(57)【要約】  ＦＺＤ１０遺伝子の発現を抑制又は低減する方法が提供される。また、被験体におけるＦＺＤ１０関連疾患の予防及び／又は治療方法が提供される。さらにＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子を発現可能な発現ベクターを含む医薬組成物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏにおいて細胞又は組織におけるＦＺＤ１０遺伝子の発現を抑制又は低減する方法であって、該細胞又は組織に、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子を発現可能な発現ベクターを導入することを含み、該ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子が配列番号１の少なくとも１０個の連続する塩基を標的とする塩基配列を含むものである、上記方法。
【請求項２】
ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子が短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
二本鎖ＲＮＡ分子が、配列番号１の１４８１〜１４９９番の塩基（配列番号５）又は１５９５〜１６１３番の塩基（配列番号６）を標的とする塩基配列を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子が、配列番号７、８、９又は１０の配列を有する発現ベクターにより発現される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
被験体においてＦｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を予防又は治療する方法であって、該被験体に、治療上有効な量の、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡを発現可能な発現ベクターを投与することを含む方法。
【請求項６】
ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子が短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
二本鎖ＲＮＡ分子が、配列番号１の１４８１〜１４９９番の塩基（配列番号５）又は１５９５〜１６１３番の塩基（配列番号６）を標的とする塩基配列を含む、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
発現ベクターが、配列番号７、８、９又は１０の配列を含む、請求項５又は６記載の方法。
【請求項９】
ＦＺＤ１０に関連する疾患が、滑膜肉腫、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病、及び急性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子を発現可能な発現ベクター、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
本出願は、２００４年８月５日出願の米国特許仮出願第６０／５９８，８３４号の優先権を主張する。上記出願の全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＦＺＤ１０遺伝子の発現を抑制又は低減する方法に関する。また本発明は、被験体におけるＦＺＤ１０関連疾患（特に滑膜肉腫、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病、及び急性骨髄性白血病）の治療及び／又は予防方法に関する。さらに本発明は、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子を発現可能な発現ベクターを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）は、Ｗｎｔシグナル伝達の受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのメンバーである。本発明者は以前にＦＺＤ１０が滑膜肉腫（ＳＳ）において有意に過剰発現されることを報告した（Nagayama S, et al. (2002). Cancer Res, 62:5859-5866；ＷＯ２００４／０２０６６８号）。
【０００４】
ＦＺＤ１０の発現は、原発性結腸直腸癌（Terasaki, H. et al., Int J Mol Med. 9: 107-12., 2002）及び原発性胃癌（Kirikoshi, H. et al., Int J Oncol. 19: 767-71., 2001）並びにＳＳにおいてアップレギュレートされることが示されているが、ＳＳの発癌におけるＦＺＤ１０の細胞機能及び役割はまだ不明である。
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０２０６６８号
【非特許文献１】Nagayama S, et al. (2002). Cancer Res, 62:5859-5866
【非特許文献２】Terasaki, H. et al., Int J Mol Med. 9: 107-12., 2002
【非特許文献３】Kirikoshi, H. et al., Int J Oncol. 19: 767-71., 2001
【発明の開示】
【０００６】
以下に記載するように、本発明者は、ＦＺＤ１０遺伝子の発現をＲＮＡインターフェアランスによりノックダウンすることによりＳＳ細胞の増殖抑制が生じることを証明したが、このことは、ＦＺＤ１０がＳＳの細胞増殖において重要な役割を果たしていることを示している。また本発明者は、ＦＺＤ１０結合タンパク質として核内移行タンパク質であるインポーチンβを同定した。
【０００７】
従って、一態様において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏにおいて細胞又は組織におけるＦＺＤ１０遺伝子の発現を抑制又は低減する方法であって、該細胞又は組織に、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子を発現可能な発現ベクターを導入することを含み、該ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子が、配列番号１の１０〜１００個の連続する塩基、好ましくは１０〜５０個の連続する塩基、より好ましくは１０〜３０個の連続する塩基を標的とする塩基配列を含むものである、上記方法を提供する。好ましくは、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として短い塩基配列を含むものである。例えば、二本鎖ＲＮＡ分子は、配列番号１の１４８１〜１４９９番の塩基（配列番号５）又は１５９５〜１６１３番の塩基（配列番号６）を標的とする塩基配列を含む。より具体的には、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子は、配列番号７、８、９又は１０の配列を有する発現ベクターにより発現されうる。
【０００８】
他の態様において、本発明は、被験体において滑膜肉腫を予防又は治療する方法であって、該被験体に、治療上有効な量の、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡを発現可能な発現ベクターを投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明者は、ＦＺＤ１０タンパク質がインポーチンβに結合可能であることを見出した。従って、ＦＺＤ１０タンパク質とインポーチンβとの相互作用又は結合を抑制する化合物は滑膜肉腫の発達に影響を及ぼす可能性がある。
【００１０】
一態様において、本発明は、ＦＺＤ１０タンパク質とインポーチンβタンパク質との相互作用及び／又は結合を抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドとインポーチンβタンパク質又はその部分ペプチドとを、被験サンプルの存在下で接触させるステップ、及び
（ｂ）ＦＺＤ１０タンパク質とインポーチンβタンパク質との相互作用又は結合形成を検出するステップを含む方法を提供する。
【００１１】
さらに一態様において、本発明は、滑膜肉腫の治療又は予防に用いることができる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドとインポーチンβタンパク質又はその部分ペプチドとを、被験サンプルの存在下で接触させるステップ、及び
（ｂ）ＦＺＤ１０タンパク質とインポーチンβタンパク質との相互作用又は結合形成を検出するステップを含む方法を提供する。
【００１２】
本明細書で用いる技術用語及び科学用語はすべて、他に定義しない限り、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及する刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献はすべてその全文を参照により本明細書に組み入れる。コンフリクトの場合には、定義を含む本明細書が統制する。さらに、材料、方法及び実施例は例示のみを目的とし、限定を意図するものではない。本発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）は、Ｗｎｔシグナル伝達の受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのメンバーである。本明細書で以下に記載するように、本発明者はＦＺＤ１０遺伝子の発現をＲＮＡインターフェアランスによりノックダウンすることによりＳＳ細胞の増殖抑制が生じることを証明したが、このことは、ＦＺＤ１０がＳＳの細胞増殖において重要な役割を果たしていることを示している。
【００１４】
ＲＮＡインターフェアランスは、内因性遺伝子からのｍＲＮＡが、該内因性遺伝子の配列に相補的な配列を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入によって分解されるという細胞事象として知られている。結果として、標的遺伝子の発現は抑制又は低減されうる。この事象は、例えば、Elbashir, SM. et al., Nature 411, 494-498, 2001；Hannon, GJ., Nature 418, 244-251, 2002 (review)；Shinagawa, T. et al., Genes Dev. 17: 1340-1345 2003；国際特許出願公開ＷＯ９９／３２６１９号及びＷＯ９９／６１６１３号に報告されている。
【００１５】
本発明者は、ＲＮＡインターフェアランスによってＦＺＤ１０遺伝子の発現を効率的に抑制又は低減するｄｓＲＮＡ分子の設計に成功した。従って、一実施形態において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏにおいて細胞又は組織におけるＦＺＤ１０遺伝子の発現を抑制又は低減する方法であって、該細胞又は組織に、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子を発現可能な発現ベクターを導入することを含み、該ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子が、配列番号１の１０〜１００個の連続する塩基、好ましくは１０〜５０個の連続する塩基、より好ましくは１０〜３０個の連続する塩基を標的とする塩基配列を含むものである、上記方法を提供する。好ましくは、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として短い塩基配列を含むものである。例えば、二本鎖ＲＮＡ分子は、配列番号１の１４８１〜１４９９番の塩基（配列番号５）又は１５９５〜１６１３番の塩基（配列番号６）を標的とする塩基配列を含む。より具体的には、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子は、以下に示す配列番号７、８、９又は１０の配列を有する発現ベクターにより発現されうる。また、配列番号７、８、９又は１０の配列を有する発現ベクターは本発明の方法において有用でありうる。
【００１６】
2008509076.tif 000002
【００１７】
さらに、上述したように、ＦＺＤ１０は滑膜肉腫（ＳＳ）において有意に過剰発現され、ＳＳ細胞の増殖はＦＺＤ１０の発現の抑制又は低減により抑制される。従って、別の実施形態において、本発明は、被験体において滑膜肉腫を予防又は治療する方法であって、該被験体に、治療上有効な量の、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡを発現可能な発現ベクターを投与することを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏ（例えば、被験体に由来する細胞をｄｓＲＮＡ又は発現ベクターと共に培養することにより行う）、あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、ｄｓＲＮＡ又は発現ベクターを被験体に投与することにより行う）で実施することができる。
【００１９】
ｄｓＲＮＡは、種々の公知の投与方法により標的部位（癌細胞など）に送達することができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを発現可能な発現ベクターを用いて送達しうる。本発明において用いることができる発現ベクターの例としては、限定されるものではないが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが挙げられる。
【００２０】
ｄｓＲＮＡを標的組織又は細胞に投与するために用いることができる遺伝子送達系の他の例としては、コロイド分散系、リポソーム誘導系、及び人工ウイルスエンベロープが挙げられる。具体的には、例えば高分子量複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを、送達系として用いることができる。
【００２１】
ｄｓＲＮＡ又は発現ベクターは、静脈内注射（持続注入を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、及び皮下注射により、又は他の投与経路により直接投与することができる。
【００２２】
あるいは、ｄｓＲＮＡ又は発現ベクターは、被験体から採取した細胞又は組織に導入することができ、次にその細胞を被験体に投与しうる（ｅｘ  ｖｉｖｏ法）。ｄｓＲＮＡ又は発現ベクターの細胞又は組織への導入は、慣用の遺伝子導入法、例えばリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション又はリポフェクションなどにより実施しうる。ｄｓＲＮＡを発現する細胞又は組織の投与もまた、ｄｓＲＮＡ又は発現ベクターの直接投与の場合と同様に行いうる。
【００２３】
ｄｓＲＮＡ又は発現ベクターの投与量は、年齢、性別、症候、投与経路、投与頻度、及び剤形に応じて異なりうる。しかしながら、関連分野における慣用の方法を適宜選択し用いることができる。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子を発現可能な発現ベクター、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００２５】
種々のタイプの組成物を、調製物の製剤化に典型的に用いられる薬学的に許容される担体を適当に選択することによって慣用的に製剤化することができる。かかる担体は、例えば賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、界面活性剤、分散剤、緩衝化剤、保存剤、可溶化剤、防腐剤、安定剤及び等張化剤である。
【００２６】
さらに、ＦＺＤ１０の過剰発現によりＳＳの発癌機構を理解するため、本発明者はＩＰ−ＭＳ法により新規なＦＺＤ１０結合タンパク質を同定することを試みた。驚くべきことに、核内移行タンパク質であるインポーチンβをＦＺＤ１０結合タンパク質として単離した。本発明者により、免疫組織化学を用いてＦＺＤ１０タンパク質が核及び細胞質に局在することが証明された（未公表データ）。従って、ＦＺＤ１０タンパク質は膜タンパク質としての機能以外に核内で機能する可能性がある。
【００２７】
従って、ＦＺＤ１０タンパク質とインポーチンβとの相互作用又は結合を抑制する化合物は滑膜肉腫の発達に影響を与える可能性がある。
【００２８】
一実施形態において、本発明は、ＦＺＤ１０タンパク質とインポーチンβタンパク質との相互作用及び／又は結合を抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドとインポーチンβタンパク質又はその部分ペプチドとを、被験サンプルの存在下で接触させるステップ、及び
（ｂ）ＦＺＤ１０タンパク質とインポーチンβタンパク質との相互作用又は結合形成を検出するステップを含む方法を提供する。
【００２９】
ＦＺＤ１０タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ８４０９３）。インポーチンβタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２２６５；ＰＤＢ  ＩＤ  Ｎｏ．１ＱＧＫ−Ａ）。
【００３０】
上記方法によりスクリーニングされた化合物は、滑膜肉腫の治療又は予防に用いることができる。
【００３１】
他の実施形態において、本発明は、滑膜肉腫の治療又は予防に用いることができる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドとインポーチンβタンパク質又はその部分ペプチドとを、被験サンプルの存在下で接触させるステップ、及び
（ｂ）ＦＺＤ１０タンパク質とインポーチンβタンパク質との相互作用又は結合形成を検出するステップを含む方法を提供する。
【００３２】
被験サンプルとしては、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成化合物、発酵産物、及び天然抽出物（例えば細胞抽出物）が挙げられる。また、被験サンプルは、化学ライブラリ又はペプチドライブラリであってもよい。
【００３３】
ＦＺＤ１０とインポーチンβとの相互作用又は結合形成の検出は、当技術分野で公知の慣用の方法に従って実施することができる。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明は、滑膜肉腫を治療又は予防するための組成物であって、有効成分として、薬学的に有効な量の、上記スクリーニング方法のいずれかにより得られる化合物、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の１以上の治療用化合物を含む医薬組成物又は治療用組成物を包含する。かかる治療用化合物としては、限定されるものではないが、本明細書に記載の二本鎖ＲＮＡが挙げられる。医薬製剤としては、経口投与、直腸投与、鼻内投与、局所投与（口腔内及び舌下など）、膣内投与又は非経口投与（筋肉内、皮下及び静脈内など）、あるいは吸入又は吹送による投与に適したものが挙げられる。製剤は、適当な場合には、別個の投与単位として提供することが簡便であり、薬学の分野で周知の任意の方法により調製することができる。そのような薬学方法はすべて、活性化合物を、液体担体若しくは微粉化固体担体又は必要に応じてその両方と会合させるステップ、続いて必要であれば生成物を所望の製剤に形成するステップを含む。
【００３６】
経口投与に適した医薬製剤は、所定量の有効成分を、粉末若しくは顆粒として、又は溶剤、懸濁剤若しくは乳剤として含む別個の単位、例えばカプセル剤、カシェ剤又は錠剤として都合よく提供しうる。有効成分はまた、ボーラス舐剤又はペーストとして、純粋な形態（すなわち担体を含まない）で提供してもよい。経口投与用の錠剤及びカプセル剤は、慣用の賦形剤、例えば結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤又は湿潤剤を含みうる。錠剤は、場合により１以上の製剤用成分と共に、圧縮又は成型により製造しうる。圧縮錠は、流動形態の有効成分を、例えば粉末又は顆粒として、そして場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性又は界面活性剤と混合して、好適な機械において圧縮することにより調製しうる。成型錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉状化合物の混合物を好適な機械において成型することにより製造しうる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によりコーティングしてもよい。経口用液体調製物は、例えば水性若しくは油性懸濁剤、溶剤、乳剤、シロップ剤又はエリキシル剤の形態であってもよいし、あるいは使用前に水又は他の好適なビヒクルと構成するための乾燥生成物として提供してもよい。そのような液体調製物は、慣用の添加剤、例えば懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含みうる）、又は保存剤などを含みうる。錠剤は、任意により、有効成分の遅延放出又は制御放出をもたらすように製剤化してもよい。
【００３７】
非経口投与用の製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を所定のレシピエントの血液と等張性にする溶質を含んでもよい、水性及び非水性滅菌注射溶液、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含んでもよい、水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量又は複数用量容器、例えば密封アンプル及びバイアルで提供し、使用直前に滅菌液体担体（例えば注射用生理食塩水）の添加のみが必要なフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管しうる。あるいは、製剤は、持続注入のために提供されうる。即時調製用の注射溶液及び懸濁液を、上述した種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。
【００３８】
直腸投与用の製剤は、通常の担体、例えばココアバター又はポリエチレングリコールと共に座剤として提供しうる。口腔（例えば口腔内又は舌下）への局所投与用の製剤としては、味付基剤（スクロース及びアカシア又はトラガカントなど）中に有効成分を含むロゼンジ剤、並びに基剤（ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアなど）中に有効成分を含むトローチ剤が挙げられる。鼻内投与のためには、本発明の化合物を、液体スプレー若しくは分散可能な粉末として、又は液滴の形態で用いうる。液滴は、１以上の分散剤、可溶化剤又は懸濁化剤をも含む水性又は非水性基剤と共に製剤化しうる。液体スプレーは、加圧パックから送達されるのが都合がよい。
【００３９】
吸入による投与の場合には、化合物は、吸入器、ネブライザー、加圧パック又はエアゾールスプレーを送達する他の好適な手段から送達するのが都合が良い。加圧パックは、好適な推進剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適な気体を含みうる。加圧エアゾールの場合には、投与単位は、所定量を送達するための弁を備えることによって決定しうる。
【００４０】
あるいは、吸入又は吹送による投与の場合、化合物は、乾燥粉末組成物、例えば化合物と好適な粉末基剤（ラクトース又はスターチなど）の粉末混合物の形態でありうる。粉末組成物は、投与単位剤形、例えばカプセル、カートリッジ、ゼラチン又はブリスターパックで提供することができ、そこから粉末が吸入器又は吹送器の補助で投与されうる。
【００４１】
所望であれば、上記の製剤は、有効成分の徐放が達成されるように適合させて用いてもよい。医薬組成物はまた、抗微生物薬、免疫抑制薬又は保存剤などの他の有効成分を含んでもよい。
【００４２】
具体的に上述した成分に加えて、本発明の製剤は、対象の製剤の種類に関する当技術分野で慣用の物質を含みうること、例えば経口投与に適したものは着香料を含みうることを理解されたい。
【００４３】
好ましい単位投与製剤は、以下に記載するように有効量の有効成分、又はその適当な画分を含むものである。
【００４４】
上述した各症状のため、組成物は、１日当たり約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与又は注射により投与しうる。成人のための用量範囲は、一般的に約５ｍｇ〜約１７．５ｇ／日、好ましくは約５ｍｇ〜約１０ｇ／日、最も好ましくは約１００ｍｇ〜約３ｇ／日である。個別の単位に提供される調製物の錠剤又は他の単位投与剤形は、そのような用量で有効である量、又は同じものの複数として含む、例えば約５ｍｇ〜約５００ｍｇ、通常は約１００ｍｇ〜約５００ｍｇを含む単位を含むことが簡便である。
【００４５】
医薬組成物は、好ましくは経口投与又は注射（静脈内若しくは皮下）により投与し、被験体に投与する正確な量は主治医の責任でありうる。しかしながら、使用する用量は、いくつかの要因、例えば被験体の年齢及び性別、治療対象の正確な疾患及びその重篤度などに応じて異なる。また、投与経路もまた症状及びその重篤度に応じて異なりうる。
【００４６】
実施例：
以下の非限定的な実施例より本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００４７】
ｓｉＲＮＡ発現ベクターの構築
ＦＺＤ１０の細胞機能を調べるため、Ｕ６プロモーターの制御下でＦＺＤ１０に特異的なｓｉＲＮＡを発現するプラスミドを構築した（ｐｓｉＵ６ＢＸ−ＦＺＤ１０）。ＦＺＤ１０のＯＲＦ配列に基づいて２つのｓｉＲＮＡ（ｐｓｉＵ６ＢＸ−ＦＺＤ１０Ｂ及びＣ）を構築した。
【００４８】
（１）ｓｉＲＮＡ発現ベクターｐｓｉＵ６Ｘ３．０の構築
ｓｎＲＮＡ  Ｕ６遺伝子は、３’末端にウリジンを有する短い転写産物を生成するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写されることが報告されているため、プロモーター領域を含むｓｎＲＮＡ  Ｕ６遺伝子のゲノム断片を、次のプライマーセット：5’-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3’（配列番号１１）及び5’-TAGGCCC CACCTCCTTCTAT-3’（配列番号１２）と、ヒト胎盤ＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲにより増幅した。その産物を精製し、ＴＡクローニングキットを供給元のプロトコール（Invitrogen）に従って用いてｐＣＲプラスミドベクターにクローニングした。ｓｎＲＮＡ  Ｕ６遺伝子を含むＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ消化断片を精製し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドの１２５７〜５６番の塩基の断片にクローニングした。なおこの断片は、プライマーセット：5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’（配列番号１３）及び5’- CTCTATCTC GAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’（配列番号１４）を用いたＰＣＲにより増幅した。ライゲートしたＤＮＡをプライマー：5’-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTT TTCT-3’（配列番号１５）及び5’-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’（配列番号１６）（下線はＨｉｎｄＩＩＩ部位を示す）を用いるＰＣＲのための鋳型として用いた。産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、これを続いてセルフライゲーションさせてｐｓｉＵ６ＢＸ３．０ベクタープラスミドを作製した。
【００４９】
（２）プラスミド構築
ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ付加全長ＦＺＤ１０発現ベクターを構築するため、最初に、鋳型としてヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリを用いて、以下のプライマーを用いてＦＺＤ１０の全長コード配列（配列番号１）をＰＣＲ増幅した：
5’-CCGGAATTCCAGACCGTGCATCATGCAGCGCCCGGGCCCCCGCCT-3’（配列番号１７）（下線はＥｃｏＲＩ部位を示す）及び
5’-AAAAAGCTTCACGCAGGTGGGCGACTG-3’（配列番号１８）（下線はＨｉｎｄＩＩＩ部位を示す）。
【００５０】
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化後、ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓベクター（Invitrogen）にクローニングし、続いてｍｙｃ／Ｈｉｓタグを有する挿入ＦＺＤ１０  ｃＤＮＡをさらにｐＣＡＧＧＳ／ｎｅｏ発現ベクターにサブクローニングした。次に、内部タグ付加ＨＡ−ＦＬＡＧ−ＦＺＤ１０ＦＬ（残基１〜５８１；配列番号２）、発現プラスミド構築物を、以下のプライマーの組み合わせを用いるＰＣＲ増幅によって、全長ＦＺＤ１０  ｃＤＮＡクローンから作製した：
ＦＺＤ１０のＮ末端部分（配列番号２の１〜２１７アミノ酸）については、
FZD10-ATG, 5’-AAGTCGACACCATGCAGCGCCCGGGCCCC-3’（配列番号１９）（下線はＳａｌＩ部位を示す）及び
FZD10-nt651, 5’-TCTCGAGGACATCCACGCCGGGCGTG-3’（配列番号２０）（下線はＸｈｏＩ部位を示す）；
ＦＺＤ１０のＣ末端部分（配列番号２の２１８〜５８１アミノ酸）については、
FZD10-nt652, 5’-AAGTCGACTACTGGAGCCGCGAGGACAAG-3’（配列番号２１）（下線はＳａｌＩ部位を示す）及び
FZD10-TGA, 5’-AACTCGAGTCACACGCAGGTGGGCGACT-3’（配列番号２２）（下線はＸｈｏＩ部位を示す）。
【００５１】
ＦＺＤ１０ΔＣ１（残基１〜５７８）及びＦＺＤ１０ΔＣ２（残基１〜５２５）発現プラスミド構築物のＮ末端部分（残基１〜２１７）を作製し、各構築物のＣ末端部分（残基２１８〜各末端）を、フォワードプライマー（ＦＺＤ１０−ｎｔ６５２）及びそれぞれ以下のリバースプライマーにより作製した：
FZD10ΔC1(1-578)：5’-AACTCGAGTCAGGGCGACTGGGCAGGGATCT-3’（配列番号２３）（下線はＸｈｏＩ部位を示す）及び
FZD10ΔC2(1-525)：5’-AACTCGAGTCAGGAGGTCCAAATCCACATCCC-3’（配列番号２４）（下線はＸｈｏＩ部位を示す）。
【００５２】
ＦＺＤ１０に特異的なｓｉＲＮＡを発現するプラスミドを、二本鎖オリゴヌクレオチドをｐｓｉＵ６ＢＸ３．０ベクターにクローニングすることにより調製した（表１）。各プラスミドにおけるｓｉＲＮＡの標的配列を表２に示す。相補的なオリゴヌクレオチドをそれぞれ３７℃で３０分間にわたりＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼと共にインキュベートすることによりリン酸化し、次に煮沸し、室温までゆっくりと冷却して、２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。各産物をｐｓｉＵ６ＢＸ３．０にライゲートしてＦＺＤ１０−ｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築した。
【００５３】
【表１】
2008509076.tif 000003
【００５４】
【表２】
2008509076.tif 000004
【実施例２】
【００５５】
滑膜肉腫細胞系の増殖に対するＦＺＤ１０−ｓｉＲＮＡの影響
実施例１で調製したプラスミドを滑膜肉腫細胞系であるＳＹＯ−１にトランスフェクトし、ＦＺＤ１０の発現レベルを半定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた。また、細胞増殖アッセイを実施して細胞増殖抑制を確認した。
【００５６】
（１）半定量ＲＴ−ＰＣＲ
ＳＹＯ−１細胞は、１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質を添加したダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。細胞系ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭキットＶ（Amaxa Biosystems, Cologne, Germany）をＳＹＯ−１細胞のトランスフェクションに用いた。トランスフェクト細胞をトランスフェクションの４８〜７２時間後にアッセイした。
【００５７】
ＴＲＩＺＯＬ試薬（Invitrogen）を製造業者のプロトコールに従って用いてトランスフェクト細胞から総ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)で処理し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）と共にオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーを用いて逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型として、以下に示すプライマーを用いてＰＣＲ増幅を実施した：
ＦＺＤ１０については、
5’-TATCGGGCTCTTCTCTGTGC-3’（配列番号３１）及び
5’-GACTGGGCAGGGATCTCATA-3’（配列番号３２）
ＦＺＤ９については、
5’-CTGCACGCTGGTCTTCCTCT-3’（配列番号３３）及び
5’-CCGATCTTGACCATGAGCTTC-3’（配列番号３４）
β２ＭＧについては、
5’-TTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3’（配列番号３５）及び
5’-TCACATGGTTCACACGGCAG-3’（配列番号３６）。
【００５８】
結果として、２つのｓｉＲＮＡ構築物、すなわちＦＺＤ１０（ｓｉ−Ｂ及び−Ｃ）特異的ｓｉＲＮＡが、コントロール（ｐｓｉＵ６ＢＸ−ＬＵＣ又は−ＥＧＦＰ）と比較して有意に発現を抑制したが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー遺伝子の中でＦＺＤ１０と最も類似性の高いＦＺＤ９の発現はこれらのｓｉＲＮＡにより影響を受けなかった（図１Ａ）。
【００５９】
（２）細胞増殖アッセイ
ＦＺＤ１０特異的ｓｉＲＮＡによる細胞増殖抑制を確認するために、それぞれコロニー形成アッセイ及びＭＴＴアッセイを実施した。ＳＹＯ−１細胞を上記（１）に記載のようにトランスフェクトした。肺癌細胞系であるＡ５４９細胞は、１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。ＦｕＧＥＮＥ６（Roche)をＡ５４９細胞のトランスフェクションに用いた。
【００６０】
ｐｓｉＵ６−ＦＺＤ１０、ｐｓｉＵ６−ｌｕｃ又はｐｓｉＵ６−ＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクトしたＳＹＯ−１細胞及びＡ５４９細胞は、適当な濃度のゲネチシンを含有する培地において１３日間維持した。この細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ギムザ溶液で染色した。さらに、記載されているようにＣｅｌｌ−ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ８（Dojindo）を用いてＭＴＴアッセイにより細胞生存度を測定した（Shimokawa T et al. (2003). Cancer Res, 63, 6116-20）。
【００６１】
その結果、ＦＺＤ１０  ｓｉＲＮＡ構築物の導入によりＳＹＯ−１の増殖が抑制され、これは上述のこの遺伝子の発現低減結果と一致した（図１Ｂ及び１Ｃ）。さらに、ＦＺＤ１０の発現が検出されなかったＡ５４９細胞の増殖は影響を受けず、このことはこれらのｓｉＲＮＡにより「オフターゲット（off-target）」効果が生じなかったことを示している。各結果は、３回の独立した実験により確認した。従って、上記知見は、ＦＺＤ１０が滑膜肉腫の細胞増殖において有意な作用を有することを示唆している。
【実施例３】
【００６２】
ＦＺＤ１０ホモダイマーの形成
ＦＺＤ１は、ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリーのメンバーであり、オリゴマーを形成することが報告されている（Kaykas A, et al. (2004). Nat. Cell Biol. 6:52-8）ため、ＦＺＤ１０が免疫沈降によりオリゴマー化することができるか否か調べた。２つのＦＺＤ１０構築物、すなわちＨＡ−ＦＬＡＧ−ＦＺＤ１０（以下に記載）及びＦＺＤ１０−ｍｙｃ−Ｈｉｓ（実施例１にて調製、図２Ａ）をＣＯＳ−７細胞に共トランスフェクトし、α−ＨＡ抗体を用いて共免疫沈降を実施した。
【００６３】
ＨＡ−ＦＬＡＧ−ＦＺＤ１０の構築のため、以下のオリゴヌクレオチドセット：5’-ACGTGTCGACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCTCGAGATGC-3’（配列番号３７）（下線はＳａｌＩ部位を示す）及び5’-GCATCTCGAGCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTCGACACGT-3’（配列番号３８）（下線はＸｈｏＩ部位を示す）をアニーリングし、ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化して、ＨＡ−ＦＬＡＧタグを作製した。最初に、残基１〜２１７の断片及び残基２１８〜停止コドン（又はＣ末端欠失）の断片を個々にＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物をＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化し、順次ｐＣＡＧＧＳ／ｎｅｏ発現ベクターにライゲートした。ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化したＨＡ−ＦＬＡＧタグ断片をフレーム内の６５１番塩基と６５２番塩基の間にライゲートした。
【００６４】
ＣＯＳ−７細胞は１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質を添加したダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。ＦｕＧＥＮＥ６（Roche）をＣＯＳ−７細胞のトランスフェクションに用いた。トランスフェクト細胞をトランスフェクションの４８〜７２時間後に使用した。
【００６５】
トランスフェクトＣＯＳ−７細胞を冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＩＰＰバッファー中で溶解した。細胞溶解物を抗ＨＡ  Ｆ７抗体（Santa Cruz）及びプロテインＧ−セファロース（Sigma）と共にインキュベートした。結合したタンパク質をＩＰバッファーで５回洗浄し、ＳＤＳ−サンプルバッファーで溶出した。溶出したタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質を電気泳動によりニトロセルロース膜（Amersham Biosciences）に移した。膜を、抗ｍｙｃ  ９Ｅ１０モノクローナル抗体、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体又は抗ＨＡ  Ｆ７抗体と共に、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Amersham Biosciences）と共にインキュベートした。結合した二次抗体をＥＣＬＴＭウエスタンブロッティング検出試薬（Amersham Biosciences）により可視化した。
【００６６】
図２Ｂの上部パネルに示すように、免疫沈降したＨＡ−ＦＬＡＧ−ＦＺＤ１０は、１〜２の予想分子量である複数のバンドと、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動ゲルの上部に積層した最大のバンドとして現れたようであった。このことは、ＦＺＤ１０がオリゴマーを形成可能であることを示唆している。さらに、ＨＡ−ＦＬＡＧ−ＦＺＤ１０を沈降（pull down）させるためにα−ＨＡ抗体を用いることにより、ＦＺＤ１０−ｍｙｃ−Ｈｉｓが共免疫沈降し（図２Ｂ、下部パネル）、このことは、ＦＺＤ１０がホモオリゴマーを形成可能であることを示している。ＨＡ−ＦＬＡＧ−ＦＺＤ１０又はＦＺＤ１０−ｍｙｃをトランスフェクトした細胞からの溶解物を免疫沈降の前に混合した場合には共免疫沈降せず、このことは、オリゴマー化が生存細胞において生じることを示している（データは示さない）。ＦＺＤ１０は２つのモチーフを含む。すなわち、７回膜貫通ドメインの後の２つのアミノ酸に位置するＫＴｘｘｘＷ（Umbhauer M, et al. (2000). EMBO J. 19:4944-4954）と、タンパク質間相互作用に重要と考えられる推定Ｃ末端におけるＴＣＶモチーフである。オリゴマー化におけるこれらのモチーフの関与を調べるために、オリゴマーを形成可能か否かの２つのＣ末端欠失構築物（図２Ａ）を設計した。図２Ｃに示すように、α−ＨＡ抗体による沈降によって、ＦＺＤ１０−ｍｙｃ−Ｈｉｓが共免疫沈降し、このことは、ＦＺＤ１０のＣ末端モチーフがオリゴマー化に関与していない可能性があることを示唆している。
【実施例４】
【００６７】
インポーチンβとの相互作用
相互作用タンパク質によるＦＺＤ１０タンパク質の機能をさらに調べるため、ＴＡＰシステム精製法を行った。
ＴＡＰ（タンデムアフィニティ精製）システム精製を既報に従って実施した（Rigaut G, et al. (1999). Nat Biotechnol, 17:1030-1032）。簡単に説明すると、ｐＣＡＧＧＳ／ｎｅｏ−ＦＺＤ１０−ＴＡＰ又はｐＣＡＧＧＳ／ｎｅｏ−ＴＡＰをコントロールとしてＳＮＵ−Ｃ５細胞にトランスフェクトした。
【００６８】
ＴＡＰ発現ベクターの構築のため、３’末端にＳａｌＩを有するタバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）の切断部位で分断された免疫グロブリンＧ結合ドメイン及びカルモジュリン結合ペプチドからなるＴＡＰタグ配列のｃＤＮＡを標準的なプロトコールに従ってＰＣＲ増幅した（図３Ａ）。最初に、上述のＴＡＰタグ配列をｐｃＤＮＡ−３．１（＋）−ｍｙｃ−Ｈｉｓ発現ベクターにクローニングした。次に、ｐｃＤＮＡ−３．１（＋）−ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＴＡＰをＸｈｏＩ及びＳａｌＩで消化し、得られたｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＴＡＰ断片をｐＣＡＧＧＳ／ｎｅｏベクターに挿入した。ＦＺＤ１０  ＯＲＦ  ｃＤＮＡをｐＣＡＧＧＳ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＴＡＰ／ｎｅｏ発現ベクターにサブクローニングした。
【００６９】
結腸癌細胞系であるＳＮＵ−Ｃ５は１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。ＦｕＧＥＮＥ６（Roche）をＳＮＵ−Ｃ５細胞のトランスフェクションに用いた。
【００７０】
トランスフェクションの７２時間後、細胞をＩＰＰバッファー（プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（Calbiochem）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、０．１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＮａＦ）で溶解した。不溶性画分を除去し、上清をＩｇＧ−セファロース（Amersham Biosciences）と共にインキュベートした。結合したタンパク質をＴＥＶプロテアーゼ（Invitrogen）と共に４℃で一晩インキュベートし、溶出したタンパク質をさらに１ｍＭ  ＣａＣｌ２を有するカルモジュリンアフィニティ樹脂（Stratagene）と共にインキュベートした。最後に、結合したタンパク質を１ｍＭ  ＥＧＴＡで溶出し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質を銀色素「Ｄａｉｉｃｈｉ」（Daiichi Pure Chemicals）を用いて銀染色により可視化した。コントロールＴＡＰと区別されるタンパク質バンドをゲルから切り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析をAproscience Co.（Tokushima, Japan）により特別実施した。
【００７１】
ＦＺＤ１０−ＴＡＰをトランスフェクトした場合、コントロールとしてＴＡＰベクターがＳＮＵ−Ｃ５細胞において過剰発現された（図３Ｂ）ため、インポーチンβをＦＺＤ１０に対する候補相互作用タンパク質として同定した。さらに、ＣＯＳ−７細胞においてＦＺＤ１０がインポーチンβと共免疫沈降したことを確認した（図３Ｃ）。
【００７２】
特定の好ましい実施形態を参照して本発明を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の精神及び範囲内で、当業者によって多数の変形及び改変をなしうることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｃは、ＳＳ細胞系であるＳＹＯ−１におけるＦＺＤ１０の発現を低減させるように設計した短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の増殖抑制効果を示す。（Ａ）ＳＹＯ−１細胞における内因性ＦＺＤ１０発現の抑制を示す半定量ＲＴ−ＰＣＲである。β２ＭＧを内部コントロールとして用いた。ＦＺＤ９の発現はこれらのｓｉＲＮＡにより影響を受けなかった。
【図１Ｂ】（Ｂ）ｐｓｉＵ６ＢＸ３．０ベクターをトランスフェクトしたＳＹＯ−１細胞のＭＴＴアッセイである。検出可能なＦＺＤ１０発現が観察されないＡ５４９細胞は、これらのｓｉＲＮＡによる増殖に対する影響を全く示さない「オフターゲット」コントロールである。
【図１Ｃ】（Ｃ）ＳＹＯ−１細胞におけるＦＺＤ１０発現のノックダウンによるコロニー数の低下を示すコロニー形成アッセイである。Ａ５４９細胞系は「オフターゲット」コントロールである。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｃは、ＦＺＤ１０がホモオリゴマーを形成可能であることを示す。（Ａ）ＦＺＤ１０構築物の概略図である。７ＴＭ；７回膜貫通ドメイン。
【図２Ｂ】（Ｂ）ＦＺＤ１０自体の共免疫沈降である。非トランスフェクトＣＯＳ−７細胞又はＨＡ−ＦＬＡＧ−ＦＺＤ１０及びＦＺＤ１０−ｍｙｃ／Ｈｉｓを発現する細胞からの溶解物をα−ＨＡ抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降物をα−ＨＡ抗体及びα−ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。
【図２Ｃ】（Ｃ）ＦＺＤ１０の細胞質領域はオリゴマー化に関与しない。非トランスフェクトＣＯＳ−７細胞又はＨＡ−ＦＬＡＧ−ＦＺＤ１０、ＨＡ−ＦＬＡＧ−ＦＺＤ１０ΔＣ（１−５７８）、ＨＡ−ＦＬＡＧ−ＦＺＤ１０ΔＣ（１−５２５）及びＦＺＤ１０−ｍｙｃ／Ｈｉｓを発現する細胞からの溶解物をα−ＨＡ  Ｆ−７抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降物をα−ＨＡ  Ｆ−７抗体及びα−ｍｙｃ  ９Ｅ１０抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、ＦＺＤ１０及びＦＺＤ１０結合タンパク質のＴＡＰシステム精製を示す。（Ａ）ＦＺＤ１０−ＴＡＰ及びコントロールＴＡＰの概略図である。
【図３Ｂ】（Ｂ）ＦＺＤ１０のＴＡＰ精製により新規な複合体を同定する。コントロールＴＡＰ又はＦＺＤ１０−ＴＡＰを発現するＳＮＵ−Ｃ５細胞からの溶解物をＴＡＰシステム精製に供した。銀染色ゲルは同定されたタンパク質を示す。
【図３Ｃ】（Ｃ）ＦＺＤ１０とインポーチンβとの相互作用が、共免疫沈降によっても示される。非トランスフェクトＣＯＳ−７細胞、あるいはｉｍｐｏｒｔｉｎβ−３ＸＦＬＡＧ若しくはＦＺＤ１０−ｍｙｃ／Ｈｉｓのいずれか又はその両方を発現する細胞からの溶解物をα−ｍｙｃ  ９Ｅ１０抗体で免疫沈降した。免疫沈降物をα−ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体及びα−ｍｙｃ  ９Ｅ１０抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。
【図１Ａ】
2008509076.tif 000005
【図１Ｂ】
2008509076.tif 000006
【図１Ｃ】
2008509076.tif 000007
【図２Ａ】
2008509076.tif 000008
【図２Ｂ】
2008509076.tif 000009
【図２Ｃ】
2008509076.tif 000010
【図３Ａ】
2008509076.tif 000011
【図３Ｂ】
2008509076.tif 000012
【図３Ｃ】
2008509076.tif 000013
【配列表】
2008509076000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月6日(2007.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏにおいて細胞又は組織におけるＦＺＤ１０遺伝子の発現を抑制又は低減する方法であって、該細胞又は組織に、ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子を発現可能な発現ベクターを導入することを含み、該ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子が配列番号１の少なくとも１０個の連続する塩基を標的とする塩基配列を含むものである、上記方法。
【請求項２】
ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子が短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
二本鎖ＲＮＡ分子が、配列番号１の１４８１〜１４９９番の塩基（配列番号５）又は１５９５〜１６１３番の塩基（配列番号６）を標的とする塩基配列を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子が、配列番号７、８、９又は１０の配列を有する発現ベクターにより発現される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子を発現可能な発現ベクター、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項６】
治療上有効な量の、Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に対する二本鎖ＲＮＡ分子又はＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子を発現可能な発現ベクターを含む、ＦＺＤ１０に関連する疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項７】
ＦＺＤ１０に対する二本鎖ＲＮＡ分子が短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
二本鎖ＲＮＡ分子が、配列番号１の１４８１〜１４９９番の塩基（配列番号５）又は１５９５〜１６１３番の塩基（配列番号６）を標的とする塩基配列を含む、請求項６又は７記載の医薬組成物。
【請求項９】
発現ベクターが、配列番号７、８、９又は１０の配列を含む、請求項６又は７記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＦＺＤ１０に関連する疾患が、滑膜肉腫、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病、及び急性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項６〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2008509076.tif 000014
2008509076.tif 000015
2008509076.tif 000016
2008509076.tif 000017