(57)【要約】  本発明は、新奇のオステオプロテゲリン・バリアントタンパク質（OVP）に関し、それらはそれらのリガンドTRAILに対して野生型オステオプロテゲリンと比較して低減した結合アフィニティーを示す。また、これらのOVPをコードする核酸を提供する。また、これらのOVPを発現する組換えベクターと宿主細胞を、組換えOVPを作製する方法として含む。本発明はまた、これらのOVPを含む組成物、並びに増大した骨代謝回転及び／または喪失を特徴とする骨疾患を治療する方法に関する。本発明のOVPは骨吸収を予防するのに有用であり、骨粗しょう症、カルシウム血症、骨のパジェット病、多発性骨髄腫、骨癌、及び関節リュウマチまたは骨髄炎による骨喪失等の異常な骨代謝回転または骨喪失を引き起こすいずれかの状態を治療するために用いられて良い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型OPGと比較して少なくとも1つの改変を含むOPGバリアントタンパク質であって、RANKLに対する結合アフィニティーを維持しているが、野生型OPGと比較してTRAILに対する低減した結合アフィニティーを示すOPGバリアントタンパク質。
【請求項２】
アミノ酸残基102-130に含まれる領域に少なくとも1つの改変を含む、請求項１に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項３】
残基102、111、115、122、128、または130位で少なくとも1つのアミノ酸置換を含む請求項２に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項４】
残基107-118を含むループ構造内に少なくとも1つの改変を含む、請求項２に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項５】
残基115での改変を含む、請求項４に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項６】
115位のIleがThr、Met、Val、Asp、Gly、Ser、またはArgで置換される、請求項５に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項７】
残基122での改変を含む、請求項２に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項８】
122位のArgがGly、Gln、Ser、Asn、またはGluで置換される、請求項７に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項９】
残基128での改変を含む、請求項２に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項１０】
128位のPheがVal、Ala、Leu、Ile、またはSerで置換される、請求項９に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項１１】
残基130での改変を含む、請求項２に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項１２】
130位のValがGluまたはAlaで置換される、請求項１１に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項１３】
少なくとも2つの改変を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項１４】
残基122-130に含まれる領域に少なくとも2つの改変を含む、請求項１３に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項１５】
（i）R122NとI115M；
（ii）R122ＮとI115M；
（iii）F128SとI115M；
（iv）F128IとI115M；及び
（v）F128LとI115M
からなる群から選択される少なくとも2つの改変を含む、請求項１４に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項１６】
残基122-130に含まれる領域に少なくとも1つの改変と、この領域外に少なくとも1つのさらなる改変を含む、請求項１３に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項１７】
残基31、40、51、100、155、167、または168のいずれか1ヶ所以上でさらなる改変が生じる、請求項１６に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項１８】
残基Gln21、Glu22、Thr23、Phe24、Pro25、Pro26、Lys27、Tyr28、Leu29、His30、Tyr31、Asp32、Glu33、Glu34、Thr35、Ser36、His37、Gln38、Asp42、Lys43、Pro45、Pro46、Thr48、Lys51、Gln52、His53、Cys54、Thr55、Ala56、Lys57、Trp58、Lys59、Thr60、Val61、Ala63、Pro64、Pro66、Asp67、His68、Tyr69、Asp72、Ser73、Trp74、Thr76、Ser77、Asp78、Glu79、Leu81、Tyr82、Ser84、Pro85、Val86、Lys88、Glu89、Leu90、Tyr92、Val93、Lys94、Gln95、Glu96、Asn98、Arg99、Thr100、His101、Val131、Gln132、Ala133、Gly134、Thr135、Pro136、Glu137、Arg138、Val141、Lys143、Arg144、Cys145、Pro146、Asp147、Gly148、Phe149、Phe150、Ser151、Asn152、Glu153、Thr154、Ser155、Ser156、Lys157、Ala158、Pro159、Cys160、Arg161、Lys162、His163、Thr164、Asn165、Cys166、Ser167、Val168、Phe169、Gly170、Leu171、Leu172、Leu173、Thr174、Gln175、Lys176、Gly177、Asn178、Ala179、Thr180、His181、Asp182、Asn183、Ile184、Cys185、Ser186、Gly187、Asn188、Ser189、Glu190、Ser191、Thr192、Gln193、Lys194、Cys195、Gly196、Ile197、Asp198、Val199、Thr200、またはLeu201のいずれか1ヶ所以上でさらなる改変が生じる、請求項１６に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項１９】
表１に示される改変のいずれか1つ以上を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項２０】
野生型OPGのものの少なくとも80%であるRANKLに対する結合アフィニティーを示す、請求項１から１９のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項２１】
実施例８に記載される測定条件の下で1nM未満のRANKLに対する50%有効濃度（nM）を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項２２】
野生型OPGのものの20%未満であるTRAILに対する結合アフィニティーを示す、請求項１から２１のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項２３】
実施例８に記載される測定条件の下で10nMより大きいTRAILに対する50%有効濃度（nM）を有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項２４】
前記OPGバリアントタンパク質がポリペプチドに接合している、請求項１から２３のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが免疫グロブリン定常ドメインである、請求項２４に記載のOPGバリアントタンパク質。
【請求項２６】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の少なくとも2つのOPGバリアントタンパク質を含む、二量体または多量体。
【請求項２７】
請求項１から２５のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
TRAILに対するOPGの結合アフィニティーを低減するための方法であって、OPGバリアントタンパク質を作製するためにOPGタンパク質またはその断片内の少なくとも1つのアミノ酸を改変する工程、及びTRAILに対する結合アフィニティーについて前記OPGバリアントタンパク質を試験する工程を含む方法。
【請求項２９】
OPGバリアントタンパク質を作製するために野生型OPGの残基102-130に含まれる領域内の少なくとも1つのアミノ酸を改変する工程、及びTRAILに対する結合アフィニティーについて前記OPGバリアントタンパク質を検査する工程を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
RANKLへのRANKの結合を阻害または低減するための組成物であって、請求項１から２６のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質と1つ以上の許容し得るキャリアーとを含む組成物。
【請求項３１】
RANKLへのRANKの結合を阻害または低減するための方法であって、RANKL分子を請求項１から２６のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質に接触させる工程を含む方法。
【請求項３２】
細胞においてRANKとRANKLの相互作用によって介在される生物学的効果を阻害または低減するための方法であって、前記細胞を請求項１から２６のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質に接触させる工程を含む方法。
【請求項３３】
被験者においてRANKとRANKLの相互作用によって介在される生物学的効果を阻害または低減するための方法であって、被験者に請求項１から２６のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質を投与する工程を含む方法。
【請求項３４】
被験者における自己免疫または免疫介在炎症性疾患の治療または予防のための方法であって、被験者に請求項１から２６のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質を投与する工程を含む方法。
【請求項３５】
被験者における心臓血管疾患の治療または予防のための方法であって、被験者に請求項１から２６のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質を投与する工程を含む方法。
【請求項３６】
RANKLによる破骨細胞の分化、活性化、及び／または生存を阻害または低減するための方法であって、破骨細胞または破骨細胞前駆体を含む組織を請求項１から２６のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質に接触させる工程を含む方法。
【請求項３７】
被験者におけるRANKLによる破骨細胞の分化、活性化、及び／または生存を阻害または低減するための方法であって、被験者に請求項１から２６のいずれか一項に記載のOPGバリアントタンパク質を投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RANKとRANKLの相互作用に介在される生物学的効果の制御に有用な進化させたタンパク質に関する。とりわけ本発明は、野生型オステオプロテゲリンと比較して結合特異性が異なる新奇のオステオプロテゲリンバリアントタンパク質（OVP）に関する。また、これらのOVPをコードする核酸を提供する。また、これらのOVPを発現する組換えベクターと宿主細胞を、組換えOVPを作製する方法として含む。本発明はまた、これらのOVPを含む組成物、及びRANKとRANKLの相互作用に介在される生物学的効果に関わる疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Rankリガンド（RANKL）／OPG／RANKの生化学的な軸は、骨粗しょう症、関節リウマチ、癌誘導性骨破壊、転移、カルシウム血症、及び痛みを治療するために上手く標的にされてきた（Hofbauer et al., Cancer 92 (3): 460-470, 2001）。また、OPG（Honore et al., Nature Medicine 6 (5): 521-528, 2000）、RANKLに対する抗体、または可溶性RANK-Fcタンパク質（Oyajobi et al., Cancer Res 61 (6): 2582-2578, 2001）を利用する治療法も開発中である。OPGと可溶性RANK-Fcタンパク質コンストラクトはRANKLに結合し、従ってRANKレセプターの活性化に利用可能なRANKLの量が減少する。
【０００３】
骨生物学において重要であるだけでなく、RANKLは、抗原特異的T細胞反応を制御することにより免疫系において役割を果たす（Anderson et al., Nature 390 (6656): 175-179, 1997）。RANKLは活性化されたT細胞上で高発現し、一方、RANKレセプターは成熟樹状細胞（DC）上で高いレベルで発現している。RANKLとRANK間の相互作用は共刺激シグナルとして作用し、それはDCの分化、サイトカインの産生、及び両細胞型におけるアポトーシスの減少をもたらすことにより、DCの生存とT細胞の増殖を促進する。移植された組織及び／または器官に対する寛容をもたらすための免疫治療は、RANK拮抗物質を用いることにより共刺激シグナルを阻害することによって達成し得る。共刺激を阻害することにより、DCによるT細胞の活性化が妨げられ、アロ反応性T細胞はアレルギー性になり、及び／またはアポトーシスを受ける（Adler et al., Current Opinion in Immunology 14: 660-665, 2002）。同様の作用メカニズムによって、RANKシグナル伝達を拮抗することは、自己免疫及び免疫介在炎症性疾患（全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、及び強直性脊椎炎等）に対する治療になり得るであろう。
【０００４】
オステオプロテゲリン（OPG）は腫瘍壊死因子（TNF）レセプターファミリーのタンパク質であり、Simonet et al.（Cell 89: 309-319, 1997）によって最初に記載された。
【０００５】
OPGは、骨の生成と代謝回転の自然な過程を制御するのに決定的な要素であると考えられる。OPGとその標的レセプターRANKLの間のバランスの変化は、異常な骨代謝に関わる多くの状態の中に認められる。
【０００６】
OPGは、骨粗しょう症、関節リウマチ、パジェット病、歯周病、道管病、及び骨に位置するまたは骨に転移する癌を含む増大した骨代謝回転と骨喪失に関わる種々の状態における、適用の可能性のある前臨床及び臨床試験を受けている（Lorenz et al., J. Amer Med Assoc 292: 490-495, 2004を参照）。OPGについての徹底的な動物試験が文献に報告されており、それは、骨喪失を低減するために現在用いられている他の治療法と比較して、同等以上の優れた成果を示している（Simonet et al., Cell 89: 309-319, 1997；Bolon et al., Cell Mol Life Sci 59: 1569-1576, 2002）。また、OPGは癌に関わる痛みを低減することも示されている（Luger et al., Cancer Research 61: 4038-4047, 2001）。
【０００７】
OPGについては、US-6,015,938、US-6,284,740、US-6,284,728、US-6,613,544、US-6,316,408、US-6,288,032、及びUS-6,369,027に詳細に記載されている。OPGの発現を欠失したトランスジェニックマウスについてはUS-6,087,555に記載されている。
【０００８】
OPGは、多発性骨髄腫患者と骨粗しょう症患者の両方において、骨代謝回転の低減のための第一相試験を受けている。骨粗しょう症に罹患した閉経後の女性における第一／二相予備試験において、OPGの単回投与により骨代謝回転のマーカーは、数日間で30-80%抑制されることが分かった（Bekker et al., J. Bone Miner Res 16: 348-360, 2001）。多発性骨髄腫患者はある範囲量のOPGで治療され、30日以上にわたり50%までの骨吸収の減少を示した（Body et al., Cancer 97: 887-892, 2003）。従って、前臨床試験と臨床試験の両方から、OPGは異常な骨代謝を特徴とする種々の状態において非常に有効な治療法でありそうだという非常に強力な証拠がある。
【０００９】
サイトカインの腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーとそれらに対応するレセプターは、相当数の構成分子を含み、構成分子間でリガンド−レセプター相互作用における実質的な交差反応がある（Igney, F. H. and Krammer, P. H. Nature Reviews Cancer 2: 277-288, 2002）。一般的にTNFレセプターは、2種類の反応、アポトーシス（プログラムされた細胞死）反応、または転写因子NFkBの活性化を介した細胞代謝経路への影響のどちらか一方を誘発する。また、レセプターファミリーはおとりとして作用する構成分子を含み、他のリガンド−レセプターペアのファミリー間の相互作用の効率を低下させる。OPGはこのレセプター類に属するようである。
【００１０】
多くのTNFレセプターファミリーの構成分子と比較して、OPGはその標的特異性において比較的制限されている。現在の知識によれば、OPGは2つのTNF様リガンドとのみ結合している。
【００１１】
１．RANKL（NFkBリガンドのレセプター活性化因子）、TNF様細胞表面分子は、通常、破骨細胞前駆体、樹状細胞、T細胞、及び造血性前駆体上に発現するTNFレセプターファミリー構成分子RANKと相互作用する（Kong et al., Nature 397: 315-323, 1999）。RANKLはRANKと細胞表面上で相互作用し、骨代謝回転に関わる主要な細胞である破骨細胞の産生と活性化を刺激する（Hsu, H. et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 3540-3545, 1999）。RANKLは間質細胞／造骨細胞上に発現している（Kong et al., Nature 397: 315-323, 1999）。OPGのRANKLとの相互作用は、RANKLのRANLへ結合する能力と破骨細胞を刺激する能力を阻害する。それが骨喪失を低減するその能力を与えるこのOPGの活性である。（Lacey et al., Amer J Pathol 157: 435-448, 2000；Simonet et al., Cell 89: 309-319, 1997）。RANKLに結合する二量体OPGの結合定数は、2と10nMの間の結合定数に位置する他の報告とともに、6.7nMであると報告されている（Willard et al., Protein Expr. Purif 20: 48-57, 2000）。
【００１２】
２．TRAIL（TNF関連アポトーシス誘導リガンド）、癌細胞におけるアポトーシスの誘導に関わるTNF様細胞表面分子。OPGは、TRAILに対する少数のおとりレセプターの1つとして見なされ、癌細胞を標的とするその能力を調節するように作用している（上に参照したIgney and Krammer, 2002において概説される）。従って、関連する部位に十分な量を提供した場合、OPGは癌細胞の生存を促進すると予測され、腫瘍細胞の生存を増大させるその能力が実証されている（例えば、Neville-Webbe et al., Breast Cancer Res Treat. 86: 271-282, 2004；Holen I. et al., Cancer Res. 62: 1619-1623, 2002）。TRAILに対するOPGのアフィニティーは、温度に応じて変化するかもしれない（Truneh et al., J. Biol Chem. 275: 23319-23325, 2000）が3nMであると報告されている（Emery et al., J. Biol Chem. 273: 14363-14367, 1998）。
【特許文献１】US-6,015,938
【特許文献２】US-6,284,740
【特許文献３】US-6,087,555
【非特許文献１】Simonet et al., Cell 89: 309-319
【非特許文献２】Igney, F. H. and Krammer, P. H. Nature Reviews Cancer 2: 277-288, 2002
【非特許文献３】Kong et al., Nature 397: 315-323, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
前記TRAIL活性を阻害するOPGの能力は、癌発症の危険性の増大をもたらし、この薬剤の治療としての使用を妨害するであろうものとして医学文献に言及されている。骨喪失を阻害する薬剤の適用分野としては、骨粗しょう症とパジェット病等であり、これらはそれ自体では生命を脅かすものではないが長期間の治療を必要とする。さらに、OPGの最も重要な可能性のある使用は、骨転移を有する癌患者の補助的治療においてである。これらの可能性のある適用分野のすべてにおいて、治療に関連して増大した癌細胞の成長と生存のいずれかの徴候は使用を妨害するものであろう。従って、TRAIL結合能を実質的に欠失したOPGの新奇バリアントを作製する必要がある。そのようなバリアントは、本来の抗癌メカニズムを重大に阻害する能力を欠失し、一方で、破骨細胞の形成と活性化、及び結果として生じる骨喪失を刺激するRANK／RANKL相互作用を阻害する能力を維持している。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は現在、TRAILに対して低減した結合アフィニティーと、TRAILとそのレセプターとの相互作用により生じる正常な生物学的効果を阻害する低減した能力とを示す新奇のOPGバリアントタンパク質（OVP）を作製している。
【００１５】
本発明のOVPの解析により、野生型OPGタンパク質配列の特定領域における点変異の焦点合わせが明白になる。特に、その変異はOPGの残基102-130に含まれる領域に集中している。本発明のOVPについて実施されたモデリング調査は、OPG／OVPのこの領域が、結合している間TRAILとRANKL両タンパク質との接触点を形成するという考えを支持している。従って、RANKLへの結合に影響を与えることなく、TRAILに対する結合アフィニティーを実質的に変え得るこの領域内の変異の同定は驚くべきである。
【００１６】
重要なことに、本発明のOVPはRANKLへ結合し、RANK-RANKL相互作用とこの相互作用の結果として生じる生物学的効果を低減または阻害する能力を維持している。本発明のOVPは、TRAIL作用の阻害により癌細胞の生存を促進するという非所望の効果を有することなく、骨代謝を調節する野生型OPGの能力を維持するであろうことが考慮される。
【００１７】
従って、本発明は野生型OPGと比較して少なくとも1つの改変を含むOPGバリアントタンパク質を提供し、前記OPGバリアントタンパク質は、RANKLに対する結合アフィニティーを維持しているが、野生型OPGと比較してTRAILに対する低減した結合アフィニティーを示す。
【００１８】
本発明のOPGバリアントは、欠失または全長の、一量体または二量体型のどちらかのOPGのいずれかのバリアントタンパク質を含み、それらは前記タンパク質への改変の結果としてTRAILへの結合が重大に低減し、一方で、RANKLへの結合を実質的に維持している。OVPの活性と野生型OPGのそれの間で比較する場合、その比較は、サイズと二量体化状態の点で同様の形態をとるタンパク質に基づいて実施される。
【００１９】
ある好ましい実施態様において、当該OPGバリアントタンパク質は、アミノ酸残基102-130に含まれる領域に少なくとも1つの改変を含む。例えば、当該タンパク質は、102、111、115、122、128、または130位で少なくとも1つのアミノ酸置換を含んで良い。
【００２０】
本発明はまた、二量体化を誘導するために、あるいはその安定性、発現、または生物学的半減期を維持または改善するために改変されたOVPを提供する。そのような改変は、アルブミン成分、Fc領域の付加、またはポリエチレングリコールでの置換、または当該OVPを二量体の形態で維持するように作用する延長部の付加を含んでも良い。
【００２１】
本発明はまた、本発明のOPGバリアントタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドはSEQ ID番号：１のバリアントであり、そのバリアントは、本発明の所望のOPGバリアントタンパク質をコードするような核酸の変化を含む。そのような核酸の変化を作製する方法は、当該技術分野において既知であり、文中に記載される。
【００２２】
また、当該コードされたタンパク質が同様のスペクトルの生物学的活性を維持するこの配列における変化を提供する。1つ以上の発現系において当該コードされたタンパク質の発現を改善するため、RNA安定性を増大させるために、当該ヌクレオチド配列を変化させても良く、あるいは偶然に当該核酸またはそのコードされたタンパク質の生物学的機能を減じない変化を含む。
【００２３】
本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。好ましくは、前記ベクターはポリヌクレオチドの複製及び／または発現に適している。前記ベクターは、複製開始点、好ましくは当該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、及び選択的に前記プロモーターの調節因子を備えた、例えば、プラスミド、ウイルス、またはファージベクターであって良い。前記ベクターは、1つ以上の選択マーカー、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、哺乳類発現ベクターにはネオマイシン耐性遺伝子を含んで良い。前記ベクターは、in vitroで、例えば、RNAの作製のために、または宿主細胞に形質移入（トランスフェクション）若しくは形質転換（トランスフォーム）のために用いられても良い。
【００２４】
本発明はまた、本発明に係るベクターを含み、または当該主題のタンパク質の発現と作製を可能にする条件下で本発明の当該タンパク質の1つをコードする遺伝子を含む宿主細胞を提供する。
【００２５】
本発明はまた、本発明のOPGバリアントタンパク質を調製する方法を提供し、その方法は、前記OPGバリアントタンパク質の作製を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及び前記OPGバリアントタンパク質を回収する工程を含む。そのような細胞を、当該コードされた商業的に有用な量のOPGバリアントタンパク質の作製のために用いることができる。
【００２６】
本発明はまた、TRAILに対するOPGの結合アフィニティーを低減する方法を提供し、その方法は、OPGタンパク質またはその断片内の少なくとも1つのアミノ酸を改変しOPGバリアントタンパク質を作製する工程、及びTRAILに対する当該OPGバリアントタンパク質の結合アフィニティーを検査する工程を含む。
【００２７】
ある好ましい実施態様において、当該方法は、野生型OPGの残基102-130に含まれる領域内の少なくとも1つのアミノ酸を改変しOPGバリアントタンパク質を作製する工程、及びTRAILに対する結合アフィニティーについて当該OPGバリアントタンパク質を検査する工程を含む。
【００２８】
本発明のOVPを、in vivoにおけるRANKLに対するRANKの結合を低減または阻害するために、並びにRANKとRANKL間の相互作用、及びこの相互作用によって介在される生物学的効果を低減または阻害するために用いることができる。
【００２９】
従って、本発明はまた、RANKLへのRANKの結合を阻害または低減するための組成物を提供し、その組成物は、本発明に係るOPGバリアントタンパク質と1つ以上の許容し得るキャリアーとを含む。
【００３０】
本発明はまた、治療上有効な量の本発明に係るOPGバリアントタンパク質、並びに1つ以上の製薬上許容し得るキャリアー、可溶化剤、安定化剤、及び抗酸化剤を含む製薬組成物を提供する。
【００３１】
本発明はまた、RANKとRANKLの相互作用によって介在される生物学的効果を阻害または低減する方法を提供し、その方法は、RANKL分子を本発明に係るOPGバリアントタンパク質に接触させる工程を含む。
【００３２】
本発明はまた、被験者におけるRANKとRANKLの相互作用によって介在される生物学的効果を阻害または低減する方法を提供し、その方法は、被験者に本発明に係るOPGバリアントタンパク質を投与する工程を含む。
【００３３】
文中における「被験者」は、ヒトと他の動物の両方を意味し、特に文中で説明されるようにヒトを含む哺乳類が好ましい。
【００３４】
本発明はまた、RANKLによる破骨細胞の分化、活性化、及び／または生存を阻害または低減する方法を提供し、その方法は、破骨細胞または破骨細胞前駆体細胞を含む組織を本発明に係るOPGバリアントタンパク質に接触させる工程を含む。
【００３５】
本発明はまた、被験者におけるRANKLによる破骨細胞の分化、活性化、及び／または生存を阻害または低減する方法を提供し、その方法は、被験者に本発明に係るOPGバリアントタンパク質を投与する工程を含む。
【００３６】
本発明はまた、骨疾患を予防または治療する方法を提供し、それは患者に本発明の製薬組成物を投与する工程を含む。
【００３７】
この明細書を通して、用語「含む」は、明記された要素、整数若しくは工程、または要素、整数若しくは工程の群の包含を意味するが、他のいずれかの要素、整数若しくは工程、または要素、整数若しくは工程の群の排除を意味するのではないと理解されるであろう。
【００３８】
文中における個々の章節の中で言及された本発明の種々の特徴及び実施態様は、また、適切なように他の章節に適用する。従って、本発明のある実施態様に関連して明記された特徴を、他の実施態様に関連して明記された特徴と適切なように組み合わせて良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
［一般的な技術］
他に定義されていない場合は、文中で用いられるすべての技術と科学的用語は、当該技術分野における（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、化学、及び生化学における）当業者によって共通に理解されるものと同様の意味を有する。
【００４０】
他に明記されていない場合は、本発明に利用した組換えDNA技術は標準的な方法であり、当該技術分野において十分既知である。そのような技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons（1984）；J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press（1989）；T. A. Brown（editor）, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press（1991）；D. M. Glover and B. D. Hames（editors）, DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press（1995 and 1996）；並びにF. M. Ausubel et al.（editors）, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience（1988, 現在までのすべての更新を含む）等の資料中の文献を通して記載され説明されている。
【００４１】
［オステオプロテゲリン（OPG）］
OPGはTNFレセプタースーパーファミリーの構成分子であり、骨代謝に関わる活性を有し、特に骨密度を増大させることによって骨吸収を阻害する活性を有する。特に、OPGのRANKLとの相互作用は、RANKLがRANKとの相互作用を介して破骨細胞の形成と活性を刺激する能力を阻害する。それが骨喪失を低減するその能力を与えるこのOPGの活性である。
【００４２】
OPGの生物学的活性はまた、TRAILとの結合に関わる活性を含む。TRAIL（TNF関連アポトーシス誘導リガンド）は、癌細胞におけるアポトーシスの誘導に関わるTNF様細胞表面分子である。OPGは、TRAILに対する少数のおとりレセプターの1つとして見なされ、癌細胞を標的とするその能力を調節するように作用している。従って、関連する部位に十分な量を提供した場合、OPGは癌細胞の生存を促進するという非所望の効果を有すると予測される。
【００４３】
OPGの種々の活性断片が記載されている。Yamaguchi et al.（J. Biol Chem. 273: 5117-5123, 1998）は、OPGの切断及び欠失バリアントはOPG様活性を維持していると証明しているが、一方で、一量体と二量体の両形態のOPGは生物学的活性を維持している（Tomoyasu, A et al., Biochem Biophys Res Commun 245: 382-387, 1998）。Schneeweis et al.（J. Biol Chem. Oct 7, 2005 epub）は、RANKLに対するOPGの組合せ、状態、及びアフィニティーを検討した。彼らは、二量体化がデスドメイン領域内の非共有結合の相互作用によって介在される全長型、または二量体化がFcの付加によって介在される切断型のどちらかの型のOPGの二量体化が、RANKLへのOPGの高いアフィニティーの結合に必要であることを報告した。
【００４４】
野生型ヒト、ラット、及びマウスオステオプロテゲリンのアミノ酸配列をSEQ ID番号２−４にそれぞれ示す。
【００４５】
野生型OPG配列はまた、除去されたアミノ酸21個のアミノ末端リーダー配列を有するもの、及び／またはアミノ酸がC末端からアミノ酸185を含む部位まで除去されるものを含む。
【００４６】
［OPGバリアントタンパク質］
文中での「タンパク質」は、少なくとも2つの共有結合で結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む。前記タンパク質は、自然に産生するアミノ酸、及びペプチド結合、または通常、合成方法に依存する合成ペプチド擬態性の構造体、すなわち、ペプチド等の「類似体」（Simon et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 89, 20: 9367-9371, 1992）から形成されても良い。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリン、及びノルロイシンは本発明の目的のためのアミノ酸と見なされる。「アミノ酸」はまた、プロリン及びヒドロキシプロリン等のイミノ酸残基を含む。D-及びL-アミノ酸の両方を利用して良い。
【００４７】
本発明は現在、TRAILに対して低減した結合アフィニティーを示す新奇のOPGバリアントタンパク質（OVP）を作製している。重要なことに、本発明のOVPはRANKLへ結合する能力を維持している。従って、本発明のOVPは、癌細胞の生存を促進するという非所望のTRAIL関連の特性を有することなく、骨代謝を調節する野生型OPGの能力を維持するであろうことが考慮される。
【００４８】
従って、本発明は野生型OPGと比較して少なくとも1つの改変を含むOPGバリアントタンパク質を提供し、前記OPGバリアントタンパク質は、RANKLに対する結合アフィニティーを維持するが、野生型OPGと比較してTRAILに対して低減した結合アフィニティーを示す。
【００４９】
「RANKLに対する結合アフィニティーを維持する」により、当該OPGバリアントタンパク質は、野生型OPGと比較してRANKLに対して少なくとも20%の結合アフィニティーを示すことを意味する。
【００５０】
前記野生型OPGは、いずれかの種、好ましくは哺乳類種から得られて良い。好ましい実施態様において、当該野生型OPGは主要なヒトOPGタンパク質である。より好ましくは、当該野生型OPGはSEQ ID番号：２に示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００５１】
本発明のOPGバリアントタンパク質は、好ましくは野生型OPGの少なくとも1つの生物学的活性を示す。
【００５２】
ある例において、前記野生型OPGの生物学的活性は骨代謝、特にRANKLによる破骨細胞の刺激及び／または活性を阻害または低減する能力に関する。好ましくは、本発明のOPGバリアントタンパク質は、骨密度の減少または異常な骨代謝回転に関連する疾患を予防する能力を維持する。
【００５３】
別の例において、前記野生型OPGの生物学的活性はT細胞活性、特にT細胞活性化を低減または阻害する能力に関する。好ましくは、本発明のOPGバリアントタンパク質は、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、及び強直性脊椎炎等の自己免疫疾患に対する治療に有効である。
【００５４】
さらなる例において、本発明のOPGバリアントタンパク質は、心臓血管疾患を治療、血管及び弁の石灰化の予防または低減、あるいは血管成長を促進するのに有効である。
【００５５】
ある実施態様において、当該OPGバリアントタンパク質は全長野生型OPG配列の改変型である。別の実施態様において、当該OPGバリアントタンパク質は、N末端、C末端、または内部に、1つ以上のさらなる挿入または欠失を含む。当該活性断片は、例えば、アミノ酸22-294、アミノ酸22-201、22-194、またはアミノ酸1-197からなって良い。
【００５６】
好ましい実施態様において、OPGバリアントタンパク質は、野生型OPG配列とは異なる少なくとも1アミノ酸残基を有し、少なくとも2、3、4、または5個の異なる残基を有するものがより好ましい。当該改変は好ましくはアミノ酸置換であり、OPGの表面または露出面に対してのものを含んで良い。OPGバリアントタンパク質は、リンカー配列によって繋がった1つのドメインまたは複数のドメインを含んで良い。OPGバリアントタンパク質は、さらなる改変、例えば、安定性または免疫原性を変化させる改変、あるいはPEG付加またはグリコシル化等の翻訳後修飾を可能にする改変を含んで良い。
【００５７】
ある好ましい実施態様において、当該OPGバリアントタンパク質は、アミノ酸残基102-130に含まれる領域に少なくとも1つの改変を含む。例えば、当該タンパク質は、102、111、115、122、128、または130位で少なくとも1つのアミノ酸置換を含んで良い。
【００５８】
ある好ましい実施態様において、当該OPGバリアントタンパク質は、残基107-118を含むループ構造内に少なくとも1つの改変を含む。特に好ましい実施態様において、この領域中の改変は、115位でのIleの置換を含む。115位のIleは、より極性のあるまたはより短い側鎖を有するアミノ酸に置換されて良い。好ましくは、115位のIleは、Thr、Met、Val、Asp、Gly、Ser、またはArgに置換される。従って、好ましい改変は、I115T、I115M、I115V、I115D、I115G、I115S、及びI115Rを含む。
【００５９】
ある好ましい実施態様において、当該OPGバリアントタンパク質は、残基120-130に含まれる領域に少なくとも1つの改変を含む。別の好ましい実施態様において、当該改変は122位でのArgの置換を含む。好ましくは、122位のArgは、Gly、Gln、Ser、Asn、またはGluに置換される。従って、好ましい改変は、R122G、R122Q、R122S、R122N、及びR122Eを含む。
【００６０】
さらに特に好ましい実施態様において、当該改変は128位でのPheの置換を含む。好ましくは、128位のPheは、Val、Ala、Leu、Ile、またはSerに置換される。従って、好ましい改変は、F128V、F128A、F128L、F128I、及びF128Sを含む。
【００６１】
よりさらに好ましい実施態様において、当該改変は、130位でのValの置換を含む。好ましくは、130位のValは、GluまたはAlaに置換される。
【００６２】
さらに好ましい実施態様において、当該OPGバリアントタンパク質は少なくとも2つの改変を含む。
【００６３】
前記少なくとも2つの改変は、両方とも残基102-130に含まれる領域に生じて良い。例えば、前記少なくとも2つの改変は、115と122位での置換を含んで良い。この領域内の適切な二重改変の例は、R122NとI115M；R122NとI115M；F128SとI115M；F128IとI115M；及びF128LとI115Mである。
【００６４】
あるいは、前記少なくとも2つの改変は、アミノ酸102-130に含まれる領域内に1つ以上の改変とこの領域外に1つ以上の改変を含んで良い。
【００６５】
前記この領域外の改変は、例えば、残基31、40、51、100、155、167、または168のいずれか1つ以上の位置で生じて良い。ある好ましい実施態様において、改変は残基40 位で生じる。好ましくは、当該改変は40位のLeuをSerで置換すること含む。
【００６６】
ある実施態様において、本発明のOPGバリアントタンパク質は、アミノ酸102-130に含まれる領域内に1つ以上の改変、及び以下のアミノ酸残基：Gln21、Glu22、Thr23、Phe24、Pro25、Pro26、Lys27、Tyr28、Leu29、His30、Tyr31、Asp32、Glu33、Glu34、Thr35、Ser36、His37、Gln38、Asp42、Lys43、Pro45、Pro46、Thr48、Lys51、Gln52、His53、Cys54、Thr55、Ala56、Lys57、Trp58、Lys59、Thr60、Val61、Ala63、Pro64、Pro66、Asp67、His68、Tyr69、Asp72、Ser73、Trp74、Thr76、Ser77、Asp78、Glu79、Leu81、Tyr82、Ser84、Pro85、Val86、Lys88、Glu89、Leu90、Tyr92、Val93、Lys94、Gln95、Glu96、Asn98、Arg99、Thr100、His101、Val131、Gln132、Ala133、Gly134、Thr135、Pro136、Glu137、Arg138、Val141、Lys143、Arg144、Cys145、Pro146、Asp147、Gly148、Phe149、Phe150、Ser151、Asn152、Glu153、Thr154、Ser155、Ser156、Lys157、Ala158、Pro159、Cys160、Arg161、Lys162、His163、Thr164、Asn165、Cys166、Ser167、Val168、Phe169、Gly170、Leu171、Leu172、Leu173、Thr174、Gln175、Lys176、Gly177、Asn178、Ala179、Thr180、His181、Asp182、Asn183、Ile184、Cys185、Ser186、Gly187、Asn188、Ser189、Glu190、Ser191、Thr192、Gln193、Lys194、Cys195、Gly196、Ile197、Asp198、Val199、Thr200、及びLeu201のいずれか1つ以上への改変を含む。
【００６７】
ある実施態様において、本発明のOPGバリアントタンパク質は、アミノ酸102-130に含まれる領域内に1つ以上の改変、及び以下のアミノ酸残基：Tyr28、His30、Tyr31、Glu34、Thr35、Ser36、His37、Lys43、Tyr49、Gln52、His53、Pro66、Asp67、His68、Tyr69、Tyr70、Thr71、Asp72、Ser73、Trp74、His75、Thr76、Ser77、Asp78、Glu79、Cys80、Leu81、Tyr82、Cys83、Ser84、Pro85、Val86、Cys87、Lys88、Glu89、Leu90、Gln91、Asn139、及びGlu153のいずれか1つ以上への改変を含む。
【００６８】
本発明はまた、残基40での改変を含むOPGバリアントタンパク質を提供し、そのOPGバリアントタンパク質は、RANKLに対する結合アフィニティーを維持しているが、野生型OPGと比較してTRAILに対して低減した結合アフィニティーを示す。好ましくは、当該改変は40位のLeuをSerで置換することを含む。
【００６９】
本発明のOPGバリアントタンパク質は、いずれか1つ以上の表１に示した改変を含んで良い。
【００７０】
さらに好ましい実施態様において、当該OPGバリアントタンパク質はSEQ ID番号：５−４７のいずれか1つに示したような配列を含む。
【００７１】
さらに好ましい本発明の実施態様において、当該OVPのRANKLに対する結合アフィニティーは、野生型OPGのそれの少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%を示す。
【００７２】
ある実施態様において、当該OVPは野生型OPGと比較して、RANKLに対して増大した結合アフィニティーを示す。
【００７３】
さらに好ましい実施態様において、実施例８に記載されるような測定条件下で、当該OVPはRANKLへの結合に対して、5nM未満、好ましくは1nM未満の50%有効濃度（EC50（nM））を有する。
【００７４】
本発明のさらに好ましい実施態様において、当該OVPのTRAILに対する結合アフィニティーは、野生型OPGのそれの50%未満、好ましくは40%未満、より好ましくは30%未満、より好ましくは20%未満、より好ましくは10%未満、より好ましくは5%未満を示す。
【００７５】
さらに好ましい実施態様において、実施例８に記載されるような測定条件下で、当該OVPはTRAILへの結合に対して、5nMより大きい、好ましくは10nMより大きい、より好ましくは25nMより大きい、より好ましくは50nMより大きい50%有効濃度（nM）を有する。
【００７６】
また、OPGのアミノ酸残基195-401または198-401の一部またはすべての欠失またはC末切断；残基195-401または198-401における1つ以上のアミノ酸変化；OPGのシステインリッチドメインの一部またはすべての欠失、特に末端（C末）システインリッチドメインの欠失；並びに、システインリッチドメイン、特に末端（C末）システインドメインにおける1つ以上のアミノ酸変化を有するOPGバリアントタンパク質を含む。
【００７７】
好ましいアミノ酸配列の欠失は、一般的には約1から30残基、好ましくは約1から10残基、典型的には約1から5隣接残基に及ぶ。
【００７８】
突然変異誘発の位置を表すために文中で用いられるアミノ酸の番号付けは、SEQ ID番号：１と２に示されたヒトOPG配列の番号付けに関連する。本発明はまた、ホモログ、誘導体、及び対立遺伝子バリアントを含む。
【００７９】
用語「に相当する」は、本発明の文脈の中で、SEQ ID番号：１と２に関連したOPGポリペプチドのアミノ酸残基を示すために用いられる（例えば、70%より高く、80%より高く、90%より高く、または95%より高くSEQ ID番号：１と２と同一）が、しかしながら、当該関連したポリペプチドの相対的な残基の番号付けは、SEQ ID番号：１と２のそれと異なって良い。
【００８０】
また、当該配列を通して、文中に記載される付加的な保存的置換を含むOPGバリアントタンパク質を含む。そのような保存的置換は以下のようなものである。：
【表１】
2008522593.tif 000002
【００８１】
さらに、所望の場合、非天然に産生するアミノ酸または化学的アミノ酸アナログを、本発明の当該ポリペプチドへの置換または付加として導入できる。そのようなアミノ酸は、一般的なアミノ酸のD-異性体、2,4-ジアミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、2-アミノ酪酸、6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、デザイナーアミノ酸（β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸等）、及び一般的なアミノ酸アナログを含むが、これに制限されない。
【００８２】
本発明はまた、OPGバリアントタンパク質の化学的に改変した誘導体を提供し、それは、当該ポリペプチドの安定性と循環時間の増大、または免疫原性の減少等の付加的な利点を提供するかもしれない（US-4,179,337を参照）。誘導体化のための化学的成分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーから選択されて良い。本発明はまた、合成の間または後に差異的に（例えば、ビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の防御／阻害基による誘導体化、タンパク質分解性の切断等により）改変されるOVPを含む。当該ポリペプチドは、当該分子内の無作為の位置、または当該分子内の所定の位置で改変されて良く、1、2，3以上の付属的化学成分を含んで良い。これらの改変は、本発明のポリペプチドの安定性及び／または生理活性を増大させるように作用するかもしれない。
【００８３】
本発明に含まれるOPGバリアントタンパク質のさらなる改変は、翻訳後修飾（例えば、N-結合型またはO-結合型糖鎖、NまたはC末端のプロセシング）、N-結合型またはO-結合型糖鎖の化学的改変、及び原核生物の宿主細胞発現の結果としてのN末のメチオニン残基の付加を含む。当該OVPはまた、検出可能な標識（例えば、当該タンパク質の検出と単離を可能にする酵素性、蛍光性、同位体性、またはアフィニティー標識等）で修飾されて良い。
【００８４】
OPGバリアントタンパク質のさらなる改変はキメラタンパク質を含み、当該OPGバリアントタンパク質は、異種のアミノ酸配列を融合している。前記異種配列は、結果として生じた融合タンパク質が当該OPGバリアントタンパク質の活性を少なくとも維持し得るいずれかの配列であって良い。前記異種配列は、例えば、Fc融合等の免疫グロブリン融合、あるいは当該タンパク質の安定性または精製の助けを増大させるかもしれない他の細胞のリガンドへの融合を含む。
【００８５】
ある実施態様において、本発明のOPGバリアントタンパク質は、二量体またはさらに2、おそらく3つ以上の一量体を有するオリゴマーの一本鎖分子として作製されて良い。
【００８６】
前記一量体は、ペプチド結合またはペプチドリンカーと、あるいは、例えば、PEG分子と連結されて良い。
【００８７】
また二量体化は、免疫グロブリンγ1（GenPept登録番号：M87789.1）のFc部分を有する融合タンパク質として化合物を作製することによって達成し得る。当該分子は、C末Fc部分またはN末Fc部分を有する融合タンパク質として発現させることができる。
【００８８】
また二量体化は、当該生成物候補をGCN4ロイシンジッパーへ融合させることによって達成し得、これは融合タンパク質の二量体化を誘導することが報告されている（Donate et al., Biochemistry 39: 11467-11476, 2000）。
【００８９】
あるいは、二量体分子は、最後の5アミノ酸残基の1つ、またはあるいは最初の5アミノ酸残基の1つをシステイン残基へ突然変異誘発させることによって作製して良い。その後、当該精製化合物の不対システイン残基を、既存のチオール反応性付加基を用いることによって「2つの活性」PEG基に付加させることができる。あるいは、二量体分子は、2つの候補分子（同一または全く異なる）を適切な柔軟性のあるポリペプチドリンカーで適切な発現ベクター中にインフレームで挿入することによって作製できる。
【００９０】
OPGバリアントタンパク質のさらなる改変は、二量体または多量体の形態を含み、ここでは、当該OPGバリアントタンパク質の一量体単位は、ペプチド若しくは化学的リンカー、またはシステイン残基間のジスルフィド架橋を含んで良い適切なリンカー分子によって、化学的または遺伝的に連結されて良い。さらに、当該主題のタンパク質の二量体または多量体の形態は、当該OPGタンパク質が融合するタンパク質（Fc領域等）間の連結によって達成されて良い。
【００９１】
本発明のOPGバリアントタンパク質は、好ましくは、組織、細胞株、及び当該OVPを発現する形質転換された宿主細胞に存在する他のポリペプチドから単離及び精製され、あるいは当該分泌タンパク質を含む培養細胞中の成分から精製される。ある実施態様において、当該OVPは、細菌性宿主細胞の発現産物等の他のタンパク質に関連していない。
【００９２】
本発明のOPGバリアントタンパク質は、当該技術分野におけるいずれかの技術によって調製できる。例えば、SEQ ID番号：１として提供されるポリヌクレオチドは、in vitro突然変異誘発を受けることができる。そのようなin vitro突然変異誘発は、適切なベクター内へ当該ポリペプチドをサブクローニングする工程、前記ベクターを大腸菌XL-1 red（Stratagene社）等の「突然変異誘発（ミューテーター）」株内へ形質転換する工程、前記形質転換された細菌を適当な世代数の間増殖させる工程を含む。別の例において、本発明のポリヌクレオチドは、Harayama（1998）によって明白に記載されるDNAシャッフリング技術を受ける。変異した／変更されたDNAから得られたタンパク質産物は、文中に記載される技術を用いることによって容易に選別し得、それらが基質特異性を高めた及び／または変化させたかどうかを確認できる。
【００９３】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列変異体はまた、適切なヌクレオチドの変化を核酸配列内に導入することによって、または所望のポリペプチドのin vitro合成によって調製できる。そのような変異体は、例えば、当該アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、または置換を含む。当該最終タンパク質産物が当該所望の特性を有する場合、欠失、挿入、及び置換の組合せを作り、最終コンストラクトへ到達できる。
【００９４】
置換変異体は、当該野生型OPG配列内に、少なくとも1つのアミノ酸残基、除去されその位置に挿入された異なる残基を有する。置換性突然変異誘発にとって最も関心のある部位は、文中に例示した部位を含む。突然変異のための部位は、例えば、（１）まず、保存的なアミノ酸の選択で、その後、得られた結果に依存してより極端な選択で置換することによって、（２）標的残基を除去することによって、または（３）位置する部位に隣接する他の残基を挿入することによって、別個にまたは連続して改変できる。
【００９５】
あるいは、OPGバリアントタンパク質は、無細胞in vitro進化（型）突然変異誘発システムを用いることによって作製できる。無細胞in vitro進化（型）のある例においては、WO 99/58661またはWO 2004/039995に記載されるものと同様のシステムを利用する。
【００９６】
無細胞系in vitro進化方法は、突然変異誘発物質（QBレプリカーゼ若しくはリバビリン、またはそれらの誘導体／アナログ等）の存在中でポリメラーゼの作用により直接的または間接的に作製された変異体OPG RNA分子を、変異タンパク質の集団の産生を生じる条件下で翻訳システムにさらす工程を含む。これらの変異体OPGタンパク質は、それが翻訳される当該RNAに連結し、変異体タンパク質／RNA複合体の集団を形成する。この変異体OPGタンパク質／RNA複合体の集団は、TRAILへ結合することなくRANKLへ結合する等の所望の生物学的活性に対して選別される。当該所望の活性を有する変異体タンパク質／RNA複合体を単離でき、当該RNAによってコードされる当該タンパク質の配列を、標準的な技術により特徴づけする。
【００９７】
本発明はまた、本発明のOPGバリアントタンパク質を調製する方法を提供し、その方法は、前記OPGバリアントタンパク質の作製を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及び前記OPGバリアントタンパク質を回収する工程を含む。そのような細胞を、当該コードされた商業的に有用な量のOPGバリアントタンパク質の作製のために用いることができる。
【００９８】
本発明のOPGバリアントタンパク質は、天然タンパク質の作製と回収、組換えタンパク質の作製と回収、及び当該タンパク質の化学的合成を含む種々の方法によって作製できる。ある実施態様において、本発明のOPGバリアントタンパク質は、当該OPGバリアントタンパク質を作製するのに有効な条件下で当該OPGバリアントタンパク質を発現し得る細胞を培養すること、及び当該OPGバリアントタンパク質を回収することによって作製される。有効な培養条件は、タンパク質産生を可能にする有効な培地、生物反応器、温度、pH、及び酸素条件を含むが、これに制限されない。有効な培地は、本発明のポリペプチドを作製するために細胞を培養するいずれかの培地を表す。そのような培地は、典型的に、吸収し得る炭素、窒素、及びリン酸供給源、並びに適当な塩、ミネラル、金属、及びビタミン等のその他の栄養分を有する水性培地を含む。本発明の細胞は、通常の発酵生物反応器、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、及びペトリプレートで培養できる。培養は、組換え細胞に適した温度、pH、及び酸素量で実施できる。そのような培養条件は、当該技術分野において通常の技術の1つの専門的知識の範囲内である。
【００９９】
また、トランスフェクションされた宿主細胞からのOPGバリアントタンパク質の精製方法を含む。前記精製方法は、クロマトグラフィー等の1つ以上の標準的なタンパク質精製工程を、精製されるタンパク質に適した順序で利用して良い。前記クロマトグラフィー工程は、イオン交換、ゲルろ過、疎水性相互作用、逆相、等電点クロマトグラフィー、抗OPG抗体またはビオチン−ストレプトアビジンアフィニティー複合体を利用するアフィニティークロマトグラフィー等を含むことができる。
【０１００】
本発明はまた、TRAILに対するOPGの結合アフィニティーを低減する方法を提供し、その方法は、OPGタンパク質またはその断片内の少なくとも1つのアミノ酸を改変しOPGバリアントタンパク質を作製する工程、及びTRAILに対する当該OPGバリアントタンパク質の結合アフィニティーを検査する工程を含む。
【０１０１】
ある好ましい実施態様において、当該方法は、野生型OPGの残基102-130に含まれる領域内の少なくとも1つのアミノ酸を改変しOPGバリアントタンパク質を作製する工程、及びTRAILに対する結合アフィニティーについて当該OPGバリアントタンパク質を検査する工程を含む。
【０１０２】
TRAILに対する結合アフィニティーについて当該OPGバリアントタンパク質を検査する方法は、当該技術分野において既知であろう。適切な測定法は、速度論的及び平衡論的結合定数を比較する定量的比較を含むが、これに制限されない。結合速度係数（Kon：kinesic association rate）と解離速度係数（Koff：dissociation rate）、及び平衡結合定数（Kd）は、文献における標準的な方法に従い、BIAcore装置を用いた表面プラズモン共鳴を用いることによって決定されて良い（Pearce et al., Biochemistry 38: 81-89, 1999）。いくつかの代替的な方法もまた、結合アフィニティーと速度論を決定するために用いることができ、その例は文中の実施例の章節に記載される。
【０１０３】
［核酸、ベクター、及び宿主細胞］
本発明はまた、本発明のOPGバリアントタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドの例は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、及びRNAを含む。
【０１０４】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドはSEQ ID番号：１のバリアントであり、そのバリアントは、本発明の所望のOPGバリアントタンパク質をコードするような核酸変化を含む。そのような核酸変化を作製する方法は、当該技術分野において既知であり、文中にも記載されている。
【０１０５】
本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。好ましくは、前記ベクターはポリヌクレオチドの複製及び／または発現に適している。前記ベクターは、複製開始点、好ましくは当該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、及び選択的に前記プロモーターの調節因子を備えた、例えば、プラスミド、ウイルス、またはファージベクターであって良い。前記ベクターは、1つ以上の選択マーカー、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、哺乳類発現ベクターにはネオマイシン耐性遺伝子を含んで良い。前記ベクターは、in vitroで、例えば、RNAの作製のために、または宿主細胞にトランスフェクション若しくは形質転換のために用いられても良い。
【０１０６】
本発明はまた、本発明に係るベクターを含み、または当該主題のタンパク質の発現と作製を可能にする条件下で本発明の当該タンパク質の1つをコードする遺伝子を含む宿主細胞を提供する。
【０１０７】
本発明の核酸は、当業者に利用できる発展的なまたは部位特異的突然変異誘発の技術を用いることによって構築されて良い。開始材料は、例えば、野生型OPGをコードするcDNAまたはゲノムDNAであって良い。cDNAは、オステオプロテゲリンを発現する種々の組織から単離されたmRNAから調製されたライブラリーから得られる。ヒトにおいて、オステオプロテゲリンの供給組織は、腎臓、肝臓、胎盤、及び心臓を含む。オステオプロテゲリンをコードするゲノムDNAは、多様な種から商業的に入手可能なゲノムライブラリーから得られる。
【０１０８】
あるいは、本発明の核酸は合成核酸であって良い。合成DNAは、例えば、重複するオリゴヌクレオチド断片の化学的合成、その後、前記断片を集めて当該コード領域とフランキング配列の一部またはすべてを再構築することによって得られる（インターフェロン遺伝子の化学的合成を記載しているUS-4,695,623を参照）。RNAは、原核生物発現ベクター、またはmRNAの高レベルな合成を誘導するin vitroコンストラクト（T7プロモーターとRNAポリメラーゼを用いたベクター等）によって非常に容易に得られる。
【０１０９】
本発明はまた、OVPをコードする核酸配列を含む発現ベクター、前記ベクターで形質転換された宿主細胞、及びOVPの作製方法を提供する。組換えタンパク質の発現についての概要は、Methods of Enzymology Vol.185（Goeddel, D. V. ed.）Academic Press（1990）に見られる。
【０１１０】
OVPの作製のための宿主細胞は、例えば、大腸菌等の原核宿主細胞、酵母、植物、菌、昆虫、及び哺乳類宿主細胞を含む。HB101またはJM101等の大腸菌株は発現に適している。好ましい哺乳類宿主細胞は、COS、CHOd-、293、CV-1、3T3、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、及びその他を含む。翻訳後修飾（グリコシル化、及びポリペプチドプロセシング等）がOVP活性に重要な場合、哺乳類宿主細胞が好ましい。哺乳類発現により、当該増殖培地から回収されるかもしれない分泌ポリペプチドの産生が可能になる。
【０１１１】
OVPの発現のためのベクターは、好ましくは、ベクターの増殖と当該複製されたインサートの発現とに必要な配列を最小限に含む。これらの配列は、複製開始点、選択マーカー、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー配列、RNAスプライス部位、及び転写終結点を含む。前述の宿主細胞における発現に適したベクターは容易に入手可能であり、本発明の核酸が標準的な組換えDNA技術を用いることによって前記ベクター内に挿入される。また、オステオプロテゲリンの組織特異的な発現のためのベクターを含む。そのようなベクターは、マウスにおける産生のために、肝臓、腎臓、または他の器官で特異的に機能するプロモーター、及び標的とされるヒト細胞におけるオステオプロテゲリンの発現のためのウイルスベクターを含む。
【０１１２】
適切な宿主−ベクターシステムを用いて、当該OVPをコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を当該OVPが産生するような条件下で培養することによって、及び発現産物を単離することによって、OVPを組換え的に作製して良い。前記OVPは、トランスフェクションされた哺乳類細胞の上清中、または形質転換された細菌宿主細胞の封入体中に産生されて良い。そのように産生されたOVPは、下に記載するような当該技術分野において既知の方法によって精製されて良い。大腸菌におけるOVPの発現について、実施例２に記載する。この実施例に記載される特定のプラスミドと宿主細胞は、説明目的のみのためのものであり、しかしながら、他の入手可能なプラスミドと宿主細胞も、本発明のOVPを発現するために用いられるであろう。
【０１１３】
［製薬組成物］
本発明は、RANKLへのRANKの結合を阻害または低減するための組成物を提供し、その組成物は、本発明に係るOPGバリアントタンパク質と1つ以上の許容し得るキャリアーとを含む。
【０１１４】
本発明はまた、RANKとRANKLの相互作用によって介在される生物学的効果を阻害または低減するための組成物を提供し、その組成物は、本発明に係るOPGバリアントタンパク質と1つ以上の許容し得るキャリアーとを含む。
【０１１５】
本発明はまた、RANKLによる破骨細胞の刺激を阻害または低減するための組成物を提供し、その組成物は、本発明に係るOPGバリアントタンパク質と1つ以上の許容し得るキャリアーを含む。
【０１１６】
本発明はまた、治療上有効な量の本発明に係るOPGバリアントタンパク質、並びに1つ以上の製薬上許容し得るキャリアー、可溶化剤、安定化剤、及び抗酸化剤を含む製薬組成物を提供する。
【０１１７】
用語「治療上有効な量」は、特定の条件と投与経路に治療上の有効性を提供する量を意味する。当該組成物は液体または凍結乾燥の形態であって良く、種々のpH値とイオン強度、TweenまたはPolysorbate等の可溶化剤、ヒト血清アルブミンまたはゼラチン等のキャリアー、チメロサールまたはベンジルアルコール等の保存剤、及びアスコルビン酸またはメタ重亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤を有する希釈液（Tris酢酸またはリン酸バッファー）を含む。また、溶解性または安定性を増大させるために水溶性ポリマーで修飾されたOVPを含む組成物を含む。組成物はまた、長期間にわたる制御された配給のために、リポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、または小胞の中へのOVPの取込みを含んで良い。特定の組成物の選択は、処理される条件、投与経路、及び所望される薬物速度論的パラメーターを含む多くの因子に依存するであろう。製薬組成物に適した成分についてのより詳細な概論は、Remington’s Phamaceutical Sciences, 18th ed. A. R. Gennaro, ed. Mack, Easton, Pa.（1980）に見られる。
【０１１８】
本発明の組成物は、皮下、静脈内または筋肉内のいずれかの注射、あるいは経口、経鼻、肺または直腸投与によって投与されて良い。選択される投与経路は、最終的に多くの因子に依存するであろうし、当業者によって確認されて良い。
【０１１９】
本発明はまた、製薬上許容し得るアジュバントとともに、治療上有効な量の本発明の核酸を含む製薬組成物を提供する。核酸組成物は、遺伝子治療療法の一部として、細胞と組織へ当該OVPの一部またはすべてを配給するのに適しているであろう。
【０１２０】
文中の「遺伝子治療」は、治療上有効なDNA、mRNA、または他の核酸の1回または繰返しの投与を意味する。ある実施態様において、治療上有効な遺伝子産物のin vivo合成を達成するために、遺伝子を細胞内へ導入する。
【０１２１】
［治療方法］
OPGは、骨粗しょう症、関節リウマチ、パジェット病、歯周病、道管病、及び骨に位置するまたは骨に転移する癌を含む増大した骨代謝回転と骨喪失に関わる種々の状態における適用の可能性のある前臨床及び臨床試験を受けている（Lorenz et al., J. Amer Med Assoc 292: 490-495, 2004を参照）。
【０１２２】
同様の作用メカニズムによって、RANKシグナル伝達を拮抗することは、自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、及び強直性脊椎炎等）に対する治療になり得るであろうことが十分既知である。
【０１２３】
最近の報告はまた、血管及び弁の石灰化を予防または低減するため（Kaden et al., J. Mol. Cardiol. 36: 17-19, 2004）、及び血管成長を促進するために（Cross et al., Int. J. Cancer Nov 14,2005, epub）、OPGを心臓血管疾患の治療または予防に用いて良いことを示している。OPG遺伝子における多型は、若年性パジェット病の発症（Daroszewska et al., J. Bone Miner. Res 19: 1506-1511, 2004）と高い危険率で冠状動脈疾患を発症させるコーカサス系の男性（Soufi et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 89: 3764-3768, 2004）に関連している。
【０１２４】
従って、本発明のOPGバリアントタンパク質が治療的使用の範囲を有しているであろうことは明白である。
【０１２５】
従って、本発明は、RANKLに対するRANKの結合を阻害または低減する方法を提供し、その方法は、RANKL分子を本発明に係るOPGバリアントタンパク質に接触させる工程を含む。
【０１２６】
本発明はまた、細胞におけるRANKとRANKLの相互作用によって介在される生物学的効果を阻害または低減する方法を提供し、その方法は、前記細胞を本発明に係るOPGバリアントタンパク質に接触させる工程を含む。
【０１２７】
本発明はまた、被験者におけるRANKとRANKLの相互作用によって介在される生物学的効果を阻害または低減する方法を提供し、その方法は、被験者に本発明に係るOPGバリアントタンパク質を投与する工程を含む。
【０１２８】
本発明はまた、被験者における自己免疫または免疫介在炎症性疾患の治療または予防のための方法を提供し、その方法は、被験者に本発明に係るOPGバリアントタンパク質を投与する工程を含む。
【０１２９】
本発明はまた、被験者における心臓血管疾患の治療または予防のための方法を提供し、その方法は、被験者に本発明に係るOPGバリアントタンパク質を投与する工程を含む。
【０１３０】
本発明はまた、RANKLによる破骨細胞の分化、活性化、及び／または生存を阻害または低減する方法を提供し、その方法は、破骨細胞または破骨細胞前駆体を含む組織を本発明に係るOPGバリアントタンパク質に接触させる工程を含む。
【０１３１】
本発明はまた、被験者におけるRANKLによる破骨細胞の分化、活性化、及び／または生存を阻害または低減する方法を提供し、その方法は、被験者に本発明に係るOPGバリアントタンパク質を投与する工程を含む。
【０１３２】
文中における「被験者」は、ヒトと他の動物の両方を意味し、特に文中で説明されるようにヒトを含む哺乳類が好ましい。
【０１３３】
本発明はまた、骨疾患を予防または治療する方法を提供し、それは患者に本発明の製薬組成物を投与する工程を含む。
【０１３４】
文中における用語「治療する」と「治療」は、疾患または障害のための予防的または抑制的処置だけでなく、治療的処置を含むことを意味する。従って、例えば、当該疾患の発症より前にOPGバリアントタンパク質を上手く投与することは、当該疾患の治療に帰するかもしれない。他の例として、当該疾患の臨床的な症状発現後に、当該疾患の症状と闘うためにOPGバリアントタンパク質を上手く投与することは、当該疾患の「治療」を含む。「治療」はまた、当該疾患の出現後に、当該疾患を根絶するためにOPGバリアントタンパク質を投与することを含む。臨床症状の可能な軽減と当該疾患のおそらくの改善をともなって、発症後及び臨床症状が進行した後に薬剤を上手く投与することは、さらに当該疾患の「治療」を含む。
【０１３５】
本発明のOVPで治療し得る状態は、：
・骨粗しょう症、例えば、原発性骨粗しょう症、内分泌性骨粗しょう症（甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、先端肥大症）、骨粗しょう症の遺伝性及び先天性型（骨形成不全症、ホモシスチン尿症、メンケズ症候群、及びライリー−デイ症候群）、並びに四肢の不動化による骨粗しょう症等。
・成人及び若年における骨のパジェット病（変形性骨炎）。
・骨喪失をもたらす骨髄炎、または骨における感染性障害
・固形腫瘍（乳房、肺、及び腎臓）と血液学的悪性疾患（多発性骨髄腫、リンパ腫、及び白血病）から生じるカルシウム血症、特発性カルシウム血症、並びに甲状腺機能亢進症と腎機能疾患に関連するカルシウム血症。
・ステロイド投与によって誘発され、小腸と大腸の疾患、及び慢性的な肝臓と腎臓の疾患に関連した手術後の骨減少症。
・ゴーシェ病、鎌状赤血球貧血症、全身性エリテマトーデス、及び他の状態に関連した外傷性または非外傷性壊死に関連した骨壊死または骨細胞死。
・関節リウマチ、強直性脊椎炎、及び他の免疫介在炎症性疾患による骨喪失。
・血管系の石灰化
・歯周骨喪失
・多発性骨髄腫、骨の原発性癌、並びに転移した乳房及び前立腺癌から等の溶骨性転移を含む骨に影響を及ぼす癌
・心臓血管疾患
・冠状動脈疾患
・全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、及び強直性脊椎炎等の自己免疫疾患。
【０１３６】
本発明のOVPは、単独または他の治療的薬剤と組み合わせて用いられて良いと理解されるであろう。例えば、本発明のOVPは、治療上有効な量のTRAIL活性化抗体または抗TNF抗体と組み合わせて用いられて良い。
【０１３７】
ある好ましい実施態様において、本発明のOPGバリアントタンパク質は過剰な骨代謝回転または喪失に関連する骨疾患を治療するために用いられる。前記骨疾患は、骨粗しょう症、骨のパジェット病、カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、ステロイド誘発骨減少症、関節リウマチ、骨髄炎、多発性骨髄腫、骨癌、血管性石灰化、溶骨性転移、及び歯周骨喪失を含んで良いが、これに制限されない。
【０１３８】
本発明のOVPは、骨疾患の治療のために、単独または他の因子と組み合わせて用いられて良いと理解される。
【０１３９】
ある実施態様において、当該OVPは治療上有効な量の骨形成を刺激する因子と組み合わせて用いられる。そのような因子は、BMP-12、形質転換成長因子-β（TGF-β）、及びTGF-βファミリー構成分子を介するBMP-1と称される骨形成因子、インターロイキン-1阻害剤、TNFα阻害剤、副甲状腺ホルモンとそのアナログ、副甲状腺関連タンパク質とそのアナログ、ビタミンEシリーズプロスタグランジン、ビスホスホン酸（アレンドロン酸とその他等）、並びにフッ化物とカルシウム等の骨増強ミネラルを含むが、これに制限されない。
【０１４０】
本発明は、以下の非制限の実施例を参照することによって、より詳細に記載されるであろう。
【実施例】
【０１４１】
＜実施例１：ヒトOPG遺伝子をクローニングする＞
OPGに対する遺伝子を、ヒト胎児腎臓cDNAライブラリー（Spring Bioscience社, Fremont, CA）から単離した。前記OPG配列の5’及び3’末端に対するプライマーを設計し、前記遺伝子を増幅するために標準的なPCRを用いた。前記OPG遺伝子を単離するために用いたプライマーは、：
正方向：5’-TATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGAACAAGTTGCTGTGCTGCGCGCTCG-3’（SEQ ID番号：４８）
逆方向：5’-CATCTTTATAATCTGCGGCCGCTAAGCAGCTTATTTTTACTGATTGGACC-3’ （SEQ ID番号：４９）
【０１４２】
前記プライマー中の突出部は、大腸菌においての増殖に適したpGC（Coia et al., J. Immunol. Meth. 192: 13-23, 1996）等のベクター内へクローニングするのを可能にする制限酵素サイトを含み、DNA塩基配列決定法によってクローニングの成功を確認した。全長401アミノ酸OPGタンパク質をコードする1203ヌクレオチドに加え、そのシグナルペプチド（アミノ酸1-21）を除いたOPG配列（OPG 22-401）を増幅した。また、4つのシステインリッチドメインを含み、そのシグナルペプチドを有する及び有しない、アミノ酸194までの当該タンパク質のN末半分を増幅した。前記OPG遺伝子構造の図解表示を図１Aに示す。
【０１４３】
当該タンパク質のRANKLとTRAILへの結合に責任のある部分を含むOPG断片22-194（上に参照したようなSimonet et al., 1997、Yamaguchi et al., 1998）を、2Lの2×YT／100μg/mLアンピシリン中で、当該pGCベクターからのIPTG発現誘導で発現させた。これは、大腸菌のペリプラズム抽出物からの検出とアフィニティー精製用のC末二重FLAGペプチドタグを備えた当該タンパク質を産生する。発現誘導は、20-22℃で3-4時間実施した。アフィニティー精製された材料を、Superdex 200カラムを用いるゲルろ過クロマトグラフィーによってさらにピーク精製した。OPG一量体にサイズが一致するピークを回収した。前記精製されたピークは、抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロットによって、およそ期待されるサイズへ移動することが検出できた。前記精製された一量体タンパク質は、OPG検出キット（R&D systems社, Minneapolis, MN）で供給される特異的抗体によって検出された。このタンパク質の正体を、当該公表配列と相関するその最初の19残基のN末アミノ酸配列決定法によって確認した。
【０１４４】
＜実施例２：OPGバリアントタンパク質（OVP）の産生＞
OPGバリアントのライブラリーを作製するために、当該OPG（22-194）DNA配列をpEGX突然変異誘発及びディスプレイベクターへクローン化し（図１B）、DNA塩基配列決定法によって確認した。当該OPGを含むプラスミド（~0.5-1.0μg）をSmaI消化により線状にし、このうちの100-200ngを、37℃で16-24時間のT7 RNAポリメラーゼ転写用の鋳型として直接用いた。前記転写の成功を、当該20μL反応液のうちの1μLをロードするアガロースゲル電気泳動によって確認した。可能な場合、リボソームディスプレイを含むRNAに関わるすべての操作は、DEPC処理したバッファー、試薬、及びRNA分解を最小限に抑えるチューブを用いる。
【０１４５】
当該RNA転写物を、37℃で16-24時間のQβレプリカーゼによる複製反応用の鋳型として直接用いる。
容量（μL）
T7 RNA転写物                    0.5
25mM rNTPs                      1
5×T7ポリメラーゼバッファー     4
100mM DTT                       2
100mM MgSO4                     0-1.6
Qβレプリカーゼ                 1
H2O                             10.5-8.9
【０１４６】
前記複製の成功を、当該反応液のうちの1μLをロードするアガロースゲル電気泳動によって評価した。この方法は、OPGのバリアントをコードする二本鎖RNAライブラリーを産生する。1遺伝子コピーあたり1-3個の無作為な変異を得るように、変異条件を調整した。この段階で、ディスプレイのために調製される当該OPG RNAライブラリーの1μgは約7×1011分子に相当する。その後、当該サンプルの濃度を分光光度計で見積る。
【０１４７】
その後、当該OPG RNAライブラリーをリボソームディスプレイに用いた。まず、前記ライブラリーを、30℃で30分間、ウサギ網状赤血球ライセート翻訳システム（Promega社）を用いて翻訳した。
容量（μL）
網状赤血球ライセート                33
アミノ酸混合物  Leu（−）           0.5
アミノ酸混合物  Met（−）           0.5
25mM MgCl2                          0.5
RNasin                              0.5
KCl                                 1.5
OPG RNA                             1-2μg
H2O                                 50μLまで
【０１４８】
当該CLスペーサードメインの末端での終始コドンの非存在により、当該リボソームが翻訳の末端で止まり、RNA／リボソーム／タンパク質複合体が生じる。翻訳の完了の際、これらの複合体を、冷たく（氷上で）維持することによって、及び酢酸マグネシウム（MgOAc）の添加で安定化させた。60μLの氷冷PBS／50mM MgOAc／10%スキムミルク（ビオチンなし）と190μLのPBS／50mM MgOAc／0.05% Tween／2.5mg/mLヘパリンの添加により、当該翻訳物を300μLに希釈した。その後、この混合物を3×100μLの分量に分注した。
【０１４９】
＜実施例３： OVPをパンニングして選別する＞
実施例２で産生した複合体を、RANKL（Roche社）とTRAIL（Peprotech社）に対して溶液中でパンニングした。Sulfo-NHS-LC-ビオチン（Pierce社）を用いてRANKLとTRAILのビオチン化型を調製し、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ（Dynal社）を用いて、溶液中で選択された複合体の捕獲を可能にした。
【０１５０】
パンニング反応を、前記3つの翻訳混合液の各分注物において実施した。2つの異なる方法を利用し、TRAILへの結合アフィニティーを低減させる一方で、RANKL結合アフィニティーを維持しているアミノ酸残基の変化を有するOVP配列の単離を促進する選択圧を作り出した。用いられた一方の方法は、まず可溶性RANKLに対してパンニングし、その後、過剰量の遊離TRAILタンパク質を用いてTRAIL結合物を競合除去した。第一の翻訳分注物中に、インプットRNAの量とおよそ等モルの濃度でビオチン化RANKLを添加した。その後、この混合物を4℃で40-60分間回転させた。ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ（Dynal社）を、PBS／50mM MgOAc／0.05% Tweenで洗浄し、再懸濁した。前記RANKLパンニング後、前記混合物にこれらのビーズの10μLを4℃で10分間添加した。その後、リボソーム−ディスプレイOPGを有する複合体中のビオチン化RANKLを捕獲したビーズを、磁気を用いて、PBS／50mM MgOAc／0.05% Tweenで2回洗浄し、PBS／50mM MgOAcで2回洗浄し、その後、このバッファー100μLで再懸濁した。TRAIL結合物を競合除去するため、過剰量の可溶性TRAILを、この混合物に前記添加されたRANKLの2倍以上のモル濃度で添加し、これを4℃で30分間回転させた。その後、この方法の間に当該ビーズから溶出したいずれかの混合物を前述のように洗浄除去し、RANKL結合複合体と結合したビーズを20μLのH2Oで再懸濁した。このパンニング方法を「RANKL-1st」と示した。
【０１５１】
用いられたもう一方の方法は、まず可溶性TRAILに対してパンニングしてより強いTRAIL結合物を除去し、その後、当該混合物をRANKLに対してパンニングして残存するRANKL結合物を単離した。第二の翻訳分注物に、インプットRNAのモル量のおよそ1/2から1/4でビオチン化TRAILを添加した。この混合物を4℃で60分間回転させ、その後、10μLのストレプトアビジンビーズを10分間添加した。リボソーム−ディスプレイOVPを有する複合体中のビオチン化TRAILを捕獲したビーズを、磁気を用いて洗浄し、それによって、より良いTRAIL結合物の混合物を除去した。その後、当該混合物にインプットRNAのおよそ1/2のモル量でビオチン化RANKLを添加し、RANKL結合アフィニティーを維持しているOPGバリアントの選択のために、これを4℃で30-40分間回転させた。その後、当該ビーズを前述のように洗浄し、H2Oに再懸濁した。このパンニング方法を「TRAIL-1st」と示した。第三の翻訳分注物において、前記RANKL-1stに対して実施したようにコントロールパンニングを実施し、ただし、ビオチン化RANKLの代わりにビオチン化IGF-I（Gropep社）を用いた。また、前記の種々のRANKL-1stとTRAIL-1st選択方法を実施し、ここでは、可溶性ビオチン化の形態の抗原の代わりに、用いられた抗原はエポキシ磁気ビーズ（Dynal社）に結合させた。
【０１５２】
＜実施例４：選択されたOVPのクローニング＞
当該複合体で選択されたRNAを、当該ビーズ懸濁液5μLを鋳型として用いて標準的な方法によるRT-PCRを用いることによってcDNAへ変換した。当該RT-PCR産物をアガロース電気泳動によって単離した。TRAIL-1stとRANKL-1stパンニングに対するバンドに加えて、前記IGF-Iパンニングから産生された弱いバンドが観察でき、この選択方法中に固有のある非特異的選択があることを示唆した。その後、選択されたDNAのプールを当該ゲルから精製し、制限酵素消化し、発現ベクターpGCへライゲーションし、当該所望の結合特性のためのスクリーニングを続行した。前記ライゲーション（物）を適切な大腸菌株にエレクトロポレーションし、形質転換体コロニーを産生した。
【０１５３】
＜実施例５：OVPクローンをスクリーニングする＞
各ディスプレイ、及び選択実験から約100クローンを選別した。OVPに対する遺伝子を保有するクローンを、マイクロタイタープレートのウェル中に200μLのアンピシリンとグルコースを補充した2×YTにおいて開始培養物として増殖させ、37℃オーバーナイトで培養した。これらの培養物を200μLのアンピシリンを補充した2×YTにおける発現培養のための種菌として用いる。前記培養物の600nmでの吸光度がおよそ1.0に到達した時点で、0.5-1mMになるようなIPTGの添加と20-22℃で16時間の培養で、pGCからのバリアントの発現を誘導する。その後、オーバーナイトでマイクロタイタープレートのウェル表面に被覆したRANKLとTRAILへ結合するELISA用に、前記培養上清を回収する。当該表面を0.5%カゼインで2時間ブロッキングする。100kD分画分子量を取り付けたマイクロタイタープレートを用いて上清をろ過し、より高い分子量種と凝集物を除去し、これは当該ELISAにおけるバックグラウンドシグナルを下げることに役立つ。これらのろ過された上清を、抗原で被覆しブロッキングしたウェルにアプライした。結合したOVPの検出を、マウス抗FLAG抗体、その後、ヤギ抗マウスペルオキシダーゼ結合体（BioRad社）を用いることによって達成する。450nmでの読み取り吸光度により測定される当該結合シグナルを有するペルオキシダーゼ基質として、TMB（KPL）を用いる。工程の間に、PBS／0.05% Tweenで3回洗浄し、その後、PBSで3回洗浄し、0.25%カゼインで希釈する。この第一の不完全な選別を、最も有望なクローン（RANKL結合シグナルが野生型OPGと同程度のレベルを維持していること、及びTRAIL結合シグナルが実質的に低減していることに基づいて）に関して評価し、第二の選別のために選択する。
【０１５４】
当該第二の選別は、10mLの培養液中に20-22℃で3時間の誘導時間で選択されたクローンを発現させる工程を含む。これらの細胞からのペリプラズム抽出物を回収し、前述のようにろ過し、その後、前述のようなELISAによる希釈の範囲で（一般的に、1:2から1:32）検査した。これらのタンパク質のうち最良のものを、野生型OPGに対して上で記載したように、大量発現と精製（0.5-2L）用に選択した。当該精製されたタンパク質を、A280nmでTrpとTyr残基による吸光係数を決定することによって定量化する。その後、当該OVPを、前記のようなELISAによるOPG野生型タンパク質と比較して同等の濃度で検査した。当該タンパク質を、一般的に0.5μMから0.031μMの濃度の倍加連続希釈法で結合について検査した。一量体の形態である当該タンパク質の大部分は、野生型OPGと同程度のRANKL結合の維持とTRAIL結合シグナルにおける実質的な低減を示す。そのようなELISAから得られる結果の例を図２に示す。結合特性について必要とされる性質を備えるバリアントを、すべての選択方法から作製した。
【０１５５】
＜実施例６：リボソームディスプレイと選択方法を繰り返す＞
その後の一連のリボソームディスプレイと選択を行い、最良のOVP候補のいくつかをさらに改良した。これを達成するために、これらのOVPに対する遺伝子をpEGXベクターにクローン化し、TRAIL結合のさらなる低減とRANKL結合の維持のための選択圧を強めるために変更された選択に用いられた当該可溶性抗原のモル量で、突然変異誘発とディスプレイを前記のように実施した。当該所望の特性の明らかな改善に関して単離されたさらなる変異体について、最良のバリアントのためのスクリーニングを前記のように実施した。一連のすべての選択からの最良のリボソームディスプレイで選択されたOVPの配列を図３に示す。Cys107-Cys118ループ内のアミノ酸115における変異が当該選択されたバリアントの多くに観察され、同様にアミノ酸102-130を含む領域にすぐ近くのアミノ酸におけるいくつかの変異が観察された。これは、この領域、特にアミノ酸115がTRAIL結合に重要であるということ、及びいくつかの変異はRANKL結合の損失なくここでは許容され得ることを示唆している。
【０１５６】
＜実施例７：部位特異的突然変異誘発＞
OPGの特異性を変化させるのに有益だと示されたリボソームディスプレイ選択により特定された変異の位置を、これらの位置の部位特異的突然変異誘発を利用することによってさらに調査した。さらなるアミノ酸変化を残基115、122、及び128でサンプルを取り、当該L40S変異をこれらの部位の変異のいくつかと組み合わせた。特定の変異残基をコードする正方向と逆方向のプライマーを設計し、相補的な突出領域を有するOVP変異体遺伝子の前部と後部断片のPCR増幅を可能にした。クローニング用の制限酵素サイトを有する全長の変異体遺伝子の増幅のために、プライマーなしで最初の10サイクル、その後、5’及び3’フランキングプライマーありで30サイクルの間、前記2つのDNA断片を互いにプライミングオフすることによって接合させるためにPCRを用いた。
【０１５７】
さらなるELISA及び細胞ベースの測定法のためのより生物学的に関連した安定な二量体の形態の当該タンパク質をより高いレベルで産生することを可能にするために、哺乳類発現系を利用した。当該部位特異的変異体とリボソームディスプレイで選択された最良の候補OVP（1-194）遺伝子（残基1-21はシグナルペプチドを形成する）を、哺乳類発現ベクターpAPEX-3.Fc内へクローン化した。これにより、安定な二量体を形成するためのヒトFcドメインを有する融合体として当該OVPを発現させることができる。また、C末FLAGタグを付加する。HEK 293 EBNA細胞を発現に用いる。これらの付着細胞を、2mM Glutamax（Invitrogen社）、10%仔ウシ血清、及び200μg/mLジェネティシンを補充したDMEM培地中で継代し、37℃で5% CO2中で培養する。リポフェクタミン（Invitrogen社）を用いた一過性トランスフェクションのために、ほぼコンフルエントの細胞を回収し、5×106個細胞を10mL容量になるように10cm組織培養ディッシュにまくために用いる。前記細胞を24時間、付着させ増殖させる。当該関心のあるOVPを有するpAPEX-3.FcプラスミドDNAの24mgをDMEM 1.5mLと混合する。リポフェクタミン60μLをDMEM 1.5mLで希釈し、室温で5分間培養する。前記希釈したDNAとリポフェクタミンを混合し、室温20分間培養し、その後、当該培養ディッシュに滴状で添加する。オーバーナイトの増殖後、1枚のディッシュから全細胞を回収し、T175ディッシュで25-30mL中にまくために用いる。細胞がほぼコンフルエントに到達次第（1-2日）、前記血清含有DMEMを4mM Glutamaxを補充したEx-cell 293T無血清培地（JRH Biosciences社）25-30mLで置換する。3-4日後、前記培地を回収し、0.22μmシリンジフィルターでろ過する。
【０１５８】
前記培地中に分泌したタンパク質の精製のために、当該上清をPBSで平衡化したprotein A（Sigma社）樹脂1mLにアプライする。それらのFc部分を介して前記protein Aに結合したタンパク質を0.1Mグリシン（pH3）で溶出し、これをA280nmでモニターする。前記溶出物をPBSで直ちに透析することにより中和する。透析したタンパク質を0.5mLまで濃縮し、Superdex 200カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーにかける。当該OVP-Fc二量体に相当する優勢なピークを回収し、抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロットとシグナルペプチドを有するOPGを明らかにするN末配列決定法によって正体を確認する。ゲルろ過で精製されたOVPのイオン交換クロマトグラフィーは1つのタンパク質ピークを溶出し、均一性を示唆している。
【０１５９】
＜実施例８：部位特異的OVP変異体をスクリーニングする＞
精製された哺乳類で発現したOVPタンパク質を、RANKLとTRAILへの結合についてELISAによって検査する。ウェルをRANKL（PBS中に5μg/mL）またはTRAIL（PBS中に10μg/mL）で4℃オーバーナイトで被覆し、PBSで洗浄し、室温で2時間0.5%カゼイン（PBS）でブロッキングし、その後、PBSで再度洗浄する。検査されるOVPの濃度を約10nMまで標準化し、その後、50μLを、前記抗原で被覆したウェルに、倍加連続希釈で6-7より多くのウェルに1時間アプライする。すべての希釈は0.25%カゼインで行う。結合インキュベーションの間のすべての洗浄は、PBS／0.05% Tweenで3回行い、その後PBSで3回行う。結合OVPの検出は、50μLの抗FLAG抗体（1.2mg/mL）で20分間、その後、50μLのヤギ抗マウス−ペルオキシダーゼ結合体（BioRad社, 1:1500）で20分間のインキュベーションで達成される。TMBを酵素基質として用い、その後、当該結合シグナルをA450nmで測定する。すべてのOVPまたは野生型OPGをC末Fc連結型について検査をする。当該OPG（22-194）に対するいくつかのOVPの結合を比較するそのようなELISAから得られた結果の例を図４Aと４Bに示す。当該データは、野生型OPG（22-194）がRANKLとTRAILの両方に結合すること、及びほとんどのOVPが野生型タンパク質のレベルと同程度にRANKL結合を維持していることを示している。ここで検査されたすべてのOVPは、野生型と比較してTRAILへの結合の少なくともいくらかの低減し、リボソームディスプレイで選択された1R17（I115M）、並びに115-115D、115G、及び115R位での部位特異的変異体に関しては、非常に低レベルのTRAIL結合を示している。ELISAにおけるOVPの相対的な結合についておおよその比較を可能にするために、当該データから得られる50%有効濃度の値を表１に要約する。50%有効濃度の値を、OVPに対する結合反応を対数目盛にプロットすることによって見積もり、当該データが50%有効濃度の範囲に達しない場合は外挿法を実施した。いくつかのOVPはRANKLへの結合の僅かな増加を示し、一方で、いくつかのRANKLへの結合は3倍まで低減した。
【０１６０】
＜実施例９： TRAIL誘導HCT116細胞アポトーシスの測定におけるOVPの生物学的検査＞
ELISAにおいて観察されたOVPのTRAIL結合活性の低減を、これらのOVPの存在中でのTRAIL誘導HCT116細胞アポトーシスの測定法でさらに検査した。これらの細胞を、37℃で5% CO2で、10%ウシ胎児血清（FCS）と1%ペニシリン−ストレプトマインを含有するDMEM中で培養する。HCT116細胞を12ウェルのプレートに7.5×104細胞個／ウェルで1mLのDMEM + FCSにまき、24時間、付着させ増殖させる。その後、増殖培地を除去し、37℃で1時間新しい培地500μLで置換する。OVPまたは組換えヒトOPG.Fc（R&D Systems社）を、0.56、1.69、5.6、及び11.2nMで添加し、当該細胞を37℃で15分間さらに培養し、その後、組換えヒトTRAIL（R&D Systems社）を10ng/mL（0.53nM）になるように添加する。その後、当該細胞を37℃で16時間培養し、その後、各ウェル中のアポトーシス細胞の割合を採点するために回収する。TRAILの非存在中で、細胞への毒性に対してOVPの最大の量を検査した。すべての細胞（付着、及び浮遊）を回収し、20μLの1mg/mLヨウ化プロピジウム（PI）、0.1% Triton X-100、0.1%酢酸ナトリウム（PBS中に）で再懸濁する。アポトーシスとして採点された細胞に関するPI染色後、それが以下の：核の辺縁趨向、染色体の凝縮化、またはアポトーシス小体の1つ以上を示す場合、蛍光顕微鏡によって核の形態を検討することによりアポトーシスを採点する。偏見を回避するために、当該サンプルになされた処理を知ることなくサンプルを採点する。そのような測定法の例を図５Aと５Bに示す。野生型OPGタンパク質の効果を図５に示し、そこでは、5.6nMのOPG量で、TRAIL誘導アポトーシスを示す細胞の割合が約70%より多くから10%より下まで低減している。当該OPG（22-194）.Fcは、当該全長OPG.Fc（R&D Systems社）分子と同様に有効であるようで、一方、当該野生型タンパク質のN末連結Fc型は僅かに有効でない。図５Bに示したすべてのOVPは、TRAIL誘導アポトーシスを阻害する能力をほとんどまたはまったく有しない。ここに示されるより4倍多い量でさえ、これらの選択されたOVPに関して、TRAIL阻害活性は無視し得るようである。
【０１６１】
＜実施例１０：RANKL介在RAW264.7細胞分化の測定におけるOVPの生物学的検査＞
マウス白血病ウイルス誘導腫瘍単球細胞株RAW264.7は、RANKL刺激の下で破骨細胞に分化する。当該OVPのRANKLに結合する能力と、RANKへの結合によって介在されるその生物学的効果を阻害する能力をさらに検査するために、OVPの存在中で、RANKL介在RAW264.7細胞分化を測定した。RAW264.7細胞は、37℃で5% CO2で、5% FCSと1%ペニシリン−ストレプトマインを含有するDMEM中で培養する。RAW264.7細胞（3×103細胞個／ウェル）を96ウェルのプレート中の100μLのDMEMと5% FCSにまき、24時間増殖させる。15ng/mL（0.75nM）のヒトRANKL（Roche社）と0から0.5nMのOVPを含有する培地100μLを各ウェルへさらに添加し、当該細胞をさらに3日間培養する。破骨細胞の形成を、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）活性を測定することによって評価する。前記細胞を固定し、乾燥し、100μL の50mMクエン酸バッファー（pH4.6）、10mM酒石酸、1mg/mL p-ニトロフェニルリン酸を添加し、TRAP活性を測定する。30分間のインキュベーション後、前記反応を停止させ、405nmで吸光度を測定する。そのような測定結果を図６Aに示す。0.4nMの量で、示された当該OVPのすべては、0.75nM RANKLによって誘導されるRAW264.7細胞の破骨細胞への分化を完全に阻害し得る。また、図６Bは、アミノ酸115での部位特異的突然変異誘導によって産生されるOVPに関するそのような測定結果を示す。これらのタンパク質はすべてTRAIL誘導アポトーシスを阻害する能力の実質的な損失を示すのにもかかわらず（図５B）、この狭い範囲の少ない量に関して、RANKL結合活性の区別を観察できる。この測定法において、いくつかのバリアントはOPGと同等以上の活性を示したことを留意すべきである。一方で、いくつかのバリアントはRANKLへの結合の比較的穏やかな低減を示し（表１）、RANKL介在破骨細胞活性化を阻害する能力の有意な減少を示した。
【０１６２】
＜実施例１１：巨破骨細胞腫細胞の吸収測定法におけるOVPの生物学的検査＞
また、RANKLへのOVPの結合の生物学的効果を測定するための手段として、巨破骨細胞腫細胞の吸収測定法を用いた。これは、歯質切片中の吸収穴形成のレベルを測定することによるRANKL介在破骨細胞発生のための測定法である（Atkins et al., Bone 28: 370-37, 2001）。前記測定法を用い、この効果の当該OPG介在の阻害を示すことができる。吸収穴の数と吸収の面積の両方を定量化できる。いくつかのOVPを検査しているこの測定法の例を図７に示す。すべてのコンストラクトが阻害を示し、当該野生型OPGは約55%阻害、最良のOVP、R23（I115M、L40S）は75%阻害を示している。
【０１６３】
＜実施例１２：OVPの生物学的検査からの結論＞
リボソーム及びディスプレイ選択により単離され選択されたOVPの配列を図８に示す。これらのOVP、及び部位特異的突然変異誘発により産生されたさらなるOVPについて実施された結合調査を表１に示す。
【０１６４】
残基115の部位での置換はTRAILへ結合するための当該OVPの能力に重要な影響力を有することが、表１に示されたデータから明らかである。特に、この部位でのMet、Gly、Asn、Asp、及びGlu等の残基の置換は、RANKLへの結合に重大に影響を及ぼすことなく、TRAILへの結合の実質的な低減をもたらす。さらに、これらの置換を有するように産生されたOVPで、TRAIL誘導腫瘍細胞アポトーシスの測定法において、いずれかの活性を示すものはない。
【０１６５】
また、残基122での変異も、TRAILへ結合するためのOVPの能力に影響を及ぼす。例えば、二重変異体I115M、R122N、及びI115M、R122Eは、TRAILに対する結合アフィニティーが実質的に低減することを示した。
【０１６６】
また、残基128での変異も、TRAILへ結合するためのOVPの能力に影響を及ぼす。例えば、二重変異体I115M、F128L、及びI115M、F128Iは、TRAILに対する結合アフィニティーが実質的に低減することを示した。
【０１６７】
当該二重変異体I115M、L40Sは、RANKL介在破骨細胞発生の75%阻害をもたらし、残基40での変異の重要性を強調している。
【０１６８】
細胞ベースの測定法において選択されたOVPの生物学的活性の一覧を表２に提供する。
【０１６９】
＜実施例１３：OPG／OVP三次元構造モデリング＞
OPGは、TNFレセプターファミリーのタンパク質として分類される。構成要素の最も顕著な特徴は、約40アミノ酸、システインリッチドメイン、の複数回の繰返しであり、リガンド結合に関与している。既知のリガンドは、構造的にホモログのTRAILとRANKLタンパク質を含む。
【０１７０】
OPG単独、またはそのリガンドのRANKL若しくはTRAILのどちらかと組み合わせた三次元構造について公示されているものはない。従って、好ましいOVPに含まれる変異の生じ得る効果を検討する目的で、OPGのアミノ末端断片中の2つのシステインリッチドメインについての構造モデルを確立した。
【０１７１】
Brookhavenタンパク質構造データベース（PDB）のBLAST検索から、TNFレセプター関連タンパク質の3つの近似したホモログが選択され、三次元構造が決定された。すなわち、pdfファイル1SG1（神経成長因子と一般的なニューロトロフィンレセプターp75間のレセプター−リガンド複合体）、及び当該ファイル1D4Vと1DU3からの5つのデスレセプター構造中のポリペプチドである。さらに、ファイル1D0Gからの構造を付加した。当該TNFレセプタースーパーファミリー構成分子DR5（TRAILレセプタータンパク質）をTRAILの三量体と複合体を形成するこの構造中に表し、当該OPGリガンド複合体に対するモデルの設計に利用した。InsightIIソフトウェアパッケージ内のモジュールModeller（Molecular Simulations社）を用いることによって、当該モデリングを実施した。1SG1 X鎖の構造をN末及びC末ドメインにさらに分割し、前記2つのドメインがOPGに対する相同性を示すように、前記2つのドメインを残りの鋳型と分離して揃えて配置した。その他の3つの鋳型と比較して、当該C末ドメインが置換されることを可能にする当該タンパク質中のヒンジ領域と考えられる。多くの選択されたOVP配列に対してのものに加え、選択実験のための開始地点として用いられた野生型OPG断片用に、50のモデルを作製した。前記モデルを、Modellerからの点数に応じて順位をつけ、上位10に順位づけされたモデルを1D0G構造中のDR5に揃えて配置した。同様に、この構造のTRAIL構成部分のレセプター接触領域を、当該決定されたマウスRANKLの構造（pdfファイル1JTZ）を用いることによって、RANKL上のレセプターの可能性のある接触構造のモデルを形成するために用いた。この方法により、TRAILとRANKL構造の結合の際のモデル形成されたOPGの比較が可能になった。OPGの複合体についての出来上がったモデルを、そのモデル形成された構造において、TRAILまたはRANKLそれぞれに関して、立体的不一致と潜在的な結合相互作用について検討した。
【０１７２】
RANKLとTRAILの両方の結合を示唆するOPGタンパク質についての本発明のモデルを、類似のTNFレセプター−リガンド相互作用に見られる広範囲の接触点（Hymowitz et al., Mol. Cell 4: 563-571, 1999；He et al, Science 304: 870-875, 2004）で形成することができた。本発明のモデリングから予測されるように、OPGの2つのTNFレセプター様ドメインは、RANKLとTRAILの両方の結合に関与していると考えられ（図９−１２を参照）、当該N末ドメインは残基42-92の領域内で、及び当該C末ドメインは残基107-154の領域内で接触している。特に重要であると考えられる107-118と120-142の2つの小領域を発見した。OPGとのN末ドメインの接触点はRANKLとTRAIL間で類似していると考えられ、従って、この領域の変異は、両方の結合相互作用に効果をより引き起こすであろう。これは、この領域が、TRAILへの結合は低減するがRANKLへの結合は低減しないことに対して選択されたOVP中に頻繁な変異が見られる場所ではないという、文中で報告された当該選択実験の結果と一致する。
【０１７３】
残基124-142の間のジスルフィド結合の周辺にヒンジがあると考えられ、これにより、C末ドメインが当該リガンドから離れて曲がりそれによって相互作用を制限すること、または、当該リガンドの方へ曲がり相互作用をより形成することのどちらかが可能になる。2つの検討されたリガンド、TRAILとRANKLの間には、さらなるコンフォメーションの違いがある。TRAILにおける残基Glu195からAsn202、特にAsn199、Thr200、及びLys201は、当該OPG結合部位に向いたループ領域として突出し、OPGにおける残基Leu119からArg143の領域内でOPGと潜在的に接触し、残基Lys120、His121、Arg122、Cys124、Pro125、Pro126、Gly127、Phe128、Cys141、Lys142とより接触する。
【０１７４】
しかしながら、この領域の正確な位置決定は、N末からヒンジ領域へ突出しているループ（これはCys107とCys118の間に囲まれている）内での接触により、さらに誘導されると考えられる。このループ内で、Glu116とPhe117は、少なくとも2つの方向に一連の好ましい相互作用を形成し得ると考えられる。隣接する残基Ile115における変異、例えばI115GまたはI115Eは1つの方向に傾いていると考えられ、より開かれた位置へ移動でき、それによってTRAILの195-202ループへ接触するC末の相互作用を弱め、一方で、RANKL相互作用を維持し得るであろう。しかしながら、これらの調査において、残基115でのいくつかの変化は、TRAILへだけでなくRANKLへの結合を分断することが分かった。これらの変化は、当該置換されたアミノ酸が正または負の電荷と結合したより大きな側鎖を有する場所のものであった。このことは、残基115はRANKLと接触することにも関与していること、またはこの残基への好ましくない変化が、116等の隣接する残基によって形成される重要な接触を分断することを示唆している。
【０１７５】
当該領域120-142内の変化についてのモデリングは、この領域における多くの残基のいずれかの1つがTRAILへの結合に特異的に影響を及ぼすかもしれないこと、及び多くのそのような変化が検討されたOVPの間で検出されたことを示唆している。
【０１７６】
当該N末結合領域内で、OPGの残基42-92はRANKLとTRAIL両方との広範囲な接触領域を形成する。両方のリガンド構造は、この接触点において類似していると考えられる。これは、TRAIL結合の損失をもたらす変異が文中に記載される研究において観察される領域ではないので、この領域における変異はTRAIL結合に実際はより弱く寄与しているかもしれないこと、またはこの領域における変異はTRAILとRANKLへの結合に同時に影響し、それゆえこの領域における変化が本スクリーニング方法の間に選択されなかったと結論する。それにもかかわらず、このまたは隣接する領域における変異による僅かなコンフォメーションの変化は、残基115の変異によりコンフォメーションの移動に対して上に示唆されているように、RANKLが介在する効果に対して当該分子の性質を好ましく変化させるかもしれない。特に関心のあるものは、検討されたOVPの中で同定された残基40での変化である。この残基はこの接触領域に隣接して存在するので、隣接する残基における変化はこのループの形態に僅かに影響を与えるかもしれず、それによってTRAIL結合を犠牲にしてRANKLへの結合に好ましく偏ると考えられる。そのような形態の僅かな移動は、このドメインの折りたたみに影響し得る他のOPG残基における変異によって達成されるかもしれないと考えられる。
【０１７７】
上に引用されたすべての文献を文中に完全な形で組み込む。
【０１７８】
本明細書に含まれている文献、行為、材料、装置、商品等についてのいずれかの議論は、本発明のための状況を提供する目的のためだけのものである。それは、これらの事柄のいずれかまたはすべてが先行技術の基礎の一部を形成している、または本出願の各請求項の優先日前に存在していたような本発明に関連する分野における共通の一般的知識であったということを承認するものとして理解されるべきでない。
【０１７９】
広範囲に記載されているような本発明の精神または視野から離れることなく、特定の実施態様に示されるような本発明に対して、多くの変更及び／または修正がなされても良いことが当業者に理解されるであろう。従って、本実施態様は、すべての点において、説明的であり、制限的なものでないと見なされる。
【０１８０】
表１：OVP結合の検討
#外挿法による
結合の増大＝より低い50%有効濃度；（）結合の低減＝より高い50%有効濃度
【表２】
2008522593.tif 000003
【０１８１】
表２：細胞ベースの測定法における生物学的活性の一覧
【表３】
2008522593.tif 000004
*−TRAIL誘導アポトーシスを阻害する最小能力
+++++ TRAIL誘導アポトーシスを阻害する最大能力
【０１８２】
（配列表の説明）
SEQ ID番号：１−ヒト野生型オステオプロテゲリン遺伝子；
SEQ ID番号：２−ヒト野生型オステオプロテゲリン；
SEQ ID番号：３−ラット野生型オステオプロテゲリン；
SEQ ID番号：４−マウス野生型オステオプロテゲリン；及び
SEQ ID番号：５−４７−ヒトオステオプロテゲリン・バリアントタンパク質（OVP）；及び
SEQ ID番号：４８と４９−前記OPG遺伝子を単離するために用いられたプライマー
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１−（A）OPG遺伝子構造。CRD-システインリッチドメイン；DD-デスドメイン；HBD-ヘパリン結合ドメイン。（B）pEGX254突然変異誘発とディスプレイカセット。
【図２】図２−RANKLとTRAILに対する精製OVPとOPGの結合についてのELISA比較。結合曲線は検査されるバリアント数に応じてラベル化される。WTは非変異OPGを表す。Rで終わる曲線ラベルはRANKL結合を表し、Tで終わる曲線ラベルはTRAIL結合を表す。これらの検討は、大腸菌において発現させた一量体OPG 22-194を用いて実施した。
【図３】図３−RANKLとTRAILに対する精製OVPとOPGの結合についてのELISA比較。図３に関する曲線ラベルと条件。
【図４Ａ】図４A−RANKLに対する哺乳類において発現させた精製OVPについてのELISA。これらの検討は、二量体Fc連結OPGまたはOVP 22-194を用いて実施した。
【図４Ｂ】図４B−TRAILに対する哺乳類において発現させた精製OVPについてのELISA。これらの検討は、二量体Fc連結OPGまたはOVP 22-194を用いて実施した。
【図５Ａ】図５A−HCT116細胞におけるTRAIL誘導アポトーシスの野生型OPGタンパク質による阻害。
【図５Ｂ】図５B−HCT116細胞におけるTRAIL誘導アポトーシスのOVPによる阻害。
【図６Ａ】図６A−RAW264.7細胞のRANKL介在破骨活性化の野生型OPGによる阻害。
【図６Ｂ】図６B−RAW264.7細胞のRANKL介在破骨活性化のOVPによる阻害。
【図７】図７−RANKL誘導破骨細胞に介在される吸収のOVPによる阻害。用いたOVPはすべて1 nM。UT-OVPで非処理。
【図８−１】図８−１−ヒト野生型OPGの配列と好ましいOVPアミノ酸配列。
【図８−２】図８−２−ヒト野生型OPGの配列と好ましいOVPアミノ酸配列。
【図９】図９−マウスRANKLに結合したOPG結合の構造モデル（pdbファイル1JTZ）。RANKL三量体を上部のライトグレーのリボンの図として、OPGをダークグレーのリボンの図として可視化する。RANKLの5オングストローム内に少なくとも1原子を有するOPG残基を塗りつぶした球体として強調する。明るい球体はN末レセプタードメインにおけるRANKLへのOPGの可能性のある接触残基を表し（42、43、49、50、52、53、69、71-82、85-91として記入された特定の接触残基を有するOPGの残基42-91）、暗い球体はC末レセプタードメインを表す（105、106、107、108、110-130として記入された特定の接触残基を有するOPGの残基105-130）。
【図１０】図１０−TRAILに接触したOPGモデルの部分的表示、第二のTNFレセプタードメインに焦点を当てている。上半分に、TRAILをリボンの図として示す。OPGをライトグレーでα炭素の線図として示す。黒でOPGバリアントをOPGと揃えて配置し、Ile 115のGluへの変異を特徴づけする。残基115と122に対する側鎖を棒図として示す。OVPのモデルを作成することにより、残基115の変異が107-118ループの変化した構造（これは境界面において再構築された接触を有する）を生じることを示唆している。前記構造変化はさらなる接触点を変化させ、残基122の側鎖の移動によって強調されるように、残基120-130の領域における接触を潜在的に破壊するかもしれない。これらの接触点は、RANKL結合に対してよりもTRAILに対してより決定的であるらしい。これは、本測定法においてこの変異体に対して観察されるTRAIL結合のほぼ完全な破壊と一致するであろう。
【図１１】図１１−OPG（下）とTRAIL（上、リボンの図として）間の結合を予測するモデル。残基102-130を塗りつぶした形状で示す。このモデルによれば、OPGの残基115を含むループ（長い矢印）とこれに対するC末残基（115ループの右へ）は、TRAIL（短い矢印）と複数の接触点を作る。TRAILの突出しているループ195-202（短い矢印）は、RANKLに対して可能であるよりも、OPG、特にOPGの残基120-130とのさらなるまたはより広範囲の接触点を可能にするようである（図１２と比較）。これは、その領域が突然変異により非変更のRANKL結合への可能性を有するTRAIL結合を変化させるらしい領域であることを立証している。
【図１２】図１２−OPG（下）とTRAIL（上、リボンの図として）間の結合を予測するモデル、マウスRANKL構造を用い、OPG-TRAIL複合体モデルを揃えて配置している。OPGの残基102-130を塗りつぶした形状で示す。残基115を含むループ（長い矢印）はRANKLへ向いて接触しているが、この領域に対するC末残基（このループの右へ）はRANKLとの接触点をほとんど有しないようである（短い矢印−RANKL残基225-233、これは図１１中の突出しているループ195-202に相当する）。これにより、RANKLとのOPGの接触は、先行する図中に示されたTRAILのそれと区別される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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