(57)【要約】  任意にリパーゼ及び／又はアミラーゼとの併用における、ノカルジオプシス種（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  １８２６２（配列番号：１）由来のプロテアーゼに関連したプロテーゼの医薬用途。医学的適応の例：消化器疾患、膵臓外分泌機能不全（ＰＥＩ）、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病タイプＩ、及び／又は糖尿病タイプＩＩの処置。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤としての使用のための、配列番号：１に対して少なくとも７０％の同一性のプロテアーゼ。
【請求項２】
薬剤としての使用のための、リパーゼ又はアミラーゼとの併用における、請求項１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３】
薬剤としての使用のための、リパーゼ及びアミラーゼとの併用における、請求項１に記載のプロテアーゼ。
【請求項４】
消化器疾患、膵臓機能不全、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病タイプＩ、及び／又は糖尿病タイプＩＩの処置のための薬剤の製造のための、配列番号：１に対して少なくとも７０％の同一性のプロテアーゼの使用。
【請求項５】
リパーゼ又はアミラーゼの使用を更に含んで成る、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
リパーゼ及びアミラーゼの使用を更に含んで成る、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
少なくとも１つの医薬として許容される補助物質と共に、好ましくは固体濃縮物の形態において、配列番号：１に対して少なくとも７０％の同一性のプロテアーゼを含んで成る医薬組成物。
【請求項８】
好ましくは固体濃縮物の形態において、リパーゼ又はアミラーゼを更に含んで成る、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
好ましくは固体濃縮物の形態において、リパーゼ及びアミラーゼを更に含んで成る、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
治療有効量の配列番号：１に対して少なくとも７０％の同一性のプロテアーゼを投与することによる、消化器疾患、膵臓機能不全、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病タイプＩ、及び／又は糖尿病タイプＩＩの処置のための方法。
【請求項１１】
治療有効量のリパーゼ又はアミラーゼを投与することを更に含んで成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
治療有効量のリパーゼ及びアミラーゼを投与することを更に含んで成る、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意にリパーゼ及び／又はアミラーゼとの併用における、ノカルジオプシス種（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  １８２６２（配列番号：１）由来のプロテアーゼに関連したプロテーゼの医薬用途に関する。医学的適応の例は：消化器疾患、膵臓外分泌機能不全（ＰＥＩ）、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病タイプＩ、及び／又は糖尿病タイプＩＩの処置である。
【背景技術】
【０００２】
膵臓外分泌機能不全の処置のための、膵酵素サプリメントの形態におけるいくつかの商業用薬剤が知られている。これらの製品の活性成分は、消化酵素、主にアミラーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼであり、それらは通常膵臓で産生され、小腸の上部（十二指腸）に分泌される。このような薬剤において使用される酵素は、ウシ又はブタの膵臓に由来する。
【０００３】
ＵＳ５６１４１８９（ＥＰ６００８６８）は、膵酵素補充治療、例えば嚢胞性線維症に罹患する患者の処置における、特定の微生物リパーゼの使用を説明する。
【０００４】
ＷＯ００／５４７９９は、糖尿病タイプＩ及びＩＩの処置における、脂肪分解、タンパク質分解活性及びデンプン分解活性を有する酵素混合物の使用を説明する。
【０００５】
ＷＯ０２／０６０４７４は、消化障害の処置における、特定のリパーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼの使用を説明する。
【０００６】
ノカルジオプシス種（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  １８２６２（配列番号：１）由来のプロテアーゼ、並びにその調製及び様々な工業的応用は、ＷＯ８８／０３９４７及びＷＯ０１／５８２７６において説明される。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の概要
本発明は、任意にリパーゼ及び／又はアミラーゼとの併用における薬剤としての使用のための、配列番号：１と少なくとも７０％の同一性のプロテアーゼに関する。
【０００８】
本発明は、消化器疾患、ＰＥＩ、膵臓機能不全、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病タイプＩ、及び／又は糖尿病タイプＩＩの処置のための薬剤の製造のためのこのようなプロテアーゼの使用にも関し、これらの使用は任意で更にリパーゼ、及び／又はアミラーゼの使用を含んで成る。
【０００９】
本発明は更に、少なくとも１つの医薬として許容される補助物質と共に、任意にリパーゼ及び／又はアミラーゼを含む、このようなプロテアーゼを含んで成る医薬組成物に関する。
【００１０】
本発明は、任意にリパーゼ及び／又はアミラーゼと共に、治療有効量のこのようなプロテアーゼを投与することによる、消化器疾患、ＰＥＩ、膵臓機能不全、膵炎、嚢胞性線維症、糖尿病タイプＩ、及び／又は糖尿病タイプＩＩの処置のための方法にも関する。
【００１１】
本発明の詳細な説明
酵素
「プロテアーゼ」という用語は、ペプチド結合を加水分解する酵素として本明細書中で定義される。それは、ＥＣ３．４酵素群（例えば、それらの各１３のサブクラス、これらの酵素は以下で「ＥＣ３．４．−．−グループに属する」と言及される）に属する任意の酵素を含む。ＥＣの数は、ＮＣ−ＩＵＢＭＢ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からの酵素命名法１９９２、例えばＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９４，２２３，１−５）; Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５，２３２，１−６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６，２３７，１−５）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７，２５０，１−６）;及びＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９，２６４，６１０−６５０）それぞれにおいて刊行された補足１−５を指す。命名法は定期的に補足及び更新される；例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｗ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブを参照のこと。
【００１２】
プロテアーゼはそれらの触媒機構に基づいて以下の群に分類される：セリンプロテアーゼ（Ｓ）、システインプロテアーゼ（Ｃ）、アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ）、メタロプロテアーゼ（Ｍ）、及び未知の（又は未だ分類されていない）プロテアーゼ（Ｕ）（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ(ｅｄｓ)，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）、特に一般的な導入部分を参照のこと）。
【００１３】
本発明は、配列番号：１のプロテアーゼ（ノカルジオプシス種（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  １８２６２由来で、ＷＯ８８／０３９４７及びＷＯ０１／５８２７６に記載されている）と少なくとも７０％の同一性のプロテアーゼの医薬用途に関する。
【００１４】
本発明の追加のプロテアーゼは、ＷＯ２００４／１１１２２０、ＷＯ２００４／１１１２２１、ＷＯ２００４／１１１２２２、ＷＯ２００４／１１１２２３、ＷＯ２００５／０３５７４７、ＷＯ２００４／１１１２１９において開示されている（本明細書中で引用文献により組み込まれる）。
【００１５】
本発明のプロテアーゼの詳細の例は、ノカルジオプシス・ダソンビレイ亜種（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ｓｕｂｓｐ．）ダソンビレイ（ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）ＤＳＭ  ４３２３５（配列番号：２）、ノカルジオプシス・アルバ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ａｌｂａ）ＤＳＭ  １５６４７（配列番号：３）、ノカルジオプシス・プラシナ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｐｒａｓｉｎａ）ＤＳＭ  １５６４８（配列番号：４）、ノカルジオプシス・プラシナ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｐｒａｓｉｎａ）ＤＳＭ  １５６４９（配列番号：５）、並びにそれらのフラグメント、突然変異体、及び変異体、例えばプロテアーゼ２２（配列番号：６）である。任意に、各配列番号：１〜６は、１又は複数のアミノ酸から成るＣ−末端伸長を有する。例えば、非極性又は非荷電性アミノ酸、例えばＱ、Ｓ、Ｖ、Ａ、又はＰのうちの１又は複数、好ましくは以下のものから成る群から選択される：ＱＳＡＰ、ＱＰ、ＴＬ、ＴＴ、ＱＬ、ＴＰ、ＬＰ、ＴＩ、ＩＱ、ＱＰ、Ｐｌ、ＬＴ、ＴＱ、ＩＴ、ＱＱ、及びＰＱ。
【００１６】
特定の実施態様において、本発明のプロテアーゼは：
（ａ）  ＥＣ３．４．−．−酵素群に属するプロテアーゼ；
（ｂ）  セリンプロテアーゼ；
（ｃ）  ペプチドファミリーＳ２Ａのセリンプロテアーゼ；
（ｄ）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９０：２０５−２１８（１９９３）及びＭＥＲＯＰＳプロテアーゼデータベース（公開  ６．２０，Ｍａｒｃｈ  ２４，２００３）（ｗｗｗ．ｍｅｒｏｐｓ．ａｃ．ｕｋ）に記載されている、ペプチドファミリーＳ１Ｅのセリンぺプチダーゼ。そのデーターベースは、Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｎ．Ｄ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｅ．Ａ．＆  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．（２００２）ＭＥＲＯＰＳに記載されている：プロテアーゼデータベース。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０，３４３−３４６；
及び
（ｅ）  ノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）の株由来のプロテアーゼ
から成る群から選択される。
【００１７】
得られたプロテアーゼがセリンプロテアーゼ、及びファミリーＳ２Ａプロテアーゼであるかを決定するために、上記のＨａｎｄｂｏｏｋ及びそこで示されている原則を参照した。このような決定は、全てのタイプのプロテアーゼに対して実施することができる（天然の又は野生型のプロテアーゼ；或いは遺伝子組み換えされた又は合成のプロテアーゼであっても）。
【００１８】
特定の実施態様において、配列番号：１に対する同一性の程度は、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％である。別の実施態様において、同一性の程度は、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、又は少なくとも６９％である。
【００１９】
更に特定の実施態様において、本発明のプロテアーゼは酸に安定である。これは、ＷＯ０１／５８２７６（基質：Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ，ｐＨ９．０，２５℃）に記載されている分析法を用いて測定した場合に、純粋なプロテアーゼ酵素（Ａ28O＝１．０に対応する希釈において、且つその後の以下のバッファー中における３７℃２時間のインキュベーションにおいて：１００ｍＭ  コハク酸，１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭ  ＣＨＥＳ，１００ｍＭ  ＣＡＢＳ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，１５ＯｍＭ  ＫＣｌ，０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００，ｐＨ３．５）のプロテアーゼ活性が、基準活性の少なくとも４０％（又は、少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は少なくとも９７％）であることを意味する。基準活性という用語は、純粋な形態におけるインキュベーション（Ａ28O＝１．０に対応する希釈において、以下のバッファーにおける２時間５℃で：１００ｍＭ  コハク酸、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ、１００ｍＭ  ＣＡＢＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１５ＯｍＭ  ＫＣｌ、０．０１  ％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ９．０）後の、同一のプロテアーゼのプロテアーゼ活性を指す。ここで、活性は上記の通りに測定する。Ａ28O＝１．０という用語は、２８０ｎｍ、１ｃｍの路長のキュベットにおいて、バッファーブランクと比較して１．０の吸収を生じさせる純粋なプロテアーゼの濃度（希釈）を意味する。純粋なプロテアーゼという用語は、１．７０以上のＡ280／Ａ260の比を有する試料を指し（ＷＯ０１／５８２７６の実施例２Ｅを参照のこと）、それはクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのスキャンにより測定すると、当該プロテアーゼに対応するバンドにおいて少なくとも９５％のスキャン強度を有する（ＷＯ０１／５８２７６の実施例２Ａを参照のこと）。
【００２０】
更なる特定の実施態様において、任意に、追加のプロテアーゼを用いることができる。例えば、哺乳動物のプロテアーゼ（例えば、ブタの膵臓抽出物の形態）、又は微生物のプロテアーゼ（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、又はリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）などの、細菌又は真菌株に由来する）である。プロテアーゼは、特に、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の株、例えばアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ）に由来することができ、特にＡｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（日本）から商業的に入手可能な製品Ｐｒｏｚｙｍｅ６（登録商標）（中性、アルカリプロテアーゼ  ＥＣ  ３．４．２１．６３）であることができる。
【００２１】
本発明のプロテアーゼは、リパーゼと併用して用いることができる。
【００２２】
本件との関連において、リパーゼはカルボン酸エステル加水分解酵素ＥＣ  ３．１．１．−を意味する。これは、ＥＣ  ３．１．１．３トリアシルグリセロールリパーゼ、ＥＣ  ３．１．１．４ホスホリパーゼＡ１、ＥＣ  ３．１．１．５リゾホスホリパーゼ、ＥＣ  ３．１．１．２６ガラクトリパーゼ、ＥＣ  ３．１．１．３２ホスホリパーゼＡ１、ＥＣ  ３．１．１．７３フェルロイルエステラーゼなどの活性を含む。特定の実施態様において、リパーゼはＥＣ  ３．１．１．３トリアシルグリセロールリパーゼである。
【００２３】
特定の実施態様において、リパーゼは、哺乳動物のリパーゼ（例えば、ブタの膵臓抽出物の形態）、又は微生物のリパーゼ（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、又はリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）などの、細菌又は真菌株に由来する）である。リパーゼは、特に、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）の株、例えばリゾプス・ジャバニカス（Rｈｉｚｏｐｕｓ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、又はリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）由来であることができ、例えばＡｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（日本）から商業的に入手可能な製品ＬｉｐａｓｅＤ  Ａｍａｎｏ  ２０００（登録商標）（ＬｉｐａｓｅＤ２（登録商標）としても指定される）であることができる。
【００２４】
更に特定の実施態様において、本発明における使用のためのリパーゼは、例えばフミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）又はリゾムコル（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）などの真菌、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）などの酵母、又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの細菌に由来する、組み換え産生した微生物リパーゼである。好ましい実施態様において、リパーゼは、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）又はリゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）の株に由来する。
【００２５】
フミコラ・ラヌギノサ（異名はサーモマイセス・ラヌギノサ）リパーゼ（配列番号：８）は、ＥＰ３０５２１６に記載されており、特定のリパーゼ変異体は、例えばＷＯ９２／０５２４９、ＷＯ９２／１９７２６、ＷＯ９４／２５５７７、ＷＯ９５／２２６１５、ＷＯ９７／０４０７９、ＷＯ９７／０７２０２、ＷＯ９９／４２５６６、ＷＯ００／３２７５８、ＷＯ００／６００６３、ＷＯ０１／８３７７０、ＷＯ０２／０５５６７９、及びＷＯ０２／０６６６２２に記載されている。真菌リパーゼの更なる例は、ＥＰ７８５９９４に記載されているフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からのシチナーゼ（ｃｉｔｉｎａｓｅ）、及びＥＰ８６９１６７に記載されているフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのホスホリパーゼである。酵母リパーゼの例は、カンジダ・アンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からのリパーゼＡ及びＢ（リパーゼＡはＥＰ６５２９４５に記載され、リパーゼＢは例えばＵｐｐｅｎｂｅｒｇ他（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２（１９９４），２９３）により記載されている）である。細菌リパーゼの例は、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）（ＥＰ２１４７６１に記載されている）に由来するリパーゼである。
【００２６】
好ましい実施態様において、リパーゼは、配列番号：８のリパーゼに対して少なくとも７０％の同一性である。追加の好ましい実施態様において、配列番号：８に対する同一性の程度は、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％である。別の実施態様において、配列番号：８に対する同一性の程度は、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、又は好ましくは６９％である。
【００２７】
更に好ましい実施態様において、哺乳動物膵リパーゼのようなリパーゼは、１，３−位特異的リパーゼである。
【００２８】
本発明のプロテアーゼ（上記のリパーゼを有する又は有しない）は、アミラーゼとの併用で用いることができる。
【００２９】
本関連において、アミラーゼは、デンプン並びに他の直鎖及び分岐オリゴ糖及び多糖類のエンド−加水分解を触媒する酵素である。デンプンのアミロース部分は１，４−アルファ−グルコシド結合が豊富であり、一方アミロペクチン部分は１，４−アルファ−グルコシド結合だけでなく１，６−アルファ−グルコシド結合を含みより分岐している。特定の実施態様において、アミラーゼはＥＣ  ３．２．１．１グループに属する酵素である。
【００３０】
特定の実施態様において、アミラーゼは、哺乳動物アミラーゼ（例えば、ブタの膵臓抽出物の形態）、又は微生物のアミラーゼ（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、又はリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）などの、細菌又は真菌株に由来する）である。
【００３１】
アミラーゼは、特に、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の株、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ）に由来することができ、例えばＡｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（日本）から商業的に入手可能なアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に由来する製品アミラーゼＡ１（登録商標）又はＥｘｔｒａｃｔ−Ｃｈｅｍｉｅ（ドイツ）から商業的に入手可能なアスペルギルス・メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ）に由来する製品Ａｍｙｌａｓｅ  ＥＣ（登録商標）のどちらかであることができる。
【００３２】
真菌アミラーゼの他の例は、ＷＯ８９／０１９６９の実施例３にも記載されているアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アミラーゼ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ｐ５６２７１）、及びアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アミラーゼ（配列番号：９）である。アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アミラーゼの変異体の例は、ＷＯ０１／３４７８４に記載されている。
【００３３】
バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するアルファ−アミラーゼは、細菌のアルファ−アミラーゼの例である。このアミラーゼは、例えばバチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、及びバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する他の相同細菌アルファ−アミラーゼ、並びにその変異体と共に、例えばＷＯ９９／１９４６７に記載されている。追加のアミラーゼ変異体の例は、米国特許第４，９３３，２７９号；ＥＰ７２２４９０、及びＥＰ９０４３６０に記載されているものである。
【００３４】
特定の実施態様において、アミラーゼは、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％である。別の実施態様において、配列番号：９に対する同一性の程度は、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、又は少なくとも６９％である。
【００３５】
一般的に、本発明の使用のためのプロテアーゼ、リパーゼ、及びアミラーゼ酵素（以下「酵素（群）」）は、動物、特に哺乳動物から得られる天然又は野生型の酵素（例えば、ヒト又はブタの酵素）；植物、又は微生物から得られる天然又は野生型の酵素、及び所望の酵素活性を示すそれらの任意の突然変異体、変異体、フラグメントなど、並びに合成酵素、例えばシャッフルした（ｓｈｕｆｆｌｅｄ）酵素、及びコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）酵素であることができる。
【００３６】
特定の実施態様において、酵素（群）は、動物（ヒトを含む）に曝露した場合に、免疫反応の減少をもたらすように設計された低アレルギー性変異体である。免疫反応という用語は、酵素（群）に曝露した動物の免疫系による任意の反応として理解される。免疫反応の１つの型は、曝露した動物においてＩｇＥのレベルの増大を引き起こすアレルギー反応である。低アレルギー性変異体は、当業界で知られた技術を用いて調製することができる。例えば、酵素群を、免疫反応に関連する酵素群の部分又はエピトープを保護するポリマー部分と複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させることができる。ポリマーとの複合は、酵素（群）へのポリマーのインビトロでの化学的カップリングを伴う（例えば、ＷＯ９６／１７９２９、ＷＯ９８／３０６８２、ＷＯ９８／３５０２６、及び／又はＷＯ９９／００４８９に記載されている）。それに加えて、複合は、追加又は代わりにポリマーの酵素（群）へのインビボでのカップリングを伴うことができる。このような複合は、酵素（群）をコードするヌクレオチド配列の遺伝子組み換え（酵素（群）に追加のグリコシル化サイトをコードするコンセンサス配列を挿入し、酵素（群）をグリコシル化することのできる宿主において当該酵素を発現させる）により達成することができる（例えば、ＷＯ００／２６３５４を参照のこと）。低アレルギー性変異体を提供する別の方法は、酵素の自己オリゴマー化を引き起こす、酵素（群）をコードするヌクレオチド配列の遺伝子組み換えであり、酵素単量体が他の酵素単量体のエピトープを保護することができるようにし、それによりオリゴマーの抗原性を低下させる。このような生成物及びそれらの調製は、例えばＷＯ９６／１６１７７に記載されている。免疫反応に関与するエピトープは、様々な方法、例えばＷＯ００２６２３０及びＷＯ０１／８３５５９に記載されているファージディスプレイ法、又はＥＰ５６１９０７に記載されているランダムアプローチにより同定することができる。エピトープがいったん同定されたら、部位特異的突然変異（例えば、ＷＯ００／２６２３０、ＷＯ００／２６３５４及び／又はＷＯ００／２２１０３を参照のこと）などの既知の遺伝子操作技術により、そのアミノ酸配列を変えて、免疫特性が変化した酵素（群）を産生することができ、そして／或いはポリマーがエピトープを保護するように、エピトープの十分近傍においてポリマーの複合を行うことができる。
【００３７】
特定の実施態様において、プロテアーゼ、リパーゼ、及び／又はアミラーゼ酵素は、（ｉ）ｐＨ４〜８、好ましくはｐＨ３〜４、より好ましくはｐＨ３．５で安定であり；（ｉｉ）ｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ６．５で活性であり；（ｉｉｉ）ペプシン及び他の消化酵素による分解に対して安定であり（例えば、膵臓プロテアーゼ、すなわち主にトリプシン及びキモトリプシン）；そして／或いは（ｉｖ）胆汁塩の存在下で安定及び／又は活性である。
【００３８】
「併用」という用語は、プロテアーゼ、リパーゼ、及び／又はアミラーゼの本発明に従った併用を意味する。併用は、同時、重複、又は順次的であることができ、これらの３つの用語は、医師により作成される処方に照らして一般的に解釈される。
【００３９】
「同時」という用語は、例えば酵素群を１つの又は複数の別の医薬生成物として同時に投与する場合、或いはそれらを１つ及び同一の医薬組成物において投与する場合に、酵素群が同時に活性を有する状況を指す。
【００４０】
「順次的」という用語は、１つ及び／又は２つの酵素が、第一、及び第二及び／又は第三の酵素として続いて振る舞う場合を指す。所望の間隔で別々の医薬製剤として問題の酵素を投与することにより、或いは問題の酵素を異なって（例えば、異なる放出時間の獲得、向上した生成物の安定性の提供、又は酵素用量の最適化の観点から）製剤（区画化）した１つの医薬組成物として問題の酵素を投与することにより、順次的作用を達成することができる。
【００４１】
「重複」という用語は、酵素の活性期間が、完全に同時又は完全に順次的でない場合、すなわち酵素群の双方又は全てが活性である一定の期間が存在する場合を指す。
【００４２】
例えば本発明のプロテアーゼ、リパーゼ、及び／又はアミラーゼとの関連で用いる場合の「１つ（ａ）」という用語は、少なくとも１つを意味する。特定の実施態様において、「１つ」は「１又は複数」又は「少なくとも１つ」を意味し、これはさらに１、２、３、４、５などを意味する。
【００４３】
本発明の目的のために、アミノ酸配列の間の同一性の程度は、プログラム「ａｌｉｇｎ」である、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメント（すなわち、グローバルアラインメント）により決定する。配列は、デフォルトスコアリングマトリクスＢＬＯＳＵＭ５０を用いて、そのプログラムによりアラインメントを行った。ギャップの最初の残基のペナルティーは１２であり、ギャップの更なる残基に関してペナルティーは２である。
【００４４】
「Ａｌｉｇｎ」は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョンｖ２０ｕ６の一部分である（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８)，”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，ＰＮＡＳ８５：２４４４-２４４８、及びＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ(１９９０)”Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＦＡＳＴＰ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３：６３−９８を参照のこと）。ＦＡＳＴＡタンパク質アラインメントは、ギャップサイズに関して制限の無いＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いる（”Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ”，Ｔ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ(１９８１) Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７を参照のこと）。
【００４５】
本発明の酵素（群）の活性は、任意の適切な試験を用いて測定することができる。一般的に、試験−ｐＨ及び試験−温度は、問題の酵素に適用する。試験−ｐＨ−値の例は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２である。試験−温度の例は、３０、３５、３７、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０、又は９５℃である。
【００４６】
例えば、プロテアーゼ活性は、問題のプロテアーゼの特異性に関するペプチド結合を含む基質を用いる任意の試験を用いて測定することができる。
【００４７】
適切な酵素試験の例は、実験部分に含まれる。他の例は、リパーゼ及びアミラーゼ活性に関するＰｈ．Ｅｕｒ．試験である。
【００４８】
薬剤
本発明との関連において、「薬剤」という用語は、疾病の症状を処理、予防及び／又は軽減する化合物、又は化合物の混合物を意味する。薬剤は、医師により処方されることができ、或いはそれは市販製品であることができる。
【００４９】
医薬組成物
本発明の酵素（群）の単離、精製、及び濃縮は、従来の手段により実施することができる。
【００５０】
特定の実施態様において、各酵素（群）の濃縮した固体又は液体調製物は別々に調製する。これらの濃縮物は、以下でより詳細を説明するように、少なくとも一部分は別々に調製することもできる。
【００５１】
更に特定の実施態様において、酵素（群）は固体濃縮物の形態で本発明の医薬組成物中に組み入れられる。酵素（群）は、当業界で知られている様々な方法により固体状態にすることができる。例えば、固体状態は、結晶（酵素分子が高度に整列された形態で配置されている）、又は沈殿（酵素分子が、より整列されていない、又は無秩序な形態で配置されている）のどちらかであることができる。
【００５２】
結晶化は、例えばＥＰ６９１９８２（本明細書中の実施例２も参照のこと）に記載されているように、例えば酵素（群）のｐＩに近いｐＨ、及び低い伝導性（例えば１０ｍＳ／ｃｍ）で実施することができる。
【００５３】
様々な沈殿法が当業界で知られており、例えば塩（例えば、硫酸アンモニウム、及び／又は硫酸ナトリウム）；有機溶媒（例えば、エタノール及び／又はイソプロパノール）；又はポリマー（例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール））を用いた沈殿である。別の方法では、酵素（群）は、当業界で知られた様々な方法（例えば、凍結乾燥、蒸発、及び／又はスプレー乾燥）により溶媒（典型的には水）を除去することにより、溶液から沈殿することができる。
【００５４】
更なる特定の実施態様において、酵素（群）の固体濃縮物は、固体濃縮物の総タンパク質含量を基準にして、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）の活性酵素タンパク質含量を有する。また更なる特定の実施態様において、固体濃縮物の総タンパク質含量と比較した活性酵素タンパク質の含量は、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）である。タンパク質含量は、当業界で知られている通り（例えば、市販のキット（例えば、Ｒｏｃｈｅから商業的に袖手可能なタンパク質試験ＥＬＳ（注文番号１７６７００３））を用いて）に、又はＷＯ０１／５８２７６の実施例８に記載の方法に基づいて測定することができる。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、好ましくは濃縮した酵素調製物、より好ましくは固体濃縮物の形態で、少なくとも１つの医薬として許容される助剤、又は補助材料、例えば（ｉ）少なくとも１つの担体及び／又は賦形剤；或いは（ｉｉ）少なくとも１つの担体、賦形剤、希釈剤、及び／又はアジュバントと共に、酵素を含んで成る。任意の全てが医薬として許容される他の成分の非制限的な例は、分解剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）、潤滑剤、緩衝剤、保湿剤、防腐剤、着香剤、溶媒、可溶化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、推進剤、及び賦形剤である。
【００５６】
一般的に、問題の医学的適応に依存して、本発明の組成物は、腸内投与（消化管を通した）、及び非経口投与（例えば、注射による（例えば、皮下、筋肉内、又は静脈内））を含む、当業界で知られた投与の全ての方法に対して設計することができる。従って、組成物は、固体、半固体、液体、又はガス状の形態であることができ、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、微小球体、軟膏、クリーム、発泡体、溶液、坐薬、注射、吸入、ゲル、微小球体、ローションとエアゾールである。
【００５７】
以下の方法及び補助物質は単なる例示であり、全く制限するものではない。
【００５８】
固体経口調製物の場合、酵素（群）は単独で、或いは錠剤、粉末、顆粒又はカプセルを製造するための適切な添加剤と組み合わせて、例えば、従来の担体、例えばラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン又はジャガイモデンプンと組み合わせて；賦形剤又は結合剤、例えば結晶質（又は微結晶性）セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンデンプン又はゼラチンと組み合わせて；分解剤、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムと組み合わせて；潤滑剤、例えばカルナバワックス、白蝋、セラック、乾燥コロイドシリカ、マクロゴール６０００、ポビドン、タルク、モノレイン（ｍｏｎｏｌｅｉｎ）又はステアリン酸マグネシウムと組み合わせて；及び、もし必要であれば、希釈剤、干渉剤、保湿剤、防腐剤、例えばパラヒドロキシ安息香酸メチル（Ｅ２１８）、着色剤、例えば二酸化チタン、（Ｅ１７１）、および着香剤、例えばサッカロース、サッカリン、オレンジ油、レモン油とバニリンと組み合わせて用いることができる。経口調製物は、ＰＥＩの医学的適応の処置のための好ましい調製物の例である。
【００５９】
酵素（群）は、非常に一般的には、水溶性溶媒、例えば水に、或いは非水溶媒、例えば野菜若しくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばＰＥＧ４０００、又は低級アルコール、例えば直鎖若しくは枝状Ｃ1〜Ｃ4アルコール、例えば２−プロパノールに；そして必要であれば、従来の補助物質又は添加剤、例えば可溶化剤、アジュバント、希釈剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定家剤、及び防腐剤と共に、それらを溶解、懸濁、又は乳化することにより、注射用の調製物、又は液体経口調製物中に製剤することができる。
【００６０】
酵素（群）は、更に一般的には、例えば加圧可能な推進剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など中に製剤することにより、吸入によって投与するエアゾール製剤において更に利用することができる。
【００６１】
更に、酵素（群）は一般的に、様々な基剤、例えば乳化基剤又は水溶解性基剤と混合することにより、経口投与のための坐薬として製造することができる。坐薬は、体温で溶解するが室温で凝固する、賦形剤、例えばココアバター、カルボワックス（ｃａｒｂｏｗａｘ）及びポリエチレングリコールを含むことができる。
【００６２】
送達賦形剤としてのリポソームの使用は、有力で一般的な注目の別の方法である。リポソームは、標的部位の細胞と融合し、内腔の内容物を細胞内に送達する。リポソームは、接触を維持する様々な手段、例えば分離、結合剤を用いて、融合するのに十分な時間細胞との接触が維持される。本発明の１つの側面において、リポソームは肺投与用にエアゾール化されるように設計する。リポソームは、センダイウイルス又はインフルエンザウイルスなどの、膜の融合を介在する精製タンパク質又はペプチドを用いて調製することができる。脂質は、ホスファチジルコリンなどの陽イオン性又は双性イオン脂質を含む、既知のリポソーム形成脂質の有用な組み合わせであることができる。残りの脂質は、通常中性又は酸性脂質、例えばコレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどである。リポソームを調製するために、Ｋａｔｏ他（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３３６１により記載された手順を用いることができる。
【００６３】
各用量単位（例えば、茶さじ一杯、大さじ一杯、カプセル、錠剤又は坐薬）が前もって決めた量の酵素（群）を含む、シロップ、エリキシル剤、粉末及び懸濁液などの、経口又は直腸投与のための単位投薬形態を提供することができる。同様に、注射又は静脈内投与のための単位用量形態は、滅菌水、通常の生理食塩水、又は別の医薬として許容される担体中の溶液としての組成物中に酵素（群）を含んで成ることができる。
【００６４】
本明細書中で用いる場合、「単位投薬形態」という用語は、ヒト及び動物の対象のための単位用量として適切な物理的に不連続な単位を指し、各単位は、所望の効果を生み出すのに十分な前もって決めた量の酵素を含む。
【００６５】
特定の実施態様において、本発明の医薬組成物は、経腸、好ましくは経口投与用である。
【００６６】
更なる特定の実施態様において、経口組成物は、（ｉ）酵素（群）の結晶を含む液体組成物；（ｉｉ）（高度）に精製した酵素（群）の沈殿物の液体懸濁液；（ｉｉｉ）固体又は可溶化形態の酵素（群）を含むゲル；（ｉｖ）固定化酵素（群）又は粒子などに吸着させた酵素群の液体懸濁液；或いは、（ｖ）酵素（群）を含む粉末、ペレット、顆粒、又は微小球体の形態、もし必要であれば錠剤、カプセルなど（任意に、例えば酸安定コーティングで被覆された）の形態における固体組成物である。
【００６７】
組成物の別の特定の形態において、酵素（群）は、例えば別個のコーティングにより区切られる、すなわち互いに分離される。
【００６８】
組成物の更に特定の実施態様において、プロテアーゼは、組成物の他の酵素成分、例えばリパーゼ及び／又はアミラーゼから分離する。
【００６９】
酵素（群）の用量は、投与する具体的な酵素（群）、投与の方法、症状の重症度、及び対象の副作用に対する感受性などに依存して、広く変わるだろう。具体的な酵素のいくつかは、他のものよりも有力であり得る。
【００７０】
アミド（ペプチド）結合、並びにアミノ末端及びカルボキシ末端は、経口投与の際の安定性を増大させるために修飾することができる。例えば、カルボキシ末端はアミド化することができる。
【００７１】
処置の方法
任意でリパーゼ及び／又はアミラーゼ（本発明の酵素（群））と併用する、本発明のプロテアーゼは、動物の様々な疾病又は疾患の治療的及び／又は予防的処置において有用である。「動物」という用語は、全ての動物、特にヒトを含む。動物の例は、非反すう動物、及び反すう動物、例えばヒツジ、ヤギ、ウマ、及びウシ、例えば肉牛、乳牛、及び若い子ウシである。特定の実施態様において、動物は非反すう動物である。非反すう動物としては、単胃動物、例えばブタ（ｐｉｇ）又はブタ（ｓｗｉｎｅ）（子ブタ、育成ブタ、及びメスブタが挙げられるが、これらに限定されない）；家禽、例えばシチメンチョウ、カモ及びニワトリ（ブロイラー、卵を産むニワトリが挙げられるが、これらに限定されない）；子ウシ；ペット、例えばネコ及びイヌ；及び魚（サケ、マス、テラピア、ナマズ及びコイが挙げられるが、これらに限定されない）；及び甲殻類（エビ及びクルマエビが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。特定の実施態様において、動物は、哺乳動物、より特別にはヒトである。
【００７２】
例えば、酵素（群）は、通常胃又は膵臓から分泌される消化酵素の不十分な産生及び／又は消化管への分泌によりしばしば引き起こされる消化障害又は消化不良などの消化疾患の処置に有用である。
【００７３】
更に、酵素（群）は、ＰＥＩの処置に特に有用である。ＰＥＩは、Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍ試験（ＪＯＰ．Ｊ  Ｐａｎｃｒｅａｓ（Ｏｎｌｉｎｅ）２００２；３（５）：１１６−１２５）を用いて証明することができ、それは、疾病及び症状、例えば膵臓癌、膵臓及び／又は胃の手術、例えば膵臓の全体的又は部分的な切除、胃切除、胃腸バイパス手術後（例えばＢｉｌｌｒｏｔｈＩＩ胃腸吻合術）；慢性膵炎；Ｓｈｗａｃｈｍａｎ Ｄｉａｍｏｎｄ症候群；膵臓又は総胆管の管の閉塞（例えば、新生物からの）；及び／又は嚢胞性線維症（多量の粘液が膵臓の管をブロックする遺伝病）、により引き起こされ得る。酵素（群）は、急性膵炎の処置においても有用であり得る。
【００７４】
消化疾患への酵素（群）の効果は、ＥＰ０６００８６８に一般的に記載されているように測定することができる。その中で、実施例２は胃の条件下におけるリパーゼ安定性試験を測定するためのインビトロ消化率試験について記載し、そして実施例３は胆汁塩の存在下におけるリパーゼ活性のためのインビトロ消化率について記載している。対応する試験は、プロテアーゼ及びアミラーゼに対して設定することができる。また、ＷＯ０２／０６０４７４は、適合性試験を開示し、例えば（１）ブタ試験試料中の脂質消化を測定するためのインビトロ試験、及び（２）脂肪、タンパク質及びデンプンの消化率を測定する膵臓機能不全ブタを用いたインビボ試験である。
【００７５】
特定の実施態様において、本発明のプロテアーゼの効力は、本明細書の実施例１のインビトロ膵臓機能不全消化モデルを用いて測定する。ここでは、様々な他の基質が要望の通りに用いることができ、例えば動物性タンパク質、他の植物性タンパク質、穀物、動物性又は植物性脂肪及び油、並びに任意のそれらの混合物である。
【００７６】
他の特定の実施態様において、本発明のプロテアーゼの効力は、実施例４のプロテアーゼの効力に関するインビボスクリーニング試験、又は実施例５の完全なインビボ消化率試験を用いて測定する。
【００７７】
糖尿病タイプＩ及び／又はタイプＩＩの処置、特にこの疾病に通常伴う消化疾患の糖尿病治療におけるアジュバント処置（後期合併症の軽減の観点から）に対して有用である。
【００７８】
酵素（群）の糖尿病への効力は、例えばグリコシル化ヘモグロビンのレベル、血中グルコース濃度、低血糖性発作、ビタミンＡ、Ｄ及びＥのような脂溶性ビタミンの状態、インシュリンの必要とされる１日の用量、体重指数、並びに高血糖期間を制御することにより、ＷＯ００／５４７９９に記載された１又は複数の方法により決定することができる。
【００７９】
実施態様は本発明のいくつかの側面の例示であることを意図するものであるので、ここに記載し、クレームする本発明は、本明細書中に開示する具体的な実施態様により範囲を制限されない。任意の同等の実施態様は、本発明の範囲内に存在することが意図されている。実際に、本明細書に示されそして記載されたものに加えて、本発明の様々な修飾が、前述の記載から当業者に明らかとなるだろう。このような修飾もまた、添付した特許請求の範囲の範囲内となることが意図される。抵触する場合は、定義を含む本開示が制御するだろう。
【００８０】
様々な引用文献が本明細書中で引用され、その開示はそれらの全てが引用文献により組み込まれる。
【実施例】
【００８１】
実施例１：インビトロでの膵臓機能不全消化モデル
ノカルジオプシス種（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  １８２６２（配列番号：１）由来のプロテアーゼの精製した調製物を、ＷＯ０１／５８２７６の実施例２に一般的に記載されている通りに調製し、膵臓機能不全に罹患する個々において消化を刺激するインビトロモデルで試験した。
【００８２】
このインビトロ系は２４のフラスコから成り、その中で基質（トウモロコシ及びダイズミールに基づいた）をＨＣｌ／ペプシン（胃内消化を刺激）と共に、そしてその後２つの低減したレベルのパンクレアチンと共に最初にインキュベートし、部分的な及び完全な膵臓機能不全を有する個々における腸内消化を刺激した。正常レベルのパンクレアチンを用いたポジティブコントロール実験も含む。
【００８３】
１０のフラスコには、胃の段階の最初にプロテアーゼを投薬し、一方残りのフラスコはブランクとしての役目を果たした。腸のインキュベーション段階の終わりに、インビトロ消化物を取り除き、可溶化及び消化したタンパク質を分析した。
【００８４】
【表１】
2008500055.tif 000002
【００８５】
条件
基質：４ｇのＳＢＭ、６ｇのトウモロコシ（予混合）
ＨＣｌ：０．１０５Ｍ  １．５時間（すなわち、３０分間ＨＣｌ−基質を予混合）
ペプシン：Ｓｉｇｍａ  Ｐ−７０００；３０００Ｕ／ｇの基質  １時間
パンクレアチン：Ｓｉｇｍａ  Ｐ−７５４５；０．４，８ｍｇ／ｇ基質  ４時間（想定される正常レベルのパンクレアチンは、８ｍｇ／ｇである）
プロテアーゼ：１００ｍｇのプロテアーゼ酵素タンパク質（ＥＰ）／１ｋｇの基質（酵素タンパク質は、Ｓ．Ｃ．Ｇｉｌｌ＆Ｐ．Ｈ．ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８２，３１９−３２６，（１９８９）において概要が説明された原則を用いて、Ａ280値及びアミノ酸配列（アミノ酸組成物）に基づいて測定した）
ｐＨ：３．０胃の段階／６．８〜７．０腸の段階
温度：４０℃
反復：５（４）
【００８６】
溶液
０．３９ＭのＮａＯＨ
０．１０５ＭのＨＣｌ
５ｍｌあたりに６０００Ｕのペプシンを含む０．１０５ＭのＨＣｌ
１ｍｌあたりに１６ｍｇのパンクレアチンを含む１ＭのＮａＨＣＯ3
１２５ｍＭのＮａＡｃ−バッファー、ｐＨ６．０
【００８７】
インビボモデルのための実験手順
実験手順は、上記概要に従った。ｐＨは１、２．５、及び５．５時間で測定した。インキュベーションは、６時間後に終了させ、３０ｍｌの試料を取り除き、遠心分離（１００００×ｇ、１０分間、４℃）の前に氷上に置いた。上清を取り除き、−２０℃で保存した。
【００８８】
分析
全ての試料を、ゲルろ過を用いて可溶化及び消化タンパク質の含量を分析した。
【００８９】
可溶化及び消化タンパク質の評価
インビトロで消化した試料からの上清中の可溶化タンパク質の含量は、ゲルろ過ＨＰＬＣを用いて粗タンパク質（ＣＰ）を定量化することにより評価した。上清を解凍し、０．４５μｍのポリカーボネートフィルターによりろ過し、そしてＨ2Ｏで希釈した（１：５０、ｖ／ｖ）。希釈試料は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＰＥ（７．５×３００ｍｍ）ゲルろ過カラム（Ｇｌｏｂａｌ）を用いてＨＰＬＣによりクロマトグラフィーを行った。定組成溶出に用いた溶離剤は、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）であった。１回の実施あたりの溶離剤の総体積は、２６ｍｌであり、流速は０．４ｍｌ／分であった。溶出プロファイルは２１４ｎｍで記録し、プロファイル下の総面積は積分により決定した。積分面積からタンパク質含量を評価するために、既知の総タンパク質含量を有する、インビトロで消化したリファレンストウモロコシ／−ＳＢＭ試料の希釈系列から較正曲線（Ｒ2＝０．９９９３）を作成した。このリファレンス試料のタンパク質測定は、標準的な方法を用いて実施した（この場合は、窒素（％）の測定のためのケルダール法；Ａ．Ｏ．Ａ．Ｃ．（１９８４）Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １４ｔｈ  ｅｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ）。
【００９０】
消化タンパク質の含量は、１５００ダルトン以下の分子量を有するペプチド及びアミノ酸に対応するクロマトグラム面積を積分することにより評価した（Ｓａｖｏｉｅ．Ｌ．；Ｇａｕｔｈｉｅｒ．Ｓ．Ｆ．Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｌｌ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．１９８６，５１，４９４−４９８；Ｂａｂｉｎｓｚｋｙ．Ｌ；Ｖａｎ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｍ．；Ｂｏｅｒ．Ｈ．；Ｄｅｎ，Ｈ．ＬＡ  Ａｎ  Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｄｉｇｅｓｔｉｂｌｅ  Ｃｒｕｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  Ｐｉｇ  Ｆｅｅｄｓ．Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒ．１９９０，５０，１７３−１７８；Ｂｏｉｓｅｎ．Ｓ．；Ｅｇｇｕｍ．Ｂ．Ｏ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  Ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ−Ｓｔｏｍａｃｈ  Ａｎｉｍａｌｓ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９１，４，１４１−１６２）。１５００ダルトンの境界線を決定するために、ゲルろ過カラムをシトクロムＣ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、アプロチニン、ガストリンＩ、及びサブスタンスＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を分子量標準として用いてキャリブレートした。
【００９１】
実験結果を表１に示し、図１において視覚化も行った。表１において、「酵素」の欄には、基質１グラムあたりのパンクレアチンの量（「ｐａｎ」と省略）、及びノカルジオプシスプロテアーゼの量（角括弧において）を示す。次の欄において、「ｎ」は各実験の反復の数である。以下の一群の欄は、可消化粗タンパク質（％ｄｉｇ．ＣＰと省略）のパーセンテージを示す（標準偏差（ＳＤ）、及び表の下の脚注において説明する有意性の上付き文字を含む）。そして最後に、最後の一群のカラムは、可溶性粗タンパク質（％ｓｏｌ．ＣＰ）のパーセンテージを示す（ＳＤ及び有意性の上付き文字を含む）。
【００９２】
表１から明らかなように、ノカルジオプシスプロテアーゼは、可溶化、可消化タンパク質のパーセンテージを改善する強い傾向（Ｐ＜０．１０）が存在し、このことは４ｍｇ／ｇのパンクレアチン及び０ｍｇ／ｇのパンクレアチンの実験において言える（「４ｍｇ  ｐａｎ、［１００］」 と「４ｍｇ  ｐａｎ、［０］」の比較；及び「０ｍｇ  ｐａｎ、［１００］」 と 「０ｍｇ  ｐａｎ、［Ｏ］」の比較）。これは、ノカルジオプシスプロテアーゼがパンクレアチンの部分的又は完全な不存在を相補することができることを意味する。
【００９３】
【表２】
2008500055.tif 000003
【００９４】
実施例２：結晶化プロテアーゼ調製物の調製
配列番号：１のプロテアーゼを実施例１に記載の通りに発酵させ、プロテアーゼを含む培養液をｐＨ４．５での遠心分離において回収した。得られた上清は、６ｋＤａｌのカットオフ値を有する膜を用いた限外ろ過にかけ、プロテアーゼを含む溶液中での伝導性が２ｍＳ／ｃｍとなるまで透析濾過にかけた。プロテアーゼの含量はおよそ１００ｍｇ／ｍＬであった。
【００９５】
濃縮し透析ろ過したプロテアーゼは、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ８．５まで、すなわちプロテアーゼのｐＩ（９．３）の近くまで調整することにより結晶化する。ｐＨ調整後に、この溶液を室温で一晩放置し、結晶化させた。
【００９６】
次の日に、結晶化プロテアーゼを遠心分離で回収する。
【００９７】
実施例３：酵素試験
プロテアーゼ
基質：Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｓ−７３８８）。
試験バッファー：１００ｍＭのコハク酸、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＣＨＥＳ、１００ｍＭのＣＡＢＳ、１ｍＭのＣａＣｌ2、１５０ｍＭのＫＣｌ、ＨＣｌ又はＮａＯＨでｐＨ９．０に統制した０．０１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００。
試験温度：２５℃
【００９８】
３００μｌの希釈プロテアーゼ試料を１．５ｍｌの試験バッファーと混合し、１．５ｍｌのｐＮＡ基質（１．０ｍｌのＤＭＳＯ中に５０ｍｇを溶解し、更に０．０１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を用いて４５×に希釈する）を添加することにより活性反応を開始し、混合した後、プロテアーゼ活性の測定としてＡ405における増大を分光光度計により測定した。試験のための用量反応曲線の直線部分に全ての活性測定が確実に収まるように、プロテアーゼ試料は、プロテアーゼ活性の測定の前に希釈した。
【００９９】
プロテアーゼＦＩＰ試験
プロテアーゼ活性は、ＦＩＰ試験（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｑｕｅ）を用いて測定することもできる（１ＦＩＰ−ユニット＝１Ｐｈ．Ｅｕｒ．−ユニット（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ））。この試験は、他のＦＩＰ試験共に：Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｑｕｅ，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｅｃｔｉｏｎ: 医薬酵素の標準化のためのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ．ａ）”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，”Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｒ．  Ｒｕｙｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｌａｕｗｅｒｓ，Ｅ．Ｓｔｏｒｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉａ，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ（１９７８），ｂ）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａに記載されている。Ｌａｕｗｅｒｓ  Ａ，Ｓｃｈａｒｐｅ Ｓ（ｅｄｓ）におけるＤｅｅｍｅｓｔｅｒ他：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，１９９７，ｐ．３４３−３８５も参照のこと。
【０１００】
原則：基質カゼインは、プロテアーゼによりｐＨ７．５、３５℃の温度で加水分解される。反応はトリクロロ酢酸の添加により止め、分解されないカゼインはろ過により除く。溶液中に残るペプチドの量は、分光光度計により２７５ｎｍで測定する。
【０１０１】
活性の定義：プロテアーゼ活性は、既知のＦＩＰ活性の粉末（プロテアーゼ標準品）を基準にして、トリクロロ酢酸の５．０％溶液（ｗｔ／ｖｏｌ、すなわち５．０ｇ／１００ｍｌ）により沈殿しないペプチドの量として測定する。
【０１０２】
材料及び方法：
カゼイン溶液：
１．２５ｇのカゼイン（乾物）（例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ｎｏ．２１８６８０）を、事実上透明な溶液が得られるまで水に溶解する。ｐＨは８．０に調整し、溶液を最終体積が１００ｍｌとなるまで水で希釈する。以下において、水は脱イオン水を意味する。
【０１０３】
ホウ酸バッファーｐＨ７．５：
２．５ｇの塩化ナトリウム、２．８５ｇの四ホウ酸二ナトリウム及び１０．５ｇのホウ酸を９００ｍｌの水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５＋／−０．１に調節し、そして１０００ｍｌの水に希釈する。
【０１０４】
ろ紙：
１２５ｍｍの直径を有する折り畳みフィルター、例えばＳｃｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ  ｎｏ．１５７３1/2。ろ紙の試験：５ｍｌの５％トリクロロ酢酸を、フィルターを通してろ過する。ろ液の２７５ｎｍでの吸収は０．０４未満であるべきである（ブランクとしてろ過していないトリクロロ酢酸を用いる）。
【０１０５】
プロテアーゼ標準品：
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）（Ｈａｒｅｌｂｅｋｅｓｔｒａａｔ  ７２，Ｂ−９０００  Ｇｈｅｎｔ，ベルギー）から商業的に入手可能なプロテアーゼ（膵臓）。標準は、ＦＩＰ／Ｐｈ．Ｅｕｒ．−ユニット／ｇにおいて、標識活性（Ａ）を有する。約１３０のプロテアーゼ−ＦＩＰ／Ｐｈ．Ｅｕｒ．−ユニット／ｇに対応する量を正確に計量する。ヘラの先の海砂を加え、数滴の冷えた０．０２Ｍの塩化カルシウム（ｐＨ６．０〜６．２）を用いて湿らせ、全体を先端が平らなガラス棒で粉砕する。約９０ｍｌの同じ冷えた塩化カルシウム溶液を用いて希釈し、氷浴中で１５〜３０分間その懸濁液を撹拌する。ｐＨを６．１に調節し、同じ塩化カルシウム溶液で１００ｍｌに調節する。５．０ｍｌのこの懸濁液を、ｐＨ７．５のホウ酸バッファーを用いて１００ｍｌに希釈する。活性試験のために、１．０、２．０及び３．０ｍｌのこの溶液を基準として用いる（以下では、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３と表し、標準はＳと表す）。
【０１０６】
試験懸濁液：
約２６０のＦＩＰ／Ｐｈ。Ｅｕｒ．−ユニットと同等な量の試料を用いて、プロテアーゼ標準品のための上記の試料の懸濁液を調製する。ｐＨは６．１に調節し、水を１００ｍｌまで添加する。５．０ｍｌのこの溶液を、５ｍｌの塩化カルシウム溶液と混合する。５ｍｌのこの希釈液を、ホウ酸バッファーを用いて１００ｍｌまで更に希釈する。試験のために２．０ｍｌのこの溶液を用いる（以下では、この試料はＵｎと表す（未知の活性、数ｎの試料））。
【０１０７】
試験手順（活性試験）：
３つの基準懸濁液（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）及び試料懸濁液（Ｕｎ）に関して試験を実施する（全て３回実施する）。ブラインド（ｂｌｉｎｄ）（Ｂ）を、分光光度計用の補正液（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ  ｌｉｑｕｉｄ）として、試料／標準を用いずに調製する。ホウ酸バッファーを以下の通りにチューブに加える：ブラインド（Ｂ）を３．０ｍｌ；試料（Ｕｎ）を１．０ｍｌ；標準（Ｓ１、Ｓ２及びＳ３）をそれぞれ２．０、１．０及び０ｍｌ。プロテアーゼ標準品を、以下の通りにＳ１、Ｓ２及びＳ３に加える：それぞれ、１．０、２．０、及び３．０ｍｌ。試験懸濁液を、以下の通りに試料チューブに加える（Ｕｎ）：２．０ｍｌ。５ｍｌのトリクロロ酢酸を全てのブランド（Ｓ１ｂ、Ｓ２ｂ、Ｓ３ｂ、Ｕｎｂ及びＢ）に加え、その後速やかに混合する。全てのチューブをガラスストッパーで止め、基質溶液と共に、一定温度（３５＋／−０．５℃）の水浴中に置く。温度平衡に到達したら（この時をゼロとする）、２．０ｍｌのカゼイン溶液をＳ１、Ｓ２、Ｓ３及びＵｎに加え、その後速やかに混合する。正確に３０分後、５．０ｍｌのトリクロロ酢酸を、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３及びＵｎの各チューブに加え、その後速やかに混合する。チューブを水浴から引き揚げ、室温で２０分間立たせ、タンパク質の沈殿を完了する。各チューブの内容物を同じフィルターを通して２回ろ過し、補正液としてのチューブＢからのろ液を用いて、そのろ液の吸収を２７５ｎｍで測定する。ＦＩＰユニットにおける試料（Ｕｎ）の活性を、標準（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）の既知の標識活性（Ａ）と比較して算出する。それぞれのブランドを指し引いた吸収値（例えば、Ｓ１の吸収からＳ１ｂの吸収値を引く）は、０．１５〜０．６０の間に位置するはずである。
【０１０８】
リパーゼ
基質：パラ−ニトロ−フェニル（ｐＮＰ）吉草酸塩
試験ｐＨ：７．７
試験温度：４０℃
反応時間：２５分間
【０１０９】
黄色の消化産物は、４０５ｎｍに特徴的な吸収を有する。その量は、分光光度計により測定する。１つのリパーゼ単位は、所定の試験条件下で１分間あたり１マイクロモルの滴定ブチル酸を放出する酵素の量である。より詳細な試験の説明（ＡＦ９５／６−ＧＢ）は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ（Ｋｒｏｇｓｈｏｅｊｖｅｊ  ３６，ＤＫ−２８８０  Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）からの依頼に応じて入手可能である。
【０１１０】
アミラーゼ
基質：Ｐｈａｄｅｂａｓ錠剤（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；架橋、不溶性、青色デンプンポリマーであって、ウシ血清アルブミン及びバッファー基質を混合し、錠剤に加工したもの）
試験温度：３７℃
試験ｐＨ：４．３
反応時間：２０分間
【０１１１】
水への懸濁後に、デンプンをアルファ−アミラーゼにより加水分解し、溶解性青色フラグメントを得る。得られた青色の溶液の吸収（６２０ｎｍでの測定）は、アルファ−アミラーゼ活性の関数である。１つの真菌のアルファ−アミラーゼ単位（１  ＦＡＵ）は、標準試験条件で１時間あたりに５．２６ｇのデンプンを分解する酵素の量である（Ｍｅｒｃｋ，Ａｍｙｌｕｍ  ｓｏｌｕｂｉｌｅ  Ｅｒｇ．Ｂ．６，Ｂａｔｃｈ  ９９４７２７５）。より詳細な試験の説明（ＡＰＴＳＭＹＱＩ−３２０７）は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ（Ｋｒｏｇｓｈｏｅｊｖｅｊ  ３６，ＤＫ−２８８０  Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）からの依頼に応じて入手可能である。
【０１１２】
実施例４：プロテアーゼの効力に関するインビボでのスクリーニング試験
実施例１に記載のプロテアーゼを、雌性のゲッティンゲンミニブタにおいて試験した。Ｔａｂｅｌｉｎｇ  他，Ｊ．１９９９，Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓ  （ｐｒｅ−ｃａｅｃａｌ ａｎｄ  ｔｏｔａｌ）  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔ−ｌｉｇａｔｅｄ  ｐｉｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，Ｊ．Ａｎｉｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ａ．Ａｎｉｍ．Ｎｕｔｒ．８２：２５１−２６３（以下では、「Ｔａｂｅｌｉｎｇ  １９９９」と称する）；及びＧｒｅｇｏｒｙ他，Ｊ．１９９９．Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔ  ｌｉｇａｔｅｄ  ｐｉｇs，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ”Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  ｉｎ  Ｇｒｏｗｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌｓ”（ＳＧ  Ｐｉｅｒｚｙｎｏｗｓｋｉ＆Ｒ．Ｚａｂｉｅｌｓｋｉ  ｅｄｓ），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ  ３８１−３９３（以下では、「Ｇｒｅｇｏｒｙ他１９９９」と称する）において記載されているように、ミニブタにおいて、膵管を結紮して膵外分泌機能不全（ＰＥＩ）を誘導し、全てをハロセン麻酔下において約２５ｋｇの体重で、それらに回腸−盲腸リエントリーカニューレを取り付けた。試験を開始する前に、手術からの回復に対して少なくとも４週間の期間を考慮した。試験開始前に、各ブタのＰＥＩ状態を便キモトリプシンにより確認した（ｌｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ＡＧ（Ｗｉｅｓｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ４，Ｄ−６４６２５Ｂｅｎｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から商業的に入手可能、カタログ番号Ｋ６９９０）。
【０１１３】
試験の間、改良した代謝ケージの中で、１２：１２時間の明暗周期において、水を自由に摂取させ、一日に二回の食事を与えて、ブタを飼育した。プロテアーゼの効力を評価するために、１リットルの水、０．６２５ｇのＣｒ2Ｏ3（酸化クロムマーカー）と混合した２５０ｇの試験食であって、与える直前に異なる量のプロテアーゼ（０、１０００、２５００、６０００  ＦＩＰ  Ｕ  プロテアーゼ／食事（プロテアーゼＦＩＰユニット、実施例３を参照のこと））を混合したものをブタに与えた。試験食は、２１．４％のタンパク質、５１．９％のデンプン、２．６％の脂肪を含み、以下の組成物（ｇ／１００ｇ  乾物）を有していた：魚粉３．５、家禽肉粉１０．２、小麦粉２９．５、玄米１４、ジャガイモデンプン１１  、トウモロコシデンプン１４、カゼイン５．９、セルロース粉末４．３、ビタミン、ミネラル及び微量元素７．６（ブタ／子ブタに対する栄養必要量による。例えば、ＷＯ０１／５８２７６の表Ａを参照のこと）。
【０１１４】
回腸（緑色の糜汁）中の食事マーカーの最初の出現後合計８時間、回腸糜汁を氷上で回収し、分析の前に−２０℃で保存した。少なくとも１日、分離測定の間に洗い流しを行った。
【０１１５】
簡潔には、凍結試料を凍結乾燥させ、乾物（ＤＭ）及び粗タンパク質を分析した。１０３℃での８時間のインキュベーションに続く凍結乾燥後に、ＤＭを重量で測定した。粗タンパク質は係数６．２５を掛けた窒素（Ｎ）として産出した。すなわち、Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ１３  （Ｅｄｓ．Ｐ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｒ．Ａ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｄ．Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，１９８８，ＩＳＢＮ  ０−５８２−４０９０３−９）で述べられている、タンパク質（ｇ／ｋｇ）＝Ｎ（ｇ／ｋｇ）×６．２５である。窒素含量は、ケルダール法により測定した（Ｎａｕｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂａｓｓｌｅｒ，１９９３，Ｄｉｅ  ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｆｕｔｔｅｒｍｉｔｔｅｌｎ．３  ｅｄｉｔｉｏｎ  ＶＤＬＵＦＡ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ＶＤＬＵＦＡ＝Ｖｅｒｂａｎｄ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  Ｌａｎｄｗｉｒｔｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅｒ  Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｓ−ｕｎｄ  Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓａｎｓｔａｌｔｅｎ））。
【０１１６】
見掛けの盲腸の前のタンパク質消化率の計算は、式：
【数１】
2008500055.tif 000004
ここで、Ｃｒ2Ｏ3及びタンパク質は、ｇ／１００ｇ  乾物として表される。
【０１１７】
【表３】
2008500055.tif 000005
【０１１８】
実施例５：完全なインビボでの消化率試験
実施例１に記載のプロテアーゼを雌性のゲッティンゲンミニブタ（Ｅｌｌｅｇａａｒｄ）において試験した。前に記載したとおり、ミニブタにおいて膵管を結紮してＰＥＩを誘導し、全てをハロセン麻酔下において約２５ｋｇの体重で、それらに回腸−盲腸リエントリーカニューレを取り付けた（Ｔａｂｅｌｉｎｇ  １９９９；Ｇｒｅｇｏｒｙ他  １９９９）。コントロールのミニブタを同様の方法において調製したが、膵管は無傷のままとした。試験を開始する前に、手術からの回復に対して少なくとも４週間の期間を考慮した。試験開始前に、各ブタのＰＥＩ状態を便キモトリプシンにより確認した（実施例４を参照のこと）。
【０１１９】
ブタには、水を自由に摂取させ、１リットルの水、０．６２５ｇのＣｒ2Ｏ3と混合した細かく粉砕した食事（実施例４のように）であって、与える直前に異なる量のプロテアーゼ（０、６０００  ＦＩＰ  Ｕ  プロテアーゼ／食事）を混合したものを、１日に２回２５０ｇを与えた（０８．００時及び２０．００時に）。各用量を２週間ブタに与え、最後の３日間は回腸糜汁を１２時間氷上で回収した。分析まで、試料を−２０℃で保存した。
【０１２０】
簡潔には、凍結試料を凍結乾燥させ、乾物（ＤＭ）及び粗タンパク質を分析した。ＤＭ及び粗タンパク質を測定し、盲腸の前のタンパク質消化率（見掛けの消化率）は実施例４に記載したとおりに算出した。
【０１２１】
用いた食事に関して、盲腸の前のタンパク質消化率は、コントロール（膵臓機能不全）のミニブタにおいて約８０％であった。未処理ＰＥＩミニブタにおいて、タンパク質消化率はこれらのコントロールの値と比較して大幅に減少したが、パンクレアチン又は微生物プロテアーゼの酵素添加により、消化率は非常に改善し、コントロール値に近づいた（下記の表３の結果を参照のこと）。
【０１２２】
【表４】
2008500055.tif 000006
【配列表】
2008500055000001.app
【国際調査報告】
2008500055.tif 000007
2008500055.tif 000008
2008500055.tif 000009
2008500055.tif 000010
2008500055.tif 000011
2008500055.tif 000012