(57)【要約】  試験被検体におけるγ−セクレターゼの活性を、被検体から採取される生物学的サンプルを利用して測定する方法が、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試験被検体由来の生物学的サンプルからの細胞の分離；
（ｂ）（ａ）において得られた細胞を界面活性剤で処置して、可溶化された膜調製物を提供すること；
（ｃ）該可溶化された膜調製物をγ−セクレターゼに対する外来性基質と接触させること；および
（ｄ）該外来性基質の切断生成物を検出することおよび定量すること；
を含む、該試験被検体におけるγ−セクレターゼ活性についてのエキソビボアッセイ。
【請求項２】
段階（ｂ）における細胞が、白血球または末梢血単核球である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
段階（ｃ）における外来性基質が、Ｃ１００Ｆｌａｇである、請求項１または請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
段階（ｄ）において検出される切断生成物が、Ａβ（１−４０）またはＡβ（１−４２）である、請求項１から３のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項５】
切断生成物が、電気化学発光分析を用いて検出および定量される、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項６】
細胞が、インビトロでγ−セクレターゼの作用を阻害することが知られている化合物で処置した試験被検体から得られる、請求項１から５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項７】
前記細胞が、インビトロで、ＡＰＰのγ−セクレターゼ介在切断によるＡβ（１−４２）の形成を選択的に阻害することが知られている化合物で処置した試験被検体から得られる、請求項１から５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項８】
試験被検体がヒトである、請求項６または請求項７に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験被検体中のγ−セクレターゼの活性を測定する方法、特に生体被検体から収集された生物学的サンプルを利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
γ−セクレターゼは、ヒトおよび他の動物の中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系に生じる。これは、（少なくとも）プレセニリン−１、ニカストリン、ａｐｈ−１ａおよびｐｅｎ−２サブユニット類を含む複合膜貫通型アスパルチルプロテアーゼであり、細胞情報伝達および他の生化学的経路に関与する種々の基質の膜内タンパク質分解に介在する。
【０００３】
このような基質の１つは、（β−セクレターゼによる切断に続いて）γ−セクレターゼにより切断されてアミロイド−β（Ａβ）を放出するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）であり、これはアルツハイマー病（ＡＤ）において重要な役割を果たすと考えられている（例えば、Ｈａｒｄｙ  ａｎｄ  Ｓｅｌｋｏｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，３５３−６（２００２）を参照のこと）。γ−セクレターゼにより介在されるタンパク質分解の部位が変動することによって、様々な鎖長のＡβ（例えば、Ａβ（１−３８）、Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２））が生じる。Ａβ（４−４２）などのＮ末端の切断も脳内で見出されるが、これはおそらくβ−セクレターゼにより介在されるタンパク質分解の部位が変動する結果であると考えられる。便宜上、「Ａβ（１−４０）」および「Ａβ（１−４２）」などの表現は、本明細書中で用いられるとき、このようなＮ末端切断変異体類を含む。細胞外媒質中への分泌後、Ａβは、ＡＤにおける重要な神経毒性薬剤であると広く考えられている初期可溶性の凝集体を形成し（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，１００（２００３），１０４１７−２２を参照のこと）、そして最終的にＡＤの病理学的特徴である不溶性析出物および高密度な老人斑を生じる。
【０００４】
もう１つのこのような基質は、Ｎｏｔｃｈタンパク質であり、これはＮｏｔｃｈ情報伝達プロセスの中心である。
【０００５】
Ｎｏｔｃｈ情報伝達系は、隣接する細胞間の受容体−リガンド相互作用により誘発される。受容体−リガンド相互作用の結果として、Ｎｏｔｃｈタンパク質は、γ−セクレターゼによる膜内のタンパク質分解を受け、細胞内断片を放出し、その断片は、遺伝子発現を調節する核へ移動する。
【０００６】
Ｎｏｔｃｈ情報伝達系は、分化、増殖、生存およびアポトーシスを含む種々の細胞のプロセスおよび発生プロセスにおいて重要な役割を果たす（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９），２８４，７７０−７７６）。また、重要な証拠により、増強されたかまたは異常に長期にわたるＮｏｔｃｈ情報伝達系が腫瘍形成に関与することもまた示唆されている（例えば、Ｃａｌｌａｈａｎ  ａｎｄ  Ｅｇａｎ，Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ（２００４），９，１４５−１６３；Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．（２００４），１４，３５７−６４；Ａｘｅｌｓｏｎ，同書（２００４），１４，３１７−３１９；Ｚｗｅｉｄｌｅｒ−ＭｃＫａｙ  ａｎｄ  Ｐｅａｒ、同書（２００４），１４，３２９−３４０；Ｗｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３），２３，６５５−６６４；およびＷｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４），３０６，２６９−２７１を参照のこと）。
【０００７】
従って、γ−セクレターゼの阻害は、かなりの治療的な関心事であり、特にＡＤを処置する観点から多数の小分子阻害剤が開発されている（概説として、Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．（２００４），７（５），７０９−７１９を参照のこと）。ＡＤの処置に関連して、Ａβ（１−４２）の形成を選択的に阻害するためにγ−セクレターゼの作用を調節する化合物もまた関心事である（例えば、ＷＯ０１／７８７２１およびＵＳ２００２／０１２８３１９およびＷｅｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ，４１４（２００１）２１２−１６；Ｍｏｒｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，８３（２００２），１００９−１２；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８（２００３），１８６４４−７０およびＢｅｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７９（２００４），４３４１９−２６を参照のこと）。
【０００８】
動物におけるこのような化合物の前臨床試験およびヒトにおける臨床試験は、インビボで関連化合物の有効性をモニターするための手段の利用可能性によって大いに促進されるであろう。γ−セクレターゼ阻害剤または修飾因子の有効性は、それら由来の細胞培養物または膜調製物を用いてインビトロで日常的にモニターされる（例えば、Ｂｅｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３），４２，８１３３−８１４２；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ（２０００），９７，６１３８−６１４３；およびＧＢ２，２９６，４１５を参照のこと）。これまでに唯一開示されたエキソビボアッセイは、活性酵素の供給源として脳ホモジネートの使用を含む（例えば、Ｐｉｎｎｉｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，（２００１），２７６，４８１−４８７を参照のこと）。このようなアッセイは、実験動物を浪費し、試験化合物の慢性的な投薬の間の有効性を連続的にモニターできず、そしてヒトにおける臨床試験に対する関連性がない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、これらのような欠点を克服する、γ−セクレターゼ活性に対するアッセイが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、本明細書では、
（ａ）被検体由来の生物学的サンプルからの細胞の分離；
（ｂ）（ａ）において得られた細胞を界面活性剤で処置して、可溶化された膜調製物を提供すること；
（ｃ）可溶化された膜調製物をγ−セクレターゼに対する外来性基質と接触させること；および
（ｄ）外来性基質の切断生成物を検出することおよび定量すること；
を含む、試験被検体におけるγ−セクレターゼ活性についてのエキソビボアッセイが提供される。
【００１１】
段階（ａ）において、生物学的サンプルは、血液のものであっても組織のものであってもよいが、好ましくは血液のものであり、分離される細胞は好ましくは白血球または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。白血球またはＰＢＭＣ（好ましくはＰＢＭＣ）の分離は、公知の方法、例えば、Ａｃｃｕｓｐｉｎ（商標）チューブ内１０００ｇでの遠心分離（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａｃｃｕｓｐｉｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ−Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（商標）−１０７７、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｎｏ．Ａ６９２９／Ａ７０５４／Ａ０５６１を参照のこと）によって実施され得る。あるいは、Ｌｅｕｃｏｓｅｐ（商標）チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒから市販の）が用いられてよい。このようにして得られた細胞は、望まれる場合は、後の分析のために凍結および保存され得る。
【００１２】
段階（ｂ）において、好ましい界面活性剤は、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパン−スルホン酸）である。可溶化された膜調製物を提供するための一般的な手順において、段階（ａ）からの細胞の、蒸留水中の懸濁液（血液の出発容量１０mlあたり１ml）をプロテアーゼ阻害剤（例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標））および０．５％ＣＨＡＰＳＯを含む緩衝液で５倍に希釈し、その混合物を２３×１ゲージのシリンジ針で６回粉砕し、そして３０分間４℃で振とうする。適した緩衝液は、５０mM  ＭＥＳ、０．３mM  ＮａＣｌ、１０mM  ＭｇＣｌ２を含み、ｐＨ７．３を呈する。
【００１３】
段階（ｂ）に引き続き、調製物のタンパク質含有量をアッセイして（例えば、標準的なＢＣＡアッセイによって）、次の段階における等量の試薬の選択を容易にすることは有利である。
【００１４】
段階（ｃ）において、外来性基質は、γ−セクレターゼによる切断を受けて検出および定量され得る断片を放出するいずれかのタンパク質またはペプチドであり得る。好ましい外来性基質は、Ｃ１００Ｆｌａｇ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、前出）であり、これはＡＰＰの組換え類似体であって、切断生成物としてＡβを生成する。適したインキュベーション条件は、前記のＬｉ  ｅｔ  ａｌの参考文献および前出のＢｅｈｅｒ  ｅｔ  ａｌに開示されている。
【００１５】
段階（ｄ）において、切断生成物の検出および定量は、従来の手段によって実施され得る。切断生成物がＡβである場合、Ａβ（１−４０）および／またはＡβ（１−４２）は、標識抗体とともにインキュベーションされ、続いて電気化学発光（ＥＣＬ）分析（例えば、Ｂｅｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１），２７６，４５３９４−４５４０２に記載されているように）を行うことによりアッセイされ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
このようにして得られたシグナルは、好ましくはアッセイを、段階（ｃ）に過剰量の公知のγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で実施するという修正を施して繰り返すことによって得られるバックグラウンドシグナルを差し引くことによって補正される。適した阻害剤類は、Ｌ−６８５，４５８として同定された化合物（Ｓｈｅａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００），３４，８６９８−８７０４）およびＷＯ０３／０９３２５２に開示された化合物を含む。最も一般には、段階（ｃ）および（ｄ）は、いくつかのウェルが公知の阻害剤を含むマルチウェルプレートを含む自動化方法を用いて実施される。望むならば、切断生成物の実際の濃度は、既知の濃度の標準生成物について実施された測定から得られる検量線への参照により測定され得る。
【００１７】
アッセイに必要な血液の量は十分に少量であるので、少なくとも大動物（例えば、霊長類およびイヌ類）の場合、動物を犠牲にすることなくアッセイが実施され得る。このような場合、アッセイは、同じ被検体からの血液を用いて適した間隔で反復することができ、それにより酵素活性の経時的な変化をモニターすることができる。最も重要なことに、アッセイは、ヒト被検体からならびに霊長類、イヌ類およびげっ歯類（特にラット類またはマウス類）を含む実験動物から得られる血液について実施することができる。１つの好ましい実施形態において、血液は、事前にγ−セクレターゼの推定上の阻害剤または修飾因子で処置した被検体から得られ、これによりアッセイは、インビボにおける前記阻害剤または修飾因子の効率の測定を提供する。
【００１８】
１つの実施形態において、アッセイは、インビトロでγ−セクレターゼの作用を阻害することが知られている試験化合物で処置した被検体から得られる血液サンプルについて実施される。
【００１９】
もう１つの実施形態において、アッセイは、インビトロで、ＡＰＰのγ−セクレターゼ介在切断によるＡβ（１−４２）の形成を選択的に阻害することが知られている試験化合物で処置した被検体から得られる血液サンプルについて実施される。
【００２０】
従ってアッセイにより、試験被検体中の末梢性γ−セクレターゼに対する試験化合物のインビボでの有効性をモニターすることが可能となる。試験化合物の関連ＰＫパラメータが既知である場合、結果はＣＮＳ中の、特に脳中のγ−セクレターゼに対する有効性を推定するために用いられ得る。これは、実験動物の脳中のＡβの実際のレベルを（公知の手順を用いて）測定し、その結果を本明細書中に記載されたアッセイにより測定される末梢における酵素阻害のレベルと関連させることによって達成され得る。この相関関係を用いて、試験化合物によって引き起こされるヒト被検体における末梢性の酵素阻害の程度により、前記被検体の脳中の阻害の程度を推定することができるが、試験化合物の脳対血漿の比は推定されなければならない（例えば、他の種における測定からの内挿によって）という注意を伴う。
【００２１】
（実施例）
一般的な手順は以下のとおりである：
１．雄ＣＤラットをペントバルビタール（約６０mg／kg）で麻酔し、上行大静脈を露出させる。動物をヘパリン処理し（約０．５ml、１０００単位／ml、ｉ．ｖ．）、末端血液のサンプル（８から１２ml）を大静脈から採取し、動物を失血させる。
２．血液を事前に室温に温められたＡｃｃｕｓｐｉｎチューブに注意深くピペットで移す。容量が６mlを超える場合、１サンプルにつき２本のチューブを用いる。
３．チューブを１０００ｇで遠心し、そしてＰＢＭＣ（末梢血単核球）の白いバンドを２mlエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｓ）に吸引する。
４．ＰＢＭＣを１０００ｇで１分間、卓上（ｂｅｎｃｈｔｏｐ）遠心機でペレットにし、血漿を吸引除去する。
５．ＰＢＭＣペレットを少なくとも１回、１mlのリン酸緩衝食塩水を添加することにより洗浄し、再懸濁するために渦巻攪拌し、そして別の遠心サイクルでペレットにする。
６．洗浄したペレットを−８０℃で急速凍結する（タイミングによって、一晩の段階まで停止することが可能である）。
７．解凍後、ペレットを血液の出発容量各１０mlあたり１mlの水の比で蒸留水中に再懸濁する。
８．次いで細胞懸濁液を５倍量の１×ＭＥＳ緩衝液（５０mM  ＭＥＳ、０．３mM  ＮａＣｌ、１０ｒ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３）、１×プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標））および０．５％ＣＨＡＰＳＯで容量を増量し、２３×１ゲージシリンジ針で６回粉砕し、４℃で３０分間振とうすることによって可溶化する。
９．このインキュベーション後、抽出物を渦巻攪拌し、標準的なＢＣＡアッセイにより［タンパク質］について定量する。
１０．すべての濃度が既知であるとき、抽出物は１×ＭＥＳ緩衝液／０．５％ＣＨＡＰＳＯ／１×プロテアーゼ阻害剤および以下のインキュベーションセット中に、一般的な濃度（通常、０から１mg／ml）まで希釈される。
５μlのＤＭＳＯ（または２０×γ−セクレターゼ阻害剤）
３５μlのプレミックス（１．５μlの２０％ＣＨＡＰＳＯ、８．５μlの水、２５μlの４×アッセイ緩衝液＊）
２０μlのＣ１００Ｆｌａｇ基質
４０μlの規準化膜調製物（再度渦巻攪拌された）
［すべての抽出物を、ＤＭＳＯおよび他の１０μM  Ｌ−６８５４５８（または等価物）を含むいくつかのウェルで試験し、非特異的なアッセイシグナルを差し引くことを可能にしなければならない。合成ペプチドの検量線を組み込むことによっても、生成されるＡβ（４０）の定量が可能になるだろう。］
１１．３７℃で３時間混合した後、４Ｇ８ＢｉｏおよびＧ２−１０Ｒｕを用い、ＥＣＬ法およびＢｉｏｖｅｒｉｓ  Ｍ−８  Ｏｒｉｇｅｎ  ｍａｃｈｉｎｅまたはＭｅｓｃ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｃｔｏｒ  ６０００  ｉｍａｇｅｒのいずれかを用いる標準的な一晩の（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）Ａβ（４０）検出アッセイのために７５μlを取り出す。
＊４×アッセイ緩衝液＝８０mM  ＨＥＰＥＳ、８mM  ＥＤＴＡ、０．４％ＢＳＡ
【実施例１】
【００２２】
上記の手順に続いて無処置のラットおよびビーグル犬からの血液を用いた。強力なＥＣＬシグナルが各場合において得られた。公知のγ−セクレターゼ阻害剤を段階１０のウェルに添加したとき、シグナルが用量に依存して減弱したが、これはＰＢＭＣが活性酵素にとって生存可能の源であることを示唆する。
【実施例２】
【００２３】
２匹のラット各々に、ＷＯ０３／０９３２５２の実施例１４において開示された化合物を、インビボでγ−セクレターゼの１００％阻害を提供するように計算された用量（３０mg／Kg  ｐ．ｏ．）で投薬した。４時間後、血液サンプルを採取して上記のように処理し、２匹の無処置対照からの血液サンプルも同様に処理した。各対照サンプルは、同様の強力なＥＣＬシグナルを発したが、試験サンプルのいずれからも感知できるほどのシグナルは、検出されなかった。このことは、酵素阻害が抽出手順で残存したことを示唆する。
【実施例３】
【００２４】
ラットを以下の処置群（１群あたり３匹）：対照（ビークル）、陽性対照（ＷＯ０３／０９３２５３の実施例１４、３０mpk）、試験１（１０mpk試験化合物）、試験２（３０mpk試験化合物）および試験３（１００mpk試験化合物）に割り当てた。投薬の４時間後、血液サンプルを上記のように処理し、結果を以下の表に要約した：
【００２５】
【表１】
2008522606.tif 000002
【００２６】
このようにして、アッセイによりインビボでのγ−セクレターゼの用量依存の阻害が検出された（試験２群および試験３群についての同様の結果は、用量が異なるにもかかわらずこれらの群において薬物の血漿レベルが同様であったことを反映した。）。
【実施例４】
【００２７】
これらの手順を霊長類におけるγ−セクレターゼ活性の測定に適用することができることを確認するために、ＰＢＭＣペレットを、３被検体により提供されたアカゲザル血液およびヒト血液から抽出し、上記のように処理し、ラットサンプルと比較した。すべての場合において、Ａβ（４０）（エキソビボで生成された）に対する強力なシグナルが検出された。このシグナルは、公知のγ−セクレターゼ阻害剤を添加することにより用量に依存して減弱し、その作用強度（計算されたＩＣ５０によって表される）が３つのすべての種においておおまかに似ていたことが示された。
【国際調査報告】
2008522606.tif 000003
2008522606.tif 000004
2008522606.tif 000005