(57)【要約】本発明は、癌の治療的処置を提供する方法、ならびに、癌細胞における抗アポトーシス過程を阻害して腫瘍細胞死を促進する細胞透過性ペプチドおよびペプチド物質を提供する。組成物は、従来の化学療法剤と共に、化学療法剤の有効性を著しく増大して癌細胞を破壊する相乗効果を提供するために送達される。本発明はまた、NF-κBの抗アポトーシス作用を阻害するための少なくとも一つのペプチド物質、および細胞アポトーシス経路を刺激するための少なくとも一つの化学療法剤を含む、癌療法のためのキットまたはシステムも提供する。2008519839.tif 000003
2008519839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むポリペプチド：
a)SEQ ID NO：1の少なくとも6個の連続した残基を含む、約6〜約50残基の細胞透過性ペプチド、および
b)NF-κB核局在化配列。
【請求項２】
NF-κB核局在化配列がNF-κB p50を含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
以下を含むポリペプチド：
a)SEQ ID NO：2の少なくとも11個の連続した残基を含む、約11〜約50残基の細胞透過性ペプチド、および
b)NF-κB核局在化配列。
【請求項４】
NF-κB核局在化配列がNF-κB p50を含む、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項５】
SEQ ID NO：2を含む約11〜約50アミノ酸の細胞透過性ペプチド。
【請求項６】
SEQ ID NO：1を含む約11〜約50アミノ酸の細胞透過性ペプチド。
【請求項７】
SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、またはそれらの組み合わせを含むペプチドの有効量を、細胞に投与する段階を含む、細胞におけるNF-κB核移行を阻害する方法。
【請求項８】
以下の治療的有効量を含む、構成的NF-κB活性化と関連する癌に対する化学療法システム：
a)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、またはそれらの組み合わせを含むペプチド、および
b)腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する化学療法剤。 
【請求項９】
化学療法剤がエトポシドまたはシスプラチンを含む、請求項8記載の化学療法システム。
【請求項１０】
癌細胞においてNF-κBの構成的活性化を阻害する少なくとも一つのペプチドの治療的有効量を、化学療法剤と共に、それを必要とする対象に投与する段階を含む、アンドロゲン非依存性前立腺癌を処置する方法。
【請求項１１】
少なくとも一つのペプチドが、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SN50、またはそれらの組み合わせを含む、請求項10記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞透過性ペプチド、および組織を介して細胞へと機能性積荷を運ぶためのそれらのペプチドの使用に関する。本発明は、NF-κB活性化を阻害する因子にもまた関連する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2004年11月9日に出願された米国特許出願第60/626,163号の優先権の恩典を主張する。
【０００３】
政府の権利に関する言明
本発明は、米国政府により提供された援助(米国衛生研究所(National Institutes of Health)、国立癌研究所(National Cancer Institute)により授与された助成金第CA99340号)を一部受けてなされた。したがって、米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００４】
発明の背景
前立腺癌(PCA)は、米国における癌関連死の第二の主要な原因である。アンドロゲン依存性前立腺癌細胞におけるアポトーシスを刺激することから、アンドロゲン除去が療法として多くの場合用いられる。PCA細胞は、多くの場合アンドロゲン非依存性であり、いくつかは経時的にアンドロゲン非依存性になる。アンドロゲン除去療法の間に、アンドロゲン非依存性細胞が最終的に選択されるが、アンドロゲン非依存性状態への進行は前立腺癌を有する男性における死亡率の主要な原因である。アンドロゲン非依存性腫瘍細胞は破壊がより困難であり、多くの抗癌剤および腫瘍壊死因子α(TNF-α)療法に非感受性を示してきた。アンドロゲン非依存性PCA細胞は、シスプラチンおよびエトポシドのような化学療法剤の高用量に応答するが、これら薬物自体が、望ましくないレベルの全身性毒性を有する。有意な数の腫瘍細胞に影響を及ぼすのに十分な高いレベルを提供することは、容認できないリスクを患者にもたらし得る。
【０００５】
アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞(例えばPC-3およびDU145)は、TNF-α非感受性であることが証明されたが、一方アンドロゲン感受性前立腺癌細胞(例えばLNCaP)はTNF-α感受性である。TNF-αのプロアポトーシス作用および多くの公知の化学療法剤への耐性は、多くの癌細胞におけるNF-κBの構成的活性化と関連していた。Muenchen, et al.,(Clin. Cancer Res. 2000, 6：1969-1977)(非特許文献１)は、IκBα「スーパーリプレッサー」(p6R-IκBS32A＋S36A)によるNF-κBの阻害が、TNF-αの作用に対して以前は非感受性であった前立腺癌細胞を感作することができることを示した。大部分の細胞タイプにおいて、NF-κBは、NF-κBに結合してその核局在化配列(NLS)をマスクするIκBタンパク質との相互作用を介して保持される、潜在的な不活性形態でサイトソル中に構成的に存在する。いくつかの細胞タイプにおいて、NF-κBは、構成的に活性化される。26Sプロテアソームによって分解されるように、細胞におけるNF-κBの活性化はIκBのユビキチン結合を含む。IκBの除去はNLSを曝露し、結果として、細胞をアポトーシスから保護するよう作用する核へのNF-κBの移行をもたらす。
【０００６】
NF-κBの構成的活性化は、例えば、乳房、膵臓、肝臓、膀胱、肺、腎臓、および卵巣を含む様々な組織において報告されてきた。神経芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、および多発性骨髄腫は、NF-κBの構成的活性化と関連する癌に含まれる。NF-κB核移行の阻害が、ドキソルビシンのプロアポトーシス作用に対する多発性骨髄腫の感作におけるいくつかの作用を有することもまた示された(Mitsiades, et al., Blood,(2002年6月)99：4079-4086(非特許文献２))。したがって、NF-κB活性化は、癌療法を改善するための標的となった。
【０００７】
標的特異的物質を癌療法のために利用すること、および同様に正常細胞に影響を及ぼすことなく癌細胞の破壊を増大する物質を開発することは好ましい。特に必要とされるのは、現在の療法の様式に耐性を示し、したがって、増大された死亡率を有するそれらの癌に対する新規の物質である。
【０００８】
【非特許文献１】Clin. Cancer Res. 2000, 6：1969-1977
【非特許文献２】Blood, (June 2002) 99：4079-4086
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、SEQ ID NO：1の少なくとも6個の連続した残基を含む約6〜約50残基の細胞透過性ペプチド、およびNF-κB核局在化配列を含むポリペプチドに関連する。本発明はまた、SEQ ID NO：2の少なくとも11個の連続した残基を含む約11〜約50残基の細胞透過性ペプチド、およびNF-κB核局在化配列を含むポリペプチドに関連する。NF-κBの核局在化配列(NLS)は、例えば、p50、p65、またはそれらの機能的等価物を含み得る。本発明は、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、またはそれらの組み合わせを含むペプチドの有効量を細胞に投与する段階を含む、細胞におけるNF-κB核移行を阻害する方法もまた提供する。本方法は、NF-κB核移行およびNF-κBの構成的活性化が特に有意な役割を担う、様々な疾病状態または代謝異常のために治療的に用いられ得る。
【００１０】
本発明は、SEQ ID NO：1を含む約6〜約50アミノ酸の細胞透過性ペプチド、およびSEQ ID NO：2を含む約11〜約50アミノ酸の細胞透過性ペプチドもまた提供する。細胞透過性ペプチドは、合成され、細胞性もしくは無細胞のDNAもしくはRNAの発現系において作製され、または積荷分子を機能的に結合するように、化学的に接着され得る。積荷分子は、例えば、細胞内活性のモジュレーター、細胞-細胞シグナル伝達のインデューサー、ホルモン、オリゴヌクレオチド、または他の活性物質であり得る。
【００１１】
本発明は、構成的NF-κB活性化と関連する癌に対する化学療法システムであって、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、またはそれらの組み合わせを含むペプチドおよび腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する化学療法剤または放射線治療薬の治療的有効量を含むシステムもまた提供する。化学療法剤は、例えば、TNFα、エトポシド、またはシスプラチンを含み得る。本発明は、癌細胞においてNF-κBの構成的活性化を阻害する少なくとも一つのペプチドの治療的有効量を、化学療法剤と共に、それを必要とする対象に投与する段階を含む、アンドロゲン非依存性前立腺癌を処置する方法もまた提供する。この少なくとも一つのペプチドは、例えば、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SN50、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００１２】
詳細な説明
本発明者らは、アンドロゲン非依存性前立腺腫瘍細胞(癌細胞)を破壊するために、NF-κB活性化または核局在化の阻害物質に機能的に接着され得る新規な細胞透過性ペプチド(CPS)を設計した。細胞に送達され、かつNF-κB活性化の阻害物質を含む積荷ペプチドを運ぶ場合、本CPSは、SN50のようなNF-κB活性化の公知の阻害物質によって提供される阻害を上回るほど増大したNF-κB活性化の阻害を提供する。本発明は、単独で、または腫瘍細胞の破壊を増大するための化学療法剤と併用して、NF-κBの抗アポトーシス作用を阻害するために投与され得るペプチドを提供する。
【００１３】
本発明は、癌細胞のアポトーシスを誘導しかつシスプラチンおよびエトポシドのような化学療法薬の細胞破壊効果に対して腫瘍細胞を感作する新規なペプチドの使用法もまた提供する。そのようなペプチドは、細胞における抗アポトーシス機構を阻害し、または細胞におけるアポトーシスを促進し、かつSEQ ID NO：1(Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala)、SEQ ID NO：2(Lys-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala)、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、またはそれらの組み合わせを含む、約6〜約50のアミノ酸のペプチドを一般的に含み得る。本発明は、構成的NF-κB活性化がアポトーシスに対して細胞性耐性を誘導するかまたはアポトーシスを阻害するような様々な癌タイプの処置、ならびにアンドロゲン非感受性前立腺癌の処置のための、新規な治療剤を提供する。
【００１４】
本発明のペプチド、および本発明の方法において用いられるペプチドは、当業者に公知の標準ペプチド合成方法によって調製され得る。ペプチドはまた、ペプチドの発現および精製を促進するために、適切なプロモーター、ターミネーター、ならびに精製タグをコードする配列のような機能的な他の配列に、機能的に結合される最適なペプチドをコードする核酸配列を有する発現ベクターを用いて作製され得る。「操作可能に」または「機能的に」結合するとは、CPSが細胞へのCPS/積荷ペプチド(例えばCPS/NLS)の移入を導くことができ、かつ積荷ペプチドが、細胞シグナル伝達のような細胞性代謝に影響を及ぼすよう機能することができるように、CPSとその積荷ペプチドが接続されることを意味する。CPSと積荷ペプチドは、例えば、1つまたは複数のペプチド結合によって結合され得る。CPSは積荷ペプチドに対する直接のC末端またはN末端であってよく、複数のCPSを用いてよく、複数の積荷ペプチドを用いてよく、かつ/または、CPSおよび積荷ペプチドアミノ酸配列を、CPSおよび積荷ペプチドの間の領域内で、1つもしくは複数のアミノ酸によって分離することができる。CPS/積荷ペプチドは、C末端またはN末端またはその両方のいずれかで、さらなるアミノ酸を含み得る。
【００１５】
本明細書で用いられる「化学療法」剤を、細胞におけるアポトーシスを刺激する化学物質であり、一般的に(必ずではないが)正常細胞に対するよりも癌または腫瘍細胞に対してより大きな作用を有する。様々な化学療法剤が、当業者に公知である。癌細胞のアポトーシスを刺激するための癌療法の当業者に公知の物質はまた、放射線治療薬を含む。本発明のペプチドはまた、放射線治療薬の効果を増大させるためおよび癌細胞の破壊を促進する相乗効果を提供するために用いられ得る。
【００１６】
細胞透過性の「インポートコンピテント(importation competent)」シグナルペプチド配列、および膜転位配列は、接着されたペプチドおよびタンパク質の細胞への運搬を促進する。この種類のいくつかの配列は以前に記載されており、これにはp50の核局在化配列(NLS)に融合してSN50(米国特許第5,807,746号)として公知のペプチドを作製する、カポジ線維芽細胞増殖因子のシグナル配列の疎水性領域を含む。本発明者らは、接着されたペプチドまたはタンパク質に対して改良された細胞透過性を付与するように本発明者らによって設計された、新規な配列を本明細書に提供する。機能的に結合するNF-κB p50、または本明細書において記載される細胞透過性配列(CPS)に対する機能性対応物は、投与の同様の条件下でSN50の活性と比較される場合、改良された活性を有するペプチドを作製する。本発明者らは、Lys-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala(SEQ ID No：2)を含む配列が、p50 NLSの細胞移入を促進することにおいて、最も広く使われているNF-κB活性化の細胞透過性阻害物質の一つであるSN50よりもずっと有効であることを示した。本発明者らによって作製されるCPS/p50 NLS(SEQ ID NO：3)ペプチドは、それらの細胞におけるアポトーシス経路を引き起こす化学療法剤と共に投与される場合、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞の有効な細胞殺害を提供する。CPS/p50 NLS(SEQ ID NO：4)ペプチドは、少なくとも一つの化学療法剤または放射線治療剤と共に投与される場合に、相乗的プロアポトーシス効果を提供するだけでなく、化学療法剤または放射線治療剤を伴わずに投与される場合もまた、プロアポトーシスおよび治療効果を提供する。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「CPS」という用語は、開示された配列、それらの誘導体、変種、もしくは機能性対応物に対するN末端またはC末端(または両方)のいずれかの付加アミノ酸を含み得るペプチドと同様に、ペプチドの変種または生物学的活性断片を含む。「機能性対応物」は、例えばペプチド核酸(PNA)を含み得る。ペプチドの「変種」は、開示されたCPSペプチド配列に完全に同一ではない。本発明の開示に与えられた変種は、1つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によりアミノ酸配列を変更することによって得ることができる。開示されたペプチドのアミノ酸配列は、例えば置換によって改変することができ、質が実質的に同じまたは改良されたペプチドを作製する。置換は、保存された置換であり得る。「保存された置換」は、極性/非極性性質、電荷、またはサイズにおいて同様の側鎖を有する他のアミノ酸によるアミノ酸の置換である。必須アミノ酸20個は、非極性側鎖(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、およびトリプトファン)、無電荷の極性側鎖(メチオニン；グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン)、酸性側鎖(アスパラギン酸およびグルタミン酸)、ならびに塩基性側鎖(リシン、アルギニン、およびヒスチジン)を有するものとしてグループ分けすることができる。保存された置換は、例えばAspからGlu、Asn、またはGln；HisからLys、Arg、またはPhe；AsnからGln、Asp、またはGlu；LeuからIleまたはVal；およびSerからCys、Thr、またはGlyを含み得る。アラニンは、保存された置換を作成するのに一般に用いられる。
【００１８】
当業者にとって、変種ペプチドは、生物活性に影響を及ぼすために、ペプチド構造における1つまたは複数の位置で第一のアミノ酸を第二のアミノ酸に置換することによって得ることができる。アミノ酸置換は、例えば増大された生物活性をもたらすポリペプチドの立体構造変化を誘導し得る。
【００１９】
当業者は、アミノ酸の親水性指数または疎水性親水性指標に基づくアミノ酸配列の置換もまた行うことができる。
【００２０】
本発明の変種ペプチドは、対応する未変性の核酸分子またはSEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、またはSEQ ID NO：4を含むポリペプチドのアミノ酸配列に対して、100％未満であるが、少なくとも約50％、およびより好ましくは少なくとも約80％〜約90％のアミノ酸配列相同性または同一性を有する。したがって、変種CPSペプチドのアミノ酸配列は、開示されたアミノ酸配列に本質的に一致する。本明細書で使用される「本質的に一致する」とは、開示されたCPSによって生成されるものと同様の生物活性を誘発するポリペプチド配列を指し、そのような活性は、開示されたCPSペプチドの活性の少なくとも約70パーセントから、開示されたCPSペプチドの活性の100パーセントを超えるものまでである。 
【００２１】
開示されたCPSの変種は、対応するCPSに存在しないアミノ酸残基を含み得るか、または対応するCPSに関連する欠失を含み得る。変種はまた、対応するCPSと比較して切り詰められた「断片」、すなわち特定の開示されたCPSのアミノ酸配列の一部のみであり得る。
【００２２】
核因子κB(NF-κB)は、組織におけるTNF-α放出により増大する活性化と共に、アンドロゲン非感受性PCA細胞において構成的に活性化される。NF-κB、およびそれにより調節される遺伝子は、ヒトPCA細胞における抗アポトーシスの誘導の原因となるように見える。NF-κB核移行は、本発明のCPS/p50 NLS(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、またはその組み合わせ)ペプチドの投与によって阻害され、NF-κB調節抗アポトーシス機構を妨げ得る。アポトーシスを刺激する化学療法剤と共に投与される場合、本発明のCPS/p50 NLS(SEQ ID NO：3)ペプチドは、NF-κB活性化およびその後のアポトーシス阻害を遮断し、かつ腫瘍細胞殺害を促進する。単独で、またはアポトーシスを誘導する化学療法剤と併用して投与される場合、SEQ ID NO：4に記載のCPS/NLSもまた、アポトーシスのNF-κB阻害を遮断し、かつ腫瘍細胞の破壊を促進する。
【００２３】
SEQ ID NO：4を含むペプチドは、任意の化学療法剤を伴わずに単独で投与され、治療効果を提供し得る。「単独」とは、有意なプロアポトーシス治療効果を有するさらなる物質を伴うことなく、ペプチドが、主要な治療剤として提供されることを表すことを意味する。本発明のペプチドまたは本発明の方法において用いられるペプチドが、例えば添加剤、希釈剤、溶剤、生理食塩水、ならびに抗生物質および鎮痛剤のような他の望ましい治療的効果を有する薬剤のような、当業者に公知の適切な薬学的物質と共に提供され得ることが理解されるべきである。
【００２４】
本発明の細胞透過性配列(SEQ ID NO：1およびSEQ ID NO：2)もまた、様々な他のペプチド、核酸、および調査または治療的使用のための他の有機化合物を送達するために用いられ得る。本発明の方法を用いて細胞の内部に送達され得る他のペプチドは、細胞内タンパク質の酵素消化部位、リン酸化部位、タンパク質-タンパク相互作用領域、および受容体結合部位を含むペプチドを含むが、それらに限定されない。CPSはまた、増殖、分化、または他の細胞機能を促進するために、細胞の内部において作用するタンパク質の機能性領域を含むペプチドを送達するために用いられ得る。
【００２５】
本発明のCPS/p50 NLSは、炎症または疼痛を低下させる目的で、NF-κBの核局在化の阻害を含む様々な他の療法においてもまた用いられ得る。NF-κB阻害は、例えばリウマチ様関節炎(RA)における治療的介入のための標的として提案された。リウマチ様関節炎において、滑膜は強力な腫瘍様構造(パンヌス)になり、かつアポトーシスの障害性調節が一般的に原因因子であると考えられる。RAの動物モデルにおいて、NF-κBデコイの関節内投与は、反対側の未処置の関節と同様に、処置した関節における連鎖球菌の細胞壁誘導関節炎の再発を予防した。脊髄性NF-κB活性化が、COX-2アップレギュレーションを誘導し、かつ炎症性疼痛過敏性反応を誘導することが示された。炎症性疼痛過敏性反応は、急性および慢性疼痛状態において役割を担う。本発明のCPS/p50 NLSは、COX-2アップレギュレーションおよび疼痛過敏性反応を低下させるために、傷害、手術、外傷、または炎症の部位に提供され得る。ペプチドは関節内空間に注射され得るか、またはカテーテルを介してポンプ貯蔵器から提供されてもよく、ポンプは体内または体外に配置される。持続性または改変放出組成物は、注射またはポンプを介して提供され得るか、または炎症部位でもしくはその近傍で、移植のためにマトリックスに組み込まれ得る。
【００２６】
NF-κBの阻害が、移植された組織または膵島細胞のような細胞に保護性効果を有することもまた報告された。移植組織または細胞と組み合わせて提供されるCPS/p50 NLS配列を有する本発明のペプチドは、したがって、細胞生存を促進する手段を提供し得る。
【００２７】
IκBαまたは切り詰めたp65の過剰発現によるNF-κB活性化の阻害は、炎症反応を低下させ、かつ異物移植における傷害から器官を保護することを示した。NF-κB活性化の阻害は、虚血/再潅流、心臓発作、および卒中と関連する組織損傷の予防において有効であると提言された。
【００２８】
本発明はまた、例えばPCA細胞のような細胞において、上記のようにNLSに機能的に結合されるCPSを含むポリペプチドによって、NF-κB転写因子ファミリータンパク質の誘導されたおよび/または構成的な活性化を抑制する方法も目的とする。本発明の方法は、核移行の阻害および内在性NF-κBの活性化のために、NF-κB p50 NLSをヒト前立腺癌細胞の内部に導入する手段を提供する。本方法は、NF-κB核局在化配列の細胞内部への輸送を促進するペプチドに機能的に結合される、NF-κB核局在化配列またはその機能性部分を含むペプチドの治療的有効量を、少なくとも一つの治療的有効量の化学療法剤と共に、患者に投与する段階を含む。NF-κB核局在化配列を含むペプチド、およびNF-κB NLSの細胞内部への輸送を促進するペプチドは、例えばSEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、またはそれらの組み合わせを含み得る。NF-κB核局在化配列の細胞内部への輸送を促進するペプチドは、例えばSEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、またはそれらの組み合わせを含み得る。CPS/NF-κB NLSペプチドは、少なくとも一つの化学療法剤の投与前、同時に、またはその後に投与され得り、かつ投与のタイミングは選択される投与経路に依存し得る。
【００２９】
CPS/p50 NLS NF-κB阻害物質、または、NF-κB核局在化の阻害物質に機能的に結合される、CB5003(SEQ ID NO：3)のような本発明に記載のCPSを含むペプチドは、同様の抗アポトーシス機構を有する癌細胞においてもまた利用され得る。本発明において、本発明者らは、CB5005(SEQ ID NO：4)によるPCA細胞の同時処理が、ヒトPCA細胞のアポトーシスを誘導するために必要なシスプラチンまたはエトポシドの濃度を著しく減少させ、かつ化学療法剤の有効性を劇的に増大させることを示した。さらに、それ自体で化学療法剤として用いられる場合、さらなる化学療法剤の非存在下で、CB5005(SEQ ID NO：4)は腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導することもできる。
【００３０】
したがって、本発明はまた、腫瘍細胞破壊を促進するNF-κBの抗アポトーシス作用を阻害する少なくとも一つのペプチド物質の治療的有効量、もしくは腫瘍細胞におけるアポトーシス経路を引き起こす少なくとも一つの化学療法剤によって供給される、少なくとも一つのペプチド物質を含む物質の組み合わせを含む化学療法キットまたはシステムを提供する。これらは、混合された形態または別々のアリコートで提供され得る。一つの態様において、そのようなキットまたはシステムは、例えばSEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、もしくはその組み合わせのような、CPS/p50 NLSもしくは同様のペプチド、および少なくとも一つの化学療法剤を含む。化学療法剤は、例えば、TNF-α、シスプラチン、エトポシド、または、化学療法を必要とする患者に投与された場合に、特にアンドロゲン非依存性前立腺癌であると診断された患者において、アポトーシスを刺激する他の物質を含み得る。CPS/p50 NLSペプチドは、例えばSEQ ID NO：1もしくはSEQ ID NO：2のアミノ酸配列、またはそこへ機能的に結合されるペプチドに膜透過性を付与する様々な配列を含み得る。そのような配列はまた、例えば、米国特許第6,780,843号に記載されたような、カポジ線維芽細胞増殖因子または膜転位配列のシグナル配列も含み得る。
【００３１】
本発明によって提供される、ペプチド物質の治療的有効量は、当業者によって決定され得り、本明細書に含まれる開示を与え、かつペプチド物質および化学療法剤の組み合わせが処方される特定の個体における腫瘍サイズ、腫瘍数、ならびに腫瘍位置によって、ならびに、年齢および体重のような投与量レベルを決定するために用いられる共通因子によって、異なり得る。投与は、静脈内投与、腹腔内注射、徐放性マトリックスの移植、装置、もしくは組成物のような標準経路、または当業者に公知の他の手段によって実施され得る。
【００３２】
徐放性、改変放出性、もしくは制御放出性の組成物、または装置は以前に記載されており、本発明記載のペプチド物質の投与を提供し得る。体内ポンプは、例えば、ペプチド物質と共に投与される化学療法剤と同様に、ペプチド物質を投与するために用いられ得る。外部ポンプはまた、特にそのようなポンプが患者の循環系または患者組織内の標的部位へのペプチド物質の送達のためのカテーテルに機能的に接続される場合に、用いられ得る。経皮的送達は、皮膚の表面またはその近傍に位置する腫瘍に対してもまた用いられ得る。本明細書において記載されるペプチド、または本明細書記載の方法において用いられるペプチドの静脈内投与が用いられ得る。ペプチド組成物は、標準的な針/シリンジを用いて注射され得る。注射は、例えば皮下、腹腔内、または筋肉内のいずれかで提供され得る。
【００３３】
本発明のCPSの増大された膜透過性は、1つまたは複数の組織を介して薬物送達を支援するための、例えばペプチド、タンパク質、DNA、RNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはそれらの組み合わせを含む活性物質を送達するためのより有効な物質もまた提供する。ドラッグデリバリーシステムを提供するための膜転位ペプチドの使用は、米国特許第6,780,846号(Elan Corporation, PLC)において記載された。ペプチド、タンパク質、ホルモン、鎮痛剤、キレート剤、細胞内代謝のモジュレーター、細胞-細胞シグナル伝達のモジュレーターなどのような薬学的組成物は、本発明のCPSに接着することによって提供され得る。接着は、CPS/活性物質積荷組み合わせ分子を合成することによって、CPSに積荷分子を化学的に接着することによって、CPS/活性物質積荷組み合わせ分子を細胞性もしくは無細胞組換えDNA発現系において作製することによって、または当業者に公知の他の手段によって達成され得る。CPS/活性物質分子は、例えばナノ粒子、ナノスフェア、リポソーム、ミクロスフェア、カプセル剤、乳剤、および/もしくはミセルのような、当技術分野において前述の様々な物質と組み合わされ、またはそれによって送達され得る。標的生物のペプチドまたはDNA配列を含むことが多いワクチン、例えばインスリン、成長ホルモン、エストラジオール、およびテストステロンのようなホルモン、化学療法剤、抗高血圧薬、および他の活性物質は、本発明のCPSを含む薬物送達系によって送達され得る。送達経路は、静脈内、腹腔内、経口、経鼻(例えば滴下または吸入によって)、局所的、または当業者に公知の他の手段を含み得る。本発明のCPS/活性物質分子を含む組成物は、皮膚癌、皮膚疾患、熱傷、および慢性的な損傷の療法を助けるために、例えば局所的に投与され得る。
【００３４】
本発明を以下の非限定的な実施例の手段によってさらに説明する。
【００３５】
実施例
CPS機能性ペプチドの設計および合成
ペプチドは、従来の固相ペプチド合成方法論(Celtek Bioscience, Nashville, TN)によって合成された。Fmoc化学に基づく標準合成プロトコールが用いられた。合成の後、粗ペプチドは、固体支持体から切断され、かつC18逆相HPLCによって精製された。精製ペプチドは、分析的HPLC分析および質量分析法分析によって特徴付けられた。
【００３６】
生物検定のために、ペプチドストックは、希釈液としてPBS(2 mg/ml)中またはDMSO(30 mg/ml)中のいずれかで作製された。培養液中のDMSOの最終濃度は、0.1％を上回らなかった。
【００３７】
NF-κB p50タンパク質の核局在化配列(NLS)は、担体として機能性積荷および細胞貫通性配列(CPS)として用いられた。CPS/NLS合成ポリペプチドは、CPSがNLSのN末端に位置するように合成された(図1)。ポリペプチドCB5003(SEQ ID NO：3)については、CPSを含むSEQ ID NO：1を伴う。ポリペプチドCB5005(SEQ ID NO：4)については、CPSを含むSEQ ID NO：2を伴う。CB5002(SEQ ID NO：5)は、NLSのN末端に位置する、非機能性変異CPSを含んだ。CB5007(SEQ ID NO：6)は、CPSのC末端の非機能性変異NLSを含んだ。 
【００３８】
細胞株
ヒト前立腺腺癌DU145およびLNCaP細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD))から得られた。ヒト前立腺腺癌PC3細胞株は、ハンチントン難治疾患研究所(Huntington Medical Research Institutes、Pasadena, CA)のDr. Lawrence Jonesによって快く提供された。3つの細胞株は全て、10％ウシ胎児血清、50ユニット/mlのペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、および1 mMのナトリウムピルバートを補充したRPMI 1640中で維持された。LNCaP細胞に対しては、10 mMのHEPESおよび4.5 g/Lグルコースも補充された。N2a神経芽細胞腫細胞株は、サザン・ミシシッピ大学(University of Southern Mississippi, Hattiesburg, Mississippi USA)のDr. Yuan Luoによって快く提供された。N2a細胞は、5％ウシ胎児血清を補充した50％DMEM/50％最適MEM中で維持された。細胞株を、5％CO2を伴う加湿大気中、37℃で増殖させた。
【００３９】
ペプチド細胞移入を検出するための間接的免疫蛍光検定
DU145細胞を、8ウェルチェンバースライド(Nunc, Naperville, IL)上で、80％コンフルエントまで増殖させた。これらの細胞は次いで、希釈液または異なる濃度のペプチドと共に、血清非含有RPMI中で、37℃で1時間インキュベートされた。細胞は、細胞外のペプチドを除去するために冷PBSによって3回洗浄され、次いで4℃で20分間、PBS中で3.5％パラホルムアルデヒド溶液により固定された。固定細胞は、冷PBSによって3回洗浄され、0.25％Triton X-100によって10分間処理された。洗浄された細胞は次いで、抗ペプチドIgGと共にPBS中で1時間インキュベートされた。PBSによる5分間の洗浄を3回行った後、(ペプチド-抗体複合体を介した)細胞内ペプチドは続いて、FITC標識ヤギ抗ウサギIgG(Pierce, Rockford, IL)によって、1時間のインキュベーションの後検出された。染色された細胞を有するカバーガラスは、Poly/Mount(Polysciences, Warrington, PA)に取り付けられ、100×油浸レンズを用いてMicrostar IV(Reichard, Buffalo, NY)によって分析された。カラー画像は、Pixeraデジタルカメラを用いて分析され、JPG形式で保存された。同じアッセイはまた、PC3、LNCaP、および神経芽細胞腫N2a細胞を含む他の細胞株において、ペプチド細胞移入を決定するために利用された。
【００４０】
CB5005 (SEQ ID NO：4)ペプチドの細胞移入
間接的免疫蛍光検定における蛍光シグナルを分析することによって、異なる細胞株におけるCB5005(SEQ ID NO：4)、CB5003(SEQ ID NO：3)、CB5002(SEQ ID NO：5)、およびCB5007(SEQ ID NO：6)ペプチドの細胞内移入活性を蛍光顕微鏡によって検討した。図2に示すように、CB5005(SEQ ID NO：4)は、アンドロゲン非依存性DU145およびPC3癌細胞、アンドロゲン依存性LNCaP癌細胞、ならびに神経芽細胞腫N2a細胞を含む全ての被験細胞株に対して細胞透過性であった。
【００４１】
CB5005(SEQ ID NO：4)の細胞移入はまた、濃度依存性であった。しかしながら、CB5003(SEQ ID NO：3)は非常に弱い移入活性を示したが、一方CB5002は本細胞移入アッセイにおいて活性でなかった。CB5007は、CB5005(SEQ ID NO：4)と同様の移入活性を示したが、これはこれら2つのペプチドが同じCPSを共有するためである。
【００４２】
この間接的免疫蛍光検定はまた、ペプチド細胞移入を定量化するために利用された。簡潔には、96ウェルプレート中で増殖した細胞は、異なる期間ペプチドによって処理され、次いで上記の通りに抗ペプチド抗体およびFITC標識抗ウサギ抗体を用いた間接的免疫蛍光検定に供される。細胞は次いで、10％SDSによって溶解され、かつ可溶性細胞溶液における蛍光は、Cytofluor(商標)2300リーダー(Millipore)によって485/560 nmで定量された。蛍光読取値は、ペプチド未処理サンプルのバックグラウンド読取値からそれらを減算することによって算出された。データは、5組のサンプルにおいて実施された3回の独立した実験の平均±SEMとして表された。移入されたCB5005ペプチド(SEQ ID NO：4)の動態は、本定量により研究された。時間依存的な蛍光蓄積(628.00±75.60(1時間)、737.33±37.10(4時間)、および1,042±58.40(2O時間))が観察され、これにより、抗ペプチド抗体によって認識されるように、細胞内区画におけるCB5005ペプチド(SEQ ID NO：4)の相対的安定性が示唆される。
【００４３】
核抽出物のウェスタンブロット分析
PCA細胞を、60-mmディッシュ上で70〜80％コンフルエントまで増殖させた。細胞は、異なる濃度のペプチドと共に30分間37℃でインキュベートされ、その後、示されるように、さらに1時間37℃でTNF-α(10 ng/ml)により処理されるか、または16時間ペプチドのみと共にインキュベートされる。処理の後、細胞は、氷冷PBSによって洗浄され、かつ500μlの緩衝液A(10 mM HEPES、pH 7.9、10 mM KCl、0.1 mM EDTA、0.1 mM EGTA、0.4％ Nonidet P-40、1 mM DTT、0.5 mM PMSF、ならびに各1μg/mlのロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチン、キモスタチン、およびアンチパイン)中で10分間氷上で溶解された。核は、高速遠心分離によってペレット化され、500μlの緩衝液Aによって洗浄された。核は次いで、40μlの緩衝液B(20 mM HEPES、pH 7.9、400 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM DTT、1 mM PMSF、ならびに各1μg/mlのロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチン、キモスタチン、およびアンチパイン)中で再懸濁された。核抽出物のタンパク質濃度は、Pierce BCAタンパク質アッセイを用いて決定され、かつ緩衝液Bを用いてサンプルの中で均一にされた。
【００４４】
等量のタンパク質は、2×SDSサンプル添加液中で5分間100℃で熱処理され、10％SDSポリアクリルアミド電気泳動によって断片化された。タンパク質はニトロセルロース紙に転写された。TBS(10 mM Tris-HCl、pH 7.6、70 mM NaCl、および0.05％Tween 20)中で、5％脱脂乳による30分間のブロッキングの後、核NFκB p50は、抗p50 IgG抗体(1：5000)(Upstate, Lake Placid, NY)を用いて検出された。一次抗体は、製造者のプロトコール(Pierce, Rockford, IL)に記載されているように、ECLウェスタンブロットシステムを用いて、西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体によって視覚化された。
【００４５】
ヒト前立腺癌細胞におけるNF-κB核移行および活性化の阻害
DU145は、TNF-α処理によってさらに増強され得る構成的NF-κB活性化を示すアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株である。アンドロゲン依存性細胞株であるLNCaPは、構成的NF-κB活性化を示さないが、NF-κB活性化はTNF-α処理によって刺激され得る。NF-κB活性化は通常、その迅速な核への移入をもたらす。したがって、核抽出物におけるNF-κBタンパク質のウエスタンブロット分析が、NF-κB活性化の程度を評価するために用いられた。NF-κB p50 NLSに機能的に結合されるCB5005(SEQ ID NO：4)およびCB5003(SEQ ID NO：3)は、DU145(図3a)およびLNCaP細胞の両方において、対照と比較してTNF-α誘導NF-κB核移行を阻害した。変異NLSを有する対照ペプチドであるCB5007(SEQ ID NO：6)は、いずれの細胞株にもおいても阻害作用を有さなかった。CB5005(SEQ ID NO：4)はまた、NF-κBの構成的活性化も阻害した(図3b)。
【００４６】
前立腺癌細胞におけるNF-κBの機能的活性に対するこれらのペプチドの阻害作用は、κB認識部位をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドへのNF-κB結合を、特異的NF-κB p50抗体を用いた酵素結合免疫学的検定(ELISA)により測定することによって定量化された。核抽出物は、ペプチド未処理細胞と比較して有意に低いNF-κB結合活性を示すペプチド前処理DU145細胞を形成し、これによって、これらのペプチドが、DU145細胞におけるTNF-α誘導のおよび構成的なNF-κB核移行の両方を阻害したことが確認された。 
【００４７】
蛍光顕微鏡検査法
DU145細胞を、4ウェルチェンバースライド上で、70〜80％コンフルエントまで増殖させた。細胞は次いで、30分間37℃でCB5005ペプチド(SEQ ID NO：4)(30μM)または希釈液によって、その後さらに5時間、シスプラチン(5μg/ml)によって処理された。処理後、製造者のプロトコール(BD Biosciences, San Diego, CA)によって示唆されるように、細胞は、結合緩衝液によって洗浄され、アネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウム(PI)を含む結合緩衝液中で、室温で15分間、暗黒下で再懸濁された。チャンバースライドは、Poly/mount(Polysciences, Warrington, PA)内に取り付けられ、かつ×100油浸レンズを用いて、蛍光顕微鏡(Microstar IV, Reichard, Buffalo, NY)によって分析された。カラー画像は、Pixeraデジタルカメラによって分析され、JPG形式で保存された。 
【００４８】
TUNELアッセイ法
DU145細胞は、8ウェルチェンバースライド上で、70〜80％コンフルエントまで増殖させた。細胞は次いで、異なる濃度のペプチドまたは希釈液と共に30分間37℃でインキュベートされ、その後さらに16時間、シスプラチン(5μg/ml)または希釈液によって処理された。細胞は、空気乾燥され、4％パラホルムアルデヒド中で1時間室温で固定された。細胞は次いでPBSによって洗浄され、透過化処理溶液(0.1％Triton X-100の0.1％クエン酸ナトリウム溶液)によって、氷上で2分間透過化処理された。アポトーシスは、製造者の説明書(Roche, Indianapolis, IN)に従って、TUNEL法「インサイチュー細胞死検出POD」を用いて検出された。アポトーシスによるフルオレセイン標識DNA鎖切断は、光学顕微鏡(Microstar IV, Reichard, Buffalo, NY)下で、抗フルオレセイン抗体結合POD(ペルオキシダーゼ)を用いて、×40拡大率で視覚化された。画像は、Pixeraデジタルカメラを用いて分析された。
【００４９】
フローサイトメトリー分析
PCA細胞は、60-mmディッシュ上で50〜60％コンフルエントまで増殖させた。これらの細胞は、異なる濃度のペプチドと共に30分間37℃でインキュベートされ、その後さらに21時間37℃で、TNF-α(10 ng/ml)、シスプラチン(2〜30μg/ml)、エトポシド(2〜20μg/ml)、または希釈液によって処理された。アポトーシス細胞上のホスファチジルセリン曝露は、アネキシンVを結合するそれらの能力によって測定された。具体的には、細胞はトリプシン処理によって収集された。トリプシン処理された細胞、培地およびPBS洗浄液は混合され、細胞は遠心分離によって収集された。製造者のプロトコール(BD Biosciences, San Diego, CA)によって示唆されるように、収集された細胞は結合緩衝液によって洗浄され、アネキシンV-FITCおよびPIを含む結合緩衝液70μl中で、室温で15分間、暗黒下で再懸濁された。染色された細胞は、フローサイトメトリーによって分析された。各サンプルについて最低20,000の事象を測定した。
【００５０】
化学療法薬によるアンドロゲン非依存性PCA細胞のアポトーシスの誘導ならびにこれらの癌細胞の殺害の感作および増強に対する、CB5005(SEQ ID NO：4)ペプチドの効果
CB5005(SEQ ID NO：4)ペプチド物質は、シスプラチンと共にアンドロゲン非依存性DU145細胞を処理するために利用された。アネキシンV/PIに基づく蛍光顕微鏡分析(図4)によって決定されるように、CB5005(SEQ ID NO：4)の非存在下で、シスプラチン(5μg/ml)は、DU145細胞におけるアポトーシスの誘導に対して効果がなく、ここで、アポトーシスの初期段階は、アネキシンV-FITC結合ホスファチジルセリン(PS)によって、アポトーシス細胞の内部から放出される細胞膜の外側で検出され得る。しかしながら、DU145細胞がCB5005(SEQ ID NO：4)ペプチドおよびシスプラチンによって同時処理された場合、強いアネキシンV-FITC染色によって示されるように、アポトーシスが誘導された(図4)。CB5005(SEQ ID NO：4)のこの相乗活性は、アポトーシスの間に起こったDNA鎖切断を優先的に標識する別のアポトーシスアッセイであるTUNELアッセイによって確認された(図5)。CB5005(SEQ ID NO：4)のこの感作活性は濃度依存的であり、20μMの濃度で最大に達した(図5)。興味深いことに、CB5005(SEQ ID NO：4)単独による細胞の処理はまた、低いレベルのアポトーシスも誘導し、このことは構成的NF-κB活性化が、DU145腫瘍細胞の増殖を持続させる原因となることを示唆した(図5)。CB5005(SEQ ID NO：4)と比較して非常に低いレベルであるが、CB5003(SEQ ID NO：3)もまた活性であったが、CB5002(SEQ ID NO：5)やCB5007(SEQ ID NO：6)は活性ではなかった(図6)。これらの結果は共に、CB5005(SEQ ID NO：4)が、抗癌剤による殺害に対してアンドロゲン非依存性前立腺癌DU145細胞を感作できる有効な物質であることを示す。
【００５１】
シスプラチンによる進行した前立腺癌DU145細胞の殺害を感作するCB5005(SEQ ID NO：4)の能力は、細胞のアネキシンV/PI標識のレベルをフローサイトメトリーによって測定することにより定量化された。DU145細胞は、シスプラチン単独、CB5005(SEQ ID NO：4)単独で処理されるか、またはCB5005(SEQ ID NO：4)およびシスプラチンによって同時処理された(図7)。シスプラチン処理(5μg/ml)は効果がなく、かつCB5005(SEQ ID NO：4)処理(30μM)は部分的に有効であったが、一方2つの物質の同時処理は、DU145癌細胞においてアポトーシスを有意に誘導した(図7)。さらにまた、CB5003(SEQ ID NO：3)は活性であったが、CB5005(SEQ ID NO：4)と比較して非常に低い程度であった(図8)。CB5003(SEQ ID NO：3)に対する対照ペプチドであるCB5002(SEQ ID NO：5)は、これらのアポトーシスに基づく実験において、有意な効果を示さなかった(図8)。最後に、CB5005(SEQ ID NO：4)は、TNFαによって誘導されたDU145細胞におけるアポトーシスを感作することもまた可能であった(図9)。
【００５２】
シスプラチンによって誘導されるアポトーシスの増強における、CB5005(SEQ ID NO：4)またはCB5003(SEQ ID NO：3)の相乗活性は、濃度依存的であった(図10a)。CB5005(SEQ ID NO：4)/シスプラチンの場合、30μMでのCB5005(SEQ ID NO：4)の同時処理は、DU145癌細胞におけるアポトーシスを、シスプラチン単独で処理されたものと比較して約15倍増で刺激した。シスプラチン投与量を5μg/mlから2μg/mlまで減少させた場合、このCB5005(SEQ ID NO：4)ペプチドによる相乗活性は、大きく変化しなかった(図10b)。興味深いことに、CB5005(SEQ ID NO：4)処理のみ(シスプラチンなし)もまた、これらの腫瘍細胞のアポトーシスの刺激において、非常に活性であった(図10b)。
【００５３】
CB5005(SEQ ID NO：4)のさらに大きな相乗活性は、進行型のPCA細胞が耐性を示す他の抗癌剤であるエトポシドを用いて観察された(図11)。アポトーシス細胞の高い割合(約60％)が、エトポシド(2μg/ml)およびCB5005(SEQ ID NO：4)(30μM)によって21時間同時処理されたDU145細胞のフローサイトメトリー分析によって検出された(図11)。
【００５４】
総合して、これらの実験データは、CB5005(SEQ ID NO：4)およびシスプラチンまたはエトポシド(2μg/ml)によるDU145細胞の同時処理が、PCA細胞におけるアポトーシス誘導において、より高用量(20〜30μg/ml)でこれらの抗癌剤のみを用いる処理よりもずっと有効であることを明らかに示した。
【００５５】
インビトロ細胞毒性分析
LNCaP、DU145、PC3、または神経芽細胞腫N2a細胞を、96ウェルプレート内で、60％コンフルエントまで増殖させた。異なる濃度のペプチドによる処理は、総容積100μlにおいて血清非含有RPMI中で37℃で24時間、四通り実施された。細胞は、次いで洗浄され、20μlのCellTiter 96 AQueous Solution試薬(Promega, Madison, WI)を含む100μlフェノールレッド非含有RPMIと共に、37℃で1時間インキュベートされた。各ウェルにおける吸光度は、Microplate Autoreader EL 309 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT)を用いて490 nmで記録された。吸光度は、生細胞の数を直接反映する。ブランクは、全てのデータから減算された。データは次いで、Prismソフトウェア(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)を用いて分析され、3回の独立した実験の平均±SEとして表された。統計的有意差は一元分散分析によって実施され、p＜0.05の場合有意であるとみなす。
【００５６】
アンドロゲン非依存性PCA細胞に対するCB5005(SEQ ID NO：4)の相乗活性の特異性
PCA細胞のアポトーシス誘導におけるCB5005(SEQ ID NO：4)の活性が、アンドロゲン非依存性細胞に特異的であるかどうかを決定するために、本発明者らは、構成的NF-κB活性化を示さないアンドロゲン依存性LNCaP細胞に対する本ペプチドの効果を検討した。図12aに示すように、CB5005(SEQ ID NO：4)は、エトポシド誘導アポトーシスに対してアンドロゲン非依存性PC3細胞を感作したが、エトポシドのプロアポトーシス作用に対してアンドロゲン依存性LNCaP細胞を感作しなかった。MTS細胞毒性分析からの結果はまた、CB5005(SEQ ID NO：4)がLNCaP細胞に対して毒性ではないことを示した(図12b)。さらに、結果は、CB5005ペプチド(SEQ ID NO：4)処理が、神経芽細胞腫N2a細胞に毒性をもたらさなかったことを示す(図12b)。総合して、結果は、CB5005のプロアポトーシス活性が、構成的NF-κB活性化によって特徴付けられるアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞に特異的であることを示す。
【００５７】
蛍光分光分析によるカスパーゼ3定量
PC3細胞は、60-mmディッシュ上で90％コンフルエントまで増殖させた。細胞は次いで、30分間37℃でCB5005(SEQ ID NO：4)と共にインキュベートされ、その後16時間、エトポシド(5μg/ml)または希釈液によって処理された。処理の後、細胞はトリプシン処理によって収集された。トリプシン処理された細胞、培地およびPBS洗浄液は混合され、細胞は遠心分離によって収集された。収集された細胞は、30分間氷上で、カスパーゼ3緩衝液(20 mM Tris-HCl、pH 7.2、150 mM NaCl、1％ Triton X-100、1 mM DTT)中で溶解された。等量のタンパク質は、2×カスパーゼ反応緩衝液(100 mM HEPES、pH 7.5、10％スクロース、0.1％CHAPS、基質として新たに添加された10 mM ジチオスレイトールおよび50μM Asp-Glu-Val-Aspアミノメチルクマリン(DEVD-AMC)を伴う0.2％BSA)と共に、室温でインキュベートされた。サンプルは、380 nmで励起され、460 nmでCytofluor(登録商標)2300(Millipore, Bedford, MA)で読み取られた。相対的な蛍光は、サンプル蛍光からブランク蛍光(緩衝液＋基質のみ)を減算することによって算出された。
【００５８】
データは平均±SEMとして表される。統計的有意差は、対データについてスチューデントt検定によって実施され、p＜0.05の場合、有意であるとみなす。 
【００５９】
CB5005誘導アポトーシスにおけるカスパーゼ3の関与
CB5005(SEQ ID NO：4)およびエトポシドの両方によって処理した場合、カスパーゼ3活性はPC3細胞において上昇したが(図13)、これはPCA細胞におけるCB5005(SEQ ID NO：4)のプロアポトーシス効果がエフェクターカスパーゼ3の作用を含むことを示した。
【００６０】
細胞毒性物質によって誘導されるPCA細胞のアポトーシスを増強する点において、SN50より強力であるCB5005(SEQ ID N0：4)
現在の様々な調査研究において用いられている市販の26merペプチドであるSN50は、細胞の多くのタイプでNF-κB核移行の阻害に対して有効性を示している。本発明者らは、TUNEL分析(図14に示すように、アポトーシスの間に起こるDNA鎖切断を優先的に標識する)およびフローサイトメトリー分析(図15に示すように、アポトーシス細胞のアネキシンV/PI標識のレベルを定量的に測定する)のようなアポトーシス分析における、CB5005ペプチド(SEQ ID NO：4)とSN50ペプチドとの並列比較を実施した。両方において、CB5005(SEQ ID NO：4)は、アンドロゲン非感受性PCA細胞におけるシスプラチン誘導アポトーシスの促進において、SN50より有意に高い活性を示した。
【００６１】
SN50より高い細胞移入活性を示すCB5005(SEQ ID NO：4)
PCA細胞におけるCB5005ペプチド(SEQ ID NO：4)の高いアポトーシスの活性が、少なくとも部分的に、その高い細胞膜転位活性に起因するかどうか決定するために、本発明者らは、間接的免疫蛍光検定を用いて、細胞移入研究において、周知の細胞透過性SN50ペプチドとCB5005ペプチド(SEQ ID NO：4)との並列比較を実施した。図16に示すように、CB5005(SEQ ID NO：4)は、SN50ペプチドより有意に高い移入活性を示した。 
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】NF-κB活性化を阻害し、ヒト前立腺癌細胞のアポトーシスを誘導し、かつシスプラチンおよびエトポシドのような抗癌剤の殺腫瘍性作用に対して腫瘍細胞を感作するペプチド物質である、CB5005の設計およびアミノ酸配列(一文字アミノ酸コード)(SEQ ID NO：4)を図示する。CB5005(SEQ ID NO：4)は、新規な11-mer細胞貫通性配列(CPS)(SEQ ID NO：2)(下線)と同様に、NF-κB p50タンパク質の核局在化配列(NLS)(イタリック)を含む。CB5003(SEQ ID NO：3)は、CPSの一部のみ(同様に下線)を有する類似のペプチドである。CB5002(SEQ ID NO：5)は、変異CPSを含み、したがって細胞透過性および機能性ではない。CB5007(SEQ ID NO：6)は、NF-κB p50 NLSにおける2塩基性残基が変異される(KR-NG)ことを除いては、CB5005に対応する対照ペプチドである。
【図２】蛍光顕微鏡分析による、DU145、PC3、LNCaP、およびN2a細胞における、CB5005(SEQ ID NO：4)の細胞移入を図示する。8ウェルチェンバースライド上の細胞は、30μMのCB5005(SEQ ID NO：4)により、37℃で1時間処理された。細胞内ペプチドは、抗ペプチド抗体およびFITC標識抗ウサギ抗体を用いた間接的免疫蛍光測定法を用いて検出され、かつ蛍光顕微鏡によって分析された。
【図３】図3aは、アンドロゲン非依存性DU145細胞の核抽出物における、NF-κB p50タンパク質のウエスタンブロット分析を図示する。DU145細胞は、CB5005(SEQ ID NO：4)(30μM)、CB5003(SEQ ID NO：3)(90μM)、CB5007(SEQ ID NO：6)(30μM)、または希釈液によって30分間、その後TNF-α(10 ng/ml)または希釈液によってさらに1時間処理された。等量の核抽出物がSDS-PAGEによって分離され、タンパク質はニトロセルロース膜に転写された。NF-κB p50タンパク質は、抗p50ウサギ抗体を用いて検出され、かつ化学発光性を増強した。図3bは、アンドロゲン非依存性DU145細胞の核抽出物における、NF-κB p50タンパク質のウエスタンブロット分析を図示する。DU145細胞は、CB5005(SEQ ID NO：4)(30μM)、CB5007(SEQ ID NO: 6)(30μM)、または希釈液によって16時間処理された。TNF-αは添加しなかった。
【図４】アネキシンV/PIで染色されたアポトーシスDU145細胞を図示する。4ウェルチェンバースライド上のDU145細胞は、CB5005(SEQ ID NO：4)(30μM)または希釈液によって30分間、その後シスプラチン(5μg/ml)によってさらに5時間処理された。細胞は次いで、製造者のプロトコール(BD-Pharmingen)によって指示されるように、アネキシンV/PIキットで処理され、かつ蛍光顕微鏡によって検討された。蛍光染色細胞は、アポトーシス細胞を示す。
【図５】アポトーシスの間に起こったDNA鎖切断を優先的に標識するTUNEL反応キット(Roche)を用いて、アポトーシスDU145細胞を図示する。8ウェルチェンバースライド上のDU145細胞は、示された濃度のCB5005(SEQ ID NO：4)または希釈液によって30分間、その後シスプラチン(5μg/ml)または希釈液によってさらに16時間処理された。矢印は、アポトーシスの一般的徴候である、核内で検出されるDNA断片化の暗褐色の領域を示す。
【図６】アポトーシスの間に起こったDNA鎖切断を優先的に標識するTUNEL反応キット(Roche)を用いて、アポトーシスDU145細胞を図示する。8ウェルチェンバースライド上のDU145細胞は、CB5003(SEQ ID NO：3)(40μM)、CB5002(SEQ ID NO：5)(72μM)、CB5007(SEQ ID NO：6)(30μM)、または希釈液によって30分間、その後シスプラチン(5μg/ml)によってさらに16時間処理された。
【図７】図7aは、アネキシンV/PIで染色されたDU145細胞のフローサイトメトリー分析を図示する。DU145細胞は、CB5005(SEQ ID NO：4)(30μM)または希釈液によって30分間、その後シスプラチン(5μg/ml)または希釈液によってさらに21時間処理された。細胞は次いで、フローサイトメトリーによって分析された。図7bは、図7aの結果のヒストグラム図を図示する。
【図８】アネキシンV/PIで染色されたDU145細胞のフローサイトメトリー分析を図示する。DU145細胞は、CB5003(SEQ ID NO：3)(72μM)、CB5002(72μM)、または希釈液によって15分間、その後シスプラチン(5μg/ml)または希釈液によってさらに21時間処理された。細胞は次いで、フローサイトメトリーによって分析された。
【図９】アネキシンV/PIで染色されたDU145細胞のフローサイトメトリー分析を図示する。 DU145細胞は、示された濃度のCB5005(SEQ ID NO：4)または希釈液によって30分間、その後TNF-α(10 ng/ml)または希釈液によってさらに21時間処理された。細胞は次いで、フローサイトメトリーによって分析された。
【図１０】図10aは、フローサイトメトリー分析の結果から算出された、CB5005(SEQ ID NO：4)またはCB5003(SEQ ID NO：3)の非存在下または存在下で、DU145細胞においてシスプラチンによって誘導されるアポトーシス細胞の割合を図示する。実験的条件は、図7における条件と同じであった。図10bは、フローサイトメトリー分析の結果から算出された、DU145細胞において、シスプラチン単独、CB5005(SEQ ID NO：4)単独、ならびにシスプラチンおよびCB5005(SEQ ID NO：4)の同時処理によって誘導されるアポトーシス細胞の割合を図示し、比較する。
【図１１】フローサイトメトリー分析の結果から算出された、CB5005(SEQ ID NO：4)の非存在下または存在下で、DU145細胞においてエトポシドによって誘導されるアポトーシス細胞の割合を図示する。DU145細胞は、CB5005(SEQ ID NO：4)(30μM)または希釈液によって30分間、その後示された濃度のエトポシドによってさらに21時間処理された。アネキシンV/PIで染色された細胞は次いで、フローサイトメトリーによって分析された。
【図１２】図12aは、フローサイトメトリー分析の結果から算出された、CB5005(SEQ ID NO：4)の非存在下または存在下で、PC3細胞およびLNCaP細胞においてエトポシドによって誘導されるアポトーシス細胞の割合を図示し、比較する。PC3細胞またはLNCaP細胞は、CB5005(SEQ ID NO：4)(30μM)または希釈液によって30分間、その後5μg/mlのエトポシドによってさらに21時間処理された。アネキシンV/PIで染色された細胞は次いで、フローサイトメトリーによって分析された。図12bは、CB5005(SEQ ID NO：4)で処理された異なる細胞株の細胞毒性研究を図示する。96ウェルプレートで増殖したDU145、PC3、LNCaP、またはN2a細胞は、四通りのペプチドの異なる濃度で、24時間37℃で処理された。細胞毒性は、1時間のMTS比色定量アッセイ(Promega)を用いて決定され、Bio-Tek Microplate Autoreader EL 309を用いて490 nmで読み取られた。データは、3回の独立した実験の平均±SEMとして表された。統計的有意差(p＜0.05)は、DU145およびPC3細胞において、ペプチド未処理サンプルと処理サンプル(30μM)の間で観察されたが、LNCaPおよびN2a細胞においては観察されなかった。
【図１３】エトポシドによって誘導されるPC3細胞におけるカスパーゼ-3活性の増強に対する、CB5005(SEQ ID NO：4)の作用を図示する。PC3細胞は、CB5005(SEQ ID NO：4)(30μM)または希釈液によって30分間、その後5μg/mlのエトポシドによってさらに16時間処理された。細胞可溶化物中のカスパーゼ-3活性は、基質としてAsp-Glu-Val-Aspアミノメチルクマリン(DEVD-AMC)を用いて蛍光分光分析のカスパーゼ-3定量アッセイキットによって測定された。サンプルは、380 nmで励起され、460 nmでCytofluor(商標)2300リーダー(Millipore, Bedford, MA)で読み取られた。相対的な蛍光は、サンプル蛍光からブランク蛍光(緩衝液＋基質のみ)を減算することによって算出された。結果は、3回の異なる実験の平均±SEMで表される。(*は、値がエトポシド単独で処理される細胞とは有意に異なる(p＜0.05)ことを示す。)
【図１４】アポトーシスの間に起こったDNA鎖切断を優先的に標識するTUNEL反応キット(Roche)を用いて、アポトーシスDU145細胞を図示する。8ウェルチェンバースライド上のDU145細胞は、示された濃度のCB5005(SEQ ID NO：4)もしくはSN50(Lin, et al.に対する米国特許第5,807,746号に記載される、シグナルペプチド配列およびNF-κB核局在化配列を含むペプチド)、または希釈液によって30分間、その後シスプラチン(5μg/ml)または希釈液によってさらに16時間処理された。暗褐色の領域は、アポトーシスの一般的徴候である、核内で検出されるDNA断片化を示す。
【図１５】フローサイトメトリー分析の結果から算出された、CB5005(SEQ ID NO：4)もしくはSN50の非存在下または存在下で、DU145細胞においてシスプラチンによって誘導されるアポトーシス細胞の割合を図示する。DU145細胞は、CB5005(SEQ ID NO：4)(18μM)、SN50(18μM)、または希釈液によって30分間、その後5μg/mlのシスプラチンによってさらに21時間処理された。アネキシンV/PIで染色された細胞は次いで、フローサイトメトリーによって分析された。
【図１６】蛍光顕微鏡分析により、DU145細胞におけるCB5005(SEQ ID NO：4)およびSN50の細胞移入を図示し、比較する。8ウェルチェンバースライド上のDU145細胞は、希釈液、CB5005(SEQ ID NO：4)、またはSN50 30μMによって、37℃で1時間処理された。細胞内ペプチドは、抗ペプチド抗体およびFITC標識抗ウサギ抗体を用いた間接的免疫蛍光測定法により緑色の染色として検出され、かつ蛍光顕微鏡によって分析された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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