(57)【要約】  分離した上皮細胞及び間葉細胞から迅速で再現性の高い毛包形成のためのアッセイ方法が開示される。前記方法は、細胞の毛形成（すなわち毛の成長を誘導する）特性を測定するため、及びそのメカニズムを研究するためのツールとして役立ち、器官を組み立てるために分離細胞を用いる。本出願の方法では、新生児マウスの皮膚から単離した分離細胞を成体マウスの躯幹皮膚に注射して毛包を発達させる。この方法は、クラスターを形成する上皮細胞の集合を必要とし、前記クラスターはアポトーシスにより骨組みとなり“漏斗状嚢胞”を形成する。前記“漏斗状嚢胞”から毛原基、続いて毛包芽、毛包栓子が形成され、前記は非対称性に成長して、周期を有する成熟した毛包脂腺構造体に分化する。種々の技術を用い、皮膚を穿刺、切開又は擦過することによって（さらにあるアプローチでは創傷包帯で露出した嚢胞を覆って）、前記“漏斗状嚢胞”を暴露したとき毛包の出現がもたらされた。
2008509679.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、分離細胞から毛包形成を誘導する方法：
a）真皮細胞及び表皮細胞を含む分離細胞の混合物を提供する工程；
b）皮膚ブレブを生じる哺乳動物の真皮/皮下組織に前記混合物を注射する工程；及び
c）注射した細胞混合物を新たな毛幹に成長させる工程。
【請求項２】
真皮細胞対表皮細胞の比率が約100：1〜約1：20の範囲である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
真皮細胞対表皮細胞の比率が約20：1〜約1：2の範囲である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
毛幹に隣接する真皮/皮下組織を破壊することによって、新たに形成された毛幹を外に出させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
破壊が真皮/皮下組織を切開することによってもたらされる、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
破壊が、真皮/表皮を貫通して中空管を挿入し、前記中空管を治癒期間後に取り除き、さらに前記中空管が以前に位置していた皮膚から前記毛包を外に出させることによってもたらされる、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
破壊が、細胞を最も表在性の真皮に静置し、毛幹を成長させて自発的に外に出させることによってもたらされる、請求項4に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物がマウスである、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
注射される真皮細胞及び表皮細胞の混合物が漏斗状嚢胞に成長し、さらに毛包が前記嚢胞から成長する、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む、分離した哺乳動物細胞の毛包誘導特性を評価するパッチアッセイ：
a）真皮細胞及び表皮細胞を含む分離細胞の混合物を提供する工程；
b）皮膚ブレブを生じる哺乳動物の真皮/皮下組織に前記混合物を注射する工程；及び
c）注射した細胞混合物を新たな毛包に成長させる工程。
【請求項１２】
アッセイが、検査材料の毛包誘導特性を試験するために用いられる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
検査材料が医薬品、化合物、ポリマー化合物、増殖因子、細胞生成物、生細胞、又は生体分子を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
真皮細胞対表皮細胞の比率が約100：1〜約1：20の範囲である、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
真皮細胞対表皮細胞の比率が約20：1〜約1：2の範囲である、請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
毛包に隣接する真皮/皮下組織を破壊することによって、前記毛包を外に出させる工程をさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１７】
破壊が真皮/皮下組織を切開することによってもたらされる、請求項11に記載の方法。
【請求項１８】
破壊が、真皮/表皮を貫通して中空ワイヤー管を挿入し、前記管を通って前記毛包を外に出させることによってもたらされる、請求項6に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物がマウスである、請求項11に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物がヒトである、請求項11に記載の方法。
【請求項２１】
注射した真皮細胞及び表皮細胞の混合物が漏斗状嚢胞に成長し、毛包が前記嚢胞から成長する、請求項11に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（背景技術）
これまでの生物工学の努力の目標は、規定の組織培養条件下で増殖させた分離細胞から出発して完全に組織化された機能的な器官系を創出又は再生することである。
毛包は、個体の生涯にわたってプロメテウスのようにその下半分を繰り返し再生させるという点で、強い再生能力を有することが長い間認識されてきた（Stenn & Paus, 2001及び前記文献中の引用文献）。実際、毛包は、個体の生涯にわたってそれ自身を再編成し続ける数少ない生物学的構造体の1つである。この再生に関する重要な疑問は（前記は全ての再生系の問題であるが）、この器官の再編成はどのようにして、すなわちどんな細胞相互作用並びにどんな分子メッセージ及びシグナルによって生じるのかということである。毛包の再生特性の研究の機動力をもたらしたのは、以下の事柄を示す最近の発見であった：1）毛包は、幹細胞特性を有する、上皮細胞集団（Cotsarelis et al. 1990；Morris et al. 2004）及び間葉細胞集団（Jahoda et al. 2003）を含み、2）毛包由来細胞は完全な皮膚器官の再生を統制し（Prouty et al. 1996, 1997）、さらに創傷修復に役割を果たすようであり（Gharzi et al. 2003；Jahoda and Reynolds 2001）；さらに3）毛包由来細胞集団は、一方で脂肪細胞、骨、軟骨及び骨髄を生じ（Lako et al. 2002；Jahoda et al. 2003）、他方で皮脂腺、毛包及び表皮を発生させることができる（Oshima et al. 2001；Taylor et al. 2000）。毛包の増殖誘導のための従来の典型的モデルは、標識保持細胞は毛包の膨らんだ領域（バルジ(bulge)）の内部で休止していることを初めて示した（。Cotsarelis et al. 1990）。バルジ活性化仮説によれば、シグナルは毛乳頭から休止中の上皮小胞へ送達され、前記は続いて次の小胞周期を誘発する。毛包バルジの細胞が誘導されて新しい毛包を形成するという直接的な証拠が提示された（Morris et al. 2004）。
【０００２】
新生小胞形成は成長した状態では通常的に発生するとは一般的に考えられていないが、一方、新規な小胞形成は細胞操作によって実験的に誘発できる。Cohen（1961）は初期の研究で、単離したラットおよびモルモットの鼻毛乳頭（小胞基底内の間葉栓子）は、耳に実験的に移植されたときに新規な小胞形成を誘導できることを示した。一連の今や古典的な実験で、Oliverの研究室は、この実験を再現しただけでなく、毛乳頭は毛包を取り囲む結合鞘膜から再生できることも示した（Oliver, 1966, 1967, 1970）。同じモデルを用いて、Jahodaと彼のチームは誘導性乳頭細胞を培養した（Jahoda et al. 1984）。
新規な小胞形成に寄与する細胞の研究は、これら細胞の毛包誘導性（毛の形成）特性について前記細胞をアッセイする能力の制約を受けていた。毛形成細胞アッセイを開発する試みが、種々の実験系、例えばハンギングドロップ培養（Hardy， 1949）、顆粒化組織床（Reynolds & Jahoda, 1992）、コラーゲンシェル（Reynolds & Jahoda, 1994）及び腎カプセル培養（Takeda et al. 1998, Inamatsu et al. 1998）で実施された。誘導性細胞の検査で有用な方法は、免疫不能マウス及びシリコンチャンバーを用いてLichtiと共同研究者らによって提示された（Weinberg et al. 1993, Lichti et al. 1993）。Lichtiらのアッセイは毛形成細胞の同定については頼もしい手段であるが、一方、前記は、必要な細胞数、時間及び動物数に関して要求が過度である。
単離された細胞から新規な毛包が形成されるメカニズムを解明するために、本発明者らは、毛形成特性もまた正確に反映するより迅速なミニアッセイを開発するために実験を開始した。本明細書に記載するものは、リクチ/プローティ（Lichti/Prouty）アッセイよりもはるかに少ない細胞（1千万に対して百万）を用い、より短い時間（35日に対して10日）で信頼できる結果を提供し、さらに多数のマウスの必要性を減じる方法又はアッセイである（例えば一時に1匹のマウスで6アッセイ以上を実施することができる）。本発明の方法で、本発明者らは、皮膚中に毛形成細胞を配置することによって、8〜12日以内に皮膚パッチとして出現する毛胞列が形成されることを見出した。隣接する皮膚の覆いを突き刺すか、切開するか又は傷をつけることによって、又は最も表在性の真皮(the superficial most dermis)に前記細胞を配置することによって毛包アッセイ物を露出したとき、毛幹の出現がもたらされた。
【０００３】
（本発明の詳細な説明）
マウス発毛(trichogenic)細胞のマウス皮膚への皮下組織注射は、毛包の迅速な形成をもたらす。リクチ/プローティ（Lichti/Prouty）アッセイ（Weinberg et al．1993；Lichti et al. 1993；Prouty et al. 1996）で用いられたのと同じ上皮及び間葉細胞の集団を（チャンバー内の代わりに）皮膚に直接注射したとき、真皮内で成熟毛包の迅速な形成が観察された。移植に用いた最初の細胞集団は、0〜2日齢の新生児マウスに由来する分離した真皮細胞及び表皮細胞小クラスターで構成されている（図1A）。新生児毛形成細胞(trichogenic cell)の注射を受けた皮膚部位（ここでは“パッチ”と称する）を、決まった手順で12日後に採集した。この時点では、前記パッチはわずかに盛り上がった灰色の円形領域の皮膚として存在する（図1B、右の挿入パネル）。個々の毛包は解剖顕微鏡を用いて腹側から最もよく見ることができる（図１B及び左の挿入パネル）。典型的なアッセイでは、100万の真皮細胞及び10,000の上皮集合体を注射した後、各部位に、毛幹が付随した約200の毛包を含むクラスターが形成する。
毛幹の横断切片によって確認されるように、未分画の毛皮の真皮細胞が実験で用いられたため、チロトリク（tylotrich）及びアンダーヘア(underhair)（錐状（awl）、オーヘン（auchene）、ジグザグ(zig-zag)）毛包の両方が予想されるとおり形成される（Dry 1926）（図1B、C、D）。この発見は、形成される毛包のタイプは真皮成分の起源を反映するということを示した先の研究と一致する（Jahoda 1992）。
【０００４】
形成される毛包の形態にはいくつかの異常な変型が存在する。多くの毛包の形態はin situの毛包と同一であるが、最遠位の(the distal-most)毛髪管の嚢胞拡張、毛幹の遺残及び異常に長い休止期から成る、いくらかの変形と不規則な配置を示す毛包形態もまた存在する。しかしながらパッチ内のほとんどの毛包は、皮膚表面に対して平行に存在し、遠心的に配置された毛球（毛包基底）を有する。新規な毛包形成に関して毛形成細胞が真皮に配置されることの影響を決定するために、本発明者らは同じ数の細胞を、皮下組織内に又はより深部の筋膜面に沿って、皮下に注射した。組織学的には、前者の事例では、細胞はほぼ皮筋層レベル（図1Dでは下部、並びに図4では上部及び内側）に存在する。この事例では、細胞は真皮内の小さな容積にとどまり、良好な毛包形成がもたらされる。細胞調製物を皮下の筋膜上に注射したとき、細胞は広い領域に拡散し、ほとんどは毛包を形成しなかった。新規な毛の形成が免疫不能マウス、例えばヌード（nu/nu）変異体に固有であるか否かを調べるために、新生児の同質な細胞を用いて野生型成体C57BL/6マウスでパッチアッセイを実施した。前記同質な細胞は前記成体マウスに寛容され、注射14日目にパッチ毛が観察された。したがって、この系での新規な毛の形成は、形態及び発育の時期に関しては免疫不能宿主に固有ではない。
毛包形成の成功は、表皮細胞及び真皮細胞の両方を必要とする。表皮細胞の注射は色素が沈着した上皮性嚢胞の形成をもたらすだけである（図2A、B）。真皮細胞の注射は、注射部位に支質の白色パッチを生じるだけである（図2C、D）。このアッセイで毛包形成の成功に必要な真皮細胞対表皮細胞の割合は約500：1〜約1：100の範囲で、好ましく約100：1〜約1：20、もっとも好ましくは約20：1〜約1：2の範囲である。
ほとんどの事例で、成熟パッチアッセイは、突出した宿主血管上に位置し、あたかもこの高度な相互作用をもつ代謝系の成長は血管形成作用を有するかのようであった。毛包の血管形成特性の証拠は既に提示されている（Stenn & Paus 2001の概論）。
【０００５】
パッチアッセイの毛包周期
本発明者らは、組織学的研究から、新規に形成された毛包は発育相に入ることを知ったが、次に本発明者らはこれらの毛包周期が最初の発育相を超えて進むか否かの疑問を持った。注射後種々の時間の部位を採集することにより、本発明者らは、新規に形成された毛包集団は集合体として事実上周期的に行動することを見出した。毛形成細胞が得られたマウスでは、in vivoでの周期の正常な発育相（すなわち、アナゲン）、は、約18日に及び、その後休止相（テロゲン）が続く（Stenn & Paus 2001）。図3Aに示されるように、パッチ内の毛包は13日でもっぱら増殖し（アナゲン）、一方、それらは21日では休止（テロゲン）している（多くの伸長休止期形態が見出されるが、アナゲン毛球はこの時期には存在しない）。この観察された周期は、最初の新生児の毛周期の時間的経過と良好な相関性を示す。しかしながら、パッチ組織がもっと後の時期（3〜4ヶ月）で採集されたとき、本発明者らは色素の沈着、類表皮嚢胞、異物反応及び巣状線維症を認めた。本発明者らは、これらの変化は、形成された毛幹が適切に脱落せず、真皮内に残留して炎症性反応及び異物反応を刺激するという事実に二次的なものであると解釈した。
完全なマウスの皮膚器官は毛周期にわたって劇的な変化を受けるので（Chase et al. 1953；Hansen et al. 1984）、本発明者らは、レシピエントの皮膚の毛周期がパッチ毛包の毛周期と一致するか否か疑問を持った。パッチの毛包を調べたとき、本発明者らは、発育相にあるパッチの毛を見出したが、一方、宿主の皮膚の毛包は休止期であった（図4）。これらの観察を総合すれば、毛包周期の内部時計は構成要素の毛形成細胞に固有であり、宿主の皮膚の毛周期に左右されないことを示している。
【０００６】
あるアッセイにおける毛包形成数は、送達される細胞総数及び真皮細胞に対する表皮細胞の割合の関数であることが初期に研究によって提唱されたので、本発明者らはこの関係を最適化しようとした。これを達成するために、本発明者らは様々な数の真皮細胞及び表皮細胞をアッセイした。真皮細胞を5百万へと5倍増加させたとき、100万の真皮細胞（255±25）の注射と比較して毛包は増加しなかった（278±25、図5A）。他方、真皮細胞の数を5倍減少させて20万にしたとき、形成された毛包数は、100万の真皮細胞の場合と比較して顕著に減少した（63±10）。３つの状況全てで表皮集合体対真皮細胞の割合を1：100に維持したことから、これらのデータは興味深い。真皮細胞を100万に固定し、表皮集合体の数を10,000〜50,000に変動させたとき、顕著な相違を生じないで対応する数の毛包がこの範囲にわたって形成された（それぞれ255±28及び240±27）。しかしながら、表皮集合体を2,000に減少させたとき、形成された毛包の数は半分以上減少した（52±25）（図5B）。以後の全ての実験では、各パッチアッセイは、真皮対表皮の割合を100：1にし100万の真皮細胞を用いて開始した。
【０００７】
パッチ毛は皮膚表面から外へ成長することができる
皮膚表面下で形成されたパッチ毛幹もまた皮膚から外へ成長できることを示すために、本発明者らはいくつかのアプローチを用いた（詳細については方法の項を参照されたい）。先ず初めに、本発明者らはパッチ毛を14日目に1匹のマウスから採集し、前記パッチを種々の方向を有する多数の毛包を含む小片に分割し、前記小片を別のヌードマウスに移植した。結果は、移植したときに正しい方向をもつ毛包（毛球は皮膚内に存在する）は生存し、皮膚表面から外へ成長することができることを示した（図6A）。本発明者らはまた、2つの方法を用い、皮膚表面への通路を開設し、パッチ毛幹を開放した。1つの方法は、パッチの上部に浅い切り傷を付けて毛包を露出させるものであり、他方は管をパッチの注射部位に挿入して3日後に管を取り除くものであった（図6C）。これらの方法のいずれも皮膚表面から成長する毛の束を自由にした。本発明者らは、伸び出た毛を組織学的に調べ、それらが注射後21日目で休止期にあり、さらにその時期のアナゲン毛包によって明らかなように約4週で発育相に入ったことを見出した。これらの結果は、パッチ毛は、開口部が開設されるならば皮膚表面から外へ成長することができ、さらに正常な毛周期を進行することができることを示した。
【０００８】
分離細胞から生じる新規な毛包形成は開始工程、形態発生工程及び分化工程を必要とし、上皮プラットフォームから出発する
上記の研究は、パッチアッセイは、再現性のある完全な周期を有する毛包を生じることを示した。この毛包の器官形成系の次の課題は、分離された細胞を初めとして新規な器官をどのように発生させるかということである。これらの実験を実施するために、本発明者らは、このパッチアッセイを時間をかけて組織学的及び免疫化学的に判定した。この実験は3回繰り返し、1回は野生型細胞を用い、2回はGFP標識細胞を用い、それらのデータは同様であった。
混合した真皮細胞及び上皮細胞の注射後1日で（図1A参照）、組織切片は、再生中の両生類の肢芽で見出される芽体細胞を連想させる、ふくらんだ間葉細胞によって取り囲まれた上皮細胞集合体を示す（図7A；Tsonis 1996）。細胞クラスターはもっぱら上皮性であり（図７A、B）、これは、C57Bl/6マウス細胞と組み合わせたGFPマウス由来の表皮細胞（図７B）又は真皮細胞（データは示されていない）を含む相互実験からビメンチン染色によって結論付けられた。前記はパン-サイトケラチン-II抗体染色によって確認された（図7L）。この時期では前記細胞クラスターは有糸分裂活性をほとんど示さなかったが（Ki67データによって示されたとおりであるが、データはここには示されていない）、それらは凝集によって外見的に増殖を続けた（図7Bと図7Gを比較されたい）。初期の形態発生の興味深い特徴は、細胞静置後1日目に認められるように、送達された細胞で観察される顕著なアポトーシスである（図7C）。このアポトーシス活性は支質内で重点的に出現するが、上皮クラスター内にもまた見出される。このアポトーシス活性は1日目にもっとも強いがその後減少する。
【０００９】
2日までに、前記細胞はグリコサミノグリカンに富む支質中に埋没する（図7F）。前記上皮クラスターは、巣状の非対称性増殖を示す。この時期には、以下の異常な状態が認められる：1）Ki67染色によって示されるように分割細胞の異常な配置（図7J）、2）原基形成を示唆するいくつかのクラスター内のEDAR（Pispa & Thesleff 2003）免疫反応性（IR）（図7I）、及びH & E染色、CD44IR及びアルカリ性ホスファターゼによって観察されるように初期間葉細胞凝縮（Handjiski et al. 1994）（図7H、7M及び7N）。この時期には、上皮クラスターのいくつかは、中央の角質化とともに巣状の顕著なアポトーシスを示す（図7G）。他のクラスターは、中心部の嚢胞形成を示し、この場合、嚢胞に沿って並ぶ細胞はケラトヒアリン顆粒を含む（図7H）。生じた構造体は、毛包の漏斗部（最遠位の）を髣髴させる。これらの“漏斗状嚢胞”は、そこから初期毛包が成長するプラットフォームとして機能する。これらのクラスターでは、p63（図7K）、p53アナローグ及び付属器原基のマーカー発現、並びに表皮の付属器の発生のために要求される構造（Mills et al 1999；Yang et al 1999）及びパン-サイトケラチンII（図7L）（角質化分化マーカー（Coulombe et al 2002））の発現は相互排除的に見え、p-63 IRは周辺でより強い。
4日には、クラスター融合物のいくつかで中央の嚢胞腔が顕著である。H & E染色及びGFPの上皮細胞特異的IR（データは示されていない）並びにKi67及びp63 IR（図7O、図7P）で観察されるように、毛包原基、芽及び初期の栓(peg)段階がこれらの構造体から伸長する。毛包原基外胚葉及びそれに続く上皮マトリックス細胞で発現することが判明しているMsx-2（Reginelli et al 1995；Ma et al 2003）、及びベルシカン（乳頭マーカー（du Cros et al 1995））が出芽中の毛包に向かって偏心的に発現され（図7Q、図7T）、ここでは、GATA3-IR（内毛根鞘マーカー（Kaufman et al 2003））がこの時期に最初に観察される（図7R）。さらにまた、Oct4 IR（多能胚性幹細胞マーカー（Nichols et al 1998））は、形成中の皮脂腺の近傍に存在する出芽中の毛包マトリックス内のいくつかの細胞に限定される（図7S）。
【００１０】
H & E（図7U）並びに上皮特異的GFP IR（図7V）及び毛乳頭特異的アルカリ性ホスファターゼの発現によって示されるように、明瞭な毛乳頭を有するいっそう成熟した毛包が6日目に観察される（図7W）。初期毛包のメラノサイトの色素沈着がこの時期に観察される。
8日には、嚢胞の漏斗状構造から成長した十分に成熟した毛包が存在する（図７X）。皮脂腺がこの時期までに発達し、Oct4 IRを示す。CD34 IRが、皮脂腺に囲まれた細胞内に発現される（前記細胞はバルジ起源の細胞から生じ得る（Trempus et al 2003））。形態発生の最初の1週間に、全ての毛包が1つの発生形態を示すとは限らず、一連の形態が存在するということは注目に値する。例えば、Pausら（1999）の分類系にしたがえば、8日目にはIV、V及びVI期の毛包が存在していた。いくつかの毛包構造体には皮脂腺の形成が観察されるが、毛幹の形成は認められなかった。
【００１１】
本明細書に記載した系は、単離上皮細胞及び間葉細胞の組合せによる新規な毛包器官の迅速な形成を示している。提示した器官形成パターンは、図8に示したように形態学的連続事象を提唱している。もっとも初期の相では、ムチン細胞が極めて豊富な真皮支質内に上皮細胞の集合及び個々の集合体の融合が存在する。この相の後に、前記クラスターのアポトーシスによるリモデリング（形成性アポトーシス又はChangら（2004）のモデル1A）が続き、毛包の漏斗部と非常に類似する上皮性構造体（“漏斗状嚢胞”）が形成される。毛包の成長過程で、これらの嚢胞構造体は融合してますます大きな嚢胞を形成する。最初期嚢胞が非対称であるという証拠は、分割細胞の偏心的配置（Ki67）、初期毛乳頭の位置（ベルシカン、アルカリホスファターゼ、CD44）及び原基マーカーの分布（EDAR、p63）からもたらされる。4日までに、毛包原基細胞が“漏斗状嚢胞”の周縁から成長し、初期芽を形成し続いて栓構造体を形成する（Paus et al 1999）。完全に成熟し、十分に分化した新しい毛包及び毛幹は組織学的には6〜8日以内に観察され、裸眼では14日以内に認められる。
【００１２】
この実験の重要な観察の1つは、新規な毛包形成の最初期相における上皮性プラットフォームの役割である。多くの他の発生期の上皮-間葉相互反応系では、最初の形態発生事象は上皮性プラットフォームと不可分である。この上皮性プラットフォームは生物学では多くの相同器官を有する。すなわち、形成時の肢芽における外胚葉頂堤（Gilbert 2000）、再生肢における創傷上皮（Tsonis 1996）、歯芽の上皮凝縮（Arias ＆ Stewart 2002）並びに羽及び毛包の原基（Widelitz and Chuong 1999）である。新規な毛包の分離細胞からの形成では、上皮細胞は迅速にクラスターを形成し、続いてそれら自身をリモデリングして、その原基を有する原始表皮、及びその漏斗部を有する先端毛包を連想させる構造体を生じる。新生児マウス及び成体マウスでそれぞれ新規な毛包形成を支持するのはこれら両構造体である。この“漏斗状嚢胞”の形成後、間葉凝縮による極の配置及び周期を有する上皮細胞は早期に認識可能な毛包原基をもたらし、これらの部位から、毛包原基、毛包芽及び栓子形態が生じる。完全に成熟した毛包は、in situの成熟毛包の全ての要素（正常な外観の皮脂腺を含む）を有し、のみならず前記成熟毛包はその固有の段階及び周期性をもつ周期を示す。この系の限界は、毛包の成長がこの環境では有限であるということである。毛幹及びケラチン性生成物を廃棄する手段がないので、最終的には毛包の排除を伴う、炎症物質、外来物質及び線維芽細胞性要素が前記環境に充満する。
【００１３】
上記に考察したように、分離細胞から毛包を形成させるための他の系が記載されてきたが、いずれも、時間、細胞及び動物の使用方法に関して有効ではない。本発明者らは、この“ヘアパッチ”系ではいかに迅速に毛包形成が発生するかに驚かされた。形態発生実験（図7）で観察されるように、毛幹形成を示す成熟毛包は8日以内に発生する。この形成速度は新生児マウスのin vivoの状態に極めて近い（Paus et al 1999）。移植された毛包からの新規な毛幹の形成には約45〜70日が要求される（Hashimoto et al 1996）ということは興味深い。したがって、組織化された構造から出発することは、分離細胞から新規な毛包を形成するよりも直感に反するがより長い時間を要する。後者の事例では、移植された無傷の原基毛包は明らかに退縮過程を経て、続いてその周期性部分を再形成しなければならない（Hashimoto et al 1996）。
本発明者らは、上皮成分対真皮成分の割合および送達するべき細胞数を最適化する実験を実施したが、本発明者らは未だ単一毛包を生成するための最小数を確立することができなかった。本発明者らは、100万の毛形成細胞（真皮対表皮細胞の割合は100：1）の配置が約200の毛包をもたらすであろうということを慣例的に見出した。これは、新規に形成される毛包1つ当たり概算で5000細胞に変換される。広範囲のアポトーシスを生じるリモデリングが新生毛包形成の初期相で存在するという事実を考慮し、さらに全ての細胞が毛形成能力を付与されているわけではないという事実が与えられているとすれば、実際には、はるかに少ない細胞が毛包の生成に寄与していると考えられる。
【００１４】
本発明者らは、このアッセイの成功は小間隙への毛形成細胞の配置に左右されることを見出した。真皮/皮下組織が機能するようである。なぜならば前記組織は通常は隙間が多いわけではなく、相互作用する上皮細胞及び真皮細胞のために密な環境を提供するからである。他方、細胞が皮下の筋膜面に置かれた場合、存在するとしても極めてわずかな毛包しか生じなかった。本発明者らは、この発見を、形態形成性をもつ毛形成細胞は緊密な接触の中に維持される必要があることを示唆していると解釈する。しかしながら、本発明者らは真皮それ自体が固有の環境を提供している可能性を排除していない。この拘束的間隙が要求されることの利点は、8つものアッセイを各マウスで実施することができ、動物の使用及びケージの必要性を減らすことができる。
分離された毛形成細胞は迅速に毛包を再形成し、前記新規に形成された毛包の周期は、正確に一致しないとしても、二次的毛包に極めて近い周期を有することは驚くべきことであり、さらに予想外であった。発毛サイクル現象は毛包の構造に固有であるように思われる。換言すれば、毛包が形成される場合、それは周期を有するであろう。この周期性の特徴は毛包構造それ自体に固有であるように見える。偶然観察した、再形成された毛包の形成及び周期は宿主の毛包周期とは別個に生じるという発見は、興味深い。初期の実験は、完全な皮膚器官は周期の各相で影響を受け変化することが示されたので（Chase et al 1953；Hnasen et al 1984）、休止期の皮膚が発育相の毛包の成長を支持することができるか否かは明らかではなかった。実際に、休止期の真皮が発育相の成長を阻害する物質を産生するならば、前記阻害物質は、パッチ反応で細胞に到達するような十分に遠い距離を拡散することはできない（Paus et al 1990）（Gurdon 1989）。
【００１５】
形成された毛包の形態は一般的には完全な毛包であるが、しかしながらいずれの時期においても観察される毛包形態には変形が存在し得る。この変形は、周期相、毛包が成長する漏斗状嚢胞のプラットフォームのサイズ、及び毛包それ自体のサイズの変型で明白であろう。パッチアッセイの低倍率顕微鏡像によって示されたように（図1B参照）、新規に形成された毛包の方向は、毛球（すなわち、毛包の基部端）に反して辺縁に向かって位置する。この発見は詳細には分析されなかったが、前記観察は、毛包基底は、高度に代謝性であり分裂している末端をより有利な環境に向かわせる固有の要求（例えば、血液の供給）をもつ可能性を示唆している。上記に記載したように、パッチアッセイは突出した宿主血管上に存在する。他の上皮-間葉細胞相互作用系は、進展するために新規な血管の形成を必要とすることは特記されるべきであり（Schwarz et al 2004）、毛包と血管形成作用が結びついていることを認識するのは、おそらくはこの状況では正しい（Stenn and Paus 2001）。これらの調製物の毛包集団は休止期に達するが、最初の周期の終わりに、全ての毛包が典型的な休止期の形態を獲得するわけではない。非常に長い下方(inferior)部分をもつ休止期形態が存在する（図3D参照）。本発明者らは完全にはこの異常な休止期形態の意味を理解しているわけではないが、後者の異常な形態はアセビア（asebia）マウスで観察される休止期形態（Sundberg et al 2000）と非常に類似するので、そのような形態は、毛幹の排除が困難なときに生じるのかもしれない。
我々が気付いた興味深い観察は、4〜8日目のマトリックス細胞及び出芽中の毛包の皮脂腺におけるOct4のIRであった。Oct4発現は、ブタの皮膚に由来する推定的幹細胞において最近観察されたが（Dyce et al 2004）、我々の知るかぎりでは、これが毛包、特に皮脂腺及びその原基におけるOct4発現の最初の報告である。Oct4は胚形成のために重要であるが、成体の生殖細胞でのみ発現されることが知られていた（Nichols et al 1998；Scholer et al 1989）。
要約すれば、毛形成細胞のためのアッセイとして、並びに分離細胞からの新規な器官形成の形態学的メカニズム及び分子メカニズムの研究のためのモデルとして機能し得る系を開示した。この系を用いて、本発明者らは、プロセスの非常に初期に分離された細胞は、毛の原基を形成するための足場を設置するために、アポトーシスによって形成される上皮性プラットフォームを構築し、最終的には成熟した周期性の毛包脂腺構造体を生じることを見出した。
“ヘアパッチ”アッセイという用語は、本明細書では新しい毛包形成の形態学的及び分子パターンを表すために用いられる。このアッセイは、もし存在するとすれば、新しい毛包形成に対する、増殖因子の作用、細胞タイプ、骨組み、骨組みの材料、医薬又は他の内部もしくは外部の影響の容易で迅速な決定を提供する。本研究はまた、本明細書に示した新しい器官の形成における上皮のプラットフォームとしての役割を毛包新生によって強調する。
【実施例】
【００１６】
新生児マウスの毛包前駆細胞の調製
マウスを以下のどちらかから購入した：Charles River（Wilmington, MA）、妊娠C57Bl/6マウス；又はJackson Laboratories（Bar Harbor, ME）、緑色蛍光タンパク質（GFP）マウス（FVB.Cg-Tg(GFPU)5Nagy/J）。細胞の調製はProutyら（1996）の方法の応用に従った。簡単に記せば、マウスは、USP（University of the Science in Philadelphia）の動物施設で、12時間の昼夜周期で、動物用固形飼料（Purina Rodent Lab Diet #5001）及び随時給水で飼育した。USPのIACUC承認プロトコルにしたがい、躯幹の皮膚を新生児マウスから取り出し、Ca++及びMg++を含まないPBSで水洗した。ジスパーゼ（Dispase、2.5mg/mL）（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含むPBSに4℃で一晩、続いて37℃で2時間前記皮膚を平らに静置した。続いて、誘導用真皮細胞及び表皮集合体を以前に記載されたように単離した（Weinberg et al. 1993；Lichti et al 1993；Prouty et al 1996）。細胞は同じ日に使用するか、又は将来の使用に向けて−80℃で冷凍保存した（表皮細胞はシンスアフリーズ（Synth-a-Freez(商標)、Cryopreservation Medium, Cascade Biologics）中で凍結し、真皮細胞は培養液A（5%DMSO及び10%ウシ血清を含む（Prouty et al 1996））中で凍結した）。
【００１７】
パッチアッセイにける毛包形成のためのレシピエントマウス及び細胞のデリバリー
毛形成細胞は、7〜9週齢のオスのヌードマウス（nu/nu）（Charles River, Wilmington, MA）でアッセイした。USPのIACUC承認プロトコルにしたがい、マウスを麻酔した（ケタミン、100mg/kg（Fort Dodge Animal Health, Iowa、キシラジン、10mg/kg（Phoenix Scientific Inc., St. Joseph, MO））。各皮内注射については別に記載がなければ、1ｘ106の真皮細胞及び10,000の表皮集合体を再懸濁し（50〜70μLのDMEM-F12培養液（Invitrogen,Carlsbad, CA））、マウスの皮膚の皮下組織に注射し（25ゲージ注射針）、ブレブ(bleb)を形成させた。注射部位は黒色の刺青穿刺（242パーマネントブラックピグメント；Aims, Hornell, NY）によって印を付けた。与えられたパッチアッセイで形成された毛包の数は顕微鏡写真判定及び形態測定によって定量した。毛包のカウントは3人の別々の観察者によって実施した。
【００１８】
毛包の成長
本発明者らは、以下の3つのアプローチを用いて、パッチアッセイ内に生じた毛幹が皮膚表面から伸び出ることができるか、及び形態学的に正常であるか否かを調べた。１）第一に、12日又はそれ以後のパッチアッセイの再生毛包及び周囲組織を切り出し、前記パッチを小フラグメントに切った。各フラグメントは毛包のクラスターを含んでいた。18Gの注射針を用い、別のヌードマウスの皮膚にいくつかの溝を形成し、PBSに浮遊させたパッチアッセイフラグメントを前記溝に挿入した。２）第二の方法では、ハサミを用い、成熟パッチアッセイ（12日目）の上層の皮膚に浅い傷を形成した。続いて前記傷を粘着包帯で2日間覆い、その後包帯を取り除いた。３）第三の方法では、ポリウレタンの血管内用チューブ（Instech Solomon, Part No.: BPU-T20、直径は2〜3フレンチ）の断片を、パッチアッセイの上の皮膚からパッチアッセイ部位内へ挿入しさらに皮膚の外へ縫うように出した（チューブの挿入は注射後2日目、チューブの除去は注射後4〜5日目）。毛幹の伸長の存在は毎日記録した。
【００１９】
組織学及び免疫組織化学
マウスの皮膚を採集し、10%ホルマリンで一晩固定した。パラフィン包埋後、組織をH&E染色組織検査のために処理した（Presnell et al 1997）。免疫組織化学検査については、抗原の回収のために、一次抗体とともにインキュベートする前に、10mM酢酸ナトリウム（pH6.0）中で脱ロウ切片を98℃で10〜15分処理した。以下の一次抗体を表示の希釈又は濃度で用いた：GFP（Novus Biologicals, Littleton, CO, 1:200）；Ki67（BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, 1:10）；p63（BD Bioscien ces Pharmingen, San Diego, CA, 4μg/mL）；CD44（Chemicon, Temecula, CA, 15μg/mL）；CD34（MEC14.7, Novus Biologicals, Littleton, CO, 1:10）；Pan-Cytokeratin-type II、CK-11（Chemicon, Temecula, CA, 1：200）；ベルシカン（Chemicon, Temecula, CA, 10μg/mL）；Msx2（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, 1:50）；Oct4（Chemicon, Temecula, CA, 20μg/mL）；GATA3（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, 1:50）。ビメンチン（Chemicon Intl. 5μg/mL）。抗EDARの場合を除いて、ホルマリン固定パラフィン包埋切片を全ての免疫組織化学検査のために用いた。抗EDARの場合は、−20℃2分のアセトン固定後の凍結切片を用いた。一次抗体は、ビオチン化二次抗体、続いてストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体及びアミノエチルカルバゾール（AEC）色素原（Histostain-SP Kit, Zymed Laboratories, San Francisco, CA）とのインキュベーションによって検出した。
【００２０】
アルカリホスファターゼ及びアポトーシス染色
ティシュ-テック（Tissue-Tek）O.C.T.化合物（Electron Microscopy Sciences, Ft. Washington, PA）中の組織をドライアイスで凍結し、4μmの凍結切片を4%パラホルムアルデヒド/PBSで20分固定し、PBSで洗浄し、さらにアルカリホスファターゼ（Histostain SAP Kit、Zymed Laboratories, San Francisco, CA）に対して通常用いられる展開溶液中で15分インキュベートした。ホルマリン固定及びパラフィン包埋切片を、アポトーシス検出キット（Derma TACS In-situ Apotosis Detection Kit；Trevigen, Gaithersburg, MD）を用い、製造元の指示にしたがってTUNEL染色のために処理した。
【００２１】
（参考文献）
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【００２２】
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【００２３】
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【００２４】
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【００２５】
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【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】分離表皮細胞及び真皮細胞の皮内注射後の毛包新生；（A）レシピエントの皮膚に注射する前の新生児マウスの分離真皮細胞及び上皮芽又は上皮集合体の位相差顕微鏡像を示す。（B）切り分けた皮膚の腹側から見たパッチ皮膚を示す。右の差込み図はヌードマウスの後方背側の皮膚を示し、2週間後に裸眼で見ることができる円形の黒い盛り上がったパッチ（矢印）を示す。左の差込み図は、切り分けた後の腹側から見た全パッチの低倍率像を示す。スケールバーは1mmである。（C、D）へアパッチ領域の組織像を示す。（C）は、マウスの背側皮膚の典型的な毛幹を含む“漏斗状嚢胞”を示す水平方向の切片である。（D）は宿主の皮膚におけるパッチ毛の位置を示す垂直方向の切片である。PC：皮筋層；Epi：宿主皮膚真皮
【図２】分離した表皮細胞単独又は真皮細胞単独の皮内注射は毛包新生を示さない；注射した細胞は表皮芽単独（A及びB）又は分離真皮細胞単独（C及びD）から成っていた。皮膚の腹側から見た（A及びC）、又はH&E染色組織検査による（B及びD）レシピエントのヌードマウスの皮膚の拡大写真を示す。
【図３】パッチアッセイにおける毛包の周期性の証拠；皮膚の腹側から見たレシピエントのヌードマウスの皮膚のパッチアッセイの顕微鏡写真を示し、（A）は13日目で毛包は発育相（アナゲン）にあり、又（C）は21日目で毛包は休止相（テロゲン）にある。それぞれの組織像が（B）及び（D）に示される。
【図４】パッチの毛包形成/周期及びレシピエント宿主皮膚の毛包周期の非依存性；ヘアパッチ領域内のヌードマウスの皮膚はアナゲンの毛包を示し、一方、ヌードマウスの宿主領域はテロゲン期の毛包を示す（H&E染色組織）。
【図５】生成される毛形成に対する細胞数及び上皮/真皮比の影響；（A）生成される毛包数に対する注射される総細胞数の影響を示す。棒グラフは、ヌードマウスの皮内に注射された真皮細胞の数に対してパッチアッセイで形成された毛包数を示す（表皮対真皮細胞の比は全ての事例で1：100）。（B）生成される毛包の数に対する表皮対真皮比の影響を示す。棒グラフは、真皮細胞数対表皮集合体数の比の変化に対してパッチアッセイで形成された毛包数を示す。真皮細胞の数は各注射について100万に固定された。棒線は4サンプルのS.D.を表す。
【図６】毛幹の表面からの突出；（A）他の部位に移植されたパッチの毛包の影響を示す。写真は移植後2週間で撮影された（本文の方法の項参照）。（B）パッチを覆う表面の皮膚への創傷形成の影響示す。写真は創傷形成後2週間で撮影された。（C）パッチへのチューブの挿入の影響を示す。写真は最初の注射後21日目に撮影された。
【図７】パッチアッセイの1日目〜8日目の毛包の形態発生及び免疫組織化学；1日目：（A）丸々とした再生芽様細胞の支質内の小さく密に詰まった、個々に分離した上皮細胞クラスター（矢印）を示す、注射部位の組織像を示す。（B）上皮系列の細胞クラスターを示す、GFP標識上皮細胞及び野生型真皮細胞を用いたパッチアッセイを示す。（C）クラスターを節約し単一細胞間での反応性（矢印）を示すTUNEL染色を示す。2日目：（D）支質のビメンチン染色を示すパッチアッセイ；（E）優勢な上皮クラスターを示す肉様相の直ぐ下のレベルにある発達したパッチ；（F）クラスターはムチン(Mucin)の豊富な支質に存在する（コロイドイオン染色）；（G）巣状のアポトーシス細胞壊死を示す、高倍率の上皮クラスター（矢印）；（H）いくらかの偏心性細胞増殖を示す中心ケラチン化を示すクラスターの顕微鏡像；（I）EDARの偏心的発現（矢印）；（J）分裂細胞の偏心的配置（矢印）；（K）p63の辺縁的発現；（L）中心のケラチン化；（M）CD44の偏心的発現（矢印）；及び（N）アルカリ性ホスファターゼを発現する毛乳頭前駆細胞の偏心的配置。4日目：（O）クラスター内の分裂細胞の偏心的配置（矢印）；（P）p63を発現する外側細胞を示す初期毛包芽様構造体；（Q）クラスターの辺縁（矢印）及び周囲の支質におけるMSX-2発現；（R）内毛根鞘のマーカーであるGATA3の最初の発現（矢印）。（S）皮脂腺増殖領域のOct4染色（矢印）；（T）初期毛乳頭における偏心的ベルシカン染色（矢印）。6日目：（U）出っ張った毛包形をもつ漏斗状嚢胞の拡張（矢印）。（V）GFP標識上皮細胞系列実験では、毛乳頭（矢印）はこの時期には輪郭は明瞭である。（W）毛乳頭の輪郭はまたアルカリホスファターゼ発現（矢印）によっても示される。8日目：（X）この時期には完全に形成された成熟毛包が存在する。差込み図は、皮脂腺のOct4染色及び皮脂腺基底層細胞のCD34染色を示す。
【図８】分離した毛形成細胞の毛包新生の提唱されるメカニズム；分離細胞（A）から出発して新規な毛包形成の明瞭な工程が描かれている。注射後非常に早くに同種タイプの上皮細胞クラスターが存在し（B）、続いて顕著なアポトーシス細胞の脱落（灰色の細胞）がクラスター内で生じ（C）、“漏斗状嚢胞”が形成される（D）。種々の極の“漏斗状嚢胞”から成長しながら、上皮細胞は毛包芽、栓子、最終的には成熟毛包を形成する（F）。最後には、周期をくり返した毛包は異物反応及び瘢痕を残して破壊される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図７】
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【図７】
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【図７】
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【図７】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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