【事件の表示】
　特許第２７６７８０３号「組織等価物を用いるテスト方法、装置、および器具」の請求項１乃至１１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７６７８０３号の請求項１乃至請求項１１に係る発明についての特許を維持する。
【理　由】
Ｉ.本件特許第２７６７８０３号に係る出願は、昭和63年３月31日（パリ条約による優先権主張1987年３月31日、米国）の出願であって、平成10年４月10日にその特許の設定登録がなされ、その後、三枝英二より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成11年10月15日に訂正請求がなされた後、訂正拒絶理由が通知され、訂正拒絶理由に対して手続補正書が提出されたものである。
　
II.訂正の適否についての判断
１．訂正請求に対する補正の適否について
　特許権者は、訂正請求書における「組織等価物」を「皮膚組織等価物または血管組織等価物」と、「前記作用原を液相に隣接している前記組織等価物に接触させるステップと」を「前記作用原を皮膚組織等価物または血管組織等価物に接触させるステップであって、その皮膚組織等価物または血管組織等価物が、少なくともその１つは液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置しており」と訂正し、また、請求項８，１２乃至２０及び２２乃至２９を削除するものであるから、当該訂正請求に対する補正は、訂正請求書の要旨を変更するものでなく、特許法１２０条の４、３項において準用する同法１３１条２項の規定に適合する。
２．訂正の内容
(1)特許請求の範囲の請求項１に係る記載「繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べる方法であって、(ｉ)前記作用原を液相に隣接している前記組織等価物に接触させるステップと、前記組織等価物、(ii）前記組織等価物の細胞内液、および(iii)前記液相の三者のうちの少なくとも１つを分析することにより該組織等価物と該作用原との相互作用を求めるステップと、を備えたことを特徴とする組織等価物を用いるテスト方法。」を、「繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べる方法であって、(ア)前記作用原を皮膚組織等価物または血管組織等価物に接触させるステップであって、その皮膚組織等価物または血管組織等価物が、少なくともその１つは液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置しており；および、(イ)(ｉ)前記皮膚組織等価物または血管組織等価物、(ii)前記皮膚組織等価物または血管組織等価物の細胞内液、および(iii)前記液相の三者のうちの少なくとも１つを分析することにより該皮膚組織等価物または血管組織等価物と該作用原との相互作用を求めるステップと；を備えたことを特徴とする皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いるテスト方法。」と訂正する。
(2)同請求項９を、「繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含みかつ表皮層と真皮層とを有する少なくとも１つの皮膚組織等価物を用いることにより、皮膚組織と少なくとも１種類の作用原との相互作用を調べる方法であって、(ア)前記作用原を皮膚組織等価物の前記表皮層に接触させるステップであって、その皮膚組織等価物が、少なくともその１つは液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置しており、かつ前記真皮層が液相に隣接しており；および、(イ)(ｉ)前記皮膚組織等価物、(ii)前記皮膚組織等価物の細胞内液、および(iii)前記液相の三者のうちの少なくとも１つを分析することにより該皮膚組織等価物と該作用原との相互作用を求めるステップと；を備えたことを特徴とする皮膚組織等価物を用いるテスト方法。」と訂正する。
(3)同請求項１０を、「繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの管状の皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べる方法であって、(ア)該管状皮膚組織等価物または血管組織等価物の内腔又は外腔面を液相に隣接させておきかつ前記作用原を該液相内に導入することによって該管状皮膚組織等価物または血管組織等価物の内腔又は外腔面を該作用原に接触させるステップであって、前記管状皮膚組織等価物または血管組織等価物は、少なくともその１つが液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置しており；および、(イ)(ｉ)前記管状皮膚組織等価物または血管組織等価物、(ii)前記管状皮膚組織等価物または血管組織等価物の細胞内液、および(iii)前記液相の三者のうちの少なくとも１つを分析することにより該管状の皮膚組織等価物または血管組織等価物と該作用原との相互作用を求めるステップと、を備えたことを特徴とする皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いるテスト方法。」と訂正する。
(4)同請求項１１を、「繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの管状の皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べる方法であって、(ア)(ｉ)前記管状の皮膚組織等価物または血管組織等価物の内腔を第１の液相に隣接させておき、かつ(ii)前記管状の皮膚組織等価物または血管組織等価物の外腔面を第２の液相に隣接させておき、しかも少なくとも１種類の作用原を前記第１又は第２の液相に導入することにより、該管状皮膚組織等価物または血管組織等価物を該作用原に接触させるステップであって、該管状皮膚組織等価物または血管組織等価物は、第１の液相と第２の液相の間の界面に位置しており；および(イ)(ｉ)前記管状皮膚組織等価物または血管組織等価物、(ii)前記管状皮膚組織等価物または血管組織等価物の細胞内液、(iii)前記第１の液相、および(iv)前記第２の液相の四者のうちの少なくとも１つを分析することにより該管状皮膚組織等価物または血管組織等価物と該作用原との相互作用を求めるステップ、を備えたことを特徴とする皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いるテスト方法。」と訂正する。
(5)同請求項２１を、「繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べるための装置であって、該装置は、前記皮膚組織等価物または血管組織等価物と、該皮膚組織等価物または血管組織等価物を収容するためのコンテナとを備えており、該コンテナは、(ｉ)前記皮膚組織等価物または血管組織等価物が少なくともその１つが液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置し、前記コンテナ内の少なくとも２つの領域の境界を定めるように該皮膚組織等価物または血管組織等価物を該コンテナ内において位置決めする手段と、(ii)少なくとも１つの出入口と、(iii)該コンテナを封鎖する手段と、を備えていることを特徴とする皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いるテスト装置であって、前記皮膚組織等価物または血管組織等価物が管状組織等価物であり、かつ前記コンテナ内の内側および外側領域を規定しており、該内側領域が第１の液相を含んでおり、該外側領域が第２の液相を含んでいることを特徴とする装置。」と訂正する。
(6)同請求項３乃至５，及び７の「組織等価物」を「皮膚組織等価物または血管組織等価物」と訂正する。
３．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項(1)は、特許請求の範囲の減縮、誤記の訂正或いは明りょうでない記載の釈明に該当し、同(2)乃至(5)は、特許請求の範囲の減縮或いは明りょうでない記載の釈明に該当し、同(6)は、特許請求の範囲の減縮に該当する。
　そして、上記訂正は、新規事項に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。　
４．独立特許要件
　訂正された請求項１乃至７，９乃至１１及び２１に係る発明（以下、「本件発明１乃至１１」という。）は、後述の「III.３．対比・判断」の項に記載のように甲各号証に記載された発明ではなく、また甲各号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえないので、本件発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
５．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４,２項、及び同条３項で準用する１２６条２項から４項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III.特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要  
　特許異議申立人 三枝英二は、証拠として甲第１号証乃至甲第８号証を提出し、訂正前の請求項１、２，４，６及び９に係る発明は、甲第１号証に、請求項１、３及び５に係る発明は、甲第２号証に、若しくは、請求項１３乃至２０，２２及び２４乃至２７に係る発明は、甲第５号証にそれぞれ記載された発明であるから、請求項１乃至６，９，１３乃至２０，２２，２４乃至２７に係る発明の特許は、特許法２９条１項３号に該当、或いは同請求項２に係る発明は、甲第１号証及び甲第４号証に、請求項７、１０乃至１２，２１，２３，２８，２９に係る発明は、甲第１号証，甲第２号証，甲第６号証及び甲第７号証に、請求項８に係る発明は、甲第１号証，甲第２号証及び甲第６号証に、若しくは、請求項１３に係る発明は、甲第１号証及び甲第３号証にそれぞれ記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることが出来たものであるから、請求項１乃至２９に係る発明の特許は、特許法２９条２項に違反してなされたものであるので、請求項１乃至２９に係る発明の特許を取り消すべき旨主張している。
　　　　             記
甲第１号証：Biomedical Research vol.7 No.4 219-231(1986)
甲第２号証：British Journal of Deratology(1984)III,Supplement27,83-87
甲第３号証：特公昭57-4235号公報
甲第４号証：The Journal of Investigation Dermatorogy, vol.81,28s-33s,(1983)
甲第５号証：Molec.Biol.Rep. vol.10,205-213(1985)
甲第６号証：特公昭61-10136号公報
甲第７号証：Cancer Metastasis Reviews 3,81-97(1984)
甲第８号証：Proc.Natl.Scad.Sci.USA vol.76,No.3,1274-1278, March1979
２．特許異議申立人が提出した甲各号証記載の発明
　甲第１号証には、
「ラット真皮線維芽細胞をコラーゲン格子に埋め込むことにより真皮のモデルを調製した（２７）。真皮モデルをラット表皮細胞で覆うことにより皮膚モデルを再構成し、媒体中で維持した。線維芽細胞も表皮細胞も共に強いコラーゲン分解活性を示した。このコラーゲン分解は動物コラゲナーゼの特異的阻害剤で完全に阻害された。コルチゾールはこれらの細胞の溶解活性を有効に阻害した。皮膚モデルのコラーゲン分解は真皮モデルの場合や表皮細胞のみの場合よりも早期に発現し、真皮モデルと表皮細胞のコラーゲン分解の和よりもかなり強かった。さらに、表皮細胞は線維芽細胞を含まないコラーゲンゲル上よりも真皮モデル上でずっとよく拡散する。
　これらの事実は線維芽細胞と表皮細胞の間に相互作用が存在することを示唆している。電子顕微鏡でこのモデルの表皮細胞の周りに橋小体が認められた。しかし半橋小体は形成されなかった。トノフイラメントは細胞質中に分散し、組織的な配向を示さなかった。皮膚モデル培養で１週間以内に表皮細胞と真皮の境界にラミニンとフイブロネクタンの存在が免疫組織化学的に確認された。しかし、この皮膚モデルは基底板構造を形成しなかった。」（「要約」の項）が、
　甲第２号証には、
「線維芽紬胞による膠原細線維の凝縮は、傷の治癒過程で発現される重要な機能である。皮膚同等組織モデルによって、この機能の定量的実験が可能になる。すなわち、時間の関数として、組織同等物の直径の減少を観察することによって、収縮の速度と程度を測定する（Coulombら，１９８３b）。このアッセイ法を用いて、２種類のコルチコイド、デキサメタゾンとヒドロコルチゾンが、線維芽細胞がコラーゲン格子を収縮させるのを阻害できることが示された。この阻害は、使用した濃度範囲（２．５×１０‐４Mから１５×１０−４M）の中では、直線的に、用量に依存している（図２）。この実験から、我々は、デキサメタゾンには細胞に侵入できる閾値用量が存在し、この２つの化合物には、格子収縮に対する効果の可逆性において、違いが存在するというを結論に達した。培地からヒドロコルチゾンを除去すると、その効果はほとんど完全に可逆的であるが、デキサメタゾンを除去しても、その効果は見られない。これは、膜がヒドロコルチゾンよりもデキサメタゾンに対して、より透過性が低いという、細胞膜の透過性の違いによるものであり、また、デキサメタゾンが細胞に侵入した後、グルココルチコイドレセブターに対して、より強く結合するためであろう（Coulombら，１９８４）。
　このように、インビトロ組織モデルを使用することによって、これらのホルモンが、どのように皮膚細胞に作用するのかの理解を広げることができた。デキサメタゾンとヒドロコルチゾンが、細胞分裂を阻害すること（Priestley＆Brown，１９８０）や、高分子の生合成に影響すること（Saarni，Jalkanen＆Hopsu‐Havu，１９８０；Verbruggen＆Abe，１９８２）は、単層培養を用いた実験から分かっているが、我々の方法は、細胞と基質の相互作用を調べる方法を提供し、デキサメタゾンとヒドロコルチゾンが、線維芽細胞のコラーゲン格子を圧縮する能力を低下させることを明らかにした。
　したがって、分化状態にある細胞に対する薬剤の効果は、インビボでの細胞に対する効果に近く、また、細胞‐基質の相互作用に対する薬剤の効果は、単層培養では評価することが不可能で、またインビボで測定することも困難であるが、この新しいモデルでは、実験することが可能である。さらに、このモデルは、伝統的に単層培養が用いられてきた、あらゆるタイプの生化学的または細胞生物学的研究に役立つ。」（「薬理学実験」の項）が、
　甲第４号証には、第９図とともに、「表皮に真皮成分を再結合するもう一つの方法は、該シンポジウムでE.Bellによって議論される。Bellによる真皮等価物上での表皮細胞の培養は、空気−培養液境界面で作成可能である。該培養物の概要図を第９図に示す。」が、
　甲第６号証には、繊維芽細胞、平滑筋細胞、血小板等の細胞要素等の生体細胞により収縮される生体用コラーゲン格子を管状に成形し、毛管、血管、腺状組織等の管状構造体を得ることが、
　甲第７号証には、ラットの尿路乳頭（膀胱上皮）の培養によって形成される管状培養物が、それぞれ記載されている。
３．対比・判断
Ａ.本件発明１について
　甲第１号証には、ラット真皮線維芽細胞をコラーゲン格子に埋め込むことにより真皮のモデルを調製し、この真皮モデルをラット表皮細胞で覆うことにより皮膚モデルを再構成し、媒体中で維持することが記載されている。
　しかし、本件発明１では、皮膚組織等価物は、少なくともその１つは液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置するものであって、甲第１号証の、単に媒体中で維持するものとは明らかに相違している。
　また、本件公報７頁14欄23〜26行には、「この等価物は、良く成長した基部細胞が完全な構造を有する基底層によって真皮層に結合して多層性の表皮から成っている。真皮層はコラーゲン礎質であり、この中には真皮繊維芽細胞が分布している。」という記載があり、この記載によると、本件発明に係る「等価物」は、完全な構造を有すると解される。
　一方、甲第１号証には、皮膚モデル培養で１週間以内に表皮細胞と真皮の境界にラミニンとフイブロネクタンの存在が免疫組織化学的に確認されるが、この皮膚モデルは基底板構造を形成しなかったことが記載されており、この記載によると、甲第１号証に係る皮膚モデルは、完全な構造を有するものではないから、本件発明１に係るものとは、明らかに相違する。
　ところで、本件発明１は、「作用原を皮膚組織等価物または血管組織等価物に接触させるステップであって、その皮膚組織等価物または血管組織等価物が、少なくともその１つは液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置」するという特定の構成からなるところ、甲第２号証には、「インビトロ組織モデルを使用することによって、これらのホルモンが、どのように皮膚細胞に作用するのかの理解を広げることができた。」との記載があるものの、インビトロ組織モデルをどのような態様で使用したか不明であって、本件発明１の上記特定の構成に関して示唆するところはない。
　そうすると、本件発明１は、甲第２号証に記載された発明であるとは到底いうことができない。
　以上のとおり、本件発明１は、甲第１号証乃至甲第２号証に記載された発明であるとはいえない。
Ｂ.本件発明２について
（特許法２９条１項３号について）
　本件発明２は、本件発明１を引用するものであるから、本件発明１についての判断と同じ理由により、甲第１号証に記載された発明であるとはいえない。
（特許法２９条２項について）
　甲第４号証の第９図には、皮膚組織等価物の表皮層を空気暴露しつつ培養することの記載はあるが、該皮膚組織等価物が、２つの相を遮断するように位置することについては開示されていない。
　そうすると、甲第１号証と甲第４号証に記載された事項を組み合わせても、本件発明２のような構成を導くことはできない。
Ｃ.本件発明３乃至６について
　本件発明３乃至６は、いずれも本件発明１を引用するものであるから、本件発明１についての判断と同じ理由により、甲第１号証乃至甲第２号証に記載された発明であるとはいえない。
Ｄ.本件発明７について
　甲第６号証及び甲第７号証には、管状構造体、すなわち管状組織等価物についての記載はあるものの、本件発明７に関するそれ以上の事項を示唆するところはない。
　したがって、甲第１号証，甲第２号証，甲第６号証及び甲第７号証に記載された事項を組み合わせても、本件発明７は、当業者が容易に想到し得たとはいえない。
Ｅ.本件発明８について
　本件発明８は、本件発明１の「皮膚組織等価物または血管組織等価物」を「表皮層と真皮層とを有する少なくとも１つの皮膚組織等価物」にするものであるから、本件発明１についての判断と同じ理由により、甲第１号証に記載された発明であるとはいえない。
Ｆ.本件発明９、１０について
　本件発明９は、「管状皮膚組織等価物または血管組織等価物の内腔又は外腔面を液相に隣接させておきかつ作用原を該液相内に導入する」ものであり、また、本件発明１０は、「管状の皮膚組織等価物または血管組織等価物の内腔を第１の液相に隣接せておき、かつ管状の皮膚組織等価物または血管組織等価物の外腔面を第２の液相に隣接させておき、しかも少なくとも１種類の作用原を第１又は第２の液相内に導入する」ものであり、いずれも本件発明７における作用原の接触についてより具体的にしたものであるから、本件発明７についての判断と同じ理由により、甲第１号証，甲第２号証，甲第６号証及び甲第７号証に記載された事項に基づき、当業者が容易に想到し得たとはいえない。
Ｇ.本件発明１１について
　本件発明１１は、「皮膚組織等価物または血管組織等価物が管状であり、かつコンテナ内の内側および外側領域を規定しており、該内側領域が第１の液相を含んでおり、該内側領域が第２の液相を含んでいることを特徴とする」ものであるところ、甲第１号証，甲第２号証，甲第６号証及び甲第７号証には、「該内側領域が第１の液相を含んでおり、該内側領域が第２の液相を含んでいること」を教示するところはない。
　そうすると、本件発明１１は、甲第１号証，甲第２号証，甲第６号証及び甲第７号証に記載された事項に基づき、当業者が容易に想到し得たとはいえない。
４．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明についての特許を取り消すことができない。
　また、他に本件発明の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年２月１８日（２０００．２．１８）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
（１）特許請求の範囲の請求項１に係る記載「繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べる方法であって、（ｉ）前記作用原を液相に隣接している前記組織等価物に接触させるステップと、前記組織等価物、（ｉｉ）前記組織等価物の細胞内液、および（ｉｉｉ）前記液相の三者のうちの少なくとも１つを分析することにより該組織等価物と該作用原との相互作用を求めるステップと、を備えたことを特徴とする組織等価物を用いるテスト方法。」を、特許請求の範囲の減縮、誤記の訂正或いは明りょうでない記載の釈明を目的として、「繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べる方法であって、（ア）前記作用原を皮膚組織等価物または血管組織等価物に接触させるステップであって、その皮膚組織等価物または血管組織等価物が、少なくともその１つは液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置しており；および、（イ）（ｉ）前記皮膚組織等価物または血管組織等価物、（ｉｉ）前記皮膚組織等価物または血管組織等価物の細胞内液、および（ｉｉｉ）前記液相の三者のうちの少なくとも１つを分析することにより該皮膚組織等価物または血管組織等価物と該作用原との相互作用を求めるステップと；を備えたことを特徴とする皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いるテスト方法。」と訂正する。
（２）同請求項９を、特許請求の範囲の減縮或いは明りょうでない記載の釈明を目的として、「繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含みかつ表皮層と真皮層とを有する少なくとも１つの皮膚組織等価物を用いることにより、皮膚組織と少なくとも１種類の作用原との相互作用を調べる方法であって、（ア）前記作用原を皮膚組織等価物の前記表皮層に接触させるステップであって、その皮膚組織等価物が、少なくともその１つは液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置しており、かつ前記真皮層が液相に隣接しており；および、（イ）（ｉ）前記皮膚組織等価物、（ｉｉ）前記皮膚組織等価物の細胞内液、および（ｉｉｉ）前記液相の三者のうちの少なくとも１つを分析することにより該皮膚組織等価物と該作用原との相互作用を求めるステップと；を備えたことを特徴とする皮膚組織等価物を用いるテスト方法。」と訂正する。
（３）同請求項１０を、特許請求の範囲の減縮或いは明りょうでない記載の釈明を目的として、「繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの管状の皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べる方法であって、（ア）該管状皮膚組織等価物または血管組織等価物の内腔又は外腔面を液相に隣接させておきかつ前記作用原を該液相内に導入することによって該管状皮膚組織等価物または血管組織等価物の内腔又は外腔面を該作用原に接触させるステップであって、前記管状皮膚組織等価物または血管組織等価物は、少なくともその１つが液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置しており；および、（イ）（ｉ）前記管状皮膚組織等価物または血管組織等価物、（ｉｉ）前記管状皮膚組織等価物または血管組織等価物の細胞内液、および（ｉｉｉ）前記液相の三者のうちの少なくとも１つを分析することにより該管状の皮膚組織等価物または血管組織等価物と該作用原との相互作用を求めるステップと、を備えたことを特徴とする皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いるテスト方法。」と訂正する。
（４）同請求項１１を、特許請求の範囲の減縮或いは明りょうでない記載の釈明を目的として、「繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの管状の皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べる方法であって、（ア）（ｉ）前記管状の皮膚組織等価物または血管組織等価物の内腔を第１の液相に隣接させておき、かつ（ｉｉ）前記管状の皮膚組織等価物または血管組織等価物の外腔面を第２の液相に隣接させておき、しかも少なくとも１種類の作用原を前記第１又は第２の液相に導入することにより、該管状皮膚組織等価物または血管組織等価物を該作用原に接触させるステップであって、該管状皮膚組等価物または血管組織等価物は、第１の液相と第２の液相の間の界面に位置しており；および（イ）（ｉ）前記管状皮膚組織等価物または血管組織等価物、（ｉｉ）前記管状皮膚組織等価物または血管組織等価物の細胞内液、（ｉｉｉ）前記第１の液相、および（ｉｖ）前記第２の液相の四者のうちの少なくとも１つを分析することにより該管状皮膚組織等価物または血管組織等価物と該作用原との相互作用を求めるステップ、を備えたことを特徴とする皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いるテスト方法。」と訂正する。
（５）同請求項２１を、特許請求の範囲の減縮或いは明りょうでない記載の釈明を目的として、「繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べるための装置であって、該装置は、前記皮膚組織等価物または血管組織等価物と、該皮膚組織等価物または血管組織等価物を収容するためのコンテナとを備えており、該コンテナは、（ｉ）前記皮膚組織等価物または血管組織等価物が少なくともその１つが液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置し、前記コンテナ内の少なくとも２つの領域の境界を定めるように該皮膚組織等価物または血管組織等価物を該コンテナ内において位置決めする手段と、（ｉｉ）少なくとも１つの出入口と、（ｉｉｉ）該コンテナを封鎖する手段と、を備えていることを特徴とする皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いるテスト装置であって、前記皮膚組織等価物または血管組織等価物が管状組織等価物であり、かつ前記コンテナ内の内側および外側領域を規定しており、該内側領域が第１の液相を含んでおり、該外側領域が第２の液相を含んでいることを特徴とする装置。」と訂正する。
（６）同請求項３乃至５，及び７の「組織等価物」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「皮膚組織等価物または血管組織等価物」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
組織等価物を用いるテスト方法、装置、および器具
（５７）【特許請求の範囲】
１．繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの
皮膚組織等価物または血管組織等価物
（ア）前記作用原を
皮膚組織等価物または血管組織等価物
であって、その皮膚組織等価物または血管組織等価物が、少なくともその１つは液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置しており；および、
（イ）（ｉ）前記皮膚組織等価物または血管組織等価物、（ｉｉ）前記皮膚組織等価物または血管組織等価物の細胞内液、
該皮膚組織等価物または血管組織等価物
を備えたことを特徴とする
皮膚組織等価物または血管組織等価物
２．前記組織等価物が表皮層と真皮層とを有する皮膚組織等価物であり、該皮膚組織等価物の該真皮層が前記液相に隣接していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
３．前記
皮膚組織等価物または血管組織等価物
皮膚組織等価物または血管組織等価物
皮膚組織等価物または血管組織等価物
皮膚組織等価物または血管組織等価物
４．前記
皮膚組織等価物または血管組織等価物
皮膚組織等価物または血管組織等価物
皮膚組織等価物または血管組織等価物
皮膚組織等価物または血管組織等価物
５．前記
皮膚組織等価物または血管組織等価物
皮膚組織等価物または血管組織等価物
６．前記組織と前記作用原との相互作用が、組織を保護することを特徴とする請求項１に記載の方法。
７．前記
皮膚組織等価物または血管組織等価物
８
（ア）
前記作用原を該皮膚組織等価物の前記表皮層に接触させるステップであって、その皮膚組織等価物が、少なくともその１つは液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置しており、かつ前記真皮層が液相に隣接しており；および
（イ）（ｉ）前記皮膚組織等価物、（ｉｉ）前記皮膚組織等価物の細胞内液、および（ｉｉｉ）前記液相の三者のうちの少なくとも１つを分析することにより該皮膚組織等価物と該作用原との相互作用を求めるステップと；
を備えたことを特徴とする
前記皮膚組織等価物
９
の皮膚組織等価物または血管組織等価物
（ア）該管状
皮膚組織等価物または血管組織等価物
皮膚組織等価物または血管組織等価物
であって、前記管状皮膚組織等価物または血管組織等価物は、少なくともその１つが液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置しており；および
（イ）（ｉ）前記管状
皮膚組織等価物または血管組織等価物、
皮膚組織等価物または血管組織等価物の細胞内液、
皮膚組織等価物または血管組織等価物
を備えたことを特徴とする皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いるテスト方法。
１０
皮膚組織等価物または血管組織等価物
（ア）（ｉ）前記管状の
皮膚組織等価物または血管組織等価物
皮膚組織等価物または血管組織等価物
皮膚組織等価物または血管組織等価物
であって、該管状皮膚組織等価物または血管組織等価物は、第１の液相と第２の液相の間の界面に位置しており；および
（イ）（ｉ）前記管状
皮膚組織等価物または血管組織等価物、
皮膚組織等価物または血管管状組織等価物
皮膚組織等価物または血管組織等価物
を備えたことを特徴とする
皮膚組織等価物または血管組織等価物
１１
繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べるための装置であって、該装置は、前記皮膚組織等価物または血管組織等価物と、該皮膚組織等価物または血管組織等価物を収容するためのコンテナとを備えており、該コンテナは、
（ｉ）前記皮膚組織等価物または血管組織等価物が少なくともその１つが液相である２つの相の間の界面に、該２つの相を遮断するように位置し、前記コンテナ内の少なくとも２つの領域の境界を定めるように該皮膚組織等価物または血管組織等価物を該コンテナ内に位置決めするための手段と、
（ｉｉ）少なくとも１つの出入口と、
（ｉｉｉ）該コンテナを封鎖する手段と、
を備えていることを特徴とする皮膚組織等価物または血管組織等価物を用いるテスト装置であって、前記皮膚組織等価物または血管組織等価物が
ことを特徴とする装置
【発明の詳細な説明】
［産業上の技術分野］
　本発明は、少なくとも１つの組織等価物を使用することにより、少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べるためのテスト方法、装置、および器具に関する。
［従来の技術および発明が解決しようとする課題］
　様々な作用原とヒトおよび動物の組織との間の相互作用を調べることを目的とし、多くの試験法が考案されてきた。
　本明細書において使用される「組織」とは、一緒になって１つ以上の何らかの機能を果たす任意の細胞群又は細胞層からなる。組織には、上皮組織、結合組織、軟骨、骨、血液、臓器、腺および血管等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
　環境内の化学物質によるヒトおよび動物の両方への影響については、危惧の念を持つ向きも多い。新しい医薬品は通常、家畜に適用されるものであれヒトに適用されるものであれ、米国法規に従ってその影響が試験されている。化学薬品製造会社、石油および塗料会社、製薬会社、並びに化粧品会社は、それぞれが使用・生産する物質に対する皮膚反応を調べるため、様々な試験系を使用している。さらに、製薬会社、病院および大学の生化学研究室では、疾病の機構を解明し、治療方法を評価する目的で試験系を使用している。
　現在、組織と作用原との相互作用を調べるために使用されている試験系としては、（ｉ）実験動物（特に齧歯類、ウサギ等）、（ｉｉ）ヒト細胞の単層培養、（ｉｉｉ）死体から得た組織切片又は臓器、（ｉｖ）生物学的応答を模擬するために開発された数学的モデル、等が挙げられる。これらの試験系にはそれぞれの長所および短所がある。
　実験動物（ヒトの被験者を除く）は従来より広範囲に使用されている。しかしながら、動物の細胞や組織はヒトのものとは異なるため、作用原のヒトに対する影響を評価する目的で実験動物を用いることの効果は限定されてしまう。更に、実験動物は管理維持が高価となる上、こうした目的に動物を使用することについての倫理的問題も生じてくる。
　培養細胞は再現性が高く、安価で、良く規格化された試験系であるが、細胞および組織の生体内における状態を模擬するものではない。従って、単層培養での増殖細胞が示す生合成活性および生理的機能は、これらが生体内で示すものとは著しく異なり、試験結果の解釈を誤ることにもつながりかねない。
　死体から得られる組織片は、ヒトでの反応を模擬できる試験系に要求されるところの、正常な生合成産出量と同様の複雑性および細胞特性の両方を備えている。しかし、これらは瀕死状態のものである。即ち、細胞の一部は生きているが、他は死にかけており、そして多くは既に死んでいる。この点が、死体から得られる組織片の有用性を限界づけている。これは、例えば毒性試験において、被験物質の影響と死体における自然な退行変化とを区別することが困難になると思われるからである。
　数学的モデルは、反応が良く理解されていてどのような反応が起るかが予測可能な場合、更に、変数が全範囲に渡って規定されている場合について有効であるが、新しい物質を試験するには不適当である。
　ヒトの健康を保護するという意味では、最も理想的な試験体は、当然に人間である。しかしながら人体試験には、厳しい制限がある。試験に動物が広く用いられるのは、動物であれば解剖することも健康な組織にメスを入れることも可能であるし、また、人間には有毒であることが分かっている物質を投与することも可能だからである。ただし、前にも述べた通り、その反応は必ずしもヒトでの反応を反映するものではない。
　皮膚は極めて重要な組織であり、生体内の環境とその外部の化学的・物理的世界とを隔てる主要な障壁である。このため、皮膚は周囲の環境からの攻撃を受けている。皮膚は、職場で、家庭で、および大気内で、化学物質および抗原物質に曝されている。皮膚には、外傷その他皮膚そのものにおける多種多様な疾患の治療のためのみならず、局所的治療による全身的健康状態の改善を目的として医薬品が適用される。皮膚にはまた、その外観および時にはその健康状態を良くするため、化粧が施される。今日、皮膚に接触しこれを損傷する可能性のある有害な物質については安全な使用法を確立し、その悪影響から人々を保護すること、また、皮膚に適用される化粧用および治療用軟膏の効果を評価することに強い関心がもたれている。従って、種々の物質と人間の皮膚との間の相互作用を調べるため多数の試験法が考案されてきたのも驚くには値しない。
　ヒトでの皮膚試験は、感作に関する「良性」形態の試験に主として限られる。例えば、被験者を使用して被験物質の皮膚への影響を評価する場合、観察対象となる皮膚反応は通常は紅斑および浮腫である。これらは複雑な過程が肉眼的に発現したもので、その過程の細胞レベルでの免疫化学的、生化学的および生理学的同等物は明確に把握されている。こうした作用を分析するには、多くの場合に不適当である、健康な組織を侵す処理を必要とする。
　皮膚試験には解剖された死体の皮膚が使用されてきたが、これも容易には入手できず、しかも急速に瀕死状態となってしまう。皮膚は退行変性すると、正常に反応する能力、即ち、信号を発したり異物を代謝する能力を失う。このため、試験した物質に起因する影響とｉｎｖｉｔｒｏでの皮膚自体の自己分解および変質に起因する影響とを識別するのは不可能となる。この点については、Ｂｒｏｎａｕｇｈ　ａｎｄ　Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７４：６４−６７〈１９８５）および　Ｆｒａｎｚ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．：１９０−１９５（１９７５）等を参照されたい。
　実験動物の毛深い皮膚は、その形態や物理特性においても、また、アレルギー性刺激等の刺激に対する反応という点でも、ヒトの皮膚とは根本的に異なっている。経皮的吸収率を例に取っても、動物の皮膚と人間の皮膚とではかなりの相違が認められる。ＬＤ５０値を決定するためや有毒物質に対する内部臓器系の反応を評価するために動物が使用され続けるであろうが、人道上の理由およびより効果的な試験方法を開発するという理由の両方から、動物実験に代わる他の多くの毒性試験が検討されている（例えば、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ　ｔｏ　Ａｎｉｍａｌ　Ｕｓｅ　ｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔｅｓｔｉｎｇ，ａｎｄ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ．Ｏｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８５）「研究、実験および教育における動物使用の代替策」を参照のこと）。
　試験系としての培養細胞は需要も多い。しかしながら、単層培養での増殖細胞は、生体内の細胞とは、生合成品目も透過性も同一ではなく、しかもその形成又は分化の様式も組織又は生体内の細胞とは異なることが厳密に証明されてきている。
　このため、動物および培養細胞に代る試験系への要請は高い。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏで自然組織の物理的・生物学的特性の多くを再現する組織の等価物が、組織細胞の生物学、生理学および病理学を研究する上で非常に有効であろう。
［課題を解決するための手段］
　本発明は、繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの組織等価物を使用することにより、少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べるためのテスト方法、テスト装置およびテスト器具を提供するものである。
　本発明により測定される組織と作用原との相互作用とは、当該作用原の組織等価物中への進入又は通過、組織等価物による１つ以上の物質の生成又は放出、並びに、組織等価物の細胞における透過性、増殖性、分化の変化又は形態の変化等であるが、これらに限定されるものではない。場合によっては、組織と作用原との相互作用は組織を保護する働きもする。試験の対象となる作用原には、例えば光や物理的損傷等の種々の刺激、また、化学薬品、化粧品、医薬品および組織保護材等の様々な物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の実施に当たっては、上皮組織、結合組織、軟骨、骨、臓器、腺および血管等、様々なタイプの組織等価物が使用されることになるが、これらに限定されるものではない。組織等価物の組成および形状は、調べる相互作用の性質、並びに相互作用を測定するために使用する分析方法の限界を考慮して選択することになる。組織等価物はどのような形にも成形することが可能である。
　より詳しくは本発明によれば、繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べる方法であって、作用原を液相に隣接している組織等価物に接触させるステップと、（ｉ）組織等価物、（ｉｉ）組織等価物の細胞内液、および（ｉｉｉ）液相の三者のうちの少なくとも１つを分析することにより組織等価物と作用原との相互作用を求めるステップとを備えたテスト方法が提供される。
　組織等価物が表皮層と真皮層とを有する皮膚組織等価物であり、皮膚組織等価物の真皮層が液相に隣接していることが好ましい。
　組織等価物が管状組織等価物であることが好ましく、その管状組織等価物が皮膚組織等価物又は血管組織等価物であるかもしれない。
　本発明によれば、さらに、繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの管状組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べる方法であって、液相を管状組織等価物の内腔又は外腔面に隣接させておきかつ作用原を液相内に導入することによって、この作用原を管状組織等価物の内腔又は外腔面に接触さえるステップと、（ｉ）管状組織等価物、（ｉｉ）管状組織等価物の細胞内液、および（ｉｉｉ）液相の三者のうちの少なくとも１つを分析することにより管状組織等価物と作用原との相互作用を求めるステップとを備えたテスト方法が提供される。
　本発明によれば、さらにまた、繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの管状組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べる方法であって、（ｉ）管状組織等価物の内腔を第１の液相に隣接させておき、かつ（ｉｉ）管状組織等価物の外腔面を第２の液相に隣接させておき、しかも少なくとも１種類の作用原を第１又は第２の液相内に導入することにより、この作用原を管状組織等価物に接触させるステップと、（ｉ）管状組織等価物、（ｉｉ）管状組織等価物の細胞内液、（ｉｉｉ）第１の液相、および（ｉｖ）第２の液相の四者のうちの少なくとも１つを分析することにより管状組織等価物と作用原との相互作用を求めるステップとを備えたテスト方法が提供される。
　望ましい管状組織としては皮膚、血管、および腺が挙げられる。
　本発明によれば、また、繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べるための装置であって、この装置は組織等価物と該組織等価物を収容するためのコンテナとを備えており、このコンテナは、（ｉ）組織等価物がコンテナ内の少なくとも１つの領域の境界を定めるように組織等価物をコンテナ内に位置決めする手段と、（ｉｉ）少なくとも１つの出入口と、（ｉｉｉ）コンテナを封鎖する手段とを備えているテスト装置が提供される。
　コンテナを封鎖する手段が、取り外し可能にこのコンテナを密閉するカバー手段であるか、又はバルブ若しくはカバー手段を備えた開口部若しくは出入口であるかもしれない。
　少なくとも２つのコンテナを備えていることも好ましい。また、これらコンテナが相互に連結されているかもしれない。
　組織等価物を本発明による装置内に入れる際には、組織等価物がコンテナ内の少なくとも２つの領域を規定するように位置決めすることが望ましい。
　場合によっては、組織等価物はコンテナ内の上方領域および下方領域を規定する。また、組織等価物が管状組織等価物である場合には、コンテナの内側および外側領域を規定するような位置にこの管状組織等価物を置く。また、このコンテナが１つ以上の液相を具備する場合もある。下方領域が第１の液相を備えている場合は組織等価物の表面がこの第１の液相に隣接しており、また、上方領域が第２の液相を備えている場合は組織等価物の一表面がこの第２の液相に隣接しているかもしれない。
　上述のコンテナが少なくとも２つの出入口を備えていることが好ましい。
　本発明によれば、コンテナ内に組織等価物を位置決めするための様々な手段を提供される。本発明の具体例の幾つかにおいては、コンテナ内に組織等価物を位置決めする手段がこのコンテナ内に備えられており、これには透過性部材が含まれる。この場合、組織等価物が透過性部材上に成形されているかもしれない。透過性部材が、選択的な透過性膜又はメッシュであることが好ましい。
　組織等価物を位置決めする手段は、このように組織等価物の支持部材としても機能しうる。さらに、このように組織等価物が組織等価物を位置決めする手段上で成形されることもある。
　組織等価物が、管状組織等価物でありかつコンテナ内の内側および外側領域を規定しており、内側領域が第１の液相を含んでおり、外側領域が第２の液相を含んでいることも好ましい。この場合、少なくとも２つのコンテナを備えている場合があり、その場合、コンテナが相互に連結されているかもしれない。
　管状組織等価物をコンテナ内に位置決めする手段がバルブ付カニューレを備えており、このカニューレの一部がコンテナ中に配置されていることも好ましい。
　組織等価物が管状組織等価物であり、この管状組織等価物をコンテナ内に位置決めする手段は、（ｉ）管状組織等価物を取り付ける手段と、（ｉｉ）該管状組織等価物の縦方向への収縮を制限する手段、および（ｉｉｉ）選択された物質が、第１および第２の液相のうちの少なくとも一方と管状組織等価物との間を通過可能にする手段とを備えていることもあり得る。
　管状組織等価物を位置決めする手段に取り付ける手段が、不活性織物材料で構成されているかもしれない。この不活性織物材料は、ベルクロ（登録商標）、ステンレススチール織物、テフロン（登録商標）織物、又はプラスチック織物である得る。また、このプラスチック織物は、ポリカーボネート、ポリスチレン又はポリウレタン・フォームであるかもしれない。
　管状組織等価物が、少なくとも１つの支持部材を備えていることが好ましく、また、管状組織等価物が、管状組織等価物をコンテナ内に位置決めする手段の周囲に成形されていることも好ましい。
　また、この装置が、循環回路内に組込まれていることもあり得る。
　組織等価物が管状組織等価物である場合、この装置を用いて少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べる方法であって、作用原を管状組織等価物に接触させるステップと、（ｉ）組織等価物、（ｉｉ）組織等価物の細胞内液、（ｉｉｉ）第１の液相、および（ｉｖ）第２の液相の四者のうちの少なくとも１つを分析することにより管状組織等価物への作用原の影響を求めるステップとを備えてもよい。
　この装置が、一定の速度又は頻度で液相のうちの少なくとも１つを移動させる手段を備えたことが好ましい。また、液相のうち少なくとも１つが定期的又は連続的にサンプル採取され分析されることも好ましい。血液流を模擬するべく、第２の液相が管状組織等価物を通って循環せしめられるかもしれない。
　本発明は、繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの組織等価物を用いることにより組織と少なくとも１種類の作用原との相互作用を調べる装置を使用して、組織と少なくとも１種類の作用原との間の相互作用を調べるための方法をも含むものであり、この装置は組織等価物とこの組織等価物を収容するコンテナとを備えており、このコンテナは、（ｉ）組織等価物がコンテナ内の少なくとも１つの領域を規定するように組織等価物をコンテナ内に位置決めする手段と、（ｉｉ）少なくとも１つの出入口と、（ｉｉｉ）コンテナを封鎖する手段とを備えている。
　また、この方法は、作用原を組織等価物に接触させるステップと、（ｉ）組織等価物、（ｉｉ）組織等価物の細胞内液、および（ｉｉｉ）液相の三者のうちの少なくとも１つを分析することにより組織等価物と作用原との相互作用を求めるステップとを備えている。
　この装置が、液相の交換、サンプル採取、循環、給液を行う手段をさらに備えていることが好ましい。この液相が定期的又は連続的にサンプル採取され分析されることが好ましい。
　本発明の装置は、繊維芽細胞を含む収縮性物質の作用によるコラーゲン格子の収縮により得られる層を含む少なくとも１つの組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織との相互作用を調べるための装置と組織等価物との組み合わせより成るテスト器具一式に組み込まれる場合もある。
　この装置は組織等価物とこの組織等価物を収容するためのコンテナとを備えており、コンテナは、（ｉ）組織等価物がコンテナ内の少なくとも２つの領域を規定するように組織等価物をコンテナ内に位置決めする手段と、（ｉｉ）少なくとも１つの出入口と、（ｉｉｉ）コンテナを封鎖する手段とを備えている。
　この場合、組織等価物がコンテナ内の上方領域および第１の液相を含む下方領域の境界を定めており、かつ組織等価物の１表面がこの第１の液相に隣接していることが好ましい。上方領域が第２の液相を備えており、組織等価物の表面が第２の液相に隣接しているかもしれない。
　装置が、２つ以上の個別のコンテナを備えていることが望ましく、この場合、液相が、各コンテナで共通となるように、これらコンテナが相互に連結されていることが望ましい。コンテナが、少なくとも２つの出入口を備えているかもしれない。
　上方領域が第２の液相を備えている場合、組織等価物が、表皮層と真皮層とを有する皮膚組織等価物であり、表皮層は第２の液相に隣接しており、真皮層は第１の液相に隣接していることが好ましい。
　上述のテスト器具が、管状組織等価物を備えおり、管状組織等価物がコンテナ内の内側領域および外側領域を規定しており、内側領域が第１の液相を含んでおり、外側領域が第２の液相を含んでいることも好ましい。この場合、管状組織等価物が皮膚組織等価物又は血管組織等価物であるかもしれない。
　組織等価物と作用原との相互作用を調べるために使用される１以上の試薬は本発明装置の中にオプションで含められる。
［発明の詳細説明］
　本発明は、組織等価物を使用することにより組織と１又は１以上の作用原との間の相互作用を調べるための装置、方法および器具を提示するものである。ヒトの皮膚組織等価物および血管組織等価物を例にとり、本発明により提示される装置、方法および器具を説明することとする。ただし、腺、骨等その他の組織等価物も同様に、これらの方法、装置および器具で好適に使用され得る。
　前にも述べた通り、本明細書では、「組織」なる用語を通常の生物学的意味において使用する。即ち、ここで使用する組織には、一緒になって１つ以上の機能を果たす細胞群又は細胞層のすべてが含まれる。
　本明細書中の「作用原」なる用語は、化学薬品、化粧品および医薬品等様々な物質、光および物理的傷害等の刺激、並びに、組織保護物を意味するが、この限りではない。
　本発明により調べられる組織と作用原との相互作用には、正常な組織が被る相互作用のすべてが含まれる。この「相互作用」とは、作用原が組織内へ侵入するもしくは組織中を通過する速度および程度、組織の透過性の変化、組織による細胞内液中への１種以上の物質の放出、組織代謝又は細胞の増殖若しくは分化に対する影響、並びに組織細胞の再構成等を意味しているが、これらに限定されるものではない。本発明のある具体例では、検査対象となる相互作用に、例えば、組織が作用原を分解する場合等、作用原に対する組織の影響が含まれる。また別の具体例では、作用原が栄養分又は前駆物質であり、この場合の相互作用とはある物質の合成あるいは生成を意味する。更に別の例では、調べられる相互作用が１つ以上の作用原による組織の保護と言う場合もある。本発明のまた更に別の例では、作用原／組織の相互作用を調べるために１種類以上の作用原が使用され、組織と第１の作用原との相互作用が第２の作用原の使用によって調べられる。例えば、組織等価物が第１の作用原に接触した後、第２の作用原がこの組織等価物に接触させられ、第１の作用原は第２の作用原と組織等価物との相互作用を阻止又は抑制する。
　本明細書で用いる「組織等価物」なる用語は、形態上も機能上もｉｎ　ｖｉｖｏでの組織と類似しており、生細胞とコラーゲン等の細胞外礎質分子とから構成されている製造された即ち人造の組織である。その例として、上皮組織、結合組織、軟骨、骨、血液、臓器、腺および血管の等価物（同等物）が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような組織等価物は、米国特許第４，４８５，０９６号及び第４，４８５，０９７号（特公昭６１−３３５９３号に対応）、米国特許第４，５３９，７１６号（特公昭６１−３４８３２号に対応）、米国特許第４，５４６，５００号（特公昭６１−１０１３６号に対応）、米国特許第４，６０４，３４６号等に記載されており、公知である。なお、本発明で使用される組織等価物には、正常組織には通常は存在しない成分が任意に設けられることもある。
　本発明で使用される組織等価物は、長期間生存可能であり、かつ製造される全ての単位が基本的に均一であると保証された量だけ生産され得る細胞で構成される。この種の組織等価物には、皮膚組織等価物、臓器組織等価物、腺組織等価物および骨組織等価物等が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明において使用されるこれら組織等価物の細胞は、その構造的構成、生合成産出量および透過性において正規組織の細胞と類似している。本発明において使用される組織等価物は、人間のものである必要はなく所望により任意の動物のものであるかもしれないと理解すべきである。
　本発明においては、組織等価物に、例えばその露出面にこれを保護するための取り外し可能な処理を施す等の保護措置を講じるのが望ましい場合もある。こうした目的に許容可能なものとしては、例えばプラスチック製のフィルム等、薄く柔軟性のあるフィルムが挙げられる。
　本発明の実施において使用されるヒトの皮膚組織等価物は、細胞分化により正常な角層および完全な基底層を生じると言う、ヒトの表皮細胞の正常な成長を可能とする。これは通常の培養方法ではこれまで望めなかったことである。このような皮膚組織等価物は、動物実験における永久的皮膚代用物として広範に使用されてきたものであり、最近ではフランスにおいてヒトヘの使用が試みられているものである。この種の皮膚組織等価物の形態的外観は正常であり、その構成細胞は、遺伝標識で明らかにされている如く、移植後も生存し続け、機能も証明されている。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１：１０５２−１０５４（１９８１）およびＪ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８１：２ｓ−１０ｓ（１９８３）を参照のこと。
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの皮膚組織等価物は天然の皮膚と極めて類似している。この等価物は、良く成長した基部細胞が完全な構造を有する基底層によって真皮層に結合して多層性の表皮から成っている。真皮層はコラーゲン礎質であり、この中には真皮腺維芽細胞が分布している。この三次元コラーゲン礎質中の細胞は、多くの点において、ｉｎ　ｖｉｖｏでの細胞と同様の分化状態を達成している。例えば、腺維芽細胞は合成的に活性であり、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの礎質にコラーゲン並びに多数の分子種を供給するのみならず、ｉｎ　ｖｉｖｏ細胞と同様の透過性を示す。例えばＣｏｌｌａｇｅｎ　Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．４：３５１−３６４（１９８４）を参照されたい。ヒトおよびラットの腺維芽細胞が組織等価物の格子に結びつく能力に対するステロイドの影響が評価されてきている（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８２：３４１−３４４，１９８４）。皮膚組織等価物モデルは、乾癬細胞と正常細胞を有する乾癬症研究用の組織を作成するために使用されてきた。（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：６６９−６７２，１９８５）。最近になって、ケラチン細胞に色素を与えるメラニン細胞を包含させることにより皮膚組織等価物に着色することが可能であり、また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで紫外線を照射するとこの過程が早められることが証明された（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８７：６４２−６４７，１９８６）。
　本発明において使用されるヒト血管組織等価物は、細胞外礎質分子および培養した血管細胞で構成された多層状の管である。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３１：３９７−４００，１９８６、米国特許第４，５３９，７１６号（特公昭６１−３４８３２号に対応）、および米国特許第４，５４６，５００号（特公昭６１−１０１３６号に対応）を参照されたい。このヒト血管組織等価物の構造および機能は人間の血管に類似し、本発明による方法、装置および器具では、人間の本来の血管における生理および血液表面相互作用、並びに、病理発生過程およびその改善を研究するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｅｘｖｉｖｏのバイオ試験に使用される。
　本発明の一実施態様では、血管組織等価物が、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて基底層を生じる内皮細胞の単層で裏打ちされる。と同時に、これら内皮細胞および基底層は血管組織等価物の内膜を構成する。中央層はコラーゲン格子中の平滑筋細胞より成り、血管組織等価物の中膜を構成する。平滑筋は礎質にコラーゲン、エラスチンその他の分子を供給する。場合によっては、これら以外にヒアルロン酸等の細胞外礎質が個々の使用法に従って任意に付け加えられる。血管組織等価物の外層はコラーゲン格子中の外膜腺維芽細胞から作られ、血管組織等価物の外膜を構成する。この血管組織等価物にはまた、合成メッシュ等の支持膜が血管組織等価物の強化を目的として任意で付加される場合もある。この場合、支持膜は普通血管中膜と外膜の間の壁に置かれる。また、外腔面の近くに、例えばプラスチック製のスリーブのような除去可能な、保護目的の不透過性の膜が任意に提供される場合もある。
　本発明で使用される血管組織等価物における層の配列順序は、天然の血管で典型的である順序とは逆になる場合もあることを理解しておくべきである。例えば、本来の血管の内膜を構成する内皮細胞および基底層が管状血管組織等価物の外側になるように配置することも可能である。このような血管組織等価物の中央層は平滑筋およびコラーゲン格子によって構成され、従って、血管組織等価物の中膜を構成する。このように順序が逆転した層を有する血管組織等価物の内層はコラーゲン格子中の外膜腺維芽細胞から作られ、通常血管の外膜を構成すると思われる層を形成する。
　本発明で使用される血管組織等価物は、適切なソースの培養細胞を用いることにより、様々なタイプの血管に作製し得る。動脈血管組織等価物は、更に、動脈の対応する層から培養された細胞を備えている。毛細血管等価物は、外膜腺維芽細胞の代わりに、毛細血管内皮細胞および周細胞を備えている。静脈血管組織等価物は、更に、静脈から培養された細胞を備えており、動脈血管組織等価物よりは薄い外層で形成される。本発明により、何らかの疾病を研究する場合には、その疾病を有する患者から採取した細胞の培養物が血管組織等価物に組み込まれる。
　本発明による装置の形態は、使用する組織等価物および調べるべき相互作用の性質によって異なってくる。本発明に使用される組織等価物は、平たいシート状、中空の管状又は中空管による網状に成形されることが多いが、必要とあらば、どのような形にも成形され得る。例えば、組織等価物は、組織の自然な形状を変えることが望ましい場合もある。例を挙げると、皮膚組織等価物はシート状ではなく円筒状でも良いし、又、血管組織等価物の層は本来の血管とは逆の順序で配置されることがある。
　本発明は少なくとも１つの組織等価物を用いることにより、組織と少なくとも１種類の作用原との相互作用を調べるための装置を提供するものであり、この装置は組織等価物のためのコンテナから成り、更にこのコンテナは、（ｉ）組織等価物がコンテナ内で少なくとも１つの領域を規定するように組織等価物を位置決めする手段、（ｉｉ）少なくとも１つの出入口、および（ｉｉｉ）コンテナを閉じる手段より成る。本発明では、必要とあらば、組織等価物がコンテナ内の少なくとも２つの領域を規定する。本発明では、装置によっては、コンテナを閉鎖するためのカバーが加わることもある。この種の装置では、このコンテナを封鎖するカバーが取り外し可能な場合もある。
　本発明は組織等価物より成る装置をもその適用範囲内に含む。いくつかの具体例においては、この組織等価物がコンテナ内の上方領域および下方領域を規定し、この下方領域は第１の液相となり、組織等価物の一面がこの液に隣接する。このタイプの数例においては更に、上方領域に第２の液相を有する。
　本発明は、また管状組織等価物より成る装置をも適用範囲内に含む。この場合、管状組織等価物はコンテナ内における内側領域および外側領域を規定し、内側領域は第１の液相より成り、外側領域は第２の液相より成る。
　次の本発明の装置の具体例について図面を用いて説明する。
　第１Ａ図は、皮膚組織等価物を使用して皮膚と１種類又は１種類以上の作用原との間の相互作用を調べることを目的とした本発明による装置の一例を示す。この装置はコンテナ１０より成り、コンテナは皮膚組織等価物６０を位置決めする手段と、下方チャンバ２０と、上方チャンバ３０とを具える。両チャンバは上方ガスケット４０と、下方ガスケット４１と、連結機構５０、５１とにより密封的に連結される。この例では皮膚組織等価物６０が使用され、この皮膚組織等価物６０は、下方チャンバ２０と上方チャンバ３０との間に除去可能に置かれる。皮膚組織等価物６０は、表皮層６２及び真皮層６４の２層より成る。この例において、コンテナ１０は上方チャンバ３０の上にカバー７０が設けられ、下方チャンバは出入口８０、９０を具える。
　第１Ａ図に示す具体例では、コンテナがしっかりと連結された上方チャンバ２０と下方チャンバ３０を具え、これら両チャンバによりコンテナ１０内において皮膚組織等価物６０が位置決めされる。コンテナ１０における組織等価物の位置決めは、例えば透過性の支持膜をコンテナ内に設置すること等の他の方法も使用し得る。この場合、組織等価物は透過性の支持膜に接触するか、あるいは、支持膜の上に置かれる。
　このタイプの具体例を第１Ｂ図に示す。第１Ｂ図の例において、上述した例で説明したものと同じ要素には同じ番号を用いている。この例では、皮膚組織等価物６０用のホルダの位置決めを行うコンテナ１０が具備されている。コンテナ１０は内部に固定された透過性の支持膜６５を有し、この支持膜６５がコンテナ１０内において、皮膚組織等価物６０を位置決めする。この例は更に皮膚組織等価物６０を有しており、これが下方チャンバ２０と上方チャンバ３０との間の境界となる。この例では、上方チャンバ３０の上にコンテナを閉鎖するカバー７０が付き、コンテナ１０を具え、下方チャンバは出入口８０、９０を具える。
　第２図および第３図は本発明によるまた別の装置例である。この例においても、他の例で説明したものと同じ要素には同じ番号を当てる。この装置は管状組織等価物を収容するための円筒形のコンテナ１０を有し、このコンテナは底部に２個の出入口８１、８２、中空の心棒１００を具える。心棒の上端は出入口７１を具え、下端は開いている。コンテナ１０を閉鎖するカバー７０は心棒１００にしっかりと接続される。コンテナ１０の内壁１２は化学反応を起こさない防水性の材料で製作される。コンテナ１０にはこれを閉鎖する取り外し可能なカバー７０をねじ込むためのネジ山が切られる。カバー７０は出入口７２を具える。出入口７２は充填の際の供給口として使用される場合もあり、また別に口７３が付くこともある。コンテナ１０は更に、心棒１００をコンテナ１０の基礎部に密着させるための機構（図には示していない）をその底部に具える。一部の装置においては、心棒１００の底部分に入口又は出口が付き、コンテナの底を密封するために利用される。
　第３図に示す心棒１００は多数の部分から構成される。即ち、１０５はコンテナをカバーし密封する部分、１０１および１０８は管状組織等価物の細胞を取りつける部分、また１０３および１０７は管状組織等価物の縦方向への収縮を抑制するための部分、１０４は選択した材料に管状組織等価物中を通過させる透過性の液相である。装置の種類によっては、１０４の液相が組織等価物を支持するために使用される。１０９はコンテナ１０の基礎部１１に心棒１００を取り外し可能に装着するための機構である（例えば、環状の溝あるいはネジ山）（図示されない）。
　コンテナ１０およびカバー７０は、組織等価物を含め分析すべき物質と反応しない、あるいは、これに悪影響を及ぼさないものであれば、いかなる材料で製作されても良い。装置の種類によっては、例えばコンテナの壁面あるいは窓を通してコンテナの外から組織等価物が見えるようにコンテナ１０を製作することが望ましい。コンテナの材料として好適とされるのはガラス、ポリカーボネイト、ポリスチレン、テフロン（登録商標）およびステンレススチール等である。また別の装置例では、コンテナ１０の内壁１２がテフロン（登録商標）、ポリカーボネイト、ステンレススチール等、化学反応を起こさない防水性の材料で製作されるか、あるいは、内壁１２は防水のためのコーティング処理が施される。
　コンテナは必要な組織等価物のサイズおよび形状に合致するものであれば、どのような形状および容積にも製作され得る。コンテナの寸法はまた、必要とされる組織等価物および必要とされる分析容量によっても異なってくる。本発明を実施する場合においては、例えば、外径約２５ｍｍ、容積約５ｍｌのコンテナが便利である。装置の種類によっては、基礎部又はホルダに複数のコンテナが具えられる場合もある。
　透過性の支持膜６５によってコンテナ１０中における組織等価物６０の位置が決定される装置例の場合、この支持膜６５は膜又はメッシュ状であることが望ましい。好適な素材としてはポリプロプレン、ナイロンおよびポリカーボネイト等が挙げられる。
　ガスケット４０、４１は、分析が行われる条件および組織等価物が使用される条件下で不活性のもの、かつ、上方チャンバ２０と下方チャンバ３０とを良好に密着させ得るものであれば、いかなる材料で製作されても良い。好適な材料とされるのはシリコンおよびテフロン（登録商標）等である。
　第１Ａ図および第１Ｂ図に示す例では、上下チャンバ２０、３０がネジ５０、５１で組み合わされる。上下チャンバを密閉的に組み合わせ得る方法であれば、連結方法はどのようなものでも良い。
　第１Ａ図および第１Ｂ図に示す装置は、液相が下方チャンバ２０中へ入り、そして、これから出て行くための出入口を具えている。下方チャンバに必要な出入口の数は、実施される分析の性質に依存する。
　第３図に示す例では、コンテナ１０のカバー７０がバルブ７１、出入口７２およびもれ口７３を具えている。装置によってはもれ口がなく、出入口７２が出入口およびもれ口の両方の機能を果たす。出入口は、例えば組織等価物を表皮化する、又は被験物質を加える際に使用される。図に示した装置ではコンテナ１０を閉鎖するためにカバー７０が使用されるが、コンテナ１０を閉鎖する目的ではこれに代わる方法も許容される、ということに留意すべきである。別の例では、コンテナ内部への進入あるいはコンテナ内部に設置された組織等価物への接近は出入口、その他の開口部あるいはコンテナ上部の適切な位置に配置された通路が使用される。更に別の例では、コンテナを封鎖する機構が、例えば加熱によって封印あるいはコンテナに溶接される。このタイプの装置では、コンテナを封鎖している封印又は溶接を除去することによってコンテナ内部へ進入する。
　第２図および第３図に示した例では、心棒１００によってコンテナ１０内部における組織等価物の位置が決定される。本発明では装置のタイプによって、心棒１００をコンテナ１０内に固定した後、この心棒１００の上で組織等価物が成形される。
　前にも述べた通り、心棒１００は多数の部分より成る。１０５および１０９部分の素材としては固く、無孔性で不活性のものが望ましく、これにはポリカーボネイトあるいはポリスチレン等のプラスチック素材、テフロン（登録商標）、ガラスあるいはステンレススチール、また、これらの組み合わせが含まれる。１０１および１０８部分は組織等価物の細胞を粘着させる部分であり、装置によっては、組織等価物と心棒１００の間を封印する機能も果たす。１０１および１０８部分の素材としてはグロー放電処理したプラスチック、コラーゲンあるいはフィブロネクチンで被覆したガラス又はプラスチックが望ましい。１０３および１０７部分は組織等価物が縦方向に収縮するのを抑制する機能を果たす。１０３および１０７部分は細かい織地であることが望ましい。織地は、例えば、この部分に孔あるいは多数の細かい突起を付けることによって得られる。望ましい素材としては、ベルクロ（登録商標）、ワイヤークロス等の網織ステンレススチール、網織プラスチック、網織テフロン（登録商標）およびポリウレタンフォーム等が挙げられるが、この限りではない。１０４部分の素材としては、栄養素等の小さい分子は通すが、コラーゲンや特にコラーゲン繊維等の大きい分子に対しては透過性が限定された材料が望ましい。このような液体透過性素材としてはナイロンあるいはポリプロピレン等の強いが活性のない材料が挙げられる。孔径としては約０．２〜５μｍが実用的であり、０．５〜３μｍが望ましい。装置によっては、この膜に支持機構が具えられる。望ましい素材としては、ステンレススチール、ポリカーボネイトまたはポリスチレンを含むプラスチック、テフロン（登録商標）等の固く活性のない材料製のフレーム構造あるいは仕切りが挙げられる。
　本発明による装置には、装置内に流入するあるいはこれから流出する液相（単数又は複数）の量を調節するための機構が具えられることもある。液量を調節する方法は、この分野の専門家には周知のものである。例えば、組織等価物に隣接する液相（あるいは複数）のサンプリング、循環、交換あるいは供給のための装置が具えられる。第１Ａ図に示した例では、出入口８０および９０をこの分野の専門家には周知の方法で適当な循環器に接続することにより、チャンバ２０内の液相が装置を通って移動するようにしても良い。
　本発明は少なくとも１つの組織等価物を用いることにより組織と少なくとも１種類の作用原との相互作用を調べるための方法を提示するものであるが、この方法は以下の手順より成る。
（ａ）作用原を組織等価物に接触させる。この時、組織等価物は、液相と隣接するようにする。
（ｂ）（ｉ）組織等価物、（ｉｉ）組織等価物の細胞内液、および（ｉｉｉ）液相の三者のうち少なくとも１つを分析することにより、作用原と組織等価物の相互作用を調べる。
　本発明による装置では、上皮層および真皮層を有する少なくとも１つの皮膚組織等価物を使用することにより、皮膚と少なくとも１種類の作用原の相互作用を測定するが、この方法は以下の手順より成る。
（ａ）作用原を組織等価物の上皮層に接触させる。この時、組織等価物の真皮層が液相と隣接するようにする。
（ｂ）（ｉ）皮膚組織等価物、（ｉｉ）皮膚組織等価物の細胞内液、および（ｉｉｉ）液相、の三者のうち少なくとも１つを分析することにより作用原と皮膚組織等価物の相互作用を測定する。
　本発明は、人間の皮膚組織等価物を使用し、皮膚と様々な作用原との相互作用を調べるための装置、方法および器具を提示するものであり、テストの対象には以下が含まれるが、この限りではない。
　１）物質の皮膚への浸透速度および浸透範囲（皮膚吸収試験）、
　２）細胞透過性の変化により反映される作用原の相互作用（皮膚細胞透過性試験）、
　３）細胞内液中への様々な調節分子あるいは信号分子の放出を惹起・促進する作用原に対する皮膚細胞反応（皮膚化学反応試験）、および
　４）真のアレルゲンである物質に対する皮膚細胞並びに特殊免疫細胞の反応（皮膚免疫反応性試験）。
　上記の装置、方法および器具は作用原とヒト皮膚組織等価物の相互作用を定量するための手段を規定するものである。上記試験の結果は、動物あるいは死体の皮膚によって実施される同様の試験に比べて、人間の自然皮膚における反応をより正確に反映するものでなくてはならない。
　本発明が提示する方法例では、表皮は気体環境に曝されるのに対し、真皮は皮膚組織等価物の組織液と自由に交換可能な無菌の組織培養液に浸される。皮膚組織等価物は気相（例えば、空気）と液相（例えば、培養基）との間に置かれる（例えば、第１Ａ図および第１Ｂ図参照）。この例では、皮膚組織等価物の真皮層は、「内部環境」を模擬した栄養基としての液相に隣接、典型的には接触、しているのに対し、角質化した表皮層は外部環境を模擬した気層に接している。皮膚組織等価物は両相の間の液遮断層として機能する。被験物質は適当な溶媒に溶解して、組織等価物の表皮面に適用される。皮膚組織等価物自体、その組織液および培養基はそれぞれ分析に使用できる。
　本発明に従って試験に使用される皮膚組織等価物の組成は、実施すべき試験の性質によって異なる。
　本発明は、一定時間内に皮膚を通過する作用原の量を測定する皮膚吸収試験のための装置、方法および器具を提供する。一般に、付属器官からの吸収は吸収の初期段階を除き極めて僅かであるとされている。従って、標準的な皮膚組織等価物は、毛孔および汗腺等の開口付属器官を欠くとは言えども、最も定常状態に近い吸収試験を実施し得るものと期待できる。しかし、付属器官からの吸収と非付属器官からの経皮吸収の生理学的比率を再現する多数の細胞孔を有する皮膚組織等価物を作成するのが望ましい場合もある。皮膚組織等価物は数カ月あるいはより長期間生存状態に維持し得るので、皮膚組織等価物を使用した長期間の試験も可能である。
　脂溶性物質等は皮膚に捕らえられる傾向があるため、本発明を使用する皮膚吸収試験では、皮膚組織等価物の真皮層に隣接した液相中の作用原の量を測定する、あるいは皮膚組織等価物自体又はその細胞内液中の作用原の量を直接的に測定することが可能である。この種の試験に使用される作用原は例えば放射化標識等の方法で検出することも可能であるし、また、この分野の専門家には周知の方法を用いた直接分析により測定されることもある。
　本発明により、被験作用原（単数又は複数）の皮膚浸透速度を測定する方法もある。この具体例では、装置はそのホルダ中に複数のコンテナを具え、ジグ中に据え付けられ、真皮を浸すための例えば栄養溶液等を定期的あるいは連続的に各皮膚組織等価物に供給する貯蔵槽に連結される。溶液の供給はポンプを使用するかあるいは重力送りとし、血流を模擬した条件下における時間の関数として流量を測定できるよう、その排出液をフラクション採集する。得られたデータを使用し、透過係数その他被験物質の初回透過に要した時間、吸収率等の関連パラメータが算出される。この方法では更に、浸透性試験前後のトリチウム化した水を使用するオプショナルな目盛り調整により、皮膚組織等価物の障壁特性に対する作用原の影響を測定することも可能である。
　本発明はまた、化学薬品、化粧品、医薬品等の作用原と皮膚との相互作用に起因する細胞透過性の変化を調べるために実施される皮膚細胞透過性試験のための装置、方法および器具を提示する。細胞から放出される細胞内にしか存在しない蛋白質の検出は作用原が細胞を損傷したことの指標となる。本発明による装置、方法および器具を用いて複数の皮膚組織等価物を試験することにより、用量−反応データが得られる。この場合、各皮膚組織等価物は固有の液相を具えた個別のコンテナ内に設置され、液相の含有物が分析に供される。ＬＤＨ等の細胞質淡白の放出量は色原帯分析等の方法で測定される。少なくとも１種の細胞質酵素および１種のリソソーム酵素の放出量が、この分野の専門家には周知の適切な分析方法で測定される。例えば、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法ＥＩＡ）、酵素標識免疫測定法（ＥＬＩＳＡ，エライサ）および蛍光後退法等、種々の蛋白結合法が使用される。本発明による皮膚細胞透過性試験は、特に刺激性作用原と腐食性作用原との識別を行うのに有用である。これは、一般に、前者が陰性の結果を示すのに対し、後者が陽性の結果を示すからである。
　本発明は更に、浮腫および紅斑又は炎症を引き起す物質に対する皮膚細胞の生理応答を調べる皮膚化学反応試験のための装置、方法および器具を提示する。この試験は様々な化学要因に起因する複雑な組織反応の定量を目的とするものであり、作用原（単数又は複数）への応答として細胞から組織液中へ放出された化学物質が測定される。これらの物質にはプロスタグランジンＥ２やプロスタサイクリン等、アラキドン酸誘導の信号物質、並びにプロスタサイクリンを分泌する真皮の腺維芽細胞を刺激することにより反応を増幅し得るインターロイキンＩが含まれる。複数の皮膚等価物サンプルを使用することにより、用量−反応曲線データを得ることができる。
　放出物の定量方法はこの分野の専門家には周知のものである。既知の接触刺激剤を試験することにより、上記媒介物質の内、１種類以上の放出と、紅斑および浮腫という定量は困難であるが明確な反応との関連を調べる。本発明においては、皮膚組織等価物のケラチノサイトはプロスタグランジンＥ２を放出する主因子と考えられているが、プロスタサイクリン放出源として毛細血管内皮細胞がオプションで皮膚組織等価物の真皮層に含められる例もある。これらはいずれも半減期の比較的短い物質ではあるが、この分野の専門家には周知の方法を使ってその分解産物を分析することによっても測定できる。
　免疫反応性試験のための装置、方法および器具もまた本発明が提示するもので、皮膚組織等価物中に組み込まれた免疫細胞から放出される様々な作用原、例えば蛋白質との共有結合により接触感受性を誘発する物質等、との反応を測定するために使用される。免疫原は「担体」として働く自己蛋白質の複合体である場合も、又、ハプテンとして作用する接触感作原である場合もある。
　本発明に基ずく皮膚免疫反応性試験の具体例では、使用する皮膚組織等価物の表皮に、免疫原性の複合体を処理して他の免疫細胞に付与する正常な皮膚の大食細胞用ランゲルハンス細胞（ＬＣ）が組み込まれ、皮膚に関係する免疫反応鎖の第一段階を構成する。皮膚組織等価物の表皮および蛋白質−ハプテン複合体から出ていく活性化したＬＣの量は、アレルギー原性の分析において良好な指標となる。移動する細胞量は免疫蛍光法その他この分野の専門家には周知の方法で追跡する場合もあり、又、既知のアレルギー原性物質を使用することにより、アレルギー原性との相関を探る場合もある。別の例では、皮膚組織等価物に大食細胞がオプションで含められ、体液免疫反応の誘発物質への反応として細胞から分泌される分析可能なリンホカイン、ＩＬ−１の供給源となる。また別の例では、特定の免疫原に応答する感作Ｔ細胞がヒスタミン等強力な信号を放出するマスト細胞のサブセットと共にオプションで皮膚組織等価物に加えられ、増幅率が高く、従って分析が容易な免疫信号を提供する。
　表皮層に接触した培養液あるいは組織自体から媒介物質を採集し、分析する。皮膚刺激性試験および皮膚化学反応試験を行えば、刺激原とアレルゲンの区別が可能である。
　本発明による装置および方法が、１つ以上の組織等価物を用いることにより少なくとも１種の作用原と組織との相互作用を調べるための器具の一部として使用される場合もある。本発明による器具は以下の組み合わせより成る。
（ａ）少なくとも１つの組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と組織の相互作用を調べるための装置であって、この装置は組織等価物を収容するためのコンテナを備えており、このコンテナは、
　（ｉ）組織等価物がコンテナ内の少なくとも１つの領域を規定するようにこのコンテナ内に組織等価物を位置決めする手段、
　（ｉｉ）少なくとも１つの出入口、および
　（ｉｉｉ）コンテナを封鎖する手段を備えている。
（ｂ）組織等価物。好ましい具体例では、組織等価物が少なくとも２つの領域を決定するようにされる。
　器具の具体例は、組織等価物がコンテナ内の上下域を決定する。管状組織等価物を使用する別の例では、この管状組織等価物がコンテナの内外領域を決定する。このタイプの具体例では、コンテナに１相以上の液相が具えられる。
　本発明が提示する器具の望ましい具体例では、装置に２つ以上の個別のコンテナが具えられる。このタイプでは、個々のコンテナからサンプルを採集するあるいはコンテナに液を供給するための多岐管に装置を接続できるようにする場合もある。また別の例では、複数のコンテナが相互に連結され、組織等価物に隣接する液相が全組織等価物試料に共通となっているタイプもある。このような器具では、各コンテナ内の組織等価物が作用原（単数又は複数）と接触するようになっており、各コンテナ内の液相が分析に供される。
　このタイプの器具にはさらに、１種類以上の作用原、および作用原と組織等価物との相互作用を分析するために必要な１種類以上の試薬が任意で加えられる。組織等価物と作用原の相互作用を測定するためにはこの分野の専門家には周知の方法が使用され、これには組織学的検査、マススペクトル分析、磁気共鳴像、超音波像、放射性トレーサー法、放射性免疫測定法、酵素免疫測定法、酵素標識免疫測定法および蛍光抗体法等が含まれるが、この方法はこれらに限定されるものではない。
　本発明はまた、少なくとも１種類の作用原と皮膚組織との相互作用を調べるための器具をも提示する。１例を挙げると、この種の皮膚組織等価物用器具は以下の組み合わせを備えている。
（ａ）少なくとも１つの皮膚組織等価物を用いることにより少なくとも１種類の作用原と皮膚組織との相互作用を調べるための装置であって、この装置は皮膚組織等価物を納めるコンテナより成り、このコンテナは、
　（ｉ）皮膚組織等価物がコンテナ内の上方領域および液相からなる下方領域を決定するようにコンテナ内にこの皮膚組織等価物を位置決めする手段、
　（ｉｉ）少なくとも１つの出入口、および
　（ｉｉｉ）コンテナを封鎖する手段、
（ｂ）表皮層および真皮層を有する皮膚組織等価物。このうち真皮層は液相に隣接する。他の例では、第二の液相がコンテナを封鎖するための手段と皮膚組織等価物の間に配される。このような例では、サンプルと皮膚組織等価物とを接触させる前に第二の液相を除去したほうが良い場合もある。また更に別の例では、装置が２つ以上の個別のコンテナ又は２つ以上の互いに連結したコンテナを具えている。
　本発明により提示される器具には、例えば管状皮膚組織等価物等の管状組織等価物を使用する装置等、別のタイプの装置も含まれ得る。
　本発明の具体例としては、１種類の作用原と種々の組織との相互作用を調べるのが望ましい場合もある。肝臓組織と皮膚に浸透した作用原の相互作用を例にとれば、まず、この作用原を本発明による皮膚組織等価物を通過させ、この作用原又はその分解物を回収した後、これら回収した作用原又はその分解物を本発明による肝臓組織等価物と接触させることによって測定可能であると思われる。
　本発明はまた、血管組織等価物と少なくとも１種類の作用原との相互作用の測定を目的としたヒト血管組織等価物を中心とする装置、方法および器具をも提示する。この場合の相互作用とは血管の生理への影響（単数又は複数）、血液面相互作用および病理発生過程を意味するが、この限りではない。
　一般に、血管組織等価物を中心とする試験系は、循環回路内に適当なタイプの血管組織等価物を組み込むことにより成る。循環回路は完全に機械化されたもの（ポンプ、タービン、貯液槽、等）もあり、また、動脈−静脈吻合における如くｅｘ　ｖｉｖｏで組み込んだ血管組織等価物を用いる生物学的なものもある。循環液は培養基であり、この培養基には血小板等の血液成分、ヘパリン処理した血液、あるいは（ｅｘ　ｖｉｖｏ経路における如く）非処理血液が含有される。大食細胞等、その他の細胞は血管組織等価物又は循環液に必要に応じて任意に追加される。
　第４Ａ図および第４Ｂ図は、血管組織等価物を使用することにより１種類以上の作用原が血管に及ぼす影響を調べることを目的とした本発明の装置の一具体例を示したもので、この装置は血管組織等価物を納めるコンテナ１０、および、これと連結するための密閉カバー７０より成り、カバー７０は２つの出入口１４、１６を具える。コンテナ１０は更に、血管組織等価物をコンテナ１０内に設置するための２つのバルブ付き挿入管１５、１７を具える。
　第４Ｃ図は第４Ａ図および第４Ｂ図中のコンテナ１０を組み込んだ簡易循環回路の模式図である。循環回路はタービン１２０、貯蔵槽１２１、拍動式ポンプ１２２より構成され、出入口１２３を具える。循環回路は更に、増幅器およびチャート・レコーダ（図示しない）に接続された変圧器（図示しない）を具える。貯蔵槽１２１はガスを循環液内に通気し、ガス交換の機能を果たす機構（図示しない）を具えている。
　第４Ａ図および第４Ｂ図に示した装置を製作するにあたっては、他の装置の製作について記述したものと同様の一般的な材料が使用できる。他の例と同様、コンテナのカバーは自由選択であり、コンテナ内および組織等価物へは出入口又は他の適当な方法を通じて接近できる。
　タービンの素材としては、医薬品級のチゴン、テフロン、シリコン、ステンレススチール又はその他活性を示さない材料が望ましい。
　血管組織等価物に基ずく試験系の例としては、動脈アテローム誘発性試験系および転移生体試験系の２つが挙げられる。
　動脈アテローム誘発性試験系は、アテローム性動脈硬化症斑の発生および改善をｉｎｖｉｔｒｏにおいて研究する際の使用を目的としたものである。この試験装置は第４Ｃ図に示したタービン１２０、ヒト動脈細胞から作成されコンテナ１０内に納められる血管組織等価物６８、拍動式ポンプ１２２、変圧器（図示しない）および貯液槽１２１をそなえた簡便な循環回路よりなる。循環液は、高脂血症血清か又は低密度リポ蛋白質等既知の動脈アテローム誘発因子を添加した培養液である。大食細胞は泡沫細胞の前駆物質として適宜追加される。血管組織等価物には、斑形成を誘発するため、局所性の機械的損傷あるいはその他の損傷を与える（Ｒｏｓｓ＆Ｇｌｏｍｓｅｔ，１９７６）。この試験系では、実験者は循環液、圧力および圧力変化、動脈透過物の成分、等を調節することにより、これらが動脈アテロームの発生および薬理療法への応答においてどのような役割を演じているかを調べることができる。
　転移試験系は、癌細胞の毛細血管壁通過機構を調べるための試験への利用を目的とするものである。腫瘍の転移は殆ど血流によって媒介されるものであるから、血管への侵入、循環、定着および血管外遊出を含む転移の様々な段階が一般的抗腫瘍剤の作用域になると考えられる。第４Ｃ図に示した循環回路と同様の装置が使用される。転移生体試験系は、毛細血管等価物（毛細血管内皮細胞で裏打ちした１本の管か、又はコラーゲン格子内で成長させた毛細血管のネットワークとしてのいずれか）、および血管組織等価物の内腔あるいは外腔のいずれかに変形細胞を添加するための出入口を具えた低圧、低流速の簡易循環回路より成る。このｉｎ　ｖｉｔｒｏ系は、転移過程並びに薬理的処置に対する反応の時間経移および段階を研究するのに適している。
　本発明はまた、血管組織等価物と少なくとも１種類の作用原との相互作用を測定するための上述と同様の器具を含む。
　本発明は、実際に単に模範的な以下の例を参考にすればより良く理解できるが、本発明の適用範囲を限定することを意図していない。
　
例１−皮膚吸収試験
　安息香酸の経皮吸収試験に使用されるシート状の皮膚組織等価物（単数又は複数）
１）真皮等価物は米国特許第４，４８５，０９６号（特公昭６１−３３５９３号に対応）に記載された方法に従い、人間の真皮腺維芽細胞より作成される。成形に適した寸法は直径１００ｍｍのシャーレ内での総容量１５ｍｌである。
２）この真皮等価物に人間の表皮細胞を植え付ける。培養した表皮細胞あるいは採集したばかりの表皮から調製した細胞懸濁液の小滴を真皮等価物の表面に滴下する（例えば米国特許第４，４８５，０９６号、特公昭６１−３３５９３号参照）。これに代る方法としては、皮膚あるいは皮膚組織等価物の小片（ストリップ、パンチ、その他の形状）を真皮等価物の表面に適用する（例えば米国特許第４，６０４，３４６号参照）。これら接種済み真皮等価物を完全な表皮層が形成されるまで培養する。
３）試験チャンバの半分まで液（通常は培養基又は緩衝塩溶液）を入れる。完成した皮膚組織等価物を、下方チャンバおよびガスケット全体が覆われるように、第１Ａ図又は第１Ｂ図に示したような装置のチャンバへ移す。上方ガスケットは皮膚組織等価物の上面に位置させる。チャンバの直径は約２５ｍｍである。試験チャンバの上半分を、密封が達成されるよう、但し皮膚組織等価物を押し潰さないよう、しっかりとネジで締める。
４）余分の液は皮膚組織等価物の上面から吸い取る。緩衝した塩溶液あるいは他の捕集液を下方チャンバから流し、フラクション・コレクタで採集する。
５）作用原（単数又は複数）が印加される。これが皮膚組織等価物を通過する様子を分析し、経時的変化および吸収をＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，７４，６５−６７（１９８５）の方法に従って算出する。被験物質サンプルを皮膚組織等価物の上面に印加する。例えば、溶媒ペトロラタム中に溶解した〔１４Ｃ〕安息香酸（適当な濃度は１０，１００および１，０００ｎｇ／ｍｇ）を皮膚組織等価物１ｃｍ２あたり溶媒２５ｍｇの割合で添加する。
６）流出液のサンプルを採集し、この分野では周知の液シンチレーション・カウンタでカウントする。これに代る方法としては、皮膚組織等価物サンプル自体を（緩衝した生理食塩水で）洗い、コンテナから取り出し、（例えば、０．５％硫酸ドデシルナトリウムおよび４Ｍ尿素の水溶液中で）可溶化したのち、その適量をカウントして皮膚組織等価物中に捕集された放射能を測定する。この方法は、皮膚組織等価物から捕集液中へ移動しにくいと思われる疎水性の物質を調べるのに適している。
この方法は、この分野の専門家には周知の方法、例えば軽いトリプシン処理、により表皮層と真皮層とを分離すれば、更に効果的である。
　
例２−皮膚細胞透過性試験
１）必要量の皮膚組織等価物を調製し、例１について前に記載した本発明による装置内に設置する。
２）皮膚組織等価物Ａの上（表皮）面に作用原（単数又は複数）を印加する。例えばフレーム試験（Ｂｅｌｌｓ，Ｍ．＆Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｊ．Ｗ．，ｉｎ　Ａｃｕｔｅ　Ｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｔｅｓｔｉｎｇ；Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，〔急性毒性試験、代替方法〕ｐｐ．６３−７９，１９８４；Ａ．Ｍ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，ｅｄ．，Ｍ．Ａ．Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）で使用される化学物質が、様々な濃度の水溶液として皮膚組織等価物の個々のサンプルに適用される。
３）流出液を下方チャンバから採取し、作用原（単数又は複数）に対する皮膚組織等価物の反応の結果生成された細胞質酵素（例：乳酸脱水酵素、ＥＣ１．１．１．２７）およびリソソーム酵素（例：β−グルグロニダーゼ、ＥＥ３．２．１．３１）について分析する。放出された酵素の分析にはこの分野の専門家には周知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，〔酵素分析方法〕Ｈ．Ｕ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｅ．Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９８３　ＩＩＩ，１１８−１３８　ａｎｄ　ＩＶ，２４６−２５６他を参照）が使用される。
４）データに基づき、細胞の損傷に起因する酵素放出における用量反応曲線を作成する。
　
例３−皮膚免疫反応試験
１）膜あるいはメッシュで区切られた２槽のチャンバより成るコンテナを使用する。第１Ｂ図を参照されたい。これらの膜あるいはメッシュは直径約２５ｍｍの円盤で、その平均ポア・サイズは０．５〜３．０μｍである。膜は、細胞およびコラーゲンが粘着しやすい材料（例：グロー放電処理したポリスチレン、又はコラーゲンで被覆しポア・サイズを調製したガラス）で作成又は被覆する。下方チャンバには培養基のサンプル採集あるいは給液のための出入口を設ける。上方チャンバは、試料添加のため取り外し可能なカバーを具える。上方チャンバの壁は細胞粘着を促進しない素材（例：ポリカーボネイト，テフロン（登録商標）、又はシリコン処理したポリスチレンとする。
２）前述の例１で記した如く、真皮等価物を上方チャンバ内で成形する。この等価物には真皮腺維芽細胞の他に免疫系の細胞を加える。ランゲルハンス細胞、大食細胞、Ｔ細胞、マスト細胞および毛細血管内皮細胞のうちの１種類以上の細胞を含める。この他の種類の細胞も適宜加えてよい。必ず含めなくてはならないのはランゲルハンス細胞，大食細胞およびマスト細胞である。
３）真皮層等価物は膜へ粘着すると緊張・収縮し、円盤を上下チャンバから分離させる。
４）真皮層等価物に表皮細胞を接種する（通常、成形から３〜１０日後）。この皮膚組織等価物を完全に角質化した表皮層が形成されるまで培養する。Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ　８１：２５−１０５（１９８３）他を参照。
５）表皮面に作用原（アレルゲンと推定されるもの）を適用する。下方チャンバ中からアレルギー反応の媒介物を１種類以上採取し、標準的な方法で分析する。媒介物の例としては、ランゲルハンス細胞および大食細胞から放出されるインターロイキン−１（ＩＬ−１）およびマスト細胞から放出されるヒスタミン等が挙げられる。
　
例４−皮膚化学反応試験
　刺激性化学品
１）第２図および第３図に示した心棒１００とコンテナ１０を組み立てる。例１に記述した如く、組み立てた心棒１００とコンテナ１０によって決定された容積又は空間内に、出入口７２を通して真皮等価物を成形する。混合物を成形した真皮等価物の体積を調節し、メッシュ１０４および細胞が粘着する部分１０３の全体が覆われるようにする。従って、このサイズの場合、混合物は約５０〜６０ｍｌが必要となる。真皮等価物を放置し、ゲル化、および心棒１００の周囲に収縮させる。孔１０３、１０７は縦方向の収縮を抑制し、メッシュ又は膜１０４を常に覆われた状態に保つ。必要とあらば、コンテナ１０を満たす際に出入口７１から心棒１００の内腔をも満たし、成形混合物が心棒１００の内腔へ流入するのを防止する。
２）この後（通常は３〜１０日後），出入口７２を通して真皮等価物に表皮細胞の懸濁液を接種する。多分岐型のマイクロピペットを出入口７２から挿入し、表皮細胞が真皮等価物の前面に均一に植え付けられるよう留意しながら、極く小量の細胞懸濁液（通常１〜５μｌ）を滴下する。角質化した表皮層が形成されるまで、これらを増殖させる。
３）次に、成形した皮膚組織等価物の表皮層に作用原（単数又は複数）を印加し、心棒の内腔を採集液で潅流する。（刺激性物質（Ｍ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ他、（Ｉｎ　Ａｎ　ｉｍａｌ　Ｍｏｄｅｌｓ　ｉｎ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ「皮膚病学における動物モデル」，Ｈ．Ｍａｉｂａｃｋ，ｅｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，１９７５，ｐｐ．１−１１）参照）を絆創膏（例えば、ガーゼ・パット）に付けて適用する場合もある。必要とあらば、これに不透性の材料（例えば、プラスチック・フィルム）を被せて閉塞する。この絆創膏は適当な時間（例えば、２４時間）の経過後に取り出す。
４）この分野の専門家には周知の方法を用い、作用原（単数又は複数）との反応の結果として細胞から放出された物質（例：プロスタグランジンＥ２）の有無について潅流液を分析する。例えば、市販されているプロスタグランジンＥ２放射性免疫測定法等を使用する。
　
例５−簡易循環回路内への血管組織等価物の組み込み
１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：３９７−４００（１９８６）に記載された動脈細胞を使用して、血管組織等価物を作成した。この血管組織等価物の内径は約６ｍｍ、長さは約１０ｃｍとした。
２）これをコンテナ１０（例えば第４Ａ図および第４Ｂ図参照）へ移し、コンテナ１０の内部に設置したカニューレの端に４−０号絹結紮糸で付けた。絹結紮糸は、血管組織等価物がしっかりと固定されるよう、しかし、血管等価物の壁を破らない程度に締める。
３）コンテナを第４Ｃ図に示した簡易循環回路内に組み込んだ。
４）培養液を循環回路に循環させた。血管組織等価物は圧力の変化に伴い膨張あるいは収縮した。圧力の変動は生理学的圧力（８０〜２００ｍｍＨｇ）および頻度（毎分断続的に６０〜１００回）の範囲内であった。
　
例６−動脈アテローマ誘発性試験
１）例５で記載した本発明装置内に数個の血管組織等価物を入れ、装置を第５図に示した簡易循環回路に組み込む。
２）対照サンプルを除くすべての血管組織等価物について、血流中における主要なコレステロール担体である低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）等の動脈アテローム誘発因子をその循環回路に添加する。
３）機械的、熱、その他の方法で、血管組織等価物の内皮層に局所的損傷を与える。
４）血管組織等価物に断続的に高圧（例えば、山圧：約２００ｍｍＨｇ；谷圧：約１２０ｍｍＨｇ）を加える。
５）様々な時間の経過後、血管組織等価物を調べ、例えば壁内における増殖性疾患（アテローム性動脈硬化斑）の発症および局所的損傷部位への脂質（特にコレステロール）の沈着等、動脈アテローム誘発の徴候を見る。検査には標準的な組織学的方法を使用する。超音波あるいは磁気共鳴像（ＭＲＩ）を含む非侵襲性の方法が開発された。
　
例７−転移性と血管組織等価物壁通過能との相関を調べるための転移性試験
１）血管組織等価物は、動脈の内皮細胞の代りに毛細血管の内皮細胞を使用する点を除けば、例５の項で記載したと同様に作成する。血管組織等価物を第５図に示す簡易循環回路内に組み込む。蠕動式のポンプを使用するだけで、必要な潅流が得られる。
２）対照サンプルを除くすべての血管組織等価物について、変形サンプル（例えば、Ｂ１２黒色斑細胞）を循環回路中に注入する。チャンバの外腔内の潅流液は一定間隔時に採集および交換する。
３）血管組織等価物を遠心し、壁を通過して等価物の内部に侵入した細胞を分離、カウントした後、マウスに注射した。転移性の評価はＰｏｓｔｅ＆Ｆｉｄｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２８３：１３９−１４６（１９８１）の方法に従い、サンプルを採集した時間との関連を調べる。これに代る方法としては、異る転移性を示すクローンを血管組織等価物に潅流し、これらクローンに由来する細胞が血管組織等価物の壁を通過する速度を測定する方法もある。
　以上説明した本願の明細書及び図面の記載はあくまで参考例であり、当業者によって想到される種々の改良又は変更も本発明の範囲に含められることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
　第１Ａ図は本発明による装置の中心を通る断面図。
　第１Ｂ図は本発明による別の装置の概略図。
　第２図は本発明によるコンテナの中心を通る断面図。
　第３図はいずれも本発明による管状組織等価物の位置調整機構並びにカバー機構の等角投影図。
　第４Ａ図は本発明による別の装置例の側面図。
　第４Ｂ図は第４Ａ図の概略図。
　第４Ｃ図は本発明による装置の一例の模式図で装置は循環ループ内に組み込まれている。