(57)【要約】本発明は、ミエロペルオキシダーゼ活性をアッセイするための方法を提供する。このアッセイにおいて、ミエロペルオキシダーゼを含むサンプルまたはミエロペルオキシダーゼを含むことが推定されるサンプルは、セリン、過酸化水素、およびハライド含む基質に接触される。このサンプル中にミエロペルオキシダーゼが存在する場合、セリンは、グリコールアルデヒドに変換され、このグリコールアルデヒドは、グリコールアルデヒド変換酵素（例えば、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ）（１．２．１．２１）によってさらにグリコレートに変換される。次いでこの方法は、グリコレートとグリオキシレートとの間の循環反応系を利用して、このミエロペルオキシダーゼ活性に対応する検出可能なシグナルをもたらす。同じ原理に基づいてミエロペルオキシダーゼをアッセイするためのキットもまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のミエロペルオキシダーゼをアッセイするための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）セリン、過酸化水素、および塩素を、ミエロペルオキシダーゼを含むことが推定されるサンプルと接触させてグリコールアルデヒドを生成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において生成される該グリコールアルデヒドを、グリコールアルデヒド変換酵素および酸化型である第１の電子受容体の存在下で、グリコレートに変換する工程；
（ｃ）工程（ｂ）から得た該グリコレートを、酸化型の第２の電子受容体、およびグリコレート変換酵素の存在下で、グリオキシレートに変換する工程であって、それによって、還元型の該第２の電子受容体が生成され；該グリオキシレートが、還元型である第３の電子受容体およびグリオキシレート変換酵素の存在下で、グリコレートへ変換されて戻ることで、循環反応系を形成し、それによって、酸化型の該第３の電子受容体が生成され；ここで該第２の電子受容体と該第３の電子受容体とが異なる、工程；ならびに
（ｄ）該循環反応系における、該還元型の第２の電子受容体もしくは該酸化型の第２の電子受容体または該還元型の第３の電子受容体もしくは該酸化型の第３の電子受容体の濃度変化を評価する工程であって、それによって、該サンプル中の該ミエロペルオキシダーゼの存在、非存在および／または量が決定される、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第１の電子受容体と前記第２の電子受容体とは、同じものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ミエロペルオキシダーゼを含むことが推定される前記サンプルは、セリン、過酸化水素、塩素、前記グリコールアルデヒド変換酵素、および前記酸化型である第１の電子受容体に接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ミエロペルオキシダーゼを含むことが推定される前記サンプルは、セリン、過酸化水素、塩素、前記グリコールアルデヒド変換酵素、前記酸化型である第１の電子受容体、前記グリコレート変換酵素、および前記酸化型である第２の電子受容体に接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）の前記グリコールアルデヒド変換酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、そして前記第１の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）の前記循環反応系において、前記グリコレート変換酵素と前記グリオキシレート変換酵素とが異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記グリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼまたはグリコレートオキシダーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記グリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼまたはＤ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記グリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼであり、そして前記グリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸化型の第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択され、そして前記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、アセチル−ＮＡＤＰＨ、（Ｒ）−ラクテート、２，６−ジクロロインドフェノール、およびフェナジンメトサルフェートからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記グリコレート変換酵素は、グリコレートオキシダーゼであり、そして前記グリオキシレート変換酵素は、Ｄ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記酸化型の第２の電子受容体は、Ｏ２であり、そして前記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、アセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）の前記循環反応系において、前記グリコレート変換酵素と前記グリオキシレート変換酵素とは同じものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記グリコレート変換酵素および前記グリオキシレート変換酵素は両方とも、グリコレートレダクターゼまたはグリオキシレートレダクターゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酸化型の第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択され、そして前記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記濃度変化は、測光的な方法によって評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、該方法が、工程（ｄ）の後に、前記酸化型の第２の電子受容体もしくは前記還元型の第２の電子受容体、または前記還元型の第３の電子受容体もしくは前記酸化型の第３の電子受容体と、色を生じる因子とを結合する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
前記サンプルは、生物学的流体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的流体は、血液、血清、血漿および尿からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、該方法が、疾患の予後および／または診断のために使用される、方法。
【請求項２１】
前記疾患は、アテローム硬化症、脳卒中、多発性硬化症、アルツハイマー病、肺癌、白血病、および感染からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ミエロペルオキシダーゼをアッセイするためのキットであって、該キットは、セリン、過酸化水素、塩素、グリコールアルデヒドからグリコレートへの変換を触媒するグリコールアルデヒド変換酵素および酸化型である第１の電子受容体、グリコレートからグリオキシレートへの変換を触媒するグリコレート変換酵素および酸化型である第２の電子受容体、ならびにグリオキシレートからグリコレートへの変換を触媒するグリオキシレート変換酵素および還元型である第３の電子受容体を備え、ここで該第２の電子受容体と該第３の電子受容体とが異なる、キット。
【請求項２３】
前記グリコールアルデヒド変換酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、そして前記第１の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記グリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼであり、そして前記酸化型の第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択され、前記グリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼであり、そして前記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨ（Ｒ）−ラクテート、２，６−ジクロロインドフェノール、およびフェナジンメトサルフェートからなる群より選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
前記グリコレート変換酵素は、グリコレートオキシダーゼであり、そして前記酸化型の第２の電子受容体は、Ｏ２であり、そして前記グリオキシレート変換酵素は、Ｄ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼであり、そして前記還元型の第２の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２６】
前記グリコレート変換酵素および前記グリオキシレート変換酵素は両方とも、グリコレートレダクターゼまたはグリオキシレートレダクターゼであり、そして前記酸化型の第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択され、そして前記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２７】
請求項２２に記載のキットであって、該キットが、疾患の予後および／または診断のための使用を示す説明書をさらに備える、キット。
【請求項２８】
前記疾患は、アテローム硬化症、脳卒中、多発性硬化症、アルツハイマー病、肺癌、白血病、および感染からなる群より選択される、請求項２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、ミエロペルオキシダーゼの検出の分野に関する。特に、本発明は、サンプル中のミエロペルオキシダーゼをアッセイするための方法およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ；ＥＣ  １．１１．１．７）は、四量体であり高度にグリコシル化された約１５０ｋＤａの塩基性ヘムタンパク質である。ミエロペルオキシダーゼは、２つの同一のジスルフィド結合で連結したプロトマーから構成され、このプロトマーの各々は、５９〜６４ｋＤａの重いサブユニットおよび１４ｋＤａの軽いサブユニットを含むプロトポルフィリンを保有する。特許文献１；非特許文献１。インビボにおいて、ＭＰＯは、二電子過酸化工程を経て、Ｃｌ−を微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）を破壊し得る強力な酸化剤である次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）に変換する。非特許文献２。
【０００３】
ＭＰＯは、侵入する微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に対する宿主の防御において重要な役割を果たす。ＭＰＯは、好中球および単球において豊富であり、これらの細胞の乾燥重量の、それぞれ、５％および１％〜２％の割合を占める。非特許文献２；特許文献１。
【０００４】
ＭＰＯは、広範囲の疾患にかかわる。ＨＯＣｌの生成を介した微生物に対する防御への関与に加えて、ＭＰＯは、遊走する好中球が活性酵素を放出し得る炎症の段階において放出される。非特許文献１。ＭＰＯレベルの増加は、感染において報告されており、そして抗ＭＰＯ抗体は、全身性脈管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｔｅ）で蓄積する。ＭＰＯはまた、非感染性疾患（例えば、アテローム硬化症、癌および前骨髄球性白血病、アルツハイマー病および多発性硬化症を含む神経変性疾患）に関与する。非特許文献１。
【０００５】
ＭＰＯのｍＲＮＡは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対する指標として臨床化学において広く使用される。非特許文献３。ＭＰＯ  Ｇ−４６３Ａ多形性のより高い発現の遺伝子型はまた、ＡＭＬに関連して報告されている。非特許文献４。Ｇ／Ａ転位によって特徴付けられるＭＰＯ  Ｇ−４６３Ａ多形性は、ホルモン応答のエレメントを含むプロモーター領域のＡｌｕ配列によって定められる。Ｇ／Ｇ遺伝子型は、白血病患者の細胞におけるＭＰＯ発現およびタンパク質レベルの増加に関連している。非特許文献４。Ａ対立遺伝子に関してホモ接合の被験体は、肺癌について減少した危険を有することがまた、示されている。非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８。しかし、最近の研究は、このＡ対立遺伝子が、高齢者のサブセットに共通して肺癌の危険の増加に関連することを示す。非特許文献９。
【０００６】
ＭＰＯは、多発性硬化症（ＭＳ）を有する患者の脳におけるミクログリアに存在し、そしてアルツハイマー病（ＡＤ）の症例からの大脳皮質の老人斑周囲のミクログリア細胞に存在する。非特許文献１０；非特許文献１１。ＭＰＯレベルの交互変化はまた、アテローム硬化症および脳梗塞に関連する。ＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／Ｃｌ−系は、アテローム硬化型の病変の開始に関係する有力な機構の１つであることが報告されている。非特許文献１２。非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５。アテローム硬化症の主要な結果の１つは、脳梗塞であり、そしてＭＰＯ活性の測定は、脳実質の好中球の浸潤の、広く使用される指標である。非特許文献１６。増加したＭＰＯ活性は、虚血性の脳梗塞後の患者の血清において観察されている。非特許文献１７。ＭＰＯの測定はまた、心血管の危険を予測するために使用されている。非特許文献１８；特許文献１。
【０００７】
広い範囲の疾患に関わるＭＰＯ、および臨床的指標および治療上の標的としてのＭＰＯの使用の可能性は、ＭＰＯレベルおよび計り知れない活性を正確に測定するためのアッセイをもたらす。数種のアッセイ方法が、報告されている。特許文献２、特許文献３。しかし、ＭＰＯをアッセイするための、確実かつ感度の高い方法に対する必要性が、なお存在する。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１６４６６２号明細書
【特許文献２】国際公開第０２／０９０５７５号パンフレット
【特許文献３】米国特許第６，０２２，６９９号明細書
【非特許文献１】Ｈｏｙら、「Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．」、２００２年、第４０巻、ｐ．２−８
【非特許文献２】Ｍａｒｑｕｅｚら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、１９９０年、第２６５巻、ｐ．５６６６−５６７０
【非特許文献３】Ｂｅｎｎｅｔｔら、「Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．」、１９７６年、第３３巻、ｐ．４５１−８
【非特許文献４】Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、「Ｂｌｏｏｄ」、１９９７年、第９０巻、ｐ．２７３０−７
【非特許文献５】Ｌｏｎｄｏｎら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」、１９９７年、第５７巻、ｐ．５００１−３
【非特許文献６】Ｌｅ  Ｍａｒｃｈａｎｄら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｒｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．」、２０００年、第９巻、ｐ．１８１−４
【非特許文献７】Ｃａｓｃｏｒｂら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」、２０００年、第６０巻、ｐ．６４４−９
【非特許文献８】Ｓｃｈａｂａｔｈら、「Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ」、２０００年、第２１巻、ｐ．１１６３−６
【非特許文献９】Ｍｉｓｒａら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．」、２００１年、第１６４巻、ｐ．１６１−７
【非特許文献１０】Ｊｏｌｉｖａｌｔら、「Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．」、１９９６年、第２１０巻、ｐ．６１−４
【非特許文献１１】Ｎａｇｒａら、「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．」、１９９７年、第７８巻、ｐ．９７−１０７
【非特許文献１２】Ｄａｕｔｈｅｒｔｙら、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．」、１９９４年、第９４巻、ｐ．４３７−４４
【非特許文献１３】Ｈｅｉｎｅｃｋｅら、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｌｉｐ．」、１９９７年、第８巻、ｐ．２６８−７４
【非特許文献１４】Ｈａｚｅｌｌら、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．」、１９９６年、第９７巻、ｐ．１５３５−４４
【非特許文献１５】Ｍａｌｌｅら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、２０００年、第２６７巻、ｐ．４４９５−５０３
【非特許文献１６】Ｂａｒｏｎｅら、「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅ．Ｒｅｓ．」、１９９１年、第２９巻、ｐ．３３６−４５
【非特許文献１７】Ｒｅら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．」、１９９７年、第４巻、ｐ．５−９
【非特許文献１８】Ｂｒｅｎｎａｎら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、２００３年、第３４９巻、ｐ．１５９５−１６０１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、サンプル中のミエロペルオキシダーゼをアッセイするための方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）セリン、過酸化水素、および塩素を、ミエロペルオキシダーゼを含むことが推定されるサンプルと接触させてグリコールアルデヒドを生成する工程；（ｂ）工程（ａ）において生成される上記グリコールアルデヒドを、グリコールアルデヒド変換酵素および酸化型である第１の電子受容体の存在下で、グリコレートに変換する工程；（ｃ）工程（ｂ）から得た上記グリコレートを、酸化型の第２の電子受容体、およびグリコレート変換酵素の存在下で、グリオキシレートに変換する工程であって、それによって、還元型の上記第２の電子受容体が生成され；上記グリオキシレートが、還元型である第３の電子受容体およびグリオキシレート変換酵素の存在下で、グリコレートへ変換されて戻ることで、循環反応系を形成するし、それによって、酸化型の上記第３の電子受容体が生成され；ここで上記第２の電子受容体と上記第３の電子受容体とが異なる、工程；ならびに（ｄ）上記循環反応系における、上記還元型の第２の電子受容体もしくは上記酸化型の第２の電子受容体または上記還元型の第３の電子受容体もしくは上記酸化型の第３の電子受容体の濃度変化を評価することによって、上記サンプル中のミエロペルオキシダーゼの存在、非存在および／または量が決定される、工程。
【０００９】
いくつかの実施形態において、工程（ｂ）における上記第１の電子受容体は、工程（ｃ）における上記第２の電子受容体および／または上記第３の電子受容体と異なる。他の実施形態において、工程（ｂ）における上記第１の電子受容体と（ｃ）における上記第２の電子受容体とは、同じものである。さらに他の実施形態において、工程（ｂ）における上記第１の電子受容体と工程（ｃ）における上記第３の電子受容体とは、同じものである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ミエロペルオキシダーゼを含むことが推定される上記サンプルは、セリン、過酸化水素、塩素、上記グリコールアルデヒド変換酵素、および上記酸化型である第１の電子受容体に接触される。他の実施形態において、ミエロペルオキシダーゼを含むことが推定される上記サンプルは、セリン、過酸化水素、塩素、上記グリコールアルデヒド変換酵素、上記酸化型である第１の電子受容体、上記グリコレート変換酵素、および上記酸化型である第２の電子受容体に接触される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、工程（ｂ）の上記グリコールアルデヒド変換酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、そして上記第１の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、工程（ｃ）の上記循環反応系では、上記グリコレート変換酵素と上記グリオキシレート変換酵素とが異なる。いくつかの実施形態において、上記グリコレート変換酵素は、上記第３の電子受容体と反応しないか、または上記第２の電子受容体に対する親和性より低い、上記第３の電子受容体に対する親和性を有し、そして上記グリオキシレート変換酵素は、上記第２の電子受容体と反応しないか、または上記第３の電子受容体に対する親和性より低い、上記第２の電子受容体に対する親和性を有する。いくつかの実施形態において、上記グリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼまたはグリコレートオキシダーゼである。いくつかの実施形態において、上記グリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼまたはＤ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、上記グリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼであり、そして上記グリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼである。これらの実施形態について、上記酸化型の第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択され得、そして上記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、アセチル−ＮＡＤＰＨ、（Ｒ）−ラクテート、２，６−ジクロロインドフェノール、およびフェナジンメトサルフェートからなる群より選択され得る。
【００１４】
他の実施形態において、上記グリコレート変換酵素は、グリコレートオキシダーゼであり、そして上記グリオキシレート変換酵素は、Ｄ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼである。これらの実施形態ついて、上記酸化型の第２の電子受容体Ｏ２であり得、そして上記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、アセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択され得る。
【００１５】
いくつかの実施形態において、工程（ｃ）の上記循環反応系では、前記グリコレート変換酵素と前記グリオキシレート変換酵素とは同じものである。例えば、上記グリコレート変換酵素および上記グリオキシレート変換酵素は両方とも、グリコレートレダクターゼまたはグリオキシレートレダクターゼである。上記酸化型の第２の電子受容体ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択され得、そして上記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される。
【００１６】
上記循環反応系における、上記還元型の第２の電子受容体もしくは上記酸化型の第２の電子受容体または上記還元型の第３の電子受容体もしくは上記酸化型の第３の電子受容体の濃度変化は、測光的な方法によって評価され得る。
【００１７】
本発明の方法は、工程（ｄ）の後に、上記酸化型の第２の電子受容体もしくは上記還元型の第２の電子受容体、または上記還元型の第３の電子受容体もしくは上記酸化型の第３の電子受容体と、色を生じる因子とを結合する工程をさらに包含し得、上記酸化型の第２の電子受容体もしくは上記還元型の第２の電子受容体、または上記還元型の第３の電子受容体もしくは上記酸化型の第３の電子受容体は、比色定量法によって評価される。
【００１８】
本発明の方法によってアッセイされ得るサンプルは、生物学的流体を含む。上記生物学的流体は、血液、血清、血漿または尿であり得る。
【００１９】
本発明の方法は、疾患の予後および／または診断のために使用され得る。このような疾患の例は、アテローム硬化症、脳卒中、多発性硬化症、アルツハイマー病、肺癌、白血病、および感染である。
【００２０】
本発明はまた、ミエロペルオキシダーゼをアッセイするためのキットを提供し、上記キットは、セリン、過酸化水素、塩素、グリコールアルデヒドからグリコレートへの変換を触媒するグリコールアルデヒド変換酵素および酸化型である第１の電子受容体、グリコレートからグリオキシレートへの変換を触媒するグリコレート変換酵素および酸化型である第２の電子受容体、ならびにグリオキシレートからグリコレートへの変換を触媒するグリオキシレート変換酵素および還元型である第３の電子受容体を備え、ここで上記第２の電子受容体と上記第３の電子受容体とが異なる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、工程（ｂ）における上記第１の電子受容体は、工程（ｃ）における上記第２の電子受容体および／または上記第３の電子受容体と異なる。他の実施形態において、工程（ｂ）における上記第１の電子受容体と（ｃ）における上記第２の電子受容体とは同じものである。さらに他の実施形態において、工程（ｂ）における上記第１の電子受容体と工程（ｃ）における上記第３の電子受容体とは同じものである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、上記グリコールアルデヒド変換酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、そして上記第１の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、工程（ｃ）の上記循環反応系では、上記グリコレート変換酵素と上記グリオキシレート変換酵素とが異なる。いくつかの実施形態において、上記グリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼであり、そして上記酸化型の第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択され；そして上記グリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼであり、そして上記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨ（Ｒ）−ラクテート、２，６−ジクロロインドフェノール、およびフェナジンメトサルフェートからなる群より選択される。
【００２４】
他の実施形態において、上記グリコレート変換酵素は、グリコレートオキシダーゼであり、そして上記酸化型の第２の電子受容体は、Ｏ２であり、そして上記グリオキシレート変換酵素は、Ｄ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼであり、そして上記還元型の第２の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、工程（ｃ）の上記循環反応系では、上記グリコレート変換酵素と上記グリオキシレート変換酵素とは同じものである。いくつかの実施形態において、上記グリコレート変換酵素および上記グリオキシレート変換酵素は両方とも、グリコレートレダクターゼまたはグリオキシレートレダクターゼであり、そして上記酸化型の第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択され、そして上記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される。
【００２６】
本発明キットは、本明細書中に記載される方法のいずれかを実施するための説明書、ならびに／または疾患の予後および／もしくは診断のための使用を示す説明書を、さらに備え得、上記疾患としては、アテローム硬化症、脳卒中、多発性硬化症、アルツハイマー病、肺癌、白血病、および感染が挙げられるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ミエロペルオキシダーゼ活性をアッセイするための方法を提供する。このアッセイにおいて、ミエロペルオキシダーゼを含むサンプルまたはミエロペルオキシダーゼを含むことが推定されるサンプルは、セリン、過酸化水素、およびハライド含む基質に接触される。このサンプル中にミエロペルオキシダーゼが存在する場合、セリンは、グリコールアルデヒドに変換され、このグリコールアルデヒドは、グリコールアルデヒド（ｇｌｙｃｏａｌｄｅｈｙｄｅ）変換酵素によってさらにグリコレートに変換される。次いでこの方法は、グリコレートとグリオキシレートとの間の循環反応系を利用して、このミエロペルオキシダーゼ活性に対応する検出可能なシグナルをもたらす。
【００２８】
開示の明瞭性のため、そして限定を目的とせず、本発明の詳細な説明は、以下の節に分けられる。
【００２９】
（Ａ．定義）
ほかに定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。全ての特許、出願、公開された出願および本明細書中で言及される他の刊行物は、その全体が参考として援用される。この節に示される定義が、本明細書中に参考として援用される特許、出願、公開された出願および他の刊行物に示される定義と反対であるか、あるいは矛盾する場合、この節に示される定義が、参考として援用される定義より優先する。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「ミエロペルオキシダーゼ」（ＥＣ  １．１１．１．７）とは、ドナーおよびＨ２Ｏ２からの、酸化されたドナーおよびＨ２Ｏの形成を触媒する酵素をいう。例えば、ミエロペルオキシダーゼは、Ｃｌ−およびＨ２Ｏ２からの、ＨＯＣｌおよびＨ２Ｏの形成を触媒する。これは、ミエロペルオキシダーゼの活性を実質的に変えない、ミエロペルオキシダーゼの誘導体、改変体、およびアナログを包含することを意図する。ミエロペルオキシダーゼは、任意の供給源（例えば、ヒト、マウス、ウシ、ラット、ショウジョウバエなど）から得られ得る。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「グリコールアルデヒド（ｇｌｙｃｏａｌｄｅｈｙｄｅ）変換酵素」とは、酸化型である電子受容体の存在下でグリコールアルデヒド（ｇｌｙｃｏａｌｄｅｈｙｄｅ）からのグリコレートの形成を触媒する酵素である。これは、グリコールアルデヒド変換酵素の活性を実質的に変えない、グリコールアルデヒド（ｇｌｙｃｏｌａｌｄｅｈｙｄｅ）変換酵素の誘導体、改変体、およびアナログを包含することを意図する。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「グリコレート変換酵素」とは、酸化型である電子受容体の存在下でグリコレートからのグリオキシレートの形成を触媒する酵素をいう。これは、グリコレート変換酵素の活性を実質的に変えない、グリコレート変換酵素の誘導体、改変体、およびアナログを包含することを意図する。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「グリオキシレート変換酵素」とは、還元型である電子受容体の存在下でグリオキシレートからのグリコレートの形成を触媒する酵素をいう。これは、グリオキシレート変換酵素の活性を実質的に変えない、グリオキシレート変換酵素の誘導体、改変体、およびアナログを包含することを意図する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「評価する」は、その反応系に存在する分析物の量または濃度についての絶対値を得る意味、また、その反応系に存在する分析物のレベルを示す指数、比、％、視覚的（ｖｉｓｕａｌ）値または他の値を得る意味での、定量的測定および定性的測定を含むことを意図する。評価は、直接的または間接的であり得、そして実際に検出される化学種は、当然、分析物それ自体である必要はないが、例えば、その誘導体またはいくつかのさらなる物質であり得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「サンプル」とは、分析物のアッセイが望まれる分析物を含み得るものをいう。そのサンプルは、生物学的サンプル（例えば、生物学的流体または生物学的組織）であり得る。生物学的流体の例としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、脳脊髄液、涙液、粘液、羊水などが挙げられる。生物学的組織は、細胞の凝集体であり、通常では、ヒトの構造、動物の構造、植物の構造、細菌の構造、真菌の構造またはウイルスの構造の構造材料の１つを形成する細胞間質と一緒になった特定の種類の凝集体である。生物学的組織の例としてはまた、器官、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞が挙げられる。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「血清」とは、循環する血液において血漿と区別される線維素凝塊および血球の除去後に得られる血液の流体部分をいう。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「血漿」とは、凝固後に得られる血清と区別される、血液の非細胞部分である流体をいう。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「流体」とは、流れ得る任意の組成物をいう。したがって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他のこのような組成物の形態である組成物を包含する。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「疾患または障害」とは、例えば、感染または遺伝的欠陥から生じ、そして識別可能な症状によって特徴付けられる、器官における病理学的状態をいう。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「接触させる」は、２つ以上の成分を１つにすることを意味する。「接触させる」は、流体混合物または半流動体混合物中の全成分を混合することによって達成され得る。「接触させる」はまた、１つ以上の成分が、固体表面（例えば、固体組織の切片、または基質）上で１つ以上の他の成分と接触される場合に達成される。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「循環反応系」とは、グリコレートからグリオキシレートに変換し、そしてグリオキシレートからグリコレートに戻すプロセスをいう。
【００４３】
（Ｂ．ミエロペルオキシダーゼをアッセイするための方法）
本発明は、サンプル中のミエロペルオキシダーゼの存在、非存在および／または量をアッセイするための方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）セリン、過酸化水素、およびハライド（好ましくは、塩素）を、ミエロペルオキシダーゼを含むサンプルまたはミエロペルオキシダーゼを含むことが推定されるサンプルと接触させてグリコールアルデヒドを生成する工程；（ｂ）工程（ａ）において生成されるこのグリコールアルデヒドを、グリコールアルデヒド変換酵素および酸化型である第１の電子受容体の存在下で、グリコレートに変換する工程；（ｃ）工程（ｂ）から得たこのグリコレートを、酸化型の第２の電子受容体、およびグリコレート変換酵素の存在下で、グリオキシレートに変換する工程であって、それによって、還元型のこの第２の電子受容体が、生成され；このグリオキシレートが、還元型である第３の電子受容体およびグリオキシレート変換酵素の存在下で、グリコレートへ変換されて戻ることで、循環反応系を形成し、それによって、酸化型のこの第３の電子受容体が、生成され；ここでこの第２の電子受容体とこの第３の電子受容体とが異なる、工程；および（ｄ）工程（ｃ）においてもたらされる少なくとも１つの検出可能なシグナルを評価する工程。いくつかの実施形態において、この工程（ｃ）においてもたらされる検出可能なシグナルは、この循環反応系における、この還元型の第２の電子受容体もしくはこの酸化型の第２の電子受容体またはこの還元型の第３の電子受容体もしくはこの酸化型の第３の電子受容体の濃度変化である。
【００４４】
（工程（ａ）：ミエロペルオキシダーゼによる過酸化水素およびハライドの存在下におけるセリンのグリコールアルデヒドへの変換）
本発明においてミエロペルオキシダーゼをアッセイするための方法は、ミエロペルオキシダーゼによって触媒される酵素活性の測定に基づく。ミエロペルオキシダーゼは、過酸化水素およびハライドの存在下でセリンとグリコールアルデヒドに変換する反応を触媒する。したがって、サンプル中のミエロペルオキシダーゼの存在または非存在および量は、これらの反応において生成されるグリコールアルデヒドを測定することによって、決定され得る。これらの反応におけるハライドは、Ｃｌ−、Ｂｒ−、またはＩ−であり得る。好ましくは、このハライドは、Ｃｌ−である。したがって、本発明の工程（ａ）に関する例示的な反応スキームは、以下：
セリン＋Ｈ２Ｏ２＋Ｃｌ−＋Ｈ＋→グリコールアルデヒド＋ＨＯＣｌ＋Ｈ２Ｏ  （１）
である。
【００４５】
上記工程（ａ）におけるセリン、過酸化水素、および塩素（または他のハライド）は、ミエロペルオキシダーゼの反応に適切であり、かつ上記サンプル中のミエロペルオキシダーゼの活性に依存する任意の濃度であり得る。例えば、このセリンの濃度は、約０．０５ｍＭ〜約１００ｍＭ（約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約５ｍＭ〜約１０ｍＭ）であり；この過酸化水素の濃度は、約５ｕＭ〜約１０ｍＭ、約１０ｕＭ〜約１ｍＭ、または約５０ｕＭ〜約５００ｕＭであり；塩素（または他のハライド）の濃度は、約１ｍＭ〜５００ｍＭ、約１０ｍＭ〜２００ｍＭ、または約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭである。塩化ナトリウムまたは他の塩は、塩素についての適切な供給源として使用され得る。
【００４６】
ミエロペルオキシダーゼを含む任意のサンプルまたはミエロペルオキシダーゼを含むことが推定される任意のサンプルは、本発明を使用してアッセイされ得る。いくつかの実施形態において、このサンプルは、血液、血清、血漿、または尿である。いくつかの実施形態において、このサンプルは、白血球（例えば、好中球、好酸球、リンパ球、および／または単球）を含む。いくつかの実施形態において、このサンプルは、組織サンプルである。いくつかの実施形態において、この組織サンプルは、このアッセイが行われる前に粗組織ホモジネートを得るために均質化に供される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、上記サンプルは、上記アッセイが実施される前に、前処理される。例示的な処理工程としては、遠心分離、抽出／洗浄、細胞溶解、凍結／解凍、および超音波処理が挙げられる。このサンプルはまた、このアッセイ前に希釈され得る。
【００４８】
（工程（ｂ）：グリコールアルデヒド変換酵素によって触媒されるグリコールアルデヒドのグリコレートへの変換）
本発明の工程（ｂ）は、グリコールアルデヒド変換酵素の作用によって酸化型である電子受容体の存在下でグリコールアルデヒドをグリコレートに変換する。酸化型である電子受容体の存在下でグリコールアルデヒドをグリコレートに変換する任意のグリコールアルデヒド変換酵素が、使用され得る。いくつかの実施形態において、このグリコールアルデヒド変換酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼである。したがって、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される例示的な反応スキームは、以下：
グリコールアルデヒド＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ→グリコレート＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋  （２）
である。
【００４９】
任意のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼが、使用され得る。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号のアミノ酸を有するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２１）が、使用され得る：Ａ３９７６３（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、Ａ３５４５２（ウシ）、Ａ６０６０３（ラット）、Ａ３４４０６（ウサギ）、Ｉ４９４８４（マウス）、Ａ５９０２１（ブタ）、Ｃ８５５０５（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ａ９７４６５（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｓ４６０２０（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびＪＱ２２５３（スズメノチャヒキ）。
【００５０】
選択されたグリコールアルデヒド変換酵素と適合性である任意の電子受容体が、使用され得る。例えば、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼが使用される場合、この電子受容体（酸化型である）は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、またはアセチル−ＮＡＤＰ＋であり得る。
【００５１】
（工程（ｃ）：グリコレート−グリオキシレート循環反応系）
本発明の工程（ｃ）は、グリコレート変換酵素の作用によって、第２の電子受容体（その酸化型である）の存在下でグリコレートをグリオキシレートに変換し、次いでグリオキシレート変換酵素の作用によって、第３の電子受容体（その還元型である）の存在下でグリオキシレートからグリコレートに戻す。この第２の電子受容体およびこの第３の電子受容体は、異なる電子受容体である。したがって、工程（ｃ）は、この還元型である第２の電子受容体の増加およびこの酸化型である第２の電子受容体の減少、ならびにこの酸化型である第３の電子受容体の増加およびこの還元型である第３の電子受容体の減少を生じる循環反応系を形成する。この特定の形態である電子受容体の増加またはこの特定の形態である電子受容体の減少は、測定され得る。いくつかの実施形態において、特定の形態である一方の電子受容体は、蓄積され、そしてこの蓄積が、評価される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、上記グリコレート変換酵素および上記グリオキシレート変換酵素とは異なる。いくつかの実施形態において、このグリコレート変換酵素は、上記第３の電子受容体と交差反応しないか、または上記第２の電子受容体に対する親和性より低い親和性でこの第３の電子受容体に結合し、このグリオキシレート変換酵素は、この第２の電子受容体と交差反応しないか、またはこの第３の電子受容体に対する親和性より低い親和性でこの第２の電子受容体に結合する。
【００５３】
酸化型である電子受容体の存在下におけるグリコレートからのグリオキシレートの形成を触媒する任意のグリコレート変換酵素が、使用され得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、上記グリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼである。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０００９６（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００４７２２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１７００２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）のヌクレオチド配列によってコードされる任意のグリコレートレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．７９）が、使用され得る。
【００５５】
他の実施形態において、上記グリコレート変換酵素は、グリコレートオキシダーゼである。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号のアミノ酸配列を有するグリコレートオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．１５）が、使用され得る：Ｓ３３３２２（ラット）、ＮＰ＿１０５５３４（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、ＡＥ３６４２（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、Ｔ１７４７１（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｓ７４７０６（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種）、Ｔ１０２４２（ウリ科植物（ｃｕｃｕｒｂｉｔ））、Ｔ０２１５０（コメ）、Ｓ７５２３１（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種）、およびＯＸＳＰＨ（ホウレンソウ）。
【００５６】
さらに他の実施形態において、上記グリコレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼである。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号のアミノ酸配列を有する任意のグリオキシレートレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．２６）が、使用され得る：ＡＢ０３３９９５（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）およびＡＦ１３４８９５（ヒト）。
【００５７】
還元型である電子受容体の存在下におけるグリオキシレートからのグリコレートの形成を触媒する任意のグリオキシレート変換酵素が、使用され得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、上記グリオキシレート変換酵素は、グリセリン酸デヒドロゲナーゼである。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号のアミノ酸配列を有するグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２９）が、使用され得る：ＮＰ＿２８３１１４（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ＣＡＢ８３５８２（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｆ８２０２２（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、Ｓ６８１６５（カボチャ属）、Ｓ６８１６４（カボチャ属）、ＤＥＫＶＧ（キュウリ）。
【００５９】
他の実施形態において、上記グリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼである。グリオキシレートレダクターゼは、本明細書中に記載される。
【００６０】
さらに他の実施形態において、上記グリオキシレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼである。グリコレートレダクターゼは、本明細書中に記載される。
【００６１】
いくつかの実施形態において、上記グリコレート変換酵素と上記グリオキシレート変換酵素とは同じものである。１つの実施形態において、このグリコレート変換酵素およびこのグリオキシレート変換酵素は両方とも、グリコレートレダクターゼである。他の実施形態において、このグリコレート変換酵素およびこのグリオキシレート変換酵素は両方とも、グリオキシレートレダクターゼである。当該分野において公知であり、そして本明細書中に記載される、任意のグリコレートレダクターゼおよびグリオキシレートレダクターゼが、使用され得る。
【００６２】
上記第２の電子受容体および第３の電子受容体は、上記反応の異なる工程ついて選択された上記酵素と適合性である任意の電子受容体であり得るが、但しこの第２の電子受容体とこの第３の電子受容体とが異なる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、上記グリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼであり、そして上記第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋、ラクテート、２−６−ジクロロインドフェノール、およびフェナジンメトサルフェートからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、このグリコレート変換酵素は、グリコレートオキシダーゼであり、そしてこの第２の電子受容体は、Ｏ２である。いくつかの実施形態において、このグリコレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼであり、そしてこの第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋、ラクテート、２−６−ジクロロインドフェノール、およびフェナジンメトサルフェートからなる群より選択される。
【００６４】
いくつかの実施形態において、上記グリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼであり、そして上記第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、このグリオキシレート変換酵素は、Ｄ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼであり、そしてこの第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、このグリオキシレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼであり、そしてこの第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、上記グリコレート変換酵素および上記グリオキシレート変換酵素は、グリコレートと、上記アッセイにおいてもたらされるシグナルを増幅するグリオキシレートとの間の循環反応を共同して触媒し得る。このグリコレート変換酵素およびこのグリオキシレート変換酵素は、異なる電子受容体を利用し得、そして他の酵素によって使用される電子受容体と交差反応しないか、または低い親和性で反応する。あるいは、この２つの酵素は、同じ電子受容体を認識し得る。上記酸化型の第２の電子受容体および上記還元型の第３の電子受容体の十分な量がこの循環反応に添加されて、両方の反応を駆動し、そして十分なシグナルがもたらされるまでこのサイクルを継続させ得る。
【００６６】
工程（ｃ）に関する以下の２つの例示的な反応スキームにおいて、上記グリコレート変換酵素と上記グリオキシレート変換酵素とが異なる。例えば、このグリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼであり、そしてこのグリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼである。したがって、工程（ｃ）に関する例示的な反応スキームは、以下：
グリコレート＋チオ−ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ→グリオキシレート＋チオ−ＮＡＤＨ＋Ｈ＋  （４ａ）
グリオキシレート＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋→グリコレート＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ  （４ｂ）
である。反応（４ａ）は、グリコレートレダクターゼによって触媒される反応を示し、そして反応（４ｂ）は、グリオキシレートレダクターゼによって触媒される反応を示す。十分なチオ−ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨは、チオ−ＮＡＤＨの蓄積を生じる循環反応をもたらすこの反応に添加され得る。
【００６７】
別の例において、グリコレートオキシダーゼは、グリコレート変換酵素として使用され、そしてＤ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼは、上記循環反応において上記グリオキシレート変換酵素として使用される。例示的な反応スキームは、以下：
グリコレート＋Ｏ２→グリオキシレート＋Ｈ２Ｏ２  （５ａ）
グリオキシレート＋チオ−ＮＡＤＨ→グリコレート＋チオ−ＮＡＤ＋  （５ｂ）
である。反応（５ａ）は、グリコレートオキシダーゼによって触媒される反応を示し、そして反応（５ｂ）は、Ｄ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応を示す。十分な量のＯ２およびチオ−ＮＡＤＨは、チオ−ＮＡＤ＋およびＨ２Ｏ２の蓄積を生じる循環反応をもたらすこの反応に添加され得る。
【００６８】
以下は、上記グリコレート変換酵素および上記グリオキシレート変換酵素が同じでものである例示的な反応スキームである。１つのこのような例示的な反応スキームは、以下：
グリコレート＋チオ−ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ→グリオキシレート＋チオ−ＮＡＤＨ＋Ｈ＋（３ａ）
グリオキシレート＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋→グリオキシレート＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ  （３ｂ）
である。反応（３ａ）および反応（３ｂ）は両方とも、同じ酵素によって触媒され、この酵素は、グリコレートレダクターゼまたはグリオキシレートレダクターゼである。十分なチオ−ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨがこの反応混合物に添加されて、チオ−ＮＡＤＨの蓄積を生じる循環反応において両方の反応を駆動し得る。
【００６９】
グリコレート変換酵素とグリオキシレート変換酵素との任意の他の組み合わせが使用されて、同じ循環効果が達成され得る。
【００７０】
工程（ａ）〜工程（ｃ）における酵素反応は、一般的に、酵素反応の完了に適した条件（例えば、緩衝液および温度）において実施される。本明細書中に記載される工程（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）について使用される緩衝液は、同じものであっても異なってもよい。この特定の酵素反応に適した当該分野において公知である任意の緩衝液が、使用され得る。例えば、この緩衝液は、約６〜約８のｐＨを有するリン酸緩衝液；約７〜約９のｐＨを有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、または約６〜約９のｐＨを有するＧｏｏｄ’ｓ緩衝液であり得る。
【００７１】
各工程についての温度は、同じものであっても異なっていてもよい。この温度は、好ましくは、約２５℃〜約３７℃の間である。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される１つ以上の工程は、別個の反応混合物において実施される。例えば、この反応中の１つ以上の工程の最終生成物は、次の工程に対する試薬が添加される前に、この反応混合物から、部分的かまたは完全に分離され得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される工程（ａ）〜工程（ｃ）は、単一の反応混合物中で実施される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、先の工程の終わりに、次の工程に対する酵素、基質、または電子受容体が、同じ反応混合物に続けて添加される。いくつかの実施形態において、先の工程における反応は、次の工程に対する試薬が添加される前に終了する。いくつかの実施形態において、１つのより多い工程に対するいくつかまたは全ての試薬は、この反応混合物に同時に添加される。いくつかの実施形態において、工程（ａ）および工程（ｂ）に対する試薬は、同時にサンプルと混合される。これらの実施形態において、ミエロペルオキシダーゼを含むことが推定されるサンプルは、セリン、過酸化水素、塩素、上記グリコールアルデヒド変換酵素、および上記酸化型である第１の電子受容体に接触される。いくつかの実施形態において、工程（ａ）、工程（ｂ）に対する試薬、および工程（ｃ）に対する試薬のいくつかは、同時にこのサンプルと混合される。これらの実施形態において、ミエロペルオキシダーゼを含むことが推定されるサンプルは、セリン、過酸化水素、塩素、このグリコールアルデヒド変換酵素、この酸化型である第１の電子受容体、上記グリコレート変換酵素、上記酸化型である第２の電子受容体に接触される。他の実施形態において、工程（ａ）、工程（ｂ）、および工程（ｃ）に対する試薬は、同時にこのサンプルと混合される。これらの実施形態において、ミエロペルオキシダーゼを含むことが推定されるサンプルは、セリン、過酸化水素、塩素、このグリコールアルデヒド変換酵素、この酸化型である第１の電子受容体、このグリコレート変換酵素、この酸化型である第２の電子受容体、このグリオキシレート変換酵素、および上記還元型である第３の電子受容体に接触される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、上記第１の電子受容体は、上記第２のおよび／または上記第３の電子受容体と異なる。他の実施形態において、この第１の電子受容体は、この第２の電子受容体と同じである。さらに他の実施形態において、この第１の電子受容体は、この第３の電子受容体と同じである。
【００７６】
（工程（ｄ）：工程（ｃ）においてもたらされるシグナルの評価）
上記サンプル中のミエロペルオキシダーゼの定量化は、工程（ｃ）においてもたらされるシグナル中の減算的な違いまたは加算的な違いをモニタリングすることによって達成され得る。評価は、連続的に実施されても異なる時点で実施されてもよい。
【００７７】
いくつかの実施形態において、上記還元型の第２の電子受容体または上記酸化型の第２の電子受容体の濃度変化が、評価される。いくつかの実施形態において、ミエロペルオキシダーゼの活性は、この還元型の第２の電子受容体の濃度の増加を評価することによって決定される。いくつかの実施形態において、ミエロペルオキシダーゼの活性は、この酸化型の第２の電子受容体の濃度の減少を評価することによって決定される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、上記還元型の第３の電子受容体または上記酸化型の第３の電子受容体の濃度変化が、評価される。いくつかの実施形態において、ミエロペルオキシダーゼの活性は、この還元型の第３の電子受容体の濃度の減少を評価することによって決定される。いくつかの実施形態において、ミエロペルオキシダーゼの活性は、この酸化型の第３の電子受容体の濃度の増加を評価することによって決定される。
【００７９】
本明細書中に記載される電子受容体の濃度変化は、当該分野で公知の方法を使用して評価され得る。例えば、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度変化は、３４０ｎｍにおける吸収を測定することによって分光光度的に決定され得る。チオ−ＮＡＤＨの濃度変化は、４０５ｎｍにおける吸収を測定することによって分光光度的に決定され得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度変化は、電子伝達色素原（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）を使用した比色定量法によって測定され得、この電子伝達色素原としては、３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド、３，３’−（４，４’−ジフェニレン）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジフェニレン）−ビス［２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（＝ニトロ−テトラゾリウム：ＮＴＢ）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’ジフェニレン）−ビス［２，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジフェニレン）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド）、および２，６−ジクロロフェノール−インドフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい例は、水溶性テトラゾリウム塩と、ジアフォラーゼまたはフェナジンメトサルフェートとの組み合わせである。これらの電子伝達色素原は、有色のホルマザン色素を形成する、ＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨに対する電子受容体であり、そしてこの形成される色素は、その最大吸収において比色定量で測定される。
【００８１】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨについてのさらなるアッセイ方法は、蛍光定量法であり、ＮＡＤまたはＮＡＤＰＨは、蛍光試薬（例えば、レサズリン）の存在下でジアフォラーゼによって処理される。
【００８２】
本明細書中に記載される還元型および／または酸化型の電子受容体の濃度の測定は、当該分野において公知である。例えば、消費されるＯ２の量または形成されるＨ２Ｏ２の量は、電子センサーの使用によってアッセイされ得る。多くの酸化還元指示薬が、この目的のために使用され得、そして広い範囲の方法が、溶液中のＨ２Ｏ２およびＯ２のアッセイに関する文献に記載される。生じたＨ２Ｏ２はまた、指示薬およびＨ２Ｏ２と反応することによって、検出可能な生成物として測定され得る。指示薬の例は、分光光度的な手段によって測定され得る試薬、変色指示薬（ｃｏｌｏｒ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）、蛍光試薬または発光試薬である。例えば、Ｈ２Ｏ２は、ペルオキシオキサレートとアクリジニウムエステルとの非酵素的な化学発光反応を使用して評価され得る。
【００８３】
アッセイは、ポジティブコントロールおよびバックグラウンドコントロールの両方を用いて二連で行われ得る。検量線は、公知の活性を有するミエロペルオキシダーゼの公知の量を使用することによって得られ得る。その後、各サンプル中のミエロペルオキシダーゼのレベルは、測定された各シグナルを検量線に対して比較することによって決定され得る。
【００８４】
（Ｃ．本方法の使用）
本発明は、サンプル中に存在する少量のミエロペルオキシダーゼさえも検出する、上昇した感度を有するアッセイを提供する。したがって、本発明の方法は、ミエロペルオキシダーゼの変化したレベルに関連する状態を検出するための実用的手段、および患者におけるミエロペルオキシダーゼレベルをモニタリングするための実用的手段を提供する。この方法は、被験体中に存在するミエロペルオキシダーゼの不適当な量もしくはそれに対する不適当な反応（すなわち、このような効果または活性）に関連する任意の疾患の、予後または診断のために使用され得る。このような疾患の例としては、急性骨髄性白血病、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ギヤン−バレー症候群、糸球体腎炎、アテローム硬化症、脳卒中、多発性硬化症、アルツハイマー病、白血病、感染、喘息、癌（例えば、肺癌）、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、および神経炎症性疾患（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
本発明の酵素的アッセイはまた、生物学的プロセスおよび種々の病理学的状態におけるミエロペルオキシダーゼの役割を調査するための研究手段を提供する。
【００８６】
（Ｄ．ミエロペルオキシダーゼをアッセイするためのキット）
本発明はまた、ミエロペルオキシダーゼの活性をアッセイするためのキット（例えば、診断キット）を提供する。このようなキットは、本発明の方法を実施するために、本明細書中に記載される、１つ以上の基質、酵素的な薬剤および電子受容体（例えば、セリン、過酸化水素、塩素（または他のハライド）、グリコールアルデヒド変換酵素、酸化型である第１の電子受容体、グリコレート変換酵素、酸化型である第２の電子受容体、グリオキシレート変換酵素、還元型である第３の電子受容体）を備え、ここでこの第２の電子受容体とこの第３の電子受容体とが異なる。本明細書中に記載される基質、酵素、および電子受容体のいずれかは、このキットに含まれ得る。このキットはまた、ポジティブコントロール標準物質および／またはネガティブコントロール標準物質、ならびに工程（ｃ）によってもたらされるシグナルを評価するために必要な試薬（例えば、含まれ得る色によるアッセイ（ｃｏｌｏｒｍｅｔｉｃ  ａｓｓａｙ）を行うための試薬）を備え得る。このキットはまた、本発明の方法を行うためおよび／または処理のために診断用の実験室にサンプルを移すための装置または容器、ならびに本発明の方法を実施するための適切な説明書を備え得る。
【００８７】
本発明のキットは、任意の適切なパッケージング中にあり得る。例えば、診断システムに関して本明細書中で考察されるパッケージは、診断システムにおいて慣習的に利用されるものである。このようなパッケージは、自動分析器において使用するのに適した容器を備える。
【実施例】
【００８８】
（Ｅ．実施例）
以下の実施例は、例示の目的のみのために含まれ、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００８９】
（実施例１．グリコレートレダクターゼおよびグリオキシレートレダクターゼを使用するミエロペルオキシダーゼのアッセイ）
この研究において、上記グリコールアルデヒド変換酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、上記グリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼであり、そして上記グリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼである。この研究において使用される試薬を、以下の表１および表２に示す。
【００９０】
（表１．試薬１の組成）
【００９１】
【表１】
2008509668.tif 000002
（表２．試薬２の組成）
【００９２】
【表２】
2008509668.tif 000003
この研究において、２５０ｕｌの試薬１を、試験する２０ｕｌのサンプルと混合し、そしてこの混合物を、３７℃にて５分間インキュベートする。次いで５０ｕｌの試薬２を、この混合物に添加し、そして３７℃にてさらに１分間インキュベートする。インキュベーションの後、４０５ｎｍにおける吸光度の変化を、２分間継続して測定する。
【００９３】
（実施例２．グリコレートオキシダーゼおよびＤ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼを使用するミエロペルオキシダーゼのアッセイ）
この研究において、上記グリコールアルデヒド変換酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、上記グリコレート変換酵素は、グリコレートオキシダーゼであり、そして上記グリオキシレート変換酵素は、Ｄ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼである。この研究において使用される試薬を、以下の表３および表４に示す。
【００９４】
（表３．試薬１の組成）
【００９５】
【表３】
2008509668.tif 000004
（表４．試薬２の組成）
【００９６】
【表４】
2008509668.tif 000005
この研究において、２８０ｕｌの試薬１を、試験する３０ｕｌのサンプルと混合し、そしてこの混合物を、３７℃にて５分間インキュベートする。次いで６０ｕｌの試薬２を、この混合物に添加し、そして３７℃にてさらに２分間インキュベートする。インキュベーションの後、４０５ｎｍにおける吸光度の変化を、２分間継続して測定する。
【００９７】
（実施例３．グリコレートレダクターゼを使用するミエロペルオキシダーゼのアッセイ）
この研究において、上記グリコールアルデヒド変換酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、上記グリコレート変換酵素および上記グリオキシレート変換酵素は、両方ともグリコレートレダクターゼである。この研究において使用される試薬は、以下の表５および表６に示す。
【００９８】
（表５．試薬１の組成）
【００９９】
【表５】
2008509668.tif 000006
（表６．試薬２の組成）
【０１００】
【表６】
2008509668.tif 000007
この研究において、２４０ｕｌの試薬１を、試験する２０ｕｌのサンプルと混合し、そしてこの混合物を、３７℃にて５分間インキュベートする。次いで６０ｕｌの試薬２を、この混合物に添加し、そして３７℃にてさらに１分間インキュベートする。インキュベーションの後、４０５ｎｍにおける吸光度の変化を、２分間継続して測定する。
【０１０１】
上記の実施例は、例示の目的のみのために含まれ、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。上に記載される実施例の多くのバリエーションが、可能である。上に記載される実施例の改変およびバリエーションは、当業者に明らかであるので、本発明が添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることが、意図される。
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月20日(2006.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のミエロペルオキシダーゼをアッセイするための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）セリン、過酸化水素、およびクロリドを、ミエロペルオキシダーゼを含むことが推定されるサンプルと接触させてグリコールアルデヒドを生成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において生成される該グリコールアルデヒドを、グリコールアルデヒド変換酵素および酸化型である第１の電子受容体の存在下で、グリコレートに変換する工程；
（ｃ）工程（ｂ）から得た該グリコレートを、酸化型の第２の電子受容体、およびグリコレート変換酵素の存在下で、グリオキシレートに変換する工程であって、それによって、還元型の該第２の電子受容体が生成され；該グリオキシレートが、還元型である第３の電子受容体およびグリオキシレート変換酵素の存在下で、グリコレートへ変換されて戻ることで、循環反応系を形成し、それによって、酸化型の該第３の電子受容体が生成され；ここで該第２の電子受容体と該第３の電子受容体とが異なる、工程；ならびに
（ｄ）該循環反応系における、該還元型の第２の電子受容体もしくは該酸化型の第２の電子受容体または該還元型の第３の電子受容体もしくは該酸化型の第３の電子受容体の濃度変化を評価する工程であって、それによって、該サンプル中の該ミエロペルオキシダーゼの存在、非存在および／または量が決定される、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第１の電子受容体と前記第２の電子受容体とは、同じものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ミエロペルオキシダーゼを含むことが推定される前記サンプルは、セリン、過酸化水素、クロリド、前記グリコールアルデヒド変換酵素、および前記酸化型である第１の電子受容体に接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ミエロペルオキシダーゼを含むことが推定される前記サンプルは、セリン、過酸化水素、クロリド、前記グリコールアルデヒド変換酵素、前記酸化型である第１の電子受容体、前記グリコレート変換酵素、および前記酸化型である第２の電子受容体に接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）の前記グリコールアルデヒド変換酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、そして前記第１の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）の前記循環反応系において、前記グリコレート変換酵素と前記グリオキシレート変換酵素とが異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記グリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼまたはグリコレートオキシダーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記グリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼまたはＤ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記グリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼであり、そして前記グリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸化型の第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択され、そして前記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、アセチル−ＮＡＤＰＨ、（Ｒ）−ラクテート、２，６−ジクロロインドフェノール、およびフェナジンメトサルフェートからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記グリコレート変換酵素は、グリコレートオキシダーゼであり、そして前記グリオキシレート変換酵素は、Ｄ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記酸化型の第２の電子受容体は、Ｏ２であり、そして前記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、アセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）の前記循環反応系において、前記グリコレート変換酵素と前記グリオキシレート変換酵素とは同じものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記グリコレート変換酵素および前記グリオキシレート変換酵素は両方とも、グリコレートレダクターゼまたはグリオキシレートレダクターゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酸化型の第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択され、そして前記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記濃度変化は、測光的な方法によって評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、該方法が、工程（ｄ）の後に、前記酸化型の第２の電子受容体もしくは前記還元型の第２の電子受容体、または前記還元型の第３の電子受容体もしくは前記酸化型の第３の電子受容体と、色を生じる因子とを結合する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
前記サンプルは、生物学的流体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的流体は、血液、血清、血漿および尿からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、該方法が、疾患の予後および／または診断のために使用される、方法。
【請求項２１】
前記疾患は、アテローム硬化症、脳卒中、多発性硬化症、アルツハイマー病、肺癌、白血病、および感染からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ミエロペルオキシダーゼをアッセイするためのキットであって、該キットは、セリン、過酸化水素、クロリド、グリコールアルデヒドからグリコレートへの変換を触媒するグリコールアルデヒド変換酵素および酸化型である第１の電子受容体、グリコレートからグリオキシレートへの変換を触媒するグリコレート変換酵素および酸化型である第２の電子受容体、ならびにグリオキシレートからグリコレートへの変換を触媒するグリオキシレート変換酵素および還元型である第３の電子受容体、ならびに少なくとも１つのポジティブコントロール標準物質またはネガティブコントロール標準物質を備え、ここで該第２の電子受容体と該第３の電子受容体とが異なる、キット。
【請求項２３】
前記グリコールアルデヒド変換酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、そして前記第１の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記グリコレート変換酵素は、グリコレートレダクターゼであり、そして前記酸化型の第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択され、前記グリオキシレート変換酵素は、グリオキシレートレダクターゼであり、そして前記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨ（Ｒ）−ラクテート、２，６−ジクロロインドフェノール、およびフェナジンメトサルフェートからなる群より選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
前記グリコレート変換酵素は、グリコレートオキシダーゼであり、そして前記酸化型の第２の電子受容体は、Ｏ２であり、そして前記グリオキシレート変換酵素は、Ｄ−グリセリン酸デヒドロゲナーゼであり、そして前記還元型の第２の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２６】
前記グリコレート変換酵素および前記グリオキシレート変換酵素は両方とも、グリコレートレダクターゼまたはグリオキシレートレダクターゼであり、そして前記酸化型の第２の電子受容体は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ−ＮＡＤ＋、チオ−ＮＡＤＰ＋、アセチル−ＮＡＤ＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ＋からなる群より選択され、そして前記還元型の第３の電子受容体は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群より選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２７】
請求項２２に記載のキットであって、該キットが、疾患の予後および／または診断のための使用を示す説明書をさらに備える、キット。
【請求項２８】
前記疾患は、アテローム硬化症、脳卒中、多発性硬化症、アルツハイマー病、肺癌、白血病、および感染からなる群より選択される、請求項２７に記載のキット。
【国際調査報告】
2008509668.tif 000008
2008509668.tif 000009
2008509668.tif 000010