【事件の表示】
　特許第２８４８９５２号「２光子レーザ走査顕微鏡」の請求項１ないし２６に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２８４８９５２号の請求項１ないし２６に係る特許を維持する。
【理　由】
１　手続の経緯
　特許第２８４８９５２号の請求項１〜２６に係る発明についての出願は、平成２（１９９０）年１１月１３日（優先権主張１９８９年１１月１４日、米国）を国際出願日とする出願であって、平成１０年１１月６日にその発明について特許の設定登録がなされ、その後申立人カール　ツアイス　イエナ　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツングにより特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内の平成１２年６月１９日に訂正請求がなされたものである。
２　訂正の適否についての判断
　特許権者が求めている訂正の内容は以下の訂正事項１〜４のとおりである。
［訂正事項１］講求項１の訂正
　訂正前の「【請求項１】　目的物（２０）のレーザ走査蛍光顕微鏡装置（１０）は以下のものを含む：特性エネルギの単一光子により励起されて蛍光光子を発生する蛍光成分を含む目的物（２０）を支持するステージ手段（２２）；
　光を上記ステージ手段に指向させるように配置されるとともに上記ステージ手段（２２）における上記目的物（２０）内に目標面を有する結像手段（４０，１２）；
　上記特性エネルギより低いエネルギの光子からなるサブピコ秒の単色コヒーレント光パルスの反復発生源（１６）；および上記コヒーレント光パルスを上記結像手段を含む光路に沿って指向させる手段；
　上記結像手段（４０，１２）は上記目標上の結像体積（２６）に上記光パルスを結像させて、上記ステージ手段（２２）における目的物（２０）に入射させ、複数の光子が組合さって上記蛍光成分内に蛍光を誘起する。」を次のように訂正する。
　「【請求項１】　目的物（２０）の２光子レーザ走査蛍光頭微鏡装置（１０）は、
　特性エネルギの単一光子により励起されて蛍光光子を発生する蛍光成分を含む目的物（２０）を支持するステージ手段（２２）と、
　光を上記ステージ手段に指向させるように配置されるとともに上記ステージ手段（２２）における上記目的物（２０）内に目標面を有する結像手段（４０，１２）と、
　上記特性エネルギより低いエネルギの光子からなるサブピコ秒の単色コヒーレント光パルスの反復発生源（１６）と、
　上記コヒーレント光パルスを上記結像手段を含む光路に沿って指向させる手段
とからなり、
　上記結像手段（４０，１２）は上記目標面上の結像体積（２６）に上記光パルスを結像させて、上記ステージ手段（２２）における目的物（２０）に入射させ、複数の光子が組合さって上記蛍光成分内に２光子蛍光を誘起する
２光子レーザ走査蛍光顕微鏡装置（１０）。」
［訂正事項２］請求頃９の訂正
　訂正前の「【請求項９】　既知の特性エネルギの光による単一光子励起に対応する分子励起を目的物（２０）内に誘起するための装置（１）は以下のものを備える：
　目標面（１８）；
　上記目標面に生物学的目的物を支持する手段（２２）；
　サブピコ秒の光パルスを供給する手段（１６）、上記光パルスは上記特性エネルギより低いエネルギを有する光子からなる；
　上記目標面に隣接して位置決めされた結像手段（４０，１２）；
　上記光子の光パルスを上記結像手段（４０，１２）を含む光路に沿って指向させて光子を上記目的物に入射させ、上記結像手段（４０，１２）は上記光子を上記目的物内の結像体積（２６）に結焦させ、上記特性エネルギより低い入射光子を上記結像体積（２６）内において上記目的物内に分子励起を誘起するに十分なエネルギを生成する。」を、次のように訂正する。
　「【請求項９】
　既知の特性エネルギの光による単一光子励起に対応する２光子分子励起を目的物（２０）内に誘起するための装置（１）は、
　目標面（１８）と、
　上記目標面に生物学的目的物を支持する手段（２２）と、
　上記特性エネルギより低いエネルギを有する光子からなるサブピコ秒の光パルスの供給手段（１６）と、
　上記目標面に隣接して位置決めされた結像手段（４０，１２）とからなり、
　上記光子の光パルスを上記結像手段（４０，１２）を含む光路に沿って指向させて光子を上記目的物に入射させ、上記結像手段（４０，１２）は上記光子を上記目的物内の結像体積（２６）に結焦させ、上記特性エネルギより低い入射光子を上記結像体積（２６）内において上記目的物内に２光子分子励起を誘起するに十分なエネルギを生成することを特徴とする、２光子分子励起を目的物（２０）内に誘起するための装置（１）。」
［訂正事項３］請求項１２の訂正
　訂正前の「【請求項１２】　上記レ−ザ光源と光路は、生物学的に活性な化学物質の局所的な放出を発生させるように上記結像点における励起に応答して目的物を走査するように適合されている、請求項１１の装置。」を、次のように訂正する。
　「【請求項１２】
　上記レ−ザ光源と光路は．生物学的に活性な化学物質の局所的な放出を発生させるように上記結像体積における励起に応答して目的物を走査するように適合されている、請求項１１の装置。」
［訂正事項４］請求項２２の訂正
　訂正前の「【請求項２２】　特性エネルギを有する光子によって励起可能な分子を含む生物学的な目的物（２０）の分子励起を発生させる方法は、以下のステップを備える；
　上記特性エネルギより低いエネルギを有する高強度のレーザ光のサブビコ秒のパルスビームで上記目的物を照射する；および上記照射を上記目的物（２０）内の小さい結像体積に結像させて、上記結像体積内においてのみ、少なくとも２個の上記入射照射光子の同時吸収によって分子励起を生成するのに十分高い照射強度を生成する。」を、次のように訂正する。
　「【請求項２２】　レーザ走査頭微鏡（１０）を用いて、特性エネルギを有する光子によって励起可能な分子を含む生物学的な目的物（２０）の２光子分子励起を発生させる方法であって、
　上記特性エネルギより低いエネルギを有する高強度のレーザ光のサブビコ秒のパルスビームで上記目的物を照射するステップと、
　上記照射を上記目的物（２０）内の小さい結像体積に結像させて、上記結像体積内においてのみ、少なくとも２個の上記入射照射光子の同時吸収によって２光子分子励起を生成するのに十分高い照射強度を生成するステップとからなる生物学的な目的物（２０）の２光子分子励起を発生させる方法。」
（訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否）
　訂正事項１において、「２光子レーザ走査蛍光顕微鏡装置」との限定は、訂正前の「レーザ走査蛍光顕微鏡装置」を限定するものであり、また、「蛍光」を「２光子蛍光」と限定して「上記蛍光成分内に２光子蛍光を誘起する」とするものも、いずれも特許請求の範囲の減縮を目的とする。
　さらに、請求頃１の記載形式の訂正は，訂正前に文頭の文章の次に各構成要件を箇条書きしていた記載形式を、各構成要件を列挙する形式としたものであって、明りようでない記載の釈明を目的とする。
　訂正事項２において、「分子励起」を「２光子分子励起」とする限定は、特許請求の範囲の滅縮を目的とする。また、請求項９の記載形式の訂正は、訂正前に文頭の文章の次に各構成要件を箇条書きしていた記載形式を、各構成要件を列挙する形式としたものであって、明りようでない記載の釈明を目的とする。
　訂正事項３において、「上記結像点」を「上記結像体積」とする訂正は、請求項１２の引用元の請求項１１において、さらに引用している請求頃１、９又は１０に記載されている「結像体積」を引用すべきところ、「結像点」と誤って引用したものを訂正するもので、誤記の訂正を目的とする。
　訂正事項４において、「生物学的な目的物（２０）の分子励起を発生させる方法」を「生物学的な目的物（２０）の２光子分子励起を発生させる方法」と限定する訂正は、特許請求の範囲の滅縮を目的とし、また「レーザ走査顕微鏡（１０２）を用いて、」を付加する訂正は、「生物学的な目的物（２０）の２光子分子励起を発生させる方法」において用いる機器を限定するもので、同様に特許請求の範囲の滅縮を目的とする。
　請求項２２の記載形式の訂正は、訂正前に文頭の文章の次に各構成要件を箇条書きしていた記載形式を、各構成要件を列挙する形式としたものであって、明りようでない記載の釈明を目的とする。
　そして、訂正事項１〜４のいずれの訂正も、願書に添付した明細書又は図面の記載の範囲内でされ、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
（独立特許要件）
　請求項１、９、２２の訂正は、特許請求の範囲の減縮を目的とするから、訂正後の請求項１、９、２２及び該請求項を引用する請求項を含む、訂正後の１〜５、８〜２６に係る発明が、特許出願の際独立して特許を受けることができるものかどうか審理する。
　訂正後の請求項１〜２６に係る発明は、訂正明細書の特許請求の範囲に記載された次のとおりのものと認められる。
　「１．目的物（２０）の２光子レーザ走査蛍光顕微鏡装置（１０）は、
　特性エネルギの単一光子により励起されて蛍光光子を発生する蛍光成分を含む目的物（２０）を支持するステージ手段（２２）と、
　光を上記ステージ手段に指向させるように配置されるとともに上記ステージ手段（２２）における上記目的物（２０）内に目標面を有する結像手段（４０，１２）と、
　上記特性エネルギより低いエネルギの光子からなるサブピコ秒の単色コヒーレント光パルスの反復発生源（１６）と、
　上記コヒーレント光パルスを上記結像手段を含む光路に沿って指向させる手段とからなり、
　上記結像手段（４０，１２）は上記目標面上の結像体積（２６）に上記光パルスを結像させて、上記ステージ手段（２２）における目的物（２０）に入射させ、複数の光子が組合さって上記蛍光成分内に２光子蛍光を誘起する
２光子レーザ走査蛍光顕微鏡装置（１０）。
２．上記反復発生源（１６）からの上記光は上記結像手段（４０，１２）によってサブミクロンの直径の結像体積（２６）を形成するように結像される、請求項１の装置。
３．上記結像手段（４０，１２）は、上記目標面（１８）の相対向する側で収束し、発散する光を生成するため上記光を円錐形状に結像し、それによって上記光は上記目標面（１８）上の上記結像体積（２６）に集中される、請求項１又は２の装置。
４．上記結像体積（２６）とステージ手段（２２）との相対位置は可変である、請求項１から３のいずれか１に記載の装置。
５．上記結像手段（４０，１２）は上記目的物（２０）内の上記結像体積（２６）に上記光を結像させ、ある制限された楕円体積内において蛍光を励起する光強度を発生させる、請求項１から３のいずれか１に記載の装置。
６．特性エネルギの単一光子によって蛍光光子を発生するように励起される蛍光成分を含む目的物（２０）に対し２光子励起技術を用いたレーザ走査蛍光顕微鏡法は、以下のステップを有する：
　上記特性エネルギより低いエネルギの光子からなる単色コヒーレントレーザ光の強いサブピコ秒のパルスのビームで上記目的物（２０）を反復して照射する；および
　上記目的物（２０）内の小さな結像体積（２６）に上記照射光を結像して、上記結像体積においてのみ入射する２個の照射光子の同時吸収による分子励起を誘起するに十分な高い照射強度を生成し、上記蛍光成分内に蛍光を誘起するとともに誘起された蛍光を検出する。
７．入射光子のエネルギは特性エネルギの半分である、請求項６の方法。
８．上記結像手段（４０，１２）は上記目的物（２０）内において異なる深さの結像体積（２６）を選択しうるように調節可能である、請求項１の装置。
９．既知の特性エネルギの光による単一光子励起に対応する２光子分子励起を目的物（２０）内に誘起するための装置（１）は、
　　目標面（１８）と、
　　上記目標面に生物学的目的物を支持する手段（２２）と、
　　上記特性エネルギより低いエネルギを有する光子からなるサブピコ秒の光パルスの供給手段（１６）と、
　　上記目標面に隣接して位置決めされた結像手段（４０，１２）とからなり、
　上記光子の光パルスを上記結像手段（４０，１２）を含む光路に沿って指向させて光子を上記目的物に入射させ、上記結像手段（４０，１２）は上記光子を上記目的物内の結像体積（２６）に結焦させ、上記特性エネルギより低い入射光子を上記結像体積（２６）内において上記目的物内に２光子分子励起を誘起するに十分なエネルギを生成することを特徴とする、２光子分子励起を目的物（２０）内に誘起するための装置（１）。
１０．上記生物学的目的物（２０）に関して上記結像体積（２６）を移動させる走査手段（３２，３４）をさらに含む、請求項９の装置。
１１．上記目的物は、既知の特性エネルギを持つ単一光子によって通常は励起されるとともに、上記特性エネルギより低いエネルギを有する少なくとも２つの光子に対して上記励起を生ずる生物学的細胞を含む、請求項１，９又は１０に記載の装置。
１２．上記し一ザ光源と光路は、生物学的に活性な化学物質の局所的な放出を発生させるように上記結像体積における励起に応答して目的物を走査するように適合されている、請求項１１の装置。
１３．上記目的物は光子活性化試薬である、請求項９又は１０の装置。
１４．上記目的物は光学メモリを有する、請求項９又は１０の装置。
１５．上記目的物は、上記誘起された分子励起に応答して生物学的に活性な化学物質を放出する、請求項９の装置。
１６．上記誘起された分子励起は上記目的物内に対応する蛍光を発生し、上記装置は上記目的物内において結像体積を移動させる走査手段および
　上記蛍光に応答して上記目的物内の蛍光体を図解する検出手段とをさらに含む、請求項１５の装置。
１７．上記目的物は、紫外光によって単一光子励起を生じ、上記光パルスは可視光である、請求項９の装置。
１８．上記サブピコ秒の光パルスを供給する手段が、少なくとも１つのレーザ光源を備える、請求項１又は９の装置。
１９．上記サブピコ秒の光パルスを供給する手段が、少なくとも２つの波長のパルスを生成し、各波長は上記既知の特性エネルギより低いエネルギの光子を含む、請求項１又は９の装置。
２０．上記目的物は、生物学的に活性な物質である、請求項１又は９の装置。
２１．上記目的物内において、上記結像体積を移動させて上記目的物の空間的に分解された分子励起を発生させる手段をさらに含む、請求項９の装置。
２２．レーザ走査顕微鏡（１０）を用いて、特性エネルギを有する光子によって励起可能な分子を含む生物学的な目的物（２０）の２光子分子励起を発生させる方法であって、
　上記特性エネルギより低いエネルギを有する高強度のレーザ光のサプピコ秒のパルスビームで上記目的物を照射するステップと、
　上記照射を上記目的物（２０）内の小さい結像体積に結像させて、上記結像体積内においてのみ、少なくとも２個の上記入射照射光子の同時吸収によって２光子分子励起を生成するのに十分高い照射強度を生成するステップとからなる生物学的な目的物（２０）の２光子分子励起を発生させる方法。
２３．上記入射光子は上記特性エネルギの少なくとも半分である、請求項２２による方法。
２４．上記目的物は、生物学的に活性なケージド分子を含んでおり、上記結像体積内の照射強度は入射光子の同時吸収により生物学的に活性なケージド化合物を放出させるのに十分である、請求項２２又は２３の方法。
２５．上記目的物は、蛍光を発生する励起に応答する生物学的細胞を含み、さらに、上記蛍光を測定することを含む、請求項２２又は２３の方法。
２６．上記目的物は、光学メモリであり、さらに上記蛍光を測定することを含む、請求項２２又は２３の方法。」
　当審が通知した取消理由通知における特許の取消しの理由の概要は以下のとおりである。
（３６条違反）
　請求項１、９、２２に係る発明について記載不備があり、また「結像体積」の語は不明瞭である。
（２９条１項３号違反及び同条２項違反）
　本件請求項１〜２６項に係る発明は、下記の引用刊行物１に記載された発明であり、また下記の引用刊行物１〜１１に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　記
　　引用刊行物1（甲第1号証）:　Dimitri A.Parthenopoulos およびPeter M.Rentzepis 「三次元光学格納メモリ」科学245巻(1989年8月25日刊)843-845頁
　　引用刊行物４（甲第4号証）:　Antonov他「ピコ秒紫外線レーザパルスによって誘起された分子内での多光子過程」（ピコ秒現象III−ピコ秒現象に関する第三回国際会議(1982年6月 16-18日)の議事録）310-314頁
　　引用刊行物５（甲第5号証）:　米国特許第4,631,581号明細書
　　引用刊行物８（甲第8号証）:　「レーザ分光測定」Springer社刊(1981年)422-441頁及び672-675頁
　　引用刊行物９（甲第9号証）:　Janis A.Valdmanis 及びR.L.Fork「光子秒パルスレーザーのための設計上の考察」lEEE量子電子工学ジャーナル、QE第22巻1号(1986年1月刊)112-118頁
　　引用刊行物１０（甲第10号証）：　C.V.Shank「超短光パルスの生成」応用物理学60巻(1988年1月刊) 5-31頁(特に15頁)
　　引用刊行物１１（甲第11号証）：　米国特第4,464,761号明細書
（引用刊行物の記載事項）
　各引用刊行物には、以下に摘記する事項が記載されている。
［引用刊行物１］
　「３次元オプチカル記憶メモリ」に関し、「情報への高速ランダムアクセスができてビット密度のきわめて高い新型３次元（３Ｄ）オプチカル記憶メモリを説明する。この装置は情報をポリマー・マトリクス中に埋め込んだフォトクロミック物質中に２光子書込、読取、消去をすることが出来る。データの吸収及び放出は、情報の２光子書込と読取が出来ることを示す。」（序文）と記載され、「この方法は、二つの光子のいずれをも個々には吸収出来なくて、双方を同時に吸収しなければならないので、二つの光線が３次元媒体内で時間及び空間（６）において重畳することを必要とする「仮想」２光子プロセスであることを強調する。」（８４３頁左欄下から５〜２行）「情報記憶プロセスには、スピロペンゾピランの２つに明確に区別された光化学的形態によるバイナリ形式で与えられる情報の書込、読取及び消去が含まれる。「書込」と「読取」の形態のエネルギ・レベルのダイヤグラムを分子構造と共に配列１に示す。励起源としては基本レーザー光線とその高調波を用いた。紫外線領域での励起を必要とする「書込」用には、１０６４ｎｍ光子と５３２ｎｍ光子（３５５ｎｍ励起を実施）又は、二つの５３２ｎｍ光子（２６６ｎｍ励起に相当）のいずれかの２光子吸収を用いた。しかし、同一波長の二光線については、各光線が誘起する２光子吸収が別個に起こることがある。これは弱い５３２ｎｍと強い１０６４ｎｍの使用により消滅する。」（８４３頁中欄２１〜４０行）「受動／能動モードでロックしたＮｄ３＋イットリウム・アルミニウム・ガーネット（ＹＡＧ）レーザーに１０６４ｎｍ、２０ｐｓパルスを２０Ｈｚで放射させた。」（８４４頁左欄８〜１０頁）「このプロセスはレ一ザー尖頭力の二乗に依存するので、本質的尖頭力の大きいピコ秒パルスが好ましい。」（８４４頁左欄下から４〜１行）と記載されている。
［引用刊行物２］
　「レーザーとレーザー分光法」について、「Ｑスイッチングによって短いパルス、一般的には２００ｎｓの長さのパルスが発生するが、ピコ秒（１０−１２）台のパルスが必要である場合、モード・ロッキングという方法が用いられることがある。」（３０８頁下から８〜６行」「１００ｆｓ（フェムトセコンド１０−１５秒）より短いパルス幅がこの方法で作られてきた。」（３０９頁下から２〜１行）こと、「２光子、つまりマルチ光子においては、電子吸収プロセスについてはさまざまな方法で監視される。この二つについて図９．２８に示す。レーザ、つまり特に調整可能な色素レーザが吸収システムによりスキャンされるならば、二光子が励起された電子または振動状態に転移すると、図９．２８（ａ）に示すように蛍光がその状態から検出されることがある。」ことが記載されている。
［引用刊行物３］
　「共振走査光学顕微鏡」に関し、「光学顕微鏡の走査において物体を共振キャビティ中に置くことによる非線型相互作用の強化」「主放射線の共振効果」（要約）について記載され、「走査光学顕微鏡においては非線型相互作用が、被検体と強く焦点を結んだ光線との間に起こると想定され」ていること、「非線形相互作用には加算周波、ラマン散乱、２光子蛍光等の発生が含まれる。」ことが記載され、パルスビームの採用について「調和振動走査光学顕微鏡において放熱が重要問題であることは明らかなので、例えばビーム・パルシングによる基本光力から調和振動光力への転換効率か又は被検体支持物の熱伝導かのいずれかを改良する方法が重要である。」（２８７９頁右欄３〜８行）こと、「一つ又は別の理由で短パルス形態での一次放射を使う必要がある」（２８８０頁左欄下から１１〜９行）ことが記載されている。
［引用刊行物４］
　「ピコ秒ＵＶレーザパルスにより誘起される分子内の多重光子プロセス」について、「レーザ放射により原子及び分子に多段階的ないし多重の光子の励起が生じることにより非線形レーザ光化学の基礎が構築され」（３１０頁序文１〜２頁）たこと、「分子の振動及び電気励起を扱う多重の光子プロセスについては、比較的長期間の励起と緩和を起こすことによりナノ秒パルスを使用できるときの気相において主に研究されてきた。室温での凝縮媒体において、急速なエネルギー緩和による有効な光子の多重励起は、ピコ秒計測時間のレーザパルスを加える場合に限り可能となる。」（同６〜１０行）
［引用刊行物５］
　「本発明による方法は顕微鏡標本の体積の３次元画像を生成することから成る」（１欄４６〜４８行）こと、この方法は「標本と焦点面の相互の相対的位置と標本内の複数個の部分要素とのカーソルまたは光点の更新された合致を変更し；標本内のカーソルと部分要素によって発生した光を集光し；標本内の隣接する（上、下、横）部分要素によって発生した同期阻害光を選別し；この様にして集光した光を検出し、前記検出から生じた測定値を記憶」（同５２〜６０行）することを含むものであり、「神経細胞の研究は本発明の方法が特に適している分野の例である。」（２欄１９〜２１行）「３次元構造が大きな関心の的である他の可能な分野として、細胞の内部構造の研究、例えば、細胞核、染色体、などの形状がある。」（同３１〜３４行）と記載されている。
［引用刊行物６］
　「走査光学顕微鏡における光二次高調波画像形成」について、従来の光学顕微鏡では、コントラストは、光学濃度、パス長もしくは被検物の屈折力の変化から得られる。
　これに反し、本走査光学顕微鏡は、入射光の調波を発生させる被検物の能力における変化からコントラストを得る。」（４３５頁左欄２〜８行）と記載されている。
［引用刊行物７］
　「高調波顕微鏡の結像および高解像」について、「内部で生成された高調波からイメージを結像することにより標本の構造についての全く新しい情報が得られるようになったため、さまざまなタイプの高調波顕微鏡が作られることになった。」（７６１頁序文１〜３行）「走査型顕微鏡では生成された調波の強度が入射の基本強度の二乗に比例するため、標本内でできた調波ポイントは入射の基本スポットに比例して尖ってしまうため、解像度が上がる。」（同１５〜２０行）と記載されている。
［引用刊行物８］
　「レーザ分光測定」に関し、「８．１０　多光子分光」において、「本節において、遷移（略）を受ける分子による２つ以上の光子の同時吸収を検討する。光子は吸収サンプルを通過する単一のレーザービームから来るか、あるいは１つ以上のレーザーから発射された２つ以上のビームによって提供される。」（４３５頁）と記載され、「８．１０．１　二光子遷移の遷移確率」において、「遷移確率は強度の積Ｉ１Ｉ２（単一レーザービームの場合はＩ２に置換しなければならない）に比例するので、十分大きなピーク出力提供するパルスレーザーが一般的に使用される。」（４３７頁）と記載されている。
［引用刊行物９］
　「フェムト秒パルスレーザーのための設計上の考察」に関し、「１９７２年における最初のダイレーザーの受動モードロック以来、モードロックレーザーが発生するパルスの持続時間は１ｐ以上からフェムト秒領域に下がった。この分野の最近の進歩の一つは、空洞間自動位相変調、群速度分散、飽和可能吸収及び飽和可能利得を複合して２７ｆｓの短さのパルスを発生するレーザーであった。」ことが記載されている。
［引用刊行物１０］
　「超短光パルスの生成」に関し、「光パルスの時間スケールがフェムト秒にまで短縮したことにより、従来の文献には予知されることさえなかった新しい実験の可能性が開けてきた。」こと（序文６〜９行）が記載され、「衝突パルス・モード同期色素レーザの到来はパルス発生方法をフェムト秒も時間領域へ推し進め、０．１ピコ秒以下のパルス発生報告を得るに至った。衝突パルス受動モード同期レーザ模型は先の構成に対して受動モード同期レーザ性能を向上させる利点がある。その中心思想は飽和性吸収帯の効率を高めるために光空洞共振器内にある二個のパルスの相互作用又は”衝突”を利用することである。」、「フェムト秒のパルスが可視スペクトルの大部分に亘って発生された。クリプトンイオンレーザが７００ー７７８ｎｍの領域でモード同期連続波色素レーザをポンピングすることに使われた。もっと最近では、５５０−７００ｎｍのスペクトル範囲をカバーする能動及び受動レーザの新しい組合わせが使われている。」と記載されている。
［引用刊行物１１］
「クロム添加ケイ酸ベリリウム−アルミニウム・レーザーシステム」について、クロム添加ケイ酸ベリリウム−アルミニウムは持続時間１０−５００フェムト秒程度の短さの高強度、同調可能、モードロックのパルス用に適していることが記載されている。
〈３６条違反について〉
　請求項１、９、２２項について、上記のように訂正された結果、請求項の記載は明確となり記載不備は解消した。
　また、特許請求の範囲に記載された「結像体積」は、明細書の「入射光は目標面１８上のくびれ即ち焦点２６を形成する。焦点２６の直径は光路内の回折によって制限されるが、好ましくは１ミクロン以下である。」（特許公報８欄３９〜４２行）「くびれにおける対象平面上の焦点領域内においてのみ、強度試料中の蛍光体内への２光子吸収を生成するのに十分なものとなり、この強度依存性（分布）は、長い波長の光をして、試料の焦点の廻りのごく局所的な体積内においてのみ短波長による励起と同等の効果をもたらす。」（同７欄１２〜１７行）等の記載からみて、光ないし光子の結像点を指す用語として明確であると認められる。
〈２９条違反について〉
（訂正後の請求項１に係る発明について）
　訂正後の請求項１に係る発明（以下、「訂正発明１」という。）と引用刊行物１に記載の発明を対比すると、引用刊行物１は、３次元メモリに関してパルスレーザによる２光子吸収現象を利用する技術を開示するものの、顕微鏡装置について開示するものではない。また、使用するレーザーのパルス時間として、「ピコ秒パルスが好ましい」と記載され、具体的には「２０ｐｓパルス」が記載されていることを考慮すると、引用発明１は、ピコ秒より短いサブピコ秒パルスを開示するものではない。
　このように、引用発明１は、サブピコ秒の光パルスを用いるレーザ走査蛍光顕微鏡を開示するものではないから、訂正発明１は、引用刊行物１に記載された発明ではない。
　また、引用刊行物２、９〜１１にフェムト秒領域でのレーザパルスが開示されているとしても、引用刊行物２は、分光分析法において使用するものであり、引用刊行物９〜１１は、フェムト秒のパルスレーザを開示するのみで、いずれの引用刊行物にも顕微鏡におけるサブピコ秒（フェムト秒）のパルスレーザの使用を開示ないし示唆するものではない。
　訂正発明１と引用刊行物２に記載された発明とを対比すると、引用刊行物２は、レーザを使用する分光分析に関し、サブピコ秒のパルスレーザを開示し、２光子吸収にも言及するが、顕微鏡におけるサブピコ秒のパルスレーザの使用を開示ないし示唆するものではない。また、引用刊行物１は、３次元メモリに関するものであり、上述のように顕微鏡におけるサブピコ秒のパルスレーザの使用を開示ないし示唆するものではないから、たとえ引用刊行物２及び１に記載された発明を組合わせたとしても、訂正発明１を構成するものではない。
　訂正発明１と引用刊行物３に記載された発明とを対比すると、引用刊行物３は、光学走査顕微鏡の共振器の使用に関するもので、非線形相互作用の例として２光子蛍光に言及するが、主に高調波の利用について記載されており、２光子蛍光の利用についての記載はない。また、引用刊行物３に短パルスのレーザを用いることが開示され、引用刊行物４にサブピコ秒のパルスレーザが開示されているとしても、引用刊行物４は、非線形レーザ光化学に関するもので、顕微鏡に言及するところはなく、引用刊行物１、２を参照しても、顕微鏡におけるサブピコ秒パルスレーザの利用を開示ないし示唆するものとはいえない。
　さらに、その他の引用刊行物についてみても、引用刊行物５は、顕微鏡の３次元画像の生成に関するものであるが、２光子励起については記載されておらず、引用刊行物６、７は高調波顕微鏡に関するもので、引用刊行物８はレーザ分光測定に関するものであり、いずれも顕微鏡におけるサブピコ秒パルスレーザの利用を開示ないし示唆するものとはいえない。
　そして、訂正発明１は、レーザ走査蛍光顕微鏡においてサブピコ秒の光パルスを用いて蛍光体の２光子励起を行うことにより、バックグラウンド判別の改善、蛍光体の光漂白の減少、細胞試料に対するダメージの最小化等の明細書記載の作用効果を奏することが認められる。
　したがって、訂正発明１は、引用刊行物１に記載された発明でもなく、引用刊行物１〜１１に記載された発明に基づいて、当業者が容易に推考し得るものでもない。
（訂正後の請求項２〜５、８に係る発明について）
　訂正後の請求項２〜５、８は、訂正後の請求項１を引用して記載され、訂正後の請求項２〜５、８に係る発明は、訂正後の請求項１に係る発明をさらに限定するものであるから、引用刊行物１に記載された発明でもなく、引用刊行物１〜１１に記載された発明に基づいて、当業者が容易に推考し得るものでもない。
（訂正後の請求項９に係る発明について）
　訂正後の請求項９に係る発明は、「生物学的目的物を支持する手段」と「サブピコ秒の光パルスの供給手段」を備え、サブピコ秒の光パルスを生物学的目的物の結像体積に結焦させるものであるが、訂正発明１について述べたように、「サブピコ秒の光パルスの供給手段」は引用刊行物１に記載されておらず、引用刊行物１は３次元メモリに関するものであるから、「生物学的目的物」について言及するところはない。したがって、訂正後の請求項９に係る発明は引用刊行物１に記載された発明ではなく、また、訂正発明１について述べた理由と同様の理由により、引用刊行物１〜１１に記載された発明に基づいて、当業者が容易に推考し得るものでもない。
（訂正後の請求項１０〜２１に係る発明について）
　訂正後の請求項１０〜２１は、訂正後の請求項９ないし１を引用して記載され、訂正後の請求項１０〜２１に係る発明は、訂正後の請求項９ないし１に係る発明をさらに限定するものであるから、引用刊行物１に記載された発明でもなく、引用刊行物１〜１１に記載された発明に基づいて、当業者が容易に推考し得るものでもない。
（訂正後の請求項２２に係る発明について）
　訂正後の請求項２２に係る発明の「レーザ走査顕微鏡を用いて、生物学的な目的物の２光子分子励起を発生させる方法」であって、「レーザ光のサプピコ秒のパルスビームで上記目的物を照射するステップ」を備え、「２光子分子励起を生成する」点は、訂正発明１及び訂正後の請求項９に係る発明について述べた理由と同様の理由により、引用刊行物１に記載されておらず、また、引用刊行物１〜１１に記載された発明に基づいて、当業者が容易に推考し得るものでもない。
（訂正後の請求項２３〜２６に係る発明について）
　訂正後の請求項２３〜２６は、訂正後の請求項２２を引用して記載され、訂正後の請求項２３〜２６に係る発明は、訂正後の請求項２２に係る発明をさらに限定するものであるから、引用刊行物１に記載された発明でもなく、引用刊行物１〜１１に記載された発明に基づいて、当業者が容易に推考し得るものでもない。
　以上のとおりであるから、上記訂正は平成６年改正法（平成６年法律１１６号）附則６条１項の規定によりなお従前の例によるとされる、特許法１２０条の４第３項において準用する平成６年改正法による改正前の特許法１２６条１項ただし書、２項及び３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
４　異議申立についての判断
（１）　本件請求項１〜２６に係る発明は、訂正明細書の特許請求の範囲に記載されたとおりのものと認められる。
（２）　特許異議申立人は、本件特許明細書には特許請求の範囲の記載に不備があり、本件特許は特許法３６条に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものであり、また、甲第１〜１１号証（上記引用刊行物１〜１１に同じ。）を提出して、請求項１〜２６に係る発明の特許は、甲第１号証に記載された発明であって、特許法２９条１項３号に規定する発明に該当し、さらに甲第１〜１１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定に違反してなされたものであり取り消すべきである旨主張している。
（３）　甲第１〜１１号証には、２（独立特許要件）で認定したとおりの事項が記載されている。
（請求項１〜５、８に係る発明について）
　請求項１及び請求項１を引用する請求項２〜５、８に係る発明については、２（独立特許要件）の（訂正後の請求項１項に係る発明について）及び（訂正後の請求項２〜５、８に係る発明について）で述べた理由と同じ理由で、甲第１号証に記載された発明でもなく、甲第１〜１１号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に推考し得るものでもない。
（請求項６、７に係る発明について）
　請求項６に係る発明は、「２光子励起技術を用いたレーザ走査蛍光顕微鏡法」で、サブピコ秒のパルスのビームで目的物（２０）を反復して照射する」ものであり、請求項１に記載された装置の使用方法に関するものであるから、請求項１に係る発明で述べた理由と同じ理由で、甲第１号証に記載された発明でもなく、甲第１〜１１号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に推考し得るものでもない。
　請求項７は請求項６を引用して記載され、請求項７に係る発明は、請求項６に係る発明を限定するものであるから、甲第１号証に記載された発明でもなく、甲第１〜１１号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に推考し得るものでもない。
（請求項９〜２１に係る発明について）
　請求項９に係る発明及び請求項９ないし請求項１を引用する請求項１１〜２１に係る発明については、２（独立特許要件）の（訂正後の請求項９に係る発明について）及び（訂正後の請求項１０〜２１に係る発明について）で述べた理由と同じ理由で、甲第１号証に記載された発明でもなく、甲第１〜１１号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に推考し得るものでもない。
（請求項２２〜２６に係る発明について）
　請求項２２に係る発明及び請求項２２を引用する請求項２３〜２６に係る発明については、２（独立特許要件）の（訂正後の請求項２２に係る発明について）及び（訂正後の請求項２３〜２６に係る発明について）で述べた理由と同じ理由で、甲第１号証に記載された発明でもなく、甲第１〜１１号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に推考し得るものでもない。
５　むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件請求項１〜２６に係る発明の特許を取消すことはできない。
　また、他に本件請求項１〜２６に係る発明の特許を取消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年８月８日（２０００．８．８）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
［訂正事項１（講求項１の訂正）］
　訂正前の「【請求項１】　目的物（２０）のレーザ走査蛍光顕微鏡装置（１０）は以下のものを含む：特性エネルギの単一光子により励起されて蛍光光子を発生する蛍光成分を含む目的物（２０）を支持するステージ手段（２２）；
　光を上記ステージ手段に指向させるように配置されるとともに上記ステージ手段（２２）における上記目的物（２０）内に目標面を有する結像手段（４０，１２）；
　上記特性エネルギより低いエネルギの光子からなるサブピコ秒の単色コヒーレント光パルスの反復発生源（１６）；および上記コヒーレント光パルスを上記結像手段を含む光路に沿って指向させる手段；
　上記結像手段（４０，１２）は上記目標上の結像体積（２６）に上記光パルスを結像させて、上記ステージ手段（２２）における目的物（２０）に入射させ、複数の光子が組合さって上記蛍光成分内に蛍光を誘起する。」を、特許請求の範囲の減縮及び明りょうでない記載の釈明を目的として、次のように訂正する。
　「【請求項１】　目的物（２０）の２光子レーザ走査蛍光頭微鏡装置（１０）は、
　特性エネルギの単一光子により励起されて蛍光光子を発生する蛍光成分を含む目的物（２０）を支持するステージ手段（２２）と、
　光を上記ステージ手段に指向させるように配置されるとともに上記ステージ手段（２２）における上記日的物（２０）内に目標面を有する結像手段（４０，１２）と、
　上記特性エネルギより低いエネルギの光子からなるサブピコ秒の単色コヒーレント光パルスの反復発生源（１６）と、
　上記コヒーレント光パルスを上記結像手段を含む光路に沿って指向させる手段とからなり、
　上記結像手段（４０，１２）は上記目標面上の結像体積（２６）に上記光パルスを結像させて、上記ステージ手段（２２）における目的物（２０）に入射させ、複数の光子が組合さって上記蛍光成分内に２光手蛍光を誘起する
２光子レーザ走査蛍光顕微鏡装置（１０）。」
［訂正事項２（請求頃９の訂正）］
　訂正前の「【請求項９】　既知の特性エネルギの光による単一光子励起に対応する分子励起を目的物（２０）内に誘起するための装置（１）は以下のものを備える：
　目標面（１８）；
　上記目標面に生物学的目的物を支持する手段（２２）；
　サブビコ秒の光パルスを供給する手段（１６）、上記光パルスは上記特性エネルギより低いエネルギを有する光子からなる；
　上記目標面に隣接して位置決めされた結像手段（４０，１２）；
　上記光子の光パルスを上記結像手段（４０，１２）を含む光路に拾って指向させて光子を上記目的物に入射させ、上記結像手段（４０，１２）は上記光子を上記目的物内の結像体積（２６）に結焦させ、上記特性エネルギより低い入射光子を上記結像体積（２６）内において上記目的物内に分子励起を誘起するに十分なエネルギを生成する。」を、特許請求の範囲の減縮及び明りょうでない記載の釈明を目的として、次のように訂正する。
　「【請求項９】
　既知の特性エネルギの光による単一光子励起に対応する２光子分子励起を目的物（２０）内に誘起するための装置（１）は、
　目標面（１８）と、
　上記目標面に生物学的目的物を支持する手段（２２）と、
　上記特性エネルギより低いエネルギを有する光子からなるサブピコ秒の光パルスの供給手段（１６）と、
　上記目標面に隣接して位置決めされた結像手段（４０，１２）とからなり、
　上記光子の光パルスを上記結像手段（４０，１２）を含む光路に沿って指向させて光子を上記目的物に入射させ、上記結像手段（４０，１２）は上記光子を上記目的物内の結像体積（２６）に結焦させ、上記特性エネルギより低い入射光子を上記結像体積（２６）内において上記目的物内に２分子分子励起を誘起するに十分なエネルギを生成することを特徴とする、２光子分子励起を目的物（２０）内に誘起するための装置（１）。」
［訂正事項３（請求項１２の訂正）］
　訂正前の「【請求項１２】　上記レーザ光源と光路は、生物学的に活性な化学物質の局所的な放出を発生させるように上記結像点における励起に応答して目的物を走査するように適合されている、請求項１１の装置。」を、誤記の訂正を目的として、次のように訂正する。
、「【請求項１２】
　上記レーザ光源と光路は．生物学的に活性な化学物質の局所的な放出を発生させるように上記結像体積における励起に応答して目的物を走査するように適合されている、請求項１１の装置。」
［訂正事項４（請求項２２の訂正）］
　訂正前の「【請求項２２】　特性エネルギを有する光子によって励起可能な分子を含む生物学的な目的物（２０）の分子励起を発生させる方法は、以下のステップを備える；
　上記特性エネルギより低いエネルギを有する高強度のレーザ光のサブビコ秒のパルスビームで上記目的物を照射する；および上記照射を上記目的物（２０）内の小さい結像体積に結像させて、上記結像体構内においてのみ、少なくとも２個の上記入射照射光子の同時吸収によって分子励起を生成するのに十分高い照射強度を生成する。」を、特許請求の範囲の減縮及び明りょうでない記載の釈明を目的として、次のように訂正する。
　「【請求項２２】　レーザ走査頭微鏡（１０）を用いて、特性エネルギを有する光子によって励起可能な分子を含む生物学的な目的物（２０）の２光子分子励起を発生させる方法であって、
　上記特性エネルギより低いエネルギを有する高強度のレーザ光のサブビコ秒のパルスビームで上記目的物を照射するステップと、
　上記照射を上記目的物（２０）内の小さい結像体積に結偽させて、上記結像体積内においてのみ、少なくとも２個の上記入射照射光子の同時吸収によって２光子分子励起を生成するのに十分高い照射強度を生成するステップとからなる生物学的な目的物（２０）の２光子分子励起を発生させる方法。」
（５４）【発明の名称】
２光子レーザ走査顕微鏡
【発明の詳細な説明】
発明の背景
　この発明は、国立保健機関によって与えられた認可番号Ｐ４１ＲＲ０４２２４、国立科学財団によって与えられた認可番号ＮＳＦ−ＢＢＳ−８７１４０６９およびＮＳＦ−ＤＭＢ−８６０９０８４の政府援助によりなされたものである。政府は本発明においてある権利を有する。
　フライイング・スポット・スキャナの原理は長い年月知られているにもかかわらず、その顕微鏡における応用は、必要な技術の開発に従ってここ２、３年活発になされるようになっている。安定したレーザ光源および高速の電子画像認識・格納技術は、走査顕微鏡にとって必須の要素である。非共焦走査顕微鏡の画像化特性は、従来の顕微鏡のそれと極めてよく似ているにもかかわらず、新しい領域が共焦点走査顕微鏡によって拓かれた。この種の装置によって得られる分解能は徐々にしか向上していないが、それらによって得られる飛躍的に改良された深度分解能は、複雑な逆たたみ込み演算の必要なしに３次元画像の生成を可能にした。深度分解は、バックグラウンドを減少させ、このことは、ホトマルチプライヤ等の単一高精度検出器の使用と相侯って高い空間分解能を伴った定量的研究を可能とした。
　共焦点走査顕微鏡の光軸に沿った分解能は、透明の目的物内において焦点面の上下において発生する背景散乱又は蛍光に対抗する有用な識別を可能とする。それは、また、一連の断面から３次元の蛍光画像を構築する場合や、定量的な蛍光インジケータ（指示薬）の使用或は非平面表面のセル表面受容体の蛍光マーカのマップ化にとって極めて有用である。この種の装置は僅かに良好な横方向分解能、極めて優れた深度視野分解能および従来の装置で理想的な条件下で得られるよりも倍率のオーダがより優れた理想的条件下でのバックグラウンド識別を与える。
　走査は、静止ビームに対して試料ステージを移動させるか、照明と蛍光応答信号の両方を高精度に同調させて光学走査のいずれかによって行われる。ステージの移動方式が光学的観点からは好ましいが、サンプルの受入れおよび装填、収納容器の使用および微細電極を用いた電気的記録に関する制限をもたらす。したがって、スポット移動方式が多くの場合好ましい。このような移動スポットは、ガルバノメータ・スキャナに装着したミラーの使用によって生成されるが、これは得ることができるフレーム周波数を制限する。音響一光学デフレクタの使用は、その強い発散のゆえに蛍光顕微鏡における共焦点空間フィルタとの干渉を惹起する。多角形ミラーはガルバノメータ・スキャナより高速であるが、それ単独では、操作のベクトルモードが不可能である。
　従来のアーク光源は、回転ディスク照明器を利用する共焦点走査顕微鏡の種々の応用に用いることができるが、明らかに不可避な強度変動によって定量的な応用のための使用は制限される。かかる装置において、画像は、ディスクの共焦ピンホールの２者一体のセットを通して、或いは、最近の形式では、照明ピンホールそれ自身を通して形成される。
　レーザによって照明される単一点が移動する目的物を横切って走査される共焦点走査顕微鏡は低走査速度において極めて良好に動作し、可視光を吸収・射出する蛍光マーカを用いて優秀なレーザ走査顕微鏡が得られている。しかしながら、スペクトルラムの紫外線部分によって励起される蛍光光団及び蛍光化学指示薬を有する共焦走査画像は、色収差が補正されなければならず、吸収及び射出波長の両方に対して透明でなければならない適当な顕微鏡用レンズがないために、そのうえ、紫外光によって生きている細胞に対して加えられるダメージのゆえに、実用に供されていない。さらに、紫外線レーザの諸種の制限が、上記の用途を困難なものとしている。蛍光顕微鏡法は、明白なことであるが、目的物内の蛍光光団の光漂白によってさらに制限される。なぜならば、励起光は、蛍光体を励起しながら、蛍光光団を徐々に光漂白するからである。レーザ走査共焦蛍光顕微鏡法においてさえ、結焦された励起光は焦点面を走査するに従って、ある時間平均では、目的試料の全体の深さに亘って均一に照射するため、広視野顕微鏡において生ずるのと本質的に同様の光漂白が惹起される。光漂白は、多数の２次元画像が必要とされ、各２次元画像の検出が試料全体の光漂白をもたらすために、３次元画像の再構成においてとりわけ問題となる。
発明の概要
　上記の各種の困難は、本発明によれば、レーザ走査顕微鏡法において蛍光体の２光子分子励起の使用によって克服される。本発明によれば、２光子励起は、（ａ）直径で１ミクロン以下の散乱が制限されたくびれ状にレーザが結像されるレーザ走査顕微鏡において可能な強力な結像作用によって与えられる極めて高く局所的でかつ瞬間的な強度と、（ｂ）パルス化されたレーザの一時的な集中の組合によって可能となる。コライディング・パルス、モード・ロック型ダイレーザ（ｄｙｅ　ｌａｓｅｒ）のように、回折限界まで結像可能な高強度、長波長、単色光源は、各パルスが約８０ＭＨｚの繰り返し率で約１００フェムト秒（１００×１０−１５秒）の期間を有するパルスの流れを生成する。これらのサブピコ秒のパルスは、例えば２色ミラーによって、顕微鏡に供給され、顕微鏡の対象面に位置する試料もしくは目的物に指向される。回折限界まで結像されたごく短時間の強力なパルスによって与えられる瞬間的な高いパワーのゆえに、目的物に含有され通常は典型的に紫外線等の短い波長の高エネルギー単一光子によって励起される蛍光光団（蛍光染料）がレーザ光源からの２つの長波長の光子を同時に吸収する相当の確率が存在する。この吸収は、蛍光体分子内において２つの光子のエネルギーを結合し、それによって、蛍光体をその励起状態に遷移させる。蛍光体が正規状態に戻ると、それは光を放出し、この光は顕微鏡の光学系を逆方向に通過して適当な検出器に至る。
　高強度短時間の光パルスによる蛍光体の２光子励起は、バックグラウンド判別の改善、蛍光体の光漂白の減少を可能にし、かつ生きている細胞試料に対する光によるダメージを最小化する顕微鏡のための一般的な蛍光技術を構成する。これは、顕微鏡内において生成され結像化された照明は、試料内を通過する際収束円錐をなすからである。収束円錐の頂点において焦点面に達する光の全ては、蛍光体に吸収される僅かな部分を除いて、発散円錐となって試料の対向面側に出ていく。収束する円錐と発散する円錐とによって形成されるくびれにおける対象面上の焦点領域内においてのみ、強度試料中の蛍光体内への２光子吸収を生成するに十分なものとなり、この強度は依存性（分布）は、長い波長の光をして、試料の焦点の廻りのごく局所的な体積内においてのみ短波長による励起と同等の効果をもたらす。この吸収は試料の焦点領域外の部分の全体にわたって長波長光の軟らかな平均照明光強度を保持する比較的長波長の高速、高強度のフェムト秒のパルス手段によって達成される。その結果、焦点面外の蛍光体の光漂白は殆どなくなる。長波長光の１光子吸収は無視でき、焦点面外では、時間平均の照明が試料の全深さに亘って実際上にほぼ均一であったとしても、瞬間的な強度は相当の２光子吸収・励起をもたらすには、あまりに低すぎる。この効果は、さらに、生きている細胞へのダメージを大幅に減少させる。
　本発明の２光子吸収は正確な空間的認識を可能とし、３次元的に位置が定められた小さな体積から、蛍光の量子化を可能とし、したがって、前述した如き共焦点レーザ走査顕微鏡において得られるものに匹敵する視野分解能の深度が得られる。このことは、より厚い細胞層が研究されるべき場所にはとりわけ重要である、さらに、２光子励起は、背景蛍光を大幅に減少させる。
　上で議論した２光子吸収技術は、デミトリ　エイ・パーセンノポーロス等（Ｄｉｍｉｔｒｉ　Ａ・Ｐａｒｔｈｅｎｏｐｏｕｌｏｓ　ｅｔ　ａｌ．）の“３次元光学格納メモリ”（Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｓｔｏｒａｇｅ　Ｍｅｍｏｒｙ）と題する論文；サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｖｏｌ．２４５、ｐａｇｅｓ　８４３−８４５、Ａｕｇｕｓｔ　２５、１９８９；に記述された型式の３次元光学メモリ装置において選択された場所を励起するためにも使用可能である。本発明によれば、単一レーザ光源又は共軸多重光源からの比較的長い波長光の極めて短いが高強度のパルスが、走査顕微鏡を通して、高分子組織内に埋込まれた結晶、組成物もしくは発光団の如き、ホトクロミック或いは光分解可能な（ｐｈｏｔｏｌｙｚａｂｌｅ）蛍光物質である格納媒体内に指向される。入射光ビームは組織内の多くの層のいずれか一つの上に高度に結像され、かつその強度は、選択された層を横切って走査されるか或いは歩進されるかにしたがって変調される。ビームはビームによって表現されるコード化された情報が媒体内において２値の形式で格納されるように、組織内において選択された場所を励起する。高度に結像されたビームは、正確な格納に必要な空間的分解能を与える。フェムト秒の高強度パルスは、通常は紫外線領域の光による励起を必要とする物質内に情報を書込むために組織物質内に２光込吸収を惹起させる。組織内の書込まれた点の励起レベルは上記した分子内において蛍光を生成する長波長の読取りレーザによって検出もしくは読取られる。
図面の簡単な説明
　本発明の上記およびさらに別の目的、特徴および利点は、添付の図面を参照した実施例の以下の詳細な説明から明らかになるであろう：
　第１図は本発明にしたがって実用化されたレーザ走査共焦顕微鏡の図式的な図である；
　第１Ａ図は第１図の装置の目標面領域の拡大部分図である；
　第２図は赤色光の２光子吸収によって励起された青色の蛍光を示す合成ステレオ画像対である；
　第３図は蛍光ラテックスビードの内側の面積から平均強度対印加された平均レーザパワーの比を示すグラフである；
　第４図はＤＮＡ色素で着色された豚の培養腎細胞の染色体の２光子励起蛍光画像である；
　第５図は焦点面に限って２光子光漂白を示すラテックスビードの画像である；
　第６図は蛍光的に着色されたラテックスビードの内側の２光子光漂白されたパターンの画像である。
実施例の記述
　第１図に示された本発明のより詳細な記述を以下に行う。第１図には図式的な形で従来のレーザ走査顕微鏡１０が示されており、レーザなどの光源１６から対物面１８に入射する入射光１４を結像するための対物レンズ１２を備えている。第１Ａ図に図示される如く対物面は移動可能なステージ２２によって搬送されうる試料もしくは目的物２０の上または内部に位置しうる。入射光ビームによる照射光は２４で示す収束円錐を満たし、該円錐は試料２０の内部を通って目標面１８の焦点面に達し、さらに目標面上の試料によって吸収されるごく一部の光を除いて発散する円錐２５を通して外部に通過する、入射光は目標面１８上においてくびれ即ち焦点２６を形成する。焦点２６の直径は光路内の回折によって制限されるが、好ましくは１ミクロン以下である。よく知られているように顕微鏡光学系の調整によって試料２０内の焦点の垂直位置は選択することができる。さらにステージ２２は水平面内において試料の選択された箇所に入射光を位置させるべくＸおよびＹ軸に沿ったラスターモーションのような方法で水平面内において移動可能であり、したがって全体として試料の３次元的な走査が得られる。しかしながら、機械的に走査されるステージは種々の困難をもたらすので、静止ステージを用いることが好ましく、例えば顕微鏡の光路内に配置した走査ミラーのごとき手段によって入射ビームをＸ−Ｙ面内において光学的に走査することが好ましい。
　レーザ１６から目標面１８に至る光路はレーザ１６からの光が指向される２色ミラー２８を含む。以下により詳細に説明するように、本発明によればレーザからの出力は比較的長い波長、好ましくは可視の赤もしくは赤外に近いスペクトラル領域の光の短い高強度のパルスからなる。ミラー２８はこの長波長の光をミラー３０に向けて下向きに偏向させ、ミラー３０は湾曲ミラー３６および３８を介して上記光を走査ミラー３２および３４の対に指向させる。ミラー３２および３４は互いに垂直な軸の回りで回転可能であり、目標面上のＸおよびＹ軸に沿って入射光１４を移動させ、それによって静止した資料は走査される。走査ミラーからの光はアイピース４０を通過して対物レンズ１２を通して目標面１８に結像される。
　第１Ａ図において点線の矢印４２で示した資料２０内で発生された蛍光は顕微鏡を通して逆方向に伝達し、入射ビーム１４の光路を逆方向に進み、したがって対物レンズ１２、アイピース４０、走査ミラー３４および３２、湾曲ミラー３８および３６を経由してミラー３０により２色ミラー２８に反射される。資料内の蛍光物質によって射出された光は資料内に含まれた蛍光物質に固有の波長であり、したがって入射光１４の波長とは異なっている。この蛍光はレーザ１６方向に反射されることなしに、２色ミラー２８を通過することができ、したがって４４で示す光路を進む。このようにして蛍光４２はバリアフィルタ４６を通過し、平面ミラー４８、５０および５２によって光増倍管５４のごとき適当な検出器に向けて反射される。本発明によれば共焦レーザ走査顕微鏡が選択され、したがってそのような顕微鏡が図面に図示されている。しかしながら、他の形式のレーザ走査顕微鏡も使用可能であることは理解されるであろう。共焦顕微鏡１０内においては調節可能な共焦ピンホール５６が集光光学系４４内に備えられており、結像面の上と下に位置する収束および発散円錐２４および２５内において励起される背景蛍光を最小化する。この共焦ピンホールは有用であるが、本発明による２光子蛍光励起においては励起が対物面の焦点２６の領域に本質的に限られるので必要ではない。従来の蛍光顕微鏡では可視光である蛍光光子４２は、励起状態から分子の弛緩の間に生成される蛍光４２より高いエネルギー、すなわちより短い波長を有する入射光１４の単一光子を吸収することによって励起される分子によって生成される。このような従来の装置においては、１分子あたりに放出される蛍光光子の数は吸収された励起光子の数に通常線形的に比例する。そのような従来の装置では単一の光子のみが吸収される必要があるので、励起光１４を吸収する分子の光分解（ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ）は、このプロセスは必ずしも強度に比例するものではないが、試料２０内の二重の円錐ビーム２４および２５に沿ったすべての領域で起こる。二重の円錐ビームのすべてで蛍光が発生されるため、励起光１４の焦点面の内部、上側および下側の試料内の各面から放出される蛍光の量は、ほぼ各部分において同じとなり、したがって３次元的な分解能を得るのは困難である。その結果試料全体を通して入射光の高いエネルギーは試料にダメージを与え、このことはとりわけ生じた細胞を観察する場合には好ましいことではない。
　走査顕微鏡において３次元的な分解能を得るとともに、顕微鏡の焦点外の領域において試料に与えるダメージを減少させるため、本発明は励起光の波長の１／２だけオーバーラップする波長に１光子吸収のピークを有する蛍光体の２光子励起を利用する。これを実現するため、レーザ１６はたとえば可視の赤色もしくは赤外領域等の比較的長い波長を有する高い瞬間パワーのごとく短いレーザビームパルスを生成する。この光は例えば紫外線等の短い波長の領域の単一光子によって通常励起される蛍光体を含む試料に向けて指向され、２つの低いエネルギー（赤色）の光子は、単一の高いエネルギー（紫外）の光子によって与えられると同じの試料の励起を発生するためには互いのエネルギーを結合する必要がある。励起およびしたがって試料の蛍光率の両方は入射光の強度の２乗に比例する。結像された励起レーザビーム１４では長波長の入射光の強度は顕微鏡光学系の焦点面２６の領域においてのみ試料内の蛍光体を励起するに足る強度を有するものとなる。この焦点面は試料内において調節可能に位置決めすることができ、試料の蛍光および光分解は焦点の回りの選択された楕円状の体積においてのみ発生される。したがって本発明によれば長い波長の励起光のみが試料内を通過し、かつこの長い波長の光はごく小さな領域においてのみ蛍光を励起するに足る強度を与えるように結像される。この蛍光は蛍光体が通常、紫外線領域のみを吸収するような場合においても生成される。焦点は試料内において選択的に位置決めすることができるので、３次元的な分解能は走査蛍光顕微鏡法および光分解によって放出されうる光子活性化可能な試薬の光分解法の両方において得ることができる。
　本発明によれば必要な励起強度は例えば約６３０ｎｍの赤色領域の波長を有し、約８０ＭＨｚの繰返率で１００ｆｓｅｃ以下の幅の光パルスを発生する例えばコライディング・パルス・モード・ロック・ダイレーザ等の光源１６から顕微鏡の焦点に与えられる。他の輝度の高いパルス化レーザも赤外もしくは可視赤色領域における比較的長い波長の光を発生させるために用いることができ、それによって入射光の波長の約１／２の波長を有する単一光子の吸収によって通常は励起されるような試料内の蛍光体によって要求されるような適当な吸収エネルギーまで足さ合わされるような必要な励起光子エネルギーを発生させる。例えば６３０ｎｍの可視赤色領域の２つの光子は紫外領域の３１５ｎｍの光を通常は吸収する蛍光体を励起するために結合され、また例えば赤色領域の１０７０ｎｍの２つの光子は可視光領域の５３５ｎｍの光子を吸収する蛍光体を励起する。
　本発明の変形例では単一波長の光源１６が２つの異なる長い波長のレーザ光源によって置き換えられ、入射光ビーム１４は高い瞬間パワーを有し、かつ波長の異なる２つの重畳されたパルス光ビームからなる。入射ビームの各波長は短い波長での吸収体である蛍光体を励起するべく選択され、それは以下のように表される。
　１／λａｂｓ＝１／λ１＋１／λ２
　λａｂｓは吸収体の短い波長であり、λ１，λ２は入射レーザビームの波長である。
　２光子励起においては典型的な２光子断面積δ：
　δ＝１０−５８ｍ４ｓ／光子・・・（式１）
　上記のパルスパラメータ（１００ｆｓｅｃ，反復率８０ＭＨｚ）：
　さらに開口数Ａ＝１．４のレンズによって結像されたビーム：
　約５０ｍＷの平均入射レーザパワー（ｐ０）の条件で各パルスあたり、各蛍光体あたり１つの光子が吸収される制限において蛍光体の蛍光体出力が飽和する。蛍光体あたり、パルスあたりに吸収される光子の数ｎａは以下の関係式によって与えられる。
　ここでτはパルス幅；ｆは反復率；Ｐ０は平均入射レーザパワー；δは光子吸収断面積；ｈはプランク常数；ｃは光の速度；Ａは結像レンズの開口数。
　蛍光輻射はパルス繰返周波数を典型的には以下の式で表される蛍光の寿命の逆数まで増大することによって増大される。
　τｆ−１＝１０９Ｓ−１・・・（式３）
　比較のため１光子蛍光の飽和は約３ｍＷの入射パワーで生ずる。
　第２図は本発明に係る２光子技術によって達成された深度判別を示す。画像６０および６２のステレオ対が通常は約３６５ｎｍの波長を有する紫外線によって励起される９マイクロメートルの直径のラテックスビートの蛍光体のクラスターの画像の積み重ねから発生されたこれらの画像は標準的なレーザ走査顕微鏡を用いて得られたが、連続波アルゴンイオンレーザ照明器１６を約６３０ｎｍの波長で出力パルスを生成する２５ｍＷのコライディング・パルス・モード・ロック・ダイレーザによって置き換えた。顕微鏡１０について行われた測定の結果、目標面では約３ｍＷに達したことを示していた。３８０〜４４５ｎｍの波長を通過させる照射フィルタがバリアフィルタ４６に設けられるとともに、検出器開口５４が小さな共焦開口に起因する光学的しきり効果を減少させるために、その境界に開口された。
　レーザ１６からの入射ビーム１４の強度はレーザ１６と２色ミラー２６との間において励起ビーム中に中性濃度フィルタを置くことによって調整され個々のラテックスビードによって生成される青色蛍光が特定された。第３図にグラフ６４で示されるように試料を合成するラテックスビードからの蛍光の検出強度は励起レーザパワーの２乗に比例して増大しており、このことは明らかにビード内での２光子励起の発生を示している。ポリサイエンシーズ・コーポレイション製のフルオレスブライトＢＢビードを用いたビードの励起断面積がビード内の染料濃度、レーザ走査顕微鏡の光学的スループット、パルス幅、反復率、開口数および入射パワー等を考慮して、ファクタ３の範囲の精度で５×１０−５８Ｍ４ｓ／光子であると推定された。この値は同様の染料に対して以前に測定された値に匹敵するものである。
　第４図は分割された細胞（ＬＬＣ−ＰＫ１；ａｔｔｃ）内の染色体の走査画像であり、紫外線で励起可能な蛍光染料（３３２５８；ヘキスト）でラベル付けされたセルーラＤＮＡを用いた。画像認識時間は１３秒で、これは数分の漂白時間に比して短いものである。さらに数分の間走査レーザによって照射した後においても、これら生きた細胞内には何らの劣化も現れなかった。
　第５図にビード７２の光漂白による輝度の減少された水平断面７０によって示されるように長時間の蛍光ビードの走査の間の光漂白は焦点面の回りの約２マイクロメーターの厚みの薄片においてのみ発生している。このビードは一定の焦点面において約６分間走査されたものである。同様の漂白の局所化は蛍光で染色された細胞核においても検出された。この局所化は単一光子励起の使用に対して明らかな利点を示しており、単一光子励起では一つの面が画像化される場合においてさえ、試料全体が漂白されてしまう。このことは単一光子励起ゆえであって、走査を広い視野の観察の両方における漂白は時間平均の励起強度に依存し、その強度は軸方向すなわち第１図のＺ方向に沿って変化しない。２光子励起においては漂白は焦点面の上側もしくは下側においては大きく低下する時間平均強度に依存する。
　励起強度の２乗に依存する蛍光信号は２光子励起のいま一つの利点に対応するものであって、このような励起は空間フィルタとして使用されるピンホールを用いる必要なしに全視野を視覚する、例えばＣＣＤアレイのような検出器を用いた場合にさえ試料の光学的な裁断効果をもたらす。第５図に図示されているように、この裁断効果は対物レンズにおける色収差や従来の共焦レーザ走査顕微鏡のスループット損失に関連する深刻な問題を回避することができる。２光子光分解はケージド（ｃａｇｅｄ）ＣＡ＋＋、Ｈ＋、ヌクレオチドや神経伝達媒体などの生物学的に活性な化学物質の高速かつ局所的な放出にも適用することができる。
　例えばケージド神経伝達物質が、走査ビームによって放出されたときに、発生された全細胞転移膜電流は、細胞表面上のそれら神経伝達物質に対する受容体活動の分布をマップ化するためのコントラスト発生機構として使用することができる。本発明によれば、２光子かご閉込光分解の実現可能性が、ＤＭＮＰＥでケージドＡＴＰ（３３ｍＭ）［オレゴン・オイジーンのモレキュラー　プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）によって提供される］を照射することによって、対物面において約１０マイクロメータの直径のくびれのビームに結像されるコライディング・パルス・モード・ロック・ダイレーザ１６によって証明された。ＡＴＰ約１０−１１モルの光分解量が、カリホルニヤ、サンジエゴのカルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）によって提供されるルシフェリンバイオルミネッサンス検定を用いて測定された。典型的には、約１０７（μｍ）３のアリコート体積内のＡＴＰの約１０％が約６００秒の間に、約１０４（μｍ）３の照射体積内において光分解された。
　本発明による２光子励起は、単一紫外線光子の励起に対応する励起エネルギーへの可視光によるアクセスをあたえるので、全く新しいクラスの蛍光体や蛍光指示薬が３次元分解能を有するレーザ走査顕微鏡に受け入れ可能となった。この種の指示薬として、Ｃａ＋２に対してはＩｎｄｏ−１、Ｍｇ＋２に対してはＭａｇ−Ｉｎｄｏ−１、Ｎａ＋に対してはＡＢＦ１、Ｋ＋に対してはＰＢＦ１等がある。
これら化合物の多くについて２光子吸収断面積は未だ知られていないが、２光子吸収には異なる選択則が適用され、分子の不整は同じ励起状態への１光子および２光子遷移の両方を可能にする。Ｉｎｄｏ−１、ＦＵＲＡ−２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、ＤＡＮＳＹＬヒドラジン［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ］、Ｓｔｉｌｂｅｎｅ４２０［Ｅｘｃｉｔｏｎ　Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｄａｙｔｏｎ，ＯＨ］および複雑のクーマリン染料の１０ｍＭの溶液から、直径２５μｍのくびれに弱く結像させたＣＭＰを用いた励起に際して可視蛍光が観察され、ＤＡＮＳＹＬとＣｏｕｍａｒｉｎ４４０の微結晶の２光子励起ＬＳＭ蛍光画像が記録された。
　本発明のいま一つの効用は書込みおよび読取り動作のための二つの横断ビームにおける多光子プロセスに依存する３次元の光学メモリ装置である。単一ビームは二つの横断ビームより簡単であり、最大の情報綴じ込み密度を可能にするであろう。多光子プロセスは焦点において極めて高い強度の領域に局所化され、第５図に示す例では蛍光ビードの内側の顕微鏡パターンの漂白は現行の蛍光体で約１０３回読取り可能な高密度書込み専用メモリを構成する。
　以上のように生物学的な或は他の応用のための実用的な２光子レーザ走査顕微鏡が図示されて、かつ説明された。２光子励起の蛍光顕微鏡は共焦点レーザ走査顕微鏡によって得られるものと匹敵するような視野深度を有する固有の３次元的な分解能を与える。２光子励起との関係で共焦点ピンホールを用いると、３軸すべてに沿って分解能を改善することができる。背景蛍光は異なった入力パワーの下で記録された画像の定量化された減算によって取り除くことができる。この技術を用いると光漂白ならびに光力学的なダメージは焦点面の近傍に限定することができ、それによって、細胞や蛍光体に対する紫外線によるダメージはエネルギが実際に集められる体積に限定されることから、３次元的な再構成のためのデータの認識のための共焦点レーザ走査顕微鏡法および領域検出画像化いずれに対しても相当な利点を与えることができる。このことは光分解や光活性化などの光化学プロセスを結像体積内に鋭く局所化することを可能にする。本発明は主として単一レーザを用いた２光子励起の利用について説明したが、足し合わすことによって目的物質の励起波長になる二つの異なる波長を有する二つの光源からの二つの光子を用いることによっても目的物質の励起を発生することができる。例えば二つの異なるレーザ光源はそれらの出力ビームを顕微鏡の光路に共軸的に指向させることによって用いることができる。さらには周波数の２倍化手段を用いて二つの異なる波長を単一の光源から発生することもできる。
　以上のように本発明は好ましい実施例との関係で記述したが、添付の請求の範囲において規定された本発明の技術思想と範囲を逸脱することなく、種々の変形や修正が当業者にとって可能である。
（５７）【特許請求の範囲】
１．目的物（２０）の２光子レーザ走査蛍光顕微鏡装置（１０）は、
　特性エネルギの単一光子により励起されて蛍光光子を発生する蛍光成分を含む目的物（２０）を支持するステージ手段（２２）と、
　光を上記ステージ手段に指向させるように配置されるとともに上記ステージ手段（２２）における上記目的物（２０）内に目標面を有する結像手段（４０，１２）と、
　上記特性エネルギより低いエネルギの光子からなるサブピコ秒の単色コヒーレント光パルスの反復発生源（１６）と、
　上記コヒーレント光パルスを上記結像手段を含む光路に沿って指向させる手段とからなり、
　上記結像手段（４０，１２）は上記目標面上の結像体積（２６）に上記光パルスを結像させて、上記ステージ手段（２２）における目的物（２０）に入射させ、複数の光子が組合さって上記蛍光成分内に２光子蛍光を誘起する
２光子レーザ走査蛍光顕微鏡装置（１０）。
２．上記反復発生源（１６）からの上記光は上記結像手段（４０，１２）によってサブミクロンの直径の結像体積（２６）を形成するように結像される、請求項１の装置。
３．上記結像手段（４０，１２）は、上記目標面（１８）の相対向する側で収束し、発散する光を生成するため上記光を円錐形状に結像し、それによって上記光は上記目標面（１８）上の上記結像体積（２６）に集中される、請求項１又は２の装置。
４．上記結像体積（２６）とステージ手段（２２）との相対位置は可変である、請求項１から３のいずれか１に記載の装置。
５．上記結像手段（４０，１２）は上記目的物（２０）内の上記結像体積（２６）に上記光を結像させ、ある制限された楕円体積内において蛍光を励起する光強度を発生させる、請求項１から３のいずれか１に記載の装置。
６．特性エネルギの単一光子によって蛍光光子を発生するように励起される蛍光成分を含む目的物（２０）に対し２光子励起技術を用いたレーザ走査蛍光顕微鏡法は、以下のステップを有する：
　上記特性エネルギより低いエネルギの光子からなる単色コヒーレントレーザ光の強いサブピコ秒のパルスのビームで上記目的物（２０）を反復して照射する；および
　上記目的物（２０）内の小さな結像体積（２６）に上記照射光を結像して、上記結像体積においてのみ入射する２個の照射光子の同時吸収による分子励起を誘起するに十分な高い照射強度を生成し、上記蛍光成分内に蛍光を誘起するとともに誘起された蛍光を検出する。
７．入射光子のエネルギは特性エネルギの半分である、請求項６の方法。
８．上記結像手段（４０，１２）は上記目的物（２０）内において異なる深さの結像体積（２６）を選択しうるように調節可能である、請求項１の装置。
９．既知の特性エネルギの光による単一光子励起に対応する２光子分子励起を目的物（２０）内に誘起するための装置（１）は、
　　目標面（１８）と、
　　上記目標面に生物学的目的物を支持する手段（２２）と、
　　上記特性エネルギより低いエネルギを有する光子からなるサブピコ秒の光パルスの供給手段（１６）と、
　　上記目標面に隣接して位置決めされた結像手段（４０，１２）とからなり、
　上記光子の光パルスを上記結像手段（４０，１２）を含む光路に沿って指向させて光子を上記目的物に入射させ、上記結像手段（４０，１２）は上記光子を上記目的物内の結像体積（２６）に結焦させ、上記特性エネルギより低い入射光子を上記結像体積（２６）内において上記目的物内に２光子分子励起を誘起するに十分なエネルギを生成することを特徴とする、２光子分子励起を目的物（２０）
内に誘起するための装置（１）。
１０．上記生物学的目的物（２０）に関して上記結像体積（２６）を移動させる走査手段（３２，３４）をさらに含む、請求項９の装置。
１１．上記目的物は、既知の特性エネルギを持つ単一光子によって通常は励起されるとともに、上記特性エネルギより低いエネルギを有する少なくとも２つの光子に対して上記励起を生ずる生物学的細胞を含む、請求項１，９又は１０に記載の装置。
１２．上記レーザ光源と光路は、生物学的に活性な化学物質の局所的な放出を発生させるように上記結像体積における励起に応答して目的物を走査するように適合されている、請求項１１の装置。
１３．上記目的物は光子活性化試薬である、請求項９又は１０の装置。
１４．上記目的物は光学メモリを有する、請求項９又は１０の装置。
１５．上記目的物は、上記誘起された分子励起に応答して生物学的に活性な化学物質を放出する、請求項９の装置。
１６．上記誘起された分子励起は上記目的物内に対応する蛍光を発生し、上記装置は上記目的物内において結像体積を移動させる走査手段および
　上記蛍光に応答して上記目的物内の蛍光体を図解する検出手段とをさらに含む、請求項１５の装置。
１７．上記目的物は、紫外光によって単一光子励起を生じ、上記光パルスは可視光である、請求項９の装置。
１８．上記サブピコ秒の光パルスを供給する手段が、少なくとも１つのレーザ光源を備える、請求項１又は９の装置。
１９．上記サブピコ秒の光パルスを供給する手段が、少なくとも２つの波長のパルスを生成し、各波長は上記既知の特性エネルギより低いエネルギの光子を含む、請求項１又は９の装置。
２０．上記目的物は、生物学的に活性な物質である、請求項１又は９の装置。
２１．上記目的物内において、上記結像体積を移動させて上記目的物の空間的に分解された分子励起を発生させる手段をさらに含む、請求項９の装置。
２２．レーザ走査顕微鏡（１０）を用いて、特性エネルギを有する光子によって励起可能な分子を含む生物学的な目的物（２０）の２光子分子励起を発生させる方法であって、
　上記特性エネルギより低いエネルギを有する高強度のレーザ光のサブピコ秒のパルスビームで上記目的物を照射するステップと、
　上記照射を上記目的物（２０）内の小さい結像体積に結像させて、上記結像体積内においてのみ、少なくとも２個の上記入射照射光子の同時吸収によって２光子分子励起を生成するのに十分高い照射強度を生成するステップとからなる
生物学的な目的物（２０）の２光子分子励起を発生させる方法。
２３．上記入射光子は上記特性エネルギの少なくとも半分である、請求項２２による方法。
２４．上記目的物は、生物学的に活性なケージド分子を含んでおり、上記結像体積内の照射強度は入射光子の同時吸収により生物学的に活性なケージド化合物を放出させるのに十分である、請求項２２又は２３の方法。
２５．上記目的物は、蛍光を発生する励起に応答する生物学的細胞を含み、さらに、上記蛍光を測定することを含む、請求項２２又は２３の方法。
２６．上記目的物は、光学メモリであり、さらに上記蛍光を測定することを含む、請求項２２又は２３の方法。