(57)【要約】【課題】ポリエチレンイミン、生分解性の基、および比較的疎水性の基を含むポリマーは生理活性物質の細胞への導入に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉａ）および式（Ｉｂ）：
【化１】
2008516011.tif 000010
（式中、
ＰＥＩは、ポリエチレンイミン繰り返し単位であり；
Ｒは、電子対、水素、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５〜Ｃ３０アリール、およびＣ２〜Ｃ３０ヘテロアリールからなる群から選択され；
Ｌは、Ｃ２〜Ｃ５０アルキル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ５０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール；Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアリール；Ｃ２〜Ｃ５０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール；Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアリール；Ｃ２〜Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２〜Ｃ５０カルボキシへテロアルケニルからなる群から選択され；
Ｗは、約２〜約５０炭素原子を含有するカチオン性部分であり；そして
ｍは、約１〜約３０の範囲の整数である）からなる群から選択される繰り返し単位を含有するポリマー。
【請求項２】
ＰＥＩが、式（ＩＩ）：
【化２】
2008516011.tif 000011
（式中、ｘは約１〜約１００の範囲の整数であり、ｙは約１〜約１００の範囲の整数である）の繰り返し単位により表される請求項１記載のポリマー。
【請求項３】
ポリマーが式（Ｉａ）の繰り返し単位を含有する請求項１記載のポリマー。
【請求項４】
ポリマーが式（Ｉｂ）の繰り返し単位を含有する請求項１記載のポリマー。
【請求項５】
Ｗが、アミンと、Ｃ２〜Ｃ５０アルキル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ５０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール；Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアリール；Ｃ２〜Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２〜Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルからなる群から選択される炭素含有基とを含む請求項１記載のポリマー。
【請求項６】
生分解可能である請求項１記載のポリマー。
【請求項７】
加水分解、酵素切断、還元、光切断および超音波処理からなる群から選択される機構により分解可能である請求項１記載のポリマー。
【請求項８】
Ｌが、Ｃ２〜Ｃ５０アルキル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ５０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０アルキニルおよびＣ２〜Ｃ５０ヘテロアルキニルからなる群から選択される請求項１記載のポリマー。
【請求項９】
Ｌが、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸、コレステロールおよびそれらの誘導体からなる群から選択される請求項１記載のポリマー。
【請求項１０】
ポリエチレンイミン繰り返し単位が約６００ダルトン〜約２５，０００ダルトンの範囲にある分子量を有する請求項１記載のポリマー。
【請求項１１】
約５００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲にある重量平均分子量を有する請求項１記載のポリマー。
【請求項１２】
約２，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの範囲にある重量平均分子量を有する請求項１記載のポリマー。
【請求項１３】
架橋されている請求項１記載のポリマー。
【請求項１４】
さらに、ポリマーに複合体化されている生体分子を含む請求項１記載のポリマー。
【請求項１５】
生体分子が、核酸、タンパク質、ペプチド、脂質および炭水化物からなる群から選択される請求項１４記載のポリマー。
【請求項１６】
核酸が、ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイザーおよびアンチセンスＤＮＡからなる群から選択される請求項１５記載のポリマー。
【請求項１７】
核酸が、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴである請求項１５記載のポリマー。
【請求項１８】
さらに、真核細胞に入ることのできる導入増強剤を含む請求項１４記載のポリマー。
【請求項１９】
さらに、ポリマーに複合体化させた診断画像組成物を含む請求項１８記載のポリマー。
【請求項２０】
導入増強剤が、受容体認識、内部移行、細胞エンドゾームからの生体分子の逃避、核の局在化、生体分子の放出、およびシステムの安定化からなる群から選択される真核細胞における１つ以上の機能を促進する請求項１８記載のポリマー。
【請求項２１】
生体分子が、核酸、ペプチド、タンパク質および炭水化物からなる群から選択される請求項２０記載のポリマー。
【請求項２２】
導入増強剤がポリマーに連結されている請求項１８記載のポリマー。
【請求項２３】
細胞を請求項１４記載のポリマーに接触させることにより生体分子を細胞に導入することからなる真核細胞の形質移入方法。
【請求項２４】
遺伝子治療を必要とする哺乳動物を同定し、請求項１７のポリマーを該哺乳動物に投与することからなる哺乳動物の治療方法において、核酸が関係する遺伝子の発現を低下させるのに効果的なｓｉＲＮＡを含む方法。
【請求項２５】
さらに、ポリマーに複合体化した診断画像組成物を含む請求項１記載のポリマー。
【請求項２６】
請求項２５のポリマーを哺乳動物に投与することからなる、診断画像組成物を哺乳動物に導入する方法。
【請求項２７】
Ｒ、Ｌ、ＰＥＩ、Ｗおよびｍからなる群から選択される少なくとも１つのパラメーターがポリマーの少なくとも２つに関して異なる、請求項１記載の複数のポリマーを含むポリマーライブラリー。
【請求項２８】
請求項１記載のポリマーと、真核細胞の特異的な受容体を認識するリガンドとを含む医学診断システム。
【請求項２９】
ポリマーがリガンドに結合している請求項２８記載の医学診断システム。
【請求項３０】
増感剤物質と請求項１記載のポリマーとを含む医薬組成物。
【請求項３１】
増感剤物質が、可視光、紫外線、または両方に対して感受性がある請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】
ポリマーが、生体分子に対する親和性を有する請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３３】
画像造影剤と請求項１記載のポリマーとを含む診断画像組成物。
【請求項３４】
さらに、ターゲッティング剤を含む請求項３３記載の診断画像組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、参照により全文が本文に編入される２００４年１０月４日出願の米国仮出願第６０／６１５，７６４号および２００５年７月１１日出願の米国仮出願６０／６９８，３５７号に基づく優先権を主張する。
（発明の背景）
【０００２】
本発明は、生理活性物質を細胞に導入するための組成物と方法に関する。好ましい実施態様において、本発明は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、生分解性の基、および比較的疎水性の基を含有するカチオン性リポポリマーに関し、およびＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび医薬等の生理活性物質を導入するために該リポポリマーを使用する方法に関する。
（関連技術の説明）
ウイルストランスフェクションシステムや非ウイルストランスフェクションシステムの使用を含む多くの技術が生理活性物質を細胞に導入するために利用可能である。ウイルスシステムは典型的には非ウイルスシステムよりも高いトランスフェクション効率を有するが、ウイルスシステムの安全性に関して疑問があった。Ｖｅｒｍａ  Ｉ．Ｍ  ａｎｄ  Ｓｏｍｉａ  Ｎ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９  （１９９７），  ｐｐ．  ２３９−２４２；  Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６  （２０００），  ｐｐ．  ２２４４−２２４５を参照されたい。さらに、ウイルスベクターの調製は複雑で費用のかかるプロセスになりやすい。非ウイルストランスフェクションシステムは一般的にウイルスシステムよりも効果に劣るが、それらのシステムは一般的にウイルスシステムよりも安全で、調製しやすいと考えられるので、かなりの注目を集めてきた。
【０００３】
多くの非ウイルストランスフェクションシステムは、生理活性物質に複合体化させたカチオン性ポリマーの使用をともなう。遺伝子キャリヤーとして用いられてきたカチオン性ポリマーの例として、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマーおよびポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）があげられる。残念ながら、ＰＬＬによるトランスフェクション効率は通常低く、高分子量ＰＬＬは細胞に対して顕著な毒性を示してきた。一部の例では、ＰＥＩはエンドソーム分解物質やターゲティング剤を不要とせずに効率的な遺伝子導入を提供する。Ｂｏｕｓｓｉｆ  Ｏ．，  Ｌｅｚｏｕａｌｃ’ｈ    Ｆ．，  Ｚａｎｔａ  Ｍ．  Ａ．，  Ｍｅｒｇｎｙ  Ｍ．  Ｄ．，  Ｓｃｈｅｒｍａｎ  Ｄ．，  Ｄｅｍｅｎｅｉｘ  Ｂ．，  Ｂｅｈｒ  Ｊ．  Ｐ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  Ａｕｇ．  １，  １９９５，  ９２（１６）  ７２９７−３０１を参照されたい。様々なポリアミドアミンデンドリマーが遺伝子導入システムとして研究されている。Ｅｉｃｈｍａｎ  Ｊ．  Ｄ．，  Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  Ａ．  Ｕ．，  Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ  Ｊ．  Ｆ．，  Ｂａｋｅｒ  Ｊ．  Ｒ．  Ｊｒ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ２０００  Ｊｕｌｙ；  ３（７）：２３２−２４５を参照されたい。残念ながら、ＰＥＩとデンドリマーの両方が細胞に対して毒性があると報告されているので、ヒト患者への応用における遺伝子導入ツールとしてＰＥＩを使用する可能性を制限している。さらに、商業的に実用的な遺伝子トランスフェクション効率を有するポリアミドアミンデンドリマーの費用は比較的高い。
【０００４】
分解性カチオン性ポリマーを使用した遺伝子キャリヤーは低減された細胞毒性で遺伝子を哺乳類細胞に移入することが報告されている。Ｌｉｍ  Ｙ．  Ｂ．，  Ｋｉｍ  Ｓ．  Ｍ．，  Ｌｅｅ  Ｙ．，  Ｌｅｅ  Ｗ．  Ｋ．，  Ｙａｎｇ  Ｔ．  Ｇ．，  Ｌｅｅ  Ｍ．  Ｊ．，  Ｓｕｈ  Ｈ．，  Ｐａｒｋ  Ｊ．  Ｓ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２３（１０），  ２４６０−２４６１，  ２００１を参照されたい。残念ながら、これらの分解性システムも、非分解性ポリマーに比較して低い遺伝子移入効率を示した。低分子量ＰＥＩのトランスフェクション効率を向上させるために、Ｇｏｓｓｅｌｉｎらは、高分子量ＰＥＩはジスルフィドを含有するリンカーを用いて得ることができることを報告した。Ｇｏｓｓｅｌｉｎ，  Ｍｉｃｈｅａｌ  Ａ．，  Ｇｕｏ，  Ｍｅｎｊｉｎ，  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｊ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２００１．  １２：２３２−２４５を参照されたい。ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）およびジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート二塩酸塩（ＤＴＢＰ）を用いたＰＥＩポリマーは類似する遺伝子トランスフェクション効率と低い細胞毒性を示した。しかし、ジスルフィドを含有するリンカーは高価であり、このシステムの大量調製を困難にするため、望ましくない。ジスルフィドを含有するリンカーを有するポリマーは還元性条件で分解するのみであり、他の条件でのポリマー適用を制限する。
【０００５】
Ｌｙｎｎらは、ジアクリレートを、カチオン性化合物間のリンカー分子として用いる生分解性カチオン性ポリマーの合成方法を記載している。Ｌｙｎｎ，  Ｄａｖｉｄ  Ａ．；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄａｎｉｅｌ  Ｇ．；  Ｐｕｔｎａｍ，  Ｄａｖｉｄ；  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ，  Ｒｏｂｅｒｔ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００１，  １２３，  ９１５５−８１５６を参照されたい。しかし、得られたポリマーは多くの生理活性物質と複合体をうまく形成しない。これらのポリマーの合成は完結するのに数日を要し、遺伝子導入に使用できる有効生成物の量は少ない。１００種類を超えるカチオン性ポリマーがＬｙｎｎらの方法にしたがって作られたが、これらポリマーのうち２種類のみが効果的な遺伝子トランスフェクション効率を示しただけである。これらの因子は、本方法による高分子量ポリマーの調製の達成を困難にしている。
【０００６】
よって、生理活性物質の細胞への導入を安全かつ効率的に促進するために使用できるカチオン性ポリマーの必要性が依然として存在する。
（発明の概要）
【０００７】
一実施態様は、次式（Ｉａ）および次式（Ｉｂ）：
【化１】
2008516011.tif 000002
【０００８】
（式中、
ＰＥＩは、ポリエチレンイミン繰り返し単位であり；Ｒは、電子対、水素、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５〜Ｃ３０アリール、およびＣ２〜Ｃ３０ヘテロアリールからなる群から選択され；Ｌは、Ｃ２〜Ｃ５０アルキル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ５０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール；Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアリール；Ｃ２〜Ｃ５０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール；Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアリール；Ｃ２〜Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２〜Ｃ５０カルボキシへテロアルケニルからなる群から選択され；Ｗは、約２〜約５０炭素原子を含有するカチオン性部分であり；そしてｍは、約１〜約３０の範囲の整数である）からなる群から選択される繰り返し単位を含有するポリマーを提供する。
【０００９】
式（Ｉａ）および式（Ｉｂ）からなる群から選択される繰り返し単位は、ここでは式（Ｉ）の繰り返し単位ということがある。よって、たとえば、式（Ｉａ）と式（Ｉｂ）からなる群から選択される繰り返し単位を含むポリマーは、ここでは式（Ｉ）の繰り返し単位を含むポリマーまたは式（Ｉ）のポリマーということがある。式（Ｉ）の繰り返し単位を含むポリマーは、ここではカチオン性リポポリマーということがある。
【００１０】
好ましい実施態様において、式（Ｉａ）および（Ｉｂ）におけるＰＥＩは下記式（ＩＩ）の繰り返し単位により表される。
【００１１】
【化２】
2008516011.tif 000003
【００１２】
式中、ｘは約１〜約１００の範囲の整数であり、ｙは約１〜約１００の範囲の整数である。当業者は、式（Ｉ）の繰り返し単位の窒素原子がカチオン電荷を有するので多様な負電荷種、たとえば、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩等のアニオンとイオン結合を形成できることを理解するだろう。式（Ｉ）の多様なポリマーを調製し、使用するまで保存してよいので、別の実施態様は、式（Ｉ）（式中、Ｒ、Ｌ、ＰＥＩ、Ｗおよびｍからなる群から選択される少なくとも１つのパラメーターがポリマーの少なくとも２つに関して異なる）の繰り返し単位をそれぞれ含む複数のポリマーを含有するポリマーライブラリーを提供する。
【００１３】
別の実施態様において、式（Ｉ）の繰り返し単位を含むポリマーは、さらに、ポリマーに複合体化した生体分子を含む。生体分子は１つ以上の陰性基を有し、式（Ｉ）の繰り返し単位とイオン結合を形成してもよい。１つ以上の陰性基を有する生体分子の例として、核酸（たとえば、ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイザー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡおよびアンチセンスオリゴ）、タンパク質、ペプチド、脂質、および炭水化物があげられる。
【００１４】
別の実施態様において、式（Ｉ）の繰り返し単位を含むポリマーは、さらに、生体分子、真核細胞に入ることのできる導入増強剤、および／またはポリマーに複合体化した診断画像組成物を含む。導入増強剤は真核細胞中で１つ以上の機能、たとえば、受容体認識、内部移行、細胞エンドゾームからの生体分子の逃避、核の局在化、生体分子の放出、およびシステムの安定化を促進することができる。
【００１５】
さらに生体分子を含み、さらに真核細胞に入ることができる導入増強剤および／またはポリマーに複合体化させた診断画像組成物を含んでよい式（Ｉ）の繰り返し単位を含むポリマーは真核細胞の形質移入に有用である。よって、別の実施態様は、細胞を、（式（Ｉ）の繰り返し単位および生体分子を含有し、任意にさらに導入強化剤および／または診断画像組成物を含有する）そのようなポリマーに接触させることにより生体分子を細胞に導入することからなる真核細胞の形質移入方法を提供する。本方法は、遺伝子治療を必要とする哺乳動物を同定し、そのようなポリマーを該哺乳動物に投与することからなる哺乳動物の治療からなってよい。好ましい実施態様において、生体分子はｓｉＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡは関係する遺伝子の発現を低下させるのに効果的である。
【００１６】
別の実施態様は、真核細胞の特定の受容体とポリマーとを認識するリガンドを含む医学診断システムにおいて、該ポリマーが式（Ｉ）の繰り返し単位と生体分子とを含み、さらに、真核細胞に入ることのできる導入増強剤および／またはポリマーに複合体化された診断画像組成物を含んでよい医学診断システムを提供する。
【００１７】
別の実施態様は、増感剤物質とポリマーからなる医薬組成物において、該ポリマーが式（Ｉ）の繰り返し単位と生体分子からなり、さらに、真核細胞に入ることのできる導入増強剤および／またはポリマーに複合体化された診断画像組成物を含んでよい医薬組成物を提供する。増感剤物質は光および他の刺激にさらされると性質の変化を受けることにより（たとえば、ポリマーの分解速度を高めることにより）生体分子の導入を促進する化合物であってよい。増感剤物質はそれ自体が、刺激を受けると活性の変化を受ける生体分子であってよい。
【００１８】
これらの実施態様および他の実施態様を以下さらに詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
１つの実施態様は、ポリエチレンイミン、生分解性の基、および比較的疎水性の「リポ」基を含むカチオン性リポポリマーを提供する。好ましいカチオン性リポポリマーは、次式（Ｉａ）および式（Ｉｂ）からなる群から選択される繰り返し単位を含む。
【００２０】
【化３】
2008516011.tif 000004
【００２１】
ここで用いられる「式（Ｉ）」は式（Ｉａ）と式（Ｉｂ）の両方を指すものと理解されたい。式（Ｉ）において、ＰＥＩは、ポリエチレンイミン（たとえば、上記式（ＩＩ）により表される繰り返し単位を含有するポリマー）であり、そのエステル結合は生分解性の基であり、Ｌは比較的疎水性の「リポ」基を表し、ｍは約１〜約３０の範囲にある。たとえば、ある実施態様において、Ｌは、Ｃ２〜Ｃ５０アルキル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ５０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール；Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアリール；Ｃ２〜Ｃ５０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール；Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアリール；Ｃ２〜Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２〜Ｃ５０カルボキシへテロアルケニルからなる群から選択される。好ましい実施態様において、ＬはＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸、コレステロールおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。式（Ｉ）中のＲは電子対または水素原子を表すことができる。当業者は、Ｒが電子対を表す場合に、式（Ｉ）の繰り返し単位は低いｐＨでカチオン性であることを理解する。式（Ｉ）においてＲは、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５〜Ｃ３０アリールまたはＣ２〜Ｃ３０ヘテロアリール等の比較的疎水性のリポ基を表すこともあり、この場合、窒素原子は、通常は広い範囲のｐＨにわたってカチオン電荷を有することが理解されるだろう。
【００２２】
式（Ｉ）の繰り返し単位を含有するカチオン性リポポリマーは、下記図式Ａに示されるように式（ＩＩＩ）のジアクリレートモノマーをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と反応させることにより調製することができる。
【００２３】
図式Ａ
【化４】
2008516011.tif 000005
【００２４】
式（ＩＩＩ）において、ＲおよびＬは、式（Ｉ）の繰り返し単位を含有するカチオン性リポポリマーについて記載したことと同じ意味を有する。図式Ａは式（Ｉａ）の繰り返し単位を含有するポリマーの調製を示す。式（Ｉｂ）の繰り返し単位を含有するポリマーは適当なＷ基を含有するジアクリレートモノマーから同様に調製できることが理解されるだろう。ＰＥＩは、好ましくは、ｘが約１〜約１００の範囲にある整数であり、ｙが約１〜約１００の範囲の整数である式（ＩＩ）の繰り返し単位を含有する。
【００２５】
【化５】
2008516011.tif 000006
【００２６】
図式Ａに示される反応は、攪拌下に、好ましくは室温で数時間、エタノール等の相互溶媒中でＰＥＩとジアクリレート（ＩＩＩ）とを混合し、次に溶媒を蒸発させて得られたポリマーを回収することで実施することができる。本発明は理論に縛られるものではないが、ＰＥＩとジアクリレート（ＩＩＩ）との反応は、ＰＥＩの１つ以上のアミンと、ジアクリレートの二重結合とのマイケル反応を伴うと考えられる。Ｊ．  Ｍａｒｃｈ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  ｐｐ．  ７１１−７１２（１９８５）を参照されたい。図式Ａに示されるジアクリレートは下記実施例に示される方法で調製することができる。
【００２７】
式（Ｉ）の繰り返し単位を含む多様なポリマーは、ＰＥＩの分子量と構造、ジアクリレート（ＩＩＩ）上のＲ基、Ｗ基およびＬ基の大きさと種類、およびＰＥＩに対するジアクリレート（ＩＩＩ）の比率を変えることにより、図式Ａにしたがって作ることができる。異なるジアクリレートの混合物および／または異なるＰＥＩの混合物を使用してよい。ＰＥＩは多機能性でありうるから、２種類以上のジアクリレートと反応することができる。架橋剤を用いて架橋カチオン性リポポリマーを作ることができ、および／または多機能性ＰＥＩとジアクリレート（ＩＩＩ）の相対的な比率を調整して架橋カチオン性リポポリマーを作ることができる。ＰＥＩの分子量は好ましくは約６００〜約２５，０００ダルトンの範囲にある。ＰＥＩ：ジアクリレートのモル比は好ましくは約１：２〜約１：２０の範囲にある。カチオン性リポポリマーの重量平均分子量は約５００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲、好ましくは約２，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの範囲にある。分子量は、ＰＥＧスタンダードを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによるか、またはアガロースゲル電気泳動により決定することができる。一実施態様において、Ｒ、Ｌ、Ｗ、ＰＥＩおよび／またはｍが少なくとも２つのポリマーについて異なる複数のカチオン性リポポリマーを調製することによりポリマーライブラリーが提供される。
【００２８】
カチオン性リポポリマーは好ましくは分解可能であり、より好ましくは生分解可能で、たとえば、加水分解、酵素切断、還元、光切断、および超音波処理からなる群から選択される機構により分解可能である。本発明は理論により制限されるわけではないが、細胞内の式（Ｉ）のカチオン性リポポリマーの分解は酵素的切断および／またはエステル結合の加水分解により進むと考えられる。
【００２９】
カチオン性リポポリマーは生体分子と複合体を形成してよいので、生体分子を細胞に導入するためのキャリヤーとして有用である。式（Ｉ）のカチオン性リポポリマーと複合体を形成する生体分子の例として、核酸、タンパク質、ペプチド、脂質および炭水化物があげられる。核酸の例として、ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイザーおよびアンチセンスＤＮＡ、たとえば、アンチセンスオリゴがあげられる。好ましい核酸はｓｉＲＮＡである。ポリマーに複合体化させた生体分子を含有するカチオン性リポポリマーは、相互溶媒中においてカチオン性リポポリマーと生体分子を混合することにより、さらに好ましくは下記実施例に記載の方法により形成することができる。
【００３０】
ポリマーに複合体化させる生体分子を含有するカチオン性リポポリマーは、真核細胞に入ることのできる導入増強剤をさらに含有してよい。導入増強剤は溶解または複合体と混合してよく、またはカチオン性リポポリマーに結合（たとえば、共有結合または複合体化）してよい。導入増強剤は、典型的には、生体分子／キャリヤー複合体の経膜輸送を増強し、輸送中の分解を減少し、および／またはキャリヤーからの生体分子の放出を促進することにより生体分子の細胞への輸送を促進する物質である。遺伝子等の生体分子の細胞への輸送は、好ましくは生体分子／キャリヤー複合体が細胞膜、エンドゾーム膜および核膜を通過した後、生体分子をキャリヤーから放出することからなる。たとえば、核酸の場合、核酸／キャリヤー複合体は最初に細胞膜を通過する。これがエンドサイトーシスにより達成される場合、核酸／キャリヤー複合体は次に内部に移行する。核酸積荷とともにキャリヤーは、ポケットの形成により細胞膜に包まれ、続いてそのポケットは摘み取られる。その結果は、核酸積荷とキャリヤーとを包む大きな膜結合構造物である細胞エンドゾームとなる。次に、核酸／キャリヤー複合体はエンドゾーム膜を通過し細胞質に逃避して、細胞質中および核膜を経る酵素的な分解を避ける。いったん核内に入ると、核酸積荷はキャリヤーから分離する。
【００３１】
一般的に、導入増強剤は、ウイルスキャリヤーシステムと非ウイルスキャリヤーシステムの２つのカテゴリーに分けられる。ヒトウイルスは障壁を克服する方法を進化させて上記のように核へと運ぶので、ウイルスまたはウイルス成分は核酸を細胞に運ぶために有用である。導入増強剤として有用なウイルス成分の一例はヘマグルチニンペプチド（ＨＡペプチド）である。このウイルスペプチドはエンドゾーム分裂により生体分子の細胞への移行を容易にする。エンドゾームの酸性ｐＨで、このタンパク質は細胞質ゾルへの生体分子とキャリヤーの放出を引き起こす。導入増強剤として有用なウイルス成分の他の例は当業者に公知である。
【００３２】
非ウイルス導入増強剤は典型的にはポリマー系または脂質系である。それらは一般的に、核酸の負電荷をつり合わせるように働くポリカチオンである。ポリカチオンポリマーは、不定の大きさのＤＮＡプラスミドを縮合するそれらの能力や、ウイルスベクターに関する安全性の懸念などによって、非ウイルス遺伝子導入増強剤として非常に有望であることが示されている。具体例として、オリゴ−リジン、オリゴ−アルギニン、またはそれらとＰＥＩとの組合せ等の塩基アミノ酸に富む領域を有するペプチドがあげられる。これらのポリカチオンポリマーはＤＮＡの縮合により輸送を促進すると考えられる。ＰＥＩや星型デンドリマー等の分岐鎖形のポリカチオンはＤＮＡ縮合とエンドゾーム放出の両方を仲介することができる。Ｂｏｕｓｓｉｆ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ｖｏｌ．  ９２：７２９７−７３０１を参照されたい。ＰＥＩはｐＨ  ６．９でイオン化可能な末端アミンを有し、ｐＨ  ３．９でイオン化可能な内部アミンを有する高度に分岐したポリマーとして調製することができる。この構成のために、ＰＥＩは小胞膨潤をもたらす小胞ｐＨの変化をもたらすことができ、最終的にはエンドゾーム捕捉からの遊離ができる。
【００３３】
導入を増強する他の方法は、生体分子積荷導入の標的とする細胞上の受容体により認識されるリガンドをカチオン性リポポリマーが含有することである。次に、細胞への生体分子の導入を受容体認識により開始することができる。ここで、用語「リガンド」は、標的細胞の表面またはその核か細胞質ゾルにある特定の受容体タンパク質に結合することのできる生体分子をいう。一実施態様において、リガンドは、受容体に結合する抗体、ホルモン、フェロモンまたは神経伝達物質、またはリガンドのように作用することのできる生体分子であってよい。抗体は、抗原に応答してＢリンパ球により産生されるタンパク質をいう。リガンドが特定の細胞の受容体に結合する場合、エンドサイトーシスが刺激される。生体分子輸送を強化するために、多様な種類の細胞とともに用いられているリガンドの例は、ガラクトース、トランスフェリン、糖タンパク質アシアロオロソムコイド、アデノウイルス繊維、マラリアサーカムスポロザイトタンパク質、上皮細胞成長因子、ヒトパピローマウイルスキャプシド、線維芽細胞成長因子および葉酸である。葉酸受容体の場合、受容体がリガンドに結合し、周囲の膜が細胞表面から閉鎖され、内部に取り入れられた物質は次に小胞膜を通過して細胞質に入るポトサイトーシスと呼ばれるプロセスにより、結合リガンドが内部に取り込まれる。Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １：１８５−１９１を参照されたい。
【００３４】
多様な導入増強剤はエンドゾーム破壊により機能すると考えられる。たとえば、上記のＨＡタンパク質に加えて、欠陥ウイルス粒子もエンドゾーム分解剤として用いられてきた。Ｃｏｔｔｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｕｌｙ  １９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ｖｏｌ．  ８９：  ６０９４−６０９８ページを参照されたい。非ウイルス剤は典型的には両親媒性または脂質系のいずれかである。
【００３５】
細胞の細胞質へのＤＮＡ等の生体分子への放出は、そろってエンドゾーム破壊の仲介、分解の減少、またはこのプロセスをバイパスする物質により高めることができる。エンドゾームｐＨを上昇させるクロロキネは、取り込まれた物質の分解を、リソソームの加水分解酵素を阻害することにより低減するために用いられている。Ｗａｇｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ｖｏｌ．  ８７：３４１０−３４１４を参照されたい。ＰＥＩや星型デンドリマー等の分岐鎖ポリカチオンは上記のようにエンドゾーム放出も促進する。
【００３６】
エンドソーム分解は、カチオン性リポポリマー／生体分子複合体に取り込まれるキメラタンパク質の成分としてジフテリア毒素とシュードモナス外毒素等の毒素のサブユニットを取り込むことによりバイパスすることができる。Ｕｈｅｒｅｋ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ｖｏｌ．  ２７３：８８３５−８８４１を参照されたい。これらの成分はエンドソーム膜を経て、小胞体に戻る核酸のシャトリングを促進する。
【００３７】
細胞質にいったん入ると、生体分子積荷の核への輸送は、核酸−キャリヤー上の核局在化シグナルの包含により高めることができる。たとえば、核局在化シグナル（ＮＬＳ）として機能する特定のアミノ酸配列を用いてよい。生体分子／キャリヤー複合体上のＮＬＳは細胞質ゾルに置かれた特定の核輸送受容体タンパク質と相互作用すると考えられる。生体分子／キャリヤー複合体がいったん組み立てられると、複合体中の受容体タンパク質は、ヌクレオポリンと複数の接触を行なうことで、複合体を核孔を通って輸送する。生体分子／キャリヤー複合体がその目的地に着いた後、それは解離して、積荷と他の成分を解放する。ＳＶ４０ラージＴ抗原に由来するＰｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌの配列を核への輸送に用いることができる。ＳＶ４０ラージＴ抗原に由来するこの短い配列は、結合巨大分子の核への輸送を引き起こすシグナルを提供すると考えられる。
【００３８】
カチオン性リポポリマーは、さらに、該ポリマーに複合体化された蛍光性であるか、放射性であるか、または放射線を通さない染料等の診断画像化合物を含有してよい。複合体は、相互溶媒中でカチオン性リポポリマーと診断画像化合物を混合することにより形成することができる。哺乳動物への投与後、（診断画像化合物と複合体化された）ポリマーは、ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＣＴ、ＳＰＥＣＴ等のよく知られた技術を用いて検知することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｗｉｔｈ  ＰＥＴ  ａｎｄ  ＳＰＥＣＴ，  Ｖｉｊａｙ  Ｓｈａｒｍａ，  ＰｈＤ，  Ｇａｒｙ  Ｄ．  Ｌｕｋｅｒ，  ＭＤ，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，  ＭＤ，  Ｐｈ．Ｄ．，  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＭＡＧＮＥＴＩＣ  ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ  ＩＭＡＧＩＮＧ  １６：３３６−３５１（２００２）を参照）。
【００３９】
別の実施態様は、増感剤物質とポリマーとを含む医薬組成物において、該ポリマーが式（Ｉ）の繰り返し単位と生体分子とを含み、さらに、真核細胞に入ることのできる導入増強剤および／またはポリマーに複合体化された診断画像組成物を含んでよい医薬組成物を提供する。増感剤物質は光および他の刺激にさらされると性質の変化を受けることにより（たとえば、ポリマーの分解速度を高めることにより）生体分子の導入を促進する化合物であってよい。増感剤物質はそれ自体が、刺激を受けると活性の変化を受ける生体分子であってよい。増感剤物質は光活性化剤であってよい。適当な光活性化剤として、フルオレセイン、メロシアニン、キサンテンおよびその誘導体および光反応性ピロール由来の大環状分子およびそれらの誘導体があげられるが、これらに限定されない。適当な光反応性ピロール由来の大環状分子として、天然または合成ポルフィリン、天然または合成のクロリン、天然または合成のバクテリオクロリン、合成イソバクテリオクロリン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、および広範なピロール系大環状システム、たとえば、ポルフィセン、サフィリンおよびテキサフィリン等があげられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００４０】
（実施例１）
【化６】
2008516011.tif 000007
【００４１】
塩化オキサリル（１３．５ｍＬ、１５２  ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ、２００ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、３滴）中のオレイン酸１（１０．７ｇ、３８ｍｍｏｌ）の０℃の溶液に加えた。反応混合物を約１時間攪拌し、次に室温まで温めた。１時間後、溶液をトルエンで希釈し、蒸留した。残留物をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ジエタノールアミン（１０．９ｍＬ、１１４ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（４９０ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（２１ｍＬ、１５２ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。溶液を０℃で３０分間攪拌し、次に室温で反応を一晩進めた。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１ＮのＨＣｌと水性ＮａＨＣＯ３で洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下に濃縮した。次に、粗製残留物をシリカゲルカラム（１０：１酢酸エチル：メタノール）により精製して、１３．５ｇ（９９．９％）の化合物２を無色の油状物として得た。
【００４２】
（実施例２）
【化７】
2008516011.tif 000008
【００４３】
トリエチルアミン（８．１ｇ、８０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．５ｇ、４ｍｍｏｌ）および２（７．１ｇ、２０ｍｍｏｌ）を２００ｍｌのジクロロメタンに室温で溶解した。システムにアルゴンを流し、溶液を氷浴で冷却した。２５ｍｌのジクロロメタン中の塩化アクリロイル（５．４ｇ、６０ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下後、反応物を室温まで温め、一晩攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水と水性ＮａＨＣＯ３で洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下に濃縮した。次に、粗製残留物をシリカゲルカラム（１：３酢酸エチル：ヘキサン）により精製して、７．５ｇ（８１％）の化合物３を無色の油状物として得た。
【００４４】
（実施例３）
カチオン性リポポリマーの合成は、図式Ａにしたがって、分子量６００を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ−６００）を化合物３と以下のように反応させることにより実施した。約０．６ｇのＰＥＩ−６００（Ａｌｄｒｉｃｈ）をはかり、小さいバイアルに置き、１０ｍｌのエタノールを加えた。ＰＥＩ−６００を完全に溶解した後、攪拌しながら、１０ｍｌのエタノール中の３．７ｇ（８．０ｍｍｏｌ）の３をＰＥＩ溶液に迅速に加えた。反応混合物を２時間室温で攪拌した。有機溶媒を減圧下で除去した後、透明で粘性のある液体が得られた。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルはアクリル炭素−炭素二重結合が完全に消えたことを示した。得られたポリマーの分子量をアガロースゲル電気泳動により予想した。これは、同様な化合物を伴う他の合成手順のモデルとして機能する一般的な手順であり、一連の分解性カチオン性リポポリマーを合成するために用いることができる。
【００４５】
（実施例４）
反応混合物を２時間室温（２５℃）で攪拌した後、エーテル中の２．５ｍｌの４ＭのＨＣｌを加えることにより反応混合物を中和する以外は実施例３に記載したように、カチオン性リポポリマーを調製した。白色沈殿物５Ｃをろ過し、エタノールで洗浄し、室温、減圧下に乾燥する。得られたポリマー５ＣはＮＭＲ分光計とアガロースゲル電気泳動により特徴付けた。ポリマー５Ａと５Ｂを同様に調製した：５Ａ：ＰＥＩ１８００、ｍ＝１２；５Ｂ：ＰＥＩ６００、ｍ＝３；５Ｃ：ＰＥＩ６００、ｍ＝８。これは、同様な化合物を伴う他の合成手順のモデルとして機能する一般的な手順であり、一連の分解性カチオン性リポポリマーを合成するために用いることができる。
【００４６】
（実施例５）
細胞培養：  ＨＥＫ  ２９３Ｔ、２０８Ｆ、ＨＴ  １０８０−ＥＧＦＰおよびＨｅＬａ−ＥＧＦＰ細胞を、１０％  ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２および１００％湿度条件下に維持する。この培地中で、細胞は約２０時間の倍加時間を有し、密集を避けるために３〜４日間ごとに分割した。
【００４７】
（実施例６）
プラスミドＤＮＡ調製：  ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入したｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドは、哺乳類細胞においてさらに明るい蛍光とさらに高い発現のために最適化された野生型ＧＦＰの赤方偏移変種をコードする。ＧＦＰタンパク質はＣＭＶの前初期プロモータ（ＰＣＭＶ  ＩＥ）により制御された。プラスミドをＤＨ５α大腸菌で増幅し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより精製したところ、１．７よりも高いＡ２６０／Ａ２８０を常に有した。
【００４８】
（実施例７）
インビトロトランスフェクション：  ２９３細胞と２０８Ｆ細胞を９６ウエル組織培養皿に塗布し（２９３細胞では５×１０４細胞／ウエルおよび２０８Ｆ細胞では１×１０４細胞／ウエル）、１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中で一晩インキュベートした。プラスミド−ポリマー複合体の正確な混合の順番はトランスフェクション結果の重要なパラメーターである。各ウエルについて、異なる濃度の７．５μｌのリポポリマー溶液のアリコートを、０．６μｇのｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドを含む７．５μｌのＤＮＡ溶液に加え、完全に混合した。ＤＮＡおよびリポポリマー混合物を１５分間室温でインキュベートして、ＤＮＡ−リポポリマー複合体を形成させた。複合体を各ウエルに加えて、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間インキュベートした。ＥＧＦＰ遺伝子トランスフェクション効率をＧＦＰシグナル分析により測定した。リポフェクタミンを、製造業者から提供されたプロトコールにしたがって陽性コントロールとして用いた。
【００４９】
（実施例８）
ＧＦＰシグナルの観察：  実施例３からのトランスフェクト細胞中の緑の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡（オリンパス、フィルター５２０  ｎｍ）で観察した。細胞の写真を１０×対物レンズを用いて取った。トランスフェクト培養物中のＧＦＰシグナルを有する細胞の比率は、最適なカチオン性ポリマー量の３フィールドの総計から決定した。リポフェクタミン２０００のトランスフェクション効率は２９３細胞で約６０％であり、５Ａ、５Ｂおよび５Ｃの効率はそれぞれ約２５％、５５％および４０％であったが、５Ａおよび５Ｃの蛍光密度はわずかに低かった（図１を参照）。上記リポポリマーの遺伝子トランスフェクション効率は２０８Ｆでも検出して、５Ａ、５Ｂ、５Ｃおよびリポフェクタミン２０００により媒介されたトランスフェクション後、ＧＦＰ陽性細胞の効率はそれぞれ約４０％、４５％、２５％および５０％であった（図２を参照）。リポポリマーはリポフェクタミン２０００ほどには良好ではなかったが、５Ｂのトランスフェクション効率は、市場の主要なトランスフェクション試薬であるリポフェクタミン２０００に非常に近かった。それらの結果は、リポポリマーが多様な細胞系に対してトランスフェクション試薬となる潜在性を有することを示した。
【００５０】
トランスフェクション効率を定量するために、トランスフェクト細胞の相対蛍光単位を蛍光マイクロプレートリーダー（ＦＬＸ  ８００，  Ｂｉｏ−ＴＥＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ  Ｌｔｄ）により測定した。リポフェクタミン２０００トランスフェクト２９３細胞の相対蛍光単位（ＲＦＵ）は１４５９６であり、５Ｂトランスフェクト細胞（６３１８）の約２．３倍である一方で、リポフェクタミン２０００および５Ｃトランスフェクト２０８Ｆ細胞のＲＦＵはそれぞれ２５４４および１９５４であり、異なる細胞においてトランスフェクション試薬は異なる性能を示し、新しいリポポリマーが一部の細胞系においてより良い性能を有しうることを示した（図３を参照）。
【００５１】
（実施例９）
ＳｉＲＮＡ導入研究：  ＳｉＲＮＡ導入効率は、安定なＥＧＦＰ遺伝子発現をそれぞれ有するＨＴ  １０８０およびＨｅＬａ細胞から生じたＨＴ１０８０−ＥＧＦＰとＨｅＬａ  ＥＧＦＰ細胞で測定した。ＳｉＲＮＡ標的ＥＧＦＰ遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社によって合成された。ｓｉＲＮＡ標的ＥＧＦＰおよびルシフェラーゼ遺伝子は２１ｂｐ二本鎖ＲＮＡであり、それらのセンス鎖の配列はそれぞれＡＡＣ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＧＡＵ  ＣＡＣ  ＡＵＧおよびＡＡＧ  ＵＧＣ  ＧＣＵ  ＧＣＵ  ＧＧＵ  ＧＣＣ  ＡＡＣであった。
【００５２】
１．５×１０４個のＨＴ１０８０−ＥＧＦＰおよびＨｅＬａ−ＥＧＦＰ細胞を９６ウエルプレートの各ウエルにトランスフェクションの２４時間前に植え付けた。各ウエルについて、異なる濃度の７．５μｌリポポリマー溶液のアリコートを、２．０  ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを含有する７．５μｌのＤＮＡ溶液に加え、完全に混合した。ＤＮＡおよびリポポリマー混合物を１５分間室温でインキュベートして、ＳｉＲＮＡ−リポポリマー複合体を形成させた。複合体を各ウエルに加え、細胞を３７℃で、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。リポフェクタミンを、製造業者により提供されたプロトコールにしたがって陽性コントロールとして用いた。ｓｉＲＮＡ導入効率はＧＦＰシグナル分析により決定した。
【００５３】
ＨＴ−ＧＦＰ細胞とＨｅＬａ  ＧＦＰ細胞の両方において、ＧＦＰシグナルは５Ｃ媒介ｓｉＲＮＡ導入後に大きく阻害されたので、５Ｃは非常に高いｓｉＲＮＡ導入を示した。５Ｃ媒介ｓｉＲＮＡ導入ＨＴ−ＧＦＰおよびＨｅＬａ−ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰシグナルは、リポフェクタミン２０００媒介ｓｉＲＮＡ導入細胞よりも低かった。それらの結果は、５Ｃが、両細胞系においてリポフェクタミン２０００よりも高いＳＩＲＮＡ導入効率を有することを示した（図４および図５）。一方、試料５Ａと５Ｂも、その効率がリポフェクタミン２０００よりも低かったもののｓｉＲＮＡ導入効率を示した。相対的な蛍光単位は蛍光マイクロプレートリーダーで測定し、その結果は、５Ｃ媒介ｓｉＲＮＡ導入ＨＴ１０８０−ＥＧＦＰとＨｅＬａ  ＥＧＦＰ細胞の相対蛍光レベルが非導入試薬グループのわずかに２７〜２８％であり、これらのレベルは、非導入試薬グループと比較して約３３〜４６％の相対蛍光レベルを示したリポフェクタミン２０００媒介ｓｉＲＮＡ導入細胞よりも低いことを示した。言い換えると、５Ｃ媒介導入細胞におけるＥＧＦＰ遺伝子発現の阻害効率は約７２〜７３％であり、これは、５４〜６７％の阻害効率を示したリポフェクタミン２０００よりもかなり高いものであった。これらの結果は、５Ｃがリポフェクタミン２０００よりも高いｓｉＲＮＡ導入効率を有することを示した。
【００５４】
（実施例１０）
細胞毒性のアッセイ：  カチオン性遺伝子キャリヤーの細胞毒性は、３−［４，５ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）を用いて哺乳類細胞にて評価した。上記実施例９に記載された方法によるｓｉＲＮＡ導入の４８時間後に、１０μｌのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ（シグマ）中５．０ｍｇ／ｍｌ）を各ウエルに加え、３７℃で３時間インキュベートした。培地を次に除去し、２００μｌのＤＭＳＯを各ウエルに加え、生細胞により作られたホルマザン結晶を溶解した。溶液の吸光度は５７０ｎｍで測定した。細胞生存度は次式を用いて計算した：生存度（％）＝｛Ａｂｓ５７０（試料）／Ａｂｓ５７０コントロール｝。コントロールは、いかなる試薬もｓｉＲＮＡも細胞に加えられていないことを示した。その結果は、５Ａ、５Ｂおよび５Ｃのすべての３試料の細胞毒性が非常に低く、最適条件でのｓｉＲＮＡ導入後に９５％を超える細胞が生存した一方で、細胞生存度はリポフェクタミン２０００によるｓｉＲＮＡ導入後で約６５％であった。ＨｅＬａ細胞はトランスフェクション試薬の細胞毒性に対して感受性があったので、これらの結果は新しいリポポリマーが非常に低い細胞毒性を有することを示唆した。
【００５５】
（実施例１１）
ｓｉＲＮＡ導入におけるリポポリマーの特異性：  ＧＦＰシグナルの阻害が細胞毒性または他の非特異的な因子により引き起こされるのかどうかを評価するために、ｓｉＲＮＡ導入の特異性を研究した。ＳｉＲＮＡ標的ＧＦＰおよびＬｕｃ遺伝子を、５Ａ、５Ｂおおび５ＣによりＨＴ−ＧＦＰ細胞に導入した。ＧＦＰシグナルを導入の４８時間後に観察した：ＧＦＰシグナルの変化がなかったので５Ｂおよび５Ａは低い導入効率を示したことが分かった。最適条件のときに７２％のＧＦＰがＳｉＲＮＡ導入（標的ＧＦＰ遺伝子）の４８時間後に阻害されたために、５Ｃは非常に高い導入効率を示した。一方、ＳｉＲＮＡ標的ｌｕｃ遺伝子が用いられた場合、いかなる阻害も見られなかった。これらの結果は、ＧＦＰシグナルが、細胞毒性に引き起こされた阻害ではなく、ＳｉＲＮＡ導入によって特異的に阻害されていることを示した。
【００５６】
（実施例１２）
分解研究：  生分解を検出するために、リポポリマーをｏｐｔｉ  ＭＥＭで最終濃度３２０μｇ／ｍｌまで希釈し、３７℃で、２、４、８、２４時間それぞれインキュベートした。試料のＤＮＡ結合親和性はＦＩＴＣ標識アンチセンスオリゴを用いて測定した。１００μｌポリマーを、攪拌下に９６ウエルプレート中の１００μｌのオリゴ溶液（２μｍｏｌ／Ｌ）に加え、混合物を１５分間インキュベートした。その後、蛍光を蛍光マイクロプレートリーダー（感度＝４５）で測定した。遊離オリゴ溶液（１００μｌ  ｏｐｔｉ  ＭＥＭ溶液と混合したオリゴ溶液のみ）の相対蛍光単位は約５２００  ＲＦＵであり、ＰＥＩ２５ＫまたはＰＥＩ  ６００はそれぞれ１８２３と４３５０であった。これらの結果は、高いＤＮＡ結合親和性を有するＰＥＩ  ２５Ｋが蛍光に対して高い阻害（約６４％の阻害）を示す一方で、ＰＥＩ  ６００は通常非常に低いＤＮＡ結合親和性を示すので、ＰＥＩ  ６００は蛍光単位に対してそれほどでもない阻害を示した（１８％）。カチオン性脂質系ポリマーに関して、蛍光に対する阻害効率は約６５％〜７０％であり、ポリマーが高いＤＮＡ結合親和性を有することを示した。
【００５７】
３７℃で、ｏｐｔｉ  ＭＥＭ中、２４時間のインキュベーション後、元の試料に比べてほとんど蛍光シグナルの変化が見られなかったので、ＰＥＩ  ２５ＫとＰＥＩ６００の両方がＤＮＡ結合親和性の有意な変化を示さず、ＰＥＩ  ２５Ｋが分解性を有しないことを示した。しかし、３７℃で８時間インキュベートした後、蛍光に対する５Ａ、５Ｂおよび５Ｃの阻害効率は、ＰＥＩ  ６００よりも低い約１０％まで徐々に減少した。これらの結果はリポポリマーがｏｐｔｉ  ＭＥＭ中で分解性があることを示した。
【００５８】
（実施例１３）
【化８】
2008516011.tif 000009
【００５９】
ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）（４３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）をはかり、小さいバイアルに置き、２ｍｌのエタノールを加えた。ＰＥＨＡが完全に溶解した後、攪拌しながら、化合物６（ｎ×１００ｍｇ、ｎ×０．１９ｍｍｏｌ）をＰＥＨＡ溶液に迅速に加えた。反応混合物を２時間室温（２５℃）で攪拌した。次に、反応混合物をエーテル中の１ｍｌの４ＭのＨＣｌを加えることにより中和した。白色沈殿物をろ過し、エタノールで洗浄し、室温で減圧下に乾燥した。得られたポリマー７をＮＭＲとアガロースゲル電気泳動により特性付けた。
【００６０】
他の架橋された、分解性のカチオン性リポポリマーを、６に対するＰＥＨＡの比率を下記のように変えることにより同様な方法で調製した：  ７Ａ：ＰＥＨＡ／６＝１／１；７Ｂ：  ＰＥＨＡ／６＝２／１；７Ｃ：ＰＥＨＡ／６＝３／１；  ７Ｄ：ＰＥＨＡ／６＝４／１；  ７Ｅ：ＰＥＨＡ／６＝５／１；および７Ｆ：ＰＥＨＡ／６＝６／１。
【００６１】
（実施例１４）
細胞培養：  ＨＥＫ  ２９３細胞とＨｅＬａ  ７０５細胞を、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２および１００％湿度条件下に維持した。ＣＨＯ−ＡＡ８  ｌｕｃを、１０％ＦＢＳと抗生物質を含むＭＥＭ培地で培養し、他の条件は２９３細胞とＨｅＬａ  ７０５細胞と同じである。細胞は約２０時間の倍加時間を有し、密集を避けるために３〜４日間ごとに分割した。
【００６２】
プラスミドＤＮＡの調製：  ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入したｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドは、哺乳類細胞においてさらに明るい蛍光とさらに高い発現のために最適化された野生型ＧＦＰの赤方偏移変種をコードする。ＧＦＰタンパク質はＣＭＶの前初期プロモータ（ＰＣＭＶ  ＩＥ）により制御された。ｐＣＭＶ−ｌｕｃプラスミドを同様に構築した。プラスミドをＤＨ５α大腸菌で増幅し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより精製したところ、１．７よりも高いＡ２６０／Ａ２８０を有した。
【００６３】
ポリマー７のＤＮＡ結合：  ポリマー７とＤＮＡの一連の試料をそれぞれｏｐｔｉ  ＭＥＭに希釈し、次に攪拌しながら１０μｌのポリマー７溶液をＤＮＡ溶液（２０μｇ／ｍｌ）に加えた。ポリマー／ＤＮＡ比は３２：１、１６：１、８：１および１０：１であった。混合物を室温で１５分間インキュベートし、ポリマー／ＤＮＡ複合体を形成した。その後、５μｌのＤＮＡ負荷緩衝液を複合体に加え、１５μｌの混合物を各ウエルについて０．３％のアガロースゲルに加えた。試料を１００Ｖ、約３０分間の電気泳動に供し、ゲルをＵＶ光で可視化した。ＤＮＡ結合親和性の結果を図１０に示す。ほとんどの試料は低いＤＮＡ結合親和性を示した。たとえば、ポリマー／ＤＮＡ比が３２：１であっても、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅおよび７Ｆ／ＤＮＡ混合物のＤＮＡ電気泳動パターンは遊離ＤＮＡと同じであった（ポリマー量は０であった）。しかし、ポリマー／ＤＮＡ比が３２：１および１６：１であった場合、プラスミドは７Ａにより妨げられ、試料７ＡがＤＮＡ結合親和性を有することを示した。
【００６４】
（実施例１５）
インビトロ遺伝子トランスフェクション：  ２９３細胞を９６ウエル組織培養プレート（５×１０４細胞／ウエル）に塗布し、１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中で一晩インキュベートした。各ウエルに関して、異なる濃度の７．５μｌのリポポリマー７溶液のアリコートを、０．６μｇのｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドを含有する７．５μｌのＤＮＡ溶液に加え、完全に混合した。ＤＮＡとリポポリマー７混合物を１５分間、室温でインキュベートしてＤＮＡ−リポポリマー複合体を形成させた。複合体を各ウエルに加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＥＧＦＰ遺伝子トランスフェクション効率をＧＦＰシグナル分析により決定した。リポフェクタミンを、製造業者により提供されたプロトコールにしたがって陽性コントロールとして用いた。試料からのトランスフェクト細胞の緑の蛍光シグナルを、蛍光顕微鏡（オリンパス、フィルター５２０ｎｍ）下に観察した。細胞の写真を１０×対物レンズを用いて取った。トランスフェクト培養物中のＧＦＰシグナルを有する細胞の比率は最適なカチオン性ポリマー量の３領域の総計から決定した。
【００６５】
トランスフェクションの約２４時間後、７Ａトランスフェクト２９３細胞の約２８％がトランスフェクション効率を示した。その結果は、リポポリマー７Ａがトランスフェクション試薬であることを示した（図１１）。
【００６６】
（実施例１６）
アンチセンスオリゴ導入：  ノーザンカロライナ大学のＫｏｌｅ博士はアンチセンス導入の機能的アッセイのためにルシフェラーゼ７０５遺伝子システムを開発した。このシステムにおいて、７０５に変異を有するヒトβグロブリンをルシフェラーゼｃＤＮＡ間の配列に挿入した。このプラスミドを安定な遺伝子発現のためにＨｅＬａ細胞に導入し、この細胞系をＨｅＬａ  ｌｕｃ７０５と命名した。通常、細胞は誤ったルシフェラーゼタンパク質を発現するために低いルシフェラーゼ活性を示す。しかし、７０５配列に結合するアンチセンスオリゴは誤ったスプライシング部位をブロックし、生物学的活性を有するルシフェラーゼタンパク質を作る。ルシフェラーゼ７０５は現在アンチセンスオリゴ導入において機能的モデルとして用いられている；高いルシフェラーゼ活性は高いアンチセンス導入効率を示す。
【００６７】
ポリマー７試料のアンチセンスオリゴ導入効率をＬｕｃ  ７０５細胞系で評価した。オリゴ標的ｌｕｃ  ７０５の最終濃度は１．０μｍｏｌ／Ｌであり、ポリマーの濃度は（ルシフェラーゼ活性が測定された）トランスフェクションの約２４時間後で（ポリマー／ＤＮＡ比がトランスフェクション中１６：および８：１であったときのポリマーの量と同じである）３２０および１６０μｇ／ｍｌであった。
【００６８】
７０５細胞中のバックグランドルシフェラーゼ活性は約１．６×１０５ＲＬＵ／ｍｇタンパク質であった。７Ａにより細胞に導入されたアンチセンスオリゴのルシフェラーゼ活性は、非導入細胞の約５０倍まで大きく上昇した。リポフェクタミン２０００の導入効率は低く、非導入細胞の約１５倍であった。これらの結果は、脂質−ポリマー７Ａはリポフェクタミン２０００よりもさらに高いアンチセンスオリゴ導入効率を有することを示した（図１２）。
【００６９】
（実施例１７）
リポ−ポリマーのＳｉＲＮＡ導入効率をＣＨＯ−ＡＡ８−ｌｕｃ細胞系で測定した。ＣＨＯ−ＡＡ８  Ｌｕｃは、ルシフェラーゼ遺伝子発現がＤｏｘにより制御されたＴｅｔ−ｏｆｆ細胞系である。ルシフェラーゼ遺伝子発現はＤｏｘが細胞に加えられると活動停止し、Ｄｏｘが除去されたときに発現する。
【００７０】
ＳｉＲＮＡ導入研究において、標的遺伝子の存在するタンパク質は評価に影響を与えることがある。なぜなら、その半減期が長い場合、標的遺伝子がすでに活動停止しているにもかかわらずタンパク質が検出されることがあるからである。この場合に、ＣＨＯ−ＡＡ８  Ｌｕｃ細胞にはメリットがあった。ルシフェラーゼ遺伝子発現は、Ｄｏｘを加えることにより活動停止させてバックグランドタンパク質を減少させることができる。ＳｉＲＮＡ導入中、Ｄｏｘは培地を変えることにより除去することができ、ＳｉＲＮＡが細胞に続けて導入される場合、ルシフェラーゼ遺伝子が同時に発現し始め、ルシフェラーゼ発現レベルはＳｉＲＮＡにより抑制されうる。
【００７１】
ＣＨＯ  ＡＡ８  ｌｕｃをＤｏｘを有する９６ウエルプレートにまいた。１８〜２４時間後、ＳｉＲＮＡカセット／ポリマー７複合体が作られた。ポリマーの最終濃度は３２０および１６０μｇ／ｍｌであった（遺伝子トランスフェクションにおいて１６：１と８：１と同じ濃度）。ＳｉＲＮＡカセットの量は１５０ｎｇ／ｍｌであった。培地を変更し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＳｉＲＮＡ／ポリマー７複合体を細胞に加えた。細胞を３７℃で４８時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ活性が検出された。
【００７２】
７Ａおよびリポフェクタミン２０００によるＳｉＲＮＡカセット導入後、コントロール（ブランク）のルシフェラーゼ活性は１０７ＲＬＵ／ｍｇタンパク質であり、ルシフェラーゼ活性はそれぞれ２．４７および３．４９×１０６ＲＬＵ／ｍｇタンパク質まで大きく阻害された。それらの結果は７ＡがＳｉＲＮＡカセットを細胞に効率的に導入することができ、その導入効率はリポフェクタミンよりも高いことを示した（図１３）。
【００７３】
（実施例１８）
カチオン性リポポリマー７遺伝子キャリヤーの細胞毒性を、３−［４，５ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）を用いて哺乳類細胞にて評価した。上記方法による遺伝子トランスフェクションの４８時間後に、１０μｌのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ（シグマ）中５．０ｍｇ／ｍｌ）を各ウエルに加え、３７℃で３時間インキュベートした。培地を次に除去し、２００μｌのＤＭＳＯを各ウエルに加え、生細胞により作られたホルマザン結晶を溶解した。溶液の吸光度は５７０ｎｍで測定した。細胞生存度は次式を用いて計算した：生存度（％）＝｛Ａｂｓ５７０（試料）／Ａｂｓ５７０コントロール｝。その結果は、７Ａの細胞毒性が非常に低く、最適条件でのｓｉＲＮＡ導入後、９５％を超える細胞が生存した一方で、リポフェクタミン２０００によるｓｉＲＮＡ導入後で細胞生存度は約７５％であった。これらの結果は、７Ａが非常に低い細胞毒性を有することを示した（図１４）。
【００７４】
（実施例１９）
ポリマー７の生分解：  ポリマー７Ａをｏｐｔｉ  ＭＥＭにより最終濃度３２０μｌ／ｍｌまで希釈した。一連の試料を３７℃で４時間、８時間および２４時間インキュベートし、次に試料を、９６ウエルプレートでの２９３細胞シードでの遺伝子トランスフェクション研究のために取った。トランスフェクションは、上記のプロトコールにより実施した。ＧＦＰシグナルはトランスフェクションの２４時間後に観察された。
【００７５】
７ＡのＧＦＰ遺伝子トランスフェクション効率は約２５％であり、試料を４時間インキュベートした後にトランスフェクション効率の有意な変化はなかった。トランスフェクション効率は、試料を８時間インキュベートした後に大きく減少し、試料を２４時間インキュベートした後にはトランスフェクション効率はほとんど見られなかった。それらの結果は、７Ａが中性条件下で生分解性であることを示した（図１５）。
【００７６】
多様な省略、付加および修正を、本発明の範囲から離れることなく上記の組成物と方法に対して行なってもよく、そのようなすべての修正と変更が、添付の特許請求の範囲に示された本発明の範囲に含まれるものであることが理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、リポポリマー（５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ）およびリポフェクタミン２０００によるトランスフェクション後の２９３細胞での典型的なＧＦＰシグナルを示す。
【図２】図２は、リポポリマー（５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ）およびリポフェクタミン２０００によるトランスフェクション後の２０８Ｆ細胞での典型的なＧＦＰシグナルを示す。
【図３】図３は、リポポリマー（５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ）およびリポフェクタミン２０００（「リポ」）によるトランスフェクション後の２０８Ｆ細胞と２９３細胞での相対的な蛍光レベルのプロットを示す。
【図４】図４は、リポポリマー（５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ）およびリポフェクタミン２０００によるｓｉＲＮＡ導入後のＨＴ−ＧＦＰ細胞での典型的なＧＦＰシグナルを示す。
【図５】図５は、リポポリマー（５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ）およびリポフェクタミン２０００によるｓｉＲＮＡ導入後のＨｅＬａ−ＧＦＰ細胞での典型的なＧＦＰシグナルを示す。
【図６】図６は、リポポリマー（５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ）およびリポフェクタミン２０００（「リポ」）によるｓｉＲＮＡ導入後のＨＴ−ＧＦＰおよびＨｅＬａ  ＧＦＰ細胞の相対的な蛍光レベルのプロットを示す。
【図７】図７は、ｓｉＲＮＡ導入後のリポポリマー（５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ）およびリポフェクタミン２０００（「リポ」）の細胞生存分画のプロットを示す。
【図８】図８は、カチオン性リポポリマー（５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ）による異なるＳｉＲＮＡ導入後のＨＴ−ＧＦＰ遺伝子の相対的な蛍光レベルのプロットを示す。
【図９】図９は、遊離オリゴ溶液と比較したアンチセンスオリゴ／リポポリマー複合体の相対的な蛍光単位のプロットを示す。
【図１０】図１０は、ポリマー６のＤＮＡへの結合に関するゲル電気泳動の結果を示す。
【図１１】図１１は、７Ａおよびリポフェクタミン２０００による形質移入後の２９３細胞の典型的なＧＦＰシグナルを示す。
【図１２】図１２は、ポリマー７Ａおよびリポフェクタミン２０００によるアンチセンスオリゴ導入後のｌｕｃ  ７０５細胞におけるルシフェラーゼ活性のプロットを示す。
【図１３】図１３は、ポリマー７Ａおよびリポフェクタミン２０００仲介のＳｉＲＮＡ導入後のＣＨＯ−ＡＡ８  ｌｕｃにおけるルシフェラーゼ活性のプロットを示す。
【図１４】図１４は、７Ａとリポフェクタミンを用いるトランスフェクション後の細胞生存分画を示すプロットを示す。
【図１５】図１５は、多様な時間のｏｐｔｉ  ＭＥＭでのインキュベーション後の７ＡのＧＦＰトランスフェクション効率のプロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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