好適には、基質によって放射される蛍光の増大が、５００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲での波長で、好ましくは５５０ｎｍ〜７８０ｎｍの範囲での波長で、最も好ましくは６３０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲での波長で検出される。例えば、化合物（１）（実施例１）については、蛍光放射を、６３０ｎｍでの励起を用いて６４５ｎｍでモニターすることができる。或いは、色素を、好適に操作された遺伝子導入動物モデルにインビボで投与することができる。その後、ニトロレダクターゼの活性及び局在化を、好適な光学システム（例えば、ｅＸｐｌｏｒｅ  ＯｐｔｉｘＴＭ）を用いた画像化によって求めることができる。
【００４４】
別の態様では、本発明は、次式の色素から選択されるニトロ置換スクアライン色素を提供する。
【００４５】
【化１１】
2008500828.tif 000013
式中、
Ｘ及びＹは同一又は異なるもので酸素、硫黄、−ＣＨ＝ＣＨ−及び次式の基から選択され、
【００４６】
【化１２】
2008500828.tif 000014
Ｒ１基及びＲ２基は独立にＣ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ、−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６及びＷ基から選択され（式中、ＰはＣＯＯＲ７、ＳＯ３−及びＯＨから選択され、Ｗは一置換又は二置換ニトロベンジルであり、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｐは１〜３の整数である。）、
Ｒ３基及びＲ４基は独立に水素、ＮＯ２、ハロゲン、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択され、
Ｒ５はＣ１〜Ｃ６アルキルであって、ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りである。）、ＳＯ３−又はＯＨで適宜置換されていてもよく、
Ｒ１基、Ｒ２基、Ｒ３基及びＲ４基の少なくとも１つが１個以上のＮＯ２基を含む。
【００４７】
好ましくは、Ｘ及びＹは、酸素、硫黄及び次式の基から選択される。
【００４８】
【化１３】
2008500828.tif 000015
式中、Ｒ５はメチルである。
【００４９】
一実施形態では、Ｒ１基及びＲ２基の一方は次式の基であり、
【００５０】
【化１４】
2008500828.tif 000016
残りのＲ１基又はＲ２基は、メチル、エチル及び−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ７ 基（式中、Ｒ７は上記で定義した通りであり、ｎは１〜１０の整数で、好ましくは５又は６である。）から選択される。
【００５１】
代わりの実施形態では、Ｒ１基及びＲ２基が独立にＣ１〜Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ７及び−｛（ＣＨ２）２−Ｏ｝ｐ−Ｒ６から選択され、式中、Ｒ６はメチル又はエチルであり、Ｒ７はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及びＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ８（式中、Ｒ８はメチル又はｔ−ブチルである。）から選択され、ｎ及びｐは上記で定義した通りであり、
Ｒ３基及びＲ４基の少なくともいずれかがＮＯ２であり、
残りのＲ３基又はＲ４基は、水素、ＳＯ３−、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ及び−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７（式中、Ｒ７は上記で定義した通りであり、ｍは０又は１〜５の整数である。）から選択される。
【００５２】
本発明のスクアライン色素は、ニトロレダクターゼ酵素活性の検出及び／又は測定用の基質として、特に、ニトロレダクターゼ遺伝子発現量を細胞アッセイにおいて測定するための基質として有用である。
【００５３】
本発明の第１の態様による色素の例には、以下のような化合物が挙げられる：
ｉ）２−（１−メチル−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物１）；
ｉｉ）２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物２）；
ｉｉｉ）２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−ベンズインドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物３）；
ｉｖ）２−（３−エチル−６−ニトロ−２−ベンゾチアゾリニリデンメチル）−４−（１−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物４）；
ｖ）２−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−メトキシ−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−５−メトキシ−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物５）；
ｖｉ）２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−メトキシ−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−５−メトキシ−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物６）；
ｖｉｉ）３−（５−カルボキシペンチル）−１−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデンメチル−４−（（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−２−イル）メチレン）−３−オキソシクロブト−１−エン−１−オレート（化合物７）；及び
ｖｉｉｉ）２−（（３，３−ジメチル−５−スルホ−１−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）メチル）−４−（（１−メチル−６−ニトロキノリニウム−２−イル）メチレン）−３−オキソシクロブト−１−エン−１−オレート（化合物８）。
【実施例】
【００５４】
本発明は、図面及び実施例を参照してさらに例示される。
【００５５】
実施例１
２−（１−メチル−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物（１））の調製
【００５６】
【化１５】
2008500828.tif 000017
１．１ １−（３，５−ジニトロベンジル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージドの調製
２，３，３−トリメチルインドレニン（１．６４ｇ）に３，５−ジニトロベンジルヨージド（３．７１ｇ）及びジクロロベンゼン（１５ｍｌ）を加えた。９０℃に６時間加熱した後、混合物を冷却し、得られた析出物を濾過で除いた。固体をジクロロベンゼン（１０ｍｌで２回）及びエーテル（５０ｍｌで２回）で洗浄した。この物質を真空乾燥機で乾燥して、生成物を黄色の固体として得た（２．６９ｇ）。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｃ１８Ｈ１６Ｎ３Ｏ４の理論Ｍ＋３４０）３３９、３４０。
【００５７】
１．２ 化合物（１）の調製
１−（３，５−ジニトロベンジル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージド（１００ｍｇ）に、３−ヒドロキシ−４−（１，３，３−トリメチル−１，３−ジヒドロインドール−２−イリデンメチル）シクロブタ−３−エン−１，２−ジオン（５４ｍｇ）、ピリジン（２．２５ｍｌ）、酢酸（２．２５ｍｌ）及び無水酢酸（０．５ｍｌ）を加えた。混合物を６時間加熱還流した後、溶媒を、ローターエバポレーションを使用して除いた。残渣を水とジクロロメタンとの間で分配し、有機相を薄い炭酸水素ナトリウム水溶液及び１ＭのＨＣｌで順次洗浄した。溶媒を除き、シリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィーを行った（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）。得られた物質を逆相ＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ）でさらに精製した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｃ３４Ｈ３０Ｎ４Ｏ６の理論Ｍ＋５９０）５９１。
【００５８】
実施例２
２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物（２））の調製
【００５９】
【化１６】
2008500828.tif 000018
１−（３，５−ジニトロベンジル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージド（４６７ｍｇ）に、３，４−ジヒドロキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオン（１１０ｍｇ）、１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージド（３５４ｍｇ）、ピリジン（４．５ｍｌ）、酢酸（４．５ｍｌ）及び無水酢酸（１ｍｌ）を加えた。混合物を３時間加熱還流した後、溶媒を、ローターエバポレーションを使用して除いた。この粗製物をシリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭによる溶出）に供した。生成物を含有する画分を一緒にし、溶媒を除いた。得られた物質を逆相ＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ）でさらに精製した。
【００６０】
実施例３
２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−ベンゾインドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物（３））の調製
【００６１】
【化１７】
2008500828.tif 000019
３．１ ３−（５−カルボキシペンチル）−１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウムヨージドの調製
１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドレニン（１６．２ｇ）に６−ブロモヘキサン酸（３１．２ｇ）及びジクロロベンゼン（５０ｍｌ）を加えた。混合物を１１０℃で１３６時間加熱し、室温に冷却し、氷で冷却し、濾過した。フィルターケークをジクロロベンゼン（５０ｍｌ）及びジエチルエーテル（５０ｍｌ）で洗浄し、低真空下で４０℃で乾燥して、表題化合物をベージュ色の固体として得た（２５．３８ｇ）。
ＬＣＭＳ（Ｃ２１Ｈ２６ＮＯ２の理論Ｍ＋３２４）３２４。
【００６２】
３．２ 化合物（３）の調製
１−（３，５−ジニトロベンジル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージド（１３２ｍｇ）に、３−（５−カルボキシペンチル）−１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウムヨージド（１１４ｍｇ）、３，４−ジヒドロキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオン（３２ｍｇ）、ピリジン（４．５ｍｌ）、酢酸（４．５ｍｌ）及び無水酢酸（１ｍｌ）を加えた。混合物を９０℃に４時間加熱した後、溶媒を、ローターエバポレーションを使用して除いた。シリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィーを行い（ＥＡ／ＤＣＭ）、該当する画分を一緒にし、濃縮した。得られた物質を逆相ＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ）でさらに精製して、１．７ｍｇを得た。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｃ４３Ｈ４０Ｎ４Ｏ８の理論Ｍ＋７４０）７４１。
【００６３】
実施例４
２−（３−エチル−６−ニトロ−２−ベンゾチアゾリニリデンメチル）−４−（１−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物（４））の調製
【００６４】
【化１８】
2008500828.tif 000020
４．１ １−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムブロミドの調製
２，３，３−トリメチルインドレニン（１．５９ｇ）に１−ブロモ−２−（２−メトキシエトキシ）エタン（２．７５ｇ）及びジクロロベンゼン（５ｍｌ）を加えた。混合物を７０℃に一晩加熱した。揮発物を除き、物質をＨＰＬＣによって精製した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｃ１６Ｈ２４ＮＯ２の理論Ｍ＋２６２）２６３。
【００６５】
４．２ ２−メチル−６−ニトロベンゾチアゾールの調製
濃硫酸（８０ｍｌ）における２−メチルベンゾチアゾール（２２ｇ）を−５℃に冷却した。濃硫酸（１２ｍｌ）／濃硝酸（２０ｍｌ）の混合物を、温度を５℃未満で維持するように加えた（約１．５時間）。この後、混合物を室温に加温し、溶液を氷に注ぎ、黄色の析出物を得た。固体を濾過で除き、エタノールから再結晶した。濾過後、固体をエタノールで洗浄し、真空乾燥機で乾燥して、１８ｇの所望する生成物を得た。
ＬＣＭＳ（Ｃ８Ｈ６Ｎ２Ｏ２Ｓの理論Ｍ＋１９４）１９５。
【００６６】
４．３ ３−エチル−２−メチル−６−ニトロベンゾチアゾリウムヨージドの調製
２−メチル−６−ニトロベンゾチアゾール（０．３６ｇ）にヨウ化エチル（１．５ｍｌ）及びジクロロベンゼン（２０ｍｌ）を加えた。混合物を１２０℃に２日間加熱した後、室温に冷却した。酢酸エチルを加え、得られた析出物を濾過で除いた。真空乾燥域で乾燥して所望する物質を得た（８０ｍｇ）。
【００６７】
４．４ 化合物（４）の調製
３−エチル−２−メチル−６−ニトロベンゾチアゾリウムヨージド（４００ｍｇ）に、３，４−ジヒドロキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオン（１２８ｍｇ）、１−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムブロミド（４２０ｍｇ）、ピリジン（２０ｍｌ）、酢酸（１８ｍｌ）及び無水酢酸（８ｍｌ）を加えた。混合物を１２０℃に４時間加熱した後、室温に冷却した。揮発物をローターエバポレーションによって除いた。残渣をＤＣＭに溶解し、シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＥＡ／ＭｅＯＨ）を行った。物質を調製用ＴＬＣでさらに精製して、２３ｍｇを得た。
ＬＣＭＳ（Ｃ３０Ｈ３１Ｎ３Ｏ６Ｓの理論Ｍ＋５６１）５６０。
【００６８】
実施例５
２−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−メトキシ−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−５−メトキシ−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物（５））の調製
【００６９】
【化１９】
2008500828.tif 000021
５．１ ５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドールの調製
４−メトキシフェニルヒドラジン塩酸塩（４．８４ｇ）に３−メチル−２−ブタノン（６．４ｍｌ）及び酢酸（４５ｍｌ）を加えた。混合物を１００℃に２．５時間加熱した後、溶媒をローターエバポレーションによって除いた。フラッシュカラムクロマトグラフィーで生成物を得た（４．６６ｇ）。
δＨ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）１．３（６Ｈ，ｓ）、２．２（３Ｈ，ｓ）、３．８（３Ｈ，ｓ）、６．８（２Ｈ，ｍ）、７．４（１Ｈ，ｍ）。
【００７０】
５．２ １−エチル−５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージドの調製
５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（１．９ｇ）にヨードエタン（５ｍｌ）及び１，２−ジクロロベンゼン（１０ｍｌ）を加えた。混合物を８０℃に４時間加熱した後、混合物を冷却し、析出物を濾過で除き、ジクロロベンゼン及びジエチルエーテルで順次洗浄した。真空乾燥機で乾燥して生成物を得た（３ｇ）。
δＨ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）１．６（３Ｈ，ｔ）、１．６（６Ｈ，ｓ）、３．１（３Ｈ，ｓ）、３．９（３Ｈ，ｓ）、４．７（２Ｈ，ｑ）、７．１（２Ｈ，ｍ）、７．７（１Ｈ，ｍ）。
【００７１】
５．３ １−（３，５−ジニトロベンジル）−５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージドの調製
５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（１．９０ｇ）に３，５−ジニトロベンジルヨージド（４．６２ｇ）及び１，２−ジクロロベンゼン（１０ｍｌ）を加えた。混合物を７５℃で３時間加熱し、その期間中にオレンジ色の固体が分離した。その後、混合物を氷浴で冷却し、固体画分を濾過によって回収した。固体をジクロロベンゼン及びジエチルエーテルで順次洗浄し、真空下で乾燥して、生成物を得た（２．６２ｇ）。
δＨ（２７０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）１．６（６Ｈ，ｓ）、２．９（〜３Ｈ，ｓ）、３．８５（３Ｈ，ｓ）、６．１（２Ｈ，ｓ）、７．１（１Ｈ，ｄｄ）、７．５５（１Ｈ，ｄ）、７．８（１Ｈ，ｄ）、８．６５（２Ｈ，ｓ）及び８．８（１Ｈ，ｓ）。
【００７２】
５．４ 化合物（５）の調製
１−（３，５−ジニトロベンジル）−５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージド（２５０ｍｇ）に、３，４−ジヒドロキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオン（５５ｍｇ）、１−エチル−５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージド（１７５ｍｇ）、ピリジン（２．２５ｍｌ）、酢酸（２．２５ｍｌ）及び無水酢酸（０．５ｍｌ）を加えた。混合物を５時間加熱還流した後、溶媒を、ローターエバポレーションを使用して除いた。粗製物をＤＣＭと１ＭのＨＣｌとの間で分配した。有機層を水でさらに洗浄した。シリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィーを行い（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）、該当する画分を一緒にし、濃縮した。得られた物質を逆相ＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ）でさらに精製した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｃ３７Ｈ３６Ｎ４Ｏ８の理論Ｍ＋６６４）６６５。
【００７３】
実施例６
２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−メトキシ−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−５−メトキシ−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオレート（化合物（６））の調製
【００７４】
【化２０】
2008500828.tif 000022
６．１ １−（５−カルボキシペンチル）−５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムブロミドの調製
５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（１．９ｇ）に６−ブロモヘキサン酸（３ｇ）及び１，２−ジクロロベンゼン（１０ｍｌ）を加えた。混合物を１００℃に３時間加熱した後、室温に冷却した。ジエチルエーテルを加え、析出物を濾過によって分離した。真空乾燥機で乾燥して生成物を得た（３．１２ｇ）。
δＨ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）１．４（２Ｈ．ｍ）、１．５（６Ｈ，ｓ）、１．６（２Ｈ，ｍ）、１．８（２Ｈ，ｍ）、２．２（２Ｈ，ｍ）、２．８（３Ｈ，ｓ）、３．８（３Ｈ，ｓ）、４．４（２Ｈ，ｍ）、７．１（１Ｈ，ｍ）、７．５（１Ｈ，ｍ）、７．９（１Ｈ，ｍ）。
【００７５】
６．２ 化合物（６）の調製
１−（３，５−ジニトロベンジル）−５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージド（５００ｍｇ）（５．３を参照のこと）に、３，４−ジヒドロキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオン（１１４ｍｇ）、１−（５−カルボキシペンチル）−５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムブロミド（３８５ｍｇ）、ピリジン（４．５ｍｌ）、酢酸（４．５ｍｌ）及び無水酢酸（１ｍｌ）を加えた。混合物を１１０℃に４．５時間加熱した後、溶媒を、ローターエバポレーションを使用して除いた。この粗製物をＤＣＭと１ＭのＨＣｌとの間で分配した。有機層を水でさらに洗浄した。シリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィーを行い（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）、該当する画分を一緒にし、濃縮した。得られた物質を逆相ＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ）でさらに精製した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｃ４１Ｈ４２Ｎ４Ｏ１０の理論Ｍ＋７５０）７５１。
【００７６】
実施例７
３−（５−カルボキシペンチル）−１−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデンメチル−４−（（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−２−イル）メチレン）−３−オキソシクロブタ−１−エン−１−オレート（化合物（７））の調製
【００７７】
【化２１】
2008500828.tif 000023
７．１ ３−（５−カルボキシペンチル）−１−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウムブロミドの調製
６−（２，３−ジメチル−３Ｈ−インドール−３−イル）ヘキサン酸（１００ｍｇ）に１−ブロモ−２−（２−メトキシエトキシ）エタン（１ｍｌ）を加え、混合物を９０℃に一晩加熱した。冷えたとき、ジエチルエーテル（１０ｍｌ）を加え、物質を濾過で除いた。
ＬＣＭＳ（Ｃ２１Ｈ３２ＮＯ４の理論Ｍ＋３６２）３６３。
【００７８】
７．２ 化合物（７）の調製
３−（５−カルボキシペンチル）−１−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウムブロミドに、スクエア酸（４４ｍｇ）、１−（３，５−ジニトロベンジル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージド（１７７ｍｇ）、ピリジン（４．５ｍｌ）、酢酸（４．５ｍｌ）及び無水酢酸（１ｍｌ）を加えた。混合物を８０℃に一晩加熱した。冷えたとき、調製用ＨＰＬＣを行って、所望する物質を得た。
ＬＣＭＳ（Ｃ４３Ｈ４６Ｎ４Ｏ１０の理論Ｍ＋７７８）７７９。
【００７９】
実施例８
化合物（７）のアセトキシメチルエステル誘導体の調製
３−（５−カルボキシペンチル）−１−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデンメチル−４−（（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−２−イル）メチレン）−３−オキソシクロブタ−１−エン−１−オレート（１４ｍｇ）に、アセトニトリル（３ｍｌ、Ｈｕｎｉｇｓ塩基（３２μｌ）及び酢酸ブロモメチル（９ｕｌ）を加えた。室温で２時間撹拌した後、ＨＰＬＣを行って、所望する物質を得た（８ｍｇ）。
ＬＣＭＳ（Ｃ４６Ｈ５０Ｎ４Ｏ１２の理論Ｍ＋８５０）８５１。
【００８０】
実施例９
化合物（７）のエチルエステル誘導体の調製
エタノール（１０ｍｌ）にアセチルクロリド（１ｍｌ）を加え、その後、３−（５−カルボキシペンチル）−１−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデンメチル−４−（（１−（３，５−ジニトロベンジル）−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−２−イル）メチレン）−３−オキソシクロブタ−１−エン−１−オレート（２ｍｇ）を加えた。混合物を室温で５時間撹拌した後、揮発物を真空下で除いた。
ＬＣＭＳ（Ｃ４５Ｈ５０Ｎ４Ｏ１０の理論Ｍ＋８０６）８０７。
【００８１】
実施例１０
２−（（３，３−ジメチル−５−スルホ−１−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）メチル）−４−（（１−メチル−６−ニトロキノリニウム−２−イル）メチレン）−３−オキソシクロブタ−１−エン−１−オレート（化合物（８））の調製
【００８２】
【化２２】
2008500828.tif 000024
１０．１ １，２−ジメチル−６−ニトロキノリニウムヨージドの調製
２−メチル−６−ニトロキノリン（０．５ｇ、２．６６ｍｍｏｌ）及びヨードメタン（１ｍｌ、１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍｌ）中で一緒に４８時間加熱還流した。混合物を室温に冷却し、灰色の物質が溶液から結晶化し、これを濾過して除いた。これは出発物質であることが示された。ろ液を酢酸エチル（２００ｍｌ）で希釈して、黄／緑色の析出物を得た。生成物を濾過して除き、酢酸エチルで洗浄した後、真空下で乾燥した。生成物を黄／緑色の固体として得た（１４７ｍｇ、１６．８％）。
ＬＣＭＳ（Ｃ１１Ｈ１１Ｎ２Ｏ２の理論Ｍ＋２０３）Ｍ＋が２０３である１つだけの成分。
【００８３】
１０．２ ２，３，３−トリメチル−５−スルホ−１−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウムのカリウム塩の調製
２，３，３−トリメチルインドレニン−５−スルホネート（カリウム塩）（６ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）及び１，４−ブタンスルトン（５５ｍｌ）を一緒に窒素下において９０℃で２４時間加熱した。冷えたとき、反応混合部物を酢酸エチルで希釈し、得られた固体を濾過して除き、酢酸エチルで洗浄し、真空下で乾燥した。生成物を薄いピンク色の固体として得た（１０．３ｇ）。生成物を１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）によって特徴付けた。
【００８４】
１０．３ 化合物（８）の調製
１，２−ジメチル−６−ニトロキノリニウムヨージド（１００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、３，４−ジヒドロキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオン（３４．５ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）及び２，３，３−トリメチル−５−スルホ−１−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウムのカリウム塩（１２４ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を一緒に、ピリジン（３ｍｌ）、酢酸（３ｍｌ）及び無水酢酸（２ｍｌ）の混合物において１２０℃で１時間加熱した。反応混合物は、暗い緑／青色に変わることが認められる。冷えたとき、反応混合物を酢酸エチルに注いで、生成物を析出させた。生成物を濾過して除き、混合物を、水／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの溶出液混合物を使用するＲＰＨＰＬＣによって精製した。生成物を暗青色の固体として得た（１４ｍｇ）。
ＬＣＭＳ（Ｃ３０Ｈ３０Ｎ３Ｏ１０Ｓ２の理論Ｍ＋６５６）ＥＳ−は（Ｍ−Ｈ）２−の再構成を与え、Ｍ−を６５４において与える。
【００８５】
実施例１１
ニトロレダクターゼ遺伝子レポーターアッセイにおける基質としてのニトロ置換スクアライン色素（化合物（１））とニトロ置換シアニン色素（化合物（ｉ）及び化合物（ｉｉｉ））との比較研究
ＮＦ−κＢ応答エレメントをＮＴＲ遺伝子の上流側に含有するレポーター構築物をｐＤＣ５１１（ＡｄｍａｘＴＭ）において構築した。このレポーターをヘルパー細胞（ＨＥＫ２９３）においてＡｄ５のゲノムＤＮＡとパッケージングし、複製不能アデノウイルスを回収した。
【００８６】
ＨｅＬａ細胞をウイルス形質導入に先立って２４時間継代培養し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で、１０％のウシ胎児血清＋２ｍＭのＬグルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地において３７℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーションの後、細胞を、トリプシンを用いてそれぞれのフラスコから剥がし、細胞の懸濁物を作製するためにプールし、細胞濃度を求めた。ＨｅＬａ細胞の懸濁物を、組織培養フラスコの底を覆うための十分な最少体積の完全培地においてウイルスと所定の感染多重度（ＭＯＩ）で混合した（典型的には、Ｔ７５ｃｍ２のＣｏｓｔａｒフラスコにおいて１０６個の細胞について１５ｍｌ）。細胞／ウイルス懸濁物をインキュベーターに戻し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で一晩放置した。翌日、培地をそれぞれのフラスコから除き、細胞の単層物を５ｍｌ〜１０ｍｌのＰＢＳですすぎ洗いした。細胞を、トリプシンを用いて剥がし、形質導入された細胞の懸濁物を作製するためにプールした。細胞懸濁物の濃度を求め、５．０ｘ１０４細胞／ｍｌに調節した。２００μｌの細胞懸濁物を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに分注した（約１０４細胞／ウェル）。すべてのプレートを５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で一晩インキュベーションした。一晩の培地を２００μｌのＰＢＳと取り替えた。ＰＢＳを各ウェルから除き、血清非含有ダルベッコ改変イーグル培地におけるＴＮＦαアゴニスト（１００ｎｇ／ｍｌ、９０μｌ）と置き換え、又は、対照（９０μｌの血清非含有培地）を複製ウェルに加えた。プレートをインキュベーターに戻し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で２時間置いた。この後、化合物（ｉ）及び化合物（ｉｉｉ）（ニトロ置換シアニン色素）並びに化合物（Ｉ）（ニトロ−スクアライン色素）の１０μＭ溶液の１０μｌを複製ウェルに個々に分注し、プレートを５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃に戻した。蛍光シグナルをＴｅｃａｎ“Ｕｌｔｒａ”蛍光計で経時的にモニターした。すべての基質を、装置による人工的作用を避けるために、同一条件のもとで測定した。
【００８７】
図２では、ニトロ基含有スクアライン色素（化合物（１））の成績が、ニトロ基含有シアニン色素（化合物（ｉ）及び化合物（ｉｉｉ））と比較される。化合物（１）についてのシグナル対バックグラウンド比は、（化合物（ｉ）についての１．３：１と比較して）３：１であった。このことは、蛍光シグナルにおける類似する増大と一緒になった、バックグラウンド蛍光の減少を明瞭に明らかにしている。
【００８８】
実施例１２
ニトロレダクターゼ遺伝子レポーターアッセイにおける基質としてのニトロ置換スクアライン色素（化合物（１）及び化合物（２））の比較研究
実施例１１に記載される方法論と同じ方法論を使用して、ＨｅＬａ細胞をアデノウイルスのＮＦ−κＢレポーター系で形質導入した。適切な時間で、化合物（１）及び化合物（２）を複製ウェルに個々に加えた。蛍光シグナルをＴｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ蛍光計で経時的にモニターした。データを図３に示す。
【００８９】
化合物（２）は、アゴニスト（ＴＮＦ−α）の存在下で化合物（１）と比較したとき、アッセイシグナルの著しい増大を明瞭に示している。化合物（２）はまた、レポーターを含有する対照サンプル細胞における基礎的な転写活性を検出することができた。この基礎活性は、アゴニストではなく、ＮＦ−κＢレポーターを含有する細胞と、モック形質導入細胞との間では異なる。化合物（１）は、この低レベルの活性を検出するために十分な感度を有していなかった。アッセイ感度におけるこれらの改善は、改善された化合物の細胞内での利用性の直接的な結果であると考えられる。従って、化合物（２）は、発現したレポータータンパク質とも同じ区画である細胞の細胞質において利用可能であると考えられる。アッセイプレートの顕微鏡画像化は、強い赤色の細胞質染色をＮＴＲ発現後に有する細胞をもたらしている。
【００９０】
図２及び図３からのデータは、ニトロ置換スクアライン色素（化合物（２））の改善された性質が、色素へのスクアリリウム成分の導入及びヘキサン酸基の付加の両方の結果であることを例示している。化合物（ｉｉｉ）（ニトロ置換シアニン色素）におけるヘキサン酸基の存在は、化合物（ｉ）の細胞局在化を変化させるためにも、又は、ＮＴＲアッセイにおけるその成績を変化させるためにも十分ではなかった。
【００９１】
実施例１３
ＨｅＬａ細胞における化合物（２）の局在化
ＨｅＬａ細胞を１２０，０００個／ディッシュで置床し、１０％のウシ胎児血清＋２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地において３７℃で一晩インキュベーションした。一晩の培地を除き、１μＭの化合物（２）を含有する血清非含有培地の２ｍｌと置き換えた。ディッシュを２時間インキュベーションに戻した後、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡での画像化を行った。
【００９２】
図４は、ＨｅＬａ細胞における化合物（２）の取り込み及び分布を示す。化合物（２）がオルガネラに隔離されたことを示す証拠はなかった。細胞構造体のバックグラウンド標識化の証拠が認められるが、これはアッセイ成績を損なっていない。
【００９３】
実施例１４
生細胞ＮＴＲアッセイにおけるニトロレダクターゼ基質としての化合物（２）、化合物（３）及び化合物（４）の評価
ニトロ置換スクアライン色素（化合物（２）、化合物（３）及び化合物（４））のニトロレダクターゼ基質としての利用性のさらなる例が生細胞ＮＴＲアッセイにおいて示される（図５）。化合物（３）について図５に示されるデータは、より長い波長で発光するスクアライン色素基質が、色素の共役系を延ばすことによって得られることを示している。ヘキサン酸基の存在は、細胞の固定処理によって明らかにされるように、細胞内でのプローブの保持特性を増大させている。化合物（２）及び化合物（３）は、固定処理後におけるシグナルの低下がほとんどないことを示し、一方で、化合物（４）は固定処理後においてシグナルのほぼ５０％を失っている。
【００９４】
実施例１５
基質に対するＮＴＲの作用の後での吸収極大の変化の例
ＤＭＳＯにおける化合物（８）（１ｍＭｏｌ）（４μｌ）をＰＢＳ緩衝液（０．０１Ｍ）（１．７６ｍｌ）に希釈した。溶液のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを測定した。この基質は６８２ｎｍにおける吸収極大（ＡＵ＝０．２２）を有する。溶液にＮＡＤＨ（ＰＢＳにおいて０．０１Ｍ）（２００μｌ）及びＮＴＲ酵素（４４６ｎｇ／ｍｌ、３７μｌ）を加え、混合物を室温で３０分間放置した。この後、吸収スペクトルを再測定した。６２１ｎｍにおける新しい吸収極大（ＡＵ＝０．１７）が観測される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】実施例１１の場合のようにニトロレダクターゼ遺伝子レポーターアッセイにおける基質としての本発明のニトロ置換スクアライン色素（化合物（１））と比較される２つのニトロ置換シアニン型色素（化合物（ｉ）及び化合物（ｉｉｉ））の分子構造を示す。
【図２】ＮＴＲ遺伝子レポーターアッセイにおけるニトロ置換スクアライン（化合物（１））と比較される２つのニトロ置換シアニン色素（化合物（ｉ）及び化合物（ｉｉｉ））の比較を示す。
【図３】ニトロレダクターゼ遺伝子レポーターアッセイにおける基質としてのニトロ置換スクアライン色素（化合物（１）及び化合物（２））の比較研究を示す。
【図４】ＨｅＬａ細胞における化合物（２）の分布を示す。
【図５】生細胞ＮＴＲアッセイにおけるニトロレダクターゼ基質としての化合物（２）、化合物（３）及び化合物（４）の評価を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【国際調査報告】
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