(57)【要約】【課題】ウイルスのマイクロＲＮＡを同定し、また、現在公知、又は将来公知となるウイルスのマイクロＲＮＡの機能を解明する手助けとなり得る、新規な材料及び方法を提供すること。また、マイクロＲＮＡの、ＲＮＡの分解を誘導、又は重要なタンパク質をコードするｍＲＮＡからの翻訳の抑制をする機能を利用し、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡにより誘導される標的ｍＲＮＡの分裂又は翻訳抑制を阻害する新規な分子を提供すること。【解決手段】本発明は、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡの配列を含む単離された核酸分子に関する。他の実施態様において、本発明は、単離された一本鎖のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子及びアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子に関する。更なる実施態様において、本発明は、単離されたマイクロＲＮＰに関する。本発明は更に、細胞内のマイクロＲＮＡ活性の阻害方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡの配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記マイクロＲＮＡが、ベクターに挿入されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡが、ヘアピン状前駆配列の一部又はそのフラグメントである、請求項１記載の単離された核酸分子
【請求項４】
前記ヘアピン状前駆配列が、ベクターに挿入されている、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子が、ＤＮＡ分子である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子が、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡから構成される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
前記核酸分子が、実質的に前記ＤＮＡウイルスのヘアピン状前駆配列から構成される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡが、表１中の配列のいずれか一つである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡが、表２中の配列のいずれか一つである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡが、表３中の配列のいずれか一つである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
前記ＤＮＡウイルスのヘアピン状前駆配列が、表１中の配列のいずれか一つである、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
前記ＤＮＡウイルスのヘアピン状前駆配列が、表２中の配列のいずれか一つである、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
前記ＤＮＡウイルスのヘアピン状前駆配列が、表３中の配列のいずれか一つである、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
分子骨格上に最少で１０の部分、最多で５０の部分を有し、前記分子骨格は骨格単位を含み、各部分は骨格単位に結合している塩基を含む単離された一本鎖のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子であって：
少なくとも１０の隣接する塩基がＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子中の塩基配列と同一の配列（その塩基対の３０％までがゆらぎ塩基対であり、かつ前記隣接する塩基の１０％までが付加、欠失、変異又はそれらの組み合わせである場合を除く）を有し、
前記隣接する部分のうち、デオキシリボヌクレオチドの骨格単位を含むものが５０％を超えない、分子。
【請求項１６】
表１に記載のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列のいずれか一つを有する、請求項１５に記載の分子。
【請求項１７】
表２に記載のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列のいずれか一つを有する、請求項１５に記載の分子。
【請求項１８】
表３に記載のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列のいずれか一つを有する、請求項１５に記載の分子。
【請求項１９】
更に、ＤＮＡマイクロＲＮＡが派生するヘアピン状前駆体に存在する塩基配列を、その５’末端及び／又は３’末端に含む、請求項１５に記載の分子。
【請求項２０】
前記ヘアピン状前駆体が、表１に記載のヘアピン状前駆配列のいずれか一つ又はそのフラグメントである、請求項１９に記載の分子。
【請求項２１】
前記ヘアピン状前駆体が、表２に記載のヘアピン状前駆配列のいずれか一つ又はそのフラグメントである、請求項１９に記載の分子。
【請求項２２】
前記ヘアピン状前駆体が、表３に記載のヘアピン状前駆配列のいずれか一つ又はそのフラグメントである、請求項１９に記載の分子。
【請求項２３】
前記ＤＮＡウイルスが、哺乳動物のＤＮＡウイルスである、請求項１５に記載の分子。
【請求項２４】
前記哺乳動物のＤＮＡウイルスが、ヒトＤＮＡウイルスである、請求項２３に記載の分子。
【請求項２５】
前記ヒトＤＮＡウイルスが、エプスタイン・バーウイルスである、請求項２４に記載の分子。
【請求項２６】
前記ヒトＤＮＡウイルスが、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ヘルペスウイルス８）である、請求項２４に記載の分子。
【請求項２７】
前記ヒトＤＮＡウイルスがサイトメガロウイルスである、請求項２４に記載の分子。
【請求項２８】
前記分子が、増加したヌクレアーゼ耐性により修飾されている、請求項１５に記載の分子。
【請求項２９】
分子骨格上に最少で１０の部分、最多で５０の部分を有し、前記分子骨格は骨格単位を含み、各部分は骨格単位に結合している塩基を含み、各塩基は相補的な配列とワトソン−クリック塩基対を形成する、単離された一本鎖のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子であって：
少なくとも１０の隣接する塩基がＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子中の塩基配列と相補的な配列（その塩基対の３０％までがゆらぎ塩基対であり、かつ前記隣接する塩基の１０％までが付加、欠失、変異又はそれらの組み合わせである場合を除く）を有し、
前記隣接する部分のうち、デオキシリボヌクレオチドの骨格単位を含むものが５０％を超えず、
前記分子はマイクロＲＮＰ活性を阻害することができる、分子。
【請求項３０】
前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子が、表１に記載の配列のいずれか一つである、請求項２９に記載の分子。
【請求項３１】
前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子が、表２に記載の配列のいずれか一つである、請求項２９に記載の分子。
【請求項３２】
前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子が、表３に記載の配列のいずれか一つである、請求項２９に記載の分子。
【請求項３３】
前記分子中の前記部分が、前記マイクロＲＮＡの位置１１に対応する位置において非相補的である、請求項２９に記載の分子。
【請求項３４】
前記隣接する部分の５％までが、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ中の前記隣接する塩基配列に非相補的である、請求項２９に記載の分子。
【請求項３５】
非相補的な部分が、付加、欠失、変異又はそれらの組み合わせである、請求項３４に記載の分子。
【請求項３６】
表９に記載のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列のいずれか一つを有する、請求項２９に記載の分子。
【請求項３７】
表１０に記載のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列のいずれか一つを有する、請求項２９に記載の分子。
【請求項３８】
表１１に記載のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列のいずれか一つを有する、請求項２９に記載の分子。
【請求項３９】
少なくとも一つの前記部分が、デオキシリボヌクレオチドである、請求項２９に記載の分子。
【請求項４０】
前記デオキシリボヌクレオチドが、修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項３９に記載の分子。
【請求項４１】
前記修飾されたデオキシリボヌクレオチドが、チオリン酸デオキシリボヌクレオチド部分である、請求項４０に記載の分子。
【請求項４２】
前記修飾されたデオキシリボヌクレオチドが、Ｎ’３−Ｎ’５ホスホロアミダートデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項４０に記載の分子。
【請求項４３】
少なくとも一つの前記部分が、リボヌクレオチド部分である、請求項２９に記載の分子。
【請求項４４】
少なくとも一つの前記部分が、修飾されたリボヌクレオチド部分である、請求項４３に記載の分子。
【請求項４５】
前記修飾されたリボヌクレオチドが、２’の位置で置換されている、請求項４４に記載の分子。
【請求項４６】
２’位置における置換基が、炭素数Ｃ１からＣ４のアルキル基である、請求項４５に記載の分子。
【請求項４７】
前記アルキル基がメチル基である、請求項４６に記載の分子。
【請求項４８】
前記アルキル基がアリール基である、請求項４６に記載の分子。
【請求項４９】
前記２’の位置における置換基が、アルコキシ（炭素数Ｃ１からＣ４）−アルキル（炭素数Ｃ１からＣ４）基である、請求項４５に記載の分子。
【請求項５０】
前記アルコキシ（炭素数Ｃ１からＣ４）−アルキル（炭素数Ｃ１からＣ４）基が、メトキシエチル基である、請求項４９に記載の分子。
【請求項５１】
前記修飾されたリボヌクレオチドが、２’−酸素原子及び４’−炭素原子との間のメチレン架橋を有する、請求項４４に記載の分子。
【請求項５２】
少なくとも一つの前記部分がペプチド核酸である、請求項２９に記載の分子。
【請求項５３】
少なくとも一つの前記部分が２’−フルオロリボヌクレオチド部分である、請求項２９に記載の分子。
【請求項５４】
少なくとも一つの前記部分がモルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分である、請求項２９に記載の分子。
【請求項５５】
少なくとも一つの前記部分がトリシクロヌクレオチド部分である、請求項２９に記載の分子。
【請求項５６】
少なくとも一つの前記部分がシクロヘキセンヌクレオチド部分である、請求項２９に記載の分子。
【請求項５７】
前記分子が、ヌクレアーゼに対する耐性を増加させるための一つ以上の修飾された部分を含む、請求項２９に記載の分子。
【請求項５８】
前記ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項５７に記載の分子。
【請求項５９】
前記分子が、一つ以上の修飾された部分を５’末端に含む、請求項５８に記載の分子。
【請求項６０】
前記分子が、少なくとも二つの修飾された部分を５’末端に含む、請求項５８に記載の分子。
【請求項６１】
前記分子が、一つ以上の修飾された部分を３’末端に含む、請求項５８に記載の分子。
【請求項６２】
前記分子が、少なくとも二つの修飾された部分を３’末端に含む、請求項５８に記載の分子。
【請求項６３】
前記分子が、一つ以上の修飾された部分を５’末端に含み、一つ以上の修飾された部分を３’末端に含む、請求項５８に記載の分子。
【請求項６４】
前記分子が、少なくとも二つの修飾された部分を５’末端に含み、少なくとも二つの修飾された部分を３’末端に含む、請求項５８に記載の分子。
【請求項６５】
前記分子が、ヌクレオチドキャップを５’末端、３’末端又はその両方に含む、請求項５８に記載の分子。
【請求項６６】
前記分子が、化学修飾キャップを５’末端、３’末端又はその両方に含む、請求項５８に記載の分子。
【請求項６７】
前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項２９に記載の分子。
【請求項６８】
前記分子が、一つ以上の修飾された部分を５’末端と３’末端の間に含む、請求項６７に記載の分子。
【請求項６９】
前記分子が、化学修飾キャップを５’末端と３’末端の間に含む、請求項６７に記載の分子。
【請求項７０】
前記部分の全てがヌクレアーゼに耐性である、請求項２９に記載の分子。
【請求項７１】
細胞内のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法であり、前記マイクロＲＮＰがＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子を含み、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子が一本鎖のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子中の塩基配列に相補的な塩基配列を含み、前記方法が最少で１０の部分、最多で５０の部分の配列を分子骨格上に含む一本鎖のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入する工程を含み、前記分子骨格が骨格単位を含み、各部分が骨格単位に結合する塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成する方法であって：
前記アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の少なくとも１０の隣接する塩基が前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡと相補的（３０％までの前記塩基がゆらぎ塩基対により置換され、少なくとも前記の１０の部分の１０％までが付加、欠失、変異又はその組み合わせである場合を除く）であり、
前記隣接する部分のうち、デオキシリボヌクレオチドの骨格単位を含むものが５０％を超えない、方法。
【請求項７２】
前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子が、表１に記載の配列のいずれか一つを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子が、表２に記載の配列のいずれか一つを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子が、表３に記載の配列のいずれか一つを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子が、表９に記載の配列のいずれか一つを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子が、表１０に記載の配列のいずれか一つを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
前記アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子が、表１１に記載の配列のいずれか一つを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子中の前記部分が、前記マイクロＲＮＡの位置１１に対応する位置において非相補的である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＤＮＡウイルスが哺乳動物のＤＮＡウイルスである、請求項７１に記載の方法。
【請求項８０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ヒトＤＮＡウイルスがエプスタイン・バーウイルスである、請求項７１に記載の方法。
【請求項８２】
前記ヒトＤＮＡウイルスがカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ヘルペスウイルス８）である、請求項７１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ヒトＤＮＡウイルスがサイトメガロウイルスである、請求項７１に記載の方法。
【請求項８４】
ＤＮＡウイルスに感染した哺乳動物の患者を治療する方法であり、前記方法が、前記哺乳動物に請求項２９に記載のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子を導入する工程を含む、方法。
【請求項８５】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項８６】
請求項１５に記載の単離された一本鎖のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願に係る発明は、米国国立衛生研究所の基金（助成金番号Ｒ０１−ＧＭ０６８４７６−０１）に基づき行われたものである。本発明に関する権利の一部はアメリカ合衆国政府に帰属する。
【０００２】
本願は、米国特許出願番号１０／９６８，８２１（出願日２００４年１０月１９日）の一部継続出願であり、左記は米国特許出願番号１０／９２５，３６３（出願日２００４年８月２日）の一部継続出願であり、左記は米国特許出願番号１０／８１９，０９８（出願日２００４年４月５日）の一部継続出願である。前記米国特許出願番号１０／９２５，３６３、１０／８１９，０９８及び１０／９６８，８２１の明細書の全ての内容は、本発明において援用される。
【背景技術】
【０００３】
マイクロＲＮＡは、約２２ヌクレオチドの小分子のＲＮＡである。このマイクロＲＮＡ分子は、配列特異的な様式にて、多様な生物において遺伝子発現を制御する機能を有する。
【０００４】
多様な生物において見られる、ｓｉＲＮＡ及びマイクロＲＮＡのような二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により媒介されるＲＮＡサイレンシングは、ＲＮＡウイルスに対する固有の免疫反応の一部であり、また転移可能な要素である。また、そのような宿主における防御反応を逆に阻害する反応も、例えば植物ウイルスまた昆虫のフロックハウスウイルスなどにおいて確認されている。これらのウイルスは、例えばｄｓＲＮＡ結合タンパク質などのインヒビターを発現し、宿主細胞のＲＮＡサイレンシング機構を妨害する。
【０００５】
例えば、マイクロＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡの３’側のノンコーディング領域に部分的にハイブリダイズした後に翻訳をブロックすることが報告されている。前記マイクロＲＮＡの標的となる遺伝子は未だ解明すべき部分が残されている。しかしながら、マイクロＲＮＡは多様な疾病や症状を発症させることを示唆する証拠が揃いつつある。例えば、ショウジョウバエのマイクロＲＮＡは、アポトーシスに関連する遺伝子を標的としていることが明らかとされ、またＢ細胞慢性リンパ性白血病は、二つのマイクロＲＮＡの欠失が関与していることが明らかとされている。
【０００６】
しかしながら、今日まで、哺乳動物のウイルスによりコードされるマイクロＲＮＡの存在は、これまで報告されていなかった。したがって、哺乳動物のウイルスのマイクロＲＮＡの同定、及び、もし存在する場合にはその生物学的機能を解明することにより、新規抗ウイルス薬の開発にとって有用な知見が得られると考えられる。
【非特許文献１】Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ，２００４，１１６，２８１−２９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上に鑑み、本発明の課題は、ウイルスのマイクロＲＮＡを同定し、また、現在公知、又は将来公知となるウイルスのマイクロＲＮＡの機能を解明する一助となり得る、新規な材料及び方法を提供することである。
【０００８】
また、マイクロＲＮＡの、ＲＮＡの分解を誘導、又は重要なタンパク質をコードするｍＲＮＡからの翻訳の抑制をする機能を利用し、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡにより誘導される、標的ｍＲＮＡの分裂又は翻訳抑制を阻害する新規な分子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一つの実施態様において、本発明は、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡの配列を含む単離された核酸分子に関する。
【００１０】
他の実施態様において、本発明は、単離された一本鎖のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子に関する。前記分子は、最少で１０の部分、最多で５０の部分を分子骨格上に含み、前記分子骨格は骨格単位を含んでなる。各部分は骨格単位に結合している塩基を含み、そこにおいて少なくとも１０の隣接する塩基がＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子中の塩基配列と同一の配列（前記塩基対の３０％までがゆらぎ塩基対であり、かつ前記隣接する塩基の１０％までが付加、欠失、変異又はそれらの組み合わせである場合を除く）を有し、前記隣接する部分のうち、デオキシリボヌクレオチドの骨格単位を含むものが５０％を超えない、分子であることを特徴とする。
【００１１】
更なる実施態様において、本発明は単離された一本鎖のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子に関する。前記アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、分子骨格上に最少で１０の部分、最多で５０の部分を有し、前記分子骨格は骨格単位を含む。前記の各部分は、骨格単位に結合している塩基を含み、各塩基は相補的な配列とワトソン−クリック塩基対を形成し、そこにおいて、少なくとも１０の隣接する塩基がＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子中の塩基配列と相補的な配列（前記塩基対の３０％までがゆらぎ塩基対であり、かつ前記隣接する塩基の１０％までが付加、欠失、変異又はそれらの組み合わせである場合を除く）を有し、前記隣接する部分のうち、デオキシリボヌクレオチドの骨格単位を含むものが５０％を超えず、前記分子がマイクロＲＮＰ活性を阻害することができる、分子であることを特徴とする。
【００１２】
更なる実施態様において、本発明は、細胞内のマイクロＲＮＰ活性の阻害方法に関する。前記マイクロＲＮＰはＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子を含み、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子が一本鎖のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子中の塩基配列に相補的な塩基配列を含む。前記方法は、最少で１０の部分、最多で５０の部分の配列を分子骨格上に含む一本鎖のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入する工程を含み、前記分子骨格が骨格単位を含み、各部分が骨格単位に結合する塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、ここにおいて、前記アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の少なくとも１０の隣接する塩基が前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡと相補的であり（３０％までの前記塩基がゆらぎ塩基対により置換され、少なくとも前記の１０の部分の１０％までが付加、欠失、変異又はその組み合わせである場合を除く）、前記隣接する部分のうち、デオキシリボヌクレオチドの骨格単位を含むものが５０％を超えない、方法であることを特徴とする。
【００１３】
その他の実施態様において、本発明は、ＤＮＡウイルスに感染した哺乳動物の患者を治療する方法である。前記方法は、前記哺乳動物にアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子を導入する工程を含む。
【００１４】
他の実施態様において、本発明は、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の配列を含む単離された核酸分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰに関する。
【００１５】
更なる実施態様において、本発明は、単離された一本鎖のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の発明者は鋭意研究の結果、ＤＮＡウイルスによりコードされるマイクロＲＮＡを発見した。ゆえに、一つの実施態様において、本発明は、単離された一本鎖のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子に関する。
【００１７】
マイクロＲＮＡ分子は、先行技術（例えば非特許文献１）により公知である。前記論文は本発明において援用されている。その分子はゲノム上の染色体位置から派生し、特異的なマイクロＲＮＡ遺伝子から産生される。
【００１８】
成熟型のマイクロＲＮＡ分子は、その前駆体転写物がプロセシングを受け、それによりヘアピン構造をとる。前記ヘアピン構造は典型的にはダイサーとして知られる酵素の働きにより分裂し、それにより一組のマイクロＲＮＡデュプレックスを生じさせる。詳細は非特許文献１を参照のこと。
【００１９】
通常、マイクロＲＮＡデュプレックスの二本鎖のうちの一本が、マイクロＲＮＡ−リボ核タンパク質複合体（マイクロＲＮＰ）中にパッケージングされる。例えば、ヒト細胞中のマイクロＲＮＰにはまた、ｅＩＦ２Ｃ２タンパク質や、Ｇｅｍｉｎ３及びＧｅｍｉｎ４などのヘリカーゼが含まれる。
【００２０】
未修飾のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子
一つの実施態様において、本発明は、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列又はＤＮＡウイルスのヘアピン状前駆配列を含む単離された核酸分子に関する。前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ又はヘアピン状前駆体の配列に加え、前記核酸分子は一つ又は複数の追加的なヌクレオチドを含めてもよい。いかなるヌクレオチドを加えることも可能である。追加するヌクレオチドの数には上限は存在しない。望ましくは約５００ヌクレオチド以下、より望ましくは約３００ヌクレオチド以下が、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列又はヘアピン状前駆配列に追加される。一つの実施態様において、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡは、ヘアピン状前駆配列のフラグメントの一部である。
【００２１】
前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡは、例えば組換えベクターなどのベクターに挿入することができる。望ましくは、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡを含むそのような組換えベクターを構築するために、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列を含む前記ヘアピン状前駆配列は、前記ベクター中に挿入される。詳細は、例えばＣｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４，３０３：８３−８６を参照のこと。
【００２２】
前記組換えベクターは、プラスミド、コスミド又はファージ等、いかなる組換えベクターであってもよい。組換えベクターは一般に、複製開始点を有する。前記ベクターは、例えばアデノウイルスベクター又はアデノ−随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのようなウイルスのベクターであってもよい。詳細は、例えばＬｅｄｌｅｙ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，１３：１５９５−１６１４、及びＶｅｒｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８７：２３９−２４２を参照のこと。
【００２３】
前記ベクターは更に、例えば薬剤耐性マーカーのような選択マーカー、又はβ−ガラクトシダーのような検出可能なマーカーを含むことができる。
【００２４】
前記ＤＮＡウイルスは当業者に公知のいかなるＤＮＡウイルスであってもよい。前記ＤＮＡウイルスは哺乳動物細胞に感染するものが望ましい。哺乳動物の例としてはイヌ、ネコなどの実験動物、ウシ、ウマ又はヒツジなどの家畜、ラット、マウス、ウサギなどの実験動物、サルやヒトなどの霊長類が挙げられる。
【００２５】
前記ＤＮＡウイルスは一本鎖又は二本鎖のＤＮＡウイルスであってもよい。一本鎖及び二本鎖のＤＮＡウイルスの例は、表４に列挙のとおりである。
【００２６】
一つの実施態様において、前記ＤＮＡウイルスはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）である。ＥＢＶのマイクロＲＮＡ及びそれに対応するヘアピン状前駆配列の例は、表１に示すとおりである。他の実施態様において、前記ＤＮＡウイルスはカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスであり、またそれはヘルペスウイルス８（ＫＳＨＶ）としても知られている。ＫＳＨＶのマイクロＲＮＡ及びそれに対応するヘアピン状前駆配列の例は、表２に示すとおりである。
【００２７】
他の実施態様において、前記ＤＮＡウイルスはサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）である。ＨＣＭＶマイクロＲＮＡ及びそれに対応するヘアピン状前駆配列の例は、表３に示すとおりである。
【００２８】
望ましい実施態様において、前記核酸分子はＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列又はヘアピン状前駆配列を含む。他の望ましい実施態様において、前記核酸分子は表１に示すＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列又はヘアピン状前駆配列のいずれか一つを含む。更に他の実施態様において、前記核酸分子は表２に記載のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列又はヘアピン状前駆配列のいずれか一つを含む。更なる実施態様において、前記核酸分子は表３に記載のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列又はヘアピン状前駆配列のいずれか一つを含む。
【００２９】
前記の単離されたＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子のいずれでもよい。表１から３に示す核酸分子の配列は、ウラシル塩基を有することが明らかとなっている。ウラシル塩基は、未修飾のＲＮＡ分子中に生じる。本発明はまた、未修飾のＤＮＡ分子も含む。前記未修飾のＤＮＡ分子の塩基配列は、未修飾のＤＮＡ分子中で前記ウラシル塩基がチミン塩基に置き換わっていることを除き、未修飾のＲＮＡ分子と同一である。
【００３０】
（表１）：ＥＢＶマイクロＲＮＡ及びヘアピン状前駆配列
【表１】
2008500817.tif 000003
太字は成熟型マイクロＲＮＡ配列を、イタリックは、マイクロＲＮＡの非機能の鎖に対応する低量の配列を示す。
【００３１】
（表２）：ＫＳＨＶマイクロＲＮＡ及びヘアピン状前駆配列
【表２】
2008500817.tif 000004
太字は、成熟型マイクロＲＮＡ配列を示す。
【００３２】
（表３）：ＨＣＭＶマイクロＲＮＡ及びヘアピン状前駆配列
【表３】
2008500817.tif 000005
太字は、成熟型マイクロＲＮＡ配列を示す。
【００３３】
（表４）：一本鎖及び二本鎖のＤＮＡウイルス
【表４】
2008500817.tif 000006
【００３４】
ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子のアナログ
他の実施態様において、本発明は、上記のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ又はヘアピン状前駆体のアナログに関するものであり、それらは表１から３に記載の配列を含む。この実施態様において、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、最低１０の部分、望ましくは最低１３の部分、より望ましくは最低１５の部分、更に望ましくは最低１８の部分、最も望ましくは最低２１の部分を含む。
【００３５】
前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、最高で５０の部分、望ましくは最高４０の部分、より望ましくは最高３０の部分、更に望ましくは２５の部分、最も望ましくは２０の部分を含む。上記の最低数及び上記の最高数とのいかなる組み合わせも適用可能である。
【００３６】
各部分は、骨格単位に結合している塩基を含む。本願明細書においては、塩基とは、ＤＮＡ又はＲＮＡ中に存在するいずれか一つの核酸塩基のことを指す。前記塩基は、プリン又はピリミジンであってもよい。プリン塩基の例としては、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）が挙げられる。ピリミジン塩基の例としては、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。前記部分の各塩基は、相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成している。
【００３７】
本発明におけるワトソン−クリック塩基対とは、例えばアデニン及びチミン（Ａ−Ｔ）、アデニン及びウラシル（Ａ−Ｕ）、並びにシトシン及びグアニン（Ｃ−Ｇ）の塩基同士の水素結合による相互作用のことを指す。前記アデニンは、塩基対を弱めることなく、２，６−ジアミノプリンと置換することができる。
【００３８】
前記骨格単位は、安定的に塩基と結合でき、オリゴマーの鎖を形成することができる分子単位であれば、いかなるものも適用可能である。適用可能な骨格単位は当業者には公知である。
【００３９】
例えば、適用可能な骨格単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドに存在する糖リン酸基、チオリン酸デオキシリボース基、Ｎ’３−Ｎ’５ホスホロアミダートデオキシリボース基、２’Ｏ−アルキル−リボースリン酸基、２’−Ｏ−アルキル−アルコキシリボースリン酸基、メチレン架橋を含むリボースリン酸基、２’−フルオロリボースリン酸基、モルフォリノホスホロアミダート基、シクロヘキセン基、トリシクロリン酸基、及びアミノ酸分子が挙げられる。
【００４０】
望ましくは、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、一つ以上の部分を含み、それによりヌクレアーゼ耐性の増加が得られる。そのような分子は、一つ以上の部分を含み、それはヌクレアーゼによって認識されない。したがって、前記分子の前記ヌクレアーゼ耐性は、未修飾のリボヌクレオチド、未修飾のデオキシリボヌクレオチド又はその両方のみを含む配列と比較し、増加する。そのように修飾された部分については公知であり、例えば、Ｋｕｒｒｅｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，１６２８−１６４４（２００３）により参照することができる。
【００４１】
前記ヌクレアーゼ耐性は、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ又はその両方に対するもののいずれも可能である。前記エキソヌクレアーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ又は５’→３’エキソヌクレアーゼのいずれであってもよい。３’→５’ヒトエキソヌクレアーゼの例としては、ＰＮＰＴｌ、Ｗｅｒｎｅｒ症候群ヘリカーゼ、ＲＲＰ４０、ＲＲＰ４１、ＲＲＰ４２、ＲＲＰ４５及びＲＲＰ４６が挙げられる。５’→３’エキソヌクレアーゼの例としては、ＸＲＮ２及びＦＥＮ１が挙げられる。エンドヌクレアーゼの例としては、Ｄｉｃｅｒ、Ｄｒｏｓｈａ、ＲＮＡｅ４、リボヌクレアーゼＰ、リボヌクレアーゼＨ１、ＤＨＰ１、ＥＲＣＣ−１及びＯＧＧ１が挙げられる。エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼの両方の活性を有するヌクレアーゼの例としては、ＡＰＥ１及びＥＸＯ１が挙げられる。
【００４２】
修飾された部分を、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子のいかなる位置に設置することもできる。例えば、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子を３’→５’エキソヌクレアーゼから保護するため、前記分子はその３’末端に一つ以上の修飾された部分を有することが可能で、少なくとも二つの修飾された部分を３’末端に有するのが望ましい。前記分子を５’→３’エキソヌクレアーゼから保護するのが望ましい場合は、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は一つ以上の修飾された部分を、望ましくは少なくとも二つの修飾された部分をその分子の５’末端に有するのがよい。また、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、少なくとも一つ、望ましくは少なくとも二つの修飾された部分を、その分子の５’と３’末端の間に設置し、エンドヌクレアーゼに対する分子の耐性を増加させるのがよい。また望ましくは、少なくとも約１０％、より望ましくは少なくとも約２５％、更に望ましくは少なくとも約５０％、また更に望ましくは少なくとも約７５％、最も望ましくは約９５％の部分が修飾されるのがよい。一つの実施態様において、前記部分の全てがヌクレアーゼ耐性である。
【００４３】
他の実施態様において、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、一つ以上の修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分を有する。適用可能な、修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分については当業者に公知である。
【００４４】
修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分の適用可能な例としては、チオリン酸デオキシリボヌクレオチド部分が挙げられる。図１中の構造式１を参照のこと。チオリン酸デオキシリボヌクレオチド部分を含むＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、一般にはチオリン酸（ＰＳ）ＤＮＡと呼ばれている。それに関しては、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０，１１７−１２１（２０００）を参照のこと。
【００４５】
修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分の他の適用可能な例としては、Ｎ’３−Ｎ’５ホスホロアミダートデオキシリボヌクレオチド部分か挙げられる。図１中の構造式２を参照のこと。ホスホロアミダートデオキシリボヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド分子は、一般にホスホロアミダート（ＮＰ）ＤＮＡと呼ばれている。それに関しては、例えば、Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，３１４３−３１４４（１９９４）を参照のこと。
【００４６】
他の実施態様において、前記分子は一つ以上の修飾されたリボヌクレオチド部分を含む。適用可能な、修飾されたリボヌクレオチド部分については当業者に公知である。
【００４７】
修飾されたリボヌクレオチド部分の適用可能な例は、その２’位置で置換されたリボヌクレオチド部分である。前記２’位置における置換基は、例えば、炭素数Ｃ１からＣ４のアルキル基であってもよい。前記Ｃ１からＣ４のアルキル基は、飽和又は不飽和であっても良く、また直鎖状又は分岐型であってもよい。Ｃ１からＣ４のアルキル基の幾つかの例としては、エチル、イソプロピル及びアリール基が挙げられる。前記の望ましいＣ１のＣ４アルキル基は、メチル基である。図１中の構造式３を参照のこと。その２’位置をＣ１からＣ４のアルキル基で置換されたリボヌクレオチド部分を含むオリゴリボヌクレオチド分子は、一般には２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）ＲＮＡ、例えば２’−Ｏ−メチルＲＮＡ（ＯＭｅＲＮＡ）と呼ばれる。
【００４８】
修飾されたリボヌクレオチド部分の２’位置における置換基の他の適用可能な例は、（炭素数Ｃ１からＣ４のアルコキシ）−（炭素数Ｃ１からＣ４のアルキル基）である。前記Ｃ１からＣ４のアルコキシ（アルキルオキシ）及びＣ１からＣ４のアルキル基は、上記のアルキル基のいかなるものを含めてもよい。前記の望ましいＣ１からＣ４のアルコキシ−Ｃ１からＣ４のアルキル基は、メトキシエチル基である。図１中の構造式４を参照のこと。一つ以上のリボヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド分子であり、その２’位置をＣ１からＣ４のアルコキシ−Ｃ１からＣ４のアルキル基で置換された分子は、２’−Ｏ−（Ｃ１からＣ４のアルコキシ−Ｃ１からＣ４のアルキル基）ＲＮＡ、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ  ＲＮＡ）と呼ばれる。
【００４９】
修飾されたリボヌクレオチド部分の他の適用可能な例は、２’−酸素原子と４’−炭素原子との間でメチレン架橋を有するリボヌクレオチドである。図１中の構造式５を参照のこと。リボヌクレオチド部分を含むオリゴリボヌクレオチド分子であり、２’−酸素原子と４’−炭素原子との間でメチレン架橋を有する分子は、一般にロックされた核酸（ＬＮＡ）と呼ばれる。それに関しては、例えば、Ｋｕｒｒｅｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３０，１９１１−１９１８（２００２）；Ｅｌａｙａｄｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ２，５５８−５６１（２００１）；Ｏｒｕｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ＭｏＩ．Ｔｈｅｒ．３，２３９−２４３（２００１）；Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４，３６０７−３６３０（１９９８）；Ｏｂｉｋａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．ｉＰ，５４０１−５４０４（１９９８）を参照のこと。ロックされた核酸は、Ｐｒｏｌｉｇｏ社（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ）から購入可能である。
【００５０】
修飾されたリボヌクレオチド部分の他の適用可能な例は、フルオロ基により２’位置を置換されたリボヌクレオチドである。そのような２’−フルオロリボヌクレオチド部分は、当業者に公知である。２’−フルオロリボヌクレオチド部分を含む分子は一般に、本発明において２’−フルオロリボ核酸（ＦＡＮＡ）と呼ばれる。図１の構造式７、またＤａｍｈａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，１２９７６−１２９７７（１９９８）を参照のこと。
【００５１】
他の実施態様において、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、アミノ酸残基に結合する一つ以上の塩基を含む。アミノ酸残基に結合する一つ以上の塩基を含む部分は、本発明において以下ペプチド核酸（ＰＮＡ）部分と記す。そのような部分はヌクレアーゼ耐性であり、当業者に公知である。ＰＮＡ部分を有する分子は一般にペプチド核酸と呼ばれる。図１中の構造式６、またＮｉｅｌｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３，１５６−１６４（１９９９）；Ｅｌａｙａｄｉら、ｉｄ．；Ｂｒａａｓｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１，４５０３−４５０９（２００２）；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，１４９７−１５００（１９９１）を参照のこと。
【００５２】
アミノ酸はいかなるアミノ酸であってもよい。また、天然及び人工のアミノ酸を含む。天然アミノ酸にはすなわち、通常タンパク質中に存在する２０の一般のアミノ酸、例えばアラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｕ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）が含まれる。
【００５３】
上記の人工のアミノ酸としては、例えば、アルキル、アリール又はアルキルアリール基を含むアミノ酸である。アルキルアミノ酸の若干の実施例として、α−アミノブチル酸、β−アミノブチル酸、γ−アミノブチル酸、δ−アミノバレリン酸及びε−アミノカプロン酸が挙げられる。アリールアミノ酸の若干の実施例としては、オルト−、メタ−、パラ−アミノ安息香酸が挙げられる。アルキルアリールアミノ酸の若干の実施例としては、オルト−、メタ−、パラ−アミノフェニル酢酸及びγ−フェニルβ−アミノブチル酸が挙げられる。
【００５４】
人工アミノ酸にはまた、天然アミノ酸の派生物も含まれる。前記天然アミノ酸の派生物には、例えば、一つ又は複数の化学基の付加した天然アミノ酸を含めることができる。
【００５５】
例えば、一つ又は複数の化学基は、フェニルアラニン又はチロシン残基の芳香環の２’、３’、４’、５’若しくは６’の位置、又はトリプトファン残基のベンゼン環の４’、５’、６’若しくは７’の位置の一つ又は複数に付加させることができる。前記基としては、芳香族環に付加することができるいかなる化学基も使用することができる。そのような基の例としては、ヒドロキシル、炭素数Ｃ１−Ｃ４のアルコキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ニトロ、ハロ（すなわちフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）又は分岐若しくは直鎖状の炭素数Ｃ１−Ｃ４のアルキル（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル又はｔ−ブチル）が挙げられる。
【００５６】
人工アミノ酸の他の例としては、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）及びヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）などを含む天然アミノ酸の派生物が挙げられる。
【００５７】
前記アミノ酸は、同一であっても、又はそれぞれ異なる種類であってもよい。塩基は前記アミノ酸単位に、分子結合により付着する。前記分子結合の例としては、メチレンカルボニル、エチレンカルボニル及びエチル結合が挙げられる（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｕｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ  １−１９；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００）を参照。ＰＮＡ部分のアミノ酸残基の一例としては、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンが挙げられる。
【００５８】
更に、ＰＮＡ部分の例としては、シクロヘキシルＰＮＡ、レトロ−インベルソＰＮＡ、フォスフォンＰＮＡ、プロピオニルＰＮＡ及びアミノプロリンＰＮＡが挙げられる。これらのＰＮＡ部分の詳細については、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｕｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  −Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ１−１９の図５を参照のこと。前記Ｎｉｅｌｓｅｎらの文献の７ページの図５は本発明において援用されている。
【００５９】
ＰＮＡは、公知の方法、例えば修飾Ｆｍｏｃ又はｔＢｏｃペプチド合成プロトコルにより化学的に合成することができる。前記ＰＮＡは多くの望ましい特性、例えば高い溶融温度（Ｔｍ）、核酸及び非荷電の分子骨格との高い塩基対の特異性を有する。更に、前記ＰＮＡは前記標的ＲＮＡにＲＮａｃｅＨ感受性を与えず、また一般に良好な代謝安定性を有する。
【００６０】
ペプチド核酸はまた、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入可能である。
【００６１】
追加的なヌクレアーゼ耐性部分は、当業者により公知である。例えば、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は一つ以上のモルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分を含む。モルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分を含む分子は一般にモルフォリノ（ＭＦ）核酸と呼ばれている。図１中の構造式８、及びＨｅａｓｍａｎ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４３，２０９−２１４（２００２）を参照のこと。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ  ＬＬＣ（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）から購入可能である。
【００６２】
ヌクレアーゼ耐性部分の他の例において、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、一つ以上のシクロヘキセンヌクレオチド部分を含む。シクロヘキセンヌクレオチド部分を含む分子は、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）と呼ばれる。図１の構造式１０、及びＷａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，８５９５−８６０２（２０００）、Ｖｅｒｂｅｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２９，４９４１−４９４７（２００１）を参照のこと。
【００６３】
ヌクレアーゼ耐性部分の最終的な例において、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は一つ以上のトリシクロヌクレオチド部分を含む。トリシクロヌクレオチド部分を含む分子は一般的にトリシクロ核酸（ｔｃＤＮＡ）と呼ばれる。図１中の構造式９、及びＳｔｅｆｆｅｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９，１１５４８−１１５４９（１９９７）、Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４，５９９３−６００２（２００２）を参照のこと。
【００６４】
他の実施態様において、前記分子の片側の末端、両末端及び／又はそれら末端の間にキャップ構造を施し、それにより前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡのアナログ又は上記本発明に係る未修飾の単離された核酸マイクロＲＮＡ分子の、ヌクレアーゼに対する耐性を増加させることが可能である。例えばエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼに対する増加した耐性が望ましい。ヌクレアーゼ耐性を増加させるキャップ構造でいかなる公知のものも適用可能である。
【００６５】
そのようなキャップの例としては、逆向きヌクレオチドキャップ及び化学修飾キャップが挙げられる。逆向きヌクレオチドキャップは５’及び／又は３’末端に付加することができる。また化学修飾キャップは前記分子の片側の末端、両末端及び／又はそれら末端の間に付加することができる。
【００６６】
逆向きヌクレオチドキャップは核酸の３’→５’配列のことであり、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子又は単離された核酸マイクロＲＮＡ分子の５’及び／又は３’末端に結合するものである。前記逆向きのキャップ中におけるヌクレオチドの数は、それが前記がその標的ｍＲＮＡに結合するのを妨害しない限りは、上限はない。いかなるヌクレオチドもヌクレオチドキャップにおいて使用することができる。通常は、前記ヌクレオチドキャップは約４０ヌクレオチド長以下、望ましくは約３０ヌクレオチド長以下、より望ましくは約２０ヌクレオチド長以下、更に望ましくは約１０ヌクレオチド長以下である。典型的には、前記逆向きヌクレオチドキャップは１ヌクレオチド長である。前記逆向きキャップに用いられる前記ヌクレオチドは、一般にはチミンであるが、アデニン、グアニン、ウラシル又はシトシンのような他のいかなるヌクレオチドも使用可能である。
【００６７】
化学修飾キャップは、核酸のヌクレアーゼ耐性を増加させるための、あらゆる公知の化学基のことを指す。そのような化学修飾キャップの例としては、ヒドロキシアルキル基（アルキルヒドロキシド）又はアミノアルキル基（アルキルアミン）が挙げられる。ヒドロキシアルキル基はしばしばアルキルグリコシル基（例えばエチレングリコール）と呼ばれる。アミノアルキル基はしばしばアミノリンカーと呼ばれる。
【００６８】
ヒドロキシアルキル基又はアミノアルキル基中の前記アルキル鎖は直鎖型又は分岐型のいずれでもよい。前記アルキル鎖中に存在する最小の炭素原子数は、１であり、望ましくは少なくとも２であり、より望ましくは少なくとも約３である。
【００６９】
前記アルキル鎖に存在する最大炭素原子数は、約１８、望ましくは約１６、より望ましくは１２である。典型的な前記アルキル基は、メチル、エチル及びプロピル基とを含む。前記アルキル基は、一つ以上の水酸基及び／又はアミノ基によって更に置換してもよい。
【００７０】
アミノリンカーの幾つかを、表５に示す。表５にリストとして挙げられているアミノリンカーは、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）から購入可能である。
【００７１】
（表５）：ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のアミノリンカー
【表５】
2008500817.tif 000007
【００７２】
前記分子はまた、キメラのＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子でもよい。上記の部分のいかなるものの混合物を含むキメラ分子は公知であり、公知の方法により調製することができる。それに関しては、例えば、上記の引用文献、及びＷａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，１３９８９−１３９９４（１９９９）；Ｌｉａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９，５７５３−５７５８（２００２）；Ｌｏｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１，３４５７−３４６７（２００２）；Ｄａｍｈａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，１２９７６−１２９７７（２００２）を参照のこと。
【００７３】
本発明の前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、少なくとも１０、望ましくは少なくとも１３、より望ましくは少なくとも１５、更に望ましくは少なくとも２０の隣接する塩基を含み、天然ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の配列を有する。望ましい実施態様において、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の完全配列（例えば前記表１に示すＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の配列のいずれか一つ）を含む。他の望ましい実施態様において、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の完全配列（例えば前記表２に示すＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の配列のいずれか一つ）を含む。更に他の望ましい実施態様において、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の完全配列（例えば前記表３に示すＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の配列のいずれか一つ）を含む。
【００７４】
前記分子中の残りの塩基（もし存在すれば）は、上記の修飾された又は未修飾の部分であってもよい。一つの実施態様において、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、リボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分の一つ以上の部分を含む。
【００７５】
分子中の部分の総数が５０を超えない限りは、４０を越えないいかなる数の部分、またいかなる塩基配列をも、隣接する塩基配列を含む上記部分に追加することが可能である。前記の追加的な部分は、前記隣接するの配列の５’末端、３’末端又は両末端に追加することが可能である。前記追加的な塩基は、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡから派生したヘアピン状前駆体に存在する５’末端の塩基配列及び／又は３’末端の塩基配列を含むことができる。一つの実施態様において、前記ヘアピン状前駆配列は表１に示すいずれか一つのヘアピン状前駆配列又はそのフラグメントを含むことができる。他の実施態様において、前記ヘアピン状前駆配列は、表２に示すいずれか一つのヘアピン状前駆配列又はそのフラグメントを含むことができる。更に他の実施態様において、前記ヘアピン状前駆配列は表３に示すいずれか一つのヘアピン状前駆配列又はそのフラグメントを含むことができる。前記フラグメントは、少なくとも約１０、望ましくは少なくとも約１５、より望ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドをその５’末端及び／又は３’末端に有するいかなるヘアピン状前駆配列のフラグメントとすることができる。望ましくは前記ヌクレオチドの配列は、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡが存在するヘアピン状前駆体内に存在するのが望ましい。
【００７６】
上記の隣接する塩基において、塩基対の３０％まで、ゆらぎ塩基対により置換することが可能である。本発明において、ゆらぎ塩基対とは、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の配列中において、１）シトシンをウラシルにより置換すること、又は２）アデニンをグアニンにより置換することのいずれかを指す。これらのゆらぎ塩基対は、一般的には、ＵＧ又はＧＵゆらぎと称する。表６は、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子中における隣接する塩基の数、及びゆらぎ塩基対の最大数を示す。
【００７７】
（表６）：隣接する塩基の数、及びゆらぎ塩基対の最大数
【表６】
2008500817.tif 000008
【００７８】
更に、ゆらぎ塩基対に加え、前記隣接する塩基の１０％まで、望ましくは５％までであれば付加、欠失、変異又はそれらの組み合わせを施すことが可能である。付加とは、隣接する配列中に、上記のいずれか一つの塩基を含む何らかの部分が挿入されることを指す。欠失とは、前記隣接する配列の何らかの部分が除去させることを指す。変異とは、前記隣接する配列中における塩基を含む部分が、上記のその他の塩基により置換されることを指す。
【００７９】
前記付加、欠失又は変異は、前記隣接する配列、例えば隣接する配列の両末端又はＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の隣接する配列内部のいかなる箇所においても生じうる。典型的には、前記付加、欠失又は変異は、その隣接する配列が例えば約１０から約１５部分長と比較的短いときは、その隣接する配列の末端にて生じる。その隣接する配列が１６塩基長以上と比較的長いときは、その付加、欠失又は置換はその隣接する配列のいかなる部分においても生じうる。
【００８０】
例えば、隣接する塩基が１０から１９塩基のときはゼロ又は一の隣接する塩基の付加、欠失又は置換、また隣接する塩基が２０から２３塩基のときは一又は二の付加、欠失又は置換が許容範囲である。
【００８１】
更に５０％未満、望ましくは３０％未満の前記隣接する部分が、デオキシリボヌクレオチド骨格単位を含む。表７及び８は隣接する塩基の数及びデオキシリボヌクレオチド骨格単位の最大数を示す。
【００８２】
（表７）：デオキシリボヌクレオチド骨格単位を含む隣接部分の５０％数
【表７】
2008500817.tif 000009
【００８３】
（表８）：デオキシリボヌクレオチド骨格単位を含む隣接部分の３０％数
【表８】
2008500817.tif 000010
【００８４】
他の実施態様において、前記ゆらぎ塩基対に加え、更に上記の付加、欠失及び変異により、天然のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ配列中の位置１１に相当する前記部分について付加、欠失又は変異が導入されてもよい。
【００８５】
単離されたマイクロＲＮＰ
他の実施態様において、本発明は、上記の単離された核酸配列又は上記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡのアナログのいずれかを含む、単離されたマイクロＲＮＰの提供に関する。
【００８６】
アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子
他の実施態様において、本発明は、アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の提供に関する。前記アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、前記の単離された核酸ＤＮＡのマイクロＲＮＡ配列又はＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子のアナログ中の塩基配列と相補的であることを除けば、上記の単離された核酸配列、又は上記のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡのアナログのいずれであってもよい。
【００８７】
アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の配列の例を、表９、１０及び１１に示す。
【００８８】
（表９）：ＥＢＶのアンチ−マイクロＲＮＡ配列
【表９】
2008500817.tif 000011
【００８９】
（表１０）：ＫＳＨＶ８のアンチ−マイクロＲＮＡ配列
【表１０】
2008500817.tif 000012
【００９０】
（表１１）：ＨＣＭＶのアンチ−マイクロＲＮＡ配列
【表１１】
2008500817.tif 000013
【００９１】
アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子に関して上記した通り、修飾することができる。一つの実施態様において、アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の前記隣接する部分は、対応するＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子と相補的である。アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の相補性の程度は、ゆらぎ塩基対あるいは付加、欠失及び変異に関する、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子のアナログに関して上記した規制に従う。
【００９２】
望ましい実施態様において、アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子が未修飾の部分だけからなる場合、アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、少なくとも１０の塩基が隣接する塩基において一つ以上、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡに対する非相補的な塩基を、及び／又は化学修飾キャップを含む。
【００９３】
他の望ましい実施態様において、アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の少なくとも１０の隣接する塩基がＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子に対する完全に相補的な（すなわち１００％）である場合、アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、少なくとも１０の隣接する塩基中に一つ以上の修飾された部分を含み、及び／又は化学修飾キャップを含む。
【００９４】
更にもう一つの実施態様において、天然ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡの位置１１に対応する位置のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の部分は、非相補的である。天然ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡの位置１１に対応するアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の部分は、付加、欠失又は変異の導入を含む上記のいかなる手段によっても、上記の通り非相補的とすることができる。
【００９５】
単離された分子
核酸分子、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子又はアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、望ましくは単離された分子である。また、それは他の核酸を実質的に含まないことを意味する。実質的に他の核酸を含まない、とは、上記のような核酸分子、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子、アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子又はマイクロＲＮＰ分子が少なくとも約９０％、望ましくは少なくとも約９５％、更に望ましくは少なくとも約９８％の純度で他の核酸を含まない状態を指す。
【００９６】
望ましくは、前記分子は基本的に純粋である。また、それは前記分子が他の核酸のみならず、分子の合成及び単離において使用する他の材料も含んでいないことを意味する。合成において使用する材料とは、例えば酵素である。単離において使用する材料は、例えばゲル（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ用）である。前記分子は、少なくとも約９０％、望ましくは少なくとも約９５％、更に望ましくは少なくとも約９８％の純度で、他の核酸及び他の材料を含まない。
【００９７】
使用
本発明のＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子及びアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける応用が可能である。
【００９８】
例えば、本発明の前記マイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡの機能を研究するために、細胞に導入することができる。前述のいかなるＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子も、それらの機能を研究するための細胞に導入することができる。
【００９９】
一つの実施態様において、細胞内のマイクロＲＮＡは、適切なアンチ−マイクロＲＮＡ分子によって阻害される。あるいは、細胞内のマイクロＲＮＡ分子の活性は、一つ又は複数の付加的なマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入することによって強化することができる。マイクロＲＮＡの機能は、細胞のマイクロＲＮＡの活性の抑制及び／又は強化と関連する変化を観察することによって推定することができる。
【０１００】
本発明の一態様において、本発明は、細胞内のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法に関する。細胞内のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法は、一本鎖のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入することを含む。マイクロＲＮＰは、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子からなる。マイクロＲＮＡ分子は、一本鎖のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の塩基配列に相補的な配列からなる。
【０１０１】
いかなるアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子も、上記の規定を前提として、アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡがマイクロＲＮＰに存在するＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡに相補的である限り、細胞内のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法で使うことができる。
【０１０２】
本発明のアンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、宿主細胞のマイクロＲＮＰのＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡと結合することによって、マイクロＲＮＰ活性を阻害することができる。マイクロＲＮＰ活性は、標的配列の裂開又は翻訳の抑制に関連する。前記標的配列は、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡの塩基の配列に対して部分的に又は完全に相補的な、いかなる配列でもあってもよい。前記標的配列は、例えばウイルスの、又は宿主メッセンジャーＲＮＡである。
【０１０３】
例えば、ＤＮＡウイルスは、宿主由来の標的配列に対する相補的なマイクロＲＮＡを生じることができる。なお、前記標的配列は、宿主細胞がウイルスの感染に対する防御のために有益である。前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＰで包まれることにより、標的配列の前記有益な効果を阻害する。したがって、アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の導入は、ＲＮＰ活性を阻害して、このことによりウイルスからの危害を減らす。
【０１０４】
あるいは、宿主細胞は、ウイルスに有害である遺伝子を転写することによって、ウイルスの感染に対する防御を行うことができる。例えば、前記遺伝子は細胞のアポトーシスを誘導することができるため、前記の遺伝子はウイルスに有害である。宿主細胞によって転写される標的配列に対して相補的なＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡは、ウイルスに有益である。その理由は、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ（マイクロＲＮＰ中に存在）が、宿主細胞のアポトーシスを阻害する能力を有するからである。したがって、ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子の導入は、細胞の生存を促進し、その結果感染も促進される。
【０１０５】
前記細胞は、特定のＤＮＡウイルスによって感染されうるいかなる細胞であってもよい。特定のＤＮＡウイルスによって感染する特定の細胞は、当業者にとって周知である。例えば、ＥＢＶが特異的にＢリンパ球に感染することは、当業者にとって周知である。
【０１０６】
マイクロＲＮＡ分子又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子は、当業者にとって公知のいかなる方法によっても、細胞に導入することができる。例えば、前記分子は、マイクロインジェクションのような方法により、直接細胞に注入することができる。あるいは、前記分子は、望ましくは輸送システムの補助を伴いながら細胞と接触することができる。
【０１０７】
使用可能な輸送システムには、例えば、リポソーム及び荷電した脂質が含まれる。リポソームは、通常それらの中心部の水相中にオリゴヌクレオチド分子をカプセル化する状態で存在する。荷電した脂質は一般に、それらの正反対の荷電の結果として、脂質−オリゴヌクレオチド分子複合体を形成する。
【０１０８】
これらのリポソーム−オリゴヌクレオチド分子複合体又は脂質−オリゴヌクレオチド分子複合体は、通常エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる。前記リポソーム又は荷電した脂質は一般にヘルパー脂質を含み、それによりエンドソーム膜を崩壊させ、オリゴヌクレオチド分子の放出が可能となる。
【０１０９】
マイクロＲＮＡ分子又はアンチ−マイクロＲＮＡを細胞に導入する他の方法には、例えばデンドリマー、生分解性ポリマー、アミノ酸ポリマー、糖ポリマー及びオリゴヌクレオチド結合性ナノ粒子などの輸送手段の使用法が含まれる。加えて、貯蔵手段としてプルロニック（登録商標）のゲルを用い、長期間にわたるアンチ−マイクロＲＮＡのオリゴヌクレオチド分子の輸送を可能にすることができる。上記方法は、例えば、Ｈｕｇｈｅｓら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ６，３０３−３１５（２００１）；Ｌｉａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９  ５７５３−５７５８（２００２）；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｓｌｉｅ，Ｒ．Ａ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ａ．Ｊ．＆Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｈ．Ａ．，ｅｄｓ），ｐｐ．１４７−１５７，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【０１１０】
マイクロＲＮＡ分子又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子の特定の細胞に対するターゲッティングは、当業者にとって公知のいかなる方法にもよって実施することができる。例えば、前記マイクロＲＮＡ分子又はアンチ−マイクロＲＮＡ分子は、抗体又はリガンドとコンジュゲートし、細胞上のレセプターによって特異的に認識することができる。例えば、細胞がＢリンパ球である場合、その抗体は、細胞レセプターＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３又はこれらのレセプタに対するリガンドとすることができる。
【０１１１】
他の実施態様において、本発明は、哺乳動物へのＤＮＡウイルス感染を治療するための方法を提供する。前記方法は、アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子を前記哺乳動物に導入することを含む。アンチ−ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は、従来技術において公知のいかなる方法によっても、哺乳動物に導入することができる。例えば、アンチ−ＤＮＡ分子を細胞に導入するための上記の方法はまた、前記分子を哺乳動物に導入するために使用することができる。
【実施例１】
【０１１２】
材料及び方法
細胞系及びウイルス：
ＥＢＶ陰性ＢＬ−４１細胞及びＥＢＶ陽性ＢＬ４１／９５細胞（Ｔｏｒｓｔｅｉｎｓｄｏｔｔｉｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １９８９、４３：２７３に記載）を、１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ）にて培養した。ＥＢＮＡ−１に対する抗体を使用したウエスタンブロット分析によって、ＢＬ−４１はＥＢＶを含まず、ＢＬ４１／９５はＥＢＶを含むことを確認した。ＥＢＶのマイクロＲＮＡ発現の分析のために、更にホジキンリンパ腫（ＨＤ）細胞のＬ５４０、ＨＤ−ＭＹ−Ｚ（ＥＢＶ陰性）及びＲＰＭＩ  ６６６６（ＥＢＶ陽性）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）細胞、ラモス（ＥＢＶ陰性）、Ｏｕｓ及びＭｕｔｕ（ＥＢＶ陽性）及び伝染性のＢ９５−８ウイルス分子を産生するＥＢＶ陽性のマーモセット由来Ｂ９５−８細胞を培養した。これらの細胞系もまた、１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ）にて培養した。ＫＳＨＶ陽性のＢＣＢＬ１細胞系（レンヌら、Ｎａｔ．ｍｅｄ．１９９６、２：３４２−３４６に記載）を、１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ）にて培養した。ＫＳＨＶの解析にあたり、ウイルスの複製を誘発するため、合計５×１０６のＢＣＢＬ１細胞を２０ｎｇ／ｍｌのホルボール−１２−テトラデカノエート−１３−酢酸塩（ＴＰＡ）によって誘導し、更にＴＰＡ処理の２４、４８及び７２時間後にＲＮＡを抽出した。ヒト包皮線維芽細胞を、１０％のＦＣＳ、１０Ｕ／ｍｌのモロナル（ｍｏｒｏｎａｌ）及び１０μｇ／ｍｌの硫酸ネオマイシンを添加したＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）で一次培養した。９０％コンフルエントな細胞を、５ＰＦＵ／細胞にてＨＣＭＶのＶＲ１８１４系統により感染し、感染から通常約４−５日後の、細胞病理学的な効果が明瞭に観察できるときに、回収された。
【０１１３】
ＲＮＡ調製、クローニング手順及びノーザンブロット分析：
全ＲＮＡの抽出は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２００２，１２：７３５に記載の方法により行った。また、ＲＮＡサイズの分画及びクローニング手順に関する記載も存在する。ノーザンブロット分析は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２００２，１２：７３５に記載の方法に従い、１レーンにつき３０μｇ又は１５μｇのトータルＲＮＡを添加し、前記マイクロＲＮＡ配列に相補的な、５’末端を３２Ｐラベルされたオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。ＥＢＶの解析において、ｔＲＮＡのバンドを臭化エチジウムにて染色するか、あるいは３２Ｐラベルされた５’ＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＧＣＴＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＡＴＣＧオリゴデオキシヌクレオチドをプローブとして使用して、Ｕ６ｓｎＲＮＡのブロットをリプローブし、ゲルへの添加量が等しいことを確認した。ブロットを除去した後、数回リプローブした。ブロットの完全な除去は、前回のプローブした膜をリン光体イメージングすることによって確認した。
【０１１４】
小分子ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡシークエンシング：
細菌のコロニーを、予めウェル当たり２０μｌの滅菌水を添加した９６ウェルプレートに添加し、それらを１：１の比率にて、１０μｌのＰＣＲカクテル（後記）と混合して第２の９６ウェルプレートに分注した（ＰＣＲカクテルの組成：２μｌの１０×Ｓｉｇｍａ  ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＰＣＲバッファー、２μｌの２ｍＭデオキシヌクレオシド三リン酸塩混合液、１０μＭのＭ１３ユニバーサル・リバースプライマーを各々０．４μｌ、１．３５μｌの１Ｕ／μｌ  ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＲＥＤＡｃｃｕＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（シグマ社）及び４．８５μｌの水）。ＰＣＲのサイクルのプログラムは、９４℃で１分３０秒、その後９４℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で３分３０秒を３０サイクルにて行った。その条件においては、プライマー及びデオキシヌクレオチドが大幅に減少するため、以降の、シークエンス前の浄化処理を省略することができる。ＰＣＲ産物を３０μｌの水で希釈した後、そのうち３μｌを、１μｌの２．５×ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット混合溶液、１．７５μｌの５×バッファー及び１４．２５μｌの水からなる１７μｌのシークエンシングカクテルを含む９６枚のウェルプレートのウェルに添加した。更に、シークエンス反応を、９６℃にて１０秒、５０℃にて５秒、６０℃にて４分のサイクルを２５サイクルにて行った。得られた反応生成物を、５０μｌの１００％エタノール／２μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．８）によって沈殿させ、得られたペレットを７０％のエタノールによってリンスし、１０μｌのＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステム）を添加した後、９４℃で１０分間変性させ、サンプルをＡＢＩ３７３０ｘ１シークエンサーにアプライした。
【０１１５】
マイクロＲＮＡの標的の予測：
最初に、Ｅｎｓｍａｒｔ（Ｋａｓｐｒｚｙｋら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００４，１４：１６０）を使用してヒトのゲノムにおいて３’ＵＴＲ配列として２０，１５３の転写物を得、また、１７５の成熟型ヒトマイクロＲＮＡの配列をＲＦＡＭマイクロＲＮＡレジストリ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００４，３２：Ｄ１０９）を得た。ｍｉＲａｎｄａ（Ｅｎｒｉｇｈｔら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，２００３，５：ＲＩ，１）を用い３’ＵＴＲ配列中のマイクロＲＮＡ結合配列を同定した。このスキャンにおける閾値は、Ｓ：９０及びＧ：−１７ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。配列スコアの生データの９０パーセンタイルの範囲内に存在するものを、マイクロＲＮＡの標的の候補として選抜した。
【実施例２】
【０１１６】
ＥＢＶによりコードされるマイクロＲＮＡの同定
ヘルペスファミリーに属する大型のＤＮＡウイルスであり、特異的にヒトＢ細胞に感染するエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を解析した。潜在的にＥＢＶに感染したバーキットリンパ腫細胞系から、小分子のＲＮＡをクローニングした。驚くべきことに、クローニングした小分子ＲＮＡの４％がＥＢＶ（表１２及び１３）から生じることが明らかとなった。
【０１１７】
（表１２）：
非感染（−）ＤＮＡウイルス感染ヒト細胞株から調製した、小分子ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーの組成を示す。アノテーションは、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＧｅｎＢａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ヒトｔＲＮＡ配列のデータセット（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ＧｔＲＤＢ／Ｈｓ／Ｈｓ−ｓｅｑｓ．ｈｔｍｌ）、ヒトの及びマウスのｓｎ／ｓｎｏＲＮＡ配列のデータセット（ｈｔｔｐ：／／ｍｂｃｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｍａｌｌＲＮＡ／Ｄａｔａｂａｓｅ）、マイクロＲＮＡのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｒｆａｍ／ｍｉｃｒｏＲＮＡ／）、マイクロＲＮＡの予測（３５）、及びＵＣＳＣからのＨＧ１６ヒトゲノムアセンブリのリピート要素アノテーション（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）からの情報に基づく。クローニングされた配列の総数は、表の最下行で括弧内に示される。最高２つの変異の許容範囲でヒトゲノムに位置するが、特定のタイプを割り当てられなかった配列は、「Ｎｏｔ  ａｎｎｏｔａｔｅｄ」として分類した。また３以上の変異を有し、ゲノムにマッチしなかったものは、「Ｎｏｔ  ｍａｔｃｈｅｄ」として分類した。
【表１２】
2008500817.tif 000014
ａ：ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ及び他の公知の小分子の細胞質内ノンコーディングＲＮＡを含む。
ｂ：ウイルスの配列に係るアノテーションは、ＥＢＶ  Ｂ９５−８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｖ０１５５５）に基づく。
【０１１８】
（表１３）：
小分子のＲＮＡの配列は、ウイルスの配列に由来した。小分子ＲＮＡの配列の位置は、上の表１２において特定されるウイルスのゲノム配列と関連させて決定した。
【表１３】
2008500817.tif 000015
【０１１９】
大部分のＥＢＶ配列は一回以上クローニングし、クローニングしたＲＮＡの側方に位置するゲノム配列の解析により、マイクロＲＮＡ遺伝子に特有の折り返し構造が示唆された。前記ＥＢＶマイクロＲＮＡは、ＥＢＶゲノムの２つの領域において集まっている５つの異なるｄｓＲＮＡ前駆体から生じた（２Ａ図ｓ及びＢ）。
【０１２０】
ＥＢＶマイクロＲＮＡは全て直ちにノーザンブロット法により検出可能であり、５つのマイクロＲＮＡのうちの３つにおいて、約６０ｎｔの折畳み前駆体が含まれていた（図２Ｃ）。第１のマイクロＲＮＡクラスターは遠いＢｃｌ−２ホモログをコードしているＢＨＦＲ１遺伝子のｍＲＮＡ中に位置していた。これらの３つのマイクロＲＮＡを、以降ｍｉＲ−ＢＦＩＲＦ１−１からｍｉＲ−ＢＨＲＦ１−３と称する。
【０１２１】
ｍｉＲ−ＢＨＦＲ１−１は、５’ＵＴＲに位置し、ｍｉＲ−ＢＨＦＲ１−２及び３は、ＢＨＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する。構造的に類似したマイクロＲＮＡ遺伝子の組織は、発現された配列タグのオープンリーディングフレームの側方に位置する若干の哺乳動物のマイクロＲＮＡとして観察された。他のＥＢＶマイクロＲＮＡはＢＡＲＴ遺伝子のイントロン領域においてクラスターを形成していた。それらを、以降ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１及びｍｉＲ−ＢＡＲＴ２と称する。マイクロＲＮＡが、ＲＮＡサイレンシング経路において標的ｍＲＮＡを分解、又は翻訳を抑制することによって機能することから、宿主及び／又はウイルスの遺伝子発現に係る新規なウイルスの調節機構を発見したこととなる。
【実施例３】
【０１２２】
エプスタイン・バーウイルスによりコードされるマイクロＲＮＡの標的配列の予測：
潜在的に細胞に感染しているＥＢＶは３つの異なる潜伏段階（ＩからＩＩＩ、図２Ａ）において検出され、潜在的な遺伝子の様々なサブセットの発現：６つの核抗原（ＥＢＮＡ１、２、３Ａ、Ｂ、Ｃ及びＥＢＮＡ−ＬＰ）、３つの潜在的な膜タンパク質（ＬＭＰ１、２Ａ及び２Ｂ）、コーディング部分が未解明のＢａｍＨＩ  Ａ領域（ＢＡＲＴ／ＣＳＴ）からの、２つのノンコーディングＲＮＡ（ＥＢＥＲ１及び２）及び転写物、によって特徴づけられる。
【０１２３】
潜伏段階ＩＩＩにおける全ての潜在的な遺伝子を発現するＥＢＶ細胞から、小分子ＲＮＡを単離した。ＥＢＶマイクロＲＮＡの発現が、特定の潜伏段階と関係するか否かを明らかにするため、異なる潜伏段階において、不死化した細胞（ホジキンのリンパ腫（ＨＤ、潜伏段階ＩＩ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、潜伏段階Ｉ、ウイルス生産マーモセット由来サルリンパ球Ｂ９５−８（潜伏段階ＩＩＩ、細胞の３〜１０％が溶菌段階に特有の抗原を発現している））におけるＥＢＶマイクロＲＮＡ発現を確認した（図２Ｄ）。
【０１２４】
ＢＡＲＴマイクロＲＮＡは、全ての潜伏段階において検出され、ＥＢＶ感染の全段階の間、報告されているＢＡＲＴの発現と一致した。しかしながら、ＢＡＲＴマイクロＲＮＡ発現は、ウイルスを生産しているマーモセット細胞系においては１０倍多かった（図２Ｄ、レーン９、列５及び６）。これまでＢＡＲＴの異なるスプライシングされた転写物からコード化されるタンパク質を識別する試みが幾つかなされたが、この領域の機能はこれまで未解明であった。本発明は、ＢＡＲＴ領域の機能解析の一助となろう。
【０１２５】
ＢＨＲＦ１マイクロＲＮＡの発現パターンは、ＥＢＶの潜伏段階に依存している。段階ＩＩ及びＩＩＩの細胞系がＢＨＲＦ１マイクロＲＮＡ（図２Ｄ、レーン５−６）を発現している一方で、段階Ｉにある２つのうち一つの細胞系のみでＢＨＲＦ１マイクロＲＮＡ（図２Ｄ、レーン７、８）の発現が確認された。潜伏段階Ｉの細胞系は、ＥＢＮＡ１、ＥＢＥＲ及びＢＡＲＴのみを発現すると考えられる。
【０１２６】
段階ＩＩ細胞系での発現と同様に、潜伏段階Ｉにある一つの細胞系におけるＢＨＲＦ１領域に由来している転写物の発現は、公知の潜伏段階Ｉ／ＩＩ  Ｑｐプロモーター（図２Ａ）の上流に位置する新規な潜伏段階Ｉ／ＩＩプロモーターの存在が示唆される。潜伏段階Ｉの新規な細分化は、潜伏段階ＩにあるＢＨＲＦ１マイクロＲＮＡを発現する細胞系を識別するために用いられると考えられる。
【０１２７】
ＢＨＲＦ１タンパク質は溶菌段階においてのみ検出されるにも関わらず、潜伏段階でのＥＢＶの転写物の存在は、ＢＨＲＦ１領域がそれ以前に観察されることを物語るものである。また、ＢＨＲＦ１−１から３のマイクロＲＮＡは、ＢＨＲＦ１タンパク質とともに溶菌段階の間に発現されることが示唆される。溶菌サイクルの間のＢＨＲＦ１の高レベル転写は細胞マイクロＲＮＡ処理能力を上回り、未処理の転写物はその後翻訳されると考えられる。
【０１２８】
ＥＢＶマイクロＲＮＡの標的を決定するために、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａマイクロＲＮＡの標的の予測のために最近開発された計算方法を使用した（Ｅｎｒｉｇｈｔら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，２００３，５：ＲＩ，１）。ほぼ２０，０００の非冗長なヒト３’ＵＴＲ及びＥＢＶのゲノム配列について、潜在的マイクロＲＮＡ結合部位を検索した。遺伝子機能アノテーションが利用できた上位のヒットを、表１４にリストとして示す。大多数の予測された宿主細胞の標的は、ウイルスのマイクロＲＮＡのための一つ以上の結合部位を有し、更にこれらのほぼ５０％は、１又は幾つかの宿主細胞由来マイクロＲＮＡの標的とされる。多数のマイクロＲＮＡ結合部位は、相乗効果を発揮し、非線形相関的にターゲッティング効果を増加させると考えられる。
【０１２９】
（表１４から１６）：
ＥＢＶマイクロＲＮＡの標的となる宿主細胞のｍＲＮＡの標的の予測を示す。ＨＵＧＯによって推奨される遺伝子名を示し、遺伝子機能アノテーションはＥｎｓｅｍｂｌｅから抜粋した。標的遺伝子（ＮＳ）の３’ＵＴＲに存在するマイクロＲＮＡ結合部位の数、及び目的部位予測（パーセンタイル）をランク付けするパーセンタイルスコアを示す。また、ヒトマイクロＲＮＡが、推定のＥＢＶのマイクロＲＮＡに制御される標的と結合すると予測される場合、それは最後のカラムにおいて示される。ヒトマイクロＲＮＡ結合部位と予測される部位はまた、マウスのオーソログｍＲＮＡにおいて保存されている。
【表１４】
2008500817.tif 000016
【表１５】
2008500817.tif 000017
【表１６】
2008500817.tif 000018
【０１３０】
予測されたウイルスのマイクロＲＮＡ目標の幾つかは、細胞増殖及びアポトーシスの顕著なレギュレーターである。またそれは、感染した細胞の成長制御にとって重要であると考えられる。細胞増殖のマイクロＲＮＡ変調も、幾つかの悪性ガンとＥＢＶの関連を検討するための新規な手掛かりを提供する。他の重要なグループのＥＢＶマイクロＲＮＡ標的は、Ｂ細胞特異的ケモカイン及びサイトカインである。またそれは白血球の活性化及び／又は走化性にとって重要である。これらの遺伝子のダウンレギュレーションはおそらく、活性化した細胞障害性Ｔ細胞からＥＢＶ感染しているＢ細胞を回避させる機能を有するを考えられる。追加的な標的は、転写制御因子及びシグナル形質導入経路の構成要素を含み、それはＥＢＶの溶菌段階及び潜伏段階の間の維持又は切替えにとって重要である。
【実施例４】
【０１３１】
ＥＢＶによりコードされるマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−ＢＡＲＴ２は、ウイルスによりコードされるＤＮＡポリメラーゼＢＡＬＦ５を標的とする
ＥＢＶによりコードされるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−ＢＡＲＴ２）のうちの一つは、ウイルスによりコードされたＤＮＡポリメラーゼＢＡＬＦ５を低下させるための標的とすることができる（図３）。ｍｉＲ−ＢＡＲＴ２は、転写されたＢＡＬＦ５転写物のアンチセンスであり、したがって、ＢＡＬＦ５の３’ＵＴＲと完全に相補的であり、このｍＲＮＡを分解することが可能である。同様に、ｍｉＲＢＨＲＦ１−２及び３のクラスターは、溶解遺伝子ＢＦＬＦ２（図２Ａ）（機能が現在知られていない）をコードしている転写物と相補的である。ウイルスのマイクロＲＮＡによる溶解遺伝子のダウンレギュレーションは、潜伏感染の開始及び維持に関与すると考えられる。
【実施例５】
【０１３２】
ＫＳＨＶによりコードされるマイクロＲＮＡの同定
様々なリンパ腫のカポージ肉腫関連のヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）の機能は十分に解明されている。ＫＳＨＶマイクロＲＮＡを同定するために、潜在的にＫＳＨＶに感染している体腔ベースのリンパ腫（ＢＣＢＬ）細胞系から小分子ＲＮＡをクローニングした。合計の２１％まで（クローニングされた細胞マイクロＲＮＡの３４％）がクローニングされた小分子ＲＮＡであり、ＫＳＨＶ（表１７及び１８）に由来することを見出した。
【０１３３】
（表１７）：
配列アノテーションに基づき決定された、ＫＳＨＶに感染したヒト細胞系から調製される小分子ＲＮＡ  ｃＤＮＡライブラリーの組成（％）。アノテーションは、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＧｅｎＢａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ヒトｔＲＮＡ配列のデータセット（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ＧｔＲＤＢ／Ｈｓ／Ｈｓ−ｓｅｑｓ．ｈｔｍｌ）、ヒトの及びマウスのｓｎ／ｓｎｏＲＮＡ配列のデータセット（ｈｔｔｐ：／／ｍｂｃｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｍａｌｌＲＮＡ／Ｄａｔａｂａｓｅ）、マイクロＲＮＡのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｒｆａｍ／ｍｉｃｒｏＲＮＡ／）、マイクロＲＮＡの予測（３５）、及びＵＣＳＣからのＨＧ１６ヒトゲノムアセンブリのリピート要素アノテーション（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）からの情報に基づく。クローニングされた配列の総数は、表の最下行で括弧において示される。最高２つの変異の許容範囲でヒトゲノムに位置するが、特定のタイプを割り当てられなかった配列は、「Ｎｏｔ  ａｎｎｏｔａｔｅｄ」として分類された。ウイルスの配列のためのアノテーションは、ＫＳＨＶ  ＢＣ−Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ７５６９８）として公知のゲノム配列に基づく。
【表１７】
2008500817.tif 000019
【０１３４】
（表１８）：
ＫＳＨＶに由来する小分子ＲＮＡ配列。小分子ＲＮＡの配列の位置は、表１７において特定されるウイルスのゲノム配列と関連して与えられる。
【表１８】
2008500817.tif 000020
【０１３５】
大部分のＫＳＨＶ配列を一つ以上クローニングし、クローニングされたＲＮＡの側方に位置しているゲノム配列の分析により、マイクロＲＮＡ遺伝子に特有の折り返し構造が示唆された。前記ＫＳＨＶマイクロＲＮＡは１０の異なるｄｓＲＮＡ前駆体から生じ、全てＫＳＨＶゲノム（図４Ａ及び４Ｂ）の同一の領域においてクラスターを形成していることを確認した。
【０１３６】
ＫＳＨＶマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−Ｋ１からｍｉＲ−Ｋ１０と命名された。前記クラスターはＫａｐｏｓｉｎという名称のタンパク質をコード化しているＫ１２遺伝子のｍＲＮＡ内に位置していた。またそれは若干の発癌性を有するものである。興味深いことに、ｍｉＲ−Ｋ１は、Ｋ１２のコーディング配列中に位置する。これまでの報告では、Ｋ１２符号化配列領域は複雑であり、ＫａｐｏｓｉｎＡ、Ｂ及びＣ（図４Ａ）と呼ばれる幾つかのタンパク質をコードすることを示唆している。
【０１３７】
また、ｍｉＲ−Ｋ１において２つのアイソフォーム（すなわちｍｉＲ−Ｋ１ａ及びｍｉＲ−Ｋ１ｂ）を同定した。それらは位置２（表１９）において一つのヌクレオチドが異なる。ＭｉＲ−Ｋ１ａは、ＢＣＢＬ１細胞に存在するゲノム配列に対応する。ＭｉＲ−Ｋ１ｂは、原発性滲出性リンパ腫（ＰＥＬ）から単離された配列に由来すると考えられる。以上より、２つの異なるウイルスのゲノム又はそれに類するものは、ＢＣＢＬ１細胞系に存在していると考えられる。ＭｉＲ−Ｋ２からｍｉＲ−Ｋ１０は、Ｋ１２をコード化している長い転写物のイントロン領域に位置し、そのプロモーターはＯＲＦ７２（図４Ａ）の上流に位置する。
【０１３８】
更に、ＫＳＨＶのマイクロＲＮＡが溶菌サイクルの誘導に応じてそれぞれ制御されるか否かを解析した。ＢＣＢＬ１細胞は、複製可能なＫＳＨＶを保持する。ＴＰＡ処理により、これらの細胞ではＫＳＨＶ遺伝子発現の完全なプログラムが実行され、最終的にウイルスの複製及び成熟したビリオンの発散が行われる。
【０１３９】
ＴＰＡ処理以後の幾つかの時点で全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロットによってＫＳＨＶのマイクロＲＮＡの発現を確認した。ｍｉＲ−Ｋ１ａのみ発現が前記処理により誘導されたが、イントロン領域のマイクロＲＮＡ（例えばｍｉＲ−Ｋ６及びｍｉＲ−Ｋ７）は影響を受けなかった（図５）。これは、ｍｉＲ−Ｋ１ａとｍｉＲ−Ｋ２からＫ１０では、由来する一次転写物が異なることを示唆する（図４Ａ）。
【０１４０】
ＫＳＨＶのゲノムにおけるマイクロＲＮＡの同定は、ウイルスの発癌性特性を解明するための新規な手掛かりを提供する。
【０１４１】
（表１９）：
ＫＳＨＶのマイクロＲＮＡの成熟型及び前駆体型の配列を示す。それぞれ、太線は成熟型、下線は不機能、星印はｍｉＲ−Ｋ２及びｍｉＲ−Ｋ６としてクローニングされた部分を示す。
【表１９】
2008500817.tif 000021
【実施例６】
【０１４２】
ＨＣＭＶによりコードされたマイクロＲＮＡの同定
ＨＣＭＶは、β−ヘルペスウイルスファミリーのユビキタスメンバーである。それらは、通常健常な児童及び成人がＨＣＭＶに感染しても症状が現れないが、先天性欠損症の主要な原因及び免疫不全症による死亡の重要な原因として残存すると言われている。
【０１４３】
ＨＣＭＶ臨床株ＶＲ１８１４に感染したヒト包皮線維芽細胞を溶菌させ、小分子ＲＫＡをクローニングした。ＨＣＭＶ感染細胞内のウイルスゲノム由来の小分子ＲＮＡを４２４種類クローニングした。それらのうち、１７１の配列は、一度クローニングし、ゲノムの全体にわたって分散していた。その他の２５３の配列は複数回クローニングし、その側方に存在するゲノム配列の分析により、マイクロＲＮＡ（表２０及び２１、並びに図６）に特有の構造の存在が示唆された。
【０１４４】
４つのマイクロＲＮＡはゲノムのＵＬ領域に位置し、５つのものはＵＳ領域に由来していた。興味深いことに、５つのマイクロＲＮＡすなわちｍｉＲ−ＵＬ３、ｍｉＲ−ＵＬ４、ｍｉＲ−ＵＳ３、ｍｉＲ−ＵＳ４及びｍｉＲ−ＵＳ５は、周知のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）に相補的な鎖上において転写される（図６Ａ）。これらの５つのマイクロＲＮＡは、ＥＢＶのｍｉＲ−ＢＡＲＴ２及びＤＮＡポリメラーゼＢＡＬＦ５において前述したように、相補的な転写物の裂開に関係すると考えられる。ＵＬ１１４は、哺乳動物のウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼのホモログであり、効率的なウイルスのＤＮＡ複製のために必要となることが示された。ＵＬ１５０は、ＨＣＭＶの臨床株に存在するＯＲＦであり、実験室株には存在しない。
【０１４５】
その他の４つのマイクロＲＮＡは、遺伝子間領域（ｍｉＲ−ＵＬ１、ｍｉＲ−ＵＳ１及びｍｉＲ−ＵＳ２）において又はイントロンの領域（ｍｉＲ−ＵＬ２）において位置する。ｍｉＲ−ＵＬ２がＵＬ３６のイントロン上に位置するという知見は興味深い。なお、それはカスパーゼ−８の活性化を抑制する、アポトーシスのインヒビターと言われている。
【０１４６】
（表２０）
配列アノテーション（表１９）に基づく、ＨＣＭＶ感染しているヒト細胞系から調製した小分子ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーの組成（％）を示す。ウイルスの配列のアノテーションは、ＨＣＭＶ  ＦＩＸ−ＢＡＣ分離株ＶＲ１８１４（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ１４６９０７）に関する公知のゲノム配列に基づく。
【表２０】
2008500817.tif 000022
【０１４７】
（表２１）：
ＨＣＭＶのマイクロＲＮＡが成熟型及び前駆体型配列を示す。それぞれ、太線は成熟型、下線は不機能、星印はｍｉＲ−Ｋ２及びｍｉＲ−Ｋ６としてクローニングされた部分を示す。
【表２１】
2008500817.tif 000023
【０１４８】
完全に配列がアノテーションされた実験室株ＡＤ１６９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ００１３４７）を参照して位置を決定した。ｍｉＲ−ＵＬ４は、本発明で使用したＦＩＸ株とＡＤ１６９株との間で保存されていないの唯一でＨＣＭＶのマイクロＲＮＡである。ＵＬ１５０遺伝子の反対側に位置し、その前駆体は、公知のＨＣＭＶのＦＤＣ−ＢＡＣ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ１４６９０７）３４６３０−３４７０１（−）に対応する。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、本願明細書にて言及される修飾されたヌクレオチド単位を示す。Ｂは、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミン又はウリジン、のいずれか一つの核酸塩基を指す。
【図２Ａ】ＥＢＶは、マイクロＲＮＡを発現する。（Ａ）はＥＢＶゲノムのセグメントを含むマイクロＲＮＡの図である。潜在的な遺伝子を白い四角、溶解遺伝子を黒い四角、公知のノンコーディングＲＮＡを青、新しく同定されたマイクロＲＮＡを赤で示す。潜伏段階（Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ）にて活性なプロモーターは白いペナント、溶菌段階にて活性なプロモーターは黒いペナント、全ての段階で活性なプロモーターは灰色のペナントで示す。ＢＡＲＴ領域中のイントロンのセグメントは点線で、エキソンのセグメントは太い棒で示す。
【図２Ｂ】（Ｂ）は、ＥＢＶマイクロＲＮＡの予測される折畳み前駆体を示す。成熟したマイクロＲＮＡを赤で強調して示す。星印は、マイクロＲＮＡ−ＢＨＲＦ１−２鎖の反対側の鎖からクローニングされた低量の小分子ＲＮＡを示す。
【図２Ｃ】（Ｃ）は、感染してないＢＬ−４１、ＥＢＶ感染ＢＬ４１／９５（＋）細胞から単離された完全ＲＮＡを使用して行った、ＥＢＶマイクロＲＮＡのノーザンブロットの結果を示す。また、ヒトｍｉＲ−１６（表Ｓ１）の発現も参考のために解析した。成熟したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）及びその折畳み前駆体（ｍｉＲ−Ｌ）の移動の位置を示す。膜へのブロッティング前に、ゲルへのアプライ量が等しいことを、臭化エチジウム染色によるｔＲＮＡバンドのモニターにより確認した。
【図２Ｄ】（Ｄ）は、様々なホジキン及びバーキットリンパ腫細胞系から単離された完全ＲＮＡを使用した、ＥＢＶマイクロＲＮＡのノーザンブロットの結果を示す。ＥＢＶ陽性群の線における各サンプルにおける潜伏段階を括弧内に示す。ｍｉＲシグナルの下の数は、Ｕ６ｓｎＲＮＡシグナルを使用した、ゲルへのアプライの際に正常化した後のＢＬ４１／９５シグナルに対するシグナル強度を示す。
【図３】ｍｉＲ−ＢＡＲＴ２により誘導されるＢＡＬＦ５のｍＲＮＡの裂開の概略を示す。溶解遺伝子を黒い四角で、発現が見られなかった遺伝子を灰色（ＧｅｎＢａｎｋエントリー：ＶＯ１５５５）で示す。ｍｉＲ−ＢＡＲＴ２配列は、ヌクレオチド配列及びＢＡＬＦ５のｍＲＮＡのプロセシング部位との関係から位置づけられた。ＢＡＬＦ５のｍＲＮＡの予測裂開位置は、マップ化された３．７ｋｂプロセシング後の末端と同じであった。
【図４Ａ】ＫＳＨＶのマイクロＲＮＡのゲノム位置及び折り返し構造を示す。（Ａ）はＫＳＨＶマイクロＲＮＡのゲノム位置を示す。黒い矢印は、ヘルペスウイルスにおいて保存されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、白い矢印はユニークなＫＳＨＶのＯＲＦを示す。繰り返し領域を、ＯＲＦの上に小さい黒い長方形として示す。クローニングされたマイクロＲＮＡを点線で示す。Ｋ１２転写物のための２つのプロモーターを黒い矢印として、Ｋ１２の転写物を黒い線として、大きい転写物のイントロンの領域を破線として示す。厚い灰色の矢は、Ｋａｐｏｓｉｎタンパク質Ａ、Ｂ及びＣのＯＲＦを示す。
【図４Ｂ】（Ｂ）は、ＫＳＨＶのマイクロＲＮＡの折畳み前駆体を示す。クローニングされた成熟マイクロＲＮＡは、赤で強調される。
【図５】ＫＳＨＶのマイクロＲＮＡは、溶菌サイクルの誘導に対応して制御される。ＴＰＡ処理の後２４、４８及び７２時間における、ＫＳＨＶ陰性（ＢＪＡＢ）細胞系及びＢＣＢＬ１細胞から単離した全ＲＮＡを用いた、ＫＳＨＶのｍｉＲ−Ｋ１ａ、ｍｉＲ−Ｋ６及びｍｉＲ−Ｋ７に関するノーザンブロットの結果を示す。
【図６Ａ】ＨＣＭＶのマイクロＲＮＡのゲノム位置及び二次構造を示す。（Ａ）は、ＨＣＭＶゲノムのマイクロＲＮＡを含有するフラグメントの図である。終端の繰り返しを、灰色の四角及び三角として示す。クローニングされたマイクロＲＮＡを、赤い点線として示す。ゲノムの（＋）−鎖にコードされるマイクロＲＮＡを、ゲノムの上に示し、ゲノム（−）鎖に由来するそれを下に示す。矢印は、ウイルスのＯＲＦの方位を示す。
【図６Ｂ】（Ｂ）は、ＨＣＭＶのマイクロＲＮＡの予測された折り返し構造の前駆体を示す。クローニングされた成熟型マイクロＲＮＡを赤で強調する。星印は、ｍｉＲ−ＵＬ１の鎖と反対側の鎖からクローニングされた低量の小分子ＲＮＡを強調するために用いた。
【図１】
2008500817.tif 000024
【図２Ａ】
2008500817.tif 000025
【図２Ｂ】
2008500817.tif 000026
【図２Ｃ】
2008500817.tif 000027
【図２Ｄ】
2008500817.tif 000028
【図３】
2008500817.tif 000029
【図４Ａ】
2008500817.tif 000030
【図４Ｂ】
2008500817.tif 000031
【図５】
2008500817.tif 000032
【図６Ａ】
2008500817.tif 000033
【図６Ｂ】
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