(57)【要約】  本発明は、カルニチン輸送体アゴニスト、または、カルニチン輸送体アンタゴニストをスクリーニングする方法、カルニチン輸送体アゴニスト、または、カルニチン輸送体アンタゴニストのスクリーニングを行うためのキット、カルニチン輸送体欠乏症を治療するための医薬品の製造方法、カルニチン輸送体欠乏症の診断方法、カルニチン輸送体と反応する抗体を製造するためのタンパク質の使用、オリゴヌクレオチド、および、カルニチン輸送体欠乏症の治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法であって：
（ａ）カルニチン輸送体を提供する工程、
（ｂ）試験化合物を提供する工程、
（ｃ）該カルニチン輸送体の活性を測定する工程、
を含む、上記方法。
【請求項２】
カルニチン輸送体は、哺乳動物のカルニチン輸送体であり、好ましくはヒト、マウスまたはラットのカルニチン輸送体であり、好ましくは腸のカルニチン輸送体であり、好ましくは、該カルニチン輸送体は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６（ＥＰ８８１２９０で開示された）、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含み、好ましくは、該カルニチン輸送体は、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含む核酸分子によってコードされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カルニチン輸送体は、脂質膜に含まれ、好ましくは細胞膜に含まれ、好ましくはミトコンドリア内膜、または、細胞質膜に含まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
カルニチン輸送体は、脂質の小胞膜に含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
カルニチン輸送体は、試験細胞の細胞質膜に含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
試験細胞は、カルニチン輸送体をコードする核酸分子を発現し、好ましくは、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６（ＥＰ８８１２９０で開示された）、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体をコードする核酸分子を発現し、好ましくは、該試験細胞は、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含む核酸分子を発現する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試験細胞は、転写活性化因子の配列に機能するように連結した、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含むＤＮＡ分子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試験細胞は、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５に相当する配列を含む翻訳可能なＲＮＡ分子を含み、好ましくは、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５に相当する配列を含むマイクロインジェクションされたｃＲＮＡ分子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
試験細胞は、細胞質膜中に、機能的なカルニチン輸送体を含み、好ましくは、該試験細胞は、アフリカツメガエル卵母細胞である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
カルニチン輸送体は、カルニチン、ノルアドレナリン、メチルフェニルピリジニウム、クレアチンおよび／またはセロトニンから選択される基質を、脂質膜を通過させて、好ましくは試験細胞に輸送する、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
検出可能な基質、特には放射性基質、ストレプトアビジン標識した、または、ビオチン標識した基質、または、抗体と反応する基質）が用いられ、好ましくは、脂質膜を通過して輸送された基質の量が、カルニチン輸送体の活性の指標である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
カルニチン輸送体の活性の指標は、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含む発現可能な核酸分子、または、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６（ＥＰ８８１２９０で開示された）、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体をコードする発現可能な核酸分子を含む試験細胞中で形成されたカルニチン輸送体の量である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
試験化合物は、カルニチン輸送体におけるアゴニストまたはアンタゴニスト作用に関してスクリーニングされ、好ましくは、該試験化合物は、化学物質ライブラリーの形態で提供される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ロボットシステムで行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）カルニチン輸送体を含む脂質膜、
（ｂ）カルニチン輸送体を検出可能な基質、
を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項１６】
カルニチン輸送体は、ヒト、マウスまたはラットのカルニチン輸送体であり、好ましくは、該カルニチン輸送体は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６（ＥＰ８８１２９０で開示された）、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含み、好ましくは、該カルニチン輸送体は、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含む核酸分子によってコードされている、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
カルニチン輸送体は、脂質の小胞膜に含まれる、請求項１５または１６に記載のキット。
【請求項１８】
カルニチン輸送体は、試験細胞の細胞質膜に含まれる、請求項１５または１６に記載のキット。
【請求項１９】
カルニチン輸送体欠乏症を治療するための医薬品の製造方法であって：
（ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を用いて、カルニチン輸送体のアゴニストを同定する工程、
（ｂ）十分な量の該アゴニストを提供する工程、
（ｃ）１種またはそれ以上の製薬上許容できるキャリアーまたは補助剤と共に、該アゴニストを製剤化する工程、
を含む、上記方法。
【請求項２０】
腎臓または腸、特には小腸におけるカルニチン輸送体欠乏症を治療するための、好ましくは、カルニチン、ノルアドレナリン、メチルフェニルピリジニウム、クレアチンおよび／またはセロトニン輸送の欠乏症を治療するための医薬品、好ましくは、全身性カルニチン欠乏症を治療するための医薬品の、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
カルニチン輸送体欠乏症の診断方法であって、組織サンプル中の、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６（ＥＰ８８１２９０で開示された）、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体の量を決定することを含む、上記方法。
【請求項２２】
カルニチン輸送体の量を決定するために、該カルニチン輸送体と反応する抗体が用いられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
カルニチン輸送体の変異体の量を決定するために、カルニチン輸送体欠乏症に関連するカルニチン輸送体の変異体と反応する抗体が用いられる、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６（ＥＰ８８１２９０で開示された）、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体と反応する抗体を製造するための、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０を含むタンパク質、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６（ＥＰ８８１２９０で開示された）、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３、または、配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０を含むタンパク質、好ましくは配列番号１、または、それらのフラグメントの使用。
【請求項２５】
カルニチン輸送体欠乏症に関連するカルニチン輸送体の変異体が用いられる、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
カルニチン輸送体欠乏症に関連するカルニチン輸送体の変異体を決定する方法であって：
（ａ）上記カルニチン輸送体欠乏症に関連する、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５の変異体の核酸配列を決定する工程、
（ｂ）カルニチン輸送体の前記変異体のアミノ酸配列を推測する工程、
を含む、上記方法。
【請求項２７】
カルニチン輸送体欠乏症の診断方法であって、組織サンプル中の、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６（ＥＰ８８１２９０で開示された）、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体をコードする核酸分子の量を決定することを含む、上記方法。
【請求項２８】
カルニチン輸送体をコードする核酸分子の量を決定するために、該カルニチン輸送体をコードする核酸分子の相補配列を含む核酸プローブが用いられる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
核酸プローブは、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５の相補配列、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５の相補配列、好ましくは配列番号４または配列番号１５の相補配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
核酸プローブは、ストリンジェントではない条件下で、好ましくはストリンジェントな条件下で、カルニチン輸送体をコードする核酸分子にハイブリダイズする、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
核酸プローブは、少なくとも１８個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号６または配列番号７の相補配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
核酸分子の量を決定するために、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチドが用いられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして用いられる、請求項３１または３３に記載の方法。
【請求項３５】
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡアレイの成分として用いられる、請求項３１、３３および３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＤＮＡ分子の量を決定する、請求項２７〜３１、３３、３４および３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、または、配列番号１５、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５に相当する配列を含むＲＮＡ分子の量を決定する、請求項２７〜３１および３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ＲＮＡ分子をＤＮＡ分子に逆転写する工程を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
核酸プローブは、カルニチン輸送体欠乏症に関連するカルニチン輸送体の変異体をコードする核酸分子の変異体にハイブリダイズする、請求項２７〜３１および３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
核酸分子の変異体は、カルニチン輸送体の変異体をコードする、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５の変異体、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５の変異体、好ましくは配列番号４または配列番号１５の変異体を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
カルニチン輸送体欠乏症に関連するカルニチン輸送体の変異体をコードする核酸分子の変異体を決定する方法であって、
（ａ）請求項２７〜３１および３３〜３８のいずれか一項に記載の方法を用いて、組織サンプルから、カルニチン輸送体欠乏症に関連するカルニチン輸送体の変異体をコードする核酸分子を単離する工程、
（ｂ）上記核酸分子の核酸配列を決定する工程、
を含む、上記方法。
【請求項４２】
組織サンプルは、患者から得られ、好ましくはその腎臓または腸、好ましくはその小腸から得られる、請求項２７〜３１および３３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
カルニチン輸送体欠乏症の治療方法であって、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６（ＥＰ８８１２９０で開示された）、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体をコードする核酸分子を、細胞に導入することを含む、上記方法。
【請求項４４】
ＤＮＡ配列は、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５に機能するように連結した、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５に機能するように連結した、好ましくは配列番号４または配列番号１５に機能するように連結した転写プロモーター配列を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
カルニチン輸送体欠乏症の治療方法であって、細胞中で、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６（ＥＰ８８１２９０で開示された）、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体をコードする核酸分子の転写活性を強化することを含む、上記方法。
【請求項４６】
配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含む細胞性遺伝子の転写活性が強化される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞は、腎細胞、腸細胞、小腸細胞、肝細胞、心臓細胞および／または筋肉細胞である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
カルニチン、ノルアドレナリン、メチルフェニルピリジニウム、クレアチンおよび／またはセロトニン輸送の欠乏症を治療するための、好ましくは、全身性カルニチン欠乏症を治療するための、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルニチン輸送体アゴニスト、または、カルニチン輸送体アンタゴニストをスクリーニングする方法、カルニチン輸送体アゴニスト、または、カルニチン輸送体アンタゴニストに関してスクリーニングするために該方法を行うためのキット、カルニチン輸送体欠乏症を治療するための医薬品の製造方法、カルニチン輸送体欠乏症の診断方法、カルニチン輸送体と反応する抗体を製造するためのタンパク質の使用、オリゴヌクレオチド、および、カルニチン輸送体欠乏症の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおけるカルニチン欠乏症は、多種多様な重度の症状を引き起こす（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｐ．Ｒ．等，１９８８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ.，１４８，１９３〜１９７）。最も重度の症状としては、なかでも心筋疾患、慢性の筋無力症および昏睡が挙げられ、これらは低血糖症または断食中のケトン体生成不全が原因であり、組織（具体的には肝臓、腎臓、心臓、筋肉および腸）でカルニチンの血清レベルが低いために起こる。
【０００３】
カルニチン欠乏症の症状は、腎臓および腸でカルニチン輸送が不足した結果と考えられてきた（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｐ．Ｒ．等，１９８８）。腎臓および腸でのカルニチン輸送系の障害により、脂肪酸の輸送と分解における障害が起こる可能性があり、それにより、多種多様な重度の症状、具体的には、進行性の筋無力症（これは、脂質代謝異常によるミオパチー（ｌｉｐｉｄｍｙｏｐａｔｈｙ）、および、低い筋肉のカルニチンレベルによって診断することができる）、および、心筋疾患、ならびに、呼吸器障害、低血圧、呼吸不全、低血糖症、肝腫大、肝不全、不整脈、意識喪失、肥大型または拡張型心筋疾患、揺りかご死、昏睡、肝機能障害、横紋筋融解症、末梢神経疾患、網膜疾患、肝障害、顔面中央部の低形成を伴う先天性の異形症、腎嚢胞、ジストニー、新生児の心筋疾患、小頭症、異形症が発症する。全身性カルニチン欠乏症は遺伝性疾患であり、その症状は、すでに新生児期や幼児期に発症することが多い。
【０００４】
これまで、遺伝性のカルニチン欠乏症のまれな常染色体劣性型に寄与するメカニズムしか知られておらず、このメカニズムにおいて、カルニチン輸送体ｈＯＣＴＮ２における突然変異は、カルニチンレベルの減少に寄与する（Ｎｅｚｕ  Ｊ．Ｉ．等，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ２１：９１〜９４）。しかしながら、ｈＯＣＴＮ２（このアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＮＰ＿００３０５１で入手可能であり、本明細書においては配列番号１２に相当する）は、腸または腎臓で組織特異的には合成されないが、人体においては遍在的に合成される。従って、食物からのカルニチン摂取を媒介する主要なメカニズム、および、腎臓のろ液からカルニチンを回収することによる腎臓におけるカルニチンのホメオスタシスは未だにわかっていない（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｐ．Ｒ．等，１９８８）。
【０００５】
加えて、ＯＣＴＮ２は、カルニチンが血管に輸送される必要があるような遠位側では検出されず、腸の内腔側と腎臓上皮でのみ検出されているため、ＯＣＴＮ２は、腸と腎臓におけるカルニチン摂取を媒介するには十分ではない（Ｌａｈｊｏｕｊｉ  Ｋ等，２００２，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５５８：８２〜９３）。興味深いことに、食事によるカルニチン投与ではなくカルニチン静脈内投与によってのみ治療が可能な、全身性カルニチン欠乏症に罹った患者に関しての報告がある（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｐ．Ｒ．等，１９８８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１４８：１９３〜１９７）。
【０００６】
従って、大部分のカルニチン欠乏症候群にとって、ｈＯＣＴＮ２欠乏症は適切なマーカーではない。
【０００７】
さらに、タンパク質ＣＴ２（このアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベース（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ），米国）において登録番号ＮＰ＿１４９１１６で入手可能であり、本明細書においては配列番号１４に相当する）は、ヒトカルニチン輸送体であるが、これは精巣でしか形成されない。従って、この欠乏症は、全身性カルニチン欠乏症の症状の原因とはなり得ない。
【０００８】
ＷＯ２００１０７７１７４は、本明細書においては配列番号１に相当するタンパク質を開示しているが、このタンパク質のカルニチン輸送体としての機能に関する情報は示されていない。ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＸＭ＿２９１１２０で入手可能であり、本明細書においては配列番号１０に相当するアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列全体、および、配列番号１のアミノ酸２９６と２９７との間に３９個のアミノ酸を含む追加の配列（配列番号１０のアミノ酸２９７〜３３５に相当）を含み、従ってこれは、配列番号１のスプライス変異体である。米国特許第５,５５９,０２１号は、本明細書の配列番号１と４７％のアミノ酸配列同一性を有するラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）を開示しているが、このタンパク質のカルニチン輸送体としての機能に関する情報は示されていない。ＡＡＷ０７６３５に相当するヒト配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＡＪ２７６２０７で見出すことができ、これは本明細書の配列番号１と４６％のアミノ酸配列同一性を有するが、これは神経伝達物質の輸送体と考えられている。ＣＮ１２８７１７０は、本明細書の配列番号１と４７％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質ＡＡＧ６４１９３を開示しているが、これは、ヒト神経物質伝達タンパク質と考えられている。ＥＰ８８１２９０は、本明細書の配列番号１と４６％のアミノ酸配列同一性を有するＡＡＷ７３３７６タンパク質、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８を開示しているが、これは、神経伝達物質の輸送体と考えられている。本明細書に包含されるマウスおよびラットのアミノ酸配列である配列番号２および配列番号３は、公開データベースで入手可能な配列の一部を形成しているが、これは、カルニチン輸送体を含むとは注釈されていないし、そのようにも考えられていない。
【０００９】
上記のことから、腸または腎臓で組織特異的に合成されたカルニチン輸送体は知られておらず、従って欠乏すると大部分のカルニチン欠乏症候群の原因となり得る酵素も知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それゆえに、関連酵素の検出は期待されてきたが、今のところ、カルニチン輸送体のレベルで大部分のカルニチン欠乏症候群を検出する診断法はない。さらに、今のところ、全身性カルニチン欠乏症を、関連する障害を起こした酵素活性のレベルで治療するための治療法もない。今のところ利用可能な治療法はカルニチン投与だけだが、これは、腸からのカルニチン摂取が減少したり、さらには失われたりもする問題が起こることが多い。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記のことを考慮して、カルニチン欠乏症を診断および治療する新規の方法を提供するする必要がある。それゆえに、本発明の目的は、カルニチン欠乏症を診断する新規の方法を提供することである。さらなる本発明の目的は、カルニチン欠乏症を治療する新しい治療法に関する。さらにその上、本発明の目的は、カルニチン欠乏症に関連する病気を診断する新規の方法、および、カルニチン欠乏症に関連する病気を治療する新しい治療法に関する。
【００１２】
本発明は、腸および腎臓で、具体的にはヒト、マウスおよびラットの腸および腎臓で組織特異的に形成されるカルニチン輸送体の有利な使用を提供する。本発明において検出されるヒトカルニチン輸送体は、アミノ酸配列の配列番号１を含み、それと高度に関連するマウスのカルニチン輸送体は、アミノ酸配列の配列番号２を含み、それと高度に関連するラットのカルニチン輸送体は、アミノ酸配列の配列番号３を含む。本発明は、具体的には、カルニチン輸送体の活性に影響を与える薬物を開発する方法、および、関連する試験キット、カルニチン欠乏症を治療する医薬品の製造方法、カルニチン輸送体に対する抗体の製造、カルニチン欠乏症の診断方法、カルニチン輸送体をコードする核酸を検出するためのオリゴヌクレオチド、および、カルニチン欠乏症を治療するための治療方法に関する。
【００１３】
本発明の第一の好ましい実施態様は、カルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関し、本方法は、（ａ）カルニチン輸送体を提供する工程、（ｂ）試験化合物を提供する工程、および、（ｃ）該カルニチン輸送体の活性を測定する工程を含む。
【００１４】
好ましくは、上記カルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法は、（ａ）カルニチン輸送体をコードする核酸分子を含む細胞、組織サンプルまたは生物を提供すること、（ｂ）前記細胞、組織サンプルまたは生物に試験化合物を提供すること、および、（ｃ）カルニチン輸送体の活性を測定することを含む。好ましくは、上記カルニチン輸送体の活性を測定することは、カルニチン輸送体をコードする核酸分子の発現を決定すること、および／または、前記細胞、組織サンプルまたは生物にカルニチン輸送体のための基質を提供すること、および、カルニチン輸送体による、前記細胞、組織サンプルまたは生物の脂質膜を通過した基質の輸送を測定することを含む。好ましくは、上記カルニチン輸送体をコードする核酸分子の発現を決定することは、上記核酸分子の転写活性を決定すること、および／または、上記カルニチン輸送体のタンパク質量を決定することを含む。
【００１５】
あるいは、上記カルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法は、好ましくは、（ａ）水性媒体を含む２つの領域を分離する脂質膜に含まれるカルニチン輸送体を提供すること、（ｂ）前記領域の少なくとも一方に試験化合物を提供すること、および、（ｃ）カルニチン輸送体の活性を測定することを含み、ここで、上記カルニチン輸送体の活性を測定することは、前記領域の少なくとも一方にカルニチン輸送体のための基質を提供すること、および、前記脂質膜を通過した基質の輸送を測定することを含む。
【００１６】
好ましくは、試験化合物は、カルニチン輸送体におけるアゴニストまたはアンタゴニスト活性について試験される。好ましくは、多数の試験化合物が、カルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングされる。好ましくは、カルニチン輸送体に適切な基質は、カルニチン、ノルアドレナリン、メチルフェニルピリジニウム、クレアチン、または、セロトニンである。
【００１７】
好ましくは、カルニチン輸送体の活性は、カルニチン輸送体による基質の輸送速度を決定することによって測定される。好ましくは、脂質膜を通過する基質の輸送速度が決定される。好ましくは、一方の領域から、他方の領域への基質の輸送速度が決定される。好ましくは、脂質膜は、実験的に設定された２つの小室を分離するか、または、封鎖されて脂質小胞の膜を形成する、もしくは生きた細胞または再生した細胞の細胞質膜を形成する。好ましくは、脂質膜は、一方の小室から他方の小室へ、または、脂質小胞の膜を通過して、または、細胞質膜を通過して基質を輸送できるような方向でカルニチン輸送体を含む。好ましくは、脂質膜を通過する基質の輸送速度を決定することは、脂質膜を通過して輸送された基質の量を測定することを含む。
【００１８】
好ましくは、カルニチン輸送体の活性における試験化合物のアゴニストまたはアンタゴニスト活性は、試験化合物の存在下でのカルニチン輸送体による基質の輸送速度を測定すること、および、その輸送速度と試験化合物の非存在下でのカルニチン輸送体による基質の輸送速度とを比較することによって決定される。好ましくは、本方法はコントロール測定を含み、この場合、カルニチン輸送体がない脂質膜を通過する基質の輸送が測定される。
【００１９】
本発明のあらゆる実施態様において、カルニチン輸送体の基質は、カルニチン輸送体によって輸送されるあらゆる基質であり、好ましくは植物または動物のカルニチン輸送体によって輸送されるあらゆる基質であり、好ましくは哺乳動物のカルニチン輸送体によって輸送されるあらゆる基質であり、好ましくはヒト、マウスまたはラットのカルニチン輸送体、具体的にはヒト、マウスまたはラットの腎臓または腸のカルニチン輸送体によって輸送されるあらゆる基質である。好ましくは、上記基質は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むカルニチン輸送体、または、配列番号４を含む核酸分子によってコードされたカルニチン輸送体、または、本発明のいずれかの実施態様で開示されたカルニチン輸送体によって輸送されるあらゆる基質である。好ましくは、上記基質は、カルニチン、ノルアドレナリン、メチルフェニルピリジニウム、クレアチンおよび／またはセロトニンである。より好ましくは、上記基質は、カルニチンである。
【００２０】
本発明の実施態様において、カルニチンは、好ましくは、Ｌ−カルニチンおよび／またはＤ−カルニチンを含み、好ましくはＬ−カルニチンを含む。好ましくは、カルニチンは、カルニチン誘導体、および／または、カルニチン類似体を含む。好ましくは、カルニチン誘導体は、カルニチン代謝産物、および、カルニチン結合体を含む。好ましくは、カルニチン代謝産物は、インビボでのＬ−カルニチンまたはＤ−カルニチンの化学的な改変によって形成された生理学的なカルニチン代謝産物を含み、例えばアセチルカルニチンである。好ましくは、カルニチン結合体は、エフェクター分子にカップリングされたＬ−カルニチン、Ｄ−カルニチンまたはカルニチン類似体を含む。好ましくは、エフェクター分子は、脂質膜を通過して、カルニチン輸送体によってカルニチンと共に輸送されると予想される化学物質である。好ましくは、エフェクター分子は薬物である。好ましくは、上記カップリングは、あらゆる化学結合であり、好ましくは共有結合、イオン結合、または、ファンデルワールス結合である。好ましくは、カルニチン類似体は、カルニチン輸送体によるカルニチンの輸送が可能な、カルニチンに類似した化学構造を有する化学物質である。
【００２１】
好ましくは、本発明のカルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法は、試験化合物を、カルニチン輸送体の活性を強化するアゴニスト作用に関して試験することを含む。代替法として、本方法は、試験化合物を、カルニチン輸送体の活性を阻害するアンタゴニスト作用に関して試験することを含む。代替法として、本発明のカルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングする方法は、多数の試験化合物のスクリーニングに適合されており、この場合、個々の試験化合物を試験するのに必要な時間は短く、好ましくは、個々の試験化合物の試験は経済的であり、さらに試薬、特に試験化合物は少量でよい。
【００２２】
本発明のカルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングする方法において試験される試験化合物は、好ましくは低分子物質であり、好ましくはタンパク質または酵素の補因子に結合するエフェクター化合物の候補物質である。好ましくは、試験化合物は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むタンパク質、または、本発明の実施態様で開示されたいずれかのカルニチン輸送体に結合することができるエフェクター化合物の候補物質である。
【００２３】
好ましくは、試験化合物は、タンパク質または酵素の補因子に結合することができるエフェクター化合物の候補物質であり、ここにおいて、前記タンパク質または酵素の補因子は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むタンパク質、または、本発明の実施態様で開示されたいずれかのカルニチン輸送体に結合するものか、または、それらに結合する化合物の候補物質である。
【００２４】
好ましくは、試験化合物は、転写因子または翻訳因子に結合することができるエフェクター化合物の候補物質であり、好ましくは、これら転写因子または翻訳因子は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むタンパク質の合成を増加させるか、もしくは減少させ、または、本発明の実施態様で開示されたいずれかのカルニチン輸送体の合成を増加させるか、もしくは減少させる。
【００２５】
好ましくは、試験化合物は、転写因子または翻訳因子の合成または活性を直接的または間接的に増加させるか、もしくは減少させることができるエフェクター化合物の候補物質であり、好ましくは、これら転写因子または翻訳因子は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むタンパク質の合成を増加させるか、もしくは減少させる、または、本発明の実施態様で開示されたいずれかのカルニチン輸送体の合成を増加させるか、もしくは減少させる。
【００２６】
好ましくは、試験化合物は、天然に存在する化合物、または、天然に存在する化合物と同一か、もしくはそれらに類似した化学合成された化合物、または、天然には存在しない化学合成されたあらゆる化合物のような化学物質のいずれかである。
【００２７】
天然に存在する化合物は、好ましくは、多細胞生物または単細胞生物中で検出することができる、または、それらから単離することができる化合物であり、具体的には、動物、植物、真菌、酵母、細菌もしくはその他のあらゆる細胞で構成される生物、または、ウイルス中で検出することができる化合物、または、それらから単離された化合物である。天然には存在しない化学合成された化合物は、好ましくは、コンビナトリアルケミストリーで合成される。好ましくは、上記化合物は、天然に存在する化合物から誘導された、好ましくはタンパク質または酵素の補因子に結合することができるエフェクター分子の候補物質から誘導されたリード構造を含む。
【００２８】
好ましくは、本発明に従って同定された、または、本発明の実施態様で用いられるカルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストはそれぞれ、個体（好ましくは健康な個体）の腎臓または腸のカルニチン輸送体の活性を強化するか、もしくは阻害する。好ましくは、カルニチン輸送体アゴニストは、カルニチン輸送体欠乏症に罹った個体のカルニチン輸送体の活性を強化する。好ましくは、カルニチン輸送体アゴニストは、カルニチン輸送体の量が減少した個体におけるカルニチン輸送体の活性を強化する。
【００２９】
好ましくは、カルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストはそれぞれ、個体中で遺伝学的なカルニチン輸送体の変異体の活性を強化または減少させる。好ましくは、カルニチン輸送体アゴニストは、カルニチン欠乏症に関連する遺伝学的なカルニチン輸送体の変異体の活性を強化する。好ましくは、カルニチン輸送体アンタゴニストは、カルニチン輸送体の活性が増加した、または、その量が増加した個体中で、カルニチン輸送体の活性、好ましくは腎臓または腸のカルニチン輸送体の活性を減少させる。好ましくは、本明細書で述べられたカルニチン輸送体の活性は、カルニチン輸送体の基質への輸送速度、カルニチン輸送体の量、および／または、カルニチン輸送体をコードする核酸分子の発現強度に関する。
【００３０】
好ましくは、本発明のカルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングする方法で提供されるカルニチン輸送体はまた、その他の本発明のあらゆる実施態様で用いることもできる。カルニチン輸送体は、好ましくは植物または動物のカルニチン輸送体、好ましくは哺乳動物のカルニチン輸送体、好ましくはヒト、マウスまたはラットのカルニチン輸送体、好ましくは腎臓または腸のカルニチン輸送体、好ましくは腸のカルニチン輸送体である。
【００３１】
好ましくは、カルニチン輸送体は、本発明のアミノ酸配列の配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む。好ましくは、カルニチン輸送体は、健康な個体の腎臓および腸で生産された、高い親和性を有するカルニチン輸送体である。好ましくは、カルニチン輸送体は、ヒト腎臓および腸の高い親和性を有するカルニチン輸送体の、アミノ酸配列の配列番号１を含む。好ましくは、カルニチン輸送体は配列番号１のアミノ酸２９６と２９７との間に３９個のアミノ酸（配列番号１０のアミノ酸２９７〜３３５に相当）を含む追加の配列を含む配列番号１の機能的なスプライス変異体であるアミノ酸配列の配列番号１０を含む。
【００３２】
好ましくは、カルニチン輸送体は、健康な動物の腎臓および腸で生産された、オーソロガスなマウスまたはラットの高い親和性を有するカルニチン輸送体である。好ましくは、カルニチン輸送体は、マウスまたはラットの腎臓および腸の高い親和性を有するカルニチン輸送体の、それぞれアミノ酸配列の配列番号２または配列番号３を含む。
【００３３】
好ましくは、カルニチン輸送体は、配列番号１、配列番号２または配列番号３に関連するアミノ酸配列を含む、関連するカルニチン輸送体である。好ましくは、カルニチン輸送体は、配列番号１に関連するアミノ酸配列を含む。好ましくは、カルニチン輸送体は、配列番号１０に関連するアミノ酸配列を含む。
【００３４】
好ましくは、上記関連するカルニチン輸送体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０の少なくとも１つに少なくとも３０％の配列同一性を有し、さらに、アミノ酸配列の配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体の少なくとも１種の基質、好ましくはカルニチン、好ましくはＬ−カルニチンに対して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％の基質輸送活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３５】
好ましくは、上記関連するカルニチン輸送体は、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
好ましくは、上記関連するカルニチン輸送体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０の少なくとも１つに少なくとも６０％の配列同一性を有し、さらに、アミノ酸配列の配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体の少なくとも１種の基質、好ましくはカルニチン、好ましくはＬ−カルニチンに対して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、または、少なくとも９０％の基質輸送活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３７】
好ましくは、カルニチン輸送体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または、配列番号１０の少なくとも１つに少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８６.５％の配列同一性を有し、さらに、アミノ酸配列の配列番号１また
は配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体の少なくとも１種の基質、好ましくはカルニチン、好ましくはＬ−カルニチンに対して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、または、少なくとも９０％の基質輸送活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３８】
好ましくは、カルニチン輸送体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０の少なくとも１つに少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９５.４％の配列同一性を有し、さらに、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、または、配列番号１０を含むカルニチン輸送体の少なくとも１種の基質、好ましくはカルニチン、好ましくはＬ−カルニチンに対して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、または、少なくとも９０％の基質輸送活性を有する。
【００３９】
好ましくは、上記カルニチン輸送体のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０に記載のアミノ酸配列とは、いわゆる保存的アミノ酸置換のために異なっており、この保存的アミノ酸置換は当業者既知であり、タンパク質の活性、従ってカルニチン輸送体の活性に影響を与えないか、影響を与えたとしてもわずかであると考えられている。好ましくは、上記カルニチン輸送体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３および／または配列番号１０とは、カルニチン輸送体の活性に影響を与えないか、影響を与えたとしてもわずかであると考えられるアミノ酸置換のために異なっており、この置換は、当業者が以下の図３で開示された配列番号１、配列番号２および配列番号３の間のアミノ酸配列アライメントを考察することによってなされる。
【００４０】
好ましくは、本発明のいずれかの実施態様で用いられるカルニチン輸送体は、腎臓および／または腸で生産されたヒトカルニチン輸送体をコードする核酸分子によってコードされている。好ましくは、上記核酸分子は、腎臓および／または腸で組織特異的に発現される。好ましくは、上記核酸分子は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０を含むヒトまたはマウスまたはラットのカルニチン輸送体をコードする。
【００４１】
好ましくは、上記核酸分子は配列番号４を含み、配列番号４は、アミノ酸配列の配列番号１を含むヒト腎臓および腸のカルニチン輸送体をコードする。好ましくは、上記核酸分子は配列番号５を含み、配列番号５は、アミノ酸配列の配列番号２を含むオーソロガスなマウスの腎臓および腸のカルニチン輸送体をコードする。好ましくは、上記核酸分子は配列番号８を含み、配列番号８は、アミノ酸配列の配列番号３を含むオーソロガスなラットの腎臓および腸のカルニチン輸送体をコードする。
【００４２】
好ましくは、上記核酸分子は配列番号９を含み、配列番号９は、アミノ酸配列の配列番号１０をコードする配列番号４の機能的なスプライス変異体である。配列番号９は、配列番号４のヌクレオチド８８７と８８８との間に挿入された１１７個のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド８８８〜１００４に相当する）を含む追加の配列を含む。
【００４３】
好ましくは、カルニチン輸送体は、ヒト腎臓および腸のカルニチン輸送体に関する、配列番号１５を含むｍＲＮＡによってコードされている。配列番号１５は、配列番号４に記載のオープンリーディングフレームと、追加の翻訳されない５’および３’フランキング配列とを含む。本発明は、アミノ酸配列の配列番号１を含むカルニチン輸送体をコードする、配列番号１５を含む完全なｍＲＮＡを初めて提供する。配列番号１５は、配列番号１をコードする配列番号４に記載のオープンリーディングフレーム、５’フランキング領域（配列番号１５のヌクレオチド１〜４５を含む）、および、３’フランキング領域（配列番号１５のヌクレオチド１９５１〜５１７５を含む）を含む。
【００４４】
好ましくは、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９または配列番号１５に類似した配列を含む核酸分子によってコードされているカルニチン輸送体を検出するために、当業者が慣例的な実験を用いて検出可能な核酸分子によって、カルニチン輸送体はコードされている。好ましくは、カルニチン輸送体は、配列番号４に類似した核酸配列によってコードされている。好ましくは、上記核酸分子は、配列番号９に類似している。好ましくは、上記核酸分子は、配列番号１５に類似している。
【００４５】
好ましくは、カルニチン輸送体をコードする核酸分子は、既知の配列を含む核酸分子を検出するための慣例的な実験によって検出可能である。好ましくは、カルニチン輸送体をコードする核酸分子は、既知の配列に類似した配列、好ましくは既知の核酸配列に関連する配列、好ましくは既知の核酸配列に相同な配列を含む核酸分子を検出するための慣例的な実験によって検出可能である。
【００４６】
好ましくは、カルニチン輸送体は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２または配列番号３をコードする核酸分子に類似した核酸配列によってコードされている。
【００４７】
好ましくは、核酸分子が、当業者が容易に認識できるような検出可能な程度の配列相同性を有する配列、好ましくは検出可能な程度の配列同一性を有する配列を含む場合、その核酸分子は、本発明のいずれかの実施態様のカルニチン輸送体をコードする核酸分子に類似している。好ましくは、核酸分子が、本発明での使用に適したカルニチン輸送体に対して、当業者が容易に認識できるような検出可能な程度の配列相同性、好ましくは、検出可能な程度の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする場合、その核酸分子は、本発明のいずれかの実施態様のカルニチン輸送体をコードする核酸分子に類似している。好ましくは、核酸分子間の配列同一性および配列相同性は、ハイブリダイゼーション実験に不当な負担を要することなく検出することができ、ここにおいて、相補的な塩基対形成は、ストリンジェントな条件下でも可能であり、または、ストリンジェントではない条件下でも可能である。
【００４８】
好ましくは、核酸分子が、配列番号４、配列番号５、配列番号８、または、配列番号９、配列番号１５を含む核酸分子またはそれらの相補配列にハイブリダイゼーションする場合、または、核酸分子が、少なくとも１８個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチドを含むそれらのフラグメントまたはそれらの相補配列にハイブリダイゼーションする場合、その核酸分子は、本発明の実施態様のカルニチン輸送体をコードする核酸分子に類似している。好ましくは、ストリンジェントではない条件が用いられ、より好ましくはストリンジェントな条件が用いられる。アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０をコードする核酸分子の類似性は、類似の方法で決定される。
【００４９】
好ましくは、本発明の実施態様に係るカルニチン輸送体をコードする核酸分子の検出は、当業者が配列番号１５の５’フランキング領域または配列番号１５の３’フランキング領域、好ましくは配列番号１５の３’フランキング領域の検出を利用することによって可能である。好ましくは、配列番号１５の３’領域のフラグメントが用いられ、好ましくは少なくとも１８個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチドを含む上記フラグメントが用いられる。好ましくは、ストリンジェントではない条件が用いられ、より好ましくはストリンジェントな条件が用いられる。好ましくは、この検出は、ハイブリダイゼーション分析またはＰＣＲ解析を含み、これらはいずれも、周知の相補的な塩基対形成の概念に基づいている。
【００５０】
ハイブリダイゼーションのストリンジェントではない条件とストリンジェントな条件は当業者既知である。好ましくは、ストリンジェントではない条件は、３×ＳＳＣ、０.５％ナトリウムＮ−ラウリルサルコシン、および、６０℃で構成される。好ましくは、ストリンジェントな条件は、１×ＳＳＣ、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および、６５℃で構成される。好ましくは、２０×ＳＳＣは、３ＭのＮａＣｌ、０.３Ｍのトリクエン酸ナトリウムを含む（ｐＨ７.０）。
【００５１】
脂質膜に含まれるカルニチン輸送体を提供することを含む本発明のカルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングする方法において、カルニチン輸送体は、好ましくは細胞膜に含まれ、好ましくはミトコンドリア内膜または細胞質膜に含まれる。適切な膜脂質は、細胞膜の天然に存在する膜脂質、および／または、自然界では発見されていないが化学者には既知の膜を形成する脂質のいずれかである。
【００５２】
好ましくは、脂質膜は、カルニチン輸送体を含むことができる膜を形成する脂質を含む。このような脂質は当業者既知である。好ましくは、リポソームを形成するためにこのような脂質を用いてもよい。好ましくは、このような脂質は、細胞膜、好ましくは細胞質膜またはミトコンドリア内膜の成分であるか、または、それらから誘導される。好ましくは、このような脂質は、生体膜の脂質と同一であるか、または、生体膜の脂質と類似した化学構造を有しており、水性媒体中で２つの親水性の表面を有する脂質二重層または脂質単分子層を形成することができる。
【００５３】
好ましくは、カルニチン輸送体を含む脂質膜は、水性媒体を含む２つの領域を分離する。好ましくは、この２つの領域は、実験的な設定を構成する２つの緩衝液の槽である。
【００５４】
好ましくは、カルニチン輸送体を含む脂質膜は、再構成された細胞膜を含む。この再構成された細胞膜は、好ましくは生きた細胞から誘導される。再構成された細胞膜を形成する方法は当業者既知である。
【００５５】
好ましくは、カルニチン輸送体は、脂質の小胞膜に含まれる。好ましくは、脂質小胞は、リポソーム、または、閉鎖された再構成された細胞膜を含む。このようなリポソームまたは再構成された細胞膜は適切なあらゆる方法によって形成される。好ましくは、リポソームまたは再構成された膜小胞は、少なくとも一種の膜脂質とカルニチン輸送体とを含む混合物を超音波に晒すこと、または、この混合物を小さい直径の出口（具体的には注射器）を通過させて緩衝溶液に出すことによって形成される。好ましくは、再構成された細胞は、生きた細胞を開口させること、カルニチン輸送体を提供すること、および、細胞質膜を再び封じることによって製造される。細胞を開口させて再び封じる際に、細胞質の成分が失われる可能性もあるし、また失われない場合もあり、その結果に応じて、再構成されたカルニチン輸送体を含む細胞質膜は、生きた細胞に属するか、またはいわゆる膜ゴーストになり得る。
【００５６】
好ましい実施態様において、カルニチン輸送体は、試験細胞の細胞質膜に含まれる。好ましくは、試験細胞は、カルニチン輸送体、好ましくは植物または動物のカルニチン輸送体、好ましくは哺乳動物、好ましくはマウスまたはラットのカルニチン輸送体、好ましくはヒトカルニチン輸送体、好ましくは腎臓または腸のカルニチン輸送体、好ましくはヒト、マウスまたはラットの腎臓または腸のカルニチン輸送体をコードする核酸分子を発現する。
【００５７】
好ましくは、試験細胞は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）を含むカルニチン輸送体をコードする核酸分子を発現し、好ましくは、試験細胞は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１をコードする核酸を発現する。好ましくは、試験細胞は、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、または、配列番号１５、好ましくは配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含む核酸分子を発現する。好ましくは、試験細胞は、転写活性化因子の配列に機能するように連結した前記核酸分子、好ましくは転写活性化因子の配列に機能するように連結した配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５のいずれかを含む。好ましくは、試験細胞は、配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５に相当する配列を含む翻訳可能なＲＮＡ分子を含む。好ましくは、試験細胞は、配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５に相当する配列を含むマイクロインジェクションされたｃＲＮＡ分子を含む。
【００５８】
好ましくは、試験細胞は、細胞質膜中に、機能的なカルニチン輸送体を含む。好ましくは、カルニチン輸送体は、カルニチン、ノルアドレナリン、メチルフェニルピリジニウム、クレアチンおよび／またはセロトニンから選択される基質を、細胞質膜を通過させて輸送する。好ましくは、カルニチン輸送体は、試験細胞に基質を輸送する。好ましくは、試験細胞は、細菌細胞または真核細胞であり、具体的には酵母細胞である。好ましくは、試験細胞は、初代細胞系または永久細胞系に属する。好ましくは、試験細胞は、アフリカツメガエル卵母細胞である。好ましくは、アフリカツメガエル卵母細胞は、配列番号４、配列番号９または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含む注入されたｃＲＮＡを含む。
【００５９】
好ましくは、カルニチン輸送体を検出することができる基質が用いられる。好ましくは、検出可能な基質は、試験細胞の内部でそれらを検出することができる。好ましくは、検出可能な基質は、試験細胞の内部に蓄積した検出可能な基質が少量でも定量が可能である。
【００６０】
好ましくは、試験化合物をカルニチン輸送体のアゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングする本発明の方法は、カルニチン輸送体によって、脂質膜を通過して、具体的には細胞質膜を通過して試験細胞に輸送される検出可能な基質の量を測定することを含み、ここにおいて脂質膜を通過して輸送された基質の量が、カルニチン輸送体の活性の指標である。
【００６１】
好ましくは、検出可能なカルニチン輸送体の基質は、放射性標識した基質、ストレプトアビジン標識した基質もしくはビオチン化基質、または、抗体と反応する基質である。
【００６２】
好ましくは、カルニチン輸送体にアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するかどうかに関してスクリーニングされる試験化合物は、化学物質ライブラリーの形態で提供される。本発明に係る用語「化学物質  ライブラリー」は、化学合成された分子および天然産物などの複数の源のいずれかから構築された、または、コンビナトリアルケミストリー技術で生成した複数種の化学物質を意味する。
【００６３】
好ましくは、カルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングする本発明の方法は自動化されており、好ましくはロボットシステムで行われる。
【００６４】
本発明の第二の好ましい実施態様は、本発明の脂質膜を含むカルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングする方法を行うためのキットに関し、本キットは、カルニチン輸送体を含む脂質膜、および、カルニチン輸送体を検出可能な基質を含む。好ましくは、本発明のキットは、試験化合物群、具体的には化学物質ライブラリー群に含まれる試験化合物のスクリーニングを可能にする。
【００６５】
好ましくは、本発明のキットに提供されるカルニチン輸送体は、ヒト、マウスまたはラットのカルニチン輸送体である。好ましくは、カルニチン輸送体は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）を含み、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含む。好ましくは、カルニチン輸送体は、配列番号４、配列番号５、配列番号９、配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含む核酸分子、または、前記タンパク質の少なくとも１種をコードする核酸によってコードされている。好ましくは、上記脂質膜は、実験的に設定された２つの領域、具体的には２つの緩衝液の槽を分離しているか、または、封鎖されて脂質小胞を形成するか、または、生きた細胞もしくは再構成された細胞の細胞質膜を形成する。好ましくは、カルニチン輸送体は、脂質の小胞膜に含まれる。好ましくは、カルニチン輸送体は、試験細胞の細胞質膜に含まれる。
【００６６】
好ましくは、本発明のキットは、カルニチン輸送体を検出することができる基質、具体的には、放射性標識した基質、ストレプトアビジン標識した基質もしくはビオチン化基質、または、抗体を用いて検出可能な基質を含む。好ましくは、本キットは基質と反応する抗体を含む。好ましくは、基質は、カルニチン、ノルアドレナリン、メチルフェニルピリジニウム、クレアチンおよび／またはセロトニンである。好ましくは、基質はカルニチンである。
【００６７】
本発明のあらゆる実施態様において、「抗体」という記載は、提示されたそれらの抗原との反応性を有するあらゆるモノクローナル抗体、抗血清、具体的には多価抗血清、抗血清分画、抗体フラグメント、組換えによって生産された抗体もしくは抗体フラグメントを含む。
【００６８】
好ましくは、本発明のキットは、本発明のカルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法のいずれかの成分または特徴を含む。
【００６９】
本発明の第三の好ましい実施態様は、カルニチン輸送体欠乏症を治療するための医薬品の製造方法に関し、本方法は、（ａ）本発明のカルニチン輸送体のアゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングする方法を用いて、カルニチン輸送体のアゴニストを同定する工程、（ｂ）十分な量の該アゴニストを提供する工程、および、（ｃ）１種またはそれ以上の製薬上許容できるキャリアーまたは補助剤と共に、該アゴニストを製剤化する工程、を含む。
【００７０】
好ましくは、本方法は、腎臓または腸のカルニチン輸送体の、カルニチン輸送体欠乏症を治療するための医薬品の製造に関する。好ましくは、本方法は、全身性カルニチン欠乏症を治療するための医薬品の製造に関する。
【００７１】
好ましくは、本方法は、カルニチン、ノルアドレナリン、メチルフェニルピリジニウム、クレアチンおよび／またはセロトニン輸送の欠乏症を治療するための医薬品の製造に関する。好ましくは、本方法は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含む本発明のヒトまたは動物のカルニチン輸送体、または、配列番号４、配列番号５、配列番号９、配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含む核酸分子、または、前記タンパク質の少なくとも１種をコードする核酸によってコードされた、本発明のヒトまたは動物のカルニチン輸送体によって輸送される基質の欠乏症のいずれかを治療するための医薬品の製造に関する。好ましくは、本方法は、不当な実験的な負担を要することなく本明細書で開示されたようにして検出可能な、または、本明細書での開示に基づき当業者によって検出可能な、本発明のカルニチン輸送体に類似したアミノ酸配列を有するあらゆるカルニチン輸送体によって輸送される基質の欠乏症のいずれかを治療するための医薬品の製造に関する。
【００７２】
好ましくは、本発明のカルニチン輸送体アゴニストに関してスクリーニングする方法のいずれの形態も、本発明のカルニチン輸送体欠乏症を治療するための医薬品の製造方法のカルニチン輸送体のアゴニストを同定する工程に関与する。
【００７３】
上記医薬品の製造方法において、アゴニストの十分な量とは、好ましくは治療上有効な量であり、好ましくは上記医薬品投与の単位用量における治療上有効な量である。好ましくは、治療上有効な量とは、患者において機能的なカルニチン輸送体の量が減少することによって引き起こされる、または、患者において活性が減少したカルニチン輸送体の変異体によって引き起こされるカルニチン輸送体欠乏症を治療するのに治療上十分な量である。
【００７４】
特定の患者における具体的な治療上有効な用量レベルは、同定されたカルニチン輸送体アゴニストの活性、投薬形態、患者の年齢、体重および性別、治療期間などの多種多様な要因、さらには医療分野で周知の同様の要因に依存すると予想される。好ましくは、単位用量は、成人、子供、幼児、新生児を治療するのに治療上十分な量、または、妊娠中の胎児を治療するのに治療上十分な量である。
【００７５】
ヒトまたはその他の哺乳動物に１回または複数回の用量で投与される本発明のカルニチン輸送体アゴニストの総１日用量は、例えば約０.０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、または、より好ましくは約０.１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の量が可能である。単回投与の組成は、このような量、または、合計で１日用量になるようにそれらを分割した量を含んでいてもよい。一般的に、本発明に係る治療計画は、このような治療が必要な患者へ、１日あたり１回または複数回の用量で、本発明のカルニチン輸送体アゴニストの約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇを投与することを含む。
【００７６】
好ましくは、上記医薬品を製造するために１種より多くのカルニチン輸送体アゴニストの組み合わせが用いられる。さらに好ましくは、上記医薬品は追加のカルニチンを含む。好ましくは、医薬品の単位用量に含まれるカルニチンの量は、医薬品の単位用量に含まれるカルニチン輸送体アゴニストによって媒介されるカルニチン輸送体の活性に合わせて調節される。
【００７７】
上記医薬品を製造するために、本発明のカルニチン輸送体アゴニストは、好ましくは、投与形態に応じて、１種またはそれ以上の製薬上許容できる添加剤または補助剤、例えば生理学的な緩衝溶液、例えば塩化ナトリウム溶液、脱塩水、安定剤、例えばプロテアーゼもしくはヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはアプロチニン、ε−アミノカプロン酸もしくはペプスタチンＡ、または、金属イオン封鎖剤、例えばＥＤＴＡ、ゲル化剤、例えば白色ワセリン、低粘度パラフィンおよび／または黄色ワックスなどを用いて製剤化される。
【００７８】
適切なさらなる添加剤は、例えば、界面活性剤、例えばトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、または、デオキシコール酸ナトリウム、加えてポリオール、例えばポリエチレングリコールもしくはグリセロール、糖類、例えばスクロースもしくはグルコース、両性イオン性化合物、例えばアミノ酸、例えばグリシン、または、具体的にはタウリンもしくはベタイン、および／または、タンパク質、例えばウシもしくはヒト血清アルブミンである。好ましくは、界面活性剤、ポリオール、および／または、両性イオン性化合物である。
【００７９】
好ましくは、生理学的な緩衝溶液のｐＨは、約６.０〜８.０であり、具体的には約６.８〜７.８、具体的には約７.４であり、および／または、浸透圧モルの濃度は、約２００〜４００ミリオスモル／リットル、好ましくは約２９０〜３１０ミリオスモル／リットルである。本医薬組成物のｐＨは、一般的に、適切な有機または無機緩衝液を用いて調節され、このような緩衝液としては、例えば、好ましくはリン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］メタンスルホン酸）、または、ＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）が用いられる。それぞれの緩衝液の選択は、一般的に、望ましい緩衝液のモル濃度に依存する。例えば注射および輸液には、リン酸緩衝液が適切である。
【００８０】
本医薬組成物は、従来の方式で投与することができ、例えば、本発明に係る医薬組成物を含む経口の投薬形態（例えば錠剤もしくはカプセル）で、粘膜（例えば鼻または口腔）を介して皮下埋め込み型の製剤（ｄｉｓｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）の形態で、注射、輸液またはゲルの形態で投与することができる。本医薬組成物はさらに、場合によりリポソーム複合体の形態で、局所投与および局部投与することもできる。その上、上記治療は、経皮吸収型製剤（ＴＴＳ）の形態で行うこともでき、これは、本医薬組成物の一時的な制御放出を可能にする。ＴＴＳは、例えばＥＰ０９４４３９８Ａ１、ＥＰ０９１６３３６Ａ１、ＥＰ０８８９７２３Ａ１またはＥＰ０８５２４９３Ａ１より調べることができる。
【００８１】
比較的少量（例えば約１〜約２０ｍｌ）の溶液または懸濁液のみを体に投与する予定の場合、一般的には注射液が用いられる。より大量の溶液または懸濁液（例えば１リットルを超える量）を投与する予定の場合、一般的には輸液が用いられる。輸液に対して、注射液の場合はほんの数ミリリットルしか投与されないため、注射の際のｐＨや血液または組織液の浸透圧のわずかな差そのものは重要ではなく、また、痛覚に関してはほんのわずかに影響を及ぼす程度である。それゆえに、本発明に係る配合物の使用前の希釈は通常必要ではない。しかしながら、比較的大量を投与する場合、本発明に係る配合物は、投与直前に、少なくともほぼ等張の溶液が得られるような程度に希釈すべきである。等張溶液の例は、０.９％濃度の塩化ナトリウム溶液である。輸液の場合、投与しながら、例えばいわゆるバイパスを介して滅菌水などを用いて希釈することができる。
【００８２】
本医薬組成物は、経口、経鼻、直腸、非経口、膣内、局所または膣内投与用に製造することができる。非経口投与としては、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、または、腹膜内投与が挙げられる。
【００８３】
加えて、本発明はまた、本発明のカルニチン輸送体のアゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングする方法を用いて同定可能なカルニチン輸送体のアゴニストおよびアンタゴニストに関する。
【００８４】
本発明の第四の好ましい実施態様は、動物、好ましくは人間の患者のカルニチン輸送体欠乏症の診断方法に関する。好ましくは、本方法は、動物または人間の患者から採取された組織サンプル中の、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）を含む、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号１０、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体の量を決定することを含む。
【００８５】
好ましくは、上記診断方法で、カルニチン輸送体と反応する抗体が用いられる。好ましくは、本発明の抗体が用いられる。好ましくは、上記抗体と反応するタンパク質の非存在または存在が決定され、それが組織サンプル中のカルニチン輸送体の非存在または存在の指標となる。
【００８６】
好ましい実施態様において、カルニチン輸送体欠乏症に関連する前記カルニチン輸送体の変異体と反応する抗体が用いられる。本発明の、抗体を用いてカルニチン輸送体またはそれらの変異体の量を決定する診断方法は、当業界のあらゆる免疫学的な方法、または、将来的に利用可能になると予想されるあらゆる免疫学的な方法を含み、ここにおいて抗体は、その抗原の量を決定するために用いられる。
【００８７】
好ましくは、本発明は、組織サンプル中のカルニチン輸送体またはその変異体の非存在または存在を決定するための、当業界既知のＥＬＩＳＡ分析の使用に関する。好ましくは、ＥＬＩＳＡ分析は、患者から採取された組織サンプル中の、健康な個体と比較した相対的なカルニチン輸送体の量を決定するのに用いられる。好ましくは、本発明は、当業界既知のウェスタン解析の使用に関し、ここにおいて、組織サンプル中のカルニチン輸送体またはその変異体の量、加えてそれらの大きさを決定することができる。
【００８８】
好ましい実施態様において、本診断方法はインビトロでの診断方法であって、このインビトロでの診断方法は、本発明の診断方法を行う前に動物または人間の患者から採取された組織サンプルを用いて実施される。
【００８９】
さらなる好ましい実施態様において、本診断方法は追加の初期工程を含み、この初期工程において、組織サンプルは動物または人間の患者から採取される。好ましくは、本診断方法は、動物または人間の患者の体内で実施される工程を少なくとも１つ含む。
【００９０】
本発明の第五の好ましい実施態様は、それぞれアミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）を含む、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体と反応する抗体を製造するための、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）を含む、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１もしくはそれらのフラグメントを含むタンパク質の使用に関する。好ましくは、カルニチン輸送体欠乏症に関連するカルニチン輸送体の変異体が用いられる。
【００９１】
本発明の抗体の製造は、当業界において利用可能な、または、将来的に利用可能になると予想される抗体を製造するためのあらゆる方法に関する。本発明の抗体の製造は、本明細書で述べられた「抗体」という表現のいずれかの意味に関連する。
【００９２】
好ましくは、上記抗体を製造するためには、動物または人間の患者におけるカルニチン欠乏症に関連するカルニチン輸送体の変異体が用いられる。カルニチン欠乏症に関連するカルニチン輸送体の変異体は、カルニチン欠乏症、好ましくは全身性カルニチン欠乏症に罹った動物、または好ましくは人間の患者の組織サンプルに含まれる好ましくはカルニチン輸送体である。カルニチン輸送体の変異体は、好ましくは、腎臓または腸からの組織サンプルに含まれる。
【００９３】
本発明の第六の好ましい実施態様は、カルニチン輸送体欠乏症に関連するカルニチン輸送体の変異体を決定する方法に関し、本方法は、（ａ）前記カルニチン輸送体欠乏症に関連する、配列番号１、配列番号２または配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）の変異体、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１の変異体をコードする核酸配列を決定する工程、および、（ｂ）前記カルニチン輸送体の変異体のアミノ酸配列を推測する工程、を含む。
【００９４】
好ましくは、上記核酸配列は、上記カルニチン輸送体の変異体を含む動物組織サンプルまたはヒト組織サンプルを用いて決定される。好ましくは、上記組織サンプルに含まれる核酸分子の核酸配列が決定される。好ましくは、上記核酸配列は、配列番号４、配列番号５、配列番号８または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５に相当するか、または、アミノ酸配列  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）を含む、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体の変異体をコードする。
【００９５】
好ましくは、上記核酸配列の決定は、当業界の核酸配列を決定する方法のいずれかを用いて、具体的には、ＤＮＡ配列解析プロトコール、または、将来的に利用可能になると予想されるあらゆる核酸配列決定方法を用いて実施される。
【００９６】
好ましくは、カルニチン輸送体の変異体をコードする核酸配列から、カルニチン輸送体の変異体のアミノ酸配列を推測することは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム中で個々のアミノ酸をヌクレオチド塩基のトリプレットのいずれかに割り当てた、当業界既知の一義的ないわゆる遺伝子コードを用いて実施される。
【００９７】
本発明の第七の好ましい実施態様は、カルニチン輸送体欠乏症の診断方法に関し、本方法は、組織サンプル中の、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）を含む、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体をコードする核酸分子の量を決定する工程を含む。好ましくは、配列番号４、配列番号５、配列番号８または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含む核酸の量を決定する。
【００９８】
好ましくは、ＤＮＡ分子の量を決定する。好ましくは、ＲＮＡ分子の量を決定する。好ましくは、配列番号４、配列番号５、配列番号８または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含むＤＮＡ分子の量、または、それに対応するＲＮＡ分子の量を決定する。好ましくは、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１をコードするＤＮＡ分子の量、または、それに対応するＲＮＡ分子の量を決定する。
【００９９】
好ましくは、本診断方法は、既知の配列を含む、または、既知の核酸配列に検出可能な類似性を有する核酸分子の量を決定するための、当業界既知の、または、将来的に利用可能なになると予想されるあらゆる方法の使用を含む。好ましくは、本診断方法は、カルニチン輸送体をコードする核酸分子と、本発明の相補的な核酸プローブとの間の相補的な塩基対を形成する工程を含む。
【０１００】
好ましくは、本発明の核酸プローブは、カルニチン輸送体をコードする核酸分子の相補配列を含む核酸分子を含む。好ましくは、核酸プローブは、配列番号４、配列番号５、配列番号８または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５の相補配列を含む。好ましくは、核酸プローブは、ストリンジェントではない条件下で、好ましくはストリンジェントな条件下で、カルニチン輸送体をコードする核酸分子にハイブリダイゼーションする。好ましくは、核酸プローブは、少なくとも１８個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む。
【０１０１】
好ましくは、本発明の核酸プローブは、カルニチン輸送体欠乏症に関連するカルニチン輸送体の変異体をコードする核酸分子の変異体にハイブリダイゼーションする。好ましくは、この核酸分子の変異体は、配列番号４、配列番号５、配列番号８または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５の変異体を含む。
【０１０２】
好ましくは、相補的な塩基対形成は、カルニチン輸送体をコードする核酸分子と、相補配列を含む核酸プローブとの間での塩基対形成を意味するだけでなく、核酸分子の変異体と、核酸プローブとの間の塩基対形成も意味し、ここにおいてこの核酸プローブは、核酸分子の変異体に部分的に相補的であればよい。好ましくは、相補的な塩基対形成は、健康な個体のカルニチン輸送体をコードする核酸分子との検出可能な類似性を利用して、カルニチン輸送体の変異体をコードするあらゆる核酸分子を検出することを可能にする。
【０１０３】
好ましくは、核酸分子、または、核酸分子によってコードされたカルニチン輸送体、または、それらのあらゆる変異体、具体的にはカルニチン輸送体欠乏症に関連するあらゆる変異体、または、それらのあらゆるオーソロガスな、または相同な変異体に関する本発明のあらゆる実施態様もまた、類似の配列、具体的には本明細書で説明されているような類似の配列を含む核酸分子に関する。好ましくは、類似の配列は、相補的な塩基対を形成してハイブリダイゼーションする。好ましくは、類似の配列は、ストリンジェントではない条件下で、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする。
【０１０４】
好ましくは、本診断方法は、核酸分子に関する分野のハイブリダイゼーション方法、具体的には、組織サンプル中でカルニチン輸送体をコードするＤＮＡ分子を検出する分野のサザンハイブリダイゼーション方法、または、組織サンプル中でカルニチン輸送体をコードするＲＮＡ分子を検出する分野のノーザンハイブリダイゼーション方法を含む。好ましくは、組織サンプル中で上記ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子とハイブリダイゼーションする本発明の核酸プローブは、ＤＮＡチップの成分である。好ましくは、本診断方法は、組織サンプルからＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を抽出する工程を含み、この工程は、本発明の核酸プローブとのハイブリダイゼーションの前に実施される。
【０１０５】
好ましくは、本診断方法は、組織サンプルに含まれるカルニチン輸送体をコードする核酸分子を増幅する工程を含む。好ましくは、本方法は、核酸分子を増幅する分野で既知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。好ましくは、組織サンプル中に含まれるＤＮＡ分子が増幅される。あるいは、組織サンプル中に含まれるＲＮＡ分子は、追加のまずＲＮＡ分子をＤＮＡ分子に逆転写する追加的な初期工程の後に増幅される。
【０１０６】
本発明の第八の好ましい実施態様は、配列番号６を含む、または、配列番号７の相補配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。有利には、本発明のオリゴヌクレオチドによって、腎臓および腸の高い親和性を有するヒトカルニチン輸送体に関する遺伝子を単離することが可能である。
【０１０７】
好ましくは、配列番号６または配列番号７の相補配列を含むオリゴヌクレオチドは、本発明のカルニチン輸送体欠乏症の診断方法で用いられる。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして用いられる。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡアレイの成分として用いられる。
【０１０８】
本発明の第九の好ましい実施態様は、カルニチン輸送体欠乏症に関連するカルニチン輸送体の変異体をコードする核酸分子の変異体を決定する方法に関し、、本方法は、（ａ）本発明の第七の好ましい実施態様に記載のカルニチン輸送体欠乏症の診断方法を用いて、組織サンプルからカルニチン輸送体の変異体をコードする核酸分子を単離する工程、および、（ｂ）前記核酸分子の核酸配列を決定する工程を含む。
【０１０９】
本発明の第十の好ましい実施態様は、カルニチン輸送体欠乏症の治療方法に関し、本方法は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）を含む、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体をコードする核酸分子を細胞に導入することを含む。好ましくは、配列番号４、配列番号５、配列番号８または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含むＤＮＡ分子が細胞に導入される。好ましくは、前記ＤＮＡ配列は、配列番号４、配列番号５、配列番号８または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５に機能するように連結した転写プロモーター配列を含む。
【０１１０】
本発明の第十一の好ましい実施態様は、カルニチン輸送体欠乏症の治療方法に関し、本方法は、細胞中で、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）を含む、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むカルニチン輸送体をコードする核酸分子の転写活性を強化することを含む。好ましくは、配列番号４、配列番号５、配列番号８または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含む細胞性遺伝子の転写活性が強化される。
【０１１１】
本発明のカルニチン輸送体欠乏症の治療方法において、核酸分子が導入される、または、カルニチン輸送体をコードする核酸分子の転写活性が強化される上記細胞は、好ましくは、腎細胞、腸細胞、腸細胞、肝細胞、心臓細胞および／または筋肉細胞である。
【０１１２】
好ましくは、本発明のカルニチン輸送体欠乏症の治療方法は、カルニチン、ノルアドレナリン、メチルフェニルピリジニウム、クレアチンおよび／またはセロトニン輸送の欠乏症の治療、または、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５（ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）を含む、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１を含むタンパク質と親和性を有するあらゆる基質の欠乏症の治療に関する。好ましくは、この治療方法は、全身性カルニチン欠乏症の治療に関する。
【０１１３】
好ましくは、本発明のカルニチン輸送体欠乏症の治療方法はインビトロでの方法であり、ここにおいて、細胞はインビトロで処理される。好ましくは、この細胞は、本発明の治療方法の工程の前に患者からから単離される。
【０１１４】
本発明の治療方法のさらなる好ましい実施態様は、配列番号１に記載の、配列番号２、配列番号３、配列番号１０、ラットのタンパク質ＡＡＷ０７６３５  （ｒＢ２１ａ）（登録番号ＡＪ２７６２０７で入手可能）、タンパク質ＡＡＧ６４１９３（ＣＮ１２８７１７０で開示された）、または、タンパク質ＡＡＷ７３３７６、すなわちヒトＨＰＤＤＶ７８（ＥＰ８８１２９０で開示された）に記載の、好ましくは配列番号１または配列番号１０、好ましくは配列番号１に記載のカルニチン輸送体をコードする核酸分子を、人体、好ましくは腎臓または腸に含まれる細胞に導入することに関する。その代わりに、細胞はまずインビトロで操作され、その後人体に移される。
【０１１５】
好ましくは、本発明の治療方法で用いられる細胞は、腎臓または腸、特に腸から採取される。
【０１１６】
配列番号４、配列番号５、配列番号８または配列番号１５、好ましくは配列番号４または配列番号１５を含む核酸分子は、本発明のスクリーニング方法の試験細胞、または、本発明の治療方法で用いられるヒト細胞に、裸の形態で、遺伝子移入ベクターの形態で、または、リポソーム、または、金粒子と複合体化した形態で導入することができる。
【０１１７】
遺伝子移入ベクターの例は、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター、または、レトロウイルスベクターである（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ等（１９９７），Ｍｏｌ．Ｍｅｄ.，３，４６６〜７６；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ等（１９８８）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ.，２，５４９〜５８）。通常、リポソームとの複合体は、特に皮膚細胞の極めて高効率のトランスフェクションを達成する（ＡｌｅｘａｎｄｅｒおよびＡｋｈｕｒｓｔ，１９９５，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：２２７９〜８５）。リポフェクションにおいて、カチオン脂質で構成される小さい単層の小胞は、リポソーム懸濁液を超音波処理することによって製造される。上記ＤＮＡは、正電荷が残存し、かつ全てのプラスミドＤＮＡがリポソームと複合体化するような比率でリポソーム表面でイオン結合している。これまで、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．等（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８４，７４１３〜７４１４によって用いられたＤＯＴＭＡ（１,２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウム臭化物）、および、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）の脂質混合物に加えて、多数の脂質配合物が合成され、それらの多種多様な細胞系をトランスフェクトする効率について試験されている（Ｂｅｈｒ等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，６９８２〜６９８６；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ（１９９１），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１８９，１９５〜２０３；Ｆｅｌｇｎｅｒ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５５０〜２５６１）。脂質配合物の例は、ＤＯＴＡＰ  Ｎ−［１−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル硫酸塩、または、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。
【０１１８】
核酸の細胞への移動を強化する補助剤としては、例えば、核酸を細胞の細胞核に輸送することができる、ＤＮＡに結合したタンパク質もしくはペプチド、または、合成ペプチド-ＤＮＡ分子が挙げられる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ等（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：２８２；Ｂｒａｎｄeｎ等（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ.，１７，７８４）。補助剤としてはまた、核酸を細胞の細胞質に放出させることができる分子も挙げられる（Ｐｌａｎｃｋ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.，２６９，１２９１８；Ｋｉｃｈｌｅｒ等（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ.，８，２１３）、または、例えばリポソーム（上記のＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ（１９９０））。
【０１１９】
その他の特に適した形態は、上述の核酸を金粒子に付着させ、これらの粒子を「ジーンガン」と呼ばれる方法を用いて組織または細胞に発射することによってことができる（Ｗａｎｇ等（１９９９）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：７７５〜８１，Ｔｕｔｉｎｇ等（１９９８）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１：１８３〜８）。
【０１２０】
以下の図、配列および実施例で、本発明の好ましい実施態様のいくつかを図１および２ならびに実施例を参照しながらより詳細に説明する。ただし、本発明を好ましい実施態様の詳細で限定することは目的としない。一方で、本発明は、本明細書に記載の実施態様には詳細が明白に説明されていないが、当業者が不当な負担を要することなく見出すことができるあらゆる実施態様に関する。
【０１２１】
図面の説明：
図１は、異なる基質を用いた本発明の方法に関与するカルニチン輸送体の活性を説明するヒストグラムを示す。図１は、基質としてＬ−カルニチン（カラム１）、ノルアドレナリン（カラム２）、メチルフェニルピリジニウム（カラム３）、および、セロトニン（カラム４）を用いた、アミノ酸配列の配列番号１を含むカルニチン輸送体の活性決定の例を示す。図１において、左のカラム（１）〜（４）は、カルニチン輸送体のそれぞれの基質に関する輸送速度（ｐｍｏｌ×時間-1×卵母細胞-1）を示す。右のカラム（１）〜（４）は、カルニチン輸送体を含まない適切なコントロールの輸送速度を示す。
【０１２２】
図１でアミノ酸配列の配列番号１を含むカルニチン輸送体に関して示されたように、アミノ酸配列の配列番号２または配列番号３を含むカルニチン輸送体も同等の活性を有する。配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むカルニチン輸送体は、さらにクレアチンを輸送する。
【０１２３】
図１は、配列番号４を含むｃＲＮＡと、放射性標識した基質のＬ−カルニチン（カラム１）、ノルアドレナリン（カラム２）、メチルフェニルピリジニウム（カラム３）およびセロトニン（カラム４）とが注射されたアフリカツメガエル卵母細胞を用いて得られた結果を示す。コントロール（各カラムの右半分に示される）は、ｃＲＮＡの代わりに水が注射されたアフリカツメガエルを用いて、各基質に関して行われたコントロール実験を含む。
【０１２４】
図２は、本発明の方法に関与するカルニチン輸送体の速度論を説明する図表を示す。図２は、基質としてＬ−カルニチンを用いたアミノ酸配列の配列番号１を含むカルニチン輸送体の速度論決定の例を示す。このカルニチン輸送体は、基質としてノルアドレナリン、メチルフェニルピリジニウム、セロトニン、および、クレアチン用いた場合と同等の速度論を示す。アミノ酸配列の配列番号２または配列番号３を含むカルニチン輸送体は、図２と同等の速度論を示す。図２において、グラフのｘ軸は、カルニチン濃度（μｍｏｌ×リットル-1）を示し、ｙ軸は、カルニチン輸送体の輸送速度（ｐｍｏｌ×時間-1×卵母細胞-1）を示す。
【０１２５】
図２で示されるように、カルニチン輸送体によるＬ−カルニチン輸送の濃度依存性の決定は、ミカエリス−メンテンの速度論で適合可能なカルニチン輸送の飽和を示す。図２で説明されている実施例において、１５μＭのＫM値が得られた。従って、本発明の方法で用いられるカルニチン輸送体、具体的にはアミノ酸配列の配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む、または、配列番号４によってコードされたカルニチン輸送体は、高い親和性を有するカルニチン輸送体であり、これは、腎臓および腸におけるカルニチン輸送について説明されている通りである（Ｌａｈｊｏｕｊｉ  Ｋ，Ｍａｌｏ  Ｃ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＧＡ，Ｑｕｒｅｓｈｉ  ＩＡ，２００２，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１５５８，８２〜９３）。
【０１２６】
図３は、それぞれ配列番号２、配列番号３および配列番号１を含む高度に関連するマウス、ラットおよびヒト腎臓および腸のカルニチン輸送体を含むアミノ酸配列アライメントを示し、これらはそれぞれ、６３４個のアミノ酸を含む。図３では、上記関連するタンパク質におけるいわゆる保存領域の観察とより可変性の高い領域の観察を可能にするために、個々のカルニチン輸送体のそれぞれ対応するアミノ酸位置が互いに上下に配置されており、いずれか１つの配列の所定位置で生じたアミノ酸置換、または、３つ全ての配列で生じたアミノ酸置換を標識してある。
【０１２７】
図３の配列同一性から、３つ全てのタンパク質が密接に関連しているが、マウスとラットのタンパク質が、ヒトカルニチン輸送体に対するより更に互いに密接に関連しているということを容易に知ることができる。さらに図３から、当業者であれば、不当な負担を要することなく、示された配列の関連は配列同一性より強く、配列中のそれぞれ対応する位置にいわゆる保存されたアミノ酸置換を含むことがわかる。当業界周知であるように、保存されたアミノ酸置換は、所定の配列の位置で、アミノ酸を機能的に類似したアミノ酸に置換することを含み、ここにおいて、アミノ酸の機能は、その側基の化学的特性、具体的には電荷、酸特性または塩基特性、親水性、疎水性、硫黄含量、芳香族特性、または、大きさ、具体的にはその側基の小ささに関する。
【０１２８】
加えて、図３から、当業者は、不当な負担を要することなく、配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のうちいずれか２種または３種を含む群の特徴であるか、または、個々のカルニチン輸送体、好ましくは配列番号１の特徴である任意数のアミノ酸を含む多種多様な配列モチーフがわかる。好ましくは、特徴的な配列モチーフは、タンパク質中でそれほど高くない頻度で存在する、好ましくは少なくとも２つのアミノ酸で構成される、少なくとも１種のアミノ酸群を含む。当業者であれば、不当な負担を要することなく一般的ではないアミノ酸を含む特徴的な配列モチーフの同定に精通している。
【０１２９】
さらに、当業者は、それぞれ配列番号１と配列番号２、配列番号１と配列番号３、および、配列番号２と配列番号３のアミノ酸配列アライメントを示す本明細書の図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａおよび図６ｂに示された、類似のアミノ酸間および高度に関連するアミノ酸の間のアミノ酸置換に関する追加の情報を考察する。
【０１３０】
好ましくは、本発明のいずれかの実施態様で用いられるカルニチン輸送体は、アミノ酸配列番号１、配列番号２または配列番号３を含む全ての３つのカルニチン輸送体にとって特徴的であるか、または、前記カルニチン輸送体のうち２種を含む任意の群にとって特徴的であるか、または、前記カルニチン輸送体のうち１種（好ましくは配列番号１）にとって特徴的なアミノ酸配列モチーフを含むカルニチン輸送体である。好ましくは、カルニチン輸送体は、図３に示される全ての３つのカルニチン輸送体にとって特徴的であるか、または、そのうち２種のカルニチン輸送体を含む任意の群にとって特徴的であるか、、または、カルニチン輸送体のうち１種（好ましくは配列番号１）にとって特徴的な配列モチーフに対する類似性によって不当な負担を要することなく同定することができるアミノ酸モチーフを含む。
【０１３１】
図４ａおよび図４ｂは、８６.９％のアミノ酸配列同一性を有するそれぞれ配列番号１および配列番号２を含む、高度に関連するヒトおよびマウスの、腎臓および腸のカルニチン輸送体を含むアミノ酸配列アライメントを示す。同一なアミノ酸は、バーによって示され、機能的に類似した類似のアミノ酸は、一つのドットによって示され、機能的および／または構造的にほとんど同一な高度に関連するアミノ酸は、二つのドットによって示される。
【０１３２】
図５ａおよび図５ｂは、８６.７％のアミノ酸配列同一性を有するそれぞれ配列番号１および配列番号３を含む、高度に関連するヒトおよびラットの腎臓および腸のカルニチン輸送体を含むアミノ酸配列アライメントを示す。同一なアミノ酸は、バーによって示され、機能的に類似した類似のアミノ酸は、一つのドットによって示され、機能的および／または構造的にほとんど同一な高度に関連するアミノ酸は、二つのドットによって示される。
【０１３３】
図６ａおよび図６ｂは、９５.４％のアミノ酸配列同一性を有するそれぞれ配列番号２および配列番号３を含む、高度に関連するマウスおよびラットの腎臓および腸のカルニチン輸送体を含むアミノ酸アライメントを示す。同一なアミノ酸は、バーによって示され、機能的に類似した類似のアミノ酸は、一つのドットによって示され、機能的および／または構造的にほとんど同一な高度に関連するアミノ酸は、二つのドットによって示される。
【０１３４】
図７ａおよび図７ｂは、配列番号１および配列番号１０を含むアミノ酸配列アライメントを示す。配列番号１は、ヒト腎臓および腸のカルニチン輸送体のアミノ酸配列を含み、それに対して配列番号１０は、配列番号１の機能的なスプライス変異体のアミノ酸配列を含む。配列番号１０は、配列番号１の完全に同一なアミノ酸配列、および、配列番号１のアミノ酸２９６と２９７との間の位置に相当する位置に挿入された追加の３９個のアミノ酸を含むアミノ酸配列（配列番号１０のアミノ酸２９７〜３３５に相当する）を含む。
【０１３５】
図８ａ〜図８ｄは、配列番号４、および、配列番号９を含む核酸配列アライメントを示す。配列番号４は、配列番号１に記載のヒト腎臓および腸のカルニチン輸送体のアミノ酸配列をコードし、それに対して、配列番号９は、配列番号１の機能的なスプライス変異体のアミノ酸配列、すなわち配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする。配列番号９は、配列番号４の完全に同一なの核酸配列、および、配列番号４のヌクレオチド８８７と８８８との間の位置に相当する位置に挿入された１１７個のヌクレオチドを含む追加の核酸配列（配列番号９のヌクレオチド８８８〜１００４に相当する）を含む。
【０１３６】
図９ａおよび図９ｂは、配列番号５を示す。
図１０は、配列番号６および７を示す。
図１１ａおよび図１１ｂは、配列番号８を示す。
図１２ａ〜図１２ｃは、配列番号１１（ＮＭ＿００３０６０）を示す。
図１３ａ〜図１３ｃは、配列番号１２（ＮＰ＿００３０５１）を示す。
図１４ａおよび図１４ｂは、配列番号１３（ＮＭ＿００３３１２５）を示す。
図１５ａ〜図１５ｄは、配列番号１４（ＮＰ＿１４９１１６）を示す。
図１６ａ〜図１６ｆは、配列番号１５を示す。
【０１３７】
配列の説明：
配列番号１は、ヒト腎臓および腸のカルニチン輸送体のアミノ酸配列を含む。
配列番号２は、配列番号１にオーソロガスな、マウスの腎臓および腸のカルニチン輸送体のアミノ酸配列を含む。
配列番号３は、配列番号１にオーソロガスな、ラットの腎臓および腸のカルニチン輸送体のアミノ酸配列を含む。
配列番号４は、アミノ酸配列の配列番号１を含むヒト腎臓および腸のカルニチン輸送体をコードするオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列を含む。
配列番号５は、アミノ酸配列の配列番号２を含むマウスの腎臓および腸のカルニチン輸送体をコードするオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列を含む。
【０１３８】
配列番号６は、配列番号４の始点からの本発明のオリゴヌクレオチドを示し、これは、配列番号４をクローニングするのに用いられた（フォワードクローニングプライマー）。
配列番号７は、配列番号４の終点から下流の本発明のオリゴヌクレオチドを示し、これは、配列番号４のクローニングのためのリバースプライマーとして用いられた。
配列番号８は、アミノ酸配列の配列番号３を含む、ラットの腎臓および腸のカルニチン輸送体をコードするオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列を含む。
配列番号９は、配列番号４、および、配列番号４のヌクレオチド８８７と８８８との間に挿入された１１７個のヌクレオチドを含む追加の配列を含む。配列番号９は、ＮＣＢＩデータベース（国立バイオテクノロジー情報センター，米国）において登録番号ＸＭ＿２９１１２０で入手可能である。
【０１３９】
配列番号１０は、配列番号９によってコードされたアミノ酸配列を含み、これは配列番号１および、配列番号９のアミノ酸２９６と２９７との間に挿入された３９個のアミノ酸を含む追加の配列を含む。配列番号１０は、ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＸＰ＿２９１１２０で入手可能である。
【０１４０】
配列番号１１は、ヒトカルニチン輸送体ＯＣＴＮ２をコードするＤＮＡ配列を含み、これは、人体で遍在的に発現される。配列番号１１は、ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＮＭ＿００３０６０で入手可能である。
配列番号１２は、配列番号１１によってコードされたアミノ酸配列を含み、これは、ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＮＰ００３０５１で入手可能である。
【０１４１】
配列番号１３は、ヒトカルニチン輸送体ＣＴ”をコードするＤＮＡ配列を含み、これは、ヒト精巣のみで発現される。配列番号１３は、ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＮＭ＿００３３１２５で入手可能である。
配列番号１４は、配列番号１３によってコードされたアミノ酸配列を含み、これは、ＮＣＢＩデータベースにおいて登録番号ＮＰ＿１４９１１６で入手可能である。
配列番号１５は、ヒト腎臓および腸のカルニチン輸送体に関するｍＲＮＡに対応するＤＮＡ配列を含み、これは、配列番号４、追加の５’フランキング配列、および、追加の３’フランキング配列を含む。
【０１４２】
実施例の説明：
腎臓および腸のカルニチン輸送体の遺伝子の同定およびクローニング
驚くべきことに、配列番号４を含む核酸分子は、ヒト腎臓およびヒト腸で組織特異的に強く発現されることが発見された。配列番号４は、アミノ酸配列の配列番号１を含むカルニチン輸送体をコードする。
【０１４３】
配列番号４を含むＤＮＡ分子を、テンプレートとしてヒト腎臓由来のｃＤＮＡを用い、さらにデータベースにおいて登録番号ＡＫ０９０５４で公共的に利用可能なＤＮＡ配列から誘導された配列番号６と配列番号７の相補配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。
【０１４４】
卵母細胞を用いた輸送の測定
いわゆる「トレーサーフラックス法（ｔｒａｃｅｒ  ｆｌｕｘ  ｍｅｔｈｏｄ）」で、アフリカツメガエル卵母細胞を用いて、放射性標識した化合物の輸送の測定を行い、卵母細胞膜を通過したサイトゾルへの基質の輸送速度を測定した。
【０１４５】
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞の注射
アフリカツメガエル卵母細胞を、配列番号４を含むｃＲＮＡ分子を注射した。
【０１４６】
注射しようとする卵母細胞を、シルガード（Ｓｙｌｇａｒｄ）の溝に並べた。光沢のあるらせん状に編まれたフィラメント内で微細に伸長したボロシリケートで作製されたガラス製キャピラリー（ヒルゲンベルグ（Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ）のマルスフェルド（Ｍａｌｓｆｅｌｄ）；直径の内部：０.５ｍｍ；外径１.０ｍｍ）を用いて、注射を行った。サンプル溶液を吸い込んで押し出すために、ドラモンド社（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ）から入手したマイクロインジェクションポンプを用いた。キャピラリーを、気泡を入れずにミネラルオイル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）４００−５，重質の白油，□＝０.８８ｇ／ｍｌ）で満たし、マニピュレーターが備付けられたマイクロポンプにマウントした。
【０１４７】
油をポンプで押出して望ましい体積のＲＮＡが吸入されるように、ずっと融合させたままの注射キャピラリーのチップを、鉗子を用いて慎重に壊して開いた。ＲＮＡ濃度の増加と汚染によるそれらの分解を防ぐために、滅菌ミネラルオイルの層の下で注射キャピラリーへのＲＮＡの吸入を行った。この注射キャピラリーを、９０°の角度で卵母細胞の表面に置き、わずかに加圧して卵母細胞に穴を開けた。このチップは、１００〜２００μｍよりも深く細胞質に侵入させるべきではない。注入物の体積は、決して５０ｎｌ（卵母細胞の体積の約０.９μｌの約５％）を超えなかった。圧力が補填されて、穴を開けた管から注入物が漏れることを防ぐために、望ましい体積が入れられてから５〜１０秒間注射キャピラリーを卵母細胞中に残した。
【０１４８】
漏れを回避するための追加の条件は、注射の前に少なくとも１０分間、１０ｍＭの代わりに１３０ｍＭのＮａＣｌを含むＯＲｉ中で（すなわち高張溶液中で）卵母細胞を「予め縮ませること」であった。実質的な卵黄の量を損失した、従って多分注射溶液の一部も損失した卵母細胞を選別した。
【０１４９】
注射された卵母細胞は、基質の摂取の測定まで、ゲンタマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＯＲｉ培地中で１８℃で維持した。損傷を受けた細胞、激しく変化した細胞、または、後になって重度のダメージを受けた細胞を捨てた。
７２時間後、カルニチン輸送体アゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングするために卵母細胞を用いた。
【０１５０】
ＯＲｉ培地溶液
標準緩衝液は、１１０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのＭｇＣｌ2、および、５ｍＭのＭＯＰＳを含む卵母細胞−リンゲル液ＯＲｉであった。
必要に応じて、ゲンタマイシンを５０ｍｇ／ｌで添加した。
【０１５１】
基質の摂取の決定
卵母細胞ホモジネートで処理したポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅ）ウェルを、基質溶液２００μｌで満たした。決定で使用する前に、まず卵母細胞をＯＲｉ溶液で２回洗浄した。統計学的に評価できるように、一つの反応混合物に８〜１０個の卵母細胞を用いた。卵母細胞を基質溶液に添加した後、この反応混合物を穏やかに混合し、インキュベートした。インキュベートを２２℃で１時間行った。反応を止めるために、氷冷ＯＲｉ（１ｍｌ）を添加した。
【０１５２】
卵母細胞を氷冷ＯＲｉ（１５ｍｌ）で４回洗浄した。その後、卵母細胞を個々に６ｍｌの計数バイアルに移した。５§ＳＤＳ溶液（１００μｌ）を添加することによって卵母細胞の細胞質膜を破壊した。バイアルをわずかに撹拌して、細胞質膜を崩壊した。３０〜４５分間撹拌して細胞質膜を完全に破壊した。この溶解産物を、シンチレーションカクテル２ｍｌと混合した。この溶解産物の放射活性を、発光と外来の標準物質で補正された液体シンチレーションカウンターで決定した。各バイアルを５分かけて計数した。
【０１５３】
卵母細胞を添加した後の基質濃度を決定するために、反応混合物から溶液１０μｌを２回採取し、５％ＳＤＳ溶液１００μｌを添加し、計数器を用いて評価した。得られた値を輸送速度の計算で考察した。
【０１５４】
ＫM値の決定
濃度依存性の基質の摂取を決定するために、調査した基質の連続希釈液を製造し、上清中、１００００〜２００００ｃｐｍの各反応混合物が計数できるように放射活性を分布させた。ＫMを決定するために、基質の摂取を１時間かけて測定した。加えて、バックグラウンド（すなわち、例えば拡散または内因性輸送タンパク質が介在する非特異的な基質の摂取）を決定するために、Ｈ2Ｏを注射した卵母細胞を用いて測定を行った。輸送速度を計算し、グラフに基質濃度に対してプロットし、ミカエリス−メンテン方程式に従って数学的に適合させた。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】異なる基質を用いた本発明の方法に関与するカルニチン輸送体の活性を説明するヒストグラムを示す。
【図２】本発明の方法に関与するカルニチン輸送体の速度論を説明する図表を示す。
【図３】配列番号２、配列番号３および配列番号１を含む高度に関連するマウス、ラットおよびヒト腎臓および腸のカルニチン輸送体を含むアミノ酸配列アライメントを示す。
【図４ａ】８６.９％のアミノ酸配列同一性を有する配列番号１および配列番号２を含む、高度に関連するヒトおよびマウスの、腎臓および腸のカルニチン輸送体を含むアミノ酸配列アライメントを示す。
【図４ｂ】図４ａの続きである。
【図５ａ】８６.７％のアミノ酸配列同一性を有する配列番号１および配列番号３を含む、高度に関連するヒトおよびラットの腎臓および腸のカルニチン輸送体を含むアミノ酸配列アライメントを示す。
【図５ｂ】図５ａの続きである。
【図６ａ】９５.４％のアミノ酸配列同一性を有する配列番号２および配列番号３を含む、高度に関連するマウスおよびラットの腎臓および腸のカルニチン輸送体を含むアミノ酸アライメントを示す。
【図６ｂ】図６ａの続きである。
【図７ａ】配列番号１および配列番号１０を含むアミノ酸配列アライメントを示す。
【図７ｂ】図７ａの続きである。
【図８ａ】配列番号４、および、配列番号９を含む核酸配列アライメントを示す。
【図８ｂ】図８ａの続きである。
【図８ｃ】図８ｂの続きである。
【図８ｄ】図８ｃの続きである。
【図９ａ】配列番号５を示す。
【図９ｂ】図９ａの続きである。
【図１０】配列番号６および７を示す。
【図１１ａ】配列番号８を示す。
【図１１ｂ】図１１ａの続きである。
【図１２ａ】配列番号１１（ＮＭ＿００３０６０）を示す。
【図１２ｂ】図１２ａの続きである。
【図１２ｃ】図１２ｂの続きである。
【図１３ａ】配列番号１２（ＮＰ＿００３０５１）を示す。
【図１３ｂ】図１３ａの続きである。
【図１３ｃ】図１３ｂの続きである。
【図１４ａ】配列番号１３（ＮＭ＿００３３１２５）を示す。
【図１４ｂ】図１４ａの続きである。
【図１５ａ】配列番号１４（ＮＰ＿１４９１１６）を示す。
【図１５ｂ】図１５ａの続きである。
【図１５ｃ】図１５ｂの続きである。
【図１５ｄ】図１５ｃの続きである。
【図１６ａ】配列番号１５を示す。
【図１６ｂ】図１６ａの続きである。
【図１６ｃ】図１６ｂの続きである。
【図１６ｄ】図１６ｃの続きである。
【図１６ｅ】図１６ｄの続きである。
【図１６ｆ】図１６ｅの続きである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１６ｄ】
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【図１６ｅ】
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【図１６ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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