(57)【要約】  本発明は、遺伝子発現を阻害するための化学修飾オリゴヌクレオチド剤を作製し、使用するための組成および方法に関する。
2008509670.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）を有する少なくとも一つのサブユニットが組み込まれているオリゴヌクレオチド剤、およびリガンドを備える複合体。
【化１】
2008509670.tif 000127
（式中、
Ｘは、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７、またはＣＨ２であり、
Ｙは、ＮＲ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であるか、または存在せず、
Ｚは、ＣＲ１１Ｒ１２であるか、または存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０はそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＲａ、ＯＲｂ、（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるが、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうちの少なくとも一つはＯＲａまたはＯＲｂであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうちの少なくとも一つは（ＣＨ２）ｎＯＲａまたは（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１、およびＲ１２はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜３個のＲ１３で任意に置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、もしくはＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であるか、またはＲ５およびＲ１１はともに、Ｒ１４で任意に置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキルであり、
Ｒ７は、Ｒｄ、またはＮＲｃＲｄもしくはＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルであり、
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１３は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり、
Ｒ１４は、ＮＲｃＲ７であり、
Ｒａは、
【化２】
2008509670.tif 000128
であり、
Ｒｂは、
【化３】
2008509670.tif 000129
であり、
ＡおよびＣはそれぞれ独立して、ＯまたはＳであり、
Ｂは、ＯＨ、Ｏ−、または
【化４】
2008509670.tif 000130
であり、
Ｒｃは、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒｄは、Ｈまたはリガンドであり、
ｎは、１〜４である）
【請求項２】
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、Ｚは存在しない請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄである請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
Ｒｄは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンＡ基、ビタミンＥ基、ビタミンＫ基、およびビタミンＢ１２基からなる群から選択される請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
Ｒｄはコレステロール基である請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、Ｒ９はＯＲａである請求項２に記載の複合体。
【請求項７】
Ｒ１およびＲ９はトランス型である請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
ｎは１である請求項６に記載の複合体。
【請求項９】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、Ｒ９はＯＲｂである請求項２に記載の複合体。
【請求項１０】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲａであり、Ｒ９はＯＲｂである請求項２に記載の複合体。
【請求項１１】
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、Ｒ９はＯＲａである請求項２に記載の複合体。
【請求項１２】
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、Ｒ９はＯＲｂである請求項２に記載の複合体。
【請求項１３】
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲａであり、Ｒ９はＯＲｂである請求項２に記載の複合体。
【請求項１４】
Ｒ３はＯＲａであり、Ｒ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂである請求項２に記載の複合体。
【請求項１５】
Ｒ３はＯＲｂであり、Ｒ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂである請求項２に記載の複合体。
【請求項１６】
Ｒ３はＯＲｂであり、Ｒ９は（ＣＨ２）ｎＯＲａである請求項２に記載の複合体。
【請求項１７】
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２である請求項１に記載の複合体。
【請求項１８】
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＮＲ８であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２である請求項１に記載の複合体。
【請求項１９】
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＯであり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２である請求項１に記載の複合体。
【請求項２０】
ＸはＣＨ２であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ５およびＲ１１はともにＣ６シクロアルキルを形成する請求項１に記載の複合体。
【請求項２１】
ＸはＣＨ２であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ５およびＲ１１はともにＣ５シクロアルキルを形成する請求項１に記載の複合体。
【請求項２２】
前記リガンドは、脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、コレステリル残基、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択された親油性部分を備える請求項１に記載の複合体。
【請求項２３】
前記リガンドは３’末端サブユニットに結合している請求項１に記載の複合体。
【請求項２４】
前記リガンドは５’末端サブユニットに結合している請求項１に記載の複合体。
【請求項２５】
前記リガンドは内部サブユニットに結合している請求項１に記載の複合体。
【請求項２６】
請求項１に記載の複合体を細胞に与える工程を備える標的遺伝子を阻害する方法。
【請求項２７】
前記複合体を生物に投与する請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞は生物の外にある請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞は細胞系の一細胞である請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の複合体を対象に投与する工程を備える、対象内の標的遺伝子の発現を調節する方法。
【請求項３１】
請求項１に記載のｉＲＮＡ剤、および薬剤として許容される担体を備える薬剤組成物。
【請求項３２】
請求項１に記載の複合体、該複合体が封じ込められている滅菌容器、および使用説明書を備えるキット。
【請求項３３】
請求項１に記載の複合体のオリゴヌクレオチド剤の合成に好適なモノマー。
【請求項３４】
腎臓の障害を治療するために請求項１に記載の複合体を使用する方法。
【請求項３５】
眼障害を治療するために請求項１に記載の複合体を使用する方法。
【請求項３６】
ウイルス性障害を治療するために請求項１に記載の複合体を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、遺伝子発現を調節するのに有用な、化学修飾されたオリゴヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、遺伝子発現を阻害するための、１本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチド、および修飾オリゴヌクレオチドの作製および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
さまざまな核酸種が、遺伝子発現を修飾する能力を有している。これらは、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマー、およびデコイＲＮＡを含む。これらの核酸種はそれぞれ、異なる機序により遺伝子発現を阻害することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、オリゴヌクレオチド剤（以下で定義される）およびリガンドの複合体を使用することにより遺伝子発現を調節する、つまり阻害もしくはアップレギュレートのいずれかを行うための方法および組成物を特徴とする。組成物は、複合されたオリゴヌクレオチド剤だけでなく、複合されたオリゴヌクレオチド剤のいくつかの成分であるか、または複合されたオリゴヌクレオチド剤を作製するために使用することができる複合されたモノマーを含む。複合されたオリゴヌクレオチド剤は、核酸、例えば、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉ−ＲＮＡ前駆体（プレｍｉＲＮＡ）、もしくはＤＮＡ、またはタンパク質を標的とし、それらに結合することにより遺伝子発現を修飾することができる。本発明の特徴とするオリゴヌクレオチド剤は、例えば、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、デコイＲＮＡ、ＤＮＡ、またはアプタマーでもよい。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、本発明は、リガンドに連結されたオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。リガンドは、モノマー、例えば、オリゴヌクレオチド剤内に組み込まれた化学修飾モノマーを介してオリゴヌクレオチド剤に結合され得る。好ましい一実施形態では、本願に記載されているように、この連結はテザーまたはリンカー（またはその両方）によるものであり、この複合体は以下のように表される式を有する。
【０００５】
リガンド−［リンカー］オプション−［テザー］オプション−オリゴヌクレオチド剤
ほとんどの場合、実施形態は多数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド剤に関して説明されているが、本発明は、以下の構造を有するモノマーサブユニットを含む。
【０００６】
リガンド−［リンカー］オプション−［テザー］オプション−モノマー
本発明には、モノマーを作製してオリゴヌクレオチド剤中に組み込む方法、およびそれらの薬剤を使用する方法が含まれる。
【０００７】
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド剤のヌクレオチドの（例えば、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド）サブユニットの１つまたは複数の糖、例えばリボース糖を、他の構成成分、例えば非炭水化物（好ましくは、環式）担体で置き換えることが可能である。サブユニットの糖がそうして置き換えられたヌクレオチド・サブユニットは、本願では糖置換修飾サブユニット（ＳＲＭＳ）と呼ばれる。これは、本願では「テザー」（または「繋留（する）」）と呼ばれることが多い。環状担体は炭素環系であり、つまり、すべての環原子が炭素原子であり、または複素環系であり、つまり、１つまたは複数の環原子がヘテロ原子、例えば窒素、酸素、または硫黄でもよい。環状担体は単環系であるか、または２つもしくはそれ以上の環を含む例えば縮合環でもよい。環状担体は完全飽和環系であるか、または２つもしくはそれ以上の二重結合を含んでもよい。
【０００８】
担体は、さらに（ｉ）少なくとも２つの「骨格結合点」および（ｉｉ）少なくとも１つの「繋留結合点」を含む。本願で使用されている「骨格結合点」は、官能基、例えばヒドロキシル基、または一般に、担体を骨格に、例えばリボ核酸のリン酸、または修飾リン酸、例えば硫黄含有リン酸骨格に組み込むのに利用可能であり、また好適である結合を指す。本願で使用されている「繋留結合点」は、環状担体の構成環原子、例えば選択された構成成分をつなぐ炭素原子またはヘテロ原子（骨格結合点を与える原子とは異なる）を指す。構成成分は、例えばリガンド、例えば標的または送達構成成分、または物理的特性を改変する構成成分でもよい。最も好ましい構成成分の一つは、細胞内への進入を促進する構成成分、例えば親油性部分、例えばコレステロールである。理論に縛られることは望まないが、親油性薬剤の結合は、オリゴヌクレオチド剤の親油性を高めると考えられている。任意で、選択された構成部分が環状担体への介在テザーによりつながれる。そのため、多くの場合、官能基、例えばアミノ基を含むか、または一般的に、構成環への他の化学物質例えばリガンドの組み込み、または繋留に適している結合をもたらす。
【０００９】
本願に記載されている１つまたは複数のＳＲＭＳをオリゴヌクレオチド剤に組み込むことで、特に適切な化学物質に繋留した場合に、１つまたは複数の新しい特性をオリゴヌクレオチド剤に付加し、および／またはオリゴヌクレオチド剤中の１つまたは複数の既存の特性を改変、強化、または調節することができる。例えば、親油性またはヌクレアーゼ耐性のうちの１つまたは複数を改変することができる。本願に記載されている１つまたは複数のＳＲＭＳをオリゴヌクレオチド剤中に組み込むことにより、特にＳＲＭＳが適切な化学物質に繋留される場合に、対象の標的ＲＮＡ、例えばプレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、または対象のｍｉＲＮＡもしくは病原体へのオリゴヌクレオチド剤の結合親和力を調節、例えば増大させることができる。１つまたは複数のＳＲＭＳを組み込むことにより、分布を改変するか、オリゴヌクレオチド剤標的を人体の特定の部分とするか、核酸結合タンパク質との相互作用を調節するか（例えば、ＲＩＳＣ形成および鎖分離時に）、配列を著しく増やし、例えば部位を外れた標的を阻害することができる。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は構造式（Ｉ）を有する少なくとも一つのサブユニットを好ましくは含むオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。
【００１１】
【化１】
2008509670.tif 000003
式中、
Ｘは、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７、またはＣＨ２であり、
Ｙは、ＮＲ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であるか、または存在せず、
Ｚは、ＣＲ１１Ｒ１２であるか、または存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０はそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＲａ、ＯＲｂ、（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるが、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうちの少なくとも一つはＯＲａまたはＯＲｂであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうちの少なくとも一つは（ＣＨ２）ｎＯＲａまたは（ＣＨ２）ｎＯＲｂ（ＳＲＭＳが末端の場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうちの一つがＲａを含み、一つがＲｂを含み、ＳＲＭＳＳが内部にある場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうちの２つはそれぞれＲｂを含む）であり、さらに、好ましくはＯＲａは（ＣＨ２）ｎＯＲｂとのみ存在することがあり、（ＣＨ２）ｎＯＲａはＯＲｂとのみ存在することがあり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１、およびＲ１２はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜３個のＲ１３で任意に置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、もしくはＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であるか、またはＲ５およびＲ１１はともに、Ｒ１４で任意に置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキルであり、
Ｒ７はリガンドでもよく、例えばＲ７は、Ｒｄでもよく、または例えば繋留構成成分、例えばＮＲｃＲｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキル、もしくはＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルを介して担体に間接的に繋留されたリガンドでもよく、
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１３は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり、
Ｒ１４は、ＮＲｃＲ７であり、
Ｒａは、
【００１２】
【化２】
2008509670.tif 000004
であり、
Ｒｂは、
【００１３】
【化３】
2008509670.tif 000005
であり、
ＡおよびＣのそれぞれは独立して、ＯまたはＳであり、
Ｂは、ＯＨ、Ｏ−、または
【００１４】
【化４】
2008509670.tif 000006
であり、
Ｒｃは、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒｄは、Ｈまたはリガンド、例えば親油性リガンド、例えばコレステロールであり、
ｎは、１〜４である。
【００１５】
実施形態は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含むことができる。
Ｒ１はＣＨ２ＯＲａであるとともにＲ３はＯＲｂでもよいし、Ｒ１はＣＨ２ＯＲａであるとともにＲ９はＯＲｂでもよいし、またはＲ１はＣＨ２ＯＲａであるとともにＲ２はＯＲｂでもよい。
【００１６】
Ｒ１はＣＨ２ＯＲｂであるとともにＲ３はＯＲｂでもよいし、Ｒ１はＣＨ２ＯＲｂであるとともにＲ９はＯＲｂでもよいし、Ｒ１はＣＨ２ＯＲｂであるとともにＲ２はＯＲｂでもよいし、Ｒ１はＣＨ２ＯＲｂであるとともにＲ３はＯＲａでもよいし、Ｒ１はＣＨ２ＯＲｂであるとともにＲ９はＯＲａでもよいし、Ｒ１はＣＨ２ＯＲｂであるとともにＲ２はＯＲａでもよい。
【００１７】
Ｒ１はＯＲａであるとともにＲ３はＣＨ２ＯＲｂでもよいし、Ｒ１はＯＲａであるとともにＲ９はＣＨ２ＯＲｂでもよいし、Ｒ１はＯＲａであるとともにＲ２はＣＨ２ＯＲｂでもよい。
【００１８】
Ｒ１はＯＲｂであるとともにＲ３はＣＨ２ＯＲｂでもよいし、Ｒ１はＯＲｂであるとともにＲ９はＣＨ２ＯＲｂでもよいし、Ｒ１はＯＲｂであるとともにＲ２はＣＨ２ＯＲｂでもよいし、Ｒ１はＯＲｂであるとともにＲ３はＣＨ２ＯＲａでもよいし、Ｒ１はＯＲｂであるとともにＲ９はＣＨ２ＯＲａでもよいし、Ｒ１はＯＲｂであるとともにＲ２はＣＨ２ＯＲａでもよい。
【００１９】
Ｒ３はＣＨ２ＯＲａであるとともにＲ９はＯＲｂでもよいし、Ｒ３はＣＨ２ＯＲａであるとともにＲ４はＯＲｂでもよい。
Ｒ３はＣＨ２ＯＲｂであるとともにＲ９はＯＲｂでもよいし、Ｒ３はＣＨ２ＯＲｂであるとともにＲ４はＯＲｂでもよいし、Ｒ３はＣＨ２ＯＲｂであるとともにＲ９はＯＲａでもよいし、Ｒ３はＣＨ２ＯＲｂであるとともにＲ４はＯＲａでもよい。
【００２０】
Ｒ３はＯＲｂであるとともにＲ９はＣＨ２ＯＲａでもよいし、Ｒ３はＯＲｂであるとともにＲ４はＣＨ２ＯＲａでもよいし、Ｒ３はＯＲｂであるとともにＲ９はＣＨ２ＯＲｂでもよいし、Ｒ３はＯＲｂであるとともにＲ４はＣＨ２ＯＲｂでもよい。
【００２１】
Ｒ３はＯＲａであるとともにＲ９はＣＨ２ＯＲｂでもよいし、Ｒ３はＯＲａであるとともにＲ４はＣＨ２ＯＲｂでもよい。
Ｒ９はＣＨ２ＯＲａであるとともにＲ１０はＯＲｂでもよい。
【００２２】
Ｒ９はＣＨ２ＯＲｂであるとともにＲ１０はＯＲｂでもよいし、Ｒ９はＣＨ２ＯＲｂであるとともにＲ１０はＯＲａでもよい。
好ましい一実施形態では、リボースはピロリン骨格または４−ヒドロキシプロリン由来骨格で置き換えられており、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、Ｚは存在しない。
【００２３】
Ｒ１およびＲ３はシス型でもよいし、Ｒ１およびＲ３はトランス型でもよい。
ｎは１でもよい。
ＡはＯまたはＳでもよい。
【００２４】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ３はＯＲｂでもよいし、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲａであるとともにＲ３はＯＲｂでもよい。
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄでもよい。Ｒｄは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンＡ基、ビタミンＥ基、ビタミンＫ基から選択され得る。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【００２５】
Ｒ１はＯＲｂであるとともにＲ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよいし、Ｒ１はＯＲｂであるとともにＲ３は（ＣＨ２）ｎＯＲａでもよいし、Ｒ１はＯＲａであるとともにＲ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよいし、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ９はＯＲａでもよい。
【００２６】
Ｒ１およびＲ９はシス型でもよいし、Ｒ１およびＲ９はトランス型でもよい。
Ｒ１はＯＲａであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよいし、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ９はＯＲｂでもよいし、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲａＲ９はＯＲｂでもよいし、Ｒ１はＯＲｂであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよいし、Ｒ１はＯＲｂであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲａでもよい。
【００２７】
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ９はＯＲａでもよいし、Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ９はＯＲｂでもよいし、Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲａであるとともにＲ９はＯＲｂでもよいし、Ｒ３はＯＲａであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよいし、Ｒ３はＯＲｂであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよいし、Ｒ３はＯＲｂであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲａでもよい。
【００２８】
Ｒ３およびＲ９はシス型でもよいし、Ｒ３およびＲ９はトランス型でもよい。
好ましい他の実施形態では、リボースはピペリジン骨格で置き換えられており、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
【００２９】
Ｒ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ１０はＯＲａでもよい。
ｎは１または２でもよい。
Ｒ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ１０はＯＲｂでもよいし、Ｒ９は（ＣＨ２）ｎＯＲａであるとともにＲ１０はＯＲｂでもよい。
【００３０】
Ａは、ＯまたはＳでもよい。
Ｒ７は、（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄでもよい。Ｒｄは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンＡ基、ビタミンＥ基、ビタミンＫ基から選択され得る。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【００３１】
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ４はＯＲａでもよいし、Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ４はＯＲｂでもよいし、Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲａであるとともにＲ４はＯＲｂでもよい。
【００３２】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ２はＯＲａでもよいし、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ２はＯＲｂでもよいし、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲａであるとともにＲ２はＯＲｂでもよい。
【００３３】
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ９はＯＲａでもよい。
Ｒ３およびＲ９はシス型でもよいし、Ｒ３およびＲ９はトランス型でもよい。
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ９はＯＲｂでもよいし、Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ９はＯＲａでもよいし、Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲａであるとともにＲ９はＯＲｂでもよい。
【００３４】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ３はＯＲａでもよい。
Ｒ１およびＲ３はシス型でもよいし、Ｒ１およびＲ３はトランスでもよい。
Ｒ３はＯＲａであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよい。
【００３５】
Ｒ１はＯＲａであるとともにＲ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよい。
好ましい他の実施形態では、リボースはピペラジン骨格で置き換えられており、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＮＲ８であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
【００３６】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ３はＯＲａでもよい。
Ｒ１およびＲ３はシス型でもよいし、Ｒ１およびＲ３はトランス型でもよい。
ｎは１でもよい。
【００３７】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ３はＯＲｂでもよいし、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲａであるとともにＲ３はＯＲｂでもよい。
Ａは、ＯまたはＳでもよく、好ましくはＳである。
【００３８】
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄでもよい。Ｒｄは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンＡ基、ビタミンＥ基、ビタミンＫ基の群から選択され得る。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【００３９】
Ｒ８はＣＨ３でもよい。
Ｒ１はＯＲａであるとともにＲ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよい。
好ましい他の実施形態では、リボースはモルホリノ骨格で置き換えられており、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＯであり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
【００４０】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ３はＯＲａでもよい。
Ｒ１およびＲ３はシス型でもよいし、Ｒ１およびＲ３はトランス型でもよい。
ｎは１でもよい。
【００４１】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるとともにＲ３はＯＲｂでもよいし、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲａであるとともにＲ３はＯＲｂでもよい。
ＡはＯまたはＳでもよい。
【００４２】
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄでもよい。Ｒｄは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンＡ基、ビタミンＥ基、ビタミンＫ基の群から選択され得る。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【００４３】
Ｒ８はＣＨ３でもよい。
Ｒ１はＯＲａであるとともにＲ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよい。
好ましい他の実施形態では、リボースはデカリン骨格で置き換えられており、ＸはＣＨ２であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ５およびＲ１１はともにＣ６シクロアルキルである。
【００４４】
Ｒ６はＣ（Ｏ）ＮＨＲ７でもよい。
Ｒ１２は水素でもよい。
Ｒ６およびＲ１２はトランス型でもよい。
【００４５】
Ｒ３はＯＲａであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよい。
Ｒ３およびＲ９はシス型でもよいし、Ｒ３およびＲ９はトランス型でもよい。
ｎは１または２でもよい。
【００４６】
Ｒ３はＯＲｂであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよいし、Ｒ３はＯＲｂであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲａでもよい。
ＡはＯまたはＳでもよい。
【００４７】
Ｒ７は、（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄでもよい。Ｒｄは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンＡ基、ビタミンＥ基、ビタミンＫ基の群から選択され得る。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【００４８】
好ましい他の実施形態では、リボースはデカリン／インダン骨格で置き換えられており、例えばＸはＣＨ２であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ５およびＲ１１はともにＣ５シクロアルキルである。
【００４９】
Ｒ６はＣＨ３でもよい。
Ｒ１２は水素でもよい。
Ｒ６およびＲ１２はトランス型でもよい。
【００５０】
Ｒ３はＯＲａであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂでもよい。
Ｒ３およびＲ９はシス型でもよいし、Ｒ３およびＲ９はトランス型でもよい。
ｎは１または２でもよい。
【００５１】
Ｒ３はＯＲｂであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲａでもよいし、Ｒ３はＯＲｂであるとともにＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲａでもよい。
ＡはＯまたはＳでもよい。
【００５２】
Ｒ１４はＮ（ＣＨ３）Ｒ７でもよい。Ｒ７は、（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄでもよい。Ｒｄは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンＡ基、ビタミンＥ基、ビタミンＫ基の群から選択され得る。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【００５３】
他の態様では、本発明は、構造式（ＩＩ）を有する少なくとも一つのサブユニットを含むオリゴヌクレオチド剤を特徴する。
【００５４】
【化５】
2008509670.tif 000007
Ｘは、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、ＯＲａ、ＯＲｂ、（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであるが、Ｒ１およびＲ２の一方はＯＲａまたはＯＲｂであり、他方は（ＣＨ２）ｎＯＲａまたは（ＣＨ２）ｎＯＲｂ（ＳＲＭＳが末端の場合、Ｒ１またはＲ２の一方がＲａを含み、もう一方がＲｂを含み、ＳＲＭＳＳが内部にある場合、Ｒ１およびＲ２は両方ともそれぞれＲｂを含む）であり、好ましくは、ＯＲａは（ＣＨ２）ｎＯＲｂとのみ存在することがあり、（ＣＨ２）ｎＯＲａはＯＲｂとのみ存在することがあり、
Ｒ７は、ＮＲｃＲｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルであり、
Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１３は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり、
Ｒ１４は、ＮＲｃＲ７であり、
Ｒａは、
【００５５】
【化６】
2008509670.tif 000008
であり、
Ｒｂは、
【００５６】
【化７】
2008509670.tif 000009
であり、
ＡおよびＣはそれぞれは独立して、ＯまたはＳであり、
Ｂは、ＯＨ、Ｏ−、または
【００５７】
【化８】
2008509670.tif 000010
であり、
Ｒｃは、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒｄは、Ｈまたはリガンドであり、
ｎは、１〜４である。
【００５８】
複合体のオリゴヌクレオチド剤は実質的に１本鎖であり、約１２から約２９個のサブユニット、好ましくは約１５から約２５個のサブユニットからなる。実質的に１本鎖のオリゴヌクレオチド剤は、二重でない少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％以上のヌクレオチドを含む。
【００５９】
実施形態は、以下に説明されている特徴のうちの１つまたは複数を含むことができる。
他の態様では、本発明は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）からなる少なくとも１つのサブユニットを有するオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。
【００６０】
一態様では、本発明は、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）からなる少なくとも２つのサブユニットを有するオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。
他の態様では、本発明は、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）からなる少なくとも一つのサブユニットを有する、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤を作製する方法を提示する。さらに他の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を調節する方法を提示する。本発明は、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）からなる少なくとも一つのサブユニットを有する、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤を対象に投与する工程を含む。
【００６１】
一態様では、本発明は、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）からなる少なくとも一つのサブユニットを有する、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤および薬剤として許容される担体を有する薬剤組成物を特徴とする。
【００６２】
本願に記載されているＳＲＭＳまたはテザーは、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤に組み込まれることができる。オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されているＳＲＭＳのうちの１つまたは複数を含むことが可能である。ＳＲＭＳは、オリゴヌクレオチド剤内の１つまたは複数の部位に導入されることができる。ＳＲＭＳは、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端のところ、またはその（１、２、または３位置内の）近くに配置することができる。いくつかの実施形態では、ＳＲＭＳを、オリゴヌクレオチドの５’末端のところ、またはその（１、２、または３位置内の）近くに配置しないようにすることが好ましい。ＳＲＭＳは、内部に入ることができ、標的に結合するうえで重要な意味を持たない領域に位置決めされることが好ましい。
【００６３】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、ＳＲＭＳを３’末端に（または１、２、または３位置内に）持つことが可能である。
他の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、ＳＲＭＳを内部の位置に持つことが可能である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、ＳＲＭＳを３’末端に、またＳＲＭＳを内部の位置に持つことが可能である。
【００６４】
本願に記載されている糖、塩基、または骨格への他の修飾も、オリゴヌクレオチド剤に組み込まれることができる。
オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されているアーキテクチャまたは構造を取ることができる。
【００６５】
オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されている遺伝子のどれかを含む、広範にわたる遺伝子のどれかを標的とするように選択されることができる。
好ましい一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されているアーキテクチャ（アーキテクチャは全長の１つまたは複数を指す）を有する。本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤のＳＲＭＳ含有塩基に加えて、ヌクレアーゼ耐性モノマー（ＮＲＭ）を含むことができる。
【００６６】
他の態様では、本発明は、親油性部分、例えばコレステロールが、例えばオリゴヌクレオチド剤のＳＲＭＳへの複合により複合されるオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。好ましい一実施形態では、親油性部分は、オリゴヌクレオチド剤が細胞内に入ることを促進する。好ましい一実施形態では、細胞は、生命体、組織、または細胞系、例えば初代細胞系、不死化細胞系、または本願で開示されている任意の種類の細胞系の一部である。そのため、複合されたオリゴヌクレオチド剤は、生命体、例えば哺乳類、例えばヒトの標的遺伝子の発現を阻害するために、または細胞系もしくは生命体の外部にある細胞内の標的遺伝子の発現を阻害するために使用されることができる。
【００６７】
親油性部分は、例えば脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、コレステリル残基、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択されることができる。好ましい親油性部分はコレステロールである。
【００６８】
オリゴヌクレオチド剤は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）からなる少なくとも一つのサブユニットを組み込むことができる。オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されている特徴のどれかの１つまたは複数を含むことができる。例えば、サブユニットが式（Ｉ）の場合、Ｒｄはコレステロールでもよく、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、Ｚは存在せず、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、およびＲ３はＯＲａでもよく、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、およびＲ１０はＯＲａでもよく、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＮＲ８であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、およびＲ３はＯＲａでもよく、ＸはＣＨ２でもよく、ＹはＣＲ９Ｒ１０でもよく、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であるとともにＲ６はＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であり、ＸはＣＨ２でもよく、ＹはＣＲ９Ｒ１０でもよく、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であるとともにＲ１１またはＲ１２はＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であり、またはＲ５およびＲ１１はともにＮ（ＣＨ３）Ｒ７で置換されたＣ５またはＣ６シクロアルキルでもよい。
【００６９】
好ましい一実施形態では、親油性部分、例えばコレステロールは、オリゴヌクレオチド剤が滑膜細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、肝細胞、白血球、内皮細胞（例えば、腎細胞）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、上皮細胞、中胚葉細胞、骨髄性細胞、神経系細胞、腫瘍細胞、肥満細胞、または線維芽細胞に進入することを促進する。いくつかの態様では、筋細胞は、平滑筋細胞または心筋細胞でもよく、線維芽細胞は皮膚線維芽細胞でもよく、白血球は単球でもよい。他の好ましい実施形態では、細胞は、膀胱、肺、胸、頸部、結腸、膵臓、前立腺、腎臓、肝臓、皮膚、または神経系（例えば、中枢神経系）などの組織に由来する付着腫瘍細胞系に由来してもよい。
【００７０】
他の態様では、本発明は、親油性部分が複合されるオリゴヌクレオチド剤、例えば本願に記載されている親油性複合オリゴヌクレオチド剤を細胞に与えることにより標的遺伝子の発現を阻害する方法を提示する。好ましい一実施形態では、複合されたオリゴヌクレオチド剤は、生命体、例えば哺乳類、例えばヒトの標的遺伝子の発現を阻害するために、または細胞系もしくは生命体の外部にある細胞内の標的遺伝子の発現を阻害するために使用可能である。生命体全体の場合、この方法は、遺伝子、例えば本願に記載されている遺伝子の発現を阻害し、遺伝子によって媒介される疾患を治療するために使用可能である。生命体の一部ではない細胞、例えば初代細胞系、２代目細胞系、腫瘍細胞系、または形質転換もしくは不死化細胞系上で使用される場合、親油性部分が複合されるオリゴヌクレオチド剤を使用して、遺伝子、例えば、本願に記載されている遺伝子の発現を阻害することができる。生命体全体の一部ではない細胞は、オリゴヌクレオチド剤が遺伝子の発現を阻害する効果を有するかどうかを判定するために、初期スクリーンにおいて使用可能である。生命体全体の一部ではない細胞の試験の後に、動物全体におけるオリゴヌクレオチド剤の試験を行うことができる。好ましいいくつかの実施形態では、送達を容易にするか、または高める他の試薬、例えば細胞膜の通過を高める化合物が存在しない（または量が少ない）場合に、親油性部分に複合されたオリゴヌクレオチド剤が生命体に投与されるか、または生命体の一部ではない細胞に接触する。（少ない量とは、標的細胞に等量の非複合オリゴヌクレオチド剤を入れるために必要であろうものと比較して低い試薬の量でもよい。）例えば、親油性部分に複合されるオリゴヌクレオチド剤が生命体に投与されるか、または生命体の一部ではない細胞に接触することは、追加の親油性部分、トランスフェクション剤、例えばオリゴヌクレオチド剤への細胞透過性を実質的に改変するイオンまたは他の物質の濃縮物、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、［米国カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在］）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（商標）、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（商標）（ミラス社（Ｍｉｒｕｓ）、［米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在］）、ＦｕＧＥＮＥ  ６（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、［米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）所在］）、ポリエチレンイミン、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２  （ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、［米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）］所在）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＥＲ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（ビオンテックス社（Ｂｉｏｎｔｅｘ）、［ドイツ、ミュンヘン（Ｍｕｎｉｃｈ）所在］）などのトランスフェクション剤が存在しない（または量が少ない）場合である。
【００７１】
好ましい一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、インビボ細胞、例えば生命体内の細胞への送達に適している。他の態様では、オリゴヌクレオチド剤は、インビトロ細胞、例えば細胞系内の細胞への送達に適している。
【００７２】
親油性部分が結合されるオリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されている遺伝子を標的とすることができ、本願に記載されている任意の細胞型、例えば生命体、組織、または細胞系内の細胞型に送達することができる。オリゴヌクレオチド剤の送達は、例えば生命体内の細胞に対してはインビボ、または細胞系内の細胞に対してはインビトロでもよい。
【００７３】
他の態様では、本発明は、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤の組成物、特に親油性部分が複合されるオリゴヌクレオチド剤、例えば本願に記載されている親油性複合オリゴヌクレオチド剤の組成物を提供する。好ましい実施形態では、組成物は薬剤として許容される組成物である。
【００７４】
好ましい実施形態では、組成物、例えば薬剤として許容される組成物は、送達を容易にするか、または増強する他の薬剤、例えば細胞膜の通過を高める化合物を含まないか、その量が少ないか、または本質的に含まない。（少ない量とは、標的細胞に等量の非複合オリゴヌクレオチド剤を入れるために必要であろうものと比較して低い試薬の量でもよい。）例えば、この組成物は、追加の親油性部分、トランスフェクション剤、例えばオリゴヌクレオチド剤への細胞透過性を実質的に改変するイオンまたは他の物質の濃縮物、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、［米国カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在］）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（商標）、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（商標）（ミラス社（Ｍｉｒｕｓ）、［米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在］）、ＦｕＧＥＮＥ  ６（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、［米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）所在］）、ポリエチレンイミン、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２  （ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、［米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）］所在）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＥＲ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（ビオンテック社（Ｂｉｏｎｔｅｘ）、［ドイツ、ミュンヘン（Ｍｕｎｉｃｈ）所在］）などのトランスフェクション剤を含まないか、量が少ないか、または本質的に含まない。
【００７５】
好ましい一実施形態では、組成物は、インビボ細胞、例えば生命体内の細胞への送達に適している。他の態様では、オリゴヌクレオチド剤は、インビトロ細胞、例えば細胞系内の細胞への送達に適している。
【００７６】
ＳＲＭＳ含有オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されている方法のいずれかで、例えば本願に記載されている遺伝子のどれかを標的とするか、または本願に記載されている障害のどれかを治療するために使用可能である。これらは、製剤、送達方法、送達様式、キットまたは調製物、例えば、本願に記載されている医薬品のどれかに組み込まれることができる。例えば、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤の１つまたは複数、オリゴヌクレオチド剤が開示されている滅菌容器、および使用説明書を含むキットである。
【００７７】
本発明の方法および組成物、例えば本願に記載されているＳＲＭＳ含有オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤のどれかとともに使用可能である。それに加えて、本発明の方法および組成物は、本願に記載されている疾病または障害の治療に、および対象、例えば動物、ヒトなどの哺乳類の治療に使用可能である。
【００７８】
本発明の方法および組成物、例えば本願に記載されているＳＲＭＳ含有オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されている投与量および／または製剤だけでなく、本願に記載されている投与経路とともに使用可能である。
【００７９】
非リボース骨格とともに、本願に記載されているＳＲＭＳモノマーおよび二量体は本発明の範囲内にある。
「オリゴヌクレオチド剤」は、標的に関するアンチセンスである、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはその両方の１本鎖オリゴマーまたはポリマー、あるいはその修飾形態を指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖類、および共有インターヌクレオシド（骨格）結合、さらには類似の機能を持つ天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾された、または置換されたオリゴヌクレオチドは多くの場合、例えば細胞取り込みの増強、核酸標的の親和力の増大、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの望ましい特性があることから天然型よりも好ましい。
【００８０】
オリゴヌクレオチド剤は、核酸標的（ＮＡＴ）オリゴヌクレオチド剤およびタンパク質標的（ＰＴ）オリゴヌクレオチド剤の両方を含む。ＮＡＴとＰＴオリゴヌクレオチド剤は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはその両方の１本鎖オリゴマーまたはポリマーあるいはその修飾形態を指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖類、および共有インターヌクレオシド（骨格）結合、さらには類似の機能を持つ天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾された、または置換されたオリゴヌクレオチドは多くの場合、例えば細胞取り込みの増強、核酸標的の親和力の増大、および／またはヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの望ましい特性があることから天然型よりも好ましい。特定のＲＮＡまたはＤＮＡ標的に結合するように設計されたＮＡＴは、実質的な相補性、例えば少なくとも７０、８０、９０、または１００％の相補性を標的核酸の少なくとも１０個、２０個、または３０個以上の塩基とともに有し、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および発現を調節することができる他の２本鎖でない構造を含む。他のＮＡＴオリゴヌクレオチド剤は、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、ＤＮＡザイム、およびリボザイムを含む。ＮＡＴオリゴヌクレオチド剤は任意の核酸、例えばｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡを標的とすることができる。これらのＮＡＴオリゴヌクレオチド剤は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相補性を介してその標的に結合する場合もあれば結合しない場合もある。ＰＴオリゴヌクレオチド剤は、好ましくは３次元相互作用に基づいてタンパク質標的に結合し、タンパク質活性を調節する。これらはデコイＲＮＡ、アプタマーなどを含む。
【００８１】
本発明による化合物は、好ましくは約５から約１００個の核酸塩基、例えば約８個から約７５個の核酸塩基、例えば約８個から約５０個の核酸塩基を含む。ＮＡＴオリゴヌクレオチド剤の長さは、好ましくは約１２または約１５ヌクレオチド長、より好ましくは約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。ＰＴオリゴヌクレオチド剤は、好ましくは約１８ヌクレオチド長、より好ましくは２３ヌクレオチド長である。特に好ましい化合物は、ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド、なおいっそう好ましいのは、約１２から約３０個の核酸塩基を含む。
【００８２】
理論に縛られることは望まないが、オリゴヌクレオチド剤は、切断依存または切断独立の機序を含む多数の機序のうちの１つまたは複数により作用することができる。切断に基づく機序は、ＲＮＡｓｅ  Ｈ依存性でもよく、および／またはＲＩＳＣ複合機能を含んでもよい。切断に依存しない機序は、ｍｉＲＮＡにより媒介可能な占有に基づく翻訳阻止、またはアプタマーを行うような、タンパク質へのオリゴヌクレオチド剤の結合を含む。また、オリゴヌクレオチド剤を使用することで、プレｍＲＮＡ内のスプライス部位の選択を変更することにより遺伝子の発現を変えることも可能である。スプライシングの阻害でも、不適切に処理されたメッセージが分解し、遺伝子発現のダウンレギュレーションが生ずることができる。
【００８３】
オリゴヌクレオチド剤は、例えば細胞またはヒトに、１本鎖または２本鎖形態で投与可能である。２本鎖形態であるオリゴヌクレオチド剤は、実質的に相補的なオリゴヌクレオチド鎖に結合される。２本鎖形態のオリゴヌクレオチド剤の送達では、ヌクレアーゼへの耐性が高まるなど、オリゴヌクレオチド剤にいくつかのメリットが生ずることができる。オリゴヌクレオチド剤が２本鎖形態で与えられる場合、オリゴヌクレオチド剤および実質的に相補的な鎖の一方または両方が、修飾、例えば塩基修飾、糖修飾、テザー・リガンドなどを含む、本願に記載されている修飾を含むことができる。
【００８４】
本発明において特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、実質的に相補的なｍｉＲＮＡを標的とすることができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、特定の疾病または障害に関連するｍｉＲＮＡなどの内因性ｍｉＲＮＡを標的とすることができる。一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、腫瘍細胞、例えば肺腫瘍細胞においてアップレギュレーションされるｍｉＲＮＡを標的とする。例えば、オリゴヌクレオチド剤はｍｉＲ−２１を標的とすることができる（シンガラら（Ｓｈｉｎｇａｒａ  ｅｔ  ａｌ）、Ａｍｂｉｏｎ  ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ  １１（６）、２００５年）。他の例では、オリゴヌクレオチド剤は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）またはバーキットリンパ腫においてアップレギュレーションされることが判明しているｍｉＲＮＡを標的とする。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、ｍｉＲ−１５５を標的とすることができる（アイスら（Ｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：３６２７〜３６３２頁、２００５年、メツラーら（Ｍｅｔｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ．Ｃａｎｃｅｒ  ３９：１６７〜１６９頁、２００４年）。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、特定の組織、または特定の細胞型、例えば膵島細胞中に豊富に存在するｍｉＲＮＡを標的とする。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、ｍｉＲ−３７５、つまりグルコース誘発インスリン分泌を抑制することが証明されている膵臓ランゲルハンス島に特異的なｍｉＲＮＡを標的とすることができる（ポイら（Ｐｏｙ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：２２６〜２３０頁、２００４年）。他の実施形態では、本発明で特徴とされているｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド剤は、過小発現が疾病に関連する遺伝子を結合する内因性ｍｉＲＮＡを標的とする。ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド剤でこのようなｍｉＲＮＡを標的とすることにより、疾病に関連した遺伝子のアップレギュレーションが生じ、それにより疾病または障害の症状が緩和する。
【００８５】
例示的な１本鎖オリゴヌクレオチド剤は、ポリペプチドである血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アプロプロテインＢ（ＡｐｏＢ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、血液凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、低酸素誘導因子１−アルファ・サブユニット（Ｈｉｆ−１α）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）、ラミンＡ／Ｃ、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡを標的とすることができる。例示的な１本鎖オリゴヌクレオチド剤は、以下の表１にまとめられている。追加の好適なｍｉＲＮＡ標的は、例えば、ジョンら（Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ）、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１８６２〜１８７９頁、２００４年（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＰＬｏＳ  ３：１３２８頁、２００５年）、およびＴｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（グリフィス−ジョーンズ  エス．（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．）、ＮＡＲ  ３２：Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁、２００４年）で説明されている。
【００８６】
【表１】
2008509670.tif 000011
2008509670.tif 000012
本発明の特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、内因性ｍｉＲＮＡなどの、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。第２のヌクレオチド配列に実質的に同一であるオリゴヌクレオチド配列は、その第２のヌクレオチド配列と７０％、８０％、９０％、またはそれ以上同一である。好ましくは、薬剤は内因性ｍｉＲＮＡと配列が同じである。ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列と実質的に同一であるオリゴヌクレオチド剤は、ｍｉＲＮＡ欠乏が疾病または障害に連関している場合などに細胞またはヒトに送達され、内因性ｍｉＲＮＡの活性を置き換えるか、または補完することができる。一実施形態では、本発明で特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、特定の癌においてダウンレギュレーションされるか、または失われることが知られているｍｉＲＮＡと実質的に同一であるヌクレオチド配列を持つことができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、および前立腺癌の多くの場合にダウンレギュレーションされるか、失われることが知られているｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１５（例えば、ｍｉＲ−１５ａまたはｍｉＲ−１５ｂ）またはｍｉＲ−１６と実質的に同一であるヌクレオチド配列を持つことができる（カリンら（Ｃａｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ９９：１５５２４〜１５５２９頁、２００２年）。他の実施例では、オリゴヌクレオチド剤は、結腸直腸新生物の腺腫様および癌段階の多くの場合にダウンレギュレーションされることが知られているｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５と実質的に同一であるヌクレオチド配列を持つことができる（マイケルら（Ｍｉｃｈｅａｌ  ｅｔ  ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：８８２〜８９１頁、２００３年）。さらに他の実施例では、オリゴヌクレオチド剤は、肺癌組織中でダウンレギュレーションされることが知られているｍｉＲＮＡであるｌｅｔ−７と実質的に同一であるヌクレオチド配列を持つことができる（ジョンソンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｃｅｌｌ  １２０：６３５〜６４７頁、２００５年）。上述のようなｍｉＲＮＡの少なくとも一部と実質的に同一であるオリゴヌクレオチド剤を対象に投与して、ｍｉＲＮＡ発現のダウンレギュレーションに関連する疾病または障害を治療することができる。他の好適なオリゴヌクレオチド剤は、例えば、ジョンら（Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ）、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１８６２〜１８７９頁、２００４年（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＰＬｏＳ  ３：１３２８頁、２００５年）、およびＴｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（グリフィス−ジョーンズＳ．（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．）、ＮＡＲ  ３２：Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁、２００４年）で説明されているｍｉＲＮＡと実質的に同一である。
【００８７】
ミクロＲＮＡ型オリゴヌクレオチド剤
オリゴヌクレオチド剤はミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。ミクロＲＮＡは、翻訳阻止または標的ｍＲＮＡの分解などにより、細胞中の特定の遺伝子の転写後サイレンシングを引き起こすことが可能な小さな非コーディングＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、完全相補的であるか、または標的核酸との非相補性を有する領域を持つ可能性があり、その結果、非相補性を有する領域に「バルジ」が生じる。非相補性の領域（バルジ）は、十分な相補性、好ましくは２本鎖を形成できる完全な相補性を持つ領域によりその両脇を固めることができる。好ましくは、相補性を持つ領域は、少なくとも８から１０ヌクレオチド長である（例えば、８、９、または１０ヌクレオチド長）。ｍｉＲＮＡは、ミクロＲＮＡが標的核酸に対し完全には相補的でない場合などに翻訳を抑制することにより、またはｍｉＲＮＡが完全な相補性を有する標的を結合する場合にのみ発生すると信じられる標的ＲＮＡ分解を引き起こすことにより、遺伝子発現を阻害することができる。本発明はさらに、標的に結合された場合にバルジを形成する場合もしない場合もあるｍｉＲＮＡの２本鎖前駆体を含むことができる。
【００８８】
好ましい一実施形態では、本発明で特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、内因性ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡを標的とすることができる。本発明で特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、天然に存在する核酸塩基、糖類、および共有インターヌクレオシド（骨格）結合、さらには類似の機能を持つ天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。このような修飾された、または置換されたオリゴヌクレオチドは多くの場合、例えば細胞取り込みの増強、内因性ｍｉＲＮＡ標的の親和力の増大、および／またはヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの望ましい特性があることから天然型よりも好ましい。特定の内因性ｍｉＲＮＡに結合するように設計されたオリゴヌクレオチド剤は実質的相補性を有しており、例えば少なくとも７０、８０、９０、または１００％の相補性を有しており、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも１０個、２０個、または２５個もしくはそれ以上の塩基を有する。
【００８９】
ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡは、１８〜１００ヌクレオチド長、より好ましくは１８〜８０ヌクレオチド長でもよい。成熟ｍｉＲＮＡは、１９〜３０ヌクレオチド長、好ましくは２１〜２５ヌクレオチド長、特に２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長でもよい。ミクロＲＮＡ前駆体は、７０〜１００ヌクレオチド長でもよいし、ヘアピン立体配座でもよい。ミクロＲＮＡは、長いプレｍｉＲＮＡを機能的ｍｉＲＮＡに特異的に処理するＤｉｃｅｒおよびＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素により、プレｍｉＲＮＡからインビボ生成することができる。本発明で特徴とされているミクロＲＮＡまたは前駆体ｍｉＲＮＡは、細胞に基づいたシステムによりインビボで合成可能であるか、または化学合成可能である。ミクロＲＮＡは、所望の特性を付与する修飾を含むように合成可能である。例えば、修飾をすることで、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織または細胞型に対するターゲッティング、または例えばエンドサイトーシス依存または独立の機序による細胞透過性を改善することができる。また、修飾は配列特異性を高めることができ、その結果、部位外れターゲッティング（ｏｆｆ−ｓｉｔｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を減少させることができる。合成および化学修飾の方法について、以下でさらに詳しく説明する。
【００９０】
センス鎖配列（例えば、ｃＤＮＡ分子のセンス鎖の配列）が与えられた場合、ｍｉＲＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合の規則に従って設計可能である。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡの一部に相補的なものでもよい。例えば、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡのコード領域または非コード領域、例えば５’ＵＴＲなどのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的なものでもよい。ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、例えば約１２または３０ヌクレオチド長、好ましくは約１５から２８ヌクレオチド長（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長）でもよい。
【００９１】
特に、本発明で特徴とされているｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡは、標的核酸との非相補性を有する内部（つまり、非末端）領域内のヌクレオチド上に化学修飾を持つことが可能である。例えば、修飾ヌクレオチドは、バルジを形成するｍｉＲＮＡの領域に組み込まれることができる。この修飾は、例えばリンカーにより、ｍｉＲＮＡに結合されたリガンドを含むことができる（例えば、以下の図ＯＴ−ＩからＯＴ−ＩＶを参照）。修飾は、例えば治療用ｍｉＲＮＡの薬物動態または安定性を改善するか、または標的核酸へのｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーション特性（例えば、ハイブリダイゼーション熱力学）を改善することができる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡのバルジ領域に組み込まれるか、または繋留される修飾またはリガンドの配向は、バルジ領域内の空間を占有するように向けられることが好ましい。例えば、修飾は、核酸鎖上の修飾塩基もしくは糖またはインターカレーターとして機能するリガンドを含むことができる。これらはバルジ内に配置されることが好ましい。インターカレーターは、芳香族、例えば多環芳香族または複素環芳香族化合物でもよい。多環式インターカレーターはスタッキング能力を有することができ、２、３、または４個の縮合環を持つ系を含むことができる。後述のユニバーサル塩基はｍｉＲＮＡに組み込まれることができる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡのバルジ領域に組み込まれるか、または繋留される修飾またはリガンドの配向は、バルジ領域内の空間を占有するように向けられることが好ましい。この配向により、ｍｉＲＮＡの改善されたハイブリダイゼーション特性または他の何らかの形で望ましい特性が強化される。
【００９２】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡに改善されたハイブリダイゼーション特性または改善された配列特異性を持たせられるアミノグリコシド・リガンドを含むことができる。例示的なアミノグリコシドは、グリコシル化ポリリシン、ガラクトシル化ポリリシン、ネオマイシンＢ、トブラマイシン、カナマイシンＡ、およびＮｅｏ−Ｎ−アクリジン（Ｎｅｏ−Ｎ−ａｃｒｉｄｉｎｅ）、Ｎｅｏ−Ｓ−アクリジン（Ｎｅｏ−Ｓ−ａｃｒｉｄｉｎｅ）、Ｎｅｏ−Ｃ−アクリジン（Ｎｅｏ−Ｃ−ａｃｒｉｄｉｎｅ）、Ｔｏｂｒａ−Ｎ−アクリジン（Ｔｏｂｒａ−Ｎ−ａｃｒｉｄｉｎｅ）、およびＫａｎａＡ−Ｎ−アクリジン（ＫａｎａＡ−Ｎ−ａｃｒｉｄｉｎｅ）などのアミノグリコシドのアクリジン複合体を含む。アクリジン類似体を使用することで配列特異性を高めることができる。例えば、ネオマイシンＢは、ＤＮＡとは対照的にＲＮＡに対し高い親和性を有するが、配列特異性は低い。アクリジン類似体であるｎｅｏ−Ｓ−アクリジンは、ＨＩＶ  Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）に高い親和性を有する。いくつかの実施形態では、アミノグリコシド・リガンドのグアニジン類似体（グアニジノグリコシド（ｇｕａｎｉｄｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ））はオリゴヌクレオチド剤に繋留される。グアニジノグリコシドではアミノ酸のアミン基がグアニジン基に交換されている。グアニジン類似体の結合により、オリゴヌクレオチド剤の細胞透過性が高まる可能性がある。
【００９３】
一実施形態では、リガンドは、標的核酸の切断により標的遺伝子阻害に寄与する開裂基を含むことができる。好ましくは、開裂基は、バルジ領域内に配置されるようにしてｍｉＲＮＡに繁留され、そこで標的ＲＮＡに接近して切断することができる。開裂基は、例えばブレオマイシン（例えば、ブレオマイシン−Ａ５、ブレオマイシン−Ａ２、またはブレオマイシン−Ｂ２）、ピレン、フェナントロリン（例えば、Ｏ−フェナントロリン）、ポリアミン、トリペプチド（例えば、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド）、または金属イオンキレート基でもよい。金属イオンキレート基は、例えばＬｕ（ＩＩＩ）またはＥＵ（ＩＩＩ）大環状錯体、Ｚｎ（ＩＩ）２，９−ジメチルフェナントロリン誘導体、Ｃｕ（ＩＩ）テルピリジン、またはアクリジンを含むことができ、Ｌｕ（ＩＩＩ）などの遊離金属イオンによりバルジの部位にある標的ＲＮＡの選択的切断を促進することができる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの切断を、例えばバルジ領域のところで促進するために、ペプチド・リガンドをｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡに繋留することができる。例えば、１，８−ジメチル−１，３，６，８，１０，１３−ヘキサアザシクロテトラデカン（シクラム）を（例えばアミノ酸誘導体により）ペプチドに複合し、標的ＲＮＡ切断を促進することができる。本発明で特徴とされている方法および組成物は、切断または非切断依存の機序により標的遺伝子発現を阻害するｍｉＲＮＡを含む。
【００９４】
ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡは、２本鎖を形成する、十分に相補性のある領域（例えば、７、８、９、１０、または１１ヌクレオチド長である領域）により両脇を固められている非相補性の領域（例えば、３、４、５、または６ヌクレオチド長である領域）を含むように設計されて合成されることが可能である。
【００９５】
ヌクレアーゼ耐性および／または標的に対する結合親和力を高めるために、ｍｉＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル、２’−フッ素、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−アミノ、および／またはホスホロチオエート結合を含むことができる。ロックト核酸（ＬＮＡ）、２−チオピリミジン（例えば、２−チオ−Ｕ）、２−アミノ−Ａ，Ｇ−Ｃｌａｍｐ修飾（Ｇ−ｃｌａｍｐ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、およびエチレン核酸（ＥＮＡ）、例えば２’−４’エチレン架橋核酸を含めた場合も、標的への結合親和力を高めることが可能である。オリゴヌクレオチド骨格にフラノース糖を含めることでも、エンドヌクレアーゼ切断を減少させることができる。ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡはさらに、３’カチオン基を含めることにより、または３’−３’結合を有する３’末端でヌクレオシドを反転することにより修飾することができる。他の代替手段では、３’末端は、アミノアルキル基、例えば３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴでブロックすることができる。他の３’複合体は、３’−５’エキソヌクレアーゼ切断を阻害することができる。理論には縛られないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの３’複合体は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するのを立体的に妨害することによりエキソヌクレアーゼ切断を阻害することが可能である。小さなアルキル鎖、アリール基、または複素環式複合体または修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）でさえ、３’−５’−エキソヌクレアーゼをブロックすることができる。
【００９６】
５’末端は、アミノアルキル基、例えば、５’−Ｏ−アルキルアミノ置換基でブロックすることができる。他の５’複合体は、５’−３’エキソヌクレアーゼ切断を阻害することができる。理論には縛られないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの５’複合体は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’末端に結合することを立体的に妨害することにより、エキソヌクレアーゼ切断を阻害することが可能である。小さなアルキル鎖、アリール基、または複素環式複合体または修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）でさえ、３’−５’ −エキソヌクレアーゼをブロックすることができる。
【００９７】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡは、ターゲッティング、例えば本願に記載されているターゲッティング修飾を改善する修飾を含む。特定の細胞型へのｍｉＲＮＡ分子を標的とする修飾の例は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノ−スなどの炭水化物糖質、葉酸塩などのビタミン、ＲＧＤおよびＲＧＤ模倣薬などの他のリガンド、およびナプロキセン、イブプロフェン、または他の知られているタンパク結合分子を含む小分子を含む。
【００９８】
ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡは、当業で知られている手順を使用する化学合成および／または酵素的ライゲーション反応を使用して構築可能である。例えば、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡを、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を高めるか、またはｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡと標的核酸との間に形成される２本鎖の物理的安定性を高めるように設計された各種修飾ヌクレオチドを使用して化学合成することが可能であり、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。他の適切な核酸修飾について、ここで説明する。ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡ核酸は、発現ベクターを使用して生物学的に生産することが可能であるが、アンチセンス配向で核酸はこの発現ベクターにサブクローン化されている（つまり、挿入核酸から転写されたＲＮＡは、注目する標的核酸に対しアンチセンス配向となる）。
【００９９】
アンチセンス型オリゴヌクレオチド剤
本発明で特徴とされている１本鎖オリゴヌクレオチド剤は、アンチセンス核酸を含む。「アンチセンス」核酸は、遺伝子発現産物をコードする「センス」核酸に相補的である、例えば、２本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的な、またはＲＮＡ配列、例えばプレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはプレｍｉＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸はセンス核酸標的と水素結合を形成することができる。
【０１００】
コード鎖配列（例えば、ｃＤＮＡ分子のセンス鎖の配列）が与えられた場合、アンチセンス核酸は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合の規則に従って設計可能である。アンチセンス核酸分子は、ＲＮＡ、例えばプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部に相補的なものでもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ、例えば５’ＵＴＲの翻訳開始部位を囲む領域に相補的なものでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約１０から２５ヌクレオチド長（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチド長）でもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはさらに、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡに相補的でもよい。
【０１０１】
アンチセンス核酸は、当業で知られている手順を使用する化学合成および／または酵素的ライゲーション反応を使用して構成可能である。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を高めるか、またはアンチセンスと標的核酸との間に形成される２本鎖の物理的安定性を高めるように設計された各種修飾ヌクレオチドを使用して化学合成可能であり、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。他の適切な核酸修飾について、ここで説明する。アンチセンス核酸は、発現ベクターを使用して生物学的に生産可能であるが、アンチセンス配向で核酸はこの発現ベクターにサブクローン化されている（つまり、挿入核酸から転写されたＲＮＡは、注目する標的核酸に対しアンチセンス配向となる）。
【０１０２】
アンチセンス剤は、リボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド）、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含むことができる。例えば、リボヌクレオチドのみからなるアンチセンス剤は相補的ＲＮＡにハイブリダイズし、翻訳機構が標的ＲＮＡ転写に接近するのを妨げ、それによりタンパク質合成を阻害することができる。デオキシリボヌクレオチドのみ、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチド、例えばアンチセンス剤の５’および３’末端のところでＲＮＡ配列により両脇を固められたＤＮＡ配列を含むアンチセンス分子は、相補的ＲＮＡにハイブリダイズすることができ、ＲＮＡ標的はその後、酵素、例えばＲＮＡｓｅ  Ｈにより切断可能である。標的ＲＮＡの分解により翻訳が妨げられる。両脇を固めるＲＮＡ配列は、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、およびホスホロチオエート結合を含むことができ、内部ＤＮＡ配列はホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。内部ＤＮＡ配列は、ＲＮＡｓｅＨ活性によるターゲッティングが望ましい場合に、好ましくは少なくとも５ヌクレオチド長である。
【０１０３】
ヌクレアーゼ耐性を高めるために、アンチセンス剤はさらに、３’−３’結合を有する３’末端でヌクレオシドを反転することにより修飾可能である。他の代替手段では、３’末端はアミノアルキル基でブロック可能である。
【０１０４】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド剤は、ターゲッティング、例えば本願に記載されているターゲッティング修飾を改善する修飾を含む。
デコイ型オリゴヌクレオチド剤
本発明において特徴としているオリゴヌクレオチド剤は、デコイ核酸、例えばデコイＲＮＡでもよい。デコイ核酸は天然核酸に類似しているが、天然核酸の活性を阻害または遮断するような形で修飾されている。例えば、デコイＲＮＡは、リガンドに対する天然の結合領域を模倣することができる。したがって、デコイＲＮＡは、特定のリガンドの結合について天然の結合標的と競合する。天然の結合標的は、内因性核酸、例えばプレｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡでもよい。例えば、ＨＩＶトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現は「デコイ」として作用し、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質を効率よく結合し、それによりＨＩＶ  ＲＮＡ内でコードされたＴＡＲ配列に結合するのを防止することができることがわかった。
【０１０５】
一実施形態では、デコイＲＮＡは、ターゲッティング、例えば本願に記載されているターゲッティング修飾を改善する修飾を含む。
ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡについて上で説明され、本願の別のところで説明されている化学修飾も、デコイ核酸で使用するのに適している。
【０１０６】
アプタマー型オリゴヌクレオチド剤
本発明において特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、アプタマーでもよい。アプタマーは、小さな有機分子またはタンパク質、例えば転写または翻訳因子などの非核酸リガンドに結合し、その後、活性を修飾（例えば阻害）する。アプタマーは、非核酸リガンド上の標的結合部位の認識を導く特定の構造内に畳み込まれることができる。アプタマーは、本願に記載されている修飾のどれでも含むことができる。
【０１０７】
一実施形態では、アプタマーは、ターゲッティング、例えば本願に記載されているターゲッティング修飾を改善する修飾を含む。
ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡについて上で説明され、本願の別のところで説明されている化学修飾も、デコイ核酸で使用するのに適している。
【０１０８】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、付属の図面および以下の説明で述べられる。本発明の他の特徴および利点は、説明および図面、ならびに請求項から明白になるであろう。引用されているすべての参考文献、特許、および特許出願は、あらゆる目的に関して本願明細書に援用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０９】
典型的な一実施形態では、対象は、ウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、または霊長類などの哺乳類である。対象は、乳畜（例えば、ウシやヤギ）、または他の家畜（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ヒツジ、ブタ、魚、エビ）とすることができる。好ましい一実施形態では、対象は、ヒト、例えば正常人または疾病もしくは障害を有しているか、または疾病もしくは障害があると診断されているか、または疾病もしくは障害にかかると予測されている個人である。
【０１１０】
さらに、オリゴヌクレオチド剤を介した調節は、オリゴヌクレオチド剤組成物を投与してから数日間持続することから、多くの場合に、１日１回よりも少ない頻度で、または場合によっては治療計画全体を通して１回のみ、組成物を投与することが可能である。例えば、ある種の癌細胞は単回ボーラス投与によって治療することができるが、慢性ウイルス感染では定期的投与、例えば、週１回または月１回の投与を必要とすることがある。例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）またはバーキットリンパ腫の治療を、１本鎖オリゴヌクレオチド剤、例えば、ｍｉＲ−１５５を標的とする１本鎖オリゴヌクレオチド剤の単回ボーラス投与で行うことができる。
【０１１１】
オリゴヌクレオチド剤を対象に投与するために使用可能な多数の例示的な送達経路が説明されている。それに加えて、オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されている例示的な方法により製剤可能である。
【０１１２】
リガンド複合モノマーサブユニットおよびオリゴヌクレオチド合成のためのモノマー
定義
「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素の基を指す。
【０１１３】
「アルキル」という用語は、指示されている数の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖でもよい炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルは、基が１から１２（含む）個の炭素原子を中に持つことができることを示す。「ハロアルキル」という用語は、１つまたは複数の水素原子がハロにより置き換えられたアルキルを指し、すべての水素原子がハロにより置き換えられたアルキル構成成分（例えば、ペルフルオロアルキル）を含む。アルキルおよびハロアルキル基は、Ｏ、Ｎ、またはＳを任意に挿入され得る。「アラルキル」という用語は、すべての水素原子がアリール基により置き換えられたアルキル構成成分を指す。アラルキルは、複数の水素原子がアリール基により置き換えられた基を含む。「アラルキル」の例としては、ベンジル基、９−フルオレニル基、ベンズヒドリル基、およびトリチル基がある。
【０１１４】
「アルケニル」という用語は、２〜８個の炭素原子を含み、１つまたは複数の二重結合を持つことを特徴とする直鎖または分枝鎖炭化水素を指す。典型的なアルケニルの例としては、限定はしないがアリル基、プロペニル基、２−ブテニル基、３−ヘキセニル基、および３−オクテニル基がある。「アルキニル」という用語は、２〜８個の炭素原子を含み、１つまたは複数の三重結合を持つことを特徴とする直鎖または分枝鎖炭化水素を指す。典型的なアルキニルのいくつかの例として、エチニル、２−プロピニル、および３−メチルブチニル、およびプロパルギルがある。ｓｐ２およびｓｐ３炭素は、アルケニルおよびアルキニル基の結合点としての機能をそれぞれ場合によって果たすことができる。
【０１１５】
「アルキルアミノ」および「ジアルキルアミノ」という用語は、−ＮＨ（アルキル）基および−ＮＨ（アルキル）２基をそれぞれ指す。「アラルキルアミノ」という用語は−ＮＨ（アラルキル）基を指す。「アルコキシ」という用語は−Ｏ−アルキル基を指し、「シクロアルコキシ」および「アラルコキシ」という用語は、−Ｏ−シクロアルキル基およびＯ−アラルキル基をそれぞれ指す。「シロキシ」という用語はＲ３ＳｉＯ−基を指す。「メルカプト」という用語はＳＨ基を指す。「チオアルキル」という用語は−Ｓ−アルキル基を指す。
【０１１６】
「アルキレン」という用語は、２価アルキル（つまり、−Ｒ−）例えば−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を指す。「アルキレンジオキソ」という用語は、構造−Ｏ−Ｒ−Ｏ−を持つ２価化学種を指し、式中、Ｒはアルキレンを指す。
【０１１７】
「アリール」という用語は、芳香族単環式、２環式、または３環式炭化水素環系を指し、環原子はどれも置換可能である。アリール構成成分の例としては、限定はしないがフェニル、ナフチル、アントラセニル、およびピレニルがある。
【０１１８】
本願で採用されている「シクロアルキル」という用語は、３から１２個の炭素を有する飽和環式、２環式、３環式、または多環式炭化水素基を含み、環原子はどれも置換可能である。本願に記載されているシクロアルキル基は縮合環を含むこともできる。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子（例えば、スピロ縮合環）を共有する環である。シクロアルキル構成成分の例としては、限定はしないがシクロヘキシル、アダマンチル、およびノルボルニル、およびデカリンがある。
【０１１９】
「ヘテロシクリル」という用語は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、２環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、または３環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子はＯ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子および単環式、２環式、または３環式の場合にそれぞれＮ、Ｏ、またはＳの１〜３、１〜６、または１〜９個のヘテロ原子）、環原子はどれも置換可能である、非芳香族の３〜１０員の単環式、８〜１２員の２環式、または１１〜１４員の３環式の環系を指す。本願に記載されているヘテロシクリル基は縮合環を含むこともできる。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子（例えば、スピロ縮合環）を共有する環である。ヘテロシクリルの例としては、限定はしないがテトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノ、ピロリニル、およびピロリジニルがある。
【０１２０】
本明細書で採用されている「シクロアルケニル」という用語は、５から１２個の炭素、好ましくは５から８個の炭素を有する部分不飽和、非芳香族、環式、２環式、３環式、または多環式炭化水素基を含み、環原子はどれも置換可能である。本願に記載されているシクロアルケニル基は縮合環を含むこともできる。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子（例えば、スピロ縮合環）を共有する環である。シクロアルケニル構成成分の例としては、限定はしないがシクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、またはノルボルネニルがある。
【０１２１】
「ヘテロシクロアルケニル」という用語は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、２環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、または３環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子はＯ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子および単環式、２環式、または３環式の場合にそれぞれＮ、Ｏ、またはＳの１〜３、１〜６、または１〜９個のヘテロ原子）、環原子はどれも置換可能である、部分飽和非芳香族の５〜１０員の単環式、８〜１２員の２環式、または１１〜１４員の３環式の環系を指す。本願に記載されているヘテロシクロアルケニル基は縮合環を含むこともできる。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子（例えば、スピロ縮合環）を共有する環である。ヘテロシクロアルケニルの例としては、限定はしないがテトラヒドロピリジルおよびジヒドロピランがある。
【０１２２】
「ヘテロアリール」という用語は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、２環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、または３環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子はＯ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子および単環式、２環式、または３環式の場合にそれぞれＮ、Ｏ、またはＳの１〜３、１〜６、または１〜９個のヘテロ原子）、環原子はどれも置換可能である、芳香族の５〜８員環の単環式、８〜１２員環の２環式、または１１〜１４員環の３環式の環系を指す。本願に記載されているヘテロアリール基は、共通炭素−炭素結合を共有する縮合環を含むこともできる。
【０１２３】
「オキソ」という用語は、炭素に結合されたときにカルボニルを形成し、窒素に結合されたときにＮ−オキシドを形成し、硫黄に結合されたときにスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。
【０１２４】
「アシル」という用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、そのどれもが、さらに置換基で置換可能である。
【０１２５】
「置換基」という用語は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルケニル、シクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリール基上でその基の任意の原子のところで「置換された」基を指す。好適な置換基は、限定はしないがアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、ＳＯ３Ｈ、硫酸塩、リン酸塩、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアルコキシ、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、カルボキシル、オキソ、チオキソ、イミノ（アルキル、アリール、アラルキル）、Ｓ（Ｏ）ｎアルキル（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎアリール（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロアリール（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロシクリル（ｎは０〜２）、アミン（モノ−、ジ−、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、エステル（アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル）、アミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、スルホンアミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換ヘテロシクリル、および非置換シクロアルキルを含む。他の態様では、１つの基上の置換基は独立して、上述の複数の置換基のうちのどれか単一の１つの置換基、または任意の部分集合である。
【０１２６】
「アデニニル（ａｄｅｎｉｎｙｌ）、シトシニル、グアニニル（ｇｕａｎｉｎｙｌ）、チミニル、およびウラシリル（ｕｒａｃｉｌｙｌ）」という用語などは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルの基を指す。
【０１２７】
「保護された」構成成分は、官能基の反応性が結合された保護基の存在により一時的にブロックされる反応性官能基、例えばヒドロキシル基もしくはアミノ基、あるいは１つまたは複数の官能基を有する、あるクラスの分子、例えば糖類を指す。本願に記載されているモノマーおよび方法で使用される保護基は、例えば本願明細書に援用するグリーン、ティー．ダブリュー．（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．）、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８１年で説明されている。
【０１２８】
概要
オリゴヌクレオチド剤、例えば好ましいが限定されないリガンド複合モノマーサブユニットを含む複合オリゴヌクレオチド剤は、以下および図１のスキームに式（ＩＩ）として提示されている。担体（いくつかの実施形態では「リンカー」とも呼ばれる）は環式または非環式構成部分でもよく、２つの「骨格結合点」（例えば、ヒドロキシル基）およびリガンドを含む。リガンドは、担体に直接結合される（例えば、複合される）か、または介在するテザー（例えば１つまたは複数の原子の非環式鎖、または核酸塩基、例えば１つまたは複数の化学修飾、例えば異常塩基を適宜有する天然に存在する核酸塩基、またはユニバーサル塩基）により担体に間接的に結合される（例えば複合される）ことが可能である。したがって、担体はさらに、それぞれリガンドおよびテザー／テザー・リガンドに対する「リガンドまたは繋留結合点」を含む。
【０１２９】
リガンド複合モノマーサブユニットは、ＲＮＡ分子の５’または３’末端サブユニットでもよく、つまり２つの「Ｗ」基のうちの１つがヒドロキシル基であり、他の「Ｗ」基は２つまたはそれ以上の非修飾または修飾リボヌクレオチドの鎖でもよい。それとは別に、リガンド複合モノマーサブユニットは内部位置を占有し、両方の「Ｗ」基は１つまたは複数の非修飾または修飾リボヌクレオチドでもよい。複数のリガンド複合モノマーサブユニットは、ＲＮＡ分子、例えばオリゴヌクレオチド剤中に存在することができる。テザー・リガンド複合モノマーサブユニット、例えば親油性部分、例えばコレステロールが担体に繋留されるサブユニットを包含するための好ましい位置は、３’末端、５’末端、または内部位置である。
【０１３０】
【化９】
2008509670.tif 000013
式（ＩＩ）の修飾ＲＮＡ分子は、当業で知られているオリゴヌクレオチド合成方法を使用して得られる。好ましい一実施形態では、式（ＩＩ）の修飾ＲＮＡ分子は、例えばホスホラミダイトまたはＨ−ホスホネート結合法を使用して、対応するモノマー化合物のうちの１つまたは複数（例えば、以下および図１のスキームのＡ、Ｂ、およびＣを参照）を成長する鎖に組み込むことにより調製可能である。
【０１３１】
モノマー、例えばリガンド複合モノマーは一般に、担体分子（以下および図１のＡを参照）に連結されている官能化の異なる２つのヒドロキシル基（ＯＦＧ１およびＯＦＧ２）、およびリガンド／繋留結合点を含む。本願で使用されているように、「官能化ヒドロキシル基」という用語は、ヒドロキシルプロトンが他の置換基により置換されていることを意味する。以下および図１の代表的な構造ＢおよびＣに示されているように、担体上の１つのヒドロキシル基（ＯＦＧ１）は、保護基（ＰＧ）により官能化される。他のヒドロキシル基（ＯＦＧ２）は、（１）Ｂの場合のように直接的に、またはリンカーＬを通じて間接的に、液相または固相合成担持試薬（中身の詰まった丸）により、または（２）Ｃの場合のようにリン含有構成成分、例えばホスホラミダイトにより官能化可能である。繋留結合点は、モノマーが成長する鎖内に組み込まれるときに水素原子、好適な保護基、テザー、またはテザー・リガンドに接続可能である（以下のＡの中の変数「Ｒ」を参照）。そのため、テザー・リガンドは、モノマーが成長する鎖に組み込まれるときにモノマーに結合できるが、そうする必要はない。いくつかの実施形態では、テザー、リガンド、またはテザー・リガンドは、「前駆体」リガンド複合モノマーサブユニットが鎖に組み込まれた後に「前駆体」リガンド複合モノマーサブユニットに連結することができる。以下で（また明細書の別のところで）使用されている波線は接続を指しており、構成成分と結合点または構成成分結合点との間に入れられているテザー分子との間の直接結合を表すことができる。直接繋留されるということは、構成成分が結合点に直接結合されることを意味する。間接的に繋留されるということは、結合点と構成成分との間に入れられたテザー分子があることを意味する。
【０１３２】
【化１０】
2008509670.tif 000014
（ＯＦＧ１）保護基は、例えばＴ．Ｗ．グリーンおよびピー．ジー．エム．ウッツ（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１年）から、必要に応じて選択可能である。保護基は、アミダイト合成条件、貯蔵条件、およびオリゴヌクレオチド合成条件の下で安定していることが好ましい。ヒドロキシル基、−ＯＨは求核基（つまりルイス塩基）であり、酸素を通して求電子剤（つまりルイス酸）と反応する。水素が保護基、例えばトリアリールメチル基またはトリアルキルシリル基で置き換えられたヒドロキシル基は、置換反応において求核剤として本質的に非反応性である。そのため、保護ヒドロキシル基は、例えばオリゴヌクレオチド合成時に構造Ｃにより例示される化合物のホモカップリングを防ぐ際に有用である。いくつかの実施形態では、好ましい保護基はジメトキシトリチル基である。他の実施形態では、好ましい保護基は以下の式を持つケイ素に基づく保護基である。
【０１３３】
【化１１】
2008509670.tif 000015
Ｘ５’、Ｘ５’’、およびＸ５’’’は、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、アルコキシ、シクロアルコキシ、アラルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、またはシロキシから選択可能である（つまり、Ｒ３ＳｉＯ−、３つの「Ｒ」基は、上記の基の任意の組み合わせでもよい）。Ｘ５’、Ｘ５’’、およびＸ５’’’はすべて同じであるか、または異なる可能性があり、またＸ５’、Ｘ５’’、Ｘ５’’’のうちの２つが同一であるが、３番目が異なる組み合わせが考えられる。いくつかの実施形態では、Ｘ５’、Ｘ５’’、およびＸ５’’’は少なくとも一つのアルコキシまたはシロキシ基を含み、図２に示されている基のうちの一つでもよく、好ましい組み合わせは、Ｘ５’、Ｘ５’’＝トリメチルシロキシおよびＸ５’’’＝１，３−（トリフェニルメトキシ）−２−プロポキシまたはシクロドデシルオキシを含む。
【０１３４】
Ｘ５’、Ｘ５’’、およびＸ５’’’の他の好ましい組み合わせは、以下で述べる脱保護および安定性基準を満たすＯＦＧ１基を結果として生じることができるものを含む。この基は、アミダイト合成条件、貯蔵条件、およびオリゴヌクレオチド合成条件の下で安定していることが好ましい。シリル基を例えば担持結合オリゴヌクレオチドから素早く、つまり１分以内に取り除くことが望ましいが、それは合成時間を短縮し、それにより、成長するオリゴヌクレオチド鎖を試薬に曝す時間を短縮できるからである。オリゴヌクレオチド合成は、例えば発色団のシリル置換基の添加から脱保護時にシリル保護基が見える場合に改善可能である。
【０１３５】
シリル保護基の選択は、安定していることと簡単に取り除けることという本質的特性の競合する要求、およびそれらの競合する目標のバランスをとる必要があることにより複雑化する可能性がある。安定性を高めるほとんどの置換基はさらに、シリル基を取り除くために要する反応時間も引き延ばし、基を取り除く難しさのレベルが高まる可能性がある。
【０１３６】
アルコキシおよびシロキシ置換基をＯＦＧ１ケイ素含有保護基に加えると、シリルエーテル結合をフッ化物で切断することに対する保護基の感受性が高まる。置換基の立体的大きさを大きくすると安定性を保つが、同じ程度にフッ化物の不安定性を減少させることはない。シリル基上で置換基のバランスを上手くとることで、シリルエーテルは存続可能なヌクレオシド保護基になる。
【０１３７】
ＯＦＧ１ケイ素含有保護基の候補は、室温でＯＦＧ１基の候補を担持した好ましい担体のテトラヒドロフラン溶液を５モル当量のテトラヒドロフランに曝すことにより試験可能である。薄層クロマトグラフィーによって出発物質の消失を監視することにより、反応時間を決定可能である。
【０１３８】
ＢにおけるＯＦＧ２が、可溶性または不溶性担持試薬に連結されたリンカー、例えば比較的長い有機リンカーを含む場合、ＯＦＧ１が脱保護され、求核剤として電子吸引性基（例えば、アミダイト基）を含む他のヌクレオシドまたはモノマーと自由に反応できるようになると、溶液または固相合成技術を使用して、天然の、および／または修飾されたリボヌクレオチドの鎖を作製することができる。それとは別に、天然の、または修飾されたリボヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド鎖は、ＯＦＧ２のところのアミダイト基またはＨ−ホスホン酸基を介してモノマーＣに連結することができる。この動作の後、ＯＦＧ１をブロック解除し、復元された求核ヒドロキシル基を、電子吸引性基を含む他のヌクレオシドまたはモノマーと反応させることができる。Ｒ’は、置換または非置換アルキルまたはアルケニルとすることができる。好ましい実施形態では、Ｒ’は、メチル、アリル、または２−シアノエチルである。Ｒ’’は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基とすることができ、好ましくは、３つまたはそれ以上の炭素を含む枝分かれした基、例えばイソプロピルである。
【０１３９】
ＢにおけるＯＦＧ２は、リンカーで官能化されたヒドロキシルでもよく、これはさらに、他のリンカー末端の液相または固相合成担持試薬を含む。この担持試薬は、本願に記載されているモノマーを担持することが可能な担持媒体でもよい。モノマーは、担体が入れられている溶媒中でモノマー（および成長する鎖）を可溶化することが可能な、リンカーＬを介して不溶性担体に結合可能である。可溶化されているが、それでも固定化されているモノマーは、周囲の溶媒中で試薬と反応可能であり、未反応試薬および可溶性副産物を、モノマーまたはモノマー誘導生成物が結合されている固体担体から容易に洗い流すことができる。それとは別に、モノマーを、可溶性担持構成成分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合することができ、液相合成技術を使用して鎖を作製することができる。リンカーおよび担持媒体の選択は当業の範囲内にある。一般に、リンカーは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＳ−でもよく、式中、ｑは０、１、２、３、または４であり、リンカーは、好ましくはオキサリル、スクシニル、またはチオグリコリルである。標準対照多孔質ガラス固相合成担体は、フッ化物不安定な５’シリル保護基とともには使用可能でない。というのも、ガラスは、完全長生成物の量が著しく少ないフッ化物により劣化するためである。フッ化物安定なポリスチレンに基づく担体またはＰＥＧが好ましい。
【０１４０】
リガンド／繋留結合点は、２価、３価、４価、５価、または６価原子でもよい。いくつかの実施形態では、リガンド／繋留結合点は、炭素、酸素、窒素、または硫黄原子でもよい。例えば、リガンド／繋留結合点前駆体官能基は、求核ヘテロ原子、例えば−ＳＨ、−ＮＨ２、第２級アミノ、ＯＮＨ２、または、ＮＨ２ＮＨ２を持つことが可能である。他の例としては、リガンド／繋留結合点前駆体官能基は、オレフィン、例えば−ＣＨ＝ＣＨ２またはＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒジエンまたは求ジエンでもよく、前駆体官能基は、例えば遷移金属触媒による炭素−炭素（例えば、オレフィン・メタセシス）工程または付加環化（例えば、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ）を使用して、リガンド、テザー、またはテザー・リガンドに結合することができる。さらに例として、リガンド／繋留結合点前駆体官能基は、求電子性構成成分、例えばアルデヒドでもよい。担体が環式担体である場合、リガンド／繋留結合点は、環内原子（つまり、環式構成成分、例えば、窒素原子の構成原子）または環外原子（つまり、環式構成成分中の構成原子に結合された原子または原子群）でもよい。
【０１４１】
担体は、ＯＦＧ１、ＯＦＧ２、およびリガンドに対する結合点を含む有機分子でもよい。いくつかの実施形態では、担体は環状分子であり、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、またはＳ）を含むことができる。例えば、担体分子は、アリール（例えば、ベンゼン、ビフェニルなど）、シクロアルキル（例えば、シクロヘキサン、シスまたはトランスデカリンなど）、またはヘテロシクリル（ピペラジン、ピロリジンなど）を含むことができる。他の実施形態では、担体は、例えばセリノールに基づく非環式構成成分でもよい。上記の環式系はどれも、ＯＦＧ１、ＯＦＧ２、およびリガンドに加えて置換基を含むことができる。
【０１４２】
糖類に基づくモノマー
いくつかの実施形態では、担体分子は酸素含有複素環である。好ましくは、担体は、以下の構造式ＬＣＭ−Ｉで示されているようなリボース糖である。この実施形態では、リガンド複合モノマーは、ヌクレオシドである。
【０１４３】
【化１２】
2008509670.tif 000016
「Ｂ」は、核酸塩基、例えば１つまたは複数の化学修飾を任意で有する、天然に存在する核酸塩基、例えば異常塩基、またはユニバーサル塩基を表す。
【０１４４】
本願で使用されているように、「異常」核酸塩基は、以下のうちのどれか１つを含むことができる。
２−メチルアデニニル（ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｙｌ）、
Ｎ６−メチルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデニニル、
Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、
Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、
Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニニル、
３−メチルシトシニル、
５−メチルシトシニル、
２−チオシトシニル、
５−ホルミルシトシニル、
【０１４５】
【化１３】
2008509670.tif 000017
Ｎ４−メチルシトシニル、
５−ヒドロキシメチルシトシニル、
１−メチルグアニニル、
Ｎ２−メチルグアニニル、
７−メチルグアニニル、
Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアニニル、
【０１４６】
【化１４】
2008509670.tif 000018
Ｎ２，７−ジメチルグアニニル、
Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアニニル、
１−メチルグアニニル、
７−シアノ−７−デアザグアニニル、
７−アミノメチル−７−デアザグアニニル、
プソイドウラシリル、
ジヒドロウラシリル、
５−メチルウラシリル、
１−メチルプソイドウラシリル、
２−チオウラシリル、
４−チオウラシリル、
２−チオチミニル
５−メチル−２−チオウラシリル、
３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシリル、
５−ヒドロキシウラシリル、
５−メトキシウラシリル、
ウラシリル５−オキシ酢酸、
ウラシリル５−オキシ酢酸メチルエステル、
５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリル、
５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリルメチルエステル、
５−メトキシカルボニルメチルウラシリル、
５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシリル、
５−アミノメチル−２−チオウラシリル、
５−メチルアミノメチルウラシリル、
５−メチルアミノメチル−２−チオウラシリル、
５−メチルアミノメチル−２−セレノウラシリル、
５−カルバモイルメチルウラシリル、
５−カルボキシメチルアミノメチルウラシリル、
５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシリル、
３−メチルウラシリル、
１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウラシリル、
５−カルボキシメチルウラシリル、
５−メチルジヒドロウラシル、または
３−メチルプソイドウラシリル。
【０１４７】
ユニバーサル塩基は、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと塩基対を形成することができ、それらは比較的違いが小さい。一般に、ユニバーサル塩基は、スタッキング相互作用を介して、例えば２本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ類似分子を安定化することができる非水素結合、疎水性、芳香族構成成分である。ユニバーサル塩基はさらに、水素結合置換基を含むこともできる。
【０１４８】
本願で使用されているように、「ユニバーサル塩基」は、アントラセン、ピレン、または以下のうちのどれか１つを含むことができる。
【０１４９】
【化１５】
2008509670.tif 000019
【０１５０】
【化１６】
2008509670.tif 000020
いくつかの実施形態では、Ｂは、リガンドを担体に連結するテザーの一部を形成することができる。例えば、テザーは、Ｂ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＮＨＣ（Ｏ）−リガンドでもよい。好ましい一実施形態では、二重結合はトランス型であり、リガンドは、置換または非置換コレステロリル基（例えば、Ｄ環側鎖またはＣ−３ヒドロキシルを通じて結合されている）、少なくとも１つの立体中心および少なくとも１つの置換基をアラルキル基のアリール部分に有するアラルキル構成成分、または核酸塩基である。いくつかの実施形態では、上述のテザーのＢは、ウラシリルまたはユニバーサル塩基、例えば追加の置換基、例えば１つまたは複数のフルオロ基を任意に有するアリール構成成分、例えばフェニルである。Ｂは、任意の原子でテザーの残り部分と置換可能である。
【０１５１】
Ｘ２は、「オキシ」または「デオキシ」置換基を２’−ＯＨの代わりに含むか、またはリガンドもしくはテザー・リガンドでもよい。
「オキシ」置換基の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、糖、または保護基）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、２’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋により同じリボース糖の４’炭素に連結されている「ロックト」核酸（ＬＮＡ）、Ｏ−ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ  ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）、およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＰＲＯＴＥＣＴＥＤ  ＡＭＩＮＥ、（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）、およびオルトエステルがある。アミン保護基は、ホルミル、アミド、ベンジル、アリルなどを含むことができる。
【０１５２】
好ましいオルトエステルは一般化学式Ｊを有する。基Ｒ３１およびＲ３２は、同じでもよいし異なってもよいし、図３に示されている基の任意の組み合わせでもよい。好ましいオルトエステルは、以下で構造Ｋとして示されている「ＡＣＥ」基である。
【０１５３】
【化１７】
2008509670.tif 000021
「デオキシ」置換基は、水素（つまり、デオキシリボース糖）、ハロ（例えば、フルオロ）、保護アミノ（例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはすべてのアミノが保護されるアミノ酸）、完全保護ポリアミノ（例えば、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ、式中、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノおよびすべてのアミノ基は保護されている）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖類）、シアノ、アルキル−チオ−アルキル、チオアルコキシ、および例えば保護アミノ官能基で任意に置換可能である、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルを含む。好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
【０１５４】
Ｘ３は、上でＯＦＧ２について説明されている通りである。
ＰＧは、トリアリールメチル基（例えば、ジメトキシトリチル基）またはＳｉ（Ｘ５’）（Ｘ５’’）（Ｘ５’’’）でもよく、（Ｘ５’）、（Ｘ５’’）、および（Ｘ５’’’）は他のところで説明されている通りである。
【０１５５】
糖置換に基づくモノマー
環式糖置換に基づくモノマー、例えば糖置換に基づくリガンド複合モノマーは、本願では糖置換モノマーサブユニット（ＳＲＭＳ）モノマー化合物ともいう。好ましい担体は、以下に示す一般式（ＬＣＭ−２）を有する。その構造において、好ましい骨格結合点は、Ｒ１またはＲ２、Ｒ３またはＲ４、あるいはＹがＣＲ９Ｒ１０の場合にＲ９およびＲ１０から選択可能である（２つの位置は、２つの骨格結合点、例えばＲ１およびＲ４、またはＲ４およびＲ９を与えるように選択される）。好ましい繋留結合点は、Ｒ７、ＸがＣＨ２の場合にＲ５またはＲ６を含む。担体は、以下では、鎖中に組み込むことができる構成要素として説明されている。そのため、これらの構造はさらに、結合点の１つ（末端位置の場合）または２つ（内部位置の場合）、例えばＲ１またはＲ２、Ｒ３またはＲ４、あるいはＲ９またはＲ１０（ＹがＣＲ９Ｒ１０の場合）がホスフェート、もしくは修飾ホスフェート、例えば硫黄含有、骨格に連結されている状況も含む。例えば、上記のＲ基の１つは−ＣＨ２−でもよいが、一方の結合は担体に連結され、他方は骨格原子、例えば結合酸素または中心リン原子に連結される。
【０１５６】
【化１８】
2008509670.tif 000022
式中、
Ｘは、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７、またはＣＨ２であり、
Ｙは、ＮＲ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であり、
Ｚは、ＣＲ１１Ｒ１２であるか、または存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０はそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうちの少なくとも２つはＯＲａおよび／または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１、およびＲ１２はそれぞれ独立して、リガンド、Ｈ、１〜３個のＲ１３で任意に置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であるか、またはＲ５およびＲ１１はともに、Ｒ１４で任意に置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキルであり、
Ｒ７はリガンドでもよく、例えばＲ７はＲｄでもよく、Ｒ７は例えば繋留構成成分、例えばＮＲｃＲｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキル、またはＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルを介して担体に間接的に繋留されたリガンドでもよく、
Ｒ８は、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１３は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり、
Ｒ１４は、ＮＲｃＲ７であり、
Ｒ１５は、シアノで任意に置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、またはＣ２〜Ｃ６アルケニルであり、
Ｒ１６は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ１７は、液相または固相担体試薬であり、
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＳ−であり、
Ｒａは、保護基、例えばＣＡｒ３（例えば、ジメトキシトリチル基）またはＳｉ（Ｘ５’）（Ｘ５’’）（Ｘ５’’’）であり、（Ｘ５’）、（Ｘ５’’）、および（Ｘ５’’’）は他のところで説明されている通りであり、
Ｒｂは、Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）Ｈ、Ｐ（ＯＲ１５）Ｎ（Ｒ１６）２、またはＬ−Ｒ１７であり、
Ｒｃは、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒｄは、Ｈまたはリガンドであり、
各Ａｒは独立して、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシで任意に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり、
ｎは１〜４であり、ｑは０〜４である。
【０１５７】
例示的な担体が含むのは、例えばＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７もしくはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、Ｚは存在しないか、またはＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７もしくはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であるか、または、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７もしくはＮＲ７であり、ＹはＮＲ８であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であるか、またはＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７もしくはＮＲ７であり、ＹはＯであり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であるか、またはＸはＣＨ２であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ５およびＲ１１はともにＣ６シクロアルキル（Ｈ、ｚ＝２）を形成するもの、またはインダン環系、例えばＸはＣＨ２であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ５およびＲ１１はともにＣ５シクロアルキル（Ｈ、ｚ＝１）を形成するものを含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、担体は、ピロリン環系または４−ヒドロキシプロリン環系に基づくことが可能であり、例えば、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、Ｚは存在しない（Ｄ）。ＯＦＧ１は、好ましくは５員環中の炭素の１つに連結された第１炭素、例えば環外アルキレン基、例えばメチレン基に結合される（Ｄ中の−ＣＨ２ＯＦＧ１）である。
【０１５９】
【化１９】
2008509670.tif 000023
ＯＦＧ２は、好ましくは５員環中の炭素の１つに直接結合される（Ｄ中の−ＯＦＧ２）。ピロリンに基づく担体では、−ＣＨ２ＯＦＧ１はＣ−２に結合することができるとともにＯＦＧ２はＣ−３に結合することがで、または−ＣＨ２ＯＦＧ１はＣ−３に結合することができるとともにＯＦＧ２はＣ−４に結合することができる。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、上で参照されている炭素の１つにジェミナル置換される（ｇｅｍｉｎａｌｌｙ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）ことが可能である。３−ヒドロキシプロリンに基づく担体では、−ＣＨ２ＯＦＧ１はＣ−２に結合することができ、ＯＦＧ２はＣ−４に結合することができる。したがって、ピロリン−および４−ヒドロキシプロリンに基づくモノマーは結合（例えば、炭素−炭素結合）を含むことができるが、結合回転は、その特定の結合の周りに制約され、例えば制約は環の存在から生じる。そのため、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、上で述べた対のどれかで互いに関してシス型またはトランス型でもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体は明らかに含まれる。モノマーはさらに、１つまたは複数の不斉中心を含むことができ、そのため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマ、個々のジアステレオ異性体、およびジアステレオ異性体混合物として出現することができる。モノマーのそのようなすべての異性体は明らかに含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を伴う中心は、両方とも、Ｒ配置を持つか、または両方ともＳ配置を有するか、または一方の中心がＲ配置を有し、他方の中心がＳ配置を有し、これは入れ換え可能である）。繋留結合点は、好ましくは窒素である。担体Ｄの好ましい実施例は以下を含む。
【０１６０】
【化２０】
2008509670.tif 000024
【０１６１】
【化２１】
2008509670.tif 000025
いくつかの実施形態では、担体は、ピペリジン環系（Ｅ）に基づくことが可能であり、例えば、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２である。ＯＦＧ１は、好ましくは６員環中の炭素の１つに連結された第１炭素、例えば環外アルキレン基、例えばメチレン基（ｎ＝１）またはエチレン基（ｎ＝２）に結合される［Ｅの−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１］。
【０１６２】
【化２２】
2008509670.tif 000026
ＯＦＧ２は、好ましくは６員環中の炭素の１つに直接結合される（Ｅ中の−ＯＦＧ２）。−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、環上にジェミナル形態で配置可能である、つまり、両方の基は同じ炭素、例えばＣ−２、Ｃ−３、またはＣ−４のところで結合することができる。あるいは、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、環上に近接形態で（ｉｎ  ａ  ｖｉｃｉｎａｌ  ｍａｎｎｅｒ）配置可能であり、つまり両方の基は、隣接する環炭素原子に結合することができ、例えば、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−２に結合することができるとともにＯＦＧ２はＣ−３に結合することができ、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−３に結合することができるとともにＯＦＧ２はＣ−２に結合することができ、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−３に結合することができるとともにＯＦＧ２はＣ−４に結合することができ、または−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−４に結合することができるとともにＯＦＧ２はＣ−３に結合することができる。したがって、ピペリジンに基づくモノマーは結合（例えば炭素−炭素結合）を含むことができ、結合回転は、その特定の結合の周りに制約され、例えば、制約は環の存在から生じる。そのため、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、上で述べた対のどれかで互いに関してシス型またはトランス型でもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体は明らかに含まれる。モノマーはさらに、１つまたは複数の不斉中心を含むことができ、そのため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマ、個々のジアステレオ異性体、およびジアステレオ異性体混合物として出現することができる。モノマーのそのようなすべての異性体は明らかに含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を伴う中心は、両方ともＲ配置を有するか、または両方ともＳ配置を有するか、または一方の中心がＲ配置を有するとともに他方の中心がＳ配置を有し、これは入れ換え可能である）。繋留結合点は、好ましくは窒素である。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、担体は、ピペラジン環系（Ｆ）に基づくことが可能であり、例えば、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７もしくはＮＲ７であり、ＹはＮＲ８であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であるか、またはモルホリン環系（Ｇ）に基づくことが可能であり、例えばＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７もしくはＮＲ７であり、ＹはＯであり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２である。ＯＦＧ１は、好ましくは６員環中の炭素の１つに連結された第１炭素、例えば環外アルキレン基、例えばメチレン基に結合される（ＦまたはＧ中の−ＣＨ２ＯＦＧ１）。
【０１６４】
【化２３】
2008509670.tif 000027
ＯＦＧ２は、好ましくは６員環中の炭素の１つに直接結合される（ＦまたはＧ中の−ＯＦＧ２）。ＦおよびＧの両方について、−ＣＨ２ＯＦＧ１はＣ−２に結合することができ、ＯＦＧ２はＣ−３に結合することができ、またはこれを入れ換えて結合することができる。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、上で参照されている炭素の１つにジェミナル置換されることが可能である。したがって、ピペラジンおよびモルホリンに基づくモノマーは結合（例えば、炭素−炭素結合）を含むことができ、結合回転はその特定の結合の周りに制約され、例えば、制約は環の存在から生じる。そのため、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、上で述べた対のどれかで互いに関してシス型またはトランス型でもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体は明らかに含まれる。モノマーはさらに１つまたは複数の不斉中心を含むことができ、そのため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマ、個々のジアステレオ異性体、およびジアステレオ異性体混合物として出現可能である。モノマーのそのようなすべての異性体は明らかに含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を伴う中心は両方ともＲ配置を有するか、または両方ともＳ配置を有するか、または一方の中心がＲ配置を有するとともに他方の中心がＳ配置を有し、これは入れ換え可能である）。Ｒ’’’は、例えばＣ１〜Ｃ６アルキル、好ましくはＣＨ３でもよい。ＦおよびＧの両方において、繋留結合点は好ましくは窒素である。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、担体はデカリン環系に基づくことが可能であり、例えばＸはＣＨ２であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ５およびＲ１１はともにＣ６シクロアルキル（Ｈ、ｚ＝２）を形成するか、またはインダン環系に基づくことが可能であり、例えばＸはＣＨ２であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、ＺはＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ５およびＲ１１はともにＣ５シクロアルキル（Ｈ、ｚ＝１）を形成する。ＯＦＧ１は、好ましくはＣ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、またはＣ−５の１つに連結された第１炭素、例えば、環外メチレン基（ｎ＝１）またはエチレン基（ｎ＝２）に結合される［Ｈの−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１］。
【０１６６】
【化２４】
2008509670.tif 000028
ＯＦＧ２は、好ましくはＣ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、またはＣ−５の１つに直接結合される（Ｈ中の−ＯＦＧ２）。−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、環上にジェミナル形態で配置可能であり、つまり両方の基は同じ炭素、例えばＣ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、またはＣ−５のところで結合することができる。あるいは、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、環上に近接形態で配置することができ、つまり両方の基は隣接する環炭素原子に結合することができ、例えば−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−２に結合することができるとともにＯＦＧ２はＣ−３に結合することができ、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−３に結合することができるとともにＯＦＧ２はＣ−２に結合することができ、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−３に結合することができるとともにＯＦＧ２はＣ−４に結合することができ、または−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−４に結合することができるとともにＯＦＧ２はＣ−３に結合することができ、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−４に結合することができるとともにＯＦＧ２はＣ−５に結合することができ、または−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−５に結合することができるとともにＯＦＧ２はＣ−４に結合することができる。したがって、デカリンまたはインダンに基づくモノマーは結合（例えば、炭素−炭素結合）を含むことができ、結合回転はその特定の結合の周りに制約され、例えば、制約は環の存在から生じる。そのため、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、上で述べた対のどれかで互いに関してシス型またはトランス型でもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体は明らかに含まれる。モノマーはさらに１つまたは複数の不斉中心を含むことができ、そのため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマ、個々のジアステレオ異性体、およびジアステレオ異性体混合物として出現可能である。モノマーのそのようなすべての異性体は明らかに含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を伴う中心は、両方ともＲ配置を有するか、または両方ともＳ配置を有するか、または一方の中心がＲ配置を有し、他方の中心がＳ配置を有し、これは入れ換え可能である）。好ましい一実施形態では、Ｃ−１およびＣ−６の置換基は互いに関してトランス型である。繋留結合点は、好ましくはＣ−６またはＣ−７である。
【０１６７】
他の担体は、３−ヒドロキシプロリンに基づくものを含むことができる（Ｊ）。そのため、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、互いに関してシス型またはトランス型でもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体は明らかに含まれる。モノマーは、さらに１つまたは複数の不斉中心を含むことができ、そのため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマ、個々のジアステレオ異性体、およびジアステレオ異性体混合物として出現可能である。
【０１６８】
【化２５】
2008509670.tif 000029
モノマーのそのようなすべての異性体は明らかに含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を伴う中心は、両方ともＲ配置を有するか、または両方ともＳ配置を有するか、または一方の中心がＲ配置を有し、他方の中心がＳ配置を有し、これは入れ換え可能である）。繋留結合点は、好ましくは窒素である。
【０１６９】
代表的な環式糖置換に基づく担体は図４〜図７に示されている。
糖置換に基づくモノマー（非環式）
非環式糖置換に基づくモノマー、例えば糖置換に基づくリガンド複合モノマーは、本願では糖置換モノマーサブユニット（ＳＲＭＳ）モノマー化合物ともいう。好ましい非環式担体は、以下に示す式ＬＣＭ−３またはＬＣＭ−４を有することができる。
【０１７０】
【化２６】
2008509670.tif 000030
いくつかの実施形態では、ｘ、ｙ、およびｚはそれぞれ互いに独立して、０、１、２、または３でもよい。式ＬＣＭ−３において、ｙおよびｚが異なる場合、第三炭素はＲ配置またはＳ配置のいずれかでもよい。好ましい実施形態では、式ＬＣＭ−３においてｘは０であり、ｙおよびｚはそれぞれ１であり（例えば、セリノールに基づく）、式ＬＣＭ−３においてｙおよびｚはそれぞれ１である。以下の式ＬＣＭ−３またはＬＣＭ−４はそれぞれ、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで任意に置換可能である。
【０１７１】
テザー
いくつかの実施形態では、構成成分、例えばリガンドは、介在テザーの仲介を介して担体に間接的に連結することが可能である。テザーは、繋留結合点（ＴＡＰ）のところで担体に連結され、Ｃ１〜Ｃ１００炭素含有構成成分（例えば、Ｃ１〜Ｃ７５、Ｃ１〜Ｃ５０、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０）、好ましくは少なくとも一つの窒素原子を有するものを含むことができる。好ましい実施形態では、窒素原子は、テザー上に末端アミノまたはアミド（ＮＨＣ（Ｏ）−）基の一部を形成し、これは、リガンドの連結点として使用されることができる。好ましいテザー（「ＴＡＰ」の後の部分）としては、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ−、ＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＮＨ−、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）−、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−、またはＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−があり、式中、ｎは、１〜２０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）であり、Ｒ’’’’はＣ１〜Ｃ６アルキルである。好ましくは、ｎは、５、６、または１１である。他の実施形態では、窒素は末端オキシアミノ基、例えば−ＯＮＨ２、またはヒドラジノ基、−ＮＨＮＨ２の一部を形成することが可能である。テザーは、例えばヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで任意に置換可能であり、および／または１つまたは複数の追加ヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、またはＳを挿入可能である。好ましいテザー・リガンドとしては、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ（リガンド）、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（リガンド）、ＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＮＨ（リガンド）、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＯＮＨ（リガンド）、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＯＮＨ（リガンド）、ＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＯＮＨ（リガンド）、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨＮＨ２（リガンド）、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨＮＨ２（リガンド）、ＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＮＨＮＨ２（リガンド）、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）（リガンド）、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ（リガンド）、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ（リガンド）、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（リガンド）、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ（リガンド）、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（リガンド）、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（リガンド）、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）（リガンド）、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ（リガンド）、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ（リガンド）、またはＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（リガンド）が考えられる。いくつかの実施形態では、アミノ末端テザー（例えば、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨ２ＮＨ２）は、リガンドとイミノ結合（つまり、Ｃ＝Ｎ）を形成することができる。いくつかの実施形態では、アミノ末端テザー（例えば、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨ２ＮＨ２）は、例えばＣ（Ｏ）ＣＦ３でアシル化可能である。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、テザーは、メルカプト基（つまり、ＳＨ）またはオレフィン（例えば、ＣＨ＝ＣＨ２）で終端可能である。例えば、テザーは、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＳＨ、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＨ＝ＣＨ２）、またはＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＨ＝ＣＨ２）でもよく、式中、ｎは、別のところで説明されている通りでもよい。いくつかの実施形態では、オレフィンは、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒジエンまたは求ジエン体でもよい。テザーは、例えばヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで任意に置換可能であり、および／または１つまたは複数の追加ヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ、またはＳを挿入可能である。二重結合は、シス型もしくはトランス型またはＥもしくはＺでもよい。
【０１７３】
他の実施形態では、テザーは、好ましくはテザーの末端位置にある、求電子性構成成分を含むことができる。好ましい求電子性構成成分は、例えばアルデヒド、ハロゲン化アルキル、メシレート、トシレート、ノシレート、またはブロシレート（ｂｒｏｓｙｌａｔｅ）、または活性カルボン酸エステル、例えばＮＨＳエステル、またはペンタフルオロフェニルエステルを含む。好ましいテザー（「ＴＡＰ」の後の部分）としては、ｎを１〜６とし、Ｒ’’’’をＣ１−Ｃ６アルキルとしてＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＣＨＯ、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＨＯ、またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＣＨＯ、あるいは、ｎを１〜６とし、Ｒ’’’’をＣ１〜Ｃ６アルキルとしてＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＮＨＳ、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＮＨＳ、またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＮＨＳ、あるいは、ｎを１〜１１とし、Ｒ’’’’をＣ１〜Ｃ６アルキルとしてＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｆ５、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｆ５、またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｆ５、あるいは、ｎを別のところで説明されている通りとし、Ｒ’’’’をＣ１〜Ｃ６アルキルとして（ＬＧは離脱基、例えばハロゲン化物、メシレート、トシレート、ノシレート、ブロシレートとすることができる）−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＬＧ、ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＬＧ、またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＬＧがある。繋留は、リガンドの求核基、例えばチオール、アミノ基をテザー上の電子吸引性基と結合することにより実行可能である。
【０１７４】
他の実施形態では、そのリガンド複合モノマーまたはある１つのリガンド複合モノマーが、テザーの末端位置でフタルイミド基（Ｋ）を含むことが望ましい場合がある。
【０１７５】
【化２７】
2008509670.tif 000031
他の実施形態では、他の保護アミノ基を、テザーの末端位置、例えばａｌｌｏｃ、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）、トリフルオロアセチル、Ｆｍｏｃ、またはアリールスルホニルに置くことができる（例えば、アリール部分は、オルト−ニトロフェニルまたはオルト、パラ−ジニトロフェニルとすることができる）。
【０１７６】
本願に記載されているテザーはどれも、さらに１つまたは複数の連結基、例えば−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＳ−、−（ＣＨ２）ｎ−、または−（ＣＨ＝ＣＨ）−を含むことができる。
【０１７７】
テザー・リガンド
さまざまな化学物質を、オリゴヌクレオチド剤に、例えばリガンド複合モノマーの担体に繋留することができる。実施例は、リガンド複合モノマーとの関連で以下に説明されているが、好ましい実施形態の１つにすぎない。化学物質は、オリゴヌクレオチド剤に他の位置で結合することができる。
【０１７８】
オリゴヌクレオチド剤（例えば、ｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド剤）に繋留されたリガンドは、そのオリゴヌクレオチド剤に有利な効果をもたらすことができる。例えば、リガンドは、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織または細胞型に対するターゲッティング、または例えばエンドサイトーシス依存または独立の機序による細胞透過性を改善することができる。リガンドおよび関連する修飾は配列特異性を高めることもでき、その結果、部位外れターゲッティングを減少させることができる。
【０１７９】
テザー・リガンドは、インターカレーターとして機能可能な１つまたは複数の修飾塩基または糖を含むことができる。これらは、好ましくはｍｉＲＮＡ／標的２本鎖のバルジ内などの内部領域に配置される。インターカレーターは、芳香族、例えば多環芳香族または複素環芳香族化合物でもよい。多環式インターカレーターはスタッキング能力を有しており、２、３、または４個の縮合環を持つ系を含むことができる。本願に記載されているユニバーサル塩基はリガンド上に組み込まれることができる。
【０１８０】
一実施形態では、リガンドは、標的核酸の切断により標的遺伝子阻害に寄与する開裂基を含むことができる。開裂基は、例えばブレオマイシン（例えば、ブレオマイシン−Ａ５、ブレオマイシン−Ａ２、またはブレオマイシン−Ｂ２）、ピレン、フェナントロリン（例えば、Ｏ−フェナントロリン）、ポリアミン、トリペプチド（例えば、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド）、または金属イオンキレート基でもよい。金属イオンキレート基は、例えばＬｕ（ＩＩＩ）またはＥＵ（ＩＩＩ）大環状錯体、Ｚｎ（ＩＩ）２，９−ジメチルフェナントロリン誘導体、Ｃｕ（ＩＩ）テルピリジン、またはアクリジンを含むことができ、Ｌｕ（ＩＩＩ）などの遊離金属イオンによりバルジの部位にある標的ＲＮＡの選択的切断を促進することができる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの切断を例えばバルジ領域のところで促進するために、ペプチド・リガンドをｍｉＲＮＡに繋留することができる。例えば、１，８−ジメチル−１，３，６，８，１０，１３−ヘキサアザシクロテトラデカン（シクラム）を（例えばアミノ酸誘導体により）ペプチドに複合し、標的ＲＮＡ切断を促進することができる。
【０１８１】
テザー・リガンドはアミノグリコシド・リガンドでもよく、これによりオリゴヌクレオチド剤は、ハイブリダイゼーション特性を改善するか、または配列特異性を改善することが可能になる。例示的なアミノグリコシドは、グリコシル化ポリリシン、ガラクトシル化ポリリシン、ネオマイシンＢ、トブラマイシン、カナマイシンＡ、およびＮｅｏ−Ｎ−アクリジン、Ｎｅｏ−Ｓ−アクリジン、Ｎｅｏ−Ｃ−アクリジン、Ｔｏｂｒａ−Ｎ−アクリジン、およびＫａｎａＡ−Ｎ−アクリジンなどのアミノグリコシドのアクリジン複合体を含む。アクリジン類似体を使用することで配列特異性を高めることができる。例えば、ネオマイシンＢはＤＮＡと比較するとＲＮＡに対し高い親和性を有するが、配列特異性は低い。アクリジン類似体であるｎｅｏ−Ｓ−アクリジンは、ＨＩＶ  Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）に高い親和性を有する。いくつかの実施形態では、アミノグリコシド・リガンドのグアニジン類似体（グアニジノグリコシド（ｇｕａｎｉｄｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ））はオリゴヌクレオチド剤に繋留される。グアニジノグリコシドでは、アミノ酸のアミン基がグアニジン基に交換されている。グアニジン類似体の結合で、オリゴヌクレオチド剤、例えばｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド剤の細胞透過性が高まる可能性がある。
【０１８２】
テザー・リガンドは、ポリアルギニンペプチド、ペプトイド、またはペプチド模倣薬でもよく、これはオリゴヌクレオチド剤の細胞取り込み能力を高めることができる。
好ましい構成成分は、好ましくは共有結合的に、直接的または介在テザーを介して間接的にリガンド複合担体に結合されるリガンドである。好ましいいくつかの実施形態では、リガンドは、介在テザーを介して担体に結合される。上述のように、リガンドまたはテザー・リガンドは、モノマーが成長する鎖内に組み込まれる場合にモノマー上に存在することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、「前駆体」であるリガンド複合モノマーが成長する鎖に組み込まれた後に「前駆体」であるリガンド複合モノマーサブユニット内に組み込まれることができる。例えばアミノ末端テザー、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２を有するモノマーは、成長するオリゴヌクレオチド鎖内に組み込まれることができる。その後の動作において、つまり前駆体モノマーを鎖に組み込んだ後、電子吸引性基、例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドは、リガンドの電子吸引性基を前駆体モノマーサブユニット・テザーの末端求核基と結合することにより前駆体モノマーサブユニットに結合することができる。
【０１８３】
好ましい実施形態では、リガンドは、リガンドが組み込まれるオリゴヌクレオチド剤の分布、ターゲッティング、または寿命を変える。好ましいいくつかの実施形態では、リガンドは、リガンドなどの種の存在がない場合と比べて、選択された標的、例えば分子、細胞または細胞型、コンパートメント、例えば細胞内または器官内コンパートメント、組織、器官または身体の領域に対する親和性を高める。
【０１８４】
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の特性を改善し、さらに、その結果得られる天然または修飾オリゴヌクレオチド、または本願に記載されているモノマーの任意の組合せおよび／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドを含む高分子のヌクレアーゼ耐性を改善することも可能である。
【０１８５】
リガンドは一般に、例えば摂取を高めるための治療用修飾剤、例えば分布を監視するための診断用化合物またはレポーター基、架橋剤、ヌクレアーゼ耐性付与構成成分、および天然または異常核酸塩基を含むことができる。一般的な例として、親油性物、脂質、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘコゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸（ｅｐｉｆｒｉｅｄｅｌａｎｏｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、炭水化物類、タンパク質、タンパク結合剤、インテグリン標的分子、ポリカチオン剤、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣薬がある。
【０１８６】
リガンドは、天然に存在する物質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）、アミノ酸、または脂質を含むことができる。リガンドはさらに、合成高分子、例えば、合成ポリアミノ酸などの組換えまたは合成分子でもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン無水マレイン酸共ポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸共ポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共ポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンがある。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチドポリアミン、ペプチド模倣（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第４級塩、またはアルファヘリックスペプチドがある。
【０１８７】
リガンドはさらに、標的基、例えば細胞もしくは組織標的薬剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば腎細胞などの指定された細胞型に結合する抗体も含むことができる。標的基には、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタント・タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣薬がある。
【０１８８】
リガンドの他の例としては、染料、挿入剤（例えば、アクリジンおよび置換アクリジン）、架橋剤（例えばプソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サップフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン、フェナントロリン、ピレン）、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド、アミノグリコシド、グアニジウム・アミノグリコシド、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばコレステロール（およびそのチオ類似体）、コール酸、コラン酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール（例えばエステル（例えばモノ、ビス、またはトリス脂肪酸エステル、例えばＣ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０脂肪酸）およびそのエーテル、例えばＣ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０アルキル、例えば１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、１，３−ビス−Ｏ（オクタデシル）グリセロール）、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ステアリン酸（例えばステアリン酸グリセリル）、オレイン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化薬、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えばアスピリン、ナプロキセン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボ核酸（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾール・クラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザ大環状分子のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰがある。
【０１８９】
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク、またはペプチド、例えばコリガンド、または抗体に対し特異親和性を有する分子、例えば癌細胞、内皮細胞、または骨細胞などの指定された細胞型に結合する抗体でもよい。リガンドはさらに、ホルモンおよびホルモン受容体も含むことができる。これらはさらに、脂質、レクチン、炭水化物類、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド種も含むことができる。リガンドは、例えばリポ多糖類、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの活性化剤、またはＮＦ−κＢの活性化剤でもよい。
【０１９０】
リガンドは、例えば細胞骨格をバラバラにする、例えば細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径繊維をバラバラにすることによりオリゴヌクレオチド剤を細胞内に取り込む能力を高めることができる物質、例えば薬物でもよい。この薬物は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）でもよい。
【０１９１】
リガンドは、例えば炎症反応を活性化することにより、オリゴヌクレオチド剤を細胞内に取り込む能力を高めることが可能である。このような効果を有する例示的なリガンドは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）、インターロイキン−１ベータ、またはガンマ・インターフェロンを含む。
【０１９２】
一態様では、リガンドは脂質または脂質に基づく分子である。このような脂質または脂質に基づく分子は、好ましくは血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドでは、複合体を標的組織、例えば身体の非腎標的組織に分配することができる。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞も含めて肝臓でもよい。ＨＳＡを結合可能な他の分子は、リガンドとしても使用可能である。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンが使用可能である。脂質または脂質に基づくリガンドは、（ａ）複合体の分解に対する耐性を高め、（ｂ）標的細胞または細胞膜内へのターゲッティングまたは輸送の能力を高めることができ、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡへの結合を調整するために使用可能である。
【０１９３】
脂質に基づくリガンドは、標的組織への複合体の結合を調節、例えば制御するために使用可能である。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質に基づくリガンドは、腎臓を標的とする可能性が小さく、したがって、身体から取り除かれる可能性が低い。ＨＳＡに結合する力が比較的弱い脂質または脂質に基づくリガンドは、複合体の標的を腎臓にするために使用可能である。
【０１９４】
好ましい一実施形態では、脂質に基づくリガンドはＨＳＡを結合する。脂質に基づくリガンドは、複合体が好ましくは非腎組織に分配される十分な親和性によりＨＳＡを結合することができる。しかし、親和性は、ＨＳＡリガンド結合を逆にできないほど強いものでないことが好ましい。
【０１９５】
他の好ましい実施形態では、脂質に基づくリガンドは、ＨＳＡを結合する程度は弱いか、または全く結合せず、複合体は、好ましくは腎臓に分配されている。腎細胞を標的とする他の構成成分も、脂質に基づくリガンドの代わりに、またはそれに加えて使用可能である。他の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば増殖細胞により取り込まれる構成成分、例えばビタミンである。これらは、例えば悪性または悪性でないタイプの、例えば癌細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するために特に使用される。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫがある。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または癌細胞により取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素がある。また、ＨＳＡおよび低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
【０１９６】
他の態様では、リガンドは、細胞浸透剤、好ましくはヘリックス細胞浸透剤（ｈｅｌｉｃａｌ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）である。好ましくは、この薬剤は両親媒性である。薬剤はｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。薬剤がペプチドである場合、修飾が可能であり、この修飾はペプチジル模倣薬、インバートマー（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒｓ）、非ペプチドまたは擬ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含む。ヘリックス薬剤（ｈｅｌｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）は、好ましくはアルファヘリックス薬剤であり、これは、好ましくは親油性相および疎油性相を有する。
【０１９７】
増殖細胞中に豊富に存在するマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ペプチドおよびペプチド模倣薬を含むＲＧＤは、癌細胞、特にαｖβ３インテグリンを示す細胞を標的とすることができる。そのため、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含む環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、さらには合成ＲＧＤ模倣薬をも使用することが可能であろう。ＲＧＤに加えて、αｖβ３インテグリン・リガンドを標的とする他の構成成分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管形成を制御するために使用可能である。この種類の好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他の癌遺伝子、例えば本願に記載されている癌遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド剤を含む。
【０１９８】
本発明のオリゴヌクレオチド剤は、特に肝臓を標的とした場合に有用である。例えば、本発明で特徴とされる１本鎖オリゴヌクレオチド剤は、肝臓内に豊富に存在するｍｉＲＮＡを標的とし、オリゴヌクレオチド剤は、肝臓への送達を高めるためのリガンドを含むことができる。オリゴヌクレオチド剤は、肝臓標的とするリガンドにより誘導体化されたモノマーを組み込むことにより肝臓を標的とするようにできる。例えば、肝臓標的薬剤は親油性部分でもよい。好ましい親油性部分は、脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、またはコレステリル残基を含む。肝臓標的薬剤として機能することができる他の親油性部分は、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンを含む。
【０１９９】
オリゴヌクレオチド剤はさらに、ラクトシル化ＬＤＬなどの低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）との関連により肝臓を標的とするようにすることもできる。糖残基と錯化された高分子担体は、オリゴヌクレオチド剤の標的を肝臓にするように機能することもできる。
【０２００】
糖、例えばガラクトースおよび／またはその類似体を組み込んだ標的薬剤は、特に有用である。これらの薬剤は、特に肝臓の実質細胞を標的とする（表２を参照）。例えば、ターゲッティング部分は、互いから約１５オングストローム離して並んでいる複数のまたは好ましくは２つもしくは３つのガラクトース構成成分を含むことができる。ターゲッティング部分は、それとは別に乳糖（例えば、３つの乳糖構成成分）でもよく、これは、ガラクトースに結合されたブドウ糖である。ターゲッティング部分はさらに、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミンでもよい。マンノースまたはマンノース−６−ホスフェート・ターゲッティング部分は、マクロファージ・ターゲッティングに使用可能である。
【０２０１】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣薬でもよい。ペプチド模倣薬（本願ではオリゴペプチド模倣薬ともいう）は、天然ペプチドに類似の定義された３次元構造内に折り畳まれることができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬がオリゴヌクレオチド剤に結合すると、細胞認識および吸収を高めることなどによりｉＲＮＡの薬物動態的分布に影響を及ぼす可能性がある。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長とすることができる（例えば、表２を参照）。
【０２０２】
【表２】
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ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞浸透ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅからなる）でもよい。ペプチド構成成分は、デンドリマーペプチド、制約ペプチド、または架橋ペプチドでもよい。他の実施形態では、ペプチド構成成分は、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１６）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１７））もまた、ターゲッティング部分でもよい。ペプチド構成成分は、細胞膜間でペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を運ぶ「送達」ペプチドでもよい。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１８））およびショウジョウバエ・アンテナペディア・タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１９））は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが判明している。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ提示ライブラリー、または１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから識別されたペプチドなどの、ＤＮＡのランダムな配列によりコードされることが可能である（ラムら（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２〜８４頁、１９９１年）。好ましくは、組み込まれているモノマーユニットを介してオリゴヌクレオチド剤に繋留されているペプチドまたはペプチド模倣薬は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、またはＲＧＤ模倣薬などの細胞標的ペプチドである。ペプチド構成成分の長さは、アミノ酸約５個からアミノ酸約４０個にわたる。ペプチド構成成分は、安定性または直接配座特性を高めるなどの構造修飾を有することができる。後述の構造修飾はどれも使用可能である。
【０２０３】
ＲＧＤペプチド構成成分は、内皮系腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用可能である（ツィツマンら（Ｚｉｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６２：５１３９〜４３頁、２００２年）。ＲＧＤペプチドは、オリゴヌクレオチド剤（例えば、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド剤）が、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含むさまざまな他の組織の腫瘍を容易に標的にできるようにすることができる（アオキら（Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：７８３〜７８７頁、２００１年）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、オリゴヌクレオチド剤が腎臓を容易に標的にできるようにする。ＲＧＤペプチドは、直線状または環状でもよく、または修飾、例えばグリコシル化またはメチル化して特定の組織を標的にし易くすることができる。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、オリゴヌクレオチド剤を、αｖβ３を発現する腫瘍細胞に送達することができる（ハウブナーら（Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ）、Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．，４２：３２６〜３３６頁、２００１年）。
【０２０４】
増殖細胞中に豊富に存在するマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ペプチドおよびペプチド模倣薬を含むＲＧＤは、癌細胞、特にαｖβ３インテグリンを示す細胞を標的とすることができる。そのため、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含む環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、さらには合成ＲＧＤ模倣薬をも使用することが可能であろう。ＲＧＤに加えて、αｖβ３インテグリンリガンドを標的とする他の構成成分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管形成を制御するために使用可能である。この種類の好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他の癌遺伝子、例えば本願に記載されている癌遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド剤を含む。
【０２０５】
「細胞浸透ペプチド」は細胞、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞を浸透することができる。微生物細胞浸透ペプチドは、例えばαヘリックス直鎖ペプチド（例えばＬＬ−３７またはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα−デフェンシン、β−デフェンシン、またはバクテネシン）、または１つまたは２つの支配的アミノ酸のみを含むペプチド（例えばＰＲ−３９またはインドリシジン）でもよい。細胞浸透ペプチドは、さらに核内保留シグナル（ＮＬＳ）を含むことができる。例えば、細胞浸透ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチド・ドメインおよびＳＶ４０大Ｔ抗原に由来する、ＭＰＧなどの２分両親媒性ペプチドでもよい（シメオニら（Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７〜２７２４頁、２００３年）。
【０２０６】
一実施形態では、リガンド複合モノマーに繋留される標的ペプチドは、両親媒性αヘリックスペプチドでもよい。例示的な両親媒性αヘリックスペプチドは、限定はしないがセクロピン、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎｓ）、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎｓ）、ブフォリン（ｂｕｆｏｒｉｎ）、ＣＰＦ、ボンビニン類似ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎｓ）、サッカメーバ（Ｓ．Ｃｌａｖａ）ペプチド、ヌタウナギ腸内抗微生物ペプチド（ｈａｇｆｉｓｈ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）（ＨＦＩＡＰ）、マゲイニン、ブレビニン−２（ｂｒｅｖｉｎｉｎｓ−２）、デルマセプチン、メリチン、プルロシジン（ｐｌｅｕｒｏｃｉｄｉｎ）、Ｈ２Ａペプチド、ゼノパスペプチド、エスクレンチニス−１（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｉｓ−１）、およびセリン（ｃａｅｒｉｎｓ）を含む。多数の因子がヘリックス安定性の完全性を保持すると考えることが好ましい。例えば、最大数のヘリックス安定化残基を利用し（例えば、ｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）、最小数のヘリックス不安定化残基を利用する（例えば、プロリン、または環状モノマー単位）。キャッピング残基（ｃａｐｐｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅ）が考えられ（例えば、Ｇｌｙは、例示的なＮ−キャッピング残基）、および／またはＣ末端アミド化を使用し、余分のＨ結合を与えてヘリックスを安定化することができる。ｉ±３またはｉ±４位置で分離される、反対の電荷を持つ基同士の塩橋の形成は、安定性をもたらすことができる。例えば、リシン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、またはヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性残基、グルタミン酸塩またはアスパラギン酸塩と塩橋を形成することができる。
【０２０７】
ペプチドおよびペプチド模倣薬リガンドは、天然に存在する、または修飾されたペプチド、例えばＤまたはＬペプチド、α、β、またはγペプチド、Ｎ−メチルペプチド、アザペプチド、１つまたは複数のアミドを有するペプチド、つまり結合が１つまたは複数の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素結合で置き換えられたペプチド、または環状ペプチドを有するものを含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、カチオン性および／または疎水性構成部分を有することができる。
いくつかの実施形態では、リガンドは、本願に記載されている核酸塩基のどれかでもよい。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、リガンドは、置換アミン、例えばジメチルアミノでもよい。いくつかの実施形態では、置換アミンは、例えばプロトン化またはアルキル化により四級化し、カチオン性になってもよい。いくつかの実施形態では、置換アミンは、比較的疎水性のテザー、例えばアルキレンの末端位置でもよい。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、リガンドは、以下のトリテルペンのうちの１つでもよい。
【０２１１】
【化２８】
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いくつかの実施形態では、リガンドは、置換もしくは非置換コレステロール、またはその立体異性体、または以下のステロイドのうちの１つでもよい。
【０２１２】
【化２９】
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いくつかの実施形態では、テザー・リガンドは、対応する非テザーまたは非結合リガンドよりも多い１つまたは複数の原子を含むことができる（例えば、ヘテロ原子に基づく官能基またはヘテロ原子に基づく官能基全体の１つまたは複数のプロトンを、リガンドを担体またはテザーに結合している間に非結合リガンドから追い出すことができる）。例えば、コレステロールの全３−ヒドロキシ基のプロトンを、テザー（例えば、Ｃｈｏｌ−３−ＯＨ（非結合）およびＣｈｏｌ−３−Ｏ−テザー（結合））で置き換えることができるか、またはコレステロールの全３−ヒドロキシ基を、硫黄原子（例えば、Ｃｈｏｌ−３−ＯＨ（非結合）およびＣｈｏｌ−３−Ｓ−テザー（結合、例えば、チオコレステロール））で置き換えることができる。
【０２１３】
オリゴヌクレオチド剤を作製する方法
本願に記載されている異常塩基を含むリボヌクレオシドのリストは、ユタ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ）［８４１１２米国ユタ州ソルトレークシティー（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ）所在］のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙのパメラ  エフ．クレイン（Ｐａｍｅｌａ  Ｆ．Ｃｒａｉｎ）、ジェフ・ロゼンスキ（Ｊｅｆ  Ｒｏｚｅｎｓｋｉ）、およびジェームス  エー．マックロスキー（Ｊａｍｅｓ  Ａ．ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ）により保持されている「Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で説明されている。
【０２１４】
５’シリル保護基を、リボヌクレオシドの２’位置にある酸に不安定なオルトエステルとともに使用し、ホスホラミダイト化学作用を介してオリゴヌクレオチドを合成することができる。最終的な脱保護条件は、ＲＮＡ生成物を著しく劣化させないということが知られている。異常およびユニバーサル塩基上の官能基は、本願に記載されている、実行中の操作と比較できる保護基とのオリゴヌクレオチド合成中にブロックされる。すべての合成は、自動的な、または手動による合成装置において、大規模、中規模、または小規模に実施可能である。さらに、合成を複数のウェルプレートまたはスライド・ガラスで行うことも可能である。
【０２１５】
５’−Ｏ−シリル基を、フッ化物イオン源、例えば、無機対イオンと対合するフッ化物イオンを含む塩、例えばフッ化セシウムおよびフッ化カリウム、または有機対イオンと対合するフッ化物イオンを含む塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウムを含むことができる、フッ化物イオンに曝すことにより除去することができる。脱保護反応において、クラウン・エーテル触媒を無機フッ化物と組み合わせて使用することができる。好ましいフッ化物イオン源は、フッ化テトラエチルアンモニウムまたはアミンヒドロフルオリドである（例えば水性ＨＦを双極性非プロトン性溶媒、例えばジメチルホルムアミド中のトリエチルアミンと組み合わされる）。
【０２１６】
ホスファイトトリエステルおよびホスホトリエステル上で使用する保護基の選択により、フッ化物に向けてトリエステルの安定性を変えることができる。ホスホトリエステルまたはホスファイトトリエステルのメチル保護はフッ化物イオンに対する結合を安定化し、収率を改善することができる。
【０２１７】
リボヌクレオシドは反応２’−ヒドロキシル置換基を有することから、ＲＮＡ内の反応２’位置を５’−Ｏ−シリル保護基に適合すること、例えばフッ化物に対し安定している保護基で保護することが望ましい場合がある。オルトエステルはこの基準を満たすものであり、ＲＮＡ分解を最小限に抑えることができる最終的な酸脱保護工程において容易に取り除かれることができる。
【０２１８】
テトラゾール触媒を標準ホスホラミダイト結合反応で使用することができる。好ましい触媒は、例えばテトラゾール、Ｓ−エチル−テトラゾール、ｐ−ニトロフェニルテトラゾールを含む。
【０２１９】
一般的工程は次の通りである。ヌクレオシドを、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの液相または固相合成で使用できるように適宜保護して官能化する。リボヌクレオチド内の２’−ヒドロキシル基を、トリスオルトエステル試薬を使用して修飾することができる。２’−ヒドロキシルを修飾して２’−Ｏ−オルトエステルヌクレオシドを生成するために、酸性触媒、例えばピリジニウムｐ−トルエンスルホネートの存在下で、リボヌクレオシドをトリスオルトエステル試薬と反応させる。この反応は当業者に知られている。次いで、この生成物に、さらなる保護基反応（例えば、５’−シリル化）および官能化（例えば、３’−Ｏ−ホスフィチル化）を作用させて所望の試薬（例えばヌクレオシドホスホラミダイト）を生成し、当業者に知られている反応により、オリゴヌクレオチドまたは高分子内に組み込むことができる。
【０２２０】
好ましいオルトエステルとしては、アシルまたはエステル保護基で保護されているエチレングリコールリガンドを含むものがある。特に、好ましいアシル基はアセチルである。次いで、当業者であれば、ヌクレオシド試薬を使用して、市販の合成装置計装、例えばＧｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｐｌｕｓ  （ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、３８０Ｂ  （アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））上でＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成することができる。オリゴヌクレオチドまたは高分子の合成（液相または固相のいずれか）に続いて、非酸性試薬を使用し、生成物に１つまたは複数の反応を作用させることができる。これらの反応のうちの１つは、強塩基性条件とする、例えば５５℃で１０分間、４０％のメチルアミンを使用するという条件でもよく、これにより、エチレングリコールリガンドからアシル保護基を取り除くが、オルトエステル構成成分は結合されたままである。その結果得られるオルトエステルは、高分子またはオリゴヌクレオチドが後の用途で使用される場合に結合されたままでもよいし、または最終的な弱酸性反応、例えば５５℃で１０分間、５０ｍＭの酢酸（ｐＨ  ３．０）中に入れ、次いで、５５℃で１０分間、等量の１５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液を加えることで取り除くことができる。
【０２２１】
ユニバーサル塩基は、本願明細書に援用する「Ｓｕｒｖｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍａｒｙ：Ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＮＡ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、ロークス、ディー．（Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１年，２９、２４３７で説明されている。具体的な実施例は、リュー、ディー．（Ｌｉｕ，Ｄ．）、モラン、エス．（Ｍｏｒａｎ，Ｓ．）、クール、イー．ティー．（Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、４、９１９〜９２６頁、モラレス、ジェイ．シー．（Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｊ．Ｃ）、クール、イー．ティー．（Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年，３９，２６２６〜２６３２頁、マトライ、ティー．ジェイ．（Ｍａｔｒａｙ，Ｔ，Ｊ．）、クール、イー．ティー．（Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１９９８年、１２０，６１９１〜６１９２頁、モラン、エス．（Ｍｏｒａｎ，Ｓ．）、レン、アール．エックス．−エフ．（Ｒｅｎ，Ｒ．Ｘ．−Ｆ．）、ラムネイＩＶ，エス．（Ｒｕｍｎｅｙ  ＩＶ，Ｓ．）、クール、イー．ティー．（Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１９９７年、１１９，２０５６〜２０５７頁、グッキアン、ケイ．エム．（Ｇｕｃｋｉａｎ，Ｋ．Ｍ．）、モラレス、ジェイ．シー．（Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｊ．Ｃ）、クール、イー．ティー．（Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８年、６３，９６５２〜９６５６頁、バーガー、エム．（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．）、ウー、ワイ．（Ｗｕ．Ｙ．）、オガワ、エー．ケイ．（Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．）、マクミン、ディー．エル．（ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．）、シュルツ、ピー．ジー．（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．）、ロメスバーグ、エフ．イー．（Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０００年，２８，２９１１〜２９１４頁、オガワ、エー．ケイ．（Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．）、ウー、ワイ．（Ｗｕ，Ｙ．）、マクミン、ディー．エル．（ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．）、リュー、ジェイ．（Ｌｉｕ，Ｊ．）、シュルツ、ピー．ジー．（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．）、ロメスバーグ、エフ．イー．（Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２０００年，１２２，３２７４〜３２８７頁、オガワ、エー．ケイ．（Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．）、ウー、ワイ．（Ｗｕ．Ｙ．）、バーガー、エム．（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．）、シュルツ、ピー．ジー．（Ｐ．Ｇ．）、ロメスバーグ、エフ．イー．（Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２０００年，１２２，８８０３〜８８０４頁、タエ、イー．エル．（Ｔａｅ，Ｅ．Ｌ．）、ウー、ワイ．（Ｗｕ，Ｙ．）、シァ、ジー．（Ｘｉａ，Ｇ．）、シュルツ、ピー．ジー．（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．）、ロメスバーグ、エフ．イー．（Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２００１年，１２３，７４３９〜７４４０頁、ウー、ワイ．（Ｗｕ，Ｙ．）、オガワ、エー．ケイ．（Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．）、バーガー、エム．（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．）、マクミン、ディー．エル．（ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．）、シュ��ツ、ピー．ジー．（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．）、ロメスバーグ、エフ．イー．（Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２０００年，１２２，７６２１〜７６３２頁、マクミン、ディー．エル．（ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．）、オガワ、エー．ケイ．（Ｏｇａｗａ．Ａ．Ｋ．）、ウー、ワイ．（Ｗｕ，Ｙ．）、リュー、ジェイ．（Ｌｉｕ，Ｊ．）、シュルツ、ピー．ジー．（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．）、ロメスバーグ、エフ．イー．（Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１９９９年，１２１，１１５８５〜１１５８６頁、ブロツキ、シー．（Ｂｒｏｔｓｃｈｉ，Ｃ）、ハーバーリ、エー．（Ｈａｂｅｒｌｉ，Ａ．）、ロイマン、シー．ジェイ．（Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｃ．Ｊ．）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００１年，４０，３０１２〜３０１４頁、ワイズマン、エイチ．（Ｗｅｉｚｍａｎ，Ｈ．）、トル、ワイ．（Ｔｏｒ，Ｙ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２００１年，１２３，３３７５〜３３７６頁、ラン、ティー．（Ｌａｎ，Ｔ．）、マクローリン、エル．ダブリュー．（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｌ．Ｗ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２０００年，１２２，６５１２〜１３頁で説明されている。
【０２２２】
上述のように、本願に記載されているモノマーおよび方法は、修飾ＲＮＡ分子、または本願に記載されているモノマー化合物の任意の組合せを含む高分子および／または１つまたは複数のサブユニットが、異常またはユニバーサル塩基を含む天然もしくは修飾リボヌクレオチドの調製で使用可能である。修飾ＲＮＡ分子として、例えば化学または立体化学修飾ヌクレオシド（例えば１つまたは複数の骨格修飾、例えばホスホロチオエートまたはＰ−アルキルを有するもの、１つまたは複数の糖修飾、例えば２’−ＯＣＨ３または２’−Ｆを有するもの、および／または１つまたは複数の塩基修飾、例えば５−アルキルアミノまたは５−アリルアミノを有するもの）またはヌクレオシド代用薬を含む分子がある。
【０２２３】
５’−ヒドロキシル基とホスホラミダイトとのカップリングによりホスファイトエステル中間体が形成され、次いで、これは、例えばヨウ素により酸化されてホスフェートジエステルになる。それとは別に、ホスファイトを、例えば硫黄、セレン、アミノ、およびホウ素試薬により処理し、修飾ホスフェート骨格を形成することができる。本願に記載されているモノマーとヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド鎖との結合も、ヨウ素、硫黄、セレン、アミノ、およびホウ素試薬で処理し、非修飾および修飾ホスフェート骨格をそれぞれ形成することができる。同様に、本願に記載されているモノマーは、本願に記載されている修飾またはヌクレオシド代用薬を含むヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドと結合することができる。
【０２２４】
オリゴヌクレオチドペプチド複合体の合成および精製を、定められた方法により行うことができる。例えば、トリュフェルトら（Ｔｒｕｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５２：３００５，１９９６年、およびマノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２００１年を参照のこと。例示的な方法は図８および図９に示されている。
【０２２５】
本発明の一実施形態では、ペプチド模倣薬を修飾し、ペプチドの効力と選択性とを高めることができる、異なる特定の優先配座を採用する制約ペプチドを作製することができる。例えば、制約ペプチドはアザペプチドでもよい（ガント（Ｇａｎｔｅ）、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８９年，４０５〜４１３頁）。アザペプチドは、アミノ酸側鎖の構造を変えることなく、アミノ酸のα炭素を窒素原子で置き換えることにより合成される。例えば、アザペプチドは、ヒドラジンを「カルボニル供与体」、例えばフェニルクロロホルメートと反応させることなどにより、従来のペプチド合成カップリング法においてヒドラジンを使用することにより合成可能である。一般的なアザペプチド合成が図１０に示されている。
【０２２６】
本発明の一実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣薬（例えば、リガンド複合モノマーに繋留されたペプチドまたはペプチド模倣薬）は、Ｎ−メチルペプチドでもよい。Ｎ−メチルペプチドはＮ−メチルアミノ酸からなり、これはペプチド骨格内に付加メチル基を与え、それにより、タンパク分解的切断に抵抗する付加的手段を実現することが可能である。Ｎ−メチルペプチドは、当業で知られている方法により合成可能である（例えば、リンドグレンら（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：９９頁、２０００年、Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌａｎｇｅｌ，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００２年、フィッシュら（Ｆｉｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．），、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．１２：８２５頁，２００１年、ワンダーら（Ｗａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２４：１３３８２頁、２００２年を参照）。例えば、ＡｎｔまたはＴａｔペプチドはＮ−メチルペプチドでもよい。例示的合成は図１１に示されている。
【０２２７】
本発明の一実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣薬（例えば、リガンド複合モノマーに繋留されたペプチドまたはペプチド模倣薬）は、βペプチドでもよい。βペプチドは、ヘリックス、プリーツ・シート、ターン、およびヘアピンなどの安定した２次構造を溶液中に形成する。これらの環状誘導体は、固体状態でナノチューブに折り畳まれることができる。βペプチドは、タンパク質分解酵素による分解に対する耐性を有する。βペプチドは、当業で知られている方法により合成可能である。例えば、ＡｎｔまたはＴａｔペプチドはβペプチドでもよい。例示的合成は図１２に示されている。
【０２２８】
本発明の一実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣薬（例えば、リガンド複合モノマーに繋留されたペプチドまたはペプチド模倣薬）は、オリゴカルバメートでもよい。オリゴカルバメートペプチドは、カルバメートトランスポータにより促進される輸送経路により細胞内に内部化される。例えば、ＡｎｔまたはＴａｔペプチドはオリゴカルバメートでもよい。例示的合成は図１３に示されている。
【０２２９】
本発明の一実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣薬（例えば、リガンド複合モノマーに繋留されたペプチドまたはペプチド模倣薬）は、オリゴ尿素複合体（またはオリゴチオ尿素複合体）でもよく、この場合、ペプチド模倣薬のアミド結合は尿素構成成分で置き換えられる。アミド結合の置換により、タンパク質分解酵素、例えば消化管内のタンパク質分解酵素による分解に対する耐性が高まる。一実施形態では、オリゴ尿素複合体をオリゴヌクレオチド剤に繋留し、経口送達に使用できるようにする。オリゴ尿素ペプチド模倣薬のそれぞれの反復単位内の骨格は、天然アミノ酸と比べて炭素原子１つ分伸ばすことができる。１回の炭素元素伸張で、例えばペプチドの安定性および親油性を高めることができる。したがって、オリゴ尿素ペプチドは、オリゴヌクレオチド剤が細菌細胞壁を通過するように導かれた場合、または神経障害の治療などのためにオリゴヌクレオチド剤が血液脳関門を横断しなければならない場合に有利である。一実施形態では、受容体との高い親和性を生み出すなどのために、水素結合ユニットはオリゴ尿素ペプチドと複合体を形成する。例えば、ＡｎｔまたはＴａｔペプチドは、オリゴ尿素複合体（またはオリゴチオ尿素複合体）でもよい。例示的合成は図１４に示されている。
【０２３０】
本発明のｓｉＲＮＡペプチド複合体は、オリゴヌクレオチド剤上のさまざまな位置に出現するリガンド複合モノマーに関連付けられ、例えば繋留可能である。例えば、ペプチドは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかで末端的に複合することができるか、またはペプチドはビス複合することができる（１つのペプチドがそれぞれの末端に繋留され、１つのペプチドがセンス鎖に複合され、１つのペプチドがアンチセンス鎖に複合される）。他の選択では、ペプチドは、短ヘアピンのオリゴヌクレオチド剤のループ内などで内部的に複合可能である。さらに他の選択では、ペプチドは、ペプチド担体複合体などの複合体に関連付けることができる。
【０２３１】
ペプチド担体複合体は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド剤（生体系および／または細胞への送達などのための）を封入できる、少なくとも１つの担体分子、および担体複合体の標的を特定の組織または細胞型にするなどのために担体分子の外側に繋留されるペプチド構成成分からなる。担体複合体は、複合体、または融合誘導因子の外側に付加標的分子を付けて、細胞送達を補助することができる。担体内に封入された１つまたは複数のオリゴヌクレオチド剤は、担体の内側に薬剤を送達するのを補助することができる親油性分子と複合体を形成することが可能である。
【０２３２】
担体分子または構造は、例えばミセル、リポソーム（例えば、カチオン性脂質）、ナノ粒子、ミクロスフェア、または生分解性高分子でもよい。ペプチド構成成分は、ジスルフィド結合、酸に不安定な結合、ペプチドに基づく結合、オキシアミノ結合、またはヒドラジン結合などのさまざまな結合により担体分子に繋留することが可能である。例えば、ペプチドに基づく結合はＧＦＬＧペプチドでもよい。いくつかの結合には特別な利点があり、それらの利点（または欠点）は、組織標的または意図された用途に応じて考察可能である。例えば、ペプチドに基づく結合は血流内で安定しているが、リソソーム内の酵素的切断には弱い。好ましい担体の概略が図１５に示されている。
【０２３３】
保護モノマー化合物は、カラムクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、または再結晶化などの方法により反応混合物から分離され、さらに精製されることができる。当業者であれば理解できるように、本願の式の化合物を合成する他の方法は、当業者にとっては明らかなことである。それに加えて、他の順序、または所望の化合物をもたらすために、さまざまな合成工程を実行することができる。本願に記載されている化合物を合成する際に使用可能な他の合成化学変換、保護基（例えば、塩基上に存在する、ヒドロキシル、アミノなどの）、および保護基の方法（保護および脱保護）は当業で知られており、例えば、アール．ラロック（Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ）、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （１９８９年）、ティー．ダブリュー．グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）およびピー．ジー．エム．ウッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９１年）、エル．フィーザー（Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ）およびエム．フィーザー（Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ）、Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９４）、およびエル．パケット（Ｌ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ）、ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９５年）、これ以降の版で説明されているようなものを含む。
【０２３４】
本発明の保護モノマー化合物は１つまたは複数の不斉中心を含むことができ、そのため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマ、個々のジアステレオ異性体、およびジアステレオ異性体混合物として出現することができる。これらの化合物のこのような異性体はすべて、明らかに本発明に含まれる。本願に説明されている化合物はさらに、結合回転を制約することができる結合（例えば、炭素−炭素結合、炭素窒素結合、例えばアミド）または置換基を含むことができるが、例えば制約は環または二重結合が存在する結果生じる。したがって、すべてのシス／トランス、Ｅ／Ｚ異性体、および回転異性体（ロタマー）は明らかに本明細書に含まれる。本発明の化合物は、さらに複数の互変異性形態で表されることがあり、そのような場合、本発明は明らかに本願に記載されている化合物のすべての互変異性型を含む（例えば、環系のアルキル化の結果、複数部位にアルキル化が生じ、本発明は明らかにすべてのそのような反応生成物を含む）。このような化合物のこのような異性体はすべて明らかに本発明に含まれる。本願に記載されているこれらの化合物の結晶体はすべて明らかに本発明に含まれる。
【０２３５】
代表的なリガンド複合モノマーならびにリガンド複合モノマーおよび本願に記載されている、関係する化合物を調製するための典型的な合成を以下に示す。他のところで説明されているように、リガンド複合モノマーヒドロキシル基、例えばＯＦＧ１の保護基は、限定はしないがジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＯＦＧ１に対する保護基としてケイ素に基づく保護基を使用することが望ましい場合がある。したがって、ケイ素に基づく保護基は、必要に応じて、または望ましい場合にＤＭＴ基と併用して、またはその代わりに使用可能である。そのため、ＯＦＧ１の保護基としてＤＭＴ保護基を特徴付ける、以下で述べるリガンド複合モノマーおよび合成は、いかなる形でも本発明への制限として解釈すべきでない。
【０２３６】
ピロリン担体の合成
【０２３７】
【化３０】
2008509670.tif 000035
スキーム１．シス−（−（３Ｓ，４Ｒ）−ピロリジンジオールの合成
【０２３８】
【化３１】
2008509670.tif 000036
スキーム２．シス−（−（２Ｒ，３Ｓ）−ピロリジンジオールの合成
【０２３９】
【化３２】
2008509670.tif 000037
【０２４０】
【化３３】
2008509670.tif 000038
５’標識ｓｉＲＮＡの合成
【０２４１】
【化３４】
2008509670.tif 000039
２５＆２６はそれぞれ、３’，５’複合に使用可能である。
【０２４２】
【化３５】
2008509670.tif 000040
フタリミド誘導体の合成
【０２４３】
【化３６】
2008509670.tif 000041
３０および３１は、ｓｉＲＮＡの３’および５’複合に対するスキーム２〜４に示されているような類似の誘導体に転換可能である。
【０２４４】
【化３７】
2008509670.tif 000042
【０２４５】
【化３８】
2008509670.tif 000043
タリミド誘導体の合成
【０２４６】
【化３９】
2008509670.tif 000044
４０および４１は、ｓｉＲＮＡの３’および５’複合に対するスキーム２〜４に示されているような類似の誘導体に転換可能である。
【０２４７】
【化４０】
2008509670.tif 000045
Ｎ−アルキルピロリン誘導体の合成
【０２４８】
【化４１】
2008509670.tif 000046
中間体５０および５１は、類似の反応を使用してｓｉＲＮＡと複合することも可能な類似体に転換可能である。
【０２４９】
【化４２】
2008509670.tif 000047
ピペリジンシリーズリガンド：
ピロリンシリーズと同様に、ピペリジンシリーズを合成することができる。
【０２５０】
【化４３】
2008509670.tif 000048
ピペリジンシリーズリガンド：
ピロリンシリーズと同様に、ピペリジンシリーズを合成することができる。
【０２５１】
【化４４】
2008509670.tif 000049
ヒドロキシプロリンシリーズリンカー：
市販のシス−３−ヒドロキシプロリンおよび（ｓ）−ピロリドンカルボン酸から
【０２５２】
【化４５】
2008509670.tif 000050
【０２５３】
【化４６】
2008509670.tif 000051
ｓｉＲＮＡを安定化するフタリミド誘導体
【０２５４】
【化４７】
2008509670.tif 000052
４−ヒドロキシプロリン誘導体
【０２５５】
【化４８】
2008509670.tif 000053
フタリミド誘導体
【０２５６】
【化４９】
2008509670.tif 000054
六員環のリンカーの合成
【０２５７】
【化５０】
2008509670.tif 000055
類似の反応は、２−ピペリドンおよび３−ピペリドンにより実行可能である。
【０２５８】
４−ピペリドンからのリンカー
【０２５９】
【化５１】
2008509670.tif 000056
３−ピペリドンからのリンカー
【０２６０】
【化５２】
2008509670.tif 000057
２−ピペリドンからのリンカー
【０２６１】
【化５３】
2008509670.tif 000058
デカリン系を介した複合
【０２６２】
【化５４】
2008509670.tif 000059
デカリン系からの複合体：
【０２６３】
【化５５】
2008509670.tif 000060
Ｗｉｅｌａｎｄ−Ｍｉｅｓｃｈｅｒケトンからのデカリンリンカー
【０２６４】
【化５６】
2008509670.tif 000061
Ｗｉｅｌａｎｄ−Ｍｉｅｓｃｈｅｒケトンからの複合体
【０２６５】
【化５７】
2008509670.tif 000062
ピロリンリンカーの合成
【０２６６】
【化５８】
2008509670.tif 000063
固相合成および合成後複合：
【０２６７】
【化５９】
2008509670.tif 000064
例示的なリガンド複合モノマー
【０２６８】
【表３】
2008509670.tif 000065
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オリゴヌクレオチド剤へのリガンドの複合
オリゴヌクレオチド剤、例えばｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド剤へのリガンドの複合は、該オリゴヌクレオチド剤の調節作用に有益な効果を及ぼすことができる。例えば、該オリゴヌクレオチド剤は、薬物動態、安定性、および／または組織特異性を改善することができる。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド剤（以下の式ＯＴ−Ｉ〜ＯＴ−ＩＶにおいては「ＮＡ」、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、キメラＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡと呼ぶ）は、リガンド（Ｌ）を結合するための１つまたは複数の化学結合を有するリガンドを含んだ部分をオリゴヌクレオチドまたは核酸に複合することによって化学的に修飾可能である。あるオリゴヌクレオチド剤のリガンドは、テザーおよびリンカーの一方または両方によって結合可能である。以下の図では、例示的な化学結合をＸ、ＹおよびＺとして表す。これらはテザーまたはリンカーの一部でもよい。
【０２７０】
【化６０】
2008509670.tif 000076
リガンドは、３’末端、５’末端、および内部の位置の１つまたは両方に結合することができる。特定の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、式ＯＴ−Ｉを有する１つまたは複数の部分を複合することによって化学修飾可能である。
【０２７１】
【表４】
2008509670.tif 000077
例示的リガンドを表４に示し、本明細書中の別の個所で考察する。表４に示した例示的リガンド（Ｌ）が好ましい。
【０２７２】
【表５】
2008509670.tif 000078
Ｌ＝
コレステロール
チオコレステロール
５β−コラン酸
コール酸
リトコール酸
ビオチン
ビタミンＥ
ナプロキセン
イブプロフェン
アミン（モノアミン、ジアミン、トリアミン、テトラアルキルアミンまたはアリールアミン）
葉酸
糖（Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、ガラクトース、マンノース）
−（ＣＨ２）ｎＮＱ１Ｑ２（式中、ｎ＝０〜４０、Ｑ１、Ｑ２＝Ｈ、ＭｅまたはＥｔ；Ｑ１＝Ｈ、Ｑ２＝Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔまたはアリール）
−（ＣＨ２）ｐＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｑＮＱ１Ｑ２（式中、ｐおよび／またはｑ＝０〜４０、Ｑ１、Ｑ２＝Ｈ、ＭｅまたはＥｔ；Ｑ１＝Ｈ、Ｑ２＝Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔまたはアリール（Ｅおよび／またはＺ配置を有する。））
−（ＣＨ２）ｐＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｑＮＱ１Ｑ２（式中、ｐおよび／またはｑ＝０〜４０、Ｑ１、Ｑ２＝Ｈ、ＭｅまたはＥｔ；Ｑ１＝Ｈ、Ｑ２＝Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔまたはアリール）
−（ＣＨ２）ｐＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｑＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｒＮＱ１Ｑ２（式中、ｐ、ｑおよび／またはｒ＝０〜４０、Ｑ１、Ｑ２＝Ｈ、ＭｅまたはＥｔ；Ｑ１＝Ｈ、Ｑ２＝Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔまたはアリール（Ｅおよび／またはＺ配置を有する。））
−Ｏ（ＣＨ２）ｍ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＲ（式中、ｍ、ｎ＝０〜４０およびＲ＝Ｈ、Ｍｅ、ＮＱ１Ｑ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’）
−ＮＨ（ＣＨ２）ｍ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＲ（式中、ｍ、ｎ＝０〜４０およびＲ＝Ｈ、Ｍｅ、ＮＱ１Ｑ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’）
−Ｏ（ＣＨ２）ｍ（ＮＨＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｒ（式中、ｍ、ｎ＝０〜４０およびＲ＝Ｈ、ＯＨ、Ｍｅ、ＮＱ１Ｑ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’）
−ＮＨ（ＣＨ２）ｍ（ＮＨＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｒ（式中、ｍ、ｎ＝０〜４０およびＲ＝Ｈ、ＯＨ、Ｍｅ、ＮＱ１Ｑ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’）
ジアルキルグリセロール（ｓｎ３、ｓｎ１、ｓｎ２およびラセミ）（メチレンの数は０〜４０で変動する。）
ジアルキルグリセロール（ｓｎ３、ｓｎ１、ｓｎ２およびラセミ）（メチレンの数は０〜４０で変動する。）
ジアルキルグリセロール（ｓｎ３、ｓｎ１、ｓｎ２およびラセミ）（メチレンの数は０〜４０で変動し、およびアルキル鎖はＥおよび／またはＺ異性体１つまたは複数の二重結合を含む。）
ジアルキルグリセロール（ｓｎ３、ｓｎ１、ｓｎ２およびラセミ）（メチレンの数は０〜４０で変動し、およびアルキル鎖はＥおよび／またはＺ異性体１つまたは複数の二重結合を含む。）
脂質
例示的Ｘ、ＹおよびＺ部分を表５に示す。該Ｘ、ＹおよびＺ部分は相互に独立して選択されることができる。
【０２７３】
【表６】
2008509670.tif 000079
例示的テザーを表７に示す。
【０２７４】
【表７】
2008509670.tif 000080
本願に記載の化合物は、本願に記載の方法または従来の方法によって、市販の試薬および開始材料から調製可能である。
【０２７５】
化合物１はフレイザーら（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．第４１巻：１５２３、２０００年）によって報告されているように調製される。工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）（ａ）、（ｉｉｉ）（ｃ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）は、文献の手順（フレイザーら（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．第４１巻：１５２３、２０００年）に従って実施される。工程（ｉｉｉ）（ｂ）および（ｖ）（ｂ）は、文献（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．第１３巻：１７１３、２００３年）に報告されているように実施される。工程（ｉｖ）は文献（コーレイとベンカテスワール（Ｃｏｒｅｙ  ａｎｄ  Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第９４巻：６１９０、１９７２年）に報告されているように実施される。
【０２７６】
【化６１】
2008509670.tif 000081
ａ（ｉ）２，２−ジ−Ｏ−メチルプロパン、ＰＴＳＡ；（ｉｉ）ＮａＨ／ＤＭＦ、３または４、−４５℃〜室温；（ｉｉｉ）（ａ）ＮＨ３、ＮＨ２ＭｅまたはＮＨＭｅ２、ＴＨＦ、オートクレーブ、（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏおよび（ｃ）Ｐｄ（ＯＨ）、ＥｔＯＨ、ＡｃＯＨ、Ｈ２、５５ｐｓｉ；（ｉＶ）Ｐｄ（ＯＨ）、ＥｔＯＨ、ＡｃＯＨ、Ｈ２、５５ｐｓｉ；（ｖ）ＮａＳＭｅ／ＤＭＦ、８０℃および（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ（ｖｉ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、イミダゾール／Ｐｙ；（ｖｉｉ）ジイソプロピルアミンテトラゾリド、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト／ＣＨ２Ｃｌ２
ある種の化合物の合成を以下のスキーム２に記載する。工程（ｉ）はダボウチックとラディア（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｒａｄｉａ）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、第３８巻：５２５７、１９９７年）に報告されているように実施される。工程（ｉｉ）はコーレイとベンカテスワール（Ｃｏｒｅｙ  ａｎｄ  Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第９４巻：６１９０、１９７２年）に報告されているように実施される。工程（ｉｉｉ）はフレイザーら（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．第４１巻：１５２３、２０００年）に報告されているように実施され、工程（ｉｖ）はミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、２．５．１〜２．５．３６、ジョンワイリーアンドサンズ社［Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．］）に記載されているように実施される。
【０２７７】
【化６２】
2008509670.tif 000082
ａ（ｉ）ＭＭＴｒ−Ｃｌ、ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２；（ｉｉ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、イミダゾール／Ｐｙ；（ｉｉｉ）ジイソプロピルアミンテトラゾリド、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト／ＣＨ２Ｃｌ２；（ｉｖ）（ａ）Ａｃ２Ｏ／Ｐｙ、（ｂ）トリアゾール、ＴＥＡ、４−クロロフェニルジクロロリン酸／ＭｅＣＮ、（ｃ）ＮＨ４ＯＨおよび（ｄ）ペンタフルオロフェニルベンゾエート／Ｐｙ
ある種の化合物の合成は以下のスキーム３に記載のように実施される。工程（ｉ）はミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、２．５．１〜２．５．３６、ジョンワイリーアンドサンズ社［Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．］）に記載されているように実施される。工程（ｉｉ）はコーレイとベンカテスワール（Ｃｏｒｅｙ  ａｎｄ  Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第９４巻：６１９０、１９７２年）に報告されているように実施される。工程（ｉｉｉ）はフレイザーら（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．第４１巻：１５２３、２０００年）に報告されているように実施される。
【０２７８】
【化６３】
2008509670.tif 000083
ａ（ｉ）（ａ）Ａｃ２Ｏ／Ｐｙ、（ｂ）トリアゾール、ＴＥＡ、４−クロロフェニルジクロロリン酸／ＭｅＣＮ、（ｃ）ＮＨ４ＯＨおよび（ｄ）ペンタフルオロフェニルベンゾエート／Ｐｙ；（ｉｉ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、イミダゾール／Ｐｙ；（ｉｉｉ）ジイソプロピルアミンテトラゾリド、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト／ＣＨ２Ｃｌ２
ある種の化合物の合成は以下のスキーム４に記載のように実施される。工程（ｉｉ）はコーレイとベンカテスワール（Ｃｏｒｅｙ  ａｎｄ  Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）（Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第９４巻：６１９０、１９７２年）に報告されているように実施され、工程（ｉｉｉ）はフレイザーら（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．第４１巻：１５２３、２０００年）に報告されているように実施される。
【０２７９】
【化６４】
2008509670.tif 000084
ａ（ｉ）Ｎ−フタルイミド−６−アミノカプロン酸、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、ＨＯＢＴ；（ｉｉ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、イミダゾール／Ｐｙ；（ｉｉｉ）ジイソプロピルアミンテトラゾリド、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト／ＣＨ２Ｃｌ２
ある種の化合物の合成を以下のスキーム５に記載する。工程（ｉ）はミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、２．５．１−２．５．３６、ジョンワイリーアンドサンズ社［Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．］）に報告されているように実施される。工程（ｉｉ）はコーレイとベンカテスワール（Ｃｏｒｅｙ  ａｎｄ  Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）（Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第９４巻：６１９０、１９７２年）に記載されているように実施され、工程（ｉｉｉ）はフレイザーら（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．第４１巻：１５２３、２０００年）に報告されているように実施される。
【０２８０】
【化６５】
2008509670.tif 000085
ａ（ｉ）（ａ）Ａｃ２Ｏ／Ｐｙ、（ｂ）トリアゾール、ＴＥＡ、４−クロロフェニルジクロロリン酸／ＭｅＣＮ、（ｃ）ＮＨ４ＯＨおよび（ｄ）ペンタフルオロフェニルベンゾエート／Ｐｙ；（ｉｉ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、イミダゾール／Ｐｙ；（ｉｉｉ）ジイソプロピルアミンテトラゾリド、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト／ＣＨ２Ｃｌ２
ある種の化合物の合成を以下のスキーム６に記載する。スキーム６に記載の化合物１３０は、リウとオースチン（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ａｕｓｔｉｎ）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：８６４３、２００１年）に報告されているように得られる。工程（ｉ）および（ｉｉｉ）（ｂ）は、文献（Ｃｈｅｍ．ｒｅｖ．，１９５４、５４，１）に報告されているように実施される。工程（ｉｉ）（ａ）は文献の手順（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９３年、５８、２３３４）に従って実施される。工程（ｉｉ）（ｂ）、（ｉｉｉ）（ａ）および（ｉｖ）（ｂ）は、文献（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００３年、第１３巻、１７１３）に報告されているように実施される。工程（ｉｉｉ）（ｃ）はダボウチックとラディア（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｒａｄｉａ）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．第３８巻：５２５７、１９９７年）に報告されているように実施される。工程（ｉｖ）（ａ）は文献（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔ．，２００１年、３、１８０９）に報告されているように実施される。工程（ｖ）はコーレイとベンカテスワール（Ｃｏｒｅｙ  ａｎｄ  Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）（Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第９４巻：６１９０、１９７２年）に報告されているように実施され、工程（ｖｉ）はフレイザーら（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．第４１巻：１５２３、２０００年）に報告されているように実施される。
【０２８１】
【化６６】
2008509670.tif 000086
ａ（ｉ）Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）／ＭｅＯＨ、１気圧；（ｉｉ）（ａ）Ｎ−フタルイミド−６−アミノカプロン酸、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、ＨＯＢＴおよび（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ；（ｉｉｉ）（ａ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ、（ｂ）Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）／ＭｅＯＨ、１気圧および（ｃ）ＭＭＴｒ−Ｃｌ、ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２；（ｉｖ）（ａ）ＣＤＩ（カルボニルイミダゾール）／ＴＨＦ、ＭｅＮＨ２、またはｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、ＤＭＡＰ／Ｐｙ、ＭｅＮＨ２、および（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ（ｖ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、イミダゾール／Ｐｙ；（ｖｉ）ジイソプロピルアミンテトラゾリド、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト／ＣＨ２Ｃｌ２
ある種の化合物の合成を以下のスキーム７に記載する。化合物１４６はリウとオースチン（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ａｕｓｔｉｎ）（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：８６４３、２００１年）に報告されているように得られる。工程（ｉ）（ｂ）および（ｉｉｉ）（ｃ）は、文献（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１９５４、５４，１）に報告されているように実施される。工程（ｉｉ）（ａ）は文献の手順（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９３年、５８、２３３４）に従って実施される。工程（ｉｉ）（ｂ）、（ｉｉｉ）（ｂ）および（ｉｖ）（ｂ）は文献（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００３年、第１３巻、１７１３）に報告されているように実施される。工程（ｉｉｉ）（ｄ）はダボウチックとラディア（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｒａｄｉａ）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９７年、第３８巻、５２５７）に報告されているように実施される。工程（ｉｖ）（ａ）は文献（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔ．，２００１年、３、１８０９）に報告されているように実施される。工程（ｖ）はコーレイとベンカテスワール（Ｃｏｒｅｙ  ａｎｄ  Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ）（Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７２年、第９４巻、６１９０）に報告されているように実施され、工程（ｖｉ）はフレイザーら（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２０００年、第４１巻、１５２３）に報告されているように実施される。
【０２８２】
【化６７】
2008509670.tif 000087
ａ（ｉ）Ｂｚ２Ｏ／Ｐｙおよび（ｂ）Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）／ＭｅＯＨ、１気圧；（ｉｉ）（ａ）Ｎ−フタルイミド−６−アミノカプロン酸、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、ＨＯＢＴおよび（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ；（ｉｉｉ）（ａ）Ｂｚ２Ｏ／Ｐｙ、（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ、（ｃ）Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）／ＭｅＯＨ、１気圧および（ｄ）ＭＭＴｒ−Ｃｌ／Ｐｙ；（ｉｖ）（ａ）ＣＤＩ（カルボニルイミダゾール）／ＴＨＦ、ＭｅＮＨ２、またはｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、ＤＭＡＰ／Ｐｙ、ＭｅＮＨ２、および（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ、（ｖ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、イミダゾール／Ｐｙ；（ｖｉ）ジイソプロピルアミンテトラゾリド、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト／ＣＨ２Ｃｌ２
ある種の化合物を合成を以下のスキーム８に記載する。化合物１６３はリウとオースチン（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ａｕｓｔｉｎ）（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１年、６６、８６４３）に報告されているように得られる。
【０２８３】
【化６８】
2008509670.tif 000088
ａ（ｉ）（ａ）Ｂｚ２Ｏ／Ｐｙおよび（ｂ）Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）／ＭｅＯＨ、１気圧；（ｉｉ）（ａ）Ｎ−フタルイミド−６−アミノカプロン酸、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、ＨＯＢＴおよび（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ；（ｉｉｉ）（ａ）Ｂｚ２Ｏ／Ｐｙ、（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ、（ｃ）Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）／ＭｅＯＨ、１気圧および（ｄ）ＭＭＴｒ−Ｃｌ／Ｐｙ；（ｉｖ）（ａ）ＣＤＩ（カルボニルイミダゾール）／ＴＨＦ、ＭｅＮＨ２、またはｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、ＤＭＡＰ／Ｐｙ、ＭｅＮＨ２、および（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ、（ｖ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、イミダゾール／Ｐｙ；（ｖｉ）ジイソプロピルアミンテトラゾリド、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト／ＣＨ２Ｃｌ２
ある種の化合物の合成を以下のスキーム９に記載する。化合物１８０はリウとオースチン（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ａｕｓｔｉｎ）（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１年、６６、８６４３）に報告されているように得られる。
【０２８４】
【化６９】
2008509670.tif 000089
ａ（ｉ）（ａ）ｉＢｕＣＯＣｌ／Ｐｙおよび（ｂ）Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）／ＭｅＯＨ、１気圧；（ｉｉ）（ａ）Ｎ−フタルイミド−６−アミノカプロン酸、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、ＨＯＢＴおよび（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ；（ｉｉｉ）（ａ）ｉＢｕＣＯＣｌ／Ｐｙ、（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ、（ｃ）Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）／ＭｅＯＨ、１気圧および（ｄ）ＭＭＴｒ−Ｃｌ／Ｐｙ；（ｉｖ）（ａ）ＣＤＩ（カルボニルイミダゾール）／ＴＨＦ、ＭｅＮＨ２、またはｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、ＤＭＡＰ／Ｐｙ、ＭｅＮＨ２、および（ｂ）ＨＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ、（ｖ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、イミダゾール／Ｐｙ；（ｖｉ）ジイソプロピルアミンテトラゾリド、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト／ＣＨ２Ｃｌ２
ターゲティング
本発明において特徴付けられるオリゴヌクレオチド剤、例えばｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチド剤は、特定の組織型または細胞型を標的にすることができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、肝臓、腎臓、神経系細胞、または筋細胞を標的にすることができる。肝臓へのターゲティングのために、例えば、あるオリゴヌクレオチド剤は肝臓、例えば親油性部分をターゲティングするリガンドを含んだＳＲＭＳを含むことができる。親油性部分としては、脂質、コレステロール、オレイル、レチニルまたはコレステリル残基が挙げられる。肝ターゲティング剤として機能することができる他の親油性部分には、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コラン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンが挙げられる。オリゴヌクレオチド剤は、例えばラクトシル化されたＬＤＬなどの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）と組み合わされることによって肝臓をターゲティングすることができる。糖残基と混成されたポリマー担体も肝臓に対してオリゴヌクレオチド剤をターゲティングするように機能することができる。
【０２８５】
オリゴヌクレオチド剤とヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン（ＳＡ）との複合を用いて、非腎組織に対してオリゴヌクレオチド剤をターゲティングすることもできる。
本願に記載のＳＲＭＳターゲティング部分によって組織を標的にするオリゴヌクレオチド剤は、該組織に発現した遺伝子を標的にすることができる。例えば、肝臓をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤は、肝癌を治療するためなど、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＤＩＰ１）、Ｐ２７（ＫＩＰ１）、βカテニン、またはｃ−ＭＥＴをターゲティングすることができる。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡；異常脂質血症、例えば家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）または後天性高脂血症；高コレステロール血症；スタチン耐性高コレステロール血症；冠動脈疾患（ＣＡＤ）；冠動脈心疾患（ＣＨＤ）；またはアテローム性動脈硬化症の治療のためなどに、ａｐｏＢ−１００を標的とすることができる。
【０２８６】
糖、例えばガラクトースおよび／またはその類似体を組み込んだターゲティング剤が有用であることができる。これらの薬剤は、例えば肝実質細胞を標的にする。例えば、ターゲティング部分は、相互に約１５Å離間した２つ以上あるいは好適には３または４つ以上のガラクトース部分を含むことができる。該ターゲティング部分は、別の場合には、ガラクトースに結合したグルコースであるラクトース（例えば、３つのラクトース部分）でもよい。該ターゲティング部分は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミンでもよい。マンノースまたはマンノース−６−リン酸ターゲティング部分は、マクロファージのターゲティングに使用可能である。
【０２８７】
本発明のオリゴヌクレオチド剤は、例えば腎臓をターゲティングするリガンドを含んだＳＲＭＳが組み込まれることによって腎臓もターゲティングすることができる。
本願に記載のＳＲＭＳターゲティング部分によって腎臓をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤は、腎臓に発現した遺伝子をターゲティングすることができる。
【０２８８】
ＳＲＭＳ上のリガンドは、葉酸、グルコース、コレステロール、コール酸、ビタミンＥ、ビタミンＫまたはビタミンＡを含むことができる。
リガンドとの複合により細胞への進入を促進する
ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをターゲティングするｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド剤などのオリゴヌクレオチド剤は、細胞、例えばエンドサイトーシス機構または非エンドサイトーシス機構への進入を増強するように修飾可能である。細胞透過性を増大させるリガンドが、ＳＲＭＳ、例えばピロリンをベースにしたＳＲＭＳへの結合などによる多数の方法でオリゴヌクレオチド剤に結合可能である。
【０２８９】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、多様な細胞型への取り込みを増強させるポリアルギニンに複合可能である。理論によって拘束されるものではないが、増強された取り込みは、非エンドサイトーシス経路によるものと考えられる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドをアミノグリコシドのグアニジウム類似体に複合して、細胞透過性を促進することができる。
【０２９０】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドを親油性部分に複合することができる。この親油性部分を、ピロリンをベースにしたＳＲＭＳの窒素原子に結合することができる。親油性部分の例としては、コレステロール、脂質、オレイル、レチニル、またはコレステリル残基が挙げられる。他の親油性部分には、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リソコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コラン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジンが挙げられる。コレステロールは特に好適な例である。
【０２９１】
細胞透過性を増強するリガンドを３’末端、５’末端または内部に結合することが可能である。該リガンドをＳＲＭＳ、例えばピロリンをベースにしたＳＲＭＳの３’末端、５’末端、または内部結合で結合することが可能である。この結合は直接的であるか、またはテザー分子を介したものでもよい。本願に記載のテザー、スペーサまたはリンカーを用いて、該部分をＳＲＭＳに結合することができる。
【０２９２】
１つまたは複数の細胞浸透性リガンドが複合されたオリゴヌクレオチド剤（「ＯＡ−細胞透過性複合体」と呼ぶ）は、インビボでは、例えば哺乳動物の対象（例えば、ヒトまたはマウス）などのある対象の組織の細胞などの細胞へ送達されることができる。あるいは、またはそれに加えて、該オリゴヌクレオチド剤はインビトロで、例えば細胞系の細胞に送達されることができる。細胞系は、例えば哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウス）などの脊椎生物からのものでもよい。細胞系へのＯＡ−細胞透過性複合体の送達は、他のトランスフェクション試薬が存在しない状態で可能である。例えば、細胞へのＯＡ−細胞透過性複合体の送達は、Ｌｉｐｏ  ｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、［米国カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在］、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（商標）（ミラス社（Ｍｉｒｕｓ）、［米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在］、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、［米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａ  ｐｏｌｉｓ）所在］、ポリエチレンイミン、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、［米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａ  ｐｏｌｉｓ）所在］、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＥＲ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（ビオンテックス社（Ｂｉｏｎｔｅｘ）、［ドイツ、ミュンヘン（Ｍｕｎｉｃｈ）所在］、または別のトランスフェクション試薬が存在しない状態で、または任意に存在下で可能である。例示的細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）［バージニア州マナッサス所在］によって提供可能である。ＯＡ−細胞透過性複合体を本願に記載の任意の細胞系などの細胞系に送達し、特定の遺伝子をターゲティングしてダウンレギュレーションすることができる。
【０２９３】
一例では、オリゴヌクレオチド剤−親油性複合体は、一次細胞系、例えば滑膜細胞系（例えば、Ｂ型滑膜細胞）、心筋細胞系、ケラチノサイト系、肝細胞系、平滑筋細胞系、内皮細胞または皮膚線維芽細胞系に送達されることができる。
【０２９４】
オリゴヌクレオチド剤の構造
ＮＡＴ（「核酸ターゲティング」）であるオリゴヌクレオチド剤は、標的遺伝子に対して十分に相補性のある領域を含み、ヌクレオチドとしては十分に長いことから、該オリゴヌクレオチド剤は標的核酸とともに２本鎖を形成する。該オリゴヌクレオチド剤は標的分子の機能を調節することができる。例えば、標的分子がｍＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍＲＮＡである場合、該ＮＡＴは遺伝子発現を抑制することができる。標的がｍｉＲＮＡである場合、該ＮＡＴはｍｉＲＮＡ機能を抑制し、故に、特定のｍｉＲＮＡによってターゲティングされたｍＲＮＡの発現をアップレギュレーションする。標的がｐｒｅ−ｍＲＮＡの領域でスプライシングに影響する場合、該ＮＡＴはスプライス部位の選択を、故にｍＲＮＡ配列を改変することができる。該ＮＡＴがｍｉＲＮＡとして機能する場合、ターゲティングされたｍＲＮＡの発現が抑制される。わかり易いように、オリゴヌクレオチド剤の１つまたは複数の単量体サブユニットに関連して、「ヌクレオチドまたはリボヌクレオチド」という用語を、本願において用いることがある。本願の「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、修飾されたＲＮＡまたは代替ヌクレオチドの場合、修飾ヌクレオチドまたは１つまたは複数の位置の代替置換部分も指すことを理解されたい。
【０２９５】
ＮＡＴオリゴヌクレオチド剤は、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり、いくつかの実施形態では完全に相補的である領域であるか、または該領域を含む。該オリゴヌクレオチド剤とその標的との間に必ずしも完全な相補性が存在するべきであるというわけではないが、該オリゴヌクレオチド剤またはその切断産物が標的遺伝子発現を調節（例えば、抑制）することができるように、対応は十分なものでなければならない。
【０２９６】
オリゴヌクレオチド剤は以下の特性の１つまたは複数を有することが好ましい。
（１）オリゴヌクレオチド剤は以下の式１、２、３または４である。
（２）オリゴヌクレオチド剤は、１つまたは複数のリン酸基またはリン酸基の１つまたは複数の類似体を含む５’修飾を有する。
【０２９７】
（３）オリゴヌクレオチド剤は、非常に多くの塩基、特に塩基対が修飾されても、ターゲティングされたＲＮＡの活性の調節を可能にするために十分な熱力学的安定性を有する相同的な標的ＲＮＡと２本鎖構造を形成する。
【０２９８】
（４）オリゴヌクレオチド剤は、非常に多くの、またはすべてのヌクレオシドで修飾されても、依然として「ＲＮＡ様の」特性を有する。すなわち、オリゴヌクレオチド剤は、排他的でなくても、または部分的であっても、リボヌクレオチドをベースにした成分のＲＮＡ分子の全体的な構造的、化学的および物理的特性を有する。例えば、ヌクレオチド糖はすべて２’ヒドロキシルの代わりに、例えば２’ＯＭｅ，２’フルオロを含むことができる。このデオキシリボヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチド剤は、依然としてＲＮＡ様の特性を呈することを期待することができる。理論によって拘束しようとするものではないが、電気的陰性のフッ素はリボースのＣ２’位置に結合しているときに、軸方向の配向を好む。また、フッ素のこの空間選択性は糖にＣ３’内向き歪みを導入させることができる。ＲＮＡ分子で観察されるような糖の歪みの形態と同じであり、ＲＮＡに特徴的なＡ−ファミリー型のらせんを生じる。さらにフッ素は良好な水素結合受容体であることから、ＲＮＡ構造を安定させることが知られている水分子との同じ水素結合相互作用に関与し得る。（一般に、２’糖位置の修飾部分はデオキシリボヌクレオチドの２’−Ｈ部分よりもリボヌクレオチドの２’−ＯＨ部分により特徴的な水素結合に入ることが可能になることが好ましい。好適なオリゴヌクレオチド剤は、糖の全部または少なくとも５０、７５、８０、８５、９０または９５％においてＣ３’内向き歪みを呈し、Ｃ３’内向き歪みをその糖の十分な量で呈するので、オリゴヌクレオチド剤はＲＮＡに特徴的なＡ−Ａ−ファミリー型のらせんを生じ得、Ｃ３’内向き歪み構造ではない糖を２０、１０、５、４、３、２または１個以下を有する。
【０２９９】
Ｃ３’内向き歪みを有する好適な２’修飾には以下のものを含む。
２’−ＯＨ、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−Ｆ、２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＭｅ、２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（Ｍｅ）２、ＬＮＡ
（５）修飾の性質に関係なく、またオリゴヌクレオチド剤がデオキシヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドを含むことが可能であっても、ＤＮＡ分子、分子中のヌクレオチドの５０、６０または７０％より多くがデオキシリボヌクレオチドである任意の分子、または２’位置がデオキシである修飾デオキシリボヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド剤の定義から除外されることが好ましい。
【０３００】
Ｃ２’内向き歪みを有する好適な２’修飾には以下のものを含む。
２’−Ｈ、２’−Ｍｅ、２’−Ｓ−Ｍｅ、２’−エチニル、２’−アラ−Ｆ。
糖修飾にはＬ−糖および２’−５’結合糖も含むことができる。
【０３０１】
本願で用いられる「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」とは、標的ＲＮＡに結合するＮＡＴオリゴヌクレオチド剤の場合、安定的で特異的な結合が本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子との間に生じるのに十分な程度の相補性を示すのに用いられる用語である。特異的結合が望ましい条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療上の処置の場合の生理学的条件下、またはインビトロアッセイの場合、該アッセイが実施される条件下で、特異的結合には、非標的配列との相補性が十分に欠けていることが必要である。ターゲティング配列と非ターゲティング配列との間に単一のミスマッチが存在すれば、ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡターゲティングを識別するのに十分であることが明らかとなっている（ブルメルカンプら（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２００２年、２：２４３）。
【０３０２】
一実施形態では、ＮＡＴオリゴヌクレオチド剤は、オリゴヌクレオチド剤が標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を抑制するように、標的ＲＮＡに対して「十分に相補的」である。該標的ＲＮＡは、例えば、対象に内因性のｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡでもよい。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、標的ＲＮＡ、例えば標的ＲＮＡに対して「正確に相補的」（ＳＲＭＳを含んだサブユニットは除外する）である。オリゴヌクレオチド剤はアニールすると正確に相補的な領域において、ワトソン・クリック塩基対から独占的に作られるハイブリッドを形成することができる。「十分に相補的」な標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して正確に相補的である（例えば、少なくとも７ヌクレオチドの）領域を含むことができる。また、いくつかの実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は単一ヌクレオチドの差を特異的に識別する。この場合、正確な相補性がその領域、単一のヌクレオチド差に認められれば、該オリゴヌクレオチド剤は遺伝子発現を下方調節するだけである。
【０３０３】
本願で考察されたオリゴヌクレオチド剤は、別の場合には、非修飾ＲＮＡおよびＤＮＡのほか、例えば有効性を改善するために修飾されたＲＮＡおよびＤＮＡならびに代替ヌクレオシドのポリマーを含む。非修飾ＲＮＡとは、天然に発生する分子と、好適には人体で天然に発生する分子と、核酸の成分、すなわち糖、塩基、およびリン酸部分が同じであるか本質的に同じである分子を指す。この技術はまれであるか例外的ではあるが天然の修飾ＲＮＡであるＲＮＡについては、例えばリンバッハら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９４年、２２：２１８３〜２１９６頁）を参照されたい。多くの場合、修飾ＲＮＡと呼ばれるこのようなまれなまたは異常なＲＮＡは、典型的には転写後修飾の結果であり、本願で用いられる「非修飾ＲＮＡ」という用語の範囲にある。本願で用いられる場合「修飾ＲＮＡ」とは、核酸の成分、すなわち糖、塩基およびリン酸部分の１つまたは複数が自然に発生する成分とは異なる分子、好適には人体で発生する成分とは異なる分子を指す。このような分子は「修飾ＲＮＡ」と呼ばれるが、当然修飾されているので、正確に言えばＲＮＡではない分子を含む。代替ヌクレオシドとは、リボリン酸骨格が、ハイブリダイゼーションがリボリン酸骨格、例えばリボリン酸骨格の非荷電模倣体に見られるものと実質的に類似するように正確な空間的関係で塩基を存在させる非リボリン酸構造と置換された分子である。上記すべての例を本願中で考察する。
【０３０４】
核酸はサブユニットのポリマーまたはモノマーであることから、以下に記載の修飾の多くは、核酸内の繰り返される位置で生じ、例えば、塩基、リン酸部分またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾である。ある場合には、この修飾は核酸内のあらゆる対象位置で生じるが、多くの場合、実際にはほとんどの場合生じない。例を挙げると、修飾は３’または５’末端位置でのみ生じてもよく、末端領域、例えば末端ヌクレオチドのある位置またはある鎖の最後の２、３、４、５または１０ヌクレオチドでのみ生じてもよい。リガンドは３’末端、５’末端、または内部位置、あるいはこれらの位置の組合せで結合することができる。例えば、該リガンドは３’末端および５’末端；３’末端および１つまたは複数の内部位置；５’末端および１つまたは複数の内部位置；または３’末端、５’末端、および１つまたは複数の内部位置にあってもよい。例えば、非結合Ｏの位置のホスホロチオエート修飾は、末端の一方または両方においてのみ生じてよいし、末端領域、例えば末端ヌクレオチド上のある位置またはオリゴヌクレオチドの最後の２、３、４、５または１０ヌクレオチドでのみに生じてもよい。５’末端はリン酸化可能である。
【０３０５】
修飾および代替ヌクレオチドを以下で考察する。
【０３０６】
【化７０】
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式１の上に示した骨格は、リボ核酸の一部を示す。この基本成分はリボース糖、塩基、末端リン酸、およびリン酸−ヌクレオチド間リンカーである。該塩基が天然塩基、例えばアデニン、ウラシル、グアニンまたはシトシンであり、糖が非修飾２’ヒドロキシルリボース糖（示したような）であり、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺがすべてＯである場合、式１は天然の非修飾オリゴリボヌクレオチドを表す。
【０３０７】
いくつかの用途では、非修飾オリゴリボヌクレオチドは最適ではないことがある。例えば非修飾オリゴリボヌクレオチドは、例えば細胞ヌクレアーゼによって分解し易い。ヌクレアーゼは核酸のリン酸ジエステル結合を加水分解することができる。しかし、上記ＲＮＡ成分の１つまたは複数に対して化学修飾すれば特性を改善することができ、例えば、オリゴリボヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより安定したものにすることができる。リガンドまたは他の部分をオリゴヌクレオチド剤に結合する連結地点を提供するという点では、非修飾オリゴリボヌクレオチドはまた最適ではないかもしれない。
【０３０８】
修飾核酸および代替ヌクレオチドは、以下の１つまたは複数を含むことができる。
（ｉ）非結合（ＸおよびＹ）リン酸酸素の一方または両方および／または結合（ＷおよびＺ）リン酸酸素の一方または両方の改変、例えば置換（リン酸が末端位置にある場合、位置ＷまたはＺの一方は天然リボ核酸中の付加的な要素にリン酸を結合しない。しかし、別途記載する場合を除き、用語をわかり易くするために、核酸の５’末端にあるＷ位置および核酸の３’末端にあるＺ末端位置は、本願で用いられるような「リン酸酸素を結合する」という用語の範囲にある。）、
（ｉｉ）リボース糖の成分の、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの改変、例えば置換、あるいは例えば本願に記載したようなリボース糖のリボース以外の構造とのホールセール置換、
（ｉｉｉ）リン酸部分（括弧Ｉ）の「脱リン酸」リンカーとのホールセール置換、
（ｉｖ）天然塩基の修飾または置換、
（ｖ）リボース−リン酸骨格（括弧ＩＩ）の置換または修飾、
（ｖｉ）ＲＮＡの３’末端または５’末端の修飾、例えば末端リン酸基の除去、修飾または置換、あるいはＲＮＡの３’末端または５’末端のいずれかへの、部分、例えば蛍光標識部分の複合。
【０３０９】
この文脈で用いられる場合、置換、修飾、改変等の用語は、任意の方法も制限することを暗示するものではない。例えば、修飾とは、基準リボ核酸または天然リボ核酸を用いて開始し、これを修飾して修飾リボ核酸を生成しなければならないことを意味するものではなく、むしろ修飾とは天然分子との差を示すものにすぎない。
【０３１０】
いくつかの化学的実体の実際の電子構造をただ一つの限界構造式（すなわち、ルイス構造）によって適切に表すことはできないことを理解されたい。理論によって拘束しようとするものではないが、その代わりに、実際の構造は集合的に共鳴形式または共鳴構造として知られている、何らかの２つ以上の限界構造式のハイブリッドまたは加重平均であることができる。共鳴構造とは化学的実体ではなく、紙上にのみ存在する。共鳴構造は特定の化学的実体に対する結合電子および非結合電子の配置または「限局化」という点においてのみ相互に異なる。他のものよりも一つの共鳴構造によって、ハイブリッドの程度をさらに拡大させることが可能である。したがって、本発明の実施形態の記載された説明および図による説明は、当該分野が特定の種に対する有力な共鳴構造として認識しているものの点でなされている。例えば、任意のホスホロアミデート（非結合酸素を窒素と置換したもの）も上図のＸ＝ＯおよびＹ＝Ｎによって表されよう。
【０３１１】
具体的な修飾を以下でさらに詳細に考察する。
リン酸基
該リン酸基は負電荷の種である。この電荷は２個の非結合酸素原子（すなわち、上の式１のＸおよびＹ）にわたって等しく分布される。しかし、このリン酸基を酸素原子の一方を異なる置換基と置換することによって修飾することができる。ＲＮＡリン酸骨格に対するこの修飾の１つの結果として、核酸分解に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性が増大されることができる。したがって、理論によって拘束しようとするものではないが、いくつかの実施形態では、非荷電リンカーまたは非対称の電荷分布を有する荷電リンカーが結果的に得られる改変を導入することが望まれる。
【０３１２】
修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルホスホン酸またはアリールホスホン酸およびアルキルリン酸トリエステルおよびアリールリン酸トリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは硫黄によって置換された両非結合酸素を有する。ＸまたはＹの一方のみが改変される場合とは異なり、ホスホロジチオエートのリン中心はオリゴリボヌクレオチド・ジアステレオマーの形成を排除するアキラルである。ジアステレオマー形成によって、個々のジアステレオマーが種々のヌクレアーゼ耐性を呈する製剤を得ることができる。さらに、キラルリン酸基含有ＲＮＡのハイブリダイゼーション親和性は、それに対応する非修飾ＲＮＡ種に対して低くなることができる。したがって、理論によって拘束しようとするものではないが、キラル中心を排除するＸおよびＹ両方に対する修飾、例えばホスホロジチオエート形成は、それらがジアステレオマー混合物を生成することができないという点で望ましいであろう。したがって、ＸはＳ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、ＮまたはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリールである。）のいずれか１つでもよい。したがって、ＹはＳ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、ＮまたはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリールである。）のいずれか１つでもよい。Ｘおよび／またはＹを硫黄と置換することが好ましい。
【０３１３】
リン酸リンカーは、結合酸素（すなわち、式１のＷまたはＺ）を窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレンホスホン酸）と置換することによって修飾することもできる。この置換は末端酸素（位置Ｗ（３’）または位置Ｚ（５’）において生じることができる。Ｗを炭素と置換することおよびＺを窒素と置換することが好ましい。
【０３１４】
以下に記載のように、候補物質の適合性を評価することができる。
糖基
修飾ＲＮＡは、リボ核酸の糖基の全部または一部の修飾を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を、多数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基を用いて修飾または置換することができる。理論によって拘束しようとするものではないが、ヒドロキシルは脱プロトン化されて２’アルコキシドイオンを最早形成することができないことから、安定性の増強が期待される。該２’アルコキシドはリンカーリン原子に対する分子内求核攻撃によって分解を触媒することができる。また、理論によって拘束しようとするものではないが、いくつかの実施形態に対しては、２’位のアルコキシド形成が不可能である改変を導入することが望ましいであろう。
【０３１５】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例には、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋またはエチレン架橋（例えば、２’−４’−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ））によって同じリボース糖の４’炭素に連結された「固定された」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ、（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が挙げられる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）のみを含んだオリゴヌクレオチド（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）が、強固なホスホロチオエート修飾で修飾されたオリゴヌクレオチドに匹敵するヌクレアーゼ安定性を呈することは注目すべきである。
【０３１６】
「デオキシ」修飾には、水素（すなわち、デオキシリボース糖）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；および例えばアミノ官能基で任意に置換されてよいアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルが挙げられる。好適な置換基は２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
【０３１７】
糖基は、対応するリボース中の炭素の立体化学構成とは反対の立体化学構成を有する１つまたは複数の炭素も含むことができる。したがって、修飾ＲＮＡは糖として、例えばアラビノースを含んだヌクレオチドを含むことができる。
【０３１８】
修飾ＲＮＡは、Ｃ−１’に核酸塩基がない「非塩基」糖も含むことができる。これらの非塩基糖は、成分である糖原子の１つまたは複数において修飾をさらに含んでもよい。
ヌクレアーゼ耐性を最大化するために、１つまたは複数のリン酸リンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせて２’修飾を用いることができる。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドとは、２つ以上の異なる修飾を含むオリゴヌクレオチドである。
【０３１９】
該修飾は、オリゴヌクレオチド剤の１つまたは複数の部位においてリボース構造を他の実体とホールセール置換することも伴うことができる。これらの修飾をＳＲＭＳの糖置換と題する項目で説明する。
【０３２０】
候補修飾を以下に記載のように評価することができる。
リン酸基の置換
リン酸基を非リン酸含有連結基（参考、上記式１の括弧Ｉ）によって置換することができる。理論によって拘束しようとするものではないが、荷電リン酸ジエステル基は核酸分解における反応中心であることから、中性の構造上の模倣体と該荷電リン酸ジエステル基とを置換すれば、ヌクレアーゼ安定性は増強されるはずであると考えられる。また、理論によって拘束しようとするものではないが、いくつかの実施形態では、荷電リン酸基が中性部分によって置換される改変を導入することは、中性部分によって置換されることが望ましい。
【０３２１】
リン酸基を置換し得る部分の例には、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸塩、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。好適な置換基には、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が挙げられる。
【０３２２】
候補修飾を下記のように評価することができる。
リボリン酸骨格の置換
リン酸リンカーおよびリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたは代替ヌクレオチドによって置換された、オリゴヌクレオチドを模倣する骨格を構成することも可能である（上記式１の括弧ＩＩを参照）。理論によって拘束しようとするものではないが、繰り返し荷電された骨格が存在しないことでポリアニオン（例えば、ヌクレアーゼ）を認識するタンパク質への結合が縮小されると考えられる。また、理論によって拘束しようとするものではないが、いくつかの実施形態では、塩基が中性の代替骨格によって繁留される改変を導入することが望ましいことがある。
【０３２３】
例として、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）代替ヌクレオシドが挙げられる。好適な代替は代替ＰＮＡである。
候補修飾を以下のように評価することができる。
【０３２４】
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を修飾することができる。このような修飾は、分子の３’末端、５’末端またはこの両方であってよい。修飾は、末端リン酸全体またはリン酸基の原子の１つまたは複数を修飾または置換することを含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を、標識部分、例えばフルオロフォア（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３またはＣｙ５染料）または保護基（例えば、硫黄基、シリコン基、ホウ素基またはエステル基に基づく）などの他の機能分子実体に複合することができる。該機能分子実体をリン酸基および／またはスペーサを介して糖に結合することができる。該スペーサの末端原子は、リン酸基の結合原子または糖のＣ−３’またはＣ−５’Ｏ、Ｎ、ＳまたはＣ基に連結するか、またはこれらを置換することができる。あるいは、該スペーサは、代替ヌクレオチド（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に連結するか、またはこれを置換することができる。これらのスペーサまたはリンカーには、例えば−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、０（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、非塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミドまたはモルホリノ、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を挙げることができる。理論によって拘束しようとするものではないが、ある種の部分を複合すれば、輸送性、ハイブリダイゼーション性および特異性を改善することができると考えられる。また、理論によって拘束しようとするものではないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端改変を導入することが望ましいと思われる。末端修飾の他の例には、染料、相互作用剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、Ｓａｐｐｈｙｒｉｎ）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リソコール酸、０３−（オレオイル）コラン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾール・クラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋混成物）が挙げられる。
【０３２５】
活性を調節するか、または分解に対する耐性を調節するために本願の別の個所で考察するようなものを含む多くの理由で、末端修飾を付加することができる。好適な修飾には、メチルホスホネートホスホネートを３’−最末端結合に付加すること；３’Ｃ５−アミノアルキル−ｄＴを付加すること；３’カチオン基を付加すること；または別の３’複合体を付加して３’−５’エキソヌクレアーゼ分解を抑制することが挙げられる。
【０３２６】
活性を調節するのに有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体で５’末端を修飾することが挙げられる。例えば、好適な実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は５’リン酸化されているか、５末端にホスホリル類似体を含む。５’−リン酸修飾には、ＲＩＳＣ媒介性遺伝子サイレンシングと適合するものを含む。適した修飾には、５’−１リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−２リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−３リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシン・キャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシン・キャップ（Ａｐｐｐ）および任意の修飾または非修飾ヌクレオチド・キャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄で置換した１リン酸、２リン酸および３リン酸（例えば、５’−α−チオ３リン酸、５’−γ−チオ３リン酸等）の任意の付加的な組合せ、５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチル等、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（０）−Ｏ−５’−）が挙げられる。
【０３２７】
末端修飾は分布をモニタリングするのにも有用であることができ、このような場合、付加されるのに好適な基には、フルオロフォア、例えばフルオレセインまたはアレクサ色素、例えばアレクサ４８８が挙げられる。末端修飾は取り込みを増強するのにも有用であることができる。これに有用な修飾にはコレステロールが挙げられる。末端修飾はオリゴヌクレオチド剤を別の部分に架橋するのにも有用であることができる。これに有用な修飾にはマイトマイシンＣが挙げられる。
【０３２８】
候補修飾を以下のように評価することができる。
塩基
アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルはＲＮＡに見出される最も一般的な塩基である。これらの塩基を修飾または置換して特性が改善されたＲＮＡを提供することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドはこれらの塩基を用いて、または合成および天然核酸塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ハイポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシンまたはツベルシジン）および上記修飾のいずれか１つを用いて調製することができる。あるいは、上記塩基、例えば本願に記載の「特異な塩基」および「一般的な塩基」のいずれかの置換または修飾類似体を用いてよい。例としては、これに限定するものではないが、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基を含む、２−アミノアデニン、６−メチル誘導体およびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが挙げられる。さらなるプリンおよびピリミジンには、米国特許第３６８７８０８号明細書に開示のもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８〜８５９頁、クロシュヴィッツ、ジェイ．エル編集（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０年に記載のもの、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１年、３０、６１３に開示されたものが挙げられる。
【０３２９】
一般に、塩基を変更することは安定性を促進するのにはあまり好ましくないが、他の理由で有用であることができる。例えば、その一部は、例えば２，６−ジアミノプリンおよび２アミノプリン（例えば、２−アミノアデニン）は蛍光性である。修飾塩基は標的特異性を低減することができる。このことはオリゴヌクレオチド剤の設計に考慮されるべきである。
【０３３０】
候補修飾を以下のように評価することができる。
候補オリゴヌクレオチド剤の評価
候補オリゴヌクレオチド剤、例えば修飾オリゴヌクレオチド剤に関して、該オリゴヌクレオチド剤または修飾分子および対照分子を適した条件に曝露し、選択された特性の存在を評価することによって、選択された特性を評価することができる。例えば、分解耐性を次のように評価することが可能である。候補修飾ＲＮＡ（および好適には対照分子、一般には非修飾形態）を分解性の条件に曝露すること、例えば分解剤、例えばヌクレアーゼを含んだある環境に曝露することができる。例えば、生物試料、例えば治療的使用、例えば血液または細胞分画、例えば無細胞ホモジネートまたは分解細胞において遭遇するかもしれない環境に類似する試料を用いることができる。次いで、該候補および対照に関して、多数のアプローチのいずれかを用いて分解耐性を評価することができる。例えば、該候補および対照は、例えば放射性標識または酵素標識、あるいはＣｙ３またはＣｙ５などの蛍光標識を用いて、好適には曝露前に標識することができる。対照および修飾ＲＮＡを分解剤とともにインキュベートすることができ、場合によって、対照、例えば不活化された例えば熱不活性化された分解剤とともにインキュベートすることができる。次いで、修飾分子および対照分子の物理的パラメータ、例えば大きさが決定される。それらを物理的方法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動またはサイジングカラムによって決定し、分子がその元の長さを維持しているかどうかを検定することができるか、または機能検定することができる。あるいは、ノーザンブロット分析を用いて未標識の修飾分子の長さを検定することができる。
【０３３１】
機能検定を用いて候補オリゴヌクレオチド剤を評価することもできる。機能検定を最初に、またはそれ以前の非機能検定（例えば、分解耐性検定）の後に適用して、修飾が分子の遺伝子発現抑制能を改変するかどうかを決定することができる。例えば、ある細胞、例えばマウスまたはヒト細胞などの哺乳類細胞を、蛍光タンパク質を発現するプラスミド、例えばＧＦＰ、および蛍光タンパク質をコードする転写産物と相同性の候補オリゴヌクレオチド剤と同時にトランスフェクトすることができる（例えば、国際特許公開第００／４４９１４号パンフレットを参照）。例えば、ＧＦＰ  ｍＲＮＡと相同性の修飾オリゴヌクレオチド剤に関し、トランスフェクションが候補オリゴヌクレオチド剤を含んでいなかった対照細胞、例えばオリゴヌクレオチド剤が付加されていない対照および／または非修飾ＲＮＡが付加された対照と比較して、細胞蛍光の低減をモニタリングすることによってＧＦＰ発現抑制能を検定することができる。遺伝子発現に対する候補オリゴヌクレオチド剤の有効性は、修飾および非修飾のオリゴヌクレオチド剤の存在下で細胞蛍光を比較することによって検定することができる。代替の機能検定では、マウスの内在性遺伝子、好適にはｃ−ｍｏｓなどの母親性発現性遺伝子に相同の候補オリゴヌクレオチド剤をマウス未成熟卵母細胞に注入して、インビボにおいてオリゴヌクレオチド剤の遺伝子発現抑制能を検定することができる（例えば、国際特許公開第０１／３６６４６号パンフレットを参照）。卵母細胞の表現型、例えば分裂中期ＩＩにおいて停止を維持する能力を、オリゴヌクレオチド剤が発現を抑制している指標としてモニタリングすることができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤によってｃ−ｍｏｓ  ｍＲＮＡが切断されると、卵母細胞は分裂中期停止を出て単為発生を開始する（カレッジら（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：６５〜６８頁、１９９４年；ハシモトら（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、第３７０巻：６８〜７１頁、１９９４年）。陰性対照と比較して、該修飾オリゴヌクレオチド剤の標的ＲＮＡ濃度に対する効果をノーザンブロット分析によって検証して、標的ＲＮＡの濃度の低下を検定することができるか、またはウェスタンブロット分析によって検証して標的タンパク質の濃度の低下を検定することができる。対照は、修飾物質が付加されていないおよび／または非修飾ＲＮＡが付加された細胞を含むことができる。
【０３３２】
ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド剤を、ｍｉＲＮＡによってターゲティングされた転写物の発現をモニタリングすることによって検定することができる。例えば、ＧＦＰを標的とするｍｉＲＮＡを結合するように設計されたオリゴヌクレオチド剤を、トランスフェクションが候補オリゴヌクレオチド剤を含んでいない対照細胞、例えば修飾物質が添加されていない対照および／または非修飾ＲＮＡが添加された対照と比較して、細胞蛍光の増大をモニタリングすることによって検定することができる。他の例では、内因性酵素をターゲティングするｍｉＲＮＡを結合するように設計されたオリゴヌクレオチド剤を、対照細胞と比較して、酵素活性の増大をモニタリングすることによって検定することができる。修飾オリゴヌクレオチド剤の標的ｍｉＲＮＡ濃度に対する効果を、ノーザンブロット分析によって検証して標的ｍｉＲＮＡの濃度の低減を検定することができる。
【０３３３】
参照文献
一般的な参照文献
本発明に従って用いられるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、固相合成を用いたものでもよい（例えば、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、エム．ジェイ．ゲイト（Ｍ．Ｊ．Ｇｅｉｔ）編集、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８４年；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、エフ．エクスタイン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）編集、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１年（特にＣｈａｐｔｅｒ  １、Ｍｏｄｅｒｎ  ｍａｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２、Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ３、２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ４、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ５、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ６、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏ−２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ、およびＣｈａｐｔｅｒ  ７、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂａｓｅｓを参照されたい。）。特に有用な他の合成手順、試薬、保護基および反応条件は、マルチン、ピー．（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．）、ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５年、７８、４８６〜５０４頁；ビューケージ、エス．エル．とイエール、アール．ピー．（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９２年、４８、２２２３〜２３１１頁およびビューケージ、エス．エル．とイエール、アール．ピー．（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９３年、４９、６１２３〜６１９４頁、またはそれらに引用されている参考文献に記載されている。
【０３３４】
本願においては、国際特許公開第００／４４８９５号パンフレット、同第０１／７５１６４号パンフレットまたは同第０２／４４３２１号パンフレットに記載の修飾を用いることができる。
【０３３５】
ここに列挙した刊行物、特許および特許出願すべての開示を援用する。
リン酸基の参考文献
ホスフィン酸オリゴリボヌクレオチドの調製法は、米国特許第５５０８２７０号明細書に記載されている。アルキルホスホネートオリゴリボヌクレオチドの調製法は、米国特許第４４６９８６３号明細書に記載されている。ホスホロアミダイト・オリゴリボヌクレオチドの調製法は、米国特許第５２５６７７５号明細書または米国特許第５３６６８７８号明細書に記載されている。リン酸トリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製法は、米国特許第５０２３２４３号明細書に記載されている。ボラノリン酸オリゴリボヌクレオチドの調製法は米国特許第５１３０３０２号明細書および同第５１７７１９８号明細書に記載されている。３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデートオリゴリボヌクレオチドの調製法は、米国特許第５４７６９２５号明細書に記載されている。３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴリボヌクレオチドは、アン、エッチら（Ａｎ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、６６、２７８９〜２８０１頁に記載されている。硫黄架橋ヌクレオチドの調製法は、スプロートら（Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ．ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９８８年、７，６５１およびクロスチックら（Ｃｒｏｓｓｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８９年、３０，４６９３に記載されている。
【０３３６】
糖基の参考文献
２’修飾に対する修飾については、ベルマ、エス．ら（Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８年、６７、９９〜１３４頁およびその中の全参考文献に見ることができる。リボースに対する具体的な修飾については、以下の参考文献：２’−フルオロ（カワサキら（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ．ａｌ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９３年、３６、８３１〜８４１頁）、２’−ＭＯＥ（マルチン、ピー．（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．）、ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９６年、７９、１９３０〜１９３８頁）、「ＬＮＡ」（ヴェンゲル、ジェイ．（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．）、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９年、３２、３０１〜３１０頁）に見ることができる。
【０３３７】
リン酸基置換の参考文献
本願ではＭＭＩ結合オリゴリボヌクレオシドとも呼ばれるメチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド、本願ではＭＤＨ結合オリゴリボヌクレオシドとも呼ばれるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド、および本願ではアミド−３結合オリゴリボヌクレオシドとも呼ばれるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、本願ではアミド−４結合５オリゴリボヌクレオシドとも呼ばれるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、ならびに例えばＭＭＩおよびＰＯまたはＰＳ結合が交互になっている混合された骨格化合物は、米国特許第５３７８８２５号明細書、同５３８６０２３号明細書、同５４８９６７７号明細書および国際出願公開ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４号および同ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３０５号（国際出願公開第９２／２０８２２号パンフレットおよび同第９２／２０８２３号パンフレットとしてそれぞれ公開されている）に記載されているように調製することができる。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５２６４５６２号明細書および同第５２６４５６４号明細書に記載されているように調製することができる。エチレンオキシド結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５２２３６１８号明細書に記載されているように調製することができる。シロキサン置換はコルミエール、ジェイ．エフ．ら（Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９８８年、１６、４５８３頁に記載されている。炭酸塩置換はチッテンソル、ジェイ．アール．ら（Ｔｉｔｔｅｎｓｏｒ，Ｊ．Ｒ．）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ  １９７１、１９３３に記載されている。カルボキシメチル置換は、エッジ、エム．ディー．ら（Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  １９７２、１９９１に記載されている。カルバメート置換は、スティアチャック、イー．ピー．（Ｓｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８９、１７、６１２９に記載されている。
【０３３８】
リン酸−リボース骨格置換の参考文献
シクロブチル糖代替化合物は、米国特許第５３５９０４４号明細書に記載されているように調製することができる。代替ピロリジン糖は、米国特許第５５１９１３４号明細書に記載されているように調製することができる。代替モルホリノ糖は米国特許第５１４２０４７号明細書および同５２３５０３３号明細書および関連する他の特許の開示に記載されているように調製することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は周知であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡｓ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、４、５−２３で参照した種々の手順のいずれかに従って調製することができる。ペプチド核酸は、米国特許第５５３９０８３号明細書に従って調製してもよい。
【０３３９】
末端修飾の参考文献
末端修飾はモノハラン、エムら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２、１０３〜１２８頁（２００２年）およびその中の参照に記載されている。
【０３４０】
塩基の参考文献
Ｎ−２置換プリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５４５９２５５号明細書に記載されているように調製することができる。３−デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５４５７１９１号明細書に記載されているように調製することができる。５，６−置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５６１４６１７号明細書に記載されているように調製することができる。５−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５４８４９０８号明細書に記載されているように調製することができる。付加的な参考文献については、塩基修飾に関する上記のセクションに開示されている。
【０３４１】
好適なオリゴヌクレオチド剤
好適なオリゴヌクレオチド剤は以下の構造を有する（以下の式２を参照）。
【０３４２】
【化７１】
2008509670.tif 000091
上記式２を参照すると、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立して、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基を含む、Ｈ、（すなわち、非塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ハイポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンである。
【０３４３】
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は各々独立して、ＯＲ８、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ８；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ９；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ９、Ｈ；ハロ；ＮＨ２；ＮＨＲ８；Ｎ（Ｒ８）２；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ９；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８；；シアノ；メルカプト、ＳＲ８；アルキル−チオ−アルキル；ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノまたはウレイドで任意に各々置換されてよい、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニルであるか；あるいはＲ４、Ｒ５またはＲ６はＲ７とともに結合して糖２’炭素と４’炭素との間に［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合橋を形成する。
Ａ１は
【０３４４】
【化７２】
2008509670.tif 000092
；Ｈ；ＯＨ；ＯＣＨ３；Ｗ１；非塩基ヌクレオチド；または存在しない。
（好適なＡ１は、特にアンチセンス鎖に関して、５’−１リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−２リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−３リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−グアノシン・キャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−アデノシン・キャップ（Ａｐｐｐ）およびあらゆる修飾または非修飾ヌクレオチド・キャップ構造（Ｎ−０−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−モノジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換１リン酸、２リン酸および３リン酸（例えば、５’−α−チオ３リン酸、５’−γ−チオ３リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチル等、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−））のあらゆる組合せから選択される。
【０３４５】
Ａ２は
【０３４６】
【化７３】
2008509670.tif 000093
であり、
Ａ３は
【０３４７】
【化７４】
2008509670.tif 000094
であり、
およびＡ４は
【０３４８】
【化７５】
2008509670.tif 000095
；Ｈ；Ｚ４；反転ヌクレオチド；非塩基ヌクレオチド；または存在しない。
【０３４９】
Ｗ１はＯＨ、（ＣＨ２）ｎＲ１０、（ＣＨ２）ｎＮＨＲ１０、（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ１０；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＳ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｓ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ１０；Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；Ｑ−Ｒ１０、Ｏ−Ｑ−Ｒ１０、Ｎ−Ｑ−Ｒ１０、Ｓ−Ｑ−Ｒ１０または−Ｏ−である。Ｗ４はＯ、ＣＨ２、ＮＨまたはＳである。
【０３５０】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は各々独立してＯまたはＳである。
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４は各々独立してＯＨ、Ｏ−、ＯＲ８、Ｓ、Ｓｅ、ＢＨ３−、Ｈ、ＮＨＲ９、Ｎ（Ｒ９）２アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、各々任意に置換されていてもよい。
【０３５１】
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は各々独立してＯ、ＣＨ２、ＮＨまたはＳである。Ｚ４はＯＨ、（ＣＨ２）ｎＲ１０、（ＣＨ２）ｎＮＨＲ１０、（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ１０；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＳ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｓ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；Ｑ−Ｒ１０、Ｏ−Ｑ−Ｒ１０、Ｎ−Ｑ−Ｒ１０、Ｓ−Ｑ−Ｒ１０である。
【０３５２】
Ｘは、本願に記載のオリゴヌクレオチド剤の長さに適合するように選択された５〜１００である。
Ｒ７はＨであるか；あるいはＲ４、Ｒ５またはＲ６とともに結合して糖２’炭素と４’炭素との間に［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合橋を形成する。
【０３５３】
Ｒ８はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アミノ酸または糖である。Ｒ９はＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノまたはアミノ酸である。Ｒ１０はＨ；フルオロフォア（ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３またはＣｙ５染料）；硫黄、シリコン、ホウ素またはエステル保護基；挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋リンカー（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン、（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミ酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リソコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コラン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ；アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール；放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾール・クラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋混成物）；またはオリゴヌクレオチド剤である。Ｍは０〜１，０００，０００であり、ｎは０〜２０である。Ｑは非塩基糖、アミド、カルボキシ、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノ、ビオチンまたはフルオレセイン試薬からなる群から選択されたスペーサである。
【０３５４】
リン酸基全体が置換された好適なオリゴヌクレオチド剤は以下の構造を有する（以下の式３を参照）。
【０３５５】
【化７６】
2008509670.tif 000096
式３を参照すると、Ａ１０〜Ａ４０はＬ−Ｇ−Ｌである。Ａ１０および／またはＡ４０はなくてもよく、Ｌはリンカーである（式中、Ｌの一方または両方は存在してよいか、または存在しなくてもよく、ＣＨ２（ＣＨ２）ｇ；Ｎ（ＣＨ２）ｇ；Ｏ（ＣＨ２）ｇ；Ｓ（ＣＨ２）ｇからなる群から選択される。）。Ｇはシロキサン、炭酸、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸塩、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノからなる群から選択された官能基である。
【０３５６】
Ｒ１０、Ｒ２０およびＲ３０は各々独立して、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基を含む、Ｈ、（すなわち、非塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ハイポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンである。
【０３５７】
Ｒ４０、Ｒ５０およびＲ６０は各々独立して、ＯＲ８、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ８；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ９；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ９、Ｈ；ハロ；ＮＨ２；ＮＨＲ８；Ｎ（Ｒ８）２；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２Ｒ９；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８；；シアノ；メルカプト、ＳＲ７；アルキル−チオ−アルキル；ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノまたはウレイド基で任意に各々置換されてよい、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニルであるか；あるいはＲ４０、Ｒ５０またはＲ６０はＲ７０とともに結合して糖２’炭素と４’炭素との間に［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合橋を形成する。
【０３５８】
Ｘは５〜１００であるか、または本願に記載のオリゴヌクレオチド剤の長さに適合するように選択される。
Ｒ７０はＨであるか；あるいはＲ４０、Ｒ５０またはＲ６０とともに結合して糖２’炭素と４’炭素との間に［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合橋を形成する。
【０３５９】
Ｒ８はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アミノ酸または糖であり；Ｒ９はＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノまたはアミノ酸である。Ｍは０〜１，０００，０００、ｎは０〜２０、ｇは０〜２である。
【０３６０】
好適な代替ヌクレオシドは以下の構造を有する（以下の式４を参照）。
【０３６１】
【化７７】
2008509670.tif 000097
Ｓはｍｏｐｈｉｌｉｎｏ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸からなる群から選択される代替ヌクレオシドである。Ｌはリンカーであり、ＣＨ２（ＣＨ２）ｇ；Ｎ（ＣＨ２）ｇ；Ｏ（ＣＨ２）ｇ；Ｓ（ＣＨ２）ｇ；−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−からなる群から選択されるか、またはなくてもよい。Ｍはアミド結合；スルホンアミド；スルフィン酸；リン酸基；本願に記載の修飾リン酸基；またはなくてもよい。
【０３６２】
Ｒ１００、Ｒ２００およびＲ３００は各々独立して、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基を含む、Ｈ、（すなわち、非塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ハイポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンである。
【０３６３】
Ｘは５〜１００であるか、または本願に記載のオリゴヌクレオチド剤の長さに適合するように選択される。ｇは０〜２である。
ヌクレアーゼ耐性モノマー
本願に記載のモノマーおよび方法を用いて、ヌクレアーゼ耐性モノマー（ＮＲＭ）を組み込んだオリゴヌクレオチド剤を調製することができる。
【０３６４】
オリゴヌクレオチド剤は、例えば対象の体に見られるヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによって分解を抑制するように修飾されたモノマーを含むことができる。これらのモノマーは、本願においてはＮＲＭ、またはヌクレアーゼ耐性促進モノマーまたは修飾と呼ばれる。多くの場合、これらの修飾はオリゴヌクレオチド剤の他の特性、例えばタンパク質、例えば輸送タンパク質、例えば血清アルブミン、またはＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング混成物）のメンバーと相互作用する能力、あるいは相互に２本鎖を形成するか、または別の配列、例えば標的分子と２本鎖を形成する第１および第２の配列の能力も調節する。
【０３６５】
理論によって拘束しようとするものではないが、オリゴヌクレオチド剤において糖、塩基および／またはリン酸骨格を修飾すれば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ耐性を増強することができ、輸送タンパク質およびＲＩＳＣ混成物の機能成分の１つまたは複数の相互作用を増強することができると考えられる。好適な修飾は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ耐性を増大させ、故にＲＩＳＣ混成物と相互作用する前のオリゴヌクレオチド剤の半減期を引き延ばすが、同時にＲＩＳＣ混成物においてはエンドヌクレアーゼ活性に対する耐性をオリゴヌクレオチド剤に与えない修飾である。また、理論によって拘束しようとするものではないが、オリゴヌクレオチド剤の３’および／または５’末端あるいはその近傍に修飾を配置すれば、上で示した好適なヌクレアーゼ耐性基準を満たす薬剤を得ることができると考えられる。
【０３６６】
上で示した好適なヌクレアーゼ耐性基準を満たすオリゴヌクレオチド剤を生成するのに有用であり得る修飾には、以下の糖、塩基および／またはリン酸骨格の化学的および／または立体化学的修飾の１つまたは複数を含むことができる。
【０３６７】
（ｉ）キラル（Ｓｐ）チオエート。したがって、好適なＮＲＭは、非結合位置、例えばＳｐまたはＲｐに、Ｘ位置（これは通常は酸素が占める位置である）にヘテロ原子を含んだ修飾リン酸基の純粋なキラル型が豊富であるか、該キラル型を有するヌクレオチド２量体を含む。Ｘの原子は、Ｓ、Ｓｅ、Ｎｒ２またはＢｒ３でもよい。ＸがＳの場合、豊富であるか、キラル的に純粋なＳｐ結合が好ましい。「豊富な」とは好適な型の少なくとも７０、８０、９０、９５または９９％を意味する。このようなＮＲＭを以下で詳細に考察する。
【０３６８】
（ｉｉ）リン酸または修飾リン酸骨格部分の糖、塩基および／またはリン原子への１つまたは複数のカチオン基の結合。したがって、好適なＮＲＭは、カチオン基において誘導体化された末端位置にモノマーを含む。オリゴヌクレオチド剤の５’末端は末端−ＯＨまたはリン酸基を有するべきであるので、このＮＲＭは該オリゴヌクレオチド剤の５’末端において使用されないことが好ましい。該基はＨ結合形成およびハイブリダイゼーションの干渉を最小にする塩基上のある位置、例えば他の鎖上の相補的塩基と相互作用する面から離れた位置、例えばピリミジンの５’位置またはプリンの７位置に結合しているべきである。これらを以下で詳細に考察する。
【０３６９】
（ｉｉｉ）末端の非リン酸結合。したがって、好適なＮＲＭは、非リン酸結合、例えばリン酸結合が与えるよりも高い切断耐性を与える４個の原子の結合を含む。例には３’ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−５’および３’ＣＨ２−ＮＨ−（Ｏ＝）−ＣＨ２−５’が挙げられる。
【０３７０】
（ｉｖ）３’架橋チオリン酸および５’架橋チオリン酸。したがって、好適なＮＲＭはこれらの構造を含み得る。
（ｖ）Ｌ−ＲＮＡ、２’−５’結合、反転結合、ａ−ヌクレオシド。したがって、他の好適なＮＲＭは：ＬヌクレオシドおよびＬ−ヌクレオシド由来の２量体ヌクレオチド；２’−５’リン酸、非リン酸および修飾リン酸結合（例えば、チオリン酸、ホスホルアミドエートおよびリン酸ホウソ）；反転結合、例えば、３’−３’または５’−５’結合を含む２量体；糖上の１’位にα結合を有するモノマー、例えば、α結合を有する本明細書に記載の構造が挙げられる。
【０３７１】
（ｖｉ）複合体基。したがって、好適なＮＲＭは、例えば、ターゲティング部分または本願に記載の複合されたリガンド、例えば糖、塩基、または骨格を介して例えばモノマーと複合されたリガンドを含むことができる。
【０３７２】
（ｖｉ）非塩基結合。したがって、好適なＮＲＭは、非塩基モノマー、例えば、本明細書に記載のような非塩基モノマー（例えば、無核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｌｅｓｓ）モノマー）；本願に記載のような芳香族モノマーまたはヘテロ環またはポリヘテロ環芳香族モノマーを含むことができる。
【０３７３】
（ｖｉｉ）５’−ホスホネートおよび５’リン酸プロドラッグ。したがって、好適なＮＲＭはリン酸基の１つまたは複数の原子が保護基で誘導体化されたモノマーを好適には末端位置に、例えば５’位置に含む。該保護基または複数の保護基は対象の身体の成分、例えばカルボキシエステラーゼ、または対象の身体に存在する酵素の作用の結果除去される。例えば、カルボキシエステラーゼが保護された分子を切断し、その結果リン酸のＯに隣接する炭素を攻撃するチオエートアニオンが生成され、またその結果脱保護されたリン酸が生成されるリン酸プロドラッグ。
【０３７４】
１つまたは複数の異なるＮＲＭ修飾をあるオリゴヌクレオチド剤に、またはあるオリゴヌクレオチド剤の配列に導入することができる。ある配列またはあるオリゴヌクレオチド剤において、ＮＲＭ修飾を２回以上用いることができる。いくつかのＮＲＭはハイブリダイゼーションに干渉することから、組み込まれる総数は許容されるレベルのオリゴヌクレオチド剤／標的ＲＮＡ２本鎖形成が維持されるようにすべきである。
【０３７５】
キラルＳｐチオエート
修飾には非結合（ＸおよびＹ）リン酸酸素の一方または両方および／または結合（ＷおよびＺ）リン酸酸素の１つまたは複数を改変すること、例えば置換することを含むことができる。以下の式Ｘは、２つの糖／糖代替−塩基部分であるＳＢ１およびＳＢ２を結合するリン酸部分を表す。
【０３７６】
【化７８】
2008509670.tif 000098
ある実施形態では、リン酸骨格部分（ＸおよびＹ）の非結合リン酸酸素の一つを、Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは水素、アルキル、アリール等）、Ｃ（すなわち、アルキル基、アリール基等）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは水素、アルキル、アリール等）またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリール）のいずれか１つによって置換することができる。非修飾リン酸基のリン原子はアキラルである。しかし、非結合酸素の一つを上記原子の１つまたは原子のグループと置換すれば、リン原子はキラルになる。言い換えれば、このように修飾したリン酸基のリン原子は立体中心である。立体中心であるリン原子は、「Ｒ」配置（ここではＲｐ）または「Ｓ」構成（ここではＳｐ）のいずれかを有することができる。したがって、立体中心リン原子の集団の６０％がＲｐ配置を有する場合、立体中心リン原子の集団の残りの４０％はＳｐ配置を有する。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、リン酸非結合酸素が別の原子または原子の集団によって置換されたリン酸基を有するオリゴヌクレオチド剤は、これらの原子の少なくとも約５０％（例えば、これらの原子の少なくとも約６０％、これらの原子の少なくとも約７０％、これらの原子の少なくとも約８０％、これらの原子の少なくとも約９０％、これらの原子の少なくとも約９５％、これらの原子の少なくとも約９８％、これらの原子の少なくとも約９９％）がＳｐ配置を有する立体中心リン原子の集団を含んでもよい。あるいは、リン酸非結合酸素が別の原子または原子の集団によって置換されたリン酸基を有するオリゴヌクレオチド剤は、これらの原子の少なくとも約５０％（例えば、これらの原子の少なくとも約６０％、これらの原子の少なくとも約７０％、これらの原子の少なくとも約８０％、これらの原子の少なくとも約９０％、これらの原子の少なくとも約９５％、これらの原子の少なくとも約９８％、これらの原子の少なくとも約９９％）がＲｐ配置を有する立体中心リン原子の集団を含んでもよい。他の実施形態では、立体中心リン原子の集団はＳｐ配置を有してよく、Ｒｐ配置を有する立体中心リン原子が実質的になくてもよい。さらに他の実施形態では、立体中心リン原子の集団はＲｐ配置を有してよく、Ｓｐ配置を有する立体中心リン原子が実質的になくてもよい。本願で用いられる場合、「Ｒｐ配置を有する立体中心リン原子が実質的にない」という句は、Ｒｐ配置を有する立体中心リン原子を含んだ部分を当該分野で知られた従来の方法（キラルＨＰＬＣ、キラル・シフト試薬を用いた１Ｈ  ＮＭＲ分析等）によって検出することができないということを意味する。本願で用いられる「Ｓｐ配置を有する立体中心リン原子が実質的にない」という句は、Ｓｐ配置を有する立体中心リン原子を含んだ部分を当該分野で知られた従来の方法（キラルＨＰＬＣ、キラル・シフト試薬を用いた１Ｈ  ＮＭＲ分析等）によって検出することができないということを意味する。
【０３７８】
好適な一実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド剤はホスホロチオエート基、すなわち、リン酸非結合酸素が硫黄原子によって置換されたリン酸基を含む。特に好適な実施形態では、ホスホロチオエート立体中心リン原子の集団はＳｐ配置を有してもよく、Ｒｐ配置を有する立体中心リン原子が実質的になくてもよい。
【０３７９】
２量体、例えば式Ｘ−１およびＸ−２を用いて、ホスホロチオエートをオリゴヌクレオチド剤に組み込むことができる。式Ｘ−１を用いて、ホスホロチオエートを
【０３８０】
【化７９】
2008509670.tif 000099
鎖の３’末端に導入することができ、式Ｘ−２を用いて、５’末端または該鎖のいずれかの末端から例えば１、２、３、４、５または６ヌクレオチドで生じる位置にこの修飾を導入することができる。上式では、Ｙは２−シアノエトキシでもよく、ＷおよびＺはＯでもよく、Ｒ２’は、例えばＣ−３内部配置を糖（例えば、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３）に付与することができる置換基でもよく、ＤＭＴはジメトキシトリチルであり、「ＢＡＳＥ」は天然塩基、特異な塩基、または一般的な塩基でもよい。
【０３８１】
Ｘ−１およびＸ−２を、キラル試薬、または結果的にＲｐ配置のみ（すなわち、実質的にＳｐ配置がない）またはＳｐ配置のみ（すなわち、実質的にＲｐ配置がない）を実質的に有する立体中心リン原子の集団を有するホスホロチオエートを含んだ２量体を得ることができる制御基を用いることによって調製することができる。あるいは、原子の約５０％がＲｐ配置を有し原子の約５０％がＳｐ配置を有する立体中心リン原子の集団を有する２量体を調製することができる。例えば、酵素分解および／または従来のクロマトグラフィー法を用いて、Ｒｐ配置を有する立体中心リン原子を有する２量体を同定し、Ｓｐ配置を有する立体中心リン原子を有する２量体から分離することができる。
【０３８２】
カチオン基
修飾は、糖、塩基、および／またはリン酸のリン原子または修飾リン酸骨格部分に１つまたは複数のカチオン基に結合することも含むことができる。天然塩基、特異な塩基または一般的な塩基上で置換が可能な任意の原子にもカチオン基を結合することができる。好適な位置とは、ハイブリダイゼーションに干渉しない位置、すなわち塩基対合に必要な水素結合相互作用に干渉しない位置である。例えば糖のＣ２’位置または環状または非環状代替糖の類似する位置を介して、カチオン基を結合することができる。カチオン基には、例えば例えばＯ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）由来のプロトン化アミノ基；アミノアルコキシ、例えば、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ、（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；あるいはＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）が挙げられる。
【０３８３】
非リン酸結合
修飾は、非リン酸結合をある鎖の５’および／または３’末端に組み込むことも含むことができる。リン酸基を置換し得る非リン酸結合の例には、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸塩、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。好適な置換基には、メチルホスホネートおよびヒドロキシルアミノ基が挙げられる。
【０３８４】
３’架橋チオリン酸および５’架橋チオリン酸；固定された−ＲＮＡ、２’−５’結合、反転結合、α−ヌクレオシド；複合体基；非塩基結合；および５’−ホスホネートおよび５’−リン酸プロドラッグも、オリゴヌクレオチド剤に含むことのできる結合である。
【０３８５】
上式Ｘを参照すると、修飾はリン酸骨格部分（ＷおよびＺ）の架橋および結合リン酸酸素の一方を置換することを含むことができる。ＸまたはＹの一方のみが変えられた場合と異なり、ホスホロジチオエートのリン酸中心は、立体中心リン原子を含んだオリゴヌクレオチド剤の形成を排除するアキラルである。
【０３８６】
修飾は、リン酸または修飾リン酸基により第１の糖の２’位置および第２の糖の５’位置を介して、２つの糖を結合させることも含むことができる。第１および第２の糖の両方の各々が個々の３’位置を介して結合された反転結合も意図される。修飾ＲＮＡは、Ｃ−１’に核酸塩基のない「非塩基」糖も含むことができる。該糖基は、対応するリボースの炭素の立体化学構成とは反対の立体化学構成を有する１つまたは複数の炭素も含むことができる。したがって、修飾オリゴヌクレオチド剤は、糖として例えばアラビノースを含んだヌクレオチドを含むことができる。この修飾の別のサブセットでは、天然塩基、特異な塩基、または一般的な塩基はα配置を有することができる。修飾はＬ−ＲＮＡも含むことができる。
【０３８７】
修飾は、５’−ホスホネート、例えばＰ（Ｏ）（Ｏ−）２−Ｘ−Ｃ５’−糖（Ｘ＝ＣＨ２、ＣＦ２、ＣＨＦ）および５’−リン酸プロドラッグ、例えばＰ（Ｏ）［ＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）Ｒ］２ＣＨ２ＣＣ５’−糖も含むことができる。後者の場合、該プロドラッグ基は、最初にカルボキシエステラーゼとの反応により分解可能である。分子内ＳＮ２の移動を介した残りのエチルチオラート基は、エピスルフィドとして出発して誘導体化されていないリン酸基を与えることができる。
【０３８８】
修飾は、複合に利用可能な任意のアミノ基も介してオリゴヌクレオチド剤に結合していることが好ましい、本願の別の場所に記載の複合体基を付加することも含むことができる。
【０３８９】
ヌクレアーゼ耐性の修飾は、末端にのみ配置することのできる修飾および任意の場所にも可能な他の修飾を含む。一般に、これらの修飾はハイブリダイゼーションを抑制することができることから、末端領域のみにそのような修飾を用いることが好ましく、配列の切断部位または切断領域にはそのような修飾を用いないことが好ましい。
【０３９０】
エンドヌクレアーゼ切断に干渉するか、それを抑制する修飾は、ＲＩＳＣ媒介性の切断を受け易いオリゴヌクレオチド剤の領域、例えば切断部位または切断領域に挿入されるべきである。本願で用いる場合、切断部位とは、標的上の切断部位のいずれかの側にあるヌクレオチド、またはそれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド剤鎖上のヌクレオチドを指す。切断領域とは、いずれかの方向での切断部位の１、２または３ヌクレオチドのヌクレオチドを意味する。
【０３９１】
このような修飾は、末端領域、例えば末端位置あるいは末端の２、３、４または５位置に導入することができる。
オリゴヌクレオチド剤は以下を含むことができる。
【０３９２】
３’末端または３’末端から１、２、３、４、５または６位置以内でのＮＭＲ修飾、
５’末端または５’末端から１、２、３、４、５または６位置以内でのＮＭＲ修飾（５’末端ＮＲＭ修飾は選択的にはその末端ではなく、むしろオリゴヌクレオチド剤の５’末端から位置１、２、３、４、５または６離れている。）、
３’末端または３’末端から１、２、３、４、５または６位置以内であり、５’末端または５’末端から１、２、３、４、５または６位置以内にＮＭＲ修飾を有するＮＭＲ修飾、
切断部位または切断領域におけるＮＲＭ修飾、
切断部位または切断領域におけるＮＲＭ修飾であり、ＮＲＭ修飾の１つまたは複数は３’末端または３’末端から１、２、３、４、５または６位置以内であるか、ＮＲＭ修飾が５’末端または５’末端から１、２、３、４、５または６位置以内であるか、ＮＲＭ修飾が３’および５’末端または３’および５’末端から１、２、３、４、５または６位置以内である（５’末端ＮＲＭ修飾は選択的にはその末端ではなく、むしろオリゴヌクレオチド剤の５’末端から位置１、２、３、４、５または６離れている。）。
【０３９３】
リボース模倣体
本願に記載のモノマーおよび方法を用いて、リボース模倣体を組み込んだオリゴヌクレオチド剤を調製することができる。
【０３９４】
したがって、本発明の一態様は、効果を増大させおよび／またはヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチド剤に与え得る２級ヒドロキシル基を含んだオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。ヌクレアーゼ、例えば細胞ヌクレアーゼは核酸−リン酸ジエステル結合を加水分解し、その結果、核酸の部分的または完全な分解を生じることができる。該２級ヒドロキシ基は、修飾のないオリゴヌクレオチド剤に対してオリゴヌクレオチド剤をヌクレアーゼ分解されにくくすることによって、ヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチド剤に与える。理論によって拘束しようとするものではないが、オリゴヌクレオチド剤上に２級ヒドロキシル基が存在することにより、３’リボースヒドロキシル基の構造上の模倣体として働き、これによって、オリゴヌクレオチド剤を分解されにくくすることができると考えられる。
【０３９５】
２級ヒドロキシル基とは、「２つの他の炭素および水素によって置換された炭素原子に結合したＯＨ」基を指す。上記のようなヌクレアーゼ耐性を付与する２級ヒドロキシル基は、任意の非環式炭素含有基の一部でもよい。該ヒドロキシルは任意の環式炭素含有基の一部でもよく、以下の条件の１つまたは複数を満たすことが好ましい。（１）ヒドロキシル基と末端リン酸基との間にリボース部分が存在しないか、または（２）ヒドロキシル基は塩基に結合した糖部分上にはない。該ヒドロキシル基は、オリゴヌクレオチド剤の末端リン酸基から少なくとも結合数２個（例えば、少なくとも結合数３個、少なくとも結合数４個、少なくとも結合数５個、少なくとも結合数６個、少なくとも結合数７個、少なくとも結合数８個、少なくとも結合数９個、少なくとも結合数１０個等離れている）離れて位置する。好適な実施形態では、末端リン酸基と２級ヒドロキシル基との間に結合数が５個存在する。
【０３９６】
末端リン酸基のリンと２級ヒドロキシル基との間に介在する結合が５個ある好適なオリゴヌクレオチド剤送達モジュールは、以下の構造を有する（以下の式Ｙを参照）。
【０３９７】
【化８０】
2008509670.tif 000100
式Ｙを参照すると、Ａは本願に記載の任意のオリゴヌクレオチド剤を含むオリゴヌクレオチド剤である。該オリゴヌクレオチド剤は直接または間接的（例えば、スペーサまたはリンカーを介して）にリン酸基の「Ｗ」に連結されてよい。これらのスペーサまたはリンカーには、例えば−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、非塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノ、あるいはビオチンおよびフルオレセイン試薬が挙げられる。
【０３９８】
該オリゴヌクレオチド剤は、非修飾（例えばＷ、Ｘ、ＹおよびＺはＯである。）または修飾された末端リン酸基を有することができる。修飾リン酸基では、ＷおよびＺは独立してＮＨ、ＯまたはＳでよく；ＸおよびＹは独立してＳ、Ｓｅ、ＢＨ３−、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｈ、Ｏ、Ｏ−、アルコキシまたはアミノ（アルキルアミノ、アリールアミノ等を含む）でもよい。Ｗ、ＸおよびＺはＯであり、ＹはＳであることが好ましい。
【０３９９】
Ｒ１およびＲ３は各々独立して、水素；またはヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸で任意に置換されたＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、および／またはＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが任意に挿入されてもよい。
【０４００】
Ｒ２は水素；ヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸で任意に置換されたＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、および／またはＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが任意に挿入されてよく；あるいはｎが１のとき、Ｒ２はＲ４またはＲ６と一緒になって５〜１２個の原子の環を形成してもよい。
【０４０１】
Ｒ４は水素；ヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸で任意に置換されたＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、および／またはＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが任意に挿入されてよく；あるいはｎが１のとき、Ｒ４はＲ２またはＲ５と一緒になって５〜１２個の原子の環を形成してもよい。
【０４０２】
Ｒ５は水素またはヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸で任意に置換されたＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、および／またはＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが任意に挿入されてよく；あるいはｎが１のとき、Ｒ５はＲ４と一緒になって５〜１２個の原子の環を形成してよい。
【０４０３】
Ｒ６は水素またはヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸で任意に置換されたＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、および／またはＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが任意に挿入されてよく；あるいはｎが１のとき、Ｒ６はＲ２と一緒になって６〜１０個の原子の環を形成してよい。
【０４０４】
Ｒ７は水素、Ｃ１〜Ｃ１００アルキル、またはＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）ＮＨＲ９；Ｔは水素または官能基；ｎおよびｑは各々独立して１〜１００である。Ｒ８はＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ６〜Ｃ１０アリールである。Ｒ９は水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたは固体支持剤である。
【０４０５】
好適な実施形態は、オリゴヌクレオチド剤送達モジュールの以下のサブセットの１つまたは複数を含むことができる。
オリゴヌクレオチド剤送達モジュールの１サブセットでは、Ａは直接的または間接的にオリゴヌクレオチド剤の末端３’または５’リボース糖炭素を介して連結されることができる
オリゴヌクレオチド剤送達モジュールの別のサブセットでは、Ｘ、ＷおよびＺはＯであり、ＹはＳである。
【０４０６】
オリゴヌクレオチド剤送達モジュールのさらに他のサブセットでは、ｎは１であり、Ｒ２およびＲ６は一緒になって６個の原子を含んだ環を形成し、Ｒ４およびＲ５は一緒になって６個の原子を含んだ環を形成する。該環系はトランス−デカリンであることが好ましい。例えば、このサブセットのオリゴヌクレオチド剤送達モジュールは、式（Ｙ−１）の化合物を含むことができる。
【０４０７】
【化８１】
2008509670.tif 000101
該官能基は、例えばターゲティング基（例えば、ステロイドまたは糖質）、レポーター基（例えば、フルオロフォア）または標識基（同位体で標識された部分）でもよい。該ターゲティング基は、タンパク質結合剤、内皮細胞ターゲティング基（例えば、ＲＧＤペプチドおよび模倣剤）、癌細胞ターゲティング基（例えば、葉酸ビタミンＢ１２、ビオチン）、骨細胞ターゲティング基（例えば、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸）、（例えば、マクロファージ試験のための）多価マンノース、ラクトース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、モノクローナル抗体、糖タンパク質、レクチン、メラノトロピンまたは甲状腺刺激ホルモンをさらに含むことができる。
【０４０８】
当業者には理解されるように、本願の式の化合物を合成する方法は当業者には明白となろう。合成された化合物を反応混合物から分離し、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは再結晶化などの方法によってさらに精製することができる。また、種々の合成工程を交互の順序または順番で実施して、所望の化合物を得ることができる。本願に記載の化合物を合成するのに有用な合成化学の変形および保護基法（保護および脱保護）は当該分野では知られており、例えばアール．ラロック（Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ）、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９年）；ティー．ダブリュー．グリーンとピー．ジー．エム．ウッツ（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１年）；エル．フィーザーとエム．フィーザー（Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ）、Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４年）；およびエル．パケット編集（Ｌ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ）、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５年）、およびこの次の版に記載されたようなものを含む。
【０４０９】
送達モジュール
本願に記載のモノマーおよび方法を用いて、薬物送達複合またはモジュールとともに用いることができるオリゴヌクレオチド剤、例えば本願に記載の複合化オリゴヌクレオチド剤を調製することができる。
【０４１０】
該オリゴヌクレオチド剤を、モジュール混成物を特徴とする送達剤に混成することができる。該混成物は、以下の１つまたは複数（そのうちの２つ以上が好ましく、３つ全部がより好ましい）に結合した担体剤を含むことができる、（ａ）縮合剤（例えば引き付けることが可能な、例えばイオン相互作用または静電相互作用を介して、例えば核酸を結合することが可能な剤）；（ｂ）膜融合剤（例えば細胞膜、例えばエンドソーム膜を融合することが可能な、および／または細胞膜、例えばエンドソーム膜を介して輸送されることが可能な剤）、および（ｃ）ターゲティング基、例えば腎細胞などの指定された細胞型に結合する、細胞または組織ターゲティング剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば抗体。
【０４１１】
オリゴヌクレオチド剤をモジュール混成物に連結、例えばカップリングまたは結合させることができる。該オリゴヌクレオチド剤は混成物の縮合剤と相互作用することができ、該混成物を用いて、例えばインビトロまたはインビボの細胞にオリゴヌクレオチド剤送達させることができる。例えば、該混成物を用いてオリゴヌクレオチド剤を、それを必要とする対象、例えば疾患または障害のある対象に送達させることができる。
【０４１２】
該膜融合剤および該縮合剤は異なった剤でもよいし、同一の剤でもよい。例えばポリアミノ鎖、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、膜融合剤および／または縮合剤でもよい。
【０４１３】
該送達剤はモジュール混成物でもよい。例えば、該混成物は、以下の１つまたは複数の（好適には、以下の２つ以上、より好適には３つ全部の）担体剤を含むことができる。
（ａ）縮合剤（例えば例えばイオン相互作用を介して、核酸を引き付けることのできる、例えば核酸を結合することのできる剤）、
（ｂ）膜融合剤（例えば細胞膜、例えばエンドソーム膜を融合することが可能な、剤および／または細胞膜、例えばエンドソーム膜を介して輸送されることが可能な剤）、
（ｃ）腎細胞などの指定の細胞型に結合する、ターゲティング基、例えば細胞または組織ターゲティング剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば抗体。ターゲティング基は甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタント・タンパク質Ａ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ネプロキシン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体。
【０４１４】
担体剤
本願に記載のモジュール混成物の担体剤は、縮合剤、膜融合剤およびターゲティング基の１つまたは複数を結合するための基質でもよい。該担体剤には内在性酵素活性がないことが好ましいであろう。該担体剤は生体分子であることが好ましく、高分子が好ましいであろう。ポリマー性の生物学的担体が好ましい。該担体分子は生分解性であることも好ましいであろう。
【０４１５】
該担体剤は、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）またはグロブリン）；糖質（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質などの天然物質でもよい。該担体分子は、組換え型分子または合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸などの合成分子でもよい。ポリアミノ酸の例には、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−メチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが挙げられる。他の有用な担体分子は、一般的方法によって同定可能である。
【０４１６】
担体剤は、以下の１つまたは複数によって特徴付けられることができる。（ａ）大きさが少なくとも１ダルトンである；（ｂ）少なくとも５個の荷電基、好適には５〜５０００個の荷電基を有する；（ｃ）担体剤対膜融合剤の比が少なくとも１：１で混成物中に存在する；（ｄ）担体剤対縮合剤の比が少なくとも１：１で混成物中に存在する；（ｅ）担体剤対ターゲティング剤の比が少なくとも１：１で混成物中に存在する。
【０４１７】
膜融合剤
本願に記載のモジュール混成物の膜融合剤は、例えばｐＨ環境に応じた荷電の変化に反応する剤でもよい。あるエンドソームのｐＨに遭遇すると、膜融合剤は物理的変化、例えばエンドソーム膜の浸透性を破壊または増大する浸透圧特性の変化を生ずることができる。該膜融合剤は、生理学的範囲未満のｐＨで電荷を変化させる、例えばプロトン化されることが好ましい。例えば、該膜融合剤をｐＨ４．５〜６．５でプロトン化することができる。該膜融合剤は、細胞による例えばエンドサイトーシスによって混成物が取り込まれた後で、細胞の細胞質にオリゴヌクレオチド剤を放出するように働き、これによってオリゴヌクレオチド剤の細胞内濃度をその細胞内で増大させることができる。
【０４１８】
一実施形態では、該膜融合剤は指定の特定のｐＨ範囲に曝露されたときに、例えば荷電、例えばプロトン化イオンの変化を受ける部分、例えばアミノ基を有することができる。該膜融合剤の電荷の変化が、小胞、例えばエンドサイトーシス小胞、例えばエンドソームにおいて変化、例えば浸透圧変化を引き起こすことができる。例えば、該膜融合剤は、あるエンドソームのｐＨ環境に曝露されると、エンドソーム膜の多孔性を増大させる（好適には破裂させる）のに実質的に十分な溶解性変化または浸透圧変化を生ずることができる。
【０４１９】
該膜融合剤は、ポリマー、好適にはポリアミノ鎖、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）でもよい。このＰＥＩは直鎖、分鎖、合成または天然でもよい。該ＰＥＩは、例えばアルキル置換ＰＥＩ、または脂質置換ＰＥＬでもよい。
【０４２０】
他の実施形態では、該膜融合剤はポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、メリチン、またはポリアセタール物質、例えば、カチオン性ポリアセタールでもよい。いくつかの実施形態では、該膜融合剤はアルファヘリックス構造を有することができる。該膜融合剤は膜破壊剤、例えばメリチンでもよい。
【０４２１】
膜融合剤は、以下の特徴の１つまたは複数を有することができる。（ａ）大きさが少なくとも１ダルトンである；（ｂ）少なくとも１０個の荷電基、好適には１０〜５０００個の荷電基、さらに好適には５０〜１０００個の荷電基を有する；（ｃ）膜融合剤対担体剤の比が少なくとも１：１で混成物中に存在する；（ｄ）膜融合剤対縮合剤の比が少なくとも１：１で混成物中に存在する；（ｅ）少なくとも１：１膜融合剤対ターゲティング剤の比が少なくとも１：１で混成物中に存在する。
【０４２２】
他の適した膜融合剤は、当業者によって試験および同定されることができる。例えば、ｐＨ環境に応じた荷電の変化に反応するある化合物の能力を、例えば細胞アッセイにおいて一般的方法によって試験することができる。例えば、ある試験化合物をある細胞と合わせ、または接触させ、例えばエンドサイトーシスによって該細胞に試験化合物を取り込ませる。次いで、エンドソーム調製物を該接触させた細胞から作製し、該エンドソーム調製物を対照細胞からのエンドソーム調製物と比較することができる。変化、例えば接触させた細胞対対照細胞からのエンドソーム断片が低減している場合、試験化合物が膜融合剤として機能することができることを示す。あるいは、接触させた細胞および対照細胞を、例えば顕微鏡、例えば光学顕微鏡または電子顕微鏡によって評価して、細胞中のエンドソーム数の差を決定することができる。試験化合物を標識することができる。別のタイプのアッセイでは、本願に記載のモジュール混成物は、１つまたは複数の試験膜融合剤または推定の膜融合剤を用いて作製される。該モジュール混成物は、オリゴヌクレオチドの代わりに標識核酸を用いて作製することができる。モジュール混成物が細胞によって取り込まれると、例えばｐＨ環境に応じた荷電の変化に反応する膜融合剤の能力を、例えば上記のような、エンドソーム調製物の調製によって、または顕微鏡技術によって評価することができる。２ステップ・アッセイを実施することもできる。このアッセイでは、第１のアッセイが、例えば、ｐＨ環境に応じた荷電の変化に反応する試験化合物のみの能力を評価し、第２のアッセイが、例えば、ｐＨ環境に応じた荷電の変化に反応する試験化合物を含んだモジュール混成物の能力を評価する。
【０４２３】
縮合剤
本願に記載のモジュール混成物の縮合剤はオリゴヌクレオチド剤と相互作用（例えば、引き付け、保持または結合する）し、（ａ）縮合、例えばオリゴヌクレオチド剤の大きさ、または電荷を低減させ、および／または（ｂ）オリゴヌクレオチド剤を保護するように、例えば分解に対してオリゴヌクレオチド剤を保護するように働くことができる。該縮合剤は、例えばイオン相互作用によって核酸、例えばオリゴヌクレオチド剤と相互作用することができる部分、例えば荷電部分を含むことができる。該縮合剤は、荷電ポリマー、例えばポリカチオン鎖であることが好ましいであろう。該縮合剤は、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファヘリックスペプチドでもよい。
【０４２４】
縮合剤は以下の特徴を有することができる。（ａ）大きさが少なくとも１ダルトンである、（ｂ）少なくとも２個の荷電基、好適には２〜１００個の荷電基を有し、（ｃ）縮合剤対担体剤の比が少なくとも１：１で混成物中に存在し、（ｄ）縮合剤対膜融合剤の比が少なくとも１：１で混成物中に存在し、（ｅ）縮合剤対ターゲティング剤の比が少なくとも１：１で混成物中に存在する。
【０４２５】
他の適した縮合剤は、例えば核酸、例えばオリゴヌクレオチド剤と相互作用する試験剤の能力を評価することによって、当業者によって試験および同定されることができる。核酸、例えばオリゴヌクレオチド剤と相互作用する試験剤の能力、例えばオリゴヌクレオチド剤を縮合または保護する試験剤の能力を、一般的な方法によって評価することができる。アッセイでは、ある試験剤を核酸と接触させ、分子量および／または分子電荷の変化を検出するのに適した技術によって、この接触させた核酸の大きさおよび／または電荷を評価する。このような技術には、非変性ゲル電気泳動、免疫学的方法、例えば免疫沈殿法、ゲル濾過、イオン相互作用クロマトグラフィー等が挙げられる。対照と比較して接触させた核酸の質量および／または電荷（好適には両方）を変化させた場合には、試験剤は縮合剤であると同定される。２ステップ・アッセイを用いることもできる。このアッセイでは、第１のアッセイが核酸と相互作用し、例えば核酸に結合し、例えば核酸の電荷および／または質量を減少させる試験化合物のみの能力を評価し、第２のアッセイが、核酸と相互作用し、例えば核酸に結合し、例えば核酸の電荷および／または質量を減少させる、該試験化合物を含んだモジュール混成物の能力を評価する。
【０４２６】
両親媒性送達剤
本願に記載のオリゴヌクレオチド剤は、本願に記載のもの、および２００３年３月１３日出願の同一譲受人の同時係属米国特許仮出願シリアル番号第６０／４５５０５０号および２００４年３月８日出願の国際出願シリアル番号第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号に記載のものなどの両親媒性送達複合体またはモジュールとともに用いることができる。これらを本願に援用する。
【０４２７】
オリゴヌクレオチド製品
オリゴヌクレオチド剤は種々の方法によって、例えば大量製造可能である。例示的方法は、有機合成およびＲＮＡ切断、例えばインビトロでの切断を含む。
【０４２８】
有機合成
大型のバイオリアクタ、例えばファルマシア  バイオテック  エービー社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＡＢ）［スウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）所在］からのＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ  ＩＩを用いて、大量のオリゴヌクレオチド剤を製造することができる。このＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ  ＩＩリアクタは、１．５モルだけ過剰なホスホルアミダイトヌクレオチドを用いてヌクレオチドを効果的にカップリングすることができる。ＲＮＡ鎖を作製するために、リボヌクレオチドアミダイトが使用される。標準的周期でモノマーを添加して、オリゴヌクレオチド剤を合成することができる。
【０４２９】
有機合成を用いて別個のオリゴヌクレオチド剤種を生成することができる。特定の標的遺伝子に対する該種の相補性が正確に指定されることができる。例えば、該種は多型、例えば単一ヌクレオチド多型を含んだ領域に対して相補的でもよい。さらに、該多型の場所を正確に定めることができる。いくつかの実施形態では、多型は内部領域、例えば末端の一方または両方から少なくとも４、５、７または９ヌクレオチドに位置する。
【０４３０】
オリゴヌクレオチド剤調製物を、製剤に適した溶液（例えば、水溶液および／または有機溶液）で調製することができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤調製物を二重蒸留した純水中で沈殿、再溶解させ、凍結乾燥させることができる。次いで、この乾燥させたオリゴヌクレオチド剤を、意図する製剤工程に適した溶液中に再懸濁させることができる。
【０４３１】
修飾オリゴヌクレオチド剤および代替ヌクレオチドオリゴヌクレオチド剤の合成を以下で考察する。
製剤
本願に記載のオリゴヌクレオチド剤は、対象に投与するために配合されることができる。
【０４３２】
わかり易いように、このセクションの製剤、組成物および方法は、主に非修飾オリゴヌクレオチド剤に関して考察する。しかし、これらの製剤、組成物および方法を、他のオリゴヌクレオチド剤、例えば修飾オリゴヌクレオチド剤を用いて実施することができ、このような実施は本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【０４３３】
配合されたオリゴヌクレオチド剤組成物は、種々の状態を取ることができる。いくつかの例では、該組成物は少なくとも部分的に結晶質、均一に結晶質、および／または無水（例えば、水が８０、５０、３０、２０または１０％未満）である。別の例では、該オリゴヌクレオチド剤は、例えば水を含んだ溶液中で水相である。
【０４３４】
この水相または結晶組成物は、例えば送達ビヒクル、例えば（特に水相用の）リポソームまたは粒子（例えば、結晶組成物に適し得るような微粒子）に組み込まれることができる。一般に、該オリゴヌクレオチド剤組成物は、意図する投与方法に適合する様式で配合される（以下参照）。
【０４３５】
特定の実施形態では、該組成物は以下の方法の少なくとも１つによって調製される：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、またはこれらの技術の組合せ；あるいは脂質を用いた超音波処理、凍結乾燥、濃縮、および他の自己集合。
【０４３６】
オリゴヌクレオチド剤調製物は、別の剤、例えば別の治療剤またはオリゴヌクレオチド剤を安定させる別の剤、例えばオリゴヌクレオチド剤と混成するタンパク質と組み合わせて配合されることができる。さらに他の剤としては、キレート剤、例えば（例えば、Ｍｇ２＋などの二価陽イオンを除去するための）ＥＤＴＡ、塩、ＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの、広い特異性を有するＲＮＡｓｅ阻害剤）等が挙げられる。
【０４３７】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤調製物としては、第２のオリゴヌクレオチド剤、例えば第２の遺伝子に対してまたは同じ遺伝子に対して遺伝子発現を調節することができる第２のオリゴヌクレオチド剤が挙げられる。さらに他の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０または１００種以上の異なったオリゴヌクレオチド剤種を含むことができる。このようなオリゴヌクレオチド剤は、同様の数の遺伝子に対して遺伝子発現を調節することができる。
【０４３８】
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤調製物は、少なくとも第２の治療剤（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ以外の剤）を含む。例えばウイルス性疾患、例えばＨＩＶの治療のためのオリゴヌクレオチド剤組成物は、知られた抗ウイルス剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害薬）を含んでもよい。別の例では、癌治療用のオリゴヌクレオチド剤組成物は、化学療法をさらに含んでもよい。
【０４３９】
本願に記載のオリゴヌクレオチド剤は、膜性の分子集合、例えばリポソームまたはミセルにおいて送達するために配合されることができる。一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤を含む調製物は、界面活性剤を含んだ乳剤として配合されることができる。
【０４４０】
ターゲティング
わかり易いように、このセクションの製剤、組成物および方法は、主に非修飾オリゴヌクレオチド剤に関して考察する。しかし、これらの製剤、組成物および方法を、他のオリゴヌクレオチド剤、例えば修飾オリゴヌクレオチド剤を用いて実施することができ、このような実施は本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【０４４１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド剤、またはオリゴヌクレオチド剤をコードするＤＮＡ、あるいはそれらの前駆物質は、特定の細胞をターゲティングする。例えば、オリゴヌクレオチド剤を含んだリポソームまたは粒子あるいは他の構造は、標的細胞上の特定の分子を認識するターゲティング部分も含むことができる。該ターゲティング部分は、ある標的細胞に対する特異的親和性を有する分子でもよい。ターゲティング部分には、標的細胞の表面に見られるタンパク質に向けられた抗体、あるいはリガンドまたは標的細胞の表面に見られる分子のリガンドの受容体結合部分を含むことができる。例えば、該ターゲティング部分は腎臓の癌特異的抗原（例えば、Ｇ２５０、ＣＡ１５−３、ＣＡｌ９−９、ＣＥＡ、またはＨＥＲ２／ｎｅｕ）またはウイルス抗原を認識し、これによってオリゴヌクレオチド剤を癌細胞またはウイルス感染した細胞に送達することができる。例示的なターゲティング部分は、抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等、またはそれらの機能部分など）、細胞表面受容体のリガンド（例えば、それらの細胞外ドメイン）を含む。
【０４４２】
表６は腎臓以外の組織にオリゴヌクレオチド剤をターゲティングすることが望ましい場合など、オリゴヌクレオチド剤を選択された細胞にターゲティングするのに用いることのできる多数の抗原を提供する。
【０４４３】
【表８】
2008509670.tif 000102
一実施形態では、該ターゲティング部分はリポソームに結合している。例えば、米国特許第６２４５４２７号明細書は、タンパク質またはペプチドを用いてリポソームをターゲティングする方法を記載している。別の例では、リポソームのカチオン性脂質成分はターゲティング部分で誘導体化される。例えば、国際特許出願公開公報第９６／３７１９４号パンフレットは、Ｎ−グルタリルジオレオイルホスファチジルエタノールアミンをＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルに転換する方法を記載している。次いで、該製剤をＲＧＤペプチドにカップリングさせた。
【０４４４】
腎臓へのターゲティング
腎臓は遺伝子発現の重要な部位である。本発明の諸態様は、例えば、腎臓に関連する疾患を治療するための腎臓に発現するサイレンシング遺伝子に関する。したがって、本発明は、オリゴヌクレオチド剤を腎臓に送達するため組成物および方法を含む。本発明はオリゴヌクレオチド剤の腎臓への送達を最小化する組成物および方法も含む。
【０４４５】
本発明のオリゴヌクレオチド剤組成物は、腎臓に有利に分布を改変するように修飾されたものでもよい。本発明の組成物は、オリゴヌクレオチド剤、例えば、本願に記載のオリゴヌクレオチド剤を含む。
【０４４６】
本発明の一態様は腎疾患を有するか、腎疾患を有するリスクのあるヒトを治療する方法を提供する。該治療方法はオリゴヌクレオチド剤をヒトに投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチド剤は核酸、例えば腎臓に発現したＲＮＡをターゲティングする。一実施形態では、ヒトは、腎臓における核酸の発現の増大または好ましくない発現、例えば遺伝子発現レベルの増大またはＲＮＡレベルの増大を特徴とする障害に罹患する。好ましくない発現レベルは、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰｌまたはオステオポンチンなどのケモカインをコードする遺伝子；または補体因子をコードする遺伝子または成長因子（例えば、形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２または血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ））に相当することができる。別の実施形態では、該遺伝子はＩＬ１αまたはＴＮＦαなどの炎症性サイトカイン；線維形成サイトカイン；アンジオテンシンＩＩまたはＥＴ１などの血管作動性タンパク質；あるいはＫＤＲ（ＶＥＧＦ受容体）、上皮細胞増殖因子受容体または線維芽細胞増殖因子受容体などの成長因子受容体をコードすることができる。
【０４４７】
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は腎臓に発現したｍｉＲＮＡをターゲティングする。別の実施形態では、ヒトは腎臓におけるｍｉＲＮＡの過剰発現または蓄積または腎臓に発現したｍｉＲＮＡの標的である核酸の発現の減少が特徴である障害に罹患する。該対象または該対象の腎細胞にオリゴヌクレオチド剤を投与すれば、オリゴヌクレオチド剤を標的ｍｉＲＮＡと対にすることができ、続いてｍｉＲＮＡを下方調節することができる。
【０４４８】
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は腎組織に通常発現するｍｉＲＮＡと実質的に同一であり、別の実施形態では、ヒトは腎臓におけるｍｉＲＮＡの発現の減少が特徴である障害に罹患する。オリゴヌクレオチド剤を対象に、または腎細胞に投与すれば、下方調節されたｍｉＲＮＡの機能が少なくとも部分的に救済される。
【０４４９】
一実施形態では、ヒトは腎血管性高血圧、尿管閉鎖、糖尿病、糖尿病性ネフロパシー、糸球体硬化、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、ＨＩＶ関連ネフロパシー、腎線維症、タンパク尿、腎癌、ファンコーニ症候群またはバーター症候群を有するか、または有するリスクがある。別の実施形態では、腎臓をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤をショック状態の対象に投与するか、または該オリゴヌクレオチド剤を腎移植の前、間および／または後に投与することができる。
【０４５０】
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、ＴＧＦβなどの成長因子または成長因子受容体をターゲティングし、ヒトは、糖尿病性ネフロパシー、進行性腎疾患、慢性組織損傷または糸球体硬化症を有するか、またはそのリスクがある。一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はＴＧＦβなどの成長因子をターゲティングし、ヒトは腎移植を受けたか、受ける予定であるか、あるいは腎移植の候補であるとみなされている。
【０４５１】
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はＰＤＧＦをターゲティングし、ヒトは腎移植を受けたか、受ける予定であるか、あるいは腎移植の候補であるとみなされている。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はアンジオテンシンＩＩなどの血管収縮またはアンジオテンシン受容体Ｉなどの血管収縮受容体をターゲティングし、ヒトはアンジオテンシンＩＩ依存性高血圧症またはＩＩ型糖尿病を有するか、またはそれを有するリスクがあるか、あるいはヒトは高血糖性状態である。
【０４５２】
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はエンドセリン−１（ＥＴ−１）などの血管収縮剤またはＥＴＡまたはＥＴＢなどのＥＴ−１受容体をターゲティングし、ヒトは常染色体優性多発性嚢胞腎疾患および／または慢性腎疾患を有するか、またはそれを有するリスクがある。例えば、ヒトは常染色体優性多発性嚢胞腎疾患を有する可能性があり、一実施形態では、該患者の状態は慢性腎疾患へ進行している。
【０４５３】
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、リガンド活性化転写因子、例えば核ホルモン受容体ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）などの転写因子をターゲティングし、ヒトは糖尿病性ネフロパシー、腎腫瘍または糸球体硬化症を有するか、またはそれを有するリスクがある。一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−β／δまたはＰＰＡＲ−γをターゲティングする。
【０４５４】
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はＩＧＦ受容体（例えばＩＧＦＲ１）などの成長因子受容体、ＶＥＧＦ受容体ＫＤＲ、上皮成長因子受容体、または線維芽細胞成長因子受容体をターゲティングし、ヒトは腎細胞癌、糖尿病性ネフロパシー、腎肥大、糸球体肥大、尿アルブミン排泄量低下および／または糖尿病を有するか、または有するリスクがある。
【０４５５】
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は副刺激分子、例えばＢ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０および／またはＣＤ１５４をターゲティングし、ヒトは自己免疫疾患または移植片拒絶反応を有するか、または有するリスクがある。
【０４５６】
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよび／またはオステオポンチンなどのケモカインをターゲティングし、ヒトは全身性高血圧、腎実質損傷、腎同種移植の急性または慢性拒絶、慢性酸素欠乏誘発性高血圧症を有するか、またはそれを有するリスクがある。
【０４５７】
本発明の一態様は、補体因子Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＢなどの補体成分をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤を提供する。補体成分をターゲティングするオリゴヌクレオチドは、例えば免疫応答を阻害することが望ましいであろう。
【０４５８】
一態様では、本発明はオリゴヌクレオチド剤を対象、例えばマウスまたはヒトなどの哺乳類対象の腎臓に送達する方法を提供する。一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤を細胞または腎臓の糸球体の細胞、例えば糸球体内皮細胞、糸球体上皮細胞、メサンギウム細胞等に送達することができ、および／または該オリゴヌクレオチド剤を腎臓の近位尿細管細胞に送達することができる。例えば、ショック、尿管閉鎖、糖尿病、タンパク尿、腎癌、またはファンコーニ症候群またはバーター症候群などの尿細管異常疾患の治療のために、オリゴヌクレオチド剤を腎臓の近位尿細管細胞に送達することができる。腎移植患者の治療に向けられたオリゴヌクレオチド剤を、腎臓の近位尿細管細胞に向けることもできる。一実施形態では、腎臓の近位尿細管細胞に向けられたオリゴヌクレオチドは、さらに間質および下流の他の細胞まで送達される。オリゴヌクレオチド剤は腎内の標的部位において標的遺伝子を沈静することが好ましい。
【０４５９】
腎臓、例えば腎臓の近位尿細管細胞に送達されるオリゴヌクレオチド剤は、非修飾オリゴヌクレオチド剤でもよい。一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はホスホジエステル結合により安定化されることができる。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤の３’末端を、カチオン基、例えばアルキルアミン（２’Ｏ−アルキルアミンなど）、ポリアミン、カチオン性ペプチドまたはカチオン性アミノ酸によって修飾することができる。該修飾は外部または末端カチオン性残基でもよい。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤を、糖、例えば、複合糖質またはアルキルグリコシド成分、例えばグルコース、マンノース、２−デオキシ−グルコース、またはそれらの類似体で修飾することができる。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、酵素基質、例えば身体の他の組織の酵素レベルに比して関連の酵素が高い量で存在するための基質に複合することができる。例えば、該オリゴヌクレオチド剤は、γ−グルタミルトランスフェラーゼまたはｎ−アセチル−γ−グルタミルトランスフェラーゼの基質に複合することができる。
【０４６０】
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、葉酸または葉酸誘導体、例えば、γ−葉酸、α−葉酸、５−メチルテトラヒドロ葉酸、プテリジン類似体、またはこれらの代替類似体に複合することができる。
【０４６１】
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド剤は、全身投与されたときに腎臓に蓄積するタンパク質に複合することができる。例えば、該オリゴヌクレオチド剤は、リゾチーム、シトクロム−ｃまたはアプロチニン・タンパク質に複合することができる。一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、タンパク質のリシン残基に複合することができる。
【０４６２】
一実施形態では、腎臓をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤は、低分子量エチレングリコール（ＰＥＧ）分子、またはグアニジウム基に複合することができ、別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、ＲＧＤペプチド、ペプチド類似体またはペプチド模倣体またはそれらの誘導体に複合することができる。ＲＧＤペプチド、ペプチド類似体またはペプチド模倣剤に複合させたオリゴヌクレオチドは、αｖβ３インテグリンと結合することができる。
【０４６３】
【表９】
2008509670.tif 000103
参考文献：グッドマン、エス．エル（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．）；ホルツマン、ジー（Ｈｏｌｚｅｍａｎｎ，Ｇ．）；スリオク、ジー．エー．ジー（Ｓｕｌｙｏｋ，Ｇ．Ａ．Ｇ．）；ケスラー、エッチ（Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００２年、４５、１０４５〜１０５１。
【０４６４】
【表１０】
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2008509670.tif 000105
参考文献：スリオク、ジー．エー．ジー．（Ｓｕｌｙｏｋ，Ｇ．Ａ．Ｇ．）；ギブソン、シー．（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｃ．）；グッドマン、エス．エル．（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．）；ホルツマン、ジー（Ｈｏｌｚｅｍａｎｎ，Ｇ．）；ヴィエスナー、エム（Ｗｉｅｓｎｅｒ，Ｍ．）；ケスラー、エッチ（Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、４４、１９３８〜１９５０頁。
【０４６５】
好適な実施形態では、対象に投与されたオリゴヌクレオチド剤の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上が腎臓に上手くターゲティングされる。好適な実施形態では、対象に投与されたオリゴヌクレオチド剤の３０〜９０％、４０〜８０％または５０〜７０％、５０〜８０％、あるいは５０〜９０％が腎臓に上手くターゲティングされる。
【０４６６】
上記実施形態のいずれにおいても、オリゴヌクレオチド剤／複合体は安定化修飾などの付加的な修飾を有することができる。例えば、リンカー分子を、タンパク質、ＰＥＧまたはＲＧＤペプチドを該オリゴヌクレオチド剤に繋留することができる。例示的なリンカーを以下に記載し、これはアミノリンカー（例えば、アミノオキシリンカー）、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、アルデヒドリンカー、ハロアセチルリンカー等を含むことができる。
【０４６７】
別の態様では、本発明は複合化オリゴヌクレオチド剤を特徴とする。該複合は、リガンドまたは治療剤にカップリング、例えば連結されたオリゴヌクレオチド剤を含む。該オリゴヌクレオチド剤は任意に、リンカー（例えば、ペプチドリンカーまたは本明細書に記載の他のリンカー）によってリガンドまたは治療剤にカップリングされる。該リガンドは、例えば体内でのオリゴヌクレオチド剤の分布に影響を及ぼすように、および／またはオリゴヌクレオチド剤を特定の組織または細胞にターゲティングするように機能することができる。
【０４６８】
該リガンドをオリゴヌクレオチド剤の末端、好適にはオリゴヌクレオチド剤の３’末端に配置することができる。該リガンドをオリゴヌクレオチド剤の５’末端または中間に配置することもできる。いくつかの実施形態では、２つ以上のリガンドをオリゴヌクレオチド剤にカップリングすることができる。例えば、リガンドをオリゴヌクレオチド剤の３’末端にカップリングすることができる。リガンドをある末端、例えばオリゴヌクレオチド剤３’末端および中間にカップリングすることができる。リガンドをオリゴヌクレオチド剤の３’末端および５’にカップリングすることができる。リガンドをオリゴヌクレオチド剤の３’末端、５’末端、および１つまたは複数の内部位置にカップリングすることができる。
【０４６９】
一実施形態では、複合したオリゴヌクレオチド剤のリガンドは、脂質または脂質をベースにした分子である。このような脂質または脂質をベースにした分子は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、該複合体が標的組織、例えば身体の非腎標的組織まで行き渡らせることを可能にする。例えば、該標的組織は、これに限定するものではないが肝実質細胞を含む肝臓でもよい。ＨＳＡと結合することができる他の分子をリガンドとして用いることもできる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを用いてもよい。脂質または脂質をベースにしたリガンドは、（ａ）該複合の分解耐性を増大させることができ、（ｂ）標的の細胞または細胞膜へのターゲティングおよび輸送を増大させることができ、および／または（ｃ）これを用いて血清タンパク質、例えばＨＳＡへの結合を調節することができる。
【０４７０】
脂質をベースにしたリガンドを用いて、標的組織への該複合体の結合を調節、例えば制御することができる。例えば、ＨＳＡにより強力に結合する脂質または脂質ベースのリガンドは腎臓を標的にしにくくなり、したがって身体から除去されにくい。ＨＳＡへの結合が弱い脂質または脂質をベースにしたリガンドを用いれば、該複合を腎臓へターゲティングすることができる。
【０４７１】
好適な実施形態では、該脂質をベースにしたリガンドはＨＳＡと結合する。該脂質をベースにしたリガンドは、該複合体が好適には非腎組織まで行き渡るような十分な親和性でＨＳＡを結合することが好ましい。しかし、該親和性はＨＳＡ−リガンド結合が反転されないようにそれほど強力なものでないことが好ましい。
【０４７２】
他の好適な実施形態では、該脂質をベースにしたリガンドは、該複合体が好適には腎臓に行き渡るように、ＨＳＡと弱く結合するか、全く結合しない。腎細胞にターゲティングする他の部分が、脂質をベースにしたリガンドの代わりに、またはそれに加えて用いられてもよい。
【０４７３】
好適な実施形態では、該脂質または脂質をベースにしたリガンドはホスホロチオエートである。この実施形態では、血清タンパク質、例えばＨＳＡとの結合に干渉するように、ホスホロチオエート上の硫黄の数がそれほど優勢でないことが好ましい。
【０４７４】
別の実施形態では、該リガンドはペプチドまたはペプトイドである。ペプトイド、特に、アンテナペディアまたはｔａｔなどの両親媒性種が好ましい。
別の実施形態では、該リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体である。ＰＥＧは、例えばオリゴヌクレオチド剤の循環を維持させることを可能にすることができる。ＰＥＧは本質的に両親媒性であり、該オリゴヌクレオチド剤３’末端にカップリングされた場合特に、安定性を促進することができる。
【０４７５】
別の実施形態では、該リガンドは荷電基または部分、例えばポリアミンまたはカチオン基または部分である。この種のテザー部分は、例えばその電荷、例えばその負電荷のために、オリゴヌクレオチド剤が細胞内に入る抵抗性を克服し易くすることができる。好適には、これらは３’末端で複合されるが、オリゴヌクレオチド分子の５’末端または中央内であってもよい。例示的なポリアミンには、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリプレプロジン、またはポリモルホリノ、ポリオルニチンが挙げられる。
【０４７６】
別の実施形態では、該リガンドは標的細胞、例えば増殖細胞によって取り込まれるビタミンまたは他の部分である。これらは、例えば、悪性型または非悪性型の例えば癌細胞の好ましくない細胞増殖が特徴である障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンは、癌細胞によって取り込まれる、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リポフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは他のビタミンまたは栄養がある。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
【０４７７】
別の実施形態では、該リガンドは細胞浸透剤、好適にはヘリックス細胞浸透剤である。該浸透剤は両親媒性であることが好ましい。例示的な浸透剤はｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。浸透剤がペプチドである場合、修飾することが可能であり、この修飾は、ペプチジル模倣薬、インバートマー、非ペプチド結合または擬ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含む。該ヘリックス薬剤は、親油性相および疎油性相を有することが好ましいα−ヘリックス薬剤であることが好ましい。
【０４７８】
該リガンドはターゲティング剤でもよい。該ターゲティング剤は、糖、ペプチド、例えばＲＧＤ含有ペプチドでもよい。
別の有用なターゲティング剤は、糖、例えばガラクトースおよび／またはそれらの類似体を組み込んだものである。これらは肝臓、特に肝実質細胞をターゲティングするので有用である。好適な実施形態では、該ターゲティング剤は１つまたは複数のガラクトース部分、好適には２または３個のガラクトース部分を含む。該ターゲティング剤は、例えば相互に約１５Å離間された３ガラクトース部分を含むことが好ましい。該ターゲティング剤はラクトースでもよい。ラクトースは、ガラクトースにカップリングされたグルコースである。該ターゲティング剤は３個のラクトースを含むことが好ましい。該ターゲティング剤は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミンでもよい。マンノース、またはマンノース−６−リン酸ターゲティング剤をマクロファージ・ターゲティングに用いることができる。
【０４７９】
増殖細胞に豊富にあるマーカーを標的とするペプチドを用いることができる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣体は、癌細胞、特にαｖβ３インテグリンを呈する細胞を標的とすることができる。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含んだ環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチドのほか、合成ＲＧＤ模倣体を使用してもよい。ＲＧＤに加え、αｖβ３インテグリン・リガンドをターゲティングする他の部分を使用することができる。一般に、そのようなリガンドを用いて増殖細胞および血管新生を制御することができる。このタイプの好適な複合体には、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦまたは他の癌遺伝子、例えば本願に記載の癌遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド剤が挙げられる。
【０４８０】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、ターゲティング剤、例えば本願に記載のターゲティング剤に結合、例えば直接結合、例えば共有結合または非共有結合される。これは「複合」法と呼ばれる。別の実施形態では、該ターゲティング剤（例えば、同じターゲティング剤）は、該オリゴヌクレオチド剤と単純に混合される。これは「混成」法と呼ばれる。混成法では、該オリゴヌクレオチド剤は、例えばターゲティング基を有するか、または有さない、例えば本願に記載の糖またはＲＧＤ構成を有するか、または有さない、例えばカチオン性分子、例えばカチオン性脂質と混合されることができる。いくつかの実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、例えばターゲティング基を有するか有さないポリマーをベースにした系と混合される。他の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤をナノ粒子と混合する。
【０４８１】
本願に記載の複合体オリゴヌクレオチド剤は、該オリゴヌクレオチド剤を所望の標的細胞または組織にターゲティングするターゲティング剤を含むことができる。該標的細胞または組織は、癌細胞、脈管構造、例えば腫瘍脈管構造の細胞、血管新生細胞、例えば腫瘍血管新生細胞、またはエンドソームでもよい。好適な標的は腎臓である。別の実施形態では、肝臓、例えば肝実質細胞が好適な標的である。
【０４８２】
本発明の方法および組成物、例えば本願に記載の複合体を、本願に記載のオリゴヌクレオチド剤のいずれもとともに用いることができる。また、本発明の方法および組成物を、本願に記載の任意の疾患または障害の治療にも、および任意の対象、例えば任意の動物、任意のヒトなどの任意の哺乳動物の治療にも用いることができる。
【０４８３】
本発明の方法および組成物、例えば本願に記載の複合を、本願に記載の任意の用量および／または製剤とともに、また本願に記載の任意の投与経路とも用いることができる。
本願で用いられる場合「複合する」とは、例えば２つの実体間の結合の治療上の有益性が実現されるような十分な親和性で２つの実体を結合することを意味する。複合には、共有結合または非共有結合のほか、例えばミセルなどの、他方の実体の上または内の１つの実体の、あるいは第３の実体の上または内の実体のいずれかまたは両方の封入といった他の結合の形態を含むことができる。複合の特に好適な形態は、共有結合、例えば本願に記載したものによる。ある実体を、オリゴヌクレオチド剤の例えば３’または５’末端あるいは内部に複合することができる。遺伝子発現の阻害を媒介するという該オリゴヌクレオチド剤の能力を保持するような様式で、ある実体をオリゴヌクレオチド剤に複合することが好ましい。
【０４８４】
眼疾患の治療
本発明の特徴であるオリゴヌクレオチド剤を用いて、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、緑内障、白内障、視神経萎縮、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、または網膜色素変性症などの眼疾患を治療することができる。表９は眼疾患の治療のために、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤用の遺伝子標的をまとめたものである。
【０４８５】
【表１１】
2008509670.tif 000106
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、例えばＡＭＤおよび糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）の治療のために、ＶＥＧＦまたはプロテインキナーゼＣをターゲティングする。
【０４８６】
別の実施形態では、あるオリゴヌクレオチド剤が、例えばアンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）、アンジオテンシンＩＩ受容体、成長因子（例えば、ｃ−Ａｂｌ、ｃ−Ｋｉｔ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、成長ホルモン１（ＧＨｌ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、またはｃ−ｒａｆキナーゼ（ｒａｆ−１）、またはそれらの受容体）、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−２、−９、−１３または−１４の阻害剤、インテグリンαｖβ３、またはαｖβ５をターゲティングすることによって、ＡＭＤまたはＤＲを治療するための療法として用いられる。
【０４８７】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、カスパーゼ、Ｂｃｌファミリー・メンバー、一酸化窒素合成酵素、エンドセリン、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α受容体、ＥＲＫ２、ＭＥＫ１／２、またはサイクリンＤ１をターゲティングする。これらのオリゴヌクレオチド剤は、例えば緑内障、網膜色素変性症、白内障形成、網膜芽細胞腫、網膜虚血、糖尿病性網膜症、またはウイルス感染症または硝子体網膜症などの後眼部に及ぶ眼疾患の治療に有用であることができる。
【０４８８】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、炭酸脱水酵素（ＣＡ２、ＣＡ４およびＣＡ１２）またはプロテインキナーゼ、例えばプロテインキナーゼＣまたはミオシン軽鎖キナーゼをターゲティングする。これらのオリゴヌクレオチド剤は、例えば緑内障の治療に有用であることができる。
【０４８９】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、接着分子、サイトカイン、ケモカイン、ＭＭＰ、またはメタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）をターゲティングする。これらのオリゴヌクレオチド剤は、例えば免疫学的攻撃、創傷、感染、遺伝性疾患、糖尿病、またはビタミンＡ欠乏症の治療に有用であることができる。
【０４９０】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、ＮＯＳ−ＩＩをターゲティングする。これらのオリゴヌクレオチド剤は、例えばブドウ膜炎の治療に有用であることができる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、サイクリンＤ１をターゲティングして、例えば眼の細胞、例えば網膜色素上皮細胞における細胞増殖を低減させる。
【０４９１】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、眼に発現したｍｉＲＮＡをターゲティングする。別の実施形態では、ヒトは、眼におけるｍｉＲＮＡの発現または蓄積の増大あるいは眼に発現したｍｉＲＮＡの標的である核酸の発現の減少が特徴である障害に罹患している。該オリゴヌクレオチド剤を対象、例えば対象の眼に投与すれば、その結果、該オリゴヌクレオチド剤が標的ｍｉＲＮＡと対になり、続いてｍｉＲＮＡを下方調節させる。
【０４９２】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は通常、眼に発現するｍｉＲＮＡと実質的に同一であり、別の実施形態では、ヒトは、眼におけるｍｉＲＮＡの発現の減少が特徴である障害に罹患している。オリゴヌクレオチド剤を対象、例えば対象の眼に投与すれば、下方調節されたｍｉＲＮＡの機能が少なくとも部分的に救われる。
【０４９３】
眼疾患を治療するのに有用なオリゴヌクレオチド剤は、例えばイオン泳動（例えば、経強膜角膜イオン泳動）、局所投与（例えば、パッチまたはディスクによる、あるいは目薬による）、あるいは硝子体内注射によって眼に送達することができる。該オリゴヌクレオチド剤を、立体的に安定化されたリポソーム内に配合することができる。
【０４９４】
肝臓へのターゲティング
本発明の態様は、肝臓に発現するサイレンシング遺伝子に関連するか、または１つもしくは複数の内在性ｍｉＲＮＡによって調節された遺伝子をアップレギュレーションすることに関する。したがって、本発明は、例えば肝臓の障害または肝臓に関連する障害を治療するために、オリゴヌクレオチド剤を肝臓に送達するための組成物および方法を含む。
【０４９５】
本発明のオリゴヌクレオチド剤組成物は、肝臓に有利に分布を改変するように修飾されたものでもよい。本発明の組成物には、オリゴヌクレオチド剤、例えば本願に記載のオリゴヌクレオチド剤を含む。
【０４９６】
肝臓に向けられたオリゴヌクレオチド剤は、ａｐｏＢ−１００を標的として、ａｐｏＢ−１００の増大または望ましくない発現、コレステロールの増大または望ましくないレベル、および／または脂質代謝の調節不全が特徴である障害を治療することができる。該オリゴヌクレオチド剤を該障害のリスクのある個人に投与して、その障害の発症またはその障害の徴候を遅延させることができる。これらの障害には、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡；異常脂質血症、例えば家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症；高コレステロール血症；スタチン抵抗性高コレステロール血症；冠動脈疾患（ＣＡＤ）、冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）、アテローム性動脈硬化症が挙げられる。一実施形態では、ａｐｏＢ−１００をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤は、スタチン抵抗性高コレステロール血症を有すると診断された対象に投与される。
【０４９７】
ａｐｏＢ−１００オリゴヌクレオチド剤は、対象における血清ＬＤＬ−Ｃおよび／またはＨＤＬ−Ｃおよび／または総コレステロールのレベルを低減させるのに十分な量で投与されることができる。一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、対象の心筋梗塞のリスクを低減させるのに十分な量で投与される。
【０４９８】
一実施形態では、ａｐｏＢ−１００の発現レベルは、ａｐｏＢ−１００オリゴヌクレオチド剤投与後の肝臓において低減される。例えば、該オリゴヌクレオチド剤を、肝臓、例えば肝の受容体に結合する抗体またはリガンドをターゲティングする部分と混成することができる。
【０４９９】
他の実施形態では、肝臓をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤は、例えばβカテニンまたはグルコース−６−ホスファターゼＲＮＡの発現を調節して、肝臓に関連する障害を治療することができる。
【０５００】
別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、肝臓に発現したｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをターゲティングする。別の実施形態では、ヒトは、肝臓におけるｍｉＲＮＡの過剰発現または蓄積または肝臓に発現したｍｉＲＮＡの標的である核酸の発現の減少が特徴である障害に罹患している。オリゴヌクレオチド剤を対象に、または対象の肺細胞に投与すれば、オリゴヌクレオチド剤を標的ｍｉＲＮＡと対にすることができ、続いてｍｉＲＮＡを下方調節することができる。
【０５０１】
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は肝組織に通常発現するｍｉＲＮＡと実質的に同一であり、別の実施形態では、ヒトは肝臓におけるｍｉＲＮＡの発現の減少が特徴である障害に罹患している。オリゴヌクレオチド剤を対象に、または肝細胞に投与すれば、下方調節されたｍｉＲＮＡの機能が少なくとも部分的に救われる。
【０５０２】
肺疾患の治療
本発明の特徴であるオリゴヌクレオチド剤を、肺疾患、例えば慢性気管支炎（慢性気管支炎を含む）、肺気腫、喘息（小児喘息を含む）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺癌、または呼吸器感染症を有すると診断された患者を治療するのに用いることができる。
【０５０３】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、例えばストレス・キナーゼ（ＪＮＫ、ＭＡＰＫまたはｐ３８など）、レドックス感受性転写因子（ＮＦ−κＢ、ＫＪＥまたはＡＰ−１など）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）またはＩＬ−５受容体、ホスホジエステラーゼ４、ＩＣＡＭ−１、ＣＤｌ１／ＣＤ１８、Ｅ−セレクチン、インターロイキン−１０、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＭＵＣ５ＡＣ、またはアデノシンＡ１受容体をターゲティングする。これらのオリゴヌクレオチド剤は、例えばＣＯＰＤまたは気管支喘息などの喘息の治療に有用であることができる。
【０５０４】
ＣＯＰＤ治療のための他の遺伝子標的には、β２アドレナリン受容体、ロイコトリエンＤ４、５’−リポキシゲナーゼ、インターロイキン−８、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、上皮成長因子受容体、チロシン・キナーゼ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ８、ならびにセリン・エラスターゼ、ＥＬＡ２、ＯＭＩＭ１３０１３０および好中球エラスターゼなどのマトリクス分解性プロテアーゼが挙げられる。
【０５０５】
【表１２】
2008509670.tif 000107
2008509670.tif 000108
本願に記載のオリゴヌクレオチド剤は、病原性感染症の治療に有用であることができる。例えば、Ａ型インフルエンザに感染したヒトには、Ａ型インフルエンザＰＢ２遺伝子またはＰＡ遺伝子を標的にするオリゴヌクレオチド剤を投与することができる。Ａ型インフルエンザなどの病原体の遺伝子を標的にするオリゴヌクレオチド剤は、生物戦争の攻撃の犠牲者を治療するのにも有用であることができる。
【０５０６】
オリゴヌクレオチド剤は、Ｒａｓファミリー遺伝子またはファルネシルトランスフェラーゼ、Ｓｔａｔ３、ヒトリボヌクレオチドリダクターゼのＲ２小サブユニット成分、ＢｃＩ遺伝子（例えば、Ｂｃｌ−２）、ポロ様キナーゼ−１（ＰＬＫ１）、ＶＥＧＦ受容体、抗−Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）または抗−ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）を標的とすることができる。これらのオリゴヌクレオチド剤は肺癌治療に有用であろう。
【０５０７】
オリゴヌクレオチド剤は、ＳＣＲ、ＳＣＦ、またはアレルゲンに対する肺反応を抑制または治療するためのＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットをターゲティングすることができる。例えば、これらのオリゴヌクレオチド剤を用いて肺炎症を抑制または治療することができる。
【０５０８】
ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットをコードする遺伝子を標的にするオリゴヌクレオチド剤を用いて、肺炎を治療することができる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、例えば肺における肺系統の組織に発現したｍｉＲＮＡを標的にする。別の実施形態では、ヒトは、肺におけるｍｉＲＮＡの過剰発現または蓄積あるいは肺に発現したｍｉＲＮＡの標的である核酸の発現の減少が特徴である障害に罹患している。オリゴヌクレオチド剤を対象に、または対象の肺細胞に投与すれば、該オリゴヌクレオチド剤を標的ｍｉＲＮＡと対にすることができ、続いてｍｉＲＮＡを下方調節することができる。
【０５０９】
喘息治療に有用なオリゴヌクレオチド剤は、例えばエアロゾルの吸入を介して直接的に肺に送達されることができる。リポソーム送達剤を用いて、オリゴヌクレオチド剤を肺に送達することができる。オリゴヌクレオチド剤および特にホスホロチオエート結合を含んだオリゴヌクレオチド剤は吸入によって投与することができ、続いて気管支および肺胞の上皮および内皮に限局することができる。オリゴヌクレオチド剤は、約１５ｍｇ／ｋｇ未満、例えば１２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．００１ｍｇ／ｋｇ未満の用量で吸入投与されることができる。
【０５１０】
肺疾患の治療のために、オリゴヌクレオチド剤を、気道内注入、鼻腔内、静脈内投与することができる。
ウイルス感染症の治療
オリゴヌクレオチド剤、例えば複合オリゴヌクレオチド剤を用いて、ウイルス遺伝子、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ＨＩＶ、エプスタインバーウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、またはインフルエンザ、例えばＡ型インフルエンザの遺伝子をターゲティングすることができる。
【０５１１】
オリゴヌクレオチド剤を用いてウイルス感染症または癌を治療することができる。例えば、子宮頸部新生物の治療のために、オリゴヌクレオチド剤はＨＰＶ、例えばＨＰＶ１６、１８、３１、３３または４５をターゲティングすることができる。オリゴヌクレオチド剤は、例えばＨＰＶのＥ６、Ｅ７、またはＭＣＰ−１をターゲティングすることができる。これに加えて、あるいは代替的には、オリゴヌクレオチド剤は宿主のヌクレオリンをターゲティングすることができる。
【０５１２】
ＨＩＶ感染症の治療のためのオリゴヌクレオチド剤は、例えばＨＩＶウイルスのｇａｇ、ｔａｔ、ｖｐｒ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ｐｏｌ、ｖｉｒまたはｇｐ１２０遺伝子をターゲティングすることができる。
【０５１３】
ウイルス遺伝子を標的にするオリゴヌクレオチド剤は、組換え型アデノ・ベクターの形態で、またはレトロウイルス・デリバリーによって、対象に送達することができる。例えば、腫瘍組織には送達は直接でもよい。
【０５１４】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は病原体、例えばウイルス性病原菌または細菌性病原菌によって発現したｍｉＲＮＡをターゲティングする。例えば、オリゴヌクレオチド剤はウイルス、例えばヘルペスウイルスによって発現したｍｉＲＮＡをターゲティングすることができる。ヘルペスウイルスは、例えばエプスタインバーウイルス（ＥＢＶまたはＨＨＶ４）、γヘルペスウイルス（例えばカポジ肉腫関連ウイルス（ＫＳＨＶまたはＨＨＶ８）、マウスγヘルペスウイルス６８（ＭＨＶ６８））、またはβヘルペスウイルス（例えばヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶまたはＨＨＶ５））でもよい（フェッファーら（Ｐｆｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）Ｓｉｅｎｃｅ、３０４：７３４〜７３６頁、２００４年およびフェッファーら（Ｐｆｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：２６９〜２７６頁、２００５年）。オリゴヌクレオチド剤を対象に投与すれば、該オリゴヌクレオチド剤は標的ｍｉＲＮＡと対になり、続いて病原性ｍｉＲＮＡとその標的、例えば該病原体またはその宿主に内在性の標的ｍｉＲＮＡとの相互作用を低減させる。この相互作用の結果、病原による宿主の感染が低減される。
【０５１５】
他の例示的な治療遺伝子標的
オリゴヌクレオチド剤、例えば本願に記載の複合化オリゴヌクレオチド剤は、細胞接着に関与する遺伝子、例えばＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、またはＥＬＡＭ−１を阻害することができる。
【０５１６】
オリゴヌクレオチド剤は、細胞増殖の調節に必要とされる遺伝子、例えばｃ−ｍｙｂ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、Ｈａ−ｒａｓ、Ａ−ｒａｆキナーゼ、ｃ−ｒａｆキナーゼまたはＭＲＰを阻害することができる。
【０５１７】
オリゴヌクレオチド剤は、疾患の発症機序に関与する遺伝子、例えばβ−サラセミアを阻害することができる。
オリゴヌクレオチド剤は、病原体によって引き起こされる疾患の発症機序に関与する遺伝子を阻害することができる。例えば、マラリア原虫はマラリアＰＳ１またはＰＳＩＩを引き起こし、日本住血吸虫は住血吸虫感染症を引き起こす可能性がある。該病原体の遺伝子をターゲティングするアリゴヌクレオチド剤を用いて、その疾患を治療することができる。
【０５１８】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は疾患の発症機序に関与するｍｉＲＮＡに結合する。
神経疾患または神経障害、例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病のリスクがあるか、それに苦しんでいるヒトに、オリゴヌクレオチド剤を投与することができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤はアミロイド−ファミリー遺伝子、例えばＡＰＰ；プレセニリン遺伝子、例えばＰＳＥＮｌおよびＰＳＥＮ２、またはα−シヌクレインをターゲティングすることができる。
【０５１９】
オリゴヌクレオチド剤をヒトに投与して、神経変性トリヌクレオチドリピート障害、例えば、ハンチントン病（ＨＤ）、状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、または脊髄小脳失調、例えばＳＣＡｌ、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３（マシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ７またはＳＣＡ８を治療することができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、ＨＤ、ＤＲＰＬＡ、ＳＣＡｌ、ＳＣＡ２、ＭＪＤｌ、ＣＡＣＮＬｌＡ４、ＳＣＡ７またはＳＣＡ８遺伝子の発現を低減することができる。
【０５２０】
本発明の特徴のオリゴヌクレオチド剤を用いて、膵臓の疾患、例えば膵炎、膵癌、糖尿病または高血糖症を治療することができる。例えば、ｒａｓ、ＪＮＫ、またはスルビビンをターゲティングするオリゴヌクレオチド剤は、膵癌の治療に有用であることができる。一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、糖尿病を治療するためなどの、膵臓に発現するｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−３７５をターゲティングすることができる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、膵臓に発現するｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−３７５と実質的に同一である。
【０５２１】
本発明の特徴のオリゴヌクレオチド剤を用いて、腸の疾患、例えば胃腸炎を治療することができる。
送達経路
本願に記載のオリゴヌクレオチド剤を、種々の送達経路、例えば、２００４年４月１６日出願の国際特許出願シリアル番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１１８２９号に記載されているような、例えば眼球、肺、静脈内、局所、直腸、肛門または膣送達によって投与することができる。この参照の内容を全体的に本願に援用する。
【０５２２】
用量
一態様では、本発明は、オリゴヌクレオチド剤を対象（例えば、ヒト対象）に投与する方法を特徴とする。該方法は、該オリゴヌクレオチド剤、ＲＮＡ、例えば対象のｍｉＲＮＡ、またはタンパク質（例えば、内在性または病原性標的ＲＮＡまたはタンパク質）を標的とする、例えばミクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、デコイＲＮＡまたはアプタマーの単位用量を投与する工程を含む。一実施形態では、該単位用量は１．４ｍｇ／ｋｇ体重未満、または１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５または０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重未満、オリゴヌクレオチド剤（例えば、約４．４×１０１６個）／ｋｇ体重の２００ｎＭ未満、あるいはオリゴヌクレオチド剤／ｋｇ体重１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎＭ未満を含む。
【０５２３】
この定められた量は、疾患または障害、例えば腎臓に存在するＲＮＡなどの標的ＲＮＡに関連する疾患または障害を治療または予防するのに有効な量であることができる。この単位用量を、例えば、注射（例えば、静脈内または筋内）、吸入投与、または局所投与によって投与することができる。特に好適な用量は２、１または０．１ｍｇ／ｋｇ体重未満である。
【０５２４】
好適な実施形態では、該単位用量は１日１回未満の頻度で、例えば２、４、８または３０日未満毎に投与される。別の実施形態では、該単位用量はある頻度では投与されない（例えば規則的な頻度ではない）。例えば、該単位用量が１回で投与されてよい。
【０５２５】
一実施形態では、該有効用量は他の従来の治療法を用いて投与される。一実施形態では、対象はウイルス感染症を有しており、そのモダリティはオリゴヌクレオチド剤以外の抗ウイルス剤である。別の実施形態では、対象はアテローム性動脈硬化症を有しており、そのオリゴヌクレオチド剤の有効用量は、例えば外科的介入、例えば血管形成術と併用して後から投与される。
【０５２６】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤、または前駆物質、例えばオリゴヌクレオチド剤に加工することができるより大きいオリゴヌクレオチド剤、またはオリゴヌクレオチド剤をコードするＤＮＡ、あるいはこれらの前駆物質の初回用量および１回以上の維持用量を対象に投与する。該維持用量または複数の維持用量は一般に、初回用量未満、例えば初回用量の１／２未満である。維持レジメンには、０．０１μｇ〜１．４ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量または複数の用量範囲で対象を治療することを含むことができる。該維持用量は、５、１０または３０日に１回以下で投与されることが好ましい。さらに、該治療計画は特定の疾患の性質、その重篤度、および患者の全体的状態に応じて変動するある時間間隔の間、継続してよい。好適な実施形態では、該用量は、１日１回以下、例えば２４、３６、４８時間以上に１回以下、例えば５日または８日毎に１回以下で送達されてよい。治療後、患者の状態の変化および疾患状態の徴候の軽減について、患者をモニターすることができる。本化合物の用量は、患者が現行の用量に対して有意に反応しない場合は増量してもよいし、または疾患状態の徴候の軽減が認められる、疾患状態が除去された場合、または望ましくない副作用が認められる場合には用量を減量してもよい。
【０５２７】
特定の条件下で必要に応じてまたは適切と考慮される場合、該有効量は単回投与または２回以上の投与で投与されることができる。反復的または高頻度の注入を容易にしようとする場合、送達装置、例えばポンプ、半永久的ステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内または関節包内）、またはリザーバの植え込みが妥当であるかもしれない。
【０５２８】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤の医薬組成物は、複数のオリゴヌクレオチド剤種を含む。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤種は、天然の標的配列に関して他の種と重ならず、また隣接しない配列を有する。別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチド剤種は、異なる天然標的遺伝子に特異的である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は対立遺伝子特異的である。
【０５２９】
いくつかの場合、患者は他の治療法と併用してオリゴヌクレオチド剤で治療される。例えば、腎疾患、例えば初期段階の腎疾患について治療中の患者に、標的遺伝子産物の活性を抑制することが知られている薬剤と併用して該疾患の進行を増強することが知られている標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド剤を投与することができる。例えば、初期段階の腎疾患を有する患者は、ナトリウム−グルコースの共輸送をブロックし、続いて１ネフロンの糸球体濾過量を低減させることが知られている小分子のフロリジンと併用して、ＳＧＬＴ２  ＲＮＡをターゲティングするオリゴヌクレオチド剤を用いて治療することができる。別の実施形態では、腎臓の癌について治療中の患者に、腫瘍細胞増殖に必須の標的に対して特異的なオリゴヌクレオチド剤を化学療法と併用して投与することができる。
【０５３０】
治療が奏功した後、疾患状態の再発を予防するために患者に維持療法を受けさせることが望ましいと思われ、この場合、本発明の化合物は０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲の維持用量で投与される（米国特許第６１０７０９４号明細書を参照）。
【０５３１】
オリゴヌクレオチド剤組成物の濃度は、ヒト障害を治療または予防するか、またはヒトにおける生理学的状態を調節する際に有効であるのに十分な量である。投与されるオリゴヌクレオチド剤の濃度または量は、オリゴヌクレオチド剤について決定されるパラメータ、および投与方法、例えば鼻腔内投与、口腔投与、肺投与に左右される。例えば、鼻腔の炎症または灼熱痛を回避するために、鼻腔投与製剤はいくつかの成分のより低い濃度を必要とすることが多い。適した鼻腔投与製剤を提供するために、１０〜１００倍まで経口製剤を希釈することが時に望ましい。
【０５３２】
特に限定するものではないが、疾患または障害の重症度、それまでに受けた治療、対象の全体的な健康および／または年齢、および存在する他の疾患といったある種の要因が、対象を効果的に治療するのに必要な用量に影響することがある。さらに、オリゴヌクレオチド剤、例えば２本鎖オリゴヌクレオチド剤またはオリゴヌクレオチド剤をコードするＤＮＡ、またはそれらの前駆物質）の治療有効量で対象を治療することには、１回の治療を含むことができ、好適には、一続きの治療を含むことができる。治療に用いられるオリゴヌクレオチド剤の有効量は、特定の治療の過程にわたって増大または低減することができることも理解されよう。用量の変更が生じ、本願に記載のような診断分析の結果から明白となることができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤組成物を投与後に対象をモニターすることができる。モニタリングからの情報に基づいて、オリゴヌクレオチド剤組成物の付加的な量を投与することができる。
【０５３３】
投薬は、治療される疾患状態の重篤度または応答性に左右され、治療過程は数日から数カ月続くか、治癒がもたらされるまで、または疾患状態の縮小が得られるまで続く。最適な投薬計画は患者の身体内の薬剤の蓄積量の測定値から算出することができる。当業者であれば、最適な用量、投薬方法および反復率を容易に決定することができる。最適な用量は個々の化合物の相対的有効性に応じて変化するかもしれず、一般に、インビトロおよびインビボ動物モデルで有効であると認められたＥＣ５０に基づいて推定することができる。いくつかの実施形態では、この動物モデルにはヒト遺伝子、例えば、標的ＲＮＡを産生する遺伝子を発現するトランスジェニック動物が挙げられる。トランスジェニック動物は対応する内在性ＲＮＡが欠損することができる。別の実施形態では、試験用の組成物には、少なくとも内部領域において動物モデルの標的ＲＮＡとヒトの標的ＲＮＡとの間で保存された配列と相補的なオリゴヌクレオチド剤を含む。
【０５３４】
一態様では、本発明は標的核酸と実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド剤、またはオリゴヌクレオチド剤、例えば２本鎖オリゴヌクレオチド剤またはその前駆物質をコードするＤＮＡを含んだ組成物の第１の量を対象に投与する工程；該標的核酸によってコードされたタンパク質に関連する活性を評価し、この評価を用いて第２の量を投与すべきかどうかを決定する工程を含む方法を特徴とする。好適な実施形態では、該方法には該組成物の第２の量を投与する工程を含み、該第２の量の投与のタイミングまたは用量は前記評価の関数である。該方法は本願に記載の他の特徴を含むことができる。
【０５３５】
別の態様では、本発明はオリゴヌクレオチド剤の源を対象に投与する方法を特徴とする。該方法はオリゴヌクレオチド剤の源を投与または埋め込む工程を含む。一実施形態では、該源はオリゴヌクレオチド剤を経時的に放出する。例えば、該源は制御放出性または持続放出性の源、例えばオリゴヌクレオチド剤を徐々に放出する微粒子である。別の実施形態では、該源はポンプ、例えばセンサを備えたポンプまたは１つまたは複数の単位用量を放出することができるポンプである。
【０５３６】
一態様では、本発明は、標的核酸との２本鎖形成を可能にするのに十分に標的ＲＮＡと相補的なヌクレオチド配列を含んだ、ＮＡＴオリゴヌクレオチド剤またはオリゴヌクレオチド剤をコードするＤＮＡを含む医薬組成物を特徴とする。該標的ＲＮＡは内在性ヒト遺伝子転写産物でもよい。一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤（ａ）は約５〜約１００核酸塩基長、例えば約８〜約７５、例えば約８〜約５０ヌクレオチド長、例えば約１５〜約３０ヌクレオチド長、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；および（ｂ）内在性標的ＲＮＡに対して相補的である。一実施形態では、該医薬組成物はエマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリーまたはリポソームでもよい。
【０５３７】
ある種の他の態様では、本発明はオリゴヌクレオチド剤またはオリゴヌクレオチド剤をコードするＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド剤の前駆物質の医薬製剤を含む、適した容器を備えたキットが提供される。ある種の実施形態では、該医薬製剤の個々の成分は１つの容器で提供されてよい。別の場合には、該医薬製剤の成分を２つ以上の容器、例えば、オリゴヌクレオチド剤調製物の１つの容器および担体化合物用の少なくとも別の容器に別個に提供することが望ましいこともある。該キットは、１つまたは複数の容器を１つの箱に入れるといった多数の異なった構成にパッケージングされてよい。例えばキットとともに提供される説明に従って、異なる成分を組み合わせることができる。例えば、ある医薬組成物を調製および投与するために、本願に記載のような方法に従って、成分を組み合わせることができる。該キットは送達装置を含んでもよい。
【０５３８】
別の態様では、本発明は装置、例えば植え込み可能な装置を特徴とし、該装置はオリゴヌクレオチド剤、または前駆物質、例えばオリゴヌクレオチド剤に加工することのできるより大きなオリゴヌクレオチド剤、またはオリゴヌクレオチド剤をコードするＤＮＡを含んだ組成物を分注または投与することができる。該オリゴヌクレオチド剤は内在性転写産物の発現を阻害することができる。一実施形態では、該装置は該組成物でコーティングされている。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は該装置内に設けられる。別の実施形態では、該装置は該組成物単位用量を分注するための機構を含む。別の実施形態では、該装置は、例えば拡散によって、該組成物を連続的に放出する。例示的な装置には、ステント、カテーテル、ポンプ、人工器官または器官部品（例えば、人工心臓、心臓弁等）、および縫合材が挙げられる。
【０５３９】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、それらはさらに限定的なものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０５４０】
実施例１
２−アザブタン−１，４−ジカルボン酸ジエチルＡＡ
【０５４１】
【化８２】
2008509670.tif 000109
４．７Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を、グリシン酸エチル塩酸塩（３２．１９ｇ、０．２３モル）を攪拌した氷冷水溶液（５０ｍＬ）に添加した。次いで、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、反応の完了がＴＬＣによって確認されるまで（１９時間）、該混合物を室温で攪拌した。１９時間後、該反応物をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で分配した。この有機層を、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、濾過、蒸発させた。この残渣を蒸留してＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得た。
【０５４２】
実施例２
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ
【０５４３】
【化８３】
2008509670.tif 000110
Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ミリモル）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解して氷冷した。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ミリモル）を０℃で該溶液に添加した。次いで、２−アザブタン−１，４−ジカルボン酸ジエチル（５ｇ、２４．６ミリモル）およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ミリモル）を添加した。該溶液を室温にし、さらに６時間攪拌した。ＴＬＣによって反応が終了したことを確認した。この反応混合物を減圧濃縮し、酢酸エチルを添加してジイソプロピル尿素を沈殿させた。この懸濁液を濾過した。濾液を５％塩酸水溶液、５％重炭酸ナトリウムおよび水で洗浄した。該混合有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して粗生成物をえた後、これをカラムクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）によって精製して１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを得た。
【０５４４】
実施例３
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］プロピオン酸エチルエステルＡＣ
【０５４５】
【化８４】
2008509670.tif 000111
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ミリモル）を、０℃のジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンに溶解した。該溶液の攪拌を１時間継続した。この反応混合物を減圧濃縮し、残留水を添加し、生成物を酢酸エチルで抽出した。この粗生成物を塩酸塩に転換することによって精製した。
【０５４６】
実施例４
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステルＡＤ
【０５４７】
【化８５】
2008509670.tif 000112
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］プロピオン酸エチルエステルＡＣ（４．７ｇ、１４．８ミリモル）の塩酸塩をジクロロメタンに入れた。この懸濁液を０℃まで氷冷した。該懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ミリモル）を添加した。得られた溶液にクロロギ酸コレステリル（６．６７５ｇ、１４．８ミリモル）を添加した。この反応混合物を一晩攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュ・クロマトグラフィーで精製した（１０．３ｇ、９２％）。
【０５４８】
実施例５
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルＡＥ
【０５４９】
【化８６】
2008509670.tif 000113
カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ミリモル）を乾燥トルエン３０ｍＬでスラリー化した。該混合物を０℃まで冷却し、５ｇ（６．６ミリモル）のジエステルを攪拌しながら２０分以内にゆっくりと添加した。添加中、温度を５℃以下に維持した。攪拌を０℃で３０分間続け、１ｍＬの氷酢酸を添加し、直後に４ｇの４０ｍＬの水中のＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏを添加した。得られた混合物を２つの１００ｍＬのジクロロメタンで抽出し、混合された有機抽出物を１０ｍＬのリン酸緩衝液で２回洗浄し、乾燥させ、蒸発乾燥させた。該残渣を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃まで冷却し、ｐＨ９．５の冷たい炭酸緩衝液の３つの５０ｍＬ部分で抽出した。この水性抽出物をリン酸でｐＨ３に転換し、混合されたクロロホルムの５つの４０ｍＬ部分で抽出し、乾燥、蒸発させて残渣を得た。該残渣を２５％酢酸エチル／ヘキサンを用いてカラムクロマトグラフィーによって精製し、１．９ｇのβ−ケトエステル（３９％）を得た。
【０５５０】
実施例６
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＦ
【０５５１】
【化８７】
2008509670.tif 000114
テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ミリモル）および水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ミリモル）の還流混合物にメタノール（２ｍＬ）を１時間かけて液滴で添加した。還流温度で攪拌を１時間続けた。室温まで冷却後、ＮＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、該混合物を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。混合された酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）によって精製した生成物を得た（８９％）。
【０５５２】
実施例７
（６−｛３−［ビス−４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テテトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＧ
【０５５３】
【化８８】
2008509670.tif 000115
ジオールＡＦ（１．２５ｇｍ、１．９９４ミリモル）をピリジン（２×５ｍＬ）とともに減圧蒸発で乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（０．７２４ｇ、２．１３ミリモル）を攪拌しながら添加した。この反応を室温で一晩実施した。メタノールを添加することにより該反応を急冷した。該反応混合物を減圧濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加した。該有機層を１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。該有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過、濃縮した。トルエンとともに蒸発させることによって、残ったピリジンを除去した。該粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中のＲｆ＝０．５）によって精製した（１．７５ｇ、９５％）。
【０５５４】
実施例８
コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン３−イル）エステルＡＨ
【０５５５】
【化８９】
2008509670.tif 000116
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ミリモル）を無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ミリモル）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ミリモル）と混合し、４０℃で一晩減圧乾燥させた。該混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ミリモル）を添加し、該溶液をアルゴン雰囲気下において室温にて１６時間攪拌した。次いで、これをジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷したクエン酸（５ｗｔ％、３０ｍＬ）水溶液および水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。この有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾燥させた。残渣をそのまま次工程に用いた。
【０５５６】
実施例９
コレステロール誘導ＣＰＧ  ＡＩ
【０５５７】
【化９０】
2008509670.tif 000117
コハク酸ＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ミリモル）をジクロロメタン／アセトニトリルの混合物（３：２、３ｍＬ）に溶解した。この溶液に、アセトニトリル（１．２５ｍＬ）中のＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ミリモル）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中の２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ミリモル）を連続して添加した。得られた溶液に、アセトニトリル（０．６ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ミリモル）を添加した。該反応混合物は明るいオレンジ色に変わった。該溶液を手首動作振とう機を使って簡単に攪拌した（５分）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１μｍ／ｇ）を添加した。該懸濁液を２時間攪拌した。ＣＰＧを焼結ガラス漏斗で濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびエーテルで連続して洗浄した。未反応のアミノ基を無水酢酸／ピリジンを用いてマスクした。ＵＶ測定を行うことによって、ＣＰＧのローディング容量を測定した（３７μＭ／ｇ）。
【０５５８】
実施例１０
（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）ホスホロアミダイトＡＪ
【０５５９】
【化９１】
2008509670.tif 000118
化合物ＡＧ（０．１５ｇ、０．１５８ミリモル）をトルエン（５ｍＬ）と共蒸発させた。Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．００８９ｇ、０．０７９ミリモル）を残渣に添加し、該混合物を真空オーブン中４０℃で、Ｐ２Ｏ５上で一晩乾燥させた。該反応混合物を無水アセトニトリル／ジクロロメタンの混合物（２；１、１ｍＬ）に溶解し、および２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト（０．０７１４ｇ、０．０７８１ｍＬ、０．２３７ミリモル）を添加した。該反応混合物を周囲温度で一晩攪拌した。この反応が終了したことをＴＬＣ（１；１酢酸エチル：ヘキサン）によって確認した。減圧下で溶媒を除去し、残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解し、５％ＮａＨＣＯ３（４ｍＬ）およびブライン（４ｍＬ）で洗浄した。この酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧濃縮した。得られた混合物をクロマトグラフィー（５０：４９：１、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン：トリメチルアミン）にかけて、ＡＪを白色発泡体として得た（０．１５２ｇ、８４％）。
【０５６０】
実施例１１
ＲＮＡ合成、脱保護および精製プロトコル
１．合成：
ＲＮＡ分子を、以下に記載するような２〜３の待機段階の変更を加え、製造業者によって記載された標準的な９３ステップ・サイクルを用いて、３９４ＡＢＩ機器で合成した。固体支持体は細孔性ガラスであり（ＣＰＧ、１μＭｍ、５００Å、グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、［米国バージニア州スターリング所在］、モノマーは、標準的な保護基（マサチューセッツ州所在のＣｈｅｍｇｅｎｅｓ社からの、Ｎ６−ベンゾイル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチルアデノシン−２’ｔブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルウリジン−２’ｔブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、Ｎ２−イソブチリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチルグアノシン−２’ｔブチルジメチルシリル，３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、およびＮ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチルシチジン−２’ｔブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト）を有するＲＮＡホスホロアミダイト（ケムジーン社（Ｃｈｅｍｅｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ）［米国マサチューセッツ州所在］）で、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中０．１５Ｍの濃度および７．５分のカップリング時間で用いた。賦活剤をチオテトラゾール（０．２５Ｍ）とした。ＰＯ−酸化にはヨウ素／水／ピリジンを用い、ＰＳ−酸化にはアセトニトリル中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬０．５Ｍ溶液を用いた。合成のための試薬もすべて、グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のものとした。
【０５６１】
２．脱保護−Ｉ（オリゴマー切断、塩基およびリン酸脱保護）
合成完了後、細孔性ガラス（ＣＰＧ）をねじ蓋付きバイアル内（（フィッシャー社（Ｆｉｓｈｅｒ）、カタログ番号０３−３４０−５Ｎ）またはねじ蓋付きのＲＮａｓｅを含まない微量遠沈管中に移した。オリゴヌクレオチドをＣＰＧから切断し、これと同時に、エタノール・アンモニア［アンモニア：エタノール（３：１）］の混合物１．０ｍＬを用いて５５℃で６時間から一晩、塩基およびリン酸基を脱保護した。バイアルを短時間氷冷し、次いで、エタノール・アンモニア混合物を新しい微量遠沈管に移した。ＣＰＧを５０％アセトニトリル０．２５ｍＬで３回洗浄した（コレステロールおよびそのような疎水性複合オリゴマーに対しては７０％ＣＨ３ＣＮ）。約１．７５ｍＬのこの溶液を２つの微量遠沈管に等しく分け、しっかり蓋をして、−８０℃で１５分間冷却してから、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ凍結乾燥機で約９０分間乾燥させた。
【０５６２】
３．脱保護−ＩＩ（２’ＴＢＤＭＳ基の除去）
得られた白色残渣を２００μＬのトリエチルアミントリヒドロフルオライド（ＴＥＡ、３ＨＦ、Ａｌｄｒｉｃｈ社）に再懸濁させ、６５℃で１．５時間加熱し、２’位置のテルトブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次いで、この反応物を４００μＬのイソプロポキシトリメチルシラン（ιＰｒＯＭｅ３Ｓｉ、Ａｌｄｒｉｃｈ社）でクエンチし、１５分間キャップを開けたままにして加熱ブロック上でさらにインキュベートした（これによって揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオライド付加化合物を蒸発させた）。Ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ中で乾燥させることによって、残ったクエンチ試薬を除去した。次いで、オリゴマーを無水メタノール（ＭｅＯＨ、８００μＬ）に沈殿させた。使用可能な最高速度で５分間遠心分離した後、非常に注意深く液体を取り出した。−８０℃で凍結させた後、残ったメタノールをＳｐｅｅｄ  ｖａｃ中において短時間で乾燥させて除去した。粗ＲＮＡがふわふわした白色物質として微量遠沈管中に得られた。
【０５６３】
４．粗オリゴマーの定量化または粗分析
試料を５０％アセトニトリル（０．５ｍＬ）水溶液に溶解し、以下のように定量化した。まず、５０％アセトニトリル水溶液（１ｍＬ）のみを用いてブランク測定を行った。
【０５６４】
５μＬの試料および９９５μＬの５０％アセトニトリルを微量遠沈管中で十分に混合し、キュベットに移し、２６０ｎｍで吸光度を読み取った。この粗物質を乾燥させ、−２０℃で保管した。
【０５６５】
５．オリゴマーの精製
粗オリゴマーを分析し、ＨＰＬＣ（Ｍｏｎｏ  Ｑ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ５／５０）によって精製した。この緩衝系は、Ａ＝１００ｍＭトリスＨＣｌ、１０％ＨＰＬＣグレードのアセトニトリルｐＨ＝８、Ｂ＝１００ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８、１０％ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル１ＭＮａＣｌであり、流速１．０ｍＬ／分、波長２６０ｎｍである。非修飾ＲＮＡ２１ｍｅｒについては、０〜０．６ＭＮａＣｌの勾配が一般に適切である。ＣＧＥまたはＭＳによって、少量（約５ＯＤ）の材料を精製し、分析することができる。この物質の同定がいったん確認されると、より大きな量の材料、すなわち、操作当たり４０ＯＤ、流速１ｍＬ／分および検出器が飽和しないように感度の弱い２８０ｎｍの波長を用いて、粗オリゴマーを精製することができる。次いで、完全長オリゴヌクレオチドを含んだ断片を一緒にプールし、蒸発させ、最後に以下のように脱塩した。
【０５６６】
６．精製オリゴマーの脱塩
次いで、Ｃ−１８Ｓｅｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社）またはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）のいずれかを用いて、精製したオリゴマーを脱塩した。このカートリッジを各々１０ｍＬのアセトニトリル、次に５０％アセトニトリル、１００ｍＭ緩衝液（これは酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸ナトリウム、または酢酸アンモニウムでもよい）で調整した。最後に、ＲＮＡｓｅを含まない水１０ｍＬに完全に溶解させた精製オリゴマーを、非常にゆっくりと滴状を溶出させながらカートリッジに入れた。カートリッジを水（１０ｍＬ）で洗浄して、塩を除去した。最後に、塩を含まないオリゴマーを５０％アセトニトリルまたは５０％メタノールでねじ蓋付きバイアル内に直接溶離させた。
【０５６７】
７．キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）およびエレクトロスプレー液体クロマトグラフィー質量分析
約０．０４ＯＤのオリゴマー１μＬをまずドライダウンさせ、水（２μＬ）に再溶解し、次いで、ＣＧＥおよび液体クロマトグラフィー質量分析用の特別なバイアルにピペットで分注した。一般には、分析前に脱塩を行うべきである。
【０５６８】
実施例１４
５’コレステロール−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号５５）
化合物１４−ａを用いて、コレステロールがＲＮＡ分子の５’末端に複合されたオリゴヌクレオチド複合体を合成した。
【０５６９】
ホスホロアミダイト１４−ａをアセトニトリル／塩化メチレン１：１溶液に溶解して０．２Ｍ溶液を得た。オリゴヌクレオチド合成中、これを末端カップリングに用いた。ＰＯ酸化のために、ヨウ素／水／ピリジンを用い、アセトニトリル中のＰＳ酸化  Ｂｅａｕｃａｇｅ  試薬０．５Ｍ溶液を用いた。シンセサイザー中でジメトキシトリオチル基を除去した。
【０５７０】
実施例１５
ｓｉＲＮＡ修飾による２本鎖安定性の増強
ｓｉＲＮＡ２本鎖の血清安定性をモニターするための放射性標識法：センス（Ｓ）またはアンチセンス鎖（ＡＳ）のいずれか微量の５’−３２Ｐで標識した材料を（例えば、３２Ｐ−Ｓ／ＡＳおよびＳ／３２Ｐ−ＡＳ）を含んだｓｉＲＮＡ２本鎖を１μＭのストック濃度で調製した。末端標識センスまたはアンチセンス鎖が存在することは、ｓｉＲＮＡ２本鎖に関連して個々の鎖をモニターすることが可能にした。したがって、２つの２本鎖調製物を試験される各ｓｉＲＮＡ配列について作製した。１００ｎＭ２本鎖の最終濃度でｓｉＲＮＡ２本鎖を９０％ヒト血清中でインキュベートした。試料を取り出し、停止混合物中で適時急冷した。典型的な経時変化として、１０秒、１５分、３０分、１時間、２時間および４時間の時間ポイントを選択した。対照試料（４時間緩衝液のみでインキュベート）およびマーカーとして標識したセンスまたはアンチセンス鎖の部分アルカリ加水分解ラダーと一緒に、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって試料を分析した。Ｆｕｊｉホスフォイメージャーを用いて該ゲルを画像化し、インキュベート中に血清ヌクレアーゼによって生成された分解フラグメントと一緒に完全長センスおよびアンチセンス鎖を検出した。
【０５７１】
血清中のホスファターゼ活性に起因して５’リン酸標識が失われる可能性があるので、５’末端標識化に代わるものが、センスまたはアンチセンス鎖のいずれかの中に内部３２Ｐまたは３３Ｐ標識を配置する。この標識方法は５’末端標識化よりも労力がかかり、現在、われわれは脱リン酸化が血清インキュベート中に生じるという証拠を得ていない。
【０５７２】
骨格修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および３’複合体に分類される一連の化学的修飾を試験し、非修飾ｓｉＲＮＡ２本鎖と比較して血清安定性が増大することがわかった。各修飾、ｓｉＲＮＡ２本鎖内のその場所および血清安定性のデータの説明は以下の通りである。
【０５７３】
非修飾親２本鎖の血清安定性：非修飾親２本鎖であるＡＬ−ＤＵＰ−１０００を用いて、血清安定性のベースラインを確立し、ヌクレアーゼ耐性に対する化学修飾の効果を評価した。
【０５７４】
【化９２】
2008509670.tif 000119
ＡＬ−ＤＵＰ−１０００を血清安定性検定に供して、その固有のヌクレアーゼ耐性を評価し、その分解パターンを画定した（図１８）。ヒト血清安定性検定において、変性ゲル電気泳動を用いてＡＬ−ＤＵＰ−１０００を分析した。５’末端標識センスＲＮＡ（＊ｓ／ａｓ）を含んだｓｉＲＮＡ２本鎖Ａおよび５’末端標識アンチセンスＲＮＡ（ａｓ／ｓ＊）を含んだ２本鎖を各々９０％ヒト血清中でインキュベートし、時間ポイントを１０秒、５分、１５分、３０分、１時間、２時間および４時間で検定した。ＰＢＳ緩衝液のみでインキュベートしたｓｉＲＮＡ２本鎖に関し、対照は４時間の時間ポイントとし、ＯＨ−をアルカリ加水分解マーカーとした。３’−５’エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの両方によってこの非修飾２本鎖が分解されるのが観察された（図１８）。
【０５７５】
３’−５’エキソヌクレアーゼによるセンスおよびアンチセンス鎖両方の３’末端の切断は、インキュベートの最初の５分以内に発生し、その結果、３’末端ｄＴ残基が失われた（図１８のｓ＊／ａｓおよびｓ／ａｓ＊パネルの上部の垂直線）。エキソヌクレアーゼ分解に加え、両鎖はエンドヌクレアーゼによって切断された。アンチセンス鎖の位置１６には、１０秒という早い段階で出現する主要なエンドヌクレアーゼ部位が存在した（図１８のｓ＊／ａｓおよびｓ／ａｓ＊パネルの一番下の垂直線）。１時間後、ヒト血清に残っている完全長センスまたはアンチセンス鎖はごく僅かであった。親２本鎖に関連して化学修飾を導入し、ヌクレアーゼ耐性に対するその修飾の効果を評価した。これらの化学修飾は、次のクラスの１つに分類される：骨格修飾、糖修飾、核酸塩基修飾、カチオン性修飾および複合体。
【０５７６】
骨格修飾によるヌクレアーゼ耐性の増強：ｓｉＲＮＡ２本鎖の特異的リン酸ジエステル結合をホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのいずれかにより置換し、ヒト血清安定性検定においてその安定性を評価した。表１１は試験した２本鎖の配列を含む。センスおよびアンチセンス鎖両方の３’末端のリン酸ジエステル結合を置換することにより、非修飾親２本鎖（図１８参照）に比して、３’オーバーハングのエキソヌクレクアーゼ分解が阻害された（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。センスおよびアンチセンス鎖両方について、完全長開始材料は４時間存在した。非修飾２本鎖に見られるエンドヌクレアーゼ切断パターンは変化しなかった。同様の結果が付加的なホスホロチオエートをその３’末端に含む２本鎖についても得られた（データ示さず）。エンドヌクレアーゼ切断部位（２本鎖１４１９、１４２０および１４２１）にホスホロチオエートを配置したところ、これらの部位ではエンドヌクレアーゼ切断が阻害されなかった（データ示さず）。まとめると、２つの３’末端ヌクレオチド間に１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートが存在することが、エキソヌクレアーゼ分解から３’を保護するのに十分であった。３’末端にホスホロチオエートを付加すれば、血清ヌクレアーゼに対する長期曝露に必要であるかもしれないこの効果を増強するように思われる。
【０５７７】
【表１３】
2008509670.tif 000120
糖修飾によるヌクレアーゼ耐性の増強：エンドヌクレアーゼ切断の部位のほかｓｉＲＮＡ２本鎖の３’末端において２’ＯＨを２’ＯＭｅで置換することの効果を評価した。ヒト血清安定性検定において試験した２本鎖を表１２に示す。２つの修飾の組合せがヌクレアーゼ耐性をより有意に増強するか否かを評価するために、これらの２本鎖の一部もホスホロチオエート結合を含んだ。末端ｄＴ残基を２’ＯＭｅ−Ｕ（ＡＬ−ＤＵＰ−１０２７）で置換したところ、３’−５’エキソヌクレアーゼ分解は、非修飾親２本鎖にわたって僅かに低減された（データ示さず）。しかし、２’ＯＭｅ−Ｕによるエキソヌクレアーゼ保護の程度は、２つの末端ｄＴ残基の間にホスホロチオエートを配置することによって得られる程度よりもはるかに小さかった（図１９Ａ参照）。
【０５７８】
【表１４】
2008509670.tif 000121
２つの末端２’ＯＭｅ−ウリジン残基の間にホスホロチオエートを１つ付加したところ、２本鎖ＡＬ−ＤＵＰ−１０３６、ＡＬ−ＤＵＰ−１３ｆｆおよびＡＬ−ＤＵＰ−１３６３について図２０に見られるように、３’−５’エキソヌクレクアーゼ切断が効果的に阻害された。それ自身に２’ＯＭｅ置換することは、内部切断部位に配置されるときにエンドヌクレアーゼ切断から保護する際にさらにより効果的であった。親２本鎖は２本鎖の２つのＵｐＡ部位のＵの３’で切断された。両鎖はこのジヌクレオチド・リピートの対称性に起因して切断され、マッピング・データを用いて切断の部位を確認した（データ示さず）。強力なエンドヌクレアーゼ部位（（図２０、ｓ／＊ａｓゲルの星印、ＡＬ−ＤＵＰ−１３ｆｆ）に２’ＯＭｅを配置したところ、この部位の切断が阻害された。しかし、強力な部位を２’ＯＭｅで保護したとき、第２の弱いエンドヌクレアーゼ部位（図２０、＊ｓ／ａｓの黒い星）が僅かに増強された（図２０、ＡＬ−ＤＵＰ−３ｆｆをＡＬ−ＤＵＰ−１０３６と比較）。２’ＯＭｅ（ＡＬ−ＤＵＰ−１３６３）で両部位を保護したところ、両部位のエンドヌクレアーゼ切断が低減された（図２０）。２’ＯＭｅ置換による阻害作用は、切断反応における求核試薬として２’ＯＨを必要とするエンドヌクレアーゼ切断の機構と一致する。２’ＯＭｅ修飾は３’オーバーハングがリボヌクレオチドで構成された単一のオーバーハングｓｉＲＮＡ２本鎖の３’オーバーハングを保護するのにも有効な手段となる。この場合、２’ＯＭｅ置換を用いて、エンドヌクレアーゼ切断によって生じ得る末端２つのヌクレオチドの損失をブロックすることができ、ホスホロチオエートを用いてエキソヌクレアーゼ分解から保護することができる。
【０５７９】
カチオン性修飾によるヌクレアーゼ耐性の増強：異なる３つのカチオン性化学修飾によるヌクレアーゼ耐性への効果を試験し、親非修飾２本鎖と比較した。試験した３つのカチオン性修飾の構造を以下に示す。
【０５８０】
【化９３】
2008509670.tif 000122
【０５８１】
【表１５】
2008509670.tif 000123
ヒト血清安定性検定で検定した２本鎖の配列を表１３に示す。アルキルアミノ−ｄＴおよびカチオン性非塩基性ピロリジン修飾の両方を３’末端オーバーハングに配置して、３’−５’エキソヌクレアーゼ分解に対するその効果を評価した。アリルアミノ−ウリジンを内部エンドヌクレアーゼ切断部位に配置して、それがエンドヌクレアーゼ切断を阻害する能力を評価した。図２１に示すように、３’末端ｄＴ残基を単一のアルキルアミノ−ｄＴで置換したところ、３’−５’エキソヌクレクアーゼ分解が効果的に阻害された（図２１、ＡＬ−ＤＵＰ−１０ａａ、左のゲル像）。オーバーハング部分の両ｄＴ残基をアルキルアミノ−ｄＴで置換したところ、同程度の阻害がもたらされた（データ示さず）。各鎖の３’末端にカチオン性非塩基ピロリジン修飾を付加したところ、エキソヌクレクアーゼ分解からも保護した（図２１、真中のゲル像）。アルキルアミノ−ｄＴおよび非塩基ピロリジン修飾の両方が、最長２３時間、３’−５’エキソヌクレクアーゼ切断から保護された（データ示さず）。アリルアミノ−Ｕを内部切断部位に配置したところ、２本鎖ＡＬ−ＤＵＰ−１４０３について図２１に示すようにエンドヌクレアーゼ切断を阻害した。異なる２つの切断事象を分離するために、２’ＯＭｅ−Ｕおよびホスホロチオエート置換によって、エキソヌクレクアーゼ分解からこの２本鎖の末端を安定化した。エンドヌクレアーゼ切断はＡＬ−ＤＵＰ−１４０６のアリルアミノ−Ｕ置換によって、両方の内部切断部位において阻害された（データ示さず）。
【０５８２】
３’複合体によるヌクレアーゼ耐性の増強：ナプロキセンおよびイブプロフェンのｓｉＲＮＡの３’末端への複合について、３’−５’エキソヌクレクアーゼ分解を阻害するその能力を試験した。ナプロキセンの構造を以下に示す。
【０５８３】
【化９４】
2008509670.tif 000124
表１４はヒト血清安定性検定において試験したｓｉＲＮＡを列挙している。ナプロキセンまたはイブプロフェンのいずれかを３’末端に複合したところ、エキソヌクレクアーゼ分解が阻害された。図２２はナプロキセン修飾２本鎖（ＡＬ−ＤＵＰ−１０６９）の血清安定性データを示しており、同様の結果がＡＬ−ＤＵＰ１４１３について得られた。ｓｉＲＮＡ２本鎖の３’末端からエキソヌクレアーゼを立体的にブロックすることによって、該複合体はエキソヌクレクアーゼ切断を阻害すると思われる。同様のデータが、マウス・プール血清中のＡＬ−ＤＵＰ−１０６９についても得られた。
【０５８４】
【表１６】
2008509670.tif 000125
モノマー合成および複合戦略の付加的な例を別紙Ｉに記載し、これを本願の開示の一部として明示的に包含する。
【０５８５】
実施例１６
適した１本鎖ｉＲＮＡ剤を用いたマイクロＲＮＡのサイレンシング
化学的に安定化させた、ｍｉＲＮＡに対して相補的なコレステロール−複合１本鎖ＲＮＡを設計し、合成した。これらの１本鎖修飾ＲＮＡを本明細書では「ａｎｔａｇｏｍｉｒ」と呼ぶ（以下参照）。これらの合成ＲＮＡの可能性を探って内在性ｍｉＲＮＡをサイレンシングするために、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２を設計して、肝臓に発現したｍｉＲ−１２２、ｍｉＲＮＡを標的とした。ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２の配列を表１５に示す。ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２をマウスに少量（０．２ｍｌ、８０ｍｇ／ｋｇ、連続３日）、常圧で静脈内投与した。ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２を投与したところ、ノーザンブロット分析によって検出されたように内在性ｍｉＲ−１２２レベルは著しく低減された（図２３Ａ）。非修飾１本鎖ＲＮＡ（抗−１２２）の投与は肝ｍｉＲ−１２２発現レベルに影響を及ぼさず（図２３Ａ）、複合していないが、部分（ｐＳ）または完全（ｆＳ）ホスホロチオエート骨格および２’−Ｏ−メチル糖修飾（抗−１２２ｆＳ、抗−２２ｐＳ、表１５参照）で化学的に安定化させた１本鎖鎖ＲＮＡは不完全な効果をもたらした（図２３Ａ）。４つのミスマッチ変異を有する対照ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２誘導体（ｍｍ−ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２）を注射した動物は肝のｍｉＲ−１２２発現に効果を及ぼさなかったように、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２の作用は特異的であることが認められた。さらに、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２およびｍｍ−ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２で処理したマウスではｍｉＲ−ｌｅｔ７およびｍｉＲ−２２の発現レベルは影響を受けず、このことはサイレンシングがｍｉＲＮＡ特異的であることを示唆している（図２３Ｂ）。マウスに注射した１本鎖ＲＮＡの構造を表１５に記載する。
【０５８６】
【表１７】
2008509670.tif 000126
ｍｉＲ−１２２は細胞１個当たり５００００以上の高いレベルで肝細胞で発現される（チャン  ジェイら（Ｃｈａｎｇ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ）、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：２、１０６〜１１３頁、２００４年）。ａｎｔａｇｏｍｉｒ処理後のｍｉＲ−１２２のサイレンシングがｍｉＲ−１２２とａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２との間の化学量論的２本鎖形成によって、またはｍｉＲ−１２２の触媒分解によって引き起こされたものかどうかを決定するために、ホルムアミドを含んだストリンジェントな変性条件下で、非複合１本鎖抗−ｍｉＲ−１２２ＲＮＡ（抗−１２２ｆＳ、抗−１２２ｐＳ）またはａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２で処理したマウスの肝からの総ＲＮＡを検証した（図２３Ｃ）。ＰＢＳ肝と非複合抗−ｍｉＲ−１２２ＲＮＡ処理肝との間にｍｉＲ−１２２レベルの差は検出できず、これは非ストリンジェント条件下で観察されたｍｉＲ−１２２レベル低減は分解によるものではないが、その代わりにｍｉＲ−１２２／ＲＮＡ２本鎖の形成によるものであることを示している。対照的に、ｍｉＲ−１２２はａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２で処理したマウスの肝蔵では検出不能のままであった。これらのデータからは、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２で処理したマウスの肝臓におけるｍｉＲＮＡ−１２２のサイレンシングはｍｉＲＮＡの分解、および非複合抗−１２２ＲＮＡではなくａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２の能力に起因するものであり、ｍｉＲ−１２２の分解はａｎｔａｇｏｍｉｒが肝細胞に効果的に送達されることに起因するものであるかもしれないという結果に至ることが示唆される。
【０５８７】
完全にｍｉＲ−１２２をサイレンシングし得るａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２の用量を決定するために、８０、１６０または２４０ｍｇ／ｋｇ体重でａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２をマウスに投与し、ｍｉＲ−１２２発現レベルを測定した。最高用量（２４０ｍｇ／ｋｇ体重）のときにｍｉＲ−１２２シグナルが完全に消え、他の験すべてにこの用量を続いて用いた（図２４Ａ）。
【０５８８】
ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２によるサイレンシングの持続時間も測定した。投与後２３日間もの間、ｍｉＲ−１２２のレベルは検出不能であり（図２４Ｂ）、これはａｎｔａｇｏｍｉｒを用いたｍｉＲＮＡのサイレンシングが長く続いたことを示している。投与されたａｎｔａｇｏｍｉｒは長期に及ぶ治療過程の間でも良好な耐性があった。つまり、肝毒性の体重マーカーまたは血清マーカー（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の変化は検出されなかった。インビボにおけるａｎｔａｇｏｍｉｒのバイオアベイラビリティおよび異なる組織においてｍｉＲＮＡ発現をサイレンシングするその能力を試験するために、あらゆる組織に豊富に発現するｍｉＲ−１６（ｍｉＲ−１６は、ＴＧＦβシグナリングに関与するアクチビンＩＩ型受容体遺伝子およびＨｏｘ−Ａ５Ｉの一方または両方をターゲティングする。（ジョンら（Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ）、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１８６２〜１８７８頁、２００４年；ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１３２８、２００５年））に向けられたａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６をマウスに投与した。最終投与１日後に組織を収集し、ｍｉＲＮＡ発現レベルをＰＢＳ投与マウスと比較した。ノーザンブロット分析によって、ｍｉＲの発現は脳を除く試験した全組織において効果的にサイレンシングされたことが明らかとなった（図２５Ａ）。ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６は骨髄で検出されるようなｍｉＲ−１６の８９ｎｔ前駆体の発現に影響を及ぼさなかった。上記組織試料を用いて、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６のバイオアベイラビリティもノーザンブロット分析によって検定した。ｍｉＲ−１６レベルをサイレンシングする能力に従って、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６の有意なレベルが脳を除く全組織で検出された（図２５Ｂ）。これとともに、これらのデータはａｎｔａｇｏｍｉｒが幅広い体内分布を達成し、インビボの大半の組織においてｍｉＲＮＡを効果的にサイレンシングし得ることを実証している。
【０５８９】
多数のｍｉＲＮＡ遺伝子は、近接して位置し、協調的に転写されることが認められている。これらの多シストロン性ｍｉＲＮＡ遺伝子は転写されて長い一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を生成し、この転写産物は細胞核および細胞質における多数の酵素によって処理されて成熟ｍｉＲＮＡを生成する。多シストロンｍｉＲＮＡをターゲティングするａｎｔａｇｏｍｉｒが隣接するｍｉＲＮＡの発現に影響を及ぼさずに標的特異性を保持するかどうかを調べるために、シストロン性クラスターｍｉＲ−１９２／１９４のｍｉＲ−１９２またはｍｉＲ−１９４いずれかをターゲティングするａｎｔａｇｏｍｉｒをマウスに投与した。ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１９２をマウスに投与したところ、肝および腎臓においてｍｉＲ−１９２がサイレンシングされ、ｍｉＲ−１９４の発現レベルに影響を及ぼさなかった。逆に、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１９４をマウスに投与したところ、ｍｉＲ−１９４発現は消滅したが、ＰＢＳ投与マウスに比して、ｍｉＲ−１９２レベルに実証できる効果を及ぼさなかった。これらのデータはａｎｔａｇｏｍｉｒには同じ一次転写産物由来の特定のｍｉＲＮＡを区別してサイレンシングする能力があることを実証している。
【０５９０】
マイクロＲＮＡはｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおいて不完全に相補的な標的部位に結合し、翻訳および恐らくはｍＲＮＡ安定性に干渉すると考えられる。したがって、ｍｉＲＮＡがサイレンシングされると、相応して、標的タンパク質レベルが増加し、恐らくはｍＲＮＡレベルが低減するものと予想される。この予想を試験するために、肝細胞では抑制されてｍｉＲ−１２２の標的となると予想される遺伝子であるアルドラーゼＡの発現を試験した。アルドラーゼ−Ａ  ｍＲＮＡは、オープン・リーディング・フレームの下流のヌクレオチド２９と３６との間に、ｍｉＲ−１２２に対して完全な配列相補性を有する細胞核を保持した。ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２を投与したマウスの肝蔵では、アルドラーゼ−Ａの発現はスクランブルな対照（ｍｍ−ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２）に比して４〜５倍上昇した。この調節は、複数の実験において、投与後の異なる時間ポイントで観察された。ルシフェラーゼ・オープン・リーディング・フレームの下流で３’ＵＴＲアルドラーゼ−Ａをクローニングし、このベクターを、対照ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２４（５’−ＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣＡ−３；クレックら（Ｋｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７：４９５〜５００頁、２００５年およびリムら（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：７６９〜７７３頁、２００５年を参照）およびｍｉＲ−１９２）およびｍｉＲ−１２２と、ｍｉＲ−１２２発現のないＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトすることによっても、この標的を独立して確認した。ｍｉＲ−１２２を共トランスフェクトしたところ、ルシフェラーゼ活性はｍｉＲ−１２４およびｍｉＲ−１９２トランスフェクト細胞に比して有意に低減した。これとともに、これらのデータはアルドラーゼ−ＡがｍｉＲ−１２２の生理学的標的であることを示している。
【０５９１】
ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２で処理したマウスにおけるアルドラーゼ−Ａのアップレギュレーションは、このｍｉＲＮＡが機能的にサイレンシングすることを実証する。アルドラーゼ−Ａはあらゆる細胞で発現するハウスキーピング遺伝子である。この遺伝子は筋肉で大量に産生され、そこでは総細胞タンパク質の５％以上になり得る。成人肝蔵では、アルドラーゼ−Ａの発現は抑制され、アルドラーゼ−Ｂが産生される。逆に、脱分化した肝細胞および形質転換肝細胞がアルドラーゼ−Ａの発現レベルを増大させ、アルドラーゼ−Ｂに取って代わり得る。ｍｉＲ−１２２の発現はアルドラーゼ−Ａの発現と逆相関を示し、分化した成人肝細胞のレベルは最高で、ＨｅｐＧ２などの未分化細胞は完全に欠損している。対照的に、ｍｉＲ−１２２標的部位のないアルドラーゼ−ＢのｍＲＮＡレベルは、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２によって影響を受けなかった。これらの知見から、哺乳動物ではマイクロＲＮＡは組織特異的な遺伝子発現を定めるという非遺伝的な薬理学的証明が得られる。
【０５９２】
データからインビボではａｎｔａｇｏｍｉｒ、特異的ｍｉＲＮＡに対し相補的な１本鎖コレステロール−複合ＲＮＡはｍｉＲＮＡの効果的な阻害剤であることがわかる。この結果は、この過程が、多シストロン性の共通の前駆物質のｍｉＲＮＡ前駆物質または非標的ｍｉＲＮＡに影響を及ぼさないので、非常に特異的であり、細胞基質で生じ易いことも示唆している。
【０５９３】
方法
ａｎｔａｇｏｍｉｒの合成  ＲＮＡは市販の６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン（ＡＢｚ）、４−Ｎ−ベンゾイルシチジン（ＣＢｚ）、２−Ｎ−イソブチルグアノシン（ＧｉＢｕ）およびウリジン（Ｕ）の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ＲＮＡホスホロアミダイトモノマーを用い、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコル（ダムハとオギルビー（Ｄａｍｈａ  ａｎｄ  Ｏｇｉｌｖｉｅ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：８１〜１１４頁、１９９３年）に従って合成した。ａｎｔａｇｏｍｉｒ、すなわちコレステロール複合ＲＮＡに関し、合成はコレステロール−ヒドロキシ・プロリノールリンカー担持細孔性ガラス固体支持体（マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，）、米国特許出願公開第２００５０１０７３２５号）から開始した。オリゴヌクレオチド合成中にフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）で亜リン酸エステルを酸化させることによってホスホロチオエート骨格を所与の位置に有するａｎｔａｇｏｍｉｒを得た（シェルバラスら（Ｃｈｅｒｕｖａｌｌａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１８：４８５〜４９２頁、１９９９年）。切断および脱保護後、ａｎｔａｇｏｍｉｒを逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、非複合ＲＮＡオリゴヌクレオチドをアニオン交換高速液体クロマトグラフィーによって精製した。ＥＳ質量分析およびキャピラリーゲル電気泳動によって、精製オリゴヌクレオチドを特徴付けた。
【０５９４】
動物．動物モデルはすべてＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ大学の無菌動物施設において、１２時間の明／暗サイクルでＣ５７Ｂｌ／６Ｊバックグラウンドで維持した。１〜３日連続で６週齢マウスに生食水または異なるＲＮＡを尾静脈投与した。ＲＮＡは８０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で注入１回当たり０．２ｍｌ投与した。特に示さない限り、組織中のｍｉＲＮＡレベルは最後の注入の２４時間後に測定した。組織を収集し、急速冷凍し、−８０℃で保存した。
【０５９５】
ノーザンブロット分析．Ｔｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、［米国カリフォルニア州カールズバッド所在］およびエタノール沈殿を用いて総ＲＮＡを単離した。８Ｍ尿素および２０％ホルムアミドを含んだ１４％ポリアクリルアミドゲル上で、４５ｍＡでＲＮＡを分離した。「マイクロＲＮＡレジストリ」（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、ＮＡＲ３２：Ｄ１０９―Ｄ１１１、２００４年）に従ってアンチセンス・プローブを設計した。
【０５９６】
ＲＴ−ＰＣＲ．総ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲをシンら（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：３８１８〜３８２３頁、２００２年に記載のように実施した。
【０５９７】
ルシフェラーゼ活活性の検定。次のプライマー：５’ｄ−ＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡＣＴＡＡＧＧＣＴＧＣＴＣＣＡ）−３’および５’ｄ−（ＣＣＣＣＴＴＡＡＡＴＡＧＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＣＡ）−３’を用いて、マウス完全長アルドラーゼ−Ａ３’ＵＴＲをＰＣＲ増幅し、ｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）において停止コドンの下流でクローンした。ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェル・プレートで培養し、各々ｐＲＬ−ＴＫ（Ｒｒ−ｌｕｃ）５０ｎｇ、ｐＧＬ３対照ベクター（Ｐｐ−ｌｕｃ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）５０ｎｇおよび２本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）２００ｎｇでトランスフェクトした。細胞を収集し、トランスフェクション後２４〜３０時間で検定した。
【０５９８】
統計学的分析。結果を平均±標準偏差で示す。統計学的分析はスチューデントのｔ検定によって行い、帰無仮説は０．０５レベルで棄却した。
他の実施形態
本発明の多数の実施形態を記載した。しかし、種々の修飾は本発明の精神および範囲から逸脱せずになされ得ることを理解されたい。したがって、他の実施形態は添付の特許請求の範囲にある。
【図面の簡単な説明】
【０５９９】
【図１】ＳＲＭＳモノマーをオリゴヌクレオチド内に組み込む合成スキームの概略図。
【図２】ＯＦＧ１においてケイ素上に存在し得る置換基の一覧。
【図３】Ｃ２’−オルトエステル基上に存在し得る置換基の一覧。
【図４】代表的な環式糖置換モノマーサブユニットＳＲＭＳ）担体の一覧。パネル１は、ピロリンに基づくＳＲＭＳを示しており、パネル２は、３−ヒドロキシプロリンに基づくＳＲＭＳを示している。Ｒ１は、コハク酸塩またはホスホルアミデートであり、Ｒ２は、Ｈまたは複合体リガンドである。
【図５】代表的な環式糖置換モノマーサブユニットＳＲＭＳ）担体の一覧。ピペリジンに基づくＳＲＭＳを示している。Ｒ１は、コハク酸塩またはホスホルアミデートであり、Ｒ２は、Ｈまたは複合体リガンドである。
【図６】代表的な環式糖置換モノマーサブユニットＳＲＭＳ）担体の一覧。モルホリンおよびピペラジンに基づくＳＲＭＳを示している。Ｒ１は、コハク酸塩またはホスホルアミデートであり、Ｒ２は、Ｈまたは複合体リガンドである。
【図７】代表的な環式糖置換モノマーサブユニットＳＲＭＳ）担体の一覧。デカリンに基づくＳＲＭＳを示している。Ｒ１は、コハク酸塩またはホスホルアミデートであり、Ｒ２は、Ｈまたは複合体リガンドである。
【図８】ペプチドをオリゴヌクレオチド剤中に３’複合する反応スキームの概要を示す図。
【図９】ペプチドをオリゴヌクレオチド剤中に５’複合する反応スキームの概要を示す図。
【図１０】アザペプチドを合成する反応スキームの概要を示す図。
【図１１】Ｎメチルアミノ酸およびペプチドを合成する反応スキームの概要を示す図。
【図１２】β−メチルアミノ酸ならびにＡｎｔおよびＴａｔペプチドを合成する反応スキームの概要を示す図。
【図１３】ＡｎｔおよびＴａｔオリゴカルバメートを合成する反応スキームの概要を示す図。
【図１４】ＡｎｔおよびＴａｔオリゴウレアを合成する反応スキームの概要を示す図。
【図１５】ペプチド担体の概略図。
【図１６】代表的なコレステロール繋留ＳＲＭＳモノマーの一覧。
【図１７】ＰＡＧＥ精製後の３’コレステロール複合体に対するＬＣＭＳデータを示す図。
【図１８】ＡＬ−ＤＵＰ−１０００に対するヒト血清安定性アッセイの変性ゲル分析の図。Ｃは、ＰＢＳ緩衝液だけでインキュベートしたｓｉＲＮＡ２本鎖に対する４時間点であり、ＯＨ−は、部分的アルカリ加水分解マーカーであり、＊ｓ／ａｓは、５’末端標識されたセンスＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ２本鎖を表し、ｓ／＊ａｓは、５’末端標識されたアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖を表す。試料は、９０％ヒト血清中でインキュベートされ、時間点は、１０秒、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、および４時間でアッセイされた。バンドの右の黒い線は、エキソヌクレアーゼ分解断片を示し、赤色の線は、エンドヌクレアーゼ分解断片のうちの少数を強調している。
【図１９】Ａは、ＡＬ−ＤＵＰ−１３９３に対するヒト血清安定性アッセイの変性ゲル分析の図。Ｃは、ＰＢＳ緩衝液だけでインキュベートしたそれぞれのｓｉＲＮＡ２本鎖に対する４時間点であり、＊ｓ／ａｓは、５’末端標識されたセンスＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ２本鎖を表し、ｓ／＊ａｓは、５’末端標識されたアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖を表す。試料は、１０秒、１５分、３０分、１時間、２時間、および４時間でアッセイされた。Ｂは、ＡＬ−ＤＵＰ−１３２９に対するヒト血清安定性アッセイの変性ゲル分析の図。レーンは標識されており、実験は、図１９Ａについて説明されている通りに実施された。
【図２０】ＡＬ−ＤＵＰ−１０３６、ＡＬ−ＤＵＰ−１３ｆｆ、およびＡＬ−ＤＵＰ−１３６３の変性ゲル分析の図（配列については表１２を参照）。黒色の縦線は、エキソヌクレアーゼ切断が抑制されている領域を強調しており、星は、アンチセンス鎖における強いエンドヌクレアーゼ切断およびセンス鎖における弱いエンドヌクレアーゼ切断の部位を示す。Ｃは、ＰＢＳ緩衝液だけでインキュベートしたそれぞれのｓｉＲＮＡ２本鎖に対する４時間点であり、＊ｓ／ａｓは、５’末端標識されたセンスＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ２本鎖を表し、ｓ／＊ａｓは、５’末端標識されたアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖を表す。試料は、１０秒、１５分、３０分、１時間、２時間、および４時間でアッセイされた。
【図２１】カチオン修飾を含むｓｉＲＮＡ２本鎖のヒト血清安定性プロファイル。ＡＬ−ＤＵＰ−１０ａａ（アルキルアミノ−ｄＴ）、ＡＬ−ＤＵＰ−１ｃｃｃ（脱塩基ピロリジン陽イオン）、およびＡＬ−ＤＵＰ−１４０３（配列については表１３を参照）の変性ゲル分析。黒色の線は、エキソヌクレアーゼ切断が抑制される領域を強調しており、赤色の星は、アンチセンス鎖内の強いエンドヌクレアーゼ切断の部位を示す。Ｃは、ＰＢＳ緩衝液だけでインキュベートしたそれぞれのｓｉＲＮＡ２本鎖に対する４時間点であり、＊ｓ／ａｓは、５’末端標識されたセンスＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ２本鎖を表し、ｓ／＊ａｓは、５’末端標識されたアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖を表す。試料は、１０秒、１５分、３０分、１時間、２時間、および４時間でアッセイされた。
【図２２】ＡＬ−ＤＵＰ−１０６９に対するヒト血清安定性アッセイの変性ゲル分析の図。黒色の縦線は、エキソヌクレアーゼ切断が抑制される領域を強調している。Ｃは、ＰＢＳ緩衝液だけでインキュベートしたそれぞれのｓｉＲＮＡ２本鎖に対する４時間点であり、＊ｓ／ａｓは、５’末端標識されたセンスＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ２本鎖を表し、ｓ／＊ａｓは、５’末端標識されたアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖を表す。試料は、１０秒、１５分、３０分、１時間、２時間、および４時間でアッセイされた。
【図２３】Ａは、ｍｉＲ−１２２を標的とする修飾の異なるＲＮＡ（２４０ｍｇ／ｋｇ）を注入してから２４時間後にマウス肝臓から分離した全ＲＮＡ（１５μｇ）のノーザンブロットのパネル。試料は、ホルムアミドがない１４％ポリアクリルアミドゲル中で分離され、ｍｉＲ−１２２について膜の調査が行われた。ｔＲＮＡの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。Ｂは、ｍｉＲ−１２２に対して修飾の異なるＲＮＡ（２４０ｍｇ／ｋｇ）を注入してから２４時間後にマウス肝臓から分離した全ＲＮＡ（１５μｇ）のノーザンブロットのパネル。試料は、ホルムアミドがない１４％ポリアクリルアミドゲル中で分離され、ｍｉＲ−１２２、ｌｅｔ７、およびｍｉＲ−２２  ＲＮＡについて膜の調査が行われた。ｔＲＮＡの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。Ｃは、ｍｉＲ−１２２に対して修飾の異なるＲＮＡ（２４０ｍｇ／ｋｇ）を注入してから２４時間後にマウス肝臓から分離した全ＲＮＡ（１５μｇ）のノーザンブロットのパネル。試料は、２０％ホルムアミドの存在下１４％ポリアクリルアミドゲル中で分離され、ｍｉＲ−１２２について膜の調査が行われた。ｔＲＮＡの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。
【図２４】Ａは、マウス肝臓から分離した全ＲＮＡ（１５μｇ）のノーザンブロットのパネル。ＲＮＡは、示されているように１、２、または３日連続で８０  ｍｇ／ｋｇ体重のａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２（ｎ＝２）を注入してから２４時間後に分離された。内因性ｍｉＲ−１２２と注入ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２の両方について膜を調査した。ｔＲＮＡの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。Ｂは、マウス肝臓から分離した全ＲＮＡ（１５μｇ）のノーザンブロットのパネル。ＲＮＡは、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２を注入してから３、６、９、１３、および２３日後に分離された。内因性ｍｉＲ−１２２と注入ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２の両方について膜を調査した。ｔＲＮＡの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。
【図２５】Ａは、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６（ｎ＝３）を注入してから２４時間後に別のマウス組織から分離した全ＲＮＡ（１０〜３０μｇ）のノーザンブロットのパネル。ｍｉＲ−１６について膜を調査した。前駆体ｍｉＲ−１６転写は、骨髄のノーザンブロット上で見え、発現は、すべてのマウスにおいて類似していた。ｔＲＮＡの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。Ｂは、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６（ｎ＝３）を注入してから２４時間後に別のマウス組織から分離した全ＲＮＡ（１０〜３０μｇ）のノーザンブロットのパネル。３匹のマウスの全ＲＮＡは、ｍｉＲ−１６およびその注入されたａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６の検出のためプールされた。ｔＲＮＡの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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