(57)【要約】  本発明は、忠実度が高いｃＤＮＡ合成のための組成物および方法を提供する。具体的には、本発明の組成物は、逆転写酵素活性を示す第１の酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写酵素活性を示す第１の酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素を含む組成物であって、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す前記第２の酵素が、真正細菌由来のイプシロンサブユニットを含む組成物。
【請求項２】
前記第２の酵素が熱安定性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第２の酵素が熱不安定性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記イプシロンサブユニットが大腸菌由来である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
逆転写酵素活性を示す前記第１の酵素がＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、逆転写酵素活性が大きい突然変異型ＤＮＡポリメラーゼである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
逆転写酵素活性を示す前記第１の酵素が、逆転写酵素（ＲＴ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記逆転写酵素（ＲＴ）が、モロニーネズミ白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus，Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus，ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（Avian Sarcoma-Leukosis Virus，ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus，ＲＳＶ）ＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（Avian Myeloblastosis Virus，ＡＭＶ）ＲＴ、トリ赤芽球症ウイルス（Avian Erythroblastosis Virus，ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ骨髄球腫症ウイルス（Avian Myelocytomatosis Virus）ＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ細網内皮症ウイルス（Avian Reticuloendotheliosis Virus，ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルス（Avian Sarcoma Virus）ＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（Rous Associated Virus，ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（Myeloblastosis Associated Virus，ＭＡＶ）ＲＴからなる群から選択されるウイルス逆転写酵素である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記逆転写酵素が、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素またはＡＭＶ逆転写酵素である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記逆転写酵素が、ＲＮアーゼＨ活性が低い逆転写酵素である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
ＲＮアーゼＨ活性が低い前記逆転写酵素が、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ逆転写酵素またはＲＮアーゼＨ活性が低いＡＭＶ逆転写酵素である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１の酵素が、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を含み、前記第２の酵素が、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
反応液２０μｌ当たり０．１〜５００単位の作用量で、ＲＮアーゼＨ活性が低い前記Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を添加する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
反応液２０μｌ当たり１０〜５０単位の作用量で、ＲＮアーゼＨ活性が低い前記Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を添加する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
反応液２０μｌ当たり２０〜４０単位の作用量で、ＲＮアーゼＨ活性が低い前記Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を添加する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
反応液２０μｌ当たり０．００１〜５０単位の作用量で、前記大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを添加する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
反応液２０μｌ当たり０．０１〜２５単位の作用量で、前記大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを添加する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
反応液２０μｌ当たり０．０１〜１０単位の作用量で、前記大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを添加する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ＲＮアーゼＨ活性が低い逆転写酵素活性を示す第１の酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素、ならびにそのための充填材料を含むｃＤＮＡ合成用キットであって、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す前記第２の酵素が、真正細菌由来のイプシロンサブユニットを含むキット。
【請求項２０】
前記イプシロンサブユニットが大腸菌由来である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記第１の酵素が、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を含み、前記第２の酵素が、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
反応液２０μｌ当たり２０〜４０単位の作用量で、ＲＮアーゼＨ活性が低い前記Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を添加する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
反応液２０μｌ当たり０．０１〜１０単位の作用量で、前記大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを添加する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、１つまたは複数のヌクレオチド、適切な緩衝液、１つまたは複数のＰＣＲ用アクセサリー要素、および１つまたは複数の終結作用物質からなる群から選択される、１つまたは複数の構成成分をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２５】
ｃＤＮＡ合成の方法であって、
（ａ）１つまたは複数の核酸鋳型を、ＲＮアーゼＨ活性が低い逆転写酵素活性を示す第１の酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素を含む酵素組成物と接触させ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す前記第２の酵素が真正細菌由来のイプシロンサブユニットを含むステップと、
（ｂ）ｃＤＮＡ合成を可能にするのに十分な条件下で前記鋳型および前記酵素組成物をインキュベートするステップと
を含む方法。
【請求項２６】
（ｃ）前記ｃＤＮＡと相補的な１つまたは複数の核酸分子を作製するのに十分な条件下で前記合成ｃＤＮＡをインキュベートするステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１つまたは複数の核酸分子を増幅する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の核酸鋳型を、ＲＮアーゼＨ活性が低い逆転写酵素活性を示す第１の酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素を含む酵素組成物と接触させ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す前記第２の酵素が真正細菌由来のイプシロンサブユニットを含むステップと、
（ｂ）１つまたは複数の核酸分子の増幅を可能にするのに十分な条件下で前記鋳型および前記酵素組成物をインキュベートするステップと
を含む方法。
【請求項２８】
前記核酸鋳型が、メッセンジャーＲＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子の集団である、請求項２５または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記イプシロンサブユニットが大腸菌由来である、請求項２５または２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願群）
本出願は、2004年４月６日に出願された米国仮出願第６０／５５９，８１０号の利益を主張するものである。上記出願群の教示全体を、参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現の研究に対する一般的な手法の１つは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の生成である。レトロウイルスからＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、いわゆる逆転写酵素（ＲＴ）が発見されたことにより、ＲＮＡを鋳型として使用してｃＤＮＡを合成する逆転写反応が可能となった。その結果、ｍＲＮＡ分子を分析する方法が急速に進歩した。逆転写酵素を使用してｍＲＮＡ分子を分析する方法は、現在、遺伝子の発現および機能の研究に不可欠な実験方法となっている。続いて、クローン化およびＰＣＲの技術に適用されているこの方法はまた、生物学、医学および農学を含めた多様な分野で不可欠な技術にもなっている。
【０００３】
レトロウイルスＲＴの３種の原型が詳細に研究されている。モロニーネズミ白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus，Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮアーゼＨの活性を有する７８ｋＤａの単一サブユニットを含む。この酵素は大腸菌（E. coli）中でクローン化され、完全な活性型で発現している（Prasad,V.R., Reverse Transcriptase，Cold Spring Harbor，ニューヨーク：Cold Spring Harbor Laboratory Press，p.135 (1993)中で総説されている）。ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus，ＨＩＶ）ＲＴは、ｐ６６およびｐ５１のサブユニットからなるヘテロダイマーであり、小さい方のサブユニットは、タンパク質分解性切断により大きい方から生じる。ｐ６６サブユニットは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとＲＮアーゼＨの両方のドメインを有するが、ｐ５１サブユニットは、ＤＮＡポリメラーゼドメインしか有さない。活性ＨＩＶ ｐ６６／ｐ５１ ＲＴは、大腸菌を含めたいくつかの発現宿主中でのクローン化および発現に成功している（Le Grice,S.F.J., Reverse Transcriptase, Cold Spring Harbor，ニューヨーク: Cold Spring Harbor Laboratory Press，p.163 (1993)中で総説されている）。ＨＩＶｐ６６／ｐ５１ヘテロダイマー内で、５１ｋＤサブユニットは触媒として不活性であり、６６ｋＤサブユニットはＤＮＡポリメラーゼとＲＮアーゼＨの両方の活性を有する（Le Grice,S.F.J.ら、EMBO Journal 10:3905 (1991)；Hostomsky,Z.ら、J.Virol.66:3179 (1992)）。トリ肉腫白血病ウイルス（Avian Sarcoma-Leukosis Virus，ＡＳＬＶ）ＲＴには、それだけに限らないが、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus，ＲＳＶ）ＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（Avian Myeloblastosis Virus，ＡＭＶ）ＲＴ、トリ赤芽球症ウイルス（Avian Erythroblastosis Virus，ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ骨髄球腫症ウイルス（Avian Myelocytomatosis Virus）ＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ細網内皮症ウイルス（Avian Reticuloendotheliosis Virus，ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルス（Avian Sarcoma Virus）ＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（Rous Associated Virus，ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（Myeloblastosis Associated Virus，ＭＡＶ）ＲＴが含まれ、それも２種のサブユニットα（約６２ｋＤａ）およびβ（約９４ｋＤａ）からなるヘテロダイマーであり、αは、タンパク質分解性切断により、βに由来するものである（Prasad,V.R., Reverse Transcriptase, Cold Spring Harbor，ニューヨーク：Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993)、p.135中で総説されている）。ＡＳＬＶ ＲＴは、さらなる２種の触媒活性構造型であるββおよびαとして存在することができる（Hizi,A.およびJoklik,W.K., J.Biol.Chem.252: 2281 (1977)）。沈降分析から、αβおよびββがダイマーであり、α型がモノマー型とダイマー型との平衡状態で存在することが示唆される（Grandgenett,D.P.ら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 70:230 (1973)；Hizi,A.およびJoklik,W.K., J.Biol.Chem.252:2281 (1977)；ならびにSoltis,D.A.およびSkalka,A.M., Proc.Nat Acad.Sci.USA 85:3372 (1988)）。ＡＳＬＶのαβおよびββのＲＴは、同じタンパク質複合体中に３種の異なる活性：ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼＨ、およびＤＮＡエンドヌクレアーゼ（インテグラーゼ）活性を含むレトロウイルスＲＴのわずかに知られ��いる例である（Skalka,A.M., Reverse Transcriptase, Cold Spring Harbor，ニューヨーク：Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993)、p.193中で総説されている）。α型は、インテグラーゼのドメインおよび活性を欠く。
【０００４】
上記で述べたように、ＲＴが媒介する逆転写によるｍＲＮＡからｃＤＮＡへの転換は、多くの遺伝子発現の研究で不可欠なステップである。しかし、非改変型のＲＴを使用して逆転写を触媒することは、少なくとも２つの理由で効率が悪い。第１に、逆転写が開始しまたは終了する前に、ＲＴ中に存在する内在ＲＮアーゼＨ活性に主に起因して、ＲＴにより、時にＲＮＡ鋳型を複製することができなくなることがある。第２に、ＲＴは一般に忠実度が低い。すなわち、ＲＴは、ｃＤＮＡ合成の間にミスマッチ塩基を組み込み、それによって配列の誤りを有するｃＤＮＡ産物が生じる。ＲＴは実際に、ｃＤＮＡ合成の間にＨＩＶ ＲＴでは３０００〜６０００ヌクレオチド当たり１塩基の誤りを組み込み、ＡＭＶ ＲＴでは１０，０００ヌクレオチド当たり１塩基の誤りを組み込むことが示されている（Berger,S.L.ら、Biochemistry 22:2365-2372 (1983)；Krug,M.S.およびBerger,S.L., Meth.Enzymol.152:316 (1987)；Bergerら、Meth.Enzymol.275:523 (1996)）。
【０００５】
この分野の科学者は、ＤＮＡまたはＲＮＡの鋳型上での重合の忠実度を高めるための様々な酵素組成物および方法を試している。例えば、Shevelevら、Nature Rev.Mol.Cell Biol.3:364 (2002)は、３’−５’エキソヌクレアーゼについての総説を提供するものである。Perrinoら、PNAS, 86:3085 (1989)は、ウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼαの忠実度を高める、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのイプシロンサブユニットの使用について報告している。Bakhanashvili, Eur.J.Biochem.268:2047  (2001)は、ｐ５３タンパク質の校正活性について記載し、Huangら、Oncogene, 17:261 (1998)は、ＤＮＡ複製忠実度を亢進するｐ５３の能力について記載している。Bakhanashvili, Oncogene, 20:7635 (2001)は後に、ｐ５３がＨＩＶ Ｉ型逆転写酵素によるＤＮＡ合成の忠実度を亢進することを報告している。Hawkinsらは、長いｍＲＮＡ転写物からの完全長ｃＤＮＡの合成について記載している (2002, Biotechniques, 34:768)。
【０００６】
米国特許出願第２００３／０１９８９４４Ａ１号および米国特許第６，５１８，０１９号は、２種以上の逆転写酵素（例えば、異なる転写休止部位を有する各逆転写酵素）、および任意選択で１つまたは複数のＤＮＡポリメラーゼを含む酵素混合物を提供する。米国特許出願第２００２／０１１９４６５Ａ１号は、突然変異型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび突然変異型逆転写酵素（例えば、突然変異型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび突然変異型ＭＭＬＶ−ＲＴ）を含む組成物を開示する。米国特許第６，４８５，９１７Ｂ１号および米国特許出願第２００３／００７７７６２号および欧州特許出願ＥＰ１１３２４７０は、逆転写活性を有する酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するα型ＤＮＡポリメラーゼの存在下でｃＤＮＡを合成する方法を提供する。
【０００７】
ＲＴのＲＮアーゼＨ活性の除去により、逆転写の効率を向上させることができる（Gerard,G.F.ら、FOCUS 11 (4):60 (1989)；Gerard,G.F.ら、FOCUS 14 (3):91 (1992)）。しかし、そのようなＲＴ（「ＲＮアーゼＨ」型）では、逆転写の忠実度は向上しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当技術分野では、高効率および高忠実度でｃＤＮＡを合成する組成物および方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、逆転写酵素活性を示す第１の酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素を含む組成物を提供し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素は、真正細菌由来のイプシロンサブユニットを含む。
【００１０】
一実施形態では、第２の酵素は熱安定性である。
【００１１】
他の実施形態では、第２の酵素は熱不安定性である。
【００１２】
好ましくは、イプシロンサブユニットは大腸菌由来である。
【００１３】
一実施形態では、逆転写酵素活性を示す第１の酵素はＤＮＡポリメラーゼである。
【００１４】
好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは逆転写酵素活性が大きい突然変異型ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１５】
他の実施形態では、逆転写酵素活性を示す第１の酵素は逆転写酵素（ＲＴ）である。
【００１６】
好ましくは、逆転写酵素（ＲＴ）は、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群から選択されるウイルス逆転写酵素である。
【００１７】
より好ましくは、逆転写酵素はＭ−ＭＬＶ逆転写酵素またはＡＭＶ逆転写酵素である。
【００１８】
さらにより好ましくは、逆転写酵素はＲＮアーゼＨ活性が低い逆転写酵素である。
【００１９】
一実施形態では、ＲＮアーゼＨ活性が低い逆転写酵素は、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ逆転写酵素またはＲＮアーゼＨ活性が低いＡＭＶ逆転写酵素である。
【００２０】
一実施形態では、本組成物の第１の酵素は、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を含み、第２の酵素は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを含む。
【００２１】
好ましくは、反応液２０μｌ当たり０．１〜５００単位の作用量で、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を添加する。
【００２２】
より好ましくは、反応液２０μｌ当たり１０〜５０単位の作用量で、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を添加する。
【００２３】
より好ましくは、反応液２０μｌ当たり２０〜４０単位の作用量で、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を添加する。
【００２４】
好ましくは、反応液２０μｌ当たり０．００１〜５０単位の作用量で、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを添加する。
【００２５】
より好ましくは、反応液２０μｌ当たり０．０１〜２５単位の作用量で、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを添加する。
【００２６】
より好ましくは、反応液２０μｌ当たり０．０１〜１０単位の作用量で、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを添加する。
【００２７】
本発明は、ＲＮアーゼＨ活性が低い逆転写酵素活性を示す第１の酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素、ならびにそのための包装材料を含むｃＤＮＡ合成用キットを提供し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素は、真正細菌由来のイプシロンサブユニットを含む。
【００２８】
好ましくは、本キットのイプシロンサブユニットは大腸菌由来である。
【００２９】
好ましい実施形態では、本キットの第１の酵素は、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を含み、第２の酵素は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを含む。
【００３０】
好ましくは、反応液２０μｌ当たり２０〜４０単位の作用量で、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を添加する。
【００３１】
好ましくは、反応液２０μｌ当たり０．０１〜１０単位の作用量で、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを添加する。
【００３２】
本キットは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、１つまたは複数のヌクレオチド、適切な緩衝液、１つまたは複数のＰＣＲ用アクセサリー要素、および１つまたは複数の終結作用物質からなる群から選択される１つまたは複数の構成成分をさらに含んでもよい。
【００３３】
本発明は、ｃＤＮＡ合成の方法を提供し、その方法は、（ａ）１つまたは複数の核酸鋳型を、ＲＮアーゼＨ活性が低い逆転写酵素活性を示す第１の酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素を含む酵素組成物と接触させ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素が真正細菌由来のイプシロンサブユニットを含むステップと、（ｂ）ｃＤＮＡ合成を可能にするのに十分な条件下で鋳型および酵素組成物をインキュベートするステップとを含む。
【００３４】
本発明の方法は、（ｃ）ｃＤＮＡと相補的な１つまたは複数の核酸分子を作製するのに十分な条件下で合成ｃＤＮＡをインキュベートするステップをさらに含んでもよい。
【００３５】
本発明はまた、１つまたは複数の核酸分子を増幅する方法をも提供し、その方法は、（ａ）１つまたは複数の核酸鋳型を、ＲＮアーゼＨ活性が低い逆転写酵素活性を示す第１の酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素を含む酵素組成物と接触させ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素が真正細菌由来のイプシロンサブユニットを含むステップと、（ｂ）１つまたは複数の核酸分子の増幅を可能にするのに十分な条件下で鋳型および酵素組成物をインキュベートするステップとを含む。
【００３６】
好ましくは、核酸鋳型は、メッセンジャーＲＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子の集団である。
【００３７】
一実施形態では、本方法で使用する第２の酵素は、大腸菌由来のイプシロンサブユニットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
（発明の詳細な説明）
定義
本明細書において、「ポリヌクレオチドポリメラーゼ」とは、ヌクレオチドの重合を触媒して、例えば、リボヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸からポリヌクレオチド鎖を合成する酵素を指す。一般に、その酵素は、ポリヌクレオチド鋳型配列とアニールしたプライマーの３’末端から合成を開始し、鋳型鎖の５’末端へと進行する。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒してＤＮＡを合成するが、「ＲＮＡポリメラーゼ」は、リボヌクレオチドの重合を触媒してＲＮＡを合成する。
【００３９】
「ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、鋳型に依存的な形でデオキシヌクレオシド三リン酸を組み込むことによって新たなＤＮＡ鎖を合成する（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する）ＤＮＡポリメラーゼを指す。ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性の１単位は、最適な温度で、３０分間に重合形態中への１０ｎｍｏｌの総デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の組み込みを触媒する酵素の量と定義される。ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定は、例えば、以前に公開された方法（Hogrefe,H.H.ら(01)Methods in Enzymology, 343:91-116）に記載のように、またDNA Replication第２版、KornbergおよびBaker、上記；Enzymes, DixonおよびWebb, Academic Press、カリフォルニア州San Diego (1979)に記載のように、当技術分野で知られているアッセイに従って行うことができる。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ依存性（すなわちＤＮＡ鋳型を使用するもの）でもよく、あるいはＲＮＡ依存性（すなわちＲＮＡ鋳型を使用するもの）でもよい。その用語は、例えば、本明細書で下記に記載のように、当技術分野で知られている任意のＤＮＡポリメラーゼを包含するものとする。熱安定性のものも熱不安定性のものも、この定義に包含される。
【００４０】
本明細書において、「逆転写酵素（ＲＴ）」という用語は、その最も広い意味で使用されて、本明細書で開示され、または当技術分野で知られている方法によって測定される逆転写酵素活性を示す任意の酵素を指す。したがって、本発明の「逆転写酵素」は、レトロウイルス、他のウイルス、および細菌由来の逆転写酵素、ならびに、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼなどの逆転写酵素活性を示すＤＮＡポリメラーゼを含む。レトロウイルス由来のＲＴには、それだけに限らないが、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴ、ならびに（その全体を参照により本明細書に組み込む）米国特許出願第２００３／０１９８９４４号に記載のものが含まれる。総説については、例えば、Levin, 1997, Cell, 88:5-8；Brosiusら、1995, Virus Genes 11:163-79を参照されたい。ウイルスに由来する既知の逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡ転写物を合成するのにプライマーを必要とする。逆転写酵素は、ＲＮＡをｃＤＮＡへと転写するのに主に使用され、次いでそのｃＤＮＡをさらなる操作用のベクターにクローン化し、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）や自己保持配列複製（３ＳＲ）などの様々な増幅方法で使用することができる。
【００４１】
本明細書において、「逆転写活性」および「逆転写酵素活性」という用語は、同義的に使用されて、ＲＮＡ鎖を鋳型として利用してＤＮＡ鎖（すなわちｃＤＮＡ）を合成する酵素（例えば逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ）の能力を指す。ＲＴ活性を測定する方法は、本明細書で下記に提供され、当技術分野で周知でもある。例えば、Ｑｕａｎ−Ｔ−ＲＴアッセイ系がAmersham（イリノイ州Arlington Heights）から市販され、Bosworthら、Nature 1989, 341:167-168に記載されている。本発明によれば、「第１の酵素」とは、当技術分野で知られている方法を使用して検出可能な逆転写酵素活性を含む精製または単離酵素である。したがって、本発明の「第１の酵素」は、レトロウイルス由来の逆転写酵素でもよく、あるいは逆転写酵素活性を示すＤＮＡポリメラーゼでもよい。
【００４２】
本明細書において、逆転写酵素活性が「大きい」という用語は、野生型と比較した突然変異型酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の逆転写酵素活性のレベルを指す。突然変異型酵素の逆転写酵素活性のレベルがその野生型の少なくとも２０％以上、例えば少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、あるいは少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍以上である場合に、突然変異型酵素の逆転写酵素活性が「大きい」という。
【００４３】
本明細書において、「エキソヌクレアーゼ」とは、ＤＮＡ分子の末端から１つずつヌクレオチド間の結合を、好ましくはホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。エキソヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の５’または３’末端に特異的なものでもよく、本明細書において５’から３’のエキソヌクレアーゼまたは３’から５’のエキソヌクレアーゼと呼ぶ。３’から５’のエキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドの３’末端から連続したヌクレオチドを切断することによりＤＮＡを分解するが、５’から３’のエキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドの５’末端から連続したヌクレオチドを切断することによりＤＮＡを分解する。ポリヌクレオチド鋳型の合成または増幅の間、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を有する（３’から５’のｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼは、誤対合した塩基を除去する能力（校正活性）を有し、したがって、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を有さない（３’から５’のｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼより誤りを起こしにくい（すなわち忠実度が高い）。本発明によれば、「第２の酵素」とは、当技術分野で知られている、例えば本明細書に記載の方法を使用して検出可能な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む精製または単離酵素である。本発明の「第２の酵素」は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含むホロ酵素でもよく、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するホロ酵素の１つまたは複数のサブユニットを含む酵素でもよい。ホロ酵素の非限定的な例は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩであり、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するサブユニットを含む酵素の非限定的な例は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのイプシロンサブユニットである。エキソヌクレアーゼ活性は、当業者に周知であり下記に記載の方法によって測定することができる。例えば、エキソヌクレアーゼ活性の１単位は、ｐＨ８および２５℃で１分当たりに１ｎｍｏｌのｐＮＰ−ＴＭＰを加水分解する、またはHamdan,S.ら（Biochemistry 2002, 41:5266-5275、その全体を本明細書に組み込む）に記載の酵素の量を指すことがある。
【００４４】
「大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素」という用語は、例えば、Kelman,Z.およびO’Donnell,M. (1995).Annu.Rev.Biochem.64, 171200（その全体を参照により本明細書に組み込む）に記載のように、２つの触媒中心に集合した１０個のサブユニット、２つの滑りクランプおよびクランプローダーからなる大腸菌ポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を指す。
【００４５】
本発明によれば、「イプシロン（ε）サブユニット」という用語は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するεサブユニットを指す。イプシロンサブユニットは、大腸菌由来のものなど、任意の真正細菌由来のものでもよく、あるいは他の生物由来のものでもよい。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のイプシロン（ε）サブユニットは、そのホロ酵素の３’−５’エキソヌクレアーゼであり、α（ポリメラーゼユニット）およびθ（機能不明）サブユニットと相互作用する（例えば、その全体を参照により本明細書に組み込む、Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａら、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93:2856-2861を参照）。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のイプシロン（ε）サブユニット（すなわち配列番号１）は、ｄｎａＱ遺伝子、例えば配列番号２によってコードされる。本発明のイプシロンサブユニットはまた、図５Ａ〜ＺＺおよび図６で示すように、配列番号１と少なくとも５０％の相同性があり（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％の相同性があり、またはそれと同一であり）、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む野生型ポリペプチドも含む。本発明によれば、イプシロン（ε）サブユニットは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を依然として含む突然変異型イプシロン（ε）サブユニットをさらに含む。そのような突然変異型イプシロンは、野生型イプシロンサブユニットに対する欠失（例えば、切断）、置換、点突然変異、複数アミノ酸の突然変異、または挿入を含んでもよい。例えば、本発明に従った有用な切断型イプシロンは、その全体を参照により本明細書に組み込む、Hamdan S.ら、Biochemistry 2002, 41:5266-5275に開示されている通りでもよい。
【００４６】
本明細書において、「真正細菌」という用語は、（例えば、Garrityら、2001, Taxonomic outline of the procaryotic genera.Bergey’s Manual（登録商標）of Systematic Bacteriology, 第２版、Ｒｅｌｅａｓｅ １．０、2001年４月、およびWerren，1997, Annual Review of Entomology 42:587-609に記載の）原核生物である単細胞生物を指す。真正細菌には、以下の属：エシェリキア（Escherichia）、シュードモナス（Pseudomonas）、プロテウス（Proteus）、ミクロコッカス（Micrococcus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、クレブジエラ（Klebsiella）、レジオネラ（Legionella）、ナイセリア（Neisseria）、ボルデテラ（Bordetella）、ビブリオ（Vibrio）、スタヒロコッカス（Staphylococcus）、ラクトバシラス（Lactobaccilus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、バシラス（Bacillus）、コリネバクテリア（Corynebacteria）、マイコバクテリア（Mycobacteria）、クロストリジウム（Clostridium）、および他の属（Kandler,O., Zbl.Bakt.Hyg., I.Abt.Orig.C3, 149-160 (1982)を参照）、ならびにアクイフェックス（Aquifex，極めて好熱性の化学合成無機栄養生物）、サーモトガ（Thermotoga，極めて好熱性の化学合成有機栄養生物）、クロロフレクサス（Chloroflexus，好熱性の光合成細菌）、デイノコッカス（Deinococcus，放射線抵抗性細菌）、サーマス（Thermus，好熱性の化学合成従属栄養生物）、スピロヘータ（Spirochaetes，周鞭毛を有するらせん状の細菌）、プロテオバクテリア（Proteobacteria，グラム陰性かつ紅色の光合成細菌）、シアノバクテリア（青緑色の光合成細菌）、グラム陽性菌（グラム陽性の細菌）、バクテロイデス／フラボバクテリウム（偏性嫌気性菌／滑走運動性のある偏性好気性菌）、クロロビウム（Chlorobium，光合成自己栄養性の硫黄酸化菌）、プランクトミセス（Planctomyces，ペプチドグリカンを有さない出芽性細菌）、クラミジア（細胞内寄生体）などの真正細菌の主要な亜群が含まれる。
【００４７】
本明細書において、本発明による「配合物」とは、上記に記載の第１の酵素および第２の酵素を少なくとも含む２種以上の精製酵素の混合物を指す。配合物は、液体の形態でもよく、あるいは乾燥した形態でもよい。配合物中の個々の各酵素（例えば、第１の酵素または第２の酵素）は、本明細書で下記に定義する「精製」または「単離」酵素としてもはや存在することができない。
【００４８】
本明細書において「本質的に大腸菌ポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットおよび逆転写酵素からなる」酵素組成物とは、その３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が、大腸菌ポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットによって実質的に（すなわち少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）もたらされる酵素組成物を指す。
【００４９】
本明細書において、「忠実度」という用語は、鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼ、例えばＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の正確性を指す。逆転写酵素を含めたＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、エラー率（誤ったヌクレオチド、すなわち鋳型依存的な形では組み込まれないヌクレオチドを組み込む頻度）によって測定される。ＤＮＡ重合の正確性または忠実度は、ポリメラーゼ活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方によって維持される。「高忠実度」という用語は、１塩基対当たり３３×１０−６以下のエラー率を指す（その全体を参照により本明細書に組み込むRoberts J.D.ら、Science, 1988, 242:1171-1173を参照）。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度またはエラー率は、当技術分野で知られ（例えば、Lundburgら、1991 Gene, 108:1-6を参照）、本明細書の実施例２に記載のアッセイを使用して測定することができる。
【００５０】
「忠実度が大きい（または亢進したまたは高い）」逆転写酵素は、その野生型または非改変型と比較して忠実度がいくらか大きい、すなわち所与の長さを有する任意の所与の核酸分子を合成する間に誤って組み込まれたヌクレオチドの数が少ない（逆転写酵素活性を示すＤＮＡポリメラーゼを含めた）突然変異型または改変型の逆転写酵素と定義される。好ましくは、所与の長さを有する任意の所与の核酸分子を合成する間に誤って組み込まれたヌクレオチドの数が１．５〜１，０００倍（より好ましくは２〜１００倍、より好ましくは３〜１０倍）少ない。例えば、１０００塩基の核酸分子セグメントの合成で１０ヌクレオチドを誤って組み込む突然変異していない逆転写酵素と比較して、突然変異した逆転写酵素は、同じサイズのセグメントで１０ヌクレオチドを誤って組み込む可能性がある。そのような突然変異型逆転写酵素は、忠実度が１０倍大きいといえる。
【００５１】
ＲＮアーゼＨ活性が「低い」酵素とは、その酵素が、ＲＮアーゼＨ活性を含む対応する野生型酵素の５０％未満、例えば４０％未満、３０％、または２５％未満、２０％、より好ましくは１５％未満、１０％未満、または７．５％未満、最も好ましくは５％未満または２％未満のＲＮアーゼＨ活性を有することを意味する。ＲＮアーゼ活性を含む酵素は、好ましくは野生型モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）や（その全体を参照により本明細書に組み込む米国特許出願第２００３／０１９８９４４号に記載のものなどの）当技術分野で知られている他の逆転写酵素などの逆転写酵素である。酵素のＲＮアーゼＨ活性は、例えば、米国特許第５，４０５，７７６号；第６，０６３，６０８号；第５，２４４，７９７号；および第５，６６８，００５号に、Kotewicz,M.L.ら、Nucl.Acids Res.16:265 (1988)およびGerard,G.F.ら、FOCUS 14 (5):91 (1992)に記載のものなど、様々なアッセイによって決定することができ、これらすべての開示を、参照により本明細書に完全に組み込む。
【００５２】
本明細書において、「増幅産物」とは、増幅反応の終了時の一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチド集団を指す。増幅産物は、元のポリヌクレオチド鋳型、および増幅反応の間にポリヌクレオチド鋳型を使用してＤＮＡポリメラーゼにより合成されたポリヌクレオチドを含む。増幅産物は、好ましくは逆転写酵素および／またはＤＮＡポリメラーゼによって生成される。
【００５３】
本明細書において、「ポリヌクレオチド鋳型」または「標的ポリヌクレオチド鋳型」とは、鋳型依存的な形でＤＮＡを合成するＤＮＡポリメラーゼの鋳型として働くポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指す。本明細書において、「増幅領域」とは、逆転写によって合成され、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されるポリヌクレオチドの領域である。例えば、ポリヌクレオチド鋳型の増幅領域は、２つのＰＣＲプライマーが相補的な２つの配列の間にある可能性がある。
【００５４】
本明細書において、「鋳型依存的な形」という用語は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）が関与する過程を指す。「鋳型依存的な形」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチド合成を指し、新たに合成されたポリヌクレオチド鎖の配列が、相補的塩基対形成の周知の規則によって決定される（例えば、Watson,J.D.ら、Molecular Biology of the Gene，第４版、W.A.Benjamin,Inc.,カリフォルニア州Menlo Park (1987)を参照）。
【００５５】
本明細書において、「熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、熱に安定な、すなわち二本鎖核酸の変性の実施に必要な時間高温にさらしたときに不可逆的に変性（不活性化）しないＤＮＡポリメラーゼを指す。核酸変性に必要な加熱条件は当技術分野で周知である。本明細書において、熱安定性ポリメラーゼは、参照により本明細書に組み込む米国特許第４，９６５，１８８号に記載の、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）増幅法などの温度サイクル反応での使用に適している。本発明によれば、「逆転写酵素活性が大きい熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ」は、少なくとも４０℃で、好ましくは４０℃〜８０℃で、より好ましくは５０℃〜７０℃の温度で実施される逆転写反応においてＲＮＡ鋳型からプライマー伸長反応を実施する能力を保持している。
【００５６】
本明細書において、「ヌクレオチド」とは、塩基−糖−リン酸の結合物を指す。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のモノマー単位であり、デオキシリボヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡに「組み込まれる」。ヌクレオチドという用語には、それだけに限らないが、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなどのデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはその誘導体が含まれる。そのような誘導体には、例えば、［ａＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ、アミノアリルｄＮＴＰ、Ｃｙ３、Ｃｙ５標識ｄＮＴＰを含めた蛍光標識ｄＮＴＰが含まれる。本明細書においてヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰおよび非環式ヌクレオチド）およびその誘導体（例えば、その全体を参照により本明細書に組み込むMartinezら、1999, Nucl.Acids Res.27:1271-1274に記載のもの）も指す。
【００５７】
本明細書において、「プライマー」とは、少なくとも３ヌクレオチドを含むデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を指す。一般に、プライマーは、約３〜約１００ヌクレオチド、好ましくは約５〜約５０ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５〜約２５ヌクレオチドを含む。５０ヌクレオチド未満のプライマーは、本明細書において「オリゴヌクレオチドプライマー」と呼ぶこともできる。本発明のプライマーは、例えばヌクレオチドの段階的な付加で、合成により作製してもよく、あるいは他のヌクレオチド酸分子の断片、一部、部分または伸長産物でもよい。「プライマー」という用語は、その最も一般的な意味で使用されて、増幅の目的で使用するとき、ＤＮＡポリメラーゼにより、ＲＮＡまたはＤＮＡの鋳型を使用してＤＮＡ合成を開始するための遊離３’ヒドロキシル基を提供することができる任意の長さのヌクレオチドを含む。ＤＮＡ合成の結果プライマーが伸長して、プライマーがハイブリダイズした核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物が生成する。
【００５８】
「相補的」とは、２つのポリヌクレオチド鎖の領域間での、または塩基対形成を介した２つのヌクレオチド間での配列相補性の幅広い概念を指す。アデニンヌクレオチドが、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特異的な水素結合を形成すること（塩基対形成）が可能であることが知られている。同様に、シトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドと塩基対形成が可能であることが知られている。
【００５９】
本発明において、「相同性」という用語は、配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の最適なアラインメントを指し、それは、アルゴリズムのコンピュータ実装形態によって行うことができる。ポリヌクレオチドに関して、「相同性」は、例えば、初期設定パラメーターを使用したBLASTN第２．０版での分析により決定することができる。ポリペプチド（すなわちアミノ酸）に関して、「相同性」は、比較するポリペプチドまたは断片を整列させ、その間のアミノ酸の同一性または類似性の程度を決定する初期設定パラメーターの付いたBLASTP第２．２．２版などのプログラムを使用して決定することができる。アミノ酸の「相同性」は、保存的置換、すなわち類似した特徴を有する他のアミノ酸でポリペプチド中の所与のアミノ酸を置換するものを含むことが理解されるであろう。下記の代替が、保存的置換として典型的に認められている：Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕやＩｌｅなどの脂肪族アミノ酸の、他の脂肪族アミノ酸での代替；ＳｅｒのＴｈｒとの代替またはその逆の代替；ＡｓｐやＧｌｕなどの酸性残基の、他の酸性残基での代替；ＡｓｎやＧｌｎなどのアミド基を有する残基の、アミド基を有する他の残基での代替；ＬｙｓやＡｒｇなどの塩基性残基の、他の塩基性残基との交換；およびＰｈｅやＴｙｒなどの芳香族残基の、他の芳香族残基での代替。他のアミノ酸配列（例えば配列番号１）または他のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１をコードする配列番号２のポリヌクレオチド）に対する少なくとも５０％の相同性を含むポリペプチド配列（すなわちアミノ酸配列）またはポリヌクレオチド配列はそれぞれ、５０％以上、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（すなわち同一）の相同性を有する。
【００６０】
「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離されたときにその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。その一方で、「改変型」または「突然変異型」という用語は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較したときに、変化したヌクレオチドまたはアミノ酸の（複数の）配列を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。例えば、本発明での突然変異型酵素は、その野生型と比較して大きな逆転写酵素活性を示す突然変異型ＤＮＡポリメラーゼである。
【００６１】
本明細書において、「突然変異」という用語は、野生型と比較した、遺伝子または遺伝子産物内での、あるいは遺伝子の外側で制御配列中でのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化を指す。その変化は、欠失、置換、点突然変異、複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の突然変異、転移、逆位、フレームシフト、ナンセンス突然変異、あるいは遺伝子または遺伝子産物の野生型配列のものからそのポリヌクレオチドまたはタンパク質の配列を区別する他の型の異常でもよい。
【００６２】
本明細書において、「ＲＴ−ＰＣＲ用アクセサリー要素」および「ＰＣＲ用アクセサリー要素」という用語は、同義的に使用され、酵素の逆転写酵素またはポリメラーゼ活性を亢進するポリペプチド因子を指す。付帯因子は、酵素のＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性の忠実度および／または伸長能を亢進することができる。ＰＣＲ用アクセサリー要素の非限定的な例には、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、トレハロース、ヌクレオキャプシドタンパク質、複製タンパク質Ａ、ｓｓｂ、ＰＣＮＡ／大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのβサブユニットおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのθサブユニット、ＰＥＧ、グリコーゲン、ならびにその全体を参照により本明細書に組み込むＷＯ０１／０９３４７、米国特許第６，３３３，１５８号、第６，１８３，９９７号、およびHogrefeら、1997, Strategies 10:93-96中で提供されるものが含まれる。
【００６３】
本明細書において、「ベクター」という用語は、宿主細胞中への外因性または内因性のポリヌクレオチドの導入に使用するポリヌクレオチドを指す。ベクターはヌクレオチド配列を含み、その配列は、１つまたは複数のポリペプチド分子をコードしてもよい。天然の状態での、または組換え工学技術を受けたプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージは、望ましい単離ポリヌクレオチド分子を少なくとも１つ含む組換えベクターの供給に通常使用されるベクターの非限定的な例である。
【００６４】
本明細書において、「形質転換」という用語または「トランスフェクション」という用語は、細胞中への外因性ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）の導入について当技術分野で認められる様々な技術を指す。外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されたとき、細胞は「形質転換されている」または「トランスフェクトされている」。「形質転換」および「トランスフェクション」という用語、ならびにそれぞれから派生する用語は同義的に使用される。
【００６５】
本明細書において、「発現ベクター」とは、細胞により転写し翻訳することができるポリペプチド（すなわちタンパク質）をコードするポリヌクレオチドを有する組換え発現カセットを指す。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、またはポリヌクレオチド断片でもよい。
【００６６】
本明細書において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用するとき、「単離」または「精製」とは、天然に存在するヌクレオチドまたはアミノ酸の配列がその正常な細胞環境から取り出され、または天然でない環境で合成された（例えば人工的に合成された）ことを意味する。したがって、「単離」または「精製」配列は、無細胞溶液中に存在してもよく、異なる細胞環境中に存在してもよい。「精製」という用語は、そのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドのみであることを意味せず、天然でそれに付随する非ポリヌクレオチドまたはポリペプチド物質を本質的に含まない（約９０〜９５％、最大で９９〜１００％純粋である）ことを意味する。単離した核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖の形で存在してもよく、あるいは二本鎖の形で存在してもよい。単離した核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがタンパク質の発現に利用されるとき、そのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは最低限センス鎖またはコード鎖を含む（すなわちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖でもよい）が、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含んでもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖でもよい）。
【００６７】
本明細書において、「コードする」という用語は、染色体中での遺伝子やｍＲＮＡなど、生物学的過程でヌクレオチドの確定配列（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、他のＲＮＡ分子）またはアミノ酸の確定配列、およびそれから得られる生物学的特性を有する他のポリマーおよび高分子を合成する鋳型として働く、ポリヌクレオチド中での特定のヌクレオチド配列に固有の特性を指す。したがって、遺伝子により生成されるｍＲＮＡの転写および翻訳から、細胞または他の生物系中でタンパク質が生成する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。遺伝子またはｃＤＮＡの、そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡの配列と同一であり通常は配列表で提供されるコード鎖も、転写用鋳型として使用する非コード鎖も、タンパク質あるいはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードするといえる。タンパク質をコードするポリヌクレオチドには、遺伝コードの縮重に起因して、異なるヌクレオチド配列を有するがタンパク質の同じアミノ酸配列をコードする任意のポリヌクレオチドが含まれる。
【００６８】
本明細書において、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、例えば、（それぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込む）米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，９６５，１８８号に記載のK.B.Mullisの方法、ならびに当技術分野で知られている他の任意の改良法を指す。ＰＣＲとは、クローン化および精製を行わずにゲノムＤＮＡの混合物中で標的配列のセグメントの濃度を増大させる方法である。標的配列を増幅するこの方法は通常、過剰量のオリゴヌクレオチドプライマー２種を、望ましい標的配列を含むＤＮＡ混合物に導入するステップ、その後ＤＮＡポリメラーゼの存在下で正確な順序の温度サイクルを行うステップからなる。その２種のプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅を実施するために、混合物を変性し、次いでプライマーを標的分子内のその相補的な配列にアニールさせる。アニールさせた後、プライマーをポリメラーゼで伸長し、その結果相補鎖の新たな対が形成される。変性、プライマーのアニールおよびポリメラーゼ伸長のステップは、多数回反復して（すなわち変性、アニールおよび伸長は１つの「サイクル」を構成する；多数の「サイクル」が存在し得る）、望ましい標的配列の高濃度の増幅セグメントを得ることができる。望ましい標的配列の増幅セグメントの長さは、互いに対してプライマーの相対的な位置によって決定され、したがって、この長さは調節可能なパラメーターである。その方法の反復する性質により、その方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下「ＰＣＲ」）と呼ばれる。標的配列の望ましい増幅セグメントは、混合物中で（濃度の点から）優勢な配列となるので、それは「ＰＣＲ増幅された」という。
【００６９】
本明細書において「ＲＴ−ＰＣＲ」という用語は、ＲＮＡ配列の複製および増幅を指す。この方法では、例えば、その全体を参照により本明細書に組み込む米国特許第５，３２２，７７０号に記載のように、逆転写をＰＣＲと連結する。ＲＴ−ＰＣＲでは、酵素の逆転写酵素活性によりＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに転換し、次いで同じまたは異なる酵素の重合活性を使用してそれを増幅する。熱安定性と熱不安定性のどちらの逆転写酵素およびポリメラーゼも使用することができる。
【００７０】
本明細書で認定される、天然のＬ型アミノ酸残基が好ましい。J.Biol.Chem.,243:3557-3559, 1969の標準的なポリペプチドの命名法に合わせて、アミノ酸残基の略語は、下記の表Ｉに示す通りである。
【表１】
2008500818.tif 000003
【００７１】
本発明に有用な酵素
本発明は、逆転写酵素活性を示す第１の酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素を含む組成物を提供する。
【００７２】
逆転写酵素活性を含む酵素−第１の酵素
本発明の組成物、方法およびキットで使用する酵素は、逆転写酵素活性を有する任意の酵素を含む。そのような酵素には、それだけに限らないが、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフォルニアモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼおよびクレノー断片、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Saiki,R.K.ら、Science 239:487-491 (1988)；米国特許第４，８８９，８１８号および第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９６／１０６４０）、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）、好熱性一酸化炭素酸化細菌カルボキシドサーマス ヒドロゲノフォルマンス（Carboxydothermus hydrogenoformans）由来のC. Therm ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰ０９２１１９６Ａ１、Roche, カリフォルニア州Pleasanton、カタログ番号２０１６３３８）、ThermoScript（Invitrogen、カリフォルニア州Carsbad、カタログ番号１１７３１−０１５）、ならびにその突然変異体、断片、変異体または誘導体が含まれる。当業者には理解されるであろうが、当技術分野で日常的であり周知である組換え技術または遺伝子工学技術によって改変型逆転写酵素を得ることができる。突然変異型逆転写酵素は、例えば、部位特異的またはランダム突然変異生成により対象とする逆転写酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子に突然変異を起こさせることによって得ることができる。そのような突然変異には、点突然変異、欠失突然変異および挿入突然変異が含まれることがある。好ましくは、１つまたは複数の点突然変異（例えば、１つまたは複数のアミノ酸の、１つまたは複数の異なるアミノ酸との置換）を使用して、本発明の突然変異型逆転写酵素を構築する。逆転写酵素の断片は、当技術分野で日常的であり周知である組換え技術による欠失突然変異によって、または任意のいくつかの周知なタンパク質分解酵素を使用した、対象とする（複数の）逆転写酵素の酵素消化によって得ることができる。逆転写酵素活性を含む突然変異型ＤＮＡポリメラーゼを、その全体を参照により組み込む米国特許出願第１０／４３５，７６６号に記載のように使用することもできる。
【００７３】
本方法で使用すると有利である可能性がある逆転写酵素活性を有するポリペプチドには、それだけに限らないが、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）逆転写酵素、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフォルニアモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、高度好熱菌サーマス サーモフィルス（Thermus thermophilus，Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス アクアティカス（Thermus aquaticus，Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ ネオポリタナ（Thermotoga neopolitana，Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ マリティマ（Thermotoga maritima，Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス リトラリス（Thermococcus litoralis，ＴｌｉまたはＶＥＮＴ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、超好熱古細菌パイロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus，Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）、パイロコッカス属種ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス ウォーシー（Pyrococcus woosii，Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、バシラス ステロサーモフィルス（Bacillus sterothermophilus，Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、バシラス カルドフィルス（Bacillus caldophilus，Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、スルホロブルス アシドカルダリウス（Sulfoloblus acidocaldarius，Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、高熱古細菌サーモプラズマ アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum，Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス フラバス（Thermus flavus，Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス ルバー（Thermus ruber，Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、高温アルカリ耐性細菌サーマス ブロッキアヌス（The
rmus brockianus，ＤＹＮＡＺＹＭＥ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ、好熱性メタン細菌メタノバクテリウム サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum，Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにその突然変異体、変異体および誘導体が含まれる。
【００７４】
好ましい実施形態では、Ｍ−ＭＬＶまたはＡＭＶ逆転写酵素を使用する。
【００７５】
ＲＮアーゼＨ活性が低いこれらの酵素の変異体（すなわちＲＮアーゼＨ−酵素）が本発明での使用に特に好ましい。好ましくは、その酵素は、野生型のＭ−ＭＬＶまたはＡＭＶ逆転写酵素などの野生型または「ＲＮアーゼＨ＋」酵素のＲＮアーゼＨ活性の２０％未満を有し、より好ましくは１５％、１０％または５％未満を有し、最も好ましくは２％未満を有する。任意の酵素のＲＮアーゼＨ活性は、例えば、米国特許第５，２４４，７９７号；第５，４０５，７７６号；第５，６６８，００５号；および第６，０６３，６０８号に、Kotewicz,M.L.ら、Nucl.Acids Res.16:265 (1988)およびGerard,G.F.ら、FOCUS 14 (5):91 (1992)に記載のものなど、様々なアッセイによって決定することができ、これらの文献すべての開示は、参照により本明細書に完全に組み込む。
【００７６】
本発明での使用に特に好ましいＲＮアーゼＨ−逆転写酵素には、それだけに限らないが、例えば、以前に記載されているＭ−ＭＬＶ Ｈ−逆転写酵素、ＲＳＶ Ｈ−逆転写酵素、ＡＭＶ Ｈ−逆転写酵素、ＲＡＶ Ｈ−逆転写酵素、ＭＡＶ Ｈ−逆転写酵素およびＨＩＶ Ｈ−逆転写酵素が含まれる（それぞれの全体を参照により組み込む米国特許第５，２４４，７９７号；第５，４０５，７７６号；第５，６６８，００５号；および第６，０６３，６０８号；ならびにＷＯ９８／４７９１２を参照）。任意の酵素のＲＮアーゼＨ活性は、例えば、米国特許第５，２４４，７９７号；第５，４０５，７７６号；第５，６６８，００５号；および第６，０６３，６０８号に、Kotewicz,M.L.ら、Nucl.Acids Res.16:265 (1988)およびGerard,G.F.ら、FOCUS 14 (5):91 (1992)に記載のものなど、様々なアッセイによって決定することができ、これらの文献すべての開示は、参照により本明細書に完全に組み込む。しかし、ＲＮアーゼＨ活性が実質的に低い、リボ核酸分子からＤＮＡ分子を生成することができる（すなわち逆転写酵素活性を有する）任意の酵素を、本発明の組成物、方法およびキットで同等に使用できることが当業者に理解されるであろう。
【００７７】
本発明で使用する、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、例えば、Invitrogen社（カリフォルニア州Carlsbad）、Pharmacia（ニュージャージー州Piscataway）、Sigma（ミズーリ州Saint Louis）またはRoche Molecular System（カリフォルニア州Pleasanton）から商業的に得ることができる。あるいは、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、天然のウイルスまたは細菌供給源から、当業者に周知である、天然のタンパク質を単離し精製する標準的な手順に従って単離することもできる（例えば、Houts,G.E.ら、J.Virol.29:517 (1979)を参照）。さらに、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者によく知られている組換えＤＮＡ技術によって調製することができる（例えば、Kotewicz,M.L.ら、Nucl.Acids Res.16:265 (1988)；Soltis,D.A.およびSkalka,A.M., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3372-3376 (1988)を参照）。上記参照文献の教示全体を、参照により本明細書に組み込む。
【００７８】
当技術分野で知られている方法によって、例えば、好ましくは上記に記載の、例えばその全体を参照により本明細書に組み込む米国特許第６，０６３，６０８号に記載の１つまたは複数の点突然変異、１つまたは複数の欠失突然変異、および／あるいは１つまたは複数の挿入突然変異により、対象とする逆転写酵素内のＲＮアーゼＨドメインに突然変異を起こさせることによって、ＲＮアーゼＨ活性が低い酵素を得ることができる。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態では、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ逆転写酵素またはＲＮアーゼＨ活性が低いＡＭＶ逆転写酵素を使用した。
【００８０】
逆転写酵素活性を有する２種以上の酵素を単一の組成物、例えば同じ反応混合物中で使用することができる。この形で使用される酵素は、その全体を参照により本明細書に組み込む米国特許出願第２００３／０１９８９４４Ａ１号に記載のように、鋳型核酸に対して別個の逆転写休止部位を有することがある。
【００８１】
本発明の逆転写酵素活性を含む酵素はまた、その全体を参照により本明細書に組み込む米国特許出願２００３／０００３４５２Ａ１号に記載のように、１つまたは複数のアミノ酸が変化し、それによってその酵素が核酸合成においてより忠実（高忠実度）になった突然変異型または改変型の逆転写酵素を含んでもよい。
【００８２】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む酵素−第２の酵素
本発明に従った３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素（すなわち校正性ＤＮＡポリメラーゼまたは自律性エキソヌクレアーゼ）には、それだけに限らないが、ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩ、大腸菌ｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼなどが含まれる（例えば、Ｋｕｏ，1994, Ann N Y Acad Sci., 726:223-34, Shevelev IV, Hubscher U.,2002, Nat Rev Mol Cell Biol.3 (5):364-76を参照）。
【００８３】
任意の校正性ＤＮＡポリメラーゼを、本発明の第２の酵素として使用することができる。例は、それだけに限らないが、ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ）、ファミリーＣ型ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ；大腸菌ｐｏｌＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ；ヒトＤＮＡポリメラーゼδ、ヒトＤＮＡポリメラーゼγ、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ（その全体を参照により本明細書に組み込む米国特許出願第２００３／０１４３５７７号に記載のもの）を含む）、真正細菌ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ（サーモトガ マリティマ（ＵｌＴｍａ断片）など、校正活性を有する）、ファミリーＤ型ＤＮＡポリメラーゼ（ファミリーＡ、Ｂ、Ｃ型と無関係）などを含めた多数のＤＮＡポリメラーゼファミリー中に認めることができる。ＤＮＡ重合活性が低いが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼ、例えば、（その全体を参照により組み込む）米国特許出願第２００３／０１４３５７７号に記載のものを使用することもできる。
【００８４】
本組成物および方法で使用する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、天然の供給源から単離することもでき、あるいは組換えＤＮＡ技術により作製することもできる。好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む酵素は、ＤＮＡポリメラーゼである。
【００８５】
より好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素は、非α型ＤＮＡポリメラーゼである。
【００８６】
さらにより好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素は、例えば、その全体を参照により組み込むItoら、Nucleic Acids Research (1991), 19:4045-4057中で列挙されているファミリーＡ型またはファミリーＣ型のＤＮＡポリメラーゼである。
【００８７】
ＤＮＡポリメラーゼの分類
参照文献
Ａ．ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ
１．細菌ＤＮＡポリメラーゼ
ａ）大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ            Joyce,C.M.ら、(1982),
J.Biol.Chem., 257:1958-1964.
ｂ）肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)    Lopez,P.ら、(1989),
ＤＮＡポリメラーゼＩ                  J.Biol.Chem., 264:4255-4263.
ｃ）サーマス アクアティカス                Lawyer,F.C.ら、(1989),
ＤＮＡポリメラーゼＩ                  J.Biol.Chem., 264:6427-6437.
２．バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ
ａ）Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ                Leavitt,M.C.ら、(1989),
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,
86:4465-4469.
ｂ）Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ                Dunn,J.J.ら、(1983),
J.Mol.Biol., 166:477-535.
ｃ）Ｓｐｏ２ ＤＮＡポリメラーゼ            Raden,B.ら、(1984),
J.Virol., 52:9-15.
３．ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼ
酵母ミトコンドリア                      Foury,F., (1989),
ＤＮＡポリメラーゼ（ＭＩＰ１）          J.Biol.Chem., 264:20552-20560.
Ｂ．ファミリーＣ型ＤＮＡポリメラーゼ
細菌複製ＤＮＡポリメラーゼ
ａ）大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ          Tomasiewicz,H.G.ら、(1987),
またはサブユニット                      J.Bacteriol, 169:5735-5744.
ｂ）ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)  Lancy,E.D.ら、(1989),
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩまたは          J.Bacteriol., 171:5581-5586.
サブユニット
ｃ）枯草菌（Bacillus subtilis）                Hammond,R.A.ら、(1991),
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ                Gene, 98:29-36.
Ｃ．ファミリーＸ型ＤＮＡポリメラーゼ
ａ）ラットＤＮＡポリメラーゼβ              Matsukage,A.ら、(1987), 
J.Biol.Chem., 262:8960-8962.
ｂ）ヒトＤＮＡポリメラーゼβ                1) Abbotts,J.ら、(1988),
Biochemistry, 27:901-909.
2) SenGupta,D.N.ら、(1986), 
Biochem.Biophys.Res.Comm.,
136:341-347.
ｃ）ヒトターミナルデオキシヌクレオチジル    Peterson,R.C.ら、(1985), 
トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）            J.Biol.Chem., 260:10495-19502.
ｄ）ウシターミナルデオキシヌクレオチジル    Koiwai,O.ら、(1986),
トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）            Nucl.Acids Res., 14:5777-5792.
ｅ）マウスターミナルデオキシヌクレオチジル  Koiwai,O.ら、(1986),
トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）            Nucl.Acids Res., 14:5777-5792.
【００８８】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素は、熱安定性でもよく、あるいは熱安定性でなくてもよい。
【００８９】
熱安定性の第２の酵素は、上記に記載のものなど、当技術分野で知られている、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す任意の酵素でもよい。熱安定性の第２の酵素はまた、例えば、参照によりその全体を本明細書に組み込む米国特許第６，２３８，９０５号に記載されているＴ．サーモフィルス（T. thermophilus）のｄｎａＱ遺伝子産物でもよい。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素は、熱安定性でないＤＮＡポリメラーゼである。
【００９１】
一実施形態では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素は、ｐ５３タンパク質、またはφ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。
【００９２】
他の実施形態では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素は、ファミリーＡ型またはファミリーＣ型のＤＮＡポリメラーゼである。
【００９３】
本発明の他の実施形態では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素は、例えばPerrinoら（上記、その全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されている大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩである。
【００９４】
好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのイプシロン（ε）サブユニットである。
【００９５】
本発明の一実施形態では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００９６】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、当技術分野で知られている任意の方法によって測定することができる。一実施形態では、３’−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのイプシロンサブユニット）の単位活性を（例えば、Hamdan,S.ら、Biochemistry 2002, 41:5266-5275に記載のように）、ｐＮＰ−ＴＭＰの加水分解により生成されるｐ−ニトロフェノールアニオンの生成を４２０ｎｍでモニターすることによって分光光度法で決定する。ｐＮＰ−ＴＭＰの貯蔵液をアッセイ用緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＤＴＴ、９７０〜９８０μｌにする］で希釈して終濃度３ｍＭにする。２５℃で平衡にした後、ＭｎＣｌ２の溶液（１０μｌ）および酵素の溶液（１０〜２０μｌ）を添加して、それぞれ終濃度１ｍＭおよび１００〜４００ｍＭにする。Ａ４２０の変化を９０秒にわたって追跡する。ｐＨ８でのｐ−ニトロフェノールのε４２０について１２５９０Ｍ−１ｃｍ−１の値を使用して、ｐＮＰ−ＴＭＰの加水分解の割合を算出する。
【００９７】
酵素配合物の製剤
本発明は、上記に記載の第１および第２の酵素を含む組成物を提供する。第１および第２の酵素は、別々に供給し次いで反応混合物中で混合することもでき、あるいは、反応中で使用する前に、混合した配合物として供給することもできる。本発明の好ましい組成物を形成するために、第１および第２の酵素は、好ましくは緩衝塩溶液中で混合する。場合によっては、１つまたは複数のＤＮＡポリメラーゼおよび／または１つまたは複数のヌクレオチドを添加して本発明の組成物を作製することができる。より好ましくは、緩衝塩溶液中での作用濃度で酵素を供給する。
【００９８】
本発明の組成物の形成で使用する水は、好ましくは、蒸留し、脱イオン化し、滅菌フィルターを通した（０．１〜０．２μｍフィルターによる）ものであり、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼの酵素による混入がない。そのような水は、例えばSigma Chemical Company（ミズーリ州Saint Louis）から市販され、または当業者に周知の方法に従って、必要に応じて作製することができる。
【００９９】
逆転写酵素活性を含む２種以上の酵素および／または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む２種以上の酵素を、本発明の組成物中に入れることができる。酵素構成成分に加えて、本組成物は、好ましくは核酸分子の合成に必要な１つまたは複数の緩衝剤および他の構成成分を含む。本組成物の形成で使用する特に好ましい緩衝剤は、酢酸塩、硫酸塩、塩酸塩、リン酸塩または遊離酸型のＴｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ（登録商標））であるが、同等の結果が得られる、ＴＲＩＳ（登録商標）と同様のイオン強度およびｐＫａの代替緩衝剤を使用することができる。緩衝塩に加えて、カリウム塩（好ましくは塩化カリウムまたは酢酸カリウム）やマグネシウム塩（好ましくは塩化マグネシウムまたは酢酸マグネシウム）などの補助因子塩を組成物中に入れる。１つまたは複数の炭水化物および／または糖を組成物および／または合成反応混合物に添加すると、貯蔵後の組成物および／または反応混合物の安定性の亢進を支持するのに有利となることもある。本発明の組成物および／または合成反応混合物中に入れるのに好ましいそのような炭水化物または糖には、それだけに限らないが、スクロース、トレハロースなどがある。さらに、そのような炭水化物および／または糖は、本発明の酵素組成物およびキットの作製で使用する酵素用の貯蔵用緩衝液に添加することができる。そのような炭水化物および／または糖は、Sigma（ミズーリ州St. Louis）を含めたいくつかの供給業者から市販されている。
【０１００】
緩衝塩、補助因子塩および炭水化物または糖を水中での作用濃度で最初に溶解し、酵素を添加する前にその溶液のｐＨを調整することがしばしば好ましい。このようにすると、ｐＨ感受性の酵素は、本組成物の製剤中に酸またはアルカリが媒介する不活性化にさらされにくくなる。
【０１０１】
緩衝塩溶液を製剤するために、好ましくはＴｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ（登録商標））の塩であり、最も好ましくはその塩酸塩である緩衝塩を、十分な量の水と混合して、ＴＲＩＳ（登録商標）の濃度が５〜１５０ｍＭ、好ましくは１０〜６０ｍＭ、最も好ましくは約２０〜６０ｍＭである溶液を得る。この溶液に、マグネシウムの塩（好ましくはその塩化物または酢酸塩）を添加して、１〜１０ｍＭの、好ましくは１．５〜８．０ｍＭの、最も好ましくは３〜７．５ｍＭのその作用濃度にすることができる。カリウムの塩（好ましくはカリウムの塩化物または酢酸塩）を、作用濃度１０〜１００ｍＭで、最も好ましくは約７５ｍＭでその溶液に添加することもできる。ジチオスレイトールなどの還元剤を、好ましくは終濃度約１〜１００ｍＭで、より好ましくは濃度約５〜５０ｍＭでまたは約７．５〜２０ｍＭで、最も好ましくは濃度約１０ｍＭで溶液に添加することができる。本発明の組成物中に入れるのに好ましい炭水化物および／または糖の濃度は、約５％（ｗ／ｖ）〜約３０％（ｗ／ｖ）、約７．５％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは約１０％（ｗ／ｖ）〜約１５％（ｗ／ｖ）である。エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）二ナトリウムなどの、少量のＥＤＴＡの塩を添加することもできる（好ましくは約０．１ｍＭ）が、ＥＤＴＡを入れることは、本発明の組成物の機能または安定性に必須ではないと思われる。すべての緩衝剤および塩を添加した後、すべての塩が溶解するまでこの緩衝塩溶液をよく混合し、当技術分野で知られている方法を使用して、ｐＨ値７．４〜９．２に、好ましくは８．０〜９．０に、最も好ましくは約８．４にｐＨを調整する。
【０１０２】
この緩衝塩溶液に、酵素（逆転写酵素および／またはＤＮＡポリメラーゼ）を添加して本発明の組成物を作製する。好ましい実施形態では、１ｍｌ当たり５００〜５０，０００単位、１ｍｌ当たり５００〜３０，０００単位、１ｍｌ当たり５００〜２５，０００単位、１ｍｌ当たり５００〜２２，５００単位、１ｍｌ当たり５００〜２０，０００単位の溶液中での作用濃度で、Ｍ−ＭＬＶ ＲＴまたはＡＭＶを添加することが好ましい。好ましい一実施形態では、１ｍｌ当たり１２５０単位（反応液２０μｌ当たり２５単位）の作用濃度で、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ ＲＴを添加する。他の好ましい実施形態では、１ｍｌ当たり５００単位（反応液２０μｌ当たり１０単位）の作用濃度で、ＡＭＶ ＲＴを添加する。
【０１０３】
本組成物中での第１の酵素と第２の酵素の比率は、本発明に従って様々となる可能性がある。好ましくは、２０μｌの反応で、その組成物により、第１の酵素（例えば、逆転写酵素または逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ）に由来する逆転写酵素活性の０．１〜５００単位、より好ましくは、第１の酵素に由来する逆転写酵素活性の５〜１００単位、より好ましくは、第１の酵素に由来する逆転写酵素活性の１０〜５０単位、より好ましくは、第１の酵素に由来する逆転写酵素活性の２０〜４０単位の作用量が得られる。好ましくは、２０μｌの反応で、その組成物により、第２の酵素に由来する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の０．００１〜５０単位、より好ましくは、第２の酵素に由来する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の０．０１〜２５単位、より好ましくは、第２の酵素に由来する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の０．０１〜１０単位の作用量が得られる。逆転写酵素活性（単位として）を３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（単位として）で割った比率は、５０００〜１であり、好ましくは１５００〜５であり、より好ましくは１００〜１０である。
【０１０４】
好ましい実施形態では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素は、ＤＮＡポリメラーゼである。ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性でもよく、あるいは熱安定性でなくてもよい。酵素は、任意の順で溶液に添加することもでき、あるいは同時に添加することもできる。
【０１０５】
他の好ましい実施形態では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む第２の酵素は、Igor V. ShevelevおよびUlrich Hubscher（2002, 上記）に記載の自律性エキソヌクレアーゼである。そのようなエキソヌクレアーゼは、熱安定性でもよく、あるいは熱安定性でなくてもよい。
【０１０６】
熱安定性３’−５’エキソヌクレアーゼは、古細菌由来のものでもよく、あるいは高温真正細菌由来のものでもよい。熱安定性でない３’−５’エキソヌクレアーゼは、哺乳動物由来のものでもよく、あるいは真正細菌由来のものでもよく、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ、大腸菌イプシロンサブユニット、Ｐ５３などでもよい。
【０１０７】
好ましくは、熱安定性でない第２の酵素は、配列番号１と少なくとも５０％の相同性があるポリペプチドである。より好ましくは、熱安定性でない第２の酵素は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのイプシロンサブユニットである。好ましくは、２０μｌの反応で、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのイプシロンサブユニットを、作用量０．０１７ｕ〜３．４ｕ（反応液２０μｌ当たり５ｎｇ〜１０００ｎｇ）で、より好ましくは０．１ｕ〜１ｕで使用する。
【０１０８】
本発明の組成物は、１つまたは複数のヌクレオチドをさらに含んでもよく、そのヌクレオチドは、好ましくはデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）である。本組成物のｄＮＴＰ構成成分は、ポリメラーゼの作用によりその中に組み込まれる、新たに合成される核酸の「構成単位」として働き、ｄｄＮＴＰは、本発明に従って、配列決定法で使用することができる。本構成物中での使用に適したヌクレオチドの例には、それだけに限らないが、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＣＴＰ、ｄｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄｄＧＴＰ、α−チオ−ｄｄＡＴＰ、α−チオ−ｄｄＴＴＰ、α−チオ−ｄｄＧＴＰ、α−チオ−ｄｄＣＴＰ、アミノアリルｄＵＴＰやアミノアリルＵＴＰやアミノアリルｄＣＴＰなどのアミノアリル修飾ヌクレオチド、Ｃｙ５やＣｙ３標識ｄＮＴＰなどの蛍光標識ヌクレオチド、またはその誘導体が含まれ、これらはすべて、New England Biolabs（マサチューセッツ州Beverly）およびSigma Chemical Company（ミズーリ州Saint Louis）を含めた供給業者から市販されている。
【０１０９】
「アミノアリル修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの５’末端に第一級アミンを含むように修飾されたヌクレオチドを指し、好ましくは１つまたは複数のメチレン基が、その核酸ポリマーの第一級アミンと核酸部分の間に配置されている。メチレン基の好ましい数は６個である。アミノアリルｄＵＴＰまたはアミノアリルｄＣＴＰのアミノアリル修飾ヌクレオチドは、本明細書で開示されているポリメラーゼにより核酸中に導入することができる。
【０１１０】
ヌクレオチドは、標識を付けなくてもよく、あるいは当技術分野で知られている方法によってそれを放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐまたは３５Ｓ）、ビタミン（例えば、ビオチン）、蛍光部分（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、またはフィコエリスリン、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、化学発光標識（例えば、Invitrogen社、カリフォルニア州Carlsbadから市販されているPHOTO-GENE（商標）またはＡＣＥＳ（商標）化学発光システムを使用する）、ジオキシゲニンなどと結合することによって、検出可能な標識を付けてもよい。標識ヌクレオチドは、例えばInvitrogen社（カリフォルニア州Carlsbad）またはSigma Chemical Company（ミズーリ州Saint Louis）から商業的に得ることもできる。本組成物では、ヌクレオチドを添加して、各ヌクレオチドの作用濃度を１０〜４０００ｍＭに、５０〜２０００ｍＭに、１００〜１５００ｍＭに、または２００〜１２００ｍＭにし、最も好ましくは濃度を１０００ｍＭにする。
【０１１１】
本発明の組成物はまた、逆転写または増幅を促進するＰＣＲ用アクセサリー要素および他の添加剤を含んでもよい。
【０１１２】
ＰＣＲ亢進因子を使用して、増幅の効率を向上させることもできる。例えば、ＰＣＲ用アクセサリー要素の１つは、参照によりその全体を本明細書に組み込む、米国特許第６，１８３，９９７号に記載のＰＥＦである。ＰＥＦは、天然の形態で（Ｐ５０およびＰ４５の複合体として）または組換えタンパク質としてＰ４５を含む。ＰｆｕのＰ５０およびＰ４５の天然複合体では、Ｐ４５だけがＰＣＲ亢進活性を示す。Ｐ５０タンパク質は、細菌フラビンタンパク質と構造が類似している。Ｐ４５タンパク質は、ｄＣＴＰデアミナーゼおよびｄＵＴＰアーゼと構造が類似しているが、それは、ｄＵＴＰをｄＵＭＰおよびピロリン酸塩に転換するｄＵＴＰアーゼとしてしか機能しない。本発明によれば、ＰＥＦはまた、古細菌供給源（例えば、パイロコッカス フリオサス）から得られる天然に存在する単離もしくは精製ポリメラーゼ亢進タンパク質；Ｐｆｕ Ｐ４５と同じアミノ酸配列を有する全体的なもしくは部分的な合成タンパク質、またはポリメラーゼ亢進活性を有するその類似体；１つもしくは複数の前記の天然に存在するタンパク質または全体的なもしくは部分的な合成タンパク質のポリメラーゼ亢進混合物；１つもしくは複数の前記の天然に存在するタンパク質または全体的なもしくは部分的な合成タンパク質のポリメラーゼ亢進タンパク質複合体；あるいは１つもしくは複数の前記の天然に存在するタンパク質を含むポリメラーゼ亢進部分精製細胞抽出物からなる群から選択することもできる（米国特許第６，１８３，９９７号、上記）。ＰＥＦのＰＣＲ亢進活性は、当技術分野で周知の手段によって定義される。ＰＥＦについての単位の定義は、ＰＥＦ（Ｐ４５）のｄＵＴＰアーゼ活性に基づき、その活性は、ｄＵＴＰからのピロリン酸塩（ＰＰｉ）の生成をモニターすることにより決定する。例えば、ＰＥＦをｄＵＴＰ（１×クローン化Ｐｆｕ ＰＣＲ緩衝液中１０ｍＭのｄＵＴＰ）とインキュベートし、その時間中にＰＥＦはｄＵＴＰをｄＵＭＰおよびＰＰｉに加水分解する。Sigma（＃Ｐ７２７５）から市販されている連結酵素アッセイシステムを使用して、形成されたＰＰｉの量を定量する。活性の１単位は、（８５℃で）１時間当たりに形成されたＰＰｉ ４ｎｍｏｌと機能上定義される。
【０１１３】
他のＰＣＲ添加剤が、ＰＣＲ反応の正確性および特異性に影響を及ぼす可能性もある。０．５ｍＭ未満のＥＤＴＡは、増幅反応混合物中に存在してもよい。Tween-20（商標）やNonidet（商標）Ｐ−４０などの界面活性剤は、酵素希釈緩衝液中に存在する。約０．１％以下の非イオン性界面活性剤の終濃度が適当であるが、０．０１〜０．０５％が好ましく、ポリメラーゼ活性に干渉しない。同様に、グリセロールは、酵素製剤中にしばしば存在し、一般に、反応混合物中で濃度１〜２０％まで希釈される。ＧＣ含量が高くまたは長さが長い（例えば＞１ｋｂ）鋳型ＤＮＡのＰＣＲで、グリセロール（５〜１０％）、ホルムアミド（１〜５％）またはＤＭＳＯ（２〜１０％）を添加することができる。この添加剤により、プライマーと鋳型のハイブリダイゼーション反応のＴｍ（融解温度）およびポリメラーゼ酵素の熱安定性が変化する。ＢＳＡ（最大で０．８μｇ／μｌ）は、ＰＣＲ反応の効率を向上させることができる。ベタイン（０．５〜２Ｍ）も、ＧＣ含量が高い長断片ＤＮＡに関するＰＣＲに有用である。塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ、＞５０ｍＭ）、塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＣ）、およびトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）を使用することもできる。試験ＰＣＲ反応を行って、上記に挙げた各添加剤の最適な濃度を決定することができる。
【０１１４】
一実施形態では、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのθサブユニットを使用して、イプシロンサブユニットの熱安定性を増大させる（例えば、Hamdanら、2002, Biochemistry, 41:5266-5275を参照）。θサブユニットを、本発明に従って他の任意のイプシロンサブユニットとともに使用して、酵素配合物の熱安定性を増大させ、熱安定性逆転写酵素の感受性および忠実度を向上させることができる。
【０１１５】
構成成分の劣化を低下させるために、試薬組成物の貯蔵は、好ましくは約４℃で最大１日間、または最も好ましくは−２０℃で最大１年間行う。
【０１１６】
他の態様では、１つまたは複数の炭水化物、糖、または合成ポリマーの存在下で、乾燥形態で本発明の組成物を調製し貯蔵することができる。乾燥した組成物または逆転写酵素の調製に好ましい炭水化物、糖またはポリマーには、それだけに限らないが、スクロース、トレハロース、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはその組合せがある。例えば、その開示を参照により本明細書に完全に組み込む米国特許第５，０９８，８９３号、第４，８９１，３１９号、および第５，５５６，７７１号を参照されたい。そのような乾燥した組成物および酵素は、本発明の組成物の酵素または構成成分が著しく劣化することなく、様々な温度で長時間貯蔵することができる。好ましくは、その乾燥した逆転写酵素または組成物は、４℃または−２０℃で貯蔵する。
【０１１７】
ｃＤＮＡ合成
本発明に従って、様々な核酸鋳型分子からｃＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）を調製することができる。本発明での使用に好ましい核酸分子には、一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ分子、ならびに二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが含まれる。より好ましい核酸分子には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソーム（ｒＲＮＡ）分子が含まれるが、ｍＲＮＡ分子が、本発明に従った好ましい鋳型である。
【０１１８】
本発明は、忠実度が高いｃＤＮＡ合成のための組成物および方法を提供する。本組成物および方法は、逆転写の効率ならびに合成されるｃＤＮＡの長さを増大させることもできる。その結果、合成ｃＤＮＡのその後の操作（例えば、増幅、配列決定、クローン化など）の忠実度、効率、および収量も増大する。本発明の方法に従ったｃＤＮＡ分子の調製に使用される核酸分子は、当業者によく知られている標準的な有機化学合成法に従って、合成により調製することができる。より好ましくは、様々な細胞、組織、臓器や生物などの天然の供給源から核酸分子を得ることができる。核酸分子の供給源として使用することができる細胞は、原核生物のもの（それだけに限らないが、エシェリキア、バシラス、セラチア（Serratia）、サルモネラ、スタヒロコッカス、ストレプトコッカス、クロストリジウム、クラミジア、ナイセリア、トレポネーマ（Treponema）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、ボレリア（Borrelia）、レジオネラ、シュードモナス、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ヘリコバクター（Helicobacter）、エルウィニア（Erwinia）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、リゾビウム（Rhizobium）、ザントモナス（Xanthomonas）およびストレプトマイセス（Streptomyces）属の種のものを含めた細菌細胞）でもよく、あるいは真核生物のもの（真菌（特に酵母）、植物、原虫および他の寄生虫、ならびに昆虫（特にショウジョウバエ種細胞）、線虫（シノラブディティス エレガンス（Caenorhabditis elegans）細胞）、および哺乳動物（特にヒト細胞）を含めた動物を含む）でもよい。
【０１１９】
核酸の供給源として使用することができる哺乳動物体細胞には、血液細胞（網赤血球および白血球）、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞（中枢神経系または末梢神経系由来）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋または心筋の筋細胞および筋原細胞を含む）、結合組織細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞および骨芽細胞を含む）および他の間質細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、シュワン細胞）が含まれる。哺乳動物生殖細胞（精母細胞および卵母細胞）を、本発明で使用する核酸の供給源として使用することもでき、上記の体細胞および生殖細胞を生じさせる始原細胞、前駆細胞および幹細胞も同様に使用することができる。脳、腎臓、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、泌尿生殖器、循環器、リンパ系、胃腸および結合組織の供給源に由来するもの、ならびに哺乳動物（ヒトを含む）胚または胎児に由来するものなどの哺乳動物の組織または臓器も、核酸供給源としての使用に適している。
【０１２０】
上記の原核生物または真核生物の細胞、組織および臓器はいずれも、正常な、罹患した、形質転換された、樹立された、始原細胞の、前駆細胞の、胎児のまたは胚性のものでよい。罹患した細胞には、例えば、（細菌、真菌または酵母、ウイルス（ＡＩＤＳ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ヘルペス、肝炎などを含む）または寄生虫によって引き起こされる）感染性疾患に、遺伝的または生化学的病理に（例えば、嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、筋ジストロフィーまたは多発性硬化症）、または癌の過程に関与するものが含まれる可能性がある。形質転換されたまたは樹立された動物細胞系統には、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｆ９細胞などが含まれる可能性がある。本発明で使用する核酸の供給源として適切な他の細胞、細胞系統、組織、臓器および生物は、当業者には明らかとなるであろう。
【０１２１】
開始する細胞、組織、臓器、または他の試料が得られた後、当技術分野で周知の方法によって核酸分子（ｍＲＮＡなど）をそれから単離することができる（例えば、Maniatis,T.ら、Cell 15:687-701 (1978)；Okayama,H.およびBerg,P., Mol.Cell.Biol.2:161-170 (1982)；Gubler,U.およびHoffman, B.J., Gene 25:263-269 (1983)を参照）。次いで、こうして単離された核酸分子を使用して、本発明に従ってｃＤＮＡ分子およびｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。
【０１２２】
本発明の実施では、組成物の酵素の作用による核酸分子の逆転写に好都合な条件下で、好ましくはｍＲＮＡ分子の集団など１つまたは複数のｍＲＮＡ分子である、上記に記載の１つまたは複数の核酸分子を本発明の組成物と混合して、ｃＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）を形成することにより、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。したがって、本発明の方法は、（ａ）１つまたは複数の核酸鋳型（好ましくは、ｍＲＮＡ分子の集団など、１つまたは複数のＲＮＡまたはｍＲＮＡの鋳型）を、本発明の組成物（例えば、ＲＮアーゼＨ活性が低い逆転写酵素活性を示す第１の酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素を含む酵素混合物）と混合するステップと、（ｂ）例えば１つまたは複数の鋳型の全部または一部に対するｃＤＮＡ合成を可能にするのに十分な条件下でその混合物をインキュベートするステップとを含む。
【０１２３】
本発明の組成物は、下記の実施例に記載の方法や、当技術分野で周知の他の方法（例えば、Gubler,U.およびHoffman,B.J., Gene 25:263-269 (1983); Krug,M.S.およびBerger,S.L., Meth.Enzymol.152:316-325 (1987); Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor，ニューヨーク：Cold Spring Harbor Laboratory Press，pp.8.60-8.63 (1989)を参照）などのｃＤＮＡ合成の方法と組み合わせて使用して、ｃＤＮＡ分子またはライブラリーを作製することができる。
【０１２４】
本発明は、第１鎖および第２鎖のｃＤＮＡをさらに作製する、当技術分野で知られているような方法を対象とする。本発明によれば、その方法によって作製された第１鎖および第２鎖のｃＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ分子を形成することができ、その分子は、完全長ｃＤＮＡ分子である可能性がある。
【０１２５】
本方法を使用すると有利である可能性があるｃＤＮＡ合成の他の方法は、当業者には容易に明らかとなるであろう。
【０１２６】
合成ｃＤＮＡのその後の操作
本方法に従ってｃＤＮＡ分子またはライブラリーを得た後、これらのｃＤＮＡを単離することもでき、あるいはｃＤＮＡを含む反応混合物をさらなる分析または操作に直接使用することもできる。ｃＤＮＡの精製の詳細な方法は、その全体を参照により本明細書に組み込むGENETRAPPER（商標）マニュアル（Invitrogen社、カリフォルニア州Carlsbad）中で教示されているが、下記の実施例に記載のものや、当技術分野で知られている他のもの（例えば、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor，ニューヨーク：Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp.8.60-8.63 (1989)を参照）など、ｃＤＮＡ単離の代替の標準的な技術を使用することもできる。
【０１２７】
本発明の他の態様では、本発明は、核酸分子を増幅し配列決定する方法で使用することができる。本発明のこの態様に従った核酸増幅法は、１ステップ（例えば１ステップＲＴ−ＰＣＲ）反応でもよく、あるいは２ステップ（例えば２ステップＲＴ−ＰＣＲ）反応でもよい。本発明によれば、１ステップＲＴ−ＰＣＲは、１本の管で行うことができ、それによって混入の可能性が低くなる。そのような１ステップ反応は、（ａ）核酸鋳型（例えば、ｍＲＮＡ）を本発明の組成物と混合するステップと、（ｂ）増幅を可能にするのに十分な条件下でその混合物をインキュベートするステップとを含む。２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応は、２つの別々のステップで行うことができる。そのような方法は、（ａ）核酸鋳型（例えば、ｍＲＮＡ）を本発明の組成物と混合するステップと、（ｂ）ｃＤＮＡ合成を可能にするのに十分な条件下でその混合物をインキュベートするステップと、（ｃ）（ｂ）での反応混合物を１つまたは複数のＤＮＡポリメラーゼと混合するステップと、（ｄ）増幅を可能にするのに十分な条件下でステップ（ｃ）の混合物をインキュベートするステップとを含む。長い核酸分子（すなわち、長さが約３〜５ｋｂを超える）の増幅では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する一方のＤＮＡポリメラーゼと３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低い他方のＤＮＡポリメラーゼなど、ＤＮＡポリメラーゼの組合せを使用することができる。
【０１２８】
本組成物は、核酸の配列決定に使用することができる。本発明のこの態様に従った核酸の配列決定法は、サイクルシークエンス反応（増幅と組み合わせた配列決定）も、標準的なシークエンス反応も含んでよい。したがって、本発明の配列決定法は、（ａ）配列決定する核酸分子を本発明の組成物および１つまたは複数の終結作用物質と混合するステップと、（ｂ）ｃＤＮＡ合成および／または増幅を可能にするのに十分な条件下でその混合物をインキュベートするステップと、（ｃ）その集団を分離して、配列決定する核酸分子のヌクレオチド配列を決定するステップとを含む。
【０１２９】
本発明に従って使用することができる増幅法には、ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号）、鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification，ＳＤＡ；例えば、米国特許第５，４５５，１６６号およびＥＰ０ ６８４ ３１５）、および核酸配列に基づく増幅（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，ＮＡＳＢＡ；例えば、米国特許第５，４０９，８１８号；ＥＰ０ ３２９ ８２２）が含まれる。本組成物を使用することができる核酸配列決定技術には、米国特許第４，９６２，０２２号および第５，４９８，５２３号中で開示されている方法などのジデオキシ配列決定法、ならびにランダム増幅多型ＤＮＡ（Random Amplified Polymorphic DNA，ＲＡＰＤ）分析（Williams,J.G.K.ら、Nucl.Acids Res.18 (22):6531-6535, 1990）、任意プライムＰＣＲ（Arbitrarily Primed PCR，ＡＰ−ＰＣＲ；Welsh,J.およびMcClelland,M., Nucl.Acids Res.18 (24):7213-7218, 1990）、ＤＮＡ増幅フィンガープリント法（DNA Amplification Fingerprinting，ＤＡＦ；Caetano-Anollesら、Bio/Technology 9:553-557, 1991）、マイクロサテライトＰＣＲまたはマイクロサテライト領域ＤＮＡの特異的増幅（ＤＡＭＤ；Heath,D.D.ら、Nucl.Acids Res.21 (24):5782-5785, 1993）や、増幅断片長多型（Amplification Fragment Length Polymorphism，ＡＦＬＰ）分析（ＥＰ０ ５３４ ８５８；Vos,P.ら、Nucl Acids Res.23 (21):4407-4414, 1995；Lin,J.J.およびKuo,J., FOCUS 17 (2):66-70, 1995）などのより複雑なＰＣＲに基づく核酸フィンガープリント技術が含まれる。特に好ましい態様では、上記に記載のＰＣＲに基づく方法のいずれかなどの１つまたは複数のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、核酸分子を増幅しまたは配列決定する方法で本発明を使用することができる。参照文献はすべて、参照によりその全体を組み込む。
【０１３０】
本発明において鋳型であるＲＮＡからのｃＤＮＡの合成に使用するプライマーは、それが鋳型ＲＮＡの配列と相補的なヌクレオチド配列を有し、使用する反応条件下で鋳型ＲＮＡとアニールできるオリゴヌクレオチドである限り、特異的なものに限定されない。プライマーは、オリゴ（ｄＴ）などのオリゴヌクレオチドでもよく、あるいはランダム配列を有するオリゴヌクレオチド（ランダムプライマー）でもよく、あるいは遺伝子特異的なプライマーでもよい。
【０１３１】
本発明の方法によって調製された核酸分子（例えば、合成ｃＤＮＡまたは増幅産物）またはｃＤＮＡライブラリーは、例えば、本発明の配列決定方法または当技術分野で標準的な他の方法（例えば、ＤＮＡ配列決定の方法を対象とする米国特許第４，９６２，０２２号および第５，４９８，５２３号を参照）によりクローン化し配列決定する（すなわち、核酸分子のヌクレオチド配列を決定する）ことによって、さらに特徴付けることができる。あるいは、当技術分野で周知の方法によって、ハイブリダイゼーションプローブなど、工業的方法での様々な物質の製造にこれらの核酸分子を使用することができる。ｃＤＮＡからハイブリダイゼーションプローブを作製すると、例えば、医学の分野で、癌のマーカー、感染性または遺伝性疾患のマーカーや、胚発生のマーカーなど特定の遺伝マーカーが存在するかどうか患者の細胞または組織をそのプローブにより調べることができる。さらに、そのようなハイブリダイゼーションプローブを使用して、さらなる特徴付けのために異なる細胞、組織または生物から調製されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーからＤＮＡ断片を単離することができる。
【０１３２】
本発明の核酸分子（例えば、合成ｃＤＮＡまたは増幅産物）を使用して、組換えＤＮＡ法で使用する組成物を調製することもできる。したがって、本発明は、本発明のｃＤＮＡまたは増幅核酸分子を含む組換えベクター、組換えベクターとともに遺伝子工学で作製された宿主細胞、このベクターおよび宿主細胞を使用して組換えポリペプチドを作製する方法、およびこの方法を使用して作製された組換えポリペプチドに関する。
【０１３３】
本発明のこの態様に従って、当技術分野で周知の方法を使用して、本方法に従って調製された１つまたは複数のｃＤＮＡ分子または増幅核酸分子をベクター中に挿入することにより組換えベクターを作製することができる。本発明のこの態様で使用するベクターは、例えば、ファージまたはプラスミドでもよく、好ましくはプラスミドである。対象とするポリペプチドをコードする核酸にシス作用性調節領域を含むベクターが好ましい。適当なトランス作用性因子は、宿主によって供給されてもよく、相補性ベクターによって供給されてもよく、あるいは宿主中に導入した後そのベクター自体によって供給されてもよい。
【０１３４】
これに関して特定の好ましい実施形態では、そのベクターは、特定の発現をもたらし（したがって「発現ベクター」と称し）、その発現は誘導可能なかつ／または細胞型特異的なものでもよい。温度や栄養添加物などの操作しやすい環境因子によって誘導可能なものが、そのようなベクターの中で特に好ましい。
【０１３５】
本発明で有用な発現ベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミドまたはバクテリオファージに由来するベクター、ならびにコスミドやファージミドなどその組合せに由来するベクターが含まれ、そのベクターは、好ましくは、細菌宿主細胞中で培養するためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子などの選択マーカーを少なくとも１つ含む。そのような発現ベクター中に挿入する前に、本発明のｃＤＮＡまたは増幅核酸分子は、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーターなどの適当なプロモーターと作動的に結合すべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に知られているであろう。
【０１３６】
Qiagenから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Stratageneから入手可能なｐＢＳベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；Invitrogenから入手可能なｐｃＤＮＡ３；Pharmaciaから入手可能なｐＧＥＸ、ｐＴｒｘｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；ならびにLife Technologies社から入手可能なpSPORT1、pSPORT2およびpSV.multidot.SPORT1が、本発明での使用に適したベクターの中に含まれる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかとなるであろう。
【０１３７】
本発明はまた、本発明のｃＤＮＡ分子、増幅核酸分子または組換えベクターを含む組換え宿主細胞を作製する方法、ならびにそのような方法によって作製された宿主細胞も提供する。本発明に従って作製することができる代表的な（原核生物または真核生物の）宿主細胞には、それだけに限らないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が含まれる。好ましい細菌宿主細胞には、大腸菌細胞（最も具体的には、大腸菌株ＤＨ１０ＢおよびＳｔｂ１２であり、これらは市販されている（Life Technologies社；メリーランド州Rockville））、枯草菌細胞、巨大菌（Bacillus megaterium）細胞、ストレプトマイセス属種細胞、エルウィニア属種細胞、クレブジエラ属種細胞およびネズミチフス菌細胞が含まれる。好ましい動物宿主細胞には、昆虫細胞（最も具体的には、スポドプテラ フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）ＳＪ９およびＳｆ２１細胞、およびトリコプルサ（Trichoplusa）High-Five細胞）、および哺乳動物細胞（最も具体的には、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫおよびヒト細胞）が含まれる。当業者によく知られている周知の形質転換、エレクトロポレーションまたはトランスフェクション技術によってそのような宿主細胞を調製することができる。
【０１３８】
さらに、本発明は、組換えポリペプチドを作製する方法、およびこの方法によって作製されたポリペプチドを提供する。本発明のこの態様によれば、上記の組換え宿主細胞のいずれかを、その細胞からのポリペプチドの生成、およびポリペプチドの単離に好都合な条件下で培養することによって、組換えポリペプチドを作製することができる。組換え宿主細胞の培養、ならびにその細胞からのポリペプチドの生成および単離の方法は、当業者に周知である。
【０１３９】
本明細書に記載の方法および適用例に対する他の適切な改変および適合が明白であり、本発明の範囲またはその任意の実施形態を逸脱せずにそれを行うことができることが、関連技術の技術者には容易に明らかとなるであろう。これまで本発明を詳細に説明してきたが、下記の実施例は例示の目的で本明細書に含まれるに過ぎず、本発明の限定を意図しないものであり、これらを参照することによって同様のことがよりはっきりと理解されるであろう。
【０１４０】
キット
本組成物をまとめて、核酸分子の逆転写または増幅で使用するキットに、あるいは核酸分子の配列決定で使用するキットにすることができる。本発明のこの態様に従ったキットは、その閉じた囲いの中でバイアル、管、アンプル、瓶などの１つまたは複数の容器手段を有する箱、紙箱、管などの運搬手段を含む。逆転写酵素活性を示す第１の酵素、および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す第２の酵素は、その酵素２つの混合物として単一の容器に入れてもよく、あるいは別々の容器に入れてもよい。本発明のキットはまた、（同じまたは別々の容器中に）１つまたは複数の逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液、１つまたは複数のヌクレオチドおよび／あるいは１つまたは複数のプライマーあるいは本発明の組成物について記載された他の任意の試薬を含んでもよい。
【０１４１】
本キット中での第１の酵素と第２の酵素の比率は、本発明に従って様々となる可能性がある。好ましくは、２０μｌの反応で、そのキットにより、第１の酵素に由来する逆転写酵素活性の０．１〜５００単位、より好ましくは、第１の酵素に由来する逆転写酵素活性の５〜１００単位、より好ましくは、第１の酵素に由来する逆転写酵素活性の１０〜５０単位の作用量が得られる。好ましくは、２０μｌの反応で、そのキットにより、第２の酵素に由来する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の０．００１〜５０単位、より好ましくは、第２の酵素に由来する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の０．０１〜２５単位、より好ましくは、第２の酵素に由来する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の０．０１〜１０単位の作用量が得られる。逆転写酵素活性（単位として）を３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（単位として）で割った比率は、５０００〜１であり、好ましくは１５００〜５であり、より好ましくは１００〜１０である。
【０１４２】
本発明のキットは、当技術分野で知られている、合成ｃＤＮＡのその後の操作を促進する試薬を含んでもよい。
【実施例】
【０１４３】
下記の実施例は、本発明をさらに詳細に例示するものであるが、その範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【０１４４】
実施例１  ＲＴ−ＰＣＲ反応
ｃＤＮＡを合成する間に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を添加する効果を、大腸菌イプシロンサブユニットおよびＲＮアーゼＨ−Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ（StrataScript RT, Stratagene社、カリフォルニア州）またはＡＭＶ−ＲＴを含む配合物を使用して調べる。
【０１４５】
各ＲＴ反応は、総量２０μｌで実施した。各反応中での試薬の終濃度は以下の通りであった：StrataScriptでは１×StrataScript緩衝液（Stratagene）中で、またはＡＭＶ−ＲＴ（ＲＮアーゼＨ＋、Stratagene）では１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＰＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣＬ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ ＤＴＴ中で、ヒト骨格筋総ＲＮＡ５００ｎｇ、オリゴ（ｄＴ）１８５００ｎｇ、および４ｍＭの総ｄＮＴＰ。すべての反応液を４２℃で６０分間インキュベートした。各ｃＤＮＡ合成反応液２μｌを、TaqPlusPrecision（Stratagene）２．５単位、１×TaqPlusPrecision緩衝液（Stratagene）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、ならびに４ｋｂ断片増幅用のＤｙｓ８Ｆプライマー（５’−ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＴＡＧ  ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＡＡＧ）（配列番号５５）およびＤｙｓ３Ｒプライマー（５’−ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＣＴＧ）（配列番号５６）または６ｋｂ断片増幅用のＤｙｓ８ＦプライマーおよびＤｙｓ４Ｒ（５’−ＡＡＴＴＴＧＴＧＣＡＡＡＧＴＴＧＡＧＴＣ）（配列番号５７）プライマー（図１）各１００ｎｇを含むＰＣＲで使用した。４ｋｂ断片の増幅は、以下の温度サイクルプロファイルを使用して実施した：ＰＥ９６００（Applied Biosystems）を使用して、９５℃、２分間を１サイクル、その後９５℃、３０秒間、５５℃、３０秒間、および７２℃、４分間を４０サイクル。６ｋｂ断片の増幅反応は、以下の温度サイクルプロファイルを使用して実施した：Robocycler（Stratagene）を使用して、９５℃、２分間を１サイクル、その後９５℃、１分間、５５℃、１分間、および６８℃、１２分間を４０サイクル。ＰＣＲ増幅はすべてTaqPlus Precision（Stratagene）で行った。各反応液８μｌを１％アガロースゲル上で泳動し、エチジウムブロマイドで染色した（図２〜４）。
【０１４６】
図２から、非常に低い濃度の大腸菌ＤＮＡｐｏｌＩおよびφ２９ ＤＮＡポリメラーゼがＲＴ反応を阻害していることが示される。その一方で、図３から、ＲＴ反応に大腸菌ＤＮＡｐｏｌＩＩＩのεサブユニットを添加すると、ｃＤＮＡ増幅断片の収量および長さが有意に増大することが示される。ＡＭＶ−ＲＴ反応に大腸菌ＤＮＡｐｏｌＩＩＩのεサブユニットを添加すると、εサブユニットによって、ＡＭＶ−ＲＴによるｃＤＮＡ合成物の収量および長さも著しく増大することが示される（図４）。したがって、εサブユニットによる亢進はＭＭＬＶ−ＲＴに限られないが、モノマー（ＭＭＬＶ様）とヘテロダイマー（ＡＭＶ様）の両方のＲＴを含めた広い種類のＲＴに当てはまるように思われる。
【０１４７】
実施例２  忠実度アッセイ
ｌａｃＺα遺伝子の１１１ヌクレオチドの断片を、Ｔ７プロモーターと融合させた（図１）。第１鎖ＤＮＡ合成用のｌａｃＺα ＲＮＡを、RNAMaxx転写キット（Stratagene社、カリフォルニア州）を使用して、製造業者の推奨に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより作製した。精製ＲＮＡを無ＲＮアーゼ水中で溶解させた。
【０１４８】
ｃＤＮＡ合成：６０℃で３分間インキュベートし、その後室温で１０分間冷ますことによって、ｐｌａｃＺ−Ｒｅｖ ５００ｎｇをｌａｃＺ ＲＮＡ ２μｇとアニールさせた。伸長反応液（３連）は、２０μｌ中に２×StrataScript緩衝液、StrataScript２５単位、４ｍＭの総ｄＮＴＰを含んでいた。忠実度アッセイでは、StrataScript２５単位を、単独で、または大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのεサブユニット５０ｎｇ、ｐ５３タンパク質１００ｎｇ、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ０．２単位、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（阻害が起こらない量）０．１単位と組み合わせて使用した。反応液を４２℃で６０分間インキュベートした。次いで、ＲＮａｃｅ−ＩＴ（Stratagene、ＲＮアーゼ−Ｔ１ ５Ｕ／μｌ、ＲＮアーゼＡ ２μｇ／μｌ）を添加し、３７℃で３０分間、その後８０℃で１０分間インキュベートすることによってＲＮＡを加水分解した。次いで、ＲＮＡ結合スピンカラム（Stratagene）を使用してｃＤＮＡを精製した。最終ｃＤＮＡ産物の１０〜２０％をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ反応（Stratagene）で使用して、野生型ｌａｃＺ断片を置換した。２５μｌのQuikChange反応液は、１０×QuikChange Multi緩衝液（Stratagene）２．５μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）１５単位、pBluescript II（Stratagene）５０ｎｇ、０．８ｍＭの総ｄＮＴＰ、PfuTurbo ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位を含んでいた。９５℃、１分間、５５℃、１分間、および６５℃、６分間のＰＣＲを３０サイクル行った。次いでその産物をＤｐｎＩ１０単位で３７℃、６０分間消化した。この反応液３μｌでlibrary efficiency DH5aコンピテント細胞（Invitrogen）を形質転換し、その細胞を３７℃で１晩インキュベートした。次いで白色コロニーの数を決定し、それをコロニーの総数で割って突然変異頻度を得た。背景の突然変異頻度は、白色コロニーの直接配列決定によって決定した。
【０１４９】
結果：表ＩＩおよびＩＩＩ中での３連の実験から平均突然変異頻度を決定し、その頻度から背景を差し引いた後、StrataScript（ＲＮアーゼＨ−のＭＭＬＶ−ＲＴ）と配合物との忠実度の倍数差は以下の通りとなる：
１−ＲＮアーゼＨ−のＭＭＬＶ−ＲＴ（StrataScript）＋大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのεサブユニットの配合物は、ＲＮアーゼＨ−のＭＭＬＶ−ＲＴ単独より３倍忠実度が高い。
【０１５０】
２−ＲＮアーゼＨ−のＭＭＬＶ−ＲＴ＋大腸菌ＤＮＡｐｏｌＩの配合物は、ＲＮアーゼＨ−のＭＭＬＶ−ＲＴ単独より４倍忠実度が高い。
【０１５１】
３−ＲＮアーゼＨ−のＭＭＬＶ−ＲＴ＋φ２９ ＤＮＡポリメラーゼの配合物は、ＲＮアーゼＨ−のＭＭＬＶ−ＲＴ単独より２．５倍忠実度が高い。
【０１５２】
４−ＲＮアーゼＨ−のＭＭＬＶ−ＲＴ＋ｐ５３の配合物は、ＲＮアーゼＨ−のＭＭＬＶ−ＲＴ単独より４倍忠実度が高い。
【表２】
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【表３】
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【０１５３】
（他の実施形態）
上記の実施例は、本発明を創作し実施する際に本発明者らによって行われ検討された実験を示すものである。この実施例は、本発明を実施する技術を知らせるのにもその有用性を示すのにも役立つ技術の開示を含むものと考えられる。本明細書で開示されている技術および実施形態が好ましい実施形態であるに過ぎず、一般に多数の同等な方法および技術を使用して同じ結果を実現できることが、当業者には明らかとなるであろう。
【０１５４】
本明細書の上記で明らかにした参照文献はすべて、それらが本発明の１つまたは複数の実施形態の実施に重要である可能性がある組成物および／または方法について記載し、示し、その基礎をもたらし、またはそれを可能にする限りにおいて、参照により本明細書に明白に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に従って、逆転写酵素反応で使用する制御配列およびプライマー配列のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に従って、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ ＲＴを、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す様々な酵素と組み合わせて使用したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態に従って、４ｋｂおよび６ｋｂの鋳型ポリヌクレオチドを増幅する際に、ＲＮアーゼＨ活性が低いＭ−ＭＬＶ ＲＴ、および様々な量の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを使用したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図４】図４は、本発明の一実施形態に従って、４ｋｂの鋳型ポリヌクレオチドを増幅する際に、ＡＭＶ ＲＴ、および様々な量の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩイプシロンサブユニットを使用したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図５】図５Ａ〜図５ＺＺは、本発明の一実施形態に従った、種々の有用なイプシロンサブユニットのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。これらの図は、種々のイプシロンサブユニットのアミノ酸配列アラインメントも示す。
【図６】図６は、本発明の一実施形態に従った、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ由来およびサーマトガ マリティマ（Thermatoga maritima）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ由来のイプシロンサブユニットのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2008500818.tif 000011
【図５Ｃ】
2008500818.tif 000012
【図５Ｄ】
2008500818.tif 000013
【図５Ｅ】
2008500818.tif 000014
【図５Ｆ】
2008500818.tif 000015
【図５Ｇ】
2008500818.tif 000016
【図５Ｈ】
2008500818.tif 000017
【図５Ｉ】
2008500818.tif 000018
【図５Ｊ】
2008500818.tif 000019
【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図５Ｍ】
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【図５Ｎ】
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【図５Ｏ】
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【図５Ｐ】
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【図５Ｑ】
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【図５Ｒ】
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【図５Ｓ】
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【図５Ｔ】
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【図５Ｕ】
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【図５Ｖ】
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【図５Ｗ】
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【図５Ｘ】
2008500818.tif 000033
【図５Ｙ】
2008500818.tif 000034
【図５Ｚ】
2008500818.tif 000035
【図５ＡＡ】
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【図５ＢＢ】
2008500818.tif 000037
【図５ＣＣ】
2008500818.tif 000038
【図５ＤＤ】
2008500818.tif 000039
【図５ＥＥ】
2008500818.tif 000040
【図５ＦＦ】
2008500818.tif 000041
【図５ＧＧ】
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【図５ＨＨ】
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【図５ＩＩ】
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【図５ＪＪ】
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【図５ＫＫ】
2008500818.tif 000046
【図５ＬＬ】
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【図５ＭＭ】
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【図５ＮＮ】
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【図５ＯＯ】
2008500818.tif 000050
【図５ＰＰ】
2008500818.tif 000051
【図５ＱＱ】
2008500818.tif 000052
【図５ＲＲ】
2008500818.tif 000053
【図５ＳＳ】
2008500818.tif 000054
【図５ＴＴ】
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【図５ＵＵ】
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【図５ＶＶ】
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【図５ＷＷ】
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【図５ＸＸ】
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【図５ＹＹ】
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【図５ＺＺ】
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【図６】
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【配列表】
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