(57)【要約】本発明はリバビリン送達システムに関し、より具体的には、単独アミノ酸又はペプチドとしてリバビリンに共有結合するアミノ酸を含む組成と、結合したリバビリン組成物を投与する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2008522959.tif 000005
を有し、Ａはペプチド、糖ペプチド、又は水素、Ｂはペプチド、糖ペプチド、又は水素、Ｃはペプチド、糖ペプチド、又は水素、Ｄはペプチド、糖ペプチド、又は水素であって、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは同時にすべてＨではない化合物。
【請求項２】
Ａがペプチドである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ａが糖ペプチドである請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ａが２、３、４又は５個のアミノ酸からなるペプチドである請求項２記載の化合物。
【請求項５】
Ａがジペプチドである請求項４記載の化合物。
【請求項６】
Ａがトリペプチドである請求項４記載の化合物。
【請求項７】
前記ペプチドのＮ−末端に糖が結合している請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
前記ペプチドの側鎖に糖が結合している請求項１〜７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項９】
ＡがＡｌａ−Ｉｌｅ−、Ａｌａ−Ｐｒｏ−、Ａｓｐ−Ａｓｐ−、Ｄ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−、Ｇａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｇａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、Ｐｈｅ−Ａｌａ−、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−、Ｐｈｅ−、Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−、及びＶａｌ−Ｖａｌ−からなる群から選ばれる請求項１〜８のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１０】
Ａ、Ｂ及びＣが水素原子である化合物と比較して低い毒性を示す請求項１〜９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１１】
前記ペプチド又は糖ペプチドがエステル結合を介して結合している請求項１〜１０のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１２】
消化プロセス中に安定で、循環への吸収で残存し、肝臓へ無傷で到達する請求項１〜１１のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１３】
ヒトにおける総平均生物学的利用能が６４パーセントより大きい請求項１〜１２のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の化合物の製造方法であって、出発材料としてリバビリンを準備すること、前記リバビリンの２’及び３’のＣ−末端を保護すること、及び、前記リバビリンの５’のＣ−末端にペプチド又は糖ペプチドを付加すること、を備えた方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の化合物の使用方法であって、前記化合物又はその薬学的に許容可能な誘導体を、それを必要とする患者に投与すること、を備えた方法。
【請求項１６】
前記化合物が経口投与される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記それを必要とする患者が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、幼児の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、Ａ型インフルエンザウイルス（ＦＬＵＡＶ）、Ｂ型インフルエンザウイルス（ＦＬＵＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ラッサ熱ウイルス（ＬＦＶ）、ハンターンウイルス（ＨＴＮＶ）、及びＳＡＲＳを引き起こす呼吸器のウイルスからなる群から選択されたウイルスに感染している請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
前記患者がＨＣＶに感染している請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容可能な誘導体を含む医薬組成。
【請求項２０】
さらに賦形剤を含む請求項１９記載の医薬組成。
【請求項２１】
経口投与剤形である請求項１９又は２０記載の医薬組成。
【請求項２２】
前記経口投与組成がピル、タブレット又はカプセルである請求項２１記載の医薬組成。
【請求項２３】
前記化合物又はその薬学的に許容可能な誘導体を、インターフェロンとともに患者へ同時投与すること、を備えた請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記インターフェロンがインターフェロン・アルファ−２ａ又はインターフェロン・アルファ−２ｂである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記インターフェロンがＰＥＧ化インターフェロン・アルファ−２ａ又はＰＥＧ化インターフェロン・アルファ−２ｂである請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記患者が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、幼児の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、Ａ型インフルエンザウイルス（ＦＬＵＡＶ）、Ｂ型インフルエンザウイルス（ＦＬＵＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ラッサ熱ウイルス（ＬＦＶ）、ハンターンウイルス（ＨＴＮＶ）、及びＳＡＲＳを引き起こす呼吸器のウイルスからなる群から選択されたウイルスに感染している請求項２３〜２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記患者がＨＣＶに感染している請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口投与されてリバビリンを肝臓に優先的に送達することのできる、リバビリンの小分子プロドラッグに関する。特に、本発明は、低分子ペプチド又は糖ペプチド鎖（１つの糖の部分を有する又は有しない２〜５のアミノ酸）とリバビリンの、限定するものではないが、主としてヌクレオシド類の５’位における結合を含む。通常、これらペプチド又は糖ペプチドの結合は、ヌクレオシドの糖の部分の１つ、２つ、又はすべての３つの水酸基のいずれかの組み合わせで起こる。この合成による改変は、この新しい誘導体が赤血球細胞膜を可逆的に透過することを可能にし、その結果、溶血性貧血のリスクが大幅に減少する。この結合はまた、肝臓への薬物の選択的な送達を促進する。
【背景技術】
【０００２】
世界人口の３％近く（〜２億人）とアメリカ人の１．８％（３９０万人）がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染していると推定されている。その感染者の７５〜８５％は長期感染であり、７０％が慢性肝臓病に苦しみ、１５％が肝硬変になり、約３％がそのウイルスの影響により死亡する。肝炎は、特に、ＡＩＤＳ患者や臓器移植者などの免疫不全の患者を脅かしている。
【０００３】
リバビリン（図１）は、シェリング−プラウ・リミテッドがＨＣＶ感染を治療するための治療薬としてリバファームのライセンス下で販売する抗ウイルス剤である。リバビリンはまた、幼児の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、Ａ型インフルエンザ（ＦＬＵＡＶ）とＢ型インフルエンザ（ＦＬＵＢＶ）、Ａ型肝炎（ＨＡＶ）とＢ型肝炎（ＨＢＶ）、ラッサ熱ウイルス（ＬＦＶ）、ハンターンウイルス（ＨＴＮＶ）、及びＳＡＲＳを引き起こす呼吸器のウイルスの治療に有用であることが分かっている。今日まで、ＨＣＶ感染の最も効果的な治療は、インターフェロン・アルファ−２ａ又はｂ（ＩＦＮ−α−２ａ又はＩＦＮ−α−２ｂ）、或いは、ＰＥＧ化インターフェロン・アルファ−２ａ又はｂ（ＰＥＧ−ＩＦＮ−α−２ａ又はＰＥＧ−ＩＦＮ−α−２ｂ）とともに、活性物質リバビリンを投与することである。
【０００４】
リバビリンの作用形態は、かなり複雑で完全には解明されていない。それは、ウイルスによっておこるＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖の複製を阻害するだけでなく、免疫調整剤としても作用する。抗ウイルス治療の目標は、新しい細胞の感染を制限して、免疫システムが感染した細胞を排除できるようにすることであり、両方の作用形態は、ほかの一般的な抗ＨＣＶ剤を超える明確な利点をリバビリンに与えている。
【０００５】
リバビリンによる治療は多数のウイルスの治療に最も効果的であるが、非常に多くの欠点を有する。以下の警告は、ＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）（経口リバビリン）に記載されており、遊離リバビリンの毒性の範囲と重大性を示している。
リバビリンの主要な毒性は、溶血性貧血である。このＲＥＢＥＴＯＬ治療に伴う貧血は、致命的又は非致命的な心筋梗塞を引き起こす心臓病を悪化させる可能性がある。重大な又は不安定な心臓病の病歴がある患者は、ＲＥＢＥＴＯＬにより治療してはならない。
【０００６】
リバビリンに接触させたすべての動物種において顕著な催奇形効果が見られた。さらに、リバビリンは、複数回投与の半減期が１２日であり、このため６ヶ月もの長期にわたって非血漿区画に残存する可能性がある。したがって、ＲＥＢＥＴＯＬ治療は、妊娠した女性と、妊娠した女性の男性パートナーに禁忌である。女性患者及びＲＥＢＥＴＯＬ治療を受けている男性患者の女性パートナーにおいて、治療中及び治療後６ヶ月間の妊娠を防ぐための細心の注意を払わなければならない。治療中と治療後に続く期間の６ヶ月間は、少なくとも２つの効果的な避妊法を利用しなければならない。非特許文献１を参照。
【０００７】
リバビリンは、顕著な毒性を呈し、通常、溶血性貧血を招く。現状のＰＥＧ−ＩＦＮ−αとリバビリン治療における潜在的副作用は、医学会に対する関心事の主要な領域であり、治療が中止されるか投与されないかの理由となっている。それぞれＩＦＮ−αとリバビリンは両方とも、結果として生じる軽い又は深刻な副作用を伴う遺伝子毒性と細胞毒性を示す。経口投与されたリバビリンは、明確に投与量に依存した溶血性貧血と鬱病を示す。溶血性貧血は、赤血球（ＲＢＣ）中のリバビリン  ５’−三リン酸の蓄積に起因し、治療の終了とともに回復可能である。この副作用は、患者へ与えられる用量を制限し、いくらかの患者におけるさらに進んだリバビリンを用いた治療を妨げる。
【０００８】
薬理的に、リバビリンは、低く可変の生物学的利用能（３３〜６９％）を有する。これにより、ウイルス感染を阻害できる血中濃度を得るために、大量の投与が要求される。この低い生物学的利用能は、大きな初回通過代謝効果によって引き起こされる。経口投与されたリバビリンの簡略化した代謝経路を、図２に概説する。消化管に到達した後、薬剤の大部分（約５３％）は、原型を保った薬剤として、又は代謝体（１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミド及び１，２，４−トリアゾール−３−カルボン酸）として、７２〜８０時間以内に尿中に排出される。一回の経口投与量の約１５％は、７２時間以内に糞便中に排出される。リバビリンの生物学的利用能の総計は、平均６４％である。リバビリンは、血漿からヌクレオシドトランスポータを経由して別の細胞系列中に速やかに吸収され、そこで種々のキナーゼによって、それぞれ５’−一リン酸、５’−二リン酸、そして最終的に５’−三リン酸へ変換される。このリン酸化反応カスケードは、核のある細胞中では可逆であるが、分裂に必要なホスホリラーゼを欠いている、赤血球などの核のない細胞中では不可逆である。この理由により、リバビリンは赤血球内に蓄積され、溶血性貧血の原因となる。
【０００９】
リバビリンは、免疫システムにおいても作用することが報告されているが、インビトロの研究により、感染した細胞の内側でＩＦＮ−αと相乗作用の効果があることが実証された（非特許文献２、３）。さらに、（赤血球溶血に伴う）肝細胞の鉄濃度の増加がＩＦＮ−αの効能を弱めるようである（非特許文献４、５）。その結果として、ペプチド／糖ペプチド結合誘導体の使用による赤血球溶血の減少は、併用治療の間のＩＦＮ−αの長期にわたる応答性を高める。この結果は、選択的に肝臓に送達するためのさらなる動機付けを与える。
【００１０】
リバビリンの肝臓への選択的送達は、ＨＣＶ治療に伴う副作用のリスクを減少させるものでなくてはならない。しかし、選択的な薬物送達には、克服しなければならい困難なハードルが常に存在する。リバビリンの場合において、選択的治療の典型的なルートは、ビラミジン（リバビリンの３−カルボキシアミジン類似体）などのプロドラッグを活用するものであり、それは肝臓中で（例えば、ビラミジンについてはアデノシンデアミナーゼによって）親化合物に変換される。選択的な薬物送達の別の一般的な経路は巨大分子を用いるものであり、ここで薬物は、作用部位に共有結合し、作用部位から最終的に放出される。この輸送形態は通常、巨大分子の受容体結合に依存し、ほとんどの場合において、経口投与することができない。
【００１１】
本発明は、リバビリンを肝臓へ優先的に送達するために経口投与可能な、リバビリンの小分子プロドラッグに関する。特に、我々はリバビリンの多くの低分子ペプチドと糖ペプチドの結合誘導体を作製した。リバビリンのペプチド／糖ペプチド誘導体の潜在的な用途は、従来はそれぞれ解決するために努力されるだけであったＨＣＶ治療の主要な欠点を両方とも改善し、すなわち副作用を顕著に減少させ、そして侵襲的な治療法を減らすための、新規な方法を代表するものである。毒性が減少した現在のリバビリンのプロドラッグは、静注（ＩＶ）投与又は筋注（ＩＭ）投与が必要である。遊離リバビリンは、経口摂取可能である（ＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標））が、望ましくない副作用を示す。両方の方法の利点を組み合わせて、同時に、薬剤の薬物動態を厳密に制御することでその欠点を排除し又は少なくとも大幅に軽減することで、顕著な治療上及び商業上の利益を伴った新規な方法が実証される。
【００１２】
例えば、本発明のリバビリンのペプチドと糖ペプチドの結合誘導体は、親化合物の毒性の改善に役立つ。毒性を減少させるために、本発明は、特定の低分子ペプチド（２〜５のアミノ酸）又は糖ペプチド（１〜２の糖の部分を有する２〜５のアミノ酸）をリバビリンの糖の部分へ結合させ、特定部位の肝臓ターゲティングを可能にし、早期の劣化を防止する。胃腸内（ＧＩ）消化に対しては安定であるが感染部において最初に代謝されるリバビリンのペプチド又は糖ペプチドの誘導体（又は「プロドラッグ」）は、大幅に向上された毒性プロフィールと、初回通過代謝を避けることにより高められた生物学的利用能を示す。このリバビリン誘導体のほとんどは、その５’−ＯＨがペプチドによってブロックされて肝臓（その他の細胞内では少量）で加水分解されるまでリン酸化されないので、形質細胞膜を可逆的に通過できるはずである。その結果、プロドラッグとその代謝体は、無核細胞（non-nucleated cell）中で蓄積しない。この効果は、この薬剤の毒性（特に溶血性貧血）を大幅に減少させるはずであり、肝臓への選択的送達をも改善するものと思われる。
【００１３】
本発明のリバビリンのペプチドと糖ペプチドの結合誘導体のもう１つの利点は、抗ウイルス性の疾病（例えば、ＨＣＶ）の治療用の方法として、この結合誘導体を用いることである。治療は、（例えば、インターフェロンとの）併用治療を不要とする経口投与のみに単純化可能である。さらに、リバビリンと低分子ペプチド鎖又は糖ペプチド鎖の結合は、さらなる可変性を与え、その結果、治療の最適化（例えば、毒性の低減、生物学的利用能の向上）にさらなる可能性を与える。他方、低分子ペプチド又は糖ペプチドの誘導体は、リバビリンの巨大分子（例えば、蛋白質）誘導体よりも作製、特性決定、最適化が容易である。
【非特許文献１】Koren, G. et al., Can. Med. Ass. J. 2003, 168(10), 1289-1292.
【非特許文献２】Miller, J. P., et al., J. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1977, 284, 211-229.
【非特許文献３】Weiss, R. C., et al., Veter. Microbiol. 1989, 20, 255-265.
【非特許文献４】Okada, I., et al., J. Lab. Clin. Med. 1992, 120, 569-723.
【非特許文献５】Di Bisceglie, A. M., et al., J. Hepatol. 1994, 21, 1109-1112.
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、リバビリンのペプチド又は糖ペプチドへの共有結合誘導体に関する。本発明は、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド（ここではキャリアペプチドのことも意味する）、又は糖ペプチドの、Ｎ末端、Ｃ末端、又は側鎖へ、リバビリンを直接共有結合する点において、従来技術から区別される。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、アミノ酸、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド、又は糖ペプチドに共有結合したリバビリンを含む組成物を提供する。好ましくは、アミノ酸、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド、又は糖ペプチドは、（ｉ）２０の天然型アミノ酸（Ｌ又はＤ異性体）、又はその異性体、類似体、誘導体のうちの１つ、（ii）２０の天然型アミノ酸（Ｌ又はＤ異性体）、又はその異性体、類似体、誘導体のうちの２つ以上、（iii）１つの合成アミノ酸、（iv）２つ以上の合成アミノ酸、又は（ｖ）１つ以上の天然アミノ酸と１つ以上の合成アミノ酸、を含む。好ましくは、アルキル側鎖を有する合成アミノ酸は、長さがＣ１〜Ｃ１７のアルキル基、より好ましくは長さがＣ１〜Ｃ６のアルキル基から選択される。ペプチドは好ましくは、（ｉ）１つのオリゴペプチド、（ii）２０の天然アミノ酸（Ｌ又はＤ異性体）、又はその異性体、類似体、誘導体のうちの１つのホモポリマー、（iii）２０の天然アミノ酸（Ｌ又はＤ異性体）、又はその異性体、類似体、誘導体のうちの２つ以上のヘテロポリマー、（iv）合成アミノ酸のホモポリマー、（ｖ）２つ以上の合成アミノ酸のヘテロポリマー、又は（vi）１つ以上の天然アミノ酸と１つ以上の合成アミノ酸のヘテロポリマーである。糖ペプチドは、好ましくは、上述のペプチドにさらに糖が結合したものである。
【００１６】
一実施形態において、リバビリン結合は、天然アミノ酸と合成アミノ酸のいずれかの単一のアミノ酸に結合している。別の実施例において、リバビリン結合は、天然アミノ酸と合成アミノ酸の任意の組み合わせからなるジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド、又は糖ペプチドに結合している。別の実施形態において、アミノ酸は、プロテアーゼで消化されるようにＬ−アミノ酸から選択される。
【００１７】
別の実施形態において、ペプチドキャリアは、従来の方法を用いて作製することができる。好ましい方法は、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の混合物の共重合である。別の実施形態において、ペプチドは、組み換え微生物の発酵プロセスと、その後の適切なペプチドの取得と精製によって作製可能である。或いは、特定のアミノ酸配列が必要な場合は、特定のパフォーマンス特性を目的とした特定の物理化学的特性を有するペプチドを製造するために、自動ペプチド合成装置を用いることができる。
【００１８】
リバビリンは、従来の方法を用いてペプチド又は糖ペプチドの側鎖に共有結合させることができる。好適な実施形態において、リバビリンを含むカルボン酸は、ペプチド側鎖のアミン又はアルコールに結合して、アミド又はエステルをそれぞれ形成することができる。別の実施形態において、リバビリンを含むアミンは、側鎖のカルボン酸塩、カルバミド、又はグアニンに結合して、アミド又は新規のグアニンを形成することができる。さらに本発明の別の実施形態において、リンカーは、事実上ペプチドの任意の側鎖が結合可能な化合物のすべての化学種のグループから選択可能である。別の実施形態において、リバビリンは、リンカーを用いることなくアミノ酸に直接結合する。
【００１９】
別の実施形態において、リバビリンのキャリアペプチド又は糖ペプチドへの直接結合は安定な化合物を形成しない可能性があり、このため、リバビリンとペプチドの間のリンカーの組み込みが必要とされる。リンカーは、キャリアペプチドの共有結合する、カルボン酸塩、アルコール、チオール、オキシム、ヒドラキソン、ヒドラジド、又はアミンなどのペンダント官能基を有する。
【００２０】
本発明はまた、ペプチド又は糖ペプチドへ共有結合したリバビリンを含む組成物の作製方法を提供する。この方法は以下のステップからなる。
（ａ）リバビリンをアミノ酸の側鎖（及び／又はＮ末端、及び／又はＣ末端）に結合させ、リバビリン／アミノ酸複合体を形成する。
（ｂ）リバビリン／アミノ酸複合体から、アミノ酸複合体Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）を形成し、又はリバビリン／アミノ酸複合体ＮＣＡを形成する。
（ｃ）リバビリン／アミノ酸複合体Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）を重合する。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、投与形態の信頼性とバッチ間の再現性を提供するための、リバビリン結合誘導体の使用方法である。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は患者にリバビリンを送達する方法を提供し、患者はヒト又はヒト以外の動物であり、その方法は、ペプチド又は糖ペプチドに共有結合したリバビリンを含む組成物を患者へ投与することを含む。一実施形態において、リバビリンは、酵素触媒反応によってその組成物から放出される。別の実施形態において、リバビリンは、酵素触媒性放出の薬物動態学に基づく時間に依存した方法で放出される。
【００２３】
本発明の組成物は、１つ以上のマイクロカプセル化剤、助剤、薬学的に許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。リバビリンは、マイクロカプセル化剤、助剤、薬学的に許容可能な賦形剤と、共有結合、イオン結合、親水性の相互作用を通じて、又はほかの非共有の方法によって結合させることができる。マイクロカプセル化剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アミノ酸、糖類、塩から選択可能である。別の実施形態において、その組成物に助剤が含まれている場合、その助剤は好ましくは、腸又は胃の膜の透過性を向上させること、又は腸のトランスポータを活性化させること、のいずれかによって、より優れた吸収作用を与える。
【００２４】
本発明の別の実施形態において、リバビリンは、要求された性能特性を与えるために、分子量、サイズ、官能基、ｐＨ感受性、溶解度、三次元構造、消化率などの共有結合に対して特定の物理化学的特性を与える、種々のアミノ酸のペプチドに結合されている。
【００２５】
別の好適な実施形態において、アミノ酸の鎖長は異なる送達基準に適合するように変化させることができる。生物学的利用能を高めて送達するために、リバビリンは単一のアミノ酸から８つのアミノ酸に結合させてもよいが、２つから５つの範囲のアミノ酸が好ましい。送達を調節し又はリバビリンの生物学的利用能を向上させるために、糖ペプチドの好適な長さは、アミノ酸の長さで２つから５０の間である。別の実施形態において、キャリアペプチドは、リバビリン−ペプチド又はリバビリン−糖ペプチド結合誘導体の溶解度を制御し、リバビリンの溶解度には左右されない。したがって、結合リバビリン組成物によって与えられる持続された又はゼロ次速度過程のメカニズムは、不規則な放出と、典型的な分解制御された徐放法が直面する扱いにくい処方を避けるものである。
【００２６】
別の実施形態において、リバビリンは、活性トランスポータとして認識され取り上げられているアジュバントに結合させてもよい。一実施例において、その活性トランスポータは、胆汁酸活性トランスポータではない。別の実施形態において、本発明は、送達用の活性トランスポータとして認識され取り上げられているアジュバントへリバビリンを結合させることを要求しない。
【００２７】
別の実施形態において、キャリアペプチドは複数のリバビリンが結合可能である。その結合誘導体は、リバビリン部分、又は、さらに送達を変更可能とし放出と標的送達を増進し及び／又は吸着を増進するほかの修飾分子、が複数結合することを可能とする追加的な利点を提供する。さらなる実施形態において、その結合誘導体は、アジュバントと結合させてもよく、マイクロカプセル化してもよい。
【００２８】
別の実施形態において、その結合誘導体は、薬剤送達、細胞標的、増強されれた生物学的感応性などの、広範囲にわたる薬学的応用法を提供する。
【００２９】
別の好適な実施形態において、本発明の組成物は、摂取可能なピル、タブレット又はカプセル、静脈注射製剤、筋肉注射製剤、皮下注射製剤、持続性製剤インプラント、経皮製剤、経口懸濁液、舌下製剤、経鼻製剤、吸入剤、又は座薬の形態である。別の実施形態において、ペプチド又は糖ペプチドは、ｐＨ依存性の方法で組成物からリバビリンを放出することができる。
【００３０】
別の実施形態において、経口以外の方法でリバビリン結合誘導体を投与した後、そのペプチド構造のために肝臓の酸化酵素の認識が回避されることによって、初回代謝が妨げられる。
【００３１】
本発明は、組成物からリバビリンの放出を制御するための方法も提供し、その組成物は、ペプチド又は糖ペプチドを含み、その方法は、リバビリンをペプチド又は糖ペプチドへ共有結合させることを含む。本発明のさらなる実施形態において、治療濃度域内で血中濃度が持続する期間を延長することによって、種々の化学的又は治療上の分類の中からリバビリンの性能を増強することが達成される。標準的な製剤が良好な生物学的利用能を実現する薬剤において、血中濃度は、以下に説明するような最適治療効果を狙って、あまりにも早くピークに達する。腸の酵素による消化でリバビリンを放出する特定のペプチド結合誘導体の設計と合成は、放出と吸収のプロフィールを調節し、したがって、曲線下の比較されうる面積を維持し、一方、長時間にわたってリバビリンの吸収を円滑にする。
【００３２】
結合プロドラッグは、持続した又は延長された放出を親化合物に与える。持続した放出とは、通常、遅い一次反応速度に向けて吸収をシフトさせることをいう。延長された放出とは、通常、化合物の吸収にゼロ次反応速度を与えることをいう。生物学的利用能は、吸収速度以外の、腸細胞と肝臓による初回代謝、腎臓によるクリアランス速度などのファクターによっても影響を受ける。これらのファクターに関連したメカニズムは、薬剤結合誘導体が吸収後に原型を保っていることを必要とする。徐放のメカニズムは、多数のファクターのいずれか又はすべてが要因となっている。これらのファクターにはつぎのものが含まれる。１）管腔の消化酵素により親薬剤を穏やかに酵素的に放出させること、２）腸粘膜の表面結合酵素により穏やかに放出させること、３）腸粘膜細胞の細胞間酵素により穏やかに放出させること、４）血清酵素により穏やかに放出させること、５）吸収の受動メカニズムを摂取の能動メカニズムへ変換し、薬物吸収を受容体密度と同様に受容体結合についてのＫｍに依存させること、６）親薬剤の溶解度を低下させ、その結果としてより穏やかに分解させること、７）溶解度を増加させ、その結果としてより大量の薬物を分解させ、利用可能量の増加により長期にわたって吸収させること。
【００３３】
酵素が仲介した放出技術の潜在的長所は、上述の例を超えて拡大する。例えば、はじめの方で説明したように、リバビリンをペプチドの１つ以上のアミノ酸と共有結合させて、その薬剤を患者に投与することによって達成される吸収の増加により、リバビリン結合誘導体は恩恵を受ける。本発明はまた、腸上皮輸送システムを対象とし、リバビリンの吸収を促進することも可能とする。つぎには、改善された生物学的利用能が、必要とされる投与量の低下に貢献する。したがって、本発明のさらなる実施形態において、ここで説明した方法でリバビリンの放出を調節し生物学的利用能を改善することによって、リバビリンの毒性を減らすことが可能となる。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、使用されるアミノ酸によって、要求された送達に応じた特定のｐＨ又は温度において結合を幾らか不安定にさせることが可能となる。さらに、一実施形態において、アミノ酸の選択は、要求された物理的性質に依存する。例えば、嵩高さ（bulk）又は親油性の増加が求められる場合は、キャリアポリペプチドはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、及びチロシンを含む。他方、極性アミノ酸は、ペプチドの親水性を増加させるために選択される。別の実施形態において、反応性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、リジン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、及びシステイン）は、リバビリン又はアジュバントが同じキャリアペプチドに結合するための複数の点を得るために組み込まれてもよい。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は、Ｃａｃｏ−２細胞を用いて結合を試験する方法を提供する。
【００３６】
前述の一般的な説明及び後述の詳細な説明はともに典型的なものであって、本発明を限定するものではない。種々の利点と有用性と同様に本発明のこれらの又はその他の特徴は、好適な実施形態の詳細な説明を参照することによって、及び添付した図面によって、より明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
本発明は、以下の詳細な説明を添付図面と関連付けて読んだときに最もよく理解される。
【図１】リバビリンの構造を示す。
【図２】リバビリン代謝（左）とリバビリン−ペプチド／糖ペプチド結合誘導体（右）の起こりうる代謝の比較を示す。
【図３】ＥＬＩＳＡ分析により測定されたときのポリ（Ｇｌｕ）−ＡＺＴの２つのバッチに対するＡＺＴの血中濃度を示す。
【図４】ＥＬＩＳＡによって検出されたＡＺＴ／Ｇｌｕ（ＡＺＴ）ｎ濃度と、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出された遊離ＡＺＴ濃度の比較を示す。
【図５】ＡＺＴのアミノ酸プロドラッグを示す。
【図６】親薬剤（赤、四角）とペンタペプチドプロドラッグ（青、菱）について、ＩＶ投与後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳで検出された遊離薬剤の量を示す。
【図７】リバビリンジペプチドの一般式を示す。
【図８】カルバミン酸結合を含む、リバビリンの糖ペプチドの構造を示す。
【図９】種々の鎖長を有するリバビリンペプチド誘導体の合成スキームの例を示す。
【図１０】リバビリン糖ペプチドの合成スキームの例を示す。
【図１１】典型的な創薬方法を示すフローチャートである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明の全体を通じて使用する「ペプチド」は、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドを含むことを意味する。本発明の全体を通じて使用する「糖ペプチド」は、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドに共有結合した糖質を含むことを意味する。本発明の全体を通じて使用する「キャリアペプチド」は、ペプチド又は糖ペプチドのことをいう。本発明の全体を通じて使用する「プロドラッグ」及び／又は「誘導体」は、ペプチド−リバビリン結合誘導体及び／又は糖ペプチド−リバビリン結合誘導体のことをいう。
【００３９】
本発明においてリバビリンがペプチド又は糖ペプチドに結合しているというときは、リバビリンの特定の実施形態を説明するものである。好適な結合の長さとその他の好適な実施形態は、ここで説明される。
【００４０】
調節とは、全体の吸収量、吸収速度、及び／又は標的送達に、少なくとも変化を及ぼすか、又は変化させることを含むことを意味する。持続された放出とは、少なくとも、単独で送達された基準薬剤と比較して、キャリアペプチド−リバビリン組成物の送達後３６時間までの期間、血流中の基準化合物の量が増加することを含むことを意味する。持続された放出とは、さらに、従来の製剤設計のリバビリンを同じ送達経路を経て放出したときと比較して長期間にわたって全身の血液循環中へリバビリンが放出されることとして定義されてもよい。
【００４１】
リバビリンは、その組成物から酵素触媒によって放出されてもよく、又はｐＨ依存性の化学触媒によって放出されてもよい。好適な実施形態において、リバビリンは、その組成物から酵素触媒によって放出される。一実施形態において、リバビリンは、持続された放出法によって組成物から放出される。別の実施形態において、組成物からのリバビリンの持続された放出は、ゼロ次、又はほぼゼロ次の薬物動態を有する。
【００４２】
本発明は、リバビリンの送達にいくつかの利益をもたらす。ほとんどの現在のリバビリン治療薬は、静注（ＩＶ）又は筋注（ＩＭ）をいまだに必要とするが、本発明は、非常に侵襲性が少なく送達可能なリバビリン結合誘導体を提供する。このペプチドプロドラッグの安定性は、アミノ酸配列又は結合だけでなく、アミノ酸の種類にも依存する。ほとんどの天然アミノ酸は、Ｌ−配置を有する。しかし、Ｄ−アミノ酸、合成アミノ酸、及びＮ−メチルアミノ酸の結合は、ペプチドとその誘導体の代謝安定性を顕著に増加させることがある。分岐アミノ酸結合を有する組み合わせにおいて（薬剤はアミノ酸の側鎖に結合している）、これらの非天然ペプチド結合誘導体は、特異性の低い肝酵素として知られているにもかかわらず、消化酵素又は血中酵素の基質になる可能性が小さい。
【００４３】
アミノ酸の選択は、要求された物理的性質に依存する。例えば、嵩高さ又は親油性の増加が求められる場合には、キャリアペプチドは、嵩高い、親油性の側鎖を有するアミノ酸が高められたものとなる。他方、極性アミノ酸は、ペプチドの親水性を増加させるために選択される。イオン化アミノ酸は、ｐＨ制御のペプチドの展開のために選択される。アスパラギン酸、グルタミン酸、及びチロシンは、胃の中では電荷を帯びていないが、腸に入るとイオン化する。反対に、ヒスチジン、リジン、及びアルギニンなどの塩基性アミノ酸は、胃の中ではイオン化され、アルカリ性環境下では電荷を帯びていない。
【００４４】
芳香族残基間のπ−π相互作用、プロリンの付加によるペプチド鎖のよじれ、ジスルフィド架橋結合、及び水素結合などのその他のファクターは、要求された性能パラメータのために最適なアミノ酸配列を選択するためにすべて用いることができる。直線状の配列の順序は、これらの相互作用を最大にすることのできる方法に影響を与え、ポリペプチドの二次及び三次の構造の方向付けに重要である。
【００４５】
分子量可変のキャリアペプチドは、リバビリン放出の反応速度において意味深い効果を有する。結果として、低分子量のリバビリン送達システムが好ましい。本発明の１つの長所は、ペプチドの鎖長と分子量を、要求された保護のレベルに応じて最適化できることである。この特性は、放出のメカニズムの第一段階の反応速度に合せて最適化することができる。したがって、本発明の別の長所は、延長された放出時間がキャリアペプチドの分子量を増加させることによって与えられることである。
【００４６】
一実施形態において、リバビリンは、長さが１個ないし４５０のアミノ酸の間の範囲にあるペプチドに結合している。別の実施形態において、２ないし５０のアミノ酸が好ましく、１ないし１２個のアミノ酸がより好ましく、１ないし８個のアミノ酸が最も好ましい。別の実施形態において、アミノ酸の数は、１，２，３，４，５，６，又は７個のアミノ酸から選択される。本発明の別の実施形態において、結合誘導体のキャリア部分の分子量は、約２，５００未満、より好ましくは、約１，０００未満、最も好ましくは、約５００未満である。
【００４７】
最適には、ペプチドの鎖長は、開発と生産のコストと時間を最小化するためにできるだけ短くすべきである。好ましくは、結合誘導体はアミノ酸が２個から最大５個までの範囲の鎖長を有するべきである。５を超えるアミノ酸を有するペプチドは、ＧＩ消化を切る抜けることができず、製造にコストがかかる。ジペプチドとトリペプチドの誘導体が特に好適である。
【００４８】
本発明の糖ペプチドは、ペプチド鎖に結合する少なくとも１つの糖の部分を含む。考えられる糖の候補としては、ガラクトース、マンノース、及びこれらの誘導体が含まれる。これら二つの糖は、肝臓のアシアロ糖蛋白受容体に最高の親和性を示す。
【００４９】
本発明の組成物は、３つの必須の結合の型を含む。この結合の型は、Ｃ−キャッピング、Ｎ−キャッピング、側鎖結合と称される。Ｃ−キャッピングは、リバビリンのペプチドのＣ−末端への直接又はリンカーを経由した共有結合からなる。Ｎ−キャッピングは、リバビリンのペプチドのＮ−末端への直接又はリンカーを経由した共有結合からなる。側鎖結合は、リバビリンのペプチドの官能側鎖への直接又はリンカーを経由した共有結合からなる。反応性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グルタミン酸、リジン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、システイン）は、複数のリバビリン又はアジュバントを同じキャリアペプチドに結合させるために組み込まれてもよい。本発明はまた、キャリアの鎖に沿った複数のリバビリン部分を用いることを想定している。
【００５０】
リバビリンには、ペプチドのＣ−末端が結合できる４つの位置がある。２’−ＯＨ、３’−ＯＨ、５’−ＯＨ、核酸塩基のアミド基である。
【００５１】
【化２】
2008522959.tif 000002
【００５２】
本発明の一実施形態において、置換誘導体が修飾されるのは、好ましくは糖環の５’−位である。この第一アルコールは、糖環の立体障害が最小の位置である。このほかのいずれかの水酸基への結合も可能であるが、合成的により困難である。その２つの第二の水酸基は、イソプロピリデン基で簡単に保護できるが、３’−ＯＨと５’−ＯＨ、又は２’−ＯＨと５’−ＯＨの選択的保護は、より複雑な経路を要する。さらに、５’−ＯＨの直接ブロッキングは、リン酸化反応を回避し、したがってＲＢＣ中の蓄積を回避する、最良の方法であると思われる。同様に、アミド基の塩基部分にペプチドを付加すると、保護されていない５’−ＯＨが残り、その上、最終的なペプチドに分裂する間に、それぞれの親薬剤のカルボン酸誘導体への望ましくない変換が生じる可能性がある。さらに、ペプチドは、ヌクレオシドの１つ以上の官能基に付加し、複数置換誘導体を与える可能性がある。
【００５３】
ペプチドを糖の水酸基に結合するには、主に２つの方法がある。第一は、エステル結合を経由したペプチドのＣ−末端の結合である。もう１つの方法は、ペプチドの安定なアミノ酸（例えば、Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ）の側鎖官能基へヌクレオシドを結合することを含む。これらの結合は、エステル結合、アミド結合、カルバミン酸結合、カーボネート結合、又はエーテル結合である。ペプチドとヌクレオシドの間の接続は、結合の安定性を決定するものであるので、この種々の異なった結合の選択の余地は、要求された性質を示す適切な主要化合物を見つける機会を増加させるだろう。
【００５４】
同様に、糖ペプチド結合誘導体は、すでに結合しているペプチドのＮ−末端又は側鎖官能基へ糖の部分を付加することによって合成することができる。糖をペプチドへ結合する単純な方法は、カルバミン酸結合を経由する（図８）。もしこの糖ペプチドが十分な安定性を示さない場合は、ほかのタイプの結合、例えば、カーボネート結合又はエーテル結合を検討することができる。
【００５５】
本発明について、以下の限定されない実施例を参照して説明する。
【実施例１】
【００５６】
［リバビリンのペプチド／糖ペプチド誘導体の調製］
リバビリンのペプチド及び／又は糖ペプチドの誘導体を多数調製し（表１）、合成の実行可能性と、その化合物の予備的なスクリーニング法を検討した（図７）。標準的なペプチドとヌクレオシドの化学により、これらの結合誘導体が簡単に得られることを見出した。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
これらの結合誘導体のいくつかについて、胃腸（ＧＩ）区域で通常見出される酵素、ペプシン、エステラーゼ、パンクレアチンを用いたインビトロアッセイを用いて胃腸（ＧＩ）消化への安定性を試験した。得られたデータは、ほとんどのリバビリンが、与えられた条件下で活性薬剤の最小量しか放出しないことを示した。
【００５９】
［実験計画と方法］
本発明は、経口投与されたときに、原型を保って血流に吸収され、循環し、肝臓でリバビリンに代謝される、リバビリンのプロドラッグの発見に関する。この発見は、リバビリンの低分子ペプチドと糖ペプチドのプロドラッグの合成と、種々のインビトロアッセイにおけるそれらの安定性、吸収、代謝の特性決定を伴う。後述のように、リバビリンのエステルを調製するための合成手順は、標準的な溶液相のペプチドと糖の化学に従うものであり、その両方は、この技術において十分に確立されたものである。さらに、安定性、吸収、代謝を評価するインビトロアッセイは、十分に文書化されており、胃腸の消化、腸の吸収、血中濃度半減期、全血の性質、肝臓の取り込みと代謝のモデルを示すものである。提案されたインビトロの基準のいくつか又はすべてを満たす選択されたリバビリン結合誘導体について、インビボの薬物動態学のプロフィールと分布を試験した。
【００６０】
［合成計画］
ペプチド鎖をエステル結合を介してリバビリンなどのヌクレオシドへ共有結合する方法は、標準的なペプチドと糖の化学に関係するものである。この方法は、ペプチド前駆体の合成、又は単一のアミノ酸の所定の薬剤への直接カップリングで始まる。アミノ酸又はペプチドの側鎖は、つぎにその中間体と、追加のペプチド（通常はジペプチド）のスクシミニドエステルを縮合することによって、延長される。アミノ酸と遊離した薬剤に応じて、我々は、初期のカップリング反応は以下の２つの技術のうちの１つを用いることで、最も効率的に行うことができることを見出した。１）アミノ酸／ペプチドのスクシミニドエステルの付加、又は、２）活性化剤（例えば、ＨＢＴＵ、ＴＳＴＵ）を用いた直接カップリング。リバビリンの場合、スクシミニドエステル法が、反応時間、収率、純度の点で好ましい結果を与える。
【００６１】
［合成スキーム］
我々は、表１（図８と９）に記載された化合物を首尾よく合成することのできる合成経路を開発した。全合成は短く（３〜７ステップ）、短時間で変形体（variables）の最大数を調査し、スクリーニング結果に素早く対応することが可能である（図８）。第一ステップにおいて、リバビリンをイソプロピリデン基で保護した。つぎのＮ−保護ジペプチドとのカップリングにより、最終のペプチド又は糖ペプチドの誘導体の前駆体が得られた。前者は１つの脱保護反応後に容易に得られた。後者の調製は、イソプロピリデン基を分離せず、又は側鎖官能基（例えば、Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ）を有すると見込まれるアミノ酸を保護することなく、ペプチドのＮ−末端を選択的に脱保護することが必要であった。結果として得られた中間体を糖の誘導体とカップリングし、つぎに完全に脱保護して最終のリバビリン糖ペプチドを得た（図９）。
【００６２】
リバビリン−２’，３’−イソプロピリデンの調製
無水オルト蟻酸トリエチル（２．２当量）とトルエンスルホン酸一水和物を無水アセトンに溶解した。溶液を２０時間、室温で撹拌した。リバビリン（１当量）をできるだけ少量の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、続いてアセトン溶液に加えた。混合物を２０時間、５０℃に加熱した。溶媒を蒸発させて乾燥させた。残渣をカラムクロマトグラフィー（０〜８％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製した。
【００６３】
保護されたリバビリンジペプチド誘導体の調製
イソプロピリデンで保護されたリバビリンを無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。Ｎ−メチルモルホリン（５当量）と保護されたジペプチドスクシニミドエステル（１当量）を加えた。溶液を２０時間、室温で撹拌した。溶媒を蒸発させ、飽和重炭酸ナトリウム溶液を残渣に加えた。その懸濁液を４５分間撹拌した。固体の粗生成物を濾別し、ＨＰＬＣで精製した。
【００６４】
Ｂｏｃで保護されたペプチド／アミノ酸側鎖の選択的脱保護
保護された結合誘導体を無水１，２−ジオキサンに溶解した。つづいて、４Ｎ塩酸の１，２−ジオキサン溶液を加え、混合物中の全体の塩酸を２Ｎとした。この懸濁液を３時間、室温で撹拌した。溶媒を蒸発させて乾燥し、十分な純度の生成物を得た。
【００６５】
Ｂｏｃで保護されたペプチド／アミノ酸側鎖とリバビリンの脱保護
ペプチド／アミノ酸側鎖とリバビリンの保護された結合誘導体を、無水１，２−ジオキサンに溶解した。溶液を４Ｎ塩酸の１，２−ジオキサン溶液で酸性にし、全体の塩酸濃度を２Ｎとした。この混合物を３時間、室温で撹拌し、つぎに水で希釈して全体の塩酸濃度を０．５Ｎにした。その溶液を再び室温で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させて乾燥し、十分な純度の生成物を得た。
【００６６】
リバビリンペプチドの遊離型のＮ−末端と糖誘導体（例えば、１，２：３，４−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−ガラクトピラノース）の水酸基の間のカップリング
糖誘導体（１当量）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。その溶液に１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ；１当量）を加え、その混合物を室温で２時間撹拌した。リバビリンペプチド結合誘導体（１．５当量）とイミダゾール（０．２当量）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液を活性化した糖に加え、その結果として得られた混合物を２４時間５５℃に加熱した。溶媒を蒸発させて、残渣をカラムクロマトグラフィー（０〜３％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製した。
【００６７】
［インビトロスクリーニングアッセイ］
遊離リバビリンと結合リバビリンの分析
遊離リバビリンとそのペプチド結合誘導体をＬＣ−ＭＳで分析する。ＬＣ−ＭＳシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズバイナリポンプ、真空脱気装置、オートサンプラー、温度自動調節カラムコンパートメント、可変波長検出器、エレクトロスプレーイオン化源を備えたＭＳＤ  ＳＬ四重極質量分析計を備えている。分離は、３０℃に保持された１５０×４．６ｍｍのＰｒｉｎｃｅｔｏｎＳＰＨＥＲ−１００アミノカラム（プリンストン・クロマトグラフィー，プリンストン，ＮＪ）を用いて、８０％ＭｅＣＮと２０％ＮＨ４ＯＡｃからなる定組成移動相（１０ｍＭ，ｐＨ３．５）、流速１ｍｌ／分で行う。ＵＶ検出器は、波長２１０ｎｍに設定する。フラグメンター、キャピラリー電圧、スプレーチャンバーパラメータなどのＭＳの条件は、現在、遊離したリバビリンとその結合誘導体の類似体の最大感度に最適化されている。
【００６８】
特に示さない限り、表示された時間の各アッセイの保温の後、分析用のサンプルの調製は、１％のＨ３ＰＯ４を含むＭｅＣＮで２倍に希釈して不溶性物質の沈殿を生じさせた後に行う。沈殿物は遠心器で沈降させ、上澄みはテフロンフィルタ（０．２μｍ）を通して分析用のＨＰＬＣバイアル中に濾過する。遊離リバビリンとその親結合誘導体の両方の存在について、結合誘導体を三重に分析する。
【００６９】
リバビリンと結合誘導体の原液の調製
リバビリン結合誘導体の原液は、分析の前に調製し、分析が必要になるまで８０℃に保つ。原液の過度の凍結融解サイクルを避けるために、分注して別々に保存し、分析が必要なときに希釈する。原液は、各結合誘導体の目標分析濃度の１００倍に調製し、以下で言及するように、分析中又は直前に希釈する。必要に応じて、有機溶媒（例えば、ＭｅＯＨ、ＭｅＣＮ）の分析時の濃度を１％未満に保つために、この原液中の濃度を５０％未満に保つ。各分析中のすべての結合誘導体の計画された濃度は、分析感度に応じて１０μＭとする。遊離リバビリンの原液は、各分析時に新たに調製し、各結合誘導体の較正標準を、それぞれの分析濃度に希釈する。
【００７０】
蛋白質分解消化に対するリバビリン結合誘導体の安定性
いくつかのインビトロの酵素分析を、リバビリンがそのプロドラッグ結合誘導体から放出されるかどうかを判断するために行った。胃又は上部腸管のモデルにおいて酵素消化が起きるかどうかを判断するために、胃腸シミュレーションのためのＵＳＰプロトコルをわずかの変更を加えて行う。U.S.Pharmacopeiaand National Formulary (2000) Reagents, Indicators, and Solution P. 2235-2236. 豚の肝臓から分離したエステラーゼを用いた分析を、リバビリン結合誘導体の肝臓消化のモデルとして用いる。さらに、スプレプトマイセス・グリセウス（タイプＸＩＶ、プロナーゼ）から分離した非特異的プロテアーゼを、結合リバビリンの一般的な加水分解性を判断するために用いる。
【００７１】
使用前に、各酵素の原液は、以下のように分析濃度の２倍に調製する。胃のシミュレーター用に、豚の胃粘膜から精製したペプシンをＮａＣｌ緩衝液（６８ｍＭ、ｐＨ１．２）に６．４ｍｇ／ｍｌの濃度で加える。腸のシミュレーター用に、豚の膵臓から分離したパンクレアチンの溶液を、ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）中で２０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製する。腸のシミュレーター緩衝液は、プロナーゼ（６ｍｇ／ｍｌ）を用いた消化にも用いる。
【００７２】
エステラーゼ活性実験のために、酵素原液を５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ８）中に６．６ｍｇ／ｍｌの濃度で調製する。リバビリン結合誘導体の原液は、各分析を開始するために酵素で２倍に希釈する（１ｍｌ  最終体積）前に、水で５０倍に希釈する。サンプルをつぎに、ボルテックスインキュベータ中、３７℃で１時間（ペプシン、プロナーゼ）と４時間（パンクレアチン）保温する。カゼイン（パンクレアチン、プロナーゼ）とヘモグロビン（ペプシン）からのチロシンの放出と、酢酸４−ニトロフェニル（エステラーゼ）からの４−ニトロフェノールの放出は、酵素活性のコントロールとして用いられる。
【００７３】
腸吸収のＣａｃｏ−２モデル
ヒト結腸腺癌に由来するＣａｃｏ−２細胞は、多くの小腸の性質を有する。それは、腸の粘膜を横切る薬剤の吸収を予測するために用いられる、有用でよく知られたインビトロモデルに相当する。膜支持体上に蒔かれたＣａｃｏ−２細胞は、尖端（腸の管腔）から胃腸管の側底（血液）側への薬物輸送の研究を可能にする。予め蒔かれたＣａｃｏ−２細胞を、結合リバビリンの吸収と浸透性（及び起こりうる代謝）を判断するために、インビトロ・テクノロジーズ（ＩＶＴ、ボルチモア、ＭＤ）から購入する。発送前に、すべての予め蒔かれたＣａｃｏ−２単層は、特に、径上皮電気抵抗、完全な単層状態であることの評価、などの厳しい一連の品質管理基準を満たしている。尖端から側底への薬剤輸送を判断するために、ＩＶＴから入手可能な技術的プロトコルに従う。In Vitro Technologies, Inc., Instructions for Using Plated Caco-2 Cells: Transport Study, Apical to Basolateral (2003).
Ｃａｃｏ−２細胞を受け取ったら、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）中で２４時間、輸送培地で細胞を保温する。尖端から側底へのＣａｃｏ−２輸送分析の間に用いられる培地は、供給されている輸送培地から調製する。側底の輸送培地（ＢＴＭ）は、１Ｎ  ＮａＯＨでそのｐＨを７．４に合せて調製し、尖端の輸送培地（ＡＴＭ）は１Ｎ  ＨＣｌでそのｐＨを６．５に合せて調製する。側底のウェルに０．６ｍｌのＢＴＭを加えた後、Ｃａｃｏ−２細胞を含む各トランスウェルを、注意深くＡＴＭで「リンス」し、排液し、そのウェルに入れる。つぎに、０．１ｍｌのＡＴＭ中の投薬溶液を各トランスウェルの尖端側にゆっくりと加え、その系を１時間保温する（５％ＣＯ２、３７℃）。側底の培地を、つぎに各ウェルから除去し、ＨＰＬＣバイアルに濾過し、指示されたようにＬＣ−ＭＳで分析する。
【００７４】
血漿安定性及び全血の性質
リバビリンは、ＨＣＶ治療の間に溶血性貧血を引き起こす可能性のあるＲＢＣに蓄積する。この提案で予定されているように、血漿中の加水分解に安定な５’−結合リバビリンプロドラッグは、リン酸化されず、したがって、ＲＢＣに蓄積することなく（少しでもＲＢＣに入った場合は）細胞内で拡散平衡となる。さらに、血漿安定性は、原型を保ったまま結合誘導体を肝臓へ届けるために重要である。したがって、血漿安定性とリバビリン結合誘導体のＲＢＣへの取り込みの両方が評価される。
【００７５】
ヒト血漿中のリバビリン結合誘導体の安定性を判断するために、既に確立されたプロトコルに従う。Aggarwal, S. K., et al., J. Med Chem. 1990, 33, 1505-1510. 結合誘導体（１００倍原液からの）又は、遊離リバビリンの溶液を、３７℃の保温の前に直接血漿内で希釈する（例えば、９９０μｌの血漿に１０μｌの結合誘導体溶液）。１時間後、説明したように、サンプルを分析用に調製する。
【００７６】
血漿中の安定性に応じて、選択されたリバビリン結合誘導体のＲＢＣへの取り込みを評価する。現在のプロトコルである、Homma, M., rt al., Antimicrob. Agents Chemother. 1999, 43(11), 2716-2719、を少し変更して、遊離リバビリンと結合誘導体の両方を、ラット（rattus norvegicus）からヘパリン添加チューブに収集した全血中で１００倍に希釈する。穏やかに振とうしながら３７℃で１時間保温した後、サンプルを遠心分離にかけ（１５００Ｇ、１５分）、血漿とＲＢＣを分離する。血漿を除去し、上述のとおり分析用に調製する。リバビリンと結合誘導体のＲＢＣへの取り込みを測定するために、分析用の調製に先立って、残った細胞を溶解させて酸ホスファターゼで処理する。
【００７７】
肝臓の吸収と代謝
分離されたヒト肝臓ミクロソームと肝細胞は、無傷の肝臓の性質の多くを示し、広く受け入れられた薬物代謝を調査するためのモデルである。ヒト肝細胞は、多くの典型的な肝機能を示し、ヒトの肝臓に最も近いインビトロモデルを与える代謝酵素を発現する。このモデルに基づいて、薬剤のインビトロとインビボの代謝の間の類似性が観察された。Gomez-Lechon, M. J., et al., Curr. Drug Metab. 2003, 4(4), 292-312. したがって、ヒト肝臓ミクロソームと予め培養されたヒト肝細胞を、インビトロ・テクノロジーズ（ＩＶＴ、ボルチモア、ＭＤ）から購入し、結合リバビリンの肝臓の吸収と代謝を測定するために用いる。
【００７８】
結合誘導体からリバビリンへの変換は、ヒト肝臓ミクロソームで観測する。各結合誘導体の安定性をインビトロ・テクノロジーズから入手可能な技術的プロトコルに従って測定する。In Vitro Technologies, Inc., Instructions for Using Microsomes and S9 fractions, 2003. 一般的な手順は、つぎのとおりである。１．７ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰを含む２％（ｗ/ｖ）ＮａＨＣＯ３緩衝液、７．８ｍｇ／ｍｌのグルコース−６−リン酸、６単位／ｍｌのグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）を調製する。この活性化緩衝液を使用するまで４℃に保ち、８時間まで安定させる。１６×１００ｍｍの試験管へ、５０μｌのミクロソーム（２ｍｇ／ｍｌの原液から）、１０μｌの結合誘導体（１００倍の原液から）、６９０μｌの２％ＮａＨＣＯ３緩衝液（活性化緩衝液ではない）を加える。この混合物を３７℃で穏やかに５〜１０分間ボルテックスで撹拌し、つぎに２５０μｌの活性化緩衝液を加える（最終体積１ｍｌ）。サンプルを分析用の調製前に３７℃で１時間保温する。
【００７９】
培養肝細胞中のリバビリンの吸収と代謝を観察するための分析条件は、ＩＶＴから入手可能な技術的プロトコルに説明されている。In Vitro Technologies, Inc., Cultured HepatocyteXenobiotic Metabolism Assay, 2001.細胞に加える前に、結合誘導体の原液を、各キットに附属する肝細胞培養培地（ＨＩＭ）中に分析濃度へ１００倍に希釈する。現存の培地を細胞から除去し、１０μＭの結合誘導体を含む培地と交換する。処理済の細胞を、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）中で１時間保温する。保温後、培地を除去して、吸収されなかった結合誘導体の濃度を決定する分析のための準備をする。つぎに細胞を洗浄（ＨＩＭで）し、２回吸引する。残った細胞を各ウェルから（初期のウェル体積の）２体積分のＭｅＣＮ（１％Ｈ３ＰＯ４）で抽出し、結合誘導体の吸収と遊離ビバビリンへの変換を決定する分析のための準備をする。
【００８０】
［インビボモデル］
プロドラッグの発見の初期では、インビトロのデータの有意性を確認することが重要である。我々は、主として、インビトロモデルの使用がプロドラッグのライフサイクルの間に起こる実際の生物学的プロセスの多くを無視していることに気付いた。これには、限定するものではないが、消化酵素又は胆汁酸塩、メカニズムの働き、活性輸送メカニズム、受動拡散メカニズム、細菌性の分解／代謝、代替の代謝経路とクリアランスメカニズムが含まれる。しかし、このすべてのファクターは、プロドラッグが動物に投与されたときに考慮される。それは、各インビトロアッセイの適切さと、そのインビボの動物モデルへの相関を確認することが重要であることを我々が確信する理由である。
【００８１】
動物保護と発見処理量（discovery throughput）の利益のために、我々は、すでに検証された技術を用いたインビトロアッセイの広範囲にわたるライブラリを構築し、そして、これらのアッセイからのデータを我々の第一世代の化合物を分類するために用いることにした。成績が優秀ないくつかの化合物（１つの参照標準で９つのプロドラッグ）を、ラットに経口投与し、その後、その血液と肝臓を分析する。この初期データは、我々のインビトロモデルの適切さを評価し、我々がその使用を続けるべきかどうかの判断をするのに役立つ。インビトロモデルがインビボデータと相関しないならば、我々は、つぎには、より大きく動物モデルに頼らざるを得ないだろう。
【００８２】
インビボモデルの有意性が立証された後、つぎに我々は、プロドラッグの薬物動態学の検証を助け、潜在的な主要な化合物の数（１つの参照標準で４つのプロドラッグ）を減らすために、インビボモデルのみを用いるだろう。
【００８３】
［発見戦略］
プロドラッグを設計し試験するときに、初めに変形体（variables）の数を最小にすべきであり、一方、これらの化合物から得られる情報は最大にすべきである。我々の発見のためのアプローチは、過去のプロジェクトにおいて極めて上首尾であり、それを図９に示す。これと同様なアプローチは、リバビリン結合誘導体の研究のために実施される。初めに、我々の第一世代の化合物をスクリーニングし、上述のインビボ／インビトロ相関を確証する。このデータを用いて、我々はつぎに、次の化合物のセットを最適化するために、インビトロデータの連続フローを用いて要求された特性を最適化する。
【００８４】
例えば、５’−位の結合がＲＢＣ中の蓄積を減少させることをデータが示唆する場合は、すべての今後の化合物はこの傾向に合せられる。特定の鎖長が要求される特性を有する場合は、つぎにスポットライトはその鎖長を有する結合誘導体のみを開発するためにシフトする。インビトロ／インビボデータからのフィードバックは、リバビリン結合誘導体のより好ましいセットを絶えず生み出す。
【実施例２】
【００８５】
［消化と腸吸収で残存するペプチド結合誘導体］
アミノ酸又は低分子ペプチドを薬物に添加すると、能動及び受動輸送メカニズムの両方が利用されて生物学的利用能が増加するだけでなく、有意な濃度の無傷のプロドラッグが血流に到達する。この方法の古典的な例としては、アシクロビルのＬ−バリンプロドラッグ（バラシクロビル）がある。ヌクレオシドに類似するアシクロビルは、生物学的利用能に乏しい（１５−３０％）抗ウイルス薬であるが、いったんエステル結合でバリンに結合すると、その生物学的利用能が２倍（５４％）に増加する。ほとんどの研究は、アミノ酸プロドラッグ結合誘導体が血清中に見つかり、ジペプチドトランスポーターを通して活発に輸送されることを示唆している。いったん吸収されると、バラシクロビルは腸と肝臓の加水分解を受けてＬ−バリンとアシクロビルになると思われる。
【００８６】
血清中の有意な抗ウイルス薬の結合誘導体濃度と結びついて吸収が改善される、ほかの例を実施した。ＡＩＤＳ治療に用いられるヌクレオシド類似体であるＡＺＴを、エステル結合を経由してポリグルタミン酸の側鎖に共有結合させ、ポリ（Ｇｌｕ）−ＡＺＴを形成した。この物質をつぎに、ＡＺＴの等モルの量でラットに経口投与した。ＥＬＩＳＡによりＡＺＴを検出したところ、高濃度の遊離ＡＺＴ又は部分的に消化されたポリ（Ｇｌｕ）−ＡＺＴ（Ｇｌｕ（ＡＺＴ）ｎ、ここでｎ≧１、ｎ＝グルタミン酸サブユニットの数）のいずれかが、経口投与後のラットの血漿中に存在することが示された（図３）。後のマススペクトロメトリーを用いた動物実験により、ＥＬＩＳＡが主に結合誘導体であるＧｌｕ（ＡＺＴ）ｎを検出しており、遊離ＡＺＴの血清濃度は低いことが確認された（図４）。
【００８７】
多くのＡＺＴ結合誘導体の一連の実験により、これらのプロドラッグに対する一般的なＥＬＩＳＡの応答が、遊離ＡＺＴに対する応答と常に同等以下であることが示された。したがって、ＥＬＩＳＡとＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（遊離ＡＺＴのみを検出）プロットの間の大きな濃度の相違は、消化と吸収の過程を無傷で通過した相当量のＧｌｕ（ＡＺＴ）ｎに起因すると思われる。
【実施例３】
【００８８】
［血中で安定なペプチド結合誘導体］
この書面中には、血中で無傷で残存したアミノ酸プロドラッグについてのいくつかの例がある。一例において、抗−ＨＩＶ薬であるＡＺＴを数種のアミノ酸のＣ−末端にエステル結合を経由して結合させた（図５）。つぎに、これらの結合誘導体をヒト血漿とラット肝臓ミクロソーム中で保温した。Aggarwal, S. K., et al., J. MEd. Chem. 1990, 33, 1505-1510. ヒト血漿中のこれらの化合物の加水分解半減期（ｔ１／２）は、フェニルアラニン誘導体の２０分から、イソロイシン誘導体の２４０分超まで分布した。ラット肝臓ミクロソーム中において、ｔ１／２は、チロシンの５分から、グルタミン酸とフェニルアラニンの３０分まで分布した。
【００８９】
【表２】
2008522959.tif 000004
【００９０】
我々は、血中で無傷で残存するエステルプロドラッグの数例を発見した。一例は、ペンタペプチドのＣ−末端にエステル結合を介して結合した薬剤である。静注投与（ＩＶ）したときに、この結合誘導体は最初の薬剤放出量が少量であるが、４時間の間に、最大８５％まで無傷で残存した（図６）。このデータは、血清酵素が循環系をきれいにする前に、このプロドラッグのほとんどを切断しないことを示唆している。
【実施例４】
【００９１】
薬物標的特性を示すプロドラッグの例としては、ラクトサミン  ポリ−Ｌ−リジン（Ｌ−ポリ（Ｌｙｓ）−ＲＩＢＶ）に結合したリバビリンがあった。Fiume, L., et al., J. Vir. Hep. 1997, 4(6), 363-370. この結合誘導体は、マウスに筋肉注射で注入したときに、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）の複製を阻害した。この化合物は、選択的に肝臓によって吸収され（［３Ｈ］で標識化したリバビリンは、肝臓中の毎分あたりの分解量の値とＲＢＣ中の毎分あたりの分解量の値の比が４．７：１であった）、ヒトの血液、又はマウスの血液とともに保温したときに薬剤を放出しなかった。
【００９２】
この実験結果を踏まえて、我々は、リバビリンの低分子ペプチド又は糖ペプチドの誘導体が、以下の理由で慢性ＨＣＶの併用治療のための最も適切なプロドラッグであると理論上想定している。ヒトのアルブミンなどの巨大分子を含む結合誘導体は胃腸（ＧＩ）管内で溶解性と安定性が乏しく、結果として、ＩＶ投与を要すること。同様に、ラクトサミン  Ｌ−ポリ（Ｌｙｓ）−ＲＩＢＶは、ＩＭ注射を必要とし、様々な部位に薬物が結合した個々の成分からなる不明瞭なポリマー混合物から構成されること。ビラミジンのようなリバビリン前駆体は、活性を与えるために、１つのヌクレオシド類似体を別のものに変換することを必要とすること。Wu, J. Z., et al., J. Antimicrob. Chemother, 2003, 52, 543-546. その前駆体はそれ自身、さらに別の毒性を示し、選択的送達をせず、代謝後のリバビリンの毒作用を除去しない。しかし、我々のプロドラッグは、肝臓ターゲティングの間中の副作用を減少させ、実際の活性薬物部分を改変しなければ、以前は気付かれていなかった毒性を示すとは思われない。
【００９３】
ここで示され説明された本発明の特定の実施形態は、典型的なもののみである。本発明の思想と範囲から逸脱することなく、当業者には、多くの変形、変更、置換、均等物が生じる。特に、本出願で用いられる用語は、関連出願で用いられる同じ用語を考慮して広く解釈されるべきである。さらに、説明した１つの実施形態からの種々の特徴を別の実施形態からの特徴とともに使用することは、当業者の能力の範囲である。したがって、ここで説明され添付された図面に示されたすべての事項は、説明のためのみであって限定する意味ではなく、本発明の範囲は添付された特許請求の範囲によってのみ決定されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月4日(2008.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
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を有し、Ａはペプチド又は水素、Ｂはペプチド又は水素、Ｃはペプチド又は水素、Ｄはペプチド又は水素であって、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは同時にすべて水素ではない、化合物。
【請求項２】
Ａがペプチドであり、かつ、Ｂ、Ｃ、及びＤがすべて水素である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｂがペプチドであり、かつ、Ａ、Ｃ、及びＤがすべて水素である、請求項１記載の化合物。Ａが糖ペプチドである請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｃがペプチドであり、かつ、Ａ、Ｂ、及びＤがすべて水素である、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｄがペプチドであり、かつ、Ａ、Ｂ、及びＣがすべて水素である、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
前記ペプチドが２、３、４又は５個のアミノ酸からなる、請求項１〜５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項７】
前記ペプチドがジペプチドである、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
前記ペプチドがトリペプチドである、請求項６記載の化合物。
【請求項９】
ＡがＡｌａ−Ｉｌｅ−、Ａｌａ−Ｐｒｏ−、Ａｓｐ−Ａｓｐ−、Ｄ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−、Ｇａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｇａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、Ｐｈｅ−Ａｌａ−、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−、Ｐｈｅ−、Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−、及びＶａｌ−Ｖａｌ−からなる群から選ばれ、かつ、Ｂ、Ｃ、及びＤがすべて水素である、請求項１又は２記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１又は２記載の化合物の製造方法であって、出発材料としてリバビリンを準備すること、前記リバビリンの２’及び３’のＣ−末端を保護すること、及び、前記リバビリンの５’のＣ−末端にペプチド又は糖ペプチドを付加することを備えた方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項記載の化合物の使用方法であって、前記化合物又はその薬学的に許容可能な誘導体を必要とする患者に投与することを備えた方法。
【請求項１２】
前記化合物が経口投与される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物必要とする患者が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、幼児の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、Ａ型インフルエンザウイルス（ＦＬＵＡＶ）、Ｂ型インフルエンザウイルス（ＦＬＵＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ラッサ熱ウイルス（ＬＦＶ）、ハンターンウイルス（ＨＴＮＶ）及びＳＡＲＳを引き起こす呼吸器のウイルスからなる群から選択されたウイルスに感染している、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
前記患者がＨＣＶに感染している請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容可能な誘導体を含む、医薬品組成物。
【請求項１６】
経口投与剤形である、請求項１５記載の医薬品組成物。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項記載の化合物の使用方法であって、前記化合物又はその薬学的に許容可能な誘導体を、インターフェロンとともに患者へ同時投与することを備えた方法。
【請求項１８】
前記インターフェロンがインターフェロン・アルファ−２ａ又はインターフェロン・アルファ−２ｂである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記インターフェロンがＰＥＧ化インターフェロン・アルファ−２ａ又はＰＥＧ化インターフェロン・アルファ−２ｂである、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記患者が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、幼児の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、Ａ型インフルエンザウイルス（ＦＬＵＡＶ）、Ｂ型インフルエンザウイルス（ＦＬＵＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ラッサ熱ウイルス（ＬＦＶ）、ハンターンウイルス（ＨＴＮＶ）、及びＳＡＲＳを引き起こす呼吸器のウイルスからなる群から選択されたウイルスに感染している、請求項１７〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
前記患者がＨＣＶに感染している、請求項２０記載の方法。
【国際調査報告】
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