(57)【要約】本発明は、Wnt阻害因子-1(WIF-1)が低発現している癌の診断および処置のための組成物、方法およびキットを提供する。2008500398.tif 000026
2008500398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Wntポリペプチドに結合するWnt阻害因子-1(WIF-1)サブドメインポリペプチドを含む組成物。
【請求項２】
WIF-1サブドメインポリペプチドがWntシグナル伝達を阻害する、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
WIF-1サブドメインポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸残基約1位〜180位に対応するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
WIF-1サブドメインポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸残基約29位〜180位に対応するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
WIF-1サブドメインポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸残基約29位〜176位に対応するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
WIF-1サブドメインポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸残基約39位〜176位に対応するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
以下の段階を含む、WIF-1が低発現する癌細胞の増殖を阻害する方法：
癌細胞の増殖を阻害するのに有効なWIF-1ポリペプチドの量と癌細胞を接触させる段階。
【請求項８】
前記の量のWIF-1ポリペプチドが癌細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
接触段階が癌細胞においてWIF-1ポリペプチドの発現を増加させることを含む、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
WIF-1ポリペプチドの発現が、細胞においてWIF-1プロモーターのメチル化を減少させることにより増加する、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
WIF-1ポリペプチドの発現が、WIF-1ポリペプチドを発現させる単離されたポリヌクレオチドと癌細胞を接触させることにより増加する、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
WIF-1ポリペプチドがSEQ ID NO:2を含む、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
SEQ ID NO:2が異種性アミノ酸配列と融合している、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
WIF-1ポリペプチドがWIF-1サブドメインポリペプチドである、請求項7記載の方法。
【請求項１５】
サブドメインポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸残基約1位〜180位に対応するアミノ酸配列を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
サブドメインポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸残基約29位〜180位に対応するアミノ酸配列を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
サブドメインポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸残基約29位〜176位に対応するアミノ酸配列を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
サブドメインポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸残基約39位〜176位に対応するアミノ酸配列を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
サブドメインポリペプチドが、WIF-1ポリペプチドと異種性であるアミノ酸配列と融合している、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
インビトロで実施される、請求項7記載の方法。
【請求項２１】
インビボで実施される、請求項7記載の方法。
【請求項２２】
癌細胞が、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、黒色腫、大腸癌、中皮腫、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頚癌、食道癌、頭頸部癌、肝細胞癌、脳癌、外陰癌、睾丸癌、肉腫、白血病、リンパ腫、神経膠腫、およびグリア芽腫細胞からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項２３】
以下の段階を含む、WIF-1が低発現する癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法：
癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量でWIF-1活性を有するポリペプチドと癌細胞を接触させる段階。
【請求項２４】
以下の段階を含む、WIF-1の低発現と関連した疾患を処置する方法：
疾患を処置するのに有効なWIF-1活性を有するポリペプチドの量を、そのような処置を必要としている被検体に投与する段階。
【請求項２５】
ポリペプチドがSEQ ID NO:2を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
SEQ ID NO:2が異種性アミノ酸配列と融合している、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
WIF-1ポリペプチドがWIF-1サブドメインポリペプチドである、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
疾患が癌である、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
癌が、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、黒色腫、大腸癌、中皮腫、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頚癌、食道癌、頭頸部癌、肝細胞癌、脳癌、外陰癌、睾丸癌、肉腫、白血病、リンパ腫、神経膠腫、およびグリア芽腫からなる群より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
WIF-1ポリペプチドならびに薬学的に許容される賦形剤、担体および/または希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項３１】
WIF-1ポリペプチドがSEQ ID NO:2を含む、請求項30記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
SEQ ID NO:2が異種性アミノ酸配列と融合している、請求項31記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
WIF-1ポリペプチドがWIF-1サブドメインポリペプチドである、請求項30記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
サブドメインポリペプチドが、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約1位〜180位に対応するアミノ酸配列を含む、請求項33記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
サブドメインポリペプチドが、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約29位〜180位に対応するアミノ酸配列を含む、請求項33記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
サブドメインポリペプチドが、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約29位〜176位に対応するアミノ酸配列を含む、請求項33記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
サブドメインポリペプチドが、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約39位〜176位に対応するアミノ酸配列を含む、請求項33記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
以下の段階を含む、過剰メチル化WIF-1プロモーターを検出するための方法：
過剰メチル化WIF-1プロモーターを検出するのに有効な量で、過剰メチル化WIF-1プロモーターへ特異的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドと、過剰メチル化WIF-1プロモーターとを接触させる段階。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2004年5月21日に出願された仮出願第60/573,197号、および2005年3月21日に出願された仮出願第60/664,241号の恩典を主張し、それらの開示は、参照により本明細書に全体として組み入れられている。
【０００２】
発明の背景
癌は世界中を通して主要な死因であり、肺癌は、たいていの国において癌死亡率の主な原因であり、毎年世界中で百万人を超える死者をもたらしている。さらに、1年あたり170,000より多い新しく診断された肺癌症例が米国ににおいて報告されている(Fong et al., Thorax 58:892-900 (2003)（非特許文献1）; Minna et al., Cancer Cell 1:49-52 (2002)（非特許文献2）)。
【０００３】
いくつかの異なる腫瘍型の発生率がこの20年間に上昇している。最近、癌の分子遺伝学の理解において著しい進歩があった。例えば、プロトオンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子は、正常な細胞成長および分化の調節に関与した他の遺伝子を制御する細胞遺伝子である。これらの遺伝子は、成長因子、成長因子受容体、多様な細胞性基質をリン酸化するキナーゼ、および多数の細胞遺伝子の発現を制御するDNA結合タンパク質をコードする。発癌は、遺伝子産物の突然変異(例えば、ras)または過剰発現(例えば、Her-2/neuおよびc-myc)が悪性を引き起こす、支配的成長促進プロトオンコジーンの活性化、および遺伝子の発現または機能の欠如が結果として悪性を生じる、成長阻害性腫瘍抑制遺伝子(p53およびRbのような)の不活性化を通して起こりうる。そのような癌は、癌の原因である変化が個体における1つまたは複数の遺伝子のヌクレオチド配列のレベルであるという点において、遺伝的な根拠を有する。
【０００４】
上の遺伝的変化に加えて、癌はまた、後成的な機構を通して引き起こされうる。1つの後成的機構は、遺伝子配列、特にCpG豊富な領域(CpGアイランド)における、のメチル化による遺伝子発現のサイレンシングを含む。正常にはメチル化されていないCpGアイランドの異常なメチル化は、ヒト癌において確定した腫瘍抑制遺伝子の転写不活性化に関連している。遺伝子転写のメチル化サイレンシングのような後成的機構は、細胞が正常な成長調節の喪失を受けやすいかどうか、およびそれゆえに、場合によっては、癌細胞であるかどうかを決定するために有用なマーカーを提供する。癌は、しばしば、疾患が十分に進行するまで臨床的徴候または症状を示さない無症状疾患である。それとして、癌に罹りやすい個体の同定を可能にするマーカーの、または初期での癌の検出を可能にするマーカーでさえ、使用は非常に有益である。
【０００５】
残念なことに、そのようなマーカーはたいていの癌について入手できない。例えば、初期非小細胞肺癌(NSCLC)は、腫瘍段階に依存して35〜85%の生存率で、日常的に切除される。残念なことに、たいていの肺癌は、NSCLCについての5年全生存率はたった15%であるように、遅くに検出される。肺癌患者の高死亡率における主要な因子は、診断時での患者のおよそ3分の2における転移性癌の存在である。より初期でのこれらの患者における癌の検出は、生存率を増加させる可能性がありうる。DNAメチル化検出は、肺癌特異的バイオマーカーを同定するための有望なアプローチであり、それはまた、初期でのバイオマーカーの検出のための非侵襲性方法でもある。
【０００６】
分泌された糖タンパク質のWntファミリーは、発生的過程および発癌に広く関与するシグナル伝達分子の群である(WO 04/032838（特許文献1）)。Wntのプロトオンコジーン的効果は、20年よりももっと前に発見された。それ以来、多数の報告が、結腸直腸癌、頭頸部癌腫(Rhee et al., Oncogene 21:6598-605 (2002)（非特許文献3）)、黒色腫(Weeraratna et al., Cancer Cell. 1:279-88 (2002)（非特許文献4）)および白血病(Jemal et al., Cancer J. Clin. 54:8-29 (2004)（非特許文献5）)のような不同性のヒト癌においてWntシグナル伝達経路の異常な活性化を実証した。
【０００７】
最近、Dv1タンパク質が中皮腫およびNSCLCにおいて過剰発現されていることが報告された(Uestema et al., Oncogene 22:7218-7221 (2003)（非特許文献6）)。Wnt-1の阻害がアポトーシスを引き起こし、肺癌細胞系における腫瘍成長を阻害することも実証された(Li et al., J. Biol. Chem. 277:5877-81 (2002)（非特許文献7）)。Wntアンタゴニストは、それらの機能の機構により2つの群へ分けられうる：第一群は、分泌性Frizzled関連タンパク質(sFRP)ファミリー、WNT-阻害因子-1(WIF-1)およびケルベロス(Cerberus)を含む。これらのアンタゴニストは、Wnt分子への直接的結合によりWntシグナル伝達を阻害する。第二群は、Wnt受容体複合体のLRP5/LRP6成分への結合によりWntシグナル伝達を阻害する、Dickkopf(DKK)ファミリーを含む(Kawano et al., J. Cell Sci. 116:2627-34 (2003)（非特許文献8）)。
【０００８】
WIF-1は自然に分泌されるWntシグナル伝達アンタゴニストである。WIF-1は、379アミノ酸残基タンパク質として生成される。WIF-1は、28アミノ酸残基のN末端シグナル配列、約150アミノ酸残基の固有のWIFドメイン(WD)、5つの上皮細胞成長因子(EGF)様リピート、および45アミノ酸残基C末端親水性ドメインを有する(Hsieh et al., Nature 398:431-436 (1999)（非特許文献9）; GenBank NP_009122)。WIF-1は、FzまたはsFRPのCRDと少しの類似性も共有しない(Bui et al., Oncogene 14(10):1249-53 (1997)（非特許文献10）; Melkonyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(25):13636-41 (1997)（非特許文献11）; Shimizu et al., Cell. Growth Differ. 8(12):1349-58 (1997)（非特許文献12）;およびTodd et al., Cancer Res. 57(7):1344-52 (1997)（非特許文献13）)。WIF-1は、いくつかの発生過程の制御に結びつけられている。例えば、アメリカツメガエル胚におけるWIF-1の過剰発現はWnt-8経路を遮断し、異常な体節形成を引き起こす(Hsieh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3546-51 (1999)（非特許文献14）)。
【０００９】
過去数十年間での肺癌の治療における進歩にもかかわらず、肺癌について5年間生存率は15%未満のままである。NSCLCはすべての肺癌の75〜80%を占める。肺癌病原論についての分子機構のより良い理解は、肺癌をもつ患者の処置を向上させるはずである。本発明は、肺癌のようなWIF-1発現が下方制御されている癌の検出および処置に、ならびにWIF-1発現が下方制御されている細胞においてアポトーシスを引き起こすことに、有用な組成物、方法およびキットを提供する。
【００１０】
【特許文献１】WO 04/032838
【非特許文献１】Fong et al., Thorax 58:892-900 (2003)
【非特許文献２】Minna et al., Cancer Cell 1:49-52 (2002)
【非特許文献３】Rhee et al., Oncogene 21:6598-605 (2002)
【非特許文献４】Weeraratna et al., Cancer Cell. 1:279-88 (2002)
【非特許文献５】Jemal et al., Cancer J. Clin. 54:8-29 (2004)
【非特許文献６】Uestema et al., Oncogene 22:7218-7221 (2003)
【非特許文献７】Li et al., J. Biol. Chem. 277:5877-81 (2002)
【非特許文献８】Kawano et al., J. Cell Sci. 116:2627-34 (2003)
【非特許文献９】Hsieh et al., Nature 398:431-436 (1999)
【非特許文献１０】Bui et al., Oncogene 14(10):1249-53 (1997)
【非特許文献１１】Melkonyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(25):13636-41 (1997)
【非特許文献１２】Shimizu et al., Cell. Growth Differ. 8(12):1349-58 (1997)
【非特許文献１３】Todd et al., Cancer Res. 57(7):1344-52 (1997)
【非特許文献１４】Hsieh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3546-51 (1999)
【発明の開示】
【００１１】
発明の簡単な概要
本発明の一つの局面は、WIF-1プロモーターのCpGアイランドにおける頻繁な過剰メチル化が、WIF-1の、癌細胞におけるそれの転写サイレンシング、および過小発現と相関しているという発見に基づいている。従って、本発明のいつかの局面では、様々な方法において、例えば、WIF-1を過小発現する癌細胞の増殖を阻害するために、WIF-1を過小発現する癌細胞においてアポトーシスを引き起こすために、癌細胞においてWntシグナル伝達を阻害するために、およびWIF-1の過小発現に関連した疾患を処置するために、有用である組成物が提供される。
【００１２】
本発明の好ましい態様において、組成物は、Wntポリペプチドに結合するWnt阻害因子-1(WIF-1)サブドメインポリペプチドを含む。好ましくは、Wntシグナル伝達を阻害するWIF-1サブドメインポリペプチドである。好ましい態様において、WIF-1サブドメインポリペプチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約1位〜180位に対応するアミノ酸配列を含む。他の好ましいWIF-1サブドメインポリペプチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約29位〜180位、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基39位〜176位に対応するアミノ酸配列を含む。WIF-1ポリペプチドに非相同的であるアミノ酸配列と融合しているWIFサブドメインポリペプチドもまた好ましい。
【００１３】
本発明は、WIF-1を過小発現する癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、癌細胞の増殖を阻害するのに有効なWIF-1ポリペプチドの量と癌細胞を接触させる段階を含む。本発明の好ましい態様において、癌細胞は、過剰メチル化されたWIF-1プロモーターを含み、癌細胞を接触させる段階は、WIF-1プロモーターのメチル化を減少させることにより癌細胞におけるWIF-1の発現を増加させることを含む。
【００１４】
本発明のもう一つの好ましい態様において、WIF-1ポリペプチドの量は癌細胞においてアポトーシスを引き起こす。
【００１５】
癌細胞を接触させる段階は、WIF-1ポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドから癌細胞においてWIF-1ポリペプチドを発現させることを含みうる。
【００１６】
本発明はさらに、WIF-1を過小発現する癌細胞においてアポトーシスを引き起こす方法を提供する。この方法は、癌細胞においてアポトーシスを引き起こすのに有効な量でWIF-1活性を有するポリペプチドと癌細胞を接触させる段階を含む。
【００１７】
本発明のもう一つの好ましい方法は、癌細胞においてWntシグナル伝達を阻害するのに有効なWIF-1ポリペプチドの量で癌細胞と接触させる段階を含む、癌細胞においてWntシグナル伝達を阻害する方法である。
【００１８】
本発明はまた、WIF-1の過小発現に関連した疾患を処置する方法を提供する。本発明は、疾患を処置するのに有効なWIF-1活性を有するポリペプチドの量をそのような処置を必要としている被検体へ投与する段階を含む。好ましい疾患は癌である。
【００１９】
本発明はまた、過剰メチル化WIF-1プロモーターを検出するための方法を提供する。好ましい態様において、本発明は、過剰メチル化WIF-1プロモーターを検出するのに有効な量で過剰メチル化WIF-1プロモーターへ特異的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドと過剰メチル化WIF-1プロモーターを接触させる段階を含む。
【００２０】
本発明の方法に使用を見出す癌細胞、または本発明の組成物、方法もしくはキットを用いて診断および/もしくは処置されうる癌は、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、黒色腫、大腸癌、中皮腫、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頚癌、食道癌、頭頸部癌、肝細胞癌、脳腫瘍、外陰癌、睾丸癌、肉腫、白血病、リンパ腫、神経膠腫、およびグリア芽腫を含む。
【００２１】
本発明の方法に用いられうる好ましいWIF-1ポリペプチドは、WIF-1サブドメインポリペプチドである。WIF-1サブドメインポリペプチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約1位〜180位に対応するアミノ酸配列、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約29位〜180位に対応するアミノ酸配列、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約29位〜176位に対応するアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基約39位〜176位に対応するアミノ酸配列を含みうる。WIF-1ポリペプチドに非相同的であるアミノ酸配列と融合しているWIFサブドメインポリペプチドもまた好ましい。
【００２２】
本発明の方法は、インビトロおよびインビボで実施されうる。
【００２３】
本発明はまた、WIF-1ポリペプチド、ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体および/または希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、本明細書に記載されたWIF-1ポリペプチドを含む。
【００２４】
発明の詳細な説明
I. 定義
用語「WIF-1」は、核酸、ポリペプチド、ならびにそれらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間相同体を指し、本明細書にさらに記載されているように、これらは (1)下に示されたWIF-1配列と、好ましくは少なくとも約25、50、75、100、150、200、250、300、350もしくは379アミノ酸の領域に対して、約60%より高いアミノ酸配列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、好ましくは91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%もしくはそれ以上のアミノ酸配列同一性、をもつアミノ酸配列を有する；(2)以下に示されるアミノ酸配列もしくは保存的に改変されたその変異体を含む免疫原に対して産生された抗体、例えばポリクローナル抗体に結合する；(3)Wntタンパク質に結合する；(4)WntのWnt結合分子への結合を干渉する；(5)Wntシグナル伝達経路を少なくとも部分的に阻害する；(6)以下に示される核酸配列もしくは保存的に改変されたその変異体へストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で特異的にハイブリダイズする；(7)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、もしくはSEQ ID NO:19と、好ましくは少なくとも約30、50、100、200、500、1000、1,500、2000もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域に対して、約90%より高い、好ましくは約96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上高いヌクレオチド配列同一性をもつ核酸配列を有する；および/または(8)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29もしくはSEQ ID NO:30の少なくとも25、しばしば、50、75、100、150、200、250、300、350もしくは379の連続したアミノ酸残基；またはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、もしくはSEQ ID NO:19の少なくとも25、しばしば、50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1,000、1,200、1,500、2,000もしくそれ以上の連続したヌクレオチドを有する。
【００２５】
WIF-1ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的にはヒト由来であるが、他の哺乳動物、限定されるわけではないが、非ヒト霊長類、齧歯類、例えば、ラット、マウス、もしくはハムスター；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または他の哺乳動物由来でありうる。「WIF-1」ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、天然に存在するまたは組換えの両方の型を含む。それゆえに、いくつかの態様において、本明細書に記載されたようなWIF-1ポリペプチドおよびWIF-1サブドメインポリペプチドは、ヒトWIF-1配列に対応する配列を含みうる。従って、例示的なWIF-1が本明細書に提供され、当技術分野において公知である。例えば、ヒトWIF-1ポリペプチドについてのGenBankアクセッション番号は、AAD25402、AAQ88710、AAH18037、NP_009122、およびQ9Y5W5である。完全長WIF-1のアミノ酸残基178に関していくつかのアミノ酸配列異種性がある。ロイシンおよびグルタミンアミノ酸残基がこの位置において報告されている。マウスWIF-1ポリペプチドについてのGenBankアクセッション番号は、例えば、Q9WUA1、NP_036045およびAAD25403；ラットWIF-1について、Q6IN38；ウシについて、XP_582244；例えば、アメリカツメガエルについて、AAD25404およびQ9W6F8；およびゼブラフィッシュについて、Q9W6F9およびAAD25405である。
【００２６】
用語「Wnt」、「Wntポリペプチド」、または「Wntリガンド」は、ショウジョウバエ(Drosophila)セグメントポラリティー遺伝子であるwinglessに関連した哺乳動物タンパク質のファミリーを指す。ヒトにおいて、遺伝子のWntファミリーは、典型的には、疎水性シグナル配列および保存されたアスパラギン結合オリゴ糖コンセンサス配列を有する38〜43 kDa システイン豊富な糖タンパク質をコードする(Schimizu et al., Cell Growth Differ 8(12):1349-58 (1997))。Wntファミリーは少なくとも19個の哺乳動物メンバーを含む。例示的なWntタンパク質は、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt12、Wnt13、Wnt14、Wnt15およびWnt16を含む。好ましくは、Wntポリペプチドは哺乳動物のWntポリペプチド、より好ましくは、ヒトWntポリペプチドである。
【００２７】
WIF-1タンパク質に関連する、用語「Wnt結合サブドメインタンパク質」、「WIF-1ドメインタンパク質」、「WIF-1サブドメインポリペプチド」、「WDタンパク質」、またはそれらの文法的相当語句は、Wntポリペプチドに結合することができる、またはWntシグナル伝達経路に干渉することができるWIF-1タンパク質の断片を指す。
【００２８】
本明細書に用いられる場合の「WIF-1関連」ポリペプチドとは、WIF-1相同体、WIF-1アイソフォーム、WIF-1オーソログ、WIF-1融合タンパク質または前記のものの断片またはそれらの任意の組み合わせを指す。
【００２９】
「WIF-1相同体」は、WIF-1のと類似したアミノ酸配列を含むが、WIF-1としての類似または同一の機能を必ずしも有するとは限らないポリペプチドを指す。
【００３０】
「WIF-1アイソフォーム」は、同じ遺伝子によりコードされるが、それのpIもしくはMW、または両方において異なる、WIF-1の変異体を指す。そのようなアイソフォームは、それらのアミノ酸組成(例えば、選択的スプライシングまたはタンパク質限定加水分解の結果として)、および、加えてまたは代替として、示差的な翻訳後修飾(例えば、グリコシル化、アシル化またはリン酸化)から起こりうる。
【００３１】
本明細書に用いられる場合、「WIF-1オーソログ」とは、(i)ヒトWIF-1のアミノ酸配列と類似したアミノ酸配列を含み、かつ(ii)ヒトWIF-1のアミノ酸配列と類似または同一の機能を有する、非ヒトポリペプチドを指す。
【００３２】
本明細書に用いられる場合、「WIF-1融合タンパク質」は、(i)WIF-1、WIF-1断片、WIF-1サブドメインポリペプチド、WIF-1関連ポリペプチド、WIF-1関連ポリペプチドの断片のアミノ酸配列、および(ii)非相同的なポリペプチド(すなわち、非WIF-1、非WIF-1断片、または非WIF-1関連ポリペプチド)のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
【００３３】
「完全長」WIF-1ポリペプチドまたは核酸とは、1つまたは複数の天然に存在する野生型WIF-1ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に正常に含まれるエレメントのすべてを含む、WIF-1ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を指す。「完全長」は、選択的スプライシングおよびシグナルペプチド切断を含む、翻訳後処理の様々な段階の前または後でありうる。
【００３４】
用語「過剰メチル化」は、WIF-1遺伝子配列、例えば、WIF-1プロモーターにおいて正常にはメチル化されていない位置におけるシトシンのメチル化を指す。当業者に認識されているように、プロモーターのようなWIF-1遺伝子の領域における過剰メチル化の検出は、プロモーターにおけるあらゆるCpG残基が分析される必要はない。1つまたは複数のCpG残基は、メチル化分析における標的でありうる。従って、典型的には、ポリヌクレオチド配列関連における「過剰メチル化」は、対照と比較した(例えば、癌細胞 対 非癌細胞)、メチル化残基の数における増加を指す。「過剰メチル化」はまた、対照と比較した、付加されたメチル基を含むシトシン残基の数または頻度を指す。
【００３５】
「WIF-1プロモーター」は、「WIF-1」の転写を調節する1つまたは複数の制御領域を含む配列を指す。いくつかの態様において、WIF-1プロモーターは、ヒトWIF-1プロモーターである。例示的なヒトWIF-1プロモーター配列は、SEQ ID NO:3に示されたヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
WIF-1プロモーターのようなポリヌクレオチド配列関連における「メチル化を減少させること」とは、対照と比較した(例えば、癌細胞対非癌細胞)、メチル化塩基の数における減少を指す。その用語はまた、対照と比較した、付加されたメチル基を含むシトシン残基の数または頻度を指す。
【００３７】
本明細書に用いられる場合、「生体試料」とは、核酸またはポリペプチドを含む生物組織または生体液の試料である。そのような試料は、典型的には、ヒト由来であるが、非ヒト霊長類、または齧歯類、例えばマウスおよびラットから単離された組織を含む。生体試料はまた、生検および剖検試料のような組織の切片、組織学的目的として採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、毛、皮膚などを含みうる。生体試料はまた、患者組織由来の外植片ならびに一次および/または形質転換された細胞培養物を含む。「生体試料」はまた、動物由来の細胞もしくは細胞の集団、または多量の組織もしくは液体を指す。ほとんどの場合、生体試料は動物から取り出されているが、用語「生体試料」はまた、インビボで、すなわち、動物からの取り出しなしに分析される細胞または組織を指しうる。典型的には、「生体試料」は、動物由来の細胞を含むものであるが、その用語はまた、癌関連ポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルを測定するために用いられうる、血液、唾液、または尿の非細胞性画分のような非細胞性生体材料を指しうる。限定されるわけではないが、組織生検、血液試料、頬側切屑、唾液試料、または乳頭分泌物を含む、多数の型の生体試料が本発明に用いられうる。本明細書に用いられる場合、「組織生検」は、診断的分析のために、動物、好ましくはヒトから取り出されたいくらかの量の組織を指す。癌をもつ患者において、組織は、腫瘍内の細胞の分析を可能にするように、腫瘍から取り出されうる。「組織生検」は、針生検、細針生検、外科生検などのような任意の型の生検を指しうる。
【００３８】
「生体試料を供給すること」とは、本発明に記載された方法に用いる生体試料の入手を意味する。ほとんどの場合、これは患者から細胞の試料を取り出すことにより成されるが、以前に単離された細胞(例えば、別の人により、別の時に、および/または別の目的のために単離された)を用いることにより、またはインビボで本発明の方法を行うことによっても達成されうる。処置または転帰歴を有するアーカイブ組織は特に有用である。
【００３９】
生体試料における「WIF-1 mRNAのレベル」は、細胞または生体試料に存在するWIF-1遺伝子から転写されたmRNAの量を指す。mRNAは一般的に機能性WIF-1タンパク質をコードするが、コードされたタンパク質の機能を変化させるかまたは除去する突然変異が存在しうる。「WIF-1 mRNAのレベル」は、定量化される必要はないが、例えば、対照試料からのレベルもしくは対照試料の予想されるレベルとの比較を伴って、または伴わずに、人による主観的な視覚的検出によって簡単に検出されうる。
【００４０】
生体試料における「WIF-1タンパク質またはポリペプチドのレベル」は、細胞または生体試料に存在するWIF-1 mRNAから翻訳されたポリペプチドの量を指す。ポリペプチドはWIF-1タンパク質活性を有していても有していなくてもよい。「WIF-1タンパク質のレベル」は、定量化される必要はないが、例えば、対照試料からのレベルもしくは対照試料の予想されるレベルとの比較を伴って、または伴わずに、人による主観的な視覚的検出によって簡単に検出されうる。
【００４１】
本明細書に用いられる場合、用語「処置する」、「処置すること」、および「処置」は以下を含む：(1)癌のような疾患を予防する、すなわち、疾患に罹りやすい可能性があるが、疾患のいずれの症状もまだ経験していない被検体において、疾患の臨床的症状を発生させない；(2)疾患を抑制する、すなわち、疾患もしくはそれの臨床的症状の発生を抑止または低減する；または(3)疾患を緩和する、すなわち、疾患またはそれの臨床的症状の退行を引き起こす。好ましくは、そのような処置を必要としている被検体は哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００４２】
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の関連における用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、下記のデフォルトパラメーターでのBLASTまたはBALST 2.0配列比較アルゴリズムを用いて、または手作業アラインメントおよび視覚的洞察により測定される場合、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定されたパーセンテージを有する(すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域に対して最大限一致として比較および整列された場合、特定された領域に対して、約60%同一性、好ましくは70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の同一性)、2つもしくはそれ以上の配列または部分配列を指す(例えば、NCBIウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/など参照)。そのような配列は、その後、「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、試験配列の相補体にあてはまるか、または適用されうる。定義はまた、欠失および/または付加をもつ配列、ならびに置換をもつ配列、ならびに天然に存在する配列、例えば、多型または対立遺伝子変異体、ならびに人工変異体を含む。下記のように、好ましいアルゴリズムはギャップなど考慮することができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約25アミノ酸長もしくはヌクレオチド長である領域に対して、またはより好ましくは50〜100アミノ酸長もしくはヌクレオチド長である領域に対して存在する。
【００４３】
比較配列について、典型的には、1つの配列が、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列は、コンピュータへ入力され、必要にならば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。好ましくは、デフォルトプログラムパラメーターが用いられうるか、または代替パラメーターが指定されうる。配列比較アルゴリズムは、その後、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００４４】
本明細書に用いられる場合、「比較ウィンドウ」は、2つの配列が最適に整列された後、配列が同じ数の連続した位置の参照配列と比較されうる、典型的には、約20個から約600個まで、通常には約50個〜約200個、より通常には約100個〜約150個からなる群より選択される連続した位置の数の1つのセグメントへの言及を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、スミス＆ウォーターマン(Smith & Waterman)の局所的相同性アルゴリズム、Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)、により、ニードルマン＆ブンシュ(Needleman & Wunsh)の相同性アラインメントアルゴリズム、J. Mol. Biol. 48:443 (1970)、により、ピアソン＆リップマンの類似性方法のための検索、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)、により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施により(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または手作業アラインメントおよび視覚的洞察により、行われうる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplementを参照)。
【００４５】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適しているアルゴリズムの好ましい例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムを含み、それらは、Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。BLASTおよびBLAST 2.0は、本発明の核酸およびタンパク質についてパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載されたパラメーターを用いて使用される。BLAST解析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公的に利用できる。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列において同じ長さのワードで整列される場合、いくつかの正の値の閾値スコアTと一致するかまたは満足させるかのいずれかである、クエリー配列において長さWの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列ペア(HSP)を同定することを含む。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschul et al.、前記)。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見出すための検索を開始する種として働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加しうる限り、各配列に沿って両方の方向に拡張される。累積スコアは、例えば、ヌクレオチド配列について、パラメーターM(一致している残基のペアについての報酬スコア；常に>0)およびN(不一致の残基についてのペナルティスコア；常に<0)を用いて計算される。アミノ酸配列について、スコア行列は累積スコアを計算するために用いられる。各方向におけるワードヒットの拡張は以下の場合停止される：累積アラインメントスコアが、それの最大達成値から量Xだけ低下する；累積スコアが、1つもしくは複数の負スコア残基アラインメントの蓄積のために、ゼロもしくはそれ未満まで進む；または、いずれかの配列の末端に達する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T、およびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列)は、デフォルトとして、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長、および10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコア行列(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989))、50のアラインメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較を用いる。
【００４６】
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計学的解析を実行する(例えば、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993))。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの測定は、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然により生じる確率の指標を提供する、最小和確率(P(N))である。例えば、核酸は、試験核酸の参照核酸との比較における最小和確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満である場合には、参照配列に類似するとみなされる。対数値は、大きな負の数、例えば、5、10、20、30、40、40、70、90、110、150、170などでありうる。
【００４７】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である事の指標は、第一核酸によりコードされるポリペプチドが、下記のように、第二核酸によりコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応性であるということである。従って、ポリペプチドは、典型的には、第二ポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、2つのペプチドは保存的置換だけ異なるのみである。2つの核酸配列が実質的に同一である事のもう一つの指標は、2つの分子またはそれらの相補体が、下記のように、ストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一である事のさらにもう一つの指標は、同じプライマーがその配列を増幅するために用いられうることである。
【００４８】
「宿主細胞」とは、発現ベクターを含み、かつ発現ベクターの複製または発現を支持する天然に存在する細胞または形質転換された細胞である。宿主細胞は、培養された細胞、外植片、インビボの細胞などでありうる。宿主細胞は、大腸菌(E. coli)のような原核細胞、または酵母、昆虫細胞、両生類細胞のような真核細胞、CHO、293、3T3、HeLaのような哺乳動物細胞などでありうる(例えば、American Type Culture Collection)。
【００４９】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」とは、それの天然の状態で見出されるような、通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を指す。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学的技術を用いて決定される。調製物に存在する支配的な種であるタンパク質または核酸は、実質的に精製されている。特に、単離された核酸は、天然でその遺伝子に隣接し、かつその遺伝子によりコードされるタンパク質以外のタンパク質をコードするいくつかのオープンリーディングフレームから分離される。いくつかの態様における用語「精製された」とは、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じさせることを示す。好ましくは、核酸またはタンパク質が少なくとも85%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、および最も好ましくは少なくとも99%純粋であることを意味する。他の態様において、「純度」または「精製」は、精製されるべき組成物から少なくとも1つの夾雑物を除去することを意味する。この意味において、精製は、精製された化合物が均一、例えば100%純粋である必要はない。
【００５０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で交換可能に用いられる。その用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーに、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー、改変された残基を含むそれらのもの、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。
【００５１】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するおよび合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似して機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるもの、ならびに後で修飾されるそれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基に結合しているα炭素をもつ化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)、または修飾されたペプチドバックボーンを有しうるが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似して機能する化学化合物を指す。
【００５２】
アミノ酸は、それらの一般的に知られている三文字記号によるかまたはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨されている一文字記号によるかのいずれかで本明細書に参照されうる。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般的に認められている一文字コードにより参照されうる。
【００５３】
「保存的に改変された変異体」とは、アミノ酸および核酸の両方の配列に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一のもしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一のもしくは関連した、例えば天然で近接する配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸がほとんどのタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUすべてがアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンにより特定されているあらゆる位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを変えることなく、記載された対応するコドンのもう一つへ変化しうる。そのような核酸変異は、保存的に改変された変異体の1種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書でのあらゆる核酸配列もまた、核酸のサイレント変異を記載する。当業者は、ある特定の関連において、核酸における各コドン(通常、メチオニンについての唯一のコドンであるAUG、および通常、トリプトファンについての唯一のコドンであるTGGを除いて)が、機能的に同一の分子を生じるように改変されうることは、認識しているものと思われる。従って、ポリペプチドをコードする核酸のたいていのサイレント変異は、発現産物に関して記載された配列に潜在的に含まれているが、実際のプローブ配列に関しては含まれていない。
【００５４】
アミノ酸配列に関して、当業者は、単一のアミノ酸、もしくはコードされた配列における低パーセンテージのアミノ酸を変化させる、付加する、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に対する個々の置換、欠失、または付加は、変化が結果としてアミノ酸の化学的に類似したアミノ酸との置換を生じる、「保存的に改変された変異体」であることを認識しているものと思われる。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野において周知である。そのような保存的に改変された変異体は追加であって、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子を排除しない。典型的な互いとの保存的置換：1)アラニン(A)、グリシン(G)；2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；4)アルギニン(R)、リシン(K)；5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；7)セリン(S)、トレオニン(T)；および8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins (1984)参照)。
【００５５】
ポリペプチド構造のような巨大分子構造は、様々なレベルの組織化によって説明されうる。この組織化の一般的な考察について、例えば、Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (第3版, 1994)およびCantor & Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980)を参照されたい。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に規則正しい、三次元構造を指す。これらの構造はドメインとして一般的に知られている。ドメインは、しばしば、ポリペプチドの小型ユニットを形成するポリペプチドの部分であり、典型的には、25〜約500アミノ酸長である。典型的ドメインは、β-シートおよびα-ヘリックスのひと続きのようなより小さい組織化の区画から構成される。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」とは、独立した三次ユニットにより、通常には非共有結合性会合により形成される三次元構造を指す。
【００５６】
本明細書に用いられる、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または文法的相当語句は、共有結合性にいっしょに連結された少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、典型的には、約5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50またはそれ以上のヌクレオチド長から約100ヌクレオチド長までである。核酸およびポリヌクレオチドは、より長い長さ、例えば、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000を含む、任意の長さのポリマーである。本発明の核酸は、一般的には、ホスホジエステル結合を含むものだが、場合によっては、例えば、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはO-メチルホスホロアミダイト結合を含む代わりのバックボーン(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照)；ならびにペプチド核酸バックボーンおよび結合をもちうる核酸類似体が含まれる。他の類似体核酸は、米国特許第5,235,033号および第5,034,506号ならびにChapter 6 and 7、ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds.に記載されたものを含む、ポジティブバックボーン；非イオン性バックボーン、および非リボースバックボーンをもつものを含む。1つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の1つの定義内に含まれる。リボース-リン酸バックボーンの改変は、様々な理由のために、例えば、生理学的環境において、またはバイオチップ上のプローブとして、そのような分子の安定性および半減期を増加させるためになされうる。天然に存在する核酸および類似体の混合物が作製することも；または、異なる核酸類似体の混合物、ならびに天然に存在する核酸および類似体の混合物が作製することもできる。
【００５７】
様々な参照文献がそのような核酸類似体を開示しており、例えば、ホスホラミデート(Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925 (1993)およびその中の参照文献; Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); およびPauwels et al., Chemica Scripta 26:141 91986))、ホスホロチオエート(Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991); および米国特許第5,644,048号)、ホスホロジチオエート(Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989))、O-メチルホスホロアミダイト結合(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照)、ならびにペプチド核酸バックボーンおよび結合(Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992); Nielsen, Nature 365:566 (1993); Carlsson et al., Nature 380:207 (1996)を参照、それらのすべては参照により組み入れられている)を含む。他の類似体核酸は、ポジティブバックボーン(Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995)；非イオン性バックボーン(米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号および第4,469,863号; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994); Chapter 2 and 3、ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (1994); Tetrahedron Lett. 37:743 (1996))、および米国特許第5,235,033号および第5,034,506号ならびにChapter 6 and 7、ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookに記載されたものを含む、非リボースバックボーンをもつものを含む。1つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の1つの定義内に含まれる(Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. pp 169 176 (1995)参照)。いくつかの核酸類似体は、Rawls, C & E News June 2,1997 page 35に記載されている。これらの参照文献のすべては、参照により本明細書に明白に組み入れられている。
【００５８】
他の類似体は、ペプチド核酸類似体であるペプチド核酸(PNA)を含む。これらのバックボーンは、天然に存在する核酸の高度に荷電したホスホジエステルバックボーンと対照的に、中性条件下で実質的に非イオン性である。これは結果として、2つの利点を生じる。第一に、PNAバックボーンは、改良されたハイブリダイゼーション動力学を示す。PNAは、ミスマッチ対完全マッチの塩基対について融解温度(Tm)におけるより大きな変化をもつ。DNAおよびRNAは、典型的には、内部ミスマッチについてTmにおいて2〜4℃降下を示す。非イオン性PNAバックボーンについて、降下は、7〜9℃近くである。同様に、それらの非イオン性性質のために、これらのバックボーンに付着した塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度に対して相対的に非感受性である。さらに、PNAは、細胞性酵素により分解されず、それゆえに、より安定しうる。
【００５９】
核酸は、特定されているように、一本鎖または二本鎖でありうるか、または二本鎖もしくは一本鎖配列の両方の部分を含みうる。当業者により認識されているように、一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列も定義する；従って、本明細書に記載された配列はまた、配列の相補体も提供する。核酸は、DNA、ゲノムおよびcDNAの両方、RNAまたはハイブリッドでありうり、核酸は、デオキシリボ-ヌクレオチドおよびリボ-ヌクレオチドの組み合わせ、ならびに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の組み合わせを含みうる。「転写産物」は、典型的には、天然に存在するRNA、例えば、プレ-mRNA、hnRNA、またはmRNA、を指す。本明細書に用いられる場合、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドならびにヌクレオチド類似体およびアミノ修飾ヌクレオシドのような修飾ヌクレオシドを含む。さらに、「ヌクレオシド」は、天然に存在しない類似体構造を含む。従って、例えば、それぞれが塩基を含む、ペプチド核酸の個々のユニットは、本明細書でヌクレオシドと呼ばれる。
【００６０】
「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的または他の物理的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識は、32P、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素(例えば、ELISAに一般的に用いられるような)、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンおよびタンパク質、または、例えば、ペプチドへ放射性標識を組み込むことにより検出可能にさせられうるか、もしくはペプチドと特異的反応性の抗体を検出するために用いられうる、他の実体を含む。標識は、任意の位置に、乳癌核酸、タンパク質および抗体へ組み込まれうる。抗体を標識へ結合させるための当技術分野において公知の任意の方法が用いられうり、Hunter et al., Nature 144:945 (1962); David et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981);およびNygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)により記載された方法を含む。
【００６１】
「標識核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」とは、プローブの存在がプローブに結合した標識の存在を検出することにより検出されうるように、リンカーもしくは化学結合を通して共有結合性に、またはイオン性、ファンデルワールス力、静電気、もしくは水素結合を通して非共有結合性に標識へ結合しているものである。または、高親和性相互作用を用いる方法は、結合パートナーのペアの1つが他のもの、例えば、ビオチン、ストレプトアビジンに結合する、同じ結果に達しうる。
【００６２】
本明細書に用いられる場合、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、1つまたは複数の型の化学結合を通して、通常には相補的塩基対形成を通して、通常には水素結合形成を通して、相補的配列の標的核酸に結合することができる核酸として定義される。本明細書に用いられる場合、プローブは、天然(すなわち、A、G、CまたはT)または修飾塩基(7-デアザグアノシン、イノシンなど)を含みうる。さらに、プローブにおける塩基は、それがハイブリダイゼーションを機能的に干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合により連結されうる。従って、例えば、プローブは、成分塩基がホスホジエステル結合よりむしろペプチド結合により連結されているペプチド核酸でありうる。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェント性に依存してプローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列を結合しうることは当業者により理解されているものと思われる。プローブは、好ましくは、同位元素、発色団、発光団、色素原でのように直接的に標識されるか、またはストレプトアビジン複合体が後で結合しうるビオチンでのように間接的に標識される。プローブの存在または非存在についてアッセイすることにより、選択配列または部分配列の存在または非存在を検出することができる。診断または予後は、ゲノムレベル、またはRNAもしくはタンパク質発現のレベルに基づいてもよい。
【００６３】
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる場合の用語「組換え」とは、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種性核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の変化により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞由来であることを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞の天然(非組換え)型内で見出されない遺伝子を発現させる、または別なふうに異常に発現されている、低発現している、または全く発現されていない天然の遺伝子を発現させる。本明細書での用語「組換え核酸」とは、一般的に、例えば、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる、核酸の操作により、通常には天然で見出されない形で、本来インビトロで形成される核酸を意味する。このように、異なる配列の実施可能な連結が達成される。従って、直線状型の単離された核酸、または通常には連結されていないDNA分子をライゲーションすることによりインビトロで形成された発現ベクターは、両方とも、本発明の目的として、組換えとみなされる。いったん組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物体へ再導入されたならば、それは非組換え的に、すなわちインビトロの操作よりむしろ宿主細胞のインビボの細胞機構を用いて複製される；しかしながら、いったん組換え的に産生されたがその後非組換え的に複製される、そのような核酸は、本発明の目的としてなお組換えとみなされる。同様に、「組換えタンパク質」は組換え技術を用いて、すなわち、上記で描写されているような組換え核酸の発現を通して作製されるタンパク質である。
【００６４】
核酸の部分に関して用いられる場合の用語「異種性」は、核酸が、天然で通常にはお互いに同じ関係で見出されない2つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には例えば新しい機能性核酸を作製するように配置された関連のない遺伝子由来の2つ以上の配列、例えば1つの起源由来のプロモーターおよび別の源由来のコード領域を有して組換え的に作製される。同様に、異種性タンパク質は、しばしば天然でお互いに同じ関係で見出されない2つ以上の部分配列を指す(例えば、融合タンパク質)。
【００６５】
「プロモーター」は、核酸の転写を指揮する核酸制御配列のアレイと定義される。本明細書に用いられる場合、プロモーターは、ポリメラーゼII型プロモーターの場合における、TATAエレメントのような転写の開始部位近くの必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、任意で、転写の開始部位から数千塩基対程に位置しうる遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。
【００６６】
「構成的」プロモーターは、たいていの環境および発生的条件下において活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的または発生的制御下で活性があるプロモーターである。用語「実施可能に連結された」とは、核酸発現制御配列(プロモーター、または転写因子結合部位のアレイのような)と第二の核酸配列との間の機能的連結であって、発現制御配列が第二配列に対応する核酸の転写を指揮する機能的連結を指す。
【００６７】
「発現ベクター」は、宿主細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特定された核酸エレメントを含む、組換え的にまたは合成的に作製された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の部分でありうる。典型的には、発現ベクターはプロモーターに実施可能に連結されて転写されうる核酸を含む。
【００６８】
「〜へ選択的に(または特異的に)ハイブリダイズする」という語句は、配列が複雑な混合物(例えば、全細胞性もしくはライブラリーDNAまたはRNA)に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、二本鎖形成、またはハイブリッド形成を指す。
【００６９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、プローブが、典型的には核酸の複雑な混合物において、その標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる環境で異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、確定したイオン強度、pHにおいて特定の配列についての熱融点(Tm)より約5〜10℃低いように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度(確定したイオン強度、pHおよび核酸濃度下で)である(標的配列が過剰に存在する場合、Tmにおいて、プローブの50%が平衡状態で占有される)。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約1.0 M未満のナトリウムイオン、典型的には、約0.01〜1.0 M ナトリウムイオン濃度(または他の塩)、pH 7.0〜8.3、ならびに温度が短いプローブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)について少なくとも約30℃、および長いプローブ(例えば、50ヌクレオチドより長い)について少なくとも約60℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により達成されうる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドの10倍のハイブリダイゼーションである。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の通りでありうる：50%ホルムアミド、5×SSC、および1% SDS、42℃でインキュベートするか、または5×SSC、1% SDS、65℃でインキュベートし、0.2×SSCおよび0.1% SDSにおいて65℃で洗浄。PCRについて、約36℃の温度が低ストリンジェント性増幅の典型であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに依存して約32℃と48℃の間を変動しうる。高ストリンジェント性PCR増幅について、約62℃の温度が典型であるが、高ストリジェント性アニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に依存して、約50℃から約65℃までの範囲でありうる。高いおよび低いストリンジェント性増幅の両方についての典型的サイクル条件は、90℃〜95℃での30秒間〜2分間の変性段階、30秒間〜2分間続くアニーリング段階、および約72℃での1〜2分間の伸長段階を含む。低いおよび高いストリンジェント性増幅反応についてのプロトコールおよびガイドラインは、例えば、Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.に提供されている。
【００７０】
ストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、なお実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝暗号により許される最大コドン縮重を用いて創造される場合に起こる。そのような場合、核酸は、典型的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、40%ホルムアミド、1 M NaCl、1%SDSの緩衝液における37℃でのハイブリダイゼーション、および1×SSCにおける45℃での洗浄を含む。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者は、代替のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が類似したストリンジェント性の条件を提供するために利用されうることを容易に認識しているものと思われる。ハイブリダイゼーションパラメーターを決定するための追加のガイドラインは、多数の参照文献、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al.に提供されている。
【００７１】
「機能的効果を決定すること」とは、間接的にまたは直接的にWIF-1の影響、例えば、機能的、酵素的、物理的および化学的効果の下にあるパラメーターを増加または減少させる化合物についてアッセイすることを意味する。そのような機能的効果は、当業者に公知の任意の手段により測定されうり、例えば、分光学的特徴(例えば、蛍光、吸光度、屈折率)における変化、タンパク質についての水力学的(例えば、形状)、クロマトグラフ的、可溶性性質、WIF-1タンパク質の誘導性マーカーまたは転写活性化を測定すること；結合活性、例えば、Frizzled受容体への結合を測定すること、細胞増殖を測定すること、アポトーシスを測定することなどである。化合物の癌への機能的効果の決定はまた、インビトロのアッセイ法、例えば、軟寒天における細胞成長；足場依存性；成長の接触阻害および密度制限；細胞増殖；細胞形質転換；成長因子または血清依存性；腫瘍特異的マーカーレベル；マトリゲルへの侵襲性；インビボの腫瘍成長および転移；転移を起こしている細胞におけるmRNAおよびタンパク質発現、および癌細胞の他の特徴であることもできる。機能的効果は、当業者に公知の多くの手段、例えば、形態的特徴における変化の定量的または定性的測定のための顕微鏡法、WIF-1 RNAまたはタンパク質レベルにおける変化の測定、RNA安定性の測定、例えば化学ルミネセンス、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導性マーカー、およびリガンド結合アッセイによる、下流またはレポーター遺伝子発現(CAT、ルシフェラーゼ、β-gal、GFPなど)の同定により評価されうる。「機能的効果」は、インビトロ、インビボおよびエクスビボ活性を含む。
【００７２】
WIF-1ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の「アクチベーター」または「モジュレーター」は、WIF-1を活性化する作用物質を指すために用いられる。アクチベーターは、例えば、本発明のポリペプチドの発現を誘導するもしくは活性化するか、または結合して活性化を刺激する、増加させる、開く、活性化する、促進する、もしくは増強する、本発明のポリペプチドの活性を増感させるもしくは上方制御する作用物質である。アクチベーターは、WIF-1をコードする核酸、脱メチル化合物、ならびに天然に存在するおよび合成化合物、化学低分子などを含む。アクチベーターについてのアッセイは、例えば、候補化合物を細胞発現WIF-1へ添加し、その後機能的効果を決定することを含む。可能性のあるアクチベーターで処理される、WIF-1を含む試料およびアッセイは、効果の程度を試験するためにアクチベーター無しでの対照試料と比較される。対照試料(候補作用物質で処理されない)は100%の相対的活性値に割り当てられる。ポリペプチドの活性化は、対照に対してのポリペプチド活性値が110%、任意で150%、任意で200%、300%、400%、500%または1000〜3000%、またはそれ以上である場合達成されている。
【００７３】
「細胞成長における変化」という語句は、病巣の形成、足場非依存性、半固体もしくは軟寒天成長、成長の接触阻害および密度制限における変化、成長因子もしくは血清要求性の喪失、細胞形態における変化、不死化の獲得もしくは喪失、腫瘍特異的マーカーの獲得もしくは喪失、適した動物宿主へ注入された場合の腫瘍を形成もしくは抑制する能力、ならびに/または細胞の不死化のような、インビトロまたはインビボでの細胞成長および増殖特徴における任意の変化を指す。例えば、Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique pp. 231-241 (第3版, 1994)を参照のこと。
【００７４】
「腫瘍細胞」とは、腫瘍における前癌性、癌性および正常な細胞を指す。
【００７５】
「癌細胞」、「形質転換された」細胞、または、組織培養における「形質転換」とは、必ずしも新しい遺伝物質の取り込みを含むとは限らない自発的または誘導された表現型的変化を指す。形質転換は、形質転換ウイルスでの感染および新しいゲノムDNAの組み込み、または外因性DNAの取り込みから生じうるが、自発的に、または発癌物質への曝露後、それにより内因性遺伝子を突然変異させても生じうる。形質転換は、細胞の不死化、異常成長調節、非形態的変化および/または悪性のような表現型的変化に関連している(Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (第3版, 1994)を参照)。
【００７６】
「抗体」とは、抗原を特異的に結合かつ認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認められている免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、および種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κかまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類されるが、それらは、次にはそれぞれ免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEを定義する。典型的には、抗体の抗原結合領域またはそれの機能的等価物は、結合の特異性および親和性において最も重要である。Paul, Fundamental Immunology参照。
【００７７】
例示的な免疫グロブリン(抗体)構造ユニットは四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一の対から構成され、各対は1つの「軽」鎖(約25 kD)および1つの「重」鎖(約50〜70 kD)を有する。各鎖のN末端は、抗原認識を主として担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。
【００７８】
抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼでの消化により作製されるいくつかの十分特徴付けられた断片として存在する。このように、例えば、ペプシンは、抗体をヒンジ領域におけるジスルフィド結合より下で消化して、F(ab)'2、それ自身、ジスルフィド結合によりVH-CH1に連結した軽鎖であるFabの二量体を生じる。F(ab)'2は、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を切断しうる穏やかな条件下で還元されうり、それによりF(ab)'2二量体をFab'単量体へと変換する。Fab'単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部をもつFabである(Fundamental Immunology (Paul ed., 第3版, 1993)参照)。様々な抗体断片が無傷の抗体の消化によって定義されるが、当業者は、そのような断片が化学的にかまたは組換えDNA方法を用いることによってかのいずれかで新規に合成されうることを認識しているものと思われる。従って、本明細書に用いられる場合、抗体という用語はまた、抗体全体の改変により作製される抗体断片か、または組換えDNA方法を用いて新規に合成されるもの(例えば、一本鎖Fv)もしくはファージディスプレイライブラリーを用いて同定されるものかのいずれかを含む(例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)参照)。
【００７９】
抗体、例えば、組換えのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製について、当技術分野において公知の多くの技術が用いられる(例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., pp. 77-96, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); およびGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (第2版, 1986)参照)。一本鎖抗体の作製についての技術(米国特許第4,946,778号)は、本発明のポリペプチドに対する抗体を作製するために適合されうる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物のような他の生物体は、ヒト化抗体を発現させるために用いられうる。または、ファージディスプレイテクノロジーが、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーのFab断片を同定するために用いられうる(例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)参照)。
【００８０】
「キメラ抗体」は、(a)定常領域またはその部分が、抗原結合部位(可変領域)が異なるもしくは変化したクラスの定常領域、エフェクター機能および/もしくは種、またはキメラ抗体に新しい性質を与える全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物など、に連結されているように、変化している、置換されている、または交換されているか；または(b)可変領域またはその部分が、異なるまたは変化した抗原特異性をもつ可変領域で変化している、置換されている、または交換されている、抗体分子である。
【００８１】
本明細書に用いられる場合、「WIF-1発現が下方制御される」または「WIF-1が低発現する」という語句およびそれらの文法的相当語句は、決定された参照レベルより下のWIF-1ポリペプチドまたはWIF-1ポリヌクレオチドを指す。従って、例えば、本発明により、正常もしくは健康な被検体におけるWIF-1ポリペプチドまたはWIF-1ポリヌクレオチドの参照レベルはカットオフ値として同定され、カットオフ値より下では、WIF-1ポリペプチドまたはWIF-1ポリヌクレオチドのレベルと癌の間に有意な相関がある。典型的には、癌細胞におけるWIF-1レベルは、同じ組織由来の正常細胞におけるWIF-1レベルより多くとも約2分の1、通常には多くとも約5分の1、およびより通常には多くとも約10分の1である。「下方制御された」および「低発現した」という用語は、本明細書で交換可能に用いられる。WIF-1レベルを決定するための方法は、本明細書に記載され、限定されるわけではないが、RT-PCRおよび抗WIF-1抗体の使用を含む。
【００８２】
「量を相関させること」とは、一つの試料において決定された物質、分子またはマーカー(WIF-1のような)の量を、もう一つの試料において決定された同じ物質、分子またはマーカーの量と比較することを意味する。もう一つの試料において決定された同じ物質、分子またはマーカーの量は、所定の癌に特異的でありうる。
【００８３】
用語「量を決定すること」の同義語は、本発明の範囲内で企図され、限定されるものではないが、WIF-1のような分子の存在、非存在、量もしくは濃度を検出すること、測定すること、試験すること、または決定することを含む。
【００８４】
II. WIF-1ポリペプチド
本発明は、新規なWIF-1ポリペプチドを提供する。シグナルペプチド配列を含む完全長WIF-1ポリペプチド(例えば、本明細書に記載されたSEQ ID NO:2およびGenBankアクセッション番号を参照)、シグナルペプチドを含まない成熟完全長WIF-1ポリペプチド(例えば、SEQ ID NO:14またはSEQ ID NO:30)は、本発明の方法を実施するために有用であり、本発明の薬学的組成物およびキットにおける組成物として使用を見出す。好ましい態様において、WIF-1ポリペプチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約29位〜379位に対応するアミノ酸配列を含む。このアミノ酸配列は、ヒトWnt2(SEQ ID NO:2)のアミノ酸残基29位〜379位と比較した場合、1つまたは複数のアミノ酸の違い(アミノ酸の付加、置換または欠失)を有しうる。
【００８５】
本発明の他の局面において、WIF-1ポリペプチドは、断片がWIF-1サブドメインを含み、かつWIF-1サブドメインポリペプチドがWntポリペプチドを結合するおよび/またはWntシグナル伝達を阻害する、完全長WIF-1ポリペプチドの断片を含む。従って、好ましいWIF-1ポリペプチドは、Wntポリペプチドに結合するおよび/またはWntシグナル伝達を阻害するWIF-1サブドメインポリペプチドである。好ましい態様において、このサブドメインは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位〜180位を含む。他の好ましい態様において、このドメインは、SEQ ID NO:14のアミノ酸残基1位〜152位、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列、SEQ ID NO:26のアミノ酸配列、SEQ ID NO:27のアミノ酸配列、SEQ ID NO:28のアミノ酸配列、SEQ ID NO:29のアミノ酸配列、またはそれらの配列と少なくとも実質的に同一であり、かつWntポリペプチドに結合するもしくはWntシグナル伝達を阻害するアミノ酸配列を含む。他の態様において、Wnt結合ドメインは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜180位、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位、またはその配列と少なくとも実質的に同一であり、かつWntポリペプチドに結合するおよび/もしくはWntシグナル伝達を阻害するアミノ酸配列を含む。従って、本発明のWIF-1サブドメインポリペプチドは、約120個から約180個までのアミノ酸残基、いくつかの態様において約130個から約150個までのアミノ酸残基を含みうる。
【００８６】
本発明の他の好ましい態様において、WIF-1ポリペプチドは、WIF-1のWnt結合ドメインからなるWIF-1の断片である。好ましい態様において、このサブドメインは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位〜180位からなる。他の好ましい態様において、このドメインは、SEQ ID NO:14のアミノ酸1位〜152位、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列、SEQ ID NO:26のアミノ酸配列、SEQ ID NO:27のアミノ酸配列、SEQ ID NO:28のアミノ酸配列、SEQ ID NO:29のアミノ酸配列、またはそれらの配列と少なくとも実質的に同一であり、かつWntポリペプチドに結合するおよび/もしくはWntシグナル伝達を阻害するアミノ酸配列からなる。他の態様において、Wnt結合ドメインは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜180位、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位、またはその配列と少なくとも実質的に同一であり、かつWntポリペプチドに結合するおよび/もしくはWntシグナル伝達を阻害するアミノ酸配列からなる。従って、本発明のWIF-1サブドメインポリペプチドは、約120個から約180個までのアミノ酸残基、およびいくつかの態様において約130個から約150個までのアミノ酸残基からなりうる。
【００８７】
WIF-1の好ましい断片は、SEQ ID NO:14のアミノ酸残基1位〜152位、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29のアミノ酸配列、またはそれらの配列と少なくとも実質的に同一のアミノ酸配列を含む。本発明はまた、これらのサブドメインポリペプチドの機能的断片を提供する。従って、例えば、SEQ ID NO:14のアミノ酸残基1位〜152位、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29の約70個のアミノ酸残基、SEQ ID NO:14のアミノ酸残基1位〜152位、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29の約80個のアミノ酸残基、SEQ ID NO:14のアミノ酸残基1位〜152位、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29の約90個のアミノ酸残基、SEQ ID NO:14のアミノ酸残基1位〜152位、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29の約100個のアミノ酸残基、SEQ ID NO:14のアミノ酸残基1位〜152位、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29の約110個のアミノ酸残基、SEQ ID NO:14のアミノ酸残基1位〜152位、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29の約120個のアミノ酸残基、SEQ ID NO:14のアミノ酸残基1位〜152位、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29の約130個のアミノ酸残基、またはそれらの配列と少なくとも実質的に同一であり、かつWntポリペプチドを結合するおよび/もしくはWntシグナル伝達を阻害するアミノ酸配列を含む、SEQ ID NO:14のアミノ酸残基1位〜152位、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29のより短い断片もまた好ましい。
【００８８】
本発明のもう一つの態様において、Wntポリペプチドに結合する、および/またはWntシグナル伝達を阻害するWIF-1サブドメインポリペプチドは、SEQ ID NO:2に示されたWIF-1前駆体タンパク質の配列の99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%または30%以下を含む断片である。もう一つの好ましい態様において、Wntポリペプチドに結合する、および/またはWntシグナル伝達を阻害するWIF-1サブドメインポリペプチドは、シグナルペプチド配列
2008500398.tif 000003
を含まないSEQ ID NO:2に示されたWIF-1前駆体タンパク質の配列の99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%または30%以下を含む断片である。
【００８９】
もう一つの好ましい態様において、WIF-1サブドメインポリペプチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約1位〜180位に、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約29位〜180位に、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位に対応するアミノ酸配列を含む。これらのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約1位〜180位、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基約29位〜180位、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位と比較した場合、1つまたは複数のアミノ酸の違い(アミノ酸の付加、置換、または欠失)を有しうる。
【００９０】
好ましくは、WIF-1サブドメインポリペプチド断片は、上で列挙された配列の連続した配列を含む。しかしながら、本明細書に記載されているように、アミノ酸残基の1つもしくは複数の挿入、置換および/または付加が行われうる。そのようなポリペプチドは、それらがWntポリペプチドに結合するかおよび/またはWntシグナル伝達を阻害するかのいずれかである限り本発明に含まれる。
【００９１】
SEQ ID NO:2の178位におけるアミノ酸は、ロイシン(例えば、SEQ ID NO:2ならびにGenBankアクセッション番号AAD25402およびNP_009122を参照)かまたはグルタミン(例えば、SEQ ID NO:14および16ならびにGenBankアクセッション番号Q9Y5W5、AAH18037、AAQ88710を参照)のいずれかでありうる。
【００９２】
まだなお機能的WIF-1サブドメインポリペプチドを生じる他のアミノ酸置換は、本明細書での教示により、例えば図20により、明らかであると思われる。WIF-1サブドメインポリペプチドに対応するアミノ酸配列は、ヒト、ラット、マウス、アフリカツメガエルおよびゼブラフィッシュのような多様な種の間で良く保存されているが、保存的および非保存的置換を含む特定のアミノ酸置換が見出される(図25)。これらのアミノ酸置換は、見たところでは、WIF-1活性に干渉しない。従って、ヒトWIF-1サブドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数を含みうる：H43N、V47I、S59A、S86A、S86H、M87V、A94S、A94T、G95D、L104Q、S105T、G112D、A115D、V121M、L123R、T126S、S132T、V134I、L141R、K143N、K143D、D153N、D153T、V154I、I155L、N158D、S159A、E160G、T163P、T163V、T163I、Q166R、またはQ169H。
【００９３】
本発明のもう一つの好ましい態様において、WIF-1ポリペプチド、好ましくはWIF-1サブドメインポリペプチドはグリコシル化されている。N結合型アミノ酸コンセンサス配列は、Asn-X-SerまたはThrであり、Xは任意のアミノ酸残基でありうるが、プロリンではない。たいていのタンパク質へのO結合型糖共有結合性付着は、単糖N-アセチルガラクトサミンとアミノ酸セリンまたはトレオニンの間の結合を含む。N結合型グリコシル化部位、NFT、NCSは、それぞれ、SEQ ID NO:2の88位に、およびSEQ ID NO:2の245位に見出される。従って、完全長WIF-1ポリペプチドは、両方のN結合型グリコシル化部位を含み、WIF-1サブドメインポリペプチドは、NFTグリコシル化部位のみを含む。これらのグリコシル化部位は、分析されるすべてのWIF-1種の間で保存され(図25参照)、WIF-1の重要な機能的特徴を示している。真核細胞から精製された組換え完全長WIF-1ポリペプチドおよび組換えWIF-1サブドメインポリペプチドはグリコシル化されているが、細菌で作製されたWIF-1ポリペプチド上にグリコシル化は見出されない(データ示されず)。従って、本発明の好ましい態様において、WIF-1ポリペプチド、および好ましくはWIF-1サブドメインポリペプチドは、真核細胞において産生される。真核細胞における組換えタンパク質の産生のための方法は本明細書に記載されている。
【００９４】
従って、本発明の好ましい態様において、少なくとも2つのN結合型グリコシル化部位を含むWIF-1ポリペプチドが提供される。本発明はさらに、少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドを提供する。本明細書に記載されているように、グリコシル化WIF-1ポリペプチドおよびグリコシル化サブドメインポリペプチドは、それらのグリコシル化されていない対応物より、アポトーシスを引き起こすにおいてより強力である。従って、本発明はまた、少なくとも1つの追加のN結合型グリコシル化部位を含むWIF-1ポリペプチドおよびWIF-1サブドメインポリペプチドを提供する。追加のグリコシル化部位は、当技術分野において知られているようなインビトロ突然変異誘発方法を用いて付加されうる。
【００９５】
III. WIF-1配列の同定
本発明の一つの局面において、WIF-1 mRNAまたはタンパク質のレベルは、診断的または予後的情報が望まれる患者の試料において決定される。すなわち、正常な組織(例えば、正常な肺、乳房または他の組織)が、同じ源からの癌性もしくは転移性癌性組織と区別されうる；または、癌組織もしくは転移性癌性組織が、他の患者、例えば生存している癌患者からの同様の組織試料と比較されうる。
【００９６】
A. 一般的な組換えDNA方法
本発明のこの局面は、組換え遺伝学の分野における日常的技術に依拠している。本発明で用いる一般的な方法を開示する基本的なテキストは、Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3版, 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994-1999)を含む。本発明に用いるWIF-1を作製するために用いられる方法はまた、本発明に用いる、リガンドの受容体への結合を調節するタンパク質リガンドまたはポリペプチドを作製するために用いられうる。
【００９７】
核酸について、サイズはキロベース(kb)かまたは塩基対(bp)のいずれかで与えられる。これらは、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動から、シーケンシングされた核酸から、または公開されたDNA配列から導かれた推定値である。タンパク質について、サイズは、キロダルトン(kDa)またはアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動から、シーケンシングされたタンパク質から、由来するアミノ酸配列から、または公開されたタンパク質配列から推定される。
【００９８】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981)により最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル方法により、Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)に記載されているように自動化合成機を用いて、化学的に合成されうる。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動によるかまたはPearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983)に記載されているように陰イオン交換HPLCによるかのいずれかである。
【００９９】
クローン化遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Wallace et al., Gene 16:21-26 (1981)の二本鎖鋳型をシーケンシングするためのチェーンターミネーション法、を用いてクローニング後検証されうる。
【０１００】
1. ヌクレオチド配列の単離のためのクローニング方法
一般的に、WIF-1をコードする核酸配列および関連した核酸配列相同体は、プローブとのハイブリダイゼーションによりcDNAおよびゲノムDNAライブラリーからクローニングされるか、またはオリゴヌクレオチドプライマーでの増幅技術を用いて単離される。例えば、配列は、典型的には、配列がSEQ ID NO:1由来でありうる核酸プローブとハイブリダイズすることにより哺乳動物核酸(ゲノムまたはcDNA)ライブラリーから単離される。
【０１０１】
プライマーを用いる増幅技術もまた、DNAまたはRNAから核酸を増幅かつ単離するために用いられうる(例えば、下のセクション「ポリヌクレオチドの検出」を参照)。特定の配列の増幅のための適切なプライマーは、当技術分野において周知の原理を用いて設計されうる(例えば、Dieffenfach & Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual (1995)参照)。これらのプライマーは、例えば、完全長配列か、またはその後WIF-1ポリヌクレオチドを同定するために用いられる、典型的にはサイズが10ヌクレオチドから数百ヌクレオチドまでいろいろある、プローブかのいずれかを増幅するために用いられうる。
【０１０２】
WIF-1をコードする核酸はまた、プローブとして抗体を用いて発現ライブラリーから単離されうる。そのようなポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、SEQ ID NO:2の配列を用いて産生されうる。
【０１０３】
合成オリゴヌクレオチドはまた、プローブとしての使用のための、またはタンパク質の発現のための、WIF-1遺伝子を構築するために用いられうる。この方法は、遺伝子のセンス鎖およびナンセンス鎖の両方を表す、通常には長さが40〜120 bpの、一連の重複オリゴヌクレオチドを用いて行われる。これらのDNA断片は、その後、アニール、ライゲーションおよびクローニングされる。または、増幅技術は、核酸の特定の部分配列を増幅するために正確なプライマーで用いられる。特定の部分配列は、その後、発現ベクターへライゲーションされる。
【０１０４】
WIF-1をコードする核酸は、典型的には、複製および/もしくは発現のための原核細胞または真核細胞への形質転換の前に、中間ベクターへクローニングされる。中間ベクターは、典型的には原核生物ベクター、例えばプラスミドまたはシャトルベクターである。
【０１０５】
任意で、WIF-1またはそのドメインを含むキメラタンパク質をコードする核酸は、標準技術に従って作製されうる。例えば、そのようなリガンド結合ドメインのようなドメインは、異種性タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、またはβ-ガラクトシダーゼに共有結合性に連結されうる。
【０１０６】
2. 原核生物および真核生物における発現
WIF-1核酸の高レベル発現を得るために、典型的には、転写を支配しうる強いプロモーター、転写/翻訳ターミネーター、および、タンパク質をコードする核酸についての場合には、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクターへWIF-1核酸をサブクローニングする。適した細菌プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook & Russell, 前記, Ausubel et al., 前記に記載されている。WIF-1タンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌(E. coli)、バチルス種(Bacillus sp.)およびサルモネラ(Salmonella)において利用できる(Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983))。そのような発現系についてのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための真核生物発現系は当技術分野において周知であり、また市販されている。一つの態様において、真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
【０１０７】
異種性核酸の発現を指揮するために用いられるプロモーターは、特定の適用に依存する。プロモーターは、任意で、異種性転写開始部位から、それの天然の設定における転写開始部位からの距離とおよそ同じ距離に配置される。しかしながら、当技術分野において知られているように、この距離におけるいくらかの変動は、プロモーター機能の損失なしに適応されうる。
【０１０８】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、宿主細胞においてWIF-1コード化核酸の発現に必要とされるすべての追加のエレメントを含む転写ユニットまたは発現カセットを含む。典型的発現カセットは、このように、WIF-1、および転写産物の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナルをコードする核酸配列に実施可能に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位、ならびに翻訳終結を含む。WIF-1をコードする核酸配列は、典型的には、形質転換細胞によるコード化されたタンパク質の分泌を促進するために切断可能なシグナルペプチド配列に連結されうる。そのようなシグナルペプチドは、とりわけ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インスリン、およびニューロン成長因子、ならびにオオタバコガ(Heliothis virescens)の幼若ホルモンエステラーゼ由来のシグナルペプチドを含みうる。カセットの追加のエレメントは、エンハンサー、およびゲノムDNAが構造遺伝子として用いられる場合には、機能的スプライス供与部位および受容部位をもつイントロンを含みうる。
【０１０９】
プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた、効率的な終結を提供するための構造遺伝子の下流に転写終結領域を含むべきである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られうる、または異なる遺伝子から得られうる。
【０１１０】
遺伝情報を細胞へ輸送するために用いられる特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞または原核細胞における発現に用いられる通常のベクターのいずれかが用いられうる。標準的細菌発現ベクターは、pBR322に基づいたプラスミド、pSKF、pET23Dのようなプラスミド、ならびにGSTおよびLacZのような融合発現系を含む。エピトープタグもまた、単離の便利な方法を提供するために、組換えタンパク質に付加されうり、例としては、c-mycが挙げられる。
【０１１１】
真核生物ウイルス由来の制御エレメントを含む発現ベクターは、典型的には、真核生物発現ベクター、例えば、SV40ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バーウイルス由来のベクターにおいて用いられる。他の例示的な真核生物ベクターは、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、真核生物細胞における発現に効果的であると示されている他のプロモーターの指揮下における、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、およびタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターを含む。
【０１１２】
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼのような遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。または、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強いバキュロウイルスプロモーターの指揮下でのWIF-1コード化配列を含む、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターを用いるような、遺伝子増幅を含まない高収量発現系もまた適している。
【０１１３】
典型的に発現ベクターに含まれるエレメントはまた、大腸菌において機能するレプリコン、組換えプラスミドを含む細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領域における固有の制限部位を含む。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当技術分野において公知の多くの耐性遺伝子のいずれでも適している。原核生物配列は、必要ならば、真核細胞においてDNAの複製を干渉しないように選択されてもよい。
【０１１４】
標準トランスフェクション方法は、後で標準技術を用いて精製される多量のWIF-1タンパク質を発現させる細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞系を産生するために用いられる(例えば、Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990参照)。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準技術に従って行われる(例えば、Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)。
【０１１５】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞へ導入するための周知の手順のうちのいずれかが用いられうる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソーム、微量注入、プラズマベクター、ウイルスベクターの使用、およびクローン化ゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞へ導入するための他の周知の方法のいずれかを含む(例えば、Sambrook and Russell., 前記参照)。用いられる特定の遺伝子操作手順が、WIF-1を発現させる能力がある宿主細胞へ少なくとも1つの遺伝子をうまく導入することができることが必要なだけである。
【０１１６】
発現ベクターが細胞へ導入された後、トランスフェクションされた細胞は、WIF-1の発現に有利である条件下で培養され、これは、標準技術を用いて培養物から回収される(例えば、Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); 米国特許第4,673,641号; Ausubel et al., 前記;およびSambrook et al., 前記を参照)。
【０１１７】
IV. WIF-1ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの検出
A. 被検体における癌細胞の検出
本発明のWIF-1ポリペプチドは様々な方法において使用を見出す。本発明の好ましい態様において、被検体において癌細胞を検出する方法が提供される。この方法は、被検体由来の生体試料を供給する段階であって、生体試料が癌細胞ではないかと疑われる細胞を含む段階、および細胞においてWIF-1発現のレベルを検出する段階を含む。任意で、この方法は、細胞におけるWIF-1発現のレベルを、1つもしくは複数の健康な被検体由来の細胞におけるWIF-1発現のレベルと、またはWIF-1発現のレベルについて以前に決定された参照範囲と比較する段階を含む。本発明の一つの態様において、WIF-1発現のレベルを検出する段階は、WIF-1 mRNAのレベルを検出することにより行われる。本発明のもう一つの態様において、WIF-1発現のレベルを検出する段階は、WIF-1ポリペプチドのレベルを検出することにより行われる。抗WIF-1抗体のようなこの方法に用いる作用物質は、本明細書に開示されている。
【０１１８】
WIF-1発現のレベルの検出は、様々な理由で決定されうる。WIF-1発現のレベルを検出することは、(i)被検体における癌のスクリーニング、診断または予後の一部；(ii)被検体の癌に対する感受性を決定することの一部；(iii)被検体において癌の病期もしくは重症度を決定することの一部；(iv)癌を発症する被検体についてのリスクを同定することの一部；または(v)癌と診断された被検体に投与される抗癌薬もしくは治療の効果をモニターすることの一部でありうる。被検体に投与される抗癌薬または治療は、WIF-1ポリペプチド、好ましくは本発明のWIF-1サブドメインポリペプチドを含みうる。
【０１１９】
B. 癌を発症するリスクのある被検体の同定、および癌の病期または重症度の被検体における同定
本発明の好ましい態様において、癌を発症するリスクのある被検体を同定するための、または癌の病期もしくは重症度を被検体において同定するための方法が提供される。本明細書に示されているように、WIF-1発現は、様々な癌細胞において下方制御される(図2)。本明細書にさらに示されているように、WIF-1ポリペプチド、特に組換えWIF-1ポリペプチド、は用量依存性様式で癌細胞において誘導される(図10〜15)。従って、WIF-1の量は、例えば、高い、中程度、または低いといった様々な癌リスク状態を特徴を示している。癌を発症するリスクは、WIF-1を測定し、その後、測定値を分類アルゴリズムにかけるか、または、癌の特定のリスクレベルと、もしくは癌の特定の病期もしくは重症度と関連しているWIF-1の参照量および/もしくはパターンとそれらを比較するかのいずれかにより決定されうる。
【０１２０】
本発明の方法を用いて、WIF-1レベルは、癌を発症するリスクが決定されることになっている被検体由来の生体試料において決定される。正常なもしくは健康な被検体由来の比較生体試料において検出されるWIF-1レベルより低い、またはあらかじめ決定された基準レベルより低い、前立腺癌を発症するリスクが決定されることになっている被検体由来の生体試料において検出されるWIF-1レベルは、癌を発症するリスクが決定されることになっている被検体が癌を発症するリスクをもつことを示している。
【０１２１】
C. 被検体における癌のスクリーニング、診断または予後
本発明のもう一つの好ましい態様において、被検体における癌は、被検体における癌のスクリーニング、診断または予後の一部として決定される。本発明の方法を用いて、WIF-1レベルが、癌についてスクリーニングされるべき被検体由来の生体試料において検出される。正常なもしくは健康な被検体由来の比較生体試料において検出されるWIF-1レベルより低い、またはあらかじめ決定された基準レベルより低い、癌についてスクリーニングされるべき被検体由来の生体試料において検出されるWIF-1レベルは、癌についてスクリーニングされた被検体が癌をもっている、または癌をもつ可能性が高いことを示している。
【０１２２】
D. 過剰メチル化配列の検出
一つの局面において、本発明は、癌細胞を検出する方法を提供する。好ましくは、癌の検出は、被検体において、より好ましくは哺乳動物において、および最も好ましくはヒトにおいてである。本明細書に記載された組成物および方法を用いて、癌の検出は様々な方法で行われうる。一つの態様において、癌は、過剰メチル化WIF-1プロモーターを検出するための方法を用いて検出される。
【０１２３】
一つの態様において、癌細胞、例えば、肺癌または乳癌細胞はWIF-1プロモーターのようなWIF-1制御エレメントの過剰メチル化の存在を検出することにより検出される。本発明のいくつかの局面において、WIF-1制御エレメント内に含まれるポリヌクレオチド配列の過剰メチル化が検出される。WIF-1制御エレメント内に含まれる好ましいポリヌクレオチド配列はCpGアイランドを含む。
【０１２４】
本発明の好ましい態様において、過剰メチル化WIF-1プロモーターを検出するための方法が提供される。過剰メチル化WIF-1プロモーターは、当技術分野において公知の任意の技術、例えば、亜硫酸水素塩、メチル化特異的PCR、またはメチル化感受性制限酵素を用いることを用いて検出されうる。本発明の好ましい態様において、方法は、過剰メチル化WIF-1プロモーターを、過剰メチル化WIF-1プロモーターに特異的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドと、過剰メチル化WIF-1プロモーターとを検出するのに有効な量で接触させる段階を含む。本発明を実施するのに有用なオリゴヌクレオチドは本明細書に記載されている。この方法は、任意で、WIF-1プロモーターのメチル化の量を決定し、それを正常な試料と比較する段階を含む。
【０１２５】
過剰メチル化WIF-1プロモーターの検出は、患者のような被検体由来の生体試料において行われうる。正常に対する試料におけるメチル化の量の増加を検出することは、患者における癌の存在を示している。
【０１２６】
上で考察されているように、プロモーター領域におけるシステイン残基の過剰メチル化は、WIF-1の低発現の指標である。メチル化の程度は、様々な方法を用いて検出されうる。例えば、メチル化分析は、WIF-1プロモーターのCpGアイランド内のメチル化感受性制限部位を評価する、サザンハイブリダイゼーションを用いて行われうる。認識部位の一部としてCGを含む、およびCがメチル化されている場合抑制される、任意の制限エンドヌクレアーゼが、この分析のために利用されうる。メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、AciI、BsiEI、BssHII、BstUI、EagI、FauI、HaeII、HpaI、HpaII、MspI、NarI、NotI、SacII、またはSmaIを含む。これらの酵素は単独でまたは組み合わせて用いられうる。
【０１２７】
DNAメチル化パターンをマッピングするためのより感度の高いアッセイ法もまた利用できる。これらは、亜硫酸水素塩DNAシーケンシングおよびメチル化特異的PCRを含む。これらの技術は、対象となる単一のCpGアイランドに渡る複数のCpGジヌクレオチドの分析を可能にする。亜硫酸水素塩DNAシーケンシングは、非メチル化シトシンがウラシルへ変換される条件下でのゲノムDNAの亜硫酸水素塩誘発改変に基づいている。亜硫酸水素塩改変配列は、その後、すべてのウラシルおよびチミン残基がチミンとして増幅され、かつ5-メチルシトシン残基のみがシトシンとして増幅される、1対の断片、各鎖から1つを生じるように2セットの鎖特異的プライマーでのPCRにより増幅される。PCR産物は、直接的にシーケンシングされうる、または単一DNA分子のメチル化マップを提供するためにクローニングおよびシーケンシングされうる(例えば、Frommer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1827-1831 (1992)を参照)。
【０１２８】
メチル化特異的PCRもまた、メチル化感受性制限酵素の使用とは無関係に、CpGアイランド内のCpGジヌクレオチド部位のメチル化状態を評価するために用いられうる。このアッセイ法は、非メチル化シトシンをウラシルへ変換するが、メチル化シトシンを変換しない、亜硫酸水素ナトリウムまたは他の匹敵する作用物質によるDNAの最初の改変を含む。メチル化DNAまたは非メチル化DNAに特異的なプライマーでのその後の増幅は、結果としてメチル化CpGジヌクレオチドからなるDNAの増幅を生じる。プライマーは、メチル化DNAと非メチル化DNAの間を特異的に区別する。これを達成するために、プライマー配列は、典型的には、頻繁なシトシンを含む領域について選択され(非改変DNAと改変DNAを区別するために)、CpGペアはプライマーの3'末端近くにある(メチル化DNAと非メチル化DNAの間のPCR反応において最大限の識別を提供するために)。DNAの2つの鎖は、亜硫酸水素塩処理後、もはや相補的ではないため、プライマーはいずれかの改変鎖について設計されうる。例えば、メチル化DNAに特異的なプライマーは、典型的には、3'CGペアにおけるTを、それとメチル化DNAにおいて保持されたCと区別するために有し、相補体は、アンチセンスプライマーについて設計される。特許第5,786,146号; Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826 (1996)参照。
【０１２９】
WIF-1プロモーター領域内のメチル化および非メチル化DNA配列を増幅するためのプライマーの例示的なセットは、例えば、それぞれ、WIF-1プロモーター領域配列-488位〜-468位および-310位〜-290位に対応する、メチル化特異的プライマー：
2008500398.tif 000004
および
2008500398.tif 000005
ならびに非メチル化特異的プライマー：
2008500398.tif 000006
および
2008500398.tif 000007
を含む(実施例参照)。
【０１３０】
一つの局面において、メチル化WIF-1プロモーター配列は、本明細書にさらに記載されているように、質量分析法により検出される。Bane et al.(Nucleic Acids Res. 30(14):e69 (2002); 参照により全体として本明細書に組み入れられている)により記載された方法は特に有用である。Bane et al.は、メチル化および非メチル化プロモーターを含むDNA断片を分析するためのSELDI-TOF質量分析法の使用を記載している。
【０１３１】
本発明に用いるもう一つの好ましい質量分光学的技術は、MALDI-TOF MS(マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法)である。MALDI-TOF MSは、質量分析法の最近の改良型である。分析されるべき分子は、イオン化しないがDNA分子のような大きな分子のイオン化を助けるマトリックスと混合される。例えば、マトリックスは、DNA分子と混合される紫外線吸収物質でありうる。MALDI-TOF MSは、様々なサイズのDNA分子を分析するために適用されうる。飛行時間は、イオンの高処理量を可能にする。試料は、この手順を用いて2〜3秒間で分析されうる。例示的なMALDI-TOFテクノロジーは、例えば、米国特許出願第2001/0033809号、第2003/0010908号、第2003/0164449号、および第2004/0050787号、Humeny et al., Anal. Biochem. 313(1):160-166 (2003), Schatz et al., Nucleic Acids Res. 32(21):e167 (2004)およびRakyan et al., PLos Biol. 2(12):e405 (2004)に記載されている；すべては参照により全体として本明細書に組み入れられている。MALDI-TOFはまた、DNA分子のDNAシーケンシングに適用されうる(例えば、Taranenko et al., Nucleic Acids Res. 26(10):2488-2490 (1998); Edwards et al., Nucleic Acids Res. 29(21):e104 (2001)参照)。従って、本明細書に記載されているように作製されたPCR産物の質量分析法によるシーケンシングのための方法および試薬もまた、本明細書において企図される。
【０１３２】
E. WIF-1 mRNAの検出
一つの態様において、癌を検出する方法は、患者のような被検体由来の生体試料においてWIF-1をコードする転写産物(例えば、Genbankアクセッション番号NM 007191およびSEQ ID NO:1を参照)のレベルを決定する段階を含む。正常に対するWIF-1 mRNAのレベルにおける減少を検出することは、被検体における癌の存在を示す。一つの態様において、WIF-1 mRNAのレベルを決定する段階は、増幅反応を含む。もう一つの態様において、癌の存在は、WIF-1をコードするmRNAの発現のレベルを細胞において決定することにより評価される。対応する非癌性組織においてよりも低いWIF-1 mRNAレベルは癌の存在を示す。特定の遺伝子のRNA発現を評価する方法は、当業者に周知であり、とりわけ、ハイブリダイゼーションおよび増幅に基づいたアッセイ法を含む。
【０１３３】
1. 直接的なハイブリダイゼーションに基づいたアッセイ法
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いるWIF-1遺伝子転写産物(mRNAまたはそれから作製されたcDNA)のレベルを検出および/または定量化する方法は、当業者に公知である。例えば、WIF-1ポリヌクレオチドの存在、非存在または量を評価するための一つの方法は、ノーザンブロットを含む。遺伝子発現レベルはまた、当技術分野において公知の技術、例えば、ドットブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼプロテクション、探索DNAマイクロチップアレイなどにより分析されうる。
【０１３４】
2. 増幅に基づいたアッセイ法
もう一つの態様において、増幅に基づいたアッセイ法は、WIF-1の発現レベルを測定するために用いられる。そのようなアッセイ法において、WIF-1核酸配列は、増幅反応(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちPCR)における鋳型として働く。定量的増幅において、増幅産物の量は、最初の試料における鋳型の量に比例する。適切な対照との比較は、試料におけるWIF-1のレベルの測度を提供する。定量的増幅の方法は、当業者に周知である。定量的PCRについての詳細なプロトコールは、例えば、Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.)に提供されている。WIF-1(例えば、SEQ ID NO:1参照)についての公知の核酸配列は、当業者が、遺伝子の任意の部分を増幅するようにプライマーを日常的に選択するのを可能にするのに十分である。
【０１３５】
一つの態様において、TaqManに基づいたアッセイ法は、癌関連ポリヌクレオチドを定量化するために用いられる。TaqManに基づいたアッセイ法は、5'蛍光色素および3'消光剤を含む蛍光発生的なオリゴヌクレオチドプローブを用いる。プローブはPCR産物にハイブリダイズするが、それ自身、3'末端におけるブロッキング剤のために伸長されることができない。PCR産物がその後のサイクルにおいて増幅される場合、ポリメラーゼ、例えば、AmpliTaq、の5'ヌクレアーゼ活性は、結果として、TaqManプローブの切断を生じる。この切断は、5'蛍光色素および3'消光剤を切り離し、それにより、結果として増幅の関数として蛍光における増加を生じる(例えば、Perkin-Elmerにより提供された文献、例えば、www2.perkin-elmer.com、を参照)。
【０１３６】
他の適した増幅方法は、限定されるわけではないが、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Wu and Wallace, Genomics 4:560 (1989); Landegren et al., Science 241:1077 (1988); およびBarringer et al., Gene 89:117 (1990)を参照)、転写増幅(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989))、自律的配列複製(Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1874 (1990))、ドットPCR、およびリンカーアダプターPCRなどを含む。
【０１３７】
F. WIF-1ポリペプチドの検出
もう一つの態様において、癌を検出する方法は、患者のような被検体由来の生体試料においてWIF-1ポリペプチドのレベルを決定する段階を含む。正常に対するWIF-1ポリペプチドのレベルにおける減少を検出することは、被検体における癌の存在を示す。
【０１３８】
WIF-1発現の下方制御は、様々な癌を示し、かつ相関されうる。従って、WIF-1ポリペプチドまたはWIF-1ポリヌクレオチドは、癌の診断におけるバイオマーカーとして用いられうる。本発明の一つの好ましい態様において、生体試料におけるWIF-1の量が決定される。典型的には、正常な健康または非癌被検体から供給された生体試料におけるWIF-1の量は、癌被検体から、または癌をもつのではないかと疑われる被検体から供給された生体試料におけるWIF-1の量と関連づけられる。癌被検体由来、または癌をもつのではないかと疑われる被検体由来の生体試料において検出されるWIF-1の量は、所定の癌に特異的でありうる。
【０１３９】
WIF-1ポリペプチドの検出は、限定されるわけではないが、本明細書にさらに記載されているように、または当業者に知られているように、親和性捕獲、質量分析法、伝統的な、WIF-1に方向づけられるイムノアッセイ法、PAGE、HPLCを含む任意の特異的検出方法により達成されうる。
【０１４０】
このために用いられうる検出パラダイムは、光学的方法、電気化学的方法(ボルタンメトリーおよびアンペロメトリー技術)、原子間力顕微鏡法、および高周波方法、例えば、多極共鳴分光法を含む。共焦点および非共焦点の両方の顕微鏡法に加えて、光学的方法の具体例は、蛍光、ルミネセンス、化学ルミネセンス、吸光度、反射率、透過率、および複屈折または屈折率の検出(例えば、表面プラズモン共鳴、楕円偏光法、共振ミラー方法、格子結合器導波管方法または干渉法)である。
【０１４１】
1. 質量分析法による検出
本発明の好ましい態様において、WIF-1ポリペプチドは、質量分析法、気相イオンを検出するために質量分析計を用いる方法により検出される。一般的に、質量分析法は、分子のイオン化または気化、電場においてイオンを加速すること、およびイオンに磁場を通過させることを含む。イオンは、磁場を通過する時、それらの質量に従って分離され、その後、同定および分析のために検出器へ向けられる。質量分析法データは、試料あたり1分未満で収集されうる。
【０１４２】
本発明に用いる好ましい質量分光学的技術は、表面増強レーザー脱離/イオン化(SELDI)である。「SELDI」は、WIF-1ポリペプチドのような分析物をエネルギー源へ提示する基板の表面が、脱離およびイオン化過程において積極的役割を果たす、気相イオン分光測定法である。SELDIテクノロジーは、参照により全体として本明細書に組み入れられている、例えば米国特許第5,719,060号に記載されている。WIF-1ポリペプチドおよびWIF-1ポリヌクレオチドを検出するのに適した他の質量分析法は、米国特許第5,894,063号、第6,020,208号、第6,027,942号、第6,528,320号、米国特許出願第2003/0091976号および第2002/0060290号に記載されており、それらのすべては参照により全体として本明細書に組み入れられている。
【０１４３】
WIF-1ポリペプチドの検出のためのもう一つの好ましい質量分光学的技術は、上記のようなMALDI-TOF MSである。本発明に用いる他の好ましい質量分光学的技術は、例えば、Song et al. (Anal. Chem. 77(2):504-510 (2005))により記載されているようなLC-ESI MS(液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法(Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry))である。
【０１４４】
典型的には、質量分析法により分析されるべきWIF-1ポリペプチドまたはWIF-1ポリヌクレオチド(例えば、PCR産物)のような分析物は、それがイオン源へ提示されるプローブに付着している。プローブ(例えば、バイオチップ)は、それが気相イオン分光計との使用に適応される限り、任意の適した形(例えば、正方形、長方形、円など)で形成されてもよい(例えば、気相イオン分光計へ取り外し可能に挿入できる)。例えば、プローブは、あらかじめ決められたアドレス可能な位置に一連のウェルをもつ条片、プレート、もしくはディッシュの形をとりうる、または他の表面特徴をもちうる。プローブはまた、気相イオン分光計の吸入系および検出器との使用のために形づけられてもよい。例えば、プローブは、プローブを連続した位置へ、手でプローブの位置を変える必要なしに水平に、垂直に、および/または回転的に動く、水平に、垂直に、および/または回転的に移動可能なキャリッジに取り付けるのに適応されうる。
【０１４５】
特定の態様において、プローブ基板表面は、分析物を結合するように調整されうる。例えば、プローブ基板の表面は、表面上に吸着剤を置くために調整されうる(例えば、ざらざらにするように化学的にまたは機械的に)。吸着剤は、WIF-1ポリペプチドのような分析物との結合のための官能基を含む。いくつかの態様において、基板材料自身もまた、吸着性質に寄与しうり、吸着剤の一部とみなされうる(例えば、米国特許出願第2003/0091976号参照)。
【０１４６】
吸着剤は、連続的または非連続的パターンでプローブ基板上に置かれうる。連続の場合には、1つまたは複数の吸着剤が、基板表面上に置かれうる。吸着剤の複数の型が用いられる場合には、基板表面は、1つまたは複数の結合特性が一次元または二次元勾配で異なるようにコーティングされうる。非連続の場合には、複数の吸着剤が、基板表面上のあらかじめ決められたアドレス可能な位置または表面特徴(例えば、質量分析計のレーザービームによりアドレス可能な)に置かれうる。プローブまたはバイオチップの表面特徴は、様々な態様を含む。例えば、バイオチップは、任意で、例えば、線、直交アレイ、円、n面の多角形(nは3以上である)に配置された複数の表面特徴を含む。複数の表面特徴は、典型的には、論理学的または空間的アレイを含む。任意で、複数の表面特徴のそれぞれは、同一もしくは異なる吸着剤、または1つもしくは複数のそれらの組み合わせを含む。例えば、複数の表面特徴のうちの少なくとも2つは、任意で、同一もしくは異なる吸着剤、または1つもしくは複数のそれらの組み合わせを含む。適した吸着剤は、例えば、米国特許出願第2003/0091976号に記載されている。
【０１４７】
プローブ基板は、任意の適した材料から作製されうる。プローブ基板は、好ましくは、吸着剤を支持する能力がある材料から作製される。例えば、プローブ基板材料は、限定されるわけではないが、絶縁材料(例えば、プラスチック、セラミック、ガラスなど)、磁気材料、半導体材料(例えば、シリコン、ウェーハー)または電気伝導材料(例えば、ニッケルのような金属、真鍮、スチール、アルミニウム、金、メタロイド、合金もしくは電気伝導性ポリマー)、ポリマー、有機ポリマー、伝導性ポリマー、バイオポリマー、天然バイオポリマー、有機ポリマーでコーティングされた金属、合成ポリマー、複合材料、またはそれらの任意の組み合わせを含みうる。プローブ基板材料はまた、固体または多孔性であってもよい。
【０１４８】
プローブは、任意で、基板材料および/または吸着剤の選択に依存する任意の適した方法を用いて作製される。例えば、金属基板の表面は、金属表面の誘導体化を可能にする材料でコーティングされうる。より具体的には、金属表面は、酸化珪素、酸化チタニウム、または金でコーティングされうる。その後、表面は、一方の末端が表面上の官能基と共有結合性に結合でき、かつ他方の末端が吸着剤として機能する基でさらに誘導体化される、二官能性リンカーで誘導体化されうる。もう一つの例において、結晶シリコンから作製される多孔性シリコン表面は、分析物を結合するために吸着剤を含むように化学的に改変されうる。さらにもう一つの例において、ヒドロゲルバックボーンをもつ吸着剤は、例えば、置換アクリルアミドモノマー、置換アクリル酸モノマー、または吸着剤として選択された官能基を含むそれらの誘導体を含むモノマー溶液をインサイチューで重合させることにより基板表面上に直接的に形成されうる。本発明に用いるのに適したプローブは、例えば、米国特許第5,617,060号、第5,894,063号、第6,020,208号、第6,027,942号、第6,528,320号、WO 98/59360、ならびに米国特許出願第2003/0091976号および第2002/0060290号に記載されており、それらのすべては参照により全体として本明細書に組み入れられている。
【０１４９】
2. WIF-1の抗体の産生および免疫学的検出
抗体もまた、WIF-1を検出するために用いられうる。WIF-1に対する抗体は、市販されている(例えば、Santa Cruz Biotechnology)、または周知の技術(例えば、Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)およびHarlow & Lane, Using Antibodies (1999); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (第2版, 1986); およびKohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)参照)を用いて作製されうる。そのような技術は、ファージまたは類似したベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体調製、およびウサギまたはマウスを免疫することによるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製を含む(例えば、Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)参照)。そのような抗体は、典型的には、診断的または予後的適用として、例えば肺癌または乳癌の検出において用いられる。
【０１５０】
WIF-1またはその断片は、WIF-1と特異的反応性の抗体を産生するために用いられうる。例えば、組換えWIF-1またはその抗原性断片は、本明細書に記載されているように単離される。組換えタンパク質は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の産生のための好ましい免疫原である。または、本明細書に開示された配列から導かれ、かつ担体タンパク質に結合した、合成ペプチドが免疫原として用いられうる。天然に存在するタンパク質もまた、純粋なまたは不純な形のいずれかで用いられうる。生成物は、その後、抗体を産生する能力がある動物へ注入される。モノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれかが、タンパク質を測定するイムノアッセイでのその後の使用のために産生されうる。
【０１５１】
典型的には、104以上の力価をもつポリクローナル抗血清が選択され、非WIF-1タンパク質または他の生物体由来の他の関連したタンパク質までにも対するそれらの交差反応性について、競合結合イムノアッセイを用いて試験される。特異的なポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約0.1 mM、より通常には少なくとも約1 μM、任意には少なくとも約0.1 μMまたはそれより良い、および任意で0.01 μMまたはそれより良い、のKdを以て結合する。交差反応性測定について、典型的には、免疫吸着抗血清が、第二タンパク質をWIF-1タンパク質と比較する競合結合イムノアッセイに用いられる。この比較を行うために、2つのタンパク質は、それぞれ、幅広い範囲の濃度でアッセイされ、固定化されたタンパク質への抗血清の結合の50%を阻害するために必要とされる各タンパク質の量が決定される。結合の50%を阻害するために必要とされる第二タンパク質の量が、結合の50%を阻害するために必要とされる抗原性WIF-1タンパク質の量の10倍未満である場合には、第二タンパク質は、WIF-1免疫原に対して産生されたポリクローナル抗体に特異的に結合すると言われる。
【０１５２】
いったん、WIF-1特異的抗体が入手できたならば、WIF-1との結合相互作用が、様々なイムノアッセイ方法により検出されうる。免疫学的およびイムノアッセイ手順の概説について、Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 第7版, 1991)を参照。さらに、本発明のイムノアッセイは、いくつかの形態のいずれかにおいて行われうり、それらは、Enzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980);およびHarlow & Lane, 前記) に広範に概説されている。
【０１５３】
イムノアッセイはまた、しばしば、抗体および抗原により形成される複合体に特異的に結合し、かつ標識する標識物質を用いる。標識物質は、それ自身、抗体/抗原複合体を含む部分の一つでありうる。従って、標識物質は、標識WIF-1ポリペプチドまたは標識抗WIF-1抗体でありうる。または、標識物質は、抗体/抗原複合体へ特異的に結合する二次抗体のような第三部分でありうる(二次抗体は、典型的には、第一抗体が由来している種の抗体に特異的である)。プロテインAまたはプロテインGのような、免疫グロブリン定常領域を特異的に結合する能力がある他のタンパク質もまた、標識物質として用いられうる。これらのタンパク質は、様々な種由来の免疫グロブリン定常領域と強い非免疫原性反応性を示す(例えば、Kronval et al., J. Immunol. 111:1401-1406 (1973); Akerstrom et al., J. Immunol. 135:2589-2542 (1985)参照)。標識物質は、ストレプトアビジンのようなもう一つの分子が特異的に結合することができるビオチンのような検出可能な部分で修飾されうる。様々な検出可能な部分は、当業者に周知である。
【０１５４】
一般的に用いられるアッセイ法は、非競合アッセイ法、例えば、サンドイッチアッセイ法、および競合アッセイ法を含む。競合アッセイ法において、試料に存在するWIF-1の量は、試料に存在する未知のWIF-1により抗WIF-1抗体から置換された(競合して離れた)、既知の追加された(外因性)WIF-1の量を測定することにより間接的に測定される。一般的に用いられるアッセイ形式は、試料においてタンパク質の存在を検出かつ定量化するために用いられる免疫ブロットを含む。他のアッセイ形式は、特定の分子(例えば、抗体)を結合し、カプセル化試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを用いる、リポソームイムノアッセイ(LIA)を含む。放出された化学物質は、その後、標準技術に従って検出される(Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41 (1986)参照)。
【０１５５】
アッセイに用いられる特定の標識または検出可能な群は、それが、アッセイに用いられる抗体の特異的結合を有意には干渉しない限り、本発明の重要な局面ではない。検出可能な群は、検出可能な物理的または化学的性質をもつ任意の材料でありうる。そのような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野において十分、開発されており、一般的に、そのような方法に有用なほとんどの任意の標識が、本発明に適用されうる。従って、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明における有用な標識は、磁気ビーズ(例えば、DYNABEADS(商標))、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど)、放射標識、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAに一般的に用いられる他のもの)、およびコロイド金または色ガラスもしくはプラスチックビーズ(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)のような比色標識を含む。
【０１５６】
標識は、当技術分野において周知の方法に従って、アッセイの望ましい成分に直接的にまたは間接的に連結されうる。上で述べられているように、幅広い種類の標識が用いられうり、標識の選択は、必要とされる感度、化合物との結合の容易さ、安定性必要条件、利用できる器具、および処分規定に依存する。
【０１５７】
非放射性標識は、しばしば、間接的手段により付着させられる。一般的に、リガンド分子(例えば、ビオチン)は、その分子へ共有結合性に結合している。リガンドは、その後、生得的に検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物もしくは化学ルミネセンス化合物のようなシグナル系へ共有結合性に結合しているかのいずれかであるもう一つの分子(例えば、ストレプトアビジン)に結合する。リガンドおよびそれらの標的は、WIF-1を認識する抗体、または抗WIF-1を認識する二次抗体との任意の適した組み合わせで用いられうる。
【０１５８】
分子はまた、例えば、酵素またはフルオロフォアとの結合による、シグナル発生化合物へ直接的に結合されうる。標識としての対象となる酵素は、主として、ヒドロラーゼ、特に、ホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ、またはオキシドターゼ、特にペルオキシダーゼ、である。蛍光化合物は、フルオレセインおよびそれの誘導体、ローダミンおよびそれの誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどを含む。化学ルミネセンス化合物は、ルシフェリン、および2,3-ジヒドロフタラジネジオン、例えば、ルミノール、を含む。用いられうる様々な標識またはシグナル発生系の概説として、米国特許第4,391,904号を参照。
【０１５９】
標識を検出する手段は当業者に周知である。このように、例えば、標識が放射性標識である場合、検出のための手段は、オートラジオグラフィーにおいてのようなシンチレーションカウンターまたは写真用フィルムを含む。標識が蛍光標識である場合、それは、適切な光の波長で蛍光色素を励起し、その結果生じた蛍光を検出することにより、検出されうる。蛍光は、写真用フィルムを用いて、電荷結合素子(CCD)または光電子増倍管などのような電子感知器の使用により、視覚的に検出されうる。同様に、酵素標識は、酵素についての適切な基質を供給し、その結果生じた反応生成物を検出することにより、検出されうる。最後に、単純な比色標識は、標識に付随した色を観察することにより簡単に検出されうる。従って、様々なディップスティックアッセイ法において、結合した金は、しばしば、ピンク色に見え、一方、様々な結合したビーズはビーズの色に見える。
【０１６０】
いくつかのアッセイ形式は、標識化合物の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイ法は、標的抗体の存在を検出するために用いられうる。この場合、抗原コーティング化粒子は、標的抗体を含む試料により凝集される。この形式において、いずれの成分も標識される必要はなく、標的抗体の存在は、単純な視覚的観察により検出される。
【０１６１】
V. WIF-1のアクチベーターの同定
WIF-1のアクチベーター、すなわち、WIF-1ポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現のアクチベーター、は癌、例えば肺癌または乳癌、を処置するために有用である。WIF-1を活性化する作用物質は、様々な方法を用いて試験されうる。WIF-1を活性化する作用物質は、WIF-1活性を活性化、増強する化合物、および、WIF-1プロモーターのメチル化を減少させる脱メチル化剤を含む、WIF-1発現を増加させる作用物質を含む。
【０１６２】
WIF-1のアクチベーターとして試験される作用物質は、任意の低分子化合物、またはタンパク質、糖、核酸もしくは脂質のような生物学的実体でありうる。典型的には、試験化合物は、化学低分子およびペプチドである。本質的に、任意の化合物が本発明のアッセイにおいて可能性のあるアクチベーターとして用いられうるが、ほとんどの場合、水性または有機(特にDMSOを主剤とした)溶液に溶解されうる化合物が用いられる。
【０１６３】
A. 大量および高処理量のスクリーニング
アッセイ法は、アッセイ段階を自動化し、任意の便利な源由来の化合物をアッセイへ供給することにより、大きな化学的ライブラリーをスクリーニングするように設計され、典型的には、並行して実行される(例えば、ロボット利用アッセイにおけるマイクロタイタープレート上でのマイクロタイター形式で)。
【０１６４】
いくつかの態様において、高処理量スクリーニング方法は、多数の可能性のある治療用化合物(可能性のあるモジュレーター化合物)を含むコンビナトリアルケミカルまたはペプチドのライブラリーを提供する段階を含む。そのような「コンビナトリアルケミカルライブラリー」または「リガンドライブラリー」は、その後、所望の特徴のある活性を示すそれらのライブラリーメンバー(特定の化学種またはサブクラス)を同定するために、本明細書に記載されているように、1つまたは複数のアッセイ法においてスクリーニングされる。このように同定された化合物は、通常の「リード化合物」としての役割を果たすことができる、またはそれ自身、可能性のあるもしくは実際の治療用物質として用いられうる。
【０１６５】
コンビナトリアルケミカルライブラリーは、試薬のようないくつかの化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることにより、化学的合成かまたは生物学的合成かのいずれかにより作製される多様な化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーのような線状コンビナトリアルケミカルライブラリーは、所定の化合物の長さ(すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数)についてあらゆる可能性のある様式で1セットの化学的ビルディングブロック(アミノ酸)を組み合わせることにより形成される。何百万個という化合物が、化学的ビルディングブロックのそのような組み合わせ混合を通して合成されうる。
【０１６６】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは当業者に周知である。そのようなコンビナトリアルケミカルライブラリーは、限定されるわけではないが、ペプチドライブラリーを含む(例えば、米国特許第5,010,175号、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991)およびHoughton et al., Nature 354:84-88 (1991)参照)。化学的多様性ライブラリーを作製するための他のケミストリーもまた用いられうる。そのようなケミストリーは、限定されるわけではないが、以下を含む：ペプトイド(例えば、PCT公開第WO 91/19735号)、コード化ペプチド(例えば、PCT公開第WO 93/20242号)、ランダムバイオオリゴマー(例えば、PCT公開第WO 92/00091)、ベンゾジアゼピン(例えば、米国特許第5,288,514号)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソマー(diversomer)(Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993))、ビニル性ポリペプチド(Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992))、グルコース足場をもつ非ペプチド性ペプチド模倣体(Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992))、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成(Chen et al., J. Amer. chem. Soc. 116:2661 (1994))、オリゴカルバメート(Cho et al., Science 261:1303 (1993))および/またはペプチジルホスホネート(Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994))、核酸ライブラリー(Ausubel et al. (1993); Berger and Sambrook, すべて前記、参照)、ペプチド核酸ライブラリー(例えば、米国特許第5,539,083号参照)、抗体ライブラリー(例えば、Vaughn et al., Nature Biotechnology 14(3):309-314 (1996)およびPCT/US96/10287参照)、糖ライブラリー(例えば、Liang et al., Science 274:1520-1522 (1996)および米国特許第5,593,853号参照)、有機低分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアセピン、Baum C & EN, Jan 18, page 33 (1993)；イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、第5,288,514号など参照)。
【０１６７】
コンビナトリアルライブラリーの調製のための装置は市販されている(例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA参照)。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーは、それら自身、市販されている(例えば、ComGenex, Princeton, N.J.; Tripos, Inc., St. Louis, MO; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MDなど参照)。
【０１６８】
1. 固相および可溶性高処理量アッセイ法
高処理量アッセイ法において、一日に数千個までの異なるモジュレーターまたはリガンドをスクリーニングすることは可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択された可能性のあるモジュレーターに対して別々のアッセイを実行するために用いられうる、または、濃度またはインキュベーション時間の効果が観察されることになっている場合には、5〜10ウェルごとが単一のモジュレーターを試験することができる。従って、単一の標準マイクロタイタープレートは、約100個(例えば、96個)のモジュレーターをアッセイすることができる。1536ウェルのプレートが用いられる場合には、単一のプレートは、容易に、約100個から約1500個までの異なる化合物をアッセイすることができる。1日あたり数個の異なるプレートをアッセイすることが可能である；約6,000〜20,000個まで、またはそれ以上の異なる化合物についてのアッセイスクリーニングが本発明の集積システムを用いて可能である。さらに、試薬操作へのマイクロ流体アプローチが用いられうる。
【０１６９】
B. WIF-1のアクチベーターのスクリーニングの方法
1. WIF-1活性
WIF-1ならびにそれの対立遺伝子および多型性変異体は、Wntシグナル伝達を阻害する役割を果たしている。従って、様々な終点のいずれかがWIF-1活性を決定するために用いられうる。これらは、限定されるわけではないが、Frizzled受容体へのWIF-1の結合を測定することを含む。さらに、細胞成長および/またはアポトーシスもまた、WIF-1活性を評価するために用いられうる。これらのアッセイを行うための方法は当技術分野において周知である(例えば、Masuhara et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 239:439-446 (1997); Minamoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:79-83 (1997)参照)。
【０１７０】
一つの態様において、WIF-1活性は、細胞生存度を測定することにより決定されうる。細胞生存度は、細胞質酵素のレベル、色素に対する細胞の透過性、DNA断片化、51Crのような放射性同位元素レベルの放出、または他の形式を含む多くの異なる終点を測定することにより評価されうる。典型的には、細胞生存度は、比色または蛍光生存度アッセイ法のような高処理量スクリーニング形式に適したアッセイ法を用いて測定される。例えば、アラマーブルー(Alamar blue)(AB)アッセイ法は、代謝性活性に応答して色または蛍光を変化させる酸化還元指標を組み入れる。アラマーブルーは、生きている細胞の存在下で蛍光を発するが、死細胞では発しない。そのようなアッセイ法は、便利なことに、マイクロプレートにおいて、またはフローサイトメトリーにより、読み取られうる。MTT(3-(4,5-ジメチル)チアゾール-2-イル-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)のホルマザンへの還元を測定するMTTアッセイ法のような比色アッセイ法もまた、細胞生存度および増殖を測定するために高処理量形式で便利に用いられうる。
【０１７１】
細胞数を測定する他のアッセイ法もまた用いられうる。これらは、細胞のDNAへの色素のインターカレーションを測定するアッセイ法を含む。インターカレートされた色素の量は、細胞数に正比例する。例えば、細胞は、生きている細胞のDNAにインターカレートするHoechst 33342のような色素で染色され、細胞数は蛍光の量を測定することにより決定されうる。細胞もまた直接的に数えられうる。
【０１７２】
可能性のあるWIF-1アクチベーターで処理される試料またはアッセイは、調節の程度を調べるために試験化合物なしの対照試料と比較される。対照試料(アクチベーターで処理されていない)は、100の相対的WIF-1活性値を割り当てられる。WIF-1の活性化は、対照に対するWIF-1活性値が110%、任意で150%、200%、300%、400%、500%または1000〜2000%である場合、達成される。
【０１７３】
2. 発現アッセイ法
WIF-1の発現を増加させる化合物についてのスクリーニングアッセイ法もまた提供される。スクリーニング方法は、一般的に、試験化合物が、WIF-1を発現させる能力がある1つまたは複数の細胞と接触させられ、その後、WIF-1発現(転写産物または翻訳産物のいずれか)における増加を検出する、細胞に基づいたアッセイ法を行うことを含む。アッセイ法は、WIF-1を発現させる任意の細胞で行われうる。
【０１７４】
WIF-1発現は、いくつかの異なる方法で検出されうる。下記のように、細胞におけるWIF-1の発現レベルは、細胞における発現されたmRNAを、WIF-1の転写産物(またはそれ由来の相補的核酸)と特異的にハイブリダイズするプローブで探索することにより、決定されうる。探索は、細胞を溶解し、ノーザンブロットを行うことにより、または細胞を溶解することなしにインサイチューハイブリダイゼーション技術を用いて、行われうる。または、WIF-1eタンパク質が、細胞可溶化物がWIF-1へ特異的に結合する抗体で探索される免疫学的方法を用いて検出されうる。
【０１７５】
他の細胞に基づいたアッセイ法は、標準レポーター遺伝子アッセイ法を用いて細胞で行われるレポーターアッセイ法を含む。これらのアッセイ法は、WIF-1を発現させる、または発現させない、どちらの細胞においても行われうる。これらのアッセイ法の一部は、検出可能な産物をコードするレポーター遺伝子に実施可能に連結されているWIF-1プロモーターを含む異種性核酸構築物で行われる。いくつかの異なるレポーター遺伝子が利用されうる。いくつかのレポーターは生得的に検出可能である。そのようなレポーターの例は、蛍光検出器で検出されうる蛍光を放射する緑色蛍光タンパク質である。他のレポーターは検出可能な産物を生じる。しばしば、そのようなレポーターは酵素である。例示的な酵素レポーターは、限定されるわけではないが、CAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；Alton and Vapnek, Nature 282:864-869 (1979))、ルシフェラーゼ、y-ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む(Toh et al., Eur. J. Biochem. 182:231-238 (1980);およびHall et al., J. Mol. Appl. Gen. 2:101 (1983))。
【０１７６】
これらのアッセイ法において、レポーター構築物を含む細胞は、試験化合物と接触させられる。調節されたプロモーター発現は、検出可能レポーターのレベルを検出することによりモニターされる。いくつかの異なる種類のWIF-1アクチベーターが、このアッセイ法において同定されうる。例えば、プロモーターをそれに結合することにより阻害する、転写因子もしくは他の制御因子に結合することによりプロモーターを阻害する、それらのプロモーターに結合する、またはプロモーターを阻害する分子を産生するカスケードを誘発する試験化合物が、同定されうる。同様に、例えば、プロモーターをそれに結合することにより活性化する、転写因子もしくは他の制御因子に結合することによりプロモーターを活性化する、それらのプロモーターに結合する、またはプロモーターを活性化する分子を産生するカスケードを誘発する試験化合物もまた、同定されうる。
【０１７７】
発現または活性のレベルは、ベースライン値と比較されうる。ベースライン値は、対照試料についての値、または対照集団(例えば、本明細書に記載されているようなリーン(lean)個体)または細胞(例えば、WIF-1モジュレーターに曝されていない組織培養細胞)についてのWIF-1発現レベルを代表する統計学的値でありうる。発現レベルはまた、陰性対照としてWIF-1を発現させない細胞について決定されうる。そのような細胞は、一般的に、他の点では、実質的に、試験細胞と遺伝学的に同じである。
【０１７８】
様々な対照は、レポーター構築物を欠く細胞での、またはレポーター構築物を含む細胞を試験化合物と接触させないことによる、並行反応を実行することを含め、観察された活性が本物であることを保証するために行われうる。化合物はまた、下記のように、さらに確証されうる。
【０１７９】
化合物は、様々な機構によりWIF-1の発現を増加させることができる。例えば、一つの態様において、化合物は、WIF-1プロモーターのメチル化を減少させることにより、発現を増加させうる。そのような化合物は、5-アザシタジンなどのようなメチル化抑制試薬を含み、それは細胞へ導入されうる。
【０１８０】
3. WIF-1活性を増加させる核酸
本発明の一つの局面において、WIF-1アクチベーターはまた、本明細書で同定されたWnt結合ドメインを含むもののようなWIF-1またはWIF-1ポリペプチドを発現させる核酸を含みうる。通常のウイルスおよび非ウイルスに基づいた遺伝子移入方法は、哺乳動物細胞または標的組織においてWIF-1ポリペプチドをコードする核酸を導入するために用いられうる。非ウイルスベクター送達系は、DNAプラスミド、裸の核酸、およびリポソームのような送達媒体と複合体を形成された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、DNAおよびRNAウイルスを含み、細胞への送達後、エピソームのかまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療手順の概説として、Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995);およびYu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照。
【０１８１】
a) 非ウイルス送達方法
本発明の操作されたポリペプチドをコードする核酸の非ウイルス送達の方法は、リポフェクション、微量注入、微粒子銃、ビロゾーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸抱合体、裸のDNA、人工ビリオン、および作用物質で増強されたDNAの取り込みを含む。リポフェクションは、例えば、US 5,049,386、US 4,946,787；およびUS 4,897,355に記載されており、リポフェクション試薬は商業的に販売されている(例えば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適している陽イオン性および中性脂質は、Felgner, WO 91/17424、WO 91/16024のものを含む。送達は、細胞(エクスビボ投与)または標的組織(インビボ投与)へでありうる。
【０１８２】
免疫脂質複合体のようなターゲット化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である(例えば、Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、および第4,946,787号参照)。
【０１８３】
b) ウイルス送達方法
WIF-1核酸の送達のためのRNAまたはDNAウイルスに基づいた系の使用は当技術分野において公知である。通常のウイルスに基づいた系は、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴および単純ヘルペスウイルスベクターを含む。
【０１８４】
多くの遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターは、特定の組織型、例えば、肺組織または乳房組織、への高程度の特異性を以て送達されることが望ましい。ウイルスベクターは、ウイルス外側表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより所定の細胞型に対する特異性をもつように改変されうる。リガンドは、対象となる細胞型上に存在することが知られている受容体への親和性を有するように選択される。例えば、Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9747-9751 (1995)は、モロニーマウス白血病ウイルスが、gp70へ融合したヒトヘレグリン(heregulin)を発現させるように改変されうり、組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現させる特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、リガンド融合タンパク質を発現させるウイルスおよび受容体を発現させる標的細胞の他のペアへ拡張されうる。例えば、繊維状ファージは、事実上任意の選択された細胞性受容体への特異的な結合親和性を有する抗体断片(例えば、FabまたはFv)を示すように操作されうる。上記は主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理は、非ウイルスベクターに適用されうる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みに有利であると考えられる特定の取り込み配列を含むように操作されうる。
【０１８５】
遺伝子治療ベクターは、下記のように、個々の患者への投与により、典型的には全身投与(例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入)または局所的投与により、インビボで送達されうる。または、ベクターは、個々の患者由来の外植される細胞のように、エクスビボで細胞へ送達されうる。
【０１８６】
診断、研究のための、または遺伝子治療(例えば、トランスフェクションされた細胞の宿主生物体への再注入による)のための、エクスビボの細胞トランスフェクションは当業者に周知である。いくつかの態様において、細胞は、対象生物体から単離され、WIF-1核酸をトランスフェクションされ、対象生物体(例えば、患者)へと再注入されて戻される。エクスビボのトランスフェクションに適した様々な細胞型は当業者に周知である(例えば、患者由来の細胞を単離および培養する方法の考察について、Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (第3版, 1994)およびそこに引用されている参照文献を参照)。
【０１８７】
治療用核酸を含むベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど)はまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物体へ直接的に投与されうる。または、裸のDNAが投与されうる。投与は、血液または組織細胞との最終的な接触へと分子を導入するために通常用いられる経路のいずれかによる。そのような核酸を投与する適した方法が利用でき、当業者に周知であり、1つより多い経路が特定の組成物を投与するために用いられうるが、特定の経路は、しばしば、別の経路より迅速かつ効果的な反応を与えることができる。
【０１８８】
薬学的に許容される担体は、投与されることになっている特定の組成物により、および組成物を投与するために用いられる特定の方法により、部分的に決定される。従って、下記のように、本発明の薬学的組成物の幅広い種類の適した製剤がある(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, 1989参照)。
【０１８９】
VI. 薬学的組成物
本発明は、WIF-1発現が下方制御されている癌を処置するための薬学的組成物を提供する。そのような薬学的組成物は、例えば、WIF-1ポリペプチド、WIF-1類似体、WIF-1模倣体、WIF-1関連ポリペプチド；前記のものに対する抗体；WIF-1ポリペプチド、WIF-1類似体、WIF-1模倣体、WIF-1関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；WIF-1発現のアクチベーター；またはWIF-1活性のモジュレーターを含む。
【０１９０】
本発明の好ましい態様において、WIF-1発現が下方制御されている癌を処置するための薬学的組成物は、(i)WIF-1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および(ii)薬学的に許容される担体を含む。本発明の好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2のWIF-1ポリペプチドをコードする。本発明のもう一つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:14のWIF-1ポリペプチドをコードする。本発明のさらにもう一つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:15のWIF-1ポリペプチドをコードする。本発明のもう一つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:16のWIF-1ポリペプチドをコードする。好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位〜180位、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜180位、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基39位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードする。
【０１９１】
本発明のもう一つの好ましい態様において、WIF-1発現が下方制御されている癌を処置するための薬学的組成物は、(i)WIF-1ポリペプチド、および(ii)薬学的に許容される担体を含む。本発明の好ましい態様において、WIF-1ポリペプチドは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む。本発明のもう一つの好ましい態様において、WIF-1ポリペプチドは、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む。本発明のさらに他の態様において、WIF-1ポリペプチドは、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、WIF-1ポリペプチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位〜180位、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜180位、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基39位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドである。
【０１９２】
A. 薬学的組成物の投与
WIF-1、WIF-1ポリペプチド、またはWIF-1ポリヌクレオチドのアクチベーターを含む薬学的組成物は、癌、例えば、肺癌または乳癌、の処置のために患者へ投与されうる。下で詳細に記載されているように、アクチベーターは、任意の適した様式で、任意で、薬学的に許容される担体と共に、投与される。
【０１９３】
同定されたアクチベーターは、癌を予防、処置または制御するために治療的有効量で患者へ投与されうる。化合物は、患者において有効な治療的応答を誘発するのに十分な量で患者へ投与される。有効な治療的応答は、疾患の症状または合併症を少なくとも部分的に、停止するまたは遅くする応答である。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効量」と定義される。用量は、用いられる特定のWIF-1アクチベーターの効力および被検体の状態、ならびに体重、または処置されるべき領域の表面積により決定されるものである。用量のサイズはまた、特定の被検体における特定の化合物またはベクターの投与に伴う任意の副作用の存在、性質および程度により決定されるものである。
【０１９４】
そのような化合物の毒性および治療的効力は、細胞培養物または実験動物において、例えば、LD50(集団の50%に対して致死的な用量)およびED50(集団の50%において治療的有効な用量)を決定することによる、標準の薬学的手順により決定されうる。毒性効果と治療効果の間の用量比率は、治療指数であり、比率、LD50/ED50として表されうる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が用いられうるが、正常な細胞への可能性のある損傷を最小限にするために罹患組織の部位へそのような化合物をターゲットする送達系を設計し、それにより副作用を低減させるように取り計られるべきである。
【０１９５】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに用いる用量範囲を策定するために用いられうる。そのような化合物の用量は、好ましくは、有るか無しかの毒性をもつED50を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、用いられる剤形および投与経路に依存してこの範囲内で変わりうる。本発明の方法に用いられる任意の化合物について、治療的有効量は、最初は、細胞培養アッセイから推定されうる。用量は、細胞培養において決定された場合のIC50(症状の最大半減抑制を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて策定されうる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いられうる。血漿におけるレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、測定されうる。一般的に、モジュレーターの用量当量は、典型的被検体について約1 ng/kgから10 mg/kgまでである。
【０１９６】
本発明に用いる薬学的組成物は、1つまたは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて標準技術により製剤化されうる。化合物ならびにそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物は、吸入による、局所的に、鼻に、経口で、非経口で(例えば、静脈内に、腹腔内に、膀胱内に、または髄腔内に)、または直腸に、を含む任意の適した経路による投与について製剤化されうる。
【０１９７】
経口投与について、薬学的組成物は、例えば、結合剤、例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース；増量剤、例えば、乳糖、微結晶性セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ；崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプン、もしくはデンプングリコール酸ナトリウム；または湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを含む、薬学的に許容される賦形剤と通常の手段により調製される錠剤またはカプセルの形をとりうる。錠剤は、当技術分野において周知の方法によりコーティングされうる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、もしくは懸濁液の形をとりうる、またはそれらは、使用前の水もしくは他の適した媒体との構成として乾燥製品として提供されうる。そのような液体調製物は、薬学的に許容される添加剤、例えば、懸濁化剤、例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂；乳化剤、例えば、レシチンまたはアラビアゴム；非水性媒体、例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分画化植物油；および保存剤、例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸、と通常の手段により調製されうる。調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、着香剤、着色剤および/または甘味剤を含みうる。必要なら、経口投与のための調製物は、活性化合物の徐放を与えるように適切に製剤化されうる。
【０１９８】
吸入による投与について、化合物は、便利には、適した高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適したガスを用いて、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー提示の形をとって送達されうる。加圧エアゾールの場合、用量単位は、計量された量を送達するようにバルブを用意することにより決定されうる。吸入器または注入器で用いる、例えば、ゼラチン、のカプセルおよびカートリッジは、化合物および適した粉末基剤、例えば、乳糖またはデンプンの粉末混合物を含み製剤化されうる。
【０１９９】
化合物は、注入による、例えば、ボーラス注入または持続注入による、非経口投与のために製剤化されうる。注入のための製剤は、添加された保存剤と共に、単位剤形で、例えば、アンプルで、または複数用量容器で、提供されうる。組成物は、油性または水性媒体における懸濁液、溶液または乳濁液のような形をとりうり、製剤化剤、例えば、懸濁化剤、安定剤、および/または分散剤を含みうる。または、活性成分は、使用前の、適した媒体、例えば、滅菌した発熱物質なしの水、との構成のための粉末形でありうる。
【０２００】
化合物はまた、直腸組成物、例として、例えば通常の坐剤基剤、例えばカカオバターまたは他のグリセリド、を含む、坐剤または保持浣腸剤、において製剤化されうる。
【０２０１】
さらに、化合物は、デボー製剤として製剤化されうる。そのような長時間作用型製剤は、植込み(例えば、皮下に、または筋肉内に)により、または筋肉内注射により投与されうる。従って、例えば、化合物は、適したポリマーのまたは疎水性材料(例えば、許容できる油における乳濁液として)もしくはイオン交換樹脂と、またはやや溶けにくい誘導体として、例えば、やや溶けにくい塩として、製剤化されうる。
【０２０２】
組成物は、必要ならば、活性成分を含む1つもしくは複数の単位剤形を含みうるパックまたはディスペンサー装置において提供されうる。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイル、例えば、ブリスターパック、を含みうる。パックまたはディスペンサー装置は、投与についての使用説明書を添付されうる。
【０２０３】
VII. 癌を処置するための方法
WIF-1が下方制御されている癌を処置するための、およびWIF-1が下方制御されている細胞においてアポトーシスを誘導するための本発明の方法は、WIF-1が、正常な細胞において発現されているが、ヒト癌細胞において低発現しているという発見に部分的に基づいている。WIF-1が低発現しており、かつ本発明の方法を用いて処置されうる癌は、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、黒色腫、大腸癌、中皮腫、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頚癌、食道癌、頭頸部癌、肝細胞癌、脳癌、外陰または睾丸癌、肉腫、白血病、リンパ腫、神経膠腫、およびグリア芽腫を含む。好ましい癌は、肺癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、または黒色腫である。
【０２０４】
本発明は、WIF-1発現が下方制御されている癌の処置または予防のための方法を提供する。この方法は、患者に薬学的組成物を投与する段階を含む。そのような薬学的組成物は、例えば、WIF-1ポリペプチド、WIF-1類似体、WIF-1模倣体、WIF-1関連ポリペプチド；前記のものに対する抗体；WIF-1ポリペプチド、WIF-1類似体、WIF-1模倣体、WIF-1関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；WIF-1発現のアクチベーター；またはWIF-1活性のモジュレーターを含む。本発明の薬学的組成物は、単独で、または1つもしくは複数の追加の治療用化合物もしくは処置と組み合わせて、投与される。そのような治療用化合物または処置の例は、限定されるわけではないが、タキソール、シクロホスファミド、タモキシフェン、フルオロウラシル、およびドキソルビシンを含む。
【０２０５】
癌を処置するための方法は、任意で、以下の段階の1つまたは複数を含みうる：個体から組織または体液の生体試料を得る段階；生体試料をWIF-1ポリペプチドの発現について、例えば、生体試料をWIF-1に対して方向づけられた抗体と接触させることにより、スクリーニングする段階；または、生体試料をWIF-1ポリヌクレオチドの発現について、例えば、WIF-1 mRNAを検出することにより、スクリーニングする段階。
【０２０６】
A. 細胞増殖の阻害
本発明のWIF-1ポリペプチドは、様々な方法において使用を見出す。この発明の好ましい態様において、WIF-1が低発現する細胞の増殖を阻害する方法が提供される。「増殖」とは、細胞の成長、細胞もしくは病的嚢胞の再生または増倍を指す。低発現されているWIF-1は、WIF-1ポリペプチドかまたはWIF-1 mRNAのいずれかでありうる。この方法は、細胞の増殖を阻害するのに有効なWIF-1ポリペプチドの量と細胞を接触させる段階を含む。本発明のWIF-1ポリペプチド、好ましくはWIF-1サブドメインポリペプチドは、細胞、好ましくは癌細胞、の増殖を阻害するために有用である。
【０２０７】
本発明の好ましい態様において、この方法は、インビトロで実施される。本明細書にさらに記載されているように、本発明の方法はまた、インビボで実施されうる。
【０２０８】
本発明の好ましい態様において、WIF-1ポリペプチドと接触させられることになっている細胞は、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、黒色腫、大腸癌、中皮腫、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頚癌、食道癌、頭頸部癌、肝細胞癌、脳癌、外陰癌、睾丸癌、肉腫、白血病、リンパ腫、神経膠腫、およびグリア芽腫の細胞からなる群より選択される癌細胞である。好ましい癌細胞は、肺癌細胞、肝細胞癌細胞、結腸直腸癌細胞、または黒色腫細胞である。
【０２０９】
本発明の好ましい態様において、WIF-1ポリペプチドと接触させられる癌細胞は、本明細書に記載されているように、過剰メチル化WIF-1プロモーターを含む。典型的には、WIF-1プロモーターのメチル化を、例えば、本明細書に記載された方法を用いることにより、減少させれば、細胞におけるWIF-1の発現は増加する。
【０２１０】
B. Wntシグナル伝達の阻害
本発明のWIF-1ポリペプチドは、様々な方法において使用を見出す。この発明のもう一つの好ましい態様において、本明細書に記載されているように、細胞、好ましくは癌細胞、においてWntシグナル伝達を阻害する方法が提供される。この方法は、WIF-1を低発現する細胞を、Wntシグナル伝達を阻害するのに有効なWIF-1ポリペプチドの量と接触させる段階を含む。この発明のWIF-1ポリペプチド、好ましくはWIF-1サブドメインポリペプチドは、細胞、好ましくは癌細胞、においてWntシグナル伝達を阻害するために用いられうる。
【０２１１】
C. 疾患の処置
本発明のWIF-1ポリペプチドは、様々な方法において使用を見出す。この発明のもう一つの好ましい態様において、WIF-1の低発現に関連している疾患を処置する方法が提供される。この方法は、被検体に、好ましくはそのような処置を必要としている被検体に、疾患を処置するために有効なWIF-1活性を有するポリペプチドの量を投与する段階を含む。好ましくは、被検体はヒトである。この発明のWIF-1ポリペプチド、好ましくはWIF-1サブドメインポリペプチドは、WIF-1の低発現に関連している疾患を処置するために用いられうる。
【０２１２】
本発明の好ましい態様において、WIF-1の低発現と関連している疾患は癌である。本発明のWIF-1ポリペプチド、好ましくはWIF-1サブドメインポリペプチドは、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、黒色腫、大腸癌、中皮腫、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頚癌、食道癌、頭頸部癌、肝細胞癌、脳癌、外陰癌、睾丸癌、肉腫、白血病、リンパ腫、神経膠腫、およびグリア芽腫の細胞からなる群より選択される癌を処置するのに有用である。好ましい癌は、肺癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、または黒色腫である。
【０２１３】
D. WIF-1ポリヌクレオチドを用いる癌を処置するための方法
本発明は、WIF-1発現が下方制御されている様々な癌の処置または予防のための方法を提供する。本発明のいくつかの局面において、細胞は、細胞においてWIF-1発現を増加させる組成物と接触させられる。本発明の好ましい態様において、組成物は、WIF-1ポリペプチド、好ましくはWIF-1サブドメインポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０２１４】
本発明は、SEQ ID NO:2のWIF-1ポリペプチド、SEQ ID NO:14のWIF-1ポリペプチド、SEQ ID NO:15のWIF-1ポリペプチド、SEQ ID NO:16のWIF-1ポリペプチド、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位〜180位を含むWIF-1サブドメインポリペプチド、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜180位を含むWIF-1サブドメインポリペプチド、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチド、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基39位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０２１５】
本発明の他の好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列、SEQ ID NO:17のヌクレオチド配列、SEQ ID NO:18のヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:19のヌクレオチド配列を含む。SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位〜180位を含むWIF-1サブドメインポリペプチド、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜180位を含むWIF-1サブドメインポリペプチド、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチド、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基39位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1から導き出されうる。
【０２１６】
本発明の好ましい態様において、癌を処置する方法は、癌と診断された患者に、(i)WIF-1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび(ii)薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物の治療的有効量を投与する段階を含む。
【０２１７】
この方法の好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2のWIF-1ポリペプチドをコードする。本発明のもう一つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:14のWIF-1ポリペプチドをコードする。本発明のさらにもう一つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:15のWIF-1ポリペプチドをコードする。本発明のもう一つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:16のWIF-1ポリペプチドをコードする。他の好ましいポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位〜180位を含むWIF-1サブドメインポリペプチド；SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜180位を含むWIF-1サブドメインポリペプチド；SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチド；またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基39位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードする。
【０２１８】
本発明のもう一つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1を含む。他の好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位〜180位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜180位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基39位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２１９】
WIF-1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物の投与の様式およびタイミングは本発明にとって重要ではない。薬学的組成物は、本明細書に記載されているような様々な方法で患者に投与されうる。この方法の好ましい局面において、WIF-1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物は、腫瘍のすぐ近傍に注入される。もう一つの局面において、薬学的組成物は、腫瘍へ直接的に注入される。癌の経過(例えば、腫瘍のサイズにより決定されるような癌の退行)をモニターすることにより、当技術分野における熟練した処置する医師は、薬学的組成物の注入が一回行われるか、または適当な時間の後、繰り返されるかを決定する。注入は、毎日のように行われうる。
【０２２０】
E. WIF-1ポリペプチドを用いる癌を処置するための方法
本発明は、WIF-1発現が下方制御されている様々な癌の処置または予防のための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、この方法は、癌と診断された患者に、(i)WIF-1ポリペプチドおよび(ii)薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物の治療的有効量を投与する段階を含む。
【０２２１】
この方法の好ましい態様において、WIF-1ポリペプチドは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む。本発明のもう一つの好ましい態様において、WIF-1ポリペプチドは、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む。本発明の他の態様において、WIF-1ポリペプチドは、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む。他の好ましいWIF-1ポリペプチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位〜180位、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜180位、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基39位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドである。
【０２２２】
WIF-1ポリペプチドを含む薬学的組成物の投与の様式およびタイミングは本発明にとって重要ではない。薬学的組成物は、本明細書に記載されているような様々な方法で患者に投与されうる。好ましい局面において、WIF-1ポリペプチドを含む薬学的組成物は、腫瘍のすぐ近傍に注入される。もう一つの局面において、薬学的組成物は、腫瘍へ直接的に注入される。癌の経過(例えば、腫瘍のサイズにより決定されるような癌の退行)をモニターすることにより、当技術分野における熟練した処置する医師は、薬学的組成物の注入が一回行われるか、または適当な時間の後、繰り返されるかを決定する。注入は、毎日のように行われうる。
【０２２３】
1. WIF-1模倣体
WIF-1ポリペプチド、WIF-1ペプチド、またはWIF-1のWnt結合ドメインを含むポリペプチドと同じ構造を有するペプチド模倣体が、本発明の方法を実施するために、および本発明のキットにおける含有として、有用でありうることもまた当業者に認識されている。ペプチド模倣体は、そのポリペプチドの望ましい性質が模倣体により保持されるようにポリペプチドに対して十分な構造類似性をもつ化合物である。しばしば、模倣体は、そのポリペプチドの基本的構造を模倣する基本的構造を有する、および/またはそのポリペプチドの顕著な生物学的性質を有する。例えば、プロテアーゼインヒビターを用いたペプチド模倣体は、WO 94/05639に記載されている。WIF-1ペプチド模倣体は、天然に存在するまたは組換えWIF-1ポリペプチドの生物学的作用を模倣することができる任意のペプチドまたは非ペプチド化合物を指す。模倣体は、限定されるわけではないが、(i)例えば、WIF-1ポリペプチドおよび模倣体に関して側鎖類似性が全くないまたは極めて少ないように実質的改変をもつペプチド(そのような改変は、例えば、分解に対する模倣体の感受性を減少させうる)；(ii)単離されたペプチドの非タンパク性部分；または(iii)コンビナトリアルケミストリーを通して同定された核酸および作用物質を含む、合成または天然の有機分子を含みうる。例えば、そのような模倣体は、例えば、大きな化学的多様性分子ライブラリー、合成もしくは天然の化合物ライブラリーの構築およびスクリーニング、または合理的な、方向をもったもしくはランダムな設計による、を含む、当技術分野において公知の様々な方法を用いて設計、選択および/または別なふうに同定されうる。そのようなライブラリーをスクリーニングする一般的な目的は、対象となる結合部位への高親和性作用物質を得るために組み合わせ選択の逐次適用を利用することである。方向をもったまたは合理的な薬物設計について、WIF-1のWnt結合ドメインの構造は、ペプチド模倣体の選択および設計のための基礎として用いられうる。ペプチド模倣体はまた、例えば、米国特許第6,514,729号、第6,627,186号、第6,682,923号、および第6,746,853号に記載されている。
【０２２４】
F. 癌の経過の測定(進行、退行)
癌の病期または重症度は、腫瘍の異なる臨床病期を指す。腫瘍の臨床病期は、医学の分野において十分確立されている様々なパラメーターにより定義される。パラメーターの一部は、形態、腫瘍のサイズ、腫瘍が患者の身体中で転移している程度などを含む。
【０２２５】
本発明の一つの好ましい態様において、癌は、癌の経過を測定することの一部として測定される。従って、本発明は、被検体において癌の経過を測定するための方法を提供する。癌経過は、癌進行(悪化)および癌退行(改善)を含む、時間を経ての癌状態における変化を指す。退行は、腫瘍緩解、腫瘍サイズの縮小または減少、癌性細胞の数の減少、および前立腺癌に関連した症状の軽減を含む。
【０２２６】
G. WIF-1が下方制御されている癌をもつ被検体に施される手術または抗癌薬または治療の効果のモニタリング
上記のように、WIF-1を含む組成物は、WIF-1発現が下方制御されている癌の処置のために有用である。しかしながら、他の薬物、例えば、本明細書に記載されているようなWIF-1のアクチベーターを含む組成物、もまたWIF-1発現が下方制御されている患者における癌を処置するために有用であると思われる。
【０２２７】
本発明の好ましい態様において、癌状態は、WIF-1発現が下方制御されている癌と診断された患者に施される、手術(例えば、腫瘍の除去)の効果、抗癌薬または治療の効果をモニターすることの一部として測定される。癌をもつ被検体に施される手術または抗癌薬または治療の効果は、癌の再発、癌の進行(悪化)および癌退行(改善)を含みうる。
【０２２８】
本発明の組成物、方法およびキットを用いて、WIF-1レベルは、手術後の様々な時間において、または様々に抗癌薬もしくは治療を与えられていることにおいて、被検体由来の生体試料で測定される。2回目(t2；例えば、抗癌薬または治療を与えた後)に採取された同じ被検体由来の比較生体試料で検出されたWIF-1レベルより低い、1回目(t1；例えば、抗癌薬または治療を与える前)における被検体由来の生体試料で検出されたWIF-1レベルは、被検体における癌が退行していることを示す。同様に、1回目におけるWIF-1レベルと比較して2回目におけるより低いWIF-1レベルは、被検体における癌が進行していることを示す。類似して、2回目(t2；例えば、手術から数週間または数ヶ月後)に採取された同じ被検体由来の比較生体試料で検出されたWIF-1レベルより低い、1回目(t1；例えば、手術直後)における被検体由来の生体試料で検出されたWIF-1レベルは、被検体における癌が再発していないことを示しうる。同様に、1回目におけるWIF-1レベルと比較して2回目におけるより低いWIF-1レベルは、被検体における癌が再発していることを示しうる。
【０２２９】
VIII. アポトーシスを誘導するための方法
アポトーシスは、多細胞生物体の発生および恒常性の両方において中心的な役割を果たしている。アポトーシスは、腫瘍壊死因子(TNF)受容体/リガンドスーパーファミリーに属する、いくつかのデス受容体とそれらのリガンドの間の複数の相互作用からなる最終のエフェクター機構に収束する複数の独立したシグナル伝達経路により誘導されうる。最も良く特徴付けられたデス受容体は、CD95(「Fas」)、TNFR1(p55)、デス受容体3(DR3またはApo3/TRAMO)、DR4およびDR5(apo2-TRAIUL-R2)である。アポトーシスの最終のエフェクター機構は、カスパーゼと名付けられた一連のプロテイナーゼの活性化である。これらのカスパーゼの活性化は、結果として、一連の生命必須の細胞性タンパク質の切断および細胞死を生じる。
【０２３０】
本発明は、WIF-1発現が下方制御されている細胞においてアポトーシスを誘導するための方法を提供する。一つの局面において、細胞においてアポトーシスを誘導するための方法は、(i)WIF-1ポリペプチド、WIF-1類似体、WIF-1模倣体、WIF-1関連ポリペプチド、WIF-1発現のアクチベーターもしくはWIF-1活性のモジュレーターをコードするポリヌクレオチド、または(ii)WIF-1ポリペプチド、WIF-1類似体、WIF-1模倣体、WIF-1関連ポリペプチド、WIF-1発現のアクチベーターもしくはWIF-1活性のモジュレーターのいずれかを含む組成物に細胞を曝す段階、または組成物と細胞を接触させる段階を含む。典型的には、細胞は、組成物の有効量に曝される、または、と接触させられる。
【０２３１】
好ましい態様において、細胞は、組成物にエクスビボで曝される、または、とエクスビボで接触させられる。もう一つの好ましい態様において、細胞は、組成物にインビボで曝される、または、とインビボで接触させられる。
【０２３２】
A. WIF-1ポリヌクレオチドを用いるアポトーシスを誘導するための方法
好ましい態様において、WIF-1発現が下方制御されている細胞においてアポトーシスを誘導するための方法は、WIF-1ポリヌクレオチドを含む組成物に細胞を曝す段階、または組成物と細胞を接触させる段階を含む。好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2のWIF-1ポリペプチドをコードする。本発明のもう一つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:14のWIF-1ポリペプチドをコードする。本発明のさらにもう一つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:15のWIF-1ポリペプチドをコードする。本発明のもう一つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:16のWIF-1ポリペプチドをコードする。他の好ましいポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位〜180位を含むWIF-1サブドメインポリペプチド；SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜180位を含むWIF-1サブドメインポリペプチド；SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチド；またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基39位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードする。
【０２３３】
本発明のもう一つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1を含む。他の好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位〜180位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜180位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基39位〜176位を含むWIF-1サブドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２３４】
本発明の一つの局面において、WIF-1ポリヌクレオチドは、インビトロで、例えば、培養細胞系において、アポトーシスを誘導するために用いられる。もう一つの好ましい局面において、WIF-1ポリヌクレオチドは、インビボで、すなわち、動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物、において、および好ましくは癌細胞において、アポトーシスを誘導するために用いられる。
【０２３５】
B. WIF-1ポリペプチドを用いるアポトーシスを誘導するための方法
本発明のWIF-1ポリペプチドは、様々な方法において使用を見出す。この発明のもう一つの好ましい態様において、WIF-1を低発現する細胞、好ましくは癌細胞、においてアポトーシスを誘導する方法が提供される。この方法は、細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量でのWIF-1活性を有するポリペプチドと細胞を接触させる段階を含む。
【０２３６】
この方法の好ましい態様において、WIF-1活性を有するポリペプチドは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含むWIF-1ポリペプチドである。この方法のもう一つの好ましい態様において、WIF-1ポリペプチドは、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む。この方法のさらに他の態様において、WIF-1ポリペプチドは、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む。本発明のもう一つの好ましい態様において、WIF-1活性を有するポリペプチドは、本明細書に完全に記載されているようなWIF-1サブドメインポリペプチドである。
【０２３７】
本発明の一つの局面において、WIF-1ポリペプチドは、インビトロで、例えば、培養細胞系において、アポトーシスを誘導するために用いられる。もう一つの好ましい局面において、WIF-1ポリペプチドは、インビボで、すなわち、動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物、において、および好ましくは癌細胞において、アポトーシスを誘導するために用いられる。
【０２３８】
IX. 遺伝子治療
一つの局面において、WIF-1ポリペプチド、WIF-1類似体、WIF-1模倣体、WIF-1関連ポリペプチド；WIF-1発現のアクチベーター；またはWIF-1活性のモジュレーターをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子治療として、WIF-1機能を促進するために投与される。遺伝子治療とは、発現されるまたは発現可能な核酸の被検体への投与を指す。この態様において、核酸は、WIF-1機能を促進することにより治療効果を仲介するそれのコードされたポリペプチドを産生する。
【０２３９】
当技術分野において利用できる、および本明細書に記載された遺伝子治療のための方法のいずれかが、本発明に従って用いられうる。遺伝子治療の方法の一般的な概説として、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); およびTIBETECH 11(5):155-215 (May, 1993)を参照されたい。用いられうる組換えDNAテクノロジーの当技術分野において一般的公知の方法は、Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); およびKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
【０２４０】
好ましい局面において、遺伝子治療としてWIF-1機能を促進する核酸は、WIF-1ポリペプチド、その断片またはキメラタンパク質をコードする配列を含み、ヌクレオチド配列が、適した宿主においてWIF-1ポリペプチド、その断片またはキメラタンパク質を発現させる発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸は、WIF-1コード領域へ実施可能に連結されたプロモーターを有する。プロモーターは、誘導性または恒常的(および任意で、組織特異的)でありうる。もう一つの特定の態様において、WIF-1コード配列および任意の他の望ましい配列が、ゲノムにおける所望の部位で相同性組換えを促進する領域に隣接しており、それに従って、WIF-1核酸の染色体内発現を提供する、核酸分子が用いられる(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989))。
【０２４１】
被検体への核酸の送達は直接的でありうり、その場合、被検体は、核酸または核酸保有ベクターに直接的に曝される、またはと接触させられる；このアプローチはインビボ遺伝子治療として知られている。または、被検体への核酸の送達は間接的でありうり、その場合、細胞は、最初、インビトロで核酸で形質転換され、その後、被検体へ移植される；このアプローチはエクスビボ遺伝子治療として知られている。
【０２４２】
X. 診断的および/または予後的適用に用いるキット
上で示唆された診断、研究および治療の適用における使用について、キットもまた、本発明により提供される。診断および研究適用において、そのようなキットは、以下のいずれかまたはすべてを含みうる：アッセイ試薬、緩衝液、WIF-1ポリペプチド、WIF-1特異的核酸または抗体、ハイブリダイゼーションプローブおよび/またはプライマー、WIF-1発現構築物、WIF-1の低分子アクチベーターなど。治療用製品は、滅菌食塩水、または別の薬学的に許容される乳濁液および懸濁液基剤を含みうる。
【０２４３】
さらに、キットは、この発明の方法の実施についての指示を含む使用説明書(すなわち、プロトコール)を含みうる。使用説明書は、1つまたは複数がキットに存在しうる、様々な形をとって本キットに存在しうる。使用説明書は、典型的には、書かれたまたは印刷された物を含むが、そのようなものに限定されない。そのような使用説明書を保存し、かつそれらをエンドユーザーへ伝達する能力がある任意の媒体がこの発明により企図される。そのような媒体は、限定されるわけではないが、電子記憶媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光媒体(例えば、CD-ROM)などを含む。そのような媒体は、そのような使用説明書を提供するインターネットサイトへのアドレスを含みうる。
【０２４４】
本発明はまた、WIF-1活性のモジュレーターについてスクリーニングするためのキットを提供する。そのようなキットは、容易に利用できる材料および試薬から調製されうる。例えば、そのようなキットは、以下の材料の1つまたは複数を含みうる：WIF-1ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、反応チューブ、およびWIF-1活性を試験することについての使用説明書。任意で、キットは生物活性のあるWIF-1タンパク質を含む。幅広い種類のキットおよび成分は、キットの意図されたユーザーおよびユーザーの特定のニーズに依存して、本発明により調製されうる。
【０２４５】
本発明の好ましい態様において、キットは薬学的キットであり、(i)WIF-1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および(ii)薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。本発明のもう一つの好ましい態様において、キットは、薬学的キットであり、(i)WIF-1ポリペプチド、好ましくはWIF-1サブドメインポリペプチド、および(ii)薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。薬学的キットは、任意で、薬学的組成物が、WIF-1発現が下方制御されている癌を処置するために用いられることができる、または、はずであることを提示する指示を含む。
【０２４６】
本発明によるキットはさらに、質量分析法を行うための試薬を含みうる。そのような試薬は、当業者に周知であり、例えば、プローブまたはチップを含む。
【０２４７】
本発明の追加のキット態様は、当業者が本明細書に記載された方法バリエーションのいずれかを行うことを可能にする任意の機能的構成要素を含む。
【０２４８】
前記の発明は、明瞭および理解のために、例証および実例としてかなり詳細に記載されているが、ある種のバリエーション、変化、改変および等価物の置換が、本発明の真意および範囲から必ずしも逸脱することはなくそれらになされうることは、本発明の教示を鑑みれば当業者にとって容易に明らかであると思われる。結果として、本明細書に記載された態様は、様々な改変、変化などを受けやすく、本発明の範囲は、ただ、それに添付された特許請求の範囲への参照によってのみ決定される。当業者は、本質的に類似した結果を生じるように変化、変更または改変されうる、様々な重要でないパラメーターを容易に認識するものと思われる。
【０２４９】
本発明の要素のそれぞれは、複数の態様を含むように本明細書に記載されているが、他に規定がない限り、本発明の所定の要素の態様のそれぞれは、本発明の他の要素の態様のそれぞれと共に用いられることができ、そのような使用のそれぞれは、本発明の別の態様を形成することが意図される。
【０２５０】
本明細書に引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み入れられていることを具体的にかつ個々に示されているかのように、参照により全体として本明細書に組み入れられている。
【０２５１】
上の開示から認識されうるように、本発明は、幅広い種類の適用を有する。本発明はさらに、以下の実施例により例証されるが、それは例証となるのみであり、決して、本発明の定義および範囲を限定することを意図されない。
【０２５２】
XI. 実施例
実施例1：一般的方法
A. 細胞系および組織試料
NSCLC細胞系(NCI-H1703、NCI-H460、NCI-H838およびNCI-A549)、黒色腫細胞系LOX、肝細胞癌細胞系SNU398、および結腸直腸癌細胞系HCT116は、American Type Culture Collections(ATCC; Manassas, Virginia)から入手され、10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 IU/ml)およびストレプトマイシン(100 μg/ml)を追加したRPMI 1640において培養された。正常なヒト末梢気道上皮細胞(SAEC)および気管支上皮細胞(NHBE、16HBE)(一次培養)は、Cambrex Bio Science Walkersville, Inc. (Walkersville, Maryland)またはClonetics (Walkersville, Maryland)から入手され、Clonetics SAGM(商標)Bullet Kitにおいて培養された。すべての細胞は、5%CO2を含む湿度の高いインキュベーターにおいて37℃で培養された。
【０２５３】
肺癌について切除術を受けた患者からの新鮮な肺癌組織および隣接した正常な肺組織が、手術の時点において収集され、すぐに、液体窒素中で急速凍結された(IRB認可H8714-15319-040)。これらの組織試料は、使用前に液体窒素フリーザーにおいて-170℃で保たれた。
【０２５４】
B. クローニングおよび配列分析
ヒトWIF-1遺伝子のプロモーター領域をクローニングするために、PCRに基づいた技術が用いられた。細胞系および新鮮な組織試料のゲノムDNAは、DNA STAT-60(商標)試薬(TEL-TEST, Inc., Friendswood, Texas)を用い、製造会社のプロトコールに従って抽出された。ゲノムDNAの亜硫酸水素塩改変は、メチル化キット(EZ DNAメチル化キット、Zymo Research, Orange CA)を用いることにより行われた。亜硫酸水素塩処理されたゲノムDNAは、2ペアのプライマー：
WIF-1プロモーター領域のヌクレオチド-555位〜-140位を増幅するために設計された
2008500398.tif 000008
および
2008500398.tif 000009
ならびに、ヌクレオチド-161位〜+118位を増幅するための
2008500398.tif 000010
および
2008500398.tif 000011
を用いて増幅された(WIF-1の開始コドンATGが+1と定義される)。PCR産物は、抽出キット(QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Valencia, CA)を用いてアガロースゲルから抽出され、続いて、UCSF Cancer Center(San Francisco, California)のDNA-sequencing Core Facilityにおいてシーケンシングされた。
【０２５５】
WIF-1の5'ゲノム領域の切断型は、ヒトゲノムDNAからPCRにより作製され、pGL3Basicベクターへサブクローニングされた。消化された挿入断片およびベクターはゲル精製され、欠失構築物を与えるようにライゲーションされた。クローン化断片は、制限酵素消化およびシーケンシングにより調べられた。
【０２５６】
C. 一過性トランスフェクションおよびプロモーター活性測定
一過性トランスフェクション実験について、細胞(2x105個)が、トランスフェクションの24時間前に、6ウェルのプレートに蒔かれた。Lipofectamine 2000が、pGL3Basicベクターにおける各プロモーター構築物の1.0 μgおよびトランスフェクション効率を補正するための0.5 μg pSV-β-ガラクトシダーゼを用いるトランスフェクションを媒介するために用いられた。トランスフェクションされた細胞は、24時間、インキュベートされ、その後、ルシフェラーゼ活性が測定された。いくつかの実験において、トランスフェクションされた細胞は、後のルシフェラーゼ活性の測定の前に6時間、サイトカインで処理された。すべてのルシフェラーゼ活性は、β-ガラクトシダーゼ活性に対して標準化され、1に設定される空のpGL3Basicベクターの基礎活性に対して与えられた。細胞がサイトカインで処理される実験において、標準化されるルシフェラーゼ活性は、サイトカイン処理後、空のpGL3Basicベクターの基礎活性に対して与えられた。測定は、3連で行われ、少なくとも3つの独立した実験において繰り返された。示されるデータは平均値(+S.D.)を表す。
【０２５７】
D. コロニー形成アッセイ
一過性トランスフェクション実験について、細胞(2x105個)が、トランスフェクションの24時間前に、6ウェルのプレートに蒔かれた。Lipofectamine 2000(Life Technologies)が、製造会社のプロトコールに従って、pCDNA3ベクターにおけるWIF-1 cDNA構築物の5.0 μgまたは対照として5.0 μg 空のpCDNA3ベクターを用いるトランスフェクションを媒介するために用いられた。トランスフェクションされた細胞は、取り出され、トランスフェクションから48時間後、10 cmの細胞培養皿上に蒔かれた。細胞は、その後、G418(400 μg/ml)により選択された。コロニーは、0.5%メチレンブルー(Methylene Blue)で染色され、トランスフェクションから4週間後、数えられた。
【０２５８】
E. 馴化培地(CM)、組換えタンパク質およびタンパク質インキュベーション
ヒトWIF-1オープンリーディングフレームを含むpcDNA3.1発現ベクターは、馴化培地を作製するために用いられた。実験の1セットにおいて、WIF-1オープンリーディングフレームは、完全長WIF-1コード領域、すなわち、SEQ ID NO:2のWIF-1ポリペプチドをコードする、を含んだ。従って、シグナルペプチドの切断後、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基29位〜379位を含む組換え成熟WIF-1ポリペプチドが精製された。実験のもう1セットにおいて、WIF-1オープンリーディングフレームは、WIF-1サブドメインポリペプチドコード領域、例えば、SEQ ID NO:26に示されているようなWIF-1ポリペプチドをコードする、を含んだ。従って、シグナルペプチドの切断後、SEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含む組換えWIF-1サブドメインポリペプチドが精製された。もう一つのWIF-1サブドメインポリペプチド配列は、SEQ ID NO:28に示されている。シグナルペプチドの切断後、SEQ ID NO:29のアミノ酸配列を含む組換えWIF-1サブドメインポリペプチドが精製された。
【０２５９】
簡単には、293T細胞系は、Lipofectamine 2000(Life Technologies)が製造会社のプロトコールに従って、pcDNA3.1/myc-hisにおけるWIF-1 cDNA構築物のトランスフェクションを媒介するために用いられる前に、無血清Freestyle 293発現培地において維持された。無血清馴化培地(対照CM)は、トランスフェクションされていない293T細胞から調製された。馴化培地は、4日および7日後、収集された。収集されたCMは、遠心分離により細胞片を除去され、遠心分離により10倍に濃縮され、濾過され、-80℃で凍結された。コムギ胚芽により産生された精製組換えヒトWIF-1タンパク質は、Abnova Corp. (Taiwan, ROC)から購入された。NSCLC細胞は、実験の1日前に6ウェルのプレートに蒔かれた。その後、標準培地は、様々な濃度での組換えヒトWIF-1タンパク質の有りまたは無しのCMを含む培地と取り替えられ、細胞は、5%CO2を含む湿度の高いインキュベーターにおいて37℃でインキュベートされた。典型的には、WIF-1ポリペプチドを含むCMの40 μl、100 μlおよび200 μlが細胞へ添加された。SDS-PAGEによる定量化に基づいて、細胞に添加されて、WIF-1活性の検出をもたらすWIF-1ポリペプチドの濃度は、約10 ng/mlから約500 ng/mlまでの範囲であると推定された。細菌において産生されたWIF-1ポリペプチドについての類似したWIF-1ポリペプチド活性を検出するために、ずっと高い濃度のWIF-1ポリペプチドが細胞へ添加された。いくつかの実験において、細菌で発現されたWIF-1の量は約500 ug/mlであった。これは、哺乳類動物細胞により産生されたタンパク質について必要とされる濃度より1000倍より高い濃度に相当した。
【０２６０】
F. アポトーシス分析
トランスフェクション(上記のような)から3日後、5日後、または1週間後、細胞(例えば、NSCLC細胞)は、トリプシン処理により収集され、Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit(Oncogene, Cambridge, Massachusetts; Apotarget, BioSource International)を用い、製造会社のプロトコールに従って、細胞表面アネキシン-Vおよびヨウ化プロピジウム(PI)含有量の測定のために処理された。アネキシン-V-PI二重染色体制を用いて、細胞の3集団が2色フローサイトメトリーにおいて識別可能である。(a)非アポトーシス細胞はアネキシン-VおよびPI陰性である；(b)露出されたホスファチジルセリンをもつが、無傷細胞膜をもつ初期アポトーシス細胞は、アネキシンV-FITCに結合したが、ヨウ化プロピジウムを排除した；(c)壊死または後期アポトーシス細胞における細胞はアネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウムの両方で標識された。染色された細胞は、フローサイトメトリー(FACScan; Decton Dickinson, Franklin Lake, New Jersey)によりすぐに分析された。
【０２６１】
G. 半定量的RT-PCR
肺癌細胞系、新鮮な肺癌および対の隣接した正常な組織からの全RNAは、抽出キット(RNeasy Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA, USA)を用いて単離された。RT-PCRは、Life Technologies Inc.からのOne-step RT-PCR Kitを用い、製造会社のプロトコールに従って、GeneAmp PCR system 9700において行われた。RT-PCRについてのプライマーは、Operon Technologies Inc. (Alameda, California)から入手された。ヒトWIF-1 cDNAについてのプライマー配列は、以下であった：
2008500398.tif 000012
および
2008500398.tif 000013
。GAPDHは、内部対照として用いられた。5-アザ-2'-デオキシシチジン(DAC)(Sigma, St. Louis, Missouri)処理は、以前に記載されているように行われた
2008500398.tif 000014
。
【０２６２】
H. ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングについての標準プロトコールが用いられた。WIF-1ウサギポリクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California)から入手された。抗WIF-1、抗Dvl3、および抗サバイビン抗体は、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)からであった。抗ヒトWIF-1モノクローナル抗体は、R&D Systems(Minneapolis, MN)から購入された。抗サイクリンD1抗体は、Oncogene(Cambridge, MA)からであった。抗β-アクチンモノクローナル抗体は、Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA)から入手された。抗β-カテニン抗体は、Transduction Laboratories (Lexington, KY)から購入された。抗チトクロムc抗体は、BD Biosciecnes (San Diego, CA)からであった。サイトゾルタンパク質が調製された。
【０２６３】
I. メチル化特異的PCR
亜硫酸水素塩処理されたゲノムDNAは、メチル化特異的プライマーセットかまたは非メチル化特異的プライマーセットのいずれかを用いて増幅された。HotSarTaq DNAポリメラーゼ(Qiagen Inc.)が実験に用いられた。メチル化特異的プライマーの配列は以下であった：
2008500398.tif 000015
および
2008500398.tif 000016
。非メチル化特異的プライマーの配列は以下であった：それぞれ、WIF-1プロモーター領域配列-488位〜-468位および-310位〜-290位に対応する、
2008500398.tif 000017
および
2008500398.tif 000018
。
【０２６４】
J. WIF-1発現ベクター
いくつかの発現ベクターが、真核細胞および原核細胞におけるWIF-1ポリペプチドおよびWIF-1サブドメインポリペプチドの発現のために構築された。標準組換えDNAテクノロジー(例えば、Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3版, 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994-1999)が、真核細胞におけるWIF-1の発現のための以下の発現ベクターを構築するために用いられた：(1)SEQ ID NO:2に示されているようなWIF-1ポリペプチドをコードする核酸を含む、pcDNA3.1-myc-his:1-379；(2)SEQ ID NO:2に示されているようなWIF-1ポリペプチドをコードする核酸を含み、かつSEQ ID NO:30(シグナルペプチドの切断後)に示されているようなWIF-1ポリペプチドを発現させる、pcDNA3.1:1-379；(3)SEQ ID NO:26に示されているようなWIF-1ポリペプチドをコードする核酸を含み、かつSEQ ID NO:27(シグナルペプチドの切断後)に示されているようなWIF-1ポリペプチドを発現させる、pcDNA3.1:1-180；(4)SEQ ID NO:28に示されているようなWIF-1ポリペプチドをコードする核酸を含み、かつSEQ ID NO:29(シグナルペプチドの切断後)に示されているようなWIF-1ポリペプチドを発現させる、pcDNA3.1:1-176；および(5)SEQ ID NO:2に示されているようなWIF-1ポリペプチドをコードする核酸を含み、かつSEQ ID NO:30(シグナルペプチドの切断後)に示されているようなWIF-1ポリペプチドを発現させる、アデノウイルスベクター:1-379。原核細胞における発現について、(1)SEQ ID NO:30の配列を含むHisタグ付きWIF-1ポリペプチドをコード化しかつ発現させる、pCo1dI:29-379、および(2)SEQ ID NO:27の配列を含むHisタグ付きWIF-1ポリペプチドをコード化しかつ発現させる、pCo1dI:29-180。
【０２６５】
K. 細菌におけるWIF-1ポリペプチド発現
SEQ ID NO:27に示されているようなWIFサブドメインポリペプチドおよびSEQ ID NO:30に示されているような完全長WIF-1ポリペプチドは大腸菌(E. coli)で産生された。それぞれのコード領域は、pColdIベクターに挿入され、WIF-1ポリペプチドは、N末端Hisタグと共に発現され、大腸菌(菌株：BL21 DE3)で発現された。両方のタンパク質は、細菌可溶化物から抽出され、ニッケルNTAカラムを用いて精製された。WIF-1ポリペプチドは、抗WIF-1抗体および抗His抗体(R&D, Santa Cruz Biotechnology)の両方を用いるウェスタンブロッティングにより検証された。WIF-1ポリペプチドの定量化は、SDS-PAGEゲル(クーマシーアッセイ)およびBCAタンパク質定量化アッセイ法の両方により行われた。
【０２６６】
L. アデノウイルスベクターを用いるWIF-1ポリペプチド発現
WIF-1完全長ポリペプチド(SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位〜379位)についてのコード領域は、アデノウイルスベクターへクローニングされた。組換えアデノウイルスベクターは、HEK-293細胞を感染させるために用いられた。上清は、濃縮され(10X)、その後、抗ヒトWIF-1モノクローナル抗体(R&D)を用いるウェスタンブロッティングにより確証された。用量(200 μl、100 μl、40 μl)および時間依存性アポトーシスは、黒色腫細胞系LOXならびに肺癌細胞系H460およびA427の両方において認められた(データ示されず)。Wntシグナル伝達経路の遮断は、経路におけるいくつかの重要なタンパク質、例えば、DVL-3、β-カテニン、サイクリンD1など、のウェスタン分析により確認された。
【０２６７】
M. WIF-1のタンパク質グリコシル化分析
WIF-1タンパク質のタンパク質グリコシル化分析が行われた。グリコシル化アッセイ法は、GlycoProfile III Kit(Sigma Chemical)を用い、製造会社の使用説明書に従って、行われた。タンパク質グリコシル化は、産生され、かつ細菌から、またはAbnova Biotech, Inc.からの市販のWIF-1タンパク質から抽出されたWIF-1タンパク質(完全長WIF-1ポリペプチドおよびWIF-1サブドメインポリペプチド)上に検出されなかった(データ示されず)。しかしながら、トランスフェクションされた293T細胞から精製された完全長組換えWIF-1ポリペプチドおよび組換えWIF-1サブドメインポリペプチドはグリコシル化を示した(データ示されず)。
【０２６８】
N. 統計学的解析
エクセル(Excel)における独立t検定が、異なる構築物および処理の活性を比較するために用いられた。
【０２６９】
実施例2：WIF-1プロモーター領域の同定
WIF-1プロモーターを同定するために、BLAST検索が、UCSCrにおけるヒトゲノムデータベースに対して仮想的プローブとしてWIF-1の1140-bpのコード配列を用いて行われた。プロモーター検索プログラムは、遺伝子の5'領域がプロモーター領域の古典的特徴を示すことを確認するために用いられた。さらに、CpGアイランド検索プログラムは、WIF-1プロモーター内にCpGアイランドをマッピングするために用いられた(図1)。このプロモーター領域(WIF-1オープンリーディングフレームのATGの前の1.2 kb)における105個のCpGが同定された。
【０２７０】
実施例3：ヒトWIF-1プロモーターの欠失突然変異体での機能性分析
プロモーター活性を研究するために、完全な1 kbの断片(ATGより前の)および5個切り詰められた断片が、プロモーターを含まないルシフェラーゼ(LUC)発現ベクターpGL3Basicへクローニングされた。293T細胞は、それらの構築物でトランスフェクションされ、LUC活性を調べられた。完全な野生型構築物(構築物1)は、非常に高い基礎活性を示した(1に設定された空のベクターのと比較してLUC活性の約200倍増加)。
【０２７１】
実施例4：WIF-1は癌細胞においてプロモーター過剰メチル化により下方制御される
いくつかの正常および腫瘍細胞系におけるWIF-1発現は、半定量的RT-PCRを用いて調べられた(図2A)。WIF-1がすべての3つの正常な一次細胞培養物NHBE、16HBEおよびSAECにおいて発現された。対照的に、WIF-1転写産物は、4つのNSCLC細胞系のうちの3つにおいて欠けていたまたは劇的に低発現していた。次に、これらの細胞系におけるCpGアイランドのメチル化状態が分析された。WIF-1発現を欠く試験されたすべての癌細胞系は、メチル化特異的PCR(MSP)を用いて過剰メチル化されていることが見出された(図2B)。対照的に、WIF-1を発現させているすべての正常な対照において過剰メチル化は見られなかった。WIF-1は、H1703細胞系においてより少ない程度で低発現され、MSPのみがこの細胞系において部分的メチル化を示す。さらに、亜硫酸水素塩シーケンシングが、いくつかの細胞系において、-554位からATGまでのプロモーターおよびATGから+118位までの最初のエクソンの一部を含むWIF-1の672 bpの断片における60個のCpG部位のメチル化状態の詳細を分析するために用いられた(図3A)。MSP結果と一致して、これらのCpGアイランドが試験されたすべてのNSCLC細胞系において高密度にメチル化されていることが見出された。さらに、WIF-1発現は、WIF-1発現を欠くそれらの細胞系における脱メチル化剤DAC処理後、回復されることが見出された(図3B)。正常および癌細胞における下方制御されたWIF-1 mRNAレベルは、これらの細胞におけるWIF-1タンパク質と相関した。WIF-1タンパク質は、正常な一次培養細胞(NHBE、SAECおよびNHEK)において発現されていることが見出された(図17)。しかしながら、WIF-1タンパク質は、肺癌(H460、A549)、乳癌(MCF-7)、大腸癌(SW480)および中皮腫(MS-1、H2052)を含むヒト癌細胞において低発現している(図17)。これらの結果は、NSCLC細胞系におけるWIF-1発現の状態が、WIF-1プロモーター領域の高密度のCpGメチル化と相関していることを示す。
【０２７２】
実施例5：WIF-1は新鮮なヒトNSCLC組織試料においてプロモーター過剰メチル化により下方制御されている
WIF-1発現およびメチル化状態は、一次NSCLC組織試料において分析された。外科的に切除された初期肺癌の18個のマッチドペアの間で、15個の癌試料(83%)がそれらの自己の正常試料と比較して有るか無しかのWIF-1 mRNAを有することが見出された(図4A)。MSPを用いることにより、異常なメチル化が、WIF-1発現を欠くすべての腫瘍試料において見出されたが、それらの対応正常試料においては見出されなかった(図4B)。この相関は、RNAおよび亜硫酸水素塩処理されたゲノムDNAの両方が入手できた8つの症例(患者6、7、9、10、11、12、15、18)において実証された。さらに、MSPは、8つの追加のマッチド試料(患者19〜26)において行われ、それらのうちの7つにおいてメチル化の証拠が見出された。いくつかの症例において、非メチル化バンドだけでなくわずかなメチル化バンドが、おそらく非癌検体における避けられない癌細胞の混入または腫瘍周囲の正常組織の前悪性変化のせいによって、それぞれ、正常および腫瘍組織において観察された。これらのデータは、WIF-1のサイレンシングが、一次NSCLC組織試料においてそれのプロモーターの過剰メチル化と相関していることを示している。さらに、多数の試料についての亜硫酸水素塩処理後のWIF-1プロモーター領域の配列が分析された。それらのCpG部位(図4C)における高密度のメチル化が検出された。要約すれば、WIF-1は、NSCLCにおいて、頻繁に下方制御され、この下方制御はプロモーター過剰メチル化と相関している。
【０２７３】
実施例6：WIF-1の回復はアポトーシス性細胞死を誘導する
WIF-1の回復が、WIF-1遺伝子がプロモーター過剰メチル化により下方制御されている肺癌細胞系において成長抑制を引き起こすことができるかどうかが実証された。トランスフェクションおよびその後の薬物選択から1週間後、WIF-1トランスフェクションされたH460、A549 MS1、SW480、H28およびMCF7細胞における、空ベクターでトランスフェクションされた対照トランスフェクタントと比較した、生きている細胞数の劇的な減少(P<0.005)が見出された(図5)。フローサイトメトリー分析は、WIF-1がメチル化サイレンシングされているWIF-1トランスフェクションされたH460、A549およびH28細胞(トランスフェクション後1週間目において約57〜70%)において、空ベクターでトランスフェクションされたH460、A549およびH28細胞(トランスフェクション後1週間目において約12〜26%)より有意に高いレベルのアポトーシス誘導を示した(P<0.005)(図5)。この結果は、WIF-1発現が、それらのH460、A549およびH28細胞においてアポトーシスを誘導することにより細胞成長を抑制することを示している。4週間の薬物耐性コロニーの選択後、WIF-1トランスフェクションされた細胞のコロニー数が空ベクターでトランスフェクションされた細胞のそれと比較して減少したことが見出された(p<0.005)。
【０２７４】
WIF-1はWntタンパク質を結合すること、およびそれらの活性を阻害することが知られている(Hsieh et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 96(7):3546-51 (1991))。最近、Wissman et al.が、いくつかのヒト癌におけるWIF-1の下方制御をマイクロアレイ分析を用いることにより報告し、乳癌の60%および肺癌の75%において免疫組織化学により後者を確認した。この適用において、転写レベルでのNSCLC細胞系におけるWIF-1の下方制御が報告されている。さらに、WIF-1はまた、正常な組織と比較した場合、新鮮なNSCLC外科的検体の83%において下方制御されていることが見出された。WIF-1サイレンシングは、癌細胞系およびヒトNSCLC一次組織の両方において、それのプロモーター過剰メチル化と相関している。
【０２７５】
本発明者らは、WIF-1下方制御が、結腸直腸癌におけるsFRPについて以前に報告されているように、NSCLCにおいて後成的制御を通して起きることを提案する。WIF-1が、FzまたはsFRPのCRDドメインとの少しの配列類似性をも欠くことは注目に値する(Bui et al., Oncogene 14(10):1249-53 (1997); Melkonyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(25):13636-41 (1997); Shimizu et al., Cell. Growth Differ. 8(12):1349-58 (1997); Todd et al., Cancer Res. 57(7):1344-52 (1997))。WIF-1は、Wnt結合ドメインおよび5つの上皮成長因子様リピートを含む。それは、細胞外間隙におけるXWnt-8およびショウジョウバエWgに結合し、XWnt-8-Dfz相互作用を阻害することができる(Hsieh et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 96(7):3546-51 (1999))。WIFがWntと相互作用する機構は、依然として部分的に理解されているままである。WIF-1プロモーターにおけるTcf応答エレメントが同定され(データ示されず)、WIF-1がWntシグナル伝達の負のフィードバック制御因子として働くことができることを示唆した。
【０２７６】
遺伝子の転写を下方制御するプロモーター領域の異常メチル化は、ヒト癌において腫瘍抑制遺伝子を不活性化することについての機構として認識されている。肺癌において、p16が最初に、メチル化されていることが報告された。今、APC、H-カドヘリン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、レチノイン酸受容体β-2、E-カドヘリン、RAS関連ドメインファミリー1Aのような多くの他の遺伝子が、肺癌の様々な型においてメチル化されていることが示されており、最近、NSCLC細胞におけるヒトSOCS-3プロモーターの過剰メチル化が報告された
2008500398.tif 000019
。本明細書に記載されているようにプロモーターメチル化によるWIF-1サイレンシングの発見により、NSCLCの発生中における重要な後成的事象が明らかにされ、WIF-1が、肺癌においてWntシグナル伝達の重要なアンタゴニストでありうることを示唆している。
【０２７７】
WIF-1の発現は、肺癌細胞系A427、A549およびH460、乳癌細胞系MCF-7、大腸癌細胞系SW480、ならびに中皮腫細胞系MS-1およびH28を含む、様々なヒト癌細胞系においてアポトーシスを誘導することもまた見出されている。さらに、WIFドメイン(WD)ポリペプチド、SEQ ID NO:2に示されているようなWIF-1ポリペプチドのアミノ酸39位〜176位を含む機能性Wnt結合サブドメインは、肺癌細胞系A427において用量依存性アポトーシスを誘導する。WIF-1ポリペプチドは、肺癌細胞系H460において用量依存性アポトーシスを誘導する；精製された組換えヒトWIF-1タンパク質は、肺癌細胞系H460において用量依存性アポトーシスを誘導する；WIF-1ポリペプチドは、黒色腫細胞系LOX(図24)およびFEMXにおいて用量依存性アポトーシスを誘導する；ならびにWDポリペプチドは、黒色腫細胞系LOXおよびH460(図22および23)において用量依存性アポトーシスを誘導する。さらに、組換えヒトWIF-1タンパク質は、肺癌細胞系H460においてWntシグナル伝達経路を阻害する。
【０２７８】
総合すれば、本明細書に記載された発見は、WIF-1サイレンシングがプロモーター過剰メチル化の結果として起こり、癌において、特に肺癌において、Wnt経路の恒常的活性化の重要な原因でありうることを示している。これらの発見は、抗体遮断のようなストラテジーを通してWntシグナル伝達経路を阻害する治療的可能性を強化し、脱メチル化剤によりWIF-1不活性化を逆転するという関心を高める。そのようなストラテジーは、Wnt経路が最も重要であるように思われ、かつ現行の処置が期待はずれのままであるNSCLCにおいて特に興味深い。
【０２７９】
実施例7：WIF-1 cDNAのトランスフェクションは癌細胞系においてアポトーシスを誘導し、WNTシグナル伝達を阻害する
WIF-1がNSCLC細胞系においてアポトーシスを誘導し、かつWntシグナル伝達を遮断することができることを実証するために、WIF-1ポリペプチドコード化プラスミドが、細胞系H460およびA549へトランスフェクションされた。ヒトWIF-1オープンリーディングフレームは、NSCLC細胞におけるWIF-1タンパク質の再発現のために哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1へクローニングされた。この研究に用いられる発現ベクターは、SEQ ID NO:2の完全長WIF-1ポリペプチドかまたはSEQ ID NO:26に示されているようなWIF-1サブドメインポリペプチドのいずれかをコードする核酸を含んだ。まず、WIF-1の低発現が、SAEC細胞、NHBC細胞および293T細胞からのWIF-1無血清CMと比較した場合のタンパク質レベルで確認された(対照；図6A)。トランスフェクションから5日後、両方の細胞系において劇的に増加したアポトーシス細胞死が観察された(図6B)。さらに、正準のシグナル経路の重要な媒介物、サイトゾルのβ-カテニンが下方制御された(図6C)。加えて、アポトーシスのインヒビター、サバイビンもまた、WIF-1トランスフェクション後、A549およびH460細胞において下方制御された。サバイビンは、Wntシグナル伝達経路における重要な下流遺伝子である(He et al., Neoplasia 6:7-14 (2004); You et al., Oncogene 23:6170-6174 (2004))。これらの結果は、WIF-1タンパク質の再発現が、Wntシグナル伝達経路の阻害を通してNSCLC細胞系H460およびA549においてプログラム細胞死を誘導することを示している。さらに、WIF-1の再発現は、中皮腫細胞系MS1およびH28において、大腸癌細胞系SW480において、ならびに乳癌細胞系MCF-7において、アポトーシスを誘導した(図9)。
【０２８０】
実施例8：WIF-1発現プラスミドでトランスフェクションされた細胞からの無血清馴化培地は癌細胞系においてアポトーシスを誘導する
さらにNSCLCにおいてWIF-1により誘導されるアポトーシス効果を検証するために、WIF-1無血清CMが、細胞系H460、A549およびH838を処理するために用いられた。組換えヒト完全長WIF-1 CMは、一過性トランスフェクションを経て作製された。無血清CMにおけるWIF-1タンパク質は、ウェスタンブロット分析により確認された(図6A)。インキュベーションから5日後、NSCLC細胞系H460、A549およびH838において劇的に増加した細胞死が観察された(図7A)。フローサイトメトリー実験より、細胞死は主にアポトーシス誘導によったことが示されている(インキュベーションの5〜7日後、>80%のアポトーシス細胞)(図7B)。さらに、アポトーシス誘導は、試験されたすべての3つのNSCLC細胞系において用量依存性であった、例えば、H460細胞におけるWIF-1とアポトーシス誘導の間の用量応答関係は、図7Cおよび図10に示されている。Wntシグナル伝達の用量応答阻害は、WIF-1 CMにより誘導されたアポトーシスのレベルと相関した(図7D)。サイトゾルのβ-カテニンおよびサバイビンの両方は下方制御された(図7D)。さらに、Wntシグナル伝達の重要な下流遺伝子、サイクリンD1は、WIF-1 CM処理後、下方制御された(図7D)。チトクロムCの過剰発現は、WIF-1 CMにより誘導されたアポトーシス細胞のさらなる証拠としての役割を果たした。これらのデータは、WIF-1 CMが、用量依存性様式で、Wntシグナル伝達経路を阻害し、アポトーシスを誘導することを示している。組換え完全長ヒトWIF-1ポリペプチドもまた、肝細胞細胞系SNU398において、および結腸直腸癌細胞系HCT-116において、用量依存性様式でアポトーシスを誘導した(図20および21)。
【０２８１】
実施例9：WIF-1(WD)発現プラスミドでトランスフェクションされた細胞からの無血清馴化培地はアポトーシスを誘導する
WIF-1のアポトーシス効果が完全長WIF-1に限定されないことを実証するために、肺癌細胞系A427が、WIF-1(WD)発現プラスミド(本明細書に記載されているように調製された)でトランスフェクションされた細胞からの無血清馴化培地とインキュベートされた。この発現プラスミドは、シグナルペプチドの切断後にSEQ ID NO:27に示されたアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基1位〜180位を含む機能性WIF-1サブドメインポリペプチドをコードする。このWIF-1(WD)ポリペプチドもまた肺癌細胞系A427においてアポトーシスを誘導することが見出された(図12)。
【０２８２】
SEQ ID NO:27の組換えWIF-1サブドメインポリペプチドはまた、黒色腫細胞系LOXおよび肺癌細胞系H460に添加された場合、有意な細胞毒性効果を示す(図22および23)。
【０２８３】
実施例10：WIF-1発現プラスミドでトランスフェクションされた細胞からの無血清馴化培地は非肺癌細胞系においてアポトーシスを誘導する
WIF-1のアポトーシス効果がNSCLC細胞に限定されないことを実証するために、本発明者らは、WIF-1発現プラスミド(上記のように作製された)でトランスフェクションされた細胞からの無血清馴化培地で他の癌細胞を処理した。WIF-1により媒介されかつNSCLC細胞に観察されたアポトーシス効果はNSCCLC細胞に限定されないことが、見出された。無血清馴化培地からの組換えWIF-1タンパク質は、黒色腫細胞系LOX(図13)および黒色腫細胞系FEMX(図14)において用量依存性アポトーシスを誘導した。NSCLC細胞について観察されたように、WIF-1ドメイン(WD)もまた、黒色腫細胞系LOXにおいてアポトーシスを誘導するのに十分であった(図15)。アポトーシスを誘導することに加えて、WIF-1(WD)はまた、例えば、dishevelled-3の発現の低下により、証明されるように、黒色腫細胞系LOXにおいてWntシグナル伝達経路を阻害した(図16)。
【０２８４】
実施例11：精製されたヒトWIF-1はNSCLC細胞系においてアポトーシスを誘導する
精製された組換えヒトWIF-1が、NSCLC細胞においてWIF-1の効果を確証するために用いられた。精製されたrhWIF-1タンパク質は、NSCLC細胞系H460を処理するために用いられた。7日間のインキュベーション後、細胞変性効果アッセイ法が死んだH460細胞のパーセンテージを決定するために用いられた。劇的な細胞死が観察された(図8A)。細胞殺害は、主として、アポトーシスの誘導によった(7日間のインキュベーション後、40.1〜62.8%のアポトーシス細胞)(図8B)。以前に、Uematsu et al.は、Dvl-3がNSCLC細胞において過剰発現されていることを示した(Uematsu et al., Oncogene 22:7218-7221 (2003))。さらに、He et al.およびYou et al.は、Wntシグナル伝達経路の阻害が、NSCLC細胞において、Dvl-3の下方制御へ導き、アポトーシスを誘導することを示した(He et al., Neoplasia 6:7-14 (2004); You et al., Oncogene 23:6170-6174 (2004))。ここで、サイトゾルβ-カテニンおよびDvl-3の両方は、NSCLC細胞系H460を精製WIF-1と接触させた後、下方制御されたことが実証されている(図8C)。β-カテニン-TCF主要ターゲット遺伝子、サイクリンD1もまた、rhWIF-1のH460細胞への添加後、下方制御されることが見出された(図8C)。WIF-1 CMデータ(上記および図7参照)と一致して、精製ヒトWIF-1は、NSCLC細胞において、アポトーシスを誘導し、Wntシグナル伝達を阻害する。さらに、精製組換えヒトWIF-1タンパク質は、肺癌細胞系H460において用量依存性アポトーシスを誘導した(図11)。
【０２８５】
実施例12：WIF-1完全長をコードするDNAおよびWIF-1ドメイン(WD)をコードするDNAはインビボで腫瘍サイズを縮小する
WIF-1が哺乳動物において腫瘍サイズを縮小できることを実証するために、pcDNA3.1 WIF-1完全長(アミノ酸1位〜379位；SEQ ID NO:2)およびpcDNA3.1 WIF-1ドメイン(WD；アミノ酸1位〜180位；SEQ ID NO:16)でのインビボ試験が行われた。3x106個のLOX細胞が、胸腺欠損ヌードマウスへ皮下注射された。3日後(3日目)、発現ベクターが腫瘍(5 mm)のすぐ近傍に注射された。発現ベクターの注射は、10日目に繰り返された。以下の発現ベクターおよび対照が用いられた(図18)：(i)対照、50 μlのPBS；ベクター対照、50 μl リポフェクタミン(lipofectamine)中の200 μgのpcDNA3.1；50 μl リポフェクタミン(lipofectamine)中の200 μgのpcDNA3.1 WIF-1完全長；および50 μl リポフェクタミン(lipofectamine)中の200 μgのpcDNA3.1 WIF-1ドメイン(WD)。腫瘍サイズは、1週間に2回、カリパスで測定され、容量は方程式x2y(x<yの場合)を用いて計算された。WIF-1処理された動物(WIF-1完全長について、およびWIF-1ドメイン(WD)ついての両方)と対照群(すなわち、非ベクターおよびベクター対照)の間の腫瘍容量の差は、統計学的に有意であった(P<0.01、スチューデントt検定)。腫瘍は対照動物において進行したが、WIF-1処理された動物において腫瘍成長における有意な低下が観察された(図18)。腫瘍成長は、非ベクター動物において、およびベクター対照動物において、同じように進行した。腫瘍成長抑制もまた、WIF-1完全長について、およびWIF-1ドメイン(WD)について、類似した。
【０２８６】
実施例13：組換えWIF-1ドメイン(WD)タンパク質はインビボで腫瘍サイズを縮小する
WIF-1ドメインタンパク質(WD；SEQ ID NO:16のアミノ酸29位〜180位)が哺乳動物において腫瘍サイズを縮小することができることを実証するために、インビボ試験が行われた。3x106個のLOX細胞が、胸腺欠損ヌードマウスへ皮下注射された。3日後(3日目)、組換えWIF-1ドメインタンパク質が腫瘍に注射された。注射は、毎日、14日間、繰り返された。組換えWIF-1ドメインタンパク質は、SEQ ID NO:18の配列を含むpcDNA3.1 WIF-1ドメイン(WD)発現ベクターでトランスフェクションされた293細胞から、本明細書に記載されているように、作製された。対照動物は、pcDNA3.1ベクターでトランスフェクションされた293細胞由来の上清を注射された。腫瘍サイズは1週間に2回、カリパスで測定され、最後の測定は18日目であった。腫瘍容量は方程式x2y(x<yの場合)を用いて計算された。18日目におけるWIF-1ドメイン(WD)処理された動物と対照動物の間の腫瘍容量の差は、統計学的に有意であった(P<0.02、スチューデントt検定、n=3)。腫瘍は対照動物において進行したが、WIF-1ドメイン(WD)タンパク質処理された動物において腫瘍成長における有意な低下が観察された(図19)。
【０２８７】
配列表
2008500398.tif 000020
2008500398.tif 000021
2008500398.tif 000022
2008500398.tif 000023
2008500398.tif 000024
2008500398.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１】ヒトWIF-1プロモーター領域におけるCpGアイランドを示す。
【図２】図2Aはヒト癌細胞系におけるWIF-1発現を示す。N、正常細胞系；T、腫瘍細胞系。図2Bは異なる細胞系におけるヒトWIF-1プロモーターのメチル化分析を示す(MSP)。U、非メチル化；M、メチル化。
【図３】図3AはヒトWIF-1プロモーターのメチル化分析を示す(亜硫酸水素塩シーケンシング)。図3Bは異なる細胞系における脱メチル化剤5-アザ-2'-デオキシシチジン(DAC)処理によるWIF-1発現の再活性化を示す。
【図４】図4Aは一次ヒト肺癌組織試料におけるWIF-1発現を示す。図4Bは一次ヒト肺癌組織試料におけるWIF-1プロモーターのメチル化分析を示す(MSP)。図4Cは一次ヒト肺癌組織試料におけるWIF-1プロモーターのメチル化分析を示す(亜硫酸水素塩シーケンシング)。
【図５】様々な細胞系におけるWIF-1トランスフェクションを示す。
【図６】ヒトWIF-1 cDNAのトランスフェクションが、NSCLC細胞系において、アポトーシスを増加させ、Wntシグナル伝達を阻害することを示す。パネルAは、NSCLC細胞系H460、A549、H838およびH1299におけるWIF-1発現のウェスタン分析を示す。WIF-1発現は、正常ヒト一次ヒト気管支上皮細胞(NHBE)および末梢気道上皮細胞(SAEC)の両方において観察され、293T細胞からのWIF-1 CMが陽性対照として用いられた。β-アクチンが負荷対照として用いられた。パネルBは、WIF-1 cDNAプラスミド(暗い棒)のNSCLC細胞系A549およびH460へのトランスフェクションが劇的に、より多いアポトーシス細胞集団を引き起こすことを示している(トランスフェクションから5日後)。空のベクターがトランスフェクション対照として用いられた(明るい棒)。パネルCは、WIF-1プラスミドトランスフェクション後(「＋」；トランスフェクションから72時間後)のウェスタン分析を示す；空ベクターが対照としての役割を果たした(「−」)。β-カテニンおよびサバイビンが試験された。β-アクチンが負荷対照として用いられた。
【図７】WIF-1 CMがNSCLC細胞系にアポトーシスを誘導することを示す。パネルAは、WIF-1 CM処理後(処理から最大5〜7日後)のSAEC細胞および3つのNSCLC細胞系(H460、A549およびH838)の0.5%クリスタルバイオレット(Crystal Violet)染色を示す。パネルBは、WIF-1 CMがNSCLC細胞系(H460、A549およびH838)においてアポトーシスを誘導することを示す。このパネルは、フローサイトメトリーによるアポトーシス分析の例を示す。NSCLC細胞は、WIF-1 CMで約5〜7日間処理された(暗い棒)。293T細胞から収集された無血清培地が対照として用いられた(明るい棒)。パネルCは、用量依存性アポトーシス誘導の例としてH460細胞(処理から5日後)のフローサイトメトリー分析を示す。FL1-HはアネキシンV-FITC染色を表す。パネルDは、72時間のWIF-1 CM処理(「WIF-1(1/50)」および「WIF-1(1/5)」)の前(「対照」)および後のウェスタン分析を示す。この分析は、ヒトWIF-1が肺癌細胞系H460においてWntシグナル伝達経路を阻害することを示す。β-カテニン、サバイビン、サイクリンD1およびチトクロムCの発現が分析された。β-アクチンは負荷対照としての役割を果たした。サイトゾルのタンパク質が調製された。全細胞タンパク質がサイクリンD1分析のために用いられた。
【図８】精製されたヒトWIF-1タンパク質がNSCLC細胞系においてアポトーシスを誘導することを示す。パネルAは、WIF-1タンパク質が用量依存性様式でH460細胞の細胞死を引き起こすことを実証しているフローサイトメトリー分析を示す。H460細胞は、WIF-1タンパク質で約7日間、処理された。下部パネルは、H460の0.5%クリスタルバイオレット染色を示す。パネルBは、WIF-1タンパク質がH460細胞において用量依存性アポトーシス誘導を引き起こすことを示す。FL1-Hは、アネキシンV-FITC染色を表す。パネルCは、72時間のH460細胞のWIF-1 CM処理有り(「＋」)または無し(「−」)のウェスタン分析を示す。Dvl-3、β-カテニンおよびサイクリンD1の発現が分析された。β-アクチンは負荷対照としての役割を果たした。サイトゾルのタンパク質が調製された。全細胞タンパク質がサイクリンD1分析のために用いられた。
【図９】WIF-1再発現が様々なヒト癌細胞系においてアポトーシスを誘導することを示す。表示された細胞系は、pcDNA3.1-空(明るい棒)で、またはpcDNA3.1-WIF-1(暗い棒)でトランスフェクションされ、%アポトーシスが決定された。
【図１０】無血清馴化培地由来の組換えWIF-1タンパク質は肺癌細胞系H460において用量依存性アポトーシスを誘導することを示す。
【図１１】精製組換えヒトWIF-1タンパク質(Abnova Corp.)は肺癌細胞系H460において用量依存性アポトーシスを誘導することを示す。
【図１２】無血清馴化培地由来の組換えWIF-1ドメイン(WD)は肺癌細胞系A427において用量依存性アポトーシスを誘導することを示す。
【図１３】無血清馴化培地由来の組換えWIF-1タンパク質は黒色腫細胞系LOXにおいて用量依存性アポトーシスを誘導することを示す。
【図１４】無血清馴化培地由来の組換えWIF-1タンパク質は黒色腫細胞系FEMXにおいて用量依存性アポトーシスを誘導することを示す。
【図１５】無血清馴化培地由来の組換えWIF-1ドメイン(WD)は黒色腫細胞系LOXにおいて用量依存性アポトーシスを誘導することを示す。
【図１６】組換えWIF-1ドメイン(WD)タンパク質は黒色腫細胞系LOXにおいてWntシグナル伝達経路を阻害することを示す。dishevelled-3、β-カテニン、サバイビンおよびチトクロムCの発現が分析された。β-アクチンは負荷対照としての役割を果たした。
【図１７】正常および癌細胞におけるWIF-1タンパク質発現を示す。WIF-1タンパク質は、正常一次培養細胞、NHBE、SAECおよびNHEK、において発現されている。WIF-1タンパク質は、肺癌(H460、A549)、乳癌(MCF-7)、大腸癌(SW480)および中皮腫(MS-1、H2052)を含むヒト癌細胞において低発現している。
【図１８】WIF-1完全長をコードするDNA(三角形)およびWIF-1ドメインをコードするDNA(WD；アスタリスク)はインビボで腫瘍サイズを縮小することを示す。対照群は、非ベクター対照(菱形)およびベクター対照(正方形)を含む。腫瘍サイズは1週間に2回、測定された。
【図１９】WIF-1ドメインの組換えタンパク質(WD；正方形)はインビボで腫瘍サイズを縮小することを示す。対照、菱形。腫瘍サイズは1週間あたり2回、測定された。
【図２０】肝細胞癌細胞系SNU398における組換え完全長ヒトWIF-1ポリペプチド(SEQ ID NO:2)により誘導されたアポトーシス細胞のパーセンテージおよび細胞毒性効果を示す。組換え完全長ヒトWIF-1ポリペプチド(SEQ ID NO:2)を含むCMの10 μlおよび100 μlが細胞へ添加された。アネキシンVアッセイ法が、処理後5日目においてアポトーシス細胞を定量化するために用いられた。
【図２１】結腸直腸癌細胞系HCT-116における組換え完全長ヒトWIF-1ポリペプチド(SEQ ID NO:2)の細胞毒性効果を示す。組換え完全長ヒトWIF-1ポリペプチド(SEQ ID NO:2)を含む200 μl CMを添加した後4日目におけるHCT-116細胞の0.5%クリスタルバイオレット染色、ほとんど100%細胞殺害が観察された。生細胞が染色される。
【図２２】黒色腫細胞系LOXおよび肺癌細胞系H460への組換えヒトWIF-1サブドメインポリペプチド(SEQ ID NO:26)の細胞毒性効果およびアポトーシス細胞のパーセンテージを示す。
【図２３】黒色腫細胞系LOXへの組換えヒトWIF-1サブドメインポリペプチド(SEQ ID NO:27)の細胞毒性効果およびアポトーシス細胞のパーセンテージを示す。
【図２４】黒色腫細胞系LOXへの組換え成熟ヒトWIF-1ポリペプチド(SEQ ID NO:30)の細胞毒性効果およびアポトーシス細胞のパーセンテージを示す。
【図２５】ヒト(hWIF-1；SEQ ID NO:2およびGenBankアクセッション番号NP_009122を参照)、ならびにマウス(mWIF-1；SEQ ID NO:22およびGenBankアクセッション番号NP_036045を参照)、ラット(rWIF-1；SEQ ID NO:23およびGenBankアクセッション番号Q6IN38を参照)、アフリカツメガエル(xWIF-1；SEQ ID NO:24およびGenBankアクセッション番号AAD25404を参照)およびゼブラフィッシュ(zWIF-1；SEQ ID NO:25およびGenBankアクセッション番号Q9W6F9を参照)由来の対応する配列についてのWIF-1アミノ酸配列のアラインメントを示す。「*」は、整列されたWIF-1配列における指示された位置でのWIF-1アミノ酸残基の同一性を示す；「:」は保存されたアミノ酸置換が見出される位置を示す；「.」は保存されていないアミノ酸置換が見出される位置を示す。
【図１】
2008500398.tif 000027
【図２Ａ】
2008500398.tif 000028
【図２Ｂ】
2008500398.tif 000029
【図３Ａ】
2008500398.tif 000030
【図３Ｂ】
2008500398.tif 000031
【図４Ａ】
2008500398.tif 000032
【図４Ｂ】
2008500398.tif 000033
【図４Ｃ】
2008500398.tif 000034
【図５】
2008500398.tif 000035
【図６】
2008500398.tif 000036
【図７】
2008500398.tif 000037
【図８】
2008500398.tif 000038
【図９】
2008500398.tif 000039
【図１０】
2008500398.tif 000040
【図１１】
2008500398.tif 000041
【図１２】
2008500398.tif 000042
【図１３】
2008500398.tif 000043
【図１４】
2008500398.tif 000044
【図１５】
2008500398.tif 000045
【図１６】
2008500398.tif 000046
【図１７】
2008500398.tif 000047
【図１８】
2008500398.tif 000048
【図１９】
2008500398.tif 000049
【図２０】
2008500398.tif 000050
【図２１】
2008500398.tif 000051
【図２２】
2008500398.tif 000052
【図２３】
2008500398.tif 000053
【図２４】
2008500398.tif 000054
【図２５】
2008500398.tif 000055
【配列表】
2008500398000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月14日(2007.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008500398000001.app
【国際調査報告】
2008500398.tif 000062