(57)【要約】  本発明は、光学的ＬＩＤバイオセンサを用いて生体細胞内の作動薬誘発性のＧＰＣＲシグナル伝達現象をリアルタイムに測定するシステムおよび方法を含む。特に、本発明は、光学的ＬＩＤバイオセンサを用いて、作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化に起因する質量再分布に基づいて生体細胞内の標的ＧＰＣＲに対する化合物のスクリーニングを実行するためのシステムおよび方法を含む。実施例を拡大解釈すれば、本発明は、光学的ＬＩＤバイオセンサを自己参照して、周辺温度や圧力変動その他の環境変化に対する不要な感受性を低減させる色々な方法を含む。実施例をさらに拡大解釈すれば、本発明は、単一の媒体溶液において単一タイプの細胞内の複数のＧＰＣＲあるいは複数種の細胞内のＧＰＣＲのスクリーニングの色々な方法を含む。実施例をさらに拡大解釈すれば、本発明は、生体細胞内の特定のＧＰＣＲに対する化合物の生理学的または薬理学的な効果を確証するための色々な方法を含む。
2008536117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識無依存検出型の光学的ＬＩＤバイオセンサを使用して、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に付着した生体細胞内の質量再分布を測定することを特徴とする生体細胞に基づく分析方法。
【請求項２】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの使用により、前記生体細胞におけるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の作動薬誘発性の活性化に起因する質量再分布を測定可能にするに当たり、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に生体細胞を配置して前記生体細胞を前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより前記生体細胞内の作動薬誘発性のＧＰＣＲ転位を測定可能にする、
分析方法。
【請求項３】
請求項２記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた細胞媒体の中に前記化合物含有溶液を添加する前に、少なくとも１回、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた細胞媒体の中に緩衝溶液を添加する分析方法。
【請求項４】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの使用により、生体細胞内の質量再分布に基づいて標的Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する作動薬のスクリーニングを実行可能にするに当たり、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記生体細胞を付着させ、
所定の親和性を持つ拮抗薬を一定濃度で含む溶液を前記細胞媒体の中に添加して前記光学的ＬＩＤバイオセンサを安定化させ、
前記拮抗薬から離れて競合するために十分に高い濃度を有する化合物を含む溶液を、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた細胞媒体の中に添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより前記生体細胞内の質量再分布に基づいて標的Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する作動薬のスクリーニングを実行可能にする、
分析方法。
【請求項５】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用いて、生体細胞内の質量再分布に基づいて標的Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する拮抗薬のスクリーニングを行うに当たり、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記生体細胞を付着させ、
所定の親和性を持つ作動薬を一定濃度で含む溶液を、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に添加し、
前記作動薬に起因する転位が発生する前に、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより生体細胞内の質量再分布に基づいて標的ＧＰＣＲに対する拮抗薬のスクリーニングを実行可能にする、
という手順を実行する分析方法。
【請求項６】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用いた処理を実行する前に、
スタンプを用いて前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の一部部位を遮蔽して前記生体細胞の付着を防止し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の遮蔽されていない部位を覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の当該遮蔽されていない部位に前記生体細胞を接着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面から前記スタンプを除去する、
という手順を実行して当該光学的ＬＩＤバイオセンサを自己参照型の光学的ＬＩＤバイオセンサに形成する分析方法。
【請求項７】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用いた処理を実行する前に、
スタンプを用いて前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の一部部位を遮蔽して前記生体細胞の付着を防止し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の遮蔽されていない部位を覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の当該遮蔽されていない部位に前記生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面から前記スタンプを除去し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の当該遮蔽部位を覆うように前記細胞媒体と同じ細胞媒体の中に第２のタイプの細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの当該遮蔽部位に前記第２のタイプの細胞を付着させる、
という手順を実行して当該光学的ＬＩＤバイオセンサを自己参照型光学的ＬＩＤバイオセンサに形成する分析方法。
【請求項８】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの使用により、複数のタイプからなる前記生体細胞におけるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の作動薬誘発性の光学的応答に起因する質量再分布を測定可能にするに当たり、
複数の前記光学的ＬＩＤバイオセンサからなる配列を含むチャンバーを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサのうちの少なくとも１つを覆うように細胞媒体の中に第１のタイプの生体細胞を配置して当該少なくとも１つの光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記第１のタイプの生体細胞を付着させ、
被覆されていない残る光学的ＬＩＤバイオセンサのうちの少なくとも１つを覆うように細胞媒体の中に第２のタイプの生体細胞を配置して当該少なくとも１つの被覆されていない残る光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記第２のタイプの生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの各々の上の生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより複数のタイプの生体細胞内の作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化を測定可能にする、
分析方法。
【請求項９】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの使用により、複数のタイプからなる前記生体細胞におけるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の作動薬誘発性の活性化に起因する質量再分布を測定可能にするに当たり、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
スタンプを用いて前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の一部部位を遮蔽して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの当該一部部位への前記生体細胞の付着を防止し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の遮蔽されていない部位を覆うように細胞媒体の中に第１のタイプの生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の当該遮蔽されていない部位に前記第１のタイプの生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面から前記スタンプを除去し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に第２のタイプの生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサ上表面の被覆されていない部位に前記第２のタイプの生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記光学的ＬＩＤバイオセンサ上の前記２タイプの生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより複数のタイプからなる前記生体細胞内の作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化を測定可能にする、
分析方法。
【請求項１０】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの使用により、単一タイプの生体細胞内の複数のＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する作動薬のスクリーニングを実行可能にするに当たり、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記生体細胞を付着させ、
複数の拮抗薬からなる混合液を含む溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより前記生体細胞内の複数のＧＰＣＲに対する作動薬のスクリーニングを実行可能にする、
分析方法。
【請求項１１】
計測システムと、
標識無依存検出型の光学的ＬＩＤバイオセンサと、
からなり、
前記計測システムは、前記光学的ＬＩＤバイオセンサに光ビームを照射し、前記光学的ＬＩＤバイオセンサからの戻り光ビームを受光することにより前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた生体細胞内の質量再分布を測定することを特徴とするシステム。
【請求項１２】
請求項１１記載のシステムであって、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより前記生体細胞内の作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化に起因する質量再分布を測定可能にする、
という手順が実行された後に、前記計測システムは、前記生体細胞内のＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の作動薬誘発性の活性化を測定するシステム。
【請求項１３】
請求項１２記載のシステムであって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加する手順が実行される前に、少なくとも１回、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの溶液表面に置かれた細胞媒体の中に緩衝溶液を添加する手順が実行されるシステム。
【請求項１４】
請求項１１記載のシステムであって、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記生体細胞を付着させ、
所定の親和性を持つ拮抗薬を一定濃度で含む溶液を前記細胞媒体の中に添加して前記光学的ＬＩＤバイオセンサを安定化させ、
前記拮抗薬から離れて競合するために十分に高い濃度を有する化合物を含む溶液を、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた細胞媒体の中に添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより前記生体細胞内の質量再分布に基づいて標的ＧＰＣＲに対する作動薬のスクリーニングを実行可能にする、
という手順が実行された後に、前記計測システムは、前記質量再分布に基づいて前記生体細胞内の標的Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する作動薬のスクリーニングを実行するシステム。
【請求項１５】
請求項１１記載のシステムであって、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記生体細胞を付着させ、
所定の親和性を持つ作動薬を一定濃度で含む溶液を、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に添加し、
前記作動薬に起因する転位が発生する前に、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより生体細胞内の質量再分布に基づいて標的ＧＰＣＲに対する拮抗薬のスクリーニングを実行可能にする、
という手順が実行された後に、前記計測システムは、前記質量再分布に基づいて標的Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する拮抗薬のスクリーニングを実行するシステム。
【請求項１６】
請求項１１記載のシステムであって、
スタンプを用いて前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の一部部位を遮蔽して前記生体細胞の付着を防止し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の遮蔽されていない部位を覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の当該遮蔽されていない部位に前記生体細胞を接着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面から前記スタンプを除去する、
という手順を実行することによって当該光学的ＬＩＤバイオセンサが自己参照型の光学的ＬＩＤバイオセンサに形成されたシステム。
【請求項１７】
請求項１１記載のシステムであって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用いた処理を実行する前に、
スタンプを用いて前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の一部部位を遮蔽して前記生体細胞の付着を防止し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の遮蔽されていない部位を覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の当該遮蔽されていない部位に前記生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面から前記スタンプを除去し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の当該遮蔽部位を覆うように前記細胞媒体と同じ細胞媒体の中に第２のタイプの細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの当該遮蔽部位に前記第２のタイプの細胞を付着させる、
という手順を実行することによって当該光学的ＬＩＤバイオセンサが自己参照型の光学的ＬＩＤバイオセンサに形成されたシステム。
【請求項１８】
請求項１１記載のシステムであって、
複数の前記光学的ＬＩＤバイオセンサからなる配列を含むチャンバーを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサのうちの少なくとも１つを覆うように細胞媒体の中に第１のタイプの生体細胞を配置して当該少なくとも１つの光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記第１のタイプの生体細胞を付着させ、
被覆されていない残る光学的ＬＩＤバイオセンサのうちの少なくとも１つを覆うように細胞媒体の中に第２のタイプの生体細胞を配置して当該少なくとも１つの被覆されていない残る光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記第２のタイプの生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの各々の上の生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより複数のタイプの生体細胞内の作動薬誘発性のＧＰＣＲ転位を測定可能にする、
という手順が実行された後に、前記計測システムは、複数のタイプからなる前記生体細胞におけるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の作動薬誘発性の光学的応答に起因する質量再分布を測定する、システム。
【請求項１９】
請求項１１記載のシステムであって、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
スタンプを用いて前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の一部部位を遮蔽して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの当該一部部位への前記生体細胞の付着を防止し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の遮蔽されていない部位を覆うように細胞媒体の中に第１のタイプの生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の当該遮蔽されていない部位に前記第１のタイプの生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面から前記スタンプを除去し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に第２のタイプの生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサ上表面の被覆されていない部位に前記第２のタイプの生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記光学的ＬＩＤバイオセンサ上の前記２タイプの生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより複数のタイプからなる前記生体細胞内の作動薬誘発性のＧＰＣＲ転位を測定可能にする、
という手順が実行された後に、前記計測システムは、複数のタイプからなる前記生体細胞におけるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の作動薬誘発性の活性化に起因する質量再分布を測定する、システム。
【請求項２０】
請求項１１記載のシステムであって、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記生体細胞を付着させ、
複数の拮抗薬からなる混合液を含む溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより前記生体細胞内の複数のＧＰＣＲに対する作動薬のスクリーニングを実行可能にする、
という手順が実行された後に、前記計測システムは、単一タイプの生体細胞内の複数のＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する作動薬のスクリーニングを実行する、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的な光学的非接触センサの技術分野に関するものであり、具体的には、付着細胞の形態変化だけでなく、生体細胞における作動薬誘発性のＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の脱感作や転位といった生体細胞での化合物誘発性の質量再分布の過程をリアルタイムに測定するための光学的標識無依存検出（ＬＩＤ）バイオセンサ（たとえば、導波路グレーティング型バイオセンサ）を用いたシステムおよび方法に関する。特に、本発明は、ＬＩＤバイオセンサを用いて生体細胞内のＧＰＣＲに対する化合物のスクリーニングを実行するためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサや導波路グレーティング型センサにより、光学的標識無依存検出（ＬＩＤ）技術をバイオセンサ表面での生体分子の結合現象の検出に使用することが可能である。特に、光学型バイオセンサは、当該バイオセンサの屈折率または光学的応答量の変化を測定するために光学的ＬＩＤ技術を使用することを可能にし、バイオセンサ表面での生体分子の結合現象を順次検出することを可能にするものである。事実、これら光学型バイオセンサは、様々な光学的ＬＩＤ技術とともに、たとえば、オリゴヌクレオチド間相互作用、抗体−抗原間相互作用、ホルモン−受容体間相互作用および酵素−担体間相互作用を含む多種多様な生体分子の結合現象を研究するために使用されてきた。
【０００３】
一般に、光学型バイオセンサは、分子認識現象を定量化シグナルに変換する光学変換器と、高度認識要素という２つの構成要素を有する。光学的ＬＩＤ技術を用いて行われた従来の研究は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサ、グレーティングカプラ（grating coupler）、偏光解析機器、エバネッセント波機器および反射率測定機器を用いるという直接的な光学的方法に関するものであった。これら直接的な光学的方法各々に関する詳細な説明については、下記の非特許文献１〜５を参照することができる。
【０００４】
これら非特許文献１〜５の内容は、本願明細書に援用されるものとする。
【０００５】
今日まで、細胞分析（細胞に基づく分析：cell-based assay）を実行するための光学的ＬＩＤ技術の使用を説明する報告書が比較的小数ながら存在する。たとえば、非特許文献６に説明されているように、ＳＰＲバイオセンサは、動物細胞の付着と拡散を研究するために使用されている。
【０００６】
また、非特許文献７に説明されているように、ＳＰＲバイオセンサは、リガンド誘導性細胞の表面と生体細胞の細胞内反応とを研究するために使用されている。
【非特許文献１】Ｊｏｒｄａｎ ＆ Ｃｏｒｎ共著、「化学的に改質された金表面への静電気的生体高分子吸着の表面プラズモン共鳴画像測定法（Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces）」、アナリティカル・ケミストリ（Analytical Chemistry）、１９９７年、第６９巻、１４４９〜１４５６ページ。
【非特許文献２】Ｍｏｒｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．共著、「光回折による細胞検出に対する微細パターンへの抗体の固定化（Immobilization of antibodies in micropatterns for cell detection by optical diffraction）」、センサ・アンド・アクチュエータ  Ｂ（Sensors and Actuators B）、２０００年、第７０巻、２３２〜２４２ページ。
【非特許文献３】Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．共著、「生体分子間相互作用に対する画像偏光解析に基づくバイオセンサの一概念（A biosensor concept based on imaging ellipsometry for visualization of biomolecular interactions）」、アナリティカル・バイオケミストリ（Analytical Biochemistry）、１９９５年、第２３２巻、６９〜７２ページ。
【非特許文献４】Ｃｌｅｒｃ、Ｌｕｋｏｓｚ共著、「集積光出力グレーティングカプラを用いた免疫感知（Direct immunosensing with an integrated-optical output grating coupler）」、センサ・アンド・アクチュエータ  Ｂ（Sensors and Actuators B）、１９９７年、第４０巻、５３〜５８ページ。
【非特許文献５】Ｂｒｅｃｈｔ ＆ Ｇａｕｇｌｉｔｚ共著、「光学プローブおよびトランスデューサ（Optical probes and transducers）」、バイオセンサ・アンド・バイオエレクトロニクス（Biosensors and Bioelectronics）、１９９５年、第１０巻、９２３〜９３６ページ。
【非特許文献６】Ｊ．Ｊ．Ｒａｍｓｄｅｎ、Ｓ．Ｙ．Ｌｉ、Ｊ．Ｅ．Ｐｒｅｎｏｓｉｌ、Ｅ．Ｈｅｉｎｚｌｅ共著、「動物細胞の付着および拡散の動力学（Kinetics of adhension and spreading of animal cells）」、バイオテクノロジ・アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnology and Bioengineering）、１９９４年、第４３巻、９３９〜９４５ページ。
【非特許文献７】Ｍ．Ｈｉｄｅ，ｅｔ ａｌ．共著、「表面プラズモン共鳴型バイオセンサを用いたリガンド誘導性細胞表面および生体肥満細胞の細胞内反応の実時間解析（Real-time analysis of ligand-induced cell surface and intracellular reactions of living mast cells using a surface plasmon resonance-based biosensor）」、アナリティカル・バイオケミストリ（Analytical biochemistry）、２００２年、第３０２巻、２８〜３７ページ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、今日に至るまで、生体細胞におけるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の作動薬誘発性の転位を含む、付着細胞における化合物誘導性の質量再分布を測定するために光学的ＬＩＤ技術を使用する点については何ら報告されていない。このような使用は実現可能であることが望ましい。なぜならば、細胞表面受容体の一系統であるＧＰＣＲは、新薬成分が開発される際の最も一般的な標的（ターゲット）となるからである。また、ＧＰＣＲは、外因性の兆し（たとえば、新薬などの刺激物の存在）を、新薬テストに極めて役立つ細胞内応答へ変換することができるからである。
【０００８】
ＧＰＣＲは、多種多様な細胞シグナル伝達経路内に存在している。リガンドが結合すると、細胞内および細胞性の一連のシグナル伝達現象が開始されるが、この現象は、受容体の配座変化、受容体のオリゴマー形成、Ｇ蛋白質の活性化（ＧαサブユニットでのＧＤＰ−ＧＴＰ交換、ＧαとＧβγ間分裂、受容体からのＧ蛋白質の脱共役、ＧαおよびＧβγの情報伝達複合体の生成）、並びに、二次メッセンジャーを生成させて最終的に特定の遺伝子発現の変化（Ｃａ2+の移動、イノシトール・トリスリン酸、および細胞内ｃＡＭＰレベルの変調のうちの少なくとも１つ）を誘発させる下流のシグナル伝達の活性化といった現象を含むものである。リガンド媒介のＧＰＣＲ活性化もまた、細胞表面からのＧＰＣＲの脱感作現象や、多くの細胞内蛋白質の輸送現象をもたらすとともに、標的細胞の表現型、形態および物理的性質の変化をもたらすこととなる。これらの変化は、静的、持続的あるいは動的（たとえば、周期的または揺動的）であり得る。シグナル伝達現象は、明確に識別可能であるとき、数十分の時間（たとえば、遺伝子発現または形態変化）を平衡にするために、数ミリ秒（たとえば、ＧＰＣＲ受容体の配座変化）から数十秒（たとえば、Ｃａ2+の流れ）の範囲内で有意差のある動態を示す。現状のＧＰＣＲ分析の中には、リガンド−受容体結合法、二次メッセンジャー（Ｃａ2+，ＩＰ３のｃＡＭＰ）分析、蛋白質相互作用分析、転位分析およびレポーター遺伝子分析が含まれる。ＧＰＣＲの活性化は、最終的に蛋白質の輸送および形態変化の双方またはいずれか一方を誘発させるので、細胞表面のＧＰＣＲを通して何らかの化合物の作用やその結果影響を受けた細胞内の現象（たとえば、輸送現象および形態変化の双方またはいずれか一方）を研究できる方法が待ち望まれていた。本発明は、このような要求等に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、光学的ＬＩＤバイオセンサを用いて、生体細胞における作動薬誘発性のＧＰＣＲシグナル伝達現象などの化合物誘導性の質量再分布をリアルタイムに測定するシステムおよび方法を包含する。特に、本発明は、光学的ＬＩＤバイオセンサを用いて、細胞の形態変化およびＧＰＣＲの脱感作や転位のうちの少なくとも１つに基づき生体細胞における標的ＧＰＣＲに対する化合物のスクリーニングを実行するためのシステムおよび方法を包含する。実施例を拡大解釈すれば、本発明は、光学的ＬＩＤバイオセンサを自己参照して、周辺温度や圧力変動などの環境変化に対する不要な感受性を低減させる方法を包含し、また、空間的に拡がりつつ同一のバイオセンサ上に置かれた２タイプの細胞の応答を比較して、予め選択された特定の標的に対する化合物の作用に関する確証的な情報を提供する方法を包含するものである。実施例をさらに拡大解釈すれば、本願発明は、単一の媒体溶液において単一タイプの細胞内の複数のＧＰＣＲあるいは複数種の細胞内のＧＰＣＲのスクリーニングを実行するための複数の異なる方法を包含するものである。実施例をさらに拡大解釈すれば、本発明は、生体細胞内の特定のＧＰＣＲに対する化合物の生理学的または薬理学的な効果を確証するための複数の異なる方法を包含するものである。
【００１０】
添付図面とともに以下の詳細な説明を参照することにより本願発明をより完全に理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本願は、２００５年４月５日に出願された米国特許出願第１１／１００，２６２号（名称：導波路グレーティングセンサを用いてＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の細胞分析を実行するための方法およびシステム（System and Method for Performing G Protein Coupled Receptor (GPCR) Cell Assays Using Waveguide-Grating Sensors））に基づく優先権の利益を主張するものであり、この米国特許出願は、本願明細書に援用されるものとする。
【００１２】
図１を参照すると、計測システム（interrogation system）１０２と光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４とを含む光学的ＬＩＤシステム１００の基本構成が図示されており、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４は、当該光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０に置かれた（図中では１個の）生体細胞１０８内の質量再分布（たとえば、矢印１０６で示されるようにＧＰＣＲ２０２の転位）を検出し且つ測定するために使用される。好ましい実施例では、計測システム１０２は、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４（たとえば、ＳＰＲセンサ１０４や導波路グレーティングセンサ１０４）に対する計測を実行して、生体細胞１０８内の質量再分布を検出し且つ測定する。このような計測は、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４に対して適当なスペクトルや角度を持つ光ビーム１１２を照射して、光ビーム１１２が検出表面１１０で反射したときに、その反射ビーム１１４において前記質量再分布を表す共鳴角成分や波長応答成分が主成分となるように実行される。よって、生体細胞１０８内に検出可能な質量再分布が存在すれば、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４は、角度成分や波長成分の変化として観測される応答量変化を検出することが可能である。そのような光学的応答量は、時間に関する関数として記録することができる。このようにして、生体細胞１０８内の質量再分布に導く何らかの現象の動態を解析することが可能である。光学的ＬＩＤシステム１００（図２〜図１８参照）により実行され且つ測定され得る生体細胞分析（生体細胞に基づく分析：living cell-based assays）には複数のタイプが存在するが、これらを説明する前に、生体細胞１０８内の多様な構成要素のいくつかについて詳細に説明する。
【００１３】
光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４内を電磁場が伝播できる範囲（およそ数百ナノメータ）には制限があり、この電磁場は周辺媒体（たとえば、付着細胞１０８）にエバネッセント電磁場として侵入することができるので（以下、その深さを侵入度または検出空間と呼ぶ。）、センサ表面１１０に近接する付着細胞の下方部分における質量再分布１０６のみを検出することができる。生物学的細胞１０８は、数ナノメータから数十ミクロンの大きさの構成要素からなる複合組織である。セル１０８は、多数の細胞小器官（オルガネラ：organelle）を含む細胞質（１０〜３０μＭ）を有している。最も大きな細胞小器官は細胞核であり、当該細胞核の大きさは３μｍ〜１０μｍ程度である。細胞核の内部は、ＤＮＡ−蛋白質複合体や複数の蛋白質で満たされており、最も重要なものは、染色質（クロマチン：chromatin）である。ミトコンドリアは、０．５μｍ〜１．５μｍの大きさを持つ一連のひだ状の細胞膜からなる小さな細胞小器官である。その他のセルの構成要素としては、（０．２μｍ〜１μｍの）小胞体（ＥＲ：endoplasmic reticulum）、（０．２μｍ〜０．５μｍの）リソーム（lysome）、（０．２μｍ〜０．５μｍの）ペルオキシソーム（peroxisome）、（約１００ｎｍの）エンドソーム（endosome）およびゴルジ（golgi）が挙げられる。生体細胞１０８は高度に動的であり、大部分の細胞小器官は細胞内を広い範囲で移動する。たとえば、微少管（microtubule）は、長距離にわたって細胞小器官を輸送することができる。刺激を与えると、セル１０８が培養されたセンサ表面１００の近接位置において高密度に充填された細胞小器官がサブミクロン単位で動く。このような動きは、セル１０８内に質量再分布１０６を起こすこととなる。質量再分布１０６は、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４によって検出することができる。以下、質量再分布１０６に関係するシグナルを、指向性質量再分布（ＤＭＲ）シグナルと呼ぶこととする。
【００１４】
仮に、原形質膜（プラズマ細胞膜）の下方が分泌系細胞小器官（分泌系オルガネラ）の結合箇所で占められており、原形質膜上の細胞内小胞が細胞質基質（シトソル）内で当該細胞内小胞の処理ステーションに達していたとすれば、細胞輸送が起こり得る。いずれの方向にしても、細胞小器官は、原形質膜の下方で、いわゆるアクチン皮質に侵入しなければならず、アクチン・フィラメントの緻密な網目構造が数百ナノメータの厚みを構成している。アクチン・フィラメントが絶えず集合し離散する限り、その網目構造は、動的であり、細胞小器官に対する浸透性を持つ。その集合と離散とを調整する制御機構は、アクチン皮質の浸透性をも調整すると思われる。
【００１５】
前述の原形質膜は、忙しい場所である。細胞外小胞（エキソサイトーシス小胞）は、受容体を原形質膜内に挿入し、リガンドを細胞外空間に解放する。細胞内小胞（エンドサイトーシス小胞）は、結合性リガンドとともに受容体を内部処理ステーションに輸送する。カベオラは、細胞シグナル伝達における役割を持つとみられる、原形質膜関連の小胞である。リピッドラフト（脂質ドメイン）は、原形質膜を小さな浮島として定着させるものと考えられており、当該浮島では、選び抜かれた複数の膜蛋白質が密かに出会ってシグナルを交換する。結局、膜受容体の領域が存在することとなる。これらの多くは、おそらく、下流のエフェクター分子を絶えず補充し解放する大きな分子複合体に組み込まれている。
【００１６】
細胞の構成要素の輸送または細胞外の刺激は、原形質膜で生じるだけでなく、複数の細胞内区画でも生じる。そのような現象の中には、（１）蛋白質の標的化、あるいは、細胞核、細胞膜、細胞基質（シトソル）に対する再循環経路を介した基質の補充、あるいは、他の細胞外空間から若しくは他の細胞外空間に対する基質の補充、あるいは、細胞外空間からの取り込み（リガンド結合、遺伝子トランスフェクション、感染および蛋白質配送）という現象や、（２）媒介による解放地点とともに所定の微少環境において様々な機能区画内で新たに合成された細胞内構成要素の再分布という現象が含まれる。これらの細胞性現象は、シグナル伝達サイクル期間の間に或る時点で指向性質量再分布をもたらす。
【００１７】
以下、光学的ＬＩＤシステム１００によって実行され且つ測定され得る生体細胞分析（生体細胞に基づく分析：living cell-based assays）のうちの幾つかの種類を、図２〜図１８を参照しつつ詳細に説明する。
【００１８】
図２を参照すると、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０上に置かれた（図中１個だけの）生体細胞１０８内のＧ蛋白質共役型受容体２０２（ＧＰＣＲ２０２）の作動薬誘発性の転位を測定するために使用される光学的ＬＩＤシステム１００が図示されている。すなわち、図２は、作動薬誘発性であり且つ時間依存性の光学的応答２０１を示し、この光学的応答２０１の一部は、生体細胞１０８内の標的ＧＰＣＲ２０２の転位に起因するものである。当該細胞は、導波路型バイオセンサ１０４の表面１１０に付着している。説明の便宜上、計測システム１０２は、符号"Ｃ"を付された部分には示されていない。
【００１９】
図に示されているように、休止状態にあるＧＰＣＲ２０２が細胞表面２０４（形質膜２０４）に位置する一方で、ＧＰＣＲキナーゼ２０６（ＧＲＫ２０６）とアレスチン２０８とが生体細胞１０８の内部に一様に分布している（図"Ａ"を参照）。作動薬による活性化に応じて、ＧＰＣＲ２０２は、α、βおよびγというサブユニットからなるヘテロトリマーＧ蛋白質を活性化する。これらのＧαサブユニットおよびＧβγサブユニットは解離して、形質膜２０４でＧＲＫ２０６が受容体２０２に補充されるように働く。次に、ＧＲＫ２０６は、ＧＰＣＲ２０２のカルボキシ末端をリン酸化する。そして、比較的豊富な細胞内蛋白質であるβ−アレスチン２０８は、形質膜２０４において細胞質内で急速に（数分以内に）活性化ＧＰＣＲ２０２へ転位し、ＧＲＫリン酸化受容体を捕捉し、同族のＧ蛋白質から当該受容体を切り離す（脱共役する）。このとき、β−アレスチン２０８は、脱感作されたＧＰＣＲ２０２に結合し、細胞表面２０４の、クラスリンで覆われた壁孔に転位する。当該壁孔では、受容体２０２が、クラスリンで覆われた小胞（ＣＣＶ：Clathrin-Coated Vesicles）に吸収される（図"Ｂ"参照）。最終的に、完全な複合体２０２，２０６がエンドソーム２１０（細胞内小胞２１０）に運ばれる（図"Ｃ"参照）。以上のプロセスは、転位現象として知られている。ＧＰＣＲ転位に関するより詳細な情報については、以下の３つの論文を参照されたし。
【００２０】
・Ｄｒｅｗｓ，Ｊ．著、「薬物発見：１つの歴史観（Drug discovery: a historical perspective）」、サイエンス（Science）、２０００年、第２８７巻、１９６０〜１９６３ページ。
【００２１】
・Ｍａ，Ｐ．、Ｚｅｍｍｅｌ，Ｒ．共著、「新規性の価値（Value of novelty）」、 Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．、２００２年、第１巻、５７１〜５７２ページ。
【００２２】
・Ｐｉｅｒｃｅ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．共著、「７つの膜貫通型受容体（Seven-transmembrane receptors）」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００２年、第３巻、６３９〜６５０ページ。
【００２３】
上記３つの論文の内容は、本願明細書に援用されるものとする。
【００２４】
上記の転位現象は、特定の時点で生体細胞１０８内の指向性質量再分布（たとえば、細胞表面の方向へ、あるいは細胞表面から離れる方向への再分布）をもたらし、結果として、長期間に亘って複数の異なる光学応答を生み出すものであることが分かる。指向性質量再分布をもたらす可能性がある他の生物学的現象は、ＧＰＣＲ活性化に起因する細胞の形態的変化である。かかる細胞の形態的変化の中には、細胞骨格の再構成や付着力の変化が含まれる。細胞骨格は、真核細胞の細胞質の至るところに広がる蛋白質微細繊維の複合ネットワークであり、当該真核細胞内での多種多様な活動の実行に関わっている。細胞骨格は、当該細胞に対する引張強度を与えるとともに筋収縮を可能にするものでもあり、細胞運動を行い、細胞内のシグナル伝達および輸送、細胞分裂、セル形状の変化に関係するものである。Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の活性化は、理論的には細胞骨格の再構成に影響を及ぼすであろう少なくとも２つの独立した現象を引き起こす。第１の現象は、細胞内のシグナル伝達経路の活性化であり、第２の現象は、受容体媒介のエンドサイトーシス（細胞食作用）（すなわち、転位現象）であり、このエンドサイトーシスは、ＧＰＣＲの大部分で作動薬による活性化が生じた後に起こる現象である。作動薬またはＧＰＣＲの結合が生じた後に細胞内シグナル伝達経路が活性化すると、さらに２系統の関連現象が誘発される。第１の系統では、二次の細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらすプロセスが誘発される（Ｇ蛋白質->エフェクタ->メッセージ）。一方、第２の系統のメカニズムは、第１の系統の現象に作用することによって細胞内のシグナル伝達の度合いを調整するものである。これらのメカニズムの中には、膜結合型受容体の下方制御（ダウンレギュレーション）、内部移行およびリン酸化反応や脱感作が含まれる。双方の系統の現象が、細胞内のアクチン・フィラメントの再構成をもたらすことができると仮定する。たとえば、ＧＰＣＲが活性化した後は、色々な形のＧ蛋白質（たとえば、ＧαおよびＧβγ）がＦ−アクチン・フィラメントと結合し得る。また、前記のシグナル伝達分子等がアクチン・フィラメントから分離し得る。受容体媒介のエンドサイトーシスを介して起こる膜結合型受容体の内部移行プロセスも、アクチン・フィラメントの動態に関与している可能性がある。
【００２５】
再び図２を参照すると、本願発明によれば、光学的ＬＩＤシステム１００から得られた光学的応答２０１を解析することによって、生体細胞１０８内のＧＰＣＲ転位に関連する複数の異なる状態を特定し測定することができる。事実、図２に示される光学的応答２０１によれば、３つの異なる現象を特定することができる。これら３つの主要な現象は、以下の通りである。（１）作動薬を入れると、大きな屈折率変化に起因して、シグナル２０１に非常に大きく急激な低下を確認できる（すなわち、一般に化合物溶液は細胞媒体よりも比較的低い屈折率を有しているので、化合物を入れるとＬＩＤシグナルが低下する）。（２）応答シグナル２０１がほとんど２０分間に亘って緩慢に変化する移行期間を確認できる。この移行期間は、クラスリンで覆われた壁孔に対する受容体２０２の脱感作、アレスチン結合、ＧＲＫ２０６による活性化された受容体のリン酸化反応、その他の細胞性反応あるいはこれらの組み合わせと関係しているのかもしれない。（３）エンドソーム２０２に対するＧＰＣＲ複合体２０２，２０８の転位に対応して、ほとんど５０分間に亘って応答シグナル２０１の緩慢な低下を確認できる。他の場合としては、初期段階の直後に生ずる付加的現象も、明らかに確認できる（たとえば、図１１）。すなわち、これは、主に、細胞媒体内の化合物の拡散現象や、細胞表面の活性化されたＧＰＣＲに対して細胞内の構成要素が補充された現象に起因する応答シグナル２０１の増加を意味する。光学的ＬＩＤシステム１００がこの検査をどのような方法で実行するのかにつき、図３に示される方法３００を参照しつつ以下に詳細に説明する。
【００２６】
図３を参照すると、本発明に係る光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を用いて、生体細胞１０８内の作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化に起因する質量再分布をリアルタイムに測定する方法３００の基本手順を示すフローチャートが図示されている。この方法３００は、（ａ）、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を用意し（ステップ３０２）、（ｂ）生体細胞１０８が光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０に付着するように、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を覆う媒体の中に適当な数の生体細胞１０８を配置し（ステップ３０４）、（ｃ）必要に応じて、少なくとも１回、緩衝溶液を細胞媒体の中に添加し（ステップ３０６）、（ｄ）化合物（作動薬）含有溶液を細胞媒体の中に添加し（ステップ３０８）、（ｅ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４に対する計測を実行し、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４上に培養された生体細胞１０８の時間依存性の光学的応答２０１を測定する（ステップ３１０）、という手順である。
【００２７】
前述の化合物を添加する前に、ステップ３０６を実行して緩衝溶液（前述の化合物を形成するために使用された緩衝溶液と同じもの）を生体細胞１０８に添加した場合には、生体細胞１０８が環境変化に反応することに起因する望ましくない効果を最小限に抑えることが可能であるという点に留意すべきである。これは、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４上に培養された生体細胞１０８が生き生きと活動しているからこそ可能となる。すなわち、そのような生体細胞１０８は、周囲の媒体組織の変化や温度変化を感知し、そのような変化に反応し得るからである。これに対し、生体細胞１０８は、緩衝液を入れた場合と同様の変化を感知するので、化学物質をこれ以上導入しないと仮定すれば、前記の媒体組織の変化に対して耐性を持つことになる傾向がある。
【００２８】
また、上記のリアルタイムに測定する方法３００は定量化情報を与えるという点に留意すべきである。また、同様に重要なことは、当該方法は、ＧＰＣＲ活性化に起因する細胞内の質量再分布の動態情報を与えるという点である。従来のＧＰＣＲのスクリーニング方法と比べて、この方法３００は、標識に依存せずに、より高い感度で、より容易に実行することができ、既知の受容体が下流のシグナル伝達経路とどのように結合しているのかという予備知識や天然リガンドの予備知識を必要とせずに、全てのＧＰＣＲ２０２に適用可能なものである。
【００２９】
さらに、前記ステップ３０４では、高い感度を得るために、最適条件下で培養されてからしばらく後に、細胞が光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０上で接着性を持つようになり且つ高い密集度（必要に応じて７５％以上）を持つに至るように細胞の数が最適化される必要があるという点に留意すべきである。
【００３０】
図４を参照すると、本発明に係る光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を用いて、生体細胞１０８内の質量再分布に基づいて標的ＧＰＣＲ２０２に対する作動薬のスクリーニングを実行する方法４００の基本手順を示すフローチャートが図示されている。この方法４００は、（ａ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を用意し（ステップ４０２）、（ｂ）生体細胞１０８が光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０に付着するように、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を覆う媒体の中に適当な数の生体細胞１０８を配置し（ステップ４０４）、（ｃ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４が安定化するまでのしばらくの間に、既知の親和性（結合力）を持つ拮抗薬を一定濃度で含む溶液を細胞媒体の中に添加し（ステップ４０６）、（ｄ）受容体と結合した拮抗薬から離れて競合するために十分な高い濃度を有する化合物（作動薬）を含む溶液を細胞媒体の中に添加し（ステップ４０８）、（ｅ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４に対する計測を実行して、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４上で培養された生体細胞１０８の時間依存性の光学的応答２０１を測定する（ステップ４１０）、という手順である。
【００３１】
この方法４００では、生体細胞１０８内の１つの受容体に拮抗薬を予め添加することにより、この特殊な受容体に対する作動薬用化合物の効果的なスクリーニングを行うことが可能になる点に留意すべきである。さらに、この方法４００は、当該方法４００が生体細胞１０８における同族受容体用の化合物の機能性に関する予備知識を必要とするという一点を除いて、上記方法３００と同様の方法である点に留意すべきである。たとえば、拮抗薬がＧＰＣＲ２０２の活性化を抑制するか否か、あるいは、拮抗薬がＧＰＣＲ２００を活性化させて転位をもたらすか否かを知っておくことが必要である。
【００３２】
図５を参照すると、本発明に係る光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を用いて、生体細胞１０８内の質量再分布に基づいて標的ＧＰＣＲ２０２に対する拮抗薬のスクリーニングの方法の基本手順を示すフローチャートが図示されている。この方法５００は、（ａ）光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し（ステップ５０２）、（ｂ）生体細胞１０８が光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０に付着するように、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を覆う媒体の中に適当な数の生体細胞１０８を配置し（ステップ５０４）、（ｃ）転位が起こらないように、短時間の間に、既知の親和性（結合力）を持つ作動薬を一定濃度で含む溶液を細胞媒体の中に添加し（ステップ５０６）、（ｄ）当該短時間が経過した後、一定濃度を有する化合物を含む溶液を細胞媒体の中に添加し（ステップ５０８）、（ｅ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４に対する計測を実行して、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４上に培養された生体細胞１０８の時間依存性の光学的応答２０１を測定する、という手順である。方法４００と同様に、この方法５００は、生体細胞１０８内の標的ＧＰＣＲ２０２に関する予備知識を必要とし、この特殊なＧＰＣＲ２０２に対して、生体細胞１０８を前処理するための作動薬あるいは拮抗薬を事前に選別しておくことが必要である点に留意すべきである。
【００３３】
上記ステップ５０６とステップ５０８を一体化して単一のステップにすることが可能である点に留意すべきである。すなわち、細胞内で標的ＧＰＣＲに知られた作動薬を、化合物とともに与えることが可能である。また、上記方法３００と同様に、検査対象の化合物を最初に導入し、続けて、既知の作動薬を入れることができる。
【００３４】
さらに、自己参照型の光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を用いて、上記方法３００，４００，５００の各々をさらに強化することができる。光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の性能は、一般に、光学的特性や当該センサの設計内容および特性の影響を受けること、並びに周辺温度や圧力といった環境変動の影響を受けることがよく知られている。自己参照型の光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を使用することの主な利点は、表面１１０が参照領域とサンプル領域とを有するので、これにより、当該サンプル領域を用いて生体細胞１０８内の質量再分布を検出することが可能になると同時に、参照領域が当該参照領域に付着する生体細胞１０８を持たないようにすれば、このような参照領域を用いて、生体細胞１０８内の質量再分布の検出に悪影響を与え得る偽の変化量を参照することが可能になる、という点である。
【００３５】
１つの実施例によれば、図６に示す方法６００に従って自己参照型の光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を構成することができる。この自己参照型光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４は、以下の手順を用いて構成できる。すなわち、（ａ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を用意し（ステップ６０２）、（ｂ）軟質スタンプ（たとえば、ゴム製スタンプ）を用いて光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０の一領域（参照領域）を物理的に遮断し（ステップ６０４）、（ｃ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の遮断されていない領域（サンプル領域）を覆う成長媒体の中に適当な数の生体細胞を配置し（ステップ６０６）、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４上の遮断されていない領域に生体細胞１０８が付着した後に、前記軟質スタンプを除去する（ステップ６０８）。この時点で、方法３００，４００，５００で説明した通りの生体細胞分析を実行する。ここで、細胞研究のため、異なる方法を適用して自己参照型ＬＩＤセンサを構成することが可能である点に留意すべきである。たとえば、物理的な遮蔽物を用いてセンサを２つの部材に分割し、一方の部材にのみ媒体内の細胞を付着させることができる。細胞が付着した後にその物理的な遮蔽物を除去すればよい。
【００３６】
次に、本発明の他の特徴については、多重細胞分析（multiplexed cell assays）の重要性が増大しており、スループット（処理量）の増大のためだけではなく、単一分析から利用できる優れた確証的な情報のためにも多重細胞分析は重要であることがよく知られている。よって、本発明がさらに多重生体細胞分析を同時に実行するように強化されることが望ましい。
【００３７】
１つの実施例として、図７に示す方法７００を用いて多重生体細胞分析を同時に実行するように本発明を強化することができる。方法７００によれば、以下の手順により、複数種の生体細胞１０８における作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化に起因する質量再分布を測定することができる。すなわち、（ａ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を用意し（ステップ７０２）、（ｂ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０の一部部位に生体細胞１０８が付着することを防止するスタンプを用いて、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０の当該部位を遮蔽し（ステップ７０４）、（ｃ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０のうちの遮蔽されていない部位を覆う細胞媒体の中に第１のタイプの生体細胞１０８を配置して、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０のうちの遮蔽されていない部位に生体細胞１０８が付着できるようにし（ステップ７０６）、（ｄ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０からスタンプを除去し（ステップ７０８）、（ｅ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を覆う細胞媒体の中に第２のタイプの生体細胞１０８を配置して、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の新たな暴露表面（遮蔽物が除去された表面）１１０に当該第２のタイプの生体細胞１０８が付着できるようにし（ステップ７１０）、（ｆ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０に配置された細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し（ステップ７１２）、（ｇ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４に対する計測を実行して、光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４上にある２タイプの生体細胞１０８内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答２０１を測定する（ステップ７１４）、という手順である。前述した２タイプの細胞を互いに関連付けることができる点に留意すべきである。たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Chinese Hamster Ovary cells）に対して、過剰発現した標的受容体を含む遺伝子操作されたＣＨＯ細胞を関連付けることができる。この方法は、多重細胞分析を可能にするだけでなく、標的受容体の発現量を除いて２つの細胞は同じであるから、２つの異なる細胞に作用する同一化合物の光学的応答量を比較することにより標的受容体へ化合物が与える効果に関する確証的結果を提供するものである。
【００３８】
他の実施例として、図８に示す方法８００を用いて多重生体細胞測定を同時に実行するように本発明を強化することができる。方法８００によれば、以下の手順に従って、複数種の生体細胞１０８における作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化に起因する質量再分布を測定することができる。すなわち、（ａ）複数の光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４からなる配列を含むチャンバー（マイクロプレート）を用意し（ステップ８０２）、（ｂ）これら光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４のうちの少なくとも１つのバイオセンサを覆う細胞媒体の中に第１のタイプの生体細胞１０８を配置し、当該少なくとも１つのバイオセンサ１０４の表面１１０に当該第１のタイプの生体細胞１０８が付着できるようにし（ステップ８０４）、（ｃ）被覆されていない残る光学的ＬＩＤバイオセンサのうちの少なくとも１つのバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に第２のタイプの生体細胞１０８を配置して、当該少なくとも１つの残る光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０に当該第２のタイプの生体細胞１０８が付着できるようにし（ステップ８０６）、（ｄ）覆いのある光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０に置かれた細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し（ステップ８１０）、当該覆いのある光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４に対する計測を実行して、当該覆いのある光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の各々の生体細胞１０８内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答２０１を測定する（ステップ８１２）、という手順である。
【００３９】
ＬＩＤセンサ上には、互いに異なる複数の標的受容体遺伝子を有し且つ互いに異なる複数のＤＮＡベクターからなる配列をトランスフェクション試薬と一緒に堆積することができる点、並びに、単一タイプの細胞がそのような配列と重畳するように置かれて当該標的受容体遺伝子を取り込む点に留意すべきである。したがって、各スポット領域に重畳された細胞のみが形質導入されることとなり、この結果、形質導入型細胞クラスター配列（transfected cell cluster array）を形成することとなる（米国特許第６５４４７９０号明細書；「リバース・トランスフェクション法（Reverse transfection method）」）。同様に、蛋白質細胞導入試薬（protein delivery reagents）と複合した複数の機能性受容蛋白質からなる配列を、類似の形質導入型細胞クラスター配列に利用することが可能である（米国特許出願公開第２００４／００２３３９１号；「蛋白質導入方法および装置（Methods and devices for protein delivery）」）。現存の技術を用いれば、いずれのタイプの形質導入型細胞配列も化合物スクリーニングのために利用することが可能である。
【００４０】
さらに他の実施例として、図９に示す方法９００を用いて単一タイプの細胞において多重標的スクリーニングを同時に実行するように本発明をさらに強化することができる。方法９００によれば、以下の手順を実行することにより、単一タイプの生体細胞１０８内の複数のＧＰＣＲに対する作動薬のスクリーニングを行うことができる。すなわち、（ａ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を用意し（ステップ９０２）、（ｂ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４を覆う細胞媒体の中に生体細胞１０８を配置して、生体細胞１０８が光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０に付着できるようにし（ステップ９０４）、（ｃ）複数の拮抗薬の混合溶液からなる溶液を添加し（ステップ９０６）、（ｄ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０に置かれた細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し（ステップ９０８）、（ｅ）光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４に対する計測を実行して、生体細胞１０８内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答２０１を測定する（ステップ９１０）、という手順である。
【００４１】
上記方法９００を変形することにより同一の細胞株にある複数の受容体に対する拮抗薬のスクリーニングを実行するように同様の方法を適用することが可能である点に留意すべきである。上記ステップ９０６で使用された複数の拮抗薬からなる混合溶液の代わりに、上記化合物からなる溶液を使用すると同時に、上記ステップ９０８で使用された化合物溶液に代えて、複数の拮抗薬からなる混合溶液を使用することができる。
【００４２】
光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０に置かれた生体細胞１０８（図２参照）の内部の質量再分布を測定するために光学的ＬＩＤシステム１００の使用が可能であることを示す目的で色々な実験が行われた。以下、これら実験結果について説明する。
【００４３】
図１０〜図１７は、本発明に係る光学的ＬＩＤバイオセンサが、当該光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた生体細胞内でのＧＰＣＲ転位の如き質量再分布を測定するために使用可能であることを示すために実行された色々な実験の結果を示すグラフおよび表である。このデータは、コーニング社によって製造された光学的導波路グレーティングセンサシステムとＬＩＤマイクロプレート（Ｎｂ2Ｏ5 プレート）を用いて得られた。
【００４４】
図１０は、光学的ＬＩＤシステム１００によって測定された、チャイニーズハムスター卵巣細胞１０８（ＣＨＯ細胞１０８）内の作動薬誘発性応答を示すグラフである。ＣＨＯ細胞１０８は、ベータ−アレスチンやＧＲＫのみならず、ベータアドレナリン受容体、アルファ２−アドレナリン受容体、Ｐ２Ｙ受容体をも内在的に発現することが知られている。また、ムスカリン受容体は、ＣＨＯ細胞１０８において非常に低いレベルで内在的に発現されることが知られている。この実験では、複数の光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４からなる配列を含むマイクロプレートの各ウェルの中には、約５×１０4個のＣＨＯ細胞１０８が入れられた。次いで、ＣＨＯ細胞１０８が基板表面１１０に対して確実に付着性を有するように、２４時間の間、ＣＨＯ細胞１０８は１５０μｌの血清媒体内で培養された。グラフには、検査済みの４種類の化合物に対するＣＨＯ細胞１０８の光学的応答が示されている。これら４種類の化合物は、（１）Ｐ２Ｙ受容体に対する作動薬であるＡＴＰ（１００μＭ）、（２）アルファ２−アドレナリン受容体に対する作動薬であるクロニジン（１０μＭ）、（３）ベータアドレナリン受容体に対する作動薬であるエピネフリン（１００μＭ）、（４）ムスカリン受容体に対する作動薬であるオキソトレモリンＭ（１０μＭ）、である。ムスカリン受容体は、ＣＨＯ細胞１０８の中で非常に低いレベルで内在的に発現されるので、ムスカリン受容体に対する作動薬であるオキソトレモリンＭは調整機能を果たす。各ウェルには血清媒体が入れられており、上記の４種類の作動薬はそれぞれ異なるウェルに直接的に添加された。その後、光学的ＬＩＤシステム１００によって光学的応答が収集された。
【００４５】
その結果、ＡＴＰ、クロニジンおよびエピネフリンという３つの作動薬の導入後に得られた光学的応答に示されるように、付着ＣＨＯ細胞１０８は、類似の動態および転移を示した。オキソトレモリンＭは、ほとんど細胞応答を誘発しなかった。図１１によれば、プロセスの最終段階の動態解析により、３つの作動薬（ＡＴＰ、エピネフリン、クロニジン）の全てについて類似の緩慢なプロセスに至ったことが明らかである。図２に示されるステージ３での変化は、これら作動薬によって引き起こされたものであり、図１２のグラフが示すものである。このような類似の変化は、ＧＰＣＲ転位について必須成分であるベータ−アレスチンがＣＨＯ細胞１０８内の制限因子であるという事実を反映している可能性があり、これは、クラスリンで覆われたピットのサイズとベータ−アレスチンのサイズとが似たサイズであるという事実を与えるものである。
【００４６】
図１３は、導波路バイオセンサ１０４上の生体ＣＨＯ細胞１０８における単分子膜のリガンド依存性且つ時間依存性の応答量を表す実験結果を示すグラフである。作動薬としては、（１）クロニジン、（２）オキソトレモリンＭ、（３）ＮＥＣＡ、および、Ｍ１受容体に対する拮抗薬であるテレンゼピンを含むものが使用された。
【００４７】
図１４は、導波路バイオセンサ１０４上において安定的に過剰発現したラットのムスカリン受容体のサブタイプ１（Ｍ１）を有する生体ＣＨＯ細胞１０８における単分子膜のリガンド依存性且つ時間依存性の応答量を表す実験結果を示すグラフである。作動薬としては、（１）クロニジン、（２）オキソトレモリンＭ、（３）ＮＥＣＡ、および、Ｍ１受容体に対する拮抗薬であるテレンゼピンを含むものが使用された。
【００４８】
図１５は、導波路バイオセンサ１０４上において安定的に過剰発現したラットのムスカリン受容体のサブタイプ１（Ｍ１ ＣＨＯ）を有する場合と（ＣＨＯ）を有しない場合とについて、生体ＣＨＯ細胞１０８における単分子膜の応答量のリガンド誘発性変化の総量を表す実験結果を示すグラフである。図１１と図１３〜図１５に示した結果は、（１）ＣＨＯ細胞とＭ１−ＣＨＯ細胞の双方で発現したアルファ２−アドレナリン受容体が存在して、これらの作動薬（クロニジン）が質量再分布シグナルを誘発し、（２）ＣＨＯ細胞では、比較的低レベルあるいは無視できる程度のＭ１受容体が発現した一方で、Ｍ１−ＣＨＯ細胞では、高レベルのＭ１受容体が発現したが、その理由として、拮抗薬（テレンゼピン）ではなく、作動薬（オキソトレモリンＭ）がＭ１−ＣＨＯ細胞内で極めて大きな応答を引き起こしたことが挙げられる。
【００４９】
図１６は、導波路バイオセンサ１０４上において安定的に過剰発現したラットのムスカリン受容体のサブタイプ１（Ｍ１ ＣＨＯ）を有する場合とこれを有しない場合とについて、生体ＣＨＯ細胞１０８における単分子膜のオキソトレモリンＭ誘発性且つ時間依存性の応答量に対し、ダイナミンリン酸化抑制剤（ダイナミン抑制ペプチド：ＤＩＰ）の前保温・培養処理（プレインキュベーション：pre-incubation）が与える影響を表す実験結果を示すグラフである。実験結果は、ＤＩＰを有する細胞の前保温・培養処理が、双方の細胞株でオキソトレモリンＭ誘発性の質量再分布応答をほぼ完全に抑制したことを示しており、これは、オキソトレモリンＭ誘発性の質量再分布がダイナミン依存性を持つことを示唆している。このようなダイナミン依存性は、作動薬誘発性のＧＰＣＲ転位の大部分で共通の性質である。
【００５０】
図１７は、導波路バイオセンサ１０４上において安定的に過剰発現したラットのムスカリン受容体のサブタイプ１（Ｍ１ ＣＨＯ）を有する場合とこれを有しない場合とについて、生きたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における単分子膜のクロニジン誘発性且つ時間依存性の応答量に対し、ダイナミンリン酸化抑制剤（ダイナミン抑制ペプチド：ＤＩＰ）の前保温・培養処理（プレインキュベーション：pre-incubation）が与える影響を表す実験結果を示すグラフである。実験結果は、ＤＩＰを有する双方の細胞株の前保温・培養処理が、クロニジン誘発性の質量再分布応答をほぼ完全に抑制したことを示しており、これは、クロニジン誘発性の質量再分布もダイナミン依存性を持つことを示唆している。
【００５１】
図１８は、導波路バイオセンサ１０４上において安定的に過剰発現したラットのムスカリン受容体のサブタイプ１（Ｍ１ ＣＨＯ）を有する場合とこれを有しない場合とについて、生体ＣＨＯ細胞１０８における単分子層のＮＥＣＡ誘発性且つ時間依存性の応答量に対し、ダイナミンリン酸化抑制剤（ダイナミン抑制ペプチド：ＤＩＰ）の前保温・培養処理（プレインキュベーション：pre-incubation）が与える影響を表す実験結果を示すグラフである。実験結果は、ＤＩＰを有する双方の細胞の前保温・培養処理がＮＥＣＡ誘発性応答に若干影響を与えたことを示しており、これは、ＮＥＣＡが、ダイナミンに依存しない経路を通じて双方の細胞株で質量再分布シグナルを引き起こしたことを示唆している。
【００５２】
本発明に係る光学的ＬＩＤシステム１００を使用することにより、さらに以下の特徴および利点が得られる。
【００５３】
（１）本発明は、標識に依存せずに機能性ＧＰＣＲ細胞に基づく分析を実行して化合物スクリーニングとプロファイリングを可能にするリアルタイムの測定方法を開示するものである。この方法により、細胞を遺伝的に操作して上記受容体を過剰発現することなく、生体細胞内の、内在性を有するが比較的高度に発現されたＧＰＣＲを研究することが可能になる。
【００５４】
（２）本発明は、スループットの増大という利点を持つセンサを１個だけ用いて多重化細胞分析（multiplexed cell-based assays）を実行するための方法を開示するものである。
【００５５】
（３）好適な光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４は、ＳＰＲセンサ１０４または導波路グレーティング型センサ１０４である。偏光解析装置、エバネッセント波装置および反射率測定装置などの他の光学バイオセンサも使用することができる。これらの２つのタイプの光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の構造および動作のより詳細な説明については、以下の文献を参照されたい。
【００５６】
・米国特許第４８１５８４３号明細書（発明の名称：ガス状、液状、固体状および多孔質のサンプルの屈折率変化の検出または物質の選択的検出の双方またはいずれか一方を実行する光学センサ（Optical Sensor for Selective Detection of Substances and/or for the Detection of Refractive Index Changes in Gaseous, Liquid, Solid and Porous Samples））
・Ｋ．Ｔｉｅｆｅｎｔｈａｌｅｒ ｅｔ ａｌ．共著、「集積化光学スイッチおよびガスセンサ（Integrated Optical Switches and Gas Sensors）」、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．１０、Ｎｏ．４、１９８４年４月、１３７〜１３９ページ。
【００５７】
上記文献の内容は本願明細書に援用されるものとする。
【００５８】
上記の通り、本発明の種々の実施例を添付図面に示しつつ説明したが、本発明は、開示された上記実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の主旨を逸脱することなく、非常に多くの再構成例、変形例および置換例を含み得る点を理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、生体細胞内の質量再分布（たとえば、ＧＰＣＲ転位）を測定するために使用される、本発明に係る光学的ＬＩＤシステムを示す図である。
【図２】図２は、図１に示した本発明に係る光学的ＬＩＤシステムから出力された時間依存性の光学的応答を解析することにより確認することができた生体細胞内のＧＰＣＲ転位に関する色々な状態を示す図である。
【図３】図３は、本発明に係る光学的ＬＩＤバイオセンサを用いて、生体細胞内のＧＰＣＲ転位を含む作動薬誘発性の質量再分布をリアルタイムに測定する方法の基本手順を示すフローチャートである。
【図４】図４は、本発明に係る光学的ＬＩＤバイオセンサを用いて、生体細胞内の質量再分布に基づき標的ＧＰＣＲに対する作動薬のスクリーニングの方法の基本手順を示すフローチャートである。
【図５】図５は、本発明に係る光学的ＬＩＤバイオセンサを用いて、生体細胞内の質量再分布に基づき標的ＧＰＣＲに対する拮抗薬のスクリーニングの方法の基本手順を示すフローチャートである。
【図６】図６は、図３〜図５に示した本発明に係る方法のいずれでも使用できる自己参照型光学的ＬＩＤバイオセンサを構成する方法の基本手順を示すフローチャートである。
【図７】図７は、図３〜図５に示した本発明に係る方法のいずれでも使用でき、且つ、同一センサ内の空間的に分離した領域に付着した２タイプの細胞を与える自己参照型光学的ＬＩＤバイオセンサを構成する他の方法の基本手順を示すフローチャートである。
【図８】図８は、本発明に係る光学的ＬＩＤバイオセンサを用いて、複数のタイプの生体細胞における作動薬誘発性のＧＰＣＲ質量再分布を測定する方法の基本手順を示すフローチャートである。
【図９】図９は、本発明に係る光学的ＬＩＤバイオセンサを用いて、質量再分布に基づき単一タイプの生体細胞内の複数のＧＰＣＲに対する作動薬のスクリーニングの方法の基本手順を示すフローチャートである。
【図１０】図１０は、化合物の添加前後のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の時間依存性のＬＩＤ応答を示す図である。
【図１１】図１１は、作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化に起因する質量再分布の様々な動態を示す図である。
【図１２】図１２は、図２の中で強調されたステージ３での作動薬誘発性の質量変化の化合物依存性応答の総量を示す図である。
【図１３】図１３は、化合物の添加前後の、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の時間依存性のＬＩＤ応答を示す図であり、化合物濃度として全ての化合物について１０μＭが使用されている。
【図１４】図１４は、化合物の添加前後の、過剰発現したラットのムスカリン受容体のサブタイプ１を有し遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（それ故、この細胞株は、Ｍ１ ＣＨＯと表現されている。）の時間依存性のＬＩＤ応答を示す図であり、化合物濃度として全ての化合物について１０μＭが使用されている。
【図１５】図１５は、図２の中で強調されたステージ３での化合物依存性応答の総量を、２個の異なる細胞株について比較したものである。
【図１６】図１６は、オキソトレモリンＭ（１０μＭ）の添加前後の、２タイプの細胞（ＣＨＯおよびＭ１ ＣＨＯ）の時間依存性のＬＩＤ応答を示す図であり、化合物添加前に、ＨＢＳＳ緩衝液（インビトロゲン社：Invitrogen）を有する場合（ＤＩＰを有していない場合）またはダイナミン抑制ペプチド（ＤＩＰ）を有する場合について、細胞は、５０μＭの濃度で４５分間、事前に保温・培養されている。
【図１７】図１７は、クロニジン（１０μＭ）の添加前後の、２タイプの細胞（ＣＨＯおよびＭ１ ＣＨＯ）の時間依存性のＬＩＤ応答を示す図であり、化合物添加前に、ＨＢＳＳ緩衝液（インビトロゲン社：Invitrogen）を有する場合（ＤＩＰを有していない場合）またはダイナミン抑制ペプチド（ＤＩＰ）を有する場合について、細胞は、５０μＭの濃度で４５分間、事前に保温・培養されている。
【図１８】図１８は、ＮＥＣＡ（１０μＭ）の添加前後の２タイプの細胞（ＣＨＯおよびＭ１ ＣＨＯ）の時間依存性のＬＩＤ応答を示す図であり、化合物添加前に、ＨＢＳＳ緩衝液（インビトロゲン社：Invitrogen）を有する場合（ＤＩＰを有していない場合）またはダイナミン抑制ペプチド（ＤＩＰ）を有する場合について、細胞は、５０μＭの濃度で４５分間、事前に保温・培養されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月3日(2007.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識無依存検出型の光学的ＬＩＤバイオセンサを使用して、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に付着した生体細胞内の質量再分布を測定することを特徴とする生体細胞に基づく分析方法。
【請求項２】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの使用により、前記生体細胞におけるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の作動薬誘発性の活性化に起因する質量再分布を測定可能にするに当たり、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に生体細胞を配置して前記生体細胞を前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより前記生体細胞内の作動薬誘発性のＧＰＣＲ転位を測定可能にする、
分析方法。
【請求項３】
請求項２記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた細胞媒体の中に前記化合物含有溶液を添加する前に、少なくとも１回、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた細胞媒体の中に緩衝溶液を添加する分析方法。
【請求項４】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの使用により、生体細胞内の質量再分布に基づいて標的Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する作動薬のスクリーニングを実行可能にするに当たり、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記生体細胞を付着させ、
所定の親和性を持つ拮抗薬を一定濃度で含む溶液を前記細胞媒体の中に添加して前記光学的ＬＩＤバイオセンサを安定化させ、
前記拮抗薬から離れて競合するために十分に高い濃度を有する化合物を含む溶液を、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた細胞媒体の中に添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより前記生体細胞内の質量再分布に基づいて標的Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する作動薬のスクリーニングを実行可能にする、
分析方法。
【請求項５】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用いて、生体細胞内の質量再分布に基づいて標的Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する拮抗薬のスクリーニングを行うに当たり、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記生体細胞を付着させ、
所定の親和性を持つ作動薬を一定濃度で含む溶液を、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に添加し、
前記作動薬に起因する転位が発生する前に、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより生体細胞内の質量再分布に基づいて標的ＧＰＣＲに対する拮抗薬のスクリーニングを実行可能にする、
という手順を実行する分析方法。
【請求項６】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用いた処理を実行する前に、
スタンプを用いて前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の一部部位を遮蔽して前記生体細胞の付着を防止し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の遮蔽されていない部位を覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の当該遮蔽されていない部位に前記生体細胞を接着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面から前記スタンプを除去する、
という手順を実行して当該光学的ＬＩＤバイオセンサを自己参照型の光学的ＬＩＤバイオセンサに形成する分析方法。
【請求項７】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用いた処理を実行する前に、
スタンプを用いて前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の一部部位を遮蔽して前記生体細胞の付着を防止し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の遮蔽されていない部位を覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の当該遮蔽されていない部位に前記生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面から前記スタンプを除去し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の当該遮蔽部位を覆うように前記細胞媒体と同じ細胞媒体の中に第２のタイプの細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの当該遮蔽部位に前記第２のタイプの細胞を付着させる、
という手順を実行して当該光学的ＬＩＤバイオセンサを自己参照型光学的ＬＩＤバイオセンサに形成する分析方法。
【請求項８】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの使用により、複数のタイプからなる前記生体細胞におけるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の作動薬誘発性の光学的応答に起因する質量再分布を測定可能にするに当たり、
複数の前記光学的ＬＩＤバイオセンサからなる配列を含むチャンバーを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサのうちの少なくとも１つを覆うように細胞媒体の中に第１のタイプの生体細胞を配置して当該少なくとも１つの光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記第１のタイプの生体細胞を付着させ、
被覆されていない残る光学的ＬＩＤバイオセンサのうちの少なくとも１つを覆うように細胞媒体の中に第２のタイプの生体細胞を配置して当該少なくとも１つの被覆されていない残る光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記第２のタイプの生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの各々の上の生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより複数のタイプの生体細胞内の作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化を測定可能にする、
分析方法。
【請求項９】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの使用により、複数のタイプからなる前記生体細胞におけるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の作動薬誘発性の活性化に起因する質量再分布を測定可能にするに当たり、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
スタンプを用いて前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の一部部位を遮蔽して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの当該一部部位への前記生体細胞の付着を防止し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の遮蔽されていない部位を覆うように細胞媒体の中に第１のタイプの生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面の当該遮蔽されていない部位に前記第１のタイプの生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面から前記スタンプを除去し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に第２のタイプの生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサ上表面の被覆されていない部位に前記第２のタイプの生体細胞を付着させ、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記光学的ＬＩＤバイオセンサ上の前記２タイプの生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより複数のタイプからなる前記生体細胞内の作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化を測定可能にする、
分析方法。
【請求項１０】
請求項１記載の分析方法であって、前記光学的ＬＩＤバイオセンサの使用により、単一タイプの生体細胞内の複数のＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する作動薬のスクリーニングを実行可能にするに当たり、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に前記生体細胞を配置して前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に前記生体細胞を付着させ、
複数の拮抗薬からなる混合液を含む溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた前記細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し、
前記光学的ＬＩＤバイオセンサに対する計測を実行して前記生体細胞内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答を得ることにより前記生体細胞内の複数のＧＰＣＲに対する作動薬のスクリーニングを実行可能にする、
分析方法。
【請求項１１】
計測システムと、
標識無依存検出型の光学的ＬＩＤバイオセンサと、
からなり、
前記計測システムは、前記光学的ＬＩＤバイオセンサに光ビームを照射し、前記光学的ＬＩＤバイオセンサからの戻り光ビームを受光することにより前記光学的ＬＩＤバイオセンサの表面に置かれた生体細胞内の質量再分布を測定することを特徴とするシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
他の実施例として、図８に示す方法８００を用いて多重生体細胞測定を同時に実行するように本発明を強化することができる。方法８００によれば、以下の手順に従って、複数種の生体細胞１０８における作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化に起因する質量再分布を測定することができる。すなわち、（ａ）複数の光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４からなる配列を含むチャンバー（マイクロプレート）を用意し（ステップ８０２）、（ｂ）これら光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４のうちの少なくとも１つのバイオセンサを覆う細胞媒体の中に第１のタイプの生体細胞１０８を配置し、当該少なくとも１つのバイオセンサ１０４の表面１１０に当該第１のタイプの生体細胞１０８が付着できるようにし（ステップ８０４）、（ｃ）被覆されていない残る光学的ＬＩＤバイオセンサのうちの少なくとも１つのバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に第２のタイプの生体細胞１０８を配置して、当該少なくとも１つの残る光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０に当該第２のタイプの生体細胞１０８が付着できるようにし（ステップ８０６）、（ｄ）覆いのある光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の表面１１０に置かれた細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し（ステップ８０８）、当該覆いのある光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４に対する計測を実行して、当該覆いのある光学的ＬＩＤバイオセンサ１０４の各々の生体細胞１０８内の質量再分布を表す時間依存性の光学的応答２０１を測定する（ステップ８１０）、という手順である。
【国際調査報告】
2008536117.tif 000021
2008536117.tif 000022
2008536117.tif 000023