(57)【要約】  アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドは、炎症性および／または免疫介在性の障害および／または自己免疫疾患の治療および／または予防に使用することができる。アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）は、自己抗原もしくは外来抗原、またはそのペプチドと併用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤の、炎症性および／または免疫介在性の障害を治療および／または予防するための使用。
【請求項２】
アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤の、免疫介在性障害を治療および／または予防するための使用。
【請求項３】
アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤の、自己免疫疾患を治療および／または予防するための使用。
【請求項４】
前記薬剤がアデニル酸ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチド、あるいはこれらの物質によって活性化された細胞の生成物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）が、自己抗原もしくは外来抗原、またはその断片、変異体、変種もしくはペプチドと併用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体コンポーネント、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、スギ花粉抗原、ブタ草花粉抗原、ライ麦草花粉抗原、動物のチリダニ抗原およびネコ抗原、組織適合抗原、移植拒絶に関与する抗原、ならびに改変ペプチドリガンドのうちのいずれか１つまたは複数から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記移植拒絶に関与する抗原が、移植片レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓に移植する移植片、および神経移植コンポーネントの抗原成分を含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記自己抗原が、ミエリンタンパク質、ベータアミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、コラーゲン、およびこれらのペプチドのうちのいずれか１つまたは複数から選択される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記ミエリンタンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質またはそのペプチドである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記ミエリン塩基性タンパク質が、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）合成ペプチド、またはその断片、変異体もしくは変種である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ミエリン塩基性タンパク質がＭＯＧペプチド（３５〜５５）である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）が、百日咳菌、気管支敗血症菌、またはパラ百日咳菌由来であるか、あるいは他の細菌由来の関連分子である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬剤が炎症性サイトカイン産生を調節する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
先天免疫系の細胞に対するＣｙａＡの前記免疫調節効果が、Ｔｏｌｌ様受容体リガンドによる同時活性化に依存する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記Ｔｏｌｌ様受容体リガンドが、ＬＰＳであるか、あるいは、ＣｐＧモチーフ、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、およびリポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓのいずれか１つまたは複数から選択された別のＴｏｌｌ様受容体リガンドである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
ＣｙａＡが、マクロファージおよび樹状細胞によるＩＬ−１０およびＩＬ−６の産生を促進する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
ＣｙａＡが、ＬＰＳと相乗的に作用して、マクロファージおよび樹状細胞によるＩＬ−１０およびＩＬ−６の産生を促進する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
ＣｙａＡが、炎症性サイトカイン、炎症性ケモカイン、または他の炎症仲介物質を抑制する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記炎症性サイトカインが、ＩＬ−１２またはＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２３、および１Ｌ−２７のいずれか１つまたは複数から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記炎症ケモカインが、マクロファージ炎症性タンパク質１αまたはマクロファージ炎症タンパク質１βである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
ＣｙａＡが、ＴＬＲ−リガンドによる同時活性化に続いて、樹状細胞の成熟を促進する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
ＣｙａＡが、樹状細胞によるＣＤ８０発現を促進する、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
ＣｙａＡが、ＴＬＲリガンドで誘導された樹状細胞の活性化を抑制する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
ＣｙａＡが、ＣＤ４０およびＩＣＡＭ−１の発現を抑制する、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
ＣｙａＡが、同時投与された抗原に対するＴｈ２細胞またはＴｒ細胞の誘導を促進するアジュバントとしてｉｎ  ｖｉｖｏで作用する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
前記同時投与された抗原が、自己抗原または外来抗原を含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
ＣｙａＡが、同時投与された抗原に対するＩｇＧ１抗体を促進するアジュバントとしてｉｎ  ｖｉｖｏで作用する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記同時投与された抗原が、自己抗原または外来抗原を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記ＣｙａＡが、非パルミトイル化形態または非アシル化形態で存在する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記ＣｙａＡがエンドトキシンを実質的に含まない、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
前記ＣｙａＡが、免疫調節物質、アジュバント、免疫療法または抗炎症性薬剤の形態にある、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記薬剤が、感染または外傷によって誘導された炎症性サイトカイン産生を調節する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
前記障害が、感染、外傷、または損傷によって誘導された敗血症または急性炎症である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
前記障害が、クローン病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、および乾癬のうちのいずれか１つまたは複数から選択される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
前記障害が、喘息またはアトピー性疾患である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
前記薬剤が、経口投与用、鼻腔内投与用、静脈内投与用、皮内投与用、皮下投与用、または筋肉内投与用の形態にある、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
前記薬剤の反復投与を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３８】
ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを、抗原と併せて含み、前記抗原が、自己抗原および外来抗原から選択される、製品。
【請求項３９】
前記ＣｙａＡが、その誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチド、またはこれらの物質によって活性化された細胞の生成物を含む、請求項３８に記載の製品。
【請求項４０】
前記自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体コンポーネント、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、スギ花粉抗原、ブタ草花粉抗原、ライ麦草花粉抗原、動物のチリダニ抗原およびネコ抗原、組織適合抗原、移植拒絶に関与する抗原、ならびに改変ペプチドリガンドのうちのいずれか１つまたは複数から選択される、請求項３８または３９に記載の製品。
【請求項４１】
前記移植拒絶に関与する抗原が、移植片レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓に移植する移植片、および神経移植コンポーネントの抗原成分を含む、請求項４０に記載の製品。
【請求項４２】
前記自己抗原が、ミエリンタンパク質、ベータアミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、コラーゲン、およびこれらのペプチドのうちのいずれか１つまたは複数から選択される、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の製品。
【請求項４３】
前記ミエリンタンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質またはそのペプチドである、請求項４２に記載の製品。
【請求項４４】
前記ミエリン塩基性タンパク質が、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質合成ペプチドである、請求項４３に記載の製品。
【請求項４５】
前記ミエリン塩基性タンパク質がＭＯＧペプチド（３５〜５５）である、請求項４４に記載の製品。
【請求項４６】
ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４７】
ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを、自己抗原または外来抗原による免疫処置のためのアジュバントとして含む医薬組成物。
【請求項４８】
ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを、抗原と併せて含み、前記抗原が自己抗原および外来抗原から選択される、医薬組成物。
【請求項４９】
前記ＣｙａＡが、その誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチド、またはこれらの物質によって活性化された細胞の生成物を含む、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体コンポーネント、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、スギ花粉抗原、ブタ草花粉抗原、ライ麦草花粉抗原、チリダニ抗原およびネコ抗原、組織適合抗原、移植拒絶に関与する抗原、ならびに改変ペプチドリガンドのうちのいずれか１つまたは複数から選択される、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記移植拒絶に関与する抗原が、移植片レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓に移植する移植片、および神経移植コンポーネントの抗原成分を含む、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記自己抗原が、ミエリンタンパク質、ベータアミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、コラーゲン、およびこれらのペプチドのうちのいずれか１つまたは複数から選択される、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記ミエリンタンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質またはそのペプチドである、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記ミエリン塩基性タンパク質がミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質合成ペプチドである、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記ミエリン塩基性タンパク質がＭＯＧペプチド（３５〜５５）である、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
非アシル化ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む医薬組成物。
【請求項５７】
アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）を含む免疫調節物質。
【請求項５８】
免疫調節効果を有する組換え非アシル化ＣｙａＡ。
【請求項５９】
アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含むワクチン。
【請求項６０】
ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドと、抗原とを含む、請求項５９に記載のワクチン。
【請求項６１】
ＣｙａＡおよび抗原が重量比０．０１：１から１００：１までの範囲で存在する、請求項６０に記載のワクチン。
【請求項６２】
ＣｙａＡおよび抗原が１：１０から１０：１までのモル比で存在する、請求項６０に記載のワクチン。
【請求項６３】
アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドに対する抗体。
【請求項６４】
配列番号３または４のいずれか１つまたは複数から選択されたアミノ酸配列。
【請求項６５】
炎症性および／または免疫介在性の障害を治療および／または予防する方法であって、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤を投与するステップを含む方法。
【請求項６６】
免疫介在性障害の治療および／または予防する方法であって、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤を投与するステップを含む方法。
【請求項６７】
自己免疫疾患の治療および／または予防のための方法であって、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤を投与するステップを含む方法。
【請求項６８】
前記薬剤がアデニル酸ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチド、あるいはこれらの物質によって活性化された細胞の生成物を含む、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）が、自己抗原もしくは外来抗原、またはその断片、変異体、変種もしくはペプチドと併用される、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体コンポーネント、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、スギ花粉抗原、ブタ草花粉抗原、ライ麦草花粉抗原、動物のチリダニ抗原およびネコ抗原、組織適合抗原、移植拒絶に関与する抗原、ならびに改変ペプチドリガンドのうちのいずれか１つまたは複数から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記移植拒絶に関与する抗原が、移植片レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓に移植する移植片、および神経移植コンポーネントの抗原成分を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記自己抗原が、ミエリンタンパク質、ベータアミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、コラーゲン、およびこれらのペプチドのうちのいずれか１つまたは複数から選択される、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ミエリンタンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質またはそのペプチドである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ミエリン塩基性タンパク質が、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）合成ペプチド、またはその断片、変異体もしくは変種である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ミエリン塩基性タンパク質がＭＯＧペプチド（３５〜５５）である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）が、百日咳菌、気管支敗血症菌、またはパラ百日咳菌由来であるか、あるいは他の細菌由来の関連分子である、請求項６５〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記薬剤が炎症性サイトカイン産生を調節する、請求項６５〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
先天免疫系の細胞に対するＣｙａＡの前記免疫調節効果が、Ｔｏｌｌ様受容体リガンドによる同時活性化に依存する、請求項６５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｔｏｌｌ様受容体リガンドが、ＬＰＳ、または、ＣｐＧモチーフ、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、およびリポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓのいずれか１つまたは複数から選択された別のＴｏｌｌ様受容体リガンドである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ＣｙａＡが、マクロファージおよび樹状細胞によるＩＬ−１０およびＩＬ−６の産生を促進する、請求項６５〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
ＣｙａＡが、ＬＰＳと相乗的に作用して、マクロファージおよび樹状細胞によるＩＬ−１０およびＩＬ−６の産生を促進する、請求項６５〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
ＣｙａＡが、炎症性サイトカイン、炎症性ケモカイン、または他の炎症仲介物質を抑制する、請求項６５〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記炎症性サイトカインが、ＩＬ−１２またはＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２３、および１Ｌ−２７のいずれか１つまたは複数から選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記炎症ケモカインが、マクロファージ炎症性タンパク質−１αまたはマクロファージ炎症タンパク質−１βである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
ＣｙａＡが、ＴＬＲ−リガンドによる同時活性化に続いて、樹状細胞の成熟を促進する、請求項６５〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
ＣｙａＡが、樹状細胞によるＣＤ８０発現を促進する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
ＣｙａＡが、ＴＬＲリガンドで誘導された、樹状細胞の活性化を抑制する、請求項６５〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
ＣｙａＡが、ＣＤ４０およびＩＣＡＭ−１の発現を抑制する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
ＣｙａＡが、同時投与された抗原に対するＴｈ２細胞またはＴｒ細胞の誘導を促進するアジュバントとしてｉｎ  ｖｉｖｏで作用する、請求項６５〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記同時投与された抗原が、自己抗原または外来抗原を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
ＣｙａＡが、同時投与された抗原に対するＩｇＧ１抗体を促進するアジュバントとしてｉｎ  ｖｉｖｏで作用する、請求項６５〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記同時投与された抗原が、自己抗原または外来抗原を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＣｙａＡが、非パルミトイル化形態または非アシル化形態で存在する、請求項６５〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＣｙａＡがエンドトキシンを実質的に含まない、請求項６５〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＣｙａＡが、免疫調節物質、アジュバント、免疫療法または抗炎症性薬剤の形態にある、請求項６５〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記薬剤が、感染または外傷によって誘導された炎症性サイトカイン産生を調節する、請求項６５〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記障害が、感染、外傷、または損傷によって誘導された敗血症または急性炎症である、請求項６５〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記障害が、クローン病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、および乾癬のうちのいずれか１つまたは複数から選択される、請求項６５〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記障害が、喘息またはアトピー性疾患である、請求項６５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記薬剤が、経口投与用、鼻腔内投与用、静脈内投与用、皮内投与用、皮下投与用、または筋肉内投与用の形態にある、請求項６５〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記薬剤の反復投与を含む、請求項６５〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（イントロダクション）
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）は、呼吸器疾患である百日咳を引き起こすグラム陰性菌、すなわち百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の病原因子である。ＣｙａＡを欠失した細菌はマウスにおける病原性が弱く、また、ＣｙａＡは、超生理学的レベルのｃＡＭＰ産生を介して宿主細胞の走化性、食作用、および超酸化物産生を妨害することによって、百日咳菌に対する免疫反応を妨害することが示されている。さらに、ＣｙａＡは、様々な細胞で溶解および細胞毒性を引き起こし、マクロファージのアポトーシスを引き起こす。ＣｙａＡは、ｃｙａＡ遺伝子によってコードされており、ｃｙａＣ遺伝子産物によるＫ９８３のパルミトイル化を介して、翻訳後に活性化される。Ｃ末端の１３０６アミノ酸は、カルシウム結合に関与する一連のノナペプチドリピートを含有し、これは、溶血能および免疫刺激能を有する外毒素の毒素（ＲＴＸ）ファミリーにある反復配列に類似している。ヒツジ赤血球に対する結合およびその溶血、ならびに、マクロファージおよびＴ細胞を溶解するその能力には、ＣｙａＡのアクセサリータンパク質であるＣｙａＣによるＣｙａＡのアシル化またはパルミトイル化が必要である（１、２）。Ｎ末端の４００アミノ酸は、ＡＴＰをｃＡＭＰに変換する触媒ドメインを含有する。細胞に結合したときに、この酵素ドメインは細胞質ゾル中に輸送されるが、酵素的に活性になるには、そこで、真核細胞のカルモジュリンに結合しなければならない。
【０００３】
ＣｙａＡが有するこの侵入性の性質は、抗原性ペプチドをＭＨＣクラスＩ限定ＣＤ８＋Ｔ細胞に提示するための抗原プロセシングの内在性経路に送達するのに利用されている（３）。酵素活性を持たないＣｙａＡは、ＣＤ４＋細胞を活性化するＭＨＣクラスＩＩプロセシング経路に、エピトープを送達できることが最近示された（４）。加えて、ＣｙａＡは、同時投与されたオボアルブミンに対する抗体レベルを向上させることが示されている（５）。この研究は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でｃｙａＣ遺伝子の非存在下に発現された非活性型のＣｙａＡが、非侵入性であって、かつ溶血活性および細胞毒活性を欠失しており、活性の毒素と比較した場合、限定的ではあるが、抗体反応のアジュバント活性を有することも示した（５）。ＣｙａＡは、発現されたウイルスエピトープに対するＴｈ１反応を促進することも示されている（６）。  ＣｙａＡのアジュバント活性は、ｃＡＭＰの上方制御を介して先天免疫系の細胞を活性化する能力（７）、ならびに／または、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）を含めた先天免疫細胞の表面に発現されたＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８  αＭβ２インテグリンへの結合（８）によるものかもしれない。
【０００４】
先天免疫系の細胞（特にＤＣ）は、ナイーブなＣＤ４＋Ｔ細胞から、機能的に識別されるＴｈ１、Ｔｈ２、または制御性Ｔ（Ｔｒ）細胞サブタイプへの分化を指示する。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびインテグリンなどの病原体認識受容体（ＰＲＲ）に対する、保存されている微生物分子の結合を介した、未成熟ＤＣの活性化には、成熟と、リンパ節へのホーミングとが伴い、このリンパ節で、成熟したＤＣがナイーブなＴ細胞に抗原を提示する。病原体由来の分子によるＤＣの活性化は、ナイーブなＣＤ４＋Ｔ細胞から、異なったＴ細胞サブタイプへの分化を調節する上で重要な役割を演じている（１０、１１、１２）。Ｔｈ１細胞は、細胞内感染に対する防御を与えるが、炎症反応および自己免疫疾患にも関連しており、一方、Ｔｈ２細胞は、アレルギー反応に関与している。Ｔｒ細胞は、Ｔｈ１反応およびＴｈ２反応を抑制することができる（１０、１１、１２）。
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症活性を調節するか、あるいは制御性Ｔ細胞を誘導するいかなる方法も、貴重な治療効果を有することは明らかである。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤を投与するステップを含む、炎症性および／または免疫介在性の障害を治療および／または予防する方法を提供する。
【０００７】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤を投与するステップを含む、免疫介在性障害を治療および／または予防する方法も提供する。
【０００８】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤を投与するステップを含む、自己免疫疾患を治療および／または予防する方法を提供する。
【０００９】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤の、炎症性および／または免疫介在性の障害を治療および／または予防するための使用も提供する。
【００１０】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤の、免疫介在性障害を治療および／または予防するための使用をさらに提供する。
【００１１】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤の、自己免疫疾患を治療および／または予防するための使用も提供する。
【００１２】
一実施形態では、上記薬剤が、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチド、あるいはこれらの物質によって活性化された細胞の生成物を含みうる。
【００１３】
本発明の一実施形態では、上記アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）が、自己抗原もしくは外来抗原、またはその断片、変異体、変種もしくはペプチドと併用される。
【００１４】
一実施形態では、上記自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体コンポーネント、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、スギ花粉抗原、ブタ草花粉抗原、ライ麦草花粉抗原、動物のチリダニ抗原およびネコ抗原、組織適合抗原、移植拒絶に関与する抗原、ならびに改変ペプチドリガンドのうちのいずれか１つまたは複数から選択される。上記移植拒絶に関与する抗原は、移植片レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓に移植する移植片、および神経移植コンポーネントの抗原成分を含む。好ましい実施形態では、上記自己抗原が、ミエリンタンパク質、ベータアミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、コラーゲン、ならびにこれらのペプチドおよび断片のうちのいずれか１つまたは複数から選択される。上記ミエリンタンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質またはそのペプチドでありうる。上記ミエリン塩基性タンパク質は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）合成ペプチド、またはその断片、変異体もしくは変種であることが好ましい。上記ミエリン塩基性タンパク質はＭＯＧペプチド（３５〜５５）であることが最も好ましい。
【００１５】
一実施形態では、上記アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）が、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｅｔｉｃａ）、またはパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来であるか、あるいは他の細菌由来の関連分子である。関連分子には、ＣｙａＡの配列に対して配列相同性を有する、他の細菌由来のタンパク質が含まれることがある。
【００１６】
本発明の一実施形態では、上記薬剤が炎症性サイトカイン産生を調節する。
【００１７】
本発明の一実施形態では、先天免疫系の細胞に対するＣｙａＡの前記免疫調節効果が、ＬＰＳ、または、ＣｐＧモチーフ、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、およびリポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓのいずれか１つまたは複数から選択された別のＴｏｌｌ様受容体リガンドなどのＴｏｌｌ様受容体リガンドによる同時活性化に依存する。
【００１８】
本発明の一実施形態では、ＣｙａＡが、マクロファージおよび樹状細胞によるＩＬ−１０およびＩＬ−６の産生を促進する。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、ＣｙａＡが、ＬＰＳと相乗的に作用して、マクロファージおよび樹状細胞によるＩＬ−１０およびＩＬ−６の産生を促進する。
【００２０】
本発明の一実施形態では、ＣｙａＡが、炎症性サイトカイン、炎症性ケモカイン、または他の炎症仲介物質を抑制する。上記炎症性サイトカインは、ＩＬ−１２またはＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２３、および１Ｌ−２７のいずれか１つまたは複数から選択されたものでありうる。上記炎症性ケモカインは、マクロファージ炎症タンパク質−１αまたはマクロファージ炎症タンパク質−１βでありうる。
【００２１】
本発明の一実施形態では、ＣｙａＡが、ＴＬＲ−リガンドによる同時活性化に続いて、樹状細胞の成熟を促進する。ある場合には、ＣｙａＡが、樹状細胞によるＣＤ８０発現を促進する。
【００２２】
本発明の一実施形態では、ＣｙａＡが、ＴＬＲリガンドで誘導された、樹状細胞の活性化を抑制する。ある場合には、ＣｙａＡが、ＣＤ４０およびＩＣＡＭ−１の発現を抑制する。
【００２３】
本発明の一実施形態では、ＣｙａＡが、同時投与された抗原に対するＴｈ２細胞またはＴｒ細胞の誘導を促進するアジュバントとしてｉｎ  ｖｉｖｏで作用する。
【００２４】
別の実施形態では、ＣｙａＡが、同時投与された抗原に対するＩｇＧ１抗体を促進するアジュバントとしてｉｎ  ｖｉｖｏで作用する。
【００２５】
上記の同時投与された抗原は、自己抗原または外来抗原を含みうる。
【００２６】
本発明の一実施形態では、ＣｙａＡが、非パルミトイル化形態で存在する。
【００２７】
本発明の一実施形態では、ＣｙａＡがエンドトキシンを実質的に含まない。上記ＣｙａＡは、１μｇタンパク質当たり３００ｐｇ未満のエンドトキシンを含みうる。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、ＣｙａＡが、免疫調節物質、アジュバント、免疫療法または抗炎症性薬剤の形態にある。
【００２９】
本発明の一実施形態では、上記薬剤が、感染または外傷によって誘導された炎症性サイトカイン産生を調節する。
【００３０】
本発明の一実施形態では、上記障害が、感染、外傷、または損傷によって誘導された敗血症または急性炎症である。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、上記障害が、クローン病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、および乾癬のうちのいずれか１つまたは複数から選択される。他の免疫介在性障害には、糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節炎、乾癬性関節炎が含まれる）、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎が含まれる）、シェーグレン症候群に二次的な乾性結膜炎を含めたシェーグレンの症候群、円形脱毛症、節足動物咬傷反応によるアレルギー反応、慢性再発性アフタ、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、腟炎、直腸炎、薬疹、癩病反転反応、結節性紅斑癩、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スチーブンスジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーヴス眼症、類肉腫症、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、間質性肺線維症、アルツハイマー病、または腹腔疾患のうちのいずれか１つまたは複数が含まれる。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、上記障害が、喘息またはアトピー性疾患である。
【００３３】
本発明の一実施形態では、上記薬剤が、経口投与用、鼻腔内投与用、静脈内投与用、皮内投与用、皮下投与用、または筋肉内投与用の形態にある。上記薬剤は、反復投与してもよい。
【００３４】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む製品も提供する。上記製品は、抗原と組み合わせてもよく、前記抗原は、自己抗原または外来抗原である。上記ＣｙａＡは、その誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチド、またはこれらの物質によって活性化された細胞の生成物を含みうる。
【００３５】
本発明は、ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む医薬組成物も提供する。
【００３６】
本発明は、ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを、自己抗原または外来抗原による免疫処置のためのアジュバントとして含む医薬組成物をさらに提供する。
【００３７】
本発明は、ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを、抗原と併せて含む医薬組成物をさらに提供し、その際、前記抗原は、自己抗原および外来抗原から選択される。
【００３８】
一実施形態では、ＣｙａＡが、その誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチド、またはこれらの物質によって活性化された細胞の生成物を含む。
【００３９】
一実施形態では、上記自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体コンポーネント、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、スギ花粉抗原、ブタ草花粉抗原、ライ麦草花粉抗原、チリダニ抗原およびネコ抗原、組織適合抗原、移植拒絶に関与する抗原、ならびに改変ペプチドリガンドのうちのいずれか１つまたは複数から選択される。
【００４０】
上記の移植拒絶に関与する抗原は、移植片レシピエントの心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓に移植する移植片、および神経移植コンポーネントの抗原成分を含みうる。
【００４１】
上記組成物は、非アシル化ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含みうる。
【００４２】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）を含む免疫調節物質も提供する。
【００４３】
本発明は、免疫調節効果を有する組換え非アシル化ＣｙａＡをさらに提供する。
【００４４】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含むワクチンも提供する。上記ワクチンは抗原を含みうる。
【００４５】
本発明の一実施形態では、ＣｙａＡおよび抗原が重量比０．０１：１から１００：１までの範囲で存在する。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、ＣｙａＡおよび抗原が１：１０から１０：１までのモル比で存在する。
【００４７】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドに対する抗体も提供する。
【００４８】
本発明は、配列番号３または４のいずれか１つまたは複数から選択されたアミノ酸配列も提供する。
【００４９】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤、あるいは上記薬剤で活性化された細胞の生成物の、炎症性および／または免疫介在性の障害を治療および／または予防するための使用をさらに提供する。
【００５０】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチドを含む薬剤、あるいは上記薬剤で活性化された細胞の生成物の、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）依存性シグナル伝達に関連した疾患または状態を予防および／または治療するための使用を提供する。
【００５１】
本発明は、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチド、あるいは上記薬剤で活性化された細胞の生成物を含む薬剤の、喘息またはアレルギーを予防および／または治療するための使用をさらに提供する。
【００５２】
本明細書で使用する場合、誘導体もしくは変異体もしくは断片もしくは変種もしくはペプチドという用語は、ＣｙａＡの非アシル化もしくは非パルミトイル化誘導体、または、アシル化もしくは非アシル化ＣｙａＡの機能性部分からなるいかなる分子または高分子も含むものと理解される。断片もしくは変種もしくはペプチドは、当技術分野で当業者に一般的に知られている技法によって調製することができる。これらには、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８と相互作用するＣｙａＡの領域に対応するペプチドまたは断片が含まれる。
【００５３】
抗原という用語は、抗原のレシピエント体内における、体液性および／または細胞性の免疫応答を開始させることのできる分子を意味する。抗原という用語は、抗体またはＴ細胞受容体によって認識されるいかなる物質も意味するものと理解される。自己抗原または自家抗原という用語は、体内の自己組織または自己細胞にある、外来性ではなく、内在性の抗原を意味するものと理解される。外来抗原という用語は、病原体（細菌、ウイルス、真菌、または寄生生物）由来の抗原を意味するものと理解される。
【００５４】
本発明の組成物および方法には、自己免疫疾患、アレルギー、および移植拒絶に関与する抗原を用いることができる。自己免疫疾患に関与する抗原の例には、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体コンポーネント、チログロブリン、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体が含まれる。アレルギーに関与する抗原の例には、スギ花粉抗原、ブタ草花粉抗原、ライ麦草花粉抗原などの花粉抗原、チリダニ抗原およびネコ抗原などの、動物由来の抗原、または組織適合抗原が含まれる。移植拒絶に関与する抗原には、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、および神経移植コンポーネントなど、移植片レシピエントに移植されるべきで移植片の抗原成分が含まれる。抗原は、自己免疫疾患を治療するのに有用な改変ペプチドリガンドである場合もある。本発明の組成物および方法で使用できる種々の抗原の例には、ベータアミロイドタンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質が含まれる。
【００５５】
アジュバントという用語は、抗原と併せて使用されて、この抗原に対する免疫応答をｉｎ  ｖｉｖｏで促進する物質を含むものと理解される。
【００５６】
免疫調節物質という用語は、細菌、ウイルス、寄生生物、または真菌病原体に由来する分子であって、免疫系の細胞の反応を調節、すなわち増強および／または低減する分子のいかなるものも含むものと理解される。
【００５７】
本発明は、添付図面を参照することにより、以下に示す本発明の説明から、より明確に理解されよう。
（詳細な説明）
【００５８】
本発明者らは、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来のアデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）または非アシル化誘導体ＣｙａＡ（ＮＡ−ＣｙａＡ）が、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドと連合して、先天免疫系の細胞によるインターロイキン（ＩＬ）−１０およびＩＬ−６産生の誘導を促進することを見出した。さらに、本発明者らは、ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡが、抗炎症性サイトカイン、または、同時投与された抗原に対する制御性Ｔ（Ｔｒ）細胞の誘導を促進することを見出した。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴｒ細胞の誘導は、炎症性疾患、自己免疫疾患、またはアレルギーの治療可能性を有する。
【００５９】
本発明者らは、上記毒素のアシル化が、細胞毒性には必要であるが、免疫調節には必要でないことも見出した。非アシル化または非パルミトイル化ＣｙａＡ分子では、細胞毒性が低下していたが、免疫調節機能を保持していた。したがって、百日咳菌アデニル酸シクラーゼ毒素、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチド、あるいはこれらの物質によって活性化された細胞の生成物は、免疫調節物質、アジュバント、免疫療法薬または抗炎症薬としての貴重な可能性を有する。非アシル化ＣｙａＡを含む組成物は、免疫調節物質、アジュバント、免疫療法薬または抗炎症薬として特に貴重であろう。
【００６０】
ＣｙａＡは宿主免疫応答を妨害し、それによって、気道における百日咳菌のコロニー形成および存続に寄与することがある。以前の研究では、野生型毒素のアジュバント活性が実証されたが、リポ多糖（ＬＰＳ）が比較的高濃度で存在していたため、これらの新知見は単純に解釈できないものであった。ＬＰＳは、精製されたＣｙａＡに密接に付随することが知られている。本発明者らは、ＣｙａＡの免疫調節特性と、ＬＰＳの潜在的寄与とを検査した。ＬＰＳは、精製ＣｙａＡ調製物中に存在することが知られている。
【００６１】
ＣｙａＡは、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の産生と、同時投与された抗原に対するＩｇＧ１抗体とをｉｎ  ｖｉｖｏで促進した。免疫処置されたマウスから産生された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンは、Ｔｈ２細胞およびタイプ１  Ｔｒ（Ｔｒ１）細胞に特徴的なサイトカインプロフィールを有していた。先天免疫細胞によってＴ細胞サブタイプの誘導が指示されるため、本発明者らは、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージの活性化に対するＣｙａＡの影響を検査した。ＣｙａＡは、有意に、ＬＰＳ誘導性のＩＬ−６およびＩＬ−１０を増大させ、かつ、骨髄由来のＤＣおよびマクロファージからの、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２ｐ７０の、ＬＰＳによって駆動された産生を抑制した。ＣｙａＡは、未成熟のＤＣにおいて、細胞表面へのＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＭＨＣクラスＩＩの発現も促進した。ＩＬ−１０産生、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＭＨＣクラスＩＩ発現に対する、ＣｙａＡ調製物の刺激活性は、ポリミキシンＢ添加の後、または、ＴＬＲ  ４欠損マウスからのＤＣの存在下で減衰した。ＣｙａＡ調製物中に存在している濃度（０、２ｎｇ／ｍｌ）のＬＰＳ単独でＤＣを処理した場合には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＣの活性化が起こらなかった。本発明者らは、ＣｙａＡによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの先天免疫細胞の活性化が、ＴＬＲ４を介したセカンドシグナルに依存していること、および、ＣｙａＡは、ＤＣおよびマクロファージによるＩＬ−１２産生の抑制およびＩＬ−１０産生の促進によって、Ｔｈ２／Ｔｒ１細胞応答を促進できることを見出した。
【００６２】
ＣｙａＡは、哺乳類細胞における細胞毒性を引き起こすので、ヒトでの臨床使用には適していないかもしれない。しかし、本発明者らは、免疫調節活性を保持する非毒性の誘導体および変異体を調製した。
【００６３】
ＣｙａＡは、毒素のＲＴＸファミリーに属し、その活性化には、翻訳後のアシル化を必要とする。ＣｙａＡによるマクロファージの溶解には、この毒素のアシル化またはパルミトイル化が必要である。アシル化ＣｙａＡ（Ａ−ＣｙａＡ）分子および非アシル化ＣｙａＡ（ＮＡ−ＣｙａＡ）分子を大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）で発現させ、細胞毒性機能および免疫調節機能を検査した。両タンパク質とも、マクロファージおよびＤＣにおける、ＬＰＳ駆動のＩＬ−１０およびＩＬ−６産生を促進し、ＬＰＳによって刺激されたＩＬ−１２産生、ＴＮＦ産生、およびケモカインＣＣＬ３（ＭｌＰ−１）産生を抑制した。低用量では、アシル化ＣｙａＡの方が、非アシル化ＣｙａＡより効率的にこれらの効果を表した。ＮＡ−ＣｙａＡおよびＡ−ＣｙａＡの両方が、ＣｐＧ（ＴＬＲ−９リガンド）およびポリ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３リガンド）を調節し、また、ＤＣおよびマクロファージにおけるＬＰＳ駆動のサイトカイン産生も調節した。加えて、アシル化の欠損にもかかわらず、ＣｙａＡは、マクロファージおよびＤＣにおけるｃＡＭＰ蓄積を刺激した。両タンパク質とも、ＤＣの成熟を刺激し、それによって、細胞表面へのＣＤ８０およびＭＨＣ−ＩＩの発現の増大を導き、また、ＬＰＳによって刺激されたＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＩＣＡＭ−１の発現を低下させた。非アシル化ＣｙａＡは、免疫調節を引き起こした用量の１０倍の用量でもマクロファージまたは赤血球を溶解させることができなかった。両タンパク質とも同様のアジュバント活性をｉｎ  ｖｉｖｏで有し、同時投与された抗原に特異的なＩｇＧ１抗体、ならびにＴｈ２細胞およびＴｒ細胞を誘導した。これらの結果は、組換え非アシル化ＣｙａＡ分子は細胞毒性を欠失しているが免疫調節作用を保持していることを示す。
【００６４】
アシル化とは異なり、酵素活性は、ＣｙａＡの免疫調節活性に必須であった。機能的なアデニル酸シクラーゼ活性を欠失したＣｙａＡ変異体は、それらのアシル化状態にかかわらず、細胞内ｃＡＭＰ濃度の増大を引き起こすことができず、また、ＬＰＳによって誘導されたＴＮＦの放出の抑制も、先天免疫細胞によるＩＬ−１０産生の促進も、行うことができなかった。これは、細胞内ｃＡＭＰ濃度の増大が、先天免疫細胞活性化の、ＣｙａＡによる調節を引き起こすシグナルの１つであることを示唆する。
【００６５】
ＣｙａＡは、孔形成タンパク質のＲＴＸファミリーのメンバーであるが、酵素ドメインがＮＨ２末端に位置し、ＲＴＸドメインがＣＯＯＨ末端に位置するという独特の二機能性の特性を有する。このドメイン配置は、ＣｙａＡによる細胞溶解、ｃＡＭＰ蓄積、免疫調節、およびアポトーシスという別々の活性の検査を、他のいかなるＲＴＸ毒素でも不可能な方法で行うことを可能にした。ＲＴＸ毒素による真核細胞の溶解は、翻訳後のアシル化に依存する。ＣｙａＡのＲＴＸドメインのアシル化が、その溶血活性および細胞毒活性に必要であることは、他の研究者によって報告された（１、２、１３）。
【００６６】
アシル化は、ＣｙａＡがマクロファージにおけるｃＡＭＰ蓄積を誘導するのにも、マクロファージおよびＤＣの活性化を調節するのにも必須ではないことを本発明者らは見出した。Ａ−ＣｙａＡと同様に、ＮＡ−ＣｙａＡは、ＬＰＳと協同してＩＬ−１０の分泌を促進し、一方、ＴＮＦ産生およびＩＬ−１２  ｐ７０産生を抑制した。先天免疫細胞のサイトカイン産生に対するＡ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡの免疫調節作用は、ＣｙａＡに密接に付随したＴＬＲ４リガンドであるＬＰＳに限定されず、ＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧ−ＯＤＮでも観察された。ＮＡ−ＣｙａＡおよびＡ−ＣｙａＡは、ＤＣの成熟には同様の効果を有し、ＣＤ８０発現を上方制御したが、ＣＤ４０およびＩＣＡＭ−１の発現は下方制御した。さらに、ＮＡ−ＣｙａＡは、Ａ−ＣｙａＡと同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏで効果的なアジュバントであり、外来抗原と同時注入された際に、Ｔ細胞による、抗原特異的なＩｇＧＩ抗体の産生、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０の産生を刺激した。
【００６７】
ＲＴＸ毒素は、β２インテグリンを介して白血球に結合し、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８がＣｙａＡの受容体として同定されている（１４、１３）。赤血球はβ２インテグリンを持たず、赤血球に結合するためには、ＣｙａＡおよび他のＲＴＸタンパク質はアシル化を必要とする（１）。
【００６８】
アシル化は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を発現する先天免疫細胞でのｃＡＭＰ蓄積をＣｙａＡが誘導するのに影響を与えることはあっても、必須ではないことを本発明者らは見出した。以前の研究では、真核細胞におけるｃＡＭＰ濃度上昇の誘導に、ＣｙａＡのアシル化が必要であることが示唆された。しかし、これらの研究は先天免疫細胞を用いたものではなく、赤血球およびＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を用いたもの、ならびに、ＣＤ１１ｂで形質移入されたＣＨＯ細胞を用いたものであり（１３、１）、赤血球およびＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、それぞれ、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を発現しないか、もしくは低レベルでしか発現しない。ＣｙａＡにおける、ＣＤ１１ｂと結合する部位は、ＲＴＸドメインの残基１１６６および１２８１の間にあるグリシン／アスパラギン酸リッチ領域に局在することが明らかにされた（１３）。この領域内に変異を含有するＣｙａＡタンパク質は、赤血球には結合するが、ＣＤ１１ｂを発現する細胞では結合しない。逆に、アミノ酸９２６にＦＬＡＧエピトープの挿入を有するＣｙａＡタンパク質は、ＣＤ１１ｂを発現する細胞には結合したが、赤血球には結合しなかった。これは、隣接しているＬｙｓ９８３のアシル化に必要な構造が破壊されたためであると筆者は示唆した。
【００６９】
本発明者らは、マクロファージにおいてＣｙａＡで誘導されたｃＡＭＰ蓄積および免疫調節にアシル化が必要でないこと、ならびに、抗ＣＤ１１ｂ抗体が、Ａ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡの調節作用を阻止することを見出した。これは、宿主細胞表面のβ２インテグリン受容体ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８とのＣｙａＡの相互作用に、翻訳後修飾が必須でないことを示す。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は主としてマクロファージおよび骨髄ＤＣで発現されており、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８とのＣｙａＡの相互作用は、先天免疫系の主要細胞におけるサイトカインシグナル伝達経路を標的として破壊するために、この細菌が進化させたストラテジーであるかもしれない。
【００７０】
アシル基は、真核細胞膜とも結合する可能性が高く、それによってＣｙａＡ−宿主細胞相互作用の効率を増大させ、膜を貫通した、標的細胞中へのアデニル酸シクラーゼドメインの輸送を促進する。この相互作用は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を持たない細胞でより大きな重要性を有するであろう。また、ＮＡ−ＣｙａＡが、アデニル酸シクラーゼドメインを赤血球、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、および、ＣＤ１１ｂで形質移入されたＣＨＯ細胞の中に輸送できなかったことを説明しうる。細胞質ゾルアデニル酸シクラーゼドメインによって引き起こされた細胞内ｃＡＭＰの増大は、マクロファージおよびＤＣによって放出される宿主サイトカインおよびケモカインの改変を含めた、宿主細胞機能の調節を導く。ＣｙａＡは細胞膜中でオリゴマー形成して、孔を形成し、それによって、膜分解を引き起こす。これは、ＤＣおよびマクロファージなど、ＣｙａＡ受容体であるＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を発現する細胞では、アシル化が細胞毒性に重要であることを示す。
【００７１】
ＣｙａＡがマクロファージの細胞死を誘導することは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣｙａＡ処理された細胞で観察されたＤＮＡ断片化によって示される（２）。ＣｙａＡを欠失した百日咳菌は、Ｊ７７４マクロファージの溶解を誘導しないし、また、ｉｎ  ｖｉｖｏで肺胞マクロファージのアポトーシスを引き起こす能力が低減しており、マウスにおける病原性がかなり低下している（２、１５）。本発明者らは、Ａ−ＣｙａＡまたは酵素が不活性なＡ−ＣｙａＡと共にインキュベートされたマクロファージで細胞死を観察した。対照的に、ＮＡ−ＣｙａＡでは、検査された中で最も高用量を用いたときにのみ細胞溶解が観察された。この効果は、一部のＡ−ＣｙａＡの分解活性と同様に、ポリミキシンＢと共に同時インキュベーションすることによって無効になった。ＬＰＳ、およびＬＰＳによって誘発されたＴＮＦ−αはアポトーシスに関連付けられており（１６）、したがって、観察された細胞死に寄与しているかもしれない。
【００７２】
本発明者らは、ＣｙａＡが、アポトーシスの主要エフェクター分子であるカスパーゼ−３の活性化も誘導することを見出した。カスパーゼ−３の活性化は、野生型毒素（Ａ−ＣｙａＡ）で処理されたマクロファージ、および酵素的に不活性な変異体（Ａ−ｉＡＣ−ＣｙａＡ）で処理されたマクロファージでは観察されたが、ＮＡ−ＣｙａＡで処理されたものでは観察されなかった。高濃度（１０μｇ／ｍｌ）のＮＡ−ｉＡＣ−ＣｙａＡはカスパーゼ−３を活性化した。ｃＡＭＰの誘導には、カスパーゼ−３の活性化およびアポトーシスの一時的抑制が伴うことが、以前に実証されている（１７、１８）。したがって、ＮＡ−ｉＡＣ−ＣｙａＡによるカスパーゼ−３の誘導は、ｃＡＭＰ誘導の抑制作用を除去して、それによって、ＮＡ−ＣｙａＡを用いた際に見られたカスパーゼ−３活性化の閾値を低下させたことを反映しているのかもしれない。ＣｙａＡによって誘導される細胞死には、アデニル酸シクラーゼ活性ではなく、アシル化が必要であると思われる。
【００７３】
本発明者らは、ＲＴＸドメインのアシル化が細菌毒素の免疫調節活性およびアポトーシス促進活性に重要であることを見出した。非アシル化された、酵素的に活性な毒素は、野生型毒素よりわずかに低い効率ではあるが、ｃＡＭＰを増大させる能力を保持している。細胞内ｃＡＭＰの上昇は、ＣｙａＡの免疫調節活性における重要因子であると思われるが、細胞溶解、またはカスパーゼ−３の活性化を引き起こすのに必須でなく、これらの作用を抑制することさえある。この非アシル化された誘導体は、野生型の毒素と同様に、ＣＡ１１ｂ／ＣＤ１８を発現するマクロファージおよびＤＣを特異的な標的として、炎症誘発性のサイトカインの放出を抑制し、ＩＬ−１０産生を促進し、かつ、Ｔｈ２およびＩＬ−１０を生成するＴｒ１細胞の誘導を指示する表現型にＤＣが成熟するのを促進する。したがって、ＮＡ−ＣｙａＡは、先天免疫および適応免疫におけるＩＬ−１０産生を両方とも促進することができ、その結果、炎症性疾患、およびＴｈ１によって媒介された自己免疫疾患の予防用および／または治療用のアジュバントまたは免疫療法薬としてかなりの可能性する。
【００７４】
アシル化ＣｙａＡおよび非アシル化ＣｙａＡ、またはそれらの誘導体もしくは変異体もしくは変種もしくはペプチドは、炎症性疾患または免疫介在性疾患の治療に供する免疫調節物質および治療薬として用いることができる。多数の免疫介在性疾患が、炎症、および過剰なＴ細胞応答を特徴としている。多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、およびクローン病を含めた自己免疫疾患には、タイプ１Ｔヘルパー（Ｔｈ１）細胞と呼ばれる、インターフェロン（ＩＦＮ）−γを分泌するＴ細胞と、自己抗原に対する炎症反応とが関与する。対照的に、アトピー性疾患および喘息は、反対のＴｈ２サブタイプのＴ細胞によって媒介される。
【００７５】
上記に詳述した疾患の多くには満足できる治療が存在しない。炎症性疾患および免疫介在性疾患の伝統的な治療は、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎症薬に大きく依存しているが、これらは非特異的であり、副作用を有するものである。より最近では、主要な炎症性サイトカイン、詳細には腫瘍壊死因（ＴＮＦ）−αを抑制する薬物が開発されている。これらには、ある特定の自己免疫疾患に対して効果的な抗体または可溶性ＴＮＦ受容体が含まれるが、副作用（再発性結核が含まれる）を伴い、また、ＴＮＦ−αが病態の主要な媒介因子である疾患に限定されたものである。別の治療方法は、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）の直接投与であるが、これは、このサイトカインのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が短いことによって有用性が損なわれている。
【００７６】
これらに代わるストラテジーは、ＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインを誘導する薬剤を利用するものであるが、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで直接的免疫抑制効果を有するであろうし、また、抗原の存在下では、ＩＬ−１０分泌性の抗原特異的Ｔｒ細胞のプライミングを行い、このＴｒ細胞がＩＬ−１０産生および免疫抑制効果を増幅するであろう。
【００７７】
本発明者らは、ＣｙａＡおよびその誘導体が、先天性および適応性のＩＬ−１０を駆動する能力を有し、それによって、抗炎症薬として、免疫療法薬として、または、免疫介在性疾患を予防するワクチンの成分として作用することを見出した。本発明者らは、多発性硬化症（ＭＳ）のマウスモデル系である実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の疾患重度を、ＣｙａＡが軽減できることを示した。ＣｙａＡの存在下において、マウスをＭＯＧペプチドで免疫処置したところ、多発性硬化症のマウスモデル系であるＥＡＥの進行を遅延させ、また、ＥＡＥにおける疾患の発症率を低下させた。ＣｙａＡおよび非毒性ＮＰ−ＣｙａＡは、炎症性疾患または自己免疫疾患の予防における抗炎症薬、免疫療法薬および免疫調節物質、ならびにワクチン用のアジュバントとしてかなりの可能性を有する。
【００７８】
本発明は、以下の実施例から、より明確に理解されるであろう。
【実施例】
【００７９】
本研究の基礎となるタンパク質は、百日咳菌のＣｙａＡタンパク質である（２１）。野生型のタンパク質の配列は、以下のＮＣＢＩオンラインデータベースに見出すことができる：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=33591934。
【００８０】
プラスミドの構築
百日咳菌（Ｗ２８株）のゲノムＤＮＡは、対数増殖中期培養物から調製した。ｃｙａＡの５’末端はＰＣＲにより増幅し、オリゴヌクレオチド（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）には、ＰＡＢ５  ５’−ＣＧＣＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＴＣＡＧＧＣＴ−３’、およびＰＡＢ６  ５’−ＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧ−３’を用いた。得られた生成物を、ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣＡ、ＵＳＡ）で消化し、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）の対応する部位に挿入し、このプラスミドを、ｐＡＰＢ４と命名した。百日咳菌ゲノムＤＮＡからのｃｙａＡの３’末端をＰＣＲで、オリゴヌクレオチド  ＰＡＢ７  ５’−ＡＡＧＡＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＣＡＴＴＣＧＴＣＧ−３’、およびＰＡＢ２  ５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＧＣＣＡＧＴＴＧＡＣＡＧＣＣＡ−３’を用いて増幅した。生成物を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、同じ制限酵素部位でｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−と連結した。このプラスミドをｐＡＰＢ５と命名し、次いでＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、３’ｃｙａＡフラグメントを、ｐＡＰＢ４の対応する部位にサブクローニングして完全な長さのｃｙａＡ遺伝子にした。このプラスミドを、ｐＡＰＢ６と命名した。百日咳菌のゲノムＤＮＡからのｃｙａＣを、オリゴヌクレオチドＰＡＢ３  ５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡＴＧＴＣＡＴＧＣＴＴＣＣＧＴＣＣＧＣＣ−３’、およびＰＡＢ４  ５’−ＣＧＣＧＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＧＣ−３’を用いてＰＣＲで増幅した。このＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩとＨｉｎＤＩＩＩで消化し、同じ制限酵素で開裂したｐＡＳＫ−ＩＡＢ６（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）発現ベクターにクローニングした。この新規のプラスミドは、ｐＡＰＢ１と名付けた。完全なｃｙａＡ遺伝子を、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩで消化したｐＡＰＢ６から分離し、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ部位を用いて、ｐＡＰＢ１のｃｙａＣ遺伝子の上流にクローニングし、このプラスミドをｐＡＰＢ８と名付けた。ｐＡＰＢ８をＫｐｎＩとＨｉｎＤＩＩＩで消化し、ｃｙａＡおよびｃｙａＣを含む５．９ｋｂの生成物を、同じ制限部位で開裂した市販のＨｉｓで標識されたベクターｐＱＥ−８０（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＫ）にクローニングした。クローン化遺伝子の配列および方向は、制限消化および塩基配列決定（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により確認した。Ｈｉｓで標識しパルミトイル化したＣｙａＡが大腸菌で発現し得るこのプラスミドを、ｐＪＲ２（配列番号８）と命名した。
【００８１】
プラスミド発現ＣｙａＡおよびＣｙａＡ誘導体の構築
プラスミドｐＪＲｌ（配列番号５）は、以下の方法で構築した。ｃｙａＡは、ｐＡＰＢ６（ｃｙａＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−）由来のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ６（ＩＢＡ）にサブクローニングして、プラスミドｐＡＰＢ７を構築した。次いでｐＡＰＢ７由来のｃｙａＡを含むＫｐｎＩ／ＨｉｎＤＩＩＩフラグメントを、ｐＰＱＥ−８０（Ｑｉａｇｅｎ）の対応部位にクローニングし、ｐＪＲ１を構築した。ｃｙａＡの５’末端をコードする、３．５ｋｂのＳｓｔＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−の対応する部位に挿入して、プラスミドｐＡＰＢ９を構築した。テンプレートとしてｐＡＰＢ９を使用して、オリゴヌクレオチドｐＵＣ  Ｆｏｒｗａｒｄ（ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧ）−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、およびＰＡＢ２７（ＣＡＡＣＣＣＣＣＡＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＧＣＣＣＡＡＴＣＣＴＴＴＧ−導入したＢａｍＨＩ部位に下線、変異した塩基はイタリックで）を用いて、０．４ｋｂのＰＣＲ生成物を構築し、ならびにオリゴヌクレオチドＰＡＢ１７（ＣＡＡＡＧＧＡＴＴＧＧＧＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＧＧＧＧＧＴＴＧ−導入したＢａｍＨＩ部位に下線）、およびＰＡＢ２９（ＣＧＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣ−  ＮｃｏＩ部位に下線）を用いて、１．７ｋｂの生成物を構築した。前者のＰＣＲ生成物は、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化し、後者はＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩで消化し、次いでＸｂａＩ／ＮｃｏＩで消化したｐＡＰＢ９と連結してｐＮＭ１を構築した。ｐＮＭ１の２．５ｋｂ  ＣｌａＩ／ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＪＲ１およびｐＪＲ２の対応部位に挿入して、それぞれｐＡＰＢ２２（配列番号７）およびｐＮＭ２（配列番号１）を構築した。これらのプラスミドは、単独で（ｐＡＰＢ２２）またはＣｙａＣ（ｐＮＭ２）と共にＨｉｓ−ＣｙａＡのＨ６３Ａ／Ｋ６５Ａ／Ｓ６６Ｇ変異体をコードしている。クローニングした遺伝子の配列と方向は、制限消化と塩基配列決定（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により確認した。
【００８２】
ＣｙａＡの精製
３７℃で強く振盪し、アンピシリン１５０μｇ／ｍｌを補ったＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で指数増殖期の細菌培養に、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｂｉｏｌｉｎｅ、ＵＫ）を添加して、大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（ｐＪＲ２）に、ＣｙａＡおよびＣｙａＣを発現するように誘導した。菌液を遠心分離し、細菌ペレットをプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ−８４６５  Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を補った５０ｍＭのトリス−塩酸、０．２ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ８．０に再懸濁した。ＦａｓｔＰｒｅｐ器械で２０秒間、速度６で、ファーストプレププロテインブルービーズ（ＦａｓｔＰｒｅｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｕｅ  ｂｅａｄｓ）（ＱｂｉｏＧｅｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて細菌を破壊した。ＣｙａＡを含む不溶性物質は、遠心で分離し、５０ｍＭのトリス−塩酸、０．２ｍＭＣａＣｌ２、０．２％トリトンＸ−１００、ｐＨ８．０で洗浄し、５０ｍＭのトリス−塩酸、０．２ｍＭＣａＣｌ２、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０（緩衝Ａ）中で、攪拌しながら１時間室温でインキュベートした。遠心後、可溶化されたＣｙａＡを集めた。ＮａＣｌを終濃度０．１Ｍになるように添加後、０．１ＭＮａＣｌを補った緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥセルロース（Ｓｉｇｍａ）カラムにＣｙａＡをロードし、０．２ＭＮａＣｌを補った緩衝液Ａで溶出した。このタンパク質を、製造業者の推奨するｐＨに調整することにより変性条件下でＮｉ＋＋カラム（Ｑｉａｇｅｎ）でさらに精製し、１００ｍＭのＮａＨＰＯ４、１０ｍＭトリス−塩酸、８Ｍ尿素、０．２ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ４．５で溶出した。製造業者のプロトコルに従い、Ｄｅｔｏｘｉｇｅｌエンドトキシン除去カラム（ポリミキシンＢ結合カラム、Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて、ＬＰＳの除去を試みた。最初にダルベッコのＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭＥＤＴＡ、１Ｍ尿素、ｐＨ４．６に対して透析し、次いでダルベッコのＰＢＳ、０．１ｍＭＣａＣｌ２、２Ｍ尿素ｐＨ８．０に対して透析して、ＬＰＳをＣｙａＡから分離した。精製したタンパク質を一定分量にして、−２０℃で保存した。ＬＰＳは、比色カブトガニ細胞分解産物分析（ＱＣＬ−１０００；Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、ＭＤ、ＵＳＡ）で測定し、タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、クーマシーブルー（ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。これとは別に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後タンパク質をニトロセルロース膜へ移し、抗Ｈｉｓ標識抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および抗ＣｙａＡ抗体（Ｅｒｉｋ  Ｈｅｗｌｅｔｔからの贈呈品）で探査した。ホースラデイツシユペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ２次抗体（Ｓｉｇｍａ）および化学発光スーパーシグナル検出システム（Ｐｉｅｒｃｅ）と共にインキュベートし、バンドを可視化した。
【００８３】
ＣｙａＡおよびＣｙａＡ誘導体の精製
プラスミドｐＪＫ１（単独でＨｉｓ−ＣｙａＡを発現する（配列番号４））、ｐＪＲ２（Ｈｉｓ−ＣｙａＡおよびＣｙａＣを共に発現する（配列番号８））、ｐＮＭ２（酵素的に不活性なＨｉｓ−ＣｙａＡおよびＣｙａＣを発現する（配列番号１））か、もしくはｐＡＰＢ２２（酵素的に不活性なＨｉｓ−ＣｙａＡを発現する（配列番号７））を持つ大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅで、ＣｙａＡタンパク質を発現させ、精製した。Ｎ末端Ｈｉｓ標識タンパク質を、ジエチルアミノエチル−セファロースおよびＮｉ＋＋−アガロースクロマトグラフィーにより封入体から精製し、低ｐＨのＥＤＴＡを含む緩衝液に対して透析して、混入したＬＰＳを除去した。特に指示しない限り、すべての化学薬品はＳｉｇｍａからのものを使用した。ＬＰＳは、非常に高感度の比色カブトガニ細胞分解産物分析（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）で測定し、タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブルーで可視化した。クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで、タンパク質は、９５％以上の純度であると評価された。これとは別に、ＳＤＳ−ＰＡＧＢ後タンパク質をニトロセルロース膜へ移し、抗Ｈｉｓ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および抗ＣｙａＡ抗体（Ｅｒｉｋ  Ｈｅｗｌｅｔｔからの贈呈品）で探査した。ホースラデイツシユペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ２次抗体、および化学発光検出システム（Ｐｉｅｒｃｅ）と共にインキュベートし、バンドを可視化した。それぞれのタンパク質が、両抗体で認められた。
【００８４】
ＣｙａＡのパルミトイル化
大腸菌でのｃｙａＣとｃｙａＡの同時発現で、Ｌｙｓ９８３とＬｙｓ８６０の部位でパルミトイル脂肪酸でアシル化されたＣｙａＡタンパク質を生成する。同じシステムでのｃｙａＡの単独発現では、この翻訳後修飾を欠くＣｙａＡタンパク質を生じる。ＮＡ−ＣｙａＡおよびＡ−ＣｙａＡの試料のアシル化状態を確かめるために、放射能標識法を使用した。プラスミドｐＪＲ１（ｃｙａＡをコードする）ならびにｐＪＲ２（ｃｙａＡおよびｃｙａＣをコードする）を持つ大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株を、アンピシリン（１５０μｇ／ｍｌ）添加ＬＢ平板にグリセロールストックから画線接種し、３７℃で終夜培養した。単一コロニーを、５ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ液体培地に接種し３７℃で終夜、振盪培養した。次いでこの培養を、ＯＤ６００＝０．２になるように５ｍｌの培地に希釈し、ＯＤ＝０．４〜０．６まで増殖した。この培養物１ｍｌの細菌を、卓上小型遠心器で１０分間、８００ｇで遠心し、５μＣｉの［１４Ｃ（Ｕ）］パルミチン酸（０．１ｍＣｉ／ｍｌ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ  ＵＳＡ）を添加した、アンピシリン（１５０のμｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地１ｍｌに再懸濁して、１時間室温で激しく振盪した。タンパク質発現は、１５分間１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。細胞を採取して、新しい培地で洗浄し、ペレット化して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング色素中に再懸濁し、菌液３００μｌ当量を７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動を行い、次いでＧｅｌ  Ｃｏｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で染色して、タンパク質を可視化して、ＣｙａＡタンパク質バンドを同定した。高度に精製した組換えＡ−ＣｙａＡ（放射性標識なし；２μｇ）も、同じゲルで泳動して溶菌液中の組換えタンパク質を同定した。次いで蛍光光度法を用いてゲル上の放射性標識されたパルミトイル化タンパク質を可視化した。
【００８５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣｙａＡ酵素活性
５０μｌ  ５０ｍＭトリス−塩酸で、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１μＭカルモジュリン、０．１２ｍＭＣａＣｌ２、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＡＴＰ、ｐＨ８．０中で、０．１μｇのタンパク質を、３０℃、５分間インキュベートした。この反応混合物を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｂｉｏｔｒａｋ酵素免疫測定法システムの溶解試薬１Ｂと混合し、５分の間沸騰した。ｃＡＭＰは、Ａｍｅｒｓｈａｍキットで競合ＥＬＩＳＡ法で測定した。単位は、３０℃、ｐＨ  ８．０で、１分当たり産生されたｃＡＭＰのμｍｏｌである。
【００８６】
ｃＡＭＰの定量
細胞内のｃＡＭＰ蓄積を定量するために、ＣｙａＡまたはＣｙａＡ誘導体を、０．１〜１０ｇ／ｍｌの濃度で、Ｊ７７４マクロファージまたは樹状細胞に加えた。ｃＡＭＰは、Ａｍｅｒｓｈａｒｎ  Ｂｉｏｓｃｔｅｎｅｅｓ  Ｂｉｏｔｒａｋ酵素免疫測定法キットを用いた競合ＥＬＩＳＡ法で測定した。試料を連続的に希釈して、濃度曲線の直線範囲内で測定値を得た。
【００８７】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の定量
Ｊ７７４マクロファージの溶解は、培養上清へのＬＤＨの放出で測定した。指示された濃度で毒素を細胞に加え、３７℃で６時間、プレートをインキュベートした。上清のＬＤＨ活性は、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で定量した。パーセンテージ溶解＝［（試料のＯＤ−未処理細胞のＯＤ）／（１００％溶解細胞のＯＤ−未処理細胞のＯＤ）］＊１００。
【００８８】
ＣｙａＡ処理Ｊ７７４細胞の形態学的評価
Ｊ７７４細胞を、処置の１日前にカバーグラス上に蒔いた。細胞を、１〜１０μｇ／ｍｌのＣｙａＡまたはＮＡ−ＣｙａＡ、１μＭシクロヘキサミド、または培地のみで６時間処理した。処理後、カバーガラスを取り除き、細胞を、ＰＢＳ中３％パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄して、分析のためにスライドガラス上に載置した。カメラを装着したＢＸ５１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で、細胞を白色光下で可視化し、ＡｎａｌｙＳＩＳ（登録商標）ソフトウェアを用いて、画像を取得した。
【００８９】
カスパーゼ−３活性化アッセイ
胎仔牛血清を欠くｃＤＭＥＭ中で６時間、Ｊ７７４細胞を、ＣｙａＡまたはＣｙａＡ誘導体（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）で処理した。細胞を洗浄し、３００μｌの溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１％トリトンＸ−１００、１００μＭフェニルメチルスルホニル弗化物、ロイペプチン１０μｇ／ｍｌ、アプロチニン５μｇ／ｍｌ）中で溶解し、タンパク質濃度を分析した。５０ｌの試料を、５０ｌの２Ｘ反応緩衝液（１００ｍＭＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭＮａＣ、１０．２％ＣＨＡＰＳ、４ｍＭＤＴＴ）、および５０μＭカスパーゼ−３基質（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ、Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐ．）に加え、３７℃でインキュベートした。フリーＡＦＣの遊離に起因する蛍光を、６０分にわたり観察した（励起、３９０ｎｍ；発光、５１０ｎｍ）。
【００９０】
マクロファージおよびＤＣ
Ｊ７７４マウスマクロファージ株細胞を、完全ＤＭＥＭ（ｃＤＭＥＭ；８％胎仔牛血清を補ったＤＭＥＭ、１００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシン）中で培養し、３〜４日ごとに継代した。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現している株化細胞（Ｊ５５８−ＧＭ−ＣＳＦ）からの上清（１０％）を補った、完全ＲＰＭＩ−１６４０（ｃＲＰＭＩ；８％胎仔牛血清を補ったＲＰＭＩ、１００ｍＭ  Ｌ−ｇｉｕｔａｍｉｎｅ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシン）中で、マウスの大腿骨および脛骨から得た骨髄細胞を培養して、骨髄由来未熟ＤＣを調製した。３日目に、１０％ＧＭ−ＣＳＦ細胞上清入りの新鮮な培地を、付着細胞に加えた。７日目に、細胞を採取し、洗浄し、ｃＲＰＭＩ中に再培養して、アッセイに用いた。Ｊ７７４細胞とＤＣを、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で実験に用いた。
【００９１】
マクロファージおよびＤＣのサイトカイン放出に及ぼすＣｙａＡの効果
ＣｙａＡを指示された濃度でマクロファージおよびＤＣに加えた。表示がある場合は、精製抗マウスＣＤ１１ｂ抗体（Ｍ１／７０）または、精製ラットＩｇＧ２ｂ、アイソタイプ対照（双方ともＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ製）を、１０ｇ／ｍｌの濃度で、ＣｙａＡ添加より３０分前に添加した。ＣｙａＡによる刺激２時間後に、ポリミキシンＢを１０ｇ／ｍｌの濃度で、該当するウェルに添加した。ＬＰＳまたはホスホロチオネート−安定化オリゴデオキシヌクレオチドを含むＣｐＧのモチーフ（ＣｐＧ−ＯＤＮ；５’−ＧＣＴＡＧＡＣＧＴＴＡＧＣＧＴ−３’；Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｌｔｄが合成）を、指示された濃度で添加した。ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−、ＩＬ−６およびＣＣＬ３濃度をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔｓ）で分析するために、２、４、２４または２８時間後に上清を採取した。
【００９２】
ＤＣの成熟に及ぼすＣｙａＡの効果
ＤＣを、ＣｙａＡ（１ｇ／ｍｌ）およびポリミキシンＢ（１０ｇ／ｍｌ）と共に培養した。２時間後に、１０ｎｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのＬＰＳを添加した。２４時間培養後、細胞を採取し、０．０５％ウシ血清アルブミンおよび０．０２％ＮａＮ３入りのＰＢＳで洗浄した。マウスＣＤ８０（ハムスターＩｇＧ２、クローン１６−１０Ａ１）、ＣＤ８６（ラットＩｇＧ２ａ、クローンＧＬ１）、ＣＤ１１ｃ（ハムスターＩｇＧ１、クローンＨＬ３）、ＭＨＣクラスＩＩ（マウスＩｇＧ２ｂ、Ｉ−Ａｄ、クローンＡＭＳ−３２．１）、ＣＤ４０（ラットＩｇＧ２ａ、クローン３／２３）または、ＩＣＡＭ−Ｉ（ハムスターＩｇＧ１、クローン３Ｅ２）に特異的な抗体で、細胞を４℃で３０分間インキュベート後、洗浄して、ビオチン標識一次抗体の場合には、ストレプトアビジン−ＰｅｒＣＰと共にインキュベートした。対照の働きをする無関係な特異性を持つ適切なアイソタイプ適合抗体で、細胞を標識化した。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒフローサイトメータで、１試料につき３０，０００個の細胞を解析した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｖ３．３ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｍｅｔｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて、ＣＤ１１ｃにゲートされた細胞に対し分析を行った。
【００９３】
動物および免疫処置
特定病原非感染メスＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスを、Ｈａｒｌａｎ  Ｏｌａｃ（Ｂｉｃｅｓｔｅｒ、ＵＫ）から購入し、１グループ当たり４匹または５匹で、６〜８週齢のマウスを用いた。マウスを、それぞれ換気されたケージに収容し、アイルランド保健省、ＥＵおよびＴｒｉｎｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｄｕｂｌｉｎ倫理委員会の規定に従ってすべての実験を実施した。
【００９４】
発熱物質を除いたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；５μｇ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣｙａＡもしくはＮＡ−ＣｙａＡ（１μｇ）と共にＫＬＨ（５μｇ）、または最終容量５０μｌでダルベッコＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）で、１度か２度（０日および２１日）マウスの後足蹠皮下（ｓ．ｃ．）に免疫した。最初または２回目の免疫投与の７日後に、頚椎脱臼によりマウスを屠殺にし、血清と膝窩リンパ節を採取した。
【００９５】
抗原特異的Ｔ細胞系統およびクローンの生成
免疫したマウスからの膝窩リンパ節細胞（１×１０６／ｍｌ）を、ＫＬＨ（５０μｇ／ｍｌ）と共に培養した。２回の抗原刺激後、（３７）に記載のように限界希釈法により、Ｔ細胞系統をクローニングした。Ｔ細胞系統とクローンは、抗原（ＫＬＨ、５０μｇ／ｍｌ）および脾臓のＡＰＣと共に４〜５日間培養後、放射線照射フィーダー細胞およびＩＬ−２で５〜７日培養して維持した。飢餓状態周期の終わりに、Ｔ細胞のサイトカイン産生を調べた。
【００９６】
抗原特異性サイトカインの産生
免疫したマウス、またはＴ細胞系統、またはクローン、およびＡＰＣ（放射線照射脾臓細胞、２×１０６／ｍｌ）からのリンパ節細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を、３７℃、５％ＣＯ２、ＲＰＭＩ培地で、ＫＬＨ（２〜５０μｇ／ｍｌ）、またはホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３−アセテート（ＰＭＡ；２５ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、および抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ；ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、または培地のみ、と共に培養した。３日後に、上清をサイトカイン検出のために採取し、培地交換した。次の日に３Ｈ−チミジン（９５０μＣｉ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＫ）を添加し、細胞をさらに５時間培養した。その後細胞を採取し、増殖を３Ｈ−チミジン取込みにより評価した。抗体および標準物質として組換えサイトカイン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の組合せを用いて、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γの濃度をイムノアッセイにより測定した。市販のＤｕｏ−Ｓｅｔキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、ＩＬ−１０の濃度を測定した。
【００９７】
抗体アッセイ。免疫したマウス血清中のＫＬＨに特異的なＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのタイターをＥＬＩＳＡで測定した。
【００９８】
統計
サイトカインおよびケモカイン濃度は、一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）により比較した。有意差が見いだされた場合、Ｔｕｋｅｙ  Ｋｒａｍｅｒ多重比較検定を、それぞれのグループ間で相違を同定するために用いた。
【００９９】
ＣｙａＡのクローニング、発現および精製
ＣｙａＡをコードする遺伝子ｃｙａＡ、およびその生成物がＣｙａＡの翻訳後の活性化に必要な遺伝子ｃｙａＣが、百日咳菌Ｗ２８のゲノムＤＮＡからｐＱＥ−８０にクローニングされ、大腸菌でこれらの遺伝子が誘導発現できるようにした。６ｘＨｉｓ標識ＣｙａＡを発現するこのプラスミドｐＪＲ２を、エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に導入した。組換えプラスミド含む細菌を回収し、クローニングした遺伝子の正しい配向および位置を、制限消化および塩基配列決定により確かめた。
【０１００】
活性なＣｙａＡを、細菌封入体から可溶化し、ＤＥＡＥとＮｉ＋＋カラムで精製した。ゲル電気泳動後のクーマシー染色の評価で、２００ｋＤａのＣｙａＡタンパク質の純度は、９５％よりも高く、抗Ｈｉｓ抗体および抗ＣｙａＡ抗体の両方でこのバンドが認められた（データは示さず）。ＣｙａＡタンパク質のＬＰＳ含有量を、全精製過程でモニターした。この段階で、タンパク質試料は、かなりの量のＬＰＳを含んでいた（＞２ｎｇＬＰＳ／μｇタンパク質）。多くの方法を使って、ＬＰＳの除去を試みた。タンパク質試料をポリミキシンＢ結合カラムを通過させると、ＬＰＳは減少するが、除去はできなかった。これは、ＣｙａＡがＬＰＳと緊密な複合体を形成していることを示唆していた。ＥＤＴＡを添加してカルシウムイオンをキレートすることにより、および本タンパク質のｐＩ以下にｐＨを低下させることにより、ＬＰＳをタンパク質から分離できる。この状況でタンパク質を透析後、ＣｙａＡの試料は、２２０ｐｇＬＰＳ／μｇタンパク質を含んでいた。このＬＰＳ濃度は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマクロファージまたはＤＣを刺激しなかった（データは示さず；さらに図４、５および７）。以下に記載するアジュバントおよび免疫調節剤の研究に、この試料を使った。
【０１０１】
ＣｙａＡの生化学的特性
ＣｙａＡ試料を生化学的に分析して、ＣｙａＡの酵素および膜移行特性の両方が活性であることを確認した。アデニル酸シクラーゼ酵素機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、タンパク質は酵素的に活性であることを示した（２６．６±０．８単位／ｍｇ）。１μｇ／ｍｌ濃度のＣｙａＡで、Ｊ７７４マクロファージのｃＡＭＰ細胞内濃度を８０倍上昇させることができ（７２．８±２．９対０．９±０．１ｐｍｏｌｃＡＭＰ／１０６細胞）、本タンパク質は、真核生物細胞を標的にして侵入する能力を持つことを示していた。最大ｃＡＭＰ濃度に３０分以内に達し、少なくとも２４時間維持された。ＬＤＨ放出で計測して、この濃度のＣｙａＡは、２４時間後に１％未満の細胞溶解を誘起したが、５〜１０μｇ／ｍｌ濃度のＣｙａＡで溶解（１０％までの）が認められた（データは示さず）。したがって、ＣｙａＡの免疫調節性機能を評価するために、細胞生存度に影響を及ぼすことなく、細胞内のｃＡＭＰの大きな増加を引き起こす濃度、１μｇ／ｍｌでＣｙａＡを使用した。
【０１０２】
ＣｙａＡは、同時に注入した抗原に対してＴｈ２およびＴｒ１細胞を産生する
ＣｙａＡのアジュバント特性を調べるために、ＫＬＨ（５μｇ）単独で、またはＣｙａＡ（１μｇ）と共に、マウス後足蹠皮下に免疫した。７日後にマウスを屠殺し、リンパ節細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原（ＫＬＨ  ２〜５０μｇ／ｍｌ）で再刺激した。サイトカイン濃度を、３日後に取り出した上清で測定し、増殖は４日後に評価した。ＫＬＨ単独での免疫は、弱い細胞性免疫応答を誘発した；ＰＢＳで免疫したマウスで認められる以上に、ＩＬ−４産生のみが増強した（図１）。対照的に、ＫＬＨおよびＣｙａＡで免疫したマウスの再刺激したリンパ節細胞からの細胞では、有意な抗原特異的増殖が認められた。さらにまた、ＫＬＨ単独で免疫したマウスと比較して、ＣｙａＡおよびＫＬＨで免疫したマウスのリンパ節細胞で、ＫＬＨに特異的なＩＬ−１０およびＩＬ−５が有意に高い濃度で検出された。ＩＬ−４およびＩＦＮ−γも増強したが、ＫＬＨ単独、ならびにＫＬＨおよびＣｙａＡを投与したマウス間の相違は、ほとんどの場合有意ではなかった。サイトカイン分泌の類似のパターンが、追加抗原免疫後の７日目に認められた（データは示さず）。
【０１０３】
抗原刺激したリンパ節細胞のサイトカインプロフィールは、ＣｙａＡが同時投与した抗原に対して、Ｔｈ２および／またはＴｒ１細胞を増強することを示唆していた。この発見を確かめるために、ＣｙａＡの存在下でＫＬＨで免疫したマウスから、ＫＬＨに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞系統およびクローンを構築した。調べたそれぞれ１０個のＴ細胞系統が高濃度のＩＬ−１０および低濃度のＩＬ−５を分泌し、これより少数の細胞がＩＬ−４も分泌していた（図２Ａ）。ＩＦＮ−γ産生は、調べた１０個のＴ細胞系統のうちの６個で検出可能であり、これらのうち１個の細胞だけから高濃度で検出された（図２Ａ）。対照的に、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド存在下で、ＫＬＨで免疫したマウス由来のすべてのＴ細胞系統が、ＩＦＮ−γを５０ｎｇ／ｍｌを上回る濃度で産生した（未発表の観察）。ＫＬＨおよびＣｙａＡで免疫したマウスから作製した多数のＴ細胞系統をクローニングし、代表的なＴ細胞系統由来のＴ細胞クローンのサイトカイン産生を、図２Ｂに示す。これらＫＬＨに特異的なＴ細胞クローンは、ＩＬ−５およびＩＬ−１０、または、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０は分泌するがＩＦＮ−γは検出不可能であり、これはＴｒ１およびＴｈ２細胞それぞれに特徴的なプロフィールである。同時投与した抗原に特異的なＴｈ２およびＴｒ１型細胞の誘導を、ＣｙａＡが促進することをこれらの所見は示している。
【０１０４】
ＣｙａＡは、同時投与した抗原に対するＩｇＧ１応答を増強する
ＫＬＨ単独で、またはＣｙａＡと共に免疫したマウスで、ＫＬＨ特異的ＩｇＧおよびＩｇＧサブクラスを評価することにより、同時に注射した抗原に対する抗体産生応答に対するＣｙａＡのアジュバント効果を調べた。抗原を単独で投与したマウスと比べて、ＫＬＨおよびＣｙａＡで免疫したマウスの血清では、ＫＬＨ特異的ＩｇＧ１が有意に高濃度で見いだされた。対照的に、ＫＬＨ単独で免疫したマウスで認められる濃度以上に、ＣｙａＡはＩｇＧ２ａ濃度を増強しなかった（図３Ａ）。２回目の免疫投与後、血清ＩｇＧタイターは、１回目の免疫投与後に認められたタイター以上に増加し、ＣｙａＡ存在下でＫＬＨに対する応答は、ＫＬＨ単独で免疫したマウスでの応答より有意に大きかった（図３Ｂ）。１回目の免疫投与後のデータと同等に、ＩｇＧ１が抗体産生応答の優性なサブクラスであった。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞応答と同様に、ＣｙａＡは抗体産生でアジュバントとして作用することを、これらのデータは明らかに示している。
【０１０５】
ＣｙａＡは、先天性細胞でサイトカイン産生を調節する
ＤＣとマクロファージを含む先天免疫系の細胞は、抗原を提示し、調節性サイトカインを分泌することにより適応免疫応答を導く。ＣｙａＡの効果をこれらの細胞で検討するために、Ｊ７７４マクロファージおよび骨髄由来の未成熟ＤＣを、ＣｙａＡ（１μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）またはＣｙａＡおよびＬＰＳと共にインキュベートした。精製の間にＬＰＳは減少はするが、完全には除去できなくて、ＣｙａＡタンパク質とＬＰＳは関連しているので、ＣｙａＡの免疫調節性効果におけるこのＬＰＳの役割を、もしあるならば決定することは重要であった。したがって、ポリミキシンＢ存在下で、同様にＣｙａＡで細胞を刺激した。上清を、刺激後２、４および２８時間で採取し、サイトカインを定量した。残留ＬＰＳ（２２０ｐｇ／ｍｌ）を含む精製したＣｙａＡは、Ｊ７７４細胞でＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αの低濃度の産生を促進し（図４）、ＤＣでＩＬ−６およびＴＮＦ−α（しかしＩＬ−１０の分泌なし）を低濃度で分泌した（図５）。このサイトカイン産生は、ポリミキシンＢの存在下で抑制された。しかし、ＣｙａＡ試料中に存在する量（２２０ｐｇ／ｍｌ）のＬＰＳ単独での刺激では、これらのサイトカインの産生を誘導しなかった（図４および５）。ＣｙａＡは、ＬＰＳ存在下でのみ、先天性細胞を活性化することを、これらのデータは示唆している。したがって、ＬＰＳの増量に応じたサイトカイン産生に及ぼす、ＣｙａＡの効果を調べた。マクロファージおよびＤＣからのＩＬ−６およびＩＬ−１０の産生促進において、ＣｙａＡはＬＰＳと相乗効果を示す。ＣｙａＡおよびＬＰＳ（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）で促進されるマクロファージのＩＬ−１０産生は、調べたすべての時間点で、ＬＰＳ単独に対応する量で促進されるマクロファージのＩＬ−１０産生より有意に大きかった（図４）。ＬＰＳ単独（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）刺激での４時間後のＤＣ上清では、ＩＬ−１０は検出できなかったが、ＣｙａＡ添加後かなりの濃度のＩＬ−１０が産生された（図５）。マクロファージおよびＤＣでのＬＰＳ誘発性のＩＬ−６産生は、ＣｙａＡの添加によっても有意に増強したが、これは初期の時間点でのみ認められた。ＩＬ−６およびＩＬ−１０産生に対する正の効果とは対照的に、マクロファージおよびＤＣでのＴＮＦ−α分泌、ならびにＤＣでのＩＬ−１２ｐ７０産生をＣｙａＡは抑制する。調べた３つの時点およびある範囲のＬＰＳ量にわたって、これらの抑制効果が認められた。ＣｙａＡ単独では、生得的な免疫系の細胞でサイトカイン産生に及ぼす効果をほとんど増強しないが、ＩＬ−６およびＩＬ−１０産生促進において、非常に低濃度でもＬＰＳと乗効果を示すことができるばかりでなく、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２産生を阻害することを、これらのデータは示している。
【０１０６】
ＤＣの成熟に及ぼすＣｙａＡの効果
ＴＬＲと結合するいくつかの病原体由来の分子が、未成熟なＤＣの成熟を誘導し、それによって、ナイーブなＴ細胞を活性化するＤＣの能力を増強する。したがって、ＤＣの成熟を促進するＣｙａＡの能力および／またはＬＰＳ誘発性の成熟を調節する能力を調べた。未成熟なＤＣを、ＣｙａＡ、ＬＰＳ、またはＣｙａＡと共にＬＰＳで刺激し、成熟に関連する表面マーカーの発現を、２４時間後に免疫蛍光検査分析により調べた。予想通り、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩの表面発現を増強した（図６）。ＣｙａＡによる未成熟なＤＣ（ポリミキシンＢの存在下で）の刺激もまた、ＣＤ８０およびＭＨＣクラスＩＩ、およびわずかながらＣＤ８６の表面発現のアップレギュレーションをもたらした。対照的に、ＣｙａＡと共に培養後のＣＤ４０およびＩ−ＣＡＭ  Ｉの発現は、ダウンレギュレートされていた。さらにまた、ＣｙａＡは、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−ＩおよびＣＤ８６のＬＰＳ誘発性のアップレギュレーションを阻害した。対照的に、ＣｙａＡ試料に存在する濃度（２２０ｐｇ／ｍｌ）のＬＰＳでの細胞処理では、ＤＣ表面マーカーの発現に及ぼす効果は認められなかった（データは示さず）。ＣｙａＡ処理により、ＤＣの部分的な成熟、ＣＤ８０およびＭＨＣ−ＩＩのアップレギュレーションを引き起こすが、Ｔｒ１細胞を分化させる表現型であるＣＤ４０およびＩＣＡＭ−１を阻害することを、これらの所見は示している。
【０１０７】
ＴＬＲ−４欠損マウス由来のＤＣに及ぼすＣｙａＡの効果
アジュバントおよび免疫修飾物質としてのＣｙａＡの作用機序で、さらにＬＰＳの役割に取り組むために、生得的なサイトカインおよびケモカイン産生、ならびにＴＬＲ４欠損マウスでのＤＣの成熟を調べた。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスのＤＣを、ＣｙａＡ、ＬＰＳ、ＬＰＳおよびＣｙａＡ、またはＣｙａＡおよびポリミキシンＢで処理し、４時間後に上清回収した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来ではなくＣ３Ｈ／ＨｅＮ由来のＤＣで、ＣｙａＡ（２２０ｐｇ／ｍｌの残存ＬＰＳ含有）が、ＩＬ−１０産生を促進した（図７）。さらにまた、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスのＤＣによるＩＬ−１０産生は、ポリミキシンＢによって阻害された。しかし、ＣｙａＡ試料に存在する濃度のＬＰＳ単独（２２０ｐｇ／μｇ）では、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスのＤＣで、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−αまたはＭＩＰ−ｌαの産生を誘導しなかった。高用量の外来のＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）の添加では、４時間の時間点で、ＩＬ−１０を誘導しなかったが、ＩＬ−１０産生の促進ではＣｙａＡと相乗効果を示した。さらにまた、ＣｙａＡはＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスのＤＣで、ＬＰＳ誘導のＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ１−αの産生を抑制したが（図７）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスのＤＣで、サイトカイン産生に及ぼす効果は認められなかった（図７）。対照的に、同じ様式でＣ３Ｈ／ＨｅＮおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪのＤＣで、ＣｐＧ、ＴＬＲ９リガンドは、サイトカイン産生を活性化した（図７）。これらのデータは、ＤＣでサイトカイン産生に及ぼす直接的な効果がないにもかかわらず、ＣｙａＡはＬＰＳ誘発性の応答を調節し、ＩＬ−１０の誘導でＬＰＳと相乗効果を示し、ＬＰＳ誘発性ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−ｌαの産生を抑制するというより詳細な証拠を提供している。
【０１０８】
さらにＣ３Ｈ／ＨｅＮおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のＤＣの成熟に及ぼすＣｙａＡの効果を調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスで見られるように、ＣｙａＡは、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスのＤＣの成熟を誘導し、特にＣｙａＡは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０およびＩＣＡＭ−１の発現を増強した（図８Ａ）。ポリミキシンＢの存在下で、これらの効果は減少し、特にＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１およびＭＨＣクラスＩＩでは減少して、培地処理の対照ＤＣで見られる濃度よりも低濃度で発現した。ＬＰＳ誘発性ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＩＣＡＭ−１の発現も、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＣで観察されるのと同程度ではないが、ＣｙａＡにより阻害された。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおける調節的な効果と対照的に、ＬＰＳ、ＣｙａＡ、またはＣｙａＡを伴うＬＰＳのＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０またはＩＣＡＭ−１に及ぼす増強効果はなく、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のＤＣのＣＤ８０に及ぼす軽度の効果が見られた（図８Ｂ）。しかし、ポリミキシンＢの存在下で、ＣｙａＡはＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来ＤＣでＣＤ４０およびＩＣＡＭ−１の発現をわずかに減少させた。ＣｙａＡによるＤＣの成熟マーカーのアップレギュレーションは、非常に低用量でさえもＬＰＳに依存するが、ＣＤ４０およびＩＣＡＭ−１の内在性の発現抑制は、ＬＰＳがなくても起りうることをこれらの所見は示唆している。
【０１０９】
アシル化されたＣｙａＡ、非アシル化されたＣｙａＡおよび、酵素的に不活性なＣｙａＡの精製と生化学的解析
以下の研究では、免疫応答を調節するＣｙａＡの能力に対する、アシル化の役割および酵素活性の役割を調べた。アシル化は、ＣｙａＡが赤血球と相互作用するために必要であり、アデニル酸シクラーゼ活性は、宿主細胞でｃＡＭＰの蓄積の原因となる。ＣｙａＡのアジュバントおよび免疫調節性効果によるアシル化およびアデニル酸シクラーゼ活性の役割を調べるために、アシル化の欠如および／またはアデニル酸シクラーゼ活性を欠損したＣｙａＡとＣｙａＡ誘導体を生成して精製した。組換え型のＮ末端Ｈｉｓ標識ＣｙａＡおよびＣｙａＡ誘導体の融合タンパク質を発現させて、大腸菌から精製した。アシル化ＣｙａＡ（Ａ−ＣｙａＡ）を、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターＰｌａｃのコントロール下にあるＨｉｓ−ＣｙａＡおよびＣｙａＣを同時発現する大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（ｐＪＲ２）から精製した。非アシル化ＣｙａＡ（ＮＡ−ＣｙａＡ）は、ｃｙａＣが欠如した同様のプラスミドであるｐＪＲ１をもつ大腸から精製した。ＣｙａＡタンパク質の触媒活性が含まれることが知られているアミノ酸をコードする遺伝子領域のｃｙａＡ遺伝子の部位特異的変異誘発により、不活性のアデニル酸シクラーゼドメインをもつＣｙａＡタンパク質（ｉＡＣ−ＣｙａＡ）を生成した。Ｈ６３Ａ、Ｋ６５ＡおよびＳ６６Ｇ置換−Ｌｙｓ６５をもつ変異タンパク質は、ＡＴＰの結合にとって重要であり、Ｈｉｓ６３が、その環化に関与している（２１、２２）。アシル化ｉＡＣ−ＣｙａＡ（Ａ−ｉＡＣ−ＣｙａＡ  ＳＥＱおよび非アシル化ｉＡＣ−ＣｙａＡ（ＮＡ−ｉＡＣ−ＣｙａＡ）（配列番号３）それぞれを、ＣｙａＣの存在または不在下で大腸菌に発現させて精製した。ＬＰＳは、ＣｙａＡと複合体を作るようであり、本研究で使用された精製試料中のＬＰＳ含有量は、１２４〜２１７ｐｇＬＰＳ／ｇＣｙａＡの範囲内にわたっていた。野生型ｃｙａＡおよびｃｙａＡ誘導体のＤＮＡ配列は、クローニングした遺伝子の塩基配列決定により確かめた。
【０１１０】
Ａ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡそれぞれの、パルミチン酸脂肪酸アシル化の存在および欠如は、［１４Ｃ（Ｕ）］パルミチン酸存在下で生育した大腸菌で、タンパク質の発現を誘導して確かめた。同時発現する付属タンパク質ＣｙａＣにより、Ａ−ＣｙａＡ試料は、翻訳後のパルミトイル化により修飾されるが、ＣｙａＣ（ＮＡ−ＣｙａＡ）がない場合、発現したＣｙａＡはパルミトイル化されないことを、図９の結果は示している。
【０１１１】
試料１は、それぞれ４７および３１モルｃＡＭＰ産生／分／ｍｇの特異的活性をもち、試料２は、それぞれ１０５および１２１モルｃＡＭＰ産生／分／ｍｇの特異的活性もち、Ａ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡは共に酵素的に活性であったが、アシル化も非アシル化もされていないｉＡＣ−ＣｙａＡタンパク質は酵素活性を示さなかった（図１１Ａ）。
【０１１２】
赤血球の溶血、ならびにマクロファージの溶解およびカスパーゼ−３活性化に、ＣｙａＡのアシル化が必要である。アシル化は、ＣｙａＡが結合し、細胞内のｃＡＭＰを増加し、赤血球の溶血を引き起こすために必要であることが以前に示されている（１）。さらにまた、非アシル化されたＣｙａＡは、Ｊ７７４マクロファージまたはＪｕｒｋａｔＴ細胞を溶解することができなかったが、これらの細胞で結合するＮＡ−ＣｙａＡの能力、またはｃＡＭＰの蓄積を生じるＮＡ−ＣｙａＡの能力は報告されていない（１、２）。ＮＡ−ＣｙａＡは、ＣＤ１１ｂでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で溶解またはｃＡＭＦ濃度を上昇させることができなかったが、ＮＡ−ＣｙａＡは、ＣＤ１１ｂに依存する様式で、しかしＡ−ＣｙａＡより低親和性で、これらの細胞に効率的に結合することができることが最近報告された（１４）。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を発現するＪ７７４マクロファージで、ＣｙａＡ誘発性ｃＡＭＰの蓄積における、アシル化と酵素活性の役割を調べた。酵素的に活性なＡ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡは、Ｊ７７４細胞で細胞内のｃＡＭＰ濃度を約１０００倍上昇させたが、Ａ−ｉＡＣ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ｉＡＣＣｙａＡはｃＡＭＰ濃度を変化させなかった（図１１Ｂ）。細胞内のｃＡＭＰの増加は、Ａ−ＣｙａＡよりもＮＡ−ＣｙａＡでより少なかった。それにもかかわらず、大きな濃度範囲にわたりＮＡ−ＣｙａＡが、細胞内のｃＡＭＰを増強したので、アシル化が細胞内ｃＡＭＰの誘導に必須でないことを、結果は明らかに示している（図１２）。
【０１１３】
ＣｙａＡは赤血球の溶血を引き起こしたが、ＮＡ−ＣｙａＡには効果が認められなかった（図１０）。マクロファージの溶解を引き起こすこれらのタンパク質の能力も評価した。濃度１０ｇ／ｍｌで、アシル化されたＣｙａＡタンパク質の両方が、Ｊ７７４マクロファージで細胞死を誘導したが、ＮＡ−ＣｙａＡまたはＮＡ−ｉＡＣ−ＣｙａＡでは、軽微な溶解のみを検出した（図１１Ｃ）。ポリミキシンＢでインキュベート後、ＮＡ−ＣｙａＡ１０μｇ／ｍｌで検出された低い溶解レベルは抑制され、Ａ−ＣｙａＡで誘導される溶解は減少した（図１２Ｃと図１２Ｄを比較）。したがって、他のＲＴＸ毒素の場合のように、アシル化は、ＣｙａＡが細胞を溶解するために必要であり、さらにＬＰＳはこの溶解効果を増強できる。これとは対照的に、酵素活性および細胞間のｃＡＭＰ濃度の増強は、細胞溶解を引き起こすＣｙａＡの能力とわずかに関連するだけである。
【０１１４】
Ａ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡ間の細胞毒性の差異は、ＣｙａＡで処理したマクロファージの形態を検討して決定した。ＮＡ−ＣｙａＡ処理した細胞の形態は、未処理の細胞の形態と同様であった（図１３）。対照的に、３または５μｇ／ｍｌの濃度のＡ−ＣｙａＡで処理したＪ７７４細胞（図１３ＢおよびＣ）は、細胞断片化の他に原形質と核が収縮して、アポトーシスの形態を帯びる（ヘキスト染色による細胞核染色で、明白な染色質凝縮を示した；データは示さず）。これは、シクロヘキシミドによって誘導される明らかなアポトーシスの形態に匹敵する（図１３Ｅ）。さらに高濃度のＣｙａＡ（図１３Ｄ）で、細胞質および核膨張が見られ、原形質の明らかな空胞化を伴う壊死による特徴的な表現型が明瞭である。アポプトーシスにおける重要なステップは、プロテアーゼであるカスパーゼ−３の活性化である。したがって、Ａ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡで処理した細胞で、カスパーゼ−３の活性化を調べた。濃度５および１０μｇ／ｍｌのＡ−ＣｙａＡは、高濃度のカスパーゼ−３を誘導し、３μｇ／ｍｌでは低濃度の活性化を誘導した（図１１Ｄおよび３Ｂ）。同様に、Ａ−ｉＡＣ−ＣｙａＡは、カスパーゼ−３活性化を誘導した（図１１Ｄ）が、ＮＡ−ＣｙａＡは、濃度範囲０．３〜１０μｇ／ｍｌで有意なカスパーゼ−３の活性化を誘導しなかった（図１１ＤおよびＢ）。カスパーゼ−３活性化は、調べた高濃度のＮＡ−ｉＡＣ−ＣｙａＡ（１０μｇ／ｍｌ）でのみ検出された。アシル化は、ＣｙａＡ誘発性アポプトーシスを促進し、酵素活性の欠如は、アシル化の欠乏を部分的に補うかもしれないこと、おそらくはカスパーゼ−３活性化に対するｃＡＭＰの抑制効果の除去によって補うかもしれないことを、これらの結果は示している。
【０１１５】
アシル化は、ＣｙａＡ処理マクロファージで、ｃＡＭＰによって与えられるサイトカイン放出の調節に必要でない
マクロファージおよびＤＣの活性化を調節するＣｙａＡの能力に及ぼすアシル化と酵素活性の影響を調べた。Ｊ７７４マクロファージを、ＣｙａＡ単独（１μｇ／ｍｌ）、ＣｙａＡと共にＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、または、ＣｙａＡおよびポリミキシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかで処理して、タンパク質試料中に残留する低濃度のＬＰＳの効果を打ち消した。分泌されたＩＬ−１０およびＴＮＦ−の濃度を、４時間後の上清で定量した。ＬＰＳはＮＡ−ＣｙａＡと相乗作用して、Ａ−ＣｙａＡに対してと同様にＩＬ−１０の分泌を誘導する（図５）。Ａ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡタンパク質（ＬＰＳの添加ありまたはなしで）は、マクロファージでのＩＬ−１０産生を誘導した。ＬＰＳをキレートするポリミキシンＢの添加により、ＩＬ−１０の産生が抑制された。ＣｙａＡタンパク質試料中に存在する濃度のＬＰＳ単独では、ＩＬ−１０産生を誘導できなかったので、このサイトカインは、それぞれのタンパク質試料中のＬＰＳおよびＣｙａＡ間の相乗作用の結果として分泌されたことがわかった。このＬＰＳとの相乗効果は、タンパク質試料中に存在する濃度（これらの試料中、約２００ｐｇ／ｍｌのＬＰＳ）で明らかであり、さらに外来のＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加しても、有意に変化しなかった。ＮＡ−ＣｙａＡおよびＡ−ＣｙａＡは、ＬＰＳ誘発性ＴＮＦ分泌を同程度に阻害した。対照的に、ｉＡＣ−ＣｙａＡタンパク質のどちらも、ＩＬ−１０産生の増強も、ＴＮＦ−産生の阻害もしなくて（図１４）、アデニル酸シクラーゼ活性は、ＣｙａＡがマクロファージでサイトカイン産生を調節するために必須であることがわかった。酵素的に不活性な毒素試料（ＮＡ−ｉＡＣ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ｉＡＣ−ＣｙａＡ）は、添加された外来のＬＰＳがない場合、ＴＮＦ−α産生を誘導する。ポリミキシンＢでベースライン濃度までこのＴＮＦ−αが減少するので、これは、広範囲にわたる精製後も、タンパク質と複合体を作ってまだ残っているＬＰＳのためである。この効果は、ＴＮＦ−α産生に対するｃＡＭＰの抑制効果のため、酵素的に活性な毒素では見られない。
【０１１６】
ＣｙａＡの免疫調節性活性における、アシル化の役割をさらに検討するために、所定の範囲にわたる濃度（０．１〜３ｇ／ｍｌ）のタンパク質のＬＰＳ誘発性サイトカイン産生に及ぼす効果を調べた（図１５）。１ｇ／ｍｌおよびそれ以上の濃度で、ＮＡ−ＣｙａＡおよびＡ−ＣｙａＡは同様の効果を及ぼし、ＩＬ−１０を増強し、マクロファージによるＴＮＦ−α産生を阻害するが、より低濃度では、ＮＡ−ＣｙａＡは、Ａ−ＣｙａＡよりもはるかに調節的活性が低かった。マクロファージのサイトカイン放出調節のために、アシル化はＣｙａＡの絶対条件ではないが、その効率を増すことをこれらのデータは示している。同様にアシル化は、ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの骨髄由来ＤＣでのサイトカインおよびケモカイン産生を調節するＣｙａＡの能力に影響しなかった（データは示さず；図１６も参照）。
【０１１７】
ＮＡ−ＣｙａＡは、Ｔｏｌｌ−様受容体（ＴＬＲ）−９を介して、ＣｐＧ−ＯＤＮシグナル伝達効果を調節する
ＩＬ−１０に対するＣｙａＡの相乗的および抑制的な効果と炎症誘発性のサイトカイン産生が、タンパク質と密接に関連するＬＰＳに限られるのか、または他のＴＬＲリガンドまで広がるかどうかを決定するために、ＴＬＲ−９リガンドであるＣｐＧ−ＯＤＮにより誘導されるサイトカイン産生に及ぼすＣｙａＡの効果を調べた。ＬＰＳの考えられる影響を取り除くために、これらの研究は、マウスをＬＰＳに低反応性にするＴＬＲ−４に点突然変異をもつＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスから生成したＤＣを用いて実施した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪＤＣによるＣｐＧ−ＯＤＮ−活性化されたＴＮＦ−、ＩＬ−１２ｐ７０およびＣＣＬ３産生は、Ａ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡによりダウンレギュレートされていた（図１６）。さらに、両タンパク質によりＩＬ−１０の分泌が増強された。ＣｐＧ−ＯＤＮシグナル伝達の及ぼすＣｙａＡの効果をさらに検討するために、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＪ７７４マクロファージおよびＤＣを、Ａ−ＣｙａＡまたはＮＡ−ＣｙａＡと共に、ポリミキシンＢとＣｐＧ−ＯＤＮの存在下でインキュベートした。Ａ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡはどちらも、ＴＮＦ−の産生を阻害し、ＣｐＧ−ＯＤＮで刺激した細胞でのＩＬ−１０産生を増強した（データは示さず）。総合すると、これらの所見は、ＣｙａＡの免疫調節性効果は、ＴＬＲ−４を介するＬＰＳのシグナル伝達に限られず、依存していないが、その受容体への他のＴＬＲリガンド、例えばＣｐＧ−ＯＤＮの結合で媒介できることを明らかにするものである。さらにまた、これらの効果は、ＣｙａＡのアシル化に依存しないが、ＣｙａＡのアシル化により増強される。
【０１１８】
免疫調節性効果は、ＣＤ１１ｂにより媒介される
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を介してＡ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡが細胞に結合することにより、これらのサイトカイン調節性効果が媒介されているかどうかを決定するために、宿主細胞へのＡ−ＣｙａＡの結合を妨げることがすでに明らかにされている、抗ＣＤ１１ｂ抗体Ｍ１／７０の存在下で、タンパク質およびＣｐＧ−ＯＤＮで細胞を処理した（１４）。抗ＣＤ１１ｂ抗体の添加により、ＣｐＧ−ＯＤＮ誘発性ＴＮＦ−産生を阻害するＡ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡの能力が抑制され、またＩＬ−１０の分泌増強でＣｐＧ−ＯＤＮと相乗作用するこれらの能力も抑制された（図１７）。ＣｐＧ−ＯＤＮをＬＰＳで置換した場合にも、同様の結果が得られた（データは示さず）。ＣｙａＡまたはＮＡ−ＣｙａＡの存在下で、ＣｐＧ−ＯＤＮ誘発性ＴＮＦ−αに及ぼす抗ＣＤ１１ｂの増強効果（またはＬＰＳ誘発性ＴＮＦ−α；データは示さず）は、ＣｙａＡの抑制的効果の除去（もはやその受容体と結合できない）、およびＣｙａＡ試料で同時に精製されたＬＰＳの効果の残留をおそらく反映している。したがって、Ａ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡによるマクロファージサイトカイン放出調節には、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８との相互作用が含まれ、細胞表面レセプターを介した、これらの２つのタンパク質の生得的免疫細胞への特異的な取込みを示唆している。
【０１１９】
ＣｙａＡによるＤＣ成熟調節に及ぼすアシル化の影響
病原体由来の分子、例えばＬＰＳおよびＣｐＧ−ＯＤＮに反応したＤＣの成熟は、同時に刺激される分子の細胞表面発現の変化により検出できる。ここで、未熟な骨髄由来ＤＣの成熟を誘導するＣｙａＡの能力、またはＬＰＳもしくはＤＣのＣｐＧ−ＯＤＮ誘発性の成熟を調節するＣｙａＡの能力に及ぼすＣｙａＡのアシル化の効果を検討した。ＴＬＲ−４シグナル伝達がない場合の、Ａ−ＣｙａＡおよびその非アシル化誘導体の効果を検討するために、ポリミキシンＢの存在下で、これら２つの効果を調べた。ポリミキシンＢの存在下で、ＮＡ−ＣｙａＡおよびＡ−ＣｙａＡはどちらも、ＣＤ８０のＤＣ表面発現を増強し、内在性のＣＤ４０発現を抑制した。さらにまた、ＮＡ−ＣｙａＡおよびＡ−ＣｙａＡと共にＤＣをプレインキュベーションすると、ＬＰＳに応答するＣＤ４０およびＩＣＡＭ−１の表面発現の増加が抑制された（図１８）。調節性効果は、Ａ−ＣｙａＡでより著しく、アシル化は、ＣｙａＡ誘導性の免疫調節性効果の効率を増強するという我々の仮説を支持していた。ＣｙａＡも、他のＴＬＲリガンドに対する応答を調節することを確かめるために、ＤＣでＣｐＧ−ＯＤＮ誘導性の成熟に及ぼすＣｙａＡの効果を検討した。ＣｐＧ−ＯＤＮは、ＣＤ８０およびＣＤ４０の表面発現を増強した。一方、Ａ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡは、ＣＤ８０の表面発現を増強したが、ポリミキシンＢの存在下で、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のＤＣ上およびＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＤＣ上で、ＣｐＧ−ＯＤＮ誘導性ＣＤ４０を抑制した（データは示さず）。ＴＬＲ−４およびＴＬＲ−９リガンドに反応してＣｙａＡは、ＤＣの成熟を調節し、アシル化はこれらの効果に必須でないことをこれらのデータは示している。
【０１２０】
アシル化は、ＣｙａＡのアジュバント活性には必須でない
ＮＡ−ＣｙａＡおよびＡ−ＣｙａＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生得的な細胞に対して同様な効果を及ぼすことを実証した後に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣｙａＡのアジュバント活性に及ぼすアシル化の影響を検討した。マウスを、Ａ−ＣｙａＡまたはＮＡ−ＣｙａＡの存在または不在下でＫＬＨで免疫した。膝窩リンパ節をドレーンして、抗原特異的Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン産生を、７日後に調べた。この結果から、２つのタンパク質どちらにも匹敵するアジュバント活性があることが明らかになった。ＫＬＨ特異的Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン産生は、ＫＬＨ単独で免疫したマウスのリンパ節細胞では、低いかあるいは検知できなかった（図１９）。しかし、ＰＭＡおよび抗ＣＤ３に反応して、これらのマウスのリンパ節細胞は増殖し、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γを分泌した。対照的に、抗原特異的ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０産生（図１９Ａ）ならびに増殖（図１９Ｂ）が、Ａ−ＣｙａＡまたはＮＡ−ＣｙａＡの存在下でＫＬＨで免疫したマウスのリンパ節細胞で検出された。Ａ−ＣｙａＡまたはＮＡ−ＣｙａＡの存在下でＫＬＨで免疫したマウスのリンパ節細胞で、ＩＦＮ−が産生された（図１９Ａ）が、ＣｐＧ−ＯＰＮ存在下でＫＬＨで免疫したマウスで観察されるＩＦＮ−と比較すると、その濃度は低かった（未発表の観察）。このサイトカインプロフィールは、ＣｙａＡは、Ｔｈ２およびＴｒ１細胞を優先的に増強することを示している図１のデータと一致している。抗体価の分析で、ＮＡ−ＣｙａＡおよびＡ−ＣｙａＡは、ＫＬＨに応答するＩｇＧを増強することが明らかになった（図１９Ｃ）。ＩｇＧ１は、ＩｇＧ２ａよりも大幅に増強され、これはＴｈ２応答の選択的増強と一致している。したがって、アシル化の欠如は、ＣｙａＡのアジュバント特性を弱めなし、またｉｎ  ｖｉｖｏでＴｈ２およびＴｒ１細胞の誘導を指令する能力も弱めない。
【０１２１】
多発性硬化症のマウスモデル
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症のマウスモデルである。１ｍｇの結核菌を補った完全フレンドアジュバントで乳化させたＭＯＧペプチド１５０μｇをｓ．ｃ．投与し、５００ｎｇの百日咳毒素を腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射し、２日後に２回目の５００ｎｇの百日咳毒素を腹腔内に注射することにより、ＥＡＥがＣ５７ＢＬ／６マウスで誘導される。マウスは、麻痺症状を呈する。自己免疫疾患に対するワクチンのアジュバントとしてのＣｙａＡの効果を評価する実験で、リン酸緩衝生理食塩水中、５０μｇＭＯＧペプチド（残基３５〜５５）および１．０μｇＣｙａＡでマウスを皮下（ｓ．ｃ．）免疫した。この操作を２１日後に、繰り返し実施した。対照マウスには、ＭＯＧペプチドまたは食塩水のみを投与し、２回目の免疫の７日後、上述のように、ＭＯＧ、フロイントアジュバントおよび百日咳毒素でＥＡＥを誘導した。マウスを、ＥＡＥの臨床徴候に関して毎日評価した。スコアは以下の通りとした：１＝尾の麻痺、２＝不安定な歩行、３＝後肢の衰弱、４＝後肢の麻痺、５＝後肢および前肢の完全な麻痺、６＝死亡。
【０１２２】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の症病進行（平均疾患指数）に対する、ＣｙａＡを伴うミエリンオリゴデンドロサイト（ＭＯＧ）ペプチドによる免疫処置の効果を図２０に示す。図２１は、ＥＡＥモデルで経時的な平均疾患スコアを示す。組織学的結果は、ＭＯＧおよびＣｙａＡによる免疫処置の効果を明らかに示している（図２２）。
【０１２３】
表１は、疾患スコアおよび疾患指数の結果を示す。この結果は、アジュバントとしてＣｙａＡの投与で、症病進行をかなり抑制できることを示している。
【０１２４】
【表１】
2008500271.tif 000002
【０１２５】
発生率は、試験したマウス数中、ＥＡＥの何らかの臨床的症状が見られたマウス数である。疾患指数は、すべての毎日の平均疾患スコアを加え、平均発症日で割り、１００倍して算出した。
【０１２６】
投与量、投与方法および医薬組成物
本発明は、選択された抗原に対する哺乳類における免疫応答を調節する方法を含み、方法は、哺乳類に治療量の、ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチド、あるいはこれらの物質により活性化された細胞の生成物を含む物質を投与すること、あるいは治療量の、ＣｙａＡ、またはその誘導体、変異体、断片、変種もしくはペプチド、および抗原、あるいはＣｙａＡおよび薬剤学的に許容可能なｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドを投与することを含む。
【０１２７】
投与のための組成物は、液体の溶液または懸濁液の注射液として調製できる；注射に先立ち液体に溶解または懸濁するのに適した固体の形状も調製することもできる。製剤は、乳化も可能であり、または組成物をリポソーム中にカプセル化することもできる。活性な免疫原性成分は、薬剤学的に許容可能でかつ活性成分と適合性の担体と混合されることが多い。「薬剤学的に許容可能な担体」という用語は、投与された対象にアレルギー反応、または他の副作用を引き起こさない担体を指している。好都合な薬剤学的に許容可能な担体には、例えば１種または複数の水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール、または同等物およびそれらの組合せが含まれる。これに加え必要に応じて、免疫修飾物質／製剤は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝薬、および／または製剤／免疫修飾物質の効果を増強するアジュバント等の補助的な物質を少量含むことができる。
【０１２８】
本発明の組成物は、非経口的に注射で、例えば、皮下、皮膚上、または筋肉内のいずれかに投与できる。好都合な他の投与法のさらなる剤形には、坐薬、および場合によっては、経口剤形、鼻腔内用製剤、またはエアゾールとして分布させるのに好都合な剤形が含まれる。坐薬には、従来の結合剤および担体、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含む；このような坐薬は、０．５％〜１０％の範囲で、好ましくは１％−２％範囲で活性成分を含む混合物から作られる。経口剤形は、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、遅延放出製剤または粉末の形態をとり、活性成分を１０％〜９５％、好ましくは２５〜７０％含む。
【０１２９】
本発明の組成物は、中性のまたは塩形態で免疫調節剤組成物に製剤化できる。薬剤学的に許容可能な塩類は、酸添加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）を含み、無機酸、例えば塩酸またはリン酸で形成されるか、または有機酸、例えば酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸等で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩類は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第２鉄等の無機塩基から、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
【０１３０】
組成物は、製剤の用量に適用可能な方法で、および予防的および／または治療的に効果が得られる量で投与できる。投与されるべき量は、例えば、個体の免疫系の抗炎症性サイトカインを合成する能力、または調節性Ｔ細胞を誘導する能力、および所望の防御の程度を含む、処置される対象に依存する。適切な用量範囲は、約０．１ｎｇ／ｇ〜１０００μｇ／ｇの好適な範囲でのワクチン接種当たり数百マイクログラムの活性成分のオーダー、例えば約０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。初回投与および追加免疫注射に適切な投薬計画はまた変化し得るが、初回投与、それに続く接種または他の投与により特徴づけられる。投与されるべき必要な活性成分の正確な量は、実施者の判断に依存し、それぞれの対象に特有である。
【０１３１】
当業者にとっては、明白なことではあるが、ＣｙａＡ組成物の治療的有効量は、とりわけ投与計画、投与される抗原の単位／用量、ＣｙａＡと他の治療薬との組合せ投与の有無、免疫状態、よび投与患者の健康状態、および特定のＣｙａＡ／抗原複合体の治療上の活性に依存する。
【０１３２】
組成物を、１回の投与スケジュールで与えるか、あるいは好ましくは複数回の投与スケジュールで与えることができる。投与の最初コースで１〜１０の独立した用量を含むことができる複数回投与形式であり、次に引き続く時間間隔で、免疫応答に及ぼす効果の維持、または、増強に必要な別の用量が投与される、例えば、１〜４カ月時点で２回目の投与、必要に応じて数カ月後に引き続き（複数回）投与する。１〜５年間隔の定期的な、通常３年間隔の投与が、所望の予防レベルを維持するために望ましい。
【０１３３】
一連のワクチン接種を、例えば、接種間隔を３カ月、または、４カ月、または６カ月の間隔で行ってもよい。このようなシリーズでは、例えば全体で３回または４回または５回のワクチン接種が含まれる。乳児に投与するワクチン接種では、一連のワクチン接種は、例えば出生時、または誕生後の第１週以内に、次いで６、１０および１４週に投与してもよい。一連のワクチン接種は、出生時および誕生後の１、３、６カ月に投与してもよい。
【０１３４】
組成物を、１週間に複数回、例えば１週間に２回、毎週、１カ月当たり複数回、毎月、数週間あるいは数カ月当たり複数回、１年間、または数年間、治療的使用ために投与してもよい。治療的使用の組成物は、単独で、または自己抗原との組合せで活性成分を含むことができる。本治療には、同時に他の薬剤（同一の製剤で、または、別々に）の投与か、もしくは時間間隔をおいた投与を含むこともある。
【０１３５】
治療的有効用量は、投与経路および剤形によって変わることもある。個々の投与量は、対象の病状、年齢、体重、全身健康状態、性別、食事習慣、用量間隔、投与経路、排出速度、および薬剤の組合せによって調整することができる。有効量を含む任意の投薬形態が、十分に通常の実験の限度内である。本発明の組成物は、自己免疫疾患の治療に使用される薬剤を含む他の薬剤と共に投与することもできる。また組成物は、自己免疫疾患の他の治療に対して使用するものと同じ用量を用いて単独で投与することができる。「治療」という用語は、疾病もしくは疾患を伴う諸症状の緩和、または更なる進行もしくはそれら諸症状の悪化の停止、または疾病もしくは疾患の予防もしくは阻止を包含するものである。
【０１３６】
治療過程に次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの刺激、例えばＬＰＳによる刺激のある場合およびない場合の免疫系細胞によるｅｘ  ｖｉｖｏでのサイトカイン産生（血液試料から回収された）を調べることができる。分析は、細胞培養の通常の試薬を用い、抗体などを用いるサイトカインの定量で実施できる。これらの技術は、当業者には一般的に知られている。
【０１３７】
本発明は、細部にわたっては変更することができる前記の実施態様に限定されない。
【０１３８】
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【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ＰＢＳおよびＫＬＨのみ、またはＣｙａＡで免疫処置された後のマウスのリンパ節細胞によって産生されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０のレベルを示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、後肢足蹠ｓ．ｃ．において、ＰＢＳおよびＫＬＨ（５μｇ）のみ、またはＣｙａＡ（１μｇ）で免疫処置した。７日後にマウスを屠殺し、膝窩リンパ節細胞を調製し、ＫＬＨ（２〜５０μｇ／ｍｌ）、または培地のみで刺激した。３日後に、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０に関して、ＥＬＩＳＡによって上清を試験した。増殖は、４日目に３Ｈ−チミジン取込みによってアッセイした。結果は、１グループ当たり５匹のマウスの平均（＋ＳＤ）を表し、３回の実験を代表するものである。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、ＫＬＨ対ＫＬＨ＋ＣｙａＡ。
【図２】ＣｙａＡの存在下にＫＬＨで免疫処置されたマウスから調製されたＴ細胞系およびＴ細胞クローンによって産生されたＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γを示すグラフである。Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞系は、ＫＬＨおよびＣｙａＡで免疫処置された１０匹のマウス個体のリンパ節から調製した。Ｂ）Ｔ細胞系７．２を限界希釈によってクローニングした。Ｔ細胞系またはＴ細胞クローンは、自家ＡＰＣの存在下に、ＫＬＨ（５０μｇ／ｍｌ）で刺激し、３日後に上清中のサイトカイン濃度を試験した。ＩＦＮ−γは、各Ｔ細胞クローンでバックグラウンドレベルであった。
【図３】後肢足蹠ｓ．ｃ．において、ＰＢＳおよびＫＬＨ（５μｇ）のみ、またはＣｙａＡ（１μｇ）で免疫処置され、さらに２１日後にブーストされた後のマウスにおける、抗原特異的なＩｇＧ、すなわちＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのレベルを示すグラフである。１回（Ａ）または２回（Ｂ）の免疫処置を行った７日後に血清試料を採取し、ＫＬＨ特異的なＩｇＧ、すなわちＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの力価をＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、１グループ当たり５匹のマウスの平均（＋ＳＤ）力価であり、２つの実験を代表するものである。＊＊＊、Ｐ＜０．００１、ＫＬＨ対ＫＬＨ＋ＣｙａＡ。
【図４】ＬＰＳ、ＣｙａＡ、リポ多糖（ＬＰＳ）およびＣｙａＡ、あるいは、ポリミキシンＢの存在下または非存在下におけるＣｙａＡと共にインキュベートされたマクロファージによって産生されたＩＬ−１０、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αのレベルを示すグラフである。ＣｙａＡは、ＬＰＳによって誘導される抗炎症性サイトカインを増大させ、マクロファージによる炎症誘発性サイトカインを抑制する。Ｊ７７４マクロファージ（１×１０６／ｍｌ）を、示されている濃度のＬＰＳ（０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）と共に、あるいは、ポリミキシンＢ（ＰＢ；１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下において、ＣｙａＡ（１μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。上清を、示されている時間に採集し、ＩＬ−１０、１Ｌ−６、およびＴＮＦ−αに関して免疫アッセイによって試験した。結果は、３つ組みアッセイの平均（＋ＳＤ）であり、３回の実験を代表するものである。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、対ＣｙａＡ；＋＋、Ｐ＜０．０１、＋＋＋、Ｐ＜０．００１：同濃度のＬＰＳ単独に対するもの。
【図５】ＬＰＳ、ＣｙａＡ、ＬＰＳおよびＣｙａＡ、あるいはポリミキシンＢの存在下または非存在下においてＣｙａＡと共にインキュベートされた後の樹状細胞（ＤＣ）におけるＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２ｐ７０のレベルを示すグラフである。ＣｙａＡは、ＬＰＳによって誘導される抗炎症性サイトカインを増大させ、ＬＰＳによって誘導される、ＤＣからの炎症誘発性サイトカインを抑制する。マウス骨髄由来の未成熟ＤＣ（１×１０６／ｍｌ）を、示されている濃度のＬＰＳ（０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）と共に、あるいは、ポリミキシンＢ（ＰＢ；１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下において、ＣｙａＡ（１μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。上清を、示されている時間に採集し、ＩＬ−１０、１Ｌ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２ｐ７０に関して免疫アッセイによって試験した。結果は、３つ組みアッセイの平均（±ＳＤ）であり、３回の実験を代表するものである。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、対ＣｙａＡ；＋、Ｐ＜０．０５；＋＋、Ｐ＜０．０１；＋＋＋、Ｐ＜０．０１、同濃度のＬＰＳ単独に対するもの。
【図６】ＤＣにおける、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ４０、およびＩＣＡＭ−Ｉの発現を示す免疫蛍光グラフである。ＣｙａＡは、ＤＣにおける、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＭＨＣ−ＩＩの発現を促進するが、ＣＤ４０およびＩＣＡＭ−Ｉの発現を抑制する。ＤＣを、ポリミキシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下におけるＣｙａＡ（１μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、ＣｙａＡおよびＬＰＳ、または培地のみで刺激した。２４ｈのインキュベーションの後に、細胞を洗浄し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ４０、およびＩＣＡＭ−Ｉに特異的な抗体、またはアイソタイプが一致している対照で染色した。処理されたＤＣ（黒線）の免疫蛍光分析の結果を、未処理のＤＣ（灰色のヒストグラム）と比較して示す。プロフィールは、単一の実験のものが示されており、２回の別々の実験を代表するものである。
【図７】免疫処置されたＴＬＲ４欠損マウスのリンパ節細胞によるサイトカイン産生を示すグラフである。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスまたはＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの骨髄由来ＤＣ（１×１０６／ｍｌ）を、示されている濃度のＬＰＳ（０〜１０ｎｇ／ｍｌ）と共に、あるいは、ポリミキシンＢ（ＰＢ；１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下において、ＣｙａＡ（１μｇ／ｍｌ）と共に培養した。上清を採集し、ＩＬ−１０およびＭＩＰ１−ａ（４ｈ）およびＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−α（２４ｈ）に関して、免疫アッセイによって試験した。結果は、３つ組みアッセイの平均（±ＳＤ）であり、３回の実験を代表するものである。＋＋＋、Ｐ＜０．０１、対ＣｙａＡ；Ｐ＜０．００１、同濃度のＬＰＳのみに対するもの。
【図８】ＣｙａＡによって誘導されるＤＣ活性化が、ＴＬＲ４欠損マウスで変化していることを示す免疫蛍光グラフである。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（Ａ）マウスまたはＣ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｂ）マウスの骨髄由来ＤＣ（１×１０６／ｍｌ）を、ＣｙａＡ（１μｇ／ｍｌ）と共に、単独で、またはポリミキシンＢ（ＰＢ；１０μｇ／ｍｌ）もしくはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）と併せて、あるいは培地のみで培養した。２４ｈのインキュベーションの後に、細胞を洗浄し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ４０、およびＩＣＡＭ−Ｉに特異的な抗体、またはアイソタイプが一致している対照抗体で染色した。処理されたＤＣ（黒線）の免疫蛍光分析を、未処理のＤＣ（灰色のヒストグラム）と比較して示す。各ヒストグラムの右側の数は、処理された細胞の平均蛍光強度を示す。培地のみで処理された細胞の値が、各ケースにおける第１のヒストグラムの左側に示されている。プロフィールは、単一の実験のものが示されており、３回の実験を代表するものである。
【図９】Ａ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡのパルミトイル化状態を示すゲルイメージである。ＣｙａＡ、およびＣｙａＡ＋ＣｙａＣをそれぞれコードするプラスミドｐＪＲ１およびｐＪＲ２を保持する大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを、［１４Ｃ（Ｕ）］パルミチン酸で補足された選択培地中で増殖させた。１ｍＭ  ＩＰＴＧで、１５分間、タンパク質発現を誘導した。細菌をペレットにし、新しい培地で洗浄した後、７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し（Ａ）、ＧｅｌＣｏｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ試薬で可視化した後、放射線標識されたタンパク質を蛍光画像分析によって可視化した（Ｂ）。レーン１、ＮＡ−ＣｙａＡ；レーン２、Ａ−ＣｙａＡ；レーン３、高純度に精製された組換えＡ−ＣｙａＡ（放射線標識されていない）。２５０ｋｄの分子量マーカーの位置が示されている。
【図１０】様々な条件下で赤血球（ＲＢＣ）が溶血した割合を示すグラフである。５×１０８ＲＢＣ／ｍｌ、１００μｌを、示されている量（μｇ／ｍｌ）の非アシル化ＣｙａＡ（ＮＡ−ＣｙａＡ）またはアシル化ＣｙａＡ（Ａ−ＣｙａＡ）で１６ｈ処理した。５０ｌの上清を採集し、ＯＤ５４１の吸光度を測定し、溶血の割合を計算するのに用いた。結果は、Ｔｕｋｅｙのポストテストを伴った、一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。＊＊Ｐ＜０．０１：処理された試料対培地。結果は、３つ組で３回行われた代表的な実験の平均±ＳＤである。
【図１１】細胞溶解およびカスパーゼ−３活性化の誘導が、アデニル酸シクラーゼ活性および細胞内ｃＡＭＰ上昇に関連するが、アシル化には依存していないことを示すグラフである。（Ａ）ＣｙａＡまたはＣｙａＡ誘導体の無細胞アデニル酸シクラーゼ活性。（Ｂ）ＣｙａＡまたはＣｙａＡ誘導体（１０ｇ／ｍｌ）に反応した、Ｊ７７４マクロファージにおける細胞内ｃＡＭＰ蓄積。（Ｃ）ＬＤＨ放出アッセイによって測定された、１０ｇ／ｍｌ  ＣｙａＡまたはＣｙａＡ誘導体に反応したＪ７７４細胞の溶解。（Ｄ）相対蛍光単位（ＲＦＵ）として経時的に表された、Ｊ７７４マクロファージにおける、ＣｙａＡまたはＣｙａＡ誘導体（１０ｇ／ｍｌ）によって誘導されたカスパーゼ−３活性化。結果は、少なくとも２回反復された実験を代表するものである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、培地対照に対するもの。
【図１２】アシル化ＣｙａＡおよび非アシル化ＣｙａＡによって誘導される細胞内ｃＡＭＰ蓄積、カスパーゼ−３活性化、および細胞溶解に対する、毒素濃度の影響を示すグラフである。（Ａ）Ａ−ＣｙａＡまたはＮＡ−ＣｙａＡの濃度の増大に反応した、Ｊ７７４マクロファージにおける細胞内ｃＡＭＰ蓄積。（Ｂ）相対蛍光単位（ＲＦＵ）として経時的に表された、Ｊ７７４マクロファージにおける、Ａ−ＣｙａＡまたはＮＡ−ＣｙａＡ（０．３〜１０ｇ／ｍｌ）によって誘導されたカスパーゼ−３活性化。（Ｃ）ＬＤＨ放出アッセイによって測定された、ポリミキシンＢの非存在下（Ｃ）または存在下（Ｄ）でＡ−ＣｙａＡ、ＮＡ−ＣｙａＡ（０．３〜１０ｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（０．２μｇ／ｍｌ）、または培地（Ｍｅｄ）のみに反応したＪ７７４細胞の溶解。結果は、少なくとも２回反復された実験を代表するものである。＊＊＊Ｐ＜０．０１、培地対照に対するもの。
【図１３】ＣｙａＡによって誘導される、マクロファージの形態変化にアシル化が必要であることを示すグラフである。Ｊ７７４マクロファージは、未処理（Ａ）とするか、あるいは、３ｇ／ｍｌ（Ｂ）、５ｇ／ｍｌ（Ｃ）、もしくは１０ｇ／ｍｌ（Ｄ）のＡ−ＣｙａＡ、または１Ｍシクロヘキシミド（Ｅ）、または、３ｇ／ｍｌ（Ｆ）、５ｇ／ｍｌ（Ｇ）、または１０ｇ／ｍｌ（Ｈ）のＮＡ−ＣｙａＡで６ｈ処理した。Ａ−ＣｙａＡおよびシクロヘキシミドで処理された後の形態は、未処理またはＮＡ−ＣｙａＡ処理の細胞の正常な形態と比較して変化していた。
【図１４】マクロファージによるサイトカイン産生の調節にはＣｙａＡのアシル化が必要でないことを示すグラフである。Ｊ７７４マクロファージを、１０ｇ／ｍｌポリミキシンＢの存在下または非存在下に、Ａ−ＣｙａＡまたはＮＡ−ＣｙａＡ（１ｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。図に示されている通り、２ｈ後に１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加した。さらに４ｈのインキュベーションの後、上清を採集し、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−  濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。結果は、Ｔｕｋｅｙのポストテストを伴った、一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。＊＊＊Ｐ＜０．００１：ＣｙａＡおよびＬＰＳ対ＬＰＳ。結果は、３つ組みアッセイの平均±ＳＤであり、３回の実験を代表するものである。
【図１５】様々な濃度のＡ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡによる、マクロファージサイトカイン産生の調節を示すグラフである。示されている濃度（ｇ／ｍｌ）のＡ−ＣｙａＡおよびＮＡ−ＣｙａＡでＪ７７４マクロファージを処理し、これに伴って、２ｈ後に１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳの添加を行うか、あるいは無添加とした。さらに４ｈのインキュベーションの後、上清を採集し、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。結果は、Ｔｕｋｅｙのポストテストを伴った、一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１：ＣｙａＡおよびＬＰＳ対ＬＰＳ。＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１、＋＋＋Ｐ＜０．００１：Ａ−ＣｙａＡ対、同濃度のＮＡ−ＣｙａＡ。結果は、３つ組で２回行われた代表的な実験の平均±ＳＤである。
【図１６】ＣｐＧ−ＯＤＮによって刺激された、ＤＣからのサイトカインおよびケモカインの放出を、非アシル化ＣｙａＡが調節することを示すグラフである。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスのＤＣを、１ｇ／ｍｌ  Ａ−ＣｙａＡまたはＮＡ−ＣｙａＡと共に２ｈインキュベートし、その後、１０ｇ／ｍｌ  ＣｐＧ−ＯＤＮを添加した。上清におけるＩＬ−１０、ＴＮＦ−、およびＣＣＬ３の存在を４ｈ後に、ＩＬ−１２  ｐ７０を２４ｈ後に試験した。結果は、Ｔｕｋｅｙのポストテストを伴った、一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１：ＣｐＧ−ＯＤＮ対ＣｙａＡおよびＣｐＧ−ＯＤＮ。結果は、３つ組で２回行われた代表的な実験の平均±ＳＤである。
【図１７】ＣｙａＡによって誘導されるマクロファージ活性化の調節が、ＣＤ１１ｂとの相互作用に依存していることを示すグラフである。Ｊ７７４マクロファージを、１μｇ／ｍｌ  Ａ−ＣｙａＡまたはＮＡ−ＣｙａＡと共に２ｈインキュベートし、その後、１０ｇ／ｍｌ  ＣｐＧ−ＯＤＮを添加した。細胞を１０ｇ／ｍｌ抗ＣＤ１１ｂまたはアイソタイプ対照抗体と共にインキュベートし、その後、ＣｙａＡを添加した。結果は、Ｔｕｋｅｙのポストテストを伴った、一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１：抗ＣＤ１１ｂ対、対照抗体。＋＋＋Ｐ＜０．００１：ＣｐＧ−ＯＤＮ＋毒素対ＣｐＧのみ。結果は、３つ組で２回行われた代表的な実験の平均±ＳＤである。
【図１８】ＣｙａＡによる、ＤＣ成熟の調節には、アシル化が必須でないことを示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＣを、１０ｇ／ｍｌポリミキシンＢ（ＰＢ）の存在下または非存在下に、１ｇ／ｍｌ  ＮＡ−ＣｙａＡまたはＡ−ＣｙａＡで処理した。２ｈ後に、１ｇ／ｍｌ  ＬＰＳまたは培地のみを添加した。２４ｈ後に、細胞を採集し、ビオチン結合の抗ＣＤ１１ｃハムスターＩｇＧ、およびストレプトアビジン−ＰｅｒＣＰ、またはアイソタイプ対照で標識した。細胞は、ＦＩＴＣまたはフィコエリトリンで標識された抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＭＨＣクラスＩＩ、抗ＣＤ４０、もしくは抗ＩＣＡＭ−１、または適切なアイソタイプ対照抗体で染色した。免疫蛍光分析の結果は、処理されたＤＣ（黒線）を、未処理のＤＣ（黒で塗りつぶされたヒストグラム）と比較して示されており、２回の実験を代表するものである。
【図１９】ＮＡ−ＣｙａＡが、Ａ−ＣｙａＡと同程度に効果的なアジュバントであり、Ｔｈ２／Ｔｒ１型の反応をｉｎ  ｖｉｖｏで選択的に促進することを示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、足蹠において、ＰＢＳおよびＫＬＨのみ、またはＮＡ−ＣｙａＡもしくはＡ−ＣｙａＡで免疫処置した。７日後に、膝窩リンパ節懸濁液を調製し、ＫＬＨ特異的サイトカインの放出（Ａ）および増殖（Ｂ）を測定した。血清を、ＫＬＨ特異的なＩｇＧ、すなわちＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａに関して、ＥＬＩＳＡによって試験し、最終力価（Ｃ）として表した。結果は、試料を三つ組で試験した、５匹のマウスの平均±ＳＤであり、２回の実験を代表するものである。
【図２０】多発性硬化症のマウスモデル系である実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）における疾病進行に対する、ＣｙａＡと共に行ったミエリンオリゴデンドロサイト（ＭＯＧ）ペプチドによる免疫処置の効果を示すグラフである。マウスを、リン酸緩衝生理食塩水中のＭＯＧペプチド（残基３５〜５５）５０μｇおよびＣｙａＡ  １．０μｇで、皮下に（ｓ．ｃ．）免疫処置した。２１日後に、これを反復した。対照マウスには、ＭＯＧペプチドまたは食塩水のみを投与した。２回目の免疫処置の７日後に、１ｍｇの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を補った完全フロイントアジュバント中に乳化させたＭＯＧペプチド１５０μｇをｓ．ｃ．投与し、５００ｎｇの百日咳毒素を腹腔内（ｉ．ｐ）注射することによってＥＡＥを誘導し、その２日後に、５００ｎｇの百日咳毒素の２回目のｉ．ｐ．注射を行った。ＥＡＥの臨床徴候に関して、マウスの評価を毎日行い、以下の通りにスコアを与えた。すなわち、１＝尾の麻痺、２＝不安定な歩行、３＝後肢の衰弱、４＝後肢の麻痺、５＝後肢および前肢の完全な麻痺、６＝死亡である。疾患指数は、毎日の平均疾患スコアをすべて加算し、開始の平均日数で割り、１００をかけることによって計算した。
【図２１】ＣｙａＡと共に行ったミエリンオリゴデンドロサイト（ＭＯＧ）ペプチドによる免疫処置の、ＥＡＥの平均疾患スコアに対する効果を経時的に示すグラフである。
【図２２】ＥＡＥを誘導した（無処置）後、あるいはミエリンオリゴデンドロサイトペプチド（ＭＯＧ）またはＭＯＧペプチド＋ＣｙａＡ（ＭＯＧ＋ＣｙａＡ）で免疫処置した後のマウス脊髄の組織病理学切片の図である。ＥＡＥを誘導し、図１６における記載の通りにマウスを免疫処置し、ＥＡＥ誘導の１９〜２３日後に、マウス脊髄切片を摘出し、ヘマトイリン（ｈａｅｍａｔｏｙｌｉｎ）およびエオシンで染色した。無処置マウスおよびＭＯＧで免疫処置されたマウスでは、重度のＥＡＥが誘導され、顕著な単核細胞浸潤を伴った。これは、ＭＯＧおよびＣｙａＡで免疫処置されたマウスでは、かなり軽減されていた。
【図２３】ｐＮＭ２（ｐＱＥ８０＋ＴＭＣｙａＡ＋ＣｙａＣ）用のプラスミド発現ベクターの図である。
【図２４】ｐＪＲ２（ｐＱＥ８０＋ＣｙａＡ＋ＣｙａＣ）用のプラスミド発現ベクターの図である。
【図２５】ｐＪＲ１（ｐＱＥ８０＋ＣｙａＡ）用のプラスミド発現ベクターの図である。
【図２６】ｐＡｒＢ２２（ｐＱＥ８０＋ＴＭＣｙａＡ）用のプラスミド発現ベクターの図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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