(57)【要約】（−）−ＥＧＣＧ、最も豊富なカテキンは、化学予防剤および抗癌剤であることが分かった。しかし、（−）−ＥＧＣＧは少なくとも１つの制限がある：低いバイオアベイラビリティしか示さない。本発明は、以下の一般式の化合物を提供し：［式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立に、−ＨおよびＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基からなる群から選択され、Ｒ５は−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキニル、Ｃ３〜Ｃ７−シクロアルキル、フェニル、ベンジルおよびＣ３〜Ｃ７−シクロアルケニルからなる群から選択され、最後に記載した７種の基は各々、任意の組合せの１〜６個のハロゲン原子で置換されていることができ、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個は−Ｈである］、これは、その保護されていない対応物よりもより強力であり、腫瘍細胞増殖を低減するためのプロテアソーム阻害剤として使用できることが分かった。【選択図】なし
2008509939.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式を有する、プロテアソームを阻害するための化合物
【化１】
2008509939.tif 000055
［式中、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立に、−ＨおよびＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基からなる群から選択され、
・Ｒ５は−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキニル、Ｃ３〜Ｃ７−シクロアルキル、フェニル、ベンジルおよびＣ３〜Ｃ７−シクロアルケニルからなる群から選択され、最後に記載した７種の基は各々、任意の組合せの１〜６個のハロゲン原子で置換されていることができ、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個はＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基であり、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個は−Ｈである］。
【請求項２】
Ｒ１１、Ｒ２およびＲ４が各々−Ｈであり、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２およびＲ３が各々アセテート基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１１、Ｒ２およびＲ４が各々−Ｈであり、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２およびＲ３が各々ベンゾエート基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１１が−Ｈであり、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々アセテート基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１１が−Ｈであり、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々ベンゾエート基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ２およびＲ４が各々−Ｈであり、Ｒ１２、Ｒ２１、Ｒ２２およびＲ３が各々アセテート基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ２およびＲ４が各々−Ｈであり、Ｒ１２、Ｒ２１、Ｒ２２およびＲ３が各々ベンゾエート基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１１およびＲ１３が各々−Ｈであり、Ｒ１２、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々アセテート基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１１およびＲ１３が各々−Ｈであり、Ｒ１２、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々ベンゾエート基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が各々−Ｈであり、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々アセテート基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が各々−Ｈであり、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々ベンゾエート基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ５が−Ｈであり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１およびＲ２２が各々アセテート基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ２がアセテート基であり、Ｒ３およびＲ４が各々−Ｈである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ３がアセテート基であり、Ｒ２およびＲ４が各々−Ｈである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ２およびＲ４が各々アセテート基であり、Ｒ３が−Ｈである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１６】
次式を有する化合物の有効量を投与するステップを含む、腫瘍細胞増殖を低減する方法
【化２】
2008509939.tif 000056
［式中、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々独立に、−ＨおよびＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基からなる群から選択され、
・Ｒ５は−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキニル、Ｃ３〜Ｃ７−シクロアルキル、フェニル、ベンジルおよびＣ３〜Ｃ７−シクロアルケニルからなる群から選択され、最後に記載した７種の基は各々、任意の組合せの１〜６個のハロゲン原子で置換されていることができ、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個はＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基である］。
【請求項１７】
腫瘍細胞増殖を低減するための医薬の製造における、次式を有する化合物の使用
【化３】
2008509939.tif 000057
［式中、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々独立に、−ＨおよびＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基からなる群から選択され、
・Ｒ５は−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキニル、Ｃ３〜Ｃ７−シクロアルキル、フェニル、ベンジルおよびＣ３〜Ｃ７−シクロアルケニルからなる群から選択され、最後に記載した７種の基は各々、任意の組合せの１〜６個のハロゲン原子で置換されていることができ、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個はＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基である］。
【請求項１８】
次式を有する、プロテアソームを阻害するための化合物
【化４】
2008509939.tif 000058
［式中、
・Ｒ１は−Ｈであり、
・Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立に、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択され、
・Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個は−Ｈである］。
【請求項１９】
Ｒ２が−ＯＨであり、Ｒ３およびＲ４が各々−Ｈである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ３が−ＯＨであり、Ｒ２およびＲ４が各々−Ｈである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ２およびＲ４が各々−ＯＨであり、Ｒ３が−Ｈである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２２】
次式を有する化合物の有効量を投与するステップを含む、腫瘍細胞増殖を低減する方法
【化５】
2008509939.tif 000059
［式中、
・Ｒ１は−Ｈであり、
・Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立に、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択され、
・Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４である場合には、Ｒ２は−ＯＨではない］。
【請求項２３】
腫瘍細胞増殖を低減する医薬の製造における、次式を有する化合物の使用
【化６】
2008509939.tif 000060
［式中、
・Ｒ１は−Ｈであり、
・Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立に、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択され、
・Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４である場合には、Ｒ２は−ＯＨではない］。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、プロテアソーム阻害剤として使用するための、および／または癌細胞増殖を阻害するための（−）−エピガロカテキンガラートの誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑茶抽出物中に見られるポリフェノールとして、（−）−エピカテキン（ＥＣ）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）−エピカテキン−３−ガラート（ＥＣＧ）および（−）−エピガロカテキン−３−ガラート（ＥＧＣＧ）がある。特に、最も豊富なカテキン（−）−ＥＧＣＧは、緑茶カテキン（ＧＴＣ）のなかでも化学予防剤および抗癌剤であることが分かった（４．Ｆｕｊｉｋｉ，Ｈ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９９、１２５、５８９〜９７頁）。
【０００３】
プロテアソームは大きなタンパク質複合体であり、使われなくなった、ミスフォールディングしたタンパク質の分解だけでなく、細胞周期およびアポトーシスに関与する調節タンパク質の分解をも担う多触媒活性を示す。プロテアソーム依存性タンパク質分解では、まず、ユビキチンが基質と結合し、それに続いて基質が分解され、アミノ酸およびユビキチンが再利用される。ユビキチン／プロテアソーム依存性分解経路は、ヒト腫瘍細胞における、細胞増殖のアップレギュレーション、細胞死のダウンレギュレーション、薬物耐性の発生において重要な役割を果たす。したがって、プロテアソーム阻害剤は、新規な抗癌剤として大きな可能性を示す（Ｄｏｕ，Ｑ．Ｐ．、Ｌｉ，Ｂ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ  Ｕｐｄａｔｅ  １９９９、２、２１５〜２３頁）。天然（−）−ＥＧＣＧおよび合成によって誘導された（＋）−ＥＧＣＧは、プロテアソームのキモトリプシン活性の強力な阻害剤であり、増殖停止および／またはアポトーシスをもたらすことがわかっている（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｍ．、Ｗａｎｇ，Ｚ．、Ｋａｚｉ，Ａ．、Ｌｉ，Ｌ．、Ｃｈａｎ，Ｔ．Ｈ．、Ｄｏｎ，Ｑ．Ｐ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００２、８、３８２〜９２頁）。米国特許公報第２００４０１１０７９０号（Ｚａｖｅｒｉら）には、化学療法薬および化学予防剤としての緑茶ポリフェノールの合成類似体が記載されているが、合成はラセミ化合物しか提供せず、緑茶に由来する天然に存在するカテキンは用いていない。
【０００４】
Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達は、周知の腫瘍細胞生存経路である（Ｖａｎｈａｅｓｅｂｒｏｅｃｋ，Ｂ．、Ａｌｅｓｓｉ，Ｄ．Ｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０００、３４６、５６１〜７６頁）。この経路を遮断することは、腫瘍増殖を阻害するための重要な機構と考えられている。リン酸化Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）は、Ａｋｔの活性型である。Ａｋｔは活性化されると、リン酸化および結果として生じるサイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２７．２４の阻害によって、細胞周期の進行を媒介できる。最近、（−）−ＥＧＣＧは、ＭＭＴＶ−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕマウス乳癌ＮＦ６３９細胞において、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼシグナルの減少を介してＡｋｔキナーゼ活性を阻害し、腫瘍細胞増殖の低減をもたらすことが分かった（Ｐｉａｎｅｔｔｉ，Ｓ．、Ｇｕｏ，Ｓ．、Ｋａｖａｎａｇｈ，Ｋ．Ｔ．、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ｇ．Ｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２、６２、６５２〜５頁）。
【０００５】
しかし、（−）−ＥＧＣＧには少なくとも１つの制限がある：低いバイオアベイラビリティしか示さない。ナカガワらの研究によって、５６ｍｇの（−）−ＥＧＣＧを経口投与されたラットでは、０．０１２％の（−）−ＥＧＣＧしか吸収され得ないということが示された（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｋ．、Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｔ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７、２４８、４１〜９頁）。この低い吸収は、中性またはアルカリ性溶液中での（−）−ＥＧＣＧの安定性が低いことによると考えられた。腸および体液のｐＨ値は中性またはわずかにアルカリ性であるので、ＧＴＣはヒトの体内では不安定となり、その結果、低いバイオアベイラビリティがもたらされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、先行技術において示される少なくとも１つまたは複数の問題を解決できる（−）−ＥＧＣＧ誘導体を提供することである。最小としても、本発明の目的は、一般の人々に有用な選択肢を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、次式を有するプロテアソームを阻害するための化合物を提供する：
【０００８】
【化１】
2008509939.tif 000003
【０００９】
［式中、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立に、−ＨおよびＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基からなる群から選択され、
・Ｒ５は−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキニル、Ｃ３〜Ｃ７−シクロアルキル、フェニル、ベンジルおよびＣ３〜Ｃ７−シクロアルケニルからなる群から選択され、最後に記載した７種の基は各々、任意の組合せの１〜６個のハロゲン原子で置換されていることができ、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個はＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基であり、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個は−Ｈである］。
【００１０】
Ｒ１１Ｒ２およびＲ４が各々−Ｈであり、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２およびＲ３が各々アセテートまたはベンゾエート基であることが好ましい。
場合によっては、Ｒ１１が−Ｈであり、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々アセテートまたはベンゾエート基である。
【００１１】
さらに、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ２およびＲ４が各々−Ｈであり、Ｒ１２、Ｒ２１、Ｒ２２およびＲ３が各々アセテートまたはベンゾエート基である。
場合によっては、Ｒ１１およびＲ１３が各々−Ｈであり、Ｒ１２、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々アセテートまたはベンゾエート基である。
【００１２】
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が各々−Ｈであり、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々アセテートまたはベンゾエート基である場合もある。
本発明の上記化合物の一実施形態では、Ｒ５は−Ｈであり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１およびＲ２２は各々アセテート基である。この特定の実施形態はまた、以下の３つの変形も提供する：
・Ｒ２がアセテート基であり、Ｒ３およびＲ４が各々−Ｈであるか、
・Ｒ３がアセテート基であり、Ｒ２およびＲ４が各々−Ｈであるか、または
・Ｒ２およびＲ４が各々アセテート基であり、Ｒ３が−Ｈである。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、次式を有する化合物の有効量を投与するステップを含む腫瘍細胞増殖を低減する方法を提供することである：
【００１４】
【化２】
2008509939.tif 000004
【００１５】
［式中、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々独立に、−ＨおよびＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基からなる群から選択され、
・Ｒ５は−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキニル、Ｃ３〜Ｃ７−シクロアルキル、フェニル、ベンジルおよびＣ３〜Ｃ７−シクロアルケニルからなる群から選択され、最後に記載した７種の基は、任意の組合せの１〜６個のハロゲン原子で置換されていることができ、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個はＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基である］。
【００１６】
本発明のさらにもう１つの態様は、腫瘍細胞増殖を低減するための医薬の製造における、次式を有する化合物の使用を提供することである
【００１７】
【化３】
2008509939.tif 000005
【００１８】
［式中、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々独立に、−ＨおよびＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基からなる群から選択され、
・Ｒ５は−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキニル、Ｃ３〜Ｃ７−シクロアルキル、フェニル、ベンジルおよびＣ３〜Ｃ７−シクロアルケニルからなる群から選択され、最後に記載した７種の基は、任意の組合せの１〜６個のハロゲン原子で置換されていることができ、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個はＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基である］。
【００１９】
本発明はまた、次式を有するプロテアソームを阻害するための化合物を提供する
【００２０】
【化４】
2008509939.tif 000006
【００２１】
［式中、
・Ｒ１は−Ｈであり、
・Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立に、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択され、
・Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個は−Ｈである］。
【００２２】
Ｒ２は−ＯＨであり、Ｒ３＝Ｒ４＝−Ｈであり得ることが好ましい。場合によって、Ｒ３は−ＯＨであり、Ｒ２＝Ｒ４＝−Ｈであってもよく；またはＲ３が−Ｈであり、Ｒ２＝Ｒ４＝−ＯＨであってもよい。
【００２３】
本発明はまた、次式を有する化合物の有効量を投与するステップを含む、腫瘍細胞増殖を低減する方法を提供する
【００２４】
【化５】
2008509939.tif 000007
【００２５】
［式中、
・Ｒ１は−Ｈであり、
・Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立に、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択され、
・Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４である場合には、Ｒ２は−ＯＨではない］。
【００２６】
本発明のもう１つの態様は、腫瘍細胞増殖を低減するための医薬の製造における、次式を有する化合物の使用を提供することである
【００２７】
【化６】
2008509939.tif 000008
【００２８】
［式中、
・Ｒ１は−Ｈであり、
・Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立に、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択され、
・Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４である場合には、Ｒ２は−ＯＨではない］。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
ここで、本発明を以下の段落において図を参照しながら実施例によって説明する。
本発明の目的、特徴および態様は、以下の説明において開示されるか、または以下の説明から明らかである。当業者には当然のことながら、本議論は、例示的実施形態の説明に過ぎず、本発明のより広い態様を制限しようとするものではなく、より広い態様は例示的構成において具現される。
【００３０】
本発明では、バイオアベイラビリティを向上させるプロドラッグ形態の（−）−ＥＧＣＧを合成する。プロドラッグは、［ｉ］中性ｐＨの生理学的条件下での安定性の向上、［ｉｉ］ｉｎ  ｖｉｖｏで酵素によって加水分解され、その結果、親薬物が放出されるまで生物学的に不活性のままであること、［ｉｉｉ］最後に、プロ部分の基が低い全身毒性しか有さないことを示す。
【００３１】
さらに、３種の（−）−ＥＧＣＧの誘導体およびそのプロドラッグ形態を合成し、驚くべきことに、天然型の（−）−ＥＧＣＧ自体よりも高い効力を有することが分かっている。
【００３２】
アルコール体の本発明の（−）−ＥＧＣＧの誘導体の一般式は、次式を有する
【００３３】
【化７】
2008509939.tif 000009
【００３４】
［式中、
・Ｒ１は−Ｈであり、
・Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立に、−Ｈおよび−ＯＨからなる群から選択される］。
【００３５】
当然ながら、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４、Ｒ２が−ＯＨである場合には、化合物は（−）−ＥＧＣＧとなり、したがって、本発明の主題ではない。
エステル体の本発明の（−）−ＥＧＣＧの誘導体の一般式は、次式を有する
【００３６】
【化８】
2008509939.tif 000010
【００３７】
［式中、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立に、−ＨおよびＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基からなる群から選択され、
・Ｒ５は−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキニル、Ｃ３〜Ｃ７−シクロアルキル、フェニル、ベンジルおよびＣ３〜Ｃ７−シクロアルケニルからなる群から選択され、最後に記載した７種の基は各々、任意の組合せの１〜６個のハロゲン原子で置換されていることができ、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個はＣ１〜Ｃ１０アシルオキシル基であり、
・Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも１個は−Ｈである］。
【００３８】
上記の化合物の定義では、以下の群全体を表す総称を用いた。
Ｃ１〜Ｃ６アシル：構造−（ＣＯ）−Ｒを有する（式中、Ｒは、水素または１〜５個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ペンチル、２−メチルブチルである）。アルキル基Ｒは、部分的または完全にハロゲン化されていてもよい。用語「部分的または完全にハロゲン化された」とは、このように特徴づけられた基では、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロフルオロメチル、ジクロロフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、１−フルオロエチル、２−フルオロエチル、２，２−ジフルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、２−クロロ−２−フルオロエチル、２−クロロ−２，２−ジフルオロエチル、２，２−ジクロロ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチルおよびペンタフルオロエチルのように、水素原子が、同一または異なるハロゲン原子で部分的または完全に置換されていてもよいことを表すものとする。
【００３９】
Ｃ１〜Ｃ１０アシルオキシル：構造−Ｏ−（ＣＯ）−Ｒを有する（式中、Ｒは−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ９−アルキル、Ｃ２〜Ｃ９−アルケニル、Ｃ２〜Ｃ９−アルキニル、Ｃ３〜Ｃ７−シクロアルキル、フェニル、ベンジルおよびＣ３〜Ｃ７−シクロアルケニルのうちいずれか１種であり得るが、最後に記載した７種の基は各々、直鎖または分岐アルキル基のいずれか、例えば、メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ペンチル、２−メチルブチルで置換されていてもよい）。アルキル基Ｒは、部分的または完全にハロゲン化されていてもよい。用語「部分的または完全にハロゲン化された」とは、このように特徴づけられた基では、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロフルオロメチル、ジクロロフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、１−フルオロエチル、２−フルオロエチル、２，２−ジフルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、２−クロロ−２−フルオロエチル、２−クロロ−２，２−ジフルオロエチル、２，２−ジクロロ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチルおよびペンタフルオロエチルのように、水素原子は同一または異なるハロゲン原子で部分的または完全に置換されていてもよいことを表すものとする。ヒドロキシメチル、２−アミノエチルまたは３−メトキシプロピル基のように、アルキル基Ｒは、ヒドロキシまたはアルコキシまたはアミノ基で部分的または完全に置換されていてもよい。
【００４０】
本発明に従い、ペルアセタート（−）−ＥＧＣＧ、１を合成した（図１）。１は、（−）−ＥＧＣＧよりもより安定であることが分かった。プロドラッグは、精製２０Ｓプロテアソームに対しては生物学的に不活性であったが、無傷の腫瘍細胞ではプロテアソームを強力に阻害した。さらに、無傷の腫瘍細胞への、親化合物ではなくプロドラッグの投与の結果、リン酸化Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）が消失し、これは、この癌関連キナーゼの不活化を示す。最後に、１での白血病ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞の処理により細胞死が誘導された。
【００４１】
他のペルアセテート（ｐｅｒａｃｔｅｔｅ）保護された茶ポリフェノールが、その保護されていない親よりも大きな生物活性を有するかどうかを評価するために、没食子酸の環上のヒドロキシル基が欠失している（−）−ＥＧＣＧの数種の合成類似体を合成した。さらに、分子の安定性を高めるために、ヒドロキシル基をアセテートまたはベンゾエート基に変換してプロドラッグを作製した。驚くべきことに、保護された類似体は、無傷の腫瘍細胞において、その保護されていない対応物よりもより強力なプロテアソーム阻害剤であることが分かった。
【００４２】
本発明の化合物の合成および特性決定を以下の節で詳述する。
【実施例】
【００４３】
材料および方法
試薬
ウシ胎児血清は、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｔｕｌａｒｅ，Ｃ  Ａ）から購入した。ペニシリン−ストレプトマイシン−１−グルタクスニン（Ｇｌｕｔａｘｎｉｎｅ）の混合物、ＲＰＭＩおよびＤＭＥＭはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）製である。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、ヘキスト３３３４２、３−（（４，５）−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテオリウムブロミド（ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）（ＭＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および（−）−ＥＧＣＧは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ（プロテオソームのキモトリプシン様活性用）は、Ｂｉｏｍｏｌ（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）から入手した。ウサギ由来精製２０ｓプロテアソームは、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手した。Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｈ２０２アッセイキットは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。Ｂａｘ（Ｈ２８０）およびユビキチン（Ｐ４Ｄ１）に対するモノクローナル抗体、ならびにＩＫＢ−ａ（Ｃ１５）およびアクチン（Ｃ１１）に対するポリクローナル抗体、ならびに抗ヤギ、抗ウサギおよび抗マウスＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。ｐ２７に対するモノクローナル抗体（５５４０６９）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍは、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）から購入した。ＰＡＲＰ切断部位に対して特異的であり、ＦＩＴＣが結合しているポリクローナル抗体は、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）から入手した。ＣａｓｐＡＣＥ  ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫマーカーはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。
【００４４】
合成茶ポリフェノール類似体の合成。１、２、２ａ、３、３ａ、４および４ａの合成（図１）
１は文献の手順に従って調製したが（Ｋｏｈｒｉ，Ｔ．、Ｎａｎｊｏ，Ｆ．、Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．、Ｓｅｔｏ，Ｒ．、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｎ．、Ｙａｍａｋａｗａ，Ｍ．、Ｈｏｊｏ，Ｈ．、Ｈａｒａ，Ｙ．、Ｄｅｓａｉ，Ｄ．、Ａｍｉｎ，Ｓ．、Ｃｏｎａｗａｙ，Ｃ．Ｃ．、Ｃｈｕｎｇ，Ｆ．Ｌ．Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ２００１、４９、１０４２〜８頁）、１の合成をここに示す。１の合成には、出発材料として市販の（−）−ＥＧＣＧを用いた。（−）−ＥＧＣＧを無水酢酸およびピリジンで一晩処理することで、目的生成物１が収率８２％で得られた（図１）。１の構造は１Ｈおよび１３ＣＮＭＲ、ＬＲＭＳおよびＨＲＭＳによって確認した。
【００４５】
【化９】
2008509939.tif 000011
【００４６】
（２Ｓ＊，３Ｒ＊）−トランス−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−［３，４，５−トリス（ベンジルオキシ）フェニル］クロマン−３−オル（５）
この化合物は文献の手順に従って合成した（Ｌｉ，Ｌ．Ｈ．、Ｃｈａｎ，Ｔ．Ｈ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１、３、７３９〜７４１頁）。
【００４７】
（２Ｓ＊，３Ｒ＊）−トランス−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−［３，４，５−トリス（ベンジルオキシ）フェニル］クロマン−３−イル  ３−（ベンジルオキシ）ベンゾエート（２ｂ）
ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中、３−（ベンジルオキシ）安息香酸（０．１２ｇ、０．５３ｍｍｏｌ）の溶液に、一定量の（ＣＯＣｌ）２（０．６８ｍＬ）を加えた。この混合物を２時間還流した。その後、過剰の（ＣＯＣｌ）２と溶媒を蒸留によって除去し、得られた残渣を真空下で一晩乾燥させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に再溶解し、０℃でＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中、５（０．２０ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０８ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。次いで、この混合物を室温で一晩撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３を加えた。有機層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。残渣を、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル４：１）によって精製すると、化合物２ｂが白色固体として得られた（０．２２ｇ、８８％）。
【００４８】
【化１０】
2008509939.tif 000012
【００４９】
（２Ｓ＊，３Ｒ＊）−トランス−５，７−ビス（ヒドロキシ）−２−［３，４，５−トリス（ヒドロキシ）フェニル］クロマン−３−イル  ３−（ヒドロキシ）ベンゾエート（２）
ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（２８ｍＬ／２８ｍＬ）およびＰｄ（ＯＨ）２（０．１９ｇ、炭素上２０％）中、２ｂ（０．２３ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の懸濁液を、Ｈ２雰囲気下に置いた。得られた混合物を、反応が完了したことをｔｌｃが示すまで室温で撹拌した。次いで、反応混合物を、綿を通して濾過して触媒を除去した。蒸発させた後、残渣をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＣＨ２Ｃｌ２２：１）によって精製すると、生成物２が白色固体として得られた（８０ｍｇ、７９％）。
【００５０】
【化１１】
2008509939.tif 000013
【００５１】
（２Ｓ＊，３Ｒ＊）−トランス−５，７−ビス（アセチルオキシ）−２−［３，４，５−トリス（アセチルオキシ）フェニル］クロマン−３−イル  ３−アセチルオキシベンゾエート（２ａ）
ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（１２ｍＬ／１２ｍＬ）およびＰｄ（ＯＨ）２（０．０８ｇ、炭素上２０％）中、２ｂ（０．１ｇ、０．１ｍｍｏｌ）の懸濁液を、Ｈ２雰囲気下に置いた。得られた混合物を、反応が完了したことをｔｌｃが示すまで室温で撹拌した。次いで、反応混合物を、綿を通して濾過して触媒を除去した。濾液を蒸発させると、脱ベンジル化化合物（２）が得られ、これを精製せずに直ちに次のステップに用いた。得られた脱ベンジル化化合物をピリジン（４ｍＬ）および無水酢酸（２ｍＬ）に溶解した。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。その後、無水酢酸およびピリジンを真空除去した。得られた残渣を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に回収し、この溶液を５×Ｈ２Ｏ５ｍＬおよびブライン５ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル１：１）によって精製すると、化合物２ａが白色粉末として得られた（０．０６１ｇ、８５％）。
【００５２】
【化１２】
2008509939.tif 000014
【００５３】
（２Ｓ＊，３Ｒ＊）−トランス−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−［３，４，５−トリス（ベンジルオキシ）フェニル］クロマン−３−イル  ４−（ベンジルオキシ）ベンゾエート（３ｂ）
標題化合物を、５（０．０８ｇ、０．１ｍｍｏｌ）および４−（ベンジルオキシ）安息香酸（０．０４９ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を用い、２ｂについて記載した方法と同様に調製すると、３ｂが白色固体として得られた（０．０８７ｇ、９０％）。
【００５４】
【化１３】
2008509939.tif 000015
【００５５】
（２Ｓ＊，３Ｒ＊）−トランス−５，７−ビス（ヒドロキシ）−２−［３，４，５−トリス（ヒドロキシ）フェニル］クロマン−３−イル  ４−（ヒドロキシ）ベンゾエート（３）
標題化合物を、３ｂ（０．２４ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を用い、２について記載した方法と同様に調製すると、３が白色固体として得られた（７９ｍｇ、７５％）。
【００５６】
【化１４】
2008509939.tif 000016
【００５７】
（２Ｓ＊，３Ｒ＊）−トランス−５，７−ビス（アセチルオキシ）−２−［３，４，５−トリス（アセチルオキシ）フェニル］クロマン−３−イル  ４−（アセチルオキシ）ベンゾエート（３ａ）
標題化合物を、３ｂ（０．１５ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を用い、２ａについて記載した方法と同様に調製すると、３ａが白色固体として得られた（９２．６ｍｇ、８８％）。
【００５８】
【化１５】
2008509939.tif 000017
【００５９】
（２Ｓ＊，３Ｒ＊）−トランス−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−［３，４，５−トリス（ベンジルオキシ）フェニル］クロマン−３−イル  ３，５−ビス（ベンジルオキシ）ベンゾエート（４ｂ）
標題化合物を、５（０．３ｇ、０．４ｍｍｏｌ）および３，５−ビス（ベンジルオキシ）安息香酸（０．２７ｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を用い、２ｂについて記載した方法と同様に調製すると、４ｂが白色固体として得られた（０．３６ｇ、８５％）。
【００６０】
【化１６】
2008509939.tif 000018
【００６１】
（２Ｓ＊，３Ｒ＊）−トランス−５，７−ビス（ヒドロキシ）−２−［３，４，５−トリス（ヒドロキシ）フェニル］クロマン−３−イル  ３，５−ビス（ヒドロキシ）ベンゾエート（４）
標題化合物を、４ｂ（０．１７ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を用い、２について記載した方法と同様に調製すると、４が白色固体として得られた（５０ｍｇ、７１％）。
【００６２】
【化１７】
2008509939.tif 000019
【００６３】
（２Ｓ＊，３Ｒ＊）−トランス−５，７−ビス（アセチルオキシ）−２−［３，４，５−トリス（アセチルオキシ）フェニル］クロマン−３−イル  ３，５−ビス（アセチルオキシ）ベンゾエート（４ａ）
標題化合物を、４ｂ（０．１５ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を用い、２ａについて記載した方法と同様に調製すると、４ａが白色固体として得られた（７２ｍｇ、７０％）。
【００６４】
【化１８】
2008509939.tif 000020
【００６５】
化合物１、２、３および４のカルボキシレート基または−ＯＨ基は容易にアシル交換を受け得るので、当業者はこれらの化合物のカルボキシレート基上のアシル基を交換できるはずである。
【００６６】
合成茶ポリフェノール類似体の合成
概要
民間の供給業者から購入した出発材料および試薬を、さらに精製することなく用いた。（２Ｒ，３Ｓ）トランスおよび（２Ｒ，３Ｒ）−シス−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−（４−ベンジルオキシフェニル）クロマン−３−オル、（２Ｒ，３Ｓ）トランスおよび（２Ｒ，３Ｒ）−シス−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−［３，４−ビス（ベンジルオキシ）−フェニル］クロマン−３−オル、（２Ｒ，３Ｒ）−シス−５，７−ビス（ヒドロキシル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル３，４，５−トリヒドロキシベンゾエートの調製には文献の手順を用いた（Ｓｈｅｎｇ  Ｂｉａｏ  Ｗａｎ、Ｔａｋ  Ｈａｎｇ  Ｃｈａｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００４、６０、８２０７頁）。
【００６７】
無水ＴＨＦは、窒素下、ナトリウムベンゾフェノンケチルから蒸留した。無水塩化メチレンは、窒素下、ＣａＨ２から蒸留した。無水ＤＭＦは、真空下、ＣａＨ２から蒸留した。反応フラスコをＮ２流下でフレーム乾燥した。感湿性の反応はすべて、窒素雰囲気下で実施した。フラッシュクロマトグラフィーはシリカ−ゲル６０（７０〜２３０メッシュ）を用いて実施した。融点は修正しなかった。１Ｈ−ＮＭＲおよび１３ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ）スペクトルは、ＣＤＣｌ３およびアセトン−ｄ６を溶媒として用いた場合には、内部標準としてＴＭＳを用いて測定した。高分解能（ＥＳＩ）ＭＳスペクトルは、ＱＴＯＦ−２  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製分光計を用いて記録した。
【００６８】
（＋）−（２Ｒ，３Ｓ）−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−［３，４−ビス（ベンジルオキシ）フェニル］クロマン−３−イル  ４−ベンジルオキシベンゾエート（１０２）
Ｎ２雰囲気下、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）および１滴のＤＭＦ中、４−ベンジルオキシ安息香酸（１４０ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）の溶液を、塩化オキサリル（１ｍＬ）とともに３時間還流した。過剰の塩化オキサリルおよび溶媒を、蒸留によって除去し、残渣を真空下で３時間乾燥させ、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）に溶解した。０℃で、ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中、（２Ｒ，３Ｓ）−トランス−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−［３，４−ビス（ベンジルオキシ）フェニル］クロマン−３−オル（１９５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（７５ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）の溶液に、この溶液を滴下した。混合物を一晩撹拌し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加えた。有機層を分離し、ＣＨ２Ｃｌ２で水層を抽出した。有機相を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、蒸発させた。残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘキサン＝１／４  ｖ／ｖ）によって精製すると、目的化合物が得られた（２２０ｍｇ、８５．０％）。ＥｔＯＡｃおよびｎ−ヘキサン中で再結晶化させると、白色粉末が得られた：融点１４８〜１５０℃、［α］Ｄ＝＋１８．３（ｃ＝１、ＣＨＣｌ３）、
【００６９】
【化１９】
2008509939.tif 000021
【００７０】
（−）−（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−［３，４−ビス（ベンジルオキシ）フェニル］クロマン−３−イル  ４−ベンジルオキシベンゾエート（１０４）
１０２の調製手順に続いて、４−ベンジルオキシ安息香酸を用いて、（２Ｒ，３Ｒ）−シス−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−［３，４−ビス（ベンジルオキシ）フェニル］クロマン−３−オルをエステル化すると、１０４が得られ、収率８６％であった。融点１４９〜１５１℃、［α］Ｄ＝−３．１（ｃ＝１．５、ＣＨＣｌ３）、
【００７１】
【化２０】
2008509939.tif 000022
【００７２】
（＋）−（２Ｒ，３Ｓ）−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−（４−ベンジルオキシフェニル）クロマン−３−イル  ４−ベンジルオキシベンゾエート（１１０）
１０２の調製手順に続いて、４−ベンジルオキシ安息香酸を用いて、（２Ｒ，３Ｓ）−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−（４−ベンジルオキシフェニル）クロマン−３−オルをエステル化すると、１１０が得られ、収率８６％であった。融点１１７〜１１９℃、［α］Ｄ＝＋２４．５（ｃ＝１．２、ＣＨＣｌ３）、
【００７３】
【化２１】
2008509939.tif 000023
【００７４】
（−）−（２Ｒ，３Ｒ）−５，７ビス（ベンジルオキシ）−２−（４−ベンジルオキシフェニル）クロマン−３イル  ４−ベンジルオキシベンゾエート（１１１）
１０２の調製手順に続いて、４−ベンジルオキシ安息香酸を用いて、（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−（４−ベンジルオキシフェニル）クロマン−３−オルをエステル化すると、１１１が得られ、収率８８％であった。融点１２９〜１３１℃、［α］Ｄ＝−５１．８（ｃ＝３．９、ＣＨＣｌ３）、
【００７５】
【化２２】
2008509939.tif 000024
【００７６】
（＋）−（２Ｒ，３Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル  ４−ヒドロキシベンゾエート（１１）
Ｈ２雰囲気下、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（１：１  ｖ／ｖ、２０ｍＬ）の溶媒混合物中、１０２（２００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ（２０％、１００ｍｇ）を加えた。得られた反応混合物をＨ２下、室温で６時間撹拌し、反応が完了したことはＴＬＣによって示された。反応混合物を濾過して触媒を除去した。濾液を蒸発させ、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、次いで、２０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって迅速に精製すると、１１が得られた（８２ｍｇ、収率８７％）：融点２２０〜２２２℃（分解）、［α］Ｄ＝＋８７．２（ｃ＝２．０、ＥｔＯＨ）、
【００７７】
【化２３】
2008509939.tif 000025
【００７８】
（−）−（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル  ４−ヒドロキシベンゾエート（１２）
１１の調製手順に続いて、１０４を水素分解すると、１２が得られ、収率は８５％であった。融点２４１〜２４３℃（分解）、［α］Ｄ＝−１４５．２（ｃ＝０．５、ＥｔＯＨ）、（Ｌｉｔ−１４４．４、ｃ＝１、Ｍｅ２ＣＯ中）、４
【００７９】
【化２４】
2008509939.tif 000026
【００８０】
（＋）−（２Ｒ，３Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル  ４−ヒドロキシベンゾエート（１１２）
１１の調製手順に続いて、１１０を水素分解すると、１１２が得られ、収率は９０％であった。融点２５３〜２５５℃（分解）、［α］Ｄ＝＋４５．９（ｃ＝３．５、ＥｔＯＨ）、
【００８１】
【化２５】
2008509939.tif 000027
【００８２】
（−）−（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル  ４−ヒドロキシベンゾエート（１０）
１１の調製手順に続いて、１１１を水素分解すると、１０が得られ、収率は８９％であった。融点２１４〜２１６℃（分解）、［α］Ｄ＝−１１６．１（ｃ＝２．０、ＥｔＯＨ）、
【００８３】
【化２６】
2008509939.tif 000028
【００８４】
（＋）−（２Ｒ，３Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル  ４−ヒドロキシベンゾエートペンタアセテート（２２＊）
Ｎ２雰囲気下、０℃で、ピリジン（１ｍｌ）中、（＋）−（２Ｒ，３Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル４−ヒドロキシベンゾエート１１（２０ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）の溶液に、無水酢酸（０．２ｍｌ）を滴下した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。過剰のピリジンを真空下で蒸留した。残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフ（ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘキサン、ｖ／ｖで１／１）によって精製すると、２２＊が得られた（３４ｍｇ、収率９５％）。融点：融点１４９〜１５１℃、［α］Ｄ＝＋４２．５（ｃ＝１．２、ＣＨＣｌ３）、
【００８５】
【化２７】
2008509939.tif 000029
【００８６】
（−）−（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル  ４−ヒドロキシベンゾエートペンタアセテート（２３＊）
２２＊の調製手順に続いて、１２をアセチル化すると、２３＊が得られ、収率は９６％であった。融点９１〜９３℃、［α］Ｄ＝−２６．５（ｃ＝０．５、ＣＨＣｌ３）、
【００８７】
【化２８】
2008509939.tif 000030
【００８８】
（＋）−（２Ｒ，３Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル  ３，４，５−トリヒドロキシベンゾエートヘプタアセテート（２４＊）
２２＊の調製手順に続いて、（＋）−（２Ｒ，３Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル３，４，５−トリヒドロキシベンゾエートをアセチル化すると（Ｓｈｅｎｇ  Ｂｉａｏ  Ｗａｎ、Ｄｉ  Ｃｈｅｎ、Ｑ．Ｐｉｎｇ  Ｄｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｋ  Ｈａｎｇ  Ｃｈａｎ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、１２、３５２１頁）、２４＊が得られ、収率は９５％であった。融点１４０〜１４２℃、［α］Ｄ＝＋３５．３（ｃ＝３．０、ＣＨＣｌ３）、
【００８９】
【化２９】
2008509939.tif 000031
【００９０】
（−）−（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル  ３，４，５−トリヒドロキシベンゾエートヘプタアセテート（２５＊）
２２＊の調製手順に続いて、（−）−（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル３，４，５−トリヒドロキシベンゾエートをアセチル化すると（Ｓｈｅｎｇ  Ｂｉａｏ  Ｗａｎ、Ｄｉ  Ｃｈｅｎ、Ｑ．Ｐｉｎｇ  Ｄｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｋ  Ｈａｎｇ  Ｃｈａｎ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、１２、３５２１頁）、２５＊が得られ、収率は９３％であった。融点１０５〜１０７℃、［α］Ｄ＝−１４．５（ｃ＝１．２、ＣＨＣｌ３）、
【００９１】
【化３０】
2008509939.tif 000032
【００９２】
（＋）−（２Ｒ，３Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル  ４−ヒドロキシベンゾエートテトラアセテート（１１４）
２２＊の調製手順に続いて、１１２をアセチル化すると、１１４が得られ、収率は９１％であった。融点１６７〜１６９℃、［α］Ｄ＝＋３．２（ｃ＝１．０、ＣＨＣｌ３）、
【００９３】
【化３１】
2008509939.tif 000033
【００９４】
（−）−（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル  ４−ヒドロキシベンゾエートテトラアセテート（２１＊）
２２＊の調製手順に続いて、１０をアセチル化すると、２１＊が得られ、収率は８９％であった。融点１４４〜１４５℃、［α］Ｄ＝−３０．７（ｃ＝２．５、ＣＨＣｌ３）、
【００９５】
【化３２】
2008509939.tif 000034
【００９６】
（＋）−（２Ｒ，３Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル  ３，４，５−トリヒドロキシベンゾエートヘキサアセテート（１６＊）
２２＊の調製手順に続いて、（＋）−（２Ｒ，３Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル３，４，５−トリヒドロキシベンゾエートをアセチル化すると（Ｓｈｅｎｇ  Ｂｉａｏ  Ｗａｎ、Ｔａｋ  Ｈａｎｇ  Ｃｈａｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２００４、６０、８２０７頁）、１６＊が得られ、収率は９３％であった。融点９６〜９８℃、［α］Ｄ＝＋１７．７（ｃ＝１．０、ＣＨＣｌ３）、
【００９７】
【化３３】
2008509939.tif 000035
【００９８】
（−）−（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル  ３，４，５−トリヒドロキシベンゾエートヘキサアセテート（１９＊）
２２＊の調製手順に続いて、（−）−（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル３，４，５−トリヒドロキシベンゾエートをアセチル化すると（Ｓｈｅｎｇ  Ｂｉａｏ  Ｗａｎ、Ｔａｋ  Ｈａｎｇ  Ｃｈａｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２００４、６０、８２０７頁）、１９＊が得られ、収率は９１％であった。融点１５２〜１５４℃、［α］Ｄ＝−３５．５（ｃ＝２．５、ＣＨＣｌ３）、
【００９９】
【化３４】
2008509939.tif 000036
【０１００】
（Ｅ）−３−［２，４−ビス（ベンジルオキシ）−６−ヒドロキシフェニル］−１−フェニル−プロペン（＃ａ）
文献の手順（Ｌｉ，Ｌ．、Ｃｈａｎ，Ｔ．Ｈ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１、５、７３９頁）に従って、シンナミルアルコールを、３，５−ジベンジルオキシフェノールと反応させると、（＃ａ）が白色固体として得られた（収率６２％）、融点７６〜７８℃、
【０１０１】
【化３５】
2008509939.tif 000037
【０１０２】
（＋）−（１Ｓ，２Ｓ）−３−［２，４−ビス（ベンジルオキシ）−６−ヒドロキシフェニル］−１−フェニルプロパン−１，２−ジオール（（＋）−＃ｂ）
出発材料として（＃ａ）およびジヒドロキシル化試薬としてＡＤ−ミックス−αを用いるが、文献の手順（Ｌｉ，Ｌ．、Ｃｈａｎ，Ｔ．Ｈ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１、５、７３９頁）に従って、（＋）−＃ｂが白色固体として得られた（収率４７％）、融点１２１〜１２３℃、［α］Ｄ＝＋４．７（ｃ＝０．６、ＣＨＣｌ３）、
【０１０３】
【化３６】
2008509939.tif 000038
【０１０４】
（＋）−（２Ｓ，３Ｓ）−シス−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−２−フェニルクロマン−３−オル（（＋）−＃ｃ）
出発材料として（＋）−＃ｂを用いるが、文献の手順（Ｌｉ，Ｌ．、Ｃｈａｎ，Ｔ．Ｈ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１、５、７３９頁）に従って、（＋）−＃ｃが白色固体として得られた（収率４７％）、融点６０〜６２℃、［α］Ｄ＝＋０．９（ｃ＝１．０、酢酸エチル）、
【０１０５】
【化３７】
2008509939.tif 000039
【０１０６】
（＋）−（２Ｓ，３Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２−フェニルクロマン−３−イル  ３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（（＋）−１５）
出発材料として（＋）−＃ｃを用いるが、文献の手順（Ｌｉ，Ｌ．、Ｃｈａｎ，Ｔ．Ｈ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１、５、７３９頁）に従って、化合物（＋）−１５が得られた（収率９０％）：融点２５８〜２６０℃（分解）、［α］Ｄ＝＋１３．９（ｃ＝３．５、エタノール）、
【０１０７】
【化３８】
2008509939.tif 000040
【０１０８】
２−ベンジル−３，５−ビス（ベンジルオキシ）フェノール（＃ｄ）
０℃で、乾燥ＤＭＦ（１２０ｍＬ）中、水素化ナトリウム（鉱油中６０％分散物、２，４ｇ、１００ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、エタンチオール（１０ｇ、２１６ｍｍｏｌ）を滴下した。１時間後、１０のバッチに１，３，５−トリベンジルオキシベンゼン（２４ｇ、６０ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を１５０℃で１．５時間加熱した。反応物を冷却した後、水（５００ｍＬ）を加え、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、蒸発させた。残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ベンゼン）によって精製すると、四塩化炭素から再結晶化させた後に３，５−ジベンジルオキシフェノールが白色固体として得られ（１１％）、ＥｔＯＡｃおよびヘキサンから再結晶化させた後に生成物＃ｄが白色固体として得られた（５６％）。化合物＃ｄは融点１０７〜１０９℃で同定された、
【０１０９】
【化３９】
2008509939.tif 000041
【０１１０】
（Ｅ）−３−［２，４−ビス（ベンジルオキシ）−５−ベンジル−６−ヒドロキシフェニル］−１−［３，４−ビス（ベンジルオキシ）フェニル］プロペン（＃ｅ）
室温、Ｎ２雰囲気下、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）中、２−ベンジル−３，５−ビス（ベンジルオキシ）フェノール（３．９６ｇ、１０ｍｍｏｌ）および（Ｅ）−３，４−ビス（ベンジルオキシ）シンナミルアルコール（３．４６ｇ、１０ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、２５％Ｈ２ＳＯ４／ＳｉＯ２（１．６ｇ、４ｍｍｏｌ）をひとまとめにして加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。濾過し、蒸発させた後、残渣をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘキサン＝１／７  ｖ／ｖ）によって精製し、ＥｔＯＡｃおよびｎ−ヘキサンから再結晶化すると、白色固体が得られた（３．４ｇ、収率４６．０％）：融点９３〜９５℃、
【０１１１】
【化４０】
2008509939.tif 000042
【０１１２】
（−）−（１Ｒ，２Ｒ）−３−［２，４−ビス（ベンジルオキシ）−５−ベンジル−６−ヒドロキシフェニル］−１−［３，４−ビス（ベンジルオキシ）フェニル］プロパン−１，２−ジオール（（−）−＃ｆ）
乾燥ＤＭＦ（３０ｍＬ）にプロペン（＃ｅ）（３．４ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を溶解し、この溶液にイミダゾール（１．０３ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）およびＴＢＳＣ１（１．２ｇ、７．８ｍｍｏｌ）を逐次加えた。得られた混合物を室温で３日間撹拌し、次いで、飽和Ｎａ２ＣＯ３溶液を加えて反応をクエンチした。この混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、蒸発させた。残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフ（ｎ−ヘキサンおよびＥｔＯＡｃ＝９／１  ｖ／ｖ）によって精製すると、［３，５−ビス（ベンジルオキシ）−６−ベンジル−２−［３−［３，４−ビス（ベンジルオキシ）フェニル］アリル］フェノキシ］−ｔ−ブチルジメチルシランが得られた。この物質をさらなる精製を行わずに次のステップに用いた。
【０１１３】
ｔ−ＢｕＯＨ（５０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５０ｍＬ）の溶媒混合物にＡＤ−ミックス−β（１３．０ｇ）およびメタンスルホンアミド（０．８７ｇ）を溶解した。得られた混合物を室温で５分間撹拌し、次いで、混合物を０℃に冷却し、ジクロロメタン（５０ｍＬ）中、［３，５−ビス（ベンジルオキシ）−６−ベンジル−２−［３−［３，４−ビス（ベンジルオキシ）フェニル］−アリル］フェノキシ］−ｔ−ブチルジメチルシランの溶液を加えた。この混合物を一晩撹拌した後、さらに２バッチのＡＤ−ミックス−β（各１３．０ｇ）およびメタンスルホンアミド（各０．８７ｇ）を各々２４時間間隔で加えた。０℃でさらに２４時間撹拌した後、反応が完了したことがＴＬＣによって示された。次いで、１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液を加えて反応をクエンチした。この混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、蒸発させた。残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフ（ｎ−ヘキサンおよびＥｔＯＡｃ＝４／１  ｖ／ｖ）によって精製すると、［３，５−ビス（ベンジルオキシ）−６−ベンジル−２−［３−［３，４−ビス（ベンジルオキシ）フェニル］−１，２−ジヒドロキシル−プロピル］フェノキシ］−ｔ−ブチルジメチルシランが得られた。得られた化合物をＴＨＦ（７５ｍＬ）に溶解し、ＴＢＡＦ（１０ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ）を加えた。得られた混合物を室温で４時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えた。この混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、蒸発させた。残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１／２  ｖ／ｖ）によって精製し、次いで、ＥｔＯＡｃおよびヘキサンから再結晶化させると、白色固体が得られた（２．４ｇ、収率６７％）（−）−＃ｆ：融点１５７〜１５９℃、［α］Ｄ＝−５．５（ｃ＝１．１、ＣＨＣｌ３）、
【０１１４】
【化４１】
2008509939.tif 000043
【０１１５】
（−）−（２Ｓ，３Ｒ）−トランス−５，７ビス（ベンジルオキシ）−８−ベンジル−２−［３，４−ビス−（ベンジルオキシ）フェニル］クロマン−３−オル（（−）−＃ｇ）
１，２−ジクロロエタン（５０ｍＬ）中、（−）−＃ｆ（２．４ｇ、３．１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、オルトギ酸トリエチル（１ｍＬ）、続いてＰＰＴＳ（４５０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を、固体が溶解するまで室温で２０分間撹拌した。次いで、この混合物を、反応が完了したことがＴＬＣによって示されるまで５５℃で５時間加熱した。溶媒を蒸発させた後、残渣をＤＭＥ（３０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３０ｍｌ）に溶解し、Ｋ２ＣＯ３（４５０ｍｇ）を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させた後、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／３  ｖ／ｖ）によって精製すると、目的生成物が白色固体として得られた（１．８ｇ、収率７７％）：融点１４５〜１４６℃、［α］Ｄ＝−２０．１（ｃ＝１．３、ＣＨＣｌ３）、
【０１１６】
【化４２】
2008509939.tif 000044
【０１１７】
（＋）−（２Ｒ）−５，７ビス（ベンジルオキシ）−８−ベンジル−２−［３，４−ビス（ベンジル−オキシ）−フェニル］クロマン−３−オン（（−）−＃ｈ））
Ｎ２雰囲気下、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中、（−）−＃ｇ（９００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、デスーマーチン  ペルヨージナン（６．３ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中１５％ｇ／ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）をひとまとめにして加えた。この混合物を、出発材料がないことがＴＬＣによって示されるまで、室温で約２時間撹拌した。続いて、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１５ｍＬ）および１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（１５ｍＬ）を加えて反応をクエンチした。有機層を分離し、ＣＨ２Ｃｌ２で水層を抽出した。合わせた有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、蒸発させた。残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ベンゼン）によって精製し、次いで、ＣＨＣｌ３およびエーテル中で再結晶化させると、目的化合物が得られた（７７０ｍｇ、８６％）：融点１４３〜１４５℃、［α］Ｄ＝−１７．１（ｃ＝１．１、ＣＨＣｌ３）、
【０１１８】
【化４３】
2008509939.tif 000045
【０１１９】
（＋）−（２Ｓ，３Ｓ）−シス−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−８−ベンジル−２−［３，４−ビス−（ベンジルオキシ）フェニル］クロマン−３−オル（（＋）−＃ｉ）
Ｎ２雰囲気下、乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）にケトン（−）−＃ｈ（７００ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）を溶解し、この溶液を−７８℃に冷却した。次いで、Ｌ−セレクトリド（１．５ｍＬ、ＴＨＦ中、１Ｍ溶液、１．５ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた溶液を−７８℃で８時間撹拌した。反応が完了したことがＴＬＣによって示された時点で、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）を加えて反応をクエンチした。有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、蒸発させた。残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（５％ＥｔＯＡＣ／ベンゼン）によって精製し、次いで、エタノールおよびＥｔＯＡＣを用いて再結晶化させると、目的生成物（６３０ｍｇ、９０％）が白色固体として得られた：融点１２９〜１３１℃、［α］Ｄ＝＋５．３（ｃ＝１．２、ＣＨＣｌ３）、
【０１２０】
【化４４】
2008509939.tif 000046
【０１２１】
（＋）−（２Ｓ，３Ｓ）−５，７ビス（ベンジルオキシ）−８−ベンジル−２−［３，４−ビス−（ベンジルオキシ）−フェニル］クロマン−３−イル  ３，４，５−トリス（ベンジルオキシ）−ベンゾエート（（＋）−＃ｊ）
Ｎ２雰囲気下、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）および１滴のＤＭＦ中、３，４，５−トリス（ベンジルオキシ）安息香酸（１７０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の溶液を塩化オキサリル（１ｍＬ）とともに３時間還流した。過剰の塩化オキサリルおよび溶媒を蒸留によって除去し、残渣を真空下で３時間乾燥させ、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）に溶解した。０℃で、ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中、（＋）−＃ｉ（１５０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（７５ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）の溶液に、この溶液を滴下した。この混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加えた。有機層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、蒸発させた。残渣を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（５％ＥｔＯＡｃ／ベンゼン）によって精製すると、目的化合物（２１５ｍｇ、９１％）が得られた。ＣＨＣｌ３およびエーテル中で再結晶化させると白色粉末が得られた：融点５２〜５４℃、［α］Ｄ＝＋３７．５（ｃ＝１．０、ＣＨＣｌ３）、
【０１２２】
【化４５】
2008509939.tif 000047
【０１２３】
（−）−（２Ｓ，３Ｒ）−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−８−ベンジル−２−［３，４−ビス−（ベンジルオキシ）−フェニル］クロマン−３−イル  ３，４，５−トリス（ベンジルオキシ）−ベンゾエート（（−）−＃ｋ）
出発材料として（−）−＃ｇを用いるが、（−）−＃ｊの調製のために用いた手順に従って、（−）−（２Ｓ，３Ｒ）−５，７−ビス（ベンジルオキシ）−８−ベンジル−２−［３，４−ビス（ベンジル−オキシ）フェニル］−クロマン−３−イル３，４，５−トリス（ベンジルオキシ）ベンゾエートが白色固体として得られた（収率９０％）：融点１０３〜１０５℃、［α］Ｄ＝−９．８（ｃ＝１．３、ＣＨＣｌ３）、
【０１２４】
【化４６】
2008509939.tif 000048
【０１２５】
（＋）−（２Ｓ，３Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−８−ベンジル−２−［３，４−ジヒドロキシ−フェニル］クロマン−３−イル  ３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（（＋）−＃Ｉ）
Ｈ２雰囲気下、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（１：１  ｖ／ｖ、２０ｍＬ）の溶媒混合物中、（＋）−＃ｊ（２００ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ（２０％、４００ｍｇ）を加えた。反応混合物を室温、Ｈ２下で６時間撹拌し、その時点で反応が完了したことがＴＬＣによって示された。反応混合物を濾過して触媒を除去した。濾液を蒸発させ、残渣を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、次いで、２０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって迅速に精製すると、（＋）−８−ベンジルカテキンガラート（（＋）−＃１）が得られた（８２ｍｇ、収率９０％）：融点２４３〜２４５℃（分解）、［α］Ｄ＝＋１２３（ｃ＝１．８、アセトン）、
【０１２６】
【化４７】
2008509939.tif 000049
【０１２７】
（−）−（２Ｓ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−８−ベンジル−２−［３，４−ジヒドロキシ−フェニル］クロマン−３−イル  ３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（（−）−１６）
出発材料として（−）−＃ｋを用いるが、（＋）−＃Ｉの調製のための手順に従って、（−）−８−ベンジルカテキンガラート（（−）−１６）が得られた（収率９１％）：融点２３９〜２４１℃（分解）、［α］Ｄ＝−３５（ｃ＝２．０、アセトン）、
【０１２８】
【化４８】
2008509939.tif 000050
【０１２９】
（−）−ＥＧＣＧおよび１の安定性試験
（−）−ＥＧＣＧまたは１（０．１ｍＭ）を、ＲＰＭＩ１６４０培養培地とともに３７℃でインキュベートした。種々の時点で、１５μＬの培地を、Ｃ−１８逆相カラム（ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ  １２０，Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、４．６ｍｍ内径×２５０ｍｍ）を備えるＨＰＬＣに注入した。流速１ｍＬ／分、検出、ＵＶ２８０ｎｍ、（−）−ＥＧＣＧ  については、時点は０、１０、２０、４０、６０、９０、１２０分とし、移動相、２０％アセトニトリル水溶液および０．０１％ＴＦＡ、プロドラッグ１については、時点は０、３０、６０、９０、１２０分とし、移動相、５０％アセトニトリル水溶液および０．０１％ＴＦＡ。
【０１３０】
１の酵素的加水分解
２×１０６個ジャーカットＴ細胞に溶解バッファー（ｐＨ５）（０．２５ｍＬ）を加えた。これによって、細胞の細胞膜を破壊し、細胞質酵素を放出することができる。培地を酵素にとって最適ｐＨ値（ｐＨ７）に中和するＰＢＳ（０．７５ｍＬ）を加えた。プロドラッグ１（０．２５ｍＭ）を反応混合物中に加え、３７℃でインキュベートした。上記で概説したように、種々の時点（０、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、３００および３６０分）で反応混合物のアリコート（０．０６ｍＬ）を採取し、濾過し、ＨＰＬＣに注入し、分析した。
【０１３１】
溶解物を含むか含まない培養培地におけるビタミンＣの存在下での１の加水分解
化合物１（３５μＭ）を、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ビタミンＣ１．６７ｍｇ／ｍＬを含有する１ｍＬ）とともに３７℃でインキュベートした。種々の時点で、１０μＬの溶液を、Ｃ−１８逆相カラムを備えるＨＰＬＣに注入した。流速１ｍＬ／分、検出、ＵＶ２８０ｎｍ、移動相、０〜８分（２０％アセトニトリル水溶液および０．０１６％ＴＦＡ）、８〜１３分（２０％アセトニトリル水溶液および０．０１６％ＴＦＡ〜６０％アセトニトリル水溶液および０．００８％ＴＦＡへ変動）。
【０１３２】
溶解物の存在下での１の加水分解を調べるために、同一濃度の１を、溶解物（０．１５ｍＬ溶解バッファーを含む５×１０５個乳癌細胞）の存在下でＤＭＥＭ（ビタミンＣ１．６７ｍｇ／ｍＬを含有する２ｍＬ）とともにインキュベートした。上記で概説したように、種々の時点で、反応混合物のアリコート（０．０６ｍＬ）を採取し、濾過し、ＨＰＬＣに注入し、分析した。
【０１３３】
細胞培養
ヒトジャーカットＴ細胞およびＬＮＣａＰ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩで培養した。非形質転換ナチュラルキラー細胞（ＹＴ株）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭ  ＭＥＭピルビン酸ナトリウムおよび０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を含有するＲＰＭＩ培地で増殖させた。ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞、正常（ＷＩ−３８）およびサルウイルスで形質転換した（ＶＡ−１３）ヒト線維芽細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｐｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したダルベッコの改変イーグル培地で増殖させた。すべての細胞培養は５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で維持した。
【０１３４】
細胞抽出物調製およびウエスタンブロッティング
全細胞抽出物を、これまでに記載された通りに調製した（Ａｎ  Ｂ，Ｇｏｌｄｆａｒｂ  ＲＨ、Ｓｉｍａｎ  Ｒ、Ｄｏｕ  ＱＰ．Ｎｏｖｅｌ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  Ｂｃｌ−２  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐ２７  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｎｏｒｍａｌ，ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  １９９８、５、１０６２〜７５頁）。Ｂａｘ、ＩＫＢａ、ｐ２７、ＰＡＷおよびユビキチン化タンパク質発現の分析は、先に報告されたプロトコールに従い、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて実施した（Ａｎ  Ｂら）。
【０１３５】
（−）−ＥＧＣＧまたは合成茶ポリフェノールによる精製２０ｓプロテアソーム活性の阻害
２０ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性の測定は、種々の濃度の、先に記載された天然および合成茶ポリフェノール（Ｎａｍ  Ｓら）とともにか、それらをともなわずに、０．５μｇの精製ウサギ２０ｓプロテアソームを４０μＭ蛍光発生ペプチド基質、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣとともにインキュベートすることによって実施した。
【０１３６】
天然／合成茶ポリフェノールによる、無傷の細胞におけるプロテアソーム活性の阻害
ＶＡ−１３またはＷＩ−３８細胞を、２４ウェルプレートで７０〜８０％コンフルエンシーまで増殖させ（２ｍｌ／ウェル）、続いて、２５ｐＭ（−）−ＥＧＣＧ、２または２ａで２４時間処理した。次いで、４０ｐＭ  Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ基質を３７℃で２．５時間加え、キモトリプシン様活性を上記の通り測定した。あるいは、細胞を２５μＭの各化合物で４時間または２４時間処理し、回収し、溶解した。次いで、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ（４０μＭ）を、調製した細胞溶解物とともに２．５時間インキュベートし、キモトリプシン様活性を上記の通り測定した。
【０１３７】
ＦＩＴＣと結合している抗切断ＰＡＲＰを用いるアポトーシス細胞の免疫染色
アポトーシス細胞の免疫染色を、ＦＩＴＣと結合している、切断されたポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）を認識するポリクローナル抗体を添加することによって実施し、Ａｘｉｏｖｅｒｔ２５（Ｚｅｉｓｓ；Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）顕微鏡で可視化した。細胞は６０ｍｍディッシュで約８０％コンフルエンシーに増殖させた。次いで、ＶＡ−１３細胞をＶＰ−１６、２または２ａ（２５μＭ）で２４時間処理した。処理後、懸濁液と接着細胞の両方を回収し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で２回洗浄した。以下に列挙したすべてのステップの間で細胞を洗浄し、すべての洗浄はＰＢＳで１分間とした。次いで、氷冷７０％エタノールで細胞を固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で透過処理し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中、室温で３０分間ブロッキングした。一次ＦＩＴＣ結合ｐ８５／ＰＡＲＰ抗体とのインキュベーションは、穏やかに撹拌しながら暗所、４℃で３０分間とした。次いで、細胞懸濁液を、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔｏｒ  Ｓｈｉｅｌｄ  ｍｏｕｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍの存在下、ガラススライドに移した。画像はＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ４．１を用いて獲得し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ６．０ソフトウェアを用いて調整した。細胞死は、同一視野中の細胞全数にわたってアポトーシス細胞数を計数することによって定量化した。データは２連の実験の平均±ＳＤである。
【０１３８】
トリパンブルーアッセイ
トリパンブルーアッセイを用いて、示した天然および合成ポリフェノールで処理したジャーカットＴ細胞において細胞死を確認した。アポトーシス形態は、先に記載されるように、位相差顕微鏡を用いて評価した（Ｋａｚｉ  Ａ、Ｈｉｌｌ  Ｒ、Ｌｏｎｇ  ＴＥ、Ｋｕｈｎ  ＤＪ、Ｔｗｏｓ  Ｅ、Ｄｏｕ  ＱＰ．Ｎｏｖｅｌ  Ｎ−ｔｈｉｏｌａｔｅｄ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｎｏｒｍａｌ  ｏｒ  ｎｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ，ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００４、６７、３６５〜７４頁；Ｋｕｈｎ  ＤＪ、Ｓｍｉｔｈ  ＤＭ、Ｐｒｏｓｓ  Ｓ、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ  ＴＬ、Ｄｏｕ  ＱＰ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００３、８９、８２４〜３６頁）。
【０１３９】
ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴを用いて、腫瘍細胞の全体的な増殖に対するポリフェノールの効果を調べた。ヒト胸部ＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、７０〜８０％コンフルエンシーに増殖させ、続いて、２４時間類似体を添加した。次いで、ウェルにＰＢＳ中、ＭＴＴ（１ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で４時間インキュベートし、代謝的に活性な細胞によってテトラゾリウム塩を完全に切断させた。次いで、ＭＴＴを除去し、１００μｌのＤＭＳＯを加え、５６０ｎｍでマルチラベルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ３；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて比色分析を実施した。プロットした吸光度値は、３連の実験から得た平均である。
【０１４０】
軟寒天アッセイ
先に記載されたように（ｋａｚｉ  Ａら）、細胞の形質転換活性を調べるために、ＬＮＣａＰ細胞（２×１０４個）を、（−）−ＥＧＣＧまたは保護された茶類似体（２５ｐＭ）の存在下、６ウェルプレート上の軟寒天に、またはＤＭＳＯ（対照）にプレーティングした。
【０１４１】
核染色
各薬物処理の後、剥離および接着ＶＡ−１３およびＷＩ−３８細胞を、ヘキスト３３３４２で染色し、アポトーシスについて評価した。簡単には、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、４℃で７０％エタノールを用いて１時間固定し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、５０ｐＭへキストを用い、暗所、室温で３０分間染色した。剥離細胞をスライド上にプレーティングし、接着細胞は、１０×または４０×分解能の蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてプレート上で可視化した。ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ４．１を用いＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって画像を獲得し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ６．０を用いて調整した。
【０１４２】
合成茶ポリフェノールによるカスパーゼ−３活性の誘導
細胞を各化合物２５μＭで４時間または２４時間処理し、次いで、回収し、溶解した。細胞溶解物にＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（４０μＭ）を２．５時間加え、カスパーゼ−３活性。
【０１４３】
結果
ペルアセタート（−）−ＥＧＣＧ、１の化学安定性および酵素的加水分解
ｐＨ値が約８であり体液を模倣する培養培地（ＲＭＰＩ）において、１および（−）−ＢＧＣＧの安定性が比較されている。０．１ｍＭの（−）−ＥＧＣＧまたは１を１ｍＬ  ＲＭＰＩ中、３７℃で、示した時間インキュベートした。種々の時点で、ＨＰＬＣによって残存する試験化合物の量について培地を分析した。図２には分解曲線が示されている。
【０１４４】
（−）−ＥＧＣＧを培養培地に溶解すると、２０分以内に迅速に分解することがわかり、これによって、培地中で（−）−ＥＧＣＧの安定性が低いことが実証された。図２に見られるように、１も培地中で分解したが、その分解速度は、（−）−ＥＧＣＧと比較するとかなり遅かった。１は２時間後に完全に消失し、このことは、この培地中で（−）−ＥＧＣＧよりも６倍より安定であるということを示す。したがって、（−）−ＥＧＣＧのフェノール基のペルアセタート保護は、培養（おそらくは生理学的）条件において１を安定化することに関与する。
【０１４５】
培養培地条件下で、１がＥＧＣＧに加水分解されたかどうかを調べるために、実験を繰り返したが、ここでは、生じたＥＧＣＧの迅速な分解を防ぐためにビタミンＣを（１．６７ｍｇ／ｍＬで）加えた。１が消失した時点で、新規ピークＡが増大し、次いで、経時的に強度が低下することがＨＰＬＣによって観察された。これに続いて、ＨＰＬＣで別のピークＢが現れ、これも最終的には低下した。最後に、ＥＧＣＧと保持時間が同一であるＨＰＬＣのピークが形成されることが観察された。これらの成分の経時的推移結果は図３に示した。ＥＧＣＧの同一性はＵＶ分光法ならびに質量分析によって確認した。さらに、ピークＡおよびＢの質量分析により、それらは、それぞれＥＧＣＧのジアセタートおよびモノアセタートであることが示された。これらの結果から、化合物１は、培養培地条件下では、まず、ジアセタートに、次いで、モノアセタートに、最終的にＥＧＣＧに加水分解されるということが示唆された。
【０１４６】
細胞条件下での化合物１からの（−）−ＥＧＣＧの生成は、（−）−ＥＧＣＧの迅速な消失を防ぐためにビタミンＣを添加することによってより明確に実証できた。この場合には、本発明者らは、乳癌細胞溶解物を含む培地中で実験を実施した。ＨＰＬＣ分析により、図３同様、経時的推移結果（図４）において、１の消失とともに、Ａ（二酢酸塩）、Ｂ（モノアセタート）、次いで（−）−ＥＧＣＧの一時的な形成が示された。したがって、化合物１は、溶解物を添加した培地において、加水分解を受け、ＥＧＣＧの二酢酸塩、次いで、モノアセタート、次いで、ＥＧＣＧ、最終的に、没食子酸を形成したと考えられる（スキーム１）。
【０１４７】
【化４９】
2008509939.tif 000051
【０１４８】
１および（−）−ＥＧＣＧによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるプロテアソーム活性の阻害
１が（−）−ＥＧＣＧのプロドラッグとして機能するなら、細胞の内側で脱アセチル化され、そこでその親化合物に変換するまで生物学的に不活性のままであるはずである。この仮説を調べるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび無傷のジャーカットＴ細胞の両方において、１または（−）−ＥＧＣＧ（陽性対照として）のいずれかを用い、プロテアソーム活性を調べた。まず、１および市販の（−）−ＥＧＣＧをＤＭＳＯに溶解し、精製２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性に対するその効果を測定した。１は、１０μＭで精製２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性の阻害において完全に不活性であった（図５）。対照的に、（−）−ＥＧＣＧは、１０μＭでプロテアソームのキモトリプシン様活性を８０〜９０％阻害した。したがって、予想したように、細胞系の外側にある１はプロテアソーム阻害剤ではない。
【０１４９】
１が細胞の内側で（−）−ＥＧＣＧに変換すれば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてプロテアソーム阻害が検出されるはずである。この可能性を調べるために、ヒトジャーカット細胞を、２５μＭの１または（−）−ＥＧＣＧで１２または２４時間処理し、続いて、無傷の細胞においてキモトリプシン様特異的蛍光発生基質を用いること（図６ａ）またはユビキチン化タンパク質についてのウエスタンブロット（図６ｂ）によってプロテアソーム活性を測定した。ジャーカットＴ細胞の（−）−ＥＧＣＧでの２４時間の処理によって、プロテアソーム活性が３１％阻害されたのに対し、１では４２％阻害された（図６ａ）。ポリユビキチン化タンパク質の細胞内レベルを分析するために、１２時間インキュベートした後に細胞を溶解し、ウエスタンブロッティングに付した。１は、天然（−）−ＥＧＣＧのものと同程度のレベルのユビキチン化タンパク質を示した（図６ｂ）。したがって、１は、無傷の細胞におけるプロテアソーム活性の阻害において、（−）−ＥＧＣＧと同等に強力か、そうでなければ（−）−ＥＧＣＧよりも強力である。一方で、１はＥＧＣＧと比べて６倍より安定であるにもかかわらず、細胞におけるその生物学的活性の効力は、同様の程度には増加しなかった。１から生じるＥＧＣＧ量、ひいては、細胞の内側でのその生物学的活性は、因子：１の細胞への相対的透過性、いずれかの時点で細胞中に存在し得るエステラーゼ酵素の量および抗酸化物質の量の組合せに応じて変わるという可能性がある。
【０１５０】
１および（−）−ＥＧＣＧによる、ジャーカット細胞におけるＡｋｔの脱リン酸化
（−）−ＥＧＣＧおよび１を、５、１０および２５μＭでジャーカットＴ細胞とともに２４時間インキュベートし、続いて、リン酸化Ａｋｔに対する特異的抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った（図７）。２５μＭで活性化Ａｋｔの７３％の減少をもたらすことがデンシトメトリー分析によって示された１での処理と比較して、（−）−ＥＧＣＧは、２５μＭで、ｐ−Ａｋｔのレベルを３２％低減することが分かった（図７）。アクチンはローディングコントロールとして用いた。
【０１５１】
１および（−）−ＥＧＣＧによって誘導される細胞死
（−）−ＥＧＣＧおよび１の、１０μＭで２４時間処理したジャーカットＴ細胞において細胞死を誘導する能力も評価されている。（−）−ＥＧＣＧは細胞死に対して最少の効果しか有さなかった（５％）のに対し、１はその濃度で最大１５％の細胞死を誘導できた（図８）。したがって、１の、細胞のプロテアソーム活性を阻害し（図６）、Ａｋｔを不活化する（図７）より大きな能力が、その細胞死誘導活性の増大と関連している（図８）。
【０１５２】
アセチル化合成茶ポリフェノールは精製２０ｓプロテアソーム活性を阻害しない
すべての保護された化合物および保護されていない化合物の最大２５μＭを、精製２０ｓプロテアソームおよびキモトリプシン活性の蛍光発生基質とともに３０分間インキュベートした。次いで、最大半量阻害濃度すなわちＩＣ５０を求めた。（−）−ＥＧＣＧは最も強力であり、ＩＣ５０は０．２μＭであり、続いて、２である（ＩＣ５０は約９．９μＭ）と分かった。化合物３および４のＩＣ５０値は１４〜１５μＭであると分かった。対照的に、保護された類似体はかなり活性が低かった：２５μＭで＜３５％阻害。これは上記の結果と一致する。
【０１５３】
保護された茶類似体は、無傷の腫瘍細胞においてより大きなプロテアソーム阻害効力を示す
合成茶類似体がｉｎ  ｖｉｖｏでプロテアソームに対してどのような効果を有していたかを調べるために、ジャーカット細胞を各合成化合物２５μＭで４時間または２４時間処理し、（−）−ＥＧＣＧを対照として用いた（図９Ａおよび９Ｂ）。４時間処理した後、ウエスタンブロット解析は、アセタート保護された類似体がより多量のユビキチン化タンパク質を誘導したことを示し（図９Ａ、レーン５、７および９）、このことはプロテアソーム活性が抑制されていることを示す。ペルアセタート保護された（−）−ＥＧＣＧは天然（−）−ＥＧＣＧよりもより強力であることを示す上記の先のデータに基づいて、１を対照として用いた（図９Ａ、レーン３対２）。さらに、２種のプロテアソーム標的として知られる、ＢａｘおよびＩκＢαについてのウエスタンブロットは、これらのタンパク質の消失と、タンパク質のマルチユビキチン化体であると推測されるより高分子量のバンドの出現を示した（図９Ａ、レーン３、５、７および９）。しかし、２４時間処理した後、（−）−ＥＧＣＧおよびその保護されていない類似体は、より多量のユビキチン化タンパク質を示した（図９Ｂ、レーン２、４、６および８）。これは、保護された類似体は、より早期の時点ではプロテアソームの強力な阻害剤であるという考えおよび２４時間処理した後には、ユビキチン化タンパク質は脱ユビキチン化酵素によって枯渇しているという考えと一致する。ｐ２７、別のプロテアソーム標的の蓄積も、保護された類似体２ａ、３ａおよび４ａで処理したジャーカット細胞において見られる（図９Ｂ、レーン９、５、７）。推定ユビキチン化ＩκＢαバンドは、２ａ、３ａおよび４ａで処理した細胞においてもまだ見られる（図９Ｂ、レーン９、５、７）。２４時間処理では、推定ユビキチン化ＩκＢαバンドは、おそらくは脱ユビキチン化のためにここでは存在しない（図９Ｂ）。この実験ではアクチンをローディングコントロールとして用いた。
【０１５４】
保護された類似体は白血病細胞においてより多い細胞死を誘導する
類似体４および４ａの対を用いる速度論実験では、保護されていない類似体４はユビキチン化タンパク質の蓄積を誘導し、最高発現は８時間のポリフェノール処理後であることが分かった（図９Ｃ）。反対に、保護された４ａは、２時間という早期にユビキチン化タンパク質蓄積の増加を示し、最大８時間まで持続した（図９Ｃ）。アセテート保護された類似体が、他の癌細胞系において強力なプロテアソーム阻害剤であるかどうかを調べるために、前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞を２５μＭの（−）−ＥＧＣＧ、１、２ａまたは３ａで２４時間処理し、対照としてＤＭＳＯを用いた。実際、ユビキチン結合タンパク質が観察され、２ａおよび３ａで処理した細胞において最大増加が見られた（図９Ｄ）。
【０１５５】
保護された類似体はより強力なアポトーシス誘導因子である
プロテアソーム阻害は、多種多様な癌細胞においてアポトーシスを誘導できるが、正常細胞、非形質転換細胞ではそうではないということがわかっている（Ａｎ  Ｂら）。ジャーカットＴ細胞を、選択されたポリフェノールおよびその保護された類似体、各２５μＭで２４時間処理し、アポトーシス細胞死を誘導するそれらの能力を調べた。トリパンブルー取り込みアッセイは、２ａ、３ａおよび４ａは、それぞれジャーカット細胞の９９、５７および８３％の死を誘導するが、他のものはそうではないことを示した（図１０Ａ）。同様に、ウエスタンブロット解析は、２ａ、３ａおよび４ａのみが、２４時間後にアポトーシス特異的ＰＡＲＰ切断を誘導することを示した（図１０Ｂ）。切断ＰＡＲＰ断片（ｐ８５：緑色）のみを検出する免疫蛍光染色は、ＳＶ４０で形質転換したＶＡ−１３細胞は、２ａによって誘導されるアポトーシスに対して高度に感受性であり、２４時間処理した後に７３％がアポトーシス細胞であることを示した（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。保護されていない２は、かなり少ないアポトーシスしか誘導しなかった（２１％）が、陽性対照として用いた２５μＭのＶＰ−１６は、９２％のアポトーシスを誘導した（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。ＤＮＡのＡ−Ｔリッチ領域の副溝と結合するＤＡＰＩを用いる対比染色は、アポトーシス細胞において著しく低下し（図１０Ｃ）、後期アポトーシスにおけるＤＮＡ断片化と一致する。
【０１５６】
保護されたポリフェノールによる腫瘍細胞増殖の阻害
次いで、処理された乳癌（ＭＣＦ−７）細胞を５または２５μＭのペルアセタート保護された類似体で２４時間、続いて、ＭＴＴ類似体で処理し、細胞増殖に対するその効果を調べた。化合物１は、２５μＭで細胞増殖を４０％阻害した（図１１Ａ）。保護された化合物２ａ、３ａおよび４ａは、それぞれ５μＭで５０％阻害を引き起こし、２５μＭで７０％阻害を引き起こした（図１１Ａ）。
【０１５７】
次いで、ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞を、選択した茶ポリフェノール保護された類似体１、２ａ、３ａ、４ａ、各２５μＭで２４時間処理し、続いて、アポトーシス性形態変化を調べた。再度、保護された類似体２ａ、３ａおよび４ａは、著しい細胞死、剥離および細胞の断片化を引き起こした（図１１Ｂ）。１は軽度の形態変化を誘導し、他方、（−）−ＥＧＣＧ処理は、肥大した、平板化した細胞をもたらし、これは増殖停止を示した。
【０１５８】
軟寒天アッセイを用いて腫瘍細胞の形質転換活性を調べる。コロニー形成の抑止は、ＧＩ停止および／またはアポトーシスと関連している。ＬＮＣａＰ細胞を、６ウェルプレートに入れた軟寒天に加え、次いで、最初のプレーティング時に１度、２５μＭの（−）−ＥＧＣＧまたは保護された類似体で処理した（図１１Ｃ）。２１日後、コロニー形成を評価した。（−）−ＥＧＣＧで処理した細胞は、ＤＭＳＯで処理した対照細胞と比較して、コロニー形成の大幅な減少を示した（図１１Ｃおよび１１Ｄ）。保護されたポリフェノールもまた、腫瘍細胞形質転換活性を阻害し、２ａおよび４ａはコロニー形成の最も強力な阻害剤である（図１１Ｄ）。
【０１５９】
保護された類似体による、腫瘍細胞におけるアポトーシスの選択的誘導
正常細胞ではなく腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する能力は、新規抗癌剤にとって重要な尺度である。保護された化合物が正常細胞にも影響を及ぼすかどうかを調べるために、ＶＡ−１３およびＷＩ−３８細胞の両方を、２５μＭの（−）−ＥＧＣＧ、２または２ａで２４時間処理し、プロテアソーム活性、核の形態変化および剥離を調べた。ＶＡ−１３細胞において、正常ＷＩ−３８細胞を超えるプロテアソームのキモトリプシン様活性の差示的減少が見られた（図１２Ａ）。（−）−ＥＧＣＧおよび２で処理したＶＡ−１３細胞では、プロテアソーム活性の４２〜４８％減少が観察され、他方、２ａはプロテアソーム活性の９２％を阻害した。反対に、ＷＩ−３８細胞ではプロテアソーム活性は、３種のポリフェノール処理すべてで−５％しか低下しなかった。
【０１６０】
次に、天然（−）−ＥＧＣＧ、２および２ａで処理した後のアポトーシス性核形態が調べられている（図１２Ｂ）。ＳＶ−４０で形質転換したＶＡ−１３細胞では、（−）−ＥＧＣＧおよび２はアポトーシスをほとんど示さなかったか、全く示さなかったが、２ａはアポトーシスを著しく誘導した。対照的に、すべての化合物で処理した正常ＷＩ−３８線維芽細胞はアポトーシスを受けず、極めてわずかな剥離が見られた。次いで、すべての保護された類似体間の比較を、２５μＭ、２４時間を用いて実施した。３６時間後、（−）−ＥＧＣＧは、ＶＡ−１３細胞においてアポトーシスを開始しなかった（図１２Ｃ）。保護された類似体のすべては、形質転換された細胞（ＶＡ−１３）においてアポトーシスを誘導したが、正常（ＷＩ−３８）細胞では誘導しなかった（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。同様に、白血病（ジャーカットＴ）および正常、非形質転換ナチュラルキラー（ＹＴ）細胞を、（−）−ＥＧＣＧおよび２ａで２４時間処理した場合に、ジャーカット細胞のみがアポトーシスを受けたことがＰＡＷ切断から明らかであった（図１２Ｄ）。
【０１６１】
新規合成茶ポリフェノール類似体による、精製２０Ｓプロテアソーム活性の阻害
緑茶ポリフェノール（−）−ＥＧＣＧは、３つの−ＯＨ基を有するＢ環を含み（図１）、精製２０Ｓプロテアソームに対するＩＣ５０値は０．３μＭである（表１）。
【０１６２】
【表１】
2008509939.tif 000052
【０１６３】
（−）−ＥＧＣＧのＢ環からの−ＯＨの除去により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてプロテアソーム阻害効力が小さい（０．５８μＭ）（−）−ＥＣＧが生じる。本発明者らは、Ｂ環−ＯＨ基の欠失の、プロテアソーム阻害および細胞死誘導能力に対する効果をさらに調べるために、Ｂ環の−ＯＨ基を排除した数種の新規ＥＧＣＧ類似体ならびにその推定プロドラッグ、ペルアセタート保護された対応物を合成した。精製２０Ｓプロテアソームおよびキモトリプシン様蛍光発生基質を用いることによって、以下の保護されていないポリフェノール類似体のプロテアソーム阻害効果が調べられている：
【０１６４】
【化５０】
2008509939.tif 000053
【０１６５】
【表２】
2008509939.tif 000054
【０１６６】
プロテアソーム阻害活性と、Ｂ環およびＤ環の−ＯＨ基の数の間には良好な相関が観察される。Ｂ環から個々の−ＯＨ基を排除するにつれ、ＩＣ５０値が段階的に増加し、観察された効力の順序は次の通りであった：（−）−ＥＧＣＧ（ＩＣ５００．３０μＭ）＞（−）−ＥＣＧ（０．５８μＭ）＞６（２．６９μＭ）＞＃ｍ（４．５６μＭ）（図１３および表１）。一連の化合物１２、１１（１２のエピマー）およびＤ環に１個の−ＯＨを含む１０（図１３）では、２個のＢ環−ＯＨ基を含む１２および１１が、１個のＢ環−ＯＨ基しか含まない１０よりもより強力であることは一貫している（それぞれ５．９９、７．７０および８．５１μＭ、表１）。
【０１６７】
さらなるＳＡＲ分析も、Ｂ環−ＯＨ排除単独と比較して、Ｄ環からさらなる−ＯＨ基が除去された場合に、阻害効力がさらに低下することを示した。例えば、６は、１０よりもより強力であり（２．６９対８．５１μＭ）、（−）−ＥＣＧならびに（−）−ＣＧは、Ｎｏ１２よりもより強力である［０．５８および０．７５対５．９９μＭ；］。最後に、本発明者らは、Ａ環周囲の疎水性作用を調べるために化合物１６を含めた。実際、化合物１６は、対応物（−）−ＣＧよりもより活性であることが分かった［０．５９対０．７５μＭ、図１３、表１および２］。
【０１６８】
比較として、保護されたポリフェノール類似体の、精製プロテアソームに対する阻害活性も調べられている。予想どおり、ペルアセタート保護された類似体（＊によって示される）は、その保護されていない類似体と比較して、精製２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性の強力な阻害剤ではなかったが、これはおそらく、変換に必要とされる細胞のエステラーゼの欠如のためである。すべての保護された類似体が２５μＭで、精製２０Ｓプロテアソーム活性の＜２０％しか阻害しなかった（表１）。
【０１６９】
合成茶ポリフェノールによる細胞のプロテアソーム活性の阻害
保護されていないポリフェノール類似体および保護されたポリフェノール類似体が、無傷の細胞においてプロテアソーム活性を阻害できるかどうかを調べるために、白血病ジャーカットＴ細胞を各化合物２５μＭで４時間および２４時間処理し、続いて、細胞ペレットを回収し、調製した溶解物においてプロテアソームのキモトリプシン様活性を測定した。保護されていない化合物は、無傷のジャーカットＴ細胞において制限されたプロテアソーム阻害を示すが、１０および１５は中程度の効力を示した（図１４）。これらのデータは、保護されていない化合物のすべてではないがほとんどは、おそらくはその細胞不安定性のために、（−）−ＥＧＣＧ同様、細胞環境において中程度にしか活性でないということを示唆する。
【０１７０】
２４時間処理した後に、試験したペルアシルオキシル保護された、特に、ペルアセタート保護されたポリフェノールのすべてが、その保護されていない対応物よりもはるかに強力なプロテアソームのキモトリプシン様活性の阻害剤であったことは重要である（図１４）。特に、１９＊は、２４時間処理した後に、キモトリプシン様活性の９７％を阻害したが、その保護されていないポリフェノール対応物６はキモトリプシン様活性の３０％しか阻害しなかった。
【０１７１】
アポトーシス促進性タンパク質Ｂａｘおよびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２７は天然のプロテアソーム標的である。ペルアセタート保護されたポリフェノールが無傷のプロテアソーム活性を阻害するとすれば、本発明者らはこれらの細胞におけるＢａｘおよびｐ２７の蓄積を予想する。この考えを調べるために、ジャーカットＴ細胞を、保護された化合物および保護されていない化合物の両方で処理し、Ｂａｘおよびｐ２７に対する特異的抗体を用いるウエスタンブロットによって溶解物を分析した（図１５）。４時間処理した後、ペルアセタート保護された類似体２４＊および１９＊は、Ｂａｘ（それぞれ３倍および２．５倍）ならびにｐ２７（それぞれ６倍および１１倍）の蓄積を増加できたが、それらの保護されていない類似体はそうではなかった（図１５Ａ）。２４時間処理した後、Ｂａｘレベルは、ペルアセタート保護された化合物のすべてで処理した細胞において上昇した（２４＊、１９＊、２１＊および２３＊によってそれぞれ、１３倍、１２倍、４０倍および３６倍）。しかし、ｐ２７上昇は、２４時間後に、主に２１＊（２倍）および２３＊（２倍）の処理で観察された（図１５Ｂ）。さらに、４時間処理した後、ユビキチン化タンパク質のレベル、プロテアソーム阻害の指標は、保護された２２＊によって大幅に上昇したが、その対応する保護されていない１１ではそうではなかった（図１５Ｃ）。これらのデータは、これらの化合物のプロテアソーム阻害活性のプロフィールと一致する（図１４）。保護された類似体は、培養腫瘍細胞において活性プロテアソーム阻害剤に変換できることが示唆される。
【０１７２】
合成茶ポリフェノール類似体によるアポトーシス細胞死の誘導
これまでに、プロテアソーム阻害はアポトーシス誘導と関連していることがわかっている。Ｂ環／Ｄ環保護された類似体が細胞死を誘導できたかどうかを調べるために、ジャーカットＴ細胞をまず、すべての保護された類似体および保護されていない類似体２５μＭで２４時間処理し、続いて、トリパンブルー排除アッセイを行った（図１６）。保護された類似体および保護されていない類似体の両方で４時間処理した後に、細胞形態の変化（縮んだ細胞および特徴的なアポトーシス性ブレブ形成）が観察され、これらの変化は２４時間処理した後には、保護された類似体で大幅に増加した（データは示していない）。さらに、ペルアセタート保護された類似体は、４時間インキュベートした後に細胞死の５〜１０倍の増加を誘導し、２４時間では最大２０倍増加した（図１６）。対照的に、保護されていないポリフェノールははるかに少ない細胞死しか引き起こさず、２４時間処理した後でさえ、３〜５倍の増加にすぎなかった（図１６）。
【０１７３】
観察された細胞死（図１６）がアポトーシスの誘導によるものであったかどうかを調べるために、ジャーカットＴ細胞において同様の実験を実施し、続いて、カスパーゼ−３活性化およびＰＡＲＰ切断を測定した。ペルアセタート保護されたポリフェノールは、最高レベルのカスパーゼ−３活性を誘導した（図１７Ａ）。４時間の２４＊処理は、約１６倍の増加をもたらしたが、保護されていない１６は４倍の増加しかもたらさなかった。さらに、保護された１９＊処理は、カスパーゼ−３活性を１６倍増加させたが、保護されていない対応物６には、はるかに小さい効果しかなかった（４倍）。２４＊および１９＊で処理した細胞においてＰＡＲＰ切断が検出されたが、保護されていない対応物１６および６ではそうではないことは一貫している（図１７Ｂ）。さらに、保護された化合物２２＊は、４時間処理した後に細胞においてＰＡＲＰ切断を誘導できたが、保護されていない対応物１１はそうではなかった（図１７Ｃ）。
【０１７４】
ペルアセタート保護された（−）−ＥＧＣＧ類似体による、腫瘍細胞におけるアポトーシスの選択的誘導
正常細胞においてではなく腫瘍細胞におけるアポトーシス誘導は、抗癌剤の重要な側面である。本発明者らは、ペルアセタート保護された類似体が正常細胞に影響を及ぼすかどうかを調べるために、白血病ジャーカットＴ細胞および非形質転換不死化ナチュラルキラー（ＹＴ）細胞の両方を、外見的に最も強力なペルアセタート保護された類似体１９＊で処理した。再度、白血病ジャーカットＴ細胞において、プロテアソーム標的タンパク質、Ｂａｘ、ｐ２７（データは示していない）およびＩκＢ−α（図１８）のレベルが上昇した。しかし、非形質転換不死化ＹＴ細胞では、これらのタンパク質のレベルは上昇しなかった。さらに、ジャーカットＴ細胞では、ユビキチン化タンパク質のレベルが用量依存的に蓄積した。対照的に、ＹＴ細胞では、ユビキチン化タンパク質のレベルのわずかな、一時的な上昇しか検出されなかった。プロテアソーム活性の選択的阻害と一致して、アポトーシス特異的ＰＡＲＰ切断はジャーカットＴでのみ見られ、ＹＴ細胞では見られなかった。したがって、強力なペルアセタート保護されたポリフェノールは、非形質転換ＹＴ細胞において、プロテアソーム阻害と、それに続くアポトーシスを誘導しないことは明らかである。
【０１７５】
考察
緑茶由来の天然（−）−ＥＧＣＧは、そのペルアセタート化合物１に変換した。さらに、ガラート環のヒドロキシル基の欠失を有する、数種の（−）−ＥＧＣＧの合成類似体を合成した。さらに、ヒドロキシル基をアセテート基に変換してプロドラッグを作出したが、これは細胞の内側でエステラーゼによって切断され、親薬物に変換されることはできなかった。驚くべきことに、保護された類似体は、無傷の腫瘍細胞において、その保護されていない対応物よりもはるかにより強力なプロテアソーム阻害剤であった。白血病（ジャーカット）、充実腫瘍、形質転換細胞株において試験した場合に、保護された類似体が、保護されていないパートナーよりもより強力なアポトーシス誘導因子でもあったことは一貫している。保護された類似体のＳＡＲ分析により、その効力の順序は次の通りであると示された：２ａ＝４ａ＞３ａ＞１＞（−）−ＥＧＣＧ。
【０１７６】
（−）−ＥＧＣＧの保護された類似体を設計し、合成した。予想外なことに、これらの化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでプロテアソーム阻害活性を有していると思われる。
ペルアシルオキシル、特に、ペルアセタート保護された類似体も、その保護されていない、ヒドロキシル化対応物よりもより強力なプロテアソーム阻害剤であるとわかる。プロテアソームのキモトリプシン様サブユニット（β５）のＮ末端Ｔｈｒは、（−）−ＥＧＣＧのエステル結合された炭素に求核攻撃を行い、これによって、β５−サブユニットへの不可逆的なアシル化が開始され、そのプロテアーゼ活性が阻害されるということが示唆された（Ｎａｍ  Ｓ、Ｓｍｉｔｈ  ＤＭおよびＤｏｕ  ＱＰ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６、１３３２２〜１３３３０頁、２００１）。しかし、ペルアセタート部分の付加により、エステル結合炭素の求電子特性が低下し、これによって精製２０Ｓプロテアソームに対する阻害がかなり小さくなる。本研究で調べた保護されたポリフェノールも、精製２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性に対して制限された阻害を示したことは驚くべきことではない（表１）。
【０１７７】
プロテアソーム阻害の活性とＢ環の−ＯＨ基数の間には相関が示されている（表２）。保護されていない類似体のＩＣ５０値は、個々の−ＯＨ基が排除されるにつれ段階的に増加した（表１）。しかし、１６は（−）−ＣＧのＡ環のＣ８炭素から離れるさらなるベンゼン環を含むが、これは（−）−ＣＧに対してわずかに増加したプロテアソーム阻害効力しか有していない（０．５９対０．７５μＭ）。
【０１７８】
別の重要なＳＡＲにより、Ｄ環から−ＯＨ基がさらに排除されると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてプロテアソーム阻害効力のさらなる低下がもたらされることが分かった（表１）。
【０１７９】
図１４に示されるように、ペルアセタート保護されたポリフェノールは、保護されていないポリフェノールよりもはるかにより強力なプロテアソームのキモトリプシン様活性の阻害剤であった。ペルアセタート保護された類似体は、２４時間での細胞のプロテアソームのキモトリプシン様活性の低下によって明らかなように、長期間安定であると思われる。対照的に、保護されていない類似体は、２４時間処理した後には安定性を失うと思われる。細胞のプロテアソームのキモトリプシン様活性は、２４時間後に類似体１９＊によって９７％阻害されたが、その保護されていない対応物６は、活性の３０％しか阻害しなかった。その他の、保護された化合物対保護されていない化合物の対と比較して、２２＊は、その対応物１１から、キモトリプシン阻害効力の相対的に少ない増加しか示さず、これは、細胞において２２＊が親薬物へ変換された可能性を示す。機構は十分には理解されていないが、細胞環境において、他のペルアセタート保護された緑茶類似体が、別個の強力な化合物に変換されるようである。
【０１８０】
合成茶ポリフェノールでプロテアソームを阻害した後に数種のプロテアソーム標的タンパク質も評価した（図１５）。Ｂａｘ、ｐ２７およびユビキチン化タンパク質の蓄積によって表されるように、ペルアセタート保護された類似体は有効なプロテアソーム阻害剤に変換されるには、細胞および／または細胞抽出物の環境を必要とするというもう１つの証拠がデータから示された。保護された類似体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルと比較して細胞モデルにおいて、その保護されていない対応物よりもより有効に標的タンパク質を蓄積できた。対照的に、保護されていない類似体は、標的タンパク質を保護された類似体の程度には蓄積しないようであり、これは−ＯＨ基からのプロトン供与とそれに続く分解の結果であり得る。データは、ペルアセタート保護された類似体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで新規化合物への変換を受け、プロドラッグとして働くことをさらに示す。
【０１８１】
トリパンブルー分析により、主に保護された類似体での処理後に誘導される、細胞死および特徴的なアポトーシス性形態変化の発生が確認された（図１６）。再度、保護された類似体は、２４時間で保護されていない類似体よりもより安定であると思われた（すべてにおいて５０％より多い細胞死）。カスパーゼ−３活性により、アポトーシスが、保護された化合物とともに４時間インキュベートした後に起こったこと、カスパーゼ−３活性が対照と比較して最大１６倍増加したことが確認される（図１７）。ＰＡＲＰ切断のウエスタンブロット解析により、１９＊、２４＊および２２＊などの保護された類似体で４時間処理した後に出現したことがさらに示された。ペルアセタート保護された（−）−ＥＧＣＧ類似体、１９＊が、ジャーカットＴ細胞においてアポトーシスを選択的に誘導したが、非形質転換ＹＴ細胞はあまり影響を受けないままであったことが最も重要であり（図１８）、このことは、保護された類似体が新規抗癌物質に開発される可能性を示唆する。
【０１８２】
要約すると、疫学的研究により、緑茶消費の抗癌的利益が示唆された。プロテアソームは、癌の病理的状態において示されており（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ  Ａ、Ｅｍｂｏ  Ｊ  １７、７１５１〜７１６０頁、１９９８）、プロテアソームの阻害剤としての緑茶ポリフェノールは、いくつかの癌のための実行可能な治療であり得る。本発明者らの本研究は、ペルアセタート保護された−ＯＨ基を含有する合成緑茶ポリフェノールは強力なプロテアソーム阻害剤であること、およびこれらの化合物をさらに調べることによって、この形の治療薬から得られるさらなる利益が解明される可能性があることをさらに示唆する。
【０１８３】
本発明は、少なくとも（−）−ＥＧＣＧと同程度には強力である（−）−ＥＧＣＧの種々の誘導体を提供する。（−）−ＥＧＣＧのカルボキシレート保護された形およびその誘導体は、保護されていない形よりもより安定であることがわかり、これをプロテアソーム阻害剤として用いて腫瘍細胞増殖を低減させることができる。さらに、１、２、３、４、１９＊、２１＊、２２＊および２３＊の構造から、（−）−ＥＧＣＧのガラート環のいくつかのヒドロキシル基は効力には重要でない可能性があるということがわかる。
【０１８４】
本発明の好ましい実施形態を実施例によって詳述したが、当業者には本発明の改変および適応が生じることは明らかである。さらに、本発明の実施形態は、実施例または図面によってのみ制限されると解釈されてはならない。しかし、このような改変および適応は、特許請求の範囲に示される、本発明の範囲内にあるということは明確に理解されなければならない。例えば、一実施形態の一部として例示されるか、記載される特徴を、別の実施形態で用い、いっそうさらなる実施形態を得ることができる。したがって、本発明は、特許請求の範囲およびその等価物の範囲内に入るこのような改変および変形を対象とするものとする。
【０１８５】
ここで、本発明の好ましい実施形態を、添付の図面を参照しながら実施例によって説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】（−）−ＥＧＣＧおよび本発明の（−）−ＥＧＣＧ誘導体の例の構造を示す図である。
【図２】（−）−ＥＧＣＧおよび１の分解曲線を示す図である。
【図３】ビタミンＣの存在下での培養培地中のペルアセタートＥＧＣＧ（１）の経時的推移結果（面積対時間）を示す図である。化合物１：◆、化合物Ａ（ジアセタート）：ｘ、化合物Ｂ（モノアセタート）：▲、ＥＧＣＧ：■。
【図４】溶解物を添加したビタミンＣの存在下での培養培地中のペルアセタートＥＧＣＧ（１）の経時的推移結果（面積対時間）を示す図である。化合物１：◆、化合物Ａ（ジアセタート）：ｘ、化合物Ｂ（モノアセタート）：▲、ＥＧＣＧ：■。
【図５】１および（−）−ＥＧＣＧによる精製２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性の阻害を示す図である。
【図６ａ】図６ａはｉｎ  ｖｉｖｏでの、１および（−）−ＥＧＣＧによるプロテアソーム活性の阻害を示す図である。
【図６ｂ】図６ｂは１および（−）−ＥＧＣＧで処理した後の、ユビキチンのウエスタンブロットアッセイを示す図である。
【図７】１および（−）−ＥＧＣＧで処理したｐ−Ａｋｔレベルの量を示す図である。
【図８】１および（−）−ＥＧＣＧで処理したジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞における細胞生存力を示す図である。
【図９ａ】示した各ポリフェノール２５μＭでジャーカット細胞を４時間処理し、続いて、ユビキチン、Ｂａｘ、ＩκＢα、ｐ２７およびアクチンに対する特異的抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った結果を示す図である。矢印によって示されるバンドは、ＢａｘおよびＩκＢαのユビキチン化体である可能性がある。レーン４、Ｕｂ−ＩκＢαバンドは、レーン５からの漏出の結果である可能性がある。示されるデータは３回の独立した実験を代表するものである。
【図９ｂ】示した各ポリフェノール２５μＭでジャーカット細胞を２４時間処理し、続いて、ユビキチン、Ｂａｘ、ＩκＢα、ｐ２７およびアクチンに対する特異的抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った結果を示す図である。矢印によって示されるバンドは、ＢａｘおよびＩκＢαのユビキチン化体である可能性がある。
【図９ｃ】示した各ポリフェノール２５μＭでジャーカット細胞を最大８時間処理してウエスタンブロット解析を行った結果を示す図である。
【図９ｄ】示した化合物２５μＭでＬＮＣａＰ細胞を２４時間（Ｄ）処理してウエスタンブロット解析を行った結果を示す図である。
【図１０ａ】示したポリフェノール２５μＭでジャーカットＴ細胞を２４時間処理した結果を示す図である。トリパンブルー取り込みアッセイ。データは全細胞集団にわたる死細胞の平均数±ＳＤとして表されている。
【図１０ｂ】示したポリフェノール２５μＭでジャーカットＴ細胞を２４時間処理した結果を示す図である。ＰＡＲＰ切断についてのウエスタンブロット。
【図１０ｃ】示したポリフェノール２５μＭでＶＡ−１３細胞を２４時間処理した結果を示す図である。ＦＩＴＣと結合しているｐ８５切断ＰＡＲＰ断片に対する特異的抗体を用いる後期アポトーシスの蛍光顕微鏡研究。ＤＡＰＩでの対比染色法が、非アポトーシス細胞の対照として用いられている。画像は、倒立蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて得た。
【図１０ｄ】示したポリフェノール２５μＭでＶＡ−１３細胞を２４時間処理した結果を示す図である。同一視野中の全細胞数にわたってアポトーシス細胞数を計数することによるＣにおけるアポトーシス細胞の定量化。データは２連の実験の平均±ＳＤである。
【図１１ａ】乳癌細胞および前立腺癌細胞に対する合成アセチル化ポリフェノールの効果を示す図である。ＭＴＴアッセイ。乳癌ＭＣＦ−７細胞を示した各化合物５または２５μＭで２４時間処理した。
【図１１ｂ】乳癌細胞および前立腺癌細胞に対する合成アセチル化ポリフェノールの効果を示す図である。形態変化。前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞を、（−）−ＥＧＣＧまたは保護された類似体２５μＭで２４時間処理し、続いて、形態評価を行った。画像は、４０×の倍率の位相差顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて得た。
【図１１ｃ】乳癌細胞および前立腺癌細胞に対する合成アセチル化ポリフェノールの効果を示す図である。軟寒天アッセイ。ＬＮＣａＰ細胞を溶媒ＤＭＳＯまたは（−）−ＥＧＣＧもしくは保護された類似体２５ｐＭを含む軟寒天にプレーティングした。さらに薬物を添加することなく、細胞を２１日間培養した。示したデータは、３連の実験を代表するスキャンしたウェルである。
【図１１ｄ】乳癌細胞および前立腺癌細胞に対する合成アセチル化ポリフェノールの効果を示す図である。Ｃ中のコロニーを自動計測器で定量し、平均値±ＳＤとして示した。
【図１２ａ】示した化合物２５μＭで、正常ＷＩ−３８およびＳＶ−４０形質転換ＶＡ−１３細胞を２４時間処理した結果を示す図である。無傷の細胞におけるプロテアソームのキモトリプシン様活性。
【図１２ｂ】示した化合物２５μＭで、正常ＷＩ−３８およびＳＶ−４０形質転換ＶＡ−１３細胞を２４時間処理した結果を示す図である。１０×倍率での剥離細胞および接着細胞双方のアポトーシス形態についての核染色。パネルがないことは、細胞の剥離が全く起こらなかったことを示す。
【図１２ｃ】示した化合物２５μＭで、正常ＷＩ−３８およびＳＶ−４０形質転換ＶＡ−１３細胞を３６時間処理した結果を示す図である。４０×倍率での剥離細胞および接着細胞双方のアポトーシス形態についての核染色。パネルがないことは、細胞の剥離が全く起こらなかったことを示す。
【図１２ｄ】各化合物２５μＭで白血病ジャーカットＴ細胞および非形質転換ＹＴ細胞を２４時間処理した結果を示す図である。ＰＡＲＰに対する特異的抗体を用いるウエスタンブロット解析。
【図１３】（−）−ＥＧＣＧの構造および本発明の（−）−ＥＧＣＧペルアシルオキシル誘導体の例の構造を示す図である。
【図１３ａ】本発明の（−）−ＥＧＣＧペルアシルオキシル誘導体を合成する際の中間体を示す図である。
【図１３ｂ】本発明の（−）−ＥＧＣＧペルアシルオキシル誘導体を合成する際の中間体を示す図である。
【図１４】溶媒（ＤＭＳＯ）および図１３中の化合物２５μＭとともにジャーカットＴ細胞をプレインキュベートした際のキモトリプシン様活性を示す図である。
【図１５】溶媒（ＤＭＳＯ）および図１３中の化合物２５μＭで、ジャーカットＴ細胞を処理した際のプロテアソーム標的およびユビキチン化タンパク質の蓄積を示す図である。
【図１６】溶媒（ＤＭＳＯ）および図１３中の化合物２５μＭで、ジャーカットＴ細胞を処理した際の細胞死パーセンテージを示す図である。
【図１７】溶媒（ＤＭＳＯ）および図１３中の化合物２５μＭで、ジャーカットＴ細胞を処理した際のカスパーゼ−３の活性化を示す図である。
【図１８】１０および２５μＭの１９＊で、ジャーカットＴ細胞および非形質転換ヒトナチュラルキラー（ＹＴ）細胞を４時間処理し、続いて、ＩκＢ−α、ＰＡＲＰおよびアクチンに対する特異的抗体を用いるウエスタンブロット解析を行った際の、腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１３】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
2008509939.tif 000090
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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