(57)【要約】  本発明は、ポリマー及び化学誘引物質を含む粘膜付着性医薬組成物であって、当該組成物のｐＨは６を上回る粘膜付着性医薬組成物に関し、当該組成物は、肛門性器疾患又は口腔疾患、特にヒトパピローマウイルスにより引き起こされる肛門性器疾患又は口腔疾患の治療において有用である。
2008525516.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー及び化学誘引物質を含む粘膜付着性医薬組成物であって、該組成物のｐＨは６を上回る、粘膜付着性医薬組成物。
【請求項２】
前記化学誘引物質は、ＭＩＰ３α、ＨβＤ２、ＭＣＰ−１及びモルグラモスチムから成る群から選択される、請求項１に記載の粘膜付着性医薬組成物。
【請求項３】
顆粒球マクロファージコロニー漸増因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びＨＮＰ２（ヒト好中球デフェンシン２）から成る群から選択される補助化学誘引物質を含有する、請求項１又は２に記載の粘膜付着性医薬組成物。
【請求項４】
前記ポリマーは、天然ゴム、半合成材料及び合成材料から成る群から選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の粘膜付着性医薬組成物。
【請求項５】
前記組成物のｐＨは６〜８であり、好ましくは前記組成物のｐＨは約６．９である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の粘膜付着性医薬組成物。
【請求項６】
鱗状粘膜の治療における、好ましくは肛門性器疾患又は口腔疾患、特にヒトパピローマウイルスの治療における使用のための請求項１ないし５のいずれか１項に記載の粘膜付着性医薬組成物。
【請求項７】
鱗状粘膜の治療における、好ましくは肛門性器疾患又は口腔疾患、特にヒトパピローマウイルスの治療における使用のための薬剤の製造における請求項１ないし６のいずれか１項に記載の粘膜付着性医薬組成物の使用。
【請求項８】
肛門性器疾患及び／又は口腔疾患を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項１ないし５のいずれか１項に記載の粘膜付着性医薬組成物を、かかる治療を必要とする患者へ投与することを含む、肛門性器疾患及び／又は口腔疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肛門性器疾患又は口腔疾患、特にヒトパピローマウイルスにより引き起こされるかかる疾患の治療のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、良性性器いぼから浸潤癌に及ぶ一連の疾患を誘発する一般的な性感染病原体である。幾つかのタイプのＨＰＶは、子宮頸癌及びその前駆体（鱗状上皮内病巣（ＳＩＬ））の発達に直接関与することが知られている(Bosch他, 1995)。鱗状上皮内病巣は、浸潤癌の発病に先立つ子宮頸部の上皮における前悪性変化の一群を指す。
【０００３】
子宮癌を発症する少数の感染個体及び癌発生までの比較的長い潜伏期間により示唆されるように、さらなる環境要因及び／又は宿主要因が悪性進行に関与する可能性が高い。ＨＰＶ感染及びＳＩＬの続く発達を制御する際の固有免疫の役割は、細胞媒介性免疫が低下された患者におけるＨＰＶ関連病巣の頻度の増大により間接的に示される(Petry他, 1994; Ellerbrock他, 2000)。ＨＰＶに対する有効な免疫応答の性質は、十分理解されていないが、細胞媒介性免疫が、体液性免疫よりも重要であると考えられる(Thivolet他, 1982; Wu他, 1994)。幾つかの研究は、頸部ＨＰＶ感染及び関連頸部病巣に付随する限局性免疫機能障害について記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
かかる状態の治療を改善する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、ポリマー及び化学誘引物質を含む粘膜付着性医薬組成物であって、上記組成物のｐＨは６を上回る、粘膜付着性医薬組成物が提供される。
【０００６】
驚くべきことに、化学誘引物質は、抗原提示細胞の走化性を著しく増強すること、及び６を上回るｐＨを有する粘膜付着性組成物において化学誘引物質を含むことは、ＨＰＶ形質転換上皮への抗原提示細胞の浸潤を刺激することが見出された。したがって、本発明による組成物は、肛門性器疾患又は口腔疾患、特にヒトパピローマウイルスにより引き起こされる肛門性器疾患又は口腔疾患の治療において有用である。本発明のさらなる有用な特徴は、化学誘引物質が、抗原提示細胞の抗原提示能力を妨げなかったことである。
【０００７】
化学誘引物質は概して、樹状細胞及び／又はランゲルハンス細胞のような細胞の漸増を調節する薬理学的作用物質であると理解されている。本発明で使用する化学誘引物質は好ましくは、ＭＩＰ３α（マクロファージ炎症性タンパク質３α）、ＨβＤ２（ヒトβデフェンシン２）、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１）及びモルグラモスチムから成る群から選択される。好ましくは、２つ又はそれ以上の化学誘引物質、例えばＭＩＰ３α及びＨβＤ２が使用される。
【０００８】
本発明による組成物は好ましくは、顆粒球マクロファージコロニー漸増因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びＨＮＰ２（ヒト好中球デフェンシン２）から成る群から選択される補助化学遊走因子を含有する。本発明による組成物における使用のための化学誘引物質及び補助化学誘引物質の好ましい組合せは、ＭＣＰ−１及びＨＮＰ２である。
【０００９】
本発明による組成物は、好ましくは固体様特性を有する連続構造の形態であることが好ましい。組成物は任意に、透明又は不透明のいずれかである。本発明による最も簡素な組成物では、ポリマーは、天然ゴム（例えば、キサンタン）、半合成材料（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロース）或いは合成材料（例えば、カルボマー、ポリカルボフィル及び／又はカルボキシビニルポリマー）である。
【００１０】
ポリマーは好ましくは、アクリル酸含有ポリマーであり、より好ましくはポリマーは、ポリカルボフィルである。本発明による組成物は好ましくは、ヒドロゲルの形態である。
【００１１】
組成物のｐＨは、好ましくは６〜８である。より好ましくは、組成物のｐＨは約６．９である。
【００１２】
本発明による組成物は任意に、防腐剤、緩衝液（特に等張性緩衝液）及び／又は安定剤（例えば、メチルパラヒドロキシベンゾエート、パラベン、ＥＤＴＡ、ソルビン酸カリウム及び／又はプロピルパラヒドロキシベンゾエート）をさらに含む。適切なキャリア、賦形剤及び／又は他の作用物質は、例えば改善された移動及び／又は送達を提供するために本発明による組成物中に含まれてもよい。
【００１３】
また、本発明によれば、鱗状粘膜の治療における、好ましくは肛門性器疾患又は経口疾患、特にヒトパピローマウイルスの治療における使用のための本発明による組成物が提供される。
【００１４】
肛門性器疾患とは、外陰部疾患、膣疾患、頸部疾患及び／又は陰茎疾患及び／又は肛門直腸疾患を意味する。
【００１５】
さらに、本発明によれば、鱗状粘膜の治療における、好ましくは肛門性器疾患又は経口疾患、特にヒトパピローマウイルスの治療における使用のための薬剤の製造における本発明による組成物の使用が提供される。
【００１６】
また、本発明によれば、肛門性器疾患及び／又は口腔疾患を治療する方法であって、治療上有効な量の本発明による組成物を、かかる治療を必要とする患者へ投与することを含む肛門性器疾患及び／又は口腔疾患を治療する方法が提供される。通常、直接的な投与による治療は、１つ又はそれ以上の症状を低減、防止或いは改善するのに十分な期間、毎日、週１回又は月１回行われる。
【００１７】
容量約１００ｍｌを有する典型的な組成物に関して、組成物中で使用される化学誘引物質の量は、使用する化学誘引物質に応じて、１０ｎｇ〜５００μｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１００μｇである。当業者は、適切な量を確定することが可能である。
【００１８】
本発明は、添付の図面の図を参照して説明される。
【実施例】
【００１９】
ここで、本発明は、以下の実施例を参照して説明され、以下の実施例は、本明細書中で規定される本発明の範囲を限定すると意図されない。
【００２０】
（実施例１）
本発明によるゲル配合物は、治療上有効な量のＭＣＰ−１、ＭＩＰ３α又はＨβＤ２、３重量％のヒドロキシエチルセルロース（ＴＹＬＯＳＥ（登録商標）  Ｈ４０００）、０．３重量％のソルビン酸カリウム、０．３重量％のＮａＨ２ＰＯ４及び精製水（１００％となるように適量）から常法で調製された。
【００２１】
（実施例２）
経口送達又は肛門送達に適した本発明によるゲル配合物は、ヒドロキシプロピルセルロース（Ｋｌｕｃｅｌ  ＧＦ）７ｇ及び等張性緩衝液（１００ｇになるように）とともに、治療上有効な量のＭＣＰ−１、ＭＩＰ３α又はＨβＤ２から常法で調製された。等張性緩衝液は、ＫＨ２ＰＯ４  １．３６ｇ、精製水２００ｍｌ及び４Ｎ  ＮａＯＨを含有して、ｐＨ６．９を付与する。
【００２２】
（実施例３）
経口送達又は肛門送達に適した本発明によるゲル配合物は、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー（Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ１２７）２０ｇ及び実施例２で規定されるような等張性緩衝液（１００ｇになるように）とともに、治療上有効な量のＭＣＰ−１、ＭＩＰ３α又はＨβＤ２から常法で調製された。
【００２３】
（実施例４）
経口送達又は肛門送達に適した本発明によるゲル配合物は、ポリアクリル酸（Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９７４Ｐ）１．５ｇ、ＥＤＴＡ  ０．５ｇ、トロメタモール（ｐＨ６．９になるように）及び精製水（１００ｇになるように）とともに、治療上有効な量のＭＣＰ−１、ＭＩＰ３α又はＨβＤ２から常法で調製された。
【００２４】
（実施例５）
経口送達又は肛門送達に適した本発明によるゲル配合物は、以下の：
ヒドロキシプロピルセルロース（Ｋｌｕｃｅｌ  ＧＦ）    ７ｇ
パラベン                                              適量
等張性緩衝液（実施例２と同様）                        １００ｇになるように
とともに、治療上有効な量のＭＣＰ−１、ＭＩＰ３α又はＨβＤ２から常法で調製された。
【００２５】
（実施例６）
経口送達又は肛門送達に適した本発明によるゲル配合物は、以下の：
ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー（Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ１２７）  ２０ｇ
パラベン                                                                  適量
等張性緩衝液（実施例２と同様）                            １００ｇになるように
とともに、治療上有効な量のＭＣＰ−１、ＭＩＰ３α又はＨβＤ２から常法で調製された。
【００２６】
（実施例７）
経口送達又は肛門送達に適した本発明によるゲル配合物は、以下の：
ポリアクリル酸（Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９７４Ｐ）      １．５ｇ
ＥＤＴＡ                                          ０．５ｇ
パラベン                                          適量
精製水                                            １００ｇになるように
トロメタモール                                    ｐＨ６．９になるように
とともに、治療上有効な量のＭＣＰ−１、ＭＩＰ３α又はＨβＤ２から常法で調製された。
【００２７】
（実施例８）
材料及び方法
頸部ＨＰＶ形質転換ケラチノサイト細胞系の培養
ＳｉＨａ及びＣａｓＫｉは、腫瘍原性子宮頸癌由来ケラチノサイト細胞系である(Friedl他, 1970; Pater他, 1985; Auersperg他, 1962)。ＳｉＨａ細胞系は、１個のコピーを含有し、ＣａｓＫｉは、組み込まれたＨＰＶ−１６  ＤＮＡのおよそ６００個のコピーを含有する。これらのＨＰＶ形質転換ケラチノサイト細胞系は、０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン(Sigma Chemical Co.,ミズーリ州セントルイス)、２ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子(Sigma)、１０％ウシ胎児血清(Life Sciences International,ベルギー、ゼリック)、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン(GIBCO BRL)、１０ｍｍｏｌ／Ｌのヘペス(GIBCO MRL)、１μｇ／ｍｌ  ファンギゾン(GIBCO BRL)、１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウム(GIBCO BRL)、３０００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO BRL)、１０−１０ｍｏｌ／Ｌのコレラ毒素、５μｇ／ｍｌのインスリン(Sigma)、２０μｇ／ｍｌのアデノシン(SIgma)、５μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン(Sigma)及び１５．１０−４μｇ／ｍｌの３，３’、５−トリヨード−Ｌ−サイロニン(Sigma)を補充したＨＡＭ  Ｆ１２(GIBCO MRL,米国ニューヨーク州グランドアイランド)／ダルベッコ変法イーグル培地(GIBCO BRL)の１／３混合物から構成される成長培地中で培養した。
【００２８】
樹状細胞培養物
樹状細胞（ＤＣ）は、これまでに記載されたようにヒトＰＢＭＣの接着分画を培養することにより生成させた(Hubert他, 1998; Sallusto及びLanzavecchia, 1994)。簡潔に述べると、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、フィコール−ハイパークにおける遠心分離により白血球に富んだバフィーコートから単離された。最大の血小板を廃棄するための低い遠心分離速度での洗浄後に、ＰＢＭＣは、６ウェル皿（Ｎｕｎｃｌｏｎ  Ｍｕｌｔｉｄｉｓｈｅｓ,デンマーク、NUNC)中で、ＦＣＳを有さない培地３ｍｌ中でウェル１つ当たり１０×１０６個のＰＢＭＣの密度で平板培養した。３７℃で１８時間後、非接着細胞は、２回の穏やかな洗浄により廃棄して、プラスチック接着分画は、ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ−５０μＭメルカプトエタノール）３ｍｌ中で、８００Ｕ／ｍｌのヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ(Amoytop Biotech,中国、アモイ)及び４０Ｕ／ｍｌのＩＬ４(ImmunoTools,ドイツ、フリゾイテ)とともに培養した。３日毎に、サイトカインを含有する新鮮な培地を培養物へ供給して、７日目にＰＢＳ−ＥＤＴＡ  １ｍＭとともに収集した。
【００２９】
ランゲルハンス細胞培養物
臍帯血単核球（ＣＢ  ＭＮＣ）は、収集後２４時間以内にＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）(Nycomed Oharma As,ノルウェー、オスロ)を使用した不連続密度勾配遠心分離後に回収された。ＣＤ３４＋細胞は、製造業者のプロトコルに従ってＭＡＣＳ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＣＤ３４前駆細胞単離キット(Miltenyi Biotec GmBH,ドイツ、ベルキッシュグラッドバッハ)及びＭｉｎｉＭＡＣＳ分離カラム(Miltenyi Biotech)を使用してＣＢ  ＭＮＣから単離された。１５  １０４個のＣＤ３４＋細胞は、Ｔ２５フラスコ(Sarstedt, Inc,ノースカロライナ州ニュートン)において１０％ＦＣＳ、抗生物質及び５０μＭのメルカプトエタノール（全てGIBCO-BRLから）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地１０ｍｌ中に播種した。予め最適化した濃度の以下のヒト分子を培養物に補充した：ＳＣＦ（２０μｇ／ｍｌ、比活性（ＳＡ）＞５  １０５Ｕ／ｍｇ）、ＴＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ、ＳＡ＞１  １０６Ｕ／ｍｇ）、ＦＩＴ３−Ｌ（２５ｎｇ／ｍｌ、ＳＡ＞２  １０５Ｕ／ｍｇ）、ＧＭ−ＣＳＦ（２００Ｕ／ｍｌ、ＳＡ：１１，１  １０６Ｕ／ｍｇ）、ＴＮＦα（５０Ｕ／ｍｌ、ＳＡ＞２  １０７Ｕ／ｍｇ）、ＩＬ４（１００Ｕ／ｍｌ、ＳＡ＞２  １０６Ｕ／ｍｌ）及びＴＧＦ−β１（５ｎｇ／ｍｌ又は１２．５ｎｇ／ｍｌ、ＳＡ＞２  １０８Ｕ／ｍｇ）。これらの作用物質は全て、PeproTech(ニュージャージー州ロッキーヒル)から購入した。但し、それぞれAmoytop(Amoytop Biotech, 中国、アモイ)及びBiosource (ベルギー、ニヴェル)から入手したＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４を除く。細胞は、加湿雰囲気中で、且つ５％  ＣＯ２の存在下で３７℃にて培養した。７日目に、細胞密度を１ｃｍ２当たり２．１０４個に調節して、７日目及び１４日目に、培養の開始時に使用されるものと同じ濃度で、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ４、ＴＮＦα及びＴＧＦ−β１と細胞に供給した。但し、全ての培養物に関して１２．５ｎｇ／ｍｌであった１４日目のＴＧＦ−β１を除く。１８日目に、細胞は、激しくピペットで採取することにより培養物から収集されて、単一細胞集団を調製した（Hubert他, 近刊）。
【００３０】
走化性アッセイ
細胞遊走は、走化性マイクロチャンバ技法を用いて評価した（４８ウェル  Ｂｏｙｄｅｎマイクロチャンバ；Neuroprobe,米国、メリーランド州キャビン・ジョン）。走化性チャンバの下位ウェルに２７個の非条件培地、ヒト線維芽細胞由来細胞条件培地又は研究される種々のケモカインを充填した。非条件培地は、無作為遊走用の対照として使用した。各条件は６回繰り返した。表現型の特性化後、ＤＣを収集して、下位ウェルと分離させるポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネート膜８μｍ孔フィルタ(Poretics Corp.,カリフォルニア州リバーモア)を用いて、ＤＣ懸濁液（２×１０６個の細胞／ｍｌ）５５μｌをチャンバの上位ウェルへ適用させた。これらの膜は、０．１％酢酸溶液中の１００μｇ／ｍｌのゼラチンとのインキュベーションによりコーティングされた。チャンバは、５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下で３７℃にて５時間インキュベートした。フィルタの下側へ遊走した細胞を固定して、Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｉｎセット(Baxter Diagnostics AG,スイス、デュディンゲン)で染色した。フィルタの上側を掻爬して、残留非遊走細胞を除去した。目盛付き格子を伴う接眼レンズを使用して、ウェル１つ当たり１つの無作為野を計数して、完全に遊走した細胞の数を評価した。
【００３１】
上位ウェルと下位ウェルとを分離させる標準的な５μｍ孔ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルタを使用して、ＬＣに関して同じ試験を実現させた。
【００３２】
ヒドロゲルの調製
ポリカルボフィル（Ｎｏｖｅｏｎ  ＡＡ１）は、Noveon(ベルギー、ブリュッセル)から供給された。ポリカルボフィルゲル（１．５％ｗ／ｗ）は、ケラチノサイト成長培地中にＮｏｖｅｏｎ  ＡＡ１を分散させることにより調製された。混合物は、濃厚化が起きるまで攪拌した後、透明なゲルが生じるまで、４０％（ｗ／ｗ）トロメタモールの滴下により中和した。トロメタモールの量は、ｐＨ７を達成するように調節された。
【００３３】
器官型培養物
ＨＰＶ形質転換ケラチノサイト細胞系の器官型培養物は、これまでに記載される手順をわずかに変更した手順により調製された(DeIvenne他, 1995; Merrick他, 1992)。皮膚等価体の調製に関して、０．１％酢酸１．６ｍｌ、フェノールレッドを補充した冷却１０倍濃縮ハンクス緩衝液１ｍｌ及びｐＨ７．２を付与するための１Ｎ  ＮａＯＨと氷上で混合したコラーゲン（コラーゲン溶液ＡＣ−５、タイプＩ、ICN, Biomedical,ベルギー、アッセ地方（relegen））３２ｍｇにより、コラーゲンマトリックス溶液が作製された。次に、５×１０５個の正常ヒト線維芽細胞を含有するＦＣＳ  １ミリリットルを添加した。コラーゲン／線維芽細胞溶液１ミリリットルを２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ  Ｍｕｌｔｉｄｉｓｈｅｓ, Nunc,デンマーク、ロスキルド）へ注ぎ、３７℃で１時間凝固させた。コラーゲン及び線維芽細胞の最終濃度は、それぞれ３．２ｍｇ／ｍｌ及び５×１０４個の細胞／ｍｌであった。３７℃で一晩の成長培地１ｍｌによるゲル平衡後、成長培地５０μｌ中に再懸濁させた３０．１０４個のＨＰＶ形質転換ケラチノサイトをゲルの上部に播種して、４８時間水面下で維持した。コラーゲンラフトが２５ｍｍ組織培養入片（８μｍ孔径、Nunc）において引き上げられ、空気と液体培地との間の界面にあるステンレス鋼グリッド上へ配置された。続いて、上皮細胞を２０日にわたって層形成させた。ケラチノサイトの層形成後、ＤＣを、４．１０５個の細胞／５０μｌ（ケラチノサイト成長培地）濃度でｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された上皮の上部上へ播種した。液体培地又はポリカルボフィルゲルには、下記濃度で種々のケモカイン／デフェンシンを補充したか、或いは補充しなかった：５００ｎｇ／ｍｌの単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１、Peprotech,ニュージャージー州ロッキーヒル）、７５０ｎｇ／ｍｌのヒト好中球ペプチド−２（ＨＮＰ２、Sigma-Aldrich,ミズーリ州セントルイス）、７５０ｎｇ／ｍｌのヒトβデフェンシン−２（ＨβＤ２、PeproTech, ニュージャージー州ロッキーヒル）又は５００ｎｇ／ｍｌのマクロファージ炎症性タンパク質３α（ＭＩＰ３α、PeproTech, ニュージャージー州ロッキーヒル）。３７℃で４８時間後、コラーゲンラフトを収集した。続いて、培養物を−７０℃でＯＣＴ化合物(Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ, Sakura, The Nethrlands)中に包埋して、免疫組織化学分析用にクリオスタットミクロトームで切片化した。
【００３４】
免疫組織化学
上皮層へ遊走するＤＣの密度は、抗ＣＤ１ａモノクローナル抗体（クローン  ＮＡ１／３４、Dako,（デンマーク、グロストルップ）社製）を用いてアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ技法（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ、Vector Laboratories,カリフォルニア州バーリンゲーム）により評価した。８ミクロンの凍結切片を冷アセトン中で３０分間固定して、内因性ペルオキシダーゼを０．１％Ｈ２Ｏ２で３０分間ブロックした。続いて、切片を順次、抗ＣＤ１ａ抗体（２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中に１／４０希釈で）とともに１時間、ビオチン化マウス抗Ｉｇ抗体とともに３０分間、及びストレプトアビジン／ホースラディッシュペルオキシダーゼ／アビジン／ビオチン複合体とともにさらに３０分間インキュベートした。陽性細胞は、３，３’−ジアミノベンジジン基質（ＤＡＢ）により可視化させた。切片はヘマトキシリンにより対比染色させた。
【００３５】
器官型培養物におけるＣＤ１ａ＋細胞浸潤の評価
器官型培養物におけるＤＣ／ＬＣ浸潤は、上皮の上部と個々のＤＣとの間の距離を、画像分析のコンピュータシステム（ＣＡＳ、Becton Dikinson,ベルギー、エーレムボードヘム）により測定することにより評価した。続いて、浸潤深さと培養物の厚さとの間の比を算出した。パーセント比は、培養物の上部上に留まるＤＣ／ＬＣに関しては０％、上皮の底部に到達するＤＣ／ＬＣに関しては１００％であった。
【００３６】
ケラチノサイト成長阻害アッセイ
ＤＣ（４００００個のＤＣ／ウェル）を伴うか、又は伴わないＨＰＶ形質転換ケラチノサイト細胞系（５×１０３個の細胞／ウェル）を、ケモカイン／デフェンシンを伴うか、又は伴わない９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ、NUNC）中で培養した。増殖は３７℃で４８時間後に測定され、続いて０．４μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジン（６，７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Moravek Biochemicals,カリフォルニア州ブレア）とともに１８時間インキュベーションした。［３Ｈ］チミジンは、分裂中に細胞周期のＳ期中にＤＮＡに組み込むことができる。ＤＮＡは、自動サンプル収集器(Packar, Canberra, オランダ、ティルブルフ）により収集されて、チミジン組込みは、液体シンチレーションカウンター(Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ、Packard, Canberra）を使用することにより分析された。データは、下記式：
増殖％＝（試験ｃｐｍ／対照ｃｐｍ）×１００
（式中、試験ｃｐｍは、ケモカイン／デフェンシンの存在下又は非存在下でＤＣを伴って培養したケラチノサイトによる［３Ｈ］チミジン組込みであり、対照ｃｐｍは、ＤＣを伴わないが、ケモカイン／デフェンシンを伴うか、又は伴わないケラチノサイトによる［３Ｈ］チミジン組込みである）
を使用することにより算出される増殖のパーセントとして提示される。
【００３７】
混合リンパ球反応アッセイ
刺激集団（樹状細胞）を収集して、２５００ラドで照射した。洗浄及び遠心分離後、細胞は、５％ヒトプールＡＢ血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で５００００個のＤＣ／１００μｌへ調節された。続いて、刺激細胞（５００００個のＤＣ／ウェル）を、ウェル１つ当たり１×１０５個の同種異系ＰＢＭＣ及び種々のケモカイン／デフェンシンを含有する丸底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ）へ添加した。試験は四重反復で実施した。増殖応答は、０．４μＣｉ［３Ｈ］チミジン（６，７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Moravek Biochemicals,カリフォルニア州ブレア）を各ウェルへ添加することにより培養の７日後に測定した。ＤＮＡは、自動サンプル収集器(Packar, Canberra,オランダ、ティルブルフ)により１８時間後に収集されて、液体シンチレーションカウンター（Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ、Packard, Canberra）で計数された。
【００３８】
統計学的分析
統計学的分析は、対応のない（unpaired)スチューデントｔ検定を使用することにより実施した（Ｉｎｓｔａｔ  Ｍａｃ  ２．０１ソフトウェア、Graph-Pad Software,カリフォルニア州サンディエゴ）。差は、Ｐ＜０．０５である場合に統計学的に有意であるとみなした。
【００３９】
結果
ＨＮＰ２及びＭＣＰ−１は、ＤＣの走化性を誘導する
ＤＣの遊走に影響を与えることができる分子を同定するために、本発明者等は、Ｂｏｙｄｅｎマイクロ走化性チャンバを使用して遊走アッセイを実施した。この研究用に生成されるＤＣは、フローサイトメトリ及び表面表現型により、形態、前方散乱値及び側方散乱値を含む幾つかの基準に基づいて９０％純粋であることが判断された（データは示さず）。
【００４０】
図１に示すように、ＤＣに関する化学誘引物質であることが既知であるＧＭ−ＣＳＦ（１ｎｇ／ｍｌ）(Hubert他, 1999)の添加は、ケモキネシスを評価するのに使用される非条件培地と比較して、ＤＣの走化性を有意に増強した。興味深いことに、ＭＣＰ−１及びＨＮＰ２は、予備研究で最適な濃度であることが予め確定されたそれぞれ５００ｎｇ／ｍｌ及び７５０ｎｇ／ｍｌで、ＤＣの遊走を増大させた。さらに、ＭＣＰ−１及びＨＮＰ２の走化性活性は、ＧＭ−ＣＳＦにより誘導される走化性のレベルに類似していた。
【００４１】
ＨβＤ２及びＭＩＰ３αは、ＬＣの走化性を誘導する
ＬＣが走化性分子により誘引され得るかどうかを確定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成させたＬＣを用いて、Ｂｏｙｄｅｎチャンバアッセイを実施した。ＬＣは、造血成長因子（ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ）、サイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＬ４）及びＴＧＦ−β１の存在下で培養されるＣＤ３４＋臍帯血前駆体から生成された（Hubert他, 近刊）。ＦＡＣＳ分析及び電子顕微鏡法により確証されるように、それらは、ＬＣの形態学的特徴、免疫組織化学的（ＣＤ１ａ＋、ＣＤ２０７＋、Ｅ−カドヘリン＋、ＣＬＡ＋及びＣＣＲ６＋）特徴及び超微細構造的特徴（バーベック顆粒）を示した（データは示さず）。
【００４２】
ＤＣに関して観察されるように、ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）は、非条件培地よりも有意に高いＬＣ遊走を誘導した。ＭＩＰ３α（５００ｎｇ／ｍｌ）又はＨβＤ２（７５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でのＬＣの移動度は、ＧＭ−ＣＳＦで観察される移動度と同一であった（図２）。
【００４３】
ポリカルボフィルゲル中に含まれるケモカイン及びデフェンシンは、ＨＰＶ形質転換ケラチノサイトの器官型培養物へのＤＣ／ＬＣの浸潤を刺激する
ＭＩＰ３α及びＨβＤ−２又はＭＣＰ−１及びＨＮＰ２の添加が、それぞれＬＣ及びＤＣの、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察される頸部高度病巣を思わせるｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された（前）腫瘍性上皮を浸潤する能力を調節することができるかどうかを研究した。培養の２０日後、空気／液体界面でコラーゲンゲル上で成長させたＨＰＶ形質転換ケラチノサイト細胞系は、厚さが最大１０〜１５個の細胞の上皮層を生じた。これらの細胞は、高度病巣生検材料で観察されるように上皮の全層全体にわたってまとまりがなく且つ非常に不規則であるようであった。
【００４４】
ＤＣ又はＬＣは、化学誘引物質分子の存在下又は非存在下でこれらの培養物の上部上で層を成した。免疫療法的アプローチにおいてこれらの分子を局所的に適用する蓋然性を評価するために、ケモカイン及びデフェンシンは、ポリカルボフィルゲル中に含まれた。走化性分子の、ＤＣ／ＬＣの遊走に影響を与える能力は、化学誘引物質添加の４８時間後に器官型培養物の切片におけるＣＤ１ａ＋細胞の密度を評価することにより確定された。図３は、ポリカルボフィルゲル中に含まれるか又は含まれない、走化性分子とともにインキュベートされるか或いは走化性分子とともにインキュベートされないＨＰＶ形質転換器官型培養物におけるＣＤ１ａ標識ＤＣを示す代表的な実験を示す。図４は、ＬＣを用いて実施した類似の実験を表す。
【００４５】
ＨＰＶ形質転換ケラチノサイト器官型培養物では、ＬＣ／ＤＣは、化学誘引物質の非存在下では上皮層を乏しく浸潤した（図３Ａ及び図３Ｂ並びに図４Ａ及び図４Ｂ）。対比して、陽性対照であるＧＭ−ＳＣＦの添加は、上皮層で観察されるＬＣ／ＤＣの密度の有意な増加を引き起こした（図３Ｃ及び図３Ｄ並びに図４Ｃ及び図４Ｄ）。成長培地におけるケモカイン及びデフェンシンの添加は、ＧＭ−ＣＳＦで観察される漸増に類似したＤＣ／ＬＣの漸増を誘導した（図３Ｃ、図３Ｅ、図３Ｇ及び図４Ｃ、図４Ｅ、図４Ｇ）。興味深いことに、この浸潤はまた、化学誘引物質がポリカルボフィルゲル中に含まれる場合にも存在した（図３Ｄ、図３Ｆ、図３Ｈ及び図４Ｄ、図４Ｆ、図４Ｈ）。
【００４６】
ＤＣ／ＬＣ浸潤の定量分析は、器官型培養物の全層全体にわたって全てのＣＤ１ａ＋細胞の浸潤深さを評価することにより実施された（図５）。
【００４７】
器官型培養物の培地にＭＣＰ１又はＨＮＰ２が補充された場合、ＤＣの浸潤は、化学誘引物質を伴わない基本的な浸潤と比較して増大し、ＧＭ−ＣＳＦで観察されるレベルと同等の浸潤レベルに達した（図５Ａ）。ポリガルボフィルゲル中に化学誘引物質分子を含ませることにより、培地中での化学誘引物質の存在下で観察される浸潤と比較してＤＣ浸潤は変更されなかった。
【００４８】
ＬＣの浸潤はまた、ＭＩＰ３α又はＨβＤ−２の存在下でも増大された（図５Ｂ）。器官型培養物の培地にＨβＤ−２が補充された場合、ＬＣの遊走は、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で観察される遊走と比較してわずかに低かった。ＭＩＰ３αの添加は、ＧＭ−ＣＳＦで得られる漸増に類似した漸増を誘導した。液体培地中又はポリカルボフィルゲル中に含まれる化学誘引物質は、類似の様式でＬＣを漸増させた。
【００４９】
ＤＣ／ＬＣ分化に対するケモカイン／デフェンシンの潜在的影響を確定するために、本発明者等は、器官型培養物の二重免疫染色（ＣＤ１ａ／ＣＤ１４）を実施した。ケモカイン／デフェンシンの存在下で器官型培養物に浸潤するＤＣ／ＬＣの表現型は、遊走前に確立される表現型と比較して変更されなかった（データは示さず）。
【００５０】
ＨＰＶ＋ケラチノサイトに対するＤＣの細胞分裂停止活性は、ケモカイン／デフェンシンの存在下で変更されない
ＤＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＰＶ形質転換ケラチノサイトの成長を阻害することが可能である(Hubert他, 2001)ため、本発明者等は、この細胞分裂停止活性に対する走化性分子の影響を確定しようとした。本発明者等は、種々の化学誘引物質の存在下又は非存在下で、ＨＰＶ＋ケラチノサイトをＤＣと共培養することにより４８時間成長阻害アッセイを実施した。
【００５１】
ＤＣは、ＤＣなしの培養物と比較して、ＨＰＶ＋ケラチノサイトの増殖を５６％にまで低減させたため、ＨＰＶ＋ケラチノサイトに対する有意な成長阻害効果を示した。デフェンシンもケモカインも、ＨＰＶ＋ケラチノサイトに対するＤＣの細胞分裂停止活性を変更しなかった。
【００５２】
ケモカイン及びデフェンシンは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＤＣの抗原提示反応に影響を及ぼさない
リンパ球増殖は、ケモカイン又はデフェンシン単独の存在下で変化しなかった（データは示さず）。
【００５３】
図７で示されるように、ＤＣは、走化性分子の存在下又は非存在下で、Ｔリンパ球増殖を刺激するそれらの能力の点で有意に異ならなかった。したがって、ＤＣの、Ｔリンパ球へ抗原を提示する能力は影響を受けなかった。
【００５４】
参考文献
【００５５】
【表１】
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【００５６】
【表２】
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【００５７】
【表３】
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【００５８】
【表４】
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【００５９】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＤＣに関する種々の分子の走化活性を示すグラフであり、ここでＮＣは、非条件培地を示す。結果は、３回の実験の平均値±ＳＤであり、アスタリスクは、統計学的に有意な差を示す：＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２】ＬＣに関する種々の分子の走化活性を示すグラフであり、ここでＮＣは、非条件培地を示す。結果は、７回の実験の平均値±ＳＤであり、アスタリスクは、統計学的に有意な差を示す：＊Ｐ＜０．０５。
【図３】ＨＰＶ＋ケラチノサイトの器官型培養物のＣＤ１ａ＋免疫標識切片により示される、器官型培養物へのＤＣの浸透と外因性ＧＭ−ＣＳＦ（Ｃ、Ｄ）、ＭＣＰ−１（Ｅ、Ｆ）及びＨＮＰ２（Ｇ、Ｈ）の添加との間の相関を示す図であり、ここで写真Ａ及びＢは、走化性分子の非存在下でのＤＣ浸潤を示し、Ｃ〜Ｈは、液体培地中の走化性分子の存在下（Ｃ、Ｅ、Ｇ）又はポリカルボフィルゲル中に含まれる走化性分子の存在下（Ｄ、Ｅ、Ｈ）でのＤＣ漸増を示す。
【図４】ＨＰＶ＋ケラチノサイトの器官型培養物のＣＤ１ａ＋免疫標識切片により示される、器官型培養物へのＬＣの浸透と外因性ＧＭ−ＣＳＦ（Ｃ、Ｄ）、ＭＩＰ３α（Ｅ、Ｆ）及びＨβＤ２（Ｇ、Ｈ）の添加との間の相関を示す図であり、ここで写真Ａ及びＢは、走化性分子の非存在下でのＤＣ浸潤を示し、Ｃ〜Ｈは、液体培地中の走化性分子の存在下（Ｃ、Ｅ、Ｇ）又はポリカルボフィルゲル中に含まれる走化性分子の存在下（Ｄ、Ｅ、Ｈ）でのＤＣ漸増を示す。
【図５】ＨＰＶ形質転換ケラチノサイトの器官型培養物へのＤＣ及びＬＣ浸潤の定量的評価を示す図であり、ここでＤＣの浸透（Ａ）は、ＧＭ−ＣＳＦ（対照として使用）、ＭＣＰ−１及びＨＮＰ２の非存在下で或いは存在下で（ポリカルボフィルゲル中に含まれるか、又は含まれない）試験され、ＬＣの浸透（Ｂ）は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ３α及びＨβＤ２の非存在下で或いは存在下で（ポリカルボフィルゲル中に含まれるか、又は含まれない）評価される。ＤＣ及びＬＣは、抗ＣＤ１ａ抗体で免疫標識することにより検出された。結果は、上皮層厚のパーセントで浸潤深さとして表される（各培養条件に関してｎ＝４）。アスタリスクは、統計学的に有意な差を示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６】ＤＣ媒介性細胞分裂停止活性がケモカイン及びデフェンシンの存在下で維持されることを示す図である。ＨＰＶ＋ケラチノサイトは、５×１０３個の細胞／ウェルで９６ウェルプレート中で培養した。これらの細胞は、４×１０４個の細胞／ウェルで添加したＤＣとともに培養した。走化性分子の存在下又は非存在下での４８時間のインキュベーション後、細胞増殖を３Ｈ−ＴｄＲ組込みにより測定した。結果は、ケモカイン又はデフェンシンの存在下又は非存在下での、単独で培養したケラチノサイトと比較した共培養におけるＨＰＶ＋ケラチノサイト増殖のパーセントとして表される。結果は、異なるドナーに由来するＤＣを使用した４回の実験の平均値±ＳＤとして提示される。
【図７】ケモカイン及びデフェンシンが、ＤＣの、強力な混合リンパ球反応を刺激する能力を変更させなかったことを示す図である。２５００ラドで照射した５×１０４個のＤＣは、７日間ケモカイン及びデフェンシンの存在下で１×１０５個のＰＢＭＣとともに培養した。細胞増殖を３Ｈ−ＴｄＲ組込みにより測定した。増殖指数は、ケモカイン／デフェンシンが添加されるか又はされない混合ＤＣ−ＰＢＭＣ培養物における細胞増殖を、ケモカイン／デフェンシンを伴って又は伴わずに単独で培養したＰＢＭＣと比較することにより得られた。これらの結果は、異なるドナーに由来するＤＣを使用した３回の実験の平均値±ＳＤとして提示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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