(57)【要約】  本発明は、加速骨吸収、特に炎症により誘発される骨吸収、を治療するためのＡ３アデノシンレセプタアゴニスト（Ａ３ＡＲアゴニスト）の使用に関するものである。本発明により、特に、Ａ３ＡＲアゴニストが加速骨吸収の被検者に投与される医薬組成物として配合される、当該症状を治療するための方法及び医薬組成物が提供される。また、本発明は当該医薬組成物を製造するためのＡ３ＡＲアゴニストの使用を提供するものである。
2008519029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療が必要な哺乳類の被検対象に、骨吸収を阻害するのに有効な量のＡ３アデノシン・レセプタ・アゴニスト（Ａ３ＡＲアゴニスト）を投与することを含む、被検対象における加速骨吸収の治療方法。
【請求項２】
前記哺乳類がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
炎症誘発性骨吸収の治療用である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
炎症性関節炎によって誘発された骨吸収の治療用である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記治療が前記被検対象にＡ３ＡＲアゴニストを経口投与することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記治療が前記被検対象にＡ３ＲＡアゴニストを１日に１回又は２回投与することを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ａ３ＡＲアゴニストが一般式（Ｉ）の範囲内： 
【化１】
2008519029.tif 000010
ここでＲ１は、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はシアノアルキル基、或いは下記の一般式（ＩＩ）の基であり：
【化２】
2008519029.tif 000011
ここで、Ｙは、酸素原子、硫黄原子、又はＣＨ２であり、
Ｘ１は、Ｈ、アルキル基、ＲａＲｂＮＣ（＝Ｏ）−、又はＨＯＲＣであって、ここで
Ｒａ及びＲｂは、同一又は相違しており、水素、アルキル基、アミノ基、ハロアルキル基、アミノアルキル基、ＢＯＣ−アミノアルキル基、及びシクロアルキル基からなる群から選択されるか、又は共に結合して２〜５個の炭素原子を含有する複素環を形成し、
ＲＣは、アルキル基、アミノ基、ハロアルキル基、アミノアルキル基、ＢＯＣ−アミノアルキル基、及びシクロアルキル基からなる群から選択され、
Ｘ２は、水素、ヒドロキシル基、アルキルアミノ基、アルキルアミド基、又はヒドロキシアルキル基であり、
Ｘ３及びＸ４は、独立して、水素、ヒドロキシル基、アミノ基、アミド基、アジド基、ハロ基、アルキル基、アルコキシ基、カルボキシ基、ニトリロ基、ニトロ基、トリフルオロ基、アリール基、アルカリル基、チオ基、チオエステル基、チオエーテル基、−ＯＣＯＰｈ、又は−ＯＣ（＝Ｓ）ＯＰｈであり、或いはＸ３及びＸ４は共に酸素であって、＞Ｃ＝Ｓに結合して５員環を形成するか、或いはＸ２及びＸ３は式（ＩＩＩ）の環を形成し：
【化３】
2008519029.tif 000012
ここで、Ｒ’及びＲ”は、独立してアルキル基を表し、
Ｒ２は、水素、ハロ基、アルキルエーテル基、アミノ基、ヒドラジド基、アルキルアミノ基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、ピリジルチオ基、アルケニル基、アルキニル基、チオ基、及びアルキルチオ基からなる群から選択され、
Ｒ３は、式：−ＮＲ４Ｒ５で表される基であり、ここで
Ｒ４は、水素原子、又はアルキル基、置換アルキル基、及びアリール−ＮＨ−Ｃ（Ｚ）−基（ここで、Ｚは、Ｏ、Ｓ又はＮＲａであり、Ｒａは前記と同様の定義を有する）からなる群から選択され、Ｒ４が水素である場合には、
Ｒ５は、非置換、又は１つ若しくはそれ以上の位置をアルキル基、アミノ基、ハロ基、ハロアルキル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、アセトアミド基、アルコキシ基、及びスルホン酸又はそれらの塩からなる群から選択される置換基によって置換されたＲ−及びＳ−１−フェニルエチル基、ベンジル基、フェニルエチル基、又はアニリド基；ベンゾジオキサンメチル基、フルフリル基、Ｌ−プロピルアラニル基、アミノベンジル基、β−アラニルアミノベンジル基、Ｔ−ＢＯＣ−β−アラニルアミノベンジル基、フェニルアミノ基、カルバモイル基、フェノキシ基、又はシクロアルキル基からなる群から選択され；或いはＲ５は下記の式の基であり：
【化４】
2008519029.tif 000013
或いは、Ｒ４がアルキル又はアリール−ＮＨ−Ｃ（Ｚ）−基である場合に、Ｒ５は、ヘテロアリール−ＮＲａ−Ｃ（Ｚ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｚ）−、アルカリル−ＮＲａ−Ｃ（Ｚ）−、アルカリル−Ｃ（Ｚ）−、アリール−ＮＲ−Ｃ（Ｚ）−、及びアリール−Ｃ（Ｚ）−、（ここでＺは酸素、スルホ基、又はアミン基である）からなる群から選択されるか、又は前記化合物の生理学的に許容される塩である、
の化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ａ３ＡＲアゴニストが一般式（ＩＶ）： 
【化５】
2008519029.tif 000014
ここで、Ｘ１、Ｒ２、及びＲ４は、請求項３における定義と同様である、
のヌクレオシド誘導体、及び当該化合物の生理学的に許容される塩である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ａ３ＡＲアゴニストが、Ｎ６−２−（４−アミノフェニル）エチルアデノシン（ＡＰＮＥＡ）、Ｎ６−（４−アミノ−３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−（Ｎ−メチルウロンアミド）（ＡＢ−ＭＥＣＡ）、Ｎ６−（３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド（ＩＢ−ＭＥＣＡ）、及び２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）−アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド（ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ）から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ａ３ＡＲアゴニストがＩＢ−ＭＥＣＡである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳類の被検対象における骨吸収を阻害するのに有効な量のＡ３ＡＲアゴニストを含む、加速骨吸収治療用医薬組成物。
【請求項１２】
経口投与に適した投与形体を有する請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
炎症誘発骨吸収の治療用である請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
炎症性関節炎により誘発された骨吸収の治療用である請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記Ａ３ＡＲアゴニストが一般式（Ｉ）の範囲内：
【化６】
2008519029.tif 000015
ここでＲ１は、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はシアノアルキル基、或いは下記の一般式（ＩＩ）の基であり：
【化７】
2008519029.tif 000016
ここで、Ｙは、酸素原子、硫黄原子、又はＣＨ２であり、
Ｘ１は、Ｈ、アルキル基、ＲａＲｂＮＣ（＝Ｏ）−、又はＨＯＲＣであって、ここで
Ｒａ及びＲｂは、同一又は相違しており、水素、アルキル基、アミノ基、ハロアルキル基、アミノアルキル基、ＢＯＣ−アミノアルキル基、及びシクロアルキル基からなる群から選択されるか、又は共に結合して２〜５個の炭素原子を含有する複素環を形成し、
ＲＣは、アルキル基、アミノ基、ハロアルキル基、アミノアルキル基、ＢＯＣ−アミノアルキル基、及びシクロアルキル基からなる群から選択され、
Ｘ２は、水素、ヒドロキシル基、アルキルアミノ基、アルキルアミド基、又はヒドロキシアルキル基であり、
Ｘ３及びＸ４は、独立して、水素、ヒドロキシル基、アミノ基、アミド基、アジド基、ハロ基、アルキル基、アルコキシ基、カルボキシ基、ニトリロ基、ニトロ基、トリフルオロ基、アリール基、アルカリル基、チオ基、チオエステル基、チオエーテル基、−ＯＣＯＰｈ、又は−ＯＣ（＝Ｓ）ＯＰｈであり、或いはＸ３及びＸ４は共に酸素であって、＞Ｃ＝Ｓに結合して５員環を形成するか、或いはＸ２及びＸ３は式（ＩＩＩ）の環を形成し：
【化８】
2008519029.tif 000017
ここで、Ｒ’及びＲ”は、独立してアルキル基を表し、
Ｒ２は、水素、ハロ基、アルキルエーテル基、アミノ基、ヒドラジド基、アルキルアミノ基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、ピリジルチオ基、アルケニル基、アルキニル基、チオ基、及びアルキルチオ基からなる群から選択され、
Ｒ３は、式：−ＮＲ４Ｒ５で表される基であり、ここで
Ｒ４は、水素原子、又はアルキル基、置換アルキル基、及びアリール−ＮＨ−Ｃ（Ｚ）−基（ここで、Ｚは、Ｏ、Ｓ又はＮＲａであり、Ｒａは前記と同様の定義を有する）からなる群から選択され、Ｒ４が水素である場合には、
Ｒ５は、非置換、又は１つ若しくはそれ以上の位置をアルキル基、アミノ基、ハロ基、ハロアルキル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、アセトアミド基、アルコキシ基、及びスルホン酸又はそれらの塩からなる群から選択される置換基によって置換されたＲ−及びＳ−１−フェニルエチル基、ベンジル基、フェニルエチル基、又はアニリド基；ベンゾジオキサンメチル基、フルフリル基、Ｌ−プロピルアラニル基、アミノベンジル基、β−アラニルアミノベンジル基、Ｔ−ＢＯＣ−β−アラニルアミノベンジル基、フェニルアミノ基、カルバモイル基、フェノキシ基、又はシクロアルキル基からなる群から選択され；或いはＲ５は下記の式の基であり：
【化９】
2008519029.tif 000018
或いは、Ｒ４がアルキル又はアリール−ＮＨ−Ｃ（Ｚ）−基である場合に、Ｒ５は、ヘテロアリール−ＮＲａ−Ｃ（Ｚ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｚ）−、アルカリル−ＮＲａ−Ｃ（Ｚ）−、アルカリル−Ｃ（Ｚ）−、アリール−ＮＲ−Ｃ（Ｚ）−、及びアリール−Ｃ（Ｚ）−、（ここでＺは酸素、スルホ基、又はアミン基である）からなる群から選択されるか、又は前記化合物の生理学的に許容される塩である、
の化合物である請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記Ａ３ＡＲアゴニストが一般式（ＩＶ）： 
【化１０】
2008519029.tif 000019
ここで、Ｘ１、Ｒ２、及びＲ４は、請求項３における定義と同様である、
のヌクレオシド誘導体、及び当該化合物の生理学的に許容される塩である請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記Ａ３ＡＲアゴニストが、Ｎ６−２−（４−アミノフェニル）エチルアデノシン（ＡＰＮＥＡ）、Ｎ６−（４−アミノ−３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−（Ｎ−メチルウロンアミド）（ＡＢ−ＭＥＣＡ）、Ｎ６−（３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド（ＩＢ−ＭＥＣＡ）、及び２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）−アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド（ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ）から選択される請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記Ａ３ＡＲアゴニストがＩＢ−ＭＥＣＡである請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
加速骨吸収治療用医薬組成物を製造するためのＡ３ＡＲアゴニストの使用。
【請求項２０】
経口投与に適切な組成物を製造するための請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
炎症誘発骨吸収治療用組成物を製造するための請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記組成物が炎症性関節炎により誘発された骨吸収の治療用である請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記Ａ３ＡＲアゴニストが一般式（Ｉ）の範囲内： 
【化１１】
2008519029.tif 000020
ここでＲ１は、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はシアノアルキル基、或いは下記の一般式（ＩＩ）の基であり：
【化１２】
2008519029.tif 000021
ここで、Ｙは、酸素原子、硫黄原子、又はＣＨ２であり、
Ｘ１は、Ｈ、アルキル基、ＲａＲｂＮＣ（＝Ｏ）−、又はＨＯＲＣであって、ここで
Ｒａ及びＲｂは、同一又は相違しており、水素、アルキル基、アミノ基、ハロアルキル基、アミノアルキル基、ＢＯＣ−アミノアルキル基、及びシクロアルキル基からなる群から選択されるか、又は共に結合して２〜５個の炭素原子を含有する複素環を形成し、
ＲＣは、アルキル基、アミノ基、ハロアルキル基、アミノアルキル基、ＢＯＣ−アミノアルキル基、及びシクロアルキル基からなる群から選択され、
Ｘ２は、水素、ヒドロキシル基、アルキルアミノ基、アルキルアミド基、又はヒドロキシアルキル基であり、
Ｘ３及びＸ４は、独立して、水素、ヒドロキシル基、アミノ基、アミド基、アジド基、ハロ基、アルキル基、アルコキシ基、カルボキシ基、ニトリロ基、ニトロ基、トリフルオロ基、アリール基、アルカリル基、チオ基、チオエステル基、チオエーテル基、−ＯＣＯＰｈ、又は−ＯＣ（＝Ｓ）ＯＰｈであり、或いはＸ３及びＸ４は共に酸素であって、＞Ｃ＝Ｓに結合して５員環を形成するか、或いはＸ２及びＸ３は式（ＩＩＩ）の環を形成し：
【化１３】
2008519029.tif 000022
ここで、Ｒ’及びＲ”は、独立してアルキル基を表し、
Ｒ２は、水素、ハロ基、アルキルエーテル基、アミノ基、ヒドラジド基、アルキルアミノ基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、ピリジルチオ基、アルケニル基、アルキニル基、チオ基、及びアルキルチオ基からなる群から選択され、
Ｒ３は、式：−ＮＲ４Ｒ５で表される基であり、ここで
Ｒ４は、水素原子、又はアルキル基、置換アルキル基、及びアリール−ＮＨ−Ｃ（Ｚ）−基（ここで、Ｚは、Ｏ、Ｓ又はＮＲａであり、Ｒａは前記と同様の定義を有する）からなる群から選択され、Ｒ４が水素である場合には、
Ｒ５は、非置換、又は１つ若しくはそれ以上の位置をアルキル基、アミノ基、ハロ基、ハロアルキル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、アセトアミド基、アルコキシ基、及びスルホン酸又はそれらの塩からなる群から選択される置換基によって置換されたＲ−及びＳ−１−フェニルエチル基、ベンジル基、フェニルエチル基、又はアニリド基；ベンゾジオキサンメチル基、フルフリル基、Ｌ−プロピルアラニル基、アミノベンジル基、β−アラニルアミノベンジル基、Ｔ−ＢＯＣ−β−アラニルアミノベンジル基、フェニルアミノ基、カルバモイル基、フェノキシ基、又はシクロアルキル基からなる群から選択され；或いはＲ５は下記の式の基であり：
【化１４】
2008519029.tif 000023
或いは、Ｒ４がアルキル又はアリール−ＮＨ−Ｃ（Ｚ）−基である場合に、Ｒ５は、ヘテロアリール−ＮＲａ−Ｃ（Ｚ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｚ）−、アルカリル−ＮＲａ−Ｃ（Ｚ）−、アルカリル−Ｃ（Ｚ）−、アリール−ＮＲ−Ｃ（Ｚ）−、及びアリール−Ｃ（Ｚ）−、（ここでＺは酸素、スルホ基、又はアミン基である）からなる群から選択されるか、又は前記化合物の生理学的に許容される塩である、
の化合物である請求項１９に記載の使用。
【請求項２４】
前記Ａ３ＡＲアゴニストが一般式（ＩＶ）： 
【化１５】
2008519029.tif 000024
ここで、Ｘ１、Ｒ２、及びＲ４は、請求項３における定義と同様である、
のヌクレオシド誘導体、及び当該化合物の生理学的に許容される塩である請求項１９に記載の使用。
【請求項２５】
前記Ａ３ＡＲアゴニストが、Ｎ６−２−（４−アミノフェニル）エチルアデノシン（ＡＰＮＥＡ）、Ｎ６−（４−アミノ−３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−（Ｎ−メチルウロンアミド）（ＡＢ−ＭＥＣＡ）、Ｎ６−（３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド（ＩＢ−ＭＥＣＡ）、及び２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）−アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド（ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ）から選択される請求項１９に記載の使用。
【請求項２６】
前記Ａ３ＡＲアゴニストがＩＢ−ＭＥＣＡである請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加速骨損失を治療又は予防するための治療的方法に関するものである
【背景技術】
【０００２】
ヒト及び他の哺乳類における様々な疾患は加速骨吸収に関係する又はこれを伴うものである。そのような疾患には、骨粗鬆症、ページェット病、義肢周囲骨損失又は骨溶解、及び悪性高カルシウム血症が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの疾患の中で最も一般的なものが、閉経後の女性に最も頻繁に発症する骨粗鬆症である。骨損失を伴う疾患は慢性的症状であるため、適切な療法は一般的に慢性的な治療を必要とするものと考えられている。
【０００３】
慢性関節リューマチ（ＲＡ）は、骨損失を伴う慢性的炎症性自己免疫疾患である。ＲＡは成人人口の１％を冒し、吻合部細胞の増殖、並びに慢性的滑膜炎及び軟骨、骨、腱、靭帯の破壊につながる、大量の造血細胞の関節への侵入に特徴付けられる。ＲＡ患者には骨容量の減少及び骨ターンオーバーの低下が見られ、これは骨粗鬆症に更に進展する（非特許文献１）。この進行性の関節損傷は機能の低下及び不能を生じる結果となる（非特許文献２）。患者のおよそ８０％が発症から２０年以内に身体障害者となる（非特許文献３）。
【０００４】
ＲＡ及び加速骨吸収を伴う他の疾患における骨の破壊が主に破骨細胞によって媒介され、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の１種であるＮＦ−κＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）レセプタ活性化因子が破骨細胞をそれらの前駆体細胞から分化するため並びに炎症部位において破骨細胞の発生を活性化させることに加えて破骨細胞の活性及び生存率を向上させるために必要なものであることは文献により十分に立証されている（非特許文献４）。ＲＡＮＫＬは関節炎を発症している関節の破骨細胞、吻合部細胞、滑膜繊維芽細胞、Ｔ細胞の外側細胞膜で多く発現される（非特許文献５）。ＲＡＮＫＬは破骨細胞前駆体に存在するレセプタであるＲＡＮＫに結合してＰＩ３Ｋ−ＰＫＢの下流シグナル経路を誘発し、転写因子であるＮＦ−κＢを活性化させる（非特許文献６）。
【０００５】
累積された証拠によって、アデノシンが主にＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＩＬ−６等の炎症誘発性サイトカインの生成を妨げることによって炎症を制限するのに重要な役割を果たすことが示されている（非特許文献７、非特許文献８）。活性化された又は代謝的に刺激された細胞から細胞外の環境に放出されたアデノシンは、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、及びＡ３を指向する選択的Ｇタンパク質付随細胞膜レセプタに結合する（非特許文献９）。アデノシンの抗炎症効果はＡ３ＡＲを通して媒介されることが見出されている（非特許文献１０）。特に、高選択性Ａ３ＡＲアゴニストであるＩＢ−ＭＥＣＡは、異なる実験動物モデルにおいて、アジュバント誘発関節炎（ＡＩＡ）、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、及びトロポミオシン誘発関節炎を含む、臨床的及び病理学的な関節炎の発症を妨げるのに効果的であることが示されている。作用のメカニズムはＮＦ−κＢ、ＴＮＦ−α、及びＭＩＰ−１αの下方制御を伴うものである（非特許文献１１）。
【特許文献１】米国特許第５７７３４２３号明細書
【特許文献２】米国特許第５６８８７７４号明細書
【特許文献３】米国特許第５５７３７７２号明細書
【特許文献４】米国特許第５４４３８３６号明細書
【特許文献５】米国特許第６０４８８６５号明細書
【特許文献６】国際公開第９５/０２６０４号パンフレット
【特許文献７】国際公開第９９/２０２８４号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９９/０６０５３号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９７/２７１７３号パンフレット
【特許文献１０】米国特許出願第０９/７００７５１号明細書（国際公開第０１/１９３６０号に対応）
【非特許文献１】Perez-Edo L, et al. J. Scand J Rheumatol., 31:285-290 (2002)
【非特許文献２】Harris ED. N. Eng.l J. Med., 322:1277-1289 (1990)
【非特許文献３】Paulos CM, et al. Adv. Drug. Deliv. Rev., 56:1205-1217 (2004)
【非特許文献４】Hsu H, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96:3540-3545 (1990)
【非特許文献５】Kwan Tat S, et al. Cytokine Growth Factor Rev., 5:49-60 (2004); Kotake S, et al. Arthritis. Rheum., 44:1003-1012 (2001)
【非特許文献６】Udagawa N, et al. Arthritis. Res., 4:281-289. (2002); Gingery A, et al. J. Cell. Biochem., 89:165-179 (2003)
【非特許文献７】Cronstein, B.N.J. Appl. Physiol. 76:5-13 (1994); Eigler, A., et al. Scand. J. Immunol., 45:132-139 (1997)
【非特許文献８】Mabley, J., et al. Eur. J. Pharmacol. 466:322-329 (2003)
【非特許文献９】Stiles, G.L., Clin. Res. 38:10-18 (1990)
【非特許文献１０】Szabo, C., et al. Br. J. Pharmacol. 125:379-387 (1998)
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【非特許文献１４】Fang X. et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3 by protein kinase A., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA, 97:11960-11965 (2000)
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【非特許文献１６】Ferkey, D.M., and Kimelman, D. GSK-3:: New Thoughts on an Old Enzyme, Dev. Biol., 225:471-479 (2000)
【非特許文献１７】Bonvini, P., et al. Nuclear beta-catenin displays GSK-3beta- and APC-independent proteasome sensitivity in melanoma cells, Biophys. Acta., 1495:308-318 (2000)
【非特許文献１８】Olah, M.E. and Stiles G.L, The role of receptor structure in determining adenosine receptor activity, Pharmacol. Ther., 85:55-75 (2000)
【非特許文献１９】Szabo C., et al. Suppression of macrophage inflammatory protein (MIP)-1α producing and collagen induced arthritis by adenosine receptor agonists, British Journal of Pharmacology, 125:379-387 (1998)
【非特許文献２０】Nicole C. Walsh and Ellen M. Gravallese. Bone loss in inflammatory arthritis: Mechanism and treatment strategies. Current Opinion in Rheumatology, 16:419-427 (2004)
【非特許文献２１】Zang Hee Lee and Hong-Hee Kim. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts., Biochemical and Biophysical Research Communication 305:211-214 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は高選択性Ａ３ＡＲアゴニストであるＩＢ−ＭＥＣＡがアジュバント誘発関節炎（ＡＩＡ）のラットモデルにおける骨損失を妨げるという驚くべき発見に基づくものである。以下に例証されるように、この選択性アゴニストは、ＮＦ−κＢ、ＲＡＮＫＬ等の鍵となる信号伝達タンパク質を下方制御して、骨損失を防止するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、その第一実施態様において、本発明は治療が必要な披見哺乳動物に、骨吸収を阻害するのに効果的な量のＡ３アデノシン・レセプタ・アゴニスト（Ａ３ＡＲアゴニスト）を投与することを含む、披見哺乳動物の加速骨吸収を治療する方法を提供するものである。
【０００８】
ここで「治療」とは、治癒的及び予防的な治療を意味する。治療は、特に、加速骨吸収及び骨溶解性病巣の進行の阻害を包含するものである。骨吸収の治療は、これらに限定されるものではないが、骨吸収に伴う所望されない症状（例えば、痛み、骨折、脊髄圧迫、及び高カルシウム血症）の改善、そのような症状の発現前にその発症を防ぐこと、骨損失に伴う疾患の慢性期に引き起こされる回復不能な損傷の遅延又は防止（例えば、骨溶解性病巣及び骨折の進行の防止）、骨吸収に伴う疾患の発病度の減少、骨回復の向上、骨吸収の進行の防止、骨組織の壊死の防止、患者の健康状態の向上、を含むものである。向上は例えば以下の事項−骨質量の増加、骨吸収に伴う痛みの緩和、骨折及びその他の減少−の１つ又はそれ以上によって明らかになる。本発明によれば、治療は上記の二つ以上の組み合わせをも包含するものである。
【０００９】
本発明のコンテクストにおいて、「加速骨吸収」という語は、「加速骨損失」、「加速骨破壊」、及び「破骨性骨」と互換性があり、破骨性骨の進行に関与する全ての疾患、障害、又は病理的症状を指し、炎症によって誘発される加速代謝プロセスの結果から生じる代謝性骨疾患又は他の全ての病理的症状の何れかであることができる。骨吸収が関係する疾患の非制限的例には、骨粗鬆症、ページェット病、義肢周囲骨損失、骨壊死（障害、血液供給、又は疾病による骨組織の壊死又は破壊）、ミエローマ骨疾患、骨溶解、及び悪性高カルシウム血症が含まれる。
【００１０】
本発明のコンテクストにおいて、「Ａ３アデノシン・レセプタ・アゴニスト」（Ａ３ＡＲアゴニスト）という語は、Ａ３アデノシンレセプタ（Ａ３ＡＲ）に特異的に結合することによって、当該レセプタを全体的又は部分的に活性化させることのできる全ての化合物を意味する。従って、Ａ３ＡＲアゴニストは、Ａ３ＡＲに結合して活性化させることによってその主要な効果を発揮する化合物である。Ａ３ＡＲアゴニストの好ましい実施形態については後に説明する。
【００１１】
本発明のコンテクストにおいて、Ａ３ＡＲアゴニストの「量」（「有効量」とも言う）という語は、骨吸収及び骨吸収を伴う疾患の進行から哺乳動物を保護するのに有効な量を指す。本発明によれば、所望される保護を提供するために有効な量は、様々な量のＡ３ＡＲアゴニストを複数の被検体に投与し、生理学的応答（例えば、医療的に有益な効果の幾つかを組み合わせた集積「ＳＳインデックス」）を量の関数として計算することによって容易に求めることができる。その代わりに、場合に応じて適切な動物モデルを用いて実験を行い、複数ある変換方法の一つを使用してヒトに当てはめるか、血漿濃度又は時間に対する血漿濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）を測定し、匹敵する血漿濃度又はＡＵＣを生じるような有効服用量を計算することによって、有効量を決定することができる。知られているように、有効量は、投与形態（例えば、経口投与は一定の血漿レベル又はＡＵＣを達成するのに静脈投与よりも高い服用量を必要とする場合がある）、年齢、体重、体表面積、性別、健康状態、被検者の遺伝要素、他の投与薬物、等の様々な要素に依存することがある。
【００１２】
以下において、特に断りがない限り、投与量は重量/Ｋｇで示されており、これはそれぞれの投与において被検体の体重１キログラムに対して投与されたＡ３ＡＲアゴニストの重量を意味する。例えば、ｍｇ/Ｋｇ及びμｇ/Ｋｇは、それぞれ、治療される被検体の体重１キログラムに対して投与される剤のミリグラム、及びマイクログラムを指す。
【００１３】
マウスにおける有効量は一般的に約１０００μｇ/Ｋｇ未満、好ましくは約５００μｇ/Ｋｇ未満である。一般的な投与量は、約１μｇ/Ｋｇ〜約２００μｇ/Ｋｇであり、好ましい投与量は約５μｇ/Ｋｇ〜約１５０μｇ/Ｋｇである。これに対応するヒトにおける有効量は、以下に説明される手法によって求めることのできる、マウスにおいて観察される量に対するヒト対応量である。
【００１４】
「ヒト対応」という語は、０．００１〜１ｍｇ/Ｋｇの量のＡ３ＡＲアゴニストをマウス又はラットに投与した際に見られるのと同様の効果をヒトにおいて生じさせる投与量を意味する。知られているように、この投与量は、体重、体表面積、活性成分の吸収率、剤のクリアランス速度、新陳代謝速度、その他の幾多のパラメータに依存し、それらに基づいて決定することができるものである。
【００１５】
ヒト対応量は、以下に説明されるような多数の変換基準に基づいて計算することができ、或いは血漿レベルが上記のように特定された量をマウスに投与した後のものと類似したものとなる投与量、若しくは特定の投与範囲においてマウスと類似した総合暴露量（即ち、時間を関数とした当該剤の血漿レベルの曲線下面積（ＡＵＣ））を生じる投与量の何れかであることができる。
【００１６】
ラットに投与したＸｍｇ/Ｋｇの量を、斯界に広く知られる適応可能な変換式の一つを用いて、他の種（特にヒト）における対応量に変換することができることは良く知られている。変換式の例は以下の通りである。
変換Ｉ：
【００１７】
【表１】
2008519029.tif 000003
【００１８】
体表面積依存投与量変換：ラット（１５０ｇ）からヒト（７０ｋｇ）へは、ラット投与量の１/７である。これは、例えば、ラットにおける０．００１〜１ｍｇ/Ｋｇは、ヒトにおける約０．１４〜１４０μｇ/Ｋｇに対応することを意味する。ヒトの平均体重が７０Ｋｇであると仮定して、これは約０．０１〜約１０ｍｇのヒトへの絶対投与量と解される。
【００１９】
変換ＩＩ：
下記の変換因子：マウス＝３、ラット＝６７。変換因子を動物の体重に掛けることによって、ｍｇ/Ｋｇからヒト対応投与量のｍｇ/ｍ２へ変換。
【００２０】
【表２】
2008519029.tif 000004
【００２１】
この式によれば、ラットの０．００１〜１ｍｇ/Ｋｇに対するヒトの対応量は０．１６〜６４μｇ/Ｋｇであり、即ち、体重が約７０Ｋｇのヒトに対する絶対投与量は、変換Ｉに示される範囲と類似して、約０．０１１〜約１１ｍｇである。
【００２２】
変換ＩＩＩ：
変換の他の方法は、動物への投与後に見られるのと同様の血漿レベル又はＡＵＣを生じる投与量を設定することによる。例えば、マウスへのＩＢ−ＭＥＣＡの経口投与後に為された測定に基づいて、及びＩＢ−ＭＥＣＡが健康な男性ボランティアに投与された臨床実験において人間に対して行われた測定に基づいて、マウスにおける１μｇ/Ｋｇ〜１０００μｇ/Ｋｇの投与量が、ヒトにおける約０．１４〜１４０μｇ/Ｋｇの投与量、即ち、７０Ｋｇの人間において０．０１〜１０ｍｇの総合投与量、に対応すると結論付けることができる。
【００２３】
上記の変換方法に基づき、例えばＩＢ−ＭＥＣＡ及びＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡの２種類の特定のＡ３ＡＲアゴニストについての好ましい投与範囲は、４ｍｇ未満、典型的には約０．０１〜約２ｍｇ（それぞれ約０．１４〜２８μｇ/Ｋｇ）の範囲、望ましくは約０．１〜約１．５ｍｇ（それぞれ約１．４〜２１μｇ/Ｋｇ）の範囲である。この量を１日に１回、２回、又は時には数回投与することができる。マウスでの半減期が僅か１．５時間であるのに比較して、ヒトでの実験において（データは示さず）ＩＢ−ＭＥＣＡのレベルはヒトの血漿中で約８〜１０時間の半減期で減衰し、一日に複数回投与する場合には、時に累積効果による投与量の修正が必要である（前回のもののレベルが減衰する前に次が投与されることにより、一回の投与による場合に比較して血漿レベルでの蓄積が生じる）。かかるヒトでの試行に基づき、１日に一回又は２回の投与が好ましい投与体系と思われる。しかしながら、これは他の投与体系を除外するものではない。
【００２４】
本発明の範囲には、当該治療方法に加えて、加速骨吸収の治療用医薬組成物であって、活性成分としてのＡ３ＡＲアゴニストと薬学的に許容されるキャリヤとを含み、Ａ３ＡＲアゴニストの量が当該治療を必要とする被検体において骨吸収を阻害するのに効果を有する量である組成物も含まれる。
【００２５】
本発明のコンテクストにおいて、「薬学的に許容されるキャリヤ」という語は、Ａ３ＡＲアゴニストと反応せず、希釈剤又はキャリヤとして製剤に加えることができるか、又は製剤に形態又はコンシステンシーを付与する全ての不活性な非毒性物質を意味する。
【００２６】
また、キャリヤは、製剤に安定性、無菌性、等張性を提供する物質（例えば、抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、及び緩衝剤）、微生物の活動を妨げる物質（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、等の抗菌、抗カビ剤）、製剤に可食性の香り又は色を提供する物質、を含む。
【００２７】
また、キャリヤは、時に、Ａ３ＡＲアゴニストの標的組織への到達又は浸透の向上、Ａ３ＡＲアゴニストの安定性の改善、クリアランス速度の低下、緩効性の付与、所望されない副作用の減少、等の効果を有することができる。
【００２８】
更に、本発明は、加速骨吸収の治療用医薬組成物を調製するためのＡ３ＡＲアゴニストの使用を包含するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
骨形成(osteogenesis)には３つの主要な段階−細胞外有機基質（類骨）の生成、骨形成のための基質の石灰化、及び吸収及び再形成による骨造形−が関与する。造骨細胞、骨細胞、及び破骨細胞の細胞活動はこの工程に必須のものである。造骨細胞は骨基質の膠原性前駆体を合成し、その石灰化を調節する。骨形成の工程が進行すると、造骨細胞は周囲の石灰化基質内の僅かな空間（小腔）に封入され骨細胞となる。骨格の成長と機械的機能としての要求に応えるために、破骨細胞による骨吸収及び造骨細胞による再形成という連結した工程によって骨は動的な再造形を経る。
【００３０】
幾つかの代謝性骨疾患（例えば、上皮小体亢進症、ページェット病、等）は、形成の増加及び破骨活動の増加によって特徴付けられる。加えて、破骨細胞及び破骨細胞類似細胞は、例えば炎症性関節炎（リウマチ性関節炎及び乾癬性関節炎、等）における炎症誘発骨損失の媒介において重要な効果細胞であることが確認されている。
【００３１】
本発明は、加速骨吸収を阻害する方法を提供することによって、異常な骨損失による結果を治療又は防止することを目的とする。従って、その第一実施態様において、治療が必要な披見哺乳動物に、骨吸収を阻害するのに効果的な量のＡ３アデノシン・レセプタ・アゴニスト（Ａ３ＡＲアゴニスト）を投与することを含む、披見哺乳動物の加速骨吸収を治療する方法が提供される。
【００３２】
上に定義されるように、Ａ３ＡＲアゴニストはＡ３ＡＲに結合し活性化させることによってその主要な効果を発揮する化合物であることが好ましい。一つの実施形態において、Ａ３ＡＲアゴニストのヒトアデノシンＡ３レセプタに対する結合親和性（Ｋｉ）は、１００nＭ未満、一般的には５０nＭ未満、好ましくは２０nＭ未満、より好ましくは１０nＭ未満、理想的には５nＭ未満の範囲である。この実施形態において、ヒトＡ３Ｒ対するＫｉが、２nＭ未満、望ましくは１nＭ未満、のＡ３ＡＲアゴニストが好ましい。
【００３３】
幾つかのＡ３ＡＲアゴニストは、より親和性の低い（即ち、Ｋｉの高い）他のレセプタとも作用して活性化させることができることには注意すべきである。本発明のコンテクストにおいて、ある化合物のＡ３Ｒに対する親和性が他の全てのアデノシンレセプタ(即ち、Ａ１、Ａ２a、及びＡ２ｂ)に対する親和性よりも、少なくとも３倍（即ち、Ａ３ＡＲに対するそのＫｉが少なくとも３倍低い）、好ましくは１０倍、望ましくは２０倍、最も好ましくは少なくとも５０倍より大きい場合に、当該化合物はＡ３ＡＲアゴニスト(即ち、Ａ３ＡＲに結合し活性化させることによってその主要な効果を発揮する化合物)であると考えられる。
【００３４】
ヒトＡ３ＡＲに対するＡ３ＡＲアゴニストの親和性、並びに他のヒトアデノシンレセプタ(Ａ１、Ａ２a、及びＡ２ｂ)に対するその相対的親和性は、結合実験等の多数のアッセイによって求めることができる。結合実験の例には、レセプタを含む膜を用い、結合した放射性アゴニストをＡ３ＡＲアゴニストが置き換える能力を測定する方法、それぞれのヒトアデノシンレセプタを示す細胞を用い、機能アッセイにおいて、ｃＡＭＰレベルの増加又は減少によってアデニレートシクラーゼの効果を測定する等のダウンストリーム・シグナリングをＡ３ＡＲアゴニストが活性化又は非活性化させる能力を測定する方法、等が含まれる。Ａ３ＡＲアゴニストの投与レベルがその血中レベルがＡ１、Ａ２a、及びＡ２ｂアデノシンレセプタのＫｉレベルに近づくレベルに達するように増加されるならば、投与後にＡ３ＡＲの活性化に加えてこれらのレセプタの活性化が起こる場合があることは明らかである。従って、その血中レベルが実質的にＡ３ＡＲのみを活性化させるような投与量でＡ３ＡＲアゴニストが投与されることが好ましい。
【００３５】
幾つかのＡ３ＡＲアゴニストの特徴及びそれらの調製方法は、とりわけ特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、及び出願人による係属中の特許出願である特許文献１０に詳細に記載されており、それら全ての開示がここに援用される。
【００３６】
本発明の一つの実施形態において、Ａ３ＡＲアゴニストはＡ３ＡＲに結合して活性化することによりその主要な効果を発揮する化合物であり、下記の一般式（Ｉ）の範囲内のプリン誘導体、及び当該化合物の生理学的に許容される塩である。
【００３７】
【化１６】
2008519029.tif 000005
【００３８】
ここでＲ１は、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はシアノアルキル基、或いは下記の一般式（ＩＩ）の基である：
【００３９】
【化１７】
2008519029.tif 000006
【００４０】
ここで、Ｙは酸素原子、硫黄原子、又はＣＨ２であり、
Ｘ１はＨ、アルキル基、ＲａＲｂＮＣ（＝Ｏ）−、又はＨＯＲＣであって、ここで
Ｒａ及びＲｂは同一又は相違しており、水素、アルキル基、アミノ基、ハロアルキル基、アミノアルキル基、ＢＯＣ−アミノアルキル基、及びシクロアルキル基からなる群から選択されるか、又は共に結合して２〜５個の炭素原子を含有する複素環を形成し、
ＲＣはアルキル基、アミノ基、ハロアルキル基、アミノアルキル基、ＢＯＣ−アミノアルキル基、及びシクロアルキル基からなる群から選択され、
Ｘ２はＨ、ヒドロキシル基、アルキルアミノ基、アルキルアミド基、又はヒドロキシアルキル基であり、
Ｘ３及びＸ４は、独立して、水素、ヒドロキシル基、アミノ基、アミド基、アジド基、ハロ基、アルキル基、アルコキシ基、カルボキシ基、ニトリロ基、ニトロ基、トリフルオロ基、アリール基、アルカリル基、チオ基、チオエステル基、チオエーテル基、−ＯＣＯＰｈ、又は−ＯＣ（＝Ｓ）ＯＰｈ、であり、或いはＸ３及びＸ４は共に酸素であって、＞Ｃ＝Ｓに結合して５員環を形成するか、或いはＸ２及びＸ３は式（ＩＩＩ）の環を形成する。
【００４１】
【化１８】
2008519029.tif 000007
【００４２】
ここで、Ｒ’及びＲ”は独立してアルキル基を表し、
Ｒ２は、水素、ハロ基、アルキルエーテル基、アミノ基、ヒドラジド基、アルキルアミノ基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、ピリジルチオ基、アルケニル基、アルキニル基、チオ基、及びアルキルチオ基、からなる群から選択され、
Ｒ３は、式：−ＮＲ４Ｒ５で表される基であり、ここで
Ｒ４は、水素原子、又はアルキル基、置換アルキル基、及びアリール−ＮＨ−Ｃ（Ｚ）−基（ここで、ＺはＯ、Ｓ、又はＮＲａであり、Ｒａは上記と同様の定義を有する）からなる群から選択され、Ｒ４が水素である場合には、
Ｒ５は、非置換、又は１つ若しくはそれ以上の位置をアルキル基、アミノ基、ハロ基、ハロアルキル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、アセトアミド基、アルコキシ基、及びスルホン酸又はそれらの塩からなる群から選択される置換基によって置換されたＲ−及びＳ−１−フェニルエチル基、ベンジル基、フェニルエチル基、又はアニリド基；ベンゾジオキサンメチル基、フルフリル基、Ｌ−プロピルアラニル基、アミノベンジル基、β−アラニルアミノベンジル基、Ｔ−ＢＯＣ−β−アラニルアミノベンジル基、フェニルアミノ基、カルバモイル基、フェノキシ基、又はシクロアルキル基からなる群から選択され；或いはＲ５は下記の式の基である：
【００４３】
【化１９】
2008519029.tif 000008
【００４４】
或いは、Ｒ４がアルキル基又はアリール−ＮＨ−Ｃ（Ｚ）−基である場合に、Ｒ５は、ヘテロアリール−ＮＲａ−Ｃ（Ｚ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｚ）−、アルカリール−ＮＲａ−Ｃ（Ｚ）−、アルカリール−Ｃ（Ｚ）−、アリール−ＮＲ−Ｃ（Ｚ）−、及びアリール−Ｃ（Ｚ）−、（ここでＺは酸素、スルホ基、又はアミン基である）からなる群から選択されるか、又は上記化合物の生理学的に許容される塩である。
【００４５】
一つの好ましい実施形態において、Ａ３ＡＲアゴニストは一般式（ＩＶ）で表されるヌクレオシド誘導体である：
【００４６】
【化２０】
2008519029.tif 000009
【００４７】
ここで、Ｘ１、Ｒ２、及びＲ４は上述の定義のもの、及び当該化合物の生理学的に許容される塩である。
【００４８】
本発明の化合物の置換基の一部を形成する非環状炭水化物基（例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アラールキル基、アルカリール基、アルキルアミン基、等）は、分枝又は非分枝のものであり、１つ又は２〜１２の炭素原子を含むことが好ましい。
【００４９】
ここで用いられる「アルキル」という語は、直鎖又は分枝の全ての飽和炭化水素を指す。ここで用いられる「低アルキル」という語は、主鎖に１〜約１０の炭素原子を含む（直鎖又は分枝）飽和炭化水素を指す。
【００５０】
ここで用いられる「アルケニル」及び「アルキニル」という語は、少なくとも２つの隣接する炭素原子がそれぞれ二重結合又は三重結合によって結合している直鎖又は分枝炭化水素を指す。従って、「低アルケニル」及び「低アルキニル」という語は、主鎖に２〜１０の炭素原子を含む直鎖又は分枝炭化水素を指す。
【００５１】
本発明において用いられるＡ３ＡＲの「生理学的に許容される塩」という語は、斯界に知られる方法によって調製され、医薬業界で通常使用される、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム、及びプロタミン亜鉛の塩を含む、全ての非毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩を意味する。この語は、本発明の化合物を適当な有機酸又は無機酸と反応させることによって一般的に調製される非毒性酸付加塩も含むものである。生じる酸付加塩は、生物学的効果及び遊離塩基の定性的特性を保つものであり、毒性又は望ましくないものではない塩である。例として、とりわけ、鉱酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタリン酸、等に由来する酸が含まれる。有機酸には、とりわけ、酒石酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、リンゴ酸、マロン酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、グリコール酸、グルコン酸、ピルビン酸、コハク酸、サリチル酸、及びｐ−トルエンスルホン酸等のアリールスルホン酸、が含まれる。
【００５２】
本発明の一般式（ＩＶ）に従って用いることのできるＡ３ＡＲアゴニストの特定の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｎ６−２−（４−アミノフェニル）エチルアデノシン（ＡＰＮＥＡ）、Ｎ６−（４−アミノ−３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−（Ｎ−メチルウロンアミド）（ＡＢ−ＭＥＣＡ）、Ｎ６−（３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド（ＩＢ−ＭＥＣＡ）、及び２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド（ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ）、が含まれる。
本発明による好ましいＡ３ＡＲアゴニストはＩＢ−ＭＥＣＡである。
【００５３】
他の実施形態において、Ａ３ＡＲアゴニストは、２−プリン位置がアルコキシ基、アミノ基、アルケニル基、アルキニル基、又はハロゲンによって置換されていてもよい、Ｎ６−ベンジルアデノシン−５’−Ｎ−アルキルウロンアミド−Ｎ１−オキシド、又はＮ６−ベンジルアデノシン−５’−Ｎ−ジアルキルウロンアミド−Ｎ１−オキシド、等のアデノシンのオキシド誘導体である。
【００５４】
加速骨損失は、骨疾患の結果又は炎症の誘発による加速代謝プロセスに起因する場合がある。斯界の当業者であれば、長期の炎症は骨からカルシウムを除去し、骨を弱めて減少させることは理解される。炎症が媒介する骨損失は、歯周病、骨関節炎、関節リウマチ、他の形体の骨粗鬆症、等の様々な疾患において発症する。
【００５５】
従って、その一つの実施形態において、本発明は、炎症により誘発される加速骨吸収の治療に関するものである。好ましい実施形態において、本発明の方法は、炎症性リウマチから生じる加速骨吸収のためのものである。
【００５６】
また、本発明は、上述のように加速骨吸収の治療用医薬組成物に関するものであって、当該組成物は活性成分としてのＡ３ＡＲアゴニストと薬学的に許容されるキャリヤとを含み、Ａ３ＡＲアゴニストの量は当該治療を必要とする被検体において骨吸収を阻害するのに効果を有する量である。
【００５７】
本発明の組成物は、個々の患者の臨床状態、投与の部位及び方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重、及び医師に知られている他の要素を考慮して、適切な医療プラクティスに基づいて投与、服用される。キャリヤの選択は、部分的には、特定の活性成分及び組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって決定される。従って、本発明の医薬組成物は多種多様なものである。
【００５８】
好ましい実施形態において、医薬組成物は経口投与に適した形体を有する。経口投与に適したキャリヤの典型例には、（a）Ａ３ＡＲアゴニストの有効量が水、生理食塩水、天然果汁、アルコール、シロップ、等の希釈剤中に溶解された液体溶液、（ｂ）それぞれが所定量のＡ３ＡＲアゴニストを固体又は粉体として含有する、カプセル（例えば、界面活性剤、潤滑剤、及び不活性充填剤、等を含む、普通、ハード、又はソフトなゼラチンタイプのもの）、錠剤、（Ａ３ＡＲアゴニストがショ糖等の香味剤中に存在する、又はＡ３ＡＲアゴニストがゼラチン及びグリセリン等の不活性ベース中に存在する）ロゼンジ、及びトローチ、（ｃ）粉末、（ｄ）適当な液体中の懸濁剤、（e）適当なエマルション、（ｆ）リポソーム配合物、その他が含まれる。
【００５９】
本発明は、更に、加速骨吸収の治療用医薬組成物の調製のためのＡ３ＡＲアゴニストの使用に関するものである。
【実施例】
【００６０】
本発明に従って実施された以下の実験の記述によって、本発明をこれから例証する。これらの例は、限定する性質のものではなく、例証することを意図するものであることは理解される。上の教示に照らして、これらの例に多くの改良及び変更を加えることができることは明白である。従って、添付された特許請求の範囲内において、本発明を以下に特に記述した以外の無数の可能な方法で実施することができることは理解される。
【００６１】
材料及び方法
（薬剤）
１−デオキシ−１−[６−[[（３−ヨードフェニル）メチル]アミノ]−９Ｈ−プリン−イル]−Ｎ−メチル−Ｄ−リボフラヌロンアミド又はＮ６−（３−ヨードベンジル）−アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロアミド（ＩＢ−ＭＥＣＡ）として一般的に知られるＧＭＰグレードの組成物であるＡ３ＡＲアゴニストを、米国ニューヨーク州アルバニーのAlbany Molecular Research Incがキャン−ファイト・バイオファーマ社用に合成した。１０ｍＭの原液をＤＭＳＯ中に調製し、所望される濃度を得るために更に培養液又はＰＢＳで希釈した。
【００６２】
フロイント不完全アジュバントをシグマ社から、加熱殺菌したヒト結核菌Ｈ３７Ｒａを米国デトロイト州のＤｉｆｃｏ社から購入した。
【００６３】
ラットＡ３ＡＲに対するウサギ・ポリクローナル抗体、及びシグナリング・タンパク質ＩＫＫ、ＴＮＦ−α、ＧＳＫ−３β、ｃａｓｐａｓｅ−３、及びｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＫＢ/Ａｋｔ、ＲＡＮＫＬを米国カリフォルニア州のＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃから購入した。
【００６４】
（動物モデル）
実験を所内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により確立されたガイドラインに従って、イスラエル国、ペタック・ティクヴァ、Ｋｉｒｙａｔ−Ｍａｔａｌｏｎのキャン−ファイト・バイオファーマ社で行った。実験動物には随時、標準化されたペレット食及び水道水を与えた。
【００６５】
Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（イスラエル国、エルサレム）から入手した生後８〜１０週のメスのＬｅｗｉｓ  ｒａｔの尾基部に１０ｍｇ/ｍｌの加熱殺菌したヒト結核菌を含むフロイント不完全アジュバントからなる１００μｌのサスペンションを皮下注射（ＳＣ）した。各々のグループは１０の個体を含み、それぞれの実験を少なくとも３回行った。
【００６６】
（治療プロトコール）
薬剤を１日に２回、胃管により経口投与した。ポジティブ・コントロールのグループには薬剤のそれに対応する希釈されたＤＭＳＯのみを与え、治療グループには１０μｇ/ｋｇのＩＢ−ＭＥＣＡを与えた。治療は接種後、１４日目に開始した。
【００６７】
（臨床疾患の評点）
ラットを２日おきに検査し、臨床的な関節炎の有無を確認した。四肢のそれぞれについて０〜４の評点を行った。０−関節炎なし、１−指の関節の１つに赤み又は腫れ、２−指の関節の２つ以上に赤み又は腫れ、３−足関節及び足根骨―中足骨関節の関与、４−足全体の赤み又は腫れ。炎症の程度についても、カリパス（Mitotoyo、日本国、東京）を用いてラットの後足の直径の増加を測定することによって決定した。
【００６８】
（組織の評点）
ビヒクル及びＣＦ１０１の治療を受けたラットの足、膝、臀部を採取し、１０％の緩衝ホルマリンで固定し、塩酸（Calci-Clear Rapid）（Patinal Diagnositics, Gr, USA）中で２４時間脱灰した。次に、検体をパラフィン包埋用に加工し、４μｍの組織部位を切断してヘマトキシリン及びエオシンで染色した。この部位を治療プロトコールを知らない医師により評価し、それぞれの関節を別個に評点した。組織の評点は、炎症細胞の浸潤の程度に応じて、０−通常、１−最小の炎症浸潤、２−軽度の浸潤、３−中程度の浸潤、４−顕著な浸潤、の０〜４の点数を付けることにより行った。パンヌス形成関節組織、滑膜管壁細胞過形成については、０−通常、１−幾つかの部位における皮質性骨の最小限の損失、２−皮質性大菱形骨の軽度の損失、３−多くの部位における中程度の骨の損失、４−多くの部位における骨の顕著な損失、５−断片化及び炎症工程又はパンヌスの皮質性骨への十分な厚みを有する穿通を伴う多くの部位における骨の顕著な損失、として評点を行った。全ての組織的パラメータの点数の平均を「組織評点」として示した。
【００６９】
（足からのタンパク質抽出）
後足を足根関節の上で切開した。骨様の組織を切刻み、液体窒素で素早く凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。１５０ｍMのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１％のＮＰ４０、０．５％のデオキシコレート、及び０．１％のＳＤＳを含むＲＩＰＡ抽出緩衝剤（４ｍｌ/ｇ組織）に足組織を加えた。組織をポリトロンを用いて氷上で均質化し、遠心分離し、上澄みをウエスタンブロットで分析した。
【００７０】
（ウエスタンブロット分析）
足抽出物のウエスタンブロット分析（ＷＢ）を、以下のプロトコールにより行った。サンプルを氷冷したＰＢＳで洗い、氷冷した溶解緩衝液（ＴＮＮ緩衝液、５０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ＝７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ＮＰ４０）に移した。７５００ｘｇで１０分間遠心分離を行い、細胞のデブリを取り除いた。バイオラド社のタンパク質分析染色剤を用いてタンパク質濃度を決定した。等量のサンプル（５０μｇ）を、１２％のポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。次に、分離したタンパク質をニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ，ＵＳＡ）上で電気ブロッティングにかけた。１％ＢＳＡで膜をブロックし、所望される一次抗体（希釈度＝１：１０００）を用いて４℃で２４時間培養した。その後、ブロットを洗浄し、二次抗体を用いて室温で１時間培養した。ＢＣＩＰ/ＮＢＴ発色キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ１，ＵＳＡ）を用いてバンドを記録した。異なる図面に示されるデータは少なくとも４つの異なる実験の典型を示すものである。
【００７１】
結果
（ＡＩＡモデルの関節炎評点の向上におけるＩＢ−ＭＥＣＡの影響）
関節炎の臨床的兆候は１４日目に現れ始めた。コントロール・グループにおいて、臨床的関節炎の評点は最大で８．７±０．７６にまで達した。一方、ＩＢ−ＭＥＣＡの治療を受けたグループでは臨床的関節炎の評点は最大でも４．８±０．９５と低かった（図１Ａ）。ＩＢ−ＭＥＣＡによる治療は、足の浮腫を著しく低下させた。また、ＩＢ−ＭＥＣＡによる治療は足の厚みを３５％±１．２抑制した（図１Ｂ）。図１Ｃはコントロール・グループにおける足全体の深刻な赤み及び腫れを、ＩＢ−ＭＥＣＡ治療グループの完全に通常のものと変わらない典型的な足（右側）との比較で示すものである。
【００７２】
（ＡＩＡの組織の特徴におけるＩＢ−ＭＥＣＡの影響）
疾病の誘発後２３日目にラットを解剖し、それぞれのラットの二本の後足の関節を採取して組織の検査を行った。組織の分析は、炎症細胞の浸潤、滑膜過形成、軟骨及び骨の破壊について行った。組織病理学的変化の多くは、足の指節間部分に見つかった。ビヒクル・グループにおいては膝部分に同様の変化が見られた一方、ＩＢ−ＭＥＣＡ治療グループの膝に損傷はなく、非治療グループにおける疾患の重症度を証明するものであった。全体的にみて、関節の組織病理学的な重症度は、臨床学的な重度指標と相関するものであった。
【００７３】
広範囲の炎症が見受けられたコントロール・グループのラットに比較して、治療されたラットの関節には統計的に有意な炎症の減少が見られた（総評点の平均がそれぞれ３．２±０．１４と０．４±０．０３４）（図２Ａ〜２Ｂ）。レジデント滑膜細胞増殖によって、滑膜は厚く繊維性のものとなり、過形成により肥大したものとなっており、コントロール・グループでは単核白血球による浸潤が見られた（図３Ａ〜３Ｂ）。一方、ＩＢ−ＭＥＣＡによる治療を受けたグループでは滑膜の繊維症は見られず、軽度の過形成が観察されたに過ぎなかった。
【００７４】
コントロール・グループでは破壊された領域に塊上のパンヌス組織が存在して関節部分の通常組織に置き換わっており、一方、ＩＢ−ＭＥＣＡ治療グループではパンヌス組織の発達の軽度な証拠しか観察されなかった（図４Ａ〜４Ｂ）。コントロール・グループでは深刻な軟骨損傷の後に軟骨の損失が見られ、一方、ＩＢ−ＭＥＣＡの治療を受けたグループでは軟骨組織は通常通りであった（図５Ａ〜５Ｂ）。
【００７５】
コントロール・グループに比較して、ＩＢ−ＭＥＣＡ治療グループでは破骨細胞の７３％の減少が見られた（図６Ａ〜６Ｂ）。加えて、コントロール・グループでは相当に高いレベルの骨破壊が観察された（図７Ａ〜７Ｂ）。結果として、ＩＢ−ＭＥＣＡ治療グループでは、破骨細胞の低レベルの存在（図８Ａ〜８Ｂ）と僅かな新しい骨形成が観察された（図９Ａ〜９Ｂ）。
【００７６】
（ＡＩＡラット由来の足抽出物中のＡ３ＡＲ活性下流での主要なシグナリング・タンパク質の発現レベルに対するＩＢ−ＭＥＣＡの影響）
コントロール・グループ及びＩＢ−ＭＥＣＡ治療グループのラットの後足を解剖し、タンパク質抽出の後、サンプルをウエスタン・ブロット分析にかけた。ＩＢ−ＭＥＣＡの治療によってＡ３ＡＲ自体のモジュレーションが観察され、レセプタの活性化とその後の分解が行われたことを証明するものであった（図１０Ａ）。Ａ３ＡＲの活性化は、ＩＢ−ＭＥＣＡ治療ＡＩＡラット由来の足抽出物中のＲＡＮＫＬタンパク質発現レベルを４０％減少させた。ＩＢ−ＭＥＣＡ治療によって下方制御される別のシグナル伝達通路は図１０Ｃに示されるようにＰＩ３Ｋ−ＰＫＢ/ＡＫＴである。ＰＩ３ＫとＰＫＢ/ＡＫＴのタンパク質発現レベルの減少は、コントロール・グループに比較して、ＩＢ−ＭＥＣＡ治療グループに見られ、この後、ＰＫＢ/ＡＫＴ downstream キナーゼであるＩＫＫのレベルが下方制御された。ＩＫＫ及びＲＡＮＫＬのレベルの減少の結果、ＩＢ−ＭＥＣＡ治療グループのラットにはＮＦ−κＢのレベルの減少が観察された。これらの現象の連鎖によって、ＴＮＦ−αの発現レベルがＩＢ−ＭＥＣＡ治療により５０％減少した。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１Ａ】図１ＡはＡＩＡラットのＩＢ−ＭＥＣＡによる治療後の臨床評点を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１ＢはＡＩＡラットのＩＢ−ＭＥＣＡによる治療後の足の厚さを示すグラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃはコントロール・グループ（写真左）における足全体の深刻な赤み及び腫れを、完全に通常の外観を有するＩＢ−ＭＥＣＡ治療グループ（写真右）との比較で示す写真（図１Ｃ）である。
【図２Ａ】図２Ａは炎症評点を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】図２ＢはＩＢ−ＭＥＣＡ治療ラットの関節における炎症の変化をコントロール・ラットとの比較で示す組織断面図（×２０、×４０）である。
【図３Ａ】図３Ａは繊維症評点を示す棒グラフである。
【図３Ｂ】図３ＢはＩＢ−ＭＥＣＡ治療ラットにおける滑膜の変化をコントロール・ラットとの比較で示す組織断面図である。
【図４Ａ】図４Ａはパンヌス評点を示す棒グラフである。
【図４Ｂ】図４ＢはＩＢ−ＭＥＣＡ治療ラットにおけるパンヌス組織の変化をコントロール・ラットとの比較で示す組織断面図である。
【図５Ａ】図５Ａは軟骨破壊評点を示す棒グラフである。
【図５Ｂ】図５ＢはＩＢ−ＭＥＣＡ治療ラットにおける軟骨の変化をコントロール・ラットとの比較で示す組織断面図である。
【図６Ａ】図６Ａは破骨評点を示す棒グラフである。
【図６Ｂ】図６ＢはＩＢ−ＭＥＣＡ治療ラットにおける破骨細胞の外観の変化をコントロール・ラットとの比較で示す組織断面図である。
【図７Ａ】図７Ａは骨破壊評点を示す棒グラフである。
【図７Ｂ】図７ＢはＩＢ−ＭＥＣＡ治療ラットにおける骨質量の変化をコントロール・ラットとの比較で示す組織断面図である。
【図８Ａ】図８Ａは造骨細胞評点を示す棒グラフである。
【図８Ｂ】図８ＢはＩＢ−ＭＥＣＡ治療ラットにおける造骨細胞群の変化をコントロール・ラットとの比較で示す組織断面図である。
【図９Ａ】図９Ａは新規骨形成評点を示す棒グラフである。
【図９Ｂ】図９ＢはＩＢ−ＭＥＣＡ治療ラットにおける造骨細胞群の変化をコントロール・ラットとの比較で示す組織断面図である。
【図１０Ａ】図１０ＡはＡ３ＡＲ発現におけるＩＢ−ＭＥＣＡ治療の効果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは足抽出物中のＲＡＮＫＬを含む付加主要制御タンパク質におけるＩＢ−ＭＥＣＡ治療の効果を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ/Ａｋｔ、ＩＫＫα,β、ＮＦ−κＢ、ＴＮＦ−αにおけるＩＢ−ＭＥＣＡ治療の効果を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄはアポトーシス酵素であるcaspase-3の白血球（ＷＢ）分析におけるＩＢ−ＭＥＣＡ治療の効果を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【国際調査報告】
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