【事件の表示】
　特許第２７７１２０４号「遺伝子工学的手法による抗体の製造法」の特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７７１２０４号の請求項１〜６に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第２７７１２０４号は、昭和６３年１２月２８日に出願され、平成１０年４月１７日に設定登録がなされ、その後、石田　敬らにより特許異議の申立てがなされ、この申立てを受けて取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１１年１１月２９日に訂正請求がなされ、さらに訂正拒絶理由通知書がなされ、これに対して、平成１２年３月２７日に手続補正がなされたものである。
２．訂正の適否
２−１．訂正の内容
ア、請求項１中の「機能性（functional）抗体フラグメントＦｖまたは機能性抗体領域と他のタンパク質との融合タンパク質」を「抗体フラグメントＦｖ」と訂正する。
イ、請求項１中の「・・・機能性発現産物・・・」を「・・・抗体フラグメントＦｖ・・・」と訂正する。
ウ、請求項５中の「機能性タンパク質・・・所望のタンパク質・・・」を「抗体フラグメントＦｖ・・・フラグメントＦｖ・・・」と訂正する。
エ、請求項６中の「・・・機能性タンパク質・・・所望のタンパク質・・・」を、「・・・抗体フラグメントＦｖ・・・該フラグメントＦｖ・・・」と訂正する。
２−２．訂正の適否についての判断
ア、訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記２−１．アの訂正は、「機能性（functional）抗体フラグメントＦｖまたは機能性抗体領域と他のタンパク質との融合タンパク質」を「抗体フラグメントＦｖ」とより狭い範囲に限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。また、同イ〜エの訂正は、上記訂正事項アの特許請求の範囲の減縮にともなう不明瞭な記載の釈明を目的とするものである。
イ、独立特許要件の判断
　後述の「３．特許異議申立てについての判断」に記載した理由により、訂正後の請求項１〜６に係る発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができない発明とすることはできない。
ウ、むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び第３項で準用する第１２６条第２項から第４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
３．特許異議申立てについての判断
３−１．訂正明細書の請求項１〜６に係る発明
　訂正明細書の請求項１〜６に係る発明は、その特許請求の範囲の請求項１〜６に記載された次の事項により特定されるとおりのものである。
「（１）抗体フラグメントＦｖの製造法であって、重鎖および軽鎖のフラグメントをコードするそれぞれの遺伝子構造物をシグナル配列、すなわち細菌細胞の細胞質膜を通してポリペプチドの輸送を促進しその後切断されるシグナル配列に連結し、該遺伝子構造物を細菌中で発現させ、ペリプラズム空間（periplasmic space）または生育メジウム（medium）から抗体フラグメントＦｖを単離することを特徴とする、製造法。
（２）細菌がグラム陰性細菌である、請求項１に記載の製造法。
（３）細菌が大腸菌（E.coli）である、請求項２に記載の製造法。
（４）二つのプレペプチドのための遺伝子を可調節性オペロン系のかたちで連結させることを特徴とする、請求項１、２または３のいずれか１項に記載の製造法。
（５）抗体フラグメントＦｖをペリプラズム空間から単離するために、ペリプラズムを溢出させるが細胞質をもとのままに保持するような浸透圧ショックを分離しておいた細菌に与えて、これによって得られた液相を遠心分離によって濃厚富化して、さらにこの濃縮物から抗体フラグメントＦｖを得ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
（６）適当な抗原またはハプテンを装填した吸着剤に抗体フラグメントＦｖを含む溶液を供し、該フラグメントＦｖをこの抗原またはハプテンを含む溶液にて溶出して単離することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造法。」
（以下、本件発明１〜６という。）
３−２．異議申立ての理由の概要
　異議申立人　石田敬らは、下記に示す甲第１号証〜甲第１５号証を提出して、訂正前の本件請求項１〜６に係る発明は、甲第６号証に記載されているから、特許法第２９条の２の規定により特許を受けることができないものであり、また同項に係る発明は、甲第５号証に記載の発明及び甲第７号証〜甲第１４号証のいずれかに記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、さらに本件特許に係る明細書の記載は、特許法第３６条第３項及び第４項に規定する要件を満たしていない旨、主張している。
                           　　記
(1)　甲第１号証　「Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.69, No.9, p.2659-2662(1972)」
(2)  甲第２号証　「Biochemistry Vol.12, No.6, p.1130-1135(1973)」
(3)  甲第３号証  「Biochemistry Vol.15, No.7, p.1591-1594(1976)」
(4)  甲第４号証　「PROTEINS: Structure, Function and Genetics Vol.1, p256-262(198　　　　　　　　　6)」
(5)  甲第５号証  「特開昭58−162599号公報」
(6)  甲第６号証  「特表平3−501321（特願昭63−506481)号公報」
(7)  甲第７号証　「特開昭57−140800号公報」
(8)  甲第８号証　「The EMBO Journal, Vol.4, No.13B, p.3901-3906(1985)」
(9)  甲第９号証  「特表昭60−500892号公報」
(10)  甲第10号証 「特開昭60−155132号公報」
(11)  甲第11号証 「Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.81, p.3273-3277(1984)」
(12)  甲第12号証 「Gene Vol. 27, p.315-322(1984)」 
(13)  甲第13号証 「Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.83, p.8506-8510(1986)」
(14)  甲第14号証 「特開昭59−203495号公報」
(15)  甲第15号証 「特願昭63−506481号の優先権証明書の写し」
３−３　甲各号証記載の発明
　甲第１号証には、Ｆａｂ’断片を酵素処理することにより、活性なＦｖフラグメントを得たことが記載されている。
　甲第２号証には、抗−２、４−ジニトロフェニル抗体の活性なＦｖフラグメントが記載されている。
　甲第３号証には、活性Ｆｖフラグメントの調製について記載されている。
　甲第４号証には、活性なＩｇＧ　ＧａｒのＦｖフラグメントが記載されている。
　甲第５号証には次のとおり記載されている。
　（５−１）「1、形質転換された表現べクターあるいはプラスミドであって、該べクターまたはプラスミドは既決したリガンドに特異な免疫グロブリンの軽(Ｌ)鎖または重(Ｈ)鎖の可変領域をコードするｄｓＤＮＡ配列を有するが前記領域に不要なアミノ酸残基をコードするヌクレオチド類を欠如しており、さらに前記ＤＮＡ配列の５’−末端および３’−末端のそれぞれにおいて開始および終止コドンを備えていることを特徴とする前記べクターまたはプラスミド。」（請求項1）、及びこの形質転換された表現べクターあるいはプラスミドを運搬する形質転換宿主（請求項9）
　（５−２）「したがって本発明はある免疫グロブリンのＬ鎖およびＨ鎖の可変領域に限定された均一な組成物として提供された新規蛋白性化合物に関するものであり、この場合これら化合物は、別個にあるいは共に既決のハプテン部位において特異な結合性によって抗体と化合物を形成する。」（第７頁左上欄第７〜１２行目）
　（５−３）「形質転換体によって産生されたポリぺプチドは細胞外へ分泌される場合、細胞と上清の分離により単離されうる。」（第８頁左下欄第１４〜１６行）
　（５−４）第１７頁右下欄以降の実施例には、ジニトロフェニル(ＤＮＰ)に対するモノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域とからなるＦｖの大腸菌での製造方法が具体的に記載されている。
　（５−５）「このようにして、５’−先頭配列をコードするストランド類およびコード配列あるいは可変領域のコード配列そのものが合成され、かつ鋳型非コードストランドの３’−配向のシングルストランドＤＮＡ配列は、３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性で分解される。先頭配列を含むストランドに対する結果のように、平滑末端でかつ開始コドンの骨格中にＤＮＡ配列を残すコードストランドの５’−末端において開始コドンを有すＬ鎖およびＨ鎖の双方の先頭配列および可変領域をコードするために複式が得られる。」（第２５頁左下欄第４〜１４行目）
　（５−６）「本法は、既決ハプテンサイトに対し高親和性をもつ化合物を形成する2つのペプチド鎖を有する均一組成の蛋白性化合物を提供する。天然に存在する免疫グロブリンを模写することによって、該２種の鎖は、特殊リガンドに対し特異性を有するγＦｖを形成する。定常領域が無い場合、生じるγＦｖはイムノジエン性が減少されさらに特殊適用、例えば補体結合に対し望ましくない機能を持ちうるペプチド配列を欠く。」（第２９頁左上欄第５〜１３行目）
　甲第６号証には次のとおり記載されている。
　（６−１）「１９．ヒト不変領域および非ヒト可変領域をそれぞれ有する重鎖および軽鎖を含んでいるキメラ免疫グロブリンのＦａｂ部を製造する方法であって、該重鎖、または該軽鎖、若しくはその両者を発現し得る宿主を培養条件下で培養し、該培養から該キメラ免疫グロブリン分子のＦａｂ部を回収することからなる方法。」（請求項１９）
　（６−２）実施例７(第４６頁左下欄第１行〜第５１頁左下欄最下行)には、マウスの抗−ＨＢｓ抗体の軽鎖可変領域とヒト軽鎖不変領域（定常領域）との融合タンパク質（第４７頁左下欄第１１行〜同頁右下欄第１２行）のＮ−末端にｐｅｌ−Ｂシグナル配列を付加したもの（第４７頁右上欄第７行〜同頁左下欄第１０行）をコードするＤＮＡと、マウス抗−ＨＢｓ抗体の重鎖可変領域とヒト重鎖不変領域（定常領域）１個との融合タンパク質（第４７頁右下欄第１３行〜第４８頁左下欄第１４行）のＮ−末端にｐｅｌＢシグナル配列を付加したもの（第４７頁右上欄第７行〜同頁左下欄第１０行）をコードするＤＮＡを一つのプラスミドに挿入し、１個のｌａｃプロモーター又はａｒａＢプロモーターの制御下で(第４８頁左上欄第１５行目〜第４９頁右上欄第１１行目)大腸菌において発現せしめ(第４９頁右上欄第１４行目〜第５０頁左下欄第１行目)、発現生成物をペリプラズム空間及び培地中に分泌せしめ(第４９頁左下欄第９〜１３行目、第５０頁左下欄第４〜５行目)、これらからキメラＦａｂフラグメントを精製した(第５０頁左下欄第２行目〜第５１頁左上欄第４行目)ことが記載されている。
　（６−３）「エシェリヒア・コリを宿主として用いることにより、免疫グロブリンの機能的活性Ｆａｂ領域を製造し、これらをペリプラズミック空間中および培養培地において分泌させる新規方法が開示されている。」（第５１頁右上欄第７〜９行目）
　（６−４）「１．修飾抗体ｃＤＮＡクローンによりコードされる蛋白質は、シグナル配列を用いて細菌から分泌され得る。
　２．２種の抗体遺伝子が、ジシストロン・メッセージとして単一細菌性プロモーターから発現され得る。
　３．２種の外来蛋白質（この実施例では抗体軽鎖およびＦｄ）が、適切に組み立てられ得、すなわち、細菌から分泌された場合、正確な二次、三次、および四次構造を呈する。
　　　　　　　　　　　　　　　　・・・
　５．この実施例は、他の抗体鎖をコードする遺伝子がジシストロン・メッセージとして一緒に発現され得る一般的方法である。これらは、軽鎖およびＦｄ遺伝子または軽鎖および無傷の重鎖遺伝子を含む。」（第５１頁右上欄第１４行目〜同頁左下欄第１０行）
　甲第７号証には次のとおり記載されている。
　「所望の生成物が小胞体(内膜)を通して分泌され、その信号ペプチドが形質転換体固有の方法で生体内で除去され、かくして外来性遺伝子生成物が得られる様に、これら３つの挿入サイトの１つを利用して所望のポリペプチドを、そのアミノ末端に位置するＥ．ｃｏｌｉリポプロテインの信号ペプチドを含むリーダ配列と共に発現させることができる。」（第７頁右下欄第９〜１６行目）
　甲第８号証には次のとおり記載されている。
　「スタフイロコッカスプロテインＡをコードする遺伝子の異る構成物を、スタフィロコッカス・アウレウム及びＳ．キシロサス、並びにエシェリシア・コリに導入した。細胞壁アンカードメインを有しない遺伝子産物はすべての宿主において効率的に分泌された。アフィニティー精製した成熟蛋白質のＮ−末端配列の決定により、３６位のアラニン残基の後に共通のプロセシング部位が存在することが明らかになった。・・・予想外にも、遺伝子産物ＥＢは、分泌されそして正しくプロセシングされるのみならず、Ｅ．ｃｏｌｉの培地に分泌された。プロテインＡのシグナル配列を含有する分泌ベクターが外来遺伝子産物の分泌を促進するために作製された。・・・」第３９０１頁左欄の要約の項）
　甲第９号証には、個々の鎖は宿主細胞により処理されて完全なポリペプチドまたは蛋白質となり、有利には宿主より分泌されるであろうと記載されている。（第５頁左下欄第１９〜２１行目）
　甲第１０号証には次のとおり記載されている。　
　「酵母及び細菌の菌株中の適切な合成条件下の蛋白質は培地中(酵母及びグラム陽性菌)又はペリプラズム空間(グラム陰性菌)へ分泌することができ、それほど激しくない方法により回収することができる。一般に、宿主としての組織培養細胞は異種蛋白質の便利な回収を可能にすると思われる。
　Ｈ鎖とＬ鎖とを同一宿主中で同時発現させる場合、単離法は、再編成抗体を回収するように設計される。これは下記するようにｉｎ　ｖｉｔｒｏで行なうことができ、或いは細胞質の還元環境からＩｇＧ鎖を分泌する微生物中ｉｎ　ｖｉｖｏで行なうことも可能である。」（第１６頁右上欄第７行目〜同頁左下欄第２行目）
　甲第１１号証には次のとおり記載されている。
　「プレ−重鎖(又はプレ−Ｆｄ’ フラグメント)及びプレ−軽鎖の、Ｅ．コリ、酵母及び哺乳類細胞での発現は、分泌される抗体の生体内アセンブリーのための条件を確立するために遂行されうる。」（第３２７７頁左欄、最終パラグラフ）
　甲第１２号証には、マウス ＭＯＰＣ３２１骨髄腫からのκ軽鎖(Ｌ−３２１)をコードするｃＤＮＡを大腸菌にクローニングした場合、Ｌ−３２１抗原が細胞質画分及びペリプラズム画分の両方に見出されること、及びシグナルペプチドから始まるインタクトな鎖を合成する細胞において、ペリプラズムは成熟したサイズの免疫グロブリンを含有しており、真核性シグナルペプチドが分泌を開始することができ且つプロセシングされ得ることが記載されている。（３１５頁サマリー）
　甲第１３号証には、大腸菌での真核生物遺伝子の高レベル発現のために合成２シストロン発現系が作製されたことが記載されている。（第８５０６頁のＡＢＳＴＲＡＣＴ）
　甲第１４号証には、オペロンまたはその一部と外来遺伝子とを組換え、ポリシストロンを形成するように再構成したオペロンを用いる外来遺伝子の発現方法が記載されている。（特許請求の範囲）
３−４　対比・判断
Ａ．特許法第２９条の２について
（本件発明１について）
　２．で述べたとおり、本件発明は訂正により「抗体フラグメントＦｖ」の製造法に減縮されたところ、このＦｖは甲第６号証の実施例７に記載されたキメラＦａｂフラグメントとは異なるものである。
　この相違点について、異議申立人は、同甲号証に「この実施例は、他の抗体鎖をコードする遺伝子がジシストロン・メッセージとして一緒に発現され得る一般的方法である。」と記載されていることから（記載事項６−４）、上記実施例の方法が他の抗体断片にも一般的に適用できることが示されており、同甲号証には、本件発明が実質的に記載されていると主張する（異議申立書第２０頁第１８〜２１行）。
　しかしながら、この『他の抗体鎖』に関して、引き続き「これらは、軽鎖およびＦｄ遺伝子または軽鎖および無傷の重鎖遺伝子を含む。」と記載されていることからみて、上記記載は「抗体フラグメントＦｖ」のような小さいフラグメントを発現しうることまでも開示しているものとは認められない。
　したがって、本件発明１が甲第６号証に記載された発明と同一であるとすることはできない。
（本件発明２〜６について）
　本件発明２〜６は、請求項１を引用する発明であるから、請求項１に係る発明と同様な理由で、これらの発明が甲第６号証に記載された発明と同一であるとすることはできない。
Ｂ．特許法第２９条第２項について
（本件発明１について）
　なるほど、甲第５号証には、免疫グロブリンのＬ鎖及びＨ鎖の可変領域の均一な組成物を得ることを目的とすること（記載事項５−２）、その目的を達成するために、形質転換された表現べクターあるいはプラスミドであって、該べクターまたはプラスミドは既決したリガンドに特異な免疫グロブリンの軽(Ｌ)鎖または重(Ｈ)鎖の可変領域をコードするｄｓＤＮＡ配列を有するが前記領域に不要なアミノ酸残基をコードするヌクレオチド類を欠如しており、さらに前記ＤＮＡ配列の５’−末端および３’−末端のそれぞれにおいて開始および終止コドンを備えていることを特徴とする前記べクターまたはプラスミドにより形質転換された宿主を使用すること（記載事項５−１）、形質転換体によって産生されたポリペプチドは細胞外へ分泌される場合、細胞と上清の分離によって単離されうること（記載事項５−３）、及び５’−先頭配列をコードするストランド類およびコード配列あるいは可変領域のコード配列そのものが合成されること（記載事項５−５）が、それぞれ記載されてはいるものの、訂正後の重鎖、軽鎖のそれぞれのフラグメントをシグナル配列に連結した遺伝子構造物を構築することは記載されておらず、そもそも、同号証には、Ｆｖフラグメントを製造するために遺伝子構造物を細菌中で発現させたことの具体的な記載がない。
　そして、本件発明は、上記構成を採用することにより、細菌細胞においても、二個の鎖をほぼ同じ化学量論的な量でつくり、二個の前駆タンパク質をペリプラズマ空間又はそれを囲むメジウムに輸送し、シグナル配列を正しく除去し、球状及び可溶性領域を正しく折りたたみ、分子間のジスルフィド結合を形成し、更に二個の鎖を合わせてヘテロダイマーをつくることができたという（公報第４欄第２３〜３５行）、即ち、機能的で安定なタンパク質であるＦｖを直接形成させることができたという優れた効果を奏し得たものである。
　さらに、異議申立人は、甲第７号証〜甲第１４号証に記載の発明を根拠として、シグナル配列を使用して発現蛋白質をペリプラズム又は培地に分泌させることは既に周知の技術となっており、かかる周知技術に基づいて、本件発明を行うことは当業者にとって極めて容易なことであったとも主張している。（同申立書第２５頁第１７〜２１行）
　しかしながら、これらの各甲号証のいずれにおいても、フラグメントＦｖについて、シグナル配列を連結させて細菌中で処理する場合にも、分泌及びプロセシングが可能であることを示唆する記載はない。
　そして、本件出願時には、蛋白質の折りたたみについての試みによって、正しく折りたたまれた組換え抗体タンパク質はごく僅かが得られたに過ぎないという状況にあり（本件特許公報第３欄第１５〜１８行）、また、異議申立人が提示した甲第１０号証では、大腸菌で免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を発現させてはいるものの、機能的で安定な形態で、「直接」発現できたことを示しているとはいえない。
　　したがって、本件発明１は甲第５号証及び甲第７号証〜甲第１４号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものとすることもできない。
（本件発明２〜６について）
　本件発明２〜６は、請求項１を引用する発明であるから、本件発明１と同様な理由で、甲第５号証及び甲第７号証〜甲第１４号証に記載された発明に基づいて、当業者が発明を容易にすることができたものとすることはできない。
Ｃ．特許法第３６条第３項及び第４項　
　異議申立人は、（１）分泌シグナル配列としては、ｏｍｐＡ及びｐｈｏＡのみが記載されているだけであって、それ以外のシグナル配列を使用するためには、当業者にとり過度の実験を必要とする、及び（２）「機能性抗体領域と他のタンパク質との融合タンパク質」を製造する場合については、本件明細書には実質的に何も記載されていないから、本件明細書の記載は、特許法第３６条第３項及び第４項に規定する要件を満たしていないと主張している（同申立書第２７頁１４〜２５）。
　そこで、上記（１）について検討すると、細菌中で発現されたポリペプチドをペリプラズム空間へ輸送可能なシグナル配列は本出願前に多数知られており、或るシグナル配列について目的を達成しうることがわかれば、他のシグナル配列についても適宜実験を行うことによりその結果を確認し得るものと考えられる。しかも、他のシグナル配列では同等の効果が奏されないとする合理的な根拠が示されているわけでもないから、この点で本件明細書が記載不備であるとすることはできない。
　上記（２）については、本件発明は、「機能性（functional）抗体フラグメントＦｖまたは機能性抗体領域と他のタンパク質との融合タンパク質」の製造方法に関するものであったが、「抗体フラグメントＦｖ」の製造方法に訂正されたから、上記異議申立人の主張は採用できない。
　したがって、本件明細書が特許法第３６条第３及び４項に規定する要件を満たしていないとすることはできない。
　４．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立人の主張する理由及び証拠方法によっては、本件請求項１〜６に係る発明の特許を取り消すことができない。
　また、他に本件請求項１〜６に係る発明の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年４月２７日（２０００．４．２７）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
特許請求の範囲の減縮及び不明瞭な記載の釈明を目的として、
「（１）機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）抗体フラグメントＦｖまたは機能性抗体領域と他のタンパク質との融合タンパク質の製造法であって、重鎖および軽鎖のフラグメントをコードするそれぞれの遺伝子構造物をシグナル配列、すなわち細菌細胞の細胞質膜を通してポリペプチドの輸送を促進しその後切断されるシグナル配列に連結し、該遺伝子構造物を細菌中で発現させ、ペリプラズム空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｓｐａｃｅ）または生育メジウム（ｍｅｄｉｕｍ）から抗体機能性発現産物を単離することを特徴とする、製造法。
（２）細菌がグラム陰性細菌である、請求項１に記載の製造法。
（３）細菌が大腸菌（Ｅｃｏｌｉ）である、請求項２に記載の製造法。
（４）二つのプレペプチドのための遺伝子を可調節性オペロン系のかたちで連結させることを特徴とする、請求項１、２または３のいずれか１項に記載の製造法。
（５）機能性タンパク質をペリプラズム空間から単離するために、ペリプラズムを溢出させるが細胞質をもとのままに保持するような浸透圧ショックを分離しておいた細菌に与えて、これによって得られた液相を遠心分離によって濃厚富化して、さらにこの濃縮物から所望のタンパク質を得ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
（６）適当な抗原またはハプテンを装填した吸着剤に機能性タンパク質を含む溶液を供し、該所望のタンパク質をこの抗原またはハプテンを含む溶液にて溶出して単離することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造法。」
とあるのを、
「（１）抗体フラグメントＦｖの製造法であって、重鎖および軽鎖のフラグメントをコードするそれぞれの遺伝子構造物をシグナル配列、すなわち細菌細胞の細胞質膜を通してポリペプチドの輸送を促進しその後切断されるシグナル配列に連結し、該遺伝子構造物を細菌中で発現させ、ペリプラズム空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　ｓｐａｃｅ）または生育メジウム（ｍｅｄｉｕｍ）から抗体フラグメントＦｖを単離することを特徴とする、製造法。
（２）細菌がグラム陰性細菌である、請求項１に記載の製造法。
（３）細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項２に記載の製造法。
（４）二つのプレペプチドのための遺伝子を可調節性オペロン系のかたちで連結させることを特徴とする、請求項１、２または３のいずれか１項に記載の製造法。
（５）抗体フラグメントＦｖをペリプラズム空間から単離するために、ペリプラズムを溢出させるが細胞質をもとのままに保持するような浸透圧ショックを分離しておいた細菌に与えて、これによって得られた液相を遠心分離によって濃厚富化して、さらにこの濃縮物から抗体フラグメントＦｖを得ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
（６）適当な抗原またはハプテンを装填した吸着剤に抗体フラグメントＦｖを含む溶液を供し、該フラグメントＦｖをこの抗原またはハプテンを含む溶液にて溶出して単離することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造法。」
と訂正する。
（５４）【発明の名称】
遺伝子工学的手法による抗体の製造法
（５７）【特許請求の範囲】
　１．　抗体フラグメントＦｖの製造法であって、重鎖および軽鎖のフラグメントをコードするそれぞれの遺伝子構造物をシグナル配列、すなわち細菌細胞の細胞質膜を通してポリペプチドの輸送を促進しその後切断されるシグナル配列に連結し、該遺伝子構造物を細菌中で発現させ、ペリプラズム空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　ｓｐａｃｅ）または生育メジウム（　ｍｅｄｉｕｍ）から
抗体フラグメントＦｖ
　２．　細菌がグラム陰性細菌である、請求項１に記載の製造法。
　３．　細菌が大腸菌（　Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項２に記載の製造法。
　４．　二つのプレペプチドのための遺伝子を可調節性オペロン系のかたちで連結させることを特徴とする、請求項１、２または３のいずれか１項に記載の製造法。
　５．　
抗体フラグメントＦｖ
抗体フラグメントＦｖ
　６．　適当な抗原またはハプテンを装填した吸着剤に
抗体フラグメントＦｖ
該フラグメントＦｖ
【発明の詳細な説明】
　酵母における抗体の発現については記述があるが（Ｃ．Ｒ．Ｗｏｏｄ、Ｍ．Ａ．Ｂｏｓｓ、Ｊ．Ｈ．Ｋｅｎｔｅｎ、Ｊ．Ｅ．Ｃａｌｖｅｒｔ、Ｎ．Ａ．Ｒｏｂｅｒｔｓ　および　Ｊ．Ｓ．Ｅｍｔａｇｅ：Ｎａｔｕｒｅ　３１４，４４６（１９８５））、発現されたタンパク質のうちのごく一部が機能することが証明されているにすぎない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においては、今までのところ、抗体タンパク質は変性したかたちでしか得ることができていない（Ｍ．Ａ．Ｂｏｓｓ、Ｊ．Ｈ．Ｋｅｎｔｅｎ、Ｃ．Ｒ．Ｗｏｏｄ　およびＪ．Ｓ．Ｅｍｔａｇｅ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２、３７９１（１９８４）、Ｓ．Ｃａｂｉｌｌｙ、Ａ．Ｄ．Ｒｉｇｇｓ、Ｈ．Ｐａｎｄｅ、Ｊ．Ｅ・Ｓｈｉｖｅｌｙ、Ｗ．Ｅ．Ｈｏｌｍｅｓ、Ｍ．Ｒｅｙ、Ｌ・Ｊ・Ｐｅｒｒｙ、Ｒ．Ｗｅｔｚｅｌ　および　Ｈ．Ｌ．Ｈｅｙｎｅｋｅｒ：　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，３２７３（１９８４））。酵母または他の微生物からの活性抗体または抗体断片の精製については、開示されていなかった。今日までに、タンパク質の折りたたみについての試みによって、正しく折りたたまれた組換え抗体タンパク質のごく僅かが得られたにすぎない。さらに、所望の機能性タンパク質を不要の非機能性タンパク質から分離することは難しい。これは、結合定数、折りたたみ率、スペクトル的性質などの正確な測定、および治療や産業における使用を妨げる。とくに、再折りたたみのための確実な工程および測定方法がないことから、折りたたみ条件を最適にすることはしたがってきわめて難しい。
　完全な機能性抗体または抗体の機能性結合領域を細菌の発現系において発現させることは、今日までに開示されておらず、その実施の見通しについての評価は悲観的である（Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９、１２０２（１９８５）、Ｍ．Ａ．Ｂｏｓｓ　およびＣ．Ｒ．Ｗｏｏｄ、ｌｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　６、１２（１９８５））。
　遺伝子工学的工程が、とくに大腸菌において、完全に確立されていることから、そのような系は非常に望ましい。迅速な増殖によって大量生産が促進され、これは、経済面からきわめて重要なことである。
　ゆえに、本発明は、機能性抗体、それらの機能性フラグメントまたは抗体領域と他のタンパク質とからなる融合タンパク質を、細菌中、好ましくはグラム陰性細菌、とくに大腸菌、中で製造することに関する。本発明による製造法は、抗体分子またはフラグメントの個々の鎖をコードする遺伝子と、細胞膜を通してポリペプチド鎖を輸送し、かつ切り離し可能なシグナル配列とをそれぞれ連結させること、遺伝子構造物を発現させること、およびぺリプラスム空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　ｓｐａｃｅ）またはメジウム（ｍｅｄｉｕｍ）から機能性タンパク質を単離することからなる。本発明の好ましい態様は、以下に詳記され、特許請求の範囲に定義される通りである。
　シグナル配列を備えた個々の鎖のための遺伝子の連結は、好ましくは、共通の調節領域によって同時発現をもたらす可調節オペロン系のかたちで起きる。このようにして、個々のタンパク質鎖はほぼ化学量論的比率で一緒に発現されて、ペリプラズム空間内に輸送され、ここで結合されて機能性分子の形成がなされる。タンパク質を、公知の方法、例えば欧州特許明細書第０，００６，６９４号に記載の方法などによって、細胞質から取り出す。
　適当な調節領域としては、適当な調節可能な遺伝子調節領域、例えば、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐまたは合成配列物（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）などのいかなるものでもよい。特に好ましいものは確実に止めることがでまる調節領域である。
　集めた細胞に軽い浸透圧ショックを与えて、これによって得られた液相を限外濾過または硫安などの塩による沈澱によって濃縮することによって、タンパク質をペリプラズム空間から好ましくは単離する。
　「軽い」浸透圧ショックによって、細胞膜はそのままでペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）からの溢出が生じる。
　タンパク質濃縮物を、便宜的に透析した後、適当な抗原またはハプテンを装▲填▼した吸着剤、有利にはアフィニティーカラムにしたもの、に供する。次いで、抗体または機能性抗体フラグメントを、適当な溶出によって、有利には抗原またはハプテンとともに、得る。
　真核細胞においては、抗体は、小胞体の内腔において、おそらくはジスルフィドイソメラーゼ、プロリンシス−トランス−イソメラーゼおよび可能な他の酵素またはタンパク質との共同作用によって、形成される。細菌細胞もまた、二つの鎖をほぼ同じ化学量論的な量でつくり、二つの前駆タンパク質をぺリブラズム空間またはそれを囲むメジウムに輸送し、シグナル配列を正しく除去し、球状および可溶性領域を正しく折りたたみ、分子間のジスルフィド結合を形成し、さらに二つの鎖を合わせてヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）をつくるという能力を有することは、驚きであった。というのは、細菌細胞がこのような性質を有するまたは同じ効果をもたらす酵素を具備していることは有り得ないとみなされるからである。このように、グラム陰性細菌の場合には、細菌ぺリプラズムはこの点で機能的には真核細胞小胞体の内腔と同等であることが驚いたことに明らかになった。
　本発明による方法は、次のような多くの利点を有する。
　既述したように簡単で低コストの大規模の細菌発酵が可能であるということの他に、機能性タンパク質の直接形成がある。これは、融合タンパク質の切断、それに続く目的タンパク質またはタンパク質フラグメントの単離、その酸化またはインビトロ再折りたたみの諸工程が避けられることを意味する。
　また、本発明の方法によると、細胞性プロテアーゼに関する問題も見出されなかった。つまり、通常は細菌細胞中では、これら細胞性プロテアーゼのためにタンパク質は融合タンパク質のかたちで、とくに不溶性の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）として発現され、そのために上記の複雑な諸工程が必要となることが知られている。これに対して、本発明の製造法によると、均質物の単離およひ精製は迅速で簡単である。
　このように、本発明によると、抗体、それらの機能性フラグメントならびに挿入、除去および／またはアミノ酸の交換によって天然型抗体とは異なる修飾抗体、の調製が容易である。したがって、例えば、不都合な折りたたみを抑制するために、システインの除去または他のアミノ酸による置換などを行うことができる。全く同様にして、ネズミの抗体をヒトの抗体に変換したり、他の突然変異を導入することも可能である。このように、可能な薬理学的および産業的応用の他に、抗体の構造や機能の研究および酵素的触媒の原理の研究が容易になる（Ｖ．ＲａｓｏおよびＢ．Ｄ．Ｓｔｏｌｌａｒ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４、５８４（１９７５）、Ｖ．Ｒａｓｏ　およびＢ．Ｄ．Ｓｔｏｌｌａｒ：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４、５９１（１９７５）、Ａ．Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ、Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ　および　Ｒ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４、１５６６（１９８６）、Ｓ．Ｊ．Ｐｏｌｌａｃｋ、Ｊ．Ｗ．Ｊａｃｏｂｓ　および　Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４、１５７０（１９８６）、Ｊ．Ｊａｃｏｂｓ、Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｓ、Ｒ．Ｓｕｇａｓａｗａｒａ　および　Ｍ．Ｐｏｗｅｌｌ：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９、２１７４（１９８７））。
　さらに、本発明は、試験系（分析）の適用を機能性抗体を形成した細菌細胞に対して直接的に行うことができ、その結果、可能な突然変異抗体の迅速な研究を可能にする。
　さらに、個々の、または二、三個の、アミノ酸の代替よる抗体分子の上記の変換の他に、他の遺伝子領域を抗体遺伝子に挿入すること、または重要でない遺伝子領域を部分的に交換することも可能である。この方法でマーカー酵素（Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｇ．Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ　およびＲ．Ｏ．Ｆｏｘ：Ｎａｔｕｒｅ　３１２、６０４（１９８４））、トキシン（Ｇ．Ｍｏｅｌｌｅｒ（編集）：「Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃａｒｒｉｅｒｓ　ｏｆ　ｄｒｕｇｓ　ａｎｄ　ｔｏｘｉｎｓ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｔｈｅｒａｐｙ」、ｌｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ・６２、Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（１９８２））または他のクラスの免疫グロプリン領域（Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｇ．Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｅ．Ｂ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｓ．Ｓ．Ｊｏｕｈａｌ、Ｊ．Ｇ．ＦｌａｎａｇａｎおよびＴ．Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓ：　Ｎａｔｕｒｅ　３１４、２６８（１９８５））または他の種の免疫グロプリン領域（Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ、Ｐ．Ｈ．Ｄｅａｒ、Ｊ．Ｆｏｏｔｅ、Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　および　Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ：　Ｎａｔｕｒｅ　３２１、５２２（１９８６））を抗体分子に連結させることが可能である。
　本発明による製造法は、フォスフォリルコリン結合性抗体骨髄腫タンパク質ＭｃＰＣ６０３の可変領域を例にとって以下に説明する通りである。このマウス免疫グロプリンＡの三次構造は公知である（Ｄ．Ｍ．Ｓｅｇａｌ、Ｅ．Ａ．Ｐａｄｌａｎ、Ｇ．Ｈ．Ｃｏｈｅｎ、Ｓ．Ｒｕｄｉｋｏｆｆ、Ｍ．Ｐｏｔｔｅｒ　および　Ｄ．Ｒ．Ｄａｖｉｅｓ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１、４２９８（１９７４））。可変軽鎖ＶＬおよび可変重鎖ＶＨの合成遺伝子を用いた。このような合成遺伝子は独国特許公開第３，７１５，０３３号明細書および公開された欧州特許出願第０，２９０，００５号明細書および公開されたオーストラリア特許出願第１５６３１／８８号明細書（その表１および２）に提示されている。そのような合成遺伝子のうちのとくに適切な遺伝子を表１に例示する。これには、完全な発現プラスミドのＤＮＡ配列が示されており、二つの鎖のための遺伝子がアミノ酸を示すことによって強調して表わされている。これらのＤＮＡ配列の構築においては、大腸菌によって利用されるだけのコードンを除いた。さらに、それぞれ，唯一の制限酵素切断部位を取り入れ、さらにＲＮＡの二次構造を考慮した。
　モデルとした機能性抗体フラグメントにおいて、それぞれの領域は分子内ジスルフィドブリッジ（ＶＬ内のＣｙｓ２３からＣｙｓ９４までおよびＶＨ内のＣｙｓ２２からＣｙｓ９８まで）を有する。
　鎖の間にはジスルフィドブリッジはなく、また遊離のシステインも存在しない。
　用いた発現ベクター、ｐＡＳＫ２２、は模式的に次に示す通りである。
　この中で、ＶＬおよびＶＨ領域の合成遺伝子は、一方を外膜タンパク質Ａ（ｏｍｐＡ）の細菌シグナル配列の遺伝子断片に、他方を同じ断片のアルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）に連結されている。二つの前駆タンパク質の遺伝子は、ｌａｃプロモーターの下流の合成オぺロン様構造内に位置している。これによって、両遺伝子の同時誘導、同時発現および同時分泌が確実になる。
　遺伝子発現の誘導の後、細胞を集めて軽い浸透圧ショックを与える。このようにして得られたぺリプラズムタンパク質を含む液相を限外濾過で濃縮して、透析して、アフィニティーリーガンドとしてフォスフォリルコリン誘導体（Ｂ．Ｃｈｅｓｅｂｒｏおよび　Ｈ．Ｍｅｔｚｇｅｒ：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１、７６６（１９７２））を含むアフィニティーカラムに直接に供する。フォスフォリルコリンによる溶出の結果、均質なＦｖフラグメントが得られた。このフラグメントは、ゲル電気泳動的には均質である。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルから、精製されたＦｖフラグメントの二つの鎖は、分子比で１：１で存在し、成熟タンパク質の期待された分子量（ＶＨ：１３，６００ダルトン、ＶＬ：１２，４００ダルトン）を有することが推定された。二つのシグナル配列が正しく除去されたことを証明するために、両鎖の６個のＮ−末端アミノ酸の配列決定を行った。その結果、両鎖は、成熟タンパク質の正しいＮ−末端配列をそれぞれ有していることが明らかになった。このように、両方の異種構造のプレタンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、細菌シグナルペプチダーゼによって正しく切断された。不正確なプロセシングやＮ−末端崩壊反応が起きたという明らかな証明は認められない。
　ＭｃＰＣ６０３の組換えＦｖフラグメントのアフィニティーコンスタントを平衡透析によって測定した。これに用いた条件は、マウス腹水から単離した天然抗体ＭｃＰＣ６０３のアフィニティーコンスタントの測定において用いられたものと同じであった。Ｆｖフラグメントについて得られた１．２１±０．０６×１０５Ｍ−１は、実験精度の範囲内で、天然の抗体について報告されている値の１・６±０．４×１０５Ｍ−１と一致している。
Ｓｃａｔｃｈａｒｄ結合プロット（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１、６６０（１９４９））は線状であって、外挿法（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ）によって約１ｍｏｌのハプテンがｍｏｌ当りのＦｖフラグメントと結合していることが不される。このことから、Ｆｖフラグメント当り唯一のタイプの結合部位しか存在しないこと、および単離された夕ンパク質には非活性の成分は存在しないことが確認される。
　このように、驚いたことに、完全に機能的で安定なタンパク質として、抗体ＭｃＰＣ６０３のＦｖフラグメントを大腸菌において調製することが可能であることが明らかになった。これは、細菌細胞のぺリプラズムヘの輸送が真核細胞の小胞体の内腔への輸送と機能的に対等であることを示している。この対等性については、今までに開示されておらず、示唆すらもない。というのは、これまでにもっともよく特徴づけられており、かつぺリプラズムにおいて可溶なヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ）のタンパク質と定義することができる細菌タンパク質−大腸ぺニシリンアシラーゼーは、タンパク質分解的プロセシングによって単鎖前駆体からぺリプラズムにおいて産生される（Ｇ．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ、Ｄ．Ｓｉｚｍａｎｎ、Ｈ．Ｈａｎｇ、Ｐ．Ｂｕｃｋｅｌ　および　Ａ．Ｂｏｅｃｋ：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４、５７１３（１９８６））。さらに、今日の知識では、真核細胞において折りたたみに関与すると思われる酵素またはタンパク質を細菌は有しないことが既ここ指摘されている。
　また、ＭｃＰＣ６０３のＦｖフラグメントが、もとのままの抗体ＭｃＰＣ６０３と実質的に同じフォスフォリルコリンとのアフィニティーコンスタントを有していることも驚くべきことである。
Ｆｖフラグメントの機能性については文献的に論争があることから（Ｊ．Ｓｅｎ　および　Ｓ．Ｂｅｙｃｈｏｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　１、２５６（１９８６））、この知見は予期外のものである。このことから、機能性は定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｄｏｍａｉｎｓ）の修飾または完全な欠失によっても保持できることが明らかである。
　Ｆｖフラグメントの調製に用いられたこれまでの唯一の方法、すなわち抗体のタンパク質分解、とは対照的に、本発明の方法においては、非機能性で、間違って折りたたまれた、間違って再結合されたまたは化学的に修飾されたタンパク質に関して問題はない。さらに、抗原またはハプテンを装▲填▼した吸着剤を用いる好ましい単離工程は、公知の諸工程によって得られたＦｖフラグメントの精製にも適している。というのは、そのような不純物は結合されないかまたは溶出されないかのいずれかであるからである。
例１：プラスミドｐＡＳＫ２２の調製：
　発現プラスミドｐＡＳＫ２２を、ｐＵＣ１２の大きい方のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｊ．Ｖｉｅｉｒａ　および　Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ：Ｇｅｎｅ　３３、１０３（１９８５））から、ベクターｐＩＮＩＩＩ−ＯｍｐＡ１のフラグメント（Ｙ．ＭａＳｕｉ、Ｊ．Ｃｏｌｅｍａｎ　および　Ｍ．ｌｎｏｕｙｅ：「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｍ．ｌｎｏｕｙｅ　編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８３）から、およびｐＨＩ６１（Ｈ．ｌｎｏｕｙｅ、Ｗ．Ｂａｒｎｅｓおよび．Ｊ．　Ｂｅｃｋｗｉｔｈ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４９、４３４（１９８２））から、さらに種々の合成ＤＮＡフラグメントから、公知の方法（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ　およびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　１９８２）を用いていくつかの工程によって構築する。得られるベクターｐＡＳＫ２２の完全なＤＮＡ配列が表１に示ざれている。
　ライゲーション混合液を用いて、コンピテントにした大腸菌細胞を形質転換させる。後者を、アンピシリン耐性を指標にして選択する。所望の遺伝子構造を有するプラスミドを、制限酵素分析および重要な接合部位の配列決定によって特徴づけする。
例２：Ｆｖフラグメントの調製：
　ｐＡＳＫ２２で形質転換させた大腸菌Ｗ３１１０株の培養物を１００ｍｇ／リットルのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養して、ＯＤ５５０を０．５にする。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように加えて、発現を誘導する。４５分の後、４，０００×ｇの遠心分離（１０分問、４℃）によって細胞を集める。細胞ペレットを原培養液１リットル当りｌ０ｍｌのＴＥＳ緩衝液（０．２Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、．０．５Ｍシュークロース）に再懸濁させて細胞の分画を行う。水で１：４に希釈して２ｍＮのフォスフォリルコリンを含むＴＥＳ緩衝液を原培養液１リットル当り１５ｍｌの濃度になるように加えることによって、細胞に軽い浸透圧ショックを与える。懸濁液を氷上で３０分間インキュベーションした後に、５，０００×ｇで１０分間遠心分離して、上清液を今度は４８，０００×ｇで１５分間遠心分離する。全可溶性ぺリプラズムタンパク質を含む得られた上清液を、限外濾過（ＲアミコンＹＭ５膜）によって原培養液１リットル当り約２．５ｍｌの容量にまで濃縮して、ＢＢＳ緩衝液（０．２Ｍホウ酸／ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、０．１６Ｍ　ＮａＣｌ）に対して透析する。この濃縮溶液を、フォスフォリルコリン誘導体を装▲填▼したアフィニティーカラム（Ｂ．Ｃｈｅｓｅｂｒｏ　およびＨ．Ｍｅｔｚｇｅｒ：前出）（ベッド容積１ｍｌ当り１〜４ｍｌの溶液）に供する。これをＢＢＳ緩衝液で洗浄して、純粋Ｆｖフラグメントを１ｍＭフォスフォリルコリンのＢＢＳ緩衝液溶液で溶出する。
例３：平衡透析：
　膜の両側がそれぞれ１００μｌの容量の透析チャンバーにおいて、一方に５０μｌの精製したＦｖフラグメントのＢＢＳ緩衝液溶液を入れ、他方に５０μｌのフォスフォリル（メチル−１４Ｃ）コリン（５０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）のＢＢＳ緩衝液溶液を入れた。ＯＤ２０５の値６．８５から決定されたＦｖフラグメントの濃度は、０．２２ｍｇ／ｍｌであった（Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８２、ｐ．２４１）。室温で２２時間おいた後に、平衡に達した。各溶液の２０μｌの試料を、シンチレーションカウンター（べックマンＬＳ１８０１）で測定して、データをＳｃａｔｃｈａｒｄプロッティング（前出）した。その結果得られた線の勾配から引き出されたアフィニティーコンスタントＫａは、１．２１±０．０６×１０５Ｍ−１である。