(57)【要約】  本発明は、分化した哺乳動物細胞を産生するための組成物および方法を提供する。さらに詳細には、本発明は細胞培養においてフィーダー層上または無フィーダー条件で細胞を培養すること、ならびに多能性哺乳動物幹細胞から分化した哺乳動物細胞を生成させるために、それらの細胞をＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤およびＴＧＦｂファミリーのメンバーとさらに接触させることを採用した細胞分化方法を提供する。好ましくは、この分化した細胞は、中内胚葉細胞、中胚葉細胞、および内胚葉細胞からなる群から選択される。【選択図】図５Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性哺乳動物細胞を分化させる方法であって、
（ａ）前記多能性哺乳動物細胞を用意すること、ならびに
（ｂ）前記多能性哺乳動物細胞を有効量のＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させて前記多能性細胞を内胚葉系列の細胞に少なくとも部分的に分化させること
を含む方法。
【請求項２】
前記哺乳動物細胞を、前記阻害剤および前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーと約２４時間よりも長い時間接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＳＫ３が活性化している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害剤が、ＬＹ２９４００２、ラパマイシン、ウォルトマンニン（wortmannin）、塩化リチウム、Ａｋｔ阻害剤Ｉ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩＩ、ＮＬ−７１−１０１、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害剤がＬＹ２９４００２である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＬＹ２９４００２が、当初約１μＭから約５００μＭの濃度で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＬＹ２９４００２が、当初約２０μＭから約１６３μＭの濃度で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記阻害剤がラパマイシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ラパマイシンが、当初約０．１ｎＭから約５００ｎＭの濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ラパマイシンが、当初約１．５ｎＭから約３０ｎＭの濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害剤がＡｋｔＩ−ＩＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＡｋｔＩ−ＩＩが、当初約１０μＭから約５０μＭの濃度で存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
段階（ｂ）がｂＦＧＦの存在下で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｂＦＧＦが、当初約１ｎｇ／ｍｌから約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーがアクチビンＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが馴化培地中に存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記馴化培地が胚性線維芽細胞のフィーダー層から得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物多能性細胞が、胚性幹細胞、ＩＣＭ／胚盤葉上層細胞、原始外胚葉細胞、始原生殖細胞、および奇形癌腫細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物多能性細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞を前記阻害剤と接触させる前に、前記細胞を本質的に単一な細胞培養物に解離させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
プロテアーゼを用いて前記細胞を解離させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＩ３−キナーゼ阻害剤および前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーとの接触前に前記多能性細胞を平板培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記分化した細胞が胚体内胚葉細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
単離され、分化した哺乳動物細胞の集団を含む組成物であって、前記細胞が多能性細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化しており、前記細胞の約５０％超がＳＯＸ１７を発現するが、ＡＦＰを発現しない組成物。
【請求項２７】
前記細胞の約６０％超がＳＯＸ１７を発現するが、ＡＦＰを発現しない、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記細胞の約７０％超がＳＯＸ１７を発現するが、ＡＦＰを発現しない、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記集団が、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＨＮＦ４α、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘ１、およびＭｓｘ１の発現増加、ならびにＡＦＰの発現減少を有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
前記集団が、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してグースコイド（Goosecoid）、ブラキュリー（Brachyury）、およびCerebrusの発現増加、ならびにＡＦＰの発現減少を有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３１】
前記集団が、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＭＩＸ１、グースコイド、およびCerebrusの発現増加、ならびにＡＦＰの発現減少を有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３２】
前記集団が、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＳＯＸ１の発現増加を有さない、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記集団が、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＳＯＸ７の発現増加を有さない、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記細胞が、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーとの接触により分化したものである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーがアクチビンＡである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが馴化培地中に存在する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
前記細胞を、前記阻害剤および前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させる前に、前記細胞を本質的に単一な細胞培養物に解離させる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３９】
プロテアーゼを用いて前記細胞を解離させる、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記細胞を、前記ＰＩ３−キナーゼ阻害剤および前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーと約２４時間よりも長い時間接触させた、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４２】
前記阻害剤が、ＬＹ２９４００２、ラパマイシン、ウォルトマンニン、塩化リチウム、Ａｋｔ阻害剤Ｉ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩＩ、ＮＬ−７１−１０１、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４３】
前記阻害剤がラパマイシンである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４４】
前記阻害剤がＬＹ２９４００２である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４５】
前記阻害剤がＡｋｔＩ−ＩＩである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４６】
ＧＳＫ３が少なくとも１つの細胞において活性化している、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４７】
単離された胚体内胚葉細胞の均一集団を含む組成物であって、前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養で分化したものであり、前記集団の約５０％超が胚体内胚葉細胞である組成物。
【請求項４８】
前記集団の約６０％超が胚体内胚葉細胞である、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記集団の約７０％超が胚体内胚葉細胞である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記胚体内胚葉細胞がＳＯＸ１７を発現するが、ＡＦＰを発現しない、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５１】
前記集団が、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＨＮＦ４α、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘ１、およびＭｓｘ１の発現増加、ならびにＡＦＰの発現減少を有する、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５２】
前記集団が、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してグースコイド、ブラキュリー、Cerebrusの発現増加、ならびにＡＦＰの発現減少を有する、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５３】
前記集団が、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＭＩＸ１、グースコイド、およびCerebrusの発現増加、ならびにＡＦＰの発現減少を有する、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５４】
前記集団が、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＳＯＸ１の発現増加を有さない、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記集団が、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＳＯＸ７の発現増加を有さない、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５６】
細胞培養用培地、ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤、およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含む組成物。
【請求項５７】
前記阻害剤が、ＬＹ２９４００２、ラパマイシン、ウォルトマンニン、塩化リチウム、Ａｋｔ阻害剤Ｉ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩＩ、ＮＬ−７１−１０１、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記阻害剤がラパマイシンである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５９】
ラパマイシンが、当初約０．１ｎＭから約５００ｎＭの濃度で存在する、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
ラパマイシンが、当初約１．５ｎＭから約３０ｎＭの濃度で存在する、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記阻害剤がＬＹ２９４００２である、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６２】
ＬＹ２９４００２が、当初約１μＭから約５００μＭの濃度で存在する、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
ＬＹ２９４００２が、当初約２０μＭから約１６３μＭの濃度で存在する、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記阻害剤がＡｋｔＩ−ＩＩである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６５】
ＡｋｔＩ−ＩＩが、当初約１０μＭから約５０μＭの濃度で存在する、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６７】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーがアクチビンＡである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが馴化培地中に存在する、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６９】
ｂＦＧＦをさらに含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項７０】
ｂＦＧＦが、当初約１ｎｇ／ｍｌから約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
前記細胞培養用培地が馴化培地である、請求項５６に記載の組成物。
【請求項７２】
前記馴化培地が胚性線維芽細胞のフィーダー層から得られる、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
多能性哺乳動物細胞を前記組成物と共に約２４時間よりも長い時間培養した後で、前記組成物との接触が、前記細胞の内胚葉系列への分化を起こすのに有効である、請求項５６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、多能性幹細胞を分化および培養するための組成物および方法、これらの方法によって生み出された細胞、ならびにそれについてのそれらの組成物および方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹（ＥＳ）細胞は、多能性細胞の生物学的性質および初期胚内での分化の根底にあるメカニズムを研究するための強力なモデル系になり、哺乳動物の遺伝的操作ならびに結果として生じる商業、医学および農学応用のための機会を提供している。さらに、ＥＳ細胞の適切な増殖および分化を使用して、細胞の損傷または機能障害に起因する疾患の治療のための移植に適した無限の細胞源を生成させることができる。国際特許出願ＷＯ９９／５３０２１に記載されたような初期原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来ＩＣＭ／胚盤葉上層、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来原始外胚葉、始原生殖細胞（ＥＧ細胞）、奇形癌腫細胞（ＥＣ細胞）、および脱分化または核移植により得られた多能性細胞を含めた他の多能性細胞および細胞系は、これらの性質および応用の一部または全てを共有するであろう。
【０００３】
多能性細胞の好結果の単離、長期クローン維持、遺伝的操作および生殖系列への伝達は一般に困難であったが、この理由は未知である。国際特許出願ＷＯ９７／３２０３３および米国特許第５４５３３５７号は、齧歯動物以外の種由来の細胞を含めた多能性細胞を記載している。ヒトＥＳ細胞は国際特許出願ＷＯ００／２７９９５および米国特許第６２００８０６に記載され、ヒトＥＧ細胞は国際特許出願ＷＯ９８／４３６７９に記載された。
【０００４】
多能性細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化によって分化を緊密に制御する能力または部分的に分化もしくは終末分化した細胞の均一集団を形成する能力は、問題があることが証明された。現行の取組みは、制御されず、かつ均一集団を生じないやり方で多能性細胞からの胚様体の形成を伴うおそれがある。この種の胚様体中の細胞集団のような混合細胞集団は、治療的または商業的な使用に一般に適しそうにない。
【０００５】
ＥＳ細胞の多能性および分化を調節している生化学的メカニズムはほとんど理解されていない。しかし、入手可能な限られた経験的データ（および大いに逸話的な根拠）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件での多能性ＥＳ細胞の維持継続が、細胞外血清環境に存在するサイトカインおよび成長因子の存在に依存することを示唆している。インスリン、ＩＧＦおよびＦＧＦなどの多数の当該因子が、脂質キナーゼであるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）を介した細胞内シグナル伝達イベントを活性化することが分かった（Carpenter & Cantley、（１９９６年）Curr.Opin.Cell.Biol.、８：１５３〜１５８）。特異的細胞表面受容体に対するこれらの可溶性因子の結合に対応して、ＰＩ３−キナーゼは細胞内の膜表面に動員され、そこで、ＰＩ３−キナーゼは、多様な生物学的過程に影響する数個の下流の細胞内標的の機能的調節に導く二次的シグナル伝達イベントのカスケードを開始する。ＰＩ３−キナーゼの下流標的の中に、「哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質」（ｍＴＯＲ）と呼ばれるタンパク質キナーゼがある。ｍＴＯＲの刺激は、タンパク質合成機械の調節に中枢的なセリン／トレオニンキナーゼであるリボソームｐ７０  Ｓ６キナーゼの活性化を進行させ、かつそれに必要である（Chungら、（１９９４年）Nature、３７０：７１〜７５）。
【０００６】
したがって、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の操作によって細胞系列中に集積した細胞集団を産生するための、これらの細胞の維持または安定化、および増殖のための、ならびにそれらがさらに分化した産物のための方法ならびに組成物同定の必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（発明の概要）
従来技術に関連した１つまたは複数の困難および不完全を克服または少なくとも軽減することが本発明の目的である。本発明の一実施形態は、多能性細胞を用いて培養物中に胚体内胚葉細胞を産生するための新規な定義された工程に関する。これらの工程は、膵臓、肝臓、肺、胃、腸および甲状腺などの内胚葉由来組織を効率的に産生するための基礎を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、単離され、分化した哺乳動物細胞の集団を含む組成物を考慮し、ここで、これらの細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ多能性細胞から分化しており、ここで、これらの細胞の約５０％超がＳＯＸ１７を発現するが、ＡＦＰを発現しない。本発明の一実施形態では、これらの細胞の約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超がＳＯＸ１７を発現するが、ＡＦＰを発現しない。
【０００９】
本発明は、単離された胚体内胚葉細胞の均一集団を含む組成物をさらに考慮し、ここで、これらの細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養で分化したものであり、ここで、その集団の約５０％超が胚体内胚葉細胞である。ある実施形態では、その集団の約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超が胚体内胚葉細胞である。一実施形態では、これらの胚体内胚葉細胞はＳＯＸ１７を発現するが、ＡＦＰを発現しない。
【００１０】
本発明の追加の実施形態では、その集団は、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＨＮＦ４α、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘ１、およびＭｓｘ１の発現増加、ならびにＡＦＰの発現減少を有する。さらなる実施形態では、その集団は、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してグースコイド（goosecoid）、ブラキュリー（brachyury）、Cerebrusの発現増加、ならびにＡＦＰの発現減少を有する。その集団は、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＭＩＸ１、グースコイド、およびCerebrusの発現増加、ならびにＡＦＰの発現減少を有しうることも考慮されている。一実施形態では、この集団は、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＳＯＸ１の発現増加を有さない。別の実施形態では、この集団は、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＳＯＸ７の発現増加を有さない。別の実施形態では、これらの細胞は、例えばフローサイトメトリーによって決定されたように多能性細胞の集団に見られるのと同様にトロンボモジュリンの低発現を示す。
【００１１】
本発明は、（ａ）多能性哺乳動物細胞を用意すること、ならびに（ｂ）その多能性哺乳動物細胞を有効量のＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させて、その多能性細胞を内胚葉系列の細胞に少なくとも部分的に分化させることを含む、多能性哺乳動物細胞を分化させる方法をさらに包含する。一実施形態では、そのＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある実施形態では、そのＴＧＦ−βファミリーのメンバーはアクチビンＡである。そのＴＧＦ−βのメンバーは、実質的に純粋な形態で多能性哺乳動物細胞に外因的に添加されうるし、またフィーダー層によって生成される物質として馴化培地中に存在しうる。
【００１２】
一実施形態では、分化した細胞を段階（ｂ）の後で単離する。
【００１３】
この多能性細胞は、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーとの接触によって分化したことが考慮されている。
【００１４】
一実施形態では、これらの細胞をその阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させる前に、これらの細胞を本質的に単一な細胞培養物に解離させる。これらの細胞を、非限定的にトリプシンなどのプロテアーゼを使用して解離させることができる。
【００１５】
一実施形態では、これらの細胞を、約１２時間から約６日間平板培養した後で、約１２時間から約４８時間平板培養した後で、または約２４時間平板培養した後で、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させる。ある実施形態では、これらの多能性細胞を、約２．５×１０４細胞／３５ｍｍ皿未満、少なくとも約２．５×１０４細胞／３５ｍｍ皿未満、約２．５×１０４から約２×１０５細胞／３５ｍｍ皿の間、約５×１０４から約２×１０５細胞／３５ｍｍ皿の間、約４×１０５細胞／３５ｍｍ皿未満の濃度で、または４×１０５細胞／３５ｍｍ皿を超える密度で平板培養する。
【００１６】
一実施形態では、これらの細胞を、約２４時間よりも長く、約４８時間よりも長く、約７２時間よりも長く、または約７２時間、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させる。ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含む組成物が、約２４時間よりも長い時間細胞をその組成物と培養した後で内胚葉系列に向けて多能性哺乳動物細胞の分化を引き起こすのに有効であることが好ましい。多能性哺乳動物細胞をその組成物と接触させる前に約１２時間よりも長い時間その細胞を平板培養したとき、またはその細胞をその組成物と接触させる前にその細胞を約２４時間平板培養したとき、ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含む組成物は、多能性哺乳動物細胞の内胚葉系列への分化を引き起こすのに有効であることも考慮されている。
【００１７】
本発明は、細胞培養用培地、ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤、およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含む、細胞を培養するための組成物をさらに包含する。そのある実施形態では、その阻害剤は、ＬＹ２９４００２、ラパマイシン、ウォルトマンニン（wortmannin）、塩化リチウム、Ａｋｔ阻害剤Ｉ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩＩ、ＮＬ−７１−１０１、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一実施形態では、この阻害剤はラパマイシンである。ある実施形態では、ラパマイシンは当初、約０．１ｎＭから約５００ｎＭ、約０．５ｎＭから約２５０ｎＭ、約１．０ｎＭから約１５０ｎＭ、または約１．５ｎＭから約３０ｎＭの濃度で存在する。別の実施形態では、その阻害剤はＬＹ２９４００２である。ある実施形態では、ＬＹ２９４００２は当初、約１μＭから約５００μＭ、約２．５μＭから約４００μＭ、約５μＭから約２５０μＭ、約１０μＭから約２００μＭ、または約２０μＭから約１６３μＭの濃度で存在する。別の実施形態では、その阻害剤はＡｋｔＩ−ＩＩである。ある実施形態では、ＡｋｔＩ−ＩＩは当初、約０．１μＭから約５００μＭ、約１μＭから約２５０μＭ、約５μＭから約２０μＭ、約１０μＭから約１００μＭ、または約４０μＭの濃度で存在する。
【００１８】
さらなる実施形態では、その多能性細胞をＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤と接触することによってＧＳＫ３が活性化する。
【発明の効果】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本出願人は、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと共に多能性哺乳動物細胞を培養することにより、分化した細胞が生成し、ここで、これらの細胞は自然に分化した細胞よりも大きい均一性を有することを実証した。
【００２０】
本発明は、単離され、分化した哺乳動物細胞集団を含む組成物を考慮し、ここで、これらの細胞は多能性細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したものであり、ここで、これらの細胞の約５０％超がＳＯＸ１７を発現するが、ＡＦＰを発現しない。本発明の一実施形態では、これらの細胞の約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超がＳＯＸ１７を発現するが、ＡＦＰを発現しない。
【００２１】
本発明は、単離された胚体内胚葉細胞の均一集団を含む組成物をさらに考慮し、ここで、これらの細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養で分化したものであり、ここで、その集団の約５０％超が胚体内胚葉細胞である。ある実施形態では、その集団の約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超が胚体内胚葉細胞である。一実施形態では、その胚体内胚葉細胞はＳＯＸ１７を発現するが、ＡＦＰを発現しない。
【００２２】
本発明の追加の実施形態では、その集団は、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＨＮＦ４α、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘ１、およびＭｓｘ１の発現増加、ならびにＡＦＰの発現減少を有する。さらなる実施形態では、その集団は、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してグースコイド、ブラキュリー、およびCerebrusの発現増加、ならびにＡＦＰの発現減少を有する。その集団は、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＭＩＸ１、グースコイド、およびCerebrusの発現増加、ならびにＡＦＰの発現減少を有しうることも考慮されている。一実施形態では、その集団は、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＳＯＸ１の発現増加を有さない。別の実施形態では、その集団は、自然に分化している多能性細胞の集団と比較してＳＯＸ７の発現増加を有さない。別の実施形態では、これらの細胞は、例えばフローサイトメトリーによって決定された多能性細胞の集団に見られるのと類似したトロンボモジュリンの低発現を示す。
【００２３】
本発明は、（ａ）多能性哺乳動物細胞を用意すること、ならびに（ｂ）その多能性哺乳動物細胞を有効量のＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させて、少なくとも部分的にその多能性細胞を内胚葉系列の細胞に分化させることを含む、多能性哺乳動物細胞を分化させる方法をさらに包含する。一実施形態では、その分化した細胞を段階（ｂ）の後で単離する。
【００２４】
その多能性細胞は、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含む組成物との接触によって分化したものであることが考慮されている。一実施形態では、これらの細胞をその組成物と接触させる前に、これらの細胞を本質的に単一な細胞培養物に解離させる。これらの細胞を、非限定的にトリプシンなどのプロテアーゼを使用して解離させることができる。ＰＩ３−キナーゼ阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーはその細胞または細胞培養物に同時に添加する必要はないが、培養の時点の間にＰＩ３−キナーゼ阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーの両方がその組成物中に存在するであろうと考慮されている。
【００２５】
一実施形態では、これらの細胞を約１２時間から約６日間平板培養した後で、約１２時間から約４８時間平板培養した後で、または約２４時間平板培養した後でその組成物と接触させる。一実施形態では、約２４時間よりも長く、約４８時間よりも長く、約７２時間よりも長く、または約７２時間これらの細胞をその組成物と接触させる。約２４時間よりも長く多能性哺乳動物細胞をその組成物と培養した後で、その組成物がその細胞の内胚葉系列への分化を引き起こすのに有効であることが好ましい。その細胞をその組成物と接触させる前に約１２時間よりも長くその細胞を平板培養したとき、またはその細胞をその組成物と接触させる前に約２４時間その細胞を平板培養したとき、その組成物は内胚葉系列への多能性哺乳動物細胞の分化を引き起こすのに有効であることも考慮されている。
【００２６】
ある実施形態では、約２．５×１０４細胞／３５ｍｍ皿未満、少なくとも約２．５×１０４細胞／３５ｍｍ皿、約２．５×１０４から約２×１０５細胞／３５ｍｍ皿の間、約５×１０４から約２×１０５細胞／３５ｍｍ皿の間、約４×１０５細胞／３５ｍｍ皿未満の濃度で、または４×１０５細胞／３５ｍｍ皿を超える密度で、その多能性細胞を平板培養する。
【００２７】
本発明は、細胞培養用培地、ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤、およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含む、細胞を培養するための組成物をさらに包含する。ＴＧＦ−βのメンバーを実質的に純粋な形態で多能性哺乳動物細胞に外因的に添加することができ、また、そのメンバーはフィーダー層により産生される物質として馴化培地中に存在しうると考えられている。
【００２８】
本発明のある実施形態では、その阻害剤は、ＬＹ２９４００２、ラパマイシン、ウォルトマンニン、塩化リチウム、Ａｋｔ阻害剤Ｉ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩＩ、ＮＬ−７１−１０１、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一実施形態では、その阻害剤はラパマイシンである。ある実施形態では、ラパマイシンは当初、約０．１ｎＭから約５００ｎＭ、約０．５ｎＭから約２５０ｎＭ、約１．０ｎＭから約１５０ｎＭ、または約１．５ｎＭから約３０ｎＭの濃度で存在する。別の実施形態では、その阻害剤はＬＹ２９４００２である。ある実施形態では、ＬＹ２９４００２は当初、約１μＭから約５００μＭ、約２．５μＭから約４００μＭ、約５μＭから約２５０μＭ、約１０μＭから約２００μＭまたは約２０μＭから約１６３μＭの濃度で存在する。別の実施形態では、その阻害剤はＡｋｔＩ−ＩＩである。ある実施形態では、ＡｋｔＩ−ＩＩは当初、約０．１μＭから約５００μＭ、約１μＭから約２５０μＭ、約５μＭから約２０μＭ、約１０μＭから約１００μＭ、または約４０μＭの濃度で存在する。
【００２９】
その細胞培養組成物は、ＦＧＦをさらに含むことがある。一実施形態では、そのＦＧＦはｂＦＧＦである。ｂＦＧＦは当初、約０．１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、約０．５ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するか、または当初約８ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００３０】
さらなる実施形態では、その細胞培養用培地は馴化培地である。その馴化培地は、フィーダー層から得ることができる。そのフィーダー層は線維芽細胞を含み、一実施形態では胚性線維芽細胞を含むことが考慮されている。さらなる実施形態では、その馴化培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（５０／５０）、約２０％のＫＳＲ、約０．１ｍＭのＮＥＡＡ、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、約５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および約８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む。他の実施形態では、ＫＳＲの濃度を調整することができ、またＫＳＲの濃度を血清に置換することができる。一実施形態では、ＫＳＲは約２％の濃度で馴化培地中に存在する。
【００３１】
本発明の方法および組成物はＴＧＦ−βファミリーのメンバーを含むことが考慮されている。ある実施形態では、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある実施形態では、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーはアクチビンＡまたはＮｏｄａｌである。アクチビンＡは当初、約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在することが考慮されている。他の実施形態では、Ｎｏｄａｌは当初、約１０ｎｇ／ｍｌから約２５０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌから約１２５μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌから約５０μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌから約２５μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌから約５μｇ／ｍｌ、または約１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００３２】
一実施形態では、多能性細胞をＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤と接触させることによりＧＳＫ３が活性化する。
【００３３】
他に言及しない限り、本明細書において使用される用語は、当業者に通常利用されるものに従うものとする。以下に提供される用語の定義に加えて、分子生物学における通常の用語の定義は、Riegerら、１９９１年  Glossary of genetics: classical and molecular、第５版、ベルリン：Springer-VerlagおよびCurrent Protocols in Molecular Biology、F.M.Ausubelら編、Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons,Inc.（１９９８年追補）にも見出すことができる。明細書および特許請求の範囲に使用されるように、「a」または「an」は、それが使用される状況に応じて１つまたは複数を意味しうるものとする。このように、例えば、”a cell”に対する参照は、少なくとも１つの細胞を利用できることを意味しうる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例を参照することにより、本発明をさらに容易に理解することができる。しかし、本組成物および方法が開示および説明される前に、本発明は、特定の核酸、特定のポリペプチド、特定の種類の細胞、特定の宿主細胞、特定の状態、または特定の方法などに限定されないものとする。それは、これらがもちろん変動することがあり、これらにおける多数の修正形態および変形形態が当業者に明白なものであるからである。
【００３５】
クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための標準技法、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを伴う酵素反応のための標準技法、ならびに様々な分離技法は、当業者に公知で、通常採用される技法である。多数の標準技法が、Sambrookら、１９８９年  Molecular Cloning、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、Plainview、ニューヨーク；Maniatisら、１９８２年  Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory、Plainview、ニューヨーク；Wu（編）１９９３年  Meth.Enzymol.218、第Ｉ部；Wu（編）１９７９年  Meth.Enzymol.６８；Wuら（編）１９８３年  Meth.Enzymol.１００および１０１；GrossmanおよびMoldave（編）１９８０年  Meth.Enzymol.６５；Miller（編）１９７２年  Experiments in Molecular Genetics、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク；Old and Primrose、１９８１年  Principles of Gene Manipulation、University of California Press、Berkeley;SchleifおよびWensink、1982 Practical Methods in Molecular Biology;Glover（編）１９８５年DNA Cloning IおよびII巻、IRL Press、オックスフォード、イギリス；HamesおよびHiggins（編）１９８５年  Nucleic Acid Hybridization、IRL Press、オックスフォード、イギリス；ならびにSetlowおよびHollaender  １９７９年  Genetic Engineering: Principles and Methods、１〜４巻、Plenum Press、ニューヨークに記載されている。採用された略語および命名は、当技術分野において標準とみなされ、本明細書に引用されたような専門雑誌に通常使用される。
【００３６】
ヒト多能性細胞は、ヒトの発育の初期段階を研究するための、ならびに糖尿病およびパーキンソン病などのいくつかの疾患状態に治療的介入を行うための独特の機会を提供する。例えば、ｈＥＳＣ由来のインスリン産生β細胞の使用は、ドナー膵臓由来の細胞を利用する現行の細胞療法手順に大きな改善を提供するであろう。ドナー膵臓由来細胞を利用する、糖尿病のための現行の細胞療法処置は、移植に必要な高品質の島細胞が不足していることによって制限されている。Ｉ型糖尿病患者１人についての細胞療法は、約８×１０８個の膵島細胞の移植を必要とする（Shapiroら、２０００年、N Engl J Med  ３４３：２３０〜２３８；Shapiroら、２００１ａ、Best Pract Res Clin Endocrinol Metab  １５：２４１〜２６４；Shapiroら、２００１ｂ、医学会会報  ３２２：８６１）。そのようなものとして、移植の成功に十分な島細胞を得るためには健康ドナーの器官が少なくとも２個必要である。ＨＥＳＣは、ヒト細胞療法のために実質的な量の高品質の分化した細胞を発生させるための出発物質の供給源を与える。
【００３７】
本明細書に使用されるように、用語「生物学的に活性な構成要素」または「生物活性構成要素」および「生物活性因子」は、多能性細胞が部分的に分化または終末分化するのを誘導する任意の化合物または分子を指し、前記分化は、ＰＩ３−キナーゼ経路を介したシグナル伝達の阻害が少なくとも一部の原因である。生物活性構成要素は下記の通りでありうるが、本用語はそれに限定されない。本明細書に使用されるように、用語「生物活性構成要素」は、その範囲内に天然もしくは合成分子または類似した生物学的活性を示す分子を含む。
【００３８】
本明細書に使用するように、用語「ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤」は、その阻害剤と接触させた細胞におけるＰＩ３−キナーゼまたはＰＩ３−キナーゼ下流の少なくとも１つの分子の活性を減少させる任意の分子または化合物を指す。本発明は、例えば、ＰＩ３−キナーゼアンタゴニスト、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達カスケードのアンタゴニスト、内因性ＰＩ３−キナーゼの合成または発現を減少させる化合物、内因性ＰＩ３−キナーゼの放出を減少させる化合物、およびＰＩ３−キナーゼ活性の活性化因子を阻害する化合物を包含する。それらのある実施形態では、その阻害剤は、ラパマイシン、ＬＹ２９４００２、ウォルトマンニン、塩酸リチウム、Ａｋｔ阻害剤Ｉ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩ（ＳＨ−５）、Ａｋｔ阻害剤ＩＩＩ（ＳＨ−６）、ＮＬ−７１−１０１、およびそれらの混合物からなる群から選択される。Ａｋｔ阻害剤Ｉ、ＩＩ、Ａｋｔ  ＩＩＩ、およびＮＬ−７１−１０１はCalbiochemから商業的に入手できる。他の実施形態では、その阻害剤はラパマイシンおよびＬＹ２９４００２からなる群から選択される。さらなる実施形態では、その阻害剤はＬＹ２９４００２を含む。別の実施形態では、その阻害剤はＡｋｔＩ−ＩＩを含む。他の実施形態では、その阻害剤は、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の上流構成要素を阻害する分子である。それらの特定の実施形態では、その阻害剤は、ＩＧＦ受容体またはＦＧＦ受容体の阻害剤である。阻害剤の組合せを使用して所望の効果を誘発できることも了解されている。
【００３９】
一実施形態では、多能性細胞を有効量のＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤と接触せる。本明細書に使用されるように、用語「有効量」は、その阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させた細胞におけるＰＩ３−キナーゼまたはＰＩ３−キナーゼ下流の少なくとも１つの分子の活性を減少させて、多能性細胞の中内胚葉への、好ましくは内胚葉への分化に影響するのに十分な阻害剤の濃度を指す。あるいは、この用語は、活性化因子と接触した細胞におけるＰＩ３−キナーゼまたはＰＩ３−キナーゼ下流の少なくとも１つの分子の活性を増加させるのに十分な活性化因子の濃度を指す。
【００４０】
本明細書に使用されるように、細胞、細胞系、細胞培養物または細胞集団を指す場合、用語「単離された」は、その細胞、細胞系、細胞培養物、または細胞集団がｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養できるように、その細胞の天然供給源から実質的に分離されたことを指す。さらに、用語「単離すること」は、２つ以上の細胞の群から１つまたは複数の細胞を物理的に選択することを指し、ここで、これらの細胞は、細胞の形態および／または様々なマーカーの発現に基づき選択される。
【００４１】
本明細書に使用されるように、用語「発現する」は、細胞中のポリヌクレオチドの転写またはポリペプチドの翻訳を指し、それによって、その分子を発現しない細胞中のその分子のレベルよりも、その分子を発現する細胞中のその分子のレベルの方が測定できる程度に高い。分子の発現を測定する方法は当業者に十分に公知であり、それらの方法には、非限定的にノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ウエスタンブロット、および免疫染色が含まれる。
【００４２】
本明細書に使用されるように、用語「接触させる」（すなわち、細胞、例えば多能性細胞を化合物と接触させる）は、その化合物および細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで一緒に（例えば、その化合物を培養中の細胞に添加して）インキュベートすることを含むことを意図する。用語「接触させる」は、ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤および対象に自然に存在しうるＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対する細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ曝露（すなわち、自然の生理学的過程の結果として起こりうる曝露）を含むことを意図しない。細胞をＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させる段階を、任意の適切な方法で実施することができる。例えば、これらの細胞を接着培養、または懸濁培養で処理することができる。ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させた細胞を他の細胞分化環境でさらに処理して、これらの細胞を安定化するか、またはこれらの細胞をさらに分化させることができることが了解されている。
【００４３】
本発明の一実施形態では、これらの細胞は、単離された核酸分子を含み、その発現はＰＩ３−キナーゼ経路のシグナル伝達を調節する。本発明によると、核酸分子を本発明の胚性細胞集団に形質転換して、特定の遺伝子または遺伝子産物を阻害または活性化することによって、細胞の分化を調節することができる。それらの一実施形態では、その細胞は胚性幹細胞であり、その胚性幹細胞は、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の一部である優性ネガティブ構成性活性型のタンパク質をコードする単離された核酸分子を含む。
【００４４】
本明細書に記載された組成物および方法は、いくつかの有用な特徴を有する。例えば、本明細書に記載された組成物および方法は、ヒトの発生初期段階のモデル化に有用である。さらに、本明細書に記載された組成物および方法は、糖尿病などの疾患状態における治療的介入にも役立つことができる。例えば、胚体内胚葉は、限定された数の組織についてだけ起源として役立つことから、胚体内胚葉を純粋な組織または細胞型の発生に使用することができる。
【００４５】
原腸形成と名付けられたヒト発生初期の重大な段階は、受精の２〜３週間後に起こる。原腸形成は、３つの初期胚葉が最初に特定され構築されるのがこの時期であることから極めて重要である（Luら、２００１年  Curr Opin Genet Dev 11：３８４〜３９２；Schoenwolf & Smith、２０００年  Methods Mol Biol １３５：１１３〜１２５）。外胚葉は、身体の外側の被覆および神経系全体の最終的な形成を担うが、心臓、血液、骨、骨格筋、および他の結合組織は中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃、ならびに小腸および大腸を含む腸管全体と、肺、肝臓、胸腺、副甲状腺および甲状腺、胆嚢ならびに膵臓などの腸管由来器官との形成を担う胚葉として定義される（Grapin-Botton & Melton、２０００年  Trends Genet 16：１２４〜１３０；Kimelman & Griffin、２０００年、Curr Opin Genet Dev 10：３５０〜３５６；Tremblayら、２０００年  Development １２７：３０７９〜３０９０；Wells & Melton、1999 Annu Rev Cell Dev Biol １５：３９３〜４１０；Wells & Melton、２０００年  Development １２７：１５６３〜１５７２）。胚体内胚葉と、原始内胚葉と名付けられた完全に異なる細胞系列の間で非常に重要な区別を行わねばならない。原始内胚葉は、胚体外組織、主に卵黄嚢胎盤の壁側内胚葉部分および臓側内胚葉部分ならびにライヘルト膜の細胞外マトリックス材料の形成を主として担っている。
【００４６】
原腸形成の間に、胚体内胚葉形成過程は、中内胚葉細胞（中胚葉または内胚葉形成に適格な細胞）が原始線条と呼ばれる構造を通過して遊走する細胞遊走イベントと共に開始する。胚体内胚葉は、線条前部および結節（線条最前部での特殊構造）を通過して遊走する細胞に由来する。遊走が起こるとき、胚体内胚葉は最前部腸管を最初占有し、腸管後端の形成と共に最高に達する。
【００４７】
ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエル（Conlonら、１９９４年  Development １２０：  １９１９〜１９２８；Feldmanら、１９９８年  Nature ３９５：１８１〜１８５；Zhouら、１９９３年  Nature  ３６１：５４３〜５４７；Aokiら、２００２年  Dev Biol ２４１：２７３〜２８８；Douganら、２００３年  Development １３０：１８３７〜１８５１；Tremblayら、２０００年  Development １２７：３０７９〜３０９０；Vincentら、２００３年  Genes Dev １７：１６４６〜１６６２；Alexanderら、１９９９年  Dev.Biol.２１５：３４３〜３５７；Alexander & Stainier、１９９９年  Curr Biol ９：１１４７〜１１５７；Kikuchiら、２００１年  Genes Dev １５：１４９３〜１５０５；Hudsonら、１９９７年  Cell ９１：３９７〜４０５）ならびにマウス（Kanai-Azumaら、２００２年  Development １２９：２３６７〜２３７９）での研究などの、胚体内胚葉形成のｉｎ  ｖｉｖｏ分析は、ヒト胚性幹細胞を用いた培養皿中の特異的胚葉細胞型の発生にどのように取り組もうと試みるかについての基礎を築いている。培養皿中で発生を反復する試みに大きな障害を引き起こす、ＥＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に関連する２つの態様が存在する。まず、構築された胚葉または器官構造が産生しない。胚葉および器官に特異的な遺伝子マーカーの大部分は、分化中のｈＥＳＣ培養系で不均一に発現するであろう。したがって、この器官特異的境界の欠如が原因で、特異的組織または細胞型の形成を評価することは困難である。特定の胚葉または組織型内の一細胞型に発現したほぼ全ての遺伝子が、異なる胚葉または組織型の他の細胞にも同様に発現する。特異的境界なしでは、遺伝子１〜３個という少数の試料で遺伝子発現特異性を割り当てる手段はかなり少ない。したがって、対象となる特定の細胞型の器官または組織に一部が存在しているはずであり、一部が発現していないはずであるかなり多数の遺伝子を調査しなければならない。第２に、遺伝子発現パターンのタイミングは、特異的発生経路下流への移動に重大である。
【００４８】
さらに複雑なことには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ幹細胞分化は相当に非同期であり、おそらくｉｎ  ｖｉｖｏよりもかなり非同期のようである。それとして、一群の細胞は原腸形成に関連する遺伝子を発現しているおそれがあるし、一方で別の群は最終分化を開始しているおそれがある。さらに、外因性因子の適用下または非適用下でのｈＥＳＣ単層または胚様体（ＥＢ）の操作は、全体的な遺伝子発現パターンおよび分化状態に関して顕著な差を招くことがある。これらの理由から、特異的分化経路下流に培養物を効率的に移動させるために、不均一細胞混合物内の遺伝子発現パターンに応じて外因性因子適用のタイミングを計らなければならない。
【００４９】
一実施形態では、ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤で処理された細胞は中内胚葉細胞であり、これらの細胞は中胚葉細胞または内胚葉細胞にさらに分化することができる。本明細書に使用されるように、「中内胚葉細胞」は、非限定的にブラキュリー、グースコイド、ツイスト（twist）、Ｌｉｍ−１、およびＧＡＴＡ５などの１つまたは複数の遺伝子の発現により定義される。これらの遺伝子は、内胚葉および中胚葉の前駆細胞によって発現されるが、これらの細胞はＳＯＸ−１７を発現しない。別の実施形態では、ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤で処理された細胞は内胚葉細胞にさらに分化し、それは、部分的に分化または終末分化した内胚葉細胞でありうる。一実施形態では、ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤で処理された細胞は、胚体内胚葉系列の細胞にさらに分化する。
【００５０】
本明細書に使用されるように、用語「内胚葉」には、胚体内胚葉、壁側内胚葉、臓側内胚葉、および中内胚葉細胞が含まれるが、それに限定されるわけではない。本明細書に使用されるように、用語「胚体内胚葉」は胚において内胚葉系列から生成する任意または多数の内胚葉細胞型（すなわち膵臓、肝臓、肺、胃、腸および甲状腺）に分化する能力を有する初期内胚葉細胞を指す。胚体内胚葉細胞は多分化能である。したがって、本発明の関連で用語「胚体内胚葉」の使用は、その細胞が、得られた多能性細胞よりも内胚葉細胞型に向けて少なくともより大きく分化していることを意味する。同様に、本明細書に使用されるように、内胚葉細胞の産生は、内胚葉細胞が集積した細胞培養物の産生を包含する。
【００５１】
本明細書に使用されるように、「胚体内胚葉」細胞は、ＳＯＸ１７などの特異的マーカー転写体の発現と、それに付随したＡＦＰおよびトロンボモジュリンに関するマーカー転写体の不在とによって特徴付けられる。なお、当該細胞はＭＩＸ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦα、およびＨＮＦ３ｂを発現することがある。追加的に、ＬＹ２９４００２処理は、未分化のｈＥＳ細胞によって当初発現された、非限定的にＣＤ９、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４６、ＣＤ５８およびＣＤ８１を含めた細胞表面ＣＤマーカーサブセットの喪失を招く。本発明のいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、臓側内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子であるＳＯＸ７よりも高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現する。追加的に、ある実施形態では、ＳＯＸ１７マーカー遺伝子の発現は、ｈＥＳＣに特徴的なＯＣＴ４マーカー遺伝子の発現よりも高い。本発明の他の実施形態では、胚体内胚葉細胞はＡＦＰ、ＳＰＡＲＣまたはトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子よりも高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現する。本発明のある実施形態では、本明細書に記載された方法によって産生した胚体内胚葉細胞はＰＤＸ１を発現しない（ＰＤＸ１陰性）。別の実施形態では、これらの細胞は、例えばフローサイトメトリーによって決定されるように、多能性細胞の集団に見られるのと同様に低いトロンボモジュリンの発現を示す。
【００５２】
本発明のある実施形態では、本明細書に記載された方法によって産生した胚体内胚葉細胞培養物は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭ、ＺＩＣｌまたはＢＲＡＣＨマーカー遺伝子を発現している細胞を実質的に有さない。他の実施形態では、本明細書に記載された方法によって生成した胚体内胚葉細胞培養物は、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭ、ＺＩＣ１またはＢＲＡＣＨマーカー遺伝子を発現している細胞を実質的に有さない。細胞培養物中の細胞に関して、用語「実質的に有さない」は、特定の細胞型が細胞培養物中に存在する細胞の総数の約５％未満の量で存在することを意味する。
【００５３】
本明細書に使用されるように、用語「分化する」は、それが得られた細胞型よりもよく分化した細胞型の産生を指す。したがって、本用語は部分的に分化および終末分化した細胞型を包含する。
【００５４】
本発明のある実施形態では、用語「集積」は、所望の細胞系列を約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％超含有する細胞培養物を指す。
【００５５】
ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触後に胚性幹細胞から分化する細胞型は、非限定的に創薬、薬物開発および薬物検査、毒性学、治療目的の細胞産生ならびに基礎科学研究を含めた様々な研究開発分野にいくつかの用途を有する。これらの細胞型は、広範囲の研究分野において対象となる分子を発現する。これらの分子には、標準的な参考図書に記載されているような、様々な細胞型の機能に必要とされることが公知の分子がある。これらの分子には、サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、細胞外マトリックス、転写因子、分泌されたポリペプチドおよび他の分子、ならびに成長因子受容体が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００５６】
一実施形態では、その多能性細胞はヒト細胞である。本明細書に使用されるように、用語「多能性ヒト細胞」は、ヒト胚、胎児または成体組織から得られた多能性細胞を包含する。好ましい一実施形態では、その多能性ヒト細胞はヒト多能性胚性幹細胞である。別の実施形態では、その多能性ヒト細胞は、始原生殖細胞などのヒト多能性胎児幹細胞である。別の実施形態では、その多能性ヒト細胞はヒト多能性成体幹細胞である。本明細書に使用されるように、用語「多能性」は、外胚葉、内胚葉、および中胚葉細胞の１つに少なくとも発達することができる細胞を指す。本発明に使用されるように、用語「多能性」は、全能性および多分化能性の細胞を指す。本明細書に使用されるように、用語「全能性細胞」は、全系列の細胞に発達することができる細胞を指す。用語「多分化能性」は、終末分化していない細胞を指す。同様に、本明細書に使用されるように、用語「多分化能性」は、操作（すなわち、核移植または脱分化誘導）なしには、３つ全ての胚葉（中胚葉、外胚葉および内胚葉）由来の分化した細胞型を形成できない細胞、また言い換えると部分的に分化した細胞を指す。多能性ヒト細胞は、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞、ヒト内部細胞塊（ＩＣＭ）／胚盤葉上層細胞、初期原始外胚葉細胞（ＥＰＬ）などのヒト原始外胚葉細胞、ヒト始原生殖（ＥＧ）細胞、およびヒト奇形癌腫（ＥＣ）細胞からなる群から選択することができる。本発明のヒト多能性細胞は、当業者に公知の任意の方法を使用して得ることができる。例えば、ヒト多能性細胞を、脱分化および核移植法を使用して産生することができる。追加的に、本発明に使用されるヒトＩＣＭ／胚盤葉上層細胞または原始外胚葉細胞をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで得ることができる。ＥＰＬ細胞は、ＷＯ９９／５３０２１に記載されているように接着培養で、または懸濁培養での細胞凝集物として生成させることができる。さらに、ヒト多能性細胞は、手作業の継代法ならびに抗体選択およびプロテアーゼ継代などのバルク継代法を含めた当業者に公知の任意の方法を用いて継代することができる。
【００５７】
ある実施形態では、本発明の胚性幹細胞は正常な核型を有し、一方、他の実施形態ではこの胚性幹細胞は異常な核型を有する。一実施形態では、大多数の胚性幹細胞は異常な核型を有する。調査された中期の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％超、または９５％超が異常な核型を示すであろうと考慮されている。ある実施形態では、この異常な核型は、細胞を５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０回よりも長く継代培養した後では明白である。一実施形態では、異常な核型は少なくとも１本の常染色体のトリソミーを含み、ここで、その常染色体は１、７、８、１２、１４、および１７番染色体からなる群から選択される。別の実施形態では、この異常な核型は１本より多くの常染色体のトリソミーを含み、ここで、１本より多くの常染色体のうち少なくとも１本は、１、７、８、１２、１４、および１７番染色体からなる群から選択される。一実施形態では、その常染色体は１２または１７番染色体である。別の実施形態では、この異常な核型は追加の性染色体を含む。一実施形態では、その核型は２本のＸ染色体および１本のＹ染色体を含む。染色体の転座が起こりうることもまた考慮されており、当該転座は用語「異常な核型」に包含される。それらの染色体異常の組合せもまた本発明によって包含されている。
【００５８】
上に挙げたように、本発明は、（ａ）多能性哺乳動物細胞を用意すること、および（ｂ）その多能性哺乳動物細胞を、有効量のＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させて、その多能性細胞を内胚葉系列の細胞に少なくとも部分的に分化させることを含む、多能性哺乳動物細胞を分化させる方法を包含する。一実施形態では、段階（ｂ）は細胞分化環境の使用を含む。別の実施形態では、これらの細胞を段階（ｂ）の後で細胞分化環境と接触させることができる。
【００５９】
本明細書に使用されるように、用語「細胞分化環境」は、多能性細胞が分化するように誘導されるか、または分化した細胞が集積したヒト細胞培養物になるように誘導される細胞培養条件を指す。好ましくは、成長因子によって誘導された、分化した細胞系列は事実上均一であろう。用語「均一」は、所望の細胞系列を約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超含有する集団を指す。
【００６０】
一実施形態では、その多能性細胞は、中内胚葉、内胚葉および中胚葉系列からなる群から選択される系列の細胞に分化するように誘導される。さらなる実施形態では、その多能性細胞は胚体内胚葉系列の細胞に分化するように誘導される。好ましくは、多能性細胞は胚体内胚葉細胞を約５０％超含む集団に分化するように誘導される。他の実施形態では、その集団は胚体内胚葉細胞系列を約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超含む。
【００６１】
分化培地または分化環境を利用して、本発明の多能性細胞をＰＩ３−キナーゼの阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させる前、途中、または後のいずれかに、その多能性細胞を部分的に分化、終末分化、または可逆的に分化させることができる。本発明によると、細胞分化環境の培地は、例えばＫＯＤＭＥＭ培地（ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地）、ＤＭＥＭ、ＨａｍのＦ１２培地、ＦＢＳ（胎仔ウシ血清）、ＦＧＦ２（線維芽細胞成長因子２）、ＫＳＲ、血清、またはｈＬＩＦ（ヒト白血病阻害因子）を含めた様々な構成要素を含有しうる。細胞分化環境は、Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ（可欠アミノ酸）、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、Ｎ２およびβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）などの補充物も含有することがある。非限定的にフィブロネクチン；ラミニン；ヘパリン；ヘパリン硫酸；レチノイン酸；上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバー；ＦＧＦ２および／またはＦＧＦ８を含めた線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバー；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバー；非限定的にノギン、フォリスタチン、コーディン、グレムリン（gremlin）、Cerebrus／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン（ventropin）、高用量アクチビン、およびアムニオンレス（amnionless）を含めた形質転換成長因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／増殖分化因子（ＧＤＦ）因子ファミリーのアンタゴニストを含めた追加の因子を細胞分化環境に添加できることが考慮されている。ＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦアンタゴニストを、ＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦ受容体−Ｆｃキメラの形態で添加することもできる。添加できる他の因子には、非限定的にＤｅｌｔａ様タンパク質およびＪａｇｇｅｄファミリータンパク質を含めた、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーを介するシグナル伝達を活性化または不活性化できる分子、ならびにＮｏｔｃｈのプロセシングまたは開裂の阻害剤が含まれる。その他の成長因子には、インスリン様成長因子ファミリー（ＩＧＦ）、インスリン、ウイングレス関連（ＷＮＴ）因子ファミリー、およびヘッジホッグ因子ファミリーのメンバーが含まれうる。中内胚葉の幹／前駆細胞、内胚葉の幹／前駆細胞、中胚葉の幹／前駆細胞、または胚体内胚葉の幹／前駆細胞の増殖および生存、ならびにこれら前駆細胞の誘導体の生存および分化を促進するために追加の因子を添加することもできる。
【００６２】
他の実施形態では、細胞分化環境は接着培養で細胞を平板培養することを含む。本明細書に使用されるように、用語「平板培養した」および「平板培養」は、細胞を接着培養で成長させる任意の工程を指す。本明細書に使用されるように、用語「接着培養」は、細胞を固体表面上で培養し、その固体表面を今度は固体支持体で被覆することができ、今度は下記に挙げたもののような別の支持体の表面被覆で、または細胞を培養物中で増殖または安定化させる任意の他の化学材料または生物学的材料でその支持体を被覆することができる細胞培養系を指す。これらの細胞は固体表面または支持体に堅固に接着できるか、またはできない。一実施形態では、これらの細胞をマトリゲルで被覆された平板上で平板培養する。接着培養用の支持体は、ポリオルニチン、ラミニン、ポリリシン、精製コラーゲン、ゼラチン、細胞外マトリックス、フィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、エンタクチン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ポリ解糖酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、および非限定的に初代線維芽細胞形または線維芽細胞系などのフィーダー層のうち任意の１つまたは組合せを含みうる。さらに、接着培養用の支持体は、フィーダー層によって敷設されたか、または多能性ヒト細胞もしくは多能性ヒト細胞培養物によって敷設された細胞外マトリックスを含むことができる。
【００６３】
本発明の方法は、細胞をフィーダー細胞またはフィーダー層と共に培養できることを考慮している。本明細書に使用されるように、「フィーダー細胞」は、標的細胞と共培養され、その標的細胞を現在の分化状態に安定化する細胞である。フィーダー層は、培養されている１より多数のフィーダー細胞を含む。上記方法の一実施形態では、馴化培地は、標的細胞をそれの現在の分化状態に安定化するフィーダー細胞から得られる。標的細胞を現在の分化状態に安定化させるフィーダー細胞によって産生される任意および全ての因子を単離して、当業者に日常的な方法を使用して特徴付けることができる。これらの因子をフィーダー層の代わりに使用することができ、またフィーダー層に補給するために使用することもできる。
【００６４】
本明細書に使用されるように、用語「安定化する」は細胞の分化状態を指す。細胞または細胞集団が安定化している場合、それは培養状態で多回継代にわたり、好ましくは培養状態で無限に増殖し続けるであろうし、追加的に、その培養物中の各細胞は、好ましくは同じ分化状態であり、その細胞が分裂するとき、典型的には同じ細胞型の細胞が生じるか、または同じ分化状態の細胞が生じる。好ましくは、安定化した細胞または細胞集団は、その細胞培養条件が変化せず、その細胞が継代され続け、過剰成長しないならば、さらに分化または脱分化しない。好ましくは、安定化している細胞は安定状態で無限に、または少なくとも２回より多くの継代の間増殖することができる。好ましくは、その細胞は５回より多くの継代、１０回より多くの継代、１５回より多くの継代、２０回より多くの継代、２５回より多くの継代の間安定であり、また最も好ましくは３０回より多くの継代の間安定である。一実施形態では、その細胞は１年より多くの連続継代の間安定である。
【００６５】
一実施形態では、幹細胞は胚体内胚葉に分化することが望まれるまで、日常的な継代によって、培養して多能性状態に維持される。ＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤と共にＴＧＦ−βファミリーのメンバーがその多能性細胞に投与されることが考慮されている。本明細書に使用されるように、用語「ＴＧＦ−βファミリーのメンバー」は、公知のＴＧＦ−βファミリーのメンバーとの相同性または公知のＴＧＦ−βファミリーのメンバーとの機能の類似性のいずれかが原因で、ＴＧＦ−βファミリーに属するとして当業者によって一般に特徴付けられた成長因子を指す。ある実施形態では、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一実施形態では、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーはアクチビンＡである。追加的に、成長因子Ｗｎｔ３ａは胚体内胚葉細胞の産生に有用である。本発明のある実施形態では、上に言及した成長因子のうち任意の組合せを使用することができる。これらの構成要素を細胞に同時に添加することは必要ない。
【００６６】
本明細書に記載される分化方法の実施形態のうちいくつかに関して、上に言及した成長因子が細胞に提供されることによって、その成長因子は幹細胞の少なくとも一部が胚体内胚葉に分化するのを促進するのに十分な濃度で培養物中に存在する。本発明のいくつかの実施形態では、上に言及した成長因子は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物中に存在する。
【００６７】
本発明のある実施形態では、上に言及した成長因子を添加した後に、その成長因子は細胞培養物から除去される。例えば、成長因子を添加後約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、または約１０日以内にその成長因子を除去することができる。好ましい実施形態では、成長因子を添加した約４日後にその成長因子は除去される。
【００６８】
胚体内胚葉細胞の培養物を、低減した血清を含有するか、または血清を含有しない培地中で成長させることができる。本発明のある実施形態では、血清濃度は約０．１％から約２０％（ｖ／ｖ）の範囲でありうる。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞を血清代替物と共に成長させる。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞をＢ２７の存在下で成長させる。当該実施形態では、Ｂ２７の補給濃度は、約０．２％から約２０％（ｖ／ｖ）まで、または約２０％（ｖ／ｖ）より高濃度の範囲でありうる。あるいは、添加されるＢ２７の補給濃度を、商業的に入手できるＢ２７原液の濃度の倍数によって計量することができる。例えば、Ｂ２７は５０×原液としてInvitrogen（Carlsbad、カリフォルニア州）から入手できる。十分量の成長培地への十分量のこの原液の添加により、所望量のＢ２７が補給された培地が産生する。例えば、成長培地９０ｍｌへの５０×Ｂ２７原液１０ｍｌの添加により、５×Ｂ２７を補給された成長培地が産生するであろう。培地中のＢ２７の補給濃度は、約０．１×、約０．２×、約０．３×、約０．４×、約０．５×、約０．６×、約０．７×、約０．８×、約０．９×、約１×、約１．１×、約１．２×、約１．３×、約１．４×、約１．５×、約１．６×、約１．７×、約１．８×、約１．９×、約２×、約２．５×、約３×、約３．５×、約４×、約４．５×、約５×、約６×、約７×、約８×、約９×、約１０×、約１１×、約１２×、約１３×、約１４×、約１５×、約１６×、約１７×、約１８×、約１９×、約２０×および約２０×超でありうる。
【００６９】
胚体内胚葉へのｈＥＳＣ培養物の進行を、胚体内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現、ならびにｈＥＳＣおよび他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の発現欠如を定量することによって監視することができる。当該マーカー遺伝子の遺伝子発現を定量する一方法は、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の使用による。Ｑ−ＰＣＲを行う方法は、当技術分野において十分に公知である。当技術分野で公知の他の方法をマーカー遺伝子発現の定量に使用することもできる。マーカー遺伝子の発現を、関心対象のマーカー遺伝子に特異的な抗体を使用することによって検出することができる。
【００７０】
本明細書に記載された方法を使用して、実質的に他の細胞型を有さない胚体内胚葉細胞を含む組成物を産生することができる。あるいは、ｈＥＳＣおよび胚体内胚葉細胞の混合物を含む組成物を産生することができる。例えば、それぞれ９５個のｈＥＳＣについて少なくとも５個の胚体内胚葉細胞を含む組成物を産生することができる。他の実施形態では、それぞれ５個のｈＥＳＣについて少なくとも９５個の胚体内胚葉細胞を含む組成物を産生することができる。追加的に、ｈＥＳＣに対する他の比の胚体内胚葉細胞を含む組成物が考慮されている。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態では、当該細胞に特異的な親和性タグを使用することによって胚体内胚葉細胞を単離することができる。胚体内胚葉細胞に特異的な親和性タグの一例は、マーカーポリペプチドに特異的な抗体であり、そのポリペプチドは、胚体内胚葉細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書に記載された方法によって産生した細胞培養物に見られるであろう他の細胞型には実質的に存在しない。
【００７２】
多能性幹細胞を、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の阻害剤と接触させる前に、その多能性幹細胞を本質的に単一な細胞培養物に解離させることができることが考慮されている。本明細書に使用されるように、「本質的に単一な細胞の培養物」は、継代中に、成長を望まれる細胞を相互に解離させることによって、大部分の細胞が単一な細胞であるか、または結合を続ける２つの細胞（ダブレット）である細胞培養物である。好ましくは、培養を望まれる細胞の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超またはそれよりも高い率がシングレットまたはダブレットである。本用語は、本質的に単一な細胞培養物を産生することができる、現在公知であるか、または今後開発される任意の方法の使用を包含する。当該方法の非限定的な例には、細胞分散緩衝液の使用、ならびにトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、tripLE、およびaccutaseなどのプロテアーゼの使用が含まれる。これらのプロテアーゼおよびこれらのプロテアーゼのうちある種の組合せが商業的に入手できる。本発明は、細胞培養物を継代の任意の時点で本質的に単一な細胞培養物に解離させることができることを考慮しており、その解離が、その阻害剤と接触させる直前に継代中に起こる必要はない。解離は１回または複数回の継代中に起こりうる。
【００７３】
本発明の方法を使用して産生した細胞は、多様な用途を有する。特に、これらの細胞を核移植技法のための核材料の供給源として使用することができ、移植用の器官の細胞、組織または構成要素を産生するために使用することができる。例えば、胚体内胚葉細胞が産生するならば、その細胞をヒト細胞療法またはヒト遺伝子療法に使用して１型糖尿病、肝臓疾患、ならびに食道、胃、小腸、大腸、肺、胸腺、副甲状腺および甲状腺、胆嚢および膵臓に影響する他の任意の疾患などの疾患を治療することができる。それらの一態様では、胚体内胚葉細胞を使用して糖尿病が治療される。
【００７４】
本出願にわたり、様々な出版物が参照されている。これらの出版物およびそれらの出版物で引用された参照の全ての開示は、本発明が属する技術分野の状態をさらに完全に記載するために、それらの全体が本明細書によって参照により本出願に組み込まれている。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）
ヒトＥＳ細胞の培養
日常的なヒトＥＳ細胞培養
ヒト胚性幹細胞系ＢＧ０１（BresaGen,Inc.、Athens、ジョージア州）を本実験に使用した。２０％ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ；Invitrogen）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ可欠アミノ酸（ＮＥＡＡ；Invitrogen）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Invitrogen）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Invitrogen）、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Sigma）および０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Sigma）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２（５０／５０）からなるｈＥＳ培地でＢＧ０１細胞を成長させた。マイトマイシンＣで有糸分裂を不活性化したマウス初代胚性線維芽フィーダー層上でこれらの細胞を成長させた。フィーダー細胞を３５ｍｍ皿あたり１．２×１０６細胞で平板培養した。コラゲナーゼ／トリプシン法を使用してＢＧ０１細胞を継代した。簡潔には、皿から培地を除き、２００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ型（GibcoBRL）１ｍｌを添加し、３７℃で１〜２分間細胞をインキュベートした。コラゲナーゼを除去し、０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（GIBCO）１ｍｌを適用した。３７℃で３０秒間細胞をインキュベートし、次にフィーダー層から細胞を洗い出し、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ；Hyclone）を有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２中でトリプシンを不活性化した。細胞を３５ｍｍ皿あたり１０００００〜３０００００細胞でフィーダー層に再平板培養して、３日毎に継代した。
【００７６】
無フィーダー条件でのＢＧ０１細胞の成長
ｈＥＳ培地（２５ｍｌ）を、５６０００細胞／ｃｍ２で７５ｃｍ２フラスコに平板培養したマイトマイシン処理ＭＥＦ上で一晩馴化した。ＭＥＦを最長１週間使用して、２４時間毎に馴化培地（ＣＭ）を採集した。使用前に、ＣＭに追加の８ｎｇ／ｍｌ  ｈｂＦＧＦを補給した。成長因子低減ＢＤマトリゲルマトリックス（BD Biosciences）を終濃度１：３０に例ＤＭＥＭ／Ｆ−１２中に希釈することによって、マトリゲルを被覆した皿を調製した。１ｍｌ／３５ｍｍ皿を使用して、室温で１〜２時間、または４℃で少なくとも一晩皿を被覆した。平板を４℃で最長１週間保存した。使用直前にマトリゲル溶液を除去した。
【００７７】
胚様体の形成
上記のコラゲナーゼ／トリプシン法を使用してＢＧ０１細胞を脱凝集させた。約１００００細胞をＥＢ培地５０μｌ（１０％ＦＢＳ（Atlanta Biolabs）、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ（Cellgro））に懸濁し、ｐ２００ピペットチップで１００ｍｍペトリ皿の蓋に滴下した。蓋１枚あたり約５０滴を落とした。その蓋を皿にかぶせ、ＰＢＳ１０ｍｌを皿に入れた。３および５日目にＥＢを蓋から洗い出し、トリプシンを加えて室温で５分間インキュベートして、引き伸ばしたガラスピペットで脱凝集させた。１×ＰＢＳ中で細胞を１回洗浄し、室温で１０分間２％ＰＦＡ／２％スクロース中で固定した。次に、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、抗体染色の準備が完了した状態で１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で保存した。
【００７８】
（実施例２）
ＰＩ３−キナーゼ阻害剤を用いたＨＥＳ細胞の処理はＨＥＳ細胞の分化を導く
阻害剤の研究
コラゲナーゼ／トリプシン法を使用してＢＧ０１細胞をフィーダーから継代し、マトリゲルで被覆した皿に１×１０５細胞／３５ｍｍ皿で馴化培地（ＣＭ；ＭＥＦ馴化培地＋８ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ）中で平板培養した。約２４時間後に、新鮮ＣＭ、阻害剤（ＥｔＯＨに再懸濁）を有するＣＭ、ＥｔＯＨを有するＣＭ、または自然分化培地（ｈＥＳ培地−ｂＦＧＦ）にその培地を置換した。
【００７９】
代替法では、ＣＭ、阻害剤を有するＣＭ、およびＥｔＯＨを有するＣＭと接触させる前に、種々の濃度でＢＧ０１細胞を平板培養した。細胞を以下の濃度で平板培養した：約５×１０４細胞／３５ｍｍ皿、約１×１０５細胞／３５ｍｍ皿、約２×１０５細胞／３５ｍｍ皿、約４×１０５細胞／３５ｍｍ皿、および約６×１０５細胞／３５ｍｍ皿。
【００８０】
阻害剤ＬＹ２９４００２（Biomol）を濃度範囲約２０〜１６３μＭで使用し、阻害剤ラパマイシン（Calbiochem）を濃度範囲約１．５〜３０ｎＭで使用した。ＬＹ２９４００２は、ｐ１１０のＡＴＰドッキング部位に結合することによってＰＩ３−キナーゼ経路を阻害する。ラパマイシンはｍＴＯＲ（哺乳動物のラパマイシン標的タンパク質）を阻害することによってＰＩ３−キナーゼ経路のサブセットを阻害する。
【００８１】
これらの条件で約７２時間細胞を成長させ、培地を２４時間毎に交換した。フローサイトメトリーおよびＲＴ−ＰＣＲ分析のためにコラゲナーゼ／トリプシン法を使用して細胞を採取し、生化学分析用に剥がした。
【００８２】
標準顕微鏡を使用して細胞を観察することによって、ＬＹ２９４００２またはラパマイシンのいずれかの存在下で培養したときＢＧ０１細胞が形態変化を受けることが注目された。この形態変化は、自然分化を受けている細胞での変化と顕著に異なる（図１Ａ〜Ｄおよび２Ａ〜Ｄ）。未分化培養物では、個別の細胞は、比較的小さく、不規則で、より高い密度で見た目に明瞭な細胞間接合部を有さないことから、容易に識別できない。しかし、ＬＹ２９４００２で処置後は、これらの細胞は顕著な拡大を経て、明らかな類上皮立方形態を採った。個別の細胞は、高密度でさらに容易に識別することもできた。それは、個々の細胞間接着接合部が隣接細胞間ではっきりとしていたからである。
【００８３】
追加的に、本実施例では馴化培地の存在下で約２×１０５細胞／３５ｍｍ皿未満の濃度で平板培養した細胞は、ＬＹ２９４００２またはラパマイシンと接触させたときに形態変化を示した。約４×１０５細胞／３５ｍｍ皿以上の密度で平板培養した細胞は、ＬＹ２９４００２またはラパマイシンと接触した際に同じ形態変化を示さなかった。
【００８４】
（実施例３）
ＰＩ３−キナーゼ阻害剤で処理された細胞の性質
実施例２に記載されたように阻害剤実験を行った。
【００８５】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのために、ＢＧ０１細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒド／１×ＰＢＳ中で１０分間、室温で固定した。次に、細胞を１×ＰＢＳ中で洗浄し、約２×１０５細胞を、１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳに希釈した一次抗体と共にインキュベートした。使用した一次抗体は、１：１０希釈の抗ＣＤ９ＦＩＴＣコンジュゲートマウスモノクローナル抗体および抗トロンボモジュリンＦＩＴＣコンジュゲートマウスモノクローナル抗体（Cymbus Biotechnology）であった。４℃で３０分間細胞をインキュベートし、次に１×ＰＢＳ中で２回洗浄した。適切ならば、１％ＢＳＡ／ＰＢＳに１：１０００希釈した二次抗体である抗マウスAlexa-488（Molecular Probes）に細胞を再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートし、次に１×ＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳに再懸濁し、Beckman Coulter ＦＣ５００を用いて表面での発現を分析した。
【００８６】
ＲＮＡの単離およびＲＴ−ＰＣＲ分析
TRIzol試薬（GibcoBRL）を用いて総ＲＮＡを単離した。エチジウムブロミドを含有する１％アガロースゲルでＲＮＡを泳動させ、AlphaImager（商標）２２００ドキュメンテーションおよび分析システムを使用して可視化して、ＲＮＡの完全性を確認した。ＲＮＡ１０μｇをＤＮアーゼ（Ambion）で処理し、そのＤＮアーゼをＤＮアーゼ不活性化試薬（Ambion）で除去した。オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いたSuperscript II逆転写酵素キット（Invitrogen）を使用して総ＲＮＡ５００ｎｇでｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡ１μｌでＰＣＲ反応を行った。エチジウムブロミドを含有する２％アガロースゲルでＰＣＲ産物を泳動させ、AlphaImager（商標）２２００ドキュメンテーションおよび分析システムを使用して可視化した。使用したＰＣＲプライマーセットは、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘ１、Ｍｓｘ１、ＡＦＰ、ＨＮＦ４α、ｅＨＡＮＤ、Ｎａｎｏｇ、ＡＦＰおよびＧＡＰＤＨであった。
【００８７】
生化学分析
ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の活性をウエスタンブロット分析によって評価した。簡潔には、未処理細胞および処理細胞培養物から洗剤抽出物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ニトロセルロースに転移させた。次に、活性形態ＰＩ３−キナーゼの細胞内標的であるＰＫＢ／Ａｋｔ、Ｓ６キナーゼおよびＳ６タンパク質の発現を、これらのタンパク質それぞれのリン酸化形態に対する適切な抗体を用いてニトロセルロースを探査することによって決定した。一般に、総タンパク質３０μｇを各試料について評価し、抗体の１：１０００希釈で一次インキュベーションを行い、各場合の結合を標準的なＥＣＬに基づく方法によって検出した。
【００８８】
Ｑ−ＰＣＲ遺伝子発現アッセイ
Ｑ−ＰＣＲによって多時点での多マーカー遺伝子について遺伝子発現のリアルタイム測定を分析した。細胞集団の全般的な動力学をいっそうよく理解するために、所望の、および所望でない細胞型の特徴となるマーカー遺伝子を評価した。ゲノム配列が容易に入手できることから、Ｑ−ＰＣＲ分析の強みは、その最高の感度および必要なマーカーの開発が比較的容易なことが含まれる。さらに、Ｑ−ＰＣＲの極めて高い感度により、ずっと大きな集団内の比較的少数の細胞から遺伝子発現を検出することが可能になる。さらに、非常に低レベルの遺伝子発現を検出できることによって、集団内の「分化の偏り」についての指標を提供することができる。それらの細胞表現型の明らかな分化前には、特定の分化経路方向の偏りは、免疫細胞化学技法を用いて認識できそうにないと思われる。この理由から、Ｑ−ＰＣＲは、分化処理の成功を選別するための免疫細胞化学技法を補足する分析法を提供する。このツールは、準高スループットスケールの分析で本分化プロトコールの成功を定量形式で評価する手段を提供する。
【００８９】
一般的なアプローチは、Rotor Gene３０００装置（Corbett Research）でのSYBR Green化学反応および２段階ＲＴ−ＰＣＲ形式を用いて相対定量を行うことであった。エキソン間境界にわたって位置するか、または可能ならば少なくとも８００ｂｐのイントロンにわたるようにプライマーを設計した。それは、このことが混入したゲノムＤＮＡからの増幅を除去するように経験的に決定されたからである。イントロンを含有しないマーカー遺伝子が採用されたか、またはそれらの遺伝子が偽遺伝子を有する場合、ＲＮＡ試料のＤＮアーゼＩ処理を行った。初期のｈＥＳＣ分化（具体的には外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉、および胚体外内胚葉）に関連するマーカーであって、それに対して確証されたプライマーセットが存在するマーカーを下記表１に提供する。これらのプライマーセットのヒト特異性も実証された。これは重要な事実である。それは、ｈＥＳＣがマウスフィーダー層上でしばしば成長したからである。最も典型的には、３回繰り返しの試料を各条件について取り出して、２回の繰り返しで独立して分析し、各定量に関連する生物学的可変性を評価した。
【００９０】
総ＲＮＡをRNeasy（Qiagen）を用いて単離し、RiboGreen（Molecular Probes）を用いて定量した。総ＲＮＡ３５０〜５００ｎｇからの逆転写を、オリゴ−ｄＴプライマーおよびランダムプライマーの混合物を含有するiScript逆転写酵素キット（BioRad）を使用して実施した。各２０μＬの反応物を続いて合計体積１００μＬまで希釈し、３μＬを、４００ｎＭフォワードプライマーおよびリバースプライマーならびに２×SYBR Greenマスターミックス（Qiagen）５μＬを含有するＱ−ＰＣＲ反応物１０μＬそれぞれに使用した。８５〜９４℃（各プライマーセットについてのアンプリコンの融解温度に応じて特異的に選択した）で５秒の変性に続く６０℃で４５秒間のアニール／伸長を採用した２段階サイクリングパラメータを使用した。各伸長期の最後の１５秒間で蛍光データを収集した。３点の１０倍希釈系列を使用して各作業について標準曲線を作成し、サイクル閾値（Ｃｔ）をこの標準曲線に基づく定量値に変換した。各試料についての定量値をハウスキーピング遺伝子の効率に対して基準化し、次に、３回繰り返しの試料について平均および標準偏差を計算した。ＰＣＲサイクリングの終わりに、融解曲線分析を行って、反応の特異性を確認した。ＰＣＲアンプリコンに適したＴｍで単ピークであることによって、単一の特異的産物であること示された。さらに、逆転写酵素不在下で行われた反応は、負対照として働き、増幅しない。
【００９１】
シクロフィリンＧおよびＧＵＳの両方を使用して、全ての試料についての基準化係数を計算した。多数のＨＧの使用は、同時に基準化過程に固有の可変性を低減し、相対遺伝子発現値の信頼性を増加させる（Vandesompeleら、２００２年、Genome Biol.、３：RESEARCH0034）。
【００９２】
Ｑ−ＰＣＲを使用して異なる実験処理を受けている試料にわたり多くのマーカー遺伝子の相対遺伝子発現レベルを決定した。採用されたマーカー遺伝子は、初期胚葉を代表する特異的集団での集積を示すことから選択され、特に胚体内胚葉および胚体外内胚葉で相違して発現する遺伝子セットに焦点を合わせていた。これらの遺伝子およびそれらの相対集積プロファイルを表１に強調する。
【表１】
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【００９３】
免疫組織化学
ＳＯＸ１７抗体
ＳＯＸ１７は原腸形成の間に形成することから、胚体内胚葉全体に発現し、その発現は器官形成の開始前後まで（発現レベルはＡ−Ｐ軸に沿って変動するが）腸管に維持される。ＳＯＸ１７は胚体外内胚葉細胞サブセットでも発現している。このタンパク質の発現は中胚葉および外胚葉では観察されなかった。それとして、ＳＯＸ１７は胚体外系列を除外するためのマーカーと共に使用された場合、胚体内胚葉系列についての適切なマーカーである。
【００９４】
全体が本明細書により参照により組み込まれている、名称「胚体内胚葉」の米国特許出願公開第２００５／０１５８８５３号に記載されているように、ＳＯＸ１７抗体を発生させた。簡潔には、抗体産生会社GENOVAC（Freiberg、ドイツ）で、そこで開発された手順に従ってラットに遺伝子免疫することによりＳＯＸ１７抗体を産生するために、ＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端のアミノ酸１７２〜４１４番に対応するヒトＳＯＸ１７  ｃＤＮＡの部分を使用した。遺伝子免疫のための手順は、米国特許第５８３０８７６号、第５８１７６３７号、第６１６５９９３号、第６２６１２８１号、および国際公開ＷＯ９９／１３９１５に見出すことができる。これらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。その抗体は、ｈＳＯＸ１７  ｃＤＮＡトランスフェクト細胞系でウエスタンブロットおよびＩＣＣの両方によりＳＯＸ１７に対して特異的であることが決定された。
【００９５】
免疫染色する細胞をチャンバースライド上に成長させ、１×ＰＢＳで１回洗浄し、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の４％ＰＦＡ／４％スクロースに入れて室温で１０分間固定した。次に、それらを１×ＰＢＳで３回すすぎ、ＰＢＳ中に０．１％トリトン−Ｘ１００を有する３％ヤギ血清に入れて室温で１時間ブロッキングした。一次抗体をＰＢＳ中の３％ヤギ血清に希釈し、この溶液を４℃で一晩適用した。使用した一次抗体は、１：５０希釈で使用したウサギ抗ヒトＡＦＰ（Zymed）および１：１０００希釈で使用したラット抗ヒトＳＯＸ１７（Cythera,Inc.．から入手）であった。１×ＰＢＳを３回交換して細胞を１時間洗浄した。二次抗体を室温で２時間適用した。使用した二次抗体は、ヤギ抗ウサギAlexa Fluor488およびヤギ抗ラットAlexa Fluor594（Molecular Probes）（共に１×ＰＢＳ中の３％ヤギ血清に１：１０００希釈）であった。１×ＰＢＳを３回交換して細胞を１時間洗浄した。チャンバーを除き、ＤＡＰＩを有するVectaShield封入剤（Vector）にスライドを封入した。
【００９６】
結果
フローサイトメトリーを使用して、接着培養または胚様体において自然分化よりもＬＹ２９４００２またはラパマイシン処理ＢＧ０１細胞の方が速やかにＣＤ９発現が減少したことに注目された（図３Ａ〜Ｅ）。さらに、他の研究者によってＣＤ９発現は細胞の増殖、運動性および接着に影響することが以前に観察された。
【００９７】
ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、初期分化を示すいくつかのマーカーが、ＬＹ２９４００２およびラパマイシンで処理した細胞で検出されたことが注目された（図４ＡおよびＢ）。特に、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達が遮断されたときに検出されたマーカーは、自然に分化しているＢＧ０１細胞の接着培養で検出されたマーカーとは異なった（図４Ａおよび４Ｂ）。例えば、ＰＩ３−キナーゼの遮断は、自然に分化している培養物と比較してＨＮＦ４α、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘ１、およびＭｓｘ１レベルの増加、ならびにＡＦＰのレベルの減少を招いた。
【００９８】
追加的に、様々な密度の多能性細胞で注目された細胞形態の差がＰＣＲデータによって支持された。ＬＹ２９４００２またはラパマイシンを用いた処理の効果は、状況によっては細胞密度に依存するおそれがある。
【００９９】
図５Ａ〜Ｇは、ｈＥＳ細胞系ＢＧ０１をＬＹ２９４００２またはラパマイシンのいずれかで１〜３日間処理すると、中内胚葉（すなわち、グースコイド／ブラキュリー／Cerebrus）、胚体内胚葉（ＳＯＸ１７／ＭＩＸ１／グースコイド／Cerebrus）系列の前駆細胞に強く関連する遺伝子の発現が量的に誘導されることを実証している。対照的に、図５Ｈ〜５Ｉに示されるように、ＬＹ２９４００２またはラパマイシンは汎神経外胚葉マーカーＳＯＸ１、または汎胚体外マーカーＳＯＸ７の発現を誘導しない。
【０１００】
さらに、ＬＹ２９４００２（８０μＭ）またはラパマイシン（３０ｎＭ）で処理されたＢＧ０１細胞系のＳＯＸ１７免疫蛍光染色およびＡＦＰ免疫蛍光染色を行った（データは示さず）。二重染色から、処理した細胞にＡＦＰの有意な発現が存在しないことが実証された。ある範囲の細胞培養物は実際にＡＦＰを発現した。５００細胞を計数して決定したとき、ＬＹ２９４００２で処理した細胞集団のうち２９６細胞、言い換えると６０％がＳＯＸ１７を発現した。
【０１０１】
図６はヒトＢＧ０１細胞におけるトロンボモジュリン発現のフローサイトメトリー分析を示す。８０μＭのＬＹ２９４００２で処理した細胞はトロンボモジュリンレベルの減少を示した。
【０１０２】
さらに、ＢＧ０２細胞（BresaGen,Inc.）およびＨ１細胞（WiCell）も実施例２に記載されたように６０μＭ  ＬＹ２９４００２で処理した。ＬＹ２９４００２と共に約７２時間培養した後で、Ｑ−ＰＣＲによってＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＦｏｘＡ２、ＧＳＣ、Ｍｏｘ１、ＭｉｘＬ１、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ１７、ＴＨＢＤ、およびＺＩＣ１の発現を調べた。図７Ａ〜Ｔに示すように、いずれかの細胞系をＬＹ２９４００２で処理した結果、Ｓｏｘ１７、ＭｉｘＬ１、Ｂｒｙ、ＦｏｘＡ２、およびＧＳＣのレベルの増加が生じたが、一方でＡＦＰ、Ｍｏｘ１、Ｓｏｘ１、ＴＨＢＤ、およびＺＩＣ１は、実質的に増加しないか、または発現の減少を示すかのいずれかであった。これらの結果は、他のｈＥＳ細胞系を用いた本発明の方法の再現性を実証している。アッセイを３回の繰り返しで行い、＋／−ＳＥＭとして示した。
【０１０３】
生化学分析により、ＬＹ２９４００２の存在下で維持された細胞ではＡｋｔ、Ｓ６キナーゼおよびＳ６の活性が阻害されたことが注目された。同様に、ラパマイシンの存在下で維持された細胞ではＳ６キナーゼおよびＳ６の活性は消失した。
【０１０４】
まとめると、これらの観察は、ｍＴＯＲへのＰＩ３−キナーゼシグナル伝達はこれらの阻害薬の存在下でＢＧ０１細胞ではダウンレギュレーションされることを示している。Ｓ６（このシグナル伝達経路における遠位の標的）の活性は、接着培養で自然分化を受けているＢＧ０１細胞では減少したが、阻害剤で処理した細胞では消失した。
【０１０５】
（実施例４）
馴化培地についてのＴＧＦ−βメンバー代替物
ＢＧ０１細胞をフィーダーからコラゲナーゼ／トリプシン法を使用して継代し、未馴化ｈＥＳ培地（ＵＣＭ）中で１×１０５細胞／３５ｍｍ皿でマトリゲル被覆皿上で平板培養した。約２４時間後に培地を、図８Ａに示すようにＬＹ２９４００２、アクチビンＡ、またはＮｏｄａｌを有する新鮮ｈＥＳ培地またはＭＥＦ−ＣＭに置換した。ＬＹ２９４００２を濃度約６０μＭで使用し、アクチビンＡを濃度約１００ｎｇ／ｍｌで使用し、Ｎｏｄａｌを濃度約１μｇ／ｍｌで使用した。細胞を約４日間処理し、２４時間毎に培地を交換した。Ｑ−ＰＣＲ分析のためにコラゲナーゼ／トリプシン法を使用して細胞を採取した。実施例３に記載されたようにＳｏｘ−１７のＱ−ＰＣＲを行った。
【０１０６】
図８Ａは、未処理細胞に比べた増加倍率としてＳｏｘ１７レベルを示したＱ−ＰＣＲの結果を提供する。（１）ＣＭおよびＬＹ２９４００１、（２）ＵＣＭ、ＬＹ２９４００２、およびアクチビンＡ、ならびに（３）ＵＣＭ、ＬＹ２９４００２、およびＮｏｄａｌで処理したが、ＣＭ、アクチビン、またはＮｏｄａｌ（図８Ａ）の不在下で処理したｈＥＳ細胞で有意なＳｏｘ１７の発現が観察された。結果は、ＭＥＦ−ＣＭまたはアクチビン／ＮｏｄａｌがＬＹ２９４００２依存性ｈＥＳＣ−ＤＥ形成に必要であることを示している。アッセイを３回の繰り返しで行い、＋／−ＳＥＭとして示す。
【０１０７】
Ｓｏｘ１７の発現を、コーディン（約５００ｎｇ／ｍｌ）、フォリスタチン（約５００ｎｇ／ｍｌ）、Ｌｅｆｔｙ−Ａ（約５００ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（約５００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＢ−４３１５２（約１０μＭ）、およびＳＵ−５４０２（約５μＭ）の存在下または不在下でｈＥＳＣ−ＤＥ形成（ＭＥＦ−ＣＭおよびＬＹ２９４００２）を支持するのに適格な培養条件でＱ−ＰＣＲによって評価した。アッセイを３回の繰り返しで行い、＋／−ＳＥＭとして示した。図８Ｂは、様々な処理における未処理細胞に対する増加倍率としてＳｏｘ１７レベルを示すが、これは、ＬＹ２９４００２、ＭＥＦ−ＣＭ依存性Ｓｏｘ１７発現はアクチビンシグナル伝達の阻害剤（フォリスタチンおよびＳＢ−４３１５２）によって抑制されたが、ＢＭＰシグナル伝達（コーディンおよびノギン）、Ｎｏｄａｌシグナル伝達（Ｌｅｆｔｙ−Ａ）、またはＦＧＦシグナル伝達（ＳＵ−５４０２）の阻害剤によっては抑制されなかったことを示している。
【０１０８】
（実施例５）
ＡｋｔＩ−ＩＩは胚体内胚葉の形成を誘導する
ＢＧ０１細胞をコラゲナーゼ／トリプシン法を使用してフィーダーから継代し、馴化培地（ＣＭ；ＭＥＦ馴化培地＋８ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ）中で１×１０５細胞／３５ｍｍ皿でマトリゲル被覆皿上に平板培養した。約２４時間後に、培地を新鮮ＣＭ、阻害剤（ＥｔＯＨに再懸濁）を有するＣＭ、またはＥｔＯＨを有するＣＭに置換した。
【０１０９】
阻害剤ＡｋｔＩ−ＩＩ（Calbiochem）をエタノールに溶解し、約１０〜４０μＭの濃度範囲で使用した。ＡｋｔＩ−ＩＩはＡｋｔＩを直接阻害することによってＰＩ３−キナーゼ経路を阻害する。
【０１１０】
これらの条件で細胞を約７２時間成長させ、培地を２４時間毎に交換した。上記のようにＱ−ＰＣＲのためにコラゲナーゼ／トリプシン法を使用して細胞を採取した。図９は未処理ｈＥＳ細胞に対する増加倍率としてＳｏｘ１７の発現を示す。
【０１１１】
Ｑ−ＰＣＲによって、約４０μＭのＡｋｔ阻害剤であるＡｋｔＩ−ＩＩの添加がＤＥ形成の促進に及ぼすＬＹ２９４００２の効果を再現することを確認した（図９）。
【０１１２】
（実施例６）
ＬＹ２９４００２が誘導する胚体内胚葉形成にはＧＳＫ３活性化が必要
ＡｋｔはＧＳＫ３をリン酸化し、ＧＳＫ３の活性化を阻害することから、またＡｋｔの遮断がＤＥ形成を促進することから、我々はＧＳＫ３活性化がＤＥ形成に必要かどうかを検討した。
【０１１３】
上記のようにコラゲナーゼ／トリプシン法を使用してマトリゲル上にＢＧ０１細胞を継代し、その細胞をＣＭ中でマトリゲル被覆チャンバースライド上で平板培養した。約２４時間後に、培地を交換し、細胞を６０μＭ  ＬＹ２９４００２、ＢＩＯ、ｍｅＢＩＯ、またはＤＭＳＯで約３〜４日間処理した。阻害剤ＢＩＯ（Ali Brivanlou博士）をＤＭＳＯに希釈し、約０．１〜５μＭの濃度で使用した。ＭｅＢＩＯ（Ali Brivanlou博士）もＤＭＳＯに希釈し、約１〜５μＭの濃度で使用した。３回の繰り返しでアッセイを行い、＋／−ＳＥＭとして示す。
【０１１４】
これらの条件で約３〜４日間細胞を成長させ、培地を２４時間毎に交換した。Ｑ−ＰＣＲのためにコラゲナーゼ／トリプシン法を使用して上記のように細胞を採取した。
【０１１５】
ｍｅＢｉｏではなくＧＳＫ３阻害剤であるＢＩＯの添加により、Ｓｏｘ１７発現によって決定されるように、ＬＹ２９４００２が誘導するＤＥ形成が遮断された（図１０）。
【０１１６】
さらに、変異ＲＮＡｉではなく２つの特異的ＲＮＡｉ分子を用いたＧＳＫ３発現のノックダウンは、ＬＹ２９４００２がＤＥ形成を促進する能力を遮断する。コラゲナーゼ／トリプシン法を使用してＢＧ０１細胞をフィーダーから継代し、...ＣＭ中のマトリゲル被覆チャンバースライド上で平板培養した。約２４時間後に、培地を交換し、細胞に様々なＲＮＡｉ配列をトランスフェクトした。リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を用いてこれらの細胞に１００ｎＭのＲＮＡｉ二本鎖をトランスフェクトした。対照変異ＲＮＡｉ（Invitrogen、＃４６−２００１）と同様にＧＳＫ３β野生型１および２（ＧＳＫ３β有効性確認ＲＮＡｉ  DuoPack；＃４５−１４８８）をInvitrogenから購入した。
【０１１７】
トランスフェクションの１２時間後に、ＬＹ２９４００２を全てのウェルに添加した。培地を毎日交換した。細胞をこれらの条件で約１〜４日間成長させ、続いて、図１１ＡおよびＢに示すように１、２、３、および４日目に細胞を固定して免疫染色した。
【０１１８】
免疫染色する細胞を１×ＰＢＳで１回すすぎ、室温でＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％ＰＦＡ／４％スクロースに入れて１０分間固定した。次に、それらの細胞を１×ＰＢＳ中で３回すすぎ、ＰＢＳ中の０．１％トリトン−Ｘ１００を有する３％ヤギ血清に入れて室温で１時間ブロッキングした。一次抗体をＰＢＳ中の３％ヤギ血清に希釈し、この溶液を４℃で一晩適用した。使用した一次抗体は、１：１０００希釈で使用した汎ＧＳＫ（BD Biosciences、カタログ番号＃６１０２０２）および１：１０００希釈で使用したラット抗ヒトＳＯＸ１７（Cythera,Inc.から入手）であった。１×ＰＢＳを３回交換して細胞を１時間洗浄した。二次抗体を室温で２時間適用した。使用した二次抗体は、共に１：１０００希釈で１×ＰＢＳ中の３％ヤギ血清に入れたヤギ抗ウサギAlexa Fluor488およびヤギ抗ラットAlexa Fluor594（Molecular Probes）であった。１×ＰＢＳを３回交換して細胞を１時間洗浄した。チャンバーを取り出し、スライドをＤＡＰＩを有するVectaShield封入剤（Vector）に封入した。一試料あたり２００細胞超を評点し、アッセイを２回の繰り返しで行った。
【０１１９】
図１１ＡおよびＢは、異なるＲＮＡｉ分子で処理したときのＧＳＫ３陽性細胞およびＳｏｘ１７陽性細胞の率をそれぞれ示す。ＧＳＫ３特異的ＲＮＡｉ配列を用いた処理によって、ＧＳＫ３およびＳｏｘ１７両方の発現が減少したが、対照ＲＮＡｉ配列を用いた処理によってＧＳＫの発現もＳｏｘ１７の発現も減少しなかった。したがって、ＧＳＫ３の活性化はＬＹ２９４００２によるＤＥ誘導に必要である。
【０１２０】
これらの結果は、ＰＩ３−キナーゼおよびＴＧＦ−βファミリーのメンバーの内因性活性がヒトＥＳ細胞の多能性に必要でありうること、ならびに自己再生集団におけるＰＩ３−キナーゼ活性の薬理学的阻害がｉｎ  ｖｉｔｒｏ多系列分化への生物学的方向付けを招くことを示している。これらのデータは、ヒトＥＳ細胞における胚体内胚葉への分化の方向付けを、内因性ＰＩ３−キナーゼレベルによって制御できること、および胚体内胚葉への分化の開始がｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こるためにこの中枢的なシグナル伝達軸をサイレンシングしなければならないことを示している。このキナーゼ活性の抑制は、高度に特異的、強力、かつ十分に証明された薬理学的阻害剤、すなわちＰＩ３−キナーゼの場合はＬＹ２９４００２（Pullen & Thomas、（１９９７年）FEBS Lett.、４１０：７８〜８２）、ｍＴＯＲの場合はラパマイシン（Hanら、（１９９５年）J.Biol.Chem.、２１３９６〜２１４０３）、およびＡｋｔＩの場合はＡｋｔＩ−ＩＩで実現された。これらの阻害剤のそれぞれによってヒトＥＳ細胞の分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで開始するための最適な有効濃度が立証された。進行中の研究は、ヒトＥＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏ多能性に関連してＰＩ３−キナーゼおよびｐ７０  Ｓ６キナーゼの両方の内因性活性化を維持するのに不可欠な、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー以外の血清因子のサブセットを規定することを目指している。
【０１２１】
（実施例７）
ＬＹ２９４００２の腎臓被膜アッセイは胚体内胚葉細胞を誘導した
未処理ｈＥＳＣまたは６０μＭ  ＬＹ２９４００２で４日間処理したｈＥＳＣをコラゲナーゼで処理して細胞凝集物（約５０細胞／凝集物）を発生させ、温かい培地で洗浄し、次にＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％ＦＣＳ）２ｍｌ中で静かに再懸濁して、３７℃、１０％ＣＯ２で一晩放置し、さらなる凝集を促進した。約２．５×１０６細胞を５週齢雄性ＳＣＩＤ−ベージュマウスの腎臓被膜に注射した。移植の６週間後にマウスを屠殺し、腎臓を取り出し、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。固定後に、腎臓をパラフィンろうに包埋し、切片にして、Ｈ＆Ｅ染色および免疫染色用のプレパラートにしてスライドガラスに封入した。封入後にスライドからパラフィンを取り除き、スライドを再水和し、Trilogy（Cell Marque、ＣＭＸ−８３３）を用いた熱誘導性エピトープ回復に供した。アルカリホスファターゼVectastain ABCシステム（Vector Labs、ＡＫ−５００２）およびVector Red基質（Vector Labs、ＳＫ−５１００）を用いてスライドを染色した。以下の抗体を免疫細胞化学分析に使用した：アルブミン（Sigma、Ａ０４３３）、ＡＦＰ（Cell Marque、ＣＭＣ７００）、ガストリン（ＣＭＣ１０６）、ＨＳＦ（Cell Marque、ＣＭＣ７７３）、ＬＦＡＢＰ（Fitzgerald Industries International、ＲＤＩ−ＦＡＢＰ−Ｌ２Ｅ３）、ＴＴＦ−１（Cell Marque、ＣＭＣ５７２）、ビリン（Cell Marque、ＣＭＣ８３３）。蛍光免疫細胞化学分析のために、以下の二次抗体を使用した：Alexa Fluor488ヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular Probes、Ａ１１００１）、Alexa Fluor594ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Molecular Probes、Ａ１１０１２）。
【０１２２】
図１２Ａは、ＬＹ２９４００２で処理したＨＥＳＣが腎臓上で大きな塊を形成したことを示す（右欄）。その塊は移植片を含まなかった腎臓（左欄）と比較して顕著であった。
【０１２３】
図１２Ｂ〜Ｇは、約６週間腎臓被膜下で培養後のＬＹ２９４００２で処理した凝集物の免疫染色顕微鏡写真を示す。この凝集物は、ＴＴＦ−１（Ｂ）、ＡＦＰ（Ｃ）、ビリン（Ｄ）、ガストリン（Ｅ）、ＨＳＡ（Ｆ）、およびＬＦＡＢＰ（Ｇ）を発現し、これはＬＹ２９４００２で処理した細胞が内胚葉誘導体に分化することを示している。ＬＦＡＢＰおよびアルブミンの発現は、大きく共局在した（データは示さず）。追加的に、図１２Ｈおよび１２Ｉは、埋め込まれなかったＬＹ２９４００２処理ＨＥＳＣと比較してＬＹ２９４００２処理ＨＥＳＣにおいてＦＡＢＰ１  ｍＲＮＡの１０００倍の増加およびアルブミンｍＲＮＡの４５００倍の増加を示しているＱ−ＰＣＲの結果を示す。アッセイを３回の繰り返しで行い、＋／−ＳＥＭとして示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】ヒトＢＧ０１細胞系の形態を示す×１０倍率の顕微鏡写真である。（Ａ）に未処理ＢＧ−１細胞を示し、（Ｂ）に８０μＭ  ＬＹ２９４００２で処理したＢＧ０１細胞を示し、（Ｃ）に３０ｎＭラパマイシンで処理したＢＧ０１細胞を示し、（Ｄ）にＢＧ０１細胞の自然分化を示す。
【図２】ヒトＢＧ０１細胞系の形態を示す×２０倍率の顕微鏡写真である。（Ａ）に未処置ＢＧ０１細胞を示し、（Ｂ）に８０μＭ  ＬＹ２９４００２で処理したＢＧ０１細胞を示し、（Ｃ）に３０ｎＭラパマイシンで処理したＢＧ０１細胞を示し、（Ｄ）にＢＧ０１細胞の自然分化を示す。
【図３】図３Ａ〜Ｅ：ヒトＢＧ０１細胞におけるＣＤ９発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。（Ａ）に二次抗体単独を示し、（Ｂ）に未処理細胞を示し、（Ｃ）に８０μＭ  ＬＹ２９４００２で処理した細胞を示し、（Ｄ）に３０ｎＭラパマイシンで処理した細胞を示し、（Ｅ）に自然に分化した細胞を示す。図３Ｆ〜Ｉ：胚様体分化時のＣＤ９発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。（Ｆ）に二次抗体単独を示し、（Ｇ）に未分化ＢＧ０１細胞を示し、（Ｈ）に３日目の胚様体を示し、（Ｉ）に５日目の胚様体を示す。
【図４】図４Ａ：ＬＹ２９４００２（８０μＭ）処理および細胞の自然分化の間の発現差を比較する、ＢＧ０１細胞における系列マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。図４Ｂ：ＬＹ２９４００２（８０μＭ）処理およびラパマイシン（３０ｎＭ）処理の間の発現差を比較する、ＢＧ０１細胞における系列マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
【図５】ＬＹ２９４００２またはラパマイシンのいずれかを用いたｈＥＳ細胞系ＢＧ０１の処理によって、中内胚葉に強く関連した遺伝子の発現が量的に誘導されるが、ＬＹ２９４００２処理もラパマイシン処理も汎神経外胚葉マーカーであるＳＯＸ１および汎胚体外マーカーであるＳＯＸ７の発現を誘導しないことを実証する図である。「ＮＴ」は未処理細胞を示し、「ＥＴＯＨ」はビヒクル対照を示し、「Ｌｙ」は８０μＭ  ＬＹ２９４００２を用いた処理を示し、「ラパ」は３０ｎＭラパマイシンを用いた処理を示し、「自然分化」はｈＥＳ細胞の自然分化を示す。本図は、処理および時間（Ｘ軸）の関数として相対遺伝子発現（Ｙ軸）を示す。図５Ａは相対ＳＯＸ１７遺伝子発現を示し、図５Ｂは相対Ｍｉｘ１遺伝子発現を示し、図５Ｃは相対グースコイド（ＧＳＣ）遺伝子発現を示し、図５Ｄは相対ＧＡＴＡ４発現を示し、図５Ｅは相対Cerebrus発現を示し、図５Ｆは相対ｎｏｄａｌ遺伝子発現を示し、図５Ａは相対ブラキュリー遺伝子発現を示し、図５Ｈは相対ＳＯＸ７遺伝子発現を示し、図５Ｉは相対ＳＯＸ１遺伝子発現を示す。
【図６】ヒトＢＧ０１細胞におけるトロンボモジュリン発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。灰色ヒストグラムは未処理細胞を示し、一方で黒色ヒストグラムは８０μＭ  ＬＹ２９４００２で処理された細胞を示す。
【図７】ＬＹ２９４００２を用いたｈＥＳ細胞系ＢＧ０２およびＨ１の処理により、中内胚葉に強く関連した遺伝子の発現が誘導されることを実証する図である。「ＮＴ」は未処理細胞を示し、「ＬＹ」は８０μＭ  ＬＹ２９４００２を用いた処理を表す。ＬＹ２９４００２と共に約７２時間培養後に、Ｑ−ＰＣＲによって発現レベルを調べた。図７ＡおよびＫにＡＦＰの相対発現を示し、図７ＢおよびＬにＢｒｙの相対発現を示し、図７ＣおよびＭにＦｏｘＡ２の相対発現を示し、図７ＤおよびＮにＧＳＣの相対発現を示し、図７ＥおよびＯにＭｏｘ１の相対発現を示し、図７ＦおよびＰにＭｉｘＬ１の相対発現を示し、図７ＧおよびＱにＳｏｘ１の相対発現を示し、図７ＨおよびＲにＳｏｘ１７の相対発現を示し、図７ＩおよびＳにＴＨＢＤの相対発現を示し、図７ＪおよびＴにＺＩＣ１の相対発現を示す。アッセイを３回の繰り返しで行い、＋／−ＳＥＭとして示す。
【図８】図８Ａ：ＭＥＦ−ＣＭまたはアクチビン／ＮｏｄａｌがＬＹ２９４００２に依存するｈＥＳＣ−ＤＥ形成に必要であることを示す図である。（Ａ）に４日間様々な条件（ＬＹ２９４００２（６０μＭ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｎｏｄａｌ（１μｇ／ｍｌ））での、Ｑ−ＰＣＲにより評価されたＳｏｘ１７ｍＲＮＡレベル（未処理に対する増加倍率）を示す。ＵＣＭは未馴化培地を示す。図８Ｂ：ＬＹ２９４００２、ＭＥＦ−ＣＭに依存するＳｏｘ１７発現がアクチビンシグナル伝達の阻害剤によって抑制されるが、ＢＭＰシグナル伝達またはＦＧＦシグナル伝達の阻害剤によって抑制されないことを示す図である。コーディン（５００ｎｇ／ｍｌ）、フォリスタチン（５００ｎｇ／ｍｌ）、Ｌｅｆｔｙ−Ａ（５００ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（５００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＢ−４３１５２（１０μＭ）、またはＳＵ−５４０２（５μＭ）の存在下または不在下でｈＥＳＣ−ＤＥ形成を支持するのに適格の培養条件で、Ｑ−ＰＣＲによってＳｏｘ１７発現を評価した。図８Ｂの第１カラムは未処理細胞を示す。アッセイを３回の繰り返しで行い、＋／−ＳＥＭとして示す。
【図９】Ｑ−ＰＣＲの結果を示す図であり、その図は約４０μＭのＡＫＴ阻害剤ＡｋｔＩ−ＩＩの添加がＤＥ形成の促進に果たすＬＹ２９４００２の効果を再現できることを示す。
【図１０】ＧＳＫ３の活性化がＬＹ２９４００２がＤＥを促進するのに必要であることを示す図である。ＭｅＢｉｏではなくＧＳＫ３阻害剤であるＢＩＯの添加は、ＬＹ２９４００２によって誘導されるＤＥ形成を遮断する。ＤＥ形成は細胞のＱ−ＰＣＲ分析によって示され、それは未処理細胞に対する増加倍率としてＳｏｘ１７ｍＲＮＡレベルを示している。アッセイを３回の繰り返しで行い、＋／−ＳＥＭとして示す。
【図１１】変異ＲＮＡｉではなく２つの特異的ＲＮＡｉ分子を用いたＧＳＫ３発現のノックダウンがＬＹ２９４００２がＤＥ形成を促進する能力を遮断することを示す図である。表示した時間にＧＳＫ３およびＳｏｘ１７の免疫細胞化学分析により細胞をアッセイした。
【図１２】図１２Ａ：移植片を含有しない対照腎臓（左）および６０μＭ  ＬＹ２９４００２で４日間処理されたｈＥＳＣの移植片を含有する腎臓（右）を示す図である。５週齢雄性ＳＣＩＤ−ベージュマウスの腎臓被膜下で６週間この移植片を成長させた。ＬＹ２９４００２で処理されたＨＥＳＣは腎臓上に大きな塊を形成した。図１２Ｂ〜Ｇ：腎臓被膜下で約６週間培養後の、ＬＹ２９４００２で処理した凝集物の免疫染色顕微鏡写真を示す図である。この凝集物はＴＴＦ−１（Ｂ）、ＡＦＰ（Ｃ）、ビリン（Ｄ）、ガストリン（Ｅ）、ＨＳＡ（Ｆ）、およびＬＦＡＢＰ（Ｇ）を発現し、これは、ＬＹ２９４００２で処理した細胞が内胚葉誘導体に分化することを示している。図１２ＨおよびＩ：埋込みを行われていないＬＹ２９４００２処理細胞と比較してＬＹ２９４００２で処理したＨＥＳＣにおけるＦＡＢＰ１  ｍＲＮＡにおける１０００倍の増加およびアルブミンｍＲＮＡにおける４５００倍の増加を示すＱ−ＰＣＲデータを実証する図である。アッセイを３回の繰り返しで行い、＋／−ＳＥＭとして示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月8日(2007.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性哺乳動物細胞を分化させる方法であって、
（ａ）前記多能性哺乳動物細胞を用意すること、ならびに
（ｂ）前記多能性哺乳動物細胞を有効量のＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の阻害剤およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーと接触させて前記多能性細胞を内胚葉系列の細胞に少なくとも部分的に分化させること
を含む方法。
【請求項２】
前記哺乳動物細胞を、前記阻害剤および前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーと約２４時間よりも長い時間接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＳＫ３が活性化している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害剤が、ＬＹ２９４００２、ラパマイシン、ウォルトマンニン（wortmannin）、塩化リチウム、Ａｋｔ阻害剤Ｉ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩＩ、ＮＬ−７１−１０１、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害剤がＬＹ２９４００２である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＬＹ２９４００２が、当初約１μＭから約５００μＭの濃度で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＬＹ２９４００２が、当初約２０μＭから約１６３μＭの濃度で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記阻害剤がラパマイシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ラパマイシンが、当初約０．１ｎＭから約５００ｎＭの濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ラパマイシンが、当初約１．５ｎＭから約３０ｎＭの濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害剤がＡｋｔＩ−ＩＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＡｋｔＩ−ＩＩが、当初約１０μＭから約５０μＭの濃度で存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
段階（ｂ）がｂＦＧＦの存在下で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｂＦＧＦが、当初約１ｎｇ／ｍｌから約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーがアクチビンＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが馴化培地中に存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記馴化培地が胚性線維芽細胞のフィーダー層から得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物多能性細胞が、胚性幹細胞、ＩＣＭ／胚盤葉上層細胞、原始外胚葉細胞、始原生殖細胞、および奇形癌腫細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物多能性細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞を前記阻害剤と接触させる前に、前記細胞を本質的に単一な細胞培養物に解離させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
プロテアーゼを用いて前記細胞を解離させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＩ３−キナーゼ阻害剤および前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーとの接触前に前記多能性細胞を平板培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記分化した細胞が胚体内胚葉細胞である、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
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