(57)【要約】  反応性蛍光色素組成物およびその使用方法が開示される。チオール反応性基を有するスクエアレイン核色素、ナイルレッド核色素、ベンゾジオキサゾール核色素、クマリン核色素またはアザクマリン核色素が開示される。少なくとも約５７５ｎｍの蛍光発光を示すスクエアレイン核色素、ナイルレッド核色素、ベンゾジオキサゾール核色素、クマリン核色素またはアザクマリン核色素が開示される。結合タンパク質およびスクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核またはアザクマリン核を有するバイオセンサーが開示される。【選択図】図１
2008500446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
Ａ−Ｙ
を有するフルオロフォアであって、
式中、Ａは、スクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核およびアザクマリン核からなる群から選択され；および
Ｙは、
【化１】
2008500446.tif 000050
（式中、ｎは１から６の整数）；
Ａ’−ＣＯ−Ｒ１（式中、Ａ’は−Ｒ２Ｏ−または−Ｒ２Ｎ（Ｒ３）−、Ｒ２はＣ１からＣ６のアルキル、Ｒ３はＨまたはＣＨ３、およびＲ１はＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２Ｂｒ、ＣＨ２Ｉ）；または
【化２】
2008500446.tif 000051
（式中、ｍは２から６の整数）
であることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項２】
Ｒ２は、Ｃ２からＣ４のアルキルであることを特徴とする、請求項１に記載のフルオロフォア。
【請求項３】
Ｒ２は、ＣＨ２ＣＨ２であることを特徴とする、請求項２に記載のフルオロフォア。
【請求項４】
Ｒ２Ｏは、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−であることを特徴とする、請求項１に記載のフルオロフォア。
【請求項５】
Ｒ２Ｎ（Ｒ３）−は、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であることを特徴とする、請求項１に記載のフルオロフォア。
【請求項６】
請求項１に記載のフルオロフォアであって、Ａは、式
【化３】
2008500446.tif 000052
を有するスクエアレイン核であり、
式中、Ｒ’は、ＨまたはＯＨであり、Ｒ’’は、独立してメチル、エチル、またはプロピルであり、Ｙは、請求項１に記載の通りであることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項７】
請求項６に記載のフルオロフォアであって、
【化４】
2008500446.tif 000053
であることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項８】
請求項１に記載のフルオロフォアであって、Ａは、式
【化５】
2008500446.tif 000054
を有するスクエアレイン核であり、
式中、Ｒ４は、Ｃ１からＣ６のアルキルまたは（ＣＨ２）ｑＣＯ２Ｈ（式中、ｑは１から５の整数）であり、ＺおよびＺ’は、独立してＳ、Ｏ、またはＣ（ＣＨ３）２であり、ＷおよびＷ’は、独立してＨ、ＣＨ３、ＳＯ３Ｈ、縮合ベンゼン、または縮合スルホベンゼンであり、
Ｙは、請求項１に記載の通りであることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項９】
請求項８に記載のフルオロフォアであって、
【化６】
2008500446.tif 000055
であり、
式中、Ｒ４は、エチルまたは（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈであることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項１０】
請求項１に記載のフルオロフォアであって、Ａは、式
【化７】
2008500446.tif 000056
を有するナイルレッド核であり、
式中、Ｒ５は、メチル、エチル、またはプロピルであり、
Ｙは、請求項１に記載の通りであることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項１１】
請求項１０に記載のフルオロフォアであって、
【化８】
2008500446.tif 000057
であることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項１２】
請求項１に記載のフルオロフォアであって、Ａは、式
【化９】
2008500446.tif 000058
を有するナイルレッド核であり、
式中、Ｒ６またはＲ７は、独立してメチル、エチル、またはプロピルであり、
Ｙは、請求項１に記載の通りであることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項１３】
請求項１２に記載のフルオロフォアであって、
【化１０】
2008500446.tif 000059
であることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項１４】
請求項１に記載のフルオロフォアであって、Ａは、
【化１１】
2008500446.tif 000060
からなる群から選択される式を有するベンゾジオキサゾール核であり、
式中、ｒは、１から３の整数であり、Ｒ８およびＲ９は、独立してＣ１からＣ６のアルキルまたは（ＣＨ２）ｓＣＯ２Ｈ（式中、ｓは、２から５の整数）であり、Ｚは、Ｓ、Ｏ、またはＣ（ＣＨ３）２であり、Ｗは、Ｈ、ＣＨ３、ＳＯ３Ｈ、縮合ベンゼン、または縮合スルホベンゼンであり、
Ｙは、請求項１に記載の通りであることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項１５】
請求項１４に記載のフルオロフォアであって、
【化１２】
2008500446.tif 000061
であることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項１６】
請求項１４に記載のフルオロフォアであって、
【化１３】
2008500446.tif 000062
であることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項１７】
請求項１に記載のフルオロフォアであって、Ａは、
【化１４】
2008500446.tif 000063
からなる群から選択される式を有するベンゾジオキサゾール核であり、
式中、ｒは、１から３の整数であり、Ｒ８およびＲ９は、独立してＣ１からＣ６のアルキルまたは（ＣＨ２）ｓＣＯ２Ｈ（式中、ｓは２から５の整数）であり、Ｗは、Ｈ、ＣＨ３、ＳＯ３Ｈ、縮合ベンゼン、または縮合スルホベンゼンであり、
Ｙは、請求項１に記載の通りであることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項１８】
請求項１７に記載のフルオロフォアであって、
【化１５】
2008500446.tif 000064
であることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項１９】
請求項１に記載のフルオロフォアであって、Ａは、
【化１６】
2008500446.tif 000065
からなる群から選択される式を有するアザクマリン核であり、
式中、Ｙは、請求項１に記載の通りであり、
Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、独立してＣ１からＣ６のアルキルまたは
−（ＣＨ２）ｓＣＯ２Ｈであり、
Ｄは、ＣＨまたはＮであり、
ｒは、１から３の整数であり、ｓは、２から５の整数であることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項２０】
請求項１９に記載のフルオロフォアであって、
【化１７】
2008500446.tif 000066
であることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項２１】
請求項１に記載のフルオロフォアであって、Ａは、
【化１８】
2008500446.tif 000067
からなる群から選択される式の核を有するクマリン核であり、
式中、Ｙは、請求項１に記載の通りであり、
Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、独立してＣ１からＣ６のアルキル、または
−（ＣＨ２）ｓＣＯ２Ｈ（式中、ｓは２から５の整数）であり、Ｚは、Ｓ、Ｏ、または−Ｃ（ＣＨ３）２であり、ｒは、１から３の整数であり、Ｗは、Ｈ、ＣＨ３、−ＳＯ３Ｈ、縮合ベンゼンまたは縮合スルホベンゼンであり、およびＤは、ＣＨまたはＮであることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項２２】
請求項２１に記載のフルオロフォアであって、
【化１９】
2008500446.tif 000068
であることを特徴とするフルオロフォア。
【請求項２３】
式
Ａ−Ｙ’−Ｂ
を有するバイオセンサー化合物であって、
式中、Ａは、蛍光発光を示し、かつスクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核、およびアザクマリン核からなる群から選択されるフルオロフォアであり、
Ｙ’−Ｂは、
【化２０】
2008500446.tif 000069
（式中、ｎは１から６の整数）であり、
またはＹ’−Ｂは、Ａ’−ＣＯ−Ｖ−Ｂであり、Ａ’は−Ｒ２Ｏ−または−Ｒ２Ｎ（Ｒ３）−（式中、Ｒ２はＣ１からＣ６のアルキル、Ｒ３はＨまたはＣＨ３）であり、およびＶ−Ｂは、−ＣＨ２−Ｂまたは
【化２１】
2008500446.tif 000070
（式中、ｍは２から６の整数であり、
Ｂは、検出されるリガンドに結合親和性を有するレセプター）であり、前記バイオセンサー化合物は、前記リガンドの結合の結果としての蛍光特性における検出可能な変化を示すことを特徴とするバイオセンサー化合物。
【請求項２４】
前記レセプターは、結合タンパク質であることを特徴とする、請求項２３に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項２５】
Ｂは、ペリプラズム結合タンパク質であることを特徴とする、請求項２３に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項２６】
前記バイオセンサーの蛍光発光は、５７５ｎｍを超えることを特徴とする、請求項２３に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項２７】
Ｂは、グルコース／ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）であることを特徴とする、請求項２３に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項２８】
前記結合タンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有するグルコース／ガラクトース結合タンパク質であり、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、位置１１のシステイン、位置１４のシステイン、位置１９のシステイン、位置４３のシステイン、位置７４のシステイン、位置１０７のシステイン、位置１１０のシステイン、位置１１２のシステイン、位置１１３のシステイン、位置１３７のシステイン、位置１４９のシステイン、位置２１３のシステイン、位置２１６のシステイン、位置２３８のシステイン、位置２８７のシステイン、位置２９２のシステイン、位置１１２のシステインおよび位置２３８のセリン、位置１４９のシステインおよび位置２３８のセリン、位置１５２のシステインおよび位置２１３のセリン、位置２１３のシステインおよび位置２３８のシステイン、位置１４９のシステインおよび位置２１３のアルギニン、位置１４９のシステインおよび位置２１３のセリンおよび位置２３８のセリン、および位置１４９のシステインおよび位置２１３のアルギニンおよび位置２３８のセリンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２３に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項２９】
Ｒ２Ｏは、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−であることを特徴とする、請求項２３に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項３０】
Ｒ２Ｎ（Ｒ３）は、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であることを特徴とする、請求項２３に記載のバイオセンサー化合物。
【請求項３１】
請求項２３に記載のバイオセンサー化合物であって、前記
Ａ−Ｙ’−Ｂは、
【化２２】
2008500446.tif 000071
【化２３】
2008500446.tif 000072
【化２４】
2008500446.tif 000073
からなる群から選択され、
Ｙ’−Ｂは、
【化２５】
2008500446.tif 000074
（式中、ｎは１から６の整数）であり、
またはＹ’−Ｂは、Ａ’−ＣＯ−Ｖ−Ｂであり、Ａ’は−Ｒ２Ｏ−または−Ｒ２Ｎ（Ｒ３）−（式中、Ｒ２はＣ１からＣ６のアルキル、Ｒ３はＨまたはＣＨ３）、およびＶ−Ｂは、−ＣＨ２−Ｂまたは
【化２６】
2008500446.tif 000075
（式中、ｍは２から６の整数であり、
Ｂは、検出されるリガンドに結合親和性を有するレセプター）であり、前記バイオセンサー化合物は、前記リガンドの濃度変化の結果としての蛍光特性における検出可能な変化を示すことを特徴とするバイオセンサー化合物。
【請求項３２】
請求項２３に記載のバイオセンサー化合物であって、前記
Ａ−Ｙ’−Ｂは、
【化２７】
2008500446.tif 000076
【化２８】
2008500446.tif 000077
【化２９】
2008500446.tif 000078
（式中、Ｂは請求項２３に記載の通り）
からなる群から選択されることを特徴とするバイオセンサー化合物。
【請求項３３】
少なくとも１つの変異結合タンパク質を有し、前記結合タンパク質のチオール基を介して前記結合タンパク質に共有結合されたフルオロフォアを伴うバイオセンサー化合物であって、前記フルオロフォアは、少なくとも約５７５ｎｍで発光蛍光を示し、スクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核およびアザクマリン核からなる群から選択されるバイオセンサー化合物を提供する工程、
前記結合タンパク質を分析物源と接触させて、前記分析物を前記結合タンパク質に結合させる工程、および、
前記結合タンパク質をエネルギー源に曝して前記フルオロフォアを励起する工程、および前記分析物源の分析物または分析物濃度の指標として蛍光特性を検出する工程
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。
【請求項３４】
前記結合タンパク質は、ペリプラズム結合タンパク質であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法は、前記結合タンパク質を前記分析物源と連続的に接触させる工程、前記結合タンパク質を前記エネルギー源に連続的に曝す工程、および前記蛍光特性を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記変異結合タンパク質は、前記分析物の分析物濃度の変化の結果として立体構造が変化し、およびここで、前記方法は、前記分析物濃度の変化の結果として前記蛍光特性の変化を検出することを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３３に記載の方法であって、前記変異結合タンパク質は、位置１１のシステイン、位置１４のシステイン、位置１９のシステイン、位置４３のシステイン、位置７４のシステイン、位置１０７のシステイン、位置１１０のシステイン、位置１１２のシステイン、位置１１３のシステイン、位置１３７のシステイン、位置１４９のシステイン、位置２１３のシステイン、位置２１６のシステイン、位置２３８のシステイン、位置２８７のシステイン、位置２９２のシステイン、位置１１２のシステインおよび位置２３８のセリン、位置１４９のシステインおよび位置２３８のセリン、位置１５２のシステインおよび位置２１３のセリン、位置２１３のシステインおよび位置２３８のシステイン、位置１４９のシステインおよび位置２１３のアルギニン、位置１４９のシステインおよび位置２１３のセリンおよび位置２３８のセリン、および位置１４９のシステインおよび位置２１３のアルギニンおよび位置２３８のセリンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するグルコース／ガラクトース結合タンパク質であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３３に記載の方法であって、前記バイオセンサー化合物は、式
Ａ−Ｙ’−Ｂ
を有し、式中、Ａは、前記スクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核、またはアザクマリン核であり、
Ｙ’−Ｂは、
【化３０】
2008500446.tif 000079
（式中、ｎは１から６の整数）であり、またはＹ’−Ｂは、Ａ’−ＣＯ−Ｖ−Ｂであり、Ａ’は−Ｒ２Ｏ−または−Ｒ２Ｎ（Ｒ３）−（式中、Ｒ２はＣ１からＣ６のアルキル、Ｒ３はＨまたはＣＨ３）であり、Ｖ−Ｂは、−ＣＨ２−Ｂであり、
または
【化３１】
2008500446.tif 000080
（式中、ｍは２から６の整数であり、
Ｂは、前記ペリプラズム結合タンパク質）である
ことを特徴とする方法。
【請求項３９】
Ｂは、グルコース／ガラクトース結合タンパク質またはマルトース結合タンパク質であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ２Ｏは、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−であることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ２Ｎ（Ｒ３）は、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３８に記載の方法であって、
Ａ−Ｙ’−Ｂは、
【化３２】
2008500446.tif 000081
【化３３】
2008500446.tif 000082
【化３４】
2008500446.tif 000083
からなる群から選択され、
Ｙ’−Ｂは、
【化３５】
2008500446.tif 000084
（式中、ｎは１から６の整数）であり、
またはＹ’−Ｂは、Ａ’−ＣＯ−Ｖ−Ｂであり、Ａ’は−Ｒ２Ｏ−または−Ｒ２Ｎ（Ｒ３）−（式中、Ｒ２はＣ１からＣ６のアルキル、Ｒ３はＨまたはＣＨ３）、およびＶ−Ｂは、−ＣＨ２−Ｂまたは
【化３６】
2008500446.tif 000085
（式中、ｍは２から６の整数であり、
Ｂは、検出されるリガンドに結合親和性を有するレセプター）であり、前記バイオセンサー化合物は、前記リガンドの濃度変化の結果としての蛍光特性における検出可能な変化を示すことを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項３８に記載の方法であって、
Ａ−Ｙ’−Ｂは、
【化３７】
2008500446.tif 000086
【化３８】
2008500446.tif 000087
【化３９】
2008500446.tif 000088
からなる群から選択され、
式中、Ｂは、請求項３８に記載の通りであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ＴＭＭコントラクトＮｏ．Ｗ８１ＸＷＨ−０４−１−００７６の下、米国陸軍医学研究物資司令部（ＵＳＡＭＲＭＣ）の助成により一部資金援助を得た研究に基づくため、米国政府は、本発明における一定の権利を有することができる。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年５月２１日に出願された先行する米国特許仮出願第６０／５７３，９４４号明細書、および２００４年８月６日に出願された米国特許仮出願第６０／５９９，５１４号明細書の、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での利益を主張するものである。これらの出願は、その全文が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００３】
本発明の実施形態は、分析物の検出に使用する新規の長波長フルオロフォアに関する。さらなる実施形態は、分子のチオール基に共有結合できるチオール反応性部位を含有するフルオロフォアに関する。
【背景技術】
【０００４】
【非特許文献１】C. Cornelissen-Gude, W. Rettig, R. Lapouyade. "Phhotophysical properties of Squaraine Derivatives: Evidence for Charge Separation." J. Phys. Chem. A 1997, 101, 9673-9677
【非特許文献２】www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/accession number D90885
【非特許文献３】www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/accession number 23052
【非特許文献４】M. L. Pisarchick and N. L. Thompson "Binding of a monoclonal antibody and its Fab fragment to supported phospholipid monolayers measured by total internal reflection fluorescence microscopy" Biophys. J. 1990, 58, 1235-1249
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
蛍光色素またはフルオロフォア化合物は、さまざまな化学的および生物学的処理での使用に適している。さまざまな実施形態は、フルオロフォアをタンパク質などの別の分子と結合（ｃｏｕｐｌｅまたはｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させるのに使用されることのできる反応性基を有するフルオロフォアに関する。バイオセンサーは、タンパク質と結合される反応性基を有するフルオロフォアを含む。
【０００６】
さらなる実施形態は、反応性基を有し、少なくとも約５７５ｎｍの発光波長を有する、近赤外色素（ＮＩＲ色素）と呼ばれるフルオロフォアである。１つの実施形態では、フルオロフォアは約６５０ｎｍで発光する。フルオロフォアの実施形態としては、特定の結合ペアのメンバーと結合することができるペンダント反応性基がある。
【０００７】
フルオロフォアは、特定のリガンドまたは分析物に親和性を有するレセプターおよび結合タンパク質との結合に適している。本発明のさまざまな実施形態では、レセプターまたは結合タンパク質は、リガンドまたは分析物に結合すると立体構造が変化する。フルオロフォアは、結合タンパク質に結合した場合、リガンド結合の結果としての検出可能なシグナルの変化を示す。
【０００８】
別の実施形態は、アミノ酸に共有結合できる反応性部分を有するフルオロフォアを提供する。１つの実施形態では、フルオロフォアは、タンパク質のアミノ酸のシステイン残基に結合できるチオール反応性基を有する。フルオロフォアに導入できる好適なチオール反応性基の例としては、ハロアセチル基および特にヨードアセチル基がある。他のチオール反応性基には、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ヨード酢酸またはマレイミドがある。
【０００９】
本発明のさらなる実施形態は、チオール反応性基を有し、少なくとも約５７５ｎｍの発光を有するフルオロフォアを提供する。本発明の１つの実施形態では、フルオロフォアは、ベンゾジオキサゾール、スクエアレイン（ｓｑｕａｒａｉｎｅ）、９−ジエチルアミノ−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（以下、ナイルレッドと称する）、クマリン、およびアザクマリンである。別の実施形態では、本発明は、スクエアレイン、ベンゾジオキサゾール、ナイルレッド、クマリンおよびアザクマリンの誘導体で、以下それぞれに、スクエアレイン核、ベンゾジオキサゾール核、ナイルレッド核、クマリン核またはアザクマリン核と同じ意味で称される、または集合的に「蛍光色素」と称されるものに関する。スクエアレイン核、ベンゾジオキサゾール核、ナイルレッド核、クマリン核およびアザクマリン核の誘導体は、例えば、タンパク質のアミノ酸基を備えた、誘導体のいずれの反応産物も含む。誘導体とは、前述の核へのいずれの化学的な修飾、付加、除去、または置換も含むことを意味する。１つの実施形態としては、少なくとも約５７５ｎｍの蛍光発光を示す前述の色素核が挙げられる。１つの実施形態では、スクエアレイン核、ベンゾジオキサゾール核、ナイルレッド核、クマリン核およびアザクマリン核は、タンパク質に結合するためのチオール反応性基を含有している。
【００１０】
また、別の実施形態は、結合タンパク質、および結合タンパク質のシステイン残基を介して結合タンパク質に結合したスクエアレイン核、ベンゾジオキサゾール核、ナイルレッド核、クマリン核ならびにアザクマリン核の複合体に関する。タンパク質のシステイン残基は、自然発生であるか、またはタンパク質中へ工学処理することができる。１つの実施形態では、結合タンパク質は、グルコースに親和性を有し、グルコースを可逆的に結合させるグルコース結合タンパク質である。フルオロフォアは、結合に反応して蛍光特性における検出可能な変化をもたらす。蛍光特性における検出可能な変化は、発光波長のシフト、発光エネルギー強度の変化、蛍光寿命の変化、異方性の変化、偏光の変化、またはそれらの組み合わせでありうる。別の実施形態では、結合タンパク質は、マルトースに親和性を有し、マルトースを結合させるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。別の実施形態では、結合タンパク質は、非天然リガンドに親和性を有し、非天然リガンドを結合させるように変更される。
【００１１】
本発明のさまざまな実施形態は、式
Ａ−Ｙ
を有するフルオロフォアであって、
式中、Ａは、スクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核、およびアザクマリン核からなる群から選択され、およびＹは、
【００１２】
【化１】
2008500446.tif 000003
【００１３】
（式中、ｎは１から６の整数）であり、またはＹは、Ａ’−ＣＯ−Ｒ１であり、Ａ’は−Ｒ２Ｏ−または−Ｒ２Ｎ（Ｒ３）−（式中、Ｒ２はＣ１からＣ６のアルキル、Ｒ３はＨまたはＣＨ３）であり、およびＲ１はＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２Ｂｒ、ＣＨ２Ｉであり、または
【００１４】
【化２】
2008500446.tif 000004
【００１５】
（式中、ｍは２から６の整数）であるフルオロフォアを提供する。
【００１６】
追加の実施形態は、式
Ａ−Ｙ’−Ｂ
を有するバイオセンサー化合物であって、
式中、Ａは、スクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核、およびアザクマリン核からなる群から選択されるフルオロフォアであり、Ｙ’−Ｂは、
【００１７】
【化３】
2008500446.tif 000005
【００１８】
（式中、ｎは１から６の整数）であり、またはＹ’−Ｂは、Ａ’−ＣＯ−Ｖ−Ｂであり、Ａ’は−Ｒ２Ｏ−または−Ｒ２Ｎ（Ｒ３）−（式中、Ｒ２はＣ１からＣ６のアルキル、Ｒ３はＨまたはＣＨ３）、およびＶ−Ｂは−ＣＨ２−Ｂ、または
【００１９】
【化４】
2008500446.tif 000006
【００２０】
（式中、ｍは２から６の整数、およびＢは、検出されるリガンドに可逆的な結合親和性を有するレセプター）であるバイオセンサー化合物を提供する。前記バイオセンサー化合物は、リガンド濃度の変化の結果として蛍光特性に生じる検出可能な変化を示す。
【００２１】
さらなる実施形態は、少なくとも１つの変異結合タンパク質を有し、フルオロフォアが、前記結合タンパク質のチオール基を介して前記結合タンパク質に共有結合されているバイオセンサー化合物を提供する工程を含む分析物の検出方法であり、フルオロフォアは、少なくとも約５７５ｎｍの発光蛍光を示し、スクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核およびアザクマリン核からなる群から選択される。バイオセンサー化合物をエネルギー源に曝して、前記フルオロフォアを励起し、かつ分析物含有源の分析物濃度の指標となる蛍光特性を検出する。
【００２２】
本開示は、リガンドおよび特に分析物を検出するためのバイオセンサー成分としての使用に適した蛍光色素、およびその使用方法を対象とする。１つの実施形態は、レセプターに結合してリガンドを検出、定量化、または検出および定量化することができる蛍光色素を対象とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
１つの実施形態では、蛍光色素は、蛍光色素が結合タンパク質に共有結合されるバイオセンサーの作成に使用される。本明細書では、「バイオセンサー」および「バイオセンサー化合物」という用語は、リガンドまたは標的分析物に対する特異反応において検出可能な変化を起こす化合物のことをいう。本明細書で論じられるバイオセンサーの実施形態には、分析物に結合可能な結合タンパク質がある。他の実施形態では、本発明のバイオセンサーは、分析物を検出すること、および分析物濃度の変化を検出することができる。さまざまな実施形態では、タンパク質は、グルコース／ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、アロース結合タンパク質、アラビノース結合タンパク質、ジペプチド結合タンパク質、グルタミン酸／アスパラギン酸結合タンパク質、グルタミン結合タンパク質、Ｆｅ（ＩＩＩ）結合タンパク質、ヒスチジン結合タンパク質、ロイシン結合タンパク質、ロイシン／イソロイシン／バリン結合タンパク質、リジン／アルギニン／オルニチン結合タンパク質、モリブデン酸塩結合タンパク質、オリゴペプチド結合タンパク質、フォスフェート結合タンパク質、リボース結合タンパク質、サルフェート結合タンパク質、Ｚｎ（ＩＩ）結合タンパク質、およびビタミンＢ−１２結合タンパク質を含むペリプラズム結合タンパク質の群から選択されることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
他の実施形態では、バイオセンサーは、結合タンパク質に共有結合した蛍光色素であり、タンパク質−色素複合体は、５７５ｎｍまたはこれを超える蛍光発光を示す。１つの実施形態では、蛍光色素は、少なくとも５７５ｎｍの蛍光発光を示す。１つの典型的な形態では、結合タンパク質は、グルコース含有源と接触した場合に、グルコースと結合することができるグルコース／ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）である。別の実施形態では、結合タンパク質は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。理論に裏付けられているわけではないが、結合タンパク質は、リガンド結合の際に立体構造が変化すると理解されている。リガンドにより占有された部位に結合タンパク質が結合する割合は、リガンド濃度および結合タンパク質の結合定数に依存性である。
【００２５】
少なくとも約５７５ｎｍの蛍光発光を示す蛍光色素の実施形態は、グルコース源の生物系成分または他の成分によるバックグラウンド干渉を回避または最小化する。蛍光色素は、グルコース濃度の変化の結果として結合タンパク質が立体構造の変化を起こす際の、蛍光シグナル強度の変化、最大蛍光発光の発光波長のシフト、蛍光寿命の変化、異方性の変化、偏光の変化、またはそれらの組み合わせを示す。方法の実施形態では、バイオセンサーは、例えば、グルコースなどの分析物含有試料に接触し、分析物を結合タンパク質と結合させることができる。ここでの試料には、血液、唾液、間質液等があるが、これらに限定されるものではない。レーザーまたはＬＥＤなどのエネルギー源は、蛍光色素を励起するためバイオセンサーに適用され、蛍光特性が検出される。結合タンパク質の立体構造の変化、それに続く色素の微環境における変化のいずれか、またはその両方により、検出された蛍光特性または検出された蛍光特性の変化を、分析物の存在または分析物濃度と相関させることができる。蛍光および検出は、所定時間で連続的または断続的に行うことができる。したがって、例えば、グルコースなどの分析物の一時的または連続的な検出が想定される。本明細書に開示されたバイオセンサーは、ストリップ、インプラント、微粒子およびナノ粒子などでの使用に適応可能である。
【００２６】
蛍光色素は、所望の蛍光変化を得るため、部位特異的な方法で結合タンパク質に共有結合される。蛍光色素は、立体構造の変化が蛍光特性の変化を最大化するように、結合タンパク質上の部位に付加される。本発明の他の実施形態では、蛍光色素は、結合タンパク質のシステイン残基のチオール基に結合されることができるチオール反応性基を有する。蛍光色素には、前述の、スクエアレイン核、ベンゾジオキサゾール核、ナイルレッド核、クマリン核およびアザクマリン核の誘導体がある。
【００２７】
１つの実施形態では、バイオセンサーは、式Ｉ
Ａ−Ｙ’−Ｂ    （Ｉ）
を有する。
【００２８】
式Ｉでは、Ａは、スクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核、アザクマリン核、およびそれらの誘導体である。Ｙ’−Ｂは、
【００２９】
【化５】
2008500446.tif 000007
【００３０】
（式中、ｎは１から６の整数）であり、またはＹ’−Ｂは、Ａ’−ＣＯ−Ｖ−Ｂである。Ａ’は−Ｒ２Ｏ−または−Ｒ２Ｎ（Ｒ３）−である。Ｒ２はＣ１からＣ６のアルキルである。１つの実施形態では、Ｒ２はＣ２からＣ４のアルキルである。Ｒ３はＨまたはＣＨ３である。Ｖ−Ｂは、−ＣＨ２−Ｂ
または
【００３１】
【化６】
2008500446.tif 000008
【００３２】
（式中、ｍは２から６の整数）である。１つの実施形態では、Ｒ２Ｏは、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−である。別の実施形態では、Ｒ２Ｎ（Ｒ３）は、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−である。Ｂは、バイオセンサーにより検出されモニターされるリガンドに結合親和性を有するレセプターである。バイオセンサー化合物は、リガンド濃度の変化の結果として蛍光特性の検出可能な変化を示す。１つの実施形態では、Ｂは、グルコースなどのリガンド濃度が変化する結果として蛍光強度の検出可能な変化を示す、グルコース／ガラクトース結合タンパク質である。別の実施形態では、Ｂは、マルトース結合タンパク質である。
【００３３】
１つの実施形態では、蛍光色素またはフルオロフォアは、チオール反応性基を有し、一般式
Ａ−Ｙ    （ＩＩ）
を有する。式中、Ａは、スクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核、アザクマリン核、またはそれらの誘導体であり、Ｙは、チオール反応性基である。
【００３４】
式ＩＩにおける他の実施形態では、Ｙは、
【００３５】
【化７】
2008500446.tif 000009
【００３６】
（式中、ｎは１から６の整数）であり、またはＹは、Ａ’−ＣＯ−Ｒ１である。Ａ’は−Ｒ２Ｏ−または−Ｒ２Ｎ（Ｒ３）−である。Ｒ２はＣ１からＣ６のアルキルである。１つの実施形態では、Ｒ２はＣ２からＣ４のアルキルである。Ｒ３はＨまたはＣＨ３である。Ｒ１はＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉであり、または
【００３７】
【化８】
2008500446.tif 000010
【００３８】
（式中、ｍは２から６の整数）である。色素は、少なくとも約５７５ｎｍの蛍光発光を示すことができる。１つの実施形態では、Ｒ２Ｏは−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−である。別の実施形態では、Ｒ２Ｎ（Ｒ３）は−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−である。さらなる実施形態では、Ｙは−（ＣＨ２）２ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｘであり、ＸはＣｌ、ＢｒまたはＩである。他の実施形態では、Ｒ２は−ＣＨ２ＣＨ２−などのＣ２からＣ４のアルキルである。
【００３９】
本発明の実施形態であるスクエアレイン核は、スクエアレイン構造の誘導体
【００４０】
【化９】
2008500446.tif 000011
【００４１】
を基にしている。
【００４２】
式ＩＩＩのスクエアレイン核は、その環境の変化に伴い蛍光特性の変化を示す。例えば、スクエアレイン核ＩＩＩは、メタノールなどの極性プロトン性溶媒からトルエンなどの非極性溶媒へその環境を変化させることで、蛍光量子収率が２０倍増加する（非特許文献１参照）。スクエアレイン色素は、６３５ｎｍ付近で最大吸光度を有することができ、約６５０ｎｍで蛍光発光ピークを示すことができる。これらの色素は、例えば、赤色半導体レーザー励起源からの光に曝露された場合、容易に蛍光することができる。
【００４３】
本発明のチオール反応性基スクエアレイン核の実施形態は、式ＩＶおよび式Ｖの構造を有する。
【００４４】
【化１０】
2008500446.tif 000012
【００４５】
式中、Ｒ’はＨまたはＯＨであり、Ｒ’’は独立してメチル、エチルまたはプロピルであり、Ｒ４はＣ１からＣ６のアルキルまたは（ＣＨ２）ｑＣＯ２Ｈであり（式中、ｑは１から５の整数）、ＺおよびＺ’は独立してＳ、Ｏ、またはＣ（ＣＨ３）２であり、ＷおよびＷ’は独立してＨ、ＣＨ３、ＳＯ３Ｈ、縮合ベンゼン、または縮合スルホベンゼンであり、およびＹは前述の定義通りである。
【００４６】
１つの実施形態では、チオール反応性スクエアレイン核は、式
【００４７】
【化１１】
2008500446.tif 000013
【００４８】
を有する。式中、Ｒ４は、化合物２においてはエチル、または化合物３においては（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈである。
【００４９】
別の実施形態には、一般に約５５０ｎｍの吸光度、および約５７５ｎｍまたはこれを超える発光極大を有するナイルレッド核がある。これらの核は、典型的には、脂質環境では発光極大が６５０ｎｍまでシフトする。１つの実施形態では、ナイルレッド核は、式
【００５０】
【化１２】
2008500446.tif 000014
【００５１】
を有する。式中、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、独立してメチル、エチルまたはプロピルであり、およびＹは前述の定義通りである。
【００５２】
１つの実施形態では、ナイルレッド核は、式
【００５３】
【化１３】
2008500446.tif 000015
【００５４】
を有する。
【００５５】
１つの実施形態には、式
【００５６】
【化１４】
2008500446.tif 000016
【００５７】
を有するベンゾジオキサゾール核がある。式中、ｒは１から３の整数であり、Ｒ８、Ｒ９、は独立してＣ１からＣ６のアルキルまたは（ＣＨ２）ｓＣＯ２Ｈ（式中、ｓは、２から５の整数）である。ＺはＳ、Ｏ、またはＣ（ＣＨ３）２である。ＷはＨ、ＣＨ３、ＳＯ３Ｈ、縮合ベンゼン、または縮合スルホベンゼンである。Ｙは前述の定義通りである。
【００５８】
１つの実施形態では、ベンゾジオキサゾール核は、式
【００５９】
【化１５】
2008500446.tif 000017
【００６０】
を有する。
【００６１】
別の実施形態には、式
【００６２】
【化１６】
2008500446.tif 000018
【００６３】
または
【００６４】
【化１７】
2008500446.tif 000019
【００６５】
を有するクマリン核およびアザクマリン核がある。式中、ＤはＣＨまたはＮであり、ｒは１から３の整数であり、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、独立してＣ１からＣ６のアルキルまたは（ＣＨ２）ｓＣＯ２Ｈ（式中、ｓは、２から５の整数）であり、ＺはＳ、Ｏ、またはＣ（ＣＨ３）２である。ＷはＨ、ＣＨ３、ＳＯ３Ｈ、縮合ベンゼンまたは縮合スルホベンゼンであり、Ｙは前述の定義通りである。
【００６６】
１つの実施形態では、アザクマリン核は、式
【００６７】
【化１８】
2008500446.tif 000020
【００６８】
を有する。
【００６９】
本発明のスクエアレイン核の実施形態は、さまざまな既知の技術により合成することができる。対称核は、スクアリン酸との芳香族求核剤の反応により調製することができる。ヨードアセチルスクエアレインを生成する第１の反応スキームは、以下のようなスキームＩに表される。
【００７０】
【化１９】
2008500446.tif 000021
【００７１】
ヨードアセトアミジルスクエアレイン核誘導体を生成するための第２の反応スキームは、以下のようなスキームＩＩに表される。
【００７２】
【化２０】
2008500446.tif 000022
【００７３】
また、ナイルレッド核誘導体の実施形態は、さまざまな反応スキームを用いて調製することができる。ヨードアセチル誘導体を生成する第１の反応スキームは、以下のようなスキームＩＩＩに表される。
【００７４】
【化２１】
2008500446.tif 000023
【００７５】
ヨードアセトアミジル誘導体を生成する第２の反応スキームは、以下のようなスキームＩＶに表される。
【００７６】
【化２２】
2008500446.tif 000024
【００７７】
ベンゾジオキサゾール核誘導体の実施形態を生成する方法は、以下のような反応スキームＶに表される。
【００７８】
【化２３】
2008500446.tif 000025
【００７９】
スキームＶは、以下のスキームＶＩに示す通り、他の環系を含有するベンゾジオキサゾール核誘導体を生成するために修正することができる。
【００８０】
【化２４】
2008500446.tif 000026
【００８１】
ベンゾジオキサゾール核誘導体を生成する代替方法は、反応スキームＶＩａに示される。
【００８２】
【化２５】
2008500446.tif 000027
【００８３】
ベンゾジオキサゾール核をヨードアセチルリンカーと合成する例示的方法は、スキームＶＩＩに表される。
【００８４】
【化２６】
2008500446.tif 000028
【００８５】
ベンゾジオキサゾール核誘導体を生成する代替方法は、反応スキームＶＩＩａに示される。
【００８６】
【化２７】
2008500446.tif 000029
【００８７】
アザクマリン核誘導体を生成する例示的方法は、反応スキームＶＩＩＩに表される。
【００８８】
【化２８】
2008500446.tif 000030
【００８９】
アザクマリン核誘導体を生成する代替方法は、反応スキームＶＩＩＩａに表される。
【００９０】
【化２９】
2008500446.tif 000031
【００９１】
クマリン核を生成する例示的方法は、反応スキームＩＸに表される。
【００９２】
【化３０】
2008500446.tif 000032
【００９３】
クマリン核誘導体を生成する別の方法は、反応スキームＩＸａに表される。
【００９４】
【化３１】
2008500446.tif 000033
【００９５】
本発明の別の実施形態では、ベンゾジオキサゾール核、スクエアレイン核、ナイルレッド核、クマリン核、およびアザクマリン核は、蛍光発光を有する。１つの実施形態では、上記特定の蛍光核は、約５７５ｎｍを超える蛍光発光を有する。
【００９６】
１つの実施形態では、結果として得られたチオール反応性核を結合タンパク質と反応させて、バイオセンサーとして有用な蛍光結合タンパク質複合体を生成する。
【００９７】
１つの実施形態では、結果として得られるスクエアレイン核−結合タンパク質複合体は、以下のマーカッシュ構造式を有する。
【００９８】
【化３２】
2008500446.tif 000034
【００９９】
式中、Ｙ’−Ｂは、
【０１００】
【化３３】
2008500446.tif 000035
【０１０１】
（式中、ｎは１から６の整数）であり、またはＹ’−Ｂは、Ａ’−ＣＯ−Ｖ−Ｂであり、Ａ’は−Ｒ２Ｏ−または−Ｒ２Ｎ（Ｒ３）−である。Ｒ２はＣ１からＣ６のアルキルである。１つの実施形態では、Ｒ２はＣ２からＣ４のアルキルである。Ｒ３はＨまたはＣＨ３である。Ｖ−Ｂは、−ＣＨ２−Ｂまたは
【０１０２】
【化３４】
2008500446.tif 000036
【０１０３】
（式中、ｍは２から６の整数）である。１つの実施形態では、Ｒ２Ｏは−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−である。別の実施形態では、Ｒ２Ｎ（Ｒ３）は、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であり、Ｂは結合タンパク質である。
【０１０４】
１つの実施形態では、結果として得られるナイルレッド核−結合タンパク質複合体は、以下のマーカッシュ構造式を有する。
【０１０５】
【化３５】
2008500446.tif 000037
【０１０６】
式中、Ｙ’Ｂは前述の定義通りであり、Ｂは結合タンパク質である。
【０１０７】
１つの実施形態では、結果として得られるベンゾジオキサゾール核−結合タンパク質複合体は、以下のマーカッシュ構造式を有する。
【０１０８】
【化３６】
2008500446.tif 000038
【０１０９】
式中、Ｙ’Ｂは前述の定義通りであり、Ｂは結合タンパク質である。
【０１１０】
１つの実施形態では、結果として得られるクマリン、およびアザクマリン核−結合タンパク質複合体は、以下のマーカッシュ構造式を有する。
【０１１１】
【化３７】
2008500446.tif 000039
【０１１２】
式中、Ｙ’Ｂは前述の定義通りであり、Ｂは結合タンパク質である。
【０１１３】
１つの実施形態では、結果として得られる結合タンパク質複合体は、以下の式を有する。
【０１１４】
【化３８】
2008500446.tif 000040
【０１１５】
【化３９】
2008500446.tif 000041
【０１１６】
【化４０】
2008500446.tif 000042
【０１１７】
結合タンパク質Ｂにはチオール基、例えば、システイン残基があり、チオール反応性蛍光色素と反応できる。「結合タンパク質」という用語は、記載の方法により、分析物が存在しない場合から、分析物が時間とともに変動する濃度で存在している場合のいずれの場合をも識別できる形式、または濃度に依存する形式の検出可能シグナルの変換または提供を可能にする形で、特定の分析物と反応するタンパク質のことをいう。本明細書では、検出可能なシグナルを変換できる、または「検出可能なシグナルを提供する」とは、リガンド−タンパク質結合の検出を可能にする形でレポーター基の特性変化を認識する能力のことである。例えば、１つの実施形態では、変異ＧＧＢＰは、グルコース結合するとその検出可能特性が変化する検出可能レポーター基を含む。検出可能な特性変化は、変異ＧＧＢＰに付加した標識環境が変化、または結合の結果としてタンパク質の立体構造が変化することが原因となりうる。検出可能なシグナルの変換または提供は、可逆的または非可逆的でありうる。本明細書では、検出可能なシグナルを変換または提供するという用語は、同じ意味で使われる。変換事象には、１回限りの適用または再利用可能な適用も含め、連続的、プログラムされた、および一時的な方法が挙げられる。可逆的なシグナル変換は、即時的または時間依存的であることができ、分析物の存在または濃度との相関を示すことが証明されている。変換に影響を与える形で変異した結合タンパク質が、本発明の実施形態である。結合タンパク質としては、グルコース／ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、アロース結合タンパク質、アラビノース結合タンパク質、ジペプチド結合タンパク質、グルタミン酸／アスパラギン酸結合タンパク質、グルタミン結合タンパク質、Ｆｅ（ＩＩＩ）結合タンパク質、ヒスチジン結合タンパク質、ロイシン結合タンパク質、ロイシン／イソロイシン／バリン結合タンパク質、リジン／アルギニン／オルニチン結合タンパク質、モリブデン結合タンパク質、オリゴペプチド結合タンパク質、フォスフェート結合タンパク質、リボース結合タンパク質、硫酸結合タンパク質、Ｚｎ（ＩＩ）結合タンパク質、およびビタミンＢ−１２結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
本明細書では、「グルコース／ガラクトース結合タンパク質」すなわち「ＧＧＢＰ」または「マルトース結合タンパク質」すなわち「ＭＢＰ」という用語は、本来、細菌のペリプラズム画分に見られるタンパク質の一種をいう。これらのペリプラズムタンパク質は、本来、小分子（例えば、糖、アミノ酸、および小ペプチドなど）の細胞質への走化性および輸送に関与している。例えば、ＧＧＢＰは、ヒンジを形成する３本のストランドによって接続される２つの球状α／βドメインからなる単鎖タンパク質である。結合部位は、２つの球状ドメイン間の凹み（ｃｌｅｆｔ）にある。グルコースが結合部位に入ると、ＧＧＢＰは立体構造の変化を起こし、ヒンジに集中する。これが２つのドメインを接合させ、グルコースを結合部位に取り込む。野生型大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＧＧＢＰ  ＤＮＡおよびアミノ酸配列は、非特許文献２（ゲノムクローン）および非特許文献３（アミノ酸配列）で見ることができる（非特許文献２および３参照）。１つの実施形態では、ＧＧＢＰは大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）由来である。
【０１１９】
本明細書では、「変異結合タンパク質」（例えば、「変異ＧＧＢＰ」など）は、少なくとも１つのアミノ酸がタンパク質に置換、欠失、付加されている、細菌由来の結合タンパク質をいう。
【０１２０】
結合タンパク質の変異には、例えば、システイン基の付加または置換、非天然由来のアミノ酸、および本来は非反応性であるアミノ酸と反応性アミノ酸との置換などがある。
【０１２１】
さらなる実施形態は、位置１１でリジンを置換したシステイン（Ｋ１１Ｃ）、位置１４でアスパラギン酸を置換したシステイン（Ｄ１４Ｃ）、位置１９でバリンを置換したシステインで（Ｖ１９Ｃ）、位置４３でアスパラギンを置換したシステイン（Ｎ４３Ｃ）、位置７４でグリシンを置換したシステイン（Ｇ７４Ｃ）、位置１０７でチロシンを置換したシステイン（Ｙ１０７Ｃ）、位置１１０でトレオニンを置換したシステイン（Ｔ１１０Ｃ）、位置１１２でセリンを置換したシステイン（Ｓ１１２Ｃ）、位置１１２でセリンを置換したシステインおよび位置２３８でロイシンを置換したセリンを含む二重変異体（Ｓ１１２Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）、位置１１３でリジンを置換したシステイン（Ｋ１１３Ｃ）、位置１３７でリジンを置換したシステイン（Ｋ１３７Ｃ）、位置１４９でグルタミン酸を置換したシステイン（Ｅ１４９Ｃ）、位置１４９でグルタミン酸を置換したシステインおよび位置２１３でアラニンを置換したアルギニンを含む二重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ）、位置１４９でグルタミン酸を置換したシステインおよび位置２３８でロイシンを置換したセリンを含む二重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）、位置２１３でアラニンを置換したセリンおよび位置１５２でヒスチジンを置換したシステインを含む二重変異体（Ｈ１５２Ｃ／Ａ２１３Ｓ）、位置１８２でメチオニンを置換したシステイン（Ｍ１８２Ｃ）、位置２１３でアラニンを置換したシステイン（Ａ２１３Ｃ）、位置２１３でアラニンを置換したシステインおよび位置２３８でロイシンを置換したシステインを含む二重変異体（Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｃ）、位置２１６でメチオニンを置換したシステイン（Ｍ２１６Ｃ）、位置２３６でアスパラギン酸を置換したシステイン（Ｄ２３６Ｃ）、位置２３８でロイシンを置換したシステイン（Ｌ２３８Ｃ）、位置２８７でアスパラギン酸を置換したシステイン（Ｄ２８７Ｃ）、位置２９２でアルギニンを置換したシステイン（Ｒ２９２Ｃ）、位置２９６でバリンを置換したシステイン（Ｖ２９６Ｃ）、位置１４９でグルタミン酸を置換したシステイン、位置２１３でアラニンを置換したセリンおよび位置２３８でロイシンを置換したセリンを含む三重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｓ／Ｌ２３８Ｓ）、位置１４９でグルタミン酸を置換したシステイン、位置２１３でアラニンを置換したアルギニンおよび位置２３８でロイシンを置換したセリンを含む三重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）、位置１４９でグルタミン酸を置換したシステイン、位置２１３でアラニンを置換したシステインおよび位置２３８でロイシンを置換したセリンを含む三重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）を有するＧＧＢＰタンパク質変異である。さらなる実施形態には、Ｙ１０Ｃ、Ｎ１５Ｃ、Ｑ２６Ｃ、Ｅ９３Ｃ、Ｈ１５２Ｃ、Ｍ１８２Ｃ、Ｗ１８３Ｃ、Ｌ２５５Ｃ、Ｄ２５７Ｃ、Ｐ２９４Ｃ、およびＶ２９６ＣでのＧＧＢＰ変異が挙げられる。
【０１２２】
さらなる実施形態は、例えば、Ｄ９５Ｃ、Ｆ９２Ｃ、Ｉ３２９Ｃ、Ｓ２３３Ｃ、およびＳ３３７Ｃを含むマルトース結合タンパク質変異がある。
【０１２３】
さらなる実施形態は、例えば、Ｅ１６７Ｃ、Ｋ２２９Ｃ、Ｖ１６３Ｃ、Ｙ２３０Ｃ、Ｙ２３１Ｃ、およびＹ８８Ｃを含むヒスチジン結合タンパク質がある。
【０１２４】
さらなる実施形態は、例えば、Ｌ６５Ｃ、Ｎ７０Ｃ、Ｑ２９４Ｃ、Ｒ１３４Ｃ、Ｗ２９０Ｃ、およびＹ６７Ｃを含むサルフェート−結合タンパク質変異がある。
【０１２５】
さらなる実施形態は、例えば、Ｄ２７５Ｃ、Ｆ２３Ｃ、Ｋ３０１Ｃ、Ｌ２５３Ｃ、およびＬ２９８Ｃを含むアラビノース−結合タンパク質がある。
【０１２６】
さらなる実施形態は、例えば、Ｄ４５０Ｃ、Ｋ３９４Ｃ、Ｒ１４１Ｃ、Ｓ１１１Ｃ、Ｔ４４Ｃ、およびＷ３１５Ｃを含むジペプチド−結合タンパク質変異がある。
【０１２７】
さらなる実施形態は、例えば、Ａ２０７Ｃ、Ａ２１０Ｃ、Ｅ１１９Ｃ、Ｆ１２６Ｃ、Ｆ１３１Ｃ、Ｆ２７０Ｃ，Ｇ２１１Ｃ、Ｋ２６８Ｃ，Ｑ１２３Ｃ、およびＴ１２９Ｃを含むグルタミン酸／アスパラギン酸−結合タンパク質変異がある。
【０１２８】
さらなる実施形態は、例えば、Ｎ１６０Ｃ、Ｆ２２１Ｃ、Ｋ２１９Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｗ２２０Ｃ、Ｙ１６３Ｃ、およびＹ８６Ｃを含むグルタミン−結合タンパク質変異がある。
【０１２９】
さらなる実施形態は、例えば、Ｅ２０３Ｃ、Ｋ２０２Ｃ、Ｋ８５Ｃ、およびＶ２８７Ｃを含むＦｅ（ＩＩＩ）−結合タンパク質変異がある。
【０１３０】
さらなる実施形態は、例えば、Ｔ１３５Ｃ、Ｄ１６５Ｃ、Ｅ１９２Ｃ、Ａ２３４Ｃ、Ｌ２３６Ｃ、およびＬ２６５Ｃを含むリボース−結合タンパク質変異がある。
【０１３１】
さらなる実施形態は、例えば、Ａ２２５Ｃ、Ｎ２２３Ｃ、Ｎ２２６Ｃ、Ｓ１６４Ｃ、Ｓ３９Ｃ、およびＡ１９７Ｃを含むフォスフェート−結合タンパク質変異がある。
【０１３２】
変異は、１つまたは複数のいくつかの目的に役立つことができる。例えば、天然由来のタンパク質を、タンパク質の長期安定性を変えるために変異させて、タンパク質を特定の封入マトリックスまたはポリマーに結合させること、結合部位に検出可能レポーター基を提供すること、特定の分析物に関してその結合定数を調整すること、またはそれらの組み合わせを行うことができる。長期安定性には、熱安定性が含まれることが意図されている。
【０１３３】
１つの実施形態では、分析物および変異タンパク質は、結合パートナーとして作用する。本明細書では、「結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｓまたはｂｉｎｄｓ）」は、タンパク質への結合を、検出手段により検出できるほど十分に強力な相対結合定数（Ｋｄ）を有する結合パートナーのことをいう。Ｋｄは、タンパク質の半分が結合している（またはその逆の）遊離分析物の濃度として計算することができる。関心のある分析物がグルコースの場合、結合パートナーのＫｄ値は、約０．０００１ｍＭ〜約５０ｍＭの間となる。
【０１３４】
蛍光標識を、当技術分野では既知の任意の慣用の方法により、変異タンパク質、例えばＧＧＢＰに付加することができる。例えば、レポーター基は、タンパク質のアミン残基またはカルボキシル残基を介して付加することができる。例示的な実施形態には、変異タンパク質または天然タンパク質のシステイン残基のチオール基を介した共有結合がある。例えば、変異ＧＧＢＰでは、システインは、位置１０、位置１１、位置１４、位置１５、位置１９、位置２６、位置４３、位置７４、位置９２、位置９３、位置１０７、位置１１０、位置１１２、位置１１３、位置１３７、位置１４９、位置１５２、位置１５４、位置１８２、位置１８３、位置１８６、位置２１１、位置２１３、位置２１６、位置２３８、位置２４０、位置２４２、位置２５５、位置２５７、位置２８７、位置２９２、位置２９４、および位置２９６にあることができる。
【０１３５】
当技術分野では既知のチオール反応性基は、フルオロフォアなどのレポーター基を、天然または工学処理した、または変異したタンパク質のシステインに付加するのに使用することができる。例えば、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、またはマレイミドなどは、この目的に用いることのできる、十分に既知のチオール反応性部分である。
【０１３６】
長い発光波長（例えば、約５７５ｎｍ以上）で作用するフルオロフォアは、分子センサーがインビボで使用される場合、例えば、埋め込み型バイオセンサー装置（皮膚は、約５７５ｎｍ未満で不透明な状態である）へ組み込まれる場合の実施形態である。例えば、変異ＧＧＢＰにおいて構築されたさまざまなシステイン変異体に付加された、これらのフルオロフォアを含有する複合体をスクリーニングして、グルコース結合の際に蛍光強度に最大の変化をもたらす結果となるものを特定することができる。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例は、本発明のさまざまな実施形態を説明するものである。
【０１３８】
（実施例１）
この実施例では、ヨードエステルスクエアレイン核１を生成するために、スキームＩの工程を使用した。
【０１３９】
中間体１ｃ：ブタノール（５ｍＬ）およびベンゼン（５ｍＬ）の混合物を、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチルアニリン１ａ（３２２ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）および４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−３−ヒドロキシ−シクロブタン−１，２−ジオン１ｂ（４３４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）の入ったフラスコに添加した。混合物を加熱して還流し、４Åモレキュラーシーブ５ｇを添加した。１時間後、混合物は明るい青緑色に変化した。２４時間後、混合物は、濃い緑青色の懸濁液になった。溶剤を蒸発させ、残留物を酢酸エチル（２５ｍＬ）で洗浄した。残りの残留物を水で洗浄し、紺色の残留物を残した。この混合物をソックスレーシンブル（ｓｏｘｈｌｅｔ  ｔｈｉｍｂｌｅ）に移し、塩化メチレンにより一晩かけて抽出した。蒸発後、残留物を酢酸エチルで洗浄し、紺色の固体のＮ−（ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ−トリメチル−ビス（４−アミノフェニル）−スクエアレイン１ｃ（２２３ｍｇ、３０％）を生成した。
【０１４０】
化合物１：ＤＭＦ１滴を、塩化メチレン（５ｍＬ）中のヨード酢酸（２２４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）溶液に添加し、その結果得られた溶液を１分間かけて塩化オキサリル（１８０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）に滴下添加した。激しいバブリングが治まった後、薄いオレンジ色の溶液を３０分間２５℃にて攪拌した。溶剤を真空下（〜１４ｍｍＨｇ）で除去して、濃いオレンジ色の残留物を真空下で１５分間保持した。この残留物を塩化メチレン（５ｍＬ）中で溶解し、ヨードアセチルクロライド溶液を生成した。前記の合成により得られたヒドロキシエチルスクエアレイン１ｃ（１７５ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を、塩化メチレン（２０ｍＬ）中で懸濁した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１５４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）および予め調製したヨードアセチルクロライド溶液をスクエアレイン縣濁液に順次的に分割添加した。その結果得られた青色の不均一混合物を、２５℃で２時間攪拌した。溶剤を蒸発させて、その結果得られた紺色の固体を１０ｍＬの酢酸エチルで６回、エチルエーテルで６回洗浄し、真空下で乾燥させた。これにより、薄い紫がかった青色の固体である２０４ｍｇのヨードアセチルエステル１を得た。蛍光スペクトル（メタノール）：最大励起６４３ｎｍ、最大発光６６９ｎｍ。
【０１４１】
（実施例２）
この実施例では、ヨードアセトアミドスクエアレイン核２は、スキームＩＩの工程により生成された。この実施例は、ＲがＣ２Ｈ５であるスキームＩＩに対応する。
【０１４２】
中間体２ｂ：２−メチルベンゾチアゾール（１ｍＭ）２ａおよびＮ−ブロモエチルフタルイミド（１ｍＭ）を、丸底フラスコで１００℃にて２４時間加熱した。その結果得られた固体を濾過により分離し、クロロホルムを用いた連続洗浄により精製して中間体２ｂを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，ＴＭＳ）δｐｐｍ：４．２９５（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．８７１（ｓ，ＣＨ３，３Ｈ）；５．１０２（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；７．７３３および８．１４８〜８．２７９（ｍ，芳香族，８Ｈ）。
Ｃ１８Ｈ１５Ｎ２Ｏ２Ｓの分子量の計算値は３２３（Ｍ＋）、実測値３２３（ＦＡＢ）
【０１４３】
中間体２ｃ：ジブチルスクエアレートを、３−エチル−２−メチル−ヨウ化ベンゾチアゾリウムと（１：１の比）、エタノール中で還流して反応させた。３０分間の還流後、反応混合物を熱時濾過した。冷却する間に濾液よりオレンジ色の固体が結晶化し、これを分離してエタノール中で再懸濁し、還流下で４０％のＮａＯＨ溶液により処理した。３０分後、内容物を冷却して２ＮのＨＣｌで酸性化した（ｐＨを４に調整）。生成物をクロロホルムで抽出して中間体２ｃを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δｐｐｍ：１．３８５（ｔ，ＣＨ３，３Ｈ）；１．４５６（ｔ，ＣＨ３，３Ｈ）；４．０６４（ｑ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．７９４（ｑ，ＣＨ２，２Ｈ）；５．４７９（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；７．０２６〜７．５１８（ｍ，芳香族，４Ｈ）。
Ｃ１４Ｈ１１ＮＯ３Ｓの分子量の計算値は２７３（Ｍ＋）、実測値２７３（ＦＡＢ）
【０１４４】
中間体２ｄ：中間体２ｂおよび２ｃを、１：１（ｖ／ｖ）のトルエンおよびｎ−ブタノール含有溶剤混合物中で反応させた。反応混合物を共沸蒸留にかけ、反応中に生成した水をディーン−スタークトラップ（Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ  ｔｒａｐ）を用いて除去した。６時間後、反応混合物を室温まで冷却し、青色の生成物を濾過して取り出した。溶離剤にメタノールおよびクロロホルム（１：４の比）を用い、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いてさらなる精製を行い、色素２ｄを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δｐｐｍ：１．４３９（ｔ，ＣＨ３，３Ｈ）；４．１２７（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．１８１（ｑ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．３８１（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；５．９２４（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；５．９６４（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；７．０７０〜７．８２３（ｍ，芳香族，１２Ｈ）。
Ｃ３２Ｈ２３Ｎ３Ｏ４Ｓ２の分子量の計算値は５７７（Ｍ＋）、実測値５７７（ＦＡＢ）。
【０１４５】
中間体２ｅ：色素２ｄを無水塩化メチレン中で溶解し、室温でヒドラジンモノハイドレートにより処理した。脱保護したスクエアレイン色素を、反応混合物から沈降させて濾過により分離し、続いて塩化メチレンで反復洗浄した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，ＴＭＳ）δｐｐｍ：１．４２０（ｔ，ＣＨ３，３Ｈ）；３．７８０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．３２０（ｑ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．５２０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；５．９２４（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；５．９６４（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；７．２００〜７．８５０（ｍ，芳香族，８Ｈ）。
Ｃ２４Ｈ２１Ｎ３Ｏ２Ｓ２の分子量の計算値は４４７（Ｍ＋）、実測値４４７（ＦＡＢ）
【０１４６】
化合物２：中間体色素２ｅを無水塩化メチレン中で溶解し、等量のヨード酢酸無水物を添加した。混合物を室温で３時間攪拌し、生成物を溶剤の蒸発により分離して最終色素２を得た。ヘキサン／塩化メチレンからの沈降を繰り返して精製を行った。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，ＴＭＳ）δｐｐｍ：１．４２０（ｔ，ＣＨ３，３Ｈ）；３．９００（ｓ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．３００（ｑ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．４５０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．４８０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；５．８２０（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；５．９８０（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；７．２００〜８．２００（ｍ，芳香族，８Ｈ）。
Ｃ２６Ｈ２２ＩＮ３Ｏ３Ｓ２の分子量の計算値は６１５（Ｍ＋）、実測値６１５（ＦＡＢ）。
【０１４７】
クロロホルム中の化合物２の具体的な吸光スペクトルを、図１に示している。クロロホルム中の化合物２の励起スペクトルおよび発光スペクトルを、図２に示す。
【０１４８】
（実施例３）
この実施例では、Ｒが、スキームＩＩの中間体３ｃのＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈであること以外は、実施例２の工程が繰り返された。その結果得られた、保護アミノ基を備えた中間体色素３ｄは、ＮＭＲ分光法により特性化された。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ）δｐｐｍ：２．７２０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；３．９７０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．４７０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．５３０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；５．７６０（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；５．８００（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；７．１００〜８．４５０（ｍ，芳香族，１２Ｈ）。
【０１４９】
化合物３：３ｄのアミノ基の脱保護を、メタノール中の１Ｍのメチルアミンとメタノール中の親色素溶液を攪拌することにより、メタノール中のメチルアミンを用いて行った。生成物を、溶剤の蒸発により分離した。色素の脱保護したアミン誘導体３ｅを、塩化メチレン中でヨード酢酸無水物と反応させ（１：１）、最終生成物を濾過により分離した。最終色素３を、塩化メチレンおよびヘキサンを用いて繰り返し沈降させて精製した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ）δｐｐｍ：１．４２０（ｔ，ＣＨ３，３Ｈ）；３．９００（ｓ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．３００（ｑ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．４５０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．４８０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；５．８２０（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；５．９８０（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；７．２００〜８．２００（ｍ，芳香族，８Ｈ）。
【０１５０】
（実施例４）
この実施例では、チオール反応性ナイルレッド核４は、スキームＩＩＩにより調製された。
【０１５１】
中間体４ｂ：Ｎ−フェニル−Ｎ−メチル−エタノールアミン４ａ（５０ｍｍｏｌ）を、濃ＨＣｌ（２８ｍＬ）中で懸濁して５℃に冷却した。この溶液に、亜硝酸ナトリウム溶液（水１０ｍＬ中６．６７ｇ）を４０分間かけて滴下添加した。添加後、反応物を２時間超攪拌し続けた。次に、生成物を濾過し、０．５ＭのＨＣｌで洗浄し真空中で乾燥してニトロソ化合物４ｂを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ：３．５９（ｓ，ＣＨ３，３Ｈ）；３．９０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．０５（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；７．２２〜７．３０（ｍ，芳香族，２Ｈ）；７．５０（ｄ，芳香族，１Ｈ）；７．７７（ｄ，芳香族，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ：４２．４４、５７．９２、５８．７２、１２０．２９、１２２．５２、１２５．９３、１４０．５６、１４９．９３、１６３．２１。
Ｃ９Ｈ１２Ｎ２Ｏ２の分子量の計算値は１８０（Ｍ＋）、実測値１８１（Ｍ＋１）（ＦＡＢ）
【０１５２】
中間体４ｄ：１，３−ジヒドロキシナフタレン４ｃ（５ｍｍｏｌ）を、エタノール（２５ｍＬ）中で懸濁し、攪拌しながら還流させた。還流液に、４５分間かけて中間体４ｂ（５ｍｍｏｌ）を分割添加した。添加後、反応混合物を還流で４時間を超えて維持し、次いで冷却した。溶剤を蒸発させ、溶離剤にメタノールおよびクロロホルム（１：９）を用い、生成物色素をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：２．９８（ｓ，３Ｈ）、３．４８（ｔ，２Ｈ）、３．８３（ｔ，２Ｈ）、６．２０（ｓ，１Ｈ）、６．７７（ｄ，１Ｈ）、７．１０（ｄ，１Ｈ）、７．４５（ｓ，１Ｈ）、７．６０〜７．７５（ｍ，３Ｈ）、７．７２（ｍ，１Ｈ）、８．０８（ｍ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：３９．２、５５．６、６０．３、１０２．２、１１０．２、１１３．６、１２４．７、１２６．３、１２６．６、１２６．８、１３０．６、１３２．３、１３３．７、１３５．１、１４５．８、１４８．２、１５２．４、１８２．５、１８３．８。
Ｃ１９Ｈ２６Ｎ２Ｏ３の分子量の計算値は３２０（Ｍ＋）、実測値３２１（Ｍ＋１）（ＦＡＢ）
【０１５３】
化合物４：中間体色素４ｄを無水アセトニトリル（１０ｍＬ）中で溶解し、ｐ−ジメチルアミノピリジン（３ｍｇ）、次にヨード酢酸無水物（２５０ｍｇ）を添加した。反応物を２時間攪拌した。生成物４を溶剤の蒸発により分離し、次いで塩化メチレンおよびヘキサンからの沈降を繰り返して精製を行った。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：３．１４（ｓ，３Ｈ）、３．６６（ｓ，２Ｈ）、３．７４（ｔ，２Ｈ）、４．３８（ｔ，２Ｈ）、６．４０（ｓ，１Ｈ，ＡｒＨ）、６．５４（ｄ，１Ｈ，ＡｒＨ）、６．７２（ｄ，１Ｈ，ＡｒＨ）、７．６４〜７．７５（ｍ，３Ｈ，ＡｒＨ）、８．２９（ｄ，１Ｈ，ＡｒＨ）、８．６５（ｄ，１Ｈ，ＡｒＨ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：−６．１、３９．６、５０．９、６３．０、９７．５、１０６．４、１１０．１、１２４．１、１２５．６、１２６．０、１３０．６、１３１．２、１３１．７、１３１．９８、１３２．０、１４１．５、１４６．５、１５１．８、１５２．２、１６９．０、１８４．１。
Ｃ２１Ｈ１７ＩＮ２Ｏ４の分子量の計算値は４８８、実測値４８９（ＭＨ＋）（ＦＡＢ−ＭＳ）。
【０１５４】
（実施例５）
この実施例は、スキームＩＶの工程によりナイルレッド核５を生成した。
【０１５５】
中間体５ｂ：９−ジメチルアミノ−２−ヒドロキシ−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン５ａ（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモエチルフタルイミド（５０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（６０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を、攪拌しながらアルゴン下のＤＭＦ（１５ｍＬ）中で混合した。４．５時間還流して反応を進めた。さらなるブロモエチルフタルイミド（２５ｍｇ）を４．５時間目および６．５時間目（１５ｍｇ）に添加した。温度を１１５℃に下げ、一晩かけて反応を進めた。ＤＭＦを真空下で除去し、残留物を真空下で乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により、３８ｍｇの生成物２−（２−フタルイミジルエトキシ）−ナイルレッド５ｂを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１．２２（ｔ，６Ｈ）、３．４０（ｑ，４Ｈ）、４．１９（ｔ，２Ｈ）、４．４０（ｔ，２Ｈ）、６．２３（ｓ，１Ｈ）、６．３６（ｄ，１Ｈ）、６．５９（ｄｄ，１Ｈ）、７．０９（ｄ，１Ｈ）、７．５２（ｄ，１Ｈ）、７．７０（ｍ，２Ｈ）、７．８４（ｍ，２Ｈ）、７．９６（ｄ，１Ｈ）、８．１３（ｄ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１２．８、３７．５、４５．２、６５．３、９６．３、１０５．２、１０６．５、１０９．８、１１８．６、１２３．５、１２４．９、１２６．０、１２７．９、１３１．３、１３２．１、１３４．２、１３９．６、１４６．８、１５０．７、１５２．２、１６１．０、１６２．８、１６８．４、１８３．３。
Ｃ３０Ｈ２５Ｎ３Ｏ５の分子量の計算値は５０７、実測値５０８（ＭＨ＋）（ＦＡＢ−ＭＳ）。
【０１５６】
中間体５ｃ：中間体５ｂ（３０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＯＨ（８ｍＬ）中で溶解し、アルゴン下に置いた。次に、メチルアミン（ＭｅＯＨ中２Ｍ、４ｍＬ、８ｍｍｏｌ））を添加した。反応をＲＴで５分間、還流で２．５時間行った。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２中で行って動きの速い不純物を除去し、次いで３０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で行って生成物２−（２−アミノエトキシ）−ナイルレッド５ｃを溶出した。溶剤をロータリーエバポレータで除去し、残留物を真空下で蒸発させた。収量：１１ｍｇ。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１．２５（ｔ，６Ｈ）、３．１７（ｔ，２Ｈ）、３．４５（ｑ，４Ｈ）、４．２０（ｔ，２Ｈ）、６．２７（ｓ，１Ｈ）、６．４３（ｄ，１Ｈ）、６．６３（ｄｄ，１Ｈ）、７．１５（ｍ，１Ｈ）、７．５６（ｄ，１Ｈ）、８．０２（ｍ，１Ｈ）、８．１８（ｄ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１２．８、４１．６、４５．３、６３．９、９６．４、１０５．４、１０６．６、１０９．９、１１８．４、１２４．９、１２５．９、１２７．４、１２８．０、１３１．３、１３４．３、１４７．１、１５１．０、１５２．３、１６１．７、１８３．５。
Ｃ２２Ｈ２３Ｎ３Ｏ３の分子量の計算値は３７７、実測値３７８（ＭＨ＋）（ＦＡＢ−ＭＳ）。
【０１５７】
化合物５：中間体５ｃ（１１ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中で溶解した。ヨード酢酸無水物（２１ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を次いで添加し、４０分間反応させた。ＣＨ２Ｃｌ２２５ｍＬをさらに添加して、反応混合物を分液漏斗に移した。有機相を、１０％Ｎａ２ＣＯ３（各１０ｍＬ）で２度洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶剤をロータリーエバポレータで除去した後、最終生成物２−ヨードアセチルアミドエトキシ−ナイルレッド核５を真空下で乾燥させ、ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサンから沈降させた。収量：３．４ｍｇ。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１．１７（ｔ，６Ｈ）、３．３５（ｑ，４Ｈ）、３．６９（ｔ，２Ｈ）、３．７８（ｓ，２Ｈ）、４．１４（ｔ，２Ｈ）、６．１２（ｓ，１Ｈ）、６．２７（ｓ，１Ｈ）、６．４８（ｄｄ，１Ｈ）、６．９１（ｄ，１Ｈ）、７．３４（ｄ，１Ｈ）、７．７４（ｓ，１Ｈ）、７．９５（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１２．９、２９．９、４０．１、４５．３、６６．９、９６．３、１０５．２、１０６．７、１０９．８、１１８．０、１２４．９、１２５．９、１２７．８、１３１．３、１３４．１、１３９．４、１４７．０、１５１．０、１５２．２、１６１．１、１６８．１、１８３．３。
Ｃ２４Ｈ２４ＩＮ３Ｏ４の分子量の計算値は５４５、実測値５４６（Ｍ−Ｈ＋）（ＣＩ−ＭＳ）。
【０１５８】
（実施例６）
この実施例は、スキームＶによりヨードアセトアミドベンゾジオキサゾール核６を生成した。
【０１５９】
中間体６ｂ：アミノベンゾジオキサゾール６ａ（１０ｍｍｏｌ）を、無水炭酸カリウム存在下で臭化エチル（５０ｍｍｏｌ）と反応させた。生成物を、クロロホルムおよびメタノールを用いてシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製し、６５％収量の中間体６ｂを得た。
【０１６０】
Ｃ１０Ｈ１３Ｎ３Ｏの分子量の計算値は１９１（Ｍ＋）、実測値１９１（Ｍ＋１）（ＦＡＢ）であった。
【０１６１】
中間体６ｃ：ＰＯＣｌ３（１ｍＬ）を、攪拌しながら丸底フラスコで〜５℃にて保持した無水ＤＭＦ（４ｍＬ）に添加した。この混合物に中間体６ｂ（０．４ｇ）を添加し、１時間攪拌し続けた。反応混合物を氷水（１００ｍＬ）に添加して反応を急冷し、次に１ＮのＫＯＨ（ｐＨを〜９．０に調整）で中和した。生成物を塩化メチレンで抽出し、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。生成物を、クロロホルムを用いてシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製し、８５％の中間体６ｃを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１．３６（ｔ，ＣＨ３，６Ｈ）；３．９１（ｑ，ＣＨ２，４Ｈ）；６．１９（ｄ，ＣＨ，１Ｈ）；７．８２（ｄ，ＣＨ，１Ｈ）；１０．０１（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）。
Ｃ１１Ｈ１３Ｎ３Ｏ２の分子量の計算値は２１９（Ｍ＋）、実測値２２０（Ｍ＋１）（ＦＡＢ）
【０１６２】
中間体６ｅ：中間体６ｃ（３５０ｍｇ）を、ピペリジン（５０ｍｇ）存在下で６時間、還流下の無水メタノール中で中間体６ｄ（６４４ｍｇ、中間体２ｂと同様の方法で調製）と反応させ、親色素６ｅを生成した。冷却すると分離する結晶を濾過して回収し、次いでメタノール（５％）およびクロロホルムの混合物を用いてシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δｐｐｍ：１．４２（ｔ，ＣＨ３，６Ｈ）；３．２０（ｔ，２Ｈ）；４．０（ｑ，ＣＨ２，４Ｈ）；４．４０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；６．５０（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；６．５１（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）；７．５〜８．７（ｍ，芳香族，１０Ｈ）。
Ｃ２９Ｈ２６Ｎ５Ｏ３Ｓの分子量の計算値は５２４（Ｍ＋）、実測値５２４（ＦＡＢ）
得られた色素６ｅは、以下第１表の極性感受性を示した。
【０１６３】
【表１】
2008500446.tif 000043
【０１６４】
色素のこのような溶剤極性感受性は、タンパク質に付加した場合のその環境−感受性を示している。
【０１６５】
親中間体であるベンゾジオキサゾール核６ｅは、Ｎａ２Ｓおよび水により脱保護して色素６ｆを生成し、続いてヨード酢酸無水物と反応させて標的色素６を形成することができる。
【０１６６】
（実施例７）
この実施例は、スキームＶＩによりヨードアセトアミドベンゾジオキサゾール核７を生成した。中間体７ｃは、実施例６の６ｃと同様の方法で生成された。
【０１６７】
中間体７ｄ：４−ピコリン（１ｇ）を、１２時間１２５℃にて加熱することによって、２−ブロモエチルフタルイミド（２．５ｇ）と反応させた。形成された無色の固体を、クロロホルムで繰り返し洗浄して精製し、３ｇ（８６％）の化合物７ｄを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：２．６７（ｓ，ＣＨ３，３Ｈ）；４．３０（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；４．８８（ｔ，ＣＨ２，２Ｈ）；７．８１（ｍ，４Ｈ）；７．９３（ｄ，２Ｈ）；８．９３（ｍ  ２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：２２．１２、３９．６３、６０．６９、１２４．４９、１３０．００、１３２．９０、１３５．７６、１４５．４５、１６２．０６、１６９．２０。
【０１６８】
中間体７ｅ：中間体７ｃ（２２０ｍｇ）を、ピペリジン（５０ｍｇ）存在下で６時間、還流下の無水メタノール中で中間体７ｄ（３４７ｍｇ）と反応させ、親色素７ｅを形成した。粗生成物を、メタノールおよびクロロホルム（１：９）を用いてシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにかけ、７ｅを得た。
【０１６９】
化合物７：７ｅのフタルイミドの脱保護により、中間体７ｆを生成し、次いでこれをヨード酢酸無水物と反応させて最終生成物である化合物７を生成した。
【０１７０】
（実施例７−１）
この実施例は、反応スキームＶＩａによりヨードアセチルベンゾジオキサゾール核７’を生成するために用いることができる。
【０１７１】
化合物７ａ’を、炭酸カリウムおよび相間移動触媒の存在下、等量のヨウ化メチルと反応させて中間体７ｂ’を形成する。続いて中間体７ｂ’を２−ブロモエタノールと反応させ、中間体７ｃ’を生成する。中間体７ｃ’のヴィルスマイヤー反応（Ｖｉｌｓｍａｅｉｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により中間体７ｄ’を生成し、７ｄ’の７ｅ’との反応により中間体７ｆ’を生成する。７ｆ’のヨード酢酸無水物との反応により最終化合物７’を生成する。
【０１７２】
（実施例８）
この実施例は、スキームＶＩＩによりヨードアセチルベンゾジオキサゾール核８を生成する。
【０１７３】
中間体８ｂ：アミノベンゾジオキサゾール核８ａ（１０ｍｍｏｌ）を、無水炭酸カリウム存在下で臭化エチル（５０ｍｍｏｌ）と反応させた。生成物を、クロロホルムおよびメタノールを用いてシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製し、６５％収量の中間体８ｂを得た。
【０１７４】
Ｃ１０Ｈ１３Ｎ３Ｏの分子量の計算値は１９１（Ｍ＋）であり、実測値１９１（Ｍ＋１）（ＦＡＢ）であった。
【０１７５】
中間体８ｃ：ＰＯＣｌ３（１ｍＬ）を、攪拌しながら丸底フラスコで〜５℃にて保持した無水ＤＭＦ（４ｍＬ）に添加した。この混合物に中間体８ｂ（０．４ｇ）を添加し、１時間攪拌し続けた。反応混合物を氷水（１００ｍＬ）に添加して反応を急冷し、次に１ＮのＫＯＨ（ｐＨを〜９．０に調整）で中和した。生成物を塩化メチレンで抽出し、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。生成物を、クロロホルムを用いてシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製し、８５％の中間体８ｃを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１．３６（ｔ，ＣＨ３，６Ｈ）；３．９１（ｑ，ＣＨ２，４Ｈ）；６．１９（ｄ，ＣＨ，１Ｈ）；７．８２（ｄ，ＣＨ，１Ｈ）；１０．０１（ｓ，ＣＨ，１Ｈ）。
Ｃ１１Ｈ１３Ｎ３Ｏ２の分子量の計算値は２１９（Ｍ＋）、実測値２２０（Ｍ＋１）（ＦＡＢ−ＭＳ）。
【０１７６】
中間体８ｄ：２−メチルベンゾチアゾール（２．２４ｇ、１５ｍｍｏｌ）および２−ブロモタノール（２．９０ｇ、２３ｍｍｏｌ）の混合物を、２５ｍＬフラスコに取った。反応混合物を１２０℃で２４時間加熱した。２４時間後、反応混合物を室温に冷却してクロロホルム（２０ｍＬ）を添加し、室温で４時間攪拌した。固体生成物を濾過し、クロロホルムで洗浄して乾燥させ、明るい茶色の固体である所望の生成物８ｄを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：３．２６（ｓ，３Ｈ）、４．０６（ｔ，２Ｈ）、４．９４（ｔ，２Ｈ）、７．８２（ｔ，１Ｈ）、７．９０（ｔ，１Ｈ）、８．２５〜８．３２（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：１６．８、５２．３、５９．１、１１７．０、１２４．２、１２８．５、１２９．４、１２９．７、１４１．６、１７８．１。
【０１７７】
中間体８ｅ：中間体８ｃ（５５ｍｇ）を、ピペリジン（１００ｍｇ）存在下で５時間、還流下の無水メタノール中で中間体８ｄ（７０ｍｇ）と反応させ、親色素８ｅを形成した。冷却すると分離する結晶を濾過して回収し、ＮＭＲおよび質量分析により確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：１．３８（ｔ，６Ｈ）、３．１３（ｔ，２Ｈ）、４．０３（ｑ，４Ｈ）、４．１３（ｔ，２Ｈ）、６．５１（ｄ，１Ｈ）、６．５３（ｄ，１Ｈ）、７．６７（ｍ，１Ｈ）、７．７８（ｍ，１Ｈ）、７．８９（ｍ，１Ｈ）、８．０３（ｍ，１Ｈ）、８．１４（ｍ，１Ｈ）、８．２０（ｍ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：１１．６２、４４．５４、５１．０８、５９．１８、１０４．７２、１０８．０１、１０９．１８、１１５．９６、１２３．３３、１２７．４７、１２７．７０、１２９．０９、１４２．１０、１４３．４０、１４４．２５、１４４．９７、１４５．３５、１４９．０４、１７２．６９。
Ｃ２９Ｈ２６Ｎ５Ｏ３Ｓの分子量の計算値は３９５（Ｍ＋）、実測値３９５（ＦＡＢ  ＭＳ）。
【０１７８】
化合物８：親色素８ｅ（２０ｍｇ）を、ピリジン（５０ｍｇ）存在下、無水塩化メチレン（５ｍＬ）中で室温にて攪拌（３時間）してヨード酢酸無水物（２０ｍｇ）と反応させた。得られた生成物色素８を、ヘキサンから沈降して精製した。
【０１７９】
Ｃ２３Ｈ２４ＩＮ４Ｏ３Ｓ＋の分子量の計算値は５６３（Ｍ＋）、実測値５６３（ＦＡＢ）であった。
【０１８０】
（実施例８−１）
この実施例は、反応スキームＶＩＩａによりヨードアセチルベンゾジオキサゾール核８’を生成する。
【０１８１】
化合物８ａ’を、無水炭酸カリウムおよび相間移動触媒の存在下、等量のヨウ化メチルと反応させてモノメチルアミノ誘導体８ｂ’を形成する。次いで化合物８ｂ’を、炭酸カリウムおよび相間移動触媒の存在下、２−ブロモエタノールと反応させて中間体８ｃ’を生成する。８ｃ’のヴィルスマイヤー反応により、中間体８ｄ’を生成し、これを８ｅ’と反応させて中間体８ｆ’を形成する。続いて中間体８ｆ’とヨード酢酸無水物との反応により最終化合物８’を生成する。
【０１８２】
（実施例９）
この実施例は、スキームＶＩＩＩによりアザクマリン核９を生成する。
【０１８３】
中間体９ｂ：１０ｍＬの濃ＨＣｌ中のＮ，Ｎ’−ジメチルアミノフェノール９ａ（３．４２ｇ、２５ｍｍｏｌ）溶液を、１００ｍＬフラスコに入れ、混合物を５℃に冷却した。フラスコの内容物を強く攪拌し、水（５ｍＬ）中のＮａＮＯ２（１．８０ｇ、２６ｍｍｏｌ）溶液を、３０分間かけて反応混合物に直接に添加した。反応温度を、添加の間中５℃に維持した。添加終了後、反応混合物を５℃で１時間攪拌し、濾過した。固体を、１０ｍＬの５ＭのＨＣｌ、次にエタノール（２５ｍＬ）で洗浄し、風乾して黄色固体９ｂ（３．００ｇ、７２％）を得た。
【０１８４】
Ｃ８Ｈ１０Ｎ２Ｏ２Ｓの分子量の計算値は１６６．１８、実測値１６７（ＭＨ＋）（ＦＡＢ−ＭＳ）であった。
【０１８５】
中間体９ｅ：メタノール５ｍＬ中の１０％Ｐｄ／Ｃ（２５ｍｇ）スラリーをアルゴン雰囲気下で１５分間攪拌した。メタノール（５ｍＬ）中のＮａＢＨ４（１９０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）溶液を、このスラリーに添加した。メタノール（１３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（２ｍＬ）を含有するニトロソ化合物９ｂ（５００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）溶液を、５分間かけて、Ｐｄ／Ｃスラリーに滴下添加した。還元反応中、赤色のニトロソ化合物は明るい黄色に変化した。１５分後、メタノール（４．０ｍＬ）中のＮａＢＨ４（１９０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）の追加量を添加して確実に完全な還元を行い、中間体９ｃを形成した。さらに３０分間攪拌を続け、エチルピルベート９ｄ（３．０ｍＬ、２７ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、次いで内容物を加熱還流した。３時間の還流後、反応混合物を室温に冷却し、セライト（登録商標）により濾過して未反応Ｐｄ／Ｃを除去した。濾液を蒸発させて残留物を得、これを、シリカゲルのクロマトグラフィーにかけてヘキサンおよび酢酸エチル（９：１ｖ／ｖ）の混合物により溶出し、黄色固体９ｅ（４００ｍｇ、７８％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：２．４８（ｓ，３Ｈ）、３．０６（ｓ，６Ｈ）、６．４０（ｓ，１Ｈ）、６．６５（ｍ，１Ｈ）、７．５０（ｍ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：２１．０、４０．５、９７．５、１０９．８、１２２．９、１２９．２、１４７．６、１４８．９、１５２．０、１５４．７。
Ｃ１１Ｈ１２Ｎ２Ｏ２の分子量の計算値は２０４、実測値２０５（ＭＨ＋）（ＦＡＢ−ＭＳ）。
【０１８６】
中間体９ｇ：ＰＯＣｌ３（１．１３ｇ、７．４ｍｍｏｌ）を、５℃に維持した無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）に添加した。混合物をアルゴン雰囲気下、５℃で３０分間攪拌し、次いで２−（メチルフェニルアミノ）−エタノール（１．１２ｇ、７．４ｍｍｏｌ）９ｆを添加し、その結果得られた溶液を室温で３時間攪拌した。反応混合物を、氷水をゆっくり添加して加水分解し、ＮａＯＨ（２Ｍ）を添加して中和し、ｐＨを７．０に調整した。生成物をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３ｘ５０ｍＬ）で抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥、蒸発させて黄色い液体を得た。生成物を、以下の通りカラムクロマトグラフィーにより精製した。粗生成物を、シリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、ヘキサンおよび酢酸エチル、（９：１ｖ／ｖ）の混合物で溶出した。純留分の蒸発により、化合物９ｇ（０．８０ｇ、６０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：３．００（ｓ，３Ｈ）、３．６４（ｔ，２Ｈ）、４．３６（ｔ，２Ｈ）、６．７６（ｍ，２Ｈ）、７．２８（ｍ，２Ｈ）、８．０７（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：３８．９、５１．２、６１．３、１１２．４、１１７．１、１２９．５、１４９．０、１６１．２。
Ｃ１０Ｈ１３ＮＯ２の分子量の計算値は１７９、実測値１７９（Ｍ＋）（ＦＡＢ−ＭＳ）。
【０１８７】
中間体９ｈ：無水エタノール（４ｍＬ）中の化合物９ｅ（１００ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）および化合物９ｇ（１００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン雰囲気下で攪拌した。この溶液に、ナトリウムメトキシド（２６ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を加熱還流した。４時間後、反応混合物を室温に冷却し、蒸発させて暗褐色の残留物を得た。得られた残留物を最少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲルのクロマトグラフィーにかけた。メタノールおよびクロロホルム（５：９５、ｖ／ｖ）の混合物を用いた溶出により、固体の生成物９ｈ（４０ｍ、２３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：２．９６（ｓ，６Ｈ）、３．１０（ｓ，３Ｈ）、３．４７（ｔ，２Ｈ）、３．８２（ｔ，２Ｈ）、６．３６（ｓ，１Ｈ）、６．４６（ｓ，１Ｈ）、６．５３（ｄ，１Ｈ）、６．７５（ｍ，１Ｈ）、６．８０（ｄ，２Ｈ）、７．２４（ｍ，２Ｈ）、７．５６（ｄ，１Ｈ）。１３Ｃ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：３８．９、４０．６、５５．７、６０．３、９６．９、１０２．２、１０３．８、１１１．０、１１３．３、１１７．４、１２９．４、１２９．８、１４３．１、１４４．５、１４５．３、１４９．７、１５０．３、１５１．８、１７８．８８。
【０１８８】
化合物９（ヨードアセチルアザクマリン、ＩＡＺＣＯ）：無水クロロホルム（２ｍＬ）中の化合物９ｈ（２０ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）溶液に、ピリジン（５０μＬ）を添加し、アルゴン雰囲気下で５分間攪拌した。この溶液に、ヨード酢酸無水物（３０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を添加し、２時間攪拌し続けた。クロロホルムを蒸発させ、残留物をシリカゲルのクロマトグラフィーにかけてメタノールおよびクロロホルム（５：９５、ｖ／ｖ）の混合物で溶出して、暗色の固体の生成物９（２５ｍｇ、８５５）を得た。
【０１８９】
（実施例９−１）
この実施例は、反応スキームＶＩＩＩａによりアザクマリン核９’を生成する。
【０１９０】
３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルアラニン９ａ’を、ＨＣｌ存在下で亜硝酸ナトリウムと反応させて化合物中間体９ｂ’を生成する。９ｂ’のニトロソ基を、Ｐｄ／Ｃおよび水素化ホウ素ナトリウムで還元して中間体９ｃ’を生成し、次に９ｄ’と反応させて中間体９ｅ’を生成する。２−ブロモエタノールを中間体９ｅ’と反応させて中間体９ｆ’生成する。中間体９ｆ’を９ｇ’と反応させて中間体９ｈ’を生成する。ピリジン存在下、９ｈ’をヨード酢酸無水物と反応させて最終生成物９’を得る。
【０１９１】
（実施例１０）
この実施例では、反応スキームＩＸを用いて化合物１０を生成した。
【０１９２】
中間体１０ｃ：４−（ジエチルアミノ）サリチルアルデヒド１０ａ（２．００ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）およびグルタコン酸ジエチル１０ｂ（２．００ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）を、ピペリジン（５０ｍｇ）存在下、無水エタノール（２５ｍＬ）中で還流した。６時間の還流後、反応混合物を室温に冷却し、得られた黄色い結晶を分離し、低温エタノール（１０ｍＬ）で洗浄、真空下で乾燥して所望の生成物１０ｃ（２．６０ｇ、８２％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１．２２（ｔ，６Ｈ）、１．２９（ｔ，３Ｈ）、３．４２（ｑ，４Ｈ）、４．２３（ｑ，２Ｈ）、６．４８（ｄ，１Ｈ）、６．６０（ｄ，１Ｈ）、６．９４（ｄ，１Ｈ）、７．３０（ｄ，１Ｈ）、７．５３（ｄ，１Ｈ）、７．７０（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１２．７、１４．６、４５．２、６０．６、９７．２、１０８．８、１０９．６、１１４．８、１１９．７、１３０．０、１３９．６、１４４．６、１５１．９、１５６．７、１６０．５、１６８．０。
Ｃ１８Ｈ２１ＮＯ４の分子量の計算値は３１５、実測値３１５（Ｍ＋）（ＦＡＢ−ＭＳ）。
【０１９３】
中間体１０ｄ：水（３ｍＬ）を、ＴＨＦ（１２ｍＬ）中の化合物１０ｃ（１．００ｇ、０．３１５ｍｍｏｌ）溶液に添加した。この混合物に、ＯｓＯ４（ｔ−ブタノール中２．５％）２０ｍｇを添加し、得られた反応混合物を室温で１時間攪拌した。この後、粉末ＮａＩＯ４（１．５０ｇ、７．０ｍｍｏｌ）の一部を３０分かけて添加し、さらに４８時間攪拌し続けた。攪拌後、溶剤を除去し、得られた固体をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中に溶解し、水（７５ｍｌ）で洗浄した。有機層を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥、蒸発させて黄色固体を得た。少量の出発原料を含有する粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ、４：１）で精製して、黄色固体（３２０ｍｇ、４１％）の純生成物１０ｄを生成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１．２５（ｔ，６Ｈ）、３．４８（ｑ，４Ｈ）、６．４８（ｄ，１Ｈ）、６．６４（ｍ，１Ｈ）、７．４０（ｄ，１Ｈ）、８．２５，（ｓ，１Ｈ）、１０．１２（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１２．６７、４５．４９、９７．３５、１０８．４３、１１０．３９、１１４．５０、１３２．４、１４５．６、１５３．７、１５９．２、１６２．１、１８８．２。
Ｃ１４Ｈ１５ＮＯ３の分子量の計算値は２４５、実測値２４６（ＭＨ＋）（ＦＡＢ−ＭＳ）。
【０１９４】
中間体１０ｆ：２−メチルベンゾチアゾール１０ｅ（２．２４ｇ、１５ｍｍｏｌ）および２−ブロモエタノール（２．９０ｇ、２３ｍｍｏｌ）の混合物を、２５ｍＬフラスコに取った。反応混合物を１２０℃で２４時間加熱した。２４時間後、反応混合物を室温に冷却し、クロロホルム（２０ｍＬ）を添加して、室温で４時間攪拌した。固体生成物を濾過し、クロロホルムで洗浄して乾燥させ、明るい茶色の固体である所望の生成物１０ｆを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：３．２６（ｓ，３Ｈ）、４．０６（ｔ，２Ｈ）、４．９４（ｔ，２Ｈ）、７．８２（ｔ，１Ｈ）、７．９０（ｔ，１Ｈ）、８．２５〜８．３２（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：１６．８、５２．３、５９．１、１１７．０、１２４．２、１２８．５、１２９．４、１２９．７、１４１．６、１７８．１。
【０１９５】
中間体１０ｇ：無水メタノール（３ｍＬ）中のクマリンアルデヒド１０ｄ（６０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）および化合物１０ｆ（５０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）溶液を１０ｍＬフラスコに取った。この溶液に、ピペリジン（３０ｍｇ）を添加し、加熱還流した。明るい茶色の反応混合物は、約３０分でゆっくりと紫色に変化した。内容物を一晩還流し、室温に冷却し、溶剤として３％メタノールを含有するクロロホルムを用いて、シリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製した。純留分の蒸発により、４５ｍｇの所望の色素、１０ｇを得た。
【０１９６】
化合物１０（ＩＣＯＢｚＴ）：無水クロロホルム（３ｍＬ）中の化合物１０ｇ（３０ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）溶液に、ピリジン（３０ｍｇ）を添加し、アルゴン雰囲気下で攪拌した。ヨード酢酸無水物（３０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）をこの攪拌した反応物に添加し、３時間攪拌し続けた。次いで溶剤を蒸発させ、得られた残留物をシリカゲルのクロマトグラフィーにかけた。５％メタノール含有クロロホルムを用いた溶出により、紫色の固体である純化合物１０を得た。本明細書に記載の１０（ＩＣＯＢｚＴ）に結合したグルコース／ガラクトース変異体Ａ２１３Ｃは、グルコース１００ｍＭの存在下で１０ｎｍの波長シフト（レッドシフト）を示した。（６２２から６３２ｎｍへのシフト）。
【０１９７】
（実施例１０−１）
この実施例は、反応スキームＩＸａによりクマリン核１０’を生成する。
【０１９８】
３−ヒドロキシ−Ｎ−エチルアニリン（１０ａ’）を２−ブロモエタノールと反応させて中間体１０ｂ’を生成する。ヴィルスマイヤー反応を１０ｂ’で行い中間体１０ｃ’を得た。さらに１０ｃ’と１０ｄ’との反応により中間体１０ｅ’を生成する。ＯｓＯ４および過ヨウ素酸ナトリウムとの反応により中間体１０ｆ’を生成する。続いて、１０ｆ’を１０ｇ’と反応させて中間体１０ｈ’を生成する。１０ｈ’をヨード酢酸無水物と反応させて所望の生成物１０’を得る。
【０１９９】
（実施例１１）
ＧＧＢＰ結合：２００ｕＬのＰＢＳ緩衝液中のＨ１５２Ｃ  ＧＧＢＰ（４ｎｍｏｌ）溶液を調製し、これをＤＴＴ（８ｎｍｏｌ）で室温にて３０分間培養した。スクエアレインヨードエステル核１（１ｍｇ、１２０ｕＬのＤＭＳＯ中に部分溶解）溶液を添加し、混合物をホイルで包み、室温で４時間放置した。標識タンパク質を、ＰＢＳ緩衝液で溶出しながら、ＮＡＰ−５サイズ排除カラムから第２留分として得た。タンパク質のグルコースに対する蛍光反応を、９６ウェルマイクロウェルプレートのいくつかのウェル中で分析した。グルコースをＰＢＳに添加し、最終グルコース濃度を０〜１ｍＭにした。標識タンパク質のグルコースに対する蛍光反応は、グルコースをＰＢＳ緩衝液中の標識タンパク質溶液に添加して判定した。典型的には、蛍光測定は、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光光度計（Ｖａｒｉａｎ，  Ｉｎｃ．、パロアルト、ＣＡ）またはＰＴＩ分光蛍光計（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．、ローレンスビル、ＮＪ）のどちらかを使用した。プレートの蛍光強度は、６２５ｎｍでの励起および６６０ｎｍでの発光を用いて、マイクロウェルプレート調節器を備えたＶａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光光度計により読み取った。この結果、スクエアレインヨードエステル核１−結合タンパク質複合体蛍光特性は、分析物濃度に対応しており、したがってバイオセンサーとして機能していた。これは、図３に示す通り、標識タンパク質およびグルコース間の近似Ｋｄが６ｕＭであることを示した。
【０２００】
さらに、各ＧＧＢＰ変異体を、スクエアレインヨードエステル核１で標識した。結合定数（第２表）は、９６ウェルマイクロプレート中に緩衝液（ＰＢＳ）中の標識タンパク質約０．１μＭを有する試料を調製し、さまざまなグルコース濃度（最終濃度は０〜１ｍＭまたは０〜１０ｍＭ）の溶液を添加して判定した。Ｋｄは、非特許文献４を出典とする以下の関係式から判定した（非特許文献４参照）：
式中、Ｆは蛍光強度であり、Ｆｉｎｆは無限遠の蛍光強度であり、Ｆ0はグルコースゼロの蛍光強度であり、ｘは、以下の関係式により決まるグルコース遊離濃度（［ＧＬｃ］ｆｒｅｅ）である：
【０２０１】
【数１】
2008500446.tif 000044
【０２０２】
式中、［ＧＬｃ］ｔｏｔおよび［ＰＬｏ］ｔｏｔは、それぞれグルコースおよびタンパク質の合計濃度である。［ＧＬｃ］ｔｏｔ＞＞Ｋｄおよび［ＧＬｃ］ｔｏｔ＞＞［Ｐｒｏ］ｔｏｔの場合、上記２つの方程式は、以下の形に単純化できることに注目されたい。
【０２０３】
Ｆ＝Ｆ0＋［（Ｆｃｏｎｓｔ＊ｘ）／（１＋ｘ／Ｋｄ）］
式中、Ｆｃｏｎｓｔ＝（Ｆｉｎｆ−Ｆ0）／Ｋｄ。
【０２０４】
【表２】
2008500446.tif 000045
【０２０５】
（実施例１２）
表３に示した通り、タンパク質にシステイン置換を有する、色素２とＧＧＢＰ（グルコース／ガラクトース結合タンパク質）との複合体をいくつか調製した。一般に、化合物２とＧＧＢＰとの複合体は、化合物１とＧＧＢＰとの複合体より溶液中では大幅に安定していた。ＰＢＳ緩衝液中のタンパク質のアリコートを、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）で１０〜３０分間処理し、続いてＤＭＳＯ中のヨードアセチルスクエアレイン色素を添加した。約３〜４時間後、反応を止め、サイズ排除クロマトグラフィー（ＮＡＰ−５カラム）により、色素標識されたタンパク質を得た。蛍光反応を、６００ｎｍでの励起および６２５ｎｍ〜７００ｎｍでスキャンされた発光により判定した。最大発光は６６０ｎｍ付近で観察された。
【０２０６】
化合物２とＶ１９Ｃ  ＧＧＢＰとの複合体の吸光スペクトルを、図４のグラフに示す。この吸光スペクトルは、本明細書に記載の複合体の典型的なスペクトルである。
【０２０７】
全ての複合体を、少なくとも１０ｍＭのグルコースで処理し、蛍光変化をモニターした。図５は、Ｖ１９Ｃ  ＧＧＢＰに結合した化合物２のグルコース濃度の変化により観察された蛍光変化を示している。誘導体Ａ２１３Ｃでは、グルコース結合により、青色領域への２〜３ｎｍの蛍光シフトが観察された。この結果、スクエアレインヨードエステル核２−結合タンパク質複合体の蛍光特性は、分析物濃度に対応しており、したがってバイオセンサーとして機能していた。
【０２０８】
【表３】
2008500446.tif 000046
【０２０９】
（実施例１３）
同様のプロトコルを用いて、Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ、Ｈ１５２Ｃ  ＧＧＢＰおよびＳ３３７Ｃ  ＭＢＰを、ナイルレッド化合物４および５で標識した。蛍光励起は５５０ｎｍであり、最大発光は６５０ｎｍであった。蛍光強度の変化を表４に示す。この結果、ナイルレッド核４−および５−結合タンパク質複合体の蛍光特性は、分析物濃度に対応しており、したがってバイオセンサーとして機能していた。
【０２１０】
【表４】
2008500446.tif 000047
【０２１１】
（実施例１４）
９（ＩＡＺＣＯ）を用いたグルコース／マルトース検出：アザクマリン核ＩＡＺＣＯを、前述の実施例の通りにグルコース結合タンパク質（ＧＢＰ）およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に結合させた。システイン残基置換を伴うタンパク質ＧＧＢＰ（グルコース／ガラクトース結合タンパク質）およびＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）の誘導体を調製した。一般的には、ＰＢＳ緩衝液中のタンパク質のアリコートを、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）で１０〜３０分間処理した後、ＤＭＳＯ中の色素９を添加した。約３〜４時間後、反応を止め、サイズ排除クロマトグラフィー（ＮＡＰ−５カラム）により、色素標識されたタンパク質を得た。標識されたタンパク質のグルコース／マルトースに対する蛍光反応を、６００ｎｍでの励起および６２０ｎｍ〜７００ｎｍでスキャンされた発光により判定した。この結果、９（ＩＡＺＣＯ）に結合したグルコース／ガラクトース結合タンパク質変異体Ｅ１４９Ｃは、１００ｍＭグルコースの存在下では９ｎｍの波長シフト（ブルーシフト）を示し（６５３ｎｍから６４４ｎｍへシフト）、したがってバイオセンサーとして機能していた。
【０２１２】
さまざまなタンパク質およびグルコース／マルトースを伴う９について観察された蛍光変化を、第５表に示す。これらの結果は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の色素−タンパク質複合体（＜１．０μＭ）の蛍光強度を測定することにより得た。グルコース／マルトースの飽和量（１００ｍＭ）を添加し、蛍光比を得た。この結果、アザクマリン核９−結合タンパク質複合体の蛍光特性は、分析物濃度に対応しており、したがってバイオセンサーとして機能していた。
【０２１３】
【表５】
2008500446.tif 000048
【０２１４】
（実施例１５）
経皮的読み取り実験
１つの実施形態では、インビトロでの経皮的グルコース／マルトース検出実験を、本明細書に記載のＮＩＲ色素を用いて行った。
【０２１５】
３つのタンパク質−ＮＩＲ複合体（以下に示す）を試験基質として選択した。
【０２１６】
（ａ）化合物９のヨードアセチルアザクマリン核（ＩＡＺＣＯ）に結合したＡ２１３Ｃ  ＧＧＢＰ
（ｂ）化合物９のヨードアセチルアザクマリン核（ＩＡＺＣＯ）に結合したＳ３３７Ｃ  ＭＢＰ
（ｃ）化合物４のヨードアセチルナイルレッド核（ＩＮＲ）に結合したＳ３３７Ｃ  ＭＢＰ
これらの複合体を、架橋ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ディスクに注入し、ディスクを経皮的読み取り試験に使用した。マイクロウェルプレート中のこれら複合体のＰＢＳ溶液についても経皮試験を行った。ブランクのＰＥＧディスクおよびＰＢＳを対照として使用した。ＰＢＳおよびＰＥＧディスク中のタンパク質活性は、インビトロでの実験前に試験した。
【０２１７】
（ｉ）グルコースに対する反応
図６では、ＰＥＧディスク１０をウサギの皮膚１２に乗せ、レーザー１４で励起し、検出器１６により皮膚の裏側から読み取った。ウサギの皮膚は、厚さ約３〜４ｍｍでヒトの目には透明でなかった。励起は５９０ｎｍのＬＥＤ光を用いて行い、蛍光強度は６５０ｎｍでモニターした。フィルター１８を用いて、励起光および励起散乱の干渉を回避した。
【０２１８】
ＰＥＧディスクおよび溶液ともに蛍光強度は安定しており、グルコースを添加すると蛍光強度は上昇し、２〜４分上昇し続けた。このタイムラグは、図７に示したように、グルコース／マルトースがヒドロゲルへゆっくり拡散したことを表している可能性がある。対照溶液では、反応が速く、ラグは見られなかった。ブランクのＰＥＧディスクおよびＰＢＳ溶液を用いた対照試験では、グルコースを添加した際の蛍光変化は見られなかった。この結果、アザクマリン核９−結合タンパク質複合体、およびナイルレッド核４−結合タンパク質複合体の蛍光特性は、分析物の存在に対応しており、したがって経皮的バイオセンサーとして機能していた。
【０２１９】
（ｉｉ）ＭＢＰを用いたマルトースに対する反応
ＩＮＲ−ＭＢＰ  ＰＥＧディスクおよび溶液を用いて、上記の実験を繰り返した。９に結合したＡ２１３Ｃ  ＧＧＢＰの場合のように、ＰＥＧディスクおよび溶液ともに蛍光強度は安定していた。マルトースを添加すると蛍光強度は上昇し、２〜４分上昇し続けた。
【０２２０】
以下の第６表は、経皮的読み取り実験で観察された蛍光強度の変化をまとめたものである。
【０２２１】
【表６】
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【０２２２】
これらの実施例で得られたデータは、色素および複合体が周囲条件下で分析物の結合および安定性を示すことを証明している。本発明のさまざまな実施形態を説明するために、いくつかの実施形態が選択されているものの、添付した特許請求の範囲に定義した本発明の範囲から逸脱することなく、さまざまな変更および修正ができることを当業者にあっては理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】クロロホルム中の化合物２の吸光スペクトルを示す図である。
【図２】クロロホルム中の化合物２の励起および発光スペクトルを示す図である。
【図３】ＰＢＳ緩衝液中のＨ１５２Ｃ  ＧＧＢＰに結合した化合物１の滴定曲線を示す図である。
【図４】ＰＢＳ緩衝液中のＶ１９Ｃ  ＧＧＢＰに結合した化合物２の吸光スペクトルを示す図である。
【図５】ＰＢＳ緩衝液中のグルコース濃度の変化に反応した、Ｖ１９Ｃ  ＧＧＢＰに結合した化合物２の蛍光強度の変化を示す図である。
【図６】実施例１５で用いられる器具の概略図である。
【図７】インビトロでの経皮的測定において、グルコースを添加した際の、Ａ２１３Ｃ  ＧＧＢＰに結合した９の蛍光特性の変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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