(57)【要約】  本発明は、共有結合的にグラフトされた生物活性種を含む高度に多孔質のポリマー材料に関する。また、本発明は、生物活性分子種にグラフトすることが可能な機能性モノマーを含む高度に多孔質の材料の調製方法であって、（ａ）液相と連続相とを含むとともにモノマーを含有するエマルジョン組成物を調製する工程と、（ｂ）エマルジョンを硬化する工程と、（ｃ）任意に、水／液相を除去する工程とを含む方法に関する。本発明はさらに、生物活性種を、かかる高度に多孔質のポリマー材料にグラフトするための方法であって、（ｉ）高度に多孔質の材料を、好適な溶媒中の生物活性種の溶液に曝す工程と、（ｉｉ）任意に、活性化剤を加える工程と、（ｉｉｉ）任意に、加熱する工程と、（ｉｖ）多孔質の材料を溶媒ですすいで、グラフトしていない種を除去する工程とを含む方法に関する。共有結合的にグラフトされた生物活性種を含む高度に多孔質のポリマー材料は、例えば、不均一触媒として、バイオセンサー、クロマトグラフィー、生物医学装置およびインプラントに使用することが可能である。【選択図】図１
2008536986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合的にグラフトされた生物活性種を含む高度に多孔質のポリマー材料。
【請求項２】
材料がモノリシックである、請求項１に記載の高度に多孔質の材料。
【請求項３】
前記共有結合的にグラフトされた生物活性種がタンパク質であり、好ましくは酵素であり、より好ましくは２種以上の酵素である、請求項１または２に記載の高度に多孔質のポリマー材料。
【請求項４】
生物活性分子種にグラフトすることが可能な機能性モノマーを含む高度に多孔質の材料の調製方法であって、
ａ．液相と連続相とを含むとともにモノマーを含有するエマルジョン組成物を調製する工程と、
ｂ．前記エマルジョンを硬化する工程と、
ｃ．任意に、前記水／液相を除去する工程と
を含む方法。
【請求項５】
工程ａ．の前記エマルジョン組成物が、架橋モノマー、機能性モノマー、重合開始剤、界面活性剤および水からなる群のうちの少なくとも１つをさらに含有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生物活性種を共有結合的にグラフトすることが可能な高度に多孔質のポリマー材料の調製方法であって、
ａ．以下のもの：
Ａ．機能性モノマーを５〜９５重量％、
Ｂ．架橋モノマーを５〜８０重量％、
Ｃ．重合開始剤を０〜１０重量％、
Ｄ．界面活性剤を０〜２０重量％、
Ｅ．機能性モノマーまたは架橋モノマー以外のモノマーを０〜９０重量％
（ここで、重量％は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの総重量に対するものである）
およびＦ、前記液相を構成する液体または液体組成物を７４〜９３体積％（ここで、体積％は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを含む連続相ならびに液相の全体積に対するものである）
を含む組成物から液相と連続相とを含むとエマルジョンを調製する工程と、
ｂ．前記エマルジョンを硬化する工程と、
ｃ．任意に、前記水／液相を除去する工程と
を含む方法。
【請求項７】
前記モノマー、架橋モノマーおよび機能性モノマーがビニル不飽和を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記モノマーが活性エステル基を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の高度に多孔質のポリマー材料に生物活性種をグラフトするための方法であって、
ａ．前記高度に多孔質の材料を、好適な溶剤中の生物活性種の溶液に曝す工程と、
ｂ．任意に、活性化剤を加える工程と、
ｃ．任意に、加熱する工程と、
ｄ．前記多孔質の材料を溶剤ですすいで、グラフトされていない種を除去する工程と
を含む方法。
【請求項１０】
前記生物活性種の溶液に用いられる溶剤が、水、より好ましくは水性緩衝液である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物活性種の溶液に用いられる溶剤が、有機溶媒である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物活性種の溶液に用いられる溶剤が、水と有機溶媒との混合物、またはより好ましくは水性緩衝液と有機溶媒との混合物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
不均一触媒としての、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生物活性種を含む高度に多孔質のポリマー材料の使用。
【請求項１４】
不均一触媒としての、請求項１に記載の生物活性種を含む高度に多孔質の材料の使用であって、１０回の反応およびすすぎサイクルの後に、同じ反応条件下で、触媒活性が元の活性の９０％超を保持する使用。
【請求項１５】
バイオセンサー、クロマトグラフィー、生物医学装置およびインプラントにおける、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生物活性種を含む高度に多孔質のポリマー材料の使用。
【請求項１６】
生物学的および生化学的に活性な装置、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生物活性種を含む高度に多孔質のポリマー材料。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、多孔質の材料に結合された生物活性分子種を含む高度に多孔質の材料に関する。また、本発明は、生物活性分子を共有結合的にグラフトすることが可能な高度に多孔質の材料を製造する方法、および多孔質の材料の材料に前記生物活性分子をグラフトするための方法に関する。さらに、本発明は、共有結合グラフトを介した生物活性分子を含む、かかる高度に多孔質の材料の、不均一触媒、バイオセンサー、クロマトグラフィー、生物医学装置およびインプラントへの用途に関する。さらに、本発明は、本発明による共有結合グラフトを介した生物活性分子を含む高度に多孔質の材料をベースとする任意の生物学的および生化学的に活性な装置に関する。
【０００２】
酵素などの生物活性分子種はこれまでに、疎水性同士の相互作用によって、疎水性の多孔質ポリマー材料に固定化されている［Ｅ．リュッケンシュタイン（Ｒｕｃｋｅｎｓｔｅｉｎ）およびＸ．ワン（Ｗａｎｇ）、Ｂｉｏｔｅｃｈ．およびＢｉｏｅｎｇ．、第４２巻、８２１頁（１９９３年）］。この物理吸着は共有結合ではなく、生物活性分子種（酵素）がその活性の一部を保持する一方、物理吸着の性質は、生物活性分子種がポリマー担体から離脱され（溶脱され（ｌｅａｃｈｅｄ））得るため、系の活性が後の再利用では低下するようなものである。このことは、ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）４３５などの、酵素が共有結合でない物理吸着プロセスを介してポリマービーズに固定化された市販の系においても見られる。
【０００３】
また、生物活性分子種は、ポリマー、例えばアガロースの誘導体に共有結合的に固定化されている［Ｒ．Ｇ．フロスト（Ｆｒｏｓｔ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、６７０、１６３頁（１９８１年）］。これは、生物学的または生化学的活性の保持をもたらすことができる。しかし、これらの系は、非孔質または高粘性のポリマーゲルであり、生物触媒反応手順において目的とする反応物質である、すなわち固定化された生物活性分子種と相互作用する化合物の拡散が著しく妨げられる。
【０００４】
したがって、生物活性分子種が固体担体表面から溶脱されず、よって生物学的または生化学的活性の低下につながる安定性の問題を生じないように、例えばタンパク質および酵素などの生物活性分子種を固体担体に固定化するための有効な方法が依然として求められている。さらに、固定化ひいては後の生物学的および生化学的作用のために利用できる表面積をできるだけ大きくするため、固体担体材料は機械的完全性を維持しながらできるだけ多孔質であることも望ましい。さらに、高い多孔性は、生物活性分子種が相互作用するか、反応するか、または反応を起こすことを目的とする化合物の液体流に固定化された酵素が曝される用途に有益であろう。
【０００５】
意外なことに、生物活性分子種を、共有結合グラフトを介して高度に多孔質のポリマー担体に固定化することによって、固定化された生物活性分子種の優れた活性および安定性が得られることが分かった。このようにして、生物活性分子種は分子の共有結合を介して高度に多孔質のポリマー担体に結合され、よってグラフトされるといわれている。このようにいったんグラフトされると、生物活性分子種はもはや、ある種の分解反応なしに担体から離脱することはなく、よってその生物学的活性を保持する。
【０００６】
また、本発明は、前記生物活性分子種をグラフトすることが可能な機能性モノマーを含む高度に多孔質の材料の調製方法であって、
ａ．液相と連続相とを含むとともにモノマーを含有するエマルジョン組成物を調製する工程と、
ｂ．エマルジョンを硬化する工程と、
ｃ．任意に、水／液相を除去する工程と
を含む方法に関する。
【０００７】
上記モノマーとは別に、エマルジョン組成物は、架橋モノマー、機能性モノマー、重合開始剤、界面活性剤および水も含有し得る。
【０００８】
エマルジョンの硬化は、例えば、熱的にまたは光化学的に行うことができる。
【０００９】
水／液相の除去は、有利なことには、例えば、蒸発、凍結乾燥、吸引ろ過によって行うことができる。
【００１０】
本発明の他の実施形態は、生物活性種を共有結合的にグラフトすることが可能な高度に多孔質のポリマー材料の調製方法であって、
ａ．以下のもの：
Ａ）機能性モノマーを５〜９５重量％
Ｂ）架橋モノマーを５〜８０重量％
Ｃ）重合開始剤を０〜１０重量％
Ｄ）界面活性剤を０〜２０重量％
Ｅ）機能性モノマーまたは架橋モノマー以外のモノマーを０〜９０重量％
（ここで、重量％は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの総重量に対するものである）
およびＦ、液相を構成する液体または液体組成物を７４〜９３体積％（ここで、体積％は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを含む連続相ならびに液相の全体積に対するものである）
を含む組成物から液相と連続相とを含むエマルジョンを調製する工程と、
ｂ．エマルジョンを硬化する工程と、
ｃ．任意に、水／液相を除去する工程と
を含む方法に関する。
【００１１】
本発明の文脈内では、高度に多孔質のポリマー材料という用語は、全空隙体積に対して７４％を超える多孔率を有する任意のポリマー材料を指す。特に、かかる材料は、高分散相エマルジョン（ＨＩＰＥ）の重合によって調製可能であり、いったん重合されたものはポリＨＩＰＥとして当該技術分野で公知である（Ｄ．バービー（Ｂａｒｂｙ）およびＺ．ハック（Ｈａｑ）、Ｅｕｒ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌ．６０１３８、１９８２年）。上記のプロセスから得られるこれらの高度に多孔質の材料は、モノリシック材料であり、すなわち、プロセスの結果、一体型の材料が得られる。これに対し、生物活性種がグラフトされた公知のポリマー材料は通常、ビーズ状または粒状である。
【００１２】
本発明の第１の方法は、種々のモノマーを含む好適なエマルジョン組成物を調製する工程と、モノマー相を後に硬化または架橋する工程とを含む。
【００１３】
ポリＨＩＰＥは、高分散相エマルジョン（ＨＩＰＥ）の重合から作製される。ＨＩＰＥは、液相が全体積の７４体積％超を占めるエマルジョンである（Ｋ．Ｊ．リサント（Ｌｉｓｓａｎｔ）編、Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐａｒｔ  １、マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９７４年、第１章）。ＨＩＰＥの場合には、連続相は、重合され得るとともに自身の典型的なセル構造をポリＨＩＰＥに与え得るモノマーを含有する。ポリマーの収縮は、エマルジョンの液滴構造のために、巨視的レベルでは起こり得ない。その結果、収縮は液滴間の連続相内で起き、セル壁に相互連通した窓が現われ、それによって、ポリＨＩＰＥは、液体および気体媒体に対して完全に透過性になり、よってそれらのモノリシック形状においてフロースルー用途に利用可能になる。
【００１４】
２種類のポリＨＩＰＥがあり、最も一般的なものは、逆エマルジョン（「油中水」型エマルジョンと呼ばれることが多い）から作製されるものであり、他方は、通常のエマルジョン（「水中油」型エマルジョン）から作製される。
【００１５】
逆エマルジョンから作製されるポリＨＩＰＥの連続相は、モノマー、好ましくは疎水性モノマー、最も好ましくは液相と不混和性のモノマーを含有する相である。本発明の実施例に記載されるスチレンおよびアクリレートベースのポリＨＩＰＥは、この種類のポリＨＩＰＥに属する。架橋剤と呼ばれる、２つ以上の重合性部分を有する少なくとも１種のモノマーを使用する必要がある。液相と混和性のモノマーを利用可能であるが、それらの液相への溶解が部分的であるために完全には重合され得ない。連続相は、エマルジョンの安定性を向上させるために少なくとも１種の界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤を含有する。連続相は、粗度を増して連続気泡構造中の空隙をさらに生成することによってポリＨＩＰＥの表面積を増大させるのに用いる際に、少なくとも１つの非重合性種、好ましくは液相と混和しない化学物質、最も好ましくはポロゲンと呼ばれることが多い疎水性溶媒を含有することができる（Ｐ．ヘイニー（Ｈａｉｎｅｙ）、Ｉ．Ｍ．ハックスマン（Ｈｕｘｍａｎ）、Ｂ．ロワット（Ｒｏｗａｔｔ）、Ｄ．Ｃ．シェリントン（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ）およびＬ．テトレー（Ｔｅｔｌｅｙ）、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９１年、２４、１１７；Ａ．バルベッタ（Ｂａｒｂｅｔｔａ）およびＮ．Ｒ．キャメロン（Ｃａｍｅｒｏｎ）、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００４年、３７、３２０２）。
【００１６】
逆エマルジョンから作製されるポリＨＩＰＥの液相は、疎水性の液体媒体、好ましくは疎水性の溶媒、最も好ましくは水である。それは、連続相との混和性を抑えることによってエマルジョンを安定化させる目的の塩または化学物質、光開始剤、または両方の混合物を含有することができるが、これらはまた、連続相ならびに両方の相中に含まれ得る。最後に、それは、連続相との界面で部分的に重合しやすい少なくとも１種のモノマー、好ましくは連続相中にも存在するモノマーを含有することができる。
【００１７】
通常のエマルジョンから作製されるポリＨＩＰＥの連続相は、モノマー、好ましくは親水性モノマー、最も好ましくは液相と混和しないモノマーを含有する相である。一例は、アリールエーテルスルホン部分によって終端されたマクロモノマーである。架橋剤と呼ばれる、２つ以上の重合性部分を有する少なくとも１種のモノマーを使用する必要がある。液相と混和性のモノマーを利用可能であるが、それらの液相への溶解が部分的であるために完全には重合されないであろう。連続相は、エマルジョンの安定性を向上させるために少なくとも１種の界面活性剤、好ましくはイオン性界面活性剤を含有する。連続相は、粗度を増して連続気泡構造中の空隙をさらに生成することによってポリＨＩＰＥの表面積を増大させるのに用いる際に、少なくとも１つの非重合性種、好ましくは液相と混和しない化学物質、最も好ましくはポロゲンと呼ばれることが多い、水などの親水性溶媒を含有することができる。
【００１８】
通常のエマルジョンから作製されるポリＨＩＰＥの液相は、疎水性の液体媒体、好ましくは疎水性の溶媒である。例は、石油エーテル、ヘキサン、および超臨界二酸化炭素である。それは、連続相との混和性を抑えることによってエマルジョンを安定化させる目的の化学物質を含有することができる。それはラジカル開始剤または光開始剤などの少なくとも１種の開始剤、または両方の混合物を含有することができるが、これらはまた、連続相ならびに両方の相中に含まれ得る。最後に、それは、連続相との界面で部分的に重合しやすい少なくとも１種のモノマー、好ましくは連続相中にも存在するモノマーを含有することができる。
【００１９】
ＨＩＰＥは、それらの液相の高い体積比（７４％超）（乾燥下でモノリスが壊れない限り液相を除去した後に少なくとも７４％多孔率のポリマーをもたらす）によって定義される。多孔率９９％のポリＨＩＰＥの複数の例がある（Ｊ．エスクエナ（Ｅｓｑｕｅｎａ）、Ｇ．Ｓ．Ｒ．Ｒ．サンカー（Ｓａｎｋｅｒ）およびＣ．ソランス（Ｓｏｌａｎｓ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００３年、１９、２９８３）。かかる材料は、セルを相互連通させる窓のためにモノリシック形態で液体媒体および気体に対して非常に透過性である。
【００２０】
基本的に、反応時にポリマー材料を形成するいかなる分子も本発明の文脈の範囲内でモノマーとして用いることができる。高分散相エマルジョンの連続相に可溶のモノマーを選択することのみが重要である。有機相が連続相である油中水型のＨＩＰＥについては、かかるモノマーは、好ましくは、有機相に十分に可溶であり、水相に不溶であるべきである。水中油型のＨＩＰＥについては、逆のことが当てはまる。
【００２１】
架橋モノマーは、重合の際に２つ以上のポリマー鎖間に架橋を形成することによって、架橋された網目構造の形成をもたらすような官能基を有するモノマーであるべきである。これらの架橋モノマーの選択は、上述したモノマーの場合のように、連続相への可溶性に基づくべきである。
【００２２】
本発明の文脈内では、機能性モノマーは、重合に関与し得る少なくとも１つの化学部分と、第２の段階で生物活性分子種と反応し、よって生物活性分子種をポリマー材料へグラフトすることができる少なくとも１つの他の化学部分とを含む。本発明の一実施形態では、グラフトできる化学部分は、中間段階で他の分子と反応可能であり、次いで生物活性分子種とグラフトすることが可能である。別の実施形態では、架橋モノマーおよび機能性モノマーの両方のモノマーが用いられる。したがって、かかるモノマーは、少なくとも２つ、好ましくは３つの重合性基および１つの化学部分を含み、生物活性種と反応可能である。かかるモノマーは、上記の成分Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの総重量に対して５〜９５重量％の量で用いることができる。
【００２３】
これは、一般構造式１ａ）Ｐ−Ｇ（式中、Ｐは重合に関与する化学部分を表し、Ｇは直接または間接的に生物活性分子種をグラフトするために後に用いられる化学部分である）によって、あるいは式１ｃ）Ｐ−Ｘ−Ｇ（式中、ＰおよびＧは上記の通りであり、Ｘは親水性または疎水性であり得る任意のスペーサー基である）として表すことができる。例としては、アルキル−、パーフルオロアルキル、エチレングリコール、または他のオリゴ−エーテルがある。
【００２４】
好ましい実施形態では、機能性モノマーは活性エステル基、最も好ましくは式２のｎ−ヒドロキシスクシンイミドをベースとする活性化エステル基を含有する。
【化１】
2008536986.tif 000003
【００２５】
生物活性分子種をグラフトするのに使用可能な官能基の他の例としては、マレイミド、チオール、イソチオシアネート、ヨードアセトアミド、２−ピリジル誘導体、アジド、オキシム、エポキシド、イソシアネートおよびアルデヒドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２６】
また、これらの機能性モノマーは、上記のモノマーおよび架橋モノマーの場合のように、ある程度、モノマー相へのそれらの可溶性に基づいて選択されるべきである。
【００２７】
式３に概略的に示されるように、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをベースとするモノマーのＰ基とＧ基との間にスペーサー基を導入することが可能である。
【化２】
2008536986.tif 000004
【００２８】
このようにして、例えば、限定されないが、３個またはそれ以上のメチレン基を有するアルキル鎖などからなるスペーサー基（ｘ）を選択することによって、疎水性を調節することができる。さらに、例えば、限定されないが、様々な長さｎを有するエチレンオキシド単位（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎなどの、本質的に親水性であるスペーサー基（Ｘ）を選択することによって、親水性を調節することができる。
【００２９】
本発明の他の実施形態では、モノマー、架橋モノマーおよび機能性モノマーは、ビニル不飽和を含み、好ましくはスチレンモノマー、より好ましくはメタクリルモノマー、最も好ましくはアクリルモノマーである。
【００３０】
本発明にしたがって用いられる開始剤は、水溶性または有機溶解性であってもよく、全体的にいずれかの相に加えられ、複数の相の間で分割されてもよく、エマルジョン形成の前、その間、またはその後に加えられてもよい。
【００３１】
１種または複数種の開始剤または開始剤部分が組み合わせて用いられる場合、これらは、必要に応じて、一緒にまたは別個に加えられてもよい。開始剤は、光開始剤および／または熱開始剤および／またはレドックス開始剤であり得る。
【００３２】
開始剤は、モノマーを重合させるのに有効な量で存在するべきである。典型的には、開始剤は、全連続相を基準にして、約０．００５〜約２０重量％、好ましくは約０．１〜約１５重量％、最も好ましくは約０．１〜約１０重量％の量で存在し得る。
【００３３】
本発明による方法において有用な開始剤は、例えば、光開始剤または熱開始剤であり得る。
【００３４】
光開始剤としては、以下の例、すなわち、アセトフェノン、アニソイン、アントラキノン、アントラキノン−２−スルホン酸、ナトリウム塩、トリカルボニルクロム、ベンジル、ベンゾイン、ベンゾインエチルエーテル、ベンゾインイソブチルエーテル、ベンゾインメチルエーテル、ベンゾフェノン、ベンゾフェノン／１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトンの５０／５０ブレンド、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、１，４−ベンゾイルビフェニル、２−ベンジル−２−（ジメチルアミノ）−４’−モルホリノブチロフェノン、４，４’−ビス（ジエチルアミノ）ベンゾフェノン、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ベンゾフェノン、３−カンファーキノン、２−クロロチオキサンテン−９−オン、（クメン）シクロペンタジエニル鉄（ＩＩ）、ヘキサフルオロホスフェート、ジベンゾスベレノン、ジエトキシアセトフェノン、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、４−（ジメチルアミノ）ベンゾフェノン、４，４’−ジメチルベンジル、２，５−ジメチルベンゾフェノン、３，４−ジメチルベンゾフェノン、ジフェニル（２，４，６−トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド／２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオフェノンの５０／５０ブレンド、４’−エトキシアセトフェノン、２−エチルアントラキノン、フェロセン、３’−ヒドロキシアセトフェノン、４’−ヒドロキシアセトフェノン、３−ヒドロキシベンゾフェノン、４−ヒドロキシベンゾフェノン、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオフェノン、２−メチルベンゾフェノン、３−メチルベンゾフェノン、メチルベンゾイルホルメート、２−メチル−４’−（メチルチオ）−２−モルホリノプロピオフェノン、フェナントレンキノン、４’−フェノキシアセトフェノン、チオキサンテン−９−オン、トリアリールスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート塩、トリアリールスルホニウムヘキサフルオロホスフェート塩が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３５】
熱開始剤としては、以下の例、すなわち、ｔｅｒｔ−アミルペルオキシベンゾエート、４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ベンゾイルペルオキシド、２，２−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）ブタン、１，１−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、２，５−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）−２，５−ジメチルヘキサン、２，５−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）−２，５−ジメチル−３−ヘキシン、ビス（１−（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）１−メチルエチル）ベンゼン、１，１−ビス（１−（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルアセテート、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシベンゾエート、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシイソプロピルカルボネート、クメンヒドロペルオキシド、シクロヘキサノンペルオキシド、ジクミルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、２，４−ペンタンジオンペルオキシド、過酢酸が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３６】
開始剤は、単独で、あるいは、他の開始剤、還元剤、および／または触媒と組み合わせて用いることができる。レドックス重合系に有用な還元剤および触媒は周知であり、所定の開始剤のための特定の還元剤または触媒の選択は、当業者のレベルの範囲内である。
【００３７】
レドックス系に有用な還元剤の例としては、第一鉄、亜硫酸水素塩、チオ硫酸塩、および種々の還元糖およびアミンが挙げられる。アスコルビン酸、ヒドロ亜硫酸ナトリウムおよび／またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミンを還元剤として用いることが好都合である。
【００３８】
用いられる還元剤または触媒は、典型的には、重合の開始が望まれるとき、すなわち、一般にエマルジョンが形成された後に導入される。開始剤は、それが水溶性か油溶性かに応じて、水相または油相に加えることができる。水溶性および油溶性の開始剤の組合せを用いることもできる。
【００３９】
任意に、内部水相は、安定したエマルジョンを形成する際に界面活性剤を助けるための水溶性電解質を含み得る。水溶性電解質としては、無機塩（１価、２価、３価の無機塩またはそれらの混合物）、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、および、ハロゲン化物、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩などの重金属塩、ならびにそれらの混合物が挙げられる。かかる電解質としては、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化アルミニウムおよびそれらの混合物が挙げられる。ハロゲン化物などの、１価のアニオンを含む１価または２価の塩が好ましい。
【００４０】
本発明による他の実施形態は、第１の方法にしたがって調製された高度に多孔質のポリマー担体への生物活性分子種の共有結合グラフトであり、共有結合グラフトは、
ａ．高度に多孔質の材料を、好適な溶剤中の生物活性分子種の溶液に曝す工程と、
ｂ．任意に、活性化剤を加える工程と、
ｃ．任意に、加熱する工程と、
ｄ．多孔質の材料を溶剤ですすいで、グラフトされていない種を除去する工程と
を含む。
【００４１】
あるいは、生物学的物質のグラフトは、モノマーの重合とともに起こり得る。かかる手順のための前提条件は、重合プロセスが生物学的物質の活性に実質的に影響しない条件が適用され、生物学的物質を含むことが、エマルジョンまたは重合プロセスの安定性に実質的に影響しないことである。
【００４２】
上記の工程ｂ）に任意に用いられる活性化剤は、例えば触媒または開始剤などの、多孔質の材料と生物活性種との間の反応を促進する化合物である。
【００４３】
本発明の文脈内では、生物活性分子種は、いったん高度に多孔質のポリマー担体にグラフトされると、生物系と相互作用することができ、生物系と反応するかまたは当業者に公知のような生化学的機序を介して生物学的種または化学種の反応を引き起こす、任意の生物学的、生体由来（ｂｉｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ）または生体模倣（ｂｉｏ−ｍｉｍｅｔｉｃ）の分子種を指す。
【００４４】
かかる生物活性分子種としては、核酸、ヌクレオチド、オリゴ糖、ペプチド、ペプチド核酸および糖タンパク質、プロテオグリカン、抗体、脂質あるいは上記の任意のものの模倣体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、生物活性分子種はタンパク質または酵素であり、ここで、当該技術分野で公知の酵素は、生体触媒タンパク質と呼ばれる。
【００４６】
本発明の他の好ましい実施形態では、生物活性分子種は、タンパク質の混合物、酵素とタンパク質との混合物、最も好ましくは酵素の混合物などの異なる種の混合物であってもよい。本発明にしたがって２種以上の酵素を固定化する際に、酵素カスケード合成として当該技術分野で公知のもので、多段階の生体触媒反応を行うことが可能である。
【００４７】
第２の方法の工程ｉ）およびｉｉｉ）で用いられる溶剤は、生物活性分子種の安定溶液を形成可能な任意の溶媒系であり得る。溶剤は水または有機溶媒、より好ましくは水性緩衝溶液あるいは有機溶媒と水性緩衝液との混合物であり得る。工程ｉ）およびｉｉｉ）で用いられる溶剤は、同じであっても、または異なる溶剤を工程ｉｉｉ）で用いてもよい。
【００４８】
また、本発明は、不均一触媒への用途のための、共有結合グラフトを介した生物活性分子を含む高度に多孔質のポリマー材料の使用に関する。さらに、本発明は、１０回、より好ましくは５０回、最も好ましくは１００回の反応およびすすぎサイクルの後に、生体触媒活性が元の活性の９０％以上を保持する、不均一触媒へのかかる用途に関する。
【００４９】
さらに、本発明は、本発明による、バイオセンサー、クロマトグラフィー、任意の生物医学装置およびインプラントならびに生物学的または生化学的に活性な装置への、共有結合グラフトを介した生物活性分子を含む高度に多孔質のポリマー材料の使用に関する。
【００５０】
また、本発明は、分析目的のため、したがって、ある化学物質の存在または不存在を、化学物質の存在または不存在と定性的または定量的に相関する検知可能な信号に変換するための、共有結合グラフトを介した生物活性分子を含む高度に多孔質のポリマー材料の使用に関する。
【００５１】
［実施例］
特に記載がなければ、全ての化学物質は、入手したままの状態で用いられる。
【００５２】
用いた紫外線硬化系は、Ｉ６００Ｍ  Ｄ−バルブが装備されたフュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）ＤＲＳＥ−Ｉ２０ＱＮＬ照射器であった。全紫外線照度（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）を、１．０Ｊ／ｃｍ２（ベルト速度：２０フィート／分）に設定した。
【００５３】
走査型電子顕微鏡は、フィリップスＸＬ３０ＣＰであった。試料を全て、導電性を高めるために金で被覆し、カーボンペーストでアルミニウムスタブ上に装着し、電子ビームを、倍率に応じて５〜２０ｋＶに設定した。
【００５４】
蛍光光学顕微鏡は、ライカＣＣ−１２カメラが結合されたライカＭＺＦＬＩＩＩであった。青色フィルタを用いた（４８０±５０ｎｍ）。ポリＨＩＰＥ試料を、黒色背景のガラススライド上に付着させた。
【００５５】
紫外線可視分光光度計は、フローセルとともに用いるための蠕動ポンプを含むヒタチ（Ｈｉｔａｃｈｉ）Ｕ−２０００であった。４００ｎｍにおける吸光度を監視し、１０秒ごとに値を取った。
【００５６】
［比較例１］
比較例１は、高分散相エマルジョンから熱重合された高度に多孔質の材料を作製するためのバッチ処理の生成物である。
【００５７】
スチレン（４．５ｍｌ、アルドリッチ）、ジビニルベンゼン（０．５ｍｌ、アルドリッチ）、およびソルビタンモノ−（Ｚ）−９−オクタデセノエートであるＳＰＡＮ８０（１．０ｍｌ、アルドリッチ）を５０ｍｌの口径の広いプラスチックボトルに入れ、矩形のＰＴＦＥパドルが装着されるとともにオーバーヘッド攪拌器モータに接続された鋼製の攪拌ロッドで、３００ｒｐｍで攪拌した。窒素流束をボトルにわたって保持した。過硫酸カリウム（０．２２ｇ、アルドリッチ）および塩化カルシウム（０．５０ｇ、無水、アルドリッチ）を含有する脱イオン化した脱気水（４５ｍｌ）を、絶えず攪拌しながら滴下して加え（約１ｍｌ／分）、ＨＩＰＥを形成した。水相を加える際に、形成しているＨＩＰＥの表面のすぐ下での攪拌を保つようにボトルを下げて、水のポケットが形成されないようにする。全ての水相が加えられたら、攪拌をさらに１０分間続けて、できるだけ均一なエマルジョンを生成する。次いで、ボトルを窒素でフラッシュしたオーブンに入れ、６０℃で４８時間加熱した。ボトルを切断し、ポリマーの管状の片をソックスレー（Ｓｏｘｈｌｅｔ）装置の中に入れ、水（２００ｍｌ）で２４時間、次いでアセトン（２００ｍｌ）で２４時間洗浄した。次いで、モノリスをオーブン中で５０℃で２４時間、軽い減圧下で乾燥させた。
【００５８】
ポリマーは硬質で壊れやすいが、これは純粋なスチレン系ポリＨＩＰＥの典型である。水置換によって測定された比較例１の密度は、連続相／液相の比１：９で予測して約０．０９ｇ／ｃｍ３であった。窒素吸着によって測定されブルナウアー−エメット−テラー（Ｂｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ）モデル面積を適用する典型的な表面積は、約４ｍ２／ｇであった。図１は、ポリＨＩＰＥを特徴付ける連続気泡構造を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【００５９】
［比較例２〜５］
比較例２〜５は、種々の比率の主モノマーを含む高分散相エマルジョンから光重合された高度に多孔質の材料を作製するためのバッチ処理から生成される。重量パーセントは、連続相の総重量を指す（比較例２〜５では５．００ｇ）。
【００６０】
比較例２では、２−エチルヘキシルアクリレート（アルドリッチ製、表１を参照のこと）、イソボルニルアクリレート（アルドリッチ製、表１を参照のこと）、トリメチロールプロパントリアクリレート（アルドリッチ製、表１を参照のこと）、ソルビタンモノ−（Ｚ）−９−オクタデセノエートであるＳＰＡＮ８０（アルドリッチ製、表１を参照のこと）およびダロキュア４２６５、すなわちダロキュアＴＰＯ（ジフェニル（２，４，６−トリメチルベンゾイル）−ホスフィンオキシド）とダロキュア１１７３（２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１−プロパノン）との５０／５０ブレンド（チバガイギー製、表１を参照のこと）を５０ｍｌの口径の広いプラスチックボトルに入れ、矩形のＰＴＦＥパドルが装着されるとともにオーバーヘッド攪拌器モータに接続された鋼製の攪拌ロッドで、３００ｒｐｍで攪拌した。窒素流束をボトルにわたって保持した。脱イオン化した脱気水（表１を参照のこと）を、絶えず攪拌しながら滴下して加え（約１ｍｌ／分）、ＨＩＰＥを形成した。水相を加える際に、形成しているＨＩＰＥの表面のすぐ下での攪拌を保つようにボトルを下げて、水のポケットが形成されないようにする。全ての水相が加えられたら、攪拌をさらに１０分間続けて、できるだけ均一なエマルジョンを生成する。２時間以内に重合されない場合、ＨＩＰＥを使用前に再び１０分間攪拌して、均一な液滴を確保する必要があった。
【００６１】
方形のＰＴＦＥフレームを用いて、ガラスプレート上に金型（金型サイズ：５ｃｍ辺、厚さ５ｍｍ）を形成した。ＨＩＰＥを中に注ぎ、第２のガラスプレートを用いて金型を閉じた。コンベヤ速度２０フィート／分で、焦点を合わせて、１００％出力で、Ｉ６００Ｍ  Ｄ−バルブが装備されたフュージョンＤＲＳＥ−Ｉ２０ＱＮＬ照射器の下に、金型の各辺を交互に３回ずつ通した。光重合されたＨＩＰＥを、かみそりの刃を用いて金型から除去した。硬化された湿潤試料を、６００ｍｌビーカー中の１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のアセトン／水混合物１００ｍｌ中に浸した。６０℃で１時間、ゆっくりと磁気攪拌にかけた。次いで、溶液を別の新鮮な１００ｍｌと取り替え、再び６０℃で１時間攪拌した。このプロセスを６回繰り返した。最後の洗浄の際には、１：３のアセトン／水混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いた。次いで、湿潤ポリＨＩＰＥを−８０℃の冷凍庫内で完全に凍結するまで凍結させ、凍結乾燥機内に２４時間入れて、サイズの収縮が５％未満の乾燥ポリＨＩＰＥを得た。凍結乾燥を用いずに乾燥した試料は、４０〜５０％の収縮を示した。いかなる場合も、有機緩衝液混合物を用いて再び試料を湿らせれば収縮を完全に元に戻すことができる。ある有機溶媒が水性緩衝液または水と混合されていない限り、乾燥ポリＨＩＰＥの水の吸い上げは非常に遅い。
【００６２】
比較例２〜５では、２−エチルヘキシルアクリレートおよびイソボルニルアクリレートの量を表１に記載のように変更し、イソボルニルアクリレートの量を増加した結果として、軟質で弾性（比較例２）ないし硬質で壊れやすい（比較例５）の範囲のポリＨＩＰＥを得た。
【００６３】
これらの例で調製され水置換によって測定される乾燥ポリＨＩＰＥの典型的な密度は、連続相／液相の比１：９で予測して約０．１０ｇ／ｃｍ３であった。上記の面積として測定される典型的な表面積は、約１．９ｍ２／ｇであった。
【００６４】
【表１】
2008536986.tif 000005
【００６５】
［実施例１〜９］
実施例１〜９は、機能性モノマーＮ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳＩ）を含む高度に多孔質のポリマーであり、よって生物活性種を共有結合的にグラフトすることが可能である。
【００６６】
実施例４では、２−エチルヘキシルアクリレート（アルドリッチ製、表２を参照のこと）、イソボルニルアクリレート（アルドリッチ製、表２を参照のこと）、トリメチロールプロパントリアクリレート（０．５０ｇ、アルドリッチ製）、界面活性剤ＳＰＡＮ８０（０．６５ｇ、アルドリッチ製）およびダロキュア４２６５（０．３５ｇ、チバガイギー製の光開始剤）を５０ｍｌの口径の広いプラスチックボトルに入れ、矩形のＰＴＦＥパドルが装着されるとともにオーバーヘッド攪拌器モータに接続された鋼製の攪拌ロッドで、３００ｒｐｍで攪拌した。Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（アクロス（Ａｃｒｏｓ）製、表２を参照のこと）を３回に分けて加え、次の分が加えられる前に完全に溶解されるように時間を与える。窒素流束をボトルにわたって保持した。Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（アクロス製、表２を参照のこと）を含有する脱イオン化した脱気水（４５ｇ）を、絶えず攪拌しながら滴下して加え（約１ｍｌ／分）、ＨＩＰＥを形成した。水相を加える際に、形成しているＨＩＰＥの表面のすぐ下での攪拌を保つようにボトルを下げて、水のポケット（すなわち、水相の２つ以上の液滴が形成されている場合の、反応混合物が不均一である領域）が形成されないようにする。全ての水相が加えられたら、攪拌をさらに１０分間続けて、できるだけ均一なエマルジョンを生成する。２時間以内に重合されない場合、ＨＩＰＥを使用前に再び１０分間攪拌して、最適な液滴径を確保する必要があった。
【００６７】
この配合物の硬化を、比較例２〜５に示されているように行い、さらに得られた高度に多孔質の機能性ポリマーを洗浄および乾燥した。密度および表面積も比較例２〜５と同様であった。
【００６８】
実施例１〜３および５〜９のポリＨＩＰＥを同じように作製した。実施例１〜５のそれぞれのための出発材料の量を表２に示す。表２に示されていない量は、実施例４に記載のものと同じである。
【００６９】
実施例１〜４を、連続相に１０％ｗ／ｗのイソボルニルアクリレートを含有するエマルジョンから作製した。ここで、重量パーセントは、連続相を構成している材料（すなわち、ＥＨＡ、ＩＢＯＡ、ＮＡＳＩ（液滴相のＮＡＳＩを除く）ＳＰＡＮ８０およびダロキュア）の総重量に対するものである。それらは、連続相内、液相内、またはその両方に導入された様々な量のＮ−アクリロキシスクシンイミドを含有する。
【００７０】
実施例５〜８を、連続相に３０％ｗ／ｗのイソボルニルアクリレートを含有するエマルジョンから作製した。それらは、連続相内、液相内、またはその両方に導入された様々な量のＮ−アクリロキシスクシンイミドを含有する。
【００７１】
実施例９を、連続相に４０％ｗ／ｗのイソボルニルアクリレートを含有するエマルジョンから作製した。Ｎ−アクリロキシスクシンイミドは、液相内にのみ導入され得るが；そうでなければエマルジョンを安定化させることができないであろう。表２は、実施例１〜９を調製するための作製されたエマルジョンの違いをまとめている。
【００７２】
【表２】
2008536986.tif 000006
【００７３】
図３の実施例の走査型電子顕微鏡写真は、Ｎ−アクリロキシスクシンイミドの組込みの効果を示す。Ｎ−アクリロキシスクシンイミドは、液相への部分的な可溶性のために、液相に導入された際（図３、実施例７）には、連続気泡構造の規則性が部分的に乱してセルのサイズ分布を広げ、連続相内にのみ導入された際（図３、実施例６）には、より薄いセル壁を生じた。
【００７４】
［ブラッド−フォードアッセイを用いた、溶液のタンパク質濃度の判定］
ブラッド−フォードアッセイタンパク質測定試験に適合する、バイオ−ラッド製のタンパク質アッセイ試薬を用いて、純粋な水性緩衝液または３０％ｖ／ｖまでのエタノールを含有する水性緩衝液中のタンパク質または酵素の濃度を判定した。
【００７５】
タンパク質溶液を用いて、水で系列希釈を行い、０〜２５μｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する０．８ｍｌの試料を調製した。次いで、純粋なタンパク質アッセイ試薬を各希釈試料に加えた。試薬は、Ｇ−２５０クマシーブルー、すなわち、タンパク質の塩基性および芳香族残基と速やかに反応して、明るい青色の錯体を形成する色素を含有する。１０分間攪拌した後、試料を紫外線可視分光光度計内に入れ、５９５ｎｍにおける吸光度を測定した（タンパク質を含有しない試料でゼロ吸光度を設定した）。外部検量線を、０〜２０μｇ／ｍｌの範囲のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む試料を用いて測定した。この曲線（図４）を用いて試料における吸光度およびタンパク質の量の相関をとった。
【００７６】
［緑色蛍光タンパク質の緩衝液交換のためのプロトコル］
この実施例では、スクシンイミドエステル（実施例１〜９）を含有するポリＨＩＰＥを共有結合的に固定化するための組み換え緑色蛍光タンパク質（ｒＡｃｅ−ＧＦＰ）を調製するのに用いられるプロセスを記載する。本プロセスは、ほとんどの場合、緩衝液を交換するとともにｒＡｃｅ−ＧＦＰが送達された添加剤を除去するためのタンパク質の透析を含んだ。
【００７７】
エヴロゲン（Ｅｖｒｏｇｅｎ）製の組み換えＡｃｅ−緑色蛍光タンパク質を用いた。１つのバイアルのＡｃｅ−ＧＦＰ（１ｍｇ／ｍｌにおいて０．１０ｍｌ）を、５種のポリＨＩＰＥ試料（２０μｇ／試料）のために用いた。１つのバイアルを、ミリポア・マイクロコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）ＹＭ−１０遠心分離装置（膜の排除分子量：１００００）でリン酸緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ８．０）に対して透析した。リン酸緩衝液（０．５ｍｌ）を６回加えてから８０００Ｇで２０分間遠心分離した後、エタノール（３０％ｖ／ｖ）を含有するリン酸緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ８．０）を用いてタンパク質濃縮物を最終的に２．０ｍｌにした。
【００７８】
［実施例１０］
実施例１０では、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（実施例１〜９）の仕込み量の様々なポリＨＩＰＥに緑色蛍光タンパク質を共有結合的にグラフトするためのプロセスを記載する。比較例２〜４のポリＨＩＰＥを陰性対照として用いた。固定化プロセスは各ポリＨＩＰＥについて同じであり、すなわち、５ｍｍのポリＨＩＰＥキューブを切断し、秤量し、２．０ｍｌのエッペンドルフバイアルに入れた。バイアルを透析したｒＡｃｅ−ＧＦＰ（０．４０ｍｌ）で満たし、ローラー攪拌器で４時間攪拌させた。次いで、バイアルの内容物を、直径５．５ｃｍのペーパーフィルタに注ぎ、フィルタ装置に減圧をかけ、エタノール（３０％ｖ／ｖ）を含有するリン酸緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ７．０）を、ポリＨＩＰＥ片に滴下して加えた。吸引は、溶媒をポリマーに勢いよく通すことによって速やかな洗浄を可能にした。２０ｍｌの緩衝液を各片のために用い、洗浄されたＧＦＰグラフトされたポリＨＩＰＥキューブを、エタノール（３０％ｖ／ｖ）を含有するリン酸緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ７．０）の中に入れた。溶出容量が２０ｍｌになった後の洗浄液に、ブラッド−フォード試験を用いてｒＡｃｅ−ＧＦＰを検出することはできなかった。表３は、どのポリＨＩＰＥを固定化のために用いたかを示す。
【００７９】
【表３】
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【００８０】
ｒＡｃｅ−ＧＦＰに曝されその後洗浄された湿潤ポリＨＩＰＥキューブを、黒色背景の顕微鏡ガラススライド上に置き、ライカＭＺＦＬＩＩＩ蛍光顕微鏡で青色ランプ（発光：４８０±５０ｎｍ）の下で調べた。ライカＣＣ−１２デジタルカメラで写真を撮影した。比較例２、および実施例１、２、４の、タンパク質の塩基性表面残基（おそらく主にリジン）と、Ｎ−アクリロキシスクシンイミドの活性化されたエステル官能基との間の反応によって生じると考えられるポリＨＩＰＥの写真は、図５に見られ、ポリＨＩＰＥの蛍光と機能性モノマー（ＮＡＳＩ）との間の関係を明確に示している。比較例２は、機能性モノマーを含まず、蛍光を示さず、このことは、非常にわずかなｒＡｃｅ−ＧＦＰがこの非機能性ポリＨＩＰＥに物理的に吸着されるかまたは全く吸着されないことを示唆している。
【００８１】
タンパク質の塩基性表面残基（例えばリジン）と、等価な仕込み量のＮ−アクリロキシスクシンイミドの活性化されたエステル官能基との間の反応によって生じると考えられるポリＨＩＰＥにおける固定化プロセスは、ポリＨＩＰＥ中のイソボルニルアクリレートの量が増加した際に、おそらく、ほとんどのタンパク質が届かないＮＡＳＩのスクシンイミドエステルを作製するバルキーなイソボルニル基の立体障害効果のために効率性が悪くなる。非機能性ポリＨＩＰＥ（比較例２）およびｒＡｃｅ−ＧＦＰに曝されその後洗浄されたＮ−アクリロキシスクシンイミド含有ポリＨＩＰＥ（実施例２）のキューブを、リン酸緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ７．０）およびエタノール（３０％ｖ／ｖ）を含有するペトリ（Ｐｅｔｒｉ）皿に入れた。各キューブのラマンスペクトルを、５２４〜５３２ｎｍのラマンレーザーで取り、ｒＡｃｅ−ＧＦＰを含まない溶液のラマンスペクトルと比較した。蛍光は、ラマン効果に対して強く競合する効果であるため、蛍光材料に対して、ラマン分光法を用いることは一般に不可能である。意外なことに、ｒＡｃｅ−ＧＦＰ吸着がレーザーの波長とそれほどかけ離れていないため、ラマンレーザーを用いて、図６のポリＨＩＰＥキューブの内部の蛍光を判定した。比較例２のキューブは蛍光を示さず（黒色のスペクトル）、このことは、アクリレートをベースとするポリＨＩＰＥ自体が非蛍光性であるとともにｒＡｃｅ−ＧＦＰを共有結合的または物理的に固定化できないことを証明している。実施例２のキューブ（赤色の曲線）は、ほぼレーザーの波長（約５０５ｎｍ）を中心とするとともに溶液中のｒＡｃｅ−ＧＦＰの蛍光ピーク（青色スペクトル）に対応する蛍光スペクトルを示した。
【００８２】
Ｎ−アクリロキシスクシンイミドなどの機能性モノマーを含有するアクリレートをベースとするポリＨＩＰＥなどの高度に多孔質のポリマーが、タンパク質、この場合ｒＡｃｅ−ＧＦＰを共有結合的にグラフトすることが可能であることが実証された。また、実施例２のキューブの厚さにわたって様々なポイントで共焦点レーザーを集束させることによって、蛍光が一定であり、よって固定化がキューブの容積全体で均一であったことが示された。
【００８３】
［固定化のためのＣＡＬ−Ｂの調製（透析および緩衝液交換）］
このセクションでは、スクシンイミドエステルを含有するポリＨＩＰＥにおける共有結合的な固定化のためにカンジダ・アンタークチカ・リパーゼ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｌｉｐａｓｅ）Ｂ（ＣＡＬ−Ｂ）を調製するのに用いられるプロセスを記載する。本プロセスは、ほとんどの場合、緩衝液を交換するとともにＣＡＬ−Ｂが送達された添加剤を除去するためのタンパク質の透析を含んだ。リン酸緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ８．０）とともに記載されるこのプロセスが、用いられる酵素に適した任意の水性緩衝液および任意のｐＨに適用可能であることは強調されるべきである。
【００８４】
純粋なＣＡＬ−Ｂ源として、ノボザイムＮ５２５Ｌを用いた。Ｎ５２５Ｌを知られていない緩衝液（ｐＨ７．０）内でグリコール（５０％ｖ／ｖ）で送達した。２つのミリポア・セントリコン・プラス−２０遠心分離装置（膜の排除分子量：２００００）を用いて緩衝液を交換し、グリセロールを除去した。各チューブにＮ５２５Ｌ（８ｍＬ）およびリン酸緩衝液（９ｍＬ、６６ｍＭ、ｐＨ８．０）を仕込み、次いで、２０分間２０００Ｇで８回遠心分離し、各運転の後リン酸緩衝液を用いて容積が最終的に１７ｍＬになるようにした。次いで、両方のチューブからＣＡＬ−Ｂ濃縮物を採取し、リン酸緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ８．０）中に分散し、最終容積が１０．５ｍＬになるようにした。ブラッド−フォードタンパク質測定を行い、最終溶液中のＣＡＬ−Ｂ濃度を判定した。
【００８５】
［実施例１１］
実施例１１では、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（実施例４の）を含有する光重合ＨＩＰＥにおけるカンジダ・アンタークチカ・リパーゼＢ（ＣＡＬ−Ｂ）の固定化のための一般的なプロセスを記載する。リン酸緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ８．０）とともに記載されるこのプロセスが、用いられる酵素に適した任意の水性緩衝液および任意のｐＨに適用可能であることは強調されるべきである。この場合、エタノール（２０％ｖ／ｖ）を含有するリン酸緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ７．０）が、保管および酵素活性試験のための緩衝液として選択されるが、担持される酵素がどのプロセスを取るかに応じて他の緩衝液または溶媒を用いることが可能である。
【００８６】
実施例４の１片のポリＨＩＰＥを切断して秤量した（通常１００ｍｇ）。ＣＡＬ−Ｂ（１ｍｌ、前のセクションの透析されたＮ５２５Ｌ）、リン酸緩衝液（３ｍｌ、６６ｍＭ、ｐＨ７．０）およびエタノール（１ｍｌ）を含有する１０ｍｌ透明ガラス試料ボトルにそれを入れた。試料ボトルをローラー攪拌器で室温で４時間振とうした。次いで、試料ボトルの内容物を直径５．５ｃｍのペーパーフィルタに注ぎ、フィルタ装置に減圧をかけ、エタノール（２０％ｖ／ｖ）を含有するリン酸緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ７．０）の混合物を、ポリＨＩＰＥ片に滴下して加えた。吸引効果は、溶媒をポリマーに勢いよく通すことによる速やかな洗浄を可能にした。約５０ｍｌを用いてポリＨＩＰＥを洗浄し、エタノール（２０％ｖ／ｖ）を含有するリン酸緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ７．０）中に入れた。洗浄分画をブラッド−フォード試験にかけて、固定化されていないＣＡＬ−Ｂの量およびポリＨＩＰＥ中で固定化されたＣＡＬ−Ｂの量を判定した。さらに、この固定化の共有結合的な性質を前提として、固定化された酵素またはポリマーマトリックスを分解させた条件を用いずに、ポリマーから固定化されたＣＡＬ−Ｂを除去できなかったことに留意されたい。
【００８７】
［実施例１２］
実施例１２では、パラ−ニトロフェニルエステル基質の酵素加水分解に基づく、ノボザイムＮ５２５Ｌ由来のカンジダ・アンタークチカ・リパーゼＢ（ＣＡＬ−Ｂ）における活性試験を記載する。
【００８８】
パラ−ニトロフェニルアセテート（ＰＮＰＡ）を基質として用いて、ＣＡＬ−Ｂの加水分解活性を評価した。エタノール（２０％ｖ／ｖ）を含有するリン酸緩衝液（１．９ｍｌ、６６ｍＭ、ｐＨ７．０）を、２ｍｌの紫外線可視石英セルに入れた。次いで、ＰＮＰＡ（０．１ｍｌ、４×１０−３ｍｍｏｌ、絶対エタノール中の７．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）を加え、ヒタチＵ−２０００紫外線可視分光光度計中の４００ｎｍにおける吸光度の増加を２分間続け、緩衝液中のバックグラウンドＰＮＰＡ化学的加水分解速度の測定をした。次いで、水中で希釈されたＣＡＬ−Ｂ（０〜０．１０ｍｌの様々な容積）を加え、パラ−ニトロフェニルの解離よる４００ｎｍにおける吸光度の増加を、線形性からの逸脱が観察されるまで続けた。計算のために、吸光度の増加曲線の傾斜から活性を推測し、化学的加水分解活性を全活性から差し引いて、単独の酵素加水分解活性を定量した。図７は、様々な量の透析され希釈されたノボザイムＮ５２５Ｌの活性曲線を示す。
【００８９】
［実施例１３］
実施例１３では、再現可能な条件（担体、流量、時間）下で、様々な多孔質の担体（ポリＨＩＰＥ上に担持されたＣＡＬ−Ｂ、ビーズ上に担持されたＣＡＬ−Ｂ）の活性を判定するために用いられる設備を記載する。この設備を用いて、実施例１１に記載されるように行われた固定化実験から得られる様々な担持されたＣＡＬ−Ｂの活性を比較する。
【００９０】
シリコーンゴムチューブ（内径１．５ｍｍ）を用いて容器（１０ｍｌガラス試料ボトル）の上のミニカラム（長さ２０ｍｍ、内径５ｍｍ）に接続された紫外線可視石英フローセル（内部容量：１ｍｌ）を用いて閉ループを構築した。蠕動ポンプをフローセルのすぐ前のチューブに装着して、ループ中に急流（３０ｍｌ／分）を生成した。様々な担持されたＣＡＬ−Ｂをミニカラムガラスフィルタの上部に充填し、液体流れが担体を通るようにした。４００ｎｍにおける吸光度０を規定するために、エタノール（２０％ｖ／ｖ）を含有するリン酸緩衝液（９．５０ｍｌ、６６ｍＭ、ｐＨ７．０）をループに通して再循環させた。次いでＰＮＰＡ（０．５０ｍｌ、２０×１０−３ｍｍｏｌ、絶対エタノール中の７．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）を反応槽に加え、パラ−ニトロフェノール化学的加水分解のための４００ｎｍにおける吸光度の増加を、それが線形になった時点から２分間続けた。次いで、担持されたＣＡＬ−Ｂをミニカラムに加え、４００ｎｍにおける吸光度の増加を、それが線形である限り監視した（典型的には１〜５分間）。
【００９１】
充填された担持酵素をすすぎ、経時的なおよび連続使用を経たそれらの安定性を評価するために再利用することが可能であった。計算のために、吸光度の増加曲線の傾斜から活性を推測し、化学的加水分解活性を全活性から差し引いて、単独の酵素加水分解活性を定量した。
【００９２】
［実施例１４］
実施例１４は、同じ酵素、カンジダ・アンタークチカ・リパーゼＢ（ＣＡＬ−Ｂ）（ノボザイムＮ５２５Ｌ由来）を含有するいくつかの担体間の安定性の比較の実施例である。
【００９３】
参照例として、ノボザイムＮ４３５を用いた。それは、ポリアクリル酸樹脂のビーズに物理的に吸着されたＣＡＬ−Ｂからなる。ＣＨＮ分析によって判定されたＣＡＬ−Ｂの仕込み量は約８％ｗ／ｗ（８０ｍｇ  ＣＡＬ−Ｂ／ｇ  ビーズ）であり、Ｎ４３５の表面積は１０５ｍ２／ｇであった。
【００９４】
第２の参照例として、比較例１で作製されるものと同様のスチレン系熱重合ＨＩＰＥを選択した。これらのスチレン系ポリＨＩＰＥは、疎水性相互作用（非共有結合的固定化）を介して酵素を物理的に吸着することができることが知られているためである。共有結合的固定化のために実施例１１に記載のようにＣＡＬ−ＢをこのポリＨＩＰＥに物理的に吸着させた。酵素の固定化の後の洗浄溶液におけるタンパク質測定によって判定されるＣＡＬ−Ｂの仕込み量は約０．７５％ｗ／ｗ（７．５ｍｇ  ＣＡＬ−Ｂ／ｇ  ポリＨＩＰＥ）であった。この担体を粉末として用いた。
【００９５】
陰性対照として、グラフトされたＣＡＬ−Ｂを含まない実施例４のポリＨＩＰＥを用いて、このポリマーが単独で加水分解に何ら影響を及ぼさないことを確認した。他の陰性対照は、固定化のための溶媒としてＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６．０）を用いた以外は、実施例１１と同様のプロセスを用いてＣＡＬ−Ｂを物理的に吸着することを試みた実施例１のポリＨＩＰＥであった。ＣＡＬ−Ｂの吸着は検出できなかった。これらのポリＨＩＰＥを５ｍｇのモノリスとして用いた。
【００９６】
最後に、固定化のための溶媒としてＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６．０）を用いた以外は、実施例１１と同様のプロセスを用いてＣＡＬ−Ｂを共有結合的に固定化するために実施例４のポリＨＩＰＥを選択した。酵素の固定化の後の洗浄溶液におけるタンパク質測定によって判定されるＣＡＬ−Ｂの仕込み量は約０．８０％ｗ／ｗ（８．０ｍｇ  ＣＡＬ−Ｂ／ｇポリＨＩＰＥ）であった。これらのポリＨＩＰＥを５ｍｇのモノリスとして用いた。
【００９７】
これらの担体の各々を、実施例１３に記載のように様々な量で試験した。
【００９８】
結果を図９および１０にまとめた。これらの図は、図９の担体のグラムおよび図１０の固定化されたＣＡＬ−Ｂのミリグラムによって正規化された、各担体についての、パラ−ニトロフェニルアセテートをパラ−ニトロフェノールと酢酸とに加水分解するための酵素活性を示す。
【００９９】
これらの結果から以下のような３つの明白な結論があった。
ａ）市販のＣＡＬ−ＢノボザイムＮ４３５を、吸着されたＣＡＬ−Ｂを含有するスチレン系熱重合ＨＩＰＥおよび共有結合的に固定化されたＣＡＬ−Ｂを含有する光重合ＨＩＰＥの両方によって得られる活性に匹敵する、担体のグラム当たりの全活性を有していた。これらのスチレン系熱重合ＨＩＰＥおよび光重合ＨＩＰＥは、溶液中のＣＡＬ−Ｂ（約５０μモル／分／ｍｇ  ＣＡＬ−Ｂ  ノボザイムＮ５２５Ｌ由来）に匹敵するＣＡＬ−Ｂのミリグラム当たりの活性を示したが、ノボザイムＮ４３５は、活性が１０分の１より低い。それは、Ｎ４３５中の吸着されたＣＡＬ−Ｂのほとんどが基質に届かないか、または溶液中のＣＡＬ−Ｂほど活性でないかのいずれかを意味する。これは、本発明による方法が低量の酵素を用いるという意味で効率的であることを示す。
ｂ）脂肪族アクリレートベース配合物のために、非機能性光重合ＨＩＰＥにおけるＣＡＬ−Ｂの物理的吸着はない。さらに、これらのポリＨＩＰＥにはエステルの加水分解に対して効果がない。
ｃ）時間の経過にわたるおよび次の再利用にわたる共有結合的にグラフトされたＣＡＬ−Ｂの安定性は、物理的にのみ吸着された場合の担体と比較して非常に良好であった。（実験再現性の限界内の）活性の減少を、パラ−ニトロフェニルアセテートの加水分解のための同じ担体を１０回用いることによって検出することができた。実施例４のポリＨＩＰＥにおける担持されたＣＡＬ−Ｂのエタノール（２０％ｖ／ｖ）を含有するリン酸緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ７．０）を３ヶ月保管した後、活性の減少を検出できなかった。
【０１００】
［実施例１５〜１８］
これらの実施例は、界面活性剤の種類および添加剤を変えながら、ＥＨＡ：ＩＢＯＡ：ＴＭＰＴＡ：ＮＡＳＩの一定のモル比（１１．６５：６５．８２：８．１９：１４．３４）に基づいている。ＨＩＰＥに安定化効果をもたらすために、当業者には予測されるように、ＣａＣｌ２（実施例１５）の添加が見られた。他のところ（国際公開第９７／４５４７９号パンフレット）に報告され、実施例１８で用いられる混合した界面活性剤系が、粘性のゲルのような稠密度および優れた熱安定性を有するＨＩＰＥをもたらす。
【０１０１】
ハイパーマー（Ｈｙｐｅｒｍｅｒ）Ｂ２４６の使用は、予想外にも、実施例１６および１７の両方で８４％の仕込み効率をもたらすポリＨＩＰＥのＮＡＳＩの保持率を高めることが分かった。これは、ＮＡＳＩが液相にも加えられる実施例４（６２％）、および３０％〜５９％の範囲の仕込み効率が観察される他の全ての実施例に勝る。
【０１０２】
実施例１５〜１８を実施例１〜９と同じように作製した。実施例１８を、６０℃で窒素雰囲気下において１６時間にわたって熱的に重合させた。
【０１０３】
【表４】
2008536986.tif 000008
【０１０４】
［実施例１９］
［ＤＥＲＡのカップリング］
大腸菌Ｄ−２−デオキシリボース−５−ホスフェートアルドラーゼ（ＤＥＲＡ）無細胞抽出液（大腸菌で過剰発現したもの）（５０ｍｌ）を、２２℃およびｐＨ６．６０で６時間にわたって、１片のＮ−アクリロキシスクシンアミド−コ−ポリマー、ポリＨＩＰＥ（１ｇ）に連続的に通すことによって固定化した。次にポリマーをトリエタノールアミン緩衝液（２００ｍｌ、５０ｍＭ、ｐＨ７．２５）で洗浄して、固定化された酵素、ＤＥＲＡを含有する灰白色のポリマーモノリスを残した。
ｉ．固定化前の溶液中の総タンパク質濃度：２３．６ｍｇ／ｍｌ
ｉｉ．ｎ−ヒドロキシスクシンアミド機能性ポリマーを通して流した６時間後の総タンパク質濃度：２１．３ｍｇ／ｍｌ
ｉｉｉ．前述したように、ブラッドフォードアッセイによってタンパク質濃度を判定した。
ｉｖ．結果として得られる、ポリＨＩＰＥにおけるＤＥＲＡの仕込み量：１１５ｍｇ／ｇ
【０１０５】
［実施例２０］
［ｓ−ＨＮＬのカップリング］
パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼ（ｓ−ＨＮＬ）無細胞抽出液（ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で過剰発現したもの）（５０ｍｌ）を、２２℃およびｐＨ５．７５で６時間にわたって、１片のＮ−アクリロキシスクシンアミド−コ−ポリマー、ポリＨＩＰＥ（１ｇ）に連続的に通すことによって固定化した。次にポリマーをＭＥＳ緩衝液（１００ｍｌ、５０ｍＭ、ｐＨ５．８０）で洗浄して、固定化された酵素、ｓ−ＨＮＬを含有する灰白色のポリマーモノリスを残した。
ｉ．固定化前の溶液中の総タンパク質濃度：４９．９ｍｇ／ｍｌ
ｉｉ．ｎ−ヒドロキシスクシンアミド機能性ポリマーを通して流した６時間後：２７．０ｍｇ／ｍｌ
ｉｉｉ．前述したように、ブラッドフォードアッセイによってタンパク質濃度を判定した。
ｉｖ．結果として得られる、ポリＨＩＰＥにおけるｓ−ＨＮＬの仕込み量：１５０ｍｇ／ｇ
【０１０６】
［実施例２１］
［ＤＥＲＡ共重合］
大腸菌Ｄ−２−デオキシリボース−５−ホスフェートアルドラーゼ（ＤＥＲＡ）無細胞抽出液（大腸菌で過剰発現したもの）（４５ｍｌ、タンパク質含量が１ｍｇ／ｍｌ）を共重合によってポリＨＩＰＥ内に固定化した。
【０１０７】
水またはＣａＣｌ２および／またはＮＡＳＩの水溶液の代わりに有機相にＤＥＲＡ無細胞抽出液を加えたことによる以外は、実施例１〜１２のようにポリＨＩＰＥを形成した。次いで、得られたポリＨＩＰＥ片をリン酸カリウム緩衝液（５×１００ｍｌ、５０ｍＭ、ｐＨ７．００）で洗浄して、固定化された酵素、ＤＥＲＡを含有する灰白色のポリマーモノリスを残した。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】比較例１の走査型電子顕微鏡写真。
【図２】比較例の走査型電子顕微鏡写真（Ａ．比較例２、Ｂ．比較例３、Ｃ．比較例４、Ｄ．比較例５）。
【図３】スクシンイミドエステルを含有するポリＨＩＰＥの走査型電子顕微鏡写真（Ａ．実施例４、Ｂ．実施例６、Ｃ．実施例７、Ｄ．実施例８）。
【図４】タンパク質測定試験のための検量線。
【図５】蛍光ポリＨＩＰＥの図（左から順に比較例２、および実施例１、２および４からのポリＨＩＰＥ）。曝露時間：５００ｍｓ。倍率：１．６倍。
【図６】いずれもｒＡｃｅ−ＧＦＰに曝された、比較例２のキューブのラマンスペクトル（ａ、黒色）および実施例２のキューブのラマンスペクトル（ｂ、赤色）、ならびに溶液中のｒＡｃｅ−ＧＦＰのラマンスペクトル（ｃ、青色）の重畳。照度は正規化されていない。
【図７】ノボザイムＮ５２５Ｌ（ＣＡＬ−Ｂ水溶液）によるパラ−ニトロフェニルアセテートの加水分解の活性曲線。
【図８】多孔質の担体におけるＣＡＬ−Ｂ活性の定量のためのフローセル設備。
【図９】異なる担体におけるＣＡＬ−Ｂ（Ｎ５２５Ｌ）によるパラ−ニトロフェニルアセテートの加水分解。活性は、担体のグラムによって正規化されている。
【図１０】異なる担体におけるＣＡＬ−Ｂ（Ｎ５２５Ｌ）によるパラ−ニトロフェニルアセテートの加水分解。活性は、担体に最初に存在するＣＡＬ−Ｂのミリグラムによって正規化されている。
【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月30日(2007.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性種を共有結合的にグラフトすることが可能な高度に多孔質のポリマー材料の調製方法であって、
ａ．以下のもの：
Ａ）機能性モノマーを５〜９５重量％
Ｂ）架橋モノマーを５〜８０重量％
Ｃ）重合開始剤を０〜１０重量％
Ｄ）界面活性剤を０〜２０重量％
Ｅ）機能性モノマーまたは架橋モノマー以外のモノマーを０〜９０重量％
（ここで、重量％は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの総重量に対するものである）
およびＦ、前記液相を構成する液体または液体組成物を７４〜９３体積％（ここで、体積％は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを含む連続相ならびに液相の全体積に対するものである）
を含む組成物から液相と連続相とを含むエマルジョンを調製する工程と、
ｂ．前記エマルジョンを硬化する工程と、
ｃ．任意に、前記水／液相を除去する工程と
を含み、
前記機能性モノマーが、活性エステル基、マレイミド、チオール、イソチオシアネート、ヨードアセトアミド、２−ピリジル誘導体、アジド、オキシム、エポキシド、イソシアネートまたはアルデヒド官能基を含む方法。
【請求項２】
前記モノマー、架橋モノマーおよび機能性モノマーがビニル不飽和を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記機能性モノマーが、一般構造式Ｐ−ＧまたはＰ−Ｘ−Ｇ（式中、Ｐが重合に関与する化学部分であり、Ｇが生物活性分子種をグラフトするために後に用いられる化学部分であり、Ｘが親水性または疎水性であり得る任意のスペーサー基である）で表される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記官能基が、式（２）
【化１】
2008536986.tif 000025
または式（３）
【化２】
2008536986.tif 000026
（式中、Ｘが親水性または疎水性であり得るスペーサー基である）
の活性化されたエステル基である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法によって得られる高度に多孔質のポリマー材料。
【請求項６】
請求項５に記載の高度に多孔質のポリマー材料に生物活性種をグラフトするための方法であって、
ａ．前記高度に多孔質の材料を、好適な溶剤中の生物活性種の溶液に曝す工程と、
ｂ．任意に、活性化剤を加える工程と、
ｃ．任意に、加熱する工程と、
ｄ．前記多孔質の材料を溶剤ですすいで、グラフトされていない種を除去する工程と
を含む方法。
【請求項７】
前記生物活性種の溶液に用いられる溶剤が、水、より好ましくは水性緩衝液である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物活性種の溶液に用いられる溶剤が、有機溶媒である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生物活性種の溶液に用いられる溶剤が、水と有機溶媒との混合物、またはより好ましくは水性緩衝液と有機溶媒との混合物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法によって得られる共有結合的にグラフトされた生物活性種を含む高度に多孔質のポリマー材料。
【請求項１１】
不均一触媒としての、請求項１１に記載の生物活性種を含む高度に多孔質のポリマー材料の使用。
【請求項１２】
請求項１１に記載の生物活性種を含む高度に多孔質の材料の使用であって、１０回の反応およびすすぎサイクルの後に、同じ反応条件下で、触媒活性が元の活性の９０％超を保持する使用。
【請求項１３】
バイオセンサー、クロマトグラフィー、生物医学装置およびインプラントにおける、請求項１１に記載の生物活性種を含む高度に多孔質のポリマー材料の使用。
【請求項１４】
請求項１１に記載の生物活性種を含む高度に多孔質のポリマー材料を含む生物学的および生化学的に活性な装置。
【国際調査報告】
2008536986.tif 000027
2008536986.tif 000028
2008536986.tif 000029