(57)【要約】  本明細書において記載するように乾燥および凝集された、ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる生成物、本発明の生成物または組成物を含んでなる種々の組成物および物品、本発明の生成物を製造する方法、およびそれらの使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
噴霧乾燥および凝集されたヒアルロン酸またはその塩を含んでなる生成物。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸またはその塩が、好ましくはグラム陽性細菌、より好ましくはバシラス (Bacillus) 属の細菌により、組換え的に産生されている、請求項1に記載の生成物。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸またはその塩が300,000〜3,000,000、好ましくは400,000〜2,500,000、より好ましくは500,000〜2,000,000、最も好ましくは600,000〜1,800,000の範囲の分子量を有する、請求項1または2に記載の生成物。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸またはその塩が10,000〜800,000 Da、好ましくは20,000〜600,000 Da、より好ましくは30,000〜500,000 Da、なおより好ましくは40,000〜400,000 Da、最も好ましくは50,000〜300,000 Daの範囲の低平均分子量を有する、請求項1または2に記載の生成物。
【請求項５】
ヒアルロン酸の無機塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛またはヒアルロン酸コバルトを含んでなる、請求項1〜4のいずれかに記載の生成物。
【請求項６】
架橋したヒアルロン酸またはその塩、好ましくはホウ酸と架橋したヒアルロン酸またはその塩を含んでなり、より好ましくは架橋したヒアルロン酸がボレートエステルを含んでなる、請求項1〜5のいずれかに記載の生成物。
【請求項７】
ここにおいて決定して、5%より低い湿分、好ましくは2%より低い湿分、最も好ましくは1%より低い湿分を含んでなる、請求項1〜6のいずれかに記載の生成物。
【請求項８】
イソプロパノール中に懸濁させた粒子のレーザー回折測定により決定して、粒度の50百分位D50が10〜1,000ミクロン、好ましくは100〜1,000ミクロン、より好ましくは150〜900ミクロン、なおより好ましくは200〜800ミクロンである粒度を有する、請求項1〜7のいずれかに記載の生成物。
【請求項９】
ここにおいて決定して、水性溶媒中で30分より短い、好ましくは20分より短い、より好ましくは15分より短い、より好ましくは10分より短い、より好ましくは5分より短い、より好ましくは3分より短い、より好ましくは2分より短い、最も好ましくは1分より短い分散性を有する、請求項1〜8のいずれかに記載の生成物。
【請求項１０】
ここにおいて決定して、水性溶媒中で60分より短い、好ましくは45分より短い、より好ましくは40分より短い、なおより好ましくは35分、30分、25分、20分、15分、10分より短い、最も好ましくは5分より短い溶解性を有する、請求項1〜9のいずれかに記載の生成物。
【請求項１１】
活性成分をさらに含んでなる、請求項1〜10のいずれかに記載の生成物。
【請求項１２】
前記活性成分が薬学上許容される物質である、請求項11に記載の生成物。
【請求項１３】
水溶性賦形剤、好ましくはラクトースをさらに含んでなる、請求項1〜12のいずれかに記載の生成物。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれかに記載の生成物と、活性成分とを含んでなり、好ましくは活性成分が薬理学的活性剤である、組成物。
【請求項１５】
水溶性賦形剤、好ましくはラクトースをさらに含んでなる、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
薬学上許容される担体、賦形剤または希釈剤と一緒に、有効量の請求項1〜13のいずれかに記載の生成物を含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
薬理学的活性剤と一緒に、ベヒクルとして有効量の請求項1〜13のいずれかに記載の生成物を含んでなる医薬組成物。
【請求項１８】
活性成分として有効量の請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物を含んでなる化粧品。
【請求項１９】
請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物を含んでなる衛生、医学的または外科的物品、好ましくはおむつ、衛生タオル、外科用スポンジ、創傷治癒スポンジ、またはバンドエイドまたは他の創傷包帯材料中に含まれる部分。
【請求項２０】
請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物を含んでなる薬剤のカプセルまたはマイクロカプセル。
【請求項２１】
下記の工程を含んでなる、ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる噴霧乾燥および凝集された生成物を製造する方法:
a)   ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる生成物を噴霧乾燥し、そして
b)   噴霧乾燥した生成物を凝集させる。
【請求項２２】
前記ヒアルロン酸またはその塩が、好ましくはグラム陽性細菌、より好ましくはバシラス (Bacillus) 属の細菌により、組換え的に産生されている、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒアルロン酸またはその塩が300,000〜3,000,000、好ましくは400,000〜2,500,000、より好ましくは500,000〜2,000,000、最も好ましくは600,000〜1,800,000の範囲の分子量を有する、請求項21または22に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒアルロン酸またはその塩が10,000〜800,000 Da、好ましくは20,000〜600,000 Da、より好ましくは30,000〜500,000 Da、なおより好ましくは40,000〜400,000 Da、最も好ましくは50,000〜300,000 Daの範囲の低平均分子量を有する、請求項21または22に記載の方法。
【請求項２５】
ヒアルロン酸の無機塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛またはヒアルロン酸コバルトを含んでなる、請求項21〜24のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
架橋したヒアルロン酸またはその塩、好ましくはホウ酸と架橋したヒアルロン酸またはその塩を含んでなり、より好ましくは架橋したヒアルロン酸がボレートエステルを含んでなる、請求項21〜25のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
噴霧乾燥器またはロータリーアトマイザー、好ましくは2流体ノズル (TFN) 噴霧乾燥器を使用して乾燥工程を実施する、請求項21〜26のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
TFN噴霧乾燥器および下記の条件範囲を使用して噴霧乾燥を実施する、請求項27に記載の方法:
入口温度:                    100〜200℃
出口温度:                     40〜 90℃
ノズル噴霧化圧力:              2〜 10バール
ノズル空気温度:               40〜100℃
供給温度:                     40〜100℃
【請求項２９】
流動床を使用して凝集工程を実施する、請求項21〜28のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
流動床入口温度が30〜80℃の範囲であり、そして粉末の水溶液を25〜50℃の出口温度に対応する速度で乾燥した粉末上に噴霧する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
好ましくは0:100〜50:50の水:溶媒比、より好ましくは0:100〜20:80の水:溶媒比を有する、水-溶媒混合物を使用して凝集工程を実施する、請求項21〜28のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記溶媒がアルコール、好ましくはイソプロパノールである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
噴霧乾燥工程および凝集工程を1工程で、好ましくは流動化噴霧乾燥器を使用して実施する、請求項21〜30のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
眼科における手順を実施する方法において、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項３５】
骨関節炎の治療を実施する方法において、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項３６】
癌の治療を実施する方法において、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項３７】
薬理学的活性剤の経皮的投与を実施する方法において、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項３８】
薬理学的活性剤の皮膚への投与を実施する方法において、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項３９】
化粧品の皮膚への投与を実施する方法において、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項４０】
毛髪の喪失または禿頭症の治療を実施する方法において、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項４１】
請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物を使用する眼科の方法。
【請求項４２】
有効量の請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物を哺乳動物に、好ましくは皮膚に、経皮的に、経口的にまたは注射により、投与することを含んでなる、骨関節炎を治療する方法。
【請求項４３】
有効量の請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物を投与することを含んでなる、創傷を治療する方法。
【請求項４４】
有効量の請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物を哺乳動物に、好ましくは皮膚に、経皮的に、経口的にまたは注射により、投与することを含んでなる、毛髪の喪失または禿頭症の治療を実施する方法。
【請求項４５】
骨関節炎を治療する薬剤を製造するための、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項４６】
眼科の治療に使用する薬剤を製造するための、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項４７】
癌を治療する薬剤を製造するための、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項４８】
創傷を治療する薬剤を製造するための、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項４９】
脈管形成の薬剤を製造するための、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項５０】
モイシュチャライザーを製造するための、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項５１】
毛髪の喪失または禿頭症を治療する薬剤を製造するための、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる乾燥および凝集された生成物、ならびに本発明の生成物または組成物を含んでなる種々の組成物および物品、本発明の生成物を製造する方法、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
体の最も豊富なヘテロ多糖はグリコサミノグルカンである。グリコサミノグルカンは非分枝鎖状ポリマーであり、反復二糖単位から成る (ケラタン硫酸のみは炭水化物のコア領域において分枝鎖状である) 。一般に、二糖単位は、第1糖単位として、2つの変性された糖 - N-アセチルガラクトサミン (GalNAc) またはN-アセチルグルコサミン (GlcNAc) の1つを含んでなる。通常、第2 単位はウロン酸、例えば、グルクロン酸 (GlcUA) またはイズロネートである。
【０００３】
グリコサミノグルカンは負に帯電した分子であり、そして溶液中で高い粘度を付与する、拡張したコンフォメーションを有する。グリコサミノグルカンは、主として細胞表面上にまたは細胞外細胞間質中に位置する。また、グリコサミノグルカンは溶液中で低い圧縮性を有し、その結果、生理学的潤滑流体、例えば、関節として理想的である。グリコサミノグルカンの剛性は細胞に構造的完全性を提供し、そして細胞間の通路を提供し、細胞の移動を可能とする。最高の生理学的重要性を有するグリコサミノグルカンは、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸およびケラタン硫酸である。大部分のグリコサミノグルカンは、特異的オリゴ糖構造を通して、プロテオグリカンコアタンパク質に共有結合している。ヒアウロナンはある種のプロテオグリカンと大きい凝集物を形成するが、遊離炭水化物鎖がプロテオグリカンと非共有結合複合体を形成するので、例外である。
【０００４】
体におけるヒアウロナンの多数の役割が同定されてきている (参照、Laurent T. C. およびFraser J. R. E.、1992、FASEB J. 6: 2397-2404およびToole B. P.、1991、“Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and dfferentiation.”In: Cell Biology of the Extracellular Matrix、pp. 305-341、Hay E. D. 編、Plenum、New York) 。ヒアウロナンはヒアリン軟骨、滑膜性連結流体および皮膚組織、真皮および表皮の両方中に存在する。また、ヒアウロナンは多数の生理学的機能、例えば、接着、発育、細胞致死性、癌、脈管形成および創傷治癒においてある役割を有することが推測される。ヒアウロナンの独特の物理的および生物学的性質のために、それは眼および関節の外科手術において使用され、そして他の医学的手順において評価されている。
【０００５】
用語 「ヒアウロナン」 または 「ヒアルロン酸」 は、細胞表面中に、脊椎動物の結合組織の基本的細胞外物質中に、関節の滑液中に、眼の球内流体中に、ヒトの臍帯中におよび鶏冠中に天然に存在する、D-グルクロン酸およびN-アセチル- D-グルコサミン酸の残基により構築された、異なる分子量を有する酸性多糖を意味するために文献において使用されている。
【０００６】
用語 「ヒアルロン酸」 は、事実、通常変化する分子量を有するD-グルクロン酸およびN-アセチル- D-グルコサミン酸の交互する残基を有する多糖の全系列、またはその分解した形態を意味するとして使用され、したがって 「ヒアルロン酸類」 という複数の用語を使用することがいっそう正しいように思われる。しかしながら、単数の用語はこの説明において全く同じに使用されるであろう; さらに、略号 「HA」 はこの集合的用語の代わりにしばしば使用されるであろう。
【０００７】
HAは多数の組織の細胞のための機械的支持体、例えば、皮膚、腱、筋肉および軟骨として、生物学的生体において重要な役割を演じ、それは細胞間質の主成分である。また、HAは生物学的プロセス、例えば、組織の加湿および潤滑において重要な部分を演ずる。
HAは前述の天然の組織から抽出されるが、今日それを微生物学的方法により製造して、感染因子が移動する危険を最小にし、かつ生成物の均一性、品質および利用可能性を増加させることが好ましい。
【０００８】
HAおよびその種々の分子サイズの画分およびそれらのそれぞれの塩は、薬剤として、ことに関節症の治療において、天然の器官および組織の補助因子および/または代替因子として、および化粧品中の因子として使用されてきている。また、ヒアウロナンの生成物は、整形外科学、リウマチ学および皮膚科学において使用するために開発されてきている。
また、HAは衛生および外科的物品のために使用する種々のポリマー物質、例えば、ポリウレタン、ポリエステルおよびその他のための、これらの物質を生物適合性とする作用を有する、添加物として使用することができる。
【０００９】
ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる水溶性ゲル形成物質はよく知られており、そして健康管理セクターにおいて、例えば、眼科において、骨関節炎の治療において、ならびに薬学的および化粧品産業において広く使用される。これらの物質は理想的には乾燥した形態で販売され、輸送され、そして貯蔵される。しかしながら、ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる乾燥した生成物は周知ようにゆっくり溶解する。
【００１０】
乾燥したHA-生成物が完全に溶解するために要する時間は、ことに健康管理の産業において、重要なパラメーターであり、したがって全溶解時間、すなわち、乾燥したHA生成物を分散させ、可溶化するために要する時間を最小とすることはかなりの重要性を有する。本発明は、ヒアルロン酸またはその塩の高速溶解生成物、および同様な水溶性ゲル形成物質を製造するために有効である。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要約
本発明が解明すべき問題は、高度に水溶性の乾燥したHA生成物を提供する方法である。
本発明は、乾燥したHA生成物の凝集が生成物の溶解性を改良し、こうして水性溶媒、好ましくは水または生理的食塩水中の非常に速い溶解を達成することを示す。
したがって、第1の面において、本発明は、乾燥し、凝集した、好ましくはここにおいて定義したように乾燥し、凝集した、ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる生成物に関する。
【００１２】
第2の面において、本発明は、第1の面において規定した生成物、および活性成分、好ましくは薬理学的活性剤を含んでなる組成物に関する。
第3の面において、本発明は、薬学上許容される担体、賦形剤または希釈剤と一緒に、有効量の第1の面において規定した生成物を含んでなる医薬組成物に関する。
第4の面において、本発明は、薬理学的活性剤と一緒に、ベヒクルとして有効量の第1の面において規定した生成物を含んでなる医薬組成物に関する。
第5の面において、本発明は、活性成分として有効量の第1の面において規定した生成物または第2 、第3または第4の面において規定した組成物を含んでなる化粧品に関する。
【００１３】
第6の面において、本発明は、活性成分として有効量の第1の面において規定した生成物または第2 、第3または第4の面において規定した組成物を含んでなる衛生、医学的または外科的物品、好ましくはおむつ、衛生タオル、外科用スポンジ、創傷治癒スポンジ、またはバンドエイドまたは他の創傷包帯材料中に含まれる部分に関する。
重要な面において、本発明は、活性成分として有効量の第1の面において規定した生成物または第2 、第3または第4の面において規定した組成物を含んでなる薬剤のカプセルまたはマイクロカプセルに関する。
【００１４】
他の重要な面において、本発明は、下記の工程を含んでなる、ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる乾燥および凝集した生成物を製造する方法に関する:
a)   ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる生成物を乾燥し、そして
b)   乾燥した生成物を凝集させる。
最後の面において、本発明は、眼科における手順を実行する方法、骨関節炎または癌、毛髪の喪失または禿頭症を治療する方法、創傷を治療する方法、薬理学的活性剤の皮膚への投与または経皮的投与を実行する方法、または化粧品の皮膚への投与を実行する方法において、活性成分として有効量の第1の面において規定した生成物または第2 、第3または第4の面において規定した組成物を使用することを含んでなる改良に関する。
【００１５】
多数の面において、本発明は、骨関節炎、癌の治療用薬剤、眼科の治療用薬剤、創傷の治療用薬剤、脈管形成の薬剤、毛髪の喪失または禿頭症の治療用薬剤、またはモイシュチャライザーの製造における、請求項1〜13のいずれかに記載の生成物または請求項14〜17のいずれかに記載の組成物の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
定義
核酸構築物
「核酸構築物」 は、一本鎖または二本鎖の核酸分子として本明細書において定義され、これは天然に存在する遺伝子から単離されるか、あるいはそうでなければ天然に存在しない方法で組合わされかつ並置された核酸のセグメントを含有するように修飾されている。用語 「核酸構築物」 は、核酸構築物がコード配列の発現に必要なすべての制御配列を含有するとき、用語 「発現カセット」 と同義である。
【００１７】
用語 「コード配列」 は、後述される制御配列の制御下に配置されたとき、mRNAに転写され、問題の酵素に翻訳される配列として本明細書において定義される。一般に、コード配列の境界は、mRNAの5’末端におけるオープンリーディングフレームから直ぐ上流に位置するリボソーム結合部位およびmRNAの3’末端におけるオープンリーディングフレームの直ぐ下流に位置する転写停止配列により決定される。コード配列は、DNA、cDNAおよび組換え核酸配列を包含するが、これらに限定されない。
【００１８】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離またはクローニングするために使用する技術は、この分野においてよく知られており、そして、例えば、ゲノムDNAからの単離、cDNAからの製造、またはそれらの組み合わせを包含する。このようなゲノムDNAからの核酸配列のクローニングは、例えば、共有する構造的特徴を有するクローニングされたDNAフラグメントを検出する発現ライブラリーの抗体スクローニングまたはよく知られているポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を使用することによって、実施することができる。例えば、下記の文献を参照のこと: Innis 他、1990、PCR Protocols:  A Guide to Methods and Applications、Academic Press、 New York。
【００１９】
他の核酸増幅手順、例えば、リガーゼ連鎖反応、結合活性化転写、および核酸配列に基づく増幅を使用することができる。クローニング手順は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる必要な核酸フラグメントの切除および単離、ベクター分子中の前記フラグメントの挿入、および核酸配列のクローンを複製させるバシラス (Bacillus) 細胞中の組換えベクターの組込みを包含する。核酸配列はゲノムDNA、cDNA、RNA、半合成、合成由来、またはそれらの任意の組み合わせであることができる。
【００２０】
酵素をコードする単離された核酸配列を種々の方法で操作して、発現を発現させる。構築物またはベクター中に挿入する前に核酸配列を操作することは、発現ベクターまたはバシラス (Bacillus) 宿主細胞に依存して望ましいか、あるいは必要であることがある。クローニング法を利用して核酸配列を修飾する技術は、この分野においてよく知られている。また、この分野においてよく知られている方法を使用して、核酸配列を宿主細胞中でin vivo操作することができることが理解されるであろう。
【００２１】
多数の酵素がヒアルロン酸の生合成に関係する。これらの酵素は下記のものを包含する: ヒアウロナンシンターゼ、UDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ、UDP-グルコースピロホスホリラーセ、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーセ、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、アミドトランスフェラーゼ、ムターゼおよびアセチルトランスフェラーゼ。ヒアウロナンシンターゼは、ヒアルロン酸の製造において主要な酵素である。
【００２２】
「ヒアウロナンシンターゼ」 は、ここにおいてGlcUAおよびGlcNAc糖前駆体の付加によりヒアウロナン連鎖の伸長を触媒するシンターゼであると定義される。ストレプトコッカルヒアウロナンシンターゼ、脊椎動物ヒアウロナンシンターゼおよびウイルスヒアウロナンシンターゼのアミノ酸配列は、パステウレラ (Pasteurella) ヒアウロナンシンターゼと区別され、そしてグループIおよびグループIIのヒアウロナンシンターゼとして分類するために提案され、グループIのヒアウロナンシンターゼはストレプトコッカルヒアウロナンシンターゼを包含する (DeAngelis、1999) 。バシラス (Bacillus) 宿主細胞中でヒアウロナンを産生するためには、真核生物由来のヒアウロナンシンターゼ、例えば、哺乳動物のヒアウロナンシンターゼは好ましさに劣る。
【００２３】
ヒアウロナンシンターゼをコードする配列は、バシラス (Bacillus) 宿主細胞中で発現することができる任意の核酸配列であることができる。核酸配列は任意の由来であることができる。好ましいヒアウロナンシンターゼ遺伝子は、グループIまたはグループIIのいずれかを包含し、例えば、ストレプトコッカス・エクイシミリス (Streptococcus equisimilis) 、ストレプトコッカス・ピオゲネス［化膿レンサ球菌］(Streptococcus pyogenes) 、ストレプトコッカス・ウベリス (Streptococcus uberis) およびストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi) サブグループズーエピデミカス (zooepidemicus) からのグループIのヒアウロナンシンターゼ遺伝子、またはパステウレラ・マルトシダ (Pasteurella multocida) のグループIIのヒアウロナンシンターゼ遺伝子を包含する。
【００２４】
ヒアウロナンの前駆体糖が宿主細胞に供給される構築物は、培地に対して、またはバシラス (Bacillus) 宿主細胞中で内因的遺伝子、非内因的遺伝子または内因的遺伝子と非内因的遺伝子との組合わせによりコードされることによって、本発明のHAを産生することにおいて好ましい。前駆体糖はD-グルクロン酸またはN-アセチル-グルコサミンであることができる。
【００２５】
本発明の方法において、核酸構築物はヒアウロナンの前駆体糖の生合成における酵素をコードする1または2以上の遺伝子をさらに含んでなることができる。選択的に、バシラス (Bacillus) 宿主細胞は、前駆体糖の生合成における酵素をコードする1または2以上の遺伝子を含んでなる1または2以上の第2 核酸構築物をさらに含んでなることができる。ヒアウロナンの前駆体糖の生合成経路におけるある段階を指令する1または2以上の遺伝子をコードする1または2以上の核酸配列を有する構築物を使用することによって、ヒアウロナン産生は改良される。 「ヒアウロナンの前駆体糖の生合成経路におけるある段階を指令する」 とは、遺伝子の発現されたタンパク質がN-アセチル-グルコサミンまたはD-ガラクツロン酸の生成、またはN-アセチルグルコサミンおよびD-グルクロン酸のいずれかの前駆体である糖の生成において活性であることを意味する。
【００２６】
前駆体糖を供給する好ましい方法において、ヒアウロナンの前駆体糖の生合成経路におけるある段階を指令する遺伝子をコードする核酸配列に作用可能に連鎖された異質プロモーター領域をもつ、組換え構築物を有する宿主細胞を培養することによって、ヒアウロナンシンターゼを有する宿主細胞におけるヒアウロナン産生を改良する構築物が提供される。好ましい方法において、宿主細胞は、また、ヒアウロナンシンターゼに作用可能に連鎖されたプロモーター領域を有する組換え構築物を含んでなり、N-アセチル-グルコサミンの生合成に関係するシンターゼに対する核酸配列と同一であるか、あるいは異なるプロモーター領域を使用することができる。それ以上の好ましい態様において、宿主細胞は、ヒアウロナンの前駆体糖の生合成に関係する第2 遺伝子をコードする異なる核酸配列に作用可能に連鎖された、プロモーター領域をもつ組換え構築物を有することができる。
【００２７】
こうして、本発明は、また、ヒアウロナンの前駆体糖の生合成経路におけるある段階を指令する遺伝子をコードする核酸配列をもつ構築物を使用することによって、ヒアウロナン産生を改良する構築物に関する。ヒアウロナンシンターゼをコードする核酸配列と同一であるか、あるいは異なるプロモーターから、前駆体糖に対する核酸配列を発現させることができる。
【００２８】
ヒアルロン酸の産生のための前駆体糖の生合成に関係する遺伝子は下記のものを包含する: UDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ遺伝子、UDP-グルコースピロホスホリラーセ遺伝子、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーセ遺伝子、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子、ホスホグルコムターゼ遺伝子、アミドトランスフェラーゼ遺伝子、ムターゼ遺伝子およびアセチルトランスフェラーゼ。
【００２９】
ヒアウロナンシンターゼを含有する細胞において、hasB、hasCおよびhasD、またはそれらの相同体、例えば、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) のそれぞれtuaD、gtaBおよびgcaDの任意の1つまたは2またはそれ以上の組合わせ、ならびにhasEを発現させて、ヒアウロナンシンターゼに利用可能な前駆体糖のプールを増加させることができる。バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) のゲノムは下記の文献に記載されている: Kunst 他、Nature 390、249-256、“The complete sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis” (20 November 1997) 。ある場合、例えば、宿主細胞が天然のヒアウロナンシンターゼ活性をもたない場合において、構築物はhasA遺伝子を含むことができる。
【００３０】
生合成酵素をコードする核酸配列は宿主細胞に対して自然であることができるが、他の場合において、異種配列を利用することができる。2またはそれ以上の遺伝子が発現される場合、それらは天然のオペロン中で互いに関連する遺伝子、例えば、hasA、hasB、hasCおよびhasDを含んでなる、ストレプトコッカス・エクイシミリス (Streptococcus equisimilis) のHASオペロンの遺伝子であることができる。他の場合において、含まれるオペロンの各要素をもたない、前駆体遺伝子配列のいくつかの組合わせを使用することが望ましいことがある。他の場合において、宿主細胞に対して自然であるいくつかの遺伝子、および外因的である他の遺伝子を使用することが好ましいことがある。選択は、所定の宿主細胞における糖の入手可能なプール、宿主細胞の他の機能を妨害しないで過剰産生を受け入れる細胞の能力、および細胞が外因的遺伝子と異なる、その天然の遺伝子からの発現を調節するかどうかに依存するであろう。
【００３１】
1つの例として、細胞の代謝必要条件および増殖条件、および入手可能な前駆体糖のプールに依存して、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーセをコードする核酸配列、例えば、hasD遺伝子、バシラス (Bacillus) gcaD、およびそれらの相同体の発現によるN-アセチル-グルコサミンの産生を増加させることが望ましいことがある。選択的に、前駆体糖はD-グルクロン酸であることができる。1つのこのような態様において、このような核酸配列はUDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼをコードする。
【００３２】
このような核酸配列は、バシラス (Bacillus) のtuaD遺伝子、ストレプトコッカス (Streptococus) のhasB遺伝子、およびそれらの相同体を包含する。また、核酸配列は、例えば、バシラス (Bacillus) のgtaB遺伝子、ストレプトコッカス (Streptococus) のhasC遺伝子、およびそれらの相同体において、UDP-グルコースピロホスホリラーセをコードすることができる。本発明の方法において、UDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ遺伝子は、hasB遺伝子またはtuaD遺伝子、またはそれらの相同体であることができる。
【００３３】
本発明において、ヒアウロナンシンターゼ遺伝子および前駆体糖をコードする1または2以上の遺伝子は、同一プロモーターの制御下にあることが考えられる。選択的に、前駆体糖をコードする1または2以上の遺伝子は、ヒアウロナンシンターゼ遺伝子を推進する異なるプロモータを除いて、同一プロモーターの制御下にある。他の別法において、ヒアウロナンシンターゼ遺伝子および前駆体糖をコードする遺伝子の各々は異なるプロモータの制御下にある。好ましい態様において、ヒアウロナンシンターゼ遺伝子および前駆体糖をコードする1または2以上の遺伝子は同一プロモーターの制御下にある。
【００３４】
本発明は、また、ヒアウロナンシンターゼ遺伝子およびUDP-グルコース6-デヒドロゲナーゼ遺伝子、および必要に応じてUDP-グルコースピロホスホリラーセ遺伝子、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーセ遺伝子およびグルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ遺伝子から成る群から選択される1または2以上の遺伝子を含んでなる、ヒアウロナンシンターゼオペロンをコードする単離された核酸配列を含んでなる核酸構築物に関する。
【００３５】
ある場合において、宿主細胞は、ヒアウロナンの前駆体糖の生合成経路におけるある段階を指令する遺伝子をコードする核酸配列に作用可能に連鎖された、異質プロモーター領域をもつ組換え構築物を有し、前記合成は組換え構築物からのヒアウロナンシンターゼの発現と共同することができる。ヒアウロナンシンターゼは、前駆体の生合成に関係する酵素をコードする核酸配列と同一であるか、あるいは異なるプロモーター領域から発現させることができる。他の好ましい態様において、宿主細胞は、ヒアウロナンの前駆体糖の合成に関係する第2 遺伝子をコードする異なる核酸配列に作用可能に連鎖されたプロモーター領域をもつ組換え構築物を有することができる。
【００３６】
1または2以上の前駆体糖の生合成に関係する酵素をコードする核酸配列を、ヒアウロナンシンターゼをコードする核酸配列と同一であるか、あるいは異なるプロモータから発現させることができる。前者意味において、 「人工的オペロン」 を構築することができ、これは各hasA、hasB、hasCおよびhasD、またはそれらの相同体を有することにおいてストレプトコッカス・エクイシミリス (Streptococcus equisimilis) のオペロンに模倣することができるか、あるいは、選択的に、ストレプトコッカス・エクイシミリス (Streptococcus equisimilis) オペロン中に存在する全部より少ない補体を利用することができる。
【００３７】
また、 「人工的オペロン」 は、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ遺伝子 (hasE) ならびにヘキソキナーゼ遺伝子、ホスホグルコムターゼ遺伝子、アミドトランスフェラーゼ遺伝子、ムターゼ遺伝子およびアセチルトランスフェラーゼ遺伝子から成る群から選択される1または2以上の遺伝子を含んでなることができる。人工的オペロンにおいて、要素の少なくとも1つは要素の他の1つに対して異質であり、例えば、プロモーター領域はエンコード配列に対して異質である。
【００３８】
好ましい態様において、核酸構築物はhasA、tuaDおよびgtaBを含んでなる。他の好ましい態様において、核酸構築物はhasA、tuaD、gtaBおよびgcaDを含んでなる。他の好ましい態様において、核酸構築物はhasAおよびtuaDを含んでなる。他の好ましい態様において、核酸構築物はhasAを含んでなる。他の好ましい態様において、核酸構築物はhasA、tuaD、gtaB、gcaDおよびhasEを含んでなる。他の好ましい態様において、核酸構築物はhasA、hasB、hasCおよびgcaDを含んでなる。他の好ましい態様において、核酸構築物はhasA、hasB、hasC、hasDおよびhasEを含んでなる。前述の好ましい構築物に基づいて、言及した遺伝子をその相同体と置換することができる。
【００３９】
本発明の方法において、核酸構築物は、ヒアウロナンシンターゼをコードする配列に対して外来性であるプロモーター配列に作用可能に連鎖された、ヒアウロナンシンターゼをコードする配列を含んでなる。プロモーター配列は、例えば、単一プロモータまたは縦列プロモータであることができる。
【００４０】
「プロモータ」は、ここにおいて、遺伝子の転写を開始するRNAポリメラーゼの結合に関係する核酸配列として定義される。 「縦列プロモータ」 は、ここにおいて、各々がコード配列に作用可能に連鎖されており、そしてコード配列のmRNAへの転写を仲介する、2またはそれ以上のプロモーター配列として定義される。 「作用可能に連鎖された」 は、ここにおいて、制御配列、例えば、プロモーター配列がコード配列によりコードされるポリペプチドの産生を指令ように、コード配列に関係する位置に適当に配置されている立体配置として定義される。
【００４１】
前述したように、 「コード配列」 は、ここにおいて、適当な制御配列の制御下に配置されたとき、mRNAに転写され、ポリペプチドに翻訳される核酸配列として定義される。一般に、コード配列の境界は、mRNAの5’末端におけるオープンリーディングフレームの直ぐ上流に位置するリボソーム結合部位、およびmRNAの3’末端におけるオープンリーディングフレームの直ぐ下流に位置する転写停止配列により決定される。コード配列は、ゲノムDNA、cDNA、半合成、合成および組換え核酸配列を包含するが、これらに限定されない。
【００４２】
好ましい態様において、プロモーター配列は細菌源から得ることができる。より好ましい態様において、プロモーター配列は下記から得ることができる: グラム陽性細菌、例えば、バシラス (Bacillus) 株、例えば、バシラス・アガラドヘレンス (Bacillus agaradhaerens) 、バシラス・アルカロフィラス (Bacillus alkalophilus) 、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) 、バシラス・ブレビス (Bacillus brevis) 、バシラス・サーキュラン (Bacillus circulans) 、バシラス・クラウシイ (Bacillus clausii) 、バシラス・コアギュランス (Bacillus coagulans) 、バシラス・フィルムス (Bacillus firmus) 、バシラス・ラウツス (Bacillus lautus) 、バシラス・レンツス (Bacillus lentus) 、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) 、バシラス・メガテリウム (Bacillus megaterium) 、バシラス・ピュミルス (Bacillus pumilus) 、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) またはバシラス・スリンジェンシス (Bacillus thuringiensis) ; またはストレプトマイセス (Streptomyces) 株、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス (Streptomyces lividans) またはストレプトマイセス・ムリヌス (Streptomyces murinus) ; またはグラム陰性細菌、例えば、大腸菌 (E. coli) またはシュードモナス (Pseudomonas) 種。
【００４３】
本発明の方法における核酸配列の転写を指令するために適当なプロモータの例は、下記から得られるプロモータである: 大腸菌 (E. coli) lacオペロン、ストレプトマイセス・ケリコロル (Streptomyces coelicolor) アガロース遺伝子 (dagA) 、バシラス・レンツス (Bacillus lentus) またはバシラス・クラウシイ (Bacillus clausii) アルカリ性プロテアーゼ遺伝子(aprH) 、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) アルカリ性プロテアーゼ遺伝子 (スブチリシンCarlsberg遺伝子) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) レバンスクラーゼ遺伝子 (sacB) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) α-アミラーゼ遺伝子 (amyE) 、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) α-アミラーゼ遺伝子 (amyL) 、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) マルトジェニックアミラーゼ遺伝子 (amyM) 、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) α-アミラーゼ遺伝子 (amyQ) 、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) ペニシリナーゼ遺伝子 (penP) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) xylAおよびxylB遺伝子、バシラス・スリンジェンシス (Bacillus thuringiensis) 亜種テネブリオニス (tenebrionis) CryIIIA遺伝子 (cryIIIA) またはその一部分、原核生物のβ-ラクタマーゼ遺伝子 (Villa-Kamaroff 他、1978、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731) 。他の例は、spo 1細菌ファージプロモータおよびtacプロモータである (DeBoer他、1983、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25) 。
【００４４】
それ以上のプロモータは下記の文献に記載されている: “Useful proteins from recombinant bacteria” in Scientific American、1980、242: 74-94およびSambrook、FritschおよびManiatis、1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor、New York。
【００４５】
また、プロモータは 「-35」 領域のために配列TTGACAおよび「-10」 領域のために配列TATAATを有する 「コンセンサス」 プロモータであることができる。コンセンサスプロモータは、バシラス (Bacillus) 宿主細胞において機能することができる任意のプロモータから得ることができる。「コンセンサス」 プロモータの構築は、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) の栄養成長 「シグマA-型」 プロモータの 「-10」 および 「-35」 領域のために確立されたコンセンサス配列にいっそう完全に順応するプロモータをつくる、位置特異的変異により達成することができる (Voskuil 他、1995、Molecular Microbiology 17: 271-279) 。
【００４６】
好ましい態様において、「コンセンサス」 プロモータは下記から得られる: 大腸菌 (E. coli) lacオペロンから得られるプロモータ、ストレプトマイセス・ケリコロル (Streptomyces coelicolor) アガロース遺伝子 (dagA) 、バシラス・クラウシイ (Bacillus clausii) またはバシラス・レンツス (Bacillus lentus) アルカリ性プロテアーゼ遺伝子 (aprH) 、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) アルカリ性プロテアーゼ遺伝子 (スブチリシンCarlsberg遺伝子) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) レバンスクラーゼ遺伝子 (sacB) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) α-アミラーゼ遺伝子 (amyE) 、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) α-アミラーゼ遺伝子 (amyL) 、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) マルトジェニックアミラーゼ遺伝子 (amyM) 、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) α-アミラーゼ遺伝子 (amyQ) 、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) ペニシリナーゼ遺伝子 (penP) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) xylAおよびxylB遺伝子、バシラス・スリンジェンシス (Bacillus thuringiensis) 亜種テネブリオニス (tenebrionis) CryIIIA遺伝子 (cryIIIA) またはその一部分、原核生物のβ-ラクタマーゼ遺伝子。より好ましい態様において、「コンセンサス」 プロモータはバシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) α-アミラーゼ遺伝子 (amyQ) から得られる。
【００４７】
Widner 他、米国特許第6,255,076号および米国特許第5,955,310号には、短いコンセンサスamyQプロモータ (またscBANと呼ぶ) を包含する、縦列プロモータおよび構築物およびバシラス (Bacillus) 細胞における発現において使用する方法が記載されている。また、バシラス (Bacillus) における産生を改良するために、cryIIIA安定剤配列の使用、および前記配列を使用する構築物の使用がその中に記載されている。
【００４８】
縦列プロモータの各プロモーター配列は、突然変異体、トランケートおよびハイブリッドプロモータを包含する、選択したバシラス (Bacillus) 細胞において転写活性を示す、任意の核酸配列であることができ、そしてバシラス (Bacillus) 細胞に対して相同的または異質的である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。各プロモーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して自然または外来であり、かつバシラス (Bacillus) 細胞に対して自然または外来であることができる。プロモーター配列は、同一のプロモーター配列であるか、あるいは異なるプロモーター配列であることができる。
【００４９】
縦列プロモータの2またはそれ以上のプロモーター配列は、核酸配列の転写を同時に促進することができる。選択的に、縦列プロモータの1または2以上のプロモーター配列は、バシラス (Bacillus) 細胞の増殖の異なる段階において核酸配列の転写を促進することができる。
【００５０】
好ましい態様において、縦列プロモータは少なくともバシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) α-アミラーゼ遺伝子のamyQプロモータを含有する。他の好ましい態様において、縦列プロモータは少なくとも 「-35」 領域のために配列TTGACAおよび 「-10」 領域のために配列TATAATを有する 「コンセンサス」 プロモータを含有する。他の好ましい態様において、縦列プロモータは少なくともバシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) α-アミラーゼ遺伝子のamyLプロモータを含有する。他の好ましい態様において、縦列プロモータは少なくともcryIIIAプロモータまたはその一部分を含有する (AgaisseおよびLareclus、1994、Molecular Microbiology 13: 97-107) 。
【００５１】
より好ましい態様において、縦列プロモータは少なくともamyLプロモータおよびcryIIIAプロモータを含有する。他のより好ましい態様において、縦列プロモータは少なくともamyQプロモータおよびcryIIIAプロモータを含有する。他のより好ましい態様において、縦列プロモータは少なくとも 「-35」 領域のために配列TTGACAおよび 「-10」 領域のために配列TATAATを有する 「コンセンサス」 プロモータおよびcryIIIAプロモータを含有する。より好ましい態様において、縦列プロモータは少なくともamyLプロモータの2つのコピーを含有する。他のより好ましい態様において、縦列プロモータは少なくともamyQプロモータの2つのコピーを含有する。他のより好ましい態様において、縦列プロモータは少なくとも 「-35」 領域のために配列TTGACAおよび 「-10」 領域のために配列TATAATを有する 「コンセンサス」 プロモータの2つのコピーを含有する。他のより好ましい態様において、縦列プロモータは少なくともcryIIIAプロモータの2つのコピーを含有する。
【００５２】
「mRNAプロセシング/安定化配列」 は、ここにおいて、1または2以上のプロモーター配列の下流およびコード配列の上流に位置する配列として定義され、ここで各プロモーター配列からの合成されたすべてのmRNAをプロセシングして、転写物の5’末端に安定剤配列をもつmRNA転写物を発生することができるように、1または2以上のプロモーター配列の各々は前記コード配列に作用可能に連鎖されている。このような安定剤配列がmRNA転写物の5’末端に存在すると、mRNA転写物の半減期は増加する (AgaisseおよびLereclus、1994、前掲、Hue 他、1995、Journal of Bacteriology 177: 3465-3471) 。
【００５３】
mRNAプロセシング/安定化配列は、細菌16SリボソームRNAの3’末端に対して相補的である。好ましい態様において、mRNAプロセシング/安定化配列は、転写物の5’末端に安定剤配列をもつ、本質的に単一サイズの転写物を発生させる。mRNAプロセシング/安定化配列は、細菌16SリボソームRNAの3’末端に対して相補的であるものであることが好ましい。参照、米国特許第6,255,076号および米国特許第5,955,310号。
【００５４】
より好ましい態様において、mRNAプロセシング/安定化配列は、WO 94/25612およびAgaisseおよびLereclus、1994、前掲、に開示されているバシラス・スリンジェンシス (Bacillus thuringiensis) cryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列、またはmRNAプロセシング/安定化機能を保持するその一部分である。他のより好ましい態様において、mRNAプロセシング/安定化配列は、Hue 他、1995、前掲、に開示されているバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) SP82 mRNAプロセシング/安定化配列、またはmRNAプロセシング/安定化機能を保持するその一部分である。
【００５５】
CryIIIAおよびそのmRNAプロセシング/安定化配列を本発明の方法において使用するとき、WO 94/25612およびAgaisseおよびLereclus、1994、前掲、に開示されている配列、またはmRNAプロセシング/安定化機能を保持するその一部分を含有するDNAフラグメントを使用することができる。さらに、種々の縦列プロモータおよびmRNAプロセシング/安定化配列の組合わせを構築するこの分野においてよく知られている方法を使用して、cryIIIAプロモータのみを含有するまたはcryIIIA mRNAプロセシング/安定化配列のみを含有するDNAフラグメントを製造することができる。この態様において、cryIIIAプロモータおよびそのmRNAプロセシング/安定化配列は、縦列プロモータを構築する1または2以上の他のプロモーター配列の下流および問題の遺伝子の制御配列の上流に配置することが好ましい。
【００５６】
次いで、ヒアルロン酸産生に関係する1または2以上の必要な酵素をコードする単離された核酸配列をさらに操作して、核酸配列の発現を改良することができる。発現はポリペプチドの産生に関係する任意の段階を包含すると理解され、このような段階は下記のものを包含するが、これらに限定されない: 転写、転写後の修飾、翻訳、翻訳後の修飾および分泌。クローニング法を利用して核酸配列を修飾する技術は、この分野においてよく知られている。
【００５７】
酵素をコードする核酸配列を含んでなる核酸構築物は、制御配列と適合する条件下に、バシラス (Bacillus) 細胞中における制御配列の発現を指令することができる1または2以上の制御配列に作用可能に連鎖することができる。
【００５８】
用語 「制御配列」 は、核酸配列のコード配列の発現に必要であるか、あるいは好都合である成分のすべてを包含するとして定義される。各制御配列は、酵素をコードする核酸配列に対して自然または外来であることができる。前述のプロモータに加えて、このような制御配列はリーダー、シグナル配列および転写ターミネーターを包含するが、これらに限定されない。最小において、制御配列はプロモータ、転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、酵素をコードする核酸配列のコード領域と制御配列との連結を促進する特異的制限部位を導入する目的で、リンカーを有することができる。
【００５９】
また、制御配列は、適当な転写ターミネーター配列、すなわち、転写を停止するためにバシラス (Bacillus) 細胞により認識される配列であることができる。ターミネーター配列は、酵素またはオペロンの最後の酵素をコードする核酸配列の3’末端に作用可能に連鎖させる。選択したバシラス (Bacillus) 細胞において機能的である任意のターミネーターを、本発明において使用することができる。
【００６０】
また、制御配列は適当なリーダー配列、すなわち、バシラス (Bacillus) 細胞による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域であることができる。リーダー配列は、酵素をコードする核酸配列の5’末端に作用可能に連鎖させる。選択したバシラス (Bacillus) 細胞において機能的である任意のリーダー配列を、本発明において使用することができる。
【００６１】
また、制御配列はシグナルペプチドコード領域であることができ、これは発現されたポリペプチドを細胞の分泌経路に向けることができるポリペプチドのアミノ末端に連鎖されたアミノ酸配列をコードする。シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドに対して自然であるか、あるいは外来源から得ることができる。核酸配列のコード配列の5’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳リーデイングフレームでで自然に連鎖された、シグナルペプチドコード領域を固有に含有することができる。選択的に、コード配列の5’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード配列の部分に対して外来である、シグナルペプチドコード領域を含有することができる。
【００６２】
コード配列が通常シグナルペプチドコード領域を含有しない場合、外来性シグナルペプチドコード領域を必要とすることがある。選択的に、通常コード配列に関連する自然シグナルペプチドコード領域に関してポリペプチドの分泌を増強させるために、外来性シグナルペプチドコード領域を自然シグナルペプチドコード領域と単に置換することができる。シグナルペプチドコード領域は、バシラス (Bacillus) 種からのアミラーゼ遺伝子またはプロテアーゼ遺伝子から得ることができる。しかしながら、選択したバシラス (Bacillus) 細胞の分泌経路中に発現されたポリペプチドを向けることができる、任意のシグナルペプチドコード領域を、本発明において使用することができる。
【００６３】
バシラス (Bacillus) 細胞のために有効なシグナルペプチドコード領域は、下記の遺伝子から得られたシグナルペプチドコード領域である: バシラス (Bacillus) NCIB 11837からのマルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) α-アミラーゼ遺伝子、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) スブチリシン遺伝子、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) β-ラクタマーゼ遺伝子、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) 中性プロテアーゼ遺伝子 (nprT、nprS、nprM) 、およびバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) prsA遺伝子。それ以上のシグナルペプチドは下記の文献に記載されている: SimonenおよびPalva、1993、Microbiological Reviews 57: 109-137。
【００６４】
また、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であることができる。生ずるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド (またはある場合においてチモーゲン) として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断により、成熟活性ポリペプチドに転化することができる。プロペプチドコード領域は、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) アルカリ性プロテアーゼ (aprE) およびバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) 中性プロテアーゼ (nprT) から得ることができる。
【００６５】
シグナルペプチド領域およびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
また、宿主細胞の増殖に関してポリペプチドの発現の調節を可能とする調節配列を付加することが望ましいことがある。調節系の例は、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにする系であり、調節化合物の存在を包含する。原核生物の系における調節系は、lac、tacおよびtrpオペレーター系を包含する。
【００６６】
産生
本発明の方法において、宿主細胞を、ヒアルロン酸の産生に適当な栄養培地中で、この分野において知られている方法に従い培養する。例えば、細胞は、震蘯フラスコ培養により、または適当な培地中でヒアルロン酸合成に関係する酵素の発現およびヒアルロン酸の単離を可能とする条件下に実行される実験室用または工業用発酵槽中の小規模または大規模の発酵 (連続的、バッチ式、供給バッチ式または固体状態の発酵を包含する) により培養することができる。培養は、炭素源、窒素原および無機塩を含んでなる適当な栄養培地中で、この分野において知られている手順に従い実施する。適当な培地は商業的供給会社から入手可能であるか、あるいは発表された組成 (例えば、American Type Culture Collectionのカタログ中に) に従い調製することができる。分泌されたヒアルロン酸は、培地から直接回収することができる。
【００６７】
生ずるヒアルロン酸は、この分野において知られている方法により単離することができる。例えば、ヒアルロン酸は栄養培地から慣用法により単離することができ、このような慣用法は遠心、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を包含するが、これらに限定されない。次いで、単離されたヒアルロン酸は種々のこの分野において知られている手順により精製することができ、このような手順は下記を包含するが、これらに限定されない: クロマトグラフィー (例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除クロマトグラフィー) 、電気泳動手順 (例えば、調製用等電点電気泳動) 、微分溶解度 (例えば、硫酸アンモニウム沈降法) または抽出 (例えば、下記の文献を参照のこと: Protein Purification J.-C. JansonおよびLars Ryden 編者、VCH Publishers、New York、1989) 。
【００６８】
詳細な説明
ヒアルロン酸
「ヒアルロン酸」 は、ここにおいて、交互するβ-1,4およびβ-1,3グルコシド結合により一緒に結合された、N-アセチルグルコサミン (GlcNAc) およびグルクロン酸 (GlcUA) の反復二糖単位から構成された非硫酸化グルコサミングルカンとして定義される。また、ヒアルロン酸はヒアウロナン、ヒアルノネートまたはHAとして知られている。用語 「ヒアウロナン」 および 「ヒアルロン酸」 は、本明細書中において互換的に使用される。
【００６９】
鶏冠はヒアウロナンの有意な商業的源である。微生物は別の源である。米国特許第4,801,539号には、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス (Streptococus zooepidemicus) の株を包含するヒアルロン酸を製造する発酵法が開示されており、報告されている収量は約3.6 gのヒアルロン酸/リットルである。欧州特許No. EP 0694616には、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス (Streptococus zooepidemicus) の改良された株を使用するヒアルロン酸を製造する発酵法が開示されており、報告されている収量は約3.5 gのヒアルロン酸/リットルである。WO 03/054163 (Novozymes) (これは全体において引用することによって本明細書の一部とされる) に開示されているように、ヒアルロン酸またはその塩は、例えば、グラム陽性細菌宿主中で、組換え的に産生することができる。
【００７０】
脊椎動物、細菌の病原体および藻類のウイルスからのヒアウロナンシンターゼが記載されてきている (DeAngelis P. L.、1999、Cell. Mol. Life Sci. 56: 670-682) 。WO 99/23227には、ストレプトコッカス・エクイシミリス (Streptococcus equisimilis) からのグループIのヒアウロナンシンターゼが開示されている。WO 99/51265およびWO 00/27437には、パステウレラ・マルトシダ (Pasteurella multocida) からのグループIのヒアウロナンシンターゼが記載されている。Ferretti 他は、ストレプトコッカス・ピオゲネス［化膿レンサ球菌］(Streptococcus pyogenes) のヒアルノネートシンターゼオペロンを開示しており、これは3つの遺伝子、hasA、hasBおよびhasCから構成されており、それらはそれぞれヒアルロネートシンターゼ、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼおよびUDP-グルコースピロホスホリラーセをコードする (Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 98: 4658-4663、2001) 。WO 99/51265には、ストレプトコッカス・エクイシミリス (Streptococcus equisimilis) ヒアウロナンシンターゼのためのコード領域を有する核酸セグメントが記載されている。
【００７１】
組換えバシラス (Bacillus) 細胞のヒアウロナンは培地に直接分泌されるので、簡単なプロセスを使用して培地からヒアウロナンを単離することができる。最初に、バシラス (Bacillus) 細胞および細胞破片を培地から物理的に除去する。まず、必要に応じて、培地を希釈して、培地の粘度を減少させる。培地から細胞を除去する多数の方法、例えば、遠心および精密濾過がこの分野において知られている。必要に応じて、残留する上澄みを引き続いて、例えば、限外濾過により濾過して濃縮し、小分子の汚染物質をヒアウロナンから除去する。
【００７２】
細胞および細胞破片を除去した後、培地からのヒアウロナンの簡単な調製を既知の機構により実行する。塩、アルコール、または塩とアルコールとの組合わせを使用して、濾液からヒアウロナンを沈殿させることができる。いったん沈殿に減少すると、物理的手段によりヒアウロナンを溶液から容易に単離することができる。この分野において知られている蒸発技術、例えば、噴霧乾燥により、ヒアウロナンを濾液から乾燥または濃縮することができる。
【００７３】
第1の面において、本発明は、ここにおいて定義したように乾燥し、凝集された、ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる生成物に関する。
【００７４】
宿主細胞
好ましい態様において、本発明は、ヒアルロン酸またはその塩が、好ましくはグラム陽性の細菌または宿主細胞により、より好ましくはバシラス (Bacillus) 属の細菌により、組換え的に産生されている、第1面の生成物に関する。
【００７５】
宿主細胞は、ヒアルロン酸の組換え産生に適当な、任意のバシラス (Bacillus) 細胞であることができる。バシラス (Bacillus) 宿主細胞は、野生型バシラス (Bacillus) 細胞またはその突然変異体であることができる。本発明の実施において有用なバシラス (Bacillus) 細胞は下記のものを包含するが、これらに限定されない: バシラス・アガラドヘレンス (Bacillus agaradhaerens) 、バシラス・アルカロフィラス (Bacillus alkalophilus) 、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) 、バシラス・ブレビス (Bacillus brevis) 、バシラス・サーキュランス (Bacillus circulans) 、バシラス・クラウシイ (Bacillus clausii) 、バシラス・コアギュランス (Bacillus coagulans) 、バシラス・フィルムス (Bacillus firmus) 、バシラス・ラウツス (Bacillus lautus) 、バシラス・レンツス (Bacillus lentus) 、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) 、バシラス・メガテリウム (Bacillus megaterium) 、バシラス・ピュミルス (Bacillus pumilus) 、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) およびバシラス・スリンジェンシス (Bacillus thuringiensis) の細胞。
【００７６】
組換え発現に特に適合する突然変異体のバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) 細胞は、WO 98/22598に記載されている。非カプセル化バシラス (Bacillus) 細胞は、本発明において特に有用である。
【００７７】
好ましい態様において、バシラス (Bacillus) 宿主細胞はバシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) 、バシラス・クラウシイ (Bacillus clausii) 、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) 、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) またはバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) の細胞である。より好ましい態様において、バシラス (Bacillus) 細胞はバシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) 細胞である。他のより好ましい態様において、バシラス (Bacillus) 細胞はバシラス・クラウシイ (Bacillus clausii) 細胞である。他のより好ましい態様において、バシラス (Bacillus) 細胞はバシラス・レンツス (Bacillus lentus) 細胞である。
【００７８】
他のより好ましい態様において、バシラス (Bacillus) 細胞はバシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) 細胞である。他のより好ましい態様において、バシラス (Bacillus) 細胞はバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) 細胞である。最も好ましい態様において、バシラス (Bacillus) 宿主細胞はバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) A164△5 (参照: 米国特許第5,891,701号) またはバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) 168△4である。
【００７９】
本発明の核酸構築物によるバシラス (Bacillus) 宿主細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換 (例えば、下記の文献を参照のこと: ChangおよびCohen、1979、Molecular General Genetics 168: 111-115) により、コンピテント細胞 (例えば、下記の文献を参照のこと: YoungおよびSpizizen、1961、Journal of Bacteriology 81: 823-829、またはDubnauおよびDavidoff-Abelson、1971、Journal of Molecular Biology 56: 209-221) を使用することによって、エレクトロポレーション (例えば、下記の文献を参照のこと: ShigekawaおよびDower、1988、Biotechniques 6: 742-751) により、または複合化 (例えば、下記の文献を参照のこと: KoehlerおよびThorne、1987、Journal of Bacteriology 169: 5271-5278) により実行することができる。
【００８０】
分子量
ヒアルロン酸のレベルは、変更されたカルバゾール法 (BitterおよびMuir、1962、Anal. Biochem. 4: 330-334) に従い決定することができる。その上、ヒアルロン酸の平均分子量は、この分野において標準的方法、例えば、下記の文献に記載されている方法により決定することができる: Ueno 他、1988、Chem. Pharm. Bull. 36: 4971-4975; Wyatt、1993、Anal. Chimi. Acta 272: 1-40; およびWyatt Technologies、1999、“Light Scattering University DAWN Course Manual” および“DAWN EOS Manual” Wyatt Technology Corporation、カリフォルニア州サンタバーバラ。
【００８１】
好ましい態様において、本発明の方法により得られるヒアルロン酸は、約10,000〜約10,000,000 Daの分子量を有する。より好ましい態様において、本発明の方法により得られるヒアルロン酸は、約25,000〜約5,000,000 Daの分子量を有する。最も好ましい態様において、本発明の方法により得られるヒアルロン酸は、約50,000〜約3,000,000 Daの分子量を有する。
【００８２】
好ましい態様において、本発明は、ヒアルロン酸またはその塩が300,000〜3,000,000、好ましくは400,000〜2,500,000、より好ましくは500,000〜2,000,000、最も好ましくは600,000〜1,800,000 Daの範囲の分子量を有する、第1面の生成物に関する。
【００８３】
組換え的に産生されたヒアルロン酸またはその塩を本発明の方法において使用して本発明の生成物または組成物を製造する場合、まずヒアルロン酸またはその塩の平均分子量を減少することは、ある用途のために好都合あることがある。例えば、ヒアルロン酸のいわゆる低分子量画分のいくつかの製造業者により述べられてきているように、低分子量画分は皮膚バリヤーを貫通して皮膚中でヒアルロン酸の自然含有率を再確立することができ、したがってこのような画分は皮膚老化防止剤およびしわ防止剤として販売されている化粧品組成物のために特に適当である。
【００８４】
食品の用途のために、低分子量ヒアルロン酸は胃腸管バリヤーを貫通し、これによりその生物学的利用率を増加させることが示された。最後に、低分子量ヒアルロン酸は抗炎症作用を示し、炎症性疾患の治療において潜在的用途を有する。ヒアルロン酸またはその塩の平均分子量の減少は、この分野において標準的方法、例えば、簡単な熱処理、酵素的分解、超音波処理または酸加水分解により達成することができる。例えば、下記の文献を参照のこと: 米国特許第6,020,484号 (添加剤としてNaOClを含むHAの超音波処理技術が記載されている) およびT. Miyazaki 他 (2001) Polymer Degradation and Stability 74: 77-85。
【００８５】
したがって、好ましい態様において、本発明は、ヒアルロン酸またはその塩が10,000〜800,000 Da、好ましくは20,000〜600,000 Da、より好ましくは30,000〜500,000 Da、なおより好ましくは40,000〜400,000 Da、最も好ましくは50,000〜300,000 Daの範囲の低平均分子量を有する、第1面の生成物に関する。
【００８６】
塩および架橋したHA
好ましい態様において、本発明は、ヒアルロン酸の無機塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛またはヒアルロン酸コバルトを含んでなる、第1面の生成物に関する。
【００８７】
HAを多官能価のエポキシ化合物と架橋させることによって製造される、架橋したHAまたはその塩の製造は、EP 0 161 887 B1に開示されている。脂肪族アルコールとのHAの完全にまたは部分的に架橋されたエステル、およびこのような部分的エステルと無機塩基または有機塩基との塩は、米国特許第4,957,744号に開示されている。HAを架橋させる他の方法は、米国特許第5,616,568号、米国特許第5,652,347号および米国特許第5,874,417号に開示されている。また、架橋したHAは、次のようにして、HAをホウ酸で処理することによって製造することができる:
【００８８】
バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) 中の発酵 (WO 03/054153; Novozymes) により組換え的に産生された乾燥したヒアルロン酸ナトリウム (Na-HA、203 mg) を、0.2 M NaOH中に溶解して4%の溶液を形成する。ホウ酸 (35 mg、ほぼ1当量のHA二糖) を添加し、試料を室温において1.5時間攪拌し、次いで5℃において2.5日間貯蔵した。正確に前述したように、しかしホウ酸を使用しないで、対照試料を並行に製造した。
【００８９】
生ずるHA-ボレートのヒドロゲルの粘度を、25℃において、キャリムド(Carrimed) CSL制御ストレスレオメーター (円錐形ジオメトリー: 6 cm、2°) により測定した。粘度は剪断速度に依存し、対照試料に比較してHA-ボレートにおいて少なくとも4倍 (4.2-から8.4倍に) に増加し、架橋した網状構造を示した。
【００９０】
1,200および945 cm-1において新しいピークがHA-ボレートヒドロゲルのFT-IRスペクトルにおいて観察され、Na-HAの標準的スペクトルと比較したとき、これらのピークは架橋したHA-ボレートヒドロゲル中の新しく形成したボレートエステルに対応した。
したがって、好ましい態様において、本発明は、架橋したヒアルロン酸またはその塩、好ましくはホウ酸と架橋したヒアルロン酸またはその塩を含んでなり、より好ましくは架橋したヒアルロン酸がボレートエステルを含んでなる、第1面の生成物に関する。
【００９１】
湿分の決定
本発明による乾燥した生成物の湿分は、粉末を102℃±2℃において一定重量に乾燥した後、百分率として表した重量損失である。すられた蓋を有する空のガラスの秤量皿を炉中で乾燥し、次いで冷却し、少なくとも0.1 mgの感度を有する分析用天秤上で秤量する。ほぼ3 gの乾燥した生成物の試料を皿上に置き、秤量する。粉末を含む皿を蓋なしで炉中に入れ、102℃±2℃において2時間乾燥し、次いでそれをデシケーター中に入れ、温室に冷却した後、再び秤量する。前述したように、粉末を含む皿を蓋なしで炉中に入れて、さらに1時間乾燥し、次いで冷却し、再び秤量する。重量が一定に止まるまで、すなわち、2つの連続的秤量が0.5 mgより多く異ならなくなるまで、これを反復する。
【００９２】
次いで湿分%を (W2-W3)(W2-W1)×100として計算する; ここでW1は空の皿の重量であり、W2は粉末を含む皿の重量であり、そしてW3は乾燥した粉末を含む皿の重量である。結果を2小数位に計算し、そしてこの方法の再現精度は約±0.1%である。
好ましくは、第1面の乾燥し、凝集した生成物は、ここにおいて決定して、5%より低い、好ましくは2%より低い、最も好ましくは1%より低い湿分を含んでなる。
【００９３】
粒度
第1面の好ましい生成物は、下記の実施例において示すように、イソプロパノール中に懸濁させた粒子のレーザー回折測定により決定して、粒度の50百分位D50が10〜1,000ミクロン、好ましくは100〜1,000ミクロン、より好ましくは150〜900ミクロン、なおより好ましくは200〜800ミクロンである粒度を有する。
【００９４】
好ましい態様において、第1面の生成物の多分散性をSPAN値として測定し、これを下記式に従い計算する; SPAN = (D90-D10)/D50、そしてSPAN値は1.0〜2.5であり、好ましくはSPAN値は1.2〜2.2であり、より好ましくはSPAN値は1.5〜1.9であり、最も好ましくはSPAN値は1.6〜1.8である。
【００９５】
分散性
本発明の生成物の分散性は次のようにして決定する; 0.1  gの乾燥し、凝集した生成物を100 mlのびんに添加する。50 mlの0.9% (w/v) の塩化ナトリウム溶液を添加し、びんを密閉し、手により反復して180°倒立させて、添加したすべての粒子を単一粒子として分散させ、すなわち、視的検査により決定して、かたまりが残らないようにし、そして倒立を実行するために要した時間をデータ用紙に記録する。こうして、記録された時間は生成物の分散性である。
【００９６】
第1面の好ましい生成物は、ここにおいて決定して、水性溶媒、好ましくは水中で30分より短い、好ましくは20分より短い、より好ましくは15分より短い、より好ましくは10分より短い、より好ましくは5分より短い、より好ましくは3分より短い、より好ましくは2分より短い、最も好ましくは1分より短い分散性を有する。
【００９７】
溶解性
本発明によるヒアルロン酸を含んでなる乾燥した、または乾燥し、凝集した、生成物または組成物の種々の溶媒中の溶解性を次のようにして決定することができる:
0.1 gの試験すべきヒアウロナン粉末を、100 mlの密閉可能なガラスフラスコに添加する。試験すべきHA試料を含有するフラスコに、50 mlの0.9% (w/v) の塩化ナトリウム、注射等級の水、無水エタノール、アセトンまたはエーテルを添加する。フラスコを密閉し、視的検査により決定して、HAが溶解するまで、手により180°の倒立を実行し、そして倒立を実行するために要した時間をデータ用紙に記録する。記録された時間は試料の溶解性である。
【００９８】
本発明による好ましい生成物は、ここにおいて決定して、水性溶媒中で60分より短い、好ましくは45分より短い、より好ましくは40分より短い、なおより好ましくは35分、30分、25分、20分、15分、10分より短い、最も好ましくは5分より短い溶解性を有する。
【００９９】
他の成分
好ましい態様において、本発明の乾燥し、凝集した生成物は、また、他の成分、好ましくは1種または2種以上の活性成分、好ましくは1種または2種以上の薬学的に活性な物質、およびまた水溶性賦形剤、例えば、ラクトースを含んでなることができる。
【０１００】
本発明において使用することができる活性成分または薬学的に活性な物質の非限定的例は下記のものを包含する: タンパク質および/またはペプチドの薬剤、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、成長ホルモン放出性ホルモン/ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリトロポイエチン、骨形態形成タンパク質、インターフェロンまたはその誘導体、インスリンまたはその誘導体、アトリオペプチン-III、モノクローナル抗体、腫瘍壊死因子、マクロファージ活性化因子、インターロイキン、腫瘍変性因子、インスリン様増殖因子、内皮増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、因子VII、因子VIIIおよびウロキナーゼ。
【０１０１】
1種または2種以上の活性成分を安定化する目的で水溶性賦形剤を添加することができ、このような賦形剤は下記のものを包含する: タンパク質、例えば、アルブミンまたはゼラチン; アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アルギニン、リシンおよびそれらの塩; 炭水化物、例えば、グルコース、ラクトース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、サッカロース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、トレハロースおよびコンドロイチン硫酸; 無機塩、例えば、リン酸塩; 界面活性剤、例えばTWEEN（商標） (ICI) 、ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物。賦形剤および安定剤は、生成物の0.001〜99重量%の範囲の量で使用することができる。
【０１０２】
本発明のいくつかの面は、他の構成成分の中でも、有効量の第1の面において規定した生成物、活性成分、好ましくは薬理学的活性剤、および薬学上許容される担体、賦形剤または希釈剤、好ましくは水溶性賦形剤、最も好ましくはラクトースを含んでなる種々の組成物および医薬組成物に関する。
【０１０３】
好ましい態様において、本発明は、そうでなければこの分野において記載されているように処方することができる、発泡性錠剤で構成された本発明の生成物または組成物に関する。例えば、発泡性錠剤は、クエン酸、重炭酸ナトリウムおよびオリゴ糖または他の糖を含んでなることができる。発泡性錠剤は貯蔵が容易であり、そして本発明の高速溶解生成物を使用すると、発泡性錠剤は急速に溶解し、こうして経口投与の理想的手段を提供する。
【０１０４】
さらに、本発明の面は、第1の面において規定した生成物または上記面および態様において規定した組成物を含んでなる物品、例えば、化粧品、衛生物品、医学的または外科的物品に関する。最後の面において、本発明は、第1の面において規定した生成物または本発明の他の面および態様において規定した組成物を含んでなる、薬剤のカプセルまたはマイクロカプセルに関する。
【０１０５】
製造方法
他の面において、本発明は、下記の工程を含んでなる、本発明の第1面および/またはその好ましい態様において規定した生成物を製造する方法を提供する:
a)   ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる生成物を乾燥し、そして
b)   乾燥した生成物を凝集させる。
【０１０６】
噴霧乾燥および凝集
方法の好ましい態様において、噴霧乾燥器、好ましくは2流体ノズル (TFN) またはロータリーアトマイザーを使用して乾燥工程を実施し、好ましくはTNFおよび下記の条件範囲を使用して噴霧乾燥を実施した:
入口温度:                    100〜200℃
出口温度:                     40〜 90℃
ノズル噴霧化圧力:              2〜 10バール
ノズル空気温度:               40〜100℃
供給温度:                     40〜100℃
【０１０７】
他の好ましい態様において、本発明は、流動床を使用して凝集工程を実施する; 好ましくは流動床入口温度は30〜80℃の範囲であり、そして粉末の水溶液は25〜50℃の出口温度に対応する速度で乾燥した粉末上に噴霧する、上記方法に関する。
【０１０８】
なお他の好ましい態様において、本発明は、好ましくは0:100〜50:50の水:溶媒比、より好ましくは0:100〜20:80の水:溶媒比を有する、水-溶媒混合物を使用して凝集工程を実施し、好ましくは溶媒がアルコール、好ましくはイソプロパノールである、上記方法に関する。
乾燥工程および凝集工程は1工程で、好ましくは流動化噴霧乾燥器を使用して実施することが好ましい。
【０１０９】
生成物および組成物を使用する方法
本発明の種々の面は、例えば、医学的分野において、第1面の生成物を使用して、または本発明の組成物を使用して、治療手順を実行する方法に関する。
1つの面は、第1の面において規定した生成物または本発明の組成物の使用を含んでなる、眼科における手順を実施する方法に関する。
他の面は、第1面において規定した生成物または本発明の組成物の使用を含んでなる、骨関節炎の治療を実施する方法に関する。
なお他の面は、第1面において規定した生成物または本発明の組成物の使用を含んでなる、癌の治療を実施する方法に関する。
【０１１０】
さらに他の面は、第1面において規定した生成物または本発明の組成物の使用を含んでなる、毛髪の喪失または禿頭症の治療を実施する方法に関する。
1つの面は、第1面において規定した生成物または本発明の組成物の使用を含んでなる、薬理学的活性剤の経皮的または皮膚への投与を実施する方法に関する。
他の面は、第1面において規定した生成物または本発明の組成物の使用を含んでなる、化粧品の皮膚への投与を実施する方法に関する。
1つの面は、第1面において規定した生成物または本発明の組成物を使用する眼科の方法に関する。
【０１１１】
他の面は、有効量の第1面において規定した生成物または本発明の組成物を哺乳動物に、好ましくは皮膚に、経皮的に、経口的に、または注射により、投与することを含んでなる、骨関節炎を治療する方法に関する。
1つの面は、有効量の第1面において規定した生成物または本発明の組成物を投与することを含んでなる、創傷を治療する方法に関する。
【０１１２】
さらに他の面は、有効量の第1面において規定した生成物または本発明の組成物を哺乳動物に、好ましくは皮膚に、経皮的に、経口的に、または注射により、投与することを含んでなる、毛髪の喪失または禿頭症の治療を実施する方法に関する。
【０１１３】
他の面は、骨関節炎を治療する薬剤を製造するための、眼科の治療に使用する薬剤を製造するための、癌を治療する薬剤を製造するための、創傷を治療する薬剤を製造するための、創傷を治療する薬剤を製造するための、脈管形成の薬剤を製造するための、または毛髪の喪失または禿頭症治療する薬剤を製造するための、第1面において規定した生成物または本発明の組成物の使用に関する。
最後の面は、モイシュチャライザーを製造するための、第1面において規定した生成物または本発明の組成物の使用。
【実施例】
【０１１４】
実施例１．
2つの異なる型の下記技術に従い、約8 g/リットルを含有するヒアルロン酸ナトリウムから成る液状供給物を乾燥した: A) 2流体ノズル (TFN) およびB) ロータリーアトマイザー。商業的に入手可能な型の噴霧乾燥技術および装置は、また本発明の目的に適当であると考えられる (例えば、下記を参照のこと: Niro Atomizers Inc.) 。
生ずる乾燥した粉末は顕著に異なっていた。TFNにより製造された粉末は有意により小さい嵩密度を有した。この差の理由は、下に示すそれ以上の分析により明らかになった。
【０１１５】
【表１】
2008500411.tif 000002
【０１１６】
粒度が非常により大きかった (これは通常溶解性時間の増加に導くであろう) という事実にかかわらず、ロータリーアトマイザーに比較して、TFN噴霧化原理を使用すると、溶解性時間は有意に減少することが理解された。しかしながら、溶解性時間の減少は、TFN噴霧乾燥した粒子中に空気が含まれているためであることが見出された。これはTFN生成物の粒子密度から理解することができた。この密度はロータリーアトマイザーにより製造された乾燥した生成物の密度の半分よりも低かった。
【０１１７】
実施例２．
約8 g/リットルのヒアルロン酸ナトリウムおよび2,400 gの塩化ナトリウムを含む、75,000 gのヒアルロン酸ナトリウム溶液から成る液状供給調製物を噴霧乾燥燥器に一定速度で添加した。ヒアルロン酸ナトリウムは約690,000 Daの分子量を有した。この噴霧乾燥燥器は約1.8 mの直径および約5 mの高さを有した。2流体ノズル (TFN) を供給物の噴霧化のために選択した。乾燥条件を調節して、必要な粒度を有する乾燥粉末バッチ (バッチNo. 03PBAC0035-1) を得た:
【０１１８】
入口温度:                           160℃
出口温度:                            75℃
ノズル噴霧化圧力:                     4バール
ノズル空気温度:                      70℃
供給温度:                            60℃
【０１１９】
イソプロパノール中の粉末の懸濁液についてレーザー回折を使用して、生ずる粒度分布を測定した:
D10:           12ミクロン
D50:           39ミクロン
D90:           84ミクロン
分子量:        631,000 Da
SPAN:          1.77
【０１２０】
多分散性の測度は、下記式に従い計算することができる、 「SPAN」 値である:
SPAN = (D90-D10)/ D50
分子量は乾燥作業間にほとんど未変化であり、こうして適用温度が高いにもかかわらず、噴霧乾燥プロセスは非常に温和であることが示された。
【０１２１】
実施例３．
20 mlの下記の溶媒-水混合物の各々の中に粉末試料を懸濁させることによって、実施例2において製造した噴霧乾燥した粉末の5 gの試料を凝集させた:
100%のイソプロパノール (IPA) 
90%のイソプロパノール
87%のイソプロパノール
【０１２２】
懸濁液を引き続いて濾過し、真空乾燥した。乾燥した濾過ケークを粉砕し、篩がけして、150ミクロンより小さくかつ600ミクロンより大きいすべての粒子を除去した。
こうして製造された凝集した粒子は生理的食塩水中に非常に高速に分散しかつ溶解することが驚くべきことには発見された。この現象を研究するために、純粋なIPA中の生成物の懸濁液についてレーザー回折を使用して、粒度をいっそう正確に測定した。こうして決定された粒度 (10、50および90百分位) を下記表2に示す。凝集に使用した溶媒-水混合物中の水分が0から13%に増加するにつれて、平均凝集粒度の有意な増加が観察された。
【０１２３】
【表２】
2008500411.tif 000003
【０１２４】
十分に高速な分散を達成するために、粒度はほぼ180ミクロン以上であるべきであることが発見された。結局、87% IPAを使用して凝集させた180〜355ミクロンのバッチからの篩分け画分を製造した。この画分を引き続いて実施例2からの非凝集であるが、それ以外は同一である生成物と比較した。結果を下記表3に示す。明らかなように、溶解性時間は凝集プロセスにより有意に改良される。
【０１２５】
【表３】
2008500411.tif 000004
【０１２６】
実施例４．
実施例3に記載されている方法を使用して実施例1に記載されている2つのバッチを処理して、純粋なヒアルロン酸塩生成物の溶解性時間を変更できるかどうかを調べた。下記表4において、凝集した生成物の250〜500ミクロンの篩分け画分についての結果を示す。実施例1および3の方法を組合わせることによって、溶解性時間を有意に短縮できることが明らかに理解される。
【０１２７】
【表４】
2008500411.tif 000005
【０１２８】
実施例５．
実施例1において製造した粉末を下記の方法により処理した: 約100 gの乾燥した粉末をストレア (Strea) 実験室用流動床に添加した。入口温度は55℃であった。次いで、実施例1において製造した粉末の1%水溶液を、35℃の出口温度に対応する速度で乾燥した粉末上に噴霧した。生ずる形成した凝集物を溶解性について試験した。それらは、未処理粉末と比較したとき、顕著に改良された溶解性を示した。
【０１２９】
実施例６．
75,000 gのヒアルロン酸ナトリウム溶液および2,400 gの塩化ナトリウムから成る液状供給調製物を、流動化噴霧乾燥燥器 (FSD) に一定速度で添加した。FSD噴霧乾燥燥器は、噴霧乾燥塔の下に配置された一体化流動床を装備した。乾燥空気は連行された微細物とともに噴霧乾燥燥器屋根に通して除去し、引き続いて粒子を取出すサイクロンに通過させた。取出された粒子は空気圧で噴霧乾燥器に輸送し戻され、ここで粒子はノズルの霧 (cloud) の中に注入された。
【０１３０】
ヒアルロン酸塩は800 kDaの分子量および約8 g/リットルの濃度を有した。この噴霧乾燥燥器は約1.8 mの直径および約5 mの高さを有した。乾燥条件を調節して、必要な粒度を有する乾燥粉末バッチ (バッチNo. 04PBAC0014) を得た:
入口温度:                           160℃
出口温度:                            68℃
ノズル噴霧化圧力:                     3.5バール
ノズル空気温度:                      50℃
供給温度:                            60℃
【０１３１】
引き続いて、イソプロパノール油中の粉末の懸濁液についてレーザー回折を使用して、粒度分布を測定した:
D10:                  89ミクロン
D50:                  220ミクロン
D90:                  466ミクロン
分子量:               790 kDa
ヒアルロン酸塩濃度:   493 mg/g
【０１３２】
分子量は乾燥作業間にほとんど未変化であり、こうして適用温度が高いにもかかわらず、噴霧乾燥プロセスは非常に温和であることが理解される。
250〜500ミクロンの生成物画分を、表5に示すように、その分散性/溶解性について試験し、それは約2分で分散しかつ溶解することが発見され、これは非凝集噴霧乾燥生成物を使用して観察された15分よりも非常に速かった。また、生ずる溶液の吸収を600 nmにおいて測定して、溶液中に小さい粒子が残留しないことを確認した (表5) 。
【０１３３】
【表５】
2008500411.tif 000006
【０１３４】
実施例７．
分子量および皮膚浸透
直径2 cm (3.14 cm2の有効面積) の並んだ拡散セルを使用して、放射線標識化ヒアルロン酸の4つの異なる平均分子量画分の皮膚浸透性を研究した。レセプター相の体積は8〜8.5 mlであり、そしてドナー隔室の体積は1〜1.5 mlであった。
【０１３５】
ブタの耳から皮膚採取した皮膚 (750マイクロメートル) を融解し、拡散セルの1つの側に配置した。感知しうる毛をハサミで注意して切取った。拡散セルの他の側をケイ素ディスクで閉鎖した。レセプターにリン酸塩緩衝液 (PBS) pH 7.4を充填した。磁気攪拌棒を導入した。
ドナー相の3つの10 μlの試料 (5.64 mg/mlの冷/22.56μg/mlの熱の冷/熱比で準備された) を採取して、比活性を決定した。次いで、ドナー相に準備された溶液を充填した: 5 ml (供給体積) について、わずかに3または4セルを構成することができた。
【０１３６】
セルを適当な攪拌プレート上に配置し、周囲温度において実験を実施した。5時間後、レセプター相全体を抜出し、その中の放射能を液体シンチレーション計数により測定した。次いでレセプターチャンバーにPBSを充填し、拡散を一夜進行させた。
22時間 (すなわち、5時間+17時間) 後、受容溶液を再び抜出し、放射能について分析した。セルを解体し、皮膚を5 mlのSOLUENE（商標） (Perkin-Elmer) 中で48時間または完全に溶解するまでインキュベートした後、シンチレーション流体添加し、放射能について計数した。4つの異なる分子量のHA画分についての実験結果を、表6に要約する。
【０１３７】
【表６】
2008500411.tif 000007
【０１３８】
典型的には、3または4反復試験 (表6: R1、R2、R3、R4) が得られた。しかしながら、時には、実験の問題が明らかであり (例えば、明らかな皮膚のパーホレーションまたは拡散セルからの漏出) 、この場合においてわずかに2反復試験が可能であった。
主として、ドナー相の粘性的特質が拡散セル隔室からのドナー相の完全な除去を妨害するので、放射能の全回収 ( 「物質収支」 ) は100%より低かった。この問題はHA分子量の増加とともに増加した。
【０１３９】
これらの結果は図1において可視化されており、そしてHA分子量に対する経皮的輸送の明らかな依存性が存在することを示す。分子量がより低いほど、浸透は明らかによくなる。HAサイズ画分のいずれにについても、5および22時間において測定した見掛けのフラックス間に有意差は存在しなかった。
したがって、全体的に、HA浸透はHA分子量に依存する。分子量がより低いほど、皮膚浸透はよりよくなる。
しかしながら、皮膚を浸透する量は適用した放射能の小さい部分に対応する。
【０１４０】
実施例８．
HAの異なる分子量画分の局所的分布
蛍光標識化ヒアルロン酸の2つの異なる平均分子量の画分の皮膚吸収および分布をレーザー走査共焦点顕微鏡検査法により研究し、HA画分の平均分子量は300,000〜50,000 Daであった。
蛍光HA試料は1 mg/mlの濃度の水溶液であった。蛍光HA溶液を蒸留水中で同一分子量の非標識化HAで10倍に希釈した後、適用した。
【０１４１】
HA適用に使用した皮膚はブタの耳からの皮膚であった。各HA画分を異なる動物に由来する皮膚の少なくとも3つの試料について適用し、試験した。皮膚試料は新鮮なものとして獲得し、2週間より長く凍結貯蔵保持しないで使用した。
実験前に、融解した皮膚試料 (ほぼ0.8 cm2) を試料ガラス拡散セルのドナー相とレセプター相との間にはさみ、32℃に維持した。ドナー相は0.1 mlの標識化HA溶液であり、そしてレセプター相はpH 7.4の緩衝液であった。
【０１４２】
蛍光HA溶液を皮膚試料と3時間接触させ、次いで過剰のドナー溶液を除去し、皮膚をpH 7.4緩衝液で3回洗浄し、ティッシューでおだやかに乾燥させた。
皮膚を直ちに、角質層を上にして、ガラススライド上に設置し、LSM 410 倒立レーザー走査型顕微鏡 (Carl Zeiss、ドイツ国) により、それ以上プロセシングしないで顕微鏡検査した。このシステムは568および488 nmの励起波長を有するアルゴン-クリプトンレーザーを装備し、それぞれ皮膚および標識化HAを見るために別々に使用した。
【０１４３】
プラン-ネオフルアル (Plan-neofluar) 10×/0.3および40×/0.6対物レンズを使用して像を獲得し、引き続いて皮膚からの蛍光が赤色であり、そして標識化HAからの蛍光が緑色になるように、ディジタル的にカラーコード化した。Zeiss LSM共焦点ソフトウェアを使用して、像をカラーコード化し、上積み (またはスーパーインポーズ) した。
【０１４４】
別の実験において、皮膚試料を蛍光プローブの非存在下に検査した。ブタ皮膚からの自己蛍光は構造的特徴の同定を可能とした。蛍光性HAの分布を可視化するために、共焦点像をxy平面 (すなわち、皮膚表面に対して平行) において得た。角質層の特徴を示す形態を有する最も輝いた蛍光の結像平面として、皮膚表面 (z = 0μｍ) を規定した。皮膚の少なくとも3つの別々の片を使用して、反復試験の像を各処理のために獲得した。
【０１４５】
50,000 Daの蛍光標識化HA (F-HA 0.05) は、角質層表面上においてわずかに希薄に表面的に可視であったが、標識化HA画分は毛嚢の回りおよび/または毛嚢中に明瞭に可視であった。図2、パネルAは、皮膚表面 (角質層) 、毛嚢および毛幹を示す; パネルBはHAからの緑蛍光が主として毛嚢の回りおよび/または毛嚢中において可視であることを明瞭に示す。
【０１４６】
角質層表面上の希薄な蛍光は、存在する毛嚢を持たない、他の皮膚試料において確認された。図3、パネルAは皮膚表面を示す; パネルBは、標識化HAからのわずかに制限された蛍光がその表面上において可視であることを示す。
300,000 Daの蛍光標識化HA (F-HA 0.30) を使用して同様な観察を実施し、これはまた毛嚢の回りにおいて明瞭に可視であった。図4、パネルAは皮膚表面 (角質層) 、毛嚢および毛幹を示す; パネルBは毛嚢の回り標識化HAからの緑蛍光を示す。
【０１４７】
しかしながら、300,000 Daの標識化HA画分はまた皮膚表面においてわずかに希薄に表面的に可視であったが、それは皮膚表面上のケラチノサイト間における優先的蓄積を明瞭に示した。図5、パネルAは皮膚表面を示す; パネルBは標識化HAからの制限された蛍光がその表面上で可視であるが、それはケラチノサイト間に蓄積していることを示す。
【０１４８】
結論は、低分子量のHAが皮膚中の毛嚢構造物の上で、中でおよび回りに多少の優先的蓄積を示すということである。これは本発明の組成物の低分子量HA生成物のための1つの可能な浸透経路であることができ、これは毛髪の喪失または禿頭症の治療に関して特に重要であろう。
【０１４９】
0.05 MDaの低分子量HAの無傷の角質層を横切る輸送についての証拠は存在しなかった。なぜなら、HAの除去後、わずかに少ない蛍光種が表面層上に希薄に表面的に見出されたからである。最後に、0.30 MDaのHAは皮膚表面上でケラチノサイト間の優先的蓄積を示す。HAバリヤーが皮膚からの受動的経皮的水喪失を制限することができるので、これは皮膚水和の改良に寄与することがある。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図1は、実施例7に記載されているように、放射線標識化ヒアルロン酸の4つの異なる平均分子量画分の皮膚浸透剤を研究した結果を示す。結果を表6に示し、そして図1において可視化する。それらはHA分子量に対する経皮的輸送 (フラックス) の明らかな依存性が存在することを示し、より低い分子量の種がよりすぐれた浸透性を有することが明らかである。研究したHAサイズ画分のいずれについても5および22時間において測定した見掛けのフラックス間に有意差が存在しなかった。
【０１５１】
【図２】図2は、実施例8においてレーザー走査共焦点顕微鏡検査法を使用して、蛍光標識化ヒアルロン酸の2つの異なる平均分子量画分の皮膚吸収および分布を研究した結果を示す。HA画分の平均分子量は300,000および50,000 Daであった。50,000 Daの蛍光標識化HA (F-HA 0.05) は角質層表面上においてわずかに希薄に表面的に可視であったが、標識化HA画分は毛嚢の回りおよび/または毛嚢中に明瞭に可視であった。図2、パネルAは、皮膚表面 (角質層) 、毛嚢および毛幹を示す; パネルBはHAからの緑蛍光が主として毛嚢の回りおよび/または毛嚢中において可視であることを明瞭に示す。
【０１５２】
【図３】図3では、図2において見られる角質層表面上の希薄な蛍光は他の皮膚試料において確認され、これは存在する毛嚢を持たなかった。図3、パネルAは皮膚表面を示す; 図3、パネルBは、標識化HAからのわずかに制限された蛍光がその表面上において可視であることを示す。
【図４】図4は、300,000 Daの蛍光標識化HA (F-HA 0.30) を使用して同様な観察を実施し、これはまた毛嚢の回りにおいて明瞭に可視であったものを示す。図4、パネルAは皮膚表面 (角質層) 、毛嚢および毛幹を示す; パネルBは毛嚢の回り標識化HAからの緑蛍光を示す。
【図５】しかしながら、300,000 Daの標識化HA画分はまた皮膚表面においてわずかに希薄に表面的に可視であったが、それは皮膚表面上のケラチノサイト間における優先的蓄積を明瞭に示した。図5、パネルAは皮膚表面を示す; パネルBは標識化HAからの制限された蛍光がその表面上で可視であるが、それがケラチノサイト間に蓄積していることを示す。
【図１】
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【図２】
2008500411.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2008500411.tif 000014
2008500411.tif 000015
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