(57)【要約】  ドーパミン作動性ニューロンの発生を促進し、かつドーパミン作動性表現型を備えた神経細胞を作製するための方法。ドーパミン作動性神経細胞は、パーキンソン病のような神経変性疾患にかかった個体の治療に使用することができる。ドーパミン作動性細胞を個体の脳に移植し、かつ/またはドーパミン作動性神経の発生を個体の脳において誘導もしくは増強することができる。これらの方法は、細胞を、Dkkリガンド（例えば、Dkk1からDkk4までのいずれか１つ、もしくはシステインリッチドメインを含むその断片）またはDkk受容体（例えば、LRP5もしくはLRP6）により処理し、それにより、増殖、自己複製、生存および/またはドーパミン作動性の誘導、分化、生存もしくはニューロンのドーパミン作動性表現型の獲得を生じさせるかまたは高めることを含む。細胞をアストロサイトまたはグリア細胞と共培養しても、FGF増殖因子と接触させてもよい。ドーパミン作動性ニューロンは薬物/毒物学試験にも有用であり、また、標的の開発や薬物の発見にも有用でありうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経幹細胞、胚性幹細胞、始原細胞、または前駆細胞における増殖、自己複製、ドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、生存、分化および/または成熟を高めることによってドーパミン作動性ニューロンの発生を誘導または促進する方法であって、
該細胞におけるDkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルおよび/または活性をモジュレートし、
それによって、増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の誘導、分化、生存もしくはニューロンのドーパミン作動性表現型の獲得を誘導または増強する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
前記細胞をDkkリガンド/受容体ポリペプチドで処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがDkk1、Dkk2、Dkk-3またはDkk4ポリペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドがヒトDkk1、Dkk2、Dkk3またはDkk4由来のシステインリッチドメイン１および/またはシステインリッチドメイン２を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
DkkポリペプチドがヒトDkk-1に対して少なくとも50％の配列同一性を有するDkk1ポリペプチドである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
Dkk-2ポリペプチドがヒトDkk-2に対して少なくとも50％の配列同一性を有する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
Dkk-3ポリペプチドがヒトDkk-3に対して少なくとも50％の配列同一性を有する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
Dkk-4ポリペプチドがヒトDkk-4に対して少なくとも50％の配列同一性を有する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項９】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがLRPポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
LRPポリペプチドがヒトLRP-5の細胞外ドメインに対して少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むLRP-5ポリペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
LRPポリペプチドがヒトLRP-5の細胞外ドメインを含むLRP-5ポリペプチドである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
LRPポリペプチドがヒトLRP-5に対して少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項10または11に記載の方法。
【請求項１３】
LRPポリペプチドがヒトLRP-5のアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
LRPポリペプチドがヒトLRP-6の細胞外ドメインに対して少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むLRP-6ポリペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
LRPポリペプチドがヒトLRP-6の細胞外ドメインを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
LRPポリペプチドがヒトLRP-6に対して少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項14または15に記載の方法。
【請求項１７】
LRPポリペプチドがヒトLRP-6のアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドが１個または複数の追加のアミノ酸をさらに含む、請求項３〜17のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドが免疫グロブリンFcドメインをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドを、前記細胞を含むin vitro培養物に添加する、請求項２〜19のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドが、前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞または前駆細胞と共培養される細胞からの発現により産生され、共培養される細胞は、１型アストロサイトまたは初期グリア細胞以外の細胞であるか、Dkkリガンド/受容体ポリペプチドをコードする核酸により形質転換された宿主細胞または導入されたDkkリガンド/受容体ポリペプチドを含有する細胞である、請求項２〜19のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
１型アストロサイトもしくは初期グリア細胞以外の共培養細胞または宿主細胞が別の幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞または神経細胞である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞が、コードする核酸からDkkリガンド/受容体ポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドが共培養される細胞に導入される、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞を非ペプチド性Dkkリガンドで処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞を、Dkkリガンド/受容体ポリペプチドの阻害剤、遮断剤、アンタゴニストまたはサプレッサーである化合物で処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物がDkk1またはDkk4の阻害剤、遮断剤、アンタゴニストまたはサプレッサーである、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルが、前記細胞における前駆タンパク質転換酵素の活性を調節することによりモジュレートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前駆タンパク質転換酵素が配列Arg-X-X-Arg、Arg/Lys-X-X-X-Arg/Lys-Arg、またはArg/Lys-Argを特異的に切断する、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前駆タンパク質転換酵素がフューリンまたはプロテアーゼ転換酵素２（PC2）である、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞がNurr1サブファミリーの核内受容体を発現する、請求項１〜30のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記核内受容体がNurr1である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞が有糸分裂し、かつ/または自己複製可能である、請求項１〜32のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞を、Wntファミリーのリガンドのメンバー、またはMsx1のようなWntの上流調節因子とさらに接触させる、請求項１〜33のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞を、レチノイドもしくはレチノイド誘導体、レチノイドX受容体（RXR）の活性化因子、レチノイン酸受容体（RAR）の抑制因子、9-cisレチナール、DHA、SR11237、またはLG849と接触させる、請求項１〜34のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞を、該細胞におけるDkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルおよび/または活性をモジュレートする前またはモジュレートすると同時に、FGFファミリーの増殖因子のメンバーにより処理する、請求項１〜35のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞を、bFGFおよび/またはEGFおよび/またはFGF-8および/またはLIFおよび/またはShhおよび/またはインスリンにより処理する、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞を、抗酸化剤、アスコルビン酸、低酸素分圧、低酸素症誘導因子、神経栄養因子、GDNF、engrailed、Pax2、Mash1、ニューロゲニン、Pitx3またはBclxLの存在下で成長させる、請求項１〜37のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞が、腹側中脳アストロサイトまたは初期グリア細胞の存在下で成長および/または分化する、請求項１〜38のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞を、初期グリア細胞または（任意で腹側中脳の）１型アストロサイトとさらに共培養することを含む、請求項１〜39のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
１型アストロサイトが不死化されているか、または腹側中脳以外の領域のアストロサイトの細胞株に由来する、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞を、非ドーパミン作動性ニューロンに対して選択する陰性選択剤とさらに接触させることを含む、請求項１〜41のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞におけるDkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルおよび/または活性をモジュレートする前に、前記神経幹細胞、胚性幹細胞、始原細胞または前駆細胞を酸化的ストレスにさらすことを含む、請求項１〜42のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
処理したニューロンを、１種以上のさらなる成分を含有する組成物に製剤化することをさらに含む、請求項１〜43のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物が製薬上許容される添加剤を含有する、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物を個体に投与することをさらに含む、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記ニューロンが個体の脳に移植される、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞が、個体におけるその発生部位で、Dkkリガンド/受容体ポリペプチドにより処理される、請求項２〜19のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドをコードする核酸が前記細胞に導入される、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドが前記細胞に導入される、請求項48に記載の方法。
【請求項５１】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞が前記個体に内因性のものである、請求項48〜50のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞が、前記個体に移植することにより外因的に供給される、請求項48〜50のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記個体がパーキンソン病、パーキンソン症候群、ニューロンの減少、または神経変性疾患を有する、請求項48〜52のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
個体を治療する医薬の製造において、前記方法により得られたニューロンを使用することをさらに含む、請求項１〜43のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記医薬が個体の脳に移植するためのものである、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記個体がパーキンソン病、パーキンソン症候群、ニューロンの減少、または神経変性疾患を有する、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
請求項１〜43のいずれか１項に記載の方法により得られたドーパミン作動性ニューロン。
【請求項５８】
神経変性疾患治療用の薬剤のスクリーニング方法における請求項57に記載のドーパミン作動性ニューロンの使用。
【請求項５９】
神経変性疾患治療用の薬剤のスクリーニング方法であって、
(i) 請求項１〜43のいずれか１項に記載の方法により得られたドーパミン作動性ニューロンを、該ドーパミン作動性ニューロンの毒素で処理し、
(ii) 該ドーパミン作動性ニューロンを該毒素から分離し、
(iii) 該ドーパミン作動性ニューロンを1種以上の試験薬剤と接触させ、
(iv) 該ドーパミン作動性ニューロンの該毒素からの回復能を測定し、
(v) 該ドーパミン作動性ニューロンの該毒素からの回復能を、該試験薬剤と接触させてないドーパミン作動性ニューロンの該毒素からの回復能と比較する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項６０】
神経変性疾患治療用の薬剤のスクリーニング方法であって、
(i) 請求項57に記載のドーパミン作動性ニューロンを、1種以上の試験薬剤の存在下で、該ドーパミン作動性ニューロンの毒素で処理し、
(ii) 該ドーパミン作動性ニューロンの該毒素に対する耐性能を測定し、
(iii) 該ドーパミン作動性ニューロンの該毒素に対する耐性能を、該試験薬剤と接触させてないドーパミン作動性ニューロンの該毒素に対する耐性能と比較する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項６１】
神経変性疾患治療用の薬剤のスクリーニング方法であって、
(i)  請求項１〜43のいずれか１項に記載の方法により得られたドーパミン作動性ニューロンを1種以上の試験薬剤と接触させ、
(ii)  該薬剤の存在下での該ドーパミン作動性ニューロンの成長または生存能または神経伝達物質の放出を確認する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項６２】
前記ドーパミン作動性ニューロンが酸化的ストレスにさらされた幹細胞、始原細胞または前駆細胞から生じる、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
前記1種以上の試験薬剤を、１種以上のさらなる成分を含有する組成物に製剤化することをさらに含む、請求項60〜62のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記組成物が製薬上許容される添加剤を含有する、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
前記組成物を個体に投与することをさらに含む、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
前記個体がパーキンソン病、パーキンソン症候群、ニューロンの減少、または神経変性疾患を有する、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、または前駆細胞における増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、分化もしくは成熟を単独でまたは組合せで高める１種以上の因子を得る方法であって、
(a)  神経幹始原または前駆細胞を、１種以上の試験物質の存在下または非存在下で、DkkリガンドまたはDkk受容体により処理し、
(b)  該細胞の増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、分化もしくは成熟を測定して、該試験物質の存在下または非存在下での該増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、分化もしくは成熟の程度を比較し、それにより該因子を得る、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項６８】
幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、または前駆細胞における増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、分化もしくは成熟を単独でまたは組合せで高める１種以上の因子を得る方法であって、
(a)  神経幹始原または前駆細胞を、１種以上の試験物質の存在下または非存在下で、DkkリガンドまたはDkk受容体で処理し、
(b)  該細胞におけるβ-カテニン活性化を測定して、該試験物質の存在下または非存在下での該β-カテニン活性化の程度を比較し、それにより該因子を得る、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項６９】
前記神経幹始原または前駆細胞をDkkリガンド/受容体ポリペプチドで処理する、請求項67または68に記載の方法。
【請求項７０】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがDkk1、Dkk-2、Dkk3またはDkk4ポリペプチドである、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがヒトDkk1、Dkk2、Dkk3またはDkk4由来のシステインリッチドメイン１および/またはシステインリッチドメイン２を含む、請求項69または70に記載の方法。
【請求項７２】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがヒトDkk-1に対して少なくとも50％の配列同一性を有するDkk1ポリペプチドである、請求項70または71に記載の方法。
【請求項７３】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがヒトDkk-2に対して少なくとも50％の配列同一性を有するDkk-2ポリペプチドである、請求項70または71に記載の方法。
【請求項７４】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがヒトDkk-3に対して少なくとも50％の配列同一性を有するDkk-3ポリペプチドである、請求項70または71に記載の方法。
【請求項７５】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがヒトDkk-4に対して少なくとも50％の配列同一性を有するDkk-4ポリペプチドである、請求項70または71に記載の方法。
【請求項７６】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがLRPポリペプチドである、請求項69に記載の方法。
【請求項７７】
LRPポリペプチドがヒトLRP-5の細胞外ドメインに対して少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むLRP-5ポリペプチドである、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
LRPポリペプチドがヒトLRP-5の細胞外ドメインを含むLRP-5ポリペプチドである、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
LRPポリペプチドがヒトLRP-5に対して少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項77または78に記載の方法。
【請求項８０】
LRPポリペプチドがヒトLRP-5のアミノ酸配列を含む、請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
前記LRPポリペプチドがヒトLRP-6の細胞外ドメインに対して少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むLRP-6ポリペプチドである、請求項76に記載の方法。
【請求項８２】
LRPポリペプチドがヒトLRP-6の細胞外ドメインを含むLRP-6ポリペプチドである、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
LRPポリペプチドがヒトLRP-6に対して少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項81または82に記載の方法。
【請求項８４】
LRPポリペプチドがヒトLRP-6のアミノ酸配列を含む、請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
LRPポリペプチドが１個または複数の追加のアミノ酸をさらに含む、請求項76〜84のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
LRPポリペプチドが免疫グロブリンFcドメインをさらに含む、請求項85に記載の方法。
【請求項８７】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドを、前記細胞を含むin vitro培養物に添加することにより、前記細胞をDkkリガンド/受容体ポリペプチドで処理する、請求項68〜86のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドをコードする核酸を前記細胞に導入することにより、前記細胞をDkkリガンド/受容体ポリペプチドで処理する、請求項68〜86のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドを前記細胞に導入することにより、前記細胞をDkkリガンド/受容体ポリペプチドで処理する、請求項68〜86のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
１型アストロサイトまたは初期グリア細胞以外の細胞、Dkkリガンド/受容体ポリペプチドをコードする核酸により形質転換された宿主細胞、または導入されたDkkリガンド/受容体ポリペプチドを含有する細胞と共培養することにより、前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞をDkkリガンド/受容体ポリペプチドで処理する、請求項68〜86のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞を、初期グリア細胞または（任意で腹側中脳の）１型アストロサイトと共培養することをさらに含む、請求項68〜86のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
神経幹細胞、胚性幹細胞、始原細胞、または前駆細胞における増殖、自己複製、ドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、生存、分化および/または成熟を高めることによってドーパミン作動性ニューロンの発生を誘導または促進するのに有用な化合物をスクリーニングする方法であって、
試験化合物の存在下でDkkポリペプチドをタンパク質加水分解により切断する前駆タンパク質転換酵素の能力を確認することを含んでなり、
その際、該試験化合物の非存在下と比べて存在下で該能力が増減すれば、該試験化合物がドーパミン作動性ニューロンの発生を誘導または促進するのに有用であることを示す、上記方法。
【請求項９３】
Dkkポリペプチドをタンパク質加水分解により切断する前駆タンパク質転換酵素の能力が、前駆タンパク質転換酵素の存在下でDkk活性を測定することにより確認される、請求項92に記載の方法。
【請求項９４】
Dkk活性がβ-カテニンの活性化またはドーパミン作動性発生を測定することにより確認される、請求項93に記載の方法。
【請求項９５】
Dkkポリペプチドをタンパク質加水分解により切断する前駆タンパク質転換酵素の能力が、Dkkポリペプチドのタンパク質加水分解的切断の産物の存在を確認することにより判定される、請求項92に記載の方法。
【請求項９６】
DkkポリペプチドがDkk-1、Dkk-2、Dkk-3および/またはDkk-4である、請求項92〜95のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９７】
前駆タンパク質転換酵素が配列Arg-X-X-Arg、Arg/Lys-X-X-X-Arg/Lys-Arg、またはArg/Lys-Argに特異的である、請求項92〜96のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９８】
前駆タンパク質転換酵素がフューリンまたはプロテアーゼ転換酵素２（PC2）である、請求項97に記載の方法。
【請求項９９】
幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、または前駆細胞における増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、分化もしくは成熟を高めることができる化合物または因子が単離されたおよび/または精製された形態で提供される、請求項68〜98のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１００】
幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、または前駆細胞における増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、分化もしくは成熟を高めることができる化合物または因子が、１種以上のさらなる成分を含有する組成物に製剤化される、請求項68〜99のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記組成物が幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、または前駆細胞を含有する、請求項100に記載の方法。
【請求項１０２】
前記組成物がDKKリガンド/受容体ポリペプチドを含有する、請求項100または101に記載の方法。
【請求項１０３】
前記組成物が製薬上許容される添加剤を含有する、請求項100〜102のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記組成物を個体に投与することをさらに含む、請求項103に記載の方法。
【請求項１０５】
前記組成物が個体の脳に移植されるものである、請求項104に記載の方法。
【請求項１０６】
前記個体がパーキンソン病、パーキンソン症候群、ニューロンの減少、または神経変性疾患を有する、請求項105に記載の方法。
【請求項１０７】
タンパク質加水分解を受けにくいDkkリガンドをスクリーニングする方法であって、
Dkkリガンドを含むと予想されるサンプルのDkk活性を前駆タンパク質転換酵素の存在下で確認することを含んでなり、
活性が存在すれば、該サンプルに該Dkkリガンドが含まれることを示す、上記方法。
【請求項１０８】
前記サンプルのDkk活性が、神経幹細胞、胚性幹細胞、始原細胞、または前駆細胞における増殖、自己複製、ドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、生存、分化および/または成熟を高めることによりドーパミン作動性ニューロンの発生を促進させることに対する前記サンプルの効果を測定することにより確認される、請求項107に記載の方法。
【請求項１０９】
前記サンプルのDkk活性がβ-カテニン活性化を測定することにより確認される、請求項107に記載の方法。
【請求項１１０】
前記サンプルのDkk活性が、Dkkリガンドのタンパク質加水分解的切断の産物の存在を確認することにより確認される、請求項107に記載の方法。
【請求項１１１】
前駆タンパク質転換酵素が配列Arg-X-X-Arg、Arg/Lys-X-X-X-Arg/Lys-Arg、またはArg/Lys-Argに特異的である、請求項107〜110のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１２】
前駆タンパク質転換酵素がフューリンまたはプロテアーゼ転換酵素２（PC2）である、請求項111に記載の方法。
【請求項１１３】
タンパク質加水分解を受けにくいDkkリガンドを含むものとしてサンプルを同定することを含む、請求項107〜112のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記サンプルからDkkリガンドを単離および/または精製することを含む、請求項113に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経幹細胞または神経始原もしくは前駆細胞、あるいは他の幹細胞においてニューロン（神経細胞）の運命を誘導することに関する。本発明は、特定のニューロンの表現型を誘導しかつその誘導を高めること、特に中脳のドーパミン作動性ニューロンの表現型を誘導しかつその誘導を高めることに関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（PD）はごく一般的な神経変性障害であり、その病因は中脳のドーパミン作動性（dopaminergic：DA）ニューロンが選択的かつ進行的に減少することを特徴とする。ニューロン表現型の誘導を高めることは、パーキンソン病やその他の非常に消耗性の神経変性障害を治療できるという可能性がある。
【０００３】
以前には、ヒト胎児中脳組織がパーキンソン病患者に移植されて、プラスの結果が得られたが、本発明を利用する特定の細胞置換療法の開発により、このような以前のアプローチに伴う実際上および倫理上の問題点が克服される。特に、本発明は、胚組織または胎児性細胞を使用する必要性を低減または排除しつつ、移植用の細胞調製物の開発を可能にする。幹細胞は臍帯から得ることができるが、この臍帯は通常捨てられる組織である。もう一つの選択肢は成人の幹細胞を取得することであり、かかる細胞は、例えば骨髄、血液、皮膚、眼、嗅球または嗅上皮から得られる。
【０００４】
特定のニューロン表現型の誘導には、遺伝的シグナルと後成的シグナルの両方の組込みが必要である。発生しつつある中脳では、ドーパミン作動性ニューロンの誘導にオーファン核内受容体Nurr1が必要であると報告されている (Zetterstroemら, 1997; Saucedo-Cardenas ら, 1998; Castilloら, 1998)。しかし、Nurr1の発現は神経幹細胞においてドーパミン作動性表現型を誘導するのに十分でない (Wagnerら, 1999)。
【０００５】
本明細書に記載する知見は、Dickkopf (Dkk)リガンドおよび受容体が、腹側中脳の神経発生における増殖、自己複製、分化および運命決定に極めて重要な調節因子であることを示す。さらに、我々の結果は、中脳DAニューロンのin vitroでの大規模生産への、また、パーキンソン病のような神経変性疾患を治療する際の幹細胞置換ストラテジーの将来の実現への、道を開くものである (BjorklundおよびLindvall 2000; PriceおよびWilliams 2001; Arenas, 2002; RossiおよびCattaneo, 2002; Gottliebら, 2002)。
【０００６】
胚性幹細胞、神経幹細胞、および多能性幹細胞は、ニューロン、アストロサイト、稀突起神経膠細胞を含む神経細胞系統に分化する能力がある。さらに、幹細胞は、分離して増やした後、脳に移植するための起源材料として使用することができる (Snyder, E. Y.ら Cell 68, 33-51 (1992); Rosenthal, A. Neuron 20, 169-172 (1998); Bainら, 1995; Gage, F.H.ら Ann. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995); Okabeら, 1996; Weiss, S.ら Trends Neurosci. 19, 387-393 (1996); Snyder, E. Y.ら Clin. Neurosci. 3, 310-316 (1996); Martinez-Serrano, A.ら Trends Neurosci. 20, 530-538 (1997); McKay, R. Science 276, 66-71 (1997); Deaconら, 1998; Studer, L.ら Nature Neurosci. 1, 290-295 (1998); BjorklundおよびLindvall 2000; Brustleら, 1999; Leeら, 2000; Shuldinerら, 2000および2001; Reubinoffら, 2000および2001; Tropepeら, 2001; Zhangら, 2001; PriceおよびWilliams 2001; Arenas 2002; Bjorklundら, 2002; RossiおよびCattaneo, 2002; Gottliebら, 2002)。
【０００７】
ほとんどの神経変性疾患はニューロン集団に影響を及ぼす。さらに、損傷の大部分は特定の神経化学的表現型をもつ細胞に起こる。例えば、ヒトのパーキンソン病では、主として失われる細胞型が中脳のドーパミン作動性ニューロンである。神経組織の移植を介した特定のニューロン集団の機能的置換は、神経変性疾患を処置するための魅力的な治療上の戦略となる (Rosenthal, A. Neuron 20, 169-172 (1998); Arenas E., Brain Res Bull. 57(6):795-808 (2002); Lindvall O., Pharmacol Res. 47(4):279-87 (2003); Bjoerklund A.ら, Lancet Neurol. 2(7):437-45 (2003))。もう一つの代替法は、再生、修復を促進するのに必要なシグナル、または幹細胞、始原もしくは前駆細胞の発生および/または補充を誘導するのに必要なシグナルを直接的に注入すること、または、こうした機能を調節する薬物を投与することであろう。
【０００８】
幹細胞/始原または前駆細胞は、それらを増やして特定のニューロン表現型をとるように指令することができるので、移植療法にとって理想的な物質である。これらの細胞は、移植のためにヒト胎児組織を使用することに関係する倫理上および実用上の問題を回避するであろう。
【０００９】
幹細胞または始原もしくは前駆細胞において単一の特定のニューロン表現型を誘導することは、当てにならないことが分かっている。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、細胞におけるドーパミン作動性ニューロンの表現型の誘導を提供する。こうして、培養物または脳におけるDickkopfリガンド（例えば、Dickkopf-1、-2、-3または-4 (Dkks)）および/またはDkk受容体（例えば、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)関連プロテイン-5または-6 (LRP5/6)）のレベルを調節することによって、本発明は、ドーパミン作動性の前駆細胞、始原細胞もしくは幹細胞の増殖および/または自己複製の誘導または促進；および/またはドーパミン作動性ニューロン、前駆細胞、始原細胞もしくは幹細胞の生存、分化および成熟の促進；ドーパミン作動性ニューロンの生産量の増加；および/または幹細胞、始原細胞、前駆細胞もしくはニューロン細胞におけるドーパミン作動性ニューロン運命の誘導をin vitroまたはin vivoにおいて可能にする。
【００１１】
本発明の態様または実施形態はいずれも、幹細胞、始原細胞、前駆細胞または神経細胞すなわちニューロンに適用することができるか、これらの細胞を使用することができる。本明細書において「神経細胞」はニューロン細胞でありうる。
【００１２】
ドーパミン作動性ニューロンが豊富な細胞調製物は、パーキンソン病やその他の障害における細胞置換療法に使用することができ、また、ドーパミン作動性ニューロンにおけるシグナル伝達現象およびドーパミン作動性ニューロンに対する薬物の効果をin vitroで（例えばハイスループットスクリーニングで）研究するために使用することができる。
【００１３】
本発明の態様および実施形態は、特許請求の範囲に記載したとおりに提供される。
【００１４】
一態様において、本発明は、幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、または神経始原もしくは前駆細胞においてドーパミン作動性ニューロンの運命を誘導する方法、またはニューロン細胞におけるドーパミン作動性の誘導もしくは分化を高める方法、またはドーパミン作動性の前駆もしくは始原細胞を増やす方法を提供し、上記方法は、
該細胞におけるDkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルおよび/または活性をモジュレートし、
それによって、ドーパミン作動性ニューロンを生産する、
ことを含んでなる。
【００１５】
本発明は、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞における増殖、自己複製、ドーパミン作動性の誘導、生存、分化および/または成熟を高めることによってドーパミン作動性ニューロンの発生を誘導または促進する方法を提供し、上記方法は、
該細胞におけるDkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルおよび/または活性をモジュレートし、
それによって、増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の誘導、分化、神経伝達、生存もしくはニューロンのドーパミン作動性表現型の獲得を生起または増強する、
ことを含んでなる。
【００１６】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドは、適当な結合パートナーと共にDkk受容体/リガンド複合体を形成することができるポリペプチドである。Dkkリガンド/受容体ポリペプチドには、DkkリガンドであるポリペプチドとDkk受容体であるポリペプチドが含まれる。Dkkリガンド/受容体ポリペプチドの例としては、Dkk受容体に結合するDkk-1、Dkk-2、Dkk-3またはDkk-4のようなDkkポリペプチド、ならびにDkkポリペプチドに結合するLRP5、LRP6、Kremen 1またはKremen 2のようなDkk受容体が挙げられる。Dkkリガンド/受容体ポリペプチドは内因性の細胞性ポリペプチドであってもよいし、組換えまたは他の手段により作られた合成ポリペプチドであってもよい。
【００１７】
Dkk受容体はDkkポリペプチドと共にDkk受容体/リガンド複合体を形成することができるポリペプチドである。適当なDkk受容体には、LRP5、LRP6、Kremen 1およびKremen 2が含まれる。
【００１８】
DkkリガンドはDkk受容体と共にDkk受容体/リガンド複合体を形成することができるペプチド性または非ペプチド性分子（すなわち、Dkk受容体アゴニスト）である。Dkkリガンドの例としては、以下で説明するようなDkkポリペプチドが含まれる。
【００１９】
Dkkポリペプチドは哺乳動物種由来のDkk-1、-2、-3または-4ポリペプチドであってよく、例えばマウスDkk-1、-2、-3または-4、あるいはヒトDkk-1、-2、-3または-4であり、Dkkポリペプチドはこれらのいずれかの断片または変異体であってもよい。例えば、Dkk-1ポリペプチドは図11に示すようなタンパク質分解断片を含み、Dkk-2ポリペプチドは図12に示すようなタンパク質分解断片を含むことができる。
【００２０】
Dkkポリペプチドは、ヒトDkk1、Dkk2、Dkk3またはDkk4のような野生型Dkk配列の２つのシステインリッチドメイン（Cys-1またはCys-2）の一方または両方を含むものでも、そのような一方または両方からなるものでもよく、また、これらのドメインの一方または両方の変異体を含むものでも、そのような変異体からなるものでもよい。
【００２１】
ヒトDkk1のCys-1ドメインは全長配列の残基85-138からなり、ヒトDkk1のCys-2ドメインは全長配列の残基189-263からなる。
【００２２】
ヒトDkk2のCys-1ドメインは全長配列の残基78-127からなり、ヒトDkk2のCys-2ドメインは全長配列の残基183-256からなる。
【００２３】
ヒトDkk3のCys-1ドメインは全長配列の残基147-195からなり、ヒトDkk3のCys-2ドメインは全長配列の残基208-284からなる。
【００２４】
ヒトDkk4のCys-1ドメインは全長配列の残基41-90からなり、ヒトDkk4のCys-2ドメインは全長配列の残基145-218からなる。
【００２５】
本明細書に記載する野生型Dkk配列の断片または変異体は、幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、または神経始原もしくは前駆細胞においてドーパミン作動性ニューロンの運命の発生をモジュレートする機能が保持されるという条件で、１個または複数のアミノ酸の付加、欠失、置換および/または挿入によって野生型配列と異なっていてもよい (Monaghanら (1999), Baficoら, (2001); Liら (2002); MacDonaldら (2004); Maoら (2001a); Semenovら, (2001))。
【００２６】
例えば、野生型配列の変異体であるポリペプチドは、野生型配列（例えば、ヒトDkk-1、-2、-3、もしくは-4）またはその１以上のドメインに対して約30％以上、約40％以上、約45％以上、約55％以上、約65％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、または約95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものでありうる。前記配列は野生型配列（例えば、ヒトDkk-1、-2、-3、もしくは-4）またはその１以上のドメインに対して約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、または約90％以上の類似性を有するものでもよい。
【００２７】
ヒトDkk-1のアミノ酸配列はGenBankリファレンスSwiss proteinアクセッション番号AAF02674.1 (GI:6049604)から、そのコードする核酸はリファレンスAF177394.1 (GI:6049603)から入手可能である。
【００２８】
ヒトDkk-2のアミノ酸配列はGenBankリファレンスSwiss proteinアクセッション番号AAQ88780.1 (GI:37181953)から、そのコードする核酸はリファレンスAY358414.1 (GI:37181952)から入手可能である。
【００２９】
ヒトDkk-3のアミノ酸配列はGenBankリファレンスSwiss proteinアクセッション番号AAF02676.1 (GI:6049608)から、そのコードする核酸はリファレンスAF177396.1 (GI:6049607)から入手可能である。
【００３０】
ヒトDkk-4のアミノ酸配列はGenBankリファレンスSwiss proteinアクセッション番号AAF02677.1 (GI:6049610)から、そのコードする核酸はリファレンスAF177397.1 (GI:6049609)から入手可能である。
【００３１】
Dkkポリペプチドに結合するDkk受容体には、LRP-5およびLRP-6ポリペプチドのようなLRPポリペプチドと、Kremen 1およびKremen 2ポリペプチドのようなKremenポリペプチドが含まれる。
【００３２】
LRPポリペプチドは哺乳動物種由来のLRP配列（例えば、マウスLRPまたはヒトLRP）を含むものでも、その断片または変異体である配列を含むものでもよい。
【００３３】
Kremenポリペプチドは哺乳動物種由来のKremen配列（例えば、マウスKremenまたはヒトKremen）を含むものでも、その断片または変異体である配列を含むものでもよい。
【００３４】
野生型LRPまたはKremen配列の断片または変異体は、幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、または神経始原もしくは前駆細胞においてドーパミン作動性ニューロンの運命の発生を高める機能が保持されるという条件で、１個または複数のアミノ酸の付加、欠失、置換および/または挿入によって野生型配列と異なっていてもよい (Monaghanら (1999), Baficoら, (2001); Liら (2002); MacDonaldら (2004); Maoら (2001a); Semenovら, (2001))。
【００３５】
例えば、LRPポリペプチドは、ヒトLRP-5またはLRP-6の細胞外ドメインまたは全長配列に対して約30％以上、約40％以上、約45％以上、約55％以上、約65％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、または約95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものでありうる。この配列はヒトLRP-5またはLRP-6の細胞外ドメインまたは全長配列に対して約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、または約90％以上の類似性を有するものでもよい。
【００３６】
ヒトLRP-5のアミノ酸配列はGenBankリファレンスアクセッション番号NP_002326.1 (GI:4505019)から、コードする核酸はDNAについてのリファレンスNM_002335.1 (GI:4505018)から入手可能である。ホモ・サピエンスLRP-5の細胞外ドメインは、最初のATGで開始する4100塩基対領域によりコードされる。
【００３７】
ヒトLRP-6のアミノ酸配列はGenBankリファレンスアクセッション番号NP_002327.1 (GI:4505017)から、コードする核酸はDNAについてのリファレンスNM_002336.1 (GI:4505016)から入手可能である。ホモ・サピエンスLRP-6の細胞外ドメインは、最初のATGで開始する4167塩基対領域によりコードされる。
【００３８】
Kremenポリペプチドは、ヒトKremen-1またはKremen-2の細胞外ドメインまたは全長配列に対して約30％以上、約40％以上、約45％以上、約55％以上、約65％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、または約95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものでありうる。この配列はヒトKremen-1またはKremen-2の細胞外ドメインまたは全長配列に対して約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、または約90％以上の類似性を有するものでもよい。
【００３９】
ヒトKremen-1のアミノ酸配列はGenBankリファレンスアクセッション番号NP_114434.3 (GI:24041012)から、コードする核酸はDNAについてのリファレンスNM_032045.3 (GI:24041011)から入手可能である。
【００４０】
ヒトKremen-2のアミノ酸配列はGenBankリファレンスアクセッション番号NP_078783.1 (GI:13375642)から、コードする核酸はDNAについてのリファレンスNM_024507.2 (GI:27437002)から入手可能である。
【００４１】
ある好ましい実施形態において、LRPまたはKremenポリペプチドは、ヒトLRPまたはKremenの細胞外ドメイン、またはヒトLRPまたはKremenの細胞外ドメインの断片もしくは変異体であるアミノ酸配列を含むものでも、そのようなアミノ酸配列からなるものでもよい。
【００４２】
ある実施形態では、LRPまたはKremenポリペプチドを、可溶性の非膜結合型ポリペプチドとすることができる。このポリペプチドには、例えば野生型LRPまたはKremenの膜貫通および/または細胞内ドメインが存在しない。
【００４３】
他の実施形態では、LRPまたはKremenポリペプチドが膜結合型であってよい。このポリペプチドには、例えば野生型LRPまたはKremenの膜貫通および/または細胞内ドメインが含まれる。
【００４４】
本明細書に記載するDkkリガンド/受容体ポリペプチドは、１個または複数の追加のアミノ酸をさらに含むことができる。例えば、LRPまたはKremenポリペプチドは、LRPまたはKremenアミノ酸配列（例えば、ヒトLRPもしくはKremenまたはその断片もしくは変異体の細胞外ドメイン）と、１以上のさらなる特性を賦与しうるペプチド成分とを含む融合体であってよい。例えば、融合体は免疫グロブリンFcドメインを含む。
【００４５】
配列類似性および同一性は一般に、アルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, Madison, WI）に関して規定される。GAPは、NeedlemanとWunschのアルゴリズムを用いて、２つの完全な配列を、マッチ数を最大にしてギャップ数を最小にするようにアライメントする。一般的には、デフォルトパラメータが使用され、ギャップ生成ペナルティ＝12、ギャップ延長ペナルティ＝４とする。GAPの使用が好適であるが、他のアルゴリズムを使用してもよい。例えば、BLAST (Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410に記載の方法を使用)、 FASTA (PearsonおよびLipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448に記載の方法を使用)、もしくはSmith-Watermanアルゴリズム (SmithおよびWaterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197)、またはTBLASTNプログラム（Altschulら (1990) 前掲；一般にはデフォルトパラメータを使用）などである。特に、psi-Blastアルゴリズム(Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402)を用いることができる。配列同一性および類似性はまた、Genomequest（商標）ソフトウェア(Gene-IT, Worcester MA USA)を用いて決定してもよい。
【００４６】
配列比較は本明細書に記載する関連配列の全長にわたって行うことが好ましい。
【００４７】
類似性は「保存的変異」を可能にし、すなわち、ある疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニン）を別のもので置換したり、ある極性残基を別のもので（例えば、アルギニンをリシンで、グルタミン酸をアスパラギン酸で、グルタミンをアスパラギンで）置換したりすることが可能である。
【００４８】
ある実施形態において、細胞中のDkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルおよび/または活性は、細胞をDkkリガンドまたはDkk受容体で処理することにより増大させることができる。例えば、細胞をDkkリガンド/受容体ポリペプチドで処理する。
【００４９】
細胞はin vivo、ex vivo、または培養下(in vitro)においてDkkリガンドまたはDkk受容体で処理する。
【００５０】
本明細書に記載の方法では、Dkkリガンドまたは受容体による処理は、細胞を一方または両方のポリペプチドと接触させることによって行うことができる。Dkkリガンドまたは受容体による処理は、幹細胞、始原細胞もしくは前駆細胞を含む培養物に、またはin vivoでそのような細胞に、精製済みおよび/または組換えDkk-2もしくは-3ポリペプチドまたは他のDkk受容体アゴニストおよび/またはLRP-5/6受容体もしくはポリペプチドを供給することによって行うことができる。Dkkリガンドまたは受容体による処理は、タンパク質形質導入によって細胞に、コードする核酸またはタンパク質を１コピー以上導入することを含みうる。細胞を核酸で形質転換する方法および細胞にタンパク質を導入する方法については、以下でさらに説明する。Dkkリガンドまたは受容体との接触は、in vivoで、または幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞を含む培養物に、前記ポリペプチドを産生する細胞を供給することによって行うことができる。Dkkリガンドまたは受容体を産生する細胞は、組換え発現によって該ポリペプチドを産生する組換え宿主細胞とすることができる。共培養される宿主細胞を、Dkkリガンドまたは受容体をコードする核酸で形質転換してもよいし、および/または、共培養される宿主細胞が導入されたDkkリガンドまたは受容体を含んでいてもよい。Dkkリガンドもしくは受容体タンパク質、またはコードする核酸は、当技術分野で利用可能な技法に従って細胞に導入することができるが、その例については以下で説明する。
【００５１】
共培養される宿主細胞は別の幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または神経細胞とすることができる。Dkkリガンドまたは受容体による処理は、該細胞におけるDkkリガンドまたは受容体の発現をアップレギュレートすることによって、あるいはDkkリガンドまたは受容体の阻害剤分子をダウンレギュレートまたは抑制することによって行ってもよい。
【００５２】
他の実施形態において、Dkk-1またはDkk-4のようなDkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルおよび/または活性は、細胞を該ポリペプチドの阻害剤、アンタゴニスト、またはサプレッサーで処理することによって低下させることができる。
【００５３】
Dkk-1またはDkk-4のようなDkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルおよび/または活性はまた、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制することによって、または該ポリペプチドの阻害剤、遮断剤、アンタゴニストもしくはサプレッサーをアップレギュレートまたは活性化することによって、低下させることもできる。
【００５４】
適当な阻害剤には、Dkkポリペプチドと特異的に結合する抗体および組換えフラグメントが含まれる。特異的抗体は当技術分野で標準的な技法を使って得ることができる。
【００５５】
適当なサプレッサーには、アンチセンスおよびセンス核酸（例えば、RNAi）が含まれる。サプレッサー核酸の使用は当技術分野で周知である (例えば、PeymanおよびUlman, Chemical Reviews, 90:543-584, (1990); Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:329-376, (1992); Reynoldsら Nature Biotech (2004) 22 3 326; Zamore P.D. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750, (2001); Zamore PDら Cell, 101, 25-33, (2000); Elbashir SM.ら Nature, 411, 494-498, (2001)を参照されたい)。
【００５６】
Dkk-1またはDkk-4のようなDkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルおよび/または活性はまた、標準的な組換え技法を用いて、胚性幹細胞、神経細胞、始原細胞または前駆細胞中の関連遺伝子を「ノックアウト」することによっても低減させることができる。
【００５７】
他の実施形態において、Dkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルおよび/または活性は、前記細胞において前駆タンパク質転換酵素の活性をモジュレートすることによって調節することができる。
【００５８】
前駆タンパク質転換酵素の例としては、配列Arg-X-X-Arg、Arg/Lys-X-X-X-Arg/Lys-Arg、またはArg/Lys-Argを特異的に切断するプロテアーゼ、例えばフューリンまたはプロテアーゼ転換酵素２（PC2）が含まれる。
【００５９】
前駆タンパク質転換酵素の活性は、細胞を阻害剤もしくはアンタゴニストで処理することにより低下させることができ、また、細胞をアゴニストもしくは補助因子で処理することにより増加させることができる。
【００６０】
「幹細胞」とは、自己複製が可能な細胞型のことであり、それが胚性幹(ES)細胞である場合には、個体のあらゆる細胞を生み出すことができ、また、それが多能性または神経の幹細胞である場合には、ニューロン、アストロサイト、稀突起神経膠細胞を含めて、神経系のあらゆる細胞を生み出すことができる。幹細胞は１種以上の次のマーカーを発現することができる：Oct-4; Nanog; Sox1-3; 時期特異的胎児性抗原 (SSEA-1、-3および-4)、ならびに腫瘍拒絶抗原TRA-1-60および-1-81（Tropepeら, 2001; Xuら, 2001に記載される)。神経幹細胞は１種以上の次のマーカーを発現することができる：ネスチン(Nestin); p75ニューロトロフィン受容体; Notch1, SSEA-1; Sox2; NCAM; RC2 (CapelaおよびTemple, 2002)。
【００６１】
「神経始原細胞」とは、神経幹細胞の娘細胞または子孫細胞のことであり、該幹細胞と比べて、より分化した表現型および/またはより低下した分化能を有する。前駆細胞は、発生においてニューロンと直系関係にあるその他の細胞であるが、特定の環境条件下では分化形質転換もしくは再分化するように、またはニューロンの表現型を獲得するように誘導することができる。好ましい実施形態において、幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または神経細胞は、自然にまたは有糸分裂促進剤（例えば、bFGF、EGFまたは血清）の欠乏時に、チロシンヒドロキシラーゼを発現しないか、または低レベルで発現するものである。
【００６２】
幹細胞、神経幹細胞、または神経始原もしくは前駆細胞は、どのような胚組織、胎児組織または成体組織からも取得または誘導することができ、かかる組織には骨髄、皮膚、眼、鼻上皮、もしくは臍帯、または神経系の領域（例えば、小脳、脳室帯、脳室下帯、線条、中脳、菱脳、大脳皮質、もしくは海馬由来）が含まれる。それは脊椎動物、例えば哺乳動物（ヒト、またはウサギ、モルモット、ラット、マウスもしくは他のげっ歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長類のような非ヒト動物）、鳥類（ニワトリなど）、または両生類から取得または誘導することができる。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態では、成人の幹細胞/始原細胞/前駆細胞をin vitro、ex vivoまたはin vivoで用いる。それには同意する成人（その成人から細胞を取得する）が必要であり、また、適切な倫理委員会による承認も必要である。ヒト胚/胎児を供給源として使用する場合、そのヒト胚は、さもなくば使用されずに破棄されるかまたは無期限に保存されるものであり、特に、妊娠が困難な夫婦のIVF（体外受精）治療の目的で作られたヒト胚である。一般的に、IVFでは、移植および最終的な妊娠のために使用される数よりも多くのヒト胚を作る必要がある。そうした予備の胚は破棄されるのが一般的である。関係者（特に、関係する卵子提供者および/または精子提供者）からの同意を得て、さもなくば捨てられる胚を、倫理上前向きなやり方で、パーキンソン病のような重症の神経変性障害の患者の利益のために使用することができる。本発明それ自体は、いかなる発生段階のヒト胚の使用にも関係しない。記述したように、本発明は、ヒト胚から直接誘導される物質を利用する必要性を最小限にする一方で、重大な疾患のための価値ある治療法の開発を可能にするものである。本発明に基づくいかなる治療的介入も、関係する自国の法律および倫理上のガイドラインに従って実施されるべきである。
【００６４】
ある好ましい実施形態において、DkkリガンドまたはDkk受容体と接触させるか、さもなくば本発明のいずれかの態様に従って処理および/または使用される幹細胞または始原もしくは前駆細胞は、同意している成人または適切な同意が得られる子供から取得することができ、例えば、本発明に従って生成されたニューロン、および/または内因性ドーパミン作動性ニューロンの発生または機能を促進・誘導するためにDkkリガンドもしくはDkk受容体（例えば、上記のようなDkkポリペプチドまたはLRPポリペプチド）により処理されたニューロンを戻し移植することによって実質的に治療される疾患を有する患者から得られる。
【００６５】
ニューロン運命を誘導しようとする幹細胞または始原もしくは前駆細胞は、未分化の表現型を示してもよいし、あるいは原始的なニューロン表現型を示してもよい。それは個体においてあらゆる細胞型を生み出すことができる全能性の細胞、または明確に区別される複数のニューロン表現型を生み出すことができる多能性の細胞、または通常の発生過程ではより限られた表現型を生み出すものの、in vitroで適切な環境因子にさらされた場合には他の細胞を生じさせる能力がある前駆もしくは始原細胞でありうる。それは特定のニューロン運命に関連したマーカー、例えばチロシンヒドロキシラーゼを欠いていてもよい。
【００６６】
細胞はNurr1陽性（すなわち、Nurr1を発現する）またはNurr1陰性（すなわち、Nurr1を発現しない）でありうる。ある実施形態では、Nurr1陰性である細胞が分化過程でNurr1を自然に発現するようになる。
【００６７】
ある実施形態において、ニューロン運命を誘導しようとする幹細胞または始原もしくは前駆細胞が酸化的ストレスのもとにある。こうした細胞から生じるニューロンは疾病細胞モデルとして有用でありうる。通常の毒素的または遺伝的手段を用いて、酸化的ストレスを幹細胞または始原もしくは前駆細胞に加えることができる。
【００６８】
細胞をDkkリガンドまたはDkk受容体で処理することによりニューロン運命を引き出す方法では、多数の細胞を、ニューロン運命をとるように誘導することができる。ニューロン細胞においては、ドーパミン作動性への誘導または分化を高めることができる。好ましい実施形態では、幹細胞および/または前駆細胞の20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、または90％以上がニューロン運命へと誘導される。
【００６９】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドは、幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞、またはニューロン細胞においてin situで、あるいは単離・精製に先だって発現系においてin vitroで、コードする核酸から発現させることができる。形質転換Dkkおよび/またはLRP核酸は、ゲノム外のベクターに挿入してもよいし、または、好ましくは安定的に、ゲノムに組み込んでもよい。かかる核酸は、幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞、またはニューロン細胞において基底レベル以上にその発現を駆動するプロモーターと機能的に連結させることができ、これについては以下で詳述する。
【００７０】
「機能的に連結させる」とは、転写がプロモーターから開始されるように、同じ核酸分子の一部として結合させ、適切に位置づけ、かつ方向づけることを意味する。
【００７１】
遺伝子を細胞に導入する方法は、当業者には周知である。Dkkおよび/またはLRPをコードする核酸は、それがベクター上にそのまま残ろうとゲノムに組み込まれようと、ベクターを用いて幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞、またはニューロン細胞に導入することができる。適当なベクターは、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列といった適切な調節配列を含むように選択されるか、または構築される。ベクターは適宜にマーカー遺伝子やその他の配列を含んでいてもよい。調節配列は幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞、またはニューロン細胞内でDkkおよび/またはLRPをコードする核酸の発現を駆動しうる。例えば、ベクターをゲノム外の発現ベクターとしてもよいし、Dkkおよび/またはLRPをコードする核酸と共に調節配列をゲノムに組み込んでもよい。ベクターはプラスミドまたはウイルスでありうる。
【００７２】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドをコードする核酸は、外部的に誘導可能な遺伝子プロモーターの制御下に配置して、それをユーザーの支配下に置くことができる。プロモーターに対して適用される「誘導可能」という用語は当業者によく理解されている。本質的に、誘導可能なプロモーターの制御下にある発現は、加えられる刺激に応答して「スイッチが入り」、つまり高まる。刺激の種類はプロモーターごとに変化する。いくつかの誘導可能なプロモーターは、適切な刺激の不在下では、発現をほとんどまたは検出不能なレベルでしか生じさせない（つまり発現なし）。刺激の不在下での発現レベルが如何ほどであろうと、誘導可能なプロモーターからの発現は適当な刺激の存在下で増加する。誘導可能なプロモーターの一例はテトラサイクリンON/OFF系 (Gossenら, 1995)であり、この場合には遺伝子発現がテトラサイクリン類似体によって調節される。
【００７３】
さらなる詳細については、例えばMolecular Cloning: a Laboratory Manual: 第3版, SambrookおよびRussell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。核酸の操作（例えば、核酸構築物の作製、変異誘発、配列決定、DNAの細胞への導入および遺伝子発現、タンパク質の分析）のための多くの公知技術およびプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編, John  Wiley & Sons, 1992またはそれ以後の版に詳しく説明されている。
【００７４】
抗生物質耐性、感受性遺伝子、または蛍光レポーターのようなマーカー遺伝子は、対象の核酸を含むクローンを同定するのに用いられるが、これらについては当技術分野で周知である。クローンはまた、結合実験、サザンブロットハイブリダイゼーション、免疫組織化学的方法、PCR、および細胞内でのタンパク質または核酸の発現を検出するための他の技法によって同定することができ、さらに研究することができる。
【００７５】
DkkまたはLRPポリペプチドのようなDkk受容体/リガンドポリペプチドをコードする核酸は、宿主の幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞、または神経細胞のゲノムに組み込むことができる。ゲノムとの組換えを促進する配列を標準的な技法に従って形質転換核酸中に含めることにより、組込みが促進される。組み込まれる核酸は、幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞、またはニューロン細胞内でDkkおよび/またはLRPをコードする核酸の発現を駆動することができる調節配列を含みうる。前記核酸はゲノムのある部位への組込みを指令する配列を含んでいてもよく、その部位とは、Dkkおよび/またはLRPコード配列が幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞、またはニューロン細胞内でその発現を駆動および/または制御することができる調節エレメントの制御下に入る部位である。組み込まれる核酸は、本明細書で述べるように、Dkkおよび/またはLRP核酸を幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞、またはニューロン細胞に形質転換するために用いるベクターから誘導することができる。
【００７６】
Dkkおよび/またはLRPコード配列を含む核酸の導入は、その核酸が線状、分枝状、または環状であろうと、一般には、制限なしに「形質転換」と呼ばれている。それにはあらゆる利用可能な技法を使用しうる。適当な技法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン、PEI、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションのような機械的技法、直接DNA取込み、受容体介在DNA移入、レトロウイルスや他のウイルスを用いる形質導入、リポソーム-、脂質-または他の陽イオンキャリアにより媒介されるトランスフェクションが挙げられる。所定の遺伝子構築物を細胞に導入する場合には、当業者によく知られている、ある種の注意事項を考慮しなければならない。当業者には明らかであろうが、Dkkおよび/またはLRPポリペプチドのようなDkk受容体/リガンドポリペプチドを幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞、またはニューロン細胞に導入するための形質転換法の特定の選択は、本発明にとって本質的なことではないし、本発明を制限することでもない。
【００７７】
Dkkおよび/またはLRP核酸による幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞、またはニューロン細胞のin vitro形質転換のための好適なベクターおよび方法は、当業者には周知である。好適なベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなどがある。無能化したウイルスベクターはヘルパー細胞株において産生させることができ、かかる細胞株では、感染性ウイルス粒子の産生に必要とされる遺伝子が発現されている。適当なヘルパー細胞株は当業者には周知である。例として、Fallaux, F.J.ら, (1996) Hum Gene Ther 7(2), 215-222; Willenbrink, W.ら, (1994) J Virol 68(12), 8413-8417; Cosset, F.L.ら, (1993) Virology 193(1), 385-395; Highkin, M.K.ら, (1991) Poult Sci 70(4), 970-981; Dougherty, J.P.ら, (1989) J Virol 63(7), 3209-3212; Salmons, B.ら, (1989) Biochem Biophys Res Commun 159(3), 1191-1198; Sorge, J.ら, (1984) Mol Cell Biol 4(9), 1730-1737; Wang, S.ら, (1997) Gene Ther 4(11), 1132-1141; Moore, K.W.ら, (1990) Science 248(4960), 1230-1234; Reiss, C.S.ら, (1987) J Immunol 139(3), 711-714を参照されたい。ヘルパー細胞株は一般に、ウイルスゲノムをパッケージングする機構によって認識される配列を失っている。それらは核酸をまったく含まないビリオンを作り出す。送達すべき遺伝子またの配列（例えば、Dkkおよび/またはLRPコード配列）と共に完全なパッケージングシグナルを含むウイルスベクターは、ヘルパー細胞内で感染性ビリオン粒子へとパッケージングされ、その後、これらの粒子を幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞、またはニューロン細胞への遺伝子送達のために使用することができる。
【００７８】
内因性Dkkおよび/またはLRPの転写および/または翻訳を高めるための別法として、または高めることに加えて、基底レベルを超えたDkkおよび/またはLRPの発現は、幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞、またはニューロン細胞に１コピー以上の余分のDkkおよび/またはLRPタンパク質を導入することによって生じさせることもできるが、これはマイクロインジェクションもしくは他のキャリア媒介法、またはタンパク質送達もしくは形質導入系（細胞浸透性ペプチド、すなわち、TAT、トランスポータン、アンテナペディア浸透ペプチドを含む）により行うことができる(Lindsay 2002)。
【００７９】
本発明は、多数のドーパミン作動性ニューロンの生成を可能にする。これらのドーパミン作動性ニューロンを起源材料として使用して、パーキンソン病において変性しているか、または損傷もしくは消失されている細胞を置換することができる。
【００８０】
好ましくは、前記細胞は、DkkリガンドまたはDkk受容体と接触させたとき、有糸分裂をするものである。
【００８１】
本発明の方法においては、細胞を以下の作用物質から選択される１種以上の物質とさらに接触させることができる：塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF); 上皮増殖因子 (EGF); およびレチノイドX受容体(RXR)の活性化因子、例えば合成レチノイド類似体SR11237 (Gendimenico, G. J.ら, (1994) J Invest Dermatol 102(5), 676-80)、9-cis-レチノールまたはドコサヘキサン酸(DHA)またはLG849 (Mata de Urquizaら, 2000); リガンドのWntファミリーのメンバー、例えばWnt-1、-3aおよび-5a (Catello-Brancoら, 2003); Wntの上流調節因子、例えばMsx-1 (IlerおよびAbate-Shen, Biochemical And Biophysical Research Communications 227, 257-265 (1996); Shangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 118-122 (1994)); またはβ-カテニン (Catello-Brancoら, 2003); またはNurr1 (Wagnerら, 1999)。本発明に従って１種以上の上記物質で細胞を処理すると、ドーパミン作動性の運命をとる幹細胞、始原細胞、または前駆細胞の割合が増加するか、またはニューロン細胞におけるドーパミン作動性の誘導もしくは分化が高まる。本発明に従ってドーパミン作動性の運命を引き出す方法、またはニューロン細胞におけるドーパミン作動性の誘導もしくは分化を高める方法は、細胞を増殖因子のFGFファミリーのメンバー、例えばFGF4、FGF8またはFGF20と、例えば予備処理段階で、接触させることを含む。
【００８２】
有利には、細胞を２種以上の上記の作用物質と接触させる。
【００８３】
予備処理の代わりに、または予備処理のほかに、細胞をDkkおよび/またはLRP処理と同時に追加の因子で処理してもよい。
【００８４】
本発明の方法（ニューロン運命が幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞において誘導されるか、またはドーパミン作動性の誘導もしくは分化がニューロン細胞において高められる）はニューロン運命のマーカーを検出することを含み、βチューブリンIII (TuJ1)がニューロン運命の１つのマーカーである (Menezes, J. R.ら, (1994) J Neurosci 14(9), 5399-5416)。その他のニューロンマーカーとして、ニューロフィラメントおよびMAP2が含まれる。特定のニューロン表現型を誘導するならば、マーカーはその表現型に特異的でなければならない。ドーパミン作動性の運命の場合は、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ(AADC)、ドーパミン輸送体(DAT)、およびドーパミン受容体を、例えば免疫反応性またはin situハイブリダイゼーションにより、検出することができる。チロシンヒドロキシラーゼはDA細胞の主要なマーカーである。ドーパミンおよび代謝産物の含有量および/または放出を、例えば高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)で検出してもよい (Cooper, J. R.ら, The Biochemical Basis of Neuropharmacology, 第7版, (1996) Oxford University Press)。（TH/ドーパミン/DATの存在下での）ドーパミンβヒドロキシラーゼおよびGABAまたはGADの非存在もドーパミン作動性運命の指標となる。さらなるマーカーとしては、Nurr1、レチナルデヒドデヒドロゲナーゼ1 (Raldh1)またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ2型 (AHD-2)、GIRK2、Lmx1a/bおよびPitx3が挙げられる。
【００８５】
マーカーの検出は当業者に公知の方法により行うことができる。検出法では、そのマーカーをコードする核酸配列と結合可能な特異的結合メンバーが使用され、該特異的結合メンバーは、該配列とハイブリダイズできる核酸プローブ、または該核酸配列もしくはそれがコードするポリペプチドに対する特異性を有する免疫グロブリン/抗体ドメインを含む。特異的結合メンバーは、該配列またはポリペプチドへのその結合が検出可能となるように、標識される。「特異的結合メンバー」は、そのマーカーに対して特別の特異性を有し、通常の条件では他の化学種に優先して該マーカーと結合する。あるいはまた、マーカーが特定のmRNAである場合は、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーと結合させて、（例えばポリメラーゼ連鎖反応で）増幅することにより、それを検出することができる。
【００８６】
核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下でマーカーとハイブリダイズすることができる。適当な条件は、例えば約80〜90％同一のマーカー配列を検出する場合、0.25M Na2HPO4、pH 7.2、6.5% SDS、10%デキストラン硫酸中42℃での一晩のハイブリダイゼーション、および0.1X SSC、0.1% SDS中55℃での最終洗浄を包含する。約90％以上同一のマーカー配列を検出する場合、適当な条件は、0.25M Na2HPO4、pH 7.2、6.5% SDS、10%デキストラン硫酸中65℃での一晩のハイブリダイゼーション、および0.1X SSC、0.1% SDS中60℃での最終洗浄を包含する。
【００８７】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に開示した方法のいずれか１つに従って作製されたニューロン（神経細胞）を提供する。そのニューロンは原始的なニューロン表現型をしていてもよい。ニューロンは明確に区別される複数のニューロン表現型を生じさせる能力がある。そのニューロンは特定のニューロン表現型であってもよい。好ましい実施形態では、ニューロンがドーパミン作動性の表現型を有する。
【００８８】
ニューロンは、神経保護作用または神経再生作用を有する分子をコードする核酸を含むことができるが、該核酸は、ニューロンにおける該分子の発現を駆動することができるプロモーターと機能的に連結されたものである。プロモーターは誘導性のプロモーター、例えばTetONキメラプロモーターであってよく、これにより、ダメージを及ぼす過剰発現が防止されうる。プロモーターは特定のニューロン表現型と関連していてもよく、例えばTHプロモーター、Nurr1プロモーター、ドーパミン輸送体プロモーター、またはPitx3プロモーターである。
【００８９】
コードされる分子は、その発現によってニューロンがその環境に依存しなくなるようなもの、すなわち、その生存が１以上の因子または条件（例えば、それが移植される予定の神経環境における因子または条件）の存在に依存しないようなものでありうる。一例として、ニューロンは以下で説明する神経保護作用または神経再生作用を有する１種以上の分子をコードする核酸を含むことができ、該核酸は、ニューロンにおける該分子の発現を駆動することができるプロモーターと機能的に連結されている。
【００９０】
これに加えて、またはこれとは別に、コードされた分子の発現がそのニューロンを取り巻く細胞性環境の神経保護または神経再生において機能してもよい。この場合には、該ニューロンが、神経保護および神経再生作用を有する分子を送達するための細胞と遺伝子の組合せ療法において使用される。
【００９１】
神経保護作用および神経再生作用を有する分子の例には、以下のものが含まれる：
(i) 神経栄養因子。かかる因子は神経変性を補償しかつ防止することができる。一例はグリア由来神経栄養因子(GDNF)であり、これは強力な神経生存因子であり、ドーパミン作動性ニューロンからの出芽を促進し、また、チロシンヒドロキシラーゼの発現を増大させる (Tomacら, (1995) Nature, 373, 335-339; Arenasら, (1995) Neuron, 15, 1465-1473)。軸索の伸長を高めることによって、GDNFは局所環境に神経を分布するニューロンの能力を増大させることができる。GDNFファミリーの他の神経栄養分子としては、ニュールツリン（Neurturin）、パーセフィン（Persephin）、およびアルテミン（Artemin）が挙げられる。ニューロトロフィンファミリーの神経栄養分子には、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、およびニューロトロフィン-3、-4/5、-6が含まれる。神経栄養活性のあるその他の因子としては、FGFファミリーのメンバー、例えばFGF2、4、8、20；Wntファミリーのメンバー、例えばWnt-1、-2、-5a、-3a、7a；BMPファミリーのメンバー、例えばBMP2、4、5、7、nodal、アクチビン、GDF；およびTGFα/βファミリーのメンバーが挙げられる。
【００９２】
(ii) 抗アポトーシス分子。細胞死において中心的な役割を果たすBc12。Bc12の過剰発現は天然に生じる細胞死および虚血からニューロンを保護する (Martinouら, (1994) Neuron, 1017-1030)。ニューロンに特異的な別の抗アポトーシス分子はBclX-Lである。
【００９３】
(iii) 軸索再生および/または伸長および/または誘導分子。かかる分子は神経の分布およびその環境との接続部の形成においてニューロンを補助し、例えばエフリン類(ephrins)である。エフリン類はチロシンキナーゼ受容体を活性化できる膜結合型リガンドの一クラスを規定する。エフリン類は神経の発生・発達に関与している (Irvingら, (1996) Dev. Biol., 173, 26-38; Krullら, (1997) Curr. Biol. 7, 571-580; Frisenら, (1998) Neuron, 20, 235-243; Gaoら, (1996) PNAS, 93, 11161-11166; Torresら, (1998) Neuron, 21, 1453-1463; Winslowら, (1995) Neuron, 14, 973-981; Yueら, (1999) J Neurosci 19(6), 2090-2101)。
【００９４】
(iv) 転写因子、例えばホメオボックスドメインタンパク質Ptx3 (Smidt, M. P.ら, (1997) Proc Natl Acad Sci USA, 94(24), 13305-13310)、Lmx1a/b、Pax2、Pax5、Pax8、またはengrailed 1もしくは2 (WurstおよびBally-Cuif, 2001; RhinnおよびBrand, 2001); Wntの上流調節因子、例えばMsx-1 (IlerおよびAbate-Shen, 1996; Shangら, 1994); βカテニン(Catello-Brancoら, 2003); Nurr1 (Wagnerら, 1999); 塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックスファミリーの神経原性遺伝子。
【００９５】
本発明に従うニューロンまたは本発明で用いられるニューロンには、１種以上の他の細胞型、例えば幹細胞、神経幹細胞、前駆細胞もしくは始原細胞が実質的に存在しない。ニューロンは当業者に公知の方法を用いて神経幹細胞または前駆細胞から分離することができ、かかる方法には磁性ビーズおよび抗体による細胞外エピトープの認識に基づく方法または蛍光活性化セルソーティング(FACS)が含まれる。一例として、幹細胞、神経幹細胞、前駆細胞もしくは始原細胞上に存在するがニューロン上には存在しない分子の細胞外領域に対する抗体を利用することができる。そのような抗体として、Notch 1、CD133、SSEA1、プロミニン(prominin)1/2、RPTPβ/ホスホカン(phosphocan)、TIS21、ならびにグリア細胞株由来神経栄養因子受容体GFRαまたはNCAMが挙げられる。抗体と結合した幹細胞は、補体に曝露することで溶解させることができ、また、例えば磁気ソーティングによって、分離することもできる (Johanssonら, (1999) Cell, 96, 25-34)。意図したニューロンの被移植者に対して異種である抗体を使用する場合には、そのようなセルソーティング法を逃れる幹細胞、神経幹細胞、前駆細胞もしくは始原細胞などを異種移植抗体で標識して、被移植者の免疫系の第一の標的とする。あるいはまた、所望の表現型を獲得する細胞も、細胞外エピトープに対する抗体によって、または細胞型特異的プロモーターの制御下にあるトランスジーン（蛍光タンパク質など）の発現によって、分離することができるだろう。一例として、ドーパミン作動性ニューロンは、TH、DAT、Ptx3、またはドーパミン作動性ニューロンによって特異的に用いられる他のプロモーターの制御下で発現された蛍光タンパク質により単離されるだろう。
【００９６】
本発明の方法は、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、または他の幹細胞、あるいは所望の表現型をもつ神経細胞について富化するために、さらなるネガティブまたはポジティブ選択を含むことができる。
【００９７】
ネガティブ選択を用いてDAニューロンを富化することが可能である。非DAニューロンに対する選択的ニューロトキシンが使用され、例えば、5,7-ジヒドロキシトリプタミン（セロトニン作動性ニューロンを排除する）、またはサポニンもしくは毒素にカップリングさせた抗体、あるいは補体の添加後に、例えばGABA輸送体に対する抗体（GABA作動性ニューロンを排除する）を使用する。本発明の方法は、神経幹細胞、原始もしくは前駆細胞、または他の幹もしくは神経細胞をネガティブ選択剤でさらに処理するか、または該選択剤と接触させることを含むが、好ましくはin vitroで、例えば該細胞を含むin vitro培養物にネガティブ選択剤を添加することにより、またはネガティブ選択剤の存在下で該細胞を培養することにより行う。ネガティブ選択剤は所望の細胞型以外の細胞型を選び出す。例えば、本発明がドーパミン作動性ニューロン表現型の促進、増強、または誘導に関係する場合、ネガティブ選択剤はDAニューロンおよびDAニューロンへと発生する細胞（例えば、幹細胞、神経幹細胞、前駆もしくは始原細胞など）以外の細胞を選び出すことができる。こうして、ネガティブ選択剤は、非DAニューロンのような、非DA表現型をもつ分化した細胞を選び出す。ネガティブ選択剤は、所望の細胞型以外の細胞の増殖を抑制もしくは防止し、かつ/または所望の細胞型以外の細胞を死滅させる。ネガティブ選択剤はDAニューロン以外のニューロンの集団を減少させる選択的なニューロトキシンであってよい。例えば、ネガティブ選択剤は5,7-ジヒドロキシトリプタミン（セロトニン作動性ニューロンを減少させる）でありうる。ネガティブ選択剤は非DAニューロンに特異的な抗体または抗体フラグメントであってもよく、この場合、該抗体または抗体フラグメント（例えば、scFvまたはFab）はブロッキング抗体であるか、またはサポニンもしくは毒素にカップリングされる。例えば、そのような抗体はFGF-4に対するブロッキング抗体（セロトニンニューロンを減少させる）、または毒素にカップリングさせた、GABA輸送体に特異的な抗体（GABA作動性ニューロンを減少させる）である。
【００９８】
本発明の方法では、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、または他の幹もしくは神経細胞を抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、低酸素分圧および/または低酸素症誘導因子（例えば、HIFまたはエリトロポエチン）の存在下で生育させることができる。
【００９９】
本発明はさらに、さまざまな態様および実施形態において、Dkkリガンドおよび/またはDkk受容体（例えば、Dkkポリペプチドおよび/またはLRPポリペプチド）、またはDkkリガンドもしくはDkk受容体をコードする核酸、または合成のDkkリガンドおよび/またはDkk受容体類似体、またはDkkおよび/またはLRPの下流にある１つ以上のシグナル伝達成分を増強する、切り替える、またはモジュレートするように作用するタンパク質、核酸もしくは合成薬物、から選択される作用物質の下記治療方法における使用を提供する。その治療方法は、内在性の幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞、あるいは外因的に供給される前記細胞に作用することによって脳におけるドーパミン作動性ニューロンの発生を誘導する、促進する、または増強するために、および/または、例えばパーキンソン症候群もしくはパーキンソン病に罹患した個体の治療において、ドーパミン作動性ニューロンの減少を抑制もしくは防止するか、またはドーパミン作動性ニューロンの生存、表現型分化、成熟、神経突起形成、シナプス形成、神経伝達、もしくは機能的出力を促進するために、Dkkリガンドおよび/またはDkk受容体（例えば、Dkkおよび/またはLRPポリペプチド）、またはコードする核酸、または前記の他の作用物質を個体に投与することを含んでなる。Dkkリガンドおよび/またはDkk受容体（例えば、Dkkおよび/またはLRPポリペプチド）、またはコードする核酸、または前記の他の作用物質は、適当な組成物（例えば、製薬上許容される賦形剤もしくは担体を含む）として投与することができ、神経変性疾患、パーキンソン症候群、またはパーキンソン病の治療用医薬の製造において使用される。Dkkリガンドおよび/またはDkk受容体（例えば、Dkkおよび/またはLRPポリペプチド）、またはコードする核酸は、中枢神経系および/または脳に投与されるか、またはそこを標的とすることができる。
【０１００】
本発明は、さまざまな態様において、本明細書に開示した方法のいずれかにより作製されたニューロンだけでなく、以下のものを包含する：そのようなニューロン、幹、始原もしくは前駆細胞を含む医薬組成物、医薬品、薬物または他の組成物；そのようなニューロン、幹、始原もしくは前駆細胞、または組成物の医学的処置方法における使用；そのようなニューロン、幹、始原もしくは前駆細胞、ニューロン細胞、または組成物を、例えばパーキンソン病や他の（例えば神経変性）疾患の処置（予防的処置を含む）のために、患者に投与することを含む方法；そのようなニューロンまたは細胞の、例えばパーキンソン病や他の（例えば神経変性）疾患の処置のために投与する、組成物の製造における使用；並びに、そのようなニューロンまたは細胞を、製薬上許容される賦形剤、ビヒクルもしくは担体と共に、場合により１種以上の他の成分（例えば、神経保護分子、神経再生分子、レチノイド、増殖因子、アストロサイト/グリア細胞、抗アポトーシス因子、または幹、始原もしくは前駆細胞、ニューロン細胞における、または宿主の脳における遺伝子発現を調節する因子）と共に、混合することを含む医薬組成物の製造方法。こうした任意の成分はニューロンをその環境とは無関係にする、すなわち、その生存がその環境中の１以上の因子または条件の存在に依存しないようにすることができる。一例として、医薬組成物の製造方法は、ニューロンを、発生しつつある腹側中脳に見出される１種以上の因子と混合することを含む。ニューロンをGDNFおよび/またはニュールツリン(NTN)と混合してもよい。
【０１０１】
本発明は、本発明に従って作製されたニューロン、幹、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞、および１種以上のさらなる成分を含有する組成物を提供する。本発明に従って使用するための、本発明による医薬組成物は、前記のニューロンまたは細胞に加えて、製薬上許容される賦形剤、担体、緩衝剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、または当業者には周知の他の物質を含むことができる。かかる物質は無毒でなければならず、また、ニューロンの活性を妨げるべきでない。担体や他の物質の明確な性質は投与経路に依存するだろう。前記組成物は神経保護分子、神経再生分子、レチノイド、増殖因子、アストロサイト/グリア細胞、または幹、神経幹、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞における遺伝子発現を調節する因子のうち１つ以上を含むことができる。かかる物質は上述したようにニューロンをその環境とは無関係にするものである。
【０１０２】
液体の医薬組成物は一般に、液状の担体、例えば水、石油、動物性もしくは植物性の油、鉱油、または合成油を含む。生理食塩溶液、組織もしくは細胞培養培地、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはグリコール類（エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）を含んでいてもよい。
【０１０３】
前記組成物は、発熱物質フリーで、適当なpH、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形でありうる。当業者であれば、例えば塩化ナトリウム、リンゲル液、または乳酸加リンゲル液を用いて、適当な溶液を調製することができよう。組成物を調製するのに、人工的な脳脊髄液を用いてもよい。
【０１０４】
本発明は、本発明に従って作製されたニューロンの、医学的処置方法（特に、ニューロン細胞の変性、損傷、減少、または障害と関連した医学的症状の処置）における使用を包含する。さらに、本発明は、特定の表現型をもつニューロンの、その表現型のニューロンの変性、損傷、または減少と関連した症状、疾患、または障害の治療における使用を提供する。より詳細には、本発明はヒトのパーキンソン病の治療におけるドーパミン作動性ニューロンの使用を提供する。本発明は特に、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病のようなα-シヌクレイン障害）を治療するための材料および方法に関するが、それに限定されない。一例として、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンに影響する病理もしくは疾患、および神経系の他の領域（特に、脊髄および/または大脳皮質のようなNurr1+ 細胞を含む領域）の変性もしくは損傷の治療にまで及ぶ。
【０１０５】
投与される細胞が２以上の異なったニューロン表現型を生じる能力のある幹細胞、始原もしくは前駆細胞である場合の治療方法では、該ニューロン、細胞または組成物を、アストロサイト/グリア細胞を含む領域（該細胞の分化を所望の特定のニューロン運命に導く）に導入することができる。該細胞または組成物は、例えば、腹側中脳に注入されるが、そこでは該細胞が１型アストロサイト/グリア細胞と相互作用してドーパミン作動性の表現型をとるように誘導される。これとは別にまたはこれに加えて、移植される組成物は、ニューロンまたは細胞を、上記のような特定のニューロン運命のほうにその発生を導く１種以上の因子（例えば、１型アストロサイト/グリア細胞）と組み合わせて、含むことができる。
【０１０６】
細胞は当技術分野で公知の技法によって患者に移植することができる（例えば、Lindvall, O., (1998) Mov. Disord. 13, Suppl. 1:83-7; Freed, C.R.ら, (1997) Cell Transplant, 6, 201-202; Kordowerら, (1995) New England Journal of Medicine, 332, 1118-1124; Freed, C.R., (1992) New England Journal of Medicine, 327, 1549-1555）。
【０１０７】
本発明による組成物の投与は、好ましくは、「予防上有効な量」または「治療上有効な量」で行われ（しかし、場合によって、予防は治療とみなされる）、これは個体に利益をもたらすのに十分な量である。実際の投与量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療される者の本性および重症度に左右されよう。治療の処方（例えば、投与量の決定など）は開業医や他の医師の裁量の範囲内である。
【０１０８】
組成物は単独で投与されるか、または他の治療と組み合わせて、治療すべき症状に応じて同時にまたは連続的に投与される。
【０１０９】
本明細書で提供する方法は、in vivoもしくはin vitro一次細胞または細胞株を原料として用いて実施することができる。in vitroで増える細胞の利点は、生産されるニューロンの数に事実上制限がないことである。
【０１１０】
移植された細胞の免疫拒絶反応に関連して起こりうる不利益を軽減するためには、幹細胞、始原もしくは前駆細胞を患者から分離して、所望の表現型に誘導する。その後細胞を患者に移植する。有利には、分離した幹細胞、始原もしくは前駆細胞を用いて、多数の免疫適合性のニューロン細胞が得られるように細胞株を樹立する。さらなる選択肢は、ある範囲の免疫適合性をカバーする細胞バンクを確立することであり、かかるバンクから個々の患者に適した細胞を選択することができる。ある個体に由来する幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞は、該細胞またはその子孫を別の個体に導入する場合の拒絶反応を軽減または防止するために改変することができる。一例として、ドナー細胞の１以上のMHC対立遺伝子を、例えば相同組換えによって、レシピエントのものと置き換える。
【０１１１】
不死性の癌遺伝子またはリポーター遺伝子を保有する細胞株由来の細胞を患者への移植に使用する場合には、該細胞を患者に移植する前にその癌遺伝子をCRE-loxP系により除去することができる(Westerman, K. A.ら Proc. Natl. Acad Sci. USA 93, 8971 (1996))。患者の体温では活動しない不死性の癌遺伝子を使用してもよい。
【０１１２】
さらなる態様において、本発明は、本発明に従って作製された細胞またはニューロンの、神経変性疾患治療用の薬剤のスクリーニング方法における使用を包含する。ニューロンはドーパミン作動性ニューロンでありうる。神経変性疾患はパーキンソン症候群またはパーキンソン病のようなα-シヌクレイノパシー（α-synucleinopathy）でありうる。薬剤は神経保護および/または神経再生分子および/または発生上の可溶性シグナルおよび/または腹側中脳の１型アストロサイトもしくはグリア細胞に由来する１種以上の因子でありうる。この方法はin vitroまたはin vivoで実施することができる。
【０１１３】
前記方法は次のステップを含むことができる：
(i) 本発明のニューロンを該ニューロンの毒素で処理し、
(ii) 該ニューロンを該毒素から分離し、
(iii) 処理したニューロンを1種以上の試験薬剤と接触させ、
(iv) 該ニューロンの該毒素からの回復能を測定し、
(v) 該ニューロンの該毒素からの回復能を、該試験薬剤と接触させてない同一ニューロンの該毒素からの回復能と比較する。
【０１１４】
前記方法は次のステップを含むことができる：
(i) 本発明のニューロンを、1種以上の試験薬剤の存在下で、該ニューロンの毒素で処理し、
(ii) 該ニューロンの該毒素に対する耐性能を測定し、
(iii) 該ニューロンの該毒素に対する耐性能を、該試験薬剤と接触させてない同一ニューロンの該毒素に対する耐性能と比較する。
【０１１５】
毒素は6-ヒドロキシドーパミン、5,7-ジヒドロキシトリプタミン、もしくは1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)、プロテアソーム阻害剤（ラクタシスチン(lactacystin)を含む）、または殺虫剤（ロテノンを含む）であってよく、これら全てがカテコールアミン作動性ニューロンの死をもたらし、かつパーキンソン病の特徴を実験的に再現する。ニューロンの毒素からの回復能または毒素に対する耐性能は、当業者に公知の方法により測定することができ、例えば、細胞生存率もしくは細胞消失（例えば細胞カウントによる、例えばTUNEL法による）または活性型カスパーゼ-3免疫染色のモニタリング、形態（例えば、発芽、軸索の伸長および/または枝分かれ）のモニタリング、および/または生化学（例えばTH活性、例えば神経伝達物質の取込み/放出/含量）のモニタリングにより測定する。
【０１１６】
神経変性疾患治療用の薬剤のスクリーニング方法は次のステップを含むことができる：
(i) 上記の方法により作製されたドーパミン作動性ニューロンを1種以上の試験薬剤と接触させ、
(ii) 該薬剤の存在下での該ドーパミン作動性ニューロンの成長、機能、維持、生存能または神経伝達物質の放出を確認する。
【０１１７】
他の実施形態において、神経変性疾患治療用の薬剤のスクリーニング方法は、酸化的ストレスのもとにある幹細胞、始原もしくは前駆細胞から生じたニューロンを利用し、次のステップを含んでなる：
(i) 酸化的ストレスのもとにある幹細胞、始原もしくは前駆細胞から生じたニューロンを用意し、
(ii) 該ニューロンを1種以上の試験薬剤と接触させ、
(iii) 該薬剤の存在下での該ニューロンの成長、機能、維持、生存能または神経伝達物質の放出を確認する。
【０１１８】
前記薬剤の存在下でのニューロンの成長、機能、維持、生存能または神経伝達物質の放出は、前記薬剤の非存在下でのニューロンの成長、機能、維持、生存能または神経伝達物質の放出と比較することができる。薬剤の非存在下と比較して、存在下での成長、神経伝達、維持、または生存能が増加すれば、その薬剤は神経変性疾患の治療に有用であることになる。
【０１１９】
ニューロンの成長、神経伝達、維持、または生存能は、当業者に公知の方法により測定することができ、例えば、細胞カウント（例えばTUNEL法による）または活性型カスパーゼ-3免疫染色により、BrdUもしくは3H-チミジン取込みにより、形態（例えば、発芽、軸索の伸長および/または枝分かれ）のモニタリングにより、生化学（例えばTH活性、例えば神経伝達物質の取込み/放出/含量）のモニタリングにより、および/または遺伝子もしくはタンパク質の発現（例えば、免疫組織化学、PCR、遺伝子チップ、プロテオーム）により測定しうる。
【０１２０】
本発明において使用できる幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、前駆細胞、始原細胞、または神経細胞の例としては、C17.2 (Snyder, E. Y.ら Cell 68, 33-51 (1992))およびH6ヒト細胞株(Flaxら Nature Biotech 16 (1998))が挙げられる。さらなるヒト神経および胚性幹細胞の例は、Gage, F.H.ら Ann. Rev. Neurosci. 18 159-192 (1995); Gotlieb (2002) Annu. Rev. Neurosci 25 381-407); Carpenterら Stem Cells. 5(1): 79-88 (2003); およびhttp://stemcells.nih.gov/research/registry/に記載されている。
【０１２１】
本明細書では神経幹細胞または神経始原もしくは前駆細胞に関して考察されるが、ここに提供した方法は他の幹細胞、始原もしくは前駆細胞におけるニューロン運命の誘導にも応用することができる。そのような細胞の例には、ヒトおよび非ヒト胚性幹細胞、ならびに非神経系と関連した幹細胞が含まれる。前記方法は間質細胞もしくは造血幹細胞および/または上皮由来の増殖性細胞に適用することができる。造血細胞は血液または骨髄生検から集めることができる。間質細胞は骨髄生検から集めることができる。上皮細胞は皮膚生検により、または例えば口腔粘膜をこすり取ることにより集めることができる。ニューロン表現型はこれらの幹細胞、始原もしくは前駆細胞のin vivoでの生理学的運命ではないので、この誘導方法は分化転換（trans-differentiation）、または脱分化（de-differentiation）および神経再分化と呼ばれている。このような細胞をニューロン運命へと誘導する方法は、非ニューロン表現型に関連した遺伝子に対するmicroRNAまたは抗センス調節因子を使用して、これらの細胞が非ニューロン運命へと分化するのを抑制および/または反転させることを含む。
【０１２２】
本発明の方法は、神経運命へと拘束されていない幹細胞に適用することができる。それらは、異なる発生系と関連した２以上の娘幹細胞を生じる能力がある幹細胞に適用しうる。こうした幹細胞の例は胚性幹細胞、造血幹細胞、上皮由来の増殖性細胞、および神経幹細胞である。
【０１２３】
さらなる各種の態様において、本発明は、神経幹細胞または始原もしくは前駆細胞におけるドーパミン作動性運命の誘導を高めるか、またはDkkリガンド（例えばDkkポリペプチド）および/またはDkk受容体（例えばLRPポリペプチド）で処理したニューロン細胞におけるドーパミン作動性の誘導または分化を高める、１種以上の因子についてのアッセイおよびスクリーニング方法を提供することに関する。
【０１２４】
本発明は、Dkkおよび/またはLRPの存在下で幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞におけるドーパミン作動性運命の誘導を単独でまたは組合せで高める、増大させる、または増強することができる、１種以上の因子のスクリーニング方法を提供する。本発明の更なる態様は、幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞におけるドーパミン作動性運命の誘導を高める１種以上の因子を取得および/または同定するためのスクリーニングまたはサーチングにおける、Dkkおよび/またはLRPの存在下での幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞の使用を提供する。
【０１２５】
スクリーニング方法は次のステップを含むことができる：
(a) 試験物質を、Dkkリガンド（例えばDkkポリペプチド）および/またはDkk受容体（例えばLRPポリペプチド）の存在下で幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞と接触させ、その際、該接触は試験物質と該細胞との相互作用をもたらすことができ、
(b) 試験物質と該細胞との相互作用を確認する。
【０１２６】
相互作用は、Dkkリガンド/受容体ポリペプチドと結合して細胞内へ取り込む該細胞の能力、および/または増大したドーパミン作動性細胞の数および/または分化をもたらすまたは伴うシグナル伝達経路または細胞プロセスを活性化する該細胞の能力を測定することにより確認することができる。これらには、kremenまたはLRP 5/6受容体により調節されるシグナル伝達プロセス、すなわち、本明細書で述べるようなβ-カテニンまたはアキシンのレベルおよび/または分解および/またはトランスロケーションおよび/またはリン酸化の調節が含まれる。
【０１２７】
スクリーニング方法は、試験物質を、Dkkリガンド（例えばDkkポリペプチド）および/またはDkk受容体（例えばLRPポリペプチド）の存在下で幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞に由来する膜画分、可溶性画分または核画分と接触させ、そして試験物質と該画分との相互作用を確認することを含む。こうした画分の調製は当業者の能力の範囲内である。
【０１２８】
結合または相互作用は当技術分野で公知のいくつかの技法（定性的または定量的）により確認することができる。試験物質と幹細胞または前駆細胞またはニューロン細胞との相互作用は、いずれか一方に検出可能な標識を付け、それを他方と接触させることにより調べることができ、その際、他方は、例えば固相支持体に結合させた抗体を用いて、またはBiacoreシステムを含むそれ自体公知の他の技法により、固相支持体に固定化しておいてもよい。
【０１２９】
スクリーニング方法は、幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞を１種以上の試験物質の存在下で培養し、該細胞をドーパミン作動性表現型への分化について（例えば、本明細書に記載するドーパミン作動性表現型のマーカーを検出することにより）分析することを含む。ドーパミン作動性表現型のマーカーの１つにチロシンヒドロキシラーゼ（TH）がある。さらなるマーカーとしては、Nurr1、レチナルデヒドデヒドロゲナーゼ1 (Raldh1)またはアルデヒドデヒドデヒドロゲナーゼ2型(AHD-2)、GIRK2、Lmx1a/bおよびPitx3が挙げられる。（TH/ドーパミン/DATの存在下での）ドーパミンβヒドロキシラーゼおよびGABAまたはGADの非存在もドーパミン作動性運命の指標となる。
【０１３０】
本発明によりスクリーニングされる物質は、天然または合成の化合物であり、例えばポリペプチド、核酸、小さな有機分子が含まれる。
【０１３１】
スクリーニング方法は、腹側中脳の１型アストロサイトまたは初期グリア細胞を、Dkkおよび/またはLRPポリペプチドの存在下で幹細胞、神経幹細胞、または始原もしくは前駆細胞におけるドーパミン作動性運命を誘導することができない神経細胞（例えばアストロサイト）と比較することを含む。こうした比較は、例えば、腹側中脳の発生中の１型アストロサイトまたは初期グリア細胞と、他の神経部位からの１型アストロサイトまたは初期グリアとの間で行うことができる。
【０１３２】
アストロサイトや初期グリア細胞を必要とするスクリーニング方法では、不死化されたアストロサイトまたはグリア細胞を利用することができる。それはアストロサイト細胞株またはグリア細胞株（例えば、アストロサイトまたはグリア中脳細胞株）でありうる。こうした細胞株は均一な細胞集団を提供する。
【０１３３】
スクリーニング方法は、細胞同士の表現型の差を分析するためのどのような公知方法を用いてもよく、またDNA、mRNA、cDNAもしくはポリペプチドのレベルで行うことができる。差次的スクリーニングと遺伝子スクリーニングがそのような２つの技法である。本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかで同定された物質は、本明細書に記載の他のスクリーニング方法のいずれかで試験物質として使用しうる。
【０１３４】
スクリーニング方法では、核酸発現アレイ、例えばマウスcDNA発現アレイを利用することができる。このアプローチでは、異なる核酸分子のアレイをフィルター、石英、または別の表面上に、例えば核酸をフィルターに架橋することで、配置する。試験溶液または抽出液を取得し、そこに含まれる核酸を例えば蛍光により標識する。次いで溶液または抽出液をフィルターもしくは遺伝子チップにアプライする。試験核酸とフィルターもしくは遺伝子チップ上の核酸とのハイブリダイゼーションを確認して、対照溶液を用いて得られたハイブリダイゼーションと比較する。試験サンプルと対照サンプルの場合に得られたハイブリダイゼーションの差が異なる核酸内容物を示している。核酸アレイに関するさらなる情報については、利用可能なウェブブラウザを用いて見つけられる、Clontechウェブサイト(例えば、www.clontech.com)またはAffymetrixウェブサイト(例えば、www.affymetrix.com)を参照されたい。
【０１３５】
スクリーニング方法は、幹細胞、始原もしくは前駆細胞、または神経細胞を、Dkkリガンド（例えば、Dkkポリペプチド）および/またはDkk受容体（例えば、LRPポリペプチド）の存在下にある幹細胞、始原もしくは前駆細胞、または神経細胞と比較して、例えば、１種以上の因子を同定することを含む。かかる因子は、DkkリガンドもしくはDkk受容体の存在下で細胞の増殖および/または自己複製および/または分化および/または生存を高め、かつ/またはドーパミン作動性運命の獲得もしくは誘導を促進し、かつ/または幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、または神経細胞におけるニューロン発生および/または神経伝達を誘導し、かつ/またはニューロン細胞におけるドーパミン作動性誘導もしくは分化を高めるものである。ひとたび標的遺伝子および/または因子が同定されたら、それらの単離および/または精製および/またはクローニングを行って、さらなる方法に使用することができる。
【０１３６】
スクリーニング方法は、幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞を１種以上の試験物質の存在下で培養し、該細胞をβカテニン活性化について、例えば本明細書で述べるような脱リン酸化またはレポーターアッセイにより、分析することを含んでいてもよい。
【０１３７】
スクリーニング方法は、幹細胞、始原もしくは前駆細胞、または神経細胞を、Dkkリガンド（例えば、Dkkポリペプチド）および/またはDkk受容体（例えば、LRPポリペプチド）の存在下にある幹細胞、始原もしくは前駆細胞、または神経細胞と比較して、例えば、DkkリガンドもしくはDkk受容体の存在下で幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、または神経細胞におけるβカテニン活性化を促進し、増大し、または高める１種以上の因子を同定することを含むことができる。ひとたび標的遺伝子および/または因子が同定されたら、それらの単離および/または精製および/またはクローニングを行って、さらなる方法に使用することができる。
【０１３８】
関連した態様では、本発明は、幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞においてドーパミン作動性運命を誘導するかまたはβカテニンを活性化するDkkリガンドまたはDkk受容体（例えば、DkkペプチドまたはLRPポリペプチド）の能力をモジュレートする物質のスクリーニング方法を提供する。
【０１３９】
こうして、前記方法は、幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、または神経細胞における増殖、自己複製、ドーパミン作動性の発生、分化、成熟、および/またはドーパミン作動性運命の獲得を誘導するDkkリガンドまたはDkk受容体（例えば、DkkペプチドまたはLRPポリペプチド）の能力をモジュレートする物質をスクリーニングすることができる。
【０１４０】
そのような方法は以下のステップを含んでなる：
(i) Dkkリガンドおよび/またはDkk受容体（例えば、Dkkペプチドおよび/またはLRPポリペプチド）および１種以上の試験物質の存在下にある幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、または神経細胞を用意し、
(ii) ドーパミン作動性運命もしくは表現型をとりかつ/またはDkkリガンドおよび/またはDkk受容体に応答する細胞の割合を分析し、
(iii) そのようなドーパミン作動性運命をとる細胞の割合を、匹敵する反応媒体および条件下であるが該試験物質の非存在下でドーパミン作動性運命もしくは表現型をとりかつ/またはDkkリガンドおよび/またはDkk受容体に応答する細胞の数と比較する。処理細胞と未処理細胞とのドーパミン作動性ニューロンの割合の差が、関係する試験物質のモジュレート効果を示している。
【０１４１】
そのようなスクリーニング方法は以下のステップを含むことができる：
(i) １種以上の試験物質の存在下で、幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞をDkkリガンドおよび/またはDkk受容体（例えば、Dkkペプチドおよび/またはLRPポリペプチド）により処理し、
(ii) ドーパミン作動性運命もしくは表現型をとりかつ/またはDkkリガンドおよび/またはDkk受容体に応答する幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞の割合を分析し、
(iii) ドーパミン作動性運命もしくは表現型をとりかつ/またはDkkリガンドおよび/またはDkk受容体に応答する幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、または神経細胞の割合を、匹敵する反応条件下であるが該試験物質の非存在下でドーパミン作動性運命もしくは表現型をとりかつ/またはDkkリガンドおよび/またはDkk受容体に応答する幹細胞、前駆もしくは始原細胞、または神経細胞の数と比較する。
【０１４２】
他の実施形態では、スクリーニング方法は以下のステップを含むことができる：
(i) １種以上の試験物質の存在下で、幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞をDkkリガンドおよび/またはDkk受容体（例えば、Dkkペプチドおよび/またはLRPポリペプチド）により処理し、
(ii) Dkkリガンドおよび/またはDkk受容体に応答してβ-カテニン活性化を受ける幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞の割合を分析し、
(iii) Dkkリガンドおよび/またはDkk受容体に応答してβ-カテニン活性化を受ける幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロン細胞の割合を、匹敵する反応条件下であるが該試験物質の非存在下でβ-カテニン活性化を受ける幹細胞、前駆もしくは始原細胞、または神経細胞の数と比較する。
【０１４３】
こうしたスクリーニング方法は、類似のまたは同一の非ヒト動物においてin vivoで、あるいはin vitroで、すなわち培養下で、細胞に対して実施することができる。
【０１４４】
上述したように、本発明に従ってスクリーニングされる物質は、例えばポリペプチド、核酸、小さな有機分子といった、天然または合成の化合物であってよい。
【０１４５】
他の実施形態では、幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞における増殖、自己複製、ドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、生存、分化および/または成熟を高めることによってドーパミン作動性ニューロンの発生を誘導または促進するのに有用な化合物のスクリーニング方法は、
試験化合物の存在下でDkkポリペプチドをタンパク質分解的に切断する前駆タンパク質転換酵素の能力を測定する、ことを含むことができる。
【０１４６】
試験化合物の非存在下に対する存在下での前記能力の増加または低下は、その試験化合物がドーパミン作動性ニューロンの発生を誘導または促進するのに有用であることを示している。
【０１４７】
Dkkポリペプチドをタンパク質分解的に切断する前駆タンパク質転換酵素の能力は、Dkk活性を測定することにより（例えば、βカテニン活性化もしくはドーパミン作動性発生を測定または検出することにより）、あるいはDkkポリペプチドの加水分解産物の存在を確認することにより、測定することができる。
【０１４８】
適当なDkkポリペプチドとしては、Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3およびDkk-4が挙げられる。
【０１４９】
前駆タンパク質転換酵素は、配列Arg-X-X-Arg、Arg/Lys-X-X-X-Arg/Lys-Arg、またはArg/Lys-Argに特異的なプロテアーゼであってよく、例えばフューリンまたはプロテアーゼ転換酵素２（PC2）である。
【０１５０】
他の実施形態では、タンパク質分解を受けにくいDkkリガンドのスクリーニング方法は、前駆タンパク質転換酵素の存在下でDkkリガンドを含むと予想されるサンプルのDkk活性を確認することを含み、該活性が存在すれば、該サンプルが前記Dkkリガンドを含むこととなる。
【０１５１】
サンプルのDkk活性は、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞における増殖、自己複製、ドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、生存、分化および/または成熟を高めることによってドーパミン作動性ニューロンの発生を促進することに及ぼす該サンプルの効果を測定することにより、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞におけるβカテニン活性化に及ぼす該サンプルの効果を測定することにより、またはDkkリガンドのタンパク質分解切断の産物の有無を確認することにより、確認することができる。
【０１５２】
ある方法は、タンパク質分解を受けにくいDkkリガンドを含むサンプルを同定することを含みうる。Dkkリガンドをサンプルから単離および/または精製してもよい。
【０１５３】
スクリーニング方法は、混合物またはサンプルから１種以上の物質を単離および/または精製することを含むことができる。この方法は、Dkkリガンド（例えば、Dkkポリペプチド）および/またはDkk受容体（例えば、LRPポリペプチド）の存在下で幹細胞、神経幹細胞、神経始原もしくは前駆細胞、または神経細胞と相互作用する混合物の１以上の画分の能力（例えば、前記細胞と結合する能力、および/または前記細胞の増殖および/または自己複製を促進する能力、および/または前記細胞におけるドーパミン作動性の表現型および/または神経伝達もしくは運命の誘導、獲得、分化または発生を高める能力）を測定すること含む。精製および/または単離するには、当業者に公知のどのような方法を使用してもよい。
【０１５４】
スクリーニング方法では、試験物質をコードする核酸と機能的に連結された誘導性プロモーターを使用することができる。そのような構築物を宿主細胞に組み込み、該プロモーターの許容性および非許容性条件下にある該細胞の１以上の性質を検討し比較する。検討される性質は、Dkkリガンド（例えば、Dkkポリペプチド）および/またはDkk受容体（例えば、LRPポリペプチド）の存在下で幹細胞、神経幹細胞、神経始原もしくは前駆細胞、または神経細胞におけるドーパミン作動性の表現型またはβカテニン活性化を誘導する該宿主細胞の能力でありうる。許容性と非許容性の条件下にある宿主細胞の能力に差があれば、その試験物質が、単独でまたは組合せで、Dkkリガンドおよび/またはDkk受容体の存在下に幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞における増殖および/または自己複製および/またはドーパミン作動性の運命および/またはドーパミン作動性の分化もしくは神経伝達、生存または発生の誘導を高めることができるか、あるいはニューロン細胞におけるドーパミン作動性の誘導または神経伝達または分化を高めることができることを示す。
【０１５５】
当業者であれば、通常のスキルや知識を用いて本発明のどのスクリーニング方法のフォーマットでも変更することができよう。モジュレート活性を試験される物質はいずれも天然または合成の化学物質であってよい。
【０１５６】
本発明により提供される方法のいずれかにより同定された化合物、物質、または因子は単離および/または精製し、かつ/またはさらに研究することができる。それを製造して、薬剤、医薬組成物、薬物のような組成物の調製（すなわち、製造または処方）に使用してもよい。
【０１５７】
種々のさらなる態様において、本発明は、本明細書に開示した方法のいずれかにより同定された因子；そのような因子を含む医薬組成物、薬剤、薬物もしくは他の組成物（かかる組成物は幹細胞、神経幹細胞、始原もしくは前駆細胞、またはニューロンをDkkリガンド（例えば、Dkkポリペプチド）および/またはDkk受容体（例えば、LRPポリペプチド）と共に含みうる）；Dkkリガンド（例えば、Dkkポリペプチド）および/またはDkk受容体（例えば、LRPポリペプチド）の存在下で幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、始原もしくは前駆細胞から誘導されるドーパミン作動性ニューロンの誘導および/または表現型分化もしくは成熟および/または生存および/または神経再生および/またはシナプス再生および/または神経伝達および/または機能的出力を高めるための該因子の使用；医学的処置方法における該因子もしくは組成物の使用；ドーパミン作動性ニューロンの変性、損傷、減少または障害に関連した医学的症状、あるいはドーパミン作動性ニューロンに影響を及ぼす医学的症状を処置（予防的処置を含む）するための、例えばパーキンソン病または他の神経変性疾患を処置するための、患者に該因子または組成物を投与することを含む方法；投与用の、例えばパーキンソン病またはその他（神経変性疾患など）の治療用の、組成物、薬剤または薬物の製造における該因子の使用；ならびに、該因子を製薬上許容される賦形剤、ビヒクルもしくは担体と、任意で他の成分と、混ぜ合わせることを含む医薬組成物の調製方法をさらに提供する。
【０１５８】
本発明の種々のさらなる態様および実施形態は、本明細書の開示内容から当業者には自明であろう。本明細書で挙げた文献はすべて、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。
【０１５９】
本発明は、上に記載した特徴の組合せおよび部分的組合せをもれなく包含する。
【０１６０】
本発明のいくつかの局面および実施形態を一例として図示し、また以下に記載された図面に関して説明する。
【０１６１】
図１から６は、発生中のVM（腹側中脳）におけるDkk-1、-2、-3の連続的発現を示している。統計解析は、一元配置分散分析（One-Way ANOVA）とフィッシャーの事後多重比較検定（Fisher’s post-hoc test）を用いて行われた。
【実施例】
【０１６２】
特に本明細書で参照により組み込まれるものは、WO 00/667136およびWO 2004/029229に記述される実験結果である。WO 00/667136は、ドーパミン作動性前駆細胞の増殖および／または自己複製、並びに1型アストロサイトまたはグリア細胞の存在下でNurr1を発現する幹細胞、神経幹細胞、前駆細胞、もしくは始原細胞におけるドーパミン作動性ニューロンの誘導を実証し、また前記細胞をFGF（例えば、FGF8）やレチノイド等の付加的な因子と接触させた時に得られる付加的結果を実証している。そしてWO 2004/029229は、ドーパミン作動性前駆細胞の増殖および／または自己複製、並びに例えばNurr1等のNG4Aサブファミリーの核内レセプターを細胞内で基底レベルを超えて発現させることやWntリガンドで細胞を処理することによる幹細胞、神経幹細胞、前駆細胞、または始原細胞におけるドーパミン作動性ニューロンの誘導を実証している。
【０１６３】
Dkk-APおよびDkk-FLAGを含む条件培地の部分精製、並びにフューリン阻害剤処理
ヒト胎生期腎細胞293T(HEK293T)細胞またはSN4741細胞を、リポフェクタミン2000（Lipofectamine 2000: Invitrogen社）を用いて使用説明書に従いDkk-AP（Maoら、2001a）プラスミド、または全長もしくはトランケート型Dkk-FLAG（Liら、2002）プラスミドで一過的にトランスフェクトした。48時間後、無血清N2条件培地を回収し、Centricon-Plus 20カラム（Millipore社）を用いて使用説明書に従って濃縮した。タンパク質含有量を測定し、等濃度のアリコート（分割量のサンプル）を調製した後、−80℃で保存した。フューリン阻害実験では、DMSO（対照として）またはデカノイル-RVKR-CMK（Calbiochem社）をトランスフェクションの開始後4時間で、OPTIMEM培地（Invitrogen社）をN2培地で置き換える際に培養物に加えた。c.m.（条件培地）を24時間後に回収し、遠心して、あらゆる細胞混入物を除き、直接解析を行った（p.p.（部分精製）なし）。
【０１６４】
前駆細胞培養物と処理
定期に交尾させたSprague-Dawleyラットから得られた胎生期(E)14.5日の腹側中脳（VM）（動物実験の倫理承認は、Stockholms Norra Djurfoersoeks Etiska Naemndより付与された）を切除し、機械的に解離させた。そして、ポリD-リシン(10μg/ml)被覆プレート（Falcon社）内の15mMのHEPESバッファおよび1mMのグルタミン（Invitrogen社）を含んだ、F12とMEM（Invitrogen社）の1：1混合物からなる無血清N2培地に、最終密度1×105細胞／cm2で播種した。N2サプリメントおよび5mg/mlのAlbuMAX（Invitrogen社提供）も培地に添加した。またはそれに代わって5μg/mlインスリン、100μg/mlアポトランスフェリン(apotransferrin)、60μMプトレスシン(putrescine)、20nMプロゲステロン、30nMセレン、6mg/mlグルコース、および1mg/mlのBSA（全てシグマ社から購入）を添加した。培養物を、固定前に37℃インキュベータ内で5％CO2下にてin vitroで３日間培養した。組換えマウスDkk-1(R＆D Systems社)および組換えヒトDkk-2（AmProx社、USA）を最終濃度0〜500ng/mlで使用した。Dkk-APおよびトランケート型Dkk-FLAGについては、25μg/μlのストック溶液を0〜10μg/mlで添加した。これら全ての試薬を培養開始時に前駆細胞培養物に加えた。
【０１６５】
Dkk-APとLRP-6N-Fcについては、25μg/μlのストック溶液を0〜10μg/mlで添加した。これら全ての試薬を培養開始時に前駆細胞培養物に加えた。
【０１６６】
グリア培養物
グリア培養物（O'Malleyら、1992）は、定期に交尾させたSprague-Dawleyラットから得られた出生後１日目(P1)のVM、皮質(Cx)、および線条体(Str)から確立した。機械的解離の後、10×106個の細胞を、予め10μMのポリD-リシンで被覆した25 cm2フラスコ内のNM15培地（MEMに15％のウシ胎児血清、7.2mg/mlグルコース、2.4ｍMのグルタミン、0.5％のファンギゾン(Fungizone)、および0.6％ゲンタマイシン(gentamycin)（全てシグマ社から購入）を含む）に播種した。細胞を単層へと増殖させ、ミクログリアおよび細胞残骸物を37℃にて1時間、190rpmで振とうして除いた。それから、付着細胞を無菌PBSで洗浄し、37℃インキュベータ内で、5％CO2にて1〜2時間培養した後、37℃にて210rpmで一晩振とうした。その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞およびその他の細胞型を含む上清培地を廃棄した。そして、残ったグリアの単層をRNA回収のために溶解した。
【０１６７】
リアルタイムPCRと遺伝子発現の定量化
GenBank cDNA配列を用いて、Primer Express 2.0 (PE Applied Biosystems社、フォスターシティー、カリフォルニア、USA)でプライマーを設計した。PCRプライマーの特異性については、プライマー配列をBLASTで検索して決定した。表１に列記したオリゴヌクレオチドを使用した。Quantum RNA 古典的18S内部標準（Ambion社、オースチン、USA)以外の全プライマーについては、DNA Technologies社（デンマーク）から購入した。
【０１６８】
E10.5、E11.5、E13.5、E15.5、およびP1ラットより切除した腹側中脳のプールから、並びにグリア単層（各領域につきn=4）からRNeasy抽出キット（Qiagen社、ヒルデン、ドイツ）を用いて総RNAを分離した。逆転写反応については、まず1μgの総RNAを１ユニットのRQ1 RNase-Free DNase（Promega社、マジソン、USA）で40分間処理した。1μlの0.02M EDTAを加え、65℃で10分間インキュベートしてDNaseを不活性化した。その後0.5μgのランダムプライマー（Invitrogen社）を加え、その混合物を65℃で5分間インキュベートした。それから、各サンプルを二つのチューブ、すなわちcDNA反応チューブと陰性対照チューブに等分した。その後、1×First-Strandバッファ（Invitrogen社）、0.01M DTT（Invitrogen社）および0.5ｍM dNTP（Promega社、マジソン、USA）を含むマスター混合物を、cDNAおよびRT−の両チューブに加え、25℃で10分間インキュベートした。続いて、42℃で2分間インキュベートした。その後、Supercript II 逆転写酵素（200ユニット、Invitrogen社）をｃDNAチューブにのみ加え、全サンプルを42℃で50分間インキュベートした。Supercript IIについては、70℃で10分間インキュベートすることで不活性化した。その後、cDNAおよびRT−の双方をさらなる解析のために10倍希釈した。
【０１６９】
リアルタイムRT-PCR反応は、25μlの最終量あたり1μlの10×希釈cDNAまたは10×希釈RT−を含む３つのマスター混合液にて行った。各PCR反応液は、1×PCRバッファ（Invitrogen社）、3mM MgCl2（Invitrogen社）、0.2mM dNTP（Promega社、マジソン、USA）、0.3μMずつのフォワード（順方向）およびリバース（逆方向）プライマー、0.5ユニットのPlatinum Taq DNAポリメラーゼ（Invitrogen社）、および1×SYBR Green（Molecular Probes社、ライデン、オランダ）からなる。PCRは、94℃で2分間の後、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で15秒および80℃で5秒（SYBR Green検出のため）の35〜40サイクルを、ABI PRISM 5700検出システム（PE Applied Biosystems社、フォスターシティー、カリフォルニア、USA)で行った。SYBR Greenシグナルがユニークかつ特異的なアンプリコンと対応することを確認するために、各反応後に各PCR産物につき融解曲線を得た。リアルタイムPCRを行う毎に全ての96ウェルプレートで、各プローブに対する対象の配列（逆転写されたRNA、プラスミドに含まれるもの、またはゲノムDNA）を含んだ対照サンプルの連続3倍希釈法を用いて、標準曲線を作成した。その後、得られた標準曲線グラフを用いて、Cts（確立した蛍光閾値にまで所与の鋳型を増幅させる上で必要なPCRサイクルの数）を所与サンプルの初期鋳型の任意量に変換した。発現レベルは、各サンプルのRT＋値から対応するRT−値を差し引き（適切な場合）、その後平行アッセイでサンプル毎に得られたハウスキーピング遺伝子18Sの値でその数を割ることによって得られる。特定の遺伝子について各アッセイを二度繰り返した。18Sアッセイを、各サンプルについて開始時とアッセイの途中で１回か２回行い、サンプルの完全性を検証した。
【０１７０】
PCR産物を2％アガロースゲルで泳動し、アンプリコンのサイズを検証した。その結果の統計解析は、一元配置分散分析により行った。この後にフィッシャーの保護最小有意差（Fisher's protected least significant difference）を用いて、有意な相互作用が起こったときにのみ、その異なる発生段階が最初のものとは違っていた特定点を同定した。全検定の有意性をp＜0.05（＊p＜0.05；＊＊p＜0.001；＊＊＊p＜0.0001）の水準で推定した。
【０１７１】
in situハイブリダイゼーション
E11.5、E12.5、およびE15.5における野生型とLrp6変異型マウスの胚を4％パラホルムアルデヒドにて4℃で一晩固定し、パラフィンに包埋した。8μmの連続切片を[S35]-UTP標識したアンチセンスリボプローブを用いる放射性in situハイブリダイゼーション用に処理した。ハイブリダイゼーションは、Dagerlindらの改変プロトコル（Dagerlind ら、1992）に従って50％ホルムアミド中にて56℃で行った。切片をCresyl Violet（Sigma社）で対比染色した。in situハイブリダイゼーション用のプローブは、以下の通りである。すなわち、Dkk1、Dkk2（Monaghanら、1999）、Lrp5、Lrp6（NM_008513のLrp5における2884-3444bp領域、およびNM_008514のLrp6における2941-3446bp領域のPCR産物）、TH、Pitx3（Jordi Guimera氏より恵与（Brodskiら、2003））、En1（DavisとJoyner、1988）、Fgf8（Martinezら、1999）およびShhである。
【０１７２】
BrdU免疫染色
増殖アッセイのためにBrdU検出キット（Roche社、ドイツ）をほんの少し改変して使用した。屠殺２時間前に妊娠マウスの腹膜に5-ブロモ-2デオキシウリジン（BrdU、1000μg/100g）を注入した。胚／脳を4％パラホルムアルデヒド中にて4℃で一晩固定し、エタノールおよびロチヒストール(rotihistol)によって脱水した後、パラフィン包埋した。パラフィン切片(8μm)をロチヒストール中で脱パラフィン処理した後、再水和し、クエン酸ナトリウム(0.01M）で５分間処理した。続いてPBSで洗浄し、ブロッキング溶液（10％ウシ胎仔血清および0.05％ Triton X100を含むPBS）中で1時間インキュベートした。次に、スライドを一次抗体である抗BrdU抗体（0.05％Triton X100を含むPBSで1:10に希釈）と共に4℃で一晩インキュベートした。PBSで３回洗浄した後、切片を２時間、二次抗体であるビオチン化抗マウス抗体（1:500、Jackson ImmunoResearch社、USA)と共にインキュベートした。PBSで３回洗浄した後、スライドを30分間ABC溶液（ABC-Kit、VECTASTAIN、Vector Laboratories社）と共にインキュベートし、シグナルを観察できるまでジアミノベンジジン染色（DAB、Sigma社）を行った。スライドをPBSで２回洗浄し、脱水した後、Roti-Histokit（ROTH社、ドイツ）を用いて封入した。
【０１７３】
免疫細胞化学
細胞を氷冷した4％パラホルムアルデヒドで20分間固定した後、PBSで洗浄した。その後、それらをPBT（1% BSA、0.3% Triton X100、および0.02% アジ化ナトリウムを含むPBS、全てSigma社から購入）と共に15分間インキュベートしてブロッキングした。一次抗体（マウス抗TH（1:1000希釈、Immunostar社）、ウサギ抗TH（1:250、Pelfreeze社）、ウサギ抗Nurr1（１:1000、Santa Cruz社））と共に４℃で一晩インキュベートした後、細胞をPBSにより２回、10分間洗浄し、それから適当な二次抗体（ビオチン化１:500抗マウスまたは抗ウサギIgG（Vector社）、シアニン-2もしくはローダミン結合ウマ抗マウスIgG 1:200、またはヤギ抗ウサギIgG 1:200（Jackson Laboratories社））と共に２時間インキュベートした。PBSで２度洗浄した後、その細胞をHoechst33258で10分間対比染色する（免疫蛍光の場合）か、またはアビジン−ビオチン複合体溶液（Vector社）と共に２時間インキュベートした。PBSで２度洗浄した後、染色剤を、色原体VIP Vector Laboratories ABCイムノペルオキシダーゼキット（赤色染色：TH）または3,3’ジアミノベンジジン四塩酸塩(DAB 0.5mg/ml)／塩化ニッケル(1.6mg/ml)（灰色／黒色：Nurr1）を用いて発色させた。
【０１７４】
Nurr1染色をTH染色前に行った。PBS中の染色細胞の画像をZeiss社製Axioplan 100M顕微鏡（LD Achrostigmat  20×、0.3 PH1∞0〜2、およびLD Achroplan  40×、0.60 Korr、PH2∞0〜2）を用いて室温にて捕らえ、HamamatsuカメラC4742-95（QED画像ソフトを用いて）で取り込んだ。Adobe Photoshopバージョン7.0を用いて画像処理した。
【０１７５】
定量的な免疫細胞化学のデータは、２〜３回の別々の実験からの条件につき２〜３個のレプリカにおける10箇所の非重複視野から得られた平均値の平均±標準誤差で示している。統計解析は、図の説明に記載したようにStat View（Cary社、NC、USA）またはPrism 4ソフト（Graph Pad社、サンジエゴ、USA）で行った。また、全検定の有意性をp＜0.05（＊p＜0.05；＊＊0.01＜p＜0.001；＊＊＊p＜0.001）の水準で推定した。
【０１７６】
免疫ブロッティング
Dkk-AP、およびLRP-6N-Fcを過剰発現するHEK293細胞由来の部分精製した条件培地を、１×Laemiliバッファと混合した（1：20）。そのサンプルを煮沸し、10％SDS PAGE（レーンあたり15μlの培地サンプル）を行い、Hybond-P PVDFメンブレンに電気転写した。
【０１７７】
メンブレンを5％ミルクでブロッキングし、抗ヒト胎盤アルカリホスファターゼ特異的一次抗体（PLAP：Abcam社）、抗Dkk-3特異的一次抗体（R&D Systems社）および抗ヒトIgG特異的一次抗体（Vector社）、並びに適当な二次抗体を用いて免疫検出した。シグナルを、ECL+Plus検出システム（Amersham Bioscience社）で使用説明書に従って視覚化した。免疫検出後、総タンパク質をアミドブラックで染色し、等しいタンパク質負荷量を確認した。
【０１７８】
LRP-6変異体の免疫組織化学
LRP-6変異体(LRP-6 -/-)（Pinsonら、2000）は、Stockholms Norra Djurfoersoeks Etiska Naemndにより許可された動物実験の倫理承認に基づいて飼育し、繁殖させ、また処理した。野生型、およびヘテロ接合型マウスについては、過去に記載（Kellyら、2004）されたLRP-6-U1、およびLRP-6-D1プライマーを用いた遺伝子型決定PCR反応法で同定した。さらに、遺伝子トラップの挿入をもつマウスについては、以下のプライマーセットを用いて確認した。すなわち、63℃のアニーリング温度を有し、108bpのアンプリコンを生じるCD4mixフォワード：5´-GCACGGATGTCTCAGATCAAGAGG-3’とCD4mixリバース：5’- CGGGATCATCGCTCCCATATATG-3’である。耳または胚組織を100〜200μlの25mM NaOH/0.2mM EDTA中にて95℃で40分間煮沸した後、等容量の40mM Tris HCl(pH5)を加えた。この溶液３μlをPCRに使用した。このPCRは、リアルタイムPCRについて記載したとおりに行ったが、SYBR Greenを用いないで、また80℃のステップを行わずに、30サイクルを実施した。
【０１７９】
E11.5、E13.5、およびE17.5のマウスを4％パラホルムアルデヒドで一晩固定した後、20％ショ糖勾配中に浸漬した。その後、サンプルをO.C.T.にて−80℃で急速凍結させた。連続した矢状切片および冠状切片（14μm厚）を顕微鏡スライド（StarFrost社）上に集め、−80℃で保存した。免疫組織化学のためスライドを解凍し、4％パラホルムアルデヒドと共に10分間インキュベートした。PBSで15分ずつ３回洗浄した後、前記スライドをPBTG（5％のヤギ血清を含んだPBT）で30分間ブロッキングした。PBTG中に含まれる一次抗体（ウサギ抗TH（1:250、Pelfreeze社）、ウサギ抗Nurr1（1:1000、Santa Cruz社）、およびウサギ抗活性型カスパーゼIII（1:100、Cell Signalling社））を4℃で一晩インキュベートした。
【０１８０】
PBSで3回洗浄した後、前記切片をPBTGで30分間ブロッキングし、二次抗体（シアニン-2またはローダミン結合ウマ抗マウスIgG (1:200)、またはヤギ抗ウサギIgG（1:200、Jackson Laboratories社)）と共に２時間インキュベートした。その後、スライドを15分間PBSで３回洗浄し、Hoechst 33258で１分間対比染色した後、PBS／グリセリン(1:4)中で封入した。画像については、共焦点レーザスキャン顕微鏡（Zeiss社、LSM510：アルゴン(488nm)レーザ、およびヘリウム−ネオン（543および633nm）レーザ）、およびZeiss社 LSM Viewerソフトを用いて室温にて捕え、Adobe Photoshopバージョン7.0で画像処理した。全パネルは、Adobe Illustrator 9.0で一まとめにされた。定量的な免疫組織化学のデータは、平均値の平均±標準誤差で示している。VMの存在する全ての切片を各動物でカウントし、３〜４対のマウス（野生型およびLRP-6変異型）を解析した。統計解析は、Prism 4ソフト（Graph Pad社、サンジエゴ、USA）を記載の通り用いて、対応のあるt検定により行った。また、全検定の有意性をp＜0.05（＊p＜0.05；＊＊0.01＜p＜0.001；＊＊＊p＜0.001）の水準で推定した。
【０１８１】
結果
発生中のVMにおけるDkk1、Dkk２およびDkk３の連続的発現
Dkkの発現プロファイルを発生中のラットVMでリアルタイムPCRによって解析した。Dkk-1は、E10.5〜E11.5で多量に発現し、E13.5で減少した（図１）。しかし、Dkk-2 mRNAレベルは、ラットでのDAニューロン形成の開始前に、E11.5でピークに達していた（図２）（Perrone-Capanoら、2000）。興味深いことに、この発現パターンは、以前に報告（Castelo-Brancoら、2003）されたDA分化に重要な調節因子Wnt-5aのそれと類似している。Dkk-3 mRNAも、VM発生の初期段階に存在していたが、その発現は神経形成後の時点の方が一層多かった（E15.5およびP1、図３）。同様の結果は、in situハイブリダイゼーションによって発生中のマウスVMでも観察された。Dkk-1は、中脳湾曲部（図４ｂ）でTHの発現（図４ａ）と重なって多量に発現していた。さらに、その発現は間脳の小領域で見られた。E15.5では、Dkk-1の発現が中脳では見られなかった（図４ｆ）。E11.5では、Dkk-2は脳室から辺縁帯にかけて、TH発現領域を覆って間脳と中脳湾曲部で発現していた（図４ｃ）。Dkk-1のそれと同様に、Dkk-2 mRNAはE15.5マウスの中脳では見られなかった（図４ｇ）。本発明者らは、DA誘導シグナル源である出生後のVMグリア（Wagnerら、1999； Castelo-Brancoら、2005)がDkkを発現するかどうかも調べた。Dkk-1は解析したいずれのグリア細胞群でも発現していなかったのに対し、Dkk-2とDkk-3はP1のVMグリアで発現していることがわかった（図５、６）。興味深いことに、Dkk-2の発現はVMグリアに特異的であったが、Dkk-3とは違って、それは皮質と線条体由来のグリアには検出されなかった（図５、６）。in vivoおよび出生後の誘導型VMグリアでのDkk発現の動的パターンは、発生中のVMにおける異なるDkkの別個のかつ重複しない機能を示唆している。
【０１８２】
発生中のVMにおけるDkkの効果を調べる目的で、本発明者らはヒト胎生期腎細胞293(HEK293)にアルカリホスファターゼ(AP)タグ融合Dkk（Maoら、2001a）を一過的にトランスフェクトした。条件培地を回収し、部分精製した後、Dkk-APの存在をAPおよびDkk-3に対する免疫ブロットで確認した。その後、本発明者らは、E14.5のラットVMの神経前駆細胞培養物を、次第に用量を増加させた部分精製Dkk-APで処理し、DA前駆細胞の分化に対するそれらの効果について調べた。Dkk-1は、どの濃度の培養物でもチロシンヒドロキシラーゼ(TH)陽性細胞の数に影響を及ぼさなかったが、Dkk-2は2.5および5μl/mlでDAニューロンの数を有意に増加した（図７）。Dkkは、どの所与投与量でも培養物のNurr1陽性細胞の総数に影響を及ぼさなかった（図８）。
【０１８３】
部分精製Dkk条件培地と組換えDkkは、VM前駆細胞の分化に対して反対の効果をもつ
面白いことに、Nurr1+/TH＋のDAニューロンに変わるDA前駆細胞(Nurr1+/TH−)の数を評価すると、Dkk-2は2.5〜10μl/mlで強力かつ持続的な効果を示し、またDkk-3は2.5μl/mlでその細胞群を有意に増加した（図９、１０）。したがって、Dkk-2は、VMのDAニューロン分化のための強力な誘導因子であると思われた。
【０１８４】
これらの結果を確認するため、本発明者らは、VM前駆細胞培養物を、次第に用量を増加させた全長組換えマウスDkk-1（R&D Systems社）および全長組換えヒトDkk-2（Aprox社）で処理した。その結果、本発明者らは、5〜10ng/mlのDkk-1がTH+細胞の数を有意に減少させることを見出した（図１１）。しかし、さらに多量に投与(30〜100ng/ml）すると、組換えDkk-1にはもはやTH+ニューロン数を減じる効果はなかった（図１１、１２）。驚くべきことに、組換えDkk-2も、組換えDkk-1より高濃度(50〜100 ng/ml)ではあるが、VM前駆細胞培養物におけるTH+の数を減少させることがわかった(図１３と１４)。したがって、哺乳動物細胞内で産生されたDkkと比較すると、全長組換えDkkはDAニューロン形成に異なる効果を及ぼしている。まとめると、このデータは、DkkがE14.5DAのVM前駆細胞の分化を差次的に調節しており、Dkk-2はTH+ニューロンへのVM前駆細胞分化の強力な誘導因子であり、Dkk-1はその阻害因子であることを示している。
【０１８５】
Dkkは、発生中のVM由来の細胞でタンパク質分解プロセシングを受ける
全長組換えDkkは大腸菌（Escherichia coli）内で作られる。それ故、哺乳動物細胞内で生じるものと同様の前駆タンパク質転換酵素を介したタンパク質分解や糖鎖付加を含む翻訳後修飾を受けない。そこで本発明者らは、プロセシングにおけるそのような相違が全長Dkkと部分精製(p.p.)条件培地(c.m.)との間の活性の違いの原因であるか否かを調べた。APに対する抗体を用いたp.p.c.mの免疫ブロッティングにより、Dkk-1とDkk-2はいずれも二つの形態で存在することが明らかとなった。APタグ(約67kDa)融合全長タンパク質(約35〜40kDa）に対応する高分子量バンド(約105〜110kDa)は別として、付加的な低分子量バンド(約80〜85kDa)が、部分精製したDkk-1およびDkk-2のc.m.で検出された。
【０１８６】
マウスとヒトのDkk-1およびDkk-2は、潜在的な最小限のフューリン切断部位(Arg-X-X-Arg)、酸性pHフューリン切断部位(Arg/Lys-X-X-X-Arg/Lys-Arg)、またはプロテアーゼ転換酵素2(PC2)切断部位(Arg/Lys-Arg)を第１システインリッチドメイン(CRD-1)の中央部に含んでいる（Rockwellら、2002；Thomas、2002）(図１５、１６)。加えて、Dkk-1は潜在的なPC2切断部位をCRD-1と第２リッチドメイン(CRD-2)の間のスペーサー領域に有し、CRD-2内にも有している。さらに、発生中のVMではフューリンおよびその他の前駆タンパク質転換酵素が、DAニューロン形成時に多量に発現していることがわかった（Zhengら、1994）。これは、Dkkがこの段階でタンパク質分解によって切断され得ることを示唆している。
【０１８７】
Dkkがタンパク質分解によりプロセシングされることを確かめるため、FLAGタグ融合Dkk-1(約40kDa)およびDkk-2(約35kDa)（Liら、2002）をHEK293T細胞内で過剰発現させた。この細胞には、次第に用量を増加させたデカノイルRVKR-CMK（これはフューリンやPC2を含む前駆タンパク質転換酵素の阻害剤である）による処理を行った（Jeanら、1998）。前記阻害剤25μMで、未切断の全長Dkk-1またはDkk-2フラクション（約35〜40kDa）の総量を増加させるのに十分であることがわかった。これらのデータは、p.p.c.m.の低分子バンドが確かにタンパク質分解プロセシングによるものであることを示している。さらに、本発明者らはこの現象がSN4741 DA細胞株（Sonら、1999）でも生じていることを観察した。FLAGタグ融合Dkkを過剰発現させると、Dkk-1は約40kDaの全長型と約25kDaのトランケート型で存在すること、またデカノイルRVKR-CMKでの処理により全長タンパク質の総量が増加することも観察された(図１７)。SN4741細胞でのDkk-2の発現は、約22〜25ｋDaの２つのトランケート型を生じるが、全長タンパク質は生じないこともわかった。これらの結果は、DkkがDA細胞を含む異なる哺乳動物細胞で異なるタンパク質分解切断を受けることを示唆している。そこで本発明者らは、次にDkk-1またはDkk-2の完全なシステインリッチドメインを含む切断断片が異なる生物学的活性を有するかどうかを調べた。
【０１８８】
Dkk-2の第２システインリッチドメインは、VM前駆細胞培養物のTH陽性細胞の数を増加する
Dkk-1とDkk-2は二つのシステインリッチドメイン（CRD）を含んでおり（Krupnikら、1999）、異なるCRDを含むトランケート型タンパク質がカノニカルWntシグナル伝達の活性化を差次的に調節していることが明らかとなった（BrottとSokol、2002；Liら、2002）。しかし、フューリンおよびPC2切断部位はDkk-1およびDkk-2の両CRD-1の内部（図１５、１６）、およびDkk-1のCRD-2の内部にあるので、Dkk-2-CRD-2は、通常の切断産物を模倣した単なるトランケート型である可能性が高い。VM DAニューロンの発生におけるDkk-1とDkk-2の異なるCRDの活性を調べるために、本発明者らは、Dkk-1およびDkk-2由来のFLAGタグ融合CRD（Liら、2002）をSN4741細胞内で過剰発現させ、部分精製した条件培地を作製した。異なるトランケート型タンパク質を適度なレベルで発現させたところ、それらは予想される分子量で存在していた（Liら、2002）。Dkk-1、およびDkk-2双方のCRD-1による処理は、2.5μl/mlでTH+細胞数を増加させた（図１８、１９）。Dkk-1のCRD-2ではDAニューロン数に有意な変化は見られなかったが、Dkk-2のCRD-2は2.5μl/mlの投与量で増加をもたらした（図２０）。これらの結果は、全長Dkk-1および全長Dkk-2がそれらのタンパク質分解断片またはCRDと比較してDA分化で異なる活性を有することを示唆している。
【０１８９】
全長DkkはカノニカルWntシグナル伝達を阻害するが、Dkk-2-CRD-2はその反対の効果を有する
本発明者らは、DkkがDA細胞株でどのようにWntシグナル伝達を調節するのかを調べた。全長の組換えDkk-1と全長の組換えDkk-2は、低用量のWnt-3aで刺激したSN4741細胞における転写活性型β-カテニンのレベルの減少により示されるように、カノニカルWntシグナル伝達を効率よく阻害した（図２１）。面白いことに、VM前駆細胞でのDkkの効果に一致して、Dkkの効果はより高用量のWnt-3aではさほど顕著ではなく、またDkk-1はDkk-2よりも低い用量でβ-カテニンシグナル伝達を阻害できた。その一方で、Dkk2-CRD-2、もしくはSN4741細胞で過剰発現されかつプロセシングされたDkk-2を用いたSN4741細胞の処理は、Wnt-3aを介するβ-カテニン活性化に相乗効果をもたらした。しかし、Dkk-1またはDkk-1-CRD-2は効果がなかった。これらの結果は、LRP-6過剰発現細胞株（Liら、2002；Liuら、2005）、またはアフリカツメガエル（Xenopus）（BrottとSokol、2002）でDkk-2もしくはDkk-2-CRD-2によるカノニカルWntシグナル伝達の活性化を示した過去の報告と一致する。したがって、本発明者らの結果は、Dkk CDRと全長タンパク質の異なる活性がカノニカルWntシグナル伝達とDAニューロン形成を制御することを示し、またタンパク質分解がDkkの機能を決定する上で重要な役割を果たすことを示唆している。
【０１９０】
発生中のVMでLRP-5、LRP-6およびKremen-1は発現しているが、Kremen-2は発現しておらず、またLRP-6N-FcはDA分化を促進する
Dkk-1およびDkk-2は、元々Wnt/β-カテニンシグナル伝達の細胞外阻害因子として同定された（KawanoとKypta、2003）。また本発明者らは、以前にグリコーゲンシンターゼキナーゼ(GSK)-3阻害／β-カテニンの安定化がDAニューロンの分化をもたらすことを示した（Castelo-Brancoら、2004）。Wnt/β-カテニンシグナル伝達を制御するためには、DkkがLRP-5またはLRP-6と結合しなければならない（Baficoら、2001；Maoら、2001a；Semenovら、2001）。そこで本発明者らは、VM発生中のLRPのmRNA発現プロファイルを解析した。LRP-5とLRP-6のいずれも、VMで発現していた（図２２、２３、２４）。また興味深いことに、LRP-6は、以前にDkk-2（図２）とWnt-5a（Castelo-Brancoら、2003）で観察されたように、E11.5でピークに達していた。高レベルのLRP-6は、Wntを介するカノニカルシグナル伝達を増強できること（Brennanら、2004；Holmenら、2002；Liuら2003）、Dkk-1の阻害効果を漸増できること（Baficoら、2001；Maoら、2002；Maoら、2001a）、そして、高レベルのDkk-2と共に、Wnt/β-カテニンシグナル伝達をXenopus（Brott and Sokol、2002；MaoとNiehrs、2003）および哺乳動物細胞（Liら、2002；MaoとNiehrs、2003）の双方で活性化できることが明らかとなった。これは、Dkk-2がβ-カテニンの活性化を通してDA分化を調節することを示唆している。この工程は、Dkk共受容体の第２のクラスであるKremenによっても調節されている。Kremen-1およびKremen-2タンパク質は、Dkkと結合でき、LRP-6と共に三つ組みの複合体を形成する。この複合体は、その後細胞内に取り込まれ、Wnt/β-カテニンによるシグナル伝達を妨げる（Maoら、2002）
しかし、内在性Kremenが限られてきたり、LRP5/6レベルが高い場合には、DkkはWnt/β-カテニンシグナル伝達を阻害できない（Davidsonら、2002；MaoとNiehrs、2003）。例えば、Kremen-2の欠如は、Dkk-2をカノニカルWntシグナル伝達の阻害因子から活性化因子に転換し得る(Dkk-1ではできない)（MaoとNiehrs、2003）。本発明者らは、Kremen-1が発生中のVMに存在し、Dkk-1およびDkk-2の双方がまだ高レベルで存在する段階であるE11.5でピークに達することを見出した（図２５）。しかし、Kremen-2はリアルタイムPCRでかろうじて検出できる程度であった。
【０１９１】
これらの結果は、初期VMでKremen-1は発現するが、Kremen-2は発現しないことを示したKremenの全戴in situハイブリダイゼーションプロファイル（Davidsonら、2002）と矛盾しない。本発明者らの結果は、初期VMでDkk-1とDkk-2の双方がKremen-1と相互作用し、Wntカノニカルシグナル伝達を阻害できることを示唆している。
【０１９２】
しかし、Kremen-2の欠如は、恐らくDAニッシェの様々な細胞型において、カノニカルWntシグナル伝達を活性化するようにDkk-2を促している可能性もある。そこで、本発明者らは、可溶性のKremen-1およびKremen-2（R&D systems社）を用いてE14.5のVM前駆細胞培養物を処理したときの効果を調べた。TH+細胞数は減少傾向にあったものの、いずれも統計学的に有意な変化は認められなかった（図２６、および２７）。Kremenの膜結合は、293T細胞およびXenopusにおいてDkkと結合する上で、またそのWnt阻害機能の上で不可欠である（Davidsonら2002； Maoら、2002）。この必要条件は発生中のVMにもあてはまるかもしれない。要するに、LRPとKremenは発生中のVMで特異的なパターンで発現して、DA分化における役割を果たしている可能性がある。
【０１９３】
本発明者らの系におけるLRP-6の関連性をさらに調べるため、本発明者らは、FRP-6の細胞外ドメインとヒトIgGのFcドメインを含む分泌性融合タンパク質LRP-6N-Fcを用いた（Tamaiら、2000）。HEK293細胞内でLRP-6N-Fcを過剰発現させ、条件培地中のその存在をヒトIgGに対する免疫ブロットにより確認した。その後、E14.5のVM前駆細胞培養物を、次第に用量を増加させたLRP-6N-Fcで処理し、TH+ニューロン数（図２８A）およびDA表現型に転換したNurr1前駆細胞のパーセンテージ（図２８C）の有意な増加によって、DA分化における強力な効果を見出した。Nurr1陽性細胞の総数は、影響を受けなかった（図２８B）。これは、前記効果が分化に対するものであり、Nurr1＋前駆細胞の増殖に対するものではないことを示唆している。LRP-6N-Fcは、Wnt1を介したβ-カテニンの安定化を弱めることが報告されている（Brennanら、2004；Gonzalez-Sanchoら、2004；Holmenら、2002）が、それはまたDkkに結合できる（Semenovら、2001）。本発明者らは、この融合タンパク質がDA分化に対するDkk-2（図２）またはWnt-5a（Castelo-Brancoら、2003）のDA効果を模倣していることを見出した。
【０１９４】
LRP-6ホモ接合変異型マウスは、VMでパターン形成、増殖または細胞死欠陥を示さない
LRP-6ホモ接合変異型マウスは、脳（encephaly）、および／または尾側中脳の欠損を含むWntシグナル伝達の制御解除に関連したいくつかの発生上の欠陥を示すことが報告されている（Pinsonら、2000）。これら以前の観察は、Engrailed(En-1)や線維芽細胞増殖因子８(fgf-8)等の中脳／後脳マーカー遺伝子の背側発現の低下によって確認された。しかし、E11.5〜12のVMではEn1、fgf-8、Sonic hedgehog (Shh)、またはWnt-5aの発現の違いは観察されていない。これは、VMが前記変異体で正常に形成されていることを示唆している（図２９）。したがって、LRP-6ホモ接合変異体における中脳〜後脳境界の欠陥は、背側／尾側の中脳構造の欠損と関連している可能性が高い。
【０１９５】
前記知見と一致して、E10.5とE11.5にS期マーカーであるBrdU（図３０）およびE11.5に細胞周期マーカーであるホスホヒストン３（図３１と３２）を用いて免疫染色で評価したとき、E11.5におけるVM前駆細胞の増殖のいかなる減少も観察されなかった（Hendzelら、1997）。さらに、活性型カスパーゼ３の免疫染色で評価したとき、アポトーシスを受けた細胞数はE13.5の野生型または変異型のVMで変わらなかった。神経幹細胞／始原細胞マーカーであるネスチンの発現と分布（図３３と３４）、およびDA前駆細胞マーカーであるアルデヒドデヒドロゲナーゼ２（AHD-2）のｍRNAレベル（図３５）（Wallenら、1999）は、変異型のVMで変わらなかった。これらの結果は、LRP-6の欠失がVMにおけるDA前駆細胞の正常なパターン形成、増殖、または細胞生存を変えないことを示唆している。
【０１９６】
LRP-6ホモ接合変異型マウスにおけるDAニューロン形成の遅延
本発明者らは、LRP-6がVMでDA発生の後期局面を調節しているかどうかを調べた。DAニューロンが誕生する時期であるE11.5付近で、TH+細胞数の著しい減少（50％、図３６と３７）が観察されたが、一般的なニューロン集団（βチューブリンIII（TUJ）免疫反応性）（図３６）に明瞭な変化は見られなかった。リアルタイムRT-PCR（図３８）、およびin situハイブリダイゼーション（図３９）で評価すると、TH mRNAもホモ接合変異型マウスでは有意に低かった。E13.5で野生型と変異型のDA細胞数の差は25％に減少していた（図４０と４１）。また、リアルタイムRT-PCRによるｍRNAレベルに差異はまったく検出されなかった（図４２）。E17.5でのTHのレベルは、変異型マウスの二つの主要なDA核領域である黒質と腹側被蓋野で正常であった（図４３）。さらに、DAニューロンは、変異型マウスの線条体に分布していた。興味深いことに、DAニューロン数の明瞭な回復は、in situハイブリダイゼーションで評価すると、ホモ接合変異型マウスの中脳でのLRP-5の発現増加と一致していた（図４４）。
【０１９７】
本発明者らは、次にDAニューロンの正常な発生に必要な転写因子の発現が、LRP-6ホモ接合変異型マウスで変化しているかどうかを調べた。まず、本発明者らは、分化（Josephら、2003）を含むVM DA発生の後期局面で必須であるNurr-1に注目した（Castilloら、1998；Leら、1999；Zetterstromら、1997）。その結果、Nurr-1＋細胞（TH−前駆細胞、およびTH+DAニューロンの双方）の数がE11.5の変異型VMで大きく減少することがわかった（図４５と４６）。この段階におけるNurr-1 mRNAレベルの４０％の減少もリアルタイムPT-PCRによって観察された（図４７）。しかし、E13.5では変異型VMであってもNurr-1＋細胞数は減らなかった（図４８）。さらに、DA分化の初期段階で発現され（Smidtら、1997）、その維持に必要な（Hwangら、2003；Maxwellら、2005；Nunesら、2003； Smidtら、2004；van den Munckhofら、2003）転写因子Pitx-3の発現も、E11.5およびE12.5の双方で、それぞれリアルタイムRT-PCRおよびin situハイブリダイゼーションで評価したとき、大きく減少した（図４９と５０）。しかし、これら二つの転写因子の発現は、E13.5までに正常レベルに近づいていた（図５１）。このように、本発明者らの結果は、LRP-6の欠如がDAニューロン形成の遅延をもたらすことを示している。これは、VMでLRP-6が絶対的に必要ではないものの、DAニューロン形成の適切な開始に必要であることを示唆している。
【０１９８】
Dkkは、発生中の肢のプログラムされた細胞死（Grotewold と Ruther、2002）、ヒト成人間葉系幹細胞（adult human mesenchymal stem cells）の増殖（Gregoryら、2003）、骨肉種細胞の浸潤および移動の阻害（Hoangら、2004）、並びに最終的な骨芽細胞分化および石灰化したマトリクス形成（Liら、2005）を含めて、いくつかの細胞プロセスの調節に関与している。本明細書で、（１）Dkk-1およびDkk-2がDA分化のきわめて重要な調節因子であること、（２）それらの生物学的活性は、前駆タンパク質転換酵素を介したタンパク質分解によって調節されていること、（３）LRP-6受容体はVMでDAニューロン形成の適切な開始に必要であること、が初めて実証された。
【０１９９】
本発明者らは、大腸菌（Escherichia coli）により産生された全長の組換えDkk-1およびDkk-2がラットのE14.5のVM前駆細胞培養物中のTH+ニューロンの数を減じることを発見した。しかし、哺乳動物細胞中で産生された部分精製Dkkの条件培地（Maoら、2001a）は、DA分化を区別して調節した。すなわち、部分精製Dkk-1はDAニューロン形成に効果がなく、部分精製Dkk-2はNurr-1＋前駆細胞のTH+ DAニューロンへの分化を高めた。これらの結果は、Wntの存在下で全長Dkk-2がタンパク質分解されると、Dkk-2の第２CRDがカノニカルWntシグナル伝達およびDAニューロン形成に対するDkk-2の活性化効果に関与し得ることを示唆している。
【０２００】
フューリンおよびその他の前駆タンパク質転換酵素は、神経成長因子、Notch、α-アミロイド前駆体タンパク質、腫瘍壊死因子(TNF)のメンバー、および形質転換増殖因子β(TGF-β)ファミリー等のいくつかのタンパク質のタンパク質分解性の成熟化に関与する（Thomas、2002）。BMP-4前駆体は二つのフューリン部位で連続的切断を受け、これは成熟BMP-4をより安定的（分解の標的とならず）にし、より活性にし、そして長期間のシグナル伝達を可能にする（Cuiら、2001；Degninら、2004）。一般的な前駆タンパク質転換酵素阻害剤であるデカノイルRVKR-CMKを使用した本発明者らの実験は、前駆タンパク質転換酵素ファミリーのメンバーによる全長Dkkの切断がDkkの能力を大きく調節して、カノニカルWntシグナル伝達を制御し、その結果としてDAニューロン形成を含む生物学的プロセスを制御していることを示唆している。興味深いことに、前駆タンパク質転換酵素は、神経形成中にVMで多量に発現している（Zhengら、1994）。また、本発明者らのデータは、DAニューロン原性のニッシェ（niche）が高レベルのDkk-1およびDkk-2を含むことを示している。
【０２０１】
本発明者らは、Dkk-1およびDkk-2がVMの初期段階でDA前駆細胞の分化を阻害するという仮説を立てている。DAニューロン形成の開始時におけるフューリンまたはPC2を介した切断は、VMでDkk-1を不活性にし、またWntの存在下で第２CRDによりDkk-2をカノニカルWnt経路およびDA分化の誘導因子へと転換するのかもしれない（Castelo-Brancoら、2003）。この仮説は、Kremen-2の欠如下で、かつ高レベルのLPR-6の存在下では、Dkk-2はカノニカルWntシグナル伝達を活性化できるというXenopusでの過去の報告（BrottとSokol、2002；MaoとNiehrs、2003）と一致する。さらに、Dkk-2-CRD-2は、LRP-6と共同してXenopusの二次軸誘導、およびWnt／β-カテニン標的遺伝子の発現に作用し（BrottとSokol、2002）、またLRP-6を過剰発現する哺乳動物細胞でTCF/LEFを介した転写を活性化することができる（Liら、2002）。活性化因子としてのDkk-2-CRD-2の効果は、本発明者らが以前に観察したβ-カテニンの安定化がDA分化を誘導するという結果（Castelo-Brancoら、2004）とも一致する。さらに、最近、Wnt-3aとDkk-2-CRD-2を含む共有結合したキメラがカノニカルシグナル伝達を活性化することがわかった（Liら、2005）。本発明者らの結果は、Wnt-3aとDkk-2-CRD-2が実際に共同してカノニカルシグナル伝達を活性化できることも示した。これは、Wntとトランケート型Dkkが一緒に様々なシグナル伝達経路を調節し、それによってDAニューロン形成を制御できることを示唆している。
【０２０２】
DAニューロン形成におけるDkks-CRD-1のプラス効果も驚くべきことであった。なぜなら、Dkkの第１CRDはカノニカルWntシグナル伝達を調節できず（BrottとSokol、2002；Liら、2002）、かつLRP-6と相互作用できない（BrottとSokol、2002；MaoとNiehrs, 2003）からである。本発明者らの結果は、これらのタンパク質がDAニューロン形成を調節し、またそれ故に治療目的で神経幹細胞または始原細胞のDA分化を促進するのに利用できることを示唆している。
【０２０３】
本発明者らはまた、マウス変異体のVMでのDAニューロン形成をLRP-6受容体について解析した。重要なのは、E11.5でのDAニューロンの50％減少やE13.5での25％減少を伴い、DA分化の開始が遅延することが判明したことである。DA分化に関与する二つの重要な転写因子であるNurr-1とPitx-3の発現レベルも一時的に低かった。これらの結果は、VMでのDkk受容体LRP-6の排除（これは過度なDkk-1シグナル伝達、またはDkk-2とカノニカルWntシグナル伝達の減退を模倣する）が、DA分化をかき乱すことを強調している。一方、Wntで調節されることが報告されている細胞死、増殖またはパターン形成（Castelo-Brancoら、2003；CianiとSalinas、2005；McMahonとBradley、1990；Panhuysenら、2004；Pinsonら、2000；ThomasとCapecchi、1990）には、どのような差異も認められなかった。細胞死と増殖では差異がないという同様の結果がLRP-6ハイポモルフマウスの前体節中胚葉で報告されている（Kokubuら、2004）。LRP-6ホモ接合変異型マウスでWntによって調節される機能の明らかな選択性は、他の脳領域でも観察されている。背側視床の発生は、LRP-6ホモ接合変異体（ShhおよびWnt-5a発現の除去を伴う）で深刻な影響を受ける（Zhouら、2004a）。LRP-6ホモ接合変異型マウスは、歯状回で神経前駆細胞の欠損を示したが、発生中の海馬の他の細胞型は影響されなかったことも報告された（Zhouら、2004b）。それ故、LRP-6の欠如がDAニューロン形成に影響することを示した本発明者らの結果は、LRP-6が細胞型特異的な神経発生の一般的な調節因子であることを強調している。
【０２０４】
興味深いことに、LRP6-/-マウスではDAニューロン形成の最初の欠損の後、E17.5までに黒質および腹側被蓋野がほぼ完全に回復することがわかった。これらの結果は、後期段階でDAニューロンの数、およびDAマーカーの発現を回復することができる補償的機構の存在を示唆している。かかる補償機構の可能性の一つとして、LRP-5がそれに関係しているかもしれない。というのは、LRP-5受容体の発現がLRP6-/-マウスでアップレギュレートされているからである。
【０２０５】
まとめると、本発明者らの結果は、LRP5/6がDAニューロン形成の開始を制御することを示している。また、LRP6リガンドの転写後プロセシングが、Wnt/β-カテニンシグナル伝達を差次的に制御していることも判明した。重要なのは、DA前駆細胞のニューロンへの分化を増強する候補としてタンパク質分解プロセシングされたDkk2、Dkk3およびDkk-2-CRD-2が同定されたことである。したがって、これらの因子は、パーキンソン病治療の（幹）細胞置換方法との関連でDAニューロン形成を促進するのに役立つかもしれない。
【０２０６】
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【０２０７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】Dkk-1が腹側中脳において初期段階に高レベルで発現していることを示すリアルタイムPCR解析を示している。
【図２】Dkk-2がE11.5（胎生期11.5日目）付近に発現のピークを有することを示すリアルタイムPCR解析を示している。
【図３】Dkk-3がE11.5後の段階で発現のピークを有することを示すリアルタイムPCR解析を示している。
【図４】E11.5およびE15.5におけるマウス胚の矢状切片がTH (a, e)、Dkk1(b, f)、およびDkk2(c, g) mRNAプローブでハイブリダイズされたものを示している。E11.5では、THは中脳湾曲部のDAニューロンで発現している(a)。Dkk1も同じ領域(b)と間脳で発現している。Dkk2は中脳湾曲部の腹側辺縁帯域で発現している(c)。E15.5では、THはVMで高レベルに発現しているが、Dkk1およびDkk2の発現は大幅に減少している。（図中記号の説明）te：終脳、ov：眼胞、di：間脳、mes：中脳、hb：後脳、cx：皮質、cp：小脳原基、rmd：中脳最高部
【図５】P1 VMグリア（VM G）がP1皮質由来のグリア(Cx G)や線条体由来のグリア(Str G)よりもDkk-2(B)を多く発現することをリアルタイムPCRによる評価で示している。
【図６】P1 VMグリア（VM G）がP1皮質由来のグリア(Cx G)や線条体由来のグリア(Str G)よりもDkk-3(B)を高レベルで発現することをリアルタイムPCRによる評価で示している。Dkk-1はいずれのグリアにも発現していない。
【図７】E14.5のVM前駆細胞を、Dkk-2-APを過剰発現するHEK 293T細胞からの次第に濃度を増加させた部分精製条件培地（partially purified conditioned media : p.p.c.m.）で３日間処理すると、TH+細胞数が有意に増加することを免疫細胞化学による評価で示している。一方、Dkk-1はどのような有意な効果も及ぼさなかった。統計解析は、一元配置分散分析とフィッシャーの事後多重比較検定を用いて行った。
【図８】VM前駆細胞を様々なDkk-APで処理してもNurr1免疫反応性細胞数が影響を受けないことを示している。統計解析は、一元配置分散分析とフィッシャーの事後多重比較検定を用いて行った。
【図９】E14.5のVM前駆細胞を、次第に濃度を増加させたDkk-2-APで3日間処理すると、TH陽性表現型を獲得したNurr1前駆細胞のパーセンテージが有意に増加することを示している。一方、Dkk-3-APでは2.5μl/mlでのみ有意な効果が見られた。Dkk-1-APでは効果は無かった。統計解析は、一元配置分散分析とフィッシャーの事後多重比較検定を用いて行った。
【図１０】E14.5のVM前駆細胞を、次第に濃度を増加させたDkk-2-APで3日間処理すると、TH陽性表現型を獲得したNurr1前駆細胞のパーセンテージが有意に増加することを二重免疫細胞化学による評価で示している。
【図１１】E14.5のVM前駆細胞を5〜10ng/mlの組換えDkk-1で3日間処理すると、全細胞集団中のTH免疫反応性細胞のパーセンテージがコントロール(未処理)と比較して減少することを示している（Hoechst33258染色により評価）。統計解析は、一元配置分散分析、およびダンネットの多重比較検定(Dunnett’s multiple comparison test)を用いて行った。
【図１２】E14.5のVM前駆細胞を5〜10ng/mlの組換えDkk-1で処理すると、全細胞集団中のTH免疫反応性細胞のパーセンテージがコントロール(0ng/ml)と比較して減少することを示している（Hoechst33258染色により評価）。
【図１３】E14.5のVM前駆細胞を50〜100ng/mlの組換えDkk-2で3日間処理すると、全細胞集団中のTH免疫反応性細胞のパーセンテージがコントロール(未処理)と比較して減少することを示している（Hoechst33258染色により評価）。統計解析は、一元配置分散分析、およびダンネットの多重比較検定を用いて行った。
【図１４】E14.5のVM前駆細胞を50〜100ng/mlの組換えDkk-2で3日間処理すると、全細胞集団中のTH免疫反応性細胞のパーセンテージがコントロール(未処理)と比較して減少することを示している（Hoechst33258染色により評価）。
【図１５】ヒトおよびマウスDkk-1の配列、並びにPC2切断断片を示している。マウスおよびヒトDkk-1は、潜在的な最小限のフューリン(furin)切断部位(Arg-X-X-Arg)、酸性pHフューリン切断部位(Arg/Lys-X-X-X-Arg/Lys-Arg)、またはプロテアーゼ転換酵素2(PC2)切断部位(Arg/Lys-Arg)を第１システインリッチドメイン(CRD-1)の中央部に含む（Rockwellら、2002；Thomas、2002）。さらに、Dkk1は、潜在的なPC2切断部位をCRD-1と第２リッチドメイン(CRD-2)の間のスペーサー領域、およびCRD-2内にも有する。これらの推定切断部位によれば、タンパク質分解時にDkk-1は、第一（CRD-1）および第二（CRD-２）の両システインリッチドメインを不活性にする４つの断片（最下パネル）に切断され得る。
【図１６】ヒトおよびマウスDkk-2の配列、並びにPC2切断断片を示している。マウスおよびヒトDkk-2は、潜在的な最小限のフューリン切断部位(Arg-X-X-Arg)、酸性pHフューリン切断部位(Arg/Lys-X-X-X-Arg/Lys-Arg)、またはプロテアーゼ転換酵素2(PC2)切断部位(Arg/Lys-Arg)を第１システインリッチドメイン(CRD-1)の中央部に含む（Rockwellら、2002；Thomas、2002）。これらの推定切断部位によれば、Dkk-2は２つの断片に切断され得る。そのうちの一つは、機能的なCRD-2を含む（最下パネル）。
【図１７】Dkkのタンパク質分解が、DAニューロン形成においてDkkの効果を制御することを示している。Aは、Dkk-1-APおよびDkk-2-APを過剰発現するHEK293T細胞由来のp.p.c.m.が、ヒトAP抗体で認識される高分子量（全長約105〜110kDa）と低分子量（矢印および矢頭、約80〜85kDa）の２本のバンドを含むことをウェスタンブロッティングによる評価で示している。APタグは約67kDaの分子量を有する。等量のタンパク質を流した。Bは、FLAGタグ融合Dkkを過剰発現するHEK293T細胞を前駆タンパク質転換酵素の一般的な阻害剤であるデカノイル(decanoyl)-RVKR-CMKで１日処理すると、分泌された全長の、すなわちタンパク質分解されていないDkk-1およびDkk-2のフラクションが増加することを、抗FLAG抗体を用いた条件培地（c.m.)のウェスタンブロッティングによる評価で示している。Cは、FLAGタグ融合Dkkを過剰発現するSN4741細胞由来のp.p.c.m.を、抗FLAG抗体を用いたウェスタンブロッティングによる評価で示している。全長Dkk-1-FLAG由来の細胞溶解物は、全長タンパク質（約40kDa）とタンパク質分解断片（約25kDa、矢頭）に一致する二つのバンドを示した。全長Dkk-2-FLAGは、25kDaよりも小さい２本のバンドのみが検出された（矢印）ことから、明らかに完全にタンパク質分解されている。
【図１８】Dkkのタンパク質分解がDAニューロン形成においてDkkの効果を制御することを示している。Dkk-1-CRD-1 (Dkk-1-C1)またはDkk-2-CRD-1 (Dkk-2-C1)を含んだ2.5μl/mlのp.p.c.m.でE14.5のVM前駆細胞を処理すると、全細胞集団中のTH免疫反応性細胞のパーセンテージがコントロールのp.p.c.m.と比較して増加した（Hoechst33258染色により評価）。スケールバーは50μm。統計解析は、一元配置分散分析とダンネットの多重比較検定を用いて行った。
【図１９】Dkk-1-CRD-1 (Dkk-1-C1)、Dkk-2-CRD-1 (Dkk-2-C1)、またはDkk-2-CRD-2 (Dkk-2-C2)を含んだ2.5μl/mlのp.p.c.m.でE14.5のVM前駆細胞を処理すると、全細胞集団中のTH免疫反応性細胞のパーセンテージがコントロールのp.p.c.m.と比較して増加することを示している（Hoechst33258染色により評価）。統計解析は、一元配置分散分析とダンネットの多重比較検定を用いて行った。
【図２０】Dkkのタンパク質分解がDAニューロン形成においてDkkの効果を制御することを示している。Dkk-2-CRD-2(Dkk-2-C2)を含んだ2.5μl/mlのp.p.c.m.でE14.5のVM前駆細胞を処理すると、全細胞集団中のTH免疫反応性細胞のパーセンテージがコントロールのp.p.c.m.と比較して増加した（Hoechst33258染色により評価）。統計解析は、一元配置分散分析とダンネットの多重比較検定を用いて行った。
【図２１】組換えDkk-1(A)または組換えDkk-2(B)が、SN4741細胞で基底の、またはWnt-3aを介したカノニカルWntシグナル伝達を阻害することを活性型β-カテニンに対する抗体を用いたウェスタンブロットによる評価で示している。(C)活性型β-カテニンに対する抗体を用いたウェスタンブロットによる評価から、Dkk-2またはDkk-2-CRD-2（10μl/ml）を含むp.p.c.mは、SN4741細胞でWnt-3aと共処理すると、基底のカノニカルWntシグナル伝達に相乗効果を奏する。
【図２２】LRP-5が腹側中脳で中程度のレベルで発現していることを示すリアルタイムRT-PCR解析を示している。
【図２３】LRP-6がE11.5付近に発現のピークを有することを示すリアルタイムRT-PCR解析を示している。
【図２４】Kremen-1がE11.5付近に発現のピークを有することを示すリアルタイムRT-PCR解析を示している。Kremen-2は発現していない。
【図２５】E11.5におけるマウス胚の矢状切片をin situハイブリダイゼーション用のLRP-5およびLRP-6 mRNAプローブでハイブリダイズした図を示している。両遺伝子とも、TH＋DAニューロンを有するVM領域を含めて、あらゆる脳構造でユビキタスに発現している。（図中記号の説明）te：終脳、ov：眼胞、di：間脳、mes：中脳、hb：後脳
【図２６】組換えKremen-1が、コントロール（未処理）と比較して、E14.5におけるVM前駆細胞由来のTH陽性細胞のパーセンテージに影響を及ぼさないことを示している。統計解析は、一元配置分散分析とダンネットの多重比較検定を用いて行った。濃度単位はng/ml。
【図２７】組換えKremen-2が、コントロール（未処理）と比較して、E14.5におけるVM前駆細胞由来のTH陽性細胞のパーセンテージに影響を及ぼさないことを示している。統計解析は、一元配置分散分析とダンネットの多重比較検定を用いて行った。濃度単位はng/ml。
【図２８】AからCは、LRP-6N-Fcが、E14.5のVM前駆細胞のDA分化を有意に増加させることを示している。Aは、次第に濃度を増加させたLRP-6N-FcでE14.5のVM前駆細胞を３日間処理すると、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)陽性細胞数が有意に増加することを、免疫細胞化学による評価で示している。Bは、Nurr1陽性細胞数がLRP-6N-Fcを用いたVM前駆細胞の処理による影響を受けないことを示している。Cは、LRP-6N-Fcを用いたVM前駆細胞の処理が、TH陽性表現型を獲得したNurr1前駆細胞のパーセンテージを有意に増加させることを示している。統計解析は、一元配置分散分析とダンネットの多重比較検定を用いて行った。
【図２９】En-1、Fgf-8およびShh等の中脳パターン形成遺伝子の発現が、コントロールと比較してE12.5におけるLRP-6ホモ接合変異型マウスのVMでは変化していないことを示している。
【図３０】E11.5のVM前駆細胞の増殖能がLRP-6ホモ接合変異型マウスでは影響されないことを、E10.5のBrdUに対する免疫組織化学による評価で示している。
【図３１】E11.5のVM前駆細胞の増殖能がLRP-6ホモ接合変異型マウスでは影響されないことを、抗ホスホヒストン３抗体を用いた細胞カウントによる評価で示している(n=3)。統計解析は、対応のあるｔ検定を用いて行った。
【図３２】E11.5のVM前駆細胞の増殖能がLRP-6ホモ接合変異型マウスでは影響されないことを、抗ホスホヒストン３抗体を用いた免疫組織化学による評価で示している。
【図３３】E11.5のVM前駆細胞におけるネスチンの発現がLRP-6ホモ接合変異型マウスでは影響されないことを、前駆細胞マーカーであるネスチンに対するプライマーを用いて、LRP-6ホモ接合変異VMのリアルタイムRT-PCR解析による評価で示している(n=4)。統計解析は、対応のあるｔ検定を用いて行った。
【図３４】E11.5のVM前駆細胞におけるネスチンの発現がLRP-6ホモ接合変異型マウスでは影響されないことを、前駆細胞マーカーであるネスチンに対する抗体を用いて、免疫組織化学による評価で示している。
【図３５】E11.5のVM前駆細胞におけるAHD-2の発現がLRP-6ホモ接合変異型マウスでは影響されないことを、DA前駆細胞マーカーであるAHD-2に対するプライマーを用いて、LRP-6ホモ接合変異VMのリアルタイムRT-PCR解析による評価で示している。統計解析は、対応のあるｔ検定を用いて行った。
【図３６】E11.5のVMを通る冠状切片を示している。この図から、（TH免疫染色による評価で）コントロールと比較してLRP-6ホモ接合変異型マウスではDAニューロン数が減少することが明らかとなった。この減少は、主に正中部のDAニューロンで起こっていた。一般的なニューロン分化（βチューブリンIII（TUJ）による評価で）は、影響されなかったが、正中面の辺縁帯では神経線維のみが見られ、神経細胞体は見られなかった。
【図３７】LRP-6変異型マウスのE11.5のVMにおける（全レベルでの）TH+細胞総数のカウントを（TH免疫染色による評価で）示している。これによると、コントロールと比較したときにLRP-6変異型マウスでは50％の減少が見られる(n=3)。ニューロン分化（βチューブリンIII（TUJ）による評価で）は、影響されなかったらしい。統計解析は、対応のあるｔ検定を用いて行った。
【図３８】LRP-6変異型マウスのE11.5のVMにおける（全レベルでの）TH+細胞総数のカウントをリアルタイムRT-PCRによる評価で示している。本図は、LRP-6ホモ接合変異型マウスのVMにおけるTHのmRNAレベルの同様の減少を示している(n=6)。統計解析は、対応のあるｔ検定を用いて行った。
【図３９】THプローブを用いたin situハイブリダイゼーションを示している。この図では、E11.5でのLRP-6ホモ接合変異型マウスのVMにおけるTH mRNAのレベルの減少が示されている。
【図４０】E13.5のVMを通る冠状切片を示している。この図から、LRP-6ホモ接合変異型マウスのDAニューロン数がE11.5期と比較して部分的に回復することが明らかとなった。
【図４１】LRP-6変異型マウスのE13.5のVMにおける（全レベルでの）TH+細胞総数のカウントを（TH免疫染色による評価で）示している。これによると、コントロールと比較したときにLRP-6変異型マウスでは25％の減少が見られた(n=4)。統計解析は、対応のあるｔ検定を用いて行った。
【図４２】VMでのTH mRNAレベルがLRP-6ホモ接合変異型マウスのE13.5で有意に減少しなかったことを示している(n=3)。統計解析は、対応のあるｔ検定を用いて行った。
【図４３】E17.5のDAニューロン数が、LRP-6ホモ接合変異型VMの黒質(substantia nigra: SN)および腹側被蓋野(ventral tegmental area: VTA)核で完全に回復したことを示す免疫染色の結果を表している。
【図４４】in situハイブリダイゼーションにより評価された矢状切片を示している。この図は、E15.5のLRP-6ホモ接合変異型VMでLRP-5 mRNAは増加したが、LRP-6 mRNAは検出できなかったことを示している。
【図４５】E11.5のVMを通る冠状切片を示している。この図から、コントロールと比較してNurr1+前駆細胞数がLRP-6ホモ接合変異型マウスで減少することが明らかとなった。
【図４６】E11.5のVMの（全水平面での）Nurr1+細胞総数が、コントロールと比較してLRP-6ホモ接合変異型マウスで減少したことを示している(n=3)。統計解析は、対応のあるｔ検定を用いて行った。
【図４７】LRP-６ホモ接合変異型マウス由来のVMのリアルタイムPCR解析によりNurr1 mRNAレベルの同様の減少が明らかになったことを示している(n=6)。統計解析は、対応のあるｔ検定を用いて行った。
【図４８】LRP-６ホモ接合変異型マウスのE13.5でのNurr1+前駆細胞数が、コントロールと比較して減少しないことを明らかにした、E13.5のVMを通る矢状切片でのNurr1に対する免疫染色とリアルタイムRT-PCRを示している(n=4)。
【図４９】E11.5のLRP-6ホモ接合変異型マウス由来のVMのリアルタイムRT-PCR解析により、Pitx-3 mRNAレベルの減少が明らかになったことを示している(n=5)。統計解析は、対応のあるｔ検定を用いて行った。
【図５０】E12.5のVMでDA分化のマーカーであるPitx-3の発現が減少したことを示すin situハイブリダイゼーションを示している。
【図５１】E13.5のLRP-6ホモ接合変異型マウスのVMで、コントロールと比較してこの段階ではNurr1+前駆細胞数の減少がないことを示している(n=4)。統計解析は、対応のあるｔ検定を用いて行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月9日(2007.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経幹細胞、胚性幹細胞、始原細胞、または前駆細胞における増殖、自己複製、ドーパミン作動性の誘導、生存、分化および/または成熟を高めることによってドーパミン作動性ニューロンの発生を誘導または促進する方法であって、
該細胞におけるDkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルおよび/または活性をモジュレートし、
それによって、増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の誘導、分化、生存もしくはニューロンのドーパミン作動性表現型の獲得を誘導または増強する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
前記細胞をDkk受容体/リガンドポリペプチドで処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Dkk受容体/リガンドポリペプチドがDkk1、Dkk2、Dkk-3またはDkk4ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Dkk受容体/リガンドポリペプチドがヒトDkk1、Dkk2、Dkk3またはDkk4由来のシステインリッチドメイン１および/またはシステインリッチドメイン２を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
DkkポリペプチドがヒトDkk-1、Dkk-2、Dkk-3またはDkk-4に対して少なくとも50％の配列同一性を有するDkkポリペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドがLRPポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
LRPポリペプチドがヒトLRP-5またはヒトLRP-6の細胞外ドメインに対して少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むLRPポリペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
LRPポリペプチドがヒトLRP-5またはヒトLRP-6に対して少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞を、Dkkリガンド/受容体ポリペプチドの阻害剤、遮断剤、アンタゴニストまたはサプレッサーである化合物で処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物がDkk1またはDkk4の阻害剤、遮断剤、アンタゴニストまたはサプレッサーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルが、前記細胞における前駆タンパク質転換酵素の活性を調節することによりモジュレートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前駆タンパク質転換酵素が配列Arg-X-X-Arg、Arg/Lys-X-X-X-Arg/Lys-Arg、またはArg/Lys-Argを特異的に切断する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前駆タンパク質転換酵素がフューリンまたはプロテアーゼ転換酵素２（PC2）である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞を、抗酸化剤、アスコルビン酸、低酸素分圧、低酸素症誘導因子、レチノイド、神経栄養因子、GDNF、FGF、Wnt、engrailed、Pax2、Mash1、ニューロゲニン、Pitx3またはBclxLの存在下で成長させる、請求項１〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞が、腹側中脳アストロサイトまたは初期グリア細胞の存在下で成長および/または分化する、請求項１〜14のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞を、初期グリア細胞、橈側グリア、または腹側中脳の１型アストロサイトとさらに共培養することを含む、請求項１〜15のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
グリア細胞が不死化されているか、または腹側中脳以外の領域のグリア細胞である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞を、非ドーパミン作動性ニューロンに対して選択する陰性選択剤とさらに接触させることを含む、請求項１〜17のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞におけるDkkリガンド/受容体ポリペプチドのレベルおよび/または活性をモジュレートする前に、前記神経幹細胞、胚性幹細胞、始原細胞または前駆細胞を酸化的ストレスにさらすことを含む、請求項１〜18のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
処理したニューロンを、１種以上のさらなる成分を含有する組成物に製剤化することをさらに含む、請求項１〜19のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が製薬上許容される添加剤を含有する、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
個体を治療する医薬の製造において、前記方法により得られたニューロンを使用することをさらに含む、請求項１〜19のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記医薬が個体の脳に移植するためのものである、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記個体がパーキンソン病、パーキンソン症候群、ニューロンの減少、または神経変性疾患を有する、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜19のいずれか１項に記載の方法により得られたドーパミン作動性ニューロン。
【請求項２６】
神経変性疾患治療用の医薬の製造における請求項25に記載のドーパミン作動性ニューロンの使用。
【請求項２７】
神経変性疾患治療用の薬剤のスクリーニング方法であって、
(i)  請求項１〜19のいずれか１項に記載の方法により得られたドーパミン作動性ニューロンを1種以上の試験薬剤と接触させ、
(ii)  該薬剤の存在下での該ドーパミン作動性ニューロンの成長または生存能または神経伝達物質の放出を確認する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２８】
前記ドーパミン作動性ニューロンが酸化的ストレスにさらされた幹細胞、始原細胞または前駆細胞から生じる、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記ドーパミン作動性ニューロンが該ニューロンの毒素で処理される、請求項27または28に記載の方法。
【請求項３０】
幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、または前駆細胞における増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、分化もしくは成熟を単独でまたは組合せで高める１種以上の因子を得る方法であって、
(a)  胚性幹細胞、神経幹始原または前駆細胞を、１種以上の試験物質の存在下または非存在下で、DkkリガンドまたはDkk受容体により処理し、
(b)  該細胞の増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、分化もしくは成熟を測定して、該試験物質の存在下および非存在下での該増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、分化もしくは成熟の程度を比較し、それにより該因子を得る、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項３１】
前記神経幹始原または前駆細胞をDkkリガンド/受容体ポリペプチドで処理する、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがDkk1、Dkk-2、Dkk3またはDkk4ポリペプチドである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがヒトDkk1、Dkk2、Dkk3またはDkk4由来のシステインリッチドメイン１および/またはシステインリッチドメイン２を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがヒトDkk-1、Dkk-2、Dkk-3、またはDkk-4に対して少なくとも50％の配列同一性を有するDkkポリペプチドである、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドがLRPポリペプチドである、請求項31に記載の方法。
【請求項３６】
LRPポリペプチドがヒトLRP-5またはLRP-6の細胞外ドメインに対して少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むLRPポリペプチドである、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
LRPポリペプチドがヒトLRP-5またはLRP-6に対して少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドを、前記細胞を含むin vitro培養物に添加することにより、前記細胞をDkkリガンド/受容体ポリペプチドで処理する、請求項30〜37のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドをコードする核酸を前記細胞に導入することにより、前記細胞をDkkリガンド/受容体ポリペプチドで処理する、請求項30〜37のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
Dkkリガンド/受容体ポリペプチドを前記細胞に導入することにより、前記細胞をDkkリガンド/受容体ポリペプチドで処理する、請求項30〜37のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
腹側中脳もしくは他の領域由来のグリア細胞、またはDkkリガンド/受容体ポリペプチドをコードする核酸で形質転換された宿主細胞、またはDkkリガンド/受容体ポリペプチドが導入されている細胞と共培養することにより、前記幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、前駆細胞、または他の幹細胞もしくは神経細胞をDkkリガンド/受容体ポリペプチドで処理する、請求項30〜37のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
神経幹細胞、胚性幹細胞、始原細胞、または前駆細胞における増殖、自己複製、ドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、生存、分化および/または成熟を高めることによってドーパミン作動性ニューロンの発生を誘導または促進するのに有用な化合物をスクリーニングする方法であって、
試験化合物の存在下でDkkポリペプチドをタンパク質加水分解により切断する前駆タンパク質転換酵素の能力を確認することを含んでなり、
その際、該試験化合物の非存在下と比べて存在下で該能力が増減すれば、該試験化合物がドーパミン作動性ニューロンの発生を誘導または促進するのに有用であることを示す、上記方法。
【請求項４３】
Dkkポリペプチドをタンパク質加水分解により切断する前駆タンパク質転換酵素の能力が、前駆タンパク質転換酵素の存在下でDkk活性を測定することにより確認される、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
Dkk活性がβ-カテニンの活性化またはドーパミン作動性発生を測定することにより確認される、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、始原細胞、または前駆細胞における増殖、自己複製、生存、および/またはドーパミン作動性の神経伝達、発生、誘導、分化もしくは成熟を高めることができる化合物または因子が単離されたおよび/または精製された形態で提供される、請求項30〜44のいずれか1項に記載の方法。
【国際調査報告】
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