(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質、ＤＮＡ等の成分を体液、培養液等の試料から分離・精製・濃縮するための固相抽出カラムにおいて、負荷圧を大きくすることなく無機系多孔質連続体の体積を大きくし、多量の試料を処理することのできる固相抽出カラムを提供する。【解決手段】中空のチューブ状無機系多孔質連続体（ゲル）２の外径と内径の比を、１．２から１０の範囲に成形する。ゲル２の上下にはフィルター１，３を装着し、ピペットチップ４に装着する。【選択図】図１
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【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせて作製した無機系多孔質連続体をチューブ状にしてなる固相吸着カラムであって、前記チューブ状無機系多孔質連続体の外径と内径との比（外径/内径）が１．２〜１０の範囲であることを特徴とする固相抽出カラム。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、タンパク質、DNA等の成分を体液、培養液等の試料から分離・精製・濃縮するための固相抽出カラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
固相抽出法はタンパク質、DNA等の成分を体液、培養液等の試料から分離・精製・濃縮するために広く用いられている。固相抽出には多孔質シリカゲルなどの大きな表面積を有する粒子の表面に目的成分を特異的に吸着する官能基を修飾した充填材をプラスチック容器やSUS容器に充填した固相抽出カラムが用いられる（例えば特許文献１）。
固相抽出法は基本的に吸着・洗浄・脱着工程を含む。まず、目的成分を含む試料を吸着溶媒とともに固相抽出カラムに通し目的成分を固相抽出カラムに吸着させる。次に、目的成分以外の成分を洗い流す洗浄溶媒を固相抽出カラムに通し目的成分以外の成分を脱着させる。次に目的成分を脱着させる脱着溶媒を流し目的成分のみを含んだ溶液を得る。この３段階の操作により目的成分の分離・精製・濃縮を達成する。各溶媒を固相抽出カラムに通すために遠心分離機、ピペッターなどが用いられる。
【０００３】
粒子充填カラムでは粒子径が小さいほど分離能はよくなるが反面カラムに溶液を通すための負荷圧が大きくなる。固相抽出では簡便な操作で抽出を行うため、カラムに溶液を通すためにピペッターや遠心分離機を用いており、大きな負荷圧を必要とするカラムを用いることはできない。このため、粒子充填カラムでは大きな粒子径の充填材を用いなければならず、大きな分離能は望めなかった。
【０００４】
これに対して、マイクロメーターサイズの連続細孔を有する無機系多孔質連続体では粒子充填カラムよりも小さな負荷圧のカラムの作製が可能であり、低負荷圧で高分離能の固相抽出カラムの作製が可能である（例えば特許文献２）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−３１６００２号公報
【特許文献２】特開平１１−２８７７９１号公報
【考案の開示】
【考案が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の無機系多孔質連続体を用いた固相抽出カラムは円盤状に成型した無機系多孔質連続体をプラスチック製の遠心チップあるいはピペットチップに装着して用いられている。
固相抽出では目的によっては多量に試料から目的成分の吸着・洗浄・濃縮を行わなければならない場合がある。このような場合には多量の試料の吸着を可能とするためカラムの体積を大きくしなければならない。
無機系多孔質連続体においては大きな体積を実現するためにはゲルの直径、厚さを大きくしなければならないが、遠心チップ、ピペットチップでは用いる装置との関係から直径を大きくすることには制限があり、厚さを大きくしなければならない。厚さを大きくすることにより負荷圧が増大し、厚さにも限界がある。
本考案は、負荷圧を大きくすることなく無機系多孔質連続体の体積を大きくし、多量の試料を処理することのできる固相抽出カラムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本考案は、無機系多孔質連続体をチューブ状にして固相抽出カラムを作製する。
この場合、固相抽出カラムの負荷圧は無機系多孔質連続体チューブの肉厚により決定される。ゲルの体積はチューブの肉厚と長さにより調節可能であり、長さを長くすることにより多量の試料の処理も可能となる。
チューブ状無機系多孔質連続体の外径と内径の比については、比が小さいと肉厚が薄くなりすぎゲルの強度を十分に保つことができない。また、比が大きいと負荷圧が大きくなったり、ゲル中を溶媒が通過するのに時間がかかり処理時間が長くなる。したがって比（外径/内径）は１．２から１０の範囲が最適である。
【０００８】
無機系多孔質連続体は、相分離を利用したゾル―ゲル法によって調製することが好ましく、本発明における無機系多孔質連続体は、直径100nm〜10000nmのマクロ孔と骨格が共連続構造をした無機系多孔質連続体で、骨格には直径2nm〜100nmのメソ孔が存在する。
無機系多孔質連続体は、シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル-ゲル転移を起こさせることにより得られる。ゾル−ゲル反応に用いられるゲル形成を起こす網目成分の前駆体としては、金属アルコキシド、錯体、金属塩、有機修飾金属アルコキシド、有機架橋金属アルコキシド、およびこれらの部分加水分解生成物、部分重合生成物である多量体を用いることができる。水ガラスほかケイ酸塩水溶液のｐＨを変化させることによるゾル−ゲル転移も、同様に利用することができる。
【０００９】
さらに具体的には、上記目的達成の手段は、水溶性高分子、熱分解する化合物を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行い、生成物が固化した後、次いで湿潤状態のゲルを加熱することにより、ゲル調製時にあらかじめ溶解させておいた低分子化合物を熱分解させ、次いで乾燥し加熱して製造することが好ましい。
【００１０】
ここで、水溶性高分子は、理論的には適当な濃度の水溶液と成し得る水溶性有機高分子であって、加水分解性の官能基を有する金属化合物によって生成するアルコールを含む反応系中に均一に溶解し得るものであれば良いが、具体的には高分子金属塩であるポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩またはカリウム塩、高分子酸であって解離してポリアニオンとなるポリアクリル酸、高分子塩基であって水溶液中でポリカチオンを生ずるポリアリルアミンおよびポリエチレンイミン、あるいは中性高分子であって主鎖にエーテル結合を持つポリエチレンオキシド、側鎖にカルボニル基を有するポリビニルピロリドン等が好適である。また、有機高分子に代えてホルムアミド、多価アルコール、界面活性剤を用いてもよく、その場合多価アルコールとしてはグリセリンが、界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類が最適である。
【００１１】
加水分解性の官能基を有する金属化合物としては、金属アルコキシド又はそのオリゴマーを用いることができ、これらのものは例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等の炭素数の少ないものが好ましい。また、その金属としては、最終的に形成される酸化物の金属、例えばＳｉ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ａｌが使用される。この金属としては1種又は2種以上であっても良い。一方オリゴマーとしてはアルコールに均一に溶解分散できるものであればよく、具体的には１０量体程度まで使用できる。
【００１２】
また、酸性水溶液としては、通常塩酸、硝酸等の鉱酸０．００１モル濃度以上のもの、あるいは酢酸、ギ酸等の有機酸０．０１モル濃度以上のものが好ましい。
【００１３】
相分離・ゲル化にあたっては、溶液を室温４０〜８０℃で０．５〜５時間保存することにより達成できる。相分離・ゲル化は、当初透明な溶液が白濁してシリカ相と水相との相分離を生じついにゲル化する過程を経る。この相分離・ゲル化で水溶性高分子は分散状態にありそれらの沈殿は実質的に生じない。
【００１４】
あらかじめ共存させる熱分解性の化合物の具体的な例としては、尿素あるいはヘキサメチレンテトラミン、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等の有機アミド類を利用できるが、加熱後の溶媒のｐＨ値が重要な条件であるので、熱分解後に溶媒を塩基性にする化合物であれば特に制限はない。
共存させる熱分解性化合物は、化合物の種類にもよるが、例えば尿素の場合には、反応溶液１０ｇに対し、０．０５〜０．８ｇ、好ましくは０．１〜０．７ｇである。また、加熱温度は、例えば尿素の場合には４０〜２００℃で、加熱後の溶媒のｐＨ値は、６．０〜１２．０が好ましい。
また、熱分解によってフッ化水素酸のようにシリカを溶解する性質のある化合物を生じるものも、同様に利用できる。
【００１５】
上記方法では、水溶性高分子を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行うと、溶媒リッチ相と骨格相とに分離したゲルが生成する。生成物（ゲル）が固化した後、適当な熟成時間を経た後、湿潤状態のゲルを加熱することによって、反応溶液にあらかじめ溶解させておいたアミド系化合物が熱分解し、骨格相の内壁面に接触している溶媒のｐＨが上昇する。そして、溶媒がその内壁面を浸食し、内壁面の凹凸状態を変えることによって細孔径を徐々に拡大する。
シリカを主成分とするゲルの場合には、酸性あるいは中性領域においては変化の度合は非常に小さいが、熱分解が盛んになり水溶液の塩基性が増すにつれて、細孔を構成する部分が溶解し、より平坦な部分に再析出することによって、平均細孔径が大きくなる反応が顕著に起こるようになる。
【００１６】
巨大空孔を持たず３次元的に束縛された細孔のみを持つゲルでは、平衡条件としては溶解し得る部分でも、溶出物質が外部の溶液にまで拡散できないために、元の細孔構造が相当な割合で残る。これに対して巨大空孔となる溶媒リッチ相を持つゲルにおいては、２次元的にしか束縛されていない細孔が多く、外部の水溶液との物質のやり取りが十分頻繁に起こるため、大きい細孔の発達に並行して小さい細孔は消滅し、全体の細孔径分布は顕著に広がることがない。
【００１７】
なお、加熱過程においては、ゲルを密閉条件下に置き、熱分解生成物の蒸気圧が飽和して溶媒のｐＨが速やかに定常値をとるようにすることが有効である。
【００１８】
溶解・再析出反応が定常状態に達し、これに対応する細孔構造を得るために要する、加熱処理時間は、巨大空孔の大きさや試料の体積によって変化するので、それぞれの処理条件において実質的に細孔構造が変化しなくなる、最短処理時間を決定することが必要である。
【００１９】
加熱処理を終えたゲルは、溶媒を気化させることによって、溝内において、管壁に密着した乾燥ゲルとなる。この乾燥ゲル中には、出発溶液中の共存物質が残存する可能性があるので、適当な温度で熱処理を行い、有機物等を熱分解することによって、目的の無機系多孔質体を得ることができる。なお、乾燥は、３０〜８０℃で数時間〜数十時間放置して行い、熱処理は、２００〜８００℃程度で加熱する。
【考案を実施するための最良の形態】
【００２０】
本考案の固相抽出カラムの概略図を図１に示す。
図１（ａ）は、ピペットチップにチューブ状無機系多孔質連続体を装着した図、（ｂ）（ｃ）は、チューブの拡大図である。
２が中空のチューブ状無機系多孔質連続体（ゲル）であり、その外径と内径の比は、1.2から10の範囲に成形する。ゲル２の上下にはフィルター１，３を装着してある。下部のフィルター１は、例えばフッ素ゴムで作製されており、ゲルの内径より小さな孔があけられている。上部のフィルター３は、例えばPEEK樹脂で作製されており、その内側部分はゲルの外径より大きな径で液が透過しないようにふさがれており、その外部は液が透過可能なようにフィルター状になっている。ピペットチップ４には、図示しない吸引・吐出手段、例えば、シリンジポンプが接続される。吸引・吐出手段は、ピペットチップ４内を負圧および正圧にできるものであれば、何でもよい。
ピペットチップ４内を負圧にして、下部から吸い上げられた溶媒を吸上げると、溶媒は、図１（ｂ）に示すごとく、ゲルの中空部分へと導入され、ゲル２の肉厚部分を通過しゲル上部へ吸い上げられる構造となっている。また、ピペットチップ４内を正圧にすることにより、吸上げられていた溶媒は、図１（ｃ）に示すごとく、ゲル２の外周中空部分からゲル２の肉厚部分を通過し、ゲルの中空部分へと吐出される構造となっている。
【００２１】
［実験例１］
外径3mm、内径1mm（外径/内径＝3）、長さ2.25mmのチューブ状のゲル２を容量1mlのピペットチップ４に図１に示すように溶着することで装着した。
ゲルの細孔径はマクロ孔が約３０μm、メソ孔が約11nmであった。下部のフィルター１はフッ素ゴムで作製し、ゲルの内径より小さな孔があけた。上部のフィルター３はPEEK樹脂で作製し、その内側部分はゲルの外径より大きな径で液が透過しないようにふさぎ、その外部は液が透過可能なようにフィルター状にした。
この固相抽出カラムをピペッターに装着し500μｌの水を吸い上げる時間を測定したところ、10回の平均値で6.2秒必要であった。
これに対して同じ体積、同じ細孔径を有する円盤状の一体型シリカゲル（直径3mm。厚さ2ｍｍ）を同じピペットチップに装着し同じピペッターで500μｌの水を吸い上げるのに10回の平均値で30.7秒必要であった。
【００２２】
［実験例２］
外径3mm 、内径0.25mm（外径/内径＝12）、長さ2.1mmのゲル（体積は同じ）を作製し、図1に示すようにピペットチップに装着し、500μｌの水を吸い上げる時間を測定したところ、10回の平均値で27.7秒必要であった。あまり効果がない。
【００２３】
［実験例３］
外径3mm、内径2.7mm（外径/内径＝1.11）、長さ5.2mm(体積は半分)のゲルを作製し、図1に示すようにピペットチップに装着を試みたが、ゲルが壊れてしまい装着できなかった。強度が不足していて使用できない。ゲル体積を十分に得るためにはゲルの長さが長くなってしまい、使いづらいことが分かった。
【産業上の利用分野】
【００２４】
本考案は、タンパク質、DNA等の成分を体液、培養液等の試料から分離・精製・濃縮するための固相抽出カラムとして利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本考案の固相抽出カラムの概略図
【符号の説明】
【００２６】
１：下部フィルター
２：チューブ状無機系多孔質連続体（ゲル）
３：上部フィルター
４：ピペットチップ
【図１】
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