(57)【要約】  ＨＥＲ２のような増殖因子受容体を発現する細胞を標的とするリガンドを持つリポソームを含んでなるイムノリポソーム組成物。イムノリポソームのＨＥＲ２発現細胞への結合は、封入された薬剤を細胞質へ送達するためにイムノリポソームのインターナリゼーションを生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）小胞形成脂質；（ｉｉ）リポポリマー；（ｉｉｉ）疎水性部分、親水性ポリマー、およびＨＥＲ２受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を含んでなる、コンジュゲート；ならびに（ｉｖ）封入された薬剤を含んでなる、リポソームを含んでなる組成物であって、該コンジュゲートがリポソームあたり平均して約２より多く、そして約２５未満の抗体を提供するために有効な量で存在する、上記組成物。
【請求項２】
抗体が２０，０００〜５０，０００ダルトンの間の分子量を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗体が配列番号２と少なくとも約８０％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
親水性ポリマーが７５０から５０００ダルトンの間の分子量を有するポリエチレングリコールである請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
封入された薬剤が細胞傷害性剤または抗腫瘍剤である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
封入された薬剤がアントラサイクリンである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
薬剤がドキソルビシンである請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
コンジュゲートの量がインビボ投与から４８時間後に、リポソームあたり平均して約２０未満の抗体を提供する請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
（ｉ）少なくとも１つの硬質な小胞形成脂質；（ｉｉ）疎水性部分およびポリエチレングリコールを含んでなるリポポリマー；（ｉｉｉ）疎水性部分、ポリエチレングリコールおよびＨＥＲ２受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する単鎖抗体を含んでなるコンジュゲート、該単鎖抗体は配列番号２の同一性を有するか、またはそれに対する保存的置換を有し；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍活性を有する封入された薬剤を含んでなる、リポソームを含んでなるリポソーム製剤であって、
該リポソームはリポソームが３７℃で９６時間インキュベーションされ、そしてリポソームから単鎖抗体の解離が測定されるインビボアッセイにより示される時、インビボ投与から９６時間後にリポソームあたり約２より多く、そして約１５未満の抗体を提供するために有効な量のコンジュゲートを特徴とする、上記リポソーム製剤。
【請求項１０】
硬質な小胞形成脂質が水素化ダイズホスファチジルコリンである請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
リポソームがさらにコレステロールを含んでなる、請求項９または１０に記載の製剤。
【請求項１２】
封入された薬剤がアントラサイクリンである請求項９ないし１１のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１３】
封入された薬剤がドキソルビシンである請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
コンジュゲートの量がインビボ投与から４８時間後に、リポソームあたり平均して約１２未満の抗体を提供する、請求項９ないし１１のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１５】
（ｉ）少なくとも１つの硬質な小胞形成脂質；（ｉｉ）疎水性部分およびポリエチレングリコールを含んでなるリポポリマー；（ｉｉｉ）疎水性部分、ポリエチレングリコールおよびＨＥＲ２受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する単鎖抗体を含んでなるコンジュゲート、該単鎖抗体は配列番号２に少なくとも８０％の同一性を有し；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍活性を有する封入された薬剤を含んでなるリポソームを含んでなる、イムノリポソーム製剤であって、
該イムノリポソーム製剤がインビボ投与された時に、類似の成分を含んでなるが該抗体を欠いているリポソームの曲線下の面積より、２５％を越えて、またはせいぜい２５％低い曲線下の面積を提供する、
上記イムノリポソーム製剤。
【請求項１６】
硬質な小胞形成脂質が水素化ダイズホスファチジルコリンである請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
リポソームがさらにコレステロールを含んでなる請求項１５または１６に記載の製剤。
【請求項１８】
封入された薬剤がアントラサイクリンである請求項１５ないし１７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１９】
封入された薬剤がドキソルビシンである請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
コンジュゲートの量が、リポソームが３７℃で４８時間インキュベーションされ、そしてリポソームから単鎖抗体の解離が測定されるインビトロアッセイにより示される時、インビボ投与から４８時間後に、リポソームあたり平均して２より多い抗体、そして約２０未満の抗体を提供する請求項１５ないし１７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項２１】
コンジュゲートの量が、リポソームが３７℃で９６時間インキュベーションされ、そしてリポソームから単鎖抗体の解離が測定されるインビトロアッセイにより示される時、インビボ投与から９６時間後に、リポソームあたり平均して２より多い抗体、そして約１５未満の抗体を提供する請求項１５ないし１７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項２２】
（ｉ）少なくとも１つの硬質な小胞形成脂質；（ｉｉ）疎水性部分およびポリエチレングリコールを含んでなるリポポリマー；（ｉｉｉ）疎水性部分、ポリエチレングリコールおよびＨＥＲ２受容体の細胞外ドメインに特異的に結合し、そして配列番号２と同定された配列を有する単鎖抗体を含んでなるコンジュゲート；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍活性を有する封入された薬剤を含んでなるリポソームを含んでなる、イムノリポソーム製剤であって、
リポソームが３７℃で９６時間インキュベーションされ、そしてリポソームから単鎖抗体の解離が測定されるインビトロアッセイにより示される時、該リポソームが、リポソームの投与から９６時間後に、３０〜６０％の間の抗体が各リポソームから解離して組成物を提供し、インビボ投与から９６時間後にリポソームあたり約２５未満の抗体を有する、上記イムノリポソーム製剤。
【請求項２３】
親水性ポリマー鎖の外側コーティングおよび封入された薬剤を有するリポソームを準備し；
該リポソームを、疎水性部分、ポリエチレングリコールおよびＨＥＲ２受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する単鎖抗体を含んでなるある量のコンジュゲートとインキュベーションし、コンジュゲートの該量は、リポソームが３７℃で９６時間インキュベーションされ、そしてリポソームから単鎖抗体の解離が測定されるインビトロアッセイにより示される時、インビボ投与から９６時間後に、リポソームあたり平均して約２より多く、そして約１５未満の抗体を提供するように選択される、
工程に従い調製されるリポソーム組成物。
【請求項２４】
抗体が配列番号２に同定される配列を有する請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
薬剤がドキソルビシンである請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２６】
コンジュゲートの上記量がリポソームあたり平均して約２〜１０の間の抗体を提供する請求項２３ないし２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
（ｉ）小胞形成脂質；（ｉｉ）リポポリマー；（ｉｉｉ）疎水性部分、親水性ポリマー、およびＨＥＲ２受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を含んでなるコンジュゲート；ならびに（ｉｖ）封入された薬剤を含んでなるリポソームを含んでなる組成物であって、該リポソームがインビボ投与前に、リポソームあたり２５未満の抗体を有し、ここでインビボ投与後に、該リポソームが該抗体の２０〜５０％を失うが、それでも細胞傷害性に十分な該Ｈｅｒ−２受容体への結合を保持する上記組成物。
【請求項２８】
抗体が配列番号２である請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
薬剤がドキソルビシンである請求項２７または２８に記載の組成物。
【請求項３０】
（ｉ）小胞形成脂質；（ｉｉ）リポポリマー；（ｉｉｉ）疎水性部分、親水性ポリマー、およびＨＥＲ２受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を含んでなるコンジュゲート、該コンジュゲートはリポソームあたり第１の選択された数の抗体を提供するために十分な第１の量で含まれ；ならびに（ｉｖ）封入された薬剤を含んでなるリポソームを提供し；
該リポソームを血液と接触させ；
該リポソームと血液とを接触させた１もしくは複数の時点で、リポソームあたりの抗体の数を測定し；
血液と接触させた後に、リポソームあたり少なくとも２の抗体を提供するために、第２の、リポソームあたりより多い数の抗体を提供するために十分な第２のコンジュゲートの量を該測定に基づき選択する、
ことを含んでなるリポソーム組成物の調製法。
【請求項３１】
接触が該リポソームを血液とインビトロで接触させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
接触が該リポソームを血液とインビボで接触させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
提供が、リン脂質、ポリエチレングリコール親水性部分、および本明細書で配列番号２と同定される配列を有する単鎖抗体を含んでなるコンジュゲートを有するリポソームを提供することを含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
提供が、封入された薬剤としてドキソルビシンを有するリポソームを提供することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
選択が、リポソームあたり５０未満の抗体を提供するために有効なコンジュゲートの第２の量を選択することを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
提供が、リポソームあたり１５０未満の抗体を提供するコンジュゲートの第１の量を有するリポソームを提供することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
選択が、リポソームあたり３０以下の抗体を提供するために有効なコンジュゲートの第２の量を選択することを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本主題は、リポソーム組成物に関する。より詳細には本主題はリポソームに封入された薬剤を細胞に送達するための特異的な細胞受容体を標的とするリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景  
リポソームは、水性相をカプセル化する同心的に並べられた脂質二重層を含んでなる球形小胞である。リポソームは水性相もしくは脂質二重層に含まれる治療薬用の送達媒体として役立つ。リポソームに封入された形態での薬剤の送達は、薬剤に依存して例えば低下した薬剤毒性、改変された薬物動態学または改善された薬剤の溶解性を初めとする様々な利点を提供することができる。疎水性ポリマー鎖、いわゆるＳｔｅａｌｔｈ（商標）の表面コーティングを含むように製剤された時のリポソーム、または長期循環リポソームは、一部は単核食細胞系によるリポソームの除去の減少により、長期の血液循環寿命といったさらなる利点をさらに提供する。リポソームはそれらの所望する標的領域に、または注入部位から細胞に到達するために、しばしば延長された寿命が必要である。
【０００３】
標的化リポソームは、リポソームの表面に結合した標的化リガンドもしくは親和性部分を有する。標的化リガンドは抗体もしくはそのフラグメントでよく、この場合、リポソームはイムノリポソームと呼ばれる。全身的に投与される場合、標的化リポソームは封入された治療薬を標的組織、領域または細胞に送達する。標的化リポソームは特異的領域または細胞に向けられているので、健康な組織は治療薬に暴露されない。そのような標的化リガンドは、標的化リガンドをリポソーム脂質成分の極性ヘッド残基に共有結合することによりリポソームの表面に直接結合させることができる（例えば特許文献１を参照にされたい）。しかしこの取り組みは、ポリマー鎖が標的化リガンドとその意図する標的との間の相互作用を妨害するので、主に表面に結合したポリマー鎖が無いリポソームに適している（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００４】
あるいは標的化リガンドはポリマー鎖の遊離末端に結合されて、リポソーム上に表面コートを形成することができる（非特許文献３；非特許文献４）。この取り組みでは、標的化リガンドは露出し、そして意図する標的と直ちに相互反応することが可能である。
【０００５】
ＨＥＲ２（ｃ−ｅｒｂＢ２、ｎｅｕ）原がん遺伝子およびｐ１８５ＨＥＲ２（これは増殖因子受容体−チロシンキナーゼをコードする）は、多くのヒトのガンの病因に役割を果たしているようである。ｐ１８５ＨＥＲ２の過剰発現は、乳癌の２０〜３０％で起こり、そしてこれらの患者の良くない予後を予測する（非特許文献５）。
【０００６】
ｐ１８５ＨＥＲ２受容体が存在する場合、ｐ１８５ＨＥＲ２の過剰発現は一般に原発性の乳癌腫で均一に起こり、特定の正常上皮細胞では低レベルでしか発現しないので、ｐ１８５ＨＥＲ２受容体は抗体に基づく治療に魅力的な標的となる。マウス抗ｐ１８５ＨＥＲ２モノクローナル抗体、ｍｕＡｂ４Ｄ５およびこの抗体のヒト化変更体が開発された（非特許文献６；特許文献２）。またｐ１８５ＨＥＲ２に結合する様々な抗体も記載された（特許文献３）。
【０００７】
ＨＥＲ２受容体に特異的な抗体を持つリポソームが報告された（非特許文献５；非特許文献７；非特許文献８；特許文献４）。細胞性の結合の程度についてリポソームあたりの抗体の数、すなわち抗体密度と、取り込みとの間の明らかな関係が開示されている（非特許文献８）。その実験結果は、リポソーム表面上の抗体密度を０から３０に変動させることに対応して細胞性の取り込みが上昇し、これはリポソームあたり３０の抗体で最大に達することを示す。抗ＨＥＲ２抗体の数をリポソームあたり３０から１００に上げることは、リポソームの細胞性の取り込みを増加させなかった。
【０００８】
ガン処置の効力は、健康な細胞にできるかぎり影響を及ぼさずに、ガン細胞を標的とし、そして殺す処置の能力に直接的に関連する。薬剤を腫瘍細胞に特異的に標的化する概念は広く検討されてきたが、特定のガン細胞に高度に選択的であり、そしてそのような特定のガン細胞への最適なインビボ結合が設計された製剤の必要性が存在する。
【０００９】
関連技術の前記例およびそれに関連する限定は、具体的説明であり、そして排除しないことを意図する。関連する技術の他の限定は、明細書を読み、そして図面の論考から当業者には明らかとなるだろう。
【参考文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，０１３，５５６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６７７，１７１号明細書
【特許文献３】国際公開第９９／５５３６７号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６，２１４，３８８号明細書
【非特許文献１】Ｋｌｉｂａｎｏｖ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０６２：１４２−１４８，１９９１
【非特許文献２】Ｈａｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３９：１３３−１４４，１９９５
【非特許文献３】Ａｌｌｅｎ．Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３７：９９−１０８，１９９５
【非特許文献４】Ｂｌｕｍｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１４９：１８０−１８４，１９９３
【非特許文献５】Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：１３２７，１９９５
【非特許文献６】Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５，１９９２
【非特許文献７】Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，７４：９５，２００１
【非特許文献８】Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｕ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５９１：１０９，２００２
【発明の開示】
【００１１】
簡単な要約
１つの観点では、組成物が記載され、該組成物は（ｉ）小胞形成脂質；（ｉｉ）リポポリマー；（ｉｉｉ）疎水性部分親水性ポリマーを含んでなる抗ＨＥＲ２受容体抗体コンジュゲート；ならびに（ｉｖ）封入された薬剤を含んでなるリポソームを含んでなる組成物が記載される。コンジュゲートの量はリポソームあたり平均して約２より多い抗体、そして平均してリポソームあたり約２５未満の抗体を提供するために有効な量で存在する。
【００１２】
１つの態様では、抗体は５，０００〜５０，０００ダルトンの間、より好ましくは１０，０００〜５０，０００ダルトンの間、さらに一層好ましくは１０，０００〜３０，０００の間の分子量を有する。別の態様では、抗体は１００，０００ダルトン未満、より好ましくは約３５，０００ダルトン未満、そしてさらにより一層好ましくは３０，０００ダルトン未満の分子量を有する。
【００１３】
別の態様では、抗体は配列番号２と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１４】
別の態様では、親水性ポリマーが７５０〜５０００ダルトンの間の分子量を有するポリエチレングリコールである。  
【００１５】
別の態様では、封入された薬剤が細胞傷害性薬剤である。さらに別の態様では、封入された薬剤は抗腫瘍薬である。封入される薬剤の例は、ドキソルビシンのようなアントラサイクリンである。
【００１６】
別の態様では、コンジュゲートの量がインビボ投与から４８時間後に平均してリポソームあたり約２０未満の抗体を提供する。
【００１７】
別の観点では、イムノリポソーム製剤が提供され、この製剤は（ｉ）少なくとも１つの硬質な小胞形成脂質；（ｉｉ）疎水性部分およびポリエチレングリコールを含んでなるリポポリマー；（ｉｉｉ）疎水性部分、ポリエチレングリコールおよび配列番号２に少なくとも８０％の同一性を有する抗Ｈｅｒ２受容体の単鎖抗体を含んでなるコンジュゲート；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍活性を有する封入された薬剤を含んでなるリポソームを含んでなる。リポソームはインビボ投与から９６時間後に、リポソームあたり約２より多く、そして約１５未満の抗体を提供するために有効な量のコンジュゲートにより特徴づけられる。
【００１８】
１つの態様では、硬質な小胞形成脂質が水素化ダイズホスファチジルコリンである。
【００１９】
別の態様では、リポソームがさらにコレステロールを含んでなる。
【００２０】
さらに別の観点ではイムノリポソーム製剤が記載され、この製剤は（ｉ）少なくとも１つの硬質な小胞形成脂質；（ｉｉ）疎水性部分およびポリエチレングリコールを含んでなるリポポリマー；（ｉｉｉ）疎水性部分、ポリエチレングリコールおよび配列番号２の同一性を有する抗Ｈｅｒ２受容体単鎖抗体を含んでなるコンジュゲート；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍活性を有する封入された薬剤を含んでなるリポソームを含んでなる。このイムノリポソーム製剤はインビボで投与された時、類似の成分を含んでなるが抗体を含まないリポソームの曲線下の面積よりも２５％を越えて、またはせいぜい２５％低い曲線下の面積を提供する。
【００２１】
１つの態様では、コンジュゲートの量が、インビボ投与から４８時間後に、平均してリポソームあたり約２０未満の抗体を提供する。別の態様では、コンジュゲートの量がインビボ投与から９６時間後に、平均してリポソームあたり約１５未満の抗体を提供する。
【００２２】
さらに別の態様では、コンジュゲートの量が、インビボ投与から４８時間後に、平均してリポソームあたり約２より多くの抗体を、そしてインビボ投与から４８時間後に、平均してリポソームあたり約２０未満の抗体を提供する。
【００２３】
さらに別の観点では、イムノリポソーム製剤が記載され、ここで製剤は（ｉ）少なくとも１つの硬質な小胞形成脂質；（ｉｉ）場合により、疎水性部分およびポリエチレングリコールを含んでなるリポポリマー；（ｉｉｉ）疎水性部分、ポリエチレングリコールおよび配列番号２に少なくとも８０％の同一性を有する抗Ｈｅｒ２受容体の単鎖抗体を含んでなるコンジュゲート；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍活性を有する封入された薬剤を含んでなるリポソームを含んでなる。組成物はイムノリポソームの投与から９６時間後に、３０〜６０％の間の抗体が各リポソームから解離して組成物を提供し、インビボ投与から９６時間後、それはリポソームあたり約２５未満の抗体を有することを特徴とする。
【００２４】
さらに別の観点では、特定の工程に従い調製されるリポソーム組成物が記載され、この工程は、（ａ）場合により親水性ポリマー鎖の外側コーティングおよび／または封入された薬剤を有するリポソームを準備し；（ｂ）該リポソームを、疎水性部分、ポリエチレングリコールおよび配列番号２に少なくとも８０％の同一性を有する抗Ｈｅｒ２受容体の単鎖抗体を含んでなるある量のコンジュゲートとインキュベーションすることを含んでなり；そしてコンジュゲートの該量が（ｉ）インビボ投与から９６時間後に平均してリポソームあたり２より多い抗体；（ｉｉ）平均してリポソームあたり１５０未満の抗体；および／または（ｉｉｉ）インビボ投与から９６時間後に平均してリポソームあたり約１５未満の抗体を提供するように選択されることを含んでなる。
【００２５】
１つの態様では、該コンジュゲートの量が平均してリポソームあたり１２以下、あるいは１０以下、あるいは８以下の抗体を提供する。
【００２６】
別の観点では組成物が記載され、組成物は上記のようなリポソームを含んでなるが、インビボ投与前のリポソームはリポソームあたり２５未満の抗体を有し、そしてインビボ投与後、リポソームは抗体の約２０〜５０％の間を失う場合、それでも細胞傷害性に十分なＨｅｒ−２受容体に対する結合を保持する。
【００２７】
さらに別の観点では、イムノリポソーム組成物を調製する方法が提供される。この方法は（ｉ）小胞形成脂質；（ｉｉ）場合によりリポポリマー；（ｉｉｉ）疎水性部分、親水性ポリマー、およびＨｅｒ２受容体の細胞外ドメインのような標的に結合親和性を有する抗体を含んでなるコンジュゲート；ならびに（ｉｖ）封入された薬剤を含んでなるイムノリポソームを提供することを含んでなる。該コンジュゲートはリポソームあたり第１の選択された数の抗体を提供するために十分な第１の量で組成物に含まれる。リポソームはインビトロもしくはインビボで血液と接触させるように導入され、そしてリポソームと血液とを接触させた１以上の時点で、リポソームあたりの抗体の数を、例えばクロマトグラフィーのような適切な分析技術により測定する。血液と接触した後の第１の選択した時点での抗体数の測定に基づき、血液と接触した後のそのような時点でのリポソームあたり少なくとも２つの抗体を提供するために、リポソームあたり第２のより多い数の抗体を提供するために十分なコンジュゲートの第２の量が選択される。
【００２８】
１つの態様では、この方法にはリポソームあたり５０未満の抗体を提供するために有効なコンジュゲートの第２の量を選択することを含む。別の態様では、リポソームあたり３０以下の抗体を提供するために有効なコンジュゲートの第２の量が選択される。
【００２９】
別の態様では、この方法はリポソームあたり１５０未満の抗体、より好ましくはリポソームあたり１００以下の抗体、そしてさらに一層好ましくはリポソームあたり７５以下の抗体を提供するコンジュゲートの第１の量を有するリポソームを提供することを含む。
【００３０】
上に記載する例示的観点および態様に加えて、さらなる観点および態様が図面および以下の説明を論考することにより明白となるだろう。
【００３１】
配列の簡単な説明
配列番号１は、本明細書においてＨＥＲ２受容体およびｐ１８５ＨＥＲ２受容体とも呼ぶｃ−ｄｒｂ−Ｂ２受容体の細胞外ドメインに結合親和性を有する抗体のヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号２は、ＨＥＲ２受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を有するＦ５と命名された単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列である。
【００３３】
詳細な説明
Ｉ．定義
他に記載しない限り、用語「小胞形成脂質」は、安定なミセルまたはリポソーム組成物の一部を形成することができ、そして典型的には１もしくは２の疎水性炭化水素鎖またはステロイド基を含むことができる任意の脂質を指し、そしてアミン、酸、エステル、アルデヒドもしくはアルコールのような化学的に反応性の基をその極性ヘッド基に含むことができる。
【００３４】
本明細書で使用する用語「抗体」には、全抗体およびその任意の抗原結合フラグメントもしくは単鎖を含む。すなわち抗体には限定するわけではないが、重もしくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレイムワーク（ＦＲ）領域、またはその任意の部分、あるいは結合タンパク質の少なくとも１つの部分のような免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含んでなる分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを含む。
【００３５】
さらに用語「抗体」は、抗体ミメティックスを含むか、あるいは単鎖抗体およびそのフラグメントを含む抗体もしくは特異的フラグメントもしくはその部分の構造および／または機能り模する抗体のドメインを含んでなる抗体消化フラグメント、その特異的部分およびバリアントを包含することを意図する。機能的フラグメントには、増殖因子受容体である哺乳動物のＨＥＲ２タンパク質に結合する抗原結合フラグメントを含む。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなる単価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂフラグメントを含んでなる二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９））；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらにＦｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によりコードされるが、それらは組換え法を使用して、それらをＶＬおよびＶＨ領域が対合して単価の分子を形成する１つのタンパク質鎖とすることができる合成リンカーにより連結することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３（１９８８）を参照にされたい）。そのような単鎖抗体も、用語抗体の中に包含されることを意図する。これらの抗体は当業者に知られている通常の技法を使用して得られ、そしてフラグメントは完全な抗体と同じ様式で使用のためにスクリーニングされる。
【００３６】
そのようなフラグメントは、当該技術分野で知られ、かつ／または本明細書に記載する酵素的分解、合成または組換え技法により生産することができる。また抗体は、１もしくは複数の終止コドンが自然な終止コドンの上流に導入された抗体遺伝子を使用して種々の短縮化形態で生産することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組み合わせ遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。抗体の種々の部分が通例の技術により化学的に一緒に連結されることができ、あるいは遺伝子工学的技術を使用して連続するタンパク質として調製することができる。
【００３７】
「ＨＥＲ２受容体」および「ｐ１８５ＨＥＲ２」は、ＨＥＲ２またはＥＲＲＢ２遺伝子（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２、赤芽球白血病ウイルスガン遺伝子ホモログ２）によりコードされるタンパク質を意味し、そしてまたニューロ／グリア芽腫由来ガン遺伝子ホモログとも呼ばれる：鳥類赤芽球白血病ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２）ガン遺伝子ホモログ２；ｖ−ｅｒｂ−ｂ２鳥類赤芽球白血病ウイルスガン遺伝子ホモログ２（ニューロ／グリア芽腫由来ガン遺伝子ホモログ）によりコードされるタンパク質とも呼ばれる。ＨＥＲ２／ＥＲＲＢ２遺伝子は、受容体チロシンキナーゼの上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーのメンバーをコードする。ＨＥＲ２のコード配列は、翻訳産物がＮＰ ００４４３９により与えられる参照配列ＮＭ ００４４４８により与えられる。ＨＥＲ２受容体は、それ自体のリガンド結合ドメインを持たず、したがって増殖因子に結合することができない。しかしＨＥＲ２受容体は他のリガンド結合ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーと強固に結合して、ヘテロ二量体を形成し、リガンド結合を安定化し、そしてマイトジェン活性化タンパク質キナーゼおよびホスファチジルイノシトール−３キナーゼが関与するもののようなキナーゼが媒介する下流のシグナリング経路の活性化を強化する。アミノ酸６５４位および６５５位の対立遺伝子バリアントのアイソフォームａ（６２４位および６２５位のアイソフォームｂ）が報告され、最も多い対立遺伝子はＩｌｅ６５４／Ｉｌｅ６５５であった。選択的スプライシングは、さらに数種の転写バリアントをもたらし、幾つかは異なるアイソフォームをコードする。すべての対立遺伝子およびスプライスバリアントは、「ＨＥＲ２受容体」の意味に含まれる。
【００３８】
「インターナライズ（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）される抗体」とは、受容体または細胞表面上の他のリガンドに結合した時、細胞、例えばリゾチームもしくは他のオルガネラもしくは細胞質に輸送される抗体である。
【００３９】
用語「単離された」とは、自然な状態で見いだされた時、通常それに付随する成分を実質的に、または本質的に含まない物質を指す。
【００４０】
２以上の核酸またはポリペプチド配列の内容において、用語「同一」または「同一性」のパーセントまたは「相同性」のパーセントとは、２以上の配列もしくは部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）が、最大に対応するように比較そして並べられた時に、視覚による調査により、またはコンピューターアルゴリズムを使用して測定されるような同じであるか、あるいは同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの具体的割合を有する２以上の配列もしくは部分配列を指す。
【００４１】
本明細書で使用するように、抗体の「親和性」という用語は、予め定めた抗原に関する抗体の解離定数、ＫＤを指す。高い親和性抗体は、予め定めた抗原に対して１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、そしてさらに一層好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する。本明細書で使用する用語「Ｋｄｉｓ」または「ＫＤ」または「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すものとする。「ＫＤ」は、解離速度（ｋ１）すなわち「オン−レイト（ｋｏｎ）」に対する解離速度（ｋ２）（「オフ−レイト（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる）の比である。このようにＫＤはｋ２／ｋ１またはｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、そしてモル濃度（Ｍ）で表される。これはＫＤが小さいほど、強い結合となる。したがって１０−６Ｍ（または１μＭ）のＫＤは、１０−９Ｍ（または１ｎＭ）に比べて弱い結合を示す。
【００４２】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。本明細書で使用する「特異的結合」および「特異的に結合する」とは、他の抗原またはタンパク質よりも大きい親和性で予め定めた抗原に結合する抗体を指す。典型的には、抗体は１０−６Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、そして予め定めた抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼインまたは任意の他の特定したポリペプチド）に結合するＫＤよりも少なくとも２倍低いＫＤで、予め定めた抗原と結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
【００４３】
本明細書に開示し、そして特許請求するように、配列番号２に説明する配列には「保存的配列の修飾」、すなわちヌクレオチド配列によりコードされる、またはアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響を及ぼさず、または改変しないヌクレオチドおよびアミノ酸配列の修飾を含む。そのような保存的配列の修飾には、ヌクレオチドおよびアミノ酸置換、付加および欠失がある。修飾は、位置指定突然変異誘発法およびＰＣＲ媒介型の突然変異誘発法のような当該技術分野で知られている標準的技法により、配列番号２に導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられたものを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００４４】
ＩＩ．リポソーム組成物
１つの観点では、本発明は標的化リガンドとして増殖因子受容体ＨＥＲ２に結合特異性を有する抗体を含むリポソームを含んでなるリポソーム組成物に関する。ＨＥＲ２標的化リガンドは、本明細書では脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートとも呼ぶ脂質−ポリマー抗体コンジュゲートの状態でリポソームに包含される。以下に記載するように、抗体はＨＥＲ２受容体の外部ドメインに特異的親和性を有し、そしてＨＥＲ２受容体を発現する細胞にリポソームを標的化する。以下の章ではリポソームの脂質および治療薬を含むリポソーム成分、ＨＥＲ２標的化リガンドを持つリポソームの調製、および障害の処置のためのリポソーム組成物の使用法を記載する。
【００４５】
Ａ．リポソーム脂質成分
本発明の組成物の使用に適するリポソームには、主に小胞形成脂質を含んでなるものを含む。そのような小胞形成脂質は、内部の二重層膜の疎水性領域と接触する疎水性部分、および外部の膜の極性表面に向かうヘッド基部分を持つリン脂質に例示されるような自然に水中で二重層小胞を形成することができるものである。コレステロールおよびその種々の類似体のような脂質二重層に安定に包含され得る脂質も、リポソームに使用することができる。
【００４６】
小胞形成脂質は、２つの炭化水素鎖、典型的にはアシル鎖、および極性または非極性のいずれかのヘッド基を有する脂質が好ましい。２つの炭化水素鎖が典型的には約１４〜２２個の間の炭素原子長であり、そして異なる程度の不飽和度（ｕｎｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）を有する、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトールおよびスフィンゴミエリンのような、様々な合成の小胞形成脂質およびリン脂質を含む自然に存在する小胞形成脂質がある。炭素鎖が異なる程度の飽和度を有する上記脂質およびリン脂質は市販されているか、または公開されている方法にしたがい調製することができる。他の適切な脂質には糖脂質、セレブロシドおよびコレステロールのようなステロールを含む。
【００４７】
またカチオン性脂質も本発明のリポソームに使用するために適しており、ここでカチオン性脂質は脂質成分の微量成分として、または主要な、もしくは唯一の成分として含まれることができる。そのようなカチオン性脂質は典型的には、ステロールのような親油性部分、アシルもしくはジアシル鎖を有し、そしてそこに脂質は全体的に正味の正電荷を有する。好ましくは脂質のヘッド基は正の荷電を持つ。例示的なカチオン性脂質には、１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）；３［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；およびジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）がある。カチオン性の小胞形成脂質は、ポリリシンもしくは他のポリアミン脂質のようなカチオン性脂質で誘導化されたジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のような中性脂質、またはリン脂質のような両親媒性脂質でもよい。例えば中性脂質（ＤＯＰＥ）は、ポリリシンで誘導化されてカチオン性脂質を形成することができる。
【００４８】
小胞形成脂質は、特異的な程度の流動性または剛性を達成するために選択されて、記載するように血清中のリポソームの安定性を制御し、標的化コンジュゲートの挿入に効果的な条件を制御し、かつ／またはリポソームに封入された作用物質の放出速度を制御することができる。より硬質な脂質二重層、または液体結晶（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）二重層を有するリポソームは、比較的堅い脂質、例えば最高６０℃の比較的高い相転移温度を有するような脂質を包含することにより達成される。剛性、すなわち飽和化された脂質は、脂質二重層においてより大きな膜の剛性に貢献する。コレステロールのような他の脂質成分も脂質二重層構造の膜の剛性に貢献することが知られている。
【００４９】
その一方、脂質流動性は比較的流動性の脂質、典型的には例えば室温以下の比較的低い液体から液体−結晶相転移温度を持つ脂質相を有するものを包含することにより達成される。
【００５０】
またリポソームは、本明細書で「リポポリマー」とも呼ばれる親水性ポリマーに共有結合した小胞形成脂質を含む。例えば米国特許第５，０１３，５５６号明細書に記載されているように、リポソーム組成物にそのようなポリマー誘導化脂質を含むことは、リポソームの回りに親水性ポリマー鎖の表面コーティングを形成する。親水性ポリマー鎖の表面コーティングは、そのようなコーティングが無いリポソームと比べた時、リポソームのインビボ血液循環寿命を上げるために効果的である。
【００５１】
親水性ポリマーでの誘導化に適する小胞形成脂質には、上に挙げた任意の脂質、そして特にジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）のようなリン脂質を含む。
【００５２】
小胞形成脂質での誘導化に適する親水性ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメチルアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミドおよび親水性ペプチド配列がある。ポリマーはポモポリマーとして、またはブロックもしくはランダムコポリマーとして使用することができる。
【００５３】
好適な親水性ポリマー鎖は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、好ましくはＰＥＧ鎖として５００〜１０，０００ダルトンの間の、より好ましくは７５０〜１０，０００ダルトンの間の、さらにより好ましくは７５０〜５０００ダルトンの間の分子量を有するポリエチレングリコールである。ＰＥＧのメトキシもしくはエトキシ−キャップ化類似体も好適な親水性ポリマーであり、例えば１２０〜２０，０００ダルトンの様々なポリマーサイズで市販されている。
親水性ポリマーで誘導化された小胞形成脂質の調製は、例えば米国特許第５，３９５，６１９号明細書に記載された。そのような誘導化脂質を含むリポソームの調製も記載され、典型的には１〜２０モルパーセントの間のそのような誘導化脂質がリポソーム製剤に含まれる（例えば米国特許第５，０１３，５５６号明細書を参照にされたい）。
【００５４】
Ｂ．標的化抗体
またリポソーム組成物は、脂質粒子を細胞に標的化する抗体を含む。１つの態様では、抗体は腫瘍由来細胞の表面上のＨＥＲ２受容体に特異的に結合する。別の態様では、抗体は腫瘍由来細胞の表面上のＨＥＲ２受容体に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含んでなる。別の態様では、抗体は腫瘍由来細胞の表面上のＨＥＲ２受容体に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含んでなる単鎖抗体である。
【００５５】
好適な態様では、本明細書に記載するリポソーム組成物中に使用する抗体は、腫瘍由来細胞の表面上のＨＥＲ２受容体に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含んでなる単鎖抗体であり、そして配列番号２に同定される配列を有する。この抗体の調製は国際公開第９９／５５３６７号明細書に記載され、そして抗体はＦ５と命名される。抗体はＨＥＲ２／ｎｅｕガン遺伝子のｃ−ｅｒｂ−Ｂ２タンパク質産物の細胞外ドメインに特異的に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、そして本明細書では抗−ＨＥＲ２抗体とも呼び、すなわちＨＥＲ２受容体に結合親和性を有する抗体である。Ｆ５抗体はリンカー分子により連結されたヒト抗体の可変ドメインを含んでなり、そして末端システインを含む２５１個のアミノ酸を含み（分子量２７．６ｋＤ）、そして中程度のＨＥＲ２結合親和性を有する（Ｋｄ＝１５０〜３００ｎＭまたは１．５〜３×１０−７Ｍ）。本発明の抗−ＨＥＲ２抗体は、それらの膜表面上にＨＥＲ２受容体を発現する細胞に迅速にインターナライズされる。
【００５６】
１つの態様では、抗−ＨＥＲ２抗体は配列番号２に対して保存的置換を表す配列を有する。
【００５７】
Ｃ．脂質−ポリマー−抗体コンジュゲートの調製
上記のように、抗−ＨＥＲ２抗体は小胞形成脂質の近位末端に結合した親水性ポリマー鎖の遊離遠位末端に共有結合されている。選択した親水性ポリマーを選択した脂質に結合させ、そして選択したリガンドとの反応にポリマーの遊離非結合末端の活性化するための広範な技術が存在し、そして特に親水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が広く記載されてきた（Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｉａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１２３７：９９−１０８（１９９５）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４（４）：２９６−２９９（１９９３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３５３：７１−７４（１９９４）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６（６）：７０５−７０８（１９９５）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ｉｎ  ＳＴＥＡＬＴＨ  ＬＩＰＯＳＯＭＥ（Ｄ．Ｌａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ編集）、第９章、ＣＲＣ出版、ボカラトン、フロリダ州（１９９５））。
【００５８】
一般にＰＥＧ鎖は、広い様々なリガンド中に存在する例えばスルフヒドリル、アミノ基、およびアルデヒドまたはケトン（典型的には抗体の炭化水素部分の弱い酸化から誘導される）とのカップリングに適した反応性基を含むように官能化される。そのようなＰＥＧ−末端反応性基の例には、マレイミド（スルフヒドリル基との反応に）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはＮＨＳ−炭酸エステル（一級アミンとの反応に）、ヒドラジドもしくはヒドラジン（アルデヒドもしくはケトンとの反応に）、ヨードアセチル（好ましくはスルフヒドリル基との反応に）およびジチオピリジン（チオール−反応性）がある。ＰＥＧをそのような基で活性化するための合成反応スキームは、米国特許第５，６３１，０１８号、同第５，５２７，５２８号、同第５，３９５，６１９号明細書に説明され、そして合成反応手順を記載する関連する章は、引用により本明細書に編入する。
【００５９】
例示的合成反応スキームは、図１Ａ〜１Ｂに示される。反応の詳細は米国特許第６，３２６，３５３号明細書に与えられている。簡単に説明すると、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ビス（アミン）（化合物Ｉ）を、２−ニトロベンゼンスルホニルクロライドと反応させて、モノ保護生成物（化合物ＩＩ）を生成する。化合物ＩＩをカルボニルジイミダゾールトリエチルアミン（ＴＥＡ）と反応させて、モノ２−ニトロベンゼンスルホンアミド（化合物ＩＩＩ）のイミダゾールカルバメートを形成する。化合物ＩＩＩをＤＳＰＥ（ＴＥＡ中）と反応させて、１つの末端が２−ニトロベンジルスルホニルクロライドで保護された誘導化ＰＥ脂質が形成する。保護基は酸による処理で除去して、ＰＥＧ鎖上に末端アミンを有するＤＳＰＥ−ＰＥＧ生成物（化合物ＩＸ）を得る。無水マレイン酸との反応で対応するマレアミド酸（ｍａｌｅａｍｉｃ）生成物を得（化合物Ｖ）、これは無水酢酸との反応で所望するＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド生成物（化合物ＶＩ）を与える。この化合物は、チオエーテル結合を介して本明細書に記載する抗−インテグリン抗体をカップリングするためのスルフヒドリル基と反応性である（化合物ＶＩＩ）。
【００６０】
上に挙げた任意の親水性ポリマーは、上に挙げた任意の小胞形成脂質と組み合わせて、脂質−ポリマー−リガンド標的化コンジュゲートを調製するための修飾剤として使用することができ、そして選択したポリマーに関する適切な反応順序が当業者により決定され得ると思われる。
【００６１】
Ｄ．リポソーム調製
様々な取り組みが、リポソーム結合ポリマー鎖の遠位末端に結合した標的化リガンドを有するリポソームを調製するために記載されてきた。１つの取り組みには末端官能化脂質−ポリマー誘導体：すなわち遊離のポリマー末端が反応性であるか、または「活性化」されている脂質−ポリマーコンジュゲートを含む脂質小胞の調製が関与する（例えば米国特許第６，３２６，３５３号および同第６，１３２，７６３号明細書を参照にされたい）。そのような活性化コンジュゲートはリポソーム組成物に包含され、そして活性化ポリマー末端をリポソーム形成後に標的化リガンドと反応させる。別の取り組みでは、脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートは、リポソーム形成時に脂質組成物に含まれる（例えば米国特許第６，２２４，９０３号、同第５，６２０，６８９号明細書を参照にされたい）。さらに別の取り組みでは、脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートのミセル溶液をリポソームの懸濁液とインキュベーションし、そして脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートが前形成リポソームに挿入される（例えば米国特許第６，０５６，９７３号、同第６，３１６，０２４号明細書を参照にされたい）。
【００６２】
封入された作用物質を運び、そして表面に結合した標的化リガンドを持つリポソーム、すなわち標的化された治療用リポソームは、これらの任意の取り組みにより調製される。好適な調製法は挿入法であり、ここで前形成されたリポソームは、標的化コンジュゲートとインキュベーションされて、標的化コンジュゲートのリポソーム二重層への挿入を達成する。この取り組みでは、リポソームは、Ｓｚｏｋａ，Ｆ．，Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９：４６７（１９８０）に詳述されているような様々な技法により調製され、そして本発明の支持で調製されたリポソームの具体例を以下に記載する。典型的にはリポソームは多重層小胞（ＭＬＶ）であり、これは単純な脂質−フィルム水和法により形成することができる。この手順では、適切な有機溶媒に溶解された上に詳述した種類のリポソーム形成脂質の混合物が容器の中で蒸発して薄いフィルムを形成し、これは次いで水性媒質により覆われる。脂質フィルムは水和してＭＬＶが典型的には約０．１〜１０ミクロンの間のサイズで形成する。
【００６３】
リポソームは、リポソームの表面上に親水性ポリマー鎖の表面コーティングを形成するために、親水性ポリマーで誘導化された小胞形成脂質を含むことができる。以下に記載する挿入工程後、リポソームは脂質−ポリマー−標的化リガンドを含むので、脂質ポリマーコンジュゲートの添加は任意である。リポソーム形成時に、そして脂質−ポリマーコンジュゲートの状態で脂質混合物に加えられるさらなるポリマー鎖は、リポソームの脂質二重層の内面および外面の両方から伸びるポリマー鎖を生じる。リポソーム形成時の脂質−ポリマーコンジュゲートの添加は、典型的には１〜２０モルパーセントの間のポリマー誘導化脂質を含むことにより達成され、リポソーム形成成分、例えば小胞形成脂質を残す。ポリマー−誘導化脂質の調製法およびポリマー−被覆リポソームの形成法は、米国特許第５，０１３，５５６号、同第５，６３１，０１８号および同第５，３９５，６１９号明細書に記載され、これらは引用により本明細書に編入する。親水性ポリマーは脂質と安定にカップリングされるか、または不安定な連結を介してカップリングされ、これによりコーティングされたリポソームは、それらが血流の循環中に、または刺激に応答してポリマー鎖のコーティングを脱げるようになると認識するだろう。
【００６４】
またリポソームは治療薬または診断薬も含み、そして例示的作用物質を以下に提供する。選択した作用物質は、（ｉ）脂質フィルムを作用物質の水溶液で水和することにより水溶性化合物の受動的封入、（ｉｉ）作用物質を含有する脂質フィルムを水和することによる親油性化合物の受動的封入、および（ｉｉｉ）内側／外側リポソームｐＨ勾配に対してイオン化可能な薬剤の装填、を含む標準法によりリポソームに包含される。逆相蒸発のような他の方法も適切である。
【００６５】
リポソーム形成後、リポソームは実質的に均一なサイズ範囲、典型的には約０．０１〜０．５ミクロンの間、より好ましくは約０．０３〜０．４０ミクロンの間を有するリポソーム集団を得るためにサイズで分けることができる。ＲＥＶおよびＭＬＶのための１つの効果的な分類法には、リポソームの水性懸濁液を、０．０３〜０．２ミクロン、典型的には０．０５、０．０８、０．１または０．２ミクロンの範囲の選択した均一な孔サイズを有する一連のポリカーボネート膜を通して押し出すことが関与する。膜の孔サイズはその膜を通して押し出すことにより生成されるリポソームの最大サイズにほぼ対応し、特に調製物が同じ膜を通して２回以上押し出される場合はそうである。均一化法もリポソームのサイズを１００ｎｍ以下のサイズに下げるために有用である（Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．，特殊化された薬剤送達系−製造および生産技術（ＳＰＥＣＩＡＬＩＺＥＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ−ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）で、Ｐ．Ｔｙｌｅ編集、マルセルデッカー、ニューヨーク、第２６７−３１６頁（１９９０））。
【００６６】
リポソームの形成後、標的化リガンドは細胞を標的とする治療用リポソームを達成するために包含される。標的化リガンドは、前形成したリポソームを上記のように調製した脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートとインキュベーションすることにより包含される。前形成したリポソームおよびコンジュゲートは、コンジュゲートとリポソームの会合に効果的な条件下でインキュベーションされ、これはコンジュゲートとリポソーム二重層の外側との相互作用、あるいはコンジュゲートのリポソーム二重層への挿入を含み得る。より具体的には、２つの成分を一緒にコンジュゲートのリポソームへの会合がなされる条件下で、標的化リガンドがリポソーム表面から外側に向かうように、したがってリガンドがそのコグネイト受容体と相互作用できるようにインキュベーションされる。これはそのような会合または挿入を達成するために効果的な条件は、所望する挿入の速度を含め、幾つかの変数に基づき定められると考えられ、ここでより高いインキュベーション温度がより早い挿入速度を達成でき、リガンドの活性に影響を及ぼすことなく、そして脂質および脂質組成物の相転移温度に及ぼす影響の度合いが少なく、リガンドが安全に加熱できる温度である。また挿入は、ポリエチレングリコールおよびエタノールを含む両親媒性溶媒のような溶媒、または界面活性剤の存在により変動することができると考えられる。
【００６７】
脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートの形態の標的化コンジュゲートは、典型的にはコンジュゲートが水性溶媒と混合される時にミセルの溶液を形成する。コンジュゲートのミセル溶液は、インキュベーション、そしてコンジュゲートとリポソームとの会合またはコンジュゲートのリポソーム脂質二重層への挿入のために、前形成リポソームの懸濁液と混合される。インキュベーションは、イムノリポソームを形成するために、脂質−ポリマー−抗体コンジュゲートとリポソームの外側二重層リーフレットとの会合または挿入を行うために効果的である。
【００６８】
調製後、イムノリポソームは例えば３０゜または９０゜での力学的光散乱により測定した時、好ましくは約１５０ｎｍ未満、好ましくは約８５〜１２０ｎｍの間、そしてより好ましくは９０〜１１０ｎｍの間のサイズを有する。
【００６９】
Ｅ．例示的イムノリポソーム
本発明を支持するために行った実験では、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体を有するイムノリポソームを、実施例１に記載するように調製した。簡単に説明すると、リポソームは脂質ＨＳＰＣ、コレステロールおよびｍＰＥＧ−ＤＳＰＥから調製した。治療薬ドキソルビシンは、アンモニウムイオン勾配（Ｄｏｘｉｌ（商標））に対して遠隔装填することによりリポソームに装填した。本明細書で配列番号２と同定される配列を有する抗ＨＥＲ２抗体を用いて、実施例１に記載するように調製された脂質−ポリマー−抗体標的化コンジュゲートは、複数のコンジュゲートを含有するミセル溶液と前形成リポソームのインキュベーションにより、前形成リポソームに挿入された。リポソームあたり平均２、５、７．５、１５、３０、４５、７５、１００、１５０および３００の抗体を有するイムノリポソームは、本明細書では２：１、５：１、７．５：１、１５：１、３０：１、４５：１、７５：１、１００：１、１５０：１および３００：１の製剤と呼ぶが、これらは実施例１に詳述されるように反応物濃度を調整することにより調製した。
【００７０】
７．５、１５、３０および４５の抗体を持つイムノリポソームのＨＥＲ２−発現細胞（ＳＫ−ＢＲ０３）への、および非ＨＥＲ２発現細胞（ＭＣＦ−７）へのインビトロ取り込みは、実施例２に記載するように測定した。結果を表１にまとめる。
【００７１】
【表１】
2008536944.tif 000002
【００７２】
表１のデータは、ＨＥＲ−２陽性ＳＫ−ＢＲ−３細胞における抗−ＨＥＲ２イムノリポソームの陽性細胞結合／取り込みを示し、１５：１および３０：１製剤のそれぞれについて、細胞あたり２．５８ｐｇ、および細胞あたり１．７５ｐｇのドキソルビシンレベルを示す。低いＨＥＲ２発現レベルを有するＭＣＦ−７細胞における抗−ＨＥＲ２イムノリポソームの結合／取り込みは、有意ではなかった。両細胞株における抗−ＨＥＲ２抗体を持たないリポソームの結合／取り込みも有意ではなかった。
【００７３】
実施例３に記載する別の実験では、ＳＫ−ＢＲ−３ヒト胸部癌腫細胞において、リポソームあたり２、５、７．５および１５の抗体を持つ抗−ＨＥＲ２イムノリポソームの細胞傷害性を評価した。遊離ドキソルビシンおよびペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）されたドキソルビシンを装填したリポソームを、それぞれ陽性および陰性対照として用いた。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を抗−ＨＥＲ２イムノリポソームに１０分間暴露し、次いで細胞の生育能を評価した。結果を図２Ａに表す。
【００７４】
図２Ａは、遊離薬剤として（三角）、リポソームに封入されて（丸）、あるいはリポソームあたり２（丸）、５（四角）、７．５（菱形）または１５（三角）の抗体を含むイムノリポソームに封入されて投与された時、未処理対照細胞のパーセントとして細胞の生育能をドキソルビシン濃度の関数としてμｇ／ｍＬで表す。リポソーム組成物の細胞傷害性における差異は、約０．５μｇ／ｍＬのドキソルビシン濃度で明らかとなり、ここでリポソームあたり５（四角）または７．５（菱形）の抗体で修飾されたイムノリポソームは、遊離薬剤（三角）とほぼ同じインビトロ細胞傷害性を提供した。しかしリポソームあたり１５の抗体を含むイムノリポソーム（三角）は、同じ濃度の遊離薬剤よりも細胞傷害性であり、約４μｇ／ｍＬのドキソルビシンで５０％の細胞生育能であった。リポソームあたり２の抗体を含むイムノリポソームは、非標的化ペグ化リポソームのドキソルビシンよりも細胞傷害性が低かった。
【００７５】
Ｈｅｒ２標的化イムノリポソームの細胞致死効果は、リポソームあたりの抗体密度に関連する。１０分間暴露した後の５、７．５および１５のｓｃＦｖ／リポソーム比の抗−Ｈｅｒ２イムノリポソーム製剤に関するＩＣ５０値は、それぞれ約３０、１６および３．９μｇ／ｍＬであった。２のｓｃＦｖ／リポソーム比を有する抗−Ｈｅｒ２イムノリポソーム製剤の細胞傷害性は、１０分の薬剤暴露後に細胞傷害性がほとんどないか、または無かった。遊離ドキソルビシンのＩＣ５０は、約９．５μｇ／ｍＬであった。ＰＥＧ−被覆リポソーム中に封入されたドキソルビシンについて記録された細胞傷害性はほとんどないか、または無かった。１５のｓｃＦｖ／リポソーム比を有する抗−Ｈｅｒ２イムノリポソームは、遊離ドキソルビシンよりも高い細胞傷害性を有し、迅速な結合にインターナリゼーションが続く標的化製剤の利点を示す。
【００７６】
このように１つの態様では、リポソームあたり２より多くの抗体を提供する、そして特に以下にさらに検討するように、２４、４８もしくは９６時間以上、インビボの血液中でイムノリポソームの循環後に、リポソームあたり平均して２より多くの抗体を提供する脂質−ポリマー−抗体コンジュゲートの量を含むイムノリポソーム製剤が企図される。
【００７７】
インビトロ細胞傷害性を測定する別の方法が行われ、ここではリポソームおよびイムノリポソーム製剤が細胞と４時間インキュベーションされた。次いで細胞を洗浄し、そして３７℃で３日間インキュベーションした。３日の終わりに細胞数がクリスタルバイオレット染色により予想された。この結果を図２Ｂに示す。図２Ｂはドキソルビシン濃度の関数として、未処理対照細胞のパーセントとして細胞の生育能をμｇ／ｍＬで示す。種々のイムノリポソームからの種々の濃度のドキソルビシンに対して４時間の暴露は、製剤のインビトロの細胞傷害性に差異があることを具体的に説明する。リポソームあたり７．５および４５の抗体を持つイムノリポソームは、細胞傷害性が遊離のドキソルビシン（菱形）よりもわずかに低いか、またはそれと同様の細胞傷害性であった。１５および３０の抗体を含むイムノリポソームは、遊離ドキソルビシンよりも細胞傷害性であった。図２Ｂも、１５および３０の抗体を含むイムノリポソームが遊離ドキソルビシンよりも細胞の細胞傷害性が強いことを示す。
【００７８】
実施例４に記載する別の実験では、血中のＨＥＲ２−標的化リポソームの安定性が評価された。１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体を持つイムノリポソームは、７．５、１５、３０、４５および９０のｓｃＦｖ抗体／リポソーム比で調製された。イムノリポソームはヒト血漿中でインキュベーションされ、そして分析用にアリコートが選択された時間に取り出された。ヒト血漿中のリポソーム物質の２連のアリコートをインキュベーションから取り出し、そしてＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラムに各時点で乗せた。
【００７９】
図３Ａ〜３Ｈは、ヒト血漿中でイムノリポソームのインキュベーション中に取り出したアリコートから、リポソームあたり１５のｓｃＦｖ抗体を有するイムノリポソームからの
１２５Ｉ標識脂質−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートの溶出プロファイルを示し、アリコートは０時間（図３Ａ）、１時間（図３Ｂ）、４時間（図３Ｃ）、８時間（図３Ｄ）、２４時間（図３Ｅ）、４８時間（図３Ｆ）、７２時間（図３Ｇ）および９６時間（図３Ｅ）で取り出した。リポソーム画分の放射活性は、２〜３の画分内の非常に狭い範囲の画分内で回収され、そして典型的には集めた全溶出液の６〜９ｍＬ以内であった。血漿画分は、血漿タンパク質の広いサイズ範囲により、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラムから少なくとも１２画分にわたり溶出した。すべての時点にわたり、リポソームおよび血漿画分は互いに識別可能であった。解離した（そして対応して会合した）１２５Ｉ−標識脂質−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートのパーセントを算出するために、リポソームおよび血漿画分からの放射活性を合わせて、１２５Ｉ−標識の総量を提供した。その総量をＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラムに乗せたサンプル中の全放射活性の比として評価した。
【００８０】
図４Ａは、７．５：１（菱形）、１５：１（四角）、３０：１（丸）、４５：１（三角）および９０：１（★）のｓｃＦｖ抗体／リポソーム比を有するイムノリポソーム製剤から１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体の解離を、ヒト血漿中で時間でのインキュベーション時間の関数として示す。図４Ｂは同じ製剤についてイムノリポソーム中に残る１２５Ｉ標識のパーセントとしてデータをプロットする。製剤から抗体の解離の速度および程度は（ドキソルビシンの量に関して）、リポソームあたりの抗体の初期密度にかかわらず本質的に同じである。
【００８１】
別の実験では、リポソームあたり１５の抗体を有するイムノリポソーム製剤を調製し、そしてインビトロでヒトの血漿中でインキュベーション中に製剤から標識の解離を測定した。結果を図５Ａ〜５Ｂに示す。
【００８２】
図５Ａは、インキュベーション時間（時間で）の関数として、２つの実験（菱形、四角）に関するイムノリポソーム製剤から解離した放射標識抗体のパーセントを示す。２つの実験間の結果は一致し、そして２４時間のインキュベーションがイムノリポソームからの抗体の約３０％解離をもたらすことを示す。ヒト血漿中９６時間のインキュベーション後、抗体の５０％はもはやイムノリポソームと会合しない。
【００８３】
図５Ｂはヒト血漿中のインキュベーション時間の関数として、イムノリポソームに残る放射性標識抗体のパーセントとして（菱形）、およびイムノリポソームから解離した放射性標識抗体のパーセントとして（四角）、１５：１のイムノリポソーム製剤を使用した実験の１つからのデータをプロットし、ここで血漿が誘導した解離は、血漿画分中に回収された放射活性として記載される。図５Ｂはリポソーム画分の放射標識ｓｃＦｖの減少を示し、対応して全ｓｃＦｖ物質のパーセントとして表される血漿画分中で増加する。放出されたｓｃＦｖ抗体の量における初期の減少は、約４８時間までに定常状態に達することが観察された。ゼロ時点で、８５％の放射活性がリポソーム画分で回収され、残りは血漿画分にあった。放射活性に付随するリポソームの減少は２４時間以内でより顕著であり、＞３０％のｓｃＦｖ抗体が解離し、そして血漿画分から回収された。９６時間のインキュベーション時間にわたり、約５０％の解離まで、リポソーム画分における初期のｓｃＦｖ抗体が減少すると、血漿画分中の放射活性の量が対応して増加することを示す（リポソーム画分では対応して減少する）。
【００８４】
したがって１つの態様では、インビボ投与後２４時間、より好ましくは投与後４８時間、そしてより一層好ましくは投与後９６時間、リポソームあたり平均して２より多くの抗体、そしてリポソームあたり平均して１５０未満の抗体を有するイムノリポソーム組成物が提供される。別の態様では、イムノリポソーム組成物は平均してリポソームあたりある初期量の抗体を有し、そして３０〜６０％の間の抗体がインビボに投与されたイムノリポソーム用量から解離して、インビボ投与後４８もしくは９６時間に、平均してイムノリポソームあたり約５０未満の抗体、より好ましくは平均してイムノリポソームあたり約３０未満の抗体、そしてさらに一層好ましくは平均してイムノリポソームあたり約１５未満の抗体を有する組成物を提供する。１つの好適な態様では、イムノリポソームは平均してイムノリポソームあたり２から１５の間（両端を含む）の抗体を含む。インビボでリポソームあたりの抗体の数は、イムノリポソームがヒト血漿中、３７℃で２４、４８または９６時間のような選択した時間インキュベーションされ、そしてリポソームからの抗体（または脂質−ポリマー−抗体構築物）の解離に関して適切な分析技術を使用して分析されるインビトロアッセイを使用して近似させることができると思われる。
【００８５】
ラットに単回、静脈内投与した後のイムノリポソーム中の抗体の安定性を評価するために、インビボ実験を行った。実施例５に記載するように、ラットは１２５Ｉ−標識イムノリポソーム（１５：１製剤）または１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体−ＰＥＧ−ＤＳＰＥコンジュゲートのいずれかを静脈内に処置した。血液サンプルは投与から５分、そして１、３、８、２４および４８時間後に集めた。全血および血漿サンプルは、１２５Ｉについてカウントし、そして注射した用量のパーセント（％）で表した。イムノリポソームでの処置群からの血漿サンプルもドキソルビシン濃度についてアッセイした。さらに各時点での血漿サンプルの一部をサイズ排除カラムに通して、遊離のコンジュゲートをリポソームに結合したコンジュゲートから分離して、放射活性がリポソーム画分に会合しているかどうかを決定した。
【００８６】
図６Ａは、血漿サンプルのリポソーム画分中で回収された放射標識ｓｃＦｖ抗体−ＰＥＧ−ＤＳＰＥコンジュゲートの割合を示す。すべての時点にわたり、＞８５％の放射活性がリポソーム画分にのみ見いだされた。これは任意の遊離抗体または遊離コンジュゲート（すなわちリポソームに会合していない）が、循環から迅速に回収されることを示す。
【００８７】
図６Ｂは、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラムで分離した後の血漿のリポソーム画分における遊離放射標識ｓｃＦｖ抗体の濃度を示す。この画分の遊離ｓｃＦｖ抗体の量は、わずかな量（１００ｎｇ／ｍＬ以下）が回収されただけなので、無視できる。実験期間にわたり、遊離ｓｃＦｖ抗体の回収は全回収の１５％未満であった。
【００８８】
ラットに１５：１のイムノリポソーム製剤を投与した後に、リポソーム画分と会合していない放射標識ｓｃＦＶ抗体（すなわち「遊離抗体」もしくは「遊離コンジュゲート」）の濃度を図６Ｃに示す。第１の時点（５分）で、初期の放射標識ｓｃＦｖ抗体濃度は予想された注射用量の２０％まで低下した。放射標識ｓｃＦｖ抗体排除の初期速度は、投与後、最初の１０時間くらいの間迅速であった。投与後、最初の４８時間にわたり、放射標識ｓｃＦｖ抗体濃度は最初の時点での放射標識ｓｃＦｖ抗体濃度の９０％まで減少した。比較して４０％のドキソルビシンが循環に留まる（図７Ａ）。
【００８９】
また実施例５に記載するように、イムノリポソームおよびドキソルビシンの薬物動態学的パラメーターを決定した。表２に薬物動態学的パラメーターをまとめ、そして図７Ａ−７Ｂは時間の関数としての濃度を示す。
【００９０】
【表２】
2008536944.tif 000003
【００９１】
図７Ａは、１５：１のイムノリポソーム製剤をラットに投与した後、時間（時間で）の関数として血漿（菱形）および血液（黒四角）中に残る１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体のパーセント；血漿（三角）中のドキソルビシンのパーセントを示す。また遊離コンジュゲートとして投与した後に、時間（時間で）の関数として血漿（白丸）および血液（白四角）中の１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体のパーセントも示す。血液および血漿中の放射活性は、イムノリポソームを投与した動物および１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体−ＰＥＧ−ＤＳＰＥコンジュゲートを投与した動物の両方で、投与から５分後にピークに達した。イムノリポソームで処置した動物では、血液および血漿中の１２５Ｉレベルは、５分でそれぞれ７８．４±４．１および７７．２±３．７％、そして９６時間で４．４±０．９および４．１±０．８％であった。血漿中のドキソルビシン含量は、５分で１２７±１９．７％または６９．４±１０．８μｇ／ｍＬ、そして９６時間で１１．８±３．９％または６．４±２．２μｇ／ｍＬであった。サイズ排除カラムから溶出した１２５Ｉのプロファイルは単一ピークを示し、これはカラム溶出液のリポソーム画分に対応した。注射した１２５Ｉ用量の血液および血漿中のパーセントに基づき、イムノリポソームの排除半減期は、それぞれ２５．６時間および２５．０時間であった。血漿中のドキソルビシン濃度に基づき、イムノリポソームの排除半減期は３１．６時間であった。
【００９２】
１２５Ｉ−ｓｃＦｖ抗体−ＰＥＧ−ＤＳＰＥコンジュゲートで処置した動物において、血液および血漿中の１２５Ｉレベルは、それぞれ５分で４１．８±６．０および４０．８±３．１％、そして８時間で２．９±０．６および２．７±１．１％であった。放射活性は２４または４８時間の時点で検出されなかった。血液および血漿中のコンジュゲートの排除半減期は、それぞれ２．１および２．０時間であった。
【００９３】
図７Ｂは、ラットに１５：１のイムノリポソーム製剤を投与した後、時間（時間で）の関数としてドキソルビシンの血漿濃度をμｇ／ｍＬで示す。見れば分かるように、ドキソルビシンは投与から９６時間後の血中に残る。
【００９４】
図８は、ラットに１５：１のイムノリポソーム製剤を投与した後、時間（時間で）の関数としてｎｇ／μｇでの血中のドキソルビシンに対する１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体比のプロットである。成分の比は投与後、最初の２４時間中に減少し、次いで投与から約５０時間後にプラトーに達する。この減少比は、ｓｃＦｖ抗体が循環からのリポソームのクリアランスよりも、またはリポソームからのドキソルビシンの損失よりも早い速度でリポソームから失われることを示す。
【００９５】
まとめると、ラットを対象としたインビボ実験では、イムノリポソームが単回の静脈内投与後９６時間にわたり、循環に留まることを示した。抗体−ＰＥＧ−ＤＳＰＥコンジュゲートはサイズ排除クロマトグラフィーにより示されるようにリポソームにしっかりと会合していた。１２５Ｉ−標識イムノリポソームの投与後の血液／血漿中の１２５Ｉの半減期は約２５時間であり、そして血漿中のドキソルビシンの半減期は３１．６時間であった。遊離形で投与された時、抗体−ＰＥＧ−ＤＳＰＥコンジュゲートは、単回の静脈内投与後、約８時間にわたり、循環に留まった。遊離コンジュゲートの循環半減期は約２時間であった。血清中のイムノリポソームの安定性を調査するインビボデータは、すべての時点にわたり、＞８５％の放射活性がリポソーム画分に残り、解離した抗体または遊離の抗体コンジュゲートが血清画分から迅速に排除されることを示す。イムノリポソームは血清および血液の両方で約２５時間の測定された半減期を有したが、遊離抗体または抗体コンジュゲートの半減期は血液および血漿の両方で約２時間であった（表２）。
【００９６】
実施例６は別のインビボ実験を行って、リポソームあたり１５、７５、１５０および３００のｓｃＦｖ抗体を有するイムノリポソーム製剤の薬物動態学を評価した。簡単に説明すると、は１つのイムノリポソーム製剤の単回の静脈内ボーラスで処置された。対照マウスはペグ化リポソームのドキソルビシンが投与された。血漿は投与後約５分、そして４、８、２４、４８、７２および９６時間に集め、そして全ドキソルビシンについてアッセイした。結果を表９に示す。
【００９７】
同様なドキソルビシン濃度  対  時間のプロファイルが、対照製剤（菱形）および１５：１（黒四角）および７５：１（三角）のイムノリポソーム製剤で処置した動物で観察された。リポソームあたり１５０（Ｘ記号）および３００（★記号）の抗体を有するイムノリポソームで処置した動物について、より早いクリアランスおよびより高い分布容量に付随するかなり低い値のＣｍａｘ、ＡＵＣおよび半減期が観察された。
【００９８】
図９のデータから定めた薬物動態学的パラメーターを表３に示す。
【００９９】
【表３】
2008536944.tif 000004
【０１００】
血漿中のドキソルビシン濃度は、最初のサンプリング時点、すなわち注射から５分後に、ピークに達した。ペグ化リポソーム対照製剤、１５：１イムノリポソーム製剤および７５：１イムノリポソーム製剤を投与したマウスのＣｍａｘ値は、それぞれ３９．０±０．２７、３９．９±５．４９および４３．３±１．３０μｇ／ｍＬであった。対応する薬剤レベルは投与から２４時間でそれぞれ１０．１±１．８２、９．０５±０．６９および１３．６±５．０μｇ／ｍＬに、そして９６時間後でそれぞれ０．３２±０．１９、０．５６±０．４１そして０．２８±０．１２μｇ／ｍＬに減少した。大変似ている薬物動態学的プロファイルがこれら３つの処置群で観察された。１５０：１のイムノリポソーム製剤および３００：１のイムノリポソーム製剤を投与されたマウスでのＣｍａｘ値は、７５：１以下のリポソーム製剤で処置したマウスよりも顕著に低く、すなわちそれぞれ２０．６±３．８８および１０．５±６．１３μｇ／ｍＬであった。対応する薬剤レベルは、２４時間でそれぞれ４．５６±０．５２および０．５８±０．１９μｇ／ｍＬに減少した。９６時間の終わりに、１５０：１および３００：１のイムノリポソーム製剤で処置した群の動物の半分は、血漿で検出可能な薬剤レベルではなかった。
【０１０１】
ペグ化リポソーム対照製剤、１５：１のイムノリポソーム製剤および７５：１のイムノリポソーム製剤を投与したマウスのＡＵＣｌａｓｔ値は、それぞれ７５１．５、７６３．１および８９８．３μｇ・ｈ／ｍＬであった。１５０：１および３００：１のイムノリポソーム製剤を投与したマウスのＡＵＣｌａｓｔ値は、それぞれ２８７．７および８１．５μｇ・ｈ／ｍＬであった。
【０１０２】
ペグ化リポソーム対照製剤、１５：１のイムノリポソーム製剤および７５：１のイムノリポソーム製剤を投与したマウスの血漿半減期は、それぞれ１４．８、１７．０および１２．８時間であった。１５０：１および３００：１のイムノリポソーム製剤を投与したマウスの半減期は、それぞれ３．３０および３．９１時間であった。
【０１０３】
ペグ化リポソーム対照製剤、１５：１のイムノリポソーム製剤および７５：１のイムノリポソーム製剤を投与したマウスのドキソルビシンの血漿クリアランスは、それぞれ０．０７０、０．０６８および０．０５９ｍＬ／時間であった。１５０：１および３００：１のイムノリポソーム製剤を投与したマウスのドキソルビシンの血漿クリアランスは、それぞれ０．１８３および０．６４５ｍＬ／時間であった。
【０１０４】
リポソーム対照製剤、１５：１のイムノリポソーム製剤および７５：１のイムノリポソーム製剤を投与したマウスの分布容量は、それぞれ１．４９、１．５０および１．２３ｍＬであった。１５０：１および３００：１のイムノリポソーム製剤を投与したマウスの分布容量は、それぞれ３．５７および１２．０ｍＬであった。
【０１０５】
実施例６の知見は、類似の薬物動態学的プロファイルが０、１５または７５のｓｃＦｖ／リポソーム比を含むイムノリポソームの単回のボーラス投与後に、マウスで観察されたことを示す。１５０または３００のｓｃＦｖ／リポソーム比を含むイムノリポソームで処置した動物について、Ｃｍａｘ、ＡＵＣおよび半減期に関しては、より早いクリアランスおよびより高い分布の容量を伴う、より低い値が観察され、ここでパラメーターはリガンド密度に逆比例した。したがって１つの態様では、標的化抗体が無い類似のリポソーム製剤に関するＡＵＣ、Ｃｍａｘおよび／または半減期よりも３０％（ｉ）を越えて、または（ｉｉ）せいぜい３０％、好ましくはせいぜい２５％、さらに一層好ましくはせいぜい２０％低いＡＵＣ、Ｃｍａｘおよび／または半減期を有するイムノリポソーム製剤が提供される。例えば抗体を欠く対照ペグ化リポソーム製剤のＡＵＣは、７５１μｇ・ｈ／ｍＬであった。１５：１および７５：１のイムノリポソーム製剤のＡＵＣは、それぞれ７６３μｇ・ｈ／ｍＬおよび８９８μｇ・ｈ／ｍＬであった。１５：１のイムノリポソーム製剤は、抗体が存在しないことを除いて同一の組成物である対応するリポソーム製剤のＡＵＣよりも１．６％低かった（すなわちせいぜい２５％低い）。７５：１のイムノリポソーム製剤は、対応するリポソーム製剤のＡＵＣよりも高いＡＵＣ値を有した。対照的に、１５０：１および３００：１のイムノリポソーム製剤のＡＵＣ値は、リポソーム製剤のＡＵＣよりも３０％をかなり越えて低かった。同様に、７５：１および１５：１のイムノリポソーム製剤のＣｍａｘおよび半減期の薬物動態学的パラメーターは、リポソームの非抗体標的化リポソーム製剤よりもせいぜい２５％低かった。
【０１０６】
このように図９のデータは、図２Ａおよび図５Ｂのデータを用いて考察する場合、イムノリポソーム製剤、および１つの態様では約２０，０００〜５０，０００ダルトンの間、より好ましくは２５，０００〜３５，０００ダルトンの分子量を有する抗体を持つイムノリポソームが、好ましくはインビボ投与前に、リポソームあたり平均して約４〜３０の間（両端を含む）の抗体、そしてより好ましくはリポソームあたり約５〜２５の間（両端を含む）の抗体、そしてさらに一層好ましくはリポソームあたり約６〜２０の間（両端を含む）の抗体を有する。インビボ投与前にリポソームあたり抗体数の好適な他の範囲は、約５〜３０の間、約６〜２５の間、そして約４〜１５の間、そして約７〜１５の間である。
【０１０７】
別の態様では、イムノリポソーム製剤は、インビボ投与から約９６時間後に、平均してリポソームあたり約２より多くの抗体、そして約１６未満の抗体を有し、より好ましくはインビボ投与から約９６時間後にリポソームあたり約２より多くの抗体、そして約１２未満の抗体を有し、そしてさらに一層好ましくはインビボ投与から約９６時間後にリポソームあたり約２より多くの抗体、そして約１０未満の抗体を有し、そしてなお一層好ましくはインビボ投与から約９６時間後にリポソームあたり約２より多くの抗体、そして約８未満の抗体を有する。あるいはイムノリポソーム組成物は、血中でインビトロ循環の約４８時間後に、平均してリポソームあたり２より多くの抗体を有し、そしてインビボ静脈内投与から約４８時間後に平均してリポソームあたり約２０未満の抗体を有する。
【０１０８】
別の態様では、本発明は標的化抗体を欠く類似のリポソーム製剤のＡＵＣの３０％以内、好ましくは２５％以内、より好ましくは２０％以内のＡＵＣを有するイムノリポソーム製剤を提供する。別の態様では、本発明は標的化抗体を欠く類似のリポソーム製剤の用量標準化ＡＵＣの３０％以内、好ましくは２５％以内、より好ましくは２０％以内の用量標準化ＡＵＣを有するイムノリポソーム製剤を提供する。
【０１０９】
イムノリポソーム組成物の抗腫瘍効力を評価するために別の実験を行った。実施例７に記載するように、ＢＴ−４７４ヒト乳癌腫外植片を持つマウス（これは細胞の表面上にＨＥＲ２受容体を表すことが知られている）を、標準化抗体を持たない（対照）、またはリポソームあたり７．５、１５、３０もしくは４５の抗体を有するイムノリポソーム製剤で処置した。結果を図１０Ａ〜１０Ｂに示す。
【０１１０】
図１０Ａは塩水（白丸）、ドキソルビシンを含有するペグ化リポソーム（白四角）、またはリポソームあたり７．５（菱形）、１５（三角）、３０（黒四角）もしくは４５（黒丸）のｓｃＦｖ抗体を含むイムノリポソームを投与した後のマウスにおける相対的な腫瘍容積をパーセントで示す。塩水対照群（白丸）の腫瘍は、平均して２３．９±７．５日でサイズが４倍になった。４５：１、３０：１、１５：１および７．５：１の抗体：リポソーム比を有するイムノリポソーム製剤で処置した動物は、それぞれ３５．１±２．９、３２．９±４．４、３６．１±１．９および３８．０±０日より長い腫瘍容積の４倍化時間を有した。対照リポソーム製剤（Ｄｏｘｉｌ（商標）白四角）で処置した動物の腫瘍は、２９．２±６．０日以上でサイズが４倍の腫瘍を有した。３８日の実験の終わりに、４５：１、１５：１および７．５：１の抗体：リポソーム比を有するイムノリポソームを投与した各処置群から１匹の動物は、腫瘍が存在しないか、または小節サイズ＜１０ｍｍ３のいずれかであった。
【０１１１】
塩水対照と比較した時、リポソームもしくはイムノリポソームのドキソルビシンで処置したすべての動物に明らかな腫瘍の増殖の遅れがあった。ＨＥＲ２−標的化イムノリポソーム製剤で処置した動物は、非標準化リポソームのドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（商標））で処置した動物よりも腫瘍の増殖にわずかに長い遅れがあった。
【０１１２】
図１０Ｂは処置期間中、試験動物の体重における変化のパーセントを示す。
【０１１３】
まとめると、実験はこのＢＴ−４７４ヒト乳癌外植片モデルで、ドキソルビシンを封入したリポソーム、またはドキソルビシンを封入したイムノリポソームを用いた処置が対照動物と比較した時に抗腫瘍活性を生じることを示す。７．５〜４５にイムノリポソーム製剤中の抗体：リポソーム比を変動させることにより、抗腫瘍効力に差異はなかった。
【０１１４】
１５：１のイムノリポソーム製剤を、腫瘍を持つマウスにおけるインビボ用量範囲の評価に選択した。実施例８に記載するように、マウスはペグ化リポソームに封入されるか、もしくはイムノリポソームに封入された種々の投薬用量（２、３、４ｍｇ／ｋｇ）のドキソルビシンで処置された。すべてのマウスは３週間、毎週、適切な製剤の静脈内投与を受けた。腫瘍サイズは１週間に２回測定して腫瘍の容積を算出し、そして結果を図１１に示す。
【０１１５】
図１１は、胸部腫瘍移植片を持ち、そして塩水（白丸）で、２ｍｇ／ｋｇ（白四角）および３ｍｇ／ｋｇ（白菱形）の投薬用量でドキソルビシンを含有するペグ化リポソームで、または１５：１のイムノリポソーム製剤を２ｍｇ／ｋｇ（黒四角）、３ｍｇ／ｋｇ（黒菱形）もしくは４ｍｇ／ｋｇ（黒三角）の投薬用量で処置したマウスにおいて、時間（日で）の関数として初期腫瘍容積のパーセントとして取った相対的な腫瘍容積のプロットである。未処置対照動物（白丸）の腫瘍は、平均１１．１±１．９日の腫瘍容積３倍化時間（ＴＶＴＴ）を有した。２、３および４ｍｇ／ｋｇ（それぞれ白四角、菱形、三角）のリポソームのドキソルビシンで処置した動物は、それぞれ１６．７±４．８日、２６．０±３．９日および＞３４．２±９．０日の腫瘍容積３倍化時間（ＴＶＴＴ）を有した。１５：１のイムノリポソーム製剤で処置した動物は、２、３、および４ｍｇ／ｋｇの用量レベルでそれぞれ３４．２±６．６、２９．５±８．６および４９．０より長いＴＶＴＴ。
【０１１６】
腫瘍増殖の遅延は、未処置対照群と比較してすべての薬剤処置群で観察された。ペグ化リポソーム処置群について、明らかな用量応答関係があったが、イムノリポソーム処置群にはなかった。しかし４ｍｇ／ｋｇの１５：１のイムノリポソームでの処置は、腫瘍の増殖においてすべての他の処置群よりも長い遅れを生じたが、イムノリポソーム処置群に関する関係は明らかでなかった。２および４ｍｇ／ｋｇの１５：１のイムノリポソームを用いた処置は、４ｍｇ／ｋｇでマウスのペグ化リポソーム処置群に関する平均ＴＶＴＴよりも大きい平均ＴＶＴＴを提供した。さらに各用量で、１５：１のイムノリポソームに関する平均ＴＶＴＴは、マウスのペグ化リポソーム処置群よりも大きかった。
【０１１７】
実施例９に記載する別の実験では、封入されたドキソルビシンを含有し、そしてイムノリポソームあたり平均して１５のｓｃＦｖ抗体を持つイムノリポソーム製剤を、単回の静脈内注射を介して動物に３回の投薬用量で投与した。イムノリポソーム、ドキソルビシンおよび抗体の薬物動態学を決定し、そして結果の図１２〜１４に示す。
【０１１８】
図１２は、１０ｍｇ／ｍＬのドキソルビシン投薬用量で１５：１のイムノリポソーム製剤（丸）およびペグ化リポソーム（四角）のサルへの静脈内投与後に、時間（時間で）の関数としての血漿ドキソルビシン濃度を示す。イムノリポソームの血液循環寿命は、本質的にｓｃＦｖ抗体を欠くペグ化リポソームに等しい。
【０１１９】
図１３Ａ〜１３Ｂは、１ｍｇ／ｋｇ（丸）、５ｍｇ／ｋｇ（四角）および１０ｍｇ／ｋｇ（三角）のドキソルビシン投薬用量で１５：１のイムノリポソームの静脈内投与後に、時間（時間で）の関数として、血漿ドキソルビシン濃度（図１３Ａ）および血漿抗体濃度（図１３Ｂ）を示す。血漿中の全（遊離および封入）ドキソルビシン濃度は、投与後に時間の関数として減少する（図１３Ａ）。全（遊離およびイムノリポソームに会合）抗体濃度は、投与から４時間に大きな初期の減少を現し、続いてその後にゆっくりとした下降を現す。
【０１２０】
ドキソルビシン濃度に対する抗体の比は、図１３Ａ〜１３Ｂに提示するデータから決定し、そして図１４Ａ〜１４Ｂに示す。図１４Ａでは、血漿中のｓｃＦｖ抗体／ドキソルビシンの濃度の比（ｎｇ／μｇで）を図１４Ｂに示し、この比を初期の抗体／ドキソルビシン比に対して標準化し、そしてパーセントとして表す。両図において、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン投薬用量で投与されたイムノリポソームが、それぞれ菱形、四角および三角で確認される。両方のデータの表示は、投与から最初の４時間での抗体の損失を具体的に説明し、約４０％の抗体がリポソームから解離し、そして投与後８時間以内に血流から排除された。このデータは抗体の損失を具体的に説明し、これはイムノリポソームからの抗体の損失またはイムノリポソームから脂質−ポリマー−抗体構築物の損失であり得る。
【０１２１】
このように、イムノリポソームは約２４時間または４８時間の時間に、インビボ循環中に会合している抗体の２０〜５０％を失い、それでもイムノリポソームは細胞傷害性に十分なＨＥＲ２受容体への結合を保持するイムノリポソーム製剤が企図される。上で説明したように、非標的化リポソームのドキソルビシンに比べて、インビトロの細胞傷害性には約２より多い抗体が必要とされる。
【０１２２】
したがって、インビボ投与用のイムノリポソーム製剤の調製法が提供され、ここで疎水性部分−親水性ポリマー−抗体構築物は、イムノリポソームあたり第１の選択した抗体数を提供するために十分な第１の量で含まれる。イムノリポソームはインビトロもしくはインビボで血液と接触するようにされ、そしてリポソームと血液とが接触する１もしくは複数の時点でイムノリポソームあたりの抗体数が決定される。例えばインビトロの容器から血液のアリコートを取るか、または動物から血液サンプルが引き抜かれる。血液はラジオイムノアッセイ、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動等のような多数の適切な分析技術を使用して抗体の量について分析される。１より多くの時点での抗体数が決定されれば、血中での時間の関数として抗体の損失を示すプロットを構築することができる。この情報を使用して、血液と接触した後の選択した時点で抗体数が決定され、そして血液と接触した後にそのような時点でリポソームあたり少なくとも２の抗体を提供するために、第２の、リポソームあたりより高い数の抗体数を提供するために十分な疎水性部分−親水性ポリマー−抗体構築物の第２の量が選択される。次いでイムノリポソームは第２の量の構築物を使用することにより調製される。例えば投与から９６時間後、イムノリポソームあたり５の抗体を有することが望まれ、そして血液インキュベーションデータは約５０％の抗体がイムノリポソームから解離するか、またはそうではなく標的化受容体との相互作用に利用できなならば、イムノリポソームは最初に、インビボ投与前に少なくとも１０の抗体を含むべきである。一般に第２の量のコンジュゲート、すなわち投与前の初期の抗体数を提供するために選択されるコンジュゲートの量は、リポソームあたり５０未満の抗体、より好ましくはリポソームあたり３０以下の抗体を生じるように選択される。
【０１２３】
別の態様では、そして一部は上記の薬物動態学的データに基づき、この方法はリポソームあたり１５０未満の抗体、より好ましくはリポソームあたり１００以下の抗体、そしてさらにより一層好ましくはリポソームあたり７５以下の抗体を提供する第１の量のコンジュゲートを有するリポソームを提供することを含む。
【０１２４】
ＩＩＩ．使用法
リポソームは封入された形態で治療薬または診断薬を含む。封入は、リポソームの水性の芯および水性の空間の中への作用物質のカプセル化、ならびにリポソームの脂質二重層（１もしくは複数）への作用物質の封入を含むことを意図している。本発明の組成物に使用することを意図する作用物質は広く変動でき、そして治療および診断の応用に適する作用物質の例を以下に与える。
【０１２５】
投与される用量は、特定の作用物質の薬物動態学的特性、およびその投与様式および経路；受容体の年齢、健康および体重；症状の性質および程度、同時処置の種類、処置頻度および所望する効果といった既知の因子に依存して変動することができる。投薬用量は１回に、あるいは時間、日または週の選択した間隔で与える周期的用量となることができる。
【０１２６】
任意の投与経路が適切であるが、静脈内および他の非経口様式が好適である。
【０１２７】
別の観点では併用処置計画が意図され、ここで上記のイムノリポソーム組成物は第２の作用物質と組み合わせて投与される。第２の作用物質は、他の薬剤化合物ならびにペプチド、抗体等のような生物製剤を含め、任意の治療薬であることができる。第２の作用物質は、同じかまたは異なる投与経路により、イムノリポソームの投与と同時に、または順次に投与することができる。特に好適な組み合わせには、限定するわけではないが、シクロホスファミド、タキサン、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）およびＡｖａｓｔｉｎ（商標）を含む。Ｈｅｒ２−標的化リポソームは、ＤＯＸＩＬ（商標）のような非標的化リポソームで投与される同じ薬剤の均等な用量に比べて、より完全な腫瘍の後退を提供する。したがってＨｅｒ２−標的化イムノリポソームに封入された第１の細胞傷害性剤の用量および第２の治療薬を含んでなる処置計画が企図され、ここで１もしくは双方の作用物質は、予想される腫瘍の後退よりも大きいような改善された臨床的成果を達成するために、単独で投与される作用物質に必要とされる用量よりも少ない用量で投与される。またＨｅｒ２−標的化イムノリポソームは、２以上の作用物質と組み合わせて投与することもできると考えられる。特定の患者に適切な作用物質は、熟練した医療従事者により同定され得る。リポソームに封入された化学療法剤および２以上のさらなる作用物質を含有するＨｅｒ２−標的化イムノリポソーム組成物を含んでなる処置計画が企図され、ここで改善された臨床的成果を達成するために、少なくとも１つ、そして好ましくは１より多くの作用物質が、単独で与えた時の作用物質の推薦される用量よりも少ない用量で投与される。
【０１２８】
本明細書に記載する処置法は、１つの態様において、細胞あたり１０５より多くのＨＥＲ２受容体、そして好ましくは細胞あたり１０６より多くのＨＥＲ２受容体を発現している患者群に投与するために企図されている。細胞受容体の密度は免疫組織化学を使用して測定することができ、そしてそのような測定のためのＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）のようなキットを購入することができる。細胞あたり１０５より多く、好ましくは１０６より多くのＨＥＲ２受容体を発現している個体は、本明細書に記載する抗体が細胞によりインターナライズされ、細胞内に送達される薬剤が増えるので、本明細書に記載するＨＥＲ２−標的化イムノリポソーム組成物に特に良く応答する。生検または適切な生物学的サンプルが患者から得られる方法では、サンプルをアッセイして腫瘍細胞あたりのＨＥＲ２受容体の数を測定し、そして受容体の数が細胞あたり１０６ＨＥＲ２受容体よりも多いならば、患者を本明細書に記載するイムノリポソーム組成物で処置する。１つの好適な態様では、患者は細胞あたり３＋（２，０００，０００）の受容体のＩＨＣスコアを有する。
【実施例】
【０１２９】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は本明細書に記載する本発明をさらに具体的に説明し、そして本発明の範囲をどのようにも限定するものではない。
材料：水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）はリポイド（ｌｉｐｏｉｄ）Ｋ．Ｇ．（ルードヴィヒスハーフェン、ドイツ）から購入した。コレステロールはクロダ（Ｃｒｏｄａ）社（ニューヨーク、ニューヨーク州）から受け、そしてＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン、ナトリウム塩（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）は、シンゲナ（Ｓｙｎｇｅｎａ）社（リースタール、スイス）から受けた。塩酸ドキソルビシンは明治製菓株式会社（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａ  Ｋａｉｓｈａ  Ｌｔｄ．）（東京、日本）から受けた。放射標識コンジュゲート（ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）は、０．０９８３ｍＣｉ／ｍＬの特異的活性でヘルメスバイオサイエンス（Ｈｅｒｍｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（サンフランシスコ、カリフォルニア州）から受けた。ヒト血漿はバイオレクラメーション（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）（イーストメドウ、ニューヨーク州）から受けた。カラム成分−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂはアマシャム  ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ウプサラ、スウェーデン）から受け、溶出バッファー−塩化ナトリウム溶液（０．９％ＮａＣｌ）はバクスター（Ｂａｘｔｅｒ）（デアフィールド、イリノイ州）からであり、そして０．４％アジ化ナトリウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ州）を含んだ。
【０１３０】
実施例１
ＨＥＲ２−標的化イムノリポソームの調製
封入されたドキソルビシンを含有するリポソームは、カリフォルニア州、マウンテンビューのアルザコーポレーションから得た（ＤＯＸＩＬ（商標））。リポソームは水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ、５６．４モル％）、コレステロール（３８．３モル％）、およびメトキシポリエチレングリコール−ジ−ステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、５．３モル％、ｍＰＥＧＭＷ２０００Ｄａ）からなった。最終調製物中のドキソルビシンの濃度は１００μｇ／ｍＭ脂質であった。調製に使用した内部バッファーは１０％シュクロースであり、そして外部バッファーは１０％シュクロースおよび１０ｍＭヒスチジンであった。最終製剤におけるリポソームの平均直径は９３ｎｍであった。
【０１３１】
抗−ＨＥＲ２受容体ｓｃＦｖ抗体（配列番号２）は、上で簡単に検討し、そして図１Ａ〜１Ｂに具体的に説明するように、当該技術分野で周知な手順に従い脂質−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートを形成した。
【０１３２】
次いで脂質−ＰＥＧ−抗−ＨＥＲ２抗体構築物は、リポソームと脂質−ポリマー−抗体構築物のミセル懸濁液をインキュベーションすることによりドキソルビシンを装填したリポソームのリポソーム二重層と会合する。平均２、５、７．５、１５、３０、４５、７５、１００、１５０および３００の抗体を持つイムノリポソームは、１モルのリン脂質あたり加えた抗体の量を調整することにより表Ａにまとめるように調製した。
【０１３３】
【表４】
2008536944.tif 000005
【０１３４】
イムノリポソームあたりの理論的平均抗体数は、タンパク質およびリン脂質濃度を測定し、そして１００ｎｍのリポソームあたり平均８０，０００のリン脂質および２８．７１４ｋＤａの抗体分子量に基づき算出することにより確認した。イムノリポソーム中の抗体の数は、抗体の分子量、リポソームのサイズおよびリポソームの組成を測定することにより決定することができる。例えば１５：１のイムノリポソーム製剤に関して、１５モルのｓｃＦｖ抗体／８０，０００モルのリン脂質×２８．７１４ｋＤａ＝５．４ｇ／モル。インキュベーション中、９０％のコンジュゲートがリポソームに挿入もしくは会合すると仮定すると：５．４／９０％＝６μｇのｓｃＦｖ抗体を１μｍｏｌｅのリン脂質あたり加える。すなわち本明細書に報告されるイムノリポソームあたりの抗体数は、リポソーム集団における抗体の平均分布を反映し、報告する数は集団におけるリポソームあたりの抗体の平均数である。
【０１３５】
脂質−ポリマー−抗体コンジュゲートとリポソームとの会合後、ドキソルビシン濃度は８６〜９２μｇ／ｍＭ脂質であり、そして後のイムノリポソームの平均直径は９３〜１１７ｎｍであった。
【０１３６】
実施例２
イムノリポソームのインビトロ取り込み
ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ７細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）から購入した。ＳＫ−ＢＲ−３細胞は、１０％ウシ胎児血清を補充したマッコイの５Ａ（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ）改良培地中のインビトロカルチャー中で維持した。ＭＣＦ細胞は、１０％ウシ胎児活性を含むダルベッコの改良イーグル培地で維持した。
【０１３７】
ウェルあたり１．５×１０５細胞／０．５ｍＬの成長培地で、ＳＫ−ＢＲ−３またはＭＣＦ−７細胞を２４ウェルプレートに加えた。付着および順化のために一晩インキュベーションした後、細胞をイムノリポソーム（７：５：１、１５：１、３０：１および４５：１の抗−ＨＥＲ２抗体：リポソーム）で、または０．５ｍＬ成長培地／ウェル中、０．０１５ｍｇ／ｍＬのリポソームで２連で処理した。次いで２４ウェルプレートをインキュベーターの内側の回転台上に置き、４０〜６０ｒｐｍで３７℃、５％ＣＯ２および１００％の湿度で４時間回転させた。インキュベーション後、細胞培地を吸引し、そして細胞をハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）で４回洗浄した。この後、細胞は０．１ｍＬの１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を各ウェルに加えることにより溶解した。プレートは旋回させて混合し、そして回転台に室温で１５分間置いた。この工程中、細胞をプレートの底から脱着させ、そして細胞核は可視の凝集塊を形成した。酸性イソプロパノール（１．０ｍＬ）を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液を含有するウェルに加え、そして旋回もしくはピペットで上下させることにより可視凝集塊が消えるまで混合した。
【０１３８】
細胞溶解物中のドキソルビシン含量は、４７０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長を使用することにより分光光度計により測定した。分光光度計の設定は以下の通りであった：スリット幅２ｎｍ、積分時間１秒、光電子倍増管電圧９５０Ｖ、および１回の波長獲得様式。バックグラウンドの細胞溶解物の蛍光を差し引き、そして細胞溶解物中のドキソルビシンの量は二次多項式回帰を使用して標準曲線に合わせた同時に測定した標準（サンプルあたり１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００および２５００ｎｇ）から決定した。ドキソルビシンの細胞の取り込みは、標準曲線の内挿により決定した。データは播種した細胞あたりのドキソルビシンをｐｇで表し、そして表１に示す。検出未満の値は有意ではない（ＮＳ）とした。
【０１３９】
実施例３
ＨＥＲ２−標的化リポソームのインビトロ細胞傷害性
ＳＫ−ＢＲ−３ヒト乳癌腫細胞株を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）から購入した。細胞は、１０％ウシ胎児血清を補充したマッコイの５Ａ（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ）改良培地中のインビトロ培養中で維持し、そして加湿化インキュベーター中、３７℃で維持した。
【０１４０】
細胞を１０分間、遊離形態のドキソルビシン（１．８ｍｇ／ｍＬ）、ペグ化リポソームに封入されたドキソルビシン（２．０６ｍｇ／ｍＬ）、またはリポソームあたり２の抗体（１．８６ｍｇ／ｍＬ）、リポソームあたり５の抗体（２．１２ｍｇ／ｍＬ）、リポソームあたり７．５の抗体（１．９９ｍｇ／ｍＬ）もしくはリポソームあたり１５の抗体（２ｍｇ／ｍＬ）を有するイムノリポソーム製剤に暴露した。
【０１４１】
対数期ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞はＶｅｒｓｅｎｅ（１：５０００）を使用して回収し、成長培地に５×１０４細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。０．１ｍＬ（５×１０３細胞）のアリコートを９６ウェルプレートの適切なウェルに加えた。付着させるために一晩インキュベーションした後、培地を取り出し、そして試験物質と入れ替えた。成長培地で０．０１３７、０．０４１２、０．１２３５、０．３７、１．１１、３．３３、１０および３０μｇ／ｍＬに希釈した０．１ｍＬのドキソルビシン、Ｓ−ＤＯＸまたはＳＴＥＡＬＴＨ４９製剤バリアントのアリコートを、各ウェルに３連で加えた。試験物質を含まない培地を対照ウェルに加えた。細胞を試験品に３７℃で１０分間暴露した。インキュベーションの終わりに、薬剤を含む培地を吸引し、そして細胞を０．２ｍＬの成長培地で洗浄した。洗浄後、細胞を０．２ｍＬの新しい培地中で成長条件下にてさらに７２時間インキュベーションした。インキュベーションの終わりに、可視細胞の量をＰｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（増殖中の可視細胞の数を測定するためのテトラゾリウムに基づく比色法、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して測定した。簡単に説明すると、ウェルから培地を吸引し、そして０．１ｍＬの新しい培地および０．０２ｍＬのプロメガ（Ｌｏｔ  Ｎｏ．１８６８１７）に変えた。次いでプレートを３〜４時間インキュベーションし、その後、吸収はマイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで記録した。細胞の生育能は式：
％生育能＝（Ａ−Ａ０）／（Ａ１００−Ａ０）×１００％
式中、Ａは測定された吸収であり、Ａ０はブランクの吸収であり、そしてＡ１００は未処理細胞を含むウェルの吸収である、
を使用して未処理対照の％として算出した。細胞の生育能のパーセントは、薬剤濃度の関数としてプロットし、そしてＩＣ５０（５０％の細胞成長阻止を生じる濃度）を内挿により決定した。
【０１４２】
イムノリポソーム製剤に関して、対照の割合としての細胞の生育能は、図２Ａにまとめる。  
【０１４３】
実施例４
血漿中のリポソームからＨｅｒ２−標的化部分のインビトロ解離
実施例１に記載するように調製したドキソルビシンを含有するペグ化リポソームは、実施例１に記載のように調製した十分な１２５Ｉ−標識脂質−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートと合わせて、リポソームあたり７．５、１５、３０、４５および９０のｓｃＦｖ抗体を有するイムノリポソームを生成した。リポソームおよびコンジュゲートを６０℃で１時間インキュベーションして、コンジュゲートのリポソームの外側二重層への挿入を可能にした。インキュベーションの終わりに、溶液を冷却し、そして続いて２〜８℃で保存した。各リポソーム製剤を１０％シュクロース／１０ｍＭヒスチジンに透析し、そしてドキソルビシン含量を測定した。各製剤中のリポソームは、サイズ、ドキソルビシンのカプセル化、脂質−ＰＥＧ−抗体コンジュゲートの挿入パーセント、およびｓｃＦｖ抗体濃度について特性を決定し、これを表Ｂにまとめる。１５のｓｃＦｖ抗体を含む製剤の最終的な特異的活性は、２８．４μＣｉ／ｍＬであった。
【０１４４】
【表５】
2008536944.tif 000006
【０１４５】
リポソームからの１２５Ｉ標識の解離は、抗体、コンジュゲートもしくは両方の解離を示し、以下のように測定した。ヒト血漿を１２５Ｉ−標識ＨＥＲ２−標的化イムノリポソームと混合し、そして３７℃で９６時間にわたりインキュベーションした。各時点（０、１、４、８、７２、９６時間）で血漿のアリコートを取り出し、そして３２ｍＬのベット容量の２８×１．２ｃｍの調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラムに乗せた。このＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラムは、１ｍＬの１００ｍＭプラセボリポソームおよび１ｍＬのラット血漿で前調整された。カラムは０．４％アジ化ナトリウムを含有する０．９％塩水で溶出した。各画分（１ｍＬ）は、１２５Ｉ放射活性についてガンマカウンターを使用してカウントした。
【０１４６】
また各アリコートに関する全活性も測定し、そしてＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラムからの回収は添加した各サンプルについて〜９０％以上であった。すべての時点にわたり、添加したアリコートから回収された全画分に対して、カラムから少なくても９０％の放射活性の回収であった。結果を以下の表に示し、そして１５：１のイムノリポソーム製剤に関する溶出プロファイルは、図３Ａ〜３Ｈに示す。図４Ａは時間の関数としてイムノリポソーム製剤からの１２５Ｉの解離を示す。図４Ｂは時間の関数としてリポソームに残る１２５Ｉ標識のパーセントを示す。図５Ａは、２つの異なる実験においてリポソームあたり１５の抗体を有するイムノリポソーム製剤から１２５Ｉ標識の解離速度を表す。図５Ｂはリポソームあたり１５の抗体を有するイムノリポソーム製剤から血漿で誘導された１２５Ｉ標識の放出を示す。
【０１４７】
【表６】
2008536944.tif 000007
【０１４８】
実施例５
血漿中のリポソームからＨｅｒ２−標的化部分のインビトロ解離
１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体は、既知の技術を使用してヨウ素−ビーズを使用して調製した。簡単に説明すると、ｓｃＦｖ抗体（配列番号２）、Ｎａ［１２５Ｉ］、およびヨソ素−ビーズを合わせ、そして反応を室温で２０分間続けた。反応はチオ硫酸でクエンチした。過剰なＮａ［１２５Ｉ］を除去するために、反応した溶液をＤＧ−１０脱塩カラムを使用して分離した。最高量の放射活性を含む最初のピーク中の物質をプールし、そしてタンパク質濃度を評価し、これをＡ２８０を使用して測定した。ヨウ素化ｓｃＦｖ抗体は最後に滅菌のために０．２μｍのフィルターを通し、そして４℃に保存した。物質は１カ月以内に使用した。
【０１４９】
リポソームあたり１５の抗体を有するイムノリポソームは、形成されたリポソームを１２５Ｉ標識ｓｃＦｖ抗体−ＰＥＧ−脂質コンジュゲートと６０℃で１時間インキュベーションすることにより上記のように調製した。インキュベーションの終わりに、溶液を冷却し、続いて２〜８℃で保存した。次いでイムノリポソームを１０％シュクロース／１０ｍＭヒスチジンに透析し、そしてドキソルビシン含量を測定した。最終的なドキソルビシン含量は２．１ｍｇ／ｍＬであった。製剤のサンプルは、サイズ＝９６ｎｍ、ｐＨ＝６．５、％ドキソルビシン＝９９％、抗体挿入のパーセント＝８９％、および抗体濃度＝４９μｇ／ｍＬと特性決定された。イムノリポソームの最終的な特異的活性は０．０１８ｍＣｉ／ｍＬであった。
【０１５０】
遊離の１２５Ｉ−ｓｃＦｖ抗体−ＰＥＧ−脂質は、１０％シュクロース／１０ｍＭヒスチジンで４９μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。十分な放射標識コンジュゲートを提供するために、冷却ｓｃＦｖ抗体−ＰＥＧ−脂質コンジュゲートを溶液に加えて、０．５μＣｉ／ｍＬの最終的な特異的活性を生じた。
【０１５１】
約１１週齢および体重３５８〜３７６ｇの９匹のオスＣＤ−１ラット（チャールズリバーラボラトリー：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に使用した。動物は少なくとも１週間、研究室の条件に慣らした。
【０１５２】
０日に、投与前、すべての動物は齧歯類のホットボックス（ｈｏｔｂｏｘ）中で暖めた。動物は手で拘束し、そして１２５Ｉ標識イムノリポソームまたは遊離１２５Ｉ−Ｆ５コンジュゲートのいずれかを外側の尾の静脈を介して単回の静脈内ボーラスを投与した。ラットあたり投与した用量は、約２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンおよび４９ｍｇ／ｋｇの抗体−ＰＥＧ−脂質コンジュゲートであった。
【０１５３】
体重および臨床的所見は、投与の日（０日）に記録した。カゴの中での所見は４日間、
毎日行った。血液サンプルは後眼窩洞を介して吸入麻酔（イソフルオラン／Ｏ２）下でヘパリン処理したミクロ遠心管に集めた。６匹のラットにイムノリポソームを投与し、そして血液サンプル（〜１．２ｍＬ）は投与から約５分、そして１、３、８、２４、４８、７２および９６時間後に集めた（１回の時点あたり３匹の動物）。３匹のラットに抗体−ＰＥＧ−脂質−コンジュゲートを投与し、そして血液サンプル（〜０．６ｍＬ）は投与から約５分、そして１、３、８、２４および４８時間後に集めた。
【０１５４】
各動物からの１００μＬの全血サンプルのアリコートは、ガンマカウンターを使用して１２５Ｉについてカウントした。残りの血液サンプルは４〜８℃で２５００ＲＰＭ（〜７５０×ｇ）で２０分間遠心して血漿を集めた。血漿サンプルのアリコート（５０もしくは１００μＬ）を確保し、そして１２５Ｉについてカウントした。イムノリポソームを投与したラットについて、別の組の血漿サンプルを−４０℃で保存し、そして分光光度計を使用してドキソルビシン濃度について後でアッセイした。血漿の残りはサイズ排除カラムを通して溶出し、そして遊離物をリポソーム結合抗体−ＰＥＧ−ＤＳＰＥコンジュゲートから分けた。カラムは約２２ｍＬのＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂビーズを含んだ。カラムのバッファー溶液（０．９％塩水および０．０２％ＮａＮ３）は、約０．５ｍＬ／分の流速で重力により送った。
【０１５５】
すべてのサンプルについて、リポソーム画分に付随するｓｃＦｖ抗体に対応する１つの主要ピークが１０〜１５画分付近で観察された。リポソーム画分を越えた画分から回収された放射活性は、「遊離ｓｃＦｖ抗体」と考えられた。すなわち血漿タンパク質に会合したか、または包含されたかもしれないミセルもしくは単量体のｓｃＦｖ抗体−ＰＥＧ−ＤＳＰＥコンジュゲート。各１ｍＬの約４０画分が集められ、そして１２５Ｉについてカウントされた。
【０１５６】
表Ｃはリポソーム画分および遊離解離画分に付随する抗体の回収濃度を示す。結果を図６Ａ〜６Ｃに示す。
【０１５７】
【表７】
2008536944.tif 000008
【０１５８】
薬物動態学的パラメーター
全血および血漿サンプルは、パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）のＣｏｂｒａ５０１０ガンマカウンター（シリアル＃４０１６１１）中で１２５Ｉの放射活性（ＣＰＭ、１分あたりのカウント）についてカウントした。ＣＰＭは以下の式
％  Ｉｎｊ．＝［（観察されたＣＰＭ／ｍＬ）／（（ＣＰＭ／ｍＬ  Ｉｎｊ．
×Ｖｏｌ．Ｉｎｊ）／ＢＷ）×０．０６５］×１００
式中、Ｉｎｊ．：注射した；ＢＷ：体重；および０．０６５は動物の全血容量を見積もるために使用する（すなわち６．５％ＢＷ）、
に従い、注射した用量のパーセント（％）に転換した。血漿中の注射した用量のパーセントを算出するために、血漿容量を血液容量の６０％（０．６）と予想した。
【０１５９】
血液および血漿中の１２５Ｉの排除半減期（Ｔ１／２β）は、以下のように算出した：
Ｔ１／２β＝ｌｎ（２）／Ｋｅｌ
ここでｌｎ（２）＝０．６９３、そしてＫｅｌ（排除定数）＝（ｌｎ（Ｃ１）−ｌｎ（Ｃ２））／｜Ｔ１−Ｔ２｜、ここでＣ１およびＣ２はＴ１およびＴ２の時点での注射用量の平均パーセントに等しい。イムノリポソームを投与されたラットついては、Ｔ１およびＴ２はそれぞれ８時間および９６時間であり、一方、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥコンジュゲートを投与したラットについては、Ｔ１およびＴ２はそれぞれ５分および８時間であった。
【０１６０】
さらに血漿ドキソルビシン濃度は、分光光度計を使用して測定された。薬物動態学的パラメーター、例えば曲線下の面積（ＡＵＣ）、分布の定常状態容量（Ｖｓｓ）、クリアランス（ＣＬｔ）および半減期は、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ  Ｎｏｎｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ４．１を使用して算出された。
【０１６１】
生データは表Ｄに示す。薬物動態学的パラメーターは表２および図７Ａ〜７Ｂに示す。
【０１６２】
【表８】
2008536944.tif 000009
【０１６３】
実施例６
マウスへのイムノリポソームのインビボ投与
ＰＥＧのコーティングを有するリポソーム、およびリポソームあたり１５、７５、１５０および３００のｓｃＦｖ抗体を有するイムノリポソームは、実施例１に記載するように調製した。製剤は表Ｅにまとめる。
【０１６４】
【表９】
2008536944.tif 000010
【０１６５】
１１５匹（投与群あたり２１匹×５投与群に、さらに１０匹を加えて１１５）のメスＩＣＲマウスは、チャールズリバーから得た。動物は通例のプラスチック底のケージに、１２時間／１２時間の明／暗の照明サイクルのスケジュール下で収容し、食料と水を自由に与えた。動物は実験を開始する前に少なくとも１週間、研究室の条件に慣らした。
【０１６６】
投与の日を０日と考えた。使用したすべてのマウスに、対照の単回ボーラス注射、または上記のイムノリポソーム試験製剤の１つを外側の尾の静脈を介して投与した。投与容量は各個別の動物について算出し、そして０．２４〜０．３３ｍＬの範囲であった。マウスは注射前に齧歯類用のホットボックス中で暖められた。対照リポソームおよび１５：１および３００；１のイムノリポソーム製剤を投与したマウスは、約２．０ｍｇ／ｋｇで投与された。７５：１および１５０：１のイムノリポソーム製剤を投与したマウスは、それぞれ約２．４０および１．６５ｍｇ／ｋｇで投与された。
【０１６７】
血液サンプル（各〜１ｍＬ）は、製剤あたり各時点（５分、４、８、２４、４８、７２および９６時間）について３匹のマウスから集めた。血液サンプルは肝臓の門脈を介して吸入麻酔（酸素／イソフルラン）下でヘパリンをコートしたシリンジに集め、そして直ちにポリプロピレンエッペンドルフ管に移した。次いで血液サンプルは、約２５００ＣＰＭ（〜７５０ｘｇ）にて１０分間、３〜８℃での遠心まで、ウェットアイス上で保存した。血漿サンプルを集め、そして−４０℃で保管した。血漿サンプルおよび投与溶液は、ＬＣ／ＭＳ分析により全ドキソルビシンについてアッセイされた。
【０１６８】
平均血漿ドキソルビシン濃度は時間に対してプロットし（図９）、そして薬物動態学的パラメーターを算出するために使用した。血漿濃度はすべて個別の動物に由来するので、薬物動態学的パラメーターは、平均血漿ドキソルビシンＨＣｌ濃度を使用して算出し、したがって薬物動態学的パラメーターについて標準偏差は存在しない。薬物動態学的パラメーターは、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ  Ｖｅｒｓｉｏｎ４．０（ファルサイト（Ｐａｈｒｓｉｇｈｔ）社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を使用して算出した。薬物動態学的パラメーターを表３に示す。
【０１６９】
実施例７
インビボ効力
ＰＥＧのコーティングを有するリポソーム、およびリポソームあたり１５、７５、１５０および３００のｓｃＦｖ抗体を有するイムノリポソームを、実施例１に記載したように調製した。
【０１７０】
約４〜５週齢のメスのＮＣＲ．ｎｕ／ｎｕホモ接合体マウス（チャールズリバーラボラトリー、ホリスター、カリフォルニア州）を、得るために使用した。平均体重は約２５ｇであった。動物は隔離ケージに１２時間の明および暗サイクルで維持した。食料と水は自由に与えた。
【０１７１】
ＢＴ−４７４ヒト胸部細胞はインビトロ培養（１０μｇ／ｍＬのウシ  インスリン、３００ｍｇ／ｍＬのＬ−グルタミンおよび１０％のウシ胎児血清を補充したのＲＰＭＩ１６４０培地）で、３７℃にて加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中に維持した。対数期の乳癌細胞をシリプシン処理し、そして細胞培養フラスコから回収して、１６×１０７細胞／ｍＬの最終濃度を得た。各マウスの首領域の後ろに皮下注射を行った（０．１ｍＬ中に１６×１０６細胞）。腫瘍形成性を上げるために、腫瘍細胞の接種２、３日前、各マウスにエストラジオールペレット（０．７２ｍｇの１７βエストラジオール、イノベイティブ  リサーチ  オブ  アメリカ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、サラソータ、フロリダ州）も皮下に移植した。処置は、平均腫瘍容積が約８０ｍｍ３に達した時、腫瘍細胞の接種から２３日後に開始した。
【０１７２】
５匹の動物を各処置群に割り当てた。種々の抗体：リポソーム比を含むイムノリポソーム製剤を適切に希釈し、そして約０．２ｍＬの容量で、真鍮のレストレイナー中で暖められて（４０℃）拘束されているマウスの側方の尾の静脈に静脈内投与した。各注射の直前に、マウスは加熱光バルブを備えた十分に換気したアクリル製の箱の中で暖めておいた。対照リポソーム（Ｄｏｘｉｌ（商標））での処置も含め、そして陽性対照とした。塩水で処置した動物は陰性対照とした。処置群に使用したドキソルビシン用量は、１週間につき（ｑｗ）約４ｍｇ／ｋｇであり、そして処置を２週間続行した。
【０１７３】
動物の体重を１週間に２回測定して、薬物の毒性を評価した。動物は体重の損失＞１５％起こった時、または異常な事態が発生した場合、実験から除き、そして安楽死させた。臨床的所見には、行動、ケージ内での活動、脱水、および疼痛もしくは疲労の兆候を含んだ。すべての臨床的所見は、実験のフォルダーに記録された。実験期間の終わりに、すべての動物は安楽死のＡＶＭＡパネル（１９９３）に従い、１００％の二酸化炭素の吸入により安楽死させた。
【０１７４】
腫瘍は、３８日まで１週間に２回、３つの寸法で測定した。腫瘍容積は式：
Ｖ＝１／２×Ｄ１×Ｄ２×Ｄ３；
式中、Ｄ１−３はミリメートル（ｍｍ）で測定された垂直方向の直径である、
に従い算出した。
【０１７５】
腫瘍がその初期容積の４倍に増殖する（４×）ために必要な時間と定められる腫瘍容積の４倍化時間（ＴＶＱＴ）を（処置の時点で）、実験の終点として使用した。ＴＶＱＴは各処置群について決定し、そして平均±標準誤差（ＳＥ）として日で表す。
【０１７６】
種々の処置群間における腫瘍の増殖における遅れの統計的分析は、スチューデント検定により行った。
【０１７７】
結果を図１０Ａ〜１０Ｂに示し、そして表Ｆにまとめる。
【０１７８】
【表１０】
2008536944.tif 000011
【０１７９】
実施例８
インビボ用量範囲実験
およそ４〜５週齢のメスの無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス（ハーランラボラトリー（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、インディアナ州）をこの実験に使用した。平均体重は約２０ｇであった。動物を隔離ケージに１２時間の明−および−暗サイクルで維持した。食料と水は自由に与えた。
【０１８０】
ＢＴ−４７４ヒト胸部細胞をインビトロ培養（１０μｇ／ｍＬのウシ  インスリン、３００ｍｇ／ｍＬのＬ−グルタミンおよび１０％のウシ胎児血清を補充したのＲＰＭＩ１６４０培地）で３７℃にて加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で維持した。対数期の乳癌細胞をシリプシン処理し、そして細胞培養フラスコから回収して、１５×１０７細胞／ｍＬの最終濃度を得た。各マウスの首領域の後ろに皮下注射を行った（０．２ｍＬ中に３０×１０６細胞）。腫瘍形成性を上げるために、腫瘍細胞の接種２、３日前に各マウスにエストラジオールペレット（０．７２ｍｇの１７βエストラジオール、イノベイティブ  リサーチ  オブ  アメリカも皮下に移植した。処置は、すべての処置群について平均腫瘍容積が約１０６〜１２６ｍｍ３の範囲になった時、腫瘍細胞の接種から１７日後に開始した。
【０１８１】
処置群を表Ｇにまとめる。７匹の動物を各処置群に割り当てた。リポソームおよびイムノリポソーム製剤は、約０．２ｍＬの容量で、真鍮のレストレイナー中で暖められて（４０℃）拘束されているマウスの側方の尾の静脈に静脈内投与（ＩＶ）した。各注射の直前に、マウスは加熱光バルブを備えた十分に換気したアクリル製の箱の中で暖めておいた。リポソーム製剤およびイムノリポソーム製剤に使用したドキソルビシン用量は、２、３または４ｍｇ／ｋｇであった。すべての処置は、１週間に１回、３週間続行した。
【０１８２】
【表１１】
2008536944.tif 000012
【０１８３】
腫瘍は、４９日まで１週間に２回、３つの寸法を測定した。腫瘍容積は式：
Ｖ＝１／２×Ｄ１×Ｄ２×Ｄ３；
式中、Ｄ１−３はミリメートル（ｍｍ）で測定された垂直方向のの直径である、
に従い算出した。
【０１８４】
腫瘍がその初期容積の３倍に増殖する（３×）ために必要な時間と定められる腫瘍容積の３倍化時間（ＴＶＴＴ）を（処置の時点で）、実験の終点と使用した。腫瘍容積の３倍化時間は各処置群について決定し、そして平均±標準誤差（ＳＥ）として日で表す。動物の体重は１週間に２回測定し、薬剤の毒性を評価した。
【０１８５】
種々の処置群間における腫瘍の増殖における遅れの統計的分析は、スチューデント検定により行った。結果を図１１に示す。
【０１８６】
実施例９
インビトロ薬物動態学的および毒性試験
３〜８年齢で、体重が２．５〜４．５ｋｇの３８匹のナイーブなカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、１群に３匹のオスおよび３匹のメスを含む６つの処置群に無作為に割り当て、表Ｈにまとめた。
【０１８７】
【表１２】
2008536944.tif 000013
【０１８８】
平均して１５の単鎖抗−ＨＥＲ２抗体を有するイムノリポソームを上のように調製した。１日目に、動物には単回のゆっくりした静脈内注射（〜１ｍＬ／分）を末梢静脈に与え、そして投与後２８日間、監視した。臨床的所見および食料摂取の監視は、少なくとも１日１回行った。体重は１週間に２回測定した。血液は血液学および血清化学分析のために投与前および１（投与から１時間後）、４、１４および２８日目に集めた。血液は毒物動態学的分析のために、投与前および投与が完了してから５分、１、４、８、２４、４８、７２および９６時間後に集めた。血液サンプルは血漿のドキソルビシンおよび抗体濃度について分析した。結果を図１２〜１４に示す。
【０１８９】
実施例１０
インビトロ反復投与毒性実験
３〜８年齢で、体重が２．５〜４．５ｋｇの７０匹のナイーブなカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、１群に５匹のオスおよ５３匹のメスを含む７つの処置群に無作為に割り当て、表Ｉにまとめた。
【０１９０】
【表１３】
2008536944.tif 000014
【０１９１】
ＨＥＲ２細胞受容体への結合親和性を有し、平均して１５の単鎖抗体を有するイムノリポソームを上のように調製した。動物には４週間毎に１回、全部で６回処置するために示した用量を静脈内に与えた。血液は血液学および血清化学分析のために投与前および選択した時点に集めた。血液サンプルは血漿のドキソルビシンについて分析し、そして結果を図１５Ａ〜１５Ｃに示す。
【０１９２】
多数の例示的観点および態様をこれまで検討してきたが、当業者は特定の修飾、交換、付加およびそれらの部分的組み合わせを認識するだろう。したがって添付する特許請求の範囲および今後導入する特許請求の範囲は、そのようなすべての修飾、交換、付加および部分的組み合わせが本発明の真の精神および範囲内にあることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】１Ａ〜１Ｂは、脂質−ポリマー−抗体−コンジュゲートの調製に関する合成反応スキームを示し、ここでポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ビス（アミン）のＤＳＰＥカルバメートのマレイミドが形成される。
【図２】２Ａは、遊離薬剤（三角）、リポソームに封入された薬剤（丸）、またはリポソームあたり２（丸）、５（四角）、７．５（菱形）もしくは１５（三角）の抗体を含むイムノリポソームに封入された薬剤として投与されたドキソルビシンに１０分間暴露された後に、未処理対照細胞のパーセントとしてドキソルビシン濃度の関数としてμｇ／ｍＬで表される細胞の生育能を示す。  ２Ｂは、遊離薬剤（菱形）、リポソームに封入された薬剤（三角）、またはリポソームあたり７．５（×記号）、１５（★記号）、３０（丸）もしくは４５（四角）の抗体を含むイムノリポソームに封入された薬剤として投与されるドキソルビシンに４時間暴露された後に、未処理対照細胞のパーセントとしてドキソルビシン濃度の関数としてμｇ／ｍＬで表される細胞の生育能を示す。
【図３】３Ａ〜３Ｈは、ヒト血漿中でイムノリポソームのインキュベーション中に取り出したアリコートからリポソームあたり１５のｓｃＦｖ抗体を有するイムノリポソームから、放射標識（１２５Ｉ）ｓｃＦｖの溶出プロファイルを示し、アリコートは０時間（図３Ａ）、１時間（図３Ｂ）、４時間（図３Ｃ）、８時間（図３Ｄ）、２４時間（図３Ｅ）、４８時間（図３Ｆ）、７２時間（図３Ｇ）および９６時間（図３Ｅ）の時点で取り出した。
【図４】４Ａは、インビトロのヒト血漿中、７．５：１（菱形）、１５：１（四角）、３０：１（丸）、４５：１（三角）および９０：１（★）の抗体／リポソーム比を有するイムノリポソーム製剤から１２５Ｉ標識ｓｃＦｖ抗体の解離を、インキュベーション時間（時間で）の関数として示す。  ４Ｂは、インビトロのヒト血漿中、７．５：１（菱形）、１５：１（四角）、３０：１（丸）、４５：１（三角）および９０：１（★）の抗体／リポソーム比を有するイムノリポソーム中に留まる１２５Ｉ標識のパーセントを、インキュベーション時間（時間で）の関数として示す。
【図５】５Ａは、２つの異なる実験で（菱形、四角）インビトロのヒト血漿中、リポソームあたり１５の抗体を有するイムノリポソーム製剤から解離した放射標識抗体のパーセントを、インキュベーション時間（時間で）の関数として示す。  ５Ｂは、ヒト血漿中、リポソームあたり１５の抗体を有するイムノリポソーム製剤中に留まる（菱形）およびからイムノリポソーム製剤からイムノリポソーム製剤から解離した（四角）放射標識抗体のパーセントを、インキュベーション時間（時間で）の関数として示す。
【図６】６Ａは、１５：１のイムノリポソーム製剤をラットに投与した後、血漿サンプルのリポソーム画分で回収される１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体のパーセントを時間（時間で）の関数として示す。  ６Ｂは、１５：１のイムノリポソーム製剤をラットに投与した後、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラムで分離した後のラット血漿のリポソーム画分で回収された１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体の濃度（ｎｇ／ｍＬで）を時間（時間で）の関数として示す。  ６Ｃは、１５：１のイムノリポソーム製剤をラットに投与した後、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラムで分離した後のラット血漿の遊離または血漿画分で回収された１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体の濃度（ｎｇ／ｍＬで）を時間（時間で）の関数として示す。
【図７】７Ａは、１５：１のイムノリポソーム製剤をラットに投与した後、血漿（菱形）、血液（黒四角）に残る１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖのパーセント、および血漿（三角）中のドキソルビシンのパーセントを、時間（時間で）の関数として示す。また遊離コンジュゲートとして２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン用量でラットに投与した後に、血漿（白円）および血液（白四角）中の１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体のパーセントも時間（時間で）の関数として示す。  ７Ｂは、１５：１のイムノリポソーム製剤を２ｍｇ／ｋｇの用量でラットに投与した後、ドキソルビシンの血漿濃度を（μｇ／ｍＬで）時間（時間で）の関数として示す。
【図８】１５：１のイムノリポソーム製剤をラットに投与した後、時間（時間で）の関数として血中ドキソルビシンに対する１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖ抗体比のプロットである。
【図９】ドキソルビシンを含有するペグ化リポソーム（菱形）またはリポソームあたり１５（四角）、７５（三角）、１５０（×）もしくは３００（★）のｓｃＦｖ抗体を含有するイムノリポソームのインビボ投与後に、時間（時間で）の関数として血漿ドキソルビシン濃度（μｇ／ｍＬで）のプロットである。
【図１０】１０Ａ〜１０Ｂは、初期の腫瘍サイズに対するパーセントでの腫瘍容積（図１０Ａ）、ならびに胸部腫瘍外植片を持ち、そして塩水（白丸）、ドキソルビシンを含有するペグ化リポソーム（白四角）またはリポソームあたり７．５（菱形）、１５（三角）、３０（黒四角）もしくは４５（黒丸）のｓｃＦｖ抗体を含有するイムノリポソームで処置したマウスの体重の変化のパーセント（図１０Ｂ）を示す。
【図１１】胸部腫瘍外植片を持ち、そして塩水（白丸）、ドキソルビシンを２ｍｇ／ｋｇ（白四角）および３ｍｇ／ｋｇ（白菱形）の投薬用量で含有するペグ化リポソーム、または２ｍｇ／ｋｇ（黒四角）、３ｍｇ／ｋｇ（黒菱形）もしくは４ｍｇ／ｋｇ（黒三角）の投薬用量の１５：１のイムノリポソーム製剤で処置したマウスを対象とした、初期の腫瘍容積のパーセントとして取った相対的腫瘍容積の時間（日で）の関数としてのプロットである。
【図１２】リポソームあたり平均１５のｓｃＦｖ抗体を持つイムノリポソームに封入された（丸）、またはペグ化リポソームに封入された（四角）ドキソルビシン（１０ｍｇ／ｍＬ）のサルへの静脈内投与後、時間（時間で）の関数としての血漿ドキソルビシン濃度（ｎｇ／ｍＬ）のグラフである。
【図１３】１３Ａは、リポソームあたり平均１５のｓｃＦｖ抗体を持つイムノリポソームに封入されたドキソルビシンのサルへの静脈内投与後、時間（時間で）の関数としての血漿中のドキソルビシン濃度（ｎｇ／ｍＬ）のグラフであり、ドキソルビシンは１ｍｇ／ｋｇ（丸）、５ｍｇ／ｋｇ（四角）および１０ｍｇ／ｋｇ（三角）の投薬用量で投与された。  １３Ｂは、リポソームあたり平均１５のｓｃＦｖ抗体を持つイムノリポソームに封入されたドキソルビシンのサルへの静脈内投与後、時間（時間で）の関数としての血漿中の抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）のグラフであり、イムノリポソームは１ｍｇ／ｋｇ（丸）、５ｍｇ／ｋｇ（四角）および１０ｍｇ／ｋｇ（三角）のドキソルビシン投薬用量で投与された。
【図１４】１４Ａは、リポソームあたり平均１５のｓｃＦｖ抗体を持つイムノリポソームに封入されたドキソルビシンのサルへの投与後、時間（時間で）の関数としての血漿中の抗体／ドキソルビシン比（ｎｇ／μｇ）のプロットであり、イムノリポソームは１ｍｇ／ｋｇ（菱形）、５ｍｇ／ｋｇ（四角）および１０ｍｇ／ｋｇ（三角）のドキソルビシン投薬用量で投与された。  １４Ｂは、リポソームあたり平均１５のｓｃＦｖ抗体を持つイムノリポソームに封入されたドキソルビシンのサルへの投与後、時間（時間で）の関数として、初期の抗体／ドキソルビシン比に対して標準化された血漿中のｓｃＦｖ抗体／ドキソルビシン濃度の比のプロットであり、イムノリポソームは１ｍｇ／ｋｇ（菱形）、５ｍｇ／ｋｇ（四角）および１０ｍｇ／ｋｇ（三角）のドキソルビシン投薬用量で投与された。
【図１５】１５Ａは、リポソームあたり平均１５のｓｃＦｖ抗体を持つイムノリポソームに封入されたドキソルビシンのサルへの投与後、時間（時間で）の関数としてのドキソルビシン濃度（ｎｇ／ｍＬ）のプロットであり、イムノリポソームは０．５ｍｇ／ｋｇ（四角）、２ｍｇ／ｋｇ（三角）および４ｍｇ／ｋｇ（逆三角）のドキソルビシン投薬用量で投与された。  １５Ｂは、リポソームあたり平均１５のｓｃＦｖ抗体を持つイムノリポソームに封入されたドキソルビシンのサルへの投与後、時間（時間で）の関数としてのドキソルビシン濃度（ｎｇ／ｍＬ）のプロットであり、イムノリポソームは４ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン投薬用量で、６カ月間にわたり６回投与され、データは第１回（逆三角）および６回目（四角）の投与に対応する。  １５Ｃは、ペグ化リポソーム中に封入された遊離形の４ｍｇ／ｋｇドキソルビシン（三角）（ＤＯＸＩＬ（商標）；四角）、またはリポソームあたり平均１５のｓｃＦｖ抗体を持つイムノリポソームに封入されたドキソルビシン（逆三角）のサルへの投与後、時間（時間で）の関数としてのドキソルビシン濃度（ｎｇ／ｍＬ）のプロットである。
【図１Ａ】
2008536944.tif 000015
【図１Ｂ】
2008536944.tif 000016
【図２Ａ】
2008536944.tif 000017
【図２Ｂ】
2008536944.tif 000018
【図３Ａ−３Ｈ】
2008536944.tif 000019
【図４Ａ】
2008536944.tif 000020
【図４Ｂ】
2008536944.tif 000021
【図５Ａ】
2008536944.tif 000022
【図５Ｂ】
2008536944.tif 000023
【図６Ａ】
2008536944.tif 000024
【図６Ｂ】
2008536944.tif 000025
【図６Ｃ】
2008536944.tif 000026
【図７Ａ】
2008536944.tif 000027
【図７Ｂ】
2008536944.tif 000028
【図８】
2008536944.tif 000029
【図９】
2008536944.tif 000030
【図１０Ａ】
2008536944.tif 000031
【図１０Ｂ】
2008536944.tif 000032
【図１１】
2008536944.tif 000033
【図１２】
2008536944.tif 000034
【図１３Ａ】
2008536944.tif 000035
【図１３Ｂ】
2008536944.tif 000036
【図１４Ａ】
2008536944.tif 000037
【図１４Ｂ】
2008536944.tif 000038
【図１５Ａ】
2008536944.tif 000039
【図１５Ｂ】
2008536944.tif 000040
【図１５Ｃ】
2008536944.tif 000041
【配列表】
2008536944000001.xml