(57)【要約】  被験体における甲状腺癌を検出する方法は、被験体の身体サンプルから核酸サンプルを入手するステップ、およびこの核酸サンプルが、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）ｍＲＮＡまたはサイログロブリン（Ｔｇ）ｍＲＮＡの少なくとも１つを含むか否かを決定するステップを包含する。
2008509672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における甲状腺癌を検出する方法であって、
被験体の身体サンプルから核酸サンプルを入手するステップ、および
前記核酸サンプルが、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）ｍＲＮＡを含むか否かを決定するステップ
を包含する方法。
【請求項２】
前記ＴＨＳＲ  ｍＲＮＡが、前記核酸サンプル中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのセグメントを増幅するステップ、および
前記体液サンプル中の前記増幅されたＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのセグメントの存在を検出するステップ
によって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅が、前記ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡに相補的なプライマーの対を用いて実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーによって増幅されるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのセグメントが、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのエキソン６〜９の少なくとも一部にまたがる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのプライマーが配列番号１を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのプライマーが配列番号２を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記身体サンプルが血液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被験体における甲状腺新生物が良性であるかまたは悪性であるかを決定するための手術前アッセイ法であって、
被験体の末梢血から核酸サンプルを入手するステップ、および
前記核酸サンプルが、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）ｍＲＮＡを含むか否かを決定するステップ
を包含するアッセイ法。
【請求項９】
前記ＴＨＳＲ  ｍＲＮＡが、前記核酸サンプル中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのセグメントを増幅するステップ、および
前記体液サンプル中の前記増幅されたＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのセグメントの存在を検出するステップ
によって決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅が、前記ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡに相補的なプライマーの対を用いて実行される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマーによって増幅されるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのセグメントが、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのエキソン６〜９の少なくとも一部にまたがる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのプライマーが配列番号１を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのプライマーが配列番号２を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
被験体における甲状腺癌を検出する方法であって、
被験体の身体サンプルから核酸サンプルを入手するステップ、
前記核酸サンプル中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのセグメントを増幅するステップ、および
体液サンプル中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの増幅セグメントの存在を検出するステップ
を包含する方法。
【請求項１５】
前記増幅が、前記ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡに相補的なプライマーの対を用いて実行される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プライマーによって増幅されるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのセグメントが、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのエキソン６〜９の少なくとも一部にまたがる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プライマーが配列番号または配列番号２の少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡがゲル電気泳動を使用して検出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの検出が悪性または転移性の甲状腺癌を示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
被験体における甲状腺新生物が良性であるかまたは悪性であるかを決定するための手術前アッセイ法であって、
被験体の身体サンプルから核酸サンプルを入手するステップ、
少なくとも１つが配列番号３または配列番号４を含むプライマーの対を使用して、前記核酸サンプル中のＴｇ  ｍＲＮＡのセグメントを増幅するステップ、および
前記体液サンプル中の前記増幅されたＴｇ  ｍＲＮＡのセグメントの存在を検出するステップ
を包含するアッセイ法。
【請求項２１】
前記Ｔｇ  ｍＲＮＡがゲル電気泳動を使用して検出される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｔｇ  ｍＲＮＡの検出が悪性または転移性の甲状腺癌を示す、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記身体サンプルが末梢血を含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、被験体における甲状腺癌を検出する方法、および核酸ベースのアッセイを使用して甲状腺癌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人口の４〜７％の間が甲状腺結節を有すると推測されている。文献には、これらの結節の５〜３０％が悪性であると報告されている。これらの場合における主に診断において考慮すべき事項は、悪性の排除である。現在、これらの結節の性質の最良の手術前予測を提供する方法は、病巣の細針吸引生検（ＦＮＡ）である。ＦＮＡの使用により、実行される甲状腺摘出術の数が減少し、切除される病巣中の悪性の収量が増加する。しかしながら、不適切な病巣のサンプリングの事例ならびに良性および悪性の甲状腺新生物の細胞学的な特徴の重複は、この技術の固有の限界である。主要なＦＮＡの限界は、それが十分に分化した濾胞状癌と良性の小胞状腺腫の間を区別することが不可能なことである。濾胞状甲状腺新生物を有する患者は、通常、甲状腺摘出術を受けており、約１５％が悪性病巣を有する。良性病巣の信頼できる手術前予測は、不必要な外科手術の数を大きく減少させるであろう。
【０００３】
癌細胞は、遠位部位において転移を発生する前に末梢血およびリンパ管中で循環する。これらの細胞の検出は、癌およびその転移の潜在能力の初期診断のためのツールを提供する。ＲＴ−ＰＣＲは、組織／腫瘍特異的ｍＲＮＡ転写物を同定するその能力に基づいて、循環中の特異的細胞型の存在を検出する際の高感度かつ強力な技術である。特異的甲状腺マーカー、Ｔｇの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、循環している甲状腺癌細胞を検出するために利用されてきた。多くの研究者は、正常被験体において循環しているＴｇ  ｍＲＮＡを検出しており、従って、甲状腺摘出術を受けた患者において残存／再発性の甲状腺癌を検出するためのみにその使用は制限されている。ＰＣＲに基づくアッセイの成功は、以下の要因の組み合わせに大部分は依存する：サンプル処理手順、ＲＮＡの純度、ＰＣＲプライマーの位置、サイクリング条件、およびシグナル検出方法。
【０００４】
＜関連出願＞
本発明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００４年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／６００，５８９号からの優先権を主張する。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の１つの態様は、被験体における甲状腺癌を検出する方法に関する。この方法は、被験体の身体サンプルから核酸サンプルを入手するステップ、およびこの核酸サンプルが、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）ｍＲＮＡを含むか否かを決定するステップを包含する。ＴＨＳＲ  ｍＲＮＡは、核酸サンプル中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのセグメントを増幅するステップ、およびＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの増幅された部分の存在を検出するステップによって決定することができる。増幅は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ転写物に相補的なプライマーの対を用いて実行することができる。本発明の１つの態様において、プライマー対は、配列番号１および配列番号２をそれぞれ含むヌクレオチド配列を有することができる。
【０００６】
本発明の別の態様は、被験体における甲状腺新生物が良性であるかまたは悪性であるかを決定するための手術前アッセイ法に関する。この手術前アッセイ法は、被験体の身体サンプルから核酸サンプルを入手するステップ、およびこの核酸サンプルが、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）ｍＲＮＡを含むか否かを決定するステップを包含する。ＴＨＳＲ  ｍＲＮＡは、核酸サンプル中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのセグメントを増幅するステップ、およびＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの増幅された部分の存在を検出するステップによって決定することができる。増幅はＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ転写物に相補的なプライマーの対を用いて実行することができる。本発明の１つの態様において、プライマー対は、配列番号１および配列番号２をそれぞれ含むヌクレオチド配列を有することができる。
【０００７】
本発明のさらなる態様は、被験体における甲状腺癌を検出するためのキットに関する。このキットは、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのセグメントを増幅することが可能なプライマーの対を含む。増幅されるセグメントは、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのエキソン６〜９の少なくとも一部を含むことができる。本発明の１つの態様において、このプライマーは、少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むことができ、配列番号１および配列番号２をそれぞれ含むヌクレオチド配列を有することができる。
【０００８】
本発明の別の態様は、被験体における甲状腺新生物が良性であるかまたは悪性であるかを決定するための手術前アッセイ法に関する。この手術前アッセイ法は、被験体の身体サンプルから核酸サンプルを入手するステップ、およびこの核酸サンプルが、サイログロブリンｍＲＮＡを含むか否かを決定するステップを包含する。Ｔｇ  ｍＲＮＡは、核酸サンプル中のＴｇ  ｍＲＮＡのセグメントを増幅するステップ、およびＴｇ  ｍＲＮＡの増幅された部分の存在を検出するステップによって決定することができる。増幅はＴｇ  ｍＲＮＡ転写物に相補的なプライマーの対を用いて実行することができる。本発明の１つの態様において、プライマー対は、配列番号３および配列番号４をそれぞれ含むヌクレオチド配列を有することができる。
【０００９】
本発明のさらなる態様は、被験体における甲状腺癌を検出するためのキットに関する。このキットは、Ｔｇ  ｍＲＮＡのセグメントを増幅することが可能なプライマーの対を含む。増幅されるセグメントは、Ｔｇ  ｍＲＮＡのエキソン１〜５の少なくとも一部を含むことができる。本発明の１つの態様において、このプライマーは、少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むことができ、配列番号３および配列番号４をそれぞれ含むヌクレオチド配列を有することができる。
【００１０】
本発明の上記および他の態様は、以下の説明を添付の図面を参照して読めば、本発明が関連する技術分野の当業者に明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、本発明の実施形態の以下の詳細な説明、ならびに本明細書に含まれる実施例および配列表を参照することにより容易に理解され得る。
【００１２】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、以下の用語は、明確に反対に言及されない限り、所定の意味を有する。
【００１３】
ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡまたはＴｇ  ｍＲＮＡ「に対して特異的な」「について特異的な」および「に対して独特な」という語句は、核酸または核酸フラグメントに関連して本明細書で使用される場合、他のｍＲＮＡに共通ではない核酸または核酸フラグメントを意味する。
【００１４】
「フラグメント」という用語は、核酸に関連して本明細書で使用される場合、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸に特徴的な別の様式におけるハイブリダイゼーションプライマーとして、適切に機能するために十分なサイズおよびコンファメーションである核酸のサブ配列を意味する。
【００１５】
用語「単離された」とは、核酸または核酸フラグメントが、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡまたはＴｇ  ｍＲＮＡについてのハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅反応のような、臨床診断的、実験的または他の手順において、それらが利用されてもよいように、および適切に機能するように十分な純度であることを意味する。核酸、核酸フラグメント、および種々の手順におけるそれらの使用の前にそれらが通常付随し得る物質を精製するための多くの手順は、当業者に公知である。
【００１６】
本発明の核酸配列、または本発明のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列に関連する、「実質的に類似する」という用語は、本発明の核酸配列、または本発明の核酸配列に相補的な核酸配列に類似し、かつこのような核酸の機能を保持するが、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／または付加によって、および／またはいくつかの他の有利な特徴の組み込みによってこのような核酸とは異なる核酸をいう。本発明のヌクレオチド配列は、これらのパーセンテージが１００％から８０％まで、または１０個のヌクレオチド配列中の０個の塩基のミスマッチから、１０個のヌクレオチド配列中の２塩基のミスマッチまでである場合に、核酸配列に実質的に類似する。いくつかの実施形態において、このパーセンテージは１００％から８５％までである。他の実施形態において、このパーセンテージは９０％から１００％までであり、さらに他の実施形態において、このパーセンテージは９５％から１００％までである。
【００１７】
本発明は、被験体における甲状腺癌を検出する方法を提供する。この方法は、被験体における甲状腺新生物が良性であるかまたは悪性であるかを決定するための、手術前（例えば、甲状腺摘出術前）アッセイ法として使用することができる。この方法はまた、甲状腺摘出術後の転移性甲状腺癌の再発をモニターするための、手術後アッセイ法として使用することができる。
【００１８】
本発明の１つの態様に従って、本発明の方法は、被験体の身体サンプルから適切な核酸サンプルを入手するステップと、この核酸サンプルが、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）ｍＲＮＡを含むか否かを決定するステップとによって、被験体の身体サンプルにおいて循環する甲状腺細胞を検出することを含むことができる。
【００１９】
本明細書に記載されるように、「身体サンプル」は、核酸サンプルがマーカー配列を含むか否かを決定するための核酸サンプルを得ることができる、被験体の身体からの任意の身体サンプル（例えば、体液）を含む。この一例は、血液、具体的には末梢血である。しかしながら、当業者は、循環している甲状腺細胞が存在しているか否かを決定するために、サンプルがＴＳＨＲ  ｍＲＮＡを含むか否かを決定することが可能な他の身体サンプル、例えば、細針吸引液および気管支液を得ることができる。
【００２０】
当業者は、種々の被験体、例えば、動物であるが、具体的にはヒトにおいて、本発明を実施可能であり得る。
【００２１】
ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの存在は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの標的ヌクレオチド配列を検出することによって決定することができる。ＴＳＨＲをコードするＤＮＡの逆転写物に対応するｍＲＮＡを含む核酸配列の少なくとも一部が、甲状腺新生物の検出および区別において利用される核酸のための標的ヌクレオチド配列として使用することができることが見い出されてきた。「標的ヌクレオチド配列」という語句は、増幅され、検出され、またはさもなくば分析される、あるヌクレオチドの一領域をいう。一例として、本発明に従って標的ヌクレオチド配列として使用することができる、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡを含む核酸配列の一部が、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのエキソン６〜９を含む。
【００２２】
本発明の１つの態様において、標的ヌクレオチド配列は、ＴＳＨＲをコードするＤＮＡの逆転写物に対応するｍＲＮＡを含む核酸配列の標的ヌクレオチド配列を増幅するステップ、および増幅された標的配列を検出するステップによって、検出することができる。本発明の標的ヌクレオチド配列は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ（またはＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの逆転写物）の少なくとも一部の転写および複製を促進するオリゴヌクレオチドプライマーを選択的にハイブリダイズすることによって増幅することができる。「ハイブリダイズする」という用語は、本明細書で使用される場合、完全に（１００％）または完全未満（１００％未満）の相補的な塩基対形成に起因する、２つの一本鎖核酸による二重鎖構造の形成をいう。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖の間、または１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加に起因するミスマッチの領域を含む、完全未満の相補的な核酸鎖の間で起こることができる。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、プライマー依存性ポリメラーゼ活性の作用のためのプライミング位置または開始位置として働く。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡに特異的であり、かつ標的ヌクレオチド配列を増幅するために使用することができる、核酸配列を含む。標的ヌクレオチド配列は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの連続するヌクレオチド、例えば、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのエキソン６〜９のヌクレオチドによって定義される。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｔａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼの作用による合成が２つのプライマー間の領域を通して進行するように、標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの対を含むことができる。これは、数回ラウンドのハイブリダイゼーションおよび複製後に、産生される増幅標的ヌクレオチド配列が、その両方の末端がプライマーがハイブリダイズする部位によって定義される規定された長さを有するセグメントであるので、有利である。
【００２５】
本発明に従ってＴＳＨＲ  ｍＲＮＡに特異的に（または選択的に）ハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチプライマーは、少なくとも約１０個のヌクレオチドを含むことができる。一例として、オリゴヌクレオチドプライマーは、約１０〜約４０個のヌクレオチド、より特定には、約１５〜約３５個のヌクレオチドを含むことができる。このオリゴヌクレオチドプライマーは、意図される目的のために十分な安定性を有する二重鎖を形成するために、十分な長さでありかつＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列の一部と相補的であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、重合化剤が、重合条件下で、標的配列と安定な二重鎖を形成しているプライマーからの複製を継続することができるように、十分な長さと標的化ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡに対する相補性を有する核酸配列を含むべきである。
【００２６】
ヌクレオチドプライマーの対に使用することができる核酸配列の対の例として、配列番号１および２が挙げられる。配列番号１は、以下のヌクレオチド配列：５’ＧＣＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＣＴＡＴＧＣＡＡ−ＴＧＡＡ３’を含むフォワードプライマーである。配列番号２は、以下のヌクレオチド配列：３’ＡＧＡＧＴＴＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＧＧＧＡＡ５’を含むリバースプライマーである。配列番号１および２は、オリゴヌクレオチドプライマーとして使用される場合、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのエキソン６〜９の２１２塩基対セグメントを増幅することが可能である。
【００２７】
本発明の他のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１〜２に相補的な核酸配列、配列番号１〜２に実質的に類似する核酸配列、配列番号１〜２に相補的な核酸配列に実質的に類似する核酸配列、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする配列番号１〜２のフラグメント、ＴＳＨ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする配列番号１〜２に相補的な核酸配列のフラグメント、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする配列番号１〜２に実質的に類似する核酸配列のフラグメント、およびＴＳＨＲ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする配列番号１〜２に相補的な核酸配列に実質的に類似する核酸配列のフラグメントを含むことができることを、当業者であれば認識するであろう。オリゴヌクレオチドプライマーは、これらの核酸配列がＴＳＨＲ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、かつＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのエキソン６〜９を特異的に増幅する限りは、他の核酸配列を含むことができることもまた認識されるであろう。
【００２８】
本発明に従ってＴＳＨＲ  ｍＲＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを形成するために使用される核酸は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡから得ることができる。得られる核酸は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡから物理的に得る必要はなく、例えば、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、または転写を含む、任意の様式で生成されてもよく、またＲＮＡおよびペプチド核酸（ＰＭＡ）から生成されてもよい。
【００２９】
本発明に従うＴＳＨＲ  ｍＲＮＡオリゴヌクレオチドプライマーは、当分野で周知の方法、例えば、化学合成によって作製されてもよい。ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡオリゴヌクレオチドプライマーは、手動でまたは機械によって合成されてもよい。これらはまた、ウイルスおよび細菌のプロモーターを組み込んでいる生成物を使用する組換え方法によって合成されてもよい。
【００３０】
ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡオリゴヌクレオチドプライマーは、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの少なくとも一部を検出する増幅アッセイにおいて使用することができる。本発明の１つの態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいて使用することができる。ＰＣＲアッセイにおいて、身体サンプルの核酸は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡに対して特異的でありかつ標的ヌクレオチド配列を増幅するために使用することができるオリゴヌクレオチドプライマーと接触される。標的ヌクレオチド配列は、例えば、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのエキソン６〜９からの連続するヌクレオチドによって定義することができる。次いで、ＰＣＲ増幅は、得られた混合物に対して、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの標的ヌクレオチド配列が存在する場合にそれを増幅するのに十分な、温度プログラムおよび温度サイクル数で実行される。ＰＣＲ増幅は、任意の市販のＰＣＲ温度サイクリング装置中で実行することができる。例えば、ＰＣＲ増幅は、急速温度サイクリング技術を使用して実施することができる。急速温度サイクリング技術は、反応増幅サンプルを入れるために、毛細管のような、表面積対体積の高いサンプル容器を使用する。表面積対体積の高いサンプル容器を使用することにより、サンプル全体を通して急速な温度応答および温度均質性が可能となる。得られる急速温度サイクリングは、３０サイクルの増幅が１５分間以内に完了することができ、ＰＣＲ増幅産物がより少ない副産物を含むという点で、従来の温度サイクリングとは対照的である。従って、急速温度サイクリング技術を用いると、増幅のために必要な時間は、約１０分の１に減少し、特異性が改善される。
【００３１】
当業者であれば、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡプライマーならびにＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ核酸に相補的な他の核酸もまた、ＲＡＰＤアッセイまたは他の増幅アッセイのような他のアッセイにおいて使用可能であることを認識するであろう。
【００３２】
増幅された標的ヌクレオチド配列は、もし存在する場合は、次いで公知の検出技術を用いて検出することができる。これらの検出技術は、定性的および／または定量的であり得る。本発明に従って使用することができる検出技術の例には、ゲル電気泳動によって決定される制限酵素消化パターンの可視化、増幅された標的ヌクレオチド配列の配列決定、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いる増幅されたヌクレオチド配列の検出が含まれる。コピー数および定量化は、サザン分析またはノーザン分析のような標準的なハイブリダイゼーション手順によって実施することができる。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを検出に用いる場合、このオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を用いて標識される核酸配列の対を含むことができる。
【００３３】
検出方法（例えば、融点分析）が、オリゴヌクレオチドプライマーによって増幅される標的ヌクレオチド配列が存在することを示す結果を生じる場合、もともとのサンプルがＴＳＨＲ  ｍＲＮＡを含むと結論付けられる。逆に、標的ヌクレオチド配列の証拠が検出されない場合、サンプルはＴＳＨＲを含まないと結論付けられる。
【００３４】
任意に、本発明の方法のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅ステップおよび検出ステップは、本質的に同時に実施される。この本質的に同時のＰＣＲ増幅ステップおよび検出ステップは、急速温度サイクラー構成要素および蛍光検出構成要素を備える１つの装置の中で実施される。このようなデバイスの１つの例は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１４０，５４０号に記載されている。急速温度サイクラー構成要素および蛍光検出構成要素を備える好ましいデバイスは、米国インディアナ州インディアナポリスのRoche Molecular Biochemicals社から、ライトサイクラー（LIGHTCYCLER）の商標名で市販されている。
【００３５】
被験体から得られる身体サンプルにおいて検出されるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのレベルは、所定の値と比較することができる。所定の値は、ヒト被験体の一般集団から、または選択集団から得られる、比較可能なサンプル中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのレベルに基づくことができる。例えば、選択集団は、見た目に健常な被験体から構成されてもよい。「見た目に健常な」とは、本明細書で使用される場合、甲状腺癌などの疾患の存在を示すいかなる徴候または症状も以前に示さなかった個体を意味する。換言すれば、このような個体は、医学の専門家によって試験された場合に、健常であって疾患の症状はないとして特徴付けられるであろう。
【００３６】
所定の値は、被験体から得られた身体サンプル中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのレベルを特徴付けるために使用される値に関係づけることができる。従って、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのレベルが絶対値である場合、所定の値もまた、一般的な集団、またはヒト被験体の選択集団中の個体におけるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの単位に基づく。同様に、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのレベルが任意単位などの代表的な値である場合、所定の値もまた、この代表的な値に基づく。
【００３７】
所定の値は、種々の型を取ることができる。所定の値は、メジアンまたは平均のような、単一のカットオフ値であってもよい。所定の値は、例えば、１つの規定された群における全身性マーカーのレベル（例えば、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのレベル）が、別の規定された群における全身性マーカーのレベルの２倍である場合に、比較群に基づいて確立されることができる。所定の値は範囲であってもよく、ここでは、例えば一般集団が等分な（または不等分な）群または象限に分けられ、最低の象限が最低レベルの全身性マーカーを有する個体であり、最高の象限が最高レベルの全身性マーカーを有する個体である。
【００３８】
所定の値は、一般集団におけるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのレベルを決定することによって得ることができる。あるいは、所定の値は、選択集団におけるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのレベルを決定することによって得ることができる。従って、選択される所定の値は、個体が含まれるカテゴリーを考慮に入れてもよい。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者による日常的な実験を超えないものを用いて選択することができる。
【００３９】
ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの所定の値、例えば、平均レベル、メジアンレベル、または「カットオフ」レベルは、一般集団または選択集団における個体の大きなサンプルをアッセイすること、および統計学的モデルを使用することによって確立される。この統計学的モデルは、例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれるKnapp,R.G.およびMiller,M.C.(1992).Clinical Epidemiology and Biostatistics.William and Wilkins,Harual Publishing Co.Malvern,Pa.において記載されるような、最適特異性（最大の真の陰性割合）および感度（最大の真の陽性割合）を規定する、陽性の判断基準または受信者動作特性（receiver operator characteristic）曲線を選択するための予測値法である。「カットオフ」値は、アッセイされる各々の全身性マーカーについて決定することができる。
【００４０】
被験体の身体サンプル中で検出される手術前（すなわち、甲状腺摘出術の前）のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのレベルは、被験体における甲状腺新生物を分類するため、すなわち、甲状腺新生物が良性であるかまたは悪性であるかを、そして疾患の程度を決定するために、単一の所定の値または所定の値の範囲と比較されてもよい。所定の値または所定の値の範囲よりも高い被験体の身体サンプル中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの手術前レベルは、被験体が悪性の病巣を有することを示すことができる。所定の値または所定の値の範囲よりも低い被験体の身体サンプル中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの手術前レベルは、被験体が良性の甲状腺新生物、例えば、小胞状腺腫に関連するものを有することを示すことができる。
【００４１】
被験体の身体サンプル中で検出される手術後（すなわち、甲状腺摘出術の後）のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのレベルもまた、甲状腺癌の再発に対する、単一の所定の値または所定の値の範囲と比較されてもよい。所定の値または所定の値の範囲よりも高い被験体の身体サンプルにおけるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの手術後レベルは、再発性／残存甲状腺癌を示すことができる。所定の値または所定の値の範囲よりも低い被験体の身体サンプルにおけるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの手術後レベルは、甲状腺癌が存在しないことを示すことができ、被験体が不必要な外科的介入をなしで済ますことができる。
【００４２】
本発明はさらに、核酸ベースのアッセイによって身体サンプル中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡを同定および検出するためのキットに向けられる。このキットは、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。オリゴヌクレオチドプライマーの対は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡに対して特異的であり、かつ、例えばＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのエキソン６〜９からのような連続するヌクレオチドによって規定される標的ヌクレオチド配列を増幅するために使用することができる、核酸配列を含むことができる。
【００４３】
本発明の１つの例において、このキットは、一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。このオリゴヌクレオチドプライマーは、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡのエキソン６〜９を選択的に増幅することが可能な、連続する少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。一例として、このオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１および２を含む核酸配列を有することができる。任意に、このキットはまた、ＰＣＲ増幅反応およびオリゴヌクレオチドプローブの蛍光検出を開始するために必要な試薬の１つまたはすべてを含んでもよい。
【００４４】
本発明の別の態様に従って、被験体における甲状腺癌を検出する方法は、被験体の身体サンプルから適切な核酸サンプルを入手するステップと、この核酸サンプルがサイログロブリン（Ｔｇ）ｍＲＮＡを含むか否かを決定するステップとによって、被験体の身体サンプル中で循環している甲状腺細胞を検出することを包含することができる。
【００４５】
Ｔｇ  ｍＲＮＡの存在は、Ｔｇ  ｍＲＮＡの標的ヌクレオチド配列を検出することによって決定することができる。一例として、本発明に従う標的ヌクレオチド配列として使用することができる、Ｔｇ  ｍＲＮＡを含む核酸配列の一部は、Ｔｇ  ｍＲＮＡのエキソン１〜５を含む。
【００４６】
本発明の１つの態様において、標的ヌクレオチド配列は、ＴｇをコードするＤＮＡの逆転写物に対応するｍＲＮＡを含む核酸配列の標的ヌクレオチド配列を増幅するステップ、および増幅された標的配列を検出するステップによって検出することができる。本発明の標的ヌクレオチド配列は、Ｔｇ  ｍＲＮＡ（またはＴｇ  ｍＲＮＡの逆転写物）の少なくとも一部の転写および複製を促進するオリゴヌクレオチドプライマーを選択的にハイブリダイズすることによって増幅することができる。
【００４７】
本発明に従ってＴｇ  ｍＲＮＡに特異的に（または選択的に）ハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも約１０個のヌクレオチドを含むことができる。一例として、オリゴヌクレオチドプライマーは、約１０〜約４０個のヌクレオチド、より特定には約１５〜約３５個のヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、意図される目的のために十分な安定性を有する二重鎖を形成するために、十分な長さでありかつＴｇ  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列の一部と相補的であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、重合化剤が、重合条件下で、標的配列と安定な二重鎖を形成しているプライマーからの複製を継続することができるように、十分な長さと標的化Ｔｇ  ｍＲＮＡに対する相補性を有する核酸配列を含むべきである。
【００４８】
ヌクレオチドプライマーの対に使用することができる核酸配列の対の例として、配列番号３および４が挙げられる。配列番号３は、以下のヌクレオチド配列：５’ＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＴＴＴＣＴＧＡＡ３’（配列番号３）を含むフォワードプライマーである。配列番号４は、以下のヌクレオチド配列：逆方向３’ＣＴＴＴＡＧＣ−ＡＧＣ−ＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧ５’（配列番号４）を含むリバースプライマーである。配列番号３および４は、オリゴヌクレオチドプライマーとして使用される場合、Ｔｇ  ｍＲＮＡのエキソン１〜５の４０７塩基対セグメントを増幅することが可能である。
【００４９】
本発明の他のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３〜４に相補的な核酸配列、配列番号３〜４に実質的に類似する核酸配列、配列番号３〜４に相補的な核酸配列に実質的に類似する核酸配列、Ｔｇ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする配列番号３〜４のフラグメント、Ｔｇ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする配列番号３〜４に相補的な核酸配列のフラグメント、Ｔｇ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする配列番号３〜４に実質的に類似する核酸配列のフラグメント、およびＴｇ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする配列番号３〜４に対して相補的な核酸配列に相補的な核酸配列のフラグメントを含むことができることを、当業者であれば認識するであろう。オリゴヌクレオチドプライマーは、これらの核酸配列がＴｇ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、具体的には、Ｔｇ  ｍＲＮＡのエキソン１〜５を特異的に増幅する限り、他の核酸配列を含むことができることもまた認識されるであろう。
【００５０】
本発明に従ってＴｇ  ｍＲＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを形成するために使用される核酸は、Ｔｇ  ｍＲＮＡから得ることができる。本発明に従うＴｇ  ｍＲＮＡオリゴヌクレオチドプライマーは、化学合成のような当分野において周知の方法によって作製することができる。プライマーは、手動でまたは機械によって合成されてもよい。これらはまた、ウイルスおよび細菌のプロモーターを組み込んでいる生成物を使用する組換え方法によって合成されてもよい。
【００５１】
オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｔｇ  ｍＲＮＡの少なくとも一部を検出する増幅アッセイにおいて使用することができる。本発明の１つの態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいて使用することができる。当業者であれば、本発明に従うＴｇ  ｍＲＮＡオリゴヌクレオチドプライマーならびにＴｇ  ｍＲＮＡ核酸に相補的な他の核酸は、ＲＡＰＤアッセイまたは他の増幅アッセイのような他のアッセイにおいても使用可能であることを認識するであろう。
【００５２】
増幅された標的ヌクレオチド配列は、もし存在する場合は、次いで、ゲル電気泳動によって決定される制限酵素消化パターンの可視化、増幅された標的ヌクレオチド配列の配列決定、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いる増幅されたヌクレオチド配列の検出のような、公知の定性的および／または定量的な検出技術を用いて検出することができる。
【００５３】
被験体の身体サンプル中で検出される手術前（すなわち、甲状腺摘出術の前）のＴｇ  ｍＲＮＡのレベルは、被験体における甲状腺新生物を分類するため、すなわち、甲状腺新生物が良性であるかまたは悪性であるかを、そして疾患の程度を決定するために、単一の所定の値または所定の値の範囲と比較されてもよい。所定の値または所定の値の範囲よりも高い被験体の身体サンプル中のＴｇ  ｍＲＮＡの手術前レベルは、被験体が悪性の病巣を有することを示すことができる。所定の値または所定の値の範囲よりも低い被験体の身体サンプル中のＴｇ  ｍＲＮＡの手術前レベルは、被験体が良性の甲状腺新生物、例えば、小胞状腺腫に関連するものを有することを示すことができる。
【００５４】
被験体の身体サンプル中で検出される手術後（すなわち、甲状腺摘出術の後）のＴｇ  ｍＲＮＡのレベルもまた、甲状腺癌の再発に対する、単一の所定の値または所定の値の範囲に対して比較されてもよい。所定の値または所定の値の範囲よりも高い被験体の身体サンプルにおけるＴｇ  ｍＲＮＡの手術後レベルは、再発性／残存甲状腺癌を示すことができる。所定の値または所定の値の範囲よりも低い被験体の身体サンプルにおけるＴｇ  ｍＲＮＡの手術後レベルは、甲状腺癌が存在しないことを示すことができ、被験体が不必要な外科的介入をなしで済ますことができる。
【００５５】
本発明はさらに、核酸ベースのアッセイによって身体サンプル中のＴｇ  ｍＲＮＡを同定および検出するためのキットに向けられる。このキットは、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。オリゴヌクレオチドプライマーの対は、Ｔｇ  ｍＲＮＡに対して特異的であり、かつ、例えばＴｇ  ｍＲＮＡのエキソン１〜５からのような連続するヌクレオチドによって規定される標的ヌクレオチド配列を増幅するために使用することができる、核酸配列を含むことができる。
【００５６】
本発明の１つの例において、このキットは、一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。このオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｔｇ  ｍＲＮＡのエキソン１〜５を選択的に増幅することが可能な連続する少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。一例として、このオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３および４を含む核酸配列を有することができる。任意に、このキットはまた、ＰＣＲ増幅反応およびオリゴヌクレオチドプローブの蛍光検出を開始するために必要な試薬の１つまたはすべてを含んでもよい。
【００５７】
当業者であれば、本発明に従う方法のバリエーションを理解および認識するであろう。例えば、本発明の方法が、ＦＮＡのような当分野において公知である他の検出方法とともに使用可能であることが認識される。さらに、甲状腺癌腫を治療するために使用される治療剤の効力をモニターするための手段として、本発明を使用することができることが認識されるであろう。これらの治療剤は、甲状腺摘出術の前後で組み合わせて投与することができる。
【００５８】
本発明は、以下の実施例によって例証される。この実施例は、本発明の理解において補助するように示されるが、添付の特許請求の範囲に示される本発明を、いかなる場合においても制限することを意図するものではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５９】
〔実施例１〕
＝＝＝甲状腺疾患を有する患者の末梢血におけるＴＳＨ受容体ｍＲＮＡおよびサイログロブリンｍＲＮＡ転写物の検出：甲状腺の高感度かつ特異的なマーカー＝＝＝
正常甲状腺組織と新生物甲状腺組織によるサイログロブリン産生は、いずれも機能的ＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）の存在に依存し、およびＴＳＨレベルの影響を受ける。本発明者らは、正常被験体、ならびに甲状腺癌を有する患者および良性の甲状腺疾患を有する患者からの末梢血中の、ＲＴ−ＰＣＲによるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡおよびＴｇ  ｍＲＮＡの検出の感度および特異性を調べた。
【００６０】
［方法］
［被験体］
甲状腺疾患の病歴を有さない５１例の正常被験体（女性：男性＝１．７；年齢範囲２５〜６０歳）、良性の甲状腺疾患を有する２７例（女性：男性＝３．５；年齢範囲１８〜７７歳）および分化した甲状腺癌（ＤＴＣ）を有する７５例の患者（女性：男性＝３．２；年齢範囲２０〜８０歳）を含む全体で１５３例の患者を評価した。良性の甲状腺疾患を有する２７例の患者の中で、３例の患者が甲状腺炎を有し、１８例が孤立性甲状腺結節または多結節性甲状腺腫を有し、３例が代償Ｔ４療法での原発性甲状腺機能低下症を有し、３例がグレーブス病を有した。
【００６１】
ＤＴＣ患者の中で、６７例（８９％）が甲状腺全摘術を受けており、その６５例（８３％）がｍＲＮＡ試験の少なくとも１年前に放射性ヨウ素（ＲＡＩ）切除を受けていた。残りの８例の患者は、全員が新たに診断された乳頭甲状腺癌を有し、甲状腺摘出術の前に試験した。すべてのＤＴＣ患者は、クリーブランド・クリニック財団法人（Cleveland Clinic Foundation)の内分泌、糖尿病および代謝系に関する科(Department of Endocrinology,Diabetes and Metabolism）において外来患者としての来院の間に評価した。各患者の病歴、手術／病理報告ならびに実験室および放射性物質の試験を入手するためにチャート式レビューを実施した。
【００６２】
甲状腺癌を有する７５例の患者の病理、疾患状態、治療状態、およびＴｇ抗体状態は表１に列挙する。
【００６３】
〔表１〕
＝＝＝甲状腺癌患者の特徴＝＝＝
2008509672.tif 000003
【００６４】
Ｔ４抑制中の４９例の患者、Ｔ４中止後の７例、および組換えヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）（サイロゲン（Thyrogen）、Genzyme Transgenics Corp.社（マサチューセッツ州のケンブリッジ（Cambridge,MA））の投与後の１１例を研究した。Ｔ４治療の間に評価された４９例の患者の中で、４１例（８６％）が、試験の日付から１２ヶ月以内、４例の患者が試験の前２４〜４８ヶ月以内に診断用放射活性ヨウ素スキャンを受けた；全員を血清サイログロブリン測定を用いてモニターし、スキャンがネガティブであり、および／またはこれらが検出可能でないＴｇレベルを有した場合に、疾患を有さないと見なした。４例は利用可能なスキャンを有さなかった；このうちの２例は再発性の疾患を有し（１例は肺、１例は結節の転移を有する）、１例はネガティブな超音波検査およびリンパ節生検を受け；他方は検出可能でない段階的血清Ｔｇレベルを有し、かつ疾患の臨床的証拠がなかった。患者は、３例で他の画像化手順および病理学的試験によって確認されるような既知の転移性疾患を有した以外は、彼らの最後の全身スキャン（ＷＢＳ）後にＲＡＩ治療を受けなかった。
【００６５】
ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡおよびＴｇ  ｍＲＮＡについての血液サンプルを、手術の最初の日から種々の間隔で収集した。ＴＳＨ（ニュージャージー州のRoche Diagnostics社）およびＴｇ（カリフォルニア州のQuest Diagnostics社）の同時血清レベルを、免疫−化学発光測定アッセイ（ＩＣＭＡ）によって測定し、感度を１．０μｇ／Ｌと規定した。Ｔｇ抗体をまた、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ；カリフォルニア州のTosoh Medics Inc.社）において大部分の患者において測定した。Ｔ４治療の間に試験した患者における≧１．０μｇ／ＬのＴｇ値およびｒｈ−ＴＳＨ投与後またはＴ４中止後に試験した患者における≧２．０μｇ／Ｌの値を、追跡調査ＷＢＳ（２４）のための有意な指標であると見なした。Ｔ４抑制におけるすべての患者は、ＴＳＨを用いた５例において１．０〜２．８ｍＵ／Ｌの間である以外は、＜１．０ｍＵ／ＬのＴＳＨ値を有した（６１％がＴＳＨ＜０．１を有した）。Ｔ４中止後の研究されたすべての患者は、１例（１９ｍＵ／ＬのＴＳＨ）を除いて、３０ｍＵ／Ｌより大きなＴＳＨ値を有した。
【００６６】
本発明者らのＲＡＩスキャニング手順には、１３１Ｉのトレーサー線量（１００μＣｉ）の投与の２４時間後の頸部取り込み、および５ｍＣｉ線量の１３１Ｉの投与の４８時間後に得られた診断用ＷＢＳの測定が含まれた。ｒｈ−ＴＳＨ（２日間、筋肉内に０．９ｍｇ）後に試験した患者は、５ｍＣｉ用量の１３１Ｉを投与され、２４時間後に２回目の用量のｒｈＴＳＨを投与され、そしてその後４８時間にＷＢＳを得た。ＴＳＨ／Ｔｇ  ｍＲＮＡならびにＴｇ測定の両方についての血液サンプルを、スキャンの前に同時に採取した。スキャンは核医学の医師によって再検討され、これらが甲状腺ベッドにおいて目に見える取り込みを示し、および／または別個の局所的取り込みが通常は１３１Ｉを取り込まなかった部位に存在した場合に陽性であると見なした。患者は、彼らが陽性ＷＢＳを有し、または、病理学によって診断された、または他の非放射性ヨウ素画像化様式によって見い出された疾患を有する場合に、疾患の証拠が認められるとして分類した。
【００６７】
［ＲＴ−ＰＣＲ］
約３〜５ｍＬの全血（ＥＤＴＡ処理したチューブ中に収集した）を、等量のＰＢＳ  ｐＨ  ７．４とともに混合し、８ｍｌフィコール（Pharmacia社）を重層し、そして４℃で２０分間、４００×ｇで遠心分離した。単核細胞層を収集し、洗浄し、そしてペレット化した。ＲＮＡを、製造業者の指示書に従って、トリゾール（Trizol）試薬（カリフォルニア州のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して単離した。Ａ２６０／２８０の光学密度の比率を使用して、単離されたＲＮＡの品質および量を評価した。スーパースクリプトプレ増幅システム（Superscript Pre-amplification System）（カリフォルニア州のInvitrogen社）を製造業者の指示書に従って使用して、１〜２μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。
【００６８】
選択したプライマー対を使用して、ＰＣＲを実行した。プライマー配列は以下の通りである：ＴＳＨＲ：フォワード５’ＧＣＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＣＴＡＴＧＣＡＡ−ＴＧＡＡ３’（配列番号１）；およびリバース３’ＡＧＡＧＴＴＴＧＧＴＣＡＣ−ＡＧＴＧＡＣＧＧＧＡＡ５’（２１２ｂｐ）（配列番号２）；Ｔｇ：フォワード５’ＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＴＴＴＣＴＧＡＡ３’（配列番号３）；リバース３’ＣＴＴＴＡＧＣ−ＡＧＣ−ＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧ５（４０７ｂｐ）’（配列番号４）；遍在的に発現されるコントロール遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）もまた、ＲＮＡ抽出ならびにＲＴ反応およびＰＣＲ反応の成功を確認するために、以前に報告されたプライマーを使用して分析した。ＰＣＲは３８サイクル（９４℃で１分間（最初のサイクルは２分間）、６２℃で１分間、７２℃で１分間（最後のサイクルは１０分間））実行した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は２％ゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。これらのアッセイについての見積もられた感度は、正常末梢血単核細胞から得られたＲＮＡとの甲状腺癌組織ＲＮＡの段階希釈によって試験し、〜１０癌細胞／血液ｍＬであることを見い出した。
【００６９】
［統計学的分析］
再発性／残存甲状腺癌の検出のために、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡおよびＴｇ  ｍＲＮＡ、血清ＴｇおよびＷＢＳの診断的感度および特異性についてデータを分析した。マーカー間の感度および特異性の比較は、フィッシャーの直接確率検定を使用して実行した。Ｐ＜０．０５を有意であると見なした。
【００７０】
［結果］
［正常コントロールおよび良性甲状腺疾患におけるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ］
結果を表２に要約する。５１例すべての正常コントロールは、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡとＴｇ  ｍＲＮＡの両方について陰性であった。良性甲状腺疾患を有する患者の２７例のうちの２４例（８９％）がＴＳＨＲ  ｍＲＮＡとＴｇ  ｍＲＮＡの両方について陰性であり、これには、甲状腺結節を有する１５例の患者が含まれる。３例の陽性患者のうち、２例が塊状の閉塞性甲状腺腫（１００および３００ｇｍ、１０×８×３ｃｍおよび１１×１１×５ｃｍ）を有し、３例目は小胞状腺腫を有した。３例の患者すべての診断が外科病理学によって確認された。
【００７１】
〔表２〕
＝＝＝健常な甲状腺機能正常被験体、良性甲状腺疾患患者および疾患の証拠がない甲状腺癌患者におけるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡおよびＴｇ  ｍＲＮＡの陽性度＝＝＝
2008509672.tif 000004
＊Ｔ４治療に対し≧１μｇ／Ｌ；Ｔ４中止またはｒｈ  ＴＳＨ後≧２μｇ／Ｌのカットオフを使用
＊＊２例の患者は塊状の閉塞性甲状腺腫を有し、１例は小胞状腺腫を有する
†ＮＡ＝適用なし
【００７２】
［甲状腺癌を有する患者におけるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ］
図１は、９例の甲状腺癌患者、１例の正常被験体および陽性甲状腺癌コントロールにおいて得られた、ＴＳＨＲ（２１２ｂｐ）、Ｔｇ（４０７ｂｐ）およびＧＡＰＤＨ（３９７ｂｐ）についての代表的なＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。表３は、６７例の以前に治療されたＤＴＣ患者、および８例の外科的切除の前に試験されたＤＴＣを有する患者において得られた結果を要約する。
【００７３】
〔表３〕
＝＝＝甲状腺癌を有する患者におけるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ、Ｔｇ  ｍＲＮＡおよび血清Ｔｇレベル＝＝＝
2008509672.tif 000005
＊Ｔ４治療に対し≧１μｇ／Ｌ；Ｔ４中止またはｒｈ  ＴＳＨ後≧２μｇ／Ｌのカットオフを使用
＊＊Ｎ＝８；＊＊＊Ｎ＝２９；†ＮＡ＝適用なし
【００７４】
ＴＣを有する４９例の患者をＴ４治療の間に試験した。これらの患者の８例が遠隔転移を有し、１０例が局所的再発または頸部リンパ節疾患を有し、そして残りの３１例が疾患を有さなかった。表３は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ、Ｔｇ  ｍＲＮＡ、血清ＴｇレベルおよびＷＢＳに伴って得られた陽性％を列挙する。ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡとＴｇ  ｍＲＮＡの両方は、遠隔転移または局所的疾患を有するすべての患者において陽性であった。また、血清Ｔｇは、Ｔ４抑制の間に再発性疾患を有する患者のうち１例を除くすべてで検出された。疾患の証拠が認められる、７例の小胞状腺癌のうちの３例、および３例すべてのヒュルトレ細胞癌の患者は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡとＴｇ  ｍＲＮＡの両方について陽性であった。
【００７５】
疾患の証拠がない３１例の患者では、ＴＳＨ−Ｒ  ｍＲＮＡはいずれも検出されず、Ｔｇ  ｍＲＮＡは２例（６％）において検出された。これらの２例の患者は、検出不可能な血清Ｔｇ値および陰性ＷＢＳを有し、１年間の追跡調査において疾患を有さないままであった。
【００７６】
７例の患者をＴ４中止後に試験した。１例はＷＢＳで局所的再発の証拠が認められ、ＴＳＨ−Ｒ  ｍＲＮＡとＴｇ  ｍＲＮＡの両方について陽性であった。ＷＢＳに疾患の証拠がない６例の患者のうちで、１例がＴＳＨ−Ｒ  ｍＲＮＡとＴｇ  ｍＲＮＡの両方について陽性であったが、Ｔ４中止後に検出不可能な血清Ｔｇ値を有した。あとの１例は、中止後血清Ｔｇ値が５５．５ｎｇ／ｍｌであったが（陰性抗体；ＴＳＨ−Ｒ  ｍＲＮＡおよびＴｇ  ｍＲＮＡについて陰性）、１年後に検出不可能なＴｇ値、陰性ＷＢＳおよびＴ４治療での陰性甲状腺超音波を有することが分かった。この単発的な高いＴｇレベルの原因は明らかではない。
【００７７】
１１例の患者をｒｈ−ＴＳＨ後に試験した。いずれも疾患の証拠が認められなかった。１例は、Ｔｇ  ｍＲＮＡについて陽性であったが、ＴＳＨ−Ｒ  ｍＲＮＡおよびＷＢＳについて陰性であった。この患者は、ｒｈ−ＴＳＨ後に２．３ｎｇ／ｍｌの血清Ｔｇ値を有した。１年後、ｒｈ−ＴＳＨ後の血清Ｔｇは、治療が与えられなかったのにも関わらず、検出不可能であった。引き続くＷＢＳおよび甲状腺回収後の３回の連続するＴｇレベルはこれまでは陰性であり、患者は疾患の証拠がないと見なした。
【００７８】
［抗Ｔｇ抗体を有する患者におけるＴｇ  ｍＲＮＡ：］
ＤＴＣを有する患者の１４例（２１％）が抗Ｔｇ抗体を有した。１４例の患者のうちの１１例が疾患の証拠が認められなかった；すべてが検出不可能な血清Ｔｇレベルを有し（測定値はＴｇ抗体の存在下で見せかけで低い）、そしてすべてがＴＳＨ−Ｒ  ｍＲＮＡについて陰性であった。局所的疾患を有する３例すべての患者は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡとＴｇ  ｍＲＮＡの両方について陽性であり、これには、血清Ｔｇについて陰性である１例が含まれる。
【００７９】
［ＴＳＨ−ｍＲＮＡの診断能］
表４は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの診断能の特徴を要約し、再発性／転移性疾患を検出するためにＴｇ  ｍＲＮＡ、血清ＴｇレベルならびにＷＢＳを用いるものを比較する。
【００８０】
〔表４〕
＝＝＝以前に治療された甲状腺癌患者におけるＴＳＨ−Ｒ  ｍＲＮＡ、Ｔｇ  ｍＲＮＡ、血清Ｔｇレベルおよび１３１Ｉ取り込み／ＷＢＳの診断能＝＝＝
Ａ．ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ陽性度：Ｔｇ  ｍＲＮＡ、血清ＴｇおよびＷＢＳとの比較
2008509672.tif 000006
Ｂ．性能の特徴
2008509672.tif 000007
【００８１】
これらのマーカーの間では統計学的に有意な違いは存在せず、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡとＴｇ  ｍＲＮＡの両方が残存／再発性疾患の検出のために等しい感度を有した（Ｐ＝０．２０９、フィッシャーの直接確率検定）。ＮＥＤ（ネガティブスキャンおよび引き続く検出不可能なＴｇレベル）を有する２例の患者は、上昇した血清Ｔｇレベルを有し、１例はＴ４中止後、別の例はｒｈ−ＴＳＨ後であったが、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡとＴｇ  ｍＲＮＡの両方について陰性であった。ＷＢＳは、４例の患者においては行わず、疾患の証拠が認められる３例の患者においては陰性であった（２例は肺転移を有し、１例は結節転移を有する（感度＝８２％））。ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡとＴｇ  ｍＲＮＡの間、およびＴＳＨＲ  ｍＲＮＡと血清Ｔｇの間の一致（Ｔｇ抗体陰性患者において）は、両方とも９５％であった。
【００８２】
［考察］
本報告における主要な知見は、血液中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡシグナルの存在が、健常被験体において、および良性甲状腺疾患を有する患者の大部分において検出不可能である甲状腺癌を有する患者に特異的であることである。さらに、本発明者らは、注意深く選択されたプライマーがアッセイにおいて使用されるときに、甲状腺癌についてのＴｇ  ｍＲＮＡの高い特異性を実証した。甲状腺癌腫は、機能的ＴＳＨ受容体を含むことが知られている。今日まで、この標的は、循環している癌細胞の検出のために利用されてこなかったが、このことは、末梢血単核細胞および他の甲状腺外組織中のＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ転写物の存在を示した以前の報告におそらく起因しているだろう。甲状腺外組織におけるこれらの転写物の発見は、ＴＳＨＲスプライシング変異体によって説明することができる。従って、甲状腺細胞に特異的なプライマーの選択は、アッセイにおいて最高に重要である。
【００８３】
本発明者らの系列においてＴＳＨ−Ｒ  ｍＲＮＡとＴｇ  ｍＲＮＡの間の高い一致が存在した。これらのＴｇ  ｍＲＮＡの知見は、定性的および定量的なＲＴ−ＰＣＲを使用し、多くの正常被験体においてＴｇ  ｍＲＮＡシグナルを検出した以前の多くの研究と対照的である。以前に議論されたように、これらの違いは、おそらく大部分は、アッセイの感度または方法論における他の変数ではなくむしろ、プライマー対の選択に起因する。確かに、本発明者らは、文献に記載されたいくつかのプライマー対を使用して、同様に、コントロールにおけるシグナルを以前に検出した。特定のプライマー対を用いて、偽遺伝子の増幅が偽陽性結果を生じ得ることが可能である。この不一致について説明するのにより可能性の高いものは、選択されたプライマーによって増幅される選択的スプライシング変異体を検出するＰＣＲベースの技術の能力の限界である。
【００８４】
他の研究者らが良性の甲状腺疾患を有する患者におけるＴｇ  ｍＲＮＡ陽性度のはるかに高い発生率（２０〜３３％）を報告しているのに対して、本発明者らは、２７例の患者から３例のみ（１１％）の患者において偽陽性結果を得た。これらの偽陽性のうちの１つは、外科病理学上の小胞状腺腫を有することが見い出された患者であった。小胞状腺腫と濾胞腺癌の間の区別は、現在のところ、外科的切除および正式の組織学的試験の後でのみ可能である。今日まで、確実に、癌から小胞状腺腫を区別することができる既知のマーカーは存在していない。なぜなら、濾胞腺癌と同様に、有意な数の小胞状腺腫がＲａｓ変異を有し、ガレクチン−３免疫染色を示すからである。それゆえに、小胞状腺腫を有する患者における循環している甲状腺細胞の発見は前代未聞ではなく、ある小胞状腺腫が濾胞腺癌の前悪性段階を表す可能性があるという概念を支持する。他の２例の偽陽性は、塊状の甲状腺腫を有する患者においてであり、このような患者は循環している甲状腺細胞を有する可能性があることを示す。あるいは、潜在性のＤＴＣは、病理学的試験において見落とされていた可能性がある。それにも関わらず、大部分の他の良性結節が陰性であり、手術前に試験された８例のＤＴＣ患者からの６例が陽性であったので、この試験は、手術前の良性甲状腺結節からの癌の示差的な診断における潜在的な用途を有し得る。
【００８５】
本発明者らの結果は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡが、再発性または転移性の甲状腺癌について患者をモニターする際に高感度かつ特異的マーカーであることを示す。本発明者らのデータはまた、患者がＴ４抑制治療にある間に、大部分の再発性疾患を検出するために血清Ｔｇレベルの高い感度および信頼性を示す。それゆえに、ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、初回の試験として、血清Ｔｇレベルのコスト効果の高い代替であるとは立証されないかもしれない。その価値は、干渉するＴｇ抗体、異好抗体または他の要因の存在によってＴｇ測定が信頼できない患者の中にある。本発明者らの系列において、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡまたはＴｇ  ｍＲＮＡは、Ｔ４治療の間に、または甲状腺ホルモン中止後に試験した、局所的または遠隔転移を有するすべての患者において検出した。血清Ｔｇレベルは、陽性ｍＲＮＡ試験によってＷＢＳの必要性が示されたであろうこれらの患者の、１例（Ｔｇ抗体陽性）以外のすべてにおいて上昇した（≧２．０ｎｇ／ｍＬ）。さらに、陰性ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡまたはＴｇ  ｍＲＮＡのシグナルの発見は、２例のＴｇ陽性患者および疾患の証拠がないすべてのＴｇ抗体陽性患者において、ＷＢＳの必要性を取り除くことができた。
【００８６】
疾患の証拠がない４８例のＤＴＣ患者の中で、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡは、Ｔｇ  ｍＲＮＡ（８％）よりもしばしば低頻度で陽性であった（２％）。これらの陽性患者は、血清Ｔｇレベルおよび／またはＷＢＳによって証明されるように、１年間の再調査においていずれも疾患を有さなかった。それにも関わらず、これらの患者は、注意深くモニターされるのに値する。なぜなら、彼らは、Ｔｇ  ｍＲＮＡアッセイによってより初期に検出される顕微鏡的疾患を有する可能性があるからである。
【００８７】
乳頭状癌を有するが他の組織学的型にはない患者においてのみＴｇ  ｍＲＮＡを見い出す以前の報告とは異なり、本発明者らは、腫瘍組織学に基づくＴｇ  ｍＲＮＡまたはＴＳＨ  ｍＲＮＡのいずれかの結果において違いを見い出さない。本発明者らの患者の中で、疾患の証拠が認められる、７例の濾胞腺癌患者の３例、およびヒュルトレ細胞癌患者の３例すべてが、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡとＴｇ  ｍＲＮＡの両方について陽性であった。
【００８８】
要約すると、末梢血におけるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡまたはＴｇ  ｍＲＮＡのいずれかの存在は、残存／再発性のＤＴＣ疾患の存在のために特異的であり、Ｔｇ抗体陰性患者をモニターする際の血清Ｔｇと同程度の感度である。しかし、信頼できない血清Ｔｇ値を有するＴｇ抗体陽性患者において、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡまたはＴｇ  ｍＲＮＡの監視は、ｍＲＮＡ陰性患者におけるＷＢＳについての必要性を除外することによって、よりコスト効果が高いことが証明される。さらに、手術前に甲状腺癌を検出するその能力の本発明者らの予備的な知見と組み合わせた、ｍＲＮＡ試験の高い特異性は、甲状腺結節を有する患者をスクリーニングする際の潜在的な役割を示唆する。
【００８９】
〔実施例２〕
＝＝＝末梢血における甲状腺刺激ホルモン／サイログロブリンメッセンジャーリボ核酸および細針吸引細胞学：甲状腺癌を検出するための診断的相乗作用＝＝＝
［患者および方法］
［患者］
本発明者らの内分泌学外科外来に付託され、かつインフォームドコンセントフォームに署名し、良性か、悪性か、またはまだ決定されていない悪性の潜在性がある甲状腺疾患の診断がなされた、合計で７２例の継続的な患者を、施設内審査委員会によって認可された本研究に含めた。７２例すべての患者は、手術前の研究室での試験の間、または手術の日のいずれかに、手術前サンプルを採取された。超音波誘導されたＦＮＡ生検を、日常的な診断的作業として７２例の患者の４６例で実施し、本発明者らの施設で実施しないときには、細胞学スライドを入手し、甲状腺細胞学において専門性を有する経験が豊富な本発明者らの病理学者中の１人によって再検査した。ＦＮＡサンプルについての適性の判断基準には、十分な細胞の数、豊富なコロイド、および少なくとも各々１０個の細胞から構成される良性小胞状細胞の少なくとも６つの群が含まれた。結果を、最終的な手術後の病理学的診断と比較した。
【００９０】
［ＲＴ−ＰＣＲ］
実施例１において既に詳細に記載した方法を使用した。手短に述べると、５ｍｌの静脈血を収集し、単核細胞をフィコールハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配を使用して、収集後２４時間以内に分離した。ＲＮＡを、フィコール分離後すぐに、トリゾール（TRIzol）試薬（カリフォルニア州、カールズバッドのLife Technologies社）を使用して単核細胞から抽出し、１μｇをスーパースクリプト（Superscript）IIプレ増幅システム（preamplification system）（Life Technologies社）を用いて逆転写した。本発明者らの以前の刊行物において文書に記されているように、特異性に基づく注意深く選択されたプライマー（非正統的転写がない）を使用して、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは合計３８サイクル［９４℃で１分間（１回目のサイクルは２分間）、６２℃で１分間、および７２℃で１分間（最後のサイクルは１０分間）］実行した。甲状腺癌組織から、および末梢血サンプルから（ＤＴＣ患者）のＲＮＡを用いて生成したＰＣＲ産物を、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ３１０遺伝子分析装置（カリフォルニア州、フォスターシティ（Foster City）のApplied Biosystems社）を用いて、それらのビッグダイターミネーター（BigDye Terminator）v3.1シークエンシングキットを使用して配列決定した。転写物の配列は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ配列と同一であり、オーセンティックな受容体ｍＲＮＡの存在を確認した。成功したＲＮＡ抽出および転写ならびにＰＣＲのためのコントロールとして、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを使用した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を２％ゲル電気泳動上で分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。ゲルの画像を、ゲル−ドック（Gel-doc）1000（カリフォルニア州、ハーキュリーズのBio-Rad社）システムおよびソフトウェアを使用して、「ライブモード」自動化設定（組み込み／露出時間、０．２秒）で取り込んだ。
【００９１】
［データ分析］
ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡおよびＦＮＡの結果を、最終的な病理学的診断と比較した。単独でまたは組み合わせて、ＴＳＨＲ／Ｔｇ  ｍＲＮＡによってまたはＦＮＡによって正しく分類された患者の数（診断的正確さ）を計算し、χ２検定を使用して比較した。
【００９２】
［結果］
合計で７２例の患者を本研究に含めた（６１例の女性、１１例の男性；年齢範囲、１８〜８８歳；平均５０歳）。これらの患者の中で４６例に対して、手術の前にＦＮＡ生検を実行した。手術後病理学的診断は、良性および悪性の甲状腺疾患群に患者を分類するために使用した（表５）。６１例の患者（２５例のＤＴＣおよび３６例の良性）を初期の診断に含めた（事前の甲状腺手術なし）。１１例の患者は、含めた時点で再発性または悪性の疾患を有し、これらのうちの１０例は事前の放射性ヨウ素除去がなされた。
【００９３】
〔表５〕
＝＝＝最終的な病理学的診断に従って分類した患者＝＝＝
2008509672.tif 000008
【００９４】
Ｔｇ  ｍＲＮＡおよびＴＳＨ−Ｒ  ｍＲＮＡについてのそれぞれのＲＴ−ＰＣＲ結果において１００％の一致が存在した。図１は、７例の患者におけるＴＳＨＲ（２１２ｂｐ）およびＴｇ（４０８ｂｐ）についての代表的なＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。全体で３６例の患者がＲＴ−ＰＣＲによって陽性であり、これには、３６例のうちの２９例の癌患者（感度８０％）および３６例のうちの７例（特異性８０％）の良性疾患患者が含まれる。初期診断された２５例の患者の中で、１９例がＲＴ−ＰＣＲによって陽性であった（感度７２％）（表５）。すべての偽陰性は、乳頭状甲状腺癌（ＰＴＣ）の病理学的診断がなされ、リンパ節転移を有する３例の患者が含まれた。偽陽性には、小胞状腺腫（ＦＡ）を有する２例の患者、ヒュルトレ細胞腺腫を有する１例の患者、過形成性好酸性結節を有する１例の患者、および非常に大きな多結節性甲状腺腫（ＭＮＧ）を有する３例の患者が含まれた。
【００９５】
ＦＮＡを使用した４６例の患者のうち、２２例がＤＴＣであると外科的に確認された。これらの２２例のうちの１８例（８２％）ではＰＴＣについての決定的なＦＮＡの結果が得られ、２例の濾胞腺癌（ＦＣ）および２例のＭＮＣ中のＰＴＣを含む４例の患者は、十分な試料を有したが、結論のでない結果となった。ＦＮＡ下で外科的に確認された良性疾患を有する２４例の患者のうち、９例が決定的に良性であり（大きなＭＮＧを有する３例の患者を含む）、１４例が十分であったが結論が出なかった（表６）。全体で４６例の患者のうちの１８例（３９％）が十分な試料を有したが、ＦＮＡ生検の結果は結論のでない／決定的ではないものであった。ＦＮＡの診断的感度は８２％であったが、全体の診断的正確さ（効力）は６１％のみであった。結果を表６に要約する。
【００９６】
〔表６〕
＝＝＝以前に甲状腺手術を受けていない患者におけるＦＮＡおよびＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの診断能＝＝＝
2008509672.tif 000009
【００９７】
ＦＮＡが細胞学的診断について十分なサンプル上（１８例の患者）で不確定であった場合、ＲＴ−ＰＣＲは、４例の癌患者のうちの３例、および１４例の良性疾患患者のうちの１１例を正確に分類した（感度７５％；特異性７８％）。ＭＮＧにおいてＰＴＣ病巣を有する１例の患者のみが陰性であった（偽陰性）。あいまいなＦＮＡを有するこれらの１８例の患者に対する実際のＦＮＡ結果およびＲＴ−ＰＣＲの結果は、図３に要約する。ＲＴ−ＰＣＲおよびＦＮＡについての組み合わせた診断的感度（９５％）および診断的効力（８９％）は、ＦＮＡ単独よりも有意に高かった（Ｐ＝０．００１）。
【００９８】
［考察］
本研究において、３９％のＦＮＡ生検が不確定であるとした。以前の報告に従って、これらの大多数（７８％）は、確かに、良性の組織学を有することが見い出された。これらの不確定な甲状腺結節は、内分泌学者および内分泌外科医にとって最もいら立たしく、かつ挑戦的な分野の１つであるようである。多くの研究は、ＦＮＡによってなされた診断の正確さを改善する手段として、分子マーカーまたはマーカーの組み合わせを同定するためのＦＮＡの試料に焦点を当てている。甲状腺結節を示す患者における、手術前悪性潜在能力を区別することが可能な、信頼できかつ満足できる方法は、まだ提案されていない。
【００９９】
本発明者らの結果は、循環している手術前ＴＳＨＲ／Ｔｇ  ｍＲＮＡが、ＦＮＡ、および不確定なＦＮＡで不正確に分類された７８％（１８例のうちの１４例）の結節の診断的正確さを増強するための付属的な試験として働く。ＦＮＡ不確定群の中で、３例の偽陽性患者およびＴＳＨＲ／Ｔｇ  ｍＲＮＡを有する１例の偽陰性患者のみが存在した。ＦＮＡ細胞学は、ＰＴＣについて高い感度を有することが認識される。また、この系列において、ＦＮＡは、結果があいまいだった２例の患者以外は、すべてを正確に同定した。相対的に、ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＴについて比較的感度が低く、７例の患者において陰性であり、これにはリンパ節転移を有する３例の患者が含まれた。これらの偽陰性結果の原因である要因は現在のところ不明のままであり、技術的な誤りおよびサンプリングの問題を含む可能性があり、またはこれらは、不十分な逆転写またはＰＣＲの非特異的阻害剤に関連する可能性がある。これらの要因の中で、技術的な誤りは、２回目のＰＣＲを使用する反復分析が同じ結果を生じたので、可能性が低い。逆転写またはＰＣＲの効率がこのアッセイにおける限定要因であるかもしれないことが可能性としてあり、これらの要因は本発明者らの研究室において現在研究中である。
【０１００】
他方、予測されたように、ＦＮＡは、ＦＣとＦＡとを区別することができない。本研究において、濾胞性新生物を有する患者は７例であり、ＦＮＡは１例を除いてすべてについて非診断性であった。従って、濾胞性新生物は、しばしば、不確定な、または濾胞性パターンの甲状腺病巣として一緒にグループ分けされ、相当な数のＦＮＡ、および不必要な診断的甲状腺肺葉切除を必要とする。今日まで、ＦＣと同様に、有意な数のＦＡがＲａｓ変異を有し、かつガレクチン−３免疫染色を示すために、癌からＦＡを確実に区別することができる既知のマーカーは存在していない。ＦＡの中には、ＦＣの前悪性段階を示す可能性があるものもあることが示唆される。本発明者らは、濾胞性癌およびヒュルトレ細胞癌を含む、組織学的型に関わらず、すべてのＤＴＣを有する患者において再発性／残存疾患を検出する際に、循環しているＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの高い感度を実証した。本研究において、この試験は、陽性としてのＦＣを有する患者と、陰性としての５例のうちの３例のＦＡの両方を検出し、従って、７例の濾胞性新生物のうちの５例を正確に分類した。濾胞性新生物の数はこの系列において少ないが、本発明者らの結果は、ＦＡとＦＣとを区別するＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの高い能力を示し、より多くの患者を用いる未来の研究における確認を待っている。２例のＦＡに加えて、他の偽陽性は、過形成結節を有する１例のＭＮＧ、大部分のヒュルトレ細胞型、および極度に大きなＭＮＧを有する３例の患者であり、このような患者が循環している甲状腺細胞を有する可能性があることを示唆した。このことは、甲状腺結節における高い過形成活性の存在に起因する可能性があり、または潜在性のＤＴＣが存在しており、病理学的試験において見落とされたという可能性がある。
【０１０１】
結論として、本発明者らの結果は、循環しているＴＳＨＲ／Ｔｇ  ｍＲＮＡが、初期診断においてＰＴＣを検出するためには、ＦＮＡよりも感度が低いことを実証する。しかしながら、ＴＳＨＲ／Ｔｇ  ｍＲＮＡは、ＦＮＡによってしばしば見逃されるＦＣを検出するための見込みを示す。その価値は、あいまいなＦＮＡを有する患者の中で良性の甲状腺疾患を同定することにある。全体として、これは、良性疾患から甲状腺癌を同定するために、ＦＮＡに対する価値のある補助手段として働く可能性がある。
【０１０２】
〔実施例３〕
＝＝＝甲状腺結節疾患を有する患者における悪性の手術前診断のための、末梢血におけるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡについての増強された定性的および定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイの臨床的評価＝＝＝
本研究において、本発明者らは、より高感度の定性的および定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用することによって、外科的切除に委ねられた各々の新たに診断された甲状腺癌患者に対して、および甲状腺結節についてのＦＮＡを受けている継続的な患者において、手術前または手術後にＴＳＨＲのレベルを検出および定量するために、この有望な分子マーカーの臨床的有用性の研究を継続する。
【０１０３】
本発明者らの仮説は、末梢血中のＴＳＨ受容体ｍＲＮＡのより高感度の定量的測定が、癌細胞の検出をさらに増強する可能性があるということである。これは、次に甲状腺ＦＮＡ生検と組み合わせた場合に、良性病巣および悪性病巣への甲状腺結節のより正確な分類を可能にする。さらに、定量的レベルは、手術前には疾患の程度を示す可能性があり、手術後には残存／転移性疾患についてのマーカーとして働く可能性がある。これによって、甲状腺手術の対象となる患者の選択の向上をもたらすはずであり、従って、多くの患者が不必要な外科的介入をなしで済ませられる。
【０１０４】
［材料および方法］
［血液の収集／単核細胞および循環している上皮細胞の単離］
６ｍｌの静脈血を、ＥＤＴＡ処理したチューブ中で収集し、氷上に配置し、および可能な限り速やかに処理する。全血を、１５ｍｌポリスチレンチューブ中で、等量のＰＢＳ  ｐＨ７．４と混合し、８ｍｌのフィコール（Pharmacia社）を重層する。サンプルを４００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離する。単核細胞層を収集し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄し、そしてペレット化する。
【０１０５】
［ＲＮＡ抽出］
ＲＮＡを、製造業者の指示書に従って、トリゾール（Trizol）試薬（Life Technologies社）を使用して単離する。手短に述べると、トリゾール試薬を、単核細胞ペレットに加え、５分間、室温にてインキュベートする。次いで、クロロホルム抽出を実行する。水相中のＲＮＡを、イソプロパノールを用いて沈殿させ、７５％エタノールで洗浄し、乾燥させ、そしてＤＥＰＣ処理した水で再懸濁する。Ａ２６０／２８０の光学密度の比率を使用して、単離されたＲＮＡの品質および量を評価する。
【０１０６】
［増強された定量的１段階逆転写（ｃＤＮＡ合成）およびＰＣＲ］
プラチナム（Platinum（登録商標））Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen Inc社）を用いるスーパースクリプトIII  １段階ＲＴ−ＰＣＲシステムを、製造業者の指示書に従って使用する。本発明者らの予備データは、スーパースクリプトII  ２段階手順を以前使用した場合と比較して、このより効率的なＲＴシステムを用いて、感度の有意な改善を示す。手短に述べると、１μｌの全ＲＮＡ、１０μＭ  プライマー、スーパースクリプトII  ＲＴ／プラチナム  Ｔａｑ高忠実度酵素ミックス（１μｌ）を含む２５μｌの反応混液および２５μｌのオートクレーブ処理した蒸留水を、サーモサイクラー中に配置する。１回目のサイクルを、ｃＤＮＡ合成および前変性用にプログラムし、５５℃で３０分間、次に９４℃で２分間とする。ＰＣＲを、９４℃で１５秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニール、および６８℃で１分間の伸長の４０サイクルで実施し、反応を７０℃で５分間で終了する。
【０１０７】
［リアルタイムＰＣＲアッセイ］
１段階「クアンチテックサイバーグリーン（Quantitech Syber Green）ＲＴ−ＰＣＲ」手順およびQiagen Inc.社（カリフォルニア州）からの試薬を使用する。手短に述べると、２５μＬのＳＹＢＲグリーンＲＴ−ＰＣＲマスターミックス、２μＭ（１μＬ）の各プライマーおよび５００ｎｇ（０．５μＬ）のＲＮＡ鋳型をＰＣＲチューブに加える。サーモサイクラーを、５０℃で３０分間のｃＤＮＡ合成および９５℃で１５分間の最初の不活性化ステップ、次いでその後の９４℃で１５秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニール、および７２℃で３０秒間の伸長の、合計で４０サイクルである１回目のＰＣＲサイクルのためにプログラムする。ＲＴ−ＰＣＲ産物の融解曲線分析は、特異性を確認するために、およびＲＴ−ＰＣＲ産物を同定するために実施する。甲状腺癌組織からの全ＲＮＡ調製物を、標準曲線を生成するため、および相対的定量を達成するための参照調製物として使用する。また、同時に、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨを、内因性コントロールとして測定し、ＲＴ−ＰＣＲ効率のサンプル間変動およびＲＮＡ負荷量に対して補正するために使用する。
【０１０８】
［患者集団］
１．甲状腺結節を示す患者：ＦＮＡが実施される、甲状腺結節を示す１００例の継続的な患者は、ＦＮＡの前に試験する。  
２．新たに診断された甲状腺癌：本発明者らの外科部門に付託された、甲状腺癌と新たに診断された５０例の患者を、手術の前および手術の後の日に試験する。  
３．小児性甲状腺癌：ＦＮＡ生検を必要とする甲状腺結節を表す１８歳より若い１０〜２０例の患者を、手術の前後で試験する。
【０１０９】
［統計学的分析（Ed Mascha, Dept.of Biostatisticsの補助で編集）サンプルサイズの計算］
より感度の低い定性的ＲＴ−ＰＣＴを用いた本発明者らの以前の経験に基づいて、本発明者らは、このアッセイを用いて、約７５％の感度および約９０％の特異性を得ていた。手術に委ねられた５０例の患者（グループ１）および内分泌学的に甲状腺結節を示す１００例の患者を用いて、予測された甲状腺癌の症例の数は、約４０〜７０例の患者であり、甲状腺癌を有さない症例の数は約８０〜１１０例の患者である。本発明者らは、約０．６６〜０．９０幅の９５％信頼区間（ＣＩ）を有する感度、および０．１５〜０．２０幅またはそれより良好なＣＩを有する特異性の正確な推定値を得ることが可能である。
【０１１０】
［計画したデータ分析］
すべての分析について、患者が甲状腺癌を有するかまたは良性甲状腺疾患を有するかを決定するために最も基準になる検査は、ＦＮＡ生検または最終組織病理による病理学的診断に基づく。グループ１患者は、新たに診断された甲状腺癌を有するものである（陽性またはあいまいなＦＮＡ）。これらのうちで、本発明者らは、約６０〜１００％がＲＴ−ＰＣＴアッセイを用いて試験して陽性であると見積もっている。このグループから、本発明者らは、感度の推定値および９５％信頼区間を得る。グループ２は、甲状腺結節の評価のために診療所に来院し、かつＦＮＡ生検を受ける患者である。このグループの中で、本発明者らは、約５〜３０％が癌について陽性であり得ると推定している。ここで、本発明者らは、特異性の推定値および９５％信頼区間を得る。両方のグループからのデータは、陽性と陰性の両方の予測値（ＰＰＶ、ＮＰＶ）、および甲状腺癌についてのＴＳＨＲ  ｍＲＮＡの効率を計算するために使用する。
【０１１１】
〔実施例４〕
＝＝＝甲状腺癌を有する患者の末梢血における甲状腺刺激ホルモン受容体メッセンジャーＲＮＡ（ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ）の、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）測定＝＝＝
甲状腺特異的ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイ方法は、甲状腺癌の再発をモニターすることを改善する可能性がある。本発明者らは、以前に、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡについての定性的ＲＴ−ＰＣＲが、再発性の甲状腺癌に対して高感度かつ特異的であり得ることを示した。ここで、本発明者らは、サイクル内蛍光検出システム（ＳＹＢＲグリーン１；Rotorgene 3000（商標））を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを開発して確証した。本発明者らは、５９例の患者；１５例の健常被験体；良性甲状腺疾患を有する１９例の患者、新たに診断された甲状腺癌を有する１４例の患者（１３例が乳頭状、１例が濾胞状）、および再発性の甲状腺癌を有する１１例の患者（すべて乳頭状）を研究した。血液サンプルを手術前に採取し、甲状腺疾患のすべての診断は、外科病理学によって確認した。ｍＲＮＡを静脈血から抽出し、分光光度計を使用して定量した。１段階ＲＴ−ＰＣＲは、Quantitect ＳＹＢＲグリーンキット（Qiagen社）についての製造業者による推奨に従って実施し、ＰＣＲを４０サイクル実行した。ゲル電気泳動は、増幅された産物の同一性を確認した。乳頭状甲状腺癌の外科的試料から抽出された全ＲＮＡを段階希釈して、アッセイを較正するために標準曲線を作製した。閾値サイクルについてのアッセイ間変動係数（ＣＶ）（ｎ＝８）は１．４％であり、平均アッセイ間ＣＶ（ｎ＝１２）は２．７％であった。サンプルは各反応チューブ（１ｇ）に負荷されたＲＮＡの量について標準化し、甲状腺癌ＲＮＡ標準曲線を使用して定量した。結果を、ｐｇ  ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡ／ｇ  甲状腺癌ｍＲＮＡとして報告する（表７）。これらの結果は、甲状腺癌を有する患者（新たに診断された／再発性）と比較して、甲状腺癌を有さない患者（正常患者／良性甲状腺疾患）におけるＴＳＨＲ  ｍＲＮＡレベルの間の有意な違いを示唆する。
【０１１２】
〔表７〕
2008509672.tif 000010
患者のグループ間の違いは、ウィルキンソン順位和検定を用いて試験した。
【０１１３】
〔実施例５〕
＝＝＝末梢血における定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＴＳＨ受容体ｍＲＮＡの測定：甲状腺癌を有する患者をモニターする際の手術前および手術後のレベルの役割＝＝＝
ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡについての定量的ＲＴ−ＰＣＲは、再発性甲状腺癌についての高感度かつ特異的なマーカーである。手術後の患者をモニターする際のその価値を評価するために、本発明者らは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡレベルを測定した。全体で７１例の被験体（２６例の正常；１９例の良性甲状腺疾患；１５例の新たに診断された癌および１１例の再発性甲状腺癌）を研究した。ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡレベルは、手術前および手術後１日目に測定し、１７例の患者はさらなる追跡調査レベルを有した（平均追跡調査１９．２±１０ヶ月）。残存／転移性疾患の状態は、刺激されたＴｇレベル（ｎｇ／ｍＬ）および／または全身Ｉ１３１スキャン（ＷＢＳ）によって、手術の９〜１８ヶ月後に評価した。正常被験体の上限（０．７８ｎｇ／μｇ全ＲＮＡ；メジアン０．１２）は、陽性ｍＲＮＡ試験のカットオフレベルを規定した。良性疾患についての手術前／手術後レベルについてのメジアン（範囲）は、０．２２（０〜２７．３）／０．２３（０〜０．５７）であり、新たに診断された癌患者および再発性の癌患者については、それぞれ、２９．８（０．０７〜６９．７）／０．０３（０．０１〜９．５）および３３．５８（４．８〜５２．９）／０．１５（０．０３〜１３６５）であった。新たに甲状腺癌と診断された１５例の患者の中で、１４例が手術後にＴＳＨＲ  ｍＲＮＡについて陰性になった。陽性の刺激されたＴｇレベルを有したが（１３．６ｎｇ／ｍＬ）、ＷＢＳ陰性であり、さらなる画像化に対して臨床的に関連した疾患を有さなかった１例を除いて、すべてが追跡調査で疾患を有さないままであった。１例の患者（Ｔｇ抗体陽性）は、手術後陽性のままであり、ＷＢＳおよび刺激されたＴｇによって実際に見逃され、病理学によって診断された臨床的に関連する疾患を有した。再発性の甲状腺癌を有する１１例の患者の中で、７例が本発明者らのアッセイによって、手術後に陰性になり；これらの４例が追跡調査で疾患を有さないままであり、そして残りの３例が増加された刺激されたＴｇレベル（≦９．３ｎｇ／ｍＬ）を有したが、しかし陰性ＷＢＳであり、それ以上の治療はしなかった。１１例の患者の４例がアッセイにより手術後に陽性のままであった；すべてが転移性疾患および上昇したＴｇ≧４６ｎｇ／ｍＬおよび陽性ＷＢＳを有した。刺激されたＴｇとの全体の一致は８１％であり、ＷＢＳとのそれは９６％であった。
【０１１４】
本発明者らの結果は、ＴＳＨＲ  ｍＲＮＡが循環中で短い寿命を有すること、および甲状腺癌を有する患者における手術後レベルは、残存／転移性疾患を予測することを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】９例の患者サンプル（レーン１〜９）、１例のネガティブコントロール（逆転写なし；レーン１０）および１例のポジティブコントロール（甲状腺癌組織ＲＮＡ；レーン１１）における、サイログロブリン（Ｔｇ）、ＴＳＨＲおよびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す代表的なゲルの写真を図示する。レーン１、５および６は良性甲状腺疾患患者；レーン２および４は疾患の証拠がない甲状腺癌患者；レーン３、７〜９は疾患の証拠が認められる甲状腺癌患者である。
【図２】患者（レーン２〜８）におけるＴｇおよびＴＳＨＲについてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す代表的なゲルの写真を図示する。ポジティブコントロールはレーン１であり、ネガティブコントロールはレーン９である。
【図３】非診断的ＦＮＡサイトロジー＊を用いる１８例の患者におけるＲＴ−ＰＣＲの結果を図示する。２つは甲状腺炎および１つはコロイド結節である。ＦＰ、偽陽性（過形成好酸性結節）；ＨＡ、ヒュルトレ細胞腺腫。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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