(57)【要約】  本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡまたはｅＩＦ５‐Ａ１と呼ばれるアポトーシス特異的真核生物開始因子５Ａ（ｅＩＦ‐５Ａ）、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を増大するかまたは低減するための核酸およびポリペプチドならびに方法に関する。本発明は、アポトーシスを増大するかまたは低減する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における細胞中のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の低減方法であって、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるアンチセンスポリヌクレオチドを細胞または哺乳類に提供することを包含する方法であり、前記ポリヌクレオチドがアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの内因性発現を低減する方法。
【請求項２】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の低減方法であって、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＲＡを提供することを包含する方法であり、前記ポリヌクレオチドがアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの内因性発現を低減する方法。
【請求項３】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現における前記低減が、以下の：ＴＬＲ４、ＩＦＮ‐γＲα、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐８、ＴＮＦＲ‐１、ｐ５３、ｉＮＯＳならびにＩＬ‐１、ＩＬ‐１２、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐６およびＩＬ‐１８の発現の低減、ＳＴＡＴ１αおよびＪＡＫ１応答のリン酸化の低減、ＮＦ‐κＢｐ５０活性化低減、ミレロペルオキシダーゼのレベル低減、ＭＩＰ‐１αのレベル低減、ならびにＢＣＬ‐２発現の増大からなる群から選択される応答を引き起こす請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
緑内障、虚血性組織損傷、敗血症および前炎症性関連障害を防止するために用いられる請求項３記載の方法。
【請求項５】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現における前記低減が細胞性アポトーシスの低減を引き起こす請求項３記載の方法。
【請求項６】
哺乳類における細胞中のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の増大方法であって、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードする外因性ポリヌクレオチドを細胞にまたは哺乳類に提供することを包含する方法であり、前記ポリヌクレオチドがアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの内因性発現の増大を引き起こす方法。
【請求項７】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの内因性発現における前記増大が細胞性アポトーシスの増大を引き起こす請求項６記載の方法。
【請求項８】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの内因性発現における前記増大がＶＥＧＦの発現における低減を引き起こす請求項６記載の方法。
【請求項９】
ＶＥＧＦの発現における前記低減が腫瘍の血管新生の低減をもたらす請求項８記載の方法。
【請求項１０】
癌細胞または腫瘍増殖を治療するために用いられる請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが突然変異体アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａであり、前記突然変異がＤＨＳによる活性化を防止する請求項６記載の方法。
【請求項１２】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡであって、細胞中でのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの内因性発現を抑制し、そして3’-GCC UUA CUG AAG GUC GAC U-5’の配列を有するｓｉＲＮＡ。
【請求項１３】
癌細胞におけるアポトーシスを誘導するかまたは増大するための薬剤のための以下の配列：5’-GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT3’をセンス配向で有するｓｉＲＮＡの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、以下の米国特許仮出願（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に対する優先権を主張する：60/632,514（2004年12月3日提出）；6060/666,626（2005年3月21日提出）；60/675,884（2005年4月29日提出）および60/711,397（2005年8月26日提出）。本出願は、米国特許第09/909,796号（2001年7月23日発行）（現在は米国特許第6,867,237号）のＣＩＰである米国特許第10/141,647号（2002年5月5日発行）のＣＩＰである米国特許第10/200,148号（2002年7月23日発行）のＣＩＰである米国特許第10/277,969号（2002年10月10日発行）のＣＩＰである米国特許第10/383,614号（2003年3月10日発行）のＣＩＰである米国特許第10/792,893号（2004年3月5日発行）のＣＩＰである米国特許第10/861,980号（2004年6月7日発行）のＣＩＰである米国特許第11/184,982号（2005年7月20日発行）のＣＩＰである（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中で援用される）。
【０００２】
産業上の利用分野
本発明は、アポトーシス特異的真核生物開始因子（「ｅＩＦ‐５Ａ」、あるいは「アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ」または「ｅＩＦ‐５Ａ１」と呼ばれる）に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アポトーシスは、明確に定義された形態学的特徴、例えば細胞縮小化、染色質凝縮、核分断および膜泡状突起形成により特性化される遺伝的にプログラムされた細胞事象である（Kerr et al. (1972) Br. J. Cancer, 26, 239-257；Wyllie et al. (1980) Int. Rev. Cytol., 68, 251-306）。それは正常組織発達およびホメオスタシスにおいて重要な役割を演じ、そしてアポトーシスプログラムの欠損は、神経変性および自己免疫疾患から新生物までの範囲の広範囲のヒト障害に関与すると思われる（Thompson (1995) Science, 267, 1456-1462；Mullauer et al. (2001) Mutat. Res, 488, 211-231）。アポトーシス細胞の形態学的特質は十分に特性化されているが、しかしこのプロセスを調節する分子経路は解明され始めたに過ぎない。
【０００４】
アポトーシスにおいて重要な役割を演じると考えられるタンパク質の一群は、カスパーゼと呼ばれるシステインプロテアーゼの一ファミリーであり、これはアポトーシスのほとんどの経路に必要とされると思われる（Creagh & Martin (2001) Biochem. Soc. Trans, 29, 696-701；Dales et al. (2001) Leuk. Lymphoma, 41, 247-253）。カスパーゼは、種々の細胞タンパク質を切断し、これが古典的症状発現、例えば細胞縮小化、膜泡状突起形成およびＤＮＡ断片化を生じることによりアポトーシス刺激に応答してアポトーシスを誘発する（Chang & Yang (2000) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64, 821-846）。
【０００５】
前アポトーシスタンパク質、例えばＢａｘまたはＢａｋも、カスパーゼ活性化分子、例えばミトコンドリアチトクロームｃを放出し、それによりアポトーシスによる細胞死を促すことにより、アポトーシス経路において重要な役割を演じる（Martinou & Green (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2, 63-67；Zou et al. (1997) Cell, 90, 405-413）。抗アポトーシスタンパク質、例えばＢｃｌ‐２は、前アポトーシスタンパク質ＢａｘおよびＢａｋの活性を相殺することにより、細胞生存を促す（Tsujimoto (1998) Genes Cells, 3, 697-707；Kroemer (1997) Nature Med., 3, 614-620）。Ｂａｘ：Ｂｃｌ‐２の比は、細胞運命が確定される一手段である；過剰量のＢａｘはアポトーシスを促進し、そして過剰量のＢｃｌ‐２は細胞生存を促す（Salomons et al. (1997) Int. J. Cancer, 71, 959-965；Wallace-Brodeur & Lowe (1999) Cell Mol. Life Sci., 55, 64-75）。
【０００６】
アポトーシスに関与する別の重要なタンパク質は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３によりコードされるタンパク質である。このタンパク質は、おそらくはＢａｘの上向き調節により損害され、遺伝的に不安定である、細胞増殖を調節しそして細胞におけるアポトーシスを誘導する転写因子である（Bold et al. (1997) Surgical Oncology, 6, 133-142；Ronen et al., 1996；Schuler & Green (2001) Biochem. Soc. Trans., 29, 684-688；Ryan et al. (2001) Curr. Opin. Cell Biol., 13, 332-337；Zornig et al. (2001) Biochem. Biophys. Acta, 1551, F1-F37）。
【０００７】
アポトーシス経路における改変は、癌を含めた多数の疾患経過において重要な役割を演じると思われる（Wyllie et al. (1980) Int. Rev. Cytol., 68, 251-306；Thompson (1995) Science, 267, 1456-1462；Sen & D’Incalci (1992) FEBS Letters, 307, 122-127；McDonnell et al. (1995) Seminars in Cancer and Biology, 6, 53-60）。癌発症および進行についての研究は、伝統的には細胞増殖に集中されてきた。しかしながら、アポトーシスが腫瘍形成において演じる重要な役割が近年明らかになってきた。実際、アポトーシスの制御は腫瘍細胞において何らかの点で常に改変されるため、アポトーシスについて目下既知であるものの多くが腫瘍モデルを用いて習得されてきた（Bold et al. (1997) Surgical Oncology, 6, 133-142）。
【０００８】
サイトカインも、アポトーシス経路に結び付けられてきた。生物学的系はそれらの調節のために細胞相互作用を要し、そして細胞間の混線は一般的に非常に種々のサイトカインを包含する。サイトカインは、多数の異なる細胞型による広範な種々の刺激に応答して産生される媒介物質である。サイトカインは、多数の異なる細胞型に多数の異なる作用を発揮し得るが、しかし免疫応答の調節ならびに造血細胞増殖および分化において特に重要である多面発現性分子である。標的細胞におけるサイトカインの作用は、特定のサイトカイン、相対濃度および他の媒介物質の存在によって、細胞の生存、増殖、活性化、分化またはアポトーシスを促し得る。
【０００９】
自己免疫障害、例えば乾癬、慢性関節リウマチおよびクローン病を治療するための抗サイトカインの使用は、人気を獲得しつつある。前炎症性サイトカインＩＬ‐１およびＴＮＦは、これらの慢性障害の病態において大きな役割を演じる。これら2つのサイトカインの生物学的活性を低減する抗サイトカイン療法は、治療的利益を提供し得る（Dinarello and Abraham, 2002）。
【００１０】
インターロイキン１（ＩＬ‐１）は、局所性および全身性炎症反応を媒介し、そして多数の障害、例えば血管炎、骨粗鬆症、神経変性障害、糖尿病、狼瘡性腎炎、ならびに自己免疫障害、例えば慢性関節リウマチの病気発生においてＴＮＦと相乗作用を示し得る重要なサイトカインである。腫瘍血管新生および侵襲性におけるＩＬ‐１βの重要性も、黒色腫細胞を注射された場合の転移および血管新生に対するＩＬ‐１βノックアウトマウスの耐性により、近年実証された（Voronov et al., 2003）。
【００１１】
インターロイキン１８（ＩＬ‐１８）はＩＬ‐１ファミリーの近年発見された一成員であり、そして構造、受容体および機能により受容体に関連づけられる。ＩＬ‐１８は、インターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）、ＴＮＦ‐αおよびＩＬ‐１を誘導するその能力の結果としての炎症性および自己免疫性障害に関与する中心的サイトカインである。ＩＬ‐１βおよびＩＬ‐１８はともに、心筋虚血中の心機能不全に関与することが既知のサイトカインであるＴＮＦ‐αの産生を誘導し得る（Maekawa et al., 2002）。ＩＬ‐１８結合タンパク質を用いた中和によるＩＬ‐１８の抑制は、超融合ヒト心房心筋の虚血／再還流モデルにおける虚血誘導性心筋機能不全を低減することが見出された（Dinarello 2001）。マウスＩＬ‐１８結合タンパク質を用いたＩＬ‐１８の中和はまた、コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルにおいて、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐αおよびＩＬ‐１β転写体レベルを低減し、関節損害を低減し得た（Banda et al., 2003）。マウス黒色腫モデルにおけるＩＬ‐１８結合タンパク質の注射が転写を首尾よく抑制したので、ＩＬ‐１８産生または利用可能性の低減はまた、転移癌を制御するために有益であると立証し得る（Carrascal et al., 2003）。前炎症性サイトカインとしてのその重要性のさらなる指標として、ＩＬ‐１８の血漿レベルは慢性肝臓疾患患者において評価され、そしてレベル増大は疾患の重症度と相関した（Ludwiczek et al., 2002）。同様に、ＩＬ‐１８およびＴＮＦ‐αは、腎症を有する真性糖尿病患者の血清中で評価された（Moriwaki et al., 2003）。外傷性脳損傷後の神経炎症も、前炎症性サイトカインにより媒介され、そしてＩＬ‐１８結合タンパク質によるＩＬ‐１８の抑制は、脳外傷後のマウスにおける神経学的回復を改善した（Yatsiv et al., 2002）。
【００１２】
サイトカインのＴＮＦファミリーの一成員であるＴＮＦ‐αは、造血細胞に及ぼす共有糸分裂作用から、炎症応答の誘導および多数の細胞型における細胞死の誘導に及ぶ多面発現作用を有する前炎症性サイトカインである。ＴＮＦ‐αは普通は、細菌リポ多糖、寄生生物、ウイルス、悪性細胞およびサイトカインにより誘導され、そして通常は感染および癌柄細胞を防御するために作用する。しかしながらＴＮＦ‐αの不適切な誘導は、急性および慢性炎症、例えば自己免疫障害に起因する障害への主要な一員であり、そして癌、エイズ、心臓疾患および敗血症にも関与し得る（Aggarwal and Natarajan, 1996；Sharma and Anker, 2002により再検討）。疾患（即ち敗血症ショックおよび慢性関節リウマチ）の実験動物モデル、ならびにヒト障害（即ち炎症性腸疾患および急性移植片対宿主疾患）は、ＴＮＦ‐αを遮断することの有益作用を実証した（Wallach et al., 1999）。ＴＮＦ‐αの抑制は、自己免疫障害、例えばクローン病（van Deventer, 1999）および慢性関節リウマチ（Richard-Miceli and Dougados, 2001）に罹患している患者に軽減を提供するに際しても有効であった。Ｂリンパ球の生存および増殖を促すＴＮＦ‐αの能力も、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ‐ＣＬＬ）の病因において一役を演じると考えられるし、Ｂ‐ＣＬＬにおいてＴ細胞により発現されているＴＮＦ‐αのレベルは腫瘍質量および疾患の段階と正相関した（Bojarska-Junak et al., 2002）。インターロイキン‐１β（ＩＬ‐１β）は、ＴＮＦ‐α産生を誘導することが既知のサイトカインである。
【００１３】
したがって、過剰量のサイトカインおよびＴＮＦ‐αの蓄積は、身体に及ぼす有害な結果、例えば細胞死をもたらすため、身体中のサイトカインのレベルを低減し、ならびにアポトーシスを抑制するかまたは低減するための方法に対する必要性が存在する。本発明は、これらの要求を満たす。
【００１４】
デオキシヒプシン（hypusine）シンターゼ（ＤＨＳ）およびヒプシン（hypusine）含有真核生物翻訳開始因子‐５Ａ（ｅＩＦ‐５Ａ）は細胞増殖および分化を含めた多数の細胞プロセスにおいて重要な役割を演じることが既知である。独特のアミノ酸であるヒプシンは全ての実験真核生物および古細菌において見出されるが、しかし真正細菌では見出されず、そしてｅＩＦ‐５Ａが唯一の既知のヒプシン含有タンパク質である（Park (1988) J. Biol. Chem., 263, 7447-7449；Schumann & Klink (1989) System. Appl. Microbiol., 11, 103-107；Bartig et al., (1990) System. Appl. Microbiol., 13, 112-116；Gordon et al. (1987a) J. Biol. Chem., 262, 16585-16589）。活性ｅＩＦ‐５Ａは、２つの翻訳後ステップで形成される：第一ステップは、デオキシヒプシンシンターゼにより触媒される前駆体ｅＩＦ‐５Ａの特異的リシンのα‐アミノ基へのスペルミジンの４‐アミノブチル部分の移動によるデオキシヒプシン残基の形成であり；第二ステップは、デオキシヒプシンヒドロキシラーゼによりこの４‐アミノブチル部分をヒドロキシル化してヒプシンを形成することを包含する。
【００１５】
ｅＩＦ‐５Ａのアミノ酸配列は種間で良好に保存され、そしてｅＩＦ‐５Ａ中のヒプシン周囲のアミノ酸配列の厳密な保存が存在するが、このことは、この修飾が生存のために重要であり得る、ということを示唆する（Park et al. (1993) Biofactors, 4, 95-104）。この仮定は、酵母において今までに見出されたｅＩＦ‐５Ａの両アイソフォームの不活性化、またはそれらの活性化における第一ステップを触媒するＤＨＳ遺伝子の不活性化が細胞分裂を遮断する、という観察によりさらに支持される（Schnier et al. (1991) Mol. Cell. Biol., 11, 3105-3114；Sasaki et al. (1996) FIBS Lett., 384, 151-154；Park et al. (1998) J. Biol. Chem., 273, 1677-1683）。しかしながら、酵母におけるｅＩＦ‐５Ａタンパク質の枯渇は全体的タンパク質合成における小低減のみを生じたが、このことは、ｅＩＦ‐５Ａが、タンパク質の全体的合成のためというよりむしろ、ｍＲＮＡの特定サブセットの翻訳のために必要とされ得る、ということを示唆する（Kang et al. (1993), “Effect of initiation factor eIF-5A depletion on cell proliferation and protein synthesis,” in Tuite, M. (ed.), Protein Synthesis and Targeting in Yeast, NATO Series H）。ｅＩＦ‐５Ａを結合するリガンドが高度保存モチーフを共有するという近年の知見も、ｅＩＦ‐５Ａの重要性を支持する（Xu & Chen (2001) J. Biol. Chem., 276, 2555-2561）。さらに、修飾化ｅＩＦ‐５Ａのヒプシン残基は、ＲＮＡとの配列特異的結合のために不可欠であることが判明した、そして結合はリボヌクレアーゼからの保護を提供しなかった。
【００１６】
さらに、ｅＩＦ‐５Ａの細胞内枯渇は核中の特定ｍＲＮＡの有意の蓄積を生じ、このことは、ｅＩＦ‐５Ａが核から細胞質への特定クラスのｍＲＮＡのシャトリングに関与し得る、ということを示す（Liu & Tartakoff (1997) Supplement to Molecular Biology of the Cell, 8, 426a. Abstract No. 2476, 37th American Society for Cell Biology Annual Meeting）。核孔関連核内フィラメントでのｅＩＦ‐５Ａの蓄積、ならびに一般核輸出受容体とのその相互作用は、ｅＩＦ‐５Ａが、ポリソームの一構成成分というよりむしろ、核細胞質シャトルタンパク質である、ということをさらに示唆する（Rosorius et al. (1999) J. Cell Science, 112, 2369-2380）。
【００１７】
ｅＩＦ‐５Ａに関する一次ｃＤＮＡは、Smit-McBride等により1989年にヒトからクローン化され、それ以来、ｅＩＦ‐５Ａに関するｃＤＮＡまたは遺伝子は、種々の真核生物、例えば酵母、ラット、ニワトリ胚、アルファルファおよびトマトからクローン化されてきた（Smit-McBride et al. (1989) J. Biol. Chem., 264, 1578-1583；Schnier et al. (1991)(yeast)；Sano, A. (1995) in Imahori, M. et al. (eds), Polyamines, Basic and Clinical Aspects, , VNU Science Press, The Netherlands, 81-88 (rat)；Rinaudo & Park (1992) FASEB J., 6, A453 (chick embryo)；Pay et al. (1991) Plant Mol. Biol., 17, 927-929 (alfalfa)；Wang et al. (2001) J. Biol. Chem., 276, 17541-17549 (tomato)）。
【００１８】
ｅＩＦ‐５Ａ  ｍＲＮＡの発現は、種々のヒト組織および哺乳類細胞系で探究されてきた。例えばｅＩＦ‐５Ａ発現における変化は、血清剥奪後の血清の付加後にヒト繊維芽細胞で観察された（Pang & Chen (1994) J. Cell Physiol., 160, 531-538）。デオキシヒプシンシンターゼ活性における年齢関連低減および多量の前駆体ｅＩＦ‐５Ａも老化中の繊維芽細胞において観察されたが、しかし、これがアイソフォームにおける示差的変化の平均を反映する可能性は確定されなかった（Chen & Chen (1997) J. Cell Physiol., 170, 248-254）。
【００１９】
ｅＩＦ‐５Ａはウイルスタンパク質、例えばヒト免疫不全ウイルス１型Ｒｅｖタンパク質およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型Ｒｅｘタンパク質の細胞性標的であり得る、ということを種々の研究が示してきた（Ruhl et al. (1993) J. Cell Biol., 123, 1309-1320；Katahira et al. (1995) J. Virol., 69, 3125-3133）。予備的研究は、Ｒｅｖのようなその他のＲＮＡ結合タンパク質と相互作用することによりｅＩＦ‐５ＡはＲＮＡを標的にし得るということを示すが、このことは、これらのウイルスタンパク質がウイルスＲＮＡプロセシングのためにｅＩＦ‐５Ａを動員し得る、ということを示唆する（Liu et al. (1997) Biol. Signals, 6, 166-174）。
【００２０】
したがってｅＩＦ‐５ＡおよびＤＨＳは既知であるが、しかしこれらのタンパク質がアポトーシス経路ならびにサイトカイン刺激に如何に関与するかを理解するに際してアポトーシスおよびサイトカイン発現を調節し得る必要性が依然として存在する。本発明は、この要求を満たす。
【発明の開示】
【００２１】
発明の要約
本発明は、「アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ」または「ｅＩＦ‐５Ａ１」と呼ばれるアポトーシス特異的真核生物開始因子５Ａ（ｅＩＦ‐５Ａ）に、ならびにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制するためにアンチセンスヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを用いて細胞におけるアポトーシスを阻害するかまたは抑制するための方法に関する。
本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を増大することにより細胞におけるアポトーシスを増大する方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の詳細な説明
真核生物開始因子５Ａ（「ｅＩＦ‐５Ａ」）のいくつかのアイソフォームが単離され、発表済みデータバンクに示されている。これらのアイソフォームは機能的に冗長である、と思われた。一アイソフォームはアポトーシスの誘導直前に上向き調節される、ということを本発明は発見し、それらはアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡまたはｅＩＦ‐５Ａ１と呼ばれた。本発明の対象は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａである。図１〜１１は、ラット、マウスおよびヒトｅＩＦ‐５Ａの配列（ヌクレオチドおよびアミノ酸）を示す。他のアイソフォームは細胞増殖に関与すると考えられ、増殖ｅＩＦ‐５ＡまたはｅＩＦ‐５Ａｓと呼ばれる。図２８は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａと増殖ｅＩＦ‐５Ａ（ｅＩＦ‐５Ａ２）の比較を示す。図３１は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａが細胞増殖に必要でない、ということを示す。図３１Ａでは、ＸＴＴ細胞増殖検定を用いて、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の代謝活性を測定した。ＨＴ‐２９細胞を96ウエルプレート上に24時間接種した後、対照ｓｉＲＮＡまたはｅＩＦ５ＡＴ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を非処置のままにするか、またはアクチノマイシンＤ（1.0 μg/ml）で48時間処置した後、代謝活性を測定した。値は、四重反復実験で実施された2つの実験に関する平均であり、0時間対照に関して得られた値に正規化して、これを1に設定した。図３１Ｂは、対照またはｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨＴ‐２９細胞の増殖能力が50 μMのＧＣ７とともに72時間インキュベートされた細胞の能力と比較された場合を示す。細胞増殖は、ＢｒｄＵ取り込みにより測定された。値はｎ＝4に関して平均＋ＳＥであり、そしてＧＣ（＋）血清試料に関する値に対して正規化され、これを1に設定した。星印（*）は、対を成すスチューデントｔ検定により有意に異なるとみなされる値を意味する（ｐ＜0.01）。
【００２３】
図３４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡは細胞分裂を抑制しないが、一方、細胞増殖ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡは細胞分裂を抑制する、ということを示す。
【００２４】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａは、細胞アポトーシス中に上向き調節される。図２３は、正常繊維芽細胞中でニトロプルシッドナトリウムを用いたアポトーシスの誘導後、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の増大が認められる、ということを示す。図３０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１が遺伝毒性ストレスにより上向き調節されることを示す。図３０Ａは、0.5 μg/mlのアクチノマイシンＤで、0、1、4および8時間処理された正常結腸繊維芽細胞におけるｅＩＦ５Ａ１発現のノーザンブロット分析を提示する。図３０Ｂは、0.5 μg/mlのアクチノマイシンＤで、0、1、4および24時間処理された正常結腸繊維芽細胞から単離される細胞溶解物のウエスタンブロットを提示する。ｅＩＦ５Ａ１、ｐ５３およびβ‐アクチンに対する抗体で、ブロットをプローブした。この図は、アクチノマイシンＤによる処理後にｅＩＦ‐５Ａタンパク質の増大が認められる、ということを示す。
【００２５】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａは、それがアポトーシス経路に関与する下流エフェクターおよび転写因子の転写後調節のレベルで作用すると思われるため、アポトーシス惹起疾患状態における介入のための適切な標的であると思われる。特定的には、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａは、核から細胞質へのアポトーシスの下流エフェクターおよび転写因子をコードするｍＲＮＡの転位を選択的に促すと思われ、この場合、それらはその後、翻訳される。アポトーシスを開始する終局的決定は、内部および外部プロおよび抗アポトーシスシグナル間の複雑な相互作用に由来すると思われる（Lowe & Lin (2000) Carcinogenesis, 21, 485-495）。下流アポトーシスエフェクターおよび転写因子の翻訳を促すその能力により、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａは、アポトーシスに有利にこれらのシグナル間の平衡を覆すと思われる。
【００２６】
したがって本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制するかまたは低減する作用物質を投与することにより、細胞中でのアポトーシスを抑圧するかまたは低減する方法を提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制するかまたは低減し得る一作用物質は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を低減するかまたは抑制することにより、細胞アポトーシスは遅延されるかまたは抑制され得る。
【００２７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、in vitroならびにin vivo遺伝子特異的抑圧の両方を成し遂げるために首尾よく用いられてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定ＤＮＡまたはＲＮＡ標的に対してアンチセンス（相補的）であるＤＮＡ（またはＤＮＡ類似体）、ＲＮＡ（またはＲＮＡ類似体）、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの短い、合成のストランドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと結合し、そして転写、翻訳またはスプライシングのレベルで発現を停止することにより、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的によりコードされるタンパク質の発現を遮断するよう設計される。分解を阻止する主鎖修飾（Blake et al., 1985）、例えばオリゴヌクレオチド中のホスホジエステル結合をホスホロチオエート連結に取り替えて、ヌクレアーゼ分解を遅らせる（Matzura and Eckstein, 1968）ことにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞培養および疾患の動物モデルの両方に首尾よく用いられてきた（Hogrefe, 1999）。オリゴヌクレオチドを分解に対してより安定に且つ耐性にさせるためのアンチセンスオリゴヌクレオチドに対するその他の修飾は、当業者に既知であり、理解されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書中で用いる場合、二本鎖または１本鎖ＤＮＡ、二本鎖または１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡおよびＲＮＡ類似体、ならびに塩基、糖または主鎖修飾を有するオリゴヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、安定性を増大するため、ヌクレアーゼ分解に対する耐性を増大する等のために、当該技術分野で既知の方法により修飾され得る。これらの修飾は当該技術分野で既知であり、例としてはオリゴヌクレオチドの主鎖を修飾すること、糖部分を修飾すること、または塩基を修飾することが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
好ましくは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａポリペプチドの一部をコードするヌクレオチド晴れまたは全コード配列を有する。本発明人等は、下記のようにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａポリペプチドの一部をコードするアンチセンスヌクレオチドを用いて種々の細胞株をトランスフェクトし、そしてアポトーシスを受けている細胞の数を測定した。アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞集団は、アンチセンスオリゴでトランスフェクトされていない同様の細胞集団と比較して、アポトーシスを受けている細胞の数の低減を示した。図７８〜８２は、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたことがない細胞と比較して、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドで処置されたことのある細胞中でアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージの低減を示す。
【００２９】
本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードする多数の適切な核酸配列の使用を意図する。例えば本発明は、以下のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ核酸配列（配列番号１、３、４、５、１１、１２、１５、１６、１９、２０および２１）のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに本明細書中に記載される他のアンチセンスヌクレオチドを提供する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、提示された配列番号の全長である必要はない。それらは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制するかまたは低減するために結合し得るのに十分な長さである必要があるだけである。「発現の抑制または低減」あるいは「発現の抑圧」とは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのような標的遺伝子からのタンパク質および／またはｍＲＮＡ産物のレベルの非存在または検出可能な低減を指す。
【００３０】
全コード配列を含まないアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号３５、３７および３９を有するアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
「アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのアンチセンスオリゴヌクレオチド」は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａとの実質的配列同一性または実質的相同性を有するオリゴヌクレオチドを包含する。本発明のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの付加的アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、上で列挙されたものとの実質的配列同一性を有する（即ち90％相同）もの、あるいは高緊縮条件下で列挙された配列番号とハイブリダイズする配列を有するものが挙げられる。本明細書中で用いる場合、「実質的配列同一性」または「実質的相同性」という用語は、一配列が別の配列との実質的構造的または機能的等価を表すことを示すために用いられる。実質的配列同一性または実質的相同性を有する配列間の任意の構造的または機能的差は、最小（de minimus）である；即ち、それらは、所望の適用において示されるように機能する配列の能力に影響を及ぼさない。差は、例えば異なる種間のコドン使用における固有の変異のためであり得る。2またはそれ以上の異なる配列間に有意量の配列重複または類似性が存在する場合、あるいは配列の長さまたは構造が異なる場合でも異なる配列が類似の物理的特質を示す場合には、構造的差は最小であるとみなされる。このような特質としては、例えば限定条件下でハイブリダイズする能力、あるいはタンパク質の場合には、免疫学的交差反応性、類似の酵素活性等が挙げられる。当該技術分野で既知の方法により、これらの特質の各々を、当業者は容易に確定し得る。
【００３２】
さらに、配列が、それらの間で少なくとも約70％またはそれ以上の、さらに好ましくは80％またはそれ以上の、さらに好ましくは約90％またはそれ以上の、最も好ましくは約95％またはそれ以上の配列類似性を有する場合、2つのヌクレオチド配列は「実質的に相補的」である。2つのアミノ酸配列は、それらがポリペプチドの活性または機能的関連部分間で少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の類似性を有する場合、実質的に相同である。
【００３３】
2つの配列の同一性％を確定するために、配列は、最適比較目的のために整列される（例えば最適アラインメントのためにギャップが最初のおよび二番目のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され得るし、そして非相同配列は比較目的のために無視され得る）。好ましい一実施形態では、参照配列の長さの少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％あるいはそれ以上が比較目的のために整列される。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが次に比較される。第一配列中の一位置が第二配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合には、分子はその位置で同一である（本明細書中で用いる場合、アミノ酸または核酸「同一性」はアミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。2つの配列間の同一性％は、当該配列により占有される同一位置の数の一関数であり、2つの配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れる。
【００３４】
2つの配列間の配列の比較、ならびに同一性および類似性％の確定は、数学的アルゴリズムを用いて成し遂げられ得る（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991）。
【００３５】
本発明の核酸およびタンパク質配列はさらに、配列データベースに対する検索を実施する、例えば他のファミリー成員または関連配列を同定するための「質問配列」として用いられ得る。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol Biol. 215: 403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン2.0）を用いて実施され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施され得る。ＢＬＡＳタンパク質検索は、本発明のタンパク質と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施され得る。比較目的のためのギャップ化アラインメントを得るために、ギャップ化ＢＬＡＳＴは、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されたように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルト・パラメーターが用いられ得る。
【００３６】
「アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ」という用語は、その機能的誘導体を包含する。核酸の「機能的誘導体」という用語は、アミノ酸またはヌクレオチド配列の相同体または類似体を意味するために本明細書中で用いられる。機能的誘導体は、本発明に従ってその有用性を可能にする所定の遺伝子の機能を保持する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａポリペプチドの「機能的誘導体」または本明細書中に記載されるようなアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのアンチセンスオリゴヌクレオチドの機能的誘導体は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ活性またはアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに特異的な抗体との免疫学的反応性を保有するアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの断片、変異体、類似体または化学的誘導体である。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの断片は、当該分子の任意のサブセットを指す。
【００３７】
機能的変異体は、機能の変化または非有意の変化を生じない類似のアミノ酸の置換も含有し得る。機能に不可欠なアミノ酸は、当該技術分野で既知の方法により、例えば部位特異的突然変異誘発またはアラニン置換変異体により同定され得る（Cunningham et al. (1989) Science 244: 1081-1085）。後者の手法は、分子中のすべての残基に単一アラニン突然変異を導入する。その結果生じる突然変異体分子は次に、生物学的活性、例えばキナーゼ活性に関して、あるいはin vitro増殖活性のような検定において試験される。相手を結合する／基質結合のために重要である部位は、構造分析、例えば結晶化、核磁気共鳴または光親和性ラベリングによっても確定され得る（Smith et al. (1992) J. Mol. Biol. 224: 899-904；de Vos et al. (1992) Science 255: 306-312）。
【００３８】
「変異体」は、全遺伝子またはその断片と実質的に類似の分子、例えば1つまたは複数の置換ヌクレオチドを有するが、しかし特定遺伝子とハイブリダイズするかまたはネイティブＤＮＡとハイブリダイゼーションするｍＲＮＡ転写体をコードする能力を保持するヌクレオチド置換変異体を指す。「相同体」とは、異なる動物属または種からの断片または変異体配列を指す。「類似体」とは、全分子、その変異体または断片と実質的に類似するかまたはそれに関連して機能する非天然分子を指す。
【００３９】
変異体ペプチドとしては、天然変異体、ならびに当該技術分野で周知の方法により製造されるものが挙げられる。このような変異体は、分子技術ならびに本明細書中に開示される配列情報を用いて、容易に同定され／製造され得る。さらにこのような変異体は、本発明のｅＩＦ‐５Ａとの配列および／または構造相同性に基づいて、他のタンパク質と容易に区別され得る。存在する相同性／同一性の程度は、主として当該タンパク質が機能的変異体であるかまたは非機能的変異体であるか、パラログ・ファミリー中に存在する発散量、ならびにオルトログ間の進化距離に基づいている。
【００４０】
本発明のｅＩＦ‐５Ａポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはタンパク質の天然変異体は、組換え技法を用いて容易に生成され得る。このような変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列中に欠失、付加および置換を含むが、これらに限定されない。例えば一クラスの置換は、保存アミノ酸置換である。このような置換は、あるタンパク質中の所定のアミノ酸を同様の特質を有する別のアミノ酸で置換するものである。保存的置換として典型的に観察されるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間で、あるものを別のものに取り替えること；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換；ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間の取替えである。アミノ酸変化がおそらくは表現型的にサイレントであることに関する指針は、Bowie et al., Science 247: 1306-1310に見出される。
【００４１】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書中で用いる場合、プローブ配列および標的配列の性質によって、当業者に容易に明らかになるような緊縮の適切な条件での核酸のハイブリダイゼーションを意味するために一般的に用いられる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は当該技術分野で周知であり、インキュベーション時間、温度および／または溶液のイオン強度を変更することにより所望の緊縮性によっている条件の調整は、容易に成し遂げられる（例えばSambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor New York, 1989参照）。
【００４２】
条件の選択は、ハイブリダイズされている配列の長さ、特にプローブ配列の長さ、核酸の相対的Ｇ‐Ｃ含量、ならびに許容されるべきミスマッチの量により指図される。低緊縮条件は、より低度の相補性を有する鎖Ｉだの部分的ハイブリダイゼーションが所望される場合に、選択される。完全なまたはほぼ完全な相補性が所望される場合、高緊縮条件が選択される。高緊縮条件は、ハイブリダイゼーション溶液が6×Ｓ．Ｓ．Ｃ．、0.01 MのＥＤＴＡ、1×デンハート溶液および0.5％ＳＤＳを含有する、ということを意味する。ハイブリダイゼーションは、約68℃で、クローン化ＤＮＡの断片に関しては約3〜4時間、そして総真核生物ＤＮＡに関しては約12〜16時間で実行される。低緊縮性に関しては、ハイブリダイゼーションの温度は二重鎖の融解温度（Ｔｍ）より低い約42℃に下げられる。Ｔｍは、Ｇ‐Ｃ含量、二重鎖長、ならびに溶液のイオン強度の一関数であることが既知である。
【００４３】
本明細書中で用いる場合、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の「対応する部分とハイブリダイズする」という語句は、ハイブリダイズする分子、例えばオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは任意のヌクレオチド配列（センスまたはアンチセンス配向で）が、ほぼ同一サイズを有し、そして適切な条件下でハイブリダイゼーションを実行するのに十分なそれとの配列類似性を有する別の核酸分子中の配列を認識し、それとハイブリダイズする、ということを意味する。例えば100ヌクレオチド長センス分子は、2つの配列間に約70％またはそれ以上の配列類似性が存在する限り、ヌクレオチド配列の約100ヌクレオチド部分を認識し、それとハイブリダイズする。「対応する部分」のサイズは、「対応する部分」がそれとハイブリダイズする分子より小さいかまたは大きく、例えば20〜30％大きいかまたは小さく、好ましくは約12〜15％以下に大きいかまたは小さくなるよう、ハイブリダイゼーションにおけるいくつかのミスマッチを可能にする、と理解されるべきである。
【００４４】
本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制するかまたは低減し得る他の作用物質も提供する。このような一作用物質としては、阻害的低分子ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）が挙げられる。ｓｉＲＮＡ技術は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて達成されるものと等価であるかまたはそれを上回る抑圧レベルを達成するためには低濃度が必要とされる（Thompson, 2002）ため、アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する実行可能な代替物として出現してきた。長い二本鎖ＲＮＡは、種々の生物体、例えば植物、線虫およびミバエにおける特定遺伝子の発現をサイレントにするために用いられてきた。ダイサーと呼ばれるＲＮアーゼ‐ＩＩＩファミリー酵素は、これらの長い二本鎖ＲＮＡを21〜23ヌクレオチドの阻害的低分子ＲＮＡにプロセシングし、これは次にＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組入れられる。ｓｉＲＮＡの非らせん化はＲＩＳＣを活性化し、そして塩基対合により１本鎖ｓｉＲＮＡが複合体を内因性ｍＲＮＡに導くようにする。ＲＩＳＣによる内因性ｍＲＮＡの認識はその切断を生じ、その結果、それを翻訳に利用可能でなくする。哺乳類細胞中への長い二本鎖ＲＮＡの導入は、強力な抗ウイルス応答を生じ、これは、ｓｉＲＮＡの使用により迂回され得る（Elbashir et al., 2001）。ｓｉＲＮＡは細胞培養に広範に用いられてきて、そして90％またはそれ以上の特定遺伝子発現の低減をルーチンに達成する。
【００４５】
ｓｉＲＮＡの使用は、疾患の動物モデルにおける遺伝子発現の抑制に際しても大衆性を獲得しつつある。ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡは、出産後マウスの広範な種々の器官中での同時トランスフェクト化プラスミドからのルシフェラーゼ発現を遮断し得る、ということを最新の研究は実証した（Lewis et al., 2002）。マウスの尾静脈中に流体力学的に注射されたＴＮＦファミリーにおける受容体であるＦａｓに対するｓｉＲＮＡは、最終注射後10日目までに、肝細胞の80％より多くをトランスフェクトし、そして肝臓中のＦａｓ発現を90％低減し得た（Song et al., 2003）。Ｆａｓ  ｓｉＲＮＡはまた、肝臓繊維症および劇症肝炎からマウスを防御し得た。致死用量のリポ多糖で処置されたマウスにおける敗血症の発症は、ＴＮＦ‐αに対して向けられるｓｉＲＮＡの使用により抑制された（Sorensen et al., 2003）。ｓｉＲＮＡは、細胞培養中でのそれらの長期残存性効力ならびにin vivoで細胞をトランスフェクトするそれらの能力そしてin vivoの血清中での分解に対するそれらの耐性の点から見て（Bertrand et al., 2002）、in vitroでの特定遺伝子発現の抑制のために非常に有効な薬剤であるべき可能性を有する。
【００４６】
本発明人等は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクトし、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現に及ぼす影響を試験した。図９９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞がより少ないアポトーシス因子５ａタンパク質を産生したことを示す。図８７〜８９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされていない細胞と比較して、アンプトテシンおよびＴＮＦ‐αに曝露後に、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞集団はより低いパーセンテージのアポトーシスを受けている細胞を有することを示す。したがって本発明の一実施形態は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡを含むベクターで細胞をトランスフェクトすることにより、細胞中のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の抑制を提供する。
【００４７】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの好ましいｓｉＲＮＡとしては、配列番号３１、３２および３３を有するものが挙げられる。付加的ｓｉＲＮＡとしては、列挙されたものとの実質的配列同一性を有する（即ち90％相同）もの、あるいは高緊縮条件下で列挙された配列番号とハイブリダイズする配列を有するものが挙げられる。実質的配列同一性および相同性が意味するものは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関して上記されている。「アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡ」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関して上記されたような機能的変異体または誘導体を包含する。
【００４８】
ｓｉＲＮＡの送達、ならびにｓｉＲＮＡを含む発現構築物／ベクターは、当業者に既知である。米国特許出願2004/106567号および2004/0086884号（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）は、多数の発現構築物／ベクター、ならびにウイルスベクター、非ウイルスベクター、リポソーム送達ビヒクル、プラスミド注入系、人工ウイルスエンベロープおよびポリリシン複合体（少数の例を挙げれば）を含む送達メカニズムを包含する。
【００４９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを有する発現構築物／ベクターにおいて有用な調節配列を、当業者は理解する。例えば調節配列は、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターまたはその組合せであり得る。
【００５０】
アンチセンスポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを用いて哺乳類における細胞中でのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を低減することにより、細胞アポトーシスの低減が認められる。例えばＲＫＯおよびＲＫＯ‐Ｅ６細胞は、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺまたはｐＨＭ６‐アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで一過的にトランスフェクトされた。アクチノマイシンＤで処置され、ｐＨＭ６‐アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡでトランスフェクトされたＲＫＯ細胞は、アクチノマイシンＤで処置されていないｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトされた細胞に比して、アポトーシスの240％増大を示した。アクチノマイシンＤで処置され、ｐＨＭ６‐アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡでトランスフェクトされたＲＫＯ‐Ｅ６細胞は、アクチノマイシンＤで処置されていないｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトされた細胞に比して、アポトーシスの105％増大を示した（図３６参照）。
【００５１】
図３７は、一過性トランスフェクション後にＲＫＯ細胞に生じるアポトーシスのパーセンテージを示すグラフである。ＲＫＯ細胞は、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺ、ｐＨＭ６‐アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ、ｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ２またはｐＨＭ６‐切頭化アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで一過的にトランスフェクトされた。ｐＨＭ６‐アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａでトランスフェクトされた細胞は、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトされた対照細胞に比して、アポトーシスの25％増大を示した。この増大は、ｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ２またはｐＨＭ６‐切頭化アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａでトランスフェクトされた細胞に関しては明白でなかった。
【００５２】
図３８は、一過性トランスフェクション後にＲＫＯ細胞に生じるアポトーシスのパーセンテージを示すグラフである。ＲＫＯ細胞は、トランスフェクトされないままであるか、あるいはｐＨＭ６‐ＬａｃＺまたはｐＨＭ６‐アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで一過的にトランスフェクトされた。トランスフェクション効率のための補正後、ｐＨＭ６‐アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａでトランスフェクトされた細胞の60％がアポトーシス性であった。
【００５３】
図３９は、一過性トランスフェクション後のＲＫＯ細胞アポトーシスのフローサイトメトリー分析の結果を提示する。ＲＫＯ細胞は、トランスフェクトされないままであるか、あるいはｐＨＭ６‐ＬａｃＺ、ｐＨＭ６‐アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ、ｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ２またはｐＨＭ６‐切頭化アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで一過的にトランスフェクトされた。表は、各ゲートのピーク下面積に基づいて算定されたアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージを示す。非トランスフェクト化細胞におけるバックグラウンドアポトーシスに関する、ならびにトランスフェクション効率に関する補正後、ｐＨＭ６‐アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａでトランスフェクトされた細胞の80％がアポトーシスを示した。ｐＨＭ６‐ＬａｃＺ、ｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ２またはｐＨＭ６‐切頭化アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａでトランスフェクトされた細胞は、バックグラウンドレベルのアポトーシスのみを示した。
【００５４】
図４０は、ＲＫＯ細胞をアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ（ｅＩＦ‐５  １）ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、その後アクチノマイシンＤ（アポトーシスを受けるよう細胞を誘導した）で処置した実験の結果を示す。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、ｅＩＦ‐５Ａのより少ない発現、ｐ５３のより少ない発現、ｂｃｌ‐２のより多くの発現ならびに同一発現レベルの対照遺伝子アクチンを示す。
【００５５】
図４１は、0.25 μg/mlのアクチノマイシンＤで0、3、7、24および48時間処置したＲＫＯ細胞から抽出されたタンパク質のウエスタンブロットを提示する。上部パネルは、一次抗体として抗アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを用いたウエスタンブロットを示す。底部パネルは等しい負荷を実証するために化学発光検出後にクーマシーブルーで染色された抗アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのために用いられるウエスタンブロットを示す。ｐ５３およびアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａはともに、アクチノマイシンＤを用いた処置により上向き調節される。
【００５６】
図４２は、（アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの）アンチセンスオリゴ１、２および３（それぞれ配列番号３５、３７および３９）で処置された後にＲＫＯ細胞により産生された細胞のレベルを示す。ＲＫＯ細胞は、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた後、より少ないアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａならびにより少ないｐ５３を産生した。
【００５７】
したがって図３６〜４２は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現がアポトーシスを誘導することが既知の化合物で後に処置される細胞集団中で低減される場合、低アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを発現する細胞は低アポトーシスを受ける、ということを示す。
【００５８】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の低減を引き起こすほかに、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは、以下の応答も引き起こす：ＴＬＲ４、ＩＦＮ‐γＲα、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐８、ＴＮＦＲ‐１、ｐ５３、ｉＮＯＳならびにＩＬ‐１、ＩＬ‐１２、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐６およびＩＬ‐１８の発現を低減する、ＳＴＡＴ１αリン酸化およびＪＡＫ１応答を低減する、ＮＦ‐κＢｐ５０活性化を低減する、ミレロペルオキシダーゼのレベルを低減する、ＭＩＰ‐１αのレベルを低減する、そしてＢＣＬ‐２発現を増大すること。
【００５９】
多くの重要なヒト疾患は、アポトーシスの制御における異常により引き起こされる。これらの異常は、細胞数の病理学的増大（例えば癌）あるいは細胞の損傷性喪失（例えば変性疾患）を生じ得る。非限定例として、本発明の方法および組成物は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現低減を生じるためにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるアンチセンスポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用によりアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの哺乳類、哺乳類細胞または哺乳類組織中での発現を低減するかまたは抑制することにより、以下のアポトーシス関連疾患および障害を有する被験者を予防するかまたは治療するために用いられ得る：神経学的／神経変性障害（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病））、自己免疫障害（例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症）、デュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、運動ニューロン障害、虚血、心臓虚血、慢性心不全、卒中、乳児脊髄性筋萎縮症、心停止、腎不全、アトピー性皮膚炎、敗血症および敗血症性ショック、ＡＩＤＳ、肝炎、緑内障、糖尿病（１型および２型）、喘息、網膜色素変性、骨粗鬆症、異種移植片拒絶、ならびに熱傷。
【００６０】
アポトーシスの制御の以上により引き起こされるこのような一疾患は、緑内障である。種々の光学的組織におけるアポトーシスは、緑内障患者において失明を引き起こす重要な因子である。緑内障は、進行性失明を生じる視神経に対する損害から生じる眼症状の一群である。アポトーシスは、この視神経損害の直接的原因であることが示されている。
【００６１】
緑内障研究の分野における初期の仕事は、眼内圧（「ＩＯＰ」）上昇が篩板（穿孔性膠原性結合組織）のレベルでの軸索輸送の妨害をもたらし、これが網膜神経節細胞の死を派生する、ということを示した（Quigley and Anderson (1976) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 15, 606-16；Minckler, Bunt, and Klock, (1978) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 17, 33-50；Anderson  and Hendrickson, (1974) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 13, 771-83；Quigley et al., (1980) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 19, 505-17）。緑内障の動物モデルの試験および死後ヒト組織は、緑内障における網膜神経節細胞の死がアポトーシスにより起こる、ということを示す（Garcia-Valenzuela et al., (1995) Exp. Eye Res., 61, 33-44；Quigley et al., (1995) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36, 774-786；Monard, (1998) In: Haefliger IO, Flammer J (eds) Nitric Oxide and Endothelin in the Pathogenesis of Glaucoma, New York, NY, Lippincott-Raven, 213-220）。ＩＯＰ増大の結果としての軸索輸送の中断は、栄養因子の欠乏による網膜神経節細胞死に関与し得る（Quigley, (1995) Aust N Z J Ophthalmol, 23 (2), 85-91）。緑内障性眼における視神経頭星状細胞も、いくつかの神経毒性物質のレベル増大を生じることが見出された。例えば腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦ‐α）（Yan et al., (2000) Arch. Ophthalmol., 118, 666-673）、ならびに一酸化窒素を生じる酵素である一酸化窒素シンターゼ（Neufeld et al., (1997) Arch. Ophthalmol., 115, 497-503）の産生増大は、緑内障性眼の視神経頭に見出されている。さらに、活性化網膜膠細胞による誘導形態の一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）およびＴＮＦ‐αの発現増大は、遺伝性網膜疾患のラットモデルで観察されている（Cotinet et al., (1997) Glia, 20, 59-69；de Kozak et al., (1997) Ocul. Immunol. Inflamm., 5, 85-94；Goureau et al., (1999) J. Neurochem, 72, 2506-2515）。緑内障性視神経頭において、過剰量の一酸化窒素は網膜神経節細胞の軸索の変性と結び付けられてきた（Arthur and Neufeld, (1999) Surv Ophthalmol, 43 (Suppl 1), S129-S135）。最後に、刺激性虚血または流体静力学的圧力上昇に応答する網膜膠細胞によるＴＮＦ‐αの産生増大は、同時培養網膜神経節細胞におけるアポトーシスを誘導することが示されている（Tezel and Wax, (2000) J. Neurosci., 20 (23), 8693-8700）。
【００６２】
アポトーシスによる変性からの網膜神経節細胞の防護は、緑内障のための失明に関して考え得る新規の治療／予防として研究中である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、眼疾患の動物モデルに首尾よく用いられてきた。一過性全網膜虚血のモデルにおいて、カスパーゼ２の発現は、主に網膜の内核および神経節細胞層中で、虚血中に増大された。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたカスパーゼの抑圧は、網膜電位図により確定されるように、有意の組織病理学的および機能的改善をもたらした（Singh et al., (2001) J. Neurochem., 77 (2), 466-75）。別の研究は、視神経のトランスフェクション時に、網膜神経節細胞が前アポトーシスタンパク質Ｂａｘを上向き調節し、そしてアポトーシスを受ける、ということを実証した。ラットの外側上網膜へのＢａｘアンチセンスオリゴヌクレオチドの反復注射は、Ｂａｘの局所的発現を抑制し、そして視神経のトランザクション後の網膜神経節細胞の生存数を増大した（Isenmann et al., (1999) Cell Death Differ., 6 (7), 673-82）。
【００６３】
網膜神経節細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達は、リポソーム中にオリゴヌクレオチドを封入し、これが次に融合（ＨＶＪリポソーム）により日本の不活性化血球凝集ウイルス（ＨＶＪ；センダイウイルス）のエンベロープで被覆されることにより改善された。ＨＶＪリポソーム中に封入されたＦＩＴＣ標識化アンチセンスオリゴヌクレオチドのマウスへの硝子体内注射は、神経節層中の細胞の44％内に高蛍光を生じ、これは3日間持続したが、一方、裸ＦＩＴＣ標識化アンチセンスオリゴヌクレオチドによる蛍光は1日後に消失した（Hangai et al., (1998) Arch Ophthalmol, 116 (7), 976）。
【００６４】
本発明の一方法は、眼の細胞および組織、例えば星状細胞、網膜神経節、網膜膠細胞および篩板（これらに限定されない）におけるアポトーシスを防止するかまたは低減することに向けられる。緑内障における網膜神経節細胞の死はアポトーシスによって生じ、これが失明をもたらす。したがって網膜神経節細胞におけるアポトーシスを抑制するかまたは低減する方法を提供すること、あるいはアポトーシスによる変性から網膜神経節を防御することは、緑内障による失明の防止のための新規の治療を提供する。この方法は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑圧して、アポトーシスを低減することを包含する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａは、全アポトーシス過程を調節すると思われる強力な遺伝子である。したがってアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を遮断することによる視神経頭におけるアポトーシスの制御は、緑内障のための治療を提供する。
【００６５】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の抑圧は、眼の細胞、例えば篩板、星状細胞、網膜神経節細胞または網膜膠細胞（これらに限定されない）にアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡを投与することにより、成し遂げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡは上記と同様であり、即ち、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａポリペプチドの少なくとも一部分をコードするヌクレオチド配列を有する。本発明のこの態様に有用な例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２６または２７、あるいは高緊縮条件下で配列番号２６または２７と相補的な配列と結合し、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを包含する。
【００６６】
本発明の別の実施形態は、篩板細胞、星状細胞、網膜神経節細胞または網膜膠細胞中でのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑圧する方法を提供する。ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ、例えば配列番号２６および２７（これらに限定されない）は、篩板細胞、星状細胞、網膜神経節細胞または網膜膠細胞に投与される。細胞は、ヒト起源のものであり得る。
図７７ＡおよびＢは、篩板細胞における蛍光的標識化アンチセンスオリゴヌクレオチドの上首尾の取込みを示す。図８６ＡおよびＢは、血清の存在下でまたは血清なしで、篩板細胞が標識化ｓｉＲＮＡを取り込む、ということを示す。
【００６７】
図７８〜８２、８４〜８５、および８８は、篩板細胞がアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するアンチセンスポリヌクレオチドおよびカンプトテシン（アポトーシスを誘導する作用物質）で処置されたいくつかの実験の結果を示す。結果は、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたことがない細胞と比較して、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドで処置されたことのある細胞中でアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージの低減が認められることを示す。図が示すように、異なる時間経過およびカンプトテシン濃度を用いた。さらにまたいくつかの異なる篩板細胞株を試験した（細胞株５０６および５１７）。対照として、図の篩板細胞をＴＮＦ‐αおよび／またはカンプトテシンで処置したが、これは、アポトーシスを受けている細胞の数の増大を生じた（図８３および９２参照）。篩板細胞株＃５０６細胞を40,000細胞／ウエルで8ウエル培養スライド上に接種した。3日後、集密ＬＣ細胞を10 μg/mlのＴＮＦ‐α、50 μMカンプトテシンまたは10 μg/mlのＴＮＦ‐α＋50 μMカンプトテシンで処置した。等容積のＤＭＳＯ（カンプトテシンに関するビヒクル対照）を非処置対照細胞に付加した。処置後48時間に細胞をHoescht 33258で染色して、ＵＶフィルターを用いて蛍光顕微鏡により可視化した。明るく染色された凝縮化または断片化核を有する細胞を、アポトーシス性として計数した。
【００６８】
図９４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡで処置された細胞が低アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質を産生する、ということを示す。篩板細胞株＃５０６および＃５１７細胞を10,000細胞／ウエルで24ウエルプレート上に接種した。3日後、ＬＣ細胞をＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡ＃１〜４（配列番号３０〜３３）または対照ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）でトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、タンパク質溶解物を収穫し、各試料からのタンパク質5 μgをＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に移して、抗‐ｅＩＦ‐５Ａ抗体でウエスタンブロット処理した。結合抗体を化学発光により検出し、Ｘ線フィルムに曝露させた。次に膜を剥ぎ取って、内部負荷対照として抗β‐アクチンで再ブロッティングした。
【００６９】
したがって、予測どおり、アンチセンスポリヌクレオチドを用いて観察された結果と同様に、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現低減をもたらしたアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡも、対照と比較して、アポトーシスの低減をもたらした（図８８〜８９参照）。図９０は、図８９および実施例１３に記載された実験からのｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた、そしてカンプトテシンおよびＴＮＦ‐αで処置されたHoescht染色篩板細胞株＃５０６の写真を示す。アポトーシス中の細胞は、より明るく染色された細胞として観察される。それらは、染色質凝縮のためより小さな核を有し、そして小型で且つ形状が不規則である。
【００７０】
図９１は、免疫蛍光による篩板細胞の特性化である。83歳男性の視神経頭から単離された篩板細胞（＃５０６）を、免疫蛍光により特性化した。一次抗体は、ａ）アクチン；ｂ）フィブロネクチン；ｃ）ラミニン；ｄ）ＧＦＡＰであった。写真はすべて、倍率400倍で撮影した。
【００７１】
図９３は、カンプトテシンまたはＴＮＦ‐α＋カンプトテシン処置中のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現レベルを示す。この図は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡはカンプトテシンおよびＴＮＦ‐α処置の結果として上向き調節されるが、一方、対照遺伝子アクチンの発現レベルは一定のままである、ということを示す。篩板細胞＃５０６細胞を40,000細胞／ウエルで24ウエルプレート上に接種した。3日後、ＬＣ細胞を50 μMカンプトテシンまたは10 μg/mlのＴＮＦ‐α＋50 μMカンプトテシンで処置し、タンパク質溶解物を1、4、8および24時間後に収穫した。等容積のＤＭＳＯをビヒクル対照として対照細胞に付加し、細胞溶解物を1および24時間後に収穫した。各試料からのタンパク質5 μgをＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に移して、抗‐ｅＩＦ‐５Ａ抗体でウエスタンブロット処理した。結合抗体を化学発光を検出し、Ｘ線フィルムに曝露させた。次に膜を剥ぎ取って、内部負荷対照として抗β‐アクチンで再ブロッティングした。
【００７２】
図９５（細胞株＃５０６）および図９６（細胞株５１７）は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡで処置された細胞が、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡでトランスフェクトされない細胞と比較して、カンプトテシンおよびＴＮＦによる処置時にアポトーシスのより小さいパーセンテージを示す、ということを示す。篩板細胞株＃５０６細胞を、7500細胞／ウエルで8ウエル培養スライド上に接種した。3日後、ＬＣ細胞をＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡ＃１〜４（配列番号３０〜３３）または対照ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）でトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、トランスフェクト化細胞を10 μg/mlのＴＮＦ‐α＋50 μMカンプトテシンで処置した。24時間後、細胞をHoescht 33258で染色して、ＵＶフィルターを用いて蛍光顕微鏡により可視化した。明るく染色された凝縮化または断片化核を有する細胞を、アポトーシス性として計数した。このグラフは、ｎ＝4の個々の実験の平均を表す。
【００７３】
図９７ａ〜ｄは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡ  ＃１でトランスフェクトされ、そしてＴＮＦ‐αおよびカンプトテシンで処置された篩板細胞株＃５０６細胞のＴＵＮＥＬラベリングを示す。この図面は、ｓｉＲＮＡ処置細胞における低アポトーシス（低核断片化）が認められることを示す。篩板細胞株＃５０６細胞を、7500細胞／ウエルで8ウエル培養スライド上に接種した。3日後、ＬＣ細胞をアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡ＃１（配列番号３０）または対照ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）でトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、トランスフェクト化細胞を10 μg/mlのＴＮＦ‐α＋50 μMカンプトテシンで処置した。24時間後、細胞をHoescht 33258で染色し、そして末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰ‐ジゴキシゲニン・ニック末端ラベリング（ＴＵＮＥＬ）法を用いてin situでＤＮＡ断片化を評価した。パネルＡは、アポトーシス細胞の断片化ＤＮＡのＴＵＮＥＬラベリングを可視化するためにフルオレセインフィルターを用いて蛍光顕微鏡により観察されるスライドを表す。パネルＢは、Hoescht染色核を可視化するためにＵＶフィルターを通して観察される同一スライドを表す。結果は2つの個々の実験を代表するものである。写真はすべて、倍率400倍で撮影した。
【００７４】
図５９および６０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａおよび増殖ｅＩＦ‐５Ａがともに心臓組織中で発現されることを示す棒グラフである。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａレベルは虚血心臓組織中で2つのサイトカイン（インターロイキン１‐β「ＩＬ‐１β」およびインターロイキン１８「ＩＬ‐１８」）のレベル上昇と相関する、ということを本発明は発見し、そしてそれが虚血性心臓組織中に存在する場合、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａが細胞死に関与する、ということを立証した。子のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ／インターロイキン相関は、非虚血性心臓組織では認められない。図６１および７４は、虚血前心臓組織および虚血後心臓組織におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ（ｅＩｆ５Ａ１）対増殖ｅＩＦ‐５Ａ（ｅＩＦ５Ａ２）の実時間ＰＣＲにより測定した遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。Ｙ軸は、pg/ngの１８ｓ（メッセージＲＮＡ（ピコグラム）／リボソームＲＮＡ１８Ｓ（ナノグラム））である。この図面に示される結果は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａが虚血性心臓組織において優先的に上向き調節される、ということを示す。
【００７５】
図６５は、ヒト心筋中のＩＬ‐１８の局在を示す。図６６は、虚血／再還流がヒト心房組織中でＩＬ‐１８の合成を誘導したことを示す。図６２Ａ〜Ｆは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡならびにＩＬ‐１βおよびＩＬ‐１８間の相関を示す。ＰＣＲ測定を用いて、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａおよび増殖ｅＩＦ‐５Ａ（「ｅＩＦ‐５Ａ２」‐別のアイソフォーム）、ＩＬ‐１βおよびＩＬ‐１８のレベルを測定し、種々の虚血性心臓組織（冠動脈バイパス移植片および弁（僧帽および心房弁）置換患者から）で比較した。したがって、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのレベル増大はＩＬ‐１βおよびＩＬ‐１８のレベル増大と相関した、と思われる。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａとこれらの強力なインターロイキンとの相関はさらに、虚血における炎症およびアポトーシス経路は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのレベルを制御することにより制御され得る、ということを示唆する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの上向き調節の変調／低減／防止（本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを用いて）は、ＩＬ‐１８の上向き調節低減をもたらす。ＩＬ‐１８および他のサイトカインのレベルは虚血性心臓における損害をもたらし、したがって低減レベルのＩＬ‐１８および他のサイトカインは低虚血性損害をもたらす（ＩＣＥ阻害薬（インターロイキン‐１β転換酵素）の存在が虚血／再還流損傷を低減した、ということを示す図６７；ＩＬ‐１８ＢＰ（ＩＬ‐１８の内因性阻害因子）によるＩＬ‐１８の中和が虚血／再還流損傷を低減する、ということを示す図６８；ＴＮＦ‐αに曝露された場合に心臓組織の収縮力に長時間の低減が認められることを示す図６９；ＴＮＦ‐α誘導性心筋抑圧がＩＬ‐１８ＢＰにより低減されることを示す図７０；ＩＬ‐１β誘導性心筋抑圧がＩＬ‐１８ＢＰにより低減されることを示す図７１；そしてクレアチンキナーゼ活性（ＣＫ）が、ＩＬ‐１βおよびＩＬ‐１８のプロセシングの抑制またはＩＬ‐１βおよびＩＬ‐１８活性における抑制により虚血／再還流に付された心房組織で保存されることを示す図７２参照）。したがって、アンチセンスヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを用いてアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのレベルを低減することにより、低ＩＬ‐１８およびその他のサイトカインが虚血組織で産生され、したがって虚血による組織損害の低減をもたらす。
【００７６】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａが免疫応答に関与するというさらなる証拠は、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は正常では非常に低レベルのｅＩＦ‐５Ａを発現するが、しかしＴリンパ球特異的刺激による刺激時に、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現は劇的に増大する（Bevec et al., 1994）、という事実により示唆される。これは、Ｔ細胞増殖および／または活性化におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに関する役割を示唆する。活性化Ｔ細胞は広範な種々のサイトカインを産生し得るため、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡはサイトカインｍＲＮＡのための核・細胞質シャトルとして必要とされ得る、ということもあり得る。上記参考文献の著者等は、ｅＩＦ５Ａのようなこれらの細胞中での効率的ＨＩＶ複製に関与し得るＨＩＶ‐１患者におけるｅＩＦ５Ａのレベル増大は、ＨＩＶ  Ｒｅｖタンパク質のための細胞結合因子でありそしてＨＩＶ複製に必要とされると実証されている（Ruhl et al., 1993）、ということも見出した。
【００７７】
さらに近年、ｅＩＦ‐５Ａ発現は、樹状細胞成熟中に増大されることが見出された（Kruse et al., 2000）。樹状細胞は、ヘルパーおよびキラーＴ細胞を感作して、Ｔ細胞媒介性免疫を誘導する抗原提示細胞である（Steinman, 1991）。未熟樹状細胞はＴ細胞を刺激する能力を欠き、そしてＴ細胞を活性化し得る細胞に成熟するためには適切な刺激（即ち、炎症性サイトカインおよび／または微生物産物）を必要とする。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを活性化するために必要とされる酵素であるデオキシヒプシンシンターゼの阻害薬は、ＣＤ８３表面発現を阻止することにより樹状細胞によるＴリンパ球活性化を抑制することが見出された（Kruse et al., 2000）。したがって、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａは、ＣＤ８３  ｍＲＮＡのための核・細胞質シャトルとして作用することにより、樹状細胞成熟を促し得る。
【００７８】
免疫系におけるｅＩＦ‐５Ａに関する役割に関連するこれらの研究（Bevec et al., 1994；Kruse et al., 2000）の両方において、著者等は、彼等が検査中であったｅＩＦ‐５Ａのどのアイソフォームも特定または同定しなかったし、あるいは彼等はそうする理由も有さなかった。上記のように、ヒトは、ｅＩＦ５Ａの2つのアイソフォーム、即ちともに別個の染色体上でコードされるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ（「ｅＩＦ‐５Ａ１」）および増殖ｅＩＦ‐５Ａ（「ｅＩＦ‐５Ａ２」）を有することが知られている。本発明人等の発見の前には、これらのアイソフォームはともに機能的冗長である、と考えられた。刺激化ＰＢＭＣ中のｅＩＦ５Ａ  ｍＲＮＡを検出するために用いられたBevec等により記載されたオリゴヌクレオチドは、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａと100％相同性を有し、そして当該研究は、増殖ｅＩＦ‐５Ａのクローニングに先行する。同様に、樹状細胞成熟中に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によりｅＩＦ５Ａを検出するために用いられたKruse等により記載されたプライマーは、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａと100％相同性を有した。
【００７９】
本発明は、樹状細胞成熟およびＰＢＭＣ活性化の速度を制御し、これが次にＴ細胞媒介性免疫の速度を制御し得るためのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の制御に関する。単球およびマクロファージは、それらが認識しそして外来侵入物により活性化／刺激されるようになり、サイトカインを産生して、残りの免疫系に警告するので、免疫系にとって重要である。
【００８０】
ＰＢＭＣは、ＰＭＡで処置され、その後、ＬＰＳで刺激されて、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現増大を示した（ウエスタンブロットに関しては図１２１参照）。図１２２は、この発現増大がＴＮＦ産生増大と同時に起こる、ということを示す。図１２３は、ＰＭＡ分化を伴わずにＬＰＳに対してＰＢＭＣが応答する、ということを実証する。図１２４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＰＢＭＣはアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の抑圧を実証する、ということを示し、そして図１２５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡの抑圧はＴＮＦの低産生と同時に起こる、ということを示す。したがって本発明は、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを用いてＰＢＭＳ中でのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を低減し、次にＴＮＦの発現低減または下向き調節をもたらす方法を提供する。
【００８１】
本発明は、Ｕ‐９３７がｅＩＦ‐５Ａ  ｍＲＮＡを発現することが既知である（Bevec et al., 1994）ので、Ｕ‐９３７細胞株を用いて、接着性マクロファージへの単球の分化におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの役割も試験した。Ｕ‐９３７は、懸濁液中で増殖し、接着性になり、そしてＰＭＡでの刺激時にマクロファージに分化するヒト単球細胞株である。ＰＭＡが培地を変えることにより除去されると、細胞は不活発になり、そして次にサイトカインを産生し得る（Barrios-Rodiles et al., J. Immunol., 163: 963-969 (1999)）。多数の最近の外膜上に見出され、そして全身炎症性応答を誘導することが既知である因子であるリポ多糖（ＬＰＳ）に応答して、マクロファージはＴＮＦ‐αおよびＩＬ‐１βの両方を産生する（Barrios-Rodiles et al., 1999）（幹細胞分化ならびにその結果生じるサイトカイン産生のチャートを示す図１７６参照）。Ｕ‐９３７細胞は、ＬＰＳ刺激後にＩＬ‐６およびＩＬ‐１０も産生する（Izeboud et al., J. Receptor & Signal Transduction Research, 19 (1-4): 191-202 (1999)）。
【００８２】
Ｕ９３７細胞を用いて、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａは単球分化およびＴＮＦ‐α分泌中に上向き調節される、ということを示した（図１２７および１２９〜１３０参照）。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質発現は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡで抑圧された（図１３１参照）。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ、トール様受容体４（ＴＬＲ４）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ‐Ｒ１）およびインターフェロンγ受容体（ＩＦＮγ‐Ｒα）の発現に関して、ウエスタン・ブロッティングにより、対照ｓｉＲＮＡおよびアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡ処置細胞を比較した。ＥＬＩＳＡにより、ならびに液相電気化学発光（ＥＣＬ）により、サイトカイン、ＴＮＦ、インターロイキン‐１β（ＩＬ‐１β）、ＩＬ‐６およびＩＬ‐８を定量した。
【００８３】
結果は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡによる処置が、対照ｓｉＲＮＡで処置された細胞に比して80％より多くアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質発現を特異的に下向き調節した、ということを示す。ＰＭＡ、ＬＰＳおよびＩＦＮ‐γ処置は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質発現を誘導した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現低減を有する細胞は、ＴＬＲ４（図１３２）、ＴＮＦ‐Ｒ１（図１３４）およびＩＦＮγ‐Ｒα（図１３３）のタンパク質発現低減も示した。初期実験は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現低減を示す細胞では、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦα発現は3時間で低減され（図１３５）、そしてＬＰＳ誘導性ＩＬ‐１β（図１３６）およびＩＬ‐８産生は24時間で低減された（図１３７）ということも示唆する。これらの試験は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａが多数の重要なサイトカインシグナル伝達分子、例えば受容体（ＴＬＲ４、ＴＮＦ‐Ｒ１およびＩＦＮγ‐Ｒα）およびサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ‐１βおよびＩＬ‐８）の転写後調節に関与し得る、ということを示唆する。図１３８は、ＩＬ‐６産生がアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡ媒介性下向き調節と無関係である、ということを示す。
【００８４】
したがって本発明の一態様は、サイトカインの産生を抑制するかまたは低減するためにマクロファージの成熟を抑制するかまたは遅延する方法を提供する。この方法は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を低減し得る作用物質を提供することを包含する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａは単球分化およびＴＮＦ‐α分泌中に上向き調節されるため、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａはこれらの事象が起こるために必要である、と考えられる。したがって、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現を低減することにより、単球分化およびＴＮＦ‐α分泌が低減され得る。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を低減し得る任意の作用物質が用いられ、その例としては好ましくは本明細書中に記載されるようなアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
本発明人等は、特定の刺激に応答してサイトカイン（単数または複数）を予測可能的に産生することが既知である細胞株を用いて、in vitroでサイトカインｍＲＮＡのための核・細胞質シャトルとして作用することにより、サイトカインの翻訳を促進するヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの能力も試験した。ヒト肝臓細胞株は他のサイトカインの産生を誘導することによりサイトカイン刺激に応答し得る、ということをいくつかの最新試験は見出した。ＨｅｐＧ２は、サイトカインに感受性であることが見出された良好に特性化されたヒト肝細胞癌細胞株である。ＩＬ‐１βに応答して、ＨｅｐＧ２細胞は、用量依存性方式で、ＴＮＦ‐α  ｍＲＮＡおよびタンパク質を迅速に産生する（Frede et al., 1996；Rowell et al., 1997；Wordemann et al., 1998）。したがって、ＨｅｐＧ２細胞をモデル系として用いて、ＴＮＦ‐α産生の調節を試験した。本発明は、ＨｅｐＧ２細胞中でのヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現の抑制が、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた後、細胞に低ＴＮＦ‐αを産生させる、ということを示した（図１００参照）。
【００８６】
したがって、本発明の方法は、サイトカインのレベルを低減するために用いられ得る。当該方法は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を低減し得る作用物質を投与することを包含する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現低減は、サイトカインの発現も低減し、したがって細胞により産生されるサイトカインの量の低減をもたらす。サイトカインは、好ましくは前炎症性サイトカイン、例えばＩＬ‐１、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐６およびＴＮＦ‐α（これらに限定されない）である。適切な作用物質は上記で考察されており、例としてはアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００８７】
さらに本発明は、ＩＬ‐１、ＴＮＦ‐アルファ、ＩＬ‐６またはＩＬ‐１８レベル増大により特性化される病理学的状態の治療方法であって、上記のようなアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を低減するための作用物質（アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ）を上記病理学的状態を有する哺乳類に投与することを包含する方法を提供する。ＩＬ‐１、ＴＮＦ‐アルファまたはＩＬ‐６レベルの増大により特性化される既知の病理学的状態としては、慢性関節リウマチおよび骨関節炎、喘息、アレルギー、動脈炎症、クローン病、炎症性腸疾患（ｉｂｄ）、潰瘍性結腸炎、冠動脈性心疾患、嚢胞性繊維症、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、グレーブス病、歯周炎、緑内障および黄斑変性、眼表面疾患、例えば円錐角膜、臓器虚血‐心臓、腎臓、再還流損傷、敗血症、多発性骨髄腫、臓器移植片拒絶、乾癬および湿疹が挙げられるが、これらに限定されない。例えば炎症性腸疾患は、一部は、前炎症性サイトカインおよび腸上皮細胞により放出されるケモカインにより引き起こされる組織損害により特性化される。
【００８８】
インターフェロンガンマ（ＩＦＮ‐γ）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＴリンパ球により産生されるサイトカインであって、これは、サイトカイン・ネットワークにおいて重要な役割を演じる。ＩＦＮ‐γは、感受性細胞における種々の応答、例えば抗ウイルス性、抗増殖性および免疫調節活性を誘導する。ＩＦＮ‐γとその受容体（ＩＦＮ‐γＲ）との結合は、ヤヌス・キナーゼＪＡＫ１およびＪＡＫ２の自己リン酸化をもたらす。チロシン残基１０２２および１０２３でのＪＡＫ１の自己リン酸化は、触媒的事象の活性化に関与すると思われる（Liu et al., Curr. Biol. (7): 817-826 (1997)）。ＩＦＮ‐γＲは、ＩＦＮ‐γＲαおよびＩＦＮ‐γＲβと呼ばれる少なくとも2つの鎖から成る。受容体とそのリガンドＩＦＮ‐γとの結合は、ＪＡＫ１の自己リン酸化を生じ、これが、転写因子である転写のシグナル伝達物質および活性物質（ＳＴＡＴ）の動員およびチロシンリン酸化をもたらす。ＳＴＡＴ転写因子のリン酸化は、ＳＴＡＴの二量体化および核転座をもたらし、この場合、それはその後、標的プロモーターの上流の素子と結合して、転写を調節する。ＪＡＫ‐ＳＴＡＴシグナル伝達変更がサイトカイン誘導性前炎症性応答を低減し、そしてＩＦＮ‐γの不適切な発現は自己免疫障害に関与すると考えられるため、ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ経路は、抗炎症療法のための良好な標的を現わす。
【００８９】
腸上皮細胞は、正常生理学的条件下では、天然腸内細菌叢の産物、例えばリポ多糖（ＬＰＳ）に対して低応答性である。ＩＦＮ‐γは、ＩＬ‐８およびＴＮＦ‐αのようなサイトカインの産生をもたらすので、ＬＰＳに対して腸上皮細胞を応答性にさせ得ると思われる。ＩＦＮ‐γが腸上皮細胞に対するＬＰＳ感受性を回復し得る一メカニズムは、ＬＰＳ認識のために必要とされる2つのタンパク質であるＭＤ‐２およびＴｏｌｌ受容体４（ＴＬＲ４）の発現を増大することによりＬＰＳ取込みを増大することである（Suzuki et al., Infection and Immunity; (71): 3503-3511 (2003)）。片利共生細菌の微生物産物に対する腸上皮細胞の応答性変更を生じるＩＦＮ‐γのようなＴｈ１サイトカインの産生増再は、炎症性腸疾患を特性化する慢性炎症に関与すると考えられる。
【００９０】
本発明人等は、ＨＴ‐２９細胞（ヒト上皮細胞株）がＩＦＮ‐γおよびＬＰＳに曝露される場合、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡはＴＮＦ‐αの発現低減をもたらす、ということを示した（図１０１〜１０２、１０８）。さらに、本発明人等は、ＨＴ‐２９細胞（ヒト上皮細胞株）がＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐αに曝露される場合、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡはＩＬ‐８の発現低減をもたらす、ということを示した（図１０３および１０４）。本発明人等は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、ＩＦＮに曝露されたＨＴ‐２９細胞が低ＴＮＦＲ１（図１１１）、低ｉＮＯｓタンパク質（図１１２）、低ＴＬＲ４（図１１３および１１７）および低ＩＦＮ‐γＲα（図１１６）ｍＲＮＡを発現する、ということも示した。
【００９１】
炎症に関与する別の分子は、ＮＦκ‐β（ＮＫκ‐ベータまたはＮＦκＢとも呼ばれる）である。ＮＦκβは、その活性化がＣＯＸ‐２の発現を誘導し、これが組織炎症をもたらすので、炎症に関する腫瘍細胞死愚なる伝達分子である。炎症部位でのプロスタグランジンの大量産生に関与すると考えられるＣＯＸ‐２コード遺伝子の発現は、ＮＦκＢにより転写的に調節される。ＮＦκＢは細胞の細胞質中に存在し、そしてその阻害薬と結合される。損傷性および炎症性刺激は、阻害薬からＮＦκＢを放出する。ＮＦκＢは、核中に移動し、そしてＣＯＸ‐２の発現に関与する遺伝子を活性化する。したがってＮＦκベータのレベルを低減することにより、炎症が低減され得る。
【００９２】
本発明人等による一実験では、ヒト上皮細胞（ＨＴ‐２９細胞）はアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに標的化されたｓｉＲＮＡで処置された。次に炎症は、1時間のＴＮＦまたはインターフェロン・ガンマおよびＬＰＳの付加により、ＮＦκＢにより誘導された。この実験の結果は、ｓｉＲＮＡによるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の抑制がガンマインターフェロンおよびＬＰＳにより活性化されたＮＦκＢのレベルの低減を提供する、ということを示す（図１０６および１１４参照）。
【００９３】
本発明人等はまた、アポトーシスｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨＴ‐２９細胞がＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐αに曝露された後にアポトーシスの低減を示す、ということを、Hoechst染色およびＴＵＮＥＬラベリングにより実証した（図１０９参照）。
【００９４】
図１１８も、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現のｓｉＲＮＡ媒介性抑制がＩＦＮ‐γ処置に応答してＳＴＡＴ１αおよびＪＡＫ１のリン酸化の低減を生じる、ということを実証する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ４のＩＦＮ‐γ刺激性上向き調節の低減は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡがＩＦＮ‐γおよびＬＰＳに応答してＨＴ‐２９細胞中のＮＦ‐κＢｐ５０活性化およびＴＮＦ‐α産生を低減することを実証する従来のデータと一致する。データは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡがＪＡＫ‐ＳＴＡＴ経路によるＩＦＮ‐γシグナル伝達を調節している、という理論と一致する。したがってアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現の阻止は、ＴＬＲ４（結腸上皮細胞がＬＰＳを検出するために必要とされる）のＩＦＮ‐γ刺激性上向き調節を防止し、したがって細胞は依然としてＬＰＳに対して低応答性である。結果として、ＮＦκＢ  ｐ５０はＴＬＲ４により結合するＬＰＳに応答して活性化されず、そしてサイトカイン産生（ＴＮＦ‐αおよびＩＬ‐８）は抑制される。
【００９５】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡがＩＦＮ‐γシグナリングを調節するという考え方のさらなる支持は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡがＳＴＡ１αおよびＪＡＫ１のリン酸化（ＩＦＮ‐γシグナルの伝達における2つの重要なステップ）を劇的に低減する、という知見である。ＩＦＮ‐γによる刺激時にＩＦＮ‐γ受容体α上向き調節の低減が観察されるが、しかしＩＦＮ‐γの量は、それが対照ｓｉＲＮＡで処置されるか、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡで処置されるかにかかわらず、ＩＦＮ‐γ処置前は同一であると思われる。ＩＦＮ‐γＲβ鎖はアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡによる影響を及ぼされ得るが、しかしデータは、その受容体と結合しているＩＦＮ‐γはアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡにより影響され得ない、ということを示唆する。これは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡがＪＡＫ１またはＪＡＫ１発現またはリン酸化を調節するタンパク質の転写後調節のために必要であり得る、ということを示唆する。ＪＡＫ‐ＳＴＡＴ経路（少なくともＪＡＫ１およびＳＴＡＴ１αによる）の適正な機能、ならびにそれによるＩＦＮ‐γシグナル伝達がアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを要する、ということは明らかである。
【００９６】
対照ｓｉＲＮＡが、ＴＬＲ３による二本鎖ＲＮＡ検出の結果であり得るＨＴ‐２９細胞における応答を引き出し得た、ということに留意することも有益である。特定的には、対照ｓｉＲＮＡで処置されたＨＴ‐２９細胞は、非トランスフェクト化細胞より有意に多くのＴＮＦ‐αおよびＩＬ‐８を産生した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡはこの応答を生じなかった。さらにまた、Ｊａｋ１は、ＩＦＮ‐γで処置されなかった対照ｓｉＲＮＡトランスフェクト化細胞中でリン酸化された（図１１８参照）。これは、ＴＬＲ３による二本鎖ＲＮＡ認識に起因するインターフェロン応答に関与するＪＡＫ‐ＳＴＡＴ経路の活性化を反映する、という可能性がある。データは、ＩＦＮ‐γ処置の非存在下でさえ、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡ処置細胞におけるＪＡＫ１リン酸化を示さなかったが、このことは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡが、Ｊａｋ‐ＳＴＡＴ経路によっても生じる二本鎖ＲＮＡの検出により誘発されるインターフェロン応答を遮断し得る、という可能性を示唆する。
【００９７】
本発明人等は、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ‐γ）シグナル伝達に及ぼす作用を調べるために、ｓｉＲＮＡを用いてＨＴ‐２９細胞中のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡは、ＩＦＮ‐γおよびＬＰＳに応答してＴＮＦ‐αを分泌するＨＴ‐２９細胞の能力を90％以上低減した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡはまた、ＩＦＮ‐γに応答してＩＬ‐８分泌を抑制したが、しかしＴＮＦ‐αには応答しなかった。同様に、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡは、ＩＦＮ‐γ特異的方式でＮＦ‐κＢｐ５０を低減し、そしてＴＬＲ４およびＴＮＦＲ１のＩＦＮ‐γ刺激性発現を低減することが判明した。さらに興味深いのは、細胞が合いＦＮ‐γで刺激され、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａがこの応答を有意に低減しえた場合、偽トランスフェクト化対照と比較して、対照ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションがＴＮＦ‐α分泌を有意に増大した、という知見である。これらの結果は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡがＩＦＮ‐γシグナル伝達経路の転写後調節物質であり、そして二本鎖ＲＮＡに対する細胞性応答にも関与し得る、ということを示す。ｓｉＲＮＡによるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの抑制は、ＩＦＮγシグナル伝達を阻止し、そしてそれぞれＴＬＲ４およびＴＮＦＲ１によりＬＰＳおよびＴＮＦ‐αに応答する腸上皮細胞の能力を低減する。したがってアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの抑制は、腸上皮細胞に及ぼす直接免疫調節作用を有すると思われ、そして炎症性腸疾患に関する治療的標的であり得る。
【００９８】
したがって本発明の一実施形態は、内因性アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制するかまたは低減することにより、前炎症性応答を抑制するかまたは低減する方法を提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現抑制は、好ましくは前記のような本発明のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのアンチセンスポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用により実行される。上に提示したように、内因性アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の低減が起こると、炎症カスケードに関与する種々の生体分子の発現も低減される、ということを本発明人等は示した。炎症カスケードに必要なこれらの生体分子のレベル低減またはこれらの生体分子の活性化低減は、炎症の低減を引き起こす。炎症カスケードに進入する細胞の能力の低減は、慢性炎症に関連づけられる疾患／状態、例えば炎症性腸疾患、関節炎、クローン病および狼瘡（これらに限定されない）を治療するのに有用であることを立証し得る。
【００９９】
したがって本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるアンチセンスまたはｓｉＲＮＡを用いて、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制するがまたは抑圧することにより、ｐ５３のレベルを低減し、前炎症性サイトカインのレベルを低減し、活性ＮＦκβ；ＴＬＲ４；ＴＮＦＲ‐１；ＩＦＮ‐γＲα、ｉＮＯＳまたはＴＮＦ‐αのレベルを低減し、そしてＳＴＡＴ１およびＪＡＫ１のリン酸化を減少させる方法も提供する。
【０１００】
炎症カスケードに関与する種々の有害な生体分子の発現を低減するほかに、本発明は、ｐ５３の発現の低減方法にも向けられる。この方法は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を低減し得る作用物質、例えば上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを投与することを包含する。アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号２６および２７）によるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現低減は、図４２および実施例１０に示されるようにｐ５３の発現を低減する。
【０１０１】
本発明は、Ｂｃｌ‐２の発現を増大するための方法にも向けられる。この方法は、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を低減し得る作用物質を投与することを伴う。好ましい作用物質としては、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡが挙げられる。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の低減は、図９８および実施例１３に示されるようにＢｃｌ‐２の発現を増大する。図９８は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞がより少ないアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質を産生し、さらにより多いＢｃｌ‐２タンパク質を産生した、ということを示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現の低減は、ＢＣＬ‐２発現の増大と相関する。
【０１０２】
本発明は、in vivoで哺乳類肺細胞にｓｉＲＮＡを送達する方法も提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡを、マウスの鼻内に（水と混合されて）投与した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡの投与後24時間に、リポ多糖（ＬＰＳ）をマウスの鼻内に投与した。ＬＰＳは、in vivoで適用されると炎症応答のネットワークを誘発する細菌の高分子細胞表面抗原である。鼻内送達ＬＰＳは、肺における好中球数の増大を引き起こす。主な事象の1つは、受容体媒介性プロセスによる単球食細胞の活性化であり、ＴＮＦ‐αを含めた多数のサイトカインの放出を伴う。次に、ＴＮＦ‐αにより誘導される内皮細胞への好中球の付着増大は、肺間隙における大量浸潤をもたらす。
【０１０３】
さらに24時間後、右肺を取り出し、ミエロペルオキシダーゼを測定した。ミエロペルオキシダーゼ（「ＭＰＯ」）は、好中球中に見出されるリソソーム酵素である。ＭＰＯは、水素ペルオキシダーゼを用いて、塩化物を次亜塩素酸に転化する。次亜塩素酸は細菌と反応し、そして破壊する。ミエロペルオキシダーゼは、動脈が炎症を起こした場合も産生される。したがって、ミエロペルオキシダーゼが好中球および炎症応答と関連する、ということは明らかである。マウスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡは、対照ｓｉＲＮＡと比較して、ミエロペルオキシダーゼを約90％抑圧した。当該試験において、各群中のマウスは5匹であった。この試験の結果は、ｓｉＲＮＡが哺乳類の肺組織にin vivoで首尾よく送達され得ることを、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡがアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制して、ミエロペルオキシダーゼ産生の抑圧を生じる、ということを示す。
【０１０４】
したがって本発明人等は、ｓｉＲＮＡによるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの下向き調節が、ＬＰＳ（正常では、ミエロペルオキシダーゼの産生を含めた炎症性応答を生じる）に曝露後に肺組織中のミエロペルオキシダーゼのレベルを低減し、したがって炎症応答を低減するかまたは抑圧する、ということを実証した（マウスがＬＰＳおよびｅＩＦ‐５Ａ１  ｓｉＲＮＡを鼻内に摂取した後、対照ｓｉＲＮＡを接種しているマウスと比較して、ミエロペルオキシダーゼ活性低減を有した、ということを示す図１４３を参照）。したがって本発明の一実施形態は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制するかまたは低減するためにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡを送達することにより肺組織中のＭＰＯのレベルを低減する方法を提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の低減は、ＭＰＯの低減をもたらす。ｓｉＲＮＡアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの送達は、鼻内であり得る。
【０１０５】
ＭＰＯレベルは、心臓発作ならびに自己免疫障害により引き起こされるサイトカイン誘導性炎症の重要な予測変数である。炎症応答を低減するかまたは抑圧するこの能力は、自己免疫障害のような炎症関連障害を治療するのに有用に使い得る。さらにＭＰＯを下げる能力は、虚血性事象および心臓発作から患者を防御する一手段であり得る。
【０１０６】
図１３９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡが血清中のＴＮＦ‐αのレベルを低減し得た、マウスで実施された実験の結果を示す。ｓｉＲＮＡを、マウスの尾静脈中に静脈内送達した。ＬＰＳの投与後90分に、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡの静脈内トランスフェクション後48時間に、ＴＮＦα血清レベルを測定した。図１４０は、ｓｉＲＮＡが経鼻的に投与された（上記と同様に）マウスにおいて実施された実験の結果を示す。マウスの血清中で、ＴＮＦ‐αの総レベルを測定した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡがＴＮＦ‐αの量の低減を引き起こした。したがって本発明の一実施形態は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制するかまたは低減するためにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡを送達することにより血清中のＴＮＦ‐αのレベルを低減する方法を提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の低減は、血清中のＴＮＦの低減をもたらす。
【０１０７】
図１４１は、マクロファージ炎症性タンパク質１‐アルファ（ＭＩＰ‐１α）のレベルも低減された、ということを示す。ＭＩＰ‐１αは、サイトカインのＲＡＮＴＥＳ（発現され、分泌された正常Ｔ細胞活性化時に調節）ファミリーに属する低分子量ケモカインであり、受容体ＣＣＲ１、ＣＣＲ５およびＣＣＲ９と結合する。したがって本発明の一実施形態は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制するかまたは低減するためにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡを送達することにより肺組織中のＭＩＰ‐１のレベルを低減する方法を提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の低減は、ＭＩＰ‐１αの低減をもたらす。
【０１０８】
図１４２は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡでマウスが処置された（鼻内／経鼻送達）実験の結果を示す。ＬＰＳの投与後90分に、そしてｓｉＲＮＡで処置された48時間後、測定されたマウス肺のＩｌ‐１ａのレベルは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡで処置されていないマウス肺と比較して、顕著な低減を示した。したがって本発明の一実施形態は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制するかまたは低減するためにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡを送達することにより肺組織中のＩｌ‐１αのレベルを低減する方法を提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の低減は、Ｉｌ‐１αの低減をもたらす。
【０１０９】
図１４４および１４６は、胸腺細胞の鼻‐ＬＰＳ誘導性損失がアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡを用いた前処置により遮断される、ということを示す。したがって本発明の一方法は、ＬＰＳ誘導性胸腺細胞アポトーシスに対する防御方法を提供するが、この場合、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡは哺乳類に鼻内送達される。
【０１１０】
胸腺細胞発達は、異なる段階の増殖および細胞死を包含する複雑な事象である。細菌感染は、細菌細胞壁構成成分、例えばＬＰＳ、リポタイコ酸およびペプチドグリカンの放出を生じる。これらの細胞壁構成成分は、その各々が敗血症性症候群、ショックおよび死に進行する敗血症の危険を増大するのに関与するＯＬ‐１β、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８およびＴＮＦ‐αのようなサイトカインの産生をもたらす。全身性炎症状態微生物産物、例えばＬＰＳの投与の動物モデルにおいて、胸腺細胞アポトーシスが観察される。
【０１１１】
グラム陰性細菌により引き起こされる肺感染は、肺胞マクロファージを活性化して、ＩＬ‐１およびＴＮＦ‐αのようなサイトカインの賛成を生じる。次にこれらのサイトカインは多形核好中球を炎症部位に動員し、そして重症感染の後期では、敗血症性ショックが発症し得る。漸増する証拠は、アポトーシスが敗血症中の多数の器官、例えば胸腺で起こる、ということを示唆する。したがって胸腺細胞アポトーシスに及ぼす鼻内ＬＰＳ投与の作用を試験した。試験結果は、ＬＰＳで鼻内処置されたマウスが胸腺細胞充実度を低減した、ということを示す。胸腺細胞充実度は、鼻内ＬＰＳ後24時間で有意に低くなり、そして48時間後に対照レベルに戻った。同様に、ピークアポトーシスはＬＰＳ投与後24時間に観察され（32％）、そして48時間までに回復した。これらの観察は、ピークアポトーシスがＬＰＳ投与後24時間に達成された（28％）ＬＰＳの腹腔内注射後に観察されるものと、ならびに静脈内ｃｏｎＡ注射後に観察された（46％）ものと同様であった。
【０１１２】
ＦａｓおよびＦａｓＬは胸腺中で発現され、そしてＬＰＳ誘導性胸腺細胞アポトーシスは糖質コルチコイドにより媒介され、これは次にＦａｓ／ＦａｓＬの発現を増大する。胸腺細胞Ｆａｓ／ＦａｓＬを下向き調節することにより、ｓｉＲＮＡ  ｅＩＦ‐５ＡがＬＰＳ誘導性アポトーシスを低減した、という可能性がある。さらに、ＬＰＳはＮＦ‐κＢを活性化し、これが多数の前炎症性媒介物質、例えばＩＬ‐１、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８およびＴＮＦ‐ａの合成および放出をもたらす（37）。ＴＮＦ‐αおよびＩＦＮ‐γはともに胸腺萎縮および胸腺細胞アポトーシス誘導性全身性炎症における重要な媒介物質であるため、ｓｉＲＮＡがＬＰＳ誘導性胸腺細胞アポトーシスを抑制するメカニズムは、より低レベルのＴＮＦ‐αおよびその他の前炎症性サイトカインのせいであって、これは、ｓｉＲＮＡ  ｅＩＦ‐５ＡがＬＰＳに応答してＩＦＮ‐γ初回刺激ＨＴ‐２９細胞によるＴＮＦ‐α産生を強力に抑制するからである。したがって、ｓｉＲＮＡ  ｅＩＦ‐５ＡがＬＰＳ誘導性胸腺細胞アポトーシスを抑圧するメカニズムは、ＴＮＦ‐αおよびＩＦＮ‐γの合成低減の結果であり、このことは、ｅＩＦ‐５Ａが抗炎症療法の開発のための重要な標的である、ということを示す。
【０１１３】
図１４７は、マウスにおいて鼻内送達されたｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡがＩＬ‐６、ＩＦＮ‐γおよびＩ１‐１αの産生を低減したことを示す。図１４８は、ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡが、ＬＰＳによる処置の結果としてＴＮＦαの発現を低減し得る、ということを示す。上部パネルは生データを示し、そして底部パネルは棒グラフでのデータを示す。
【０１１４】
したがって本発明人等は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａおよび免疫応答間の相関を示し、ならびにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡがミエロペルオキシダーゼの産生を抑制する（即ち、炎症応答の一部）ということを示した。本発明人等は、１回鼻内送達により肺組織にin vivoでｓｉＲＮＡを送達することが可能であるということも示した。ｓｉＲＮＡは、水中でのみ混合された。他の当業者はｓｉＲＮＡに関する許容可能な送達方法を計画しようと試みてきたので、これは大きな躍進および発見を提示する。
【０１１５】
別の実験において、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡで同様にマウスを処置した。リポ多糖（ＬＰＳ）をマウスに投与して、炎症および免疫系応答を誘導した。対照条件下で、ＬＰＳは、感染を払いのけるために胸腺中で作られる重要な免疫系前駆体細胞である胸腺細胞を殺害する。しかしながら、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡの使用は、ＬＰＳの存在下で胸腺細胞の約90％生存度を可能にした。胸腺細胞が破壊されると、それらはＴ細胞に対する前駆体であるため、身体の自然免疫はＴ細胞を産生し得ないことにより危うくされ、したがって細菌感染等を撃退し得ない。したがってアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡは、身体の自然免疫防衛系を破壊することなく、炎症を低減する（最初の実施例においてＭＰＯの低レベルにより示されるように）ために用いられ得る。
【０１１６】
本発明の別の実施形態は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡを投与することにより、敗血症を治療するための方法を提供する。敗血症は、全身性炎症性応答症候群（「ＳＩＲＳ」）としても既知である。敗血症は、身体中のどこでも生じ得る細菌感染により引き起こされる。敗血症は、単に、全身性炎症および凝血により特性化される感染に対する患者の免疫応答により引き起こされる臨床状態の一領域、と定義され得る。それは、臓器不全に対する全身性炎症性応答（ＳＩＲＳ）から多臓器不全および最終的には死までの全範囲の応答を包含する。
【０１１７】
敗血症は、非常に複雑な一連の事象であり、そして患者がＳＩＲＳから敗血症性ショックに如何に進行するかを完全に理解するためには、多くの研究を実行する必要がある。敗血症性ショックを有する患者は、二相的免疫学的応答を示す。最初にかれらは、感染に対する圧倒的な炎症性応答を現わす。これはほとんどが前炎症性サイトカインである腫瘍液因子（ＴＮＦ）、ＩＬ‐１、ＩＬ‐１２、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮガンマ）およびＩＬ‐６によるものである。次に身体は、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ‐１０）、可溶性阻害薬［ＴＮＦ受容体、ＩＬ‐１受容体ＩＩ型およびＩＬ‐１ＲＡ（不活性形態のＩＬ‐１）］を産生することによりこの応答を調節するが、これは免疫抑制の期間により患者で表徴される。この応答性低下の持続は、院内感染および死の危険増大に関連する。
【０１１８】
この全身性炎症カスケードは、種々の細菌産物により開始される。これらの細菌産物（グラム陰性細菌＝内毒素、ホルミルペプチド、外毒素およびプロテアーゼ；グラム陽性細菌＝外毒素、スーパー抗原（毒物ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ）、連鎖球菌発熱性外毒素Ａ（ＳｐｅＡ））、腸毒素、溶血素、ペプチドグリカンおよびリポタイコ酸、ならびに真菌細胞壁物質）は、宿主のマクロファージ上の細胞受容体と結合し、そして核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）のような調節タンパク質を活性化する。内毒素は、いくつかの受容体と相互作用することにより、調節タンパク質を活性化する。ＣＤ受容体は細胞の表面にＬＰＳ‐ＬＰＳ結合タンパク質複合体をプールし、そして次にＴＬＲ受容体がシグナルを細胞中に移す。
【０１１９】
産生される前炎症性サイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン１、６および１２、ならびにインターフェロン・ガンマ（ＩＦＮガンマ）である。これらのサイトカインは、臓器機能に影響を及ぼすよう直接作用し得るし、あるいはそれらは二次媒介物質を介して関節的に作用し得る。二次媒介物質としては、一酸化窒素、トロンボキサン、ロイコトリエン、血小板活性因子、プロスタグランジンおよび補体が挙げられる。ＴＮＦおよびＩＬ‐１（ならびに内毒素）は、内皮細胞による組織因子の放出も生じ、フィブリン沈着および播種性血管内凝固（ＤＩＣ）をもたらし得る。
次にこれらの一次および二次媒介物質は、凝固カスケードの活性化、補体カスケード、ならびにプロスタグランジンおよびロイコトリエンの産生を生じる。血餅は血管中に留まり、これが臓器の還流を低下させ、そして多臓器系不全をもたらし得る。そのうちに、凝固カスケードのこの活性化は、血餅を作ってＤＩＣおよびＡＲＤＳを生じる患者の能力を枯渇させる。
【０１２０】
このカスケードの累積的作用は非平衡状態であって、炎症は抗炎症に対して支配的であり、そして凝固は繊維素溶解に対して支配的である。微小血管血栓症、低還流、虚血および組織損傷が生じる。重症敗血症、ショックおよび多臓器不全が起こり、死を引き起こし得る。
【０１２１】
本発明人等は、ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡが種々の炎症サイトカイン、例えばＴＮＦ‐αの発現を低減し得た、ということを以前に示した（そして上記で提示した）。マウスにおける敗血症を治療するためのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡの投与を包含する試験において、本発明人等は、ｓｉＲＮＡがin vivoで敗血症を治療するために用いられ得る、ということをさらに示した（実施例２１および図１４９〜１６０参照）。この試験では、ＬＰＳが投与された後48時間以内に、動物において敗血症および死を誘導する用量のＬＰＳをマウスに投与した。ｓｉＲＮＡ（3’-GCC UUA CUG AAG GUC GAC U-5’）を、ＬＰＳ投与の前および後の異なる時間に、マウスに腹腔内投与した。いくつかの試験群において、ｓｉＲＮＡを摂取した5匹のマウスすべてが生存した。ｓｉＲＮＡの使用は炎症カスケードを遮断し、したがってマウスにおける敗血症を防止し得た、と考えられる。
【０１２２】
したがって、本発明の一実施形態は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを提供するが、この場合、上記ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドはアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの内因性発現を抑制し、そして3’-GCC UUA CUG AAG GUC GAC U-5’の配列を有する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑圧することにより、炎症カスケードが敗血症性ショックを開始し且つ生じないよう、炎症性サイトカインの産生は抑制されるかまたは低減される。
【０１２３】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａは、アポトーシスおよび炎症に関与する核からｍＲＮＡのサブセットを往復させると考えられる。ｅＩＦ‐５Ａの量が低減されるかまたは完全に排除される場合、核から種々の炎症および細胞死サイトカインのｍＲＮＡを往復させるために利用可能なシャトルは存在しない。これは、細胞により産生される炎症性サイトカインの量の低減を生じ、したがって炎症カスケードの開始を抑制する。敗血症および敗血症性ショックは炎症カスケードの結果であるため、カスケードのシャトルダウンは、敗血症／敗血症性ショックを治療するかまたは予防する方法を提供する。したがって本発明の別の実施形態は、哺乳類における敗血症の治療方法であって、前記のｓｉＲＮＡを哺乳類に投与することを包含する方法を提供する。
【０１２４】
本発明は、癌／腫瘍におけるアポトーシスを増大するためにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードするポリヌクレオチドを投与することにより、癌を治療するかおよび／または新血管形成を低減する方法（あるいは癌を治療するかおよび／または新血管形成を低減する薬剤）も提供する。本発明人等は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの過剰発現がアポトーシスを誘導する、ということを示した（図４４〜５８参照）。本発明人等は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａポリヌクレオチドがいくつかの腫瘍／癌モデルにおいてアポトーシスを増大し、そしてさらに周囲の非癌性組織中でアポトーシスを誘導するようには見えない、ということを示した（図１６１〜１７１参照）。
【０１２５】
鼻咽頭癌細胞モデルにおいて、本発明人等は、ａｄ５ｏｒｉｏＰ．ｅＩＦ‐５Ａ１は2回の細胞分裂以内に鼻咽頭癌細胞（Ｃ６６６‐１）の98％を選択的に殺害する、ということを実証した。
【０１２６】
肺癌モデルでは、肺組織に対する親和性を有する黒色腫の一型でマウスを処置した。3週間の処置後、腫瘍負荷を査定するために重量により、処置および非処置マウスの肺を比較した。「処置マウス」に、ｅＩＦ‐５Ａヌクレオチドを含有するプラスミドを注射した（実施例２５参照）。ＥＩＦ‐５Ａを摂取したマウスは、非処置マウスに比して、平均で41％の腫瘍重量低減を示した。さらに、処置マウスのほぼ半数が、いかなる腫瘍も有さなかった対照（健常）マウスに統計学的に匹敵する肺重量を有した（図１７３〜１７５参照）。
【０１２７】
本発明人等は、癌細胞が外因性アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａポリヌクレオチドの使用によりアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを過剰発現するよう誘導される場合、癌細胞はＶＥＧＦ発現の低減を示す、ということも示した（実施例２４および図１７８〜１７９参照）。ＶＥＧＦは、内皮細胞増殖および新血管形成を媒介するサイトカインである。ＶＥＧＦは、多数の細胞株がＶＥＧＦを分泌するので、病理学的新血管形成において重要であると思われる。ＶＥＧＦは、大多数のヒト腫瘍において上向き調節されることが見出されている。
【０１２８】
本発明は、癌細胞においてアポトーシスを誘導するための方法も提供する。癌細胞は正常細胞死経路を外見上は迂回するため、癌細胞におけるアポトーシスを誘導するためのメカニズムを有することが望ましい。本発明人等は、癌細胞におけるアポトーシスを誘導するためにｅＩＦ５Ａ１に対するｓｉＲＮＡを用いた。さらに、本発明人等は、非ヒプシン化形態のｅＩＦ５Ａ１がアポトーシスを誘導し得る、ということを発見したが、この場合、ｅＩＦ５Ａ１はＤＨＳによるヒプシン化により活性化されなければならない、と従来考えられている（実施例２２参照）。
【０１２９】
本発明人等は、アポトーシス中のｅＩＦ５Ａ１の役割を調べ、そして結腸癌細胞株中でのｅＩＦ５Ａ１の過剰発現がｐ５３非依存的にアポトーシスを誘導した、ということを観察した。細胞質から核へのｅＩＦ５Ａ１タンパク質の動的転位は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）死受容体活性化により、またはアクチノマイシンＤにより誘導される遺伝毒性ストレスにより媒介されるアポトーシスの誘導後にも観察されたが、このことは、ｅＩＦ５Ａ１がアポトーシスに関連した重要な核機能を有し得る、ということを示唆する。
【０１３０】
本発明の発明人等による以前の研究は、ＴＮＦ‐αによるヒト篩板細胞の処置はｅＩＦ５Ａ１を上向き調節し、そしてアポトーシスを誘導する、ということを実証した。さらに、ｅＩＦ５Ａ１に対するｓｉＲＮＡは、このサイトカインにより誘導されるアポトーシスから篩板細胞を防御した。これらの観察は、ｅＩＦ５Ａ１がＴＮＦ‐α誘導性アポトーシスにおいて一役を演じる、ということを示す。ｅＩＦ５Ａ１がＤＮＡ損害誘導性アポトーシスにも関与し得るという可能性を調べるために、正常結腸繊維芽細胞を、トポイソメラーゼＩＩを抑制する抗新生物薬であるアクチノマイシンＤで処置し、そしてｅＩＦ５Ａ１発現をノーザンおよびウエスタン・ブロッティングにより調べた（図３０）。ノーザン・ブロット分析は、ｅＩＦ５Ａ１に関する転写体がこれらの細胞中で構成的に発現されるということを、そしてアクチノマイシンＤによる処置がｅＩＦ５Ａ１転写体数度に影響を及ぼさない、ということを示した（図３０Ａ）。ｅＩＦ５Ａ１タンパク質は処置前に繊維芽細胞中に中等度レベルで存在し、そしてｅＩＦ５Ａ１タンパク質発現の中等度増大がアクチノマイシンＤ処置の1時間以内に観察された（図３０Ｂ）。タンパク質は、処置後少なくとも24時間蓄積し続けた（図３０Ｂ）。転写体レベル増大の非存在下でのｅＩＦ５Ａ１タンパク質の蓄積は、ｅＩＦ５Ａ１が後転写的に調節され得る、ということを示唆する。アクチノマイシンＤに応答するｐ５３の発現もこれらの細胞において調べられ、そしてｅＩＦ５Ａ１と平行して増大し、処置後少なくとも24時間増大し続けることが見出された（図３０Ｂ）。したがってｅＩＦ５Ａ１は、ＤＮＡ損害により誘導される細胞死に関与し得る。
【０１３１】
ヒト結腸腺癌細胞株ＨＴ‐２９を用いて、アクチノマイシンＤ誘導性細胞傷害性におけるｅＩＦ５Ａ１に関する要件を調べた。アクチノマイシンＤによる処置は、48時間後にＨＴ‐２９細胞の生存度を60％低減した（図３１Ａ）。ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションによるｅＩＦ５Ａ１の抑圧は、アクチノマイシンＤの細胞傷害性作用を低減した。対照ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞に比して、ｅＩＦ５Ａ１抑圧細胞に関するアクチノマイシンＤ処置後に細胞生存度の40％増大が観察された（図３１Ａ）。したがってアクチノマイシンＤの細胞傷害性作用は、一部は、ｅＩＦ５Ａ１の存在によっていると思われるが、このことは、遺伝毒性ストレス経路におけるｅＩＦ５Ａ１に関する役割を示す。
【０１３２】
ｅＩＦ５Ａ１は細胞増殖にも関与し得る、ということを多数の報告が示唆する。例えばＧＣ７のようなＤＨＳの阻害薬によるｅＩＦ５Ａ１のヒプシン化の遮断は、種々の腫瘍細胞株における細胞周期停止およびアポトーシスを誘導する。細胞増殖におけるｅＩＦ５Ａ１の提唱された関与を明らかにするための尽力において、細胞増殖に及ぼすｅＩＦ５Ａ１のｓｉＲＮＡ媒介性抑圧の影響を調べた。ＨＴ‐２９細胞をこれらの試験のために用いて、細胞増殖をＢｒｄＵ取り込みにより測定した。ｅＩＦ５Ａ１発現を＞90％低減した（データは示されていない）ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを用いたＨＴ‐２９細胞のトランスフェクトによるｅＩＦ５Ａ１タンパク質の枯渇は、細胞増殖および生存度に影響を及ぼさなかった（図３１Ａおよび２Ｂ）。このｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞株のいずれにおいても、細胞増殖に及ぼす負の影響は観察されなかった。細胞増殖に及ぼすｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの影響を、血清の存在下または非存在下で増殖させたＨＴ‐２９細胞を用いて、ＧＣ７の影響と比較した（図３１Ｂ）。ＧＣ７を用いた細胞の処置は、腫瘍細胞増殖を停止するこのＤＨＳ阻害薬の能力についての従来の報告と一致して、ＨＴ‐２９細胞の増殖を抑制し、そしてこの作用は血清飢餓により劇的に増大された（図３１Ｂ）。それに対して、ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションによる細胞からのｅＩＦ５Ａ１タンパク質の枯渇は、対照ｓｉＲＮＡと比較した場合、細胞増殖に及ぼすいかなる顕著な影響も生じなかった（図３１Ｂ）。したがってｅＩＦ５Ａ１タンパク質レベルの低減は、代謝活性または新規のＤＮＡ合成により測定した場合、増殖するＨＴ‐２９の能力に及ぼす影響を有さなかったが、このことは、ｅＩＦ５Ａ１が細胞生存度および増殖に必要とされない、ということを示す。これらの結果は、ＧＣ７およびその他のＤＨＳ阻害薬の報告された細胞分裂停止活性がヒプシン化ｅＩＦ５Ａ１のレベル低減に関連しないということ、そしてｅＩＦ５Ａ１が細胞増殖に必要とされない、ということを示唆する。
【０１３３】
本発明人等の実験室における最新の仕事は、ＨＡタグ化ｅＩＦ５Ａ１がin vitroでヒプシン化されない、ということを実証した。ＨＡタグ化ｅＩＦ５Ａ１がヒプシン化され得るか否かを確定するために、ＨＡ‐ｅＩＦ５Ａ１融合タンパク質を発現するｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ１構築物をＣＯＳ‐７細胞中に電気穿孔した。次に、スペルミジンはｅＩＦ５Ａ１中の保存リシンをヒプシンに修飾するためにＤＨＳにより用いられる基質であるため、電気穿孔細胞を［3Ｈ］‐スペルミジンとともに2日間インキュベートした。抗ＨＡ抗体を用いて細胞溶解物からＨＡタグ化ｅＩＦ５Ａ１を免疫沈降させ、そして免疫沈降タンパク質をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分離した。分離タンパク質を膜に移し、ｅＩＦ５Ａ１タンパク質中への［3Ｈ］の取り込みを検出するために、Ｘ線フィルムに曝露した。ｅＩＦ５Ａ１の予測サイズに対応する17 kDaで、標識化帯域を検出した（図３３Ａ）。抗ｅＩＦ５Ａ１抗体（図８Ｂ）および抗ＨＡ抗体（図３３Ｃ）を用いたウエスタン・ブロッティングにより、膜上のｅＩＦ５Ａ１タンパク質の位置を確定した。興味深いことに、2つの帯域が抗ｅＩＦ５Ａ１ウエスタンで観察された（図３３Ｂ）。抗ｅＩＦ５Ａ１ウエスタンにおける上帯域（〜20 kDa）は、抗ＨＡウエスタンで観察された単一帯域のサイズに対応した（図３３Ｃ）が、このことは、二重線の上帯域はＨＡタグ化形態のｅＩＦ５Ａ１であり、一方、二重線の底帯域（〜17 kDa）は内因性ｅＩＦ５Ａ１でなければならない、ということを示す。内因性ｅＩＦ５Ａ１がＨＡタグ化ｅＩＦ５Ａ１と結合され、そして同時沈降された、ということを示すため、内因性形態のｅＩＦ５Ａ１が抗ＨＡ抗体により免疫沈降されたことは興味深いが、これは、ｅＩＦ５Ａ１が正常では細胞内で多量体として存在し得る、ということを示唆する。したがって図３０Ａにおける17 kDa［3Ｈ］標識化帯域は、ヒプシン化形態の内因性ｅＩＦ５Ａ１タンパク質でなければならない。対応する帯域は20 kDaで観察されなかったため、細胞中に導入されたＨＡタグ化ｅＩＦ５Ａ１はヒプシン化されないか、または内因性ｅＩＦ５Ａ１より非常に程度にヒプシン化されると思われる。
【０１３４】
ＨＡタグ化ｅＩＦ５Ａ１がin vitroでヒプシン化されないという事実は、この構築物の過剰発現が癌細胞株中でのアポトーシスを誘導し得るため、興味深い。われわれの実験室における従来の仕事は、癌細胞株中のヒトｅＩＦ５Ａ１の過剰発現がアポトーシス増大と関連するということを実証したが、これは、ｅＩＦ５Ａ１が癌細胞におけるアポトーシスを誘導し得る前アポトーシスタンパク質である、ということを示唆する。ＨＡタグ化形態のｅＩＦ５Ａ１を発現する構築物であるｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ１によるヒト結腸癌細胞株ＲＫＯおよびＲＫＯ‐Ｅ６のトランスフェクションは、アポトーシスの発生における200％増大を生じた（図５Ａおよび５Ｂ）。これらの結果は、非ヒプシン化ｅＩＦ５Ａ１が癌細胞株においてアポトーシスを誘導し得る、という見解を強力に支持する。
ｅＩＦ５Ａ１の発現がｐ５３と平行してＤＮＡ損害誘導性アポトーシス中に上向き調節される（図３０Ｂ）と思われるという、そしてｅＩＦ５Ａ１発現の抑圧がアクチノマイシンＤの細胞傷害作用からＨＴ‐２９を部分的に防御する（図３１Ａ）という観察は、ｅＩＦ５Ａ１およびｐ５３間の関係が存在し得るという可能性を生じた。ｅＩＦ５Ａ１がＤＮＡ損害誘導性アポトーシス中のｐ５３の適正な発現のために必要であるか否かを確定するために、トランスフェクト化ＲＫＯ細胞におけるｐ５３のアクチノマイシンＤ誘導性上向き調節を調べた。ＲＫＯ細胞はヒト結腸直腸癌腫細胞株であり、そしてそれらが機能的ｐ５３腫瘍抑圧遺伝子タンパク質１８を有することが既知であるため、この実験に用いられた。ｐ５３タンパク質レベルはこの細胞中では正常では検出未満であるが、しかしアクチノマイシンＤによる処置時に迅速に蓄積する、ということが判明した（図４３Ａ）。ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションはｅＩＦ５Ａ１タンパク質レベルを有意に低減し（図４３Ａ）、そしてアクチノマイシンＤ処置に応答してｐ５３蓄積を抑圧した（図４３Ａおよび４３Ｂ）。ｓｉＲＮＡトランスフェクションによるｅＩＦ５Ａ１の抑圧は、アクチノマイシンＤ処置後8時間に対照ｓｉＲＮＡに比して58％、24時間で68％、ｐ５３タンパク質のレベルを低減した（図４３Ｂ）が、これは、ｅＩＦ５Ａ１がＤＮＡ損害に応答した適正なｐ５３発現に必要とされることを示す。
【０１３５】
アポトーシスにおけるｅＩＦ５Ａ１に関する役割をさらに実証するために、ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現に対するＲＫＯ細胞のアポトーシス性応答を調べた。ＲＴ‐ＰＣＲを用いてＲＫＯ細胞からヒトｅＩＦ５Ａ１をクローン化し、そして強力なＣＭＶプロモーターの制御下で発現ベクターｐＨＭ６中にサブクローニングした。その結果生じたＰＣＲ産物は、ヒトｅＩＦ５Ａ１に関して前に報告されたのと同一のアミノ酸配列を有することが判明した。ＲＫＯ細胞をｐＨＭ６‐ＬａｃＺまたはｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ１で一過的にトランスフェクトし、トランスフェクションの48時間後、細胞を固定し、ＴＵＮＥＬ染色し、フローサイトメトリーにより分析した（図４４）。30％〜40％というトランスフェクション効率をルーチンに得た。ＴＵＮＥＬ染色は、ｅＩＦ５Ａ１を含有するプラスミドでトランスフェクトされた細胞の29.3％がアポトーシスを受けていたが、一方、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトされた細胞の12.8％だけがアポトーシス性であった、ということを示した（図４４）。したがってｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、ＲＫＯ細胞でのアポトーシスを誘導する。
【０１３６】
ｅＩＦ５Ａ１のＣ末端は、オリゴヌクレオチド結合フォールドとのその類似性に基づいて、ＲＮＡ結合に関与すると提示されている。Ｃ末端ドメインがアポトーシスのために重要であるか否かを確定するために、Ｃ末端の最後の37アミノ酸が欠失された切頭化ｅＩＦ５Ａ１  ｃＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ１Δ３７）を構築した。蛍光顕微鏡を用いてＴＵＮＥＬにより、一過的トランスフェクト化ＲＫＯ細胞におけるアポトーシスを採点した（図４５Ａ）。切頭化ｅＩＦ５Ａ１構築物で一過的にトランスフェクトされた細胞は、対照ベクターでトランスフェクトされた細胞のものと類似のアポトーシスレベルを有することが判明した。これに対して、ｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクトされた細胞は、対照ベクターでトランスフェクトされた細胞より2倍高いレベルのアポトーシスを示した（図４５Ａ）。
【０１３７】
ｅＩＦ５Ａ１がｐ５３の発現を調節すると思われる（図４３）という観察にかんがみて、ｅＩＦ５Ａ１過剰発現により誘導されたアポトーシスに対する機能性ｐ５３を欠く細胞株の感受性を調べた。安定的に取り込まれたヒト乳頭腫ウイルスいい６癌遺伝子を含有し、そして容易に感知可能な機能性ｐ５３を欠くＲＫＯ由来の細胞株であるＲＫＯ‐Ｅ６を、この目的のために用いた。ＲＫＯ‐Ｅ６中でのｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトされた対照細胞と比較して、アポトーシス細胞数の3倍以上の増加を生じた（図４５Ｂ）が、これは、ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現がｐ５３とは関係なくアポトーシスを誘導し得る、ということを示唆する。ＲＫＯ細胞株を用いて得られた結果と同様に、切頭化ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクトされたＲＫＯ‐Ｅ６細胞におけるアポトーシスのレベルは、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトされた細胞に関するものと有意に異ならなかったが、これは、ｅＩＦ５Ａ１の最後の37アミノ酸がそのアポトーシス活性のために必要である、ということを示す（図４５Ｂ）。ｅＩＦ５Ａ１のＣ末端がＲＮＡ結合に関与すると考えられるとすると、これらの結果は、ｅＩＦ５Ａ１がアポトーシス中に核・細胞質シャトルタンパク質として機能する、という考えを支持する。ｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクトされたＲＫＯ‐Ｅ６細胞中でのアポトーシスのレベルは、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトされた対応する細胞に関するものより平均で＞3倍高かったが、しかしこの差は、対を成すｔ検定により確定した場合に統計学的に有意でなかった（図４５Ｂ）。これは、トランスフェクト化ＲＫＯ‐Ｅ６中で誘導されるアポトーシスの程度での実験間の変異を反映する。しかしながら、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺによりトランスフェクトされる対照細胞に関するアポトーシスのレベルを実験内で1に設定することによりこの変異が正規化される場合、これらの正規化対照値に比してｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクトされた細胞に関するアポトーシスの増大は平均で3.25倍で、図４５Ｂに示したデータに関して＜0.03の有意確率を有した。
【０１３８】
細胞質および核周囲領域に局在されていることが反復的に見出され、そしてこの局在化は細胞周期に伴って変化しないため、核・細胞質シャトルタンパク質としてのｅＩＦ５Ａ１の役割はしばしば疑問視されていた。ｅＩＦ５Ａ１が核からのｍＲＮＡの動員に関与する場合、それは少なくとも一過的に核内に局在されると予測される。ｅＩＦ５Ａ１がアポトーシスに関与し、そして細胞分裂には関与しない（図３１および４５）という本発明人等の従来の知見にかんがみて、ｅＩＦ５Ａ１の細胞以下局在がアポトーシスを誘導することが既知の作用物質による処置後に変更されるか否かを確定するための試験を実行した。アポトーシスは、ＩＦＮ‐γ２６〜３０での感作後、ＴＮＦとともにインキュベートすることによりＨＴ‐２９細胞中で誘導され得る。ＩＦＮ‐γ初回刺激化ＨＴ‐２９細胞のＴＵＮＥＬ染色は、ＴＮＦ‐αでの24時間の刺激後に、約30％の細胞がアポトーシスを受けている、ということを実証した（データは示されていない）。ＩＦＮ‐γまたはＴＮＦ‐αはいずれもこの細胞型においては独立してアポトーシスを誘導し得ないので、アポトーシスのためには同時刺激が必要である。したがってＨＴ‐２９細胞をＩＦＮ‐γで16時間初回刺激し、次にＴＮＦ‐αで処置した。ＴＮＦ‐α処置の開始後10分から8時間の範囲の間隔で細胞をホルムアルデヒドで固定し、そして市販抗ｅＩＦ５Ａ１抗体を用いて間接的免疫蛍光によりｅＩＦ５Ａ１局在化を観察した。従来の報告と一致して、ｅＩＦ５Ａ１は非処置細胞の細胞質中に優勢的に局在化され［図１９Ａ（ｉ）、６Ｂ（ｉ）］、そしてこの局在化はＩＦＮ‐γ処置単独により変更されなかった［図１９Ａ（ｉｉ）］。しかしながらＩＦＮ‐γ初回刺激化細胞においてＴＮＦ‐α処置の10分以内に優勢的細胞質から主に可区へのｅＩＦ５Ａ１の局在化の動的シフトが認められた［図１９Ａ（ｉｉｉ）］。ｅＩＦ５Ａ１はＩＦＮ‐γ初回刺激を伴わずにＴＮＦ‐αで刺激された細胞中の核に局在しなかったので、ＴＮＦ‐α処置に応答したｅＩＦ５Ａ１の転位のために細胞のＩＦＮ‐γ感作が必要とされた（データは示されていない）。ｅＩＦ５Ａ１は、ＩＦＮ‐γ／ＴＮＦ‐α処置後少なくとも8時間、その核局在化を保持した［図１９Ａ（ｖｉ）］。ｅＩＦ５Ａ１局在化のシフトが遺伝毒性ストレスに応答しても起こるか否かを確定するために、ＨＴ‐２９細胞をアクチノマイシンＤとともに漸増時間インキュベートした（図１９Ｂ）。アクチノマイシンＤを用いた24時間のインキュベーションは、ＨＴ‐２９細胞の約10％においてアポトーシスを誘導した（データは示されていない）。この場合、ｅＩＦ５Ａ１は、アクチノマイシンＤ処置の開始後少なくとも30分間その細胞質分布を保持した［図１９Ｂ（ｉｉ）］が、しかし90分以内では［図１９Ｂ（ｉｉｉ）］核内に優勢的に見出され、そして少なくとも16時間そこに保持された［図１９Ｂ（ｖｉ）］。固定細胞が二次抗体のみを用いてインキュベートされた場合、蛍光シグナルは観察されなかったが、これは、観察された蛍光（図１９）が一次抗体によるｅＩＦ５Ａ１の認識のためである、ということを示す（データは示されていない）。これらの観察は、ｅＩＦ５Ａ１が実際には、死受容体活性化ならびに遺伝毒性ストレ���により誘導されたアポトーシス中に核・細胞質シャトルタンパク質として機能し得るという、そしてｅＩＦ５Ａ１の局在化がアポトーシスの調節に一役を演じ得るという考えを支持する（図３２）。
【０１３９】
ｅＩＦ５Ａ１は、それが異常アミノ酸であるヒプシンを含有することが既知の唯一のタンパク質である、という点で独特である。ヒプシン残基は、デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）により触媒される2つの酵素反応で翻訳後に形成され、そしてｅＩＦ５Ａ１の機能は解明されておらず、核・細胞質シャトルタンパク質として機能することが提唱された。本発明の試験に用いられるＧＣ７のようなＤＨＳ阻害薬を用いた多数の研究は、細胞増殖を遮断するこれらの阻害薬の能力を実証し、ヒプシン化ｅＩＦ５Ａ１が細胞分裂に関与するｍＲＮＡの翻訳を助長する、という見解を促した。この提唱は、ｅＩＦ５Ａ１アイソフォームまたはＤＨＳの両方の不活性化が細胞分裂を遮断するということを実証する酵母を用いた実験によりさらに支持される。しかしながら、ｅＩＦ５Ａ１のｓｉＲＮＡ媒介性抑圧は結腸腺癌細胞株の細胞生存度または増殖に影響を及ぼさなかった、ということをわれわれは観察したので、この見解は本発明の試験で報告されたデータと一致しない。さらに、白血病細胞株を用いた初期の研究において、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｅＩＦ５Ａ１発現の開始は実際に細胞増殖に及ぼすＧＭ‐ＣＳＦの刺激作用を増強した、ということが見出された。ｅＩＦ５Ａ１発現および増殖間の相関の明らかな欠如は、2つの肺腺癌細胞株中でも観察された。さらに、本発明の試験において、ＧＣ７による処置の結果として細胞増殖の低減を観察したが、しかしｅＩＦ５Ａ１タンパク質レベルが＞90％枯渇された細胞は正常に増殖できなかった。ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後に残存するｅＩＦ５Ａ１タンパク質の残留量は増殖を支持するために十分であり得るが、しかしこれらのデータは、細胞増殖に及ぼすＤＨＳ阻害薬の抑制作用がヒプシン修飾化ｅＩＦ５Ａ１のレベルの低減と関連する、という見解に挑戦するものであると思われる。実際、これらの知見は、新規のＤＨＳ阻害薬が細胞の生存度または増殖に影響を及ぼさないということを示す近年の報告と一致するが、これは、従来の試験に用いられたＤＨＳ阻害薬の抗増殖作用がｅＩＦ５Ａ１のヒプシン化を抑制するそれらの能力と無関係であり、そして細胞代謝に及ぼす非関連作用のためであり得る、ということを示唆する。
【０１４０】
いくつかの最近の研究は、ｅＩＦ５Ａ１がアポトーシス経路に関与し得る、ということを示した。例えばｅＩＦ５Ａ１に対するｓｉＲＮＡは、ＴＮＦ‐α誘導性アポトーシスからヒト篩板細胞を防御した。別の研究において、ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現が肺癌細胞株のアポトーシス増大を生じる、ということを本発明人等は実証した。最近の研究の結果は、アポトーシスにおけるｅＩＦ５Ａ１に関する役割も支持する。第一に、ｅＩＦ５Ａ１タンパク質の発現は、アクチノマイシンＤにより誘導されるｐ５３蓄積と相関し、そしてｅＩＦ５Ａ１のｓｉＲＮＡ媒介性抑圧はＨＴ‐２９細胞に及ぼすアクチノマイシンＤの細胞傷害性作用を低減した。これは、サイトカインＩＦＮ‐αおよびＴＮＦ‐αにより誘導されるアポトーシス中のｅＩＦ５Ａ１発現増強という従来の報告と一致する。第二に、ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現は、それらのｐ５３状態と関係なく、ヒト結腸直腸癌腫細胞におけるアポトーシスを誘導した。これは、ｅＩＦ５Ａ１の過剰発現がＨ４６０（ｐ５３＋／＋）細胞におけるアポトーシスを誘導したが、しかし無ｐ５３Ｈ１２９９細胞では誘導せず、そして用いられた細胞型における差を反映し得る、という最近の報告と対照を成す。オリゴヌクレオチド・結合フォールドを含有することが提唱されているｅＩＦ５Ａ１のＣ末端ドメインは、そのアポトーシス活性に不可欠である、ということもわれわれは観察した。これらの結果は、アポトーシスのために必要とされるＲＮＡ、おそらくはｍＲＮＡの結合が、ｅＩＦ５Ａ１の前アポトーシス機能において重要であり得る、ということを示唆する。実際、本発明の試験において、ＲＫＯ細胞中でアクチノマイシンＤによるＤＮＡ損害に応答したｐ５３の適正な発現におけるｅＩＦ５Ａ１に関する要件を、われわれは実証した。ｅＩＦ５Ａ１へのｐ５３発現の依存は、ＣＯＳ‐７細胞に関しても報告されている。さらにｅＩＦ５Ａ１タンパク質発現は、肺腺癌におけるｐ５３の核蓄積と正の相関を示すことが判明した。別のＲＮＡ結合タンパク質であるＨｕＲは、ｐ５３の転写体と結合し、そしてＲＫＯ細胞において紫外線に応答するｐ５３発現を増強することが示された。したがって遺伝毒性ストレスに応答するｐ５３の発現は、1つまたは複数のＲＮＡ結合タンパク質を必要とする、と思われる。遺伝毒性ストレス、例えばガンマ線照射に応答して観察されるｐ５３タンパク質の発現増強は、おそらくは1つまたは複数のＲＮＡ結合タンパク質との相互作用の結果として、その３’ＵＴＲの抑制作用の軽減に起因するｐ５３転写体の翻訳増強のためであると思われる。本発明人等のデータは、ｅＩＦ５Ａ１が、遺伝毒性ストレスに応答するｐ５３の翻訳増強に関与するＲＮＡ結合タンパク質のうちの1つであり得る、ということを示唆する。
【０１４１】
核・細胞質シャトルタンパク質として提唱されたｅＩＦ５Ａ１の役割は、局在化試験により混乱させられた。細胞質および核全体に分布されているｅＩＦ５Ａ１についての2〜3の報告があるが、しかし大多数の研究は、ｅＩＦ５Ａ１が細胞質および核周囲領域に局在され、そして書くからは大々的に欠けている、ということを示す。Shi等（1996b）は、ｅＩＦ５Ａ１細胞以下局在化についての特に詳細な研究において、当該タンパク質は細胞の細胞質および核周囲領域に高度に限定され、核内には1％未満である、と報告した。ｅＩＦ５Ａ１の細胞以下局在化は、細胞周期の変化中、あるいはウイルス癌遺伝子形質転換後には変更されない、ということも彼等は見出した。この局在化パターンは、ｅＩＦ５Ａ１が細胞増殖のために必要とされる転写体に関して核・細胞質シャトルとして機能する、という提案と一致しない。本発明の試験において、ｅＩＦ５Ａ１発現は、正常増殖条件下では、ＨＴ‐２９細胞の細胞質および核周囲領域に制限された。しかしながらこの細胞株におけるアポトーシスを誘導することが既知の処置であるＴＮＦ‐αでＨＴ‐２９細胞が処置された場合、核中へのｅＩＦ５Ａ１タンパク質の非常に迅速な転位が観察された。核へのこの転位は、刺激の最初の10分以内に起こり、これは、死受容体シグナル伝達が細胞質から核へのｅＩＦ５Ａ１タンパク質の迅速な輸送を開始する、ということを示す。同様に、結果は、アクチノマイシンＤが核中へのｅＩＦ５Ａ１の輸送を刺激したことを示すが、しかしＴＮＦ‐αと同じくらい迅速ではなかった。従来の研究は、ｅＩＦ５Ａ１局在化がアクチノマイシンＤの影響を受けない、と報告した。この不一致の理由は明らかではないが、しかし細胞株の差異および細胞を刺激するために用いられるアクチノマイシンＤの濃度（4〜5 μg/mL対本発明で用いられた1 μg/mL）は、異なる知見を説明し得る。ｅＩＦ５Ａ１は、受動的拡散によってのみ核に進入することが報告されている。しかしながら、死受容体活性化または遺伝毒性ストレスにより誘導されるアポトーシスと関連する条件化でのｅＩＦ５Ａ１の調節された核輸入についての証拠が、ここで提供される。
【０１４２】
非ヒプシン化ｅＩＦ５Ａ１のレベル増大は、アポトーシスの誘導と相関した。これらの観察は、非修飾化ｅＩＦ５Ａ１の蓄積がある種の型のアポトーシスの誘導に一役を演じ得る、という示唆をもたらした。火修飾化ｅＩＦ５Ａ１のみが核局在化を可能にし、これは、非修飾化形態のｅＩＦ５Ａ１が核中で行なわれるアポトーシス機能を有し得ることを示唆する、ということも報告された。正常増殖条件下では、事実上すべての細胞性ｅＩＦ５Ａ１タンパク質が、合成のほとんど直後にヒプシン化される。したがって、ｅＩＦ５Ａ１はヒプシン化され、そしてアポトーシス刺激が、それが前アポトーシス機能を有し得る核へのその転位を誘発するまで細胞質中に保持される、と思われる。ヒプシン化は不可逆的修飾であると考えられるが、しかし脱ヒプシン化活性を有するタンパク質は正常生理学的条件化では不活性であり得る、と想像される。
【０１４３】
要するに、ｅＩＦ５Ａ１は、死受容体活性化および遺伝毒性ストレスの両方により誘導されるアポトーシス中に核機能を有する前アポトーシスタンパク質であると思われる。この独特のタンパク質のアポトーシス機能についてのさらに理解は、癌の治療のための新規の療法的介入をもたらし得る。
【０１４４】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは、哺乳類、哺乳類細胞または哺乳類組織におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を低減するための薬剤を製造するために用いられ得る。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を低減することにより、細胞アポトーシスの低減が生じる。
【０１４５】
あるいは本発明の方法および組成物は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の増大を引き起こすためにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードするポリヌクレオチドの使用によりアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの哺乳類、哺乳類細胞または哺乳類組織中での発現を増大することにより、腫瘍または癌を有する被験者を治療するために用いられ得る。
【０１４６】
さらにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードするポリヌクレオチドは、哺乳類、哺乳類細胞または哺乳類組織中でのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を増大するための薬剤を製造するために用いられ得る。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を増大することにより、細胞アポトーシスの増大が生じる。したがって薬剤は、癌細胞または腫瘍細胞増殖を低減することにより、あるいは癌細胞または腫瘍においてアポトーシスを誘導することにより、癌を治療するために用いられ得る。
【０１４７】
本発明のアンチセンス核酸およびｓｉＲＮＡは、予防または治療の目的のために動物に用いられる場合、製薬上許容可能な担体を付加的に含む組成物の形態で投与される、と理解される。適切な製薬上許容可能な担体としては、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうちの1つまたは複数、ならびにその組合せが挙げられる。製薬上許容可能な担体はさらに、結合タンパク質の保存寿命または有効性を強化する少量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤を含む。注射用の組成物は、当該技術分野で周知であるように、哺乳類への投与後に活性成分の迅速、持続性または遅延放出を提供するよう処方され得る。
本発明の組成物は、種々の形態であり得る。これらの例としては、固体、半固体および液体剤形、例えば錠剤、ピル、粉末、液体溶液、分散液、懸濁液、リポソーム、座薬、注射および注入溶液が挙げられる。好ましい形態は、意図された投与方式および治療用途によっている。
【０１４８】
このような組成物は、製薬業界で周知の方法で調製され得る。組成物の製造に際して、活性成分は通常は担体と混合されるか、または担体により希釈され、および／または例えばカプセル、サッシェ、紙またはその他の容器の形態であり得る担体内に封入される。担体が希釈剤として役立つ場合、それは固体、半固体または液体物質であり、これは活性成分のためのビヒクル、賦形剤または媒質として作用する。したがって組成物は、錠剤、ロゼンジ、サッシェ、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、エーロゾル（固体としてまたは液体媒質中で）、例えば10重量％までの活性化合物を含有する軟膏、軟質および硬質ゼラチンカプセル、座薬、注射溶液、懸濁液、滅菌包装粉末の形態で、そして局所パッチとして存在し得る。
【０１４９】
本発明をここで一般的に記載する場合、それは、説明として提供される以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解される。実施例は本発明の理解を助けるために記述されるが、しかしいかなる点でも本発明の範囲を限定するよう意図されないし、意図されるべきでない。実施例は、慣用的方法の詳細な説明を含まない。このような方法は当業者に周知であり、そして多数の出版物に記載されている。慣用的方法、例えばベクターおよびプラスミドの構築、このようなベクターおよびプラスミド中へのポリペプチドをコードする核酸の挿入、宿主細胞中へのプラスミドの導入、ならびに遺伝子および遺伝子産物のその発現および確定に用いられる方法の詳細な説明は、多数の出版物、例えばSambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press（参考文献はすべて、参照により本明細書中で援用される）から得られる。
【実施例】
【０１５０】
実施例
実施例１
ＤＮＡラダーリングによるラット黄体におけるアポトーシスの可視化
ＤＮＡラダーリングにより、アポトーシスの程度を確定した。メーカーの使用説明書に従って、QIAampＤＮＡ血液キット（Qiagen）を用いて、分散黄体細胞から、または切除黄体組織からゲノムＤＮＡを単離した。ＰＧＦ‐２αを用いた処置によるアポトーシスの誘導前、アポトーシスの誘導後1時間および24時間に、黄体組織を切除した。室温で30分間、0.2 μCi［α‐32Ｐ］ｄＣＴＰ、1 mMトリス、0.5 mMＥＤＴＡ、3単位のクレノウ酵素および各々0.2 pMのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰとともに500 ngのＤＮＡをインキュベートすることにより、単離ＤＮＡを末端標識した。Sambrook等に従って1 ml Sepadex G-50カラムに試料を通すことにより、非組入れヌクレオチドを除去した。次に、トリス・アセテート・ＥＤＴＡ（1.8％）ゲル電気泳動により、試料を分解した。真空下で室温で30分間ゲルを乾燥し、−80℃で24時間、Ｘ線フィルムに曝露した。
一実施形態では、過排卵ラット黄体中のアポトーシスの程度を、ＰＧＦ‐２αを用いた注射後0、1または24時間に調べた。0時間対照では、ＰＧＦ‐２α注射無しで卵巣を除去した。アポトーシスに関連したヌクレアーゼ活性を反映する低分子量ＤＮＡ断片のラダーリングは、ＰＧＦ‐２αによる処置の前に切除される対照黄体組織中では明白ではないが、しかしアポトーシスの誘導後1時間以内に識別可能になり、そしてアポトーシスの導入後24時間までに顕著になる（これは図１４に示されている）。この図において、上部パネルは、ラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳ  ｃＤＮＡの32Ｐ‐ｄＣＴＰ標識化３‘非翻訳領域でプローブされたノーザンブロットのオートラジオグラフである。下部パネルは、総ＲＮＡの臭化エチジウム染色ゲルである。各レーンは、10 μgのＲＮＡを含有する。データは、血清剥奪後のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ転写体の下向き調節が認められる、ということを示す。
【０１５１】
別の実施形態では、対応する対照動物を、ＰＧＦ‐２αの代わりに生理食塩水で処置した。生理食塩水またはＰＧＦ‐２αによる処置後15分に、動物から黄体を取り出した。動物からの組織の除去後3時間および6時間に、黄体からゲノムＤＮＡを単離した。ＤＮＡラダーリングおよびゲノムＤＮＡの末端ラベリング増大は、ＰＧＦ‐２α処置動物からの組織の除去後6時間で明白であるが、しかし組織の除去後3時間では明白でない（図１５参照）。アポトーシスを反映するＤＮＡラダーリングは、黄体がＰＧＦ‐２αによる処置後15分に切除され、ＥＢＳＳ（Gibco）中でin vitro条件下で6時間保持される場合にも明白である。アポトーシスに関連したヌクレアーゼ活性は、ゲノムＤＮＡのより広範な末端ラベリングからも明白である。
【０１５２】
別の実験では、500 μgのＰＧＦ‐２αを用いた皮下注射により、過排卵を誘導した。等容積の生理食塩溶液で、対照ラットを処置した。15〜30分後、卵巣を取り出し、コラゲナーゼで細かく刻んだ。ＰＧＦ‐２αで処置されたラットからの分散細胞を、10 mmグルタミン＋10 mmスペルミジン中で1時間、そしてスペルミジンを有さない10 mmグルタミン中でさらに5時間（レーン２）、あるいは10 mmグルタミン＋10 mmスペルミジン中でさらに1時間および10 mmグルタミン＋1 mmスペルミジン中でさらに5時間（レーン３）、インキュベートした。生理食塩水で処置されたラットからの対照細胞をコラゲナーゼで分散させて、1時間、そしてグルタミンのみでさらに5時間インキュベートした（レーン１）。各試料からの500ナノグラムのＤＮＡを、クレノウ酵素を用いて［α‐32Ｐ］‐ｄＣＴＰで標識し、1.8％アガロースゲル上で分離して、フィルムに24時間曝露した。結果を図１６に示す。
【０１５３】
さらに別の実験では、過排卵ラットに1 mg/体重100 gのスペルミジンを皮下注射し、500 μgのＰＧＦ‐２αの皮下注射前24、12および2時間に0.333 mg/体重100 gの3回の等用量で送達した。対照ラットを3つの組に分けた：無注射、スペルミジン（ＰＧＦ‐２α無し）の3回注射、ならびに等容積の生理食塩水の3回注射後、ＰＧＦ‐２α処置。プロスタグランジン処置後1時間35分または3時間45分に、ラットから卵巣を取り出し、ＤＮＡの単離のために用いた。各試料からの500ナノグラムのＤＮＡを、クレノウ酵素を用いて［α‐32Ｐ］‐ｄＣＴＰで標識し、1.8％アガロースゲル上で分離して、フィルムに24時間曝露した（図１７参照）：レーン１、  注射無し（レーン３〜５と同時機に動物を屠殺した）；レーン２、  スペルミジンを3回注射（レーン３〜５と同時機に動物を屠殺した）；レーン３、  生理食塩水を3回注射、その後、ＰＧＦ‐２αを注射（ＰＧＦ‐２αで処置後1時間35分で動物を屠殺した）；レーン４、  スペルミジンを3回注射、その後、ＰＧＦ‐２αを注射（ＰＧＦ‐２αで処置後1時間35分で動物を屠殺した）；レーン５、  スペルミジンを3回注射、その後、ＰＧＦ‐２αを注射（ＰＧＦ‐２αで処置後1時間35分で動物を屠殺した）；レーン６、  スペルミジンを3回注射、その後、ＰＧＦ‐２αを注射（ＰＧＦ‐２αで処置後3時間45分で動物を屠殺した）；レーン７、  スペルミジンを3回注射、その後、ＰＧＦ‐２αを注射（ＰＧＦ‐２αで処置後3時間45分で動物を屠殺した）。
【０１５４】
ＲＮＡ単離
アポトーシスのＰＧＦ‐２α誘導後の種々の時間にラットから取り出された黄体組織から、総ＲＮＡを単離した。要するに、組織（5 g）を液体窒素中で粉砕した。粉砕粉末を30 mlのグアニジニウム緩衝液（4 Mグアニジニウムイソチオシアネート、2.5 mMＮａＯＡｃ、ｐＨ8.5、0.8％β‐メルカプトエタノール）と混合した。混合物を4層のミラクロスを通して濾過し、4℃で30分間、10,000gで遠心分離した。次に上清を、20時間、11,200gでの塩化セシウム密度勾配遠心分離に付した。ペレット化ＲＮＡを75％エタノールですすぎ、600 mlのＤＥＰＣ処理水中に再懸濁して、95％エタノール1.5 mlおよび3 MＮａＯＡｃ 60 mlを用いて−70℃でＲＮＡを沈殿させた。
【０１５５】
ゲノムＤＮＡ単離およびラダーリング
メーカーの使用説明書に従って、QIAampＤＮＡ血液キット（Qiagen）を用いて、抽出黄体組織または分散黄体細胞からゲノムＤＮＡを単離した。室温で30分間、0.2 μCi［α‐32Ｐ］ｄＣＴＰ、1 mMトリス、0.5 mMＥＤＴＡ、3単位のクレノウ酵素および各々0.2 pMのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰとともに500 ngのＤＮＡをインキュベートすることにより、ＤＮＡを末端標識した。Maniatis等により記載された方法に従って1 ml Sepadex G-50カラムに試料を通すことにより、非組入れヌクレオチドを除去した。次に、トリス・アセテート・ＥＤＴＡ（2％）ゲル電気泳動により、試料を分解した。真空下で室温で30分間ゲルを乾燥し、−80℃で24時間、Ｘ線フィルムに曝露した。
【０１５６】
プラスミドＤＮＡ単離、ＤＮＡシーケンシング
Sambrook等により記載されたアルカリ溶解法（上記）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した。ジデオキシシーケンシング法を用いて、全長陽性ｃＤＮＡクローンをシーケンシングした（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467）。オープン・リーディングフレームをコンパイルし、ＢＬＡＳＴ検索（GenBank, Bethesda, MD）を用いて分析し、そしてBCM Search Launcher: Multiple Sequence Alignments Pattern-Induced Multiple Alignment Method（F. Corpet, Nuc. Acids Res., 16: 10881-10890, (1987)参照）を用いて配列アラインメントを達成した。配列および配列アラインメントを図５〜１１に示す。
【０１５７】
ラット黄体ＲＮＡのノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション
アポトーシスの種々の段階でラット黄体から単離された総ＲＮＡ20 mgを1％変性ホルムアルデヒド・アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜上に固定した。ランダム・プライマーキット（Boehringer）を用いて32Ｐ‐ｄＣＴＰで標識された全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｃＤＮＡ（配列番号１）を用いて、膜7×107をプローブした。あるいはランダム・プライマーキット（Boehringer）を用いて32Ｐ‐ｄＣＴＰで標識された全長ラットＤＨＳ  ｃＤＮＡ（配列番号６）を用いて膜をプローブした（7×107 cpm）。膜を1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳで室温で1回、0.2かけるＳＳＣ、0.1％ＳＤＳで65℃で3回洗浄した。膜を乾燥し、−70℃で一晩Ｘ線に曝露した。
【０１５８】
観察され得るように、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡおよびＤＨＳはともに、アポトーシス中の黄体組織で上向き調節される。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現は、ＰＧＦ‐２αでの処置によるアポトーシスの誘導後に有意に増強される：0時点で低く、処置の1時間以内に実質的に増大され、処置の8時間以内にはさらに増大され、そして処置の24時間以内にわずかに増大される（図１２）。ＤＨＳの発現は、0時点で低く、処置の1時間以内に実質的に増大され、処置の8時間以内にはさらに増大され、そして処置の24時間以内に再びわずかに増大された（図１３）。
【０１５９】
酵母、真菌およびヒトｅＩＦ５Ａ１配列に基づいたプライマーを用いたアポトーシス中ラット黄体ＲＴ‐ＰＣＲ産物の生成
酵母、真菌およびヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ配列から設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＴ‐ＰＣＲにより、アポトーシス中ラット黄体ＲＮＡ鋳型から、当該遺伝子の３’末端に対応する部分長アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ配列（配列番号１１）を生成した。ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ遺伝子の３’末端を単離するために用いられる上流プライマーは、20ヌクレオチド縮重プライマー：5’TCSAARACHGGNAAGCAYGG3’（配列番号９）であって、この場合、ＳはＣおよびＧから選択され；ＲはＡおよびＧから選択され；ＨはＡ、ＴおよびＣから選択され；ＹはＣおよびＴから選択され；そしてＮは任意の核酸である。ラットｅＩＦ５Ａ１遺伝子の３’末端を単離するために用いられる下流プライマーは、42ヌクレオチドを含有する：5’GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3’（配列番号１０）。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）を実行した。要するに、下流プライマー5 mgを用いて、ｃＤＮＡの一次鎖を合成した。次に一次鎖を、上流および下流プライマーの両方を用いるＲＴ‐ＰＣＲにおける鋳型として用いた。
【０１６０】
アガロースゲル上でのＲＴ‐ＰＣＲ産物の分離は900 bp断片の存在を明示したが、これを、平滑末端結紮を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTM（Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA）中にサブクローニングし、そしてシーケンシングした（配列番号１１）。３’末端のｃＤＮＡ配列は配列番号１１であり、そして３’末端のアミノ酸配列は配列番号１２である（図１〜２参照）。
【０１６１】
ＲＴ‐ＰＣＲにより、アポトーシス中ラット黄体ＲＮＡ鋳型から、当該遺伝子の５’末端に対応し、そして３’末端と重複する部分長アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ配列（配列番号１５）を生成した。５’プライマーは、配列：5’CAGGTCTAGAGTTGGAATCGAAGC3’（配列番号１３）を有する24‐ｍｅｒであって、これは、ヒトｅＩＦ５Ａ１配列から設計された。３’プライマーは、配列：5’ATATCTCGAGCCTTGATTGCAACAGCTGCC3’（配列番号１４）を有する30‐ｍｅｒであって、これは、３‘末端ＲＴ‐ＰＣＲから設計された。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）を実行した。要するに、下流プライマー5 mgを用いて、ｃＤＮＡの一次鎖を合成した。次に一次鎖を、上流および下流プライマーの両方を用いるＲＴ‐ＰＣＲにおける鋳型として用いた。
アガロースゲル上でのＲＴ‐ＰＣＲ産物の分離は500 bp断片の存在を明示したが、これを、それぞれ上流および下流プライマー中に存在するＸｂａＩおよびＸｈｏＩクローニング部位を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTM（Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA）中にサブクローニングし、そしてシーケンシングした（配列番号１５）。５’末端のｃＤＮＡ配列は配列番号１５であり、そして５’末端のアミノ酸配列は配列番号１６である（図２参照）。
【０１６２】
ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの３’および５’末端の配列（それぞれ配列番号１１および配列番号１５）は重複し、全長ｃＤＮＡ配列（配列番号１）を生じた。この全長配列を一列に並べて、GeneBankデータベース中の配列と比較した（図１〜２参照）。ｃＤＮＡクローンは、16.8 KDaの算定分子量を有する154アミノ酸ポリペプチド（配列番号２）をコードする。ラットアポトーシス特異的黄体ｅＩＦ５Ａ１の全長ｃＤＮＡに関して、ＲＴ‐ＰＣＲにより得られる遺伝子は図３に示されており、そして対応する誘導アミノ酸配列は配列番号９である。ｅＩＦ５Ａ１の誘導全長アミノ酸配列を、ヒトおよびマウスｅＩＦ５Ａ１配列と一列に並べた（図７〜９参照）。
【０１６３】
ヒトＤＨＳ配列に基づいたプライマーを用いたアポトーシス中ラット黄体ＲＴ‐ＰＣＲ産物の生成
ヒトＤＨＳ配列から設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＴ‐ＰＣＲにより、アポトーシス中ラット黄体ＲＮＡ鋳型から、当該遺伝子の３’末端に対応する部分長ＤＨＳ配列（配列番号６）を生成した。５‘プライマーは、配列：5’GTCTGTGTATTATTGGGCCC3’（配列番号１７）を有する20‐ｍｅｒであり；３’プライマーは、配列：5’GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3’（配列番号１８）を有する42‐ｍｅｒである。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）を実行した。要するに、下流プライマー5 mgを用いて、ｃＤＮＡの一次鎖を合成した。次に一次鎖を、上流および下流プライマーの両方を用いるＲＴ‐ＰＣＲにおける鋳型として用いた。
アガロースゲル上でのＲＴ‐ＰＣＲ産物の分離は606 bp断片の存在を明示したが、これを、平滑末端結紮を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTM（Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA）中にサブクローニングし、そしてシーケンシングした（配列番号６）。ＲＴ‐ＰＣＲにより得られるラットアポトーシス特異的黄体ＤＨＳ遺伝子の部分長ｃＤＮＡに関するヌクレオチド配列（配列番号６）を図４に示し、そして対応する誘導アミノ酸配列は配列番号７である。
【０１６４】
ゲノムＤＮＡの単離およびサザン分析
サザン・ブロッティングのためのゲノムＤＮＡを、切除ラット卵巣から単離した。約100 mgの卵巣組織を小片に分けて、15 ml試験管に入れた。組織懸濁液を静かに振盪することにより組織をＰＢＳ  1 mlで2回洗浄し、次にピペットを用いてＰＢＳを除去した。ＤＮＡ緩衝液（0.2 Mトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ8.0および0.1 mMＥＤＴＡ）2.06 ml中に組織を再懸濁し、そして10％ＳＤＳ  240 μlおよびプロテイナーゼＫ（Boehringer Manheim；10 mg/ml）100 μlを付加した。組織を、45℃で一晩、振盪水浴中に入れた。翌日、さらに100 μlのプロテイナーゼＫ（10 mg/ml）を付加し、組織懸濁液を、45℃でさらに4時間、水浴中でインキュベートした。インキュベーション後、組織懸濁液を、等容積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）で1回、そして等容積のクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）で1回抽出した。抽出後、1/10容積の3 M酢酸ナトリウム（ｐＨ5.2）および2容積のエタノールを付加した。ブンゼンバーナーを用いて封止され、フックに成形されたガラスピペットを用いて、溶液からＤＮＡ糸を引き抜いて、ＤＮＡを清浄微小遠心分離管に移した。ＤＮＡを70％エタノール中で1回洗浄し、10分間風乾した。ＤＮＡペレットを500 μlの10 mMトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ8.0）中に溶解し、10 μlのＲＮアーゼＡ（10 mg/ml）を付加し、そしてＤＮＡを37℃で1時間インキュベートした。ＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）で1回抽出し、そして1/10容積の3 M酢酸ナトリウム（ｐＨ5.2）および2容積のエタノールを付加することにより、ＤＮＡを沈殿させた。4℃で13,000gで10分間の遠心分離により、ＤＮＡをペレット化した。ＤＮＡペレットを70％エタノール中で1回洗浄し、そして4℃で一晩回転することにより、200 μlの10 mMトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ8.0）中に溶解した。
【０１６５】
サザン・ブロット分析のために、ラット卵巣から単離されたゲノムＤＮＡを、内因性遺伝子中で切断しないかまたは1回だけ切断する種々の制限酵素で消化した。これを達成するために、10 μgのゲノムＤＮＡ、20 μlの10×反応緩衝液および100 Uの制限酵素を、200 μlの総反応容積中で5〜6時間反応させた。消化ＤＮＡを0.7％アガロースゲル上に載せて、40ボルトで6時間、または15ボルトで一晩、電気泳動に付した。電気泳動後、ゲルを、0.2 NＨＣｌ中で10分間、脱プリン化し、その後、変性溶液（0.5 MＮａＯＨ、1.5 MＮａＣｌ）中での15分間の洗浄を2回、中和緩衝液（1.5 MＮａＣｌ、0.5 Mトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ7.4）中での15分間の洗浄を2回実施した。ＤＮＡをナイロン膜に移し、ハイブリダイゼーション溶液（40％ホルムアルデヒド、6×ＳＳＣ、5×デンハート溶液（1×デンハート溶液は0.02％フィコール、0.02％ＰＶＰおよび0.02％ＢＳＡ）、0.5％ＳＤＳおよび1.5 mgの変性サケ精子ＤＮＡ）中で予備ハイブリダイズした。ラットｅＩＦ５Ａ１  ｃＤＮＡの700 bpＰＣＲ断片（650 bpの３’ＵＴＲおよび50 bpのコーディング）をランダムプライミングにより［ａ‐３２Ｐ］‐ｄＣＴＰで標識し、1×106 cpm/mlで膜に付加した。
【０１６６】
同様に、ラットＤＨＳ  ｃＤＮＡの606 bpＰＣＲ断片（450 bpのコーディングおよび156 bpの３’ＵＴＲ）を［α‐32Ｐ］‐ｄＣＴＰでランダムプライム標識し、1×106 cpm/mlで第二同一膜に付加した。ブロットを42℃で一晩ハイブリダイズし、次に42℃で2×ＳＳＣおよび0.1％ＳＤＳで2回、そして42℃で1×ＳＳＣおよび0.1％ＳＤＳで2回洗浄した。次にブロットをフィルムに3〜10日間曝露した。
【０１６７】
ラット黄体ゲノムＤＮＡを図１８に示したように制限酵素で切断し、32Ｐ‐ｄＣＴＰ標識化全長ｅＩＦ５Ａ１  ｃＤＮＡでプローブした。高緊縮条件下でのハイブリダイゼーションは、全長ｃＤＮＡプローブと、各制限酵素消化ＤＮＡ試料に関するいくつかの制限断片とのハイブリダイゼーションを明示したが、これは、ｅＩＦ５Ａ１のいくつかのアイソフォームの存在を示す。特に注目すべきは、ラットゲノムＤＮＡが、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのオープン・リーディング・フレーム内に制限部位を有するＥｃｏＲＶで消化された場合、ｅＩＦ５Ａ１のアポトーシス特異的アイソフォームの2つの制限断片がサザンブロットで検出可能であった。2つの断片は、図１８中で二重矢印で示される。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対応する制限断片は、オープン・リーディング・フレーム内に切断部位が存在しない制限酵素であるＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１で標識されたレーン中で、一重矢印により示される。これらの結果は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａがラットにおける単一コピー遺伝子である、ということを示唆する。図５〜１１に示したように、ｅＩＦ５Ａ１遺伝子は、種間で高度に保存され、したがって、任意の種内のアイソフォーム間には有意量の保存が存在する、と予測される。
【０１６８】
図１８は、32Ｐ‐ｄＣＴＰ標識部分長ラット黄体ＤＨＳ  ｃＤＮＡでプローブされたラットゲノムＤＮＡのサザンブロットを示す。ゲノムＤＮＡを、プローブとして用いられる部分長ｃＤＮＡを切断しない制限酵素であるＥｃｏＲＶで切断した。2つの制限断片が明らかであり、これは、遺伝子の2つのコピーが存在するということ、あるいは遺伝子がＥｃｏＲＶ部位を有するイントロンを含有するということを示す。
【０１６９】
実施例２
本実施例は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの変調（センス配向でのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａでアポトーシスを増大する）を実証する。
【０１７０】
ＣＯＳ‐７細胞の培養およびＲＮＡの単離
野生型Ｔ抗原をコードするＳＶ４０の突然変異体で形質転換されたアフリカミドリザル腎臓繊維芽細胞様細胞株であるＣＯＳ‐７を、すべてのトランスフェクションベースの実験のために用いた。0.584 g/lのＬ‐グルタミン、4.5 gのグルコース／ｌおよび0.37％重炭酸ナトリウムを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ＣＯＳ‐７細胞を培養した。培地に10％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および100単位のペニシリン／ストレプトマイシンを補足した。5％ＣＯ2および95空気の加湿環境中で、37℃で細胞を増殖させた。0.25％トリプシンおよび1 mMＥＤＴＡの溶液で接着細胞を剥ぎ取ることにより、3〜4日毎に細胞を継代培養した。新鮮な培地を含有する新規の培養皿中に1:10の分割比で、剥離細胞を分配した。
【０１７１】
ＲＮＡの単離に用いられるべきＣＯＳ‐７細胞を、150-mm組織培養処理皿（Corning）中で増殖させた。トリプシン‐ＥＤＴＡの溶液で剥ぎ取ることにより、細胞を収穫した。剥離細胞を遠心管中に収集し、そして3000 rpmで5分間の遠心分離により、細胞をペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを液体窒素中で急速冷凍した。メーカーの使用説明書に従って、GenElute Mammalian Total RNA Miniprepキット（Sigma）を用いて、凍結細胞からＲＮＡを単離した。
【０１７２】
組換えプラスミドの構築およびＣＯＳ‐７細胞のトランスフェクション
センス配向でのラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの全長コード配列ならびにアンチセンス配向でのラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの３‘非翻訳領域（ＵＴＲ）を保有する組換えプラスミドを、図１９に示した哺乳類エピトープタグ発現ベクターｐＨＭ６（Roche Molecular Biochemicals）を用いて構築した。ベクターは、以下を含有する：ＣＭＶプロモーター  ‐  ヒトサイトメガロウイルス即時性プロモーター／エンハンサー；ＨＡ  ‐  インフルエンザ・ヘマグルチニンからのノナペプチド・エピトープタグ；ＢＧＨｐＡ  ‐  ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル；ｆ１  ｏｒｉ  ‐  ｆ１起点；ＳＶ４０ｏｒｉ  ‐  ＳＶ４０初期プロモーターおよび起点；ネオマイシン  ‐  ネオマイシン耐性（Ｇ４１８）遺伝子；ＳＶ４０ｐＡ  ‐  ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；Ｃｏｌ  Ｅ１  ‐  ＣｏｌＥ１起点；アンピシリン  ‐  アンピシリン耐性遺伝子。ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの全長コード配列およびラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの３’ＵＴＲを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中の本来のラットｅＩＦ５Ａ１  ＲＴ‐ＰＣＲ断片（配列番号１）からＰＣＲにより増幅した。全長ｅＩＦ５Ａ１を増幅するためには、用いられたプライマーは以下のものであった：正5’GCC AAG CTT AAT GGC AGA TGA TTT GG3’（配列番号５９）（Ｈｉｎｄ３）および逆5’CT GAA TTC CAGT TATTTTGCCATGG3’（配列番号６０）（ＥｃｏＲ１）。３‘ＵＴＲラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを増幅するためには、用いられたプライマーは以下のものであった：正5’AAT GAA TTC CGCCATGACAGAGGAGGC3’（配列番号６１）（ＥｃｏＲ１）および逆5’GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3’（配列番号６２）（Ｈｉｎｄ３）。
【０１７３】
アガロースゲル電気泳動後に単離された全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ＰＣＲ産物は430 bp長であったが、一方、３’ＵＴＲラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ＰＣＲ産物は697 bp長であった。両ＰＣＲ産物をｐＨＭ６のＨｉｎｄ３およびＥｃｏＲ１部位にサブクローニングして、ｐＨＭ６‐全長アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡおよびｐＨＭ６‐アンチセンス３’ＵＴＲｅＩＦ５Ａを作製した。全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ＰＣＲ産物を、多クローニング部位の上流に存在するインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）からのノナペプチド・エピトープタグを用いてフレーム内でサブクローニングして、抗‐［ＨＡ］‐ペルオキシダーゼ抗体を用いて組換えタンパク質の検出を可能にした。発現は、ヒトサイトメガロウイルス即時性プロモーター／エンハンサーにより駆動されて、哺乳類細胞株中での高レベルの発現を保証する。プラスミドは、安定トランスフェクト体の選択を可能にするネオマイシン耐性（Ｇ４１８）遺伝子、ならびにＳＶ４０大Ｔ抗原を発現する細胞、例えばＣＯＳ‐７中でのエピソーム複製を可能にするＳＶ４０初期プロモーターおよび起点も特徴づける。
【０１７４】
トランスフェクション実験に用いられるべきＣＯＳ‐７細胞を、タンパク質抽出のために用いられるべき細胞用に24ウエル細胞培養プレート（Corning）中で、あるいは染色のために用いられるべき細胞用に4小室培養スライド（Falcon）中で培養した。10％ＦＢＳを補足された、しかしペニシリン／ストレプトマイシンを欠くＤＭＥＭ培地中で、細胞を50〜70％集密度に増殖させた。無血清ＤＭＥＭ  42.5 μl中にプラスミドＤＮＡ  0.32 μgを希釈し、そして混合物を室温で15分間インキュベートすることにより、24ウエルプレートのうちの1ウエルまたは培養スライドに十分なトランスフェクション培地を調製した。トランスフェクション試薬LipofectAMINE（Gibco, BRL）1.6 μlを無血清ＤＭＥＭ42.5 μl中に希釈し、室温で5分間インキュベートした。5分後、LipofectAMINE混合物をＤＮＡ混合物に付加し、一緒に室温で30〜60分間インクとした。トランスフェクトされるべき細胞を無血清ＤＭＥＭで1回洗浄した後、トランスフェクション培地を被せて、そして細胞を増殖小室中に4時間、戻し入れた。
【０１７５】
インキュベーション後、0.17 mlのＤＭＥＭ＋20％ＦＢＳを細胞に付加した。細胞をさらに40時間培養した後、アポトーシスを受けるよう誘導してその後に染色するか、またはウエスタンブロット分析のために収穫した。対照として、偽トランスフェクションも実施したが、この場合、トランスフェクション培地からプラスミドＤＮＡを省いた。
【０１７６】
タンパク質抽出およびウエスタン・ブロッティング
ＰＢＳ（8 g/LのＮａＣｌ、0.2 g/LのＫＣｌ、1.44 g/LのＮａ2ＨＰＯ4および0.24 g/LのＫＨ2ＰＯ4）中で細胞を2回洗浄し、次に150 μlの熱ＳＤＳゲル負荷緩衝液（50 mMのトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ6.8、100 mMのジチオトレイトール、2％ＳＤＳ、0.1％ブロモフェノールブルーおよび10％グリセロール）を付加することにより、トランスフェクト化細胞からウエスタン・ブロッティングのためにタンパク質を単離した。細胞溶解物を微小遠心分離管中に収集し、95℃で10分間加熱し、次に13,000xgで10分間遠心分離した。上清を新たな微小遠心管に移し、そして用いる準備ができるまで、−20℃で保存した。
【０１７７】
ウエスタン・ブロッティングのために、2.5または5 μgの総タンパク質を12％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。分離タンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜に移した。次にブロッキング溶液（ＰＢＳ中5％スキムミルク粉末、0.02％アジ化ナトリウム）中で1時間、膜をインキュベートし、ＰＢＳ‐Ｔ（ＰＢＳ＋0.05％トゥイーン２０）中で15分間、3回洗浄した。膜を、4℃でＰＢＳ‐Ｔ中に一晩保存した。翌日、室温に暖めた後、1 μg/mlポリビニルアルコール中で30秒間、膜を遮断した。膜を脱イオン水中で5回すすぎ、次にＰＢＳ中の5％ミルクの溶液中で30分間遮断した。一次抗体をＰＢＳ中の5％ミルクの溶液中で30分間予備インキュベートした後、膜とともにインキュベートした。
【０１７８】
いくつかの一次抗体を用いた。抗‐［ＨＡ］‐ペルオキシダーゼ抗体（Roche Molecular Biochemicals）を1:5000の希釈で用いて、組換えタンパク質の発現を検出した。この抗体はペルオキシダーゼに接合されるため、二次抗体は必要でなく、そしてブロットを洗浄し、化学蛍光により現像させた。用いられた他の一次抗体は、ｐ５３（Ａｂ‐６）、Ｂｃｌ（Ａｂ‐１）およびｃ‐Ｍｙｃ（Ａｂ‐２）を認識する癌遺伝子からのモノクローナル抗体である。ｐ５３に対するモノクローナル抗体を0.1 μg/mlの希釈で用い、そしてＢｃｌ‐２およびｃ‐Ｍｙｃに対するモノクローナル抗体をともに0.83 μg/mlの希釈で用いた。一次抗体とともに60〜90分間インキュベート後、膜をＰＢＳ‐Ｔ中で15分間、3回洗浄した。次に二次抗体をＰＢＳ中の1％ミルク中で希釈し、膜を60〜90分間インキュベートした。ｐ５３（Ａｂ‐６）を一次抗体として用いる場合、用いられる二次抗体は、1:1000の希釈でアルカリ性ホスファターゼ（Rockland）に接合されたヤギ抗マウスＩｇＧであった。Ｂｃｌ‐２（Ａｂ‐１）およびｃ‐Ｍｙｃ（Ａｂ‐２）を一次抗体として用いた場合、ペルオキシダーゼ（Sigma）に接合されたウサギ抗マウスＩｇＧを1:5000の希釈で用いた。二次抗体とともにインキュベーション後、膜をＰＢＳ‐Ｔ中で3回洗浄した。
【０１７９】
2つの検出方法、即ち比色法および化学発光法を用いて、ブロットを現像した。ｐ５３（Ａｂ‐６）を一次抗体として、アルカリ性ホスファターゼ接合二次抗体と協力して用いた場合にのみ、比色法を用いた。0.33 mg/mLのニトロブルーテトラゾリウム、0.165 mg/mLの５‐ブロモ‐４‐クロロ‐３‐インドリルホスフェート、100 mMのＮａＣｌ、5 mMのＭｇＣｌ2および100 mMのトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ9.5）の溶液中で暗所でブロットをインキュベートすることにより、結合抗体を可視化した。ＰＢＳ中の2 mMＥＤＴＡ中でブロットをインキュベートすることにより、発色反応を停止させた。他のすべての一次抗体、例えば抗‐［ＨＡ］‐ペルオキシダーゼ、Ｂｃｌ‐２（Ａｂ‐１）およびｃ‐Ｍｙｃ（Ａｂ‐２）に関して、化学発光検出法を用いた。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出キット（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、ペルオキシダーゼ接合結合抗体を検出した。要するに、膜を軽くブロット乾燥し、次に試薬Ａおよび試薬Ｂの40:1混合物とともに5分間、暗所でインキュベートした。膜をブロット乾燥し、アセテートのシート間に置いて、10秒から10分間の種々の時間、Ｘ線フィルムに曝露した。
【０１８０】
ＣＯＳ７細胞におけるアポトーシスの誘導
2つの方法、即ち血清剥奪ならびにアクチノマイシンＤ、ストレプトミセス種（Calbiochem）による処置を用いて、トランスフェクト化ＣＯＳ‐７細胞においてアポトーシスを誘導した。両処置のために、トランスフェクション後40時間に培地を取り出した。血清剥奪実験のために、培地を無血清および無抗生物質ＤＭＥＭに取り替えた。10％ＦＢＳを補足した無抗生物質ＤＭＥＭ中で増殖した細胞を、対照として用いた。アポトーシスのアクチノマイシンＤ誘導のために、培地を、メタノール中に溶解した10％ＦＢＳおよび1 μg/mlのアクチノマイシンＤを補足した無抗生物質ＤＭＥＭに取り替えた。対照細胞を、10％ＦＢＳおよび等容積のメタノールを補足した無抗生物質ＤＭＥＭ中で増殖させた。両方法に関して、HoeschtまたはAnnexinＶ‐Ｃｙ３を用いて染色後48時間に、アポトーシス細胞のパーセンテージを確定した。図２０に示すように、ノーザンブロット分析によりアポトーシスの誘導も確証した。
【０１８１】
Hoescht染色
核断片化および凝縮といった形態学的特徴に基づいてアポトーシス細胞を同定するために、核染色Hoeschtを用いてトランスフェクト化ＣＯＳ‐７細胞の核を標識した。無水メタノールおよび氷酢酸の3:1混合物から成る固定液を、使用直前に調製した。培養スライド上で増殖中のＣＯＳ‐７細胞の培地に等容積の固定液を付加し、2分間インキュベートした。培地／固定液混合物を細胞から除去し、廃棄して、1 mlの固定液を細胞に付加した。5分後、固定液を廃棄し、1 mlの新鮮な固定液を細胞に付加して、5分間インキュベートした。固定液を廃棄し、細胞を4分間風乾した後、1 mlのHoescht染色液（ＰＢＳ中の0.5 μg/ml  Hoescht 33258）を付加した。暗所での10分間インキュベーション後、染色溶液を廃棄し、脱イオン水で1分間、スライドを3回洗浄した。洗浄後、1 mlのマクイルバイン緩衝液（0.021 Mクエン酸、0.058 MＮａ2ＨＰＯ4・7Ｈ2Ｏ；ｐＨ5.6）を細胞に付加し、それらを20分間暗所でインキュベートした。緩衝液を廃棄し、細胞を暗所で5分間風乾して、培養スライドのウエルを分離する小室を除去した。蛍光用の2〜3滴のVectashield mounting media（Vector Laboratories）をスライドに付加し、カバーガラスで覆った。ＵＶフィルターを用いて蛍光顕微鏡下で、染色細胞を観察した。明るく染色されたまたは断片化した核を有する細胞を、アポトーシス性としてスコアした。
【０１８２】
アネキシンＶ‐Ｃｙ３染色
アネキシンＶ‐Ｃｙ３アポトーシス検出キット（Sigma）を用いて、アポトーシス性細胞上にホスファチジルセリンを蛍光的標識外在化した。メーカーのプロトコールに従って、以下の修正を加えて、キットを使用した。要するに、4小室培養スライド上で増殖中のトランスフェクト化ＣＯＳ‐７細胞をＰＢＳで2回、そして1×結合緩衝液で3回洗浄した。150 μlの染色溶液（1×結合緩衝液中の1 μg/mlＡｎｎＣｙ３）を付加し、細胞を暗所で10分間インキュベートした。次に染色溶液を除去し、細胞を1×結合緩衝液で5回洗浄した。小室壁を培養スライドから除去し、数滴の1×結合緩衝液細胞上に置いて、カバーガラスを被せた。染色細胞を緑色フィルターを用いて蛍光顕微鏡により分析して、陽性染色（アポトーシス性）細胞の赤色蛍光を可視化した。可視光下で細胞数を計数することにより、総細胞集団を確定した。
【０１８３】
実施例３
本実施例は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの変調を実証する。
前記実施例に記載された一般的手順および方法を用いて、図２１は、ＣＯＳ‐７細胞の一過的トランスフェクションのための手順を説明するフローチャートであって、この場合、無血清培地中の細胞をリポフェクトアミン中のプラスミドＤＮＡ中で4時間インキュベートし、結成を付加して、細胞をさらに40時間インキュベートした。次に細胞を、分析前にさらに48時間血清を含有する通常培地中でインキュベートし（即ちさらなる処置なし）、48時間血清を剥奪して分析前にアポトーシスを誘導するか、あるいはアクチノマイシンＤで48時間処置してアポトーシスを誘導した後、分析する。
【０１８４】
図２２は、ｐＨＭ６によるトランスフェクション後のＣＯＳ‐７細胞中での外来タンパク質の一過性発現を示すウエスタンブロットである。偽トランスフェクションあるいはｐＨＭ６‐ＬａｃＺ、ｐＨＭ６‐アンチセンス３’ｒＦ５Ａ（ｐＨＭ６‐アンチセンス３’ＵＴＲラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ）またはｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａ（ｐＨＭ６‐全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ）によるトランスフェクション後48時間に、タンパク質をＣＯＳ‐７細胞から単離した。各試料からのタンパク質5 μgをＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分別し、ＰＶＤＥ膜に移して、抗‐［ＨＡ］‐ペルオキシダーゼでウエスタンブロット処理した。結合抗体を化学発光により検出し、Ｘ線フィルムに30秒間曝露した。ＬａｃＺ（レーン２）のならびにセンスラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ（レーン４）の発現が明瞭に見える。
【０１８５】
上記のように、ＣＯＳ‐７細胞を、偽トランスフェクトするか、またはｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａ（ｐＨＭ６‐全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの40時間後に、血清の撤退によりアポトーシスを受けるよう、48時間、細胞を誘導した。蛍光定量的均質カスパーゼ検定キット（Roche Diagnostics）を用いて、トランスフェクト細胞抽出物中のカスパーゼタンパク質分解活性を測定した。ＤＮＡ断片化も、フルオレセイン標識化デオキシヌクレオチドでＤＮＡ断片の曝露３’‐ＯＨ末端を標識するFragELＤＮＡ断片化アポトーシス検出キット（Oncogene）を用いて測定した。
【０１８６】
付加的ＣＯＳ‐７細胞を、偽トランスフェクトするか、またはｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａ（ｐＨＭ６‐全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの40時間後に、血清を含有する通常培地中でさらに48時間細胞を増殖させて（さらなる処置なし）、血清の撤退によりアポトーシスを受けるよう、48時間、細胞を誘導するか、あるいは0.5 μg/mlのアクチノマイシンＤを用いた処置によりアポトーシスを受けるよう48時間誘導した。細胞を、Hoescht 33258（アポトーシスを伴う核断片化を示す）で染色するか、あるいはアネキシンＶ‐Ｃｙ３（アポトーシスを伴うホスファチジルセリン曝露を示す）で染色した。染色細胞を緑色フィルターを用いて蛍光顕微鏡によっても可視化し、計数して、アポトーシスを受けている細胞のパーセンテージを確定した。可視光下で、総細胞集団を計数した。
【０１８７】
図４６は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のカスパーゼ活性増大により反映されるようなアポトーシス増強を示す。ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現は、カスパーゼ活性の60％増大を生じた。
図４７は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のＤＮＡ断片化増大により反映されるようなアポトーシス増強を示す。ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現は、ＤＮＡ断片化の273％増大を生じた。図４８は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合の核断片化増大により反映されるようなアポトーシスの検出を示す。ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを発現する細胞中で断片化核のより大きな証拠が認められる。図４９は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合の核断片化増大により反映されるようなアポトーシス増強を示す。ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現は、それぞれ、非血清飢餓および血清飢餓試料における対照を上回る核断片化の27％および63％増大を生じた。
【０１８８】
図５０は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のホスファチジルセリン曝露により反映されるようなアポトーシスの検出を示す。図５１は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のホスファチジルセリン曝露増大により反映されるようなアポトーシス増強を示す。ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現は、それぞれ、非血清飢餓および血清飢餓試料における対照を上回るホスファチジルセリンの140％および198％増大を生じた。
【０１８９】
図５２は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合の核断片化増大により反映されるようなアポトーシス増強を示す。ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現は、それぞれ非処置および処置試料における対照を上回る核断片化の115％および62％増大を生じた。図５３は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６で一過的にトランスフェクトされたＣＯＳ‐７細胞がさらなる処置を施されないかまたはアポトーシスを誘導するよう処置を施される条件下でのアポトーシス増強の比較を示す。
【０１９０】
実施例４
本実施例は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの投与後のアポトーシス活性の変調を実証する。
ＣＯＳ‐７細胞を、偽トランスフェクトするか、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトするか、またはｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａ（ｐＨＭ６‐全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ）でトランスフェクトして、40時間インキュベートした。各試料からのタンパク質抽出物の試料5 μgをＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分別し、ＰＶＤＥ膜に移して、Ｂｃｌ‐２を認識するモノクローナル抗体でウエスタンブロット処理した。ペルオキシダーゼに接合されたウサギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として用いて、そして結合抗体を化学発光により検出し、Ｘ線フィルムに曝露した。結果を図５４に示す。この図は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のＢｃｌ‐２の下向き調節を示す。上部パネルはクーマシーブルー染色タンパク質ブロットを示す；底部パネルは対応するウエスタンブロットを示す。ｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトされたものより低いＢｃｌ‐２が、ｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａでトランスフェクトされた細胞において検出可能である；したがってＢｃｌ‐２はｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａ構築物で下向き調節される、ということを示す。
【０１９１】
付加的ＣＯＳ‐７細胞を、偽トランスフェクトするか、ｐＨＭ６‐アンチセンス３’ｒＦ５Ａ（ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｐＨＭ６‐アンチセンス３‘ＵＴＲ）でトランスフェクトするか、またはｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａ（ｐＨＭ６‐全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの40時間後に、血清の撤退によりアポトーシスを受けるよう、48時間、細胞を誘導した。各試料からのタンパク質抽出物の試料5 μgをＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分別し、ＰＶＤＥ膜に移して、Ｂｃｌ‐２を認識するモノクローナル抗体でウエスタンブロット処理した。ペルオキシダーゼに接合されたウサギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として用いて、そして結合抗体を化学発光により検出し、Ｘ線フィルムに曝露した（図５５参照）。この図は、アンチセンス配向でアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの３’末端を含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のＢｃｌ‐２の上向き調節を示す。上部パネルはクーマシーブルー染色タンパク質ブロットを示す；底部パネルは対応するウエスタンブロットを示す。偽トランスフェクトされるかまたはｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａでトランスフェクトされたものより多いＢｃｌ‐２が、ｐＨＭ６‐アンチセンス３‘ｒＦ５Ａでトランスフェクトされた細胞において検出可能である。
【０１９２】
さらに付加的には、ＣＯＳ‐７細胞を、偽トランスフェクトするか、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトするか、またはｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａ（ｐＨＭ６‐全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ）でトランスフェクトし、40時間インキュベートした。各試料からのタンパク質抽出物の試料5 μgをＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分別し、ＰＶＤＥ膜に移して、ｐ５３を認識するモノクローナル抗体でウエスタンブロット処理した。アルカリ性ホスファターゼに接合されたヤギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として用いて、そして結合抗体を比色法により検出した（図５６参照）。この図は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のｃ‐Ｍｙｃの上向き調節を示す。上部パネルはクーマシーブルー染色タンパク質ブロットを示す；下部パネルは対応するウエスタンブロットを示す。ｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトされたものまたは偽対照より高レベルのｃ‐Ｍｙｃが、ｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａでトランスフェクトされた細胞中で検出される。
【０１９３】
最後に、ＣＯＳ‐７細胞を、偽トランスフェクトするか、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトするか、またはｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａ（ｐＨＭ６‐全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ）でトランスフェクトし、40時間インキュベートした。各試料からのタンパク質抽出物の試料5 μgをＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分別し、ＰＶＤＥ膜に移して、ｐ５３を認識するモノクローナル抗体でプローブした。対応するタンパク質ブロットを抗‐［ＨＡ］‐ペルオキシダーゼでプローブして、ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現のレベルを確定した。アルカリ性ホスファターゼに接合されたヤギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として用いて、そして結合抗体を化学発光により検出した（図５７参照）。この図は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のｐ５３の上向き調節を示す。上部パネルはクーマシーブルー染色タンパク質ブロットを示す；下部パネルは対応するウエスタンブロットを示す。ｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトされたものまたは偽対照より高レベルのｐ５３が、ｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａでトランスフェクトされた細胞中で検出される。
【０１９４】
図５８Ａ〜Ｅは、ＣＯＳ‐７細胞中でのｐＨＭ６‐全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現へのｐ５３上向き調節の依存を示す。第二のトランスフェクションにおけるよりも多くのラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａが、第一のトランスフェクションにおいて検出可能である。抗ｐ５３でプローブされたウエスタンブロットにおいて、当該パネルは、対応するクーマシーブルー染色タンパク質ブロットを示し、そして当該パネルは、ｐ５３を用いたウエスタンブロットを示す。第一のトランスフェクションに関しては、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺでトランスフェクトされたものまたは偽対照におけるよりも多くのｐ５３が、ｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａでトランスフェクトされた細胞において検出可能である。ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの低発現が認められる第二のトランスフェクションに関しては、ｐＨＭ６‐センスｒＦ５Ａ、ｐＨＭ６‐Ｌａｃでトランスフェクトされた細胞または偽対照間のｐ５３レベルに検出可能な差は認められなかった。
【０１９５】
実施例５
心臓組織を正常酸素レベルに曝露し、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａおよび増殖性ｅＩＦ５Ａ１の発現レベルを測定した。その後、心臓組織に送達される酸素の量は低減され、したがって低酸素症および虚血を、そして最後には心臓組織における心臓発作を誘導した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａおよび増殖性ｅＩＦ５Ａ１の発現レベルを測定し、それが虚血により損害される前の心臓組織の発現レベルと比較した。
【０１９６】
心臓弁置換術中に取り出される心臓組織の薄片を電極に掛けた。小さい錘を心臓組織に取り付けて、心拍の強さを測定を容易にした。電極は、組織に拍動を開始させるための電気的刺激を提供した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａおよび増殖性ｅＩＦ５Ａ１の両方に関する遺伝子発現のレベルを、虚血が誘導される前に心臓組織で測定した（図６１参照）。前虚血心臓組織では、低レベルのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａおよび増殖性ｅＩＦ５Ａ１が産生され、そしてそれらのレベルは相対的平衡状態であった。この時間中、酸素および二酸化炭素を緩衝液中に送達して、それぞれ92.5％および7.5％とした。その後、酸素レベルを低減し、窒素レベルを増大して、虚血を、そして最終的には「心臓発作」ヲ誘導した。心臓組織は拍動を停止した。次に酸素レベルを正常に戻して、心臓組織を再び電気刺激で脈動させて、心臓拍動を再開させた。「心臓発作」後、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａおよび増殖性ｅＩＦ５Ａ１の発現レベルを再び測定した。この時点で、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現レベルの有意の増大が認められたが、一方、増殖性ｅＩＦ５Ａ１の発現レベルの増大は、顕著に低かった（図６１参照）。
「心臓発作」後、心臓は、付着錘の低圧縮／動きにより示されるように強くは拍動せず、したがってアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの存在のために心臓組織細胞が急速に殺害されていたことを示す。
【０１９７】
実施例６
以下の実施例は、細胞培養条件を提示する。
ヒト篩板および星状細胞培養
カナダのオンタリオ地区のアイバンクから、死後48時間以内に対を成すヒトの眼を入手した。視神経頭（付着極付き）を取り出し、抗生物質／抗真菌薬、グルタミンおよび10％ＦＢＳを補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に3時間入れた。視神経頭（ＯＮＨ）ボタンを各組織試料から回収して、微細切断鋏で4つの小片に刻んだ。ＤＭＥＭ培地中で、12.5 cm2プラスチック培養フラスコ中で外植片培養した。生育可能外植片で、1ヶ月以内に増殖を観察した。細胞が集密度90％に達したら、それらをトリプシン処理し、鑑別継代培養に付して、篩板（ＬＣ）および星状細胞集団を生じた。特定的には、ゲンタマイシン、グルタミンおよび10％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で25 cm2フラスコ中でＬＣ細胞を継代培養し、一方、ＥＢＭ完全培地（Clonetics）を含入し、ＦＢＳを含有しない25 cm2フラスコ中で星状細胞を展開させた。10日間の継代培養後に、ＦＢＳを星状細胞培養に付加した。このプロトコールに従って細胞を保持し、継代培養した。
【０１９８】
鑑別継代培養により得た細胞集団を、8ウエル培養スライド上での鑑別蛍光抗体染色を用いて、同一性および集団純度に関して特性化した。細胞を10％ホルマリン溶液中で固定し、ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で3回洗浄した。ＤＰＢＳ中の2％脱脂乳で遮断後、抗体をＤＰＢＳ中の1％ＢＳＡ中で希釈して、6つのウエル中の細胞に適用した。対照として、残り2つのウエルを1％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液のみ、一次抗体なしで処置した。細胞を一次抗体とともに室温で1時間インキュベートし、次にＤＰＢＳで3回洗浄した。適切な二次抗体をＤＰＢＳ中の1％ＢＳＡ中で希釈し、各ウエルに付加して、1時間インキュベートした。ＤＰＢＳで洗浄後、培養スライドのウエルを分離する小室をスライドから除去し、そしてスライドを二重蒸留水中に浸漬して、次に風乾させた。Fluoromount（Vector Laboratories）を各スライドに適用して、22×60 mmのカバーガラス片を上に載せた。
【０１９９】
適切なフィルターを用いて蛍光顕微鏡下で免疫蛍光染色を観察して、一次抗体で処置されていない対照ウエルと比較した。一次抗体はすべて、別記しない限り、Sigmaから入手した。二次抗体はすべて、Molecular Probesから購入した。ＬＣ細胞を同定するために用いられた一次抗体を以下に示す：抗コラーゲンＩ、抗コラーゲンＩＶ、抗ラミニン、抗細胞フィブロネクチン。星状細胞を同定するために用いた一次抗体を以下に示す：抗ガラクトセレブロシド（Chemicon International）、抗Ａ２Ｂ５（Chemicon International）、抗ＮＣＡＭ、抗ヒト・フォン・ヴィレブランド因子。両細胞集団のために用いられた付加的抗体としては、抗神経膠原繊維（ＧＦＡＰ）および抗α‐平滑筋アクチンが挙げられる。コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、ラボフィブロネクチン、アルファ平滑筋アクチンに関して陽性に染色され、そして神経膠原繊維（ＧＦＡＰ）に関して陰性に染色された場合、細胞集団はＬＣ細胞からなると確定した。ＮＣＡＭ、神経膠原繊維（ＧＦＡＰ）に関して陽性に染色され、そしてガラクトセレブロシド、Ａ２Ｂ５、ヒト・フォン・ヴィレブランド因子およびアルファ平滑筋アクチンに関して陰性に染色された場合、細胞集団は星状細胞からなると確定した。
【０２００】
この予備試験では、3組のヒトの眼を用いて、培養を開始した。ＬＣ細胞株＃５０６、＃５１７および＃５２４を、それぞれ83歳男性、17歳男性および26歳女性の視神経頭から確立した。ＬＣ細胞株はすべて、十分に特性化され、そして90％以上のＬＣ細胞を含有することが見出された。
【０２０１】
ＲＫＯ細胞培養
野生型ｐ５３を発現するヒト結腸癌細胞株であるＲＫＯ（American Type Culture CollectionＣＲＬ‐2577）を用いて、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質発現を抑圧する能力に関して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを試験した。非必須アミノ酸、アール塩およびＬ‐グルタミンを含有するイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）中で、ＲＫＯを培養した。培地に10％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および100単位のペニシリン／ストレプトマイシンを補足した。5％ＣＯ2および95空気の加湿環境中で、37℃で細胞を増殖させた。0.25％トリプシンおよび1 mMＥＤＴＡの溶液で接着細胞を剥ぎ取ることにより、3〜4日毎に細胞を継代培養した。新鮮な培地を含有する新規の培養皿中に1:10〜1:12の分割比で、剥離細胞を分配した。
【０２０２】
ＨｅｐＧ２細胞培養
ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌細胞株）を用いて、ＩＬ‐１βによる処置に応答したＴＮＦ‐αの産生を遮断するヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるアンチセンスオリゴの能力を試験した。ゲンタマイシン、グルタミンおよび10％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中でＨｅｐＧ２細胞を培養し、5％ＣＯ2および95空気の加湿環境中で37℃で増殖させた。
【０２０３】
実施例７
アポトーシスの誘導
ぞれぞれ、アクチノマイシンＤ（ＲＮＡポリメラーゼ阻害薬）およびカンプトテシン（トポイソメラーゼ阻害薬）を用いてＲＫＯおよび篩板細胞中にアポトーシスを誘導した。アクチノマイシンＤを0.25 μg/mlの濃度で用い、そしてカンプトテシンを20、40または50 μMの濃度で用いた。カンプトテシン（50 μM）およびＴＮＦ‐α（10 ng/ml）の組合せを用いても、篩板細胞中にアポトーシスを誘導した。カンプトテシンおよびＴＮＦ‐αの組合せは、カンプトテシンまたはＴＮＦ‐α単独よりも、アポトーシスの誘導に有効であることが判明した。
【０２０４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化される３アンチセンスオリゴヌクレオチド組は、Molecular Research Labsにより設計され、そしてそこから購入された。ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化される第一アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（＃１）は、5’CCT GTC TCG AAG TCC AAG TC 3’（配列番号６３）であった。ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化される第二アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（＃２）は、5’GGA CCT TGG CGT GGC CGT GC 3’（配列番号６４）であった。ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化される第三アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（＃３）は、5’CTC GTA CCT CCC CGC TCT CC 3’（配列番号６５）であった。対照オリゴヌクレオチドは、配列：5’CGT ACC GGT ACG GTT CCA GG 3’（配列番号６６）を有した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化アンチセンスオリゴヌクレオチド（Molecular Research Labs）を用いて、トランスフェクション効率をモニタリングし、そしてそれは配列：5’GGA CCT TGG CGT GGC CGT GCX 3’（配列番号６７）（ここで、ＸはＦＩＴＣ標識である）を有した。アンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、完全にホスホロチオエート化された。
【０２０５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクション
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質発現を遮断するアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を、ＲＫＯ細胞で試験した。トランスフェクション試薬オリゴフェクタミン（Invitrogen）を用いて、ＲＫＯ細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間前に、10％ＦＢＳを補足されたがしかしペニシリン／ストレプトマイシンを欠くＭＥＭ培地中で157,000／ウエルで、24ウエルプレート上に細胞を分割した。24時間後、細胞は一般的に約50％の集密度に達した。ＲＫＯ細胞を偽トランスフェクトするか、または100 nMまたは200 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。アンチセンスオリゴヌクレオチドの20 μMストック0、1.25または2.5 μlを、無血清ＭＥＭで希釈して、最終容積を42.5 μlとし、そして混合物を室温で15分間インキュベートすることにより、24ウエルのうちの1ウエルのために十分なトランスフェクション培地を調製した。オリゴフェクタミン1.5 μlを無血清ＭＥＭ6 μl中に希釈し、室温で7.5分間インキュベートした。5分後、希釈オリゴフェクタミン混合物をＤＮＡ混合物に付加し、室温で20分間、一緒にインキュベートした。細胞を無血清ＭＥＭで1回洗浄した後、200 μlのＭＥＭを細胞に付加し、50 μlのトランスフェクション培地を被せる。細胞を増殖小室中に4時間戻し入れる。インキュベーション後、125 μlのＭＥＭ＋30％ＦＢＳを細胞に付加した。次に細胞をさらに48時間培養し、0.25 μg/mlアクチノマイシンＤで24時間処置して、次に細胞抽出物をウエスタンブロット分析のために収穫した。
【０２０６】
ＲＫＯ細胞に関して記載したものと同一手順を用いて、100および200 nMアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびオリゴフェクタミンを用いて、篩板細胞のトランスフェクションも試験した。しかしながら篩板細胞の有効トランスフェクションは、細胞に24時間、無血清培地中に1 μMから10 μMまで希釈されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを単に付加し、その後、その培地を、合計で2〜5日間、24時間毎に、血清含有培地中に希釈された新鮮なアンチセンスオリゴヌクレオチドと取り替えることにより達成された。
【０２０７】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａアンチセンスオリゴヌクレオチド＃２（配列番号６４）と同一配列を有するが、しかし３’末端でＦＩＴＣに接合されるＦＩＴＣ標識化アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクションを実施することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチド・トランスフェクションの効率を最適化し、そしてモニタリングした。ＲＫＯおよび篩板細胞を、8ウエル培養スライド上で、ＦＩＴＣ標識化アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトした。48時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ中の3.7％ホルムアルデヒド中で10分間固定した。ウエルを取り出し、封入剤（Vectashield）を付加し、その後、カバーガラスを加えた。次に、フルオレセインフィルター（グリーンＨ５４６、フィルター組48915）を用いて蛍光顕微鏡上のＵＶ光下で細胞を可視化し、明緑色の蛍光を発する細胞を、オリゴヌクレオチドを取り込んだと確定した。
【０２０８】
アポトーシスの検出
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた篩板細胞のトランスフェクションならびにカンプトテシンを用いたアポトーシスの誘導後、対照アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ（配列番号２６）で処置された細胞中のアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージを確定した。2つの方法、即ちHoescht染色およびDeadEndTM蛍光定量的ＴＵＮＥＬを用いて、アポトーシス性篩板細胞を検出した。形態学的特徴、例えば核断片化および凝縮に基づいてアポトーシス細胞を同定するために、核染色Hoeschtを用いて、篩板細胞の核を染色した。無水メタノールおよび氷酢酸の3:1混合物から成る固定液を、使用直前に調製した。培養スライド上で増殖中の細胞の培地に等容積の固定液を付加し、2分間インキュベートした。培地／固定液混合物を細胞から除去し、廃棄して、1 mlの固定液を細胞に付加した。5分後、固定液を廃棄し、1 mlの新鮮な固定液を細胞に付加して、5分間インキュベートした。固定液を廃棄し、細胞を4分間風乾した後、1 mlのHoescht染色液（ＰＢＳ中の0.5 μg/ml  Hoescht 33258）を付加した。暗所での10分間インキュベーション後、染色溶液を廃棄し、培養スライドのウエルを分離する小室を除去し、そして脱イオン水で1分間、スライドを3回洗浄した。洗浄後、2〜3滴のマクイルバイン緩衝液（0.021 Mクエン酸、0.058 MＮａ2ＨＰＯ4・7Ｈ2Ｏ；ｐＨ5.6）を細胞に付加し、カバーガラスで覆った。ＵＶフィルターを用いて蛍光顕微鏡下で、染色細胞を観察した。明るく染色されたまたは断片化した核を有する細胞を、アポトーシス性としてスコアした。最小で200細胞を、ウエル当たりで計数した。
【０２０９】
DeadEndTM蛍光定量的ＴＵＮＥＬ（Promega）を用いて、アポトーシス細胞の独特の特徴であるＤＮＡ断片化を検出した。Hoescht染色後、培養スライドを蒸留水で手短に洗浄し、洗浄間に紙タオル上でスライドの水気を取りながら、ＰＢＳ（137 mMＮａＣｌ、2.68 mMＫＣｌ、1.47 mMＫＨ2ＰＯ4、8.1 mMＮａ2ＨＰＯ4）中に5分間、スライドを5回浸漬することによりさらに洗浄した。ＰＢＳ中の0.2％トリトンＸ‐１００中に5分間浸漬することにより、細胞を透過性にした。次に、ＰＢＳ中に5分間、スライドを2回浸漬し、洗浄間に紙タオル上でスライドの水気を取ることにより、細胞を再び洗浄した。25 μlの平衡緩衝液［200 mMカコジル酸カリウム（ｐＨ6.6）、25 mMトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ6.6）、0.2 mMジチオトレイトール、0.25 mg/mlウシ血清アルブミンおよび2.5 mM塩化コバルト］をウエル当たりで付加し、5〜10分間インキュベートした。平衡中、それぞれ平衡緩衝液、ヌクレオチド混合物［50 μMフルオレセイン‐１２‐ｄＵＴＰ、100 μMｄＡＴＰ、10 mMトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ7.6）および1 mMＥＤＴＡ］および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素（Ｔｄｔ、25 U/ μl）を45:5:1の比で混合することにより、30 μlの反応混合物を各ウエルのために調製した。平衡緩衝液中でのインキュベーション後、30 μlの反応混合物をウエル当たりで付加し、カバーガラスを載せた。37℃で1時間、暗所で反応を進行させた。2×ＳＳＣ［0.3 MＮａＣｌおよび30 mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.0）］中にスライドを浸漬し、15分間インキュベートすることにより、反応を終結させた。次に、5分間を3回、ＰＢＳ中の浸漬によりスライドを洗浄した。Kimワイプでウエル周囲をぬぐうことによりＰＢＳを除去し、１滴の封入剤（Oncogene research project, JA1750-4ML）を各ウエルに付加して、スライドにカバーガラスを被せた。Hoescht染色核を計数するために、ＵＶフィルター（ＵＶ‐Ｇ３６５、フィルター組487902）を用いて蛍光顕微鏡下で細胞を観察した。明るく染色されるかまたは断片化した核を有する任意の細胞を、アポトーシス性としてスコアした。同一視野を用いて、次に細胞をフルオレセインフィルター（グリーンＨ５４６、フィルター組48915）を用いて観察し、明緑色の蛍光を発する任意の核をアポトーシス性としてスコアした。フルオレセインフィルターを用いて計数された明緑色核の数をＵＶフィルター下で計数された核の総数で割ることにより、視野中のアポトーシス細胞のパーセンテージを算定した。最小で200細胞をウエル当たりで計数した。
【０２１０】
図７８〜８２は、これらの試験の結果を示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａでトランスフェクトされた試料中のアポトーシス細胞のパーセンテージは、対照オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞で観察されるものより明らかに非常に低い。
【０２１１】
タンパク質抽出およびウエスタン・ブロッティング
ＰＢＳで細胞を洗浄し、40 μlの熱溶解緩衝液［0.5％ＳＤＳ、1 mMジチオトレイトール、50 mMのトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ8.0）］／ウエルを付加することにより、トランスフェクト化ＲＫＯ細胞からのタンパク質をウエスタン・ブロッティング分析のために収穫した。細胞を掻き集めて、その結果生じた抽出物を微小遠心分離管中に移し、5分間煮沸して、−20℃で保存した。メーカーの使用説明書に従って、Bio-Radタンパク質検定（Bio-Rad）を用いてタンパク質を定量した。
【０２１２】
ウエスタン・ブロッティングのために、5 μgの総タンパク質を12％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。分離タンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜に移した。次にブロッキング溶液（ＰＢＳ中5％スキムミルク粉末）中で1時間、膜をインキュベートし、0.05％トゥイーン２０／ＰＢＳ中で15分間、3回洗浄した。膜を、4℃でＰＢＳ‐Ｔ中に一晩保存した。翌日、室温に暖めた後、1 μg/mlポリビニルアルコール中で30秒間、膜を遮断した。膜を脱イオン水中で5回すすぎ、次に0.025％トゥイーン２０／ＰＢＳ中の5％ミルクの溶液中で30分間遮断した。一次抗体を0.025％トゥイーン２０／ＰＢＳ中の5％ミルクの溶液中で30分間予備インキュベートした後、膜とともにインキュベートした。
【０２１３】
いくつかの一次抗体を用いた。ｐ５３を認識するOncogeneからのモノクローナル抗体（Ａｂ‐６）、ならびにニワトリ中で産生されたヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのｃ末端と相同である合成ペプチド（アミノ‐CRLPEGDLGKEIEQKYD‐カルボキシ）（配列番号６８）に対して向けられるポリクローナル抗体（Gallus Immunotech）。タンパク質の等負荷を実証するために、抗β‐アクチン抗体（Oncogene）も用いた。ｐ５３に対するモノクローナル抗体を0.05 μg/mlの希釈で用い、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対する抗体を1:1000の希釈で用い、そしてアクチンに対する抗体を1:20,000の希釈で用いた。一次抗体とともに60〜90分間インキュベート後、膜を0.05％トゥイーン２０／ＰＢＳ中で15分間、3回洗浄した。次に二次抗体を0.025％トゥイーン２０／ＰＢＳ中の1％ミルク中で希釈し、膜を60〜90分間インキュベートした。ｐ５３（Ａｂ‐６）を一次抗体として用いる場合、用いられる二次抗体は、1:5000の希釈でペルオキシダーゼに接合されたウサギ抗マウスＩｇＧ（Sigma）であった。抗アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを一次抗体として用いた場合、ペルオキシダーゼに接合されたウサギ抗ニワトリＩｇＹ（Gallus Immunotech）を1:5000の希釈で用いた。アクチンとともに用いられる二次抗体は、1:5000の希釈でペルオキシダーゼに接合されたヤギ抗マウスＩｇＭ（Calbiochem）であった。二次抗体とともにインキュベーション後、膜をＰＢＳ‐Ｔ中で3回洗浄した。
【０２１４】
ＥＣＬプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、ペルオキシダーゼ接合結合抗体を検出した。要するに、膜を軽くブロット乾燥し、次に試薬Ａおよび試薬Ｂの40:1混合物とともに5分間、暗所でインキュベートした。膜をブロット乾燥し、アセテートのシート間に置いて、10秒から10分間の種々の時間、Ｘ線フィルムに露出した。剥取り緩衝液［100 mM２‐メルカプトエタノール、2％ＳＤＳおよび62.5 mMトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ6.7）］中に膜を沈水し、そして50℃で30分間インキュベートすることにより、膜を剥ぎ取った。次に膜を脱イオン水中ですすぎ、そして大量の0.05％トゥイーン２０／ＰＢＳ中で10分間、2回洗浄した。膜を剥ぎ取り、3回まで、再ブロットした。
【０２１５】
実施例８
ｓｉＲＮＡの構築
ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられる小抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて、ＲＫＯおよび篩板細胞中でのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を特異的に抑圧した。SilencerTMｓｉＲＮＡ構築キット（Ambion Inc.）を用いて、in vitro転写により、6つのｓｉＲＮＡを生成した。ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して、4つのｓｉＲＮＡを生成した（ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４）（配列番号３０〜３３）。2つのｓｉＲＮＡを対照として用いた；キットで提供されるＧＡＰＤＨに対して向けられるｓｉＲＮＡ、ならびにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡｓｉＲＮＡ＃１（配列番号３０）の逆配列を有したがしかしそれ自体アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを標的にしないｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃５）（配列番号３４）。メーカーのプロトコールに従って、ｓｉＲＮＡを生成した。要するに、所望のｓｉＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として用いて、Ｔ７プロモータープライマーのアニーリングおよびクレノウ断片を用いた充填反応後に、ｓｉＲＮＡの個々の鎖を生成した。センスおよびアンチセンス鎖の両方に関する転写反応後、反応を併合して、2つのｓｉＲＮＡ鎖をアニーリングし、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼで処理し、そして次にカラム精製した。ｓｉＲＮＡを生成するために用いられるＤＮＡオリゴヌクレオチド（下線を付したＴ７プライマーアニーリング部位）の配列を以下に示す：ｓｉＲＮＡ＃１アンチセンス5’AAAGGAATGACTTCCAGCTGACCTGTCTC3’（配列番号６９）およびｓｉＲＮＡ＃１センス5’AATCAGCTGGAAGTCATTCCTCCTGTCTC3’（配列番号７０）；ｓｉＲＮＡ＃２アンチセンス5’AAGATCGTCGAGATGTCTACTCCTGTCTC3’（配列番号７１）およびｓｉＲＮＡ＃２センス5’AAAGTAGACATCTCGACGATCCCTGTCTC3’（配列番号７２）；ｓｉＲＮＡ＃３アンチセンス5’AAGGTCCATCTGGTTGGTATTCCTGTCTC3’（配列番号７３）およびｓｉＲＮＡ＃３センス5’AAAATACCAACCAGATGGACCCCTGTCTC（配列番号７４）；ｓｉＲＮＡ＃４アンチセンス5’AAGCTGGACTCCTCCTACACACCTGTCTC3’（配列番号７５）およびｓｉＲＮＡ＃４センス5’AATGTGTAGGAGGAGTCCAGCCCTGTCTC3’（配列番号７６）；ｓｉＲＮＡ＃５アンチセンス5’AAAGTCGACCTTCAGTAAGGACCTGTCTC3’（配列番号７７）およびｓｉＲＮＡ＃５センス5’AATCCTTACTGAAGGTCGACTCCTGTCTC3’（配列番号７８）。
【０２１６】
ＲＫＯおよび篩板細胞中へのｓｉＲＮＡの取り込みをモニタリングするために、SilencerTMｓｉＲＮＡ標識キット‐ＦＡＭ（Ambion）を用いて、ＦＡＭでＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを標識した。8ウエル培養スライド上でのトランスフェクション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ中の3.7％ホルムアルデヒド中で10分間固定した。ウエルを取り出し、封入剤（Vectashield）を付加した後、カバーガラスを載せた。フルオレセインフィルターを用いてＵＶ光下で蛍光顕微鏡下で、ＦＡＭ標識化ｓｉＲＮＡの取込みを可視化した。メーカーのプロトコールに従って、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを標識した。
【０２１７】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
同一トランスフェクション・プロトコールを用いて、ＲＫＯ細胞および篩板細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。それぞれ46,000および105,800細胞／ウエルの密度で、8ウエル培養スライドまたは24ウエルプレート上に、トランスフェクション前日にＲＫＯ細胞を植え付けた。細胞集密度が40〜70％になった場合に篩板細胞をトランスフェクトし、一般的にトランスフェクションの3日前に、7500〜10,000細胞／ウエルで8ウエル培養スライド上に植えつけた。25.5 pmolのｓｉＲＮＡストックをＯｐｔｉ‐Ｍｅｍ（Sigma）中で最終容積21.2 μlに希釈することにより、8ウエル培養スライドのうちの1ウエルに十分なトランスフェクション培地を調製した。0.425 μlのリポフェクタミン2000を、Ｏｐｔｉ‐Ｍｅｍ（Sigma）中で最終容積21.2 μlに希釈し、そして室温で7〜10分間インキュベートした。次に希釈リポフェクタミン2000混合物を希釈ｓｉＲＮＡ混合物に付加し、室温で20〜30分間、一緒にインキュベートした。細胞を無血清培地で1回洗浄した後、135 μlの無血清培地を細胞に付加し、42.4 μlのトランスフェクション培地を被せた。細胞を、増殖小室中に4時間入れ戻した。インキュベーション後、65 μlの無血清培地＋30％ＦＢＳを細胞に付加した。ウエスタンブロット分析のために用いられるべき細胞中へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、8ウエルスライド中でのトランスフェクションと同一条件を用いて24ウエルプレート中で実施したが、但し、容積は2.3倍増大した。
トランスフェクション後、ＲＫＯおよび篩板細胞を72時間インキュベートした後、ウエスタンブロット分析のために細胞抽出物を収集した。アポトーシスを遮断するためにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡの有効性を確定するために、篩板細胞を50 μMのカンプトテシン（Sigma）および10 ng/mlのＴＮＦ‐α（Leinco Technologies）で処置して、トランスフェクション後48または72時間でアポトーシスを誘導した。アポトーシスを受けている細胞のパーセンテージを確定するために、24または48時間後に細胞をHoeschtで染色した。
【０２１８】
実施例９
ＨｅｐＧ２  ＴＮＦ‐α産生の定量
ＨｅｐＧ２細胞を、48ウエルプレート上で20,000細胞／ウエルでプレート化した。72時間後、培地を除去し、2.5 μM対照アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは2.5 μMアンチセンスオリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ＃２を含有する新鮮な培地を細胞に付加した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する新鮮培地を、24時間後に付加した。オリゴヌクレオチドを用いた合計48時間のインキュベーション後、培地を、インターロイキン１β（ＩＬ‐１β、1000 pg/ml；Leinco Technologies）を含有する培地と取り替えて、6時間インキュベートした。ＴＮＦ‐α定量のために、培地を収集し、凍結した（−20℃）。非処置細胞（アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＩＬ‐１βなし）およびＩＬ‐１βのみで処置された細胞を用いた付加的平行インキュベーションを、対照のために用いた。処置はすべて、二重反復実験で実行した。培地中に放出されるＴＮＦ‐αを、メーカーのプロトコールに従って、ＥＬＩＳＡ検定（Assay Designs Inc.）により測定した。
【０２１９】
実施例１０
以下の実験は、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａヌクレオチドがアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａならびにｐ５３の発現を抑制し得る、ということを示す。
ＲＫＯ細胞を、トランスフェクトしないままで置き、偽トランスフェクトし、あるいは200 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ＃１、＃２または＃３（配列番号２５、２６および２７）でトランスフェクトした。ＲＫＯ細胞をさらにまた、100 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ＃２（配列番号２６）でトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を0.25 μg/mlアクチノマイシンＤで処置した。24時間後、細胞抽出物を収穫し、各試料からのタンパク質5 μgをＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移して、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対する抗体を用いてウエスタンブロット処理した。化学発光検出後、膜を分割し、ｐ５３に対する抗体で再プローブした。化学発光検出後、膜を再び分割し、アクチンに対する抗体で再プローブした。図４２は、（アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対する）アンチセンスオリゴ１、２および３（それぞれ配列番号２５、２６および２７）で処置された後にＲＫＯ細胞により産生されたタンパク質のレベルを示す。ＲＫＯ細胞は、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａヌクレオチドでトランスフェクトされた後に低アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを、ならびに低ｐ５３を産生した。
【０２２０】
実施例１１
以下の実験は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａヌクレオチドがアポトーシスを低減し得た、ということを示す。
一実験において、篩板細胞株＃５０６を（Ａ）トランスフェクション試薬であるオリゴフェクタミンを用いて100 nMのＦＩＴＣ標識化アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトするか、あるいは（Ｂ）無血清培地中に直接希釈された10 μMの裸ＦＩＴＣ標識化アンチセンス落ち後ヌクレオチドでトランスフェクトした。24時間後、10％ＦＢＳおよび10 μMに希釈された新鮮なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する新鮮な培地を、細胞に付加した。細胞（Ａ）および（Ｂ）を、合計48時間後に固定し、フルオレセインフィルターを用いてＵＶ光下で蛍光顕微鏡で可視化した。図７７ＡおよびＢは、蛍光的標識化アンチセンスオリゴヌクレオチドの取込みを示す。
【０２２１】
別の実験では、篩板細胞株＃５０６を、10 μMの、対照アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ＃２（配列番号２６）で合計4日間トランスフェクトした。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置開始後48時間に、細胞を20 μMまたは40 μMのカンプトテシンで48時間処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびカンプトテシン含有培地を、毎日取り替えた。HoeschtおよびＴＵＮＥＬで細胞を標識することにより、アポトーシス細胞のパーセンテージを確定した（図７８参照）。
【０２２２】
別の実験では、篩板細胞株＃５０６を、10 μMの、対照アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ＃２（配列番号２６）でトランスフェクトした。24時間後、培地を取り替えて、新鮮なアンチセンスオリゴヌクレオチドを付加した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置開始後48時間に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去し、細胞を20 μMカンプトテシンで3日間処置した。カンプトテシン含有培地を、毎日取り替えた。HoeschtおよびＴＵＮＥＬで細胞を標識することにより、アポトーシス細胞のパーセンテージを確定した（図７９参照）。
【０２２３】
別の実験では、篩板細胞株＃５１７を、1 μMの、対照アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ＃２（配列番号２６）で合計5日間トランスフェクトした。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置開始後48時間に、細胞を20 μMカンプトテシンで3または4日間処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびカンプトテシン含有培地を、毎日取り替えた。HoeschtおよびＴＵＮＥＬで細胞を標識することにより、アポトーシス細胞のパーセンテージを確定した（図８０参照）。
【０２２４】
別の実験では、篩板細胞株＃５１７を、2.5 μMの、対照アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ＃２（配列番号２６）で合計5日間トランスフェクトした。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置開始後48時間に、細胞を40 μMカンプトテシンで3日間処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびカンプトテシン含有培地を、毎日取り替えた。Hoeschtで細胞を標識することにより、アポトーシス細胞のパーセンテージを確定した（図８１参照）。
【０２２５】
別の実験では、篩板細胞株＃５１７を、1 μMまたは2.5 μMの、対照アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ＃２（配列番号２６）で合計5日間トランスフェクトした。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置開始後48時間に、細胞を40 μMカンプトテシンで3日間処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびカンプトテシン含有培地を、毎日取り替えた。Hoeschtで細胞を標識することにより、アポトーシス細胞のパーセンテージを確定した（図８２参照）。
【０２２６】
別の実験では、篩板細胞株＃５１７を、非処置のままで置くか、あるいは10 ng/mlのＴＮＦ‐α、50 μMのカンプトテシンまたは10 ng/mlのＴＮＦ‐αおよび50 μMのカンプトテシンで処置した。Hoeschtで細胞を標識することにより、アポトーシス細胞のパーセンテージを確定した（図８３参照）。
【０２２７】
別の実験では、篩板細胞株＃５０６および＃５１７を、2.5 μMまたは5 μMの、対照アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ＃２（配列番号２６）で合計2日間トランスフェクトした。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する新鮮な培地を、24時間後に付加した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置開始後48時間に、細胞を50 μMカンプトテシンおよび10 ng/mlＴＮＦ‐αで2日間処置した。Hoeschtで細胞を標識することにより、アポトーシス細胞のパーセンテージを確定した（図８４参照）。
【０２２８】
別の実験では、篩板細胞株＃５０６、＃５１７および＃５２４を、2.5 μMの、対照アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ＃２（配列番号２６）で合計2日間トランスフェクトした。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する新鮮な培地を、24時間後に付加した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置開始後48時間に、細胞を50 μMカンプトテシンおよび10 ng/mlＴＮＦ‐αで2日間処置した。Hoeschtで細胞を標識することにより、アポトーシス細胞のパーセンテージを確定した（図８５参照）。
【０２２９】
実施例１２
以下の実験は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化されるｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞が低アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを発現した、ということを示す。実験は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化されたｓｉＲＮＡがアポトーシスを低減し得た、ということも示す。
【０２３０】
一実験において、篩板細胞株＃５１７を、トランスフェクション中に血清を伴う（Ａ）または血清を伴わない（Ｂ）リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬を用いて100 nMのＦＡＭ標識化ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞（Ａ）および（Ｂ）を、合計24時間後に固定し、フルオレセインフィルターを用いてＵＶ光下で蛍光顕微鏡で可視化した（図８６参照）。
【０２３１】
別の実験では、ＲＫＯ細胞を、トランスフェクション中に血清の存在下または非存在下で、100 nMのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。6つのｓｉＲＮＡ、すなわち2つの対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）およびＧＡＰＤＨに対して標的化されたもの）、ならびにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化された4つ（ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４）（配列番号３０〜３３）をトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、細胞抽出物を収穫し、各試料からのタンパク質5 μgをＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移して、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対する抗体を用いてウエスタンブロット処理した。化学発光検出後、膜を分割し、ｂｃｌ‐２に対する抗体で再プローブした。化学発光検出後、膜を再び分割し、アクチンに対する抗体で再プローブした（図９８参照）。
【０２３２】
別の実験では、篩板細胞株＃５０６および＃５１７を、100 nMのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。6つのｓｉＲＮＡ、すなわち2つの対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）およびＧＡＰＤＨに対して標的化されたもの）、ならびにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化された4つ（ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４）（配列番号３０〜３３）をトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、細胞抽出物を収穫し、各試料からのタンパク質5 μgをＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移して、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対する抗体を用いてウエスタンブロット処理した。化学発光検出後、膜を分割し、アクチンに対する抗体で再プローブした（図９９参照）。
【０２３３】
別の実験では、篩板細胞株＃５０６を、100 nMのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。6つのｓｉＲＮＡ、すなわち2つの対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）およびＧＡＰＤＨに対して標的化されたもの）、ならびにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化された4つ（ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４）（配列番号３０〜３３）をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、培地を、50 μMカンプトテシンおよび10 ng/mlＴＮＦ‐αを含有する培地と取り替えた。24時間後、Hoeschtで細胞を標識することにより、アポトーシス細胞のパーセンテージを確定した（図８７参照）。
【０２３４】
別の実験では、篩板細胞株＃５０６を、100 nMのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。6つのｓｉＲＮＡ、すなわち2つの対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）およびＧＡＰＤＨに対して標的化されたもの）、ならびにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化された4つ（ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４）（配列番号３０〜３３）をトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後に、培地を、50 μMカンプトテシンおよび10 ng/mlＴＮＦ‐αを含有する培地と取り替えた。24時間後、Hoeschtで細胞を標識することにより、アポトーシス細胞のパーセンテージを確定した（図８８参照）。
【０２３５】
別の実験では、篩板細胞株＃５０６を、トランスフェクトしないままで置くか、あるいは100 nMのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。6つのｓｉＲＮＡ、すなわち2つの対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃５（配列番号３４）およびＧＡＰＤＨに対して標的化されたもの）、ならびにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化された4つ（ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４）（配列番号３０〜３３）をトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後に、培地を、50 μMカンプトテシンおよび10 ng/mlＴＮＦ‐αを含有する培地と取り替えた。新鮮な培地をまた非トランスフェクト化、非処置対照細胞に付加した。48時間後、Hoeschtで細胞を標識することにより、アポトーシス細胞のパーセンテージを確定した（図８９参照）。
【０２３６】
図６７および実施例１３に記載される実験からの、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、カンプトテシンおよびＴＮＦ‐αで処置されたHoescht染色篩板細胞株＃５０６の写真を、図９０に提示する。
【０２３７】
実施例１３
本実施例は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドでヒト細胞株を処置すると、細胞に低ＴＮＦ‐αを産生させるということを示す。
【０２３８】
ＨｅｐＧ２細胞を、合計2日間、2.5 μMの対照アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ＃２で処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する新鮮な培地を、24時間後に付加した。付加的細胞を、2日間、処置しないままで置いた。処置開始後48時間に、細胞を新鮮な倍地中のＩＬ‐１β（1000 pg/ml）で6時間処置した。実験終了時に、ＴＮＦ‐α定量のために、培地を収集し、凍結（−20℃）した。ＥＬＩＳＡ検定（Assay Designs Inc.から購入）を用いて、培地に放出されるＴＮＦ‐αを測定した（図１００参照）。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞は、低ＴＮＦ‐αを産生した。
【０２３９】
実施例１４
ＨＴ‐２９細胞（ヒト結腸腺癌）を、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡで、または逆配列を有する対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。用いたｓｉＲＮＡを以下に示す：
位置６９０（３’ＵＴＲ）、Ｇ／Ｃ（％）＝48
5’AAGCUGGACUCCUCCUACACA3’（配列番号７９）
用いた対照ｓｉＲＮＡを以下に示す：
Ｇ／Ｃ（％）＝39
5’AAACACAUCCUCCUCAGGUCG3’（配列番号８０）
【０２４０】
48時間後、細胞をインターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐ガンマ）で16時間処置した。16時間後、細胞を新鮮な培地で洗浄し、そしてリポ多糖（ＬＰＳ）で8または24時間処置した。各時点（8または24時間）で、細胞培地を細胞から除去し、凍結し、そして培地中に存在するＴＮＦ‐アルファをＥＬＩＳＡにより定量した。細胞溶解物も収穫し、タンパク質に関して定量し、ＴＮＦ‐アルファ値をpg/タンパク質1 mgに調整するために（異なるウエル中の細胞数の差に関して調整するために）用いた。ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡの結果を、図１０１ＡおよびＢに提示する。図１０２は同一実験の結果であるが、但し、細胞はより高密度であった。
【０２４１】
実施例１５
Ｕ‐９３７細胞株の組織培養条件
Ｕ‐９３７は懸濁液中で増殖するヒト単球細胞株であり、ＰＭＡによる刺激時に接着性になり、マクロファージに分化する（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ‐1593.2）（ＡＴＣＣから直接入手されない細胞）。37℃、ＣＯ2（5％）インキュベーター中で、2 mMＬ‐グルタミン、1.5 g/L重炭酸ナトリウム、4.5 g/Lグルコース、10 mMＨＥＰＥＳ、1.0 mMピルビン酸ナトリウムおよび10％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ1640培地中に細胞を保持した。細胞を、週2回、新鮮な培地中に分割し（分割比1:4または1:5）、そして細胞密度を常に105および2×106細胞／ml間に保持した。細胞を組織培養処置プラスチックＴ‐２５フラスコ中の懸濁液中で培養し、実験を24ウエルプレート中で実行した。
【０２４２】
時間経過実験
実験開始の2日前に、細胞密度を3×105細胞／培地1 mlに調整した。実験当日に、細胞を対数期に収穫した。細胞懸濁液を15 ml試験管に移し、400×gで室温で10分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットを新鮮な培地で洗浄／再懸濁した。細胞を再び400×gで10分間遠心分離し、上清を吸引して、細胞ペレットを最後に新鮮な培地中に再懸濁した。等容積の細胞懸濁液およびトリパンブルー溶液（ＰＢＳ中0.4％トリパンブルー染色）を混合し、そして血球計算器および顕微鏡を用いて、肝細胞を計数した。細胞を4×105細胞／mlに希釈した。
【０２４３】
ＰＭＡまたはＤＭＳＯ（ビヒクル対照）を各ウエルに付加することにより、24ウエルプレートを調製した。各ウエルが400,000細胞、0.1％ＤＭＳＯ＋／−162 nMＰＭＡを含有するよう、1 mlの細胞懸濁液を各ウエルに付加した。細胞を、37℃、ＣＯ2（5％）インキュベーター中に保持した。別個のウエルの細胞を、0、24、48、72、96、99および102時間時点で収穫した。実験時点および付加についての要約に関しては、図１２６を参照されたい。
【０２４４】
培地を72時間で取り替えた。ある細胞は接着性であり、そして他のものは懸濁液中に存在したため、接着細胞の崩壊を回避するよう注意した。各ウエルからの培地を注意深く対応する微小遠心分離管に移し、14,000×gで3分間遠心分離した。管を吸引し、細胞ペレットを新鮮な培地（1 ml、（−）ＤＭＳＯ、（−）ＰＭＡ）中に再懸濁して、それらの元のウエルに戻した。細胞は、ＰＭＡを含有しないこの新鮮培地中で静止状態になる。96時間目に、ＬＰＳ（100 ng/ml）を付加し、細胞を3時間後（99時間）および6時間後（102時間）に収穫した。
【０２４５】
その時点で、懸濁液細胞および培地を各ウエルから微小遠心管に移した。細胞を、14,000×gで3分間、ペレット化した。ＥＬＩＳＡ／サイトカイン分析のために、培地（上清）を清浄試験管に移して、保存（−20℃）した。ウエル中に残留する細胞をＰＢＳ（1 ml, 37℃）で洗浄し、このＰＢＳは対応する微小遠心管中の細胞ペレットを洗浄するためにも用いた。細胞を再び14,000×gで3分間、ペレット化した。細胞を沸騰溶解緩衝液（50 mMトリス、ｐＨ7.4および2％ＳＤＳ）で溶解した。各ウエルからの接着細胞および懸濁液細胞をプールした。試料を煮沸し、次に−20℃で保存した。
【０２４６】
ウエスタン・ブロッティング
標準タンパク質としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いて、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）法により、各細胞試料中のタンパク質濃度を確定した。12％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動により、タンパク質試料（総タンパク質5 μg）を分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。膜をポリビニルアルコール（1 μg/ml, 30秒）で、そしてＰＢＳ‐ｔ中の5％スキムミルク（1時間）で遮断した。ヒトｅＩＦ５Ａ１に対して産生されたマウスモノクローナル抗体（BD Biosciencesカタログ番号611976；5％スキムミルク中1:20,000、1時間）で、膜をプローブした。膜を3×10分ＰＢＳ‐ｔで洗浄した。二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合抗マウス抗体（Sigma、1％スキムミルク中1:5000、1時間）であった。膜を3×10分ＰＢＳ‐ｔで洗浄した。化学発光（ＥＣＬ検出系、Amersham Pharmacia Biotech）により、タンパク質帯域を可視化した。
【０２４７】
同様の量のタンパク質が各ゲルレーン上に負荷されたことを実証するために、膜を剥ぎ取り、アクチンに関して再プローブした。上記と同様に、膜を剥ぎ取り（100 mM２‐メルカプトエタノール、2％ＳＤＳ、62.5 mMトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ6.7；50℃、30分）、洗浄し、次に遮断した。膜を、アクチン一次抗体（マウスで作製されたアクチンモノクローナル抗体；Oncogene、Ａｂ‐１；5％スキムミルク中1:20,000）でプローブした。二次抗体、洗浄および検出は、上記と同様であった。
図１２７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａが単球（Ｕ‐３９７）分化中と、その後のＴＮＦ‐α分泌中に上向き調節される、ということを示す。
【０２４８】
実施例１６：アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡによるインターフェロン・ガンマに応答したＩｌ‐８産生の抑圧
ＨＴ‐２９（ヒト結腸腺癌）細胞を、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの約48時間後、試験試料のいくつかがインターフェロン・ガンマを含有する培地を有し、そして試料のいくつかがインターフェロン・ガンマを含有しない培地を有するよう、培地を取り替えた。インターフェロン・ガンマ付加の16時間後に、細胞を洗浄し、培地（ＴＮＦ‐アルファを含有するかまたは含有しない）を細胞上に入れた。培地（ＩＬ‐８のＥＬＩＳＡ検出のために用いられる）および細胞溶解物を、8または24時間後に収穫した。
【０２４９】
図１０３および１０６は、ＩＬ‐８がＴＮＦ‐アルファに応答して、ならびにインターフェロンに応答して産生される、ということを示す。ＴＮＦ処置前にインターフェロン・ガンマで細胞を初回刺激すると、細胞は、処置単独より多くのＩＬ‐８を産生する。これは、インターフェロンに応答したＴＮＦ受容体１の既知の上向き調節のためであり、したがってインターフェロンで細胞を「初回刺激する」と、細胞がより多くの受容体を有するため、細胞はＴＮＦにより良好に応答する。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡは、ＴＮＦ単独に応答してＩＬ‐８産生に影響を及ぼさなかった（前の実験）が、しかしながらｓｉＲＮＡはインターフェロンに応答して産生されたＩＬ‐８のほとんどすべてを、ならびにインターフェロンおよびＴＮＦの組合せ処置の結果として産生されたＩＬ‐８の有意量を遮断した。これらの結果は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡを用いることにより、本発明人等は、ＩＬ‐８をもたらすインターフェロンシグナル伝達経路を有するがしかしＴＮＦ経路を有さない、ということを示す。図１０５は、ＨＴ‐２９細胞においてインターフェロン・ガンマに応答したアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの上向き調節（8時間で4倍）を示すウエスタンブロットである。
【０２５０】
実施例１７
ヒト篩板培養
カナダのオンタリオ地区のアイバンクから、死後48時間以内に対を成すヒトの眼を入手した。視神経頭（付着極付き）を取り出し、抗生物質／抗真菌薬、グルタミンおよび10％ＦＢＳを補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に3時間入れた。視神経頭（ＯＮＨ）ボタンを各組織試料から回収して、微細切断鋏で4つの小片に刻んだ。ＤＭＥＭ培地中で、12.5 cm2プラスチック培養フラスコ中で外植片培養した。生育可能外植片で、1ヶ月以内に増殖を観察した。細胞が集密度90％に達したら、それらをトリプシン処理し、鑑別継代培養に付して、篩板（ＬＣ）および星状細胞集団を生じた。ゲンタマイシン、グルタミンおよび10％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で25 cm2フラスコ中でＬＣ細胞を継代培養により濃化した。このプロトコールに従って細胞を保持し、継代培養した。
【０２５１】
鑑別継代培養により得た細胞集団の同一性および集団純度を、8ウエル培養スライド上での鑑別蛍光抗体染色を用いて特性化した。細胞を10％ホルマリン溶液中で固定し、ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で3回洗浄した。ＤＰＢＳ中の2％脱脂乳で遮断後、抗体をＤＰＢＳ中の1％ＢＳＡ中で希釈して、6つのウエル中の細胞に適用した。対照として、残り2つのウエルを1％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液のみ、二次抗体のみで処置した。細胞を一次抗体とともに室温で1時間インキュベートし、次にＤＰＢＳで3回洗浄した。適切な二次抗体をＤＰＢＳ中の1％ＢＳＡ中で希釈し、各ウエルに付加して、1時間インキュベートした。ＤＰＢＳで洗浄後、スライドを水中で洗浄して、風乾し、Fluoromount（Vector Laboratories）を被せた。適切なフィルターを用いて蛍光顕微鏡下で免疫蛍光染色を観察して、一次抗体で処置されていない対照ウエルと比較した。一次抗体はすべて、別記しない限り、Sigmaから入手した。二次抗体はすべて、Molecular Probesから購入した。ＬＣ細胞を同定するために用いられた一次抗体を以下に示す：抗コラーゲンＩ、抗コラーゲンＩＶ、抗ラミニン、抗細胞フィブロネクチン、抗神経膠原繊維産生タンパク質（ＧＦＡＰ）および抗アルファ‐平滑筋アクチン。コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、細胞フィブロネクチン、アルファ平滑筋アクチンに関して陽性に染色され、そして神経膠原繊維（ＧＦＡＰ）に関して陰性に染色された場合、細胞集団はＬＣ細胞からなると確定した。この試験では、2組のヒトの眼を用いて、培養を開始した。ＬＣ細胞株＃５０６および＃５１７を、それぞれ83歳男性および17歳男性の視神経頭から確立した。ＬＣ細胞株はすべて、十分に特性化され、そして90％以上のＬＣ細胞を含有することが見出された。
【０２５２】
ＬＣ細胞の処置
50 μMカンプトテシン（Sigma）および10 ng/mlＴＮＦ‐α（Leinco Technologies）の組合せを用いて、篩板細胞にアポトーシスを誘導した。カンプトテシンおよびＴＮＦ‐αの組合せ葉、カンプトテシンまたはＴＮＦ‐α単独よりも、アポトーシス誘導においてより有効であることが判明した。
【０２５３】
ｓｉＲＮＡの構築およびトランスフェクション
ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられる小抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて、篩板細胞中でのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を特異的に抑圧した。SilencerTMｓｉＲＮＡ構築キット（Ambion Inc.）を用いて、in vitro転写により、6つのｓｉＲＮＡを生成した。ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して、4つのｓｉＲＮＡを生成した（ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４）。2つのｓｉＲＮＡを対照として用いた；キットで提供されるＧＡＰＤＨに対して向けられるｓｉＲＮＡ、ならびにアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡｓｉＲＮＡ＃１（配列番号３０）の逆配列を有したがしかしそれ自体アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを標的にしないｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃５）。メーカーのプロトコールに従って、ｓｉＲＮＡを生成した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａおよび対照ｓｉＲＮＡ標的は、以下の配列を有した：ｓｉＲＮＡ＃１5’AAAGGAATGACTTCCAGCTGA3’（配列番号８１）；ｓｉＲＮＡ＃２5’AAGATCGTCGAGATGTCTACT3’（配列番号８２）；ｓｉＲＮＡ＃３5’AAGGTCCATCTGGTTGGTATT3’（配列番号８３）；ｓｉＲＮＡ＃４5’AAGCTGGACTCCTCCTACACA3’（配列番号８４）；ｓｉＲＮＡ＃５5’AAAGTCGACCTTCAGTAAGGA3’（配列番号８５）。篩板細胞を、LipofectAMINE 2000を用いてｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。
【０２５４】
細胞集密度が40〜70％になった場合に篩板細胞をトランスフェクトし、一般的にトランスフェクションの3日前に、7500〜10,000細胞／ウエルで8ウエル培養スライド上に植えつけた。25.5 pmolのｓｉＲＮＡをＯｐｔｉ‐Ｍｅｍ（Sigma）中で最終容積21.2 μlに希釈することにより、8ウエル培養スライドのうちの1ウエルに十分なトランスフェクション培地を調製した。0.425 μlのリポフェクタミン2000を、Ｏｐｔｉ‐Ｍｅｍ（Sigma）中で最終容積21.2 μlに希釈し、そして室温で7〜10分間インキュベートした。次に希釈リポフェクタミン2000混合物を希釈ｓｉＲＮＡ混合物に付加し、室温で20〜30分間、一緒にインキュベートした。細胞を無血清培地で1回洗浄した後、135 μlの無血清培地を細胞に付加し、42.4 μlのトランスフェクション培地を被せた。細胞を、増殖小室中に4時間入れ戻した。インキュベーション後、65 μlの無血清培地＋30％ＦＢＳを細胞に付加した。ウエスタンブロット分析のために用いられるべき細胞中へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、8ウエルスライド中でのトランスフェクションと同一条件を用いて24ウエルプレート中で実施したが、但し、容積は2.3倍増大した。トランスフェクション後、篩板細胞を72時間インキュベートした後、50 μMのカンプトテシン（Sigma）および10 ng/mlのＴＮＦ‐α（Leinco Technologies）で処置して、アポトーシスを誘導した。次に細胞溶解物をウエスタンブロッティングのために収穫するか、あるいは細胞をアポトーシスに関して検査した。
【０２５５】
アポトーシス細胞の検出
アポトーシスを受けている細胞のパーセンテージを確定するために、Hoescht 33258を用いて、ＴＮＦ‐αおよびカンプトテシンで24時間処置されていたトランスフェクト化細胞を染色した。要するに、無水メタノールおよび氷酢酸の3:1混合物で細胞を固定し、次にHoescht染色液（ＰＢＳ中の0.5 μg/ml  Hoescht 33258）とともにインキュベートした。暗所で10分間のインキュベーション後、染色溶液を廃棄し、培養スライドのウエルを分離する小室を除去し、そして脱イオン水で1分間、スライドを3回洗浄した。洗浄後、2〜3滴のマクイルバイン緩衝液（0.021 Mクエン酸、0.058 MＮａ2ＨＰＯ4・7Ｈ2Ｏ；ｐＨ5.6）を細胞に付加し、カバーガラスで覆った。ＵＶフィルターを用いて蛍光顕微鏡下で、染色細胞を観察した。明るく染色されたまたは断片化した核を有する細胞を、アポトーシス性としてスコアした。最小で200細胞を、ウエル当たりで計数した。DeadEndTM蛍光定量的ＴＵＮＥＬ（Promega）も、アポトーシス細胞の独特の特徴であるＤＮＡ断片化を検出するために用いた。Hoescht染色後、培養スライドを蒸留水で手短に洗浄し、洗浄間に紙タオル上でスライドの水気を取りながら、ＰＢＳ（137 mMＮａＣｌ、2.68 mMＫＣｌ、1.47 mMＫＨ2ＰＯ4、8.1 mMＮａ2ＨＰＯ4）中に5分間、スライドを5回浸漬することによりさらに洗浄した。ＰＢＳ中の0.2％トリトンＸ‐１００中に5分間浸漬することにより、細胞を透過性にした。次に、ＰＢＳ中に5分間、スライドを2回浸漬し、洗浄間に紙タオル上でスライドの水気を取ることにより、細胞を再び洗浄した。25 μlの平衡緩衝液［200 mMカコジル酸カリウム（ｐＨ6.6）、25 mMトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ6.6）、0.2 mMジチオトレイトール、0.25 mg/mlウシ血清アルブミンおよび2.5 mM塩化コバルト］をウエル当たりで付加し、5〜10分間インキュベートした。平衡中、それぞれ平衡緩衝液、ヌクレオチド混合物［50 μMフルオレセイン‐１２‐ｄＵＴＰ、100 μMｄＡＴＰ、10 mMトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ7.6）および1 mMＥＤＴＡ］および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素（Ｔｄｔ、25 U/ μl）を45:5:1の比で混合することにより、30 μlの反応混合物を各ウエルのために調製した。平衡緩衝液中でのインキュベーション後、30 μlの反応混合物をウエル当たりで付加し、カバーガラスを載せた。37℃で1時間、暗所で反応を進行させた。2×ＳＳＣ［0.3 MＮａＣｌおよび30 mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.0）］中にスライドを浸漬し、15分間インキュベートすることにより、反応を終結させた。次に、5分間を3回、ＰＢＳ中の浸漬によりスライドを洗浄した。Kimワイプでウエル周囲をぬぐうことによりＰＢＳを除去し、１滴の封入剤（Oncogene research project, JA1750-4ML）を各ウエルに付加して、スライドにカバーガラスを被せた。Hoescht染色核を計数するために、ＵＶフィルター（ＵＶ‐Ｇ３６５、フィルター組487902）を用いて蛍光顕微鏡下で細胞を観察した。明るく染色されるかまたは断片化した核を有する任意の細胞を、アポトーシス性としてスコアした。同一視野を用いて、次に細胞をフルオレセインフィルター（グリーンＨ５４６、フィルター組48915）を用いて観察し、明緑色の蛍光を発する任意の核をアポトーシス性としてスコアした。フルオレセインフィルターを用いて計数された明緑色核の数をＵＶフィルター下で計数された核の総数で割ることにより、視野中のアポトーシス細胞のパーセンテージを算定した。最小で200細胞をウエル当たりで計数した。
【０２５６】
タンパク質抽出およびウエスタンブロット分析
ＰＢＳ（8 g/LのＮａＣｌ、0.2 g/LのＫＣｌ、1.44 g/LのＮａ2ＨＰＯ4および0.24 g/LのＫＨ2ＰＯ4）中で細胞を2回洗浄し、次に50 μlの溶解緩衝液［2％ＳＤＳ、50 mMトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ7.4）］、を付加することにより、24ウエルプレート上で増殖中の篩板細胞からウエスタン・ブロッティングのためにタンパク質を単離した。細胞溶解物を微小遠心分離管中に収集し、5分間煮沸し、そして用いる準備ができるまで、−20℃で保存した。ビシンコニン酸キット（ＢＣＡ；Sigma）を用いて、タンパク質濃度を確定した。ウエスタン・ブロッティングのために、5 μgの総タンパク質を12％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。分離タンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜に移した。次にブロッキング溶液（ＰＢＳ中5％スキムミルク粉末、0.02％アジ化ナトリウム）中で1時間、膜をインキュベートし、ＰＢＳ‐Ｔ（ＰＢＳ＋0.05％トゥイーン２０）中で15分間、3回洗浄した。膜を、4℃でＰＢＳ‐Ｔ中に一晩保存した。翌日、室温に暖めた後、1 μg/mlポリビニルアルコール中で30秒間、膜を遮断した。膜を脱イオン水中で5回すすぎ、次にＰＢＳ中の5％ミルクの溶液中で30分間遮断した。一次抗体をＰＢＳ中の5％ミルクの溶液中で30分間予備インキュベートした後、膜とともにインキュベートした。用いた一次抗体は、1:20,000での抗ｅＩＦ５Ａ１（BD Transduction Laboratories）および抗β‐アクチン（Oncogene）であった。膜をＰＢＳ‐Ｔ中で3回洗浄し、ＰＢＳ中の1％ミルク中で希釈された適切なＨＲＰ接合二次抗体とともに1時間インキュベートした。ブロットを洗浄し、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出キット（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、ペルオキシダーゼ接合結合抗体を検出した。
【０２５７】
結果
年齢83歳（＃５０６）〜17歳（＃５１７）の範囲の男性ドナーから得られた視神経頭から、2つの篩板（ＬＣ）細胞株を確立した。ヒト篩板から単離された細胞は、他の研究（Lambert et al., 2001）で観察された顕著な核を伴う同一の広範な平坦な形態を有した。他の群の特性化と一致して、ＬＣ細胞は、アルファ平滑筋アクチン（図９１ａ）に対する、ならびに多数の細胞外マトリックスタンパク質、例えば細胞フィブロネクチン（図９１ｂ）、ラミニン（図９１ｃ）、コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＶ（データは示されていない）に対する免疫反応性を示した（Clark et al., 1995；Hernandez et al., 1998；Hernandez and Yang, 2000；Lambert et al., 2001）。神経膠原繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対するＬＣ細胞の陰性免疫反応性も、前の知見（図９１ｄ）（Lambert et al., 2001）と一致して観察された。これらの知見は、視神経頭星状細胞というよりむしろＬＣ細胞であるという単離細胞の同定を支持する。
【０２５８】
ＴＮＦ‐αは緑内障経過中に重要な役割を演じると考えられるため、ＴＮＦ‐αの細胞傷害性作用に対するＬＣ細胞の感受性を調べた。集密ＬＣ細胞を、カンプトテシン、ＴＮＦ‐αまたはカンプトテシンとＴＮＦ‐αの組合せに48時間曝露した（図９２）。Hoescht染色は、ＴＮＦ‐α単独はＬＣ細胞に対して細胞傷害性でない、ということを明示した。カンプトテシンによる処置は、ＬＣ細胞の約30％細胞死を生じた。しかしながらＬＣ細胞をカンプトテシンおよびＴＮＦ‐αの両方で処置した場合、アポトーシスの相乗的増大が観察され、その処置は、48時間までにＬＣ細胞の45％の死を生じた。これらの結果は、カンプトテシンによりアポトーシスに関して初回刺激された場合、ＬＣ細胞がＴＮＦ‐αの細胞傷害性作用に応答し得る、ということを示す。
【０２５９】
ｅＩＦ５Ａ１は、細胞分裂に必要であることが既知の核・細胞質シャトルタンパク質であり、そして近年、アポトーシス中に包含されることも示唆されている。ＬＣ細胞中でのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質の発現は、カンプトテシンまたはカンプトテシン＋ＴＮＦ‐αによりアポトーシスを受けるよう誘導される。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現は、カンプトテシンによる処置時に有意に変わらなかったが、但し、おそらくわずかに低減した（図９３）。しかしながら、８および24時間のカンプトテシン＋ＴＮＦ‐α処置後に、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質の有意の上向き調節が観察された（図９３）。これらの結果は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現がＴＮＦ‐αの曝露により特異的に誘導され、そして発現はアポトーシスの誘導と相関する、ということを示す。これは、ＴＮＦ‐α受容体結合の下流のアポトーシス経路におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに関する役割を指し示す。
【０２６０】
ＬＣ細胞中でのＴＮＦ‐α誘導性アポトーシス中のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現の重要性を調べるために、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを標的にする一連の4つのｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４）（配列番号８１〜８４）を設計し、そしてin vitro転写により合成した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質発現の抑圧に際してのｓｉＲＮＡの有効性を確定するために、ＬＣ細胞株＃５０６および＃５１７を各々のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、細胞溶解物中のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質の発現を72時間後に調べた（図９４）。比較のために、ＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ＃１と同一化学組成を有するがしかしアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを認識しない対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃５）（配列番号８５）でも、細胞をトランスフェクトした。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡはすべて、両ＬＣ細胞株中でのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現を有意に抑圧し得た（図９４）。ｓｉＲＮＡ＃１の逆配列を単に融資、そして細胞標的を有さない対照ｓｉＲＮＡ＃５と違って、その標的タンパク質ＧＡＰＨの発現を抑圧し得る（データは示されていない）活性ｓｉＲＮＡであるため、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを付加的対照として用いた。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対する4つのｓｉＲＮＡもすべて、ＴＮＦ‐αおよびカンプトテシンを用いた24時間処置により誘導されるアポトーシスからトランスフェクト化ＬＣ細胞（＃５０６）を防御し得た（図９５）。細胞死を検出するためにHoescht染色を用いて、ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４）（配列番号８１〜８４）は、ＬＣ細胞のアポトーシスを、59％（ｓｉＲＮＡ＃１）（配列番号８１）、35％（ｓｉＲＮＡ＃２）（配列番号８２）、50％（ｓｉＲＮＡ＃３）（配列番号８３）および69％（ｓｉＲＮＡ＃４）（配列番号８４）低減し得ることが判明した。興味深いことに、ＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡも、ＬＣ細胞のアポトーシスを42％低減し得た（図９５）。ＧＡＰＤＨは、解糖酵素としてのその役割以外の細胞機能、例えば小脳ニューロンのアポトーシス中の提唱された機能を有することが既知である（Ishitani and Chuang, 1996；Ishitani et al., 1996a；Ishitani et al., 1996b）。同様の実験において、ｓｉＲＮＡ＃１（配列番号８１）がＴＮＦ‐αおよびカンプトテシンに応答してＬＣ株＃５１７のアポトーシスを53％低減し得たということをわれわれも実証したが、これは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡが異なる視神経頭から単離されたＬＣ細胞に関して防御性である、ということを示す（図９６）。これらの結果は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａがアポトーシス中に一機能を有し、そしてその経路における重要な中間体であって、ＬＣ細胞におけるＴＮＦ‐α誘導性アポトーシスをもたらし得る、ということを示す。
【０２６１】
ＴＮＦ‐ａおよびカンプトテシンに曝露されたＬＣ細胞が古典的アポトーシスにより死亡しつつあったということを確証するために、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰ‐ジゴキシゲニン・ニック末端ラベリング（ＴＵＮＥＬ）法を用いてin situでＤＮＡ断片化を評価した。ＬＣ細胞（＃５０６）をＴＮＦ‐αおよびカンプトテシンで24時間処置し、3日後に、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃１）（配列番号８１）または対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃５）（配列番号８５）でトランスフェクトした。細胞をさらにまたHoeschtで染色して、核の可視化を促した。対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＬＣ細胞の46％がＴＵＮＥＬ染色に対して陽性であったが、一方、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡ＃１（配列番号８１）でトランスフェクトされたＬＣ細胞の8％だけが陽性に標識され、このことは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡがアポトーシスからの80％以上の防御を提供したことを示す（図９７）。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡ＃４を用いて同様の結果を得たが、これは、対照ｓｉＲＮＡに比して、アポトーシスからの60％以上の防御を提供した（データは示されていない）。
【０２６２】
実施例１８
血液採取およびＰＢＭＣの調製
各健常ドナーから、約10 mlの血液を採取した。抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを含有する採血管中に、静脈穿刺により血液を採取した。採取24時間以内に、血液を加工処理した。
60％ＳＩＰ（9部v/vのパーコールと1部v/vの1.5 MＮａＣｌ）を、15 ml円錐管の底にクッションとして置いた。次に血液をその上層になるように入れて、血液およびパーコールクッションの混合を最小度にした。試料を30分間、最初の5分は徐々に加速し、最後の5分は徐々に減速して、全体で1000×gで遠心分離した。その結果生じた勾配の極上部の純血清を除去し、ＰＢＭＣの白色クッション（1〜2 ml）を収集し、10 mlの温ＲＰＭＩ＋15％ＦＢＳを含有する試験管に滴下した。ＰＢＭＣをペレット化し、そして計数した。
【０２６３】
時間経過全体に亘るＰＢＭＣにおけるサイトカイン産生を誘導するための刺激
ＰＢＭＣを単離し、2×105〜5×105細胞／ウエルで植え付けた。細胞をフォルボール１２‐ミリステート１３‐アセテート（ＰＭＡ；100 ng／ウエル）で処置した。72時間目に、培地を取り替えたが、いかなる刺激因子も含有していなかった。次にＰＭＡをＰＢＭＣに付加して96時間後に、リポ多糖（ＬＰＳ；100 ng／ウエル；大腸菌血清型0111から）をウエルに付加した。ＬＰＳの付加後（96時間）、ならびに図１２０に列挙したような付加後の種々の時間に、試料を収集した。両接着細胞（たいていは単球およびマクロファージ）を浮遊細胞（たいていはリンパ球）とともに収集した。サイトカイン分泌の分析のために細胞を収集するために、各ウエルからの培地を清浄微小遠心管に移し、そして13,000×gで3分間の遠心分離により、任意の破砕屑を取り除いた。その結果生じたペレットを、接着細胞とともに収集した。培地を200〜250 μlアリコートで−20℃で保存した後、分析した。細胞を37℃のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）1 mlで洗浄し、次に沸騰溶解緩衝液（50 mMトリス、ｐＨ7、2％ＳＤＳ；100 μl／ウエル）中で溶解した。細胞溶解物を煮沸し、−20℃で凍結保存した。ウエスタンブロットを図１２１に、そして対応するＥＬＩＳＡを図１２０に示す。
【０２６４】
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現を誘導するためのＰＢＭＣ刺激
ＰＢＭＣを収集し、2×105〜5×105細胞／ウエルで植え付けた。刺激剤がアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを誘導することを確定するために、ならびにそれらが相乗的に作用するか否かを観察するために、ＰＢＭＳをフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；100 ng/ml）、フォルボール１２‐ミリステート１３‐アセテート（ＰＭＡ；100 ng/ml）、リポ多糖（ＬＰＳ；100 ng/ml）または3つすべて（各々100 ng/ml）で刺激した。刺激後12および36時間に試料を収集し、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現に関して分析した（図１２３）。
【０２６５】
ＰＢＭＣのトランスフェクション
ＰＢＭＣを、それらが調製された当日にトランスフェクトした。細胞を2×105〜5×105細胞／ウエル（24ウエルプレート中でのトランスフェクションに関して150 μl／ウエル）で植え付けた。それらを、各植える中で個別に（ドナー７７、７８および７９；図１２４および１２５）、あるいは植え付け前に円錐管中ですべて一度に（ドナー８０および８４；図１２５）、トランスフェクトした。トランスフェクトされるべき細胞の各ウエルに関して、15 pmolのｓｉＲＮＡをＯｐｔｉ‐ＭＥＭ（Sigma）50 μl中に希釈した。1 μlのリポフェクタミン2000（Invitrogen）を、Ｏｐｔｉ‐Ｍｅｍ  49 μl中に希釈し、そして7〜10分間インキュベートし、希釈ｓｉＲＮＡに付加し、25分間インキュベートした。トランスフェクション培地を被せて、細胞を、37℃増殖小室中に4時間入れた。最終トランスフェクション培地は、9％血清を含有した。インキュベーション後、250 μlの無血清ＲＰＭＩ＋21％ＦＢＳを細胞に付加して、最終血清濃度を15％とした。
【０２６６】
ＰＢＭＣ後トランスフェクションにおいてサイトカイン産生を誘導するための刺激
ＰＢＭＣのトランスフェクションの72時間後に、上記のように、リポ多糖（ＬＰＳ；100 ng／ウエル；大腸菌血清型0111から）を培地500 μl中の細胞に付加した。刺激後24時間に、試料を収集した。ＬＰＳで処置された両ウエルおよびトランスフェクトされただけのウエル（即ち、刺激なし）を収集した。サイトカイン分泌の分析のために細胞を収集するために、各ウエルからの培地を清浄微小遠心管に移し、そして13,000×gで3分間の遠心分離により、任意の破砕屑を取り除いた。その結果生じたペレットを、接着細胞とともに収集した。培地を200〜250 μlアリコートで−20℃で保存した後、分析した。細胞を37℃のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）1 mlで洗浄し、次に沸騰溶解緩衝液（50 mMトリス、ｐＨ7、2％ＳＤＳ；100 μl／ウエル）中で溶解した。細胞溶解物を煮沸し、ＢＣＡタンパク質定量のために−20℃で凍結保存した。
【０２６７】
実施例１９
細胞培養
ＨＴ‐２９（ヒト結腸直腸腺癌細胞株）を、10％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ中に保持した。Ｕ９３７（細網肉腫細胞株）を、10％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中の懸濁液中で増殖させた。両細胞株を、37℃で5％ＣＯ2の加湿環境中に保持した。Ｕ９３７細胞を用いた実験のために、細胞を計数し、3×105細胞／mlに調整した2日後に、実験を開始した。実験初日に、細胞を400×gで10分間遠心分離することにより収集し、細胞ペレットを、10％ＦＢＳを含有する新鮮なＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、遠心分離を反復して、再ペレット化細胞を、ＦＢＳを含有しない新鮮なＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。細胞を計数し、2×106細胞／mlに調整した。
【０２６８】
ｓｉＲＮＡ
ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ配列に基づいてｓｉＲＮＡ配列を設計し、DharmaconＲＮＡ技法により合成した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡ（ｈ５Ａ１）標的配列は：5’NNGCUGGACUCCUCCUACACA3’（配列番号 ）であった。対応する二本鎖ｓｉＲＮＡ配列は：5’GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT3’（配列番号 ）、3’dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU5’（配列番号 ）であった。
【０２６９】
対照ｓｉＲＮＡ（ｈ対照）配列は、5’NNACACAUCCUCCUCAGGUCG3’（配列番号 ）であった。対応する二本鎖ｓｉＲＮＡ配列は：5’ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT3’（配列番号 ）、3’dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC5’（配列番号 ）であった。
【０２７０】
ＨＴ‐２９細胞のトランスフェクション
トランスフェクション前日に、ＨＴ‐２９細胞を24ウエルプレート上に105,000細胞／ウエルで植え付けた。トランスフェクトされるべき細胞の各ウエルに関して、25.5 pmolのｓｉＲＮＡをＯｐｔｉ‐ＭＥＭ（Sigma）50 μl中に希釈した。1 μlのリポフェクタミン2000（Invitrogen）を、Ｏｐｔｉ‐Ｍｅｍ  49 μl中に希釈し、そして7〜10分間インキュベートし、希釈ｓｉＲＮＡに付加し、25分間インキュベートした。トランスフェクトされるべき細胞を無血清ＲＰＭＩで1回洗浄した後、無血清ＲＰＭＩ300 μlを付加し、100 １μlのトランスフェクション培地を被せた。細胞を、増殖小室中に4時間入れ戻した。インキュベーション後、300 μlの無血清ＲＰＭＩ＋30％ＦＢＳを細胞に付加した。
【０２７１】
Ｕ９３７細胞の電気穿孔
アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａおよび対照ｓｉＲＮＡを、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭ（Sigma）中に希釈した。400 μlの細胞（800,000細胞）および100 pmolのｓｉＲＮＡを、0.4 mm電気穿孔キュベット中で混合した。ＥＣＭ８３０Electrosquare porator（BTX, San Diego, CA）を用いて300 V、10 mSec、1パルスで細胞を電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を静かに混合し、ＲＰＭＩおよび濃縮ＦＢＳを含有するウエルに付加し、最終ＦＢＳ濃度を10％とした。
【０２７２】
ＨＴ‐２９細胞の処置
Suzuki et al. 2003により開発された方法に従って、ＨＴ‐２９細胞中で、ＴＮＦ‐α産生を誘導した。トランスフェクションの48時間後に、ＨＴ‐２９細胞を、200 単位／mlのインターフェロン・ガンマ（Roche Diagnostics）で初回刺激した。インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）初回刺激の16時間後、細胞を培地で洗浄し、リポ多糖（ＬＰＳ；100 ng/ml；大腸菌血清型0111から；Sigma）を100 μg/mlで付加した。ＬＰＳ刺激の8または24時間後に、各ウエルからの培地を微小遠心管に移し、ＥＬＩＳＡによりＴＮＦαに関して検定されるまで、−20℃で保存した。細胞を37℃に加熱したリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）1 mlで洗浄し、次に沸騰溶解緩衝液（50 mMトリス、ｐＨ7、2％ＳＤＳ）中で溶解した。細胞溶解物を煮沸し、−20℃で凍結保存した。標準として用いられるウシ血清アルブミンを伴うビシンコニン酸検定（ＢＣＡ）により、細胞溶解物中のタンパク質濃度を確定した。
【０２７３】
ＩＦＮγを用いた処置により、ＨＴ‐２９細胞中でＩＬ‐８産生を誘導した。トランスフェクションの48時間後に、ＨＴ‐２９細胞を200単位／mlのＩＦＮγで処置した。処置の24時間後、各ウエルからの培地を微小遠心管に移し、液相電気化学発光（ＥＣＬ）によりＩＬ‐８に関して検定されるまで、−20℃で保存した。細胞を37℃に加熱したリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）1 mlで洗浄し、次に沸騰溶解緩衝液（50 mMトリス、ｐＨ7、2％ＳＤＳ）中で溶解した。細胞溶解物を煮沸し、−20℃で凍結保存した。標準として用いられるウシ血清アルブミンを伴うビシンコニン酸検定（ＢＣＡ）により、細胞溶解物中のタンパク質濃度を確定した。
【０２７４】
Ｕ９３７細胞中での分化の誘導
Ｕ９３７細胞を収集し、電気穿孔後、16時間に計数した。培地1 ml中の200,000細胞を、24ウエルプレートの各ウエルに付加した。フォルボール１２‐ミリステート１３‐アセテート（ＰＭＡ；100 ng/ml）を付加することにより、マクロファージ分化を刺激した。ＰＭＡ使用の48時間後、＞80％の単球が懸濁液中の細胞（単球）から付着細胞（マクロファージ）に形質転換した。48時間後、培地および任意の非接着細胞を除去し、10％ＦＢＳ（1 ml／ウエル）を含有する新鮮な培地を付加した。細胞を新鮮な培地中に24時間放置すると、静止状態になった。
【０２７５】
Ｕ９３７細胞中でサイトカイン産生を誘導するための刺激
Ｕ９３７細胞へのＰＭＡ付加の72時間後に、リポ多糖（ＬＰＳ；100 ng／ウエル；大腸菌血清型0111から）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ；100単位／ml）、またはＬＰＳおよびＩＦＮγの組合せをウエルに付加した。刺激剤の付加前（72時間）ならびに図１３１に略記されたように付加後種々の時間に、試料を収集した。サイトカイン分泌の分析のために細胞を収集するために、各ウエルからの培地を清浄微小遠心管に移し、そして13,000×gで3分間の遠心分離により、任意の破砕屑を取り除いた。培地を200〜250 μlアリコートで−20℃で保存した後、分析した。細胞を37℃のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）1 mlで洗浄し、次に沸騰溶解緩衝液（50 mMトリス、ｐＨ7、2％ＳＤＳ；75 μl／ウエル）中で溶解した。同様のウエルをプールした。細胞溶解物を煮沸し、−20℃で凍結保存した。
【０２７６】
サイトカイン定量
全培地試料を、−20℃で凍結保存した。0〜250 pgＴＮＦα／mlに関する供給された標準を用いてメーカーの使用説明書に従って、Assay DesignsからのＥＬＩＳＡキットを用いて、ＴＮＦαを定量した。Ｕ９３７実験に関しては、ＴＮＦαのための培地試料を、ＲＰＭＩ＋10％ＦＢＳで20倍（0時間、3時間ＬＰＳ）または80倍（6時間、24時間、30時間ＬＰＳ）希釈した。液相電気化学発光（ＥＣＬ）により、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐８およびＩＬ‐６を定量した。ＨＴ‐２９実験からの培地は、希釈しなかった。全サイトカイン測定結果を、総細胞タンパク質の量（mg）／ウエルに関して補正した。
【０２７７】
液相により、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１βおよびＩＬ‐６を検定した。要するに、精製モノクローナルマウス抗マウス抗ヒトＩＬ‐８、ＩＬ‐６またはＩＬ‐１β（R & D Systems）を、ビオチン（Igen, Inc., Gaithersburg, MD）で標識した。さらに、ヤギ抗ヒトＩＬ‐８、ＩＬ‐６またはＩＬ‐１β抗体（R & D）を、メーカーの使用説明書に従って、ルテニウム（Igen）で標識した。ビオチニル化抗体を希釈して、ＰＢＳ（ｐＨ7.4；0.25％ＢＳＡ、0.5％トゥイーン２０および0.01％アジ化物（ＥＣＬ緩衝液））中の最終濃度を1 mg/mLとした。検定管当たりで、25 mLのビオチニル化抗体を、激しく撹拌しながら30分間、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Dynal Corp., Lake Success, NY）の1 mg/mL溶液25mLで室温で予備インキュベートした。ＲＰＭＩまたは標準中に希釈された試験されるべき試料（25 mL）を試験管に付加し、その後、25 mLのルテニル化（ruthenylated）抗体（最終濃度1 mg/mL、ＥＣＬ緩衝液中に希釈）を付加した。次に試験管をさらに2時間振盪した。200 mL／管のＰＢＳの付加により反応をクエンチし、そしてOrigen アナライザー（Igen）を用いて化学発光の量を確定した。
【０２７８】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロッティング
標準として用いたウシ血清アルブミンを伴うビシンコニン酸検定（ＢＣＡ）により、細胞溶解物中のタンパク質濃度を確定した。5 μgの総細胞タンパク質を、10％または14％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により分離した。10％ゲルは50 kDaより大きいタンパク質（ＴＬＲ４、ＩＦＮγ、ＴＮＦ‐Ｒ１、ｉＮＯＳ）の分析のために用いられ、一方、14％ゲルはアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ（17 kDa）のために用いられた。半乾燥運搬ユニット（Bio-Rad）を用いて、運搬緩衝液（48 mMトリス、39 mMグリシン、1.3 mMＳＤＳ、ｐＨ9.2；15 V、18時間）によりゲルをポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に移した。膜をＰＢＳ‐ｔ（0.1％トゥイーン２０を含有するＰＢＳ）中5％スキムミルクで1時間遮断した。ブロッキング溶液中で一次抗体を希釈し、浸透しながら室温で全ブロットをインキュベートした。用いた一次抗体は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ（BD Biosciences；1:20,000；1時間インキュベート；アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡおよびｅＩＦ５Ａ２の両方を認識する）、ＴＬＲ４（Santa Cruz Biotechnology Inc；ＴＬＲ４（Ｈ‐８０）：ｓｃ‐10741；1:1000；2時間インキュベート）、ＩＦＮ‐γＲα（Santa Cruz Biotechnology Inc；ＩＦＮ‐γＲα（Ｃ‐２０）：ｓｃ‐700；1:1000；1時間インキュベート）、ＴＮＦ‐Ｒ１（Santa Cruz Biotechnology Inc；ＴＮＦ‐Ｒ１（Ｈ‐５）：ｓｃ‐8436；1:200；3時間インキュベート）、ｉＮＯＳ（BD Transduction Laboratories：610431；1:10,000；1時間インキュベート）およびβ‐アクチン（Oncogene；アクチン（Ａｂ‐１）；1:20,000；1時間インキュベート）であった。一次抗体インキュベーション後、ブロットをＰＢＳ‐ｔ中で5〜10分間、3回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合（ＨＲＰ）二次抗体を1％スキムミルク中に希釈し、膜とともに1時間インキュベートした。用いた二次抗体は、抗マウスＩｇＧ‐ＨＲＰ（Sigma；1:5000；アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡおよびＴＮＦ‐Ｒ１に対する）、抗ウサギＩｇＧ‐ＨＲＰ（Amersham Pharmacia Biotech；1:2500；ＴＬＲ４およびＩＦＮγ‐Ｒαに対する）、抗マウスＩｇＭ‐ＨＲＰ（Calbiochem；1:5000；アクチンに対する）であった。二次抗体インキュベーション後、ブロットをＰＢＳ‐ｔで5〜10分間、4回洗浄した。メーカーの使用説明書に従って強化化学発光検出試薬（ＥＣＬ；Amersham Pharmacia Biotech）を用いてブロットを現像し、帯域をＸ線フィルム（Fuji）上で可視化した。
【０２７９】
ＲＴ‐ＰＣＲ
ＩＦＮγに応答したトランスフェクト化ＨＴ‐２９細胞中でのＴＬＲ４  ｍＲＮＡの変化を観察するために、Medvedev et al. 2002に従って、ＲＴ‐ＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨの発現を対照として用いて、等量のｃＤＮＡが試料間で用いられたことを示した。漸増ＰＣＲ周期（20、25、30および35）を用いて、非飽和条件下で検出可能な増幅産物を生じる最適周期数を確定した。臭化エチジウム取込みによりＰＣＲ産物を検出し、アガロースゲル電気泳動により分離した。ＩＦＮγを用いてまたは用いずに6時間処置されたｓｉＲＮＡトランスフェクト化ＨＴ‐２９細胞から単離された総ｍＲＮＡのＲＴ‐ＰＣＲを用いて、ＴＬＲ４およびＧＡＰＤＨ転写体を検出した。ＨＴ‐２９細胞を、上記のようにｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を200単位／mlＩＦＮγで処置した。ＩＦＮγで処置されなかった対照細胞葉、培地交換のみを施された。接着細胞に関するメーカーのプロトコールに従って、GenElute哺乳類ＲＮＡミニプレップキット（Sigma）を用いて、総ｍＲＮＡを単離した。培地を除去し、細胞を温ＰＢＳで2回洗浄した。メーカーのプロトコールに従って、溶解緩衝液を細胞に付加し、溶解物を微小遠心管に移して、総ＲＮＡを単離した。
【０２８０】
ＴＬＲ４（NM 003266）に関するプライマー：
正5’CGGATGGCAACATTTAGAATTAGT3’（配列番号 ）
逆5’TGATTGAGACTGTAATCAAGAACC3’（配列番号 ）
予測断片サイズ：674 bp
ＧＡＰＤＨ（BC023632）に関するプライマー：
正5’CTGATGCCCCCATGTTCGTCAT3’（配列番号 ）
逆5’CCACCACCCTGTTGCTGTAG3’（配列番号 ）
予測断片サイズ：599 bp
【０２８１】
以下の条件を用いて、総ＲＮＡを逆転写した：
混合物：
ＲＮＡ                        2.5 μg
ポリ（Ｔ）プライマー          6.25 μl
ＤＥＰＣ処理水                13.75 μlに
70℃5分加熱
氷上で5分冷却
【０２８２】
付加：
5×ＡＭＶ緩衝液                5.0 μl
ｄＮＴＰ（10 mM）            2.5 μl
ＲＮアーゼ阻害薬              1.25 μl
ＡＭＶ  ＲＴ                  2.5 μl
42℃60分加熱
70℃10分加熱
【０２８３】
以下の条件を用いて、1回ＰＣＲ反応を実施した：
10×Ｔｓｇ緩衝液                2.0 μl
ｄＮＴＰ（10 mM）              0.4 μl
正プライマー（25 pmol/μl）    0.4 μl
逆プライマー（25 pmol/μl）    0.4 μl
ＭｇＣｌ2（15 mM）              2.0 μl
ｃＤＮＡ                          0.8 μl
Ｈ2Ｏ                            13.88 μl
Ｔｓｇポリメラーゼ                0.12 μl
ＴＬＲ４に関するＰＣＲ条件：
95℃に5分間加熱
95℃1分；55℃1分；72℃2分を20、25、30または35回
72℃で10分間伸長
4℃に沈漬
ＧＡＰＤＨに関するＰＣＲ条件：
95℃に5分間加熱
95℃1分；57℃1分；72℃2分を20、25、30または35回
72℃で10分間伸長
4℃に沈漬
【０２８４】
実施例２０：ＮＦκＢ検定のための材料および方法
この検定の結果は、ＩＦＮ‐γおよびＬＰＳに曝露されたＨＴ‐２９細胞アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトされる場合、ＮＦκＢｐ５０活性化およびＴＮＦ‐α産生の低減が認められる、ということを示す（図１１４参照）。
【０２８５】
培養
ＨＴ‐２９（ヒト結腸直腸腺癌細胞株）を、37℃で5％ＣＯ2の加湿環境中で、ＲＰＭＩ＋10％ＦＢＳ中に保持した。
【０２８６】
トランスフェクション
トランスフェクション前日、6ウエルプレート上に、500,000細胞／ウエルでＨＴ‐２９細胞を植え付けた。トランスフェクトされるべき細胞の各ウエルに関して、155 pmolのｓｉＲＮＡをＯｐｔｉ‐Ｍｅｍ（Sigma）240 μl中に希釈した。4.8 μlのリポフェクタミン2000（Invitrogen）を、Ｏｐｔｉ‐Ｍｅｍ  240 μlに希釈し、7〜10分間インキュベートし、希釈ｓｉＲＮＡに付加して、25分間インキュベートした。トランスフェクトされるべき細胞を無血清ＲＰＭＩで1回洗浄した後、1400 μlの無血清ＲＰＭＩを付加し、480 μlのトランスフェクション培地を被せた。細胞を、増殖小室中に4時間入れ戻した。インキュベーション後、720 μlの無血清ＲＰＭＩ＋30％ＦＢＳを細胞に付加した。トランスフェクションの24時間後に、新鮮な培地を細胞に付加した。
【０２８７】
細胞の処置
トランスフェクションの48時間後に、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ；Roche Diagnostics）で初回刺激されるべき細胞に200単位／mlのＩＦＮγを施した。残りのウエルはすべて、培地の取替えを施した。ＩＦＮ付加16時間後、細胞をＴＮＦ‐α（20 ng/ml；Leinco Technologies Inc., St. Louis, MO）またはリポ多糖（ＬＰＳ；100 ng/ml；大腸菌血清型0111から；Sigma）、あるいは非処置対照に関しては付加を伴わない培地で処置した。ＩＦＮγのみで処置されるべき細胞を、ＩＦＮγで一晩初回刺激して、16時間後に、新鮮なＩＦＮγを有する培地を施した。
【０２８８】
核抽出およびＮＦκＢ転写因子検定
種々の刺激剤による処置の1時間後に、核タンパク質を細胞から収穫し、それを用いてＮＦκＢ活性を測定した。メーカーのプロトコールに従ってTransAM 核抽出キット（Active Motif, Carlsbad, CA）を用いて、核抽出を実行した。メーカーのプロトコールに従って、核抽出物20 μgを用いて、TransAM ＮＦκＢファミリー転写因子検定キット（Active Motif, Carlsbad, CA）を用いて、ＮＦκＢのｐ５０サブユニットのＤＮＡ結合能力を測定した。
【０２８９】
実施例２１
哺乳類ベースのマウス敗血症モデルにおける敗血症の治療
2つの型のマウス群を試験に用いた。Ｂａｌｂ／ＣマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた。両試験において、48時間以内に敗血症および死を100％誘導する用量のＬＰＳをマウスに投与した。ｅＩＦ５Ａ１に対するｓｉＲＮＡ（3’-GCC UUA CUG AAG GUC GAC U-5’）が異なる時間経過で腹腔内に投与されるよう、試験を設計した。ｓｉＲＮＡの用量はすべて、50 μgであった。各試験において、5つの試験群および1つの対照群を用いた。各群は5匹のマウスで開始した。対照群は、ｓｉＲＮＡを摂取しなかった。
【０２９０】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスモデル
図１４９および１５０は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける試験の結果を示す。マウスはすべて、48時間目に致死用量のＬＰＳを摂取した。群１マウスは、0および24時間目にｓｉＲＮＡを摂取し、5匹のうち3匹が生存した。群２マウスは、0、24および48時間目にｓｉＲＮＡを摂取し、5匹のうち5匹が生存した。群３マウスは、48時間目にｓｉＲＮＡを摂取し、5匹のうち5匹が生存した。群４マウスは、50、56、64および72時間目にｓｉＲＮＡを摂取し、5匹のうち4匹が生存した。群５マウスは、48、56、64および72時間目にｓｉＲＮＡを摂取し、5匹のうち2匹が生存した。群６マウス（対照群）は、ｓｉＲＮＡを摂取せず、0匹が生存し、そして5匹すべてがＬＰＳ処置の48時間以内（4日目）に死亡した。
【０２９１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデル
図１５１および１５２は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける試験の結果を示す。マウスはすべて、48時間目に致死用量のＬＰＳを摂取した。群１マウスは、0および24時間目にｓｉＲＮＡを摂取し、5匹のうち1匹が生存した。群２マウスは、0、24および48時間目にｓｉＲＮＡを摂取し、5匹のうち2匹が生存した。群３マウスは、48時間目にｓｉＲＮＡを摂取し、5匹のうち2匹が生存した。群４マウスは、50、56、64および72時間目にｓｉＲＮＡを摂取し、5匹のうち2匹が生存した。群５マウスは、48、56、64および72時間目にｓｉＲＮＡを摂取し、5匹のうち2匹が生存した。群６マウス（対照群）は、ｓｉＲＮＡを摂取せず、0匹が生存し、そして5匹すべてがＬＰＳ処置の48時間以内（4日目）に死亡した。
【０２９２】
実施例２２
化学物質
ＤＨＳの強力な阻害薬であるＮ１‐グアニル‐１，７‐ジアミノヘプタン（ＧＣ７；Biosearch Technologies）を、50 μMの濃度で用いた。アクチノマイシンＤ（Calbiochem）は、0.5または1.0 μg/mlで用いた。
【０２９３】
細胞培養および処置
ヒト結腸腺癌細胞株ＨＴ‐２９を、細胞増殖およびｅＩＦ５Ａ１局在化試験のために用い他が、これは、Anita Antes（University of Medicine and Dentistry of New Jersey）の御厚意によるものであった。Ｈ‐２９細胞を、1 mMピルビン酸ナトリウム, 10 mMＨＥＰＥＳおよび10％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したＲＰＭＩ1640中に保持した。他の細胞株はすべて、アメリカ培養細胞コレクション（American Type Culture Collection）から入手した。
【０２９４】
ＣＣＤ112Ｃｏは、正常結腸繊維芽細胞株である。ＲＫＯは、野生型ｐ５３を含有するヒト結腸直腸癌細胞株（ＣＲＬ‐2577）である。ＲＫＯ‐Ｅ６細胞株（ＣＲＬ‐2578）は、ＲＫＯ細胞株に由来した。それは、安定的に取り込まれたヒト乳頭腫ウイルスＥ６癌細胞を含有し、したがって適切な機能性ｐ５３腫瘍抑圧遺伝子タンパク質を欠く。ＲＫＯ、ＲＫＯ‐Ｅ６および細胞株ＣＣＤ112Ｃｏを、2 mMＬ‐グルタミンを含有する変法イーグル最小必須培地、ならびに1.5 g/L重炭酸ナトリウム、0.1 mM非必須アミノ酸、1 mMピルビン酸ナトリウムを含有するよう調整され、そして10％ＦＢＳを補足されたイーグル平衡塩溶液中で増殖させた。5％ＣＯ2を含有する加湿環境中で37℃で、細胞を保持した。
【０２９５】
クローニングおよびプラスミドの構築
接着細胞に関するメーカーのプロトコールに従って、GenIlute哺乳類ＲＮＡミニプレップキット（Sigma）を用いて、ＲＫＯ細胞から単離された総ＲＮＡから、ＲＴ‐ＰＣＲによりヒトｅＩＦ５Ａ１をクローン化した。用いたプライマーを以下に示す：
正5’-CGAGTTGGAATCGAAGCCTC-3’；および逆5’-GGTTCAGAGGATCACTGCTG-3’。その結果生じた525塩基対産物をＰＧＥＭ‐Ｔ  Ｅａｓｙ（Promega）中にサブクローニングし、シーケンシングした。その結果生じたプラスミドを、以下のプライマー：正：5’-GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG-3’；および逆：5’-CCTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG-3’を用いてＰＣＲのための鋳型として用い；そしてＰＣＲ産物をｐＨＭ６（ヘマグルチニン［ＨＡ］標的化；Roche Moleculara Biochemicals）ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲ１部位中にサブクローニングして、ｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ１ベクターを生成した。以下のプライマー：正：5’-GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG-3’；および逆：5’-GCCGAATTCTCCCTCAGGCAGAGAAG-3’を用いて、ＰＣＲにより、ｅＩＦ５Ａ１のＣ末端切頭化構築物（ｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ１Δ３７）を生成した。その結果生じたＰＣＲ産物を、ｐＨＭ６ベクター中にサブクローニングした。ｐＨＭ６‐ＬａｃＺベクター（Roche Molecular Biochemicals）を用いてトランスフェクションを最適化し、そしてアポトーシスに及ぼすトランスフェクションの作用に関する対照として用いた。
【０２９６】
ノーザンブロッティング
ＲＫＯ細胞を6ウエルプレート上で集密に増殖し、1.0 μg/mlアクチノマイシンＤで0、1、4または8時間処置した。GenElute哺乳類ＲＮＡミニプレップキット（Sigma）を用いて総ｍＲＮＡを単離し、そして1.2％アガロース／ホルムアルデヒド・ゲル上で分別した。確立された方法に従って、ｅＩＦ５Ａ１の３’非翻訳領域（３’‐ＵＴＲ）と相同の32Ｐ標識化ｃＤＮＡで膜をプローブした。ノーザンブロッティングのために用いられたｅＩＦ５Ａ１  ３’‐ＵＴＲ  ｃＤＮＡを、以下のプライマーを用いて、ＲＫＯ細胞からＲＴ‐ＰＣＲによりクローン化した：
正5’-GAGGAATTCGCTGTTGCAATCAAGGC-3’
逆5’-TTTAAGCTTTGTGTCGGGGAGAGAGC-3。’
【０２９７】
プラスミドのトランスフェクションおよびアポトーシスの検出
メーカーの推奨プロトコールに従って、リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いてプラスミドＤＮＡで、ＲＫＯおよびＲＫＯ‐Ｅ６細胞を一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、ＤＮＡ断片化検出キット（Oncogene Research Products）を用いて、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰ‐ジゴキシゲニン・ニック末端ラベリング（ＴＵＮＥＬ）により、断片化ＤＮＡを含有するアポトーシス細胞を検出した。次に、フローサイトメトリーにより、または蛍光顕微鏡によって、標識細胞を分析した。フローサイトメトリー分析に関しては、収穫細胞をＰＢＳ中の4％ホルムアルデヒドで固定し、ＴＵＮＥＬにより標識し、そして488 nmアルゴンレーザー光源およびフルオレセイン検出のためのフィルターを装備したフローサイトメーター（Coulter Epics XL-MCL）で分析した。蛍光顕微鏡分析に関しては、Taylor et al. (2004)により記載された方法に従って、細胞を8ウエル培養スライド上でトランスフェクトし、4％ホルムアルデヒドで固定し、次にＴＵＮＥＬにより標識して、Hoescht 33258で染色した。
【０２９８】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
ｓｉＲＮＡはすべて、Dharmaconから入手した。ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡは以下の配列を有した：センス鎖5’-GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3’；およびアンチセンス鎖3’-dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5’。用いられた対照ｓｉＲＮＡは、ｅＩＦ５Ａ１特異的ｓｉＲＮＡの逆配列を有し、そしていかなる既知のヒト遺伝子産物との同一性も示さなかった。対照ｓｉＲＮＡは、以下の配列を有した：センス鎖5’-ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT-3’；およびアンチセンス鎖3’-dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC-5’。リポフェクタミン2000を用いてｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクトし、そして増殖試験にまたはウエスタン・ブロッティングのために用いた。
【０２９９】
ウエスタン・ブロッティング
沸騰溶解緩衝液［2％ＳＤＳ、50 mMトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ7.4）］を用いて、ウエスタン・ブロッティングのためのタンパク質を単離した。ビシンコニン酸キット（Sigma）を用いて、タンパク質濃度を確定した。ウエスタン・ブロッティングのために、12％ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上で総タンパク質5 μgを分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜に移した。用いた一次抗体は、抗ｅＩＦ５Ａ１（BD Transduction Laboratories；マウスＩｇＧ）および抗β‐アクチン（Oncogene；マウスＩｇＭ）であった（ともに5％ミルク中1:20,000の希釈で）。二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼに接合された抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ；Sigma）および抗マウスＩｇＭ  ＨＲＰ（Oncogene）であった。強化化学発光法（ＥＣＬ、Amersham Biosciences）を用いて、抗体‐タンパク質複合体を可視化した。ｅＩＦ５Ａ１の検出後、ＥＣＬプラス・ウエスタン・ブロッティング検出系により提供されるプロトコールに従ってブロットを分割し、そして抗β‐アクチン抗体で再プローブして、等負荷を確証した。
【０３００】
増殖検定
リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いて96ウエルプレート上で、ＨＴ‐２９細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＸＴＴ細胞増殖キット（Roche Applied Science）で、増殖中細胞の代謝活性を測定した。ＢｒｄＵ細胞増殖キット（Roche Applied Science）を用いて、メーカーのプロトコールに従って、ＤＮＡ合成を測定した。
【０３０１】
間接的免疫蛍光
ＨＴ‐２９細胞を、ポリＬ‐リシン被覆カバーガラス上で培養した。亜集密細胞を、200単位のインターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ‐γ、Roche Applied Science）とともに16時間、その後、ＴＮＦ‐α（100 ng/ml；Leinco Technologies）とともに10分から8時間までの種々の時間、インキュベートした。あるいは細胞を、30分から16時間までの漸増長の時間、1.0 μg/mlのアクチノマイシンＤで処置した。処置細胞を3％ホルムアルデヒド（無メタノール；Polysciences Inc.）で20分間固定し、ＰＢＳで5分間、2回洗浄し、100 mMグリシンを含有するＰＢＳで5分間、1回洗浄して、ＰＢＳ中の0.2％トリトンＸ‐１００で4分間、透過性にした。次に、標準プロトコールを用いて、免疫蛍光に関して細胞を標識した。一次抗体は、抗ｅＩＦ５Ａ１（BD Transduction Laboratories；マウスＩｇＧ）であった（1:250の希釈で1時間インキュベート）。二次抗体は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８（Molecular Probes）であった（1:200の希釈で1時間使用）。抗体標識後、核をHoescht  33258で染色し、標識化細胞を蛍光顕微鏡により観察した。
【０３０２】
ヒプシン修飾の検出
10％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に、ＣＯＳ‐７細胞を保持した。ＣＯＳ‐７細胞を、Ｔ‐２５フラスコ中で集密度90〜95％に培養した。0.25％トリプシン‐ＥＤＴＡ（37℃で3分間）で剥離後、ＣＯＳ‐７細胞を収穫し、10％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中に希釈して、1000 rpmで5分間遠心分離した。ペレットを1 mlＤＭＥＭ中に再懸濁し、そして総細胞数を血球計算器で計数した。細胞をＤＭＥＭで1.5×106細胞／mlの濃度に希釈し、そして希釈細胞650 μLを電気穿孔のために用いた。プラスミドＤＮＡ（ｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ１）15 μgを50 μLのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ（Gibco）中に希釈し、650 μLの希釈ＣＯＳ‐７細胞に付加して、キュベットに移した。Ｔ８２０ElectroSquarePoratorを、以下の条件で用いて、細胞を電気穿孔した：
ｉ．      モード：高電圧モード（ＨＶ）、99 μsec；
ｉｉ．    電圧：1.5 kV；
ｉｉｉ．  パルス長：90 μsec；
ｉｖ．    パルス数：1または2
【０３０３】
電気穿孔後、細胞をキュベットから6ウエルのうちの1ウエルに移して、これに、各ウエルに関して16％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ1.2 mlを負荷し、37℃でインキュベートした。トランスフェクションの6時間後、10％ＦＢＳおよび50 μCi［3Ｈ］スペルミジンを含有するＤＭＥＭ  100 μLを、各ウエルに付加した。電気穿孔の48時間後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、氷上に載せた。200 μLの冷溶解緩衝液［150 mMＮａＣｌ、1％ＮＰ４０、50 mMトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ8.0）、プロテアーゼ阻害剤カクテル］を各ウエルに付加し、氷上で30分間、振盪器でインキュベートした。細胞をプレートから掻き取り、遠心管に移して、4℃で10分間、13,000 rpmで遠心分離した。溶解物を新しい試験管に移し、抗ＨＡ抗体（Roche Applied Science）20 μlを付加した。混合物を、回転しながら、4℃で2時間インキュベートした。50 μlのプロテインＡアガロース（Roche Applied Science）を付加し、混合物を4℃で1時間、ローター上でインキュベートし、次に4℃で15秒間、13000 rpmで遠心分離した。上清を除去し、800 μｌの冷溶解緩衝液をビーズに付加して、掻き混ぜて再懸濁した。ビーズをさらに2回洗浄し、次に80 μlの1×ＳＤＳ  ＰＡＧＥ負荷緩衝液中に再懸濁した。ビーズを85℃で10分間加熱し、13000 rpmで15秒間遠心分離した。上清を15％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。膜をAmplifyTM蛍光写真試薬（Amersham）中で30分間インキュベートして、3Ｈに関する検出効率を増大し、次に−80℃で10日間Hyperfilm（Amersham）に露出した後、現像した。次に膜を、抗ＨＡ（Roche Applied Science）および抗ｅＩＦ５Ａ１（BD Transduction Laboratories）抗体とともにウエスタン・ブロッティングのために用いた。
【０３０４】
ウエスタン・ブロッティング
ＰＢＳ（8 g/LのＮａＣｌ、0.2 g/LのＫＣｌ、1.44 g/LのＮａ2ＨＰＯ4および0.24 g/LのＫＨ2ＰＯ4）中で細胞を2回洗浄し、次に50 μlの沸騰溶解緩衝液［2％ＳＤＳ、50 mMトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ7.4）］を付加することにより、24ウエルプレート上で増殖中の正常結腸繊維芽細胞から、ウエスタン・ブロッティングのためにタンパク質を単離した。細胞溶解物を微小遠心分離管中に収集し、5分間煮沸して、−20℃で保存した。ビシンコニン酸キット（ＢＣＡ；Sigma）を用いて、タンパク質濃度を確定した。ウエスタン・ブロッティングのために、12％ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上で総タンパク質5 μgを分離した。分離タンパク質を、ポリビニリデンジフルオリド膜に移した。用いた一次抗体は、抗ｅＩＦ５Ａ１（BD Transduction Laboratories；マウスＩｇＧ）および抗ＨＡ（Roche Applied Science）であった（それぞれ5％ミルク中1:20,000または1:5000の希釈で）。膜をＰＢＳ‐Ｔ中で3会洗浄し、そして適切なＨＲＰ接合二次抗体（ＰＢＳ中の1％ミルク中に1:5000希釈）とともに1時間インキュベートした。ＥＣＬプラスウエスタン・ブロッティング検出キット（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、抗体‐結合タンパク質を検出した。
【０３０５】
実施例２３
ｅＩＦ５Ａ１は全哺乳類細胞中の保存タンパク質であり、細胞生存において一役を演じるため、in vivo試験前に、in vitroでのｅＩＦ５Ａ１の構成的発現を低減するｓｉＲＮＡの有効性を確立する必要があった（実施例２３参照）。Ｌ９２９を、24ウエルプレート上に植え付けた。翌日、細胞をｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡまたは対照スクランブルシアルな（ＣｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、抗ｅＩＦ５Ａ抗体を用いてウエスタン・ブロッティングにより、細胞溶解物を検定した。ｅＩＦ５Ａタンパク質の構成的発現の特異的抑制は、ネズミｅＩＦ５Ａに対するｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクション後に達成されたが、しかしＣｓｉＲＮＡでは達成されなかった。
【０３０６】
全身性炎症は胸腺のアポトーシスを生じるため、胸腺細胞アポトーシスの誘導に際しての鼻内ＬＰＳの作用を試験した。マウスは鼻内的にＬＰＳを摂取し、そして24時間後、非処置またはビヒクル処置マウスにおける数と比較して、小数の胸腺細胞を示した。ＬＰＳ投与の48〜72時間後には、胸腺細胞の数はベースラインレベルに戻った。胸腺細胞数の低減はアポトーシスによるものでありえるため、アネキシン‐ＶおよびＰＩ分析により測定した場合の胸腺細胞の初期および後期アポトーシスを確定した。
【０３０７】
ピーク胸腺細胞アポトーシスはＬＰＳ後24時間で観察され、そして48〜72時間で生理学的速度のアポトーシスに戻った。この観察は、ＬＰＳで処置されたマウスにおける胸腺に起こった萎縮は胸腺アポトーシスのためであった、という概念を支持する。胸腺細胞数の同様の低減、ならびにＰＩおよびアネキシン‐Ｖ増大は、静脈内ｃｏｎＡによる全身性炎症のモデルにおいて報告された。
【０３０８】
鼻内ｓｉＲＮＡ投与は、ＬＰＳ誘導性胸腺細胞アポトーシスを防止した。ピーク胸腺細胞アポトーシスは鼻内ＬＰＳ処置後24時間目に観察されたため、この時点でのＬＰＳ誘導性胸腺細胞アポトーシスに及ぼすｅＩＦ５Ａに対するｓｉＲＮＡの役割を、われわれは研究した。ｓｉＲＮＡ  ｅＩＦ５Ａの投与は、ビヒクル処置対照マウスにおける胸腺細胞数もアポトーシス事象も有意に変えなかった。しかしながらＬＰＳ前のｓｉＲＮＡ  ｅＩＦ５Ａの投与は、胸腺細胞萎縮およびアポトーシスの誘導からマウスを防御したが、一方、ＣｓｉＲＮＡは有意の作用を示さなかった。
【０３０９】
細胞培養
2 mMのＬ‐グルタミン、10％のウシ胎仔血清、ならびに1.5 g/L重炭酸ナトリウム、0.1 mM非必須アミノ酸および1.0 mMのピルビン酸ナトリウムを含有するよう調整されたアールＢＳＳを補足されたイーグル最小必須培地（イーグル）中に、Ｌ９２９を保持した（培地構成成分はすべて、Sigma-Aldrich, St. Louis, MOから購入した）。1:5の継代培養比を用いて、週2回、Ｌ９２９細胞を継代培養した。
【０３１０】
ｓｉＲＮＡ
ヒトｅＩＦ‐５Ａ転写体（寄託番号ＮＭ‐001970）中のｓｉＲＮＡに関する標的配列を、Ambion（htto://www.ambion.com/techlib/tb/tb506.html）により示唆された設計ガイドラインを用いて同定した。Ｌ９２９細胞においてウエスタン・ブロッティングによりｅＩＦ５Ａ抑圧を実証するために用いられるｓｉＲＮＡを、サイレンサーTMｓｉＲＮＡ構築キット（Ambion Inc.）を用いて、in vitro転写により生成した。in vivoでの使用のために、Dharmacon, Lafayette, COにより、同一配列を有するｓｉＲＮＡが合成された。ｅＩＦ５Ａおよび対照ｓｉＲＮＡの配列を、以下に示す：それぞれ、5’CGGAAUGACUUCCAGCUGAdTdT3’および5’AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT3’。
【０３１１】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよびウエスタン・ブロッティング
前記と同様に、リポフェクタミン2000（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad、 CA）を用いて、150 nMｓｉＲＮＡでＬ９２９細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、細胞溶解物をウエスタン・ブロッティングのために収集した。熱溶解緩衝液［2％ＳＤＳ、50 mMのトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ7.4）］中にタンパク質を収穫し、5分間煮沸して、−20℃で保存した。ビシンコニン酸キット（ＢＣＡ；Sigma）を用いて、タンパク質濃度を確定した。ウエスタン・ブロッティングのために、12％ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上で総タンパク質5 μgを分別した。分離タンパク質を、ポリビニリデンジフルオリド膜に移した。用いた一次抗体は、抗ｅＩＦ５Ａ１（BD Transduction Laboratories；マウスＩｇＧ）および抗１３‐アクチン（Oncogene；マウスＩｇＭ）であった（各々、5％粉末スキムミルク中1:20,000の希釈で）。ＥＣＬプラスウエスタン・ブロッティング検出キット（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、抗体‐結合タンパク質を検出した。結合抗体を電気化学発光により検出し、Ｘ線フィルムに露出した。ｅＩＦ５Ａに関する検出後、ＥＣＬプラスウエスタン・ブロッティング検出系により提示されるプロトコールに従って、ブロットを分割し、アクチン抗体で再ブロットして、等負荷を確証した。
【０３１２】
動物および処置
8週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Jackson Laboratories, Bar Harbor, MEから購入）を用いた。マウスを、無菌条件下で保持した。プロトコールは、University of Colorado Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committeesにより承認された。小ピペットを用いて軽く麻酔されたマウスの鼻孔上に載せることにより、75 μgのＬＰＳ（大腸菌Ｋ‐２３４、Sigma）を含有する食塩水50 μlを鼻内投与した。対照マウスは、等量のＰＢＳを鼻内投与されるか（ビヒクル）、あるいは非処置であった。いくつかの実験において、ＬＰＳ滴注の48時間前に、鼻内に用いられる50 μgのｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡで、マウスを前処置した。下記のように、ＬＰＳ後の種々の時間に胸腺を切除し、そして胸腺細胞を単離した。
【０３１３】
Ｔ細胞単離およびアポトーシスの検出
100 μM細胞濾し器（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）を用いて、新たにそして前記のように、胸腺細胞を単離した。完全細胞培地（10％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、2 mMのＬ‐グルタミン、100 IU/mlペニシリンおよび100 μg/mlストレプトマイシンを補足されたＲＰＭＩ1640、Invitrogen）中に細胞を保持した。胸腺細胞を1回洗浄し、光学顕微鏡を用いて細胞を計数した。単離胸腺細胞を洗浄し、190 μlの結合緩衝液（0.1 MＨｅｐｅｓ／ＮａＯＨ（ｐＨ7.4）、1.4 mMＮａＣｌ、25 mMＣａＣｌ2）中に懸濁した。細胞を、10 μlのアネキシン‐Ｖおよび5 μlのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Pharmingen, San Diego, CA）とともに室温で10分間インキュベートし、フローサイトメトリーにより分析した。
【０３１４】
統計学的分析
データは、平均±ＳＥＭとして表わす。階乗ＡＮＯＶＡにより、処置および対照群間の差の統計学的有意を確定した。ＸＬＳｔａｔソフトウエア（Addinsoft, Brooklyn, NY, USA）を用いて、統計学的分析を実施した。
【０３１５】
実施例２４
マウス‐ＶＥＧＦ確定のための方法
実施例２５に記載するように各マウスからマウス肺を採取し、−70℃で凍結した。肺組織の一部を切除し、液体Ｎ2中で乳鉢と乳棒を用いて粉砕した。肺組織の微細粉末を清浄試験管に移して、1％ＮＰ‐４０およびプロテアーゼ阻害薬を含有する1×ＴＢＳ緩衝液中に再懸濁した。撹拌後、肺組織懸濁液を、4℃で15分間、13,000×gで遠心分離した。マウス肺タンパク質を含有する上清を新規の試験管に移して、−70℃で保存した。標準としてＢＳＡを用いてブラッドフォード法により、試料中のタンパク質の濃度を確定した。
R & D Systems Inc.（Minneapolis, MN, USA）により提供されたＥＬＩＳＡキット（カタログ番号 ＭＭＶ00）を用いて、マウス‐ＶＥＧＦを確定した。要するに、50 μlの検定希釈剤ＲＤ１Ｎ中のタンパク質50 μgを各ウエル中で試験し、各試料を二重反復実験した。メーカーにより提供された標準手法に従って、検定を実行した。
【０３１６】
実施例２５
肺癌試験
細胞株およびマウス：
Ｂ１６Ｆ１０ネズミ黒色腫細胞をATCCから購入し、ＤＭＥＭ‐10％ＦＢＳ中で培養した。細胞単一層をトリプシン処理し、ＭＥＭ‐10％ＦＢＳで中和した。細胞をＰＢＳで2回洗浄し、トリパンブルー染色により生存度に関して確定した。Ｂ１６Ｆ１０細胞を、ＰＢＳ中で1×106生育可能細胞／mlに希釈した。200 ulの細胞を、尾静脈を介して各マウスに注射した。
Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣＲＬマウスは、5〜7週齢で、Charles River, Quebec, Canadaから購入した。
【０３１７】
ｅＩＦ５Ａ１ベクターの構築：
ＣｐＧジヌクレオチドを欠くｐＣｐＧ‐ｌａｃＺベクターを、InvivoGen, San Diego, USAから購入した。ｅＩＦ５Ａ１およびｅＩＦ５Ａ１突然変異体をｐＣｐＧ‐ｌａｃＺベクター中にサブクローニングするために、ｐＣｐＧ‐ｌａｃＺプラスミドＤＮＡをＮｃｏＩおよびＮｈｅＩで消化し、ｌａｃＺ遺伝子コード配列を有さない3.1 kbのｐＣｐＧベクター主鎖を単離し、そしてプライマーｅＩＦ５Ａ１for：5’-GCTCCATGGCAGATGATTTGGACTTCG-3’およびｅＩＦ５Ａ１rev：5’-CGCGCTAGCCAGTTATTTTGCCATCGCC-3’を用いて、ＰＣＲ増幅ｅＩＦ５Ａ１またはｅＩＦ５Ａ１突然変異体と結紮した。構築されたｐＣｐＧ‐ｅＩＦ５Ａ１およびｐＣｐＧ‐ｅＩＦ５Ａ１突然変異体を、25 μg/mlのゼオシンを含有するＬＢまたは２ＸＹＴ培地中で培養された大腸菌ＧＴ115中で増幅した。プライマーＨＡ‐５Ａ１for：5’-GCTCCATGGATGTACCCATCGACGTCCC-3’およびｅＩＦ５Ａ１revを用いて、同一戦略を用いて、ｐＣｐＧ‐ＨＡ‐ｅＩＦ５Ａ１を構築した。
QIAGEN Endofree Plasmid Gigaキットにより、プラスミドを抽出し、精製した。260 nmでのＵＶ吸収およびアガロースゲル電気泳動により、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０３１８】
尾静脈注射：
2、4、7、11、16、21、26、31日目に、群３〜８の各マウスには1×ＰＢＳ中のプラスミドＤＮＡ（体重に基づいて約200 μl）を、そして群１〜２の各マウスには1×ＰＢＳを注射した。プラスミド濃度は、2×（6.6 mg/kg）に関しては660 ng/μl、1×（3.3 mg/kg）に関しては330 ng/μlおよび0.1×（0.33 mg/kg）に関しては33 ng/μlであった。
【０３１９】
体重および肺重量：
尾静脈注射前または月および金曜日毎に、体重を測定した。病的状態（嗜眠性、呼吸窮迫）に達したら、マウスをＣＯ2で安楽死させて、肺を取り出し、計量し、写真撮影して、凍結し、−70℃で保存した。
哺乳類ＤＮＡは、低頻度のシチジン‐ホスフェート‐グアノシン（ＣｐＧ）ジヌクレオチド（これは通常はメチル化される）を含有する、という点で細菌ＤＮＡと異なる。一方、細菌ＤＮＡは、高頻度の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有し、これは、特定配列状況で存在する場合、脊椎動物免疫系を刺激し得る。細菌ＤＮＡ中の非メチル化ＣｐＧは、トール様受容体（ＴＬＲ）９により認識され、そして前炎症性サイトカイン、例えばＩＬ‐６およびＩＬ‐１２１，２の産生を生じるシグナル伝達カスケードを開始する。プラスミドは大腸菌中で産生されるため、プラスミド中に存在する任意のＣｐＧモチーフはメチル化されないままであり、そしてin vivoで導入される場合、おそらくは免疫刺激性である。免疫刺激性ＣｐＧは、in vivoでの導入遺伝子発現の急速な減少をもたらすことも示されている。伝統的遺伝子療法ベクターの別の限界は、in vivoで2〜3週間以内のサイトメガロウイルス初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）の転写活性の損失であり、したがって反復投与および持続性導入遺伝子発現のためのその使用を限定する。
【０３２０】
伝統的ＤＮＡプラスミド遺伝子療法の障害物のいくつかを回避するために、ＣｐＧジヌクレオチドを完全に欠いているｐＣｐＧと呼ばれるInvivogenからのプラスミドを用いることを、われわれは選択した。当該ベクターは、広範に用いられるＣＭＶプロモーターの代わりに、強健な細胞プロモーター（マウスＣＭＶエンハンサーを伴うヒト延長因子１アルファコアプロモーター）も使用し、これは、ＣｐＧ低減主鎖の状況で、in vivoでの導入遺伝子発現の持続期間を増大し、ならびにプラスミドＤＮＡに対する炎症性応答を低減するはずである。対照プラスミドＣｐＧ‐ＬａＣＺは、ＣｐＧジヌクレオチドを完全に欠いており、一方、ｅＩＦ５Ａ１を含有するベクターは、ｅＩＦ５Ａ  ｃＤＮＡ中に14のＣｐＧジヌクレオチドを有する（免疫刺激性であり得るしまたはそうでないこともある）。
【０３２１】
参考文献
【化１】
2008522591.tif 000002
【化２】
2008522591.tif 000003
【化３】
2008522591.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０３２２】
【図１】図１は、ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの３’末端のヌクレオチド配列（配列番号１１）および誘導アミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図２】図２は、ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｃＤＮＡの５’末端のヌクレオチド配列（配列番号１５）および誘導アミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【図３】図３は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ全長ｃＤＮＡ（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す。アミノ酸配列は、配列番号２で示される。
【図４】図４は、ラットアポトーシス特異的ＤＨＳ  ｃＤＮＡの３’末端のヌクレオチド配列（配列番号６）および誘導アミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図５】図５は、ヒトｅＩＦ‐５Ａのヌクレオチド配列（配列番号３）（寄託番号BC000751またはNM 001970、配列番号３）を伴うラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｃＤＮＡの全長ヌクレオチド配列（配列番号２０）のアラインメントである。
【図６】図６は、ヒトｅＩＦ‐５Ａのヌクレオチド配列（配列番号４）（寄託番号NM 020390、配列番号４）を伴うラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｃＤＮＡの全長ヌクレオチド配列（配列番号２０）のアラインメントである。
【図７】図７は、マウスｅＩＦ‐５Ａのヌクレオチド配列（寄託番号BC003889）を伴うラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｃＤＮＡの全長ヌクレオチド配列（配列番号２０）のアラインメントである。マウスヌクレオチド配列（寄託番号BC003889）は、配列番号５である。
【図８】図８は、ヒトｅＩＦ‐５Ａの誘導アミノ酸配列（配列番号２１）（寄託番号BC000751またはNM 001970）を伴うラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの誘導全長アミノ酸配列（配列番号２）のアラインメントである。
【図９】図９は、ヒトｅＩＦ‐５Ａの誘導アミノ酸配列（配列番号２２）（寄託番号NM 020390）を伴うラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの誘導全長アミノ酸配列（配列番号２）のアラインメントである。
【図１０】図１０は、マウスｅＩＦ‐５Ａの誘導アミノ酸配列（配列番号２３）（寄託番号BC003889）を伴うラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの誘導全長アミノ酸配列（配列番号２）のアラインメントである。
【０３２３】
【図１１】図１１は、ヒトＤＨＳのヌクレオチド配列（配列番号８）（寄託番号BC000333、配列番号８）を伴うラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳ  ｃＤＮＡの部分長ヌクレオチド配列（配列番号６の残基１〜４５３）のアラインメントである。
【図１２】図１２は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｃＤＮＡの32Ｐ‐ｄＣＴＰ標識３’末端でプローブされた全ＲＮＡのノーザンブロット（上部）および臭化エチジウム染色ゲル（底部）である。
【図１３】図１３は、ラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳ  ｃＤＮＡの32Ｐ‐ｄＣＴＰ標識３’末端でプローブされた全ＲＮＡのノーザンブロット（上部）および臭化エチジウム染色ゲル（底部）である。
【図１４】図１４は、ＰＧＦ‐２αを注射後に過排卵ラット黄体におけるアポトーシスの程度を検査したＤＮＡラダーリング実験を示す。
【図１５】図１５は、ＰＧＦ  Ｆ‐２αによるラットの処置後のＤＮＡラダーリングを示しているアポトーシス中ラット黄体から単離されるゲノムＤＮＡのアガロースゲルである。
【図１６】図１６は、ＰＧＦ‐２αへの曝露前にスペルミジンで処置したラットにおいて、過排卵ラット黄体の分散細胞におけるアポトーシスの程度を検査したＤＮＡラダーリング実験を示す。
【図１７】図１７は、スペルミジンおよび／またはＰＧＦ‐２αで処置したラットにおいて、過排卵ラット黄体におけるアポトーシスの程度を検査したＤＮＡラダーリング実験を示す。
【図１８】図１８は、32Ｐ‐ｄＣＴＰ標識部分長ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｃＤＮＡでプローブされたラットゲノムＤＮＡのサザンブロットである。
【図１９】図１９は、ｐＨＭ６、哺乳類エピトープタグ発現ベクター（Roche Molecular Biochemicals）を示す。
【図２０】図２０は、ラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳ  ｃＤＮＡの32Ｐ‐ｄＣＴＰ標識３‘非翻訳領域でプローブされた血清の抜き取りによるアポトーシスの誘導後のＣＯＳ‐７細胞から単離された全ＲＮＡのノーザンブロット（上部）および臭化エチジウム染色ゲル（底部）である。
【０３２４】
【図２１】図２１は、ＣＯＳ‐７細胞の一過性トランスフェクションのための手順を示すフローチャートである。
【図２２】図２２は、ｐＨＭ６によるトランスフェクション後のＣＯＳ‐７細胞中での外来タンパク質の一過性発現のウエスタンブロットである。
【図２３】図２３は、ニトロプルシッドナトリウムを用いた処置による正常繊維芽細胞におけるアポトーシスの誘導がアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを上向き調節することを示す。
【図２４】図２４は、ヒトｅＩＦ５Ａ２の配列（配列番号２２）（Genbank寄託番号XM 113401）を伴うＲＫＯ細胞から単離されたヒトｅＩＦ５Ａ２のアラインメント（配列番号２４）である。コンセンサス配列は、配列番号２８で示される。
【図２５】図２５は、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの配列（配列番号２９）および本発明の5つのｓｉＲＮＡの配列（配列番号３０、３１、３２、３３および３４）を示す。
【図２６】図２６は、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの配列（配列番号２９）および本発明の3つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（出現順に、それぞれ配列番号３５、３７および３９）を示す。
【図２７】図２７は、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して標的化される3つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（出現順に、それぞれ配列番号２５〜２７）の結合一を示す。全長ヌクレオチド配列は、配列番号１９である。
【図２８Ａ】図２８ａおよびｂは、ヒト増殖性ｅＩＦ‐５Ａに対するヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのヌクレオチドアラインメント（出現順に、それぞれ配列番号４１および４２）およびアミノ酸アラインメント（出現順に、それぞれ配列番号４３および２２）を示す。
【図２８Ｂ】図２８ａおよびｂは、ヒト増殖性ｅＩＦ‐５Ａに対するヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａのヌクレオチドアラインメント（出現順に、それぞれ配列番号４１および４２）およびアミノ酸アラインメント（出現順に、それぞれ配列番号４３および２２）を示す。
【図２９Ａ】図２９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡの設計図を示す。ｓｉＲＮＡは、配列番号４５、４８、５１、５４および５６を有する。全長ヌクレオチド配列は、配列番号２９で示される。
【図２９Ｂ】図２９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡの設計図を示す。ｓｉＲＮＡは、配列番号４５、４８、５１、５４および５６を有する。全長ヌクレオチド配列は、配列番号２９で示される。
【図３０】図３０は、ｅＩＦ５Ａ１発現が遺伝毒性ストレスにより増大されることを示す。図３０Ａは正常結腸繊維芽細胞におけるｅＩＦ５Ａ１発現のノーザンブロット分析を提示する。  図３０Ｂは正常結腸繊維芽細胞から単離される細胞溶解物のウエスタンブロットを提示する。
【図３１Ａ】図３１は、ｅＩＦ５Ａ１が細胞増殖のために必要とされないことを示す。
【図３１Ｂ】図３１は、ｅＩＦ５Ａ１が細胞増殖のために必要とされないことを示す。
【図３２】図３２は、ｅＩＦ５Ａ１機能および調節のモデルである。健常細胞中では、ｅＩＦ５Ａ１は、ＤＨＳによりヒプシン化され、そして細胞質中に局在化される。ヒプシン化ｅＩＦ５Ａ１は、何らかの未知の細胞質機能により細胞増殖を支持し得る。遺伝毒性ストレスまたは死受容体活性化は核中へのｅＩＦ５Ａ１の転位を刺激し、そこでそれはアポトーシス性細胞死の誘導または実行に関与する。遺伝毒性ストレスにより誘導されるアポトーシスの事象では、核ｅＩＦ５Ａ１は、おそらくはそのｍＲＮＡの核輸出を調節することにより、ｐ５３の発現を調節するよう機能し得る。
【０３２５】
【図３３】図３３は、ＨＡタグ化ｅＩＦ５Ａ１１がin vitroでヒプシン化されないことを示す。
【図３４】図３４は、ＸＴＴ細胞増殖検定の結果を示す。結果は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ（ｅＩＦ‐５Ａ１）に対するｓｉＲＮＡが細胞分裂を抑制しない、ということを示す。細胞増殖ｅＩＦ‐５Ａ（ｅＩＦ‐５Ａ２）に対して向けられるｓｉＲＮＡは、細胞分裂を抑制する。
【図３５】図３５は、炎症および細胞アポトーシスに関与する種々のスキームを示す。
【図３６】図３６〜３８は、一過性トランスフェクション後にＲＫＯおよびＲＫＯ‐Ｅ６細胞に生じるアポトーシスのパーセンテージを示すグラフである。
【図３７】図３６〜３８は、一過性トランスフェクション後にＲＫＯおよびＲＫＯ‐Ｅ６細胞に生じるアポトーシスのパーセンテージを示すグラフである。
【図３８】図３６〜３８は、一過性トランスフェクション後にＲＫＯおよびＲＫＯ‐Ｅ６細胞に生じるアポトーシスのパーセンテージを示すグラフである。
【図３９】図３９は、一過性トランスフェクション後のＲＫＯ細胞アポトーシスのフローサイトメトリー分析の結果を提示する。
【図４０】図４０は、ＲＫＯ細胞をアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ（ｅＩＦ‐５  １）ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、その後アクチノマイシンＤ（アポトーシスを受けるよう細胞を誘導した）で処置した実験の結果を示す。
【図４１】図４１は、0.25 μg/mlのアクチノマイシンＤで0、3、7、24および48時間処置したＲＫＯ細胞から抽出されたタンパク質のウエスタンブロットを提示する。
【図４２】図４２は、（アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの）アンチセンスオリゴ１、２および３（それぞれ配列番号３５、３７および３９）で処置された後にＲＫＯ細胞により産生された細胞のレベルを示す。
【０３２６】
【図４３Ａ−Ｂ】図４３は、ｅＩＦ５Ａ１がアクチノマイシンＤに応答するｐ５３の発現を調節することを示す。ＲＫＯ細胞を、対照ｓｉＲＮＡまたはｅＩＦ５Ａ１に対して向けられるｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後に、0.5 μg/mlのアクチノマイシンＤで0、4、8または24時間、細胞を処置した。Ａ）ｅＩＦ５Ａ１、ｐ５３またはβ‐アクチンに対する抗体でブロットした細胞溶解物のウエスタンブロット。Ｂ）対応するアクチン帯域に対して正規化されたウエスタンブロットにおけるｐ５３の相対強度のプロット。ｐ５３／アクチン強度比を0時間対照に関して得られた比に対して正規化し、これを値1に設定した。値は、ｎ＝3に関して平均＋ＳＥを表す。星印（*）は、対を成すスチューデントｔ検定により対応する対照値とは有意に異なるとみなされる値を意味する（ｐ＜0.05）。
【図４４】図４４は、ヒトｅＩＦ５Ａ１の過剰発現がアポトーシスを誘導することを示す。ＲＫＯ細胞を、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺまたはｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞を固定し、ＴＵＮＥＬ法を用いて標識して、アポトーシス細胞の特徴を示すＤＮＡ断片化を検出した。フローサイトメトリー分析により、アポトーシス細胞の数を定量した。値は、平均＋ＳＥ（ｎ＝3）である。星印（*）は、対を成すスチューデントｔ検定による有意差を意味する（ｐ＜0.01）。
【０３２７】
【図４５Ａ−Ｂ】図４５は、ヒトｅＩＦ５Ａ１の過剰発現がｐ５３と無関係にアポトーシスを誘導する、ということを示す。ＲＫＯ細胞（Ａ）またはＲＫＯＥ６細胞（Ｂ）を、ｐＨＭ６‐ＬａｃＺ、ｐＨＭ６  ｅＩＦ５Ａ１またはｐＨＭ６‐ｅＩＦ５Ａ１Δ３７（Ｃ末端の37アミノ酸切頭化）でトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞を固定し、ＴＵＮＥＬ法を用いて標識した。核をHoescht 33258で染色し、標識化細胞を蛍光顕微鏡により検査した。細胞染色明緑色を、アポトーシス性であるとスコアした。Hoescht染色核を用いて、総細胞数を確定した。値は、平均＋ＳＥ（ｎ＝4（Ａ）またはｎ＝3（Ｂ））である。星印（*）は、対を成すスチューデントｔ検定による対照（ｐＨＭ６‐ＬａｃＺ）からの有意差を意味する（ｐ＜0.01）。
【図４６】図４６は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のカスパーゼ活性増大により反映されるようなアポトーシス増強を示す。
【図４７】図４７は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のＤＮＡ断片化増大により反映されるようなアポトーシス増強を示す。
【図４８】図４８は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合の核断片化増大により反映されるようなアポトーシスの検出を示す。
【図４９】図４９は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合の核断片化増大により反映されるようなアポトーシス増強を示す。
【０３２８】
【図５０】図５０は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のホスファチジルセリン曝露により反映されるようなアポトーシスの検出を示す。
【図５１】図５１は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のホスファチジルセリン曝露増大により反映されるようなアポトーシス増強を示す。
【図５２】図５２は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合の核断片化増大により反映されるようなアポトーシス増強を示す。
【図５３】図５３は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のアポトーシス増強を示す。
【図５４】図５４は、センス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６でＣＯＳ‐７細胞を一過的にトランスフェクトした場合のＢｃｌ‐２の下向き調節を示す。上部写真はクーマシーブルー染色タンパク質ブロットであり；底部写真は対応するウエスタンブロットである。
【図５５】図５５は、プローブとしてＢｃｌ‐２を用いてアンチセンス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６で一過的にトランスフェクトされたＣＯＳ‐７細胞のクーマシーブルー染色タンパク質ブロットおよび対応するウエスタンブロットである。
【図５６】図５６は、プローブとしてｃ‐Ｍｙｃを用いてセンス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６で一過的にトランスフェクトされたＣＯＳ‐７細胞のクーマシーブルー染色タンパク質ブロットおよび対応するウエスタンブロットである。
【図５７】図５７は、プローブとしてｐ５３を用いた場合のセンス配向で全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを含有するｐＨＭ６で一過的にトランスフェクトされたＣＯＳ‐７細胞のクーマシーブルー染色タンパク質ブロットおよび対応するウエスタンブロットである。
【図５８Ａ】図５８Ａ〜Ｃは、抗‐［ＨＡ］‐ペルオキシダーゼプローブを用いたＣＯＳ‐７細胞中でのｐＨＭ６‐全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現のクーマシーブルー染色タンパク質ブロットおよび対応するウエスタンブロット、ならびにｐ５３プローブが用いられる場合のＣＯＳ‐７細胞中でのｐＨＭ６‐全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現のクーマシーブルー染色タンパク質ブロットおよび対応するウエスタンブロットである。
【図５８Ｂ−Ｃ】図５８Ａ〜Ｃは、抗‐［ＨＡ］‐ペルオキシダーゼプローブを用いたＣＯＳ‐７細胞中でのｐＨＭ６‐全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現のクーマシーブルー染色タンパク質ブロットおよび対応するウエスタンブロット、ならびにｐ５３プローブが用いられる場合のＣＯＳ‐７細胞中でのｐＨＭ６‐全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現のクーマシーブルー染色タンパク質ブロットおよび対応するウエスタンブロットである。
【図５９】図５９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａおよび増殖ｅＩＦ‐５Ａがともに心臓組織中で発現されることを示す棒グラフである。冠動脈バイパスグラフト（「ＣＡＢＧ」）を受けている患者から、心臓組織を採取した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの遺伝子発現レベル（明灰色バー）を、増殖ｅＩＦ‐５Ａ（暗灰色バー）と比較する。Ｘ軸は、患者識別番号である。
【図６０】図６０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａおよび増殖ｅＩＦ‐５Ａがともに心臓組織中で発現されることを示す棒グラフである。心臓弁置換術を受けている患者から、心臓組織を採取した。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの遺伝子発現レベル（明灰色バー）を、増殖ｅＩＦ‐５Ａ（暗灰色バー）と比較する。Ｘ軸は、患者識別番号である。
【０３２９】
【図６１】図６１は、虚血前心臓組織および虚血後心臓組織におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ（ｅＩｆ５ａ）対増殖ｅＩＦ‐５Ａ（ｅＩＦ５ｂ）の実時間ＰＣＲにより測定した遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。
【図６２Ａ−Ｂ】図６２Ａ〜Ｆは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのレベルがＩＬ‐１βおよびＩＬ‐１８のレベルと相関する患者データを報告する。図６２Ａは、冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）患者から得たデータのチャートである。図６２Ｂは、心臓弁置換患者から得たデータのチャートである。
【図６２Ｃ】図６２Ｃは、ＣＡＢＧ患者におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ対ＩＬ‐１８の相関を示すグラフである。
【図６２Ｄ】図６２Ｄは、ＣＡＢＧ患者における増殖ｅＩＦ‐５Ａ対ＩＬ‐１８の相関を示すグラフである。
【図６２Ｅ】図６２Ｅは、心臓弁置換患者におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ対ＩＬ‐１８の相関を示すグラフである。
【図６２Ｆ】図６２Ｆは、心臓弁置換患者における増殖ｅＩＦ‐５Ａ対ＩＬ‐１８の相関を示すグラフである。
【図６３】図６３〜６４は、虚血事象の前、最中および後の心臓組織の収縮力の線図を示す。虚血後組織は虚血前組織と同様の収縮力を生じない。
【図６４】図６３〜６４は、虚血事象の前、最中および後の心臓組織の収縮力の線図を示す。虚血後組織は虚血前組織と同様の収縮力を生じない。
【図６５】図６５は、ヒト心筋中のＩＬ‐１８の局在を示す。
【図６６】図６６は、虚血／再還流がヒト心房組織中でＩＬ‐１８の合成を誘導したことを示す。
【図６７】図６７は、ＩＣＥ阻害因子（インターロイキン‐１β転換酵素）の存在が虚血／再還流損傷を低減したことを示す。
【図６８】図６８は、ＩＬ‐１８ＢＰ（ＩＬ‐１８の内因性阻害因子）によるＩＬ‐１８の中和が虚血／再還流損傷を低減することを示す。
【図６９】図６９は、ＴＮＦ‐αに曝露された場合に心臓組織の収縮力に長時間の低減が認められることを示す。
【図７０】図７０は、ＴＮＦ‐α誘導性心筋抑圧がＩＬ‐１８ＢＰにより低減されることを示す。
【図７１】図７１は、ＩＬ‐１β誘導性心筋抑圧がＩＬ‐１８ＢＰにより低減されることを示す。
【図７２】図７２は、クレアチンキナーゼ活性（ＣＫ）が、ＩＬ‐１βおよびＩＬ‐１８のプロセシングの抑制またはＩＬ‐１βおよびＩＬ‐１８活性における抑制により虚血／再還流に付された心房組織で保存されることを示す。
【図７３】図７３は、虚血／再還流ならびにＴＮＦα・ＩＬ‐１８カスケード後の筋細胞損傷のスキームを示す。
【図７４】図７４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ（ｅＩＦ‐５Ａ１）が、増殖ｅＩＦ‐５Ａ（ｅＩＦ‐５Ａ２）より多量に、虚血心臓組織中で上向き調節されることを示す。
【図７５】図７５は、虚血性および非虚血性心不全の両方において、ＩＬ‐１８発現の増大が認められることを示す。
【図７６】図７６は、虚血性および拡張性心筋症では、正常心臓組織と比較して、ＩＬ‐１８の相対発現は増大されるが、一方、ＩＬ‐１８ＢＰ（ＩＬ‐１８の内因性抑制因子）の発現は低減される、ということを示す。
【図７７Ａ−Ｂ】図７７ＡおよびＢは、蛍光的標識化アンチセンスオリゴヌクレオチドの取込みを示す。
【図７８】図７８〜８２は、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたことがない細胞と比較して、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドで処置されたことのある細胞中でアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージの低減を示す。
【図７９】図７８〜８２は、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたことがない細胞と比較して、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドで処置されたことのある細胞中でアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージの低減を示す。
【図８０】図７８〜８２は、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたことがない細胞と比較して、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドで処置されたことのある細胞中でアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージの低減を示す。
【図８１】図７８〜８２は、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたことがない細胞と比較して、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドで処置されたことのある細胞中でアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージの低減を示す。
【図８２】図７８〜８２は、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたことがない細胞と比較して、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドで処置されたことのある細胞中でアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージの低減を示す。
【図８３】図８３は、ＴＮＦ‐αおよび／またはカンプトテシンによる篩板細胞の処置がアポトーシスを受けている細胞の数の増大を生じることを示す。
【図８４】図８４および８５は、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたことのない細胞と比較した場合の、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドで処置されたことのある細胞中でのアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージ低減を示す。
【図８５】図８４および８５は、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたことのない細胞と比較した場合の、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａオリゴヌクレオチドで処置されたことのある細胞中でのアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージ低減を示す。
【図８６Ａ−Ｂ】図８６ＡおよびＢは、血清の存在下でまたは血清なしで、篩板細胞が標識化ｓｉＲＮＡを取り込む、ということを示す。
【図８７】図８７〜８９は、非トランスフェクト化細胞よりも、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた篩板細胞の方が、より低いパーセンテージのアポトーシスを受けている細胞をカンプトテシンおよびＴＮＦ‐αへの曝露後に有することを示す。
【図８８】図８７〜８９は、非トランスフェクト化細胞よりも、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた篩板細胞の方が、より低いパーセンテージのアポトーシスを受けている細胞をカンプトテシンおよびＴＮＦ‐αへの曝露後に有することを示す。
【図８９】図８７〜８９は、非トランスフェクト化細胞よりも、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた篩板細胞の方が、より低いパーセンテージのアポトーシスを受けている細胞をカンプトテシンおよびＴＮＦ‐αへの曝露後に有することを示す。
【図９０】図９０は、図８９および実施例１３に記載された実験からのｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた、そしてカンプトテシンおよびＴＮＦ‐αで処置されたHoescht染色篩板細胞株＃５０６の写真である。アポトーシス中の細胞は、より明るく染色された細胞として観察される。それらは、染色質凝縮のため、より小さな核を有し、そして小型で且つ形状が不規則である。
【０３３０】
【図９１Ａ−Ｄ】図９１は、免疫蛍光による篩板細胞の特性化である。
【図９２】図９２は、カンプトテシンおよびＴＮＦ‐αによる処理に応答する篩板細胞株＃５０６のアポトーシス％を示すグラフである。
【図９３Ａ−Ｂ】図９３は、カンプトテシンまたはＴＮＦ‐α＋カンプトテシン処置中のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対する発現レベルを示す。
【図９４】図９４は、ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後の篩板細胞株＃５０６および＃５１７中のアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ｈの発現レベルを示す。
【図９５】図９５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、そしてＴＮＦ‐αおよびカンプトテシンで処置された篩板細胞株＃５０６細胞のアポトーシス％を示す。
【図９６】図９６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡ  ＃１でトランスフェクトされ、そしてＴＮＦ‐αおよびカンプトテシンで処置された篩板細胞株＃５１７細胞のアポトーシス％を示す。
【図９７Ａ−Ｂ】図９７ａ〜ｄは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡ  ＃１でトランスフェクトされ、そしてＴＮＦ‐αおよびカンプトテシンで処置された篩板細胞株＃５０６細胞のＴＵＮＥＬラベリングを示す。パネルＡは、アポトーシス細胞の断片化ＤＮＡのＴＵＮＥＬラベリングを可視化するためにフルオレセインフィルターを用いて蛍光顕微鏡により観察されるスライドを表す。パネルＢは、Hoescht染色核を可視化するためにＵＶフィルターを通して観察される同一スライドを表す。
【図９８】図９８は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞がより少ないアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質を産生し、さらにより多いＢｃｌ‐２タンパク質を産生した、ということを示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現の低減は、ＢＣＬ‐２発現の増大と相関する。
【０３３１】
【図９９】図９９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞がより少ないアポトーシス因子５ａタンパク質を産生したことを示す。
【図１００】図１００は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ細胞でトランスフェクトされたＩＬ‐１曝露ＨｅｐＧ２細胞が、非トランスフェクト化細胞より少ないＴＮＦ‐αを分泌した、ということを示す。
【図１０１Ａ】図１０１Ａは、ウエスタンブロットの図を提示するが、この場合、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡは、トランスフェクト化ＨＴ‐２９細胞中でのＴＮＦ‐αの産生を抑制しなかった場合、低減した。
【図１０１Ｂ】図１０１Ｂは、ＥＬＩＳＡの結果を提示する。
【図１０２】図１０２は、ＥＬＩＳＡの結果を提示する。ＴＮＦ‐α産生は、対照細胞と比較して、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡで処置された細胞中で低減された。
【図１０３】図１０３は、ＩＬ‐８がＴＮＦ‐αに応答して、ならびにインターフェロンに応答して産生される、ということを示す棒グラフである。このグラフは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡが、インターフェロンに応答して産生されるほとんどすべてのＩＬ‐８を、ならびにインターフェロンおよびＴＮＦの組合せ治療の結果として産生される有意量のＩＬ‐８を遮断した、ということを示す。
【図１０４】図１０４は、ＩＬ‐８がＴＮＦ‐アルファに応答して、ならびにインターフェロンに応答して産生される、ということを示す別の棒グラフである。このグラフは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡが、インターフェロンに応答して産生されるほとんどすべてのＩＬ‐８を、ならびにインターフェロンおよびＴＮＦの組合せ治療の結果として産生される有意量のＩＬ‐８を遮断した、ということを示す。
【図１０５】図１０５は、ＩＦＮガンマで8〜24時間処置されたＨＴ‐２９細胞のウエスタンブロットである。このブロットは、インターフェロン・ガンマに応答したアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するＨＴ‐２９細胞における上向き調節（8時間で4倍）を示す。
【図１０６】図１０６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡがインターフェロン・ガンマおよびＬＰＳの存在下でＮＫｋＢ活性化の低減を提供する実験の結果を示す。
【図１０７】図１０７は、対照ｓｉＲＮＡまたはアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨＴ‐２９細胞からの細胞溶解物のウエスタンブロットを示す。この図面は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡがアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制することを示す。
【図１０８】図１０８は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨＴ‐２９細胞が低レベルのＴＮＦ産生を有する、ということを示す。
【図１０９】図１０９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨＴ‐２９細胞が、対照細胞と比較して、アポトーシスの低減を示す、ということを示す。対照およびｓｉＲＮＡトランスフェクト化細胞の両方をインターフェロン・ガンマで初回刺激し、そしてさらにＴＮＦ‐αで処置した。
【図１１０】図１１０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨＴ‐２９細胞が対照細胞より少ないＴＬＲ４タンパク質を発現することを示す。
【図１１１】図１１１は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨＴ‐２９細胞が対照細胞より少ないＴＮＦＲ１タンパク質を発現することを示す。
【０３３２】
【図１１２】図１１２は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨＴ‐２９細胞が対照細胞より少ないｉＮＯＳタンパク質を発現することを示す。
【図１１３】図１１３は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨＴ‐２９細胞が対照細胞より少ないＴＬＲ４  ｍＲＮＡを発現することを示す。
【図１１４】図１１４は、ＩＦＮ‐γおよびＬＰＳに曝露されたＨＴ‐２９細胞において、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡによるトランスフェクションがＮＦκＢｐ５０活性化およびＴＮＦ‐α産生の低減を引き起こす、ということを示す。
【図１１５】図１１５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡがＨＴ‐２９細胞中での内因性アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現を抑制する、ということを示す。
【図１１６】図１１６は、ＨＴ‐２９細胞において、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡ媒介性抑制がＩＦＮ‐γに応答してＩＦＮ‐γ受容体‐α蓄積を低減する、ということを示す。
【図１１７】図１１７は、ＨＴ‐２９細胞において、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡ媒介性抑制がＩＦＮ‐γに応答してＴｏｌｌ受容体４（ＴＬＲ４）蓄積を低減する、ということを示す。
【図１１８】図１１８は、ＨＴ‐２９細胞において、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡ媒介性抑制がＩＦＮ‐γに応答してＪＡＫ１およびＳＴＡＴ１リン酸化を低減する、ということを示す。
【図１１９Ａ−Ｂ】図１１９は、ｅＩＦ５Ａ１の免疫蛍光局在を示す。ＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐α（Ａ）またはアクチノマイシンＤ（Ｂ）で刺激されたＨＴ‐２９細胞中のｅＩＦ５Ａ１タンパク質の細胞下局在を、間接的免疫蛍光により確定した。Ａ）ＨＴ‐２９細胞は、未処置（ｉ）であるか、あるいは0分間（ｉｉ）、10分間（ｉｉｉ）、30分間（ｉｖ）、90分間（ｖ）または8時間（ｖｉ）、ＴＮＦ‐αで刺激する前に、ＩＦＮ‐γで16時間初回刺激された。Ｂ）ＨＴ‐２９細胞は、未処置（ｉ）であるか、あるいは30分間（ｉｉ）、90分間（ｉｉｉ）、4時間（ｉｖ）、8時間（ｖ）または16時間（ｖｉ）、アクチノマイシンＤで処置された。写真はすべて倍率400倍で撮影した。結果は、3つの個々の実験を代表するものである。
【０３３３】
【図１２０】図１２０は、ＰＢＭＣ実験に関する時間経過を示す（実施例１８参照）。
【図１２１】図１２１は、時間経過中の2つのドナーから収集されたＰＢＭＣからの細胞溶解物のウエスタンブロットを示す。ＰＢＭＣは、ＰＭＡで処置され、その後、ＬＰＳで刺激されて、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現増大を有する。
【図１２２Ａ】図１２２は、ＰＭＡで処置され、その後、ＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣはアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現増大を有し、これはＴＮＦ産生増大と同時に起こる、ということを示す。
【図１２２Ｂ】図１２２は、ＰＭＡで処置され、その後、ＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣはアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ発現増大を有し、これはＴＮＦ産生増大と同時に起こる、ということを示す。
【図１２３】図１２３は、ＰＭＡ分化を伴わずにＬＰＳに対してＰＢＭＣが応答する、ということを実証する。
【図１２４】図１２４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＰＢＭＣはアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの発現の抑圧を実証する、ということを示す。
【図１２５Ａ】図１２５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、ＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされないＰＢＭＣより少ないＴＮＦを産生する、ということを示す。
【図１２５Ｂ】図１２５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、ＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされないＰＢＭＣより少ないＴＮＦを産生する、ということを示す。
【図１２５Ｃ】図１２５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、ＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされないＰＢＭＣより少ないＴＮＦを産生する、ということを示す。
【図１２５Ｄ】図１２５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、ＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣは、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされないＰＢＭＣより少ないＴＮＦを産生する、ということを示す。
【図１２６】図１２６は、Ｕ‐９３７分化実験の時間経過を示す。実施例１６参照。
【図１２７】図１２７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａが単球分化中と、その後のＴＮＦ‐α分泌中に上向き調節される、ということを示すウエスタンブロットの結果を示す。
【図１２８】図１２８は、Ｕ９３７処置に関する時間経過を示す。
【０３３４】
【図１２９】図１２９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡがＵ９３７細胞中でＰＭＡにより上向き調節される、ということを示す。
【図１３０】図１３０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡがＵ９３７細胞中でＬＰＳにより上向き調節される、ということを示す。
【図１３１】図１３１は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａタンパク質発現はｓｉＲＮＡ処置後の何時間後でも依然として低減される、ということを示す。
【図１３２】図１３２は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡ媒介性下向き調節がＴＬＲ４の低減と同時に起こる、ということを示す。
【図１３３】図１３３は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡ媒介性下向き調節がＵ９３７細胞中でより少ないグリコシル化形態のインターフェロン・ガンマ受容体と併在する、ということを示す。
【図１３４】図１３４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡ媒介性下向き調節がＵ９３７中でＴＮＦＲ１の低減と同時に起こる、ということを示す。
【図１３５】図１３５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡ媒介性下向き調節がＵ９３７細胞中でＬＰＳ誘導性ＴＮＦ‐α産生の低減と同時に起こる、ということを示す。
【図１３６】図１３６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡ媒介性下向き調節がＵ９３７細胞中でＬＰＳ誘導性ＩＬ‐１β産生の低減と同時に起こる、ということを示す。
【図１３７】図１３７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡ媒介性下向き調節がＵ９３７細胞中でＬＰＳ誘導性ＩＬ‐８産生の低減と同時に起こる、ということを示す。
【図１３８】図１３８は、ＩＬ‐６産生がＵ９３７細胞中ではアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５ＡのｓｉＲＮＡ媒介性下向き調節と無関係である、ということを示す。
【図１３９】図１３９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡの静脈内送達が血清中のＴＮＦ‐αのレベル低減を引き起こす、ということを示す。
【図１４０】図１４０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡの経鼻送達が肺中のＴＮＦ‐αのレベル低減を引き起こす、ということを示す。
【０３３５】
【図１４１】図１４１は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡの経鼻送達が肺中のＭＩＰ‐１のレベル低減を引き起こす、ということを示す。
【図１４２】図１４２は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対して向けられるｓｉＲＮＡの鼻内送達がＩＬ‐１αのレベル低減を引き起こす、ということを示す。
【図１４３】図１４３は、マウスがＬＰＳおよびｅＩＦ‐５Ａ１  ｓｉＲＮＡを鼻内摂取した後、対照ｓｉＲＮＡを摂取しているマウスより低いミエロペルオキシダーゼ活性を有した、ということを示す。
【図１４４】図１４４は、胸腺細胞の鼻‐ＬＰＳ誘導性損失がアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを用いた前処置により遮断される、ということを示す。
【図１４５】図１４５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡの鼻内送達を用いた実験に関する時間経過を示す。
【図１４６】図１４６は、胸腺細胞の鼻‐ＬＰＳ誘導性損失がアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡを用いた前処置により遮断される、ということを示す。
【図１４７Ａ−Ｃ】図１４７は、ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡがＩＬ‐６、ＩＦＮ‐γおよびＩ１‐１αの産生を低減したことを示す。
【図１４７Ｄ−Ｅ】図１４７は、ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡがＩＬ‐６、ＩＦＮ‐γおよびＩ１‐１αの産生を低減したことを示す。
【図１４８】図１４８は、ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡが、ＬＰＳによる処置の結果としてＴＮＦαの発現を低減し得る、ということを示す。上部パネルは生データを示し、そして底部パネルは棒グラフでのデータを示す。
【０３３６】
【図１４９】図１４９は、敗血症Ｂａｌｂ／Ｃマウスが異なる濃度のｓｉＲＮＡを用いて異なる時間に処置された実験の結果を示す。
【図１５０】図１５０は、異なるフォーマットでの図１３３の結果を示す。
【図１５１】図１５１は、敗血症Ｃ５７ＢＬ／６マウスが異なる濃度のｓｉＲＮＡを用いて異なる時間に処置された実験の結果を示す。
【図１５２】図１５２は、異なるフォーマットでの図１５１の結果を示す。
【図１５３】図１５３〜１５５は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける組合せ敗血症生存試験の結果を示す。この試験は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを摂取しているマウスは対照マウスより長く生存した、ということを示す。
【図１５４】図１５３〜１５５は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける組合せ敗血症生存試験の結果を示す。この試験は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを摂取しているマウスは対照マウスより長く生存した、ということを示す。
【図１５５】図１５３〜１５５は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける組合せ敗血症生存試験の結果を示す。この試験は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを摂取しているマウスは対照マウスより長く生存した、ということを示す。
【図１５６】図１５６〜１５８は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける組合せ敗血症生存試験の結果を示す。この試験は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを摂取しているマウスは対照マウスより長く生存した、ということを示す。
【図１５７】図１５６〜１５８は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける組合せ敗血症生存試験の結果を示す。この試験は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを摂取しているマウスは対照マウスより長く生存した、ということを示す。
【図１５８】図１５６〜１５８は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける組合せ敗血症生存試験の結果を示す。この試験は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａを摂取しているマウスは対照マウスより長く生存した、ということを示す。
【図１５９】図１５９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡで処置された動物が生存のより良好な機会を有したということを示す敗血症試験を要約した。
【０３３７】
【図１６０】図１６０は、敗血症マウスモデルに用いられたｓｉＲＮＡの構築物を示す。
【図１６１】図１６１は、対照ｓｉＲＮＡで処置された腫瘍および非腫瘍（健常）組織の写真であり、癌性組織では、アポトーシスがほとんどまたは全く認められないことを示す。
【図１６２】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６３】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６４】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６５】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６６】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６７】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６８】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６９】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１７０】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１７１】図１７１は、全身注射ａｄ５ｏｒｉｏＰ．ルセルフェラーゼ（lucerferase）が鼻咽頭異種移植腫瘍中で選択的に発現される、ということを実証するグラフを示す。
【０３３８】
【図１７２】図１７２は、ａｄ５ｏｒｉｏＰ．ｅＩＦ‐５Ａ１が、2回の細胞分裂内の鼻咽頭癌細胞（Ｃ６６６‐１）の98％を殺害する、ということを示す。
【図１７３】図１７３は、癌細胞がマウスに注射されて、肺癌の発症を生じた実験の結果を示す。ｅＩＦ‐５Ａを注射されたマウスは、対照マウスと比較して、癌性細胞の量の低減を示した。
【図１７４】図１７４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで処置された癌性肺組織が、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａで処置されない対照肺と比較して、癌性組織の量の低減を示す、ということを示す。
【図１７５】図１７５は、肺癌実験に用いられる肺の重量を示す。
【図１７６】図１７６は、幹細胞分化、ならびにサイトカイン産生を抑制するためのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａに対するｓｉＲＮＡの使用を示す。
【図１７７】図１７７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａ  ｓｉＲＮＡがＣＯＸ‐２のＬＰＳ誘導性上向き調節を抑制する、ということを示す。
【図１７８】図１７８は、ｅＩＦ‐５Ａ１がＶＥＧＦの発現を下向き調節し得た実験の結果を示す。
【図１７９】図１７９は、滑膜肉腫細胞株中でのアポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａの過剰発現は、腫瘍細胞によるＶＥＧＦの産生を低減する、ということを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008522591.tif 000014
【図１１】
2008522591.tif 000015
【図１２】
2008522591.tif 000016
【図１３】
2008522591.tif 000017
【図１４】
2008522591.tif 000018
【図１５】
2008522591.tif 000019
【図１６】
2008522591.tif 000020
【図１７】
2008522591.tif 000021
【図１８】
2008522591.tif 000022
【図１９】
2008522591.tif 000023
【図２０】
2008522591.tif 000024
【図２１】
2008522591.tif 000025
【図２２】
2008522591.tif 000026
【図２３】
2008522591.tif 000027
【図２４】
2008522591.tif 000028
【図２５】
2008522591.tif 000029
【図２６】
2008522591.tif 000030
【図２７】
2008522591.tif 000031
【図２８Ａ】
2008522591.tif 000032
【図２８Ｂ】
2008522591.tif 000033
【図２９Ａ】
2008522591.tif 000034
【図２９Ｂ】
2008522591.tif 000035
【図３０】
2008522591.tif 000036
【図３１】
2008522591.tif 000037
【図３２】
2008522591.tif 000038
【図３３】
2008522591.tif 000039
【図３４】
2008522591.tif 000040
【図３５】
2008522591.tif 000041
【図３６】
2008522591.tif 000042
【図３７】
2008522591.tif 000043
【図３８】
2008522591.tif 000044
【図３９】
2008522591.tif 000045
【図４０】
2008522591.tif 000046
【図４１】
2008522591.tif 000047
【図４２】
2008522591.tif 000048
【図４３Ａ−Ｂ】
2008522591.tif 000049
【図４４】
2008522591.tif 000050
【図４５Ａ−Ｂ】
2008522591.tif 000051
【図４６】
2008522591.tif 000052
【図４７】
2008522591.tif 000053
【図４８】
2008522591.tif 000054
【図４９】
2008522591.tif 000055
【図５０】
2008522591.tif 000056
【図５１】
2008522591.tif 000057
【図５２】
2008522591.tif 000058
【図５３】
2008522591.tif 000059
【図５４】
2008522591.tif 000060
【図５５】
2008522591.tif 000061
【図５６】
2008522591.tif 000062
【図５７】
2008522591.tif 000063
【図５８Ａ】
2008522591.tif 000064
【図５８Ｂ−Ｃ】
2008522591.tif 000065
【図５９】
2008522591.tif 000066
【図６０】
2008522591.tif 000067
【図６１】
2008522591.tif 000068
【図６２Ａ】
2008522591.tif 000069
【図６２Ｂ】
2008522591.tif 000070
【図６２Ｃ】
2008522591.tif 000071
【図６２Ｄ】
2008522591.tif 000072
【図６２Ｅ】
2008522591.tif 000073
【図６２Ｆ】
2008522591.tif 000074
【図６３】
2008522591.tif 000075
【図６４】
2008522591.tif 000076
【図６５】
2008522591.tif 000077
【図６６】
2008522591.tif 000078
【図６７】
2008522591.tif 000079
【図６８】
2008522591.tif 000080
【図６９】
2008522591.tif 000081
【図７０】
2008522591.tif 000082
【図７１】
2008522591.tif 000083
【図７２】
2008522591.tif 000084
【図７３】
2008522591.tif 000085
【図７４】
2008522591.tif 000086
【図７５】
2008522591.tif 000087
【図７６】
2008522591.tif 000088
【図７７Ａ】
2008522591.tif 000089
【図７７Ｂ】
2008522591.tif 000090
【図７８】
2008522591.tif 000091
【図７９】
2008522591.tif 000092
【図８０】
2008522591.tif 000093
【図８１】
2008522591.tif 000094
【図８２】
2008522591.tif 000095
【図８３】
2008522591.tif 000096
【図８４】
2008522591.tif 000097
【図８５】
2008522591.tif 000098
【図８６Ａ−Ｂ】
2008522591.tif 000099
【図８７】
2008522591.tif 000100
【図８８】
2008522591.tif 000101
【図８９】
2008522591.tif 000102
【図９０】
2008522591.tif 000103
【図９１Ａ】
2008522591.tif 000104
【図９１Ｂ】
2008522591.tif 000105
【図９１Ｃ】
2008522591.tif 000106
【図９１Ｄ】
2008522591.tif 000107
【図９２】
2008522591.tif 000108
【図９３Ａ−Ｂ】
2008522591.tif 000109
【図９４】
2008522591.tif 000110
【図９５】
2008522591.tif 000111
【図９６】
2008522591.tif 000112
【図９７Ａ−Ｂ】
2008522591.tif 000113
【図９８】
2008522591.tif 000114
【図９９】
2008522591.tif 000115
【図１００】
2008522591.tif 000116
【図１０１Ａ】
2008522591.tif 000117
【図１０１Ｂ】
2008522591.tif 000118
【図１０２】
2008522591.tif 000119
【図１０３】
2008522591.tif 000120
【図１０４】
2008522591.tif 000121
【図１０５】
2008522591.tif 000122
【図１０６】
2008522591.tif 000123
【図１０７】
2008522591.tif 000124
【図１０８】
2008522591.tif 000125
【図１０９】
2008522591.tif 000126
【図１１０】
2008522591.tif 000127
【図１１１】
2008522591.tif 000128
【図１１２】
2008522591.tif 000129
【図１１３】
2008522591.tif 000130
【図１１４】
2008522591.tif 000131
【図１１５】
2008522591.tif 000132
【図１１６】
2008522591.tif 000133
【図１１７】
2008522591.tif 000134
【図１１８】
2008522591.tif 000135
【図１１９Ａ】
2008522591.tif 000136
【図１１９Ｂ】
2008522591.tif 000137
【図１２０】
2008522591.tif 000138
【図１２１】
2008522591.tif 000139
【図１２２Ａ】
2008522591.tif 000140
【図１２２Ｂ】
2008522591.tif 000141
【図１２３】
2008522591.tif 000142
【図１２４】
2008522591.tif 000143
【図１２５Ａ】
2008522591.tif 000144
【図１２５Ｂ】
2008522591.tif 000145
【図１２５Ｃ】
2008522591.tif 000146
【図１２５Ｄ】
2008522591.tif 000147
【図１２６】
2008522591.tif 000148
【図１２７】
2008522591.tif 000149
【図１２８】
2008522591.tif 000150
【図１２９】
2008522591.tif 000151
【図１３０】
2008522591.tif 000152
【図１３１】
2008522591.tif 000153
【図１３２】
2008522591.tif 000154
【図１３３】
2008522591.tif 000155
【図１３４】
2008522591.tif 000156
【図１３５】
2008522591.tif 000157
【図１３６】
2008522591.tif 000158
【図１３７】
2008522591.tif 000159
【図１３８】
2008522591.tif 000160
【図１３９】
2008522591.tif 000161
【図１４０】
2008522591.tif 000162
【図１４１】
2008522591.tif 000163
【図１４２】
2008522591.tif 000164
【図１４３】
2008522591.tif 000165
【図１４４】
2008522591.tif 000166
【図１４５】
2008522591.tif 000167
【図１４６】
2008522591.tif 000168
【図１４７Ａ−Ｃ】
2008522591.tif 000169
【図１４７Ｄ−Ｅ】
2008522591.tif 000170
【図１４８】
2008522591.tif 000171
【図１４９】
2008522591.tif 000172
【図１５０】
2008522591.tif 000173
【図１５１】
2008522591.tif 000174
【図１５２】
2008522591.tif 000175
【図１５３】
2008522591.tif 000176
【図１５４】
2008522591.tif 000177
【図１５５】
2008522591.tif 000178
【図１５６】
2008522591.tif 000179
【図１５７】
2008522591.tif 000180
【図１５８】
2008522591.tif 000181
【図１５９】
2008522591.tif 000182
【図１６０】
2008522591.tif 000183
【図１６１】
2008522591.tif 000184
【図１６２】
2008522591.tif 000185
【図１６３】
2008522591.tif 000186
【図１６４】
2008522591.tif 000187
【図１６５】
2008522591.tif 000188
【図１６６】
2008522591.tif 000189
【図１６７】
2008522591.tif 000190
【図１６８】
2008522591.tif 000191
【図１６９】
2008522591.tif 000192
【図１７０】
2008522591.tif 000193
【図１７１】
2008522591.tif 000194
【図１７２】
2008522591.tif 000195
【図１７３】
2008522591.tif 000196
【図１７４】
2008522591.tif 000197
【図１７５】
2008522591.tif 000198
【図１７６】
2008522591.tif 000199
【図１７７】
2008522591.tif 000200
【図１７８】
2008522591.tif 000201
【図１７９】
2008522591.tif 000202
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月5日(2007.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
本発明は、癌細胞においてアポトーシスを誘導するための方法も提供する。癌細胞は正常細胞死経路を外見上は迂回するため、癌細胞におけるアポトーシスを誘導するためのメカニズムを有することが望ましい。本発明人等は、癌細胞におけるアポトーシスを誘導するためにｅＩＦ５Ａ１ポリヌクレオチドを用いた。さらに、本発明人等は、非ヒプシン化形態のｅＩＦ５Ａ１がアポトーシスを誘導し得る、ということを発見したが、この場合、ｅＩＦ５Ａ１はＤＨＳによるヒプシン化により活性化されなければならない、と従来考えられている（実施例２２参照）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３７】
【図１６０】図１６０は、敗血症マウスモデルに用いられたｓｉＲＮＡの構築物を示す。
【図１６１】図１６１は、対照ｓｉＲＮＡで処置された腫瘍および非腫瘍（健常）組織の写真であり、癌性組織では、アポトーシスがほとんどまたは全く認められないことを示す。
【図１６２】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードするポリヌクレオチドで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６３】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードするポリヌクレオチドで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６４】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードするポリヌクレオチドで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６５】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードするポリヌクレオチドで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６６】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードするポリヌクレオチドで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６７】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードするポリヌクレオチドで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６８】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードするポリヌクレオチドで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１６９】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードするポリヌクレオチドで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１７０】図１６２〜１７０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ‐５Ａをコードするポリヌクレオチドで処置された腫瘍では、強度のアポトーシスが存在するが、しかし非腫瘍組織中には認められなかった。種々の組織が示されている（図１６７には腎臓、図１６８には肝臓、図１６９には心臓、そして図１７０には脾臓）。
【図１７１】図１７１は、全身注射ａｄ５ｏｒｉｏＰ．ルセルフェラーゼ（lucerferase）が鼻咽頭異種移植腫瘍中で選択的に発現される、ということを実証するグラフを示す。
【国際調査報告】
2008522591.tif 000235
2008522591.tif 000236
2008522591.tif 000237
2008522591.tif 000238
2008522591.tif 000239
2008522591.tif 000240
2008522591.tif 000241