(57)【要約】  本発明は、炎症性気道疾患の治療方法に関し、とりわけ喘息および慢性閉塞性肺疾患の治療方法に関する。本発明は、アレルギー性（アトピー性）および非アレルギー性（内因性）の両方の喘息に使用することができる。一形態において、この方法は、T細胞受容体(TCR)の１つ以上の機能を阻害することができる有効量の化合物を治療を必要とする被験体に投与することを含み、かかる化合物は、好ましくはペプチドであり、このペプチドの配列は、（a）TCRα膜貫通ドメイン；（b）TCRβ膜貫通ドメイン；（c）TCRα細胞内ドメイン；または（d）CD3−γ、δ、ε、ηもしくはξ鎖、の不変領域に由来する。【選択図】図４
2008500289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
気道または肺の炎症性疾患を治療するための方法であって、T細胞受容体(TCR)の１つ以上の機能を阻害することができるペプチドの有効量を、該治療を必要とする被験体に投与するステップを含み、
該ペプチドは、
（a）TCRα膜貫通ドメイン；
（b）TCRβ膜貫通ドメイン；
（c）TCRα細胞内ドメイン；または
（d）CD3−γ、δ、ε、ηもしくはξ鎖、
の不変領域に由来する配列を有する、上記方法。
【請求項２】
前記ペプチドが、式A-B-C-D-Eを有し、式中、
Aは存在しないか、またはグリシンおよび1個の疎水性アミノ酸、または1個もしくは2個の疎水性アミノ酸であり；
Bは陽電荷アミノ酸であり；
Cは3〜5個の疎水性アミノ酸から成るペプチドであり；
Dは陽電荷アミノ酸であり；および
Eは存在しないか、または8個までの疎水性アミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Cが3個または4個の疎水性アミノ酸から成るペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Cが4個の疎水性アミノ酸から成るペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Eが1〜8個のアミノ酸から成るペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Aが2個の疎水性アミノ酸であり、かつEが1〜3個の疎水性アミノ酸である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Eが1個の疎水性アミノ酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（a）Bがアルギニンであり、かつDがリジンであるか、または
（b）Bがリジンであり、かつDがアルギニンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、
NH2-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH (配列番号1)；
NH2-Leu-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val-OH (配列番号2)；
NH2-Gly-Phe-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH (配列番号3)； 
NH2-Val-Phe-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH (配列番号4)；
NH2-Phe-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val-OH (配列番号5)；
NH2-Ala-Arg-Leu-Pro-Val-Leu-Lys-Leu-Val-OH (配列番号6)； 
NH2-Arg-Val-Met-Ala-Pro-Arg-Ala-Leu-Leu-OH (配列番号7)；
NH2-Val-Lys-Leu-Phe-Pro-Val-Lys-Leu-Phe-Pro-OH (配列番号8)；
NH2-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Ile-Lys-Val-OH (配列番号9)；または
NH2-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH (配列番号10)である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドがNH2-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OHである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
化合物が、式P-Q-Pで表されるペプチドであり、式中、
Pが疎水性アミノ酸であるか、または2〜12個のアミノ酸から成る疎水性ペプチドであり、
Qがシステインまたは荷電したアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Pが疎水性アミノ酸または２〜６個のアミノ酸から成る疎水性ペプチド配列である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１３】
化合物が式W-X-Yで表されるペプチドであり、式中、
Wが、存在しないか、または１〜５個のアミノ酸であり；
Xが、システインまたは荷電したアミノ酸であり；および
Yが、２〜１０個のアミノ酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
Wが、アラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、グリシン、メチオニン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンおよびセリンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Yが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギンおよびシステインからなる群から選択されるアミノ酸であり、そして
Xが、荷電したアミノ酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
荷電したアミノ酸が、アルギニン、リジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが、
NH2-Met-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-OH (配列番号11)；
NH2-Leu-Asp-Ile-Leu-Leu-Leu-Glu-Val-OH (配列番号12)；
NH2-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-Ala-Gly-Phe-OH (配列番号13)；
NH2-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-Ala-Gly-OH (配列番号14)；
NH2-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Gly-Val-OH (配列番号15)；
NH2-Leu-Gly-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH (配列番号16)；
NH2-Ile-Leu-Leu-Gly-Lys-Ala-Thr-Leu-Tyr-OH (配列番号17)；
NH2-Leu-Leu-Met-Thr-Leu-Arg-Leu-Trp-Ser-Ser-OH (配列番号18)；
NH2-Ile-Ile-Val-Thr-Asp-Val-Ile-Ala-Thr-Leu-OH (配列番号19)；
NH2-Ile-Val-Ile-Val-Asp-Ile-Cys-Ile-Thr-OH (配列番号20)；
NH2-Phe-Leu-Phe-Ala-Glu-Ile-Val-Ser-Ile-OH (配列番号21)；
NH2-Tyr-Gly-Arg-Ala-Asp-Cys-Gly-Ile-Thr-Ser-OH (配列番号22)；
NH2-Trp-Gly-Arg-Ala-Asp-Cys-Gly-Ile-Thr-Ser-OH (配列番号23)；
NH2-Tyr-Gly-Arg-Ala-Asp-Cys-Ile-Thr-Ser-OH (配列番号24)；および
NH2-Ser-Ser-Asp-Val-Pro-Cys-Asp-Ala-Thr-Leu-Thr-OH (配列番号25)からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドが、
NH2-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Gly-Val-OH (配列番号15),
NH2-Leu-Leu-Met-Thr-Leu-Arg-Leu-Trp-Ser-Ser-OH (配列番号18)または
NH2-Ile-Val-Ile-Val-Asp-Ile-Cys-Ile-Thr-OH (配列番号20)である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドが、NH2-Ile-Val-Ile-Val-Asp-Ile-Cys-Ile-Thr-OH (配列番号20)である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドが、システイン残基を含み、かつTCRα鎖とTCRβ鎖との鎖間ジスルフィド結合を不安定化することができる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
炎症性肺疾患を治療するための方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のペプチドであって、そのC末端が脂質部分に化学的にコンジュゲートしている該ペプチドの有効量を、該治療を必要とする被験体に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項２１】
前記脂質部分が、2〜30個の炭素原子からなる飽和、一不飽和または多価不飽和の脂肪酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記脂質部分が、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)またはエタノールアミンにカップリングされている脂肪酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記脂質部分が、N-パルミトイル-S-[2,3-ビス(パルミトイルオキシ)プロピル]システイン(Pam3Cys)であるか、または２個のアシル置換基のみが存在するその類似体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
気道または肺の炎症性疾患を治療するための方法であって、T細胞受容体(TCR)の１つ以上の機能を阻害することができるペプチドの有効量を、被験体に投与するステップを含み、
該ペプチドは、
（a）TCRα膜貫通ドメイン；
（b）TCRβ膜貫通ドメイン；
（c）TCRα細胞内ドメイン；または
（d）CD3−γ、δ、ε、ηもしくはξ鎖、
の不変領域に由来する配列を有する、上記方法。
【請求項２５】
前記ペプチドのC末端が、脂質部分に化学的にコンジュゲートされている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記気道または肺の炎症性疾患が喘息である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記気道または肺の炎症性疾患が、慢性閉塞性肺疾患である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ペプチドが、静脈内、皮下、気管内、気管支内、鼻腔内に、または吸入を介して投与される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ペプチドが、吸入を介して投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ペプチドが、エアロゾル、噴霧器または乾粉吸入器を用いて投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
a）請求項１〜１９のいずれか一項に記載のペプチド、または
b）請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の脂質コンジュゲート、
と共に、吸入による投与に適合された製薬上許容される担体を合わせて含む、組成物。
【請求項３２】
密封したバイアル、容器またはカートリッジに入れた既に投与できる形態である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物が無菌である、請求項３１または３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記組成物が、安定剤および／またはバルク剤を含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記密封したバイアル、容器またはカートリッジが、吸入によって被験体に前記組成物を送達することに適合された吸入器である、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記吸入器が、エアロゾル、噴霧器または乾粉送達装置を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記吸入器がエアロゾルを含む、請求項３５および３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記吸入器が乾粉形態の組成物を送達する、請求項３５または３６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記吸入器が噴霧器を含む、請求項３５または３６に記載の組成物。
【請求項４０】
前記組成物を使用前に再構成することを要しない、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
（a）請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物、または
（b）請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の脂質コンジュゲート、と共に
製薬上許容される担体を合わせて含む組成物を含み、患者が投与するのに適した剤形である、製品。
【請求項４２】
前記剤形が、ヒトの気道または肺の炎症性疾患を治療または予防するための説明書のラベルを含むか、または該説明書を伴う、請求項４０に記載の製品。
【請求項４３】
既に投与できる形態である組成物を含む密封したバイアル、容器またはカートリッジである、請求項４０に記載の製品。
【請求項４４】
前記組成物が無菌である、請求項４０または４１に記載の製品。
【請求項４５】
前記組成物が、安定剤および／またはバルク剤を含む、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の製品。
【請求項４６】
前記密封したバイアル、容器またはカートリッジが、吸入により患者に前記組成物を送達するのに適合した吸入器である、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の製品。
【請求項４７】
前記吸入器がエアロゾルを含む、請求項４３に記載の製品。
【請求項４８】
前記吸入器が、乾粉形態の組成物を送達する、請求項４４または４５に記載の製品。
【請求項４９】
前記吸入器が噴霧器を含む、請求項４４に記載の製品。
【請求項５０】
前記組成物が、使用する前に再構成することを要しない、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の製品。
【請求項５１】
前記気道または肺の炎症性疾患が喘息である、請求項３８〜４７のいずれか一項に記載の製品。
【請求項５２】
前記気道または肺の炎症性疾患が、慢性閉塞性肺疾患である、請求項３８〜４７のいずれか一項に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その全体が本明細書中に参考として援用される米国仮特許出願第60/574592号（2004年5月27日出願）の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、炎症性気道疾患の治療方法に関連し、とりわけ、喘息および慢性閉塞性肺疾患の治療方法に関する。本発明は、アレルギー性(アトピー性)喘息および非アレルギー性(内因性)喘息の両方に用いることが可能である。
【背景技術】
【０００３】
多数の先行技術文献が、背景技術の情報を記述するために本明細書中に引用されるが、これらの参考文献のいずれもが、オーストラリアまたは他の国において、当該分野の一般的知識の一部を構成するということを承認するものではないということが、明確に理解されるであろう。参考文献の考察において、それらの著者が主張する事柄が述べられているが、本出願人らは引用された文書の正確性および妥当性に対して異議を述べることができる。
【０００４】
いくつかの参考文献は、本発明の特定の特徴を述べる文書に詳細に記載されている。特許または特許出願を含む、このような参考文献は、本明細書中に参考文献として援用される。
【０００５】
喘息は、肺気道の断続的、可逆的、広範性の収縮によって特徴付けられる慢性疾患であり、かかる収縮は正常な肺には影響を及ぼさない種々の刺激物のいずれかに対して反応する。喘息は、気管支の慢性的な炎症および奇異性狭小化、ならびに制限された気流、粘液産生および咳からなる再発性急性発症がある。アレルゲン（花粉、カビの胞子、ペットまたは他の動物の鱗屑およびハウスダストのダニなど）または環境的トリガー（タバコの煙もしくは他の空気の汚れなど）によって生じる症状としては、とりわけ、呼吸における喘鳴、息切れ、呼吸困難、および胸の締め付けが挙げられる。他のトリガーとしては、感染（感冒および上部呼吸器感染、ウイルスまたは副鼻腔感染など）、刺激物（香水または洗剤の強い香りなど）、運動または激しい活動、温度または湿度の変化、ストレスおよび強い情動が挙げられる。アレルゲンによって引き起こされる喘息は一般的に、アレルギー性喘息またはアトピー性喘息として知られている。
【０００６】
１型（即効性）免疫応答は、子供および多くの大人における喘息の発症において重要な役割を果たしうる。しかし、疾患の発症が、成人期で生じた場合、アレルギー因子を同定することは困難でありうる。
【０００７】
喘息は、大きく以下の二種類に分けられる。それはアレルギー性またはアトピー性喘息としても知られる外因性喘息と、内因性または非アトピー性喘息である。これら二つの喘息のサブクラスを、それぞれアレルギー性喘息および非アレルギー性喘息と、本明細書中ではいう。これら喘息の二つの型の免疫病理学は、Humbert M.ら（1999）によって概説されている。アレルギー性喘息は、好酸球および２型ヘルパーT細胞（Th2）の気管支粘膜への浸潤、特異的な免疫グロブリンE（IgE）抗体の循環系における存在、一般的な風媒性アレルゲンに対する皮膚検定の陽性反応、および気道の過剰反応性によって特徴付けられる。B細胞によるIgE合成は、インターロイキン-4（IL-4）によって刺激されると考えられ、好酸球の移動性は、インターロイキン-5（IL-5）によって刺激されると考えられる。アレルギー性喘息に対して、非アレルギー性喘息に罹患している患者は、皮膚検定陰性であり、臨床または家族性のアレルギーの病歴を有さず、また、一般的なアレルゲンに対する特異的なIgE抗体を有さない。さらに、非アレルギー性喘息の患者は一般的に、アレルギー性喘息の患者よりも高齢であり、その症状は晩年になって初めて現れ、しばしばより重篤な臨床過程を示す。
【０００８】
気管支の生検試料を用いた研究によって、上記両方の喘息型が、好酸球およびIL-4、IL-5またはこれら両方のサイトカインを分泌するTh2細胞の浸潤、CCケモカインおよびFcεRI+細胞の存在、ならびにε生殖系列転写物（Iε）およびIgEのε重鎖（Cε）のmRNAを発現する細胞によって特徴付けられたことが示された。唯一の明確な相違点は、アレルギー性喘息を罹患する患者と比べて、非アレルギー性喘息を有する患者におけるGM-CSF受容体αサブユニットを発現するCD68+マクロファージの顕著な増加であった(Humbert M.ら、1999)。T細胞とB細胞の両方が、喘息反応に関与しており、とりわけ、IgEの産生において、T細胞とB細胞両方の反応を調節することが、外因性および内因性の喘息を治療することに有用であると期待される。
【０００９】
12〜1500万人のアメリカ人が喘息に冒され、そこにはおよそ10％〜12％の18歳未満の子供が含まれる。喘息を有する全患者の約10％〜33％が、非アレルギー型である。喘息の家族性病歴を有する人々は、疾患発症の高い危険性を有する。喘息はまた、アレルギーを有する人々、またはタバコの煙に曝されている人々にとって、より一般的なものである。喘息はしばしば、小児期または十代で発症し、最も一般的な慢性的な小児疾患である。40歳未満の人でより一般的ではあるが、喘息はいずれの年齢においても発症しうる。
【００１０】
喘息の治療は、薬物を用いること、および喘息のトリガーを避けることに重点を置く。かかる薬物は、炎症を制御し、慢性的な症状を防止し（長期制御薬物）、また喘息の発作が生じた時にそれを治療（迅速に軽減する薬物）する。以下の２つの喘息薬物の一般的な型が存在する:
（a）抗炎症性薬物。かかる薬物は、進行中の喘息の発作を防ぐ。「コルチコステロイド」とも称されるステロイドは、喘息に罹患している人々にとって抗炎症性薬物の１つの重要種類である。これらの薬物は、気道における腫脹および粘液産生を低減する。その結果、気道の感受性が低下し、トリガーに対して反応しにくくなる。
【００１１】
(b)気管支拡張剤。かかる薬剤は、気道の周囲を締める筋肉のバンドを弛緩させることによって、喘息の症状を軽減する。この作用によって、気道を迅速に開き、より多くの空気を肺に出入りさせる。その結果、呼吸が改善される。気管支拡張剤はまた、肺から粘液を取り除くのに役立つ。気道が開いたとき、粘液は自由に移動し、咳によって容易に外に排出することができる。
【００１２】
これら従来の薬物に加えて、IgEに対する組換えヒト化モノクローナル抗体（Xolair； Genentech, Inc）が、2003年6月に承認された。この抗体はマスト細胞および好塩基球に対するIgEの結合をブロックし、そうして気道の収縮を引き起こすアレルギー性反応を抑制する。
【００１３】
炎症を防ぐことは、喘息の発作、喘息による入院および死亡を防ぐために重要である。長期制御薬物を、長期にわたって毎日摂取して、持続的な喘息の制御を達成および維持する。かかる持続的な喘息は、週に２回以上の症状および活動に影響する頻繁な発作を生じる。
【００１４】
最も有効な長期制御薬物は、抗炎症性薬物であるが、他にも、しばしば抗炎症性薬物と共に用いられ抗炎症性薬物の効果を高めるものがある。これら薬物としては、以下のものが挙げられる：
１．コルチコステロイド：吸入形態は、持続的な喘息のための選択の抗炎症性薬物である；
２．マスト細胞安定剤：抗炎症性薬物；
３．長期作用型β-アゴニスト:しばしば抗炎症性薬物と共に用いられる気管支拡張剤；
４．テオフィリン:抗炎症性薬物と共に用いて夜間の症状を防ぐための気管支拡張剤；
５．ロイコトリエン改質剤:ステロイドおよびマスト細胞安定剤の代替物。
【００１５】
これら全ての薬物の有効利用性にもかかわらず、喘息はしばしば、制御することが非常に難しく、毎年喘息の急性発作（喘息重積状態）によって、（特に子供たちの）頻繁な入院、およびかなり数の死亡をもたらす。
【００１６】
喘息は、アレルギー性肺胞炎とはまったく異なる病状であると考えられる。かかるアレルギー性肺胞炎は、外因性アレルギー性肺胞炎、アレルギー性間質性肺炎、外因性アレルギー性肺炎または過敏性肺炎としても知られている。外因性アレルギー性肺胞炎は、比較的稀な肺障害であり、一般的に特定の職場において、有機的な塵を繰り返し吸入することによって生じる。急性型では、呼吸器の症状と発熱が、塵に曝された数時間後に起こる。慢性型は、刺激物に数年にわたって曝されてきた肺組織における漸進的な変化によって特徴付けられる。砂糖きび肺、浴槽の再仕上げ工の肺、鳥またはハトのブリーダー病、チーズ作業者の肺、酵素洗浄剤過敏症、エポキシ樹脂肺、農作業者の肺、研究室技術者の肺、モルト作業者の肺、メープル樹皮をはぐ人の疾患、キノコ採取をする人の疾患、キノコ作業者の肺、かぎタバコ収集者の肺、プラスチック作業者の肺、家禽畜産者の疾患、セクオイオシス（sequoiosis）、コルク肺、人工呼吸による間質性肺炎、およびコムギゾウムシ病など様々な病名が付けられており、これらの名前は惹起する因子によって決まる。
【００１７】
慢性閉塞性肺疾患（COPD）（慢性閉塞性肺疾患（COLD）または慢性気流閉塞症（CAO）としても知られる）は、肺気腫、閉塞性細気管支炎および慢性気管支炎からなる主な疾患群である。COPDは、米国における死亡原因の第４位であり、身体障害の原因である。およそ1500万人のアメリカ人が、COPDに冒されており、女性の発症が増加している。COPDは、慢性的な進行性疾患の過程であり、これは最も一般的には喫煙の結果であるが、他の肺刺激物（産業上の粉塵または化学蒸気など）に長期間曝されることによっても引き起こされうる。遺伝的要因、不十分な出生時体重または肺感染を繰り返すことによって、COPDへの罹患率が高まりうる。COPDは長期にわたって（しばしば10〜30年間にもわたって）発症し、60歳以上にて最も一般的に診断される。従って、COPDは一般に、高齢者の疾患と考えられる。COPDは、呼吸困難、喘鳴および慢性的な咳によって特徴付けられる。治療としては、禁煙、進行した疾患を有する患者に気管支拡張剤および酸素を用いるものが挙げられ、そして肺気腫の患者は、外科手術を受けて、肺容積を減少させるのがよい。COPD患者は、症状の周期的な増悪にかかり、この増悪は、息切れの急速な増加によるものであり、致命的でもありうる。
【００１８】
慢性気管支炎（CB）は、一または複数の気管支の炎症であり、一般的に感染による二次的なものであり、気管支における粘液の過剰な産生によって特徴付けられ、頻発する咳を伴う。かかる咳は、少なくとも連続して２年間、そのうち１年に少なくとも３ヶ月間続く。CBは、肺の主要な非喘息性疾患である。多くの様々な要因が、CBを引き起こし、かかる要因としては、タバコの喫煙、環境汚染、慢性的な感染および種々の遺伝的異常が挙げられる。これらの要因のうち、タバコの喫煙が最も広く認められている。肺における病理学的な変化としては、以下のものが挙げられる:
（１）気管支の粘液分泌腺の肥大化および過形成、
（２）杯細胞の増加、
（３）繊毛の消失または損傷、および
（４）慢性的な炎症の変化および小気道の狭小化。
【００１９】
細菌感染またはウイルス感染もしばしばある。過剰量の粘液が、気道に見出され、時々、小細気管支を閉塞しうる。最終的に、気管支の壁を傷つけうる。咳は、保持した粘液によって刺激され、かかる粘液は、繊毛の減少および粘膜毛様体のクリアランス機能の低下によって、適切に除去することができない（Svartengrenら、1996）。気管支炎の患者が、咳をすることによって保持した粘液を排除することが重要である。しかし、しばしば咳することは、粘液の分泌を適切に除去することに有効でなく、それは気管支炎の患者が、保持された分泌物を末梢に流す気流を生じるのに十分なほど深く呼吸できないためである。
【００２０】
肺気腫は、肺の症状であり、肺の肺胞嚢に対する損傷より生じ、一般的に長期にわたる喫煙によって引き起こされる。この損傷は、組織における空気の病理学的な蓄積を生じる。
【００２１】
肺気腫、閉塞性細気管支炎および慢性気管支炎におけるT細胞およびB細胞の機能を阻害することによる慢性的な炎症の減少ならびに、小気道の狭小化の症状を罹患する患者におけるその症状の低減によって、一般的な衰弱性疾患による健全な身体への負荷を減少させる。
【００２２】
T細胞受容体（TCR）は、少なくとも７個の膜貫通型タンパク質から成る。ジスルフィド結合（αβ-Ti）のヘテロダイマーは、クローン形質の抗原認識単位を形成し、一方、CD3の不変鎖（γ、δ、ε、ζおよびη鎖から成る）は、シグナル経路に結合しているリガンドをカップリングするために作用し、かかるシグナル経路は、T細胞の活性化および細胞性免疫応答の同化作用を生じる。TCRポリペプチド鎖をコードする遺伝子の多様性にもかかわらず、２つの構造的特徴が、全ての既知のTCRサブユニットについて一般的なものである。第一に、TCRサブユニットは、単一膜貫通ドメインを有する膜貫通型タンパク質であり、かかるドメインはおそらくα-ヘリカルである。第二に、全てのTCR鎖は、予測される膜貫通ドメイン内に荷電したアミノ酸を保有することからなる独特の特徴を共有する。不変鎖は、マウスとヒトとの間で保存されている単一の負電荷を有し、変異鎖は、１個（TCRβ）または２個（TCRα）の正電荷を保有する。
【００２３】
国際特許出願 PCT/AU96/00018およびPCT/AU97/00367 （Northern Sydney Area Health Services）は、ペプチドを開示し、かかるペプチドは、抗原に対する哺乳動物T細胞受容体(TCR)の機能を阻害することができる。これら二つの文書の全内容は、本明細書中に参照として援用されている。これらのペプチドを、以下の知見に基づいて設計した：TCR-α鎖とCD3-δおよびCD3-εサブユニットとの間の安定した相互作用は、TCR-αの膜貫通ドメイン内の８個のアミノ酸に配置されていたこと、ならびに荷電したアミノ酸がこの相互作用に重要であったこと（PCT/AU96/00018に開示されている）。さらなるペプチドは、CD3-δ、-εおよび-γ鎖の代替鎖アセンブリ領域、TCR-αβ鎖間ジスルフィド結合相互作用領域、およびコアペプチド（GFRILLLKV（ヒト）またはGLRILLLKV（マウス））の下流領域に対応するペプチド由来の配列に基づいていた。これらは、PCT/AU97/00367に開示されている。これらのペプチドは、細胞内に入り込むことが可能であり、アジュバント誘導可能である関節炎のラットモデルにおけるin vivoでのT細胞媒介性炎症の症状を低減できることを示した。これらの結果は、文献（Manoliosら、1997）にも報告されていた。この文書の全内容は、本明細書中に参照として援用されている。
【００２４】
ペプチドが、種々の障害を治療することに有用であることが報告されていた。かかる障害においては、T細胞が関与し、またはT細胞が病態部に移動する（リウマチ様関節炎を含む）。これらペプチドのうちの１つは、TCR-α鎖の膜貫通ドメイン内の９個のアミノ酸領域に対応し、in vitroおよびin vivoにおいてT細胞機能を抑制でき、抗原誘導刺激に続く、インターロイキン-2の産生を阻害することができる（Wangら、2002）。また、「コアペプチド」と称される9個のアミノ酸ペプチド（Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val）が、接触性過敏症の発症を阻害することが、感受性動物に接触性アレルゲンを塗布した後にかかるペプチドを局所的に塗布した場合に示されている（EnkおよびKnop 2000； Gollnerら、2000； Manoliosら、2002）。EnkおよびKnopならびにGollnerらはまた、かかるペプチド配列をコードする裸の（naked）DNAを、接触性アレルゲンを用いる前に皮下注射することによって、接触性過敏症の発症を防いだことを示した。このペプチドは、乾癬、アトピー性湿疹、扁平苔癬、または接触性皮膚炎を有するヒト患者において治療活性を示した。またこのペプチドまたはそれをコードするDNAが、ヒトT細胞媒介性皮膚疾患を治療する際に、コルチコステロイドの代替物として有用であることを、彼らは結論付けた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者らは今回、アレルゲンでチャレンジする前にTCR模倣ペプチドを投与することによって、白血球および好酸球の肺組織への浸潤（とりわけ好酸球の浸潤）における顕著な低減、気管支肺胞洗浄液中の好酸球ペルオキシダーゼおよびミエロペルオキシダーゼの活性における低減、ならびに全身の容積変動測定法によって測定した場合気道閉塞症に顕著な低減をもたらすことを見出した。
【００２６】
第一の態様において、本発明は、気道または肺の炎症性疾患を治療するための方法を提供する。この方法は、被験体に有効量のペプチドを投与するステップを含み、かかるペプチドは、T細胞受容体(TCR)の１つ以上の機能を阻害することができ、かつ
（a）TCRα膜貫通ドメイン；
（b）TCRβ膜貫通ドメイン；
（c）TCRα細胞内ドメイン；または
（d）CD3−γ、δ、ε、ηもしくはξ鎖
の不変領域に由来する配列を有する。
【００２７】
一実施形態において、化合物がペプチドであり、かかるペプチドはそのサブユニットがTCR複合体を形成することを阻害できる。
【００２８】
本発明のこの態様の一形態において、ペプチドは式 A-B-C-D-Eを有し、式中、
Aは存在しないか、またはグリシンおよび1個の疎水性アミノ酸であるか、または1個もしくは2個の疎水性アミノ酸であり；
Bは陽電荷アミノ酸であり；
Cは1、2、3、4もしくは5個の疎水性アミノ酸から成るペプチドであり；
Dは、陽電荷アミノ酸であり；ならびに
Eは存在しないか、または1、2、3、4、5、6、7もしくは8個の疎水性アミノ酸である。
【００２９】
本発明のこの形態の一実施形態において、Cは3、4または5個の疎水性アミノ酸、好ましくは3個または4個の疎水性アミノ酸、好ましくは4個の疎水性アミノ酸から成るペプチドである。
【００３０】
第二の実施形態において、Aは2個の疎水性アミノ酸であり、Eは1、2または3個の疎水性アミノ酸、より好ましくは1個の疎水性アミノ酸である。
【００３１】
第三の実施形態において、
（a）Bはアルギニンであり、かつDはリジンであるか、または
（b）Bはリジンであり、かつDはアルギニンである。
【００３２】
第四の実施形態において、Eは1、2、3、4、5、6、7または8個のアミノ酸から成るペプチドである。
【００３３】
第五の実施形態において、ペプチドは、
NH2-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH (配列番号:1)；
NH2-Leu-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val-OH (配列番号:2)；
NH2-Gly-Phe-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH (配列番号:3)；
NH2-Val-Phe-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH (配列番号:4)；
NH2-Phe-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val-OH (配列番号:5)；
NH2-Ala-Arg-Leu-Pro-Val-Leu-Lys-Leu-Val-OH (配列番号:6)；
NH2-Arg-Val-Met-Ala-Pro-Arg-Ala-Leu-Leu-OH (配列番号:7)；
NH2-Val-Lys-Leu-Phe-Pro-Val-Lys-Leu-Phe-Pro-OH (配列番号:8)；
NH2-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Ile-Lys-Val-OH (配列番号:9)；または
NH2-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH (配列番号:10)である。
【００３４】
好ましくは本実施形態において、ペプチドはGly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Valである。
【００３５】
本発明のこの態様の第二の形態において、化合物は式NH2-P-Q-P-COOHで表されるペプチドであり、式中、
Pは、疎水性アミノ酸または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12個のアミノ酸からなる疎水性ペプチドであり、
Qは荷電したアミノ酸である。
【００３６】
本発明のこの形態の特異的な実施形態において、
（a）Pは、疎水性アミノ酸または、2、3、4、5もしくは6個のアミノ酸からなる疎水性ペプチド配列であり；
（b）Pは、少なくとも１個の疎水性アミノ酸を含み、荷電したアミノ酸を含まず、そして好ましくは、疎水性ペプチドを構成する少なくとも50％のアミノ酸が疎水性アミノ酸である。より好ましくは、疎水性ペプチドを構成する少なくとも80％のアミノ酸が疎水性アミノ酸である；
（c）このペプチド配列がTCRα膜貫通ドメインに由来する場合、Qは、陽電荷アミノ酸であり、好ましくはリジンまたはアルギニンである；
（d）このペプチド配列が、CD3-γ、δまたはε膜貫通ドメインに由来する場合、Qは負に荷電したアミノ酸でありうる。このペプチド配列が、CD3-δまたはεドメインに由来する場合、Qはアスパラギン酸でありうる。このペプチド配列が、CD3-γドメインに由来する場合、Qはグルタミン酸でありうる；および
（e）このペプチドは、システイン残基を含み、TCRα鎖とTCRβ鎖の鎖間ジスルフィド結合を不安定化できる。
【００３７】
好ましくはこのペプチドは、以下の配列からなる群より選択される：
NH2-Met-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-OH (配列番号:11)；
NH2-Leu-Asp-Ile-Leu-Leu-Leu-Glu-Val-OH (配列番号:12)；
NH2-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-Ala-Gly-Phe-OH (配列番号:13)；
NH2-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-Ala-Gly-OH (配列番号:14)；
NH2-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Gly-Val-OH (配列番号:15)；
NH2-Leu-Gly-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH (配列番号:16)；
NH2-Ile-Leu-Leu-Gly-Lys-Ala-Thr-Leu-Tyr-OH (配列番号:17)；
NH2-Leu-Leu-Met-Thr-Leu-Arg-Leu-Trp-Ser-Ser-OH (配列番号:18)；
NH2-Ile-Ile-Val-Thr-Asp-Val-Ile-Ala-Thr-Leu-OH (配列番号:19)；
NH2-Ile-Val-Ile-Val-Asp-Ile-Cys-Ile-Thr-OH (配列番号:20)；
NH2-Phe-Leu-Phe-Ala-Glu-Ile-Val-Ser-Ile-OH (配列番号:21)；
NH2-Tyr-Gly-Arg-Ala-Asp-Cys-Gly-Ile-Thr-Ser-OH (配列番号:22)；
NH2-Trp-Gly-Arg-Ala-Asp-Cys-Gly-Ile-Thr-Ser-OH (配列番号:23)；
NH2-Tyr-Gly-Arg-Ala-Asp-Cys-Ile-Thr-Ser-OH (配列番号:24)；および
NH2-Ser-Ser-Asp-Val-Pro-Cys-Asp-Ala-Thr-Leu-Thr-OH (配列番号:25)。
【００３８】
より好ましくはペプチドは、
NH2-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Gly-Val-OH、
NH2-Leu-Leu-Met-Thr-Leu-Arg-Leu-Trp-Ser-Ser-OHまたは
NH2-Ile-Val-Ile-Val-Asp-Ile-Cys-Ile-Thr-OH、である。
【００３９】
本発明のこの態様の第三の形態において、化合物は、式NH2-W-X-Y-COOHで表されるペプチドであり、式中
Wは、存在しないか、または1、2、3、4または5個のアミノ酸であり；
Xは、システインまたは荷電したアミノ酸であり；
Wは、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸からなるペプチド配列である。
【００４０】
一実施形態において、ペプチドはTCR-β鎖に由来する。好ましくはYは、4または5個のアミノ酸から成るペプチドであり、少なくとも１個の疎水性アミノ酸を含む。
【００４１】
本発明のこの態様の第四の形態において、
Wは、アラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、グリシン、メチオニン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸であり、
Yは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギンおよびシステインからなる群より選択されたアミノ酸であり、そして
Xは、荷電したアミノ酸である。
【００４２】
特にそこに開示されたペプチド類である、TCR-α鎖配列のTCR-α鎖末端の最後の１５アミノ酸中に、種の範囲を超えた完全な配列相同性が存在すること、ならびに、これらの付加的な15残基を含むペプチド類もまた、抗炎症性の活性をもつ可能性があることが、PCT/AU96/00018に示された。さらに、ペプチドのカルボキシ末端における改変（脂質担体とのコンジュゲートによる改変など）は、ペプチドの機能を変化させなかった。
【００４３】
したがって、第二の態様において、本発明は、炎症性肺疾患を治療するための方法を提供する。この方法は、有効量の上記ペプチドを投与するステップを含み、かかるペプチドのC末端またはN末端のいずれかは、脂質部分に化学的にコンジュゲートされている。この脂質部分は、吸収および／または細胞膜の横断を容易にする。
【００４４】
一実施形態において、脂質部分は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個の炭素原子からなる脂肪酸であり、飽和脂肪酸、一不飽和脂肪酸または多価不飽和脂肪酸でありうる。好ましくは脂肪酸は、パルミトイル、ミリストイル、ステアロイルまたはデカノイルである。
【００４５】
代替的な実施形態において、脂質部分は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（TRIS；トロメタミンとしても知られている）またはエタノールアミンにカップリングされた脂肪酸である；好ましくは脂肪酸は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18個、より好ましくは10、11、12、13、14、15、16、17または18個、最も好ましくは16個の炭素原子有する。特に好ましい実施形態において、脂質部分はTRIS（モノパルミチン酸）またはTRIS（トリパルミチン酸）である。
【００４６】
好適なTRIS-脂肪酸およびその製造方法は、米国特許第5,583,198号および同第5,869,606号およびWhittakerら1993に記載されており、これらの全開示内容は、本明細書中に参照として援用されている。
【００４７】
別の代替的な実施形態において、脂質部分は、N-パルミトイル-S-[2,3-ビス(パルミトイルオキシ)プロピル]システイン（Pam3Cys； Wiesmullerら、1983）もしくは別のN-アシル-S-(2-ヒドロキシアルキル)システイン（米国特許第5,700,910号に記載される）であるか、またはアシル置換基が２個だけ存在する類似体（例えば、S-[2,3-ビス(パルミトイルオキシ)プロピル]システイン)Pam2Cys； Metzgerら1995）である。これら文書の全開示内容は、本明細書中に参照として援用されている。
【００４８】
気道または肺の炎症性疾患は、アレルギー性喘息と非アレルギー性喘息の両方を含むと考えられる喘息、または肺気腫、慢性気管支炎および閉塞性細気管支炎を含む慢性閉塞性肺疾患（COPD）でありうる。
【００４９】
一実施形態において、気道または肺の炎症性疾患は喘息である。第二の実施形態において、気道または肺の炎症性疾患はCOPDである。第二の実施形態の一形態において、化合物は炎症を減少させ、それによって小気道の狭小化を低減する。肺気腫は、肺への損傷（例えば、長期にわたる喫煙の結果）により生じるか、α1-アンチトリプシの先天的な欠乏によって生じうる。
【００５０】
アレルギー性喘息と非アレルギー性喘息の両方が、好酸球ならびにIL-4およびIL-5分泌Th2細胞の気管支粘膜への浸潤によって特徴付けられるために、本発明が、喘息の両サブクラスを包含することが明瞭に理解されるであろう。
【００５１】
ペプチドまたはペプチドコンジュゲートを、静脈内、皮下、気管内、気管支内、鼻腔内または吸入を介して投与することができる。好ましくはペプチドを、吸入を介して投与する。
【００５２】
本発明のペプチドが、B細胞の機能およびT細胞の機能を阻害できることが、最近示された（Huynhら、2003）。IgE抗体反応は、アレルギー性喘息と非アレルギー性喘息の両方に含まれる。従って、第四の態様において、本発明は喘息の治療方法を提供する。この方法は、有効量の化合物を治療を必要とする被験体に投与するステップを含み、かかる化合物は、B細胞によるIgEの産生を阻害することができる。
【００５３】
別の実施形態において、化合物は、本発明の第一および第二の態様について記載されたものである。この方法は、本発明の第三の態様に記載された組成物を投与することを含みうる。
【００５４】
哺乳動物は、ヒトであっても、家畜またはペットであってもよい。本発明の化合物が、ヒトの医療に用いることに好適であることが特に考えられるが、この化合物はまた、獣医治療（ペット（イヌおよびネコなど）ならびに家畜（ウマ、ウシおよび羊）または動物園の動物（非ヒト霊長類、ネコ科の動物、イヌ科の動物、ウシ科、および有蹄動物など））に用いることもできる。
【００５５】
第三の態様において、本発明は、上記のペプチドまたはペプチド-脂質コンジュゲートと共に、製薬上許容される担体を含む組成物を提供する。かかる担体は、吸入による投与に適合されている。
【００５６】
一実施形態において、組成物は投与できる形態で、密封したバイアル、容器またはカートリッジに入っている。好ましくは組成物は無菌である。
【００５７】
組成物は場合により、安定剤および／またはバルク剤を含んでもよい。
【００５８】
一実施形態において、密封したバイアル、容器またはカートリッジは、吸入を介して患者に組成物を送達することに適合した吸入器である。吸入器は、エアロゾル、噴霧器または乾粉送達装置を備えうる。好ましくは吸入器は、エアロゾルを含む。
【００５９】
好ましくは吸入器は、噴霧器を備える。
【００６０】
好ましくは吸入器は、乾粉形態である組成物を送達する。さらに好ましくは組成物は、使用する前に再構成を要しない。
【００６１】
さらなる態様において、本発明は製品を提供する。かかる製品は、本発明による１個または複数のペプチドを含む組成物を含み、かかる組成物は患者が投与するのに好適な剤形である。
【００６２】
好ましくは剤形は、ヒトの気道または肺の炎症性疾患を治療または予防するための説明書のラベルを含むか、または説明書を伴う。
【００６３】
好ましくは剤形は、投与できる状態の医薬組成物を含む密封したバイアル、容器またはカートリッジであり、かかる医薬組成物は、本発明による１個または複数のペプチドを含む。
【００６４】
好ましくは医薬組成物は、無菌である。
【００６５】
好ましくは医薬組成物は、安定剤を含む。
【００６６】
好ましくは医薬組成物は、バルク剤を含む。
【００６７】
好ましくは密封したバイアル、容器またはカートリッジは、吸入を介して患者に医薬組成物を送達するのに適合した吸入器である。
【００６８】
好ましくは吸入器は、エアロゾルを含む。
【００６９】
好ましくは吸入器は、乾粉形態である医薬組成物を送達する。好ましくは医薬組成物は、使用する前に再構成することを要しない。
【００７０】
本発明の全ての態様において、気道または肺の炎症性疾患は好ましくは、喘息であり、より好ましくはアレルギー性喘息である。
【００７１】
医薬組成物を製造するための方法および医薬担体が、当該分野において周知である（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20版, Williams & Wilkins, Pennsylvania, USAなどの教科書に示されている）。
【００７２】
本発明の化合物および組成物は、任意の好適な経路によって投与することができ、当業者であれば、治療すべき症状に対して最も好適な経路およびを用量を容易に決定することができる。投薬量は、主治医または獣医の裁量によってきまり、治療する症状の性質および状態、治療する被験体の年齢および普段の健康状態、投薬経路、ならびに管理されてきたであろうこれまでの治療によって左右される。
【００７３】
担体または希釈剤、および他の賦形剤は、投薬経路によって決定され、この場合もまた当業者であれば、個々のケースそれぞれのために、最も好適な製剤を容易に決定することができる。
【００７４】
吸入によって送達するためのペプチドおよびポリペプチドの製造方法は、当該分野において周知である。例えば、Nektar Therapeutics（以前はInhale Therapeutic Systems）は、タンパク質、ペプチドおよび他の分子を吸入によって肺へ送達するための乾粉製剤および送達装置を長年開発している。さらに、インスリン用AERxTM肺送達装置（Aradigm Corporation）が現在、第III相臨床試験にある。
【００７５】
本発明によるペプチドをコードする核酸分子、ペプチドのペプチド模倣類似体、またはペプチド、核酸もしくはペプチド模倣体のいずれかのエステル、塩もしくはプロドラッグもまた、本発明の範囲内であることが明瞭にわかるであろう。ペプトイドが本発明の範囲内であることも、明瞭にわかるであろう。ペプトイドは、ペプチド模倣オリゴマーの原型的なおよび比較的保守的な例である。ペプトイドは、側鎖付加体の様式においてペプチドと異なる。特に、ペプトイドオリゴマーの側鎖はシフトして、主鎖窒素原子のペンダント基となる。しかし、ペプトイド骨格上の原子配列は、対応するペプチドの原子配列と同一である。
【００７６】
当業者に容易に理解されるように、疎水性アミノ酸としては、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、TyrおよびMetが挙げられ；陽電荷アミノ酸としては、Lys、ArgおよびHisが挙げられ；そして陰電荷アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
詳細な説明
T細胞応答は、ヘルパーT細胞として知られるT細胞のサブクラスによって媒介される。２つのサブタイプ、Th-1およびTh-2が存在する。これらTh-1およびTh-2の細胞サブタイプは、共通の前駆体（Th-0細胞と称される）より派生すると考えられる。Th-1およびTh-2サブタイプの特徴である相互に排他的なサイトカイン産生のパターンに対して、Th-0細胞は、ほとんどまたは全てのサイトカインを産生する。Th-1およびTh-2サブタイプの異なるサイトカインの放出プロファイルは、エフェクター機構および細胞障害性細胞の選択において活性的な機能を果たす。Th-1細胞によって分泌されたIL-2およびγ-インターフェロンは、マクロファージおよび細胞障害性細胞を活性化する傾向があるが、Th-2細胞によって分泌されるIL-4、IL-5、IL-6およびIL-10は、好酸球およびマスト細胞の産生を高めるだけではなく、IgEを含む抗体の産生を高め、また細胞障害性細胞の機能を減少させる傾向がある。一度確立されると、Th-1またはTh-2の応答パターンは、サイトカイン産生によって維持され、かかるサイトカインは、別のサブセットの産生を阻害する。Th-1細胞によって産生されるγ-インターフェロンは、Th-2サイトカイン（IL-4およびIL-10など）の産生を阻害し、一方Th-2細胞によって産生されるIL -10は、Th-1サイトカイン（IL -2およびγ-インターフェロン）の産生を阻害する。Th-1細胞サブセットおよびTh-2細胞サブセットによって産生されるサイトカイン間の微妙なバランスが乱されることによって、宿主の障害を引き起こす。特に、Th-2 サイトカインの過剰な産生は、アレルギー性障害（アナフィラキシー性過敏症、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、春季結膜炎、湿疹、じん麻疹および食品アレルギーなど）を引き起こす(Umetsuら、1997)。
【００７８】
喘息の発症に関連する免疫応答は、混合した組織病理学的な特徴を有し、急性免疫応答と慢性的な細胞媒介性免疫応答の両方の特徴を示す。この応答は、好中球、好酸球、マクロファージ、およびリンパ球による気管支粘膜への浸潤によって特徴付けられる（CorriganおよびKayの総説（1992）を参照のこと）。さらに、好塩基球は、走化性因子の供給源としても関与する。
【００７９】
喘息が、抗原特異的なTH2型応答によって引き起こされることを多くの研究が示唆する（CorriganおよびKay, 1992； Robinsonら, 1992； Romagnaniら, 1991； Kay, 1991； Walkerら, 1991）。
【００８０】
喘息反応の発症は、CD4+ Tリンパ球によって制御され、かかるリンパ球は、リンホカイン産生の特徴的なTh2パターンを生じ（KayおよびCorrigan, 1992）、これはIL-4、IL-5、およびIL-10の発現を伴う（MosmannおよびMoore 1989； Mosmannら1986)。これらリンホカインの個々の機能は、喘息反応において機能を果たす。IgE（IL-4）の発現（Zhangら1992）および好酸球増加（IL-4/IL-5）（Spryら1992）は共に、喘息反応の特徴である（Del Prete, 1992）。
【００８１】
喘息の主な特徴は、気管支肺胞洗浄(BAL)液中の好酸球の蓄積である（CorriganおよびKay 1992； ArmおよびLee 1992； Diazら1989）。好酸球はまた、気管支粘膜損傷誘導の原因となる主な細胞として関与し、喘息反応に関連する気管支閉塞症を引き起こすと考えられる（CorriganおよびKay 1992； Djukanovicら1990； Walkerら1993）。IL-4媒介性好酸球増加は、トランスフェクトした腫瘍細胞（Tepperら1989）およびトランスジェニックマウス (Tepperら1990)を用いた研究で示されている。かかる研究は、IL-4が好酸球応答の主な誘導因子であることを示唆している。
【００８２】
T細胞媒介性応答のこの重要な機能は、喘息治療における免疫抑制剤（コルチコステロイドなど）の広範な用途の基礎となる。
【００８３】
TCRは、少なくとも７個の膜貫通型タンパク質からなる。ジスルフィド結合（α,β-Ti）ヘテロダイマーは、クローン形質の抗原認識単位を形成し、一方ε、γ、δ、ζおよびη鎖から成るCD3の不変鎖は、リガンドのTCRに対する結合をシグナル伝達経路にカップリングさせ、その結果、T細胞を活性化させ、また細胞性免疫応答の同化作用を生じる。TCR鎖の遺伝子多様性にもかかわらず、既知のサブユニットの全てについて２つの構造的特徴が共通する。第一に、これらサブユニットは、単一の膜貫通ドメインを有する膜貫通型タンパク質であり、かかる膜貫通ドメインは、α-ヘリカルである。第二に、全てのTCR鎖は、予測される膜貫通ドメイン内に荷電したアミノ酸を保有する独特の特徴を有する。不変鎖は、マウスとヒトの間で保存された単一の陰電荷を有し、変異鎖は、１個（TCRβ）または２個（TCRα）の陽電荷を保有する。
【００８４】
表1は、いくつかの種のTCRαの膜貫通配列を示し、かかる領域が、系統学的に高度に保存されていることを示す。これは、この領域が重要な機能的役割を有していることを示す。種間の置換は、非常に保存されている。
【表１】
2008500289.tif 000003
【００８５】
本発明に用いるペプチドの１つの群は、TCRαの膜貫通ドメインの一部に基づく。かかる部分の完全なマウスの配列は、
NLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSであり、そして対応するヒトの配列は、
NLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLである。
【００８６】
太字で示される本発明のペプチドの基になるTCRα鎖配列のTCRα鎖末端の最後の15アミノ酸中に、種の範囲を超えた完全な配列相同性が存在する。これらの付加的な15残基を含むペプチドは、本発明のペプチドの活性と類似した活性を有することが予想される。この本質的な特徴とは、TCRα膜貫通配列由来ペプチドが、3〜5個の疎水性アミノ酸によって隔てられている２個の陽電荷アミノ酸を含むことである。さらに、PCT/AU96/00018に示されるように、ペプチドは、活性を失うことなく、そのカルボキシ末端を改変することができる。アミノ末端の改変もまた活性を失うことなくなしうることが予想される。
【００８７】
従って、本発明は、その範囲内に以下のペプチドを含むことが意図される：本発明のTCRα膜貫通ペプチドの「コア」配列NH2-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OHの他に、複数のアミノ酸を含む、および、T細胞抗原受容体に作用するペプチド。
【００８８】
（a）TCRα膜貫通ドメイン；
（b）TCRβ膜貫通ドメイン；
（c）TCRα細胞内ドメイン；もしくは
（d）CD3-γ、δ、εまたはη鎖、
の不変領域の配列に基づく配列を有するペプチド、またはかかる不変領域の配列と同等の機能特性を有する配列を有するペプチドもまた、本発明の範囲内であるが、ただしこれらのペプチドは、T細胞受容体(TCR)の１つ以上の機能を阻害することができる。このような配列を、本明細書中では「不変領域の配列に由来する」配列という。また、本発明が、本発明のペプチドや本発明ペプチドのペプチド模倣類似体をコードする核酸分子、およびこれらのペプチド、核酸分子またはペプチド模倣類似体のエステル、塩、またはプロドラッグの使用を含むことを、明確に理解するであろう。
【００８９】
特に明記しない限り、本発明は、当業者の能力内の従来の化学、タンパク質化学、分子生物学および酵素学的な技術を用いる。このような技術は、当業者に周知であり、文献に十分に説明されている。Coligan, Dunn, Ploegh, SpeicherおよびWingfield:「Current protocols in Protein Science」(1999) I巻およびII巻(John Wiley & Sons Inc.)； Sambrook, FritschおよびManiatis:「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(2001)； Bailey, J.E.およびOllis, D.F.: Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986； Glazer, AN, DeLange, RJおよびSigman, DS: Chemical Modification of Proteins (North Holland Publishing Company, Amsterdam, 1975)； Lundblad, RL (1995) Techniques in protein modification. CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, USA。
【００９０】
本発明は、本明細書中に記載される特定の材料および方法に限定されないことが、明確に理解されるであろう。それは、材料および方法を変更することが可能であるためである。また、本明細書中で用いられる専門用語が、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されることがわかる。
【００９１】
本発明のペプチドは、当業者に周知の組換え技術を用いて製造することができる。例えば、ペプチドを、以下の組換え技術を用いて製造することができる： Maniatis, 「Recombinant DNA Methods: a Laboratory Handbook」, 1985または「Molecular Cloning. A Laboratory Manual」, Maniatis, T., Fritsch, E.F.およびSambrook, J.編, Cold Spring Harbor Laboratory (第2版, 1989)など。
【００９２】
あるいは、本発明のペプチドは、当業者に周知である技術を用いて合成できる。
【００９３】
例えば、ペプチドを、溶液合成法または固相合成法を用いて合成できる（例えば「Synthetic Vaccines」（Nicholson編） (Blackwell Scientific Publications, 1994)の第9章、表題「Peptide Synthesis」（AthertonおよびSheppard）に説明される）。好ましくは固相支持体を利用する。固相支持体は、ポリスチレンゲルビーズでありえ、そのポリスチレンは、わずかな割合で（例えばl％）ジビニルベンゼンと架橋し、親油性溶媒（ジクロロメタンなど）またはより極性の高い溶媒（ジメチルホルムアミド（DMF）など）によって膨潤する。ポリスチレンを、クロロメチル基またはアミノメチル基を用いて官能化できる。あるいは、架橋しかつ官能化したポリジメチル-アクリルアミドゲルを用いる。このゲルは、DMFおよび他の双極性非プロトン溶媒によって高度に溶媒和し、また膨潤させることができる。ポリエチレングリコールを基材とする他の支持体であって、不活性なポリスチレンビースの表面に一般的にグラフトするか、そうでなければ接着されているものを用いることができる。好ましい形態において、市販されている固体支持体または樹脂を使用し、かかる固体支持体または樹脂は、PAL-PEG、PAK-PEG、KA、KRまたはTGRから選択される。
【００９４】
固体合成法は、可逆的なブロック基を用いる。かかるブロック基は、アミノ官能基、カルボキシ官能基または側鎖官能基の望ましくない反応性をマスクすることと、アミノ酸およびペプチドの双極性特性を破壊することの二重の機能を有し、この機能は、それらを不活性化する。このような官能基としては、構造式RCOOCMe3-CO-NHRのt-ブチルエステルが挙げられ、これらはt-ブトキシカルボキシルまたはBOC誘導体として知られている。
【００９５】
構造式RCO-OCH2-C6H5を有する対応するベンジルエステル、構造式C6H5CH20 CO-NFIRを有するウレタン（ベンジルオキシカルボニルもしくはZ-誘導体として知られる）、またはフルオレニルメタノール誘導体および特にフルオレニル-メトキシカルボニル（Fmoc）基も、用いることができる。これらそれぞれの保護基の型は、互いの存在下で独立して切断可能であり、そのため例えば、BOC-ベンジルおよびFmoc第三級ブチル保護戦略をしばしば用いる。
【００９６】
縮合剤を用いて、カルボキシ基を活性化することによって保護されたアミノ酸またはペプチドのアミノ基とカルボキシ基を結合することができ、そして遊離型の一級または二級アミンと自発的に反応する。活性型エステル（p-ニトロフェノールおよびペンタフルオロフェニルに由来するものなど）をこのために用いることができ、そしてそれらの反応性を、触媒（1-ヒドロキシベンゾトリアゾールなど）を付加することによって高めることができる。トリアジンDHBTのエステル（Nicholson（前記）の215〜216頁にて取り上げられている）もまた用いることができる。他のアシル化種が、縮合剤を用いたカルボン酸処理によってin situにて形成され（すなわち、Naによって保護されたアミノ酸またはペプチド）、すぐにアミノ成分（カルボキシまたはC-保護アミノ酸もしくはペプチド)と反応する。ジシクロヘキシルカルボジイミド、BOP試薬（Nicholsonによる参考文献の216頁を参照）、O’-ベンゾトリアゾール-N,N,NW-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（HBTU）およびその類似体テトラフルオロボラートが、しばしば用いられる縮合剤である。
【００９７】
第一のアミノ酸を、任意の好適な方法で固相支持体に結合することができる（例えば、BOC-アミノ酸を用いる）。１つの方法において、BOC-アミノ酸をトリエチルアンモニウム塩と樹脂を温めることによって、クロロメチル樹脂に結合する。Fmoc-アミノ酸を、同様の方法でp-アルコキシベンジルアルコール樹脂にカップリングできる。あるいは、種々の結合剤または「ハンドル」を用いて、第一アミノ酸を樹脂に結合してもよい。このためにアミノメチルポリスチレンに結合したP-ヒドロキシメチルフェニル乳酸を用いてもよい。
【００９８】
また、種々の基を本発明のペプチドに付加し、それによって利点（能力の増大またはin vivoにおける半減期の延長など）をペプチドの生物学的活性を低減することなく与えることが可能である。このような生物学的活性を実質的に減少させない本発明のペプチドに対する改変は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００９９】
定義
喘息は、肺気道の慢性疾患であり、気管支の炎症および奇異性狭小化を特徴とする。喘息としては、T細胞の作用を介して媒介される喘息症状を含み、それには外因性喘息（アレルギー性喘息）、内因性喘息（非アレルギー性喘息）、混合型喘息（外因性および内因性喘息）、薬剤（トルエンジイソシアネート、ポリ塩化ビニル、無水フタル酸、無水トリメリト酸、プリカン酸（plicatic acid）（西洋赤スギ）または金属塩（白金もしくはニッケル）など）によって誘発される職業喘息、薬物誘発性喘息（アスピリン誘発性喘息もしくは非ステロイド系抗炎症性薬物（NSAID）によって誘発される喘息を含む）、運動誘発性喘息、および咳変形(cough variant)喘息を含む。アレルゲンまたは環境的なトリガー（タバコの煙もしくは他の大気汚染など）によって誘発される症状としては、喘鳴、息切れ、呼吸困難（とりわけ息を吐くとき）、および胸のしめつけが挙げられる。他のトリガーとしては、感染、刺激物（香水または洗剤溶液の強い香りなど）、運動または激しい活動、温度または湿度の変化、ストレスおよび強い情動が挙げられる。好ましい実施形態において、喘息は、T細胞の機能によって媒介されるアレルギー性または非アレルギー性の喘息症状である。
【０１００】
喘息を診断するために医師が用いる標準的な検査としては、詳細な医学的病歴検査および理学的検査、肺活量測定による呼吸検査、ならびに胸部および胴房部のX線検査が挙げられる。喘息を診断するために行われうる特定の検査としては、気管支吸入誘発検査、運動誘発性気管支収縮検査、および日常的な肺機能検査が挙げられる。
【０１０１】
喘息を管理するためにさらなる検査を行うことができ、かかる検査としては、皮内皮膚アレルギー検査、皮膚刺激アレルギー検査、洞房部のCTスキャン、運動耐容能／運動についてのデサチュレーション検査、pHプローブ検査、および患者に合わせたバリウム呑み込み検査が挙げられる。AridolTM（Pharmaxis Ltd, French’s Forest, Australia）は、乾粉吸入検査であり、これは喘息を診断および監視するための臨床試験における検査である。
【０１０２】
T細胞の機能によって媒介されるアレルギー性および非アレルギー性の喘息症状を診断するのに好適な方法は、上記の方法に加えて、IgE、IL-4、IL-13および／またはIL-5の気管支粘膜におけるレベルを測定し、そのレベルを喘息症状を有さない患者の対照群と比較することを含む。対照群のレベルと比べて患者の気管支におけるIgE、IL-4、IL-13および／またはIL-5の増加したレベルは、T細胞機能によって媒介される喘息症状が存在することを示す。気管支粘膜におけるIgE、IL-4およびIL-5のレベルを測定するための好適な技術は、当業者に周知である。好適な技術としては、気管支の洗浄、続く細胞集団の分析、および／または気管支の生検、続く免疫組織化学が挙げられる。免疫組織化学に好適な試薬とは、ビオチン結合抗ヒト免疫グロブリンE（IgE）（カタログ番号48-139-B-0.5mg, Antibodies Incorporated, P.O. Box 1560, Davis, CA 95617-1560, USA）、ビオチン結合抗ヒトインターロイキン-4（カタログ番号13-7048, eBioscience, USA, www.ebioscience.com）、およびビオチン結合抗ヒトインターロイキン-5（カタログ番号13-7059, eBioscience, USA, www.ebioscience.com）が挙げられる。
【０１０３】
T細胞の機能によって媒介されるアレルギー性および非アレルギー性の喘息症状を診断するのに好適な代替的方法としては、上記方法に加えて、好酸球およびTh2細胞の気管支粘膜への浸潤を測定すること、ならびに／またはCCケモカインおよびFcεRI+細胞の存在を測定することが挙げられる。好酸球およびTh-2細胞の気管支粘膜への浸潤ならびに／またはCCケモカインおよびFcεRI+細胞の存在は、喘息症状の特徴である。好酸球およびTh-2細胞の気管支粘膜への浸潤を定量するために用いられる好適な方法としては、免疫細胞化学的な技術が挙げられ、例えば蛍光活性化細胞選別装置（FACS）と共に用いる。好ましくは細胞を、気管支肺胞洗浄または経気管支肺生検によって得る。
【０１０４】
好酸球ペルオキシダーゼ（EPO）およびミエロペルオキシダーゼ（MPO）の測定もまた、BAL液中の好酸球および好中球のそれぞれの数を測定する場合に広く用いられる（Strathら1985； SchneiderおよびIssekutz, 1996； Erpenbeckら2003）。EPOおよびMPOならびに好酸球および好中球の活性化の他のマーカーのレベルは、喘息個体の気道において、疾患を最初に検出できる時期においてさえも増大しており、血漿および気道におけるEPOおよびMPOの量は、疾患活性のレベルおよび治療に対する応答に相関する。
【０１０５】
B細胞の機能によって媒介されるアレルギー性および非アレルギー性の喘息症状を診断するのに好適な方法としては、IgEの血清レベルを測定し、そのレベルを喘息症状を有さない患者の対照群と比較することが挙げられる。対照群のものと比べて増大した患者のIgE血清レベル、さらに喘息症状を診断するための一般的方法に関する多くの基準（上述）を満たすことは、B細胞の機能によって媒介される喘息症状が存在することを示す。
【０１０６】
喘息関連の症状としては、気管支の奇異性狭小化を特徴とする疾患プロセスが挙げられ、かかる狭小化は呼吸困難をもたらす。喘息関連状態の症状としては、喘鳴、呼吸困難（とりわけ息を吐くこと）および／または胸の締め付けが挙げられる。
【０１０７】
「慢性閉塞性肺疾患（COPD）」という用語は、肺疾患群をいい、慢性気管支炎、肺気腫および閉塞性細気管支炎を含む。これら疾患の最も一般的なものは、慢性気管支炎および肺気腫である。COPDを有する人々は、慢性気管支炎または肺気腫のいずれかを有しうるが、彼らはしばしば、これら二つの状態が混合した症状を有する。肺気腫は一般的に、環境的な傷害によって生じる肺への損傷、一般的に長期にわたる喫煙によって引き起こされるが、肺気腫はまた、肺におけるα1-アンチトリプシの先天的な欠乏によっても生じうる。この型の肺気腫は一般的に遺伝する。COPDを早期発見するするための診断装置「PulmoScreenTM」（PulmoSonix Pty Ltd（Melbourne, Australia））が臨床試験にある。
【０１０８】
「T細胞受容体模倣化合物」という用語は、TCRの１つ以上の機能を阻害することができる化合物を意味する。この化合物の構造は、TCRα膜貫通ドメイン、TCRβ膜貫通ドメイン、TCRα細胞内ドメイン、またはCD3-γ、-δ、ε、η、もしくはξ鎖の不変領域に基づくか、あるいはTCRα鎖とTCRβ鎖の鎖間ジスルフィド結合を不安定化する能力をさらに有するペプチドである。化合物は、ペプチド、ペプチドをコードする核酸分子、ペプチドのペプチド模倣類似体であってもよいし、これらのいずれかのエステル、塩またはプロドラッグであってもよい。
【０１０９】
「T細胞受容体機能」という用語は、T細胞受容体によって媒介される機能を意味する。かかる機能としては、限定はしないが、T細胞の活性化、抗原による刺激に対する応答におけるT細胞の増殖、プロ炎症性サイトカイン（例えば腫瘍壊死因子またはインターロイキン-1など）の合成および／または放出、ならびにサイトカイン受容体の発現のアップレギュレーションが挙げられる。これらの機能の全ては、当該分野で周知であるアッセイを用いて測定できる。したがって、T細胞受容体機能の阻害剤を同定するための方法は、TCRポリペプチドと候補のアゴニスト分子またはアンタゴニスト分子を接触させること、およびTCRポリペプチドと通常関連する１つまたは複数の生物学的活性の検出可能な変化（例えばTh-2細胞の機能または効果のダウンレギュレーション）を測定することを含みうる。
【０１１０】
本発明に従う特許請求の範囲および本発明の説明において、用語および必要な意味を表わすために文脈が特に要求していない限り、「含む(comprise)」またはその変化形（「含む(comprises)」または「含んでいる(comprising)」など）という単語は、中に含める(inclusive)意味で用いられ、すなわち述べた特徴の存在を具体的挙げるが、本発明の種々の実施形態におけるさらなる特徴の存在および、それらを付加することを除外するものではない。
【０１１１】
本明細書中で用いられる、単数形の「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に断らない限り、対応する複数の対象を含む。従って、例えば、「酵素（an enzyme）」という語句は、複数の酵素を含み、「アミノ酸（an amino acid）」は、１つまたは複数のアミノ酸に対する語句である。
【０１１２】
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基（好ましくはC1-30アルキル）または環状アルキルを意味する。直鎖アルキル基の例としては、以下のものが挙げられる：メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、アミル、イソアミル、sec-アミル、1,2-ジメチルプロピル、1,1-ジメチルプロピル、ヘキシル、4-メチルペンチル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、1,2,2-トリメチルプロピル、1,1,2-トリメチルプロピル、ヘプチル、5-メチルヘキシル、1-メチルヘキシル、2,2-ジメチルペンチル、3,3-ジメチルペンチル、4,4-ジメチルペンチル、1,2-ジメチルペンチル、1,3-ジメチルペンチル、1,4-ジメチルペンチル、1,2,3- トリメチルブチル、1,1,2-トリメチルブチル、1,1,3-トリメチルブチル、オクチル、6-メチルヘプチル、1-メチルヘプチル、1,1,3,3-テトラメチルブチル、ノニル、1-、2-, 3-、4-、5-、6-または7-メチルオクチル、1-、2-、3-、4-または5-エチルヘプチル、1-、2-または3-プロピルヘキシル、デシル、1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-および8-メチルノニル、1-、2-、3-、4-、5-または6-エチルオクチル、1-、2-、3-または4-プロピルヘプチル、ウンデシル 1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-または9-メチルデシル、1-、2-、3-、4-、5-、6-または7-エチルノニル、1-、2-、3-、4-または5-プロピルオクチル、1-、2-または3-ブチルヘプチル、1-ペンチルヘキシル、ドデシル、1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-または10-メチルウンデシル、1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-または8-エチルデシル、1-、2-、3-、4-、5-または6-プロピルノニル、1-、2-、3-または4-ブチルオクチル、1-2 ペンチルヘプチルなど。
【０１１３】
本明細書中で用いられる「被験体」(subject)という用語は、医薬的に活性な薬剤を用いた治療を必要とする疾患または症状を有する任意の動物をいう。被験体は、ヒトであっても、家畜またはペットであってもよい。本発明の化合物は、ヒトの医療に用いることに好適であると特に考えられるが、獣医療に用いることもできる。かかる獣医療には、ペット（例えばイヌおよびネコなど）、家畜（例えばウマ、ウシ、およびヒツジなど）または動物園の動物（例えば非ヒト霊長類、ネコ科の動物、イヌ科の動物、ウシ科の動物、および有蹄類など）を治療することを含む。
【０１１４】
値の範囲が示されている場合、この範囲は、その範囲の上限および下限、ならびにこれらの間の範囲にある全ての値を含むということが明確にわかるであろう。
【０１１５】
特に定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者が通常理解しているものと同様の意味を有する。本明細書中に記載されたものに類似するか、または均等である任意の材料および方法を用いて、本発明を実施または試験することができ、好ましい材料および方法を本明細書中に記載する。
【０１１６】
本明細書中に用いられる略語は以下のとおりである:
BAL       気管支肺洗浄
COPD      慢性閉塞性肺疾患
EPO       好酸球ペルオキシダーゼ 
i.n.      鼻腔内
i.p.      腹腔内
i.t.      気管内
inhal.    吸入
MPO       ミエロペルオキシダーゼ
NSAID     非ステロイド系抗炎症性薬物
OVA       卵白アルブミン
s.c.      皮下
Th-1細胞  １型ヘルパーT細胞
Th-2細胞  ２型ヘルパーT細胞
TCR       T細胞受容体
【０１１７】
ペプチド模倣体
上記一般式で示される制限を前提に、本発明はまた、ペプチド類似体を含むことが明確にわかる。かかるペプチド類似体は、限定はしないが以下を含む：
１．その中の一つ以上のアミノ酸が、対応するD-アミノ酸によって置換された化合物。当業者は、逆向き（retro-inverso）のアミノ酸配列を、標準的な方法で合成できることがわかるだろう（例えば、ChorevおよびGoodman 1993を参照のこと）；
２．その中のペプチド結合が、代謝分解に対してより耐性である構造によって置換されたペプチド模倣化合物（例えば、Olsonら1993を参照のこと）；ならびに
３．その中の個々のアミノ酸が、類似構造（例えば、修飾末端またはアルキル置換基、アシル置換基もしくはアミン置換基を有するかまたは有さないgem-ジアミノアルキル基またはアルキルマロニル基など）によって置換され、それらの電荷が変えられた化合物。
【０１１８】
このような代替的な構造を用いることによって、身体内で有意に長い半減期を与えることができる。それは代替的な構造が、生理学的条件下での分解に対してより耐性なためである。
【０１１９】
ペプチド類似体のコンビナトリアル合成方法およびペプチドおよびペプチド類似体をスクリーニングするための方法は、当該分野において周知である（例えば、Gallopら1994； Hogan, 1997を参照のこと）。
【０１２０】
本明細書について、「ペプチドおよびペプチド類似体」という用語は、1,2、1,3、1,4またはそれ以上の置換パターンで隔てられたアミノ末端とカルボキシ末端を有する単位からなる化合物を含む。これは以下を含む：L配置またはD配置のいずれかである20種の天然の、または「一般的な」α-アミノ酸、生合成的に利用可能な、またはタンパク質中に普通見出されない「一般的でない」アミノ酸（例えば4-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシリジン、シトルリンおよびオルニチンなど）、合成的に得られるα-アミノ酸（例えば、α-メチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、Cα-アルキル化アミノ酸、N-アルキル化アミノ酸、ホモシステイン、およびホモセリンなど）ならびに当該分野で公知であるその他多数のもの（βアミノ酸を含む）。
【０１２１】
この用語はまた、以下のものを有する化合物を含む：1,3またはそれ以上の置換パターンで隔てられたアミン官能基およびカルボキシル官能基（例えば、β-アラニン）、γ-アミノ酪酸、Freidingerラクタム（Freidingerら1982）、二環式ジペプチド（BTD）（NagaiおよびSato 1985）、アミノ-メチル安息香酸（Smytheおよびvon Itzstein 1994）、ならびに当該分野において周知であるその他のもの。スタチン様アイソスター、ヒドロキシエチレンアイソスター、還元型アミド結合アイソスター、チオアミドアイソスター、尿素アイソスター、カルバメートアイソスター、チオエーテルアイソスター、ビニルアイソスターおよび当該分野で公知である他のアミド結合アイソスターもまた、本発明に有用である。
【０１２２】
「一般的な」アミノ酸は、L-アミノ酸であり、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、メチオニン、アルギニン、リジン、プロリン、セリン、スレオニンおよびヒスチジンからなる群より選択される。これらのアミノ酸は、本明細書中に慣例的な三文字または一文字の略語によって示される。
【０１２３】
「一般的でない」アミノ酸としては、限定はしないが、D-アミノ酸、ホモアミノ酸、N-アルキルアミノ酸、デヒドロアミノ酸、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン以外)、オルト-、メタ-またはパラ-アミノ安息香酸、オルニチン、シトルリン、ノルロイシン、γ-グルタミン酸、アミノ酪酸（Abu）、およびα,α-二置換アミノ酸からなる群より選択されたものが挙げられる。
【０１２４】
上皮表面を横断してペプチドを輸送するための２つの機構が考えられる。それは、イオン化合物に有利に働く能動的機構と、親油性化合物に有利に働く受動的機構である。したがって、生物利用能を、イオン性および親油性を変化させることによって調整することができる。ペプチドがさらに、N末端アミノ保護基を有している場合、これは、このペプチドの性質を、別の保護基または全く保護基を持たないペプチドの性質よりも改善するように思われることが幾つかの場合に観察されている。その他の場合、エステルが生理学的条件下で切断され、C末端酸性基を放出する。
【０１２５】
したがって、生物利用能を高めるか、または化合物を容易に製造するために、以下の変更を用いることができ、これら全ては、in vivoで潜在的に可逆的であり「親」化合物を放出する：
(a)酸付加塩（NH4+Cl-を作製するため)または塩基付加塩（カルボン酸イオンを形成するため）への変換
(b)エステル化（エステルを、カルボキシエステラーゼによってin vivoで切断できる）
(c)一以上のアミノ基における置換。
【０１２６】
当業者は、これらの変更を容易に行うことができ、用いられるそれぞれの化合物および目的に、なにが最も好適であるかを容易に調べることができる。
【０１２７】
医薬品
本発明方法は、本発明の化合物を、医薬的に活性な第二の薬剤を投与する前、同時もしくは逐次的に投与するか、または本発明の化合物と医薬的に活性な第二の薬剤の組合せを投与することを含む。
【０１２８】
本明細書中で用いられる「治療有効量」という用語は、望ましい治療反応（例えば、疾患を予防または治療するなど）を生じるのに有効な本発明化合物の量を意味する。かかる疾患とは、本発明の化合物を含む医薬的に活性な薬剤を投与することによる治療に対して感受性を有するものである。
【０１２９】
具体的な「治療有効量」とは、当然ながら以下に挙げる要因などによって変わる：処置される特定の症状、被験体の身体的状態および臨床的病歴、治療される動物の種類、治療期間、併用療法の性質（もしあるならば）、ならびに化合物またはその誘導体の用いられた特定の製法および構造など。一般的に、in vitroで用いられた投薬量は、医薬組成物のin situ投与に有用な量における有益なガイダンスを与えることができ、そして動物モデルは、望ましくない副作用を生じることのない治療に有効な投薬量を決定するために用いることができる。例えば、適切な用量範囲を決定することを含む様々な考え方が、Langer, 1990に記載されている。
【０１３０】
本明細書中で用いられる「医薬担体」は、本発明の化合物および／または医薬的に活性な薬剤を被験体に送達するための薬学的に受容可能な溶媒、懸濁剤、賦形剤またはビヒクルである。担体は、液体であっても固体であってもよく、計画された投与方法によって選択される。
【０１３１】
本発明の化合物を、慣習的な非毒性の製薬上許容される担体、アジュバント、およびビヒクルを含む用量単位製剤として、静脈内、皮下、気管内、気管支内、鼻腔内または吸入を介して投与することができ、吸入による投与が好ましい。本発明はまた、本発明の新規治療方法に用いるための好適なエアロゾルまたは乾粉体医薬製剤を提供する。
【０１３２】
保存剤および他の添加剤、例えば、抗生物質、抗酸化剤、キレート剤、増殖因子および不活性ガスなども含む。
【０１３３】
このような投与のための製剤は、無菌水または非水性溶液、懸濁液、およびエマルションを含むことができる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、および注射可能な有機エステル（例えばオレイン酸エチル）が挙げられる。水性担体としては、水、アルコール性/水性溶液、エマルションまたは懸濁液が挙げられ、食塩水および緩衝媒体（例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖溶液、ブドウ糖と塩化ナトリウムおよび乳酸含有リンゲル液など）を含む。
【０１３４】
一般に「治療する」、「治療」などの用語は、本明細書中に用いられ、被験体、組織または細胞に所望される薬理学的効果および／または生理学的効果が得られるように作用することを意味する。その効果は、喘息またはその兆候もしくは症状を完全にまたは部分的に防ぐことによる予防的なものであっても、喘息の部分的なまたは完全な治癒による治療的なものであってもよい。本明細書中で用いられる「治療する」とは、哺乳動物（とりわけヒト）の喘息を治療することまたは予防すること、被験体において喘息が発症することを予防すること（かかる被験体とは、喘息にかかりやすいが、未だに喘息を有すると診断されていない被験体でありうる）、喘息を阻害すること（すなわち、その発症を阻止すること）または喘息の影響を軽減または改善すること（すなわち、喘息の影響を緩和させること）を含む。
【０１３５】
本発明は、喘息を改善するのに有用な種々の医薬組成物を含む。本発明の一実施形態による医薬組成物を、本発明の化合物またはプロドラッグ、類似体、誘導体もしくはその塩と共に、場合によっては１または複数種の他の医薬的に活性な薬剤を用いて、被験体への投与に好適な形態に、担体、賦形剤および添加剤または補助的な物質を使用して製造する。
【０１３６】
本発明の化合物を、それ自体でまたは、薬学的に受容可能な塩の形態で投与してもよい。このような薬学的に受容可能な塩としては、限定はしないが、以下に挙げた酸から製造できるものである：酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、サリチル酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン-2-スルホン酸およびベンゼンスルホン酸。薬学的に受容可能な塩をまた、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩もしくはカルシウム塩など）あるいはアンモニウム塩として製造できる。
【０１３７】
さらに、いくつかの本発明の化合物は、水または一般的な有機溶媒と共に溶媒和物を形成することができる。このような溶媒和物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３８】
しばしば用いられる担体または補助的な物質としては、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖類、タルク、ミルクタンパク質、ゼラチン、澱粉、ビタミン、セルロールおよびその誘導体、動物油および植物油、ポリエチレングリコールならびに溶媒（例えば、無菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコール）が挙げられる。保存剤としては、抗微生物薬、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスが挙げられる。他の製薬上許容される担体としては、水性溶液、非毒性賦形剤（塩、保存剤を含む）、緩衝液などが挙げられる（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,第２０版 Williams & Wilkins (2000) およびThe British National Formulary 第４３版 (British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 2002； http://bnf.rhn.net)に記載され、これらの内容は本明細書中に参考として援用される）。医薬組成物の種々の成分のpHおよび的確な濃度は、当該分野で慣用的な方法に従って調整される。GoodmanおよびGilmanによる、The Pharmacological Basis for Therapeutics（第７版, 1985）を参照のこと。
【０１３９】
医薬組成物は好ましくは、投薬量単位で製造および投与する。被験体を治療するために様々な一日量が用いられ、その量は、化合物の活性、投与方法、障害の性質および重篤度、ならびに被験体の年齢および体重によって決まる。しかし、特定の状況下においては、より多いかまたは少ない一日用量が、好適でありうる。一日用量の投与を、個別の１投薬量単位もしくはより少ない数投薬量単位の形で単回投与によって行うか、または小分けにした用量を特定の間隔で複数回投与することによって行うことができる。
【０１４０】
水性懸濁液は普通、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤との混合物中に活性物質を含む。このような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロールナトリウム、メチルセルロール、ヒドロキシプロピルメチルセルロール、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガムおよびアラビアガム；分散剤または湿潤剤でありうる、かかる分散剤または湿潤剤は以下のものでありうる：
（ａ）天然のホスファチド（例えば、レシチン）；
（ｂ）脂肪酸と酸化アルキレンの縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）；
（ｃ）長鎖脂肪族アルコールと酸化エチレンの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）；
（ｄ）脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルと酸化エチレンとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、または
（ｅ）脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導される部分エステルと酸化エチレンとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）。
【０１４１】
また、本発明の化合物を、リポソーム送達系（例えば、小さな単層のベシクル、大きな単層のベシクル、および多層のベシクル）によって投与できる。リポソームは、種々のリン脂質（例えば、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリン）より形成できる。
【０１４２】
本発明化合物の用量レベルは一般的に、体重１ｋｇあたり約0.001mg〜約100mgのオーダーであり、すなわち、患者一人につき（平均体重70kgと想定）一日あたり約0.07mg〜約7gであり、好ましい投薬量範囲は、一日あたり体重１ｋｇあたりにつき約0.01mg〜10mg、すなわち、患者一人につき一日あたり約0.7mg〜約700mgの範囲である。単一用量を製造するために担体物質と組み合わすことができる活性成分の量は、治療する被験体および特定の投与方法によって変わる。しかし、特定の患者のための特定の用量は、種々の要因に左右されることがわかるであろう。種々の要因としては、治療を受けている特定の個人における、用いた特定化合物の活性、年齢、体重、通常の健康状態、性別、食事、投与時間、投薬経路、排泄速度、薬物の組合せおよび喘息の重篤度が挙げられる。
【０１４３】
好ましい形態において、本発明による使用に好適な任意のビヒクル中のペプチドフラクションの全濃度は、十分に高く、必要とされる用量の約0.00007〜7g/患者/日を与える。したがって、例えば、噴霧器が、１用量あたり4 mlの溶液を投与する場合、溶液中のペプチドの濃度は、およそ 0.0000175〜1750mg/mlにすべきである（体重75 kgの患者の場合）。
【０１４４】
本発明は、本発明の化合物を用いた喘息の予防的処置および治療的処置の両方を提供する。アレルギー性喘息を予防的に処置する場合、本発明の化合物を、アレルゲンに曝されることが予測される約24時間前までに、またはアレルギー性喘息が発症する前に患者に投与することが望ましい。急性喘息（アレルギー性喘息を含む）を治療的に処置する場合、喘息の患者を、喘息の発作が発症した後、できるだけ早く処置することが望ましい。一実施形態において、急性喘息の発症(episode)を、症状発症の24時間以内に、本発明の化合物を投与することによって治療する。しかし、本発明の方法を用いて、喘息性疾患発症のいずれかの時点で症状を改善することができると考えられる。さらに、本発明の方法を用いて、慢性的な喘息の症状を緩和することが可能である。
【０１４５】
本発明の化合物を、他の化合物とさらに組み合わせて、有効な組合せを提供することができる。医薬的に活性な薬剤の化学的に適合可能な任意の組合せを含むことが意図されるが、ただしかかる組合せは、本発明の化合物の活性を排除しないものに限る。
【０１４６】
本発明による化合物を、以下に述べるように処方して、所望される量の活性剤を、吸入によって患者の肺に、または液体薬物を局所的に適用することによって鼻の呼吸器上皮に送達することができる。
【０１４７】
本発明の化合物を含む組成物は、固体または液体のいずれかの形態で製造できる。微粒子に粉砕した活性剤からなる呼吸に適した乾粒体を含む組成物を、乾燥した活性剤を、乳鉢と乳棒を用いて粉砕し、そしてその微粒子に粉砕した組成物を400メッシュスクリーンに通して大きな塊を粉砕または分離することによって製造することができる。液体組成物は、水性担体（例えば、発熱物質が存在しない無菌食塩水または発熱物質が存在しない無菌水など）中に分散した活性剤を含む。必要な場合には、組成物を、噴射剤と混合してもよく、これによって組成物をスプレーし、そのエアロゾルを形成することを補助することができる。活性剤の固体粒子形態は、場合により分散剤を含むことができ、かかる分散剤は、エアロゾルの形成を容易にするために役立つ。好適な分散剤はラクトースであり、好適な任意の割合（例えば、重量比で１：１）で活性剤と混合することができる。医薬組成物を、単位投与剤型（例えば、無菌のアンプルまたは加圧した容器の形）で提供できる。
【０１４８】
本発明に用いられる吸入組成物は、ペプチドを含む液状または粉状の組成物を含み、噴霧使用および気管支内使用に好適であるか、または計量された用量を投与するエアロゾルユニットを介して投与されるエアロゾル組成物を含むことができる。好適な液体組成物は、薬学的に受容可能な水性吸入剤溶媒（例えば、等張食塩水または静菌水など）中にペプチドを含む。溶液を、ポンプもしくは圧搾式噴霧スプレー装置によって、または必要とされる用量の液体組成物が患者の肺へ吸入されることを生じるか、可能とする任意の他の従来方法によって投与できる。
【０１４９】
本発明の方法で使用するためのエアロゾル製剤は一般的に、フッ化アルカン噴射剤、界面活性剤および共溶媒を含み、アルミニウムまたは従来のエアロゾルの容器に詰めることができ、かかる容器は、好適な計量バルブによって閉じ、噴射剤を用いて加圧した。好適な粉体組成物としては、化合物を粉末化した製剤であって、ラクトースまたは気管支内投与に好ましい他の不活性な粉体と完全に混合しているものが挙げられる。粉体組成物は、エアロゾルディスペンサーを介して投与するか、または壊れやすいカプセルに入れることができ、かかるカプセルは、患者によって装置に挿入され、この装置がカプセルに穴を開け、吸入に好適な一定した流れで粉体を送る。
【０１５０】
当業者には理解されるように、多くの従来方法および装置が、正確に計量された用量の気管支内薬物を投与すること、ならびに患者の体重および患者の状態の重篤度によって所望される投薬量を調節することに利用することができる。さらに、本発明の気管支内組成物に好適な、周知の液状、粉末状およびエアロゾル状ビヒクルが多数存在する。本発明は、特定の不活性なビヒクル、溶媒、担体および賦形剤に限定されず、気管支内投与のための特定の方法および装置に限定されない。例えば、Corkery, K. 2000を参照のこと。
【０１５１】
吸い込まれやすい粒子の液状エアロゾルは、任意の好適な方法（例えば、活性剤を含有する液体組成物を（例えば、ジェット噴霧器または超音波噴霧器を用いて）噴霧し、患者に噴霧した組成物を吸入させること）によって投与することができる。
【０１５２】
固体粒状薬物のエアロゾル発生装置を使用して、以下に挙げた実施例により本発明を実施できる。固体粒状薬物をヒト被験体に投与するためのエアロゾル発生装置は、前述したような吸い込まれやすい粒子を製造し、所定の計量された薬物用量をヒトへの投与に好適な割合で含む量のエアロゾルを生じる。エアロゾル発生装置の種類の一例は、その中にローターが取り付けられているチャンバーを備え、かかるローターは、計量された用量の乾性粒状薬物を含むゼラチンカプセルを運ぶ。使用に際し、カプセルに穴を開け、患者は、チャンバーより吸入し、ローターは薬物を調合するのに十分な速度でスピンし、それによって乾性粒子のエアロゾルが形成される。エアロゾル発生装置の種類の第二例は、噴射剤に入れた乾性粒状薬物を含む加圧したキャニスターを備える。噴射剤は、計量バルブを通して放出され、かかる計量バルブは、計量された用量の乾性粒状薬物を大気に分配するように形成されている。噴射剤は蒸発し、乾性粒状薬物のエアロゾルを残す。
【０１５３】
あるいは、人工呼吸装置で維持される患者に、吸い込まれやすい粒子のエアロゾルを、液体組成物を噴霧し、エアロゾルを人工呼吸装置の吸気ガス流に導入することによって投与することができる（RaabeおよびLeeらの米国特許第4,832,012号に記載される）。
【０１５４】
本発明のペプチド化合物を吸入を介して送達するのに好適な装置としては、以下のものが挙げられる： AeroDose Inhaler System（Aerogen（Sunnyvale, California；米国特許第6,640804号、第6,629,646号、第6,615,824号および第6,543,443号）、AIR Technology（Alkermes（Cambridge, Massachusetts）、AERx Pulmonary Drug Delivery System（Aradigm Corporation, Hayward, California； 米国特許第5,819,726号）、Spiros Pulmonary Drug Delivery System（Dura Pharmaceuticals, San Diego, California； 米国特許第6,060,069号）ならびにInhance Drug Delivery Platform（Inhale Therapeutic Systems, San Carlos, California；米国特許第6,138,668号、第5,775,320号および第5,458,135号）。本発明のペプチド化合物を吸入を介して送達するのに好適な装置としては、Glaxo Group Ltd.による米国特許第6,536,427号に開示される装置が挙げられる。
【０１５５】
DNAを送達するための粉末注射技術もまた公知である（例えば、PowderJect Research Limitedによる米国特許第6475181号、Powderject Vaccines, Inc.による国際特許出願PCT/US01/50673、PCT/US00/10766 およびPCT/US00/30897、Powderject Vaccines, Inc.およびPowderJect Research LimitedによるPCT/GB02/02677、ならびにPowderJect Research LimitedによるPCT/GB00/00156、PCT/GB00/01421およびPCT/GB02/00114を参照のこと）。
【０１５６】
上記引用される明細書の全開示内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０１５７】
喘息の動物モデル
アレルギー性喘息の種々の動物モデル系が、当該分野で公知である。例えば、種々の抗原が、イヌ、霊長類、およびモルモットの喘息モデルで用いられている（Mappら1985； Sasakiら1989； Yamadaら1992）。
【０１５８】
三種の動物モデルが広範に用いられ、喘息が研究されている。第一のモデルは、回虫（Ascaris suum）寄生虫抗原誘発性霊長類モデル系である（Gundelら1992； Pritchardら1983）。
【０１５９】
第二のモデルは、種々の抗原（Iijimaら1987； Ishidaら1989； Vertesら1987）、および医薬（Hayesら1992； Obataら1992）によってモルモットに誘導される。第三のモデルは、Brown Norway (BN)ラットモデルである。BNモデルは、多くの点でヒトアレルギー性喘息を模倣する。このラット系統は、アレルギー感作（Renziら1996）に対する、高レベルのアレルゲン特異的IgEを伴う（Murpheyら1974）Th2駆動の応答を示す。感受性動物へのエアロアレルゲン(aeroallergen)チャレンジの後、初期および後期の気管支収縮が生じ（Renziら1993）、これらの気管支収縮は、肺炎症およびメタコリンに対する気管支過剰反応性に関連する（Elwood, 1991）。
【０１６０】
他のモデルとしては、Brownellらによる米国特許第5,911,988号に開示されるマウスモデル、およびAllergenix Pty Ltd.による国際特許出願PCT/AU02/00715に開示されるヒツジモデルが挙げられる。
【０１６１】
T細胞ペプチドを試験したり、選択したりするのに好適な非アレルギー性喘息のモデルとしては、Gebaら1997、Houtmanら2003、Romijnら、Bloemenら1996、およびKraneveldら2002に記載されるモデルが挙げられる。
【０１６２】
閉塞性細気管支炎および慢性気管支炎の治療において本発明の化合物を試験するのに好適なモデルとしては、Alhoら2003、Maasiltaら、2001およびZhongら2003に開示されるモデルが挙げられる。
【０１６３】
肺気腫の治療において本発明の化合物を試験するのに好適なモデルとしては、Marchら、2003およびZhongら、2003に開示されるモデルが挙げられる。
【０１６４】
次に、以下の非限定的な実施例および図面のみを参照しながら本発明を詳細に説明する。
【実施例】
【０１６５】
実施例１    ペプチドの合成
以下のペプチド（「ペプチド」という）：
NH2-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH
を、95％を超える純度で合成し、実施例２〜５で用いた。
【０１６６】
このペプチドの特徴としては以下のものが挙げられる：分子量1024kD、9個のアミノ酸、マウスTCR-α膜貫通鎖のオリジン/ドメイン。このペプチドを、Bachem Company, Karlsruhe, FRG、またはUCB BioProducts, Belgiumのいずれかで合成した。
【０１６７】
以下のネガティブコントロールペプチド（「モックペプチド」という）：
NH2-Leu-Gly-Ile-Leu-Leu-Leu-Gly-Val-OH
を、95％を超える純度で合成し、実施例２および３で用いた。モックペプチドを、Bachem Company, Karlsruhe, FRGで合成した。
【０１６８】
実施例２    喘息のマウスモデルにおけるTCR模倣ペプチドの影響
卵白アルブミン（OVA）で免疫化したマウスモデルを用いて、用いた正常Balb/cマウスに喘息様症状を誘導する。このモデルは、Archerら2004に記載される。
【０１６９】
このモデルは、トランスジェニックマウスを用いる必要がなく、実験を、種々の異なる標準的なマウス系統を用いて行うことができる。このモデルを、図1に示す。
【０１７０】
マウスを、注射（i.p.）によってOVAに対して免疫化し、１４日後、鼻腔内（i.n.）チャレンジ用量のOVAタンパク質を投与した。３日後、気道炎症の程度を気管支肺胞洗浄（BAL）によって評価し、その後浸潤白血球を計数した。さらに、肺を切片にし、組織学的解析のためにヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。予備実験において、生きたマウスを、処置後監視し、全身容積変動測定法(whole body plethysmography)を用いて気道閉塞症の程度を評価した。
【０１７１】
OVAに対する免疫化
メスBALB/c マウス（6〜8週齢）に、200μlの水酸化アルミニウム(alum)アジュバント（Serva, Heidelberg, Germany）中10 μgのOVA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を1日目に注射（i.p.）した。免疫化（i.p.）から１４日後、マウスを、ケタミンとキシラジンの混合物(Sigma-Aldrich)を注射（i.p.）して麻酔し、100 μgのOVAを含有する50μlのPBSを用いて処置した（i.n.）。
【０１７２】
TCRペプチドの投与
予備実験において、ペプチドまたは「モック」ペプチドを、異なる二つの時点（OVA感作（i.p.）の２４時間前またはOVAチャレンジ（i.n.）の２４時間前)のいずれかにおいて、リン酸緩衝食塩水（PBS；0.15 M 塩化ナトリウムを含む0.02 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4に調整）中最終濃度が1 mM（溶液）または50 mM（懸濁液）のいずれかで与えた。濃度50 mMのTCRペプチドを選択した。それは、500μMが、in vitro実験におけるT細胞の最適ブロッキング濃度であったためである。しかし、ペプチドの滴定に用いた実験を用いて、最適用量を決定する。100μl容量の処方したペプチドを、マウス鼻腔内に投与した。
【０１７３】
実験群は、以下のものであった:
A.:処置なし
B.:最終濃度が1mMまたは50mMでPBS中に処方した（懸濁した）100μlのペプチドまたは「モック」ペプチドを、1日目の最初の免疫化の直前に投与した（i.n.）
C.: 最終濃度が1mMまたは50mMでPBS中に処方した（懸濁した）100μlのペプチドまたは「モック」ペプチドを、チャレンジ（i.n.）の24時間前に投与した（i.n.）。
【０１７４】
気管支肺胞洗浄（BAL）
OVAを用いたチャレンジ（i.n.）から3日後に、異なる群のマウスを屠殺し、気管をカニューレ処置し、そしてBALを、肺および気道を1 mlのPBSを用いて5回洗い流すことによって行った。BAL細胞を、計数し、サイトスピン（Shandon Southern Products, Asmoor, U.K.）を用いてスライドグラスに落とし、そして製造者の指示に従ってDiff-Quik（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を用いて染色した。細胞数が5×104/200μlよりも少ない場合、容量を最終濃度に関わらず200μlまでにした。
【０１７５】
マクロファージ、リンパ球、好中球、および好酸球の％を、標準的な組織学的な判定基準を用いて光学顕微鏡によって測定した。結果は、図2に要約する。
【０１７６】
肺組織学
OVAまたは食塩水のいずれかを用いた最後の鼻腔内チャレンジから1〜6日後に、肺を組織学的に分析した。各肺の葉を１つ、10％ホルマリンで固定し、脱水し、パラフィンに包埋し、切片を作製し、そして従来方法に従ってヘマトキシリンとエオシンを用いて染色した。肺中の好酸球の数を、検量されたステージを用いて、光学顕微鏡によって定量した。結果を図3に示す。図中、計数値を、１mm2あたりの好酸球の％として示した。
【０１７７】
サイトカイン産生
肺組織および肺リンパ節のT細胞によるサイトカインのEx vivo産生を、特定のサイトカイン（例えば、IL-4、IL-5、IL-6およびIL-10）に対する抗体を用いて評価できる。このような抗体は、市販されている。
【０１７８】
T細胞を、肺組織または肺リンパ節より作製し、FACSを用いた細胞内染色によって分析する。あるいは、T細胞の培養上清を、従来方法を用いてサイトカインプロファイルを決定するために、ELISAによってアッセイした。
【０１７９】
実施例3    気道の過剰反応性の測定 
抗原チャレンジによる、上記実験モデルにおけるマウスの気道の過剰反応性への影響は、全身容積変動測定法によって測定することができる。これを用いて、ヒト喘息で見られる気道の過剰反応性を正確に比較することができる。マウスを、ペントバルビタール（70〜90 mg/kg体重、i.p.）で麻酔し、そして頸静脈を、PE 10シラン処理(silastic)チューブを用いてカニューレ処置する。その後、気管を特別な角度の18ゲージ針を用いて挿管し、開胸し、そしてチューブを、ハーバード人工呼吸器（一回呼吸量=0.2 ml、回数120呼吸/分、終末呼気陽圧 2.5-3.0 cm H.sub.2 O）に繋ぎ、全身プレチスモグラフに配置した。この換気は、被験体マウスの正常な動脈血ガスを維持する。デッドスペース量は0.025 mlである。
【０１８０】
全身容積変動測定法を、上記モデルを使用したマウスの処置から0〜6日後に、動態学的研究に用いた。この結果を図4に示す。
【０１８１】
プールしたデータを用いた２つの独立した実験の結果は、群C（ペプチド）では、BALおよび肺組織学の両方で好酸球増加が有意に減少したことを示す。全身容積変動測定法を用いた予備実験の結果は、処置した動物における顕著な効果を示した。
【０１８２】
このデータは、TCR模倣ペプチドを用いた喘息マウスの治療によって、非トランスジェニック系で喘息症状を減少させたことを示す。
【０１８３】
実施例4    喘息ラットモデルにおけるTCR模倣ペプチドの効果
Brown Norwayラットモデルもまた用いて、TCR模倣ペプチドによる喘息の症状緩和への効果を調べた。上記マウスモデルと同様に、ラットモデルもまたOVAを用いて免疫化した。このモデルは、Elwood, 1991に記載される。このモデルを、図5に示す。このモデルでは、１処置群あたり10匹のラットを用いた。
【０１８４】
ラットを、1日目、14日目および21日目に注射（s.c.）によって、OVAに対して免疫化し、そして28日目に、OVAタンパク質の吸入チャレンジ用量を投与した。次の日（２９日目）に、気道炎症の程度を、気管支肺胞洗浄（BAL）、それに続く浸潤白血球の計数ならびに、好酸球ペルオキシダーゼおよびミエロペルオキシダーゼの活性を測定することによって評価した。
【０１８５】
OVAに対する免疫化
オスのBrown Norwayラット（およそ8週齢）に、1mlの水酸化アルミニウム(alum)アジュバント中10μgのOVAを、1日目、14日目および21日目に注射（s.c.）した。同時に、これらの動物は、0.25 ml百日咳菌（Bordetella pertussis）ワクチン（Trivax-Evans Medical）の注射（i.p.）を受けた。最後の感作投薬から７日後に、これらの動物を拘束し、そして鼻だけに、Wright噴霧器を使用して、10 mg/mlのOVAエアロゾルに1時間曝した。
【０１８６】
TCRペプチドの投与
これらの実験では、ペプチドを、気管内（i.t）（3 mg/ml、ラット１匹につき0.9％ 食塩水中50μl、OVA誘発の24時間前）、鼻腔内（i.n.）（50 mg/ml、ラット１匹につき0.9％ 食塩水中100μl、OVAチャレンジの24時間前）または吸入によって（0.9％ 食塩水中0.1 mg/ml、OVAチャレンジの24時間および4時間前に、Wright 噴霧器を使用して10匹のラットに、流速1 ml/分で合計して50分間エアロゾルによって50 ml送達）投与した。ブデソニド(budesonide)（90％食塩水／10％エタノール中5 mg/ml）を、ポジティブコントロールとして用いて、OVAチャレンジの24時間および4時間前に吸入によって送達した。
【０１８７】
気管支肺胞洗浄（BAL）
OVAを用いたチャレンジから24時間後、別の群に由来するラットを、ペントバルビタールナトリウム（100 mg/kg）を注射（i.p）して麻酔した。気管カニューレ挿入の後、BALを、肺および気道を4 mlのハンクス緩衝塩溶液を用いて2回洗い流すことによって行った。BAL液を遠心分離し、集めた細胞を2 mlのPBSに懸濁し、そして回収した白血球の総数を計数した。遠心分離後の上清（すなわち、無細胞のBAL液）中の好酸球ペルオキシダーゼおよびミエロペルオキシダーゼの活性を、Schneiderら1997に記載される方法で測定した。結果を、図6、7および8に要約する。
【０１８８】
実施例5    さらなるペプチドの検査
実施例2、3および4に記載される方法で試験されるさらなるペプチドを、表2に要約する。表２ではアミノ酸についての慣例的な一文字コードを用いる。
【表２】
2008500289.tif 000004
【０１８９】
実施例6    候補ペプチドについてのin vitroでのさらなる試験
候補ペプチドを試験するためのおよび本発明による使用に好適なペプチドを選択するためのさらなるin vitro方法としては、PCT/AU96/00018およびManoliosら1997に記載される方法が挙げられる。
【０１９０】
抗原提示アッセイを用いて、抗原認識後のT細胞活性化を阻害するT細胞模倣ペプチドの能力を、インターロイキン-2（IL-2：T細胞活性化による産生物）のレベルを測定することによって評価した。
【０１９１】
以下の細胞株を用いた： 
（i）2B4.11、T細胞ハイブリドーマであって、細胞表面上に完全な抗原受容体を発現し、抗原チトクロムcを認識した後IL-2 を産生する（Samelsonら1983）；
（ii）インターロイキン-2依存性Ｔ細胞株（CTLL）、慣例的なIL-2の生物学的アッセイ用；および
（iii）B細胞ハイブリドーマ細胞株LK 35.2（LK, I-Ek保有；（Kappler ら1982））抗原提示細胞として機能する。
【０１９２】
異なる抗原に対して特異的な他のハイブリドーマ細胞株を代替的に用いることができるこがわかるだろう。ハイブリドーマを、10％ウシ胎児血清、ゲンタマイシン（80μg/ml）および0.002％メルカプトエタノールを含有するRPMI 1640培地中で増殖する。
【０１９３】
アッセイにおけるペプチドまたはリポペプチドの最終濃度は一般に、5μM〜250μMの範囲であるが、それぞれの化合物に応じて、それより高くても低くてもよい。一般に、ペプチドと比較してより低い濃度のリポペプチドが必要であると考えられる。アッセイに加える前にペプチドを培地中37℃で予めインキュベートすることによって、溶解度および活性を改善できる。
【０１９４】
アッセイのために、細胞を、抗原と共に16時間、マイクロタイターウェル中で培養する。各ウェルは、2×104 2B4.11 T細胞ハイブリドーマ細胞、2×104 LK35.2 抗原提示細胞および50μM ハトチトクロムc（Sigma, USA；PBS中に溶解）を含む。アッセイを、３通り行う。上清を回収し、IL-2含有量をCTLL増殖によって測定する。3H-チミジンの取り込みは、上清中にあるIL-2量に正比例した。異なるペプチドのIL-2 産生を阻害する能力について調べる。3H-チミジンの取り込みを測定することに加えて、IL-2（IU/ml）の濃度についても測定した。対照ペプチドとしては、種々の供給源に由来し、候補ペプチドの長さと等しい、他のペプチドが挙げられる。さらなる対照試料には、チトクロムc（抗原）またはLK細胞（抗原提示細胞）のいずれかは、除外した。
【０１９５】
本発明の好ましいペプチドおよびリポペプチドは、このアッセイで活性を有することがこれまでに見出されている（PCT/AU96/00618； PCT/AU97/00367； Manoliosら1997）。
【０１９６】
実施例7    用量と反応の関係
本発明による化合物の各種類についての効果的な用量範囲を、実施例1に記載されるモデルを用いて決定した。好適な試験用量範囲は、in vitroでのペプチドの効力によって決まり、例えば、実施例6に記載される抗原提示アッセイの結果に基づいて選択できる。例えば、ペプチドまたはパルミチン酸-ペプチドについては、好適には、100μlの容量で、0.1〜100 mMの濃度範囲を用いることができる。cDNAについては、ペプチドをコードするおよそ1〜100μgのプラズマDNAを用いることができる。当業者は、試験する各化合物の好適な用量範囲を容易に決定することができる。例えば、EnkおよびKnop 2000ならびにGollnerら2000； Henggeら1995,ならびにHenggeら1998を参照のこと。
【０１９７】
当業者は、本発明が、明瞭性および理解のためにある程度詳細に説明されているが、本明細書中に記載される実施形態および方法について種々の変形および変更が、本明細書中に開示される発明概念の範囲から離れることなくなされうることがわかるであろう。
【０１９８】
本明細書中に引用される参考文献を、以下に挙げ、これらは本明細書中に参照として援用されている。
【０１９９】
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【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】図1は、本発明の方法を試験するために用いた実験マウスモデルの模式図である。このモデルを用いて、図2、3および4に示されるデータを作成した。
【図２】図２は、処理したマウスと対照マウスに由来するBAL液からなるサイトスピン調製物中の白血球（好酸球、好中球、リンパ球およびマクロファージ）のパーセントを比較する。群A:処置なし。群B: PBS中100μlのペプチド（終濃度1mM）を、1日目の抗原感作の24時間前に、投与した（i.n.）。群C: PBS中100μlのペプチド（終濃度1mM）を、チャレンジ（i.n.）を行う24時間前に投与した（i.n.）。
【図３】図３は、処理したマウスおよび対照マウスの肺切片における全白血球に対するパーセントとして好酸球を示す。群は、（1）処理なし（Txなし）；（2）PBS中100μlのモック（つまり、偽）ペプチド（終濃度50mM）を、チャレンジ（i.n.）を行う24時間前に投与（i.n.）した(モックペプチド)；（3）PBS中100μlのペプチド（終濃度50mM）を、チャレンジ（i.n.）を行う24時間前に投与した（i.n.）（ペプチド）。
【図４】図４は、気道閉塞症の程度についての全身プレチスモグラフィ測定の結果を示す。群は、（1）処理なし（Txなし）；（2）PBS中100μlのモックペプチド（終濃度50mM）を、チャレンジ（i.n.）を行う24時間前に投与（i.n.）した(モックペプチド)；（3）PBS中100μlのペプチド（終濃度50mM）を、チャレンジ（i.n.）を行う24時間前に投与（i.n.）した（ペプチド）。
【図５】図５は、本発明の方法を試験するために用いた実験ラットモデルの模式図である。このモデルを用いて、図6〜8のデータを作成した。
【図６】図６は、処理したラットおよび溶媒(vehicle)対照ラットに由来する無細胞BAL液中の好酸球マーカー（好酸球ペルオキシダーゼ）の活性を示す。データは、平均値 ± SEMで表す。* 溶媒対照からの有意差（p<0.05）。** 溶媒対照からの有意差（p<0.01）。
【図７】図7は、処理したラットおよび溶媒(vehicle)対照ラットに由来する無細胞BAL液中の好中球マーカー（ミエロペルオキシダーゼ）の活性を示す。データは、平均値 ± SEMで表す。* 溶媒対照からの有意差（p<0.05）。** 溶媒対照からの有意差（p<0.01）。
【図８】図８は、処理したラットまたは溶媒(vehicle)対照ラットに由来するBAL液中の回収された炎症性細胞（白血球）の総数を示す。データは、平均値 ± SEMで表す。* 溶媒対照からの有意差（p<0.05）。** 溶媒対照からの有意差（p<0.01）。
【図１】
2008500289.tif 000005
【図２】
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【図３】
2008500289.tif 000007
【図４】
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【図５】
2008500289.tif 000009
【図６】
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【図７】
2008500289.tif 000011
【図８】
2008500289.tif 000012
【配列表】
2008500289000001.xml
【国際調査報告】
2008500289.tif 000020
2008500289.tif 000021
2008500289.tif 000022