(57)【要約】本発明は、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの様々な使用に関する。該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、目的とする標的部位に物質および/または薬物を送達および放出するために、または液体または非液体材料から、例えば体組織または体液体から物質を除去するために、該ペプチドおよび/またはフラグメントの空洞中への薬物および/または物質の取込みおよび結合を可能にする。RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、ある文脈において、ナノ粒子の生成または化学反応における触媒として使用され得る。好ましい態様において、該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、生物体内で所望の部位に薬物を送達するための薬物送達システムを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物送達システムと薬物との結合のために、少なくとも１つのエレメントを含む薬物を投与するための、薬物送達システムとしてのRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用。
【請求項２】
エレメントが金属元素である、請求項1記載の使用。
【請求項３】
エレメントが、Al、Sc、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Te、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs および Mt、および/またはその組合せ、からなる群から選択される、請求項1または2記載の使用。
【請求項４】
薬物が、シスプラチン(PtH6N2Cl2)、カルボプラチン(PtC6H12N2O4)、ネダプラチン(PtN2C2H8N2O3)、オキサリプラチン(PtN2C8H14O4)、ZD0473(PtC6H10N2Cl2)、JM216 (PtC10H22N2O4Cl2)、ロバプラチン(PtC9H18N2O3)、トランス-[PtCl2(ピリジン)2]、およびトランス-[Pt(OH)2Cl2(NH3)(NH2-C6H5)]からなるPt含有薬物の群、および/またはその組合せから選択される、請求項1-3いずれかに記載の使用。
【請求項５】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントが特異的標的化のためのタグをさらに含む、請求項1-4いずれかに記載の使用。
【請求項６】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントからの薬物-放出が、標的環境におけるpHの変化、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの酵素分解、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの加水分解、および/または熱力学的平衡および/または速度論的バリアにおける変化による漏出が起こるRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの塩架橋の解裂を理由とする、請求項1-5いずれかに記載の使用。
【請求項７】
薬物送達システムが、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメント、ならびに、Al、Sc、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Te、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs および Mt、および/またはその組合せからなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを含む薬物を含む、薬物を投与するための薬物送達システム。
【請求項８】
エレメントが金属元素である、請求項7記載の薬物送達システム。
【請求項９】
薬物が、シスプラチン(PtH6N2Cl2)、カルボプラチン(PtC6H12N2O4)、ネダプラチン(PtN2C2H8N2O3)、オキサリプラチン(PtN2C8H14O4)、ZD0473 (PtC6H10N2Cl2)、JM216 (PtC10H22N2O4Cl2)、ロバプラチン(PtC9H18N2O3)、トランス-[PtCl2(ピリジン)2]、およびトランス-[Pt(OH)2Cl2(NH3)(NH2-C6H5)]からなるPt含有薬物の群、および/またはその組合せから選択される、請求項7または8記載の薬物送達システム。
【請求項１０】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントが特異的標的化のためのタグをさらに含む、請求項7-9のいずれかに記載の薬物送達システム。
【請求項１１】
請求項7-10いずれかに記載の薬物送達システムを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
医薬物として使用するための、請求項11記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌の処置用医薬物を製造するための、請求項11記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
薬物送達システムと該薬物との結合のために、少なくとも１つのエレメントを含む薬物を投与するための方法であって、請求項7-10いずれかに記載の薬物送達システムおよび/または請求項11に記載の医薬組成物をそれらを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項１５】
エレメントが金属元素である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
液体および/または非液体から、物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとを結合するために、少なくとも１つのエレメント含む物質を濾過するためのRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用。
【請求項１７】
エレメントが金属元素である、請求項16記載の使用。 
【請求項１８】
液体および/または非液体材料が、体液、例えば、血液および尿および/または身体組織である、請求項16 または17記載の使用。
【請求項１９】
エレメントが、Al、Sc、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Te、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、およびMt、および/またはその組合せ、からなる群から選択される請求項16-18いずれかに記載の使用。
【請求項２０】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントおよび固体マトリックスを含む、請求項16-19いずれかに記載の使用のための濾過システム。
【請求項２１】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントならびにサイズ排除フィルターを含む、請求項16-19いずれかに記載の使用のための濾過システムの使用。
【請求項２２】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを含み、該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントが解裂していないポリヒスチジンタグで標識されている、請求項16-19いずれかに記載の使用のための濾過システム。
【請求項２３】
液体および/または非液体材料から、物質がRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントに結合するための少なくとも１つのエレメントを含む物質を濾過するための方法であって、
該物質を濾過するために、該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを該液体および/または固体材料と混合すること、そして
該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを該液体および/または固体材料から分離すること、
を含む方法。
【請求項２４】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントが固体マトリックスに結合されている、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
分離ステップがサイズ排除フィルターを用いることを含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントが解裂していないポリヒスチジンタグで標識されている、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
分離ステップがアフィニティークロマトグラフィーを用いることを含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
分離ステップが、身体の腎濾過を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２９】
前駆物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む前駆物質からナノ粒子を生成するためのRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用。
【請求項３０】
エレメントが金属元素である、請求項29記載の使用。
【請求項３１】
エレメントが、Al、Sc、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Te、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs および Mt、および/またはその組合せ、からなる群から選択される、請求項29または30記載の使用。
【請求項３２】
前駆物質が、HAuCl4、K2PtCl4、K2PdCl4、CuCl2、FeCl2およびAgNO3、および/またはその組合せ、からなる群から選択される請求項29-31いずれかに記載の使用。
【請求項３３】
前駆物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む前駆物質からナノ粒子を生成するための方法であって、
該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを含む溶液、および該前駆物質と該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む前駆物質を調製すること、
該溶液を混合すること、そして
還元剤を該溶液に添加すること、
を含む方法。
【請求項３４】
エレメントが金属元素である、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
溶液が水性である、請求項33または34に記載の方法。
【請求項３６】
前駆物質が、HAuCl4、K2PtCl4、K2PdCl4、CuCl2、FeCl2およびAgNO3、および/またはその組合せからなる群から選択される、請求項33-35いずれかに記載の方法。
【請求項３７】
還元エレメントが[Ru(bpy)3]2+ およびNaBH4、および/またはその組合せからなる群から選択される、請求項33-36いずれかに記載の方法。
【請求項３８】
化学反応における触媒として、金属ナノ粒子、例えばPt、Pd、Ir、Rhおよび/またはRuを含む、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達、濾過、触媒およびナノ粒子生成におけるタンパク質およびその使用の分野に関する。より具体的には、本発明は、例えば、薬物送達に、濾過により液体および/または非液体材料から毒性物質を除去するために、化学反応における触媒として、さらにナノ粒子を生成するための使用に適切である疎水性の空洞を含む特異的タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の技術分野
本発明の背景
RHCC(右巻きのコイルド−コイル)と呼ばれるポリペプチド鎖は、海洋地殻上のいわゆる"ブラック・スモーカー"なる環境にて生存する細菌であるStaphylothermus marinusにより生成されるテトラブラキオン（tetrabrachion）タンパク質のフラグメントである。該細菌は、硫黄依存性であって、92℃の至適増殖温度を示し、ペプチド類の発酵で生存する。該細菌は、２つのプロテアーゼiiと一体となって４本鎖ヘリカルコイルド・コイルを形成するいわゆるスタックを含有する疑似ペリプラスムスペースを有する。該細菌のテトラブラキオンおよびRHCCの顕著な特性は、非常に高い熱安定性と変性に対するその強力な耐性である。
【０００３】
RHCCの構造は、Ｘ線結晶解析によって確立された。それは、右巻きヘリックスおよび右巻き超構造であるフラグメントとの四量体会合物である。４つの各RHCC鎖は、52残基を含有し、テトラブラキオンのプロテアーゼ結合領域(アミノ酸残基1238-1287)を含む。RHCCは、平均72Å長であって、25Åの直径を有する。一方で、ロッド様タンパク質の外側はいくぶん親水性であって、内側は強い疎水性特性を有しており、大きく埋没した表面はおよそ9500 Å2である。最大の特性は、テトラマー全体を通り抜けるチャンネルであって、これは4つの空洞に付随して生じる。この空洞は、145から300Å3の範囲の体積と、強い疎水特性も持つii, iii, iv, v。しかし、結晶構造ではこれらの空洞は水分子で満たされている。
【０００４】
金属および金属イオンおよび金属複合体は、それらの作用様式が知られるずっと前に医薬目的に用いられていた。その例はビスマスであって、胃腸疾患の処置のために使用される。作用様式は調査されており、細胞膜、タンパク質、DNAおよび酵素との金属薬物相互作用が特に重要であると指摘される。作用様式を理解すれば、金属を基にした薬物設計が可能となる。金属薬物が進歩してきた領域の例示には、銀を基にした抗感染剤、ガドリニウムおよび鉄を基にした磁気共鳴映像法のための造影剤、X線画像化のための放射性核種、および癌処置viiのためのプラチナ、例えばシスプラチンである。
【０００５】
しかし、治療剤として強力である上に、金属が制御されずに摂取された場合には強い毒性となり得る。重金属、例えば鉛、水銀、ヒ素など、およびそれらの多くの化合物は、ヒトに毒性であるが、これらのものおよびその他のものに対する汚染は、社会の産業化により増加している。毒性効果は、金属化合物と身体の天然構成成分、例えば酸素、硫黄および窒素との間での複合体形成の結果であり得る。金属に修飾された生物学的分子は、機能特性に対するその能力を失い、この徴候は金属が十分量で摂取される場合に病気となり得る。
【０００６】
薬物送達
大部分の薬物(例えば、シスプラチン)は、深刻な副作用を持っており、それらが、例えば細菌、ウイルスおよび癌細胞に対して活性であるだけでなく、体細胞および臓器をも攻撃するという結果をまねく。これらの副作用を最小にするためには、身体を通って移動する場合に、それが標的細胞または臓器に達するまで該薬物を遮蔽する容器を持つことが望まれる。
【０００７】
多くの薬物は、血液中に所望の程度まで溶解できず、血液中では非常に低濃度しか適応され得ない。この問題を解決するために、薬物送達システム(DDS)が開発されてきた。これは、疎水性中心部の周りに親水性の殻を提供して、疎水性薬物(例えば、リポソーム)を適合させるものである。
【０００８】
金属含有薬物および非金属含有薬物は、該薬物を薬物送達システム(DDS)と組合せて用いることによって改善できる。DDSは、特定薬物の薬物動態および生体内分布(例えば、標的化送達)を変化させ得る。DDSは、長時間にわたり薬物の放出を制御するための薬物貯蔵所として使用され得る。脂質およびポリマーは一般的にDDSとして使用され得る、広範な試験により、これらの送達システム周辺が開発されてきた。近年、デンドリマーおよびデンドリマーポリマーも、薬物の徐放送達および/または造影目的viiiの用造影剤に対する市場に出現してきた。最近、多くのタンパク質ix, x, xiを基にしたDDSは出現しており、これらはタンパク質-ポリマーシステム、さらにコイルド・コイルタンパク質に関する。今日、この分野で知られるDDSは、依然として次に挙げるような深刻な難点がある。代表的なDDSは、十分な量の担体-薬物複合体を患者に適用し得るためには血液中に容易に溶解し得るべきである。しかし残念ながら、該ポリマーが疎水性側鎖を含有するかまたはデンドリマーが疎水性の外殻を持つ場合に、DDSに使用したポリマーおよびデンドリマーは溶解性の問題点を持ち得る。
【０００９】
薬物が身体の特定位置にてDDSから放出されるべきである場合に、特異的標的化が望まれる。標的化はタグをこのDDSに付加することによって達成でき、このタグは標的組織または標的組織上の成分に特異的である。大部分の一般的な送達システムは、タグ化することが困難である；リポソームをタグ化することが困難であるのは、リポソームは凝集された数百の脂質分子(リピド類)から構成されているためである。リポソームを基にしたDDSについて、タグを脂質分子に添加することにより、リポソームを得るために必要な濃度および方法を変化させ得る。また、脂質のタグ化方法は、所望のタグと相溶性がない有機溶媒中で行われるべきである可能性がある、これは例えばペプチドを基にした構造(有機溶媒中で低い溶解性および安定性)であり得る。同様の基本的な問題がポリマーおよびデンドリマーにて生じる。
【００１０】
DDSは、薬物の機能性を許容し得ない程減少すべきでない。例えば癌処置のためには、シスプラチンの加水分解された形態に関する十分に定義された形状のみが癌細胞のRNAに結合することができ、その増殖を阻害することができる。例えば、それを受容体-標的化低分子とタグ化することによって癌細胞にシスプラチンを送達する試みがあり、これは、幾何学的かつ化学的形状を維持し、これによりシスプラチンxiiiの機能性を維持する要件下では非常に挑戦的なことである。
【００１１】
このDDSは、再現可能な方法で大量に提供することが可能でなければならない。リポソームの生成は、規模を大きくすることが難しい；大量に生成したリポソームの特性が少量で生成したものと一致しないことは非常多い。
【００１２】
ポリマーを基にしたDDSはポリマーの狭い分子量分布に依存する。これは、困難な生成技術および/または分離ステップを必要とする。デンドリマーは提供することが非常に困難であることが多い、その生成が通常多段階ステップの化学合成であるためである。
【００１３】
有用なDDSは、安定であり、貯蔵可能であるべきである。リポソームは、唯一準安定性であって、室温で分解する。従って、DDSに関する生成後の取り扱いに対して制限をうける。
【００１４】
金属濾過
金属汚染の処理は、身体からの金属排出に焦点がおかれる。一般的に使用される処置は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、陽性に電荷を帯びた金属イオンと複合体を形成する金属キレートである。EDTAは、細胞膜の完全性に関与し得るカチオン（例えばカルシウムおよびマグネシウムなど）と複合体を形成させるが、副作用および免疫反応は無視できない。
【００１５】
ナノ粒子の生成
ナノサイズの材料(例えば、金属ナノクラスター)は、ここ２０年間にわたって多大な関心を引いてきた。この関心は無数にある特性および用途の可能性によりおこり、原子および低分子からナノサイズの対象物まで制御された規則性に関する効果に関係がある。この用途は、無比の機械的強度を持つ材料(例えば、炭素ナノチューブ)の新規分類に対して、量子ドット、センサーおよび触媒を基にした新規電気装置の範囲にわたる。金属ナノ粒子の特定の態様は、巨大な金属よりもむしろ分子の様に機能することである；例えば、かかる低粒子は、バルク金属の連続的なバンド構造に対してエネルギーレベルが異なるために異なる吸収バンドを示す。この効果を、金属ナノ粒子のサイズを決定するために利用できる。
【００１６】
ナノ粒子を生成するために、多くの方法が発表されてきた。ナノ粒子の生成のための具体的な挑戦は、狭いサイズ分布xiiを達成することである。ナノ粒子を構成する場合の主な問題は、より大きなユニットへのそれらが凝集することである。チオールが例えば金粒子表面に結合して粒子-粒子相互作用を防止するので、チオールはこの問題を解決するために使用されてきた。
【００１７】
本発明の要旨
本発明は、本明細書ではRHCCと呼ばれるテトラブラキオンタンパク質から得たペプチドおよび/またはそのフラグメントの様々な使用に関する。該RHCCペプチドは、空洞を持つ４本鎖のコイルドコイルであり、空洞内で、例えば金属複合体が蓄積し得る。
【００１８】
本発明は、一本の形態および/または結晶化形態において、該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントのための新規使用を提供する。該RHCCペプチドおよび/またはペプチドの結晶複合体は個々のペプチドおよび/または結晶周辺でタグ化され、例えば生体内の環境および/または部位または効果が望まれるあらゆる場所での特異的標的化を可能にする。ある態様において、かかる標的は、微生物、例えば細菌および/またはウイルスでもあり得る。当業者には理解されるであろうが、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを引用する場合はいつでも、少なくとも２つのRHCCペプチドおよび/またはペプチドフラグメントの少なくとも１つのRHCCペプチドおよび/または一つの結晶複合体が意図される。
【００１９】
本発明は、該薬物を該薬物送達システムに結合するための、少なくとも１つのエレメント、例えば金属元素を含む薬物を、身体中の特異的部位に送達するための、薬物送達システムとして使用するための該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントにも関する。該薬物送達システムおよび選択の薬物は、医薬物として使用するための医薬組成物に包含され得る。
【００２０】
さらに、本発明に包含されるものは、液体および/または非液体材料、例えば体液および/または体組織から、物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための、少なくとも１つのエレメント、例えば金属元素を含む物質を濾過するために使用するためのRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントである。別の実施形態において、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントと接触した物質は、その空洞内に蓄積し得る、そしてサイズ排除フィルターおよび/または腎臓および/または他の機能によって、該担持ペプチドが液体および/または非液体材料から除去される。より具体的には、該物質とは、通常、重金属さらに重金属含有物質であり得る。
【００２１】
また、本発明に包含されるものには、化学反応[例えば、還元、酸化、C-CおよびC-ヘテロ原子(例えば、O、N、S、Pであるがこれに限定しない)形成反応および再配列]のための、触媒として金属ナノ粒子(例えば、Pt、Pd、Ir、Rh、Ru)を含有するRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用がある。ここで、空洞内で会合した金属は、好ましくは溶媒として水中で、化学反応[例えば、水素化および還元反応、C-C-およびC-X-結合および再配列]のための触媒として機能する。
【００２２】
さらに、本発明は、ナノ粒子の構造中で使用するための該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントと関連する。RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの空洞は、金属塩と金属ナノ粒子との反応が行われる反応チャンバーとして機能する。
【００２３】
図面の詳細な説明
図１：トリス-緩衝液(A)中、メタノールおよびトリス-緩衝液の混合物(B)中(vol. 50/50)、メタノール中(C)およびRHCCと共にトリス-緩衝溶液(E)中、に溶解したHgI42-の吸収スペクトル。トリス-緩衝液(D)のスペクトルは、全てのスペクトルから控除されており、RHCCのスペクトルはスペクトルEから控除されている。
【００２４】
図２：トリス-緩衝液(A)に、RHCCを有する未濾過混合物(B)およびサイズ排除フィルター("Centurion 10")を用いる濾過後(C)に溶解した、HgI42-の吸収スペクトル。
【００２５】
図３：別々の溶液中におけるシスプラチンとRHCC(挿入)の吸収スペクトル、および過剰シスプラチン濾過しおよび金属複合体不含溶媒により溶媒を置換した後のRHCCおよびシスプラチンの混合溶液の吸収スペクトル。
【００２６】
本発明の詳細な説明
驚くべきことに、発明者は、物質および/または薬物とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合、ならびにRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントからの物質および/または薬物の放出の可能性により、化学反応における触媒としてナノ粒子を生成するためまたは反応容器としての使用するための、例えば薬物送達の際、生体からの毒性物質の選別の際の貴重なツールとなることを見出した。
【００２７】
結果として、本発明の主な目的は、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを使用して、薬物送達のためのシステム、物質の選別および/またはナノ粒子の生成のためのシステムを提供することであって、これは目的とする特異的部位で物質および/または薬物を結合および放出することが両方可能である。また、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、ナノ粒子の生成における使用、ならびに化学反応における触媒であると意図される。
【００２８】
従って、本発明は、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの多様な使用に関する。RHCCペプチドは、目的とする物質および/または薬物と結合することができ、これにはRHCCペプチドとの結合を可能にするエレメントが含まれており、該物質および/または薬物がペプチド内部に結合しており、その後に標的環境において条件を変化させることによって放出されるということを本願発明者は示す。従って、該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、薬物送達システムとして、選別システムとして、触媒として、および/またはナノ粒子の生成のために使用される。さらに、該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、医薬組成物中に含まれ、さらに該薬物および/または物質を、例えば標的組織へ送達するための選択に関する薬物および/または物質をさらに含み得る。
【００２９】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、本発明のある内容において、適切なタグ(例えば、癌細胞上で細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体)、例えば該タグをコードしているコード化cDNAフラグメントを、RHCC配列に隣接する挿入部分を保護する制限部位を用いてpet15b-RHCC構築体にクローニングすることにより融合される。本発明を限定する意図ではないが、融合ペプチドの発現および/または精製は、実験の章に記載したとおりにRHCCのみの発現および精製に従って達成され得る。もちろん該RHCCペプチドがRHCCペプチドの生成および精製後にタグと共に融合され得ることは、当業者には理解されるであろう。
【００３０】
表１： RHCC(配列番号：１)の一本鎖のアミノ酸配列
【表１】
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本発明の明細書において、RHCCペプチドは、ペプチド鎖と呼ばれる４本鎖を含むペプチドを含み、一緒になって右巻き平行RHCCテトラマーを形成する。該ペプチド鎖の一つの配列は、表１(配列番号：１)において提供される。四量体RHCCペプチドは、各々52個のアミノ酸残基である４本のペプチド鎖、全体で208個のアミノ酸を含む。英字小文字によって示した11残基の反復部位は、LupasXIII および StetefeldIIによって提案されたモデルに従って指定される。疎水性コア部位は、aおよびhであった。11-残基の反復の連続性は、Ile11およびThr16の間の４つの残基挿入物(スタッター；stutter)によって遮断される。この最初の２つのＮ末端残基のGly1およびSer2は、テトラブラキオンコード配列の一部ではない。このネイティブRHCCはIIで開始する。GSはベクター由来であり、テトラブラキオンタンパク質には属さない。我々は、GSで開始する遺伝子工学的に発現したタンパク質を用いて全ての実験を行ったので我々は該配列を参照する。融合分子において、これらのアミノ酸はリンカーとして機能する。アミノ酸の番号は、配列の左側に示す。アミノ酸残基Ile 3は、テトラブラキオン配列上の位置1238に対応している。従って、本発明の文脈において、該用語"RHCCペプチド"は、４つのペプチド鎖からなる四量体複合体および/またはそのフラグメントを示し、このペプチド鎖は各々互いに独立して、あらゆる適当な長さ、例えば配列番号：1から由来する約1〜52個のアミノ酸の長さであり得る。本発明の一つの好ましい実施形態において、ペプチド鎖は約52個のアミノ酸である。また、"RHCCペプチド"は、、あらゆる適当な方法で、例えば本発明により開示したとおりに点変異によって修飾されているRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントも示し得る。さらに、"RHCCペプチド"とは、またいくつかのRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの結晶複合体を指し得ると解される。かかる結晶複合体は、10nm3 以上の好ましいサイズを有する少なくとも２つのRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを含む。かかるRHCC結晶複合体は、さらに目的とする用途にとってあらゆる適当なサイズで存在し得る。
【００３１】
タンパク質は、ペプチド結合によって一緒に結合したアミノ酸残基により構成された生物学的高分子である。本発明の文脈において、タンパク質および/またはペプチドは、相互作用、例えば、疎水性および/または親水性相互作用および/または塩架橋により保持され得る。アミノ酸残基の直線状ポリマーとしてのタンパク質は、ポリペプチドとも呼ばれる。通常、タンパク質は、50-800個のアミノ酸残基を持つ、そのためこの分子は約6,000〜数万ダルトンまたはそれ以上の範囲の分子量を有する。低分子タンパク質とは、ペプチドまたはオリドペプチドと呼ばれる。しかし、本発明の文脈において、該用語"タンパク質"は、該用語"ペプチド"および"ポリペプチド"と交換可能に使用され得ると、解される。
【００３２】
本発明に関連のあるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、例えばRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、実質的に単離されたおよび/または精製された形態で存在し得る。このタンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドは、該タンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドとの意図する目的と相互作用しない担体または希釈剤と混合でき、それらは依然として実質的に単離されたものと見なされると解される。このように実質的な精製された形態は、一般的に、調製物および/または組成物中に該タンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドを含んでおり、この中ではおおよそ90%以上であって、例えば、調製物中でタンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドの95%、96%、97%、98%、99%または100%が、本発明のタンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドである。
【００３３】
さらに、本発明のRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントのアミノ酸配列と少なくとも70%同一、例えば、少なくとも72%、75%、77%、80%、82%、85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるあらゆるアミノ酸配列は、本発明の範囲内にあるとも考えられる。
【００３４】
本発明の"フラグメント"は、あらゆる長さのRHCCペプチドのあらゆる適当なアミノ酸フラグメントを含む。従って、RHCCペプチドのフラグメントは、本発明の範囲内にあり得、RHCCペプチドの４本の鎖の少なくとも１部分まで、四量体RHCCペプチドの一本のペプチド鎖の少なくとも１部分を含む。本発明のRHCCペプチドフラグメントは、約1-207個のアミノ酸、例えばこれに限定しないが約1〜50、50〜100、100〜150、150〜200、または200〜207個のアミノ酸を含む。RHCCペプチドのフラグメントは、もしいずれかの該RHCCペプチド鎖が、追加のアミノ酸残基により伸長される場合にはより長くなり得るが、それはRHCCペプチド鎖(配列番号：1)の天然アミノ酸配列の一部ではない。天然配列に付加されるべき追加のアミノ酸残基の量は制限されないが、結合ドメインは約100-150個の残基を含むと考え得る。
【００３５】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、これに限定しないが、より大きな分子の断片化、化学合成、組換え技術および/またはこれら方法の組合せを含む様々な異なる方法で生成できる。当業者には理解されるであろうが、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを生成するためのあらゆる方法は、本発明の文脈において使用できる。
【００３６】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントはあらゆる適当な方法で修飾されてきたが、それらの使用も本発明に含まれる。参照アミノ酸配列と、例えば少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび/またはそのフラグメントということによって、例えば該ペプチドのアミノ酸配列が、限定しないが参照アミノ酸配列の各100個のアミノ酸に対して10個の点変異まで包含し得ることを除いて、参照配列とアミノ酸配列が同一であることを意図される。言い換えると、例えば参照アミノ酸配列と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を有するペプチドを得るためには、参照配列のアミノ酸の10%まで削除され得るかまたは別のアミノ酸または多数のアミノ酸で置換され得る。これらの参照配列の変異は、この参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置またはそれらの末端位置の間のいずれの場所でも起こり、参照配列内の個々のアミノ酸間に散在しているか、または参照配列内の１または１以上の隣接する群のいずれかの場所で起こる。RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの４つの各鎖の１または１以上の配列において１または１以上点変異は、RHCCペプチドの官能性、例えばこれに限定しないが物質、例えば金属含有物質および/または薬物の結合および放出を改善するために設計される。結果として、本発明のある文脈は、改善された官能性を得るために、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントにおいてあらゆる適当な位置で点変異されているRHCCタンパク質および/またはそのフラグメントの使用に関する。点変異のあらゆる適切な量を使用して、所望の官能性を有するRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを得る。本発明の一局面において、該RHCCペプチドの少なくとも１つの空洞の性質を変化するために、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの少なくとも１つのペプチド鎖において点変異が行われる。
【００３７】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの修飾は、さらに１または１以上のRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントへ、および/またはRHCCペプチド鎖へのタグの添加、即ちアミノ酸、炭水化物および/または化学物質の添加を包含し、それは生物中でRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを生成する場合には発現ベクター内でRHCCのコード配列およびその他のペプチドまたはタンパク質への結合を介して達成されるし、または化学的手段により合成中または合成後のRHCCペプチドの１または１以上のペプチド鎖への結合を介して達成される。かかるタグは、一本鎖のRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントおよび/または少なくとも２つのRHCCペプチドRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの複合体と関連して会合され得る。
【００３８】
さらに、もちろん本発明は、所望とする物質および/または薬物と結合することが依然として可能である、および/または天然のRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントと機能的に依然として等価であるRHCCおよび/またはそのフラグメントのその他の変異体、誘導体および/またはアナログの使用を含む。かかる変異体は、あらゆる適切な量のアミノ酸を、例えば、次に限定するものではないが1-5および5-10個のアミノ酸をRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントに付加することによって伸長される、該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントであり得る。本発明のRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの修飾は、さらに切断物も包含する。本発明に開示されたあらゆる修飾は、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの１または１以上の核酸および/またはアミノ酸配列において行われ得ると解されるべきである。
【００３９】
本発明において、部分的アルゴリズムプログラムが同一性を決定するために最も適切である。部分的アルゴリズムプログラム(例えば、Smith Waterman)は、第一の配列における部分配列と第二の配列における部分配列とを比較して、この部分配列の組合せ物とこれらの部分配列のアラインメントとを見出し、これにより最も高い全体の類似性スコアを得る。インターナル・ギャップが認められれば、ペナルティーを課す。部分的アルゴリズムは、複数ドメインまたは共通する結合部分を有する２つのマルチドメインタンパク質を比較するためには十分機能する。
【００４０】
同一性および類似性を決定するための方法は、公的に利用し得るプログラムにおいて分類される。２つの配列の間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、次に限定しないが、GCGプログラムパッケージ（Devereux, J et al (1994)) BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul, S.F. et al (1990))を包含する。BLASTX プログラムは、一般的にNCBIおよびその他の情報源(BLAST Manual, Altschul, S.F. et al, Altschul, S.F. et al (1990))から入手可能である。各配列分析プログラムは、デフォルト・スコア・マトリックスおよびデフォルトギャップペナルティを持つ。一般的には、分子生物学者は、使用したソフトウェアプログラムによって確立されたデフォルトセッティングを用いて予測される。
【００４１】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、さらに本発明の文脈では、単一のペプチドおよび/または２つかそれ以上のRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの結晶複合体として適用でき、これによって適切な該結晶のサイズが設計されうる。さらに、RHCCペプチドは、単一のまたは結晶構造において、目的とする部位にRHCCペプチドを蓄積するという目的によってタグにて修飾され得る。代表的には、この部位は腫瘍であり得、また該タグは目的とするこの腫瘍型に特異的に結合し得る分子である。組織または組織の構成成分であろうと、タグに対して特異的な部位は標的、標的組織または標的化組織と呼ばれる。かかる標的は、本発明の一態様において、微生物、例えば細菌および/またはウイルスを含み得る。
【００４２】
薬物送達システム(DDS)としてのRHCC
好ましい実施形態において、本発明は、薬物と該薬物送達システムとを結合するための少なくとも１つのエレメントを含む薬物を投与するための薬物送達システムとしてのRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用に関する。一態様において、該エレメントは金属元素である。
【００４３】
本発明の特定の目的は、薬物、例えば金属含有薬物類の意図的でない毒性を低下させるRHCCタンパク質および/またはそのフラグメントを含む新規DDSを提供することである。
【００４４】
本発明の明細書において、該用語"薬物送達システム"は、例えば本明細書に開示したようなあらゆる種類の薬物の送達のためのシステムを指すものであり、これはRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを含み、該RHCCペプチドの空洞に目的とする該薬物を結合させることができ、該薬物を身体中に運搬し、その後これが到達した時に標的環境における条件の変化により拡散されるか、または供されるかまたはもたらされることにより、該空洞から該薬物を放出することができる。
【００４５】
本発明の文脈において、該用語"エレメント"は、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの空洞に結合されるべき物質および/または薬物の一部であるあらゆる物質であって、また該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントに対する結合に関与するその能力に依って選択されるあらゆる物質に関する。かかるエレメントは、金属元素、疎水性エレメント、親水性エレメントなどであり得るが、これらに限定するものではない。
【００４６】
本発明の文脈において、該用語"結合"は、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの空洞に入り、続いてそこに結合する薬物および/または物質の作用を説明するために使用される。ここでRHCCペプチドへの結合は、目的とする物質および/または薬物とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの間のあらゆる相互作用、例えばこれに限定しないが疎水性相互作用、親水性相互作用、静電相互作用、共有結合、ファンデルワールス結合、イオン結合、ならびにそれらの組み合わせによって行われ得る。
【００４７】
本発明の文脈において、該用語"薬物"は、医薬目的のために身体に添加した物質および/または物質の組合せを示す。かかる医薬目的とは、診断、治療および/または造影であり得るが、これに限定しない。本発明の"薬物"および/または"物質"は、対象とする目的に適切なあらゆる化学物質、ペプチド/タンパク質、合成物質などに関する。
【００４８】
本発明の文脈において、"薬物"および"物質"は、互換的に使用され得る。本発明の一つの実施形態において、金属含有薬物が好ましい。かかる薬物および/または薬物の組合せは、患者の性別、年齢、健康状態、病気などに依り各患者について設計される用量にて適当な方法で患者に投与される。
【００４９】
明細書では、意図的でない毒性とは、副作用と呼ばれるものを包含する、全ての望ましくない薬物の効果を指すが、これに限定しない。RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを含むDDSは、薬物がペプチド空洞内に保持されるので、該薬物から身体を保護することが可能である。本発明を限定することを望むわけではないが、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、さらに身体構成成分による分解から該薬物を保護できる。
【００５０】
本発明の文脈において、該用語"金属元素"は、電荷を帯びたまたは非電荷の、疎水性、親水性またはその他のいずれかの形態にしろ、あらゆる種類および/または量の金属構成成分、例えば金属および/または半金属の原子だけでなくそれらを含有するあらゆる適用可能な物質をも含むエレメントを指す。
【００５１】
本発明の別の好ましい実施形態において、エレメントは、金属元素からだけでなく、Al、Sc、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Te、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs およびMt、および/またはその組合せからも選択される。しかし、該エレメントはこれらに限定されると解されるべきではない。さらに、該エレメントは、物質および/または薬物の一部であり得ると考えられる。
【００５２】
また別の実施形態において、該薬物は、シスプラチン (PtH6N2Cl2)、カルボプラチン(PtC6H12N2O4)、ネダプラチン(PtN2C2H8N2O3)、オキサリプラチン(PtN2C8H14O4)、ZD0473 (PtC6H10N2Cl2)、JM216 (PtC10H22N2O4Cl2)、ロバプラチン(PtC9H18N2O3)、トランス-[PtCl2(ピリジン)2]およびトランス-[Pt(OH)2Cl2(NH3)(NH2-C6H5)]からなるPt含有薬物の群、および/またはその組合せから選択される。しかし、本発明はそれらに限定されるものではなく、他の薬物、例えば本発明により開示された薬物から得られるかまたは起源とする薬物も本発明の文脈において使用され得る。
【００５３】
本発明の文脈において、使用のためのPt含有薬物および/またはその他の薬物は、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの空洞中に担持されるべきであると考えられる。本発明の範囲を限定するものではないが、該担持は、薬を含有する溶液中でRHCCペプチドおよび/またはRHCCペプチド結晶を浸漬することにより、例えば1 mM 溶液のcis-PtCl2(NH2)2と0.2 mMのペプチド溶液とを混合することにより達成され得る。本発明の文脈において、混合溶液を1時間室温で攪拌した。しかし、混合条件だけでなくその混合中の温度は、あらゆる適切な方法において変化され得ると考えられる。RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの安定性により、該薬物特性に依存してより高い温度でまたはより低い温度で担持できる。薬物の担持する例示は、図1および2に示される。
【００５４】
さらに、一実施形態において、本発明は、本発明に開示されるとおり、薬物と薬物送達システムとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む薬物を投与するために、薬物送達システムとしてのRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用に関し、ここで該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、特異的標的化のためのタグをさらに含む。
【００５５】
本発明の文脈において、該用語"タグ"は、特異的環境の選択的標的化を可能とする分子標識を示す。本発明のタグは、標的と特異的に相互作用する。他のDDS、すなわちリポソーム、ポリマーおよびデンドリマーと比較して、タグ化ペプチドは、細菌における遺伝子発現によって生成され得る。さらに、各ペプチド鎖のタグ化(例えば、癌細胞の細胞表面の抗原に対する抗体を用いて)は、該タグ(テトラマー形成)のオリゴマー化を提供し、これによって結合活性および生物学的活性を増加させることができる(参照：Proc Natl Acad Sci USA 2004 ４月 13;101(15):5547-52)。RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントと結合され得るタグの例示は、アミノ酸、炭水化物および/または別の化学物質であって、これは１以上のRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントおよび/またはRHCCペプチド鎖に添加され、生体内でRHCCペプチドを生成する場合にコドン配列をコード化ベクターに付加することによって達成されるか、または合成中または合成後に該RHCCペプチドの１以上のRHCCペプチド鎖に化学的手段による結合により達成され得る。かかるタグは、一本のRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントに、および/または少なくとも２つのRHCCペプチドのRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの複合体に結合され得る。
【００５６】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントが標的に到達する場合に、該薬物は一つの特定の実施形態において、該ペプチドから放出され得る。本発明の文脈において、該用語"薬物-放出"とは、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントにおいて薬物が結合されている空洞および/または空間から、薬物が解離される場合を指す。かかる解離は、環境における拡散および/または環境における変化、例えばこれに限定しないが、pH変化、RHCCペプチドの酵素分解、RHCCペプチドの加水分解、ペプチドを解裂し、漏出を可能にする塩架橋の破壊などによるか、または標的等と相互作用する場合に該細胞中へタグが引き金となるRHCCペプチドの内在化によるかもしれない。特に、該ペプチドからの該薬物の漏出は、pHがこの環境と比べて低い場合には、低いpHほど塩架橋を破壊するので、細胞の取込みシステムの近傍において起こる。本発明の一態様において、RHCCペプチドは、このタグという手段によって細胞中に入るように作成され得る。
【００５７】
別の態様において、本発明は、薬物と薬物送達システムとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む薬物を投与するための薬物送達システムとしてRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用にも関し、ここで該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントからの薬物-放出は、標的環境におけるpHの変化、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの加水分解、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの酵素分解、および/または熱力学的平衡および/または速度論的バリアの変化により漏出が可能となるRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの塩架橋の解裂を理由とする。
【００５８】
"標的環境におけるpHの変化"は、例えばpHが元々の環境よりも高いかまたは低い別の環境へのRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの輸送によるpHの変化を指し、例えば該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの電荷などの変化をもたらし、RHCCペプチドの空洞内に存在する物質および/または薬物の放出を引き起こす。本発明の好ましい実施態様において、pHは標的環境、例えば癌細胞において低く、ここで該物質は好ましくは特異的効果のために放出されるべきである。
【００５９】
"標的環境"および/または"標的"は、本発明の文脈において、生物体内でのあらゆる組織、細胞タイプおよび/または液体であり得る。さらに、ある文脈では、標的は、微生物、例えば、細菌またはウイルス、ならびにかかかる微生物またはウイルス上に存在するあらゆる表面分子でもあり得る。RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントに対する"標的環境"および/または"標的"は、かかるRHCCペプチドが、例えばタグの使用により導かれるあらゆる部位であり得ると解されるべきである。
【００６０】
本発明の文脈において、物質および/または薬物は、特異的結合を介する所望の標的部位でRCHHペプチドおよび/またはそのフラグメントの固定化によって促進され、この部位で放出される物質および/または薬物の確率を増加させ得る。かかる放出様式は、特に、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントが標的部位で直接投与され、該標的に固定化され、その後標的に対して特異的結合する場合に適用され得る。物質および/または薬物の放出は、この場合結合平衡に主に依存する。
【００６１】
本発明の範囲を限定することは望まないが、該薬物は、所望の作用場所で、例えば臓器、感染細胞および/または腫瘍細胞で、本明細書では標的および/または"標的環境"と呼ばれる場所で、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントから放出されると考えられる。前記に指摘したとおり、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、多くの代替となる放出機構を提供する。放出は、例えば生物学的(例えば、タンパク質の酵素分解)および化学的処理によって開始され得る。
【００６２】
さらに、放出時期が制御できるのが好ましい、即ち標的(関わりのある器官、細胞または腫瘍)に到達する前には放出は非常少ないかまたはせずに、その後標的にて所望の速度で放出するのが好ましい。それ故に、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの内側と外側(溶媒、結晶内空間)との間の該薬物輸送の速度論的バリアが重要である。
【００６３】
RHCCペプチドの空洞の入口は、塩架橋および/または水素結合によって構成される。本発明を限定することは望まないが、複数の塩架橋は、RHCCペプチドの非常に高い安定性にに関する理由であって、即ち放出が開始されるまで、また該塩架橋が解裂されるまで、該薬物がペプチドの内側に存在する理由であると考えられる。
【００６４】
別の好ましい実施形態において、本発明は、薬物を投与するための薬物送達システムに関し、該薬物送達システムは、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメント、ならびにAl、Sc、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Te、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、HsおよびMt、および/またはその組合せからなる群から選択される少なくとも１つのエレメントを含む薬を含む。しかし、該エレメントはこれらに限定されないと解されるべきである。さらに、該エレメントは物質および/または薬物の一部であり得ると考えられる。
【００６５】
別の態様において、本発明は、薬物送達システムに関し、該薬物はシスプラチン(PtH6N2Cl2)、カルボプラチン(PtC6H12N2O4)、ネダプラチン(PtN2C2H8N2O3)、オキサリプラチン(PtN2C8H14O4)、ZD0473 (PtC6H10N2Cl2)、JM216 (PtC10H22N2O4Cl2)、ロバプラチン(PtC9H18N2O3)、トランス-[PtCl2(ピリジン)2]、およびトランス-[Pt(OH)2Cl2(NH3)(NH2-C6H5)]、および/またはその組合せからなる群から選択されるPt含有薬物の群から選択される。しかし、本発明はこれらに限定されないが、他の薬物、例えば本発明により開示された薬物から得られるかまたは起源とする薬物類もまた本発明の文脈において使用され得る。かかる薬物送達システムは、本発明の一態様において、特異的標的化のためには本発明により開示されたようなタグを含み得る。
【００６６】
厳しい条件において、また広範囲な温度においても、RHCCペプチドの安定性により、薬物送達目的のために考えられた大部分のその他のペプチド(例えば、他のコイルドコイル)よりも優れたものを作成する。比較において、リポソームの完全性は、血流中で制御することは難しい、それ故にリポソームを基にしたDDSからの該薬物-放出は予測することができない。
【００６７】
RHCCペプチドは、親水性の殻のために水中に非常に溶解し易い。RHCCペプチドの空洞は、疎水性内面を持ち、薬物は水にそれほど溶解しない、特に金属含有薬物は該空洞内に蓄積する。本発明は、他のものより高濃度の使用を可能にする貧溶解性薬物の溶解性を改善するDDSを提供する。さらに、該ペプチドは、単に薬物を送達するものであって、RHCCペプチドと薬物との間の化学反応を起こさず、該薬物は変化せずに送達されることを示す。
【００６８】
薬物送達のためのRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの調製は、通常、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントと、該薬物の溶液とを混合することで開始する。攪拌は必要であろう。該RHCCペプチドは安定であり、温度および他のパラメーターは選択された薬物の特性に従って設定され得る。
【００６９】
選択された薬物、例えばシスプラチンは、RHCCペプチドの空洞および/またはそのフラグメント内に蓄積し、担持したペプチドを作成し得る。特定の実施形態において、該RHCCペプチドは、タグ化されて、標的部位の蓄積を達成する。タグとRHCCペプチドとの結合は、この分野での当業者に既知のあらゆる手段により達成され得る。例えば、RHCCペプチドは、標的細胞または組織上の抗原を認識するために設計した抗体であるタグと融合され得る。該融合は、ペプチドとタグ配列とを両方組み込む遺伝子を設計することによって容易になり、ペプチドおよびタグ特性を併せ持つ融合タンパク質の生成をもたらし得る。
【００７０】
本発明の一実施形態において、タグまたは複数タグを有するかまたは有さない物質および/または薬物と共に担持したRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、静脈点滴にて（静脈的に）該患者に提供される。該薬物がタグ化されていれば、該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは該タグの効果により標的化組織にて蓄積される。
【００７１】
単独でまたは医薬組成物に包含されたRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメント中に担持した薬物の投与は、あらゆる従来の投与経路を介して、例えばこれに限定しないが、経口、非経口、静脈内、口腔、耳、直腸、膣、腹腔内、経皮(真皮)、または鼻の経路を介して、または体腔への投与によって行われ得る。ある文脈において、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、該タグが特異的である標的に到達するまで身体内で移動され得る。
【００７２】
別の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の薬物送達システムを含む医薬組成物に関する。
【００７３】
"医薬組成物"は、医薬的使用に適切であって、また本発明の薬物送達システム、選択に関する薬物および/または物質、所望により賦形剤を含む組成物を示す。しかし、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用により、医薬組成物は、医薬および/または治療用および/または化粧用組成物であり得る。次の用語"医薬組成物"は、化粧用組成物、さらに医薬組成物および化粧品の間にあるいわゆるグレーゾーン、即ち化粧用組成物に属する組成物を包含することも意図する。
【００７４】
RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを含む医薬組成物は、本発明に従って薬物送達システムを含む。本発明の文脈において、該用語"薬物送達システム"は、投与の際に、ヒトまたは動物の身体に活性な物質および/または薬物を与える医薬組成物 (医薬製剤または用量形態)に含まれ得る。
【００７５】
医薬的にまたは化粧用に許容し得る賦形剤は、組成物が投与される個体に対して、実質的に有害でない物質である。かかる賦形剤は、通常国立健康保健局によって提示される要件を満たしている。公的な薬局方、例えば英国薬局方、米国薬局方および欧州薬局方は、医薬的に許容し得る賦形剤の標準を設定している。
【００７６】
本発明の使用のための組成物において医薬的に許容し得る賦形剤の選択およびその至適濃度は、一般的には予測できず、最終組成物の実験評価に基づいて決定されるべきである。医薬および/または治療用製剤の分野における当業者は、例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th Edition, Mack Publishing Company, Easton, 1990において指針を見出すことができる。しかし、かかる賦形剤の例示は本明細書に示されているが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７７】
医薬組成物は、外科手術と関連した投与、例えば全身投与として、血液、リンパ液、腹水または脊髄液中への注入によるかまたは吸入により適用される。全身適用のためには、本発明の組成物は、従来的に、本発明の非毒性の医薬的に許容し得る担体および賦形剤を含有でき、ミクロスフェアおよびリポソームを包含できる。
【００７８】
本発明に従って、使用のための医薬組成物は、例えば、液体、半固体または固体組成物の形態であり得るが、これらに限定されない。例えば、輸血液体、例えば滅菌食塩水、リンガー溶液、グルコース溶液、リン酸緩衝液生理食塩水、血液、血漿、水、粉末、マイクロカプセル、生体吸収性パッチ、ドレンチ（drenche）、シート、包帯、絆創膏、インプラント、錠剤、スプレー、石鹸、座薬、バギトリー（vagitories）、歯磨用ペースト、ローション、口内洗浄剤、シャンプー、ミクロスフェア、ナノ粒子、スプレー、エアゾール、吸入デバイス、溶液、分散剤、湿潤剤、懸濁液、エマルジョン、ペースト、軟膏、親水性軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、包帯剤、デバイス、テンプレート、スマートゲル、グラフト（grafts）、溶液、エマルジョン、懸濁液、粉末、フィルム、フォーム、パッド、スポンジ（例えば、コラーゲンスポンジ）、経皮送達システム、顆粒、粒状物、カプセル、アガロースまたはキトサンビーズ、錠剤、マイクロカプセル、凍結乾燥粉末、顆粒、粒状物またはペレット、およびその混合物であるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明に従って、使用するための適当な分散剤または湿潤剤は、天然リン脂質、例えば、レシチン、またはダイズレシチンであり得る；エチレンオキシドと、例えば脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、または脂肪酸から誘導し得る部分的エステルとヘキシトールまたはヘキシトール無水物との縮合産物、例えばポリオキシエチレンステアレート、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどであり得る。しかし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８０】
適当な懸濁剤は、例えば、天然ガム、例えば、ガムアカシア、キサンタンガムまたはトラガカントガム等であり；セルロース、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、微晶質セルロース(例えば、Avicel（登録商標）RC 591、メチルセルロース)などであり；アルギン酸塩およびキトサン、例えばこれに限定しないが、アルギン散ナトリウムなどであるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８１】
医薬的に許容し得る賦形剤が医薬組成物における使用に適切であるかどうかは、一般的には、身体への障害および/または損傷のタイプに対して使用するために選択される用量形態の種類に依存する。
【００８２】
医薬的に許容し得る賦形剤は、溶媒、緩衝剤、保存剤、保湿剤、キレート剤、抗酸化剤、安定剤、乳化剤、懸濁剤、ゲル形成剤、軟膏基材、浸透増強剤、香料、粉末および皮膚保護剤を包含し得る。しかし、本発明がこれらに限定されるものではないことは強調されるべきである。
【００８３】
本発明に従って、組成物中で使用され得るかかる溶媒の例示は、水、アルコール、植物性油および魚油(例えば、食用油類、アーモンド油、カストール油、カカオバター、ココナッツ油、コーン油、綿実油、アマニ油、オリーブ油、パーム油、ピーナッツ油、ケシ油、菜種油、ゴマ油、ダイズ油、ヒマワリ油および茶油)、無機油、脂肪油、液体パラフィン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、液体ポリアルキルシロキサン、または他の親水性またはエーテル含有溶媒、例えば約5,5-6,0のpHを有する弱酸、ならびにその混合物である。
【００８４】
緩衝剤の例示は、クエン酸、酢酸、酒石酸、乳酸、水素リン酸（hydrogen phophoric acid）、重炭酸塩、リン酸塩、ジエチルアミンなどである。
【００８５】
保存剤の適当な例示は、パラベン、例えばメチル、エチル、プロピルp-ヒドロキシベンゾエート、ブチルパラベン、イソブチルパラベン、イソプロピルパラベン、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、安息香酸、安息香酸メチル、フェノキシエタノール、ブロノポール、ブロニドックス、MDMヒダントイン、ヨードプロピニルブチルカルバメート、EDTA、塩化ベンザルコニウム、およびベンジルアルコール、または保存剤の混合物である。
【００８６】
保湿剤の例示は、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、乳酸、尿素およびその混合物である。
【００８７】
キレート剤の例示は、ナトリウムEDTAおよびクエン酸である。
【００８８】
抗酸化剤の例示は、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、アスコルビン酸およびその誘導体、トコフェロールおよびその誘導体、システイン、ならびにその混合物である。
【００８９】
乳化剤の例示は、天然ガム、例えばアカシアガムまたはトラガカントガム；天然リン脂質、例えばダイズレシチン、ソルビタンモノオレエート誘導体；ウール脂肪；ウールアルコール；ソルビタンエステル；モノグリセリド；脂肪アルコール；脂肪酸エステル(例えば脂肪酸のトリグリセリド)；およびその混合物である。
【００９０】
懸濁剤の例示は、例えばセルロースおよびセルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微晶質セルロース、カラゲーナン、アカシアガム、アラビアガム、トラガカントおよびその混合物である。
【００９１】
創傷から漏出物を取り出すことができるゲル基材、粘性増強剤または成分の例は次のものである：液体パラフィン、ポリエチレン、脂肪油、コロイド様シリカまたはアルミニウム、亜鉛石鹸（zinc soaps）、グリセリン、プロピレングリコール、トラガカント、カルボキシビニルポリマー、マグネシウム-アルミニウムシリケート、カルボポール（登録商標）、親水性ポリマー、例えばスターチまたはセルロース誘導体など、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、水膨潤性ハイドロコロイド、カラゲナン、ヒアルロン酸(例えば、塩化ナトリウムを所望により含有するヒアルロン酸塩ゲル)、コラーゲン、ゼラチン、ペクチン、キトサンおよびプロピレングリコールアルギネートを包含するアルギネート。
【００９２】
軟膏基材の例示は、例えば、ミツロウ、パラフィン、セタノール、パルミチン酸セチル、植物性油、脂肪酸のソルビタンエステル(Span)、ポリエチレングリコール、および脂肪酸のソルビタンエステルとエチレンオキシドとの縮合酸物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween)である。
【００９３】
疎水性または水乳化剤軟膏基材は、パラフィン、植物性油、動物脂肪、合成グリセリド、ワックス、ラノリンおよび液体ポリアルキルシロキサン類である。
【００９４】
親水性軟膏基材の例示は、固体マクロゴール(ポリエチレングリコール)である。
【００９５】
軟膏基材の他の例示は、トリエタノールアミン石鹸、硫酸化脂肪アルコールおよびポリソルベートである。
【００９６】
粉末成分の例示は次のものである：創傷に適用した場合にゲルを形成できる(液体／創傷漏出物を吸収する)アルギネート、コラーゲン、ラクトース、粉末。通常、広く切開した創傷上への適用を目的とする粉末は滅菌性であるべきであり、存在する該粒子は微細化されるべきである。
【００９７】
他の賦形剤の例示は、ポリマー、例えばカルメロース、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ペクチン、キサンタンガム、ローカストビーンガム、アカシアガム、ゼラチン、カルボマー、乳化剤様のビタミンE、グリセリルステアレート、セタニツグルコシド、コラーゲン、カラゲナン、ヒアルロン酸塩およびアルギネート、およびキトサンである。
【００９８】
希釈剤および崩壊剤の例示は、ラクトース、サッカロース、エムデックス、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、スターチおよび微晶質セルロースであるが、これに限定されない。
【００９９】
結合剤の例示は、これに限定しないが、サッカロース、ソルビトール、アカシアガム、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、スターチ、セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールである。
【０１００】
医薬的に許容し得る賦形剤が様々な用量形態または組成物に用い得るそのような場合に、特定の医薬的に許容し得る賦形剤の用途が、特定用量形態または賦形剤の特定機能に限定されるものではないということは評価されることである。
【０１０１】
包帯剤および/または包帯は、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントにとって重要な送達システムである。包帯剤が用量形態として使用される場合、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、包帯剤の製造前または製造中に他の材料/構成成分と混合されるか、または該ペプチドおよび/またはそのフラグメントは、なんらかの方法で包帯剤上に被覆され得る、例えば該ペプチドおよび/または該そのフラグメントの溶液または分散物中に包帯剤を浸積するか、または包帯剤上へ該フラクションおよび/またはペプチドフラグメントを噴霧することによって被覆され得る。あるいは、該ペプチドおよび/またはペプチドフラグメントを粉末の形態で包帯剤に適用し得る。包帯剤は、漏出している創傷に適用するための吸収性の創傷包帯剤の形態であり得る。また、包帯剤は、ヒドロゲル包帯剤(例えば、交差結合したポリマーなどの、例えばイントラサイト（Intrasites）、カルボキシメチルセルロース、プロピレングリコールまたはポリサッカライド、ジサッカライドおよびタンパク質を含有するもの)の形態であり得るか、または閉塞性包帯剤の形態、例えばアルギネート、キトサン、親水性ポリウレタンフィルム、コラーゲンシート、プレート、粉末、フォーム、またはスポンジ、フォーム(例えば、ポリウレタンまたはシリコン)、ヒドロコロイド(例えば、カルボキシメチルセルロース、CMC)、コラーゲンおよびヒアルロン酸を基にした包帯剤の形態で有り得、それらの組合せを包含する。
【０１０２】
本発明の使用のための医薬組成物において、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、約0.001%〜約99.9% w/wの範囲の濃度で一般的に存在する。
【０１０３】
好ましい態様において、本発明は、医薬物として使用するための、本発明に関する医薬組成物に関する。本発明は、癌の処置のための医薬物の製造における、かかる医薬組成物の使用にも関する。
【０１０４】
本発明の文脈において、該用語"癌"は、例えば、これに限定しないが、乳癌、前立腺癌、肺癌、白血病、脳腫瘍、骨肉腫、皮膚腫瘍、肝臓癌、腎臓癌、睾丸癌、ならびにあらゆる種類の固体腫瘍の症状を示す。
【０１０５】
また別の態様において、本発明は、薬物と薬物送達システムとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む薬物を投与するための方法に関し、ここで該方法は、それを必要とする患者に、本発明の薬物送達システム、および/または本発明の医薬組成物を投与することを含む。一態様において、該エレメントは金属元素である。
【０１０６】
濾過システムとしてのRHCCおよび/またはそのフラグメント
本発明の別の実施形態において、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、特に血液または他の体液または組織から重金属含有複合体の毒性化合物の濾過のために使用される。RHCCペプチドは、一つの状態において使用されるか、または10 nm3と等しいかまたは10 nm3よりも大きいサイズの結晶複合体において使用される。身体の特定部分から金属を濾過するために、身体のこの部分に特異的なタグが、本発明によって開示したプロトコールに従って使用され得る。RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、塩化ナトリウムまたは栄養液体またはその他の適切な液体に溶解して、静脈注入し得る。RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの濃度は1nM から100 mMの間であり、解毒されるべき患者の状態によって１回または反復して与えられる。
【０１０７】
特に好ましい実施形態において、本発明は、液体および/または非液体材料から、物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む物質の濾過のためのRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用に関する。
【０１０８】
一実施形態において、該エレメントは金属元素である。本発明に従って、該液体および/または非液体材料は、体液、例えば血液、尿および/またはその他の体組織であり得る。
【０１０９】
本明細書において、該用語"濾過"は、培地、液体および/または非液体材料から、物質および/または成分を除去するおよび/または回収する方法を指す。"濾過"とは、本発明のある文脈においては、本明細書に開示したようなあらゆる手段により、液体または非液体材料中に存在する物質のRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの空洞中への結合、そしてその後の、該液体または非液体材料から、該物質と結合した該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの除去の両方を含む。本発明の文脈において、該用語"濾過"は、吸着および/または除去と互換的に使用される。本発明に従って除去される物質は、例えば重金属であって、これはヒトに対して毒性である。濾過は、本発明に従って、例えばアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除フィルター等を用いて行われ得る。本発明のある文脈において、濾過は透析によって行われる。かかる文脈において、重金属をこのフィルターに直接結合するように、RHCCは透析フィルター内に導入される。
【０１１０】
該用語"液体および/または非液体材料"は、液体状態にあるあらゆる材料、例えば体液、例えば血液、血漿、尿など、または非液体材料、例えば体組織を指す。
【０１１１】
さらに、本発明は、液体および/または非液体材料から、物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む該物質を濾過するための該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用に関し、ここで該エレメントは、Al、Sc、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Te、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、HsおよびMt、および/またはその組合せからなる群から選択される。しかし、該エレメントはこれらに限定されないと解されるべきである。さらに、該エレメントは物質の一部であり得ると考えられる。
【０１１２】
別の好ましい態様において、本発明は、液体および/または非液体材料から、物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの結合のための少なくとも一つのエレメントを含む該物質を濾過するために使用するための濾過システムに関し、本発明に従って、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントおよび固体マトリックスを含むものである。
【０１１３】
該用語"濾過システム"は、本明細書において、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを、例えば、固体マトリックス、サイズ排除フィルターなどと組合せて含むシステムに関する。該濾過システムは、効果的な除去のために、体液などの液体および/または非液体材料から望ましくない物質を、そのような物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを結合することにより除去する。
【０１１４】
同様に好ましい態様において、本発明は、液体および/または非液体材料から、物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む物質を濾過するための使用のための濾過システムに関し、本発明によれば、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントおよびサイズ排除フィルターを含む。
【０１１５】
別の同等の好ましい態様において、本発明は、液体および/または非液体材料から、物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとを結合するために少なくとも１つのエレメントを含む物質の濾過に使用するための濾過システムに関し、本発明によれば、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを含んでおり、ここで該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントが、解裂していないポリヒスチジンタグで標識される。本発明のある文脈において、該解裂していないポリヒスチジンタグは、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの固定化を、例えばアフィニティークロマトグラフィーを用いて可能にする。
【０１１６】
さらに別の態様において、本発明は、液体および/または非液体材料から、物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む物質を濾過するための方法に関し、該方法は次の工程を含む：物質を濾過するために、該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントと液体および/または固体材料とを混合すること、そして該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを該液体および/または固体材料から分離すること。
【０１１７】
本発明は、さらに、液体および/または非液体材料から、物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む物質を濾過するための方法に関し、ここで該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは固体マトリックスに結合される。
【０１１８】
さらに、本発明は、液体および/または非液体材料から、物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む物質を濾過するための方法に関し、ここで該分離の工程は、サイズ排除フィルターを用いることを含む。
【０１１９】
別の態様において、液体および/または非液体材料から、物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む物質を濾過するための方法は、解裂していないポリヒスチジンタグで標識されているRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを含む。かかる方法はアフィニティークロマトグラフィーを使用することも含み得る。
【０１２０】
さらに別の好ましい態様において、本発明は、液体および/または非液体材料から、該物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む物質を濾過するための方法に関し、ここで該分離のステップは身体の腎濾過を含む。
【０１２１】
本発明の目的は、ヒトの身体、血液、他の体液および/または他の組織から、毒性金属含有エレメント、特に重金属含有エレメントを濾過するのに適当なRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用を提供することである。フィルターとして使用するために、該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、あらゆる適当な形態で、例えば経口的に投与され得る。本発明の範囲を限定することは望まないが、考えられるある可能な作用様式は、消化器系における酸性環境がタンパク質を解裂することができるが、中性pHとなる場合に再形成できることである。タンパク質は身体内で循環し、毒性金属元素と遭遇する場合に、これらはRHCCペプチド空洞内に蓄積し、その後該RHCCペプチドは腎機能により血流から除かれ得る。
【０１２２】
本発明の一実施形態において、該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、液体および/または非液体材料から毒性物質を除去するための濾過システムとして使用され得る。RHCCペプチドは、この実施形態において、その天然および一本鎖の状態か、または10 nm3と等しいかまたは10 nm3よりも大きいサイズの結晶において使用される。
【０１２３】
本発明の特定の実施形態において、ここでRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントが、重金属からヒトを解毒するために使用され、RHCCペプチドを標的、即ち特異的標的組織に局在させるためにタグが使用され得る。該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、経口的または静脈注射によって摂取でき、塩化ナトリウムまたは栄養液体または別の適切な液体に溶解されていてよい。RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの濃度および用量計画は、解毒されるべき患者の状態によって決定され得る。金属複合体、特に重金属複合体は、RHCCペプチドの空洞内部に蓄積し得る。本発明の一態様において、ここで身体内のRHCCペプチドは、金属複合体、特に重金属複合体と遭遇し、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの内部に重金属を平衡に保つ交換反応が起こり得る。RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、分または時間または日ごとに身体に循環でき、最終的に腎機能によって排出されると考えられる。
【０１２４】
本発明のまた別の実施形態において、水、血液、または他の液体は、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用により、重金属から濾過される。この実施形態において、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは、一つのペプチドまたは結晶複合体構造として基質と結合され得る。該基質はアルミニウム、セルロース、紙、金属オキシドおよびポリマーであり得るが、これらに限定されない。
【０１２５】
本発明のまた別のある実施形態において、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントは溶液中にも存在でき、該RHCCペプチドと溶解した重金属との相互作用が十分な時間供された後に該溶液から金属を担持した該RHCCペプチドを他の手段による分離を必要とする。かかる分離は、市販購入し得るような、例えばサイズ排除フィルター、または解裂していないポリヒスチジンタグを有するRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって達成されうる。
【０１２６】
ナノ粒子生成のためのRHCCおよび/またはそのフラグメント
本発明のさらに別の実施形態において、金属複合体または金属イオン(例えば、[AuCl4]-)は、金属ナノ粒子の合成のための前駆物質として使用され得る。該反応によれば、金属塩および/または金属複合体および/または金属複合体塩であり得るm金属イオン(Mn＋)または別の前駆物質が還元されて、m原子を有する金属(M)ナノ粒子を得る：
m[Mn＋]＋n m Cl− ＝＞ Mm (1)
m[AuCl4]- ＋ 3me− ＝＞ 4 mCl− ＋ Auｍ (2)
【０１２７】
[AuCl4]-がAuに遷移される例が、反応2に示される。
狭いサイズ分布を有する低粒子の生成のための最も重要なことは、凝集を誘起する粒子の安定化である。本発明の一態様において、安定化は、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメント内側で異なる形状およびサイズのナノ粒子を生成することにより達成される。式3および4に従って、かかる合成は２つの工程で行われ得る；金属イオンのRHCCペプチド空洞中(3)への組込み、その後の該イオンを還元して元素金属(4)を得る。[AuCl4]-がAuに遷移される例示は、反応5および6に示される。
【０１２８】
ペプチド＋m[Mn＋]＝＞[ペプチド・ m[Mn＋]](3)
[ペプチド・ m[Mn＋]]＋n m Cl−＝＞ [ペプチド ・ Mm](4)
ペプチド＋ m[AuCl4]-＝＞ [ペプチド ・ m[AuCl4]-] (5)
[ペプチド ・ m[AuCl4]-] ＋3Cl−＝＞ [ペプチド・ Auｍ] ＋ 4 mCl- (6)
ペプチド-金属複合体を構築するための反応(3)は、RHCCペプチド結晶が金属イオン溶液に浸積される場合に容易に起こることが判っている。NMRおよびUV-Vis吸収実験は、RHCCペプチドが溶液中で該金属イオンを組み込む等価な金属イオン([PtCl4]-および[HgI4]2-)について示している。反応(4)に関する電子の付加について、化学的還元剤の単なる添加(例えば、NaBH4)も可能であるが、電気化学または光電気化学的還元(例えば、[Ru(bpy)3]2+と共に)が使用され得る。
【０１２９】
従って、本発明は、前駆物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む前駆物質からナノ粒子を生成するための、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用に関する。一態様において、該エレメントは金属元素である。
【０１３０】
"ナノ粒子"は、少なくとも２つの原子、好ましくは約1〜100nmのサイズの複合体を示す。
【０１３１】
本発明の文脈において、"前駆物質"は、本明細書に開示したような、本発明に従ってナノ粒子を形成するために使用されるあらゆる物質を指す。一実施形態において、かかる前駆物質は、ナノ粒子の効果的生成のために、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントと結合するためのエレメント、例えば金属元素を含む。ナノ粒子の前駆物質は、本発明に従って、金属塩または錯体金属塩および/または複数の錯体金属塩であり得る。
【０１３２】
本発明は、前駆物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む前駆物質からナノ粒子を生成するための、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用に関し、ここで該エレメントは、Al、Sc、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Te、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs および Mt、および/またはその組合せからなる群から選択される。しかし、該エレメントがこれらに限定されると解されるべきでない。
【０１３３】
発明における特定の目的の金属ナノ粒子の群は、Ag、Au、Pd、Pt、Rh、Ru、Feおよび/またはその組合せからなる。
【０１３４】
さらに、本発明は、前駆物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む前駆物質からナノ粒子を生成するための、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用に関し、ここで該前駆物質がHAuCl4、K2PtCl4、K2PdCl4、CuCl2、FeCl2およびAgNO3、および/またはその組合せからなる群から選択される。しかし、本発明は、これに限定されるものではないが、他の前駆物質は、本発明の文脈において、例えば本発明において開示された前駆物質から得られる前駆物質、または起源とする前駆物質も使用され得る。
【０１３５】
別の実施形態において、本発明は、前駆物質をRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含むナノ粒子を前駆物質から生成するための方法に関し、該方法は後記ステップを含む；RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを含む溶液、および前駆物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む前駆物質を調製すること；該溶液を混合すること；そして還元剤を溶液に添加すること。一実施形態において、該エレメントは金属元素である。別の実施形態方法において、該溶液は水性である。
【０１３６】
本発明は、さらに、ナノ粒子を、該前駆物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための少なくとも１つのエレメントを含む前駆物質から生成するための方法に関し、ここで該前駆物質はHAuCl4、K2PtCl4、K2PdCl4、CuCl2、FeCl2およびAgNO3、および/またはその組合せからなる群から選択される。しかし、本発明はこれらに限定されるものではなく、他の前駆物質もまた、本明細書の文脈において、例えば本明細書で開示したような前駆物質から得られるか、または起源とする前駆物質もまた使用され得る。
【０１３７】
本発明は、さらに、該前駆物質とRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントとの結合のための、少なくとも１つのエレメントを含むナノ粒子を前駆物質から生成するための方法に関し、ここで該還元エレメントは、[Ru(bpy)3]2+およびNaBH4、および/またはその組合せからなる群から選択される。しかし、本発明がこれらに限定されるものではなく、他の還元エレメントは、本発明の文脈において使用され得る、例えば還元エレメント、本明細書で開示したような還元エレメントから得られる還元エレメント、または本明細書で開示したような還元エレメントを起源とする還元エレメントを使用され得る。
【０１３８】
さらなる本発明の目的は、ナノ粒子、例えば金ナノ粒子の構築のためのリアクター・チャンバーを提供するものである。リアクター・チャンバーとは、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントのあらゆる空洞を意味する。該粒子は、RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの空洞内部の化学反応によって構築される。該RHCCペプチドは、ナノ粒子に対する凝集、さらに生成した該粒子のサイズ分布のための物理的制限からの保護を提供する。
【０１３９】
本発明のこの実施態様において、ナノ粒子はRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを用いて構築される。限定することは望まないが、可能なシナリオとしては、溶液中または結晶形態における該RHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントが、溶液中の金属イオン、例えば[AuCl4]-と混合されることである。該金属イオンはRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの空洞に入る。電子が加えられる場合に、金属に対する金属イオンの還元が起こり、そしてnmスケールのサイズの粒子が個々の空洞内に形成される。電子は、化学的に(還元剤によって)、電気化学的細胞中では電気化学的におよび/または光感作(光感作剤による励起状態から電子の遷移)によって加えられ得る。
【０１４０】
触媒としてのRHCC
また別の態様において、本発明は、化学反応、例えば還元、酸化、C-C-およびC-ヘテロ原子(例えば、O、N、SまたはPであるが、これに限定しない) 形成反応および再配列などの化学反応における触媒として金属ナノ粒子(例えば、Pt、Pd、Ir、Rh、Ru)または金属イオンを含むRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントの使用にも関する。本発明における使用のための特定目的の既知および未知の金属ナノ粒子または金属イオンの群は、Ag、Au、Pd、Pt、Rh、Ru、Fe、Cu、Ir、Niおよび/またはあらゆるその組合せを含む。その他の金属および組合せ物も、本発明の文脈において使用されることにも注目すべきである。この空洞内での金属の会合は、特には溶媒としては水を用いて、化学反応、例えば水素化および/または還元反応、酸化、C-C-およびC-ヘテロ原子カップリング、再配列などの化学反応に対する均一または不均一触媒として作用する。金属ナノ粒子または金属イオンを含有するRHCCペプチドおよび/またはそのフラグメントを介する化学触媒作用について溶媒としての水の使用は、有機溶媒を回避または少なくとも低減させ得るので、従来技術の状態と比べて有意な前進と考えられるべきである。目下使用される大量の有機溶媒は、環境的問題であることは明らかである。
【０１４１】
実験の部
RHCCペプチドの発現
組換えRHCCポリペプチド鎖フラグメントをEscherichia coli 株 JM109 (DE3) (Novagen)または幾つかの他の適当な細菌株で発現させた。完全長テトラブラキオン分子およびＮ末端ポリヒスチジンタグの残基Ile3からIle52をコードするcDNAフラグメントを、pet15b-RHCCをテンプレートとして用いてPCR技術により生成した。該PCR生成物を、このpet15b発現ベクター (Novagen)またはその他の適当な発現ベクターに適切な制限部位を用いて連結させた。RHCC発現ベクターを用いて形質転換した後、細菌を37℃で液体ブロス中で光学密度が600nmで0.6に達するまで培養した。次いで、RHCCポリペプチド鎖フラグメントの発現を、0.4 mMにてイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して誘導した。培養物を少なくとも2時間継続させて誘導に供した。細菌細胞からのRHCCペプチドの調製を、細菌を培養培地から回収し、細胞分解を変性条件下で行うことにより実施した。RHCCペプチドの自発的変性は、生理学的条件を再構築することによって容易となる。Ni2+-セファロース(Novagen)でのアフィニティークロマトグラフィーによる6xHis-タグ化融合ペプチドの精製を、変性条件下で製造者指示書に記載のとおりに行った。6xHisタグからのRHCCポリペプチド鎖フラグメントの分離を、プロテアーゼ処置によって行った。該組換えポリペプチド鎖フラグメントは、発現プラスミドが起源であり、テトラブラキオンコード配列の一部分ではない２つの追加のN末端のGlyおよびSer残基を含有する。
【０１４２】
結晶化
結晶化実験を4℃で蒸気拡散技術を用いて行った。静置液滴（sitting droplets）を4μlペプチド溶液(12.8 mg ml-1)と、2M 硫酸アンモニウムおよび200 mM トリス-HCl(pH 7.9)とを混合することによって作成した。該結晶は、a=110.02Å、b=110.02Å および c=70.96Åの寸法を有する空間群P3121に属する。
【０１４３】
薬物の局在化
空洞内側の薬物の場所を、分子、例えば該薬物の局部の微視的環境に対して感知可能な技術によって検出した。例えば、可視光の吸収(UV-Vis分光法−ソルバトクロミック効果)は、局所環境、例えばHgI4−(図1)を探索するために使用できる。HgI4−の吸収ピークの位置を、水(図1−プロットA)、メタノール(図1、プロットC)、水/メタノール(50/50)(図1−プロットB)、および該ペプチド(図1−プロットE)との混合物において測定した。ペプチドを含む混合物中のHgI4−ピークの位置はメタノール中のHgI4−のピークと一致しており、こHgI4−が、ペプチドと混合した場合(図1−プロットCとプロットEとを比較されたい)に、疎水性環境にてHgI4−が存在することを示している。該ペプチドは、溶解した種(HgI4−)についてメタノール様の疎水性環境を提供することを結論づけることができる。すなわち、HgI4−は、上記様式において該ペプチドと混合した場合に疎水性空洞内側に存在する。
【０１４４】
金属複合体とRHCCとの強力な相互作用のさらなる適用は、濾過実験によって確立できる：まずRHCCを過剰量の金属複合体と混合した(例えば、HgI42-またはシスプラチン)。該混合溶液を少なくとも1時間攪拌させた後、該溶媒はRHCC、金属複合体および緩衝液またはその他の支持塩を含有する、あらゆる過剰金属複合体および塩と一緒になった溶媒をサイズ排除フィルターによって、いずれの金属複合体をも含まない溶媒に置換する。かかる実験の結果を図2にプロットした。該スペクトルは、RHCCから過剰金属複合体を分離した後であっても、HgI42-の通常のピークが観察できることを示している。これは、HgI42-/RHCC相互作用は十分に強く、該溶液からHgI42-が濾過されることを防止することを強く示唆するものである。Ｘ線構造との組合せから、溶液中でのHgI42-の空洞内側の位置を結論付けることができる。同じ実験を、図3に示したとおりシスプラチンを用いて行った：RHCCの濾過済み溶液は、２つの成分の間の強い相互作用を示すシスプラチンの存在を明確に示している。結晶構造から、RHCCの空洞中への導入はシスプラチンとして結論づけることができる。
【０１４５】
タンパク質への荷電または非電荷の種の導入を評価するための他の方法は、質量分光分析(MALDI-TOF)であり、該薬物がIR活性基であれば赤外分光法(IR)、そして該薬物が不対電子を有する金属イオンであれば電子スピン共鳴(ESR)である。
【０１４６】
RHCCおよびヒトインターロイキン-6の融合分子
融合タンパク質を、配列中に下記部分を用いて生成した:
i)精製のためのヒスチジンタグ:
HHHHHHLVPRGS(配列番号：2)
ii)ヒトインターロイキン-6 配列:
MPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM (配列番号：3)
ii) GSリンカー
iii)RHCC配列:
IINETADDIVYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTILASI (配列番号：4)
RHCC-IL-6 モノマーの計算分子量は28.3 kDaであった。SDS−PAGEでは、該分子は32 kDaのみかけの分子量を明確に示した。テトラマーに対応する値は約130kDaである。該RHCC-IL-6 融合分子は、水性媒体中で可溶性であって、IL-6-依存性BAF/3細胞系に対して完全な生物学的活性を示す。これは、該融合分子が生存細胞上の細胞表面受容体に結合することができ、元来のリガンドの様式でそれらを活性化することができることを示すものである。
【０１４７】
引用文献
i  Stetter KO: Life at the upper temperature border. In Colloque Interdisciplinaire du Comite National de la Recherche Scientifique, Frontiers of Life, C55. Edited by Tran Than Van J & K, Mounolou JM, Schneider J, McKay C. Gif-sur-Yvette, France: Editions Frontieres; 1993:195219.
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iv  J. Peters, M. Nitsch, B. Kuehlmorgen, R. Golbik, A. Lupas, J. Kellermann, H. Engelhardt, J.-P. Pfander, S. Mueller, K. Goldie, A. Engel, K.-O. Stetter and W. BAuｍeister, J. Mol. Biol., 245, 1995, 385 - 401.
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Xiii  Lupas, A. Trends Biochem. Sci. 21, 375382 (1996).
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１：トリス-緩衝液(A)中、メタノールおよびトリス-緩衝液の混合物(B)中(vol. 50/50)、メタノール(C)およびRHCCと共にトリス-緩衝溶液(E)中に溶解したHgI42-の吸収スペクトル。
【図２】図２：トリス-緩衝液(A)に、RHCCを有する未濾過混合物(B)およびサイズ排除フィルター("Centurion 10")を用いる濾過後に溶解したHgI42-(C)の吸収スペクトル。
【図３】図３：別々の溶液中でのシスプラチンおよびRHCC(導入)の吸収スペクトル、および過剰シスプラチン濾過および金属複合体不含溶媒による溶媒の置換後のRHCCおよびシスプラチンの混合溶液の吸収スペクトル。
【図１】
2008536916.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月19日(2007.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008536916000001.app
【国際調査報告】
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