(57)【要約】  記載されているのは、フラビウイルス科感染症およびフラビウイルス科誘発障害の予防または処置において有用な特性を有する、例えば明細書に定義の通りの、式(Ｉ)、(Ｉａ)または(II)の非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリンである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラビウイルス科感染症またはフラビウイルス科誘発障害の予防または処置用医薬組成物の製造におけるサイクロスポリンの使用であって、該サイクロスポリンが(ｉ)ヒト組み換えシクロフィリンに０.７未満の結合比(ＢＲ)で結合し(ＢＲは、競合ＥＬＩＳＡ試験で試験して、サイクロスポリンのＩＣ５０対サイクロスポリンＡの同時の試験のＩＣ５０の底１０の対数である)；かつ(ii)混合リンパ球反応で、サイクロスポリンＡの５％以下の活性を有するものである、使用。
【請求項２】
フラビウイルス科ウイルス複製の阻害用医薬組成物の製造における、請求項１記載のサイクロスポリンの使用。
【請求項３】
フラビウイルス科ウイルスがフラビウイルス、ペスチウイルス、またはヘパシウイルスである、請求項２記載のサイクロスポリンの使用。
【請求項４】
サイクロスポリンが、式Ｉ
【化１】
2008525458.tif 000008
〔式中、
ＷはＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、８'−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔまたはＯ−アセチル−ＭｅＢｍｔ１であり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＮｖａまたはＯ−メチルスレオニン(ＭｅＯＴｈｒ)であり；
ＲはＰｒｏ、Ｓａｒ、(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ、(Ｄ)−ＭｅＡｌａ、または(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ(Ｏアセチル)であり；
ＹはＭｅＬｅｕ、チオＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａＩｌｅまたはＭｅａＴｈｒ；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルＩｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ(Ｏアセチル)であり、
ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり、
ＱはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＡｌａまたはＰｒｏであり、
Ｔ１は(Ｄ)ＡｌａまたはＬｙｓであり、
Ｔ２はＭｅＬｅｕまたはγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕであり、そして
Ｔ３はＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである。〕
の化合物、式Ｉａ
【化２】
2008525458.tif 000009
〔式中、
Ｗ'はＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔまたは８'−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔであり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＮｖａまたはＯ−メチルスレオニン(ＭｅＯＴｈｒ)であり；
Ｒ'はＳａｒ、(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ、(Ｄ)−ＭｅＡｌａ、または(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ(Ｏアセチル)であり；
Ｙ'はＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａＩｌｅまたはＭｅａＴｈｒ；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルＩｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ(Ｏアセチル)であり、
ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり；そして
Ｑ'はＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである。〕
の化合物または式II
【化３】
2008525458.tif 000010
〔式中、
Ｗａは
【化４】
2008525458.tif 000011
であり、ここで、Ｒａは式ＩｃまたはＩｄ
【化５】
2008525458.tif 000012
の残基であり、ここで、Ｒ４はＣ１−４アルキルチオ、アミノＣ１−４アルキルチオ、Ｃ１−４アルキルアミノＣ１−４アルキルチオ、ジＣ１−４アルキルアミノ−Ｃ１−４アルキルチオ、ピリミジニルチオ、チアゾリルチオ、Ｎ−Ｃ１−４アルキルイミダゾリルチオ、ヒドロキシＣ１−４アルキルフェニルチオ、ヒドロキシＣ１−４アルキルフェノキシ、ニトロフェニルアミノまたは２−オキソピリミジン−１−イルであり、そしてＲ'４はＣ１−４アルキルであり、
ＸａはＡｂｕであり；
Ｒａは−ＮＭｅ−ＣＨ(Ｒｂ)−ＣＯ−であり、ここで、ＲｂはＨまたは−Ｓ−Ａｌｋ−Ｒ０であり、ここで、Ａｌｋ−Ｒ０はメチルであるか；またはＡｌｋは直鎖または分枝鎖Ｃ２−６アルキレンまたはＣ３−６シクロアルキレンであり、そしてＲ０はＨ；ＯＨ；ＣＯＯＨ；Ｃ２−５アルコキシ−カルボニル；ＮＲ１Ｒ２(ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立してＨ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ３−６シクロアルキルおよびフェニルから選択され、各々所望によりハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ２−５アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノおよび／またはジＣ１−４アルキル−アミノで置換されていてよい)ならびにベンジルおよびヘテロ環式ラジカルから選択され、該ベンジルおよびヘテロ環式ラジカルは、飽和または不飽和であり、５個または６個の環員および１個から３個のヘテロ原子を含むか、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一体となって、４から６員ヘテロ環を形成し、これは、窒素、酸素および硫黄から選択される他のヘテロ原子を含んでよく、所望によりＣ１−４アルキル、フェニルまたはベンジルで置換されているか；またはＲ１およびＲ２の各々は、式Ｉｂ
【化６】
2008525458.tif 000013
のラジカルであり、ここでＲ１およびＲ２は上記で定義の通りであり、Ｒ３はＨまたはＣ１−４アルキルであり、そしてｎは２から４の範囲の整数であり；
ＹａはＭｅＬｅｕまたはγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕであり；
ＺａはＶａｌであり；そして
ＱａはＭｅＬｅｕである。
ただし、ＹａがＭｅＬｅｕであるとき、ＲｂはＨではない。〕
の化合物または、それらの薬学的に許容される塩である、請求項１、２または３記載の使用。
【請求項５】
請求項１に記載のサイクロスポリンを、１種以上の薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含む、フラビウイルス科感染症またはフラビウイルス科誘発障害の予防または処置用医薬組成物。
【請求項６】
ａ)請求項１記載のサイクロスポリンである第一剤、およびｂ)抗フラビウイルス科特性を有する併用剤を含む、医薬組み合わせ剤。
【請求項７】
ａ)請求項１記載のサイクロスポリンである第一剤、およびｂ)抗フラビウイルス科特性、抗繊維形成剤、免疫調節剤またはＳ１Ｐ受容体アゴニストから選択される併用剤を含む、フラビウイルス科感染症またはフラビウイルス科誘発障害の予防または処置において使用するための医薬組み合わせ剤。
【請求項８】
抗フラビウイルス科ウイルス特性を有する併用剤が、インターフェロン、リバビリン、インターロイキン、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、フェナントレンキノン、チアゾリジン誘導体、チアゾリジン、ベンズアニリド、ヘリカーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体、グリオトキシン、セルレニン、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、ＩＲＥＳ依存翻訳の阻害剤、およびリボザイムである、請求項６記載の医薬組み合わせ剤。
【請求項９】
処置を必要とする対象におけるフラビウイルス科感染症またはフラビウイルス科誘発障害を予防または処置する方法であって、該対象に治療的有効量の請求項１記載のサイクロスポリンを投与することを含む、方法。
【請求項１０】
培地中のフラビウイルス科ウイルス複製を阻害する方法であって、該培地に有効量の請求項１記載のサイクロスポリンを適用することを含む、方法。
【請求項１１】
処置を必要とする対象におけるフラビウイルス科ウイルス複製を阻害する方法であって、該対象に治療的有効量の請求項１記載のサイクロスポリンを投与することを含む、方法。
【請求項１２】
請求項１記載の治療的有効量のサイクロスポリンと、抗フラビウイルス科特性を有する剤、抗繊維形成剤、免疫調節剤またはＳ１Ｐ受容体アゴニストから選択される併用剤を、同時にまたは連続して併用投与することを含む、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１３】
抗フラビウイルス科特性を有する併用剤が、インターフェロン、リバビリン、インターロイキン、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、フェナントレンキノン、チアゾリジン誘導体、チアゾリジン、ベンズアニリド、ヘリカーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体、グリオトキシン、セルレニン、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、ＩＲＥＳ依存翻訳の阻害剤、およびリボザイムから成る群から選択される、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビウイルス科ウイルス感染症および誘発障害の処置における非免疫抑制性サイクロスポリンの新規使用に関する。(本明細書では“cyclosporin”を“サイクロスポリン”と、“Cicrosporine”を“シクロスポリン”と、それぞれ表記する)
【背景技術】
【０００２】
サイクロスポリンは、一般に薬理学的、特に免疫抑制性、または抗炎症性活性を有する、構造的に特徴的な、環状、ポリ−Ｎ−メチル化ウンデカペプチドのクラスを含む。単離された最初のサイクロスポリンは、天然に存在する真菌代謝物シクロスポリンまたはサイクロスポリンＡとしても既知のサイクロスポリンであった。
【０００３】
サイクロスポリンＡがＩＬ−２の転写開始を遮断することによってＴ細胞活性化の工程を妨害することにより作用することはよく確立されている。サイクロスポリンＡは、シクロフィリンと命名された１７ｋＤ細胞質タンパク質と複合体を形成することが示されており、後者は多くの細胞型で生成し、タンパク質折り畳みに関与する酵素であるペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼと同じであることが示されている。
【０００４】
しかしながら、シクロフィリンへの結合が免疫抑制性活性に必須ではあるが、十分な判定基準ではないことが判明した。サイクロスポリンＡ／シクロフィリン複合体はまた、ホスファターゼスーパーファミリーに属するカルシニューリン(ＣＮ)と命名された細胞性タンパク質とも会合できる。この結合は、そのホスファターゼ活性を阻止し、転写因子ＮＦ−ＡＴの沈黙化をもたらす。ＣＮ／ＮＦ−ＡＴ経路の阻害は、サイクロスポリンＡ仲介免疫抑制の機構に必須である。
【０００５】
シクロフィリンに強く結合するが、免疫抑制性ではないサイクロスポリンが同定されている。サイクロスポリンは、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)における活性がサイクロスポリンＡの５％以下、好ましくは２％以下であるとき、非免疫抑制性であると見なされる。混合リンパ球反応はT. Meo in “Immunological Methods”, L. Lefkovits and B. Peris, Eds., Academic Press, N.Y. pp. 227-239 (1979)により記載されている。Ｂａｌｂ／ｃマウス(雌、８−１０週)からの脾臓細胞(０.５×１０６)を、５日間、ＣＢＡマウス(雌、８−１０週)からの０.５×１０６の照射した(２０００ラド)またはマイトマイシンＣ処理した脾臓細胞と共インキュベートする。照射した同種異系細胞はＢａｌｂ／ｃ脾臓細胞において増殖応答を誘発し、これは標識前駆体のＤＮＡへの取り込みにより測定できる。スティミュレーター細胞が照射されている(またはマイトマイシンＣ処理されている)ため、それらはＢａｌｂ／ｃ細胞に対して増殖では応答しないが、それらの抗原性は維持している。ＭＬＲにおいて本試験化合物で見られるＩＣ５０は、並行実験におけるサイクロスポリンＡと同等である。加えて、非免疫抑制性サイクロスポリンはＣＮおよび下流ＮＦ−ＡＴ経路を阻害する能力を欠く。
【０００６】
ＥＰ０４８４２８１Ａ１および米国特許５,７６７,０６９は、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連障害の処置における非免疫抑制性サイクロスポリンの使用を開示している。
【０００７】
出願ＥＰ２００４／００９８０４に開示の通り、シクロフィリンに結合する非免疫抑制性サイクロスポリンはまた、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)に対する阻害効果を有することも判明している。
【０００８】
非Ａ、非Ｂ肝炎の主要な原因因子として同定されているＨＣＶによる難治性の感染は、慢性肝炎、肝硬変または肝細胞性癌腫のような肝臓疾患に密接に関連していると見なされている。これらの肝臓疾患の発症は、大きな公衆衛生問題である。有効な抗ＨＣＶ治療はインターフェロンまたはインターフェロンとリバビリンの組み合わせでの治療に限定されている。しかしながら、該ウイルスがこれらの既知薬剤で処置したＨＣＶ患者の約半数で除去されないため、別の抗ＨＣＶ剤の強い必要性がまだ存在する。
【０００９】
Ｃ型肝炎感染症またはＨＣＶ誘発障害は、例えば慢性肝炎、肝硬変または肝臓癌、例えば肝細胞性癌腫である。非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリンはまた例えばＨＣＶ感染母体から生まれた新生児もしくはこのウイルスに曝されるヘルスケア従事者に、または移植レシピエント、例えば臓器または組織移植レシピエント、例えば肝臓移植に、移植後のＨＣＶ感染再発の可能性を排除するために予防的処置としても使用できる。
【００１０】
ＨＣＶはヘパシウイルス属の唯一のメンバーである。ヘパシウイルス、フラビウイルスおよびペスチウイルスはフラビウイルス科のウイルスの異なる３つの属である。フラビウイルス属は、血清学的関連性に基づいて群分けされた６８を超えるメンバーを含む(Calisher et al., J. Gen. Virol. 1993, 70:37-43)。臨床症状は様々であり、発熱、脳炎および出血熱を含む(Fields Virology, Eds: Fields, B.N., Knipe, D.M., およびHowley, P.M., Lippincott Raven publishers, Philadelphia, PA, 1996, Chapter 31, 931-959)。フラビウイルスの世界的懸念は、デング出血熱ウイルス(ＤＨＦ)、黄熱ウイルス、ショック症候群および日本脳炎ウイルスを含むヒト疾患と関連する(Halstead, S.B., Rev. Infect. Dis., 1984, 6, 251-264;Halstead, S.B., Science, 239:476-481, 1988;Monath, T.P., New Eng. J. Med. 1988, 319, 641-643)。
【００１１】
ペスチウイルス属は、ウシウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)、古典的ブタ熱ウイルス(ＣＳＦＶ、別名ブタコレラウイルス)およびヒツジのボーダー病ウイルス(ＢＤＶ)を含む(Moennig, V. et al., Adv. Vir. Res. 1992, 41, 53-98)。家畜(ウシ、ブタ、およびヒツジ)のペスチウイルス感染症は、世界中で著しい経済的損失の原因である。ＢＶＤはウシの粘膜疾患であり、畜産業において経済的に非常に重要である(Meyers, G. and Thiel, H.-J., Advances in Virus Research, 1996, 47, 53-118;Moening V., t al. Adv. Vir. Res. 1992, 41, 53-98)。ヒトペスチウイルスは、動物のペスチウイルス程は広範に特徴付けされていない。しかしながら、血清学的調査は、ヒトにおける相当なペスチウイルス暴露を示唆する。
【００１２】
ペスチウイルスおよびヘパシウイルスは、フラビウイルス科内の密接に関連するウイルス群である。この科における他の密接に関連するウイルスは、ＧＢウイルスＡ、ＧＢウイルスＡ様因子(agent)、ＧＢウイルス−ＢおよびＧＢウイルス−Ｃ(別名Ｇ型肝炎ウイルス、ＨＧＶ)を含む。ヘパシウイルス群(Ｃ型肝炎ウイルス；ＨＣＶ)は、ヒトに感染する、多くの密接に関連するが、遺伝子型により区別されるウイルスから成る。約６種のＨＣＶ遺伝子型および５０を超えるサブタイプが存在する。ペスチウイルスとヘパシウイルスの類似性のために、ヘパシウイルスが細胞培養中で効率的に増殖する能力が低いことと合わせて、ウシウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤ)がＨＣＶウイルスの試験の代用物としてしばしば使用されている。
【００１３】
ペスチウイルスおよびヘパシウイルスの遺伝子構成は非常に類似している。これらのプラス鎖ＲＮＡウイルスは、ウイルス複製に必要なウイルスタンパク質全てをコードする一つの大きなオープン・リーディング・フレーム(ＯＲＦ)を有する。これらのタンパク質は、成熟ウイルスタンパク質を産生するために、細胞性およびウイルスがコードするプロテイナーゼの両方により翻訳と同時におよび翻訳後に処理されるポリタンパク質として発現される。ウイルスゲノムＲＮＡの複製を担うウイルスタンパク質は、おおよそカルボキシ末端の範囲内に位置する。ＯＲＦの２／３は非構造(ＮＳ)タンパク質と呼ばれる。ペスチウイルスおよびヘパシウイルスについてＯＲＦの非構造タンパク質の遺伝子構成およびポリタンパク質処理は非常に類似している。ペスチウイルスおよびヘパシウイルスの両方について、成熟非構造(ＮＳ)タンパク質は、非構造タンパク質コード領域のアミノ末端からＯＲＦのカルボキシ末端の方向で、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂから成る。ＨＣＶの遺伝子構成は図１に示す。
【００１４】
ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳタンパク質は、特異的タンパク質機能に特有の配列ドメインを共有する。例えば、両群のウイルスのＮＳ３タンパク質は、セリンプロテイナーゼおよびヘリカーゼに特有のアミノ酸配列モチーフを有する(Gorbalenya et al. (1988)Nature 333:22;Bazan and Fletterick (1989)Virology 171:637-639;Gorbalenya et al. (1989)Nucleic Acid Res. 17:3889-3897)。同様に、ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳ５Ｂタンパク質は、ＲＮＡ特異的(directed)ＲＮＡポリメラーゼに特有のモチーフを有する(Koonin, E.V. and Dolja, V.V. (1993)Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 28:375-430)。
【００１５】
ウイルスの生活環におけるペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳタンパク質の実際の役割および機能はまさに類似している。両方の場合、ＮＳ３セリンプロテイナーゼは、ＯＲＦ中でその下流に位置するポリタンパク質前駆体の全てのタンパク質分解処理を担う(Wiskerchen and Collett (1991)Virology 184:341-350;Bartenschlager et al. (1993)J. Virol. 67:3835-3844;Eckart et al. (1993)Biochem. Biophys. Res. Comm. 192:399-4067;Grakoui et al. (1993)J. Virol. 67:2832-2843;Grakoui et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10583-10587;Hijikata et al. (1993)J. Virol. 67:4665-4675;Tome et al. (1993)J. Virol. 71:5312-532２)。両ウイルスのＮＳ３タンパク質はまたヘリカーゼとして機能する(Kim et al. (1995)Biochem. Biophys. Res. Comm. 215:160-166;Jin and Peterson (1995)Arch. Biochem. Biophys., 323:47-53;Warrener and Collett (1995)J. Virol. 69:1720-1726)。最後に、ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳ５Ｂタンパク質は、予測されたＲＮＡ特異的ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する(Behrens et al. (1996)EMBO J. 15:12-22;Lechmann et al. (1977)J. Virol. 71:8416-8428;Yuan et al. (1997)Biochem. Biophys. Res. Comm. 232:231-235;Hagedorn, PCT WO 97/12033;Zhong et al. (1998)J. Virol. 72:9365-9369)。
【００１６】
本発明は、フラビウイルス科ウイルス感染症および誘発障害の予防または処置における非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリンの使用を提供する。
【発明の開示】
【００１７】
発明の詳細な記載
本発明によって、非免疫抑制性サイクロスポリンを含む医薬組成物および組み合わせ剤、ならびにそれを使用したフラビウイルス科ウイルス感染症および誘発障害の処置法が提供される。
【００１８】
本発明の範囲内に含まれるフラビウイルスは、一般にFields Virology, Editors: Fields, N., Knipe, D.M.およびHowley, P.M.;Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA;Chapter 31 (1996)に記載されている。具体的フラビウイルスは、限定しないが、以下に記載するものを含む：アブセッタロフ(Absettarov)；アルフイ(Alfuy)；アポイ(Apoi)；アオラ(Aroa)；バガザ(Bagaza)；バンジ(Banzi)；ボウオウイ(Bououi)；ブスクアラ(Bussuquara)；カシパコール(Cacipacore)；ケアリー・アイランド(Carey Island)；ダーカー・バット(Dakar bat)；デングウイルス１、２、３および４；エッジ・ヒル(Edge Hill)；エンタッベ・バット(Entebbe bat)；ガジェット・グリー(Gadgets Gully)；ハンザロバ(Hanzalova)；ヒプロ(Hypr)；イレウス(Ilheus)；イスラエルシチメンチョウ髄膜脳炎；日本脳炎；ジュルガ(Jugra)；ジュティアパ(Jutiapa)；カダム(Kadam)；カルシ(Karshi)；カドウゴウ(Kedougou)；ココエラ(Kokoera)；コウタンゴ(Koutango)；クムリンゲ(Kumlinge)；クンジン(Kunjin)；キャサヌール森林病；ランガット(Langat)；跳躍病；マエバン(Meaban)；モドック(Modoc)；モンタノ・ミオティス(Montano myotis)白質脳炎；マレー渓谷脳炎；ナランジャル(Naranjal)；ネギシ(Negishi)；ヌタヤ(Ntaya)；オムスク出血熱；プノンペン・バット(Phnom-penh bat)；ポワッサン(Powassan)；リオ・ブラボ(Rio Bravo)；ロシオ(Rocio)；ロイヤル・ファーム(Royal Farm)；ロシア春夏脳炎；サボヤ(Saboya)；セントルイス脳炎；サル・ビエジャ(Sal Vieja)；サン・ペリタ(San Perlita)；サウマレックス・リーフ(Saumarex Reef)；セピク(Sepik)；ソクルク(Sokuluk)；スポンドウェニ(Spondweni)；ストラトフォード(Stratford)；テムズ(Temusu)；チュレニー(Tyuleniy)；ウガンダ・エス・ウスツ・ウエッセルズブロン(Uganda S, Usutu, Wesselsbron)；西ナイル；ヤオウンデ(Yaounde)；黄熱；およびジカ(Zika)。
【００１９】
本発明の範囲内に含まれるペスチウイルスは、一般的にFields Virology (Id.)に記載されている。具体的ペスチウイルスは、限定しないが、以下に記載するものを含む：ウシウイルス性下痢ウイルス(“ＢＶＤＶ”)；古典的ブタ熱ウイルス(“ＣＳＦＶ”)、ブタコレラウイルスとしても既知；およびボーダー病ウイルス(“ＢＤＶ”)。
【００２０】
本発明の範囲内のフラビウイルス科の他のメンバーは、ＧＢウイルスＡ、ＧＢウイルスＡ様因子(agent)、ＧＢウイルス−ＢおよびＧＢウイルス−Ｃ(Ｇ型肝炎ウイルス、ＨＧＶとも呼ばれる)を含むが、これらに限定されない。加えて、約６種のＨＣＶ遺伝子型および５０種を超えるサブタイプを含むヘパシウイルス群(Ｃ型肝炎ウイルス；ＨＣＶ)もまた本発明の範囲内に含まれる。
【００２１】
サイクロスポリンは、Quesniaux in Eur. J. Immunol. 1987 17 1359-1365に記載の競合ＥＬＩＳＡ試験において、ヒト組み換えシクロフィリンに、サイクロスポリンＡの少なくとも１／５倍結合するとき、シクロフィリン結合性と見なす。本試験において、試験するサイクロスポリンを、シクロフィリンとＢＳＡ−サイクロスポリンＡのインキュベーションの間に添加し、競合剤なしでのコントロール反応の５０％阻害をもたらすのに必要な濃度(ＩＣ５０)を計算する。結果を結合比(ＢＲ)として示し、これは、本試験化合物のＩＣ５０対サイクロスポリンＡ自体の同時の試験のＩＣ５０の底１０の対数である。故に、１.０のＢＲは、本試験化合物がヒトシクロフィリンにサイクロスポリンＡの１／１０倍少ない結合を示し、負の値は、サイクロスポリンＡよりも強い結合を示す。ＨＣＶに対して活性なサイクロスポリンは、０.７未満、好ましくは０以下のＢＲを有する。
【００２２】
非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリンの例は、例えば式Ｉ
【化１】
2008525458.tif 000002
〔式中、
ＷはＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、８'−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔまたはＯ−アセチル−ＭｅＢｍｔ１であり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＮｖａまたはＯ−メチルスレオニン(ＭｅＯＴｈｒ)であり；
ＲはＰｒｏ、Ｓａｒ、(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ、(Ｄ)−ＭｅＡｌａ、または(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ(Ｏアセチル)であり；
ＹはＭｅＬｅｕ、チオＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａＩｌｅまたはＭｅａＴｈｒ；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルＩｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ(Ｏアセチル)であり、
ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり、
ＱはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＡｌａまたはＰｒｏであり、
Ｔ１は(Ｄ)ＡｌａまたはＬｙｓであり、
Ｔ２はＭｅＬｅｕまたはγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕであり、そして
Ｔ３はＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである。〕
の化合物を含む。
【００２３】
好ましい式Ｉの化合物は、例えば式Ｉａ
【化２】
2008525458.tif 000003
〔式中、
Ｗ'はＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔまたは８'−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔであり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＮｖａまたはＯ−メチルスレオニン(ＭｅＯＴｈｒ)であり；
Ｒ'はＳａｒ、(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ、(Ｄ)−ＭｅＡｌａ、または(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ(Ｏアセチル)であり；
Ｙ'はＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａＩｌｅまたはＭｅａＴｈｒ；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルＩｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ(Ｏアセチル)であり、
ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり；そして
Ｑ'はＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである。〕
の化合物である。
【００２４】
基Ｗ'、Ｘ、Ｙ'、Ｚ、Ｑ'およびＲ'は、独立して、下記の好ましい意味を有する：
Ｗ'は好ましくはＷ”であり、ここで、Ｗ”はＭｅＢｍｔまたはジヒドロ−ＭｅＢｍｔであり；
Ｘは好ましくはＸ'であり、ここで、Ｘ'はαＡｂｕまたはＮｖａであり、より好ましくはＸ”であり、ここで、Ｘ”はαＡｂｕであり；
Ｒ'は好ましくはＲ”であり、ここで、Ｒ”はＳａｒであり；
Ｙ'は好ましくはＹ”であり、ここで、Ｙ”はγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＩｌｅ、Ｎ−エチルＩｌｅまたはＮ−エチルＶａｌであり；
Ｚは好ましくはＺ'であり、ここで、Ｚ'はＶａｌまたはＭｅＶａｌであり；そして
Ｑ'は好ましくはＱ”であり、ここで、Ｑ”はＭｅＬｅｕである。
【００２５】
式Ｉａの化合物の好ましいグループは、Ｗ'がＷ”であり、ＸがＸ'であり、Ｙ'がＹ”であり、ＺがＺ'であり、Ｑ'がＱ”であり、そしてＲ'がＲ”であるものである。
【００２６】
好ましい式Ｉａの化合物の例は、例えば下記である：
ａ)  [ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ]１−[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]４−シクロスポリン；ＢＲ＊＝０.１；ＩＲ＜１％
ｂ)  [ＭｅＶａｌ]４−シクロスポリン；ＢＲ＝０.１；ＩＲ＜１％
ｃ)  [ＭｅＩｌｅ]４−シクロスポリン；ＢＲ＝−０.２；ＩＲ＜１％
ｄ)  [ＭｅＴｈｒ]４−シクロスポリン；
ｅ)  [γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]４−シクロスポリン；ＢＲ＝０.４；ＩＲ＜１％
ｆ)  [エチル−Ｉｌｅ]４−シクロスポリン；ＢＲ＝０.１；ＩＲ＜２％
ｇ)  [エチル−Ｖａｌ]４−シクロスポリン；ＢＲ＝０；ＩＲ＜２％
ｈ)  [Ｎｖａ]２−[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]４−シクロスポリン；
ｉ)  [γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]４−[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]６−シクロスポリン；
ｊ)  [ＭｅＶａｌ]５−シクロスポリン；ＢＲ＝０.４；ＩＲ＝５.３％
ｋ)  [Ｍｅ０Ｔｈｒ]２−[(Ｄ)ＭｅＡｌａ]３−[ＭｅＶａｌ]５−シクロスポリン；
ｊ)  [８'−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔ]１−シクロスポリン；ＢＲ＝０.３５；ＩＲ＝１.８％
ｋ)  [ＭｅＡｌａ]６−シクロスポリン；ＢＲ＝−０.４；ＩＲ＝３.２
ｌ)  [γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]９−シクロスポリン；ＢＲ＝０.１５；ＩＲ＝２.９
ＩＲ＝免疫抑制性比、サイクロスポリンＡに対する活性パーセントとして表示。
【００２７】
非免疫抑制性サイクロスポリンのさらなる例は、内容を引用により本明細書に包含させるＷＯ９８／２８３３０、ＷＯ９８／２８３２９およびＷＯ９８／２８３２８に記載の化合物、例えば式II
【化３】
2008525458.tif 000004
〔式中、
Ｗａは
【化４】
2008525458.tif 000005
であり、ここで、Ｒａは式ＩｃまたはＩｄ
【化５】
2008525458.tif 000006
の残基であり、ここで、Ｒ４はＣ１−４アルキルチオ、アミノＣ１−４アルキルチオ、Ｃ１−４アルキルアミノＣ１−４アルキルチオ、ジＣ１−４アルキルアミノ−Ｃ１−４アルキルチオ、ピリミジニルチオ、チアゾリルチオ、Ｎ−Ｃ１−４アルキルイミダゾリルチオ、ヒドロキシＣ１−４アルキルフェニルチオ、ヒドロキシＣ１−４アルキルフェノキシ、ニトロフェニルアミノまたは２−オキソピリミジン−１−イルであり、そしてＲ'４はＣ１−４アルキルであり、
ＸａはＡｂｕであり；
Ｒａは−ＮＭｅ−ＣＨ(Ｒｂ)−ＣＯ−であり、ここで、ＲｂはＨまたは−Ｓ−Ａｌｋ−Ｒ０であり、ここで、Ａｌｋ−Ｒ０はメチルであるか；またはＡｌｋは直鎖または分枝鎖Ｃ２−６アルキレンまたはＣ３−６シクロアルキレンであり、そしてＲ０はＨ；ＯＨ；ＣＯＯＨ；Ｃ２−５アルコキシ−カルボニル；ＮＲ１Ｒ２(ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立してＨ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ３−６シクロアルキルおよびフェニルから選択され、各々所望によりハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ２−５アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノおよび／またはジＣ１−４アルキル−アミノで置換されていてよい)ならびにベンジルおよびヘテロ環式ラジカルから選択され、該ベンジルおよびヘテロ環式ラジカルは、飽和または不飽和であり、５個または６個の環員および１個から３個のヘテロ原子を含むか、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一体となって、４から６員ヘテロ環を形成し、これは、窒素、酸素および硫黄から選択される他のヘテロ原子を含んでよく、所望によりＣ１−４アルキル、フェニルまたはベンジルで置換されているか；またはＲ１およびＲ２の各々は、式Ｉｂ
【化６】
2008525458.tif 000007
のラジカルであり、ここでＲ１およびＲ２は上記で定義の通りであり、Ｒ３はＨまたはＣ１−４アルキルであり、そしてｎは２から４の範囲の整数であり；
ＹａはＭｅＬｅｕまたはγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕであり；
ＺａはＶａｌであり；そして
ＱａはＭｅＬｅｕである。
ただし、ＹａがＭｅＬｅｕであるとき、ＲｂはＨではない。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【００２８】
式IIにおいて、Ｒ１および／またはＲ２がヘテロ環式残基であるとき、それはピリジル、テトラヒドロ−ピリジル、ピペリジル、イミダゾリル、オキサゾリルまたはチアゾリルであり得る。Ｒ１とＲ２がそれらが結合している窒素原子と一体となってヘテロ環式残基を形成するとき、ヘテロ環式残基は、例として、アゼチジニル、ピペリジル、ピペラジニル、Ｎ−メチル−ピペラジニル、Ｎ−フェニルピペラジニル、Ｎ−ベンジルピペラジニル、ピリジル、イミダゾリル、モルホリノ、チオモルホリノ、テトラヒドロピリジル、メチルテトラヒドロピリジル(例えば４−メチル−テトラヒドロピリジル)またはフェニルテトラヒドロピリジル(例えば４−フェニルテトラヒドロピリジル)から選択できる。
【００２９】
式Ｉ、ＩａまたはIIの化合物は：
１)  発酵
２)  生物学的変換
３)  誘導体化
４)  部分合成
５)  全合成
に分類され得る、種々の方法で、例えば引用によりその内容を本明細書に包含させるＥＰ０４８４２８１Ａ１、ＷＯ００／０１７１５、ＷＯ９８／２８３３０、ＷＯ９８／２８３２９またはＷＯ９８／２８３２８に記載の通りに得ることができる。
【００３０】
一連のさらなるまたは他の態様において、本発明はまた下記を提供する：
１.１  処置を必要とする対象におけるフラビウイルス科感染症またはフラビウイルス科誘発障害を予防または処置する方法であって、該対象に治療的有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはIIの化合物を投与することを含む、方法。
本発明によって、非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリンは、フラビウイルス科感染症または誘発障害の一つ以上の徴候または症状を軽減するもしくは排除するのに有効な量で、例えば、対象の血清サンプルで測定してフラビウイルス科ウイルスを減少させるのに有効な量で投与し得る。
【００３１】
１.２  培地中のフラビウイルス科複製を阻害する方法であって、該培地に有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはIIの化合物を適用することを含む、方法。
【００３２】
１.３  処置を必要とする対象におけるフラビウイルス科ウイルス複製を阻害する方法であって、該対象に治療的有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはIIの化合物を投与することを含む、方法。
【００３３】
１.４  移植レシピエントにおけるＣＶ感染の再発を予防する方法であって、該レシピエントに治療的有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはIIの化合物を投与することを含む、方法。
【００３４】
２.  上記に定義のいずれかの方法において使用するための医薬組成物の製造における、非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはIIの化合物の使用。
【００３５】
３.  非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはIIの化合物を、１種以上の薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含む、上記で定義のいずれかの方法において使用するための医薬組成物。
【００３６】
非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリン(以後“本発明のサイクロスポリン”または“対象非免疫抑制性サイクロスポリン”と呼ぶ)の、上記に特記した疾患および状態の処置における有用性は、例えば下記の方法に従った、標準動物試験または臨床試験で証明できる。
【００３７】
Ａ. インビトロ
細胞培養：Ｈｕｈ−７およびＭＨ−１４細胞、ＨＣＶレプリコン細胞を、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)添加ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)中で培養する。ＰＨ５ＣＨ８細胞を、１００ng／mlの上皮細胞増殖因子、１０μ／mlのインスリン、０.３６μg／mlのヒドロコルチゾン、５μg／mlのトランスフェリン、５μg／mlのリノール酸、２０ng／mlのセレン、４μg／mlのグルカゴン、１０ng／mlのプロラクチン、１０μg／mlのゲンタマイシン、２００μg／mlのカナマイシン、および２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭおよびＦ１２培地の１：１混合物中で培養する。
【００３８】
免疫ブロット分析：免疫ブロット分析をK. Watashi et al., Virology 2001, 286, 391-402に記載の通り行う。本実験で使用する一次抗体は、抗ＮＳ５Ａ、抗ＮＳ５Ｂ、および抗β−アクチン(Sigma)抗体である。
【００３９】
間接的免疫蛍光分析：間接的免疫蛍光分析を、K. Watashi, supraに記載の通りに行う。本実験で使用する一次抗体は抗ＮＳ５Ａおよび抗ＰＤＩ(StressGen)抗体である。
【００４０】
逆転写(ＲＴ)−ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)分析
培養した細胞の全ＲＮＡを、製造業者の推奨通り、Sepasol-RNA I Super(ナカライテスク)で単離する。ＲＴ−ＰＣＲ分析を、製造業者の指示に従い、ワン・ステップＲＮＡ  ＰＣＲキット(タカラ)を使用して行う。２',５'−オリゴアデニレートシンセターゼおよび二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼのｍＲＮＡの検出に使用するプライマーは、各々５'−ＣＣＧＴＧＡＡＧＴＴＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧ−３'、５'−ＧＡＣＴＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＣＣＧ−３'および５'−ＴＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＣＴＴＧＣＡＴＡＴＣ−３'、５'−ＧＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３'である。
【００４１】
ノーザンブロット分析：ノーザンブロット分析は、H. Kishine et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 47, 119-125に記載の通り行う。本実験で使用するＮＳ５Ｂ配列に対するプローブ相補性は、H. Kishine, supraに記載されている。
【００４２】
実時間ＲＴ−ＰＣＲ分析：ＨＣＶゲノムＲＮＡの５'−ＵＴＲを、T. Takeuchi et al., Gastroenterology, 1999, 116, 636-642に記載の通り、ABI PRISM 7700配列検出器(AppliedBiosystems)を使用して定量する。本実験で使用する前向きおよび後ろ向きプライマーは、各々５'−ＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧ−３'および５'−ＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧ−３'である。蛍光性プローブは５'−ＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣ−３'であり。内部コントロールとして、リボソームＲＮＡをまた、TaqMan  Ribosomal RNA Control Reagents(Applied Biosystems)を使用して定量する。
【００４３】
インビトロＨＣＶ感染実験：インビトロＨＣＶ感染実験は、本質的にN. Kato et al., Jpn. J. Cancer Res. 1996, 87, 787-792およびM. Ikada et al., Virus Res., 1998, 56, 157-167に記載の通り行う。ＰＨ５ＣＨ８細胞(１×１０５)を、ＨＣＶ陽性血液ドナーから調製する血漿１Ｂ−２に感染させる(１０４から１０５  ＨＣＶ  ＲＮＡコピーに相当)。接種２４時間後、細胞を３回リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、新鮮培地に維持する。
【００４４】
トランスフェクションおよびレポーターアッセイ：ＭＨ−１４およびＨ９細胞へのトランスフェクションを、FuGENE 6(Roche)およびリポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬(Invitrogen)を各々使用して、製造業者のプロトコールに従い行う。レポーターアッセイを、K. Watashi, supraに記載の通り行う。本試験で使用するレポータープラスミドは、pNFAT-Luc、pAP1-Luc、pNFKB-Luc(PathDetect Reporter System;Stratagene)、およびpRL-TK(デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイ系；Promega)である。
【００４５】
図１Ａに示す通りのＨＣＶサブゲノムレプリコンが自主的に複製する、ＭＨ−１４細胞を使用したＨＣＶゲノムの複製に対する種々の本発明のサイクロスポリンの効果。本発明のサイクロスポリン、例えば１μg／mlの、例えば[ＭｅＩｌｅ]４−シクロスポリンでのならびにポジティブコントロールとして使用する１００Ｕ／ml  ＩＦＮαでの７日間の処置は、ＨＣＶＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂタンパク質を、免疫ブロット分析で検出不可能なレベルまで減少させる。間接的免疫蛍光分析は、ＮＳ５Ａタンパク質産生を、１μg／ml  本発明のサイクロスポリンで処置した全細胞において減少させるが、内部コントロールとしての小胞体マーカーであるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(ＰＤＩ)はこの条件では変化させないことを示す。本発明のサイクロスポリンは、本アッセイで、ＨＣＶレプリコン細胞におけるＨＣＶタンパク質発現を減少させる。
【００４６】
レプリコンＲＮＡは、ノーザンブロット分析により、本発明のサイクロスポリンまたはＩＦＮαで７日間処置されたまたはされていないＭＨ−１４細胞で分析する。例えば１μg／ml  本発明のサイクロスポリン、例えば[ＭｅＩｌｅ]４−シクロスポリンでの処置は、レプリコンＲＮＡを検出不可能なレベルまで減少させる。１００Ｕ／ml  ＩＦＮαでの処置は同様の効果をもたらす。加えて、力価が徐々に低下し、ＨＣＶ  ＲＮＡは７日目に最初の約１／４００まで減少する。ＩＦＮαとの併用処置において、試験した全ての時点(３日目、５日目および７日目)で、サイクロスポリンまたはＩＦＮαいずれかの単剤処置と比較して、さらに減少する：サイクロスポリンおよびＩＦＮαの両方で７日間処置したＭＨ−１４細胞におけるレプリコンＲＮＡレベルは、ＩＦＮα単独で処置した細胞よりも著しく減少する。
【００４７】
さらに、ＰＨ５ＣＨ８細胞(非新生物肝細胞細胞系)を、ＨＣＶ陽性血漿で処置し、続いて、接種後の種々の時点で、ＨＣＶ  ＲＮＡゲノム力価を実時間ＲＴ−ＰＣＲ分析により定量する。接種後５日目の細胞におけるＨＣＶ  ＲＮＡゲノム力価は１日目と比較して約１０倍に増加していたが、本発明のサイクロスポリン、例えば[ＭｅＩｌｅ]４−シクロスポリン、またはＩＦＮαで連続的に処置した細胞において、これらの時点でＨＣＶ  ＲＮＡゲノム力価の著しい増加は観察されなかった。本発明のサイクロスポリンは、ＨＣＶ感染させた培養肝細胞の複製を阻害する。
【００４８】
結果は図２Ｅ、２Ｆおよび２Ｇに示す：免疫ブロット分析(２Ｅ)、間接的免疫蛍光分析(２Ｆ)および実時間ＲＴ−ＰＣＲ分析(２Ｇ)を、[ＭｅＩｌｅ]４−シクロスポリン(■)または非シクロフィリン結合性サイクロスポリン(●)、例えば６−[[Ｒ−(Ｅ)]−６,７−ジデヒドロ−Ｎ,４−ジメチル−３−オキソ−Ｌ−２−アミノオクタン酸]−７−Ｌ−バリン−サイクロスポリンＡで処置したＭＨ−１４細胞を使用して行う。２Ｅおよび２Ｆ(第一行)、処置なし；２ＥのＣｙｓＡ、１μg／ml；２Ｅ(■)および２Ｆ(■)の[ＭｅＩｌｅ]４−シクロスポリン、１μg／ml；２Ｅ(●)および２Ｆ(●)の非シクロフィリン結合性サイクロスポリン、１μg／ml。
【００４９】
抗ウイルス活性を決定するためのさらなる細胞培養系
上記の方法および下記方法のいくつかは、ＨＣＶを使用する。記載の方法は、しかしながら、細胞系およびウイルス病原を変えることにより単純にフラビウイルス科の他のメンバーに適合させ得る。
【００５０】
ＨＣＶおよびその阻害を検出するための、有用な細胞ベースのアッセイは、ＨＣＶレプリコンを保持するＨｕｈ７細胞からのレプリコンＲＮＡのレベルの評価である。これらの細胞は標準培地、例えば１０％ウシ胎児血清、１×非必須アミノ酸、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｕ(各々１００単位／リットル、１００マイクログラム／リットル、および２.９２mg／リットル)、およびＧ４１８(５００〜１０００マイクログラム／ミリリットル)を添加したＤＭＥＭ培地(高グルコース、ビルビン酸無し)で培養できる。抗ウイルススクリーニングアッセイは、Ｇ４１８なしの同じ培地で行うことができる。細胞を対数増殖期に維持するために、細胞を９６ウェルプレートに、例えば、１０００細胞／ウェルほど低密度で播種する。本試験化合物、すなわち、対象非免疫抑制性サイクロスポリンを次いで細胞播種直後に添加し、それらを３〜７日間、３７℃でインキュベーター中でインキュベートする。次いで培地を除去し、細胞を全ＲＮＡ抽出(レプリコンＲＮＡ＋宿主ＲＮＡ)のために調製する。レプリコンＲＮＡを次いで実時間ＲＴ−ＰＣＲ(Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ)プロトコールで増幅し、定量できる。
【００５１】
レプリコンＲＮＡの量の観察される差異が、本試験化合物、すなわち、対象非免疫抑制性サイクロスポリンの抗ウイルス効果を表す一つの方法である。典型的実験において、同等量のレプリコンをネガティブコントロール中に、非活性化合物と共に産生する。これは、両方の設定においてフラビウイルスまたはペスチウイルスＲＴ−ＰＣＲの測定された閾値サイクルがほぼ同じであるかどうかを決定できる。このような実験において、本化合物の抗ウイルス効果を示す一つの方法は、ネガティブコントロールの平均閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクル(Ｃｔネガティブ)を、本試験化合物の閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクル(Ｃｔ試験化合物)から引くことである。この値は†Ｃｔ(†Ｃｔ＝Ｃｔ試験化合物−Ｃｔネガティブ)と呼ぶ。３.３の†Ｃｔ値がレプリコン産生の１ログ(log)減少を示す。ポジティブコントロールとして、組み換えインターフェロンアルファ−２ａ(例えば、Roferon-A、Hoffmann-Roche, NJ, USA)を本試験化合物、すなわち、対象非免疫抑制性サイクロスポリンと並行して使用できる。さらに、本化合物を希釈シリーズ(典型的に１００、３３、１０、３および１：Ｍ)で試験できる。各濃度の†Ｃｔ値は、５０％有効濃度(ＥＣ５０)の計算を可能にする。
【００５２】
先に記載の通り、上記アッセイを、細胞系およびｔｈｅウイルス病原を変えることによりフラビウイルス科の他のメンバーに適合させ得る。対象非免疫抑制性サイクロスポリンの効果を決定するための方法は, Holbrook MR et al. Virus Res. 2000, 69, 31;Markland W. et al. Antimicrob. Agents. Chemother. 2000, 44, 859;Diamond MS et al., J. Virol. 2000, 74, 7814;Jordan I et al. J. Infect Dis.. 2000, 182, 1214;Sreenivasan V et al. J. Virol. Methods 1993, 45(1), 1;またはBaginski SG et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 2000, 97(14)7981に記載の通りの標準法の修飾または実時間ＲＴ−ＰＣＲ技術を含む。例として、ＨｕＨ７細胞中のＨＣＶレプリコン系(Lohmann V et al. Science, 1999, 285(5424, 110)またはその修飾(Blight et al. 2000)を使用できる。
【００５３】
細胞保護アッセイ
アッセイは、本質的にBaginski, S.G., et al. “Mechanism of action of pestivirus compound” PNAS USA 2000, 97(14), 7981-7986に記載の通り行い得る。ＭＤＢＫ細胞(ＡＴＣＣ)を９６ウェル培養プレート(４,０００細胞／ウェル)に、使用する２４時間前に播種する。ＢＶＤＶ(株ＮＡＤＬ、ＡＴＣＣ)で、細胞あたり０.０２プラーク形成単位(ＰＦＵ)の感染多重度(ＭＯＩ)で感染させた後、対象非免疫抑制性サイクロスポリンの連続希釈を、感染および非感染細胞の両方に、増殖培地中０.５％ＤＭＳＯの最終濃度で添加し得る。各希釈をデュプリケート、トリプリケートまたはクアドロプリケートで試験できる。細胞密度およびウイルス接種物を、実験の間中の連続的細胞増殖を確実にするために、および、感染４日後に未処置コントロールの９０％を超えるウイルス誘発細胞破壊が達成されるように調製できる。４日後、プレートを５０％ＴＣＡで固定し、スルホローダミンＢで染色する。ウェルの光学密度をマイクロプレート・リーダーで５５０nmで読み得る。５０％有効濃度(ＥＣ５０)値を、ウイルスの細胞変性作用の５０％減少を達成する対象非免疫抑制性サイクロスポリンの濃度として定義する。
【００５４】
プラーク減少アッセイ
対象非免疫抑制性サイクロスポリンの有効濃度を、プラーク減少アッセイにより、デュプリケート２４ウェルプレートで決定できる。細胞単層を１００ＰＦＵ／ウェルのウイルスで感染させる。次いで、２％不活化血清および０.７５％のメチルセルロース添加ＭＥＭ中の対象非免疫抑制性サイクロスポリンの連続希釈を、単層に添加する。培養物をさらに３７℃で３日間インキュベートし、次いで５０％エタノールおよび０.８％クリスタル・バイオレットで固定し、洗浄し、空気乾燥する。プラークを計測して、９０％ウイルス抑制が得られる濃度を決定する。
【００５５】
収量減少アッセイ
各対象非免疫抑制性サイクロスポリンについて、ウイルス負荷の６ログ減少をえるための濃度を、収量減少アッセイによりデュプリケート２４ウェルプレートで決定できる。本アッセイを、Baginski, S.G., et al. “Mechanism of action of pestivirus compound” PNAS USA 2000, 97(14), 7981-7986に記載の通り、わずかに改変して行い得る。ＭＤＢＫ細胞を２４ウェルプレート(２×１０５細胞／ウェル)に播種し、２４時間後に細胞当たり０.１ＰＦＵの感染の多重度(ＭＯＩ)でＢＶＤＶ(ＮＡＤＬ株)で感染させる。非免疫抑制性サイクロスポリンの連続希釈を、増殖培地中０.５％ＤＭＳＯの最終濃度で細胞に添加する。各希釈をデュプリケート、トリプリケート、またはクアドロプリケートで試験し得る。３日後、細胞培養(細胞単層および上清)を、複数回の凍結−融解サイクルにより溶解し、ウイルス収量をプラークアッセイにより定量する。簡単に言うと、ＭＤＢＫ細胞を、使用する２４時間前に６ウェルプレート(５×１０５細胞／ウェル)に播種する。細胞を０.２mLの試験溶解物で１時間接種し、洗浄し、増殖培地中０.５％アガロースと重層する。３日後、細胞単層を３.５％ホルムアルデヒドで固定し、１％クリスタル・バイオレット(５０％エタノール中ｗ／ｖ)で染色して、プラークを可視化する。次いで、プラークを計測して、ウイルス負荷の６ログ減少をもたらす濃度を決定する。
【００５６】
フラビウイルス科ウイルスの検出に適合させた細胞に基づかないアッセイ
核酸増幅技術が、ここで、生物学的サンプルにおける大量のさらにまだ数が増え続けている結核菌、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、およびＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)の同定のための選択法である。核酸増幅技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)、核酸配列ベースの増幅(ＮＡＳＢＡ)、鎖置換増幅(ＳＤＡ)、および転写媒介増幅(ＴＭＡ)を含む。フラビウイルス科ウイルスゲノムの少なくとも一部のヌクレオチド配列が核酸増幅技術のために必要である。このような配列は公開された文献および遺伝子データベースから容易に入手可能である。
【００５７】
増幅産物検出スキーム
増幅産物検出スキームは２個の基本的タイプ：異種および同種がある。異種検出は、ハイブリダイズしたプローブからハイブリダイズしていないプローブを徐依拠するために設計された洗浄のような異なる工程により特徴付けられ、一方同種検出においては、遊離プローブを結合プローブから除去する物理的分離工程はない。多数の異種および同種検出法が存在する。
【００５８】
異種検出
サザンブロット法は、例えば、異種検出技術である。サザンブロット法において、電気泳動を使用して、サイズおよび荷電により増幅産物を分離する。サイズ分画された産物を膜またはフィルターに拡散、減圧、またはエレクトロブロッティングにより移す。標識検出プローブを、次いで膜結合標的に溶液中でハイブリダイズさせ、フィルターを洗浄して、全てのハイブリダイズしていないプローブを除去し、膜上のハイブリダイズしたプローブを、種々の方法のいずれかにより検出する。
【００５９】
異種検出の他のタイプは、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)の手段による増幅産物の特異的捕捉に基づく。ＰＣＲで使用する一つの方法は、一つのプライマーをビオチンのようなハプテンまたはリガンドで標識し、増幅後、それを抗体またはストレプトアビジン被覆マイクロプレートで捕捉することを含む。他方のプライマーは、フルオレッセインのようなレポーターで標識し、検出を抗フルオレッセイン抗体、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)接合体の添加により達成する。このタイプの方法は、目的に適宜された増幅産物にハイブリダイズする検出プローブを使用するほど特異的ではない。
【００６０】
同種検出
ハイブリダイズしたおよびハイブリダイズしていない検出プローブを同種検出系では物理的に分離しないため、これらの方法は、異種法よりも少ない固定を必要とし、故に汚染の傾向が少ない。蛍光および化学発光標識の同種検出を使用する市販のキットの選り抜きは、TaqMan系(Applied Biosystems;Foster City, CA)、BDProbeTecET系(Becton Dickinson;Franklin Lakes, NJ)、QPCR System 5000(Perkin-Elmer Corp.;Norwalk, CT)およびハイブリダイゼーション保護アッセイ(Gen Probe Inc.;San Diego)である。
【００６１】
TaqMan系は、アンプリコンを実時間で検出する。アンプリコン内の領域にハイブリダイズする検出プローブは、フルオレッセインのようなドナーフルオロフォアを、その５'末端に、そしてクエンチャー部分、例えば、ローダミンをその３'末端に含む。クエンチャーおよびフルオロフォアの両方が同じオリゴヌクレオチドに存在するとき、ドナー蛍光が阻害される。増幅中、プローブは標識に結合する。Taqポリメラーゼが置換され、検出プローブを、それが交互鎖を合成するように開裂する。検出プローブの開裂は、フルオロフォアのクエンチャーからの分離をもたらし、ドナー蛍光シグナルの増加に至る。各増幅サイクルの間、この工程を繰り返す。アンプリコンの量が増加するに連れて、蛍光シグナルの量が増加する。
【００６２】
分子ビーコンはクエンチャーおよびフルオロフォアも使用する。ビーコンは、標識アンプリコンに相補的なプローブであるが、各末端に相補的オリゴヌクレオチドの短い伸張(約５ヌクレオチド)を含む。ビーコンの５'および３'末端は、各々フルオロフォアおよびクエンチャーで標識する。ビーコンが標識にハイブリダイズしないときにヘアピン構造が形成され、フルオロフォアとクエンチャーが接触し、蛍光の消光がもたらされる。本ループ領域はアンプリコンに相補的な領域を含む。標識とのハイブリダイゼーションにより、ヘアピン構造が開き、クエンチャーとフルオロフォアが離れ、蛍光シグナルの発生が可能となる。蛍光光度計は、シグナルを実時間で測定する。
【００６３】
BDProbeTecET系は、TaqManと分子ビーコンの特徴を組み合わせた実時間検出法を使用する。本プローブはヘアピンループ構造を有し、フルオレッセインおよびローダミン標識を含む。この系において、しかしながら、標識分子に相補的な領域はループ内ではなく、むしろローダミン標識に対して３'の領域にある。標識に相補的な配列を含む代わりに、本一本鎖ループは、制限酵素ＢｓｏＢＩの制限部位を含む。本一本鎖配列は酵素の基質ではない。フルオレッセインおよびローダミン標識は増幅前は互いに近く、フルオレッセイン蛍光を消光する。鎖置換増幅は、プローブを二本鎖分子に変換する。次いで、ＢｓｏＢＩ制限酵素が分子を切断でき、標識の分離と蛍光シグナルの増加をもたらす。
【００６４】
QPCR System 5000は、電気化学発光とルテニウム標識を用いる。ビオチニル化プライマーを使用する。増幅後、ビオチン産物をストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ上に捕捉する。本ビーズを、電気化学フローセルに吸引により移し、電極表面に磁気的に保持させる。電気刺激により、ルテニウム標識プローブが発光する。
【００６５】
検出プローブ設計は、増幅産物の検出にプローブを使用する全ての方法で重要である。良い検出プローブは、特異的増幅産物にしかハイブリダイズせず、非特異的産物とはハイブリダイズしない。検出法を最適化する他の重要な論点は、プローブの標識およびサンプルスループットの最大化を含む。
【００６６】
標識法およびレポーター分子
検出プローブは、数種の異なる方法で標識できる。３２Ｐまたは３５Ｓのプローブへの酵素的取り込みが、同位体標識の最も一般的な方法である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に続き、シグナルをオートラジオグラフィー・フィルム上で検出する。
【００６７】
非放射活性検出を行うために、プローブを、種々の分子で酵素的に標識する。ビオチンを酵素的に取り込み、次いで、ストレプトアビジン−接合アルカリホスファターゼで、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート(ＢＣＩＰ)およびニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)のようなＡＰ基質を使用して、検出できる。Lumi-Phos 530またはLumi-Phos Plus(Lumigen, Southfield, MI)のような化学発光法基質もＡＰと共に使用できる。加えて、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰをＤＮＡまたはＲＮＡに酵素的に取り込み、抗ジゴキシゲニンＡＰ接合体を比色または化学発光法検出と共に使用できる。
【００６８】
アクリジニウムエステルのような化学発光部分を含む、多くの他のタイプのレポーター分子が存在する。多くの蛍光部分が同様に入手可能である。トリス(２,２'−ビピリジン)ルテニウム(II)のような電気化学発光化合物も使用できる。これらおよび類似の技術のさらなる記載は：Schiff ER, de Medina M, Kahn RS. Semin Liver Dis. 1999;19(Suppl 1:3-15)に見ることができる。
【００６９】
これらの異種または同種アッセイのいずれも、フラビウイルス科のウイルスに対する本発明のサイクロスポリンの効果の評価に使用できる。
【００７０】
Ｂ.  臨床試験
慢性Ｃ型肝炎感染症または他のフラビウイルス科ウイルス感染症の全１５名の患者が、２週間の試験に参加する。各患者に、本発明のサイクロスポリン、例えば[ＭｅＩｌｅ]４−シクロスポリンを、７〜１５mg／kg  ｐ.ｏ.のレベルで投与する。Ｃ型肝炎抗原(または他のフラビウイルス科ウイルス抗原)の血清レベルを、０日目および１４日目に各患者で決定する。
【００７１】
Ｃ型肝炎感染を有する患者は、下記の徴候および症状の１つ以上を示し得る：(ａ)上昇したＡＬＴ、(ｂ)抗ＨＣＶ抗体試験陽性、(ｃ)ＨＣＶ−ＲＮＡ試験で陽性であることにより証明されるＨＣＶの存在、(ｄ)慢性肝臓疾患の臨床徴候、(ｅ)肝細胞損傷。このような基準はＣ型肝炎の診断に使用できるだけでなく、薬剤処置に対する患者の応答の評価にも使用できる。
【００７２】
上昇した血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(ＡＳＴ)は、制御されてないＣ型肝炎で起こることが知られており、処置に対する完全な応答は、一般に、これらの血清酵素、特にＡＬＴの正常化として定義される(Davis et al., 1989, New Eng. J. Med. 321:1501-1506)。ＡＬＴは、肝臓細胞が破壊されたときに放出される酵素であり、ＨＣＶ感染症に症候的である。
【００７３】
薬剤処置に応答した対象におけるＨＣＶ複製または他のフラビウイルス科ウイルス複製の経過を追跡するために、ウイルスＲＮＡを、血清サンプル中で、例えば、ＨＣＶゲノムのＮ５３およびＮ５４非構造遺伝子領域由来の２セットのプライマー(Farci et al., 1991, New Eng. J. Med. 325:98-104. Ulrich et al., 1990, J. Clin. Invest., 86:1609-1614)または他のフラビウイルス科ウイルスの類似領域を使用するネスティッドポリメラーゼ連鎖反応アッセイにより、測定できる。
【００７４】
肝臓生検サンプルの組織学的試験を、ＨＣＶ複製の評価のための第二の基準として使用できる。例えば、その組織学的活性指数(肝門炎症、断片的なまたは架橋した壊死、小葉傷害および線維症)が疾患活性のスコアリング法を提供する、Knodell et al., 1981, Hepatology 1:431-435を参照のこと。
【００７５】
本発明の実施に際して必要な１日投与量は、例えば、用いる非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリン、宿主、投与の形態、処置すべき状態の重症度に依存して変化する。好ましい１日投与量範囲は、１回量または分割量で、約１〜５０mg／kg／日である。患者のための適当な１日量は、例えば１〜２０mg／kg  ｐ.ｏ.またはｉ.ｖ.の桁である。経口投与のための適当な単位投与形態は、約０.２５〜１０mg／kg活性成分、例えば[ＭｅＩｌｅ]４−シクロスポリンを、１種以上の薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含む。
【００７６】
本発明のサイクロスポリンは、任意の慣用の経路で、特に経腸的に、例えば経口で、例えば飲用液、錠剤またはカプセルの形で、または非経腸的に、例えば注射溶液または懸濁液の形で投与できる。好ましい医薬組成物は、例えばＵＫ２,２２２,７７０Ａに記載のマイクロエマルジョンに基づくものである。
【００７７】
本発明のサイクロスポリンは、唯一の成分として、または他の薬剤、例えば抗フラビウイルス科活性を有する薬剤、例えばインターフェロン、例えばインターフェロン−α−２ａまたはインターフェロン−α−２ｂ、例えばIntronR A、RoferonR、AvonexR、RebifRまたはBetaferonR、または水溶性ポリマーもしくはヒトアルブミンに結合したインターフェロン、例えばalbuferon、抗ウイルス剤、例えばリバビリン、ラミブジン、ＮＶ０８またはＮＭ２８３、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ、ヘリカーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼのようなＨＣＶまたは他のフラビウイルス科ウイルスがコードする因子の阻害剤またはこのような阻害剤のプロドラッグ、抗繊維形成剤、例えばＮ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、例えばイマチニブ、免疫調節剤、例えばミコフェノール酸、その塩またはプロドラッグ、例えばミコフェノール酸ナトリウムもしくはミコフェノール酸モフェチル、またはＳ１Ｐ受容体アゴニスト、例えばＦＴＹ７２０または、例えばａＥＰ６２７４０６Ａ１、ＥＰ７７８２６３Ａ１、ＥＰ１００２７９２Ａ１、ＷＯ０２／１８３９５、ＷＯ０２／７６９９５、ＷＯ０２／０６２６８、ＪＰ２００２３１６９８５、ＷＯ０３／２９１８４、ＷＯ０３／２９２０５、ＷＯ０３／６２２５２およびＷＯ０３／６２２４８に記載の通り所望によりリン酸化されたその類似体と共に投与できる。
【００７８】
水溶性ポリマーに結合したインターフェロンは、とりわけポリエチレングリコール(ＰＥＧ)またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマーのようなポリアルキレンオキシドホモポリマーとの結合体を意味する。ポリアルキレンオキシド骨格のポリマーの代わりに、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物骨格のポリマーなどの非抗原性物質を有効に使用できる。このようなインターフェロン−ポリマー結合体は、米国特許４,７６６,１０６、４,９１７,８８８、欧州特許出願０２３６９８７、欧州特許出願０５１０３５６および国際出願公開ＷＯ９５／１３０９０に記載されている。重合修飾が抗原性応答を十分に減少させるため、外来インターフェロンが完全に自己である必要はない。ポリマー結合体の製造に使用されるインターフェロンは、ヒト、反芻動物またはウシインターフェロンのような哺乳動物抽出物から製造でき、または組み換えにより製造する。好ましいのは、インターフェロンのポリエチレングリコールへの結合体であり、ペグ化インターフェロンとしても既知である。
【００７９】
インターフェロンのとりわけ好ましい結合体は、ペグ化アルファ−インターフェロン、例えばペグ化インターフェロン−α−２ａ、ペグ化インターフェロン−α−２ｂ；ペグ化コンセンサスインターフェロンまたはペグ化精製インターフェロン−α製品である。ペグ化インターフェロン−α−２ａは、例えば欧州特許５９３,８６８に記載され、例えば商品名PEGASYS(登録商標)(Hoffmann-La Roche)の下に市販されている。ペグ化インターフェロン−α−２ｂは、例えば欧州特許９７５,３６９に記載され、例えば商品名PEG-INTRON A(登録商標)(Schering Plough)の下に市販されている。ペグ化コンセンサスインターフェロンはＷＯ９６／１１９５３に記載されている。好ましいペグ化α−インターフェロンは、ペグ化インターフェロン−α−２ａおよびペグ化インターフェロン−α−２ｂである。また好ましいのは、ペグ化コンセンサスインターフェロンである。
【００８０】
リバビリン(１−β−Ｄ−リボフラノシル−１−１,２,４−トリアゾール−３−カルボキサミド)は商品名Virazoleの下に販売されている、合成の、インターフェロンを誘導しない、広スペクトル抗ウイルスヌクレオシド類似体である(The Merk INdex, 11th edition, Editor:Budavar, S, Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, p1304,1989)。米国特許３,７９８,２０９およびＲＥ２９,８３５は、リバビリンを開示し、請求している。リバビリンはグアノシンに構造的に類似し、フラビウイルス科を含む数種のＤＮＡおよびＲＮＡウイルスに対してインビトロ活性を有する(Gary L. Davis, Gastroenterology 118:S104-S114, 2000)。
【００８１】
リバビリンは、患者の４０％で血清アミノトランスフェラーゼレベルを正常まで低下させるが、ＨＣＶ−ＲＮＡの血清レベルを低下させない(Gary L. Davis, Gastroenterology 118:S104-S114, 2000)。故に、リバビリン単独ではウイルスＲＮＡレベルの低下に有効ではない。加えて、リバビリンは著しい毒性を有し、貧血を誘発することが知られている。リバビリンはＨＣＶに対する単剤療法としては認可されてない；それは、ＨＣＶの処置についてインターフェロンアルファ−２ａまたはインターフェロンアルファ−２ｂとの組み合わせで認可されている。
【００８２】
使用する併用剤に関する一日投与量は、例えば、用いる化合物、宿主、投与形態および処置すべき状態の重症度に依存する。例えば、ラミブジンは１００mgの１日量で投与できる。ペグ化インターフェロンは、非経腸的に週に１〜３回、好ましくは週に１回、１週間の総量が２,０００,０００〜１０,０００,０００ＩＵ、より好ましくは５,０００,０００〜１０,０００,０００ＩＵ、最も好ましくは８,０００,０００〜１０,０００,０００ＩＵの範囲で投与できる。
【００８３】
前記によって、本発明はなおさらに下記の局面を提供する：
４.  ａ)非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはIIの化合物である第一剤、およびｂ)併用剤、例えば上記で定義の通りの第二剤を含む、例えば上記で定義の方法のいずれかに使用するための、医薬組み合わせ剤。
【００８４】
５.  治療的有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはIIの化合物、および併用剤、例えば上記で定義の通りの第二剤を、例えば同時にまたは連続して併用投与することを含む、上記で定義の方法。
【００８５】
ここで使用する用語“併用投与”または“組み合わせ投与”などは、選択した治療剤を単独の患者に投与することを包含することを意味し、薬剤を必ずしも同じ投与経路でまたは同時に投与するものではない処置レジメンを含むことを意図する。
【００８６】
本発明の医薬組み合わせ剤は、その薬学的活性成分の一方のみを適用する単剤療法と比較して有利な効果、例えば相乗的治療効果をもたらす。好ましい相乗作用的組み合わせは、非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリンと、所望によりポリマーに結合しているインターフェロンの組み合わせである。
【００８７】
さらに好ましい組み合わせは、非免疫抑制性シクロフィリン結合性サイクロスポリンとミコフェノール酸、その塩もしくはプロドラッグ、またはＳ１Ｐ受容体アゴニスト、例えばＦＴＹ７２０との組み合わせである。
【００８８】
組み合わせまたは交互治療
本発明の活性化合物は、他の抗フラビウイルス科薬剤と組み合わせてまたは交互に投与できる。組み合わせ治療では、２種以上の薬剤の有効量を一緒に投与するが、交互または連続工程治療では、各薬剤の有効量を連続的もしくは断続的に投与する。投与する量は、薬剤の吸収、不活性化および排泄速度ならびに当業者に既知の他の因子に依存する。投与量はまた緩解すべき状態の重症度により変化することも注意すべきである。任意の特定の対象に関して、具体的な投与レジメンおよびスケジュールを、個々の必要性に従い経時的に調節すべきであり、そして組成物を投与するまたは投与を監督する者の専門的判断に従い調節すべきであることはさらに理解されよう。好ましい態様において、１０−１５：Ｍ、または好ましくは１−５：Ｍ未満のＥＣ５０を示す抗フラビウイルス科化合物が望まれる。
【００８９】
フラビウイルス科ウイルスの薬剤耐性変異株が、抗ウイルス剤での長期処置の後に発生し得ることは認識されている。薬剤耐性は、最も典型的には、ウイルス複製において使用する酵素をコードする遺伝子の変異により起こる。ウイルス感染に対する薬剤の効果は、主薬剤によりもたらされるものと異なる変異を誘発する第二の、そしておそらく第三の抗ウイルス化合物との組み合わせまたは交互の投与により延長でき、増強でき、または回復し得る。あるいは、薬剤の薬物動態学、生体内分布または他のパラメータが、このような組み合わせまたは交互の治療により変化し得る。一般に、組み合わせ治療が、それがウイルスに対して複数の負荷を同時にかけるため、交互治療よりも典型的に好ましい。
【００９０】
上記の通り、多くのウイルス処置、例えば、インターフェロンおよびリバビリンを、本明細書に記載の非免疫抑制性サイクロスポリンと組み合わせて、または交互に使用できる。さらに、非限定的例は下記を含む：
(１)プロテアーゼ阻害剤
例は、アルファケトアミドおよびヒドラジノウレアを含む、基質に基づいたＮＳ３プロテアーゼ阻害剤((Attwood et al., Antiviral peptide derivatives, PCT WO 98/22496, 1998; Attwood et al., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1999, 10, 259-273; Attwood et al, Preparation and use of amino acid derivatives as anti-viral agents, German Patent Pub. DE 19914474; Tung et al. Inhibitors of serine proteases, particularly hepatitis C virus NS3 protease; PCT WO 98/17679)を含み、そしてボロン酸またはホスホネートのような親電子基で終わる阻害剤(Llinas-Brunet et al. Hepatitis C inhibitor peptide analogues, PCT WO 99/07734)が治験中である。
【００９１】
RD3-4082およびRD3-4078(前者はアミドを１４炭素鎖置換され、そして後者はパラ−フェノキシフェニル基を有する)を含む、２,４,６−トリヒドロキシ−３−ニトロ−ベンズアミド誘導体のような基質に基づかないＮＳ３プロテアーゼ阻害剤(Sudo K. et al., Biochemiscal and Biophysical Research Communications, 1997, 238 643-647; Sudo K. et al. Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 1998, 9, 186)もまた治験中である。
【００９２】
フェナントレンキノンであるSch 68631はＨＣＶプロテアーゼ阻害剤である(Chu M et al., Tetrahedron Letters 37:7229-7232, 1996)。同じ著者による他の例において、真菌ペニシリウム・グリセオフルバム(Penicillium griseofulvum)から単離されたSch 351633はプロテアーゼ阻害剤として同定されている(Chu M. et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9:1949-1952)。ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ酵素に対するナノモル濃度での効果が、巨大分子eglin cに基づいた選択的阻害剤の設計により達成されている。ヒルから単離されたeglin cは、S. griseusプロテアーゼＡおよびＢ、∀−キモトリプシン、キマーゼおよびサブチリシンのような数種のセリンプロテアーゼの強力な阻害剤である。Qasim M.A. et al., Biochemistry 36:1598-1607, 1997。
【００９３】
ＨＣＶの処置に関してプロテアーゼ阻害剤を開示する米国特許は、例えば、Spruce et al. の米国特許６,００４,９３３(ＨＣＶエンドペプチダーゼ２の阻害のためのシステインプロテアーゼ阻害剤のクラスを開示する)；Zhang et al. の米国特許５,９９０,２７６(Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼの合成阻害剤を開示する)；Reyes et alの米国特許５,５３８,８６５を含む。ＨＣＶＮＳ３セリンプロテアーゼ阻害剤としてのペプチドは、Corvas International, Inc.のＷＯ０２／００８２５１、ならびにSchering CorporationのＷＯ０２／０８１８７およびＷＯ０２／００８２５６に開示されている。ＨＣＶ阻害剤トリペプチドは、Boehringer Ingelheimの米国特許６,５３４,５２３、６,４１０,５３１および６,４２０,３８０ならびにBristol Myers SquibbのＷＯ０２／０６０９２６に開示されている。ＨＣＶのＮＳ３セリンプロテアーゼ阻害剤としてのジアリールペプチドは、Schering CorporationのＷＯ０２／４８１７２に開示されている。ＨＣＶのＮＳ３セリンプロテアーゼ阻害剤としてのイミダゾリジノンは、Schering CorporationのＷＯ０２／１８１９８およびBristol Myers SquibbのＷＯ０２／４８１５７に開示されている。Vertex PharmaceuticalsのＷＯ９８／１７６７９およびBristol Myers SquibbのＷＯ０２／４８１１６もまたＨＣＶプロテアーゼ阻害剤を開示する。
【００９４】
(２)ＮＳ３／４Ａ融合タンパク質およびＮＳ５Ａ／５Ｂ基質での逆相ＨＰＬＣアッセイにおいて適切な阻害を示すチアゾリジン誘導体(Sudo K. et al., Antiviral Research, 1996, 32, 9-18)、とりわけ長アルキル鎖で置換された縮合シンナモイル部分を有する化合物RD-1-6250、RD46205およびRD46193；
【００９５】
(３)Kakiuchi N. et al. J. FEBS Letters 421, 217-220;Takeshita N. et al. Analytical Biochemistry, 1997, 247, 242-246で同定されたチアゾリジンおよびベンズアニリド；
【００９６】
(４)ストレプトマイセス属の発酵培養液から単離されたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーアッセイでプロテアーゼに対して活性を有するフェナントレンキノン、Sch 68631(Chu M. et al., Tetrahedron Letters, 1996, 37, 7229-7232)、および真菌ペニシリウム・グリセオフルバムから単離されたシンチレーション近接アッセイにおいて活性が証明されるSch 351633(Chu M. et al, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9, 1949-1952)；
【００９７】
(５)ヘリカーゼ阻害剤(Diana G.D. et al., Compounds, compositions and methods for treatment of hepatitis C, U.S. Patent No. 5,633,388; Diana G.D. et al., Piperidine derivatives, pharmaceutical compositions thereof and their use in the treatment of hepatitis C, PCT WO 97/36554)；
【００９８】
(６)ヌクレオチドポリメラーゼ阻害剤およびグリオトキシン(Ferrari R. et al. Journal of Virology, 1999, 73, 1649-1654), and the natural product cerulenin (Lohmann V. et al. Virology, 1998, 249, 108-118)；
【００９９】
(７)ウイルスの５'非コード領域(ＮＣＲ)の配列伸張に相補的なアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(Ｓ−ＯＤＮ)(Alt M. et al., Hepatology, 1995, 22, 707-717)、またはＮＣＲの３'末端を含むヌクレオチドおよびＨＣＶ  ＲＮＡのコア・コード領域に位置するヌクレオチド３７１−３８８(Alt M. et al., Archives of Virology, 1997, 142, 589-599; Galderisi U. et al., Journal of Cellular Physiology, 199, 181, 251-257)；または治療の効果を高める、ＨＣＶゲノムの任意の部分に相補的なアンチセンス配列。
【０１００】
(８)ＩＲＥＳ依存翻訳の阻害剤(特開平８−２６８８９０、池田信ら、Ｃ型肝炎の予防・治療剤;特開平１０−１０１５９１、甲斐康信ら、ウイルス感染症の予防・治療剤)；
【０１０１】
(９)リボザイム、例えばヌクレアーゼ抵抗性リボザイム(Maccjak, D.J. et al., Hepatology 1999, 30, abstract 995)ならびにBarber et al.の米国特許６,０４３,０７７およびDraper et al.の米国特許５,８６９,２５３および５,６１０,０５４に記載のもの；および
【０１０２】
(１０)ヌクレオシド類似体がまたフラビウイルス科感染症の処置のために開発されている。例えば、発明の名称“フラビウイルス科感染の治療のための２’−Ｃ−メチル−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステルリボフラノシルシチジン”である特許出願ＷＯ２００４／００２４２２Ａ２および米国特許６,８１２,２１９を参照のこと。
【０１０３】
Idenix Pharmaceuticalsは、国際公開ＷＯ０１／９０１２１およびＷＯ０１／９２２８２の中でフラビウイルス(ＨＣＶを含む)およびペスチウイルスの処置における分枝ヌクレオシドの使用を開示している。具体的に、有効量の生物学的に活性な１'、２'、３'または４'−分枝Ｂ−ＤまたはＢ−Ｌヌクレオシドまたはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを投与することを含む(単独で、または他の抗ウイルス剤と共に、所望により薬学的に許容される担体中で投与する)、ヒトおよび他の宿主動物におけるＣ型肝炎感染(およびフラビウイルスおよびペスチウイルス)の処置法が、Idenixの公報に開示されている。
【０１０４】
Ｃ型肝炎ウイルスの処置のためのある種のヌクレオシド類似体の使用を開示する他の特許は：BioChem Pharma, Inc.(現在Shire Biochem, Inc.）が出願したＰＣＴＣＡ００／０１３１６(ＷＯ０１／３２１５３；２０００年１１月３日出願)およびＰＣＴ／ＣＡ０１／００１９７(ＷＯ０１／６０３１５；２００１年２月１９日出願)；Merck & Co., Inc.が出願したＰＣＴ／ＵＳ０２／０１５３１(ＷＯ０２／０５７４２５；２００２年１月１８日出願)およびＰＣＴ／ＵＳ０２／０３０８６(ＷＯ０２／０５７２８７；２００２年１月１８日出願)、Rocheが出願したＰＣＴ／ＥＰ０１／０９６３３(ＷＯ０２／１８４０４；２００１年８月２１日公開)、およびPharmasset, Ltd.が出願したＰＣＴ公開ＷＯ０１／７９２４６(２００１年４月１３日出願)、ＷＯ０２／３２９２０(２００１年１０月１８日出願)およびＷＯ０２／４８１６５を含む。
【０１０５】
Emory Universityの発明の名称“２'−フルオロヌクレオシド”であるＰＣＴ公開ＷＯ９９／４３６９１は、ＨＣＶの処置に対するある種の２'−フルオロヌクレオシドの使用を開示する。
【０１０６】
Eldrup et al. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16th International Conference on Antiviral Research (April 27, 2003, Savannah, GA))は、ＨＣＶの阻害のための２'−修飾ヌクレオシドの構造活性相関を記載している。
【０１０７】
Bhat et al. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae, 2003 (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16th International conference on Antiviral Research (April 27, 2003, Savannah, Ga); p A75)は、可能性のあるＨＣＶ  ＲＮＡ複製の阻害剤として、ヌクレオシド類似体の合成および薬物動態学的特性を記載している。著者らは、２'−修飾ヌクレオシドで、細胞を利用したレプリコンアッセイで強力な阻害活性が立証されることを報告している。
【０１０８】
Olsen et al. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16th International Conference on Antiviral Research (April 27, 2003, Savannah, Ga)p A76)はまた、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製に対する２'−修飾ヌクレオシドの効果も記載している。
【０１０９】
(１１)１−アミノ−アルキルシクロヘキサン(Gold et al.の米国特許６,０３４,１３４)、アルキル脂質(Chojkier et al.の米国特許５,９２２,７５７)、ビタミンＥおよび他の抗酸化剤(Chojkier et al.の米国特許５,９２２,７５７)、スクアレン、アマンタジン、胆汁酸(Ozeki et al.の米国特許５,８４６,９９９６４)、Ｎ−(ホスホノアセチル)−Ｌ−アスパラギン酸(Diana et al.の米国特許５,８３０,９０５)、ベンゼンジカルボキサミド(Diane et al.の米国特許５,６３３,３８８)、ポリアデニル酸誘導体(Wang et al.の米国特許５,４９６,５４６)、２'３'−ジデオキシイノシン(Yarchoan et al.の米国特許５,０２６,６８７)、ベンゾイミダゾール(Colacino et al.の米国特許５,８９１,８７４)、植物抽出物(Tsai et al.の米国特許５,８３７,２５７、Omer et al.の米国特許５,７２５,８５９、および米国特許６,０５６,９６１)およびピペリジン(Diana et al.の米国特許５,８３０,９０５)を含む、その他の雑多な化合物。
【０１１０】
(１２)ＴＯＬＬ様受容体アゴニストであるヌクレオシド類似体である、イサトリビン(isatoribine)(ＡＮＡ９７５およびＡＮＡ２４５)(米国５,０４１,４２６および４,８８０,７８４)のような受容体アゴニスト。
【０１１１】
(１３)１−(４−ペンチルオキシ−３−トリフルオロメチルフェニル)−３−(ピリジン−３−カルボニル)チオウレア(米国公開２００４／０１３８２０５、米国出願１０／７１６,１７５)のような置換チオアリールウレア誘導体。
【０１１２】
(１４)抗葉酸、５−フルオロピリミジン(５−フルオロウラシルを含む)、β−Ｌ−１,３−ジオキソラニルシチジンまたはβ−Ｌ−１,３−ジオキソラニル５−フルオロシチジンのようなシチジン類似体、代謝拮抗剤(プリン代謝拮抗剤、シタラビン、フルダラビン、フロクスウリジン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、および６−チオグアニンを含む)、ヒドロキシウレア、有糸分裂阻害剤(ＣＰＴ−１１、エトポシド(ＶＰ−２１)、タキソール、およびビンクリスチンおよびビンブラスチンのようなビンカアルカロイドを含む)、アルキル化剤(ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イフォスアミド、メクロレタミン、メルファラン、およびチオテパを含むが、これらに限定されない)、非古典的アルキル化剤、白金含有化合物、ブレオマイシン、抗腫瘍抗生物質、ドキソルビシンおよびダウノマイシンのようなアントラサイクリン、アントラセンジオン、トポイソメラーゼII阻害剤、ホルモン剤(コルチコステロイド(デキサメサゾン、プレドニゾン、およびメチルプレドニゾン)、フルオキシメステロンおよびメチルテストステロンのようなアンドロゲン、ジエチルスチベステロールのようなエストロゲン、タモキシフェンのような抗エストロゲン、リュープロリドのようなＬＨＲＨ類似体、フルタミド、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、およびメドロキシプロゲステロンのような抗アンドロゲンを含むが、これらに限定されない)、アスパラギナーゼ、カルムスチン、ロムスチン、ヘキサメチル−メラミン、ダカルバジン、ミトタン、ストレプトゾシン、シスプラチン、カルボプラチン、レバミソール、およびロイコボリンを含む、組み合わせ治療の効果を高める化合物。本発明の化合物はまた、酵素治療剤ならびにインターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、マクロファージ−コロニー刺激因子およびコロニー刺激因子のような免疫系調節剤と組み合わせても使用できる。
【国際調査報告】
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