(57)【要約】  本発明は、配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７のヘプタペプチドパターンと形質導入ドメインからなり、又は配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７のヘプタペプチドパターンを含み、キメラポリペプチドであること、前記アミノ酸Ｘ７が前記ポリペプチドのＣ末端の５及び３５アミノ酸の間に位置すること、及びドメイン（ｂ）がパターン（ａ）に関してＣ末端に位置すること、を特徴とする相互作用ポリペプチドに関する。本発明は、細胞の表現型を修飾することができる相互作用ポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法及び表現型スクリーニング又は治療目的のための前記相互作用ポリペプチドの使用に関する。最後に、本発明は、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖウイルスタンパク質の機能を修飾することができる相互作用ポリペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の要素：
（ａ）配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７を有するヘプタペプチドモチーフと；
（ｂ）形質導入ドメインと；
を含み、キメラポリペプチドであること、アミノ酸Ｘ７が前記ポリペプチドのＣ末端から５ないし３５のアミノ酸であること、及びドメイン（ｂ）がモチーフ（ａ）に関してＣ末端側に位置すること、を特徴とする相互作用ポリペプチド。
【請求項２】
前記モチーフがランダムプロセスによって規定される配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の相互作用ポリペプチド。
【請求項３】
（ｃ）安定化ドメイン；をさらに含み、前記安定化ドメインが前記ポリペプチドのヘプタペプチドに関してＮ末端側に位置することを特徴とする、請求項１に記載の相互作用ポリペプチド。
【請求項４】
前記要素（ａ）と（ｂ）及び／又は（ａ）と（ｃ）の間にリンカーが挿入されていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の相互作用ポリペプチド。
【請求項５】
前記リンカーが５未満のアミノ酸を含有する配列であり、少なくとも２０％のアミノ酸グリシン又はプロリンを含むことを特徴とする、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記形質導入ドメインがＨＩＶ−Ｔａｔタンパク質の形質導入ドメインであることを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記形質導入ドメインが配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含むことを特徴とする、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記安定化ドメインが配列ＭＳＤＱＥＡＫＰＳＴＥＤＬＧＤＫＫＥＧＥＹＩＫＬＫＶＩＧＱＤＳＳＥＩＨＦＫＶＫＭＴＴＨＬＫＫＬＫＥＳＹＣＱＲＱＧＶＰＭＮＳＬＲＦＬＦＥＧＱＲＩＡＤＮＨＴＰＫＥＬＧＭＥＥＥＤＶＩＥＶＹＱＥＱＴ（配列番号１）を含み、又は配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項３から７の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
アミノ酸Ｘ７が前記ポリペプチドのＣ末端から１０と３０アミノ酸の間にあることを特徴とする、請求項１から８の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸Ｘ７が前記ポリペプチドのＣ末端から１５と２５アミノ酸の間にあることを特徴とする、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
以下の配列：
ＮＸ１ＷＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｃ
（Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、天然又は修飾アミノ酸から独立に選択されるアミノ酸であり、Ｘ４及び／又はＸ５はシステインであり、Ｗはトリプトファンである。）を有するモチーフ（ａ）を含む、請求項１から１０の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記システインが好ましくはＸ５位に存在する、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
モチーフ（ａ）として、以下の配列ＦＷＦＣＧＬＫ（配列番号２）、ＮＷＬＣＣＬＮ（配列番号３）、ＦＷＦＣＧＬＡ（配列番号２７）、ＡＷＬＣＣＬＮ（配列番号２５）、ＮＷＬＣＣＬＡ（配列番号２６）、ＦＷＦＣＧＡＫ（配列番号４５）、ＦＷＦＣＧＡＡ（配列番号４６）、ＮＷＡＣＣＬＮ（配列番号４７）、ＮＷＬＡＣＬＮ（配列番号４８）、ＡＷＡＣＣＬＮ（配列番号４９）、ＡＷＬＡＣＬＮ（配列番号５０）、ＡＷＬＣＣＬＡ（配列番号５１），ＮＷＡＡＣＬＮ（配列番号５２）、ＮＷＡＣＣＬＡ（配列番号５３）、ＮＷＬＡＣＬＡ（配列番号５４）、ＡＷＡＡＣＬＮ（配列番号５５）、ＡＷＡＣＣＬＡ（配列番号５６）、ＡＷＬＡＣＬＡ（配列番号５７）、ＮＷＡＡＣＬＡ（配列番号５８）及びＡＷＡＡＣＬＡ（配列番号５９）から選択される配列を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ＦＷＦＣＧＬＫＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号４）、ＮＷＬＣＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号５）、ＦＷＦＣＧＡＫＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６０）、ＦＷＦＣＧＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６１）、ＦＷＦＣＧＡＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６２）、ＡＷＬＣＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６３）、ＮＷＡＣＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６４）、ＮＷＬＡＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６５）、ＮＷＬＣＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６６）、ＡＷＡＣＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６７）、ＡＷＬＡＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６８）、ＡＷＬＣＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６９）、ＮＷＡＡＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７０）、ＮＷＡＣＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７１）、ＮＷＬＡＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７２）、ＡＷＡＡＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７３）、ＡＷＡＣＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７４）、ＡＷＬＡＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７５）、ＮＷＡＡＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７６）及びＡＷＡＡＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７７）から選択される配列を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列：ＮＸ１ＷＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｃ
（Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、天然又は修飾アミノ酸から独立に選択されるアミノ酸であり、Ｘ４及び／又はＸ５はシステインであり、Ｗはトリプトファンである。）を有するヘプタペプチドを含み、Ｒｅｖタンパク質又はそのドメインの一つの相互作用するポリペプチド。
【請求項１６】
前記Ｒｅｖタンパク質がＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＳＨＩＶ又はＦＩＶのＲｅｖタンパク質である、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ヘプタペプチドがツーハイブリッド酵母試験においてＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質と相互作用することができ、前記ポリペプチドがＨＩＶ−１ウイルスの複製をインビボで阻害することができる、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ヘプタペプチドの配列が、以下の配列：ＦＷＦＣＧＬＫ（配列番号２）、ＮＷＬＣＣＬＮ（配列番号３）、ＦＷＦＣＧＬＡ（配列番号２７）、ＡＷＬＣＣＬＮ（配列番号２５）、ＮＷＬＣＣＬＡ（配列番号２６）、ＦＷＦＣＧＡＫ（配列番号４５）、ＦＷＦＣＧＡＡ（配列番号４６）、ＮＷＡＣＣＬＮ（配列番号４７）、ＮＷＬＡＣＬＮ（配列番号４８）、ＡＷＡＣＣＬＮ（配列番号４９）、ＡＷＬＡＣＬＮ（配列番号５０）、ＡＷＬＣＣＬＡ（配列番号５１）、ＮＷＡＡＣＬＮ（配列番号５２）、ＮＷＡＣＣＬＡ（配列番号５３）、ＮＷＬＡＣＬＡ（配列番号５４）、ＡＷＡＡＣＬＮ（配列番号５５）、ＡＷＡＣＣＬＡ（配列番号５６）、ＡＷＬＡＣＬＡ（配列番号５７）、ＮＷＡＡＣＬＡ（配列番号５８）及びＡＷＡＡＣＬＡ（配列番号５９）から選択される、請求項１５又は１６に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
集団の各メンバーが請求項１、２又は３に記載のポリペプチドによって構成され、又は請求項１、２又は３に記載のポリペプチドを含み、前記ヘプタペプチド配列のみによって他のメンバーから区別される、相互作用分子の集団。
【請求項２０】
前記集団が少なくとも１００個の異なる分子、好ましくは少なくとも１０００個の異なる分子を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の相互作用分子の集団。
【請求項２１】
各メンバーが以下の配列：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＰＧＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６）を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の相互作用分子の集団。
【請求項２２】
各メンバーが以下の配列：
ＭＳＤＱＥＡＫＰＳＴＥＤＬＧＤＫＫＥＧＥＹＩＫＬＫＶＩＧＱＤＳＳＥＩＨＦＫＶＫＭＴＴＨＬＫＫＬＫＥＳＹＣＱＲＱＧＶＰＭＮＳＬＲＦＬＦＥＧＱＲＩＡＤＮＨＴＰＫＥＬＧＭＥＥＥＤＶＩＥＶＹＱＥＱＴＡＲＰＰＮＰＫＫＥＩＥＬＧＧＧＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＰＧＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７）を含み、又は
各メンバーが以下の配列：
ＭＳＤＱＥＡＫＰＳＴＥＤＬＧＤＫＫＥＧＥＹＩＫＬＫＶＩＧＱＤＳＳＥＩＨＦＫＶＫＭＴＨＬＫＫＬＫＥＳＹＣＱＲＱＧＶＰＭＮＳＬＲＦＬＦＥＧＱＲＩＡＤＮＨＴＰＫＥＬＧＭＥＥＥＤＶＩＥＶＹＱＥＱＴＡＲＧＧＧＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＰＧＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７８）を含むことを特徴とする、請求項１９から２１の何れか一項に記載の相互作用分子の集団。
【請求項２３】
請求項１から２２に記載のポリペプチドのうち何れか一つをコードする配列を含む核酸分子。
【請求項２４】
薬物として使用するための、請求項１から１８の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１から１８の一項に記載のポリペプチドを活性成分として含む、薬学的又は獣医用調製物。
【請求項２６】
注射可能溶液の形態で梱包された、請求項２５に記載の薬学的調製物。
【請求項２７】
静脈内又は経口投与用の、請求項２５に記載の薬学的調製物。
【請求項２８】
他の動物種におけるＨＩＶ又は相同ウイルスによる感染を治療するための薬物を製造するための、請求項１から１８の何れか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２９】
ｉ．請求項１から１４及び１９から２２の何れか一項に記載の相互作用ポリペプチドを、前記細胞の存在下に置くことと；
ｉｉ．前記細胞の表現型の修飾を検出することと；
ｉｉｉ．必要に応じて、前記ポリペプチドのヘプタペプチドモチーフの配列を決定することと；
を含む、細胞の表現型を修飾することができるポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法。
【請求項３０】
「前記存在下に置くこと」が、前記細胞による相互作用ポリペプチドの合成であることを特徴とする、請求項２９に記載のスクリーニング方法。
【請求項３１】
「前記存在下に置くこと」がポリペプチドの細胞外添加であることを特徴とする、請求項２９に記載のスクリーニング方法。
【請求項３２】
細胞内スクリーニングであることを特徴とする、請求項２９に記載のスクリーニング方法。
【請求項３３】
細胞外スクリーニングであることを特徴とする、請求項２９に記載のスクリーニング方法。
【請求項３４】
インビボスクリーニング方法であることを特徴とする、請求項２９に記載のスクリーニング方法。
【請求項３５】
インビトロで実施される方法であることを特徴とする、請求項２９に記載のスクリーニング方法。
【請求項３６】
観察された表現型の変化がレポーター遺伝子によって誘導されることを特徴とする、請求項２９に記載のスクリーニング方法。
【請求項３７】
前記レポーター遺伝子がツーハイブリッドシステムのレポーター遺伝子であることを特徴とする、請求項３６に記載のスクリーニング方法。
【請求項３８】
ｉ．請求項１から１４又は１９から２２の何れか一項に記載のポリペプチドを作製することと；
ｉｉ．作製されたポリペプチドの存在下に標的を置くことと；
ｉｉｉ．ポリペプチドの前記標的との相互作用を検出することと；
ｉｖ．必要に応じて、ヘプタペプチドモチーフの配列を決定することと；
を含む、所定の細胞内標的と相互作用する分子を同定するために分子をスクリーニングする方法。
【請求項３９】
前記相互作用が、例えば、ツーハイブリッドシステムを用いて、表現型の変化を観察することによって、又は存在物のアッセイによって検出される、請求項３８に記載のスクリーニング方法。
【請求項４０】
標的分子を含有する細胞を、請求項１から１４の何れか一項に記載の相互作用ポリペプチドとインビトロで接触させることを含み、前記ポリペプチドが前記標的分子と相互作用するヘプタペプチドモチーフを有する、細胞内標的分子の特性を調節する方法。
【請求項４１】
表現型スクリーニングにおけるプレイとしての、請求項２３に記載の分子の使用。
【請求項４２】
前記表現型スクリーニングがツーハイブリッドスクリーニングであることを特徴とする、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記スクリーニングにおけるベイトがＨＩＶ−Ｒｅｖタンパク質又はそのドメインの一つをコードする配列を含むことを特徴とする、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
前記スクリーニングにおけるベイトが７から１５個のアミノ酸のドメインをコードする配列を含むことを特徴とする、請求項４２に記載の使用。
【請求項４５】
前記ドメインがＮＬＳ（核局在化シグナル）であることを特徴とする、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記ドメインがＮＥＳ（核外移行シグナル）であることを特徴とする、請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
前記ＮＥＳがＨＩＶ−Ｒｅｖタンパク質のＮＥＳであることを特徴とする、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記ＮＥＳが以下の配列：ＬＱＬＰＰＬＥＲＬＴＬ（配列番号８）を有することを特徴とする、請求項４６に記載の使用。
【請求項４９】
ｉ．請求項１から１４又は１９から２２の何れか一項に記載の相互作用ポリペプチドの存在下に標的分子を置くことと；
ｉｉ．前記標的分子と前記相互作用ポリペプチド間の相互作用を検出することと；
ｉｉｉ．候補分子を添加することと；
ｉｖ．前記標的分子と前記相互作用ポリペプチド間の相互作用に対する修飾を検出することと；
を含む、分子内標的分子と相互作用できる候補分子をスクリーニングする方法。
【請求項５０】
前記標的分子と前記相互作用ポリペプチド間の前記相互作用が、例えばツーハイブリッド試験において、レポーター遺伝子を使用することによって観察される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記標的タンパク質がＲｅｖタンパク質であり、前記相互作用ポリペプチドが請求項１５から１８の何れか一項に記載のポリペプチドである、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５２】
ｉ．１９から２２の何れか一項に記載のポリペプチドの集団の異なるメンバーをコードする配列を含む核酸分子を作製することと；
ｉｉ．標的分子をベイトとして含む、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて前記分子をスクリーニングすることと；
ｉｉｉ．相互作用を検出することと；
ｉｖ．必要に応じて、ヒト細胞における相互作用を確認することと；
を含む、細胞内標的分子の特性を調節することができる分子を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、ヘプタペプチドモチーフ（パターン）と細胞透過領域とを含む相互作用ペプチド、並びに、細胞の表現型を修飾することができる相互作用ペプチドを同定するためのスクリーニング方法、及び細胞内標的と相互作用することができるその他の分子を同定するためのスクリーニング方法に関する。本発明は、表現型スクリーニングにおける、又は治療目的のための、上記相互作用ポリペプチドの使用にも関する。最後に、本発明は、Ｒｅｖウイルスタンパク質の機能を修飾することができる相互作用ポリペプチド、及びＲｅｖと相互作用することができるその他の分子を同定するためのスクリーニング方法におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
ペプチドの相互作用は、主として、細胞内及び細胞間の連絡；細胞の機能に必要であり、タンパク質とそのリガンド間の複数の複雑な相互作用を通じて、その環境に適合する。新規タンパク質が同定されても、新規タンパク質に対するパートナーが同定でき、タンパク質の細胞機能が決定できるようになるまでは、この知見も、当初は関心を抱かせるものではないように思われる。
【０００３】
さらに、多くの事例では、タンパク質は、異なるパートナーと相互作用することができる。これらの相互作用から、パートナーの各々について、同一の機能が生じることがあり（例えば、異なるペプチドリガンドをリン酸化するタンパク質）、又は、そこから、完全に異なる機能が生じることもある。これは、細胞中でのそれらの本来の機能とは独立して、ウイルスの侵入点としても作用する膜タンパク質の場合に特に当てはまる。あるタンパク質の機能は、このため、そのタンパク質が相互作用するペプチド又はタンパク質によって主として決定される。
【０００４】
タンパク質相互作用は、一般には、静電的結合、水素結合及び立体的な障害による反発的な相互作用など、様々な結合による、タンパク質上に存在する高度に特異的な部位（２、３のアミノ酸）間の局所的な相互作用の組み合わせである。
【０００５】
あるタンパク質は、あるタンパク質ドメインと特異的に相互作用する場合があり、その結果、このタンパク質は当該ドメインを共有するタンパク質のクラス全体と相互作用する可能性がある。
【０００６】
あるタンパク質について、一般には、少数の天然ペプチドパートナーのみが知られているが、その相互作用能力はずっと重要である。あるタンパク質は、相互作用を作り出すことができ、他のペプチドに対してアクセス可能な多数の部位を有し得る。
【０００７】
このため、新規相互作用パートナーを決定することによって、相互作用を修飾し（速度論、特異性を擾乱、抑制、改善、変化するなど）、又は既存の相互作用を模倣し、又は新規相互作用をもたらすことが可能となり得る。
【０００８】
新規相互作用パートナーの同定は、一般的には、２つの異なる状況下で行われる。
【０００９】
第一のケースでは、細胞内又は細胞外であり得る所定の標的に対して、パートナーが探索される。このようなケースでは、標的と相互作用し得るポリペプチドを産生することが可能である。ポリペプチドが相互作用しなければならない標的タンパク質の構造、電荷分布、誘引および反発力を考慮に入れることによって、そのポリペプチドの配列が決定される。その段階は、通常、分子モデリングによって実施される。そのアプローチには、標的タンパク質の極めて詳細な知見、特に、その三次元構造が必要である。標的に対して、多くの候補ポリペプチドを調べるために、スクリーニングすることも可能である。スクリーニングは、試験ポリペプチドの一つと所定の標的間の相互作用を実証することが可能でなければならない。このようなケースで一般的に使用されるスクリーニングは、所定の標的とポリペプチドの候補が同時に発現される酵母ツーハイブリッドスクリーニングシステム（米国特許ＵＳ−Ａ−５  ５８０  ７３６）である。
【００１０】
第二のケースでは、標的タンパク質が決定されない。すなわち、新規相互作用パートナーは、それらが相互作用する標的タンパク質を知らずに、細胞のある表現型を修飾するそれらの能力に対してスクリーニングすることもできる。その場合には、細胞を介して異なるポリペプチドを発現し、予期される方向で表現型を修飾することが可能なポリペプチドを同定することからなる表現型スクリーニングが使用される（ＵＳ−Ａ−６  １５３  ３８０）。
【００１１】
その状況の変形は、２つの他のタンパク質間の相互作用を抑制、破壊、修飾又は不安定化することができる新規相互作用パートナーをスクリーニングすることからなる。その場合にも、一般に、表現型スクリーニングが使用される。他の２つのタンパク質間の相互作用に対してパートナーが作用する様式は、必ずしも明らかでない。
【００１２】
上記スクリーニングに使用されるべきポリペプチドを作製するために、数多くの構築物が提案されており、特に、その配列がランダムであるモチーフがその中に挿入された一定のタンパク質配列（プラットフォームと称されることがある。）が同時に存在することを特徴とする（国際特許出願ＷＯ−Ａ９６／０２５６１を参照）。その配列を変更することによって、次いで、ポリペプチドの完全なファミリーを作製し、続いて、それらが細胞内で相互作用する能力について検査することが可能である。
【００１３】
細胞内タンパク質に対して新規相互作用パートナーを決定するためにこのアプローチが使用される場合には、新規相互作用パートナーが探索されているタンパク質がその中で発現されている細胞中で検査すべき構築物を発現させることができるクローニング及び形質転換を利用するのが通常である。
【００１４】
治療の分野では、このことは、パートナーの候補が検出されれば、次いで、細胞内部で作用する薬物をそこから作製可能であることを意味する。すなわち、それを細胞中に透過させる手段が発見されるはずである。遺伝子治療は、通常、このステップを容易に達成することができない。相互作用パートナー上への細胞の透過を促進するモチーフを移植することからなる、その他の解決法には、予想不可能な様式で相互作用パートナーを修飾するという欠点がある。この修飾後に、リガンドとして選択されたタンパク質とそれがなお相互作用可能であるという保証はない。
【００１５】
さらなるアプローチは、モデリングによって、タンパク質の模倣物を作製することからなるが、その方法は、完全に開発されたわけではない。さらに、多くの場合、細胞の膜を横切ることができないか、又は容易に横切ることができず、このため、その分子を産生した目的の相互作用をもたらさない分子が産生される。細胞の透過を保証するモチーフをこれらの分子上に移植しなければならないのであれば、上記の場合と同様に、それらの分子がリガンドとして選択されたタンパク質となお相互作用できるという保証はない。
【発明の開示】
【００１６】
本発明の目的は、細胞透過ドメインが相互作用パートナーと会合するように、特定の構造を有する新規相互作用ペプチドを提案することである。最初のスクリーニング後に、このようなパートナーが、目的のパートナーと相互作用可能であることが示されれば、スクリーニングから薬物の作製への移行によって、スクリーニング工程中に実証された相互作用を擾乱するリスクがある新しいモチーフが付加されることはない。
【００１７】
本発明の相互作用ペプチドは、（例えば、リンパ球及び／又はマクロファージ中への）細胞透過及びパートナーとの相互作用という二重の性質を有している。
【００１８】
本発明者らは、ヘプタペプチドモチーフを有し、ウイルス又は細胞起源のタンパク質標的に結合することによって、その活性を阻害できる小タンパク質を作製することができる方法を開発した。これらの小タンパク質は、細胞中に透過できるように設計された。
【００１９】
本発明の相互作用ポリペプチドは、安定化ドメイン、リンカー又はその他の成分も有し得る。
【００２０】
本発明は、ある表現型を修飾し、又はある標的と相互作用することができる新規ポリペプチドを作製するための異なるスクリーニング方法も提案する。本発明は、あるタンパク質標的と相互作用できる化学分子をスクリーニングする方法も提案する。
【００２１】
このようなパートナーの決定が重要であるドメインはウイルスの複製である。ヒト又は動物細胞中でのある種のウイルスの複製は、限られた数のウイルスタンパク質の発現によって可能となり、このウイルスタンパク質の幾つかは、このプロセスを引き起こす上で不可欠な活性を有する。本発明のスクリーニングに従って確定され、このため、細胞中に透過し、他のウイルス又は細胞のタンパク質との必要な接触を抑制する相互作用ポリペプチドにより、それらのタンパク質を遮断することによって、ウイルスの複製を抑制することが可能となる。
【００２２】
本発明を実施すると、Ｒｅｖタンパク質、特にＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質と相互作用することができ、このため、ウイルス複製を抑制することができるパートナーを同定することが可能であった。これらのポリペプチドも、本発明の一部を構成する。
【００２３】
本発明は、ある種の癌に関与する様々なタンパク質と相互作用できるパートナーを同定することを目的とした方法において実施することもできる。
【００２４】
本発明に関連して、以下の用語を以下のように定義する。
【００２５】
ヘプタペプチド又はヘプタペプチドモチーフ：共有結合された連続する７つのアミノ酸の直線状の連なり；
（ペプチド）ドメイン：それを含む配列中に、欠失−変異分析によって確定され得る少なくとも５つのアミノ酸を含むペプチド配列。このようなドメインは、一般に、機能又は役割に関与しており、その変異が機能の喪失を引き起こす不可欠なアミノ酸の存在によって特徴付けられる。例としては、核の多くのタンパク質中に存在するＮＬＳ（核局在化シグナル）ドメイン、細胞透過ドメイン、ＮＥＳ（核外移行シグナル）ドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン及び触媒ドメインを挙げることができる。
【００２６】
細胞透過又は形質導入ドメイン又はモチーフ：インビボ、エキソビボ又はインビトロで、当該ドメインを含有するタンパク質の細胞中への透過を引き起こすことが可能な、５から３５個のアミノ酸を含むペプチド配列。
【００２７】
細胞透過を確実にするために、ドメインは、タンパク質の一端、例えば、Ｃ末端に配置しなければならないことがある。細胞透過機能は、タンパク質内におけるモチーフの位置とは無関係なこともある。細胞透過機能は、おそらく、一定のタンパク質サイズに限定され、これを超えると、透過がもはや確保されなくなる。
【００２８】
細胞透過モチーフは、全ての細胞種に対して一般的であるか、又はある種の膜、例えば、原核細胞の膜、若しくはグラム陽性若しくはグラム陰性細菌の膜、若しくはリンパ球、例えば、初代リンパ球及び／又はマクロファージなどのある種のヒト細胞種の膜に特異的である。
【００２９】
透過モチーフは、真核細胞の核内への透過も確保し得る。
【００３０】
安定化ドメイン又はモチーフ：その二次構造が長期間且つある種のストレス条件下において安定的であり、それを含む任意のキメラタンパク質を安定化する能力を有する、少なくとも３０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列。特に、その構造は、変性並びにプロテアーゼによる分解及びストレス条件一般に対して影響を受けないものでなければならない。この構造は、そのドメイン中に、又はそのドメインの末端に挿入した場合に、ごく僅かしか擾乱されてはならない。安定化ドメインは、免疫原性が低いという性質によっても特徴付けられる。好ましくは、安定化ドメインは、比較的サイズが大きくなく、このため、３００未満のアミノ酸、好ましくは２００未満のアミノ酸を有する。
【００３１】
一般に、多くの場合、安定化ドメインは、細胞中に存在する天然タンパク質の断片であり、このタンパク質は、豊富に存在し、遍在し、分解プロセスに関与していない細胞内タンパク質から選択されなければならない。
【００３２】
ランダム配列：ランダムプロセスによって規定又は構築される配列。
【００３３】
ＤＮＡ配列のケースでは、ランダム配列は４つの候補から１つずつデオキシリボ核酸を選択することからなり、各候補は選択される確率が同じであるか（等確率）、又は同じでない（偏った選択）。遺伝コードの縮重のため、４塩基が等しい確率を有するランダムＤＮＡ配列は、ランダムなペプチド配列をもたらすが、複数のコドンによってコードされるアミノ酸が他のアミノ酸と比べて多く出現するので、偏りが生じる。
【００３４】
２１塩基（すなわち、７アミノ酸）のランダムＤＮＡ配列が一致して停止コドンを含有しない確率は７１．５％である。
【００３５】
ランダムな様式で規定されるのは、ペプチド配列でもあり得る。すなわち、アミノ酸は、順に、等しい確率で、又は等しくない確率で、全ての可能なアミノ酸からの選択によって決定される。
【００３６】
ベイト：ベイトとは、互いに相互作用できる新規分子を決定することを目的としたスクリーニングにおいて、それに対するリガンドがスクリーニングを用いて探索される、予め確定された所定の分子である。
【００３７】
ベイトは、レポーターとして作用する分子に融合させてもよく、融合させなくてもよい。
【００３８】
プレイ：この同じスクリーニングにおいて、プレイとは、所定のベイトと相互作用する能力について検査される分子である。
【００３９】
プレイは、レポーターとして作用する分子に融合させてもよく、融合させなくてもよい。
【００４０】
ツーハイブリッドシステム：これは、当初、酵母で開発されたスクリーニングであるが、その原理は、他の細胞種にも適合させ得る。
【００４１】
ツーハイブリッド標的では、ベイトをコードするＤＮＡ配列が、第一のドメイン「Ｄ１」をコードする「ｄ１」配列にインフェーズで融合される。プレイをコードする配列は、第二のドメイン「Ｄ２」をコードする配列「ｄ２」にインフェーズで融合される。「Ｄ１」及び「Ｄ２」ドメインは、それらの組み合わせ「Ｄ１＋Ｄ２」が、要素「Ｄ１」及び「Ｄ２」が別々には有しない特定の特性又は機能を有することを特徴とする。「Ｄ１」及び「Ｄ２」の組み合わせは、それらが接触して配置し、維持するために、外的な介入を必要とする。翻訳後、ベイト（「Ｄ１」に融合されている）とプレイ（「Ｄ２」に融合されている）の相互作用が生じると、「Ｄ１」と「Ｄ２」の組み合わせが生じるであろう。この組み合わせ「Ｄ１＋Ｄ２」から得られる特定の特性又は機能は、ベイトとプレイ間の相互作用を実証することが可能である。
【００４２】
キメラペプチド：本来、同一タンパク質中では隣接していない少なくとも２つのアミノ酸配列の共有的な融合を含むポリペプチド。共有的な融合は、直接又は間接（リンカーを介する）共有結合によって達成され得る。
【００４３】
同一細胞の２つのタンパク質に由来する２つの配列、又は近い属若しくは遠い属の細胞（例えば、異なる動物種）に由来する２つのタンパク質に由来し、又は真核細胞タンパク質の配列と原核細胞から得られる他の配列に由来する２つの配列も想定され得る。そのタンパク質中に本来存在しない合成配列と、そのタンパク質の配列との共有的融合も想定され得る。
【００４４】
リンカー：一般的には、１から１０個のアミノ酸、好ましくは１から５個のアミノ酸を含み、それが隔てるポリペプチドの２つのドメイン間に存在する極めて短いアミノ酸配列。リンカーは、それらが隔てる２つのドメインを機能的に妨害しないように選択される。リンカーの使用は、各ドメインが互いに独立に三次元の折り畳みを採れるようにするためにも特に推奨される。
【００４５】
側鎖の立体的な障害が極めて少なく、且つ反応性が低いので、リンカーは、一般に、グリシンアミノ酸が豊富である。プロリンも、屈曲を形成し易いため、リンカーが隔てる２つのドメインがさらに大きな独立性を有するという性質故に、リンカーの中に極めて高い頻度で挿入される。
【００４６】
２つのタンパク質配列間のパーセント同一性：このパーセントは、配列全体に沿った２つのアミノ酸配列間の同一性の程度を表す。検討されている配列が異なるサイズを有する場合には、％同一性は、最も長い配列の全長の関数として表される。％同一性を計算するために、２つの配列は、有限長のギャップを用いて、同一のアミノ酸の数を最大化させるように重ね合わせられ、次いで、同一アミノ酸の数を、最も長い配列中のアミノ酸の総数で割る。この定義が、本明細書中で使用される定義である。
【００４７】
第一の側面において、本発明は、配列ＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｃ（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７はアミノ酸である。）を有するヘプタペプチドモチーフと、細胞透過ドメインとを含む相互作用ペプチドに関する。本発明の相互作用ポリペプチドはキメラポリペプチドであり、その「キメラの」性質は、ヘプタペプチドモチーフと細胞透過ドメインの融合に由来する。すなわち、この連続は、何れのタンパク質においても天然には存在しない。
【００４８】
さらに、本発明のポリペプチドは、細胞透過ドメインに関する、ヘプタペプチドモチーフの具体的な配置によって特徴付けられる。実際、アミノ酸Ｘ７は、ポリペプチドのＣ末端から５ないし３５、好ましくは７ないし２５、より好ましくは９ないし２０、例えば１２ないし１５のアミノ酸に見出され、細胞透過ドメインは、ヘプタペプチドモチーフに関してＣ末端に位置する。形質導入ドメインは、前記相互作用ポリペプチドのＣ末端に配置され得る。形質導入ドメインは、Ｃ末端にではなく、ヘプタペプチドモチーフに関してＣ末端に配置することもできる。例えば、形質導入ドメインの後には、Ｈｉｓタグ又は相互作用ポリペプチドの精製又は検出を可能とする別のモチーフが続くこともできる。
【００４９】
本発明の相互作用ポリペプチド中に存在するヘプタペプチドは、７アミノ酸の連続である。好ましくは、前記アミノ酸は、天然に存在する２０のアミノ酸から選択される。しかしながら、本発明においては、修飾されたアミノ酸も取り込ませることができる。
【００５０】
一例として、ヘプタペプチドモチーフは、ランダムプロセスによって作製される、ヘプタペプチドは、それ自体ランダムプロセスによって生成されるＤＮＡ配列によってコードされることもできる。これに対して、ヘプタペプチドモチーフは、必要に応じて、分子モデリング工程の後に、相互作用ポリペプチドが予め決められたタンパク質と相互作用する能力についてスクリーニングされる場合、完全に選択され、予め決定することができる。
【００５１】
特に、モチーフがランダムプロセスによって生成されたＤＮＡ配列によってコードされる場合には、モチーフに対して７アミノ酸の長さは特に有利である。ＤＮＡ配列がランダムな様式で生成される場合には、これによって、停止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡ）が産生されることがある。７アミノ酸（すなわち、２１ヌクレオチド）の長さは、相互作用可能なドメインが産生されるのには十分な長さを保ちながら、比較的に少ない停止コドンと無用な配列を産生する。このため、ヘプタペプチドモチーフの長さに関して７という数は、有利な妥協点であると思われる。
【００５２】
７という数のさらなる有利さは、この長さの配列は免疫原性である確率が殆どないという事実に存する。主要組織適合複合体クラスＩ（ＭＨＣクラス１）によって提示される抗原は、最小８又は９のアミノ酸長を有すること、すなわち、ヘプタペプチドの長さより長いことが知られている。
【００５３】
本発明の相互作用ポリペプチドは、このように、少なくとも１２から４２のアミノ酸を含む。このサイズのポリペプチドは、時折、細胞中では不安定な場合があり、それらは、抗菌ペプチドなどの２、３のペプチドを除き、プロテアーゼの標的になりやすいことが一般に認められている。このため、本発明の相互作用ポリペプチドは、好ましくは、この集合を安定化させ得る分子に連結される。好ましくは、このような安定化は、安定化ドメインを相互作用ポリペプチド配列と一体化させることによって達成される。
【００５４】
安定化ドメインは、安定化ドメインを含むポリペプチドの長期的な安定性が、安定化ドメインを持たない同じポリペプチドの安定性より大きいことによって特徴付けられる。安定化ドメインは、ストレス条件下、例えばインビトロ又はインビボで起り得る変性及び切断条件下でのその安定性によっても特徴付けられる。ある安定化ドメインは、例えば、このようなドメインを含有する相互作用パートナーが、摂食の際又は血流中を通過する際に安定であるように、腸媒質又は絹媒質（ｓｅｒｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）などのある種の生物媒質中での安定性に関して選択することもできる。その安定化の役割とは独立に、安定化ドメインは、検出を可能とする特性を有することもできる。
【００５５】
安定化ドメインのさらなる利点は、組換えタンパク質を大量且つ安定な形態で産生できる細菌中又は別の生物中で産生されるその能力である。
【００５６】
好ましい安定化ドメインには、天然のタンパク質の断片が含まれる。ある種のタンパク質は、特に、細胞中に豊富であり、遍在的で、非免疫原性で、安定である。このため、このようなタンパク質の断片は、安定化ドメインとして使用するのに特に好ましい。これは、ユビキチンファミリー（ユビキチン様）から得られるタンパク質に関して特に当てはまる。
【００５７】
相互作用ポリペプチドがある細胞中に導入されるべきときには、前記細胞中に存在するタンパク質又は該細胞がその一部を形成している種に属するタンパク質の断片を、安定化ドメインとして選択することが特に有利であることが示されている。このため、本発明では、ヒト又は動物細胞中に存在するタンパク質の断片から得られる安定化ドメインを選択することが有利である。
【００５８】
本発明者らは、ジグリシンモチーフ及びこのモチーフの下流にある全ての配列を除去するために、そのＣ末端部分が末端切断されたユビキチンファミリーのあるメンバーが、安定化ドメインとして極めて有利な特性を有することを実証した。
【００５９】
本発明において特に好ましいタンパク質は、ＳＵＭＯ−１として知られているユビキチン相同体である。本発明において得に適切なＳＵＭＯ−１の断片は、ジグリシンモチーフ及びその下流にある全配列が末端切断された、図６に記載されている断片（配列番号１）である。本発明において安定化ドメインとして使用する場合、上記配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する任意の配列が特に有利である。
【００６０】
他のタンパク質又はタンパク質断片、特に、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）などのシャペロンタンパク質を、この「安定化ドメイン」機能に適合させることもできる。
【００６１】
安定化ドメインの使用に対する一つの代替策は、同じ安定化効果を得るために、相互作用パートナーを環状化することである。「環状化」という用語は、ヘプタペプチドドメインの上流にあるＮ末端部分を、相互作用ポリペプチドのＣ末端にペプチド融合することを意味する。
【００６２】
本発明によれば、リンカーと称される極めて短いアミノ酸配列が、安定化ドメイン（安定化ドメインが存在する場合）とヘプタペプチドモチーフの間、又はヘプタペプチドと形質導入ドメインの間に存在すべきことが想定される。これらのリンカーは、主として、ポリペプチドの様々なドメインを連結することを目的としている。
【００６３】
この役割は、このため、例えば、一方のドメインとも、他方のドメインとも相互作用しない十分な数のアミノ酸により、例えば、ドメインを単純に隔てることによって、ドメイン間に相互作用が存在しないようにドメインを隔離することである。次いで、この二つのドメインは、他のドメインの存在によって影響されない様式で折り畳まれ得る。
【００６４】
特に、屈曲を形成することによって、あるドメインから別のドメインにある特定の位置を強制することも、リンカーの役割であり得、同じく、一般的には、あるドメインから他のドメインを隔離する結果がもたらされる。
【００６５】
最後に、前記ドメインは、ある種のプロテアーゼ、好ましくは細胞内プロテアーゼによる切断のための部位として知られるアミノ酸も含み得る。このアプローチは、細胞の透過後に、リンカー部位を切断することによって、２つのドメインの分割を可能とし得る。
【００６６】
逆に、例えば、透過工程前に細胞透過ドメインに対して起り得る切断を回避するために、プロテアーゼに対して特に抵抗性があるようにリンカーを選択することもできる。
【００６７】
好ましくは、本発明のリンカーは、主に、低い反応性、低障害性アミノ酸（すなわち、２、３の原子のみを含有する側鎖を有するアミノ酸、これは、特に、アミノ酸グリシン及びプロリンの場合に該当する。）を含む。さらに、プロリンは、一般的に、その中に挿入された鎖中に屈曲を形成し、あるドメインを別のドメインから隔離するためにこの特性が活用される。
【００６８】
好ましくは、本発明のリンカーは、５個以下のアミノ酸を含む。
【００６９】
本発明のリンカーは、タンパク質の様々な機能的部分の間にある程度の柔軟性を導入することができる。
【００７０】
本発明に対して特に適切であるリンカーは、５個未満のアミノ酸と少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも５０％のアミノ酸グリシン及びプロリンとを含む。ある状況では、本発明のリンカーは、グリシン及びプロリンから選択されるアミノ酸のみを含む。一例として、本発明のリンカーは、配列ＧＧＧＧ又はＰＧ（Ｇはグリシンを表し、Ｐはプロリンを表す。）を有することができ、その配列は、慣習的に、Ｎ末端からＣ末端へと記載される。
【００７１】
本発明の相互作用ポリペプチドは、そのＣ末端に見出される５から３５のアミノ酸の細胞透過ドメインを含む。この細胞透過ドメインによって、ポリペプチドは細胞中に透過することが可能となる。
【００７２】
この目的のために、文献に記載されている様々なドメインを使用し得る。本発明において使用するのに特に好ましいドメインは、ＨＩＶ−Ｔａｔ−タンパク質の透過ドメイン、又は同じ活性を有する他のウイルス株から得られるドメイン中に見出される。
【００７３】
ＨＩＶ−Ｔａｔタンパク質中の細胞透過ドメインは、以下の配列ＮＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣ（配列番号９）によって特徴付けられる（アミノ酸を表すために、一文字コードが使用されている。）。本発明は、特に透過特性を改善し、プロテアーゼに対する抵抗性を増加させ、又は起り得る免疫反応を低減するために、幾つかのアミノ酸が変異された先行する配列に実質的に対応する細胞透過ドメインの使用も想定している。
【００７４】
本発明の相互作用ポリペプチドの細胞内透過ドメインは、配列ＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ又はＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（７から９アミノ酸−アルギニン）を有するポリアルギニンモチーフを含み、その透過の役割はリンパ球において実証されている（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。
【００７５】
本発明において想定される、さらなる形質導入ドメインは、Ｔａｔの形質導入ドメインの配列に部分的に対応するが、幾らかの修飾：ＲＲＫＡＲＲＱＲＲＲ（配列番号２１）を組み込む配列を有する。
【００７６】
本発明の相互作用ポリペプチドの具体的な構築は、ポリペプチドのＣ末端から１０ないし３０アミノ酸、好ましくはＣ末端から１２ないし２８、より好ましくは１５ないし２５アミノ酸の間にヘプタペプチドモチーフのアミノ酸Ｘ７を配置することからなる。
【００７７】
本発明の相互作用ポリペプチドに対する安定化ドメインの選択に関して、特に適切なドメインはＳＵＭＯ−１タンパク質である。好ましくは、使用される安定化ドメインは、図６に配列が示されているＳＵＭＯ−１タンパク質の断片（配列番号１）、又はこの配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは９０％の同一性を有する任意のドメインである。
【００７８】
本発明において使用し得るさらなるドメインは、図６に示されている配列によって規定されるユビキチン断片である。
【００７９】
他のドメイン又は要素も、相互作用ポリペプチドの一部を有利に形成し、又は相互作用ポリペプチドに有利に移植される。特に、ポリペプチドの配列中に位置指定配列、又はその検出及びモニタリング、例えば、その局在化若しくは分解を促進する配列を取り込むことが特に有利である。想定され得る検出促進配列の例は、容易に検出できる酵素的な特性、または所定の抗体との反応性、又は蛍光特性を有する配列である。例えば、ポリヒスチジン尾部又はＨｉｓ−Ｔａｇを与えることによって、ポリペプチドの精製を促進する配列をポリペプチドの配列中に移植し、又は取り込むことも想定され得る。
【００８０】
ある種の細胞へ本発明のポリペプチドを優先的に送達することができる位置指定シグナルも、本発明において特に有利である。特に魅力的な標的細胞は、リンパ球、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、幹細胞、筋肉細胞などである。このような位置指定シグナルは、安定化ドメインの一部を形成することができる。位置指定シグナルは、安定化ドメイン、リンカー、ヘプタペプチド及び透過ドメインの他に、本発明のポリペプチドの一部を形成することもできる。あるいは、一部の細胞種に対して特異的又は優先的である細胞透過ドメインを使用してもよい。
【００８１】
ヘプタペプチドモチーフに対して特に好ましい配列としては、以下の特性のうち少なくとも一つを有する配列を挙げることができる。Ｘ２がアミノ酸トリプトファンであり、Ｘ４及び／又はＸ５がアミノ酸システインである。本発明の他の配列は、アミノ酸Ｘ５がロイシンである。好ましくは、ヘプタペプチドモチーフの配列は、Ｘ２にトリプトファン、Ｘ４及び／又はＸ５にシステインを含む。ヘプタペプチドモチーフは、好ましくは、上記３つの特徴を有する。
【００８２】
本発明において特に好ましいヘプタペプチド配列は、以下のような、ＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質と相互作用するヘプタペプチド配列である。
【００８３】
ＮＦＷＦＣＧＬＫＣ（配列番号２）、ＮＮＷＬＣＣＬＮＣ（配列番号３）、ＮＫＬＧＣＦＷＦＣ（配列番号１０）、ＮＮＬＣＣＬＷＮＣ（配列番号１１）、ＮＦＷＦＣＧＬＡＣ（配列番号２７）、ＮＡＷＬＣＣＬＮＣ（配列番号２５）、ＮＮＷＬＣＣＬＡＣ（配列番号２６）、ＦＷＦＣＧＡＫ（配列番号４５）、ＦＷＦＣＧＡＡ（配列番号４６）、ＮＷＡＣＣＬＮ（配列番号４７）、ＮＷＬＡＣＬＮ（配列番号４８）、ＡＷＡＣＣＬＮ（配列番号４９）、ＡＷＬＡＣＬＮ（配列番号５０）、ＡＷＬＣＣＬＡ（配列番号５１）、ＮＷＡＡＣＬＮ（配列番号５２）、ＮＷＡＣＣＬＡ（配列番号５３）、ＮＷＬＡＣＬＡ（配列番号５４）、ＡＷＡＡＣＬＮ（配列番号５５）、ＡＷＡＣＣＬＡ（配列番号５６）、ＡＷＬＡＣＬＡ（配列番号５７）、ＮＷＡＡＣＬＡ（配列番号５８）及びＡＷＡＡＣＬＡ（配列番号５９）。
【００８４】
単一のアミノ酸を置換することによって上記配列から得られる７アミノ酸の配列も好ましい。
【００８５】
本発明の相互作用ポリペプチドに対して特に好ましい配列としては、以下のものを挙げることができる。
【００８６】
ＦＷＦＣＧＬＫＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号４）、ＮＷＬＣＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号５）、ＦＷＦＣＧＡＫＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６０）、ＦＷＦＣＧＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６１）、ＦＷＦＣＧＡＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６２）、ＡＷＬＣＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６３）、ＮＷＡＣＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６４）、ＮＷＬＡＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６５）、ＮＷＬＣＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６６）、ＡＷＡＣＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６７）、ＡＷＬＡＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６８）、ＡＷＬＣＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６９）、ＮＷＡＡＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７０）、ＮＷＡＣＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７１）、ＮＷＬＡＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７２）、ＡＷＡＡＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７３）、ＡＷＡＣＣＡＬＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７４）、ＡＷＬＡＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７５）、ＮＷＡＡＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７６）及びＡＷＡＡＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７７）。
【００８７】
このように、本発明のポリペプチドは、細胞と接触されたときに、外的な介在なしに、細胞内部に透過する能力を有している。本発明のポリペプチドは、細胞内又は細胞外であり得るタンパク質又はタンパク質ドメインと相互作用する能力も有する。
【００８８】
さらに、ポリペプチド自体の構造が、特に、ヘプタペプチドモチーフである可変部分に関して、大きな柔軟性を保証する。このモチーフは、実際には、ポリペプチドのＣ末端部分から３５アミノ酸未満、好ましくは２５アミノ酸未満に配置される。ポリペプチドのより中央部分に比べて、高次構造上のストレスがより少ない、ポリペプチド部分中のこの有利な位置は、ヘプタペプチドがより大きな折り畳みの自由を有することを保証する。この自由の増加は、その標的に対する適合能力の増加をもたらす可能性が極めて高い。ヘプタペプチドの各末端におけるストレスが低いと、ある高次構造から別の高次構造へと移行するためのエネルギー障壁が低くなるので、ヘプタペプチドは、より多くの高次構造を採ることができる。この柔軟性は、与えられたヘプタペプチドについて異なる高次構造を採る可能性をもたらし、このため、標的との相互作用の確率を高める。
【００８９】
さらなる側面において、本発明は、より具体的には、Ｒｅｖタンパク質の複製を阻害するためにＲｅｖタンパク質と相互作用することができ、ヘプタペプチド配列ＮＸ１ＷＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｃ（Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、天然又は修飾アミノ酸から独立に選択されるアミノ酸であり、Ｘ４及び／又はＸ５はシステインであり、Ｗはトリプトファンである。）からなり、又はヘプタペプチド配列ＮＸ１ＷＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｃを含むことを特徴とするペプチドに関する。好ましくは、Ｘ５はシステインである。
【００９０】
Ｒｅｖタンパク質は、ウイルスＨＩＶタイプの系統、例えばＨＩＶ−１若しくはＨＩＶ−２、又はＳＩＶタイプ（サル免疫不全ウイルス）、ＳＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルスとサル免疫不全ウイルスのハイブリッド）、ＦＩＶ（ネコ免疫不全ウイルス）又はＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質と相同なタンパク質を有する他の任意のウイルス系統のものである。Ｒｅｖタンパク質は、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２又はＢＬＶの等価なＲｅｘタンパク質でもあり得る。
【００９１】
このようなペプチドは、酵母ツーハイブリッド系においてＲｅｖタンパク質と相互作用できる配列を含み、又は酵母ツーハイブリッド系においてＲｅｖタンパク質と相互作用できる配列からなる。さらに、これらのペプチドは、インビボでウイルスの複製を阻害することもできる。好ましいヘプタペプチド配列は、以下のとおりである。
【００９２】
ＮＦＷＦＣＧＬＫＣ（配列番号２）、ＮＮＷＬＣＣＬＮＣ（配列番号３）、ＮＦＷＦＣＧＬＡＣ（配列番号２７）、ＮＡＷＬＣＣＬＮＣ（配列番号２５）、ＮＮＷＬＣＣＬＡＣ（配列番号２６）、ＦＷＦＣＧＡＫ（配列番号４５）、ＦＷＦＣＧＡＡ（配列番号４６）、ＮＷＡＣＣＬＮ（配列番号４７）、ＮＷＬＡＣＬＮ（配列番号４８）、ＡＷＡＣＣＬＮ（配列番号４９）、ＡＷＬＡＣＬＮ（配列番号５０）、ＡＷＬＣＣＬＡ（配列番号５１）、ＮＷＡＡＣＬＮ（配列番号５２）、ＮＷＡＣＣＬＡ（配列番号５３）、ＮＷＬＡＣＬＡ（配列番号５４）、ＡＷＡＡＣＬＮ（配列番号５５）、ＡＷＡＣＣＬＡ（配列番号５６）、ＡＷＬＡＣＬＡ（配列番号５７）、ＮＷＡＡＣＬＡ（配列番号５８）及びＡＷＡＡＣＬＡ（配列番号５９）。
【００９３】
酵母ツーハイブリッド試験において、ペプチドがＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質と相互作用する能力を検査するために、実験の部でさらに展開されている、以下の試験を実施することができる。
【００９４】
ベイト：プラスミドｐＬｅｘＲｅｖ（実施例１参照）；
プレイ：試験ペプチドをコードする配列と融合しているＧＡＬ４の活性化ドメインを含有するプラスミド、例えば、ｐＧＡＤ４２４由来のプラスミド。
【００９５】
酵母：Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＦ７ｃ株
実施例１は、この試験に対して想定され得る作業条件に関して、さらに詳しい情報を提供する。
【００９６】
ペプチドがウイルスの複製をインビボで阻害する能力を調べるために、実施例の部でさらに詳しく記載されている、以下の試験を実施することができる。
【００９７】
細胞：ヒト細胞、末梢血単核球；
ウイルス：ＨＩＶ−１−ＬＡＩというリンパ球向性株（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ；１９８３）；
プロトコール；５つの濃度の試験ペプチド中で、細胞を３０分間前処理した後、ＨＩＶ−１−ＬＡＩ株に感染させる。培養を通じて、このペプチドを培地中に維持し、感染から７日後に細胞上清を集め、逆転写活性を測定する。本試験を実施するために使用できる作業条件、濃度及び緩衝液に関して、実験の部に、さらに詳しい情報が記載されている。
【００９８】
配列ＦＷＦＣＧＬＫＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号４）、ＮＷＬＣＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号５）、ＦＷＦＣＧＡＫＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６０）、ＦＷＦＣＧＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６１）、ＦＷＦＣＧＡＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６２）、ＡＷＬＣＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６３）、ＮＷＡＣＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６４）、ＮＷＬＡＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６５）、ＮＷＬＣＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６６）、ＡＷＡＣＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６７）、ＡＷＬＡＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６８）、ＡＷＬＣＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号６９），ＮＷＡＡＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７０）、ＮＷＡＣＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７１）、ＮＷＬＡＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７２）、ＡＷＡＡＣＬＮＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７３）、ＡＷＡＣＣＡＬＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７４）、ＡＷＬＡＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７５）、ＮＷＡＡＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７６）及びＡＷＡＡＣＬＡＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７７）を含むポリペプチドが、Ｒｅｖタンパク質の阻害剤又は調節物質として使用するのに特に好ましく、ＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質が特に好ましい。
【００９９】
このようなペプチドは、一般的にはＲｅｖタンパク質、又はおそらくそのドメインの一つのうち何れかと相互作用することが可能である。前記タンパク質は、一般的には、異なる機能を時折有する異なるドメインがそれらの配列内に存在することを特徴とする。タンパク質が採る三次元構造及び折り畳みに応じて、これらのドメインは、互いに独立したパートナーにアクセス可能な場合がある。
【０１００】
この類似の状況は、単一のタンパク質の様々なエピトープに対して起って、異なるモノクローナル抗体の生成を可能とし、様々なエピトープが、タンパク質の互いに異なるドメインであり、互いにアクセスすることが可能である。
【０１０１】
Ｒｅｖタンパク質中にはＮＥＳと称されるシグナル又は核内移行シグナルが同定されており、核外からのタンパク質の配送を確保する。このシグナルは、本願において提供されるドメインの定義を充足する。このため、ペプチドは、Ｒｅｖタンパク質と一般的に相互作用するか、又はＲｅｖタンパク質のＮＥＳドメインと特異的に相互作用する。ＮＥＳタンパク質は、配列ＮＬＱＬＰＰＬＥＲＬＴＬＤＣ（配列番号８）によって定義される（一文字コードは、使用されるアミノ酸を表す。）。
【０１０２】
さらなる側面において、本発明は、本発明の相互作用ポリペプチドのファミリー又は本発明の相互作用分子の集団にも関し、ファミリー／集団のメンバーは、ヘプタペプチドモチーフの配列のみが他のメンバーと異なる相互作用ポリペプチドである。
【０１０３】
同じファミリー／集団の様々なメンバーは、このため、それらの貫通ドメイン、それらの安定化ドメイン（これを有する場合）及び存在し得るそれらのリンカーが同一である。ファミリー／集団は、ヘプタペプチドモチーフの配列のみが異なる少なくとも２つのメンバーの存在によって規定される。しかしながら、ファミリーは、一般的には、３以上のメンバー、一般的には少なくとも１０、好ましくは少なくとも５０のメンバーを含む。本発明に属する特に好ましいファミリーは、少なくとも１００、好ましくは１０００の異なるメンバーを含むファミリーである。これは、同一である一定数のメンバーを有するファミリー又は集団を除外するものではない。
【０１０４】
ヘプタペプチドモチーフが、２０個の天然アミノ酸から選択される７アミノ酸によって構成される場合には、本発明に規定されるファミリー又は集団は、最大２０７個の異なるメンバーを含む。
【０１０５】
このようなファミリーの利点は、ヘプタペプチドモチーフがメンバーの唯一の可変部であるとすれば、ファミリーの各メンバーの異なる特性に関して、ヘプタペプチドモチーフのみが関与するということである。
【０１０６】
好ましくは、本発明の相互作用ポリペプチドファミリーは、ＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＰＧＫＫＲＲＱＲＲＲＧＣ（配列番号６）を含み、配列ＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｃは、本発明に規定されるヘプタペプチドモチーフに対する配列に対応し、配列ＰＧＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号１２）は、リンカー及び細胞透過ドメインに対する配列に対応する（一文字コードは、使用されるアミノ酸を表す。）。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、アミノ酸を表す。ヘプタペプチドドメインは、同じくファミリーのメンバーである別のポリペプチドと比べて、ファミリー（又は集団）のメンバーであるポリペプチド中の唯一の可変領域である。
【０１０７】
より好ましくは、相互作用ポリペプチドファミリーは、その配列が以下の配列を含み、又は以下の配列からなるメンバーを含む。
【０１０８】
ＭＳＤＱＥＡＫＰＳＴＥＤＬＧＤＫＫＥＧＥＹＩＫＬＫＶＩＧＱＤＳＳＥＩＨＦＫＶＫＭＴＴＨＬＫＫＬＫＥＳＹＣＱＲＱＧＶＰＭＮＳＬＲＦＬＦＥＧＱＲＩＡＤＮＨＴＰＫＥＬＧＭＥＥＥＤＶＩＥＶＹＱＥＱＴＡＲＰＰＮＰＫＫＥＩＥＬＧＧＧＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＰＧＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７）、又は配列ＭＳＤＱＥＡＫＰＳＴＥＤＬＧＤＫＫＥＧＥＹＩＫＬＫＶＩＧＱＤＳＳＥＩＨＦＫＶＫＭＴＴＨＬＫＫＬＫＥＳＹＣＱＲＱＧＶＰＭＮＳＬＲＦＬＦＥＧＱＲＩＡＤＮＨＴＰＫＥＬＧＭＥＥＥＤＶＩＥＶＹＱＥＱＴＡＲＧＧＧＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＰＧＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号７８）。配列ＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｃに対応するヘプタペプチドモチーフは、ファミリーのある負メンバーが別のメンバーと異なっている唯一の領域である。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、アミノ酸を表す。
【０１０９】
このファミリーの相互作用ポリペプチドは、「ＳＵＭＯ−１ヘプタペプチドタンパク質形質導入ドメイン」又はＳＨＰと称される。
【０１１０】
配列ＰＧＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号１２）は、本発明のポリペプチドに対する細胞透過ドメインを含む。この配列と比較して３未満の修飾を有する配列も、本発明において好ましい配列である。「修飾」という用語は、アミノ酸の付加若しくは除去、又は別のアミノ酸による、この配列のアミノ酸の置換を意味する。
【０１１１】
配列：ＭＳＤＱＥＡＫＰＳＴＥＤＬＧＤＫＫＥＧＥＹＩＫＬＫＶＩＧＱＤＳＳＥＩＨＦＫＶＫＭＴＴＨＬＫＫＬＫＥＳＹＣＱＲＱＧＶＰＭＮＳＬＲＦＬＦＥＧＱＲＩＡＤＮＨＴＰＫＥＬＧＭＥＥＥＤＶＩＥＶＹＱＥＱＴＡＲＰＰＮＰＫＫＥＩＥＬＧＧＧＧＳ（配列番号１６）は、相互作用ポリペプチドのための安定化ドメインを含む。安定化ドメインを含む別の配列は、ＭＳＤＱＥＡＫＰＳＴＥＤＬＧＤＫＫＥＧＥＹＩＫＬＫＶＩＧＱＤＳＳＥＩＨＦＫＶＫＭＴＴＨＬＫＫＬＫＥＳＹＣＱＲＱＧＶＰＭＮＳＬＲＦＬＦＥＧＱＲＩＡＤＮＨＴＰＫＥＬＧＭＥＥＥＤＶＩＥＶＹＱＥＱＴＡＲＧＧＧＧＳ（配列番号７９）である。前記配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する配列も、本発明のポリペプチドのファミリーの安定化ドメインを構成するために使用され得る配列である。
【０１１２】
本発明は、単独で存在する、若しくはファミリー若しくは集団の一部を形成する、本発明のポリペプチドをコードする全てのＤＮＡ配列、又は本発明に記載されている他の任意の断片若しくはドメインをコードする全てのＤＮＡ配列にも関する。ＤＮＡ配列は、二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＤＮＡであり得る。本発明において、一本鎖ＤＮＡは、この配列又は相補的配列がコーディング部分を含有するときに、一本鎖ＤＮＡはポリペプチドをコードすると考えられる。ＤＮＡ配列は、直鎖又は環状形態であり、例えば、プラスミド中に存在し得る。
【０１１３】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の転写から得ることができる様々なＲＮＡも、本発明に含まれる。
【０１１４】
本発明に規定されている相互作用ポリペプチドは、細胞の挙動を修飾するために、予め決定され、又は予め決定されていないタンパク質パートナーとの潜在的な相互作用能力を有する。細胞内では、特に競合的阻害剤として作用することによって、このようなポリペプチドの存在は、このため、ある種の細胞機能を遮断できるようにすることができる。前記細胞の修飾が細胞中の有害な機能を弱め、又は妨げることからなる場合には、この作用は多数の疾病において治療効果を有する。細胞外のポリペプチドの存在が、メッセンジャー又は細胞表面上のタンパク質との相互作用によって、細胞の特性を修飾することも想定される。
【０１１５】
このため、上記本発明のポリペプチドは、薬物中の活性成分としてそれらを使用することができる治療の分野において有利に適用される。本発明のポリペプチドには、薬学的に許容される様々な賦形剤が伴われることが多い。「治療」という用語は、治療及び予防目的の両方を意味する。
【０１１６】
Ｒｅｖタンパク質との相互作用について特異的に検査される本発明の相互作用ポリペプチドは、ＨＩＶによる感染に対する治療、好ましくはヒトの治療で使用するために、さらに好ましい。本発明のポリペプチドは、Ｒｅｖタンパク質又は近縁の相同体を有するＨＩＶの相同体であるウイルスに感染した動物を治療するために、獣医用途に使用することもできる。それらは、予防的に使用することもできる。
【０１１７】
細胞を透過するための手段、すなわち、それらの透過ドメインを有するように、それらが特異的に設計されている場合には、限定なく、様々な形態で投与することができる。それらは、特に、錠剤、カプセル若しくはシロップの形態で摂取されることができ、又はローション、ゲル若しくはポマードの透過によって、筋肉又は静脈内に注入することができる。他の任意の投与形態も想定することができる。それらは、リポソームの形態でパッケージした後、その形態で投与することもできる。
【０１１８】
薬物が、本発明の相互作用ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子からなり得ることも除外されない。これは、遺伝子治療が実施されるときに、特に当てはまる。
【０１１９】
本発明は、それ自身の上に、又はファミリーの一部を形成して、本発明のポリペプチド又は本発明に記載されている他の任意の断片若しくはドメインを含有する細胞、並びに前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する細胞にも関する。好ましい細胞は、リンパ球及びマクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞又は幹細胞であり、好ましくは、このような細胞は、哺乳動物から、特にヒトから得られる細胞である。他の細胞は酵母細胞及び細菌細胞である。
【０１２０】
上記種類の細胞は、形質転換、遺伝子治療によって、又は細胞と本発明の相互作用ポリペプチドとの接触によって取得することができる。このような細胞は、治療において、特に有利な用途を有する。本発明の相互作用ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された細胞、特に細菌細胞が、前記ポリペプチドを産生する上で特に有利である。細菌中で産生されたポリペプチドは、次いで、必要に応じて精製され、薬物中の活性成分として使用することができる。
【０１２１】
さらなる側面において、本発明は、上記相互作用ポリペプチドを含むスクリーニング方法にも関する。これらのポリペプチドは、それらが検査されるタンパク質標的に対して作用するように特異的に設計される。
【０１２２】
本発明によって想定される第一のスクリーニング方法は、細胞の表現型を修飾することができるポリペプチドを同定することを目的とする。
【０１２３】
この方法は、その表現型が修飾されるべき細胞と、本発明のポリペプチドを接触させる工程を含む。この工程の後には、細胞の表現型の変化を検出する。これらの工程には、検査されているポリペプチドの配列中に含まれるヘプタペプチドモチーフの配列を決定する工程が必要に応じて補充される。
【０１２４】
「表現型」という用語は、その広い意味で使用され、細胞のあらゆる形態的又は機能的特徴を包含する。表現型の修飾は、細胞の形状の変化、膜の組成の修飾、特定のタンパク質の分泌、色の変化又はある条件下での反応性の変化によって特徴付けられ得る。
【０１２５】
本方法は、細胞の表現型を、一般的な様式で、修飾できるポリペプチドを同定することを目的とする。それは、予測された修飾又は所望の修飾であり得る。それは、驚くべき修飾又は所望でない修飾であり得る。
【０１２６】
本方法の一応用によれば、本発明は、あるタンパク質と相互作用できるポリペプチドを同定するために使用することができる。このような状況では、その標的とのポリペプチドの相互作用は、予想される表現型の修飾、例えば、細胞死、又は抗生物質、若しくはウイルス若しくは熱に対する耐性若しくは感受性をもたらすことができる。必要に応じて、前記相互作用は、レポーター、特にレポーター遺伝子を介して実証することができる。このレポーター要素は、表現型への修飾に必要であり、その修飾は予測されている。
【０１２７】
本方法は、あるタンパク質の群、又は、例えば代謝経路若しくはある免疫カスケードと相互作用できるポリペプチドを同定するために使用することもできる。このような状況では、表現型に対する予想される修飾は、群の機能の修飾又は経路若しくは免疫カスケードの修飾である。このような修飾の効果は、常に予め決定されているとは限らない。
【０１２８】
スクリーニング方法の開始時に修飾の正確な性質を決定せずに、ポリペプチドをスクリーニングする本発明の方法を使用して、例えば、細胞に対する有益な修飾を調べることが可能である。
【０１２９】
本発明の第一の工程は、本発明のポリペプチドを細胞の存在下に置くことを特徴とする。「存在下に置く」という用語は、ポリペプチドを細胞に近接させることからなる動作、接触、及びポリペプチドを細胞中に導入することからなる動作を意味する。「存在下に置く」という表現には、ポリペプチドをコードするＤＮＡを細胞中に導入し、次いで、このＤＮＡが翻訳されて、ポリペプチドを生じる場合も含まれる。この状況では、細胞自体がポリペプチドを生成することに寄与する。
【０１３０】
このため、本方法の第一の工程は、その表現型が修飾されるべき細胞を含有する培地にポリペプチドを細胞外添加することによって、例えば、細胞を含有する液体にポリペプチドを添加することによって実施される。本発明のポリペプチドは透過ドメインを有するので、必要であれば、細胞の膜を横切ることができる。
【０１３１】
記載されている方法は、細胞外スクリーニング方法又は細胞内スクリーニング方法である。ポリペプチドとその標的間の相互作用が細胞中で起るのであれば、ポリペプチドが細胞外から添加されるか、又は細胞内に導入されるか否かとは無関係に、スクリーニングは細胞内であると考えられる。これに対して、ポリペプチドとその標的間の相互作用が細胞外（例えば、その表面上）で起るのであれば、スクリーニングは細胞外と考えられる。
【０１３２】
本発明のスクリーニング方法は、インビボ又はインビトロで実施することができる。本発明のスクリーニング方法がインビボで実施されるときには、ポリペプチドと細胞は、細胞を含む液体又は前記細胞を含有する組織の存在下にポリペプチドを置くことによって接触させることができる。
【０１３３】
本発明の方法の特に好ましい用途は、ツーハイブリッドスクリーニングシステムを使用することである。相互作用ポリペプチドの形態のパートナーが探索されている標的タンパク質が公知であり、その配列が決定されているときに、この用途が推薦される。次いで、標的タンパク質と本発明の相互作用ポリペプチド間の相互作用を検出することが可能である。このような相互作用は、その発現が表現型を修飾するレポーター遺伝子の誘導によって、例えば、細胞の色の変化により簡単に検出できる様式で、一般に明瞭となる。
【０１３４】
本方法の特に好ましい用途は、Ｒｅｖタンパク質を含むウイルスタンパク質に対して新規相互作用パートナーをスクリーニングする分野である。このようなタンパク質は、様々なウイルス、特にＨＩＶ中に見出される。この用途では、Ｒｅｖタンパク質をコードする遺伝子は、ベイトとして作用するように、例えば、ツーハイブリッド系にクローニングされる。このようなスクリーニングは、宿主細胞中でのウイルス複製を抑制又は制限することによって、ＨＩＶによる感染に対する耐性を細胞に与えることができるポリペプチドを同定し得る。
【０１３５】
本方法のさらなる用途は、スリーハイブリッドスクリーニング系を使用することからなる。このような系では、その相互作用が公知である２つのペプチドパートナーをツーハイブリッド系にクローニングし、第三のプラスミドが本発明の相互作用パートナーを含む。後者は、前二者のパートナー間の相互作用を修飾する能力について検査される。ツーハイブリッドスクリーニングに対するレポーター系を使用することによって、２つのペプチドパートナー間の相互作用に対する前記相互作用パートナーの作用を観察及び測定することが可能である。
【０１３６】
本発明によって包含される第二の方法は、分子をスクリーニングして、所定の細胞内標的と相互作用する分子の一つを同定する方法である。
【０１３７】
このような方法は、本発明のポリペプチドを作製するための第一の工程を含む。このようにして作製されたポリペプチドは、細胞内標的の存在下に置かれ、ポリペプチドと標的間の相互作用を検出した後、ポリペプチドのヘプタペプチドの配列を必要に応じて決定する。
【０１３８】
前記ポリペプチドは、ポリペプチドを細胞中に導入することによって直接的に、又はポリペプチドを細胞の存在下に置いた後、細胞中にポリペプチドを透過させることによって間接的に、標的の存在下に置くことができる。
【０１３９】
検出工程は、当業者に公知である任意の技術を用いて実施することができる。想定され得る一つの検出の種類は、表現型の変化の観察である。表現型の修飾がレポーター遺伝子の発現の結果であるように、標的を適合させ得る。検出には、存在物のアッセイ、例えば、タンパク質又は代謝物のアッセイも含まれ得る。
【０１４０】
本発明の第一の方法に関して記載された様々な好ましい用途又は特徴は、この第二の方法についても当てはまる。特に、本方法は、インビボ又はインビトロで実施することができる。本方法は、ツーハイブリッド系を用いて実施されることが好ましい。最後に、このようなスクリーニング方法の好ましい用途は、ウイルスの複製に不可欠なウイルスタンパク質、より具体的には、ＨＩＶのＲｅｖタンパク質と相互作用できる相互作用分子を同定することを目的とする。
【０１４１】
本発明によって包含される第三の方法は、細胞内標的分子の特性を調節する方法である。このような方法は、標的分子を含有する細胞を、本発明の相互作用ポリペプチドの存在下に置く工程を含む。
【０１４２】
標的分子は、好ましくは、タンパク質、又は少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸を含むタンパク質の断片である。本発明のポリペプチドは、標的分子と相互作用できるヘプタペプチドモチーフを有するように特異的に設計されている。このようなヘプタペプチドモチーフは、本発明の第一のスクリーニング方法を実施することによって有利に決定される。
【０１４３】
「特性を調節する」という用語は、その機能又はその特性に影響を与え得る標的に対する任意の修飾を意味し、特に、そのパートナーと相互作用するその能力を修飾する修飾を意味する。また、ある種の条件下で、多かれ少なかれ安定性を引き起こす修飾、酵素の速度論に対する修飾、又は特異性若しくは選択性に対する修飾を意味する。
【０１４４】
既述のように、本発明の第一の方法に関して記載された様々な特徴又は好ましい用途は、この第三の方法についても当てはまる。特に、本方法は、インビボ又はインビトロで実施することができる。本方法は、ツーハイブリッド系を用いて実施されることが好ましい。最後に、このような方法の好ましい用途は、ウイルス複製に不可欠なウイルスタンパク質、特にＨＩＶのＲｅｖタンパク質の特性を修飾することを目的とする。
【０１４５】
さらなる側面において、本発明は様々な使用に関する。特に、本発明は、次いで翻訳されたポリペプチドが表現型スクリーニングにおいてプレイとして作用するように、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を使用することを含む。好ましくは、前記ＤＮＡ配列は、ツーハイブリッド系にクローニングされる。
【０１４６】
実際に、ツーハイブリッド系は、一般に「ベイト」と称される、ある分子（タンパク質）と候補となる試験パートナー（一般的に、「プレイ」と称される。）との相互作用を調べることを特徴とする。ツーハイブリッド系は、一般的に、ベイト、プレイ及び他の要素に特異的に結合されたレポーター遺伝子をコードする配列を細胞中に導入することを含む。この文脈において、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、プレイとして使用することができる。
【０１４７】
本発明において特に好ましい状況は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をツーハイブリッド系におけるプレイとして使用することからなる。この状況において、ベイトとなり得るのは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＲｅｖタンパク質である。実際に、このウイルスタンパク質は、新規阻害剤を同定するための特に興味深い標的である。より具体的には、本発明は、このように、ツーハイブリッド系において、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をＨＩＶのＲｅｖタンパク質とともに使用することを想定する。
【０１４８】
上述のように、本発明のポリペプチドと、あるタンパク質（例えば、ＨＩＶ−Ｒｅｖ）との調査された相互作用は、タンパク質の全部又は特定のドメインの何れかを含み得る。このように、本発明では、標的タンパク質のドメインをコードする配列を一つだけベイトとしてクローニングすることが想定される。この戦略は、同定されるべきそのドメインに対して特異的な相互作用ポリペプチドを可能とする。
【０１４９】
実際に、本発明者らは、２つのポリペプチドのサイズが同等であるときに、２つのポリペプチド間の相互作用の可能性が増加することを発見した。本発明の相互作用ポリペプチドは、おそらくは、透過モチーフによって生成される相互作用の組み合わせとともに、相互作用に関与するかなり短い配列、すなわち７アミノ酸のヘプタペプチドを有する。この理由のため、相互作用ポリペプチドは、同じようなサイズのドメインを有する同じようなサイズのポリペプチドと、好ましい様式で相互作用できるために、特に推奨される。
【０１５０】
ツーハイブリッド系における相互作用ポリペプチドの特に有利な使用は、このように、５から３０個のアミノ酸、好ましくは６から２０、より好ましくは７から１５のアミノ酸のドメインをコードする配列を、ベイトのために使用する。このようなドメインは、例えば、結合ドメイン、位置指定シグナル（ａｄｄｒｅｓｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）又は触媒ドメインである。
【０１５１】
これらの使用において特に好ましいドメインのさらなる例は、ＮＬＳ（核局在化シグナル）である。さらなる好ましいドメインは、ＮＥＳ（核外移行シグナル）である。このようなＮＥＳドメインは、特に、ＨＩＶのＲｅｖタンパク質のＮＥＳドメインである。多かれ少なかれ同じ程度が類似し、規模が同じ程度のサイズの配列を有する他の「ＮＥＳ」シグナルが知られている。２つのドメインＮＬＳ及びＮＥＳは、本発明のポリペプチドとの相互作用に対して最適なサイズと完璧に適合するサイズを有する。
【０１５２】
ＮＥＳドメインに対する具体的な配列は、ＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質、ＬＱＬＰＰＬＥＲＬＴＬＤ（配列番号８）のものである。
【０１５３】
ＨＩＶのＲｅｖタンパク質が、それに対する相互作用パートナーを探索する標的タンパク質であるときには、ベイトとして作用させるために、Ｒｅｖタンパク質をツーハイブリッドスクリーニング中にＲｅｖタンパク質のドメイン、好ましくはｒｅｖのＮＥＳドメインをクローニングすることが特に有利である。
【０１５４】
本発明は、候補分子から、ある細胞内標的と相互作用できる分子を同定するためのスクリーニング方法にも関する。本発明の本側面によれば、細胞内標的の、本発明の相互作用ポリペプチドとの相互作用特性が活用される。本方法に従って、標的と相互作用ポリペプチド間のこの相互作用における変動は、候補試験分子を添加したときに、検出されることになる。標的と相互作用ポリペプチド間の相互作用の修飾は、候補分子が細胞内標的と相互作用する能力を与え得る。この用途において、ある細胞内標的と相互作用できる本発明の相互作用ポリペプチドは、性質がタンパク質様であってもよく、タンパク質様でなくてもよい、前記細胞内標的と相互作用することも可能な新規薬物を同定するためのツールとして作用する。本発明は、このように、以下の工程：
ｉ．本発明の相互作用ポリペプチドの存在下に標的分子を置くことと；
ｉｉ．前記標的分子と前記相互作用ポリペプチド間の相互作用を検出することと；
ｉｉｉ．候補分子を添加することと；
ｉｖ．前記標的分子と前記相互作用ポリペプチド間の相互作用に対する修飾を検出することと；
を含む。
【０１５５】
本方法によれば、特に高処理量スクリーニングによって、異なる候補分子を検査することが可能である。標的分子と本発明の相互作用ポリペプチド間の相互作用は、任意の適切な手段を用いて、特にレポーター遺伝子を用いて検出することができる。慣用の様式で、「ツーハイブリッド」系が使用される。このような状況では、標的分子と相互作用ポリペプチド間の相互作用は、レポーター遺伝子を用いて検出される。
【０１５６】
本方法を実施するために、一旦、標的分子が固定されれば、予備的な段階で、前記標的分子と相互作用できる本発明の相互作用ポリペプチドを同定することが有利であり得る。
【０１５７】
本発明は、タンパク質分子、ポリヌクレオチド、例えば、１０００未満の分子量を有する小有機分子、脂質、糖質など、この方法によって同定される候補分子も包含する。
【０１５８】
本発明の特に好ましい実施形態に従えば、細胞内標的分子はＲｅｖタンパク質であり、使用される相互作用ポリペプチドは、本発明に定義されているとおりであり、好ましくは以下のヘプタペプチド配列のうち一つを有する。ＮＦＷＦＣＧＬＫＣ（配列番号２）、ＮＮＷＬＣＣＬＮＣ（配列番号３）、ＮＦＷＦＣＧＬＡＣ（配列番号２７）、ＮＡＷＬＣＣＬＮＣ（配列番号２５）、ＮＮＷＬＣＣＬＡＣ（配列番号２６）、ＦＷＦＣＧＡＫ（配列番号４５）、ＦＷＦＣＧＡＡ（配列番号４６）、ＮＷＡＣＣＬＮ（配列番号４７）、ＮＷＬＡＣＬＮ（配列番号４８）、ＡＷＡＣＣＬＮ（配列番号４９）、ＡＷＬＡＣＬＮ（配列番号５０）、ＡＷＬＣＣＬＡ（配列番号５１）、ＮＷＡＡＣＬＮ（配列番号５２）、ＮＷＡＣＣＬＡ（配列番号５３）、ＮＷＬＡＣＬＡ（配列番号５４）、ＡＷＡＡＣＬＮ（配列番号５５）、ＡＷＡＣＣＬＡ（配列番号５６）、ＡＷＬＡＣＬＡ（配列番号５７）、ＮＷＡＡＣＬＡ（配列番号５８）及びＡＷＡＡＣＬＡ（配列番号５９）。  一例として、使用される相互作用ポリペプチドは、表記ＳＨＰＲで、実験の部に記載されているものの一つである。
【０１５９】
本発明は、細胞内標的分子の特性を調節することができる分子を同定するための方法にも関する。本方法は、以下の様々な工程によって特に特徴付けられる。
【０１６０】
第一の工程において、本発明の相互作用ポリペプチドのファミリーの様々なメンバーをコードする配列を含む核酸分子が作製される。これらの様々なメンバーは、ヘプタペプチドモチーフの配列のみが異なる。
【０１６１】
本方法は、酵母ツーハイブリッド系を用いて、このように作製された分子をスクリーニングすることも含む。この系では、探索されている標的分子と相互作用するパートナーが、ベイトとして使用される。作製された分子は、プレイとして作用する。
【０１６２】
本方法は、相互作用を検出するための工程も含む。この相互作用は、ツーハイブリッド系に含まれるレポーター遺伝子の発現によって明らかにすることもできる。細胞中の表現型の変化又は存在物のアッセイも、相互作用の検出を可能にすることができる。
【０１６３】
必要に応じて、本方法は、ヒト細胞中でこの相互作用を確認することも含む。この工程は、様々な様式で実施することが可能である。一つの様式は、ヒト細胞に適合されたツーハイブリッド系の均等物を作製することからなる。このシステムは、細胞株を用いて有利に実施される。共免疫沈降による相互作用を確認すること、又はこの相互作用によって引き起こされる効果を確認することも想定することが可能である。このようにして、スクリーニングされたポリペプチドは、細胞内標的を含有する細胞の存在下に置かれる。このポリペプチドが、標的とのその相互作用のために、細胞に対する影響を誘導するかどうかが観察される。
【０１６４】
想定され得るその後の工程は、本発明において同定された大量の相互作用ポリペプチドを産生することからなる。このような産生は、例えば、ポリペプチドを過剰発現することができる誘導性プロモーターの作用によって、細菌中で有利に実施される。ポリペプチドは、可溶性形態で又は封入体の形態で産生され得る。哺乳類細胞、例えばＳｆ９細胞中での大量の産生も想定され得る。
【０１６５】
この方法は、ＨＩＶ：Ｔａｔ、Ｒｅｖなどのウイルスタンパク質の機能を修飾することができる相互作用ポリペプチドを検出するのに特に適している。
【０１６６】
このようなケースでは、本発明の相互作用ポリペプチドを取得し、性質を決定する方法は、幾つかの工程で実施され、本発明者らによって使用された、以下の方法を用いて実施することができる。
【０１６７】
標的タンパク質に対する、酵母中でのランダムヘプタペプチドのライブラリーのスクリーニング
そのＮ末端が転写因子（本ケースではＧＡＬ４）の活性化ドメインと融合され、そのＣ末端が塩基性Ｔａｔドメインの９つのアミノ酸と融合されたランダムヘプタペプチドのライブラリーを、酵母発現ベクター中に構築した。酵母中で目的のタンパク質を発現させることができるベクター中で、目的のタンパク質（ウイルス又は細胞性）をコードする配列を、ＤＮＡの結合ドメインをコードする配列（本ケースではＬｅｘＡ）の下流にクローニングする。
【０１６８】
ヘプタペプチドモチーフに付随する塩基性Ｔａｔドメインは、細胞内透過を確保するモチーフとして使用される。様々なドメインが、それらの分割を確保するアミノ酸グリシン又はプロリンによって隔てられるように、タンパク質の最終配列が設計される。標的融合ＬｅｘＡタンパク質（ＬｅｘＡ−Ｔａｔ、ＬｅｘＡ−Ｒｅｖ及びＬｅｘＡ−ＮＥＳ  Ｒｅｖタンパク質を用いて実施される。）を発現するベクターによって、次いで、ランダムヘプタペプチドを有するベクターのライブラリーによって、結合モチーフＬｅｘＡの依存下にあるＨｉｓ及びｌａｃｚレポーター遺伝子を有するＬ４０酵母株を形質転換する。ＨＩＶ−１のＴａｔ及びＲｅｖタンパク質は、ウイルス複製に不可欠な制御タンパク質である。クローンの最初の選択は、無ヒスチジン培地中で行われる。次いで、陽性クローンに対して、フィルター上でβ−ガラクトシダーゼ試験を行う。
【０１６９】
明確に陽性なクローンを回収し、Ｅ．コリ中での形質転換によって、ヘプタペプチドモチーフを含有するベクターを単離する。ベクターを配列決定することによって、ヘプタペプチドモチーフの同定が可能となる。
【０１７０】
哺乳類細胞における相互作用の存在の確認：
酵母環境中で選択されたモチーフがヒト細胞の生化学的状況下でも機能することを確かめるために、上述した試験と類似の試験をＨｅＬａ細胞中で行う。ヒト細胞中で、Ｆｌａｇエピトープ、核局在化シグナル及びタンパク質Ｖｐ１６の活性化因子ドメインをコードする配列の下流をヒト細胞中での発現を可能とするプラスミド中の酵母ベクターから、ヘプタペプチドモチーフを再クローニングする。
【０１７１】
ＬｅｘＡ−標的タンパク質融合物を発現するベクター及びＬｅｘＡ結合配列の制御下にあるレポーター遺伝子ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ）を有するベクターで、この構築物をＨｅＬａ細胞中に同時形質移入する。ＳＥＡＰ活性の測定は、評価されるべきヒト細胞の核内で、ヘプタペプチドが標的細胞と相互作用できるようにする。ヘプタペプチドモチーフを発現するベクターは、この構築物によって形質移入される細胞の抽出物を用いて実施されるイムノブロット実験による評価、評価すべきこのモチーフとの融合タンパク質の発現レベル、確認すべき細胞中でのその安定性を可能にした。これらの実験によって、幾つかのヘプタペプチドモチーフがＴａｔ及びＲｅｖと相互作用できることが確認された。
【０１７２】
ヘプタペプチド／Ｔａｔの塩基性アミノ酸配列の安定化タンパク質との会合：
短い直鎖ペプチドは、細胞外及び細胞内培地中での安定性が乏しい場合がある。この問題を克服するために、本発明者らは、ヒト細胞中において安定で、豊富に存在する小タンパク質に、ヘプタペプチド／塩基性Ｔａｔアミノ酸配列を会合させることを決定した。それらの選択は、まず、ユビキチンファミリーのメンバーに的を絞った。この構築物は、ユビキチン（ｕｂ）そのもの及び相同タンパク質ＳＵＭＯ−１を用いて作製した。これらのタンパク質をコードする配列を、哺乳類細胞に対する発現ベクター中に導入した。喪失されたジグリシンモチーフの場所で、ＳＵＭＯ−１又はユビキチンの下流に、ヘプタペプチド／塩基性Ｔａｔアミノ酸配列を導入する。このジグリシンモチーフは、前記ポリペプチドによって修飾されたタンパク質のリジンの側鎖に通常結合される。ＳＵＭＯ−１特異的Ｔａｔヘプタペプチド融合タンパク質（ＳＨＰＴ）及びＲｅｖ（ＳＨＰＲ）の適切な発現を確認することができた。Ｕｂ構築物の場合、ユビキチンに対して誘導された良い抗体が存在せず、実施されなかった。
【０１７３】
これらの構築物を用いて、本発明者らは、それぞれＲｅｖ及びＴａｔに対して誘導されたＳＨＰＲ及びＳＨＰＴがこれらのタンパク質の機能を抑制することができるかどうかを評価するために、機能的試験を実施した。Ｔａｔの場合、Ｔａｔを発現するベクター及びＣＡＴ配列の前にＨＩＶ−１プロモーターを有する指示構築物とともにＳＨＰＴ発現ベクターを同時形質移入した。６つのうち２つの抗Ｒｅｖ  ＨＳＰＲが、イントロン中のＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）と会合したＣＡＴ配列を有する構築物に対するＲｅｖの効果の完全な阻害を示した。ＲＮＡ  ＲＲＥ配列は、Ｒｅｖタンパク質の結合を可能にした。この種の指示構築物は、スプライシングされていないＲＮＡの細胞質への輸送を引き起こして、ＣＡＴ酵素の発現を可能にすることによって、Ｒｅｖの効果の評価を可能にした。
【０１７４】
ＳＨＰＴ及びＳＨＰＲ相互作用ペプチドの大量生産：
これらの結果に従って、本発明者らは、細胞中に透過し、細胞外培地から始まる標的タンパク質の機能を阻害する能力を評価できるようにするため、相互作用ペプチドを大量に作製するためのシステムを開発した。細菌中での産生を可能とするベクター中に、抗Ｒｅｖ  ＳＵＭＯ−１−ヘプタペプチド／塩基性Ｔａｔドメイン配列をクローニングした。ヘパリンカラム、次いでゲルろ過上で精製するためのプロトコールを確定した。最初の結果は、ＳＨＰＲが大量に産生され、この方法によって精製できることを示した。
【０１７５】
これら２つの分子の巨大バッチの作製によって、評価すべきこれらのタンパク質は薬学的に重要なものとなった。
【０１７６】
ここに記載されているプロセス全体が、確立されるべき標的タンパク質機能のアンタゴニストリガンドを同定する方法の実行を可能にする。得られた相互作用ペプチドは、治療分子として直接使用することができ、又は、それらの構造を模倣する小有機分子を開発するためのモデルとして働き得る。
【０１７７】
図１に示されている模式図は、使用された様々な工程と構築物を要約している。工程及び構築物は、例として挙げられており、当業者であれば、著しい困難なしに、均等物によって適合し、又は置き換えることが可能である。
【実施例１】
【０１７８】
ＨＩＶ−１のＴａｔ及びＲｅｖタンパク質と相互作用するペプチドを同定するために使用された構築物及び作業状況の記載
ＨＩＶ−１は、細胞の重要な因子に対するその作用がウイルス粒子の迅速且つ効果的な産生を確保する幾つかの制御タンパク質を発現する。２０年にわたる熱心な研究の後、これらの制御タンパク質の様々な作用を誘導する分子的機序を理解する上で、著しい進歩が遂げられた。特に、これらの制御タンパク質のうち２つ、すなわち、Ｔａｔ及びＲｅｖタンパク質に興味が持たれた。
【０１７９】
転写因子及びウイルスＲＮＡの５’末端に位置するＴＡＲモチーフとの接触が確立されることによって、Ｔａｔは、組み込まれたプロウイルスの転写を活性化する。
【０１８０】
Ｒｅｖも、ＲＮＡ（このケースでは、ウイルスＲＮＡの３’位内のイントロン位置に存在するＲＲＥモチーフ）及び細胞の核因子と相互作用する二重の能力を有する。このウイルスタンパク質には、核局在化シグナル（ＮＬＳ）と核外移行シグナル（ＮＥＳ）がともに含まれ、核と細胞質間のシャトルとして作用することによって、このタンパク質は核外移行を可能とし、スプライシングされていないウイルスＲＮＡ及び部分的にスプライシングされたウイルスＲＮＡの翻訳を可能とする。
【０１８１】
Ｔａｔ及びＲｅｖは、タンパク質−タンパク質相互作用を介して作用する小タンパク質なので、本発明者らは、これらのタンパク質が関与している会合を競合的に妨害することができるペプチドリガンド（相互作用ペプチド）を用いて、ウイルスの複製に絶対に必要なそれらの機能を阻害することが可能なはずであると推測した。
【０１８２】
二重ハイブリッド（又はツーハイブリッド）検査は、細胞内媒体、特に核内での相互作用を明らかにすることができるので、二重ハイブリッド（又はツーハイブリッド）検査は、このような相互作用ペプチドを選択する第一段階として選択される方法となる。
【０１８３】
ペプチドの使用に関連する重要な問題は、それらの細胞内への透過である。複雑な遺伝子治療操作の使用を回避するために、本発明者らは、タンパク質形質導入ドメイン、より具体的には、本ケースでは塩基性Ｔａｔドメインを付加することによって、スクリーニング工程で細胞透過特性を付加した。この方法により、本発明者らは、Ｔａｔ又はＲｅｖに結合する短いペプチド配列を同定することができた。それらを安定化させるために、これらのペプチド配列をＳＵＭＯ−１と会合させることにより、ＳＵＭＯ−１ヘプタペプチドタンパク質形質導入ドメイン又はＳＨＰと称される小タンパク質が産生され、これは、リンパ球の中に効果的に貫通することが可能となり、そのうち幾つかはＲｅｖの機能を阻害することができる。リンパ球とマクロファージの両者の中でウイルスの複製を阻害することが観察されたこれらのタンパク質は、新たなウイルス粒子の生成の撲滅に使用するための新規治療剤となり得る。
【０１８４】
Ｔａｔタンパク質に対して開発されたＳＨＰは、ＳＨＰＴと名付けられ、Ｒｅｖタンパク質に対して開発されたＳＨＰは、ＳＨＰＲと名付けられた。
【０１８５】
Ｉ．酵母ツーハイブリッドシステム：
Ａ．ランダムペプチドライブラリー：
１−ｐＧＡＤ−ＣＲ構築物：
このプラスミドは、ｐＧＡＤ４２４（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の誘導物であった。このベクターをＥｃｏＲＩ及びＢｇｌｌＩで消化した。
【０１８６】
リンカー領域を含有する断片、ランダム配列に対するクローニング部位及び塩基性Ｔａｔドメインは、以下のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって得られた。
【０１８７】
５’ｐＡＡＴＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＧＴＧＧＴＴＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＧＧＣＣＡＡＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＧＣＡＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＡＴＴＣＴＡＧｐ５’（ｐはリン酸を表す。）。この断片を、ｐＧＡＤ４２４のＥｃｏＲＩ及びＢｇＩＩＩ部位の間に挿入した。
【０１８８】
２−相互作用ペプチド（ｐＧＡＤ−ＣＲ−Ｐ）のライブラリーの構築
ランダム配列断片は、以下の２つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼで修復し、酵素ＢａｍＨＩ及びＸｍａＩで消化することによって作製された。
【０１８９】
５’−ｂＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＧＧＧＴＣＧＣＡＧＴＧ
ＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＣＡＣｂ−５’
（ｂはビオチンを表す。）
ビオチン化された末端を抽出するために、この消化産物を常磁性ストレプトアビジンビーズと混合した。
【０１９０】
上清中に含有されるＢａｍＨＩ−ＸｍａＩ断片を、ｐＧＡＤ−ＣＲベクターのＢａｍＨＩとＸｍａＩ部位の間に挿入し、プラスミドｐＧＡＤ−ＣＲ−Ｐを作製した。
【０１９１】
ＸＬ１−ブルーＥコリ株の中にこの連結産物を形質導入し、アンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に画線した。２×１０６個の独立コロニーを回収し、アンピシリンを含有するＬＢ培地中で１時間培養した。次いで、プラスミドを抽出し、標準的なＰＥＧ操作を用いて精製した。
【０１９２】
Ｂ．ベイト
１．ｐＬｅｘ９ベクター：
このプラスミドは、ｐＧＢＴ９（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の誘導物であった。ＧＡＬ４  ＤＮＡの結合ドメインをＬｅｘＡに対する結合ドメインと交換した（Ｆａｒｊｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。
【０１９３】
２．ｐＬｅｘ−Ｔａｔの構築：
ｐＳＧ−Ｔａｔベクター（Ｖｅｓｃｈａｍｂｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）から得られた、修復されたＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片を、ｐＬｅｘ９のＳａｍＩ及びＢａｍＨＩ部位の間にクローニングした。
【０１９４】
３．ｐＬｅｘＲｅｖ及びｐＬｅｘ−ＮＥＳの構築
これらの構築物は、ＬｅｘＡのものと融合された、完全なＲｅｖ配列（ｐｌｅｘＲｅｖ）又はＮＥＳのもののみ（ｐＬｅｘ−ＮＥＳ）を含有した（Ｆａｒｊｏｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９９）。
【０１９５】
既述のように（Ｒｏｕｓｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １９９８，１６，  ６４３−６５４）、ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＦ７ｃ株の中で、ｐＬｅｘＴａｔ、ｐＬｅｘＲｅｖ又はｐＬｅｘ−ＮＥＳの何れかをベイトとして、及びｐＧＡＤ−ＣＲ−Ｐをプレイとして用いるツーハイブリッドスクリーニングを行った。このコロニーを無ヒスチジン最小培地上で培養し、以前に記載したとおりに（Ｒｏｕｓｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １９９８，１６，  ６４３−６５４）、フィルター上でのアッセイによって、β−ガラクトシダーゼの発現について分析した。陽性コロニーのプラスミドｐＧＡＤ−ＣＲ−Ｐを回収し、ヘプタペプチドモチーフの配列を決定した。
【０１９６】
ＩＩ．哺乳類細胞ツーハイブリッドシステム：
Ａ．ｐＳＧ−ＦＮＶ−Ｐ構築物：
これらの構築物は、プラスミドｐＳＧ−ＦＮＶ（Ｄｅｓｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）の誘導物である。以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ｐＧＡＤ−ＣＲ−Ｐ構築物から、ヘプタペプチドを含有する領域を増幅した。
【０１９７】
５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧ−３’（オリゴ５’）
５’−ＣＣＴＧＡＧＡＡＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣ−３’（オリゴ３’）
ＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩでこのＰＣＲ断片を消化し、ｐＳＧ−ＦＮＶベクターのＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩ部位の間に挿入し、プラスミドｐＳＧ−ＦＮＶ−Ｐを得た。
【０１９８】
Ｂ．ベイト
１．ベクターｐＳＧ−ＬｅｘＡ−Ｒｅｖの構築：
このベクターは、哺乳類細胞中で融合物ＬｅｘＡ−Ｒｅｖを発現する（Ｆａｒｊｏｔ  ｅｔａｌ．，  １９９９）ｐＳＧ５（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９８８）の誘導物である。
【０１９９】
２．ベクターｐＳＧ−ＬｅｘＡ−Ｔａｔの構築：
Ｔａｔをコードする配列を、ｐＳＧ−ＬｅｘＡ中のＬｅｘＡをコードする配列の下流に導入した。
【０２００】
Ｃ．指標構築物（レポーター構築物）：
このプラスミドは、ＬｅｘＡに対する５つの結合部位の制御下にあるＳＥＡＰ配列を有していた（Ｆａｒｊｏｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。
【０２０１】
ＩＩＩ．哺乳類細胞に対する発現ベクターＳＵＭＯ−１及びＳＵＭＯ−１ペプチド
Ａ．野生型ｐＴＬ１−ＳＵＭＯ−１構築物：
ＳＵＭＯ−１配列は、以下のオリゴを用いて、ｃＤＮＡ（ＨＧＭＰ−ＵＫから得られたＩＭＡＧＥクローン）から増幅した。  ５’−ＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧ−３’
５’−ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＴＡＡＡＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＣＣ−３’
増幅された断片を、ＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、ｐＳＧ５の誘導物である発現ベクターｐＴＬ１のＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩ部位の間に挿入した。
【０２０２】
ｂ．ベクターｐＴＬ１−ＳＵＭＯ−ＣＰの構築：
この構築物は、ＳＵＭＯ−１と融合したヘプタペプチドの挿入を可能とし、ジグリシンモチーフを置換した。以下のオリゴヌクレオチドを用いてＳＵＭＯ−１配列を増幅した。
【０２０３】
５’−ＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧ−３’
５’−ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＧＴＴＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＡＡＡＣ−３’
増幅された断片をＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、ベクターｐＴＬ１のＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩ部位の間に挿入した。
【０２０４】
Ｃ．ベクターｐＴＬ１−ＳＵＭＯ−Ｐの構築
ヘプタペプチド及び塩基性Ｔａｔドメインを含有する配列を、ＩＩ．Ａに記載されているように増幅し、ＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、ベクターｐＴＬ１−ＳＵＭＯ−ＣＰのＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩ部位の間に挿入した。
【０２０５】
ＩＶ．哺乳類細胞のためのユビキチン及びユビキチンペプチド発現ベクター：
Ａ．ｐＴＬ１−Ｕｂ−ＣＰ構築物：
ユビキチンに対する配列は、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡ（ＨＧＭＰ−ＵＫから得られたＩＭＡＧＥクローン）から増幅した。
【０２０６】
５’−ＣＴＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＣＴＴＣＧＴＧＡＡＡＡＣＣ−３’
５’−ＣＡＣＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＡＣＣ−３’
増幅された断片をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、ｐＴＬ１のＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ部位の間に挿入した。
【０２０７】
Ｂ．ベクターｐＴＬ１−Ｕｂ−Ｐの構築
ＩＩ．Ａに記載されているように、ヘプタペプチドと塩基性Ｔａｔドメインを含有する配列を増幅し、ＳａｌＩ及びＢａｇｌＩＩで消化し、ｐＴＬ１−Ｕｂ−ＣＰのＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩ部位の間に挿入した。
【０２０８】
Ｖ．ｐＦＬＡＧ−ＳＵＭＯ−Ｐ中での細菌発現ベクターの構築
ｐＴＬ１−ＳＵＭＯ−ＰプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩによって消化した。ヘプタペプチド／塩基性Ｔａｔドメイン部分と融合したＳＵＭＯ−１配列を含有する断片を、ｐＦＬＡＧＭａｃベクター（ＩＢＩ  ＦＬＡＧ（Ｒ）  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩ部位の間に挿入した。
【０２０９】
ＶＩ．ｐＦＬＡＧ−Ｕｂ−Ｐ中での細菌発現ベクターの構築
ＰＴＬ１−Ｕｂ−ＰプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩによって消化した。ペプチド／塩基性Ｔａｔドメイン部分と融合したＵｂ配列を含有する断片を、ベクターｐＦＬＡＧ−２（ＩＢＩ  ＦＬＡＧ（Ｒ）  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ部位の間に挿入した。
【０２１０】
ＶＩ．細胞培養及び形質移入：
５％  ＣＯ２を含有する湿った雰囲気中において、５％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地中でＨｅＬａ及びＣＯＳ７細胞を培養した。形質移入は、カルシウム／リン酸共沈法を用いて行った。
【０２１１】
哺乳類細胞中でのツーハイブリッド検査では、形質移入は８００００個のＨｅＬａ細胞を播種した６ウェルプレート中で行った。ＤＮＡ混合物は、１２５ｎｇのＳＥＡＰレポーター構築物、ＬｅｘＡと融合している２５ｎｇのＴａｔ又はＲｅｖ発現ベクターを含有し、その量は、プレイを発現するプラスミドに最適なものとして定義された量である。すなわち、クローン１４２及び１９２（５０ｎｇ）を除いては、Ｔａｔに対して選択されたモチーフについては２５０ｎｇ、Ｒｅｖに対して選択されたモチーフについては２５ｎｇであった。ＳＥＡＰ活性は、製造業者の指示書に従い、「ＳＥＡＰレポーター遺伝子アッセイ化学発光」キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定した。Ｔａｔ機能的検査は、６０ｍｍのペトリ皿中の３０００００個のＨｅＬａ細胞を、レポーター構築物ＬＴＲ  ＨＩＶ−ＣＡＴ（５０ｎｇ）、ｐＳＧ−Ｔａｔ（２ｎｇ）及びＳＵＭＯ−１又は相互作用ペプチド（０．５及び２μｇ）に対する発現ベクターで形質移入することによって行った。Ｒｅｖ機能的検査は、レポータープラスミドｐＤＭ１２８（５０ｎｇ）、ｐＳＧ−Ｒｅｖ（５ｎｇ）及びＳＵＭＯ−１又は相互作用ペプチド（０．５及び２μｇ）に対する発現ベクターで形質移入することによって同様に行った。ＣＡＴ活性は、ＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定された。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、５％ＣＯ２を含有する湿った雰囲気中において、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０中で、３７℃で培養した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び単球は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｅｕｒｏｂｉｏ）を用いた密度勾配遠心によって、健康な血清陰性のドナーの血液から単離した。１μｇのフィトヘマグルチニン−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び５ＩＵ／ｍＬのヒト組換えインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）によって、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を活性化した。次に、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２００μＬの培地Ａ（ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、熱で不活化された（＋５６℃、４５分間）１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｂｉｏ  Ｗｅｓｔ）及び２０ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を補充した１％の三抗生物質混合物（ペニシリン、ストレプトマイシン及びネオマイシン；ＰＳＮ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、９６ウェルマイクロプレート（１００００細胞／ウェル）上に置いた。５％ＣＯ２を有する湿った雰囲気中、３７℃に細胞を維持した。
【０２１２】
７日目に、接着によって、単球から単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）が分化した。３日目に、１ｍＬの培地中、４８ウェルプレート中に３０００００細胞／ウェルを分散させた。単球の分化及びＭＤＭ培養は、湿った５％ＣＯ２雰囲気中、細胞培地Ａ’：１０％熱不活化ＦＣＳ及びＰＳＮ三抗生物質混合物１×を補充したＤＭＥＭ  ｇｌｕｔａｍａｘＴＭ中、３７℃で行った。
【０２１３】
ＶＩＩＩ．細菌の産生及びＳＨＰの精製
２ＬのＬＢ培地中で、０．９の光学密度まで培養されたＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓＴＭ−ＲＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）Ｅコリ細胞を形質転換するために、セクションＶＩに記載したベクターを使用した。１８℃で３０分後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加し、これを１８℃で一晩継続した。Ｒｏｃｈｅの「完全」アンチプロテアーゼ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｎｔｉｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｒｏｃｈｅ）、０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび２０ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を補充した溶解緩衝液：２００ｍＭのＮａＣｌ、０．１Ｍのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２中で、この細菌に音波処理を施した。４０００ｒｐｍで３０分間の遠心後、５ｍＬのヘパリンＨｙｐｅｒＤカラム（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）に上清をかけた。溶出は、ＤＥ  ６００緩衝液（６００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、１０μＭのＺｎＣｌ２、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍＭのＤＴＴ）を用いて行った。Ｈｉｌｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲルろ過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、溶出産物を分画した。ＳＨＰを含有する画分を合わせて、ＤＥ５０緩衝液（ＫＣｌ濃度が２０ｍＭであることを除いて、ＤＥ６００緩衝液と同じ組成）に対する透析後、５ｍＬのｍｏｎｏＱ  ＨｙｐｅｒＤカラム（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）にかけた。ＰＢＳ  １×緩衝液に対して、フロースルーを透析し、凍結乾燥によって１０倍濃縮し、滅菌ろ過を行った。
【０２１４】
ＩＸ−イムノブロット及び免疫蛍光
使用した技術は、本分野において慣用されているものであった（ポリアクリルアミドゲル、二フッ化ポリビニリデン膜、ＰＶＤＦ、Ｓｉｇｍａ製のＦＬＡＧに対して誘導され、１：１０００希釈され、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製ＥＣＬキットで可視化されるモノクローナル抗体）。
【０２１５】
１：５００に希釈され、２時間インキュベートされた一次抗ＦＬＡＧ抗体と、１：１０００に希釈され、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光標識試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に結合され、１時間インキュベートされた二次抗体とを用いて、免疫蛍光検査を行った。
【０２１６】
Ｘ．ウイルス及び抗ウイルス検査：
ＰＢＭＣ細胞には、ＨＩＶ−１−ＬＡ１（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８３，２２０，  ８６８−８７１）というリンパ指向性株を感染させ、ＭＤＭ細胞には、マクロファージに対して指向性を有するＨＩＶ−１／Ｂａ−Ｌ（Ｇａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １０８６，  ２３３，２１５−２１９）という株を感染させた。ＰＨＡ−Ｐで活性化された臍帯血単核細胞（ＵＢＭＣ）とともに、これらのウイルスをインビトロで増幅した。可溶性因子を除去するために、無細胞上清を３６００００ｇで、１０分間遠心し、残留物を細胞培養培地中に再懸濁した。ＰＨＡ−Ｐで活性化されたＰＢＭＣ細胞を用いて、ウイルス株を滴定し、Ｋａｒｂｅｒの式を用いて、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）を計算した。
【０２１７】
５つの濃度の各分子によって、ＰＢＭＣ細胞を３０分間、前処理し、７５  ＴＣＩＤ５０のＨＩＶ−１−ＬＡ１株に感染させた。ＡＺＴ（１．６、８、４０、２００及び１０００ｎＭ）及びインジナビル（１．６、８、４０、２００及び１０００ｎＭ）を対照として使用した。相互作用ペプチドＳＨＰＲ−８、−１５、−１９０及びＳＨＰＴ−１４２を、３１、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００及び２０００ｎＭの濃度で調べた。逆転写酵素活性（ＲＴ）アッセイによってウイルスの複製を測定するために、培養を通じて、この分子を維持し、感染から７日後に細胞上清を採集し、−２０℃で保存した。薬物によって誘導された細胞毒性を検出するために、第７日目に、ＰＢＭＣ細胞を顕微鏡レベルで観察した。
【０２１８】
６つの濃度の異なる分子中で、ＭＤＭ細胞を３０分間、前処理し、３００００ＴＣＩＤ５０のＨＩＶ−１／Ｂａ−Ｌ株を感染させた。ＡＺＴ（０．８、４、２０、１００及び５００ｎＭ）及びインジナビル（０．８、４、２０、１００及び５００ｎＭ）を対照として使用した。相互作用ペプチドＳＨＰＲ−８、−１５、−１９０及びＳＨＰＴ−１４２を、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００及び２０００ｎＭの濃度で調べた。逆転写酵素活性（ＲＴ）アッセイによってウイルスの複製を測定するために、感染後７日間、この分子を維持し、感染から７、１４及び２１日後に細胞上清を採集し、−２０℃に保存した。薬物によって誘導された細胞毒性を検出するために、第７、１４及び２１日目に、ＭＤＭ細胞を顕微鏡レベルで観察した。
【０２１９】
ＲｅｔｒｏＳｙｓ  ＲＴキット（Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、細胞培養から得た上清中のＲＴ活性をアッセイすることによって、ＨＩＶ複製を分析した。実験は３回行い、ＲＴ活性の平均±標準偏差（ＳＤ）として、結果を表す。非処理対照からのパーセント及びソフトウェア（Ｊ  ａｎｄ  Ｔ  Ｃ  Ｃｈｏｕ，  Ｂｉｏｓｏｆｔ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）を用いて、５０％、７０％及び９０％有効用量（ＥＤ５０、ＥＤ７０、ＥＤ９０）を計算した。
【実施例２】
【０２２０】
結果
Ｔａｔ及びＲｅｖに結合するペプチド配列の同定
まず、ツーハイブリッド酵母システムスクリーニングによって、制御タンパク質Ｔａｔ及びＲｅｖに対する相互作用ペプチドの探索を行った。ベイトは、Ｔａｔ、Ｒｅｖ又はＲｅｖのＮＥＳの全配列と融合したＬｅｘＡに対する配列を含有していた（図７Ａ）。プレイは、ＧＡＬ４活性化ドメイン、７アミノ酸のランダム配列及びＴａｔ形質導入ドメイン（図７Ｂ）という３つの異なる部分を含んでいた。２１の縮重位の系列を含む、合成オリゴヌクレオチドから調製されたＤＮＡ断片をクローニングすることによって、プレイに対する発現ベクターのライブラリーを構築した。
【０２２１】
ＬｅｘＴａｔ、ＬｅｘＲｅｖ又はＬｅｘＮＥＳをベイトとして使用する３つの異なるスクリーニングにおいて、このライブラリーを使用した（表１ａ参照）。無ヒスチジン培地中で培養され、β−ガラクトシダーゼに対する検査に対して陽性であったクローンのベクター全てを単離し、再検査を行った。ＬｅｘＡのみをベイトとして使用したときには、これらのベクターは何れも、β−ガラクトシダーゼの発現を誘発しなかった（表１ｂ、ｃ、ｄ参照）。次いで、Ｔａｔ対して選択された４つのベクター、Ｒｅｖに対して選択された３つのベクター、ＮＥＳに対して選択された１９のベクターを取得した（表１ｂ、ｃ、ｄ参照）。哺乳類細胞中でのツーハイブリッド検査を用いて、これらの陽性クローンを分析した。産生された構築物は上に記載されており、図１Ｃに示されている。単独で又はプレイタンパク質とともに、ＬｅｘＡを一過性に発現したときには、レポーター構築物からの分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現は観察されなかった。ＬｅｘＴａｔ及びＬｅｘＲｅｖはいずれも、それ自体、ＳＥＡＰの発現を誘発することができるが、この産生は、プレイベクターとの同時形質移入によって増加する。結果を図８に示す。酵母に対して選択された配列は、ヒト細胞の核内中で、Ｔａｔ及びＲｅｖタンパク質にも結合できることを示している。
【表１ａ】
2008500267.tif 000002
【表１ｂ】
2008500267.tif 000003
【表１ｃ】
2008500267.tif 000004
【表１ｄ】
2008500267.tif 000005
Ｔａｔ及びＲｅｖ機能の阻害  前工程で単離された相互作用ペプチドの能力を考えると、次の工程は、Ｔａｔ及びＲｅｖ活性に対するアンタゴニストとして作用し、それらの細胞エフェクターとの会合に影響を与えることができるかどうかを確認することであった。このため、機能的検査を実施した。同定された相互作用ペプチドを安定化するために、ＳＵＭＯ−１タンパク質とともに構築物を作製した。ヘプタペプチド形質導入ドメインモジュールをコードする配列の上流に、ジグリシンＣ末端モチーフ中の変異を含む、コーディング配列全体を挿入した。このようにして産生された人工又はキメラタンパク質を、ＳＵＭＯ−１−ヘプタペプチド−タンパク質形質導入ドメインＴａｔ又はＲｅｖ、すなわち、それぞれＴａｔ又はＲｅｖに結合する能力に応じて、ＳＨＰＴ又はＳＨＰＲと表記した。
【０２２２】
ＴａｔによるＨＩＶ−１プロモーターのトランス活性化に対する４つのＳＨＰＴの効果を、ＨｅＬａ細胞中での一時的な発現実験によって評価した。低濃度では、様々なＳＨＰＴはＴａｔのトランス活性化を減少させなかったが、さらに高い濃度では、特に、ＳＨＰＴ−８を用いると、トランス活性化の僅かな減少が観察された（図９Ａ参照）。これらのデータは、選択されたＳＨＰＴがＴａｔ機能のあまり優れた阻害剤ではないことを示している。
【０２２３】
ＳＨＰＲ活性は、コーディング配列ＣＡＴとイントロン中にＲＲＥモチーフを含むレポーター構築物ｐＤＭ１２８を用いて評価された。Ｒｅｖの発現は、ＣＡＴの発現を刺激し、スプライシングされないメッセンジャーを細胞質へ移行させる。この検査を用いて、様々なＳＨＰＲが異なる活性を有することが観察された。結果は、図９Ｂに示されている。このデータは、２つのＳＨＰＲ、ＳＨＰＲ−１４２及びＳＨＰＲ−１９０が、Ｒｅｖの機能の先験的な効果的阻害剤であることを明確に示している。この阻害が、実際に、予想通り、タンパク質−タンパク質相互作用と直接相関するかどうかを確認した。この目的のために、ＲｅｖとＳＨＰＲの両者を細菌中で産生した。ＳＨＰを精製するためのプロトコールを開発した（実施例１参照）。Ｒｅｖは、ＧＳＴと融合されて発現され、グルタチオン−アガロースビーズに連結された。ＳＨＰＲ−１４２及びＳＨＰＲ−１９０をカラムにかけ、ＳＨＰＴ−８も対照としてＳＨＰＲ−１９０カラムにかけた。ＧＳＴ−Ｒｅｖ融合物がグルタチオンとともに放出されると、ＳＨＰＲ−１４２とＳＨＰＲ−１９０の同時溶出が観察されたが、ＧＳＴ−Ｒｅｖを含有する画分中にＳＨＰＴは存在しなかった（図１０参照）。このことは、ＳＨＰＲ−１４２及びＳＨＰＲ−１９０とＲｅｖとの相互作用が直接的であり、中間体が関与していないことを示している。
【０２２４】
細胞外培地から細胞中へのＳＨＰの透過
次いで、細胞外培地から同定されたＳＨＰの活性を調べた。まず、細胞毒性を調べた。最大１μＭの濃度まで、これらの分子は、インビトロで培養され、ＰＨＡ及びＩＬ−２で活性化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団における細胞死のパーセントを変化させないように見えた。
【０２２５】
ＳＨＰが細胞中に透過する能力を評価するために、２μＭのＳＨＰＲ−１９０が補充された培地中でＰＢＭＣを培養した。様々な時点で、上清の分割量を取り出し、細胞を集めた。数回洗浄した後、ＲＩＰＡ緩衝液中に細胞を溶解し、ＦＬＡＧエピトープ（細菌中で産生されたＳＨＰのＮ末端に存在する。）に対して誘導された抗体を用いたイムノブロットによって、上清及び抽出されたものを分析した。休止しているリンパ球（図１１Ａ）及び活性化されたリンパ球（図１１Ｂ）ともに、ＳＨＰＲ−１９０は培地中で安定であり、タンパク質の画分が細胞内に存在することが観察された（図１１）。リンパ球が直径１２μの球形であると仮定することによって、蛍光標識試薬で標識された抗体を用いて実施された定量実験は、２μＭの外部濃度が１５μＭの細胞濃度をもたらすことが示された。このことは、ＳＨＰが細胞内に濃縮され得ることを示している。
【０２２６】
ＳＨＰが実際に細胞に侵入できることを確認するために、免疫蛍光分析も実施した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を１μＭのＳＨＰとともに４時間インキュベートし、２回洗浄した後、細胞を２４時間培養した。ＦＬＡＧに対する抗体を用いた免疫蛍光分析によって、４つの検査ＳＨＰでは、かなりの蛍光が、拡散する様式で細胞の内側全体に存在する（図１１Ｃ）のに対して、対照細胞はこれに該当しないことが示された。
【０２２７】
このように本実験は、精製されたＳＨＰとともにリンパ球を培養することができ、これらの分子が細胞内に入ることができることを証明する。
【０２２８】
ＳＨＰによるＨＩＶ−１の複製の阻害
最後の工程では、ＳＨＰがＨＩＶ−１の複製を実際に阻害できるかどうかを調べた。これは、ＰＨＡ−Ｐによって活性化されたＰＢＭＣ中及びＭＤＭ中で行った。ＰＨＰ−Ａによって活性化されたＰＢＭＣのモデルでは、ＨＩＶ−１−ＬＡ１の複製は第７日目に最適であった。このため、様々なＳＨＰの効果をこの時点で検査した。ＡＺＴ及びインジナビルを対照として用いた。予想どおり、ＨＩＶ−１−ＬＡ１の複製は、ＡＺＴ及びインジナビルによって効果的に阻害された（図１２Ａ及び表２ａ）。ＳＨＰＴ−８、抗ＨＩＶ活性を全く有しなかったが、ＳＨＰＲ−１５は低い活性を有していた。これに対して、ＳＨＰＲ−１４２及びＳＨＰＲ−１９０は、ＰＨＡ−Ｐで活性化されたＰＢＭＣ細胞中での複製を減少した。ＨＩＶ−１の複製は、２μＭのＳＨＰＲ−１４２（７３±６％、表２ａ参照）並びに１及び２μＭのＳＨＰＲ−１９０（それぞれ、８０±７％及び１００％、表２ａ参照）によって減少された。５０％有効量の比較によって、ＳＨＰＲ−１９０がＳＨＰＲ−１４２より活性が高いことが確認される（表２ｂを参照）。
【表２ａ】
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【表２ｂ】
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基準株ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌは、ＭＤＭ（単球由来マクロファージ）中で効果的に複製した。培養上清中の逆転写活性は、感染後（ｐｉ）７日目に検出され、感染後１４及び２１日目に最大となった。予想されたとおり、ＨＩＶ−１／Ｂａ−Ｌの複製は、ＡＺＴ及びインジナビルによって、用量依存的に減少した（図１２Ｂ及び表３ａ）。これらの細胞では、ＰＢＭＣにおける場合と同様、ＳＨＰＲ−１５が極めて低い活性を示した。活性化されたＰＢＭＣについて得られた結果とは異なり、ＳＨＰＴ−１４２もＨＩＶ複製を僅かに阻害した（２μＭでは、１４日目に４４±１０％、１μＭでは効果なし、表３ａ）。これに対して、ウイルスの複製は、２μＭのＳＨＰＴ−８及びＳＨＰＲ−１９０の両方によって阻害された（それぞれ、１４日目に６９±６％及び９２±２％、表３ａ）。ＳＨＰＴ−８とは異なり、ＨＩＶ複製に対するＳＨＰＲ−１９０の効果は用量依存的であった（図１２Ｂ）。さらに、ＥＤ９０の値によって示されるように（表３ｂ）、相互作用ペプチドＳＨＰＲ−１９０は、さらに高い抗ＨＩＶ活性を有していた。これらの効果は、おそらくは、相互作用ペプチドの分解のために、１４日後に減弱した。
【表３ａ】
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このように、本結果は、相互作用ペプチドＳＨＰＲ−１９０が、ＨＩＶの２つの主要な細胞標的、すなわち、Ｔ  ＣＤ４＋リンパ球とマクロファージにおいて真の抗ＨＩＶ効果を有することを示している。
【０２２９】
さらに、ペプチドＳＨＰＲ−１４２はＲｅｖ由来のＮＥＳに対して選択されたこと、ペプチドＳＨＰＲ−１９０もＲｅｖ由来のＮＥＳシグナルと相互作用することが示されたことに鑑み、これら２つの分子は、Ｒｅｖタンパク質の搬出特性を妨害する可能性がある。
【表３ｂ】
2008500267.tif 000009
【実施例３】
【０２３０】
同定されたＳＨＰ配列
ＳＨＰＴ：
ＳＨＰＴ−８      Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｓｐ
ＳＨＰＴ−９＃    Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ
ＳＨＰＴ−１０−  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ
ＳＨＰＴ−２４    Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ
＃：このクローンは、幾つかのヘプタペプチド配列の挿入から得られた。
【０２３１】
ＳＨＰＲ：
ＳＨＰＲ−１５      Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ
ＳＨＰＲ−３１      Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ
ＳＨＰＲ−１１５    Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ
ＳＨＰＲ−１４２＊  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ
ＳＨＰＲ−１９０＊  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ
＊  ：これら２つのヘプタペプチドは、Ｒｅｖタンパク質の機能に対して阻害効果を有するヘプタペプチドである。
【実施例４】
【０２３２】
ＳＨＰＲ−１４２及びＳＨＰＲ−１９０中の変異
Ｒｅｖに対して誘導されたＳＨＰの作用機序並びにＳＨＰＲ−１４２及び−１９０中の各位置に存在する残基の重要性を最大限決定するために、変異分析を行った。
【０２３３】
１．ウイルスタンパク質の、そのＲＮＡ標的配列Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）への結合に対するＳＨＰＲ−Ｒｅｖの結合の効果
Ｒｅｖタンパク質は、特定のＲＮＡ配列：ＲＲＥに結合することによって、ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの細胞質への移行を引き起こす。本発明者らは、ＲｅｖのＳＨＰＲ阻害剤の結合が、このＲｅｖ／ＲＲＥ会合を妨害するかどうかという問いに対して答えを出した。この目的のために、ＲＲＥ要素に対応するＲＮＡ分子をプローブとして用いたゲル遅延実験を行った。細菌中で産生されたＲｅｖタンパク質は、このＲＮＡに結合し、非変性ポリアクリルアミドゲル移動の遅延を誘発する。ＳＨＰＲ−１９０及び−１４２タンパク質の添加は、この会合を阻害しなかったが、さらに大きな遅延を引き起こし、ＳＨＰＲ−Ｒｅｖ複合体がなおＲＲＥに結合できることを示している。
【０２３４】
これらの実験では、ＳＨＰＴ−８などの対照タンパク質の添加は、全く効果を有さなかった。
【０２３５】
このため、これらの実験から、ＳＨＰＲ阻害剤−１９０及び−１４２は、Ｒｅｖの要素ＲＲＥとの相互作用を修飾しないと結論付け得る。それらの阻害作用は、むしろ、細胞質へのＲｅｖ−ＲＲＥ複合体の移行に起因するものにちがいない。この点は、ＳＨＰＲ−１９０及び−１４２がＲｅｖ  ＮＥＳと相互作用するという観察と一致している。
【０２３６】
２．ＳＨＰＲ−１４２及び−１９０の阻害剤活性に対して必要とされる配列：
本発明者らによって、以下の実験が行われた。
【０２３７】
・ＳＵＭＯ−１配列の下流にあるヘプタペプチドモチーフのクローニング中に、選択された結合モチーフの直近の環境を改変しないために、タンパク質ＧＡＬ４（ＰＰＮＰＫＫＥＩＥＬ）をコードする約１０個のアミノ酸が保存された。
【０２３８】
・短いＧＡＬ４モチーフをコードするこの配列が除去された、ＳＨＰＲ−１４２及び−１９０の変異体（ΔＧＡＬ４と命名）を作製した。
【０２３９】
・阻害剤活性を有するヘプタペプチドモチーフのアミノ酸のそれぞれの寄与を評価するために、ＳＨＰＲ−１４２及び−１９０の７つの位置のそれぞれをアラニン（Ａｌａ）に変異し、増強された抗ウイルス活性を有する変異体を探すために、変異体を検査した。
【０２４０】
ＲＲＥがイントロン位置に会合したＣＡＴ配列を有するレポータープラスミドのＨｅＬａ細胞に、Ｒｅｖタンパク質及びＳＨＰＲタンパク質に対する発現ベクターを形質移入することからなる一時的発現系を用いて、これらの様々な変異体を検査した。これらのＳＨＰＲ誘導体の阻害剤活性を測定し、親ＳＨＰＲの阻害剤活性と比較した以下の表中に示す。値は、２つの独立した測定に対して得られた値の平均に対応する。２つの値の隔たりは、２０％未満であった。
【表４】
2008500267.tif 000010
【０２４１】
表４：ＳＨＰＲ−１４２（２列目）及びＳＨＰＲ−１９０（３列目）の哺乳類細胞中の発現ベクターは、ヘプタペプチドの各位置が変異され（アラニンに変化）、ＧＡＬ４をコードするアミノ酸の欠失によって変異された。上記セクション（及びＲｏｉｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  ＪＢＣ（２００４）２７９：９２０８）に記載されているように、レポータープラスミドｐＤＭ１２８及び発現ベクターＲｅｖをこれらのベクターに形質移入した。ＣＡＴタンパク質の量は、親ＳＨＰＲの形質移入に対応する％として表されている。このため、１００を超える値は、ＳＨＰＲの阻害能に対する負の効果を表し、１００より低い値は、この阻害特性の増加を表している。
【表５】
2008500267.tif 000011
【０２４２】
表５：ＧＡＬ４をコードするアミノ酸を欠失させることによって、ＳＨＰＲの発現ベクターを修飾し、ヘプタペプチドの１又は４位を修飾した。表４の脚注に記載されているとおりに、これらの発現ベクターを検査した。
【０２４３】
これらの結果は、ＧＡＬ４のアミノ酸をコードする配列が負の役割を果たすことを示している。１４２配列については、最初の５個の残基の修飾が負の効果を有し、アミノ酸６及び７、特に７位の修飾が活性を増加することを示している（表４）。−１９０ヘプタペプチドの場合、アミノ酸１の置換が活性をかなり顕著に増加させるが、３、４及び７の置換はこれより程度が低いようである（表４）。さらに、１位又は４位の変異は、ＧＡＬ４配列の除去の効果をさらに増加させる（表５）。
【０２４４】
これらの結果から、残部のＧＡＬ４は、最終のハイブリッドタンパク質から除去され得ると結論付けることができる。−１９０ヘプタペプチドについては、１位の修飾も有利であるように思われる。
【０２４５】
４位の修飾も、システイン残基の量を限定する目的で、有利となり得る。これらは、酸化による修飾を引き起こし得る。２つのモチーフ−１４２及び−１９０に対して得られた結果を検討することによって、２位のトリプトファン残基が重要であり、トリプトファン残基は、４位、又は好ましくは５位に存在し得る近接するシステイン残基を必要とするように思われる。
【０２４６】
これらの結果は、さらに高い活性を有する可能性があるＳＨＰＲ−１９０の新規誘導体をもたらす。
【０２４７】
形質導入ドメインの役割をさらに識別するための研究も行った。この目的のために、主要部分を欠失するために塩基性Ｔａｔドメイン（ＳＨＰＲ−１４２及び−１９０に対して用いた。）を末端切断するか、又はポリアルギニンモチーフによって置換した。いずれのケースでも、そのＲｅｖ標的と相互作用するポリペプチドの細胞内能力は保存されることが示された。これらの結果は、標的と相互作用する能力に関して（この相互作用において、形質導入ドメインは関与していない。）、ヘプタペプチドが不可欠であることを確証する。
【０２４８】
このため、本発明のポリペプチドがある標的と相互作用する能力が同定されれば、次に、得られたポリペプチドが当該標的と常に相互作用できるようにしながら、ヘプタペプチドを修飾せずにその特性を最適化するために（形質導入の効率、安全性、非免疫原性など）、形質導入ドメインを変更することが可能である。
【参考文献】
【０２４９】
・Desbois C, Rousset R, Bantignies F and Jalinot P (1996).  Exclusion of Int-6 from PML nuclear bodies by binding to the HTLV-1 Tax oncoprotein.  Science 273, 951-3;
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・Veschambre P, Simard P and Jalinot P (1995).  Evidence for functional interaction between the HIV-1 Tat transactivator and the TATA box binding protein in vivo.  J Mol Biol 250, 169-80;
・Wender P A, Mitchell D J, Pattabiraman K, Pelkey E T, Steinman L, Rothbard J B (2000).  The design, synthesis and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake: peptoid molecular transporters.  Proc Natl Acad Sci USA, 97 (24): 13003-8;
・Kraber G, Beitrag zur kollektiven Behandlung Pharmakologischer Reihenversuche [contribution regarding the collective treatment of serial pharmacological investigations] (1931) Arch Exp Path Pharmak 162, 956-959。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】この図は、所定の標的タンパク質と相互作用できる相互作用ポリペプチドを作製するために使用された様々な工程と構築物を示している。二重矢印は、２つの分子間の相互作用を示している。各工程に対して、様々な種類の細胞が記されている。標的としてウイルスＲｅｖタンパク質を用いて、工程３（機能的試験）を実施した。
【図２Ａ】図２は、酵母「ツーハイブリッド」工程に使用された様々なプラスミドのマップを示している。
【０２５１】
図２Ａ：ｐＧＡＤ４２４から得られるプラスミドｐＧＡＤ−ＣＲ。ｐＧＡＤ−ＣＲから得られ、制限部位ＢａｍＨＩ及びＸａｍＩの間に挿入されるヘプタペプチドモチーフをコードする配列を含むプラスミドｐＧＡＤ−ＣＲ−Ｐ。
【図２Ｂ】図２は、酵母「ツーハイブリッド」工程に使用された様々なプラスミドのマップを示している。
【０２５２】
図２Ｂ：プラスミドｐＬｅｘ９の制限部位ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの間に挿入されたＴａｔ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＬｅｘ−Ｔａｔ。
【０２５３】
プラスミドｐＬｅｘ９の制限部位ＢａｍＨＩとＸｈｏＩの間に挿入されたＲｅｖのＮＥＳモチーフをコードする配列を含有するプラスミドｐＬｅｘＮＥＳ。
【図２Ｃ】図２は、酵母「ツーハイブリッド」工程に使用された様々なプラスミドのマップを示している。
【０２５４】
図２Ｃ：プラスミドｐＬｅｘ９の制限部位ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩの間に挿入されたＲｅｖ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｌｅｘＲｅｖ。
【図３Ａ】図３は、哺乳類細胞中でのツーハイブリッド工程のために使用される様々なプラスミドのマップを示している。
【０２５５】
図３Ａ：
プラスミドｐＳＧ−ＦＮＶ−Ｐ。ｐＧＡＤ−ＣＲ−ＰからＸ７  ＰＴＤモチーフを増幅し、制限酵素ＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化した後、プラスミドｐＳＧ−ＦＮＶの制限部位ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩの間に挿入した。
【０２５６】
ｐＳＧ５ＬｅｘＡから得られ、Ｔａｔ  ｃＤＮＡを含む、プラスミドｐＳＧ５ＬｅｘＡ−Ｔａｔ。
【図３Ｂ】図３は、哺乳類細胞中でのツーハイブリッド工程のために使用される様々なプラスミドのマップを示している。
【０２５７】
図３Ｂ：
ｐＳＧ５ＬｅｘＡから得られ、Ｒｅｖ  ｃＤＮＡを含む、プラスミドｐＳＧ５ＬｅｘＡ−Ｒｅｖ。
【図４】図４は、機能的試験のための発現ベクターＳＵＭＯ−１−Ｐのマップを示している。制限部位ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩを含むＳＵＭＯ−１をコードする配列ｐＴＬ１−ＳＵＭＯ−１ＣＰＰをｐＴＬ１中に挿入した。
【０２５８】
ｐＴＬ１−ＳＵＭＯ−１−Ｐ：Ｘ７  ＰＴＤモチーフに対する配列を、ｐＴＬ１−ＳＵＭＯ−１−ＣＰの制限部位ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩの間に挿入した。
【図５】図５は、細菌中で発現ベクターとして使用されるプラスミドｐＦＬＡＧ−ＳＵＭＯ−１−Ｐのマップを示している。このプラスミドは、プラスミドｐＦＬＡＧ−ＭＡＣの制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩの間にＳＵＭＯ−１−Ｐモチーフをコードする配列を挿入することによって構築された。
【図６】図６は、ＳＵＭＯ−１（番号１）及びユビキチン（番号３）の野生型配列並びに、安定化ドメインとして、ＳＵＭＯ−１の断片（相互作用ペプチドＳＵＭＯ、番号２）又はユビキチン（相互作用ペプチドＵＢ、番号４）を含む本発明の相互作用ペプチドの配列を示している。
【０２５９】
野生型ＳＵＭＯ−１に対する配列とＳＵＭＯ−１の断片を含む相互作用ペプチドが並列されている。星は、２つの配列中に同一アミノ酸が存在することを示している。
【０２６０】
ユビキチンに対する配列とユビキチン断片を含む相互作用ペプチドに対する配列との間でも、類似のアラインメントを行った。
【０２６１】
相互作用ペプチド中のモチーフＸＸＸＸＸＸＸは、ランダムな様式で確定され得る７アミノ酸配列を表している。
【図７】図７は、酵母（Ａ）又は哺乳類細胞（Ｃ）中でのツーハイブリッド試験においてベイト（Ａ）及びプレイ（Ｂ、Ｃ）として作用するタンパク質の模式図である。
【０２６２】
Ａ．ベイトは、Ｔａｔ（アミノ酸ａａ１から８６）、Ｒｅｖ（ａａ１から１１６）又はＲｅｖの核外移行シグナル（ａａ７０から９６）と融合したタンパク質ＬｅｘＡからなる。
【０２６３】
Ｂ．酵母プレイは、活性化ドメインＧＡＬ４（一連の７アミノ酸のランダム配列）及びＴａｔ形質導入ドメイン（タンパク質形質導入ドメインＰＴＤ）を含む。
【０２６４】
Ｃ．哺乳類細胞中のプレイは、ＦＬＡＧエピトープ、ＳＶ４０のＮＬＳ（核局在化シグナル）（ワイドＴ）、ＨＳＶのＶｐ１６活性化ドメイン及びヘプタペプチド＋ＴａｔＰＴＤモジュールを含む。
【図８】図８は、哺乳類のツーハイブリッドスクリーニングによって、Ｔａｔ及びＲｅｖに対して選択されたヘプタペプチド＋Ｔａｔ  ＰＴＤモジュールの分析を示している。
【０２６５】
Ａ．単独で、又はｐＳＧ−ＦＮＶ−Ｐ−Ｔ８、−Ｔ９、−Ｔ１０又は−Ｔ２４とともに、レポーター構築物ｐＳＥＡＰ  Ｌｅｘ５Ｘ及びｐＳＧ５ＬｅｘＡ−ＴａｔをＨｅＬａ細胞に形質移入した。ＳＥＡＰの量を測定し、形質移入の２つの独立した点について得られた値の平均が示されている。エラーバーは、２つの値間の差の半分に相当する。
【０２６６】
Ｂ．ｐＳＧ−ＦＮＶ−Ｐ−Ｔ２４、Ｒ１５、−Ｒ１１５、−Ｒ１９０、−Ｎ１４２−Ｎ３１及び−Ｎ７とともに、ｐＳＥＡＰ  Ｌｅｘ５Ｘ及びｐＳＧＬｅｘＡ−Ｒｅｖを用いて、同じ検査を行った。結果は、図８Ａと同様に示されている。
【図９】図９は、構築物ＳＨＰＴ及びＳＨＰＲに対するＴａｔ及びＲｅｖの活性の阻害を示している。
【０２６７】
Ａ．ジグリシンモチーフ（ＧＧ）がＡＲに変異されており、そのＣ末端がヘプタペプチド−Ｔａｔ  ＰＤＴモジュールと結合されたＳＵＭＯ−１の配列全体を含む構築物ＳＨＰの模式図。
【０２６８】
Ｂ．ｐＳＧ−Ｔａｔ及びｐＴＬ−１−ＳＵＭＯ−１、ｐＴＬ１−ＳＨＰＴ−８、−９、−１０又は−２４の何れかとともに、構築物ＬＴＲ  ＨＩＶ−ＣＡＴをＨｅＬａ細胞に形質移入した。これらの後者のプラスミドの量は、０．５μｇ（薄い灰色のバー）又は２μｇ（濃い灰色のバー）の何れかであった。ＣＡＴ活性を測定し、形質移入の２つの独立した点について得られた値の平均が示されている。エラーバーは、２つの値間の差の半分に相当する。
【０２６９】
Ｃ．Ｒｅｖ活性を評価するために、ｐＴＬ１−ＳＵＭＯ−１、ｐＴＬ１−ＳＨＰＲ−１５、−１１５、−１９０、−Ｒ７、−Ｒ３１及びＲ１４２の何れかとともに、プラスミドｐＭＤ１２８及びｐＳＧ−ＲｅｖをＨｅＬａ細胞に形質移入した。ＣＡＴ活性は、図９Ｂと同様に示されている。
【図１０】図１０は、ＳＨＰＲ及びＲｅｖ間の直接のタンパク質−タンパク質相互作用を表している。ＧＸＴ−Ｒｅｖを細菌中で産生し、アガロース−グルタチオンカラムにかけた。ＳＨＰＲ−１４２、−１９０及びＳＨＰＴ−８をこのカラムにかけた。リンスの後、グルタチオンでタンパク質を溶出した。それぞれ、ＧＳＴ又はＦＬＡＧに対する抗体を用いて、フィード（ライン１）、リンス（ライン２）及び溶出（ライン３、４、５）画分の分割量を、ＧＳＴ−Ｒｅｖ（上部グラフ）及びＳＨＰに対するイムノブロットによって分析した。これは、ＳＨＰＲ−１４２及びＳＨＰＲ−１９０がＧＳＴ−Ｒｅｖとともに溶出されたのに対して、ＳＨＰＲ−８はカラム上のタンパク質に結合しなかったことを示している。
【図１１】図１１は、ＳＨＰの細胞内への侵入を示している。
【０２７０】
直接（Ａ）又はＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）及びＩＬ−２（インターロイキン２）で活性化した後に（Ｂ）、単核細胞を末梢血から調製し、次いで、２μＭのＳＨＰＲ−１９０とともにインキュベートした。相互作用ペプチド添加後の表記の時点で、ＦＬＡＧに対する抗体を用いたイムノブロットによって、上清の分割量を分析した（Ａ、ライン１から４；Ｂ、ライン１から３）。細胞を集め、ＲＩＰＡ緩衝液中に溶解した。上清に対して記載したとおりに、得られた抽出物を、イムノブロットによって分析した（Ａ、ライン５及び６；Ｂ、ライン４）。部分Ａでは、曝露時間は、ライン５及び６（３０秒）とライン１から４（５秒）の間で異なった。
【０２７１】
これらの分析は、上清中でタンパク質が安定であること、それが細胞内に存在することを示している。
【０２７２】
部分Ｃでは、２μＭのＳＨＰＴ−８、ＳＨＰＲ−１５、ＳＨＰＲ−１４２又はＳＨＰＲ−１９０とともに、Ｊｕｒｋａｔ細胞を一時間インキュベートし、２４時間後に細胞を集め、ＦＬＡＧに対する抗体を用いた免疫蛍光によって分析した。代表的な細胞について、光の透過及び蛍光画像が示されている。細胞は、対照に対して観察されていない散乱蛍光を有していた。
【図１２】図１２は、リンパ球及びマクロファージにおけるＨＩＶ−１の複製の阻害を示している。
【０２７３】
Ａ．末梢血から単核細胞を調製し、活性化した。異なる量のＡＺＴ、インジナビル、ＳＨＰＲ−１５、−１４２、−１９０又はＳＨＰＴ−８で細胞を処理し、ＨＩＶ−１−ＬＡＩに感染させた。上清中の逆転写活性をアッセイすることによってウイルスの複製を測定し、パーセント阻害は、化合物の量の関数として示されている。
【０２７４】
Ｂ．単球からマクロファージを調製し、異なる濃度の薬物とＳＨＰで処理し、ＨＩＶ−１／Ｂａ−Ｌに感染させた。逆転写活性をアッセイすることによって、ウイルスの複製を測定した。感染から７日後のパーセント阻害が、図１２と同様に示されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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