(57)【要約】  本発明は、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユット、およびその免疫原性またはアセチルコリン結合フラグメントである新規ポリペプチドをコードする新規ポリヌクレオチドに関する。新規ポリペプチドは、例えば有害生物防除剤および抗寄生生物剤として使用するために、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルを調節する化合物を同定するために有用である。アセチルコリン依存性クロライドチャンネルを調節する化合物を同定する方法が提供される。
2008509681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルコリン依存性クロライドチャンネル（ＡＣＣ）サブユニットポリペプチド、またはその生物学的に活性な、または免疫原性フラグメントを含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ＡＣＣ−１（配列番号２）、ＡＣＣ−２（配列番号４）、ＡＣＣ−３（配列番号８）およびＡＣＣ−４（配列番号１０）からなる群から選択されるＡＣＣサブユニットの少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基に同一のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２（ＡＣＣ−１）、配列番号４（ＡＣＣ−２）、配列番号８（ＡＣＣ−３）または配列番号１０（ＡＣＣ−４）に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
ＡＣＣ−１（配列番号２）、ＡＣＣ−２（配列番号４）、ＡＣＣ−３（配列番号８）およびＡＣＣ−４（配列番号１０）からなる群から選択されるＡＣＣチャンネルサブユニットの細胞外リガンド結合ドメインの１もしくは複数のループ領域Ａ、Ｅ、ＦおよびＣとアミノ酸同一性を有し、該アミノ酸同一性が少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の同一性からなる群から選択される請求項１ないし３のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
ＡＣＣ−１（配列番号２）、ＡＣＣ−２（配列番号４）、ＡＣＣ−３（配列番号８）およびＡＣＣ−４（配列番号１０）からなる群から選択されるＡＣＣチャンネルサブユニットの細胞外リガンド結合ドメインのループ領域Ａ、Ｅ、ＦおよびＣにわたるアミノ酸同一性を有し、該アミノ酸同一性が少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の同一性からなる群から選択される請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
ＡＣＣサブユニットポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを含んでなり、該生物学的に活性なフラグメントが他のポリペプチドまたはそのフラグメントと集成して５量体タンパク質を形成することができる、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
上記他のポリペプチドまたはそのフラグメントが、ＡＣＣサブユニットポリペプチドに由来する請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
上記５量体タンパク質がアセチルコリンに結合する請求項７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
上記５量体タンパク質がさらにクロライド選択的チャンネル孔を形成する、請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
上記５量体タンパク質がさらにアセチルコリン結合に共役したクロライドチャンネル活性を有する、請求項９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
アセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットポリペプチドの免疫原性フラグメントを含んでなり、該免疫原性フラグメントがＡＣＣ−１（配列番号２）、ＡＣＣ−２（配列番号４）、ＡＣＣ−３（配列番号８）およびＡＣＣ−４（配列番号１０）からなる群から選択されるＡＣＣチャンネルサブユニットに由来する少なくとも１０、１２、１
４、１６以上の連続するアミノ酸残基を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
上記免疫原性ペプチドが：
（ａ）ＡＣＣ−２のアミノ酸３４８〜４０４およびＡＣＣ−１の３２８〜４２５に対応する細胞内ループ領域；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸１９〜３９に対応するＡＣＣ−２中のシグナル配列切断部位に続く最初の２０アミノ酸；および
（ｃ）ＡＣＣ−２のアミノ酸４３０〜４４５およびＡＣＣ−１の４５２〜４６６に対応するカルボキシ末端；
からなる群から選択されるＡＣＣチャンネルサブユニットの領域に由来する請求項１１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
ＡＣＣ−１（配列番号２）と並べた場合、以下のアミノ酸残基：
（ａ）ＡＣＣ−１のＹ１００に対応する位置にＹ；
（ｂ）ＡＣＣ−１のＦ１５６に対応する位置にＦ；
（ｃ）ＡＣＣ−１のＭ１５８に対応する位置にＭ；
（ｄ）ＡＣＣ−１のＦ１９８に対応する位置にＦ；
を有する請求項１ないし５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
ＡＣＣ−２（配列番号４）と並べた場合、以下のアミノ酸残基：
（ａ）ＡＣＣ−２のＹ８１に対応する位置にＹ；
（ｂ）ＡＣＣ−２のＦ１３７に対応する位置にＦ；
（ｃ）ＡＣＣ−２のＭ１３９に対応する位置にＭ；
（ｄ）ＡＣＣ−２のＦ１７９に対応する位置にＦ；
を有する請求項１ないし５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
ＡＣＣ−１（配列番号２）と並べた場合、以下の残基：
（ａ）ＡＣＣ−１のＩ１２１に対応する位置にＩ；
（ｂ）ＡＣＣ−１のＦ１７９に対応する位置にＦ；
（ｃ）ＡＣＣ−１のＹ２２１に対応する位置にＹ；
（ｄ）ＡＣＣ−１のＷ２２６に対応する位置にＷ；
（ｅ）ＡＣＣ−１のＹ８１に対応する位置にＹ；
（ｆ）ＡＣＣ−１のＮ８３に対応する位置にＮまたはＴまたはその保存的置換；
（ｇ）ＡＣＣ−１のＷ１４７に対応する位置にＷまたはＭまたはその保存的置換；
（ｈ）ＡＣＣ−１のＮ１４９に対応する位置にＮ；
を有する請求項１ないし５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
さらに
（ｉ）ＡＣＣ−１のＭ１３９に対応する位置にＭ；
（ｊ）ＡＣＣ−１のＦ１４１に対応する位置にＦ；
を含んでなる請求項１５項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
ＡＣＣ−２（配列番号４）と並べた場合、以下の残基：
（ａ）ＡＣＣ−２のＩ１４０に対応する位置にＩ；
（ｂ）ＡＣＣ−２のＦ１９８に対応する位置にＦ；
（ｃ）ＡＣＣ−２のＹ２４１に対応する位置にＹ；
（ｄ）ＡＣＣ−２のＷ２４６に対応する位置にＷ；
（ｅ）ＡＣＣ−２のＹ１００に対応する位置にＹ；
（ｆ）ＡＣＣ−２のＴ１０２に対応する位置にＮまたはＴまたはその保存的置換；
（ｇ）ＡＣＣ−２のＷ１６６に対応する位置にＷまたはＭまたはその保存的置換；および（ｈ）ＡＣＣ−２のＮ１６８に対応する位置にＮ；
を有する請求項１ないし５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
さらに
（ｉ）ＡＣＣ−２のＭ１５８に対応する位置にＭ；
（ｊ）ＡＣＣ−２のＦ１６０に対応する位置にＦ；
を含んでなる請求項１７項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
アニオン選択的ＰＡＲＴモチーフまたはそのバリアントを、そのＭ２膜貫通ドメインに含んでなる請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
ＰＡＲＴモチーフのバリアントがＰＡＲＴモチーフの保存的されたプロリンおよびアラニン残基、およびアルギニンおよび／またはトレオニン位の保存的アミノ酸置換からなる請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１ないし２０のいずれか１項に定める単離されたポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチド相補体。
【請求項２２】
請求項２１または２２のポリヌクレオチドに操作可能に連結された転写調節配列を含んでなる組換えポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなる細胞。
【請求項２４】
請求項２１または２２に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック生物。
【請求項２５】
請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの調製法であって：
（ａ）請求項２３に記載の細胞をポリペプチドの発現に適する条件下で培養し；そして
（ｂ）こうして発現したポリペプチドを回収する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２６】
請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドであって、該アンチセンスポリヌクレオチドが請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチドの連続する配列に相補的な少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含んでなる、上記アンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項２１のポリヌクレオチド配列に由来する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含んでなる二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子。
【請求項２８】
請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる単離された抗体。
【請求項２９】
アセチルコリン依存性クロライドチャンネルのモジュレーターの同定法であって：
（ａ）試験化合物を準備し；
（ｂ）請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの供給源を準備し；そして
（ｃ）試験化合物が該ポリペプチドの活性を調節するかどうかを検出する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法により同定されるアセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性を調節する化合物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の化合物および適切な担体または希釈剤を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項３２】
請求項３０に記載の化合物および適切な担体または希釈剤を含んでなる有害生物防除組成物。
【請求項３３】
アセチルコリン依存性クロライドチャンネルのモジュレーターを同定する方法であって：
（ａ）試験化合物を準備し；
（ｂ）請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの供給源を準備し；
（ｃ）工程ｂ）のポリペプチドの結合パートナーを準備し；そして
（ｄ）試験化合物がポリペプチドへの結合パートナーの結合を調節するかどうかを検出する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法により同定されるアセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性を調節する化合物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の化合物および適切な担体または希釈剤を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項３６】
請求項３４に記載の化合物および適切な担体または希釈剤を含んでなる有害生物防除組成物。
【請求項３７】
アセチルコリン依存性クロライドチャンネルのモジュレーターの設計方法であって；
（ａ）アセチルコリン依存性クロライドチャンネルのアセチルコリン結合部位の３次元モデルを開発し；
（ｂ）工程（ａ）からのアセチルコリン結合部位と結合パートナーとの間の３次元的構造−活性の関係を解析し；
（ｃ）工程（ａ）の結合部位と相互作用することが予想される分子を設計し；そして
（ｄ）工程（ｃ）からの分子の調節または結合活性を測定する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法により同定されるアセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性を調節する化合物。
【請求項３９】
請求項３８に記載の化合物および適切な担体または希釈剤を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項４０】
請求項３８に記載の化合物および適切な担体または希釈剤を含んでなる有害生物防除組成物。
【請求項４１】
線虫を、請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物と接触させることを含んでなる線虫を殺すか、または抑制する方法。
【請求項４２】
個体の線虫による寄生生物感染を防止または処置する方法であって、個体に請求項１な
いし２０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を調節する化合物の有効量を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項４３】
上記化合物が上記ポリペプチドの結合パートナーである請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
上記化合物がアンチセンスＲＮＡ分子である請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
上記化合物が干渉ＲＮＡ分子である請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４６】
上記化合物がｍＡｂである請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４７】
上記化合物が請求項３４または３８に記載の化合物である請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４８】
配列番号４（ＡＣＣ−２）に説明するアミノ酸配列を含んでなり、アミノ酸１００位のＴｙｒがＬｅｕに置き換えられ、そしてアミノ酸１６０位のＰｈｅがＴｙｒに置き換えられている、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、引用により本明細書に編入する２００４年６月９日に出願された特許文献１の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は無脊椎動物、特にセノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｏｌｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）に由来するアセチルコリン依存性クロライドチャンネル（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）サブユニットをコードする新規ポリヌクレオチドに関する。アセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットは、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来の卵母細胞のような異種系で集成して、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルを形成することができる。発明のアセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットおよびそのフラグメントは、例えば有害生物防除剤および寄生虫駆虫剤として使用するために、特に抗線虫剤として使用するために、無脊椎動物におけるアセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する化合物を同定するために有用である。アセチルコリン依存性クロライドチャンネルを調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
成功した多くの有害生物防除剤および抗線虫剤は、リガンド依存性（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ）イオンチャンネル（ＬＧＩＣ）を標的とする。例には昆虫のＡ−型ガンマアミノ酪酸受容体（ＧＡＢＡＡ受容体）を標的とするジエルドリン（非特許文献１：ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＧＡＢＡ受容体における点突然変異は、殺虫剤耐性を付与する）、昆虫のニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を標的とするイミジクロプリド（ｉｍｉｄｉｃｌｏｐｒｉｄ）（非特許文献２：ニトロメチレン複素環：マウスＮＩＥ−１１５およびＣＢＣ３Ｈ１細胞に比べて、バッタ（ｌｏｃｕｓｔ）のニューロンでのニコチン性受容体の選択的アゴニスト）、線虫のｎＡＣｈＲを標的とするレバミゾール（非特許文献３：セノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のレバミゾール耐性遺伝子ｌｅｖ−１、ｎｕｃ−２９およびｎｕｃ−３８は機能的ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードする；非特許文献４：寄生虫駆虫剤モランテル（ｍｏｒａｎｔｅｌ）、ピランテルおよびレバミゾールの線虫の筋肉細胞膜に及ぼす作用様式）、および線虫および昆虫のグルタミン酸依存性クロライドチャンネル（ＧｌｕＣｌ）を標的とするアイバメクチン（非特許文献５：寄生虫駆虫剤アベルメクチンに感受性のショウジョウバエ（Ｄｏｒｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のグルタミン酸依存性クロライドチャンネルの同定；非特許文献６：セノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）に由来するアベルメクチン感受性グルタミン酸依存性クロライドチャンネルのクローニング）がある。
【０００４】
しかし暴露された集団における有害生物防除剤および抗線虫剤に対する耐性の発生には、新規薬剤標的に関して継続する調査が必要となる。
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／５７７，９１９号明細書
【非特許文献１】Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ＲＨ，Ｒｏｃｈｅｌｅａｕ  ＴＡ，Ｓｔｅｉｃｈｅｎ  ＪＣ，Ｃｈａｌｍｅｒｓ  ＡＥ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４９−４５１，１９９３
【非特許文献２】Ｚｗａｒｔ  Ｒ，Ｏｏｒｔｇｉｅｓｅｎ  Ｍ，Ｖｉｊｖｅｒｂｅｒｇ  ＨＰＭ，Ｐｅｓｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０２−２１３，１９９４
【非特許文献３】Ｆｌｅｍｉｎｇ  ＪＴ，Ｓｑｕｉｒｅ  ＭＤ，Ｂａｒｎｅｓ  ＴＭ，Ｔｏｒｎｏｅ  Ｃ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｋ，Ａｈｎｎ  Ｊ．Ｆｉｒｅ  Ａ，Ｓｕｌｓｔｏｎ  ＪＥ，Ｂａｒｎａｒｄ  ＥＡ，Ｓａｔｔｅｌｌｅ  ＤＢ，Ｌｅｗｉｓ  ＪＡ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７：５８４３−５８５７，１９９７
【非特許文献４】Ｈａｒｒｏｗ  ＩＤ，Ｇｒａｔｉｏｎ  ＫＡＦ，Ａｓｃａｒｉｓ  Ｓｕｕｍ．Ｐｅｓｔ  Ｓｃｉ  １６：６６２−６７２，１９８５
【非特許文献５】Ｃｕｌｌｙ  ＤＦ，Ｐａｒｅｓｓ  ＰＳ，Ｌｉｕ  ＫＫ，Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ＪＭ，Ａｒｅｎａ  ＪＰ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：２０１８７−２０１９１，１９９６
【非特許文献６】Ｃｕｌｌｙ  ＤＦ，Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓ  ＤＫ，Ｌｉｕ  ＫＫ，Ｐａｒｅｓｓ  ＰＳ，Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ  ＬＨ，Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ＪＭ，Ａｒｅｎａ  ＪＰ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：７０７−７１１，１９９４
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
本発明は、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットである新規ポリペプチド、およびその生物学的に活性な、または免疫原性フラグメントおよびそれらをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０００６】
すなわち１つの観点では、本発明はアセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットポリペプチドまたはその生物学的に活性な、または免疫原性フラグメントである単離されたポリペプチドを提供する。さらに本発明は：本発明のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチド相補体；本発明のポリペプチドに操作可能に連結された転写調節配列を含んでなる組換えポリヌクレオチド；本発明のポリペプチドに特異的に結合することができる単離された抗体；本発明の組換えポリヌクレオチドを含んでなる細胞；および本発明の組換えポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック生物を提供する。
【０００７】
さらに本発明は、本発明のポリペプチドの調製法を提供し、この方法は（ａ）本発明のポリペプチドの発現に適する条件下で、本発明の組換えポリヌクレオチドを含んでなる細胞を培養し；そして（ｂ）そのように発現した本発明のポリペプチドを回収することを含んでなる。
【０００８】
さらに本発明は、本発明のポリペプチドの発現を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドを提供し、ここで該アンチセンスポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチドの連続する配列に相補的な少なくとも１４個の連続するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含んでなる。本発明はさらに本発明のポリヌクレオチド配列に由来する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含んでなる二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。
【０００９】
さらに本発明は、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルのモジュレーター（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）の同定法を提供し、この方法は（ａ）試験化合物を準備し；（ｂ）本発明のポリペプチドの供給源を準備し；そして（ｃ）試験化合物が該ポリペプチドの活性を調節するかどうかを検出することを含んでなる。さらにアセチルコリン依存性クロライドチャンネルのモジュレーターの同定法は：（ａ）試験化合物を準備し；（ｂ）本発明のポリペプチドの供給源を準備し；（ｃ）本発明のポリペプチドの結合パートナーを準備し；
そして（ｄ）試験化合物がポリペプチドへの結合パートナーの結合を調節するかどうかを検出することを含んでなる。さらに本発明は、本発明の方法により同定されるアセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性を調節する化合物、およびそのような化合物および適切な担体または希釈剤を含んでなる製薬学的組成物または有害生物防除組成物を提供する。
【００１０】
別の観点では、本発明はアセチルコリン依存性クロライドチャンネルのモジュレーターの設計方法を提供し、この方法は；（ａ）アセチルコリン依存性クロライドチャンネルのアセチルコリン結合部位の３次元モデルを開発し；（ｂ）工程（ａ）からのアセチルコリン結合部位と結合パートナーとの間の３次元的構造−活性の関係を解析し；（ｃ）工程（ａ）の結合部位と相互作用することが予想される分子を設計し；そして（ｄ）工程（ｃ）からの分子の調節または結合活性を測定することを含んでなる。本発明はさらに、そのような方法により同定されるアセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性を調節する化合物、ならびにそのような化合物および適切な担体または希釈剤を含んでなる製薬学的組成物および有害生物防除組成物を提供する。
【００１１】
発明の詳細な説明
無脊椎動物では、シス−ループ（ｃｙｓ−ｌｏｏｐ）リガンド依存性イオンチャンネル（ＬＧＩＣ）スーパーファミリーに、共通する特定の構造的特徴を有する多様なチャンネルを含む。遺伝子ファミリーのすべてのメンバーは、大きな細胞外リガンド結合ドメインおよびイオン選択的孔を形成する４つの膜貫通ドメインを含んでなるトポロジーを共有する（図１を参照にされたい。Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．（１９９２）発散可能な膜のイオンチャンネル。Ｓｉｎａｕｅｒ，第２版；Ｍｉｙａｚａｗａ  Ａ，Ｆｕｊｉｙｏｓｈｉ  Ｙ，Ｕｎｗｉｎ  Ｎ（２００３）アセチルコリン受容体孔の構造および開閉メカニズム。Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：９４９−９５５；Ｕｎｗｉｎ  Ｎ（１９９５）開放状態で造影されたアセチルコリン受容体チャンネル。Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：３７−４３）。チャンネルは５量体であり、そして多くとも４種の型のサブユニットを含んでなるホモマーまたはヘテロマーであり得る（Ｕｎｗｉｎ（１９９５）同上）。恐らく、種々のリガンド特異性のリガンド−結合ドメインが膜貫通ドメインと対合して種々のイオン特性を与えることができるので、多数のリガンド−イオン対合に進化した。脊椎動物では、これらにはＧＡＢＡおよびグリシン−依存性アニオンチャンネルならびにアセチルコリンおよびセロトニン依存性カチオンチャンネルがある（Ｏｒｔｅｌｌｓ  ＭＯ，Ｌｕｎｔ  ＧＧ（１９９５）レセプターのリガンド依存性イオンチャンネルスーパーファミリーの進化の歴史［コメントを参照にされたい］。Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １８：１２１−１２７）。
【００１２】
無脊椎動物のＬＧＩＣのレパートリーは、無脊椎動物のレパートリーよりも大きく、脊椎動物のチャンネルの相同体に加えて、ヒスタミン依存性クロライドチャンネル（Ｇｉｓｓｅｌｍａｎ  Ｇ，Ｐｕｓｃｈ  Ｈ，Ｈｏｖｅｍａｎｎ  ＢＴ，Ｈａｔｔ  Ｈ（２００２）ショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）におけるヒスタミン依存性イオンチャンネルをコードする２つのｃＤＮＡ。Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ５：１１−１２；Ｚｈｅｎｇ  Ｙ，Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ  Ｂ，Ｙｕａｎ  Ｊ，Ｗａｎｇ  ＡＰ，Ｈｕｎｔ  ＤＣ．Ｌｕｄｍｅｒｅｒ  ＳＷ，Ｓｃｈｍａｔｚ  ＤＭ，Ｃｕｌｌｙ  ＤＦ（２００２）目で発現する２つの新規なショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のヒスタミン依存性クロライドチャンネルサブユニットの同定。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２０００−２００５）、ＧＡＢＡ依存性カチオンチャンネル（Ｂｅｇ  ＡＡ，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＥＭ（２００３）ＥＸＰ−１は興奮性のＧＡＢＡ依存性カチオンチャンネルである。Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ６：１１４５−１１５２）、セロトニン依存性アニオンチャンネル（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ  Ｒ，Ｃａｎｎｏｎ  ＳＣ，Ｈｏｒｖｉｔｚ  ＨＲ（２０００）ＭＯＤ−１は、Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｃｅ）での運動行動を調節するセロトニン依存性クロライドチャンネルである。Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４７０−４７５）、および幾つかのグルタミン酸依存性アニオンチャンネル（Ｃｕｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）同上；Ｄｅｎｔ  ＪＡ，Ｄａｖｉｓ  ＭＷ，Ａｖｅｒｙ  Ｌ（１９９７）ａｖｒ−１５は、虫の阻害的グルタミン酸作用性神経伝達およびアベルメクチン感度を調節するクロライドチャンネルサブユニットをコードする。ＥＭＢＯ Ｊ  １６：５８６７−５８７９；Ｄｅｎｔ  ＪＡ，Ｓｍｉｔｈ  Ｍ，Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓ  ＤＫ，Ａｖｅｒｙ  Ｌ（２０００）セノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）におけるアベルメクチン耐性の遺伝学。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：２６７４−２６７９；Ｈｏｒｏｓｚｏｋ  Ｌ，Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｖ，Ｓａｔｔｅｌｌｅ  ＤＢ，Ｗｏｌｓｔｅｎｈｏｌｍｅ  ＡＪ（２００１）ＧＬＣ−３：セノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）に由来する新規なフィプロニルおよびＢＩＤＮ感受性の、しかしピクロトキシニン非感受性、Ｌ−グルタミン酸依存性クロライドチャンネルサブユニット。Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３２：１２４７−１２５４；Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓ  ＤＫ，Ａｒｅｎａ  ＪＰ，Ｐｌａｓｔｅｒｋ  ＲＨ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＨＡ，Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ＪＭ，Ｃｕｌｌｙ  ＤＦ，Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ  ＬＨ（１９９７ａ）セノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）における新規アベルメクチン感受性クロライドチャンネルに関する遺伝学的および生化学的証拠。Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７２：３３１６７−３３１７４）を含む。
【００１３】
さらに無脊椎動物のチャンネルは、脊椎動物の相同体から実質的に分岐したことを示唆する幾つかの証拠がある。例えばサブユニットＵＮＣ−３８、ＵＮＣ−２９およびＬＥＶ−１からなる線虫Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）のレバミゾール受容体は、脊椎動物のｎＡＣｈＲとの相同性を共有するが、異なる薬理学的プロフィールを有するアセチルコリン依存性カチオンチャンネルである（Ｆｌｅｍｉｎｇ  ＪＴ，Ｓｑｕｉｒｅ  ＭＤ，Ｂａｒｎｅｓ  ＴＭ，Ｔｏｒｎｏｅ  Ｃ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｋ，Ａｈｎｎ  Ｊ，Ｆｉｒｅ  Ａ，Ｓｕｌｓｔｏｎ  ＪＥ，Ｂａｒｎａｒｄ  ＥＡ，Ｓａｔｔｅｌｌｅ  ＤＢ，Ｌｅｗｉｓ  ＪＡ（１９９７）セノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ
ｅｌｅｇａｎｓ）のレバミゾール耐性遺伝子、ｌｅｖ−１、ｕｎｃ−２９およびｕｎｃ−３８は、機能的なニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードする。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７：５８４３−５８５７；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ＪＥ，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＥＭ（１９９９）１つのＧＡＢＡおよび２つのアセチルコリン受容体が、Ｃ，エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の神経筋接合部で機能する。Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２：７９１−７９７）。ニコチンはほとんどの脊椎動物のｎＡＣｈＲのアゴニストであるが、レバミゾール受容体のアゴニストではなく、一方レバミゾールはレバミゾール受容体を活性化するが、脊椎動物のｎＡＣｈＲを活性化しない（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ  ＳＤ，Ａｄｃｏｃｋ  Ｃ，Ｓａｎｓｏｍ  ＭＳ，Ｓａｔｔｅｌｌｅ  ＤＢ，Ｂａｙｌｉｓ  ＨＡ（１９９８）膜貫通ドメイン２に挿入されたロイシン残基を有する突然変異したニワトリのアルファ７ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットの機能的特性決定。Ｂｒ  Ｊ
ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １２４：７４７−７５５；Ｆｌｅｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）同上；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ａｎｄ  Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  （１９９９）同上）。同様に、昆虫に由来するｒｄ１型ＧＡＢＡ受容体は、脊椎動物のＧＡＢＡ受容体とはそれらの薬理学において異なる（Ｈｏｓｉｅ  ＡＭ，Ｓａｔｔｅｌｌｅ  ＤＢ（１９９６）。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の発現されたホモ−オリゴマー性ＧＡＢＡ依存性クロライドチャンネルのアロステリック調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）。Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １１７：１２２９−１２３７；Ｉｋｅｄａ  Ｔ，Ｎａｇａｔａ  Ｋ，Ｓｈｏｎｏ  Ｔ，Ｎａｒａｈａｓｈｉ  Ｔ（１９９８）ＧＡＢＡ（Ａ）受容体シングルチャンネルのジエルドリンおよびピクロトキシニン調節。Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ９：３１８９−３１９５）。この多様性が昆虫の受容体に選択的な化合物の同定を可能とする。
【００１４】
我々は線虫のアセチルコリン依存性クロライドチャンネルであるシス−ループＬＧＩＣの新規ファミリーを同定した。Ｃ，エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）の命名法委員会は、ＡＣＣ−１、ＡＣＣ−２、ＡＣＣ−３およびＡＣＣ−４の名を本明細書に記載するチャンネルサブユニットに割り当て、ここで“ＡＣＣ”はアセチルコリン依存性クロライドチャンネル（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎ  ｇａｔｅｄ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）を表す。新規ＡＣＣサブユニットを特性決定した特定のクローンを、本明細書では：ＡＣＣ−１Ｇ６．４、ＡＣＣ−２Ｄ６．３、ＡＣＣ−３Ｄ１０．５およびＡＣＣ−４Ｅ９．９と同定した。これらの特定のｃＤＮＡの対立遺伝子バリアントも存在し得る。
【００１５】
これはアニオン選択的アセチルコリン受容体の初めての分子特性の決定であり、そして線虫におけるそのようなチャンネルの初めての記載である。それらの独自な特性により、脊椎動物において高度な特異性および低い毒性を持つ殺線虫剤の開発の有望な標的として、これらのチャンネルが薦められる。
【００１６】
ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２は両方とも、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞でホモメリックな（ｈｏｍｏｍｅｒｉｃ）アセチルコリン依存性チャンネルを形成するシス−ＬＩＧＣサブユニットである。それらはムスカリン性アゴニストのアレコリンに対して強く応答し、そしてニコチンに対してはあまり応答しない明白な薬理学的特徴を共有する。配列決定により、それらはＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｃｅ）のセロトニン依存性クロライドチャンネルサブユニットのＭＯＤ−１に最も類似し、そしてジフテリアまたは哺乳動物のゲノムのいずれかにおいてオルソログは持たないらしい。これらのアセチルコリン依存性チャンネルは、安全な無脊椎動物特異的、特に線虫特異的な有害生物防除剤および薬剤の開発に有望な標的である。
【００１７】
我々は、さらに以下に基づきアセチルコリン依存性クロライドチャンネルが特性決定されるはずであると予想する。第１に、Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｃｅ）およびショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のゲノムは、既知のイオンまたはリガンド特異性のサブクラスに明らかに属さない多数の予想されるＬＧＩＣを明らかにする（Ａｄａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）同上；Ｂａｒｇｍａｎｎ  ＣＩ（１９９８）セノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のゲノムの神経生物学。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０２８−２０３３；コンソーシアム  ＴＣｅＧ（１９９８）線虫Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｃｅ）のゲノム配列：生物学を調査するためのプラットフォーム。Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｃｅ）シークエンシングコンソーシアム［Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９  Ｊａｎ  １；２８３（５３９８）：３５および１９９９  Ｍａｒ２６；２８３（５４１０）：２１０３に公開された正誤表が見られる］。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０１２−２０１８；Ｇｅｌｂａｒｔ  ＷＭ，Ｃｒｏｓｂｙ  Ｍ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ  Ｂ，Ｒｉｎｄｏｎｅ  ＷＰ，Ｃｈｉｌｌｅｍｉ  Ｊ，Ｒｕｓｓｏ  Ｔｗｏｍｂｌｙ  Ｓ，Ｅｍｍｅｒｔ  Ｄ，Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ  Ｍ，Ｄｒｙｓｄａｌｅ  ＲＡ，Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  Ｅ，Ｍｉｌｌｂｕｒｎ  ＧＨ，ｄｅ  Ｇｒｅｙ  Ａ，Ｋａｕｆｍａｎ  Ｔ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ  Ｋ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｄ，Ｓｔｒｅｌｅｔｓ  Ｖ，Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  Ｃ（１９９７）ＦｌｙＢａｓｅ；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）データベース。ＦｌｙＢａｓｅコンソーシアム。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：６３−６６）。特にＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｃｅ）は、２０未満が薬理学的に特性決定された約８０のＬＧＩＣサブユニット遺伝子をコードする（Ｂａｒｇｍａｎｎ，（１９９８）同上）。第２に、アメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ）が２つの明確なアセチルコリン依存性アニオンチャンネル（Ｋｅｈｏｅ  Ｊ，ＭｃＩｎｔｏｓｈ  ＪＭ（１９９８）２つの明確なニコチン性受容体、１つは脊椎動物アルファ７−含有受容体に薬理学的に類似し、アメフラシのニューロンのＣ１電流を媒介する。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １８：８１９８−８２１３）を有することを示す電気生理学的証拠がある。しかしアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ）のチャンネルは分子レベルで特性決定されておらず、それらがシス−ループＬＧＩＣであるかどうかは分からない。
【００１８】
単離および精製されたポリペプチドおよびポリヌクレオチド 
１つの観点では、本発明は単離され、実質的に純粋または精製されているポリペプチドおよびポリヌクレオチドを提供する。この内容では、用語「単離された」または「実質的に純粋」とは、実質的または本質的に自然にそれに付随す成分を含まない物質を指す。「単離された」物質は、場合によりその自然な環境でその物質に見いだされない物質を含んでなる。すなわち例えば、化学的に合成されたか、または組換え技術により生産されたポリペプチドは、一般に実質的にそれが自然に付随する成分を含まない。ポリヌクレオチドは、本発明のＤＮＡが由来する生物の自然に存在するゲノムでは通常は連続しているコード配列に直ちに連続（すなわち共有結合している）していない場合、単離されている。典型的には、化合物はサンプル中の全物質の少なくとも６０％、より一般的には７５％または９０重量％より多い場合、実質的に純粋である。実質的に純粋な化合物は、例えば天然源からの抽出により（精製）；ポリペプチド化合物をコードする組換えポリヌクレオチドの発現により；あるいは化学合成により得ることができる。純度は、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ等のような任意の適切な方法を使用して測定することができる。
【００１９】
本明細書で使用する「タンパク質」および「ポリペプチド」とは、両方とも長さや翻訳後修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、アミノ酸の任意の鎖を意味し、そして天然のタンパク質、合成または組換えポリペプチドおよびペプチド、ならびにハイブリッド分子（例えば本発明のポリペプチドのすべてまたは一部を含んでなる１つの部分、および別のタンパク質またはペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでなる第２部分を有する融合タンパク質またはキメラ）を含む。典型的にはタンパク質またはポリペプチドは、単離されているか、または実質的に純粋であるか、または組換えである。本内容では、ポリペプチドは例えば少なくとも６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００等のアミノ酸の長さを有することができる。
【００２０】
用語「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さ（例えば少なくとも９、１２、１５、１８、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００等のヌクレオチド）のヌクレオチドのポリマー形態を指し、そしてまた当該技術分野では「核酸」もしくは「核酸分子」を指すこともできる。ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの型のヌクレオチドの修飾された形態であることができる。この用語にはＤＮＡまたはＲＮＡの一本および二本鎖形態を含む。ＤＮＡには例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡおよびそれらの組み合わせを含む。本発明のポリヌクレオチドには、完全長の遺伝子およびｃＤＮＡ分子ならびにそれらのフラグメントの組み合わせを含む。本発明のポリヌクレオチドは無脊椎動物起源、特に線虫に優先的に由来する。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドは、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットおよびその生物学的に活性な、または免疫原性フラグメントをコードし、そしてプローブ、プライマー（例えばＰＣＲプライマー）、化学的中間体、および生物学的アッセイに有用である。本発明のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ、転写産物／ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡを同定および／または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプライマーとして有用であり、そしてポリヌクレオチドまたは関連するペプチドを生産するバリアント（対立遺伝子、オルソログ等）に対応するｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために有用である。
【００２２】
また本発明のポリヌクレオチドは、組換えベクターを構築するために有用である。その
ようなベクターには、ペプチド配列の一部または全部を発現する発現ベクターを含む。またベクターには、遺伝子および／または遺伝子産物のその場での発現を改変するために、細胞ゲノムのような別のポリヌクレオチド配列に組み込むために使用する挿入ベクターを含む。例えば内因性コード配列は、１もしくは複数の特別に導入された突然変異を含むコード領域のすべてまたは一部と相同的組換えを介して置き換えることができる。
【００２３】
また本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質の抗原性部分を発現するためにも有用である。
【００２４】
また本発明のポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ様分子、または本明細書に記載するポリヌクレオチドから生産されるｍＲＮＡのすべてまたは一部に対応するリボザイムを設計するためにも有用である。
【００２５】
また本発明のポリヌクレオチドは、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットの一部または全部を発現するベクターを作成するために有用であり、そしてまたポリヌクレオチドおよびペプチドの一部または全部を発現する宿主細胞を構築するためにも有用である。
【００２６】
また本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド発現の存在、レベル、形態および分布を測定するためのハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。したがってプローブは細胞、組織および生物中のアセチルコリン依存性クロライドチャンネル発現の存在を検出し、またはレベルを測定するために使用することができる。レベルが測定されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。したがって本明細書に記載するポリペプチドに対応するプローブを使用して、所定の細胞、組織または生物中の発現および／または遺伝子コピー数を評価することができる。これらの用途は、アセチルコリン依存性クロライドチャンネル発現を調節する因子を決定することに関連し、すなわち線虫のような寄生生物の生活環における発生段階中に、その生活環の特定の段階中の寄生生物を標的とする用途に関連する。
【００２７】
ｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技術には、例えばノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む。ＤＮＡを検出するためのインビトロの技術には、例えばサザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む。
【００２８】
プローブは無脊椎動物の被検体に由来する細胞のサンプル中のアセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットをコードするポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡのレベルを測定することにより、あるいはアセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニット遺伝子が突然変異したかどうかを測定すること（例えば有害生物防除剤もしくは寄生虫駆虫剤に対する耐性を付与するために）によるように、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルを発現する細胞または組織を同定する診断試験キットの一部として使用することができる。
【００２９】
組換えポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは組換えであることができる。ポリヌクレオチドを「組換え」という場合、これはポリヌクレオチドが遺伝子工学を使用して、すなわちヒトの介入により操作されたことを意味する。したがって用語「組換え」には、分子生物学的技術により一緒に連結された２以上のポリヌクレオチド配列（核酸分子）を含んでなるポリヌクレオチドを含む。組換えポリヌクレオチド構築物には、自然には連結されていないか、または自然とは異なる位置に連結されたポリヌクレオチド配列に連結された、または連結するように操作されたポリヌクレオチド配列を含むことができる。組換えポリヌクレオチド構築物は、例えば形質転換により宿主細胞に導入することができる。そのような組換えポリヌクレオチド構築物は同じ宿主細胞種に由来する配列、または単離され、そして宿主種の細胞に再導入された異なる宿主細胞種に由来する配列を含んでよい。組換えポリヌクレオチド構築物の配列は、宿主細胞の元の形質転換の結果として、あるいは引き続く組換えおよび／または修復反応（ｅｖｅｎｔ）の結果のいずれかとして宿主細胞ゲノムに組み込まれるようになることができる。
【００３０】
遺伝子組成物に関して用語「組換え」に言及する場合、親のゲノムでは生じなかった対立遺伝子の新規組み合わせをもつ配偶子または子孫または細胞またはゲノムを指す。
【００３１】
タンパク質またはポリペプチドに関して用語「組換え」に言及する場合、分子生物学的技術により作成された組換えポリヌクレオチド構築物を使用して発現されるタンパク質またはポリペプチド分子を指す。
【００３２】
キメラまたは融合タンパク質またはフラグメントは、標準的なＤＮＡ技術により生産することができる。例えば種々のタンパク質配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の技術に従いフレーム内に一緒に連結される。別の態様では、融合遺伝子が自動化ＤＮＡ合成器を含む従来技術により合成され得る。あるいは遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続的遺伝子フラグメント間に相補的な突出部を生じ、これを引き続きアニーリングして、そして再度増幅してキメラ遺伝子配列を生成するアンカープライマーを使用して行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，分子生物学における現在の手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），１９９２を参照にされたい）。さらに融合部分（例えばＧＳＴタンパク質）をすでにコードする多くの発現ベクターが市販されている。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヘテロロガス部分がフーイム内でアセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドに連結されるように、そのような発現ベクター中にクローン化され得る。
【００３３】
ベクター
本発明の別の観点では、本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドはさらにベクター、例えば発現ベクター中に包含されることができる。１つの態様では、ベクターは転写調節配列、または本発明のサブユニット（またはその相同体、フラグメントもしくはバリアント）をコードすることができる配列を含んでなるポリヌクレオチドに操作可能に連結されるプロモーターを含んでなる。第１のポリヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチド配列と機能的に関連して配置される場合、第１のポリヌクレオチド配列は第２のポリヌクレオチド配列と「操作可能に連結」される。例えばプロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に操作可能に連結されている。一般に操作可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、そしてここで２つのタンパク質コード領域はリーディングフレーム内で連結する必要がある。しかし例えばエンハンサーは、一般にプロモーターから数キロベース離れ、そしてイントロン配列が可変の長さでよい場合に機能するので、ポリヌクレオチドの中には要素が操作可能に連結されているが、連続していないものもある。「転写調節要素」とは、操作可能に連結されてタンパク質コード配列の転写を誘導または制御する開始および終結シグナル、エンハンサーおよびプロモーター、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナルのようなＤＮＡ配列を指す総称である。
【００３４】
本発明のベクターは当業者に知られ、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）に見いだされる標準技術により構築することができる。ＤＮＡのフラグメントを連結するための種々の方法
を利用することができ、その選択はＤＮＡフラグメントの末端の性質に依存し、そして当業者により容易に決定され得る。本発明のベクターはベクターの増殖およびバクテリアおよび宿主細胞中での選択を促進するための他の配列要素を含むことができる。さらに本発明のベクターは、１もしくは複数の制限エンドヌクレアーゼ部位用のヌクレオチドの配列を含んでなることができる。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子のようなコード配列も、当業者には周知である。
【００３５】
幾つかの態様では、本発明のベクターは宿主細胞、例えばベクターのタンパク質コード領域を発現することができる生きている細胞に導入することができる。生きている細胞は培養された細胞または生きている生物中の細胞でよい。したがって本発明は本発明のベクターを含有する宿主細胞も提供する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は互換的に使用することができる。そのような用語は、特定の個体細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指す。突然変異または環境的影響により、特定の修飾が継代中に生じるかもしれないので、そのような子孫は実際に親細胞と同一ではなく、親細胞の「派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」となることはできないが、それでも本明細書で使用する用語の範囲内に含める。
【００３６】
ベクターＤＮＡは従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して細胞に導入することができる。用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する技術を指し、それには例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介型トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクションおよびウイルス媒介型トランスフェクションがある。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするために適する方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（同上）および他の研究室用マニュアルに見いだすことができる。
【００３７】
抗体
さらなる観点では、本発明は本発明のポリペプチドを認識する抗体を提供する。
【００３８】
本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであることができる。抗体は組換え、例えばキメラ（例えばヒト定常領域に会合したマウス起源の可変領域により構成される）、ヒト化（動物、例えばマウス起源の超可変領域と一緒になったヒト免疫グロブリン定常骨格）、および／または単鎖であることができる。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体のいずれも免疫グロブリンフラグメント、例えばＦ（ａｂ）’２、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントの形態でよい。本発明の抗体は任意のアイソタイプ、例えばＩｇＧまたはＩｇＡであり、そしてポリクローナル抗体は単一のアイソタイプまたはアイソタイプの混合物である。
【００３９】
本発明のポリペプチドに対する抗体は、哺乳動物を本ポリペプチドを含んでなる部分精製した画分、すなわちアセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットまたはその免疫原性フラグメントで免疫感作することにより生成される。そのような抗体はポリクローナルまたはモノクローナルでよい。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生産する方法は、当該技術分野では周知である。（総説として例えば：「抗体：ア  ラボラトリーマニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）編集、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８）およびＤ．Ｅ．Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：６５７−６８０を参照にされたい。両方とも引用により本明細書に編入する）。モノクローナル抗体に関しては、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（引用により本明細書に編入する）を参照にされた
い。  
【００４０】
本発明のポリペプチドを含んでなる部分精製された画分に対して生じ得る本発明の抗体は生産され、そして標準的な免疫学アッセイ、例えばウエスタンブロット解析、ドットブロット解析またはＥＬＩＳＡを使用して同定され得る（例えばＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，により編集された免疫学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（１９９４）、グリーネ（Ｇｒｅｅｎｅ）出版アソシエイツおよびウィリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を参照にされたい。引用により本明細書に編入する）。抗体は本発明のポリペプチドの存在および／または組織もしくは体液のようなサンプル中の対応する活性を検出する診断法に使用することができる。また抗体は本発明のポリペプチドを含んでなる精製画分を得るためのアフィニティクロマトグラフィーに使用することもできる。
【００４１】
抗体は本発明のポリペプチドの任意の領域または別個のフラグメントから調製することができる。しかし好適な領域はアセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットに独自である領域、例えば細胞内ループ領域（ＡＣＣ−２のアミノ酸３４８−４０４、およびＡＣＣ−１の３２８−４２５）、ＡＣＣ−２のシグナル配列切断部位後の最初の２０アミノ酸（ＡＣＣ−２のアミノ酸１９−３９）、およびカルボキシ末端（ＡＣＣ−２のアミノ酸４３０−４４５およびＡＣＣ−１の４５２−４６６）を含む。
【００４２】
免疫原性エピトープは、典型的には少なくとも８個の連続するアミノ酸残基を含んでなる。しかし抗原性ペプチドは少なくとも１０、１２、１４、１６以上のアミノ酸残基を含んでなることができる。そのようなフラグメントは、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば親水性領域に対応するフラグメントのような物理的特性で選択することができ、あるいは配列の独自性に基づき選択することができる。
【００４３】
本発明の抗体の検出は、抗体を検出可能な物質にカップリング（すなわち物理的に連結する）することにより容易にすることができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を含む。適当な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み；適切な補欠分子族複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適切な蛍光物質の例にはウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンを含み；発光物質の例にはルノミールを含み；生物発光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含み、そして適切な放射性物質の例には１２５Ｉ、１３Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。
【００４４】
したがって、本発明のさらなる観点は（ｉ）組織または体液中の本発明のポリペプチドの存在を検出するための試薬（すなわち本発明の抗体）；および（ｉｉ）免疫複合体が形成されるように、組織または体液を本発明の抗体と接触させ、そしてそのような複合体を検出して、サンプル中またはサンプルが引き出された生物中の本発明のポリペプチドおよび／または活性の存在を示すことによる本発明のポリペプチドおよび／または組織もしくは体液中の活性の存在を検出するための診断法を提供する。組織または体液サンプルは、無脊椎生物から、または線虫のような寄生性の無脊椎生物に感染したことが疑われる脊椎生物（すなわち患者）から得ることができる。
【００４５】
当業者は免疫複合体がサンプルの成分と抗体の間に形成され、そして任意の非結合物質が複合体を検出する前に除去されると容易に理解するだろう。本発明の抗体は、例えば血液、血漿、リンパ球、脳脊髄液、尿、唾液、上皮、繊維芽細胞または宿主細胞のようなサ
ンプルを本発明のポリペプチドの存在についてスクリーニングするために使用することができると理解される。
【００４６】
診断的用途については、試薬（すなわち本発明の抗体）は遊離状態であるか、または試験管、ビーズまたはこの分野で使用される他の通常の支持体に固定化されるかのいずれかであることができる。固定化は、直接的または間接的手段を使用して達成することができる。直接的手段には、受動的吸着（非共有結合）または支持体と試薬との間の共有結合を含む。「間接的手段」とは、試薬と相互作用する抗試薬化合物が最初に固体支持体に結合されることを意味する。間接的手段はリガンド−受容体系を使用することもでき、ここでビタミンのような分子が試薬にグラフト化され、そして対応する受容体が固体相に固定化される。これはビオチン−ストレプトアビジン系により具体的に説明される。あるいはペプチドテイル（ｔａｉｌ）を化学的に、または遺伝子工学的に試薬に付加し、そしてグラフト化もしくは融合産物をペプチドテイルの受動吸着または共有結合により固定化する。
【００４７】
そのような診断薬は、使用説明書も含んでなるキットに含めることができる。試薬は標的に結合した時に試薬の検出を可能とする検出手段で標識することができる。適切な検出手段には、例えばフルオレセインイソシアネートまたはフルオレセインイソチオシアネートのような蛍光試薬、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素、および１２５Ｉまたは５１Ｃｒのような放射性元素がある。
【００４８】
したがって本発明のさらなる観点は、サンプル（例えば組織もしくは体液）から本発明のポリペプチドを精製する方法を提供し、これにはサンプルを用いた抗体に基づくアフィニティクロマトグラフィーの実施が含まれ、ここで抗体は本発明の抗体である。
【００４９】
本発明の精製法で使用するために、抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり、そして好ましくはＩｇＧ型である。精製したＩｇＧは標準的方法を使用して抗血清から調製される（例えばＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）同上を参照にされたい）。通例のクロマトグラフィー支持体ならびに抗体をグラフト化する標準法は、例えば抗体：ア  ラボラトリーマニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（編集）コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（１９８８）に記載され、これは引用により本明細書に編入し、そして以下に概説する。
【００５０】
簡単に説明すると、好ましくはバッファー溶液中のサンプルを、好ましくはサンプルを希釈するために使用したバッファーで平衡化して、本発明のポリペプチド（すなわち抗原）が材料に結合するようにしたクロマトグラフィー材料に乗せる。本発明の抗体にカップリングしたゲルまたは樹脂のようなクロマトグラフィー材料は、バッチ状態またはカラムのいずれかである。非結合成分は洗い出され、そして次に抗原がグリシンバッファーまたはカオトロピック剤（例えばグアニジンＨＣｌ）もしくは高塩濃度（例えば３Ｍ  ＭｇＣｌ２）を含有するバッファーのような適切な溶出バッファーで溶出する。溶出画分は回収され、そして例えば２８０ｎｍでの吸収を測定することにより抗原の存在について検出される。
【００５１】
本発明のさらなる観点は、本発明の抗体を生物学的系に導入することを含んでなる診断撮影法であり、これは本発明のポリペプチドまたはその活性が存在するか、または不存在である場所を同定するための適切な検出系と一緒に使用する。
【００５２】
本発明のさらなる観点は、本発明の抗体の治療的応用を提供し、これにより本発明の抗体は線虫の感染のような寄生生物の感染を処置し、または改善するために患者に投与され
る。
【００５３】
類似配列
用語「同一性」および「同一な」とは、２つのペプチドまたは２つのポリヌクレオチド分子間の類似性を指す。同一性は並べた配列における各位置を比較することにより決定することができる。ポリヌクレオチド間またはアミノ酸配列間の同一性の程度は、配列が共有する位置で、すなわち特定する領域にわたる同一の、または対合するヌクレオチドまたはアミノ酸の数の関数である。
【００５４】
ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、２つの配列が特定する領域にわたり実質的な同一性を有し、そして配列の機能的活性が保存されている場合、もう１つの配列と「相同的」である（本明細書で使用する用語「相同的」は、進化的関連性を考えない）。２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、最適に並べた時（ギャップを許して）、それらが少なくとも約５０％の配列同一性を共有する場合、あるいは配列が定めた機能的モチーフを共有する場合に実質的な同一性を有すると考える。別の態様では、最適に並べた配列は、それらが少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９の同一性を特定した領域にわたり共有する場合に実質的に同一である（すなわち実質的同一性を有する）と考えることができる。「無関係」または「非相同的」配列は、相同性の特定領域にわたり本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと、４０％未満の同一性を共有するが、好ましくは約２５％未満の同一性である。
【００５５】
実質的に相補的なポリヌクレオチドは、１つの分子の相補鎖が別の分子と実質的に同一であるポリヌクレオチドである。
【００５６】
同一性を比較するために最適な配列のアライメントは、種々のアルゴリズム、例えばｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐから利用可能なＣｌｕｓｔａｌｗプログラム（６１１−００１１、日本、京都府、宇治の京都大学バイオインフォマチックセンター、化学調査研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の常置住所を有する）、スミスおよびウォーターマンのローカルホモロジーアルゴリズム（ｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｏｆ  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２、ニュードルマンおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルコリズム（ｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｏｆ  Ｎｅｅｄｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ）、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、ピアーソンおよびリップマンの類似法に関する調査（ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ），１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４、およびこれらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（米国、ウィスコンシン州、マジソンのジェネティックコンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）によるウィスコンシン  ジェネティック  ソフトウエア  パッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡのような）を使用して行うことができる。
【００５７】
配列同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用しても決定することができる（公開されたデフォルト設定を使用して）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウエアは、ナショナル  センター  フォ  バイオテクノロジー  インフォメーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通しても利用することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／のインターネットを介して）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムには、最初にクエリ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、データベース配列中の同じ長さのワードと並べた時、幾つかの正の値の閾値スコアＴと合うか、または満たす高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは隣のワードスコア閾値を指す。最初の隣のワードのヒットは、より長いＨＳＰを見いだすための調査を開始するシード（ｓｅｅｄ）として作用する。ワードヒットは、累積的アライメントスコアが上がることができる限り、各配列に沿って両方向に伸びる。各方向におけるワードヒットの伸びは、以下のパラメーターに合った時に止められる：累積的アライメントスコアが、最大達成値から量Ｘまで落ちる；累積的スコアが、１もしくは複数の負のスコア残基のアライメントの累積によりゼロ以下に行く；あるいはいずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９）、５０のアライメント（Ｂ）、１０（または１または０．１または０．０１または０．００１または０．０００１）の期待（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を使用することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用する２つの配列間の統計的類似性の１つの尺度は、最小の確率の和（ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間で偶然に起こる対合による可能性の表示を提供する。本発明の別の態様では、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、最小の確率の和が試験配列と比べた時に約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、実質的に同一と考えられる。
【００５８】
２つのポリヌクレオチド配列が実質的に相補的であることの別の表示は、２つの配列が穏やかなストリンジェント、または好ましくはストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。穏やかなストリンジェント条件下でフィルターに結合した配列へのハイブリダイゼーションは、例えば０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃で行い、そして４２℃にて０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄により行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（編集）、１９８９、分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１巻、グリーン出版アソシエイツ社、およびジョン  ウィリー＆サンズ社、ニューヨーク、ｐ．２．１０．３を参照にされたい）。あるいはストリンジェント条件下でフィルターに結合した配列へのハイブリダイゼーションは、例えば０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃で行い、そして６８℃にて０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄により行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（編集）、１９８９、同上を参照にされたい）。ハイブリダイゼーション条件は目的の配列に依存して、既知の方法に従い修飾することができる（Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，生化学および分子生物学における研究技術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）−−−核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ），第Ｉ部、第２章「核酸プローブアッセイのハイブリダイゼーションおよび方法の原理の総説（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ）」、エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨークを参照にされたい）。一般にストリンジェント条件は、定めたイオン強度およびｐＨでの具体的配列に関する融解点よりも約５℃低くなるように選択される。
【００５９】
バリアントポリペプチド
本発明のポリペプチドには、天然のアセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユ
ニットのバリアントを含み、例えば：短縮化およびフラグメントを含む欠失；タグ付ポリペプチドおよび融合タンパク質を含む挿入および付加；置換、例えば位置指定突然変異および対立遺伝子バリアント；およびペプチドに共有結合した１もしくは複数の非アミノアシル基（ｑ．ｖ．，糖、脂質等）を有するペプトイドおよび翻訳後修飾を含む修飾がある。バリアントは例えば、天然のアセチルコリン依存性クロライドチャンネルまたはそのフラグメントのアミノ酸配列中の１もしくは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失し、または付加し、そして生物学的活性をスクリーニングすることにより調製することができる。好ましくは置換は保存的アミノ酸残基、すなわち類似の物理的、生物学的または化学的特性を有する残基を用いて作成される。
【００６０】
当該技術分野では、機能的に均等なポリペプチドを得るために、ペプチドの生物学的活性を実質的に改変せずにポリペプチドの構造に幾つかの修飾および変化を作成できることが周知である。すなわち本発明は、保存的アミノ酸の置換により、天然のアセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットおよびその生物学的に活性な、または免疫原性フラグメントのアミノ酸配列の部分とは異なる生物学的に均等なポリペプチドにも広がる。本明細書で使用する用語「保存的アミノ酸置換」は、ペプチドの所定の位置で１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換を指し、ここで置換は関連する機能の実質的な損失が無く行うことができる。そのような変化を作成するには、同様のアミノ酸残基の置換を側鎖置換基の関連する類似性、例えばそれらのサイズ、荷電、疎水性、親水性等に基づき作成することができ、そしてそのような置換はそれらのペプチドの機能への効果について日常的な試験により評価することができる。幾つかの態様では、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を類似の親水性値（例えばプラスまたはマイナス２．０の値内）を有する別のアミノ酸残基に置換することにより作成することができる（本明細書に引用により編入する米国特許第４，５５４，１０１号明細書に詳述されているように）：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；Ａｓｐ（＋３．０）；Ｇｌｕ（＋３．０）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｕ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｐｒｏ（−０．５）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０．５）；Ｃｙｓ（−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅｕ（−１．８）；Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（−２．３）；Ｐｈｅ（−２．５）；およびＴｒｐ（−３．４）。
【００６１】
別の態様では、アミノ酸残基を類似の水治療指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）（例えばプラスまたはマイナス２．０の値内）を有する別のアミノ酸残基に置換する保存的アミノ酸置換を作成することができる。そのような態様では、各アミノ酸残基にその疎水性および荷電特性に基づき水治療指数を以下のように割り当てることができる。：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−３．２）；Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（−３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）；およびＡｒｇ（−４．５）。
【００６２】
別の態様では、アミノ酸残基が同じクラスの別のアミノ酸残基に置換される保存されたアミノ酸置換を作成することができ、ここでアミノ酸は、以下のように非極性、酸性、塩基性および中性のくらすに分割することができる：非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ．Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ，Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ。
【００６３】
保存的アミノ酸の変化には、保存的Ｄ−アミノ酸による、またはアミノ酸の自然に起こる遺伝的にコードされていない形態によるＬ−アミノ酸の対応するＤ−アミノ酸への置換、ならびにＬ−アミノ酸の保存的置換を含む。自然に起こる遺伝的にコードされていないアミノ酸には、ベータ−アラニン、３−アミノ−プロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、アルファ−アミノイソ酪酸、４−アミノ−酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２−ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニル  アラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ベータ−２−チエニルアラニン、メチオニン  スルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチル  リシン、２−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２，４−ジアミノ酪酸、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、システイン酸、イプシロン−アミノヘキサン酸、デルタ−アミノ吉草酸または２，３−ジアミノ酪酸がある。
【００６４】
別の態様では、保存的アミノ酸の変化には、親水性もしくは疎水性、サイズもしくは容積、または荷電の考慮に基づく変化を含む。アミノ酸は一般に、主にアミノ酸側鎖の特性に依存して疎水性または親水性と特徴付けることができる。Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１７９：１２５−１４２，１９８４）の標準化されたコンセンサスの疎水性尺度に基づき、疎水性アミノ酸はゼロより大きい疎水性を表し、そして親水性アミノ酸はゼロ未満の親水性を表す。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸にはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＭｅｔおよびＴｒｐを含み、そして遺伝的にコードされた親水性アミノ酸にはＴｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＬｙｓを含む。遺伝的にコードされていない疎水性アミノ酸にはｔ−ブチルアラニンを含み、一方、遺伝的にコードされていない親水性アミノ酸にはシトルリンおよびホモシステインを含む。疎水または親水性アミノ酸はさらにそれらの側鎖の特性に基づき再分割することができる。例えば芳香族アミノ酸は、少なくとも１つの芳香族もしくはヘテロ芳香族環を含有する側鎖をもつ疎水性アミノ酸であり、これは−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ等のような１もしくは複数の置換を含むことができ、ここでＲは独立して（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、置換（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ２６）アルクアリール、置換（Ｃ６−Ｃ２６）アルクアリール、５〜２０員のヘテロアリール、置換５〜２０員のヘテロアリール、６〜２６員のアルクヘテロアリールまたは置換６〜２６員のアルクヘテロアリールである。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸にはＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｙｐを含み、一方、遺伝的にコードされていない芳香族アミノ酸にはフェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、ベータ−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、および４−フルオロフェニルアラニンを含む。
【００６５】
非極性アミノ酸は、生理学的ｐＨで非荷電であり、そして一般に２つの各原子に共有される１対の電子が、２つの各原子により等しく保持されている結合を有する側鎖を持つ疎水性アミノ酸である（すなわち側鎖は極性ではない）。遺伝的にコードされた非極性アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＡｌａおよびＭｅｔを含み、一方、遺伝的にコードされていない非極性アミノ酸にはシクロヘキシルアラニンを含む。非極性アミノ酸はさらに再分割されて脂肪族アミノ酸を含むことができ、これは脂肪族の炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸には、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅを含み、一方、遺伝的にコードされていない脂肪族アミノ酸には、ノルロイシンを含む。
【００６６】
極性アミノ酸は、生理学的ｐＨで非荷電であるが、そして２つの原子に共有される電子対が、そのうちの１つの原子により接近して保持されている１つの結合を有する側鎖を持つ疎水性アミノ酸である。遺伝的にコードされる極性アミノ酸にはＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎを含み、一方、遺伝的にコードされていない極性アミノ酸にはシトルリン、Ｎ−アセチルリシンおよびメチオニンスルホキシドを含む。
【００６７】
酸性アミノ酸は、７未満の側鎖ｐＫａ値を持つ親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は典型的には水素イオンの損失により生理学的ｐＨで負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸にはＡｓｐおよびＧｌｕを含む。塩基性アミノ酸は、７より大きい側鎖ｐＫａ値を持つ親水性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は典型的にはヒドロニウムイオンとの会合により生理学的ｐＨで正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸にはＡｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓを含み、一方、遺伝的にコードされていない塩基性アミノ酸には非環式アミノ酸のオルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸およびホモアルギニンを含む。
【００６８】
上記の分類は絶対的ではなく、そしてアミノ酸は１より多くの範疇に分類することができる。さらに、アミノ酸は特異的アッセイに基づく既知の挙動およびまたは特徴的な化学的、物理的または生物学的特性に基づき、あるいはこれまでに同定されたアミノ酸と比較して分類することができる。またアミノ酸は、アミノ酸様の側鎖を有する二官能性部分を含むことができる。
【００６９】
また保存的変化には、例えばアミノ酸の官能性側基の反応により非誘導化残基の化学的に誘導化された部分への置換を含むことができる。すなわちこれらの置換には、遊離のアミノ基がアミンヒドロクロライド、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基に誘導化された化合物を含むことができる。同様に、遊離のカルボキシル基は塩、メチルおよびエチルエステル、または他の種類のエステルもしくはヒドラジドを形成するように誘導化することができ、そして側鎖は遊離のヒドロキシル基についてはＯ−アシルもしくはＯ−アルキル誘導体を、またはヒスチジンのイミダゾール窒素についてはＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導化することができる。ペプチド類似体も、例えばメチル化により、エチルアミン、エタノールアミンもしくはエチレンジアミンのようなアルキルアミンによるＣ−末端アミノ酸のアミド化により、またはアミノ酸側鎖のアシル化もしくはメチル化により（リシンのイプシロンアミノ基のアシル化のような）化学的に改変されたアミノ酸を含む。またペプチド類似体は、ペプチド中のアミド結合の置換アミドへの置き換え（例えば式−Ｃ（Ｏ）−ＮＲの基、ここでＲは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルケニルまたは置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキニルである）、アミド結合の等配電子体への置き換え（例えば−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−または−ＣＨ２ＳＯ−）を含むこともできる。
【００７０】
トポロジー
膜貫通ドメインは、隠れマルコフ（ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ）モデルに基づくＴＭＨＭＭ法を使用して予測することができる（Ｋｒｏｇｈ  Ａ，Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｂ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｇ，Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ＥＬ（２００１）隠れマルコフモデルを用いた膜貫通タンパク質トポロジーの予測：完全なゲノムへの応用。Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０５：５６７−５８０）。人工的な神経ネットワークに基づくＳｉｇｎａｌＰ  ２．０、ＮｅｔＧｌｙｃ  １．０およびＮｅｔＰｈｏｓ  ２．０を使用して、それぞれシグナルペプチド配列、Ｎ−グリコシル化およびリン酸化部位を予想することができる（Ｂｌｏｍ  Ｎ，Ｇａｍｍｅｌｔｏｆｔ  Ｓ，Ｂｒｕｎａｋ  Ｓ（１９９９）真核生物のタンパク質リン酸化部位の配列および構造に基づく予測。Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９４：１３５１−１３６２；Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｈ，Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ  Ｊ，Ｂｒｕｎａｋ  Ｓ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｇ（１９９７）原核および真核生物のシグナルペプチドの同定およびそれらの切断部位の予測。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１−６）。これらの予測プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓから入手可能であり、これは以下の常置住所を有する：
生物配列解析センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）  
ＢｉｏＣｅｎｔｒｕｍ−ＤＴＵ
デンマーク技術大学（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ）  
ケミトロールベット（Ｋｅｍｉｔｏｒｖｅｔ）、ビルディング２０８
デンマーク、リングバイ  ＤＫ−２８００  
【００７１】
アンチセンスポリヌクレオチド
別の態様では、本発明は標的ｍＲＮＡ、すなわち本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの分解および／または翻訳の阻害を行うために外から投与するためのアンチセンス分子およびリボザイムを提供する。引用により本明細書に編入する治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドの応用には：１９９２年８月４日に発効された米国特許第５，１３５，９１７号明細書；１９９２年３月２４日に発効された米国特許第５，０９８，８９０号明細書：１９９２年２月１１日に発効された米国特許第５，０８７，６１７号明細書；１９９２年１１月２４日に発効された米国特許第５，１６６，１９５号明細書；１９９１年４月２日に発効された米国特許第５，００４，８１０号明細書；１９９３年３月１６日に発効された米国特許第５，１９４，４２８号明細書：１９８９年２月２１日に発効された米国特許第４，８０６，４６３号明細書：１９９４年２月１５日に発効された米国特許第５，２８６，７１７号明細書：米国特許第５，２７６，０１９号および同第５，２６４，４２３号明細書；ＢｉｏＷｏｒｌｄ  Ｔｏｄａｙ，Ａｐｒ．２９，１９９４，ｐ．３を含む。
【００７２】
アンチセンス分子の非標的配列への結合を避けるために、インビボアッセイまたは治療的処置の場合には生理学的条件下、あるいはインビトロアッセイの場合にはアッセイが行われる条件下のような特異的結合が望まれる条件下で、アンチセンス分子中に標的ｍＲＮＡに対して十分な程度の相同性があることが好ましい。アンチセンス結合に対する標的ｍＲＮＡには、タンパク質をコードするための情報だけでなく、例えば５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、５’キャップ領域およびイントロン／エキソン連結リボヌクレオチドを形成する関連するリボヌクレオチドも含むことができる。本発明のアンチセンス分子を提供するために使用できるアンチセンスおよびリボザイムポリヌクレオチドのスクリーニング法は、米国特許第５，９３２，４３５号明細書に開示されている（これは引用により本明細書に編入する）。
【００７３】
本発明のアンチセンス分子（オリゴヌクレオチド）は、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖間結合、ホスホロチオエートのような糖間骨格結合を含むもの、ならびにＣＨ２−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２、ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている）、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２、ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２およびＯ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２骨格（ここでホスホジエステルはＯ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２である）を含むものを含むことができる。モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも使用することができる（米国特許第５，０３４，５０６号明細書）。別の態様では、
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ、「タンパク質核酸」と呼ぶことがある）骨格を有することができ、ここでオリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ヌクレオシド塩基がポリアミド骨格のアザ窒素原子またはメチレン基に直接または間接的に結合しているポリアミド骨格に置き換えることができる（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ
ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７および米国特許第５，５３９，０８２号明細書）。ホスホジエステル結合はキラルおよび鏡像異性体的に特異的な構造に置換することができる。当業者は本発明の実施で使用するための他の連結を選択することができる。
【００７４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド塩基を含む種を含んでもよい。すなわち通常、天然に見い出されるもの以外のプリンおよびピリミジンを使用するこことができる。同様に、ヌクレオチドサブユニットのペントフラノシル部分上の修飾も行うことができる。そのような修飾の例は、２’−Ｏ−アルキル−および２’−ハロゲン−置換ヌクレオチドである。本発明に有用な糖部分の２’位での特別な修飾例は、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ここでｎは１から約１０である）、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルクアリールまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルクアリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する基；またはオリゴヌクレオチドおよび類似の特性を有する他の置換基の薬力学特性を改善する基である。１もしくは複数のペントフラノシル基は、別の糖に、シクロブチルのような糖模造物に、または糖に代わる別の部分に置き換えることができる。
【００７５】
幾つかの態様では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５から約１００個のヌクレオチド単位を含んでなることができる。多くの場合で、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明をポリペプチドをコードするヌクレオチドの連続配列に相補的な少なくとも１４、１６または３０個の連続するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含んでなる。認識されているように、ヌクレオチド単位は骨格構造を形成するホスホジエステルまたは他の結合を介して、隣接するヌクレオチドに適切に結合した塩基−糖の組み合わせである（または類似構造の組み合わせ）。
【００７６】
ＲＮＡｉ
さらなる態様では、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの発現は、翻訳後遺伝子サイレンシングの類いであるＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）技術を使用して阻害または防止することができる。ＲＮＡｉは偽「ノックアウト」、すなわち目的の遺伝子またはコード領域によりコードされる産物の発現が低減され、系におけるコードされた生産物の活性の全体的減少がもたらされる系を作成するために使用することができる。そのようにＲＮＡｉは目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントもしくはバリアントを標的とし、次いでその発現、そしてそれがコードする生産物の活性のレベルを低減するために行うことができる。そのような系は生産物の機能的実験、ならびにそのような生産物の活性に関連する障害を処置するために使用することができる。ＲＮＡｉは例えばＨａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｒｎｒｔ．２：１１０−１１１９；Ｓｈａｒｐ（２００１）Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ  １５：４８９−４９０；Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｓｅｄｌａｋ（２０００）および公開された米国特許出願第２００２０１７３４７８号明細書（Ｇｅｗｉｒｔｚ；２００２年１１月２１日に公開）および２００２０１３２７８８号明細書（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．；２００２年１１月７日に公開）に記載され、これらのすべては引用により本明細書に編入する。ＲＮＡｉを行うための試薬およびキットは
、例えばアンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．）（オースチン、テキサス州、米国）うよびニューイングランドバイオラボズ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）（ベヴァリー、マサチューセッツ州、米国）から市販されている。
【００７７】
幾つかの系ではＲＮＡｉ用の最初の薬剤は、標的ポリヌクレオチドに対応するｄｓＲＮＡ分子であると考えられる。次いでｄｓＲＮＡは２１〜２３ヌクレオチド長（１９〜２１ｂｐ二重鎖、各々が２ヌクレオチドの３’突出部を持つ）の短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断されると考えられる。この最初の切断工程を行うと考えられる酵素は、「サイコロ（Ｄｉｃｅｒ）」と呼ばれ、そしてｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーに分類される。あるいはＲＮＡｉは、細胞に直接導入するか、または細胞にそのようなｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子の適切な前駆体（例えば前駆体（１つもしくは複数）をコードするベクター等）を導入することにより細胞内に生成することを介して行うことができる。次いでｓｉＲＮＡは他の細胞内成分と会合して、ＲＮＡが誘導するサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成することができる。このように形成されたＲＩＳＣは、続いて相同性によるそのｓｉＲＮＡ成分と標的の転写物との間の塩基対合相互作用を介して目的の転写産物を標的とし、ｓｉＲＮＡの３’末端から約１２ヌクレオチドの標的転写物の切断を生じることができる。このように標的ｍＲＮＡは切断され、そしてそれがコードするタンパク質産物のレベルが低減される。
【００７８】
ＲＮＡｉは、適切なインビトロで合成されたｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子を細胞に導入することにより行うことができる。ＲＮＡｉは例えば化学的に合成したＲＮＡ（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を使用して行うことができる。あるいは適切な発現ベクターを使用して、そのようなＲＮＡをインビトロまたはインビボのいずれかで転写することができる。センスおよびアンチセンス鎖（同じベクターまたは別のベクターー上に存在する配列によりコードされる）のインビトロ転写は、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して行うことができ、そのような場合、ベクターはＴ７プロモーターに操作可能に連結された適切なコード配列を含んでなることができる。この態様において、インビトロで転写されたＲＮＡは（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮａｓｅＩＩＩを使用して）、ＲＮＡｉの助けとなるサイズにインビトロでプロセッシングされ得る。センスおよびアンチセンス転写物を組み合わせて、目的の標的細胞に導入するＲＮＡ二重鎖が形成される。ｓｉＲＮＡ様分子にプロセッシングされ得る小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＢＡ）を発現する他のベクターを使用してもよい。種々のベクターに基づく方法が、例えばＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｍｉｙａｇａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ（２００２），Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）およびＹｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）に記載されている。そのようなベクターをインビトロまたはインビボで細胞に導入するための種々の方法（例えば遺伝子治療）が当該技術分野で知られている。
【００７９】
したがって、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの発現の態様は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはそのフラグメント、またはそれに相同的なポリヌクレオチドに対応するｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子を細胞に導入することにより、または細胞内でそれらを生成することにより阻害することができる。「ｓｉＲＮＡ様分子」とは、ｓｉＲＮＡに類似し（例えばサイズおよび構造）そしてｓｉＲＮＡ活性、すなわち発現のＲＮＡｉが媒介する阻害を行うことができるポリヌクレオチド分子を指す。種々の態様では、そのような方法はｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子の細胞への直接投与、または上記のベクターに基づく方法の使用を必要とするかもしれない。１つの態様では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は約３０ヌクレオチド長未満である。さらなる態様では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は約２１〜２３ヌクレオチド長である。１つの態様では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、
各々の鎖が２ヌクレオチドの３’突出部を有する１９〜２１ｂｐの二本鎖を含んでなる。態様では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、目的とするポリペプチドまたはそのフラグメントまたはバリアントをコードするポリヌクレオチド（またはフラグメントまたはバリアント）と実質的に同一である。そのようなバリアントは目的のポリペプチドに類似の活性を有するタンパク質をコードすることができる。態様では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子のセンス鎖は、配列番号１または３に説明するデオキシリボヌクレオチド配列またはそのフラグメント（ＤＮＡのＴ残基の代わりにＵを有するＲＮＡ）に実質的に同一である。
【００８０】
遺伝子ノックアウト
内因性の遺伝子発現は、標的遺伝子またはそのプロモーターを、標的化相同的組換え（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を使用して不活性化することにより低減することができる（例えばＳｍｉｔｈｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０，１９８５；Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ５１，５０３，１９８７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５，３１３，１９８９を参照されたい；各々引用により全部、本明細書に編入する）。例えば内因性の標的遺伝子に相同的なＤＮＡにより平滑化された変異体非機能的標的遺伝子（または完全に無関係なＤＮＡ配列）は、選択可能なマーカーおよび／またはネガティブ選択可能なマーカーを用いて、または用いずに使用することができる。標的化相同的組換えを介するＤＮＡ構築物の挿入は、標的遺伝子の不活性化をもたらす。そのような取り組みは、胚性幹細胞に対する修飾が不活性な標的化遺伝子を有する非ヒト動物の子孫を作出するために使用できる場合に特に適している（例えばＴｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９８９，同上を参照にされたい；またＧｒｉｓｈｏｋ  ｅｔ  ａｌの「ＲＮＡ干渉（“ＲＮＡｉ”）」技術．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７（５４６２）：２４９４，２０００）、およびＤｅｒｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．１４（１３）：１５７８，２０００を参照にされたい）。
【００８１】
線虫に特異的なノックアウト技法は以下に記載されている：  
Ｚｗａａｌ  ＲＲ，Ｂｒｏｅｋｓ  Ａ，ｖａｎ  Ｍｅｕｒｓ  Ｊ，Ｇｒｏｅｎｅｎ  ＪＴＭ，Ｐｌａｓｔｅｒｋ  ＲＨＡ。凍結トランスポゾン挿入変異体バンクを使用することにより、セノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）の標的−選択化遺伝子の不活性化。Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ  ９０：７４３１−７４３５  １９９３。
【００８２】
Ｊａｎｓｅｎ，Ｇ．，Ｈａｚｅｎｄｏｎｋ，Ｅ．，Ｔｈｉｊｓｓｅｎ，Ｋ．Ｌ．ａｎｄ
Ｐｌａｓｔｅｒｋ，Ｒ．Ｈ．（１９９７）セノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）における化学的突然変異誘発法による逆遺伝学。Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１７，１１９−１２１。
【００８３】
セノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）における弾丸形質転換による相同的遺伝学ターゲッティングに関する技法は、Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ  Ｅ，Ｂａｒｇｍａｎｎ  ＣＩ，Ｐｌａｓｔｅｒｋ，ＲＨＡ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：ｅ４０−２００４を参照にされたい。
【００８４】
タンパク質の生産および精製
本発明のポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換したか、または注入した宿主細胞を、本発明のポリペプチドを発現するために適する条件下で培養することにより調製することができる。そのように発現されたポリペプチドは、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーのような既知の精製法を使用して、そのようなカルチャーから精製することができる。またポリペプチドの精製には、ポリペプチドに結合する作用物質（ａｇｅｎｔ）を含有するアフィニティカラムクロマトグラフィー；コンカナバリンＡ−ａｇａｒｏｓｅ、ヘパリン−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）またはシバクロンブルー３ＧＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）のようなアフィニティ樹脂での１もしくは複数のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルのような樹脂を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーが関与する１もしくは複数の工程；またはイムノアフィニティクロマトグラフィーを含む。あるいは本発明のポリペプチドは精製を容易にする状態でも発現することができる。例えばマルトース結合ポリペプチド（ＭＥＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）のような融合タンパク質として発現され得る。そのような融合ポリペプチドの発現および精製キットは、それぞれニューイングランドラボ（ベヴァリー、マサチューセッツ州）、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、およびインビトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）から販売されている。またポリペプチドはエピトープで標識（ｔａｇｇｅｄ）し、そして引き続きそのようなエピトープに向けた特異的抗体を使用して精製することもできる。１つのそのようなエピトープ（Ｆｌａｇ）がコダック（Ｋｏｄａｋ）（ニューヘブン、コネチカット州）から販売されている。場合により疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用した１もしくは複数の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を採用して、ポリペプチドをさらに精製することができる。前述の幾つかの、またはすべての精製工程は、様々に組み合わせて実質的に精製された組換えポリペプチド、すなわち他の哺乳動物ポリペプチドを実質的に含まず、そして本発明で「実質的に精製されたポリペプチド」と定める組換えポリペプチドを提供することができる。本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する体細胞または生殖細胞を特徴とするトランスジェニック動物の産物としても、例えばトランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジの乳として発現され得る。
【００８５】
ポリペプチドを発現するために適する宿主細胞には、真核および原核細胞を含む。幾つかの目的には、本発明のポリヌクレオチドに由来するＤＮＡまたはＲＮＡを注入したアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞をポリペプチドの都合の良い供給源として使用することができる。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に関する材料および方法は、キットで例えばインビトロジェン（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国（ＭａｘＢａｃ（商標）キット）から販売され、ならびに方法は引用により本明細書に編入するＳｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）およびＬｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）に記載されている。哺乳動物の宿主細胞には、例えばサル腎細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＸ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０）細胞系、アフリカミドリサル腎細胞系ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）（ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１，１９９１）、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換した霊長類細胞系、通常の二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養に由来する細胞株、初代エクスプラント、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞がある。あるいは酵母のような低級真核細胞またはバクテリアのような原核細胞中でポリペプチドを生産することが可能かもしれない。潜在的に適する酵母株には、サッカロミセス  セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）またはヘテロロガスなポリペプチドを発現することができる任意の酵母株を含む。潜在的に適するバクテリア株には、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはヘテロロガスなポリペプチドを発現することができる任意のバクテリア株を含む。ポリペプチドが酵母またはバクテリアで作られる場合、そこで生産されるポリペプチドは、機能的なポリペプチドを得るために、適切な部位をリン酸化またはグリコシル化により修飾する必要があるかもしれない。そのような共有結合は、既知の化学的または酵素的方法を使用して達成することができる。またポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドを１もしくは複数の昆虫発現ベクター中の適切な制御配列に操作可能に連結し、そして昆虫発現系を使用することによっても生産することができる。
【００８６】
また無細胞翻訳系も、本明細書に開示する核酸構築物に由来するＲＮＡを使用してポリペプチドを生産するために使用することができる。本発明の単離されたポリヌクレオチド、好ましくは少なくとも１つの発現調節配列に操作可能に連結されたポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。
【００８７】
ＤＮＡを哺乳動物の細胞に導入するための確立された方法が記載された（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５−６９）。さらにリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）またはリポフェクタミン−プラス（Ｐｌｕｓ）脂質試薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）のような市販されている試薬を使用するプロトコールを使用して、細胞をトランスフェクトすることができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３，１９８７）。さらにＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ
ａｌ．（モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、１〜３巻、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、１９８９のような通例の手順を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトするために、電子穿孔を使用することができる。適切な形質転換体の選択は、例えば細胞傷害性薬剤に対する耐性のような当該技術分野で知られている方法を使用して行うことができる。Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：４８７，１９９０はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性のような幾つかの選択スキームを記載する。ＤＨＦＲ選択に適する株は、ＣＨＯ  ＤＸ−Ｂ１１株であることができ、これはＤＨＦＲが欠失している（Ｕｒｌａｕｂ
ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６，１９８０）。ＤＧＦＲ  ｃＤＮＡを発現するプラスミドは、ＤＸ−Ｂ１１株に導入され、そしてプラスミドを含有する細胞のみが適切な選択培地で成長できる。発現ベクターに包含することができる選択可能なマーカーの他の例は、Ｇ４１８およびヒグロマイシンＢのような抗生物質に耐性を付与するｃＤＮＡを含む。ベクターを宿す細胞は、これらの化合物に対する耐性に基づき選択される。
【００８８】
また発現したポリペプチドを親和性により精製するために、本発明のポリペプチドに対して生じたモノクローナル抗体のようなアフィニティカラムを利用することが可能でもある。これらのポリペプチドは、通例の技術、例えば高塩溶出バッファー、そして次いで使用する低塩バッファーへの透析、または使用したアフィニティマトリックスに依存して、ｐＨまたは他の成分を変えることにより除去することができ、あるいは本発明に由来するポリペプチドのような親和性部分の自然に存在する基を使用して競合的に除去することができる。本発明のこの観点では、本発明のポリペプチドに結合する結合タンパク質（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば本発明のポリペプチドに結合する抗体）は、固相支持体、または同定、分離または本発明のポリペプチドを発現する細胞をそれらの表面から精製するために適する類似の支持体に結合させることができる。結合タンパク質の固相表面への接着は任意の手段により行うことができ、例えば磁気微小球をこれらの結合タンパク質で覆い、そして磁場を介してインキュベーション容器中で保持する。細胞混合物の
上清を、そのような結合タンパク質を上に有する固相と接触させる。結合タンパク質は、それらの表面に本発明のポリペプチドを有する細胞に結合し、非結合細胞（例えば本発明のポリペプチドを持たない細胞）は、結合した細胞から洗い出される。この親和性結合法は、溶液からそのようなポリペプチドを発現する細胞を精製し、スクリーニングし、または分離するために有用である。固相から陽性に選択される細胞を放出する方法は既知であり、そして例えば酵素の使用を包含する。そのような酵素は細胞に対して非毒性かつ非傷害性であることが好ましく、そして細胞表面の結合パートナーの切断に向けられることが好ましい。あるいは本発明のポリペプチドを発現する細胞を含有すると思われる細胞混合物を、最初にビオチン化された本発明のポリペプチドとインキュベーションする。インキュベーション期間は、本発明のポリペプチドへの十分な結合を確実とするために、典型的には少なくとも１時間の期間である。生じた混合物は次いでアビジンを被覆したビーズを詰めたカラムに通し、これによりアビジンに対するビオチンの高親和性がビーズに対する細胞の結合を提供する。アビジンを被覆したビーズの使用は当該技術分野で知られている（Ｂｅｒｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９，１９８６を参照にされたい）。非結合物質の洗浄および結合した細胞の放出は、常法を使用して行う。
【００８９】
また本発明のポリペプチドは、既知の従来の化学合成により生成することもできる。合成手段により本発明のポリペプチドを構築する方法は、当業者に知られている。天然のポリペプチドと１次、２次または３次構造および／または立体配座的特徴を共有することにより合成的に構築されたポリペプチド配列は、生物活性を含め、それらに共通する生物学的特性を保有することができる。すなわち合成したポリペプチドは、治療用化合物のスクリーニングにおいて、および抗体を開発するための免疫原的プロセスにおいて、天然の精製されたポリペプチドと、生物学的に活性または免疫学的置換物として使用することができる。
【００９０】
所望する純度の程度は、ポリペプチドの意図する使用に依存する。ポリペプチドが例えばインビボに投与される場合、比較的高純度が望まれる。そのような場合、ポリペプチドはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析で検出できる他のポリペプチドに対応するポリペプチドバンドが無くなるように精製される。当業者はポリペプチドに対応する多数のバンドが、示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）グリコシル化、示差的翻訳後プロセッシング等によりＳＤＳ−ＰＡＧＥで視覚化することができると認識している。本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析で単一のポリペプチドのバンドにより示されるような実質的均一性まで精製されることが最も好ましい。ポリペプチドのバンドは銀染色、クーマシーブルー染色、または（ポリペプチドが放射性標識されている場合）オートラジオグラフィーにより視覚化することができる。
【００９１】
スクリーニングアッセイ
本発明の別の観点は、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルのモジュレーターを同定するために使用することができるスクリーニングアッセイにおいて、標的としての本発明のポリペプチドの使用に関する。アセチルコリン依存性クロライドチャンネルのモジュレーターは、有害生物防除剤として、または無脊椎動物に関連する寄生生物感染の防止および／または処置に有用となり得る。
【００９２】
幾つかの態様では、そのようなスクリーニングアッセイは：
（ａ）試験化合物を準備し；
（ｂ）本発明のポリペプチドの供給源を準備し；そして
（ｃ）試験化合物が該ポリペプチドの活性を調節するかどうかを検出する、
工程を含んでなる。
【００９３】
別の種類の本発明のポリペプチドのモジュレーターを同定するアッセイは、「結合パートナー」（通例のリガンド、アセチルコリンのような）を利用する、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルの競合結合アッセイである。そのようなスクリーニングアッセイは：
（ａ）試験化合物を準備し；
（ｂ）本発明のポリペプチドの供給源を準備し；
（ｃ）該本発明のポリペプチドの結合パートナーを準備し；そして
（ｄ）試験化合物が該本発明のポリペプチドへの結合パートナーの結合を調節するかどうかを検出する、
工程を含んでなる。
【００９４】
結合パートナーの本発明のポリペプチドへの結合は、例えば放射標識した結合パートナーの放出を測定することにより、またはアセチルコリン依存性クロライドチャンネルの活性を測定することにより従来の方法で測定することができる。結合パートナーはアセチルコリン、アトロピンまたはアレコリンのようなアセチルコリン依存性クロライドチャンネルのアゴニストであることができる。多くの場合で、アセチルコリンが好適な結合パートナーである。また結合パートナーはジヒドロ−β−エリスロイジンのようなアセチルコリン依存性クロライドチャンネルのアンタゴニストでもあることができる。
【００９５】
試験化合物には、例えば１）Ｉｇテイル化融合ペプチド、およびランダムペプチドライブラリー（例えばＬａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６（１９９１）を参照にされたい）、ならびにＤ−および／またはＬ−立体配置のアミノ酸から作られた組み合わせの化学誘導化分子ライブラリーのメンバーを含む可溶性ペプチドのようなペプチド；２）ホスホペプチド（例えば無作為におよび部分的に縮重したディレクティッド（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えばＳｏｎｇｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８（１９９３）を参照にされたい）；３）抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗−イディオタイプ、キメラおよび単鎖抗体ならびに抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、およびエピトープ−結合フラグメント）；および４）ペプチド模造物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）を含む低有機分子および無機分子（例えば組み合わせおよび天然産物ライブラリーから得られる分子）を含む。ペプチド模造物は特定のペプチドの生物学的に活性な形態の立体配座および特定の立体化学的特徴を模する化合物である。一般にペプチド模造物は化合物の特定の望ましい特性を模するが、しかし生物学的に活性な立体配座の損失および結合の分解を導く柔軟性のような望ましくない特性を模することはないように設計される。ペプチド模造物は望ましくない特性に寄与する特定の基または結合を、生物学的等価体と置き換えることにより調製することができる。生物学的等価体は当業者に知られている。例えばメチレンの生物学的等価体ＣＨ２Ｓは、エンケファリン類似体においてアミド置換として使用されてきた（例えばＳｐａｔｏｌａ（１９８３）ｐｐ．２６７−３５７の「アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質の化学および生化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、Ｗｅｉｓｔｅｉｎ編集、第７巻、マルセルデッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨークを参照にされたい）。具体的例の説明として、モルホリンはペプチドエンドルフィンの周知なペプチド模造物である。本明細書の目的のためには、環式ペプチドがペプチド模造物に含まれる。
【００９６】
本明細書で使用する「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）／調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」とは、生物学的活性のアップレギュレーション（すなわち例えば作用する（ａｇｏｎｉｚｅ）か、または強化する（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）ことによる活性化または刺激）、およびダウンレギュレーション（すなわち、例えば拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎ
ｇ）、減少または阻害することによる阻害または抑制）の両方を指す。
【００９７】
本明細書で使用する「生物学的活性」には、内因的または外因的のいずれかで発現されるアセチルコリン依存性クロライドチャンネルの影響下で、間接的または直接的な任意のパラメーターを含む。これには結合パートナーへの結合、イオン流動および／または膜電位の変化、ならびに転写またはホルモン放出の上昇または減少のようなアセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性に関連する他の生理学的効果を含む。
【００９８】
したがって本発明のポリペプチドの生物学的活性に及ぼす試験化合物の効果は、例えばチャンネル伝導性の変化（すなわちクロライド電流、イオン流動または膜をわたる膜電位の変化）、リガンド置換として、あるいはチャンネルの伝導性における変化の結果により（ホルモンまたは伝達物質の上昇または減少のような）測定することができる。膜をわたるクロライド流動の変化は、従来の電気生理学的（例えば電圧クランプ）技術のような標準的技術を使用して測定することができる。あるいは膜をわたるクロライド流動は：電圧感受性色素を利用する蛍光技術または放射性結合または流動アッセイ（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ．６（２４）：１２７８に記載されているような）；放射性クロライド流動アッセイ（Ｂｌｅｄｎｏｖ  ＹＡ，Ｂｌｅｃｋ  Ｖ．Ｈｅｒｒｉｓ  ＲＡ．放射性クロライドの取り込みによるグリシン受容体機能の測定。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．６８（２）：２５３−７，１９９６  Ｏｃｔを参照にされたい）を使用して；あるいはチャンネル自体の蛍光修飾に基づくチャンネル立体配座の変化をアッセイすること（Ｃｈａｎｇ，Ｙ．ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｄ．Ｓ．（２００２）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１１６３−１１６８に記載されているような）によりアッセイすることができる。チャンネルが昆虫細胞または動物のような系でアッセイされる場合、伝達物質の放出、ホルモンの放出、既知の、および特性が決定されていない遺伝子マーカーの両方に対する転写的変化（例えばノーザンブロットによる）、細胞容量の変化、および細胞増殖もしくはｐＨ変化のような細胞の代謝における変化のような種々の効果も測定することができる。
【００９９】
本発明のアッセイ法は、生物系におけるアセチルコリン依存性クロライドチャンネルを調節することができる化合物を同定するために使用することができる。態様では、上記の生物系は線虫、そして特にＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）のような無脊椎動物でよい。そのようにこれらのアッセイは、例えばクロライド伝導性の上昇または抑制についてアッセイすることにより、生物系においてアセチルコリンが誘導するクロライド電流の調節について化合物をアッセイする工程をさらに含んでなることができる。
【０１００】
別の観点では、本発明はアセチルコリン依存性クロライドチャンネル発現を調節する作用物質のレポーターアッセイに基づく選択法を提供し、すなわちアセチルコリン依存性クロライドチャンネル発現を調節（例えば阻害）することにより、寄生生物が関連する感染を防止および／または処置する化合物の同定における使用を提供する。そのような方法は、試験化合物の存在  対  不存在下で、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルの遺伝子発現をアッセイすることを含んでなることができる。そのような遺伝子発現は対応するＲＮＡまたはタンパク質の検出、あるいはレポーター遺伝子に操作可能に連結されたそのようなアセチルコリン依存性クロライドチャンネル遺伝子と通常結合している転写調節要素（１つもしくは複数）を含んでなる適切なレポーター構築物の使用を介して検出することにより測定することができる。そのようなレポーター遺伝子の発現は、転写または翻訳レベルで、例えばＲＮＡまたは生産されるタンパク質の量により測定することができる。ＲＮＡは例えばノーザン解析により、または逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により検出することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（第２版）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、米国を参照にされたい）。タンパク質レベルは親和性試薬を使用して直接的に（例えば抗体またはそのフラグメント［方法については、例えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ（１９８８）抗体：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨークを参照にされたい］；タンパク質に結合するリガンド）、あるいは他の特性により（例えば緑色蛍光タンパク質の場合には蛍光）、あるいは検出可能な生成物を生産できる酵素活性（例えば改変された分光光学的特性）、または検出可能な表現型（例えば細胞増殖の変化）を必要とするタンパク質の活性を測定するいずれかにより検出することができる。適切なレポーター遺伝子には限定するわけではないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−Ｄガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質がある。
【０１０１】
上記方法およびアッセイは、単一もしくは複数の試験化合物または試験化合物のライブラリー（例えば組み合わせライブラリー）のいずれかを用いて使用することができる。後者の場合、化合物の組み合わせにより提供される相乗効果も同定され、そして特徴付けることができる。上記の化合物はアセチルコリン依存性クロライドチャンネルの活性を調節するために（例えば有害生物防除剤として）、および患者の寄生生物感染、特に線虫感染を防止かつ／または処置するために使用することができ、あるいは改善された特異性、効力および／または薬理学的（例えば薬物動態学的）特性を有するさらなる化合物を開発そして試験するためのリード化合物として使用することができる。特定の態様では、本発明のスクリーニング／試験法の１もしくは複数の工程を自動化することができる。そのようなアッセイ系は、有用なアッセイ条件を可能にし、そして至適化するために種々の手段を含んでなることができる。そのような手段には限定するわけではないが：例えばｐＨおよびイオン強度を制御するために、そしてアセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性および安定性を至適化するための必要な成分を提供するために（例えばプロテアーゼインヒビター）適切なバッファー溶液、アセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性およびまたは安定性を至適化するための温度制御手段、およびアセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性の検出を可能とする検出手段を含む。種々のそのような検出手段を使用することができ、それらには限定するわけではないが以下の１もしくは組み合わせを含む：放射性標識（例えば３２Ｐ）、抗体に基づく検出、蛍光、化学発光、分光光度法（例えば改変された分光的特性を持つ生産物の生成）、種々のレポーター酵素またはタンパク質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、緑色蛍光タンパク質）、特異的結合試薬（例えばビオチン／ストレプトアビジン）、およびその他。結合は、未変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動のような当該技術分野で一般的に知られている方法、ならびに酵母２−ハイブリッド系またはインビトロ結合アッセイのような融合タンパク質に基づくアッセイ、またはアセチルコリン依存性クロライドチャンネル結合タンパク質を同定するためのプロテオミックスに基づく取り組みを使用しても解析することができる。
【０１０２】
アセチルコリン依存性クロライドチャンネルの少なくとも１つの生物学的活性を保持するアセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットのバリアントおよび／またはフラグメントも、本発明の方法に使用することができる。
【０１０３】
アッセイは本発明のポリペプチドの供給源として、細胞に基づく、または無細胞系を使用してインビトロで行うことができる。そのようなアッセイはアレイ形式で行うことができる。１もしくは複数のアッセイ工程を自動化することができる。本発明のポリペプチドを生産するために、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡを宿主細胞に導入し、そしてアセチルコリン依存性クロライドチャンネルの発現のための条件を提供することにより宿主細胞を調製することができる。そのような宿主細胞は哺乳動物（例えばヒト、マウス、ラット、霊長類または他の非ヒト由来）、または非哺乳動物（例えばアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ゼブラダニオ、またはハエもしくは線虫のような無脊椎動物、またはバクテリアもしくは酵母由来）でよい。例えばアフリカツメガエル（
Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞は、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡまたは好ましくはｍＲＮＡをアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞に注入し、そして注入した卵母細胞を外来チャンネルの発現を可能とする適切な条件下で、例えば本明細書に記載するように維持することにより、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルを発現するための宿主細胞として使用することができる。
【０１０４】
無細胞薬剤スクリーニングアッセイを行うためには、本発明のポリペプチドまたはその結合パートナーのいずれかを固定化し、１もしくは両方の成分の非複合化状態から複合体の分離を促進し、ならびにアッセイの自動化を適用することが望ましい場合がある。
【０１０５】
タンパク質をマトリックス上に固定化するための技術は、薬剤スクリーニングアッセイで使用することができる。１つの態様では、タンパク質をマトリックスに固定化できるようにするドメインを加えた融合タンパク質が提供され得る。例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質は、グルタチオンｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズキ（シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、セントルイス、ミズーリ州）またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレートに吸着され、これらは次いで細胞溶解物（例えば３５Ｓ−標識化）および候補化合物と合わせられ、そして混合物は複合体の形成に資する条件下（例えば塩およびｐＨについて生理学的条件で）でインキュベーションされる。インキュベーション後、ビーズを洗浄して非結合標識を除去し、そして固定化されたマトリックスおよび放射標識を直接測定するか、あるいは複合体が解離した後の上清中を測定する。あるいは複合体をマトリックスから解離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてビーズ画分に見いだされた本発明のポリペプチドのレベルを、標準的な電気泳動技術を使用してゲルから定量する。例えば本発明のポリペプチドまたはその標的分子のいずれかは、当該技術分野で周知の技術を使用してビオチンおよびストレプトアビジンの結合体を利用して固定化することができる（ビオチン化キットおよびストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートが、例えばピアスケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ロックフォード、イリノイ州から販売されている）。あるいはタンパク質と反応性であるが、タンパク質のその標的分子との結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導化し、そしてタンパク質は抗体結合によりウェル中に捕らえることができる。結合パートナーおよび試験化合物の調製物はウェル中でインキュベーションされ、本発明のポリペプチドを提示し、そしてウェル中に捕らえられた複合体の量を定量することができる。そのような複合体を検出する方法は、ＧＳＴ−固定化複合体に関して上に記載した方法に加えて、抗体を使用した複合体の免疫検出、ならびに複合体と結合した酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイを含む（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ）。
【０１０６】
１つの態様では、試験化合物を標識する。試験化合物または結合パートナーのいずれか、または両方が最初に、結合を可能とするに十分な期間、本発明のポリペプチドに加えられる。インキュベーションは最適な活性を促進する任意の温度、典型的には４から４０度Ｃの間で行うことができる。インキュベーション期間は最適な活性のために選択されるが、迅速な高処理スクリーニングを促進するためにも至適化され得る。典型的には０．１から１時間の間で十分である。過剰な試薬は一般に除去されるか、または洗い出される。次いで第２成分を加え、そして結合を示すために標識成分の存在または不存在を追跡する。
【０１０７】
また２つの分子間の相互作用は、例えば少なくとも１つの分子が蛍光標識される蛍光アッセイを使用しても検出することができる。そのようなアッセイの１例には、蛍光エネルギー転移がある（蛍光共鳴エネルギー転移用のＦＥＴまたはＦＲＥＴ）（例えばＬａｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６３１，１６９号明細書；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８６８，１０３号明細書を参照にされたい）。蛍光アッセイの別の例は蛍光分極（ＦＰ）（例えばＮａｓｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  ＨＴＳ  ２：１７７−１９０；Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２４６：２８３；Ｓｅｅｔｈａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：２５７）があり、これは例えばＴｅｃａｎ  Ｐｏｌａｒｉｏｎ（商標）リーダーを使用して、マルチウェルプレート中を監視することができる（例えばＰａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ５：７７−８８；およびＳｈｏｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  ３８，１６８０２−１６８０９を参照されたい）。
【０１０８】
また結合パートナーが本発明のポリペプチドに結合する能力は、リアルタイムの生体分子相互作用解析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＢＩＡ）を使用して行うこともできる（例えばＳｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５を参照にされたい）。アセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットおよびそのフラグメントを調節する作用物質は、１もしくは複数の上記アッセイを単独または組み合わせて使用して同定することができる。一般に細胞に基づく、または無細胞系を最初に使用し、そして次に動物のようなモデル系、例えば哺乳動物（マウス、ラット、霊長類または他の非ヒトのような）、あるいは他の動物（例えばアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ゼブラダニオ、またはハエもしくは線虫のような無脊椎動物）を使用して、活性を確認することが好ましい。このように上記のアッセイ法は、さらにそのように同定された化合物が、適切な疾患動物モデル系における疾患症状に及ぼすそれらの効果（１もしくは複数）を調査するような、寄生生物感染を処置するために使用できるかどうかを測定することを含んでなる。同様に上記方法は、生物系、例えばＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）のような全動物系（ｗｈｏｌｅ−ａｎｉｍａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）でのアセチルコリン依存性クロライドチャンネルのモジュレーションのための化合物を同定し、そして特徴付けるために使用することができる。
【０１０９】
別の態様では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットおよびそれらが形成するチャンネルの他のタンパク質パートナー対を同定するために、酵母ツー−バブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）系で使用することができる。
【０１１０】
構造−活性の関係および構造に基づく設計
構造−活性の関係および構造に基づく設計の原理を、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルタンパク質を調節する新規化合物を設計するために使用することが可能である。すなわち本発明は本発明のポリペプチドのインヒビターまたは結合剤を設計する方法も提供する。この方法には本発明のチャンネルタンパク質のアセチルコリン結合部位の３次元モデルを開発し（例えばカタツムリ（Ｌｙｍｎａｅａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓ）（Ｂｒｅｊｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ．４１１（６８３５）：２６９−７６）、またはニコチン性アセチルコリン受容体（Ｍｉｙａｚａｗａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ．４２４（６９４３）：９４９−５５）に由来するアセチルコリン結合タンパク質のアセチルコリン結合部位の既知の構造を利用し、そしてアミノ酸配列アライメントに基づきアミノ酸置換を導入することにより）、タンパク質と結合パートナーとの間の３次元的な構造−活性関係を解析し、タンパク質と相互作用することが予想される分子を設計し、そして分子の調節または結合活性を測定することを含む。タンパク質の３次元構造に基づき基質または結合剤をモデル化するアルゴリズム、ソフトウェアおよび方法の例は、国際公開第１０７５７９Ａ２号パンフレットに記載され、その開示は引用により本明細書に編入する。
【０１１１】
構造−活性の関係および構造に基づく設計の取り組みの両方を、ファルマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）を同定するために使用することができる。ファルマコフォアは、薬剤探査および薬剤−リード至適化（ｄｒｕｇ−ｌｅａｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）において高度に価値があり、そして有用な概念である。ファルマコフォアは生物学的活性に必須な化学基の明確な３次元（３Ｄ）配置（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）として定義される。製薬学的に活性な分子は、効果的になるために個体の体内の１もしくは複数の分子構造と相互作用しなければならず、そして分子の所望する機能的特性がこれらの相互作用から引き出されるので、各活性化合物はこの相互作用が起こることができるようにする化学基の明確な配置を含まなければならない。通常、デェスクリプター  センター（ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒ  ｃｅｎｔｅｒ）で命名される化学基は、（ａ）原子または原子群；（ｂ）偽原子、例えば環の中心、または分子の塊の中心；（ｃ）ベクター、例えば原子対、孤立電子対方向または平面に対する基準により表される。いったん定式化すれば、ファルマコフォアは化学化合物のデータベースを、例えばファルマコフォアと適合性の構造を有するものについて調査するために使用することができる。例えば米国特許第６，３４３，２５７号明細書；Ｙ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ、ドラッグデザインにおける３Ｄのデータベース調査、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５，２１４５（１９９２）；およびＡ．Ｃ．Ｇｏｏｄ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｍａｓｏｎ、３次元構造のデータベース調査。Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．７，６７（１９９６）を参照にされたい。データベース調査のクエリは化学的特性の情報のみならず、正確な幾何学的情報にも基づくことができる。
【０１１２】
コンピューターに基づく取り組みは、対合する鋳型を見いだすためのデータベース調査を使用することができる：引用により本明細書に編入するＹ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ，ドラッグデザインにおけるデータベース調査。Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．３５，ｐｐ２１４５−５４（１９９２）。化合物の２Ｄおよび３Ｄデータベースを調査する既存の方法を応用することができる。アメリカンシアナミド（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ）（パールリバー、ニューヨーク）のＬｅｄｅｒｌｅは、先駆的な分子形状調査、３Ｄ調査およびデータベースのベクター傾向（ｔｒｅｎｄ−ｖｅｃｔｏｒ）を有する。商業的売り主および他の研究グループも、調査能力を提供する（ＭＡＣＳＳ−３Ｄ、モレキュラーデザイン社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．）（サン  レアンドロ、カリフォルニア州）；ＣＡＶＥＡＴ，Ｌａｕｒｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，カリフォルニア大学（バークレー、カリフォルニア州）；ＣＨＥＭ−Ｘ、ケミカルデザイン社、（マーワ、ニュージャージー州））。これらの調査に関するソフトウェアは、有望な薬剤化合物の重要な化学的および幾何学構造により示されるそれらのデータベースを解析するために使用することができる（例えば標準薬剤ファイル（ダルウェント出版社（Ｄｅｒｗｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．）、ロンドン、英国）、ビールステイン（Ｂｉｅｌｓｔｅｉｎ）データベース（ビールステインインフォメーション）、フランクフルト、ドイツまたはシカゴ）、およびケミカルレジストリー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）データベース（ＣＡＳ、コロンバス、オハイオ州））。
【０１１３】
いったんファルマコフォアに合う化合物が同定されれば、これは活性、例えば本発明のチャンネルタンパク質への結合、および／または調節について試験することができる（例えば上記「スクリーニング法」を参照にされたい）。
【０１１４】
以下の化合物は、本発明のチャンネルタンパク質の既知のアゴニストである；アセチルコリンおよびアレコリン。アトロピンおよびムスカリンは、ＡＣＣ−２Ｄ６．３の部分アゴニストとして、そしてＡＣＣ−１Ｇ６．４のアンタゴニストとして作用する。ジヒドロ−β−エリスロイジンは、ＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４のアンタゴニストとして作用する。これらの各化合物は、上に概略した技術を使用して本発明のチャンネルタンパク質のモジュレーターを同定または設計するための基本化合物として役立つことができる。
【０１１５】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏドッキング（ｄｏｃｋｉｎｇ）法に関するコンピューター法およびそれらの成功裏の使用は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｈｍ（２００２）Ｄｒｕｇ
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，７（１）：６４に総説されている。
【０１１６】
治療用製剤
様々な態様において、アセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性のモジュレーターは、ヒト個体を初めとする哺乳動物個体のような個体における寄生生物疾患、特に線虫に関連する疾患を処置するための製剤または薬剤中で治療的に使用することができる。本明細書で使用する用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、治癒的、防止的（例えば予防的）および軽減的または改善的処置を含む。本発明は対応する医学的処置法も含み、ここでアセチルコリン依存性クロライドチャンネルモジュレーターの治療的用量が薬理学的に許容され得る製剤中で、例えばそれを必要とするば患者または個体に投与される。したがって本発明は、アセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性を調節することができる化合物、および薬理学的に許容され得る賦形剤または担体を含んでなる治療用組成物も提供する。１つの態様では、そのような組成物はセチルコリン依存性クロライドチャンネルモジュレーターのインヒビターを、寄生生物関連疾患を処置するために十分な治療的または予防的に有効な量で含む。治療用組成物は、生理学的に許容され得るｐＨで水溶液に可溶性であり得る。
【０１１７】
「治療に有効な量」とは、アセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性のモジュレーション、そして次いで寄生生物関連疾患の進行の低減のような所望する治療的成果を達成するために必要な投薬用量および期間での有効な量を指す。アセチルコリン依存性クロライドチャンネルモジュレーターインヒビターの治療に有効な量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望する応答を誘発する化合物の能力のような因子に従い変動し得る。投薬処方は、最適な治療的応答を提供するために調整することができる。治療に有効な量はまた、化合物の毒性または有害効果よりも治療的に有益な効果が重要な量である。「予防に有効な量」は、寄生生物関連疾患の発症率または進行の防止または抑制のような所望する予防的成果を達成するために必要な投薬用量および期間での有効な量を指す。予防に有効な量は、上記の治療に有効な量で記載したように決定することができる。特定の個体については、具体的な投薬処方は個体のニーズおよび組成物の投与を管理または指導する人の専門的判断に従い、期間について調整することができる。
【０１１８】
本明細書で使用する「製薬学的に許容され得る担体」または「賦形剤」には、生理学的に適合性があるありとあらゆる溶媒、分散媒質、コーティング、抗バクテリアおよび抗菌・カビ剤、張性調整および吸収遅延剤等を含む。１つの態様では、担体は非経口投与に適する。あるいは担体は静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下または経口投与に適することができる。製薬学的に許容され得る担体には、滅菌水溶液または分散物、および滅菌注入溶液または分散物を即座に調製するための滅菌粉末を含む。製薬学的に活性な物質のために、そのような媒体および作用物質を使用することは当該技術分野では周知である。活性化合物と適合しない通例の媒体または作用物質を除く限り、本発明の製薬学的組成物中でのそれらの使用が企図される。補助的に活性な化合物も組成物に包含することができる。
【０１１９】
治療用組成物は典型的には滅菌されており、そして製造および保存条件下で安定でなければならない。組成物は溶液、ミクロエマルジョン、リポソームまたは高い薬剤濃度に適する他の注文構造として配合することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒質であることができる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングを使用することにより、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持により、そして表面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合で張性調整剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール類、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注入可能な組成物の長期（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ）吸収は、組成物に吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによりもたらすことができる。さらにアセチルコリン依存性クロライドチャンネルモジュレーターは、時限放出製剤中、例えば遅延放出（ｓｌｏｗ  ｒｅｌｅａｓｅ）ポリマーを含む組成物中で投与することができる。活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤のような迅速な放出に対して化合物を保護する担体を用いて調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ酢酸、ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）のような生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法が特許を取得し、あるいは一般に当業者に知られている。
【０１２０】
滅菌の注射可能溶液は、活性化合物（例えばアセチルコリン依存性クロライドチャンネルモジュレーター）を必要な量で適切な溶媒中に、上に列挙した成分の１もしくは組み合わせと一緒に包含させ、必要に応じて続いて滅菌濾過することにより調製することができる。一般に分散物は活性化合物を、基本的分散媒質および上に列挙した成分から必要な他の生物を含む滅菌賦形剤に包含させることにより調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好適な調製法は、有効成分にその事前に滅菌濾過した溶液からの任意の付加的な所望の成分を加えた粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。本発明の別の観点に従い、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルモジュレーターは、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルモジュレーターの溶解性を強化する１もしくは複数のさらなる化合物を用いて配合することができる。
【０１２１】
本発明の別の観点に従い、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルモジュレーターを含んでなる本発明の治療用組成物は、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルのモジュレーションのためのアセチルコリン依存性クロライドチャンネルモジュレーター、および／または寄生生物関連疾患の防止および／または処置のための使用に関する使用説明書をさらに含んでなる容器または商業用の包装中に提供され得る。
【０１２２】
したがって本発明はさらに、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルモジュレーターまたは上に述べた組成物を寄生生物関連疾患の防止および／または処置のための使用説明書と一緒に含んでなる商業用包装を提供する。さらに本発明は、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルのモジュレーションおよび／または寄生生物関連疾患の防止および／または処置のためのアセチルコリン依存性クロライドチャンネルモジュレーターの使用を提供する。さらに本発明は寄生生物関連疾患の防止および／または処置のための薬剤を調製するために、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルモジュレーターの使用を提供する。
【０１２３】
有害生物防除用組成物
本発明は、有害生物防除用組成物、および本発明の有害生物防除用組成物を事前に選択した部位または「場所（ｌｏｃｕｓ）」に適用することによる昆虫、ダニおよび線虫の望ましくない集団を防除する方法を提供する。本明細書で使用する「有害生物防除用組成物」には、有害生物の集団を１０％から１００％の間まで、すなわち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％まで減少させる殺虫組成物、殺ダニ組成物および殺線虫組成物を含む。本発明の有害生物防除用組成物は：（Ａ）アセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性を調節することができる少なくとも１つの化合物、および（Ｂ）それに適切な担体を含んでなる。加えて本発明の有害生物防除用組成物は、さらに配合剤または別の有害生物防除剤のような１もしくは複数の付加的化合物を含んでもよい。
【０１２４】
アセチルコリン依存性クロライドチャンネル活性を調節することができる化合物は、スクリーニングアッセイおよび／または上記のような合理的な薬剤設計法により同定することができ、そして本明細書での「本発明の化合物」と呼ぶことができる。
【０１２５】
担体の同一性および種類は、有害生物防除用組成物の意図する適用に依存して変動してよい。特定の態様では、適切な担体は微細に分割された粒状固体もしくは粒子、またはペレットの形態を取ることができ；あるいは担体は湿潤性粉末、流動性液体または可溶性粉末の形態を取ることができるが、さらに別の応用では、担体は水性もしくは有機溶媒、水性もしくは有機分散物、または水性もしくは有機乳化剤の形態を取ってもよい。
【０１２６】
適切な固体担体（例えばペレット、粒子、湿潤性粉末、可溶性粉末、他の微細に分割された粒子等の形態を取る担体）を生成するために利用できる材料には、アタパルジャイトクレー、砂、バーミキュライト、トウモロコシ穂軸、活性炭、および雲母、タルク、葉蝋石のような鉱物珪酸塩等のような市販されている材料を含む。
【０１２７】
担体が固体である場合、有害生物防除用固体組成物は、例えば本発明の化合物を当該技術分野で知られている方法を使用して固体担体に含浸させることにより容易に調製することができる。あるいは本発明の化合物は、本発明の化合物を微細粉末に挽き、そして生じた粉末をすでに中に適切な表面活性分散剤が加えられた適切な固体担体と混合するか、またはそうではなく合わせることにより湿潤性粉末に配合することができる。次いで生じた湿潤性粉末は水中に分散され、そしてその後に例えば土壌表面または作物上に噴霧される。
【０１２８】
また担体は液体であることもでき、この場合、生じた有害生物防除用組成物は、液体溶液、分散物またはエマルジョンでよい。経済的理由から、水は好適な液体担体である。
【０１２９】
液体溶液の場合、本発明の化合物は水性または有機溶媒（例えば芳香族もしくは脂肪族炭化水素、好ましくはトルエン）に溶解され得る。
【０１３０】
液体エマルジョンは通常使用され、そしてそれらは水を担体として、または溶媒と水の組み合わせを使用して調製することができるので経済的である。この態様では、本発明の化合物をベンゼン、トルエンまたは他の脂肪族もしくは芳香族炭化水素のような溶媒に溶解する。乳化可能な濃度は、表面活性剤および／または分散剤の添加により形成される。次いで乳化可能な濃度を水に分散する。この組成物では、水溶性はアセトン、ジメチルスルフォキシドを含む共溶媒系、または他の水混和性溶媒を使用することにより上げることができる。その後、生じた水性エマルジョンは保護されるべき特定の場所に有利に適用され得る（例えば噴霧により）。
【０１３１】
表面活性分散剤には、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎの界面活性剤および乳化剤（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ）、１９９９、マニファクチャリング  コンフェクショナー出版社（Ｔｈｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．米国特許第２，６１４，９１６号明細書、カラム２〜４；および米国特許第２，５４７，７２４号明細書、カラム３および４に記載されているものを含む。
【０１３２】
アセチルコリン依存性クロライドチャンネルおよびそれらの構成サブユニットポリペプチド
以下の検討は図１、３および７〜９で具体的に説明するような本発明のタンパク質およびポリペプチドの構造的特徴に関する。
【０１３３】
（ａ）４次構造  
アセチルコリン依存性クロライドチャンネルは、シス−ループリガンド依存性イオンチャンネルのスーパーファミリーに属する。それらのサブユニットはシグナル配列、細胞外リガンド結合ドメイン、３つの膜貫通ドメイン、細胞内ループおよび４番目の膜貫通ドメイン（Ｍ４）を含んでなる特徴的なトポロジーを有する。それ自体で、我々はこれらのチャンネルが５量体、すなわち５つのサブユニットを含んでなると予想する。ＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１の両方はアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞で発現した時にホモメリック（ｈｏｍｏｍｅｒｉｃ）チャンネルを形成することができるが、それらはインビボで他のサブユニットとヘテロマーを形成するかもしれない。Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）のゲノムにコードされる６つの他のサブユニットがあり、これは推定されるアミノ酸配列に基づき、ＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１と群をなし、そしてそれらと会合してヘテロメリック（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）なチャンネルを形成することができる。
【０１３４】
例えば我々はＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）に由来する２つの緊密に関連するチャンネルサブユニットであるＡＣＣ−４（配列番号９および１０）およびＡＣＣ−３（配列番号７および８）をクローン化した。これらのチャンネルサブユニットは、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中では独立してホモメリックチャンネルを形成しない。しかしアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中で、ＡＣＣ−４またはＡＣＣ−３とＡＣＣ−２との同時発現は、ＡＣＣ−２がアセチルコリン−感受性チャンネルを形成する能力を妨害する。他の発現系はＡＣＣ−２およびＡＣＣ−４および／またはＡＣＣ−３サブユニットを含んでなるヘテロメリックチャンネルを支持することができる可能性がある。ＡＣＣ−３はＡＣＣ−１と相互作用して、アセチルコリンの活性化について異なるＥＣ５０を有するヘテロメリックチャンネルをアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中で形成する。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中では、ＡＣＣ−４とＡＣＣ−１サブユニットとの間に明白な相互作用は無い。
【０１３５】
（ｂ）イオン選択性
これらチャンネルの最も並外れた特徴の１つは、アセチルコリンの開閉が従来からカチオンチャンネルと関係してきたので、アニオン選択性とアセチルコリンによる開閉との関係である。我々はこのアニオン選択性の原因となる構造的モチーフを指摘することができる。Ｍ２膜貫通ドメインはＬＧＩＣチャンネルの孔を並べ、そしてイオン選択性を決定する（Ｇａｌｚｉ  ＪＬ，Ｄｅｖｉｌｌｅｒｓ−Ｔｈｉｅｒｙ  Ａ，Ｈｕｓｓｙ  Ｎ，Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｓ，Ｃｈａｎｇｅｕｘ  ＪＰ，Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｄ（１９９２）ニューロンのニコチン性受容体のチャンネルドメインにおける突然変異は、カチオン性からアニオン性へとイオン選択性を転換する。Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：５００−５０５）。このドメインの細胞質末端は、Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）のほとんどのアニオンチャンネルで見いだされるＰＡＲＶモチーフである。同様のモチーフが脊椎動物のチャンネルに見い出され、そしてこのモチーフの位置指定突然変異誘発法でアニオン選択性の決定におけるその重要性が確認された（Ｇａｌｚｉ  ＪＬ，Ｄｅｖｉｌｌｅｒｓ−Ｔｈｉｅｒｙ  Ａ，Ｈｕｓｓｙ  Ｎ，Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｓ，Ｃｈａｎｇｅｕｘ  ＪＰ，Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｄ（１９９２）ニューロンのニコチン性受容体のチャンネルドメインにおける突然変異は、カチオン性からアニオン性へとイオン選択性を転換する．Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：５００−５０５；Ｇｕｎｔｈｏｒｐｅ  ＭＪ，Ｌｕｍｍｉｓ  ＳＣ（２００１）５−ＨＴ（３ａ）受容体のカチオン性からアニオン性へのイオン選択性の転換は、リガンド依存性イオンチャンネルスーパーファミリーの保存された特徴を明らかにする。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１０９７７−１０９８３；Ｊｅｎｓｅｎ  ＭＬ，Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ＤＢ，Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ＴＨ，Ｓｃｈｏｕｓｂｏｅ  Ａ，Ｖａｒｍｉｎｇ  Ｔ，Ａｈｒｉｎｇ  ＰＫ（２００２）ベータサブユニットはＧＡＢＡＡ受容体のイオン選択性を決定する。ＪＢｉｏＣｈｅｍ  ２７７：４１４３８−４１４４７）。ＡＣＣ−２Ｄ６．３
およびＡＣＣ−１Ｇ６．４では、Ｍ２ドメイン中（図１および図７および８を参照にされたい）の細胞質末端に、これらのチャンネルのアニオン選択性の原因と推定される対応するＰＡＲＴモチーフが存在する。
【０１３６】
関連するアニオン選択的チャンネルにおける実験では、Ｍ２の標準ＰＡＲＴモチーフのアミノ酸ＰＡがアニオン選択性に重要な唯一のアミノ酸であり、すなわちＲＴは少なくとも保存的置換により変動し得ることが示された。したがって我々は本発明のチャンネルがアニオン選択性となるために、Ｍ２のアミノ末端にはＰＡＲＴモチーフの少なくともアミノ酸ＰＡが必要であると予想する。
【０１３７】
さらにＭ２のＰＡＲＴモチーフ中のプロリンまたはアラニン残基を変異させることにより、本発明のチャンネルのイオン選択性を改変することは当該技術分野の技術範囲内である。
【０１３８】
（ｃ）アセチルコリン結合部位
ＬＧＩＣのアミノ末端ドメインは、リガンド結合に関与する。既知のアセチルコリン依存性チャンネルのアミノ末端ドメインをわたる重要な相違があった。ＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１のアセチルコリン結合部位は、ｎＡＣｈＲに対して実質的に改変されているらしい。カタツムリ（Ｌｙｍｎａｅａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓ）に由来するアセチルコリン−結合タンパク質の結晶構造の解析により最近確認された（Ｂｒｅｊｃ  Ｋ，ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ＷＪ，Ｋｌａａｓｓｅｎ  ＲＶ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎｓ  Ｍ．ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｏｏｓｔ  Ｊ，Ｓｍｉｔ  ＡＢ，Ｓｉｘｍａ  ＴＫ（２００１）ＡＣｈ−結合タンパク質の結晶構造は、ニコチン性受容体のリガンド結合ドメインを明らかにする［コメント参照］Ｎａｔｕｒｅ．４１１：２６９−２７６）、光親和性（ｐｈｏｔｏａｆｆｉｎｉｔｙ）標識および突然変異誘発法実験（Ｋａｒｌｉｎｇ  Ａ（２００２）ニコチン性アセチルコリン受容体の新生構造。Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３：１０２−１１４）では、アセチルコリン−結合部位の本質的部分が、２つのサブユニットの境界に形成されることが示された。ホモメリックＡＣｈＢＰでは、１つのサブユニットがループＡ（Ｔｙｒ８９）、Ｂ（Ｔｒｐ１４３）およびＣ（Ｔｙｒ１８５、Ｃｙｓ１８７−１８８、Ｔｙｒ１９２；番号付けは（Ｂｒｅｊｃ  Ｋ，ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ＷＪ，Ｋｌａａｓｓｅｎ  ＲＶ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎｓ  Ｍ．ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｏｏｓｔ  Ｊ，Ｓｍｉｔ  ＡＢ，Ｓｉｘｍａ  ＴＫ（２００１）ＡＣｈ−結合タンパク質の結晶構造は、ニコチン受容体のリガンド結合ドメインを明らかにする．［コメント参照］Ｎａｔｕｒｅ．４１１：２６９−２７６）に従う）中の残基由来の側鎖を与える。隣接するサブユニットは、ループＤ（Ｔｒｐ５３、Ｇｌｎ５５）、Ｅ（Ａｒｇ１０４、Ｖａｌ１０６、Ｌｅｕ１１２およびＭｅｔ１１４）およびＦ（Ｔｙｒ１６４）由来の側鎖を与え、これらは結合ポケットの相補的部分を形成する。ヘテロメリックｎＡＣｈＲでは、結合部位はアルファと非アルファ型サブユニットの境界に形成する。またループＣ残基はアルファ−ＢＴおよび他の競合的アンタゴニストの結合にも関与することができる（Ａｒｉａｓ  ＨＲ（２０００）ニコチン性アセチルコリン受容体上のアゴニストおよび競合的アンタゴニスト結合部位の局在化。Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  ３６：５９５−６４５）。
【０１３９】
ＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１中の有望なリガンド結合残基を同定するために、それらのアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＷを使用してＡＣｈＢＰと並べた。アライメントにより作られた予想を確認するために、ＡＣＣ−２Ｄ６．３配列をＡＣｈＢＰ結晶構造に通した（ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ  ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ．ｓｗｉｓｓｍｏｄ／ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ．ｈｔｍｌ，Ｓｃｈｗｅｄｅ  Ｔ，Ｋｏｐｐ  Ｊ，Ｇｕｅｘ  Ｎ，ａｎｄ  Ｐｅｉｔｓｃｈ  ＭＣ（２００３）ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬを使用して；自動化タンパク質ホモロジー−モデリングサーバー。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：３３８１−３３８５）。我々の結果は（表Ｉ、図９および１０）、ＡＣｈＢＰのループＡの本質的Ｔｙｒ８９残基が、ＡＣＣ−１および２で非極性のイソロイシンに置換される（それぞれＩ１２１およびＩ１４０）ことを示す。興味深いことには、ＡＣＣ−１、ＡＣＣ−２およびＭＯＤ−１が、他のシス−ループリガンド依存性イオンチャンネル中に見いだされないシステイン残基の保存された対を含む（ＡＣＣ−１のＣ９９およびＣ１１９；ＡＣＣ−２のＣ１１８およびＣ１３８）。これらシステインの１つ（ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２のそれぞれＣ９９およびＣ１３８）はループＡ中に見いだされ、そしてリガンド結合に影響を及ぼすことができる。ループＢでは、ＡＣｈＢＰ残基の本質的芳香族Ｔｒｐ１４３が、芳香族フェニルアラニンに置き換えられている（ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２のそれぞれＦ１７９およびＦ１９８）。ＡＣｈＢＰに見いだされる２つの隣接するシステインはループＣには存在しないが、１つの本質的Ｔｙｒ残基が保存されているようであり（ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２のそれぞれＹ２２１およびＹ２４１）、そしてもう１つ（Ｙ１９２）がＴｒｐに置換されている（ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２のそれぞれＷ２２６およびＷ２４６）。ループＤのＴｒｐ５３残基はＴｙｒと置き換えられ（ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２のそれぞれＹ８２およびＹ１００）、そしてＧｌｎ５５はＡｓｎ８３（ＡＣＣ−１）またはＴｈｒ１０２（ＡＣＣ−２）に置き換えられている。ＥループのＡｒｇ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＭｅｔは、それぞれＡＣＣ−１および２のＭｅｔ（Ｍ１３９およびＭ１５８）、Ｐｈｅ（ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２のそれぞれＦ１４１およびＦ１６０）、ＭｅｔまたはＴｒｐ（Ｗ１４７およびＭ１６６）およびＡｓｎ（Ｎ１４９およびＮ１６８）に置き換えられている。ループＦの領域中のＡＣＣチャンネルとＡＣｈＢＰとの間の相同性は大変低く、Ｔｙｒ１６４について均等な残基の明確な同定を妨げるが、我々の最高の予測はこれがＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２のそれぞれＬｙｓ２００およびＳｅｒ２２０に対応する。ループＥおよびＦの本質的残基はｎＡＣｈＲサブユニット間で高度に保存されておらず、したがってリガンド結合の重要性に影響を及ぼさないかもしれない。対照的に、ループＡ、Ｂ、ＣおよびＤ中の上に挙げた置換は、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルのアゴニストおよびアンタゴニストの結合特性を決定し得るＡＣｈ−結合部位の立体配座の変化を示唆する。
【０１４０】
【表１】
2008509681.tif 000003
【０１４１】
予測はＡＣＣ−１、ＡＣＣ−２およびＭＯＤ−１と、カタツムリ（Ｌｙｍｎａｅａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓ）のアセチルコリン−結合タンパク質（ＡＣｈＢＰ）とのアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷを使用したアライメントに基づく。アセチルコリン結合部位を形成す
るＡＣｈＢＰの残基および対応するループは、Ｂｒｅｊｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００１により記載された結晶構造から取る。‘−’は均等なアミノ酸が無いことを示す（すなわちギャップ）。‘？’はＡＣｈＢＰとの低い配列相同性がこの割り当てに疑問を呈する。‘＊’は、アセチルコリンとセロトニンとの間を識別するＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２の能力に最も貢献する見込みがあるアミノ酸を示す。
【０１４２】
ＡＣＣ−１、ＡＣＣ−２およびＡＣｈＢＰはアセチルコリンに結合し、一方ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２に高度に相同性のＭＯＤ−１はセロトニンに結合するので、アセチルコリン結合サブユニットは、ＭＯＤ−１と共有しないリガンド結合部位のアミノ酸を共有すると予想される。しかしそうではない（表Ｉ）。ＡＣＣ−１またはＡＣＣ−２のいずれかにより共有されているＡＣｈＢＰ中の唯一の結合部位のアミノ酸はＴｙｒ１８５であり、この残基はＭＯＤ−１にも存在する。しかしＭＯＤ−１に保存されていない、ＡＣＣ−１とＡＣＣ−２との間にのみ保存されている幾つかの結合部位の残基がある。これらの中で、以下の残基はＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２がアセチルコリンとセロトニンとの間を識別する能力に貢献することができる：Ｐｈｅ１７９（ＡＣＣ−１）およびＰｈｅ１９８（ＡＣＣ−２）およびＴｙｒ２２６（ＡＣＣ−１）およびＴｙｒ２４６（ＡＣＣ−２）、これらはそれぞれＭＯＤ−１のＴｙｒおよびＬｅｕである。Ｍｅｔ１３９（ＡＣＣ−１）およびＭｅｔ１５８（ＡＣＣ−２）およびＰｈｅ１４１（ＡＣＣ−１）およびＰｈｅ１６０（ＡＣＣ−２）もこの基準に合うが、アセチルコリン受容体間で高度に保存されていないＥループ中にある。したがってリガンド識別に対するそれらの貢献には、さらに疑問がある。これらの予想は標準的な位置指定突然変異誘発技術を使用して、構造／機能解析により確認することができる。
【０１４３】
もちろん、実際の結合部位の外側のＡＣＣ−１／ＡＣＣ−２とＭＯＤ−１との間の差異も、タンパク質の全体的な立体配座を変化させることによりリガンド特異性に影響を及ぼすかもかれない。どのアミノ酸置換が最も重要であるかを決めるために、ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２をＭＯＤ−１と並べ、そしてＡＣＣ−２およびＡＣＣ−２中の残基とは同一であるが、ＭＯＤ−１中の残基とは異なるものを見いだした（表ＩＩ）。ＭＯＤ−１中の均等なアミノ酸が保存的置換を示すかどうかを決定するために、我々はこれらのアミノ酸をそれらが水治療および／または親水性値（上記の「バリアントポリペプチド」を参照されたい）を共有するかどうかにより分類した。我々は水治療でも親水性指数でも保存されない３個の残基：Ｗ６２／８１、Ｆ１３３／１５２およびＫ１７１／１９０を同定した。これらの残基はサブユニットの構造および特性に最も有意な効果を有するようである。さらに１１個の残基が２つのの指数のうちの１つにのみ保存された（表ＩＩ）。これらも細胞外ドメインの構造に有意な変化を生じ、これはそのリガンド−結合特性に影響を与える可能性がある。図７および８から分かるように、保存された残基はループＦおよびループＣの間の低い保存の領域を除き、１次配列に沿って大変均一に分布している。興味深いことに、保存残基のほとんどがリガンド結合部位または２つのサブユニット間の境界にある一方、外側面は大変低い保存を示す（図９および１０）。
【０１４４】
【表２】
2008509681.tif 000004
【０１４５】
ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２で保存され、そしてＭＯＤ−１では異なる細胞外リガンド結合ドメインからの４６アミノ酸。各残基でＡＣＣ−１／ＡＣＣ−２とＭＯＤ−１との間の保存の程度は、水治療および疎水性値を比較することにより決定された（明細書中に列挙するように）。ＭＯＤ−１残基が、水治療または疎水性指数のいずれかについて、ＡＣＣ−１／ＡＣＣ−２中の均等なアミノ酸の＋／−２単位内のスコアを有する場合、残基は‘＋’と採点された（両指数について２位内のスコアである場合、‘＋＋’）。アミノ酸は、リガンド結合部位に貢献するＡＣｈＢＰ由来の均等なアミノ酸が、そのループ（太字で示す、表Ｉを参照にされたい）に由来するか、あるいは残基が表Ｉの残基から２アミノ酸の距離内にあるならば、そのループにあると見なした。‘？’はＡＣＣ−１／ＡＣＣ−２とＭＯＤ−１との間の相同性がこの領域で低すぎて配列を並べることができないことを示す。
【０１４６】
このように、ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２中の以下の領域はアセチルコリン結合に重要であり、そしてこれらの領域との相同性に基づき、ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２の相同体および対立遺伝子バリアントを同定することが可能となり得る：
【０１４７】
【表３】
2008509681.tif 000005
【０１４８】
（ｄ）Ｍ３とＭ４との間の細胞内ループ
Ｍ３とＭ４との間のループはＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１中で大きく、そして保存されていない。この領域中のＡＣＣ−１とＡＣＣ−２との間の保存の欠失が、ＡＣＣ−１とＡＣＣ−２との間で低い全体的な同一性パーセントの原因の大部分である。すなわちこのループはアセチルコリン依存性クロライドチャンネルサブユニットファミリーの特徴を定めないようだが、特定のサブユニット種に特異的な機能的役割を有するかもしれない。同様に、Ｍ３およびＭ４が膜に正しく挿入できるために必要な最少の長さが存在する。
【０１４９】
（ｅ）膜貫通ドメインおよびそれらのリンカー
ＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１のＭ１、Ｍ２およびＭ３ドメインは、高度に保存されてい
る。Ｍ１とＭ２の間に存在する短いリンカーは、高度に保存されている。したがってこれらの領域中での修飾（すなわちアミノ酸置換、特に非保存的置換、挿入、欠失等）は、チャンネル機能を、より破壊する見込みがあるかもしれない。
【０１５０】
ＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１のＭ４膜貫通ドメインは、高度に保存的されていない。すなわち本発明のチャンネルは、チャンネル機能を破壊せずにＭ４領域中の修飾（すなわちアミノ酸置換、特に非保存的置換、挿入、欠失等）にさらに容易に適用することができるかもしれない。
【０１５１】
ＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１のＭ２とＭ３との間に存在するリンカーは、大変高度に保存されている。このリンカーはチャンネルの開閉、すなわちチャンネルの孔に結合するリガンドの変化を連絡するためのサブユニット間のアロステリック相互作用に関与することが知られている。このリンカーは保存的アミノ酸とのある程度の置換に耐えることができるが、リンカーはリガンド結合とチャンネルの孔の開閉との間の関係を保存するために、全体としてかなり保存されてなければならない。
【０１５２】
（ｆ）シグナル配列
プロ−ペプチドのアミノ末端は、タンパク質の膜への正しい挿入を導くためのシグナル配列を有する。シグナル配列は引き続き切断され、そして成熟タンパク質の一部を形成しない。同じ結果を達成するために、異なるシグナル配列を使用することが可能である。当業者はこの目的に関して多くの可能なシグナル配列を知っている（例えばＧ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  ａｎｄ  Ｌ．Ａｂｒａｈｍｓｅｎ，シグナルペプチドの設計における種特異的変化。外来宿主でのタンパク質分泌の意義。ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２４４（１９８９），ｐｐ４３９−４４６；Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，シグナル配列。変化の限界、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １８４（１９８５），ｐｐ．９９−１０５を参照にされたい）。
【０１５３】
シグナルペプチド配列は、当該技術分野で利用可能な任意の方法を使用して予測することができる。ＡＣＣ−２の最初の１８アミノ酸残基（配列番号５）は、残基１８と１９との間で同定された切断部位を持つ推定上のシグナル配列を含んでなり（０．８６の確率）；そしてＡＣＣ−１の最初の２４アミノ酸残基（配列番号６）は、残基２４と２５との間で同定された切断部位を持つ推定上のシグナル配列を含んでなる（０．８３の確率）。ＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１のシグナル配列解析は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓから利用できるＳｉｇｎａｌＰ２．０プログラム（Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７）を使用して行った。
【０１５４】
（ｇ）カルボキシ末端
ＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１のカルボキシ末端に知られている機能は無い。この領域はＡＣＣ−２とＡＣＣ−１との間で保存されておらず、そして修飾（置換、挿入、欠失等）を許容するだろう。
【０１５５】
薬理学
構造データに基づき、ＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１が通例ではないアセチルコリン結合部位を有するという提案は、これらチャンネルの異常な薬理学的プロファイルと合致する。第１に、ｎＡＣｈＲの明確なアゴニストであるニコチン、および別のアゴニストであるシチシンは、ＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４の弱いアゴニストおよび／またはアンタゴニストである。これは自体は独自ではない。Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）のレバミゾール受容体（カチオン性アセチルコリン依存性シス−ループＬＧＩＣ）はニコチンに非感受性であり、そしてＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）はニコチン感受性および非感受性のアセチルコリン受容体の両方を有することがすでに示されている（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ＪＥ，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＥＭ（１９９９）１つのＧＡＢＡおよび２つのアセチルコリン受容体がＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）の神経筋肉接合部で機能する。Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２：７９１−７９７）。さらにニコチンおよびシチシンは脊椎動物のアルファ−９ｎＡＣｈＲのアンタゴニストである（Ｖｅｒｂｉｔｓｋｙ  Ｍ，Ｒｏｔｈｌｉｎ  ＣＶ，Ｋａｔｚ  Ｅ，Ｅｌｇｏｙｈｅｎ  ＡＢ（２０００）アルファ−９ニコチン性コリン作用性受容体の混合ニコチン性−ムスカリン作用特性。Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３９：２５１５−２５２４）。さらに驚くことには、ムスカリン作用性アゴニストであるアレコリンはＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４の両方の強力なアゴニストであるが、アセチルコリンよりは実質的に低い親和性を持つ。アレコリンはカチオン選択性の線虫および昆虫のＬＧＩＣに作用すると仮定されてきたので、アレコリンに対するこの感受性は無脊椎動物のアセチルコリン受容体の一般的特徴かもしれない（Ｇａｒｃｉａ  ＬＲ，Ｍｅｈｔａ  Ｐ，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ＰＷ（２００１）明確な筋肉挙動の調節は、接合中のＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）のオスの連結交接刺を制御する。Ｃｅｌｌ  １０７：７７７−７８８；Ｔｒｉｂｕｔ  Ｆ，Ｄｕｖａｌ  Ａ，Ｌａｐｉｅｄ  Ｂ（１９９４）２つの明確な受容体が、ゴキブリの第６腹部神経節ＤＵＭニューロン上でアレコリンにより活性化される。Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  １８６：３２５−３３１）。ムスカリンおよびアトロピンもムスカリン作用性受容体に選択的であると考えられるが、部分アゴニスト（ＡＣＣ−２Ｄ６．３）またはアンタゴニスト（ＡＣＣ−１Ｇ６．４）として作用する。最後にアルファ−アマガサヘビ毒（アルファ−ＢＴ）は、ＣＮＳで脊椎動物のアルファ−７およびアルファ−９ｎＡＣｈＲに、そして神経筋肉接合部のｎＡＣｈＲに選択的であるが、ＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４に効果が無い。Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）のアセチルコリン依存性クロライドチャンネルおよびアルファ−９  ｎＡＣｈＲの薬理学的プロファイルは幾つかの特性を共有するが（表ＩＩ）、それでも線虫と脊椎動物のチャンネルとの間には特定の配列類似性が無いことは興味深い。アレコリンもアルファ−９  ｎＡＣｈＲのアゴニストであるどうかを知る価値がある。
【０１５６】
ＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４の個々の薬剤に対する応答は独特ではないが、それらの薬理学的プロファイルは、これらのＬＧＩＣの結合部位が独自であることを示すので独特である。すなわちＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４に特異的に結合する薬剤を同定することが可能である。カタツムリ（Ｌｙｍｎａｅａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓ）のアセチルコリン−結合タンパク質からの構造データは、アセチルコリン依存性クロライドチャンネルのアセチルコリン結合部位の形状を推定し、そしてそれら独自の特徴を決定するために使用することができる。これらの特徴は本発明のイオンチャンネルの特異的なアゴニストまたはアンタゴニストを設計するために活用することができる。アレコリンに対する異常な応答は、ＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４に特異的な化合物を見いだすための出発点を提供する。最後にアセチルコリンの高い親和性と比べて、ＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４について試験した神経化学物質の低い親和性は、特にＡＣＣ−１Ｇ６．４について、本発明のアセチルコリン依存性クロライドチャンネルに対して、より高い親和性および特異性を持つ化合物を同定または設計できることを示す。
【０１５７】
進化
アセチルコリン依存性クロライドチャンネルはアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）について記載されてきた（Ｋｅｈｏｅ  Ｊ，ＭａＩｎｔｏｓｈ  ＪＭ（１９９８）２つの明確なニコチン性受容体、１つは脊椎動物のアルファ−７含有受容体に薬理学的に類似し、アメフラシのニューロンにおいてＣ１電流を媒介する。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １８：８１９８−８２１３）、線虫およびアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ）のチャンネルがオルソログであるかどうか、またはそれらが独立して生じたのであるかを問うかもしれない。クローン化したアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ）のチャンネルが無く、電気生理学的および薬理学的に基づく推論を引き出すことしかできない。最近、ＫｅｈｏｅおよびＭｃＩｎｔｏｓｈ（１９９８）（同上）は、アメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ）の頬神経節細胞のクロライド依存的応答が、急速に脱感作（ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ）する、およびゆっくりと脱感作する（または徐々に）成分を含んでなることを示した。遅い脱感作は、ＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４の特徴である。線虫のチャンネルのように、伝導性における変化の電位依存性は、アセチルコリンに対するアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ）のいずれの成分の応答でも検出されなかった。ＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１受容体と、ゆっくりと脱感作するクロライド依存性応答を媒介するアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ）の受容体との間の薬理学的プロファイルの比較は、幾つかの平行を示す（表４）。例えばニコチンおよびシチシン  対  アセチルコリンの予想される相対的効力は、アメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ）受容体に関する約０．１および約０．１４に比べ、相応じてＡＣＣ−２受容体に関しては約０．０７および０．１６である。両種類の受容体に関するアンタゴニストの効力は同じ範囲である。同時に幾つかの差異もある。第１にアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ）の頬細胞の応答は、アセチルコリンの濃度を１００マイクロＭ濃度を十分に超えて上げると上昇することが報告され（ＥＣ５０、評価せず）、線虫のチャンネルについて見いだされるよりもさらに高いＥＣ５０を示唆する。またアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ）の受容体は、Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）のチャンネルよりも低い濃度でニコチンおよびシチシンに応答した（２０〜１００マイクロＭ対０．８〜１ｍＭ、表４）。全体として、データはＡＣＣ−２受容体のオルソログと一致し、これはアセチルコリンに対するアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ）の頬細胞のクロライド依存的応答において、ゆっくりと脱感作する成分の分子決定基である。アセチルコリン、ニコチンおよびシチシンのＥＣ５０における差異は、アメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ）の受容体がヘテロマーであり、かつ／または軟体動物と線虫のアセチルコリン依存性クロライドチャンネル間の系統発生的距離にあることによるかもしれない。しかし薬理学的データは、ＡＣＣ−２、ＡＣＣ−１および脊椎動物のアルファ−９ｎＡＣｈＲ間の薬理学的類似性がオルソログ関係を反映していないので、注意しながら解釈しなければならない。
【０１５８】
リガンド結合特異性の進化はイオン選択性の進化よりも早く起こると思われる。グリシン、ＧＡＢＡおよびアニオン選択的グルタミン酸受容体（ＧｌｕＣｌ）は、すべて緊密に関連している（Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓ  ＤＫ，Ｅｌｌｉｓｔｏｎ  ＫＯ，Ｐａｒｅｓｓ  ＰＳ，Ｈａｍｅｌｉｎ  Ｍ，Ａｒｅｎａ  ＪＰ，Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ＪＭ，Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ  ＬＨ，Ｃｕｌｌｙ  ＤＦ（１９９７ｂ）リガンド依存性イオンチャンネルおよびアベルメクチン感受性、グルタミン酸依存性クロライドチャンネルの進化的関係。Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ４４：５０１−５０８）。さらにアセチルコリン依存性クロライドチャンネルはｎＡＣｈＲチャンネルよりもＧＡＢＡおよびグルタミン酸依存性ＬＧＩＣに緊密に関連しているようである。リガンド特異性が進化できる容易さは、特にセロトニンおよびアセチルコリン受容体で顕著である。興奮性５ＨＴ３受容体はｎＡＣｈＲに最も類似し、そしてここで証明するように、アニオン選択的アセチルコリン受容体はＭＯＤ−１、アニオン感受性セロトニン受容体に最も類似する。興味深いことに、アルファ７ｎＡＣｈＲ中の単一のアミノ酸の変化はそれをセロトニン感受性にすることができる（Ｐａｌｍａ  Ｅ，Ｍｉｌｅｏ  ＡＭ，Ｅｕｓｅｂｉ  Ｆ，Ｍｉｌｅｄｉ  Ｒ（１９９６）ニューロンのアルファ（７）ニコチン性受容体のドメインＭ２におけるロイシンのトレオニンへの突然変異（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−ｆｏｒ−ｌｅｕｃｉｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）は、アンタゴニストからアゴニストへ５−ヒドロキシトリプタミンを転換する。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１１２３１−１１２３５）。チャンネル群がイオン選択性により分類されるこの規則に対する１つの例外は、最近特徴付けられたＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）由来のカチオン選択的ＧＡＢＧ受容体、ＥＸＰ−１である。ＥＸＰ−１は、アニオンチャンネルに、より緊密に関連していると思われる。しかしこれはまたこの群の最も分岐したメンバーであり、ＬＧＩＣの多様化においてそのイオン選択性を早期に逆転させたのかもしれないことを示している（Ｂｅｇ  ＡＡ，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＥＭ（２００３）ＥＸＰ−１は興奮性ＧＡＢＡ依存性カチオンチャンネルである。Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ６：１１４５−１１５２）。
【０１５９】
本明細書で引用したすべての公報、特許出願、特許および他の参考文献は、参考により全部、本明細書に編入する。
【０１６０】
本発明の種々の態様が本明細書で開示されるが、多くの適合および修飾を当業者の共通する一般知識に従い本発明の観点内で作成することができる。そのような修飾には実質的に同じ方法で同じ結果を達成するために、本発明の任意の観点の既知の均等物の置換を含む。数値範囲は範囲を規定する数値を含む。特許請求の範囲では、用語「含んでなる」を「含むが限定しない」という句に実質的に均等な制限を設けない用語（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ  ｔｅｒｍ）として使用されている。以下の実施例は本発明の種々の観点を具体的に説明するが、本明細書に開示する本発明の広い観点を限定しない。
【実施例】
【０１６１】
材料および方法
ＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４のｃＤＮＡのクローニング  
Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）の全ＲＮＡは３ｍｌの虫成体（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｎ２種）からＴｒｉａｚｏｌ試薬（ギブコ  ＢＲＬ、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を使用して抽出した。Ｐｏｌｙ（Ａ＋）ＲＮＡは、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｄｉキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、バレンシア、カリフォルニア州、米国）を使用して精製した。逆転写（ＲＴ）反応は、２００ｎｇのｍＲＮＡを使用して行った。第１鎖ｃＤＮＡはオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、ＡＭＶ逆転写酵素系（インビトロジェン  カナダ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を使用して合成した。２本鎖ｃＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、予想されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５‘および３’末端に対して設計した以下のプライマーを使用して合成した：
【０１６２】
【表４】
2008509681.tif 000006
【０１６３】
ＰＣＲのプロトコールは以下の通りであった：９２℃で２分間、５５℃で３０秒、６８℃で２．５分間を３５サイクル、そして６８℃で５分間。プライマー配列はｐＴ７Ｎベクターへのサブクローニングを容易にするためのＮｄｅＩおよびＸｂａＩ制限部位、およびｐＤＯＮＲ２０１ベクターへのサブクローニングのためのａｔｔＢ組換え部位を含んだ。ＰＣＲ産物は、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙキット（インビトロジェン  カナダ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を使用して、組換え反応を介してｐＤＯＮＲ２０１にサブクローン化した。３つのＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４  ｃＤＮＡクローンがシークエンシングされて真のＯＲＦを決定し、そしてＲＴ−ＰＣＲから生じる可能な突然変異が見いだされた。非−サイレント突然変異は、重複延長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）（Ｈｏｒｔｏｎ  ＲＭ，Ｈｏ  ＳＨ，Ｐｕｌｌｅｎ  ＪＫ，Ｈｕｎｔ  ＨＤ，Ｃａｉ  Ｚ，Ｐｅａｓｅ  ＬＲ（１９９３）重複延長による遺伝子スプライシング。Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：２７０−２７９）、または通例の制限部位を使用する突然変異を含まないｃＤＮＡフラグメントと一緒のスプライシングのいずれかにより固定した。
【０１６４】
ＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−２Ｄ６．３のヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１および３に説明する。ＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−２Ｄ６．３の予想されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２および４に説明する。
ＡＣＣ−４Ｅ９．９およびＡＣＣ−３Ｄ１０．５ｃＤＮＡのクローニング
ＡＣＣ−４はＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２について上に記載したＰＣＲ技術により、ゲノム配列から推定されるオープンリーディングフレームに基づくプライマーを使用してクローン化した。プライマーは：
【０１６５】
【表５】
2008509681.tif 000007
【０１６６】
であった。
【０１６７】
生じたＰＣＲ産物は、プライマーにコードされるＫｐｎＩおよびＸｂａＩ部位を使用してｐＢＳ  ＫＳ＋（ストラテジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、ラジョラ、カリフォルニア州）にクローン化した。これを続いてＮｄｅＩおよびＸｂａＩ部位を使用してｐＴ７Ｎにクローン化した。
【０１６８】
ＡＣＣ−３Ｄ１０．５はゲノム配列から推定されるオープンリーディングフレームに基づく遺伝子特異的３’プライマーを使用してクローン化した。５’プライマーは多くのＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）遺伝子上に見いだされるＳＬ−１トランス−スプライス化リーダーに基づいた（Ｋｒａｕｓｅ，Ｍ  ａｎｄ  Ｈｉｒｓｈ，Ｄ．Ａ  Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）中のアクチンｍＲＮＡ上のトランス−スプライス化リーダー。Ｃｅｌｌ  ４９：７５３−７６１  １９８７）。プライマーは：
【０１６９】
【表６】
2008509681.tif 000008
【０１７０】
であった。
【０１７１】
これらはＲＴ−ＰＣＲによるｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから増幅するために使用し、そしてＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２について記載したようなＧａｔｅｗａｙ系を使用してｐＤＯＮＲにクローン化した。このクローンからの配列を、オープンリーディングフレームの開始を推定し、そして遺伝子特異的５’プライマー：
【０１７２】
【表７】
2008509681.tif 000009
【０１７３】
を設計するために使用し、これは鋳型として前のクローンを使用して、オープンリーディングフレームのみを増幅するための前の３’プライマーと使用した。生じたＰＣＲ産物をｐＤＯＮＲにクローン化し、そしてシークエンシングした。次いでこれはＡＣＣ−３Ｄ１０．５のＮｄｅＩおよびＰｓｔＩ部位、およびｐＴ７ＮのＮｄｅＩおよびＰｓｔＩ部位を使用してｐＴ７Ｎにクローン化した。ＸｂａＩおよびＰｓｔＩ部位は、ライゲーション前にクレノーを用いて平滑化した。
【０１７４】
配列解析
アミノ酸配列はｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐで利用可能なＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して並べた。膜貫通ドメインは隠れマルコフモデルに基づくＴＭＨＭＭ法を使用して予測した（Ｋｒｏｇｈ  Ａ，Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｂ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｇ，Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ＥＬ（２００１）隠れマルコフモデルを用いた膜貫通タンパク質トポロジーの予測：完全なゲノムへの応用。Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０５：５６７−５８０）。人工的な神経ネットワークに基づくＳｉｇｎａｌＰ２．０、ＮｅｔＧｌｙｃ１．０およびＮｅｔＰｈｏｓ２．０プログラムを使用して、シグナルペプチド配列、Ｎ−グリコレーションおよびリン酸化部位をそれぞれ予想した（Ｂｌｏｍ  Ｎ，Ｇａｍｍｅｌｔｏｆｔ  Ｓ，Ｂｒｕｎａｋ  Ｓ（１９９９）真核生物のタンパク質リン酸化部位の配列および構造に基づく予測。Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９４：１３５１−１３６２；Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｈ，Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ  Ｊ，Ｂｒｕｎａｋ  Ｓ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｇ（１９９７）原核および真核生物のシグナルペプチドの同定およびそれらの切断部位の予測。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１−６）。これらの予測プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓから入手可能である。
【０１７５】
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中でのＲＮＡ発現
キャップ化ｃＲＮＡ合成に関して、ｃＤＮＡはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）ベータ−グロビンの５’−および３’−ＵＴＲ、およびコード化ポリ（Ａ＋）テイルを含むｐＴ７Ｎベクターにサブクローン化した（Ｃａｒｙ  ＲＢ，Ｋｌｙｍｋｏｗｓｋｙ  ＭＷ，Ｅｖａｎｓ  ＲＭ，Ｄｏｍｉｎｇｏ  Ａ，Ｄｅｎｔ  ＪＡ，Ｂａｃｋｕｓ  ＬＥ（１９９４）ビメンチンのテイルはインビボでアクチンを含有する構造と相互作用する。Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０７：１６０９−１６２２）。ｐＴ７ＮｃＤＮＡ構築物はＳａｌＩ（ＡＣＣ−２Ｄ６．３）またはＢａｍＨＩ（ＡＣＣ−１Ｇ６．４）で線状化し、そしてＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、オースチン、テキサス州、米国）を使用して転写した。合成されたｃＲＮＡはＬｉＣｌ沈殿により回収し、そしてヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏに、１マイクログラム／ｍｌの最終濃度で再懸濁した。
【０１７６】
卵母細胞は成熟したメスのアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌｅａｖｉｓ）から、標準的手順に従い回収した（Ｇｏｌｄｉｎ，Ａ．Ｌ．（１９９２）アフリカツメガエルの管理および卵母細胞注入。Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０７：２６６−７９）。内側卵巣上皮、包膜細胞層および小胞細胞を除去するために、卵巣片をＯＲ−２溶液：１ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を含有する８２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）に、穏やかに撹拌しながら２０℃で３時間、または１時間置いて、その後に手で脱小胞化（ｄｅｆｏｌｌｉｃｕｌｉｚａｔｉｏｎ）した。第ＶＩ段階の脱小胞化卵母細胞をＮＤ９６溶液（９６ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．５）に入れた。卵母細胞に４０ｎｌのｃＲＮＡをＮａｎｏｊｅｃｔシステム（ドラモンドサイエンティフィック（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ブルームボール、ペンシルバニア州、米国）を使用して注入した。注入された卵母細胞は、１００ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび５５０ｍｇ／ｍｌのピルベートを補充したＮＤ９６中で２０℃にてインキュベーションした。卵母細胞に２日間ｃＲＮＡを発現させ、その後に測定を行った。
【０１７７】
電気生理学的読み取り
２電極電圧−クランプ読み取りは、ＡｘｏＣｌａｍｐ  ２Ｂ  増幅器（エキソン  インスツルメント（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を使用して行った。微小電極はホウ珪酸塩ガラスキャピラリー（ワード  プレシジョン  インスツルメント社（Ｗｏｒｄ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）、サラソータ、フロリダ州、米国）からＰ−９７マイクロピペットプラー（サッター  インスツルメント（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ノバト、カリフォルニア州、米国）に引いた。電極は３Ｍ  ＫＣｌで満たし、そして０．５から２ＭΩの間の抵抗を有した。各卵母細胞をＲＣ−１２記録チャンバー（ワーナーインスツルメント社（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ．）、ハムデン、コネチカット州、米国）またはＭａｌｔｓｅｓクロスチャンバー（ＡＬＡサイエンティフィック  インスツルメント（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ウエストベリー、ニューヨーク州、米国）に配置し、そして−８０ｍＶで挟んだ。データはＣｌａｍｐｅｘソフトウェア（エキソン  インスツルメント、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を使用して１ｋＨｚで得た。
【０１７８】
ＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４チャンネルはアセチルコリンの存在下でゆっくりと不活性化するので、電圧傾斜を使用してＩ−Ｖ曲線を測定することができた。Ｉ−Ｖ関係は、それぞれＡＣＣ−２Ｄ６．３またはＡＣＣ−１Ｇ６．４を発現する卵母細胞について、２０マイクロＭまたは２マイクロＭのいずれかのアセチルコリンの存在または不存在下で、４ｍＶ／ｓの連続的な電圧傾斜を使用して、両方向に−８０ｍＶから７０ｍＶで測定した。クロライド透過性は、低ＮａＣｌ濃度（０ｍＭ，２０ｍＭおよび６０ｍＭ）を含むＮＤ９６溶液を使用して得、ここでＮａＣｌをＮａ−グルコネートに置き換えて（９６ｍＭ，７６ｍＭおよび３６ｍＭ）、９６ｍＭの全Ｎａ＋濃度を得た。カチオン透過性は、以下の溶液中でＮａ＋をアルギニンに置き換えることにより得た：９６ｍＭアルギニン−Ｃｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５
ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５。イオン選択性実験では、ＮＤ９６寒天ブリッジを使用して、チャンバー溶液を含む浴電極を連結した。Ｉ−Ｖ記録中、卵母細胞には浴溶液を連続して注いだ。電流は各実験について−８０ｍＶでの値に対して標準化した。
【０１７９】
アゴニストに関する用量応答曲線は、濃度を増加させてアゴニストを適用することにより作成し、続いて各濃度で３〜９分間洗浄した。ＥＣ５０およびＨｉｌｌ係数を決定するために、アゴニストの用量応答曲線は以下の式を使用して適合させた：
【０１８０】
【数１】
2008509681.tif 000010
【０１８１】
式中、Ｉは特定濃度でのアゴニストに対する標準化応答であり、Ｉｍａｘはアゴニストの飽和濃度により誘発される最大応答であり、ＥＣ５０は最大の半分の応答を誘導するアゴニストの濃度であり、ｎはＨｉｌｌ係数であり、そしてＩｍｉｎは最低濃度のアゴニストでの標準化応答である。
【０１８２】
アンタゴニストに関する実験について、卵母細胞をアンタゴニストと１分間インキュベーションした後、それぞれＡＣＣ−２Ｄ６．３またはＡＣＣ−１Ｇ６．４を発現する卵母細胞に１０マイクロＭまたは１マイクロＭのいずれかのアセチルコリンと共にアンタゴニストを同時投与した。アセチルコリンおよびアンタゴニストの同時投与に対する応答の増幅は、１０マイクロＭまたは１マイクロＭのいずれかのアセチルコリン単独に対する応答に対して標準化した。実験あたり少なくとも３個の卵母細胞の平均、およびピーク電流応答の平均の標準誤差を表す。
【０１８３】
薬剤の適用
すべての薬剤は、クロンプトン社（Ｃｒｏｍｐｔｏｎ  Ｃｏ，）（ゲルフ、オンタリオ州、カナダ）から提供されたイミジクロプリド（ｉｍｉｄｉｃｌｏｐｒｉｄ：ＩＭＩ）を除き、シグマ−アルドリッチ（セントルイス、ミズーリ州、米国）から得た。薬剤は保存溶液としてＤＭＳＯ中に作られたＩＭＩを除きＮＤ９６に溶解し、そしてＮＤ９６中で作業濃度に希釈した。必要に応じて、薬剤溶液をｐＨ７．５にＮａＯＨまたはＨＣｌのいずれかを用いて調整した。新しい溶液を測定前に調製し、そして４℃で１〜５日間保存した。
【０１８４】
結果：
新規クラスのＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）ＬＧＩＣサブユニットを表すＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４のクローニング
本発明のＬＧＩＣサブユニットを同定するために、我々はＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）ゲノムのＢＬＡＳＴ調査を、ＧｌｕＣｌサブユニットＡＶＲ−１５（Ｄｅｎｔ  ＪＡ，Ｄａｖｉｓ  ＭＷ，Ａｖｅｒｙ  Ｌ（１９９７）ａｖｒ−１５は、蠕虫における阻害的グルタミン酸作用性神経伝達およびアイバメクチン感受性を媒介するクロライドチャンネルサブユニットをコードする）ＥＭＢＯ  Ｊ  １６：５８５７−５８７９；Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓ  ＤＫ，Ａｒｅｎａ  ＪＰ，Ｐｌａｓｔｅｒｋ  ＲＨ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＨＡ，Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ＪＭ，Ｃｕｌｌｙ  ＤＦ，Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ  ＬＨ（１９９７ａ）セノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）の新規アベルメクチン−感受性クロライドチャンネルに関する遺伝的および生化学的証拠。Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７２：３３１６７−３３１７４）、およびレバミゾール受容体サブユニットＵＮＣ−３８（Ｆｌｅｍｉｎｇ  ＪＴ，Ｓｑｕｉｒｅ  ＭＤ，Ｂａｒｎｅｓ  ＴＭ，Ｔｏｒｎｏｅ  Ｃ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｋ，Ａｈｎｎ  Ｊ，Ｆｉｒｅ  Ａ，Ｓｕｌｓｔｏｎ  ＪＥ，Ｂａｒｎａｒｄ  ＥＡ，Ｓａｔｔｅｌｌｅ  ＤＥ，Ｌ
ｅｗｉｓ  ＪＡ（１９９７）セノラブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のレバミゾール耐性遺伝子ｌｅｖ−１、ｕｎｃ−２９およびｕｎｃ−３８は機能的ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードする。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７：５８４３−５８５７）のような既知のＬＧＩＣサブユニット遺伝子をクエリ配列として使用して行った。以前の調査で同定された遺伝子を次にクエリ配列として使用する対話式調査を使用して、４０以上の推定されるＬＧＩＣサブユニット遺伝子を同定することができた（データは示さず）。Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）のＬＧＩＣサブユニット遺伝子の樹系図は、少なくとも１６のメンバーを含むＬＧＩＣ遺伝子の明確なクレードの存在を明らかにした。このクレードの遺伝子は、アミノ酸レベルでＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）において同定されたセロトニン依存性クロライドチャンネルサブユニットであるＭＯＤ−１に最も類似した（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ  Ｒ，Ｃａｎｎｏｎ  ＳＣ，Ｈｏｒｖｉｔｚ  ＨＲ（２０００）ＭＯＤ−１は、Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）において運動挙動を調節するセロトニン依存性クロライドチャンネルである。Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４７０−４７５）。このＭＯＤ−１様群のメンバーは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）または脊椎動物のゲノムに明白なオルソログを持たない（図２）。
【０１８５】
新たに同定されたクレードは、２〜３の亜群に分かれ、そして我々はこれらの亜群が新規なリガンド特異性のチャンネルをコードするかどうかを判断した。我々は１つの亜群から４種のｃＤＮＡ、ＡＣＣ−１、ＡＣＣ−２、ＡＣＣ−３およびＡＣＣ−４を単離し、そしてシークエンシングした。ＡＣＣ−２Ｄ６．３（１３３８ｂｐ）、ＡＣＣ−１Ｇ６．４（１４０１ｂｐ）およびＡＣＣ−４Ｅ９．９（１２２７ｂｐ）ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ゲノムデータベースに注釈を付けられているものに対応した（Ｈａｒｒｉｓ  ＴＷ，Ｃｈｅｎ  Ｎ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｆ，Ｔｅｌｌｏ−Ｒｕｉｚ  Ｍ，Ａｎｔｏｓｈｅｃｈｋｉｎ  Ｉ，Ｂａｓｔｉａｎｉ  Ｃ，Ｂｉｅｒｉ  Ｔ，Ｂｌａｓｉａｒ  Ｄ，Ｂｒａｄｎａｍ  Ｋ，Ｃｈａｎ  Ｊ，Ｃｈｅｎ  ＣＫ，Ｃｈｅｎ  ＷＪ，Ｄａｖｉｓ  Ｐ，Ｋｅｎｎｙ  Ｅ，ｋｉｓｈｏｒｅ  Ｒ，Ｌａｗｓｏｎ  Ｄ，Ｌｅｅ  Ｒ，Ｍｕｌｌｅｒ  ＨＭ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｃ，Ｏｚｅｒｓｋｙ  Ｐ，Ｐｅｔｃｈｅｒｓｋｉ  Ａ，Ｒｏｇｅｒｓ  Ａ，Ｓａｂｏ  Ａ，Ｓｃｈｗａｒｚ  ＥＭ，Ｖａｎ  Ａｕｋｅｎ  Ｋ，Ｗａｎｇ  Ｑ，Ｄｕｒｂｉｎ  Ｒ，Ｓｐｉｅｔｈ  Ｊ，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ＰＷ，Ｓｔｅｉｎ  ＬＤ（２００４）ＷｏｒｍＢａｓｅ：線虫の生物学およびゲノムのための多種供給源（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ）。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ  ３２：Ｄ４１１−４１７）。ＡＣＣ−３Ｄ１０．５  ｃＤＮＡはＳＬ１リーダー配列とトランスプライスされ（ｔｒａｎｓｐｌｉｃｅｄ）、そして第１および第７〜第９エキソン中の予想ＯＲＦとは異なった。シグナル配列、シス−ループを持つＮ−末端細胞外ドメイン、４つの膜貫通ドメイン（Ｍ１〜Ｍ４）およびＭ３とＭ４との間に位置する大きな細胞質ループのようなＬＧＩＣサブユニットに起因するすべての典型的な特徴は、これらタンパク質のアミノ酸配列中に認めることができた。
【０１８６】
ＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４サブユニットはホモメリックなＡＣｈ−依存性クロライドチャンネルを形成する
ＡＣＣ−サブユニットのリガンド特異性を決定するために、我々はアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞中でＡＣＣ  ｃＲＮＡを発現させ、そして−８０ｍＶで電圧−クランプした。ＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−２Ｄ６．３を注入した卵母細胞はＡＣｈが誘導する内方の電流を現し、最大規模は０．８μＡ〜３．４μＡに変動した（図４Ａ、Ｂ）。ＡＣＣ−１Ｇ６．４依存的電流は、たとえＡＣｈ濃度を飽和させても脱感作をほとんど示さなかった。対照的に、ＡＣＣ−２Ｄ６．３依存的電流は、脱感作した。ＡＣＣ−１Ｇ６．４は０．２６±０．０１μＭの半−エフェクター濃度（ＥＣ５０）および１．２６±０．０４の推定Ｈｉｌｌ係数でＡＣｈに応答し（図４Ｃ）、一方ＡＣＣ−２Ｄ６．３は感受性が一層低く、９．５４±０．１１μＭのＥＣ５０および２．６４±０．０
８のＨｉｌｌ係数で応答した（図２Ｄ）。ＡＣＣ−３Ｄ１０．５  ｃＲＮＡを注入された卵母細胞は、１ｍＭ  ＡＣｈに対して弱い応答（１０〜３０ｎＡ）を現し、そしてＡＣＣ−４Ｅ９．９を注入されたものは応答を表さなかった。ＡＣｈ誘導電流は、ｄＨ２Ｏ注入または非注入卵母細胞では検出されなかった。ＡＣＣ  ｃＲＮＡを発現している卵母細胞は、１ｍＭ  ＧＡＢＡ、グルタメート、グリシンまたはヒスチジンに応答しなかった（データは示さず）。１ｍＭのセロトニンに対する１０〜３０ｎＡの弱い応答が、ＡＣＣ−２Ｄ６．３注入卵母細胞で検出されたが、他のＡＣＣサブユニットを発現している卵母細胞では観察されなかった。（表Ｉ）。
【０１８７】
ＡＣＣ−１、２および３は脊椎動物ＧＡＢＡおよびグリシン受容体にアニオン選択性を付与することがすでに示されている第２膜貫通ドメイン中のＰＡモチーフを共有する（図３）。ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２がクロライドチャンネルでもあるかどうかを決定するために、我々はＩ−Ｖ曲線を作成した。ＡＣＣ−１Ｇ６．４またはＡＣＣ−２Ｄ６．３ホモメリックチャンネルに関するＮＤ９６での逆電位（ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は、それぞれ１８．７±１．４ｍＶおよび１８±１．６ｍＶであり、Ｃｌ−に関する平衡電位に一致した（図５Ａ、Ｂ）（Ｗｅｂｅｒ，１９９９）。非浸透アニオングルコネートにクロライド（７．６ｍＭ外部クロライド）から変えた場合、６５．７ｍＶ（ＡＣＣ−１Ｇ６．４）および６８．６ｍＶ（ＡＣＣ−２Ｄ６．３）の逆電位における正のシフトがあった。対照的にアルギニンにナトリウムから代えた場合、逆電位のシフトは無視できた（Ｅｒｅｖｅｒｓａｌ＝−１７．２±１．７ｍＶ、ＡＣＣ−１Ｇ６．４、および−１７．０±１、ＡＣＣ−２Ｄ６．３）（図５Ｂ、Ｃ）。我々は［Ｃｌ−］の１０倍の変化について、逆電位における５９．８±４．９ｍＶおよび５４．４±３．７ｍＶのシフトを、それぞれＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−２Ｄ６．３に観察した（図５Ｃ）。これはクロライド選択的チャンネルに関するＮｅｒｎｓｔの式により予想される５８ｍＶの理論的シフトと非常に良く合致している。
【０１８８】
ＡＣＣ−２およびＡＣＣ−１チャンネルの薬理学的プロファイル
ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２チャンネルの配列は、線虫および脊椎動物のニコチン性ＡＣｈ受容体の両方とは、それらの細胞外リガンド結合ドメインで実質的に異なる。ＡＣＣリガンド結合部位が、十分に研究されたｎＡＣｈリガンド結合部位とどのくらい類似するのかという疑問に取り組むため、我々は脊椎動物のｎＡＣｈＲに影響を及ぼす多数のアゴニストおよびアンタゴニストを試験した。古典的なｎＡＣｈＲアゴニストであるニコチンは、ＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−２Ｄ６．３チャンネルの両方の大変弱いアゴニストとして挙動した（表３）。より低濃度で、ニコチンはＡＣＣ−１Ｇ６．４の部分アンタゴニストである。ニコチン性アゴニストであるシチシンは、より低濃度でＡＣＣ−２Ｄ６．３を遮断し、そしてより高濃度では弱いアゴニストとして作用するが、シチシンはＡＣＣ−１Ｇ６．４のアンタゴニストとしてのみ作用した。アルカロイドであるストリキニンは、脊椎動物のグリシン受容体およびｎＡＣｈＲのアンタゴニストであり、ＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−２Ｄ６．３チャンネルの両方をそれぞれ４．６１±０．２７μＭおよび２．９５±０．８μＭのＩＣ５０、および０．７３±０．２および１．３８±０．１２のＨｉｌｌ係数で遮断した。同様に、ヘキサメトニウム（ｈｅｘａｍｅｔｈｏｎｉｕｍ）（Ｃ６）およびアルカロイドであるジヒドロ−β−エリスロイジン（ｄβｅ）（非選択的ｎＡＣｈＲアンタゴニスト）は、両チャンネルのアンタゴニストとして作用した。より高濃度でＣ６はＡＣＣ−１Ｇ６．４のアゴニストおよびアンタゴニストとして同時に作用した。興味深いことに、ｄ−ツボクラリン（ｄＴＣ）（ｎＡＣｈＲおよび５−ＨＴ３Ａ受容体の競合的アンタゴニスト）は、ＡＣＣ−１Ｇ６．４および−２を不可逆的に遮断した。ニコチンおよびシチシンに対する弱い応答およびストリキニン、ｄＴＣおよび（ｄβｅ）による遮断は、脊椎動物のｎＡＣｈＲチャンネルのサブセット、α７−α９サブ−タイプ、およびアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）のニューロンに見いだされるアセチルコリン依存性クロライドチャンネルの特徴である。しかしこれらのチャンネルとは異なり、ＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−２Ｄ６．３は、α−アマガサヘビ毒により遮断されなかった。
【０１８９】
殺虫剤であるイミダクロプリド（ＩＭＩ）は、カチオン選択的昆虫ｎＡＣｈＲと選択的に相互作用し（Ｚｗａｒｔ  Ｒ，Ｏｏｒｔｇｉｅｓｅｎ  Ｍ，Ｖｉｊｖｅｒｂｅｒｇ  ＨＰＭ（１９９４）ニトロメチレン複素環；マウスＮ１Ｅ−１１５およびＣＢＣ３Ｈ１細胞に比べて、バッタのニューロン中のニコチン性受容体の選択的アゴニスト。Ｐｅｓｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２０２−２１３）、そして我々は昆虫のチャンネルに対して選択的な薬剤が、我々の線虫アセチルコリン依存性クロライドチャンネルとも相互作用するのかどうかを知ることは興味深かった。比較的高い機能的濃度で、ＩＭＩはＡＣＣ−２Ｄ６．３チャンネルを部分的に遮断するだけであり、そしてＡＣＣ−１Ｇ６．４チャンネルに効果は無かった。
【０１９０】
驚くことに、ニコチン性アゴニストはＡＣＣ−２Ｄ６．３およびＡＣＣ−１Ｇ６．４にほとんど効果が無かったが、アレコリン（代謝生成物産性ＡＣｈ受容体（ｍＡＣｈＲ）のアゴニスト）は、最大ＡＣｈ−誘発電流の８２〜８９％である電流を誘起した（図４Ａ、Ｂ）。アレコリンはＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−２Ｄ６．３発現卵母細胞の両方で、それぞれ４．７±０．１１μＭおよび７５４±２２μＭのＥＣ５０のゆっくりと脱感作する電流を誘起した（図４Ｃ、Ｄ）。リバウンドする内方電流が、両タイプの受容体でアレコリンを除去した時に観察され、アゴニスト依存的な開放−チャンネル遮断（ｏｐｅｎ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋ）を示した。アレコリンはＡＣｈ応答を阻害しない。我々はＡＣＣ−２Ｄ６．３−およびＡＣＣ−１Ｇ６．４−発現卵母細胞についてそれぞれ２．６６±０．２３および１．５９±０．０９のアレコリンに関する予想Ｈｉｌｌ係数は、ＡＣｈに対する応答についてのＨｉｌｌ係数とは有意に異ならず、ＡＣｈとアレコリンとの同程度の協同性を示す。ムスカリン（代謝生成物産性ｍＡＣｈＲの明確なアゴニスト）は、ＡＣＣ−２Ｄ６．３チャンネルを最大アセチルコリン誘起電流の３７％まで活性化し、そしてＡＣＣ−１Ｇ６．４チャンネルに対しては弱いアンタゴニスト活性を現した。
【０１９１】
アトロピン（ｍＡＣｈＲの非選択的アンタゴニストおよびα９ｎＡＣｈＲの競合的アンタゴニスト）は、ＡＣＣ−２Ｄ６．３チャンネルを０．９８±０．７の予想Ｈｉｌｌ係数で８７３±６３μＭのＥＣ５０で活性化した（図４Ｄ）。アトロピンは最大ＡＣｈ誘導電流のわずか４３％を誘起しただけであった。対照的に、我々はＡＣＣ−１Ｇ６．４発現卵母細胞のアトロピン誘起活性化を検出しなかった（１ｍＭまで）。実際にアトロピンは５０μＭ濃度で、１μＭＡＣｈに対するＡＣＣ−１Ｇ６．４チャンネルの応答を有意に遮断した（表３）。すなわちＡＣＣ受容体は、ムスカリン性薬剤に対して独自の応答を表す。薬理学データと一緒にすると、ＡＣＣ  ＡＣｈ結合部位およびｎＡＣｈＲ  ＡＣｈ結合部位は実質的に分岐し、そして独立して進化した可能性を示す。
【０１９２】
ＡＣＣ−３Ｄ１０．５およびＡＣＣ−４Ｅ９．９は、ホモマーとしてＡＣｈに激しく応答しないので、我々はそれらが他のＡＣｈ依存性クロライドチャンネルサブユニットと絶対的な（ｏｂｌｉｇａｔｅ）ヘテロマーを形成する可能性を考えた。ＡＣＣ−２Ｄ６．３
ｃＲＮＡをＡＣＣ−３Ｄ１０．５またはＡＣＣ−４Ｅ９．９  ｃＲＮＡと同時に発現している卵母細胞は、それぞれ１ｍＭ  ＡＣｈに対して５０〜６０ｎＡの弱い応答を現すか、または応答しないかのいずれかであった（図６Ａ）。ＡＣＣ−２Ｄ６．３＋ＡＣＣ−３Ｄ１０．５も、ＡＣＣ−２Ｄ６．３＋ＡＣＣ−４Ｅ９．９発現卵母細胞のいずれも、１ｍＭ  セロトニン、ＧＡＢＡ、グルタメート、グリシンまたはヒスタミンに応答しなかった。ＡＣＣ−３Ｄ１０．５およびＡＣＣ−４Ｅ９．９はグルタメート依存性クロライドチャンネルサブユニットであるＡＶＲ−１５、またはＡＣＣ−１Ｇ６．４の発現を阻害しなかったので、阻害はＡＣＣ−２Ｄ６．３に特異的であった（図６Ａおよび以下）。我々はこの結果を、ＡＣＣ−３Ｄ１０．５およびＡＣＣ−４Ｅ９．９がＡＣＣ−２Ｄ６．３とヘテロメリックチャンネル中で集成し、そしてその開閉またはトラフィッキングを妨害することができることを示すと解釈した。恐らく天然のチャンネルにはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞に存在しないさらなるサブユニットまたはコファクターが必要であるか、あるいはサブユニットがインビボで相互作用することを妨げられているのだろう。
【０１９３】
ＡＣＣ−３Ｄ１０．５もＡＣＣ−４Ｅ９．９もＡＣｈに対するＡＣＣ−１Ｇ６．４の応答を阻害しなかった（図４Ａ、Ｂ）。しかしＡＣＣ−１Ｇ６．４ホモマーとは対照的に、ＡＣＣ−１Ｇ６．４＋ＡＣＣ−３Ｄ１０．５を同時発現している卵母細胞のＡＣｈ誘導電流は、顕著な脱感作を現した（図６Ｂ）。さらにＡＣＣ−１Ｇ６．４＋ＡＣＣ−３Ｄ１０．５発現卵母細胞は、ＡＣｈにＥＣ５０＝３９．６±１．６μＭで応答し、これはホモメリックなＡＣＣ−１Ｇ６．４チャンネルよりも２倍高く、そして０．７８±０．０２のより低い予想Ｈｉｌｌ係数を特徴とする（図６Ｃ）。ＡＣＣ−４Ｅ９．９とＡＣＣ−１Ｇ６．４の同時発現は、ＡＣＣ−１Ｇ６．４ホモマーに比べて最大応答、ＥＣ５０（０．３６±０．０２）またはＨｉｌｌ係数（１．１１±０．０７）を有意に変化させなかった（図６Ｃ）。このようにＡＣＣ−３Ｄ１０．５はＡＣＣ−１Ｇ６．４とヘテロメリックなチャンネルを形成するが、ＡＣＣ−４Ｅ９．９がＡＣＣ−１Ｇ６．４と相互作用することは示されない。
【０１９４】
【表８】
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【０１９５】
アゴニストの効果は、最大アセチルコリン誘導応答の割合として示す。アンタゴニストの効果は１０μＭ（ＡＣＣ−２Ｄ６．３）または１μＭ（ＡＣＣ−２Ｄ６．３）アセチルコリンに対する応答における低下の割合として示す。１００％のアンタゴニスト活性は、応答が観察されなかったことを意味する。ｄβｅ、ジヒドロ−β−エリスロイジン；ＴＣ、ツボクラリン；α−ＢＴ、α−アマガサヘビ毒。
【０１９６】
【表９】
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【０１９７】
【表１０】
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【０１９８】
【表１１】
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【０１９９】
リガンドに対する応答を改善するＡＣＣ−２における変異
適用されたアセチルコリンに対する、より高い平均応答を生じるＡＣＣ−２（配列番号４）の２つの突然変異を作成した。これらの突然変異は、アミノ酸１００（Ｙ１００Ｌ）のＴｙｒからＬｅｕ、およびアミノ酸１６０（Ｆ１６０Ｙ）のＰｈｅからＴｙｒの置換である。４０ｎｇのＲＮＡを注入したアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞では、野生型ＡＣＣ−２（１±０．１３．．ｎ＝１４；範囲４６０−２、５５０ｎＡ）の応答に対して標準化されたこれらの突然変異チャンネルの応答の平均増幅は、１．９７±０．１７（ｎ＝１５）および２．１６±０．０８（Ｎ＝１０）、または野生型チャンネルの約２倍であった。これらの突然変異はアセチルコリンに対する感受性を、野生型ＡＣＣ−２の９．５４±０．１１μＭのＥＣ５０からＹ１００Ｌについては３５１±３３に、Ｆ１６０Ｙについては４４±１．８μＭに下げる。しかしリガンドが限定されず、そして発現系の本来の生物学的変動性に直面してチャンネルの発現をより強固にできる場合、大きく増幅された応答がアッセイをさらに感受性とする。
【０２００】
導入遺伝子から発現されるＲＮＡｉヘアピンを使用したＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２発現の減少  
ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２オープンリーディングフレームに対応する干渉ＲＮＡの発現を、それらの各内因性プロモーターの元で駆動するＤＮＡ構築物を作成した。プロモーター要素ならびにＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２の各ｃＤＮＡの７００ｂｐフラグメントを、ベクターｐＰＤ４９．２６にクローン化した。７００ｂｐのフラグメントはフォワードおよびリバース方向の両方にクローン化した。生じた２つのプラスミドは、Ｃ５３ ４ｋｂ ＩＲおよびＦ５８ ４ｋｂ ＩＲであった。Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）にマイクロインジェクションで形質転換した場合、Ｃ５３ ４ｋｂ ＩＲは緑色蛍光タンパク質に融合され、そしてＲＮＡｉヘアピンと同じＡＣＣ−１プロモーター下で駆動されたＡＣＣ−２タンパク質の発現の実質的な低下をもたらした。これはインビボでのＡＣＣ−２チャンネルの発現を減少するこのＲＮＡｉ構築物の効力を示す。
【０２０１】
前記本発明を、理解を明確にする目的で具体的説明および実施例によりある程度詳細に記載してきたが、当業者には添付する特許請求の精神または範囲から逸脱せずに、本発明の教示に照らして特定の変更および修飾を本発明に行うことができることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】リガンド依存性イオンチャンネル（ＬＧＩＣ）のシス−ループスーパーファミリーの構造である。Ａ．シス−ＬＧＩＣの単一サブユニットのトポロジーを示し、「アミノ」および「カルボキシ」は、各末端を指す。リガンド結合ポケットを定める細胞外リガンド結合ドメインの６つのループ（Ａ−Ｆ）をおおざっぱに示す。孔を形成する４つの膜貫通ドメインをＭ１−４と標識する。５量体チャンネルの各サブユニットに由来するＭ２ドメインは孔を並べ、そしてイオン選択性を決定する。Ｍ３とＭ４の間に、しばしばチャンネルのトラフィッキングに影響する大きな細胞内ループがある。Ｂ．細胞外側から膜を垂直に見た５量体チャンネルのサブユニットの配置を示す。黒い四角は２つのチャンネルサブユニット間の境界でリガンドの結合を示す。矢印はサブユニットの傾き（ｐｏｌａｒｉｔｙ）を示す。
【図２】ＬＧＩＣのＡＣＣファミリー。Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）におけるＬＧＩＣサブユニットスーパーファミリーポリペプチドの縮小した隣接連結樹であり、比較のために選択した脊椎動物およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＬＧＩＣサブユニットを含む。分岐点の数はブートストラップ値であり、末端分岐の数（イタリック体）は、チャンネルサブユニットのクレードを定める分岐点のブートストラップ値を表す。括弧内は各クレード中のＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）遺伝子の数である。アニオン選択的チャンネルを青で示し、カチオンチャンネルを赤で示す。ＡＣＣ／ＭＯＤ−１クレードおよびそれを定めるブートストラップ値は、太字で示す。
【図３】セロトニン依存性クロライドチャンネルＭＯＤ−１およびマウスα９ニコチン性アセチルコリン受容体を持つＡＣＣ−１から−４のラインアップ。４つの予想される膜貫通ドメイン（Ｍ１−４）に下線を付す。（▲）はシス−ループシステイン記する。（††）はアニオン選択性を定めるＰＡモチーフを記する。斜線は保存の程度を示す。
【図４】ＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−２Ｄ６．３はホモメリックなアセチルコリン依存性チャンネルを形成する。ＡおよびＢ．アセチルコリンおよびアレコリンに対するＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−２Ｄ６．３の応答を示すトレース。卵母細胞は−８０ｍＶで挟んだ。棒はアゴニスト適用の期間を示す。ＣおよびＤ．アゴニスと用量応答曲線。誤差棒はＳＥＭで表す。
【図５】ＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−２Ｄ６．３はアニオンチャンネルである。ＡおよびＢ．標準外液（９６ｍＭ  ナトリウムおよび１０４ｍＭクロライド）中、低ナトリウム（０ｍＭ）および低クロライド（７．６ｍＭ）ＮＤ９６のＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−２Ｄ６．３チャンネルのＩ−Ｖ曲線。各卵母細胞について、応答は−８０ｍＶで挟んだ同じ卵母細胞中での応答に対して標準化した。修飾ＮＤ中で測定された応答はるＩ（−８０ｍＶ、修飾ＮＤ９６）／Ｉ（−８０ｍＶ、標準ＮＤ９６）として算出された係数をさらに掛けた。Ｃ．逆電位  対  外部クロライド濃度のプロット。各点は実験を示す。線は４３ｍＭの内部クロライドと推定されるクロライド選択的チャンネルに関してＮｅｒｎｓｔ式により示される理論的関係を表す。誤差棒はＳＥＭで表す。
【図６】ＡＣＣサブユニットは相互作用する。Ａ．サブユニットの組み合わせを発現している卵母細胞中の平均最大電流応答。ＡＣＣ−３Ｄ１０．５およびＡＣＣ−４Ｅ９．９は、ＡＣＣ−２Ｄ６．３の発現を阻害するが、ＡＣＣ−１Ｇ６．４またはＡＶＲ−１５Ｂにより形成される非関連のグルタミン依存性クロライドチャンネルの発現は阻害しない。Ｂ．ヘテロメリックなチャンネルの脱感作の速度上昇を示す同時発現したＡＣＣ−１Ｇ６．４およびＡＣＣ−３Ｄ１０．５の応答。棒はＡＣｈ適用の期間を示す。Ｃ．同時発現したチャンネルの用量応答曲線、ＡＣｈはＡＣＣ−１Ｇ６．４ホモマーよりも弱い効力のＡＣＣ−１Ｇ６．４／ＡＣＣ−３Ｄ１０．５のアゴニストである。ＡＣＣ−４Ｅ９．９とＡＣＣ−１Ｇ６．４の同時発現は、ＡＣｈの効力に影響はない。誤差棒はＳＥＭで表す。
【図７】ＡＣＣ−１のトポロジーおよび機能的ドメイン、および図８．ＡＣＣ−２のトポロジーおよび機能的ドメイン。アミノ酸配列は、青で示す膜貫通ドメインを持つペプチドの膜トポロジーを示すために配置する。細胞外アミノ末端のシグナルを黄色で示す。リガンド−結合ポケットを形成すると予想されるアミノ酸は、３種の影を付けた緑色で示して、それらのＡＣＣ−１、ＡＣＣ−２およびＭＯＤ−１間での保存の程度を示す。同様に残りの細胞外リガンド−結合ドメインの保存の程度を示す。オレンジ色はアライメントにより定められる場合、ＡＣＣ−１およびＡＣＣ−２中のアミノ酸と同一であるが、ＭＯＤ−１中では均等なアミノ酸であることを示し、水治療または親水性指数のいずれかについて非保存的置換を表す（どのように保存的置換が採点されるかの記載については明細書を参照にされたい）。
【図９】ＡＣＣ−２リガンド結合ドメインの予想される３次構造：ループＡ、ＢおよびＣ。ＡＣＣ−２の細胞外リガンド結合ドメインを、カタツムリ（Ｌ．ｓｔａｇｎａｌｉｓ）由来のＡＣｈＢＰと並べ、そしてＡＣＣ−２ペプチドをＡＣｈＢＰ結晶構造に通すために使用した。側鎖は非保存的残基が青色である点を除き、図７および８のように着色する。図面は、ループＡ、ＢおよびＣにより形成されるリガンド結合ポケットの半分である。
【図１０】ＡＣＣ−２リガンド結合ドメインの予想される３次構造：ループＤ、ＥおよびＦ．図面はサブユニットの反対側のリガンド結合ポケットの半分になる点を除き図９の通りである。リガンド結合部位は、１つのサブユニットに由来する図９からのポケットを、隣接するサブユニット中の図１０に由来するポケットと並列することにより形成される。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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