【事件の表示】
　特許第２６６９５６６号「遊離及び複合体形成した前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の分析」の請求項１ないし１６に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２６６９５６６号の請求項１ないし１６に係る特許を維持する。
【理由】
Ｉ　手続の経緯
　本件特許第２，６６９，５６６号の発明は、平成３年７月２２日（パリ条約による優先権主張、１９９０年７月２３日、スウェーデン）に国際出願され、平成９年７月４日にその特許の設定登録がされた。
　その後、本件特許について申立人石神慶司、申立人高橋登、申立人中川英子および申立人カンアグ・ダイアグノスティック・アクチボラーグから特許異議の申立があり、取消理由が通知され、それに対して、平成１１年５月６日に意見書および訂正請求書が提出された。
ＩＩ　訂正の適否の検討
　前記訂正請求書による訂正について、訂正の要件の適否を以下検討する。
１．訂正事項
　本件訂正請求の訂正事項は、以下のとおりである。
　訂正事項▲１▼
　請求項４および請求項６〜請求項８において、「前記のＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビタ−複合体」または「前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビタ−複合体」をそれぞれ「前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシン複合体」に訂正する。
　訂正事項▲２▼
　請求項４において、「前記プロテイナーゼインヒビター」を「前記プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシン」に訂正する。
２．　訂正の目的
　上記訂正事項▲１▼〜▲２▼は、いずれも明りょうでない記載の釈明を目的にしているものといえる。
３．　　明細書の記載事項の範囲内
　上記訂正事項▲１▼〜▲２▼は、本件特許明細書の記載事項の範囲内であることは明らかである。
４．　　拡張・変更
　上記訂正事項▲１▼〜▲２▼は、いずれも、特許請求の範囲を拡張するものでなく、また、変更するものでもない。
５．　　訂正適否の検討結果
　したがって、本件訂正は、特許法１２０条の４、２項および３項の規定に適合する。
ＩＩＩ　申立理由についての検討
１．本件特許発明
　本件特許の請求項１〜請求項１６の各発明は、本件訂正明細書の特許請求の範囲の各請求項に記載された事項により構成される。
　本件訂正明細書の特許請求の範囲は次のとおりである。
　【請求項１】
　前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のイムノアッセイであって、
プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分及び／または
遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分及び／または
ａ）遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分とｂ）プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分との割合
を、遊離及び複合体形成したＰＳＡを区別し得る１種以上の抗体を使用して測定することを特徴とするイムノアッセイ。
　【請求項２】
　α１−抗−キモトリブシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分及び／または遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分及び／または
ａ）遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分とｂ）α１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分との割合
を、非競合イムノアッセイにより測定することを特徴とする請求項１に記載のイムノアツセイ。
　【請求項３】
α１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分及び／または
遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分及び／または
ａ）遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分とｂ）α１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分との割合
を、少なくとも２種類の異なるモノクローナル抗体を使用する非競合イムノアッセイにより測定することを特徴とする請求項２に記載のイムノアッセイ。
　【請求項４】
　前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリブシン複合体（複合体形成したＰＳＡ）を認識するために使用したモノクローナル抗体が、前記前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）または前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシン複合体（複合体形成したＰＳＡ）または前記プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシンのいずれかと結合することを特徴とする請求項３に記載のイムノアッセイ。
　【請求項５】
　前記遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原（遊離　ＰＳＡ）を認識するために使用したモノクローナル抗体が前立腺特異的抗原に結合すること、及びモノクローナル抗体により規定される少なくとも一つのエピトープは、前立腺特異的抗原がα１−抗−キモトリプシンと複合体形成しているときには露出されないことを特徴とする請求項３に記載のイムノアッセイ。
　【請求項６】
　前記遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原（遊離ＰＳＡ）と前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシン複合体（複合体形成したＰＳＡ）との割合を測定することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のイムノアツセイ。
　【請求項７】
　前記遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原（遊離ＰＳＡ）と、前記遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原および前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシン複合体（複合体形成したＰＳＡ）の合計との割合を測定することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のイムノアツセイ。
　【請求項８】
　前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシン複合体（複合体形成したＰＳＡ）と、前記遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原および前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシン複合体（複合体形成したＰＳＡ）の合計との割合を測定することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のイムノアッセイ。
　【請求項９】
　プロテイナーゼインヒビターがα１−抗−キモトリプシンである、精製されたＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビター複合体。
　【請求項１０】
　患者の血清中の全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの割合、またはα１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの割合、を測定することにより、良性の前立腺過形成と前立腺癌を区別する方法。
　【請求項１１】
　患者の血清中の全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの割合、またはα１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの割合、を測定することにより、前立腺癌をスクリーニングする方法。
　【請求項１２】
　遊離ＰＳＡと結合するが、α１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡとは結合しない抗体。
　【請求項１３】
　抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１２に記載の抗体。
　【請求項１４】
請求項１３に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞系。
　【請求項１５】
　プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分及び／または
遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分及び／または
ａ）遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分と、ｂ）プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分との割合
を、測定することを特徴とする、少なくとも２種類の異なるモノクローナル抗体を使用することによる前立腺特異的抗原の免疫定量アッセイ。
　【請求項１６】
α１−抗−キモトリプシンと複合体形成していない遊離の前立腺特異的抗原のみに特異的な抗体にサンプルを暴露する段階と、
α１−抗−キモトリプシンと複合体形成していない遊離の前立腺特異的抗原のみに結合した抗体の量を検出する段階
からなる、サンプル中の、α１−抗−キモトリプシンと複合体形成していない遊離の前立腺特異的抗原の量を測定するためのイムノアッセイ方法。
２．特許法２９条違反の申立
　申立人石神慶司、申立人高橋登、申立人中川英子および申立人カンアグ・ダイアグノスティック・アクチボラーグは、本件特許が、下記の理由で特許法２９条の規定に違反してされたものである、と主張している。
　（下記刊行物に、付記した記号「石５」などは、申立人の頭文字と証拠番号である。たとえば、「石５」は、申立人石神慶司提出の甲第５号証である。）
（「取数字」は取消理由通知における刊行物番号である）
　刊行物Ａ：（石５、高５、中３、カ９）（取５）
　蒲池信一ら「酵素免疫測定法による血清中γ−セミノプロテイン（γ−Ｓｍ）濃度測定法の検討」臨床検査２８（１３）、１９８４、ｐ１７５５−１７５８
　刊行物Ｂ：（石８、高４、カ７）（取１２）
　γ−Ｓｍ「中外」キットの添付文書
　　　　　　昭和６１年３月作成（新）（石８）
　　　　　　昭和６３年６月改訂（新）（高４）
　　　　　　平成４年４月改訂
　　　　　　平成６年６月改訂（カ７）
　刊行物Ｃ：（高１、中２、カ１）（取１１）
　　　　特開昭６２−４６２６３号
　刊行物Ｄ：（石４）（取４）
　原三郎「γ−Ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ（γ−Ｓｍ）とは何か」
臨床病理　特集６８：５０−５６，１９８６
　刊行物Ｅ：（石６）（取６）
　蒲池信一ら「酵素免疫測定法による血清中γ−Ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ（γ−Ｓｍ）濃度測定法の検討」臨床検査２９（１）：８７−９０，１９８５
　刊行物Ｆ：（中４）（取８）
　蒲池信一ら「腫瘍マーカーとしての前立腺特異抗原γ−Ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ（γ−Ｓｍ）に関する基礎的検討ならびに基準値の設定」臨床病理、３２巻７号（１９８４）、ｐ．７８１−７８５
　刊行物Ｇ：（カ５）（取１０）
　　　特表昭５７−５００１６９号
　刊行物Ｌ：（石１、高２）（取１３）
　原三郎「前立腺特異抗原とくにγ−Ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｍおよびβ−ｍｉｃｒｏｓｅｍｍｏｐｒｏｔｅｉｎについて」生物物理化学ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．６，（１９８７）ｐ３７１−３７８
　刊行物Ｍ（石２、カ２）（取１４）
　Ａｋｅ　Ｌｕｎｄｗａｌｌ　ｅｔ　ａｌ“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｃ　ａｎｔｉｇｅｎｃＤＮＡ”ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ　Ｖｏｌ　２１４，Ｎｏ２，ｐ３１７−３２２（１９８７）
　刊行物Ｎ：（石３、高３、中１、カ３）（取１５）
　Ｊ．Ｓｃｈａｌｌｅｒ　Ｅｔ　ａｌ“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　γ−ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ，ａ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｍｉｎａｌ　ｐ．ｌａｓｍａ”Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７０　ｐ１１１−１２０（１９８７）
　刊行物Ｏ：（石７）（取７）
　出口隆ら「Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法および　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法による抗γ−ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体および抗　ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｎｔｉｇｅｎ抗体の認識抗原の比較検討」日泌尿会誌、８０巻、３号、１９８９年：３４９−３５２
　刊行物Ｑ：（中６）（取９）
　荒井陽一ら「前立腺癌腫瘍マーカーとしての前立腺特異抗原の臨床的意義−三者同時測定を行った新鮮前立腺癌１１３例によるγ−ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎおよび前立腺性酸性フォスファターゼとの比較検討−」泌尿紀要、３５巻（１９８９），ｐ．１５１９−１５２８
　刊行物Ｒ：（カ１０）（取３）
　Ｕ．　ＭＡＩＥＲ　ｅｔ　ａｌ“Ｇａｍｍａ−ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ−ａ　Ｎｅｗ　Ｔｕｍｏｕｒ　ｍａｒｋｅｒ　ｉｎ　Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｃａｎｃｅｒ？”Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｕｒｏｌｏｇｙ　６５（１９９０）ｐ．５０９−５１２
　刊行物Ｓ：（カ１１）（取１）
　Ｙ．Ａｒａｉ　ｅｔ　ａｌ“Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｕｓｉｎｇ　Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｇａｍｍａ−Ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ”Ｕｒｏｌｏｇｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　４４（１９８９）ｐ．１３５−１４０
　刊行物Ｔ：（カ１２）（取２）
　塚本泰司ら「前立腺癌における腫瘍マーカーの臨床的検討―Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，　Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ，γ−Ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎの同時測定による検討−」泌尿紀要　３４巻６号（１９８８）ｐ．９８７−９９５、
　刊行物Ｕ：（カ１３）
　Ｔ．　Ｃｈａｎｄｒａ　ｅｔ　ａｌ“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｈｕｍａｎ　α１−Ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ，α　１−Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ　ａｎｄ　Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ　ＩＩＩ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２２（１９８３），ｐ．５０５５−５０６０
　刊行物Ｖ：（カ４）（取１９）
　Ｍ．　Ｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ“Ｔｗｏ　ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ，γ−ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　β−ｍｉｃｒｏｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ”Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｖｏｌ．　１１３　Ｎｏ．５（１９８２）ｐ．５４１−５４８
　刊行物Ｗ：（カ６）（取２０）
　Ｍ．Ｃ．ＷＡＮＧ　ｅｔ　ａｌ“ＰＲＯＳＴＡＴＥ　ＡＮＴＩＧＥＮ　ＯＦ　ＨＵＭＡＮ　ＣＡＮＣＥＲ　ＰＡＴＩＥＮＴＳ”　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｖｏｌ．ＸＩＸ　　ＴＵＭＯＲＭＡＲＫＡＥＲＳ，ｃｈａｐｔ．ＩＶ，ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｈ．ｂｕｓｃｈ　ａｎｄ　Ｌ．Ｃ．　Ｙｅｏｍａｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８２，ＮＹ．　ｐ．１７９−１９６
　刊行物Ｘ：（石９）（取１６）
　白根等「ｆｒｅｅ　ＰＳＡと　ｃｏｍｐｌｅｘ　ＰＳＡ」泌尿器外科、８巻、１号、１９９５年：ｐ．５−９
　刊行物Ｙ：（中５）（取１７）
　川上圭子ら「γ−セミノプロテインＥＩＡ法の前立腺特異抗原による妨害反応について」臨床化学、２２巻（１９９３）、Ｐ４２−４８
　刊行物Ｚ：（中７）（取１８）
　飯田暢子「前立腺特異抗原（ＰＳＡ）」日本臨牀、５３巻（１９９５）、増刊号「広範囲血液・尿化学検査免疫学的検査」（下巻）、ｐ．７５３−７５６
２．１　申立人石神慶司の申立理由の概要
　刊行物Ｌ（石１）、刊行物Ｍ（石２）、刊行物Ｎ（石３）、および、刊行物Ｏ（石７）の記載から、ＰＳＡとγ−Ｓｍとは同一物質である。
　刊行物Ｘ（石９）から、刊行物Ｄ（石４）および刊行物Ａ（石５）に記載のγ−Ｓｍ抗体は、遊離γ−Ｓｍ（遊離ＰＳＡ）を認識する。
　そうすると、本件特許の請求項１〜請求項５、請求項１２〜請求項１３、請求項１５および請求項１６の各発明は、出願前に頒布された上記の刊行物Ｄ（石４）、刊行物Ａ（石５）、刊行物Ｅ（石６）、刊行物Ｏ（石７）、および刊行物Ｂ（石８）に記載された発明であるか、あるいは、これらの発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
２．２　申立人高橋登の申立理由の概要
　刊行物Ｌ（高２）、刊行物Ｎ（高３）によればγ−ＳｍとＰＳＡとが同一物質である。
　刊行物Ｃ（高１）には、ＰＳＡの複合体のみを認識する抗体を使用する測定法が記載されている。
　刊行物Ｂ（高４）および刊行物Ａ（高５）には、遊離のＰＳＡのみを認識する抗体を使用する測定法が記載されている。
　本件特許の請求項１〜請求項９、請求項１２〜請求項１６の各発明は、上記の刊行物Ｃ（高１）、刊行物Ｂ（高４）、および、刊行物Ａ（高５）に記載された発明であるか、あるいは、これらの発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
２．３　申立人中川英子の申立理由の概要
　刊行物Ｎ（中１）によれば、γ−ＳｍとＰＳＡとは同一のタンパク質である。
　刊行物Ｃ（中２）には、血中に遊離のＰＳＡと複合体を形成したＰＳＡが存在することが記載されている。
　刊行物Ａ（中３）には、抗ＰＳＡモノクローナル抗体および抗ＰＳＡポリクローナル抗体を用いたイムノアッセイが記載されている。刊行物Ｆによれば、このイムノアッセイを行うキット（中外キット）が使用されていた。
　刊行物Ｑ（中６）には、前ＰＳＡと遊離のＰＳＡの測定を、良性前立腺過形成の患者と、様々なレベルの前立腺癌の患者で行ったことが記載されている。
　刊行物Ｙ（中５）によれば、中外キットのγ−Ｓｍ抗体は、遊離のＰＳＡと複合体形成ＰＳＡとを区別しうる抗体に該当する。
　したがって、本件特許の請求項１の発明は、出願前に頒布された上記の刊行物Ａ（中３）に記載された発明、あるいは、公然実施された発明、に該当する。または、本件特許の請求項１の発明は、刊行物Ａ（中３）、刊行物Ｃ（中２）、刊行物Ｎ（中１）、刊行物Ｆ（中４）および刊行物Ｑ（中６）の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　本件特許の請求項２〜請求項８、請求項１０〜請求項１６の各発明は、刊行物Ａ（中３）、刊行物Ｃ（中２）、刊行物Ｎ（中１）、刊行物Ｆ（中４）および刊行物Ｑ（中６）の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
２．４　申立人カンアグ・ダイアグノスティック・アクチボラーグの申立理由の概要
　刊行物Ｃ（カ１）には、「抗γ一Ｓｍ抗体および抗プロテアーゼインヒビター抗体を用いることを特徴とする、γ−Ｓｍ−プロテアーゼインヒビター複合体の定量方法」が記載されている。
　刊行物Ｍ（カ２）および刊行物Ｎ（カ３）によれば、「ＰＳＡ」と「γ−Ｓｍ」とは同義である。
　刊行物Ｖ（カ４）、刊行物Ｇ（カ５）、刊行物Ｗ（カ６）、刊行物Ａ（カ９）、および、刊行物Ｕ（カ１３）によれば、刊行物Ｃ（カ１）のα１−アンチトリプシンは、α１−アンチキモトリプシンの誤記であるか、あるいは、均等物である。
　刊行物Ｂ（カ７）の（中外キットの）γ一Ｓｍ抗体が、遊離のＰＳＡに特異的であることは、甲第８号証の実験結果が示している。
　刊行物Ｒ（カ１０）、刊行物Ｓ（カ１１）、および、刊行物Ｔ（カ１２）では、遊離のＰＳＡを測定する中外キットと、全ＰＳＡを測定する各種市販のキットを用いて、ＰＳＡを測定している。
　そうすると、本件特許の請求項１〜請求項１６の各発明は、出願前に頒布された上記の刊行物Ｃ、刊行物Ｂ、刊行物Ｒ〜刊行物Ｓに記載された発明であるか、あるいは、これらの発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　さらに、本件の請求項１０および請求項１１の発明は、いわゆる、人の診断方法に該当し、特許法２９条柱書きの「産業上の利用性」を欠如している。
３．　特許法３６条違反の申立
　申立人石神慶司、申立人高橋登、申立人中川英子は、本件特許が、下記の理由で、特許法３６条に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである、と主張する。
３．１　申立人石神慶司の３６条違反の申立の概要
　本件特許の請求項１〜請求項５、請求項１２〜請求項１３、請求項１５および請求項１６の各発明について、抗体２Ｅ９は、複合体形成したＰＳＡを特異的に認識するが遊離ＰＳＡは認識しないと明細書に記載しているが、この抗体は遊離ＰＳＡを抗原とするものであるから、遊離ＰＳＡを認識しない抗体が得られるはずがない。
　本件請求項４に記載された３種の抗体のうちの一つであるプロテイナーゼインヒビターのみと結合する抗体は、当業者がその実施をすることができる程度に発明の詳細な説明の項に記載されていない。
３．２　申立人高橋登の３６条違反の申立の概要
　本件特許の請求項９の発明は、発明の詳細な説明の項に記載されていない。
３．３　申立人中川英子の３６条違反の申立の概要
　本件特許の請求項１０の発明について、「全ＰＳＡ」の定義が、発明の詳細な説明の項に記載されていない。
４．　引用刊行物の記載事項
（Ａ）　刊行物Ａ（石５、高５、中３、カ９）（取５）
　刊行物Ａは、蒲池信一らの「酵素免疫測定法による血清中γ−セミノプロテイン（γ−Ｓｍ）濃度測定法の検討」という表題の学術論文である。刊行物Ａには、次の事項が記載されている。
（Ａｌ）　γ−Ｓｍ
　ヒトの前立腺組織から産生，分泌され，精漿中に存在するγ−セミノプロテイン（γ−Ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ；γ−Ｓｍ）は原らによって分離，精製された。γ−Ｓｍは９５％の糖を含む分子量約２３，０００の糖蛋白質で、沈降係数２．５Ｓ、等電点５．８〜７．１（６．９）の性状を示す。また、２６％のα−ヘリックス構造を有し，ＳＨ基４個を有し，精漿中に２．５〜５．０ｇ／１含まれている。
　さらに，γ−Ｓｍは前立腺由来酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）と異なる前立腺特異抗原で，前立腺の上皮細胞の細胞質，特にその核周囲に局在している。そこで，ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法で血清中のγ−Ｓｍ濃度を測定したところ，健常者および非前立腺癌患者に比べて前立腺癌患者血清中のγ−Ｓｍ濃度は有意に高濃度であった。
（Ａ２）　酵素免疫測定（ＥＩＡ）法
　最近，放射性物質を取り扱うことなく，一般の検査室で測定でき，かつＲＩＡ法と同等の測定感度を有する酵素免疫測定（ＥＩＡ）法が普及してきた．そこで今回血清中のγ−Ｓｍ濃度を測定するためにγ−Ｓｍに対するモノクローナル抗体を用いたＥＩＡ法を確立したので報告する．
（Ａ３）　考察
　現在、前立腺癌の血清診断には、ＰＡＰのみが用いられているので、診断率を高める意味での他の診断法が望まれていた。
　最近、前立腺特異抗原であるγ−Ｓｍの血清中濃度を測定することにより、前立腺癌の診断の補助になること、さらに血清中γ−Ｓｍ濃度は血清中ＰＡＰ濃度と相関がないことから、前立腺癌患者血清中γ−Ｓｍ濃度測定はＰＡＰ濃度測定と異なる意義を有することが示唆された。
　そこで、血清中のγ−Ｓｍ濃度を測定するためにγ−Ｓｍに対するモノクローナル抗体を用いたＥＩＡについて検討した。固相化抗体に抗γ−Ｓｍモノクローナル抗体を用いることにした。酵素標識抗体は、ウサギ抗γ−Ｓｍ　Ｆａｂ’とＨＲＰを架橋試薬で調整することにより高感度測定が可能となった。確立したＥＩＡ法は約５時間で血清中のγ−Ｓｍ濃度を測定でき、測定感度のうえでＲＩＡ法に決して劣るものでないことが示唆された。したがって、一般の検査室で測定できるγ−ＳｍのＥＩＡ法は今後の臨床への応用が期待される。
（Ｂ）　刊行物Ｂ：（石８、高４、カ７）（取１２）
　刊行物Ｂは、γ−Ｓｍ「中外」キットの添付文書である。下記の事項が記載されている。
（Ｂ１）　開発の経緯及び特徴
　ガンマーセミノプロテイン（以下γ−Ｓｍ）は原らによりヒト精漿から発見された糖蛋白で、免疫電気泳動においてγ−グロブリン領域に泳動される精漿蛋白である。このγ−Ｓｍは前立腺分泌液および前立腺上皮細胞に特異的に証明されることが免疫組織化学的に明らかとなり、前立腺特異抗原であることが示された。
　γ−Ｓｍは前立腺癌患者においては血清中で有意に高く検出されることが明らかとなり、血清中γ−Ｓｍの測定は前立腺癌の診断に有用であることが示唆された。そこで、当社では、γ−Ｓｍの測定をより簡便な操作で行うことができるように、エンザイムイムノアッセイによるγ−Ｓｍ測定キットの開発を行った。
　本キットを用いて血清中のγ−Ｓｍを測定すると、前立腺癌患者においては病期の進行に伴ってγ−Ｓｍは高値を示す傾向にあった。また、治療経過を追うとき、γ−Ｓｍはその臨床所見と良く相関することから、予後の判定や再燃癌の発見に有用であることが示唆されている。
（Ｂ２）　測定方法
　本キットは固相担体に球形ビーズを用いたエンザイムイムノアッセイである。
　ガンマ−セミノプロテインに対するモノクローナル抗体を吸着した球形ビーズに、標準液もしくは被検血清を反応させ、次いでペルオキシダーゼ標識抗ガンマーセミノプロテインＦａｂ’を反応させる。一定時間経過後洗浄を行い、未反応の酵素標識流体を取り除き、次にビーズに結合したペルオキシダーゼ活性を測定する。標準曲線を作成し、これより検体中のガンマーセミノプロテイン（γ−Ｓｍ）濃度を求める。
（Ｃ）　刊行物Ｃ：（高１、中２、カ１）（取１１）
　刊行物Ｃは、出願人中外製薬株式会社、発明者蒲池信一らの、発明の名称「前立腺特異抗原とα１−アンチトリプシン複合体の定量方法」という発明の公開公報である。刊行物Ｃには次の事項が記載されている。
（Ｃ１）　刊行物Ｃ発明の請求項１
　抗γ−Ｓｍ抗体および抗α１−アンチトリプシン抗体を用いることを特徴とするγ−Ｓｍ−α１−アンチトリプシン複合体の定量方法。
（Ｃ２）　「γ−Ｓｍ−α１ＡＴ複合体」の定量
　本発明（刊行物Ｃ発明）は、ヒト精漿中に特異的に存在する蛋白であるγ−セミノプロテイン（γ−Ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ）（以下「γ−Ｓｍ」と略記する）とα１−アンチトリプシンからなる複合体（以下「γ−Ｓｍ−α１ＡＴ複合体」と略記する）の定量方法に関する。
　本発明者（刊行物Ｃ発明）は、血清中のγ−Ｓｍの性状を調べる目的で、前立腺癌患者血清をゲルろ過し、γ−Ｓｍの酵素免疫測定（ＥＩＡ）法でγ−Ｓｍを検出したところ、低分子量（分子量約３万）と高分子量（分子量約９万）の分画にγ−Ｓｍが検出された。低分子量のγ−Ｓｍは精漿から単離されるγ−Ｓｍ（分子量３３０００〜３４０００）と同じであるが、高分子量のγ−Ｓｍは血清中に存在する蛋白と結合した複合体ではないかと示唆された。そこで、γ−Ｓｍと複合体を形成する血清中に存在する蛋白について検討した結果，α１−アンチトリプシンがγ−Ｓｍと複合体を形成することがわかった。すなわち、γ−Ｓｍは血清中において遊離のγ−Ｓｍおよびγ−Ｓｍ−α１ＡＴ複合体の状態で存在している。
　遊離のγ−Ｓｍおよびγ−Ｓｍ−α１ＡＴ複合体の総量を測定するには、例えば抗γ−Ｓｍ抗体を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法，ＥＩＡ法等で行うことができる。この方法は、文献，日泌尿会誌，７４巻，１３２０〜１３２５頁，１９８３年（岡部勉他）、臨床検査，２８巻，１７５５〜１７５８頁，１９８４年（蒲池信一他）に報告されている。
（Ｃ３）　当該複合体のみを測定
　しかし、γ−Ｓｍ−α１ＡＴ複合体のみを測定することは上記文献記載の方法では不可能である。本発明者（刊行物Ｃ発明）は、当該複合体のみを測定する目的で、抗γ−Ｓｍ抗体および抗α１−アンチトリプシン抗体を使用するイムノアッセイ法を確立した。
　すなわち、本発明（刊行物Ｃ発明）は抗γ−Ｓｍ抗体ならびに抗α１−アンチトリプシン抗体を用いることからなるγ−Ｓｍとα１−アンチトリプシンの複合体（γ−Ｓｍ−α１ＡＴ複合体）の測定方法および少なくとも当該２種の抗体を含むγ−Ｓｍ−α１ＡＴ複合体測定用組成物である。
（Ｃ４）　試験例２　血清中のγ−Ｓｍ−α１ＡＴ複合体と前立腺癌との関連の検討
　正常者１９例，前立腺肥大症患者１９例および前立腺癌患者（未治療）１９例の血清中のγ−Ｓｍ−α１ＡＴ複合体を後述する実施例（４）に従って測定した。この結果を第２図に示す。結果から明らかな如く、前立腺癌患者血清中のγ−Ｓｍ−α１ＡＴ複合体の濃度は正常者および前立腺肥大症患者よりも高濃度であった。以上の試験例から明らかな如く、本発明（刊行物Ｃ発明）のγ−Ｓｍ−α１ＡＴ複合体の測定は前立腺癌の診断に有用なものである。
（Ｄ）　刊行物Ｄ：（石４）（取４）
　刊行物Ｄには、γ−Ｓｍのモノクローナル抗体を用いたイムノブロッティング法が記載されている（５２頁４行〜６行）。
　刊行物Ｄには、中外製薬製γ−Ｓｍ抗体を用いた旨の記載がある（第５４頁第２２〜２２行目）。
（Ｅ）　刊行物Ｅ：（石６）（取６）
　表題から明らかなとおり、γ−Ｓｍのモノクローナル抗体および免疫測定法を記載している。
　抗体を得る際の抗原γ−Ｓｍは分子量約２６，０００〜３７，０００である（８７頁右欄５行〜）。
（Ｆ）　刊行物Ｆ：（中４）（取８）
　刊行物Ｆには、中外製薬株式会社が提供したγ−Ｓｍ−ＥＩＡキット（７８５頁左欄１４行〜１５行参照）を使用して、抗γ−Ｓｍモノクローナル抗体及びＨＲＰ標識抗γ−ＳｍウサギＦａｂ’（酵素標識抗体）を用いたサンドイッチ法によりγ−Ｓｍを測定することが記載されている（７８１頁右欄４行〜７８２頁左欄１８行）。
　このキットを用いてγ−Ｓｍを測定するには、被検血清に抗体結合ビーズを入れ、酵素標識抗体を加えて反応させ、洗浄したビーズに基質溶液を加えて反応させた後、吸光度を測定する（７８２頁左欄下から８行目〜右欄１２行）。
（Ｇ）　刊行物Ｇ（カ５）（取１０）
　刊行物Ｇは、抗ＰＳＡモノクローナル抗体、ＰＳＡに対するイムノアッセイ、血清中のＰＳＡの決定、さらにＰＳＡ複合体の存在について記載している（７頁右上欄７行−最終行）。
（Ｌ）　刊行物Ｌ：（石１、高２）（取１３）
　刊行物Ｌには、ＰＳＡとγ−Ｓｍとが同じと考えて差し支えない、と記載されている（５頁左欄６行〜）。
（Ｍ）　刊行物Ｍ：（石２、カ２）（取１４）
　刊行物Ｍには、ＰＳＡのアミノ酸配列が記載されている（Ｐ．３１９、図２）。
（Ｎ）　刊行物Ｎ：（石３、高３、中１、カ３）（取１５）
　刊行物Ｎには、γ−Ｓｍのアミノ酸配列が記載されている（Ｐ１１６、図５）。
（Ｏ）　刊行物Ｏ：（石７）（取７）
　刊行物Ｏには、「考察」の欄に次の事項が記載されている。
（Ｏ１）　抗γ−Ｓｍ抗体および抗ＰＡ（ＰＳＡ）抗体
　しかしながら、今回の　Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法および　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法による検討では、抗γ−Ｓｍ抗体および抗ＰＡ（ＰＳＡ）抗体は、分子量３３，０００の単一で、しかも同一の抗原を認識することが明らかになった。このことは、抗γ−Ｓｍ抗体および抗ＰＡ（＝ＰＳＡ）抗体を利用した免疫学的な測定系においては、前立腺：癌患者の血清中の同一物質を測定している可能性のあることを意味している。現在、血清中のγ−ＳｍおよびＰＡ（ＰＳＡ）の測定は、それぞれ条件の異なった測定系により行われており、そのためにγ−ＳｍとＰＡ（ＰＳＡ）との間に、高い相関性を示さないのか、その理由は明確ではない。
（Ｑ）刊行物Ｑ：（中６）（取９）
　刊行物Ｑには、マーカーＰＡ、γ−Ｓｍ、ＰＡＰの同時測定が記載されている。刊行物Ｑには次の事項が記載されている。
（Ｑ１）　ＰＡとγ−Ｓｍとの同一性と臨床上の差異
　ＰＡとγ−ＳｍはそれぞれＰＡＰとは免疫学的にもまた化学的にも異なる糖蛋白抗原である，とされている　しかしＰＡとγ−Ｓｍとの異同についてはこれまで多くの議論があった６−８）．最近、Ｌｕｎｄｗａｌｌ　ａｎｄ　Ｌｉｉｊａｍは　ＰＡ　のアミノ酸配列について報告し，その基本構造から　ＰＡは　ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ系プロテアーゼの類似物質であろう，と述べている．一方，γ−Ｓｍ　に関する研究は　ＰＡとは別に本邦においてよく研究が進められてきた１２，１３）．Ｓｃｈａｌｌｅｒ　ら１４）はほぼ時を同じくしてγ−Ｓｍ　のアミノ酸配列を決定し，ＰＡとγ−Ｓｍとは同一蛋白であろうと結論づけている．しかし臨床的にはこれらの２つのマーカーは必ずしも平行な動きを示さない８）．われわれの成績でも両者の相関はそれほど高いものではなかった．この臨床上の差異については今後，抗原上の認識部位の分析，抗原の血液中での動態など分子レベルでの検討が必要と考えられる．
　ＰＡの　ｋｉｔは内外で開発されているが，それぞれ独自に作成した抗体を用いているためにそれらが必ずしも同じ抗原決定基を認識しているとは限らない．そのため測定値やｃｕｔ−ｏｆｆ値もまちまちであり，臨床上は特に測定値間の比較を行う場合十分な注意が必要である．ＰＡの測定ｋｉｔ間の比較についても最近報告されるようになっているが１５，１６）、今後同一検体を用いたさらに多数の症例での検討が必要であろう．
（Ｑ２）　ｓｔａｇｅの進行と各マーカーの値
　ｓｔａｇｅの進行にともなって各マーカーの値も一般に上昇する傾向がみられるが，その程度はそれぞれ異なるところがあり，各マーカーの特徴をなす部分でもある．ＰＡでは他の２つのマーカーに比べｓｔａｇｅＡ，Ｂの早期癌でも高い値を示す例が多くみられている４，５）．またγ−ＳｍとＰＡＰ　では　ｓｔａｇｅ　ＧとＤ１との間に有意差がみられなかったのに対し，ＰＡでは　Ｄ１　で有意な上昇がみられている．その結果ＰＡ　のマーカー値でみる限りｓｔａｇｅ　ＤＩとＤ２　では有意差が見られない．動物実験では治療前ＰＡ値が　ｔｕｍｏｒｖｏｌｕｍｅと良く相関するとの報告もあり１７），臨床上のｓｔａｇｅとは別に　ＰＡ値の観点から予後を考えると興味深い所見である．局所の浸潤進展度やりリンパ節転移の診断における　ＰＡ　の有用性については前立腺全摘術やｓｔａｇｉｎｇ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎを施行した症例で検討を行ってみる必要がある．この点についてＯｅｓｔｅｒｌｉｎｇら１８）は，ＰＡは癌の被膜外浸潤，精漿浸潤，リンパ節転移と良く相関すると報告している．
（Ｑ３）　ＰＡ−テストワコーの　ｃｕｔ−ｏｆｆ値
　ＰＡ−テストワコーの　ｃｕｔ−ｏｆｆ値については，布施ら１９）が５０歳以上の健常男子の平均値＋３ＳＤより算出した１４ｎｇ／ｍｌが暫定的に用いられてきた．しかし，この　ｃｕｔ−ｏｆｆ値で前立腺肥大症の偽陽性率が５２％と高率であった，と述べている．吉数ら７）も同じｋｉｔを用いた検討でこの　ｃｕｔ−ｏｆｆ値を用いた場合に３０％の偽陽性がでることを報告し，いわゆゆるＢＰＨ　ｒａｎｇｅの設定の必要性について言及している．ＰＡ測定の対象はそのほとんどが４０〜５０歳以上の男子となるが，現実的にはこの年齢層で前立腺肥大症を厳密に除外した「健常人」を定義することはきわめて離しい．われわれの健常男子についての結果でも年齢が進むにつれてＰＡ値は上昇する傾向がみられ，前立腺の加齢に伴う変化をある程度反映していることが示唆される．臨床において最も問題となるのは前立腺肥大症と前立腺癌との鑑別であり，今回の検討では前立腺肥大症を　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　としてｃｕｔ−ｏｆｆ値を　１９．０ｎｇ／ｍｌと設定した．さらに前立腺肥大症でも直腸診や経尿道的操作などでＰＡ値は一時的に上昇することが指摘されており２０），採血の時期については今回のわれわれの検討のような細心の注意が必要である．
（Ｑ４）　各マーカーの陽性率
　各マーカーの陽性率では，ＰＡが８１．４％と最も高く，しかもすべてのｓｔａｇｅにおいて他の２つのマーカーよりも高い結果が得られた．またｓｔａｇｅ　Ａ，Ｂ，Ｃの限局性前立腺癌でもＰＡ　では６６％と比較的高い陽性率を示している．他のマーカーと比較してＰＡが早期癌の検出率に優れていることはこれまでの報告でも指摘されている５，８，２１）．一方，前立腺肥大症をｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌとした場合の特異性では　ＰＡ　は８１．０％であり，γ−Ｓｍ　の８４．７％よりはやや低く，ＰＡＰの９４．２％と比べると満足の得られるものではなかった．結果として診断効率では３者とも８０％前後で大差ないものであった．これらの結果から，ＰＡを早期スクリーニングとして使用するにはかなり困難と考えられる２０，２１）．また、ＰＡが癌特異抗原ではなく臓器特異抗原である以上，陽性率と特異性には一定の限界があり，これらの観点からのみで優劣を論じることはあまり意味がない．
（Ｑ５）　複数のマーカーの組み合わせと癌の検出率の向上
　複数のマーカーを組み合わせることで癌の検出率をあげることは十分期待できることである４）．Ａｒａｉら８）は今回とは異なるＰＡのＥＩＡ　ｋｉｔを用いた１２１例の未治療前立腺癌の検討で，ＰＡ，γ−Ｓｍ，ＰＡＰの３者を併用することで陽性率は８６％まで上昇する，と報告している．しかし逆に特異性は６７％に低下した，と述べている実際の個々の症例ではそれぞれのマーカーの特徴を理解して診断する必要がある．しかし，臨床の上で３つのマーカ−を常時測定するのは種々の観点からも困難であり，今後さらに多くの症例を追加・検討することによってより適したマーカーの選択が迫られることになろう．
（Ｑ６）腫瘍マーカーの有用性
　腫瘍マーカーとして最大の有用性は，治療効果の判定，制癌状態の評価，再燃再発の早期予知など，モニターとして用いることにある４，８）．制癌例の検討では各マーカーともほとんどｃｕｔ−ｏｆｆ値内にあり，臨床像とよく一致した結果であった（Ｆｉｇ．８）．再燃・再発例についてはγ−ＳｍとＰＡが臨床診断時期よりかなり早期に上昇を示しており，再燃・再発の早期予知についてはＰＡＰより明らかに有用であると考えられた．Ｓｉｄｄａｌｌら２２）も，癌の進行時にはＰＡとγ−ＳｍがＰＡＰよりも鋭敏に反応すると報告している．Ｗｉｌｌｉａｍｓ２０）は，ＰＡは臨床的な再発の平均６ヵ月前から上昇がみられ，しかもＰＡＰよりも早い時期に変動する，と述べている．したがってＰＡを用いることで再発・再燃のより早期に　ａｄｊｕｖａｎｔ　ｔｈｅｒａｐｙを考慮しうることが期待される．
（Ｑ７）　ＰＡ
　ＰＡが発見されてからすでに１０年を経ているが３），前立腺癌のマーカーとしての有用性がようやく明らかにされたに過ぎない．ＰＡの予後因子としての役割，すなわち治療前値や治療によるマーカー値の変動様式などが予後と如何なる関係にあるかなどについては今後の長期経過観察による検討を待たねばならない．またＰＡの前立腺機能における役割についてはほとんど解明がなされておらず，その高い臓器特異性を利用した多方面の応用の可能性が示唆される．
（Ｑ８）　結語
　１）新鮮前立腺癌１１３例を用いて腫瘍マーカーとしてのＰＡの意義について検討した．また同時にγ−Ｓｍ，ＰＡＰについても測定を行い比較検討した．
　２）ＢＰＨの１３７例をｎｅｇａｔｉｖｃｏｎｔｒｏｌとしてＰＡのｃｕｔ−ｏｆｆ値を１９．０ｎｇ／ｍｌと設定して検討した．
　３）健常人のＰＡ値は加齢とともに上昇する傾向がみられた．
　４）組織学的分化度とＰＡ値との間には一定の相関はみられなかった
　５）各マーカー値ともｓｔａｇｅ　の進行と共に上昇する傾向にあり，特にＰＡではｓｔａｇｅＤ１とＤ２での上昇が顕著であった．
　６）ＰＡ，γ−Ｓｍ，ＰＡＰの陽性率（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）はそれそれ，８１．４％，７３．５％，６９．０％であり，ＰＡが最も高かった．特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）ではＰＡとγ−Ｓｍでそれそれ，８１．０％，８４．７％と低かったのに対し，ＰＡＰでは９４．２％であった．結果的に診断効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）はそれそれ，８１．２％，７９．６％，８２．８％となり，三者間に大差はみられなかった．
　７）ＰＡはすべてのｓｔａｇｅで他の２者よりも高い陽性率を示した．特に限局性癌（ｓｔａｇｅＡ，Ｂ，Ｃ）のＰＡの陽性率は６６％であった．
　８）制癌例の検討では，各マーカー値ともほぼｃｕｔ−ｏｆｆ値内にあり，臨床的な制癌状態をよく反映していた．
　９）再燃・再発例の検討では，γ−ＳｍとＰＡがＰＡＰに比べ再燃・再発の早期予知に有用であった．
（Ｒ）　刊行物Ｒ：（カ１０）（取３）
　刊行物Ｒでは、「γ一Ｓｍ「中外」キット」、「Ｔａｎｄｅｍ−Ｅ−ＰＳＡ　ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｒｉｃ　ａｓｓａｙ」（ハイブリテック社製）により、ＰＳＡの測定値について、特異性、感受性を評価している。
（Ｓ）　刊行物Ｓ：（カ１１）（取１）
　刊行物Ｓでは、血清のＰＡ値、γ一Ｓｍ値、および、ＰＡＰ値を評価している。
　刊行物Ｓには、γ一Ｓｍ値は、病状進行の早期検出に於いて、他の２つのマーカーよりより感受性であることが記載されている。（１３９頁右欄１段落）。
（Ｔ）　刊行物Ｔ：（カ１２）（取２）
　刊行物Ｔでは、血清のＰＡ値、γ一Ｓｍ値、および、ＰＡＰ値を評価している。
（Ｕ）　刊行物Ｕ：（カ１３）
　刊行物Ｕは、ヒトα１−アンチキモトリプシンはα１−アンチトリプシンとアミノ酸配列で４２％、ｃＤＮＡの核酸配列で５６％の相同性を有することを示している（５０５７頁第３段落）。
（Ｖ）　刊行物Ｖ（カ４）（取１９）
　刊行物Ｖは、本件優先日後に頒布されたものである。
　刊行物Ｖは、γ−Ｓｍ（即ちＰＳＡ）がトリプシン様特性ではなく、むしろキモトリプシン様特性を有することを示す（５４１頁右欄下３行〜５４２頁右欄５行）。
（Ｗ）　刊行物Ｗ（カ６）（取２０）
　刊行物Ｗは、本件優先日後に頒布されたものである。
　刊行物Ｗは、前立腺組織、精液および血清において、ＰＳＡタンパク質が３３ｋＤａと９０−１００ｋＤａの２つの型で存在することを記載しており、後者はＰＳＡの多量体あるいはＰＳＡと他のタンパク質との結合体であることが示唆されている（１８５頁−１９１頁）。
（Ｘ）　刊行物Ｘ：（石９）（取１６）
　刊行物Ｘは、本件優先日後に頒布されたものである。
　刊行物Ｘには、次の事項が記載されている。
（Ｘｌ）　ＰＳＡ測定キットとγ−Ｓｍ測定キット（γ−Ｓｍ中外）
　γ−ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ（γ−Ｓｍ）も本邦で広く使用されている前立腺の腫瘍マーカーであるが，キモトリプシン様生物活性やアミノ酸配列の分析などによってＰＳＡと同一なペプタイドであることが明らかとなってきた。臨床的にＰＳＡとγ−Ｓｍの値に相異を経験するが，これはＰＳＡ測定キットが前述のようにｆｒｅｅとｃｏｍｐｌｅｘ両者のＰＳＡを測定しているのに対して、γ−Ｓｍ測定キット（γ−Ｓｍ中外）の抗体がｆｒｅｅ　ＰＳＡのみを認識してｃｏｍｐｌｅｘ　ＰＳＡの分画を測定しないためとされている。この点に着目して，出村らは前立腺生検または経尿道的前立腺切除術により病理組織学的診断を行った前立腺癌５０例と非前立腺癌１１２例のＰＳＡおよびγ−Ｓｍの比率（Ｐ／Ｓｒａｔｉｏ）を測定した。
（Ｘ２）　ＰＳＡおよびγ−Ｓｍの比率（Ｐ／Ｓ　ｒａｔｉｏ）
　すなわち，Ｐ／Ｓ　Ｒａｔｉｏは（ｆｒｅｅ　ＰＳＡ＋ｃｏｍｐｌｅｘ　ＰＳＡ値／ｆｒｅｅ　ＰＳＡ値を意味しており，Ｐ／Ｓ　Ｒａｔｉｏの１．５０をカットオフ値とした場合に　Ｐ／Ｓ　Ｒａｔｉｏによる前立腺癌診断の感度は９０．０％，特異度は９１．１％で，いずれもＰＳＡやγ−Ｓｍより優れた感度と特異度を示した。前立腺癌およびＢＰＨにおいて，γ−Ｓｍ値／ＰＳＡ値を　ｆｒｅｅ　ＰＳＡ　ｒａｔｅと算定すると，ＢＰＨに比較してｓｔａｇｅ　Ｃと　ｓｔａｇｅ　Ｄでｆｒｅｅ　ＰＳＡ　ｒａｔｅが有意に低下する。さらに，Ｐ／Ｓ　Ｒａｔｉｏやｆｒｅｅ　ＰＳＡ　ｒａｔｅが内分泌療法に対する治療効果や再燃の指標にもなりうる可能性が示された。なお，γ−Ｓｍ測定キッは１９９２年９月に現行の新キットに変更されたが，Ｐ／Ｓ　Ｒａｔｉｏ　に関する報告はいずれも旧キットによるデータであり，新キットではＰＳＡ値とγ−Ｓｍ値がほぼ一致してしまうために，Ｐ／Ｓ　Ｒａｔｉｏ　による前立腺癌の鑑別は困難とされている。
（Ｙ）　刊行物Ｙ（中５）（取１７）
　刊行物Ｙは、本件優先日後に頒布されたものである。
　刊行物Ｙには、次の事項が記載されている。
（Ｙｌ）　測定法の比較検討
　（１）γ−Ｓｍ測定法（中外製薬）、（２）γ−Ｓｍ改良法（中外製薬）、（３）γ−Ｓｍ２ステップ法、（４）ＰＳＡ測定法（東ソー法）。
（Ｙ２）　血清中のγ−Ｓｍ、血清中のＰＳＡ（４７頁左欄下から５行〜右欄２行）
　阻害物質がＰＳＡであることを証明するために行った、ＨＰＬＣゲルろ過分画は、▲１▼血清中のγ−Ｓｍは３４ＫＤ画分のみであるが、▲２▼血清中のＰＳＡは３４ＫＤ画分だけでなく１２０ＫＤ画分にもある２峰性であり、しかもＰＳＡ値が上昇した患者血清では１２０ＫＤ画分が大部分を占めることを明らかにした。
（Ｙ３）　α１−アンチキモトリプシンと結合
　一方、ＰＳＡについては　Ｓｔｅｎｍａｎら９）　が血清中ではＰＳＡは主にα１−アンチキモトリプシンと結合し、高分子型（フリーの　３０ＫＤに対し　１００ＫＤ）となっていることを報告しており、我々の知見とほとんど一致する。
（Ｙ４）　γ−ＳｍとＰＳＡの同一性
　精漿や前立腺から抽出されたγ−ＳｍとＰＳＡが類似することは疑いがないことであり、γ−Ｓｍを発見した原らは同一物質と考えて差し支えないといっており、キモトリプシン様生物活性、免疫源性、アミノ酸配列、塩基性配列などのγ−ＳｍとＰＳＡとの類似性はほとんど決定的であり、最近の　Ｏｅｓｔｅｒｌｉｎｇの総説でも同一物質と取り扱っている。
（Ｙ５）　中外製薬のγ−Ｓｍ測定法は主に遊離型
　しかし、血清中のγ−ＳｍとＰＳＡ測定値は必ずしも相関しないし、また、本実験では同一物質とすると、中外製薬のγ−Ｓｍ測定法は主に遊離型、東ソーのＰＳＡ測定法は結合型を測定しており、熱安定性では、遊離型は安定で結合型は不安定ということになる。こららの関係を明らかにすることは今後の検討が必要である。
（Ｚ）　刊行物Ｚ（中７）（取１８）
　刊行物Ｚは、本件優先日後に頒布されたものである。
　刊行物Ｚには、ＰＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）及びＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ）は前立腺特異抗原であり、これらが同義であることが示されている（７５３頁左欄１行〜２行）。
５．　特許権者の主張の概要
　特許権者が、特許異議意見書において、本件発明の概要を次のように主張している。
５．１従来技術
　従来、前立腺癌における腫蕩マーカーとして、γ−セミノプロテイン（以下「γ−Ｓｍ」という。）および前立腺特異抗原（以下「ＰＳＡ」という。）の血清レベルが測定されていた。前立腺癌患者の多くにおいては、これらマーカーの血清濃度は比較的高い（３〜４ｎｇ／ｍｌ以上）ことが確認されてはいるが、いずれも前立腺癌にのみ特異的なマーカーではなく、良性の前立腺異常である前立腺肥大症（本件特許明細書では「前立腺過形成」と表示している。以下「ＢＰＨ」ともいう。）においても血清中のγ−ＳｍまたはＰＳＡレベルが増加することが認められており、前立腺癌と前立腺肥大症とを区別してスクリーニングすることは容易ではなかった。そのため、それ自体早期発見が難しい前立腺癌を血液検査のみで正しく検診することは困難で、確定的な前立腺癌の検出は結局患者の苦痛を伴う生検に頼らざるを得ないというのが実状であった。
５．２　ｃｏｍｐｌｅｘＰＳＡの知見と「比」についての発見
　そこで、本件特許発明は、血清中のＰＳＡが遊離型（以下「ｆｒｅｅ　ＰＳＡ」ともいう。）及び複合体型（以下「ｃｏｍｐｌｅｘ　ＰＳＡ」ともいう。）で存在することに鑑み、このｃｏｍｐｌｅｘＰＳＡがＰＳＡとα１−抗−キモトリプシン（以下「ＡＣＴ」ともう。）との複合体であることを初めて知見するとともに、前立腺癌患者ではｆｒｅｅＰＳＡとｃｏｍｐｌｅｘ　ＰＳＡ間の比、例えばｆｒｅｅ　ＰＳＡと全ＰＳＡ（以下「　ｔｏｔａｌ　ＰＳＡ」ともいう。）との比がＢＰＨのそれよりも小さいこと、或いはｃｏｍｐｌｅｘ　ＰＳＡとｔｏｔａｌ　ＰＳＡとの比がＢＰＨのそれよりも大であることを初めて発見し、この「比」が前立腺癌の診断に極めて有力なマーカーになり得ることを初めて明らかにしたのである。
５．３　前立腺癌の検出率
　かかる比により前立腺癌の検出率の向上が期待されることは、引用の刊行物１６（本件特許の優先日の後である１９９５年に頒布）の第６〜７頁の「ｌ１．前立腺癌スクリーニングにおける　ｆｒｅｅ　ＰＳＡと　ｃｏｍｐｌｅｘ　ＰＳＡの意義」の欄および本意見書において後述する参考文献Ｋ．Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ．４１／１０，１４８０−１４８８（１９９５）に詳述されている。
５．４　明細書のバックアップ
　尚、本件特許発明が前立腺癌診断における重要な要素としてｆｒｅｅ　ＰＳＡ、ｃｏｍｐｌｅｘＰＳＡおよびその比を測定するものであることは、例えば、本件特許明細書（特許公報）の第５欄２６〜２７行の「本発明は、前立腺癌患者の診断に非常に有用であることも立証した。」という記載、さらには同欄３６〜３９行の「本発明は、遊離ＰＳＡ、ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビタ−複合体及びその割合を、前立腺癌患者の診断に適用することによっても特徴付けられる。」という記載をした上で、特許請求の範囲に当該遊離ＰＳＡ、複合体ＰＳＡおよびその比を明記していることから、明白である。
５．５　本件発明の効果
　本件特許発明によれば、血中ＰＳＡのＦｒｅｅまたはｃｏｍｐｌｅｘを測定することで、従来の苦痛を伴う生検を必要とするまでもなく、正確な前立腺癌の診断が可能となる。
６．特許法２９条違反の申立について
６．１　申立人石神慶司の申立２．１についての検討
（１）　ＰＳＡとγ−Ｓｍ
　刊行物Ｌ（石１）、刊行物Ｍ（石２）、刊行物Ｎ（石３）、および、刊行物Ｏ（石７）の記載事項によれば、ＰＳＡとγ−Ｓｍとは同一物質であると認められる。
（２）　刊行物Ｘ（石９）に記載の中外キット
　刊行物Ｘには、中外キットのγ−Ｓｍ抗体は、遊離のＰＳＡのみを認識する抗体であると、文献番号１７の刊行物Ｙを引用して、記載されている（前記（Ｘｌ）参照）。このことは、旧キットによるデータであり、１９９２年９月に改訂された新キットでは、遊離と複合体の両方を認識する抗体に変更になったことも、刊行物Ｘに記載されている（前記（Ｘ２）参照）。
　刊行物Ｙの記載事項をみると、「主に遊離型を測定している」と記載されており（前記（Ｙ５）参照）、刊行物Ｙの図５のｄ）、ｅ）、ｆ）図では、γ−Ｓｍによる血清検体の測定結果が３４ｋＤ（遊離型）で主に反応し、１２０ｋＤ（複合体型）にも少量反応することが示されている。
　したがって、中外の旧キット（１９９２年９月改訂前）のγ−Ｓｍ抗体は、「主に遊離型を測定している」ものであり、すなわち、「遊離型を認識する抗体」であると認められる。
　なお、特許権者は、この中外の旧キットのγ−Ｓｍ抗体は、１２０ｋＤ（複合体型）にも少量反応することということを根拠にして、本件発明の「遊離型のみを認識する抗体」に該当しない旨主張しているが、本件発明の抗体も複合型とわずかに反応することが本件図面の【第３図】にも示されているので、このことを根拠に、この中外の旧キットのγ−Ｓｍ抗体は本件発明の「遊離型のみを認識する抗体」に該当しないということはできない。
　しかしながら、刊行物Ｘおよび刊行物Ｙはともに、本件特許出願の公開後の刊行物であるから、中外キットのγ−Ｓｍ抗体は、「遊離γ−Ｓｍ（遊離ＰＳＡ）を主に認識する抗体」であることは、本件出願の優先日前に知られていたということはできない。
（３）　本件優先日前の中外キット
　γ−Ｓｍの添付文書（刊行物Ｂ：石８、高４、カ７）によれば、中外のγ−Ｓｍキットは、しばしば改訂されるものと認められる。
　前述したように刊行物Ｘによれば、１９９２年９月に遊離のＰＳＡを測定するものから総量を測定するものに、抗体を変えている。
　申立人カンアグ・ダイアグノスティック・アクチボラーグが提出した甲第８号証によれば、平成６年６月改訂の中外キットでは、遊離のＰＳＡを測定する抗体に変えているものと認められる。
　これらのことから見ると、中外キットは、しばしば抗体を変更するものであるから、１９９２年９月以前の中外の旧キットが遊離のＰＳＡを測定するものであるといっても、本件優先日前の中外キットが、「遊離のＰＳＡを測定する抗体」に該当するものを使用していたものと認めることはできない。
（４）　公然実施
　仮に本件優先日前に、中外キットが、「遊離のＰＳＡを測定する抗体」に該当するものを使用したことがあったとしても、その使用は、「遊離のＰＳＡを測定する抗体」であることを開示して使用していたものということができないので、この中外キットは、「遊離のＰＳＡを測定する抗体」を使用する発明を公然と実施していたものということができない。この場合、中外キットは市販されているので、第三者が分析により「遊離のＰＳＡを測定する抗体」を使用していることが解明可能な状態であるということはできるが、それが解明されたとしても、このキットが「遊離のＰＳＡを測定する抗体」を開示しているということはできない。
（５）　刊行物Ａ（石５）のγ−Ｓｍ抗体
　本件優先日前に頒布された刊行物Ｃには、刊行物Ａのγ−Ｓｍ抗体が、遊離体と複合体の総量を測定するものとして記載している。このことは、刊行物Ｃの第１図にも図示されている。そして、刊行物Ｃのγ−Ｓｍ抗体は、刊行物Ａを引用しているので、刊行物Ａのγ−Ｓｍ抗体である。そうすると、刊行物Ａのγ−Ｓｍ抗体は、本件優先日前にはむしろ遊離体と複合体の総量を測定するものと考えられていたということができる。　中外キットのγ−Ｓｍ抗体も刊行物Ａを引用しているものである。この中外キットのγ−Ｓｍ抗体は、１９９２年９月に現行のキットに変更され、新キットではＰＳＡ値（すなわち総量値）と一致してしまうもので（前記（Ｘ２）参照）、この点からも、結局刊行物Ａは、遊離のＰＳＡを測定する抗体を開示しているということはできない。
（６）　刊行物Ｄ（石４）、刊行物Ａ（石５）、刊行物Ｅ（石６）、刊行物Ｏ（石７）および刊行物Ｂ（石８）に記載の抗体
　したがって、本件出願前に頒布された刊行物Ｄ、刊行物Ａ、刊行物Ｅ、刊行物Ｏおよび刊行物Ｂには、「遊離のＰＳＡを認識する抗体」を使用する発明を開示しているということはできない。
（７）検討結果
　したがって、本件請求項１〜請求項５、請求項１２〜請求項１３、請求項１５および請求項１６の各発明は、出願前に頒布された上記の刊行物Ｄ、刊行物Ａ、刊行物Ｅ、刊行物Ｏ、および刊行物Ｂに記載された発明ということはできない。そして、本件請求項１〜請求項５、請求項１２〜請求項１３、請求項１５および請求項１６の各発明は、出願前に頒布された上記の刊行物Ｄ、刊行物Ａ、刊行物Ｅ、刊行物Ｏ、および刊行物Ｂに記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということもできない。
６．２　申立人高橋登の申立２．２についての検討
（１）　ＰＳＡとγ−Ｓｍ
　前記６．１（１）で述べたとおり、ＰＳＡとγ−Ｓｍとは同一物質と認められる。
（２）　刊行物Ｃ（高１）の複合体のみを認識する抗体
　刊行物Ｃには、血清中のＰＳＡの複合体のみを測定しようとすることは開示されているといえる。
　しかしながら、刊行物Ｃでは、血清中のＰＳＡと複合体を形成するタンパクが、α１−アンチトリプシンであることを前提にしているもので、総量を測定する抗体であるγ−Ｓｍ抗体とα１−アンチトリプシンの抗体を使用して、当該複合体のみの濃度を測定するものである（前記（Ｃ３）参照）。
　これに対し、本件発明は、血清中のＰＳＡと複合体を形成するタンパクが、α１−抗キモトリプシンであるという知見に基づくものである（本件特許公報５欄２２行〜２６行参照）。そして、本件請求項１中の「複合体を形成したＰＳＡ」とは、「ＰＳＡとα１−抗キモトリプシンとの複合体」を意味することは明らかである。
　そうすると、刊行物Ｃに記載の「α１−アンチトリプシンの抗体」は、本件請求項１中の「複合体を形成したＰＳＡ」を区分しうる抗体、すなわち「ＰＳＡとα１−抗キモトリプシンとの複合体」を区分しうる抗体、ということはできない。
（３）　刊行物Ｃ（高１）の「γ−Ｓｍ抗体」
　そして、刊行物Ｃにおいて「γ−Ｓｍ抗体」は「総量を測定する抗体」とされているから（前記（Ｃ２）参照）、刊行物Ｃの「γ−Ｓｍ抗体」は、「遊離のみのＰＳＡを認識する抗体」ということはできない。
　刊行物Ｃでは、総量を測定する方法として、刊行物Ａを引用している（前記（Ｃ２）参照）。この刊行物Ａを参照しても、刊行物Ｃが、遊離のＰＳＡを測定する抗体を開示しているということはできない。
（４）　刊行物Ｃ（高１）の「２種の抗体」
　刊行物Ｃのこれらの「２種の抗体」は、それぞれ異なる２種の抗体である。そしてこれらの抗体は、モノクローナル抗体であってよいと記載されている（刊行物Ｃ２頁右上欄６行〜１６行参照）。
　本件請求項１５のアッセイにおいて、「２種類の異なるモノクローナル抗体」とは、本件明細書の発明の詳細な説明の項を参照すると、「α１−抗−キモトリプシン複合体のＰＳＡ」「遊離のＰＳＡ」および「両ＰＳＡの合計量」と反応する、３種類のモノクローナル抗体の内の少なくとも２種をいうものと認められる。
　そうすると、刊行物Ｃの発明の「γ−Ｓｍ抗体」は、前述のように、総量を測定するものであるから、「両ＰＳＡの合計量」と反応するモノクローナル抗体に該当すると認められる。刊行物Ｃの発明の「複合体のみを認識する抗体」は、α１−アンチトリプシンとの複合体を認識する抗体であるから、この抗体がモノクローナル抗体であった場合でも、請求項１５の「α１−抗−キモトリプシン複合体のＰＳＡ」のみと反応するモノクローナル抗体ということはできない。
　そうすると、刊行物Ｃは本件請求項１５の発明を開示しているということはできない。
（５）　刊行物Ｂ（高２）、刊行物Ａ（高３）のγ−Ｓｍ抗体
　この刊行物Ａの抗体は、前記６．１（５）で述べたように、遊離のＰＳＡを測定する抗体を開示しているということはできない。
　刊行物Ｂにも、「γ−Ｓｍ抗体」は「遊離のＰＳＡを認識する抗体」ということは記載されていない。刊行物Ｂの「γ−Ｓｍ抗体」は、文献番号５として刊行物Ａを引用しているが、刊行物Ａを参照しても、刊行物Ｂの「γ−Ｓｍ抗体」は、「遊離のＰＳＡを認識する抗体」ということはできない。
（６）　検討結果
　したがって、本件特許の請求項１〜請求項９、請求項１２〜請求項１６の各発明は、上記の刊行物Ｃ、刊行物Ｂ、および、刊行物Ａに記載された発明であるということはできず、あるいは、これらの発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということもできない。
６．３　申立人中川英子の申立２．３についての検討
（１）　ＰＳＡとγ−Ｓｍ
　ＰＳＡとγ−Ｓｍとが同一物質といえることは、前記６．１で述べたとおりである。（２）　刊行物Ａのγ−Ｓｍ抗体
　刊行物Ａは、前記６．１（５）で述べたように、遊離のＰＳＡを測定する抗体を開示しているということはできない。
（３）　刊行物Ｑ（中２）のγ−Ｓｍ抗体
　刊行物Ｑには、ＰＡ（ＰＳＡ）、γ−ＳｍおよびＰＡＰの三者の併用することにより癌の検出率を向上させることが示されている（前記（Ｑ５）参照）。
　しかしながら、刊行物Ｑでは、ＰＡ（ＰＳＡ）とγ−Ｓｍの異同についてはこれまで多くの議論があったとし、同一タンパクであると結論する論文を紹介し、これらの二つのマーカーが必ずしも平行な動きを示さないとし、同一タンパクであると結論するには、今後の検討が必要であるとしているものである（前記（Ｑｌ）参照）。そうすると、γ−Ｓｍ抗体が血液中の遊離体を認識することが、刊行物Ｑに記載されいるとは認められない。
（４）　中外のγ−Ｓｍ旧キット
　前記６．１（３）〜（４）で述べたように、本件優先日前において、中外のγ−Ｓｍキットは、「遊離のＰＳＡを認識する抗体」の使用を公然と実施していたものと認めることはできない。
（５）　検討結果
　そうすると、本件特許の請求項１の発明は、出願前に頒布された上記の刊行物Ａ（中３）に記載された発明、あるいは、公然実施された発明、に該当するということはできない。
　したがって、本件特許の請求項１の発明は、刊行物Ａ（中３）、刊行物Ｃ（中２）、刊行物Ｎ（中１）、刊行物Ｆ（中４）および刊行物Ｑ（中６）の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということもできない。
　そして、本件特許の請求項２〜請求項８、請求項１０〜請求項１６の各発明についても、刊行物Ａ（中３）、刊行物Ｃ（中２）、刊行物Ｎ（中１）、刊行物Ｆ（中４）および刊行物Ｑ（中６）の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということはできない
６．４　申立人カンアグ・ダイアグノスティック・アクチボラーグの申立２．４についての検討
（１）　ＰＳＡとγ−Ｓｍ
　前記６．１（１）で述べたとおり、ＰＳＡとγ−Ｓｍとは同一物質と認められる。
（２）　刊行物Ｃ（カ１）の複合体
　刊行物Ｃでは、血清中のＰＳＡと複合体を形成するタンパクが、α１−アンチトリプシンであることを前提にしているもので、総量を測定する抗体であるγ−Ｓｍ抗体とα１−アンチトリプシンの抗体を使用して、当該複合体のみの濃度を測定するものである（前記（Ｃ３）参照）。
　刊行物Ｃにそのように明記されている以上、刊行物Ｖ（カ４）、刊行物Ｇ（カ５）、刊行物Ｗ（カ６）、刊行物Ａ（カ９）、および、刊行物Ｕ（カ１３）を参照しても、刊行物Ｃ（カ１）のα１−アンチトリプシンは、α１−アンチキモトリプシンの誤記であるということはできないし、また、均等物であるともいうこともできない。
（３）　中外キットのγ−Ｓｍ抗体
　前記６．１（３）〜（４）で述べたように、本件優先日前において、中外のγ−Ｓｍキットは、「遊離のＰＳＡを認識する抗体」の使用を公然と実施していたものと認めることはできない。
（４）　申立人カンアグ・ダイアグノスティック・アクチボラーグが提出した甲第８号証の実験
　そして、申立人カンアグ・ダイアグノスティック・アクチボラーグが提出したγ−Ｓｍ中外キットの添付文書（刊行物Ｂ：カ７）は、平成６年６月改訂のものであるから、そのキットに基づく実験である前記甲第８号証の実験は、平成６年６月以後のキットについての実験といえる。そうすると、前記甲第８号証は、本件優先日前の中外キットの「γ−Ｓｍ抗体」を試験しているものということはできない。
（５）　刊行物Ｒ（カ１０）、刊行物Ｓ（カ１１）および刊行物Ｔ（カ１２）
　刊行物Ｒ、刊行物Ｓおよび刊行物Ｔには、中外キットが記載されているが、「遊離のみのＰＳＡ」を測定することは記載されていない。そして、中外キットは、本件優先日前において、前述したように、「遊離のみのＰＳＡ」を測定することを開示したものということもできない。
　そうすると、刊行物Ｒ、刊行物Ｓおよび刊行物Ｔでは、遊離のＰＳＡを測定することが記載されているということはできない。
（６）　検討結果
　したがって、本件特許の請求項１〜請求項１６の各発明は、出願前に頒布された上記の刊行物Ｃ（カ１）、刊行物Ｂ（カ７）、刊行物Ｒ〜刊行物Ｓ（カ１０〜カ１１）に記載された発明であるということはできないし、そして、これらの発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということもできない。
（７）　産業上の利用性
　さらに、本件の請求項１０および請求項１１の発明は、血清を扱うものではあるが、人体を使うことを必須の構成とするものでないので、これらの発明が特許法２９条柱書きの「産業上の利用性」を欠如しているということは妥当でない。
６．５　２９条違反の申立２１〜２４の検討結果
　以上、検討したように、各申立人の２９条違反の申立２．１〜２．４は、いずれも、理由がない。
７．３６条違反の申立について
７．１　申立人石神慶司の申立３１について
（１）　抗体２Ｅ９
　抗体２Ｅ９は、遊離のＰＳＡと反応すること、およびＰＳＡ複合体とも反応することが、本件明細書に記載されている（本件特許公報７欄３３行〜３５行、３７行〜４１行参照）。
（２）　プロテイナーゼインヒビター
　請求項４の「プロテイナーゼインヒビター」は、本件訂正により、「プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシン」に訂正された。
（３）　検討結果
　そうすると、申立人石神慶司の申立３．１は、理由がない。
７．２　申立人高橋登の申立３．２について
　本件明細書において、本件発明者は、ＰＳＡが、人細胞外体液中で、高濃度でα１−抗−キモトリプシンと複合体を形成する能力を有することを示しているといえる（本件特．汗公報５欄２２行〜２６行参照、）。
　そして、ゲル透過実験により、アッセイＣで溶離した画分の分析（α１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡに特異的）から、８０〜９０ｋＤａの範囲の主要な免疫学的反応性ピークを認識したことが、本件明細書に記載されている（本件特許公報８欄３７行〜４１行参照）。
　このことから、本件明細書は、「プロテイナーゼインヒビターがα１−抗−キモトリプシンである、精製されたＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビター複合体」を開示しているということができる。
　そうすると、申立人高橋登の申立３．２は、理由がない。
７．３　申立人中川英子の申立３．３について
　本件特許の請求項１０の発明について、「全ＰＳＡ」は、遊離のＰＳＡと複合体ＰＳＡの合計量をいうことは明らかであるから、請求項１０の「全ＰＳＡ」について発明の詳細な説明の項に定義の記載を要するものということはできない。
　そうすると、申立人中川英子の申立３．３は、理由がない。
７．４　３６条違反の申立３．１〜３．３の検討結果
　以上、検討したように、各申立人の３６条違反の申立３．１〜３．３は、いずれも、理由がない。
８．本件異議申立についての検討結果
　以上、検討したように、本件特許異議申立はいずれも理由がない。
　したがって、本件特許異議申立の理由によっては、本件請求項１〜請求項１６の各発明に係る特許を取り消すことができない。
ＩＶ　むすび
　前記ＩＩで検討したように、本件訂正は、特許法１２０条の４、２項および３項の規定に適合する。
　前記ＩＩＩで検討したように、本件特許異議申立の理由によっては、本件請求項１〜請求項１６の各発明に係る特許を取り消すことができない。
　また、他に本件請求項１〜請求項１６の各発明に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年９月３０日（１９９９．９．３０）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
　明りょうでない記載の釈明を目的にして下記の事項について訂正する。
　訂正事項▲１▼
　請求項４および請求項６〜請求項８において、「前記のＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビター複合体」または「前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビタ−複合体」をそれぞれ「前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシン複合体」に訂正。
　訂正事項▲２▼
　請求項４において、「前記プロテイナーゼインヒビター」を「前記プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシン」に訂正。
（５４）【発明の名称】
遊離及び複合体形成した前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の分析
（５７）【特許請求の範囲】
（１）前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のイムノアッセイであって、
プロテイナーゼインヒヒターα１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分及び／または
遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分及び／または
ａ）遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分とｂ）ブロテイナーゼインヒヒターα１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分との割合
を、遊離及ひ複合体形成したＰＳＡを区別し得る１種以上の抗体を使用して測定することを特徴とするイムノアッセイ。
（２）α１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分及ひ／または
遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分及び／または
ａ）遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分とｂ）α１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分との割合
を、非競合イムノアッセイにより測定することを特徴とする請求項１に記載のイムノアッセイ。
（３）α１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分及び／または
遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分及び／または
ａ）遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分とｂ）α１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分との割合
を、少なくとも２種類の異なるモノクローナル抗体を使用する非競合イムノアッセイにより測定することを特徴とする請求項２に記載のイムノアッセイ。
（４）
前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒヒターα１−抗−キモトリプシン複合体
前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒヒターα１−抗−キモトリプシン複合体
前記プロテイナーセインヒビターα１−抗−キモトリプシン
（５）前記遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原（遊離　ＰＳＡ）を認識するために使用したモノクローナル抗体か前立腺特異的抗原に結合すること、及びモノクローナル抗体により規定される少なくとも一つのエピトープは、前立腺特異的抗原かα１−抗−キモトリプシンと複合体形成しているときには露出されないことを特徴とする請求項３に記載のイムノアッセイ。
（６）前記遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原（遊離ＰＳＡ）と
前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒヒターα１−抗−キモトリプシン複合体
（７）前記遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原（遊離　ＰＳＡ）と、前記遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原および
前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシン複合体
（８）
前記ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシン複合体
前記　ＰＳＡ−プロテイナーセインヒヒターα１−抗−キモトリプシン複合体
（９）プロテイナーセインヒヒターがα１−抗−キモトリプシンである、精製されたＰＳＡ−プロテイナーセインヒビター複合体。
（１０）患者の血清中の全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの割合、またはα１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの割合、を測定することにより、良性の前立腺過形成と前立腺癌を区別する方法。
（１１）患者の血清中の全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの割合、またはα１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの割合、を測定することにより、前立腺癌をスクリーニングする方法。
（１２）遊離ＰＳＡと結合するが、α１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡとは結合しない抗体。
（１３）抗体かモノクローナル抗体てあることを特徴とする請求項１２に記載の抗体。
（１４）請求項１３に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞系。
（１５）プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリプシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分及び／または
遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分及び／または
ａ）遊離の複合体形成していない前立腺特異的抗原の画分と、ｂ）プロテイナーゼインヒビターα１−抗−キモトリブシンと複合体形成している前立腺特異的抗原の画分との割合
を、測定することを特徴とする、少なくとも２種類の異なるモノクローナル抗体を使用することによる前立腺特異的抗原の免疫定量アッセイ。
（１６）α１−抗−キモトリプシンと複合体形成していない遊離の前立腺特異的抗原に特異的な抗体にサンプルを暴露する段階と、
α１−抗−キモトリプシンと複合体形成していない遊離の前立腺特異的抗原に結合した抗体の量を検出する段階
からなる、サンプル中の、α１−抗−キモトリプシンと複合体形成していない遊離の前立腺特異的抗原の量を測定するためのイムノアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
　本発明は、遊離ＰＳＡ並ひにＰＳＡ−プロテイナーセインヒビター複合体の測定かできる特異的な試薬（抗体）か使用される前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のイムノアッセイに関する。
　本発明は、前立腺癌の患者の診断に於ける有用なマーカーとしての遊離ＰＳＡ及ひＰＳＡプロテイナーセインヒビター複合体並ひにその割合を使用することに関する。
発明の背景
　前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は前立腺組織から最初に精製されたか（Ｗａｎｇら，Ｉｎｖｅｓｔ　Ｕｒｏｌ　１９７９）、この蛋白質は殆と同時に独立して精液血漿からも特徴付けられた（Ｈａｒａら，Ｊ　Ｌａｂ　Ｃｌｉｎ　Ｍｅｄ　１９８９；Ｇｒａｖｅｓら，Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　１９８５）。ＰＳＡは、３３−ｋＤａクリコシル化単鎖セリーンプロテアーゼであることは公知である［Ｌｉｌｊａ，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１９８５；Ｗａｔｔら，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ（ＵＳＡ）１９８６］。２３７アミノ酸ポリペプチド主鎖は、腺カリクレインの主鎖と酷似している（Ｌｕｎｄｗａｌｌら，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　１９８７；Ｓｃｈｌｌｅｒら，Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９８７）。Ａｒｇ−制限基質特異性を示すトリプシン様腺カリクレインとは異なり（ＭａｃＤｏｎａｌｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　１９８８）、ＰＳＡはキモトリプシン様基質特異性を示す（Ａｋｉｙａｍａら，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　１９８７；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎら，
精液中のＰＳＡの生物学的活性は、精嚢により分泌された主要蛋白質の限定された蛋白質加水分解分裂に関連する（Ｌｉｌｊａ，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１９８５；Ｌｉｌｊａら，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１９８７；ＭｃＧｅｅら．Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ　１９８８）。
　前立腺上皮から放出される以外にもＰＳＡは血液循環からも検出され得る（Ｐａｐｓｉｄｅｒｏら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　１９８０）。ＰＳＡの血清中濃度の測定は、前立腺癌の患者をモニターするのに広く使用し得ることか知見されたが、ＰＳＡの高い血清中濃度は良性の前立腺過形成及び前立腺の外科的創傷時ても報告されていた（Ｄｕｆｆｙ，Ａｎｎ　Ｃｌｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９８９；Ｂｒａｗｅｒら，Ｕｒｏｌｏｇｙ　ｓｕｐｐｌ　１９８９）。しかしながら、現在のところ、血清中の免疫学的反応性かＰＳＡ−チモーゲン、活性ＰＳＡまたは細胞外プロテイナーセインヒビターにより不活化されたＰＳＡを表しているかとうかは未知であり、この免疫学的反応性の分子量に関しては矛盾か報告された。１９８０年にＰａｐｓｉｄｅｒｏ　は、ＰＳＡ−免疫学的反応性を単一９０〜１００ｋＤａ　ピークとして溶離したか（Ｐａｐｓｉｄｅｒｏら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　１９８０）、Ａｌｆｔｈａｎ　及び　Ｓｔｅｎｍａｎは、ゲル透過クロマトグラフィーにかけてこの免疫学的反応性の主要部分を３０−ｋＤａ蛋白質として溶離した（Ａｌｆｔｈａｎら，Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ　１９８８）。
　本発明に於いて、本出願人は、ＰＳＡは、ヒト細胞外体液中、高濃度でプロテイナーゼインヒビターと複合体を形成する能力を有すること及びＰＳＡは、これらの液体中、遊離及び複合体形の両方を形成し得ることを示した。さらに、本発明は、前立腺癌患者の診断に非常に有用であることも立証した。
発明の該要
　本発明の方法により、イムノアッセイを遊離ＰＳＡ並びにプロテイナーゼインヒビター複合体としてのＰＳＡを測定するために適用した。遊離ＰＳＡ及びＰＳＡ複合体は、本発明により少なくとも２種類の異なったモノクローナル抗体を使用する非−競合イムノアッセイにより測定した。本発明は、当該ＰＳＡ−プロテイナーセインヒビター複合体がα１−抗−キモトリプシンと形成することによりさらに特徴付けられる。さらに、本発明は、遊離ＰＳＡ、ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビター複合体及びその割合を、前立腺癌患者の診断に適用することによっても特徴付けられる。
図面の説明
　図１は、アガロースゲル電気泳動後にＰＶＤＦ−膜にブロットした蛋日質をプローブするために使用したポリクローナル抗体及び３種類のモノクローナル抗体を示している。レーン１は、１μｇＰＳＡであり、レーン２は６μｇα１−抗−キモトリプシンと３７℃３０分インキュベートした１μｇＰＳＡであり、レーン３は、６μｇα１−抗−キモトリプシンである。
　図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＰＶＤＦ−膜にブロットした蛋白質をプローブするために使用したポリクローナル及び３種類のモノクローナル抗体を示している。レーン１は、１μｇＰＳＡてあり、レーン２は、６μｇα１−抗−キモトリプシンと３７℃３０分インキュベートした１μｇＰＳＡてあり、レーン３は、６μｇα１−抗−キモトリプシンである。
　図３は、３種類のアッセイ型の特異性を示している。
　図４は、アッセイ型ＡとＣで分析した時の６５人の患者からの血清サンプルに於けるＰＳＡ免疫学的反応性の相関関係を示している。
　図５は、アッセイ型ＡとＢて分析した時の６５人の患者からの血清サンプルに於けるＰＳＡ免疫学的反応性の相関関係を示している。
　図６は、ＴＳＫ　２５０　ＨＰＬＣカラムに於ける患者サンプルＢのゲル透過を示している。溶離した画分のＰＳＡ免疫学的反応性をアッセイ型Ａ、Ｂ及ひＣで分析した。
　図７は、ＴＳＫ　２５０　ＨＰＬＣカラムに於ける患者サンプルＣの透過を示している。溶離した画分のＰＳＡ免疫学的反応性をアッセイ型Ａ、Ｂ及ひＣで分析した。
　図８は、ＴＳＫ　２５０　ＨＰＬＣカラムに於ける患者サンプルＤのケル透過を示している。溶離した画分のＰＳＡ免疫学的反応性をアッセイ型Ａ、Ｂ及ひＣで分析した。　図９は、ゲル透過による１００００μｇ／ｌのＰＳＡレベルの血清サンプル中のＰＳＡ免疫学的反応性の特徴を示している。ＰＳＡ及ひＰＳＡ−ＡＣＴ複合体は、ＩＦＭＡにより測定した。
　図１０は、ＰＳＡ濃度の関数としての前立腺癌の患者の血清に於ける全ＰＳＡ免疫学的反応性のＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の割合を示している。ＰＳＡのレベルは、ＩＲＭＡにより測定し、ＰＳＡ−ＡＣＴのレヘルは、ＩＦＭＡにより測定した。
　図１１は、前立腺癌の患者由来の血清中のＩＲＭＡにより測定したＰＳＡ濃度の関数としてのＩＦＭＡにより測定したＰＳＡ−ＡＰＩ複合体濃度を示している。
発明の詳細な説明
１．モノクローナル抗体の産生及ひ特徴付け
　抗−ＰＳＡ特異的モノクローナル抗体Ｂａｌｂ／ｃマウスの産生を、フロイントの完全アジュバントと等容量て乳化させたＰＳＡ７０μｇて腹腔内注入により免疫した。３、６及ひ９週間後、フロイントの不完全アジュバントで乳化させたＰＳＡ５０μｇで免疫感作を繰り返した。３週間後、マウスにＰＳＡ　４０μｇの最終ブースターを与え、４日後にマウスを殺した。脾臓のリンパ球様細胞を取り出し、形質細胞（ＮＳ−１）と１：１で混合した。細胞を溶解し、２００ｇ／Ｌ牛胎児血清及びＨＡＴ−サプルメントＨ−０２６２（１：５０，Ｓｉｇｍａ）を含むＫＣ−２０００（Ｈａｚｌｅｔｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　Ｉｎｃ．，Ｌｅ　ｎｅｘａ，ＵＳＡ）中ミクロ滴定ウエル中で収穫した（Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎら，Ｊ　Ｇｅｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　１９８３）。
　マスタークローンによる抗−ＰＳＡ特異的性抗体の産生を、ウサギ抗−マウスＩｇＧ
ストリップをハイフブリドーマ上清または標準（ＰＳＡに特異的なモノクローナル抗体；０８１２Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ）のいずれかとインキュベートし、洗浄し、Ｅｕ−標識ＰＳＡ（５０ｎｇ／ウエル）とインキュベートし、次いで結合したＥｕ−標識ＰＳＡ量を測定した。
　限定希釈液によるマスタークローンのクローニングを記載の如く実施した（Ｓｔａｓｚｅｗｓｋｉ及びＹａｌｅ，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ　１９８４）。所望のクローンをＢａｌｂ／ｃマウス中、腹腔内て増殖させ、腹水液を１０日目で集めた。腹水液のＩｇＧ−画分を、製造業者により推奨のプロトコルに従って蛋白質Ａ−セファロース上クロマトグラフィーにより精製した。
　固相に結合したＰＳＡを使用して、未標識モノクローナル抗体か固相に結合したＰＳＡに対するもう一つのＥｕ−標識抗−ＰＳＡ　ＭＡｂ　の結合をブロックできたかどうかを試験した。固相に結合したＰＳＡは、２Ｅ９または５Ａ１０抗−ＰＳＡ　ＭＡｂでコートしたウエルストリッププレート中２時間、精製ＰＳＡ（２５μｇ／Ｌ）の２５μｌアリコート及び２００μＬアッセイ緩衝液ＤＥＬＦＩＡ（商標）（５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．７５，０．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，０．５ｇ／Ｌ　ＢＳＡ，及び０．５ｇ／Ｌ　ＮａＮ３）のインキュベーションにより得られた。ストリップを洗浄し、次いで未標識抗−ＰＳＡＭＡｂ（０．００５−５０μｇ／Ｌ）の一つ２００μしと１時間インキュベートした。再び、ストリップを洗浄し、もう一つのＥｕ−標識抗−ＰＳＡ　ＭＡｂと１時間インキュべートし、結合したＥｕ−標識抗−ＰＳＡ量を測定した。ＰＳＡに特異的な３種類のモノクローナル抗体のエピトープ特異性の特徴付け
　幾つかのクローンは、蛍光定量分析により示されるようにＰＳＡ特異的モノクローナル抗体を産生した。これらのうち３種類（２Ｅ９、２Ｈ１１及び５Ａ１０）を増殖させ、腹水液から抗体を単離した。３種類のＰＳＡ特異的モノクローナル抗体を使用して、１μｇＰＳＡ（レーン１）；６μｇα１−抗−キモトリプシンと３７℃３０分インキュベートした１μｇＰＳＡ（レーン２）；及び６μｇα１−抗−キモトリプシン（レーン３）のアガロースゲル電気泳動（図１〉またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２）後、ＰＶＤＦ−膜上にブロットした蛋白質をプローブした。アガロースゲル由来のＰＶＤＦ−膜にフロットしたＰＳＡを全３種類のモノクローナル抗体により認識した。α１ｒ抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡは２Ｅ９及ひ２Ｈ１１抗体により認識できたが、５Ａ１０抗体では認識できなかった。２Ｅ９抗体は、これらの蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＰＶＤＦ−膜上にブロットするとき、ＰＳＡと、α１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡとをすぐに認識できた唯一の抗−ＰＳＡ　ＭＡｂであった。しかしながら、２Ｈ１１及び５Ａ１０抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＰＶＤＦ−膜にブロットしたこれらの蛋白質をプローブするのに使用するとき、ＰＳＡとほんの少し反応した（α１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡては得られない）。
　３種類のモノクローナル抗体のエピトープ特異性は、固相サンドイッチアッセイの３種類の異なるセットを使用しても特徴つけられた。従って、２Ｅ９抗体を固相キャッチャーとして使用し、Ｅｕ−標識２Ｈ１１を検出抗体として使用するアッセイ（Ａ）は、α１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡと比較して、ＰＳＡと殆ど同一の濃度−反応を示した（表１；図３）。これは、５Ａ１０抗体をキャッチャーとして使用し、ＰＳＡを認識するかα１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡは殆ど認識しない検出抗体としてＥｕ−標識　２Ｈ１１　を使用したアッセイ（Ｂ）及び、２Ｅ９抗体をキャッチャーとして使用し、α１−抗−キモトリプシンに特異的なＥｕ−標識抗体をα１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡのみを認識する検出抗体として使用したアッセイ（Ｃ）と対照的である（表１；図３）。
　ＰＳＡと結合させた固相を使用して、ＰＳＡに特異的な３種類のモノクローナル抗体のエピトープ特異性をさらに特徴つけた。ＰＳＡの固相との結合は、２Ｅ９または５Ａ１０抗体でコートしたウエルストリッププレートを使用して実施した。これにより、ＰＳＡと結合させた固相に対するもう一つのＥｕ−標識抗−ＰＳＡ　ＭＡｂの結合をブロックする抗−ＰＳＡ　ＭＡｂの能力を試験したとき、抗−ＰＳＡ　ＭＡｂの２Ｅ９、２Ｈ１１または５Ａ１０はいずれも互いに結合を全くブロックしないことか知見された。
２．ヒト血清に於けるＰＳＡ−プロテイナーセインヒビター複合体の発生
ヒト血清中でのＰＳＡ分析
　個々の患者サンプル（ｎ＝６５）からの血清を、３種類の異なるアッセイ（Ａ、Ｂ及びＣ）て分析した。アッセイＡ及ひアッセイＣで得られた結果の回帰分析から、ｙ＝０．８９ｘ＋６．５５、ｒ＝０．９７（図４）が得られた。アッセイＡ及びアッセイＢの間の回帰分析から、ｙ＝０．１０ｘ＋９．５６、ｒ＝０．８２（図５）か得られた。
　ＴＳＫ　２５０　ＨＰＬＣカラム上の患者サンプルのゲル透過実験からの免疫学的反応性の全回収率は、使用した全３種類のアッセイ（Ａ、Ｂ及びＣ）に関して等しく高かった（８２〜１０７％）。ＴＳＫ　２５０　ＨＰＬＣカラム上の患者サンプルのゲル透過実験から、アッセイＡで分析するとき、ＰＳＡ−免疫学的反応性の主要ピークは、分子量８０〜９０ｋＤａに対応する位置の溶離画分中に認識され、この免疫学的反応性の弱いピークは、分子量２５〜４０ｋＤａに対応する位置の溶離画分中に認識された（図６〜８）。同様にして、アッセイＣで溶離した画分の分析（α１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡに特異的）から、８０〜９０ｋＤａの範囲の主要な免疫学的反応性ピークを認識したく図６〜８）。しかしながら、アッセイＢを使用してゲル透過実験から溶離した画分を分析すると、主要な免疫学的反応性ピークは２５〜４０ｋＤａの分子量に対応する位置に溶離した。このピークの溶離位置は、アッセイＡにより認識された弱い免疫学的反応性ピークに対応する（図６〜８）。
　ＰＳＡの種々のレべル（１０〜１０，０００μｇ／Ｌ）を含む男性由来の血清サンプルを、ゲル透過により分画すると、ＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴに対応する２成分も知見された。ＰＳＡ−レベルか高いサンプルでは、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体か優位であった（図９）。女性の血清中では、これらの成分は見られなかった（示されていない）。免疫学的反応性の全ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣＴの割合は、ＰＳＡレベルか高くなるにつれて増加した（図１０）。２．８μｇ／Ｌ以下のＰＳＡレヘルの健康な男性由来の血清中では、ＰＳＡ−ＡＣＴの割合は２３〜４７％であり、ＰＳＡレベル２．８〜１０μｇ／しのサンプルに於いては、割合は２６〜８６％であり、高いレべル（１０００μｇ／Ｌ以上のＰＳＡレべル）のサンプル中では割合はさらに増加して７０〜１００％であった（図１０）。
　任意のユニット中に発現した複合体の濃度をベースとして血清中の主複合体はＰＳＡ−ＡＣＴ複合体であった。ＰＳＡレベルか低いサンプルでは、ＰＳＡ−ＡＰ１及びＰＳＡ−ＡＣＴの両方の濃度は、検出限界に近かった。従って、通常のサンプル中でこれらの複合体の割合を計算するのは困難であった。４０μｇ／Ｌ以上のＰＳＡレべルのサンプルではＰＳＡ−ＡＰ１複合体のレべルが明らかに増加し、ＰＳＡレベルか高くなるにつれて増加した（図１１）。
３．前立腺癌の患者の診断でのＰＳＡ及ひＰＳＡ一α１一抗一キモトりプシン複合体
　『３種類のＰＳＡ特異的モノクローナル抗体のエピトープ特異性の特徴つけ』の段落で参照した３種類のアッセイ型を使用して、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）の患者１４４人及び前立腺癌（ＣＡＰ）の種々の段階の患者１２２人を試験した。Ａα１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡ／全ＰＳＡの割合、Ｂ：遊離の、複合体形成していないＰＳＡ／全ＰＳＡの割合並びに、全ＰＳＡ及びＰＳＡα１−抗−キモトリプシン単独の測定の臨床的感受性及び特異性を計算した。示されたデータから、高い臨床特異性は、ＰＳＡα１−抗−キモトリプシン複合体を測定することにより達成され、遊離ＰＳＡ／全ＰＳＡ及び遊離ＰＳＡ／α１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡの割合は、ＢＰＨ及ひＣＡＰ患者の間で大きく異なっていることは明らかである。
表１
　表１は、３種類の異なるアッセイのセットで分析した時の精製ＰＳＡ及ひα１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡの用量応答を示している。
−アッセイＡでは、固相キャッチャーは２Ｅ９抗−ＰＳＡ　ＭＡｂであり、検出抗体はＥｕ−標識２Ｈ１１抗−ＰＳＡ　ＭＡｂである。
−アッセイＢでは、固相キャッチャーは５Ａ１０抗−ＰＳＡ　ＭＡｂであり、検出抗体はＥｕ−標識２Ｈ１１抗−ＰＳＡ　ＭＡｂである。
−アッセイＣでは、固相キャッチャーは２Ｅ９抗−ＰＳＡ　ＭＡｂであり、検出抗体はα１−抗−キモトリプシンに特異的なＥｕ−標識ウサギ抗体である。
　欄１は、精製ＰＳＡを表し、欄２は、α１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡを表す。
表２ａ及び２ｂ
　表２ａ及び２ｂは、遊離、複合体形成及び全ＰＳＡに関する３種類のアッセイ型による患者サンプルの試験結果を示している。表２ａ中、ＢＰＨは良性の前立腺過形成を示し、ＣＡＰは前立腺癌を示し、Ｇは分化のｎ段階を示し、Ｔは段階を示す。表２ｂは、感受性及ひ特異性を示している。感受性は、被検患者に対し陽性と判定する能力を指し、（陽性被検患者の数／被検患者の総数）×１００から計算できる。また、特異性は、対象疾患をもたない被検者に対し陰性と判定する能力を指し、（陰性被検者の数／被検者の総数）×１００から計算できる。
１．精製ＰＳＡ；
２．α１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡ