(57)【要約】  本発明は、変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分を見出すための、ＳＧＫタンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント、または、このようなタンパク質、フラグメントまたは誘導体のいずれか一種をコードする核酸の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分を見出すための、ＳＧＫタンパク質、その機能的な誘導体もしくはフラグメント、または、このようなタンパク質、フラグメントもしくは誘導体をコードする核酸の使用。
【請求項２】
変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分の同定方法であって、
ａ．ＳＧＫタンパク質、その機能的な誘導体またはフラグメントと、可能性のある活性成分とを接触させる工程；
ｂ．可能性のある活性成分の存在下でＳＧＫ活性を測定する工程；
ｃ．可能性のある活性成分の非存在下でＳＧＫ活性を測定する工程；
ｄ．ｂ）のＳＧＫ活性とｃ）のＳＧＫ活性とを比較する工程、
を含む、上記方法。
【請求項３】
変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分の同定方法であって、
ａ．少なくとも転写が可能な系中で、ＳＧＫタンパク質、その誘導体またはフラグメントをコードする核酸と、可能性のある活性成分とを接触させる工程；
ｂ．可能性のある活性成分の存在下で、ＳＧＫタンパク質、誘導体もしくはフラグメントの量、または、それらをコードするｍＲＮＡの量を測定する工程；
ｃ．可能性のある活性成分の非存在下で、ＳＧＫタンパク質、誘導体もしくはフラグメントの量、または、それらをコードするｍＲＮＡの量を測定する工程；
ｄ．ｂ）からのタンパク質またはｍＲＮＡの量と、ｃ）からのタンパク質またはｍＲＮＡの量を比較する工程、
を含む、上記方法。
【請求項４】
変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分の同定方法であって、
ａ．少なくとも翻訳が可能な系中で、ＳＧＫタンパク質、その機能的な誘導体もしくはフラグメント、または、それらをコードする核酸と、可能性のある活性成分とを接触させる工程；
ｂ．可能性のある活性成分の存在下で、ＳＧＫタンパク質、その機能的なフラグメントまたは誘導体の活性を測定する工程；
ｃ．可能性のある活性成分の非存在下で、ＳＧＫタンパク質、その機能的なフラグメントまたは誘導体の活性を測定する工程、
を含む、上記方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法に基づき活性成分を見出すための、ハイスループットスクリーニング。
【請求項６】
軟骨組織中のＳＧＫを検出することを含む、変性性の軟骨の変化の同定方法。
【請求項７】
請求項６に記載の変性性の軟骨の変化の同定方法であって、
ａ．調査するために単離された軟骨サンプルのＳＧＫタンパク質またはｍＲＮＡの含量を測定する工程；
ｂ．変性していない軟骨の単離されたサンプルのＳＧＫタンパク質またはｍＲＮＡの含量と比較する工程、
を含む、上記方法。
【請求項８】
ＳＧＫは、単離された分子として用いられる、請求項１に記載の使用、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法、または、請求項５に記載のハイスループットスクリーニング。
【請求項９】
ＳＧＫは、生化学的な分析または細胞レベルの分析で用いられる、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
分析は、生化学的な分析または細胞レベルの分析である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法、または、請求項５に記載のハイスループットスクリーニング。
【請求項１１】
ＳＧＫは、ヒトＳＧＫである、請求項１に記載の使用、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法、または、請求項５に記載のハイスループットスクリーニング。
【請求項１２】
血清／糖質コルチコイド調節キナーゼは、ＳＧＫ１、２または３であり、好ましくはＳＧＫ１である、請求項１１に記載の使用、方法、または、ハイスループットスクリーニング。
【請求項１３】
ＳＧＫ、または、そのフラグメントもしくは誘導体は、ポリヌクレオチドである、請求項１に記載の使用または請求項５に記載のハイスループットスクリーニング。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドは、以下の配列：
ａ．配列番号１、配列番号２または配列番号３；
ｂ．ストリンジェントな条件下でａ）に記載の配列の少なくとも１つとハイブリダイゼーションし、そしてＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードする配列；
ｃ．ａまたはｂに記載の配列のいずれか１つに関して遺伝子コードに基づき変化し、そしてＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードする配列；
ｄ．ＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードするａ）、ｂ）またはｃ）に記載の配列のいずれか１つのフラグメント、好ましくは配列番号７〜９に示される配列のいずれか１つを有するフラグメント；
ｅ．上記配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つを元にして、遺伝子コードの縮重に基づいていない、または、部分的に遺伝子コードの縮重に基づいていない１個またはそれ以上の塩基の置換によって作製され、そしてＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードする配列；
のいずれか１つを含むか、または、それらからなる、請求項１５に記載の使用またはハイスループットスクリーニング、または、請求項３もしくは４に記載の方法。
【請求項１５】
ＳＧＫまたはその機能的なフラグメントもしくは誘導体は、ポリペプチドである、請求項１に記載の使用または請求項５に記載のハイスループットスクリーニング。
【請求項１６】
ポリペプチドは、以下の配列:
ａ．配列番号１、配列番号２または配列番号３；
ｂ．ストリンジェントな条件下でａ）に記載の配列の少なくとも１つとハイブリダイゼーションし、そしてＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードする配列；
ｃ．ａまたはｂに記載の配列のいずれか１つに関して遺伝子コードに基づき変化し、そしてＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードする配列；
ｄ．ＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードするａ）、ｂ）またはｃ）に記載の配列のいずれか１つのフラグメント、好ましくは配列番号１０〜１２に示される配列のいずれか１つを有するフラグメント；
ｅ．上記配列  ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つを元にして、遺伝子コードの縮重に基づいていない、または、部分的に遺伝子コードの縮重に基づいていない１個またはそれ以上の塩基の置換によって作製され、そしてＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードする配列；
のいずれか１つを有するポリヌクレオチドによってコードされている、請求項１５に記載の使用またはハイスループットスクリーニング、または、請求項２または４に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドは、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６に示される配列を含む、または、それらからなる、請求項１５に記載の使用もしくはハイスループットスクリーニング、または、請求項２もしくは４に記載の方法。
【請求項１８】
機能的なフラグメントまたは誘導体は、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２に示される配列を含む、または、それらからなる、請求項１５に記載の使用またはハイスループットスクリーニング、または、請求項２または４に記載の方法。
【請求項１９】
ＳＧＫを検出するための手段を少なくとも１つ含む、変性性の軟骨の変化を診断するための試験キット。
【請求項２０】
手段は、抗体、プライマーセット、または、核酸プローブである、請求項１９に記載の試験キット。
【請求項２１】
診断方法を行うための使用説明書をさらに含む、請求項１９または２０に記載の試験キット。
【請求項２２】
変性性の軟骨の変化は、関節炎による障害、好ましくはリウマチ様関節炎、または、骨関節症、特に好ましくは骨関節症である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法、使用、ハイスループットスクリーニングまたは試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性成分を見出すための、血清／糖質コルチコイド調節キナーゼ（ＳＧＫ）の使用に関する。本発明のさらなる形態は、変性性の軟骨の変化を同定するための方法および試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血清および糖質コルチコイドにより誘導されるキナーゼＳＧＫ−１は、１９９３年に初めて、ラット乳癌細胞系における前初期遺伝子として説明された（Ｗｅｂｓｔｅｒ等，１９９３ａ；Ｗｅｂｓｔｅｒ等，１９９３ｂ）。これらの細胞において、糖質コルチコイド投与に対する初期応答として、ＳＧＫ−１遺伝子活性の誘導、その結果としてＳＧＫ−１のｍＲＮＡの量の有意な増加が観察される。さらなる研究において、ＳＧＫ−１およびその誘導能は、様々な細胞系と、正常な組織の細胞との両方で生じることが示された（Ｂｒｅｎｎａｎ等，２０００；Ｎａｒａｙ−Ｆｅｊｅｓ−Ｔｏｔｈ等，２０００；Ｃｏｏｐｅｒ等，２００１；Ｍｉｋｏｓｚ等，２００１）。ＳＧＫ−１は、セリン／スレオニンキナーゼのファミリーに属するものであり、このファミリーには、これまでに３種が判明しており、それぞれＳＧＫ−１、ＳＧＫ−２およびＳＧＫ−３と称される。ＳＧＫ−３はまた、ＳＧＫＬ（ＳＧＫ様）、および、ＣＩＳＫのような名前でも記載される。その触媒ドメインにおいて、これらの３種のアイソフォームは、タンパク質レベルで少なくとも８０％互いに相同である。
【０００３】
ＳＧＫ−１は、実際にはこれまで試験された全ての組織で発現されているが、発現されたｍＲＮＡの量は、調査した組織型の性質に応じて様々である（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｏｂａｙｎａ等，１９９９；Ｗａｌｄｅｇｇｅｒ等，１９９９；Ａｌｌｉｓｔｏｎ等，２０００；Ｋｌｉｎｇｅｌ等，２０００；Ｌａｎｇ等，２０００；Ｌｏｆｆｉｎｇ等，２００１；Ｆｉｌｌｏｎ等，２００２；Ｗａｒｎｔｇｅｓ等，２００２ａ；）。加えて、ＳＧＫ−１のｍＲＮＡは、典型的な胎児組織に見出される。マウスの胚形成中において、ＳＧＫ−１のｍＲＮＡは、胚の特定の組織（脱落膜、卵黄嚢、耳胞）で、発達した動力学的な変化を示し、肺芽、脳、心臓、肝臓、胸腺などにおける器官形成中で検出できる（Ｌｅｅ等，２００１）。ＳＧＫ−２は、上皮組織で最も多く発現されており、例えば腎臓、肝臓、膵臓、さらに脳の特定の領域においても発現されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，１９９９ｂ）。ＳＧＫ−３は、これまで試験された全ての組織で検出されており、特に成人の心臓と脾臓で見出されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，１９９９ｂ；Ｌｉｕ等，２０００）。
【０００４】
しかしながら、変性中の、または、変性した軟骨組織においてＳＧＫが発現しているという証拠は、未だ知られていない。
【０００５】
骨関節症（ＯＡ）は、最も一般的に起こる変性関節障害の１つであり、進行期において関節の機能を失わせる。この病気の慢性的な経過中に、基礎をなす骨組織に伸長する関節軟骨の破壊が起こるため、罹患した患者は関節置換術が必要になる。軟骨の破壊の他に、滑膜と靱帯にも病理学的な変化を観察することができる。この病気は、リウマチ様関節炎と同様に炎症性の経過を伴う場合があるが、リウマチ様関節炎とは異なる。
【０００６】
この障害の正確な原因は未だわかっていないが、代謝の変化、機械的応力、遺伝的欠陥または関節の傷害のような様々な要因が関与すると考えられている。
【０００７】
元々のきっかけに関わりなく、ＯＡに共通の病理学的特徴は、関節軟骨の分解である。ＯＡの病的状態の主要な特徴は、コラーゲンとプロテオグリカンのタンパク質分解的切断である。同時に、同化作用による修復メカニズム、細胞の再生・分化、または細胞死のような、一連のさらなる経過の全てが起こる。これらの経過の詳細な分子メカニズムは、それでもなお完全に理解されているとはいえない。
【０００８】
成人の軟骨の健全な機能は、高圧に対する耐性と、組織に必要な弾力性の両方を確保するそれらに特有の生物機械学的な特性に由来する。軟骨組織に特徴的な構成は、それに応じて決定される。その他ほとんどの組織とは異なり、軟骨細胞は、互いに直接接触しないで、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内でそれぞれ別々に埋め込まれている。このＥＣＭの高分子により、関節軟骨と関節がきちんと機能するようになる。
【０００９】
ＥＣＭの基本構造は、ＩＩ型、ＩＸ型およびＸＩ型のコラーゲン細線維によって形成されたネットワークからなる。そこにプロテオグリカン（主にアグリカン）が埋め込まれており、それにより、極めて高い浸透性の水と結合する能力が生じる。それによって生じた膨張圧が、コラーゲンの基本構造の特性と共に、軟骨特有の特性を保障する。
【００１０】
ＯＡの病因の主な特徴は、軟骨および関節軟骨組織のＥＣＭの損失である。それにより、罹患した関節の機能化が制限されるか、または、失われる。それに加えて、病気の経過中に、例えば痛みのような様々な症候的なパラメーターが出現する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来の骨関節症の治療方法は、ほとんどが症候的な病状の緩和に限定されている。薬物療法をベースとした軟骨変性の回復をもたらす原因治療は、現状の知見では不可能である。この理由のために、具体的には、骨関節症を予防および／または治療するための新規の活性成分が強く要望されている。加えて、可能であれば病気の初期段階で治療を開始できるように、関節軟骨における変性性の変化の、初期の信頼できる診断を可能にすることが必要である。従って、本発明の目的は、変性性の軟骨の変化に対する活性成分を同定するための新しい可能性を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的は、本発明によって、変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分を見出すために、ＳＧＫタンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント（さらに、このようなフラグメントの機能的な誘導体）、または、このようなタンパク質、機能的なフラグメントまたは誘導体をコードする核酸（およびその機能的な誘導体、例えば安定化された誘導体）を使用することによって達成される。
【００１３】
ヒトＳＧＫ遺伝子の配列は既知である。これらの遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースから、ＮＭ＿００５６２７、ＡＦ１５３６０９（ＳＧＫ−１）、ＡＦ１６９０３４、ＡＦ１８６４７０（ＳＧＫ−２）、ＮＭ＿０１３２５７、ＡＦ０８５２３３、ＡＦ１６９０３５（ＳＧＫ−３）という番号でダウンロードすることができる。同様に、そのタンパク質配列も、ＮＰ＿００５６１８（ＳＧＫ−１）、ＮＰ＿７３３７９４、ＮＰ＿０５７３６０（ＳＧＫ−２）、Ｑ９６ＢＲ１（ＳＧＫ−３）という番号でＮＣＢＩタンパク質データベースより入手可能である。ヒトＳＧＫ遺伝子は、様々な染色体に局在している。ＳＧＫ−１は、第６染色体（６ｑ２３）に位置し、ＳＧＫ−２は、第２０染色体（２０ｑ１３．２）に位置し、ＳＧＫ−３は、第８染色体（８ｑ１２．３−８ｑ１３．１）に位置する。ＮＣＢＩとは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のことである（郵便のあて先：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４，ＵＳＡ；ウェブアドレス：www.ncbi.nhm.nih.gov）。ＳＧＫ−１遺伝子のクローニングは、Ｗｅｂｓｔｅｒ等，１９９３ａ；Ｗａｌｄｅｇｇｅｒ等，１９９７；１９９８に具体的に説明されており；ＳＧＫ−２およびＳＧＫ−３のクローニングは、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，１９９９ｂによって初めて説明された。
【００１４】
その他のたくさんのキナーゼとは異なるＳＧＫの特徴の一つは、転写、分子の細胞局在性および酵素による活性化の、厳密な刺激依存性の調節に基づいている（Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ等，２００３）。
【００１５】
様々な刺激によってＳＧＫ−１の転写が活性化されることがわかっている。このような刺激としては、鉱質コルチコイド（Ｂｒｅｎｎａｎ等，２０００；Ｓｈｉｇａｅｖ等，２０００；Ｂｈａｒｇａｖａ等，２００１）、ゴナドトロピン（Ｒｉｃｈａｒｄｓ等，１９９５；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｏｂａｙｎａ等，２０００）、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3（Ａｋｕｔｓｕ等，２００１）、ｐ５３の変化、浸透圧変化、細胞体積の変化、および低張性の変化（Ｗａｌｄｅｇｇｅｒ等，１９９７；Ｋｌｉｎｇｅｌ等，２０００；Ｗａｌｄｅｇｇｅｒ等，２０００；Ｒｏｚａｎｓｋｙ等，２００２；Ｗａｒｎｔｇｅｓ等，２００２ａ）、ＧＭ−ＣＳＦやＴＮＦ−アルファのようなサイトカイン（Ｃｏｏｐｅｒ等，２００１）、または、ＴＧＦ−ベータ（Ｋｕｍａｒ等，１９９９；Ｗａｌｄｅｇｇｅｒ等，１９９９；Ｌａｎｇ等，２０００）が挙げられる。ＳＧＫの誘導は、さらなる成長依存性のシグナル伝達経路において、血清（Ｗｅｂｓｔｅｒ等，１９９３ａ）、インスリンおよびＩＧＦ−１（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，１９９９ａ；Ｐａｒｋ等，１９９９；Ｐｅｒｒｏｔｔｉ等，２００１）、ＦＳＨ（Ａｌｌｉｓｔｏｎ等，１９９７）、線維芽細胞増殖因子および血小板由来増殖因子（Ｄａｖｉｅｓ等，２０００）、Ｅｒｋシグナル伝達カスケードの活性化因子（Ｈａｙａｓｈｉ等，２００１）、ならびに、ＴＰＡ（Ｍｉｚｕｎｏ等，２００１）によって起こる。
【００１６】
また、ＳＧＫ−１の活性化に関与する病理学的な変化のいくつかは、例えば、脳に対する虚血性障害（Ｉｍａｉｚｕｍｉ等，１９９４）、ウイルス性肝炎（Ｆｉｌｌｏｎ等，２００２）、肺線維症（Ｗａｒｎｔｇｅｓ等，２００２ｂ）、または、心臓線維症（Ｆｕｎｄｅｒ  ２００１）においても観察されている。
【００１７】
しかしながら、変性関節障害の過程におけるＳＧＫの関連は、これまでに明らかになっていない。
【００１８】
原則として、ＳＧＫ−１の活性化は、細胞外の刺激によっては通常起こらない。従って、例えばヘパリン投与は、血管系の増殖中の平滑筋細胞においてＳＧＫ−１転写を阻害した後に行われる（Ｄｅｌｍｏｌｉｎｏ等，１９９７）。
【００１９】
ＳＧＫ−１は、それらが機能するような形態に変換するために、リン酸化による活性化を必要とする。これには、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）−３キナーゼ、ならびに、３−ホスホイノシチド依存性キナーゼＰＤＫ１およびＰＤＫ２が関与するシグナル伝達カスケードが介在する。
【００２０】
ＰＩ−３キナーゼシグナル伝達経路によるＳＧＫ−１の活性化は、インスリン、ＩＧＦおよび増殖因子に対する応答であることがわかっている。活性化は、２個のアミノ酸残基、すなわちこのタンパク質のＴループにおけるスレオニン２５６と、疎水性モチーフにおけるセリン４２２でリン酸化を受けることを必要とする。スレオニン２５６におけるリン酸化にはＰＤＫ１が介在し、セリン４２２のリン酸化は、まだ明らかになっていない推定のＰＤＫ２によって触媒されると言われている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，１９９９ａ；Ｐａｒｋ等，１９９９；Ｂｉｏｎｄｉ等，２００１）。
【００２１】
ＰＤＫ１による活性化は、スレオニン２５６およびセリン４２２のリン酸化部位の突然変異によって示される。スレオニン２５６のアラニンへの突然変異によって、リン酸化が８０〜９０％減少し、さらに、ＳＧＫ−１のＰＤＫ１−依存性の活性化が妨害される。スレオニン２５６とセリン４２２の両方がアラニンに突然変異した場合にも同じ作用が観察される。それに対して、セリン４２２のアスパラギン酸への突然変異では、リン酸化とＰＤＫ１による活性化が約６倍増加する（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，１９９９ａ）。
【００２２】
生理学的または病理学的な過程におけるＳＧＫの機能は、未だに明らかになっていない。ＳＧＫの機能については、今のところ、ＳＧＫ−１、２および３は、細胞膜のチャンネルに調節による作用を有することを示す一連の調査があるのみである。それによれば、上皮性Ｎａ+チャンネル（ＥＮａＣ）は、尿細管において鉱質コルチコイドによって調節されるＮａ+再吸収のための主要な輸送体であり、ＳＧＫ−１、ＳＧＫ−２およびＳＧＫ−３の標的分子であることが示されている（Ａｌｖａｒｅｚ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｏｓａ等，１９９９；Ｂoｈｍｅｒ等，２０００；Ｗａｇｎｅｒ等，２０００ａ；Ｗａｎｇ等，２００１；Ｆａｌｅｔｔｉ等，２００２；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ等，２００３）。ＳＧＫとＥＮａＣとの相互作用は、直接のリン酸化によって起こるのではなく（Ｌａｎｇ等，２０００）、ＳＧＫによるリン酸化の結果としての、ユビキチンリガーゼＮｅｄｄ４−２の不活性化によって起こる（Ｄｅｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ等，２００１；Ｓｎｙｄｅｒ等，２００２）。それによって、細胞膜中のＥＮａＣの量と滞留時間は増加する（Ｓｔａｕｂ等，１９９７；Ａｌｖａｒｅｚ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｏｓａ等，１９９９；Ｗａｇｎｅｒ等，２０００ａ）。加えて、多数の実験において、ＲＯＭＫ１はＳＧＫの標的分子であることが示されている。しかしながら、ＲＯＭＫ１は、ＳＧＫによって直接調節されないが、この目的のために、媒介分子として「Ｎａ+／Ｈ+交換制御因子２」（ＮＨＥＲＦ２）を必要とする（Ｓｈｅｎｏｌｉｋａｒ等，２００１；Ｙｕｎ等，２００３）。同じことが、ＳＧＫのさらなる標的分子であるＮａ+／Ｈ+輸送体ＮＨＥ３にも当てはまる（Ｙｕｎ等，２００２）。加えて、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた実験で、ＳＧＫは、Ｋｖ１.３チャンネル依存性のＫ+電流に影響を与えることが示されている（Ｇａｍｐｅｒ等，２００２ｂ；Ｗａｒｎｔｇｅｓ等，２００２ａ）。加えて、ＳＧＫは、アミノ酸輸送体４２Ｆ／ＬＡＴおよびＳＮ１を調節することが報告されている（Ｗａｇｎｅｒ等，２０００ｂ；Ｂoｈｍｅｒ等，２００３ａ，ｂ）。
【００２３】
しかしながら、これらの発見にもかかわらず、これまで、生理学的または病理学的な過程におけるＳＧＫの機能の実態は、ほんの部分的にしか再現ができていない。
【００２４】
ＳＧＫのフラグメントとは、１個またはそれ以上のアミノ酸の欠失によって、天然に存在するＳＧＫ、好ましくはヒトＳＧＫ、具体的に好ましくは配列番号１、２または３に示される配列のいずれか１つに記載のＳＧＫの末端またはその内部とは異なっているポリペプチドまたはオリゴペプチド（あるいは、それらをコードするポリもしくはオリゴヌクレオチド）である。機能的なフラグメントの好ましい例は、ＳＧＫキナーゼドメインを含むか、または、それらからなる（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，１９９９ａを参照）。この点について具体的に好ましくは、配列番号７〜１２で示される配列を含むフラグメント、特にそれらからなるフラグメントである。ＳＧＫの誘導体とは、少なくとも１個のアミノ酸の置換、および／または、少なくとも１個のアミノ酸の付加、および／または、例えばビオチン化、リン酸化などの少なくとも１個のアミノ酸の化学修飾によって、天然に存在するＳＧＫタンパク質、好ましくはヒトＳＧＫ、具体的には配列番号１、２または３に示される配列のいずれか１つに記載のＳＧＫとは異なっているＳＧＫの機能を有するポリペプチドまたはオリゴペプチドである。
【００２５】
ＳＧＫの機能的なフラグメントまたは誘導体とは、少なくとも１種のＳＧＫの機能を有するポリもしくはオリゴペプチド、または、それらをコードするポリもしくはオリゴヌクレオチドである。様々なＳＧＫの機能は、以下で説明されている：例えば細胞体積の調節（Ｆｉｌｌｏｎ等，２００１）、上皮性Ｎａチャンネル（ＥｎａＣ）の活性化、（Ｄｅｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ等，２００１）；Ｎａ+輸送の活性化（Ｒｏｚａｎｓｋｙ等，２００２、または、ＬａｎｇおよびＣｏｈｅｎ，２００１）、または、アミノ酸輸送の活性化（Ｗａｇｎｅｒ等，２０００）、または、ＫＣＮＥ１−依存性のＫ+の流動の調節；ＳＧＫのキナーゼ活性、例えばユビキチンリガーゼＰのリン酸化、または、セリン４４４および／またはセリン３３８におけるＮｅｄｄ４−２のリン酸化（Ｓｙｎｄｅｒ等，２００２）；自己リン酸化能力、または、所定のペプチドをリン酸化する能力（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，１９９９ａを参照）。所定のタンパク質（例えば上述したもののうち１種）と相互作用する能力も同様に、ＳＧＫの機能に含まれる。この点について具体的に適切なのは、Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，１９９９ａを参照）、具体的には以下の配列：ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧを含む、または、それらからなるオリゴまたはポリペプチドにおいて、ＳｅｒおよびＴｈｒ残基をリン酸化するＳＧＫの能力である。さらに、全てのＳＧＫサブタイプに共通の機能のうち少なくとも一種（例えば、Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフ、または、配列ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧで示されるペプチドにおけるＳｅｒおよびＴｈｒ残基をリン酸化するＳＧＫの能力）を有する特定のＳＧＫサブタイプのフラグメントまたは誘導体も考えられる。好ましくは、これらは、それぞれのサブタイプに特異的な機能を有する（例えば、異なる配列からなる特定の合成ペプチドのリン酸化において活性が異なること、例えばＫｏｂａｙａｓｈｉ等，１９９９ａを参照）。
【００２６】
タンパク質活性を見出すための試験方法は、当業者には十分に周知である。従って、従来の方法によって、例えばリン酸化活性、特定の標的タンパク質、または、それらのフラグメントとの相互作用、または、特定のイオンチャンネルおよび輸送体の活性を調節するＳＧＫの能力（これについては、以下も参照）を決定することが可能である。これを行うために、適切な実施態様において、ＳＧＫは単離された分子として用いられる。
【００２７】
本発明によれば、ポリペプチド／タンパク質／ポリヌクレオチド／核酸、および、それらのフラグメントおよび誘導体に関して、用語「単離された」とは、これらの分子が自然源から精製されていること、または、組換えによって製造され、精製されていることのいずれかを意味する（ここにおいて、用語「精製した」は、「部分的に精製した」も含む）。
【００２８】
単離されたＳＧＫ分子の製造は、当業者には十分に周知である。従って、既知のゲノム、または、コーディングポリヌクレオチド配列に基づき、望ましい長さのポリヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅し、続いて宿主細胞中でクローニングすることにより増やすことが可能である（これについては、具体的には以下で詳述する標準的な文献を参照）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、２つの既知の配列を両端に持つポリヌクレオチドセグメントを特異的に増幅することができるインビトロの技術である。この点について、増幅しようとする配列から５’側の位置にある配列が既知であれば十分である。この場合、従来技術（例えば制限消化など）を用いて、増幅しようとする部分のフラグメントを生成し、その３’末端に既知の配列を有するＤＮＡ分子（いわゆるリンカー）をライゲーションさせ、増幅しようとする配列が最終的に２つの既知の配列を両端にもつようにすることができる（いわゆるリンカー介在ＰＣＲ，ｌｍＰＣＲ）。
【００２９】
増幅のためには、増幅しようとするポリヌクレオチドの両端に相当し、ＤＮＡまたはＲＮＡテンプレートの配列領域に相補的な短い一本鎖ＤＮＡ分子（プライマー）が用いられる。既定の反応条件下で、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で一本鎖にそってプライマーは伸張し、ポリメラーゼ（ＤＮＡをテンプレートとして認識しＤＮＡ鎖を生産するＤＮＡポリメラーゼ、または、ＲＮＡをテンプレートとして認識し、ＤＮＡ鎖を生産する逆転写酵素）と呼ばれる特定の酵素によってマトリックスを変性させることによって、テンプレートの配列に相補的な配列を有する新しいＤＮＡ鎖が生じる。定期的に繰り返される特定の温度の順番を選択することによって、新たに形成されたポリヌクレオチド鎖の変性、そこへのプライマーのハイブリダイゼーション、最終的には新しい伸長反応の発生などを確実にする。新しい酵素を続いて添加しなくても変性に必要な温度を用いることができるようにするために、熱安定性のポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ（サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ）を用いることが適切である。適切なポリメラーゼの選択は使用目的によるが、当業者には既知である。従って、クローニング目的でＰＣＲが用いられる場合例えば、エラー修正（いわゆる校正）の能力を有するポリメラーゼを選択することが有利である。
【００３０】
典型的なＰＣＲ混合物は、ポリヌクレオチドテンプレート以外に、２種の適切なプライマー（例えば０.２〜２μｍの濃度）、さらにｄＮＴＰ（例えばｄＮＴＰあたり２００μｍの濃度）、さらにＭｇＣｌ2（１〜２ｍＭの濃度）、および、例えばＴａｑのような熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ（１〜１０ユニット）、および、例えば、ポリヌクレオチド（すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ）テンプレート（０.０１〜２０ｎｇ）を含む。
【００３１】
プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、従来のプロトコールに従って化学合成で作製してもよい。このような合成は、具体的にはＭＷＧバイオテク（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような商業的な供給元によって行われることがより一般的である。例えばプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの供給元から、多種多様の源に由来するｃＤＮＡが市販されている。ＰＣＲを行うのに適切な緩衝液および酵素も同様に、当業者にとっては既知であり、市販もされている。ポリヌクレオチド配列を単離状態で作製するさらなる方法は、既知の方法で望ましい配列をクローニングし、続いて、適切な生物、好ましくは例えば適切な細菌または酵母株のような単細胞生物中でそれらを発現させ、続いて発現されたポリヌクレオチドを（少なくとも部分的に）精製することからなる。
【００３２】
ＰＣＲ反応は、例えば、クローニングのためのポリヌクレオチドフラグメントの製造に適している。この場合、その５’部分に制限エンドヌクレアーゼの認識配列（いわゆる制限切断部位）を有するプライマーを少なくとも１種使用することが有利である。
【００３３】
このような切断部位を有することが両方のプライマーにとって有利であり、２つの切断部位は、同一のものを選択してもよいし、または異なっていてもよい。一般的な制限酵素としては、例えば：ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）、Ｃｌａｌ（ＡＴＣＧＡＴ）、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）、ＥｃｏＲＶ（ＧＡＴＡＴＣ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）、ＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）、Ｓａｌｌ（ＧＴＣＧＡＣ）、ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）などが挙げられる。適切な制限酵素と適切な反応条件の選択は、当業者には十分に周知である。クローニングのために、同様にクローニングしようとするｃＤＮＡフラグメントのプライマー配列中に適切な認識部位を有するベクターのＤＮＡを、適切な制限エンドヌクレアーゼによって切断する（「消化する」）。例えばＰＣＲによって生成したフラグメントを、同じ制限酵素で単離し処理することによって、「消化した」ベクターと適合するようにする。その後、ベクターを精製し、フラグメントを処理した後に、適切な反応条件（これらは当業者既知である）下でＤＮＡリガーゼにより結合させる。
【００３４】
ベクターとは、例えばプラスミド、バクテリオファージまたはコスミドのような環状または直鎖状ＤＮＡ分子であり、それらの作用によって、ＤＮＡフラグメントは適切な生物中で特異的に増幅される（いわゆるクローニング）。適切な生物は、ほとんどが、例えば細菌または酵母のような高い増殖速度を有する単細胞生物であるが、例えば多種多様の生物から作製した細胞系（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＳＦ９細胞など）のような、多細胞性の集合体由来の細胞も可能である。適切なベクターは、当業者にはよく知られており、これらは生物工学系の供給元から市販されており、例えば、ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、およびその他多数が挙げられる。
【００３５】
単離されたポリペプチドの組換え生産もまた、クローニングしたポリヌクレオチドに基づき、適切な特異的なベクターによって可能であり、これは、同様に従来技術において既知である。これは、細菌（好ましくはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株）、または、真核生物宿主（例えばＳＦ９細胞など）のような適切な宿主細胞中で発現させることによって起こすことができ、いずれの場合も、ポリヌクレオチドは特異的な発現ベクターにクローニングされ、次に適切な細胞に挿入される。形質転換およびトランスフェクションに適した方法は、同様に当業者にとって既知であり（例えば添付の標準的な文献を参照）、細胞培養およびタンパク質発現の誘導の条件も同様である。単離されたポリペプチドの組換え生産に関するさらなる可能性は、インビトロでの翻訳である。この目的のためにも同様に、ポリヌクレオチドは適切なベクターにクローニングされ、次に適切な緩衝液および細胞抽出物（例えば網状赤血球の溶解産物）中でインビトロで発現される。ベクター、さらに必要な試薬および条件も同様に、十分に周知であり、市販されている（例えばインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）より）。
【００３６】
従来技術において、３種のＳＧＫサブタイプ（ＳＧＫ１〜３）が既知である。従って、これらの３種のファミリーの少なくとも１種の使用、ただし、好ましくはＳＧＫ１の使用が、様々な本発明の形態に関して好ましく、例えばこれらの３種のファミリーの少なくとも１種の発現、特にＳＧＫ１の発現を本発明に従って検出することに関して好ましい。
【００３７】
本発明は、健康な軟骨組織、および、変性した／変性中の軟骨組織由来の細胞のトータルＲＮＡサンプルを比較遺伝子発現解析したところ、驚くべきことに、血清／糖質コルチコイド調節キナーゼ−１（ＳＧＫ−１）は、変性した／変性している変形性関節症の軟骨では発現されるが、一方で健康な関節軟骨組織では検出不可能であることを示す発明者等の結果に基づく。軟骨組織におけるこのような分子の検出は、本発明において初めて述べられている。加えて、発明者等によるさらなる実験により、変性性の軟骨の変化の進行におけるＳＧＫの原因となる関連の第一の証拠が示された。
【００３８】
さらに軟骨組織におけるＳＧＫ−１の発現は、全く新しい発見であり、なぜなら、従来技術において、この組織におけるＳＧＫの役割、または、軟骨細胞における病理学的なパラメーターや進行中に特有のパラメーター下でのＳＧＫの発現の起こりうる調節メカニズムに関する公開された調査は報告されていないためである。初めて、発明者等の研究に基づき、ＳＧＫは、例えばリウマチ様関節炎または骨関節症の構造において、ただし具体的には骨関節症の構造において、軟骨の病的状態に特異的な関連を有することから、軟骨を分解するプロセスを誘導する主要な分子の代表であると結論づけることができる。
【００３９】
ＳＧＫファミリー間の相同性は大きいため、これはＳＧＫ−２とＳＧＫ−３にも同様に当てはまると考えることができる。
【００４０】
これらの関連性を同定することにより、既知の試験方法で、ＳＧＫの活性、および／または、ＳＧＫのレベルに対する可能性のある活性成分の作用を見出すことによって、変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分を見出すことが初めて可能になる。さらに、変性関節障害の進行におけるＳＧＫの原因となる関連は、軟骨の正常な細胞生理学を復元するための調節メカニズムを標的とする治療的な活性成分を特定して検索することを可能にする。
【００４１】
従って、本発明のさらなる形態は、変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分の同定方法に関し、本方法は：
ａ．ＳＧＫタンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメントと、可能性のある活性成分とを接触させる工程；
ｂ．可能性のある活性成分の存在下でＳＧＫ活性を測定する工程；
ｃ．可能性のある活性成分の非存在下でＳＧＫ活性を測定する工程；
ｄ．ｂ）のＳＧＫ活性とｃ）のＳＧＫ活性とを比較する工程、好ましくは、可能性のある活性成分の存在下で、ＳＧＫ（タンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント）の活性が、その非存在下よりも低いかどうかを決定する工程、
を含み、従って、活性成分は、好ましくは、ＳＧＫの活性を阻害するそれらの能力に基づき判別される。
【００４２】
本発明のさらなる形態は、変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分の同定方法に関し、本方法は：
ａ）少なくとも転写が可能な系中で、ＳＧＫタンパク質、機能的な誘導体、または、それらをコードする核酸のフラグメントを含むサンプルと、可能性のある活性成分とを接触させる工程；
ｂ）可能性のある活性成分の存在下で、ＳＧＫタンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント、または、それらをコードするｍＲＮＡの量を測定する工程；
ｃ）可能性のある活性成分の非存在下でＳＧＫタンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント、または、それらをコードするｍＲＮＡの量を測定する工程；
ｄ）ｂ）からのタンパク質またはｍＲＮＡの量と、ｃ）からのタンパク質またはｍＲＮＡの量とを比較する工程、好ましくは、可能性のある活性成分の存在下で、ＳＧＫ（タンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント、または、それらをコードするｍＲＮＡ）の量が、その非存在下よりも低いかどうかを決定する工程、
を含み、従って、活性成分は、好ましくは、利用可能なＳＧＫの量を減少させるそれらの能力に基づき判別される。
【００４３】
本発明はさらに、変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分の同定方法に関し、本方法は：
ａ）少なくとも翻訳が可能な系中で、ＳＧＫタンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント、または、それらをコードする核酸を含むサンプルと、可能性のある活性成分とを接触させる工程；
ｂ）可能性のある活性成分の存在下で、ＳＧＫタンパク質、フラグメントまたは誘導体の活性を測定する工程；
ｃ）可能性のある活性成分の非存在下で、ＳＧＫタンパク質、フラグメントまたは誘導体の活性を測定する工程、好ましくは、可能性のある活性成分の存在下で、ＳＧＫ（タンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント、または、それらをコードするｍＲＮＡ）の活性または量が、その非存在下よりも低いかどうかを決定する工程、
を含み、従って、活性成分は、好ましくは、ＳＧＫの活性を阻害するそれらの能力、または、利用可能なＳＧＫの量を減少させるそれらの能力に基づき判別される。
【００４４】
可能性のある活性成分の存在下で、例えば合成ペプチドまたはその他のＳＧＫの基質をリン酸化する能力（これには自己リン酸化も含む）を決定することによって、ＳＧＫ活性が、その非存在下よりも低いかどうかを決定することが可能である。この点について、配列モチーフＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、好ましくはモチーフＲＰＲＴＳＳ、具体的にはモチーフＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧを含む、または、それらからなるポリまたはオリゴペプチドを使用することが好ましい。さらなる可能性は、ＳＧＫの所定のイオンチャンネルの活性を調節する能力を決定することである；これは、例えば、細胞内イオン濃度によって、または当業者にとって既知のその他の方法によって測定することができる。
【００４５】
この点について、ＳＧＫ活性とは、ＳＧＫのあらゆる機能を意味する（上記も参照）。ＳＧＫ活性は、可能性のある活性成分によって、タンパク質活性に影響を及ぼすあらゆるレベルで調節される可能性がある（例えば、キナーゼドメインとの直接的な相互作用によって調節が可能であり、それにより、翻訳後修飾に影響を与えることができ、これは、タンパク質活性に影響を与える可能性があり、さらに、例えばＰＩ３ＫのようなＳＧＫの天然の阻害剤または活性化因子によるタンパク質フォールディングまたは活性化に影響を与えることができる）。ＳＧＫの量は、ある系における、例えば細胞または生化学的な混合物中での、ある特定の時点における活性なＳＧＫのバランスに関連している。その上、ＳＧＫの量は、ＳＧＫ発現またはＳＧＫ分解のあらゆるレベル（転写、例えば転写プロセシング、および、細胞核からの排除、または、翻訳または翻訳後修飾のレベルであり、これらは、タンパク質の安定性、すなわち利用可能な活性なＳＧＫのバランスに影響を与える可能性がある）で調節できる。
【００４６】
その上、ＳＧＫ活性および／またはＳＧＫの量を調節する、好ましくは減少させる能力を有する活性成分は、軟骨細胞の変性性の状態への変化においてＳＧＫが機能的に関係しているために、変性性の軟骨の変化の進行を阻害する、好ましくは抑制するはずであり、および／または、既存の軟骨の変化の作用を減少させる、好ましくは止めるはずである。
【００４７】
当業界の現状において、可能性のある活性成分の活性パラメーターとして、体内の特定の標的分子（ここではＳＧＫ）（いわゆる標的であり、通常はタンパク質または核酸）の活性または濃度または量を測定する適切な分析方法またはシステム（いわゆる分析）が既知である。このようなものとして、例えば、例えばインビトロでの分析が挙げられ、これは、単離された、または部分的に単離された成分を混合して反応混合物を作製して行われる生化学的分析を意味し、それによって、可能性のある活性成分の活性を測定することができる。従って、さらなる可能性は、細胞を用いた試験システム（分析）であり、これは、細胞環境における標的タンパク質（ここではＳＧＫ）の活性、および、このような標的分子の活性に対して起こり得る活性成分の活性を測定することができる。
【００４８】
この点について、分析とは、生物学的なプロセスをモニターすることが可能なあらゆるタイプの分析方法である。これには、慣習的には、分子のプロセス、および、シグナル伝達カスケード（これは、生理学的な代謝経路および制御メカニズムの一部を意味する）を必要とするが、病的状態は細胞または生化学的システムで模擬される。続いて、活性成分の薬理学的活性は、これらの経路およびメカニズムに介在するその能力に基づいて決定することができる。
【００４９】
活性成分の発見に使用するため、特に活性成分のハイスループットスクリーニングに使用するため、分析は再現可能でなければならなず、好ましくは、拡張性があり、かつ強固な（外来の影響に対する感度が低いことを意味する）ものである。分析は、好ましくは、化学物質を、標的分子の活性に影響を与えるそれらの能力に関してハイスループットスクリーニングすることに適しているべきである。この点について、分析のタイプは、特に、用いられる標的分子の性質（例えば、生化学的に基本的な分子、例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチドの正確なタイプまたは性質）、および、読み出し、すなわちそれによって標的分子の活性が決定されるパラメーターに依存する。当業界の現状において様々な分析タイプが既知であり、ほとんどの場合、産業的な供給元からも市販されている。
【００５０】
２種の結合パートナーの相互作用の測定に適した分析としては、例えば、放射線同位体または蛍光分析、例えば蛍光偏光分析が挙げられ、例えば、パンベラ（Ｐａｎｖｅｒａ）、パーキン・エルマー・ライフサイエンス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ＮＥＮTM，ＬＡＮＣＥTM）、または、パッカード・バイオサイエンス（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）（ＨＴＲＦ；アルファスクリーン（ＡＬＰＨＡｓｃｒｅｅｎTM））から市販されているものである。上述の分析は、標識された成分と、標識されていない成分との相互作用（例えば、標識されたタンパク質と、標識されていないリガンドとの相互作用）の測定に適している。
【００５１】
さらなる分析の例としては、細胞分析が挙げられ、この場合、細胞系が、安定して（誘導的または構成的に、染色体またはエピソームによって）、または、一時的に、望ましい組換えタンパク質を発現する。このような分析としては、例えばレポーター遺伝子分析が挙げられ、この場合、特定のプロモーターの調節、または、シグナル伝達経路もしくはシグナル伝達カスケードの構成要素の調節が、関連するプロモーターの制御下で発現が行われるレポーター酵素の活性によって測定される。このタイプの分析のためには、それ自身が調査を受ける、または、調査しようとするシグナル伝達カスケードによって調節される既定のプロモーターの制御下でレポーター遺伝子を発現する組換え細胞系を生成することが必要である。当業者にとって、適切なレポーター酵素は一般的に既知であり、例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ（いずれも、例えばパッカード・リージェンツ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）から市販されている）、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。当業者にとって、適切な細胞系の選択は既知であり、特に分析の標的または読み出しに応じて選択される。これらは、通常は、培養してトランスフェクションすることが簡単な細胞系であり、例えばＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、または、ＮＩＨ３Ｔ３細胞である。
【００５２】
細胞内イオン濃度を測定する分析としては、例えば、いわゆるＦＬＩＰＲTM（蛍光イメージングプレートリーダー、モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）から市販）分析が挙げられ、この分析において、冷却ＣＣＤカメラと組み合わせたアルゴンレーザー光源によって、３８４ウェルプレートで培養された細胞（例えば、特定のイオンチャンネルを、組換えによって、または、自然に発現する細胞）中の、異なる混合物の細胞内イオン濃度（例えばＮａ+またはＣａ2+など）を同時に測定することを可能にする。このようなＦＬＩＰＲTM分析によって、例えば、特定の蛍光色素、例えばフルオ−３（Ｆｌｕｏ−３）、フルオ−４によって細胞内カルシウムレベルを測定すること、ＢＣＥＣＦ、ＢＣＰＣＦ、または、特殊なＦＬＩＰＲTM分析キットを用いることによって細胞内ｐＨを測定すること、例えばＤｉＢＡＣ、または、特殊なＦＬＩＰＲTM分析キットを用いることによって膜電位における変化を測定すること、または、膜分極における変化を測定することが可能である。亜鉛、ナトリウムなどのその他のイオンの濃度を決定するのに適している色素もあり、これらも同様に当業界の現状において既知であり、市販されている。
【００５３】
特定のイオンチャンネルの活性を測定するのに適した分析および色素（これらは、例えば細胞内イオン濃度を制御し、従ってその活性は特定のイオンの細胞内濃度に基づき決定することができる）の例は、膜電位における変化に高感度で応答するものであり、例えばＤｉＢＡＣ、または、モレキュラーデバイス製のＦＬＩＰＲTM分析のための膜電位分析キット、ＦＬＩＰＲTM技術を用いたＪＣ−１色素によるミトコンドリアの膜分極の測定；イオン感受性の色素、例えばフルオ−３、フルオ−４、または、モレキュラーデバイス製の、細胞内イオン濃度を決定するためのＦＬＩＰＲTM技術を用いたカルシウム分析キット；細胞内ナトリウム濃度を決定するための、ナトリウム感受性の色素、例えばモレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）製の色素；細胞内カルシウム濃度を決定するための、例えばパッチクランプ法、または、原子吸着の分光分析によるルビジウムイオン流出測定に基づく分析などが挙げられる。さらに、細胞中の特定の変化および状態を測定および決定するための自動装置やロボットが当業者にとって既知であり、例えば、アキュメン・バイオサイエンス（Ａｃｕｍｅｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）製のアキュメン（ＡｃｕｍｅｎTM）検出器、蛍光に基づくレーザースキャニング読み取り装置（これは、適切に標識された物体の分布を三次元で再構築することができる）が挙げられる。
【００５４】
タンパク質のリン酸化またはキナーゼ活性の測定に適した例は、蛍光偏光法、例えばパンベラ（Ｐａｎｖｅｒａ）から市販されているもの、ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ、シス・バイオ（Ｃｉｓ  Ｂｉｏ））、または、ＬＡＮＣＥTM分析（パーキン・エルマー・ライフサイエンス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））、または、増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ法（パッカード・バイオサイエンス製のアルファスクリーン（ＡＬＰＨＡｓｃｒｅｅｎTM））である。
【００５５】
その他の分析のタイプおよびその他の読み出しのタイプも同様に当業者にとっては十分に周知である。
【００５６】
本発明のさらなる形態は、上述の方法のいずれか１つに基づいて活性成分を見出すためのハイスループットスクリーニングに関する。ハイスループットスクリーニングとは、本発明に関して、極めて小さいスケールで、例えば９６、３８６または１５３６ウェルプレートで、または、数ミリリットルから数ナノリットルの範囲に至るほどの少量の混合物で行うことによって、多数の混合物、例えば５０００００種またはそれ以上を極めて短時間で解析できる方法を意味する。
【００５７】
上述の本発明の使用および方法、および、上述のハイスループットスクリーニングは、変性性の軟骨の変化を治療および／または予防するための活性成分を見出すのに役に立つ。これらは特に、このような変性性のプロセスを惹起し進行させるＳＧＫの能力を阻害することができる活性成分を見出すのに役に立つ。様々な本発明の形態に関して、阻害とは、ＳＧＫファミリーの少なくとも１つの機能、好ましくはＳＧＫ１の少なくとも１つの機能を阻害するのに適していることを意味する。このような阻害は、多種多様のメカニズムから得ることが可能であり、例えば、細胞のＳＧＫレベルを低くすること（例えば、転写および／または翻訳を減少させることによって、タンパク質またはｍＲＮＡの安定性を低くすることなど）、ＳＧＫの酵素活性を阻害すること、または、上流または下流のシグナル伝達経路に負の影響を与えることによってなされる。
【００５８】
ここにおいて、細胞のＳＧＫレベルを低くすること、または、酵素活性を阻害することが好ましい。
【００５９】
加えて、本発明は、進行中の変性性の軟骨の変化や、既存の変性性の軟骨の変化の同定方法に関し、本方法は、軟骨組織中のＳＧＫを検出することを含む。
【００６０】
この点について、ＳＧＫの検出は、当業者にとって既知の方法によって行われる。従って、例えば、ＳＧＫタンパク質またはＲＮＡの免疫組織化学的な検出（例えば、組織サンプルの組織切片を免疫組織化学的に染色すること、免疫ブロット、エライザ（Ｅｌｉｓａ）またはタンパク質マイクロアレイ）に基づく、または、ノーザンブロッティング、定量ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーションまたはＤＮＡマイクロアレイなどでＳＧＫのＲＮＡを検出することによる、変性した、または、変性中の軟骨におけるＳＧＫの検出のような適切な方法によって、既存の、または、進行中の軟骨変性を同定するために、軟骨組織中のＳＧＫの存在を利用することが可能である。さらなる適切なＳＧＫ発現検出方法が、当業者にとって既知である。組織サンプル、例えば軟骨、または薄く削られた軟骨細胞を含む滑液を採取するのに適した技術、および、様々な分析方法に応じたそれらの加工も同様に、当業者にとって十分に周知である。
【００６１】
ＳＧＫファミリー、または、単一のＳＧＫファミリーを検出する適切な抗体は、市販されており（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ヨーロッパ・バイオプロダクツ社（Ｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ））、または、標準的なプロトコール（例えば、以下で指定された標準的な文献を参照）によって、ＳＧＫペプチド、例えば配列番号４、５、６または配列番号７〜１２で示される配列を有するポリペプチドを用いてウサギで生産することができる。それらの生産は、一般的には、例えばバイオトレンド（ＢｉｏＴｒｅｎｄ，コローニュ，ドイツ）のような様々な供給元が商業的に受注している。この点について、ＳＧＫファミリーのいずれか１種に特異的な抗血清または抗体は、好ましくは、例えば、個々のファミリーの１００個、好ましくは８０個またはそれ未満のＣ末端アミノ酸からなるＣ末端の非触媒領域のポリペプチドフラグメント、または、具体的に好ましくは、ＳＧＫタンパク質の１００個、好ましくは８５個のＮ末端アミノ酸から選択されるポリペプチドフラグメント、具体的には、個々のＳＧＫファミリーの２０〜１００個、５０〜９０個、具体的に好ましくは８５個のＮ末端アミノ酸からなるフラグメント（ＳＧＫ２βの配列から始まるＳＧＫ２の場合；この目的に関して具体的にＳＧＫ２αに適しているのは、２１個のＮ末端アミノ酸である；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，１９９９ｂも参照）を用いることによって生産される。
【００６２】
ノーザンおよびサザンブロット、ＤＮＡマイクロアレイ、または、インサイチュで組織切片に固定された核酸をハイブリダイゼーションするのに適したプローブの選択および製造、および、ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドプライマーの選択および製造は、当業者には十分に周知である（これについては、以下で指定された標準的な文献も参照）。この点について、差異的な検出に適したものは、具体的には、上記した様々なＳＧＫファミリーの相同性が低い領域をコードするプローブであり、例えば、コード配列の最初の２５５個のヌクレオチドから選択されるプローブである（様々なＳＧＫファミリーの８５個の相同性が低いＮ末端アミノ酸に相当する；および、ＳＧＫ２αプローブについては、ＳＧＫ２αタンパク質の相同性が低いＮ末端の２１個のアミノ酸に相当するコード配列の最初の６３個のヌクレオチドから選択される；上記参照）。この点について、ＳＧＫ１発現を検出するのに適しているのは、好ましくは、配列番号１（図１）、配列番号７（図７）または配列番号１３（図８）に示される配列を有するプローブである。
【００６３】
好ましい実施態様において、本発明の方法では、ＳＧＫ１が検出される。
【００６４】
好ましくは、本発明の変性性の軟骨の変化の同定方法は：
ａ）調査するために単離された軟骨サンプルのＳＧＫタンパク質またはｍＲＮＡの含量を測定する工程；
ｂ）変性していない軟骨の単離されたサンプルのＳＧＫタンパク質またはｍＲＮＡの含量と比較する工程、
を含み、ここにおいて、変性した、または、変性中の軟骨におけるＳＧＫの量は、変性していない軟骨中のそれらの量よりも大きい。
【００６５】
これらの本発明の方法により、採取した滑液または組織サンプルを適切に解析することによって、進行中の、または、既存の変性性の軟骨の変化を、簡単に、かつ確実に診断することが可能になる。
【００６６】
本発明はさらに、ＳＧＫを検出するための手段を少なくとも１つ含む、変性性の軟骨の変化を診断するための試験キットに関する。本発明に関して、部品からなるキット（または略して「キット」）は、前記成分をそれぞれ空間的に配置させ一つの機能単位にまとめた組み合わせを意味し、これらは、必要に応じてさらなる成分を含んでいてもよい。
【００６７】
その手段は、好ましくは、少なくとも１種のＳＧＫタンパク質またはタンパク質フラグメントに対する抗体、および／または、プライマーセット、および／または、核酸プローブである（後者の２つは、少なくとも１種のＳＧＫのｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現を検出するためである）。このような手段の製造は、当業者には十分に周知である。本キットは、加えて、さらなる有利な成分、例えば適切な緩衝液、酵素、使用説明書などを含んでいてもよい。このような成分や必要なパッケージング手段は、当業者にとっては市販の診断テストキットから既知である。
【００６８】
本発明の様々な主題および形態の好ましい実施態様において、ＳＧＫは、ポリヌクレオチド、好ましくはヒトＳＧＫ、または、それらのフラグメントもしくは誘導体であり、具体的に好ましくは以下の配列のいずれか１つを含む、または、それらからなる：
ａ）配列番号１、配列番号２または配列番号３；
ｂ）ストリンジェントな条件下でａ）に記載の配列の少なくとも１つとハイブリダイゼーションする、ＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードする配列；
ｃ）ａまたはｂに記載の配列のいずれか１つに関して遺伝子コードに基づき変化している、ＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードする配列；
ｄ）ＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードするａ）、ｂ）またはｃ）に記載の配列のいずれか１つのフラグメント、好ましくは配列番号７〜９に示される配列のいずれか１つを有するフラグメント（図７）；
ｅ）前記配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つを基にして、遺伝子コードの縮重に基づいていない、または、部分的に遺伝子コードの縮重に基づいていない１またはそれ以上の塩基を置換することによって作製された、ＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードする配列。
【００６９】
さらなる好ましい実施態様において、ＳＧＫポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む、または、それらからなる。
【００７０】
本発明に従って用いられるＳＧＫフラグメントは、好ましくは配列番号７、配列番号８または配列番号９に示されるヌクレオチド配列のいずれか１種（図７に示されるポリヌクレオチドフラグメント）を含む、または、それらからなる。
【００７１】
本発明の様々な主題および形態のその他の好ましい実施態様において、ＳＧＫは、ポリペプチド、好ましくはヒトＳＧＫ、または、それらのフラグメントまたは誘導体であり、具体的に好ましくは、以下の配列の少なくとも１つを有する、、または、それらからなる核酸によってコードされたものである：
ｆ）配列番号１、配列番号２または配列番号３；
ｇ）ストリンジェントな条件下でａ）に記載の配列の少なくとも１つとハイブリダイゼーションする、ＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードする配列；
ｈ）ａまたはｂに記載の配列のいずれか１つに関して遺伝子コードに基づき変化している、ＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードする配列；
ｉ）ＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードするａ）、ｂ）またはｃ）に記載の配列のいずれか１つのフラグメント、好ましくは配列番号７〜９に示される配列のいずれか１つを有するフラグメント（図７）；
ｊ）前記配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つを元にして、遺伝子コードの縮重に基づいていない、または、部分的に遺伝子コードの縮重に基づいていない１個またはそれ以上の塩基の置換によって作製された、ＳＧＫの機能を有するポリペプチドをコードする配列。
【００７２】
さらなる好ましい実施態様において、ＳＧＫポリペプチドは、配列番号４、配列番号５または配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、または、それらからなる。
【００７３】
本発明に従って用いられるＳＧＫフラグメントは、好ましくは、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２に示されるアミノ酸配列のいずれか１種を含む、または、それらからなる（図７）。
【００７４】
ストリンジェンシーとは、２つの一本鎖核酸分子の相互のハイブリダイゼーション、または、アニーリングの特異性に影響を与える反応条件を説明するものである。この点について、ストリンジェンシー、従って反応特異性も、特に温度と緩衝液の条件に依存する：従って、ストリンジェンシー、従って特異性は、温度を高め、イオン強度を低くすることによって増加させることができる。低ストリンジェンシー条件（すなわち、より低い反応特異性またはハイブリダイゼーション特異性ともいう）は、例えば、ハイブリダイゼーションが、室温で２×ＳＣＣ溶液中で行われる場合に起こる。それに対して、高ストリンジェンシー条件は、例えば、ハイブリダイゼーションが、６８℃で、０.１×ＳＣＣおよび０.１％ＳＤＳ溶液中で行われる場合に適用される。
【００７５】
本願に関して、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、好ましくは、さらに以下を意味する：
１）５０ｍＭのトリス（ｐＨ７.５）、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０.５ｍｇ／ｍｌの変性ニシンまたはサケ精子ＤＮＡ中で、標識されたプローブと、調査しようとするサンプルと、６０〜７０℃、好ましくは６５℃でハイブリダイゼーションすること、または、オリゴヌクレオチドの場合、オリゴヌクレオチド二本鎖およびサンプルの融点（この融点は、いわゆる「アニーリング温度」とも称される）より５℃低い温度で、一晩ハイブリダイゼーションすること；
２）２×ＳＳＣ中で、室温で１０分間洗浄すること；
３）１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で、６０〜７０℃、好ましくは６５℃で（または、オリゴヌクレオチドの場合、アニーリング温度より５℃低い温度で）、３０分間洗浄すること；
４）０.２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で、６０〜７０℃、好ましくは６５℃で（または、オリゴヌクレオチドの場合、アニーリング温度より５℃低い温度で）、３０分間洗浄すること；
５）０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で、６０〜７０℃、好ましくは６５℃で（または、オリゴヌクレオチドの場合、アニーリング温度より５℃低い温度で）、３０分間洗浄すること。
【００７６】
オリゴヌクレオチドは、好ましくは、１５〜３０、好ましくは２０個のヌクレオチドの長さを有するＤＮＡフラグメントである。この場合、アニーリング温度は、式Ｔｍ（℃）＝２×（Ａ＋Ｔの数）＋４×（Ｇ＋Ｃの数）によって決定される。２×ＳＳＣ、または、０.１×ＳＳＣ溶液は、例えば２０×ＳＳＣ溶液を適切に希釈することによって製造される。２０×ＳＳＣ溶液は、３ＭのＮａＣｌ／０.３Ｍクエン酸ナトリウム×２Ｈ2Ｏからなる。
【００７７】
ハイブリダイゼーションを行う前に、調査しようとするポリヌクレオチドは、必要に応じて、電気泳動による分画化の後に（いわゆるサザン（ＤＮＡ）またはノーザン（ＲＮＡ）ブロット）、または、電気泳動による分画化を行わないで（いわゆるドットまたはスロットブロット）、適切なメンブレン、例えばナイロンまたはニトロセルロースメンブレンに移される。ハイブリダイゼーションは、適切な方法で標識されたプローブと共に起こる。従って、放射性の標識付け、または、蛍光色素での標識付けが適切であるが、その他のタイプの標識付けも同様に可能である。プローブは、一本鎖のポリリボまたはポリデオキシリボヌクレオチドであり、これは、それ自体が一本鎖型であるか、または、通常二本鎖であるが、変性した状態で用いられる。このようなプローブは、塩基対を形成することによってＤＮＡまたはＲＮＡプローブに結合し、これらはその後一本鎖型になる。
【００７８】
図に、様々なアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００７９】
本発明の様々な主題および形態は、特に、関節炎による障害、好ましくは骨関節症、または、リウマチ様関節炎、具体的には骨関節症の症例に使用するのに適している。
【００８０】
参考文献
【化１】
2008522596.tif 000002
【００８１】
【化２】
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【００８２】
【化３】
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【００８３】
【化４】
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【００８４】
【化５】
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【００８５】
【化６】
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【００８６】
【化７】
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【００８７】
【化８】
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【００８８】
標準的な方法に関する文献：
特に他の指定がない限り、本明細書で説明されている実験方法は、以下で詳述した標準的な文献の通りであるか、または、それに従って行うことができる。
【化９】
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【００８９】
以下、本発明を実施例および図面によって詳細に説明するが、本発明の主題を制限することが目的ではない：
【実施例】
【００９０】
実施例１：骨関節症アレイを用いた遺伝子発現解析
遺伝子発現解析は、ＧＰＣ−バイオテク（ＧＰＣ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）に注文生産してもらった骨関節症に特異的なｃＤＮＡアレイに基づき、このアレイは、ナイロンメンブレンに付着させた４５００種の軟骨関連の遺伝子からなる。アレイへのハイブリダイゼーションのためのプローブとして、健康な関節軟骨、および、変形性関節症の関節軟骨由来のトータルＲＮＡ（標準的な方法による調製物）を、逆転写によって、32Ｐで標識されたヌクレオチドを放射性ｃＤＮＡに取り込ませて翻訳し、標準的な方法によってアレイのｃＤＮＡサンプルとインキュベートした。ハイブリダイゼーションとそれに続くメンブレンの洗浄を行い、続いて、オートラジオグラフィでハイブリダイゼーションシグナルを検出した。健康な軟骨と変形性関節症の軟骨とで差異的に異なって発現した２７０種の遺伝子を、さらに解析することとした。これらの遺伝子の１つは驚くべきことにＳＫＧであった：発明者等の遺伝子発現解析の発見から、ＳＧＫ発現は、骨関節症の関節軟骨で誘導されることが初めて示された。この発見は、ｃＤＮＡライブラリー中のクローン数によって確認することができる：これから、ＳＧＫのｃＤＮＡは、正常な軟骨のライブラリーに比べて、変形性関節症の軟骨のｃＤＮＡライブラリーでは１４倍もの頻度で発現されることがわかる。
【００９１】
実施例２：アレイの製造およびハイブリダイゼーション
アレイ製造のためのクローンは、ＳＳＨ（サブトラクティブ・サプレッション・ハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ））によって選択された。また、コントロールクローン、および、ハウスキーピング遺伝子のクローンも用いられた。３８４ウェルのポリプロピレンプレート（ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｘ），イギリス）で、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ  ＵＫ）製のＰＣＲキットを使用して増幅を行い、ここにおいて、ＰＣＲ反応（反応体積５０μｌ）では、Ｍ１３フォワード（５’ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ＧＧＧ  ＡＴＧ  ＴＧ  ３’）、および、Ｍ１３リバースプライマー（５’ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＴＴＡ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＣＧ  ３’）を製造元（キアゲン，Ｈｉｌｄｅｎ  ＵＫ，上記参照）が説明する通りに用いた。この反応混合物に、３８４個のピンを有するトランスファー装置（ジェネティックス）を用いて、２μｌまたはそれより少ない量の細菌培養物を植え付け、プラスチックフィルム（ジェネティックス）でプレートを密封した。ＰＣＲ増幅は、自動化したウォーターバスシステム（Ｋバイオシステムズ（ＫＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，ベイジルドン，イギリス）で、標準的な条件下で行われた（Ｍｅｉｅｒ−Ｅｗｅｒｔ，Ｓ．等）。４３９６種のｃＤＮＡクローン由来のＰＣＲ産物を、Ｍａｉｅｒ等によって説明されているようなロボット利用のアプリケーターを用いて、個々に８×１２ｃｍのレプリカのナイロンメンブレン（ハイボンドＮ+（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ+，アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））に移し、空気乾燥させてメンブレンに固定した。さらにＰＣＲ産物を、２地点間の距離を８５０μｍとして５×５パターンの形態でメンブレンに２回付着させた。
【００９２】
実施例３：プローブの標識付け、ハイブリダイゼーションおよび洗浄
４つの異なる反応混合物中で、スーパースクリプトＩＩ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）逆転写酵素（番号１８０６４−０７１，インビトロジェン）を用いて、トータルＲＮＡ（総量２μｇ）をｃＤＮＡに転写した。この場合、この混合物はそれぞれ：スーパースクリプトＩＩ（番号１８０６４−０７１，インビトロジェン）を２００ユニット、３３Ｐα−ｄＣＴＰ（番号ＮＥＧ３１３Ｈ，ＮＥＮライフサイエンス・プロダクツ社（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＧｍｂＨ））を５０μＣｉを含み、いずれのケースにおいても、スーパースクリプトＩＩを含む第一の鎖反応緩衝液（インビトロジェン）中に、０.６６ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ランダムヘキサマー（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を０.５μｇ、および、１０ｍＭのＤＴＴを含む。この反応液を４２℃で４時間インキュベートし、クイックスピンカラム（ｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ，ロシュ（Ｒｏｃｈｅ），ペンツバーグ，ドイツ）を製造元が説明する通りに用いてｃＤＮＡを精製した。変性溶液（１ＭのＮａＯＨ／１０ｍＭのＥＤＴＡ）０.１１体積部、および、ヒトＣＯＴ−１ＤＮＡ（１５２７９−０１１，インビトロジェン）５μｇを用いて各プローブを変性させて、７０℃で２０分間ハイブリダイゼーションを行った。次に、中和溶液（１Ｍのリン酸ナトリウム／ｐＨ７.０）１体積部を７０℃で１０分間添加することによって各プローブを中和し、これをハイブリダイゼーション混合物に添加した。軟骨トータルＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡをプローブとして用いた。
【００９３】
それぞれのハイブリダイゼーション実験のために、プローブを添加する前に、３種のアレイを、ハイブリダイゼーション緩衝液（７％ＳＤＳ、５０％脱イオン化ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.０）、および、２％乾燥粉乳）５０ｍｌ中で２時間プレハイブリダイゼーションさせた。プラスチック容器（２０ｃｍ×１０ｃｍ）中でプローブの添加後に、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの後に、アレイを、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ緩衝液中で２回、さらに０.１％ＳＳＣ、および、０.５％ＳＤＳ緩衝液中で２回洗浄した。各洗浄工程は、６５℃で１５分間行われた。次に、このメンブレンをクリングフィルムで包み、ホスホストレージスクリーンと５日間接触させ、フジ（ＦＵＪＩ）のＢＡＳ５０００イメージングシステムを解像度２５μｍで用いてスキャンした。市販のアレイ解析プログラム（ビジュアルグリッド（ＶｉｓｕａｌＧｒｉｄ）、ＧＰＣバイオテク社（ＧＰＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ））を用いて画像を解析し、アレイに付着させたそれぞれの位置の平均シグナル強度をコンピューターで読取り可能なデータに変換して、それを記憶媒体にファイルとして保存した。
【００９４】
実施例４：データ解析
様々なアレイのシグナルのシグナル強度（これらはそれぞれ、個々のクローンに相当する）を含むファイル中の生データを、以下のように解析した：まず最初に、ＤＮＡをローディングしていない位置から得られたシグナル強度を差し引くことによってバックグラウンドシグナルを修正した。その後、１クローンあたり６個の異なるレプリカの値（３つのアレイであり、いずれの場合においても２個のデータポイントを有する）を考慮して平均シグナル強度を修正し、対数的に変換し、アレイ上のそれぞれのクローンの標準偏差を決定した。次に、可能性のあるサンプルの異常値を、平均連結法に基づく階層的クラスタ分析のアルゴリズムを用いて個々の患者のサンプルからのデータを組み合わせることによって確認した（Ｅｉｓｅｎ等，１９９８）。最終的に、差異的に発現されたクローンを、得られた平均シグナル強度を比較すること（ＯＡ患者の軟骨由来のｃＤＮＡサンプルの特定のクローンの平均シグナル強度と、健康な軟骨由来のｃＤＮＡサンプルの平均シグナル強度とを比較すること）によって同定した。
【００９５】
あるいは、それぞれのＯＡ患者群の特定のクローンの平均シグナル強度を、健康な軟骨のサンプルの平均シグナル強度と比較した。
【００９６】
特定のｃＤＮＡクローンで代表される特定の組織サンプルにおける遺伝子発現レベルは、いずれの場合においても、その組織サンプルに対応するプローブを用いたハイブリダイゼーション実験で得られた特定のクローンの平均シグナル強度に相関していた。この場合、平均シグナル強度が高いほど、より高い発現レベルであるということであった。遺伝子発現の有意性を、それぞれの比較について、両側ｔ検定を用いることによって決定した。有意性の理論限界として０.１のｐ値を用いて、正常な軟骨サンプル群と比較してＯＡ患者由来のサンプル群で差異的に発現された遺伝子を示すクローンを同定した。
【００９７】
実施例５：ｃＤＮＡアレイのハイブリダイゼーション
差異的な遺伝子発現を確認するために、上記の手順によって同定された個々のクローンをプローブとして用い、変形性関節症および正常な組織由来の一次ｃＤＮＡライブラリーが固定されたアレイとハイブリダイゼーションさせた。この場合、一次ｃＤＮＡライブラリーを標準的な方法によって作製し、細菌に導入し、ライブラリーを示す細菌クローンの選択を単離し、この選択されたクローンを標準的な方法によってマイクロタイタープレートに導入した（Ｂａｎｃｒｏｆｔ等，１９９９を参照）。（１９９９；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２８：６７〜８２）。上述の方法によって上述のロボット利用システムを用いてアレイを作製したが、いずれの場合においても、２３×２３ｃｍの大きさであり、二連で付着させた一次ｃＤＮＡクローンに相当する約〜４００００種のＰＣＲ産物を含んでいた。これらの実験に２セットのアレイを用いた；５個のアレイからなる第一のセットは、正常な組織由来のｃＤＮＡライブラリーの２０００００種のｃＤＮＡクローンに対応し、５個のアレイからなる第二のセットは、変形性関節症の組織由来のｃＤＮＡライブラリーの２０００００種のｃＤＮＡクローンに対応する。
【００９８】
差異的に発現された遺伝子を示す個々のクローンのＰＣＲ産物を、標準的な方法によってランダム・プライミング（デカプライム（ＤｅｃａＰｒｉｍｅ）システム，アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を用いて放射標識した。それぞれの標識されたクローンを、２つのアレイセット（第一および第二）のレプリカ一つずつにハイブリダイゼーションし、それぞれ、正常な軟骨組織および変形性関節症の軟骨組織由来の２０００００種の異なる一次ｃＤＮＡクローンを提示するアレイが総計１０個得られた。この場合、２４×２４ｃｍの面積を有するプラスチック培養皿で、チャーチ（ｃｈｕｒｃｈ）の緩衝液（７％ＳＤＳ、０.５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.０、１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。洗浄工程は、これまで説明したものと同じである。フィルムで包んだハイブリダイゼーションさせたアレイに、ホスホストレージスクリーンを一晩晒した後に、上記の手順に従ってアレイをフジのＢＡＳ１８００ＩＩシステムを解像度１００μｍで用いてスキャンし、シグナルを保存可能なデータに変換した。標識されたクローンとハイブリダイゼーションさせたアレイセットそれぞれにおける一次ｃＤＮＡクローンの数を、上述の画像解析システムを用いて決定した（その手順は上述した通りである）。この場合、第二の組織よりも第一の組織で発現量の多かった特定の遺伝子は、第二の組織のライブラリーで構成されるアレイセットよりも、第一の組織の一次ｃＤＮＡライブラリーに対応するアレイセットでハイブリダイゼーションシグナルの数がより多かった。
【００９９】
実施例６
遺伝子発現の比較解析によるＯＡの分子メカニズムの調査から、病理学的な状態の解析、および、薬理学的な介入のための新規の分子レベルの攻撃ポイントの同定への魅力的なアプローチが示される。この目的のために用いられた結果の「ゲノミクス解析」による解釈は複雑であり、これはなぜなら、複数のプロセスを、場合によっては逆方向で、ＯＡに罹患した軟骨中でそれぞれ平行して進行させるためである。ここで述べることができる例は、軟骨形成活性、および、軟骨分解活性の同時出現である。
【０１００】
正常な軟骨と比較してＯＡで差異的に発現された遺伝子のポテンシャル関数に対する一次近似を得るために、軟骨分解活性と、軟骨形成活性とを別々に可視化することができるシステムが必要である。
【０１０１】
この目的に適したシステムの一例は、骨格発達モデルである軟骨内骨化である。軟骨合成と軟骨分解は同様に、軟骨内骨化中に同時に起こる。しかしながら、ＯＡとは異なり、これはそれぞれ境界がはっきりしたゾーンで起こり、さらに分化した細胞タイプも異なる。増殖軟骨細胞のゾーンは、いわゆる肥大軟骨細胞の領域（高い細胞体積から形態学的にはっきりと認識することができる）とは境界がはっきりしている。主要な成分として典型的にはＩＩ型、ＩＸ型およびＸＩ型コラーゲン、および、プロテオグリカンアグリカンで構成されている正常な細胞外の軟骨基質（ＥＣＭ）の再形成および分解現象は、この領域で起こる。それに対して、肥大軟骨細胞は、このゾーンに特徴的なＸ型コラーゲンを合成する。肥大軟骨ゾーンにおいて、組織が石灰化されて軟骨の抗血管新生状態が失われ、組織の血管新生が起こり、続いて骨格原基の肥大軟骨ゾーンに隣接する骨の形成が起こる（図９Ａ）。軟骨ＥＣＭの残りは、なお発達の初期段階における骨形成部位に存在しており、続いてさらなる分解が起こるか、または、その他の細胞が分化するためのマトリックスとして役立つ。
【０１０２】
従って、このような骨格発達モデルにおける関節軟骨で変形性関節症の状態で発現された遺伝子の活性を可視化するためには、増殖ゾーンにおける調査しようとする遺伝子の発現に関しては、軟骨形成機能に基づいていなければならず、肥大ゾーンまたは胎児の骨における発現に関しては、軟骨分解機能に基づいていなければならない。
【０１０３】
軟骨組織におけるＳＧＫ−１の発現に関するデータはこれまでまったく知られていないため、ＳＧＫ−１のｍＲＮＡの発現を、軟骨内骨化中に上述したように試験した。それらの目的は、前述のアレイ解析で検出された軟骨組織における高いＳＧＫ−１のｍＲＮＡレベルの重要性に関する最初の情報を得ることである。新生児マウスの四肢を、調査しようとする組織として用いた。この期間中においても、マウス胎児発達の際に起こる骨格の成長と軟骨内骨化プロセスは、なお進行中であった。
【０１０４】
次に、インサイチュハイブリダイゼーション法によってＳＧＫ−１のｍＲＮＡを調査した。
【０１０５】
この目的のために、新生児マウスの四肢と、発達の様々な段階のマウス胎芽を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で一晩固定し、これを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解させ、エタノール濃度を連続的に高くした一連の溶液に段階的に移すことによって（ＰＢＳ溶液をエタノール／ＰＢＳ溶液で交換して）脱水した。次に、脱水した組織をキシレンに移し、パラフィンに埋め込んだ。この目的のために、キシレン／パラフィン混合物中での最初のインキュベートに続いて、組織を純粋なパラフィンに入れ、キシレンを蒸発させた後に、ワックスに埋め込んだ。インサイチュハイブリダイゼーションのための組織切片を、パラフィンに埋め込まれた胎芽および四肢を直径７μｍの切片に切断することによって製造し、それらを顕微鏡スライドに移した。次に、この切片をジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰで標識し、ＳＧＫ−１に特異的なアンチセンスリボプローブとハイブリダイゼーションさせた。標準的な方法によって、プラスミドベクターｐＣＲR−ｂｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰR（インビトロジェン）にクローニングしたＳＧＫ−１のｃＤＮＡフラグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を用いてリボプローブを転写した。そこで転写を終わらせるためにためにＫｐｎｌ（インビトロジェン）を用いてＳＧＫ−１のｃＤＮＡ配列の末端でプラスミドを直線状にすることによって、インビトロでの転写を行った。
【０１０６】
用いられたマウスのＳＧＫ−１のｃＤＮＡフラグメントの配列（ヌクレオチド７４６〜１４２５）は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースでＢＣ００５７２０という番号で開示された配列の部分的な配列（ヌクレオチド７４６〜１４２５）を示し、これは、図８で配列番号１３として示される。
【０１０７】
組織切片のインサイチュハイブリダイゼーションを、Ｄｉｅｔｚ等（１９９９）で説明されているようにして行った。ハイブリダイゼーション産物を検出した後に、切片をカイザーのグリセリンゼラチン（メルク（Ｍｅｒｃｋ））中でカバーガラスで覆い、ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）のアクシオプラン２（Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２）顕微鏡を用いて解析し、撮影した。発明者等は、上述のインサイチュハイブリダイゼーションに基づき、初めて軟骨細胞中でＳＧＫ−１のｍＲＮＡを検出することを可能にした。ここにおいて検出されたＳＧＫ−１のｍＲＮＡの発現ドメインは、肥大軟骨細胞で特異的に存在しており（図９ｃ）、増殖軟骨を形成する細胞では検出不可能であった。Ｘ型コラーゲンに関するｍＲＮＡの出現、肥大軟骨細胞に関するマーカー遺伝子と比較することによって、この発見を明確に示すことができた（図９Ｂ）。それに対して、増殖軟骨は、ＳＧＫ−１のｍＲＮＡに関しては明らかに陰性であった（図９ｃ）。
【０１０８】
行われたインサイチュハイブリダイゼーション実験の結果から、軟骨におけるＳＧＫ−１の天然の出現は、軟骨の合成と維持とは関連がないが、それらの変換（肥大）および分解ではそれらは機能を示すことが明らかである。
【０１０９】
従って、変形性関節症の軟骨におけるＳＧＫ−１の発現は、好ましいプロセスであるか、または、部分的にＯＡの病理の原因である。ＳＧＫ−１は、その調節特性のために、初期の病理学的な軟骨の変化の誘導に関する、同様に、軟骨における後期の分解活性の新しい主要な分子である可能性がある。この理由のために、ＳＧＫ−１は、骨関節症における薬理学的な介入のための極めて関心の高い新規の標的分子である。
【０１１０】
実施例７
軟骨におけるＳＧＫ−１の機能に関する前記の実験から得られた推測を調べるために、軟骨形成性の細胞系ＡＴＤＣ５でさらなるインビトロでの実験を行った。
【０１１１】
ＡＴＤＣ５は、マウス奇形癌系ＡＴ８０５から得られたクローン細胞系であり、インスリンの影響下で（培地中、１０μｇ／ｍｌ）軟骨の分化が起こる。実験手順について、この細胞は、細胞培養皿上で単分子層として維持される。細胞が密集した層が形成されたら、インスリンの影響下で細胞の濃縮を形成し始め、比較的長い期間が経過した後、光屈折（ｌｉｇｈｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｎｇ）クラスターを形成して、数を増やす。この軟骨の分化は、軟骨のプロテオグリカンをアルシアンブルーで染色することによって容易に可視化できる（Ｓｈｕｋｕｎａｍｉ等，１９９６）。軟骨内骨化と同様にして、細胞は、肥大および石灰化にさらに分化する可能性がある。このプロセスは、特定の媒体および二酸化炭素条件で促進される（Ｓｈｕｋｕｎａｍｉ等，１９９７）。培養物の石灰化は、アリザリンレッドを用いたＣａ2+染色で検出することができる。分子レベルで、Ｘ型コラーゲンに関するｍＲＮＡ、肥大軟骨細胞に関するマーカー遺伝子が増加していることは明らかである（Ｓｈｕｋｕｎａｍｉ等，１９９７）。ここで行われた実験では、ＩＩ型コラーゲンのような正常な軟骨マーカー遺伝子と平行して、ｍＲＮＡレベルで少量のＸ型コラーゲンも検出可能になるように、肥大性の分化を、ＡＤＴＣ５細胞の軟骨細胞増殖活性から完全に明確に分離することは不可能であった。しかしながら、これらは培養物の石灰化の誘導の際に著しく増加したが（図１０）、それに対してＩＩ型コラーゲンのｍＲＮＡの量は減少した（図なし）。
【０１１２】
これらの条件下でのＳＧＫ−１のｍＲＮＡの発現は、Ｘ型コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１）のｍＲＮＡと類似していた。軟骨の分化およびＡＴＤＣ５細胞の増殖中に、基底量のＳＧＫ−１のｍＲＮＡが検出されたが、細胞の肥大および石灰化が誘導されると一気に減少した（図１０）。定量ＰＣＲ実験およびノーザンブロットハイブリダイゼーションを行うことによって、ＳＧＫ−１、および、Ｃｏｌ１０ａ１のｍＲＮＡの量を検出した。両方の解析法により、同等の結果が得られた。そこで、インサイチュハイブリダイゼーションからの発見を、それと同等のインビトロモデルで確認した。
【０１１３】
実施例８
軟骨分化中のＳＧＫ−１の機能に的を絞った調査のために、ＭＭＬＶ（マウスモロニー白血病ウイルス）から誘導されたレトロウイルスベクター系（ｐＬＰＣＸベクター）によって、ＡＴＤＣ５細胞中でヒトＳＧＫ−１を過剰発現させた。ここでは、２種の異なるＳＧＫ−１変異体を用いた：キナーゼが欠損した突然変異体（スレオニン256およびセリン422のアラニンへの突然変異＝ＳＧＫ−１ＫＤ）、および、天然に存在する機能型（ＳＧＫ−１ｗｔ）。レトロウイルスベクターのみを含みＳＧＫ−１を含まない、または、形質転換されていないＡＴＤＣ５細胞を、ウイルスＳＧＫ−１の導入のためのコントロールとして用いた。次に、この細胞を、インスリンで刺激して軟骨分化させ、２１日間が経過した後に解析した。プロテオグリカン合成を解析することによって軟骨が分化した細胞の程度を調査した。この目的のために、培養物をアルシアンブルーで染色し、軟骨の主要なプロテオグリカンであるアグリカンに関するｍＲＮＡ発現について試験した（図１１）。
【０１１４】
これらの実験で、ＳＧＫ−１の過剰発現は、軟骨合成の阻害を引き起こすことを明確に示すことができた。アルシアンブルーで染色されたプロテオグリカンの量（図１１）、および、アグリカンのｍＲＮＡの量（図１２）はいずれも有意に減少した。それに対して、キナーゼが欠損したＳＧＫ−１型は、このパラメーターに関して負の作用は示さなかった（図１１、１２）。上述したコントロールも同様に、どちらでもない挙動を示した。従って、軟骨合成およびＥＣＭ形成の阻害は、ＳＧＫ−１の作用に起因しており、過剰発現の結果として人工的に量を増加させたタンパク質によっては発生しないことを示すことができた。
【０１１５】
これらのＯＡに罹患した関節軟骨におけるＳＧＫ−１の作用に関する実験から、様々な結論を引き出すことができる。
【０１１６】
まず第一に、ＳＧＫ−１−を発現する軟骨細胞は、例えばプロテオグリカンのような組織の機能に必須な細胞外マトリックスを十分に合成することができなくなる。第二に、軟骨細胞は、アグリカンのような遺伝子の発現を高めることによって分解プロセス償うこと、または、修復することが阻止される。従って、見込みのある開始剤やＯＡの病理学の中心的な因子としてのＳＧＫ−１の機能が確認された。
【０１１７】
それゆえに、ＳＧＫ−１は、変性性の軟骨の変化、具体的には骨関節症を治療する新規の活性成分を発見および開発するための、高度に関心のある標的分子の代表である。
【０１１８】
関節軟骨細胞におけるＳＧＫ−１、２および３の発現は、このような分子の機能をさらに解析するための重要な情報を提供すると推測される。この目的に関して、例えば当業者にとって既知の標準的な方法によって、マウスのトランスジェニックモデルやノックアウトモデルを生産し、解析することが可能である（例えば、標準的な方法に関する上述の文献を参照）。
【０１１９】
図面の説明
図１
ＮＣＢＩアクセス番号ＮＭ＿００５６２７、ＡＦ１５３６０９によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ１（ＳＧＫ１）のポリヌクレオチドコード配列である（配列番号１）。
【０１２０】
図２
ＮＣＢＩアクセス番号ＡＦ１６９０３４、ＡＦ１８６４７０によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ２（ＳＧＫ２）のポリヌクレオチドコード配列である（配列番号２）。
【０１２１】
図３
ＮＣＢＩアクセス番号ＮＭ＿０１３２５７、ＡＦ０８５２３３、ＡＦ１６９０３５によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ３（ＳＧＫ３）のポリヌクレオチドコード配列である（配列番号３）。
【０１２２】
図４
ＮＣＢＩアクセス番号ＮＰ＿００５６１８によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ１（ＳＧＫ１）のアミノ酸の配列である（配列番号４）。
【０１２３】
図５
ＮＣＢＩアクセス番号ＮＰ＿７３３７９４、ＮＰ＿０５７３６０によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ２（ＳＧＫ２）のアミノ酸の配列である（配列番号５）。この図において、２種の異なるＳＧＫ２アイソフォームαおよびβの第一のアミノ酸が太字で示される。これらの２種のサブタイプのＤＤＧ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号は、ＡＦ１６９０３４（α）、および、ＡＦ１８６４７０（β）である。ＳＧＫ２αは、３６７個のアミノ酸からなるタンパク質であり、一方、ＳＧＫ２βは、４２７個のアミノ酸からなるタンパク質である。
【０１２４】
図６
ＮＣＢＩアクセス番号Ｑ９６ＢＲ１によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ３（ＳＧＫ３）のアミノ酸の配列である（配列番号６）。ＳＧＫ３は、４２９個のアミノ酸からなる長さを有するタンパク質である。
【０１２５】
図７
ＳＧＫサブタイプ１〜３の機能的なフラグメントのアミノ酸、および、それらをコードするポリヌクレオチド配列である：図７ａは、ＳＧＫ１をコードするポリヌクレオチド配列のキナーゼドメインを含むフラグメントを示す（配列番号７）；図７ｂは、ＳＧＫ２をコードするポリヌクレオチド配列のキナーゼドメインを含むフラグメントを示す（配列番号８）；図７ｃは、ＳＧＫ３をコードするポリヌクレオチド配列のキナーゼドメインを含むフラグメントを示す（配列番号９）；図７ｄは、ＳＧＫ１のアミノ酸配列のキナーゼドメインを含むフラグメントを示す（配列番号１０）；図７ｅは、ＳＧＫ３のアミノ酸配列のキナーゼドメインを含むフラグメントを示す（配列番号１１）；図７ｆは、ＳＧＫ３のアミノ酸配列のキナーゼドメインを含むフラグメントを示す（配列番号１２）。
【０１２６】
図８
マウスＳＧＫ−１のｍＲＮＡのｃＤＮＡフラグメントである：
図８は、マウスＳＧＫ−１のｍＲＮＡからクローニングされ、リボプローブを製造するのに用いられたｃＤＮＡフラグメントのヌクレオチドの配列を示す（配列番号１３）。
【０１２７】
図９
新生児マウスの脛骨の組織切片のインサイチュハイブリダイゼーションによるＳＧＫ−１のｍＲＮＡ発現の検出である。
Ａ：ヘマトキシリンおよびエオシンで染色されたコントロール。
Ｂ：ジゴキシゲニン標識アンチセンスリボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーション、および、それに続く色の反応による肥大軟骨細胞中でのＣｏｌ１０ａ１発現の検出。
Ｃ：ジゴキシゲニン標識アンチセンスリボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションによる、および、それに続く色の反応による肥大軟骨細胞中でのＳＧＫ−１のｍＲＮＡｍＲＮＡの検出。
図中の図解は、特異的なアンチセンスリボプローブのインサイチュハイブリダイゼーションによる新生児マウスの脛骨の肥大軟骨細胞におけるＳＧＫ−１の検出を示す（図９Ｃ）。細胞のより優れた同定のために、対応する組織切片を染色したコントロールを示す（図９Ａ）。
【０１２８】
図１０
様々な分化段階におけるＡＴＤＣ５細胞中のＳＧＫ−１、および、Ｃｏｌ１０ａ１のｍＲＮＡ発現の比較である。
１：密集する前段階のＡＴＤＣ５細胞
２：密集したＡＴＤＣ５細胞、
３：インスリン添加して３週間後の軟骨形成により分化したＡＴＤＣ５細胞、
４：２週間にわたりさらに石灰化させた後の、３で説明したのと同じ軟骨形成により分化したＡＴＤＣ５細胞。
図１０Ａは、ＳＧＫ−１、および、Ｃｏｌ１０ａ１のｍＲＮＡの量の定量ＰＣＲによる解析を示す。数値単位は、発現の豊富さの程度の指標になるように示される。
図１０Ｂは、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによるＳＧＫ−１、および、Ｃｏｌ１０ａ１のｍＲＮＡの検出を示す。
反応で用いられる細胞のトータルＲＮＡの量を較正するために、ＡおよびＢにおけるβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を測定した。
【０１２９】
図１１
ＳＧＫ−１の安定な過剰発現のためにウイルスによって形質転換されたＡＴＤＣ５細胞である。
ＡＴＤＣ５：コントロールとしての未処理細胞；
ｐＬＣＰＣＸ：ＳＧＫ−１を含まない形質導入ベクターの安定な組み込み、同様にコントロール用；
ＳＧＫ−１ｗｔ：機能的なＳＧＫ−１の過剰発現；
ＳＧＫ−１ＫＤ：キナーゼが欠損したＳＧＫ−１の過剰発現。
細胞が密集した状態に達したら、軟骨形成性の分化状態で２１日間細胞を維持した。アルシアンブルーで染色することによって、軟骨形成性の分化、および、プロテオグリカン生産の程度を検出した。
ＳＧＫ−１を過剰発現する細胞は、軟骨が分化した細胞、および、プロテオグリカン形成の量が有意に減少したことを示したが、それに対して、キナーゼが欠損したＳＧＫ−１は、それに関しては作用を示さなかった。
ＡおよびＢは、２つの独立した実験での同一の試験を示す。
【０１３０】
図１２
定量ＰＣＲによる、図１１で説明したサンプルのプロテオグリカン発現のアグリカンのｍＲＮＡのレベルでの解析である。
ＡおよびＢは、図１１ＡおよびＢに示されたサンプルに対応する。
１．ＡＴＤＣ５
２．ｐＬＰＣＸ
３．ＳＧＫ−１ｗｔ
４．ＳＧＫ−１ＫＤ
数値単位は、発現の豊富さの程度の指標になるように示される。測定されたアグリカンのｍＲＮＡの量はほとんど全て、アルシアンブルー染色によって検出されたプロテオグリカンに関する図１１に示される量と共通する挙動を示す。
図１１ＢのｐＬＰＣＸサンプルだけが、ｍＲＮＡレベルでの比較において、ＳＧＫ−１ｗｔサンプルと比較してあまり豊富ではないことを示す。しかしながら、ＳＧＫ−１ｗｔの過剰発現の後に、ＡＴＤＣ５、および、ＳＧＫ−１ＫＤと比較してアグリカンのｍＲＮＡ発現が相当減少したことは、明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ＮＣＢＩアクセス番号ＮＭ＿００５６２７、ＡＦ１５３６０９によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ１（ＳＧＫ１）のポリヌクレオチドコード配列である（配列番号１）。
【図２】ＮＣＢＩアクセス番号ＡＦ１６９０３４、ＡＦ１８６４７０によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ２（ＳＧＫ２）のポリヌクレオチドコード配列である（配列番号２）。
【図３−１】ＮＣＢＩアクセス番号ＮＭ＿０１３２５７、ＡＦ０８５２３３、ＡＦ１６９０３５によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ３（ＳＧＫ３）のポリヌクレオチドコード配列である（配列番号３）。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図４】ＮＣＢＩアクセス番号ＮＰ＿００５６１８によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ１（ＳＧＫ１）のアミノ酸の配列である（配列番号４）。
【図５】ＮＣＢＩアクセス番号ＮＰ＿７３３７９４、ＮＰ＿０５７３６０によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ２（ＳＧＫ２）のアミノ酸の配列である（配列番号５）。
【図６】ＮＣＢＩアクセス番号Ｑ９６ＢＲ１によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ３（ＳＧＫ３）のアミノ酸の配列である（配列番号６）。
【図７−１】ＳＧＫサブタイプ１〜３の機能的なフラグメントのアミノ酸、および、それらをコードするポリヌクレオチド配列である（配列番号７〜１２）。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８】マウスＳＧＫ−１のｍＲＮＡのｃＤＮＡフラグメントである（配列番号１３）。
【図９】新生児マウスの脛骨の組織切片のインサイチュハイブリダイゼーションによるＳＧＫ−１のｍＲＮＡ発現の検出である。
【図１０】様々な分化段階におけるＡＴＤＣ５細胞中のＳＧＫ−１、および、Ｃｏｌ１０ａ１のｍＲＮＡ発現の比較である。
【図１１】ＳＧＫ−１の安定な過剰発現のためにウイルスによって形質転換されたＡＴＤＣ５細胞である。
【図１２】定量ＰＣＲによる、図１１で説明したサンプルのプロテオグリカン発現のアグリカンのｍＲＮＡのレベルでの解析である。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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