(57)【要約】抗ウイルス活性を有するランダム配列オリゴヌクレオチドおよびその抗ウイルス薬としての使用について記載する。多くの場合、オリゴヌクレオチドは、40より大きいヌクレオチド長を有し、かつ例えば修飾されたヌクレオチド間結合およびリボース部分の2'位の修飾などの化学修飾を含む。ヒトおよび動物のウイルス感染の予防または処置のための使用、ならびにヒトおよび動物のオンコウイルスを原因とする癌の予防または処置のための使用も記載する。これら使用は典型的に、そのような処置を必要とするヒトまたは動物に対して、配列非依存的な作用様式により作用する、薬理学的に許容される治療有効量の少なくとも一種のオリゴヌクレオチドを投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド内の少なくとも50%のそのヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾され、かつ少なくとも50%のそのヌクレオチド間結合が修飾されているオリゴヌクレオチドであって、標的ウイルスに対する抗ウイルス活性を有し、該活性が、大部分は配列非依存的な作用様式により作用するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
オリゴヌクレオチド内の少なくとも50%のそのヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾され、かつ少なくとも80%のそのヌクレオチド間結合が修飾されているオリゴヌクレオチドであって、標的ウイルスに対する抗ウイルス活性を有し、該活性が、大部分は配列非依存的な作用様式により作用する、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
オリゴヌクレオチド内の少なくとも80%のそのヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾され、かつ少なくとも80%のそのヌクレオチド間結合が修飾されているオリゴヌクレオチドであって、標的ウイルスに対する抗ウイルス活性を有し、該活性が、大部分は配列非依存的な作用様式により作用する、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
オリゴヌクレオチド内の少なくとも90%のそのヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾され、かつ少なくとも90%のそのヌクレオチド間結合が修飾されているオリゴヌクレオチドであって、標的ウイルスに対する抗ウイルス活性を有し、該活性が、大部分は配列非依存的な作用様式により作用する、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
オリゴヌクレオチド内の少なくとも100%のそのヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾され、かつ少なくとも100%のそのヌクレオチド間結合が修飾されているオリゴヌクレオチドであって、標的ウイルスに対する抗ウイルス活性を有し、該活性が、大部分は配列非依存的な作用様式により作用する、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
修飾された結合が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合およびボラノホスフェート結合からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
オリゴヌクレオチド内の少なくとも50%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において2'-OMe部分を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
オリゴヌクレオチド内の少なくとも50%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において2'-メトキシエトキシ置換を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
少なくとも30ヌクレオチド長である、請求項1〜8のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
A、T、U、C、GおよびIからなる群より選択される、少なくとも10個の連続するヌクレオチドのホモポリマー配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
ポリAT、ポリAC、ポリAG、ポリAU、ポリAI、ポリGC、ポリGT、ポリGU、ポリGI、ポリCT、ポリCU、ポリCIおよびポリTIからなる群より選択される、少なくとも10ヌクレオチド長の配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチド内の少なくとも15%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において、2'-メトキシエトキシまたは2'OMe置換を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
リンカーで連結された2個またはそれ以上のオリゴヌクレオチド配列からなる鎖状体である、請求項1〜12のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
1個または複数のヌクレオチド残基において、オリゴヌクレオチドの性質を変更して、より高い安定性、血清とのより低い相互作用、より高い細胞取り込み、ウイルスタンパク質とのより高い相互作用、送達用に調合するための改善された能力、検出可能なシグナル、より高い抗ウイルス活性、より良好な薬物動態学的性質、特定の組織分布、より低い毒性からなる群より選択される一つまたは複数の性質を獲得する分子に対して結合または複合化されている、請求項1〜13のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
二本鎖である、請求項1〜14のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
DNAウイルスまたはRNAウイルスを標的とする、請求項1〜15のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
ヘルペスウイルス科、HSV-1、HSV-2、CMV、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス6Aおよび6B、ヘパドナウイルス科、HBV、パルボウイルス科、ポックスウイルス科、パピローマウイルス科、アデノウイルス科、レトロウイルス科、HIV-1、HIV-2、パラミクソウイルス科、RSV、パラインフルエンザウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ブニヤウイルス科、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ピコルナウイルス科、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、フラビウイルス科、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、C型肝炎ウイルス、フィロウイルス科、エボラウイルス、マールブルグウイルス、オルトミクソウイルス科、インフルエンザウイルス、トガウイルス科、西部馬脳炎ウイルス、コロナウイルス科、レオウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ラッサ熱ウイルスならびにカルシウイルス科からなる群のメンバーを標的とする、請求項1〜16のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
REP 1001、REP 2001、REP 3007、REP 2004、REP 2005、REP 2006、REP 2007、REP 2008、REP 2017、REP 2018、REP 2020、REP 2021、REP 2024、REP 2036、A20、G20、C20、REP 2029、REP 2031、REP 2030、REP 2033、REP 2055、REP 2056、REP 2057、REP 2060およびREP 2107のいずれか一つに示されるようなオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか一項記載の少なくとも2種の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチドの混合物を含む、オリゴヌクレオチド混合物。
【請求項２０】
請求項1〜18のいずれか一項記載の少なくとも10種の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチドの混合物を含む、オリゴヌクレオチド混合物。
【請求項２１】
請求項1〜18のいずれか一項に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容される抗ウイルスオリゴヌクレオチド；および
薬学的に許容される担体
を含有する、抗ウイルス薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項1〜18のいずれか一項に定義される抗ウイルスオリゴヌクレオチドの少なくとも一種を、ラベルを貼ったパッケージ内に含むキットであって、該オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性が、主として配列相補的ではない作用様式により生じ、該パッケージ上のラベルが、該抗ウイルスオリゴヌクレオチドを少なくとも一種のウイルスに対して使用できることを示すキット。
【請求項２３】
少なくとも2種の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチドの混合物を含む、請求項22記載のキット。
【請求項２４】
治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容されるポリピリミジンオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む抗ウイルス薬学的組成物であって、該オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性が主として配列非依存的な作用様式により生じる、抗ウイルス薬学的組成物。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項24記載の抗ウイルス薬学的組成物。
【請求項２６】
インビボの酸性部位への投与用に調合されている、請求項24または25のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７】
経口、経膣、または局所投与に適合している、請求項24〜26のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２８】
少なくとも一つのポリCオリゴヌクレオチドを含む、請求項24〜27のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２９】
少なくとも一つのポリTオリゴヌクレオチドを含む、請求項24〜27のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３０】
少なくとも一つのポリCTオリゴヌクレオチドを含む、請求項24〜27のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３１】
そのヌクレオチド間結合の少なくとも50%が修飾されていたオリゴヌクレオチドであって、標的ウイルスに対する抗ウイルス活性を有し、該活性が、大部分は配列非依存的な作用様式により作用する、少なくとも80%のピリミジン残基を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
そのヌクレオチド間結合の少なくとも80%が修飾されている、請求項31記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
そのヌクレオチド間結合の少なくとも80%が修飾されており、かつ100%のピリミジン残基を有する、請求項31記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
そのヌクレオチド間結合の少なくとも100%が修飾されており、かつ少なくとも80%のピリミジン残基を有する、請求項31記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
そのヌクレオチド間結合の少なくとも100%が修飾されており、かつ100%のピリミジン残基を有する、請求項31記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
修飾された結合が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合およびボラノホスフェート結合からなる群より選択される、請求項31〜35のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
修飾された結合がホスホロチオエート結合である、請求項31〜35のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
ピリミジン残基がシトシン残基である、請求項31〜37のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
ピリミジン残基がチミン残基である、請求項31〜37のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
ピリミジン残基がシトシン残基またはチミン残基である、請求項31〜37のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
少なくとも30ヌクレオチド長である、請求項31〜40のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
少なくとも40ヌクレオチド長である、請求項31〜40のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
含有されるヌクレオチドの少なくとも15%がリボース部分の2'位において2'-メトキシエトキシまたは2'-OMe置換を含む、請求項31〜42のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
リンカーで結合された2個またはそれ以上のオリゴヌクレオチド配列からなる鎖状体である、請求項31〜43のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
１個または複数のヌクレオチド残基において、オリゴヌクレオチドの性質を変更して、より高い安定性、血清とのより低い相互作用、より高い細胞取り込み、ウイルスタンパク質とのより高い相互作用、送達用に調合するための改善された能力、検出可能なシグナル、より高い抗ウイルス活性、より良好な薬物動態学的性質、特定の組織分布、より低い毒性からなる群より選択される一つまたは複数の性質を獲得する分子に対して結合または複合化されている、請求項31〜44のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
二本鎖である、請求項31〜45のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
DNAウイルスまたはRNAウイルスを標的とする、請求項31〜46のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
ヘルペスウイルス科、HSV-1、HSV-2、CMV、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス6Aおよび6B、ヘパドナウイルス科、HBV、パルボウイルス科、ポックスウイルス科、パピローマウイルス科、アデノウイルス科、レトロウイルス科、HIV-1、HIV-2、パラミクソウイルス科、RSV、パラインフルエンザウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ブニヤウイルス科、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ピコルナウイルス科、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、フラビウイルス科、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、C型肝炎ウイルス、フィロウイルス科、エボラウイルス、マールブルグウイルス、オルトミクソウイルス科、インフルエンザウイルス、トガウイルス科、西部馬脳炎ウイルス、コロナウイルス科、レオウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ラッサ熱ウイルスならびにカルシウイルス科からなる群のメンバーを標的とする、請求項31〜46のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項31〜48のいずれか一項記載の少なくとも2種の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチドの混合物を含む、オリゴヌクレオチド混合物。
【請求項５０】
請求項31〜48のいずれか一項記載の少なくとも10種の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチドの混合物を含む、オリゴヌクレオチド混合物。
【請求項５１】
請求項31〜48のいずれか一項に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容される抗ウイルスオリゴヌクレオチド；および
薬学的に許容される担体
を含有する、抗ウイルス薬学的組成物。
【請求項５２】
インビボの酸性部位への投与用に調合されている、請求項51記載の組成物。
【請求項５３】
経口、経膣、または局所投与に適合している、請求項51〜52のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５４】
請求項31〜48のいずれか一項に定義される抗ウイルスオリゴヌクレオチドの少なくとも一種を、ラベルを貼ったパッケージ内に含むキットであって、該オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性が、主として配列相補的ではない作用様式により生じ、該パッケージ上のラベルは、該抗ウイルスオリゴヌクレオチドが少なくとも一種のウイルスに対して使用できることを示すキット。
【請求項５５】
少なくとも2種の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチドの混合物を含む、請求項54記載のキット。
【請求項５６】
治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容されるポリピリミジンオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む抗ウイルス薬学的組成物であって、該オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性が主として配列非依存的な作用様式により生じる抗ウイルス薬学的組成物；および薬学的に許容される担体。
【請求項５７】
オリゴヌクレオチドが修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項56記載の抗ウイルス薬学的組成物。
【請求項５８】
インビボの酸性部位への投与用に調合されている、請求項56または57記載の組成物。
【請求項５９】
粉末形態である、請求項56〜58のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６０】
経口、経膣または局所投与に適合している、請求項56〜58のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６１】
少なくとも一つのポリCオリゴヌクレオチドを含む、請求項56〜58のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６２】
少なくとも一つのポリTオリゴヌクレオチドを含む、請求項56〜58のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６３】
請求項1〜18および31〜48のいずれか一項に定義される、少なくとも一種の薬理学的に許容されるオリゴヌクレオチドの、対象におけるウイルス感染の予防または処置のための医薬の製造における使用。
【請求項６４】
請求項1〜18および31〜48のいずれか一項に定義される、少なくとも一種の薬理学的に許容されるオリゴヌクレオチドの、対象におけるウイルス感染の予防または処置のための使用。
【請求項６５】
請求項19、20、49または50に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容されるオリゴヌクレオチド混合物の、対象におけるウイルス感染の予防または処置のための医薬の製造における使用。
【請求項６６】
請求項19、20、49または50に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容されるオリゴヌクレオチド混合物の、対象におけるウイルス感染の予防または処置のための使用。
【請求項６７】
請求項21、24〜30、51〜53および56〜62のいずれか一項に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容される抗ウイルス薬学的組成物の、対象におけるウイルス感染の予防または処置のための医薬の製造における使用。
【請求項６８】
請求項21、24〜30、51〜53および56〜62のいずれか一項に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容される抗ウイルス薬学的組成物の、対象におけるウイルス感染の予防または処置のための使用。
【請求項６９】
請求項1〜18および31〜48のいずれか一項に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容されるオリゴヌクレオチドの、ヒトまたはヒトではない動物内でオンコウイルスに起因する癌の予防的処置のための医薬の製造における使用。
【請求項７０】
請求項1〜18および31〜48のいずれか一項に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容されるオリゴヌクレオチドの、ヒトまたはヒトではない動物内でオンコウイルスに起因する癌の予防的処置のための使用。
【請求項７１】
請求項19、20、49または50に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容されるオリゴヌクレオチド混合物の、ヒトまたはヒトではない動物内でオンコウイルスに起因する癌の予防的処置のための医薬の製造における使用。
【請求項７２】
請求項19、20、49または50に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容されるオリゴヌクレオチド混合物の、ヒトまたはヒトではない動物内でオンコウイルスに起因する癌の予防的処置のための使用。
【請求項７３】
請求項21、24〜30、51〜53、および56〜62のいずれか一項に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容される抗ウイルス薬学的組成物の、ヒトまたはヒトではない動物内でオンコウイルスに起因する癌の予防的処置のための医薬の製造における使用。
【請求項７４】
請求項21、24〜30、51〜53、および56〜62のいずれか一項に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容される抗ウイルス薬学的組成物の、ヒトまたはヒトではない動物内でオンコウイルスに起因する癌の予防的処置のための使用。
【請求項７５】
インビボの酸性部位への投与に適合された、請求項51〜53のいずれか一項に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容される抗ウイルス薬学的組成物の、対象における酸性環境内のウイルス感染の予防または処置のための医薬の製造における使用。
【請求項７６】
インビボの酸性部位への投与に適合された、請求項51〜53のいずれか一項に定義される、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容される抗ウイルス薬学的組成物の、対象における酸性環境内のウイルス感染の予防または処置のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、抗ウイルス活性を有するオリゴヌクレオチド、並びにヒト及び動物のウイルスにより起きるウイルス感染、癌遺伝子ウイルスにより起きる癌及び病因がウイルスに基づくそのほかの疾患における治療剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
以下の記述は、単に読者の理解を助けるために提供されるのであって、記述された情報又は引用された文献のいかなるものも本発明の先行技術を構成することを容認するものではない。
【０００３】
人類を苦しめる多数の重大な感染症はウイルスによって引き起こされる。狂犬病、天然痘、灰白髄炎、ウイルス性出血熱、肝炎、黄熱病、免疫不全症、及び種々の脳炎を含む、これら多数の疾患は、致命的であることが多い。そのほかの疾患も、呼吸障害及び消化器障害と同様にインフルエンザ、麻疹、おたふく風邪、水痘のように伝染性であり、急性の不快感を生じさせるという点で重要である。風疹やサイトメガロウイルスのようなものは、先天異常を生じさせる。最後に、ヒトや動物で癌を生じさせうる腫瘍ウイルスとして知られるウイルスがある。
【０００４】
ウイルスの中でも、ヘルペスウイルス科は大変興味深い。ヘルペスウイルス科は遍在する部類の十二面体の二本鎖DNAのウイルスである。性状分析された100を超えるヘルペスウイルス（HHV）科のうち8種類だけがヒトに感染する。これらの中で最もよく知られているのは、単純疱疹ウイルス1（HSV-1）、単純疱疹ウイルス２（HSV-2）、水痘帯状疱疹ウイルス（水痘又は帯状疱疹）、サイトメガロウイルス（CMV）及びエプステイン・バーウイルス（EBV）である。ヘルペスウイルスのヒトにおける蔓延は高く、全世界人口の少なくとも1/3が冒され、米国では人口の70〜80%が何らかのヘルペス感染を有する。ヘルペス感染の病態は、通常は口の周りや顔にすぐに直る病変を生じさせるだけであるHSV-1の場合のように、通常危険ではない一方で、これらのウイルスが、さらに危険な症状の原因になりうることも知られており、それは、性器潰瘍及び分泌物から、脳炎（致死率15%）や播種性の感染（致死率40%）を招く可能性がある致命的な感染まで異なる。
【０００５】
ヘルペスウイルスは自然界では播種性が高く、ヒトに対して病原性が高い。たとえば、エプステイン・バーウイルス（EBV）は、小児期後期もしくは青年期又は成人初期で感染性単球増多症を生じさせることが知られている。急性感染性単球増多症の顕著な特徴は、喉の痛み、発熱、頭痛、リンパ節症、扁桃腺肥大及び末梢血における異型のリンパ球分裂である。そのほかの徴候には軽い肝炎、脾臓肥大及び脳炎が挙げられることが多い。EBVはまた、癌：バーキットリンパ腫（BL）及び鼻咽腔癌（NPC）に関係する。赤道アフリカの流行域では、BLは最も一般的な小児悪性腫瘍であり、小児における癌のおよそ80%を占める。NPCは北アメリカの白人ではほどほどに認められるが、中国南部では25〜55歳の年齢で生じる最も一般的な癌の1つである。サイトメガロウイルスと同様に、EBVは、移植後のリンパ増殖性疾患に関係しており、それは、固形臓器又は骨髄の移植後の慢性免疫抑制の致命的な合併症になりうる。
【０００６】
たとえば、中心性網脈絡膜炎又は角結膜炎のような皮膚や眼の感染を含むそのほかの疾患もHSVに関係する。米国では1年におよそ300,000例の眼のHSV感染が診断される。
【０００７】
AIDS（後天性免疫不全症候群）はヒト免疫不全ウイルス（HIV）により引き起こされる。身体の免疫系の細胞を殺す又は損傷することによって、HIVは感染及び特定の癌と闘う身体の能力を漸進的に破壊する。現在、世界中でおよそ4200万人の人々がHIV／AIDSと共に暮らしている。2002年にはHIV/AIDSに関係した原因で総計310万人が死亡した。抗HIV薬物療法の最終的な目標はウイルスが再生して免疫系を損傷するのを妨げることである。HIVに対する過去15年間にわたる闘いで実質的な進歩は遂げられているが、治療は未だに医学をかわしている。今日、内科医は、この疾患を管理するのに3種の異なる薬剤クラスの多数の抗ウイルス剤を有している。通常2又は3種のクラスの薬剤が、HAART（高活性抗レトロウイルス治療）として知られる多様な組み合わせで調合される。HAART療法は通常2つのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤を、プロテアーゼ阻害剤又は非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のいずれかの第3の薬剤と共に含む。臨床試験によって、HAARTは、ウイルス負荷を軽減し、薬剤耐性の可能性をできるだけ抑える最も有効な手段であることが判っている。
【０００８】
HAARTは一般にウイルス負荷として知られる体内のHIVの量を減らすことが示されているが、何万という患者がこの療法で重大な問題に遭遇している。副作用には重篤なものもあり、脂肪代謝の異常、腎臓結石及び心疾患が挙げられる。たとえば、悪心、吐き気及び不眠のようなそのほかの副作用はさほど重篤ではないが、一生、慢性的な薬剤療法を必要とするHIV患者にとっては依然として問題である。
【０００９】
現在認可されている抗HIV剤は、HIVが感染したCD4+T細胞に入り、逆転写酵素又はプロテアーゼいずれかのウイルス酵素の機能を阻止することによって作用する。HIVは再生するためにこれらの酵素を必要としている。しかしながら、HIVは度々突然変異して、逆転写酵素又はプロテアーゼの阻害剤がこれらの耐性株に対して効かないようにする。いったん耐性が生じると、ウイルス負荷が上昇し、効かない薬剤を別の抗レトロウイルス剤に交換する必要を強いられる。残念ながら、ウイルスがあるクラスの1つの薬剤に耐性になると、そのクラスの別の薬剤の有効性も低くなる。多数の抗HIV剤が類似の様式で作用するので、交差耐性として知られるこの現象が生じる。薬剤の交差耐性の発生は、患者にとって利用できる治療選択肢が減るので極めて望ましくない。
【００１０】
従って、ウイルスが耐性を発現していないほかの作用機序を介して作用する、HIVに対して有効なそのほかの抗ウイルス剤の開発に対して大きなニーズがある。ヨーロッパで新たにHIVと診断された患者の10人に1人が市場にある認可された薬剤の少なくとも1種にすでに耐性であるHIV株に感染しているという最近のデータを考えると、このことは、特に重要になりつつある。
【００１１】
呼吸器多核体ウイルス（RSV）は、上下気道に感染を起こす。それは、マイナス鎖のエンベロープ型RNAウイルスであり、感染性が高い。それは幼年の小児を一般に冒し、幼児の下部気道疾病の最も一般的な原因である。RSVの感染は通常、中程度から重篤な風邪のような症状と関係する。しかしながら、いかなる年齢でも、特に高齢の又は免疫障害のある患者では重篤な下部気道疾患が生じる可能性がある。重篤な感染のある小児は酸素療法、及び特定の症例では機械的人工呼吸を必要とする可能性がある。全米医師会によれば、RSV感染が原因であることが多い、細気管支炎のために入院する小児の数が増えている。RSV感染はまた、骨髄移植センタ-の患者における地域関連型の呼吸器ウイルス感染のおよそ1/3の原因である。高齢集団では、RSV感染は最近では、重篤度においてインフルエンザウイルス感染に非常に類似すると認識されている。
【００１２】
流感としても知られているインフルエンザ（INF）はインフルエンザウイルスにより生じる伝染病である。それはヒトの気道（鼻、喉及び肺）を攻撃する。米国では年に平均約36,000人がインフルエンザで死亡し、年に114,000人がインフルエンザのために入院している。インフルエンザは近年、以前に動物にのみ見つかっているより高い病原性を有する株（例えば鳥インフルエンザ）の出現が、さらに深刻な懸念となっている。
【００１３】
あらゆる感染性疾患において、所定の療法の有効性は、宿主の免疫応答に依存することが多い。潜在性感染を確立するすべてのヘルペスウイルスの能力により、免疫障害のある患者において再活性化した感染が極めて高い発生率で生じるので、これはヘルペスウイルスに特にあてはまる。腎移植患者では、40〜70%がHSVの潜在感染を再活性化させ、80〜100%がCMV感染を再活性化させる。そのようなウイルスの再活性化は、AIDS患者でも認められる。
【００１４】
B型肝炎ウイルス（HBV）は、ウイルスの肝炎ウイルス科に属するDNAウイルスである。HBVはヒトにおいてB型肝炎を発症させる。世界で20億人が感染していると推定される（3人に1人）。約3億5000万人は慢性的に感染したままであり、毎年、推定100万人がB型肝炎及びその合併症で死亡している。HBVは、生涯にわたる感染、肝硬変、肝癌、肝不全及び死を引き起こす。ウイルスは血液及び体液を介して伝染する。これは、血液と血液の直接的接触、無防備な性交、不潔な針の使用を介して、又、出産過程で感染した女性から新生児へと起こりうる。感染する健常な成人のほとんど（90%）は回復し、将来のB型肝炎感染への防御抗体を作る。少数（5〜10%）がウイルスを始末することができず、慢性の感染を煩うが、幼児の90%及び50%までの幼年小児はウイルスに感染した際、慢性の感染を煩う。α-インターフェロンは、使用する治療剤の最も頻度の多いタイプである。インフルエンザ様の症状、鬱、発疹、そのほかの反応及び血球数の異常を含む重大な副作用がこの治療に関係する。もう1つの治療選択肢には、その使用に関連した多数の副作用を有する3TCが挙げられる。ここ数年  、3TCで治療した患者がHBVの耐性株を発現していることを示す報告の数が増えている。このことは、HBVとHIVを同時感染した患者集団で特に問題である。このウイルスに対する新たな抗ウイルス剤を開発する緊急の必要性が明らかにある。
【００１５】
C型肝炎ウイルス（HCV）の感染は、感染患者数が400万人を超えると思われる米国で最も一般的な血液由来の慢性感染である。この一般的なウイルスの感染は、米国における肝硬変及び肝癌の主な原因であり、今や肝臓移植の主な理由である。感染からの回復は一般的ではなく、感染患者の約85パーセントは慢性のウイルス保有者になり10〜20パーセントは肝硬変を発症する。現在、世界で1億7000万人が慢性保有者であると推定される。疾病対策センタ-によれば、米国だけで毎年、8,000〜10,000人が慢性C型肝炎で死亡し、約1,000人が肝臓移植を受けている。C型肝炎に利用できるワクチンはない。インターフェロンα、又はインターフェロンとリバビリンの併用による長い治療法は約40パーセントの患者にしか有効ではなく、有意な副作用を生じさせる。
【００１６】
今日、ウイルス感染の治療の見通しは一般によくない。一般に、ウイルスに対する治療は平凡な有効性しか有さず、有効投与量の投与の妨げになるか又は長期の治療を妨げる強い副作用と関係している。これらの問題を例示する3つの臨床状況は、ヘルペスウイルス、HIV及びRSVの感染である。
【００１７】
ヘルペスウイルスの場合、診療所での使用が現在認可されている5つの主な治療薬がある：イドクスウリジン、ビダラビン、アシクロビル、フォスカーネット及びガンシクロビルである。限られた有効性を有するが、これらの治療も副作用を伴う。イドクスウリジンで治療を受けた患者の35%でアレルギー反応が報告されており、ビダラビンは患者の15%で胃腸障害を生じさせ、ヌクレオシド類縁体であるアシクロビル、フォスカーネット及びガンシクロビルは宿主細胞でのDNA複製に影響を及ぼす。ガンシクロビルの場合、この薬剤で治療を受けたAIDS患者の40%で好中球減少症及び血小板減少症が報告されている。
【００１８】
HIV感染を治療するために現在利用可能な多数の異なる薬剤があるが、これらはすべて、患者が妥当な生活の質を得るには、多大な補足的投薬を必要とするに十分なほど強力な副作用と関係している。HIVの薬剤耐性株の追加的問題（ヘルペスウイルス科感染にも見られる問題）は通常、治療カクテルの周期的変更を要し、場合によっては感染を極めて治療しにくくする。
【００１９】
乳児でのRSV感染の治療は、新薬開発の緊急の必要性のもう1つの例である。この場合、通常の治療法は、隔離テントの中で微粒子のエアゾールを用いた吸入によるリバビリンの送達である。リバビリンは、穏やかな効果しないだけでなく、その使用は重大な副作用に関係している。加えて、リバビリンには催奇形性が知られているので、薬剤の流出の可能性が病院職員に大きな懸念を抱かせてきた。
【００２０】
開発中の新しく出現する抗ウイルス性薬剤については、以下の3つの特徴、1．改善された有効性、2．軽減された副作用のリスク及び3.突然変異によってウイルスが克服しにくい作用メカニズムを取り入れることが極めて望ましいことは明らかである。
【００２１】
種々のアンチセンス手法によって特定のウイルスを阻害する試みが行われている。
【００２２】
Zamecnikらは、逆転写酵素プライマ-部位及びスプライスドナー／アクセプタ部位を特異的に標的としたONを用いた（Zamecnik et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143）（Goodchild & Zamecnik, 1989, 米国特許第4,806,463号）
【００２３】
Crooke及び共同研究者らは（Crooke et al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother., 36:527-532）HSV-1に対するアンチセンスを記載した。
【００２４】
Draperらは（1993, 米国特許第5,248,670号）Cat配列を有し、HSV-1遺伝子、UL13、UL39、及びUL40にハイブリッド形成する抗HSV活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを報告した。
【００２５】
Keanらは（Biochemistry, 34:14617-14620, 1995）、抗HSV作用剤としての、アンチセンスメチルホスホネートリゴマーの調査を報告した。
【００２６】
Peymanらは（Biol. Chem. Hoppe. Seyler, Mar, 376:195-198, 1995）、その抗ウイルス特性について、HSV-1のＩE110及びＵＬ30のmRNAに関する特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを報告した。
【００２７】
IE1、IE2又はDNAポリメラーゼをコードするCMVのmRNAを標的とするオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類縁体が、Andersonら（1997, 米国特許第5,591,720号）により報告された。
【００２８】
Hanecakらは（1999, 米国特許第5,952,490号）、保存されたGカルテット配列及び十分な数の隣接ヌクレオチドを有し、HSV-1のようなウイルスの活性を有意に阻害する修飾オリゴヌクレオチドを記載した。
【００２９】
Jairathらは（Antiviral Res., 33:201-213, 1997）RSVに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを報告した。
【００３０】
Torrenceらは（1999, 米国特許第5,998,602号）、RSVのアンチゲノム鎖（mRNA鎖）の一本鎖部分に相補的なアンチセンスを含む化合物、リンカー及びRNA分解酵素Lのオリゴヌクレオチド活性化剤を報告した。
【００３１】
Qiらは（Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi, 14:253-256, 2000）、コクサッキーウイルスB3におけるアンチセンスPS-オリゴヌクレオチド（PS-ON）を調べたことを報告した。
【００３２】
国際公開公報第9203051号（Roizman and Maxwell）は、HSVウイルスゲノムの肝要な領域又はそのmRNA転写物に相補的であり、抗ウイルス活性を示すメチルホスホネートアンチセンスオリゴマーを記載している。
【００３３】
グアノシン／チミジン又はグアノシン-リッチのホスホロチオエートのオリゴデオキシヌクレオチド（GT-PS-ON）は抗ウイルス活性を有することが報告されている。論文には、「幾つかの異なるPS含有のGTリッチON（B106〜140、Ｉ100〜12及びG106〜57）すべて長さは26又は27ntは、36（B106〜96、B106〜97）又は45ntから成るGTリッチONと同様にHIV-2の力価を下げるのに有効であった(表4）」。（Fennewald et al., Antiviral Res., 26:37-54, 1995）
【００３４】
米国特許第6,184,369号には、高い比率でグアノシン塩基を含有する抗HIV、抗HSV及び抗CMVのオリゴヌクレオチドが記載されている。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは三次構造を有し、この構造は、グアノシン四分子によって安定化される。さらなる態様では、この発明のオリゴヌクレオチド組成物は2つの隣接したデオキシグアノシンの2以上の種類を有する。この特許は、少なくとも2つの位置で少なくとも2つのG残基を包含するGリッチのオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）を請求している。
【００３５】
Cohenらは（米国特許第5,264,423号及び同第5,276,019号）HIVの複製の阻害を記載し、さらに詳しくは、正常な生きている細胞の存在下で外来の核酸の複製を妨げるのに使用することができるPS-ODN類縁体を記載している。Cohenらは、ウイルス配列に特異的なアンチセンスPS-ODNの抗ウイルス活性を記載している。彼らはまた14、18、21及び28量体のポリA、ポリT及びポリCのPS-ODNを調べたことを記載し、これらPS-ODNの抗ウイルス効果を示している。
【００３６】
Matsukuraらは（Matsukura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7706-7710, 1987）、上記Cohenらの米国特許に記載された結果を後になって公開した。
【００３７】
Gaoらは（Gao et al., J. Biol. Chem, 264:11521-11526, 1989）、7、15、21及び28ヌクレオチドのサイズにおけるポリA、ポリT及びポリCのPS-ODNを調べることによるPS-ODNによってHSV-2の複製が阻害されることを記載している。
【００３８】
Archambault, Stein及び Cohenは（Archambault et al., Arch. Virol., 139:97109, 1994）28ヌクレオチドのPS-ODNポリCがHSV-1に対して有効ではないことを報告している。
【００３９】
Steinらは（Stein et al., AIDS Res. Hum. Retrovir., 5:639-646, 1989）、一般に21〜28ヌクレオチドの長さの抗HIV ODNに関する追加データに関する結果を公表した。
【００４０】
Marshalらは（Marshall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6265-6269, 1992）、長さ4〜28ヌクレオチドのホスホロチオエート及びホスホロチオエートポリCオリゴの抗HIV-1効果を記載している。
【００４１】
Stein及びChengは（Stein et al., Science, 261:1004-1012, 1993）、概説論文の中で28ヌクレオチドの非特異的ODNの抗ウイルス活性について言及し、「PSオリゴの抗HIV特性は、非配列特異的な効果によって有意に影響され、すなわち、阻害効果は塩基配列に依存しない」と述べている。
【００４２】
概説論文の中で、Lebedeva及びSteinは（Lebedeva et al., Annul. Rev. Pharmacol., 41:403-419, 2001）、ウイルスタンパク質も含めて、PS-ODNの活性を結合する種々の非特異的タンパク質を報告している。彼らは、「これらの分子は生物学的に極めて活性が高く、相対的に人為物をアンチセンスと間違えやすいことが多い」と述べている。
【００４３】
Reinらは（米国特許第6,316,190号）、融合相手に連結され、抗ウイルス性化合物として使用することができるHIVのヌクレオカプシドに結合するGTリッチのONデコイを報告した。同様に、Campbellらは（Campbell et al., J. Virol., 73:2270-2279, 1999）、HIVのヌクレオカプシドに特異的に結合するが、抗ウイルス活性には関係しないTGTGTモチーフを持つPO-ODNを報告した。
【００４４】
Fengらは（Feng et al., J. Virol., 76:11757-11762, 2002）、組換えHIVのヌクレオカプシドに結合するが、抗HIV活性に関するデータの参照もないA（n）及びTG（n）のPO-ODNを記載した。
【００４５】
抗癌剤、抗ウイルス剤として又はそのほかの疾患を治療するために開発されたアンチセンスODNは通常、長さ、およそ20ヌクレオチドである。概説論文（Stein, CA, J. Clin. Invest., 108:641-644, 2001）では、「アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは最適化されなければならない：アンチセンスオリゴヌクレオチドが長すぎるか又は短かすぎれば、特異性の要素は失われる。現在、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最適な長さは大雑把に16〜20ヌクレオチドであると思われる」と確認されている。同様に、もう1つの概説論文（Crooke, ST., Methods Enzymol., 313:3-45, 2000）では、「RNA及びRNA二本鎖形成に比べて、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、単位当たりおよそ-2.2°低いTmを有する。このことは、インビトロで有効であるには、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは通常、長さ17〜20量体であらねばならない」と述べられている。
【００４６】
Caruthers及び共同研究者らは（Marshall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6265-6269, 1992）、12量体のポリシチジン-PS2-ODN及び14量体のPS2-ODNに関するホスホロジチオエートODNの抗HIV活性を報告した。抗HIV活性について別のサイズは調べなかった。彼らはまた、12、14、20及び28量体のポリシチジンPS2-ODNについてHIV逆転写酵素（RT）の阻害剤を報告した。後になって（Marshal et al., Science,259:1564-1570, 1993）、HIV RTの配列特異的阻害を示す結果を報告した。同じグループは幾つかの特許の中でPS2-ODNに関するデータを公表した。米国特許第5,218,103号及び同第5,684,148号では、PS2-ODNの構造及び合成を記載している。米国特許第5,452,496号、同第5,278,302号、及び同第5,695,979号では15塩基以下のPS2-ODNに関してHIV RTの阻害が記載されている。米国特許第5,750,666号及び同第5,602,244号では、PS2-ODNのアンチセンス活性が記載されている。
【００４７】
リボースの2'位が修飾されたオリゴヌクレオチドおよびそれらをアンチセンス戦略において使用することは、例えば、以下に引用する参照に記載されているように評価されている。
【００４８】
lnoueおよび共同研究者(Inoue et al. (1985) Nucleic Acid Res. 16:165168)は、オリゴ(2'-O-メチルリボヌクレオチド)の合成および性質について記載している。同一グループ(Inoue et al. (1987) FEBS Letter 215:327-330)は、オリゴヌクレオチドが全て2'-O-メチルリボヌクレオチドを含む場合、RNase Hが仲介しないmRNA切断が起こることを報告した。混合オリゴヌクレオチド、即ち非修飾および2'-O-メチルリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを用いて、その研究者等は、RNAおよび2'-O-メチルリボヌクレオチドにより形成された核酸複合体の、配列特異的なRNAse H加水分解を報告している。
【００４９】
RNase H仲介による標的mRNAの切断を支持しない、完全2'-O-メチル化およびホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドを使用して、活性アンチセンスオリゴヌクレオチドが、RNase H-依存性機序によるICAM-1発現を阻害するか否かを決定した(Chiang et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:18162-18171)。彼等は、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、治療薬として有用であり得ることを述べた。
【００５０】
2'-O-メチル、2'-O-プロピル、2'-O-ペンチルおよび2'-フルオロを含む2'-糖修飾を伴うオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を分析した。均一に2'-修飾したオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性の評価により、これらの化合物は遺伝子発現の阻害に全く効果的ではないことが明らかとなった。活性は、化合物が少なくとも5個の2'-デオキシリボヌクレオチド残基の伸展を含む場合に回復した。この最小限度のデオキシリボヌクレオチド長は、インビトロでの有効なRNase H活性に必要な最小の長さと完全に相関した(Monia et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:14514.)。
【００５１】
Yuら((1996) Bioorganic. Med. Chem. 4:1685-1692)は、ホスホロチオエート、ホスホジエステルまたは2'-O-メチル修飾糖部分を含む混合バックボーンを有するハイブリッドアンチセンスオリゴヌクレオチドは、p24ELISA定量化により測定した特異的抗-HIV活性を有することを報告した。
【００５２】
ホスホロチオエート化2'-O-メチル-オリゴリボヌクレオチドが、その変異型ヒトβ-グロブリン遺伝子によって安定的に形質転換された哺乳動物細胞内で発現したIVS2-654プレmRNAの異常なスプライス部位を標的とした場合に、正確なスプライシングが効果的に回復したことが報告されている(Sierakowska, et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12840-12844.)。
【００５３】
総説、Agrawal ((1999) Biochim. Biophys. Acta 1489:53-68)は、最適な活性のためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに関する増大した安定性または標的RNAに対する高い親和性のみでなく、様々な性質を組み合わせる必要があることを示唆している。そのような性質は、RNase H活性を含む。後の再考において、AgrawalおよびKandimalla ((2000) Mol. Med. Today-6:72-81)は、2'-O-メチル修飾を含む混合バックボーンオリゴヌクレオチドは、それらのRNAse H活性を含む改善された性質のために、第二世代アンチセンスオリゴヌクレオチドの選択肢となっていると述べている。アンチセンスオリゴは、標的RNAに結合してRNAse Hを活性化する能力など、所定の重要な性質を有すると想定される(Agrawal and Kandimalla, 2001, Current Cancer Drug Target 1:197-209.)。殆どのアンチセンスアプローチでは、アンチセンス効能を増大させるために、RNase Hによる標的RNA切断が所望される(Kurreck, 2003, Eur. J. Biochem. 270:1628-1644.)。
【００５４】
多数の研究が、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける2'-O-メトキシエチル修飾の使用について記載している。一例は、Zellweger et al. ((2001) J. Pharmacol. Experimental Therapeutics 298:934-940)に記載されているギャップ2'修飾オリゴヌクレオチドアンチセンスを使用した研究である。別の一例は、RNase H非依存的な2'-O-メトキシエチルアンチセンスを使用した翻訳開始複合体の形成の阻害を示している(Baker et al. 1997) J. Biol. Chem. 272:1994-12000.)。
【００５５】
Kuwasaki et al. (2003) J. Antimicrob. Chemother. 51:813-819は、高度なヌクレアーゼ耐性の、ヌクレオシド上に2'-O-メチル基を含みかつヌクレオチド間結合上に硫黄基を含む二量体ヘアピングアノシン−四重鎖の構造、およびその培養細胞内の抗-HIV-1活性を記載している。
【００５６】
Mou および Gray (2002) (Nucleic Acid Res. 30:749-758)は、典型的なホスホロチオエート-DNAオリゴマーと比較して、2'-O-メチル修飾の追加は、非特異的なタンパク質結合特性を低下させることを示している。36mersオリゴヌクレオチドに関するg5pのタンパク質結合親和性は、dA36<rA36<2'-O-MeA36<S-rA36<<S-2'-O-MeA36<S-dA36 (ここで、d=デオキシ、r=リボ、2'-O-Me=2'-O-メチル、S=ホスホロチオエート)の順序で増大した。この順序は、これらのオリゴマー修飾に関して、血漿タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、γ-グロブリンおよびフィブリノーゲンの非特異的結合に関する、Kandimallaら((1998) Bioorganic Med Chem Lett. 8:2103-2108)に報告されたS-RNA<<S-2'-O-MeRNA<S-DNAの順序と一致していた。
【００５７】
米国特許第5,591,623号および米国特許第5,514,788号は、細胞内付着分子の合成または代謝の調節を介した治療の可能性がある疾病の処置および診断のための組成物および方法を記載している。好ましい態様によれば、細胞内付着遺伝子をコードする核酸との特異的ハイブリダイズが可能なオリゴヌクレオチドについて記載する。本発明は、2'-O-メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成およびそのアンチセンスとしての使用について記載する。
【００５８】
米国特許第5,652,355号、米国特許第6,143,881号および米国特許第6,346,614号は、核酸分解に抵抗し、RNAまたはDNAと安定な二重鎖を形成しかつRNAとハイブリダイズした際にRNase Hを活性化する、ハイブリッドオリゴヌクレオチド(デオキシ-およびリボヌクレオチドのセグメントを含む)を記載している。ホスホロチオエート2'-O-メチル-オリゴヌクレオチドの特性の一つは、RNase Hを活性化しないことであることが示されている。一局面において、本発明は、ウイルス、病原有機体または細胞遺伝子の発現の阻害に有効なハイブリッドオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のこの局面に従ったオリゴヌクレオチドの特徴は、デオキシリボヌクレオチドの存在である。本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のこの局面に従ったオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ウイルス、病原有機体または細胞遺伝子に由来する核酸配列に相補的である。
【００５９】
米国特許第5,591,721号および米国特許第6,608,035号は、ヌクレオチド配列が標的遺伝子と相補的なオリゴヌクレオチドの経口投与による、動物内の遺伝子発現を下方調節する方法を記載している。従って、該特許に記載されている性質により、このようなオリゴヌクレオチドは、動物内の特定の遺伝子の発現を制御または下方調節する能力により、治療的に有用であると言われている。本発明の方法において有用なハイブリッドDNA/RNAオリゴヌクレオチドは、核酸分解に抵抗し、RNAまたはDNAと安定な二重鎖を形成しおよび好まくはRNAとハイブリダイズするとRNase Hを活性化する。本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、ウイルス、病原有機体内の様々な遺伝子の発現の阻害に、または細胞遺伝子の発現の阻害に有効であることが報告されている。従って、本発明の方法に従ったオリゴヌクレオチドは、ウイルス、病原有機体または細胞遺伝子由来の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。
【００６０】
米国特許第6,608,035号には、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは胃内で6時間後には安定ではないが、3'末端および5'末端に2'-O-メチルリボヌクレオチドを含みかつ内部にデオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、胃内でより安定であり、但し一部は分解されることを示すデータを示している。
【発明の開示】
【００６１】
発明の概要
本発明は、オリゴヌクレオチド(ON)、例えば高度に修飾されたオリゴヌクレオチドを含むオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)が、幅広く適合可能な、配列非依存的な抗ウイルス活性を有し得るという発見に関する。有利な修飾は、修飾されたヌクレオチド間結合および2'-修飾を含む。抗ウイルス活性を有することを目的として、オリゴヌクレオチドが任意のウイルス配列に相補的であるかまたは特定のヌクレオチド分布を有する必要はない。このようなオリゴヌクレオチドはランダマーとして調製してもよく、従って調製物中、例えば32またはそれ以上のヌクレオチド長の15マイクロモルのランダマーの調製物中に、任意の特定の配列が多くて数コピー存在すると考えられる。
【００６２】
加えて、本発明者らは、異なる長さのオリゴヌクレオチドが、異なる抗ウイルス効果を有することを発見している。例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合で修飾された際、最大の抗ウイルス効果を産み出す抗ウイルスオリゴヌクレオチドの長さは、典型的に40〜120ヌクレオチドの範囲内にある。オリゴヌクレオチドの抗ウイルス特性に関する本発見の観点から、本発明は、多数の異なるウイルスに対する活性を有し得、かつ抗ウイルス薬として幅広い範囲で選択することも可能な、オリゴヌクレオチド抗ウイルス薬を提供する。そのような抗ウイルス薬は、現在入手可能な抗ウイルス治療の限られた選択肢の観点から、特に有利である。
【００６３】
従って、本発明のON、例えばODNはウイルス感染の処置もしくは予防、またはウイルス、例えばオンコウイルス(例、レトロウイルス、パピローマウイルスおよびヘルペスウイルス)により誘導される腫瘍もしくは癌の処置もしくは予防に関する治療法、ならびにその病因がウイルスを基礎とする他の疾病の処置または予防に有用である。そのような処置は、例えばヒトおよび動物の免疫抑制患者のウイルス感染の予防または処置を含む、多くの種類の患者および処置に適用される。
【００６４】
本発明の第一の局面は、抗ウイルス性が基本的には配列非依存的に、例えば配列相補的ではない作用様式で発生する抗ウイルスオリゴヌクレオチド、例えば精製オリゴヌクレオチド、およびそのようなオリゴヌクレオチドを含有する調合物に関する。
【００６５】
本発明において有用なオリゴヌクレオチドは、様々な長さ、例えば少なくとも6、10、14、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、38、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、140、160またはそれ以上のヌクレオチド長を有し得る。同様に、オリゴヌクレオチドは、例えば前記した値の任意の二つを、その範囲の終点を含むものとして定義する範囲内、例えば10〜20、20〜30、20〜40、30〜40、30〜50、40〜50、40〜60、40〜80、50〜60、50〜70、60〜70、70〜80、60〜120および80〜120範囲内のヌクレオチド長を有し得る。特定の態様において、最小の長さまたは長さの範囲は、本抗ウイルスオリゴヌクレオチドに関して本明細書に列挙した、他の任意のオリゴヌクレオチドの詳細と組み合わされる。
【００６６】
抗ウイルスヌクレオチドは、様々な修飾、例えば安定化修飾を含んでもよく、従って少なくとも一つの修飾をホスホジエステル結合内に、ならびに／または糖、および／もしくは塩基上に含んでもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、1個または複数のホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合および／またはメチルホスホネート結合を含んでもよい。例えば、合成条件が化学的に適合可能である修飾など、化学的に適合可能な異なる修飾結合を組み合わせることができる。修飾結合が有用である一方、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、例えば少なくとも一つのホスホジエステル結合、または少なくとも5、10、20、30%もしくはそれ以上のホスホジエステル結合を含み得る。更なる有用な修飾は、糖の2'位における修飾、2'-O-メチル修飾のような2'-O-アルキル修飾、2'-アミノ修飾、2'-フルオロのような2'-ハロ修飾；非環式ヌクレオチド類似体を含むが、それらに限定されない。他の修飾も当該技術分野にて公知であり、使用することができる。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、全体に修飾結合、例えばホスホロチオエートを有する；3'-および／または5'-キャップを有する；末端3'-5'結合を含む；オリゴヌクレオチドは、リンカーにより連結された2個またはそれ以上のオリゴヌクレオチド配列からなる鎖状体であるか、または該鎖状体を含む。
【００６７】
本発明は更に、1個または複数のヌクレオチド残基において、オリゴヌクレオチドの性質を変更して、より高い安定性、血清とのより低い相互作用、より高い細胞取り込み、ウイルスタンパク質とのより高い相互作用、送達用に調合するための改善された能力、検出可能なシグナル、より高い抗ウイルス活性、より良好な薬物動態学的性質、特定の組織分布、より低い毒性からなる群より選択される1個または複数の性質を獲得する分子に対して結合または複合化されているオリゴヌクレオチドを提供する。
【００６８】
所定の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、95または100%の修飾結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよび／またはメチルホスホネートを含む。
【００６９】
所定の態様において、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90もしくは95%、または全部のヌクレオチドが、リボースの2'位において、例えば2'-OMe、2'-F、2'-アミノで修飾されている。
【００７０】
所定の態様において、修飾結合はオリゴヌクレオチドの2'-修飾と組み合わされ、例えば、少なくとも30%の修飾結合と少なくとも30%の2'-修飾；または各々少なくとも40%と40%、少なくとも50%と50%、少なくとも60%と60%、少なくとも70%と70%、少なくとも80%と80%、少なくとも90%と90%、100%と100%のように組み合わされる。所定の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも30、40、50、60、70、80、90または100%の修飾結合と、少なくとも30、40、50、60、70、80、90または100%の2'-修飾とを含み、ここで、該態様は、列挙した各修飾結合の割合と2'-修飾の割合との組み合わせを含む(例、少なくとも50%の修飾結合と少なくとも80%の2'-修飾、および少なくとも80%の修飾結合と100%の2'-修飾)。記載した組み合わせの割合の各々の特定の態様において、修飾結合はホスホロチオエート結合である；修飾結合がホスホロジチオエート結合である；2'-修飾が2'-OMeである；2'-修飾が2'-フルオロである；2'-修飾が2'-OMeと2'-フルオロの組み合わせである；修飾結合がホスホロチオエート結合でありかつ2'-修飾が2'-OMeである；修飾結合がホスホロチオエート結合でありかつ2'-修飾が2'-フルオロである；修飾結合がホスホロジチオエート結合でありかつ2'-修飾が2'-OMeである；修飾結合がホスホロジチオエート結合でありかつ2'-修飾が2'-フルオロである；修飾結合がホスホロジチオエート結合でありかつ2'-修飾が2'-OMeと2'-フルオロの組み合わせである。特定パーセントの修飾結合と特定の割合の2'-修飾を組み合わせる本明細書に記載されたオリゴヌクレオチドの所定の態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110もしくは120ヌクレオチド長であるか、または特定の長さの任意の二つを、その範囲の終点を含むものとして定義する範囲内の長さである。
【００７１】
所定の態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のヌクレオチド間結合を除いた全部のヌクレオチド間結合、および／またはリボース部分の2'位が、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホネート結合により、ならびに／またはリボース部分の2'-OMe、2'-F、および／もしくは2'-アミノ修飾により修飾される。
【００７２】
数個の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1、2、3もしくは4個のリボヌクレオチドを含むか、または少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90%もしくは100%ものリボヌクレオチドを含む。
【００７３】
特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、鎖内に(即ち、鎖バックボーンの一部を形成する)および／または側鎖部分として、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個もしくはそれ以上もの、または5、10、20%もしくはそれ以上までの鎖部分および／または側鎖部分に非ヌクレオチド基を含む。
【００７４】
所定の態様において、オリゴヌクレオチドは、5、8、10、15、20、25、30ヌクレオチドよりも長い自己相補的な配列を有さない；オリゴヌクレオチドは、触媒活性、例えばRNAに対する切断活性を有さない；オリゴヌクレオチドは、RNAi機序を誘導しない。
【００７５】
特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、1個または複数のウイルスタンパク質に結合する；オリゴヌクレオチドの配列(またはその一部、例えば少なくとも20、30、40、50、60、70%もしくはそれ以上の配列)は、ウイルスゲノムに由来する；ウイルスゲノム由来の配列を伴うオリゴヌクレオチドの活性は、同一長のランダマーオリゴヌクレオチドもしくはランダムオリゴヌクレオチドに優位ではない；オリゴヌクレオチドは、ウイルス配列に相補的な部分と、ウイルス配列に相補的ではない部分とを含む；オリゴヌクレオチドの配列は、ウイルスパッケージング配列、またはアプタマー相互作用に関与する他のウイルス配列に由来する；別に示さない限り、オリゴヌクレオチド配列は、A(x)、C(x)、G(x)、T(x)、U(x)、l(x)、AC(x)、AG(x)、AT(x)、AU(x)、CG(x)、CT(x)、CU(x)、GT(x)、GU(x)、TU(x)、Al(x)、IC(x)、IG(X)、IT(x)IU(x)を含み、ここで、xは、2、3、4、5、6、...60...120である(特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも15、20、25、29、30、32、34、35、36、38、40、45、46、50、60、70、80、90、100、110、120、140もしくは160ヌクレオチド長、もしくは列挙した値の任意の二つを、その範囲の終点を含むものとして定義する範囲内の長さであるか、または特定した反復配列の長さが、少なくとも、直前に特定した長さもしくは長さの範囲内である)；オリゴヌクレオチドは、例えば、上記の単量体および／または二量体の各組み合わせが、一度に2、3または4回反復される各組み合わせを含む、反復配列の組み合わせ(例、上記に特定した反復配列)を含む；オリゴヌクレオチドが一本鎖(RNAまたはDNA)である；オリゴヌクレオチドが二本鎖(RNAまたはDNA)である；オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのGカルテット(Gquartet)またはCpG部分を含む；オリゴヌクレオチドがウイルスmRNAに相補的な部分を含みかつ少なくとも29、37もしくは38ヌクレオチド長(または上記に特定した他の長さ)である；オリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの非ワトソン-クリックオリゴヌクレオチド、および／または他の一つのヌクレオチドとの非ワトソン-クリック結合に参加する少なくとも一つヌクレオチド、および／または他のヌクレオチドと塩基対を形成できない少なくとも一つのヌクレオチドとを含む；オリゴヌクレオチドがランダムオリゴヌクレオチドである、オリゴヌクレオチドがランダマーであるか、またはランダマー部分を含み、例えば少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40もしくはそれ以上の連続したオリゴヌクレオチドの長さを有するか、もしくは上記にオリゴヌクレオチド長に関して特定した長さを有するランダマー部分を含むか、または少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90%もしくは全部のヌクレオチドがランダマーである；オリゴヌクレオチドが、1個または複数のヌクレオチド残基において、オリゴヌクレオチドの性質を変更する、例えばより高い安定性(血清中での安定性または特定の溶液中での安定性など)、血清とのより低い相互作用、より高い細胞取り込み、ウイルスタンパク質とのより高い相互作用、送達用に調合するための改善された能力、検出可能なシグナル、改善された薬物動態学的性質、特定の組織分布、および／またはより低い毒性を提供する分子に対して結合または複合化している。
【００７６】
シトシンおよび／またはチミジンおよび／または他のピリミジンを含む、ピリミジンヌクレオチドのみ(または、少なくとも主として)を含有するホスホロチオエート化ONは、低pHに耐性を有し、またポリシトシンオリゴヌクレオチドは多数のヌクレアーゼに対して増大した耐性を示し、それにより抗ウイルスONの経口投与のための二つの重要な性質を提供することが発見された。従って、所定の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも80、90、もしくは95または100%の修飾されたヌクレオチド間結合(例、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート)を有し、ピリミジン含有量が50%より多い、60%より多い、70%より多い、80%より多い、90%より多いもしくは100%であり、即ちピリミジンオリゴヌクレオチドであるか、またはシトシン含有量が50%より多い、60%より多い、70%より多い、80%より多い、90%より多いもしくは100%であり；即ちポリシトシンオリゴヌクレオチドである。所定の態様において、長さは、少なくとも29、30、32、34、36、38、40、45、50、60、70もしくは80ヌクレオチド、または20〜28、25〜35、29〜40、30〜40、35〜45、40〜50、45〜55、50〜60、55〜65、60〜70、65〜75もしくは70〜80の範囲内、または列挙した値の任意の二つを、その範囲の終点を含むものとして定義する範囲内の長さである。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも50、60、70、80または90%シトシンである；少なくとも50、60、70、80または90%チミジン(および、上記に列挙した総ピリミジン含有量を有し得る)である。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、列挙した割合のシトシンおよびチミジンのいずれかを含み、残りのピリミジンヌクレオチドは、シトシンおよびチミジンのもう一方である。また所定の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10、12、14、16、18、20、25、30、35、40またはそれ以上の連続するピリミジンヌクレオチド、例えばCヌクレオチド、Tヌクレオチド、またはCTジヌクレオチド対を含む。所定の態様において、ピリミジンオリゴヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドのみからなる；少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の非ピリミジン部分を含む；1〜5、6〜10、11〜15または少なくとも16個の非ピリミジンバックボーン部分を含む；少なくとも一つの、1〜20、1〜5、6〜10、11〜15または16〜20個の非ヌクレオチド部分を含む；少なくとも一つの、1〜20、1〜5、6〜10、11〜15または16〜20個のプリンヌクレオチドを含む。好ましくは、非ヌクレオチド部分が存在する態様において、そのような部分間の結合、またはそのような部分とヌクレオチドとの間の結合は、オリゴヌクレオチドのサイズおよび化学的性質に適切な条件下でのゲル電気泳動により評価して、40-mer ポリCオリゴヌクレオチドのPS結合と同様に、酸性条件に対して少なくとも25、35、50、70、90または100%耐性である。
【００７７】
オリゴヌクレオチドは、組み合わせて例えば混合物として使用してもよい。そのような組み合わせまたは混合物は、例えば、少なくとも2、3、4、5、10、20、50、100、1000、10,000、100,000、1,000,000またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドを含み得、例えばオリゴヌクレオチドの任意の組み合わせは、本明細書において記載されている。そのような組み合わせまたは混合物は、例えば、異なる配列、および／または異なる長さ、および／または異なる修飾、および／または異なるリンカーまたは複合分子を有し得る。そのような組み合わせまたは混合物の複数の特定の態様において、複数のオリゴヌクレオチドは最小の長さを有し、またはオリゴヌクレオチドに関して上述したような範囲内の長さを有する。このような組み合わせまたは混合物の特定の態様において、少なくとも一つの、複数の、または各オリゴヌクレオチドは、個々の抗ウイルスオリゴヌクレオチドに関して本明細書において詳細する任意の他の性質を有し得る(両立する任意の組み合わせを有してもよい)。
【００７８】
所定の態様において、オリゴヌクレオチドの配列は、標的ウイルスのゲノム配列の任意の等しい長さ部分に対して完全には相補的でなく、または標的ウイルスのゲノム配列の任意の等しい長さ部分に対して95、90、80、70、60もしくは50%未満の相補性を有する。オリゴヌクレオチド配列は、本質的にポリA、ポリC、ポリG、ポリT、GカルテットまたはTGリッチ配列からなるわけではない。
【００７９】
本発明のオリゴに関連して使用されるように、用語「TGリッチ」は、抗ウイルスオリゴヌクレオチドの配列が、少なくとも50パーセントのTおよびGヌクレオチドからなり、またはそのように特定された場合、少なくとも60、70、80、90もしくは95%、または100%ものTおよびGからなることを示す。
【００８０】
関連する局面において、本発明は、本明細書に記載する少なくとも二種の、例えば少なくとも2、3、4、5、7、10、50、100、1000、10,000、100,000、1,000,000またはそれ以上の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチドを含有する抗ウイルスオリゴヌクレオチドの混合物を提供する。
【００８１】
本明細書においてオリゴヌクレオチドまたは他の物質に関連して使用されるように、用語「抗ウイルス」は系において、さもなければ少なくとも一種のウイルスの感染性ウイルス粒子の形成に適切な系において、ウイルス粒子の産生を阻害する、即ち形成される感染性ウイルス粒子数を低下させる、オリゴヌクレオチドまたは他の物質の存在の効果を指す。本発明の所定の態様において、抗ウイルスオリゴヌクレオチドは、多数の異なるウイルスに対して抗ウイルス活性を有すると想定される。
【００８２】
用語「抗ウイルスオリゴヌクレオチド製剤」は、抗ウイルス薬としての使用に適合された少なくとも一種の抗ウイルスオリゴヌクレオチドを含有する調製物を指す。製剤は、一種または複数種のオリゴヌクレオチドを含有し、インビボで抗ウイルス薬としての製剤の用途を妨害しない他の物質を含有し得る。そのような他の物質は、希釈剤、賦形剤、担体物質、および／または他の抗ウイルス物質を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００８３】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的組成物」は、生理学的または薬学的に許容される担体または賦形剤を含有する抗ウイルスオリゴヌクレオチド製剤を指す。そのような組成物は、組成物を所望の対象、例えばヒトへの投与に対して不適切なものとしない他の成分も含み得る。
【００８４】
本発明の文脈において、特に限定しなければ、用語「オリゴヌクレオチド(ON)」は、オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)もしくはオリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドを意味する。従って、「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸(RNA)および／またはデオキシリボ核酸(DNA)、および／またはそれらの類似体のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖およびヌクレオシド間の共有結合(バックボーン)からなるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する、天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、所望の性質、例えば、向上した細胞取り込み、核酸標的に対する向上した親和性およびヌクレアーゼ存在下での安定性の増大などにより、天然の形態よりも好ましい場合がある。使用し得る修飾の例は、本明細書に記載されている。バックボーンおよび／または他の修飾を含むオリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドと称され得る。
【００８５】
本発明の文脈において、「修飾されたヌクレオチド間結合」という表現は、天然に存在するポリヌクレオチドに一般に見られるホスホジエステル結合とは異なる、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間の結合を指す。例としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合およびメチルホスホネート結合がある。
【００８６】
オリゴヌクレオチドの特定の長さの詳細、例えば少なくとも20ヌクレオチド長は、オリゴヌクレオチドが少なくとも20個の結合したヌクレオチドを含むことを意味する。明確に否定しない場合、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド鎖のバックボーンの一部を形成する、付加的な非ヌクレオチド部分も含んでもよい。別に示さない限り、バックボーンに非ヌクレオチド部分が存在する場合、少なくとも10個の結合したヌクレオチドは連続している。
【００８７】
抗ウイルス製剤、薬学的組成物、または他の材料に関連して使用される、「抗ウイルス薬としての使用に適合された」という表現は、物質が抗ウイルス効果を示し、例えばヒト対象のような対象に投与するための、インビボ系でのウイルス産生阻害における使用に対して該物質を不適切なものとする、いずれの成分または物質も含有しないことを示す。
【００８８】
抗ウイルスオリゴヌクレオチドの抗ウイルス作用に関連して本明細書において使用される場合、「配列非依存的な作用様式」とは、特定の生物学的活性(例、抗ウイルス活性)が、オリゴヌクレオチド内の特定のオリゴヌクレオチド配列に依存しないこと示す。例えば、活性は、アンチセンス活性または配列依存的なアプタマー相互作用を起こす特定の配列のような、配列依存的なハイブリダイゼーションに依存しない。同様に、「配列相補的ではない作用様式」という表現は、それにより物質が抗ウイルス効果を示す機序が、相補的な核酸配列のハイブリダイゼーション、例えばアンチセンス効果を原因としないことを示す。逆に、「配列相補的な作用様式」は、物質の抗ウイルス効果が、相補的な核酸配列のハイブリダイゼーションまたは配列特異的なアプタマー相互作用に関与することを意味する。従って、物質の抗ウイルス活性が「配列非依存的な作用様式を原因とする」、または活性が「主として配列相補的な作用様式を原因としない」と示される場合、オリゴヌクレオチドの活性は、本明細書において提供する4つの試験のうち少なくとも一つを満たすことを意味する(実施例10参照)。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、試験1、試験2、試験3、試験4または試験5を満たす；オリゴヌクレオチドは、二つの試験の組み合わせ、即ち試験1および2；試験1および3；試験1および4、試験1および5、試験2および3、試験2および4、試験2および5、試験3および4、試験3および5、または試験4および5を満たす；オリゴヌクレオチドは、3つの試験の組み合わせ、即ち試験1、2および3、試験1、2および4、試験1、2および5、試験1、3および4、試験1、3および5、試験2、3および4、試験2、3および5、試験3、4および5を満たす；オリゴヌクレオチドは、試験1、2、3および4の全てを満たす。
【００８９】
抗ウイルス物質の投与に関連して本明細書において使用される場合、用語「対象」は、例えば哺乳動物のような動物、例、ヒト、ヒトではない霊長類、牛、豚、羊、馬、犬および猫を含む高等生物；鳥(鳥綱)；ならびに植物、例えば果樹を指す。
【００９０】
関連する局面は、抗ウイルスオリゴヌクレオチドランダマーまたは少なくとも一種のランダマーを含有するランダマー調合物に関し、ここでランダマーの抗ウイルス活性は、主として配列非依存的に、例えば配列相補的ではない作用様式により生じる。このようなランダマー調合物は、例えば、異なる長さ、例えば少なくとも2、3、5、10もしくはそれ以上の異なる長さのランダマーの混合物を含むか、または本明細書に記載する他の混合物を含み得る。
【００９１】
オリゴヌクレオチド配列に関連して本明細書において使用される場合、用語「ランダム」は、ウイルスmRNAに相補的ではない配列またはONを特徴付け、ヘアピンを形成しないように選択され、またその内部にパリンドローム配列を含まない。用語「ランダム」が、特定のウイルスに向けたオリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性の文脈で使用される場合、用語は、特定のウイルスのウイルスmRNAに対する相補性の不在を暗示する。相補性の不在は、例えば、複数のウイルス、特定のウイルスファミリー由来のウイルスまたは感染性ヒトウイルスのように、より広範囲に亘り得る。
【００９２】
本出願において、用語「ランダマー」は、各位置に、例えばNNNNNNNNNNのようなゆらぎ(N)を有する一本鎖DNAを意味するものとする。各塩基は、このONが実質的に同一サイズの、異なるランダムに生成した配列の集団として実際に存在するように、ゆらぎとして合成される。このようなランダマーの調製は、通常、特定の長さ(主により短い長さ)に前後するサイズの分布を生成することが認識されている；明確に否定しない場合、本文脈において、このような調製物は特定の長さのランダマーとして見なされる。
【００９３】
「ウイルスゲノム由来の」という表現は、特定の配列が、ウイルスゲノムヌクレオチド配列またはその相補体と少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド塩基配列を有する(例、そのようなウイルスゲノム配列と同一または相補的)か、または対応するRNA配列であることを示す。本発明の特定の態様において、用語は、配列がオリゴヌクレオチドが指向する特定のウイルスのウイルスゲノム配列またはその相補的な配列と少なくとも70%の同一性であることを示す。特定の態様において、同一性は、少なくとも80、90、95、98、99または100%である。
【００９４】
本発明はまた、治療有効量の薬理学的に許容される抗ウイルスオリゴヌクレオチド、または本明細書に記載する、例えば少なくとも6ヌクレオチド長の、または本明細書に列挙する他の長さのオリゴヌクレオチドの混合物、ここで、オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性は、主として配列非依存的に、例えば、配列相補的ではない作用様式により生じる、および薬学的に許容される担体を含有する抗ウイルス薬学的組成物を提供する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組み合わせもしくは混合物は、個々のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組み合わせもしくは混合物に関して上記に特定した通りである。特定の態様において、薬学的組成物は、ヒト、またはヒトではない動物、例えばヒトではない霊長類への投与が認可されている。
【００９５】
特定の態様において、薬学的組成物は、ウイルス病因を伴う疾病の処置、制御または予防に適合している；プリオン疾病の処置、制御、または予防に適合している；眼内投与、経口消化、経腸投与、吸入、皮内、皮下、筋内、腹腔内、くも膜下腔内、気管内、もしくは静脈内注入、または局所投与による送達に適合している。
【００９６】
特定の態様において、薬学的組成物は、経口消化、経口粘膜送達、鼻腔内滴下または噴霧、眼内注入、結膜下注入、点眼、点耳、吸入により、気管内注入もしくは噴霧、気管支内注入もしくは噴霧、胸膜内注入、腹腔内注入灌流もしくは洗浄、くも膜下腔内注入もしくは灌流、頭蓋内注入もしくは灌流、筋内注入、静脈内注入もしくは灌流、動脈内注入もしくは灌流、リンパ管内注入もしくは灌流、皮下注入もしくは灌流、皮内注入、局所皮膚適用、臓器灌流により、外科手術中の局所適用により、腫瘍内注入、局所適用、胃注入灌流もしくは洗浄、腸内注入もしくは灌流、大腸内注入灌流もしくは洗浄、直腸注入灌流もしくは洗浄、直腸坐薬もしくは浣腸により、尿道坐薬もしくは注入により、膀胱内注入灌流もしくは洗浄または関節内注入からなる群より選択されるが、これらに限定されない様式による送達用に調合され得る。
【００９７】
特定の態様において、組成物は、例えば特定の細胞または組織を標的とした送達系；リポソーム調合物、別の一抗ウイルス薬、例えば非ヌクレオチド抗ウイルスポリマー、アンチセンス分子、siRNAまたは小分子薬を含有する。
【００９８】
特定の態様において、抗ウイルスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド調製物、オリゴヌクレオチド製剤または抗ウイルス薬学的組成物は、インビトロで、標的ウイルス(例、任意の特定のウイルス、または本明細書に示すようなウイルス群のウイルス)に関して、10、5、2、1、0.50、0.20、0.10、0.09.0.08、0.07、0.75、0.06、0.05、0.045、0.04、0.035、0.03、0.025、0.02、0.015もしくは0.01μMであるかまたはそれ未満のIC50を有する。
【００９９】
製剤、薬学的組成物、予防または処置のための使用、および予防または処置のための方法の特定の態様において、組成物または製剤は、ウイルス病因を伴う疾病の処置、制御、または予防に適合している；プリオン疾病の処置、制御、または予防に適合している；眼内、経口消化、経腸、吸入、または皮内、皮下、筋内もしくは静脈内注入からなる群より選択される送達様式に適合しており；更に、特定の細胞との親和性を増大させる分子を含むか、該分子に関連し得る送達系を含む；更に、少なくとも一種の他の抗ウイルス薬を組み合わせて含む；および／または更に抗ウイルスポリマーを組み合わせて含む。
【０１００】
特定の態様において、薬学的組成物は、本明細書に記載したような少なくとも一種のポリピリミジンオリゴヌクレオチドを含有する。ポリピリミジンオリゴヌクレオチドについて発見された低pHに対する耐性を考慮すると；所定の態様において、この組成物は、インビボの酸性部位への送達、例えば経口送達または経膣送達に適合している。
【０１０１】
このようなポリピリミジンオリゴヌクレオチドを含有する経口投与用の組成物および調合物の特定の態様において、組成物または製剤は、粉末、顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体中の縣濁液または溶液、エマルション(例、ミクロエマルジョン)、カプセル、ジェルカプセル、サシェ、錠剤もしくは小錠剤の形態で調製される。所定の態様において、増粘剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が含まれてもよい。いくつかの態様において、経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが、1個または複数の浸透促進剤、界面活性剤および／またはキレート剤、例えばそれらに限定されるわけではないが、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩(例えば、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリドもしくはその薬学的に許容される塩(例、ナトリウム)、胆汁酸および／またはその塩(例えば、ケノデオキシコール酸(CDCA)およびウルソデオキシコール酸(ursodeoxychenedeoxycholic acid)(UDCA)、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸(glycholic acid)、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ-24、25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム)と共に投与される製剤である。いくつかの態様は、浸透促進剤の組み合わせ、例えばラウリン酸、カプリン酸およびUDCAのナトリウム塩のような脂肪酸／塩と胆汁酸／塩との組み合わせを含む。更なる例示的な浸透促進剤は、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルを含む。
【０１０２】
本発明のオリゴヌクレオチドが顆粒形態(噴霧乾燥粒子を含む)で調製されるかまたは錯化されて微粒子またはナノ粒子を形成する特定の態様において、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール(PEG)およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；DEAE-誘導体化ポリイミン、ポルラン、セルロース、およびデンプンから選択されるか、またはより詳細には、キトサン、N-トリメチルキトサン(N-trimethytchitosan)、ポリ-L-リシン、ポリヒスチジン、ポリオリチン(polyorithine)、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノ-メチルエチレンP(TDAE)、ポリアミノスチレン(例、p-アミノ)、ポリ(メチルシアノアクリレート)、ポリ(エチルシアノアクリレート)、ポリ(ブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソヘキシルシアノアクリレート)、DEAE-メタクリレート、DEAE-ヘキシルアクリレート、DEAE-アクリルアミド、DEAE-アルブミンおよびDEAE-デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ(D、L-乳酸)、ポリ(DL-乳酸-グリコール酸(PLGA)、アルギネートおよびポリエチレングリコール(PEG)から選択される錯化剤が使用されるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０３】
特定の態様において、組成物は、経膣投与に適合している。このような態様において、組成物は、錠剤、溶液、クリーム、ジェル、坐薬の形態で調製され得るが、それらに限定されるわけではない。
【０１０４】
特定の態様において、組成物は、局所投与に適合している。
【０１０５】
本明細書において使用される場合、用語「ポリピリミジンオリゴヌクレオチド」または「ピリミジンオリゴヌクレオチド」は、50%より多いピリミジンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１０６】
本発明のオリゴヌクレオチドおよび組成物のインビボでの投与に関して使用されるように、用語「酸性部位」は、pH7未満の部位を意味する。例としては、胃(一般にpH1〜2)、膣(一般にpH4〜5であるが、より低い場合もある)、およびより低い程度では、皮膚(一般にpH4〜6)が含まれる。
【０１０７】
本明細書において使用される場合、「経口送達に適合している」および同様の表現は、組成物が酸性のpHに十分耐性を有して、臨床的に過剰な活性の損失、例えば胃の酸性を原因とする、初回通過による50%未満(または40%、30%、20%、10%または5%未満と示されている)の過剰な損失を起こすことなく、経口投与できることを示す。
【０１０８】
本明細書において使用される場合、「経膣投与に適合している」および同様の表現は、組成物が適切に投与された場合に、本組成物が臨床的に許容できない程度(例、特定の保持時間中、50%、40%、30%、20%、10%未満または5%)に分解せず、(吸収された物質を除いて)膣内に少なくとも1時間(または、指定された場合、少なくとも2時間、4時間、8時間、12時間、1日または2日)実質的に留まるように調製されていることを示す。このような組成物の保持は、例えば、物理的形態または接着特性等の、多数の異なる因子または因子の組み合わせによるものであり得る。
【０１０９】
特定のウイルスまたはウイルス群に関連して、本明細書において抗ウイルスオリゴヌクレオチドおよび調合物等に関連して使用されるように、用語「標的とする」は、ウイルスまたはウイルス群を阻止するためにオリゴヌクレオチドを選択することを示す。特定の組織または細胞タイプに関連して使用される場合、本用語は、オリゴヌクレオチド、調合物、または送達系が、オリゴヌクレオチドが特定の組織または細胞タイプ内またはその近位に優先的に存在し、および／または優先的に抗ウイルス効果を示すように選択されることを示す。
【０１１０】
本明細書において使用される場合、用語「送達系」は、オリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスオリゴ、siRNAまたは本明細書に記載するオリゴヌクレオチド)と組み合わせると、インビボで意図する位置と接触するオリゴヌクレオチドの量を増大させる、ならびに／または標的におけるその存在の持続時間を、例えば送達系の不在下での量および／もしくは持続時間と比較して、少なくとも20、50もしくは100%、またはそれ以上延長させる、ならびに／または副作用の原因となる相互作用を防止または低減する、成分を指す。
【０１１１】
抗ウイルス薬および他の薬物または試験化合物に関連して本明細書において使用される場合、用語「小分子」は、分子量が1500ダルトンまたはそれ未満である分子を意味する。いくつかの場合において、分子量は、1000、800、600、500もしくは400ダルトンまたはそれ未満である。
【０１１２】
別の局面において、本発明は、少なくとも一種の抗ウイルスオリゴヌクレオチド、抗ウイルスオリゴヌクレオチド混合物、抗ウイルスオリゴヌクレオチド製剤または抗ウイルス薬学的組成物を含むキットを提供し、該キットは、そのようなオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド混合物またはオリゴヌクレオチド製剤を、ラベルを貼ったパッケージ内に含み、ここで、オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性は、主として配列非依存的に、例えば配列相補的ではない作用様式により生じ、パッケージ上のラベルは、抗ウイルスオリゴヌクレオチドが、少なくとも一種のウイルスに対して使用し得ることを示す。
【０１１３】
特定の態様において、キットは、本明細書に記載する少なくとも一種の抗ウイルスオリゴヌクレオチドを含有する薬学的組成物を含む。一態様において、キットは、少なくとも二種の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチドの混合物を含む。一態様において、抗ウイルスオリゴヌクレオチドは、動物のインビボでの使用に適合し、および／またはラベルは、オリゴヌクレオチドまたは組成物が動物での使用に許容および／または認可されていることを示す；動物はヒトのような哺乳動物、または牛、豚、反すう動物、羊、もしくは馬のようなヒトではない哺乳動物である；動物は、ヒトではない動物である；動物は、鳥である、キットは、例えば米国食品医薬品局(U.S. Food and Drug Administration)または同等の機関のような規制機関により、動物、例えばヒトでの使用が認可されている。
【０１１４】
別の局面において、本発明は、抗ウイルス薬として使用するための、抗ウイルスオリゴヌクレオチド、例えば配列相補的ではない抗ウイルスオリゴヌクレオチドを選択するための方法を提供する。本方法は、複数の異なるランダムオリゴヌクレオチドを合成し、オリゴヌクレオチドのウイルスの感染性ビリオンを産生する能力を阻害する活性を試験し、抗ウイルス薬として使用するための、薬学的に許容されるレベルの活性を有するオリゴヌクレオチドを選択することを含む。
【０１１５】
特定の態様において、異なるランダムオリゴヌクレオチドは、異なる長さのランダマーを含む；ランダムオリゴヌクレオチドは、異なる配列を有するかまたは共通する配列、複数の最短のオリゴの配列を有し得る；および／または異なるランダムオリゴヌクレオチドは、少なくとも5ヌクレオチド長のランダマーセグメントを含む複数のオリゴヌクレオチドを含むか、もしくは異なるランダムオリゴヌクレオチドは、異なる長さの複数のランダマーを含む。例えば抗ウイルスオリゴヌクレオチドに関して本明細書に記載する他のオリゴヌクレオチドは、特定の系で試験し得る。
【０１１６】
更に別の局面において、本発明は、対象においてウイルス感染を予防または処置する方法を提供し、該方法は、そのような処置を必要とする対象に、本明細書に記載する治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容されるオリゴヌクレオチド、例えば少なくとも6ヌクレオチド長の配列相補的ではないオリゴヌクレオチドを投与するか、またはそのようなオリゴヌクレオチドを含有する抗ウイルス薬学的組成物もしくは製剤または混合物を投与することによる。更なる態様において、本発明は、ウイルス感染の予防または処置のための使用を提供し、該使用は、そのような処置を必要とする対象に、本明細書に記載する治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容されるオリゴヌクレオチド、例えば少なくとも6ヌクレオチド長の配列相補的ではないオリゴヌクレオチドを投与するか、またはそのようなオリゴヌクレオチドを含有する抗ウイルス薬学的組成物もしくは製剤または混合物を投与することによる。特定の態様において、ウイルスは、本発明を用いた抑制に適した、本明細書に列挙されている任意のウイルスであり得る；感染は、ウイルス感染に関連するものとして本明細書に示される疾病または病状に関係する；対象は、本明細書に示される種類の対象、例えばヒト、ヒトではない動物、ヒトではない哺乳動物、鳥、植物等である；処置は、ウイルス疾病、またはウイルス病因を伴う疾病、例えば本明細書の「発明の背景」に示される疾病に関する。
【０１１７】
また別の局面において、本発明は、対象において酸性環境内のウイルス感染を予防または処置する方法を提供し、本方法は、そのような処置を必要とする対象に、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容される本発明の抗ウイルス薬学的組成物を投与することを含み、該組成物は、インビボの酸性部位への投与に適合している。
【０１１８】
また別の局面において、本発明は、対象における酸性環境内のウイルス感染の予防または処置における使用を提供し、本使用は、そのような処置を必要とする対象に、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容される本発明の抗ウイルス薬学的組成物を投与することを含み、組成物は、インビボの酸性部位への投与に適合している。
【０１１９】
特定の態様において、本明細書に記載されている抗ウイルスオリゴヌクレオチド(またはオリゴヌクレオチド製剤もしくは薬学的組成物)が投与される；投与は、本明細書に記載されているような方法で行われる；本明細書に記載するような送達系または方法が使用される；ウイルス感染は、DNAウイルスまたはRNAウイルスの感染である；ウイルスは、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科またはパピローマウイルス科である；ウイルスは、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、カルシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、レオウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科またはトガウイルス科である；ヘルペスウイルス科ウイルスは、EBV、HSV-1、HSV-2、CMV、VZV、HHV-6、HHV-7またはHHV-8である；ウイルスは、HIV-1またはHIV-2である；ウイルスは、呼吸器多核体ウイルス(RSV)である；ウイルスは、パラインフルエンザ-3ウイルスである；ウイルスは、インフルエンザウイルス、例えばインフルエンザAである；ウイルスは、HBVである；ウイルスは、天然痘ウイルスまたは牛痘ウイルスである；ウイルスは、コロナウイルスである；ウイルスは、SARSウイルスである；ウイルスは、ウエストナイルウイルスである；ウイルスは、ハンタウイルスである；ウイルスは、パラインフルエンザウイルスである；ウイルスは、コクサッキーウイルスである；ウイルスは、ライノウイルスである；ウイルスは、黄熱病ウイルスである；ウイルスは、デングウイルスである；ウイルスは、C型肝炎ウイルスである；ウイルスは、エボラウイルスである；ウイルスは、マールブルグウイルスである；ウイルスは、ラッサ熱ウイルスである；ウイルスは、水痘帯状疱疹ウイルスである；ウイルスは、エプスタイン・バーウイルスである；ウイルスは、ヒトヘルペスウイルス6Aまたは6Bである；ウイルスは、HBVである；ウイルスは、パラインフルエンザウイルスである；ウイルスは、ヒトメタニューモウイルスである；ウイルスは、リフトバレー熱ウイルスである；ウイルスは、クリミア・コンゴ出血熱ウイルスである；ウイルスは、西部馬脳炎ウイルスである。
【０１２０】
特定の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、インフルエンザウイルスを標的とする。
【０１２１】
特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、ポリピリミジンオリゴヌクレオチド(またはそのようなポリピリミジンオリゴヌクレオチドを含有する製剤もしくは薬学的組成物)であり、これは例えば本明細書に記載する経口または経膣投与に適合し得る。
【０１２２】
同様に、関連する局面において、本発明は、ヒトまたは動物におけるオンコウイルスに起因する癌の予防的処置方法を提供し、本方法は、そのような治療を必要とするヒトまたは動物に、少なくとも6ヌクレオチド長(または本明細書に記載する他の長さ)の治療有効量の薬理学的に許容される少なくとも一種のランダムオリゴヌクレオチド、またはそのようなオリゴヌクレオチドを含有する製剤もしくは薬学的組成物を投与することによる。一つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドの混合物。
【０１２３】
同様に、関連する局面において、本発明は、ヒトまたは動物におけるオンコウイルスに起因する癌の予防的処置のための使用を提供し、本使用は、そのような処置を必要とするヒトまたは動物に、少なくとも6ヌクレオチド長(または本明細書に記載する他の長さ)の治療有効量の薬理学的に許容される少なくとも一種のランダムオリゴヌクレオチド、またはそのようなオリゴヌクレオチドを含有する製剤もしくは薬学的組成物を投与することによる。一つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドの混合物を投与する。
【０１２４】
特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、本発明のために本明細書に記載するようなものであり、例えば本明細書に記載する長さを有する；本明細書に記載するような投与方法が用いられる；本明細書に記載するような使用が用いられる；本明細書に記載するような送達系が用いられる。
【０１２５】
用語「治療有効量」は、意図されるタイプの典型的な対象に投与した場合に、感染性ウイルス粒子の産生の治療的または予防的に有意な低下をもたらすに十分な量を指す。対象に対する抗ウイルスオリゴヌクレオチド投与に関与する局面において、典型的には、オリゴヌクレオチド、製剤または組成物は、治療有効量で投与されるべきである。
【０１２６】
本明細書に記載するオリゴヌクレオチド製剤、薬学的組成物、処置および予防方法、ならびに／または処置および予防のための使用を含む特定の態様において、配列非依存的な作用様式を有するオリゴヌクレオチドは、トランスフェクション剤と関連していない；配列非依存的な作用様式を有するオリゴヌクレオチドは、リポソームおよび／または非リポソーム脂質粒子内に封入されていない。所定の態様において、配列非依存的な作用様式を有するオリゴヌクレオチドは、薬学的組成物中に存在するか、または主として配列依存的な作用様式で作用する抗ウイルスオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはsiRNAと共に(同時にまたは連続的に)投与される。ここで、配列依存的な作用様式を有するオリゴヌクレオチドは、トランスフェクション剤と関連されるか、および／またはリポソームおよび／または非リポソーム脂質粒子内に封入され得る。
【０１２７】
別の局面において、配列非依存性の、例えば配列相補的ではない相互作用が、有効な抗ウイルス活性をもたらすという発見は、ウイルス成分、1個または複数のウイルスタンパク質(例、感染した宿主有機体のウイルス培養物から抽出もしくは精製した、または組換え法により生成した)に対するオリゴヌクレオチドの結合を変更する化合物を同定するスクリーニング方法を提供する。例えば、本方法は、試験化合物が1個または複数のウイルス成分に対するオリゴヌクレオチドの結合を低下させるか否かの測定に関与し得る。
【０１２８】
本明細書において使用される用語「スクリーニング」は、複数の化合物をアッセイして、所望の性質を所有するか否かを決定することを指す。複数の化合物は、例えば少なくとも10、100、1000、10,000またはそれ以上の試験化合物であり得る。
【０１２９】
特定の態様において、多様なアッセイフォーマットおよび検出方法のいずれかを使用して、そのような結合の変化を同定することができる。例えばオリゴヌクレオチドを、スクリーニングするべき化合物の存在下および不在下で、ウイルス成分と接触させて(例、別個の反応において)、化合物の不在下と比較して、化合物の存在下でオリゴのウイルス成分に対する結合における差異が生じるか否かを測定する。そのような差異の存在は、化合物がランダムオリゴヌクレオチドのウイルス成分に対する結合を変更することを示す。または、オリゴヌクレオチドをウイルス成分に結合させ、加えた試験化合物による置換を測定するか、または逆に、試験化合物を結合させ、加えたオリゴヌクレオチドによる置換を測定するといった競合的置換を用いることができる。
【０１３０】
特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、抗ウイルスオリゴヌクレオチドに関して本明細書に記載した通りである；オリゴヌクレオチドは、少なくとも6、8、10、15、20、25、29、30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110もしくは120ヌクレオチド長を有するか、または少なくとも抗ウイルスオリゴヌクレオチドに関して本明細書に特定した他の長さを有するか、または前記の値の任意の二つをその範囲の終点を含むものとして定義する範囲内の長さを有する；試験化合物は、小分子である。試験化合物は、400、500、600、800、1000、1500、2000、2500または3000ダルトン未満の分子量を有するか、または前記の値の任意の二つを、その範囲の終点を含むものとして定義する範囲内の分子量を有する；ウイルス抽出物またはウイルス成分は、本明細書に列挙するウイルスを由来とする；少なくとも100、1000、10,000、20,000、50,000または100,000の化合物がスクリーニングされる；オリゴヌクレオチドは、インビトロで、10、5、2、1、0.500、0.200、0.100、0.075、0.05、0.045、0.04、0.035、0.03、0.025、0.02、0.015または0.01μMと等しいかまたはそれ未満のIC50を有する。
【０１３１】
本発明は更に、表21に示すオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１３２】
本発明は更に、REP 1001、REP 2001、REP 3007、REP 2004、REP 2005、REP 2006、REP 2007、REP 2008、REP 2017、REP 2018、REP 2020、REP 2021、REP 2024、REP 2036、A20、G20、C20、REP 2029、REP 2031、REP 2030、REP 2033、REP 2055、REP 2056、REP 2057、REP 2060およびREP 2107のいずれか一つに示されている抗ウイルスオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１３３】
本明細書で使用される用語「ウイルス構成成分」は、ウイルスにコードされた生成物又はウイルス感染の結果感染した宿主細胞により産生される生成物を言う。そのような構成成分には、タンパク質及びそのほかの生体分子を挙げることができる。そのようなウイルス構成成分は、たとえば、ウイルスの培養、感染した宿主生物、たとえば、動物又は植物から得ることができ、又は組換え系（原核生物又は真核生物）においてウイルスの配列、同様に、ウイルスがコードするタンパク質に相当するアミノ酸配列を有する合成タンパク質から産生することができる。用語「ウイルス培養抽出物」は、ウイルス特異的生成物を包含するウイルスにより感染させられた細胞からの抽出物を言う。同様に、「ウイルスタンパク質」は、通常ウイルスにコードされたウイルス特異的タンパク質を言うが、ウイルス感染の結果として宿主の配列により部分的にコードされうるウイルス特異的タンパク質も言う。
【０１３４】
関連する局面では、本発明は、前出の方法により同定される抗ウイルス性化合物、たとえば、新規の抗ウイルス性化合物を提供する。
【０１３５】
さらなる局面では、本発明は、オリゴヌクレオチドのプールを、たとえば、固定相媒体に結合した少なくとも1つのウイルス構成成分に接触させ、ウイルス構成成分に結合したオリゴヌクレオチドを回収することによってオリゴヌクレオチドのプールから少なくとも1つのウイルス構成成分に結合するオリゴヌクレオチドを精製する方法を提供する。一般に、回収には、ウイルス構成成分からのオリゴヌクレオチドの置き換えが含まれる。本方法は、回収したオリゴヌクレオチド（すなわち、ウイルスタンパク質に結合したオリゴヌクレオチド）の配列決定及び／又は抗ウイルス活性試験を含むこともできる。
【０１３６】
特定の態様では、プールの結合したオリゴヌクレオチドは、たとえば、イオン性の置き換え体を用いて、任意の適当な方法によって固定相媒体から置き換えられ、置き換えられたオリゴヌクレオチドを回収する。通常、種々の置換方法について、オリゴヌクレオチドが高い結合親和性の順に一様に置き換わるように厳密性を高くすること（たとえば、段階的な又は連続的な勾配があるように塩のような置換剤の濃度を高めることによって）によって置換を実施することができる。多くの場合、低い厳密性の洗浄を行って弱く結合したオリゴヌクレオチドを取り除き、置き換わった、さらに強く結合したオリゴヌクレオチドを含有する1以上の分画を回収する。場合によっては、さらに使用するために、非常に強く結合するオリゴヌクレオチド（たとえば、さらに厳密な置換条件による置換で生じた分画におけるオリゴヌクレオチド）を含有する分画を選択することが望ましい。
【０１３７】
同様に、本発明は、オリゴヌクレオチドのプールを1以上のウイルスタンパク質に接触させ、ウイルスタンパク質に結合したオリゴヌクレオチドを増幅させて濃縮したオリゴヌクレオチドプールを提供することによる、少なくとも1つのウイルス構成成分に結合するオリゴヌクレオチドのプールからオリゴヌクレオチドを濃縮する方法を提供する。接触及び増幅は、次の回のオリゴヌクレオチドのプールとして前の回の濃縮したオリゴヌクレオチドプールを用いて、複数回、たとえば1、2、3、4、5、10以上の追加回数行うことができる。方法はまた、接触及び増幅の1以上の回数に続いて、濃縮されたオリゴヌクレオチドプールにおけるオリゴヌクレオチドの配列決定及び抗ウイルス活性試験をも含むことができる。
【０１３８】
本方法は、たとえば、置換剤を用いて、上述のように、種々の技法によりウイルス構成成分（たとえば、固相媒体に結合したウイルスタンパク質）からオリゴヌクレオチドを置換することを含む。上記で示したように、更なる使用、たとえば、結合及び増幅のさらなる回のために、さらに強く結合するオリゴヌクレオチドを選択することは有利でありうる。方法は1以上の濃縮されたオリゴヌクレオチド、たとえば、高親和性オリゴヌクレオチドを選択することをさらに含み、さらに使用することができる。特定の態様では、選択には、関心のある特定のウイルスについて、宿主のゲノム配列（たとえば、ヒト）に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドの排除が包含されうる。そのような排除は、たとえば、配列配置プログラム（たとえば、BLAST検索）を用いて配列データベースにおける特定の宿主に由来する配列とオリゴヌクレオチド配列を比較すること、及び宿主配列と同一の、又は特定のレベルで同一性を持つ配列を有するオリゴヌクレオチドを排除することを含むことができる。そのような宿主相補性配列の排除及び／又は宿主配列に相補的でない1以上のオリゴヌクレオチドの選択は、本発明のそのほかの局面についても実施することができる。
【０１３９】
オリゴヌクレオチドを同定する、精製する又は濃縮する、前出の方法では、オリゴヌクレオチドは本明細書に記載されるような種類である。上記の方法は、たとえば、オリゴヌクレオチドのランダマー調製物から、高親和性オリゴヌクレオチドを同定する、精製する又は濃縮するために有利である。
【０１４０】
関連する局面では、本発明は、当初のオリゴヌクレオチドプールから抗ウイルス性オリゴヌクレオチドを同定する、精製する又は濃縮する前出の方法のいずれかの方法を用いて同定される1以上のオリゴヌクレオチドを包含する抗ウイルス性オリゴヌクレオチド調製物に関するものであり、その際、オリゴヌクレオチド調製物中のオリゴヌクレオチドは、当初のオリゴヌクレオチドプールにおけるオリゴヌクレオチドの平均結合親和性よりも、高い、1以上のウイルスタンパク質に対する平均結合親和性を呈する。
【０１４１】
特定の態様では、オリゴヌクレオチドの平均結合親和性は、当初のオリゴヌクレオチドプールにおけるオリゴヌクレオチドの平均結合親和性よりも少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍又は100倍高く、又はさらに高く；結合親和性の中央値は、当初のオリゴプールの結合親和性の中央値に比べて、少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍又は100倍高く、その際、中央値は真ん中の値を言う。
【０１４２】
さらにもう1つの局面では、本発明は、少なくとも1つの抗ウイルス性オリゴヌクレオチド及び少なくとも1つの非ヌクレオチド抗ウイルス性ポリマーを包含する抗ウイルス性ポリマーミックスを提供する。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは抗ウイルス性オリゴヌクレオチドについて本明細書で記載されるようなオリゴヌクレオチドであり及び／又は抗ウイルス性ポリマーは本明細書で記載されるような抗ウイルス性ポリマーはであり、又はさもなければ、当該技術で既知である抗ウイルス性ポリマーは、又は以下に特定する抗ウイルス性ポリマーはである。
【０１４３】
さらにもう1つの局面では、本発明は、ランダマーが少なくとも長さ6ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドランダマーを提供する。特定の態様では、ランダマーは抗ウイルス性オリゴヌクレオチドについて上記で特定されたような長さを有し；ランダマーは、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を包含し、ランダマーは、少なくとも1つのホスホロジチオエート結合又は本明細書で列記されるようなそのほかの修飾を包含し；ランダマーオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの非ランダマー断片（たとえば、選択されたウイルスの核酸配列に相補的な断片）を包含し、それは、オリゴヌクレオチドについて上記で特定されたような長さを有することができ；ランダマーは、少なくとも5、10、15、20、50、100、200、500又は700μM、1、5、7、10、20、50、100、200、500又は700mM若しくは1Mのランダマーを含有する調製物中若しくは調製物のプール中にあり、又は包含的な端点として前出から2つの異なる値をとることにより画定される範囲内にあり、又は列記された尺度若しくは尺度の範囲の1つで合成される。
【０１４４】
同様に、本発明は、少なくとも1つのランダマー、たとえば、上述のようなランダマーを合成することによって抗ウイルス性ランダマーを調製する方法を提供する。
【０１４５】
上記で示したように、ウイルス感染又はウイルス感染のリスク又は特定のウイルスへの標的化に関与するいかなる局面についても、特定の態様では、ウイルスは上記で列記されたようなものである。
【０１４６】
表現「ヒト及び動物のウイルス」は、限定することなく、一般にDNAウイルス及びRNAウイルスを包含することが意図される。DNAウイルスには、たとえば、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、肝炎ウイルス科、及びパピローマウイルス科が挙げられる。RNAウイルスには、たとえば、アレナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、レオウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科又はトガウイルス科が挙げられる。
【０１４７】
もう1つの分子又は部分と結合又は複合化することによるオリゴヌクレオチドの特性の改変に関連して、特性の改変は、結合又は複合化した分子又は部分のない同一オリゴヌクレオチドに比べて、評価される。
【０１４８】
追加の態様は、詳細な説明及び請求の範囲から明らかになるであろう。
【０１４９】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、配列非依存的な機序により作用する抗ウイルスオリゴヌクレオチドの同定および使用に関し、また多数のウイルスに対する使用の発見を含み、抗ウイルス活性は、より大きいオリゴヌクレオチドにおいてより大きく、典型的に40ヌクレオチドまたはそれ以上の長さのオリゴヌクレオチドにおいて最適である。
【０１５０】
本発明によれば、少なくとも一種の修飾されたヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを提供し、該オリゴヌクレオチドは、標的ウイルスに対する抗ウイルス活性を有し、該活性は、大部分は配列非依存的な作用様式で作用する。
【０１５１】
本発明によれば、オリゴヌクレオチド内の少なくとも50%のヌクレオチドが、リボース部分の2'位において修飾され、かつ少なくとも50%のヌクレオチド間結合が修飾されているオリゴヌクレオチドを提供し、該オリゴヌクレオチドは、標的ウイルスに対する抗ウイルス活性を有し、該活性は、大部分は配列非依存的な作用様式で作用する。一態様においては、各々50%、80%である。一態様においては、各々80%、80%である。一態様においては、各々90%、90%である。一態様においては、各々100%、100%である。
【０１５２】
長さおよび非自己相補性
本発明は更に、少なくとも15ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、少なくとも20ヌクレオチド長。一態様において、少なくとも25ヌクレオチド長。一態様において、少なくとも30ヌクレオチド長。一態様において、少なくとも35ヌクレオチド長。一態様において、少なくとも40ヌクレオチド長。一態様において、少なくとも45ヌクレオチド長。一態様において、少なくとも50ヌクレオチド長。一態様において、少なくとも60ヌクレオチド長。一態様において、少なくとも80ヌクレオチド長。
【０１５３】
本発明は更に、20〜30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、30〜40ヌクレオチド長。一態様において、40〜50ヌクレオチド長。一態様において、50〜60ヌクレオチド長。一態様において、60〜70ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド。一態様において、70〜80ヌクレオチド長。
【０１５４】
本発明は更に、5より大きい連続するヌクレオチドからなる自己相補的な配列を有さないオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、10より大きい連続するヌクレオチド。一態様において、20より大きい連続するヌクレオチド。
【０１５５】
本発明は更に、触媒活性を有さないオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１５６】
ランダム
本発明は更に、標的ウイルスに対する抗ウイルス活性を有するオリゴヌクレオチドを提供し、該オリゴヌクレオチドの配列は、該標的ウイルスのゲノム配列の等しい長さのいずれの部分とも相補的ではない。
【０１５７】
本発明は更に、ヒト病原ウイルスのゲノム配列の等しい長さのいずれの部分とも相補的ではないオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１５８】
本発明は更に、2005年1月1日に配列決定されたようなヒト病原ウイルスのゲノム配列の等しい長さのいずれの部分とも相補的ではないオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１５９】
本発明は更に、ヒトのゲノム配列の等しい長さのいずれの部分とも相補的ではないオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１６０】
本発明は更に、牛、馬、豚、羊、鳥、犬、猫および魚からなる群より選択される1種または複数種の動物のゲノム配列の等しい長さのいずれの部分とも相補的ではないオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１６１】
RNAおよび他の鎖部分の制限
本発明は更に、少なくとも30%のヌクレオチドがリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、少なくとも50%のヌクレオチドがリボヌクレオチドである。一態様において、少なくとも70%のヌクレオチドがリボヌクレオチドである。一態様において、少なくとも80%のヌクレオチドがリボヌクレオチドである。一態様において、少なくとも90%のヌクレオチドがリボヌクレオチドである。一態様において、全部のヌクレオチドがリボヌクレオチドである。
【０１６２】
本発明は更に、1〜4個の非ヌクレオチド鎖部分を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１６３】
ランダマー
本発明は更に、ランダマー配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを提供する。一態様において、ランダマー配列の少なくとも20個のヌクレオチド。一態様において、ランダマー配列の少なくとも30個のヌクレオチド。一態様において、ランダマー配列の少なくとも40個のヌクレオチド。
【０１６４】
本発明は更に、ランダマーオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１６５】
ホモポリマー
本発明は更に、少なくとも10個の連続するAヌクレオチドからなるホモポリマー配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、少なくとも10個の連続するTヌクレオチド。一態様において、少なくとも10個の連続するUヌクレオチド。一態様において、少なくとも10個の連続するCヌクレオチド。一態様において、少なくとも10個の連続するGヌクレオチド。一態様において、少なくとも10個の連続するIヌクレオチド類似体。
【０１６６】
ヘテロ二量体
本発明は更に、少なくとも10ヌクレオチド長のポリAT配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、少なくとも10ヌクレオチド長のポリAC配列。一態様において、少なくとも10ヌクレオチド長のポリAG配列。一態様において、少なくとも10ヌクレオチド長のポリAU配列。一態様において、少なくとも10ヌクレオチド長のポリAI配列。一態様において、少なくとも10ヌクレオチド長のポリGC配列。一態様において、少なくとも10ヌクレオチド長のポリGT配列。一態様において、少なくとも10ヌクレオチド長のポリGU配列。一態様において、少なくとも10ヌクレオチド長のポリGI配列。一態様において、少なくとも10ヌクレオチド長のポリCT配列。一態様において、少なくとも10ヌクレオチド長のポリCU配列。一態様において、少なくとも10ヌクレオチド長のポリCI配列。一態様において、少なくとも10ヌクレオチド長のポリTI配列。
【０１６７】
psおよびps2を含む、修飾結合
本発明は更に、修飾された結合が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合およびボラノホスフェート結合からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１６８】
本発明は更に、少なくとも50%のヌクレオチド間結合が、修飾された結合であるオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、少なくとも80%のヌクレオチド間結合が修飾された結合である。一態様において、少なくとも90%のヌクレオチド間結合が修飾された結合である。一態様において、全部のヌクレオチド間結合が修飾された結合である。
【０１６９】
本発明は更に、少なくとも50%のヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合であるオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、少なくとも80%のヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である。一態様において、少なくとも90%のヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である。一態様において、全てのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である。
【０１７０】
本発明は更に、少なくとも50%のヌクレオチド間結合がホスホロジチオエート結合であるオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、少なくとも80%のヌクレオチド間結合がホスホロジチオエート結合である。一態様において、全てのヌクレオチド間結合がホスホロジチオエート結合である。
【０１７１】
2'-修飾、修飾結合との組み合わせ
本発明は更に、少なくとも1個のホスホジエステル結合を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも10%のホスホジエステル結合を含む。一態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも20%ホスホジエステル結合を含む。
【０１７２】
一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも50%のヌクレオチドが、リボース部分の2'位において修飾されている。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも60%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾されている。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも70%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾されている。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも80%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾されている。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも90%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾されている。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の100%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾されている。
【０１７３】
本発明は更に、オリゴヌクレオチド内の、少なくとも50%のヌクレオチド間結合が修飾されかつ少なくとも50%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾されているオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも60%のヌクレオチド間結合が修飾され、かつ少なくとも60%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾されている。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも70%のヌクレオチド間結合が修飾され、かつ少なくとも70%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾されている。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも80%のヌクレオチド間結合が修飾され、かつ少なくとも80%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾されている。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオチド間結合が修飾され、かつ全てのヌクレオチドがリボース部分の2'位において修飾されている。
【０１７４】
本発明は更に、オリゴヌクレオチド内の少なくとも15%のヌクレオチドが、リボース部分の2'位において2'-0Me部分を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも20%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において2'-0Me部分を含む。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも30%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において2'-0Me部分を含む。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも50%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において2'-0Me部分を含む。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも60%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において2'-0Me部分を含む。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも70%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において2'-0Me部分を含む。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも80%のヌクレオチドが、リボース部分の2'位において2'-0Me部分を含む。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の少なくとも90%のヌクレオチドがリボース部分の2'位において2'-0Me部分を含む。一態様において、該オリゴヌクレオチド内の全部のヌクレオチドがリボース部分の2'位において2'-0Me部分を含む。
【０１７５】
多様な特徴
本発明は更に、リンカーで連結された2個またはそれ以上のオリゴヌクレオチド配列からなる鎖状体であるオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１７６】
本発明は更に、1個または複数のヌクレオチド残基において、オリゴヌクレオチドの性質を変更して、より高い安定性、血清とのより低い相互作用、より高い細胞取り込み、ウイルスタンパク質とのより高い相互作用、送達用に調製するための改善された能力、検出可能なシグナル、より高い抗ウイルス活性、より良好な薬物動態学的性質、特定の組織分布、より低い毒性からなる群より選択される1個または複数の性質を獲得する分子に対して結合または複合しているオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１７７】
本発明は更に、二本鎖であるオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１７８】
本発明は更に、二本鎖または一本鎖であり、かつ非ワトソン-クリック型の相互作用を介してハイブリダイズすることが可能な、少なくとも1個の塩基を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１７９】
本発明は更に、ウイルスmRNAに対して相補的な部分を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８０】
本発明は更に、1個または複数のウイルス成分に結合するオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８１】
本発明は更に、1個または複数の宿主成分と相互作用し、該相互作用がウイルスの活性または産生の阻害をもたらす、オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８２】
本発明は更に、その配列の少なくとも一部が、ウイルスゲノムに由来するオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８３】
本発明は更に、その配列の少なくとも一部がウイルスゲノムに由来し、かつ配列相補的ではない作用様式が大部分である抗ウイルス活性を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８４】
本発明は更に、その配列の少なくとも一部が、ウイルスパッケージング配列またはアプタマー相互作用に関与する他のウイルス配列に由来する、オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８５】
本発明は更に、その配列の少なくとも一部が、ウイルス成分もしくは宿主成分またはその両方とのアプタマー相互作用に関与する、オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８６】
活性レベル
本発明は更に、標的ウイルスに関して0.10μmまたはそれ未満のIC50を有するオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、該オリゴヌクレオチドは、標的ウイルスに関して0.05μmまたはそれ未満のIC50を有する。一態様において、該オリゴヌクレオチドは、標的ウイルスに関して0.025μmまたはそれ未満のIC50を有する。一態様において、該オリゴヌクレオチドは、標的ウイルスに関して0.015μmまたはそれ未満のIC50を有する。
【０１８７】
標的ウイルス
本発明は更に、DNAウイルスを標的とするオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、RNAウイルス。一態様において、ヘルペスウイルス科の一メンバー。一態様において、HSV-1。一態様において、HSV-2。一態様において、CMV。一態様において、ヘパドナウイルス科の一メンバー。一態様において、HBV。一態様において、パルボウイルス科の一メンバー。一態様において、ポックスウイルス科の一メンバー。一態様において、パピローマウイルス科の一メンバー。一態様において、アデノウイルス科の一メンバー。一態様において、レトロウイルス科の一メンバー。一態様において、HIV-1。一態様において、HIV-2。一態様において、パラミクソウイルス科の一メンバー。一態様において、RSV。一態様において、パラインフルエンザウイルス。一態様において、ブニヤウイルス科の一メンバー。一態様において、ハンタウイルス。一態様において、ピコルナウイルス科の一メンバー。一態様において、コクサッキーウイルス。一態様において、ライノウイルス。一態様において、フラビウイルス科の一メンバー。一態様において、黄熱病ウイルス。一態様において、デングウイルス。一態様において、ウエストナイルウイルス。一態様において、C型肝炎ウイルス。一態様において、フィロウイルス科の一メンバー。一態様において、エボラウイルス。一態様において、マールブルグウイルス。一態様において、オルトミクソウイルス科の一メンバー。一態様において、インフルエンザウイルス。一態様において、トガウイルス科の一メンバー。一態様において、コロナウイルス科の一メンバー。一態様において、レオウイルス科の一メンバー。一態様において、ラブドウイルス科の一メンバー。一態様において、アレナウイルス科の一メンバー。一態様において、カルシウイルス科の一メンバー。一態様において、水痘帯状疱疹ウイルス。一態様において、エプスタイン・バーウイルス。一態様において、ヘルペスウイルス6Aまたは6B。一態様において、ヘパドナウイルス科の一メンバー。一態様において、ヒトメタニューモウイルス。一態様において、リフトバレーウイルス。一態様において、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス。一態様において、西部馬脳炎ウイルス。一態様において、ラッサ熱ウイルス。
【０１８８】
オリゴヌクレオチド
本発明は更に、少なくとも20個の結合したヌクレオチドを含み、少なくとも80%の結合が修飾されており；かつ少なくとも80%のヌクレオチドが、リボース糖部分の2'-修飾を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、このオリゴヌクレオチドは抗ウイルス活性を有している。
【０１８９】
一態様において、少なくとも90%のヌクレオチド間結合が修飾されている。一態様において、全部のヌクレオチド間結合が修飾されている。一態様において、少なくとも90%のヌクレオチドがリボース糖の2'-修飾を含む。一態様において、全部のヌクレオチドがリボース糖の2'-修飾を含む。
【０１９０】
本発明は更に、2'-修飾が2'-OMe置換であるオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、少なくとも90%のヌクレオチドが2'-OMe置換を含む。一態様において、全部のヌクレオチドが2'-OMe置換を含む。
【０１９１】
本発明は更に、2'-修飾が2'-メトキシエトキシ置換であるオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、少なくとも15%のヌクレオチドが2'-メトキシエトキシ置換を含む。一態様において、少なくとも50%のヌクレオチドが2'-メトキシエトキシ置換を含む。一態様において、少なくとも90%のヌクレオチドが2'-メトキシエトキシ置換を含む。一態様において、全部のヌクレオチドが2'-メトキシエトキシ置換を含む。
【０１９２】
本発明は更に、少なくとも40ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、少なくとも50ヌクレオチド長。一態様において、少なくとも60ヌクレオチド長。一態様において、少なくとも80ヌクレオチド長。
【０１９３】
本発明は更に、30〜40ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、40〜50ヌクレオチド長。一態様において、50〜60ヌクレオチド長。一態様において、60〜70ヌクレオチド長。一態様において、70〜80ヌクレオチド長。
【０１９４】
本発明は更に、5個より多い連続するヌクレオチドからなる自己相補的な配列を有さないヌクレオチドを提供する。一態様において、10個より多い連続するヌクレオチド。一態様において、20個より多い連続するヌクレオチド。
【０１９５】
本発明は更に、触媒活性を有さないオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９６】
鎖部分の制限
本発明は更に、1〜4個の非ヌクレオチド鎖部分を更に含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９７】
混合物
本発明は更に、少なくとも2種の異なる本発明の抗ウイルスオリゴヌクレオチドの混合物を含む、オリゴヌクレオチド混合物を提供する。一態様において、少なくとも10種の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチド。一態様において、少なくとも100種の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチド。一態様において、少なくとも1000種の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチド。一態様において、少なくとも106種の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチド。
【０１９８】
本発明は更に、複数の該異なるオリゴヌクレオチドが、少なくとも10ヌクレオチド長である混合物を提供する。一態様において、少なくとも20ヌクレオチド長である。一態様において、少なくとも30ヌクレオチド長である。一態様において、少なくとも40ヌクレオチド長である。一態様において、少なくとも50ヌクレオチド長である。一態様において、少なくとも60ヌクレオチド長である。一態様において、少なくとも70ヌクレオチド長である。一態様において、少なくとも80ヌクレオチド長である。一態様において、少なくとも120ヌクレオチド長である。
【０１９９】
薬学的組成物
本発明は更に、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容される抗ウイルスオリゴヌクレオチド、ポリピリミジンまたはオリゴヌクレオチド混合物、および薬学的に許容される担体とを含有する抗ウイルス薬学的組成物を提供し、該オリゴヌクレオチドまたは該混合物中のオリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性は、主として配列非依存的な作用様式により生じる。
【０２００】
本発明は更に、ウイルス病因を伴う疾病の処置、制御または予防に適合された抗ウイルス薬学的組成物を提供する。
【０２０１】
本発明は更に、プリオン疾病の処置、制御または予防に適合された抗ウイルス薬学的組成物を提供する。
【０２０２】
本発明は更に、眼内、経口消化、経腸、吸入、皮内注入、皮下注入、筋内注入、腹腔内注入、くも膜下注入、気管内注入および静脈内注入からなる群より選択される様式による送達に適合された抗ウイルス薬学的組成物を提供する。
【０２０３】
本発明は更に、送達系を更に含む抗ウイルス薬学的組成物を提供する。一態様において、該送達系は、特定の細胞または特定の組織を標的とする。一態様において、該組成物は、更に少なくとも一種の他の抗ウイルス薬を、組み合わせて含有する。一態様において、該組成物は、更に非ヌクレオチド抗ウイルスポリマーを、組み合わせて含有する。一態様において、該組成物は、抗ウイルスアンチセンスオリゴヌクレオチドを、組み合わせて含有する。一態様において、該組成物は、更に抗ウイルスRNAi-誘導オリゴヌクレオチドを含有する。一態様において、該抗ウイルスRNAi-誘導オリゴヌクレオチドは、siRNAである。
【０２０４】
本発明は更に、標的ウイルスに関して0.10μMまたはそれ未満のIC50を有する抗ウイルス薬学的組成物を提供する。一態様において、標的ウイルスに関して0.05μMまたはそれ未満のIC50を有する抗ウイルス薬学的組成物を提供する。一態様において、標的ウイルスに関して0.025μMまたはそれ未満のIC50を有する抗ウイルス薬学的組成物を提供する。一態様において、標的ウイルスに関して0.015μMまたはそれ未満のIC50を有する抗ウイルス薬学的組成物を提供する。
【０２０５】
キット
本発明は更に、少なくとも一種の抗ウイルスオリゴヌクレオチド、混合物または抗ウイルス薬学的組成物を、ラベルを貼ったパッケージ内に含み、該オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性が主として配列相補的ではない作用様式により生じ、かつ該パッケージ上のラベルが該抗ウイルスオリゴヌクレオチドを少なくとも一種のウイルスに対して使用できることを示す、キットを提供する。
【０２０６】
本発明は更に、少なくとも二種の異なる抗ウイルスオリゴヌクレオチドの混合物を含むキットを提供する。
【０２０７】
本発明は更に、規制機関によりヒトでの使用が認可されたキットを提供する。
【０２０８】
本発明は更に、規制機関により、少なくとも一種のヒトではない動物での使用が許可されたキット提供する。一態様において、該ヒトではない動物は、霊長類である。一態様において、該ヒトではない動物は、猫である。一態様において、該ヒトではない動物は、牛である。一態様において、該ヒトではない動物は、羊である。一態様において、該ヒトではない動物は、犬である。一態様において、該ヒトではない動物は、豚である。一態様において、該ヒトではない動物は、馬である。
【０２０９】
処置の方法
本発明は更に、本発明による少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、または本発明による薬学的組成物の、対象におけるウイルス感染の予防または処置のための医薬の製造における使用を提供する。
【０２１０】
一態様において、該対象はヒトである。一態様において、該対象はヒトではない動物である。一態様において、該ヒトではない動物は霊長類である。一態様において、該ヒトではない動物は猫である。一態様において、該ヒトではない動物は牛である。一態様において、該ヒトではない動物は羊である。一態様において、該ヒトではない動物は犬である。一態様において、該ヒトではない動物は豚である。一態様において、該ヒトではない動物は馬である。一態様において、該対象は植物である。
【０２１１】
本発明は更に、本発明による少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、または本発明による薬学的組成物の、ヒトまたはヒトではない動物内でオンコウイルスに起因する癌の予防的処置のための医薬の製造における使用を提供する。
【０２１２】
一態様において、該オリゴヌクレオチドはヒトに投与される。一態様において、該オリゴヌクレオチドは、ヒトではない動物に投与される。一態様において、該ヒトではない動物は霊長類である。一態様において、該ヒトではない動物は猫である。一態様において、該ヒトではない動物は牛である。一態様において、該ヒトではない動物は羊である。一態様において、該ヒトではない動物は犬である。一態様において、該ヒトではない動物は豚である。一態様において、該ヒトではない動物は馬である。
【０２１３】
ポリピリミジンオリゴ関連
【０２１４】
本発明は更に、少なくとも50%のピリミジン残基を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一態様においては、少なくとも80%。一態様においては、少なくとも90%。一態様においては、ピリミジン残基のみである。
【０２１５】
本発明は更に、ピリミジン残基がシトシン残基であるオリゴヌクレオチドを提供する。一態様においては、チミン残基。一態様においては、シトシン残基またはチミン残基である。
【０２１６】
本発明は更に、治療有効量の少なくとも一種の薬理学的に許容されるポリピリミジンオリゴヌクレオチドまたはポリピリミジンオリゴヌクレオチド混合物、および薬学的に許容される担体とを含有し、該オリゴヌクレオチドまたは該混合物中のオリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性が主として配列非依存的な作用様式により生じる、抗ウイルス薬学的組成物を提供する。一態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド間結合を含む。
【０２１７】
一態様において、該組成物は、インビボの酸性部位への投与に適合している。
一態様において、該組成物は、更に浸透促進剤を含有する。
一態様において、該組成物は、更に界面活性剤を含有する。
一態様において、該組成物は、粉末形態である。
一態様において、該組成物は、顆粒形態である。
一態様において、該組成物は、微粒子形態である。
一態様において、該組成物は、ナノ粒子形態である。
一態様において、該組成物は、縣濁液または溶液形態である。
一態様において、該組成物は、エマルション形態である。
一態様において、該組成物は、経口投与に適合している。
一態様において、該組成物は、経膣投与に適合している。
一態様において、該組成物は、少なくとも一種のポリCオリゴヌクレオチドを含有する。
一態様において、該組成物は、少なくとも一種のポリTオリゴヌクレオチドを含有する。
一態様において、該組成物は、少なくとも一種のポリCTオリゴヌクレオチドを含有する。
一態様において、該組成物は、ヒトへの投与が認可されている。
一態様において、該組成物は、哺乳動物への投与が認可されている。
一態様において、該組成物は、非哺乳動物への投与が認可されている。
【０２１８】
本発明は更に、インビボの酸性部位への投与に適合された、少なくとも一種の薬理学的に許容されるポリピリミジンオリゴヌクレオチドを含有する薬学的組成物の、対象においてウイルス感染を予防または処置するための医薬の製造における使用を提供する。
【０２１９】
一態様において、該対象はヒトである。一態様において、該対象は哺乳動物である。一態様において、該対象は非哺乳動物である。
【０２２０】
「発明の背景」に記載したように、多数のアンチセンスオリゴヌクレオチド(ON)の抗ウイルス活性が試験されている。しかしながら、これらのアンチセンスONは配列特異的であり、典型的に約16〜20のヌクレオチド長である。
【０２２１】
実施例1および実施例2の結果に示されるように、ランダムPS-ONの抗ウイルス効果は、配列特異的ではない。これらの試験に使用したPS-ONの容積および濃度を考慮すると、混合物中に特定のランダム配列が1コピーより多く存在することは、理論的にほぼ不可能である。このことは、これらPS-ONランダマーにアンチセンス効果は存在し得ないことを意味する。後者の例では、抗ウイルス効果がPS-ONの配列特異性により生じたと仮定すると、そのような効果は、1個のみの分子により生じる必要があり、それは可能であるとは思われない。例えば、40塩基長のONランダマーに関して、集団中の特定の配列はいずれも、理論的には総断片の1/440または4.1×10-41のみ存在する。1モル=6.022×1023分子を前提とし、本発明者らの最大規模の合成が現在、15マイクロモルの規模で行われている事実により、可能な配列の全ては存在しないと思われ、また、各配列は、1個のコピーのみとして存在する可能性が最も高い。勿論、本発明の教示を適用する当業者は、そのような配列特異的なONの配列を有するONも使用し得るが、本発明で発見された配列非依存的活性を利用する。従って、本発明は、非配列相補的なONに限定されないが、ウイルス感染を処置するための、配列特異的なアンチセンスおよびRNAi(例、siRNA)ONに関する先行技術に開示されているものの特許請求権を放棄する。
【０２２２】
適用可能なウイルス(例えば、本明細書にデータが記載されているものを含む)に関しては、ランダマーのサイズが増大するにつれて、オリゴヌクレオチド長さが40ヌクレオチド迄、および更に40ヌクレオチドを越える迄、その抗ウイルス能が増加する。現在のホスホロアミダイトベースのオリゴヌクレオチド合成の限界を原因として、比較的大きいPS-ON(例、80-および120-mers)は、所望のサイズよりも小さい断片が相当混入することを指摘せねばならない。比較的大きいオリゴ(80および120bp)に見られる比較的弱い効果(塩基毎ベースで)は、これら集団中の完全長ランダマーの濃度が比較的低いことを反映し得、また適切な部位における利用可能性の低下も反映し得る。適切な純度(例、少なくとも完全長75%)の比較的大きいランダマー(>40塩基)が合成または精製され、および／またはこれらの任意のONの送達が、例えば標的放出または持続放出を提供する送達系によって促進されるならば、はるかに増大した抗ウイルス活性を達成することが可能であり得るだろう。
【０２２３】
本発明において、ランダマー(または本明細書に記載するような他の抗ウイルスオリゴヌクレオチド)は、以下を含むが、それらに限定されるわけではない数個の機序によりウイルス複製を遮断し得る：1. ビリオンの吸収または受容体相互作用を阻止して、感染を防止する、2. ウイルスアセンブリーをドーピングするかまたはウイルスゲノムをカプシドにパッケージングして(ウイルスDNAまたはRNAを競合させてパッケージングする)、不完全ビリオンとする、3. パッケージングまたはカプシドタンパク質が他の構造タンパク質と相互作用する間、カプシドの形成を混乱させまたは防止して、その結果ウイルス放出を阻害するか、または不完全ビリオンを放出させる、4. キーとなるウイルス成分に結合し、それらの活性を阻害または低下させる、5. ウイルス増殖に必要なキーとなる宿主成分に結合する。
【０２２４】
上記に示したような、ウイルス阻害を達成する機序に限定されることなく、ONのウイルス複製に対する阻害特性を説明および／または予想し得る数個の可能な機序が存在する。これらのうちの第一の機序は、ONの一般的なアプタマー効果が、それらを細胞表面上のタンパク質またはウイルスタンパク質のいずれかに結合させて、ウイルス吸収および融合を防止することである。効果に関するサイズ閾値は、相互作用に必要な所定の累積電荷の結果であると考えられる。
【０２２５】
第二の可能な機序は、ウイルスのパッケージングおよび／またはアセンブリーを阻害することにより、ONが細胞内で機能し得ることである。所定のサイズ閾値を越えるONは、正常なカプシド／核酸相互作用と競合するかまたは妨害して、新しいウイルス内への機能的ウイルスゲノムのパッケージングを防止し得る。または、ONは正常なカプシドの形成を阻止して正常なウイルス発芽を阻止し、ウイルス安定性を変更し得るか、または内部移行により適切なビリオン分解を阻止し得る。
【０２２６】
作用機序は未だ完全に証明されていないが、アッセイの結果により、本ONが、臨床的関連物質、アシクロビル、ガンシクロビル、リバビリンおよびプロテアーゼ阻害剤と比較して、ウイルス阻害に多大な抗力を有し得ることが示される。従って、本発明によるONは、ウイルス感染の処置または予防に使用し得る。処置するウイルス感染は、ヒト、動物および植物ウイルスを原因とし得る。本抗ウイルスオリゴヌクレオチドの安定性および／または活性を増大させるために、オリゴヌクレオチドの化学修飾を有利に使用することができる。RNA上のリボースの2'位におけるメトキシ化および他の修飾は、RNAをヌクレアーゼに対して安定化し、ホスホロチオエート化核酸に見られるタンパク質結合を最小にし、および標的配列を伴うこれらオリゴの融点を上昇させることが証明されている。2'-Oメチル化および他の2'-修飾は、現在、アンチセンスオリゴヌクレオチドの性質を改善させるために使用されているが、これらの修飾が全リボース上に存在する場合、オリゴヌクレオチドはRNase H活性を引き出さず、完全2'-修飾オリゴヌクレオチドをアンチセンス活性に関する比較的弱い候補とする。このことにより、オリゴヌクレオチドの両端のみに2'修飾を含み、オリゴのRNase Hを活性化させる能力を維持する、2'-Oメチルおよび他の2'修飾「ギャップマー(gapmers)」を使用する結果となっている。本発明者らの知識によれば、ホスホロチオエート結合およびオリゴヌクレオチドの各リボース糖上が2'-O-メチルまたは他の2'修飾されたリボヌクレオチドを伴う配列非特異的な抗ウイルスオリゴヌクレオチドは報告されていない。
【０２２７】
本明細書において記載するように、本発明者らは、40塩基PS-ONランダマーが、数種の異なるウイルスの強力な阻害剤であることを見出した。本発明者らは、チオエート化バックボーンは、ONランダマーに増大した疎水性の性質を付与し、それによりONランダマーのウイルス融合タンパク質の疎水性ドメインとの相互作用が可能になり得るという非限定的な仮説を提案する。これら疎水性ドメインは、HSV、HIV、インフルエンザ、RSVおよびエボラを含む多数の異なるウイルスの膜融合活性に不可欠であると考えられている。HIVの場合、このような疎水性ドメインは、融合阻害剤の開発のための標的として使用されている。
【０２２８】
従って、ホスホロチオエート結合ならびに2'-O-メチルおよび他の2'糖修飾を含むリボヌクレオチド修飾を本発明のオリゴヌクレオチドに組み込むことは、配列非特異的な抗ウイルスオリゴヌクレオチドの性質の改善に有用である。結果は、PS-ONの各リボースの2'位の修飾はその抗ウイルス活性を有意に変更しないが、PS-ONの血清タンパク質との一般的な相互作用を低下させ、低いpHに対する耐性を有意に向上させることを示す。これらの性質は、薬物動態学的性能を改善し、および通常PS-ONに見られる毒性の副作用を低減することが期待される。例えば、これらのpH耐性は、PS-ONを経口送達により適したものとする。また、これらの血清タンパク質との相互作用の低下は、抗ウイルス活性に影響を与えずに、その薬物動態学的挙動を改善することが期待される。このように、各結合のホスホロチオエート化、および各リボヌクレオチドのリボースの2'位における修飾、例えば2'-O-メチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、抗ウイルス活性を有し、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドに所望される性質であるRNase H活性を引き起こさないが、該性質は本発明に記載する活性には完全に不必要である。結果はまた、PS-ONの各リボースの'2位における修飾は、同一の修飾を含むが両端のみ(ギャップマー)が修飾されたPS-ONと比較して、ONのヌクレアーゼ耐性をより高めることを示している。ギャップマーは、アンチセンス技術において優先的に使用されている。各リボースの'2-位に修飾を含むPS-ONのヌクレアーゼ耐性は、薬物動態学的および／または経口利用性の改善のような有益な性質を示す筈である。
【０２２９】
加えて、各リボースの2'位に修飾を含むPS-ONが所望の性質を示すと共に、リボースの2'位の多数が修飾されたPS-ON、例えばリボースの少なくとも50%の修飾、およびより好ましくは80%もしくはそれ以上の修飾を含むPS-ONも、所望の性質を示すと思われる。
【０２３０】
上述したように、本オリゴヌクレオチドの活性は、ランダマーが例えばアンチセンス活性を有さないため、ハイブリダイゼーションにより核酸を標的としない。従って、本発明者らは、オリゴヌクレオチドはタンパク質を標的とするものと確信する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに2'-O-メチルリボース修飾を加えると、タンパク質結合活性が低下するため(Kandimalla et al., 1998, Bioorganic Med Chem Lett. 8:2103-2108; Mouet al., 2002, Nucleic Acid Res. 30:749-758)、これらの修飾が抗ウイルス活性を低下させることが予想された。意外にも、本発明者らは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに対して2'-O-メチルリボース修飾を加えても、抗ウイルス活性に影響を及ぼさないことを見出した。
【０２３１】
本明細書において、多数の異なるオリゴヌクレオチドに関するアッセイの結果を記載する。別に示さない限り、試験したオリゴヌクレオチドは、2'-H部分(2'-デオキシ)を有し、従ってODNである。しかしながら、本発明の配列非依存的な活性は、そのような2'-H部分を含むオリゴヌクレオチドに限定されず、2'-OH部分ならびに他の2'-修飾、例えば2'-O-メチルおよび2'-フルオロを有するヌクレオチド含有のオリゴにも存在する。
【０２３２】
本明細書の記載において、以下を含む多数の略語を使用する：
選択された略語
ON：オリゴヌクレオチド
ODN：オリゴデオキシヌクレオチド
PS：ホスホロチオエート
PS2：ホスホロジチオエート
PRA：プラーク減少アッセイ
PFU：プラーク形成単位
INF A：インフルエンザAウイルス
HIV：ヒト免疫不全ウイルス(特定しない場合、HIV-1およびHIV-2の双方を含む)
HSV：単純ヘルペスウイルス(特定しない場合、HSV-2およびHSV-3の双方を含む)
RSV：呼吸器多核体ウイルス
COX：コクサッキーウイルス
DHBV：アヒルB型肝炎ウイルス
【０２３３】
広いスペクトルの抗ウイルス活性
上記で議論された結論及び本明細書で報告されるデータに従って、ランダムON及びONランダマーは、ウイルスゲノムの集合及び／又はパッケージング及び／又はカプシド形成が複製に必要な工程であるウイルスとの広いスペクトルの抗ウイルス活性を有すると思われる。従って、この仮説を調べるために、サイズの異なる幾つかのPS-ONを選択して、種々のウイルス感染の細胞モデルで試験した。多数のそのような試験を実施例において本明細書で記載するが、それには、CMV、HIV-1、RSV、コクサッキーウイルスB2、DHBV、ハンタウイルス、パラインフルエンザウイルス、及びワクシニアウイルスによる試験が含まれ、並びに実施例1及び2に記載されるHSV-1及びHSV-2における試験も含まれる。
【０２３４】
広いスペクトルの抗ウイルス活性における結論
様々なウイルスによる有効性試験は、ランダムON及びランダマーが種々の異なるウイルスに対して阻害特性を示すことを明らかにしている。さらに、これらの試験は、小さいランダマーよりも大きいランダマーの方がウイルス阻害についてさらに大きな有効性を示すという結論を指示している。このことは、カプシド形成するウイルスすべてにおけるランダムON又はONランダマーについて共通するサイズ依存性及び／又は電荷依存性のメカニズムを示唆している。
【０２３５】
HSV及びCMVは双方ともヘルペスウイルスファミリーの二本鎖DNAウイルスであるが、HIVは、レトロウイルス由来のRNAウイルスであり、又、RSVはパラミクソウイルス由来のRNAウイルスである。ONランダマーが種々の異なるウイルスのウイルス機能を阻害できるという事実を考えると、上述のように列記したメカニズムに限定されることなく、以下のメカニズムが合理的である：A）ON／ONランダマーはアプタマー効果を介してウイルス機能を阻害しており、原形質膜とのウイルスの融合を妨げる；及び／又は、B）ON／ONランダマーはビリオンの集合又はウイルスDNAのカプシド内へのパッケージングを妨げる又はドープして結果として欠陥のあるビリオンを生じる；及び／又は、C）ON／ONランダマーは、ウイルスの集合及び／又はパッケージング及び／又は遺伝子発現に必要とされる宿主のタンパク質又は構成成分を妨害している。
【０２３６】
抗ウイルス活性の必要条件
無作為化されたDNA配列がウイルス阻害にとって十分であると思われるので、ホスホロチオエート非存在下で抗ウイルス活性を維持できるかどうか、又、有効性は、ランダム配列又はウイルスゲノムで見い出される特異的配列のいずれの選択によって増強されるかを見るのは興味深い。
【０２３７】
従って、ランダマーの抗ウイルス有効性に対するその効果に関してDNA及びRNAの修飾を調べた。ランダマーは配列非依存的な、例えば非配列相補的なメカニズムを介して作用するので、これらの実験は、核酸構成におけるわずかな変化及び抗ウイルス有効性における電荷分布を調べるように設計した。
【０２３８】
異なるヌクレオチド／ヌクレオシド修飾を含むONがHSV-1を阻止できるか否かを試験するために、実施例に記載したようにHSV-1PRA中でREP 2024、2026、2059および2060を試験した。REP 2024 (ONの両端の4塩基上のリボースに2-O-メチル修飾を含むPS-ON)、REP 2026 (ONの両端の4塩基間の結合にメチルホスホネート修飾を含むPO-ON)、REP 2059 (20塩基長のRNA PS-ONランダマー)およびREP 2060(30塩基長のRNA PS-ONランダマー)は、抗-HSV-1活性を示した。アッセイをVERO細胞内で、HSV-1 (KOS株)を用いてプラーク減少アッセイとして実施した。濃度を上昇させて、PS-ONを試験した。直線回帰から計算したIC50値は、各々0.14、3.41、1.36および0.80であった。
【０２３９】
後者の例では、抗ウイルス効果がDNAホスホロチオエート主鎖から成るONによってのみ生じるのであれば、そのような効果はたった1つの分子で生じることになる。しかし、そのほかの主鎖及び修飾も陽性の抗ウイルス活性を提供した。当然、本発明の教示を適用する当業者は、異なる化合物ONも使用できる。ホスホロチオエートのような、しかし、それに限定されないONの修飾は、抗ウイルス活性に有益であると思われる。このことは、媒体及び細胞内での双方でのONの必要とされる電荷及び／又はDNAの安定化に対する必要条件によるのが最も可能性が高く、又、PS-ONのキラル性によってもよい。
【０２４０】
化合物REP 2026は、分解から保護する両端で未修飾のPOヌクレオチド及び4つのメチルホスホネート結合を含む中心部分を有する一方で、抗ウイルス活性を示した。このことは、分解から保護する一方で抗ウイルス剤としてPO-ONを使用できることを示している。末端でヌクレオチドを修飾し、及び／又は後に記載するような好適な送達システムを使用することによって、この保護を達成することができる。
【０２４１】
一般に、使用されるDNAの配列組成は、ランダマーであれ、ランダム配列であれ、又は特異的なHSV-1配列であれ、全体としての有効性にはほとんど影響しない。しかしながら、中間の長さで、HSV-1配列はランダム配列よりもほぼ3倍強力だった。このデータは、特異的なアンチセンスが特異的なHSV配列に対して機能的に存在する一方で、本明細書で解明された配列非依存的なメカニズム（非アンチセンスメカニズム）がこの活性の優勢な部分を表してもよいことを示唆している。実際、ONが40塩基に増殖するにつれて、本質的に抗ウイルス活性はすべて配列非依存的な（例えば非アンチセンス）効果に起因しうる。
【０２４２】
低毒性ランダマー
ONランダマーを用いた目標の1つは、毒性を下げることである。動物では、異なる配列が、たとえば、一般毒性、血清タンパク質との相互作用及び免疫系との相互作用のような異なる応答を誘発することが知られている（Monteith et al., Toxicol. Sci., 46:365-375,1998）。従って、ONの混合物は、任意の特定の配列のレベルが極めて低いので、毒性効果を下げてもよく、そのため、配列又はヌクレオチド組成による有意な相互作用の可能性は低い。
【０２４３】
薬学的組成物
本発明のONは、ウイルス性疾患を処置するのに（又はその予防に）有用な治療組成物又は製剤の形態であってもよく、ヒト又は非ヒト動物において、及び／又は特定のウイルス又はウイルス群に対して使用するために規制当局により認可されることができる。これらONは、生理学的に及び／又は薬学的に許容される担体とともに組み合わせた場合、薬学的組成物の一部として使用してもよい。担体の特性は投与経路に依存してもよい。本発明の薬学的組成物は、そのほかの活性因子及び／又は活性を向上させる作用剤も含有してもよい。
【０２４４】
薬学的組成物又は製剤において使用される、又は動物を処置する方法を実践するために使用される本発明のONの投与は、種々の従来の方法、たとえば、眼内、経口摂取、腸内、吸入、又は皮膚、皮下、筋肉内、腹腔内、くも膜下、気管内、又は静脈内への注入において行うことができる。
【０２４５】
本発明の薬学的組成物又はオリゴヌクレオチド製剤はさらに、たとえば、限定なしで、リファンピン、リバビリン、プレコナリル、シドフォビル、アシクロビル、ペンシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、ファムシクロビル、フォスカーネット、ビダラビン、アマンタジン、ザナミビル、オセルタミビル、レスキモド、抗プロテアーゼ、ペグ化したインターフェロン（Pegasys(商標)）抗HIVプロテアーゼ（例えばロピニビル、サキニビル、アンプレナビル）、HIV融合阻害剤、ヌクレオチドHIV RT阻害剤（たとえば、AZT、ラミブジン、アバカビル）、非ヌクレオチドHIV RT阻害剤、ドコノソル、インターフェロン類、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）及びハイパーリシンのようなウイルス疾患の治療用化学療法剤を含有してもよい。たとえば、本発明のONとの相乗効果を生じるために、そのような追加因子及び／又は作用剤が薬学的組成物に包含されてもよい。
【０２４６】
本発明の薬学的組成物又はオリゴヌクレオチド製剤はさらに、たとえば、限定なしで、ポリ陰イオン作用剤、硫酸化多糖類、ヘパリン、硫酸デキストラン、ポリ硫酸ペントサン、硫酸ポリビニルアルコール、アセマナン、ポリヒドロキシカルボキシレート類、硫酸セルロース、スルホン化ベンゼン環又はナフタレン環を含有するポリマー類及びナフタレンスルホネートポリマー、アセチルフタロイルセルロース、ポリ-L-リジン、カプリン酸ナトリウム、陽イオン系両親媒系物質、コール酸のようなポリマーを含有してもよい。ポリマーは場合によっては、ビリオン自体に結合する又は吸着することによって細胞におけるビリオンの侵入に影響を及ぼすことが知られている。抗ウイルス性ポリマーのこの特性は、ビリオンへの結合又は吸着についてONと競合するのに有用であることができ、その結果、細胞外活性に比べて、ONの細胞内活性が高められる。
【０２４７】
例示的な脂質封入および送達
PS-ON(ならびに他の修飾結合を含むオリゴヌクレオチド)は、天然のホスホジエステルと比較して内因性ヌクレアーゼに対する耐性が高いが、完全に安定ではなく、血液および組織内でゆっくりと分解する。PSオリゴヌクレオチド薬物の臨床的適用における限界は、そのi.v.投与による補体の活性化の性向である。一般に、リポソームおよび他の送達系は、薬物の毒性を低下させ、血漿中での滞留時間を延長し、および浸透亢進(hyperpermeable)血管系を介した担体の管外遊出により疾病組織へより多量の活性薬物を送達することによって、ONを含む薬物の治療係数を向上させる。更に、PS-ONの場合、脂質封入により、循環中、タンパク質結合部位との可能な相互作用が防止される(Klimuk et al.(2000) J Pharmacol Exp Ther 292:480-488)。
【０２４８】
本明細書において記載する本発明者らが得た結果によれば、アプローチとしては、それらに限定されるわけではないが、親油性分子、極性脂質、リポソーム、単分子膜、二分子膜、小胞、プログラム可能な融合小胞、ミセル、シクロデキストリン、PEG、イオン注入、粉末注入およびナノ粒子(例えばPIBCA、PIHCA、PHCA、ゼラチン、PEG-PLAのような)のような送達系を使用して、本明細書において記載したON、ならびに／またはアンチセンスおよびsiRNAオリゴヌクレオチドを送達する。このような送達系の使用は、それらに限定されるわけではない1個または複数の以下の利点を提供する：活性化合物の動物およびヒト内での毒性の低下、IC50の低下、薬物送達の観点からの作用持続時間の延長ならびにオリゴヌクレオチドの血清タンパク質との非特異的結合からの保護。
【０２４９】
従って、本発明者らは、PS-ONランダマーの抗ウイルス活性が、サイズの増大と共に増加することを示した。更に、この活性は、ウイルスタンパク質(ウイルス溶解物中の)に対する親和性の増大と相関する。ホスホロチオエート修飾がタンパク質-DNA相互作用における親和性を増大させることが当技術分野にて周知であるため、本発明者らは、ウイルス溶解物との相互作用の測定と同じFP-ベースのアッセイを用いて、牛胎児血清(FBS)に対する益々増大するPS-ONランダマーの結合能力を試験した。このアッセイでは、250ugの熱不活性化されていないFBSを、結合(mP値)が飽和した条件下で、蛍光標識した20塩基PS-ONランダマーと複合させた。増大するサイズ(REP 2003、REP 2004、REP 2006およびREP 2007)の非標識PS-ONランダマーを使用して、FBSの標識したベイトとの相互作用と競合させた。この試験の結果は、PS-ONランダマーのサイズが増大するにつれ、FBSに対する親和性が増大することを明白に示す。この結果は、最も高い活性の抗ウイルスPS-ONはまた、最も高い親和性でタンパク質に結合するであろうことを示唆している。
【０２５０】
しかしながら、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの主な治療的問題点は、Kandimallaおよび共同研究者(Kandimalla et al.(1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:2103-2108)により記載されるように、主として、タンパク質(特に、血清タンパク質)との増大した相互作用を原因とする副作用であることが、当技術分野にて公知である。従って、ある場合には、抗ウイルスONを作用部位へ送達する一方で、その血清タンパク質との相互作用を防止することができる適切な送達系の使用が有益であろう。加えて、本発明の配列非依存的ONと、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNAsのような他の種類の抗ウイルスONとの組み合わせ使用に適切な送達系を用いることが有益であり得る。
【０２５１】
送達系の所定の効果を示すために、本発明者らは、リポソームベースの二つの異なる送達技術を試験した：それらはサイトフェンクチン(Cytofectin)およびDOTAPである。本発明者らは本発明者らのインビトロでのFP-ベースの相互作用アッセイにおいて、DOTAPおよびサイトフェンクチンによるREP 2006の血清タンパク質との相互作用からの保護を測定した。封入されていないREP 2006は、結合した蛍光オリゴを血清から競合することができたが、REP 2006がDOTAPおよびサイトフェンクチンのいずれかで封入されると、血清の結合においてもはや競合が不可能であった。これらのデータにより、封入は、オリゴを血清との相互作用から保護し、副作用が低減された、より良好な薬物動態学的挙動をもたらすことが示唆される。
【０２５２】
本発明者らはまた、PS-ONランダマーREP 2006(サイトフェンクチンおよびDOTAPのいずれかで封入された)の、高濃度の血清(50%)の存在下での293A細胞への送達を、蛍光定量法を用いて、標識したREP 2006の細胞内濃度を測定することにより測定した。これらの結果は、そのような送達薬がREP 2006の細胞内濃度を上昇させ、かつDOTAPの場合、細胞内REP 2006のレベルが24時間後顕著に上昇したことを示す。最後に、本発明者らは、本発明者らのインビトロでのFPベースの相互作用アッセイにおいて、DOTAPおよびサイトフェンクチンによる、REP 2006の血清タンパク質相互作用からの保護を測定した。封入されていないREP 2006は、結合した蛍光オリゴを血清から競合することができたが、REP 2006がDOTAPおよびサイトフェンクチンのいずれかで封入されると、血清の結合においてもはや競合が不可能であった。これらのデータにより、封入は、オリゴを血清との相互作用から保護し、および副作用が低減されたより良好な薬物動態学的挙動をもたらすであろうことが示唆される。
【０２５３】
同様に、オリゴヌクレオチドの脂質封入の効果を示すために、本発明者らは、培養細胞を蛍光標識したランダマーに暴露し、次に溶解細胞中の蛍光強度を2ラウンドの洗浄の後、試験することにより、追加のPS-ONランダマーの取り込みを監視した。250nM REP 2004-FLに暴露した細胞の細胞内取り込みを、送達系なしでおよび以下の脂質ベースの送達系の一つの内部に封入した後、試験した：リポフェクタミン(商標) (Invitrogen)、ポリフェクト(商標) (Qiagen)およびオリゴフェクタミン(商標)(Invitrogen)。4時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、MPER溶解試薬(PROMEGA)を用いて溶解した。脂質系を伴うおよび伴わない同数の暴露細胞からの相対的な蛍光収率を検出した。本発明者らは、試験した3種の全薬剤の存在下、送達系を用いない場合と比較して、細胞内PS-ON濃度の有意な上昇があったことを観察した。
【０２５４】
試験結果に従えば、送達系の使用は、オリゴヌクレオチドを血清相互作用から保護する役割をし、副作用を低減し、組織分布を増大させ、および／またはONの細胞内送達を有意に増大することができる。
【０２５５】
送達システムを使用することにおけるもう1つの可能性のある利益は、ビリオンの細胞侵入の増加のような異なるメカニズムを介してウイルス感染の増幅を妨げるために、吸着のような、感染性ビリオンとの相互作用からONを保護することである。
【０２５６】
もう1つのアプローチは、特異的な細胞との親和性を高める分子に送達システムを会合させることによって細胞特異的な送達を達成することであり、そのような分子は、制約なしで、抗体、受容体、リガンド、ビタミン、ホルモン及びペプチドである。
【０２５７】
送達システムに関する追加の選択肢は以下に提供される。
【０２５８】
結合されたON
特定の態様では、本発明のONは、ウイルス複製を阻害するというそれらの能力を危うくすることなく、多数の方法で修飾される。たとえば、ONは1以上のそのヌクレオチド残基にてもう1つの部分と結合されるか、又は複合化される。従って、本発明のオリゴヌクレオチドの修飾は、活性を高める、細胞の分布を高める、特異的に又は非特異的に細胞膜を透過する輸送を増やす、又は分解若しくは排泄に対して保護する、又は有利な特性を提供する1以上の部分又は抱合体にオリゴヌクレオチドを化学的に連結することを含むことができる。そのような有利な特性には、たとえば、さらに低い血清相互作用、さらに高いウイルス-タンパク質相互作用、送達用に配合される能力、検出可能なシグナル、改善された薬物動態特性、及びさらに低い毒性が挙げられる。そのような共役基は第1級又は第2級のヒドロキシル基のような官能基と共有結合することができる。たとえば、共役部分には、ステロイド分子、非芳香族親油性分子、ペプチド、コレステロール、ビスコレステロール、抗体、PEG、タンパク質、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、もう1つのON、又はONの活性及び／又は生物利用性を改善するそのほかの任意の分子を挙げることができる。
【０２５９】
さらに詳細には、本発明の典型的な共役基には、干渉物質、リポータ分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、SATE、t-ブチル-SATE、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、及びオリゴマーの薬物動態特性を高める基を挙げることができる。典型的な共役基には、コレステロール類、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、蛍光ヌクレオ塩基及び染料を挙げることができる。
【０２６０】
本発明に関連して、薬力学的特性を高める基には、オリゴマーの分解耐性を高める基及び／又は血清の相互作用に対して保護する基が挙げられる。本発明に関連して、薬物動態特性を高める基には、オリゴマーの取り込み、分布、代謝又は排泄を改善する基が挙げられる。典型的な共役基は1992年10月23日に出願され、参考として本明細書に組み入れられる国際特許出願PCT/US92/09196号に記載されている。
【０２６１】
共役部分には、たとえば、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553-6556, 1989）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 4:1053-1060, 1994）、チオエーテル、たとえば、ヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:306-309, 1992、Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 3, 2765-2770, 1993）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 20:533-538, 1992）、脂肪族鎖、たとえば、ドデカジオール若しくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 10:1111-1118, 1991、Kabanov et al., FEBS Lett., 259:327-330, 1990、Svinarchuk et al., Biochimie, 75, 49-54, 1993）、リン脂質、たとえば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール又はトリエチル-アンモニウム1,2-ジ-o-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36:3651-3654,1995; Shea et al., Nucl. Acids Res.,18:3777-3783,1990）、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides,14:969-973, 1995）、又はアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36:3651-3654, 1995）、パールミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1264, 229-237, 1995）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノカルボニル-オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol Exp. Ther., 277:923-937, 1996）のような脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６２】
本オリゴヌクレオチドは、たとえば、限定することなく、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリオド安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツール酸塩、セファロプロリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤又は抗生剤のような活性のある薬剤物質に共役してもよい。
【０２６３】
典型的なオリゴヌクレオチド抱合体の調製を記載する典型的な米国特許には、たとえば、米国特許第4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541 ,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439;5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737;4,824,941 ; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963;5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371 ,241 , 5,391 ,723; 5,416,203,5,451 ,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928; および5,688,941号が挙げられ、それぞれ参考としてその全体を本明細書に組み入れる。
【０２６４】
もう1つのアプローチは、たとえば、s-アセチルチオ-エチル又はs-ピバシロイルチオ-エチルのような酵素的に切断可能な、電荷を中和する付加体による修飾によって親油性プロオリゴヌクレオチドのような抗ウイルス性ONを調製することである（Vives et al., Nucl. Acids Res., 27:4071-4076, 1999）。そのような修飾は、ONの細胞への取り込みを高め、従って細胞内で活性であるONにとって有益であることが示されている。
【０２６５】
非特異的ONの設計
もう1つのアプローチにおいて、ヒト（又はそのほかの対象生物）のゲノムに対して低い、好ましくはできれば最低の相同性を示す抗ウイルス性ONを設計する。目標は、ヒト又は動物のゲノム配列及びmRNAとの相互作用による毒性が最低を示すONを得ることである。第1工程は、たとえば、手動で、又はさらに通例ではコンピュータプログラムを用いて、無作為方式にてヌクレオチド、A、C、G、Tを並べることにより、ONの所望の長さの配列を製造する。第2の工程は、GenBank及び／又はアンサンブルヒューマンゲノムデータベースのようなヒト配列のライブラリとONの配列を比較する。所望であれば、配列の生成及び比較を繰り返して行い、対象ゲノムとの所望の低い相同性を有する配列を同定することができる。望ましくは、ONの配列は、ゲノム全体とのできるだけ最低の相同性であり、一方、好ましくは自己相互反応をできるだけ抑える。
【０２６６】
アンチセンス活性を持つ非特異的ON
もう1つのアプローチでは、抗ウイルス性の非特異的配列部分をアンチセンス配列部分に結合して最終的なONの活性を高める。ONの非特異的部分は本発明に記載されている。アンチセンス部分はウイルスmRNAに相補的である。
【０２６７】
Gリッチモチーフ活性を持つ非特異的ON
もう1つのアプローチでは、抗ウイルス性の非特異的配列部分を、最終的なONの活性を改善するモチーフ部分に結合させる。ONの非特異的部分は本発明に記載されている。モチーフ部分は、非限定例として、免疫系の刺激剤として文献に記載されているCpG、Gカルテット、及び／又はCGを挙げることができる。Agrawal et al., Curr. Cancer Drug Targets, 3: 197-209, 2001。
【０２６８】
非ワトソン・クリックON
もう1つのアプローチは、1以上の種類の非ワトソン・クリック型ヌクレオチド／ヌクレオシドから構成されるONを使用することである。そのようなONは、PS-ONに類似する以下の特性の一部を持つPS-ONを模倣することができる：（a）全体の変化；（b）単位間の空間；（c）鎖の長さ；（d）一方の側での負の電荷の蓄積による正味の双極子；（e）タンパク質に結合する能力；（f）ウイルスタンパク質に結合する能力；（g）細胞に侵入する能力；（h）許容される治療指数、（i）抗ウイルス活性。ONは好ましいホスホロチオエートの主鎖を有するが、それに限定されない。非ワトソン・クリック型ヌクレオチド／ヌクレオシドの例は、Kool, Acc. Chem. Res., 35:936-943, 2002及び合成の脱塩基部位を含有するONを記載しているTakeshita et al., J. Biol. Chem., 262:10171-10179, 1987に記載されている。
【０２６９】
抗ウイルス性ポリマー
もう1つのアプローチは、ホスホロチオエートONの活性を模倣するポリマーを使用することである。文献に記載されているように、幾つかの陰イオン性ポリマーは抗ウイルス性の阻害活性を有することが示された。これらのポリマーは幾つかのクラスに属する：（1）多糖類の硫酸エステル（デキストリン及び硫酸デキストラン；硫酸セルロース）；（2）スルホン化されたベンゼン環又はナフタレン環を含有するポリマー及びスルホン酸ナフタレンポリマー；（3）ポリカルボキシレート（アクリル酸ポリマー）；及びアセチルフタロイルセルロース（Neurath et al., BMC Infect. Dis., 2:27, 2002）及び（4）脱塩基オリゴヌクレオチド（Takeshita et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:10171-10179）。非ヌクレオチドの抗ウイルス性ポリマーのそのほかの例は文献に記載されている。本明細書に記載されるポリマーは、本明細書に記載されるPS-ONを模倣し、PS-ONに類似する以下の特性を有する：（a）鎖の長さ；（b）一方の側での負の電荷の蓄積による正味の双極子；（c）タンパク質に結合する能力；（d）ウイルスタンパク質に結合する能力；（e）許容される治療指数、（f）抗ウイルス活性。PS-ONの効果を模倣するために、抗ウイルス性ポリマーは好ましくは、PS-ONに比較されるように、その単位間で類似の空間を示すポリ陰イオンであってもよい。それは、単独で又は送達システムと組み合わせて、細胞に侵入する能力を有してもよい。
【０２７０】
二本鎖PS-ONの抗ウイルス活性
ランダム配列及びその相補体（PSが修飾されている又はされていないのいずれか）をどこかに記載したように蛍光で標識し、本発明に記載しているように蛍光分極により精製したHSV-1及びHIV-1に結合する能力を調べる。アクリルアミドゲル電気泳動により、ハイブリッド形成を検証した。修飾していないREP2017（2017U）は一本鎖（ss）又は二本鎖（ds）のいずれもHSV-1又はHIV-1の溶解物における結合活性を有さなかった。しかしながら、PS修飾したREP2017は、一本鎖又は二本鎖のいずれかでHSV-1及びHIV-1との相互作用が可能であった。
【０２７１】
本明細書で記載される我々の結果に従って、アプローチは有効な抗ウイルス剤として二本鎖ONを使用することである。好ましくは、そのようなONは、ホスホロチオエート主鎖を有するが、本明細書で一本鎖ONについて記載されるような抗ウイルス活性及び／又は安定性及び／又は送達特性を高める他の及び／又は追加的な修飾も有してもよい。
【０２７２】
創薬のためのインビトロアッセイ
蛍光分極に基づいてインビトロアッセイを開発し、PS-ONのウイルス構成成分、たとえば、ウイルスタンパク質に結合する能力を測定する。タンパク質（又はもう1つの相互作用因子）が蛍光的に標識されたベイトに結合すると、溶液中でベイトの三次元のタンブリングが遅れる。標識されたベイトに由来する励起された光の分極における固有の上昇によってこのタンブリングの遅延を測定する。従って、上昇した分極（大きさのない測定値［mP］として報告される）は増加した結合に相関する。
【０２７３】
一つの方法体系は、非可撓性リンカー(3'-(6-フルオレセイン)CPG)を使用して3'末端をFITCで標識したPS-ONランダマーを、ベイトとして使用することである。このPS-ONランダマーを、アッセイ緩衝液(10mM Tris、pH7.2、80mM NaCl、10mM EDTA、100mM b-メルカプトエタノールおよび1%トゥイーン20)中で2nMに希釈する。次いで、このオリゴを、適切な相互作用物(interactor)と共に混合する。この場合、本発明者らは、0.5M KClおよび0.5% Triton X-100 (HSV-1およびHIV-1)または10mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、1mM EDTAおよび0.1% Triton X-100 (RSV)中に懸濁させた、ショ糖傾斜精製したHSV-1 (Maclntyre株)、HIV-1(Mn株)またはRSV(A2株)の溶解物を使用する。ベイトとの相互作用の後、複合体を様々な非標識PS-ONでチャレンジして、ベイトをその複合体から置換する能力を評価する。
【０２７４】
予備試験において、異なるサイズの3種のベイト；6 (REP 2032-FL)、10 (REP 2003-FL)および20塩基(REP 2004-FL)を使用し、ベイトのHSV-1、HIV-1およびRSV溶解物と相互作用する能力を試験した。異なるサイズのベイトに対するウイルス溶解物の結合を、蛍光偏光により測定した。任意のウイルス溶解物の存在下、結合の程度は、使用するベイトのサイズに依存し、ウイルス溶解物の存在下、2004-FLはmP(結合)において最大のシフトを示した。本発明者らは、サイズ依存的なPS-ONランダマーの抗ウイルス効力と類似することに気付いた。次いで、このベイトを使用して、異なるサイズのPS-ONの、ベイトと溶解物との相互作用に競合する能力を評価した。
【０２７５】
REP 2004-FLのHSV-1、HIV-1、およびRSV溶解物との相互作用を、増大するサイズのPS-ONを用いてチャレンジした。ウイルス溶解物に対するPS-ONランダマーの親和性の測定は、蛍光偏光により検出した。ベイトとしてREP 2004-FLを使用して、HSV-1溶解物、HIV-1溶解物またはRSV溶解物との複合体形成を、増大する濃度のREP 2003、REP 2004、REP 2006またはREP 2007でチャレンジした。試験した各ウイルス溶解物に関して、本発明者らは、REP 2003はベイトを溶解物から競合除去できないことに気が付いた。REP 2004(非標識ベイト)競合物により引き出された比較的弱い競合から明らかとなったように、ベイト相互作用は非常に強力であった。しかしながら、競合物PS-ONのサイズが20塩基を越えて増大すると、そのベイト置換能力もより増強することが観察された。このことは、PS-ONランダマーのサイズが増大するにつれ、ウイルス溶解物中のタンパク質成分に対する親和性が増大することを示す。この現象は、より大きいPS-ONランダマーの、HSV-1、HSV-2、CMV、HIV-1およびRSVに対する抗ウイルス活性の増大を反映している。
【０２７６】
ベイト競合における効力と、PS-ONランダマーの抗ウイルス活性との間の類似性は、このアッセイの典型が抗ウイルス活性の優れた予測物であることを示す。このアッセイは強固であり、実行が容易で、非常に安定であるため、特定の標的の同定に基づくのではなく、1個または複数の成分、例えば、ウイルスタンパク質との相互作用能力に基づいて、新規な抗ウイルス分子を同定するハイスループットスクリーニングの非常に良好な候補とする。
【０２７７】
本明細書において記載した例示的な方法は、ウイルス溶解物との相互作用の測定に蛍光偏光を使用するが、タンパク質相互作用を監視するための多数の技術が当該技術分野にて公知であり、本方法に使用することができる。それらは表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、酵素免疫吸着測定法(ELISA)、ゲル電気泳動(移動度シフト測定のため)、等熱滴定および差分走査熱量測定ならびにカラムクロマトグラフィーを含むが、それらに限定されるわけではない。これらの他の異なる技術をONのウイルス溶解物または成分との相互作用の測定に適用することができ、従って抗ウイルス活性を有する化合物のスクリーニングに有用であり得る。
【０２７８】
所望の供給源、たとえば、コンビナトリアルケミストリにより合成された又は天然物質の精製により単離されたライブラリから新規の化合物をスクリーニングするのに、本明細書に記載された方法を使用する。それを、a）新規のONの適当なサイズ、修飾及び主鎖を決定するのに；b）新規のポリマーを含む新規の分子を調べるのに；c）新規のON又は新規の化合物に対する特定のウイルスの感受性を予測するのに；又はd）特定のウイルスを最大限阻害するための一揃いの化合物を決定するのに用いられる。
【０２７９】
大きなサイズのPS-ONランダマーとの溶解物の大きな親和性は、PS-ONランダマーの作用の抗ウイルスメカニズムが、ビリオンの感染又は複製の修正のいずれかを妨げる1以上のウイルスタンパク質構成成分との相互作用に基づくことを示唆している。それはまた、この相互作用が、電荷（サイズ）依存性であり、配列に依存していないことを示唆している。これらPS-ONランダマーは、幾つかの異なるファミリーにまたがって複数のウイルスにわたってサイズ依存性の活性を有するので、我々は、PS-ONは、共通する、電荷依存性のタンパク質-タンパク質相互作用、タンパク質-DNA/RNA相互作用及び／又は分子-分子相互作用を妨害することを示唆している。これらの相互作用には以下を挙げることができる（これらに限定されない）。
カプシド形成中の個々のカプシドサブユニット間の相互作用。
カプシド／ヌクレオカプシドタンパク質とウイルスゲノムとの間の相互作用。
出芽中のカプシドと糖タンパク質との間の相互作用。
感染中の糖タンパク質と受容体との間の相互作用。
ウイルス複製に関与するそのほかの鍵となるウイルス構成成分間の相互作用。
【０２８０】
タンパク質-タンパク質相互作用のこれら複数の同時阻害剤は、抗ウイルス性の阻害の新規のメカニズムを代表する。
【０２８１】
ウイルス溶解物相互作用に対するPS-ONの配列組成の効果
本発明者らは、異なる配列のPS-ONの幾つかのウイルス溶解物と相互作用する能力をモニターした。各場合において、本明細書において前に記載したように20merのPS-ONを3’末端にてFITCで標識する。調べたPS-ONは、A20、G20、T20、C20、AC10、AG10、TC10、TG10、REP 2004及びREP 2017から成った。これら配列のそれぞれをアッセイ緩衝液で4nMに希釈し1ugのHSV-1、HIV-1又はRSVの溶解物の存在下インキュベートした。蛍光分極によって相互作用を測定した。
【０２８２】
試験する全配列との相互作用のプロファイルは、全ウイルス溶解物で同様であり、結合相互作用の性質は、非常に類似することが示される。異なる配列組成を有する20mer PS-ON (A20、C20、G20、T20、AC10、AG10、TC10、TG10、REP 2004、REP 2017)の、ウイルス溶解物に結合する能力を、蛍光偏光法により測定した。FITCで標識したPS-ON3'を、HSV-1、HIV-1またはRSV溶解物1ugの存在下でインキュベートした。各溶解物のうち、均一組成(A20、G20、T20、C20)のPS-ONは最も弱い相互作用物であり、これらのうちA20は有意な差をもって最も弱い相互作用物であった。試験した他のPS-ONについては、TG10を除いたそれら全部が、類似する、強力な相互作用を示し、TG10は各溶解物中で一貫して最も強い相互作用を示した。これらPS-ONの結合プロファイルは、3個のウイルス溶解物の全部について同様であった。
【０２８３】
HIV-IにおけるPS-ONランダマーの標的同定
実施例9に記載した蛍光偏光法により、PS-ONランダマーの、精製HIV-1タンパク質に結合する能力を試験した。精製HIV-1p24または精製HIV-1gp41の量を増大させて、REP 2004-FLと反応させた。本発明等は、これら両方のタンパク質について、これら両方のタンパク質との相互作用を示す蛍光偏光におけるタンパク質濃度依存的なシフトが存在することに注目する。
【０２８４】
ある範囲のサイズのPS-ONランダマーの、これらのタンパク質に結合する能力も、REP 2032、REP 2003、REP 2004、REP 2006およびREP 2007の蛍光バージョンを用いて試験した。本発明者らは、p24については、p24とのサイズ依存的な相互作用が存在しないことを観察したが、しかし、本発明者らは、20塩基未満のランダマーに対して、20塩基を越えるPS-ONランダマーのgp41に対する結合が増加したことを観察した。このことは、PS-ONランダマーの長さが20塩基を越えると、gp41の多数のコピーが個々のランダマーに結合し、それらの偏光を増大させ得ることを示唆している。
【０２８５】
このことは、それが、ウイルス合成の間構造タンパク質を隔離するさらに大きなONの能力を明らかにし、新しいビリオン形成への利用性を限定しているので、有意な所見である。
【０２８６】
高親和性のオリゴヌクレオチド
もう1つのアプローチは、ウイルスタンパク質のようなウイルス構成成分に対する、ONの標準プールにおける平均親和性よりも高い親和性を有するONを濃縮する又は精製する方法である。従って、方法は1以上のウイルス構成成分に対する高い親和性を示し、たとえば、そのように高い結合親和性に寄与する三次元形状を有する1以上の非配列相補的ONを提供する。理論的根拠は、ONがウイルス構成成分との結合で直鎖分子として作用する一方でそのようなウイルス構成成分との相互作用を高める三次元形状にも折り畳むことができるということである。特定の技術に限定することなく、以下の方法によって高い親和性のONを精製又は濃縮することができる。
【０２８７】
高い親和性のON又は複数の高い親和性のONを精製する方法の1つは、ONを結合する親和性マトリクスとしてウイルスタンパク質を結合させた固定相媒体を用い、次いで、漸増する厳密性条件下（たとえば、漸増する濃度の塩又はそのほかのカオトロピック剤、及び／又は漸増する温度及び／又はpHの変化）でそれを溶出することができる。そのような方法はたとえば、以下によって行うことができる。
（a）固定相に結合したウイルスタンパク質又は数種のウイルスタンパク質又はウイルス溶解物を有する交換カラムにONのプールを装填すること；
（b）たとえば、漸増する塩溶液のような置換剤溶液を使用することによってカラムから結合したONを置換すること（溶出すること）；
（c）異なる塩濃度で溶出されたONの分画を回収すること；
（d）高い塩濃度で溶出されたONがウイルスタンパク質との高い親和性を有するように、異なる分画から、さらに好ましくは高い塩濃度の分画から溶出されたONをクローニングし、配列決定すること；及び
（e）結合アッセイ及び／又はウイルス阻害アッセイ、たとえば本明細書で記載されたような蛍光分極結合アッセイ及び／又は細胞ウイルス阻害アッセイ及び／又は動物ウイルス阻害アッセイにおいて配列決定されたONの活性を調べること。
【０２８８】
第2の例では、SELEX方法論（Morris et al., Biochemistry, 95:2902-2907, 1998）に由来する及びそれから改変された方法を用いて、高い親和性のONを精製することができる。そのような方法の実施の1つは以下のように行うことができる。
（a）たとえば1014〜1016の異なる配列のような膨大な数の配列を含有する合成ランダムONの集団であるONの出発プールを提供すること。各ON分子は、各末端でのプライマ-結合配列に隣接してランダム配列の断片を含有してポリメラーゼ鎖反応（PCR）を促進する。本質的にすべての分子のヌクレオチド配列が固有なので、集団では膨大な数の構造が試料採取される。これらの構造が、たとえば、所定のウイルス標的分子に結合する能力のような各分子の生化学的特性を決定する；
（b）ウイルスタンパク質又は数種のウイルスタンパク質又はウイルス溶解物にONを接触させること；
（c）たとえば、元々のゲルシフト及びニトロセルロースろ過のような、結合したONと結合しないONを区分化することができる区分化技術を用いて、ウイルスタンパク質に結合したONを選択すること。これらの方法のいずれかが結合していない種から結合した種を物理的に分離し、最も結合した配列を優先的に回収することができる。また、小さなタンパク質に結合するONを選択するには、標的を固相支持体に結合させ、親和性精製マトリクスとしてその支持体を用いることが望ましい。結合しないそれらの分子は洗い流され、結合したものは遊離した標的とともに溶出され、再び、結合した種と結合しない種を物理的に分離する。
（d）ONの隣接配列とハイブリッド形成するプライマ-を用いたPCRを用いて、溶出された結合ONを増幅すること；
（e）ウイルスタンパク質への最高の結合親和性を示すONを優先的に回収するために、工程（b）、（c）及び（d）を複数回（すなわち、複数サイクル又は複数回の濃縮及び増幅）繰り返す。数サイクルの濃縮及び増幅の後、集団では所望の生化学的特性を示す配列が優勢である：
（f）濃縮サイクル、たとえば、最後のサイクルから選択した1以上のONをクローニングし、配列決定すること；及び
（g）アッセイ、たとえば本明細書で記載されたような蛍光分極結合アッセイ及び／又は細胞ウイルス阻害アッセイ及び／又は動物ウイルス阻害アッセイにおいて配列決定されたONの結合及び／又は活性を調べること。
【０２８９】
もう1つのアプローチは、スプリット合成方法論の修飾を適用して、Yang et al., Nucl. Acids Res., 30(e132): 1-8, 2002に記載されているように1-ビーズ1-PS-ON及び1-ビーズ1-PS2-ONを創製する。ウイルスタンパク質への特異的なビーズの結合及び選択を行うことができる。選択されたビーズのPCRに基づいた同定タグを用いて、双方の核酸塩基の配列決定及びチオエート／ジチオエート結合の位置決めを行うことができる。このアプローチによって、ウイルスタンパク質に結合する強力な抗ウイルス特性を呈するPS-ON又はPS2-ONの同定を迅速に且つ都合よく行うことができる。
【０２９０】
ウイルスタンパク質に結合する高親和性の具体的配列がいったん決定されると（たとえば、個々の増幅及び配列決定によって）1つ以上のそのような高親和性の配列を選択し、合成して（たとえば、化学合成又は酵素的合成のいずれか）、薬物動態特性を改善することを含む活性を改善するために修飾されうる高親和性ONの調製を提供する。そのような高親和性ONを本発明では使用することができる。
【０２９１】
プリオン病
もう1つのアプローチは、プリオン病の治療、進行の制御又は予防のための本発明の別の態様で使用される。この致死的神経変性疾患は感染性であり、ヒト及び動物の双方を冒す。細胞性プリオンタンパク質、PrPCのスクレイピーアイソフォーム、PrPSCへの構造変化がプリオン病の発症及び進行の必須段階であるとみなされている。プリオン病の神経病理学にはアミロイドポリマーが関係している。
【０２９２】
プリオンタンパク質断片と二本鎖核酸とのインキュベートの結果、アミロイド線維形成物を生じる（Nandi et al., J. Mol. Biol., 322:153-161, 2002）。ホスホロチオエート類のようにタンパク質に親和性を有するONは、二本鎖核酸とPrPCとの相互作用と競合させる又はそれを阻害するのに使用され、その結果、アミロイドポリマー形成物を止める。異なるサイズ及び異なる組成のそのようなONを適当な送達形態で用いて、プリオン病に罹った患者を治療することができ、又はリスクの高い状況を予防することができる。そのような干渉するONは、試験ONの存在下で、Nandi et al.,（前記）により記載されたように、アミロイドポリマーの折り畳み変化を測定することによって同定することができる。
【０２９３】
想定されるウイルスの病因
もう1つのアプローチは、以下の例で限定することなく記載されるように、想定されるウイルス病因のある疾患又は症状の治療又は予防のための本発明のもう1つの態様で使用される。ウイルスは、ウイルスの一次感染に関係のない疾患及び症状において推定上の原因物質である。たとえば、関節炎はHCV（Olivieri et al., Rheum. Dis. Clin. North Am., 29:111-122, 2003）、パルボウイルスB19、HIV、HSV、CMV、EBV及びVZV（Stahl et al., Clin Rheumatol., 19:281-286, 2000）に関係している。そのほかのウイルスも様々な疾患において役目を担っているとして同定されている。たとえば、パーキンソン病におけるインフルエンザA（Takahashi et al., Jpn. J. Infect. Dis., 52:89-98, 1999）、多発性硬化症におけるコロナウイルス、EBV及びそのほかのウイルス（Talbot et al., Curr Top Microbiol. Immunol., 253, 247-71, 2001）、慢性疲労症候群におけるEBV、CMV及びHSV-６（Lerner et al., Drugs Today, 38:549-561, 2002）、喘息（Walter et al., J. Clin. Invest., 110:165-175, 2002）及びパージェット病におけるパラミクソウイルス、及びGuillain-Barre症候群におけるHBV、HSV及びインフルエンザ。
【０２９４】
これらの病因のために、本発明を用いた関連するウイルスの阻害は、相当する疾患若しくは症状、又は疾患の少なくとも症状の一部の進展を遅延させる、減速させる又は防ぐことができる。
【０２９５】
オリゴヌクレオチドの修飾及び合成
上記の要約で示したように、修飾したオリゴヌクレオチドは本発明で有用である。そのような修飾されたオリゴヌクレオチドには、たとえば、修飾した主鎖又は非天然のヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。修飾した主鎖を有するオリゴヌクレオチドには、主鎖にリン原子を保持するもの及び主鎖にリン原子を有さないものが挙げられる。
【０２９６】
そのような修飾されたオリゴヌクレオチドの主鎖には、たとえば、ホスホロチオエート類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、3'-アルキレンホスホネート類、5'-アルキレンホスホネート類及びキラルホスホネート類を含むメチル又はそのほかのアルキルホスホネート類、ホスフィネート類、3'-アミノホスホロアミダイト及びアミノアルキルホスホロアミダイトを含むホスホロアミダイト類、チオノホスホロアミダイト類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、セレノホスフェート類、カルバラニルホスフェート通常の3',5'結合を有するボラノ-ホスフェート類、2',5'結合したこれらの類縁体、並びに1以上のヌクレオチド間結合が、3'〜3'、5'〜5'又は2'〜2'の結合である反転した極性を有するものが挙げられる。反転した極性を有するオリゴヌクレオチドには通常、3'のほとんどのヌクレオチド間結合で単一の3'〜3'結合、すなわち、脱塩基（ヌクレオ塩基を失っている又はそれに代わってヒドロキシル基を有する）である単一の反転ヌクレオシド残基が挙げられる。種々の塩、混合塩及び遊離の酸の形態も挙げられる。
【０２９７】
上記で示されるようなリンを含有する結合を持つオリゴヌクレオチドの調製は、たとえば、米国特許第3,687,808; 4,469,863; 4,476,301;5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717;5,321 ,131 ; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925;5,519,126; 5,536,821 ; 5,541 ,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571 ,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697; および5,625,050号に記載されており、参考としてその全体を本明細書に組み入れる。
【０２９８】
ホスホジエステルを包含しない一部の典型的なオリゴヌクレオチドの主鎖は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオチド間結合、混合へテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオチド間結合、又は1以上の短鎖へテロ原子の又は複素環のヌクレオチド間結合により形成される主鎖を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部が形成される）、シロキサン主鎖、硫化物、スルホキシド及びスルホンの主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチルの主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルの主鎖；リボセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；及び混合されたN、O、S及びCH2の成分部分を有するそのほかのものを有するものが挙げられる。特に有利なのは、1以上の荷電された部分を包含する主鎖結合である。先行するオリゴヌクレオチドの調製を記載する米国特許の例には、米国特許第5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141 ; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489, 677; 5,541 ,307; 5,561 ,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269; 5,677,439号が挙げられ、それぞれ参考としてその全体を本明細書に組み入れる。
【０２９９】
修飾されたオリゴヌクレオチドは1以上の置換された糖部分も含有してもよい。たとえば、そのようなオリゴヌクレオチドは、以下の2'修飾：OH；F；O-、S-、又はN-アルキル；O-、S-、又はN-アルケニル；O-、S-、又はN-アルキニル；又はO-アルキル-O-アルキルの1つを包含することができ、その際、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換された又は置換されないC1〜C10のアルキル又はC2〜C10のアルケニル及びアルキニル、あるいは2'-o-（o-カルボラン-1-イル）メチルであってもよい。特定の例は、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)-OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及びO(CH2)nON[CH2)nCH3]2であり、その際、n及びmは1〜10である。そのほかの典型的なオリゴヌクレオチドは、以下の2'修飾：C1〜C10の低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル又はO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、リポータ基、干渉物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基の1つを包含する。例には、2'-メトキシエトキシ（2'-O-(2-メトキシエチル) 又は2'-MOEとしても知られる2'-O-CH2CH2OCH3)(Martin et al., Helv. Chim. Acta., 78:486-504, 1995)、すなわち、アルコキシアルコキシ基；2'-ジメチル-アミノキシエトキシ、すなわち、2'-DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基；及び2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（2'-O-ジメチルアミノエトキシエチル又は2'-DMAEOEとしても知られる）すなわち、2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2が含まれる。
【０３００】
そのほかの修飾には、2'-ヒドロキシ基が糖環の3'又は4'の炭素に結合し、それによって二環式糖部分を形成するロックされた核酸（LNA）が挙げられる。結合は、2'の酸素原子と4'の炭素原子を架橋するメチレン(-CH2-) 基であることができ、その際、nは1又は2である。LNA及びその調製は、国際公開公報第98/39352号及び同第99/14226号に記載されており、参考としてその全体を本明細書に組み入れる。
【０３０１】
そのほかの修飾には、Orum et al., (2001) Curr. Opin. Mol. Ther., 3:239-243に記載されているようなロックされた核酸のようなイオウ-窒素架橋修飾が挙げられる。
【０３０２】
そのほかの修飾には、2'-メトキシ(2'-O-CH3)、2'-メトキシエチル(2'O-CH2-CH3)、2'-エチル、2'-エトキシ、2'-アミノプロポキシ(2'-OCH2CH2CH2NH2)、2'-アリル(2'-CH2-CH=CH2)、2'-O-アリル(2'-O-CH2-CH=CH2)及び2'フルオロ(2'-F) が挙げられる。
【０３０３】
2'修飾は、アラビノ位（上）であっても、リボ（下）位であってもよい。類似の修飾をオリゴヌクレオチドの他の位置で行ってもよく、特に3'末端ヌクレオチド上の糖の3'位又は2'-5'結合オリゴヌクレオチドで、及び5'末端ヌクレオチドの5'位で行ってもよい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分として糖模倣体を有してもよい。そのような修飾された糖構造の調製を記載する典型的な米国特許には、たとえば、米国特許第4,981 ,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393, 878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567, 811 ; 5,576,427; 5,591 ,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627, 053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792, 747; および5,700,920号が挙げられる。
【０３０４】
さらにそのほかの修飾には、リンカーで連結された複数のオリゴヌクレオチドから成るONコンカテマーが挙げられる。リンカーはたとえば、修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチド単位から成ってもよい。場合によっては、リンカーはONコンカテマーに自由度を提供する。そのようなONコンカテマーの使用は、さらに小さなオリゴヌクレオチド基礎単位を連結して所望の長さを得ることにより最終分子を合成する容易な方法を提供することができる。たとえば12個の炭素のリンカー（C12ホスホロアミダイト）を用いて2以上のONコンカテマーを連結し、長さ、安定性及び自由度を提供する。
【０３０５】
本明細書で使用されるとき、「未修飾の」又は「天然の」塩基（ヌクレオ塩基）には、プリン塩基のアデニン（A）及びグアニン（G）並びにピリミジン塩基のチミン（T）、シトシン（C）及びウラシル（U）が包含される。オリゴヌクレオチドは、塩基修飾又は塩基置換も包含してもよい。修飾された塩基は、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及びそのほかのアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及びそのほかのアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニル（-C≡C-CH3）ウラシル及びシトシン及びピリミジン塩基のそのほかのアルキル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル（偽ウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル及びそのほかの8-置換されたアデニン及びグアニン、5-ハロ、特に、5-ブロモ、5-トリフルオロメチル及びそのほかの5-置換されたウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン及び3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンのような合成塩基及び天然塩基を包含してもよい。追加の修飾された塩基には、フェノキサジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン)、置換されたフェノキサジンシチジン（たとえば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド[3',2'：4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン)のようなG-クランプのような三環式ピリミジン類が挙げられる。修飾された塩基にはプリン又はピリミジンが、たとえば、7-デアザアデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジン及び2-ピリドンのようなそのほかの複素環で置き換えたものを挙げてもよい。さらなるヌクレオチドには、米国特許第3,687,808号に記載されたもの、ポリマー科学および技術のコンサイス百科事典（The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering） p858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990 に記載されているもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition,30:613, 1991 に記載されるもの、及びアンチセンス研究と応用（Antisense Research and Applications）15章 Sanghvi Y.S., p289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993 に記載されているものが挙げられる。
【０３０６】
もう1つの修飾には、ホスホロジチオエート結合が挙げられる。ホスホロジチオエートON（PS2-ON）及びPS-ONがタンパク質に対して類似の結合親和性を有すること（Tonkinson et al., Antisense Res. Dev., 4:269-278, 1994）（Cheng et al., J. Mol. Recogn., 10:101-107, 1997）は知っているが、及びONの作用の可能性のあるメカニズムがウイルスタンパク質に結合することであるのは知っているが、本発明で記載される抗ウイルス性ONにホスホロジチオエートを包含することが望ましい。
【０３０７】
ONを修飾するもう1つのアプローチは、Yu et al., Bioorg. Med. Chem., 8:275-284, 2000及びInagawa et al., FEBS Lett., 25:48-52, 2002に記載されているような立体定義された又は立体濃縮されたONを製造することである。従来の方法で調製されたONは、ヌクレオチド間結合に関与するリン原子のまわりの不斉性によるジアステレオマーの混合物から成る。これは、ONとウイルスタンパク質のようなウイルス構成成分との間の結合の安定性に影響を及ぼす可能性がある。以前のデータは、タンパク質の結合が有意に立体依存性であることを示していた（Yu et al.）。従って、立体定義された又は立体濃縮されたONを使用することによって、タンパク質の結合特性を改善し、抗ウイルス有効性を改善することができた。
【０３０８】
上述のような修飾の組込みを多数の様々な組込みパターン及びレベルで利用することができる。すなわち、オリゴヌクレオチドでの各ヌクレオチド又は結合で特定の修飾が包含される必要はなく、単一のオリゴヌクレオチド又は単一のヌクレオチドにおいてさえ、様々な修飾を組み合わせて利用することができる。
【０３０９】
例として、また上記の説明によれば、ホスホロチオエートまたはジチオエート結合を含む修飾オリゴヌクレオチドは、1個または複数の置換された糖部分、特に糖部分における2'-エチル、2'-エトキシ、2'-メトキシ、2'-アミノプロポキシ、2'-アリル、2'-フルオロ、2'-ペンチル、2'-プロピル、2'-ジメチルアミノオキシエトキシおよび2'-ジメチルアミノエトキシエトキシを含むが、これらに限定されない修飾も含んでもよい。2'-修飾は、アラビノ(上方)位またはリボ(下方)位に存在してもよい。好ましい2'-アラビノ修飾は、2'-フルオロである。同様の修飾を、オリゴヌクレオチド上の他の位置に、特に3'末端ヌクレオチド上にまたは2'-5'結合オリゴヌクレオチド中の糖の3'位、および5'末端ヌクレオチドの5'位にしてもよい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖に代わって、シクロブチル部分のような糖擬似も有してもよい。更にONは、非環式プロピレングリコールホスホジエステルバックボーンを伴うグリコール核酸(GNA)からなる構造またはその一部を含む構造を有してもよい(Zhang L, et al (2005) J. Am. Chem. Soc. 127(12):4174-5)。このようなGNAは、ホスホロチオエート結合を含んでもよく、かつピリミジン塩基のみを含んでもよい。
【０３１０】
オリゴヌクレオチドの合成
当該技術で既知の方法を用いて、本オリゴヌクレオチドを合成することができる。たとえば、標準のホスホロアミダイト試薬をヨウ素による酸化と共に用いて、自動DNAシンセサイザー（たとえば、Applied Biosystems モデル380B）にて、非置換又は置換のホスホジエステル(P=O)オリゴヌクレオチドを合成することができる。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドについて、ホスフィト結合の段階的チオエート化のために0.2Mの311-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシドのアセトニトリル溶液により標準的な酸化瓶を置き換えることを除いて、ホスホロチオエート(P=S)を合成することができる。チオエート化待機工程を68秒に増やすことができ、その後、キャッピング工程が続く。CPGカラムからの切断及び55℃（18時間）における濃縮水酸化アンモニウム中での脱ブロックの後、2.5容積のエタノールにより、0.5MのNaCl溶液から2回沈殿させることによりオリゴヌクレオチドを精製することができる。
【０３１１】
米国特許第5,508,270号に記載されるように、ホスフィネートオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第4,469,863号に記載されるように、アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第5,610,289号及び同第5,625,050号に記載されるように、3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第5,256,775号及び同第5,366,878号に記載されるように、ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドを調製することができ；公表されたPCT出願、PCT/US94/00902号及び同PCT/US93/06976（それぞれ国際公開公報第94/17093号及び同第94/02499号として公表）に記載されるように、アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第5,476,925号に記載されるように、3'-デオキシ-3'-アミノホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第5,023,243号に記載されるように、ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第5,130,302号及び同第5,177,198号に記載されるように、ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第5,378,825号、同第5,386,023号、同第5,489,677号、同第5,602,240号及び同第5,610,289号に記載されるように、MMI結合オリゴヌクレオチドとしても同定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオチド、MDII結合オリゴヌクレオチドとしても同定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオチド、及びアミド-3結合オリゴヌクレオチドとしても同定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオチド、及びアミド-４結合オリゴヌクレオ-シドとしても同定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオチド、並びにたとえば別のMMI及びP=O又はP=Sの結合を有する混合主鎖化合物を調製することができ；米国特許第5,264,562号及び同第5,264,564号に記載されるように、ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオチドを調製することができ；並びに米国特許第5,223,618号に記載されるように、エチレンオキシド結合オリゴヌクレオチドを調製することができる。引用した特許及び特許出願はそれぞれ、その全体を参考として本明細書に組み入れられる。
【０３１２】
オリゴヌクレオチド製剤及び薬学的組成物
本オリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチド製剤又は薬学的組成物に調製することができる。従って、本オリゴヌクレオチドは、そのほかの分子、分子構造又は、たとえば、リポソーム、受容体標的分子、取り込み、分布及び／又は吸収を助けるための経口、経腸、局所又はそのほかの製剤のような化合物の混合物と混合されてもよく、内包されてもよく、共役されてもよく、さもなければ会合されてもよい。そのような取り込み、分布及び／又は吸収を助ける製剤の調製を記載する典型的な米国特許には、たとえば、米国特許第5,108,921 ; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521 ,291 ; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591 ,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221 ; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; , 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; および5,595,756号が挙げられ、それぞれその全体を参考として本明細書に組み入れられる。
【０３１３】
本発明のオリゴヌクレオチド、製剤及び組成物は、ヒトを含む動物に投与する際、生物学的に活性のある代謝産物又はその残余を提供する（直接的に又は間接的に）することが可能である、薬学的に許容される塩、エステル又はそのようなエステルの塩を包含する。従って、たとえば、開示もまた、本発明の化合物のプロドラッグ及び薬学的に許容される塩、そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、及びそのほかの生物等価物に引き付けられる。
【０３１４】
用語「プロドラッグ」は、内因性の酵素の作用又はそのほかの化学物質及び／又は条件によって体内又は細胞内で活性形態（すなわち、薬剤）に変換される不活性形態で調製される治療剤を指す。特定の態様では、本オリゴヌクレオチドのプロドラッグ版は、その全体を参考として本明細書に組み入れられる、Gosselinらの国際公開公報第93/24510号及びImbachらの国際公開公報第94/26764号及び米国特許第5,770,713号に開示されている方法に従って、SATE[(S-アセチル-2-チオエチル)ホスフェート]誘導体として調製される。
【０３１５】
用語「薬学的に許容される塩」は、本化合物の生理学的に、且つ薬学的に許容される塩、すなわち、母型化合物の所望の生物活性を保持し、且つ、望ましくない毒性効果をそれに付与しない塩を言う。そのような薬学的に許容される塩の多数は既知であり、本発明で使用することができる。
【０３１６】
オリゴヌクレオチドについて、薬学的に許容される塩の有用な例には、たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムのような陽イオンと共に形成される塩、スペルミン及びスペルミジンなどのようなポリアミン類；たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などのような無機酸と共に形成される酸付加塩；たとえば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギニン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような有機酸と共に形成される塩；並びに塩素、臭素及びヨウ素のような元素陰イオンから形成される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１７】
本発明はまた、本発明の抗ウイルス性オリゴヌクレオチドを含有する薬学的に許容される組成物及び製剤を包含する。局所治療又は全身性の治療が所望なのかどうか、及び治療すべき場所によって、多数の方法でそのような薬学的に許容される組成物を投与してもよい。たとえば、投与は、局所（眼並びに膣及び直腸への送達を含む粘膜）であってもよく；噴霧器による粉末又はエアゾールの吸入又は吸い込みによる肺へのものであってもよく；気管支内；鼻内；上皮及び経皮；経口；又は非経口であってもよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内の注射又は点滴；あるいはたとえば、くも膜下又は脳室内のような頭蓋内投与が挙げられる。
【０３１８】
局所投与用の薬学的に許容される組成物及び製剤には、経皮貼付剤、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、ドロップ、座薬、スプレー、液体及び粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水溶液、粉末又は油性の基剤、濃厚剤などが必要であってもよいし、望ましくてもよい。被覆したコンドーム、手袋なども有用である。好ましい局所用製剤には、本発明のオリゴヌクレオチドが、たとえば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、及び界面活性剤のような局所送達剤との混合剤であるようなものが挙げられる。好ましい脂質及びリポソームには、中性の（たとえば、ジオレオイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性の（たとえば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPG）及び陽イオンの（たとえば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAP及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMA）が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、リポソーム内に内包されてもよいし、それとの、特に陽イオンのリポソームとの複合体を形成してもよい。又は、オリゴヌクレオチドは、脂質、特に陽イオン脂質と複合体を形成してもよい。好ましい脂肪酸及びエステル類には、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル 1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、若しくはC1〜10のアルキルエステル（たとえば、イソプロピルミリステ-トIPM）、モノグリセリド、ジグリセリド又はこれらの薬学的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１９】
経口投与用の組成物及び製剤には、粉末又は顆粒、微粒子、ナノ粒子、水若しくは非水性媒体における懸濁液若しくは溶液、カプセル、ジェルカプセル、サック、錠剤又は微小錠剤が挙げられる。濃厚剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましくてもよい。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが1以上の浸透増強剤界面活性剤及びキレート剤と合わせて混合されるものである。典型的な界面活性剤には、脂肪酸及び／又はそのエステル類又は塩、胆汁酸及び／又はその塩が挙げられる。典型的な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（CDCA）、及びウルソデオキシケネデオキシコール酸（UDCA）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。典型的な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリル酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アクリルカルニチン、アクリルコリン、モノグリセリド、ジグリセリド又はこれらの薬学的に許容される塩（たとえば、ナトリウム）が挙げられる。また、好ましいのは、浸透増強剤の併用、たとえば、胆汁酸／塩と併用する脂肪酸／塩である。特に好ましい併用は、ラウリル酸、カプリン酸及びUDCAのナトリウム塩である。さらに典型的な浸透増強剤には、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、スプレー乾燥した粒子を含む顆粒形態で経口的に送達してもよいし、又は複合化して微粒子又はナノ粒子を形成してもよい。オリゴヌクレオチド錯化剤には、ポリアミノ酸；ポリイミン類；ポリアクリレート類；ポリアルキルアクリレート類、ポリオキシエタン類、ポリアルキルシアノアクリレート類；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート類、ポリエチレングリコール（PEG）及びデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート類；DEAE-誘導体化ポリイミン類、ポルラン類、セルロース及びデンプンが挙げられる。特に有利な錯化剤には、キトサン、N-トリメチルキトサン、ポリ-Ｌ-リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（TDAE）、ポリアミノスチレン（たとえば、p-アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、DEAE-メタクリレート、DEAE-ヘキシルアクリレート、DEAE-アクリルアミド、DEAE-アルブミン及びDEAE-デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ(D,L-乳酸)、ポリ(DL-乳酸-コ-グリコール酸（PLGA）、アルギネート並びにポリエチレングリコール（PEG）が挙げられる。
【０３２０】
経膣送達のための組成物は、例えば、ジェル、クリーム、錠剤、丸剤、カプセル、坐薬、フィルム、または粘膜に接着し容易に洗浄除去されない任意の他の薬学的に許容される形態を含む様々な形態を有し得る。更に経膣送達のための非常に多様な異なる製剤が、当該技術分野にて、例えば米国特許第4,615,697号および米国特許第6,699,494号に記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３２１】
加えて、添加物(特許第4,615,697号に記載されているような)を、送達系の最大のもしくは所望の効力のために、または患者の心地よさのために、製剤中に組み合わせてもよい。そのような添加物は、例えば、滑沢剤、可塑化剤、保存剤、ゲル形成剤、錠剤形成剤、丸剤形成剤、坐薬形成剤、フィルム形成剤、クリーム形成剤、錠剤崩壊剤、コーティング、結合剤、ビヒクル、着色剤、味覚および／または香り調整剤、湿潤剤、粘度調節剤、pH調整剤、ならびに同様の薬剤を含む。
【０３２２】
所定の態様において、組成物は、一般に米国特許第4,615,697号に記載されている架橋ポリカルボン酸ポリマー調合物を含み得る。一般に、このような態様において、そのような調合物中のポリマーの単量体の少なくとも80パーセントは、少なくとも1個のカルボキシル官能基を含んでいるはずである。架橋剤は、十分な生体接着を提供して、系が十分な時間、標的上皮表面に取り付けられた状態を保ち、所望の投薬が行われる量で存在する必要がある。
【０３２３】
経膣投与に関して、このような製剤は、上皮表面に少なくとも約24〜48時間、取り付けられた状態を保つ。これらの結果は、ポリマーの連続的存在による膣からのサンプルのpH低下を試験することにより、様々な期間を通して臨床的に測定してもよい。この生体接着の好ましいレベルは、通常、架橋剤がポリマーの約0.1〜6.0重量パーセントにて存在する場合に得られ、適切なレベルの生体接着が得られる限り、約1.0〜2.0重量パーセントが最も好ましい。生体接着は、接着強度の測定に使用される市販の表面張力計を用いても測定することができる。
【０３２４】
ポリマー調合物は、ポリマー中の架橋剤の量を変動させることにより、放出速度を制御するよう調整することができる。適切な架橋剤は、ジビニルグリコール、ジビニルベンゼン、N,N-ジアリルアクリルアミド、3,4-ジヒドロキシ-1,5-ヘキサジエン、2,5-ジメチル-1,5-ヘキサジエンおよび同様の薬剤を含む。
【０３２５】
このような調合物に使用する好ましいポリマーは、商品名NOVEON.RTM.-AA1の下でB. F. Goodrich Speciality Polymers of Cleveland, Ohioから市販されているポリカルボフィル(Polycarbophil)、U.S.P.である。米国薬局方、1995版、United States Pharmacopeial Convention、Inc., Rockville, Md.の1240〜41ページには、ポリカルボフィルは、ジビニルグリコールと架橋したポリアクリル酸であることが示されている。
【０３２６】
このような薬物送達系の製剤に使用できる他の有用な生体接着性ポリマーは、特許第4,615,697号に言及されている。例えば、これらは、例えば3,4-ジヒドロキシ-1,5-ヘキサジエンと架橋したポリアクリル酸ポリマー、および例えば、ジビニルベンゼンと架橋したポリメタクリルポリマーを含む。典型的には、これらのポリマーは、生体接着能力を低下させることから、その塩形態では使用されないであろう。このような生体接着性ポリマーは、例えば過酸化ベンゾイル、アゾビスイソブチロニトリル等のような開始剤を用いた、従来の遊離ラジカル重合法により製造され得る。有用な生体接着剤の例示的な製剤は、特許第4,615,697号に提供されている。
【０３２７】
非経口、くも膜下又は脳室内の投与のための組成物及び製剤は、緩衝液、希釈液及び、たとえば、浸透増強剤、担体化合物及びそのほかの薬学的に許容される担体又は賦形剤に限定されない添加物も含有してもよい、無菌の水溶液を包含してもよい。
【０３２８】
本発明の薬学的組成物は、溶液、エマルション、及びリポソーム含有製剤を包含してもよいが、これらに限定されない。これらの組成物は、予備形成された液体、自己乳化する固体及び自己乳化する半固体を含むが、これらに限定されない種々の成分から生成してもよい。
【０３２９】
都合良く、単位投与形態で提示してもよい本発明の薬学的製剤は、製薬業界で周知の従来技術に従って調製してもよい。そのような技術は、薬学的担体又は賦形剤と共に有効成分を会合させる工程を包含する。一般に、製剤は、有効成分を液体担体又は微細に分割した固体担体又はその双方と均一且つ密接に会合させ、必要に応じて生成物を振盪することによって調製される。
【０３３０】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ジェルカプセル、液体シロップ、軟ジェル、座薬及び浣腸を含むが、これらに限定されない多数の可能な投与形態に製剤化してもよい。本発明の組成物はまた、水性、非水性又はその混合の媒体中での懸濁液として製剤化されてもよい。水性懸濁液はさらに、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、懸濁液の粘度を高める物質を含有してもよい。懸濁液はまた安定剤も含有してもよい。
【０３３１】
本発明の態様の1つでは、薬学的組成物は発泡体として製剤化し、使用する。薬学的発泡体には、エマルション、微細エマルション、クリーム、ゼリー及びリポソームのような剤形が挙げられるが、これらに限定されない。性質では基本的に類似しているものの、これらの剤形は、最終産物の成分及び濃度において異なる。そのような組成物及び製剤の調製は一般に、製薬及び製剤技術の当業者に知られており、本発明の組成物の製剤に適用してもよい。
【０３３２】
エマルション
本発明の製剤及び組成物は、エマルションとして調製し、製剤化してもよい。エマルションは、普通、直径0.1μmを超える液滴の形態で、一方の液体が他方に分散された通常、不均質システムである。（Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (lids.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et at., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301）。エマルションは、互いに密接に混合され分散された非混和性の液相を含む二相性システムであることが多い。一般に、エマルションは、油中水型（w/o）又は水中油型（o/w）型のいずれかであってもよい。水性相が微細な液滴として大量の油相に細かく分割され、分散されている場合、得られる組成物は油中水（w/o）エマルションと呼ばれる。又は、油相が微細な液滴として大量の水性相に細かく分割され、分散されている場合、得られる組成物は水中油（o/w）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び、水性相、油相に液体として存在する有効薬剤又は分離相としてのそれ自体に加えて、追加の成分を含有してもよい。乳化剤、安定剤、染料及び抗酸化剤のような薬学的な賦形剤も、必要に応じてエマルションに存在してもよい。薬学的エマルションは、たとえば、油中水中油（o/w/o）及び水中油中水（w/o/w）のような二相より多くから構成される複数のエマルションであってもよい。そのような複雑な製剤は、単純な二相性エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。o/wエマルションの個々の油性液滴が小さな水性液滴を内包する複数のエマルションがw/o/wエマルションを構成する。同様に、油性連続相で安定化された水の小球に内包された油性液滴のシステムがo/w/oエマルションを提供する。
【０３３３】
エマルションは、熱力学的安定性がほとんどないか、全くないことを特徴とする。エマルションの分散された又は不連続の相が、製剤の乳化剤又は粘度の手段を介して、外部の又は連続した相に上手く分散され、この形態で維持されることが多い。エマルション型の軟膏基剤やクリ-ムの場合のように、エマルションのいずれかの相が半固体又は固体であってもよい。エマルションを安定化するそのほかの手段は、エマルションのいずれかの相に組み入れられてもよい乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、おおまかに4つのカテゴリー：合成の界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤及び微細に分散された固体に分類してもよい（Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., volume 1 p.199）。
【０３３４】
表面活性化剤としても知られる合成界面活性剤は、エマルションの配合において広い適用性が見い出されており、文献（Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199）で概説されている。界面活性剤は、通常、両親媒性であり、親水性部分及び疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性の性質と疎水性の性質の比は、親水性／親油性バランス（HLB）と呼ばれ、製剤の調製で界面活性剤を分類し、選択する有益なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質：非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び両性イオン性に基づいて異なる部類に分類してもよい（Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., Vol.1 p.285）。
【０３３５】
エマルション配合で使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、ハチミツ、ホスファチド、レシチン及びアカシアが挙げられる。吸収基剤は、無水ラノリンや親水性ワセリンのような半固体の一貫性を保持するけれども、水を吸収してw/oエマルションを形成するように親水性特性を持つ。微細に分割された固体も特に、界面活性剤との併用で、及び種々の調製物中で良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物のような極性無機固体、ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モントモリロナイトのような非膨張粘土、コロイド状珪酸アルミニウム及びコロイド状珪酸マグネシウムアルミニウム、色素、及び炭素又はトリステアリン酸グリセリルのような非極性固体が挙げられる。
【０３３６】
多種多様な非乳化材料がエマルション製剤に包含され、エマルションの特性に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール類、脂肪エステル類、湿潤剤、親水性コロイド類、防腐剤及び抗酸化剤が挙げられる（Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199）。
【０３３７】
親水性コロイド類又は親水コロイド類には、天然に存在するゴム及び、多糖類のような合成ポリマー類（たとえば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアーゴム、カラヤゴム及びトラガカント）、セルロース誘導体（たとえば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー類（たとえば、カルボマー類、セルロースエーテル類及びカルボキシビニルポリマー類）が挙げられる。これらは水に分散し、又は水中で膨潤し、分散相液滴の回りに強力な表面間の被膜を形成し、内部相の粘度を高めることによってエマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
【０３３８】
エマルションは、微生物の増殖を容易に支える炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドのような多数の成分を含有することが多いので、これらエマルションには防腐剤を組み入れることが多い。エマルション製剤に包含され一般に使用される防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、p-ヒドロキシ安息香酸のエステル類、及びホウ酸が挙げられる。抗酸化剤も一般にエマルション製剤に添加され、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール類、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンのような遊離のラジカルスカベンジャー、又はアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムのような還元剤、並びにクエン酸、酒石酸及びレシチンのような抗酸化共力剤であってもよい。
【０３３９】
皮膚、経口及び非経口の経路を介したエマルション製剤の適用並びにその製造方法は、文献に概説されている（Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., Vol.1 p.199）。容易な製剤化、吸収及び生物利用性の観点からの有効性のために経口送達のためのエマルション製剤は非常に広く使用されている（Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1 , p. 245; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1 , p. 199）。鉱物油系の下剤、油溶性ビタミン及び高脂肪栄養剤は、o/wエマルションとして一般に経口で投与される物質のうちである。
【０３４０】
本発明の態様の1つでは、オリゴヌクレオチドの組成物がマイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、光学的に単一の等方性で、熱力学的に安定な溶液である、水、油及び両親媒性物質の系として定義されてもよい（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., volume 1, p245）。通常、先ず、水性の界面活性剤溶液に油を分散し、次いで、十分量の第4の成分、一般的には中間鎖長のアルコールを加えて透明な系を形成することによりマイクロエマルションを調製する。従って、マイクロエマルションは、表面活性化分子の表面間被膜により安定化される2つの非混和性の液の熱力学的に安定な、等方的に透明な分散液としても記載されている（Leung and Shah, in Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., VCH Publishers, New York, p.185-215, 1989）。一般に、油、水、界面活性剤、界面活性剤共力剤及び電解質を含む3〜5つの成分の組み合わせによってマイクロエマルションを調製する。マイクロエマルションが油中水(w/o)型であるか、水中油(o/w)型であるのかは、使用する油及び界面活性剤の特性、及び界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素の尾部の構造及び幾何的詰め込みに依存する（Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., p.271, 1985）。
【０３４１】
位相図を利用した現象論的アプローチが鋭意検討され、マイクロエマルションの製剤化方法の包括的な知識が当業者に与えられてきた（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335）。従来のエマルションに比べて、マイクロエマルションは、自然に形成される熱力学的に安定な液滴形成物における水不溶性薬剤の可溶化という利点を提供する。
【０３４２】
マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤には、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Brij96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類、ポリグリセロール脂肪酸エステル類、単独又は界面活性剤共力剤との組み合わせで、テトラグリセロールモノラウレート（ML310）、テトラグリセロールモノオレート（MO310）、ヘキサグリセロールモノオレート（PO310）、ヘキサグリセロールペンタオレート（PO500）、デカグリセロールモノカプレート（MCA750）、デカグリセロールモノオレート（MO750）、デカグリセロールセスキオレート（SO750）デカグリセロールデカオレート（DA0750）が挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤共力剤は、通常、エタノール、1-プロパノール及び1-ブタノールのような短鎖アルコールであり、界面活性剤分子の間で生じる空隙のために、界面活性剤被膜に浸透し、その結果、無秩序の被膜を創製することによって表面間の流動性を高めるように作用する。しかしながら、マイクロエマルションは、界面活性剤共力剤を使用せずに調製されてもよく、アルコールを含まない自己乳化エマルションの系は当該技術で既知である。水性相は、通常、水、薬剤の水溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール類、プロピレングリコール、及びエチレングリコール誘導体であってもよい。油相は、カプテックス300、カプテックス355、カプムールMCM、脂肪酸エステル、中鎖（C8〜C12）モノ、ジ、及びトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化C8〜C10のグリセリド、植物油及びシリコーン油を挙げてもよいが、これらに限定されない。
【０３４３】
マイクロエマルションは、薬剤の可溶化及び薬剤の吸収の向上の観点から特に興味深い。脂質系マイクロエマルション（o/w及びw/oの双方）は、ペプチドを含む薬剤の経口の生物利用性を高めることが提案されている（Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 11:1385-1390, 1994; Ritschet, Met/i. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 13:205, 1993）。マイクロエマルションは、薬剤可溶化の改善、酵素的加水分解からの薬剤の保護、膜の流動性及び透過性における界面活性剤が誘発する変化による薬剤吸収の向上の可能性、容易な調製、固形投与形態での容易な経口投与、臨床的効能の改善及び毒性の低下という利点を提供する（Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 11:1385, 1994; Ho et al., J. Pharm. Set., 85:138-143, 1996）。その成分を常温で一緒にするとマイクロエマルションが自然に形成してもよいことが多い。熱不安定性の薬剤、ペプチド又はオリゴヌクレオチドを配合する際、これは特に有利であってもよい。マイクロエマルションは、化粧品への適用及び薬学的な適用の双方において有効成分の経皮送達にも有効である。本発明のマイクロエマルション組成物及び製剤は、消化管、膣、口腔及び投与のそのほかの場所におけるオリゴヌクレオチド及び核酸の局所の細胞取り込みを改善すると共に、消化管からのオリゴヌクレオチド及び核酸の全身性の吸収を促進することが期待される。
【０３４４】
本発明のマイクロエマルションはまた、製剤の特性を改善し、本発明のオリゴヌクレオチド及び核酸の吸収を高めるソルビタンモノステアレート（グリル3）、ラブラソール、及び浸透増強剤のような追加成分及び添加剤を含有してもよい。本発明の浸透増強剤は、５つの大まかなカテゴリー、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤及び非界面活性剤の1つに属するとして分類することができる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92）。
【０３４５】
リポソーム
薬剤の製剤化に検討され、使用されているマイクロエマルションに加えて、整理された界面活性剤の構造体が多数ある。これらには、単層、ミセル、二重層及び小胞が挙げられる。小胞は、薬剤送達の作用の特異性及び延長した持続時間を提供する。従って、本明細書で使用されるとき、用語「リポソーム」は、球状の二重層に配置された両親媒性脂質から構成される小胞を言い、すなわち、リポソームは、親油性物質から形成される膜及び水性の内部を有する単層状体又は複層状体である。水性部分は通常、送達されるべき組成物を含有する。無傷の哺乳類の皮膚を横切るために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下、それぞれ直径50nm未満の一連の微細孔を通過するべきである。従って、極めて変形しやすい、且つ、そのような微細孔を通過できるリポソームを使用することが望ましい。リポソームの追加の因子には、脂質表面の変化及びリポソームの水性容積が挙げられる。
【０３４６】
リポソームのさらなる利点には、天然のリン脂質から得られるリポソームは生体適合性であり、生分解性であること；リポソームは広範囲の水溶性及び脂溶性の薬剤を組み入れることができること；リポソームはその内部区画にて内包された薬剤を代謝及び分解から保護できること（Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., volume 1, p245）が挙げられる。
【０３４７】
局所投与については、リポソームはそのほかの製剤に対して幾つかの利点を提示するという証拠がある。そのような利点には、投与された薬剤の高い全身性の吸収に関連する副作用を減らすこと、所望の標的にて投与された薬剤の蓄積を増やすこと、皮膚に対して親水性及び疎水性の両方であることが挙げられる。鎮痛剤、抗体、ホルモン及び高分子量のDNAを含む化合物が皮膚に投与され、一般に上部上皮が標的とされる。
【０３４８】
リポソームは2つに大別される。陽イオンリポソームは、正に荷電したリポソームであり、負に荷電したDNAと相互作用して安定な複合体を形成する。正に荷電したDNA／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソームに内部移行する。エンドソーム内の酸性pHのために、リポソームは破裂し、細胞の細胞質にその内容物を放出する（Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147,980-985）。
【０３４９】
pH感受性又は負に荷電したリポソームは、DNAと複合するよりもDNAを捕捉する。DNA及び脂質は似たように荷電しているので、複合体形成ではなく相反が生じる。従って、DNAは、これらリポソームの水性内部に捕捉される。pH感受性のリポソームは、たとえば、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを培養における細胞の単層に送達するのに使用されている（Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19,269-274）。
【０３５０】
リポソーム組成物の主要な種類の1つに天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が挙げられる。中性のリポソーム組成物は、たとえば、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）から形成することができる。陰イオンリポソーム組成物は一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、陰イオン膜融合性のリポソームはジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）から主として形成される。もう1つの種類のリポソームは、たとえば、大豆PC及び卵PCのようなホスファチジルコリン（PC）から形成される。もう1つの種類は、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールから形成される。
【０３５１】
幾つかの研究によってリポソーム薬剤製剤の皮膚への局所送達が評価されている。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への適用により、皮膚のヘルペスによる傷を軽減したが、他の手段を介した送達（たとえば、溶液として、又はエマルションとして）は効果がなかった（Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2,405-410）。追加の研究により、水性系を用いたインターフェロンの投与に対する、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性を調べ、リポソーム製剤は水性投与より優れていると結論付けた（du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18,259-265）。
【０３５２】
非イオン性のリポソーム系も調べられ、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系で、皮膚への薬剤送達における利便性が確定している。ノバソン（商標）I（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル）及びノバソーム（商標）II（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を用いて、マウスの皮膚の真皮にシクロスポリンAを送達した。結果は、そのような非イオン性リポソーム系が皮膚の異なる層へのシクロスポリンAの沈着を促進する上で有効であることを示した（Hu et al., S.T.P. Pharma Sci., 1994, 4,6,466）。
【０３５３】
リポソームはまた、「立体的に安定化された」リポソームを包含し、その用語は、本明細書で使用されるとき、1以上の特殊化された脂質を含むリポソームを言い、特殊化された脂質はリポソームに組み入れられると、そのような特殊化された脂質を欠くリポソームに比べて循環寿命が長くなる。立体的に安定化されたリポソームの例は、小胞形成する脂質部分の一部がモノシアロガングリオシドGM1のような糖脂質を1以上包含するもの、又はポリエチレングリコール（PEG）部分のような親水性ポリマーの1以上で誘導体化されるものである。特定の理論に束縛されないで、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はPEGで誘導体化された脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームについては、これら立体的に安定化されたリポソームの循環寿命の延長は、網内系（RES）の細胞への取り込みの低下によると考えられている（Allen et al., FEBS Lett., 1987, 223,42; Wu et al., Cancer Research 1993, 53,3765）。
【０３５４】
1以上の糖脂質を含む種々のリポソームは、Papahadjopoulos et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1987, 507:64, （モノシアロガングリオシドGM1、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトール）；Gabizon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85,6949; Allen et al., 米国特許第4,837,028号及び国際出願公報、国際公開公報第88/04924号（スフィンゴミエリン及びガングリオシドGM1又は硫酸ガラクトセレブロシドエステル）；Webb et al., 米国特許第5,543,152号（スフィンゴミエリン）；Lim et al., 国際公開公報第97/13499号（1,2-sn-ジミリストイルホスファチジルコリン）に報告されている。
【０３５５】
1以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含むリポソーム、及び調製方法は、たとえば、Sunamoto et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778（非イオン性界面活性剤、PEG部分を含む2C1215G）；Illum et al., FEBS Lett., 1984, 167,79（ポリマーグリコールによるポリスチレン粒子の親水性被覆）；Sears, 米国特許第4,426,330号及び同第4,534,899号（ポリアルキレングリコール（たとえば、PEG）のカルボキシル基の結合により修飾された合成リン脂質）；Klibanov et al., FEBS Lett., 1990, 268, 235（PEG又はPEGステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（PE）；Blume et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029:91（PEGで誘導体化されたリン脂質、たとえば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）とPEGとの組み合わせから形成されるDSPE-PEG）；Fisher, 欧州特許第EP 0 445 131 B1号及び国際公開公報第90/04384号（リポソームの外側表面で共有結合したPEG部分）；Woodle et al., 米国特許第5,013,556号及び同第5,356,633号、及びMartin et al., 米国特許第5,213,804号及び欧州特許第EP0496813B1（1〜20モルパーセントのPEGで誘導体化したPEを含有するリポソーム組成物）；Martin et al., 国際公開公報第91/05545号及び米国特許第5,225,212号及びZalipsky et al., 国際公開公報第94/20073号（多数のそのほかの脂質-ポリマー抱合体を含有するリポソーム）；Choi et al., 国際公開公報第96/10391号（PEGで修飾したセラミド脂質を含むリポソーム）；Miyazaki et al., 米国特許第5,540,935号及びTagawa et al., 米国特許第5,556,948号（その表面で機能部分によりさらに誘導体化することができるPEGを含有するリポソーム）に記載されている。
【０３５６】
核酸を含むリポソームは、たとえば、Thierry et al., 国際公開公報第96/40062（高分子量の核酸をリポソームに内包する方法）；Tagawa et al., 米国特許第5,264,221号（タンパク質に結合した、RNAを含有するリポソーム）；Rahman et al., 米国特許第5,665,710号（オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに内包する方法）；Love et al., 国際公開公報第97/04787号（アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソーム）に記載されている。
【０３５７】
もう1つの種類のリポソームである、トランスファーソームは極めて変形しやすい脂質の凝集体であり、薬剤送達ビヒクルに魅力的である（Cevc et al., 1998, Biochim. Biophys. Acta, 1368(2):201-15）。トランスファーソームは、液滴よりも小さい孔を介して浸透することができる極めて変形しやすい脂質液滴として記載されてもよい。トランスファーソームはそれが使用される環境に適用可能であり、たとえば、それらは、形状適用可能であり、自己修復性であり、分断することなく標的に到達し、自己負荷することが多い。トランスファーソームは、たとえば、標準のリポソーム組成物に表面端活性化剤、通常、界面活性剤を添加することにより作製することができる。
【０３５８】
界面活性剤
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）及びリポソームのような製剤で広く使用されている。天然の及び合成の多数の異なる種類の界面活性剤を分類し、ランク付けする最も共通した方法は、親水性／親油性比（HLB）の使用による。親水性基（「頭部」としても知られる）の性質は、製剤で使用される様々な界面活性剤を分類する最も有用な手段を提供する（Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., 1988 p.285）。
【０３５９】
界面活性剤の分子がイオン化されていなければ、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は薬学的製品及び化粧品で広く使用されており、広い範囲のpH値にわたって使用でき、典型的なHLB値は、構造によって2〜約18である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、及びエトキシル化エステルのような非イオン性エステル；並びに脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールのような非イオン性アルカノールアミドが挙げられ、エトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもこの部類に包含される。ポリオキシエチレン界面活性剤は非イオン性界面活性剤の部類で最もよく使用されるものである。
【０３６０】
水に溶解するか、又は分散したとき負の電荷を持つ界面活性剤分子は陰イオン性に分類される。陰イオン性界面活性剤には、石鹸のようなカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルサルフェート及びエトキシル化アルキルサルフェートのような硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネートのようなスルホネート、アシルイソチオネート、アシルラウレート及びスルホスクシネート及びホスフェートが挙げられる。アルキルサルフェート及び石鹸が、最もよく使用される陰イオン性界面活性剤である。
【０３６１】
水に溶解するか、又は分散したとき正の電荷を持つ界面活性剤分子は陽イオン性に分類される。陽イオン性界面活性剤には、四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが挙げられ、四級アンモニウム塩が最も頻繁に使用される。
【０３６２】
正の電荷又は負の電荷のいずれかを持つことができる界面活性剤分子は両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、N-アルキルベタイン及びホスファチドが挙げられる。
【０３６３】
薬剤製品、製剤及びエマルションにおける界面活性剤の使用は、Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., 1988, p.285に概説されている。
【０３６４】
浸透増強剤
幾つかの態様では、組成物中で又は組成物と共に浸透増強剤を用いて核酸、特にオリゴヌクレオチドの動物皮膚へのまたは粘膜を通した送達を高める。ほとんどの薬剤はイオン化された形態及び非イオン化の形態の双方で溶液中に存在する。しかしながら、普通、脂溶性又は親油性の薬剤だけが細胞膜を容易に横切る。横切るべき膜が浸透増強剤で処理されていれば、非親油性薬剤であっても細胞膜を横切ることができることが発見されている。非親油性の薬剤が細胞膜を横切るのを助けるのに加えて、浸透増強剤は、親油性薬剤の透過性も高める。
【０３６５】
浸透増強剤は、5つの大まかなカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤及び非キレート性非界面活性剤の1つに属するとして分類される（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92）。これらの部類の浸透増強剤のそれぞれを以下で詳細に説明する。
【０３６６】
界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（又は「表面活性化剤」）は、水性溶液に溶解すると溶液の表面張力又は水性溶液と別の液体との界面張力を低下させ、その結果、粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収が高められる化学構成要素である。これら浸透増強剤には、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン-20-セチルエーテル（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92）；並びにFC-43のようなパーフルオロ化合物エマルション（Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40,252）が挙げられ、それぞれその全体を参考として本明細書に組み入れる。
【０３６７】
脂肪酸：浸透増強剤として作用する種々の脂肪酸及びその誘導体には、たとえば、オレイン酸、ラウリル酸、カプリン酸（n-デカン酸）、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（1-モノオレオイル-rac-グリセロール）、ジラウリン、カープリル酸、アラキドン酸、グリセロール1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのC1〜10アルキルエステル（たとえば、メチル、イソプロピル及びt-ブチル）並びにそれらのモノ-及びジグリセリド（すなわち、オレート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレートなど）（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654）が挙げられ、それぞれその全体を参考として本明細書に組み入れる。
【０３６８】
胆汁塩：胆汁の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が挙げられる（Brunton, Chapter 38, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therpeutics, 9th Ed., Hardman et al., Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, p.934-935）。種々の天然の胆汁塩及びその合成誘導体が浸透増強剤として作用する。従って、用語、「胆汁塩」は、胆汁の天然に存在するいかなる成分及びそのいかなる合成誘導体も包含する。本発明の胆汁塩には、たとえば、コール酸（又は薬学的に許容されるそのナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、ジヒドロコール酸（ジヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（UDCA）、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウム（STDHF）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル（POE）が挙げられる。（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991 , page 92; Swinyard, Chapter 39, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther, 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm:. Sci., 1990, 79, 579-583）。
【０３６９】
キレート剤：本背景では、キレート剤は、それと錯体を形成することにより溶液から金属イオンを除き、その結果粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収が高められる化合物とみなすことができる。本発明での浸透増強剤としてのその使用に関して、性状分析されたDNAヌクレアーゼのほとんどが触媒について二価の金属イオンを必要とし、キレート剤により阻害されるので、キレート剤はDNA分解酵素阻害剤として作用するという追加的な利点を有する（Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618,315-339）。限定することなく、キレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、クエン酸、サリチレート（たとえば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチレート及びホモバニレート）、コラーゲンの N-アシル誘導体、ベータジケトンのラウレス-9及びN-アミノアシル誘導体（エナミン）（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7,1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14,43-51）が挙げられる。
【０３７０】
非キレート剤非界面活性剤：本明細書で使用されるとき、非キレート剤非界面活性剤の浸透を増強する化合物は、有意なキレート剤活性及び界面活性剤活性を有さず、消化器系粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を高める化合物である（Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7,1-33）。そのような浸透増強剤の例には、不飽和環状尿素1-アルキル及び1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92）並びにジクロフェナックナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンのような非ステロイド抗炎症剤（Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39,621-626）が挙げられる。
【０３７１】
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを高める作用剤を本発明の薬学的組成物及びそのほかの組成物及び製剤に添加してもよい。たとえば、リポフェクチン（Junichi et al., 米国特許第5,705,188号）のような陽イオン性脂質、陽イオン性グリセロール誘導体、及びポリリジン（Lollo et al., PCT出願、国際公開公報第97/30731号）のようなポリ陽イオン分子は、オリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みを高めることも知られている。
【０３７２】
エチレングリコール及びプロピレングリコールのようなグリコール類、2-ピロールのようなピロール類、アゾン類（azones）、並びにリモネン及びメントンのようなテルペン類を含むそのほかの作用剤を利用して投与された核酸の浸透を高めてもよい。
【０３７３】
担体
本発明の特定の組成物はまた、製剤中に担体化合物を組み入れる。本明細書で使用されるとき、「担体化合物」又は「担体」は、核酸又はその類縁体を言い、それは不活性（すなわち、それ自体の生物活性を持たない）であるが、たとえば、生物学的に活性のある核酸を分解する又は循環からのその除去を促進することによって生物活性を有する核酸の生物利用性を低下させる生体内の過程によって核酸として認識される。核酸と担体化合物の同時投与は、後者の物質が過剰であることが多いが、肝臓、腎臓、又は循環外のそのほかの貯蔵場所で回収される核酸の量の実質的低下を招く。たとえば、肝臓組織におけるホスホロチオエートの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸又は4-アセトアミド-4'イソチオシアノ-スチルベン-2,2-ジスルホン酸と共に同時投与された場合、低下させることができ（Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5,115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl Acid Drug Dev., 1996, 6,177-183）、それぞれその全体を参考として本明細書に組み入れる。
【０３７４】
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」又は「賦形剤」は1以上の核酸を動物に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤又はそのほかの任意の薬学的に不活性のビヒクルであり、通常、液体又は固体である。薬学的担体は、所定の薬学的組成物の核酸及びそのほかの成分と組み合わせた場合、意図する投与方式の観点から一般的に選択され所望の嵩、濃度等を提供する。典型的な薬学的担体には、結合剤（たとえば、予備ゲル化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（たとえば、ラクトース及びそのほかの糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化珪素、ステアリン酸、金属ステアレート、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（たとえば、デンプン、デンプングリコテートナトリウムなど）；並びに湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７５】
本発明の組成物を製剤化するのに、核酸と有害に反応しない非経口投与に好適な薬学的に許容される有機又は無機の賦形剤も使用することができる。好適な、薬学的に許容される担体には、水、塩溶液、アルコール類、ポリエチレングリコール類、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘度のあるパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７６】
核酸の局所投与のための製剤には、無菌及び非無菌の水溶液、アルコールのような一般の溶媒中での非水性溶液、又は液体若しくは固体油の基剤における核酸の溶液が挙げられてもよい。溶液は、緩衝液、希釈液及びそのほかの好適な添加剤を含有してもよい。核酸と有害に反応しない非経口投与に好適な薬学的に許容される有機又は無機の賦形剤を使用することができる。
【０３７７】
そのほかの薬学的組成物成分
本組成物は、薬学的組成物に従来見い出されるそのほかの成分を、技術で確立した用途レベルで追加的に含有してもよい。従って、たとえば、組成物は、たとえば、かゆみ止め剤、収斂剤、局所麻酔剤又は抗炎症剤のような追加的な、相溶性の、薬学的に活性のある物質を含有してもよく、又は、たとえば、染料、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、濃厚剤及び安定剤のような、本発明の組成物の種々の投与形態を物理的に製剤化するのに有用な追加の物質を含有してもよい。しかしながら、そのような物質は、添加した際、本発明の組成物の成分の生物活性に過度に干渉すべきではない。製剤を滅菌し、所望であれば、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、たとえば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色剤、香味剤及び／又は芳香族物質などを混合する。
【０３７８】
水性懸濁液は、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む懸濁液の粘度を高める物質、及び／又は安定剤を含有してもよい。
【０３７９】
本発明の特定の態様は、（a）1以上の抗ウイルス性オリゴヌクレオチド及び（b）異なるメカニズムにより機能する1以上のそのほかの化学療法剤を含有する薬学的組成物を提供する。そのような化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イフォスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメタミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、窒素マスタード、メラファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコフォマイシン、4-ヒドロキシパーオキシシクロホスホロアミド、5-フルオロウラシル（5-FU）、5-フルオロデオキシウリジン（5-FUdR）、メソトレキセート（MTX）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（VP-16）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストロール（DES）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. 1987, pp. 1206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, NJ.を参照のこと。本発明の化合物と共に使用する場合、個々に（たとえば、5-FUとオリゴヌクレオチド）、順に（たとえば、5-FUとオリゴヌクレオチドを一定期間、続いてMTXとオリゴヌクレオチド）又は1以上のそのような化学療法剤と組み合わせて（たとえば、5-EU、MTX及びオリゴヌクレオチド、又は5-FU、放射線療法及びオリゴヌクレオチド）そのような化学療法剤を使用すればよい。抗炎症薬には、非ステロイド性抗炎症薬及びコルチコステロイド類が挙げられるが、これらに限定されず、抗ウイルス剤には、リバビリン、シドフォビル、ビダラビン、アシクロビル及びガンシクロビルが挙げられるが、これらに限定されず、本発明の組成物で組み合わせてもよい。一般に、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. Berkow et al., eds., 1987, Rahway, NJ., pages 2499-2506を参照のこと。そのほかの非オリゴヌクレオチドの化学療法剤も本発明の範囲内である2以上の化合物を一緒に又は順に用いてもよい。
【０３８０】
実施例
実施例1：単純ヘルペスウイルス
単純ヘルペスウイルス（HSV）はヒト集団の有意な割合を冒す。ランダムON又はONランダマーはHSVのようなウイルスの感染性を阻害することが本発明で見い出された。VERO細胞（HSV-1（KOS株）及びHSV-2（MS2株）の感染に感受性）におけるHSVの細胞性複製アッセイを用いて、HSVの複製開始点に相補的な一本鎖PS-ONがHSV-1及びHSV-2の複製を阻害した。驚くべきことに、ヒト（343ARS）及びプラスミド（pBR322／pUC）の開始点に相補的な対照のPS-ONもウイルスの感染性を阻害した。ランダム配列のPS-ON及びPS-ONランダマーによる実験は、ONのサイズの増加に伴ってウイルス感染の阻害が高まることを実証した。これらのデータは、ONは、ウイルス感染の治療的処置に有用な強力な抗ウイルス剤であることを示している。
【０３８１】
本発明者らは、HHVのようなウイルスの広がりを阻止する可能性のあるメカニズムはそのDNAの複製を妨げることであると理論付けた。このことを念頭に置いて、HSV1及びHSV2の複製開始点に相補的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ON）を感染細胞に導入した。これらのONは、ウイルスの複製開始点にてDNAの三重体形成を生じ、必要なトランス作用因子の会合及びウイルスDNAの複製を阻止した。驚くべきことに、実験的パーラダイムにおいて、ウイルス感染を阻害するONの能力はそのサイズ（長さ）が増加するにつれて高まることを示す結果が本明細書で提示される。
【０３８２】
HSV-1の阻害
プラーク減少アッセイ（PRA）にてHSV-1を阻害するPS-ONの能力を測定した。不死化したアフリカミドリザルの腎臓細胞（VERO）を10%のウシ胎児血清をプラスし、ゲンタマイシン、バンコマイシン及びアンフォテレシンBを補完したMEM（最低必須培地）中で、37℃、5% CO2にて培養した。4日間の増殖で集密な単層細胞が得られる密度にて細胞を12ウェルプレートに播いた。集密に達すると、培地を5%血清と上記の補完物だけを含有するものに代え、次いで、試験化合物の存在下、細胞を90分間、HSV-1（KOS株、総計およそ40〜60PFU）にさらした。ウイルスに暴露したのち、培地を、5%血清、1％ヒト免疫グロブリン、上記の補完物及び試験化合物を含有する新しい「重層する」培地に変更した。感染の3〜4日後、感染培養物のホルマリン固定及びクレシルバイオレット染色に続いて、プラークの計数を行った。
【０３８３】
ONはすべて（別に言及したものは除いて）University of Calgary、コアDNAサービスラボで合成した1又は15μMの合成スケ-ルでON（表21を参照のこと）を調製し、50cmのセファデックスG-25カラムで脱保護し、脱塩した。UVシャドウゲル電気泳動により得られたONを分析し、約95%の完全長、n-1及びn-2オリゴ並びに5%までの短いオリゴ種（これらはランダム欠失を有すると思われる）を含有することを確定した。ランダムなオリゴ合成については、アデニン、グアノシン、シトシン及びチミジンのアミダイトを等モル量にて一緒に混合し、合成の間、ONの各位置での取り込みの無作為さをできるだけ大きくした。
【０３８４】
PS-ONによるHSV-1阻害の能力を試験するために、HSV-1 PRAでREP 1001、2001および3007を試験する。PS-ONがHSV内の複製起点に指向されているため、REP 2001のみが任意の活性を示すであろうと想定された(他の2つは、ヒトおよびプラスミド内の複製起点に指向されている)。しかしながら、3つのPS-ON全部が、抗HSV-1活性を示した。試験は、HSV-1 (KOS株)を用いて、VERO細胞内で実施したプラーク減少アッセイにより行った。感染細胞は、濃度を増大させたREP 1001、REP 2001、またはREP 3007により処理した。アッセイ結果の直線回帰から計算したIC50値は、各々、2.76、0.77、および5.33マイクロモルであった。更に、抗HSV-1効果の有効性は、オリゴのサイズに依存することが見出された。
【０３８５】
PS-ONの抗HSV-1活性上のサイズ依存性および相対的な配列非依存性を確認するために、本発明者らは、様々なサイズのPS-ON (REP 2002、2003、2004、2005および2006)を、抗ウイルス薬アシクロビルと共に試験した。これらPS-ONは、各塩基を「ゆらぎ」(N)として合成して、各PS-ONが実際に同一サイズの異なるランダム配列を有する集団とすることにより、配列特異的な効果に関して不活性にされている；これらのPS-ONは、「ランダマー」と称される。HSV-1 (KOS株)を用いて、VERO細胞内でプラーク減少アッセイを実施した。感染細胞を、濃度を増大させたREP 2001、REP 2002またはREP 3003、REP 2004、REP 2005、REP 2006およびアシクロビルにより処理する。アッセイデータの直線回帰からIC50値を計算した。HSV-1に対するPS-ONのサイズとIC50との関係は、抗HSV-1活性を示した、試験した各PS-ONの特定のサイズに対してIC50値をプロットすることにより決定した。アシクロビルのIC50を、臨床的相関の参照として使用した。本発明者らは、10塩基またはそれ未満のオリゴは、検出可能な抗HSV-1活性を有さないが、PS-ONのサイズが10塩基を越えて増加するにつれ、有効性もまた上昇する(IC50低下)ことを見出した。本発明者らはまた、20塩基より大きいPS-ONは、臨床的に許容される抗HSV-1薬、アシクロビルと比較して有意に低いIC50値を有することにも注目した。
【０３８６】
抗HSV-1活性に関するPS-ONの有効なサイズ範囲を更に明確にするために、本発明者らは、より広範なサイズに亘る10〜120塩基のPS-ONランダマーを試験した。HSV-1 (KOS株)を用いて、VERO細胞内でプラーク減少アッセイを実施した。REP 2003、REP 2009、REP 2010、REP 2011、REP 2012、REP 2004、REP 2006、REP 2007およびREP 2008の濃度を上昇させながら、広範なサイズのPS-ONランダマーを試験した。直線回帰からIC50値を計算した。本発明者らは、12塩基およびそれより大きいオリゴが、検出可能な抗HSV-1活性を有し、HSV-1に対する効力は、PS-ONランダマー長が少なくとも120塩基迄上昇すると共に増大することも発見した。しかしながら、サイズにおける塩基の増加による効力の上昇は、40塩基より大きいPS-ONランダマーでより少ない。
【０３８７】
非PS-ONランダマー、ランダム配列PS-ONおよびHSV-1特異的配列PS-ONの効力を比較するために、本発明者らは、サイズ10、20および40塩基のONに対するこれらの3つの種類の修飾を試験した。HSV-1(KOS株)を用いて、VERO細胞内でプラーク減少アッセイを実施した。非修飾ON、ランダム配列を伴うPS-ON、およびHSV-1の開始コドンIE110を標的とするPS-ONを、濃度を上昇させて試験した。ONは、REP 2013、REP 2014、REP 2015、REP 2016、REP 2017、REP 2018、REP 2019、REP 2020およびREP 2021であった。直線回帰からIC50値を計算した。この系では、非修飾ONランダマーは、試験したサイズにおいて検出可能な抗HSV-1活性を有さない。ランダム配列およびHSV-1特異的配列PS-ONの双方は、サイズ依存性の抗HSV-1活性を示す(これらの修飾のいずれも10塩基では活性を認めない)。ランダム配列、HSV-1特異的配列およびランダマーPS-ONの比較により、20塩基長のPS-ONでは、HSV-1特異的配列による抗HSV-1活性の増大が存在したが、40塩基長では、全修飾、ランダマー、ランダム配列またはHSV-1特異的配列のいずれも、HSV-1に対して同等に有効であることが示された。
【０３８８】
本発明者らが知る限り、PS-ONに関して、0.059μMおよび0.043μMもの低いHSV-1に関するIC50が報告されたことは、これが初めてである。
【０３８９】
実施例2：HSV-2の阻害
PS-ONによるHSV-2阻害の能力を、PRAにより測定する。不死化アフリカミドリザル腎臓(VERO)細胞を、37℃および5% CO2において、ゲンタマイシン、バンコマイシンおよびアンフォテリシンBで補充したMEMならびに10%ウシ胎児血清中で培養する。細胞を、増殖から4日後に細胞のコンフルエントな単層を得る密度で、12ウェルプレート内に播種する。コンフルエンシーに到達したら、培地を、5%血清および上記の補充物のみを含有するように交換し、次いで細胞を、試験化合物の存在下、HSV-2 (MS2株、合計約40〜60PFU)に90分間暴露する。ウイルス暴露後、培地を、5%血清、1%ヒト免疫グロブリン、上記の補充物および試験化合物を含有する新しい「オーバーレイ」培地で代替する。感染から3〜4日間後、感染培養物をホルマリン固定およびクレシルバイオレット染色した後、プラーク計数を実施する。
【０３９０】
PS-ONによるHSV-2阻害の能力を試験するために、REP 1001、2001および3007を、HSV-2 PRAで試験する。HSV-2(MS2株)を用いて、感染した細胞を、濃度を増大させたREP 1001、REP 2001またはREP 3007により処理して、ヒト神経芽細胞内でプラーク減少アッセイを実施した。直線回帰からIC50値を計算した。阻害活性が、アンチセンスまたは他の配列相補的な機序によるものであれば、REP 2001のみ任意の活性を示すと予期され、それはこのPS-ONがHSV-1/2内の複製起点に指向されているためである(他の2つは、各々、ヒトおよびプラスミド内の複製起点に指向されている)。3つのPS-ON全部が、抗HSV-2活性を示した。更に、抗HSV-2効果の有効性は、PS-ONのサイズに依存し、配列に依存しない。
【０３９１】
PS-ONの抗HSV-2活性上のサイズ依存性および配列非依存性を確認するために、本発明者らは、様々なサイズのPS-ON (REP 2001、2002、2003、2004、2005および2006)を試験した。これらPS-ONは、各塩基を「ゆらぎ」(N)として合成して、各PS-ONが実際に同一サイズの異なるランダム配列を有する集団とすることによって、配列特異的な効果に関して不活性にされており、これらのPS-ONは「ランダマー」と称される。これらのPS-ONをHSV-2PRAで試験する場合、本発明者らは、10塩基またはそれ未満のオリゴは、検出可能な抗HSV-2活性を有さないが、PS-ONのサイズが10塩基より大きく増加するにつれ、有効性もまた上昇する(IC50低下)ことを見い出す。本発明者らはまた、20塩基より大きいPS-ONは、臨床的に許容される抗HSV-2薬、アシクロビル(商標)と比較して有意に低いIC50値を有することにも注目した。
【０３９２】
本発明者らが知る限り、PS-ONに関して、0.012μMもの低いHSV-2に関するIC50が報告されたことは、これが初めてである。
【０３９３】
配列非特異的な組成が、ONの抗ウイルス活性上に効果を有するか否かを測定するために、等価なサイズを有するが、配列組成が異なる数種のPS-ONの抗HSV1活性を、HSV-1 PRAで試験した。試験したPS-ONは、REP 2006 (N20)、REP 2028 (G40)、REP 2029 (A40)、REP 2030 (T40)およびREP 2031 (C40)であった。HSV-1 PRAから生成したIC50値は、REP 2006 (N40)が、試験した全配列中最も活性が高かった一方で、REP 2029 (A40)は最も活性が低かったことを示す。本発明者らは、他の全PS-ONは、N40と比較して有意に低い活性を有し、効力の点でN40>C40>T40>A40>G40と序列されることにも注目する。
【０３９４】
本発明者らはまた、2つの異なるヌクレオチドを用いて、様々な配列組成を有する異なるPS ONの効力を試験した。PS-ONランダマー(REP 2006)は、HSV-1に対して、AC20 (REP 2055)、TC20 (REP 2056)またはAG20 (REP 2057)と比較して有意に高い効力を有し、それらの効力は、以下のように序列された：N40>AG>AC>TC。このデータは、抗ウイルス効果が配列相補的ではなく、非特異的な配列組成(即ち、C40およびN40)は、より強力な抗ウイルス活性を有することを示唆する。本発明者らは、この現象が固有のタンパク質結合能を保持する一方で、C40、A40、T40およびG40のような配列が、おそらく、これらの配列内で形成されたいくつかの制限的な三次構造により、より少数のウイルスタンパク質と高い親和性で結合する事実により説明することができることを提案する。その一方、N40のランダムな性質により、N40は広範囲の抗ウイルスタンパク質に高い親和性で結合する能力を維持し、このことは、その強力な抗ウイルス活性に寄与する。
【０３９５】
実施例3：CMVの阻害
PS-ONによるCMV阻害の能力を、プラーク減少アッセイ(PRA)にて測定する。このアッセイは、CMV(AD169株)をウイルス接種材料として使用し、かつヒト神経芽繊維を細胞宿主として使用した以外は、抗HSV-1および抗HSV-2の試験に用いたアッセイと同一である。
【０３９６】
PS-ONの抗CMV活性上のサイズ依存性および配列非依存性を試験するために、本発明者らは、様々なサイズのPS-ONランダマーを試験した。CMV (AD169株)を用いて、VERO細胞内でプラーク減少アッセイを実施した。感染細胞を、濃度を増大させたREP 2004 (a)またはREP 2006 (b)で処理した。直線回帰からIC50値を計算し、CMVに対するPS-ONサイズとIC50との関係を、試験した各PS-ONの特定のサイズに対してIC50値をプロットすることにより決定した。これらのPS-ONをCMV PRAにて試験する場合、本発明者らは、PS-ONのサイズが増大するにつれ、有効性もまた上昇する(IC50低下)ことを発見する。
【０３９７】
抗CMV活性に関するPS-ONの有効なサイズ範囲をより明らかにするために、本発明者らは、より広範なサイズに亘る10〜80塩基のPS-ONランダマーを試験した。本発明者らはまた、臨床的に許容できる数種の小分子CMVによる処理(ガンシクロビル、ホスカルネットおよびシドフォビル)ならびにCMV網膜炎の2バージョンの市販のアンチセンス処理(Vitravene(商標)；University of Calgaryにより合成および市販されている)も含めた。CMV(AD169株)を用いて、VERO細胞内でプラーク減少アッセイを実施した。3種の臨床的CMV治療を試験した：ガンシクロビル、ホスカルネットおよびシドフォビル。REP 2003、REP 2004、REP 2006、およびREP 2007の濃度を上昇させ、広範なPS-ONランダマーサイズも試験した。最後に、室内で合成したおよび市販されているREP 2036 (Vitravene)を試験した。直線回帰からIC50値を計算した。本発明者らは、PS-ONランダマーサイズの上昇が効力の増大をもたらす一方、この効果は、約40塩基にて飽和することを発見した。更に、20、40および80塩基のPS-ONランダマーは全て、試験した任意の小分子治療と比較して有意に高い効力を有する。加えて、40および80塩基のPS-ONランダマーは、Vitravene(商標)と比較して高い効力を有する。
【０３９８】
本発明者らが知る限り、PS-ONに関して、0.067μMもの低いCMVに関するIC50が報告されたことは、これが初めてである。
【０３９９】
実施例4：HIV-1の阻害
2つの異なるアッセイにより、PS-ONのHIV-1を阻害する能力を測定した。
【０４００】
細胞変性効果（CPE）
細胞の代謝程度を報告するため、MTT色素を用いて細胞変性効果をモニターする。10%ウシ胎児血清を加え、抗生物質を補完したMEM中で、37℃、5% CO2にて不死化したヒトリンパ球（MT4）を培養する。96ウェルプレートにて適当な試験化合物を含有する培地に細胞を播き2時間インキュベートする。試験化合物との予備インキュベートの後、HIV-1（NL4-3株）をウエルに加えた（0.0002TCID50／細胞）。6日間の追加のインキュベートの後、MTT変換によりCPEをモニターする。ウイルス播種の非存在下で6日間薬剤をインキュベートすることにより細胞障害性を測定する。MTTの吸収値を％生存率に変換するには、非感染未処置細胞における吸収を100%に設定し、感染未処置細胞の吸収を0%に設定する。
【０４０１】
複製アッセイ（RA）
不死化したヒト胎児腎臓細胞（293A）においてHIVの複製能力をモニターする。2種のプラスミドをこれらの細胞に同時形質移入する。一方のプラスミドはルシフェラーゼ発現カセットを介入させたenv遺伝子を有する組換え野生型HIV-1ゲノム（NL4-3）を含有し（CNDO株として同定される）、他方のプラスミドはマウス白血病ウイルス（MLV）に由来するenv遺伝子を含有する。これら2種のプラスミドは、MLVのenv遺伝子に由来するトランスで提供されるタンパク質産物を除いて、HIV-1に由来するすべての成分を有する成熟キメラウイルスを産生するあらゆるタンパク質因子をトランスで提供する。これらの細胞から産生されるビリオンは感染性であり複製するが、env遺伝子を欠くために感染性ビリオンの次世代を産生することはできない。
【０４０２】
形質移入の24時間後、これらの細胞をトリプシン処理し、96ウェルプレートに播く。細胞が付着した後、培地を洗浄し、試験化合物を含有する培地と交換する。さらなる24時間の間にウイルス産生が進む。次いで、上清を回収し、元のままの293A細胞を再び感染させるのに使用する。ルシフェラーゼ遺伝子産物によって感染させた元の細胞を同定する。ルシフェラーゼ陽性細胞の数が、組換えHIV-1による複製及び／又は感染の程度の測定値である。幾つかの異なる部類の抗HIV薬に耐性を誘導することが知られている幾つかの点突然変異を持つHIV-1ゲノムを用いることにより多数の臨床的に認可されている抗HIV-1薬に対する耐性を調べるのにも、このアッセイが適用される。パーセント阻害は、検出可能なルシフェラーゼ陽性細胞がない場合を100%、感染細胞における陽性細胞の数を0%、未処置細胞を対照に設定する。
【０４０３】
PS-ONの抗HSV-1活性上のサイズ依存性および配列非依存性を試験するために、本発明者らは、様々なサイズのPS-ONランダマーを試験した。HIV-1 (NL4-3株)を用いて、MT4細胞内でCPEアッセイを実施した。感染した細胞を、濃度を増大させたREP 2004またはREP 2006で処理した。直線回帰からIC50値を計算した。REP 2004およびREP 2006に関する非感染MT4細胞内での細胞毒性のプロファイルを測定した。本発明者らは、PS-ONのサイズが増大するにつれ、有効性もまた上昇(IC50低下)することを見出した。本発明者らはまた、このアッセイにてPS-ONランダマーが宿主細胞に有意な毒性を示さないことにも注目した。
【０４０４】
本発明者らが知る限り、PS-ONに関して、0.011μMもの低いHIV-1に関するIC50が報告されたことは、これが初めてである。
【０４０５】
抗HIV-1活性に関するPS-ONの有効なサイズ範囲をより明らかにするために、本発明者らは、野生型HIV-I(組換えNL4-3 (CNDO))を用いたRAにより、より広範なサイズに亘る10〜80塩基のPS-ONランダマーを試験した。組換え野生型HIV-1 NL4-3 (CNDO株)を用いて、293A細胞内で複製アッセイを実施した。加えて、本発明者らは、現在臨床で使用されている4つのプロテアーゼ阻害剤(アンプレナビル(aprenavir)、インジナビル、ロピナビルおよびサキナビル)を試験した。感染した細胞を、濃度を増大させたアンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、サキナビル、REP 2003、REP 2004、REP 2006およびREP 2007により処理した。本発明者らは、10塩基およびそれより大きいPS-ONランダマーは抗HIV-1活性を有し、およびHIV-1に対する効力は、PS-ONランダマーの長さの上昇と共に増大するが、約40塩基にて飽和することを発見した。更に、40および80塩基のPS-ONランダマーは、4つの臨床的対照による効力と殆ど等価であった。
【０４０６】
本発明者らが知る限り、PS-ONに関して、0.014μMもの低いHIV-1に関するIC50が報告されたことは、これが初めてである。
【０４０７】
PS-ONランダマーの、HIVの薬物耐性株阻害の能力を試験するために、本発明者らは、HIV-1の組換えMDRC4株を用いて、上記の試験を再現した。この組換え株は、臨床的に許容される薬物の全クラス：ヌクレオチドRT阻害剤、非ヌクレオチドRT阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤のうち少なくとも16種に対して有意な耐性を示す。本発明者らは、試験した全部のPS-ONランダマーが、耐性株に対して、野生型株に対すると同様に機能することを見出した。しかしながら、4種のプロテアーゼ阻害剤のうち3種は、変異型株に対する効力が低下し、従って40および80塩基PS-ONランダマーは、これらの薬物と比較して、この耐性株に対してより強力であることが示された。
【０４０８】
実施例5：RSVの阻害
PS-ONランダマーによるRSV阻害の能力を、CPEをアラマーブルー(細胞代謝の間接的指標)で監視することにより測定する。ヒト喉頭癌(Hep2)細胞を、37℃および5% CO2において、5%ウシ胎児血清を加えたMEM中で培養する。細胞を、増殖から5〜6日後に細胞のコンフルエントな単層を得る密度で、96ウェルプレート内に播種する。プレーティングの翌日、細胞を、試験化合物の存在下、低下した容積にて、RSV (A2株、108.2TCID50/mL)で2時間感染させた。接種後、培地を交換して、試験化合物を補充した。感染から6日後、アラマーブルーの蛍光変換を測定することにより、CPEを監視した。Hep2細胞内の試験化合物の毒性を、非感染細胞の7日間の処理、およびこれら細胞内のアラマーブルー変換の測定により監視した。非感染、未処理細胞内のアラマーブルー測定値を100%生存に設定し、感染、未処理細胞内の測定値を0%生存に設定した。
【０４０９】
PS-ONの抗RSV活性上のサイズ依存性および配列非依存性を確認するために、本発明者らは、様々なサイズのPS-ONランダマーを試験した。加えて、本発明者らは、RSV感染のための臨床的に許容される処置、リバビリン(Virazole(商標))を試験した。RSV (A2株)を用いて、Hep2細胞内でCPEアッセイを実施した。感染細胞を、濃度を増大させたREP 2004、REP 2006、REP 2007、またはリバビリンで処理する。直線回帰からIC50値を計算し、各グラフに報告する。REP 2004、REP 2006、REP 2007またはリバビリンに関する非感染Hep2細胞内での細胞毒性のプロファイルを測定した。本発明者らは、PS-ONランダマーのサイズが増大するにつれ、有効性もまた上昇するが、約40塩基のサイズで飽和することを見出した。本発明者らはまた、20、40および80塩基のPS-ONランダマーが、臨床的に許容される抗RSV薬、リバビリンと比較して有意に低いIC50値を有することにも注目した。リバビリンが有意な毒性(治療係数=2.08)を示した一方、PS-ONランダマーはHep2細胞内で毒性を示さなかった。
【０４１０】
本発明者らが知る限り、PS-ONに関して、0.015μMもの低いRSV-1に関するIC50が報告されたことは、これが初めてである。
【０４１１】
実施例6：コクサッキーウイルスB2型の阻害
PS-ONランダマーによるCOX B2阻害の能力を、CPEをアラマーブルー(細胞代謝の間接的指標)で監視することにより測定する。アカゲザル腎臓(LLC-MK2)細胞を、37℃および5%CO2において、5%ウシ胎児血清を加えたMEM中で培養する。細胞を、増殖から5〜6日後に細胞のコンフルエントな単層を得る密度で、96ウェルプレート内に播種する。プレーティングの翌日、細胞を、試験化合物の存在下、低下した容積にて、COX B2 (Ohio-1株、107.8TCID50/mL)で2時間感染させた。接種後、培地を交換して、試験化合物を補充した。感染から6日後、アラマーブルーの蛍光変換を測定することにより、CPEを監視した。LLC-MK2細胞内の試験化合物の毒性を、非感染細胞の7日間の処理、およびこれら細胞内のアラマーブルー変換の測定により監視した。非感染、未処理細胞内のアラマーブルー測定値を100%生存に設定し、感染、未処理細胞内の測定値を0%生存に設定した。
【０４１２】
本発明者らは、COX B2 CPEアッセイにおいて、REP 2006の抗COX B2活性を試験した。コクサッキーウイルスB2型(Ohio-1株)を用いて、LLC-MK2細胞内でCPEアッセイを実施した。感染細胞を、濃度を増大させたREP 2006により処理した。REP 2006に関するLLC-MK2細胞内での細胞毒性のプロファイルを測定した。本発明者らは、このPS-ONランダマーが、LLC-MK2細胞内で、ある僅かな毒性を示す一方、感染LLC-MK2細胞を、ある程度COX B2感染から救い得ることを見出した。
【０４１３】
実施例7：ワクシニアウイルスの阻害
本発明者らは、天然痘ウイルスを含むポックスウイルスに対する本発明者らの化合物の効力の指標として、ワクシニア感染モデルを使用した。PS-ONランダマーによるワクシニア阻害の能力を、CPEをアラマーブルー(細胞代謝の間接的指標)で監視することにより測定する。Vero細胞を、37℃および5% CO2において、5%ウシ胎児血清を加えたMEM中で培養する。細胞を、増殖から5〜6日後に細胞のコンフルエントな単層を得る密度で、96ウェルプレート内に播種する。プレーティングの翌日、細胞を、試験化合物の存在下、低下した容積にて、ワクシニア(107.9TCID50/mL)で2時間感染させた。接種後、培地を交換して、試験化合物(50μMで使用したシドフォビルを除いて、全て10μM)を補充した。感染から5日後、上清を回収した。VERO細胞を1:100に希釈した上清で再感染させて、再感染から7日後、アラマーブルーの蛍光変換を測定することによりCPEを監視して、上清中のウイルス負荷を測定した。
【０４１４】
本発明者らは、様々なサイズのPS-ONランダマー(REP 2004、2006および2007)を試験した。加えて、本発明者らは、ワクシニア感染の公知の有効な治療薬、シドフォビル(Vistide(商標))を試験した。ワクシニア感染VERO細胞からの感染上清中のウイルス負荷の間接的な測定は、これら上清により誘導されたナイーブ細胞内のCPEを測定することにより決定した。REP 2004、2006および2007は10μMで試験した一方、シドフォビルは50μMで試験した。ワクシニアCPEアッセイにて試験した場合、本発明者らは、REP 2004、2006および2007による処理が、全て抗ウイルス活性を示した(即ち、再感染により上清中のCPEの減少が示された)が、この活性は、シドフォビルに関して観察されたものと比較して弱いことを見出した。
【０４１５】
実施例8：DHBV、パラインフルエンザ3型ウイルスおよびハンタウイルスの阻害
DHBV、パラインフルエンザ3型ウイルスおよびハンタウイルスは、測定可能なプラークまたはCPEを容易に生成しないため、本発明者らは、蛍光焦点形成ユニット(FFFU)検出により、これらウイルス内のREP 2006の効力を試験した。このアッセイでは、REP 2006(最終濃度10μMにおける)をウイルスと混合し、次いでこれを細胞上に吸着させる。吸着後、感染した細胞を更に7〜14日間インキュベートし、その時点でこれらをメタノール中で固定する。ウイルス複製の領域を、適切なウイルス抗原に対する免疫蛍光顕微鏡により検出する。試験した3つのウイルスの各々に関する特定の実験条件および結果を、下の表1に示す。
【０４１６】
(表1)DHBV、パラインフルエンザ3型ウイルスおよびハンタウイルスの阻害
2008516996.tif 000002
【０４１７】
この最初のデータは、10μMにおいて、REP 2006は、DHBV、パラインフルエンザ2型およびハンタウイルスの阻害に有効であることを示す。本発明者らは、予備試験における所与の強力な応答により、IC50値がより低いであろうことを予想する。これらのデータは、ハンタウイルスおよびB型肝炎(DHBVと密接に関連する)のヒト感染の処置のためのPS-ONランダマーの効力を支持すると共に、処置を開始するための鑑別診断を必要とし得ない、RSVおよびパラインフルエンザ3型に起因する小児気管支炎の急性処置のための原理を提供する。
【０４１８】
実施例9：現在の非応答性ウイルス
今日迄、本発明者らは、表2に示す以下のウイルス系において、送達系、薬物の組み合わせまたは化学的修飾を使用しない、PS-ONランダマー(10μM迄)の検出可能な抗ウイルス効力を観察していない。
【０４１９】
(表2)ウイルス系
2008516996.tif 000003
【０４２０】
現在の試験手順の下では、本発明者らは活性の実証に至らなかった。しかしながら、実証された抗ウイルス活性の欠如は、使用した特定のアッセイの限界によるものであり得る。これらのウイルスの効力を実証するための更なる試験が進行中である。
【０４２１】
本発明者らの証明は、数種の異なるファミリーのウイルスを阻害する際に、PS-ONの電荷特性が重要であることを示しているため、本発明者らは、ウイルス活性阻害のためのこの電荷依存性機序が、カプシド形成した全ウイルスの活性を阻害する可能性を有することを期待する。これに対する推論は、実施例9に列挙したそれらのウイルスに対する抗ウイルス効力が検出されないことは、これらウイルスの複製中の、PS-ONとこれらのウイルスの構造タンパク質との間の相互作用が、ウイルスタンパク質の相互作用を阻止するに十分強力ではない可能性を示唆する。この場合、これらウイルスに対する効力を実現する一つの方法は、DNAまたは抗ウイルスポリマーの電荷特性を変更(例えば、DNAのホスホロチオエート結合をホスホロジチオエートで置換)して、ウイルスタンパク質に対するそれらの親和性を増大させることである。
【０４２２】
実施例10：A型インフルエンザの阻害
PS-ONによるA型インフルエンザウイルス(INF)阻害の能力を、プラーク減少アッセイ(PRA)により測定する。不死化犬腎臓(MDCK)細胞を、37℃および5% CO2において、ゲンタマイシン、バンコマイシンおよびアンフォテリシンBで補充した、10%ウシ胎児血清を加えたMEM中で培養する。細胞を、増殖から6日後に細胞のコンフルエントな単層を得る密度で、6ウェルプレート内に播種する。コンフルエンシーに到達したら、培地を、上記の補充物のみを含有するよう交換し、次いで細胞を、試験化合物の存在下、INF A (H3N2株、合計約35〜70PFU)に60分間暴露する。ウイルス暴露後、培地を、薬物のみを含有する新しい培地で代替する。感染から24時間後、培地を再度、4%アルブミン、0.025% DEAEデキストラン、2mg/mL TPCK-処理トリプシンおよび0.8%シープラークアガロース、上記の補充物を含有し、試験化合物を含有しないオーバーレイ培地で代替する。感染から2〜3日間後、感染培養物をホルマリン固定およびクレシルバイオレット染色した後、プラーク計数を実施する。
【０４２３】
本発明者らは、INF A PRAアッセイにおいて、多様なPS-ONランダマーの抗INF A活性を試験した。本発明者らは、REP 2006のみが任意の測定可能な抗ウイルス活性を示すが、しかしこの活性は、有意であることを見出した(下の表3参照)。
【０４２４】
(表3)INF A(H3N2)に対するPS-ONランダマーの活性
2008516996.tif 000004
【０４２５】
最大のランダマーのみが、幾分かの活性を有するように思われ、本発明者らは他の多数のウイルスにおけるランダマーの活性が、サイズ依存性であったことを理解しているため、本発明者らは、より幅広い希釈範囲を用いて、より大きいサイズに分布するランダマーの抗ウイルス活性を試験した。本発明者らは、本発明者らが試験した他のウイルスに関して、ランダマーの抗INF A活性は、それらの長さが増大するにつれより強力となるが、40塩基長を越えるランダマーに関しては、活性の有意な増大はないことを発見した。
【０４２６】
(表4)PS-ONランダマーのサイズ依存的な抗INF A活性
2008516996.tif 000005
【０４２７】
REP 2006の作用機序を決定するため、本発明者らは、感染前、感染中および感染後の様々な時間におけるREP 2006 (IC99濃度)の添加の効果を測定する試みを行った。この実験において、本発明者らは、感染から5時間(300分)後でさえも、REP 2006の添加は、INF A活性を完全に阻害することを観察した(下の表を参照)。これら結果は、インフルエンザに対するREP 2006の作用の少なくとも有意な部分が、感染後に起こることを示す。PS-ONランダマーは細胞内に容易に進入しないため、PS-ONランダマーは宿主細胞から出芽するウイルスにも干渉するであろう。
【０４２８】
(表5)REP 2006の添加時間対INF A活性上の効果
2008516996.tif 000006
【０４２９】
実施例11：オリゴヌクレオチドが大部分は配列非依存的な作用様式により作用することを決定する試験
本発明者らは、本明細書において本発明のONの抗ウイルス活性が配列非依存的な作用様式により生じることを証明した。勿論、当業者は、配列特異的なON、例えば特定のウイルスのmRNAを標的とするアンチセンスONを調製し、ならびに全てのホスホロチオエートおよび2'-O-メチル修飾を組み込むことができる。しかしながら、そのようなONは、本発明者らが本明細書に記載したON修飾、および本発明者らが本明細書にて証明したこのような修飾されたONの活性が配列非依存的であるという事実から利益を受けることができると考えられる。従って、ONは、以下に概略する5つの試験の任意の一つの基準を満たす場合、即ち、その機能の実質的な部分が配列非依存的活性によるものである場合、配列非依存的活性を有するものと見なされる。以下の試験に使用するONは、PS-ONの合成に関して実施例12に記述する一般的な方法体系に従って調製し得る。
【０４３０】
試験#1 - 候補ONの部分縮重のその抗ウイルス効力上の効果
この試験は、その配列の一部が縮重された場合の、候補ON配列の抗ウイルス活性を測定する役割を果たす。同一の化学構造を有する候補ONの縮重バージョンが、以下に記載するようにその活性を保持する場合、配列非依存的活性を有すると見なされる。候補ONは、以下の規則に従って縮重される。
【０４３１】
L＝候補ONの塩基数
X＝(候補ONと同一の化学構造を有するが)縮重されたオリゴの各末端上の塩基数。
Lが偶数の場合、X＝整数(L/4)である。
Lが奇数の場合、X=整数((L+1)/4)である。
Xは、4と等しいかまたはそれ以上でなければならない。
【０４３２】
候補ONが、ヘルペスウイルス科、レトロウイルスまたはパラミクソウイルスファミリーの一メンバーに対する抗ウイルス活性を有すると断定された場合、そのウイルスファミリーに関して、好ましくは指示したウイルス株を使用して、本明細書に記載したアッセイによりIC50生成を実行する。候補ONが上記していない特定のウイルスファミリーの一メンバーに対する抗ウイルス活性を有すると断定された場合、医薬品産業により容認されている抗ウイルス効力試験によりIC50値を生成する。IC50値は、化合物の最低7種の濃度を使用して、用量応答曲線の直線範囲内の3つまたはそれ以上の点により生成する。これらの試験を用いて、候補ONのIC50をその縮重対応物と比較する。部分縮重ONのIC50が、元の候補ONの5倍よりも小さい場合(最小3回の測定に基づき、標準偏差が平均の15%を越えない)、ONは、大部分は配列非依存的作用様式により作用するものと見なす。
【０４３３】
試験#2 - 候補ONとONランダマーの抗ウイルス活性の比較
この試験は、同一ウイルス内で候補ONの抗ウイルス効力を等価なサイズおよび化学構造のランダマーONの抗ウイルス効力と比較する役割を果たす。
【０４３４】
候補ONが、ヘルペスウイルス科、レトロウイルスまたはパラミクソウイルスファミリーの一メンバーに対する抗ウイルス活性を有すると断定された場合、そのウイルスファミリーに関して、好ましくは指示したウイルス株を使用して、本明細書に記載したアッセイよりIC50生成を実行する。候補ONが上記していない特定のウイルスファミリーの一メンバーに対する抗ウイルス活性を有すると断定された場合、医薬品産業により容認されている抗ウイルス効力試験によりIC50値を生成する。IC50値は、化合物の最低7種の濃度を使用して、用量応答曲線の直線範囲内の3つまたはそれ以上の点により生成する。この試験を用いて、候補ONのIC50を等価なサイズおよび化学的性質を有するONランダマーと比較する。ONランダマーのIC50が候補ONの5倍よりも小さい場合(最小3回の測定に基づき、標準偏差が平均の15%を越えない)、候補ONは、大部分は配列非依存的作用様式により作用するものと見なす。
【０４３５】
試験#3 - 同一ウイルスファミリーの2つの非相同ウイルスにおける候補ONの抗ウイルス活性の比較
この試験は、ゲノムが候補ONと相同である標的ウイルスに対する候補ONの効力を、ゲノムが候補ONのゲノムと相同性を有さないが同一のウイルスファミリーに属する第二のウイルスに対する候補ONの効力と比較する役割を果たす。例えば、候補ONがHSVに対する活性を有すると報告された場合、そのHSVに対する活性をそのCMVまたはVZV等に対する活性と比較する。標的ウイルスおよび第二のウイルスにおける候補ONの相対的な活性の比較は、両方のウイルス内での同一の長さおよび化学構造のONランダマーの活性を使用して、2つのウイルス内で得られた候補ONのIC50値を正規化することにより遂行される。
【０４３６】
従って、候補ONが、所定のウイルスに対して抗ウイルス活性を有すると断定された場合、ヘルペスウイルス科、レトロウイルスもしくはパラミクソウイルスファミリーに関して、本明細書に記載したアッセイの一つまたは当該技術分野で公知の他のアッセイを用いてこのウイルス内でのIC50生成を決定する。同様に、本明細書に記載したアッセイの一つまたは医薬品産業により容認されているアッセイを用いて、ゲノムが候補ONの配列に対して相同性を有さないが、同一ウイルスファミリーに属するウイルスに関して、第二のウイルスに対する候補ONに関するIC50生成を実行する。IC50はまた、各ウイルスに対する等価なサイズおよび化学的性質を有するランダマーに関しても生成する。2つのウイルスに対するONランダマーのIC50を使用して、以下のように2つのウイルスに対する候補ONのIC50値を正規化する。
【０４３７】
第一の(相同)ウイルス内での候補ONおよびONランダマーのIC50に等価な代数的変換を適用して、ランダマーのIC50を1とする。
【０４３８】
第二の(非相同)ウイルス内での候補ONおよびONランダマーのIC50に等価な代数的変換を適用して、ランダマーのIC50を1とする。
【０４３９】
相同ウイルス内での候補ONのIC50と、対非相同ウイルス内での候補ONのIC50の倍数の差異を、非相同ウイルス内での候補ONの変換IC50を相同ウイルス内での候補ONの変換IC50で割ることにより計算する。
【０４４０】
2つのウイルス間のIC50の倍数の差異が5未満の場合、候補ONは、大部分は配列非依存的な作用様式により作用するものと見なす。
【０４４１】
試験#4 - 異なるウイルスファミリー内での候補ONの抗ウイルス活性
この試験は、候補ONがウイルス内で薬物様活性を有するか否かを決定する役割を果たし、ここで該候補ONの配列は、ウイルスゲノムの任意の部分と相同ではなく、かつ該ウイルスは異なるファミリーに属する。従って、ヘルペスウイルス科、レトロウイルスまたはパラミクソウイルスファミリーに関して本明細書に記載したアッセイの一つを用いて、試験する候補ONの配列が、使用するウイルスのゲノムの任意の部分に対して相同ではないのような候補ONを試験する。候補ONの最低7種の濃度を使用して、用量応答曲線の直線範囲内の3つまたはそれ以上の点によりIC50値を生成する。得られた用量応答曲線が、薬物様活性を示す場合(典型的には、候補ONの濃度の低下に伴い抗ウイルス効力の低下を示す、減衰またはシグモイド曲線として出現し得る)、および曲線から生成したIC50が10μM未満の場合、候補ONは薬物様活性を有すると見なされる。候補ONが、該候補ONが相補的ではないために配列依存的なアンチセンス活性を有し得ない、異なるファミリーのウイルス内で薬物様活性を有すると見なされる場合、大部分は配列非依存的な作用様式で作用するものと見なす。
【０４４２】
試験#5 - 候補ONの細胞外抗ウイルス活性
本発明者らが示す目下の結果により、ONの配列非依存的な抗ウイルス活性は、細胞外で生じることが示される。最先端のON技術は、ONが細胞を容易に浸透できないことから、それらは、アンチセンス活性を示すために適切な担体により細胞膜を貫通して送達される必要があることを教示している。従って、定義によるアンチセンスONの抗ウイルス活性は、活性のための細胞内送達に依存する。特定の配列特異的な候補ONが、インビトロで裸で使用された際に抗ウイルス活性を有する場合(従って細胞内浸透が乏しい場合)、本発明に記載するONの配列非依存的性質により利益を受けると思われる。
【０４４３】
配列特異的な候補ONが、HSV-1、HIV-1またはRSVのゲノムの一部と相補的である場合、候補ONの配列非依存的抗ウイルス活性の存在は、以下に記載する適切なアッセイにて決定され得る。候補ONが、HSV-1、HIV-1またはRSVではないウイルスに対して相補的である場合、候補ONの抗ウイルス活性は、医薬品産業により容認されたアッセイを用いて決定される。
【０４４４】
適切なアッセイを用いて、裸の候補ONの抗ウイルス活性を、封入した(移入のために)候補ONの抗ウイルス活性と比較する(裸の状態および封入した状態の両方の候補ONの同一の濃度を用いて)。活性は、7種以上の濃度を用いた、そのうちの少なくとも3種は、ウイルス活性の50%阻害を含む直線範囲内に入る用量応答曲線により測定する。IC50(ウイルス活性を50%低下させる濃度)を、上記に定義した用量応答曲線の直線範囲の直線回帰により計算する。裸の候補ONのIC50が、封入した候補ONのIC50の5倍よりも小さい場合、候補ONの活性は、大部分は配列非依存的な作用様式により作用するものと見なす。
【０４４５】
これらの試験で使用した閾値
これらの試験の目的は、ONが本明細書に記載したONの配列非依存的な抗ウイルス性質により利益を得るか、またはそれを利用するかおよび配列非依存的な活性で作用するかを合理的な分析により決定することである。勿論、任意の当業者は、試験の全方法体系、特に抗ウイルス試験方法の固有の変動性を想定して、2つの化合物間の抗ウイルス活性の差異の測定は、閾値が該化合物の活性の間で2倍または3倍の差異に設定されている場合、確実には結論付けられないことを認識するであろう。このことは、これらのアッセイにおいて同一化合物による実験ごとの変動が、この範囲内で変動するIC50を与え得る事実に起因する。従って、2種の化合物(例、2種のON)の活性間に実際に差異が存在することを合理的に確認するために、本発明者らは、該化合物のIC50間の少なくとも5倍の差異を閾値に設定する。この閾値は、上述した試験の評価の信頼性を保証する。
【０４４６】
上記の試験1〜3および5に記載した閾値は、初期設定の閾値である。特に示す場合、上記の比較試験1〜3および5に他の閾値を使用してもよい。従って例えば、特に示す場合、ONが配列非依存的な活性で作用しているか否かを決定する閾値は、10倍、8倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1.5倍および同一のいずれかであり得る。上記の試験4に記載した閾値も、初期設定の閾値である。特に示す場合、試験4でONが配列非依存的活性を有するか否かを決定するための閾値は、10μM、5μM、1μM、0.8μM、0.6μM、0.5μM、0.4μM、0.3μM、0.2μMまたは0.1μM未満のIC50であり得る。
【０４４７】
同様に、初期設定が、上記の5試験の任意の一つを満たすに十分であっても、特に示す場合、ONは、任意の2つ(例、試験1および2、1および3、1および4、1および5、2および3、2および4、2および5、3および4、ならびに3および5)、任意の3つ(例、試験1および2および3、1および2および4、1および2および5、1および3および4、1および3および5、2および3および4、ならびに2および4および5)、試験の任意の4つ(例、1および2および3および4、1および2および3および5、ならびに2および3および4および5)を初期設定の閾値で、または特に示す場合、上記に示した別の一閾値で満たす必要があり得る。
【０４４８】
実施例12：方法体系
以下の方法は、実施例11に記載した試験に適用するために提供する。
【０４４９】
オリゴヌクレオチド合成
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法により合成し得る。例えば、非置換および置換ホスホジエステル(P=O)オリゴヌクレオチドは、自動化DNA合成機(例、Applied Biosystems model 380BまたはAkta Oligopilot 100)上で、標準的なホスホロアミダイト化学構造を用いて、ヨウ素で酸化して合成し得る。ホスホロチオエート(P=S)は、標準的な酸化瓶を、アセトニトリル中の311-1,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキシドの0.2M溶液で代替し、亜リン酸結合の段階的にチオエート化すること以外は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様に合成し得る。チオエート化待機ステップは、68秒に延長してもよく、次にキャッピングのステップが続く。支持カラムから切断し、55℃にて濃縮水酸化アンモニウム中で非ブロック化(18時間)した後、オリゴヌクレオチドをエタノール2.5容積で0.5M NaCl溶液から2回沈殿させることにより精製し得る。
【０４５０】
ヘルペスウイルス科に関する抗ウイルスアッセイ
ヘルペスウイルス科に関するプラーク減少を、以下のように実施する：
HSV-1またはHSV-2に関しては、VERO細胞(ATCC# CCL-81)を、12ウェルの組織培地プレート(NUNCまたは相当物)内で、37℃にておよび5% CO2において、10%熱不活性化ウシ胎児血清、ならびにゲンタマイシン、バンコマイシンおよびアンフォテリシンBで補充したMEMの存在下、コンフルエンス迄増殖させる。コンフルエンシーに到達したら、培地を、HSV-1 (KOS株、合計40〜60PFU)またはHSV-2 (MS2株、合計40〜60PFU)のいずれかで補充した5%ウシ胎児血清および上記に詳細した抗生物質を含有するよう交換する。ウイルス吸着を90分間進行させた後、細胞を洗浄し、5%ウシ胎児血清および1%ヒト免疫グロブリンを含有する新しい「オーバーレイ」培地で代替する。吸着から3〜4日間後、細胞をホルマリンで固定して、ホルマリン固定およびクレシルバイオレット染色後、プラークを計数する。
【０４５１】
CMVに関しては、ヒト神経芽細胞を、HSV-1/2アッセイでVERO細胞に関して詳細したように増殖させる。培地成分および吸着／オーバーレイ手順は、以下の例外を除き同一である：
1. 吸着中、細胞の感染にCMV(AD169株、合計40〜60PFU)を用いる。
2. オーバーレイ培地中、1%ヒト免疫グロブリンを4%シープラークアガロースで代替する。
【０４５２】
他のヘルペスウイルス科に関して、試験は、吸着中、適切な細胞宿主および40〜60PFUのウイルスを用いて上述したプラークアッセイにて実施される。
【０４５３】
この試験は、試験の終盤に化合物の不在下で識別可能なプラークが存在する場合のみ有効である。
【０４５４】
この試験において、IC50は、未処理対照と対比して50%のプラークが存在する濃度である。
【０４５５】
試験すべき化合物は、吸着中およびオーバーレイ中に存在する。
【０４５６】
レトロウイルスに関する抗ウイルスアッセイ
レトロウイルスHIV-1に関するアッセイは、HIV-1感染細胞の上清中の総p24を、以下のように実施したELISAにより検出することにより実施する。
【０４５７】
HIVおよびHBVに関して血清陰性である、スクリーニングを受けたドナーの新鮮なヒト血液からPBMCを単離した。末梢血細胞を低速遠心分離およびPBS中の再懸濁によりペレット化／2〜3回洗浄して、混入した血小板を除去した。次いで、洗浄した血液細胞をDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:1に希釈し、50mL遠心分離管内でリンパ球分離用溶液(Mediatech, Inc.のLSM; cellgro(登録商標); 密度1.078+/-0.002g/mL; Cat.# 85-072-CL) 14mL上に重ね、600×gで30分間遠心分離した。得られた界面から帯状PBMCを緩やかに吸引し、次に低速遠心分離によりPBSで2回洗浄した。最終洗浄後、細胞をトリパンブルー排除により計数し、15%ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、4μg/mL PHA-Pで補充したRPMI 1640中に1×107細胞/mLにて再懸濁した。細胞を37℃で48〜72時間インキュベートした。インキュベーション後、PBMCを遠心分離にかけ、15% FBS、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、10μg/mLゲンタマイシンおよび20U/mL組換えヒトIL-2を伴うRPMI 1640中に再懸濁した。PBMCをこの培地中で1〜2×106細胞/mLの濃度にて維持し、アッセイプロトコールに使用する迄、隔週で培地交換した。組織培養フラスコに吸着した結果として、単球は培養物から枯渇した。
【０４５８】
標準的なPBMCアッセイのために、少なくとも2人の正常なドナーからのPHA-P刺激細胞をプールして、新鮮な培地中で最終濃度1×106細胞/mLに希釈し、96ウェル丸底マイクロプレートのウェル内に、50μL/ウェル(5×104細胞/ウェル)にてプレーティングした。試験薬物の希釈物をマイクロタイターチューブ内にて2×濃度で調製し、各濃縮物100μLを標準的なフォーマットの適切なウェル内に配置した。2時間のプレインキュベーション期間(細胞+薬物)の後、ウイルスの既定の希釈物のストック50μLを、各試験ウェル内に配置した(最終MOI 0.1)。細胞およびウイルスのみを含むウェルを、ウイルス対照に使用した。MTSアッセイ系を用いて(以下に記載する)、薬物の細胞毒性試験のためにウイルスを除いた別個のプレートを同一に調製した。PBMC培養物を感染後7日間維持し、その時点で、細胞フリー上清サンプルを収集して、以下に記載するように逆転写酵素活性についてアッセイした。
【０４５９】
p24 ELISAキットをCoulter Electronicsから購入した。製造業者の指示に従って、アッセイを実施する。各サンプル中のp24抗原の量を正確に定量するために、各アッセイにおいてコントロールカーブ(Control curves)を生成する。データは、Molecular Devices Vmaxプレートリーダーを用いた450nmでの分光光度分析により獲得する。最終濃度を光学密度の値から計算する。
【０４６０】
この試験は、感染した未処理細胞の組織培養上清中に、p24の蓄積が存在する場合のみ有効である。
【０４６１】
この試験において、IC50は、検出可能なp24量が未処理対照内に存在するp24の50%である濃度である。
【０４６２】
試験するべき化合物は、吸着中および吸着後、培地中に存在する。
【０４６３】
パラミクソウイルス科に関する抗ウイルスアッセイ
RSVに関して、CPEの測定を以下のように実施する。
【０４６４】
Hep2細胞を96ウェルプレート内にプレーティングして、5%ウシ胎児血清を加えたMEM中、5% CO2で37℃において一夜増殖させた。翌日、細胞を、吸着により2時間、RSV (100ul／ウェル内にA2株、108.2TCID50/mL)で感染させる。吸着後、培地を交換し、7日間の増殖後、CPEを、アラマーブルー色素の生細胞によるその蛍光付加体への変換により測定する。
【０４６５】
この試験は、化合物の不在下での感染細胞内のCPE測定値(アラマーブルー変換により測定)が、非感染細胞内で測定した変換の10%である場合にのみ有効である。
【０４６６】
IC50を比較するために、100% CPEは、感染細胞内で見られる変換レベルに設定し、0% CPEは、非感染細胞で見られる変換レベルに設定する。従ってIC50は、50% CPEを生成する化合物の濃度である。
【０４６７】
試験するべき化合物は、吸収中および吸収後、培地中に存在する。
【０４６８】
実施例13：2'-Oメチル化ホスホロチオエート化ランダマーは、pH耐性の増大および血清タンパク質結合の低下に伴う強力な抗ウイルス活性を示す
本発明者らは、本明細書において、PS-ONランダマーが配列特異的な機序を介して作用しない(即ち、それらの活性は、核酸に対する結合を必要とせず、および該活性は、配列特異的なアプタマー効果によるものではない)ことを示す。本発明者らは、更に、この実施例において、40塩基ランダマー上に非修飾結合、ホスホロチオエート結合、2'-Oメチル修飾リボースおよび非修飾リボヌクレオチドを組み合わせたオリゴヌクレオチドの、それらの抗ウイルス活性、血清タンパク質相互作用および化学的安定性に対する効果を示す。
【０４６９】
全ランダマーは、University of Calgary Core DNA Services labにて、標準的な固相、バッチ合成を用いて、1または15 □mol合成規模で調製し、脱保護し、および50cm Sephadex G-25カラム上で脱塩した。
【０４７０】
A型インフルエンザ(INF A)内での抗ウイルス活性試験のために、不死化犬腎臓(MDCK)細胞を、37℃および5% CO2において、ゲンタマイシン、バンコマイシンおよびアンフォテリシンBで補充した、10%ウシ胎児血清を加えたMEM中で培養する。細胞を増殖から6日後にコンフルエントな単層を得る密度で、6ウェルプレート内に播種する。コンフルエンシーに到達したら、培地を上記の補充物のみ含有するよう交換し、次いで細胞をINF A(H3N2株、合計約35〜70PFU)に60分間暴露する。ウイルス暴露後、培地を薬物のみ含有する新しい培地と交換する。感染から2〜3日後、感染培養物のホルマリン固定およびクレシルバイオレット染色後、プラーク計数を実施する。
【０４７１】
HSV内での抗ウイルス試験のために、不死化アフリカミドリザル腎臓(VERO)細胞を、37℃および5% CO2において、ゲンタマイシン、バンコマイシンおよびアンフォテリシンBで補充した、10%ウシ胎児血清を加えたMEM中で培養する。細胞を、増殖から4日後に細胞のコンフルエントな単層を得る密度で、12ウェルプレート内に播種する。コンフルエンシーに到達したら、培地を5%血清および上記の補充物のみを含有するよう交換し、次いで細胞を、試験化合物の存在下、HSV-1 (KOS株、合計約40〜60PFU)に90分間暴露する。ウイルス暴露後、培地を、5%血清、1%ヒト免疫グロブリン、上記の補充物および試験化合物を含有する新しい「オーバーレイ」培地で代替する。感染から3〜4日間後、感染培養物をホルマリン固定およびクレシルバイオレット染色後、プラーク計数を実施する。
【０４７２】
血清タンパク質相互作用を測定するために、3'端においてFITC(ベイト)で標識したホスホロチオエートランダマーを、アッセイ緩衝液(10mM Tris、pH7.2、80mM NaCl、10mM EDTA、100mM b-メルカプトエタノールおよび1%トゥイーン20)中で2nMに希釈する。次いで、このオリゴを、熱不活性化されていない適量のFBSと混合する。ランダマー-FBS相互作用の後、複合体を様々な非標識ランダマーでチャレンジして、それらのベイトをその複合体から置換する能力について評価する。置換されたベイトを蛍光偏光により測定する。置換曲線を使用して、Kdを決定した。
【０４７３】
pH耐性は、HClで適切なpHに調整したPBS中で、ランダマーをインキュベートすることにより測定した。インキュベーションから24時間後、サンプルを1M TRIS、pH7.4で中和して、変性アクリルアミドゲル上で移動させ、EtBr染色に次いで視覚化した。
【０４７４】
これらの実験に関して、本発明者らは、異なる修飾ランダマー：REP 2006、REP 2024、REP 2107、REP 2086およびREP 2060の挙動を比較した(この実施例の表6参照)。これらランダマーの抗ウイルス活性を、HSVおよびA型インフルエンザ内での抗ウイルス活性について、プラーク減少アッセイにより試験した(この実施例の表7参照)。これらの2種のウイルス内で、REP 2006、2024および2107は、同様の、かつ強力な抗ウイルス活性を有し、REP 2060は有意な抗HSV活性を示し、またREP 2086は、これらのアッセイ条件下で、HSV-1およびA型インフルエンザの両方内で、検出可能な抗ウイルス活性を有さなかった。
【０４７５】
(表6)ランダマーの記述
2008516996.tif 000007
N＝非修飾デオキシリボヌクレオチド、非修飾結合
N＝非修飾デオキシリボヌクレオチド、ホスホロチオエート結合
N＝2'-Oメチル修飾リボース、非修飾結合
N＝2'-Oメチル修飾リボース＋ホスホロチオエート結合
N＝非修飾リボヌクレオチド＋ホスホロチオエート結合
【０４７６】
(表7)HSVおよびA型インフルエンザ内における様々なランダマーの抗ウイルス活性
2008516996.tif 000008
【０４７７】
血清タンパク質に対するこれらのランダマーの相対的な親和性を上述したように測定した。これらの実験の結果は、REP 2107が、REP 2006またはREP 2024よりも低い血清タンパク質に対する親和性を有し(この実施例の表8参照)、およびREP 2086と血清タンパク質との間に相互作用が検出されないことを示した。更に、競合の飽和において、REP 2107は、結合したベイトの置換において、REP 2006またはREP 2024と比較して低い有効性を有した(この実施例の表9参照)。
【０４７８】
(表8)様々なランダマーの血清タンパク質親和性
2008516996.tif 000009
【０４７９】
(表9)飽和におけるベイトランダマーの置換
2008516996.tif 000010
【０４８０】
最後に、本発明者らは、これらのランダマーの、37℃で24時間のインキュベーションの間の、pH1〜pH7の範囲内におけるpH安定性を試験した。REP 2006およびREP 2024がpH3で有意な分解を示し、pH2.5で完全に分解した一方、REP 2107、2086および2060は、24時間のインキュベーション後、pH1で完全に安定であった。
【０４８１】
これら結果は、ONランダマーのホスホロチオエート化が、それらの抗ウイルス活性において非常に有益であるとの本発明者らの以前の研究結果を再現する。本発明者らは、更に、PS-ONランダマー内の2'-Oメチル修飾の組み込みが、たとえPS-ONランダマー内の各リボースが2'-O-メチル修飾を含むとしても、これら分子の抗ウイルス活性に影響を与えないことを示す。更に、完全な2'-O-メチル化および完全なホスホロチオエート化されたランダマー(REP 2107)は、血清タンパク質との相互作用が比較的弱く、低pHにより誘導される加水分解に対する耐性が有意に増大されている。
【０４８２】
実施例14：PS-ONは、大部分は細胞外作用様式により作用する
先行技術は、PS-ONの細胞内濃度を増大させる送達剤の使用が、それらの活性に有益であろうことを教示している。本発明者らは、本明細書において、PS-ONの抗ウイルス活性が大部分は細胞外で作用し、従って細胞内送達剤の移入促進により主な利益を受容しないであろうことを示す。
【０４８３】
この実施例において、本発明者らは、例えばリボヌクレオチド(RNA)または2'-O-メチル修飾のような他の修飾を含まない、デオキシリボヌクレオチド(DNA)から作製されたPS-ONを使用する。これらの分子は、特にアンチセンス活性の場合、送達系またはトランスフェクション剤の補助なしでは、インビトロで細胞を容易に貫通しないことが当該技術分野にて周知であるため、このデータは、更なる修飾を支持するPS-ONに適用されると考えることが安全である。
【０４８４】
細胞送達の測定のために、HeLa細胞を、標準的な条件下で培養し、次いで裸でまたは送達剤(この場合、DOTAP [1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン]、カチオン性脂質)で封入して、蛍光標識したREP 2006 (FL-REP 2006、3'フルオレセインイソチオシアナート結合40塩基PS-ONランダマー)と共にインキュベートした。インキュベーションの様々な時間の後、細胞をPSBで徹底的に洗浄して、任意の非内在化ONを除去し、次いで細胞を溶解した。細胞溶解物中の細胞内ONのレベルを、蛍光プレートリーダーにより測定した。
【０４８５】
HSV-1およびインフルエンザ内の裸のREP 2006、ならびにDOTAPおよびPEI(ポリエチレンイミン)で封入したREP 2006による抗ウイルス効力は、上述したように測定した。
【０４８６】
HSV-1の感染サイクル中のREP 2006の作用時間を、上述したように測定したが、REP 2006を感染前、感染中および感染後の様々な時間において加えた。HIV-1内では、REP 2006を感染前、感染中および感染後の様々な時間において、HIV-LTR-β-gal HeLa細胞に加えることにより測定した。HIV-1感染は、吸収光度法を用いたβ-gal産生の比色分析アッセイにより監視した。
【０４８７】
最初に、本発明者らは、DOTAPおよびPEIが蛍光REP 2006を細胞内に送達し得ることを測定した(表10参照)。このデータは、DOTAPおよびPEIの両方が、FL-2006(および推論によりREP 2006)を細胞内に送達できることを示した。
【０４８８】
(表10)送達を伴うおよび伴わないFL-REP 2006の細胞内濃度(pmol/細胞)
2008516996.tif 000011
【０４８９】
次に、本発明者らは、HSV-1、A型インフルエンザ内での封入(DOTAPまたはPEI) REP 2006の活性を測定した(この実施例の表11および表12参照)。これらの結果は、封入REP 2006が、HSV-1およびインフルエンザの両方内で、検出可能な抗ウイルス活性を有さないことを示した。
【０４９０】
(表11)HSV-1内における封入REP 2006の活性(IC50、μM)
2008516996.tif 000012
【０４９１】
(表12)A型インフルエンザ内におけるPEI封入REP 2006の活性(%プラーク形成の阻害)
2008516996.tif 000013
【０４９２】
最後に、HSV-1およびHIV-1内における添加時間の研究を行った。ここで、REP 2006は、感染前、感染中および感染後の様々な時間に加えられた。これらの結果は、REP 2006が、両方のウイルス内で、感染前または感染中に存在した場合に最も有効であることを示し、REP 2006がHSV-1およびHIV-1内で融合／進入阻害剤であることを示した。
【０４９３】
これらの結果は、REP 2006および例えばリボヌクレオチド(RNA)または2'-O-メチルのような、但しこれらに限定されない、更なる修飾を支持するPS-ONの抗ウイルス活性が、主として細胞外で生じることを示している。
【０４９４】
実施例15：REP 2107は、優れたヌクレアーゼ耐性を示す
様々な化学構造の40merランダマーを、様々なヌクレアーゼによる分解に抵抗するそれらの能力について、37℃で4時間評価した(この実施例の表13参照)。殆どの化学構造が一種より多いヌクレアーゼに耐性を示したが、REP 2107のみが、試験した4種の全ヌクレアーゼに対して耐性であった。REP 2024(分子の各末端の4リボースに、2'-Oメチル修飾を有する)は、その親分子REP 2006と同一の耐性プロファイルを示し、S1ヌクレアーゼ分解に感受性であったが、2107(完全に2'-Oメチル修飾された)は、この酵素に耐性であったことに注目することが重要である。これらの結果は、試験したオリゴヌクレオチドのうち、REP 2107が、血液中でのヌクレアーゼ分解に対する耐性において最も有効であろうことを示唆している。
【０４９５】
(表13)異なるランダマー化学構造による様々なヌクレアーゼに対する耐性
2008516996.tif 000014
【０４９６】
実施例16：ホスホロチオエート化ポリピリミジンONは、酸耐性およびヌクレアーゼ耐性を示す
ONの酸耐性のONの程度を測定するために、異なる化学構造および／または配列を有する様々な40塩基ONを、異なるpH値に緩衝したPBS中で、37℃で24時間インキュベートする。これらのONの分解を、尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価した(表14参照)。
【０４９７】
これらの研究の結果は、ランダマーON(ピリミジンヌクレオチドおよびプリンヌクレオチドの両方を含む)が、それらが完全に2'-O-メチル化された場合にのみ、酸性のpHに耐性であることを示す。本発明者らのデータは、部分2'-O-メチル化ON(ギャップマー、REP 2024)でも、完全ホスホロチオエート化ONと比較して、酸耐性の有意な増大を全く示さないことを示した。完全ホスホロチオエート化ランダマーでさえも、非修飾ONと比較して、pH耐性の増大を示さない。対照的に、本発明者らは、ピリミジンヌクレオチドシトシン(ポリC、REP 2031)もしくはチミジン(ポリT、REP 2030)またはポリTCヘテロポリマー(REP 2056)のみを含むホスホロチオエート化40mer ONは、ホスホロチオエート化された(REP 2107)またはされていない(REP 2086)完全2'-O-メチル化ランダマーと等価な酸耐性を有することに気付いた。ポリピリミジンオリゴヌクレオチドの結果と対照的に、プリンヌクレオチドアデノシン(ポリA、REP 2029)のみを含むホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドまたは任意のアデノシンもしくはグアノシンヌクレオチド(REP 2033、2055、2057)は、非修飾DNAと比較して高い酸耐性を全く示さなかった。
【０４９８】
これらの結果は、ホスホロチオエート化ONと比較して高い酸耐性を達成するための、先行技術に記載された好ましい方法が、2'-O-メチル修飾(もしくは他の2'-リボース修飾)または他の修飾を加えることであることから有意である。本発明のデータは、ONがポリピリミジン(即ち、ピリミジンヌクレオチドのみを含む[例、シトシンもしくはチミジンのホモポリマー、またはシトシンおよびチミジンのヘテロポリマー])の場合、pH耐性およびヌクレアーゼ耐性を達成するために、2'-O-メチルリボース修飾または他の2'-リボース修飾を必要としないことを示す。ピリミジン存在下におけるプリン(AまたはG)の存在も、ONを酸に不安定なものとし得る。
【０４９９】
(表14)様々な40mer ONの酸安定性
2008516996.tif 000015
PII＝ホスホジエステラーゼII、S1＝S1ヌクレアーゼ、Exo1＝エキソヌクレアーゼ1、PS＝全結合がホスホロチオエート化、2'OMe＝全リボースが2'Oメチル化、+++＝分解なし、++＝5%未満の分解、-/+＝90%より多い分解、−＝完全に分解
【０５００】
ヌクレアーゼ耐性に対するONヌクレオチドの組成および修飾の範囲を決定するために、異なるヌクレオチド組成および修飾を有する様々な40塩基ONを、様々なエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの存在下、37℃で4時間インキュベートした。これらONの分解を、尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価した。
【０５０１】
これらの研究の結果は、ランダマーONが、それらが完全にホスホロチオエート化および完全に2'-O-メチル化された場合のみ、試験した4種の全酵素(ホスホジエステラーゼII[Sigma]、S1ヌクレアーゼ[Fermentas], Bal31 [New England Biolabs]およびエキソヌクレアーゼ1 [New England Biolabs])に耐性であることを示した(表15参照)。ランダマー内でのこれらのいずれかの修飾の脱落は、試験した1種または複数種のヌクレアーゼに対する感受性を増大させた。本発明者らは、完全ホスホロチオエート化、部分2'-O-メチル化ランダマー(REP 2024)が、ヌクレアーゼ耐性においてREP 2006と等価であり、最適なヌクレアーゼ耐性の達成のためには、ホスホロチオエート化ONの各ヌクレオチドに2'-O-メチル化が必要であり得ることに気付いた。しかしながら、本発明者らは、ホスホロチオエート化40merポリピリミジンポリシトシン(ポリC、REP 2031)が、完全ホスホロチオエート化、完全2'0メチル化ランダマー(REP 2107)と等価なヌクレアーゼ耐性を有することに気付いた。
【０５０２】
これらの結果は、先行技術がホスホロチオエート化ONのヌクレアーゼ耐性を高める好ましい方法は、2'-O-メチル修飾、他の2'-リボース修飾または他の修飾を加えることであると教示していることから有意である。この新しいデータは、ONが完全にホスホロチオエート化されかつピリミジンのホモポリマーからなる場合、ヌクレアーゼ耐性を高めるために2'-O-メチル修飾もしくは他の2'-リボース修飾または任意の他の修飾を必要としないことを示す。
【０５０３】
(表15)様々な40mer ONのヌクレアーゼ耐性
2008516996.tif 000016
PII＝ホスホジエステラーゼII、S1=S1ヌクレアーゼ、Exo1＝エキソヌクレアーゼ1、PS＝全結合がホスホロチオエート化、2'OMe＝全リボースが2'Oメチル化、−＝完全に分解、++++＝分解なし、PS＝ホスホロチオエート、2'OMe＝リボースの2'-O-メチル修飾
【０５０４】
これらの結果は、シトシンおよび／またはチミジンおよび／または他のピリミジンを含む、ピリミジンヌクレオチドのみを含有するホスホロチオエート化ONが低pHに耐性であり、かつシトシンヌクレオチドのみを含有するホスホロチオエート化ONが優れたヌクレアーゼ耐性を示し、抗ウイルスONの経口投与に重要な2つの特性を有することを示す。従って、抗ウイルスONの高いピリミジンヌクレオチド含有量は、低pHに対する耐性を提供するのに有利であり、高いシトシン含有量は、改善されたヌクレアーゼ耐性を提供するのに有利である。例えば、ある実施態様において、このようなオリゴヌクレオチドのピリミジン含有量は、50%より多く、60%より多く、もしくは70%より多く、もしくは80%より多く、もしくは90%より多くまたは100%である。更に、これらの結果は、ピリミジンヌクレオチドから構成された、治療有効量の少なくとも一種の薬学的に許容されるONの経口投与による処置方法の可能性を示す。これらの結果はまた、抗ウイルスON製剤の成分としてピリミジンヌクレオチドを高いレベルで含有するONの可能性も示す。
【０５０５】
実施例17：インビボでのONの配列非依存的な広域な活性
本発明者らは、本明細書において、40塩基の配列非依存的なPS-ONランダマーがウイルス感染した6種の異なる動物モデルにおいて強力な抗ウイルス活性を有することを示す(表16参照)。40塩基PS-ONランダマーを、皮下、腹腔内およびエアロゾル(吸入)を含む多数の投与経路により動物に導入した。これらデータは、配列非依存的なONの広域抗ウイルス薬としての治療的可能性を強力に支持する。
【０５０６】
(表16)PS-ONランダマーは、インビボで強力な広域抗ウイルス活性を有する
2008516996.tif 000017
ND＝測定せず
【０５０７】
実施例18：オリゴヌクレオチドは、広域なウイルスに抗ウイルス活性を有する
本発明者らは、本明細書において、40 PS-ONランダマーがインビトロで13のウイルスファミリーに対して抗ウイルス活性を有することを示す(表17参照)。
【０５０８】
(表17)PS-ONランダマーは、インビトロで広域な抗ウイルス活性を有する
2008516996.tif 000018
【０５０９】
実施例19：PS-ONのインビボおよびインビトロでの抗インフルエンザ活性
ONの抗インフルエンザ活性を更に評価するために、赤血球凝集アッセイにより、REP 2006をインフルエンザの異なる株に対して試験した。表18に示すように、REP 2006は、広域な抗インフルエンザ活性を示した。
【０５１０】
(表18)インフルエンザの多数の株に対するREP 2006の広域な抗ウイルス活性
2008516996.tif 000019
【０５１１】
ONのインフルエンザ処置のための薬物としての可能性を評価するために、REP 2006をインフルエンザ感染のマウスモデル内で試験した。REP 2006を注射用蒸留水中にて2つの濃度で調製し、噴霧によりエアロゾル化し、ここで排気口は、Andersonのカスケードチャンバ(cascade chamber)に接続されていた。エアロゾルチャンバ内の様々な濃度のREP 2006 10mLを用いて、20g Balb/cマウスをエアロゾル化ランダマー1に連日、30分間暴露した。マウスにA型インフルエンザ(H3N2、A/Hong Kong/68)約100TCIDを鼻腔内感染させ、感染から4日後、動物を屠殺にし、肺ウイルス力価を赤血球凝集アッセイにより測定した。表19に示すように、REP 2006は、インビボで強力な抗インフルエンザ活性を示した。
【０５１２】
(表19)インビボでのREP 2006のA型インフルエンザに対する効力
2008516996.tif 000020
SDA＝小滴エアロゾル、IP＝腹腔内、SC＝皮下、**は、12時間間隔で投与される2つの1日量
【０５１３】
実施例20：ホスホロチオエート化ポリピリミジンONは、インビボで酸性環境において改善された抗ウイルス活性を示す
ポリピリミジンONの低いpHに対する耐性と、それらがインビボにてより低pHで活性薬物となる能力を評価するために、REP 2031 (PS ポリC)をHSV-2膣内マウスモデルで試験した。雌のSwiss Websterのグループに、ウイルスチャレンジの7日前および1日前、酢酸メドロキシプロゲステロン3mgを含有する縣濁液0.1mLを、皮下注射により投与して、膣内HSV-2感染の感受性を増大させた。膣腔を綿棒で2回、最初はアルギン酸カルシウムを先端につけた湿潤タイプ1の綿棒で、次に乾燥綿棒で拭き取った。連続分注ピペットを使用して、候補溶液またはプラセボ対照のいずれか15μLで動物を処置した。5分後、動物を、HSV-2、186株104pfuを含有する縣濁液15μLの滴下注入により接種した。膣拭き取りサンプルを、接種から2日後に全動物から収集し、ウイルスの存在をアッセイする迄、培養液により冷凍貯蔵した(-80℃)。マウスを、接種から21日後迄、脱毛および会陰周辺の紅斑、慢性尿失禁、後肢麻痺および死亡を含み得る、症候性感染の兆候に関して連日評価した。症候を発現しなかった動物は、接種から2日後に収集した膣拭き取りサンプルからウイルスが単離された場合、感染したものと定義した。結果は、ポリピリミジンREP 2031が、例えばこの実施例では膣または胃のような酸性の環境内で抗ウイルス活性を有することを示した(表20)。
【０５１４】
(表20)HSV-2に対するONの膣内効力
2008516996.tif 000021
【０５１５】
明細書に引用された特許及びそのほかの参考文献はすべて、本発明が関係する当業者の技量のレベルを示しており、いかなる表及び図も含めて、それぞれの参考文献が個々にその全体を参考として本明細書に組み入れたのと同等に、それら全体を参考として組み入れる。
【０５１６】
当業者は、本発明が上手く適用されて、言及された結果及び利点並びにその中で固有のものを得ることを容易に十分に理解するであろう。好ましい態様の現在の代表として本明細書に記載された方法、変異及び組成物は典型的なものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。その中の変更及びそのほかの用途が当業者に生じるであろうが、それらは本発明の範囲内に包含され、請求の範囲によって定義されている。
【０５１７】
本発明の範囲と精神から逸脱することなく、本明細書で開示された発明に対して種々の置換及び修正を行ってもよいことは当業者には容易に明らかであろう。たとえば、合成条件及びオリゴヌクレオチドの組成物に対して変更を行うことができる。従って、そのような追加的態様は、本発明及び請求の範囲内である。
【０５１８】
本明細書で好適に、説明的に記載された本発明を、本明細書で具体的に開示されていないいかなる要素、限定の非存在下で実践してもよい。従って、たとえば、本明細書の各例において、用語「含む」、「本質的に成る」及び「成る」のいかなるものも、ほかの2つの用語のいずれかで置き換えてもよい。採用された用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定の用語ではなく、そのような用語及び表現の使用において、示された及び記載された特徴の同等物、又はその一部を排除する意図はないが、請求された発明の範囲内で様々な改変が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい態様及び任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示された概念の修正及び変更は当業者に頼ってもよく、そのような修正及び変更が、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
【０５１９】
さらに、本発明の特徴及び局面がマーカッシュ群又は代替の他の群という点で記載される場合、当業者は、本発明がそれによって、マーカッシュ群又はそのほかの群の個々の一員又は亜群の一員という点で記載されることを理解するであろう。
【０５２０】
また、それとは反対に、記載していなければ、様々な数値が態様に対して提供される場合、範囲の端点として任意の2つの異なる値を利用することによって追加の態様が記載される。そのような範囲も記載された本発明の範囲内である。
【０５２１】
従って、追加の態様も本発明の範囲内であり、特許請求の範囲の範囲内である。
【０５２２】
(表21) オリゴヌクレオチドの記述
2008516996.tif 000022
2008516996.tif 000023
2008516996.tif 000024
2008516996.tif 000025
2008516996.tif 000026
2008516996.tif 000027
【配列表】
2008516996000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月21日(2007.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるウイルス感染の予防または処置のための医薬の製造における、少なくとも1つの酸およびヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの使用であって、該オリゴヌクレオチドが抗ウイルス活性を有し、該活性が、大部分は配列非依存的な作用様式により作用する、少なくとも1つの酸およびヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、リボース部分の2'位において修飾されている少なくとも50%のそのヌクレオチド、および修飾されている少なくとも50%のそのヌクレオチド間結合を有する、請求項1記載の使用。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、リボース部分の2'位において修飾されている100%のそのヌクレオチド、および修飾されている100%のそのヌクレオチド間結合を有する、請求項1記載の使用。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、リボース部分において修飾されている少なくとも50%のそのヌクレオチド、および修飾されている少なくとも50%のそのヌクレオチド間結合を有する、請求項1記載の使用。
【請求項５】
前記の修飾されているヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項1〜4のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
リボース部分の2'位における修飾が2'O-メチルまたは2'メトキシエトキシである、請求項2または3記載の使用。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドがポリピリミジンであり、さらに少なくとも1つの修飾を含む、請求項1記載の使用。
【請求項８】
少なくとも1つの修飾がホスホロチオエート結合である、請求項7記載の使用。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドがポリシチジンである、請求項8記載の使用。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが、修飾されている100%のそのヌクレオチド間結合を有し、修飾されている結合がホスホロチオエート結合である、請求項1または7記載の使用。
【請求項１１】
対象におけるウイルス感染の予防または処置のための、少なくとも1つの酸およびヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの使用であって、該オリゴヌクレオチドが抗ウイルス活性を有し、該活性が、大部分は配列非依存的な作用様式により作用する、少なくとも1つの酸およびヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが、リボース部分の2'位において修飾されている少なくとも50%のそのヌクレオチド、および修飾されている少なくとも50%のそのヌクレオチド間結合を有する、請求項11記載の使用。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、リボース部分の2'位において修飾されている100%のそのヌクレオチド、および修飾されている100%のそのヌクレオチド間結合を有する、請求項11記載の使用。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、リボース部分において修飾されている少なくとも50%のそのヌクレオチド、および修飾されている少なくとも50%のそのヌクレオチド間結合を有する、請求項11記載の使用。
【請求項１５】
修飾されているヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項11〜14のいずれか一項記載の使用。
【請求項１６】
リボース部分の2'位における修飾が2'O-メチルまたは2'メトキシエトキシである、請求項12または13記載の使用。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドがポリピリミジンであり、さらに少なくとも1つの修飾を含む、請求項11記載の使用。
【請求項１８】
少なくとも1つの修飾がホスホロチオエート結合である、請求項17記載の使用。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドがポリシチジンである、請求項18記載の使用。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドが、修飾されている100%のそのヌクレオチド間結合を有し、修飾されている結合がホスホロチオエート結合である、請求項11または17記載の使用。
【国際調査報告】
2008516996.tif 000028
2008516996.tif 000029
2008516996.tif 000030
2008516996.tif 000031