(57)【要約】本発明は、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ活性をアッセイする方法を提供する。このアッセイでは、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有するサンプル、またはα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルを、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡと接触させる。α−メチルアシルＣｏＡラセマーゼが、サンプル中に存在している場合、（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡは、（２Ｓ）−メチルアシル−ＣｏＡに変換される。本方法は、次に、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ活性に対応する検出可能なシグナルを発生する、（２Ｓ）−メチルアシルＣｏＡとトランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡとの間の循環反応系を利用する。同じ原理に基づく、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするためのキットもまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするための方法であって、該方法は：
ａ）α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルと（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡとを接触させ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡを発生させる工程；
ｂ）工程ａ）からの該（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡを、発生した場合、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および酸化型の第一の電子アクセプターの存在下で、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡに変換し、これによって第一の電子アクセプターの還元型が発生される工程であって；該トランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡを、トランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素および還元型の第２の電子アクセプターの存在下で、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡに再変換し、循環反応系を形成させ、これによって第２の電子アクセプターの酸化型が発生される工程；ここで第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターとは異なる工程；および
ｃ）該循環反応系において、第１の電子アクセプターの還元型もしくは酸化型の濃度変化または第２の電子アクセプターの還元型もしくは酸化型の濃度変化を評価し、これによって、該サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの、存在、非存在および／または量を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項２】
前記（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡが、Ｃ（４）からＣ（３０）までの鎖長を有する（２Ｒ）−２−メチル−分枝アシル−ＣｏＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡが、Ｃ（８）からＣ（２５）までの鎖長を有する（２Ｒ）−２−メチル−分枝アシル−ＣｏＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡが、（２Ｒ）−プリスタノイル−ＣｏＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡが、（２５Ｒ）−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コレスタノイル−ＣｏＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
最初に前記（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および前記酸化型の第１の電子アクセプターが前記サンプル中へ添加され、そして次に前記サンプルは（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素、および前記還元型の第２の電子アクセプターに接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素と前記トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素とが異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素がアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、そして前記第１の電子アクセプターがＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素がアシル−ＣｏＡオキシダーゼであり、そして前記第１の電子アクセプターがＯ２である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素がトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして前記第２の電子アクセプターがＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素がトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして前記第２の電子アクセプターがＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素がトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして前記第２の電子アクセプターがＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素と前記トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素とが同じである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および前記トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の両方が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酸化型の前記第１の電子アクセプターが、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群から選択され；そして前記還元型の前記第２の電子アクセプターが、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
濃度変化が光度測定法によって評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、該方法はさらに、工程ｃ）の後で、前記酸化型もしくは還元型の前記第１の電子アクセプターまたは前記還元型もしくは酸化型の前記第２の電子アクセプターを、発色試薬に結合させる工程を包含し、該酸化型もしくは還元型の該第１の電子アクセプターの濃度変化または該還元型もしくは酸化型の該第２の電子アクセプターの濃度変化は、比色測定法によって評価される、方法。
【請求項１８】
前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的サンプルが血液サンプルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記血液サンプルが、全血、血清、および血漿からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的サンプルが、前立腺、結腸、卵巣、乳房、膀胱、肺、腎臓、リンパ球からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、該方法は個体における癌の予後および／または診断のために使用される、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、該方法はさらに、前記個体からの前記サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの量を、あらかじめ決められた値と比較する工程を包含し、これによって、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの量の増加が、該個体が癌を有しているまたは癌を発生させる危険性があることを示す、方法。
【請求項２４】
前記癌が、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、リンパ腫、および黒色腫からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするためのキットであって、該キットが、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、酸化型の第１の電子アクセプター、酸化型の該第１の電子アクセプターの存在下において（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡのトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡへの変換を触媒する（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、還元型の第２の電子アクセプター、および還元型の該第２の電子アクセプターの存在下においてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡの（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡへの変換を触媒するトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素を備え、ここで該第１の電子アクセプターと該第２の電子アクセプターは異なる、キット。
【請求項２６】
前記（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡが、Ｃ（４）からＣ（３０）までの鎖長を有する（２Ｒ）−２−メチル−分枝アシル−ＣｏＡである、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡが、Ｃ（８）からＣ（２５）までの鎖長を有する（２Ｒ）−２−メチル−分枝アシル−ＣｏＡである、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡが、（２Ｒ）−プリスタノイル−ＣｏＡである、請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
前記（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡが、（２５Ｒ）−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コレスタノイル−ＣｏＡである、請求項２５に記載のキット。
【請求項３０】
前記（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素がアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、そして前記第１の電子アクセプターがＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群から選択される、請求項２５に記載のキット。
【請求項３１】
前記（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素がアシル−ＣｏＡオキシダーゼであり、そして前記第１の電子アクセプターがＯ２である、請求項２５に記載のキット。
【請求項３２】
前記トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素がトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして前記第２の電子アクセプターがＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される、請求項２５に記載のキット。
【請求項３３】
前記トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素がトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして前記第２の電子アクセプターがＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される、請求項３０に記載のキット。
【請求項３４】
前記トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素がトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして前記第２の電子アクセプターがＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３５】
請求項２５に記載のキットであって、該キットはさらに癌の予後および／または診断のための使用を示す使用説明書を備える、キット。
【請求項３６】
前記癌が、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、リンパ腫、および黒色腫からなる群から選択される、請求項３５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年１０月１５日に出願された米国特許出願第１０／９６６，９８３号の一部継続出願である、２００４年１２月３日に出願された、米国特許出願第１１／００４，４７７号に関連する（これらの出願は、その全体が参考として援用される）。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概してα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ検出の分野に関する。特に、本発明は、サンプル中でα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするための方法およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）は、食餌中の分枝鎖脂肪酸およびＣ２７−胆汁酸中間体のペルオキシソームでのβ酸化において鍵となる役割を演じる、特色づけのよくなされた酵素である。（非特許文献１）。ＡＭＡＣＲは、（Ｒ）−α−メチル分枝鎖脂肪アシル−ＣｏＡエステルをこれらの（Ｓ）立体異性体へ変換するのを触媒する。（非特許文献２；非特許文献３）。ＡＭＡＣＲは、ヒト肝臓から４７ｋＤａのモノマーとして単離され、そして主にペルオキシソームに局在化し、少量はミトコンドリアでも検出される。（非特許文献３；非特許文献４）。ヒト肝臓から単離されたＡＭＡＣＲの等電点は、ｐＨ６．１であり、そしてこの酵素はｐＨ７とｐＨ８の間で最適活性を示す。
【０００４】
ＡＭＡＣＲ発現の上昇は、前立腺、結腸直腸、卵巣、乳房、膀胱、肺、腎細胞癌腫、リンパ腫、および黒色腫などの、いくつかのタイプの癌のバイオマーカーであることが示されている。（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。研究はまた、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ酵素活性が前立腺癌組織標本において上昇していることも示す。（非特許文献８）。特許文献１および特許文献２は、前立腺癌を有する患者または前立腺癌を発生する危険性のある患者、および前立腺癌が別の組織に転移することから生じる癌を有する患者または癌を発生する危険性のある患者を、ＡＭＡＣＲの発現または活性を測定することによって同定する方法を記載している。
【０００５】
ＡＭＡＣＲの酵素活性をアッセイするためのいくつかの方法が報告されている。非特許文献４は、２−メチル［２-（３）Ｈ］アシル−ＣｏＡを基質として用いる、ＡＭＡＣＲ酵素活性の放射アッセイを記載している。非特許文献９は、ＡＭＡＣＲが、２Ｒ−メチル−ペンタデカノイル−ＣｏＡと結合される、ＡＭＡＣＲの代替の酵素アッセイを記載している。反応生成物の２Ｓ異性体は、過剰量の添加オキシダーゼ（プリスタノイルＣｏＡオキシダーゼ）によって不飽和化され、これは過酸化水素の生成をもたらす。この過酸化水素は、適切な水素供与体の存在下でペルオキシダーゼによってモニターされる。しかし、サンプル中のＡＭＡＣＲ酵素活性をアッセイするための（例えば、癌の診断のために）、信頼性がありそして感受性のある方法が、未だ、必要とされている。
【特許文献１】国際公開第０２／２７３２４号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／０１２３０８１号
【非特許文献１】Ｆｅｒｄｉｎａｎｄｕｓｓｅら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．（２０００）４１：ｌ８９０−１８９６
【非特許文献２】Ｃｕｅｂａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００２）３６３：８０１−８０７
【非特許文献３】Ｓｃｈｍｉｔｚら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５）  ２３１：８１５−８２２
【非特許文献４】Ｓｃｈｍｉｔｚら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９４）２２２：３１３−２３
【非特許文献５】Ｒｕｂｉｎら，ＪＡＭＡ（２００２）２８７：１６６２−１６７０
【非特許文献６】Ｌｕｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００２）６２：２２２０−２２２６
【非特許文献７】Ｓｒｅｅｋｕｍａｒら，Ｊ  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（２００４）９６：８３４−８４３
【非特許文献８】Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｈａら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００４）１６４：７８７−９３
【非特許文献９】Ｖｅｌｄｈｏｖｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９７）１３４７：６２−６８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするための方法を提供する。該方法は、以下：ａ）α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルと（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡとを接触させ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡを発生させる工程；ｂ）工程ａ）からの該（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡを、発生した場合、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および酸化型の第一の電子アクセプターの存在下で、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡに変換し、これによって第一の電子アクセプターの還元型が発生される工程；該トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡを、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素および還元型の第２の電子アクセプターの存在下で、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡに再変換し、循環反応系を形成させ、これによって第２の電子アクセプターの酸化型が発生される工程；ここで第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターは異なる工程；およびｃ）該循環反応系において、第１の電子アクセプターの還元型もしくは酸化型の濃度変化または第２の電子アクセプターの還元型もしくは酸化型の濃度変化を評価し、これによって、サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの、存在、非存在および／または量が測定される工程、を包含する、方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、該（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、アシル基の鎖長がＣ（４）〜Ｃ（３０）までの、Ｃ（８）〜Ｃ（２５）までの、またはＣ（１０）〜Ｃ（２５）までの、（２Ｒ）−２−メチル−分枝アシル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｒ）−プリスタノイル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは（２５Ｒ）−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コレスタノイル−ＣｏＡである。
【０００８】
いくつかの実施形態では、最初に、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および酸化型の第１の電子アクセプターがサンプルに添加され、そして次に、このサンプルは（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素、および還元型の第２の電子アクセプターに接触される。いくつかの実施形態では、α-メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、酸化型の第１の電子アクセプターと接触される。他の実施形態では、α-メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、酸化型の第１の電子アクセプター、トランス−２，３−デヒドルアシル−ＣｏＡ変換酵素、および酸化型の第２の電子アクセプターと接触される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は異なる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、そして第１の電子アクセプターは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群から選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼであり、第１の電子アクセプターはＯ２である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして第２の電子アクセプターは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素とは、同じである。いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の両方が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の両方が、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼである。酸化型の第１の電子アクセプターは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群から選択され得、還元型の第２の電子アクセプターは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択され得る。
【００１４】
前記循環反応系における還元型もしくは酸化型の第１の電子アクセプターの濃度変化、または還元型もしくは酸化型の第２の電子アクセプターの濃度変化は、光度測定法（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）によって評価され得る。
【００１５】
本発明の方法は、さらに、酸化型もしくは還元型の第１の電子アクセプターまたは還元型もしくは酸化型の第２の電子アクセプターを、還元型もしくは酸化型の第１の電子アクセプターの濃度変化または還元型もしくは酸化型の第２の電子アクセプターの濃度変化を評価するための、発色試薬に結合させる工程を包含し得る。ここで、この酸化型もしくは還元型の第１の電子アクセプターの濃度変化または還元型もしくは酸化型の第２の電子アクセプターの濃度変化は、比色測定法（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）によって評価される。
【００１６】
本発明の方法によってアッセイされ得るサンプルは、生物学的サンプルを含む。いくつかの実施形態では、この生物学的サンプルは、血液、血清、血漿、および尿などの生物学的流体である。いくつかの実施形態では生物学的サンプルは、前立腺、結腸、卵巣、乳房、膀胱、肺、腎臓、リンパ球からなる群から選択される。
【００１７】
本発明の方法は、個体における癌の予後および／または診断のために使用され得る。いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、リンパ腫、および黒色腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、血液サンプル（例えば、全血、血漿、および血清）中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ活性をアッセイすることによって、個体における前立腺癌の予後および／または診断のために使用され得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、個体からのサンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの量と、あらかじめ決められた値とを比較する工程を含み、これによって、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの量の増加は、個体が癌を有しているまたは癌を発生させる危険性があることを示す。いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、リンパ腫、および黒色腫からなる群から選択される。
【００１９】
本発明はまた、サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするためのキットを提供する。該キットは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、酸化型の第１の電子アクセプター、酸化型の第１の電子アクセプターの存在下において、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡのトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡへの変換を触媒する（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、還元型の第２の電子アクセプター、および還元型の第２の電子アクセプターの存在下において、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡの（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡへの変換を触媒するトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素を備え、ここで第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターは異なる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、この（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、アシル基の鎖長がＣ（４）〜Ｃ（３０）までの、Ｃ（８）〜Ｃ（２５）までの、またはＣ（１０）〜Ｃ（２５）までの、（２Ｒ）−２−メチル−分枝アシル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｒ）−プリスタノイル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは（２５Ｒ）−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コレスタノイル−ＣｏＡである。
【００２１】
いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は異なる。いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、そして第１の電子アクセプターは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼであり、第１の電子アクセプターはＯ２である。いくつかの実施形態では、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして第２の電子アクセプターは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、同じである。いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の両方が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、酸化型の第１の電子アクセプターは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群から選択され、還元型の第２の電子アクセプターは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される。
【００２３】
キットは、さらに、これらに限られるわけではないが、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、リンパ腫、および黒色腫を含む癌の予後および／または診断のための使用を示す使用説明書を含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ活性をアッセイする方法を提供する。このアッセイでは、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有するサンプルまたはα−メチルアシル−ＣｏＡを含有する疑いのあるサンプルを、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡと接触させる。酵素的に活性なα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼがサンプル中に存在する場合、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡに変換される。本方法は、次に（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡおよびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡの間の循環反応系を利用して、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの酵素活性に対応する検出可能なシグナルを発生させる。本明細書において記載される方法は、癌を診断するために使用され得る。例えば、本方法は、血液サンプルを使用して、生検なしで、前立腺癌を診断するために使用され得る。
【００２５】
開示を明確にするために、そして限定するつもりはないが、本発明の詳細な説明は、以下に続くサブセクションに分けられる。
【００２６】
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって、一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において参照される、全ての特許、特許出願、公開公報および他の出版物は、参考としてその全体が援用される。このセクションで記載される定義が、参考として本明細書において援用される、特許、特許出願、公開公報および他の出版物において示される定義と相容れないまたはさもなくば矛盾する場合は、このセクションにおいて示される定義を、参考として本明細書において援用される定義より優先させる。
【００２７】
本明細書において使用されるときは、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００２８】
本明細書において使用されるときは、「α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ」または「ＡＭＡＣＲ」（ＥＣ５．１．９９．４）とは、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡと（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡの間の変換を触媒する酵素をいう。その活性を実質的には変更しない、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの誘導体、改変体、および類似体を含むことが意図される。α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼは、ヒト、マウス、ウシ、ラット、ショウジョウバエ（ｆｒｕｉｔ  ｆｌｙ）、その他などのいかなる供給源からも得られ得る。
【００２９】
本明細書において使用されるときは、「（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素」とは、酸化型の電子アクセプターの存在下において、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡからのトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡの形成を触媒する酵素をいう。その活性を実質的には変更しない（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素の誘導体、改変体、および類似体を含むことが意図される。
【００３０】
本明細書において使用されるときは、「トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素」とは、還元型の電子アクセプターの存在下において、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡからの（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡの形成を触媒する酵素をいう。その活性を実質的には変更しないトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の誘導体、改変体、および類似体を含むことが意図される。
【００３１】
本明細書において使用されるときは、用語「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」は、反応系中に存在する分析物の量または濃度の絶対値を得るという意味での、および反応系中の分析物のレベルを示す、指標、比、パーセンテージ、視覚的値または他の値をも得るという意味での、量的測定および質的測定を含むことを意図する。評価は、直接でも間接でもよく、そして実際に検出される化学種は、当然分析物それ自身である必要はなく、例えばそれらの誘導体または何かのさらなる物質であり得る。
【００３２】
本明細書において使用されるときは、「サンプル」とは、分析物アッセイが望まれる分析物を含有し得る全てのものをいう。サンプルは、生物学的流体または生物学的組織のような生物学的サンプルであり得る。生物学的流体の例としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水などが挙げられる。生物学的組織は、通常、特定の種類の、それらの細胞間物質を伴った、細胞の集合であり、ヒト、動物、植物、細菌、真菌またはウイルス構造体の構造材料の一つを形成する。これらとしては、結合組織、上皮組織、筋肉組織および神経組織が挙げられる。生物学的組織の例としては、器官、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞もまた挙げられる。
【００３３】
本明細書において使用されるときは、「血液サンプル」としては、全血、血清、および血漿が挙げられる。
【００３４】
本明細書において使用されるときは、「血清」とは、フィブリン血塊と血球とを取り除いた後に得られる血液の液体部分をいい、循環血液中の血漿とは区別される。
【００３５】
本明細書において使用されるときは、「血漿」とは、血液の流体、非細胞部分をいい、血液凝固の後に得られる血清とは区別される。
【００３６】
本明細書において使用されるときは、「流体」とは、流れ得る任意の組成物をいう。従って流体は、このように、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他のこのような組成物の形態である組成物を含む。
【００３７】
本明細書において使用されるときは、「疾患または障害」とは、例えば、感染または遺伝的欠陥によりもたらされ、そして同定可能な症状によって特色付けられる、生物における病理学的状態をいう。
【００３８】
本明細書において使用されるときは、「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」とは、２つ以上の成分を一緒にすることを意味する。「接触させる」は、全ての成分を流体混合物中または半流体混合物中で、混合することによって達成され得る。「接触させる」は、１つ以上の成分を１つ以上の他の成分と、固体組織切片または基板などの固体表面上で接触させる場合もまた達成され得る。
【００３９】
本明細書において使用されるときは、「循環反応系（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）」とは、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡをトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡへ変換する過程、およびトランス−２，３−デヒドロアシルＣｏＡから逆に（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡへと、変換する過程をいう。
【００４０】
（Ｂ．α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイする方法）
本発明は、サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするための方法を提供する。該方法は、以下：ａ）α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルと（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡとを接触させ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡを発生させる工程；ｂ）工程ａ）からの該（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡを、発生した場合、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および酸化型の第一の電子アクセプターの存在下で、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡに変換し、これによって第一の電子アクセプターの還元型が発生される工程；該トランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡを、トランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素および還元型の第２の電子アクセプターの存在下で、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡに再変換し、循環反応系を形成させ、これによって第２の電子アクセプターの酸化型が発生される工程；ここで第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターは異なる工程；およびｃ）該循環反応系において、第１の電子アクセプターの還元型もしくは酸化型の濃度変化または第２の電子アクセプターの還元型もしくは酸化型の濃度変化を評価し、これによって、サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの、存在、非存在および／または量が測定される工程、を包含する。いくつかの実施形態では、工程ｃ）で発生した検出可能シグナルは、該循環反応系における、還元型もしくは酸化型の第１の電子アクセプター、または還元型もしくは酸化型の第２の電子アクセプターの濃度変化である。いくつかの実施形態では、サンプルは、血液サンプル（例えば、全血、血清、および血漿）である。
【００４１】
（工程ａ）：α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼによる（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡの（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡへの変換）
本発明においてα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイする方法は、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼによって触媒される酵素活性を測定することに基づいている。α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼは、（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡを（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡへ変換するする反応を触媒する。従って、サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの存在または非存在および量は、これらの反応において発生した（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡを測定することによって決定され得る。それゆえ、本発明の工程ａ）の例示的反応スキームは：
（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ  →
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ                （１）
である。
【００４２】
アッセイされるα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの基質であれば、どんな（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡも使用され得る。アシル基は、どんな脂肪酸からも由来し得る。アシル基は、鎖長が少なくともＣ（４）の、少なくともＣ（６）の、少なくともＣ（８）の、少なくともＣ（１０）またはそれを超える、分枝アシル（例えば脂肪酸アシル）であり得る。例えば、鎖長は、Ｃ（４）〜Ｃ（３０）、Ｃ（４）〜Ｃ（１６）、Ｃ（８）〜Ｃ（２５）、Ｃ（８）〜Ｃ（１８）、Ｃ（１０）〜Ｃ（２５）、またはＣ（１２）〜Ｃ（２５）であり得る。アシル基としては、芳香族化合物（例えば、イブプロフェン）およびトリヒドロキシコプロスタノイル−ＣｏＡなどの胆汁酸中間体が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｒ）−プリスタノイル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡは（２Ｒ，６Ｒ，１０）−トリメチルウンデカノイル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡは、（２Ｒ，６）−ジメチルヘプタノイル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡは、（２Ｒ）−メチル−ペンタデカノイル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２５Ｒ）−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コレスタノイル−ＣｏＡである。
【００４３】
工程ａ）の（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ反応のために適切であり、そしてサンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの活性に依存する、任意の濃度であり得る。例えば、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡの濃度は、約０．０１ｍＭから約１００ｍＭ、約０．０５ｍＭから約５０ｍＭ、約０．５ｍＭから約１０ｍＭ、または約１ｍＭから約５ｍＭである。酵素反応は、概して、酵素反応の完了に適切な条件（例えば緩衝液および温度など）の下で行われる。α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ酵素反応のために適切な、当該分野で公知の任意の緩衝液が使用され得る。例えば、緩衝液は、約６から約８のｐＨのリン酸緩衝液、約７から約９のｐＨのトリス−ＨＣｌ緩衝液、または約６から約９のｐＨのＧｏｏｄ緩衝液であり得る。例えば、反応は、約３０℃から３７℃の間の温度下で５分間、１０分間、１５分間、３０分間、または６０分間、行われ得る。この反応は、次の工程の前に終了され得る。
【００４４】
本発明を用いて、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する任意のサンプルまたはα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのある任意のサンプルがアッセイされ得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、血液（全血、血清および血漿が挙げられる）または尿である。いくつかの実施形態では、サンプルは組織サンプル（例えば、前立腺、結腸、卵巣、乳房、膀胱、肺、腎臓、およびリンパ球）である。いくつかの実施形態では、組織サンプルをホモジェナイゼーションにかけ、アッセイを行う前に粗組織ホモジェネートを得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、サンプルは、アッセイが行われる前に、前処理される。例示的処理工程としては、遠心分離、抽出／洗浄、細胞溶解、凍結／融解、および音波破砕が挙げられる。サンプルはまた、アッセイの前に、希釈され得る。
【００４６】
（工程ｂ）：（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ／トランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡ循環反応系）
本発明の工程ｂ）では、第１の電子アクセプター（その酸化型）の存在下において、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素の作用を介して、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡをトランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡに変換し、そして次に、第２の電子アクセプター（その還元型）の存在下において、トランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の作用を介して、トランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡを（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡに逆変換する。第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターは異なる電子アクセプターである。工程ｂ）は、このように循環反応系を形成し、還元型の第１の電子アクセプターの増加および酸化型の第１の電子アクセプターの減少、ならびに、酸化型の第２の電子アクセプターの増加および還元型の第２の電子アクセプターの減少を生じる。特定の型の電子アクセプターの増加または特定の型の電子アクセプターの減少が測定され得る。いくつかの実施形態では、特定の型の電子アクセプターが蓄積され、そしてその蓄積が評価される。
【００４７】
いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素とは異なる。いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、第２の電子アクセプターと交差反応しないかまたは第２の電子アクセプターに第１の電子アクセプターに対するよりも低い親和性でしか結合しない、および／あるいはトランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、第１の電子アクセプターと交差反応しないかまたは第１の電子アクセプターに第１の電子アクセプターに対するよりも低い親和性で結合する。
【００４８】
酸化型の電子アクセプターの存在下において、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡからのトランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡの形成を触媒する、任意の（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素が使用され得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．３．１．８）である。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｂ７０７１９（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のアミノ酸配列を有する任意のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．３．１．８）、またはＣｖｅｔａｎｏｖｉｃら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．２２７：４９−５６（１９８５））、Ｄｏｍｍｅｓら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２５：３３５−３４１（１９８２））、およびＳｅｕｂｅｒｔら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６４：４９８−５１７（１９６８））によって記載された任意のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．３．１．８）が使用され得る。
【００５０】
他の実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．６）である。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｔ５２１２１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、Ｔ５２１２０（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、Ｉ３８０９５（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｓ６４２２４（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ａ５４９４２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ＯＸＲＴＡ２（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｑｉｃｕｓ）、ＯＸＲＴＡ１（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｑｉｃｕｓ）、ＯＸＣＫＸ５（ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）のアミノ酸配列を有する、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．６）が使用され得る。
【００５１】
さらに他の実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．３８）である。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｓ７２４００（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）のアミノ酸配列を有する任意のトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．３８）、またはＭｉｚｕｇａｋｉら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１６４９−１６５４（１９８２））およびＰｒａｓａｄら（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２３７：５３５−５４４（１９８５））によって記載された任意のトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．３８）が使用され得る。
【００５２】
還元型の電子アクセプターの存在下において、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡからの（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡの形成を触媒する、任意のトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素が使用され得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、このトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．３８）である。当該分野で公知でありそして本明細書において記載される、任意のトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼが使用され得る。
【００５４】
他の実施形態では、このトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．３．１．８）である。当該分野で公知でありそして本明細書において記載される、任意のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが使用され得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素とは同じである。一つの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の両方が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。他の実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の両方が、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼである。当該分野で公知でありそして本明細書において記載される、任意のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび任意のトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素が使用され得る。
【００５６】
第１および第２の電子アクセプターは、第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターとが異なるとの条件で、反応のために選択される酵素と適合性がある、任意の電子アクセプターであり得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、そして第１の電子アクセプターは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼであり、そして第１の電子アクセプターはＯ２である。いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして第１の電子アクセプターは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群から選択される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、このトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして第２の電子アクセプターは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、このトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、そして第２の電子アクセプターは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アッセイにおいて発生するシグナルを増幅する、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡとトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡとの間の循環反応を、集合的に触媒し得る。この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、異なる電子アクセプターを使用し得、そして他方の酵素によって使用される電子アクセプターと交差反応（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔ）しないかまたは低い親和性でしか反応しない。代替として、これらの２つの酵素は、同じ電子アクセプターを認識し得る。十分な量の酸化型の第１の電子アクセプターおよび十分な量の還元型の第２の電子アクセプターが、両反応を駆動させ、そして十分なシグナルが発生されるまで循環がつづけられることを可能にするために、循環反応に添加され得る。
【００６０】
工程ｂ）のための２つの以下の例示的反応スキームでは、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素とは異なる。例えば、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．３．１．８）であり、そしてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．３８）である。このように、工程ｂ）のための例示的反応スキームは以下である：
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ＋チオ−ＮＡＤＰ＋＋Ｈ２Ｏ  →
トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋チオ−ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋      （２ａ）
トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋  →
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ                  （２ｂ）
反応（２ａ）は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される反応を表し、そして反応（２ｂ）は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼによって触媒される反応を表す。例として、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｓ）−プリスタノイル−ＣｏＡであり、そしてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡは、トランス−２，３−デヒドロプリスタノイル−ＣｏＡである。十分なチオ−ＮＡＤＰ＋およびＮＡＤＨが、循環反応を発生させるために反応物に添加され得る。これはチオ−ＮＡＤＰＨの蓄積をもたらす。
【００６１】
別の例では、循環反応で、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＥＣ  １．３．３．６）は（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素として使用され、そしてトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．３８）がトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素として使用される。例示的反応スキームは以下である：
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ＋Ｏ２  →
トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ２                    （３ａ）
トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋  →
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＰ＋＋Ｈ２Ｏ                （３ｂ）
反応（３ａ）は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼによって触媒される反応を表し、そして反応（３ｂ）は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼによって触媒される反応を表す。例として、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｓ）−プリスタノイル−ＣｏＡであり、そしてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡは、トランス−２，３−デヒドロプリスタノイル−ＣｏＡである。十分な量のＯ２およびＮＡＤＰＨが、循環反応を発生させるために反応物に添加され得る。これはＮＡＤＰ＋およびＨ２Ｏ２の蓄積をもたらす。
【００６２】
以下は、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素が同じである場合の、例示的反応スキームである。一つのこのような例示的反応スキームは以下である：
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ＋チオ−ＮＡＤＰ＋＋Ｈ２Ｏ  →
トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋チオ−ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋      （４ａ）
トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋  →
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ                  （４ｂ）
反応（４ａ）および（４ｂ）の両方は、同じ酵素によって触媒され、この酵素はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．３．１．８）またはトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．３８）である。例として、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｓ）−プリスタノイル−ＣｏＡであり、そしてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡは、トランス−２，３−デヒドロプリスタノイル−ＣｏＡである。十分なチオ−ＮＡＤＰ＋およびＮＡＤＨが、循環反応中で両反応を駆動させるために反応混合物に添加し得る。循環反応はチオ−ＮＡＤＰＨの蓄積をもたらす。
【００６３】
同じ循環効果を達成するのに、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の任意の他の組み合わせが使用され得る。
【００６４】
工程ａ）および工程ｂ）の酵素反応は、概して、酵素反応の完了のために適切な条件（例えば、緩衝液および温度）下で行われる。本明細書において記載される工程ｂ）および工程ａ）のための緩衝液は、同じでものであっても異なるものであってもよい。工程ａ）および／またはｂ）における特定の酵素反応のために適切な、当該分野で公知の任意の緩衝液が使用され得る。例えば、緩衝液は、約６から約８のｐＨのリン酸緩衝液、約７から約９のｐＨのトリス−ＨＣｌ緩衝液、または約６から約９のｐＨのＧｏｏｄ緩衝液であり得る。
【００６５】
工程ｂ）の温度は、工程ａ）と同じであっても異なっていてもよい。工程ｂ）の温度は、好ましくは、約２５℃から約３７℃の間である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される１つ以上の工程が、別々の反応混合物中で行われる。例えば、反応の１つ以上の工程の最終生成物が、次の工程のための試薬が添加される前に、反応混合物から部分的または完全に分離され得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される工程ａ）およびｂ）は、単一の反応混合物中で行われる。いくつかの実施形態では、次の工程のための酵素、基質、または電子アクセプターは、前の工程の終わりに同じ反応混合物に、連続して添加される。いくつかの実施形態では、前の工程の反応は、次の工程のための試薬が添加される前に、終了される。いくつかの実施形態では、１つを超える数の工程のためのいくつかの試薬または全ての試薬が、反応混合物に同時に添加される。いくつかの実施形態では、工程ａ）およびｂ）のための試薬が、同時にサンプルと混合される。これらの実施形態では、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、および酸化型の第１の電子アクセプター、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素、および還元型の第２の電子アクセプターと接触される。いくつかの実施形態では、工程ａ）のための試薬および工程ｂ）のための試薬のいくつかが、同時にサンプルと混合される。これらの実施形態では、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、酸化型の第１の電子アクセプターと接触される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、工程ｂ）のための試薬のいくつかがサンプルと最初に混合され、そして工程ａ）のための試薬および工程ｂ）のための他の試薬が後に添加される。いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および酸化型の第１の電子アクセプターが、サンプルに最初に添加され、そして次にサンプルは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素、および還元型の第２の電子アクセプターと接触される。いくつかの実施形態では、このサンプルは（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および酸化型の第１の電子アクセプターと共にインキュベートされ、サンプル中の（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡのトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡへの変換を可能にする。これらの実施形態は、実施例１および実施例２に詳細に記載されている。
【００６９】
（工程ｃ）：工程ｂ）において発生したシグナルの評価）
サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの定量は、工程ｂ）において発生したシグナルの減ずる差または加えられる差をモニターすることによって達成され得る。評価は、連続的にまたは異なる時点で行い得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、還元型または酸化型の第１の電子アクセプターの濃度変化が評価される。いくつかの実施形態では、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの活性は、還元型の第１の電子アクセプターの濃度の増加を評価することによって決定される。いくつかの実施形態では、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの活性は、酸化型の第１の電子アクセプターの濃度の減少を評価することによって決定される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、還元型または酸化型の第２の電子アクセプターの濃度変化が評価される。いくつかの実施形態では、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの活性は、還元型の第２の電子アクセプターの濃度の減少を評価することによって決定される。いくつかの実施形態では、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの活性は、酸化型の第２の電子アクセプターの濃度の増加を評価することによって決定される。
【００７２】
本明細書において記載される電子アクセプターの濃度変化は、当該分野で公知の方法を用いて評価され得る。例えば、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度変化は、３４０ｎｍの吸収を測定することによって、分光光度測定的に決定され得る。チオ−ＮＡＤＰＨの濃度変化は、４０５ｎｍの吸収を測定することによって、分光光度測定的に決定され得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度変化は、電子輸送色原体（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）を用いる比色測定法によって測定され得る。電子輸送色原体としては、塩化３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム、臭化３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム、３，３’−（４，４’−ビフェニレン）−ビス（塩化２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）−ビス［塩化２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］（＝ニトロ−テトラゾリウム：ＮＴＢ）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’ビフェニレン）−ビス［塩化２，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）−ビス（塩化２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）、および２，６−ジクロロフェノール−インドフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい例は、水溶性テトラゾリウム塩およびジアホラーゼまたはフェナジンメトスルフェートとの組み合わせである。これらの電子輸送色原体は、ＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨのための電子アクセプターであり、着色したホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎｅ）色素を形成し、そして形成される色素は、それらの最大吸収において比色測定的に測定される。
【００７４】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのためのさらなるアッセイ方法は、ＮＡＤまたはＮＡＤＰＨが、リザズリン（ｒｅｓａｚｕｌｉｎ）などの蛍光試薬の存在下にジアホラーゼで処理される、蛍光光度測定法である。
【００７５】
本明細書において記載される還元型および／または酸化型の電子アクセプターの濃度の測定は、当該分野において公知である。たとえば、消費されたＯ２または形成されたＨ２Ｏ２の量は、電子センサー（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ）の使用によってアッセイされ得る。非常に多くの還元−酸化指示器（ｒｅｄ−ｏｘ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）が、この目的のために使用され得、そして溶液中のＨ２Ｏ２およびＯ２をアッセイするために、広範囲の方法が文献中に記載されている。発生したＨ２Ｏ２はまた、指示薬とＨ２Ｏ２を反応させることによって、検出可能生成物として測定され得る。指示薬の例は、分光光度測定的方法によって測定され得る試薬、カラー指示薬（ｃｏｌｏｒ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）、蛍光試薬または発光試薬である。例えば、Ｈ２Ｏ２は、ぺルオキシオキザレートおよびアクリジニウムエステルの非酵素的化学発光反応を使用して評価され得る。
【００７６】
アッセイは、ポジティブおよびバックグラウンドの対照（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ）を伴う、二重で行い得る。既知の量の、既知の活性のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを使用することによって、標準曲線が得られ得る。それぞれのサンプルのα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼのレベルは、次に、測定されるそれぞれのシグナルをこの標準曲線と比較することによって測定され得る。
【００７７】
（Ｃ．本方法の使用）
本発明は、血液サンプルなどのサンプル中に存在するα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを検出するための増加した感度を有するアッセイを提供する。本発明の方法は、このように、変更されたα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼのレベルと関係する状態を検出するための実用的手段、および個体においてα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼレベルをモニターするための実用的手段を提供する。本方法は、被験体における、不適当な量もしくは活性のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ、またはこれの効果もしくは活性と関係する任意の疾患の予後または診断のために使用され得る。このような疾患の例としては、これらに限られるわけではないが、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、リンパ腫、および黒色腫などの癌が挙げられる。
【００７８】
本発明の酵素アッセイは、生物学的過程および種々の病理学的状態におけるα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの役割を探求するための研究道具もまた提供する。
【００７９】
（Ｄ．α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするためのキット）
本発明は、診断キットなどの、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ活性をアッセイするためのキットもまた提供する。このようなキットは、本発明の方法を行うために、本明細書において記載される、１つ以上の基質、酵素試薬および電子アクセプターを包含する。いくつかの実施形態では、キットは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、酸化型の第１の電子アクセプター、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素、および還元型の第２の電子アクセプターを含み、ここで第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターとは異なる。本明細書において記載される任意の基質、酵素、および電子アクセプターが、キットに含まれ得る。キットはまた、ポジティブおよび／またはネガティブの対照標準も含み得、同様に、例えば比色測定アッセイを行うための試薬などの、工程ｂ）によって発生されるシグナルを評価するために必要な試薬を含み得る。キットはまた、本発明の方法を行うためのおよび／または加工のためにサンプルを診断試験所まで移動させるための、器具または容器、ならびに本発明の方法を行うための適切な使用説明書も含み得る。
【００８０】
本発明のキットは、任意の適切な包装状態であり得る。例えば、診断システムに関連して本明細書において論じられる包装は、診断システムにおいて習慣的に利用されるものである。このような包装は、自動分析器において使用するために適切な容器を含む。
【００８１】
（Ｅ．実施例）
以下の実施例は、例示的目的にのみのために含められ、そして本発明の範囲を限定する意図はない。
【００８２】
（実施例１．アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼを使用するα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）アッセイ）
この研究では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり；そしてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼである。この研究において使用される試薬は、以下の表１および表２に示される。
【００８３】
【表１】
2008516608.tif 000002
【００８４】
【表２】
2008516608.tif 000003
この研究では、２６０μｌの試薬１を２０μｌのサンプル（血清または血漿）に加える。２５℃または３７℃下での５分間のインキュベーションの後、６０μｌの試薬２を、反応混合物に加える。４０５ｎｍの吸収変化を、８分間から１０分間の間モニターする。４０５ｎｍでの増加速度を、ＡＭＡＣＲキャリブレーターから発生される速度に対して、サンプル中のＡＭＡＣＲ活性をキャリブレーションするため使用する。
【００８５】
（実施例２．アシル−ＣｏＡオキシダーゼおよびトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼを使用するα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）アッセイ）
この研究では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼであり；そしてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼである。この研究において使用される試薬は、以下の表３および表４に示される。
【００８６】
【表３−１】
2008516608.tif 000004
【００８７】
【表３−２】
2008516608.tif 000005
【００８８】
【表４】
2008516608.tif 000006
この研究では、２６０μｌの試薬１を２５μｌのサンプル（血清または血漿）の中へ加える。２５℃または３７℃下での５分間のインキュベーションの後、６０μｌの試薬２を、反応混合物に加える。５５０ｎｍの吸収変化を、８分間から１０分間の間モニターする。サンプル中のＡＭＡＣＲ活性を、ＡＭＡＣＲキャリブレーターを用いてキャリブレーションする。
【００８９】
上記の実施例は、例示的目的のみのために包含され、そして本発明の範囲を限定する意図はない。上に記載されるものの多くの変形形態が可能である。上記の実施例の変更形態および変形形態が、当該分野の当業者には明白であるので、本発明は添付の特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されることが意図される。
【国際調査報告】
2008516608.tif 000007
2008516608.tif 000008