【事件の表示】
　特許第２６７２０８８号「セリンプロテアーゼ阻害剤の生産のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なＤＮＡ塩基配列」の特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２６７２０８８号の特許請求の範囲第１項ないし第３１項に記載された発明についての特許を維持する。
【理由】
１．手続の経緯
　本件特許第２６７２０８８号は、昭和６０年１２月４日（パリ条約による「優先権主張」１９８４年１２月６日米国及び１９８５年１２月２日米国）を国際出願日とする特願昭６１−５０００１８号に係る出願であって、平成９年７月１１日に設定登録がなされ、その後、帝人株式会社（以下、申立人という。）から特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１１年８月１９日に訂正請求がなされたものである。
２．訂正請求について
２−１．訂正の概要
　本件訂正の趣旨は、本件特許の明細書を請求書に添付した訂正明細書のとおりに訂正を求めるにあり、その訂正の要旨は、特許請求の範囲の減縮を目的として、請求項１、２、１７、１８、１９及び４０を下記のように訂正し、且つ、請求項２０、３３〜３８及び請求項４１を削除し、当該訂正に伴い不連続となった請求項の番号を整理すると共に、番号訂正に伴いそれを引用する請求項の番号を訂正するものである。
記
「１．断片化されていない１本のポリペプチド鎖からなる組換えセリンプロテアーゼインヒビターの製造方法であって、同インヒビターはセリンプロテアーゼインヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位を有し、そして同インヒビターは以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりなるセリンプロテアーゼインヒビターの製造方法において、
（式中、Ｒ１およびＲ７は同一または異り、置換または非置換アミノ酸残基からなる群から選択され、そしてＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８およびＲ９は同一または異り、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択される）
（ａ）セリンプロテアーゼインヒビターの産生を指示しうるＤＮＡ配列で形質転換した宿主組胞をＤＮＡ配列の発現に適した条件下に培養し、そして
（ｂ）このインヒビターを採取することからなる方法。
２．アミノ酸配列
を有するセリンプロテアーゼインヒビターを製造する請求の範囲第１項の方法。
１７．（ａ）アミノ酸配列
（但し、Ｒ１およびＲ７は同一または異り、置換または非置換アミノ酸残基またはその誘導体からなる群から選択され、かつＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８およびＲ９は同一または異り、メチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、グリシン、ロイシンおよびアルギニンからなる群から選択される）からなるポリペプチドを製造するように宿主微生物に指示することができるＤＮＡ配列を調製し、
（ｂ）このＤＮＡ配列を、宿主微生物内に転移、かつ複製することができるベクターにクローン化し、そしてこのベクターはＤＮＡ配列のオペレーショナルエレメントを含有し、
（ｃ）ＤＮＡ配列およびオペレーショナルエレメントを含有するベクターをセリンプロテアーゼインヒビターを発現することができる宿主微生物内に転移し、
（ｄ）この宿主微生物をベクターの増幅およびインヒビターの発現に適した条件で培養し、
（ｅ）インヒビターを採取し、そして
（ｆ）インヒビターをセリンプロテアーゼインヒビター活性を有する活性三次構造をとるようにすることからなる、断片化されていない１本のポリペプチド鎖からなる組換えセリンプロテアーゼインヒビターを製造する、請求の範囲第１項の方法。
１８．断片化されていない１本のポリペプチド鎖セリンプロテアーゼインヒビターがアミノ酸配列
を有する請求の範囲第１７項の方法。
１９．断片化されていない１本のポリペプチド鎖からなるセリンプロテアーゼインヒビターであって、同インヒビターはセリンプロテアーゼインヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位を有し、そして同インヒビターは以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりなるセリンプロテアーゼインヒビター、
（式中、Ｒ１およびＲ７は同一または異り、置換または非置換アミノ酸残基からなる群から選択され、そしてＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８およびＲ９は同一または異り、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択され、但し、Ｒ１がＳｅｒ、Ｒ２がＡｒｇ、Ｒ３〜Ｒ６がＭｅｔ、Ｒ７がＡｌａ、そしてＲ８−Ｒ９がＬｅｕである場合を除く）。
　２６（訂正前の請求項４０）．活性成分として、断片化されていない１本のポリペプチド鎖からなるセリンプロテアーゼインヒビターであって、同インヒビターはセリンプロテアーゼインヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位を有し、そして同インヒビターは以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりなるセリンプロテアーゼインヒビターを含有する医薬組成物、
（式中、Ｒ１およびＲ７は同一または異り、置換または非置換アミノ酸残基からなる群から選択され、そしてＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８およびＲ９は同一または異り、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択され、但し、Ｒ１がＳｅｒ、Ｒ２がＡｒｇ、Ｒ３〜Ｒ６がＭｅｔ、Ｒ７がＡｌａ、そしてＲ８−Ｒ９がＬｅｕである場合を除く）。
２−２．訂正の適否についての検討
２−２−１．訂正の目的の適否及び拡張・変更の存否等について
　上記訂正は、訂正前の特許請求の範囲に記載された「１または２個以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失または置換された」という択一的な構成要件の削除及び請求項の削除をするものであり、特許請求の範囲の減縮に相当する。そして、願書に添付した明細書又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、しかも実質上特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもない。
２−２−２．独立特許要件について
　上記訂正請求により訂正された明細書及び図面の記載からみて、必須構成要件項である請求項１、請求項１９及び請求項２６に係る発明（以下、それぞれ本件発明１、１９及び２６という。）の要旨は、その特許請求の範囲に記載されたとおりのものと認められる。
　そして、特許異議申立の項で言及するように、本件発明１、１９及び２６は、独立して特許を受けることができるものと認められる。
　よって、本件訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項ただし書及び同条第３項の規定により準用する同法第１２６条第２〜４項の訂正に関する規定が、平成６年法律第１１６号附則第６条第１項の規定によりなお従前の例によるとされることから適用される、平成５年特許法第１２６条第１項ただし書、第２項、及び第３項の規定に適合するので、当該訂正は認められるものである。
３．特許異議の申立てについて
３−１．特許異議申し立ての概要
　申立人は、以下の（１）〜（３）の理由により、訂正前の請求項１〜４６にかかる特許は、取り消されるべきものである旨を主張している。
（１）申立人は、証拠方法として、
甲第１号証（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ′ｓ，Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｂｄ．３５７（１９７６）ｐ．１２５１−１２６０）
甲第２号証（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ′ｓ，Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｂｄ．３５８（１９７７）ｐ．５８３−５８９
甲第３号証　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｉｂａ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　７５（ｎｅｗ　ｓｅｒｉｅｓ），Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉｃａ　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．Ｏｘｆｏｒｄ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８０），ｐ．３５１−３７９
を提出し、訂正前の請求項１、１９及び４０に係る発明は、甲第１号証〜甲第４号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、訂正前の請求項１、１９及び４０に係る発明の特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものである。
（２）トリプシンを有意に阻害することなく、エスタラーゼ阻害活性等を維持しているとする請求項３３、３４、３５に係る発明は実験的根拠が全くなく、当業者が発明を実施し得る程度に明細書に本件発明の目的、構成及び効果が記載されていない。よって、本件特許明細書の記載は、特許法第３６条第３項に規定する要件を満たしていない。
（３）医薬組成物発明である訂正前の請求項４０〜４６に係る発明において、万能薬というものは存在しないのであるから不明りょうである。よって、本件特許明細書の記載は、特許法第３６条第４項に規定する要件を満たしていない。
（４）医薬組成物発明である訂正前の請求項４０〜４６に係る発明について、医薬組成物であるにもかかわらず、毒性、投与量等について本件特許明細書に何等記載されておらず、当業者が発明を実施し得る程度に明細書に本件発明の目的、構成及び効果が記載されていない。よって、本件特許明細書の記載は、特許法第３６条第３項に規定する要件を満たしていない。
（５）訂正前の請求項１記載の「２個以上」、訂正前の請求項７記載の「約６０個」という点について、個数の範囲が不明瞭である。よって、本件特許明細書の記載は、特許法第３６条第４項に規定する要件を満たしていない。
３−２．申立理由の検討
　そこで、上記申立理由について順に検討する。
３−２−１．申立理由（１）について
　甲第１及び２号証には、精漿から分離されたプロテアーゼ阻害活性の有るＨＵＳＩ−Ｉと称される分子量約１１０００のペプチドが記載されている。
　また、甲第３号証には、
▲１▼第３６０頁末行〜第３６１頁第９行
「ヒト精漿から我々の研究室で分離されたＨＵＳＩ−Ｉは、同様の阻害的性質を有し、同じ約１１，０００の分子量を有するいくつかの多様な形態からなる。ＨＵＳＩ−Ｉの調製物の不均一性は、対立遺伝子ではなく、精漿で部分的な蛋白質分解の結果であろう。この多型性は、多様なものでＨＵＳＩ−Ｉの精製することとアミノ酸配列の決定の両方を困難にする。基本的に、ＨＵＳＩ−Ｉ分子は、６つのジスルフィド結合により架橋された約１００アミノ酸残基の一本鎖のポリペプチドからなる。予備的な結果は、分画ＤからのＨＵＳＩ−Ｉの１−２４位と５４−９９位以下に示すアミノ酸配列を示す（ｃｆ．Ｓｃｈｉｅｓｓｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ　１９７８ｂ）。」
▲２▼第３６３頁ＴＡＢＬＥ５
　ＨＵＳＩ−Ｉが、各種セリンプロテアーゼインビターとしての活性を有する旨が記載されている。
　まず、本件発明１、１９及び２６と甲第３号証記載の発明を対比する。
　甲第３号証には、ＨＵＳＩ−Ｉなるセリンプロテアーゼインヒビターのアミノ酸配列の一部が記載されている。この配列を本件明細書記載のアミノ酸配列番号を基準とした位置番号に換算して精査すると、本件発明１、１９及び２６に存在する第１〜４９位の配列は、甲第３号証記載のものに存在しない。また、甲第３号証記載のポリペプチドには、本件発明１、１９及び２６に存在しない一連の大きな配列が存在する（甲第３号証記載の２５〜５３位）点で大きくアミノ酸配列が異なっている。
　したがって、本件発明１、１９及び２６の必須の構成要件であるポリペプチドと甲第３号証に記載されたＨＵＳＩ−Ｉなるポリペプチドは異なる物質である。
　また、甲第１及び２号証に記載された発明は、ＨＵＳＩ−Ｉなる蛋白質を精製により単離したもので、前述したようにＨＵＳＩ−Ｉは本件発明１、１９及び２６の必須の構成要件であるポリペプチドとは異なる物質である。
　そうすると、本件発明１、１９及び２６の必須の構成要件であるポリペプチドはいずれの甲号証にも記載されておらず、また、そのポリペプチドを示唆する記載もない。
　よって、本件発明１、１９及び２６は、甲第１〜３号証記載の発明に基づいて当業者が容易に発明し得たものとはいえず、これらの発明の特許を、特許法第２９条第２項の規定により取り消すことはできない。
３−２−２．申立理由（２）について
　訂正前の請求項３３、３４、３５は、上記訂正請求により削除されたので、本件特許明細書の記載は、特許法第３６条第３項に規定する要件を満たすものとなった。
３−２−３．申立理由（３）について
　請求項２６に係る医薬組成物は、請求項２６においてそれに含有される活性成分が「・・・（略）・・・セリンプロテアーゼインヒビター」と規定されていることから、セリンプロテアーゼにより引き起こされる病気の治療に用いられるものと解される。
　したがって、特許請求の範囲の記載が不明瞭であるとはいえず、申立理由（３）を採用することはできない。
３−２−４．申立理由（４）について
　本件特許明細書には、「このようにしてできた上澄みは、分泌性白血球プロテアーゼ阻害活性を示すＳＬＰＩを含んでいた。・・・・全タンパク１３０ＵＧ当たり少なくとも０．７ＵＧのＳＬＰＩが示された。それについて、例６に従ってリフォールディングを行った。」（本館特許明細書第５７欄第４１〜４３行）と記載されているように、遺伝子組換え技術により作成された請求項２６〜３１に係る発明の構成要件である「セリンプロテアーゼインヒビター」を発現させ、その結果、薬理的な活性が確認されている。
　そして、薬理的な活性のある物質の投与量、投薬頻度、剤型を決めることは、動物実験などにより通常行われることであり、これらについて記載が無いという理由のみをもって、請求項２６〜３１に係る発明についての明細書の記載が、特許法第３６条第３項に規定する要件を満たしていないということはできない。
　また、毒性について、申立人の主張は、具体的な根拠も提示せず、単に毒性の有無について本件特許明細書に記載がないということに止まっており、直ちに、請求項２６〜３１に係る発明の構成要件である「セリンプロテアーゼインヒビター」に医薬として使用できないような毒性があるものということはできない。よって、請求項２６〜３１に係る発明についての明細書の記載が、特許法第３６条第３項に規定する要件を満たしていないとはいえない。
　したがって、申立理由（４）を採用することはできない。
３−２−５．申立理由（５）について
　上記訂正により、特許請求の範囲から「２個以上」及び「約６０個」という事項が削除され、明りょうになった。よって、本件特許明細書の記載は、特許法第３６条第４項に規定する要件を満たすものとなった。
４．むすび
　以上のとおりであるから、申立人の主張する理由及び提出した証拠方法によっては、本件発明１、１９及び２６に係る特許が、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものとすることができない。そして、本件特許明細書の記載が特許法第３６条第３項及び第４項に規定する要件を満たしていないということもできない。
　また、他に本件発明１、１９及び２６に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年９月１０日（１９９９．９．１０）
【訂正の要旨】
（３）訂正の要旨
　本件特許に係り、平成１０年９月２１日付け取消理由通知書において、刊行物１として「Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｉｂａ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　７５（ｎｅｗ　ｓｅｒｉｅｓ），Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉｃａ　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．Ｏｘｆｏｒｄ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８０），ｐ．３５１−３７９」が引用され、請求項１の発明に対し進歩性の欠如、請求項１９および４０の発明に対して新規性の欠如、の指敵を受けたので、上記（２）のごとく本件発明に係るセリンプロテアーゼインヒビターを減縮した。
　すなわち、請求項１、１９および４０における訂正は特定アミノ酸配列において１または２個以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失または置換されたアミノ酸配列を、
　同各請求項の従属項である請求項２、２０および４１のアミノ酸配列に減縮した。
　なお、請求項２、１７および１８の訂正は請求項１の訂正に伴うものである。
　さらに、平成１１年８月１９日付取消理由通知書において、請求項２５−２８、３１、３２および３９の発明に対して記載不備の指摘を受けたので、これらの請求項をすべて削除した。
（５４）【発明の名称】
セリンプロテアーゼ阻害剤の生産のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なＤＮＡ塩基配列
【発明の詳細な説明】
　この出願は１９８４年１２月６日に出願されたＵ．Ｓ．特許出願連続番号Ｎｏ．６７８，８２２の一部継続出願である。
発明の背景
　内生タンパク分解酵素は、侵入する生物体、抗原−抗体複合体と、生体に最早必要乃至は有用でないある特定の組織タンパクを分解するのに役立つ。正常に機能している生物体では、タンパク分解酵素は、限られた量だけ生産され、一部はプロテアーゼの阻害剤の合成を通じて制御されている。
　多数の天然に存在するプロテアーゼ阻害剤は、その反応を場所的に及び時間的に制御することによつて、内生プロテアーゼを制御している。その上、プロテアーゼ阻害剤は、感染及び寄生生物によつて身体の中に持ち込まれたプロテアーゼを阻害することがある。特別にタンパクの加水分解の攻撃や感染を受け易い組織、例えば、呼吸路の組織はプロテアーゼ阻害剤に富んでいる。
　プロテアーゼ阻害剤は、ヒト血漿タンパクの約１０％を構成している。少くとも８種の阻害剤がこの材料源から単離され、文献中にその特性が記載されている。これらの中には、α２−マクログロブリン（α２Ｍ）、α１−プロテアーゼ阻害剤（α１ＰＩ）、α１−アンチキモトリプシン（α１Ａｃｈｙ）、β１−アンチコラゲナーゼ（β１ＡＣ）、及び、インター−α−トリプシン阻害剤（ＩαＩ）がある。
　プロテアーゼ／プロテアーゼ阻害剤のバランスの撹乱は、気腫、関節炎、糸球体腎炎、歯周炎、筋ジストロフィー、腫瘍の侵入及びさまざまな他の病理的状態を包含するプロテアーゼを媒介とする組織の破壊へと導く。ある状況、例えば、敗血症とか急性白血病のようなきびしい病理学的進行の場合には、存在する遊離のタンパク分解酵素の量は、分泌細胞からの酵素の放出により増加する。それに加えて、他の状況下では、これとは別に生体の制御的な阻害剤の容量が減少するため、プロテアーゼ／プロテアーゼ阻害剤−バランスの変化が起きることもある。このよえな制御的な阻害剤の容量が減少する例は、α１−プロテアーゼ阻害剤の欠損であり、肺気腫の発生と大きく関わり合つている。
　生体にこのように常規を逸脱した状態が存在すると、タンパク分解酵素を制御するための方策を講じなければ、生体への深刻な傷害が起り得る。したがつて、生体に投与すれば、タンパク分解酵素を制御することが出来るプロテアーゼ阻害剤が探し求められてきた。
　白血球エラスターゼは、病理学的見地からことのほか興味深いセリンプロテアーゼの１つの例である。白血球エラスターゼは、細胞外に放出されると、結合相識やその他の貴重なタンパクを分解する。正常に機能している生体にとつて、ある一定量の結合組織や他のタンパクを分解することは必要であるが、過剰の白血球エラスターゼの存在は、気腫やリユーマチ様関節炎のような様々な病理的状態と関連づけられている。白血球エラスターゼが正常よりも大量に存在する場合、その効果に対抗するため、白血球エラスターゼ活性を阻害するプロテアーゼ阻害剤が探し求められてきた。精製した形で薬剤として役立つに足る量を、組み換えＤＮＡ法によつて生産できるとしたら、このようなプロテアーゼ阻害剤は特別に有用であろう。
　文献によると、過去において、少くとも２種の白血球エラスターゼ阻害剤が同定されている。“ヒト多形核白血球の中性プロテアーゼ”（Ｈａｖｅｍａｎｎら（編）ＵｒｂａｎとＳｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｉｎｃ．（１９７８））中の“ヒト粘液性分泌物中の顆粒球中性プロテアーゼの酸に安定な阻害剤；生化学と可能な生物学的機能”において、Ｓｃｈｉｅｉｓｌｅｒらが記述した１つのタンパクがヒトの精液のプラズマ及び痰から単離され、Ｎ末端アミノ酸としてチロシンを持つ、大きさが１１ｋｄａのタンパクとして性格づけられた。このタンパクの文献報告からは、部分的なアミノ酸配列しか提供されていないが、部分的な配列からさえも、このタンパクは本発明のタンパク類とは実質的に異なつていることがわかる。このタンパクのアミノ酸配列の報告と、本発明のタンパクのアミノ酸配列データーから考えると、Ｓｃｈｉｅｓｓｌｅｒらによつて配列が決定されたものは、元来一本鎖のポリペプタイドではないタンパクの分解物であつたかもしれないということが発明者らに示唆される。
　１例において、ヒトの血漿から単離された２番目のタンパクは、α１−ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒと名付けられた。このタンパクに関する業績は、ＴｒａｖｉｓとＳａｌｖｅｓｅｎによつて総説、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
５２
　本発明の一本鎖ポリペプタイドのタンパク類が以前の技術による一本鎖ポリペプタイドのセリンプロテアーゼ阻害剤のいずれとも著しく異なつているから、以前に研究された、一本鎖ポリペプタイドのセリンプロテアーゼ阻害剤類は本発明のタンパク類とは“実質的に相同”ではない。
　トリプシンは、病理学的見地から特別興味のあるもう１つのタンパクである。トリプシンは、膵臓炎のような種々の急性症状のなかで、膵臓のような特定の軟かい器官の組織の分解を始めることが知られている。これらの症状の治療を目的として、トリプシンの作用を阻害するだろうと期待されたタンパク類の使用による種々の努力がなされたが、目覚しい成功は得られなかつた。このような努力の実例は、ヒトの膵臓炎の治療に牛の外生トリプシン阻害剤を用いる試みである。このような技術は、ヨーロツパで試みられたが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によつて効果があると認められなかつた。したがつて、種々の急性または慢性症状中の、過剰のトリプシンを中和する効果のあるプロテアーゼ阻害剤が必要である。上に論議した白血球エラスターゼ阻害剤の場合にそうであつたように、トリプシン阻害剤は、もし、組み換えＤＮＡ法によつて精製した形で、薬剤として役立てるに足る量だけ単離製造できれば、ことのほか有用であろう。
　カテプシンＧは、白血球に大量に存在するもう１つのプロテアーゼである。カテプシンＧは、補足的経路のタンパクをはじめとする種々の価値のあるタンパクを、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで分解できることが知られている。膵臓のエラスターゼが、膵臓炎で役割を果している可能性のあるもう１つのプロテアーゼである。したがつて、これらのプロテアーゼに対する阻害剤も薬剤としての潜在的価値がある。
　白血球エラスターゼ、トリプシン、カテプシンＧと膵臓のエラスターゼは、セリンプロテアーゼとして知られている一群のプロテアーゼの例であり、共通の構造と作用機作の要素を持つている。それらの異なる基質に対する活性や、異なる阻害剤への活性は、２、３のアミノ酸残基だけが異なつていることから生ずると信じられている。類推によれば、やはり構造と作用機作の共通の要素を持つていて、比較的少ないアミノ酸の変化が、異なつたプロテアーゼの阻害を結果として生ずるセリンプロテアーゼ阻害剤を想像することが可能であり、しかも、少くともこの群の１員は、前述の群中のセリンプロテアーゼのすべてを阻害するであろう。そうであるとすれば、この群のセリンプロテアーゼ阻害剤は、大きな価値があるであろう。
　驚くべきことに、本発明者達は、このようなセリンプロテアーゼ阻害剤の合成を導き行なうことができるＤＮＡ配列を発見し、その阻害剤は、耳下腺分泌物から単離されたものと生物学的に等価である。組み換えＤＮＡ法によつて作られ、本特許に提出される本発明のプロテアーゼ阻害剤は、少くとも２箇所の活性部位を持つている。すなわち、白血球エラスターゼ阻害の性質を示す１つの部位と、トリプシンに対して阻害活性を示す２番目の部位である。
　現在の発明によつて生産された組み換え阻害剤は、熱や酸による変性に著しく抵抗性があり、また様々なタンパク分解酵素によるタンパク分解作用に対しても抵抗性があると考えられる。この出願に用いられるように“組み換え阻害剤”は、組み換えＤＮＡの方法論と技術によつて生産されるプロテアーゼ阻害剤のことを指すよう意図されている。さらに、本発明の組み換え阻害剤の活性形は、哺乳動物の身体の細胞外の部位で普通に出会うような条件下では、熱力学的に安定である。組み換えプロテアーゼ阻害剤の変成した形はまた、ジスルフイド結合を形成する能力も持つており、生化学的刺戟の存在しない状態で活性三次構造をとるのに必要な非共有結合的相互作用を成立させる能力がある。
　より十分に、ここに以下に提示する本発明のＤＮＡ塩基配列は、発表されている他の白血球エラスターゼ阻害剤のアミノ酸配列とは大きく異なつているところのタンパクの合成を導き行なう能力がある。したがつて、本発明のＤＮＡ塩基配列の同定によつて、本出願の中で明らかにされる。新規の組み換えプロテアーゼ阻害剤の製造に関する組換えＤＮＡ法の本発明を可能とした。
　このような組換え法は、セリンプロテアーゼ阻害活性を持つている経済的な薬剤組成物を供給するために、量的にも、純度的にも、阻害剤の製造を可能にする。さらに、ＤＮＡ塩基配列の同定により、上述のセリンプロテアーゼ阻害剤の類縁体を製造する組み換えＤＮＡ法の発明を可能にした。
発明の総括
　本発明は、プロテアーゼ阻害剤製造に関するものであり、一般、そして更に特定的には、ヒト、多形核（ＰＭＮ）−顆粒球プロテアーゼを阻害対象とした紺換え阻害剤の製造である。特にこの発明は白血球エラスターゼやトリプシンを始めとするヒト・セリンプロテアーゼに対する阻害剤の製造のための組換えＤＮＡ法に関するものである。
　それに加えて、本発明は、本セリンプロテアーゼ阻害剤の類縁体の製造に関する組み換えＤＮＡ法にも関連する。本発明はまた、以下に述べるような組み換えＤＮＡ法において有用な合成並びに天然のＤＮＡ塩基配列に関するものである。
　セリンプロテアーゼ阻害活性を持つ一本鎖のポリペプタイドであるセリンプロテアーゼ阻害剤の組み換えＤＮＡ合成法を提供することが本発明の目的である。これらの阻害剤は、ヒトの耳下腺分泌物から単離された天然の白血球エラスターゼまたはトリプシン阻害剤によつて示される活性と生物学的に同等な活性を持つている。
　これらのセリンプロテアーゼ阻害剤の代替的組み換えＤＮＡ合成を容易にするために、等価の天然のＤＮＡ塩基配列と同様に、これらの組み換えプロテアーゼ阻害剤の生産を導き行なうことができる合成ＤＮＡ塩基配列を供給することが、この発明のなおそれ以上の目的である。このような自然のＤＮＡ塩基配列は、プロテアーゼの阻害剤の合成を導き行なうことができる遺伝子が、そこから単離、同定されうるｃＤＮＡもしくはジエノミツクライブラリーから単離されうる。
　さらに、先に検討したプロテアーゼ阻害剤の類縁体を製造する組み換えＤＮＡ法及びこのような方法に役立つ、相当する類縁ＤＮＡ塩基配列を提供することが本発明の目的である。
　なおその他の本発明の目的と利点は、以下に続く記述において一部出てくるであろう。そして一部は記述から明白であるか、発明の実施から学ばれることもあろう。その目的と利益は、添付した特許請求の範囲において特に指摘されている手段と組合せによつて了解され、達成されるであろう。
　この目的を達成するため、そして本発明の目的に従つて、セリンプロテアーゼ阻害活性を示すところの、活性型で一本鎖ペプタイドのタンパクであるプロテアーゼ阻害剤の組み換えＤＮＡ方法論による生産を導き行なうことができるＤＮＡ塩基配列を発見した。これらの組み換えプロテアーゼ阻害剤は、熱や酸による変性に対して著しく抵抗性である。さらに、これらのプロテアーゼ阻害剤は、キモトトリプシンやマウスの顎下腺プロテアーゼやクロストリパインのような多くのタンパク分解酵素に接触した後でさえ、それらの生物活性を維持している。
　これらの組み換えセリンブロテアーゼ阻害剤の製造を導き行なうために発見されたＤＮＡ塩基配列の（遺伝暗号鎖）コーデイングストランドは以下の通りである。
　上述の略号によつて表示されたヌクレオタイドは、提起された具象化の詳細な記述において明らかになる。
　これらの遺伝子組み換えセリンプロテアーゼ阻害型、特に本発明の分泌形白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）の製造を導き行なうために発見した、２番目の好ましいＤＮＡ塩基配列に対するコーデイングストランドは以下の如くである。
　さらに目的を達成するため、そして本発明の目的に従つて、上に掲げた天然または合成ＤＮＡ塩基配列を用いて、本セリンプロテアーゼ阻害剤の微生物製造に帰着する組み換えＤＮＡ法を明らかにする。この組み換えＤＮＡ法は以下の項目を包含する。
　（ａ）宿主微生物を導き、セリンプロテアーゼ阻害活性、好ましくは白血球エラスターゼ阻害活性を持つタンパクの製造を行なうことができるＤＮＡ配列の調製。
　（ｂ）宿主微生物の中に導入され、複製することができるＤＮＡ塩基配列をクローニングすること。このようなベクターはＤＮＡ塩基配列に対するオペレーシヨナルエレメント（操作要因）を含んでいる。
　（ｃ）ＤＮＡ塩基配列とオペレーシヨナルエレメントを含むベクターをプロテアーゼ阻害タンパクを発現することができる宿主微生物の中に移すこと。
　（ｄ）ベクターの増幅と阻害剤の発現のため適切な条件下でその微生物を培養すること。
　（ｅ）阻害剤を収穫すること；そして
　（ｆ）阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害活性を有する活性三次構造をとれるようにすることである。
　本発明において使うための天然のＤＮＡ塩基配列の同定単離を容易にするため、本発明者達はヒト耳下腺組織ｃＤＮＡライブラリーを開発した。このライブラリーは、細胞が本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤を合成するようにしむけることができる遺伝情報を含んでいる。ここに述べられた組み換えＤＮＡ法に用いられることがある他の天然ＤＮＡ塩基配列は、ヒト・ジエノミツクライブラリーから単離することができる。
　本発明の過程において役に立つ合成塩基配列は、ポリヌクレオチドの合成と、この道の普通の技量を持つた人人にとつて知られている配列を行なう技術によつて作ることができる。先に述べた過程において、有用な天然のＤＮＡ塩基配列は、以下の項目を含む方法によつて同定・単離することができる。
　（ａ）細胞から、好ましくは耳下腺の細胞からセリンプロテアーゼ阻害剤を発生することができるヒトｃＤＮＡライブラリーを調製すること。
　（ｂ）プロテアーゼ阻害剤の遺伝子またはそのタンパク生産物に結合することができる少なくとも１つのプローブでヒトＤＮＡライブラリーをプローブすること。
　（ｃ）クローンが遺伝子又はそのタンパク生成物に対する、少くとも１つのプローブに結合する能力によつて、阻害剤をコードしている遺伝子を含む少なくとも１つのクローンを同定すること。
　（ｄ）同定されたクローンから阻害剤をコードしている遺伝子の単離、そして
　（ｅ）遺伝子またはそれについての適切な断片を宿主の微生物の遺伝子を維持し、表現することに必要なオペレーシヨナルエレメントにつなぐこと。
　前に述べた過程において、有用な天然のＤＮＡ塩基配列も、以下の項目を含む方法によつて同定・単離できる。
　（ａ）宿主
ｒｅｃ　
ｒｅｃ　
　Ｅ．ｃｏｌｉ　
　（ｂ）ヒト・ジエノミツクＤＮＡライブラリーをセリンプロテイン阻害剤遺伝子に結合することができるか、そのタンパク生成物に結合することができる少くとも１つのブローブでプローブすること。
　（ｃ）遺伝子又はそのタンパク産物に対する少くとも１つのプローブに結合するクローンの能力によつて阻害剤をコードする遺伝子を含む少くとも１つのクローンを同定する。
　（ｄ）同定されたクローンから阻害剤をコードする遺伝子を単離する。そして、
　（ｅ）遺伝子もしくは適当なその断片を宿主微生物中の遺伝子を維持し発現するのに必要なオペレーシヨナルエレメントにつなげること。
　さらに、目的を達成するため、そして本発明の目的に従つて、セリンプロテアーゼ阻害剤の薬剤的に有用なアナログは上に詳述した遺伝子組み換えＤＮＡ法により、適切なベクターにクローニングを行なつて、適切な宿主微生物に移した場合、欲しいアナログの発見を誘導できる遺伝子をつくり出すために、上に列挙した組み換えＤＮＡ技術を通じて合成的なＤＮＡ塩基配列もしくは天然ＤＮＡ断片を変えることにより生産することができる。
　さらに、目的を達成するために、そして本発明の目的に従つて、本発明に従つた組み換えプロテアーゼ阻害剤、もしくは上に述べた、組み換えＤＮＡ法で生産された生物活性を有するアナログを活性成分として含んでいる薬剤組成物を明らかにする。
　本発明に組み込まれていてこの出願の一部をなしている添付されている図は、この発明に役立つ種々のプラスミツドを図解し、同時に、本発明の原理を説明するのに役立つ記述を含んでいる。
図の簡単な記述
　第１図は、プラスミドｐＳＧＥ６の地図である。
　第２図は、プラスミドｐＳＧＥ８の地図である。
　第３図は、プラスミドｐＧＳ２８５の地図である。
　第４図は、プラスミドｐＧＳ４８５である。
好ましい実施態様に関する記述
　現在において提出した発明の実施態様について、今、詳細に述べよう。それらは、あとに続く実施例とともに本発明の原理を説明するのに役に立つ。
　上に記したように、本発明は精製した形で単離されたプロテアーゼ阻害剤に関するものである。望ましくは、本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤は、一本鎖ポリペプチドタンパクであり、ヒト・耳下腺分泌物から単離された天然のセリンプロテアーゼ阻害剤に実質的に同族であるかもつとも好ましくは生物学的に等価である。特許明細と請求範囲を通じて使われている“生物学的に等価”とは、組成物は、プロテアーゼによつて誘起された、同じ型の組織の損傷を防ぐことができるが、必ずしも天然プロテアーゼ阻害剤と同程度ではないということである。あとに続く明細と請求範囲を通じて使用されている“実質的に相同”とは、天然の耳下腺阻害剤に対して以前に報告されている一本鎖ペプタイドセリンプロテアーゼ阻害剤によつて示された相同性以上の相同性のことである。
　好ましくは、相同性の程度が４０％より大きく、最も好ましくは５０％より大きく、特別に好ましい群のタンパクは天然耳下腺阻害剤との相同性が６０％より大きい。上に記述したような百分率の相同牲は、２つの配列のうちの小さい方に見出された成分の百分率として計算されており、２つの配列のうちの大きい方でも、同じことがみつかるかもしれない。この成分は４つの続いたアミノ酸の配列として理解されているものである。
　本発明の組み換え法によつて製造される好ましいプロテアーゼ阻害剤は、Ｒｏｂｅｒｔ　Ｃ．Ｔｏｍｐｓｏｎ　
ｅｔ．ａｌ
　　　　　　　
　これらの特性を持っている好ましいセリンプロテアーゼ阻害剤のアミノ酸の配列を検討し、その配列を以下の如く決定した。
　上記の略号は、ポリペプチド中のアミノ酸残基に次の如く対応する。
　ここに明らかにされた組み換えＤＮＡ法によつて製造されたこれらのプロテアーゼ阻害剤は１つ以上の区別できるドメインを持つていることが発見された。１つ以上の区別できるドメインとは、そのタンパクが異なる酵素に対して機能する複数の活性部位を持つているということである。これらの場所の存在と位置づけは、プロテアーゼ阻害剤の少くとも２つの部分の間には、実質的な相同性があることが発見されたことによつて決定された。区別できるドメインの存在が、本プロテアーゼ阻害剤に白血球エラスターゼもトリプシンも含む広い範囲のセリンプロテアーゼを阻害する能力を与えていると考えられる。
　さらに、これらプロテアーゼ阻害剤のはつきりしたドメインの複数性のために、プロテアーゼ阻害剤が附加的特性をもつプロテアーゼ阻害剤をつくるために、さまざまな他の活性部位がその上に構築されるような枠組みとして役立つかもしれないということが注目された。好ましい本発明の具体化は、白血球エラスターゼ、カテプシンＧ、膵臓のエラスターゼとトリプシンを阻害するプロテアーゼ阻害剤の生産を含んでいる。これらの酵素はすべて共通のメカニズムと多くの構造的特徴を共有しているセリンプロテアーゼとして知られているプロテアーゼのクラスのメンバーである。本発明によつて生産されたプロテアーゼ阻害剤において、小数のアミノ酸側鎖を細工することによつて阻害剤の複合性が創り出され、各々が全体のクラスのセリンプロテアーゼの少くとも１員を阻害することができると考えられる。その上、このような側鎖の修飾は、上に述べたような特定のセリンプロテアーゼのクラスのメンバーに関して阻害活性が改善されている複数性の阻害剤を産出することが期待できる。
　これらの目標を達成するのに必要なアミノ酸の側鎖の変化は、本発明によつて生産された好ましい阻害剤と阻害剤の重要な機能部分がＸ−線結晶学によつて解明された他のセリンプロテアーゼ阻害剤の間の構造類似性の特定の要素によつて示唆される。構造的類似牲のこれらの要素は上述の本発明によつて製造された好ましいセリンプロテアーゼ阻害剤のアミノ酸１７から２９及び７０から８３を含んでいる。量的か質的かのいずれかにおいて、トリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤の活性を改良するために示唆された変化は、２０番目のアミノ酸をＡｒｇからＰｈｅ、ＴｙｒあるいはＴｒｐ、７２あるいは７４番目のアミノ酸をＬｅｕから、ＬｙｓまたはＡｒｇ、そして７３番目のアミノ酸をＭｅｔからＬｙｓまたはＡｒｇへ変換することの１つもしくはそれ以上を含んでいる。
　カテプシンＧをはじめとするキモトリプシン様セリンプロテアーゼに対する活性を、量的又は質的に改善するべく示唆された変化は、アミノ酸２０をＡｒｇからＰｎｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐへ、アミノ酸７２または７４をＬｅｕからＰｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐへ、そしてアミノ酸７３をＭｅｔからＰｈｅ、ＴｙｒもしくはＴｒｐへ変換することを、１つもしくはそれ以上行なうことを含んでいる。
　膵臓のエラスターゼ様セリンプロテアーゼに対する阻害剤の活性を、量的もしくは質的に変えるべく示唆された変化は、アミノ酸２０をＡｒｇからＡａｌへ、７２または７４番目のアミノ酸をＬｅｕからＡｌａへ、そして７３番目のアミノ酸をＭｅｔからＡｌａへ変換することの１つ又はそれ以上を含んでいる。
　本発明の実施例にあたつては、本発明のタンパクに新しいプロテアーゼ阻害活性を付与するためのアミノ酸の変更は、白血球エラスターゼもしくはトリプシンに対する阻害剤の活性を破壊するかもしれないということを心にとめておかねばならない。このような効果は本発明の教えに従つて行なわれる型通りの実験によつて決定されよう。
　さらに、上に提出されたように、特定のアミノ酸もしくは特定のアミノ酸の配列を置換すると、一方では強化されないドメインの活性を幾分か犠牲にすることになるが、本発明のプロテアーゼ阻害剤の白血球エラスターゼもしくは、トリプシン阻害活性のいずれかを増強するかもしれないということが考えられる。事実：阻害タンパクの中のどの領域の活性も、適切なアミノ酸置換によつて完全に除去され、その際、それに対して通常そのタンパクが活性がある１つか、もしくはいくつかの酵素のサブセツトに対して、特異性のあるタンパクをつくるかもしれない。例えば、７３の位置のＭｅｔに対し、Ｇｌｙを置換するか、もしくは、７２か、７４の位置のＬｅｕに対してＧｌｙを置換すると、白血球エラスターゼ阻害ドメインを不活性化するが、２０の位置のＡｒｇに対しＧｌｙを置換するとトリプシン阻害ドメインを不活性化する。これらドメインはまた、各々が望ましい阻害機能を保持する、別々のタンパクに分けることもできる。本発明の請求範囲は、これらの手段によるこのような阻害剤を生産する他の工程に対しても拡張される。
　本発明者らは、上に議論したプロテアーゼ阻害剤の細胞内生産を導き行なうことができる合成的ＤＮＡ塩基配列を発見した。この塩基配列は、次のような構造をもつている。
　この中で、ヌクレオチドは、下記のような略号で表されている。
　本発明者らは、上に議論したプロテアーゼ阻害剤、とりわけ、上述の分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）の細胞外生産を導き行なうことができる２番目の好ましい合成ＤＮＡ塩基配列を発見した。この塩基配列は次のような構成をもつている。
　上に注意したように、本プロテアーゼ阻害剤の複合的ドメイン構造のため、上に議論したようなセリンプロテアーゼ阻害剤の類縁体生産を導くことができるＤＮＡ配列を結果として生ずる、ここに提出する合成的ＤＮＡ配列に変化を与えることが考えられる。
　特に本発明に従つて組み換えＤＮＡ技術によつて生産されたセリンプロテアーゼ阻害剤の好ましい類縁体は、次のアミノ酸配列をもつている。
ここで
　Ｒ１とＲ７は同一か、異なつたものであり、置換もしくは無置換アミノ酸残基もしくはその誘導体から成立つ群から選ばれている。そして
　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８及びＲ９は同一か異なつたものであり、メチオニン、バリン、アラニン、フエニールアラニン、チロシン、トリプトフアン、リジン、グリシン及びアルギニンからなる群から選ばれる。
　上に示されたＤＮＡ塩基配列は、本発明の好ましい具象化を表していることに注目すべきである。ジエネテイツクコードの縮重のためにヌクレオチドの多数の選択、本プロテアーゼ阻害剤、もしくはその類縁体の生産を導き行なうことができるＤＮＡ塩基配列に導く多数のヌクレオチドの選択がなされうるということが理解されるべきである。上に提出した塩基配列に対し、機能的に同等であるＤＮＡ塩基配列もしくは上に提出したアミノ酸配列に従つて生産されたプロテアーゼ阻害剤のアナログの生産を導き行なうであろうところの配列に機能的に等価である配列は、それ自体で本発明の中に包含されるものとする。以下の図式は、縮重したジエネテイツクコードの結果として考えられるコドンの置換の例として、上に数え上げた好ましいアミノ酸配列の製造のための本発明の範囲に含めることを意図した追加のＤＮＡ配列である。このタンパクの生産に対する等価ＤＮＡ塩基配列を決定するための例を辿ることによつて、この道の普通のわざを持つた人々なら、好ましいアミノ酸配列の類縁体の生産のための等価なＤＮＡ塩基配列も決定できる。
　上の配列においては、用いられる略号は下に示されるヌクレオチドを表わすよう意図されている。
　すぐ上にかかげたものを含め、本発明の合成ＤＮＡ塩基配列において用いられる遺伝暗号を選択する場合に、特定のアミノ酸を指示するのに用いられる遺伝暗号は高度に発現されるタンパクと関連するものであることが望ましい。これらの望ましい遺伝暗号は１部Ｇｒａｎｔｈａｎ，Ｒ　
ｅｔ　ａｌ．
９
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　さらに、本発明のプロテアーゼ阻害剤の類縁体の生産を導き行なうことが出来る追加の合成ＤＮＡ塩基配列をつくり上げるための合成ＤＮＡ塩基配列の変換を容易にする遺伝暗号を選ぶことが望ましい。特に、もし可能なら、制限酵素、エンドヌクレアーゼの切断位置を、追加の遺伝暗号を挿入することが望ましい合成ＤＮＡの位置の近くに、もしくは類縁体が作られるように遺伝暗号を取り換えることが望ましい位置に、もつてくることができるようにヌクレオチド配列を選ぶことが望ましい。本発明のＤＮＡ配列の望ましい実施態様においては、制限酵素の切断位置が上に示したヌクレオチド配列の下に示してある。
　ここに考えられている合成ＤＮＡ配列をつくり出す方法は、一般的に、最近の報告によつて導かれたこの道の普通のわざの１つによつて遂行される型通りの業務の範囲内にある。ここで明らかにした合成ＤＮＡ塩基配列を得るために用いられる適切な方法の例は、Ｍａｔｔｅａｃｃｉ，Ｍ，Ｄ，とＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
１０３
２２
　本発明の代替的実施態様において、１つのＤＮＡ塩基配列が、本発明の望ましい分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）をコードするヒト・ジエノミツクライブラリーから単離された。この４番目の遺伝暗号からコードされ、現在発明者らに知られているイントロン（介在配列）を含むこの塩基配列は以下の通りである。
この配列においては、アミノ酸残基に用いられた１文字の略号は普通に用いられており、例えば、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒによる
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　この塩基配列とここに含まれるアミノ酸配列データーを用いて、上のジエノミツク配列に加えられた場合、全プロテアーゼ阻害剤をコードする遺伝子に到達する合成ＤＮＡ配列が構築できる。そのかわりに、上に示したＤＮＡ塩基配列を用いてプローブを作り、最初の３つのアミノ酸に対するコドンを持つている、ヒトジエノミツクライブラリーから、ＤＮＡ断片を回収するのに用いた。
　このようなプローブは、それに加えて適切なリーダー配列を含むヒトジエノミツク配列を同定するのに用いられる。このリーダー配列、または、どの他の適切なリーダー配列も、ＤＮＡジエノミツク配列と併用して、哺乳動物の発現システムに用いられると考えられる。
　本発明のもう１つの別法としての具体化において、本発明の好ましい分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤の細胞内生産を導き行なうことができるＤＮＡ配列をコードする耳下腺ライブラリーからｃＤＮＡクローンを単離した。このクローンはＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．
　　　　　　　
　セリンプロテアーゼ阻害活性を有する少なくとも１つの活性部位をもつ１本鎖ポリペプタイドから構成されている１つのプロテアーゼ阻害剤の製造に対する組み換えＤＮＡ法が明らかとなつた。発明の１つの具体化において、この活性部位は、ヒト・耳下腺分泌物から単離された天然の白血球エラスターゼ阻害剤の活性部位と生物学的に等価な方法で機能する。天然又は合成ＤＮＡ塩基配列は、プロテアーゼ阻害剤の直接生産に用いることができる。この方法は、以下の工程を含む。
　（ａ）宿主微生物が、セリンプロテアーゼ阻害剤活性をもつているタンパクを生産するよう導くＤＮＡ塩基配列の調製。
　（ｂ）ＤＮＡ塩基配列を宿主に移し増殖することができるベクターにそのＤＮＡ塩基配列をクローニングすること。このようなベクターは、そのＤＮＡ塩基配列に対してオペレーシヨナルエレメントを含んでいる。
　（ｃ）合成ＤＮＡ塩基配列とオペレーシヨナルエレメントを含むベクターをプロテアーゼ阻害剤を発現することができる宿主微生物に移す。
　（ｄ）その微生物をベクターの増殖と阻害剤の発現に適切な条件下で培養すること。
　（ｅ）阻害剤を収穫すること。そして、
　（ｆ）阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害活性を持つ、活性３次構造をとれるようにすること。
　この方法における使用のために考えられた合成ＤＮＡ塩基配列が、上に詳細に検討された。代替的実施態様において、この方法で天然のＤＮＡ塩基配列も使うことができるということが更に考えられる。これらの配列には、ｃＤＮＡもしくはジエノミツクＤＮＡ断片が用いられる。この実施態様のより好ましい変形として天然のＤＮＡ配列は、以下の項目を含む方法によつて得られる。
　（ａ）セリンプロテアーゼ阻害剤を生成できる細胞、さらに望ましくは、耳下腺の細胞からヒトのｃＤＮＡライブラリーを調製する。
　（ｂ）プロテアーゼ阻害剤遺伝子もしくはそのタンパク産物に結合することができる少くとも１つのプローブで、ヒトＤＮＡライブラリーを検索する。
　（ｃ）そのクローンが遺伝子もしくはそのタンパク産物に対する、少くとも１つのプローブと結合する能力によつて阻害剤をコードする遺伝子を含む少くとも１つのクローンを同定する。
　（ｄ）選ばれた単一クローンもしくは複数のクローンから阻害剤をコードする遺伝子の単離。
　（ｅ）遺伝子もしくはその適切な断片を宿主微生物中の遺伝子を維持し、発現するために必要なオペレーシヨナルエレメントにつなげること。
　前出の工程において、有用な天然のＤＮＡ塩基配列も以下の工程を経て同定単離される。
　（ａ）より好ましくは、宿主
ｒｅｃ　
ｒｅｃ　
　Ｅ．ｃｏｌｉ
　（ｂ）ヒトジエノミツクライブラリーをセリンプロテイン阻害剤遺伝子、もしくは、その生産物に結合することができる少なくとも１つのプローブを用いて検索する。
　（ｃ）そのクローンが遺伝子またはタンパク産物に対する少なくとも１つのプローブに結合するクローンの能力によつて阻害剤をコードする遺伝子を含む少くとも１つのクローンを同定する。
　（ｄ）同定されたクローンからの阻害剤をコードする遺伝子を単離する。
　（ｅ）遺伝子もしくはその適当なフラグメントを宿主微生物中の遺伝子を維持し、表現するのに必要なオペレーシヨナルエレメントにつなげること。
　上にかかげた方法を用いるのに、適切な天然のＤＮＡ遺伝子を単離するにあたり、適当な遺伝子の両端部分、すなわち遺伝子の断面の内側または最も近い部分に位置している２つの制限酵素切断部位を同定することがより好ましい。適切な遺伝子を含むＤＮＡ断片を次に適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、ゲノム物質の残りから除去する。切り出した後、セリンプロテアーゼ阻害剤タンパクのＮ−及びＣ−末端にコードすることができ、またそのＤＮＡ配列をそのオペレーシヨナルエレメントに融合させることができるように、ＤＮＡ配列の３′及び５′末端は再構築される。
　本発明において、使用のため考えられるベクターは、優先されるか、もしくは、必要となるオペレーシヨナルエレメントとともに、上の検討したようなＤＮＡ塩基配列が挿入され、又そのベクターが、その後宿主微生物に移され、その微生物中で複製出来るような、ベクターすべてを含む。より好ましいベクターは、その制限酵素切断部位がよく報告されていて、ＤＮＡ塩基配列の転写に、より好まれるか、もしくは必要である、オペレーシナルエレメントを含んでいるようなベクターである。
　ここで検討されるオペレーシヨナルエレメントには、少なくとも１つのプロモーター、少くとも１つのオペレーター、少くとも１つのリーダー配列、少くとも１つのシヤイン−ダルガーノ配列、少くとも１つの停止コドン及びベクターＤＮＡの適切な転写とその次の翻訳に必要か、より好ましい他のＤＮＡはすべて含まれる。特に、このようなベクターは、少くとも１つの選択可能なマーカーとともに、宿主微生物によつて認識される複製の少くとも１つの起点、及び合成ＤＮＡの塩基配列の転写を始めることが出来る少くとも１つのプロモーター塩基配列を含んでいると予測されている。ベクターは、ある実施態様においては、レギユレーターとして機能することができるあるＤＮＡを含み、レギユレータープロテインをコードすることができる他のＤＮＡ塩基配列を含んでいることが、さらに、より好ましい。これらのレギユレーターは、１つの実施態様においては、ある環境条件の存在下でＤＮＡ配列の発現を防ぐのに役立ち、他の環境条件では転写と、続いて起る合成ＤＮＡ塩基配列によつてコードされたタンパクの発現が行なわれる。とりわけ、例えば、イソプロピルチオー−ｄ−ガラクトシツドが存在しないと、合成ＤＮＡの発現が起らないようなベクターのなかには調節断片が挿入されることがより好ましい。この状況下では、合成ＤＮＡを含む形質転換した微生物は、プロテアーゼ阻害剤の発現がはじまる以前にある望ましい密度まで育てられるかもしれない。この実施態様においては、望ましいプロテアーゼ阻害剤の発現は、望ましい密度が達された後にＤＮＡ塩基配列の発現を起すことができるある物質を微生物の環境に加えることにより誘導される。
　それに加えて、ベクター中か、もしくは合成ＤＮＡ配列の５′末端に、適切な分泌リーダー配列が存在することがより望ましい。リーダー配列は、リーダー配列がプロテアーゼ阻害剤の発現を導くことができるヌクレオチド配列のはじめの部分に、翻訳停止シグナルを間にはさまずに、すぐに隣りあつていることができるような位置にある。リーダー配列の存在は、一部には以下の理由のうち１つかそれ以上の理由から、望まれる。１）リーダー阻害剤が存在すると、宿主が初期の生産物を成熟した組み換えプロテアーゼ阻害剤に仕上げることを容易にするかもしれない。２）リーダー配列の存在は、プロテアーゼ阻害剤を細胞質の外へ導くことにより、組み換えプロテアーゼ阻害剤の精製を容易にするかもしれない。３）リーダー配列の存在は、組み換えプロテアーゼ阻害剤が、プロテアーゼ阻害剤を細胞質の外へ導くことを通じてその活性構造へ組み込まれる能力に影響を与えるかもしれない。
　とりわけ、リーダー配列は、最初の産物をリーダーぺプチダーゼによつて、リーダー配列を除去し、セリンプロテアーゼ阻害活性の潜在力をもつより好ましいポリペプタイドを残すため、初期の翻訳産物の開裂を導く。宿主微生物のある種においては、適切なリーダー配列の存在により
Ｅｓｃｈｅｒｌｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　
Ｂａｃｉｌｌｉ　
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
　３番目に、本発明によつて調製されたプロテアーゼ阻害剤の中のあるものの場合には、完成されたタンパクを適切なエラスターゼ阻害剤活性をもつ活性性構造をとるように組み込まれる環境のなかに位置させることに、リーダー配列の存在が必要である。
　それ以上のオペレーシヨナルエレメントには、そればかりではないが、リボゾーム結合部位と余所者タンパクの微生物発現のために必要な他のＤＮＡ配列がふくまれる。本発明のより好ましい具体例においては、ＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡ（ＡＴＧ）の配列がリボゾーム結合部位として用いられるであろう。この中で検討された、オペレーシヨナルエレメントは、以前の文献や、ここに含まれている教訓に照らしてバイオテクノロジーの普通の技能をもつた人々によつて型通りに選ばれる。これらのオペレーシヨナルエレメントの一般的例は、Ｂ．Ｌｅｗｉｎ，
Ｇｅｎｅｓ　
　現在の発明のより好ましい実施態様において、プロテアーゼ阻害剤をコードする合成ＤＮＡ配列のすぐ前に、さらにあらたなＤＮＡ配列が位置している。この追加のＤＮＡ配列は、翻訳カツプラーとして機能することができる。即ち、それはリボゾームをそれが隣り合つて並んでいるプロテアーゼ阻害剤ＲＮＡのリボゾーム結合部位のすぐ隣りにリボゾームを位置させるのに役立つＲＮＡをコードしているＤＮＡの配列である。本発明の１つの実施態様において、翻訳カツプラーは、ＤＮＡ配列ＴＡＡＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＣＧＧＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＧを使用し、翻訳カツプラーに関連したその道の普通のわざをもつた人々にとつて現在知られている方法を使つて導き出すことができる。２番目の好ましい翻訳カツプラーはＴＡＡＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧ．のＤＮＡ配列をもつている。
　上に検討したベクターの、すべての必要なそして望ましい成分要素の合成と単離ができたところで、ベクターはその道の普通の技能をもつ人々に一般に知られている方法によつて組立てられる。このようなベクターの組立ては、その道の普通の技能をもつた人々によつて遂行される義務的職務の範囲内にあると信じられており、そしてそれ自体、特別むずかしい実験をしなくても遂行できる。例えば、参照として特別に本出願に加えたＳｈｏｎｅｒらＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ．Ｓ．Ａ．，
８１
　本発明のクローニングベクターの構築において、合成ＤＮＡ配列の多重コピーとその付随のオペレーシヨナルエレメントが各ベクターに挿入されるかもしれないということが、つけ加えて注目されるべきである。このような実施態様においては、宿主生物は、望まれるプロテアーゼのベクターあたりのより大きな量を生産するであろう。ベクターの中に挿入され得るＤＮＡ配列の複数のコピーの数は、結果としてできたベクターは、その大きさのため、適切な宿主微生物に移されたり、その中で複製したり転写されたりする能力によつてのみ制限を受ける。
　さらにつけ加えて、ベクターが、薬剤抵抗性マーカーや宿主微生物による特性の発現の原因となる他のマーカーのような選択可能なマーカーを含んでいることがより望ましい。本発明の特に望ましい実施態様において、テトラサイクリン抵抗性に対する遺伝子がクローニングベクターに優先的に含まれている。
　このような薬剤抵抗性や他の選択可能なマーカーは、部分的にトランスフオーマントの選択を容易にすることを意図している。それに加えて、クローニングベクターの上の、このような選択可能なマーカーの存在は、混入した微生物が培地中で増殖するのを防ぐのに役立つかもしれない。この実施態様において、この形質転換した宿主徴生物の純粋な培養は、生き残るのに誘導した表現型を必要とする条件下で微生物を培養することによつて得られるであろう。
　このようにして得られたベクターは、次に適切な宿主微生物に移される。外生のＤＮＡを取り込んで、それらの遺伝子や付随するオペレーシヨナルエレメントを発現する能力を持つた微生物はすべて選ばれてよいと信じられている。宿主微生物は、通性嫌気性または好気性菌であることがより望ましい。この方法における使用に好ましい特別な宿主は、酵母と細菌である。特定の酵母は、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｖｉｓｉａｅ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ
　宿主微生物が選ばれた後、ベクターはその道の普通の技能をもつ人々によって、一般的に知られている方法を用いて宿主微生物に移される。このような方法の例は、Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ　
ｅｔ　ａｌ．
　組み換えセリンプロテアーゼ阻害剤が終局的に酵母中で発現される場合を考えると、クローニンクベクターを、まず
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
Ｅ．Ｃｏｌｉ　
　宿主微生物は、セリンプロテアーゼ阻害剤の発現に対して適切な条件下で培養される。これらの条件は、一般に宿主微生物にとつて特異的であり、例えば、Ｂｅｒｇｅｙ′ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，８ｔｈ　Ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄのような微生物のための生育条件に関する出版された文献に照らして、この道の普通の技能をもつた人人によつて容易に決められる。この文献は参照としてここに特別に組み込まれている。
　ベクターの中に挿入された、又は存在するオペレーシヨナルエレメントすべてに応じて、ＤＮＡ配列の表現の調節に必要な条件は、すべて形質転換と培養の段階で効果をもつであろう。１つの実施態様においては、細胞はＤＮＡ配列の発現を阻害する適切な調節条件において、高密度迄育てられる。最適の細胞密度に近づいたとき、環境条件は、合成ＤＮＡ配列の発現に対して適切な条件に変えられる。このようにして、プロテアーゼ阻害剤の生産条件は、宿主の細胞がほゞ最適密度に近づいたあとの時期で起り、そして結果として生ずるプロテアーゼ阻害剤は、その発現に必要な調節条件が誘起された後、しばらくしてから収穫されると考えられる。
　本発明のより望ましい実施態様において、組み換えプロテアーゼ阻害剤は、収穫の後、そしてその活性構造をとる以前に精製される。発明者は、リフオルデイング済みのタンパクの高収率回収は、タンパクが先ず精製される場合に、容易に得られると信じているので、この実施態様がより望ましい。しかし、１つのより好ましい代替的実施態様においては、プロテアーゼ阻害剤は、その活性構造をとるべく、リフオルデイングするのにまかせてから精製することがある。さらにもう１つのより好ましい代りの実施態様においては、プロテアーゼ阻害剤は、培養液から回収するとき、リフオルデイングの済んだ活性な状態で存在している。
　ある条件では、プロテアーゼ阻害剤は、宿主微生物での発現、そしてそのタンパクの細胞壁を通過しての輸送又は膜を通つて細胞周辺腔への輸送の際に、そのしかるべき活性な構造をとつている。これは、一般的に適切なリーダー配列をコードするＤＮＡが、組み換えプロテインをコードするＤＮＡにつながつていると起る。プロテアーゼ阻害剤が、その適切な活性構造をとらない場合は、形成したどのジスルフイド結合も、そして／または、どの生じた非共有結合的相互作用も、変性試薬や還元試薬、例えば、グアニジウムクロライド、−メルカプトエタノールによつて先ず破壊してから、プロテアーゼ阻害剤をコントロールした条件においての希釈及びこれらの試薬の酸化に続いてその活性構造がとれるようにする。
　本発明の教示を特定の問題や環境に応用することは、ここに含まれた知見に照らして、この道の普通の技能をもった人の能力の範囲内にあるということが理解されるべきである。本発明の生産物とそれらの単離、製造に対する代表的工程が以下の例にみられる。
例１
　上記のアミノ酸配列、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ
タンパク質を
Ｅ．ｃｏｌｉ　
ｔａｃ
ｌａｃ
ｌａｃ
ｌａｃ
　タンパクが
Ｅ．ｃｏｌｉ　
ｔａｃ
ｌａｃ
ｌａｃ
Ａ．
遺伝子断片の構築
　上の配列を組み立てるため、次のデオキシリボヌクレオチドがＡＢＩ　ＤＮＡシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて合成される。合成産物は、ＡＢＩ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　ｍａｎｕａｌ中に記述してあるように、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて精製される。それらを、標準の方法に従つてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′をリン酸化した。
　次下のグループのオリゴヌクレオチド配列がフラグメント（断片）Ａａを組み立てるために使用される。
　以下のオリゴヌクレオチド配列が、組み立てられ、断片Ａｂが作られる。
　以下は、断片Ｂを構築するために組立てられるオリゴヌクレオチド配列である。
　以下は断片Ｃを構築するために用いられるオリゴヌクレオチド配列である。
　以下のグループのオリゴヌクレオチド配列が組立てられて断片Ｄが作られる。
　以下のグループのオリゴヌクレオチドを混合し、標準条件下でアニーリングを行ない、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて標準条件下で互い同志及び適切な制限酵素エンドヌクレアーゼで切つたクローニング及びケーシングベクターＭ１３ｍｐ１８及び１９につなげる。出来上つたものを、
Ｅ．Ｃｏｌｉ　
　グループＡａは、
Ｐｓｔ
Ｈｉｎ
Ｐｓｔ
Ｈｉｎ
Ｈｉｎ
Ｂａｍ
Ｂａｍ
Ｘｂａ
Ｂａｍ
Ｓａｌ
　Ｍ１３複製型のＤＮＡを、標準的手法によつて目的とする挿入ＤＮＡを持つているクローンから回収する。グループＡａに相当する挿入ＤＮＡを適切な制限酵素エンドヌクレアーゼで、Ｍ１３ＤＮＡから切り取る。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて精製する。その構造は以下の通りである。
　グループＡｂに相当する挿入ＤＮＡを、制限酵素エンドヌクレアーゼ
Ｅｃｏ
Ｈｉｎ
　グループＢに相当する挿入ＤＮＡを制限酵素、エンドヌクレアーゼ、
Ｈｉｎ
Ｂａｍ
　グループＣに相当する挿入ＤＮＡを
Ｂａｍ
Ｂｇｌ
　グループＤに相当する挿入ＤＮＡを制限酵素
Ｓａｕ
Ｓａｌ
Ｂ．遺伝子の構造
　外部への輸送のための組み立てには、グループＡａ、Ｂ、Ｃ及びＤを標準条件下で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、
Ｅｃｏ
Ｓａｌ
　細胞質での発現のための組み立てにおいては、グループＡｂ、Ｂ、Ｃ、及びＤからの挿入配列を合せて、標準条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、
Ｅｃｏ
Ｓａｌ
例２
　上に述べたアミノ酸配列、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ
　
Ｅ．Ｃｏｌｉ
ｔａｃ
ｌａｃ
Ｅ．Ｃｏｌｉ　
ｌａｃ
ｌａｃ
　生成タンパクが、
Ｅ．ｃｏｌｉ　
ｔａｃ
ｌａｃ
Ｅ．ｃｏｌｉ
ｌａｃ
Ｃ．遺伝子フラグメントの構築
　上述の配列を組み立てるため、以下のデオキシリボヌクレオチドをＡＢＩ　ＤＮＡシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使つて合成した生成物を、ＡＢＩインスツルメンタルマニユアルに記述されているように、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて精製する。それらは、標準的手段によつてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰを用いて５′をリン酸化する。
　以下のオリゴヌクレオチド配列をフラグメントＡａを組み立てるために用いる。
　以下の、オリゴヌクレオチド配列を組立て、断片Ａｂをつくり上げる。
　以下は、断片Ｂを構築するために組み立てられるヌクレオチド配列である。
　以下は断片Ｃを組み立てるために使用されるヌクレオチド配列である。
　以下のグルーブのオリゴヌクレオチドが断片Ｄを形成するために組立てられる。
　以下のグループのオリゴヌクレオチドを混合し、標準条件下でアニーリングを行ない、互い同志で、又、適当な制限酵素エンドヌクレアーゼで切つたクローニング及び配列形成ベクターＭ１３ｍｐ１８と１９に、標準条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてつなげる。この生成物は、
Ｅ．ｃｏｌｉ　
　オリゴヌクレオチドＡａ１−Ａａ４を、
Ｅｃｏ
Ｂａｍ
Ｅｃｏ
Ｐｖｕ
　オリゴヌクレオチドＡａ５とＡａ６は、
Ｂａｍ
Ｈｉｎ
Ｐｖｕ
Ｈｉｎ
この
Ｐｖｕ
Ｈｉｎ
Ｅｃｏ
Ｈｉｎ
Ｅｃｏ
Ｈｉｎ
　オリゴヌクレオチドＡｂ１−Ａｂ４を
Ｅｃｏ
Ｂａｍ
Ｅｃｏ
Ｐｖｕ
　この
Ｅｃｏ
Ｐｖｕ
Ｅｃｏ
Ｈｉｎ
　オリゴヌクレオチドＢ１からＢ７までを含むグループＢを
Ｈｉｎ
Ｂａｍ
Ｈｉｎ
Ｂａｍ
　オリゴヌクレオチドＣ１からＣ９を含むグループＣを
Ｂａｍ
Ｘｂａ
Ｂａｍ
Ｂｇｌ
　オリゴヌクレオチドＤ１からＤ４までを含むグループＤをＢａｍＨＩとＳａｌＩで切つたＭ１３ｍｐ１８と１９につなぐ。グループＤに相当する挿入ＤＮＡを、制限酵素、エンドヌクレアーゼ
Ｓａｌ
Ｄ．遺伝子の構築
　外部への輸送のための組み立てにおいては、グループＡａ，Ｂ，Ｃ及びＤからの挿入配列を合し、
Ｅｃｏ
Ｓａｌ
例３
　発現ベクターの組み立て
　外部への輸出用と細胞質内発現用の組み立てに対する挿入配列を、次の如く発現プラスミドに移す。所用の挿入ＤＮＡをもつたＭ１３増殖型ＤＮＡを、上述の如く標準型手法で回収する。適切な挿入ＤＮＡを制限酵素、エンドヌクレアーゼ、
Ｅｃｏ
Ｐｓｔ
Ｅｃｏ
Ｐｓｔ
Ｅ．ｃｏｌｉ　　
Ｅ．ｃｏｌｉ　
Ａ．
ｐＳＧＥ６の編成
　プラスミドｐＳＧＥ６をｐＫＫ２２３−３の
Ｅｃｏ
ＯｍｐＡ
Ｅｃｏ
Ｐｓｔ
これから後、“ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩ”と呼ぶ配列は、上に述べた外部への輸送のためのＭ１３ｍｐ１８の最終構造からのＤＮＡである。プラスミドｐＳＧＥ６は、図１に描かれている。図１において、ｏｍｐＡｓｓ−ＳＬＰＩに対する最初のコドンは、“ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩ”と呼ばれるＤＮＡ配列の６２−６４の位置にある。成熟したＳＬＰＩに対する最初のコドンは、１２５−１２７に位置している。Ｐｔａｃは、ｔａｃプロモーター、ｌａｃオペレーター及びべーターガラクトーゼＳｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ配列のためのＤＮＡを含んでいる。略号、ＲＩ，Ｐｓｔ及びＢａｍは、制限酵素、
Ｅｃｏ
Ｐｓｔ
Ｂａｍ
Ｂ．
ｐＣＪ−ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩの編成
　プラスミドｐＣＪ−ｏｍｐＡ−ＳＬＰＩは、部分的でなく完全なテトラサイクリン遺伝子およびプロモーターを含んでいることを除いては、ｐＳＧＥ６と同じである。このプラスミドは、Ｅ．Ｃｏｌｉに挿入すると、テトラサイクリン耐性を附与し、ｏｍｐ　ＡＳＬＰＩをコードするＤＮＡを含む
Ｅｃｏ
Ｐｓｔ
Ｓｐｈ
Ｂａｍ
及び、ｐＢＲ３２２（ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，２７−４８９１−０１）のｔｅｔｒ遺伝子の
Ｃｌａ
Ｓｐｈ
Ｃ．
ｐＳＧＥ８の構造
　
Ｅｃｏ
Ｐｓｔ
Ｄ．
ｐＣＪ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩの編成
　プラスミドｐＣＪ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩは、それが（部分的ではなく）完全なテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいることを除けば、ｐＳＧＥ８と同じである。プラミドＣＪ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩは、ｏｍｐＡ−ｔｃ−ｍｅｔ−ＳＬＰＩをコードする
Ｅｃｏ
Ｐｓｔ
Ｅ．
酵母発現用プラスミドの組立て
　プラスミドｐＵＣ８を
Ｈｉｎ
Ｈｉｎ
Ｓｍａ
Ｈｉｎ
Ｈｉｎ
Ｓｍａ
Ｅ．ｃｏｌｉ　
Ｈｉｎ
Ｓｍａ
Ｅｃｏ
Ｓｍａ
Ｈｉｎ
Ｈｉｎ
Ｅｃｏ
Ｓｍａ
　酵母のＭＦ１遺伝子を含有している
Ｅｃｏ
３０
Ｅｃｏ
Ｅｃｏ
　Ｋｕｒｊａｎ＆Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（同前）によつて認められたように、ＭＦ１遺伝子中の内部の４個の
Ｈｉｎ
Ｈｉｎ
　例２において記述したように、合成ＳＬＰＩ遺伝子の４から１０７迄のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列になつているＭ１３ＡａＢＣＤを、
Ｈｉｎ
このアダプターは、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングによつて形成し、５′ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＧＧＴ　ＡＡＧ及び５′ＡＧＣ　ＴＣＴ　ＴＡＣ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＣＡＧＣ　先づ２分間７０℃に保ち、続いて、一夜かかつて徐々に冷す。
　このアダプターを
Ｈｉｎ
Ｈｉｎ
Ｓａｌ
Ｈｉｎ
Ｈｉｎ
Ｓａｌ
Ｈｉｎ
Ｓａｌ
Ｈｉｎ
８１
Ｅｃｏ
Ｅｃｏ
例４
プラスミドｐＳＧＥ６を用いての分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）の発現と精製。
　プラスミドｐＳＧＥ６（ＳＧＥ１０細胞）を含んでいる
Ｅ．ｃｏｌｉ　
　凍結ペレツトを、２０ｍＭのＤＴＴ（ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ−０６３２から入手）、４ｍＭのＰＭＳＦ（ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−７６２６）及び８Ｍ尿素（超高純度、ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５５０５ＵＡ）を含む２５ｍｌの１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）と４ｍＭのＥＤＴＡ（今後、Ｔ１００Ｅ４と略称する）で、３７℃、１時間抽出し、１０，０００×ｇで１０分遠心した。得られた上澄みを、あらかじめ２０ｍＭのＤＴＴと８Ｍ尿素を含む抽出緩衝液Ｔ１００Ｅ４で平衡処理（Ｐｒｅ−ｅｑｕｉｂｒａｔｅｄ）しておいた１０ｍｌの上澄みを除いたセフアデツクスｓｐ−ｃ２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手）と混ぜ、ローラーの上で３７℃で１０分混合し、ＳＬＰＩをＳＰ−セフアデツクスに吸収させる。
　吸収させたＳＬＰＩを含んだ樹脂を１０分間３，０００×ｇで遠心してペレツトとし、上澄みをデカントした。残つたセフアデツクスを２０ｍＭのＤＴＴと８Ｍ尿素を含む２５ｍｌのＴ１００Ｅ４で２回洗つてから２０ｍＭのＤＴＴを含む、２５ｍｌのＴ１００Ｅ４で２回洗つた。次にセフアデツクスを１回、２０ｍＭのＤＴＴと０．３Ｍの食塩を含む２５ｍｌのＴ１００Ｅ４で抽出した。この抽出物は、約０．１５ｍｇ／ｍｌのタンパクと、０．０４ｍｇ／ｍｌ以上のＳＬＰＩを含んでいた。この方法で得たＳＬＰＩは、高圧液体クロマトグラフイーにより７０％以上の純度であることが確定された。
例５
　例４の方法を用い、２番目の凍結ペレツトを最初のＴ１００Ｅ４／ＤＴＴ／ＰＭＳＦ／尿素の代りに、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｔ−６８７８から入手）を含むＴ１００Ｅ４で抽出した。得られたＳＬＰＩは、例４で得られたものより僅かに純度が高く、例６において述べるリフオルデイング・アツセイにおいて、より高い活性があつた。
例６
　精製ＳＬＰＩのリフオルデイング
　例４または５からの約４０μｇの部分的に精製したＳＬＰＩを尿素中８Ｍ、もしくはグアニジン塩酸塩中５Ｍ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，＃２４１１０）、そしてＤＴＴ中４ｍＭとして、室温で１時間温置した。酸化型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ−４６２６）を１３．５ｍＭになる迄加え、混合物を再び室温で１時間温置した。混合物をｐＨ１０．７の５０ｍＭトリス溶液で１０倍稀釈し、更に室温で４時間温置した。
それから、混合物をｐＨ８．０の５０ｍＭトリスと０．１５Ｍ食塩で５倍に稀釈し、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリスと、０．２５Ｍ塩化ナトリウムで前もつて平衡させた、セフアデツクスＳＰ−Ｃ２５の１×２ｃｍカラムにかけた。
　樹脂を０．２５Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ８．０の５０ｍＭトリスで洗い、それから０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリスで洗つた。０．５Ｍの塩の洗滌で溶出する区分は、十分に活性であり、カラムにかけたＳＬＰＩの約３０％を呈している。
例７
　ＳＧＥ３０細胞融解物の可溶区分不溶区分からのＳＬＰＩの精製。
　Ｅ．
ｃｏｌｉ
Ａ．不溶区からのＳＬＰＩの精製
　ｐＳＧＥ８を含む
Ｅ．ｃｏｌｉ
　ペレツトを３倍容量のＴ５０Ｅ４で洗い、１０Ｍ尿素か６Ｍグアニジン塩酸塩のいずれか、及び５ｍＭの還元型ＤＴＴを含む溶液で、室温で溶解させた。室温で１時間温置した後酸化型グルタチオンを１７．５ｍＭの濃度で加え、混合物をもう１時間温置した。それから混合物をｐＨ１０．７の１０倍容積量の５０ｍＭトリス−塩酸で希釈した。希釈混合物を室温で４時間放置後、５Ｎ塩酸を加えてｐＨを８に調節した。この混合物を遠心分離して、沈殿したタンパクを除いた。
　このようにしてできた上澄みは、分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤活性を示すＳＬＰＩを含んでいた。このタンパクを上に述べたようなセフアデツクスＳＰ−Ｃ２５カラム上のクロマトグラフイーで精製した。
Ｂ．
可溶区分からのＳＬＰＩの精製
　プラスミドｐＳＧＥ８を含む
Ｅ．ｃｏｌｉ
　上澄みをＤＴＴ中で２５ｍＭとし、この混合物を０℃で１時間温置し最終濃度が５％になる迄十分量の塩酸を加えた。０℃で３０分間温置した後、混合物を２５，０００×ｇで１５分遠心分離し、上澄みを除き次の工程にかけた。１０Ｍの水酸化ナトリウムで上澄みのｐＨを８．０に調整し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフイー及びエライサ（ＥＬＩＳＡ）法によつて精製及び分析を行ない、その結果、全タンパク１３０ＵＧあたり少くとも０．７ＵＧのＳＬＰＩが示された。それについて、例６に従つてリフオルデイングを行なった。
例８
　癒合ＳＬＰＩ−ＭＦ１遺伝子（例３Ｅ参照）を含む
Ｅｃｏ
Ｅｃｏ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
１０１
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＵＲＡ
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　２番目の株、ＳＧＹ−３も活性ＳＬＰＩを生産し、分泌する。この株は複製性酵母プラスミツドｐＧＳ５８５上にＭＦ１：　　：ＳＬＰＩ癒合をもつている。このプラスミドは、本出願に特別に参照文献として加えた、Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
１０１
ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，
ＵＲＡ
Ｈｉｎ
Ｅｃｏ
Ｅｃｏ
Ｘｈｏ
Ｓａｌ
１５３
　
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
　本発明の工程や生産物について、さまざまな改変を行なつたり変化を与えたりすることができることは、この道で技能をもつた人々にとつては明白である。したがつて、本発明は、附帯の請求範囲及びそれらの同等の範囲内にあるならば、その修飾や改変を包含することを意図するものである。
（５７）【特許請求の範囲】
　１．断片化されていない１本のポリペプチド鎖からなる組換えセリンプロテアーゼインヒビターの製造方法であって、同インヒビターはセリンプロテアーゼインヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位を有し、そして同インヒビターは以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりなるセリンプロテアーゼインヒビターの製造方法において、
（式中、Ｒ１およびＲ７は同一または異り、置換または非置換アミノ酸残基からなる群から選択され、そしてＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８およびＲ９は同一または異り、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択される）
　（ａ）セリンプロテアーゼインヒビターの産生を指示しうるＤＮＡ配列で形質転換した宿主細胞をＤＮＡ配列の発現に適した条件下に培養し、そして
　（ｂ）このインヒビターを採取することからなる方法。
　２．アミノ酸配列
を有するセリンプロテアーゼインヒビターを製造する請求の範囲第１項の方法。
　３．インヒビターにセリンプロテアーゼインヒビター活性を有する活性な三次構造をとらしめる工程をさらに包含する請求の範囲第１項の方法。
　４．ＤＮＡ配列が合成ＤＮＡ配列である請求の範囲第１項の方法。
　５．ＤＮＡ配列が天然のＤＮＡ配列である請求の範囲第１項の方法。
　６．さらにインヒビターの精製を包含する請求の範囲第１項の方法。
　７．精製をインヒビターに活性形をとらしめる前に行う請求の範囲第６項の方法。
　８．精製をインヒビターに活性形をとらしめた後に行う請求の範囲第６項の方法。
　９．ＤＮＡ配列がｐＢＲ３２２およびｐＩＱからなる群から選択されるベクターの部分からなるベクターに担持される請求の範囲第１項の方法。
　１０．宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の微生物からなる群から選択される微生物である請求の範囲第１項の方法。
　１１．宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉである請求の範囲第１０項の方法。
　１２．宿主微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓである請求の範囲第１０項の方法。
　１３．宿主微生物がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求の範囲第１０項の方法。
　１４．天然のＤＮＡ配列が、
　（ａ）天然のセリンプロテアーゼインヒビターを発現することができる細胞からヒトｃＤＮＡライブラリーを調製し、
　（ｂ）このインヒビターをコードするｃＤＮＡとハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸プローブでまたはこのｃＤＮＡライブラリーのクローンにより発現されるプロテアーゼインヒビタータンパクに結合することができる少なくとも１つのプローブでこのｃＤＮＡライブラリーをプローブし、
　（ｃ）このインヒビターをコードするｃＤＮＡを含有する少なくとも１つのクローンを同定し、そして場合により、
　（ｄ）このインヒビターをコードするｃＤＮＡをこのクローンから単離し、そして
　（ｅ）このｃＤＮＡまたはその断片を、宿主微生物においてｃＤＮＡを維持し、発現させるオペレーショナルエレメントに結合する
工程からなる方法により得られる請求の範囲第５項の方法。
　１５．細胞がヒト耳下腺細胞である請求の範囲第１４項の方法。
　１６．天然のＤＮＡ配列が、
　（ａ）ヒトゲノムＤＮＡライブラリーを調製し、
　（ｂ）このゲノムＤＮＡライブラリーを、インヒビターをコードするゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることができる少なくとも１つの核酸プローブで、またはこのゲノムＤＮＡライブラリーのクローンにより発現されるプロテアーゼインヒビタータンパクに結合することができる少なくとも１つのプローブでプローブし、
　（ｃ）このインヒビターをコードするゲノムＤＮＡを含有する少なくとも１つのクローンを同定し、そして場合により、
　（ｄ）このインヒビターをコードするゲノムＤＮＡをこのクローンから単離し、そして
　（ｅ）このゲノムＤＮＡ、またはその断片を、宿主微生物においてＤＮＡを維持し、発現するオペレーショナルエレメントに結合する工程からなる方法により得られる、請求の範囲第５項の方法。
　１７．（ａ）アミノ酸配列
（但し、Ｒ１およびＲ７は同一または異り、置換または非置換アミノ酸残基またはその誘導体からなる群から選択され、かつＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８およびＲ９は同一または異り、メチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、グリシン、ロイシンおよびアルギニンからなる群から選択される）からなるポリペプチドを製造するように宿主微生物に指示することができるＤＮＡ配列を調製し、
　（ｂ）このＤＮＡ配列を、宿主微生物内に転移、かつ複製することができるベクターにクローン化し、そしてこのベクターはＤＮＡ配列のオペレーショナルエレメントを含有し、
　（ｃ）ＤＮＡ配列およびオペレーショナルエレメントを含有するベクターをセリンプロテアーゼインヒビターを発現することができる宿主微生物内に転移し、
　（ｄ）この宿主微生物をベクターの増幅およびインヒビターの発現に適した条件で培養し、
　（ｅ）インヒビターを採取し、そして
　（ｆ）インヒビターをセリンプロテアーゼインヒビター活性を有する活性三次構造をとるようにすることからなる、断片化されていない１本のポリペプチド鎖からなる組換えセリンプロテアーゼインヒビターを製造する、請求の範囲第１項の方法。
　１８．断片化されていない１本のポリペプチド鎖セリンプロテアーゼインヒビターがアミノ酸配列
を有する請求の範囲第１７項の方法。
　１９．断片化されていない１本のポリペプチド鎖からなるセリンプロテアーゼインヒビターであって、同インヒビターはセリンプロテアーゼインヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位を有し、そして同インヒビターは以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりなるセリンプロテアーゼインヒビター、
（式中、Ｒ１およびＲ７は同一または異り、置換または非置換アミノ酸残基からなる群から選択され、そしてＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８およびＲ９は同一または異り、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択され、但し、Ｒ１がＳｅｒ、Ｒ２がＡｒｇ、Ｒ３〜Ｒ６がＭｅｔ、Ｒ７がＡｌａ、そしてＲ８−Ｒ９がＬｅｕである場合を除く）。
　２０．Ｒ２およびＲ３がメチオニンである請求の範囲第１９項のインヒビター。
　２１．Ｒ２およびＲ３がアルギニンである請求の範囲第１９項のインヒビター。
　２２．Ｒ２がアルギニンであり、Ｒ３がメチオニンである請求の範囲第１９項のインヒビター。
　２３．Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６がメチオニンであり、そしてＲ８およびＲ９がロイシンである請求の範囲第１９項のインヒビター。
　２４．セリンプロテアーゼインヒビター活性が白血球エラスターゼ阻害活性、カテプシンＧ阻害活性、トリプシン阻害活性、膵エラスターゼ阻害活性およびキモトリプシン阻害活性からなる群の少なくとも一つから選択される請求の範囲第１９項のインヒビター。
　２５．セリンプロテアーゼインヒビター活性が白血球エラスターゼ阻害活性である請求の範囲第２４項のインヒビター。
　２６．活性成分として、断片化されていない１本のポリペプチド鎖からなるセリンプロテアーゼインヒビターであって、同インヒビターはセリンプロテアーゼインヒビター活性を有する少なくとも１つの活性部位を有し、そして同インヒビターは以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりなるセリンプロテアーゼインヒビターを含有する医薬組成物、
（式中、Ｒ１およびＲ７は同一または異り、置換または非置換アミノ酸残基からなる群から選択され、そしてＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８およびＲ９は同一または異り、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択され、但し、Ｒ１がＳｅｒ、Ｒ２がＡｒｇ、Ｒ３〜Ｒ６がＭｅｔ、Ｒ７がＡｌａ、そしてＲ８−Ｒ９がＬｅｕである場合を除く）
　２７．経口投与、非経口投与、局所投与およびエーロゾル投与からなる群から選択される経路による投与に適した形態の請求の範囲第２６項の組成物。
　２８．呼吸疾患の改善のための請求の範囲第２６項の組成物。
　２９．気道障害の改善のための請求の範囲第２６項の組成物。
　３０．エーロゾル投与に適当な請求の範囲第２６項の組成物。
　３１．炎症の改善のための請求の範囲第２６項の組成物。