(57)【要約】本発明は、in vivoで哺乳類細胞上のＯｖｒ１１０に結合すると内部移行する、単離された、抗−卵巣癌抗原、膵臓癌抗原、肺癌抗原または乳癌抗原（Ｏｖｒ１１０）抗体を提供する。本発明はまた、抗Ｏｖｒ１１０抗体と担体を含む組成物を包含する。これらの組成物は、製造品またはキット中に提供することも可能である。本発明の他の観点は、抗Ｏｖｒ１１０抗体をコードする単離核酸、および該単離核酸を含む発現ベクターである。さらに提供されるのは、抗Ｏｖｒ１１０抗体を産生する細胞である。本発明は、抗Ｏｖｒ１１０抗体を産生する方法を包含する。本発明の他の観点は、癌細胞を抗Ｏｖｒ１１０抗体と接触させることを含む、Ｏｖｒ１１０発現癌細胞を死滅させる方法、および、治療的に有効量の抗Ｏｖｒ１１０抗体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるＯｖｒ１１０発現癌を寛解または処置する方法である。
2008519841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞上のＯｖｒ１１０に結合する、単離されたＯｖｒ１１０抗体。
【請求項２】
哺乳類細胞上のＯｖｒ１１０に結合すると内部移行する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
抗体断片である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、配列番号２７、３２、３４および３５からなる群から選択されるＯｖｒ１１０ペプチドに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
Ｏｖｒ１１０ペプチドが翻訳後修飾を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
翻訳後修飾がリン酸化である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
抗体が、配列番号４４〜４７からなるエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される、請求項３に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体により結合されるエピトープと同一のエピトープへの結合に対して競合する、請求項３に記載の抗体。
【請求項１２】
増殖阻害剤に結合している、請求項３に記載の抗体。
【請求項１３】
細胞毒性剤に結合している、請求項３に記載の抗体。
【請求項１４】
細胞毒性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位体および核酸分解酵素からなる群から選択される、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
細胞毒性剤が、毒素である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
毒素が、リシン、サポニン、メイタンシノイドおよびカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
毒素が、メイタンシノイドである、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
哺乳類細胞が、癌細胞である、請求項３に記載の抗体。
【請求項１９】
Ｏｖｒ１１０発現細胞を選択的に結合する、抗Ｏｖｒ１１０モノクローナル抗体。
【請求項２０】
in vivoでＯｖｒ１１０発現癌細胞の増殖を阻害する、抗Ｏｖｒ１１０モノクローナル抗体。
【請求項２１】
ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
細菌中で産生される、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
ＡＴＣＣ受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗Ｏｖｒ１１０抗体のヒト化形態である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２４】
癌細胞が、卵巣癌、膵臓癌、肺癌および乳癌からなる群から選択される癌からのものである、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２５】
癌が、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌である、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
請求項３に記載の抗体を産生する、細胞。
【請求項２７】
細胞が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129の下で寄託されるハイブリドーマ細胞からなる群から選択される、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
適切な細胞を培養し、抗体を該細胞培養物から回収することを含む、請求項３に記載の抗体を産生する方法。
【請求項２９】
請求項３または１９に記載の抗体、および担体を含む、組成物。
【請求項３０】
抗体が、細胞毒性剤に結合している、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
細胞毒性剤が、メイタンシノイドである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
抗体が、ヒト抗体またはヒト化抗体であり、担体が、薬学的担体である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３３】
ヒト化抗体が、ＡＴＣＣ受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗Ｏｖｒ１１０抗体のヒト化形態である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
Ｏｖｒ１１０発現癌細胞を死滅させる方法であって、該癌細胞を、請求項１または２に記載の抗体と接触させ、これにより該癌細胞を死滅させることを含む、前記方法。
【請求項３５】
癌細胞が、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞および乳癌細胞からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
癌細胞が、卵巣癌細胞または乳癌細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
卵巣癌または乳癌が、卵巣漿液性腺癌または乳房浸潤性乳管癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
癌細胞が、転移性の卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌からのものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
抗体が、抗体断片である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
抗体が、ヒト化抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
抗体が、細胞毒性剤に結合している、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
細胞毒性剤が、メイタンシノイド、リシン、サポリンおよびカリケアマイシンからなる群から選択される毒素である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
抗体が、ＡＴＣＣ受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗体のヒト化形態である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
細胞毒性剤が、放射性同位体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
哺乳類におけるＯｖｒ１１０発現癌を寛解する方法であって、請求項１９に記載の抗体の治療的に有効な量を、該哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項４６】
癌が、卵巣癌、膵臓癌、肺癌および乳癌からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
卵巣癌または乳癌が、卵巣漿液性腺癌または乳房浸潤性乳管癌である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
抗体が、ヒト化抗体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
抗体が、細胞毒性剤に結合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
細胞毒性剤が、メイタンシノイドである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
抗体を、少なくとも１種の化学療法剤と組み合わせて投与する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
化学療法剤が、パクリタキセルまたはその誘導体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
容器およびその中に含まれた組成物を含む製造品であって、該組成物が、請求項３に記載の抗体を含む、前記製造品。
【請求項５４】
組成物が卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を処置するために使用可能であることを示す添付文書をさらに含む、請求項５３に記載の製造品。
【請求項５５】
試料中の細胞がＯｖｒ１１０を発現するか否かを決定する方法であって、
（ａ）細胞の試料を、請求項３に記載のＯｖｒ１１０抗体と、Ｏｖｒ１１０抗体のＯｖｒ１１０への特異的な結合に適する条件の下で接触させること、および
（ｂ）該抗体の前記試料中の細胞への結合のレベル、または前記試料中の細胞によるＯｖｒ１１０抗体の内部移行のレベルを、決定すること、
を含み、ここで、前記試料中の細胞に結合するＯｖｒ１１０抗体、または前記試料中の細胞によるＯｖｒ１１０抗体の内部移行が、前記試料中の細胞がＯｖｒ１１０を発現することを示す、前記方法。
【請求項５６】
細胞の試料を、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗体と接触させる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
細胞の試料が、癌を有するか、癌を有することが疑われるか、または癌を発生する素因を有し得る対象からのものである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
癌が、乳癌、結腸癌または卵巣癌である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
抗体が、標識抗体である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
試験細胞試料中でのＯｖｒ１１０過剰発現を検出するための方法であって：
（ａ）Ｏｖｒ１１０の、試験試料中の細胞により発現されたＯｖｒ１１０への特異的な結合に適する条件の下で、前記試験細胞試料を請求項３に記載のＯｖｒ１１０抗体と混ぜ合わせること、
（ｂ）該Ｏｖｒ１１０抗体の前記試験試料中の細胞への結合のレベルを決定すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）において細胞に結合したＯｖｒ１１０抗体のレベルを、対照の細胞試料中の細胞に結合するＯｖｒ１１０抗体のレベルと比較すること、
を含み、ここで、対照と比較した前記試験細胞試料中のＯｖｒ１１０抗体の結合の増加が、前記試験細胞試料中の細胞によるＯｖｒ１１０過剰発現を示す、前記方法。
【請求項６１】
試験細胞試料が、癌細胞試料である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
癌細胞試料が、乳癌または卵巣癌のものである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
卵巣癌が卵巣漿液性腺癌であり、乳癌が乳房浸潤性乳管癌または転移癌である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
対照が、隣接する正常組織の試料である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
Ｏｖｒ１１０過剰発現を、その検出を必要としている対象において検出する方法であって、
（ａ）対象の血清試料を、請求項３に記載のＯｖｒ１１０抗体と、Ｏｖｒ１１０抗体の、前記血清試料中のＯｖｒ１１０への特異的な結合に適する条件の下で混ぜ合わせること、
（ｂ）前記血清試料中のＯｖｒ１１０のレベルを決定すること、
（ｃ）ステップｂにおいて決定したＯｖｒ１１０のレベルを、対照中のＯｖｒ１１０のレベルと比較すること、を含み、ここで、対照と比較した、対象からの前記血清試料中のＯｖｒ１１０のレベルの増大が、対象におけるＯｖｒ１１０過剰発現を示す、前記方法。
【請求項６６】
対象が、癌を有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
対象が、乳癌または卵巣癌を有する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
卵巣癌が卵巣漿液性腺癌であり、乳癌が乳房浸潤性乳管癌または転移癌である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
対照が、Ｏｖｒ１１０を過剰発現する癌を有さない対象からの血清試料である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
請求項３に記載の抗体により結合されたエピトープに結合する抗体のスクリーニング方法であって、
（ａ）Ｏｖｒ１１０含有試料を、試験抗体および請求項３に記載の抗体と混ぜ合わせて、混合物を形成すること、
（ｂ）前記混合物中のＯｖｒ１１０に結合したＯｖｒ１１０抗体のレベルを決定すること、および
（ｃ）ステップ（ａ）の混合物中で結合したＯｖｒ１１０抗体のレベルを、対照混合物と比較すること、
を含み、ここで、対照と比較した、前記混合物中のＯｖｒ１１０に結合するＯｖｒ１１０抗体のレベルが、請求項３に記載の抗Ｏｖｒ１１０抗体により結合されたエピトープへの試験抗体の結合の指標である、前記スクリーニング方法。
【請求項７１】
Ｏｖｒ１１０に結合するＯｖｒ１１０抗体のレベルを、ＥＬＩＳＡにより決定する、請求項７０に記載のスクリーニング方法。
【請求項７２】
対照が、Ｏｖｒ１１０、請求項３に記載のＯｖｒ１１０抗体および、請求項３に記載のＯｖｒ１１０抗体により結合されるエピトープに結合することが知られている抗体の混合物である、請求項７０に記載のスクリーニング方法。
【請求項７３】
抗Ｏｖｒ１１０抗体が標識されている、請求項７０に記載のスクリーニング方法。
【請求項７４】
Ｏｖｒ１１０が固体支持体に結合された、請求項７３に記載のスクリーニング方法。
【請求項７５】
固体支持体がセファロースビーズである、請求項７４に記載のスクリーニング方法。
【請求項７６】
負のシグナリング免疫細胞Ｏｖｒ１１０受容体のシグナリングを、Ｏｖｒ１１０を請求項６に記載の抗体に結合させることにより調節し、これにより、抑制された免疫機能を、低減させる方法。
【請求項７７】
哺乳類におけるＯｖｒ１１０発現自己免疫疾患を寛解させる方法であって、請求項６に記載の抗体の治療的有効量を、該哺乳類に投与することを含む、前記方法。
【請求項７８】
自己免疫疾患が、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性神経障害例えばギランバレー、自己免疫性ブドウ膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎例えばヴェーゲナー肉芽腫症、ベーチェット病、乾癬、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、Ｉ型もしくは免疫介在性糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、副腎の自己免疫疾患、関節リューマチ、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症例えば強直性脊椎炎、およびシェーグレン症候群からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この特許出願は、２００４年１１月１０日出願の米国仮特許出願第60/626,817号からの優先権の利益を請求し、これの教示をその全体において、参照として本明細書中に組入れる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、抗Ｏｖｒ１１０抗体組成物および、Ｏｖｒ１１０を発現する卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞または乳癌細胞を死滅させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
卵巣癌
卵巣の癌は、米国における女性の癌死亡の４番目に一般的な原因であり、２３，０００件を超える新たな症例および約１４，０００人の死亡が２００１年について予測される。Shridhar, V. et al., Cancer Res. 61(15): 5895-904 (2001); Memarzadeh, S. & Berek, J. S., J. Reprod. Med. 46(7): 621-29 (2001)。米国癌学会（ＡＣＳ）は２００４年において、約２５，５８０件の新たな卵巣癌の症例と、卵巣癌が米国において約１６，０９０人の死亡の原因となるであろうことを予測している。ＡＣＳウェブサイト：cancer with the extension .org of the world wide web。年間の女性の死亡数は、卵巣癌による死亡数の方が、その他の婦人科悪性腫瘍を全て合わせた死亡数より多い。米国における卵巣癌の発生率は、1年間に女性１００，０００人当たり１４．２件と推定され、卵巣癌によって毎年１００，０００人当たり９人の女性が死亡する。２００４年には、新たな診断のうち約７０〜７５％が、推定５年生存率が約１５％であるステージＩＩＩおよびＩＶの癌腫であろう。Jemal et al., Annual Report to the Nation on the Status of Cancer, 1975-2001, with a Special Feature Regarding Survival. Cancer 2004; 101: 3-27。卵巣癌の発生率は世界的に重大な関心事であり、毎年１９１，０００件と概算される新たな症例が予測される。Runnebaum, I. B. & Stickeler, E., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127(2): 73-79 (2001)。不都合なことに、卵巣癌を有する女性は通常、疾患が転移するまで無症候性である。卵巣癌についての有効なスクリーニングが利用可能ではないため、診断された女性の約７０％が、５年生存率が約２５〜３０％である進行したステージの癌を有する。Memarzadeh, S. & Berek, J. S.、上記；Nunns, D. et al., Obstet. Gynecol. Surv. 55(12): 746-51。逆に、初期のステージの卵巣癌を有すると診断された女性は、顕著により高い生存率を享受している。Werness, B. A. & Eltabbakh, G. H., Int'l. J. Gynecol. Pathol. 20(1): 48-63 (2001)。本発明者らによる卵巣癌の病因論の理解は不完全であるが、この領域における大規模な研究の結果は、年齢、遺伝的特徴、生殖的および食事性／環境的要因の組み合わせを指摘している。年齢は、卵巣癌の発生における重要な危険因子である：３０歳前に卵巣癌を発生するリスクは低い一方で、卵巣癌の発生率は、３０〜５０歳の間に直線的に上昇し、その後より遅い速度で上昇し、最高の発生率は、７０歳代の女性である。Jeanne M. Schilder et al., Heriditary Ovarian Cancer: Clinical Syndromes and Management, in Ovarian Cancer 182 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)。
【０００４】
遺伝的要因に関して、卵巣癌の家族履歴は、当該疾患の発生における最も重要な危険因子であり、当該リスクは、罹患した家族の数、該家族の該女性に対する親等に依存し、特に第１度近親者は当該疾患により影響される。同上。いくつかの遺伝子における突然変異が卵巣癌に関連しており、これには、両者共に乳癌の発生において重要な作用を奏しているＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２、並びに両者共に遺伝性非ポリープ症結腸癌と関連しているｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１が含まれる。Katherine Y. Look, Epidemiology, Etiology, and Screening of Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer 169, 171-73 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)。染色体１７上に位置するＢＲＣＡ１および染色体１３上に位置するＢＲＣＡ２は、ＤＮＡ修復に関係する腫瘍抑制遺伝子であり；これらの遺伝子における突然変異は、卵巣癌の約１０％と関連する。同上の171-72; Schilder et al.、上記の185-186。ｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１は、ＤＮＡミスマッチ修復に関連し、それぞれ染色体２および３上に位置する；遺伝性卵巣癌腫の約３％は、これらの遺伝子における突然変異のためであると報告されている。Look,上記の173；Schilder et al.,上記の184, 188-89。
【０００５】
生殖的要因もまた、卵巣癌のリスクの増加または低下と関連している。遅い閉経、未産婦および早い年齢の初経は、すべて、卵巣癌のリスクの上昇と関連している。Schilder et al.、上記の182。ある理論の仮説によれば、これらの因子により女性の一生における排卵サイクルの数が増大し、「絶え間のない排卵」がもたらされるとし、これは、卵巣上皮に対する突然変異の主要な原因であると考えられる。同上；Laura J. Havrilesky & Andrew Berchuck, Molecular Alterations in Sporadic Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer 25 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)。突然変異は、排卵の結果当該上皮の破壊および修復が生じ、細胞分裂の増加が必要となるという事実によって説明することができ、これにより、検出されない突然変異が生じる可能性が増加する。同上。この理論についての支持は、妊娠、授乳および経口避妊薬の使用はすべて排卵を抑制するが、これらは卵巣癌の発生に関する防御効果を付与するという事実において見出すことができる。同上。
【０００６】
食事性／環境的要因の中で、動物性脂肪または赤肉の多量の摂取と卵巣癌との間に、関連があると見られる一方、遊離基形成を防止し、また正常な細胞分化を維持するのを補助する酸化防止剤のビタミンＡは、防御効果を提供し得る。Look、上記の169。報告はまた、アスベストおよび含水三ケイ酸マグネシウム（タルク）に関連しており、この後者は、隔壁および生理用ナプキン中に存在し得る。同上の169-70。
【０００７】
卵巣癌についての現在のスクリーニング手順は一定の有用性を示す一方で、これらの診断的能力において極めて限定されており、疾患が典型的にまだ無症候性である、癌進行の初期ステージにおいて特に緊急である問題が、最も容易に対処される。Walter J. Burdette, Cancer: Etiology, Diagnosis, and Treatment 166 (1998); Memarzadeh & Berek、上記；Runnebaum & Stickeler、上記；Werness & Eltabbakh、上記。一般的に用いられているスクリーニング試験には、年２回の直腸膣内診、ＣＡ−１２５血清腫瘍マーカーを検出するためのラジオイムノアッセイおよび経膣的超音波検査が含まれる。Burdette、上記の166。現在、ＣＡ−１２５は、卵巣癌において用いられる唯一の臨床的に承認された血清マーカーである。ＣＡ−１２５は多くの漿液性癌において増加することが見出されているが、しかし、初期の疾患の女性においてはその半数のみで増加する。ＣＡ１２５の主要な臨床的応用は、卵巣癌の処置を受けた女性において、処置の成功のモニタリングまたは再発の検出である。Markman M. The Oncologist; 2: 6-9 (1997)。ＣＡ１２５のスクリーニング用マーカーとしての使用は限定されており、これは、子宮内膜症などの良性の疾患を有する女性においてもしばしば増加するからである。従って、それのみで用いても、あるいはＣＡ１２５と組み合わせて用いても、卵巣癌の検出により感度が高く特異的である、新規な血清マーカーの重大な必要性が存在する。Bast RC. Et al., Early Detection of Ovarian Cancer: Promise and Reality in Ovarian Cancer. Cancer Research and Treatment Vol 107 (Stack MS, Fishman, DA, eds., 2001)。
【０００８】
内診では初期の診断の適切な数が得られておらず、他の方法は十分正確ではない。同上。１つの研究により、卵巣癌を罹患している患者のわずか１５％が、当該患者の内診の時点において疾患を有すると診断されたことが報告された。Look、上記の174。さらに、ＣＡ−１２５試験は、閉経前の女性において偽陽性を示す傾向があり、閉経後の女性において予測的価値が低いことが報告された。同上の174-75。経膣的超音波検査は、現在では、卵巣癌をスクリーニングするための好ましい手順であるが、良性と悪性の腫瘍を高い信頼性で識別することはできず、また卵巣の大きさが正常である場合には、原発腹膜悪性腫瘍または卵巣癌を発見することができない。Schilder et al.、上記の194-95。ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１遺伝子の突然変異についての遺伝子診断は現在利用可能であるが、これらの試験は、一部の患者に対しては費用がかかりすぎることがあり、また偽陰性の、もしくは不確定な結果を生じ得る。Schilder et al.、上記の191-94。
【０００９】
さらに、現在の努力は、組み合わせて用いることができるバイオマーカーのパネルの識別に集中されている。Bast RC Jr., J Clin Oncol 2003; 21: 200-205。現在、卵巣癌の検出を改善するための複数マーカーパネルの１つとなり得る、潜在的卵巣血清マーカーとして評価されている他のマーカーは、ＨＥ４；メソセリン(mesothelin)；カリクレイン（Kallikrein）５、８、１０および１１；およびプロスタシンである。Urban et al. Ovarian cancer screening Hematol Oncol Clin North Am. 2003 Aug;17(4):989-1005; Hellstrom et al.。「ＨＥ４（ＷＦＤＣ２）タンパク質は卵巣癌腫についての生物マーカーである」[The HE4 (WFDC2) protein is a biomarker for ovarian carcinoma]、Cancer Res. 2003 Jul 1;63(13):3695-700; Ordonez, 「腫瘍診断におけるメソセリン免疫染色の適用」[Application of mesothelin immunostaining in tumor diagnosis]、Am J Surg Pathol. 2003 Nov;27(11):1418-28；Diamandis EP et al., Cancer Research 2002; 62: 295-300; Yousef GM et al., Cancer Research 2003; 63: 3958-3965; Kishi T et al., Cancer Research 2003; 63: 2771-2774; Luo LY et al., Cancer Research 2003; 63: 807-811; Mok SC et al., J Natl Cancer Inst 2001; 93(19): 1437-1439。
【００１０】
手術的探索による卵巣癌のステージ分類は、当該疾患の処置および管理のコースを決定するにあたり、重要である。AJCC Cancer Staging Handbook 187 (Irvin D. Fleming et al. eds., 5th ed.1998); Burdette、上記の170；Memarzadeh & Berek、上記；Shridhar et al.、上記。ステージ分類は、International Federation of Gynecology and Obstetricsにより開発された分類システムを参照して行われる。David H. Moore, Primary Surgical Management of Early Epithelial Ovarian Carcinoma, in Ovarian Cancer 203 (Stephen C. Rubin  & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)；Fleming et al. eds.、上記の188。ステージＩの卵巣癌は、卵巣に限定され、３つのサブステージからなる腫瘍増殖を特徴とする。同上。サブステージＩＡにおいて、腫瘍増殖は１つの卵巣に限定され、卵巣の外部表面上には腫瘍はなく、卵巣カプセルは無傷であり、悪性細胞は腹水または腹膜洗浄液中に存在しない。同上。サブステージＩＢは、腫瘍増殖が両方の卵巣に限定される以外は、Ａ１と同一である。同上。サブステージＩＣは、一方または両方の卵巣に限定される腫瘍増殖の存在を示し、また以下の特徴の１つまたは２つ以上を含む：カプセル破裂、一方または両方の卵巣の表面上での腫瘍増殖、および腹水または腹膜洗浄液中に存在する悪性細胞。同上。
【００１１】
ステージＩＩの卵巣癌は、一方または両方の卵巣を含む腫瘍増殖および骨盤への浸潤を意味する。同上。サブステージＩＩＡは、子宮および／またはファロピウス管への浸潤および／または播腫を含み、腹水または腹膜洗浄液中に悪性細胞を含まず、一方サブステージＩＩＢは、他の骨盤内器官および組織への浸潤を含み、再び、腹水または腹膜洗浄液中に悪性細胞を含まない。同上。サブステージＩＩＣは、ＩＩＡまたはＩＩＢと同様に骨盤への浸潤を含むが、腹水または腹膜洗浄液中に悪性細胞を含む。同上。
【００１２】
ステージＩＩＩの卵巣癌は、一方または両方の卵巣中に腫瘍増殖を含み、顕微鏡により確認される骨盤を越えての腹膜転移、および／または所属リンパ節における転移を有する。同上。サブステージＩＩＩＡは、骨盤外の顕微鏡的な腹膜転移により特徴付けられ、サブステージＩＩＩＢは、最大寸法で２ｃｍ以下の、骨盤外の肉眼で見える腹膜転移を含む。同上。サブステージＩＩＩＣは、転移が最大寸法において２ｃｍより大きく、所属リンパ節への転移を含み得る以外は、ＩＩＩＢと同一である。同上。最後に、ステージＩＶは、腹膜転移を除く遠隔転移の存在を示す。同上。
【００１３】
手術的ステージ分類が、現在の卵巣癌の管理および処置を評価するための基準である一方、これには顕著な欠点があり、これには、手順の侵襲性、合併症の可能性および不正確さについての可能性が含まれる。Moore、上記の206-208, 213。これらの制限の観点において、卵巣癌の種々のステージにおける異なる遺伝子発現を理解することにより、および当該疾患の進行を一層良好に評価するのを補助する種々の生物マーカーを得ることにより、代替のステージ分類方法を開発することに、注意が向けられた。Vartiainen, J. et al., Int'l J. Cancer, 95(5):  313-16 (2001); Shridhar et al. 上記；Baekelandt, M. et al., J. Clin. Oncol. 18(22): 3775-81。
【００１４】
卵巣癌の処置は、典型的には多面的な攻撃を含み、外科的介入は処置の基礎として作用する。Dennis S. Chi & William J. Hoskins, Primary Surgical Management of Advanced Epithelial Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer 241 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds, 2d ed. 2001)。例えば、卵巣癌の約９０％の症例にのぼる上皮性卵巣癌の場合において、処置は、典型的には、以下からなる：（１）腹式子宮全摘術、両側卵管卵巣摘除術、オメンテクトミー(omentectomy)およびリンパ節切除を含む、腫瘍縮小手術、続いて（２）パクリタキセル(paclitaxel)およびシスプラチン(cisplatin)またはカルボプラチン(carboplatin)のいずれかでのアジュバント化学療法。Eltabbakh, G.H. & Awtrey, C.S., Expert Op. Pharmacother. 2(10): 109-24。アジュバント療法への臨床反応率が８０％であるにもかかわらず、ほとんどの患者は、処置の３年以内に腫瘍の再発を経験している。同上。ある患者は、第２の腫瘍縮小手術および／または第二次化学療法を受ける場合もある。Memarzadeh & Berek、上記。
【００１５】
上記のことから、卵巣癌の再発を検出、診断、モニタリング、ステージ分類、予見および予防するために用いられる手順は、患者の予後に決定的に重要であることが明らかである。さらに現在の手順は、これらの分析の各々において有用である一方、これらの特異性、感度、侵襲性および／またはこれらの費用のために制限される。このように、最小の侵襲性を伴って、および合理的な費用において、細胞、組織または体液中の新規なマーカーを検出することにより作用する、高度に特異的で高感度の手順は、非常に望ましい。
従って、ある人が卵巣癌を発生しやすいかどうかを予測するため、卵巣癌の診断のため、疾患の進行のモニタリングのため、卵巣癌のステージ分類のため、卵巣癌が転移したかどうかを決定するため、および、卵巣癌の画像化のための、より感度が高く正確な方法に対する多大な必要性が存在する。卵巣癌のよりよい処置の必要性もまた存在する。
【００１６】
乳癌
乳腺腫瘍癌とも呼ばれる乳癌は、女性の間で２番目に一般的な癌であり、米国において診断された癌の３分の１を占める。９人に１人の女性は、当該女性の生涯において乳癌を発生し、年間約１９２，０００件の新たな乳癌の症例が診断され、死者は約４２，０００人である。Bevers, Primary Prevention of Breast Cancer, in Breast Cancer, 20-54 (Kelly K Hunt et al., ed., 2001)；Kochanek et al., 49 Nat'l. Vital Statistics Reports 1, 14 (2001)。乳癌は、２０歳未満の若い女性においては極度にまれであり、３０歳未満の女性においては非常にまれである。乳癌の発生率は年齢に伴って上昇し、５０歳の年齢までに顕著となる。ラテンアメリカ系ではない白人女性が乳癌について最も高い発生率を有し、韓国の女性は最も低い発生率を有する。乳癌および他の癌を促進する遺伝子的突然変異ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の有病率の増大は、アッシュケナージ系ユダヤ人(Ashkenazi Jews)において見出される。アフリカ系アメリカ人女性は、これらの同一の群の中で、乳癌についての最も高い死亡率を有し（１００，０００人あたり３１人）、一方中国人女性は、１００，０００人あたり１１人の最も低い死亡率を有する。男性も乳癌を罹患し得るが、これは極度にまれである。米国においては、２００４年に、２１７，４４０件の乳癌の新しい症例および４０，５８０人の乳癌による死亡が推定されている。（アメリカ癌協会ウェブサイト：cancer with the extension .org of the world wide web）。関連する遺伝子的要因を有する症例を除き、乳癌の正確な原因は知られていない。
【００１７】
乳癌の処置においては、乳癌の早期の正確なステージ分類が生存に対して顕著な影響を有するため、検出およびリスクアセスメントがかなり重要視されている。例えば、初期のステージ（ステージＴ０、以下に記載する）において検出された乳癌は、９２％の５年生存率を有する。逆に、癌が後期のステージ（即ちステージＴ４（ＩＶ））まで検出されない場合、５年生存率は１３％まで低下する。AJCC Cancer Staging Handbook pp. 164-65 (Irvin D. Fleming et al., 5th ed.1998)。いくつかの検出手法、例えばマンモグラフィーおよび生検は、不快感、費用および／または放射線の増加を伴い、乳癌リスクの高い患者のみに処方されるに過ぎない。
【００１８】
乳癌のリスクを予測するかまたは検出するための現在の方法は、最適ではない。乳癌の相対的なリスクを予測するための１つの方法は、患者の危険因子を試験し、高リスクの患者についての攻撃的（agressive）診断および処置計画を探求することによる。患者の乳癌のリスクは、年齢の上昇、未産婦、乳癌の家族履歴、乳癌の個人的履歴、早い初経、遅い閉経、最初の満期妊娠の遅い年齢、前の増殖性乳房疾患、早い年齢での乳房の照射および悪性腫瘍の個人的履歴に正に関連している。ライフスタイル要因、例えば脂肪消費、アルコール消費、教育および社会経済的地位もまた、乳癌の発生率の増大に関連しているが、直接的な因果関係は確立されていない。これらの危険因子は統計的に有意である一方で、これらの乳癌との弱い関連により、その有用性が制限された。乳癌を発生するほとんどの女性は、加齢に伴って到来するリスク以外に、上記した危険因子のいずれも有していない。NIH Publication No. 00-1556 (2000)。
【００１９】
癌を検出するための現在のスクリーニング方法、例えば乳房の自己検診、超音波およびマンモグラフィーは、その有効性を低下させる、またはその幅広い採用を妨げるような欠点を有する。乳房自己検診は有用である一方、腫瘍が小さく触診により検出することが困難である初期の段階においては、乳癌の検出について信頼性が低い。超音波測定には、増大した費用において熟練したオペレータが必要である。マンモグラフィーは感度が高い一方で、悪性腫瘍の可能性が疑われる病変の検出において過剰診断となりやすい。また、前の胸部への照射が乳癌発生率の増大に関連する要因であるため、マンモグラフィーにおいて用いられる照射に対する恐れも存在する。
【００２０】
この時点において、乳癌予防の適切な方法は存在しない。乳癌予防の現在の方法は、予防的な乳房切除術（癌診断の前に行う乳房切除術）および化学的予防（癌診断の前の化学療法）を含み、これは、乳癌リスクの高い女性の間でさえもこれらの採用が限定されるような荒療治である。Bevers、上記。
【００２１】
多くの遺伝子マーカーが乳癌と関連した。これらのマーカーの例には、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）(Mughal et al., JAMA 249:1881 (1983))、ＭＵＣ−１(Frische and Liu, J. Clin. Ligand 22:320 (2000))、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ(Haris et al., Proc.Am.Soc.Clin.Oncology 15:A96 (1996))、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＲＡＫおよびＢＲＣＡ(Esteva and Fritsche, Serum and Tissue Markers for Breast Cancer, in Breast Cancer, 286-308 (2001))が含まれる。これらのマーカーは、限定された感度、低い相関関係および偽陰性についての問題を有し、そのためこれらの初期診断への使用が制限される。例えば、ＢＲＣＡ１遺伝子突然変異は、乳癌についての増大したリスクの指標として有用である一方で、乳癌のわずか６．２％のみがＢＲＣＡ１陽性であるため、癌診断における使用が限定される。Malone et al., JAMA 279:922 (1998)。またMewman et al., JAMA 279:915 (1998)も参照（わずか３．３％の相関関係）。
【００２２】
出現部位および疾患発達の程度により、乳癌について４つの主な分類がある。
Ｉ．in situでの乳管癌腫（ＤＣＩＳ）：その正常な位置に残留する乳管上皮細胞の悪性形質変換。ＤＣＩＳは純粋に局所的な疾患であり、転移することはない。
ＩＩ．侵襲性乳管癌腫（ＩＤＣ）：基底膜を突破して乳房の支持組織中に至る乳管上皮細胞の悪性腫瘍。ＩＤＣは、最終的には身体の別の場所に拡大し得る。
ＩＩＩ．in situでの小葉癌腫（ＬＣＩＳ）：乳房の単一の小葉において発生し、小葉壁を通して浸潤しない悪性腫瘍、これは一般に、局所的なままである。
ＩＶ．浸潤性小葉癌腫（ＩＬＣ）：乳房の単一の小葉において発生し、小葉壁を貫通して隣接する組織中に直接侵襲する悪性腫瘍。小葉壁を越えるこの侵襲により、ＩＬＣは、リンパ管および血管に浸入し、遠位の部位に拡大し得る。
【００２３】
予後および処置を決定するために、これらの４つの乳癌の種類を、主な腫瘍の大きさ（Ｔ）、リンパ節の関与（Ｎ）および転移の存在（Ｍ）によりステージ分類した。定義によれば、ＤＣＩＳは局所的なステージＩの疾患を表すが、乳癌の他の形態は、ステージＩＩからステージＩＶにまでわたり得る。さらに手術的および医学的介入の指針となる、追加的な予後因子がある。最も一般的なものは、関与するリンパ節の合計数、ＥＲ（エストロゲン受容体）状態、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体状態および組織学的階級である。
【００２４】
乳癌は、異なる処置が癌の異なるステージについてより有効であることを認識して、適切なステージカテゴリーに診断される。ステージＴＸは、原発腫瘍が評価できない（即ち腫瘍が除去されたかまたは乳房組織が除去された）ことを示す。ステージＴ０は、過形成などの異常を特徴とするが、原発腫瘍の痕跡を伴わない。ステージＴｉｓは、in situでの腫瘍、管内癌腫、in situでの小葉癌腫または腫瘍を伴わない乳頭のパジェット病を特徴とする。ステージＴ１（Ｉ）は、最大寸法で２ｃｍ以下の腫瘍を有することを特徴とする。ステージＴ１内で、Ｔｍｉｃは、０．１ｃｍ以下の微小侵襲を示し、Ｔ１ａは、０．１〜０．５ｃｍの腫瘍を示し、Ｔ１ｂは、０．５〜１ｃｍの腫瘍を示し、そしてＴ１ｃは、１ｃｍ〜２ｃｍの腫瘍を示す。ステージＴ２（ＩＩ）は、最大寸法で２ｃｍ〜５ｃｍの腫瘍を特徴とする。大きさが５ｃｍより大きい腫瘍は、ステージＴ３（ＩＩＩ）として分類される。ステージＴ４（ＩＶ）は、胸壁または皮膚への浸潤を伴う、任意の大きさの腫瘍を示す。ステージＴ４内で、Ｔ４ａは、胸壁への腫瘍の浸潤を示し、Ｔ４ｂは、乳房の皮膚または同一の乳房に限定された皮膚衛星結節の浮腫または潰瘍形成を示し、Ｔ４ｃは、Ｔ４ａとＴ４ｂとの組み合わせを示し、そしてＴ４ｄは、炎症性癌腫を示す。AJCC Cancer Staging Handbook pp. 159-70 (Irvin D. Fleming et al., eds., 5th ed.1998)。標準的なステージ分類に加えて、乳房腫瘍を、これらのエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体タンパク質状態により分類することができる。Fisher et al., Breast Cancer Research and Treatment 7:147 (1986)。さらなる病理学的状態、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ状態もまた、有用であり得る。Thor et al., J. Nat'l. Cancer Inst. 90:1346 (1998); Paik et al., J. Nat'l. Cancer Inst. 90:1361 (1998); Hutchins et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncology 17:A2 (1998).；およびSimpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000)。
【００２５】
原発腫瘍のステージ分類に加えて、所属リンパ節への乳癌転移もステージ分類することができる。ステージＮＸは、リンパ節を評価することができない（即ち、前に除去された）ことを示す。ステージＮ０は、所属リンパ節転移がないことを示す。ステージＮ１は、移動可能な同側性腋窩リンパ節への転移を示す。ステージＮ２は、互いに、または他の構造に固定された同側性腋窩リンパ節への転移を示す。ステージＮ３は、同側性内部乳腺リンパ節への転移を示す。同上。
【００２６】
ステージ決定は潜在的な予後値を有し、最適な治療法を設計するための基準を提供する。Simpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000)。一般に、乳癌の病理学的ステージ分類はより正確な予後を与えるため、臨床的ステージ分類より好ましい。しかし、臨床的ステージ分類は、これが病理学的ステージ分類と同等に正確であるならばより好ましく、その理由は、病理学的評価のための組織を得る侵襲性手順に依存しないからである。乳癌のステージ分類は、異なる侵襲のステージ間で区別され得る細胞、組織または体液中の新たなマーカーを検出することにより改善される。この分野における進歩により、乳癌患者を処置するための一層迅速で信頼性のある方法が可能となる。
【００２７】
乳癌の処置は、一般に、原発腫瘍の正確なステージ分類の後に決定される。主な処置の選択肢には、乳房保存療法（乳腺腫瘍摘出術、乳房照射および腋窩の外科的ステージ分類）並びに改善された根治的な乳房切除術が含まれる。追加の処置には、化学療法、領域性照射および極端な場合においては、卵巣切除によるエストロゲン産生の終了が含まれる。
最近まで、すべての乳癌のための一般的な処置は、乳房切除術であった。Fonseca et al., Annals of Internal Medicine 127:1013 (1997)。しかし、最近のデータは、より根治的でない手順が、初期のステージの乳癌について、生存の点において同等に有効であり得ることを示す。Fisher et al., J. of Clinical Oncology 16:441 (1998)。初期のステージの乳癌（即ちステージＴｉｓ）を有する患者についての処置の選択肢は、乳房を残す手術と、続いて乳房における局所的な放射線療法であり得る。代替的に、乳房切除術を随意に放射線または乳房再構成と組み合わせて用いることができる。これらの処置方法は、乳癌の初期ステージにおいて同等に有効である。
【００２８】
ステージＩおよびステージＩＩの乳癌を有する患者には、外科手術と共に化学療法および／またはホルモン療法が必要である。手術は、ステージＩＩＩおよびステージＩＶの患者においては有用性が限定される。従ってこれらの患者は、化学療法および放射線療法の良好な候補であって、手術は初めのステージ分類またはその後の再ステージ分類を可能にするための生検に限定されるが、その理由は、疾患のこのステージにおいて、癌がほとんど治癒的ではないためである。AJCC Cancer Staging Handbook 84, 164-65 (Irvin D. Fleming et al., eds., 5th ed. 1998)。
患者により多くの処置の選択肢を提供する努力において、再発性が低く、術後の放射線処置を伴わない乳腺腫瘍摘出術での処置が可能な、初期ステージの乳癌を明確にする努力が進行中である。多くの試行が初期ステージの乳癌を分類するためになされている一方、術後の放射線処置に対する一致した提言は、これらの研究からは得られていない。Page et al., Cancer 75:1219 (1995); Fisher et al., Cancer 75:1223 (1995); Silverstein et al., Cancer 77:2267 (1996)。
【００２９】
膵臓癌
膵臓癌は、世界で１３番目に一般的な癌であり、癌による死亡の第８位の原因である。Donghui Li, Molecular Epidemiology, in Pancreatic Cancer 3 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。米国においては、膵臓の癌は男性と女性両方において４番目に一般的な癌であり、全体で、癌による死亡の５％およびほぼ３０，０００人の死亡の原因となっている。同上。膵臓癌の割合は女性より男性で高く、白人よりアフリカ系アメリカ人で高い。同上の9。膵臓癌の最も重要な予測指標は、患者の年齢である；白人の中では、膵臓癌の年齢に関連する発生率は連続して増加しており、８５歳以上においても同様である。同上の3。約８０％の症例が６０〜８０歳の年齢範囲で起きており、８０代では、４０代と比べて、疾患を有するリスクが４０倍も高い。同上。さらに米国癌学会は、２００４年に米国のみにて、３１，８００件の新たな膵臓癌の症例を予測している。膵臓癌は、同年に約３１，２００人の新たな死亡を引き起こすであろう。ＡＣＳウェブサイト：cancer with the extension .org of the world wide web。研究者および医師による膵臓癌の処置を考案するための努力にも関わらず、膵臓癌は例外なく致命的であり続けている。James R. Howe, Molecular Markers as a Tool for the Early Diagnosis of Pancreatic Cancer, in Pancreatic Cancer 29 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。
【００３０】
年齢の他にも多数の膵臓癌の危険因子が同定されており、喫煙、食生活、職業、一定の医療状態、遺伝、および分子生物学的因子（molecular biologic）などが含まれる。喫煙は該疾患を生じる最も重要な危険因子であり、喫煙と膵臓癌との関連は多数の研究によって確立されている。Li、上記の3。相対的リスクは少なくとも１．５であり、喫煙の程度と共に上昇して、外部リスク率（outer risk ratio）は１０倍に達する。同上。次に重要な因子は食生活のようであり、リスクの増加は動物性タンパク質および脂肪の摂取と関連し、リスクの減少は果物および野菜の摂取と関連する。同上の3-4。特定の職業については、膵臓癌の過大な率は、化学、石炭およびガスの探査、金属産業、革なめし、繊維、アルミニウム精練、および輸送の従事者と関連している。同上の4。多くの医療状態も膵臓癌の発生率の増加と関連し、糖尿病、慢性膵炎、胃切除術、および胆嚢摘出術を含むが、これらの状態と膵臓癌との間の因果関係は確立されていない。同上。
【００３１】
遺伝的な遺伝因子は、膵臓癌の負荷の１０％未満を構成しており、遺伝性膵炎、および家族性の癌症候群遺伝子、例えばｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１（遺伝性非腺腫性大腸癌）、ｐ１６（家族性異型多発性ほくろメラノーマ（mole-melanoma））およびＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２（乳癌および卵巣癌）について関連が記載されている。上記の3。いかなる器官における癌についての遺伝性の基盤も、膵臓のそれよりは低いが、しかし研究者らは、ある個人の膵臓癌に対する感受性に影響する１つまたは２つ以上の特定の遺伝的欠陥を示すことができていない。David H. Berger & William E. Fisher, Inherited Pancreatic Cancer Syndromes, in Pancreatic Cancer 73 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。
【００３２】
分子生物学の立場から、研究により膵臓癌と多数の遺伝的突然変異の間の関連が明らかとなり、これには、プロトオンコジーンＫ−ｒａｓの活性化および癌抑制遺伝子ｐ５３、ｐ１６、およびＤＰＣ４の不活性化が含まれる。Marina E. Jean et al., The Molecular Biology of Pancreatic Cancer, in Pancreatic Cancer 15 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。
【００３３】
膵臓腺癌の１つの研究において、８３％は、ｐ１６およびｐ５３の不活性化と共にＫ−ｒａｓ活性化を有していた。同上。Ｋ−ｒａｓ突然変異は、膵臓腺癌の８０〜９５％に見出され、膵臓の癌においては、ｐ５３、ｐ１６、およびＤＰＣ４遺伝子が、最も頻繁に欠損される癌抑制遺伝子である。Howe、同上の29。ホモ接合体欠失、過剰メチル化、およびｐ１６遺伝子の突然変異は、膵臓腺癌の８５〜９８％において見出された。同上。Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３、ｐ１６、およびＤＰＣ４遺伝子における改変の役割から予想されるように、細胞サイクルの調節を失うことが、膵臓の腫瘍形成の鍵となるようであり、この癌がこのように攻撃的であることを説明するかも知れない。Jean、同上の15。研究により、この癌とある種の成長因子および成長因子受容体の異常な調節との間の関連、およびマトリクス・メタロプロテイナーゼと腫瘍血管新生レギュレータの上方調節が明らかにされた。同上。上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、形質転換成長因子β、インスリン様成長因子、肝細胞増殖因子、および血管内皮成長因子は、膵臓癌において種々の役割を果たす可能性があるが、かかる役割は明らかにされていない。同上の18-22。
【００３４】
膵臓癌の存在を検出するためのスクリーニング技法の開発は、この致死的な癌に対して特に重要であるが、それは、殆どの患者が、その膵臓腫瘍が膵臓を囲む毛細血管およびリンパ管に侵入し、腫瘍が胆管を閉塞するかまたは痛みを引き起こすときまで、癌の存在を示さないからである：Howe、上記の29；残念ながら、この疾患の転位形態を有する患者は、概して診断後１年未満の生存である、Jean et al.、上記の15。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）は、症候性の患者の診断を支援することができるが、治療できる可能性のある時期での早期発見を可能とする、膵臓腫瘍のスクリーニングのツールは、現在存在しない。Howe、上記の29。癌胎児性抗原などのマーカー、および、ヒト結腸癌の細胞系に対して生成される抗体（ＣＡ１９−９およびＣＡ１９５）、ヒト卵巣癌の細胞系に対して生成される抗体（ＣＡ１２５）、およびヒト膵臓癌の細胞系に対して生成される抗体（ＳＰＡＮ−１およびＤＵＰＡＮ−２）は、膵臓癌患者の血清において上昇するが、これらのマーカーは特異性の欠如および疾患の後期に現れるために、信頼できるスクリーニングのツールとしては十分ではない。Walter J. Burdette, Cancer: Etiology, Diagnosis, and Treatment 99 (1998); Hasholzner, U. et al., Anticancer Res. 19(4A): 2477-80(1999)。
【００３５】
現在適切なスクリーニング法が存在しないために、医師は、この疾患の早期の診断のための最も期待される方法として、分子生物学的方法を用いる技術にますます傾いている。Howe、上記の30。現在、無症候性の患者において膵臓癌を検出できる、高感度で高特異性のマーカーは存在しないが、幾つかの生物学的マーカーが検討されている。同上。現在相当の努力がＫ−ｒａｓに集中しており、研究者らは、膵液、胆汁、十二指腸液、またはＥＲＣＰブラッシングの試料をスクリーニングして、Ｋ−ｒａｓの突然変異を検出する技術を考案した。これらの試料の採集は侵襲的であり、無症候性の被験者に対するスクリーニングに特に有用ではないため、研究者らはまた、Ｋ−ｒａｓの突然変異用の血清および大便の分析に向っており、後者は供給源材料の複雑さによる障害があるために、前者が最も期待できる。同上の35-38,42。さらに、転写因子タンパク質ｐ５３の血清濃度は癌の進行と平行している可能性があるため、ｐ５３も潜在的な腫瘍マーカーとして研究されている。同上の37；Jean et al.、同上の17。
【００３６】
一旦膵臓癌と診断されると、癌の進行のステージを参照して処置の決定がなされる。多数の画像技術が膵臓癌のステージ分類のために用いられ、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）が現在の選択方法であり、Harmeet Kaur et al., Pancreatic Cancer: Radiologic Staging, in Pancreatic Cancer 86 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)；Ishiguchi, T. et al., Hepatogastroenterology 48(40): 923-27(2001)、しかしながら、ＣＴは、小容量の転移がしばしばＣＴの解像度を超えるために、癌の範囲について頻繁に過小評価となる、H. J. Kim & K. C. Conlon, Laparascopic Staging, in Pancreatic Cancer 15 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。ＭＲＩはある時点においてはＣＴに取って代わるものであり、特に以下のその能力の視点においてそうである：（１）種々の組織間にコントラストをつける、（２）パルス順序を修正して病変部の視覚化を改善し、アーチファクトを最小化する、（３）イオン化放射への患者の暴露を制限しながら画像化を行う、および（４）ＩＶヨウ化コントラスト試薬を使用せずに血管を視覚化する。Kaur et al.、上記の87。しかしながら現在、ＭＲＩはＣＴに対して明確な利点を示していない。Kim & Conlon、上記116。
【００３７】
種々の超音波技術もまた、現在ステージ分類に用いられ、これには経腹的超音波検査（ＴＵＳ）、超音波内視鏡検査（ＥＵＳ）、および術中超音波検査（ＩＵＳ）などを含み、ＥＵＳが最も期待されるものの１つである。Kaur et al.、上記の86；Richard A. Erickson, Endoscopic Diagnosis and Staging: Endoscopic Ultrasound, Endoscopic Retrograde Cholangiopancreatography, in Pancreatic Cancer 97-106 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。これらの技術はしかし、それぞれ様々な要因によって制限される：ＴＵＳは胃腸管のガスおよび腹膜の脂肪によって妨害され、ＥＵＳは超音波検査および内視鏡検査に相当な経験を必要とし、広く利用可能ではない可能性があり、そしてＩＵＳは、術中にのみ使用できる。Kaur et al.、上記の86。
【００３８】
まだ初期の段階ではあるが、膵臓癌のステージ分類を支援するマーカーの探索は、幾つかの可能性のある手がかりを見出した。例えば、２つの転位抑制遺伝子、ｎｍ２３−Ｈ１およびＫＡＩ１が、膵臓癌のステージに依存して異なって発現され、それらの発現は該疾患の早期のステージでは上方制御され、遅いステージにおいては下方制御されることが、研究により見出された。Friess, H. et al., J. Clin. Oncol. 19(9): 2422-32(2001)。研究者らはまた、遺伝性リンパ節ステージ分類に、特にＫ−ｒａｓプロトオンコジーンにおける突然変異の探索に焦点をあてている。Yamada, T. et al. Int’l J. Oncol. 16(6): 1165-71(2000)。同様に、研究によって、突然変異したＫ−ｒａｓ配列の血漿／血清における存在が、後期ステージの膵臓癌と関連することを確認したが、ただし、早いステージの膵臓癌の存在もまたこの方法により検出できる。Sorenson, G.D., Clin. Cancer Res. 6(6): 2129-37(2000)。多数のマーカーの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応試験を用いる、期待されるステージ分類技術は、以下の腫瘍マーカーのｍＲＮＡ発現について血液および組織試料を分析することにより、膵臓癌のステージを識別することに成功した：β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン遺伝子、肝細胞増殖因子受容体遺伝子ｃ−ｍｅｔ、およびβ−１，４−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ遺伝子。Bilchik, A. et al., Cancer 88(5): 1037-44(2000)。
【００３９】
膵臓癌のステージ分類に一般に用いられる分類システムの１つは、Union Internationale Contre le Cancerにより考案されたＴＮＭシステムである。AJCC Cancer Staging Handbook 3 (Irvin D. Fleming et al. eds., 5th ed. 1998)。このシステムは、数個の段階に分けられ、その各々は、原発腫瘍（Ｔ）、所属リンパ節（Ｎ）、および遠隔転移（Ｍ）について癌の増殖の範囲を評価する。同上。
ステージ０はin situでの癌腫を特徴とし（Ｔｉｓ）、所属リンパ節への転移はなく（Ｎ０）、遠隔転移もない（Ｍ０）。同上の113。ステージＩおよびＩＩは、腫瘍のカテゴリーに関してのみ、ステージ０と異なる：ステージＩは、膵臓のみに限定される腫瘍を含み、これは、（１）最大寸法が２ｃｍ以下であるか（Ｔ１）、または（２）最大寸法が２ｃｍより大であり（Ｔ２）、一方ステージＩＩは、十二指腸、胆管または膵臓周辺組織まで直接広がった腫瘍（Ｔ３）を含む。同上。ステージＩＩＩは、腫瘍のカテゴリーＴ１、Ｔ２またはＴ３を含む；所属リンパ節転位（Ｎ１）は、単一のリンパ節（ｐＮ１ａ）または複数のリンパ節（ｐＮ１ｂ）のどちらかを含み；そして遠隔転移はない（Ｍ０）。ステージＩＶＡは、胃、脾臓、結腸、または隣接する大きな血管まで直接広がった腫瘍を特徴とし（Ｔ４）；任意のＮカテゴリーであり；および、遠隔転移はない（Ｍ０）。最後に、ステージＩＶＢは、任意のＴカテゴリー、任意のＮカテゴリー、および遠隔転移（Ｍ１）を特徴とする。同上。
【００４０】
一旦癌がステージ分類されると、この疾患に対する、唯一の一定して効果的な処置は外科手術であり、潜在的に治効のある切除術を受けることができるのは１０〜１５％の患者のみである。Jean et al.、上記の15；Fleming et al., eds.、上記の111；William F. Regine, Postoperative Adjuvant Therapy: Past, Present, and Future Trial Development in Pancreatic Cancer 235 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。さらに、切除術を受けたこれらの患者の５年生存率は２０％を下回る。Regine、上記の235。一方、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルなどの化学療法剤は、膵臓癌に対して一定の有効性を示したが、現実的には、化学療法は膵臓癌からの生存に対してはほとんど効果を示さなかった。Burdette、上記の101。放射線療法はその有効性について矛盾する結果を示した（同上）が、５−フルオロウラシルと組み合わせた放射線は、一定の見込みを示した、Regine、上記の235。
【００４１】
従来技術が膵臓癌の処置に失敗していることから、分子生物学の技術を用いる多くの新規なアプローチが検討されている。遺伝子治療の分野で多くの研究がなされ、アンチセンス技術、遺伝子指向的プロドラッグ活性化戦略、プロモーター遺伝子戦略、およびオンコリティックウイルス（oncolytic viral）療法を含む。Eugene A. Choi & Francis R. Spitz, Strategies for Gene Therapy, in Pancreatic Cancer 331 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)；Kasuya, H. et al., Hepatogastroenterology 48(40): 957-61(2001)。最近の他のアプローチは、マトリクス・メタロプロテイナーゼの阻害に焦点を当て、これは、腫瘍細胞の転位および侵入を、該細胞の基底膜の分解を介して、および腫瘍周辺間質分解および血管形成における役割を通して、促進する酵素である。Alexander S. Rosemurgy, II & Mahmudul Haq, Role of Matrix Metalloproteinase Inhibition in the Treatment of Pancreatic Cancer, in Pancreatic Cancer 369 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。
【００４２】
癌における血管形成（angiogenesis）
固体腫瘍の増殖および転位はまた、血管形成に依存する。Folkman, J., 1986, Cancer Research, 46, 467-473; Folkman, J., 1989, Journal of the National Cancer Institute, 82, 4-6。例えば、２ｍｍより大きく広がった腫瘍は、それ自身の血液供給を受けねばならず、これは新しい毛細血管の成長を誘導することにより達成される。これらの新しい血管が一旦腫瘍に埋め込まれると、それらは腫瘍細胞に対し、循環に入り、遠隔部位、例えば肝臓、肺または骨などに転位する手段を提供する。Weidner, N., et al., 1991, The New England Journal of Medicine, 324(1), 1-8。
【００４３】
既存の血管からの新たな血管の増殖または発生として定義される血管形成は、第一に胚発生中に起こる複雑なプロセスである。このプロセスは、血管を覆う新しい内皮細胞が、幹細胞からの分化ではなく、既存の細胞の増殖により作られる点で、脈管形成（vasculogenesis）から区別される。このプロセスは侵襲的であり、細胞外基質（ＥＣＭ）のタンパク質分解、新しい内皮細胞の移動、および新しいマトリクス成分の合成に依存する。血管形成は循環系の胚発生中に起こるが、しかし成長したヒトにおいては、血管形成は病的な状態への反応としてのみ起こる（ただし、女性の生殖周期を除く）。
【００４４】
成人の正常な生理的状態のもとで、血管形成は、毛髪の成長および創傷の治癒などの非常に限定された状況でのみ起こる。Auerbach, W. and Auerbach, R., 1994, Pharmacol. Ther. 63(3):265-3 11; Ribatti et al., 1991, Haematologica 76(4):3 11-20; Risau, 1997, Nature 386(6626):67 1-4。血管形成は、内皮細胞の移動するカラムの形成を引き起こす刺激によって進行する。タンパク質分解活性は、この「血管新生の芽（vascular sprout）」が前進する先端に集中され、これは、細胞のカラムが侵入し移動することを許容するのに十分なだけ、ＥＣＭを破壊する。前進部の後ろでは内皮細胞が分化し、互いに付着し始めて、新しい基底膜を形成する。細胞は次に増殖をやめ、最終的には新しい細動脈または毛細血管の内腔を規定する。
制御されない血管形成が、広い範囲の疾患に対して責任を負うことが次第に認識されてきたが、これには、限定されることなく、癌、心臓血管疾患、関節リューマチ、乾癬および糖尿病性網膜症を含む。Folkman, 1995, Nat Med 1(1): 27-31; Isner, 1999, Circulation 99(13): 1653-5; Koch, 1998, Arthritis Rheum 41(6):951-62; Walsh, 1999, Rheumatology (Oxford) 28(2):103-12; Ware and Simons, 1997, Nat Med 3(2): 158-64。
【００４５】
特に重要であるのは、血管形成は、固体腫瘍がその増殖と転位のために必要とするとの観察である。Folkman, 1986上記；Folkman 1990, J Natl. Cancer Inst., 82(1)4-6; Folkman, 1992, Semin Cancer Biol 3(2):65-71; Zetter, 1998, Annu Rev Med 49:407-24。腫瘍は通常は、利用可能な毛細管ベッドからの距離のために数立方ミリメーターの大きさにまでしか増殖できない、単一の異常細胞（aberrant cell）として始まり、さらなる増殖および播種なしに長期間「潜伏して」留まることができる。幾つかの腫瘍細胞は、次に、血管形成の表現型に切り換わって内皮細胞を活性化し、これは新しい毛細血管へと増殖および成熟する。これらの新しく形成された血管は、原発腫瘍の連続した増殖を許容するのみでなく、転位腫瘍細胞の播種および再コロニー形成を許容する。血管形成の切換えを制御する正確なメカニズムはよく理解されていないが、腫瘤の新血管形成は、多数の血管形成促進因子と阻害因子との間の、純バランスから生じると考えられている。Folkman, 1995、上記。
【００４６】
最も強力な血管形成阻害剤の１つは、O’ReillyおよびFolkmanによって同定されたエンドスタチンである。O’Reilly et al., 1997, Cell 88(2):277-85; O’Reilly et al., 1994, Cell 79(2):3 15-28。この発見は、ある種の原発腫瘍が遠隔転移の増殖を阻害できるという現象に基づいていた。O’ReillyおよびFolkmanは、原発腫瘍が、阻害剤よりも多量の血管形成促進剤を生成することにより、血管形成を開始させるとの仮説を立てた。しかし血管形成阻害剤は、それらの循環における長い半減期のために、促進剤より多量に二次腫瘍の部位に到達する。このため最終的には、原発腫瘍の増殖と二次腫瘍の阻害がもたらされる。エンドスタチンは、原発腫瘍により産生される、かかる血管形成阻害剤の増加するリストの中の１つである。これは大きなタンパク質の、タンパク質分解断片である：エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩ（マウスコラーゲンＸＶＩＩＩのアミノ酸Ｈ１１３２−Ｋ１３１５）の２０ｋＤａの断片である。エンドスタチンは、in vitroで内皮細胞の増殖を特異的に阻害し、in vivoで血管形成をブロックすることが示された。より重要なことには、腫瘍を有するマウスにエンドスタチンを投与すると、顕著な腫瘍の退縮を引き起こし、毒性または薬剤耐性は、複数の処置サイクルの後にも観察されなかった。Boehm et al., 1997, Nature 390(6658):404-407。エンドスタチンが遺伝的に安定な内皮細胞を標的化し、種々の固体腫瘍を阻害するという事実は、エンドスタチンを抗癌療法の非常に魅力的な候補にしている。Fidler and Ellis, 1994, Cell 79(2):185-8; Gastl et al., 1997, Oncology 54(3):177-84; Hinsbergh et al., 1999, Ann Oncol 10 Suppl 4:60-3。さらに、血管形成阻害剤は、放射線および化学療法剤と組み合わされるとより効果的であることが示された。Klement, 2000, J. Clin Invest, 105(8) R15-24. Browder, 2000, Cancer Res. 6-(7) 1878-86, Arap et al., 1998, Science 279(5349):377-80; Mauceri et al., 1998, Nature 394(6690):287-91。
【００４７】
上で述べたように、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を診断およびステージ分類するための各方法は、用いられる技術により制限される。従って、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を検出するための、感度の高い分子マーカーおよび細胞マーカーの必要性が存在する。処置方法を最適化するために、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌の臨床的および病理学的なステージ分類を含んだ正確なステージ分類のための、分子マーカーの必要性が存在する。さらに、寛解後の卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌の再発を検出できるマーカーを含む、癌の処置の進行をモニタリングするための感度の高い分子マーカーおよび細胞マーカーの必要性が存在する。
本発明は、従来の治療法の制限を克服し、また以下の詳細な記載から明らかである付加的な利点を提供する、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を処置するための代替方法を提供する。
【００４８】
自己免疫疾患
免疫系の細胞活性は、細胞表面相互作用の複雑なネットワークおよび関連するシグナル伝達プロセスによって制御される。細胞表面受容体がそのリガンドにより活性化されると、シグナルが該細胞へ伝達され、携わるシグナル変換経路に依存して、該シグナルは抑制的または活性化的となりえる。多くの受容体系に対して、細胞活性は活性化シグナルと抑制性シグナルとの間のバランスによって調節される。これらの幾つかにおいて、細胞表面受容体の関与に関連するそのリガンドによる正のシグナルが、異なる細胞表面受容体の関与によってそのリガンドにより伝達される負のシグナルにより、下方調節または阻害されることが知られている。
【００４９】
これら正および負のシグナル伝達経路の生化学的機構は、多数の既知の免疫系受容体およびリガンド相互作用について研究されている。正のシグナル伝達を媒介する多くの受容体は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られているチロシンホフファターゼリン酸化の部位を含む、細胞質尾部を有する。正のシグナル伝達のための共通の機構経路には、受容体の細胞質ドメイン上および他のシグナル伝達分子上の部位をリン酸化するチロシンキナーゼの活性化が関与している。一旦受容体がリン酸化されると、シグナル変換分子のための結合部位が生成され、これがシグナル伝達経路を開始させ、細胞を活性化する。阻害経路には、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する受容体が関与し、これはＩＴＡＭ同様、チロシンキナーゼによりリン酸化される。これらのモチーフを有する受容体は、阻害シグナル伝達に関連するが、それはこれらのモチーフが、活性化された受容体またはシグナル伝達分子からチロシンを除去することによりシグナル伝達をブロックするチロシンホスファターゼに、結合部位を提供するからである。
【００５０】
正および負のシグナル伝達のバランスにより調節される免疫系活性の１例は、Ｂ細胞の増殖である。Ｂ細胞抗原受容体は、抗体に結合すると正のシグナル伝達を媒介してＢ細胞増殖をもたらす、Ｂ細胞表面免疫グロブリンである。しかし、Ｂ細胞はまた、低親和性ＩｇＧ受容体であるＦｃγＲＩＩｂ１も発現する。抗原が、可溶性免疫グロブリンを有する免疫複合体の一部である場合、Ｂ細胞抗原受容体とＦｃγＲＩＩｂ１の両方を、それぞれ抗原および可溶性免疫グロブリンを介して関与させることによって、該免疫複合体はＢ細胞を結合することができる。ＦｃγＲＩＩｂ１とＢ細胞受容体複合体との共同関与により、活性化シグナルを下方調節し、Ｂ細胞増殖を妨害する。ＦｃγＲＩＩｂ１受容体はＩＴＩＭモチーフを含み、該ＩＴＩＭモチーフは、Ｂ細胞受容体が共同関与すると、ＩＴＩＭとチロシンホスファターゼの相互作用を介して阻害シグナルをＢ細胞に伝達すると考えられている。
【００５１】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞溶解活性は、細胞機能を開始させる正のシグナルと、活性を妨害する負のシグナルの間のバランスによって調節される免疫系活性の他の例である。ＮＫ細胞毒性を活性化させる受容体は完全には理解されていない。しかし、標的細胞が、ＮＫ細胞がそれに対して特異的受容体を有する細胞表面ＭＨＣクラスＩ抗原を発現する場合、該標的細胞は、ＮＫによって死滅させられることから保護される。キラー抑制性受容体（ＫＩＲ）として知られるこれらの特異的受容体は、そのＭＨＣリガンドにより関与させられると、負のシグナルを伝達し、ＮＫ細胞の細胞毒性を下方制御する。
【００５２】
ＫＩＲは、免疫グロブリンのスーパーファミリーまたはＣ型レクチンファミリーに属する（Lanier et al., Immunology Today 17: 86-91, 1996を参照）。既知のヒトＮＫ ＫＩＲは、免疫グロブリンのスーパーファミリーのメンバーであり、その細胞外、膜貫通および細胞質領域において相違点および類似点を示す。多くのＫＩＲに共通する細胞質ドメインのアミノ酸配列は、ＹｘｘＬ／Ｖの配列を有するＩＴＩＭモチーフである。幾つかの場合においては、リン酸化されたＩＴＩＭは、チロシンホスファターゼを補充し、これがシグナル伝達経路において分子を脱リン酸化し、細胞活性を妨害する（Burshtyn et al., Immunity 4: 77-85, 1996を参照）。ＫＩＲは一般に、２６個のアミノ酸［YxxL/V(x).sub.26YxxL/V］によって隔てられた２つのこれらのモチーフを有する。それぞれがヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ｃ対立遺伝子（ＭＨＣクラスＩ分子）に特異的な、少なくとも２個のＮＫ細胞受容体が、抑制性および活性化受容体として存在する。これらの受容体は、細胞外の部分で非常に相同であるが、しかし膜貫通および細胞質部分では大きな違いを有する。違いの１つは、抑制性受容体におけるＩＴＩＭモチーフの外観および、活性化受容体における、ＩＴＩＭモチーフの欠如である（Biassoni et al., Journal. Exp. Med, 183: 645-650, 1996）。
【００５３】
マウス肥満細胞により発現される免疫受容体ｇｐ４９Ｂ１は、免疫グロブリンのスーパーファミリーのメンバーでもあり、細胞活性化シグナルを下方制御し、ＩＴＩＭモチーフの対を含むことが知られている。ｇｐ４９Ｂ１はヒトＫＩＲと高度の相同性を有する（Katz et al., Cell Biology, 93: 10809-10814, 1996）。マウスＮＫ細胞はまた、免疫受容体のファミリー、Ｌｙ４９ファミリーを発現し、これはＩＴＩＭモチーフを含み、ヒトＫＩＲと類似の態様で機能する。しかしＬｙ４９免疫受容体はヒトＫＩＲと構造的相同性は有さず、細胞外Ｃ型レクチンドメインを含み、これにより、分子のレクチンスーパーファミリーのメンバーとなっている（Lanier et al., Immunology Today 17: 86-91を参照）。
【００５４】
明らかに、対立するキナーゼおよびホスファターゼにより媒介される免疫系の活性化および抑制シグナルは、免疫系においてバランスを維持するのに非常に重要である。活性化シグナルが優勢な系は、自己免疫および炎症をもたらす。抑制シグナルが優勢な免疫系は、感染細胞または癌細胞にチャレンジする能力が低い。新しい活性化または抑制性受容体を単離することは、受容体を介して変換される１または２以上の生体信号を研究するのに非常に望ましい。さらに、かかる分子を同定することは、自己免疫、炎症および感染に関連する病的な状態を調節および処置する方法を提供する。
【００５５】
例えば、拮抗抗体または可溶化受容体を有するＩＴＩＭモチーフを有する細胞表面受容体と相互作用する、Ｏｖｒ１１０などのリガンドを関与させることは、特定の免疫機能を、抑制された免疫機能と関連する病的状態において活性化させるために用いることができる。一方、Ｏｖｒ１１０に特異的、またはＯｖｒ１１０受容体の可溶化形態に特異的な拮抗抗体を用いて、Ｏｖｒ１１０と細胞表面受容体との相互作用を遮断し、増大した免疫機能と関連する病的状態における、特定の免疫機能を低減させることができる。逆に、ＩＴＩＭモチーフが欠如した受容体は、一旦関与すると上記のように活性化シグナルを伝達するため、抗体および可溶化受容体の効果は上記の逆となる。
【００５６】
このように、自己免疫疾患を診断およびステージ分類する方法は、用いる技術によって制限される。従って、自己免疫疾患を検出する感度の高い分子マーカーおよび細胞マーカーの必要性が存在する。処置方法を最適化するために、臨床的および病理学的なステージ分類を含めて自己免疫疾患を正確にステージ分類するための、分子マーカーの必要性が存在する。さらに、寛解後の自己免疫疾患の再発を検出できるマーカーを含む、自己免疫疾患の処置の進行をモニタリングするための感度の高い分子マーカーおよび細胞マーカーの必要性が存在する。
本発明は、従来の治療法の制限を克服し、また以下の詳細な記載から明らかである付加的な利点を提供する、自己免疫疾患を処置するための代替方法を提供する。
【発明の開示】
【００５７】
発明の概要
本発明は、in vivoで哺乳類細胞上のＯｖｒ１１０に結合する、単離されたＯｖｒ１１０抗体に関する。本発明はさらに、in vivoで哺乳類細胞上のＯｖｒ１１０に結合すると内部移行する、単離されたＯｖｒ１１０抗体に関する。抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。代替的に、抗体は、抗体断片またはキメラもしくはヒト化抗体である。モノクローナル抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129の下で寄託されたハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマにより産生され得る。
【００５８】
抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129の下で寄託されたハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体により結合されたエピトープと同一のエピトープに結合することについて、競合することができる。
本発明はまた、結合した抗体に関する。これらは、増殖阻害剤または細胞毒性剤に結合することができる。細胞毒性剤は、毒素、抗生物質、放射性同位体並びに核酸分解酵素および毒素からなる群から選択され得る。毒素の例には、メイタンシン(maytansin)、メイタンシノイド類(maytansinoids)、サポリン(saporin)、ゲロニン(gelonin)、リシンまたはカリケアマイシン(calicheamicin)が含まれるが、これらには限定されない。
【００５９】
哺乳類細胞は、癌細胞であってもよい。好ましくは、抗Ｏｖｒ１１０モノクローナル抗体は、in vivoでＯｖｒ１１０発現癌細胞の増殖を阻害する。
抗体は、細菌中で産生され得る。代替的に、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129を有するハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗Ｏｖｒ１１０抗体のヒト化形態であってもよい。
好ましくは、癌は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌および乳癌からなる群から選択される。本発明はまた、抗体を産生する方法であって、適切な細胞を培養することおよび該抗体を該細胞培養物から回収することを含む、前記方法に関する。
【００６０】
本発明はまた、抗体および担体を含む組成物に関する。抗体は、細胞毒性剤に結合することができる。細胞毒性剤は、放射性同位体または他の化学療法剤であってもよい。
本発明はまた、Ｏｖｒ１１０発現癌細胞を死滅させる方法であって、該癌細胞を、本発明の抗体と接触させ、これにより該癌細胞を死滅させることを含む、前記方法に関する。癌細胞は、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞および乳癌細胞からなる群から選択することができる。
卵巣癌または乳癌は、卵巣漿液性腺癌または乳房浸潤性乳管癌または転位癌であってもよい。乳癌は、ＨＥＲ−２陰性乳癌であってもよい。本発明はまた、哺乳類におけるＯｖｒ１１０発現癌を寛解する方法であって、抗体の治療的に有効な量を、該哺乳類に投与することを含む、前記方法に関する。
【００６１】
さらに、本発明は、容器およびこの中に含まれた組成物を含む製造品であって、該組成物が、本明細書中に記載した抗体を含む、前記製造品に関する。この製造品はまた、追加の要素、例えば、組成物が卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌の処置に使用可能であることを示す添付文書を含むことができる。
【００６２】
さらに、Ｏｖｒ１１０に結合して細胞機能を下方調節する受容体による負のシグナル伝達の障害に関連する、自己免疫疾患が介在する障害を、かかる障害に苦しむ患者に、可溶化形態のＯｖｒ１１０の治療的に有効な量を投与することにより、処置することができる。抑制された免疫機能が関連する病的状態が介在する障害は、拮抗的Ｏｖｒ１１０抗体の治療的に有効な量を投与することにより、処置することができる。逆に、Ｏｖｒ１１０による活性化シグナル伝達の障害に関連する疾患が介在する障害を、Ｏｖｒ１１０の可溶化形態の治療的に有効な量を投与することにより、処置することができる。自己免疫機能に関連する状態が介在する障害は、拮抗的Ｏｖｒ抗体の治療的に有効な量を投与することにより、処置することができる。かかる自己免疫疾患は、限定することなく以下を含む：多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性神経障害例えばギランバレー、自己免疫性ブドウ膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎例えばヴェーゲナー肉芽腫症、ベーチェット病、乾癬、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、Ｉ型もしくは免疫介在性糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、副腎の自己免疫疾患、関節リューマチ、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症例えば強直性脊椎炎、およびシェーグレン症候群。
【００６３】
発明の詳細な説明
定義および一般的手法
本明細書中で用いるヒト「Ｏｖｒ１１０」は、細胞表面上に糖タンパク質として発現された、２８２個のアミノ酸のタンパク質を意味し、Ｏｖｒ１１０のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、WO 00/12758、癌特異的遺伝子（ＣＳＧ）Ｏｖｒ１１０；WO 99/63088、膜結合タンパク質ＰＲＯ１２９１；WO00/36107、ヒト卵巣癌抗原；WO 02/02624-A2、ヒトＢ７様タンパク質（Ｂ７−Ｌ）；WO 2004/101756、ＯＶＲ１１０；などに開示されており、これらの開示はここに参照として明示的に組み込まれる。アミノ酸３０〜２８２は、細胞表面上に存在すると推定されている。本明細書中で用いるＯｖｒ１１０には、Ｏｖｒ１１０生物学的活性を有するタンパク質の対立遺伝子多型および同類置換変異体も含まれる。
【００６４】
Ｏｖｒ１１０は文献において、Ｂ７ｘ、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｓ１、Ｂ７−Ｈ４またはＢ７ｈ．５として知られている。ＮＣＢＩのRefSeqデータベースでは、アクセッションNM_024626を「Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）、ｍＲＮＡを含むホモサピエンスＶセットドメイン」として注記している。このヌクレオチドおよびコードされたタンパク質NP_078902.1には、以下の概要を与えられている：
Ｂ７Ｈ４は、共刺激性タンパク質のＢ７ファミリー（CD80; NIM 112203を参照）に属する。これらのタンパク質は、抗原提示細胞の表面上に発現され、Ｔリンパ球上のリガンド（例えば、CD28; NIM 186760）と相互作用する。［ＯＭＩＭにより供給］。
【００６５】
近年、一連の３つの独立した刊行物において、マウスおよびヒトのＯｖｒ１１０が、Ｔ細胞機能の活性化／抑制を非常に厳重に調節する分子の重要なクラスである、共刺激性分子のＴ細胞Ｂ７ファミリーの新しいメンバーとして同定された。Prasad et al., B7S1, a novel B7 family member that negatively regulates T cell activation, Immunity 18: 863-73 (2003)； Sica et al., B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively regulates T cell immunity, Immunity 18: 849-61 (2003)；およびZang et al., B7x: a widely expressed B7 family member that inhibits T cell activatioh, Proc. Natl Acad. Sci USA 100: 10388-92 (2003)。Ｂ７Ｓ１についてのマウス遺伝子の推定されたアミノ酸配列（Prasad 2003）は、我々が前に同定したＯｖｒ１１０分子と非常に相同であり、ヒトＢ７−Ｈ４／Ｂ７ｘ分子の推定配列（Sica 2003; Zang 2003）は、Ｏｖｒ１１０と同一であった。フローサイトメトリーによる間接免疫蛍光分析では、これらの著者の記載の通り、我々のＯｖｒ１１０モノクローナル抗体が活性化Ｔリンパ球集団に結合することをさらに確認した。Ｏｖｒ１１０について検討している文献のリストを下記に示す；これらの開示はここに参照として組み込まれる。
【００６６】
【表１】
2008519841.tif 000003
【表２】
2008519841.tif 000004
【００６７】
Ｏｖｒ１１０が明らかに、より攻撃的な卵巣癌および乳癌に限定されているとの我々の所見は、この細胞表面抗原を、これらおよび潜在的に他の種類の腫瘍の免疫療法についての魅力的な標的にする。
本明細書において用語「抗体」（Ａｂ）とは、それが所望の生物学的活性を示す限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば２重特異性抗体）、および抗体断片を含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書中では、「抗体」と同義的に用いる。
【００６８】
「単離された抗体」は、その天然の環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されたものである。その天然の環境の汚染された成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含むことができる。好ましくは、抗体を、次のように精製する：すなわち、（１）ローリー法により決定して、９５重量％より高い、および最も好ましくは９９重量％より高い抗体に、（２）回転カップ配列決定装置を用いることにより、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度に、または（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、クマジーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて、還元もしくは非還元条件の下で、均一に精製する。単離された抗体は、抗体の天然の環境の少なくとも１種の成分が存在しないため、組換え細胞内のin situの抗体を含む。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
【００６９】
塩基性４鎖抗体単位は、２つの同一な軽（Ｌ）鎖および２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成されている、ヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドと共に５つの塩基性ヘテロ四量体単位からなり、従って、１０個の抗原結合部位を含み、一方分泌されたＩｇＡ抗体は、重合して、Ｊ鎖と共に２〜５個の塩基性の４鎖単位を含む多価の集合を形成することができる）。ＩｇＧの場合において、４鎖単位は、一般的に、約１５０，０００ダルトンである。各々のＬ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖に結合しており、一方２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに依存して、１つまたは２つ以上のジスルフィド結合により互いに結合している。各々のＨおよびＬ鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端において、可変領域（ＶＨ）、続いて、αおよびγ鎖の各々について３つの定常領域（ＣＨ）並びにＬおよびＦアイソタイプについて４つのＣＨ領域を有する。各６Ｌ鎖は、Ｎ末端において可変領域（ＶＬ）、続いてその他方の末端において定常領域（ＣＬ）を有する。
【００７０】
ＶＬはＶＨと共に整列し、ＣＬは、重鎖の第１の定常領域（ＣＨＩ）と共に整列する。
特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の間で界面を形成すると考えられている。ＶＨおよびＶＬの一緒の対形成により、単一の抗原結合部位を形成する。抗体の異なるクラスの構造および特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition、Daniel P. Stites, Abba I. Teff and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, ７１頁および６章を参照。
【００７１】
すべての脊椎動物種からのＬ鎖は、これらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に識別できる種類の１つに割り当てることができる。これらの重鎖（ＣＨ）の定常領域のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、それぞれα、δ、ε、γおよびμと示される重鎖を有する。γおよびαクラスは、さらに、ＣＨ配列および機能における比較的主要でない差異に基づいてサブクラスに分けられ、例えばヒトは、以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。
【００７２】
用語「可変」は、可変領域の一定のセグメントが、配列について抗体間で大きく異なるという事実を意味する。Ｖ領域は抗原結合を媒介し、この特定の抗原への特定の抗体の特異性を規定する。しかし、可変性は、可変領域の１〜１０個のアミノ酸範囲にわたり均一に分散されてはいない。代わりにＶ領域は、各々９〜１２個のアミノ酸の長さの、「超可変領域」と呼ばれる極めての可変性の高い比較的短い領域により分離された、１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、比較的不変の伸長からなる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、各々４つのＦＲを含み、これらは大きくＰシート形状を採り、３つの超可変領域により結合されており、該領域はループを形成してＰシート構造に結合し、そしてある場合はこの一部を形成する。各々の鎖における超可変領域は、ＦＲにより一緒に密接に保持され、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照）。定常領域は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体の抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）への関与を示す。
【００７３】
用語「超可変領域」は、本明細書中で用いる際には、抗体の抗原結合に関与するアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（例えば、ＶＬ中のおよその残基２４〜３４（Ｌ１）、５０５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、並びにＶＨ中のおよそ１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（１１３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）からのアミノ酸残基および／または「超可変ループ」（例えば、ＶＬ中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｕ）、並びにＶＨ中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（１−１２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）からのこれら残基を含む。
【００７４】
本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能性のある突然変異体を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に指向される。さらに、種々の決定因子（エピトープ）に指向される種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に指向される。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、これらが、他の抗体により汚染されることなく合成され得るという点で、有利である。修飾語句「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすることと解釈すべきではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ方法により調製することができ、または細菌性、真核生物動物もしくは植物細胞における組換えＤＮＡ方法を用いて作製することができる（例えば米国特許第4,816,567号を参照）。「モノクローナル抗体」はまた、ファージ抗体ライブラリから、例えばClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載されている手法を用いて単離することができる。
【００７５】
本明細書中のモノクローナル抗体は、これらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて「キメラ」抗体並びにその断片を含み、該「キメラ」抗体とは、その重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の、対応する配列と同一であるか、またはこれと相同的であり、一方残りの１または２以上の鎖が、他の種に由来するか、または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の、対応する配列と同一であるか、またはこれと相同的であるものである（米国特許第4,816,567号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)を参照）。関連するキメラ抗体は、本明細書中では、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変領域抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む、「霊長類化された(primatized)」抗体を含む。
【００７６】
「無傷の」抗体は、抗原結合部位およびＣＬ並びに少なくとも重鎖定常領域、ＣＨＩ、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常領域は、天然配列定常領域（例えばヒト天然配列定常領域）またはこのアミノ酸配列変異体であってもよい。好ましくは、無傷の抗体は、１つまたは２つ以上のエフェクター機能を有する。
【００７７】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディー(diabody)；直線状抗体（米国特許第5,641,870号、例２；Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]を参照）；単一鎖抗体分子；並びに抗体断片から形成される多選択性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片および残りの「Ｆｃ」断片と呼ばれる２種の同一な抗原結合断片が生じ、表示は、容易に結晶化する能力を反映している。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）および１つの重鎖の第１の定常領域（ＣＨＩ）と共に完全なＬ鎖からなる。各々のＦａｂ断片は、抗原結合に関して１価であり、即ち、これは、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により１つの大きいＦ（ａｂ’）２断片が得られ、これは、ジスルフィドが結合した２つのＦａｂ断片にほぼ相当し、２価の抗原結合活性を有し、尚抗原を架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは２つ以上のシステインを含むＣＨＩ領域のカルボキシ末端において、追加のいくつかの残基を有することにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域の１または２以上のシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’についての、本明細書中での表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、もともとはこれらの間にヒンジシステインを有する８つのＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００７８】
Ｆｃ断片は、両方のＨ鎖がジスルフィドにより一緒に保持されたカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域における配列により決定され、この領域はまた、ある種類の細胞上に見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される部分である。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、厳密な、非共有的な会合における、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つの領域の折り畳みから、６つの超可変ループ（ＨおよびＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が放射し、これは、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変領域（または抗原に特異的な３つのみのＣＤＲを含むＦｖの半分）さえも、抗原を認識し、これを結合する能力を有するが、ただし、完全な結合部位よりも低い親和性においてである。
【００７９】
「単鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略記され、これは単一のポリペプチド鎖に結合したＶＨおよびＶＬ抗体領域を含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはさらに、ＶＨおよびＶＬ領域の間にポリペプチドリンカーを含み、これによってｓＦｖは、抗原結合のための所望の構造を形成することができる。ｓＦｖの概説のために、PluckthunによるThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Borrebaeck 1995、下記、を参照。
【００８０】
用語「ダイアボディー」は、小さい抗体断片であって、対形成が鎖内ではなくＶ領域の鎖間に達成され、これによって２価の断片、即ち２つの抗原結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨおよびＶＬ領域の間に短いリンカー（約５〜１０個の残基）を有するｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構成することにより調製された、前記小さい抗体断片を意味する。二重特異性ダイアボディーは、２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体であり、ここで、２つの抗体のＶＨおよびＶＬ領域は、異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディーは、例えばEP 404,097; WO 93/11161；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)にさらに完全に記載されている。
【００８１】
「天然配列」のポリペプチドは、天然のものに由来するポリペプチド（例えば抗体）と同一のアミノ酸配列を有するものである。このような天然配列のポリペプチドは、天然のものから単離することができるか、または組換えもしくは合成手段により産生することができる。従って、天然配列のポリペプチドは、天然に存在するヒトポリペプチド、マウスポリペプチドまたは任意の他の哺乳類種からのポリペプチドのアミノ酸配列を有することができる。
用語「アミノ酸配列変異体」は、ある程度に天然配列のポリペプチドと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、Ｏｖｒ１１０のアミノ酸配列変異体は、天然配列のＯｖｒ１１０と少なくとも約７０％の相同性、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の相同性、および最も好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。アミノ酸配列変異体は、天然のアミノ酸配列のアミノ酸配列内のある位置において、置換、欠失および／または挿入を有し得る。
【００８２】
抗体の「機能的断片または類似体」の語句は、全長抗体と共通する定性的生物学的活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能的断片または類似体は、ＩｇＥ免疫グロブリンに結合できるものであって、ここでかかる分子の能力が、高親和性の受容体であるＦｃεＲＩに結合する能力を有することを防止または実質的に低減するような様式で、結合することができるものである。
「相同性」は、最大のパーセンテージの相同性を達成するために、配列を整列させ、所要に応じて間隙を導入した後に同一である、アミノ酸配列変異体中の残基のパーセンテージとして定義される。整列のための方法およびコンピュータープログラムは、当該分野において十分知られている。配列の類似性を、任意の一般的な配列分析アルゴリズム、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴまたは他の変法のSmith-Waterman整列により測定することができる。T. F. Smith and M. S. Waterman, J. Mol. Biol. 147:195-197 (1981)およびW.R. Pearson, Genomics 11:635-650 (1991)を参照。
【００８３】
非ヒト（例えば、げっ歯動物）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体由来の最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基が、所望の抗体特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（供与者抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の、超可変領域からの残基により置換されている、ヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換されている。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体中または供与者抗体中に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに精巧にするためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的にすべてを含み、ここで、超可変ループのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、随意にまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照。
【００８４】
本明細書中において、「内部移行する」抗Ｏｖｒ１１０抗体は、哺乳類細胞上でＯｖｒ１１０（即ち細胞表面Ｏｖｒ１１０）に結合することによって、細胞により取り込まれる（即ち進入する）ものである。内部移行する抗体は、当然、抗体断片、ヒトまたはヒト化抗体および抗体結合体を含む。治療的用途のために、in vivoでの内部移行が意図される。内部移行した抗体分子の数は、Ｏｖｒ１１０発現細胞、特にＯｖｒ１１０発現癌細胞を死滅させるのに十分または適切な数である。抗体または抗体結合体の効能に依存して、いくつかの例において、１つの抗体分子の細胞中への取り込みは、該抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、ある毒素は、抗体に結合した毒素の１分子の内部移行が腫瘍細胞を死滅させるのに十分であるように、死滅させるのに高度に有効である。
【００８５】
抗Ｏｖｒ１１０抗体が、哺乳類細胞上のＯｖｒ１１０に結合すると内部移行するか否かは、以下の実験例において記載するものを含む、種々のアッセイにより決定することができる。例えば、in vivoでの内部移行を試験するために、試験抗体を標識し、ある細胞の表面上で発現されるＯｖｒ１１０を有することが知られている動物中に導入する。この抗体を、放射性標識するかまたは、例えば蛍光または金粒子で標識することができる。このアッセイに適する動物には、哺乳類、例えばヒトＯｖｒ１１０発現腫瘍移植または異種移植を含むＮＣＲヌードマウス、またはヒトＯｖｒ１１０を形質移入した細胞が導入されたマウス、またはヒトＯｖｒ１１０導入遺伝子を発現する遺伝子組換えマウスが含まれる。適切な対照には、試験抗体が施与されていないかまたは関連しない抗体が施与された動物、および関連する細胞上の他の抗原に対する抗体が施与され、この抗体が、抗原に結合すると内部移行することが知られている動物が含まれる。抗体を、動物に、例えば静脈内注射により投与することができる。好適な時間間隔において、この動物の組織切片を、既知の方法を用いて、または以下の実験例中に記載したように調製し、光学顕微鏡または電子顕微鏡により、内部移行および細胞中の内部移行した抗体の位置について分析することができる。in vitroでの内部移行について、細胞を、組織培養皿中で、培養培地に加えられた関連する抗体の存在または不存在においてインキュベートし、所望の時点において顕微鏡分析のために加工することができる。
【００８６】
細胞中の内部移行した標識抗体の存在を、顕微鏡により、または放射性標識した抗体を用いる場合にはオートラジオグラフィーにより、直接視覚化することができる。代替的に、定量的な生化学的アッセイにおいて、Ｏｖｒ１１０発現細胞を含む細胞の集団を、in vitroまたはin vivoで、放射性標識した試験抗体と接触させ、細胞（in vivoで接触させた場合には、次に、好適な量の時間の後に細胞を単離する）を、プロテアーゼで処理するか、またはこれに酸洗浄を施して、細胞表面上の内部移行していない抗体を除去する。細胞を粉砕し、細胞の各々のバッチに付随する１分当たりのプロテアーゼ耐性放射線計測値（ｃｐｍ）の値を、ホモジネートをシンチレーションカウンターを通過させることにより測定する。放射性標識抗体の既知の特定の活性に基づいて、細胞あたり内部移行した抗体分子の数を、粉砕した細胞のシンチレーションカウントから推定することができる。細胞は、in vitroで、好ましくは溶液形態で、以下のようにして、例えば、細胞を培養皿またはフラスコ中の細胞培養培地に加え、抗体を培地と十分に混合して、抗体に対する細胞の均一な曝露を確実にすることにより、抗体と「接触」させる。培養培地に加える代わりに、細胞を、試験抗体と、試験管内のＰＢＳなどの等張性溶液中で、所望の時間にわたり接触させることができる。患者に投与された際には、細胞は抗体とin vivoで、試験抗体を投与する任意の好適な方法、例えば以下に記載する投与方法により接触させられる。
【００８７】
in vivoでのＯｖｒ１１０発現細胞に結合した際の抗体の内部移行の速度が速くなるに従って、標的Ｏｖｒ１１０発現細胞に対する所望の死滅または増殖阻害効果を、例えば細胞毒性免疫結合体によりより迅速に達成することができる。好ましくは、抗Ｏｖｒ１１０抗体の内部移行の動力学は、これらが、Ｏｖｒ１１０発現標的細胞の迅速な死滅を好む程度である。従って、抗Ｏｖｒ１１０抗体は、好ましくはin vivoで抗体を投与してから２４時間以内に、一層好ましくは約１２時間以内に、さらに一層好ましくは約３０分〜１時間以内に、最も好ましくは約３０分以内に、内部移行の迅速な速度を示すのが望ましい。本発明は、in vivoで抗Ｏｖｒ１１０抗体を導入した時から約１５分程度で迅速に内部移行する抗体を提供する。抗体は、好ましくは、細胞表面上のＯｖｒ１１０に結合した際に、数時間以内に、好ましくは１時間以内に、さらに一層好ましくは１５〜３０分以内に、細胞中に内部移行する。
【００８８】
試験抗体が、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生された抗体を含む、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体により結合されたエピトープと同一のエピトープに結合することについて競合することができるか否かを試験するために、クロスブロッキング(cross-blocking)アッセイ、例えば競合的ＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。例示的な競合的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、マイクロタイタープレートのＯｖｒ１１０で被覆したウェルまたはＯｖｒ１１０で被覆したセファロースビーズを、候補の競合的抗体と共に、またはこれを伴わずにプレインキュベートし、次にビオチン標識した本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体を加える。ウェル中で、またはビーズ上でＯｖｒ１１０抗原に結合した、標識した抗Ｏｖｒ１１０抗体の量を、アビジン−ペルオキシダーゼ結合体および適切な基質を用いて測定する。
【００８９】
代替的に、抗Ｏｖｒ１１０抗体を、例えば放射性もしくは蛍光標識または幾つかの他の検出可能な、および測定可能な標識で標識することができる。抗原に結合する標識した抗Ｏｖｒ１１０抗体の量は、候補の競合的抗体（試験抗体）が、抗原上の同一のエピトープに結合することについて競合する能力に対して、逆相関を有する。即ち、同一のエピトープへの試験抗体の親和性が大きくなるに従って、より少量の標識した抗Ｏｖｒ１１０抗体が、抗原で被覆したウェルに結合する。候補の競合的抗体が、候補の競合的抗体の不存在において（しかし、既知の非競合的抗体の存在下であってもよい）平行して行う対照と比較して、抗Ｏｖｒ１１０抗体の結合を少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０〜５０％、さらに一層好ましくは少なくとも５０％遮断することができる場合には、候補の競合的な抗体は、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体と同一のエピトープに実質的に結合する抗体であるか、または、これと同一のエピトープに結合することについて競合する抗体であると考えられる。このアッセイの変更を行って、同一の定量的数値データに到達可能であることが、理解される。
【００９０】
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体、例えば次のモノクローナル抗体：Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (前にOvr110 A22.1として同定), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A 99.1, Ovr110.A102.1,  Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2およびOvr110.J3の任意のものは、同一の抗原に結合する他の抗体から区別する、その指定抗体の生物学的特徴の、１つまたは２つ以上を有するものであり、Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (前にOvr110 A22.1として同定), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A 99.1, Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2およびOvr110.J3は、Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (前にOvr110 A22.1として同定), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A 99.1, Ovr110.A102.1,  Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2およびOvr110.J3により結合されたものと同じエピトープに結合し（例えば、以下のモノクローナル抗体：Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (前にOvr110 A22.1として同定), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A 99.1, Ovr110.A102.1,  Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2およびOvr110.J3の、Ｏｖｒ１１０への結合と競合し、またはＯｖｒ１１０への結合を遮断し）、in vivoでＯｖｒ１１０発現腫瘍細胞を標的化することができ、in vivoで哺乳類細胞上のＯｖｒ１１０に結合すると内部移行することができる。同様に、Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1 (前にOvr110 A22.1として同定), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A 99.1, Ovr110.A102.1,  Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2およびOvr110.J3抗体の生物学的特性を有する抗体は、前記抗体と同じ、エピトープ結合、標的化、内部移行、腫瘍増殖阻害および細胞毒性の特性を有する。
【００９１】
用語「アンタゴニスト」抗体は最も広い意味で用いられ、本明細書中に開示した天然のＯｖｒ１１０タンパク質の生物学的活性を、部分的に、または完全に、遮断、阻害または中和する抗体を含む。Ｏｖｒ１１０ポリペプチドのアンタゴニストを同定するための方法は、Ｏｖｒ１１０ポリペプチドまたはＯｖｒ１１０を細胞表面上で発現する細胞を、候補のアンタゴニスト抗体と接触させること、および、Ｏｖｒ１１０ポリペプチドと通常に関連する１または２以上の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを、含むことができる。
【００９２】
「Ｏｖｒ１１０を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体」または「増殖阻害」抗体は、Ｏｖｒ１１０を発現するかまたは過剰発現する癌細胞に結合して、測定可能な増殖阻害をもたらすものである。好ましい増殖阻害抗Ｏｖｒ１１０抗体は、Ｏｖｒ１１０発現腫瘍細胞（例えば卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞および乳癌細胞）の増殖を、適切な対照と比較して２０％より大きく、好ましくは約２０％〜約５０％、およびさらに一層好ましくは５０％より大きく（例えば約５０％〜約１００％）阻害し、該対照とは、典型的には、試験する抗体で処置していない腫瘍細胞である。増殖阻害を、細胞培養物中の約０．１〜３０ｐｇ／ｍｌまたは約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、ここで、増殖阻害は、腫瘍細胞を抗体に曝露した１〜１０日後に決定される。in vivoでの腫瘍細胞の増殖阻害を、以下の実験例の節において記載するように、種々の方法で決定することができる。抗Ｏｖｒ１１０抗体を、約１ｐｇ／体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇで投与することにより、腫瘍の大きさまたは腫瘍細胞増殖の減少が、抗体の最初の投与から約５日〜３ヶ月以内、好ましくは約５〜３０日以内にもたらされる場合に、抗体はin vivoで増殖阻害的である。
【００９３】
「アポトーシスを誘発する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞断片化および／または膜小胞の形成（アポトーシス体と呼ばれる）により決定される、プログラムされた細胞死を誘発するものである。細胞は、通常、Ｏｖｒ１１０を過剰発現するものである。好ましくは、細胞は、腫瘍細胞、例えば卵巣細胞、膵臓細胞、肺細胞または乳房細胞である。種々の方法が、アポトーシスに関連する細胞の事象を評価するのに利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転座を、アネキシン結合により測定することができ；ＤＮＡ断片化を、ＤＮＡラダリング(laddering)により評価することができ；およびＤＮＡ断片化に伴う核／クロマチン縮合を、低二倍体細胞の任意の増大により評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘発する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞に対して約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合の誘発をもたらすものである。
【００９４】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を意味し、抗体アイソタイプにより変化する。抗体エフェクター機能の例には、以下のものが含まれる：Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方調節；およびＢ細胞活性化。
【００９５】
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用」または「ＡＤＣＣ」は、ある細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した、分泌されたＩｇが、これらの細胞毒性エフェクター細胞に対して、抗原を有する標的細胞に特異的に結合してその後標的細胞を細胞毒で死滅させることを可能にするような、細胞毒性の形態を意味する。抗体は細胞毒性細胞を「武装し(arm)」、このような死滅に絶対的に必要である。ＡＤＣＣを媒介するための主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３に要約されている。関連する分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、in vitroＡＤＣＣアッセイ、例えば米国特許第5,500,362号または5,821,337号に記載されているアッセイを行うことができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に、またはさらに、関連する分子のＡＤＣＣ活性を、in vivoで、例えばClynes et al.  PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデルにおいて、評価することができる。
【００９６】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述する。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）を結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、対立遺伝子多型および代替的にこれらの受容体のスプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性受容体」）が含まれ、これは、主にこの細胞質ドメインにおいて異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を、その細胞質ドメイン中に含む。抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢは、免疫受容体チロシンベースの抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を、その細胞質ドメイン中に含む。（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)の概説Ｍ．を参照）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126.330-41 (1995)中に概説されている。将来同定されるべきものを含む、他のＦｃＲは、本明細書中の用語「ＦｃＲ」により包含される。この用語はまた、母系性のＩｇＧの胎児への輸送に関連する新生児受容体、ＦｃＲｎを含む（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
【００９７】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたは２つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞および好中球が含まれ；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞を、天然の供給源、例えば血液から単離することができる。
「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。古典的な補体経路の活性化は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の、これらの同族の抗原に結合する抗体（適切なサブクラスの）への結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００９８】
用語「癌」および「癌性」は、調節されていない細胞増殖を典型的な特徴とする、哺乳類の生理学的状態を意味するかまたは記述する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病またはリンパ様悪性腫瘍が含まれるが、これらには限定されない。このような癌のより特定的な例には、扁平細胞癌（例えば上皮性扁平細胞癌）並びに、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平癌腫を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃癌(gastric or stomach cancer)、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓(kidney or renal)癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、脳および頭および首の癌、並びに関連する転移が含まれる。
【００９９】
「Ｏｖｒ１１０発現細胞」は、細胞表面上で内因性のまたは形質移入したＯｖｒ１１０を発現する細胞である。「Ｏｖｒ１１０発現癌」は、細胞表面上に存在するＯｖｒ１１０タンパク質を有する細胞を含む癌である。「Ｏｖｒ１１０発現癌」は、この細胞の表面上で、抗Ｏｖｒ１１０抗体が結合可能で癌について治療的効果を有するのに十分なレベルの、Ｏｖｒ１１０を産生する。Ｏｖｒ１１０を「過剰発現する」癌は、同一の組織型の非癌性細胞と比較して、顕著に高いレベルのＯｖｒ１１０をこの細胞表面において有するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、または増大した転写もしくは翻訳により生じ得る。Ｏｖｒ１１０過剰発現は、診断または予見アッセイにおいて、細胞の表面上に存在するＯｖｒ１１０タンパク質の増大したレベルを評価することにより（例えば免疫組織化学的アッセイ；ＦＡＣＳ分析により）、決定され得る。代替的に、または付加的に、細胞中のＯｖｒ１１０がコードする核酸またはｍＲＮＡのレベルを、例えば蛍光in situハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に刊行されたWO98/45479を参照）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法、例えばリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定することができる。また、Ｏｖｒ１１０過剰発現を、生物学的液体例えば血清中における抗原を、例えば抗体に基づくアッセイを用いて測定することにより、検討することができる（また、例えば米国特許第4,933,294号、１９９０年６月１２日刊行；W091/05264、１９９１年４月１８日刊行；米国特許第5,401,638号、１９９５年３月２８日刊行；およびSias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)を参照）。上記のアッセイとは別に、種々のin vivoアッセイが技術のある開業医に利用可能である。例えば、患者の体内の細胞を、随意に検出可能な標識、例えば放射性同位体で標識した抗体に曝露することができ、この抗体の患者の細胞への結合を、例えば放射性について外部走査することにより、または前に抗体に曝露した患者から採取した生検を分析することにより評価することができる。Ｏｖｒ１１０発現癌は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を含む。体液とは、身体の全ての内液、分泌液、放出および派生される液体を含み、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、涙、腹水、腹腔洗浄液、リンパ液、胆汁、精液、膿汁、羊水、房水、耳垢、乳糜、糜粥、腸液、月経、乳、粘液、胸膜液、汗、膣の潤滑液、嘔吐物、脳脊髄液および滑液である。
【０１００】
癌を処置するかまたは癌の症状を寛解する目的のための「哺乳類」は、任意の哺乳類を意味し、ヒト、家畜（domestic and farm animals）、並びに動物園の、スポーツの、またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【０１０１】
「処置する」または「処置」または「寛解」は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を意味し、ここで、目的は、標的となる病理学的状態または障害を防止するかまたは遅延させる（低下させる）ことである。処置を必要としているものには、すでに障害を有しているもの、および障害を有する傾向があるもの、または障害が防止されるべきであるものが含まれる。対象または哺乳類は、本発明の方法により抗Ｏｖｒ１１０抗体の治療的な量が施与された後に、該患者が、１つまたは２つの以下の観察可能なおよび／または測定可能な低減またはこの欠如を示す場合に、Ｏｖｒ１１０発現癌について成功して「処置される」：癌細胞の数の減少または癌細胞の欠如；腫瘍の大きさの減少；軟組織および骨中への癌の拡大を含む、癌細胞の末梢器官中への浸潤の阻害（即ち、ある程度までの遅延および好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（即ち、ある程度までの遅延および好ましくは停止）；腫瘍増殖のある程度までの阻害；および／または特定の癌に関連する１つまたは２つ以上の症状の、ある程度までの寛解；罹患率および死亡率の低下、並びに生活の質の問題における改善。抗Ｏｖｒ１１０抗体が、存在する癌細胞の増殖を防止し、かつ／またはこれを死滅させることができる程度に、これは、細胞増殖抑制性および／または細胞毒性であり得る。これらの徴候または症状の低減はまた、患者により感知され得る。
【０１０２】
疾患における成功した処置および改善を評価するための上記のパラメーターは、医師に十分知られている常習的な手順により容易に測定可能である。癌療法のために、例えば疾患の無増悪期間（ＴＴＰ）を評価し、かつ／または応答率（ＲＲ）を決定することにより、効能を測定することができる。
用語「治療的に有効な量」は、対象または哺乳類における疾患または障害を「処置する」のに有効な、抗体または薬剤の量を意味する。癌の場合において、薬剤の治療的に有効な量により、癌細胞の数が減少し；腫瘍のサイズが減少し；末梢器官中への癌細胞の浸潤が阻害され（即ち、ある程度まで遅延および好ましくは停止され）；腫瘍転移が阻害され（即ち、ある程度まで遅延および好ましくは停止され）；腫瘍増殖がある程度まで阻害され；かつ／または癌に関連する症状の１つまたは２つ以上が、ある程度まで寛解され得る。「処置する」の前記定義を参照。薬剤が、存在する癌細胞の増殖を防止し、かつ／またはこれを死滅させることができる程度に、これは、細胞増殖抑制性および／または細胞毒性であり得る。
【０１０３】
「慢性の」投与は、１種または２種以上の剤を、急性の方式に対して連続的な方式で投与して、長期間にわたり最初の治療的効果（活性）が維持されるようにすることを意味する。
「間欠性」投与は、中断なく連続的にはなされず、むしろ周期的な性質の処置である。
１種または２種以上の他の治療剤と「組み合わせて」の投与は、任意の順序での、同時の（併用）および連続的な投与を含む。
本明細書中で用いる「担体」には、用いられる投与量および濃度において曝露される細胞または哺乳類に無毒である、薬学的に許容し得る担体、添加剤または安定剤が含まれる。
【０１０４】
しばしば、生理学的に許容し得る担体は、水性のｐＨ緩衝された溶液である。生理学的に許容し得る担体の例には、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸および他の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール類、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびPLURONICS（登録商標）が含まれる。
【０１０５】
本明細書中で用いる用語「細胞毒性剤」は、細胞の機能を阻害もしくは防止し、かつ／または細胞の破壊を生じる物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えばメトトレキセート(methotrexate)、アドリアマイシン(adriamicin)、ビンカアルカロイド類(vinca alkaloids)（ビンクリスチン(vincristine)、ビンブラスチン(vinblastine)、エトポシド(etoposide)）、ドキソルビシン(doxorubicin)、メルファラン(melphalan)、マイトマイシン(mitomycin)Ｃ、クロラムブシル(chlorambucil)、ダウノルビシン(daunorubicin)または他の挿入剤、酵素およびこの断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、並びに毒素、例えば小分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素であって、これらの断片および／または変種を含むもの、例えばゲロニン(gelonin)、リシン、サポリン並びに以下に開示する種々の抗腫瘍剤または抗癌剤を含むことを意図する。他の細胞毒性剤を以下に記載する。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を生じる。
【０１０６】
本明細書中で用いる際には、「増殖阻害剤」は、細胞、特にＯｖｒ１１０発現癌細胞の増殖を、in vitroまたはin vivoのいずれかで阻害する化合物または組成物を意味する。従って、増殖阻害剤は、Ｓ期においてＯｖｒ１１０発現細胞のパーセンテージを顕著に減少させるものであってもよい。増殖阻害剤の例には、（Ｓ期以外の位置において）細胞サイクル進行を遮断する剤、例えばＧＩ停止およびＭ期停止を誘発する剤が含まれる。古典的なＭ期ブロッカーには、ビンカ類（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン(taxane)類およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン(epirubicin)、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシン(bleomycin)が含まれる。ＧＩを停止する剤はまたＳ期停止に波及し、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン(tamoxifen)、プレドニソン(prednisone)、ダカルバジン(dacarbazine)、メクロレタミン(mechlorethamine)、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシルおよびアラ(ara)−Ｃである。さらなる情報は、Murakami et al.によるThe Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel編、第１章、題名「細胞サイクル調節、発癌遺伝子および抗悪性腫瘍薬」(WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁中に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌薬である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、Bristol-Myers Squibb）の半合成類似体である。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の組み立てを促進し、脱重合を防止することにより微小管を安定化させ、これにより細胞中での有糸分裂の阻害をもたらす。
【０１０７】
本明細書中で用いる「標識」は、抗体に直接的または間接的に結合して、「標識された」抗体を生じる、検出可能な化合物または組成物を意味する。標識は、それ自体が検出可能であってもよく（例えば放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または、酵素的標識の場合においては、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒してもよい。
【０１０８】
本明細書中で用いる用語「エピトープタグ化」は、「タグポリペプチド」に融合した抗Ｏｖｒ１１０抗体ポリペプチドを含む、キメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、抗体を作成することができるエピトープを提供するのに十分であるが、これが融合するＩｇポリペプチドの活性に干渉しない程度には十分短い、残基を有する。タグポリペプチドはまた、好ましくは、極めてユニークであり、従って抗体は、他のエピトープと実質的に交差反応しない。好適なタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも６個のアミノ酸残基および通常８〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸残基）を有する。
【０１０９】
「小分子」は、本明細書中では、約５００ダルトンより小さい分子量を有すると定義される。
用語「添付文書」は、慣例的に治療製品の市販の包装中に含まれ、このような治療製品の使用に関する適応、使用、投与量、投与、禁忌および／または注意についての情報を含む使用説明書を意味するために用いる。
「単離された核酸分子」は、核酸分子、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーであって、これらは実質的に他のゲノムＤＮＡ配列およびタンパク質または複合体、例えばリボゾームおよびポリメラーゼから分離され、必然的にに天然配列を伴う。この用語は、この天然に存在する環境から取り除かれた核酸分子を包含し、組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物および、化学的に合成された類似体または異種性の系により生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な核酸分子は、核酸分子の単離された形態を含む。
【０１１０】
「ベクター」は、シャトルベクターおよび発現ベクターを含み、例えばプラスミド、コスミドまたはファージミドを含む。典型的に、プラスミド構成物（construct）はまた、細菌におけるプラスミドの複製および選択のための、複製の起点（例えば複製のＣｏｌＥｌ起点）および選択可能なマーカー（例えばアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）をそれぞれ含む。「発現ベクター」は、原核生物、例えば細菌または真核生物細胞における、本発明の抗体断片を含む抗体の発現に必要な対照配列または調節要素を含むベクターを意味する。好適なベクターを以下に開示する。
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体を産生する細胞には、親ハイブリドーマ細胞、例えばＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ、並びに抗体をコードする核酸が導入された、細菌および真核生物宿主細胞が含まれる。好適な宿主細胞を、以下に開示する。
【０１１１】
ＲＮＡ干渉は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを意味する(Fire et al., 1998, Nature, 391, 806)。植物における対応するプロセスは、一般に、転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、また真菌における停止を意味する。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、種々の植物相および門により一般的に共有された、外来の遺伝子の発現を防止するために用いられる、進化的に保存された細胞防御機構であると考えられる(Fire et al., 1999, Trends Genet., 15, 358)。外来の遺伝子発現からのこのような保護は、相同的な単鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答による、ウイルス感染またはホストゲノム中へのトランスポゾン要素の無秩序な一体化に由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に応答して、進化した場合がある。細胞中のｄｓＲＮＡの存在によりＲＮＡｉ応答が誘発されるが、機構は未だ完全には特徴付けられていない。この機構は、プロテインキナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニレートシンセターゼのｄｓＲＮＡ媒介活性化からもたらされ、結果としてリボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断を生じさせるインターフェロン応答とは、異なると考えられる。
【０１１２】
細胞中に長いｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られている、ｄｓＲＮＡの短い片中へのｄｓＲＮＡの加工に関与する(Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363)。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは、典型的には、長さが約２１〜２３ヌクレオチドであり、約１９個の塩基対二本鎖を含む。ダイサーはまた、翻訳制御に関係する、保存された構造のＲＮＡ前駆体からの２１および２２ヌクレオチドの小さい一時的なＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切除に関係していた(Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834)。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する、一般にＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央において起こる(Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188)。
【０１１３】
低分子干渉ＲＮＡが媒介するＲＮＡｉは、種々の系において研究されている。Fire et al., 1998, Nature, 391, 806は、C. Elegans中のＲＮＡｉを最初に観察した。Wianny and Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70には、マウス胚におけるｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉが記載されている。Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293には、ｄｓＲＮＡを形質移入したショウジョウバエ細胞中のＲＮＡｉが記載されている。Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494には、ヒト胚腎臓およびＨｅＬａ細胞を含む培養した哺乳類細胞中の、合成２１ヌクレオチドＲＮＡの二本鎖の導入により誘発されたＲＮＡｉが記載されている。ショウジョウバエ胚可溶化液における最近の研究（Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877）により、効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するのに必須のｓｉＲＮＡ長さ、構造、化学的組成および配列についての一定の必要条件が明らかになった。これらの研究により、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二本鎖が、２個のヌクレオチド３’−オーバーハングを含む際に、最も活性であることが示された。さらに、２’−デオキシ（２’−Ｈ）または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを有する一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖の完全な置換により、ＲＮＡｉ活性が消失し、一方３’末端ｓｉＲＮＡオーバーハングヌクレオチドのデオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）による置換は、耐容されることが示された。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心での単一のミスマッチ配列はまた、ＲＮＡｉ活性を消失させることが示された。さらに、これらの研究はまた、標的のＲＮＡ中の切断部位の位置が、ｓｉＲＮＡ案内配列の３’末端ではなく、５’末端により定められることを示す(Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877)。他の研究により、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的相補的鎖上の５’リン酸塩がｓｉＲＮＡ活性のために必要であること、および、ＡＴＰによってｓｉＲＮＡ上の５’リン酸塩部分が維持されることが示された（Nykanen et al., 2001, Cell, 107, 309)。
【０１１４】
研究により、２個のヌクレオチド３’オーバーハングを有する２１量体のｓｉＲＮＡ二本鎖の３’オーバーハングセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置換することは、ＲＮＡｉ活性に対して悪影響を有さないことが示された。ｓｉＲＮＡの各末端上での４個までのヌクレオチドの、デオキシリボヌクレオチドによる置換は、良好に耐容される一方、デオキシリボヌクレオチドによる完全な置換の結果、ＲＮＡｉ活性はもたらされないことが、報告された(Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877)。さらに、Elbashir et al.、上記はまた、ｓｉＲＮＡの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドでの置換により、ＲＮＡｉ活性が完全に消失されることを報告している。Li et al., 国際ＰＣＴ公開WO 00/44914およびBeach et al., 国際ＰＣＴ公開WO 01/68836は、共に、ｓｉＲＮＡが、「リン酸塩−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかに対する修飾を含むことができ、少なくとも１個の窒素または硫黄ヘテロ原子を含む」ことを示唆しているが、いずれの出願にも、これらの修飾がどの程度までｓｉＲＮＡ分子において耐容されるかが教示されておらず、かかる修飾されたｓｉＲＮＡのいかなる例も提供されていない。Kreutzer and Limmer、カナダ国特許出願第2,359,180号にはまた、ｄｓＲＮＡ構成物において用いて、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼＰＫＲ、特に２’−アミノまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、および２’−Ｏまたは４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドの活性化を妨げるための、ある化学的修飾が記載されている。しかし、KreutzerおよびLimmerは、同様に、これらの修飾がどの程度までｓｉＲＮＡ分子において耐容されるかを示しておらず、かかる修飾されたｓｉＲＮＡのいかなる例も提供していない。
【０１１５】
Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1977-1087は、C. elegansにおけるｕｎｃ−２２遺伝子を標的化するある化学的修飾を、長い（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写物を用いて試験した。この著者は、Ｔ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼを有するチオリン酸塩ヌクレオチド類似体を包含させることによる、これらのｓｉＲＮＡ転写物中へのチオリン酸塩残基の導入を記載し、「２つの（ホスホロチオエート）修飾塩基を有するＲＮＡもまた、ＲＮＡｉトリガーとしての有効性の顕著な低下を有し（データは示されず）；２つよりも多い残基の（ホスホロチオエート）修飾により、in vitroでＲＮＡが大きく不安定化され、我々は、干渉活性を分析することができなかった」ことを観察した。同上の1081。この著者はまた、長いｓｉＲＮＡ転写物中のヌクレオチド糖の２’位置において、ある修飾を試験し、デオキシヌクレオチドのリボヌクレオチドによる置換が、「干渉活性を顕著に低下させた」ことを観察し、特にウリジンのチミジンへの、および／またはシチジンのデオキシシチジンへの置換の場合においてそうであった。同上。さらに、この著者は、ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖における４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、３−（アミノアリル）ウラシルの、ウラシルへの置換、およびイノシンのグアノシンへの置換を含む、ある塩基修飾を試験し、いずれの鎖中に含まれる際にも、４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシルがすべて良好に耐容される一方、イノシンが「干渉活性を顕著に低下させた」ことを見出した。５−ヨードウラシルおよび３−（アミノアリル）ウラシルの、アンチセンス鎖における導入の結果、ＲＮＡｉ活性の顕著な低下ももたらされた。
【０１１６】
Beach et al., 国際ＰＣＴ公開WO 01/68836には、内因的に誘導されたｄｓＲＮＡを用いた、遺伝子発現を減衰する特定の方法が記載されている。Tuschl et al., 国際ＰＣＴ公開WO 01/75164には、in vitroのショウジョウバエＲＮＡｉ系並びに、特定のｓｉＲＮＡ分子の、ある機能的ゲノムおよびある治療的用途のための使用が記載されている；しかし、Tuschl, 2001, Chem. Biochem., 2, 239-245では、「インターフェロン応答を活性化する危険」のために、ＲＮＡｉを用いて遺伝子的疾患またはウイルス感染を治療することは、できないのではないかと疑っている。Li et al., 国際ＰＣＴ公開WO 00/44914には、ある標的遺伝子の発現の減衰に用いるための、特定のｄｓＲＮＡの使用が記載されている。Zernicka-Goetz et al., 国際ＰＣＴ公開WO 01/36646には、哺乳類細胞における特定の遺伝子の発現を、あるｄｓＲＮＡ分子を用いて阻害するための、ある方法が記載されている。Fire et al., 国際ＰＣＴ公開WO 99/32619には、遺伝子発現の阻害に用いるための、あるｄｓＲＮＡ分子を細胞中に導入する特定の方法が記載されている。Plaetinck et al., 国際ＰＣＴ公開WO 00/01846には、細胞中の特定の表現型を付与する原因となる特定の遺伝子を、特定のｄｓＲＮＡ分子を用いて同定するためのある方法が記載されている。Mello et al., 国際ＰＣＴ公開WO 01/29058には、ｄｓＲＮＡ媒介ＲＮＡｉに関与する特定の遺伝子の同定が記載されている。Deschamps Depaillette et al., 国際ＰＣＴ公開WO 99/07409には、ある抗ウイルス剤と組み合わされた、特定のｄｓＲＮＡ分子からなる特定の組成物が記載されている。Driscoll et al., 国際ＰＣＴ公開WO 01/49844には、標的の生物における遺伝子サイレンシングの促進に用いるための、特定のＤＮＡ構成物が記載されている。Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1977-1087には、C. elegansのｕｎｃ−２２遺伝子を標的にする、特定の化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ構成物が記載されている。Tuschl et al., 国際ＰＣＴ公開WO 02/44321には、ある合成ｓｉＲＮＡ構成物が記載されている。
【０１１７】
本発明の組成物および方法
本発明は、抗Ｏｖｒ１１０抗体を提供する。好ましくは、抗Ｏｖｒ１１０抗体は、哺乳類細胞上の細胞表面Ｏｖｒ１１０に結合すると内部移行する。抗Ｏｖｒ１１０抗体はまた、Ｏｖｒ１１０を有する腫瘍細胞を破壊するか、またはこの破壊をもたらすことができる。
【０１１８】
Ｏｖｒ１１０が内部移行競合的であることは、明らかではなかった。さらに、抗体が内部移行する能力は、親和性、結合活性、および抗体のアイソタイプ、およびこれが結合するエピトープを含むいくつかの要因に依存する。本発明者らは、本明細書中で、細胞表面Ｏｖｒ１１０が、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体により結合されると内部移行競合的であることを実証した。さらに、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体が、in vivoでＯｖｒ１１０発現腫瘍細胞を特定的に標的化し、これらの細胞を阻害するかまたは死滅させることができることが、実証された。抗Ｏｖｒ１１０抗体のこれらのin vivoでの腫瘍標的化、内部移行および増殖阻害特性により、これらの抗体は、治療的使用、例えば、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を含む種々の癌の処置において、極めて好適となる。抗Ｏｖｒ１１０抗体の内部移行は、例えば、抗体または抗体結合体が作用の細胞内部位を有する場合、およびこの抗体に結合した細胞毒性剤（例えば毒素カリケアマイシン）が血漿膜を容易に横断しない場合に、好ましい。内部移行は、抗体または抗体に結合した剤が作用の細胞内部位を有さない場合、例えば抗体が、ＡＤＣＣまたはある他の機構により腫瘍細胞を死滅させることができる場合には、必要ではない。
【０１１９】
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体はまた、種々の非治療的用途を有する。本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体は、Ｏｖｒ１１０発現癌の診断およびステージ分類のために有用となり得る（例えば放射性イメージングにおいて）。これらを、単独で、または他の卵巣癌マーカーと組み合わせて用いることができ、該マーカーには、限定されることなく、ＣＡ１２５、ＨＥ４およびメソセリンが含まれる。この抗体はまた、Ｏｖｒ１１０を細胞から精製または免疫沈殿するために、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットなどにおいて、in vitroでＯｖｒ１１０を検出および定量するために、他の細胞の精製における１ステップとして、Ｏｖｒ１１０発現細胞を混合細胞の集団から死滅させ排除するために、有用である。本発明の内部移行する抗Ｏｖｒ１１０抗体は、本明細書中で「抗体」の定義により包含される種々の形態であってもよい。従って、抗体は、全長または無傷な抗体、抗体断片、天然配列の抗体またはアミノ酸変異体、ヒト化、キメラまたは融合抗体、免疫結合体およびこれらの機能的断片を含む。融合抗体においては、抗体配列は、異種性のポリペプチド配列に融合される。抗体を、Ｆｃ領域において修飾して、所望のエフェクター機能を提供することができる。以下の章において一層詳細に記載するように、適切なＦｃ領域を用いて、細胞表面上に結合した裸の抗体は、例えば抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）により、または補体依存性細胞傷害作用において補体を獲得することにより、またはある他の機構により、細胞毒性を誘発することができる。代替的に、エフェクター機能を消失させるかまたは低減させて、副作用または治療の合併症を最小にするのが望ましい場合において、ある他のＦｃ領域を用いることができる。
【０１２０】
抗体は、本発明の抗体により結合された同一のエピトープに結合することについて競合することができ、または実質的にこれに結合する。本発明のこの抗Ｏｖｒ１１０抗体の生物学的特徴を有する抗体も意図され、例えば、特にin vivoでの腫瘍標的化、内部移行およびすべての細胞増殖阻害または細胞毒性特徴を含む、ＡＴＣＣ受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129に一致するハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体の生物学的特徴を有する抗Ｏｖｒ１１０抗体である。具体的に提供されるのは、ヒトＯｖｒ１１０のアミノ酸３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２１０、２１０〜２２０、２２０〜２３０、２３０〜２４０、２４０〜２５０、２５０〜２６０、２６０〜２７０、２７０〜２８２、または２１〜３５、３１〜４５、４１〜５５、５１〜６５、６１〜７５、７１〜８５、８１〜９５、９１〜１０５、１０１〜１１５、１１１〜１２５、１２１〜１３５、１３１〜１４５、１４１〜１５５、１５１〜１６５、１６１〜１７５、１７１〜１８５、１８１〜１９５、１９１〜２０５、２０１〜２１５、２１１〜２２５、２２１〜２３５、２３１〜２４５、２４１〜２５５、２５１〜２８５において存在するエピトープに結合する、抗Ｏｖｒ１１０抗体である。
【０１２１】
上記抗体を生産する方法を以下にさらに詳細に述べる。
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体は、哺乳類におけるＯｖｒ１１０発現癌を処置するかまたは癌の１つもしくは２つ以上の症状を寛解するのに、有用である。このような癌は、卵巣、膵臓、肺もしくは乳癌、尿路の癌、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、および卵巣癌、より具体的には前立腺腺癌、腎臓細胞癌腫、直腸結腸腺癌、肺腺癌、肺扁平細胞癌腫および胸膜中皮腫を含む。癌は、上記の任意の転移性癌、例えば卵巣癌転移、膵臓癌転移、肺癌転移および乳癌転移を包含する。この抗体は、哺乳類におけるＯｖｒ１１０を発現する癌細胞の少なくとも一部に結合することができ、好ましくはＨＡＭＡ応答を誘発しないかまたはこれを最小化するものである。好ましくは、抗体は、in vivoまたはin vitroで、細胞上のＯｖｒ１１０に結合すると、Ｏｖｒ１１０発現癌細胞を破壊または死滅させるか、またはかかる腫瘍細胞の増殖を阻害するのに、有効なものである。かかる抗体は、裸の抗Ｏｖｒ１１０抗体（いかなる剤にも結合していないもの）を含む。in vivoでの腫瘍増殖阻害特性を有する裸の抗Ｏｖｒ１１０抗体には、以下の実験例に記載する抗体が含まれる。細胞毒性または細胞増殖阻害特性を有する裸の抗体を、さらに細胞毒性剤と結合させて、これらを腫瘍細胞破壊において尚一層有効にすることができる。例えばこの抗体を細胞毒性剤と結合させて、以下に記載するように免疫結合体を形成することにより、抗Ｏｖｒ１１０抗体に細胞毒性特性を付与することができる。細胞毒性剤または増殖阻害剤は、好ましくは小分子である。毒素、例えばメイタンシン(maytansin)、メイタンシノイド(maytansinoid)、サポリン、ゲロニン、リシンまたはカリケアマイシンおよびこれらの類似体または誘導体が、好ましい。
【０１２２】
本発明は、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体および担体を含む組成物を提供する。癌の処置のために、組成物を、かかる処置を必要としている患者に投与することができ、ここでこの組成物は、免疫結合体としてまたは裸の抗体として存在する、１種または２種以上の抗Ｏｖｒ１１０抗体を含むことができる。さらにこの組成物は、これらの抗体を、他の治療剤、例えば化学療法剤を含む細胞毒性剤または増殖阻害剤と組み合わせて、含むことができる。本発明はまた、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体および担体を含む製剤を提供する。この製剤は、薬学的に許容し得る担体を含む治療的製剤であってもよい。
【０１２３】
本発明の他の観点は、内部移行する抗Ｏｖｒ１１０抗体をコードする、単離された核酸である。ＨおよびＬ鎖の両方並びに特に超可変領域残基をコードする核酸、天然配列の抗体および変異体をコードする鎖、抗体の修飾物およびヒト化された様式が包含される。
【０１２４】
本発明はまた、哺乳類におけるＯｖｒ１１０発現癌を処置するかまたはこの癌の１つもしくは２つ以上の症状を寛解するのに有用な方法であって、内部移行する抗Ｏｖｒ１１０抗体の治療的に有効な量を該哺乳類に投与することを含む、前記方法を提供する。この抗体治療組成物を、医師により指示されたように、短期間（急性）もしくは慢性的に、または間欠的に投与することができる。また提供されるのは、Ｏｖｒ１１０発現細胞の増殖を阻害し、これを死滅させる方法である。最後に、本発明はまた、本発明の少なくとも１種の抗体、好ましくは本発明の少なくとも１種の内部移行する抗Ｏｖｒ１１０抗体を含む、キットおよび製造品を提供する。抗Ｏｖｒ１１０抗体を含むキットは、Ｏｖｒ１１０発現の検出において、または治療的もしくは診断的アッセイにおいて、例えばＯｖｒ１１０細胞死滅アッセイのために、またはＯｖｒ１１０の細胞からの精製および／または免疫沈殿のために、用途が見出される。例えば、Ｏｖｒ１１０の単離および精製のために、キットは、固体支持体、例えば組織培養プレートまたはビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合した抗Ｏｖｒ１１０抗体を含むことができる。in vitroでの、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおけるＯｖｒ１１０の検出および定量のための抗体を含むキットを、提供することができる。検出に有用なこのような抗体は、標識、例えば蛍光または放射性標識と共に提供することができる。
【０１２５】
抗Ｏｖｒ１１０抗体の産生
以下に、本発明において有用な抗体の産生のための例示的な手法を記載する。これらの手法のいくつかを、さらに例１に記載する。抗体の産生のために用いるべきＯｖｒ１１０抗原は、例えば、膜貫通配列を欠いているＯｖｒ１１０の可溶性形態またはタンパク質の選択された部分に対する合成ペプチドを含む、全長ポリペプチドまたはこの一部であってもよい。
【０１２６】
代替的に、その細胞表面においてＯｖｒ１１０を発現する細胞（例えばＯｖｒ１１０を過剰発現するように形質転換されたＣＨＯまたはＮＩＨ−３Ｔ３細胞；卵巣、膵臓、肺、乳房もしくは他のＯｖｒ１１０発現腫瘍細胞系）、またはかかる細胞から調製される膜を用いて、抗体を生成することができる。ヒトおよびマウスＯｖｒ１１０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、前に示したように入手可能である。Ｏｖｒ１１０は、標準的な組換えＤＮＡ方法を用いて、原核細胞、例えば細菌細胞、または真核細胞において組換え的に産生し、これから単離することができる。Ｏｖｒ１１０を、タグ化して（例えばエピトープタグ）、または他の融合タンパク質として発現させて、種々のアッセイにおけるその単離およびその同定を容易にすることができる。
種々のタグおよび融合配列に結合する抗体または結合タンパク質は、以下に詳しく述べるように入手可能である。抗体を生成するのに有用なＯｖｒ１１０の他の形態は、当業者に明らかである。
【０１２７】
タグ
種々のタグポリペプチドおよびこれらのそれぞれの抗体が、当該分野においてよく知られている。例には、ポリヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリヒスチジングリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびこの抗体１２ＣＡ５(Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988))；ｃ−ｍｙｃタグ並びにこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体(Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985))；並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびこの抗体(Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990))が含まれる。ＦＬＡＧペプチド(Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988))は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体により認識される(Eastman Kodak Co., New Haven, CT)。ＦＬＡＧペプチドを含むタンパク質の精製は、免疫親和性クロマトグラフィーにより、アガロースに共有結合した抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体を含むアフィニティーマトリックスを用いて行うことができる(Eastman Kodak Co., New Haven, CT)。他のタグポリペプチドには、ＫＴ３エピトープペプチド[Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]；α−チューブリンエピトープペプチド(Skinner et al., J. Biol. Chenz., 266:15163-15166 (1991))；およびＴ７遺伝子タンパク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))が含まれる。
【０１２８】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、動物、好ましくは非ヒト動物において、関連する抗原およびアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により生じる。関連する抗原を、免疫化すべき種において免疫原性であるタンパク質に結合させることが（特に合成ペプチドを用いる場合）、有用であり得る。例えば、抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、二官能化または誘導化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を用いて結合させることができる。結合体はまた、タンパク質融合として組換え細胞培養物中に作製することができる。
【０１２９】
動物を、抗原、免疫原性結合体または誘導体に対して、例えば５〜１００ｐｇのタンパク質または結合体（それぞれウサギまたはマウスに対して）を、３容量の完全フロイントアジュバントと混ぜ合わせ、溶液を皮内に、複数の部位において注射することにより免疫化することができる。１ヶ月後、この動物を、完全フロイントアジュバント中のペプチドまたは結合体の最初の量の１／５〜１／１０で、複数の部位における皮下注射により追加免疫する。７〜１４日後に動物を放血させ、血清を、抗体力価についてアッセイする。動物を、力価が水平状態になるまで追加免疫する。また、凝集剤、例えばミョウバンを好適に用いて、免疫応答を増強する。
【０１３０】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、最初にKohler et al., Nature, 256:495 (1975)により記載されたハイブリドーマ方法を用いて作製するか、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第4,816,567号）により、作製することができる。ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切なホスト動物、例えばハムスターを、上記のように免疫化して、免疫化のために用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を顕在化させる。代替的に、リンパ球を、in vitroで免疫化することができる。免疫化の後、リンパ球を単離し、次に「融合パートナー」、例えば骨髄腫細胞系と、好適な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies. Principles and Practice, pp 103 (Academic Press, 1986))。
【０１３１】
このように調製したハイブリドーマ細胞を好適な培養培地中に播種し、この中で増殖させ、この培地は好ましくは、融合していない融合パートナー例えば親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する、１種または２種以上の物質を含む。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合には、ハイブリドーマのための選択的な培養培地は、典型的にヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、この物質が、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【０１３２】
好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、融合していない親細胞に対して選択する選択的培地に高感度であるものである。好ましい骨髄腫細胞系は、マウス骨髄腫系、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−ＩＩマウス腫瘍に由来するもの並びにＳＰ−２および誘導体、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville, Maryland USAから入手できるＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫(heteromyeloma)細胞系はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；およびBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０１３３】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地を、抗原に指向されたモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈殿により、またはin vitro結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定する。
【０１３４】
モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載されているScatchard分析により決定することができる。所望の特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後に、クローンを、制限希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 103 (Academic Press, 1986))。この目的に適する培養培地には、例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞を、in vivoで、動物における腹水腫瘍として、例えばマウス中への細胞のｉ．ｐ．注射により増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、培養培地、腹水流体または血清から、慣用の抗体精製手順、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡまたはプロテインＧ−セファロースを用いて）またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などにより好適に分離する。
【０１３５】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用の手順を用いて（例えばマウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、容易に単離し、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として作用する。単離した後に、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次にこれを、他の方法では抗体タンパク質を産生しない、原核または真核宿主細胞、例えば大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞に形質転換または形質移入して、組換え宿主細胞中にモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの、細菌における組換え発現についての概説記事は、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)およびPhickthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)を含む。
【０１３６】
さらに、モノクローナル抗体または抗体断片を、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)中に記載された手法を用いて生成した抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)には、ファージライブラリを用いた、マウスおよびヒト抗体の単離がそれぞれ記載されている。その後の刊行物には、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の、連鎖混合による産生(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、並びに極めて大きいファージライブラリを構成するための方法としての、組み合わせ感染およびin vivo組換え(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))が記載されている。従ってこれらの手法は、モノクローナル抗体を単離するための、伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ手法に代わる実行可能な代替法である。
【０１３７】
抗体をコードするＤＮＡを修飾して、キメラまたは融合抗体ポリペプチドを産生することができ、この修飾は例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常領域（ＣＨおよびＣＬ）配列を、相同的なマウス配列で置換することによる（米国特許第4,816,567号；およびMorrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）、または免疫グロブリンコード配列を、非免疫グロブリンポリペプチド（異種性ポリペプチド）についてのコード配列の全部または一部と融合することによる修飾である。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常領域で置換することができ、または、これらを抗体の１つの抗原組み合わせ部位の可変領域で置換して、１つの抗原への特異性を有する１つの抗原組み合わせ部位と、異なる抗原への特異性を有する他の抗原組み合わせ部位とを含む、キメラの２価の抗体を作製する。
【０１３８】
ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、この中に非ヒトである供給源から導入された１つまたは２つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは、典型的には、「移入」可変領域から採取される。ヒト化は、本質的に、Winterおよび共同研究者らの方法に従って(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより行うことができる。従って、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第4,816,567号）、ここで、無傷のヒト可変領域より顕著に小さいものが、非ヒト種からの対応する配列により置換されている。実際にヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基および場合によってはいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における同様の部位からの残基により置換されている、ヒト抗体である。
【０１３９】
ヒト化抗体の作製において用いるべき、軽および重の両方のヒト可変領域の選択は、抗体のヒトの治療的使用を意図する際には、抗原性およびＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）を低減するのに極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」方法によれば、げっ歯類抗体の可変領域の配列を、既知のヒト可変領域配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。げっ歯類のものに最も近いヒトＶ領域配列を同定し、この中のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）が、ヒト化抗体のために受容される(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987))。他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する、特定のフレームワーク領域を用いる。同一のフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために用いることができる(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993))。
【０１４０】
抗体が、抗原に対する高い結合親和性および他の好ましい生物学的特性を維持してヒト化されるのが、さらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体を、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列の分析のプロセスおよび種々の概念的ヒト化生成物により調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者に精通されている。
【０１４１】
選択された免疫グロブリン候補配列の可能な三次元高次構造を例示し、表示するコンピュータープログラムが、利用可能である。これらの表示の検査により、免疫グロブリン候補配列の機能においての、可能性のある残基の作用の分析、即ちこの抗原に結合する免疫グロブリン候補の能力に影響する残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基を受容者から選択して組み合わせ、配列を移入して、所望の抗体特性、例えば１または２以上の標的抗原への増大した親和性を達成することができる。一般に超可変領域残基は、抗原結合への影響において直接的に、および最も実質的に関与する。
ヒト化抗Ｏｖｒ１１０抗体の種々の形態が意図される。例えば、ヒト化抗体は、随意に１種または２種以上の細胞毒性剤と結合して免疫結合体を生じる抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。代替的に、ヒト化抗体は、無傷の抗体、例えば無傷のＩｇＧ１抗体であってもよい。
【０１４２】
ヒト抗体
ヒト化の代替として、ヒト抗体を生成することができる。例えば現在では、免疫化にされると、内因性免疫グロブリン産生の不存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができる遺伝子組換え動物（例えばマウス）を作製することが可能である。例えば、キメラの生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記述された。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを、かかる生殖系列突然変異マウスに移した結果、抗原チャレンジによりヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,806号、5,569,825号、5,591,669号（すべてGenPharm）；5,545,807号を参照；および、代替的に、ファージ提示手法(McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))を用いて、ヒト抗体および抗体断片を、in vitroで、免疫化していない供与者からの免疫グロブリン可変（Ｖ）領域遺伝子レパートリーから産生することができる。この手法によれば、抗体Ｖ領域遺伝子を、インフレームで、糸状バクテリオファージ、例えばＭｌ３またはｆｄの主要な、または主要でない被覆タンパク質遺伝子のいずれかの中にクローニングし、ファージ粒子の表面上の機能的抗体断片として提示する。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能的な特性に基づく選択によっても、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がもたらされる。従って、このファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージ提示法を、種々の様式で行うことができ、これは例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)中に概説されている。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージ提示法のために用いることができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)は、抗オキサゾロン抗体の種々のアレイを、免疫化したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さい無秩序な組み合わせライブラリから単離した。免疫化していないヒト供与者からのＶ遺伝子のレパートリーを構成することができ、抗原（自己抗原を含む）の種々のアレイに対する抗体を、本質的にMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)またはGriffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)により記載された手法に従って単離することができる。また米国特許第5,565,332号および5,573,905号も参照。上記したように、ヒト抗体もまた、in vitro活性化Ｂ細胞により生成することができる（米国特許第5,567,610号および5,229,275号を参照）。
【０１４３】
抗体断片
ある状況においては、完全抗体よりむしろ抗体断片を用いる方に利点がある。断片のより小さいサイズにより、迅速なクリアランスが可能になり、固体腫瘍へのアクセスの改善がもたらされ得る。種々の手法が、抗体断片の産生のために開発された。伝統的に、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク質分解消化に由来した（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)；およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照）。しかしこれらの断片は、現在では、組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌において発現され、これから分泌されることができ、従って大量のこれら断片の容易な産生が可能になる。抗体断片を、上記した抗体ファージライブラリから単離することができる。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を、大腸菌から直接回収し、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ）２断片を形成することができる(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。他の方法において、Ｆ（ａｂ）２断片を、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、増大したin vivoでの半減期を有するＦａｂおよびＦ（ａｂ）２断片は、米国特許第5,869,046号に記載されている。抗体断片の産生のための他の手法は、技術のある実行者に明らかである。選択された抗体はまた、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）であってもよい。WO 93/16185；米国特許第5,571,894号および米国特許第5,587,458号を参照。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域を欠いている無傷の組み合わせ部位を有する唯一の種である；従って、これらは、in vivoで用いる間に低下した非特異的結合に適する。ｓＦｖ融合タンパク質を構成して、ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかにおいてエフェクタータンパク質の融合を得ることができる。Antibody Engineering, ed. Borrebaeck、上記を参照。抗体断片はまた、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているように、「直線状抗体」であってもよい。かかる直線状抗体断片は、単一特異的または二重特異的であってもよい。
【０１４４】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、Ｏｖｒ１１０タンパク質の２つの異なるエピトープに結合することができる。他のかかる抗体は、Ｏｖｒ１１０結合部位を、他のタンパク質についての結合部位と組み合わせることができる。代替的に、抗Ｏｖｒ１１０アームを、白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えばＣ１３３）またはＩｇＧについてのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）上のトリガー分子に結合するアームと組み合わせて、細胞防御機構をＯｖｒ１１０発現細胞に集中させ、局在化させることができる。二重特異性抗体はまた、細胞毒性剤をＯｖｒ１１０を発現する細胞に局在化させるために用いることもできる。これらの抗体は、Ｏｖｒ１１０結合アームおよび細胞毒性剤（例えばサポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位体ハプテン）を結合するアームを有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ）２二重特異性抗体）として調製することができる。WO 96/16673には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第5,837,234号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は、WO98/02463中に示されている。米国特許第5,821,337号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体が教示されている。
【０１４５】
二重特異性抗体を作製する方法は、当該分野において知られている。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいており、ここで、２つの鎖は、異なる特異性を有する(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の無秩序な分類のために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の可能な混合物を産生し、この中で１個のみが、正確な二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィーのステップにより行われる、正確な分子の精製は、いくらか面倒であり、生成物の収量は低い。同様の手順は、WO 93/08829およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１４６】
別の方法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原組み合わせ部位）を有する抗体可変領域が、免疫グロブリン定常領域配列に融合される。好ましくは、この融合は、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の一部を含むＩｇ重鎖定常領域との融合である。軽鎖結合に必要な部位を含み、融合の少なくとも１つに存在する第１の重鎖定常領域（ＣＨＩ）を有するのが、好ましい。免疫グロブリン重鎖融合および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、好適な宿主細胞中に同時形質移入する。これにより、構造において用いられる３つのポリペプチド鎖の異なる比率によって所望の二重特異性抗体の最適な収量を提供する態様において、３つのポリペプチド断片の相互の比率を調整する際のより大きい柔軟性が得られる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現の結果、高い収量が得られる場合、または、所望の鎖の組み合わせの収量に対してこの比率が顕著な影響を及ぼさない場合には、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖についてのコード配列を、単一の発現ベクター中に挿入することが可能である。
【０１４７】
好ましくは、この方法における二重特異性抗体は、一方のアーム中に第１の結合特異性を有するハイブリッドの免疫グロブリン重鎖および、他方のアーム中のハイブリッドの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）から構成される。この非対称構造により、所望の二重特異性化合物が、所望でない免疫グロブリン鎖組み合わせから容易に分離されることが見出され、これは、二重特異性分子の片半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することにより、容易な分離方法が提供されるからである。この方法はWO 94/04690中に開示されている。二重特異性抗体を生じるさらなる詳細について、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照。
【０１４８】
米国特許第5,731,168号に記載されている他の方法によれば、一対の抗体分子の間の界面を設計して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にすることができる。好ましい界面は、ＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つまたは２つ以上の小さいアミノ酸側鎖が、より大きい側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）で置換される。１つまたは２つ以上の大きい側鎖と同一であるか、またはこれと類似した大きさの補償的な「空洞」が、第２の抗体分子の界面上に、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはスレオニン）で置換することにより作り出される。これにより、ヘテロ二量体の収量を、例えばホモ二量体などの他の所望でない最終生成物より多くするための機構が提供される。
【０１４９】
二重特異性抗体には、架橋した、または「ヘテロ結合した(heteroconjugate)」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ結合体中の抗体の一方をアビジンに結合させ、他方をビオチンに結合させることができる。このような抗体は、例えば、所望でない細胞に対して（米国特許第4,676,980号）、およびＨＩＶ感染の処置のため（WO 91/00360、WO 92/200373およびEP 03089）、免疫系細胞を標的化するために提案されている。ヘテロ結合抗体を、任意の好都合な架橋方法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において十分知られており、米国特許第4,676,980号に、多くの架橋手法と共に開示されている。
【０１５０】
二重特異性抗体を抗体断片から生成するための手法は、文献にも記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)には、無傷の抗体をタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する手順が記載されている。これらの断片は、ジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、近隣のジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次に、生じたＦａｂ’断片を、チオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次に、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを、メルカプトエチルアミンで還元することによりＦａｂ’−チオールに再び変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。産生した二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための剤として用いることができる。
【０１５１】
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨ断片の直接的な回収が容易になり、これを化学的に結合して、二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)には、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生が記載されている。各々のＦａｂ’断片は大腸菌から別個に分泌されており、これに、in vitroでの定方向化学的カップリングを施して、二重特異性抗体を形成した。このようにして形成した二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合でき、またヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１５２】
二重特異性抗体断片を、組換え細胞培養物から直接作製し、単離するための種々の手法もまた、記載されている。例えば、二重特異性抗体が、ロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドが、２種の異なる抗体のＦａｂ’部分に、遺伝子融合により結合された。抗体ホモ二量体を、ヒンジ領域において還元してモノマーを形成し、次に再び酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。また、この方法を、抗体ホモ二量体の産生のために用いることができる。
【０１５３】
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記載された「ダイアボディー」手法により、二重特異性抗体断片を作製するための代替の機構が提供された。この断片は、同一の鎖上の２つの領域間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによりＶＬに結合するＶＨを含む。従って、１つの断片のＶＨおよびＶＬ領域を、他の断片の相補的なＶＬおよびＶＨ領域と強制的に対形成させ、これにより２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用いることにより二重特異性抗体断片を作製するための、他の方法も報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照。
２よりも大きい価数を有する抗体が、意図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)。
【０１５４】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、２価の抗体よりも迅速に内部移行する（および／または異化する）ことができる。本発明の抗体は、３つまたは４つ以上の抗原結合部位を有する（ＩｇＭクラス以外である）多価の抗体（例えば４価の抗体）であってもよく、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により、容易に産生され得る。多価の抗体は、二量体化領域および３つまたは４つ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化領域は、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはこれからなる）。この筋書きにおいて、抗体は、Ｆｃ領域および、Ｆｃ領域に対する３つまたは４つ以上の抗原結合部位アミノ末端を含む。本明細書中で好ましい多価抗体は、３個〜約８個、しかし好ましくは４個の、抗原結合部位を含む（またはこれからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（および好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ここで、１つまたは２つ以上のポリペプチド鎖は、２つまたは３つ以上の可変領域を含む。例えば、１つまたは２つ以上のポリペプチド鎖は、ＶＤｌ（Ｘ１ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含むことができ、ここで、ＶＤ１は、最初の可変領域であり、ＶＤ２は、２番目の可変領域であり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは、０または１である。例えば、１つまたは２つ以上のポリペプチド鎖は、以下のものを含むことができる：ＶＨ−ＣＨＩ−柔軟リンカー−ＶＨ−ＣＨＩ−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨＩ−ＶＨ−ＣＨＩ−Ｆｃ領域鎖。本明細書中の多価抗体は、好ましくは、さらに、少なくとも２つ（および好ましくは４つ）の軽鎖可変領域ポリペプチドを含む。本明細書中の多価抗体は、例えば、約２個〜約８個の軽鎖可変領域ポリペプチドを含むことができる。本明細書中で意図する軽鎖可変領域ポリペプチドは、軽鎖可変領域を含み、随意にさらにＣＬ領域を含む。
【０１５５】
他のアミノ酸配列修飾
本明細書中に記載した抗Ｏｖｒ１１０抗体の１または２以上のアミノ酸配列修飾が、意図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善するのが望ましい場合がある。抗Ｏｖｒ１１０抗体のアミノ酸配列変異体を、適切なヌクレオチド変化を抗Ｏｖｒ１１０抗体核酸中に導入することにより、またはペプチド合成により調製する。
かかる修飾には、例えば、抗Ｏｖｒ１１０抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはこの中への挿入および／またはこの置換が含まれる。最終的な構成物が、所望の特徴を有する場合には、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせを行って、最終的な構成物に到達する。アミノ酸変化はまた、抗Ｏｖｒ１１０抗体の翻訳後プロセスを変えることができ、例えばグリコシル化部位の数または位置を変化させる。
【０１５６】
変異原性のための好ましい位置である抗Ｏｖｒ１１０抗体のある残基または領域の同定に有用な方法は、Cunningham and Wellsにより、Science, 244:1081-1085 (1989)中に記載されているように、「アラニン走査変異原性」と呼ばれる。ここで、抗Ｏｖｒ１１０抗体内の残基または標的残基の群（例えば、荷電した残基、例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕ）を同定し、中性の、または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置換して、アミノ酸のＯｖｒ１１０抗原との相互作用に影響を及ぼす。
次に、置換に対する機能的な感受性を示すアミノ酸の位置を、置換の部位において、またはこの部位についてさらなる、または他の変種を導入することにより精巧にする。従って、アミノ酸配列の変更を導入するための部位が予め決定されている一方、突然変異の性質それ自体を予め決定する必要はない。例えば、所定の部位における突然変異の性能を分析するために、ａｌａ走査または無秩序な変異原性を、標的コドンまたは領域において行い、発現された抗Ｏｖｒ１１０抗体変異体を、所望の活性についてスクリーニングする。
【０１５７】
アミノ酸配列挿入には、１個の残基から、１００個またはこれ以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲内のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、並びに単一の、または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗Ｏｖｒ１１０抗体、または細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗Ｏｖｒ１１０抗体分子の他の挿入変異体には、酵素に対する（例えばＡＤＥＰＴについての）抗Ｏｖｒ１１０抗体のＮもしくはＣ末端への融合、または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドへの融合が含まれる。
【０１５８】
変異体の他の種類は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基により置換された少なくとも１個のアミノ酸残基を、抗Ｏｖｒ１１０抗体分子中に有する。置換変異原性に最も大きく関連する部位には、超可変領域が含まれるが、ＦＲ変化もまた意図される。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下に、表Ｉに示す。かかる置換により生物学的活性の変化がもたらされる場合には、表Ｉにおいて「例示的な置換」と命名されているか、またはアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載されている、さらに実質的な変化を導入し、生成物を所望の特性についてスクリーニングすることができる。
【表３】
2008519841.tif 000005
【０１５９】
抗体の生物学的特性における実質的な修飾が、（ａ）例えばシートもしくはらせん構造としての、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩、を維持することに対するこれらの効果において、顕著に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１６０】
非保存性置換は、これらの群の１つの要素を他の群のもので交換することを伴う。抗Ｏｖｒ１１０抗体の適切な立体構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基もまた、一般にセリンで置換されることができ、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防止する。逆に、１または２以上のシステイン結合を抗体に付加して、その安定性を改善することができる（特に、抗体が、例えばＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
【０１６１】
置換変異体の特に好ましい種類は、親抗体（例えばヒト化またはヒト抗体）の１つまたは２つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、さらなる発生について選択された、得られた１種または２種以上の変異体は、これらを生成する親抗体に比べて改善された生物学的特性を有する。かかる置換変異体を生じるための好都合な方法は、ファージ提示法を用いた親和性成熟を伴う。簡単に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７部位）を変異させて、各々の部位において可能なアミノ酸置換のすべてを生じさせる。このようにして生じた抗体変異体を、糸状ファージ粒子から、各々の粒子内に包装されたＭｌ３の遺伝子ＩＩＩ生成物への融合として、１価の様式で提示する。次に、ファージ提示された変異体を、本明細書中に開示したように、これらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補の超可変領域部位を同定するために、アラニン走査変異生成を行って、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定することができる。代替的に、または付加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とヒトＯｖｒ１１０との間の接触点を同定することが有益であり得る。かかる接触残基および隣接する残基は、本明細書中で詳しく述べる手法による置換のための候補である。かかる変異体が生じた後に、変異体のパネルに、本明細書中に記載したようにスクリーニングを施し、１つまたは２つ以上の関連するアッセイにおける優れた特性を有する抗体を、さらなる発生について選択することができる。
【０１６２】
抗体の他の種類のアミノ酸変異体は、抗体のもとのグリコシル化パターンを変化させる。変化させることにより、抗体中に見出される１つもしくは２つ以上の炭水化物部分の欠失、および／または抗体中に存在しない１つもしくは２つ以上のグリコシル化部位の添加を意味する。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型は、炭水化物部分が、アスパラギン残基の側鎖に結合していることを意味する。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合のための認識配列である。従って、これらのトリペプチド配列のいずれかが、ポリペプチド中に存在することにより、有効なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた用いることができる。アミノ酸配列を変化させて、これが上記したトリペプチド配列の１つまたは２つ以上を含むようにする（Ｎ結合型グリコシル化部位について）ことにより、抗体へのグリコシル化部位の添加が好都合に達成される。変化はまた、１つまたは２つ以上のセリンまたはスレオニン残基の、もとの抗体の配列への添加、またはこれによる置換によってもなされ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。
【０１６３】
抗Ｏｖｒ１１０抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子を、当該分野において知られている種々の方法により調製する。これらの方法には、自然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド媒介（もしくは部位特異的な）変異生成、ＰＣＲ変異生成、および抗Ｏｖｒ１１０抗体の変異体もしくは非変異体方式をコードする、早期に調製された核酸分子のカセット変異生成による調製が含まれるが、これらには限定されない。
【０１６４】
本発明の抗体を、エフェクター機能に関して修飾して、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強するのが、望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域における１つまたは２つ以上のアミノ酸置換を導入することにより達成することができる。代替的に、または付加的に、１個または２個以上のシステイン残基をＦｃ領域中に導入して、これによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このようにして生じたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力および／または増大した補体媒介細胞死滅および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を有することができる。Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。増強した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体もまた、Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されたように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。代替的に、二重のＦｃ領域を有し、これにより増大した補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を設計することができる。Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
【０１６５】
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば米国特許第5,739,277号に記載されているように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に抗体断片）中に導入することができる。本明細書中で用いる用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、抗体のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【０１６６】
所望の特性を有する抗体についてのスクリーニング
抗体を生成するための手法は、上に記載した。さらに、所望により、ある生物学的特性を有する抗体を選択することができる。
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体の増殖阻害効果を、当該分野において知られている方法により、例えばＯｖｒ１１０を発現する細胞を、内因的に、またはＯｖｒ１１０遺伝子の形質移入に続いて用いて、評価することができる。例えば、以下の例１に提供する腫瘍細胞系およびＯｖｒ１１０形質移入細胞を、本発明の抗Ｏｖｒ１１０モノクローナル抗体で、種々の濃度において、数日（例えば２〜７日）にわたり処理し、クリスタルバイオレットもしくはＭＴＴで染色し、またはある他の比色アッセイにより分析することができる。増殖を測定する他の方法は、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体の存在下で、または不在下で処理した細胞による３Ｈ−チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理の後、細胞を収穫し、ＤＮＡ中に導入された放射能の量を、シンチレーションカウンターにおいて定量する。適切な陽性対照には、選択された細胞系の、当該細胞系の増殖を阻害することが知られている増殖阻害抗体による処理が含まれる。in vivoでの腫瘍細胞の増殖阻害を、以下の実験例の節において記載するように、種々の方法により決定することができる。好ましくは、腫瘍細胞は、Ｏｖｒ１１０を過剰発現するものである。好ましくは、抗Ｏｖｒ１１０抗体は、in vitroまたはin vivoでＯｖｒ１１０発現腫瘍細胞の細胞増殖を、約０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗体濃度において、未処理の腫瘍細胞と比較して、約２５〜１００％、さらに好ましくは約３０〜１００％、およびさらにより好ましくは約５０〜１００％または７０〜１００％、阻害する。増殖阻害は、細胞培養物中で、約０．５〜３０μｇ／ｍｌまたは約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度において測定することができ、ここで、増殖阻害を、腫瘍細胞を抗体に曝露した１〜１０日後に決定する。抗体は、約１μｇ／体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇにおける抗Ｏｖｒ１１０抗体の投与により、抗体の最初の投与から約５日〜３ヶ月以内、好ましくは約５〜３０日以内に腫瘍の大きさまたは腫瘍細胞増殖の減少がもたらされた場合に、in vivoで増殖阻害的である。
【０１６７】
細胞死を誘発する抗体を選択するために、例えばプロピジウムヨージド（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７ＡＡＤ取り込みにより示される膜完全性の損失を、対照に対して評価することができる。ＰＩ取り込みアッセイは、補体および免疫エフェクター細胞の不在において行うことができる。Ｏｖｒ１１０発現腫瘍細胞は、培地のみ、または例えば約１０μｇ／ｍｌの適切なモノクローナル抗体を含む培地と共にインキュベートする。細胞は、３日の期間にわたりインキュベートする。各々の処理に続いて、細胞は、細胞凝集塊の除去のため、洗浄して３５ｍｍの濾過器でキャップした１２×７５の管（管あたり１ｍｌ、処理群あたり３つの管）中に等分する。次に、管に、ＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を施与する。試料を、FACSCAN（登録商標）フローサイトメーターおよびFACSCONVERT（登録商標）CellQuestソフトウエア(Becton Dickinson)を用いて分析することができる。ＰＩ取り込みにより決定される、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発する抗体を、細胞死誘発抗体として選択することができる。
【０１６８】
例えば本発明のＯｖｒ１１０抗体などの関連する抗体により結合されるＯｖｒ１１０上のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような、常習的なクロスブロッキングアッセイを行うことができる。このアッセイを用いて、試験抗体が、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体と同一の部位またはエピトープに結合するか否かを決定することができる。代替的に、または付加的に、エピトープマッピングを、当該分野において知られている方法により行うことができる。例えば、抗体配列を、例えばアラニン走査により変異誘発して、接触残基を同定することができる。変異体抗体を、最初にポリクローナル抗体との結合について試験して、適切な折り畳みを確保する。異なる方法においては、Ｏｖｒ１１０の種々の領域に対応するペプチドを、試験抗体を用いた、または試験抗体および特徴付けられるかもしくは既知のエピトープを有する抗体を用いた、競合アッセイにおいて用いることができる。
【０１６９】
例えば、本発明の抗体により結合されるエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするための方法は、Ｏｖｒ１１０含有試料を試験抗体および本発明の抗体と混ぜ合わせて、混合物を形成することを含むことができ、次に混合物中のＯｖｒ１１０に結合したＯｖｒ１１０抗体のレベルを決定し、混合物中で結合したＯｖｒ１１０抗体のレベルについて対照混合物に対して比較し、ここで、対照と比較しての混合物中のＯｖｒ１１０に結合したＯｖｒ１１０抗体のレベルは、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体により結合されるエピトープへの試験抗体の結合の指標である。Ｏｖｒ１１０に結合したＯｖｒ１１０抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡにより決定する。対照は、陽性対照または陰性対照または両方であってもよい。例えば、対照は、Ｏｖｒ１１０、本発明のＯｖｒ１１０抗体および本発明のＯｖｒ１１０抗体により結合されるエピトープに結合することが知られている抗体の混合物であってもよい。抗Ｏｖｒ１１０抗体は、本明細書中に開示されているような標識で標識されている。Ｏｖｒ１１０は、固体支持体、例えば組織培養プレートまたはビーズ、例えばセファロースビーズに結合していてもよい。
【０１７０】
免疫結合体
本発明はまた、抗癌剤、例えば細胞毒性剤または増殖阻害剤に結合した抗体を含む免疫結合体を用いる療法に関する。
このような免疫結合体の生成において有用な化学療法剤は、前に記載した。抗体および１種または２種以上の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド類、トリコテンおよびＣＣ１０６５の結合体並びに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体もまた、本明細書において意図される。
【０１７１】
メイタンシンおよびメイタンシノイド類
好ましくは、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体（全長または断片）を、１または２以上のメイタンシノイド分子に結合させる。
メイタンシノイド類は、チューブリン重合を阻害することにより作用する、有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、キャストアフリカ低木Maytenus serrataから最初に単離された（米国特許第3,896,111号）。その後、ある微生物もまた、メイタンシノイド類、例えばメイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルを産生することが見出された（米国特許第4,151,042号）。合成メイタンシノール並びにこの誘導体および類似体は、例えば、米国特許第4,137,230号；4,248,870号；4,256,746号；4,260,608号；4,265,814号；4,294,757号；4,307,016号；4,308,268号；4,308,269号；4,309,428号；4,313,946号；4,315,929号；4,317,821号；4,322,348号；4,331,598号；4,361,650号；4,364,866号；4,424,219号；4,450,254号；4,362,663号；および4,371,533号に開示されており、これらの開示を本明細書中に参照として明確に導入する。
【０１７２】
メイタンシノイド−抗体結合体
これらの治療指数を改善する試行において、メイタンシンおよびメイタンシノイドを、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体に結合させた。メイタンシノイドを含む免疫結合体およびこれらの治療的使用は、例えば、米国特許第5,208,020号、5,416,064号および欧州特許EP 0 425 235 B1に開示されており、これらの開示を本明細書中に参照として明確に導入する。Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)には、ヒト直腸結腸癌に指向されたモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合した、ＤＭＩと表示されるメイタンシノイドを含む免疫結合体が記載されている。この結合体は、培養した結腸癌細胞に対して高度に細胞毒性であることが見出され、in vivoでの腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)には、ヒト結腸癌細胞系における抗原に結合するマウス抗体Ａ７、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ発癌遺伝子に結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に、メイタンシノイドがジスルフィドリンカーを介して結合している免疫結合体が記載されている。ＴＡ．１−メイタンシノイド結合体の細胞毒性が、細胞あたり３×１０５のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３に対してin vitroで試験された。薬剤結合体は、遊離のメイタンシノイド薬剤と同様の程度の細胞毒性を達成し、これは、抗体分子あたりのメイタンシノイド分子の数を増大させることにより増大し得る。Ａ７−メイタンシノイド結合体は、マウスにおいて低い全身的細胞毒性を示した。  
【０１７３】
抗Ｏｖｒ１１０抗体−メイタンシノイド結合体（免疫結合体）
抗Ｏｖｒ１１０抗体−メイタンシノイド結合体を、抗Ｏｖｒ１１０抗体をメイタンシノイド分子に、抗体またはメイタンシノイド分子のいずれかの生物学的活性を顕著に低下させずに化学的に結合させることにより調製する。抗体分子あたり結合した平均３〜４個のメイタンシノイド分子が、抗体の機能または溶解性に悪影響を与えずに標的細胞の細胞毒性を増強させることにおいて効能を示したが、１個の毒素分子／抗体さえも、裸の抗体の使用にまさって細胞毒性を増強すると予測される。メイタンシノイド類は、当該分野において十分知られており、既知の手法により合成するかまたは自然の供給源から単離され得る。好適なメイタンシノイド類は、例えば、米国特許第5,208,020号並びに上記で言及した他の特許および非特許刊行物中に開示されている。好ましいメイタンシノイド類は、メイタンシノールおよび、芳香環またはメイタンシノール分子の他の位置において修飾されているメイタンシノール類似体、例えば種々のメイタンシノールエステルである。
【０１７４】
例えば米国特許第5,208,020号またはEP特許0 425 235 B1およびChari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)中に開示されているものを含む、抗体−メイタンシノイド結合体を作製するための、当該分野において知られている多くの結合基がある。この結合基には、上記で識別した特許中に開示されているジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基またはエステラーゼ不安定基が含まれ、ジスルフィド基およびチオエーテル基が好ましい。抗体とメイタンシノイドの結合体を、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル類（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えばトルエン２，６ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するための、Ｎ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）(Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978])およびＮ−スクシンイミジル（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が含まれる。
【０１７５】
リンカーは、結合の種類に依存して、メイタンシノイド分子に、種々の位置において結合していてもよい。例えば、エステル結合は、慣用のカップリング手法を用いて、水酸基との反応により形成し得る。反応は、水酸基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位置、水酸基で修飾されたＣ−１５位置および水酸基を有するＣ−２０位置において起こり得る。好ましくは、結合は、メイタンシノールまたはメイタンシノール類似体のＣ−３位置において形成される。
【０１７６】
カリケアマイシン
関連する他の免疫結合体は、１または２以上のカリケアマイシン分子に結合した抗Ｏｖｒ１１０抗体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル以下の濃度において二本鎖ＤＮＡ破壊を発生させることができる。カリケアマイシンファミリーの結合体の調製について、米国特許第5,712,374号、5,714,586号、5,739,116号、5,767,285号、5,770,701号、5,770,710号、5,773,001号、5,877,296号（すべてAmerican Cyanamid Company）を参照。用いることができるカリケアマイシンの構造的類似体には、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθ１Ｉ（Hinman et al. Cancer Research 53: 3336 (1993), Lode et al. Cancer Research 5 8: 2925-2928 (1998)およびAmerican Cyanamidの前述の米国特許明細書）が含まれるが、これらには限定されない。抗体を結合させることができる他の抗腫瘍薬剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシンおよびＱＦＡは共に、作用の細胞内部位を有し、原形質膜を容易に横断しない。従って、抗体媒介内部移行によるこれらの剤の細胞への取り込みにより、これらの細胞毒性効果が大幅に増大する。
【０１７７】
他の細胞毒性剤
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体に結合することができる他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン(streptozoicin)、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号および5,770,710号に記載されている、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体と知られている剤のファミリー並びにエスペラマイシン(esperamicin)類（米国特許第5,877,296号）が含まれる。用いることができる酵素的に活性な毒素およびこの断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の１  ５非結合活性断片、エクソトキシンＡ鎖（Pseudomonas aeruginosaから）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、momordica charantia阻害剤、カルシン(curcin)、クロチン(crotin)、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン(gelonin)、マイトジェリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)およびトリコテセン(tricothecene)類が含まれる。例えば１９９３年１０月２８日に刊行されたWO 93/21232を参照。本発明は、さらに、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間に形成される免疫結合体を意図する。
【０１７８】
腫瘍の選択的な破壊のために、抗体は、高度の放射性原子を含むことができる。種々の放射性同位体は、放射結合した抗Ｏｖｒ１１０抗体の産生のために有用である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体が含まれる。結合体が診断に用いられる場合には、これは、シンチグラフィー検査のための放射性原子、例えばＴｃ９９ＭもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄を含むことができる。
【０１７９】
放射標識または他の標識を、結合体中に、既知の方法により導入することができる。例えば、ペプチドを、生合成することができるか、または例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む、好適なアミノ酸前駆体を用いて、化学的アミノ酸合成により合成することができる。標識、例えばＴｃ９９Ｍ、Ｉ１２３、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−９０は、リシン残基を介して結合することができる。IODOGEN法(Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)を用いて、ヨウ素を導入することができる。"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)には、他の方法が詳細に記載されている。
【０１８０】
抗体および細胞毒性剤の結合体を、種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて、例えばＮ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル類（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えばトルエン２，６ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて、作製することができる。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素標識１−イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、ラジオヌクレオチド(radionucleotide)の抗体への結合のための例示的なキレート剤である。WO 94/11026を参照。リンカーは、細胞中での細胞毒性薬剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー(Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)；米国特許第5,208,020号)を用いることができる。
【０１８１】
代替的に、抗Ｏｖｒ１１０抗体および細胞毒性剤を含む融合タンパク質を、例えば、組換え手法またはペプチド合成により作製することができる。ＤＮＡの長さは、互いに隣接しているか、または結合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分離されている、結合体の２つの部分をコードする、それぞれの領域を含むことができる。
さらに、腫瘍の前標的化において用いるために、抗体を「受容体」（例えばストレプトアビジン）に結合させることができ、ここで、抗体−受容体結合体を患者に投与し、続いて結合していない結合体を循環から清澄剤を用いて除去し、次に、細胞毒性剤（例えばラジオヌクレオチド）に結合する「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０１８２】
抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）
プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、WO81/01145を参照）を活性抗癌薬剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に、抗体を結合させることにより、本発明の抗体をＡＤＥＰＴにおいても用いることができる。例えば、WO 88/07378および米国特許第4,975,278号を参照。
【０１８３】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫結合体の酵素成分には、プロドラッグに対して作用でき、これをより活性な細胞毒性の形態に変換する任意の酵素が含まれる。本発明の方法において有用な酵素には、リン酸塩含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸塩含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；無毒性フルオロシトシンを抗癌薬剤である５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なプロテアーゼ、例えばセラチア(serratia)プロテアーゼ、テルモリシン(thermolysin)、サブチリシン(subtilisin)、カルボキシペプチダーゼ類およびカテプシン類（例えばカテプシンＢおよびＬ）；Ｄアミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用な炭水化物切断酵素、例えばＯ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；Ｐ−ラクタム類で誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なＰ−ラクタマーゼ；並びにこれらのアミン窒素においてそれぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ類、例えばペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼが含まれるが、これらには限定されない。代替的に、また当該分野において「アブザイム（abzymes）」として知られている、酵素活性を有する抗体を用いて、本発明のプロドラッグを遊離の活性な薬剤に変換することができる（例えば、Massey, Nature 328: 457-458 (1987)を参照）。アブザイムを腫瘍細胞集団に送達するための酵素−アブザイム結合体を、本明細書中に記載したようにして調製することができる。本発明の酵素は、当該分野において十分知られている手法、例えば上記したヘテロ二官能性架橋試薬を用いることにより、抗Ｏｖｒ１１０抗体に共有結合させることができる。
【０１８４】
代替的に、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に結合した本発明の抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当該分野において十分知られている組換えＤＮＡ手法を用いて構成することができる（例えばNeuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)を参照）。
【０１８５】
他の抗体修飾
抗体の他の修飾が本明細書で意図される。例えば、抗体は、種々の非タンパク質ポリマーの１種、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーの１種に結合させることができる。抗体はまた、例えばコアセルベーション手法によりまたは界面重合により調製したマイクロカプセル中に（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、捕獲することができる。このような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。
【０１８６】
本明細書中に開示した抗Ｏｖｒ１１０抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化することができる。「リポソーム」は、種々のタイプの脂質、リン脂質および／または、薬剤を哺乳類に送達するのに有用な界面活性剤で構成される小さい小胞である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質配置と同様に、二層形態において配置されている。抗体を含むリポソームは、当該分野において知られている方法により、例えばEpstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；米国特許第4,485,045号および4,544,545号；並びに１９９７年１０月２３日刊行のW097/38731に記載されているように、調製される。増大した循環時間を有するリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発方法により生成することができる。リポソームを所定の孔の大きさを有するフィルターを通して押し出すことにより、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’断片を、Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているようにして、ジスルフィド交換反応によりリポソームに結合させることができる。化学療法剤は、随意的に、リポソーム内に包含される。Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989)を参照。
【０１８７】
ベクター、宿主細胞および組換え方法
本発明はまた、ヒト化抗Ｏｖｒ１１０抗体、ベクター、および核酸を含む宿主細胞をコードする、単離された核酸分子、並びに抗体を産生するための組換え手法を提供する。抗体の組換え産生のために、これをコードする核酸分子を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために複製可能なベクター中に挿入するか、または発現のためのプロモーターを有する作動可能な(operable)結合においてベクター中に挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用の手順を用いて（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸分子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には一般に以下の１種または２種以上が含まれるが、これらには限定されない：シグナル配列、複製の起点、１種または２種以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。
【０１８８】
シグナル配列成分
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体は、直接、組換え的に産生するだけでなく、異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換え的に産生することができ、ここで該異種性ポリペプチドは、好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端において特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択された異種性シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、加工される（即ちシグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。天然の抗Ｏｖｒ１１０抗体シグナル配列を認識および加工しない原核宿主細胞に対しては、シグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核シグナル配列により置換する。酵母分泌のために、天然のシグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、ｏｃ因子リーダー（SaccharomycesおよびKluyveromycesｃｃ因子リーダーを含む）または酸ホスファターゼリーダー、C albicansグルコアミラーゼリーダー、またはWO 90/13646に記載されているシグナルにより置換することができる。哺乳類細胞発現において、哺乳類シグナル配列およびウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。かかる前駆体領域についてのＤＮＡは、抗Ｏｖｒ１１０抗体をコードするＤＮＡにリーディング・フレームにおいて連結する。
【０１８９】
複製の起点
発現およびクローニングベクターは、共に、ベクターが、１または２以上の選択された宿主細胞中で複製されるのを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが、ホスト染色体ＤＮＡとは独立して複製されるのを可能にするものであり、複製の起点または自己複製配列を含む。かかる配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製の起点はほとんどのグラム陰性細菌に適し、２μプラスミド起点は酵母に適し、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製成分の起点は、哺乳類発現ベクターについては必要ではない（ＳＶ４０起点は、典型的には、これが早期のプロモーターを含むとの理由のみにより用いることができる）。
【０１９０】
選択遺伝子成分
発現およびクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性欠乏を補完し、または（ｃ）天然培地から入手可能ではない臨界的に重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードし、例えば、これは、桿菌についてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。選択スキームの１つの例では、宿主細胞の増殖を停止する薬剤を用いる。異種性遺伝子で成功に形質転換されたこれらの細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、従って選択計画を生き延びる。このような優性の選択の例では、薬剤であるネオマイシン、マイコフェノール酸およびヒグロマイシンを用いる。
【０１９１】
哺乳類細胞に適する選択可能なマーカーの他の例は、抗Ｏｖｒ１１０抗体核酸、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−１１、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどを吸収することについて競合性の細胞を同定することを可能にするものである。例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換される細胞を、先ず、メトトレキセート（Ｍｔｘ）、即ちＤＨＦＲの競合的アンタゴニストを含む培養培地中ですべての形質転換体を培養することにより同定する。野生型のＤＨＦＲを用いる場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠乏しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えばATCC CRL-9096）である。
【０１９２】
代替的に、抗Ｏｖｒ１１０抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質および他の選択可能なマーカー、例えばアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、選択可能なマーカーのための選択剤、例えばアミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８のための選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4,965,199号を参照。
【０１９３】
酵母において用いるのに適する選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐｌ遺伝子である(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母の、突然変異菌株、例えばATCC No. 44076またはPEP4 Jones, Genetics, 85:12 (1977)のための選択マーカーを提供する。次に、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１病変の存在は、トリプトファンの不在下での増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母菌株(ATCC 20,622または38,626)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドにより補完される。
さらに、１．６ｐｍ環状プラスミドｐＫＤＩに由来するベクターを、Kluyveromyces酵母の形質転換のために用いることができる。代替的に、組換え子ウシキモシンの大規模な産生のための発現系が、K. lactisについて報告された。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。Kluyveromycesの工業的な菌株による、成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピー発現ベクターも開示されている。Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)。
【０１９４】
プロモーター成分
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識されるプロモーターを含み、抗Ｏｖｒ１１０抗体核酸に作動的に結合している。原核宿主と共に用いるのに適するプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、Ｐ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターが含まれる。しかし、他の既知の細菌性プロモーターが好適である。細菌系において用いるためのプロモーターはまた、抗Ｏｖｒ１１０抗体をコードするＤＮＡに作動的に結合したShine-Dalgarno（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０１９５】
プロモーター配列は、真核生物について知られている。事実上すべての真核遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置する、ＡＴが豊富な領域を有する。多くの遺伝子において転写開始部位の７０〜８０塩基上流に見出される他の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここでＮは、任意のヌクレオチドであってよい。ほとんどの真核遺伝子の３’末端において、ポリＡ尾のコード配列を３’末端へ添加するためのシグナルとなり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列のすべてを、真核発現ベクター中に好適に挿入する。酵母宿主と共に用いるのに適するプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素についてのプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼについてのプロモーターが含まれる。
【０１９６】
増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである、他の酵母プロモーターは、以下についてのプロモーター領域である：アルコールデヒドロゲナーゼ２，イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、並びにマルトースおよびガラクトース利用の原因となる酵素。酵母発現において用いるのに適するベクターおよびプロモーターは、さらに、EP 73,657に記載されている。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターと共に有利に用いられる。
【０１９７】
哺乳類宿主細胞中のベクターからの抗Ｏｖｒ１１０抗体転写は、プロモーターが宿主細胞系と適合性である場合には、例えば次のものから得られたプロモーターにより、制御される：ウイルスのゲノムから、例えばポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサルウイルス（シミアン・ウイルス）４０（ＳＶ４０）のゲノムから、異種性哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから。
ＳＶ４０ウイルスの初期の、および後期のプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即座の早期のプロモーターは、ＨｉｎｄＩｌｌ  Ｅ制限断片として好都合に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いる哺乳類宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の変更は、米国特許第4,601,978号に記載されている。また単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御の下での、マウス細胞におけるヒトＰ−インターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)を参照。代替的に、ラウス肉腫ウイルスの長い末端繰り返しを、プロモーターとして用いることができる。
【０１９８】
エンハンサー要素成分
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体をコードするＤＮＡの，高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することにより多くの場合増強される。多数のエンハンサー配列が、現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）から知られている。しかし、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを用いる。例には、複製起点の後期の側上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期の側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核プロモーターの活性化のためのエンハンシング要素については、Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)も参照。エンハンサーは、ベクター中に、抗Ｏｖｒ１１０抗体コード配列に５’または３’の位置においてスプライシングすることができるが、好ましくは、プロモーターから５’部位に位置させる。
【０１９９】
転写終結成分
真核宿主細胞（酵母、真菌類、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの有核細胞）において用いられる発現ベクターはまた、転写を終結させるのに、およびｍＲＮＡを安定化させるのに必要な配列を含む。かかる配列は、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、および場合によっては３’未翻訳領域から一般的に入手できる。これらの領域は、抗Ｏｖｒ１１０抗体をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO 94/11026およびこの中に開示されている発現ベクターを参照。
【０２００】
宿主細胞の選択および形質転換
本明細書において、ベクター中でＤＮＡをクローニングするかまたは発現するのに適する宿主細胞は、上記した原核、酵母または高等真核細胞である。この目的に適する原核生物には、真性細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、例えばEscherichiaなどの腸内細菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、Erwinia、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばSalmonella typhimurium、セラチア属、例えばSerratia marcescans、および赤痢菌属、並びに桿菌、例えばB. subtilisおよびB. licheniformis（例えばDD 266,710、１９８９年４月１２日刊行中に開示されているB. licheniformis 41P）、シュードモナス属、例えばP. aeruginosa、並びにストレプトマイセス属が含まれる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ATCC 31,446）であるが、他の菌株、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ATCC 31,537）および大腸菌Ｗ３１ １０（ATCC 27,325）が好適である。これらの例は、限定的であるよりむしろ例示的である。
【０２０１】
全長抗体、抗体断片および抗体融合タンパク質を細菌中に産生することができ、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ではない場合に、例えば治療的抗体が細胞毒性剤（例えば毒素）に結合しており、免疫結合体が単独で腫瘍細胞破壊における有効性を示す場合にそうである。全長抗体は、循環においてより長い半減期を有する。大腸菌での産生はより迅速で費用効率的である。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、翻訳開始領域（ＴＩＲ）並びに発現および分泌を最適化するためのシグナル配列を記載している、例えば米国特許第5,648,237号(Carter et. al.)、米国特許第5,789,199号(Joly et al.)および米国特許第5,840,523号(Simmons et al.)を参照。これらの特許は、参照として本明細書中に導入する。発現の後に、抗体は大腸菌細胞ペーストから可溶性画分中に単離し、アイソタイプに依存して、例えばプロテインＡまたはＧカラムにより精製することができる。最終的な精製は、例えばＣＨＯ細胞中で発現された抗体を精製するための方法と同様にして、行うことができる。
【０２０２】
原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状真菌類または酵母が、抗Ｏｖｒ１１０抗体コードベクターに適するクローニングまたは発現宿主である。Saccharomyces cerevisiaeまたは一般的なパン酵母は、下等な真核宿主微生物の中で最も一般的に用いられている。しかし、多くの他の属、種および菌株が一般に入手可能で有用であり、例えばSchizosaccharomyces pombe；Kluyveromyces宿主、例えばK. lactis、K. fragilis (ATCC 12,424)、K. bulgaricus (ATCC 16,045)、K. wickeramii (ATCC 24,178)、K. waltii (ATCC 56,500)、K. drosophilarum (ATCC 36,906)、K . thermotoleransおよびK. marxianus; yarrowia (EP 402,226)；Pichia pastoris (EP 183,070)；カンジダ；Trichoderma reesia (EP 244,234)；Neurospora crassa；Schwanniomyces、例えばSchwanniomyces occidentalis；並びに糸状真菌類、例えばパンカビ属、アオカビ属、Tolypocladiumおよびコウジカビ属宿主、例えばA. nidulansおよびA. nigerなどである。
【０２０３】
グリコシル化された抗Ｏｖｒ１１０抗体の発現に適する宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス菌株および変異体並びに宿主、例えばSpodoptera frugiperda（鱗翅目幼虫）、Aedes aegypti（カ）、Aedes albopictus（カ）、Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）およびBombyx moriからの対応する許容的な昆虫宿主細胞が、同定されている。形質移入のための種々のウイルス菌株、例えばAutographa californica NPVのＬ−１変種およびBombyx mori NPVのＢｍ−５菌株が公的に入手可能であり、かかるウイルスは、ここで本発明のウイルスとして、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質移入のために用いることができる。
【０２０４】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナおよびタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として用いることができる。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生において有用なクローニングおよび発現ベクターは、当業者に知られている。例えばHiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78、Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794、Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750およびFecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986を参照。
【０２０５】
しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最も大きく、培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞の増殖が常習的な手順となった。有用な哺乳類宿主細胞系の例は、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１系列（ＣＯＳ−７、ATCC CRL 1651）；ヒト胚腎臓系列（２９３または懸濁液培養物中で増殖するためにサブクローニングした２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ATCC CRL1587）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ATCC CCL 2）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ATCC CCL 75）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、1413 8065）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ATCC CCL5 1）；ＴＲＩ細胞(Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫系列（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞を、上記の発現ベクターまたはクローニングベクターを用いて抗Ｏｖｒ１１０抗体産生のために形質転換し、プロモーターを誘発するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変した、慣用の栄養素培地中で培養する。
【０２０６】
宿主細胞の培養
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体を産生するために用いられる宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。商業的に入手できる培地、例えばハムのＦＩＯ(Sigma)、基礎培地(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)およびダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Sigma)は、宿主細胞を培養するのに適する。さらに、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)、米国特許第4,767,704号；4,657,866号；4,927,762号；4,560,655号；もしくは5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；または米国特許Re. 30,985号に記載されている培地のいずれかを、宿主細胞のための培養培地として用いることができる。これらの培地のすべてに、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリンもしくは上皮細胞成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド類（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばGENTAMYCIN（登録商標）薬剤）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補足することができる。すべての他の必要な補足物もまた、当業者に知られている適切な濃度で含有することができる。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞について前に用いられているものであり、通常の当業者には明らかである。
【０２０７】
抗Ｏｖｒ１１０抗体の精製
組換え手法を用いる場合、抗体は、細胞内で、細胞膜周辺腔で産生するか、または培地に直接分泌することができる。抗体が細胞内で産生される場合は、第１のステップとして粒子状残骸、宿主細胞または溶解した断片のいずれかを、例えば遠心分離または限外濾過により除去する。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)には、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分にわたり融解させる。細胞残骸は遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合は、このような発現系からの上清は一般に、先ず、商業的に入手できるタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて濃縮する。例えばＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、前述のステージのいずれかにおいて導入して、タンパク質分解を阻害することができ、抗生物質を導入して、外来性の汚染物の増殖を防止することができる。
【０２０８】
細胞から調製された抗体組成物を、例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが、好ましい精製手法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域の種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。プロテインＧが、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３のために推奨される(Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986))。アフィニティーリガンドが付着したマトリックスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば細孔性ガラス（controlled pore glass）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンにより、アガロースを用いて達成できるよりも速い流速および短い加工時間が可能になる。抗体がＣＨ３領域を含む場合、Bakerbond ABX（登録商標）樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。タンパク質精製のための他の手法、例えばイオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンSEPHAROSE（登録商標）上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＩＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収されるべき抗体に依存して利用可能である。
【０２０９】
１または２以上のすべての予備的精製ステップに続いて、関連する抗体および汚染物を含む混合物に、ｐＨ約２．５〜４．５の溶離緩衝液を用いて、好ましくは低い塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍの塩）において行われる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを施すことができる。
【０２１０】
医薬製剤
本発明に従って用いる抗体の医薬製剤を、保管のために所望の程度の純度を有する抗体を随意の薬学的に許容し得る担体、賦形剤または安定剤と混合し(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))、凍結乾燥した製剤または水性溶液の形態において調製する。許容し得る担体、賦形剤または安定剤は、用いられる用量および濃度において受容者に対して無毒性であり、そして以下を含む：緩衝液、例えば酢酸塩、トリス、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸類；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノールおよびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０個の残基よりも小さい）ポリペプチド類；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン類；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸類、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；トニシファイヤー(tonicifier)、例えばトレハロースおよび塩化ナトリウム；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；界面活性剤、例えばポリソルベート；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体類（例えばＺｎ−タンパク質複合体類）；および／または非イオン系界面活性剤、例えばTWEEN（登録商標）、PLURONICS（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。抗体は、好ましくは、５〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度での抗体を含む。
【０２１１】
ここでの製剤はまた、処置される特定の適応のための必要に応じて、１種より多い活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含むことができる。例えば、内部移行する抗Ｏｖｒ１１０抗体に加えて、１つの製剤において、追加の抗体、例えばＯｖｒ１１０上の異なるエピトープに結合する第２の抗Ｏｖｒ１１０抗体、または、例えば特定の癌の増殖に影響する成長因子などの他の標的に対する抗体を含むのが望ましい場合がある。代替的に、または付加的に、この組成物はさらに、化学療法剤、細胞毒性剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤および／または心臓保護剤(cardioprotectant)を含むことができる。かかる分子は、好適に、意図される目的のために有効な量で、組み合わせて存在する。
【０２１２】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション手法により、または界面重合により、調製したマイクロカプセルに捕獲することができ、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド状薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて捕獲することができる。かかる手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０２１３】
持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の好適な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマー類の半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形した物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第3,773,919号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー類、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー類、例えばLUPRON DEPOT（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成された注射可能な微粒子）、並びにポリ−Ｄ−（−）ヒドロキシ酪酸が含まれる。
in vivoでの投与のために用いるべき製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通しての濾過により容易に達成される。
【０２１４】
抗Ｏｖｒ１１０抗体を用いた方法および処置
本発明によれば、細胞表面上のＯｖｒ１１０に結合すると内部移行する抗Ｏｖｒ１１０抗体を用いて、Ｏｖｒ１１０発現癌細胞を特徴とする癌、特に卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌、例えば卵巣漿液性腺癌または乳房浸潤性乳管癌、および関連する転移を有する、これを必要としている対象を処置する。
前記の癌は一般にＯｖｒ１１０発現細胞を含み、従って抗Ｏｖｒ１１０抗体はこれに結合することができる。前記の癌はＯｖｒ１１０分子の過剰発現により特徴付けることができるが、本出願はさらに、Ｏｖｒ１１０過剰発現癌であるとは考えられない癌を処置するための方法も提供する。
【０２１５】
本発明はまた、Ｏｖｒ１１０を過剰発現する細胞を検出するための方法および、Ｏｖｒ１１０を発現する細胞を検出するにあたり、または患者の血清中のＯｖｒ１１０を検出するにあたり有用な診断キットに関する。この方法は、細胞含有試験試料を本発明の抗体と混ぜ合わせること、試験試料を、試験試料中の細胞に結合する抗体についてアッセイすること、および試験試料において結合する抗体のレベルを、細胞の対照試料において結合する抗体のレベルに対して比較することを含むことができる。好適な対照は、例えば、試験試料と同一種類の正常な細胞の試料、またはＯｖｒ１１０過剰発現細胞を含まないことが知られている細胞試料である。かかる対照試料より高いＯｖｒ１１０結合のレベルは、試験試料がＯｖｒ１１０を過剰発現する細胞を含むことを示す。代替的に、対照は、Ｏｖｒ１１０を過剰発現する細胞を含むことが知られている細胞の試料であってもよい。このような場合において、対照試料に類似した、またはこれを超える、試験試料におけるＯｖｒ１１０抗体結合のレベルは、試験試料がＯｖｒ１１０を過剰発現する細胞を含むことを示す。
【０２１６】
Ｏｖｒ１１０過剰発現は、種々の診断アッセイにより検出することができる。例えば、Ｏｖｒ１１０の過剰発現は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）によりアッセイすることができる。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片に、ＩＨＣアッセイを施し、Ｏｖｒ１１０タンパク質染色強度の以下の基準と一致させることができる。
スコア０  染色は観察されないか、または腫瘍細胞の１０％未満において膜染色が観察される。
スコア１＋  わずかな／辛うじて知覚可能な膜染色が、腫瘍細胞の１０％を超える比率において検出される。細胞は、それらの膜の一部において染色されているに過ぎない。
スコア２＋  弱い、ないし中程度の完全な膜染色が、腫瘍細胞の１０％を超える比率において観察される。
【０２１７】
スコア３＋  中程度ないし強い完全な膜染色が、腫瘍細胞の１０％を超える比率において観察される。
Ｏｖｒ１１０発現についての０または１＋のスコアを有する腫瘍を、Ｏｖｒ１１０を過剰発現しないとして特徴付けることができ、一方２＋または３＋のスコアを有する腫瘍を、Ｏｖｒ１１０を過剰発現するとして特徴付けることができる。
代替的に、または付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばINFORM（登録商標）（Ventana, Arizonaにより販売されている）またはPATHVISION（登録商標）(VySiS, Illinois)を、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織において行って、腫瘍におけるＯｖｒ１１０過剰発現の程度（存在する場合には）を決定することができる。Ｏｖｒ１１０過剰発現または増幅を、in vivo診断アッセイを用いて評価することができ、例えばＯｖｒ１１０を結合する、検出可能な標識（例えば放射性同位体または蛍光標識）で標識した分子（例えば本発明の抗体）を投与し、患者を該標識の局在について外部から走査することにより、評価することができる。
【０２１８】
Ｏｖｒ１１０を発現するかまたは過剰発現する細胞を含むことが疑われる試料を、本発明の抗体と、抗体のＯｖｒ１１０への特異的な結合に適する条件の下で、混ぜ合わせる。本発明のＯｖｒ１１０抗体の結合および／または内部移行は、細胞がＯｖｒ１１０を発現することを示す。結合のレベルを決定して好適な対照と比較することができ、ここで、対照より高い結合Ｏｖｒ１１０のレベルは、Ｏｖｒ１１０過剰発現を示す。Ｏｖｒ１１０を過剰発現する細胞を含むことが疑われる試料は、癌細胞試料、特に卵巣癌、例えば卵巣漿液性腺癌、または乳癌、例えば乳房浸潤性乳管癌の試料であってもよい。対象からの血清試料もまた、対象からの血清試料を本発明のＯｖｒ１１０抗体と混ぜ合わせ、抗体に結合したＯｖｒ１１０のレベルを決定し、このレベルを対照と比較することにより、Ｏｖｒ１１０のレベルについてアッセイすることができ、ここで、対照と比較して、患者の血清中におけるＯｖｒ１１０の上昇したレベルは、患者の細胞によるＯｖｒ１１０の過剰発現を示す。対象は、癌、例えば卵巣癌、例えば卵巣漿液性腺癌、または乳癌、例えば乳房浸潤性乳管癌を有していてもよい。
【０２１９】
現在、癌のステージに依存して、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌の処置は、以下の療法の１種または組み合わせを含む：癌組織を除去するための手術、放射線療法、アンドロゲン剥脱（例えばホルモン療法）、および化学療法。抗Ｏｖｒ１１０抗体療法は、化学療法の毒性および副作用を十分に耐容しない年長の患者において、放射線療法の有用性が限定された転移性疾患において、およびアンドロゲン剥脱処置に耐性である前立腺癌腫の管理のために、特に望ましい場合がある。本発明の腫瘍標的化および内部移行抗Ｏｖｒ１１０抗体は、Ｏｖｒ１１０発現癌、例えば卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を、疾患の最初の診断の際に、または再発の間に寛解させるのに有用である。治療的用途のために、抗Ｏｖｒ１１０抗体を単独で、または組み合わせ療法において用いることができ、例えばホルモン、抗血管新生剤もしくは放射標識した化合物との組み合わせ、または手術、凍結療法および／または放射線療法との組み合わせ療法において、特に卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌のために、また特に排出された細胞が到達し得ない場合において用いることができる。抗Ｏｖｒ１１０抗体による処置はまた、他の形態の従来の療法と組み合わせて、前または後慣用療法に連続して投与することができ、化学療法薬剤、例えばタキソテレ(Taxotere)（登録商標）（ドセタキセル）、タキソール(Taxol)（登録商標）（パクリタキセル）、エストラムスチンおよびマイトキサントロンは、転移性およびホルモン抵抗性卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌の処置において、特に危険の少ない患者において用いることができる。癌、特に、アンドロゲン非依存性および／または転移性卵巣癌、膵臓癌、肺癌もしくは乳癌を処置または寛解するための、本発明のこの方法において、癌患者に、抗Ｏｖｒ１１０抗体を、１種または２種以上の前の化学療法剤での処置と組み合わせて投与することができる。特に、パクリタキセルおよび修飾した誘導体（例えばEP0600517を参照）との組み合わせ療法が意図される。抗Ｏｖｒ１１０抗体を、治療的に有効な用量の化学療法剤と共に投与する。抗Ｏｖｒ１１０抗体はまた、化学療法と組み合わせて投与して、化学療法剤、例えばパクリタキセルの活性および効能を増強することができる。米国医薬品便覧（ＰＤＲ）には、種々の癌の処置において用いられている当該剤の投与量が開示されている。治療的に有効なこれらの前述の化学療法薬剤の投薬計画および投与量は、処置される特定の癌、疾患の程度および当該分野における技術のある医師が精通している他の要因に依存し、医師により決定することができる。
【０２２０】
特に、細胞毒性剤と結合した抗Ｏｖｒ１１０抗体を含む免疫結合体を、患者に投与することができる。好ましくは、Ｏｖｒ１１０タンパク質に結合した免疫結合体は細胞により内部移行され、これが結合する癌細胞の死滅における、免疫結合体の増大した治療効果がもたらされる。好ましくは、細胞毒性剤は、癌細胞の核酸を標的化するかまたはこれに干渉する。かかる細胞毒性剤の例は上記した通りであり、メイタンシン、メイタンシノイド類、サポリン、ゲロニン、リシン、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
【０２２１】
抗Ｏｖｒ１１０抗体または免疫結合体を、ヒト患者に、既知の方法、例えば静脈内投与により、例えば大量瞬時投与として、またはある期間にわたる連続的な注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内(intracerobrospinal)、皮下、関節内、滑膜内(intrasynovial)、くも膜下腔内、経口、局所的または吸入経路により投与する。抗体または免疫結合体は、腫瘍本体中に直接注射することができる。抗体の静脈内または皮下投与が好ましい。他の治療計画を、抗Ｏｖｒ１１０抗体の投与と組み合わせることができる。
組み合わされた投与には、個別の製剤または単一の医薬製剤を用いた同時投与、およびいずれかの順序での連続的投与が含まれ、ここで、両方（またはすべて）の活性剤が、その生物学的活性を同時に奏する期間があるのが好ましい。好ましくは、かかる組み合わされた療法の結果、相乗的な治療効果がもたらされる。
【０２２２】
また、１種または２種以上の抗Ｏｖｒ１１０抗体の投与を、特定の癌に関連する他の腫瘍抗原に指向された抗体の投与と組み合わせるのが、望ましい場合がある。このようにして、本発明はまた、本発明の１種または２種以上の抗体および、Ｏｖｒ１１０発現腫瘍細胞と関連する他の腫瘍抗原に結合する少なくとも１種の他の抗体を含む、抗体「カクテル」に関する。カクテルはまた、Ｏｖｒ１１０の他のエピトープに指向された抗体を含むことができる。好ましくは、他の抗体は、本発明の抗体の結合およびまたは内部移行に干渉しない。
【０２２３】
本発明の抗体治療処置方法は、１種または２種以上の抗Ｏｖｒ１１０抗体および１種または２種以上の化学療法剤もしくは増殖阻害剤の組合わせ投与を含むことができ、種々の化学療法剤のカクテルの同時投与を含む。化学療法剤には、例えば、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン類（例えばパクリタキセルおよびドキセタキセル）および／またはアントラサイクリン抗生物質が含まれる。かかる化学療法剤のための調製および投与計画は、製造者の指示に従って、または技術のある開業医が経験的に決定するようにして、用いることができる。このような化学療法のための調製および投与計画もまた、Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)に記載されている。
【０２２４】
抗体を、抗ホルモン化合物；例えば抗エストロゲン化合物、例えばタモキシフェン；抗プロゲステロン化合物、例えばオナプリストン（EP 616 812を参照）；または抗アンドロゲン化合物、例えばフルタミドと、かかる分子について知られている投与量で混ぜ合わせることができる。処置されるべき癌がアンドロゲン非依存性癌である場合には、患者は予め抗アンドロゲン療法を受けていてもよく、癌がアンドロゲン非依存性となった後に、抗Ｏｖｒ１１０抗体（および随意に本明細書中に記載した他の剤）を、患者に投与することができる。
時々、心臓保護剤（療法に付随する心筋機能障害を予防するかまたは低減させるために）または１種もしくは２種以上のサイトカインを患者に同時投与することも、有益であり得る。前述の療法計画に加えて、患者に対して、癌細胞の手術的除去および／または放射線療法を、抗体療法の前、これと同時に、またはこの後に施すことができる。前述の同時投与される任意の剤に適する投与量は、ここで用いられたものであり、剤および抗Ｏｖｒ１１０抗体の組み合わされた作用（相乗作用）のために低減することもできる。
【０２２５】
疾患の予防または処置のために、投与量および投与の方式を、既知の基準に従って医師が選択する。抗体の適切な投与量は、前に定義した、処置すべき疾患の種類、疾患の重篤度および経過、抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、前の療法、患者の臨床履歴および抗体への応答並びにかかっている医師の裁量に依存する。抗体は、患者に対して、１回でまたは一連の処置にわたり好適に投与する。好ましくは抗体は、静脈内注入により、または皮下注射により投与する。疾患の種類および重篤度に依存して、約１ｐｇ／体重１ｋｇ〜約５０ｍｇ／体重１ｋｇ（例えば約０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体を、例えば、１もしくは２以上の別個の投与による、または連続的な注入による、患者への投与のための最初の候補投与量とすることができる。投与計画は、約４ｍｇ／ｋｇの最初の負荷用量を投与し，続いて約２ｍｇ／ｋｇの抗Ｏｖｒ１１０抗体の用量を毎週維持することを含むことができる。しかし、他の投与計画も有用であり得る。典型的な毎日の投与量は、前述の要因に依存して、約１ｐｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはこれ以上の範囲内であり得る。状態に依存した、数日またはこれより長い期間にわたる繰り返し投与については、疾患症状の所望の抑制が発生するまで処置を持続させる。この療法の進行を、慣用の方法およびアッセイにより、および医師または他の当業者に知られている基準に基づいて、容易にモニタリングすることができる。
【０２２６】
抗体タンパク質の患者への投与に加えて、本出願は、遺伝子療法による抗体の投与を意図する。抗体をコードする核酸分子のこのような投与は、「抗体の治療的に有効な量を投与する」との表現により包含される。例えば、遺伝子療法を用いて細胞内抗体を生成することに関する、１９９６年３月１４日刊行のWO 96/07321を参照。
【０２２７】
核酸分子（随意にベクター中に包含されている）を患者の細胞中に導入するための、in vivoおよびex vivoという２つの主要な方法がある。in vivo送達に対しては、核酸分子を、患者に直接、通常は抗体が必要である部位において注射する。ex vivo処置に対しては、患者の細胞を取り出し、核酸分子をこれらの単離した細胞中に導入し、修飾した細胞を、患者に、直接、または例えば多孔質膜内に封入し、これを患者中に移植して、投与する（例えば米国特許第4,892,538号および5,283,187号を参照）。核酸分子を生存可能な細胞中に導入するのに利用可能な種々の手法がある。これらの手法は、核酸が、培養した細胞中にin vitroで移送されるか、意図された宿主の細胞中にin vivoで移送されるかに依存して、変化する。核酸を哺乳類細胞中にin vitroで移送するのに適した手法には、リポソームの使用、電気穿孔法、マイクロ注射、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法などが含まれる。遺伝子のex vivo送達のために共通して用いられるベクターは、レトロウイルスベクターである。
【０２２８】
現在の好ましいin vivoの核酸分子移送手法には、ウイルスベクター（例えばアデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルスまたはアデノ関連ウイルス）および脂質に基づく系（遺伝子の脂質媒介移送に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである）を用いた形質移入が含まれる。現在知られている遺伝子マーキングおよび遺伝子療法プロトコルの概説について、Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)を参照。またWO 93/25673およびこの中に引用されている参考文献を参照。
【０２２９】
製造品およびキット
本発明はまた、Ｏｖｒ１１０過剰発現細胞の検出および／またはＯｖｒ１１０発現癌、特に卵巣癌、膵臓癌、肺癌および乳癌の処置に有用な物質を含む、製造品に関する。製造品は、容器およびこの中に含まれた組成物を含み、該組成物は本発明の抗体を含む。該組成物はさらに、担体を含むことができる。製造品はまた、容器上またはこれに付随するラベルまたは添付文書を含むことができる。好適な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、種々の材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成することができる。容器は、Ｏｖｒ１１０発現細胞を検出し、および／または癌状態を処置するのに有効な組成物を保持し、また無菌のアクセス口を有することができる（例えば、この容器は、静脈内溶液袋または皮下組織注射針により貫通可能な栓を有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性な剤は、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、Ｏｖｒ１１０発現細胞を検出し、および／または卵巣癌、膵臓癌、肺癌および乳癌、またはさらに具体的に卵巣漿液性腺癌、乳房浸潤性乳管癌を、これを必要としている患者において処置するのに用いられることを示す。ラベルまたは添付文書は、さらに、抗体組成物を癌患者に投与するための指示を含むことができる。さらに、製造品は、本発明の抗体を検出する物質、例えば本発明の抗体に結合する第２の抗体を含む第２の容器をさらに含むことができる。この物質は、検出可能な標識、例えば本明細書中に開示したもので標識することができる。第２の容器は、例えば、薬学的に許容し得る緩衝液、例えば注射用の静菌性水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含むことができる。製造品はさらに、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を含むことができ、これらには他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジが含まれる。
【０２３０】
種々の目的のために有用なキットが提供され、例えばＯｖｒ１１０細胞死滅アッセイのために、Ｏｖｒ１１０を細胞から精製もしくは免疫沈澱するために、または血清試料中のＯｖｒ１１０の存在を検出するかもしくは細胞試料中のＯｖｒ１１０発現細胞の存在を検出するために有用なキットである。Ｏｖｒ１１０の単離および精製のために、キットは、固体支持体、例えば組織培養プレートまたはビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合した抗Ｏｖｒ１１０抗体を含むことができる。Ｏｖｒ１１０をin vitroで、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいて検出し、定量するための抗体を含むキットを提供することができる。製造品について、キットは、容器および、この中に含まれた組成物であって本発明の抗体を含む該組成物を含む。キットはさらに、容器上の、またはこれに付随するラベルまたは添付文書を含むことができる。キットは、追加の成分を含むことができ、例えば希釈剤および緩衝液、本発明の抗体に結合する物質、これは、例えば本明細書中に開示したような標識、例えば放射性標識、蛍光標識を含むことができる第２の抗体もしくは酵素を含むことができ、またはキットはまた対照の抗体を含むことができる。追加の成分は、キット内の別の容器内にあってもよい。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明および、意図されたin vitroまたは診断的使用のための指示を提供することができる。
【０２３１】
例
例１：モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの産生および単離
本発明の次のＭＡｂ／ハイブリドーマについて、以下に記載する：
Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1(前にOvr110 A22.1として同定されたもの), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A 99.1, Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2およびOvr110.J3。
ＭＡｂがクローニングされている場合、これは、「Ｘ．１」の命名を得る。例えば、Ａ７の最初のクローンをA7.1と呼び、Ａ７の第２のクローンをA7.2と呼ぶなどである。本発明のために、Ａ７についての言及は、すべてのクローン、例えばA7.1、A7.2などを含む。
【０２３２】
免疫原および抗原（組換えタンパク質、ＨＡおよびＨｉｓタグおよび形質移入した細胞）
以下に記載するＯｖｒ１１０構成物（construct）のために、Ｏｖｒ１１０の領域をコードする核酸分子を種々の発現ベクターに挿入して、組換えタンパク質を産生した。これらの核酸配列は、その設計が当業者にはルーチンであるプライマーを用いて単離した。幾つかの場合においては、用いたプライマーは各構成物の以下の説明に含められている。
説明のために、各構成物によりコードされる予想されるアミノ酸配列も含める。しかし、構成物は、プライマーにより単離されたＯｖｒ１１０領域内に天然に存在する変異体（例えば対立遺伝子変異体、ＳＮＰ）も含むことができる。これらの変異体配列、およびこれに結合する抗体は、本明細書に記載したように、本発明の一部であると考えられる。
【０２３３】
Ｏｖｒ１１０Ａ配列およびタンパク質産生
Ｍｅｔ１〜Ｌｙｓ２８２の未成熟Ｏｖｒ１１０タンパク質配列全体（配列番号：１）をコードする完全長ＤＮＡを、ヒト・スタニオカルシン（ＳＴＣ）からの１７アミノ酸分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列および６Ｈｉｓタグをコードする配列を含む修飾ベクター中に挿入して、Ｏｖｒ１１０タンパク質のＮ末端に融合する分泌シグナルとＣ末端に融合する６Ｈｉｓタグとを有する組換えＯｖｒ１１０融合タンパク質をコードするベクターを生成した。得られたベクターは、標準手法を用いて組換えタンパク質を産生するために用いた。簡単に述べると、得られたベクターにより形質転換された細胞を、組換えＯｖｒ１１０タンパク質の産生に適した条件下で培養した。形質転換した細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄し、０．８Ｍ塩化ナトリウム、０．３％両性洗浄剤（Zwittergent）３〜１４および０．１％オクチルホスホグルコシドを含む５容量（５ｍｌ／細胞１ｇ）の５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０に、超音波処理により溶解させた。不溶解性の物質は沈殿物として分離し、抽出を２回繰り返した。分離した沈殿物は、６Ｍ塩酸グアニジオン（３ｍｌ／細胞１ｇ）を含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．８に溶解し、Ａｋｔａ−１００システム（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）上の同じ緩衝液で平衡化した１０−ｍｌ−Ｎｉ−ＮＴＡ（Qiagen, Alameda, CA）カラムを通して、約４０カラム容量（ＣＶ）について５ｍｌ／分の流量で循環させた。カラムは次に、上記リン酸−グアニジン緩衝液中で、２ＣＶの同じリン酸−グアニジン緩衝液、２ＣＶの２０ｍＭイミダゾール、２ＣＶの５０ｍＭイミダゾール、および４ＣＶの１００ｍＭイミダゾールを用いて洗浄した。
【表４】
2008519841.tif 000006
【０２３４】
得られたベクターは、標準手法により組換えタンパク質を産生するために用いた。簡単に述べると、得られたベクターにより形質転換された細胞を、組換えＯｖｒ１１０タンパク質の産生に適した条件下で培養した。形質転換した細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄し、０．８Ｍ塩化ナトリウム、０．３％両性洗浄剤（Zwittergent）３〜１４および０．１％オクチルホスホグルコシドを含む５容量（５ｍｌ／細胞１ｇ）の５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０に、超音波処理により溶解させた。不溶解性の物質は沈殿物として分離し、抽出を２回繰り返した。分離した沈殿物は、６Ｍ塩酸グアニジオン（３ｍｌ／細胞１ｇ）を含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．８に溶解し、Ａｋｔａ−１００システム（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）上の同じ緩衝液で平衡化した１０−ｍｌ−Ｎｉ−ＮＴＡ（Qiagen, Alameda, CA）カラムを通して、約４０カラム容量（ＣＶ）について５ｍｌ／分の流量で循環させた。カラムは次に、上記リン酸−グアニジン緩衝液中で、２ＣＶの同じリン酸−グアニジン緩衝液、２ＣＶの２０ｍＭイミダゾール、２ＣＶの５０ｍＭイミダゾール、および４ＣＶの１００ｍＭイミダゾールを用いて洗浄した。
【０２３５】
Ｏｖｒ１１０を、リン酸−グアニジン緩衝液中で４ＣＶの５００ｍＭイミダゾールを用いて溶離し、カラムをさらに、１Ｍイミダゾールおよび６Ｍ塩酸グアニジンを含む４ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．６で洗浄した。採集した断片からの試料にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を行い、Ｏｖｒ１１０Ａの純度を評価した。精製した断片をプールし、ＰＢＳに対して透析した。沈殿物を採集し、短い超音波処理により少量のＰＢＳ中に再度懸濁させた。
【０２３６】
Ｏｖｒ１１０Ｂ配列およびタンパク質産生
マウスの免疫化のために、分子の予想された細胞外部のみを構成するＯｖｒ１１０の組換えタンパク質断片を作製して、細胞の外部表面に結合するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を選択した。シグナルペプチドを含む、未成熟なタンパク質のＧｌｙ３０（下の配列において下線で示す）からＬｙｓ２８２（開始コドン位置におけるＭｅｔを加える）までのＯｖｒ１１０配列をコードするＤＮＡ断片を、修飾ベクターに挿入し、ここで該修飾ベクターは、ヒト・スタニオカルシン（ＳＴＣ）からの１７アミノ酸分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列および６Ｈｉｓタグをコードするヌクレオチド配列を含み、Ｏｖｒ１１０タンパク質のＮ末端に融合するヒト・スタニオカルシン（ＳＴＣ）からの１７アミノ酸分泌シグナルとＣ末端に融合する６Ｈｉｓタグとを有する組換えＯｖｒ１１０融合タンパク質をコードするベクターである（Ｏｖｒ１１０Ｂ）。
【表５】
2008519841.tif 000007
【０２３７】
得られたベクターは、ＤＨ１０Ｂａｃ細菌を形質転換して、転位により感染ベクターを生成するために用いた。次に組換えバキュロウィルスを、Ｓｆ９細胞を転置されたベクターで形質移入することにより、生成した。組換えＯｖｒ１１０Ｂを、増幅および収穫したウィルス粒子でＨｉ５細胞系を感染させて、発現させた。
組換えＨｉ５細胞からの培養培地を、感染の４８時間後に収穫した。培地は１０倍に濃縮し、ｐＨ７．９のＰＢＳ３０容量でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションした物質を次に１０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ急速ゲル（Qiagen）で４℃で一晩、プロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下でインキュベートした。ゲルをＳＫカラムに注ぎ、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８で洗浄した。Ｏｖｒ１１０Ｂを、同じリン酸−塩化ナトリウム緩衝液中の段階的に増加させたイミダゾール（２０ｍＭを４ＣＶ、５０ｍＭを４ＣＶ、１００ｍＭを４ＣＶ、５００ｍＭを４ＣＶおよび１０００ｍＭを２ＣＶ）で溶離した。採集した断片からの試料にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を行って、Ｏｖｒ１１０Ｂの純度を評価した。精製した断片は、プールして濃縮した。最終生成物はＰＢＳ中で透析した。
【０２３８】
哺乳類細胞発現Ｏｖｒ１１０の配列およびタンパク質産生
Ｇｌｙ３０からＬｙｓ２８２までのＯｖｒ１１０をコードする核酸分子を、完全長Ｏｖｒ１１０のｃＤＮＡ（ｐＤＯＮＲ２０１＿Ｏｖｒ１１０）を含むシャトルベクターから、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ断片を産生することにより、生成した：
【表６】
2008519841.tif 000008
ＰＣＲ断片は、ＮｓｉＩおよびＮｈｅＩで消化し、ヒト・スタニオカルシン１（ＳＴＣ−１）分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列および１０ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列を含む、修飾哺乳類発現ｐＣＭＶ５Ｈｉｓ２ベクター中に、インフレームでクローニングして、ＮＨ２末端に融合したヒト・スタニオカルシン１（ＳＴＣ−１）分泌シグナルおよびＣＯＯＨ末端に融合した１０ヒスチジンタグをそれぞれ有する組換えＯｖｒ１１０タンパク質をコードする、組換えプラスミドｐＣＭＶ５ｊｏｓ２＿Ｏｖｒ１１０を産生した。Ｏｖｒ１１０配列は、以下の記載において下線で示す。ＤＮＡ配列分析は、PE Applied Biosystems （Foster City, CA）からのABI Prism BigDye終了サイクルシーケンシング簡易反応キットを用いて行った。
【表７】
2008519841.tif 000009
【０２３９】
組換えプラスミドｐＣＭＶ５Ｈｉｓ２＿Ｏｖｒ１１０を用いて、スピナーフラスコ内の懸濁培養物中（１Ｌの無血清培地）で、２９３Ｔ細胞を形質移入した。
培養培地は、形質移入の４８時間後に収穫した。培地は１０倍に濃縮し、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ８．０でダイアフィルトレーションした。Ｏｖｒ１１０を含有する濃縮した培地は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ８．０で予め平衡化した５ｍＬニッケル金属キレートカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ急速、Qiagen Inc.）上を通した。次にカラムを６カラム容量（ＣＶ）の１００ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、ｐＨ８．０で洗浄した。Ｏｖｒ１１０を、カラムから、それぞれ５ｍＭイミダゾールおよび５００ｍＭイミダゾールを含む２２ＣＶの１００ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ８．０を用いて溶離した。Ｏｖｒ１１０を含む断片をプールし、１００ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロール、ｐＨ７．５で透析した。
【０２４０】
ＢＴＬＡ配列およびタンパク質産生：
Ｍｅｔ１からＳｅｒ２８９の完全長ヒトＢＴＬＡ（ｈＢＴＬＡ）をコードする核酸分子を、下垂体およびリンパ節ｃＤＮＡライブラリから以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによりクローニングした：
【表８】
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単離した核酸分子はベクターに挿入した；コードされたタンパク質を次に示す。
【表９】
2008519841.tif 000011
【０２４１】
表面免疫グロブリン（Ｉｇ）領域を包含するＭｅｔ１−Ｐｒｏ１５２をコードする切断ｈＢＴＬＡ遺伝子を、バーキットリンパ腫ｃＤＮＡライブラリから以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによりクローニングした：
ATN551: （上記配列参照）配列番号６および
ATN554: 5'-CG GCT AGC GGG TCT GCT TGC CAC TTC GTC （配列番号８）。
膜透過領域を欠いた、Ｍｅｔ１〜Ｓｅｒ２４１のｈＢＴＬＡの完全長分泌形態をコードする核酸分子を、リンパ節ｃＤＮＡライブラリからオリゴヌクレオチドプライマーＡＴＮ５５１およびＡＴＮ５５２を用いて、ＰＣＲによりクローニングした。ＰＣＲ断片はＰｍｅＩおよびＮｈｅＩで消化し、同一の酵素で切断されたｐＣＭＶ５ＨＩＳ２またはｐＣＭＶ５Ｆｃ１のどちらかに結紮して、それぞれＣ末端伸長ＡＳ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨまたはＡＳ−マウスＦｃ領域（ｍＦｃ）を有するタンパク質構成物を生成した。ＤＮＡ配列分析を、PE Applied Biosystems（Foster City, CA）からのABI Prism BigDye終了サイクルシーケンシング簡易反応キットを用いて行った。
【０２４２】
【表１０】
2008519841.tif 000012
【表１１】
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【０２４３】
ｍＦｃ（ＢＴＬＡ５ＮＴ＿ｍＦｃ）に融合するｈＢＴＬＡの表面Ｉｇ領域のみをコードした組換えプラスミドｐＣＭＶ５Ｆｃ１＿ＢＴＬＡ５ＮＴを用いて、スピナーフラスコ内の懸濁培養物（１Ｌの無血清培地）中で２９３Ｔ細胞を形質移入した。培養培地は、形質移入の４８時間後に収穫した。塩化ナトリウムを３Ｍ最終で、収穫した培地に加え、培地をｐＨ８．０に調節した。ＢＴＬＡ含有培地を次に、予め１０カラム容量（ＣＶ）の５０ｍＭのホウ酸塩、４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化した、５ｍＬ組換えタンパク質Ａカラム上を通した。タンパク質Ａカラムは次に３０ＣＶの５０ｍＭホウ酸塩、４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄した。ＢＴＬＡ５ＮＴ＿ｍＦｃは、タンパク質Ａカラムから、１０ＣＶの１００ｍＭ酢酸塩、ｐＨ３．０を用いて溶離した。ＢＴＬＡ５ＮＴ−ｍＦｃ含有断片を１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和し、３ＬのＰＢＳ，ｐＨ７．５中で透析した。
【０２４４】
Ｏｖｒ１０７配列およびタンパク質産生
組換えＯｖｒ１０７タンパク質を用いて、多反応性ハイブリドーマクローンをスクリーニングして選択した。Ｏｖｒ１０７は複数の癌において広く上方制御され、本明細書で用いる組換えＯｖｒ１０７は、潜在的に交差反応性のヘキサヒスチジンタグを含む。従って、組換えＯｖｒ１０７は多反応性抗体の同定に有用である。
Ｍｅｔ１からＩｌｅ５９６までのＯｖｒ１０７配列（WO01/37864ヒトＯｖｒ１０７卵巣癌マーカー）をコードする完全長ｃＤＮＡをＰＣＲによりクローニングし、ベクターに挿入した。次にＯｖｒ１０７コーディング領域を、組換えにより、６Ｈｉｓタグをコードするヌクレオチド配列を含むベクターに移送して、Ｃ末端に融合した６Ｈｉｓタグを有するＯｖｒ１０７融合タンパク質を生成した。
【０２４５】
【表１２】
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得られたベクターを用いて、ＤＨ１０Ｂａｃ細菌を形質転換し、転位により感染ベクターを生成させた。次に、組換えバキュロウィルスを、Ｓｆ９細胞を転位ベクターで形質移入することにより生成した。組換えＯｖｒ１０７を、増幅し収穫した組換えバキュロウィルス粒子でＳｆ９またはＨｉ５細胞系を感染させることにより、発現させた。
【０２４６】
組換えバキュロウィルス感染Ｈｉ５細胞を、感染の４８時間後に収穫した。細胞はＤＰＢＳで洗浄し、０．４Ｍ塩化ナトリウム、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００および１０ｍＭイミダゾールを含有するｐＨ８．０の１００ｍＭリン酸ナトリウムに、超音波処理により溶解した（５ｍｌ／細胞１ｇ）。抽出物を１０ｍｇのＤＮａｓｅで室温で３０分間インキュベートし、次にＳＳ−３４ローター内で１７，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清物をさらに４５ｎｍフィルタを通して濾過し、０．４Ｍ塩化ナトリウムおよび１０％グリセロールを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．１で平衡化した、５ｍｌ−Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Quiagen）上に、３ｍｌ／分の流量で負荷した。カラムを、１５カラム容量（ＣＶ）の同じ平衡緩衝液で洗浄し、Ｏｖｒ１０７を、リン酸−塩化ナトリウム緩衝液中の段階的に増加させたイミダゾール（２０ｍＭを１０ＣＶ、５０ｍＭを１０ＣＶ、１００ｍＭを１０ＣＶ、５００ｍＭを５ＣＶおよび１０００ｍＭを５ＣＶ）で溶離した。断片を、５ｍｌ／チューブに採集し、採集した断片からの試料にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン分析を行い、Ｏｖｒ１０７の純度を評価した。精製した断片をプールして濃縮した。最終生成物はＰＢＳ中で透析した。
【０２４７】
安定なＬＭＴＫマウス細胞系の生成
Ｃ末端ＨＡタグ化Ｏｖｒ１１０をコードする哺乳類ベクターを、マウスＬＭＴＫ細胞に形質移入した。安定な形質移入体を、１０ｕｇ／ｍｌのブラストシジン（blastocidin）を用いてダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）／１０％ＦＢＳ中で７〜１０日間選択し、続いて蛍光に基づく単一細胞分類（Coulter Elite, Beckmann Coulter, Sunnyvale, CA）を、９６ウェルプレート中で１細胞／ウェルで行った。形質移入したＬＭＴＫ細胞は、９６ウェルプレート中で増殖させ（VWR, Brisbane, CA）、２４ウェルプレートに拡大し、次に６ウェルプレートに拡大した細胞である。１週間の培養の後、個々のクローンを、Ｏｖｒ１１０の発現についてウェスタンブロットにより抗ＨＡ抗体（Covance, Richmond, CA）を用いてアッセイした。Ｏｖｒ１１０−ＨＡの最高レベルを発現する２個のＬＭＴＫ細胞クローンを、７５ｃｍ２のフラスコ（VWR）中に拡大してハイブリドーマのスクリーニングを行い、１０％ＤＭＳＯを含むウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で凍結保存し、−１９６℃の液体窒素中に貯蔵して、生存可能なクローン培養物の維持を確実にした。ベクターによりコードされるタンパク質は、以下にＨＡ−タグに下線をつけて表示した。
【表１３】
2008519841.tif 000015
【０２４８】
一過性２９３Ｆ形質移入細胞の生成
ＨＡタグを持たない、Ｏｖｒ１１０（配列番号：１３）をコードする核酸分子を、哺乳類発現ベクター、ＰＣＤＮＡ３．１にクローニングし、組換えベクターを用いてヒト２９３Ｆ細胞（Invitrogen）を形質移入した。１０６細胞／ｍｌでフリースタイル培地（GIBCO）中で培養した５０ｍｌの２９３Ｆ細胞を、２９３フェクチン形質移入試薬（Invitrogen）を用いて、製造業者の指針に従い、形質移入した。ＤＮＡ、細胞および２９３フェクチンをＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（GIBCO）中に混合した。細胞は、形質移入の４８時間後に分析に用いた。
【０２４９】
免疫化
ＡシリーズＭＡｂ融合のために、可溶性の大腸菌発現Ｏｖｒ１１０Ｂ組換えタンパク質でマウスを免疫化した。ＣシリーズＭＡｂ融合のために、Ｏｖｒ１１０の哺乳類発現細胞外領域でマウスを免疫化した。ＩシリーズＭＡｂ融合のために、上記の昆虫由来のＨｉｓタグ化Ｏｖｒ１１０タンパク質で、週に２回マウスを免疫化した。
８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、両方の後ろ足蹠において皮内免疫化した。全ての注射は、１つの足当たり２５ｕＬであった。１匹のマウス当たり１０ｕｇの抗原の最初の注射（１日目）は、等しい容積対容積比でTitermax gold アジュバント(Sigma, Saint Louis, MS)と混合したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）において行った。マウス当たり１０ｕｇの抗原のその後の注射は、５、９、１２、１６、１９、２３、２６、２９、３０日目に行い、これはマウス当たり、２０ｕＬのＤＰＢＳと５ｕＬのAdju-phosアジュバント(Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY)中の抗原からなっていた。３３日目の最後の追加免疫注射は、ＤＰＢＳのみで希釈した抗原からなっていた。融合は、３７日目に生じた。
【０２５０】
ハイブリドーマ融合
マウスを、免疫化プロトコルの完了時に絶命させ、排出するリンパ節（膝窩）組織を、無菌の解剖により採集した。リンパ節細胞は、無菌のふるいを通してＤＭＥＭ中に押圧し、抗ＣＤ９０（Ｔｈｙ１．２）で被覆した磁性ビーズ(Miltenyl Biotech, Baraisch-Gladbach, Germany)を介してＴ細胞を除去することにより、分散させた。
次に、これらの一次Ｂ細胞が豊富なリンパ節細胞を、連続的な骨髄腫細胞系Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３(Kearney, J.F. et al., J. Immunology 123: 1548-1550, 1979)との電子−細胞融合(BTX, San Diego, CA)により不死化した。成功に融合した細胞を、標準的なヒポキサンチン、アザセリン（ＨＡ）(Sigma)含有選択培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）中で培養することにより選択した。これらの融合培養物を、直ちにプレートあたり１０００万個の細胞で、９６ウェル培養プレートのウェル中に分散させた。融合後直ちに培養物を９６ウェル培養プレート中に分散させることにより、単一の特異的な抗体を産生するより広範囲の種類のハイブリドーマクローンの選択が容易になった。ウェルからの上清液を、ＥＬＩＳＡにより、Ｏｖｒ１１０Ｂ、Ｏｖｒ１１０Ａに対する反応性について、および、無関係のタンパク質（Ｏｖｒ１１７）との交差反応性の不在について、スクリーニングした。
【０２５１】
単一の細胞からの遺伝子的に均一な子孫からなるモノクローナル培養物を、上記のスクリーニング手順の後に、単一の生存可能な細胞を２つの９６ウェルプレートのウェル中にフローサイトメトリー(Coulter Elite)を用いて分類することにより、確立した。得られたマウスＢ細胞ハイブリドーマ培養物は、標準的な組織培養手法を用いて拡大した。選択されたハイブリドーマを、１０％ＤＭＳＯを有するウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で凍結保存し、−１９６℃の液体窒素中に貯蔵して、生存可能なクローン培養物の維持を確実にした。
【０２５２】
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングおよび選択
ハイブリドーマ細胞系を、Ｏｖｒ１１０特異的抗体の産生について、酵素結合固相イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により選択した。Ｏｖｒ１１０ＢまたはＯｖｒ１０７タンパク質を、９６ウェルポリスチレンＥＩＡプレート（VWR）のウェルに非特異的に吸着させた。（ＤＰＢＳ）中で０．９１ｍｇ／ｍＬにおいて、５０ｕＬのＯｖｒ１１０Ｂタンパク質またはペプチドＢＳＡ結合体を、９６ウェルポリスチレンＥＩＡプレートのウェル中で、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、０．０５％のTween 20、ｐＨ７．４を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で２回洗浄した。次に、プレートウェルを排出し、非特異的結合能力を、ウェルをＴＢＳＴ／０．５％ウシ血清アルブミン（ＴＢＳＴ／ＢＳＡ）で完全に満たし、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートすることにより遮断した。次に、プレートウェルを排出し、５０ｕＬのハイブリドーマ培養培地試料をウェルに加え、１時間ＲＴでインキュベートした。次に、ウェルを、（ＴＢＳＴ）で３回洗浄した。次に、ＴＢＳＴ／ＢＳＡで１：５０００に希釈した１００ｕＬのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)を、各々のウェルに加え、１時間ＲＴでインキュベートした。次に、ウェルを、ＴＢＳＴで３回洗浄した。次に、１Ｍのジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ８．９(Sigma)中の１００ｕＬのアルカリホスファターゼ基質パラニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）(Sigma)、１ｍｇ／ｍＬを、各々のウェルに加え、２０分間ＲＴでインキュベートした。結合したアルカリホスファターゼ活性を、視覚可能な黄色の発色により示した。酵素反応を、溶液の吸光度を４０５ｎｍの波長において測定することにより定量した。最高の吸光度の値を生じる培養物を、拡大およびさらなる評価のために選択した。
【０２５３】
Ｏｖｒ１１０ＭＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニング
２週間の培養の後、Ｏｖｒ１１０Ｂについて１．０より大きい、およびＯｖｒ１０７について０．２より小さいＥＬＩＳＡ吸光度値を生じる上清を有するハイブリドーマを、２５個の９６ウェル培養プレートから新しい９６ウェル培養プレート中へ再配置し、さらに１週間培養した。
さらに１週間培養した後、Ｏｖｒ１１０Ｂについて１．０より大きい（表１Ａおよび１Ｂ）、およびＯｖｒ１０７について０．２より小さいＥＬＩＳＡ吸光度値を生じる上清を有するハイブリドーマを、Ａシリーズから１２個、およびＣシリーズから１５個、９６ウェル培養プレート中の単一細胞クローニング用に、細胞分類により選択した（Coulter Elite）。
【０２５４】
【表１４】
2008519841.tif 000016
【表１５】
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【０２５５】
クローニングしたＯｖｒ１１０ＭＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニングからの結果
２週間の培養の後、各親ハイブリドーマからの２つのハイブリドーマクローンからの上清を、Ｏｖｒ１１０Ｂ（表１Ａおよび１Ｂ）またはＯｖｒ１１０ペプチドについて１．５より大きい、またはＯｖｒ１０７について０．２より小さい、ＥＬＩＳＡ吸光度値の生成について試験した。次のクローン：Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1, Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89.1,  Ovr110.A 99.1, Ovr110.A102.1, Ovr110.A107.1, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1 & Ovr110.C17.1、は全て、免疫組織化学法、免疫蛍光法および機能試験についてスケールアップのために選択された。
【０２５６】
Ｏｖｒ１１０ＭＡｂの細胞表面結合についてのＦＡＣＳスクリーニング
ＬＭＴＫ−Ｏｖｒ１１０−ＨＡ安定形質移入体およびＯｖｒ１１０ｍＲＮＡ陽性（ＳＫＢＲ３）およびｍＲＮＡ陰性（ＨＴ２９）腫瘍細胞系を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ中で増殖させた。染色の１日前に、ＬＭＴＫ−Ｏｖｒ１１０−ＨＡ安定形質移入細胞を、酪酸ナトリウムを５ｍＭの最終濃度となるように加えて刺激した。ＦＡＣＳ分析のために、ＬＭＴＫ−Ｏｖｒ１１０−ＨＡ細胞または腫瘍細胞系を、１０ｍｌのＣａ＋２／Ｍｇ＋２非含有ＤＰＢＳで１回洗浄し、次に７ｍｌの温かい（３７℃）Cellstripper(Mediatech, Herndon, VA)を１５０ｃｍ２のフラスコにつき加えた。次に、細胞を、３７℃で５分間、フラスコを軽くたたいてしっかり付着した細胞を除去しながらインキュベートした。細胞を除去し、数回ピペットで採取して凝集体を破壊し、次に直ちにＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５ｍＭ酪酸ナトリウム中に配置した。次に、細胞を、５分間１３００ｒｐｍで遠心分離し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５ｍＭ酪酸ナトリウム中に再懸濁させた。細胞を、３７℃で３０分の回収時間にわたりインキュベートした。染色の前に、細胞の生存可能性をGuava Viacount (Guava Cytometers, City, CA)を用いて測定し、＞９０％生存可能である場合には、これらを９６ウェルｖ底プレート（ＶＷＲ）中に分散させて、ＭＡｂで染色した。
【０２５７】
細胞を、９６ウェルｖ底プレート中に、０．５〜１．０×１０６個の細胞／ウェルで等分し、２分間１５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を吸引し、プレートをボルテックスミキサー上で短時間振盪して細胞を再懸濁させ、次に２００ｕｌのＤＰＢＳ／３％ＦＢＳ／０．０１％アジ化Ｎａ（ＦＡＣＳ緩衝液）を、各々のウェルに加えた。遠心分離および吸引を繰り返し、次にハイブリドーマ上清または精製したＭＡｂの２５ｕＬの連続希釈物を、細胞に加えた。プレートを氷上で１５分間貯蔵し、次に前述のように、２００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄した。この洗浄手順を２回繰り返し、次に２５ｕＬのフィコエリスリン（ＰＥ）結合ロバ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA)を、細胞に加えた。氷上で１５分後、細胞を前述のように２回洗浄し、次に２５０ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させて、セルソーターまたはフローサイトメーター上で分析した。ある場合において、分析前に４℃で一晩貯蔵するために、１３３ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液および６７ｕＬの１％パラホルムアルデヒド／ＤＰＢＳを、固定のために各々のウェルに加え、次に容積を、ＤＰＢＳで２５０ｕＬに増加させた。染色した細胞を、Elite蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）(Beckman-Coulter, Miami, FL)上で分析した。
【０２５８】
ＦＡＣＳ分析による、細胞表面の発現を示す代表的な実験の結果を、図１に示す。Ｏｖｒ１１０ＭＡｂ A7.1の結合、続いてロバ抗マウスＩｇ−ＰＥ結合体（ＤＡＭＰＥ）の結合により、Ｏｖｒ１１０形質移入マウスＬＭＴＫ細胞の４９％が陽性となり、蛍光強度（平均蛍光強度、ＭＦＩ）が、ＤＡＭＰＥのみで染色された細胞より７．５倍高かった。ヒト腫瘍細胞系のさらなるＦＡＣＳ分析のデータを、下の表２に示す。この結果に見られるように、Ovr110.C3.2、Ovr110.C5.3およびOvr110.C6.3の各々は、８０％以上の新鮮なＯｖｒ１１０ｍＲＮＡ陽性ＳＫＢＲ３細胞に結合し、一方、対照の陰性ＭＡｂPro4.D9.1は、これらの同じ乳癌由来の細胞の２％未満にしか結合しなかった。Ovr110.C3.2、Ovr110.C5.3およびOvr110.C6.3は、同様に、結腸癌株ＨＴ２９のＯｖｒ１１０ｍＲＮＡ陰性細胞の２％未満に結合した。
【表１６】
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【０２５９】
Ｏｖｒ１１０のＩシリーズ抗体融合からの上清を、昆虫由来Ｏｖｒ１１０タンパク質および２９３Ｆ哺乳類細胞に由来するＯｖｒ１１０−ヒトＩｇＦｃ融合タンパク質および陰性対照タンパク質に対して、ＥＬＩＳＡアッセイ（上記）によりスクリーニングした。２２ウェルの細胞が、昆虫および哺乳類タンパク質の両方に反応性であり、陰性対照タンパク質に対しては非反応性であった。フローサイトメトリにより、Ｏｖｒ１１０形質移入２９２３Ｆ細胞および非形質移入の親細胞系について試験すると、５つの抗体（Ｉ２、Ｉ３、Ｉ４、Ｉ１１およびＩ２０）はＯｖｒ１１０細胞表面タンパク質について高レベルの反応性を示し、親対照株についてはごくわずかな反応性しか示さなかった。
【表１７】
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【０２６０】
Ｏｖｒ１１０ＭＡｂアイソタイプ
ＭＡｂのアイソタイプは、市場で入手可能なマウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定用免疫測定試験キット（IsoStrip, Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN）を用いて決定した。アイソタイプ決定結果を表３に示す。ＩｇＧ２ｂ／κアイソタイプであるＯｖｒ１１０ＭａｂA10.1を除き、全てのＭＡｂは、ＩｇＧ１／κアイソタイプであった。
【表１８】
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【０２６１】
Ｏｖｒ１１０ＭＡｂ親和性分析
結合動力学および親和性定数を、表面プラスモン共鳴測定から、BIACORE 3000機器(Biacore, Piscataway, NJ)を用いて計算した。実験を設計して、Ｏｖｒ１１０ＭＡｂについてのオンレート、オフレートおよび親和性値を同時に発生させた。
【０２６２】
ラビット抗マウスＩｇＧＦｃ抗体（Biacore）を、ＣＭ５センサーチップ(Biacore)の流動細胞２、３および４上で、標準的なアミンカップリング(Biacore)により固定化した。流動細胞１を減算基準のためのブランク表面として用い、これを活性化し、次にエタノールアミンで不活性化した。Ｏｖｒ１１０ＭＡｂをラビット抗マウスＩｇＧＦｃ被覆チップ上に捕捉し、抗原を結合した。従ってこれらの測定は、ＩｇＧ抗体の二価の性質のため、抗原の直接の固定化で観察されるアビジチー（abidity）効果ではなく、実際の１：１親和性を示すはずである。ＭＡｂはＨＢＳ ＥＰ緩衝液(Biacore)で１５ｕｇ／ｍＬに希釈し、サイクル間での蒸発を最小化するために複数の管に分けた。ＭＡｂは、流動細胞内を２０ｕＬ／分で２分間通過した。ＭＡｂの捕捉レベルは、流動細胞当たり２００〜３００応答単位（ＲＵ）の範囲であった。ＭＡｂの捕捉後、表面を３分間安定化させた。次にＯｖｒ１１０Ｂ（１．５６ｍｇ／ｍＬ）抗原を、捕捉したＭＡｂ上に、流動細胞中２０ｕＬ／分で流動させ、およびブランク流動細胞中を４分間、順番に次の濃度：１４４、７２、３６、１８、９、４．５ｕｇ／ｍＬで通した。Ｏｖｒ１１０Ｂ分子量は３５ｋＤであるため、これらの抗原濃度は、４．１１、２．０６、１．０３、０．５１４、０．２５７、０．１２９ｕＭに相当する。それぞれの抗原濃度または緩衝液に対して、２回の反復サイクルを実行した。サイクルの間には４２０秒の解離時間をとり、抗マウスＩｇＧＦｃ抗体についてのチップ表面またはブランク表面の再生は、ｐＨ１．７５の１００ｍＭのグリシンを流動細胞を通して３０秒間、１００ｕｌ／分で流すことにより行なった。
【０２６３】
得られたデータは、BiaEvaluation ソフトウェア（Biacpre）により、全体的適合同時ｋａ／ｋｄ仮定ラングミュア結合（global fit simultaneous ka/kd assuming Langmuir binding）を用いて解析した。ソフトウェアのＲｍａｘパラメータは、抗マウスＩｇＧＦｃ捕捉段階におけるマイナーな変化を補償するように、局所的に設定した。計算した親和性は表４に示すが、これは１０−９〜１０−１３の範囲にあり、in vivoでの１０ｍｇ／ｋｇ以下の治療用量を実現するのに十分高い。
【表１９】
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【０２６４】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロット分析のためのタンパク質抽出物を、細胞溶解緩衝液（１％ＮＰ−４０；１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２；１５０ｍＭの塩化ナトリウム）中に、Ｏｖｒ１１０−２９３Ｔ形質移入体および哺乳類腺癌細胞系から調製した。タンパク質は、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲル(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)上での電気泳動により、変性条件下で、Novex-XCell II Minicellゲル装置(Invitrogen, Life Tech)において分離し、その後ＰＶＤＦ膜に、XCell II Blot Module (Invitrogen Life Technologies)を用いて移送した。タンパク質の移送に続いて、膜を、１％遮断試薬(Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN)中で遮断し、精製した一次抗体（Ｏｖｒ１１０モノクローナル抗体：A10.2、A13.1、A31.1、A57.1、A72.1、A77.1、A89、A107、C3.2、C5.1、C5.3、C6.3、C7.1、C9.1、C11.1、C12.1またはC17.1）と共に、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.)と共に４℃で一晩インキュベートし、最後に化学発光により、ＥＣＬアドバンスウェスタンブロッティング検出キット(Amersham Biosiences, Piscataway, NJ)を用いて視覚化した。
【０２６５】
脱グリコシル化実験を、Ｏｖｒ１１０−２９３Ｔ形質移入体、Ｏｖｒ１１０ｍＲＮＡ陽性（ＱＰＣＲ＋）およびＯｖｒ１１０ｍＲＮＡ陰性（ＱＰＣＲ−）哺乳類腺癌細胞系および卵巣癌からのタンパク質抽出物に対して、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）を用いて、製造者の指示に従って行った。次に、脱グリコシル化された試料を、前述のようにウェスタンブロットにより分析した。簡単に述べると、１００ｕｇのタンパク質抽出物を、糖タンパク質変性緩衝液（０．５％ＳＤＳ＋還元剤）中で、１００℃で１０分間変性させた。これに続いて、１００単位のPNGaseFを加える前に、キット反応緩衝液を１％のＮＰ−４０および５０ｍＭのリン酸ナトリウムの最終濃度で加え、３７℃で４時間インキュベートした。
【０２６６】
【表２０】
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【０２６７】
ウェスタンブロット実験の結果を、表５Ａおよび表５Ｂにまとめて示す。これに見られるように、Ｏｖｒ１１０ＭＡｂA10.1、A13.1、A31.1、A57.1、A72.1、A77.1、A89、A107、C3.2、C5.1、C5.3、C6.3、C7.1、C9.1、C11.1、C12.1およびC17.1により、Ｏｖｒ１１０形質移入ヒト２９３Ｔ細胞の溶解物中で、非グリコシル化Ｏｖｒ１１０タンパク質（３０ｋＤａ）についての予想されたサイズのマイナーなバンドおよび、４９〜６０ｋＤａの主要なバンドが同定された。大きいバンドは、Ｏｖｒ１１０タンパク質上の幾つかのグルコシル化部位の存在と一致していた。、５０〜６０ｋＤａの主要なバンドはまた、同じＯｖｒ１１０ＭＡｂにより、ＱＰＣＲ＋ヒト乳癌細胞系ＳＫＢＲ３およびＭＣＦ７（ATCC, Manassas, VA）からの溶解物中にも検出されたが、ＱＰＣＲ細胞系ＣａＯＶ３およびＨＴ２９（ATCC）からの溶解物中には検出されなかった。PNGaseによる脱グリコシル化は、Ｏｖｒ１１０形質移入ヒト２９３Ｔ細胞からの溶解物において、並びにＳＫＢＲ３およびＭＣＦ７（ATCC）乳癌細胞系からの溶解物において、Ｏｖｒ１１０ＭＡｂA57.1により検出されるバンドを、〜６０ｋＤａ（グリコシル化）から〜３０ｋＤａ（推定の非グリコシル化サイズ）へと減少させた。３つの卵巣癌試料からの溶解物の、PNGaseＦによる脱グリコシル化も、Ｏｖｒ１１０ＭＡｂ57.1により検出されるバンドのサイズを、〜６０ｋＤａ（グリコシル化）から〜３０ｋＤａへと減少させた。
【表２１】
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【０２６８】
例２：免疫蛍光法により示される、生きている癌細胞におけるＯｖｒ１１０ＭＡｂの細胞表面結合
以下の癌細胞系をこの試験で用いた：卵巣ＯｖＣａｒ−３、卵巣ＣａＯＶ−３および乳房ＳＫＢｒ−３。ＯｖＣＡＲ−３およびＳＫＢＲ−３細胞はＯｖｒ１１０を発現するが、対照ＣａＯＶ−３細胞はＯｖｒ１１０を発現しない。
細胞は、１８ｍｍガラス製カバースリップ上に播種し、１０％ウシ胎仔血清およびペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で、３７℃にて４８時間培養し、その後抗Ｏｖｒ１１０ＭＡｂで処理した。
【０２６９】
１１個のＯｖｒ１１０ＭＡｂ（Ovr110.A7.1、Ovr110.A13.1、Ovr110.A72.1、Ovr110.A31.1、Ovr110.A57.1、Ovr110.A77.1、Ovr110.A87.1、Ovr110.A89.1、Ovr110.A99.1、Ovr110.A102.1およびOvr110.A107.1）を試験して、どの抗体が、Ｏｖｒ１１０発現癌細胞の細胞表面に結合するかを決定した。一次ＭＡｂを培地に最終濃度１０ｕｇ／ｍｌで加え、３７℃で１時間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３％のホルムアルデヒドで固定した後、細胞を二次Ｃｙ３標識ロバ抗マウス（Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA）で、１０ｕｇ／ｍｌの濃度で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＤＡＰＩを含む倍地（Vectastain, Vector, Burlingame, CA）中に載置し、細胞核を視覚化して対比染色を提供し、適切な蛍光フィルターを搭載したZeiss蛍光顕微鏡Axiophotで観察した。顕微鏡写真をＣＣＤカメラにより得た。
【０２７０】
結果
試験した１１個のＭＡｂ（Ovr110.A7.1、Ovr110.A13.1、Ovr110.A72.1、Ovr110.A31.1、Ovr110.A57.1、Ovr110.A77.1、Ovr110.A87.1、Ovr110.A89.1、Ovr110.A99.1、Ovr110.A102.1およびOvr110.A107.1）のうち、１０個の抗体は、Ｏｖｒ１１０発現細胞の少なくとも一部に結合することができた。図２は、Ovr110.A57.1の、ＯｖＣＡＲ−３卵巣癌細胞（図Ａの矢印）およびＳＫＢＲ−３乳癌細胞（図Ｂの矢印）の細胞膜への結合を示す。Ｏｖｒ１１０を発現しない対照細胞系であるＣａＯＶ−３細胞の細胞膜は、細胞が同じ抗体でインキュベートされても、標識されなかった（図２Ｃ）。
【０２７１】
生きている癌細胞における結合および内部移行
この試験は、蛍光抗体を用いて行った。蛍光色素Ｃｙ３で抗体を標識することにより、抗体の結合および内部移行を、蛍光顕微鏡観察により視覚化することができる。この手法は当分野で十分に確立されている。Ｏｖｒ１１０を発現しないＯｖＣＡＲ−３細胞を、陰性対照として用いた。
【０２７２】
Ｃｙ３結合
Ovr110.A7.1、Ovr110.A13.1、Ovr110.A72.1、Ovr110.A57.1、およびOvr110.A87.1をＣｙ−３で標識した。Ｃｙ３結合は、標準的な手順および製造者のガイドラインに従って行った。簡単に述べると、１ｍｇの抗体を、０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．３）に対して６０分間透析し、Ｃｙ３染料と混合し、ＲＴで２時間インキュベートし、次にPierceのSlide-A Lyzer透析カセット中に移送して、２リットルのＰＢＳ中で６時間、４℃で透析した。この操作を６回繰り返した。Ｃｙ３結合抗体を回収し、濃度を分光計で２８０ｎｍで測定した。
次にOvr110.A7.1、Ovr110.A13.1、Ovr110.A72.1、Ovr110.A57.1およびOvr110.A87.1ＭＡｂを、１０ｕｇ／ｍｌの濃度で、細胞と共に３７℃で、水チャンバー中で６０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中の３％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。固定に続いて、細胞とカバースリップを、ＤＡＰＩを含む培地(Vectastain)中に載置して細胞核を視覚化し、細胞を適切な蛍光フィルターを備えたZeiss蛍光顕微鏡Axiophotを用いて観察した。顕微鏡写真をカラーＣＣＤカメラにより得た。
【０２７３】
結果
Ｃｙ３−Ovr110.A7.1、Ovr110.A13.1、Ovr110.A72.1、Ovr110.A57.1およびOvr110.A87.1で処理した癌細胞の免疫蛍光顕微鏡観察により、Ｏｖｒ１１０を発現する癌細胞が、異なる程度において蛍光抗体に結合し、これを内部移行することが示された。図３Ａ（矢印）は、結合後にＣｙ３−Ovr110.A57.1が、ＳＫＯＶ−３細胞により、またより少ない程度においてＳＫＢｒ−３細胞により（図３Ｂ）内部移行されることを示す。ＣａＯＶ−３対照細胞においては、Ｃｙ３−Ovr110.A57.1の結合は全く観察されないか、または低い程度の結合が観察された（図３Ｃ）。ＳＫＯＶ−３細胞における内部移行パターンの染色の特徴は、ゴルジ体に近接して位置するエンドソームに相当する可能性の高い、核周囲小胞の存在である（図３Ａおよび３Ｂ）。
【０２７４】
結論
Ｏｖｒ１１０ＭＡｂは、 in vitroでＯｖｒ１１０発現癌細胞の細胞表面上でＯｖｒ１１０に結合すると、内部移行される。
免疫組織化学法により評価した腫瘍および正常組織におけるＯｖｒ１１０分布
組織
乳癌、卵巣癌および正常な隣接組織のホルマリン固定パラフィン包埋ブロックをNational Disease Research Interchange (Philadelphia, PA)から得た。正常な器官のＯＣＴ包埋ブロックをZoion (Hawthorne, NY)から得た。
【０２７５】
ホルマリン固定パラフィン包埋切片についての免疫組織化学的染色
ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックから切断した厚さ６μｍの切片を、４５℃で加熱し、Histoclear中で脱パラフィン化し、ＰＢＳまで一連のエタノールにより再水和した。抗原検索を、切片スライドを１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で１２０℃、１５〜１７ＰＳＩにおいて、デクローキング(decloaking)チャンバー(Biocare, Walnut Creek, CA)内で１０分間沸騰することにより、実施した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％過酸化水素溶液で１５分間切片を処理することにより停止させた。スライドを１％ＢＳＡと共にインキュベートして非特異的抗体結合を遮断し、次に、６種類の異なる一次Ｏｖｒ１１０ＭＡｂを１ｕｇ／ｍｌの濃度で用いて、１時間、室温でＤＡＫＯオートステイナー(autostainer)(Dako Co., Carpinteria, CA)中で反応させた。０．５％のTween-20を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で洗浄した後に、スライドを、二次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合している抗マウスＩｇＧと共に、インキュベートした。０．５％のTween-20を含むＴＢＳ中で洗浄した後に、切片を、３，３’−ジアミノベンジジン色素原(Immunovision Technologies, Co. Daly City, CA)により２〜５分間処理して視覚化し、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水後にPermount培地中に載置した。一次抗体と同一の濃度の正常なマウスＩｇＧを、陰性対照とした。
【０２７６】
ＯＣＴ包埋凍結未固定切片についての免疫組織化学的染色
スライドを、クリオチャンバー(cryochamber)内で、適切な温度において５〜８ｕｍに切断し、少なくとも３０分間室温で風乾した。ＩＨＣはImmunovision Powervision Kit (Immunovision Technologies, Co. Daly City, CA)を用いて行った。簡単に述べると、スライドをＴＢＳ中で洗浄してＯＣＴを除去し、一次抗体Ovr110.A13.1およびOvr110.A57.1と共に室温で１時間インキュベートした。これらは次に、４％パラホルムアルデヒド固定液中で１０分間後固定し、上記のようにして処理した。
【０２７７】
結果
Ovr110.A7.1、Ovr110.A10.1、Ovr110.A13.1、Ovr110.A57.1およびOvr110.A87.1を用いて、卵巣漿液性腺癌の臨床試料切片を免疫標識した。図４は、ＩＨＣによりOvr110.A57.1を用いて評価した、卵巣腫瘍におけるＯｖｒ１１０の分布を示す。
１５個の臨床試料のうち１３個（８７％）は、Ovr110.A57.1を用いて陽性免疫標識を示し、一方、１５個のうち１４個（９３％）は、Ovr110.A13.1を用いて陽性であった（表６Ａ）。特異的免疫染色は、腫瘍における上皮細胞に限定されており、陽性細胞の数は、５０％から殆ど全ての腫瘍細胞にいたるまでの範囲で変化した。図４Ａおよび４Ｂから、腫瘍の上皮細胞が、強い膜染色（矢印）とそれより弱い細胞質染色を示し、間質には背景染色がないことがわかる。図４Ｃは、一次抗体がマウスＩｇＧ断片で置き換えられている対照実験において、特異的標識がないことを示す。
【０２７８】
Ovr110.A57.1を用いた場合、１０個の乳癌臨床試料のうち８個（８０％）は陽性であり、Ovr110.A13.1を用いた場合、１０個のうち５個（５０％）が陽性であった（表６Ａ）。図５は、乳房浸潤性乳管癌の臨床試料における発現のパターンを示す。標識は、腫瘍の上皮細胞の表面に限定されていた（図５Ａおよび５Ｂ、矢印）。図５Ｃは、一次抗体がマウスＩｇＧ断片で置き換えられている対照実験において、特異的標識がないことを示す。免疫標識の強度によって判定されるように、腫瘍性の卵巣および乳房組織におけるＯｖｒ１１０についての発現レベルは高かった。Ｏｖｒ１１０発現について、限られた数の膵臓癌試料を試験した。Ovr110.A57.1によって、４個の臨床試料のうち２個（５０％）がＯｖｒ１１０発現を示し、Ovr110.A13.1によって、５個のうち３個がＯｖｒ１１０発現を示した（表６Ａ）。図６Ａおよび６Ｂは、膵臓腺癌の臨床試料における、Ovr110.A57.1を用いて得られた免疫標識パターンを示す。標識は、上皮細胞の細胞表面に限定されている（矢印）。Ovr110.A57.1の代わりに正常マウスＩｇＧを用いた場合には、特異的標識は見られなかった。肺癌組織もまた、A7.1、A13.1およびA31.1による免疫標識について陽性であることが見出された（それぞれ、２／２、２／３および１／２ケースにおいて）。
【０２７９】
Ｏｖｒ１１０発現を正常な組織においても分析し、一般に以下の器官においては陰性であることが見出された：肝臓、胃、膀胱、睾丸、結腸、卵巣、前立腺および肺（A13.1によってのみ、１／７が陽性であった）。正常な心臓の細胞は、中程度の細胞質染色を示したが、細胞表面の染色はなかった。腎臓は、幾つかの末端尿細管および上行ループにおいて中程度の膜染色を示した。正常な乳房および膵管における頂端膜もまた標識された。
【表２２】
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【表２３】
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【０２８０】
Ｏｖｒ１１０のげっ歯類相同体への結合は、抗Ｏｖｒ１１０ＭＡｂの結合についての前臨床安全試験を容易にするため、正常ヒト組織と同じ様式で調製し、切片化し、染色した正常なマウス乳房組織において、幾つかの抗Ｏｖｒ１１０ＭＡｂを試験した。この試験の結果を表６Ｂに示す。Ovr110.A57.1、Ovr110.C3.2、Ovr110.C6.3およびOvr110.C12.1は全て、マウス乳腺の導管上皮に対し、正常なヒト乳房組織におけるのと同様のパターンで反応した。
【０２８１】
まとめ
結果は、Ｏｖｒ１１０の発現が、卵巣の漿液性腺癌および乳房浸潤性乳管癌に対する、高感度で特異的な指標として用いることができることを示すが、ただし、Ｏｖｒ１１０は幾つかの膵臓癌および肺癌においても発現され、また幾つかの抗Ｏｖｒ１１０ＭＡｂは明らかに、マウス乳房組織における関連する分子とも反応した。細胞膜染色パターンは、Ｏｖｒ１１０が理想的な治療標的となることを示す。
【０２８２】
例３：Ｏｖｒ１１０形質移入ＣＨＯ細胞の、ＭＡｂおよび抗マウスＭＡｂサポリン結合体とのインキュベーションによる死滅
実験を次にようにして行った：Ｏｖｒ１１０を形質移入したＣＨＯ細胞（Ｏｖｒ１１０−ＣＨＯ）を、Ｍａｂ−ｚａｐヤギ抗マウスＩｇサポリン結合体（Advanced Targeting Systems, San Diego, CA）と予め混合したＯｖｒ１１０Ｍａｂと共にインキュベートし、細胞の生存を７２および９６時間後に測定して、これらＯｖｒ１１０発現細胞に対する潜在的な死滅効果を検出した。１日目、Ｏｖｒ１１０−ＣＨＯ細胞を９６ウェル平底無菌細胞培養プレート（Corning）に、トリプリケートのウェルで、２０００細胞／７５ｕＬ／ウェルにて、１０％ＦＢＳ、Ｐ／Ｓを含むＦ１２培地中に載置した。プレートは３７℃、５％ＣＯ２中で一晩インキュベートした。デュプリケートのプレートは、７２時間後および９６時間後での読取りのために設定された。２日目（０時間）、２５ｕＬの４×最終ＭＡｂ濃度のみ、または２５ｕＬの４×ＭＡｂを２５ｕＬの４×ＭａｂＺａｐと予め混合したもの、または２５ｕＬの４×ＭａｂＺａｐのみ、または２５ｕＬの培地のみを、９６ウェルプレートのウェルにトリプリケートで加えて、最終容量を１００ｕＬとした。ＭＡｂの最終濃度は、２ｕｇ／ｍＬ、０．４ｕｇ／ｍＬ、０．０８ｕｇ／ｍＬおよび０ｕｇ／ｍＬであり、ＭＡｂＺａｐの最終濃度は、１ｕｇ／ｍＬであった。培地のみ、ＭＡｂのみ（２ｕｇ／ｍＬのみ）、およびＭＡｂＺａｐのみのトリプリケートのウェルは、陰性対照として用いた。抗トランスフェリン受容体ＭＡｂ５Ｅ９（ATCC, Manassus, VA）は、死滅の陽性対照ＭＡｂとして用いた。プレートは５分間ゆっくり振盪して試薬を混合させ、次に３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートした。５日目（７２時間）、１０ｕＬのアラマーブルー（Alamar Blue）原液（Biosource International, Camarillo, CA）を最初のプレートセットのウェルに加え、これを３７℃、５％ＣＯ２中で、２〜７時間インキュベートした。次にプレートを、SpectraMAX GeminiEM分光光度計（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）（発光＝５９０ｎｍ、励起＝５６０ｎｍおよび自動カットオフ＝５７０ｎｍ）で分析し、生存能力を、培地のみの対照ウェルに対するパーセンテージとして表わした。
【０２８３】
【表２４】
2008519841.tif 000026
【０２８４】
Ovr110.A10.1、Ovr110.A31.1、Ovr110.A57.1、Ovr110.A87.1、Ovr110.C3.2、Ovr110.C5.1、Ovr110.C5.3、Ovr110.C6.3、Ovr110.C9.1、Ovr110.C11.1およびOvr110.C12.1の試験結果を、表８に示す。ここに見られるように、ＭＡｂＺａｐのみでは高い背景値がもたらされ、Ｏｖｒ１１０−ＣＨＯ細胞の増殖を０〜４１．４％阻害した。これはＰｒｏ１０４−ＣＨＯ細胞およびＭＡｂＺａｐのみを有する陰性対照ウェルでは生じず、これらの場合には、０〜１０％の増殖阻害であった（データ示されず）。しかし、Ｏｖｒ１１０ＭＡｂのみの場合のいずれも、Ｏｖｒ１１０−ＣＨＯ細胞の３．８％を超える増殖阻害を生じなかった。一方、ＭＡｂＺａｐサポリン結合体を添加すると、試験した全てのＯｖｒ１１０ＭＡｂは、ＭＡｂＺａｐのみの場合よりも１０％以上の増殖阻害を生じた。特にOvr110.A57.1は、ＭＡｂＺａｐと共に０．０８、０．４および２．０ｕｇ／ｍＬ濃度において、ＭＡｂＺａｐのみの場合より１５．４〜２１．１％高いＯｖｒ１１０−ＣＨＯ細胞増殖阻害をもたらし、培地のみのウェルと比べて５７．７〜６３．４％高い増殖阻害をもたらした。結論として、Ｏｖｒ１１０発現ＣＨＯ細胞の増殖阻害は、治療目的のために、in vivoで容易に達成可能なＭＡｂ濃度において得られた。これらのin vitroのデータは、上記Ｏｖｒ１１０ＭＡｂが、in vivoにおいて薬剤または同位体を腫瘍細胞に標的化するのに適していることを示唆する。
【０２８５】
例４：Ｏｖｒ１１０ＭＡｂおよび可溶性ＢＴＬＡ−Ｆｃの、活性化Ｔ細胞および腫瘍細胞への結合
抗ヒトＢ７ｘ／Ｂ７Ｈ４および抗マウスＢ７Ｓ１ＭＡｂは、活性化されたＴ細胞へ結合することが前に示された（Prasad et al., Immunity 18: 863-73 (2003); Sica et al., Immunity 18: 849-61 (2003); Zang et al., Proc. Nat.1 Acad. Sc.i U S A. 100: 10388-92 (2003)）。本発明のＯｖｒ１１０ＭＡｂの活性化細胞への結合を確認するために、新鮮なヒトＴ細胞を精製し、下に述べるようにして、異なる化合物により刺激した。Ｏｖｒ１１０ＭＡｂの、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ）およびＣＤ７１（ＴＦＲ）を発現するＣＤ３陽性活性化Ｔ細胞への結合を、ＦＡＣＳにより分析した。ＢＴＬＡが、Ｏｖｒ１１０（Ｂ７ｘ／Ｂ７Ｈ４）の推定受容体であるとの主張（Watanabe et al., Nat Immunol. 2003 4: 670-9; Carreno & Collins Trends Immunol. 2003 24: 524-7）並びに、本明細書に開示されたヒトＢＴＬＡ−マウスＩｇＧ２ａＦｃ融合体の、これら活性化されたＴ細胞および腫瘍細胞への結合を検討した。
【０２８６】
ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）の調製
正常な男性ドナーからのヒト末梢血を、Stanford Blood Center (Palo Alto, CA)における自発的提供者から得た。単核細胞を、標準のFicoll/Hypaque一段階密度勾配遠心法（１．０７７ｇ／ｍＬ）を用いて分離した。
【０２８７】
Ｔ細胞の活性化
単核細胞を最終濃度１０６／ｍＬで３日間、３７℃、１０％ＣＯ２にて、標準の２５ｃｍ２組織培養フラスコ中のＰＲＭＩ−１６４０（CellGro）に以下のいずれかを加えて培養した：１０％ＦＣＳ（Hyclone, Utah）、１０ｕｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｍ）（Sigma, St. Louis, MO）または１０ｕｇ／ｍＬのリポ多糖体（ＬＰＳ）（Sigma）、または１０ｎｇ／ｍＬのホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）（Sigma）と１ｕＭのイオノマイシン（Sigma）との組合せ。
【０２８８】
免疫蛍光法およびフローサイトメトリ
細胞は、３日間のＰＨＡ刺激の後に採集し、よく洗浄した。単核細胞を９６ウェルＶ底プレートに分散させ、自己血清中でインキュベートしてＦｃ受容体を遮断した。抗ＣＤ３ＦＩＴＣ抗体（Serotec, Raleigh, NC）を各ウェルに加え、ＣＤ８０ＰＥ、ＣＤ８６ＰＥ、ＣＤ２５ＰＥのいずれか、またはビオチン化抗ＣＤ７１（Serotec）、Ovr110.A57.1またはOvr110.C3.2を、第二のＭＡｂとして２０ｕｇ／ｍＬにて、二色分析のために加えた。細胞を２回洗浄し、ビオチン化ＭＡｂでプレインキュベートしたウェルに、フィコエリスリン−ストレプトアビジン（ＰＥＳＡ）を加えた。細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再度懸濁させた。細胞を自己血清中でプレインキュベートし、Ｏｖｒ１１０−ＩｇまたはＢＴＬＡ−Ｉｇ融合タンパク質２０ｕｇ／ｍＬで染色した。細胞を２回洗浄し、ロバ抗マウスＰＥ（１ｕｇ／ｍＬ）を試料に加え、次に細胞を２回洗浄し、マウス血清中でインキュベートして、ロバ抗マウス抗体上のフリーの結合部位を遮断した。次に抗ＣＤ３ＦＩＴＣ抗体を、Ｔ細胞を同定する最後のステップとして加えた。２回の洗浄の後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させて、フローサイトメトリで解析した。ヒト腫瘍細胞系ＳＫＢＲ３は、ＭＡｂまたはＢＴＬＡＦｃで、前述のようにしてインキュベートした。
【０２８９】
全試料は、EPCS Elite フローサイトメータで解析した。全てのヒストグラムは、Winmdiプログラムを用いて作成した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞は、Ｂ７ファミリーおよび活性化マーカー（ＣＤ７１およびＣＤ２５）の発現を解析するためのゲートとして用いた。
【表２５】
2008519841.tif 000027
【表２６】
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【表２７】
2008519841.tif 000029
【０２９０】
黒塗りの曲線がＭＡｂの刺激されないＴ細胞への結合を示す図７、および表８Ａ、８Ｂ、８Ｃに見られるように、刺激なしのＴ細胞と比較して、ＣＤ２５およびＣＤ７１の発現の増加（すなわち、ＰＥ平均蛍光値の増加）が、ＰＨＡ活性化Ｔ細胞（ＣＤ３にゲートされた）上で達成された。ＣＤ７１の発現の増加（すなわち、陽性細胞または蛍光強度の増加）が、活性化樹状細胞（ＣＤ１ｃにゲートされた）および活性化単核細胞で達成された。これらのデータは、Ｔ細胞、樹状細胞および単核細胞の正の活性化を示す。図７および表８Ａ、８Ｂおよび８Ｃの蛍光プロファイルは、ＣＤ８６（B7.2）およびＯｖｒ１１０（ＭＡｂA57.1）の発現が、活性化Ｔ細胞および活性化樹状細胞において増加し、Ｏｖｒ１１０が活性化単核細胞においていくらか増加したことを示す。
【０２９１】
ＢＴＬＡがＯＶｒ１１０に対する受容体であるかどうかを評価するため、ＢＴＬＡ−Ｆｃ（マウスＩｇＧ２ａ）融合タンパク質の、Ｏｖｒ１１０形質移入２９３Ｆ細胞（Ｏｖｒ１１０−２９３Ｆ）への結合を試験した。図７Ｇ、７Ｈおよび７Ｉから、ＢＴＬＡ−Ｆｃ融合タンパク質が、Ｏｖｒ１１０−２９３Ｆ細胞へいくらか結合したが（１７％の細胞が陽性、ＭＦＩ２４．５７）、しかし対照９３Ｆ細胞へは結合しなかった（２％の細胞が陽性、ＭＦＩ３．４４）ことが観察できる。さらに、マウスＩｇＧ２ａの、Ｆｃ断片を介したＯｖｒ１１０−２９３Ｆ細胞への検知可能な結合は観察できなかった（３％の細胞が陽性、ＭＦＩ４．３２）。表８Ｂに示されたＢＴＬＡ−ＦｃおよびＯｖｒ１１０−Ｆｃの活性化細胞への結合、および図７Ｇ、７Ｈおよび７Ｉにおける、ＢＴＬＡ−ＦｃのＯｖｒ１１０−２９３Ｆ細胞への結合のデータから、Ｏｖｒ１１０発現とＢＴＬＡのＯｖｒ１１０発現細胞への結合の間には関連が存在し得ると結論できる。ＢＴＬＡはＯｖｒ１１０に対する受容体である可能性があり、またはＯｖｒ１１０の発現は、複雑な形成、シグナル伝達または他の細胞プロセスを介したＢＴＬＡの結合を促進する可能性がある。いずれにしても、これらの２つのタンパク質は、腫瘍機能を遮断することにより、診断または治療剤として有用となり得る。さらに、例えば細胞毒性成分または細胞増殖抑制成分、または他の機能性に結合したＢＴＬＡ−ＦｃおよびＯｖｒ１１０−Ｆｃの修飾形態もまた、治療剤として用いることができる。
【０２９２】
表８Ａおよび８Ｂに示されたデータは、ＭＡｂA57.1が活性化Ｔ細胞に選択的に結合すること、およびＭＡｂC3.2が、腫瘍細胞系ＳＫＢＲ３に選択的に結合することを示す。これらのデータは、Ｔ細胞上のＯｖｒ１１０および腫瘍細胞上のＯｖｒ１１０上に、異なるエピトープが存在することを示唆する。これは、Ｏｖｒ１１０がＴ細胞上で結合したことにより引き起こされる任意の免疫抑制効果を最小化しつつ、Ｏｖｒ１１０を腫瘍細胞に結合させるため、および腫瘍発現Ｏｖｒ１１０または遊離（shed）Ｏｖｒ１１０の免疫抑制効果を低減させるためには有利である。Ovr110.C3.2などの抗体、またはＣ３．２により結合されるエピトープに結合する抗体は、治療的抗腫瘍抗体として有用である。
【０２９３】
例５：Ｏｖｒ１１０の機能の確認
材料および方法
細胞および細胞培養物
ＲＫ３Ｅ、２９３Ｔ、ＩＥＣ−１８、ＳＫＯＶ３、ＨｅＬａ、ＣａＯＶ３、ＨＴ２９、ＭＣＦ７およびＳＫＢＲ３細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Manassas, VA)から購入した。細胞は、Ｌ−グルタミンおよび４．５ｇ／Ｌのグルコースを有し、１０％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン(Cellgro)を補足したＤＭＥＭ(Invitrogen)中で増殖させた。すべての細胞を、加湿した３７℃インキュベーター中で、５％ＣＯ２で保持した。
【０２９４】
ウェスタンブロット
図８Ａは、細胞系におけるｍＡｂA57.1を用いたＯｖｒ１１０タンパク質のウェスタンブロット検出であり、ｍＲＮＡ発現とタンパク質発現の相関を示す。図８Ｂのウェスタンブロットは、細胞系およびヒト卵巣腫瘍組織試料中においてはＯｖｒ１１０タンパク質の検出を示すが、正常隣接組織（ＮＡＴ）においては検出を示さない。図８Ｂのウェスタンブロットは、細胞系およびヒト乳房腫瘍組織試料中においてはＯｖｒ１１０タンパク質の検出を示すが、正常隣接組織（ＮＡＴ）においては検出を示さない。さらに、図９は、Ｏｖｒ１１０タンパク質が主要器官の抽出物には検出されないことを示すウェスタンブロットであり、Ｏｖｒ１１０に指向された治療戦略は、主要なまたは重要な器官の機能に干渉しないであろうことを示唆する。
【０２９５】
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計および調製
ｓｉＲＮＡ分子を設計するために、配列を、前に記載された方法(Elbashir et al., 2001)に基づいて、Ｏｖｒ１１０ ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームから選択した。いかなる既知の細胞ｍＲＮＡのノックダウンをも生じない、無秩序な「スクランブルした」ｓｉＲＮＡ配列を、陰性対照として用いた。追加の陰性対照として、エメリン（Emerin）を標的化するｓｉＲＮＡ用いて、非必須ｍＲＮＡのノックダウンが、Ｏｖｒ１１０レベルにも、試験したいずれの生物学的終点にも影響しないことを実証した（データ示されず）。アポトーシス誘発をもたらすｍＲＮＡのノックダウンについての陽性対照として、ＤＡＸＸを標的化するｓｉＲＮＡを、刊行されたデータに基づいて用いた（Michaelson et al., J. Cell Sci., 2003 Jan 15; 116(Pt2): 345-52）。ヒトゲノムに対するＢＬＡＳＴ探索を、各々の選択されたｓｉＲＮＡ配列について行い、ｓｉＲＮＡが標的に特異的であり、他の配列をノックダウンする機能を有さないことを確実にした。すべてのｓｉＲＮＡ分子（ＨＰＰ精製階級）は、Xeragon Inc. (Germantown, MD)により化学的に合成した。ｓｉＲＮＡは用いる前に、無菌の緩衝液に溶解し、９０℃で１分間加熱し、次に３７℃で１時間インキュベートした。配列の３’末端における２つのチミジン残基（ｄＴｄＴ）を有するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、以下の特異的なＲＮＡ配列からなっていた：
【表２８】
2008519841.tif 000030
【０２９６】
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによる形質移入
６×１０４個のＳＫＢＲ３細胞を、１２ウェルプレート中に、形質移入の１８〜２４時間前に播種した。一過性形質移入を、オリゴフェクタミン（Oligofectamine）試薬(Invitrogen)を用いて、製造者のプロトコルに従って行った。最終濃度１００ｎＭのｓｉＲＮＡ（２００ｎＭであったＤＡＸＸ ｓｉＲＮＡを除く）および１．５ｕｌのオリゴフェクタミンを、細胞のウェルあたり用いた。すべての実験について、ｓｉＲＮＡをトリプリケートで形質移入した。細胞の平行ウェルの評価を、形質移入の７２時間後、ｍＲＮＡレベルの変化については定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）により、タンパク質レベルの変化についてはウェスタンイムノブロットにより、およびアポトーシスの変化については２つの異なるアッセイシステム（以下を参照）により行った。図１０Ａは、Ｏｖｒ１１０ ｓｉＲＮＡがＯｖｒ１１０転写物に特異的であり、ＱＰＣＲで測定されたようにＧＡＰＤＨをノックダウンしないことを示す。図１０Ｂは、Ｏｖｒ１１０ ｓｉＲＮＡは、不在の場合およびスクランブルｓｉＲＮＡ対照と比較して、Ｏｖｒ１１０メッセージ発現を低減させることを示す。Ｏｖｒ１１０タンパク質の下方制御を示す結果を、図１１に示す。Ｏｖｒ１１０に対するｓｉＲＮＡ＃３７もまた、Ｏｖｒ１１０を発現しない細胞により試験し、アポトーシスへの影響はみられなかった（データ示されず）。全ての所見は、少なくとも２回の追加実験により確認した。
【０２９７】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
Qiagen Inc.からのQuantiTech SYBR Green RT-PCRキットを、ＱＰＣＲ評価のために用いた。２０〜４０ｎｇの鋳型ＲＮＡを、反応あたり用いた。ＱＰＣＲは、Taqman 7700配列検出システム(Applied Biosystem Inc.)を用いて行った。
【０２９８】
アポトーシスアッセイ
２つの異なるアッセイキットを用いて、ｓｉＲＮＡのアポトーシスに対する影響を評価した。「Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay」キット(Promega Inc.)を用いて、試験細胞を培養プレート内で直接可溶化し、蛍光読み取り値に反映されるカスパーゼ活性を、供給者の指示に従って測定した。第２のキットである「Guava Nexin V-PE Kit」(Guava Technologies Inc.)を用いて、処理した細胞をトリプシン処理および洗浄により収穫し、約１０５個の細胞を、４０ｕｌの提供された緩衝液中に再懸濁させ、各々５ｕｌのアネキシンＶ（＋）および７−ＡＡＤ（−）を加えた。氷上での２０分間のインキュベーションに続いて、細胞を、製造者の指示に従ってGuava PCAフローサイトメーターを用いて分析した。図１２および図１３に、Ｏｖｒ１１０ノックダウンによりアポトーシスが誘発されることを示す結果を示す。
【０２９９】
アノイキスアッセイについては、指定の遺伝子を発現するＩＥＣ−１８およびＲＫ３Ｅ細胞をトリプシン化し、ＦＢＳ非含有培地にそれぞれ１５０，０００および２００，０００細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。混合物の１ｍｌのアリコットを１２ウェルプレートの各ウェルにプレートし、試料を３７℃で２４時間インキュベートした。次に細胞を採取し、上記のGuava Nexin V-PE Kitを用いて評価した。強い癌遺伝子であるＲａｓをアノイキスアッセイ陽性対照として用い、ＡＰを陰性対照として用いた。結果を図１５に示す。
【０３００】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンイムノブロット解析
ｓｉＲＮＡによる形質移入の７２時間後に、細胞抽出物を氷上で、溶解緩衝液（１％ＮＰ４０、１０ｍＭのＮａ２ＰＯ４、０．１５ＭのＮａＣｌ）とプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Inc.)を用いて調製した。ウィルス感染細胞または形質移入なしの細胞を用いる他の実験用の抽出物を、同様の様式で調製した。収穫した腫瘍から抽出したタンパク質を、抽出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＩＧ−Ｐａｌに、プロテアーゼ阻害剤を加える）中でスナップ凍結し、すりつぶした腫瘍細胞を均一化して調製し、続いて超音波処理し、次に微量遠心管内で遠心分離して、抽出物を浄化した。２０〜５０ｕｇの間のタンパク質抽出物を、各ゲルレイン（gel lane）に用いた：タンパク質当量濃度を評価して、同一ゲル上でのタンパク質レベルを比較した。浄化した抽出物を、等しい容積の２×濃縮Laemmli試料緩衝液（Invitrogen）と混合し、７０℃まで１０分間加熱し、次に、プレキャスト４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル(Nupage, Invitrogen)をＭＥＳ実行緩衝液(Nupage, Invitrogen)と共に用いて分析した。ゲルを、Immobilon-P PVDF膜（０．４５μｍの孔サイズ、Invitrogen）に、１×Nupage移送緩衝液および１０％メタノールを用いて移送した。膜を洗浄し、１時間室温で、０．０５％のTween-20を含むＰＢＳ中の５％脱脂粉乳を用いて遮断した。膜を、一次抗体と共に一晩、０．０５％のTween-20を含むＰＢＳ中の５％脱脂粉乳中でインキュベートした。Ｏｖｒ１１０に対して指向されたマウスモノクローナル抗体を、組換えＯｖｒ１１０タンパク質を用いて産生した。Ｏｖｒ１１０に対するモノクローナル抗体を１ｕｇ／ｍｌの最終濃度で用いて、ＧＡＰＤＨ(Chemicon Inc.)に対するマウスモノクローナル抗体を最終濃度２ｕｇ／ｍｌで用いた。一次抗体インキュベーションに続いて、膜を、室温で１０分間、各々０．０５％のTween-20を含む１×ＰＢＳ中で４回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(Jackson Lab Inc.)を、０．０５％のTween-20を含むＰＢＳ中の５％脱脂粉乳中で、室温で１時間用いて（１：１０，０００希釈）、一次モノクローナル抗体を検出した。膜を最後に、０．０５％のTween-20を含む１×ＰＢＳ中で１０分間、４回洗浄し、続いて製造者の指示(Amersham)による増強した化学発光（ＥＣＬ）試薬を用いて検出した。
【０３０１】
発現ベクター構成
哺乳類細胞でのＯｖｒ１１０タンパク質の発現のために、Ｏｖｒ１１０ ｃＤＮＡをｐＬＸＳＮベクター（BD Bioscience/Clontech）中にサブクローニングし、配列を確認した。ｐＬＸＳＮレトロウィルスベクターは、ＭＬＶ ＬＴＲを利用して、ｃＤＮＡ発現の、多数のクローニング部位へのクローニングを駆動し、ＳＶ４０プロモーターは、Ｇ４１８抵抗をコードするＮｅｏ遺伝子の発現を駆動する。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）をコードするレトロウィルス発現ベクターであるｐＬＡＰＳＮは、BD Bioscience/Clontechから購入した（ｐＬＸＳＮ−ＡＰ）。
【０３０２】
ウイルス産生
狭宿主性ウイルスを用いて、ＲＫ３ＥおよびＩＥＣ−１８細胞を感染させ、広宿主性ウイルスを用いて、ＳＫＯＶ３細胞を感染させた。狭宿主性ウイルスパッケージングのために、形質移入の１日前に、２９３Ｔ細胞を、６ウェル皿のウェルあたり８×１０５個の細胞の密度で、Biocoatコラーゲン被覆プレート（ＢＤ）上に播種した。細胞は、精製したプラスミドＤＮＡで、ＰＬＵＳ試薬(Invitrogen)を加えたリポフェクタミンを用いて形質移入した。細胞ウェルあたり０．８μｇのウイルスプラスミドＤＮＡ：ｐＬＸＳＮ−Ｏｖｒ１１０、ｐＬＸＳＮ−Ｏｖｒ１１０ＨＡまたはｐＬＸＳＮ−ＡＰと、０．８μｇのpVpack-Ecoおよび０．８μｇのpVpack GP (Stratagene)を、血清を含まない１２５μＬのＤＭＥＭおよび１０μＬのＰＬＵＳ試薬のストックに添加し、続いて１５分間室温でインキュベートした。その後、１２５μＬのＤＭＥＭ培地中に希釈した８μＬのリポフェクタミンを、ＤＮＡ／ＰＬＵＳ試薬混合物に加え、１５分間室温でインキュベーションした。１ｍｌのＤＭＥＭを、最終的なリポフェクタミン／ＤＮＡ混合物に加え、すでに１ｍｌのＤＭＥＭを含むが血清は含まない細胞単層に適用し、続いて３７℃で３時間インキュベーションした。形質移入混合物を、２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで置き換えて、細胞を一晩増殖させた。最後に、培地を、１０％のＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍＬのPen/Strepを補足したＤＭＥＭと交換して、ウイルスを採集した。ウイルス含有培地を２４時間後に収穫し、０．４５μｍのポリスルホンフィルターを通して濾過した。広宿主性ウイルスパッケージングのために同一の手順を繰り返したが、ただし、pVpack Ecoプラスミドの代わりに、pVpack Amphoプラスミド(Stratagene)を用いた。
【０３０３】
ウイルス感染および選択
ポリブレン(Hexadimethrine Bromide; Sigma)を、新鮮なウイルス含有培地に、４μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。前日に１００ｍｍ２の皿あたり３×１０５個の細胞密度でプレーティングした、ＲＫ３Ｅ、ＩＥＣ−１８またはＳＫＯＶ３細胞を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むリン酸緩衝生理食塩水(Cellgro)で１回洗浄した。ウイルス溶液（１００ｍｍ２の皿あたり６ｍｌ）を、細胞に直接適用し、次に３時間、加湿した３７℃インキュベーター中で、５％ＣＯ２と共に、時々回旋しながらインキュベートした。ウイルス含有培地を、新鮮な増殖培地と交換し、細胞を３７℃で６０〜７２時間インキュベートし、この時点で、３５０ｕｇ／ｍＬの最終濃度のＧ４１８硫酸塩(Cellgro)を増殖培地中に含有させて、ウイルスに感染した細胞を選択した。細胞は７０〜８０％の集密に維持し、Ｇ４１８含有培地を２日毎に交換した。Ｇ４１８選択に続いて、細胞のプールを、ウェスタンイムノブロット分析によるＯｖｒ１１０タンパク質発現の検証を含むその後の実験のために用い、ここで細胞は、上記のようにして抽出し分析した。感染した細胞単層によるＡＰの発現を、染色によりモニタリングし、これにより細胞の単層を、室温で１０分間０．５％グルタルアルデヒド溶液で固定し、ＰＢＳで洗浄し、６５℃で３０分間加熱し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ液体基質(Sigma)と共に２〜３時間インキュベーションすることにより、ＡＰを視覚化した。
【０３０４】
腫瘍異種移植実験
ＡＰまたはＯｖｒ１１０のいずれかを発現するＳＫＯＶ３細胞の、レトロウィルスに感染したＧ４１８選択プールを、皮下的にヌードマウスに注射した。親ＳＫＯＶ３細胞も比較のために用いた。各種類１０７個の細胞を、マトリゲルで、６匹のマウスそれぞれに移植した。腫瘍細胞を注射したマウスは１００％腫瘍を発症し、腫瘍の形成は、触診および可能な場合にはノギス測定にて、本研究の期間中４日毎にモニタリングした。結果を図１４に示す。データは、時間経過に渡る平均グループ腫瘍容積として表わす。
【０３０５】
例６：Ｏｖｒ１１０のモノクローナルサンドイッチＥＬＩＳＡ検出
高結合ポリスチレンプレート(Corning Life Sciences (MA))を、０．８μｇ／ウェルの抗Ｏｖｒ１１０ＭＡｂで４℃にて一晩被覆した。被覆溶液を吸引して除去し、フリーの結合部位を、３００μｌ／ウェルのSuperblock-TBS (Pierce Biotechnology, Illinois)と１００％仔ウシ血清を加えて、１時間室温（ＲＴ）で遮断した。ＴＢＳ＋０．１％Tween 20で４回洗浄した後、５０μｌのアッセイ緩衝液（ＴＢＳ、１％ＢＳＡ、１％マウス血清、１％仔ウシ血清、０．１％Tween 20）を各ウェルに加え、次に５０μｌの抗原を加えて、９０分間インキュベーションした。チェッカー盤実験のために、各々の対を５０ｎｇ／ｍｌおよび０ｎｇ／ｍｌの組換え哺乳類Ｏｖｒ１１０（細胞外部位）上で試験した。各サンドイッチＥＬＩＳＡに対し、１０、２．５、０．５、０．２５、０．１および０ｎｇ／ｍｌＯｖｒ１１０の標準物を、試験試料と平行して走らせた。標準物および試験試料は、アッセイ緩衝液で希釈した。検出には、１００μｌのビオチン化ＭＡｂ（１μｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、室温で１時間振盪しながらインキュベートした。洗浄後、１００μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（１ｍｇ／ｍｌ、Jackson ImmunoReserach Laboratories, PA）を１：２０，０００の希釈で各ウェルに加え、ＲＴで３０分、振盪しながらインキュベートした。洗浄後、プレートを次にDAKO TMB Plus 基質（DAKO, Denmark）を用いて３０分、ＲＴで発現させた。反応は、１ＮのＨＣｌを１００μｌ／ウェル用いて停止させ、プレートをSpectramax１９０プレートリ−ダー(Molecular Devices, CA)を用いて４０５ｎｍで読み取った。
【０３０６】
チェッカー盤ＥＬＩＳＡのために、抗体の全ての可能な組合せを、被覆または検出試薬としての効率について試験した。次の対：A72.1/A7.1、A77.1/A57.1、A57.1/A7.1およびA57.1/C3.2は、最良のシグナル／ノイズ比を与え、サンドイッチＥＬＩＳＡによりさらに評価して、癌細胞系および体液からの溶解物における内因性Ｏｖｒ１１０の検出の効率を分析した。A72.1/A7.1の対を用いて、以下に挙げた２７００の血清試料を試験した。
【０３０７】
結果
Ａシリーズの１０種類のＭＡｂおよびＣシリーズの８種類のＭＡｂを試験した、チェッカー盤ＥＬＩＳＡの結果を、表９Ａおよび９Ｂに示す。各々の抗体は、可能な全組み合わせにおいて、被覆抗体と検出抗体の両方として試験した。すべての対を、緩衝液中１００ｎｇの組換えＯｖｒ１１０Ｂタンパク質上でデュプリケートで、緩衝液のみをブランクとして試験した。結果は、特異的シグナル／ノイズ比として示す。これらの対形成データに基づき、ＭＡｂは２つの異なるエピトープを検出した。Ｏｖｒ１１０ A7、A77、A87およびA10 ＭＡｂは、他の３つのＭＡｂの結合を立体的に妨げるのに十分近い、１または２以上のエピトープと反応する。全てのＣシリーズ抗体は、このエピトープ（または重複する複数のエピトープ）も検出する。１または２以上の他の異なるエピトープは、Ｏｖｒ１１０ A89、A57、A31、A72、A107ＭＡｂにより検出される。最大のシグナル／ノイズ比を有する幾つかの対を用いて、組換えタンパク質に対する感受性および、細胞系および幾つかの初めの血清試料中における天然タンパク質に対する反応性について試験した。
【０３０８】
【表２９】
2008519841.tif 000031
【表３０】
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これらの表の結果から得られるＯｖｒ１１０ＭＡｂのエピトープマップを、図１６に示す。
【０３０９】
ヒト血清試料
ヒト癌試料および良性血清試料を、IMPATH-BCP, Inc and DSS（Diagnostic Support Service）から得た。健康な女性からの血清試料を、ProMedex, LCCから得た。全ての試料は、到着時に等分し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【０３１０】
結果
上に記したように、血清試料中のＯｖｒ１１０の検出のために、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）および高感度ＴＭＢ基質（DAKO）の使用に基づく、高感度検出システムを用いた。このＥＬＩＳＡの様式におけるＯｖｒ１１０についての最小検出用量（ＭＤＤ）は、１００ｐｇ／ｍｌである。中央値の計算のために、ＭＤＤより低い値の試料を１００ｐｇ／ｍｌＯｖｒ１１０と定義した。最小検出可能用量は、背景シグナルを超える２つの標準省略値（two standard abbreviations）として定義される。健康な患者からのほとんどの血清試料は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより低いＯｖｒ１１０濃度を示し、一方、卵巣癌患者からの血清は、増加したレベルのＯｖｒ１１０を有する。
【０３１１】
肺癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌または非癌性良性疾患の患者からの、２７００を超える血清試料における、Ｏｖｒ１１０濃度を試験した。試験した全試料の完全なリストは、次の表１０を参照。
【表３１】
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【０３１２】
図１７は、５４０人の健康な提供者および１２００人以上の癌患者からの血清における、Ｏｖｒ１１０濃度を示す。Ｏｖｒ１１０レベルの増加は全ての癌種類において幾人かの患者に観察されるが、卵巣癌患者は最大のＯｖｒ１１０濃度中央値を有する。
漿液性または子宮内膜性卵巣癌を有する１４７人の女性の血清および、粘液性癌を有する女性の６７の血清中のＯｖｒ１１０濃度を、腫瘍進行の全４ステージを表わす血清を用いて試験した。図１８に示すように、初めの２つの卵巣癌の種類はＩＨＣによりＯｖｒ１１０について陽性であり、一方、粘液性癌ではそうでなかった。これらのデータとよく整合して、子宮内膜性および漿液性卵巣癌を有する患者の結成におけるＯｖｒ１１０濃度の中央値は、粘液性癌患者におけるより高い。
【０３１３】
健康な女性と比べて、漿液性および子宮内膜性卵巣癌におけるＯｖｒ１１０濃度の中央値は、２倍以上高い。２６０人の健康な女性であるこの群の殆どの女性は、卵巣癌を有する女性の年齢分布を反映させて５０歳を超える年齢である。閉経前と閉経後の健康な女性におけるＯｖｒ１１０検出に差をみることはできない。より重要なことには、良性卵巣疾患を有する１５０人の女性の血清（子宮内膜症、拡大卵巣および多嚢胞卵巣の患者それぞれにつき、５０血清）におけるＯｖｒ１１０の上昇もまた、検出できない。図１９Ａは、Ｏｖｒ１１０血清ＥＬＩＳＡの所見を、全卵巣癌についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線として概要を示し、ここで曲線の下の面積（ＡＯＣ）は０．７８である。さらに、図１９Ｂは、０．８と高いＡＯＣが示すように、漿液性卵巣癌を検出するための、Ｏｖｒ１１０ＥＬＩＳＡの特異的有用性を示すＲＯＣ曲線である。
Ｏｖｒ１１０が細胞表面膜タンパク質として発現されるとの我々の所見と一致して、血清におけるＯｖｒ１１０の濃度は概して、漿液性癌の女性においてさえも、非常に低い。従って、漿液性癌を有する女性からの血清中に検出されるＯｖｒ１１０濃度は、２０ｎｇ／ｍｌより低い。
【０３１４】
例７：Ｏｖｒ１１０のエピトープマッピング
Ａ、ＣおよびＩシリーズからの抗体パネルにより認識されるエピトープを、重複ペプチドの抗体への反応性について、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを通してスクリーニングすることにより決定した。２４個の重複ペプチドは、SynPep（Dublin, CA）から注文した。ペプチド１〜２３は１５マーであり、ペプチド２４は８個のアミノ酸を含んでいた。ペプチド配列は、Ｏｖｒ１１０タンパク質の、Ｎ末端のアミノ酸Ｇ２１から開始し、Ｃ末端のＡ２５８で終了した。これらのペプチドは、シグナルペプチド配列の終りから膜透過ドメインの始まりまでの、成熟したＯｖｒ１１０タンパク質の細胞外領域に広がっている。図２０を参照。ペプチドは、原液として１〜３ｍｇの範囲の小量のアリコットで提供された。各ペプチドのＰＢＳで１：４００倍の希釈を行い、９６ウェル４ＸCostar plates (#3690)(Costar Corporation; Cambridge, MA)上に、５０μｌを各ウェルにデュプリケートで加え、一晩放置した。上記の、ｈｉｓタグ化哺乳類Ｏｖｒ１１０完全長タンパク質を、各９６ウェルプレート上の陽性対照として用いた。翌日、プレートをフリック乾燥し（flicked dry）、ＴＢＳＴ０．５％ＢＳＡで約４０分間遮断した。抗Ｏｖｒ１１０抗体（５０μｌ）を、ウェル当たり２０μｇ／ｍｌで加え、室温で約２時間インキュベートした。プレートは、ＴＢＳＴ洗浄緩衝液で３回洗浄した。二次結合体のヤギ抗マウスＩｇＦｃ−ＡＰ（Pierce, Rockford, IL）を、ＴＢＳＴ／ＢＳＡ溶液中で１：５０００に希釈し、５０μｌを各ウェルに加えた。プレートは２時間室温で振盪した。プレートを３回洗浄し、５０μｌの基質を各ウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。用いた基質は、１ｘＤＥＡ中のｐＮＰＰ（１ｍｇ／ｍｌ）であった。アッセイを視覚化するため、プレートをSpectraMaxPlus（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）上４０５ｎｍにて、Softmax Pro（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）および解析用にExcel（Microsoft; Seattle, WA）ソフトウェアを用いて読み取った。
【０３１５】
下の表１１は、上記の抗Ｏｖｒ１１０抗体ペプチド結合実験の結果の概要である。抗Ｏｖｒ１１０のＡ、ＣおよびＩシリーズ抗体は、Ｏｖｒ１１０のペプチド８、１３、１５および１６と強い特異的反応性を示した。I2、I3およびI4の３種類の抗体は、ペプチド８に強い反応性を示し、抗体C9.1は、ペプチド１６に対して強く反応性であった。C7.1、C12.1、C16.1およびI20の４種類の抗体は、いずれのペプチドも認識しなかったが、しかし上に示すように、Ｏｖｒ１１０を発現する完全長タンパク質および形質移入細胞に結合し、これらが、Ｏｖｒ１１０の直線エピトープよりも、立体的エピトープを認識することを示唆する。
【０３１６】
試験した残りの抗体は、ペプチド１３もしくは１５、または両方に反応した。例えば、A57.1、A72.1、C10.1、C11.1、I11抗体は、ペプチド１３に強く反応した。A7.1、C3.2およびC6.3抗体は、ペプチド１５のみに反応した。A87.1、C5.3.1、およびC17.1抗体は、これらがペプチド１３および１５の両方に結合する点で新規な結合パターンを示したが、ただしペプチド１５に対する反応性は、ペプチド１３に対する反応性より高かった。
公的に利用可能なソフトウェアを用いて、翻訳後修飾を完全Ｏｖｒ１１０タンパク質について予測し、各特徴をそれぞれのペプチドにマッピングした。
【表３２】
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【０３１７】
図２０に示すように、イタリック体で表わしたＯｖｒ１１０の領域は、ほとんどのＡ、ＣおよびＩシリーズ抗体がＯｖｒ１１０上のエピトープに結合する部位を示す。この領域は、Ｏｖｒ１１０タンパク質のＩｇＶ（下線部）およびＩｇＣ（二重下線部）領域に重複している。興味深いことには、ほとんどのＡ、ＣおよびＩ抗体は、ＣＫ２リン酸化、チロシン硫酸化、Ｎ−グリコシル化およびＰＫＣリン酸化に対する推定部位であるペプチド１３および１５に結合する（上の表１１参照）。この配列はまた、ＩｇＶ領域がＩｇＣ領域から分かれる部分にも存在する。
【０３１８】
上に示したように、これらのペプチド領域は高い免疫原性を有するようにみえ、従って、表面上で高度の暴露性を有する、Ｏｖｒ１１０タンパク質の一部であると考えられる。表１２は、この予想についてのさらなる証拠を提供するが、これは、ＥＬＩＳＡアッセイによりペプチド１５に強く結合する殆どの抗体（A7.1、A87.1、C3.2、C5.3.1およびC6.3）はまた、乳癌細胞系であるＳＫＢｒ３の細胞表面上に強い結合を示すからである。抗Ｏｖｒ１１０モノクローナル抗体A57.1およびI20は、これら活性化されたＴ細胞上のＯｖｒ１１０に結合する点でユニークであるが、ＳＫＢｒ３細胞上のＯｖｒ１１０には重要な結合は示さない。
【表３３】
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【０３１９】
前の刊行物によれば、Ｂ７ファミリータンパク質中には保存三次構造が示されたが、保存残基はほとんどなかった。Sica、上記。これらの保存残基は、結合のための活性または受容体認識より、ファミリーメンバーの構造に、より重要であると考えられる。ヒトＢ７ファミリーメンバータンパク質Ｂ７．１（Refseqアクセッション：NP_005182）、Ｂ７．２（Refseqアクセッション：NP_787058）およびＯｖｒ１１０の配置は、公的に利用可能なClustalW Version 1.83ソフトウェアを用いて、デフォールト設定を使用して行った。図２１参照。Ｂ７ファミリータンパク質の配置を、公的に利用可能なＢ７．１（ＰＤＢＩＤ：１ＤＲ９）の３次元モデルと組み合わせてみると、保存残基の位置が示された。従って、Ｂ７．１三次元モデル上のどこにＯｖｒ１１０ペプチドの類似領域が位置するかを決定することができた。我々の所見によれば、ペプチド１３および１５上の残基は、Ｏｖｒ１１０の表面上に暴露されており、従って容易に到達可能であり、免疫原性である。この分析は、Ｏｖｒ１１０タンパク質に対して生成された多くの抗体が、ペプチド１３もしくは１５またはこの両方に対して、特異的な反応性を示すとの所見を支持する。さらに、上記の配置およびＢ７．１の３次元モデルに基づき、Ｏｖｒ１１０のＩｇＶ領域（残基Ｎ４７〜Ｆ１５０、図２０参照）に結合する抗体は、Ｏｖｒ１１０の、Ｏｖｒ１１０受容体への結合を阻害することが予想される。特に、ペプチド１２（配列番号：３１）またはペプチド１２上の残基を含む立体エピトープに結合する抗体は、Ｏｖｒ１１０のその受容体への結合を阻害することが予想される。
【０３２０】
図２２は、マウス（Refseqアクセッション：NP_848709）、ラット（Refseqアクセッション：XP_227553）およびゼノパス（Genbankアクセッション：AAH44000）からのＯｖｒ１１０およびＯｖｒ１１０ホモログの配置である。配置は、公的に利用可能なClustalW Version 1.83ソフトウェアを用いて、デフォールト設定を使用して行った。マウスＯｖｒ１１０ホモログはマウスにおいては免疫原性ではないため、ヒトＯｖｒ１１０およびマウスホモログの間の差が免疫反応に、従って抗体に関与する。交差種Ｏｖｒ１１０−ホモログ配置と共に解析した重複ペプチドと、Ｏｖｒ１１０およびファミリーメンバーＢ７．１とＮ７２の間の保存３次元構造（Sica、上記）により、Ａ、ＣおよびＩシリーズ抗体によって認識されるエピトープをより高い精度で決定することが可能である。
【０３２１】
上に示したように、抗体I2、I3およびI4はペプチド８に結合し、この領域におけるマウスおよびヒトの配列の間の重要な違いは、アミノ酸９１〜９４（ヒトにおいてＳＥＱＤであり、マウスにおいてＳＱＱＨ）であり、ここでグルタミン（Ｑ）およびヒスチジン（Ｈ）はそれぞれグルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）によって置き換えられている。従って、I2、I3およびI4は、配列ＳＥＱＤ（配列番号：４４）によって生成されるエピトープに対しておそらく特異的であると結論づけることができる。
抗体A57.1、A72.1、C10.1、C11.1、C17.1およびI11は、ペプチド１３に強い反応性を示すが、ペプチド１４または１５に対しては反応性ではない。ヒトからマウスへのアミノ酸配列変化は、イソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）によって置き換えられている１５５位で起こり（ＳＭＰＥＩからＳＭＰＥＶ）、従って、これらの抗体は、配列ＳＭＰＥＶ（配列番号：４５）によって生成されるエピトープに対しておそらく特異的であると結論づけることができる。
【０３２２】
抗体A7.1、C3.2、C6.3は、ペプチド１５のみに結合する。この領域においてマウスとヒトのアミノ酸配列を比べると（それぞれＳＥＳＬＲおよびＳＥＴＬＲ）、１６５位のセリンが、スレオニンで置き換えられている。従って、これらの抗体は、ペプチド１５または完全長天然タンパク質のどちらかにおいてスレオニンを認識すること、従ってこれは、ＳＥＴＬＲにおけるＴＬＲ配列（配列番号：４６）により予想されたＰＫＣリン酸化部位への結合またはそのリン酸化を遮断することができると、結論づけることができる。
【０３２３】
抗体A87.1、C5.3.1およびC17.1は、上で述べたように、これらのシリーズの抗体の中でユニークな結合パターンを有する。これらの抗体はペプチド１５および１３に結合するが、ペプチド１５への結合はペプチド１３への結合より強い。ペプチド１４に対しては反応性を持たないため、これらの抗体はペプチド１３および１５の両方に共通するある残基に特異的であることが示唆され、これらのうち１つはスレオニンである。A87.1、C5.3.1およびC17.1抗体はペプチド１３にも結合する点で、これに結合しないA7.1、C3.2およびC6.3と異なっている。これにより、ペプチド１３および１５は、Ｏｖｒ１１０の３次元タンパク質構造内の平行な鎖を走ることが示唆され、これは、Ｏｖｒ１１０ファミリーメンバーＢ７．１内の相同な領域についての予想と同様である。抗体A87.1、C5.3.1およびC17.1は、これらのＦ（ａｂ）ドメインが両方の鎖にまたがって位置するのに十分大きく、従って両方の鎖に同時に反応する。しかし、ペプチド１５に対するより強い反応性は、ペプチド１３のスレオニン残基が異なる配置にあり、結合がより困難であることを示唆する。従って、抗体A7.1、C3.2およびC6.3は、異なる立体配置にあるスレオニンを認識するか、あるいは上に示唆したように、スレオニン残基よりもさらに多くを認識するかのどちらかでなければならない。
【０３２４】
抗体C9.1は、ペプチド１６を認識する唯一の抗体である。この領域において、１８０位はマウスではアラニン（Ａ）、ヒトではバリン（Ｖ）である。従って、C9.1抗体は、配列ＴＶＶＷ（配列番号：４７）により生成されるエピトープに特異的であるであろうと結論される。
【０３２５】
例８：Ｏｖｒ１１０Ｔ細胞増殖機能性実験
Ａ、ＣおよびＩシリーズ抗Ｏｖｒ１１０抗体のペプチド１３および１５への結合に基づき、これらの部位が免疫系を保護するのに、特にＴ細胞活性を維持することに関して重要であると考えられる。図２３は、Ｔ細胞活性化の複雑性を簡略に図示したものである。Ｔ細胞を活性化するには、幾つかのＴ細胞表面タンパク質と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）例えばＢ細胞または樹状細胞などの上に見出される特異的リガンドとの、相互反応が必要である。
何よりもまず、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の文脈において、抗原ペプチドを作動させなければならない。このＴＣＲペプチド／ＭＨＣシグナルは、Ｔ細胞活性化に必要であるが、第二のシグナルもまた必要であり、これは共刺激シグナルと呼ばれる。このシグナルは、ＣＤ２８と呼ばれる細胞表面分子の別のセット並びにそのリガンドB7.1およびB7.2によって生成される。Ｔ細胞増殖は、ＣＤ２８とB7.1またはB7.2との相互作用を通じて増強されるが、それはこの相互作用がＩＬ−２ｍＲＮＡを産生し、これによってＩＬ−２サイトカイン産生が増加するからである。従って、ＩＬ−２の産生は、Ｔ細胞活性化および増殖の直接の測度として用いることができる。一方で、ＣＤ２８のホモログであるＣＴＬＡ−４がB7.1またはB7.2に結合した場合、ＩＬ−２産生は大きく低減され、Ｔ細胞拡大が制限されることになる。
【０３２６】
我々が示したように、Ｏｖｒ１１０は卵巣癌および乳癌の組織および細胞上、また活性化Ｔ細胞および他の免疫細胞上に見出される。抗Ｏｖｒ１１０抗体のヒトＴ細胞への効果を決定するために、ＩＬ−２増殖アッセイを、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２産生のレベルを測定して行った。これらの実験において、Ｔ細胞は、血液（男性提供者、年齢３５〜５５、スタンフォード大学血液センター）から得られた末梢血単核細胞から、Miltenyi (Auburn, CA)から購入したヒトＴ細胞単離キットを用いて精製する。ＯＫＴ３産生ハイブリドーマは、ＡＴＣＣ（Manassas, VA）から購入し、自家でスケールアップおよび精製する。Ｔ細胞はＣＤ３ε鎖を刺激することにより直接活性化できるため、９６ウェルプレートを、ＰＢＳ中の３〜５ｕｇ／ｍｌＯＫＴ３抗体（抗ＣＤ３）５０μｌで、４℃にて一晩被覆する。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌのＴ細胞を１．５〜２×１０６細胞／ｍｌでウェルに加える。個別の抗Ｏｖｒ１１０抗体、すなわちA57.1またはI20を、５０μｌの容量でＴ細胞に加えて、抗体の効果を、ＥＬＩＳＡキット（Roche, Emeryville, CA）を用いてＴ細胞によるＩＬ−２産生を測定することにより、決定する。図２４の模式図を参照。ＩＬ−２産生の減少が抗Ｏｖｒ１１０抗体の添加のみによって生じることは、Ｔ細胞上のＯｖｒ１１０に特異的に結合する抗体、またはＯｖｒ１１０のペプチド１３に結合する抗体、例えばA57.1またはI20が、Ｔ細胞およびＴ細胞の免疫活性を阻害するのに有用であることを示す。これらの結果を、図２４のシナリオ１として図示する。
【０３２７】
これらの抗Ｏｖｒ１１０抗体は、ほとんどの自己免疫疾患において起こる望ましくない免疫応答を低下させるための治療に有用であり、該自己免疫疾患の例は、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性神経障害例えばギランバレー、自己免疫性ブドウ膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎例えばヴェーゲナー肉芽腫症、ベーチェット病、乾癬、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、Ｉ型もしくは免疫介在性糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、副腎の自己免疫疾患、関節リューマチ、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症例えば強直性脊椎炎、およびシェーグレン症候群などである。
【０３２８】
腫瘍細胞のみを認識する抗Ｏｖｒ１１０抗体、例えばC3.2、A7.1またはC6.3は、上記のようにＩＬ−２増殖アッセイで用いられる。Ｏｖｒ１１０の腫瘍細胞への選択的結合は、Ｏｖｒ１１０受容体の、腫瘍細胞上のＯｖｒ１１０リガンドへの結合を遮断することにより、Ｔ細胞が機能的であり続けることが可能であることを示す。実験は上記のように実施し、ただし、これに加えて、ＳＫＢｒ３細胞をウェルに加えた。ＳＫＢｒ３はＯｖｒ１１０リガンドを発現するが、受容体（Ｏｖｒ１１０−Ｉｇｆｃ融合タンパク質による染色実験により決定されたもの）を発現しないとすると、ＳＫＢｒ３腫瘍細胞の、活性化Ｔ細胞への効果が決定できる。ＳＫＢｒ３はＯｖｒ１１０リガンドを発現し、Ｔ細胞はＯｖｒ１１０を認識する受容体を発現するため、この相互反応により、Ｔ細胞の阻害がもたらされる。Sica、上記およびPrasad、上記を参照。しかし、腫瘍細胞上でＯｖｒ１１０に特異的に結合する抗Ｏｖｒ１１０抗体のウェルへの添加は、継続したＩＬ−２産生により測定されるように、Ｔ細胞に影響しない。これらの結果を、図２４のシナリオ２に図示する。これらの抗Ｏｖｒ１１０抗体、例えばC3.2、A7.1またはC6.3は、腫瘍細胞上のＯｖｒ１１０を結合するが、免疫反応を阻害せず、免疫系を負に制御することなく、乳癌、卵巣癌または膵臓癌の腫瘍または腫瘍細胞を標的化できるため、大きな治療的有用性を有する。
【０３２９】
例９：抗体依存性細胞傷害作用機能実験におけるＯｖｒ１１０抗体の性能
さらに、抗Ｏｖｒ１１０腫瘍特異的抗体、例えばC3.2、A7.1またはC6.3は、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエフェクター細胞として用いて、媒介することができる。これは、ＳＫＢｒ３細胞を５１クロミウムで１時間標識することによって示される。過剰な５１Ｃｒは洗浄して取り除き、腫瘍細胞を、C3.2またはC6.3などの抗Ｏｖｒ１１０腫瘍特異的抗体により、陰性および陽性の対照細胞とともに、２μｇ／ｍｌで１５〜３０分間、プレインキュベートする。ナチュラルキラー細胞は、エフェクター中の９６ウェルプレートに、１００：１〜０．４４１５：１の範囲の目標比まで滴定する。インキュベートした腫瘍細胞を、ウェル当たり１０，０００細胞の一定量で加える。腫瘍細胞のみを含むウェルは、自発的溶解のレベルを提供する。可能な最大溶解は、ＰＢＳ中に希釈した１％トリトン−Ｘをいかなるエフェクター細胞も含まない腫瘍細胞のセットに加えて決定する。全てのウェルは、トリプリケートで実施する。
【０３３０】
３７℃で４時間のインキュベーション時間の後、プレートを１０００ｒｐｍで５分間、遠心沈降させる。上清（１００μｌ）を採集し、ガンマカウンター上で読み取る。特異的溶解は、以下の式により決定する。
（実験値−自発値）（トリトンＸ処理−自発値）×１００
対照抗体より高い特異的溶解を有する抗Ｏｖｒ１１０抗体は治療的に有用であり、免疫系を刺激し身体自体のエフェクター細胞を用いることにより、体内の腫瘍を消滅させる。in vitroでの抗Ｏｖｒ１１０抗体の有用性を示すＡＤＣＣin vitroアッセイからの結果は、これらの抗体が、in vivoでＡＤＣＣを促進する有用性を有することを示唆する。
【０３３１】
例１０：寄託
細胞系およびＤＮＡの寄託
以下のハイブリドーマ細胞系を、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A. にあるアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託し、受託番号が付与された。
寄託されたハイブリドーマ細胞系の名称を、参照の便宜上短縮することができる。例えば、A57.1はOvr110.A57.1に相当する。これらのハイブリドーマは、表１３にリストされたクローン（これらの完全な名称と共に）に相当する。
【表３４】
2008519841.tif 000036
【０３３２】
これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項、およびそのもと（ブダペスト条約）での規定の下でなされた。これは、寄託の日付から３０年間、生存可能な培養物の維持を確実にする。生物は、ブダペスト条約の規約の下およびdiaDexus, Inc.とＡＴＣＣとの間の合意に従って、ＡＴＣＣにより入手可能にされており、これは、関連する米国特許の発行または米国もしくは外国の任意の特許出願の公共への公開のうち、いずれか最初に到来する際に、培養物の子孫の永久的で制限されない公共への入手可能性を保証し、そして３５ ＵＳＣ§１２２およびこれに準拠する長官の規則（８８６ ＯＧ ６３８に対する特定の参照を有する３ ７ ＣＦＲ§１．１４を含む）に従って、米国の特許および商標局長官によって権利を付与すべきものとすると決定されたものに対する、子孫の入手可能性を保証する。
【０３３３】
本出願の出願人は、寄託された培養物が、好適な条件の下で培養された際に死滅するかまたは失われるかまたは破壊された場合に、通知によりこれらを同一の培養物の生存可能な標本と即座に交換することに同意している。寄託された菌株の入手可能性は、特許法に従い任意の政府の権力の下に付与された権利に違反して、本発明の実施の許諾として考慮されるべきではない。これらの寄託をなすことは、いかなる意味においても、寄託が、本発明を可能にするのに必要であることを承認するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０３３４】
【図１】Ｏｖｒ１１０形質移入マウスＬＭＴＫ細胞のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図２】生きている卵巣癌細胞および乳癌細胞におけるOvr110-A57.1による免疫蛍光を示す図である。
【図３】生きている卵巣癌細胞および乳癌細胞におけるOvr110-A57.1の結合および内部移行を示す図である。
【図４】卵巣漿液性腺癌におけるOvr110-A57.1による免疫組織化学を示す図である。
【図５】乳房浸潤性乳管癌におけるOvr110-A57.1による免疫組織化学を示す図である。
【図６】膵臓腺癌におけるOvr110-A57.1による免疫組織化学を示す図である。
【図７Ａ−７Ｆ】ＣＤ３ ＦＩＴＣゲートされたＰＨＡ刺激Ｔ細胞における３日目のＢ７ファミリーメンバーの発現を示す図である。
【図７Ｇ−７Ｉ】ＢＴＬＡ−Ｆｃ融合タンパク質の、Ｏｖｒ１１０−２９３Ｆ細胞への結合を示す図である。
【図８】Ａ〜Ｃは、細胞系およびヒト腫瘍組織における、ｍＡｂA57.1によるＯｖｒ１１０タンパク質のウェスタンブロット検出を示す図である。
【０３３５】
【図９】Ｏｖｒタンパク質が主要器官の抽出物において検出されないことを示す図である。
【図１０】ＳＫＢＲ３乳癌細胞におけるＯｖｒ１１０ ｍＲＮＡの特異的ノックダウンを示す図である。
【図１１】ＳＫＢＲ３細胞における、ｓｉＲＮＡによるＯｖｒ１１０タンパク質の下方制御を示す図である。
【図１２】Ｏｖｒ１１０ ｍＲＮＡのノックダウンが、ＳＫＢＲ３細胞にアポトーシスを誘発することを示す図である。
【図１３】Ｏｖｒ１１０ ｍＲＮＡのノックダウンが、ＳＫＢＲ３細胞にカスパーゼ活性を誘発することを示す図である。
【図１４】Ｏｖｒ１１０の過剰発現が、腫瘍の異種移植増殖を増強することを示す図である。
【図１５】Ｏｖｒ１１０の過剰発現が、アポトーシスから保護することを示す図である。
【図１６】異なる抗体についてのＯｖｒ１１０エピトープマップを示す図である。
【０３３６】
【図１７】健康な提供者および癌患者の血清におけるＯｖｒ１１０検出を示す図である。
【図１８】異なる種類の卵巣癌および良性疾患試料のＯｖｒ１１０検出を示す図である。
【図１９】Ｏｖｒ１１０検出についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。
【図２０】Ｏｖｒ１１０タンパク質ドメインおよび抗体結合領域を示し、シグナルペプチド、ＩｇＶ、ＩｇＣおよび膜透過領域、および重複ペプチドを構成するために用いられる領域を含む。
【図２１】Ｏｖｒ１１０タンパク質およびヒトファミリーメンバーの配置を示す図である。
【図２２】Ｏｖｒ１１０タンパク質およびホモログの配置を示す図である。
【図２３】Ｔ細胞とＡＰＣの間のリガンド−受容体相互作用を示す図である。
【図２４】Ｏｖｒ１１０Ｔ細胞増殖機能実験の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−７Ｆ】
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【図７Ｇ−７Ｉ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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