(57)【要約】【課題】  細胞で、プロモーター及びエンハンサーなどの複数のシス調節配列及び/又は転写因子などの複数のトランス作用性因子の活性を測定するために役立つ、組成物、方法及びキットを提供すること。【解決手段】  ある実施態様において、各RTUはレポーター配列、レポーター配列内に位置するプロセシングタグ、及びレポーター配列に機能的に結合したシス調節エレメントを含む、ポリヌクレオチドレポーター転写単位(RTU)の集団を含む組成物が提供され、集団内の任意の2つのRTUの間でプロセシングタグ外のレポーター配列は実質的に同一であり、レポーター配列内のプロセシングタグの位置は、例えばそれらのシス調節エレメントにおいて異なる任意の2つのRTUを区別する。これらの組成物、方法及びキットは、例えば生物内で、例えば細胞型又は疾病状態を特定するために更に用いることができる。【選択図】  図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドRTUを含むレポーター転写単位(RTU)集団であって、各RTUは、
該レポーター配列、
該レポーター配列内に位置するプロセシングタグ、及び
レポーター配列に機能的に結合したシス調節エレメントを含み、該レポーター配列の転写は該シス調節エレメントによって調整され；かつ
非同一のシス調節エレメントに機能的に結合した任意の2つのRTUのレポーター配列が、該レポーター配列内のプロセシングタグの位置によって識別可能である、前記RTU集団。
【請求項２】
トランス作用性因子が前記シス調節エレメントに結合する、請求項1記載のRTU集団。
【請求項３】
ポリヌクレオチドRTUを含むレポーター転写単位(RTU)集団であって、各RTUは、
レポーター配列、
該レポーター配列内に位置するプロセシングタグ、及び
該レポーター配列に機能的に結合したシス調節エレメントを含み、該レポーター配列の転写が該シス調節エレメントへのトランス作用性因子の結合によって調整され；かつ
非同一のトランス作用性因子によって調整されたシス調節エレメントに機能的に結合した任意の2つのRTUのレポーター配列が、該レポーター配列内のプロセシングタグの位置によって識別可能である、前記RTU集団。
【請求項４】
前記レポーター配列内のプロセシングタグの位置は、非同一シス調節エレメントを有する任意の2つのRTUを区別する、請求項1記載のRTU集団。
【請求項５】
前記集団内の任意の2つのRTUの間で該プロセシングタグ外のレポーター配列が実質的に同一である、請求項1記載のRTU集団。
【請求項６】
前記実質的に同一のレポーター配列は10未満のヌクレオチドが異なる、請求項1記載のRTU集団。
【請求項７】
前記実質的に同一のレポーター配列は1ヌクレオチド異なる、請求項1記載のRTU集団。
【請求項８】
前記プロセシングタグ外のレポーター配列は該集団内の任意の2つのRTUの間で同一である、請求項1記載のRTU集団。
【請求項９】
前記集団内の任意の2つのRTUの間で、プロセシングタグを含む該レポーター配列が同数のヌクレオチドを含む、請求項1記載のRTU集団。
【請求項１０】
少なくとも5、少なくとも10、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1500又は少なくとも2000の非同一のRTUを更に含む、請求項1記載のRTU集団。
【請求項１１】
前記レポーター配列内のプロセシングタグの相対位置は、該集団内の任意の2つのRTUの間で少なくとも1から15のヌクレオチドが異なる、請求項1記載のRTU集団。
【請求項１２】
集団内の各RTUのプロセシングタグが、
a)特有のチミン、アデニン、シトシン又はグアニンヌクレオチド残基、
b)エンドヌクレアーゼ認識部位、
c)プライマー配列、
d)ポリアデニル化終止シグナル、及び
e)欠失、挿入又は置換を含むレポーター配列内の変異
からなる群から選択される、請求項1記載のRTU集団。
【請求項１３】
前記プロセシングタグが特有のチミン、アデニン、シトシン又はグアニンヌクレオチド残基、及びエンドヌクレアーゼ認識部位からなる群から選択される、請求項12記載のRTU集団。
【請求項１４】
前記プロセシングタグは集団内の任意の2つのRTUの間で同一である、請求項13記載のRTU集団。
【請求項１５】
前記集団内の少なくとも1つのRTUがプロモーター、エンハンサー、RNA安定性シグナル及びポリアデニル化シグナル又はその組合せからなる群から選択されるシス調節エレメントを含む、請求項1記載のRTU集団。
【請求項１６】
前記集団内の各RTUについて、シス調節エレメントはプロモーター又はエンハンサーを含み、DNA結合タンパク質のための少なくとも1つの結合部位を有する、請求項1記載のRTU集団。
【請求項１７】
前記結合部位は転写因子結合部位である、請求項16記載のRTU集団。
【請求項１８】
前記シス調節エレメントは該レポーター種の安定性又は成熟を調整する、請求項16記載のRTU集団。
【請求項１９】
前記集団内の少なくとも1つのRTUにおけるシス調節エレメントの位置は、該レポーター配列の上流側、レポーター配列の内部、又はレポーター配列の下流側である、請求項1記載のRTU集団。
【請求項２０】
前記集団内の各RTUはレポーター配列の両端に位置する5'及び3'プライマー配列を更に含む、請求項1記載のRTU集団。
【請求項２１】
前記集団内のRTUの少なくとも1つはイントロンを含む、請求項1記載のRTU集団。
【請求項２２】
請求項1記載のRTU集団を含むベクターの集団。
【請求項２３】
各ベクターはプラスミド、ファージミド、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ関連ベクターからなる群から選択される、請求項22記載のベクターの集団。
【請求項２４】
集団の各検出プローブは、請求項1のRTU集団のRTU内にプロセシングタグを含むレポーター配列のある領域に相補性である配列を含む、オリゴヌクレオチド検出プローブの集団。
【請求項２５】
各検出プローブは蛍光標識を含み、該標識の蛍光は検出プローブのプロセシングによって調整される、請求項24記載の検出プローブ集団。
【請求項２６】
各検出プローブは該蛍光標識の蛍光を低下させる失活剤を更に含み、かつプローブのプロセシングは蛍光標識を失活剤から分離する、請求項25記載の検出プローブ集団。
【請求項２７】
前記プローブは固形基質上に固定化される、請求項24記載のプローブ集団。
【請求項２８】
請求項24記載の検出プローブを含む核酸アレイ。
【請求項２９】
請求項1記載のRTU集団を含む細胞。
【請求項３０】
前記RTU集団は前記細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項29記載の細胞。
【請求項３１】
植物、細菌、真菌及び脊椎動物からなる群から選択される、請求項29記載の細胞。
【請求項３２】
胚幹細胞である、請求項29記載の細胞。
【請求項３３】
請求項29記載の細胞を含む組織。
【請求項３４】
生検試料、検死試料又は組織切片培養物を含む、請求項33記載の組織。
【請求項３５】
請求項1記載のRTU集団を含む細胞集団であって、該細胞集団の各細胞はRTU集団の少なくとも１RTUメンバーを含む細胞集団。
【請求項３６】
請求項1記載のRTU集団を含む細胞集団であって、該細胞集団の各細胞はRTU集団の各メンバーを含む細胞集団。
【請求項３７】
請求項29記載の細胞を含むヒト以外の生物。
【請求項３８】
生物系で複数のトランス作用性因子の活性を測定する方法であって、該生物系は請求項3記載のRTU集団を含み、
a)レポーター配列のレポーター種をプロセシングすること、及び
b)プロセシングしたレポーター種の少なくとも2つを検出することによって複数のトランス作用性因子の相対活性を測定することを含む、前記方法。
【請求項３９】
生物系内の請求項1記載のRTU集団内で複数のシス調節エレメントの活性を測定する方法であって、
a)レポーター配列のレポーター種をプロセシングすること、及び
b)プロセシングしたレポーター種の少なくとも2つを検出することによって複数のシス調節エレメントの相対活性を測定することを含む、前記方法。
【請求項４０】
生物系内の請求項3記載のRTU集団内で、複数のトランス作用性因子又は複数のシス調節エレメントの活性を測定する方法であって、
a)RTU集団のレポーター種をオリゴヌクレオチド検出プローブの集団と接触させること、
b)該オリゴヌクレオチド検出プローブをプロセシングすること、及び
c)プロセシングしたオリゴヌクレオチド検出プローブの少なくとも2つを検出することによって生物系内の複数のトランス作用性因子又は複数のシス調節エレメントの相対活性を測定することを含む前記方法。
【請求項４１】
生物系内の請求項3記載のRTU集団内で複数のトランス作用性因子又は複数のシス調節エレメントの活性に及ぼす治療の影響を評価する方法であって、
a)生物系に治療を受けさせること、
b)レポーター配列のレポーター種をプロセシングすること、及び
c)プロセシングしたレポーター種の少なくとも2つを検出することによって生物系で複数のトランス作用性因子又は複数のシス調節エレメントの活性に及ぼす治療の影響を評価することを含む、前記方法。
【請求項４２】
少なくとも2つの検出されたプロセシングされたレポーター種を、治療を受けなかった生物系からの少なくとも2つの検出されたプロセシングされたレポーター種と比較することを更に含む、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記治療は該生物系を物理的刺激、機械的刺激、化学的刺激又は生物的刺激に曝すことを含む、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
前記治療は該生物系を有機分子、無機分子、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、電離放射線、電磁場、重力又は圧力に曝露させることを含む、請求項41記載の方法。
【請求項４５】
生物系のためにトランス作用性因子活性プロファイルを作成する方法であって、該生物系は請求項3記載のRTU集団を含み、
a)該RTU集団のレポーター配列のレポーター種をプロセシングすること、
b)プロセシングしたレポーター種を検出すること、及び
c)検出されたレポーター種の量を表す有形媒体値で記録することによって、
生物系のためにトランス作用性因子活性プロファイルを作成することを含み、プロファイル中のトランス作用性因子活性は生物系のトランス作用性因子の活性に対応する、前記方法。
【請求項４６】
記録した値は検出されたレポーター種の量の正規化数を表す、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
生物系のためにシス調節活性プロファイルを作成する方法であって、該生物系は請求項1記載のRTU集団を含み、
a)該RTU集団のレポーター配列のレポーター種をプロセシングすること、
b)プロセシングしたレポーター種を検出すること、及び
c)検出されたレポーター種の量を表す有形媒体値で記録することによって、
生物系のためにシス調節活性プロファイルを作成することを含み、プロファイル中のシス調節活性はRTU集団内のシス調節エレメントの活性に対応する、前記方法。
【請求項４８】
前記生物系は無細胞抽出物又はタンパク質の混合物を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４９】
前記生物系は細胞、器官培養物又は多細胞生物である、請求項38記載の方法。
【請求項５０】
前記RTU集団を含むレポーターベクターの注射、微粒子銃送達、エレクトロポレーション、リポフェクション又は感染によって、該RTU集団を生物系に導入することを更に含む、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
前記レポーター種は該レポーター種のプロセシングに先行して又はその間に増幅される、請求項38記載の方法。
【請求項５２】
前記レポーター種の増幅は逆転写レポーター種の逆転写及びPCR増幅を含む、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
前記レポーター種をプロセシングが、酵素反応、化学反応、熱化学反応、又はその任意の組合せを含む、請求項38記載の方法。
【請求項５４】
前記プロセシングタグが、RTU集団のレポーター配列の間で差別的に位置する変異を含み、レポーター種のプロセシングは、少なくとも1つのミスマッチを有するヘテロ二本鎖の集団の形成を可能にする条件下でレポーター種を非突然変異のレポーター配列の相補体を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズして、ミスマッチの部位でヘテロ二本鎖を切断することを含む、請求項38記載の方法。
【請求項５５】
前記ヘテロ二本鎖の切断は酵素反応、化学反応又は熱反応を含む、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
前記RTU集団内のプロセシングタグはエンドヌクレアーゼ認識部位を含み、前記レポーター種のプロセシングはレポーター種をエンドヌクレアーゼによりエンドヌクレアーゼ認識部位で切断することを含む、請求項38記載の方法。
【請求項５７】
前記RTU集団内のプロセシングタグは特有のチミジン残基を含み、前記レポーター種のプロセシングは、レポーター種を脱グリコシル化によって媒介される反応により特有のチミジン残基部位で切断することを含む、請求項38記載の方法。
【請求項５８】
前記RTU集団内のプロセシングタグは伸長終止シグナルを含み、前記レポーター種のプロセシングは、伸長反応の前記伸長終止シグナルでの終止を可能にする条件下で前記レポーター種をインキュベートすることを含む、請求項38記載の方法。
【請求項５９】
前記RTU集団内のプロセシングタグはプライマー配列を含み、前記レポーター種のプロセシングは、その長さがプロセシングタグの様々な位置によって決められる増幅産物を生成する条件下でレポーター種を増幅することを含む、請求項38記載の方法。
【請求項６０】
前記プロセシングしたレポーター種の検出は、レポーター種を大きさ、分子量、電荷、移動性又はその組合せによって分離することを含む、請求項38記載の方法。
【請求項６１】
前記プロセシングしたレポーター種が、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動法又はクロマトグラフィーによって分離される、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
前記RTU集団の各RTU内のプロセシングタグがエンドヌクレアーゼ認識部位を含み、前記オリゴヌクレオチド検出プローブのプロセシングが、オリゴヌクレオチド検出プローブをエンドヌクレアーゼによりエンドヌクレアーゼ認識部位で切断することを含む、請求項40記載の方法。
【請求項６３】
前記RTU集団の各RTU内のプロセシングタグが変異を含み、前記オリゴヌクレオチド検出プローブのプロセシングが、オリゴヌクレオチド検出プローブを5から3のエキソヌクレアーゼにより消化することを含む、請求項40記載の方法。
【請求項６４】
前記プロセシングしたオリゴヌクレオチド検出プローブの少なくとも2つの検出が、プロセシングしたオリゴヌクレオチド検出プローブの蛍光を検出することを含む、請求項40記載の方法。
【請求項６５】
3つ以上のトランス作用性因子の活性が測定される、請求項38記載の方法。
【請求項６６】
10を超えるトランス作用性因子の活性が測定される、請求項38記載の方法。
【請求項６７】
100を超えるトランス作用性因子の活性が測定される、請求項38記載の方法。
【請求項６８】
1,000を超えるトランス作用性因子の活性が測定される、請求項38記載の方法。
【請求項６９】
前記トランス作用性因子の少なくとも1つは、
a)転写因子、
b)核内受容体、
c)転写アクチベーター、
d)転写リプレッサー、
e)異種トランス活性化ドメインにインフレームで融合したDNA結合ドメインを含むキメラタンパク質、
f)RNA安定性調節因子、及び
g)RNA成熟調節因子
からなる群から選択される、請求項38記載の方法。
【請求項７０】
前記トランス作用性因子の少なくとも1つは、
a)炎症性刺激、
b)ストレス刺激、
c)発達又は細胞分化シグナル、
d)発癌シグナル、
e)毒素、
f)生体異物、又は
g)薬剤
によって調節される、請求項38記載の方法。
【請求項７１】
前記シス調節エレメントの少なくとも1つはプロモーター、エンハンサー、RNA安定性シグナル又はポリアデニル化シグナルである、請求項39記載の方法。
【請求項７２】
2つ以上のシス調節エレメントの活性が測定される、請求項39記載の方法。
【請求項７３】
10を超えるシス調節エレメントの活性が測定される、請求項39記載の方法。
【請求項７４】
100を超えるシス調節エレメントの活性が測定される、請求項39記載の方法。
【請求項７５】
1,000を超えるシス調節エレメントの活性が測定される、請求項39記載の方法。
【請求項７６】
請求項1記載のRTU集団を生物系に導入することを含む、少なくとも1つのトランス作用性因子又は少なくとも1つのシス調節エレメントの活性を検出することができる系の生成方法。
【請求項７７】
細胞型を特定する方法であって、
請求項45記載の方法に従って対象となる細胞のために生成された第1のトランス作用性因子活性プロファイルを、請求項45記載の方法に従って既知の細胞型の細胞のために生成された第2のトランス作用性因子活性プロファイルと比較して、第1のトランス作用性因子活性プロファイルが第2のトランス作用性因子活性プロファイルと一致するかを決定することを含み、第1のトランス作用性因子活性プロファイルを第2のトランス作用性因子活性プロファイルと比較したときにマッチングが存在すると判断された場合は対象となる細胞の細胞型が特定される前記方法。
【請求項７８】
細胞型を特定するための方法であって、
請求項47記載の方法に従って対象となる細胞のために生成された第1のシス調節活性プロファイルを、請求項47記載の方法に従って既知細胞型の細胞のために生成された第2のシス調節活性プロファイルと比較して、第1のシス調節活性プロファイルが第2のシス調節活性プロファイルと一致するかを決定することを含み、第1のシス調節活性プロファイルを第2のシス調節活性プロファイルと比較したときにマッチングが存在すると判断された場合は対象となる細胞の細胞型が特定される、前記方法。
【請求項７９】
疾病状態を特定するための方法であって、
請求項45記載の方法に従って、対象となる細胞のために生成された第1のトランス作用性因子活性プロファイルを、請求項45記載の方法に従って疾病状態の細胞のために生成された第2のトランス作用性因子活性プロファイルと比較して、第1のトランス作用性因子活性プロファイルが第2のトランス作用性因子活性プロファイルと一致するかを決定することを含み、第1のトランス作用性因子活性プロファイルを第2のトランス作用性因子活性プロファイルと比較したときにマッチングが存在すると判断された場合は、対象となる細胞の疾病状態が特定される前記方法。
【請求項８０】
疾病状態を特定するための方法であって、
請求項47記載の方法に従って、対象となる細胞のために生成された第1のシス調節活性プロファイルを、請求項47記載の方法に従って疾病状態の細胞のために生成された第2のシス調節活性プロファイルと比較して、第1のシス調節活性プロファイルが第2のシス調節活性プロファイルと一致するかを決定することを含み、第1のシス調節活性プロファイルを第2のシス調節活性プロファイルと比較したときにマッチングが存在すると判断された場合は、対象となる細胞の疾病状態が特定される前記方法。
【請求項８１】
対象となるポリヌクレオチド又はポリペプチドの機能を評価する方法であって、
請求項45記載の方法に従って第1の細胞のために生成された第1のトランス作用性因子活性プロファイルを、請求項45記載の方法に従って第2の細胞のために生成された第2のトランス作用性因子活性プロファイルと比較して、第1のトランス作用性因子活性プロファイルが第2のトランス作用性因子活性プロファイルと一致するかを決定することを含み、但し第1の細胞内の対象となるポリヌクレオチド又はポリペプチドの活性又は量は調整され、第2の細胞内の対象となるポリヌクレオチド又はポリペプチドの活性又は量は調整されず、第1のトランス作用性因子活性プロファイルが第2のトランス作用性因子活性プロファイルと一致しないと判断された場合は、対象となるポリヌクレオチド又はポリペプチドの機能が評価される、前記方法。
【請求項８２】
対象となるポリヌクレオチド又はポリペプチドの機能を評価するための方法であって、
請求項47記載の方法に従って第1の細胞のために生成された第1のシス調節活性プロファイルを、請求項47記載の方法に従って第2の細胞のために生成された第2のシス調節活性プロファイルと比較して、第1のシス調節活性プロファイルが第2のシス調節活性プロファイルと一致するかを決定することを含み、但し第1の細胞内の対象となるポリヌクレオチド又はポリペプチドの活性又は量は調整され、第2の細胞内の対象となるポリヌクレオチド又はポリペプチドの活性又は量は調整されず、第1のシス調節活性プロファイルが第2のシス調節活性プロファイルと一致しないと判断された場合は、対象となるポリヌクレオチド又はポリペプチドの機能が評価される、前記方法。
【請求項８３】
対象となるポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの調整された活性又は量は、活性又は量の減少を含む、請求項81記載の方法。
【請求項８４】
対象となるポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの調整された活性又は量は、活性又は量の増加を含む、請求項81記載の方法。
【請求項８５】
第1の細胞及び第2の細胞は、細胞培養物、組織試料又は多細胞生物に由来する、請求項81記載の方法。
【請求項８６】
生物系内の所定の細胞型の細胞内でのトランス作用性因子活性の変化をモニタリングする方法であって、
a)請求項45記載の方法に従って生物系のために第1のトランス作用性因子活性プロファイルを生成することであって、生物系は所定の細胞型の細胞を含み、所定の細胞型の細胞はRTU集団を含むこと、
b)請求項45記載の方法に従って生物系のために第2のトランス作用性因子活性プロファイルを生成することであって、第2のトランス作用性因子活性プロファイルは生物系の後の発達時点で、又は生物系への治療の後に生成されること、及び
c)第1のトランス作用性因子活性プロファイルを第2のトランス作用性因子活性プロファイルと比較して第1のトランス作用性因子活性プロファイルは第2のトランス作用性因子活性プロファイルと一致するかを決定することであって、
それによって、該生物系内の所定の細胞型の細胞内でトランス作用性因子活性の変化をモニタリングすることを含む、前記方法。
【請求項８７】
生物系内の所定の細胞型の細胞内でのシス調節活性の変化をモニタリングする方法であって、
a)請求項47記載の方法に従って生物系のために第1のシス調節活性プロファイルを生成することであって、該生物系は所定の細胞型の細胞を含み、所定の細胞型の細胞はRTU集団を含むこと、
b)請求項47記載の方法に従って生物系のために第2のトランス作用性因子活性プロファイルを生成することであって、第2のシス調節活性プロファイルは生物系の後の発達時点で、又は生物系への治療の後に生成されること、及び
c)第1のシス調節活性プロファイルを第2のシス調節活性プロファイルと比較して第1のシス調節活性プロファイルは第2のシス調節活性プロファイルと一致するかを決定することであって、
それによって、該生物系内の所定の細胞型の細胞内でシス調節活性の変化をモニタリングすることを含む、前記方法。
【請求項８８】
前記生物系は細胞培養物、組織培養物、多細胞生物、動物又はヒトを含む、請求項86記載の方法。
【請求項８９】
所定の細胞型の細胞は生物系から単離された一次細胞に由来する、請求項86記載の方法。
【請求項９０】
混合型細胞集団内の異なる細胞型の相対数を決定する方法であって、混合型細胞集団は請求項1記載のRTU集団を含み、細胞集団内の各細胞型はRTU集団の1RTUメンバーを含み、
a)RTU集団によって発現されるレポーター配列をプロセシングすること、及び
b)検出されたプロセシングされたレポーター配列の相対量を測定することによって、混合型細胞集団内の異なる細胞型の相対数を決定することを含む、前記方法。
【請求項９１】
前記混合型細胞集団を治療と接触させることを更に含み、混合型細胞集団はレポーター配列のプロセシングステップの前に接触させる、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
前記治療は細胞傷害性治療、細胞増殖抑制性治療、増殖治療及び増殖抑制治療からなる群から選択される、請求項91記載の方法。
【請求項９３】
請求項1記載のRTU集団を含むキット。
【請求項９４】
細胞を含むキットであって、細胞は請求項1記載のRTU集団を含むキット。
【請求項９５】
ベクター集団を含むキットであって、ベクター集団は請求項1記載のRTU集団を含むキット。
【請求項９６】
使用者が読取可能な記憶媒体及び内部に埋め込まれたコンピュータプログラム機構を含む、コンピュータシステムとの連携使用のためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュータプログラム機構は生物系内の所定の細胞型の細胞内でのトランス作用性因子活性の変化をモニタリングするためのものであり、コンピュータプログラム機構は、
第1のトランス作用性因子活性プロファイルを第2のトランス作用性因子活性プロファイルと比較して第1のトランス作用性因子活性プロファイルは第2のトランス作用性因子活性プロファイルと一致するかを決定することにより所定の細胞型の細胞内でのトランス作用性因子活性の変化をモニタリングするための命令を含み、
第1のトランス作用性因子活性プロファイルは請求項45記載の方法に従って生物系のために生成され、生物系は所定の細胞型の細胞を含み、所定の細胞型の細胞はRTU集団を含み、
第2のトランス作用性因子活性プロファイルは請求項45記載の方法に従って生物系のために生成され、第2のトランス作用性因子活性プロファイルは生物系の後の発達時点で、又は生物系への治療の後に生成される、コンピュータプログラム製品。
【請求項９７】
モニタリングのための命令は第1のトランス作用性因子活性プロファイルと第2のトランス作用性因子活性プロファイルとの間の距離を計算することを含み、距離はユークリッド距離、マンハッタン距離、チェビシェフ距離、ベクター間角度、ピアソン相関距離、二乗ユークリッド距離、標準ユークリッド距離、マハラノビス距離及びミンコフスキー距離からなる群から選択される距離測定法で測定される、請求項96記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項９８】
前記モニタリングのための命令が、第1のトランス作用性因子活性プロファイルと第2のトランス作用性因子活性プロファイルとの間のユークリッド距離を計算することを含む、請求項96記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項９９】
使用者が読取可能な記憶媒体及び内部に埋め込まれたコンピュータプログラム機構を含む、コンピュータシステムとの連携使用のためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュータプログラム機構は生物系内の所定の細胞型の細胞内でのシス調節活性の変化をモニタリングするためのものであり、コンピュータプログラム機構は、
第1のシス調節活性プロファイルを第2のシス調節因子活性プロファイルと比較して第1のシス調節活性プロファイルは第2のシス調節活性プロファイルと一致するかを決定することにより所定の細胞型の細胞内でのシス調節活性の変化をモニタリングするための命令を含み、
第1のシス調節活性プロファイルは請求項47記載の方法に従って生物系のために生成され、但し生物系は所定の細胞型の細胞を含み、所定の細胞型の細胞はRTU集団を含み、
第2のシス調節活性プロファイルは請求項47記載の方法に従って生物系のために生成され、但し第2のシス調節活性プロファイルは生物系の後の発達時点で、又は生物系への治療の後に生成される、コンピュータプログラム製品。
【請求項１００】
前記モニタリングのための命令が第1のシス調節活性プロファイルと第2のシス調節プロファイルとの間の距離を計算することを含み、距離はユークリッド距離、マンハッタン距離、チェビシェフ距離、ベクター間角度、ピアソン相関距離、二乗ユークリッド距離、標準ユークリッド距離、マハラノビス距離及びミンコフスキー距離からなる群から選択される距離測定法で測定される、請求項99記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１０１】
前記モニタリングのための命令は、第1のシス調節活性プロファイルと第2のシス調節プロファイルとの間のユークリッド距離を計算するための指示を含む、請求項99記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１０２】
生物系内の所定の細胞型の細胞内でトランス作用性因子の変化をモニタリングするためのコンピュータシステムであって、プロセッサ、及びプロセッサに接続した1つ又は複数のプログラムをエンコードするメモリを含み、1つ又は複数のプログラムはプロセッサに、
第1のトランス作用性因子活性プロファイルを第2のトランス作用性因子活性プロファイルと比較して第1のトランス作用性因子活性プロファイルは第2のトランス作用性因子活性プロファイルと一致するかを決定することにより所定の細胞型の細胞内でのトランス作用性因子活性の変化をモニタリングすることを含む方法を実行させ、
第1のトランス作用性因子活性プロファイルは請求項45記載の方法に従って生物系のために生成され、生物系は所定の細胞型の細胞を含み、所定の細胞型の細胞はRTU集団を含み、
第2のトランス作用性因子活性プロファイルは請求項45記載の方法に従って生物系のために生成され、第2のトランス作用性因子活性プロファイルは生物系の後の発達時点で、又は生物系への治療の後に生成される、コンピュータシステム。
【請求項１０３】
前記モニタリングステップは第1のトランス作用性因子活性プロファイルと第2のトランス作用性因子活性プロファイルとの間の距離を計算することを含み、距離はユークリッド距離、マンハッタン距離、チェビシェフ距離、ベクター間角度、ピアソン相関距離、二乗ユークリッド距離、標準ユークリッド距離、マハラノビス距離及びミンコフスキー距離からなる群から選択される距離測定法で測定される、請求項102記載のコンピュータシステム。
【請求項１０４】
前記モニタリングステップは、第1のトランス作用性因子活性プロファイルと第2のトランス作用性因子活性プロファイルとの間のユークリッド距離を計算することを含む、請求項103記載のコンピュータシステム。
【請求項１０５】
生物系内の所定の細胞型の細胞内でシス調節活性の変化をモニタリングするためのコンピュータシステムであって、プロセッサ、及びプロセッサに接続した1つ又は複数のプログラムをエンコードするメモリを含み、1つ又は複数のプログラムはプロセッサに、
第1のシス調節活性プロファイルを第2のシス調節因子活性プロファイルと比較して第1のシス調節活性プロファイルは第2のシス調節活性プロファイルと一致するかを決定することにより所定の細胞型の細胞内でのシス調節活性の変化をモニタリングすることを含む方法を実行させ、
第1のシス調節活性プロファイルは請求項47記載の方法に従って生物系のために生成され、生物系は所定の細胞型の細胞を含み、所定の細胞型の細胞はRTU集団を含み、
第2のシス調節活性プロファイルは請求項47記載の方法に従って生物系のために生成され、第2のシス調節活性プロファイルは生物系の後の発達時点で、又は生物系への治療の後に生成される、コンピュータシステム。
【請求項１０６】
前記モニタリングステップは第1のシス調節活性プロファイルと第2のシス調節プロファイルとの間の距離を計算することを含み、距離はユークリッド距離、マンハッタン距離、チェビシェフ距離、ベクター間角度、ピアソン相関距離、二乗ユークリッド距離、標準ユークリッド距離、マハラノビス距離及びミンコフスキー距離からなる群から選択される距離測定法で測定される、請求項105記載のコンピュータシステム。
【請求項１０７】
前記モニタリングステップは、第1のシス調節活性プロファイルと第2のシス調節プロファイルとの間のユークリッド距離を計算することを含む、請求項105記載のコンピュータシステム。
【請求項１０８】
プロセッサ、及び
既知化合物と接触させた、請求項3記載のRTU集団を含む生物系内で生成した1つ又は複数のトランス作用性因子プロファイルを含むデータ構造と、
前記データ構造内でトランス作用性因子プロファイルを記憶するための命令とを記憶するメモリを含むコンピュータシステム。
【請求項１０９】
メモリは、
第1のトランス作用性因子活性プロファイルを第2のトランス作用性因子活性プロファイルと比較して第1のトランス作用性因子活性プロファイルは第2のトランス作用性因子活性プロファイルと一致するかを決定することにより所定の細胞型の細胞内でのトランス作用性因子活性の変化をモニタリングするための命令を更に含み、
第1のトランス作用性因子活性プロファイルは請求項45記載の方法に従って生物系のために生成され、但し生物系は所定の細胞型の細胞を含み、所定の細胞型の細胞はRTU集団を含み、
第2のトランス作用性因子活性プロファイルは請求項45記載の方法に従って生物系のために生成され、但し第2のトランス作用性因子活性プロファイルは生物系の後の発達時点で、又は生物系への治療の後に生成され、
第1のトランス作用性因子活性プロファイル及び第2のトランス作用性因子活性プロファイルの少なくとも一方は前記データ構造内に記憶される、請求項110記載のコンピュータシステム。
【請求項１１０】
前記モニタリングのための命令は第1のトランス作用性因子活性プロファイルと第2のトランス作用性因子活性プロファイルとの間の距離を計算するための命令を含み、距離はユークリッド距離、マンハッタン距離、チェビシェフ距離、ベクター間角度、ピアソン相関距離、二乗ユークリッド距離、標準ユークリッド距離、マハラノビス距離及びミンコフスキー距離からなる群から選択される距離測定法で測定される、請求項109記載のコンピュータシステム。
【請求項１１１】
前記モニタリングのための命令は、第1のトランス作用性因子活性プロファイルと第2のトランス作用性因子活性プロファイルとの間のユークリッド距離を計算するための命令を含む、請求項109記載のコンピュータシステム。
【請求項１１２】
プロセッサ、及び
既知化合物と接触させた、請求項3記載のRTU集団を含む生物系内で生成した1つ又は複数のシス調節活性プロファイルを含むデータ構造と、
前記データ構造内でシス調節活性プロファイルを記憶するための命令とを記憶するメモリを含むコンピュータシステム。
【請求項１１３】
メモリは、
第1のシス調節活性プロファイルを第2のシス調節活性プロファイルと比較して第1のシス調節活性プロファイルは第2のシス調節活性プロファイルと一致するかを決定することにより所定の細胞型の細胞内でのシス調節活性の変化をモニタリングするための命令を更に記憶し、
第1のシス調節活性プロファイルは請求項47記載の方法に従って生物系のために生成され、但し生物系は所定の細胞型の細胞を含み、所定の細胞型の細胞はRTU集団を含み、
シス調節活性プロファイルは請求項47記載の方法に従って生物系のために生成され、但し第2のシス調節活性プロファイルは生物系の後の発達時点で、又は生物系への治療の後に生成され、
第1のシス調節活性プロファイル及び第2のシス調節活性プロファイルの少なくとも一方は前記データ構造内に記憶される、請求項112記載のコンピュータシステム。
【請求項１１４】
前記モニタリングのための命令は第1のシス調節活性プロファイルと第2のシス調節活性プロファイルとの間の距離を計算するための命令を含み、距離はユークリッド距離、マンハッタン距離、チェビシェフ距離、ベクター間角度、ピアソン相関距離、二乗ユークリッド距離、標準ユークリッド距離、マハラノビス距離及びミンコフスキー距離からなる群から選択される距離測定法で測定される、請求項113記載のコンピュータシステム。
【請求項１１５】
前記モニタリングのための命令は、第1のトランス作用性因子活性プロファイルと第2のトランス作用性因子活性プロファイルとの間のユークリッド距離を計算するための命令を含む、請求項113記載のコンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一部、National Institutes of Health(NIH)/Small Business Innovation Research(SBIR)からの補助金、グラント番号CA101271-1及びCA101636-02で完成された。米国政府は、本発明に対する一定の権利を有する。
【０００２】
（1.技術分野）
本発明は、生物系で核ホルモン受容体及び転写因子などの複数のトランス作用性因子の活性を検出するために、ポリヌクレオチドレポーター系を利用する組成物、方法及びキットに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
（2.発明の背景）
細胞の素性及び挙動は、特定の細胞内で発現される遺伝子レパートリーによって決定される。ヒトゲノムに存在する約26,000遺伝子の中で、一部だけが特定の細胞型の中で与えられた時間に発現される。細胞は、変化する環境に適応するために、遺伝子の発現パターンを変化させる。遺伝子発現を調節するために、細胞によって複数の機構が使用される。例えば、通常遺伝子の非翻訳領域で見られるプロモーター及びエンハンサーなどの調節配列は、転写因子(TF)と呼ばれる細胞内DNA結合性タンパク質によって特異的に認識されるエレメントを含む。調節配列内のそれらの同族部位への転写因子の結合は、遺伝子転写を開始する基本転写機構の起用を制御する。転写を活性化するシス調節配列及び転写因子の能力は、転写活性と称される。遺伝子発現は、転写後レベルでも調節されることが知られている。例えば、多くのRNAは、RNA転写物の成熟、安定性及び又は分解を調節する、シス調節エレメントを含む。転写産物レベルを調節する複数の機構は、細胞が遺伝子発現のホメオスタシス調節を維持することを可能にする。
【０００４】
精巧に調整された調節の障害は、細胞死、形質転換又は代謝病を引き起こすことがある。従って、遺伝子発現を制御する機構の活性の評価を可能にする技術を正しく導入することが重要である。
【０００５】
例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質などの容易に検出されるレポータータンパク質は、細胞に導入されたレポーター構築物によって発現されるようにすることができる。しかし、レポータータンパク質を検出することは、複数の転写活性を測定することを目的とするアッセイにはあまり適さない。これは、一部、便利で迅速な検出に適合するタンパク質生成物の数が比較的少ないこと、並びに転写量及び異なるレポータータンパク質の間の安定性の差による。
【０００６】
例えば、遺伝子発現を評価する他の広いクラスの手法は遺伝子転写物の量の評価に基づき、例としてはノーザンブロット法、逆転写PCR及びRNAアレイハイブリダイゼーションがある。しかし、RNA存在量は転写調節、RNAプロセシング、蓄積及び分解を含む多くの機構によって調節されるので、これらの方法はシス調節配列及びトランス作用性因子の活性に関して限定された情報を提供するだけである。更に、複数の転写因子活性を検出するためのレポーター構築物ライブラリーの使用が記載されている(例えば米国特許出願2003/0148287及び2003/0143547を参照)ものの、レポーター構築物ライブラリーによって発現される異なるレポーターRNAの間に存在する、転写レベル、メチル化、安定性、ハイブリダイゼーション効率及びRNアーゼに対する感受性における差を含む、RNA存在量の検出と関連する問題は、対処されていない。
【０００７】
転写を開始するために転写因子をそれらの同族DNA配列と結合する必要があるので、DNA結合は転写因子活性化のマーカーとして広く使われている。ゲルシフト法、別名EMSAは、DNA結合を評価するための古典的な方法である。しかし、DNA結合から独立して複数の調節レベルで転写因子の活性に影響を及ぼすことができる、多くの機構が存在する(Baldwinの論文((2001)J Clin Invest 107:241-246))。従って、DNA結合アッセイは、転写を活性化する転写因子の能力に関して、限定された情報を提供するだけである。
【０００８】
様々な転写因子の調節障害は慢性炎症病態、自己免疫及び癌を含む様々なヒト疾患と関連している(Makarovの論文((2000)Mol Med Today 6:441-448)、Baldwinらの論文((2001)J:Clin Invest 107:241-246))ので、転写因子は薬剤開発のための魅力的な標的と考えられる。合成化合物又は生物学的化合物のライブラリーを、対象となる転写因子の転写活性を選択的に調整するそれらの能力についてスクリーニングするために、多数の転写因子のハイスループットプロファイリングを可能にする適当なアッセイを必要とする。これらの問題への対処を始めるために、当技術分野は多数の転写因子の活性のプロファイリングを可能にする技術を必要とする。この領域における進歩は、十分な手段がないために妨げられた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
レポーター配列の集団及びそれらの使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（3.発明の要旨）
一態様では、本発明は、レポーター転写単位(RTU)の集団を利用する組成物、方法及びキットに関し、集団の各RTUはレポーター配列、プロセシングタグ及び前記レポーター配列に機能的に結合するシス調節エレメントを含む。プロセシングタグはレポーター配列に、即ちその内部に又は隣接して配置することができる。下記のように、RTU内のレポーター配列は、例えば転写及び検出の効力で最小限の差を一般に示し、従って集団内でRTUの均一性の高い性能を与える。RTU集団内のレポーター配列間で実質的な同一性を示す実施態様においても、本明細書で記載されるプロセシングタグとのレポーター配列の組合せは、非常に低い非特異的バックグラウンドで検出される個々のレポーター種の最小限の交差干渉を与える。
【００１１】
一態様では、ポリヌクレオチドRTUを含むレポーター転写単位(RTU)集団を含み、各RTUはレポーター配列、レポーター配列に位置するプロセシングタグ及び前記レポーター配列に機能的に結合したシス調節エレメントを含む組成物が提供され、前記レポーター配列の転写はトランス作用性因子又は前記シス調節エレメントに結合する因子よって調整される。
【００１２】
ある実施態様では、RTU集団内のレポーター配列の非プロセシングタグ部分は、実質的に同一又は同一であってもよい。ある実施態様では、前記実質的に同一のレポーター配列は、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1つのヌクレオチドが異なる。いかなる特定の理論及び機構によっても束縛されるものではないが、実質的に同一のレポーター配列は検出条件の変更を最小にし、それによってRTU集団を再現性の非常に高い評価で用いることを可能にする。
【００１３】
一部の実施態様では、レポーター配列は10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1つのヌクレオチドが異なり、その差はレポーター配列内のプロセシングタグによるものである。
ある実施態様では、RTU集団のレポーター配列は、レポーター配列内のプロセシングタグの位置だけが異なる。
【００１４】
一部の実施態様では、RTUの集団は、2、10、50、100、500、1000、1500、2000、2500以上を超える非同一RTUを含む。従って、2、10、50、100、500、1000、1500、2000、2500以上を超えるトランス作用性因子又はシス調節エレメントの活性は、RTU集団を使って決定することができる。
【００１５】
レポーター配列内のプロセシングタグの位置は、非同一トランス作用性因子によって転写調整されるレポーター配列を有する任意の2つのRTUを区別することができる。プロセシングタグは、例えば、固有のチミン、アデニン、シトシン又はグアニンヌクレオチド残基、エンドヌクレアーゼ認識部位、プライマー配列、伸長終止シグナル、及び、欠失、挿入又は置換を含むレポーター配列の変異からなる群から選択することができる。
【００１６】
ある実施態様では、プロセシングタグは1ヌクレオチドと同じくらい短くてよく、さもなければRTU集団内の普通のレポーター配列内の単一又はいくつかのヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を表すことができる。
ある実施態様では、レポーター配列内のプロセシングタグの位置は、非同一シス調節エレメントを有する任意の2つのRTUを区別する。
【００１７】
一部の実施態様では、RTU集団内のシス調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、RNA安定性シグナル及びポリアデニル化シグナル又はそれらの組合せを含むことができる。一般的に、シス調節エレメントは、DNA結合タンパク質のために少なくとも1つの結合部位を有する。
【００１８】
他の態様において、本発明は本明細書で記載されるRTU集団を含むベクターの集団を提供する。
他の態様において、本発明は本明細書で記載されるRTU集団を含む細胞を提供する。ある実施態様では、RTU集団は細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。本発明の細胞は、例えば、植物、細菌、真菌及び脊椎動物からなる群から選択することができる。
【００１９】
他の態様では、本発明は細胞を含む組織又はヒト以外の生物を提供し、前記細胞は本明細書で記載されるRTU集団を含む。
一態様では、本発明は生物系内の複数のトランス作用性因子又は複数のシス調節エレメントの活性を測定する方法を提供し、前記生物系は本発明のRTU集団を含む。
【００２０】
例えば、RTU集団のメンバーによって発現されるレポーター配列のレポーター種は、単離及び一般的には増幅することができ、また、異なるレポーター種を区別するようにプロセシングすることができる。プロセシングは、例えば、(a)エンドヌクレアーゼでレポーター種を切断すること(但しプロセシングタグは制限部位である)、(b)ミスマッチ特異ヌクレアーゼでレポーター種を切断すること(但しプロセシングタグは前記レポーター種に相補性のハイブリダイゼーションポリヌクレオチドと一致しない1つ又は複数のヌクレオチドを含む)、(c)ウラシル-グリコシル化レポーター種の熱分解(但しプロセシングタグはさもなければウラシルを有しないレポーター種内にウラシルを含む)、及び、(d)レポーター種を増幅すること(但しプロセシングタグは増幅終止部位又はプライマー配列を含む)を含むことができる。
【００２１】
RTUのレポーター種は、例えば、プロセシングしたオリゴヌクレオチド検出プローブの検出によって検出することができる。検出プローブは、一般的に、プロセシングタグを含むRTUレポーター種に相補性である配列を含む。レポーター種の間の差、例えばプロセシングタグの位置の差、又は前記プロセシングタグを含むヌクレオチドその他の差のために、オリゴヌクレオチド検出プローブはレポーター種を識別するために使用することができる。一部の実施態様では、検出プローブは標識、例えばその蛍光特性はプロセシングによって調整することができる蛍光標識を更に含む。一部の実施態様では、検出プローブはアレイ内にあっても、固形基質に結合してもよい。
【００２２】
ある実施態様では、複数のトランス作用性因子又は複数のシス調節エレメントの活性を測定するための方法であって、レポーター配列のレポーター種をプロセシングすること、及びプロセシングしたレポーター種の少なくとも2つを検出することによって複数のトランス作用性因子又は複数のシス調節エレメントの相対活性を測定することを含む方法が提供される。
【００２３】
一部の実施態様では、RTU集団を含む生物系に及ぼす治療の影響を評価するための方法であって、ある生物系における複数の個々のトランス作用性因子又は複数の個々のシス調節エレメントの活性に及ぼす治療の影響を、前記治療を受けない生物系における前記複数の個々のトランス作用性因子又は前記複数の個々のシス調節エレメントの活性と比較して決定することを含む方法が提供される。
【００２４】
一部の実施態様では、ある生物系における複数のトランス作用性因子又は複数のシス調節エレメントの活性に及ぼす治療の影響を評価する方法であって、前記生物系はRTU集団を含み、前記生物系に治療を受けさせること、レポーター配列のレポーター種をプロセシングすること、及び、プロセシングしたレポーター種の少なくとも2つを検出することによって複数のトランス作用性因子又は複数のシス調節エレメントの活性に及ぼす前記治療の影響を評価することを含む方法が提供される。
【００２５】
ある生物系における複数のトランス作用性因子又は複数のシス調節エレメントの活性に及ぼす治療の影響を評価するために提供される方法の一部の実施態様において、前記方法は前記治療を受けた生物系における複数の個々のトランス作用性因子又は複数のシス調節エレメントの活性を、前記治療を受けない生物系における前記複数のトランス作用性因子又は前記複数のシス調節エレメントの活性と比較して測定することを更に含む。
【００２６】
一部の実施態様では、ある生物系のためにトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節活性プロファイルを作成する方法であって、前記生物系はRTU集団を含み、RTU集団のレポーター配列のレポーター種をプロセシングすること、及び、プロセシングしたレポーター種を検出することによって前記生物系のためにトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節活性プロファイルを作成することを含む方法が提供される。ある実施態様では、そのような方法は、RTU集団を含むある生物系のためにトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節活性プロファイルを記録、記憶又は伝達することを更に含む。一部の実施態様では、生物系のためのトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節活性プロファイルは、有形的表現媒体、例えば紙、プラスチック透明材又はコンピュータ可読記憶媒体で記録又は記憶される。
【００２７】
一部の実施態様では、本発明は細胞型を特定するための方法であって、対象となる細胞のために作成した第1のトランス作用性因子活性プロファイル(又は、第1のシス調節活性プロファイル)を細胞型が既知の細胞のために作成した第2のトランス作用性因子活性プロファイル(又は、第2のシス調節活性プロファイル)と比較して、前記第1のトランス作用性因子活性プロファイル(又は、第1のシス調節活性プロファイル)が前記第2のトランス作用性因子活性プロファイル(又は、第2のシス調節活性プロファイル)と一致するかを決定することを含む方法を提供し、前記第1のトランス作用性因子活性プロファイル(又は、第１のシス調節活性プロファイル)を前記第2のトランス作用性因子活性プロファイル(又は、第2のシス調節活性プロファイル)と比較したときに一致が見られると判断された場合は、前記対象となる細胞の細胞型は特定される。
【００２８】
一部の実施態様では、本発明は疾病状態を特定するための、対象となる細胞で作成したトランス作用性因子活性(又は、シス調節活性)プロファイルを所定の疾病状態の細胞のそれと比較することを含む方法を提供する。
【００２９】
一部の実施態様では、細胞内の対象となる分子の機能を評価するための、対象となる分子が細胞内に導入された細胞又は細胞内の対象となる分子の活性量が調整された細胞で作成したトランス活性化因子活性(又は、シス調節活性)プロファイルを、対象となる分子が存在しない細胞又は細胞内の対象となる分子の活性量が調整されていない細胞で作成したトランス活性化因子活性(又は、シス調節活性)プロファイルと比較することを含む方法が提供される。対象となる分子は、例えば、対象となるポリヌクレオチド又はポリペプチドでよい。例えば、対象となる分子がポリペプチドである場合は、細胞でその活性を調整することとは、例えば、酵素活性を増加又は抑制すること、結合活性を増加又は抑制すること、ポリペプチドの翻訳後修飾、その他を含むことができる。他の例として、対象となる分子がポリヌクレオチドである場合は、細胞内のその量を調整することとは、例えば、小さな干渉RNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどを用いる遺伝的組換え、ノックダウンなどによるその過剰発現、ノックアウト、その他を含むことができる。
【００３０】
一部の実施態様では、混合型細胞集団内の異なる細胞型の相対数を決定するための方法であって、前記混合型細胞集団は本発明のRTU集団を含み、前記細胞集団内の各細胞型は前記RTU集団の少なくとも1つのRTUメンバーを含み、前記方法は前記RTU集団によって発現されるレポーター配列をプロセシングすること、及び、検出されたプロセシングされたレポーター配列の相対量を測定することによって、混合型細胞集団内の異なる細胞型の相対数を決定することを含む方法が提供される。
【００３１】
他の態様において、本発明は本明細書で記載されるRTU集団を含むキットを提供する。本明細書で提供されるキットは、例えば、RTU集団を含む細胞又はベクターを含むことができる。一部の実施態様では、キットはその内容に応じてRTU集団の使用説明書、又はRTU集団を含む細胞若しくはベクターの使用説明書を更に含むことができる。
【００３２】
一部の実施態様では、キットはRTU集団を作製するのに用いられる、ポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、キットはプラスミドの集団を含むことができ、各プラスミドはレポーター配列、プロセシングタグ、及びそれによりシス調節配列をプラスミドに導入してレポーター配列に機能的に結合することができる、マルチクローニングサイトを含む。
【００３３】
ある実施態様では、キットは1つ又は複数のトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節活性プロファイルを含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
（5.詳細な説明）
本発明は、本発明の実施態様のすべてではないが一部を示す添付の実施例に関して、以下により完全に記載される。実際は、これらの発明は多くの異なる形で具体化することができるので、本明細書で示す実施態様に限定されると解釈されてはならない。むしろ、これらの実施態様は、この開示が適用される法定事項を満たすように提供される。
【００３５】
本明細書で示す本発明の多くの修正及び他の実施態様は、前述の記載及び関連図で提示される教示の利点を有する、これらの発明が関係する技術分野の当業者には思い浮かぶものである。従って、本発明は、開示される具体的な実施態様に限定されるものではなく、修正及び他の実施態様が添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されていることを理解されたい。本明細書で特異な用語が使用されているが、それらは一般的及び記述的意味合いだけで用いられ、限定が目的ではない。
冠詞「a」及び「an」は、本明細書で1つ又は複数(即ち、少なくとも1つ)の冠詞の文法上の目的語を指す意味で使われる。例として、「要素」は1つ又は複数の要素を意味する。
【００３６】
5.1.概要
本発明は、複数のトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性の同時プロファイリングを可能にする組成物、方法及びキットを提供する。本発明の成分はレポーター転写単位(RTU)であり、これはレポーター配列及びレポーター配列の発現レベルを調整するシス調節エレメントを含む。RTU発現は、レポーター配列のレポーター種(即ちRNA転写物)のレベルを測定することによって評価される。この手法の利点は、複数のトランス作用性因子又はシス調節エレメントを同時に評価することが可能になることである。そうするために、それぞれ識別可能なレポーター配列を有する個々のRTUを集めて集団にする。RTUの集団が生物系に送達されるとき、個々のRTUの転写は対応するトランス作用性因子の活性を忠実に反映する。
【００３７】
5.2.組成物
一態様では、ポリヌクレオチドの集団を含む組成物が提供され、各ポリヌクレオチドは、その位置は集団内で様々なレポーター配列を互いと区別するプロセシングタグを有するレポーター配列を含むDNA構築物を含む。ある実施態様では、DNA構築物はレポーター転写単位(RTU)を含む。
【００３８】
5.2.1.RTU
本明細書で使用するように、「レポーター転写単位」即ち「RTU」はレポーター配列に機能的に結合したシス調節エレメントを含み、シス調節エレメントの活性は対応する1つ又は複数のトランス作用性因子の存在下で調整される。
【００３９】
シス調節エレメントは、RNA転写物の存在量に影響するポリヌクレオチドを含む。シス調節エレメントは、例えば、レポーター配列の安定性、成熟又は転写を調整する任意の配列を含むことができる。そのようなシス調節配列としては、それらには限定されないが、プロモーター、エンハンサー、RNA安定性シグナル、ポリアデニル化シグナル、及びRNA転写物のレベルに影響を及ぼす他のいかなるシスエレメントがある。
【００４０】
レポーター転写産物の存在量が評価されているシス調節配列によって決定されるように、シス調節エレメントはレポーター配列に機能的に結合される。プロモーターを含むシス調節エレメントは、レポーター配列に近接してその上流側に通常置かれる。しかし、評価されているシス調節エレメントの性質に従い、そのエレメントはレポーター配列の上流、下流又は内部に置かれることができる。例えば、それらの配向性に関係なく作用することができるエンハンサー配列は、調節される配列の上流、下流又は内部に、及びしばしば、調節されている配列から遠い距離に置くことができる。シス調節エレメントの他の例は、RNA安定性を制御する調節配列を含む。これらのエレメントは、転写された配列内のコード領域内、イントロン内、又は3'若しくは5'の非翻訳領域内で見ることができる。シス調節エレメントは、転写産物のスプライシング及びポリアデニル化を調節する配列を更に含む。そのようなエレメントは、レポーター配列の転写される領域の中に位置することができる。
【００４１】
シス調節エレメントが転写調節領域及びプロモーターを含まない実施態様では、RTUは対象となる生物系で活性である転写調節領域に機能的に結合される。具体的な実施態様において、転写調節領域は構成的に活性であるか、誘導可能である。
【００４２】
RTUで使用されるシス調節エレメントは、生物系又はレポーター配列にとって未変性/類似、又は異種であることができる。本明細書で使用するように、配列に関して「異種」は、外来の種に由来する配列、又は、同じ種からとしても、故意の人為的介入により組成及び/又はゲノム遺伝子座がその未変性の形から相当修飾されている配列である。他の実施態様では、シス調節エレメントは天然体、天然配列の変異体又は合成配列でよい。
【００４３】
一実施態様では、RTUで使用されるシス調節エレメントは、プロモーターを含む。プロモーターは、以下の2つのエレメントを含む。基本転写機構の起用を促進する最小限のポリヌクレオチド配列、及び、転写因子によって特異的に認識される配列の1つ又は複数のコピー。そのような配列は未変性でも合成でもよい。与えられた対象となる転写因子のために存在する結合部位の数は、結合部位間の距離に従い変動する。具体的な実施態様では、結合部位はタンデム型である。当業者は、所望の活性について検査するために必要である、結合部位の適当な数を認識する。例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又はそれ以上の数の結合部位が、プロモーターに存在することができる。以下で述べるように、結合部位は当技術分野において既知である。例えば、転写因子結合部位の非限定的例を提供する表1〜3を参照されたい。与えられたプロモーターは、異なる転写因子からの1つ又は複数の結合部位を更に含むことができる。基本転写機構の起用を促進する最小限のポリヌクレオチド配列も、当技術分野で既知である。
【００４４】
【表１】
2008519605.tif 000003
【００４５】
シス調節エレメントがプロモーターを含むとき、RTUは未変性のプロモーター(即ち、自然界では最小限のプロモーター配列及び転写因子結合部位が一緒に見られる)を含むことができるが、例えば、転写因子結合部位に対して異種である最小限のプロモーターを有する異種プロモーターを使用することもできることを、当業者ならば認めると認識されている。
【００４６】
最小限のプロモーター配列及び転写因子結合部位の間の距離は、変動してもよい。例えば、最小限のプロモーター配列及び一番3'側の転写因子結合部位は直接に隣接してもよく、又は、プロモーターが転写活性を保持する限り、5、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000ヌクレオチド、若しくはそれ以上の範囲内でもよい。
【００４７】
シス調節エレメントの活性は、その対応するトランス作用性因子(即ちその活性を調節する1つ又は複数のトランス作用性因子)の存在下で調整される。「シス調節エレメント活性」は、シス調節エレメントに機能的に結合するヌクレオチド配列の転写レベルを調整する、シス調節エレメントの能力と定義される。一般には、シス調節エレメント活性の調整は、レポーター配列から転写されるRNA転写物のレベルの、適当な対照と比較した任意の統計学的に有意な増減を含む。例えば、シス調節エレメント活性の調整は、適当な対照と比較して少なくとも0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、140%、160%、200%又はそれ以上の、レポーター配列のレポーター種のレベルの増減を含む。シス調節エレメントの活性を検出する方法は、本明細書の他の場所で述べている。
【００４８】
RTUのシス調節エレメントは、レポーター配列に機能的に結合される。本明細書で用いる「機能的に結合された」は、2つ以上のエレメントの間の機能的結合を意味する。例えば、プロモーター及びレポーター配列の間の作動可能的結合は、レポーター配列の発現を可能にする機能的結合である。RNA安定性要素及びレポーター構築物の間の作動可能的結合は、RNA安定性エレメントによるレポーターRNA安定性の調整を可能にする機能的結合である。機能的に結合されたエレメントは、連続的でも又は不連続でもよい。
【００４９】
本明細書で使用するように、「レポーター配列」はその配列がプロセシングタグを含むポリヌクレオチド配列を含む。従って、プロセシングタグはレポーター配列内に位置し、即ち、プロセシングタグはレポーター配列の非プロセシングタグ部分内に位置することができるか、又はレポーター配列の非プロセシングタグ部分に隣接することができる。この標識は、本明細書の他の場所で詳述される。レポーター配列は、任意のポリヌクレオチドを含むことができる。レポーター配列は、生物系又はシス調節エレメントにとって未変性/類似、又は異種であることができる。レポーター配列は天然配列、天然配列の変異体又は合成配列でもよい。例えば、レポーター配列は遺伝子、コード領域、エクソン又はイントロン、又はこれらの各構造物の任意の断片を含むことができる。或いは、レポーター配列は、合成DNAオリゴヌクレオチドを含むことができる。更に、レポーター配列はポリペプチドをコードすることもあるし、又はしないこともある。レポーター配列は、受容体及び供与体スプライス部位、ポリアデニル化シグナル及び転写終止シグナルなどの細胞機構による転写後修飾のためのシグナルを含むこともある。
【００５０】
具体的な実施態様では、レポーター配列は以下の基準の1つ又は複数を満たすように選択される。(1)バックグラウンドを最小にするために、レポーター配列は宿主細胞のゲノムに存在することができない、(2)偽の転写を排除するために、レポーター配列は、対象となる生物系で見られる内因性のトランス作用性因子のための結合部位を欠くことができる、(3)レポーター配列は、対象となる生物系の転写機構によってRNAに有効に転写されなければならない、及び、(4)レポーター配列は、時期尚早に転写を終了するエレメントを有してはならない。従って、レポーター配列の設計において、生物系で発現及び/又は安定性を強化することが既知であるいくつかの配列修飾は、レポーター配列の設計に際して有用であることを当業者は認識する。例えば、レポーター配列は、ポリアデニル化シグナル及び/又は転写を終了する転写終止シグナル(ターミネーター)を含むことができる。レポーター配列への更なる修飾としては、例えば、偽のポリアデニル化シグナル、エクソン‐イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、及び遺伝子発現に有害である可能性のある特徴の明らかにされた他の配列をコードする配列の除去がある。配列のGC含量は、その生物系で発現される既知遺伝子を参考にして計算されるような、与えられた生物系の平均的なレベルに調節することができる。更に、レポーター配列は、予測されるヘアピン二次mRNA構造物を避けるように設計することができる。
【００５１】
レポーター配列は、任意の長さでよい。当業者は、所望の検出方法のための適当な長さを認識する。具体的な実施態様において、レポーター配列は15nt、35nt、55nt、75nt、95nt、110nt、125nt、155nt、175nt、200nt、250nt、275nt、300nt、350nt、400nt、450nt、500nt、550nt、600nt、650nt、700nt、750nt、800nt、850nt、900nt、950nt、1000nt、1050nt、1100nt、1150nt、1200nt、1300nt、1400nt、1500nt、1600nt、1700nt、2000nt、2500nt、3000nt、又はそれ以上である。
【００５２】
RTUを調製する際には、適切な読み枠(該当する場合)内で適切な配向の配列を提供するように、及び、シス調節エレメント及びレポーター配列が機能的に結合されるように、様々な断片を操作することができる。この目的のために、アダプター若しくはリンカーを用いて断片を結合することができ、又は、都合のよい制限部位の提供、余分なポリヌクレオチド配列の除去、制限部位の除去、その他のために、他の操作が含まれてもよい。この目的のため、in vitro突然変異誘発、プライマー修復、切断、アニーリング、再置換、例えば転位及び転換が含まれてもよい。
【００５３】
5.2.2.プリヌクレオチドの集団
レポーター配列を有するDNA構築物を含む単離されたポリヌクレオチドの集団が提供され、各レポーター配列は固有のプロセシングタグを含み、プロセシングタグの位置は集団内のDNA構築物のそれぞれで異なる。下でより詳細に説明されるように、具体的な実施態様において、集団内のレポーター配列はお互いと実質的に同一である。
【００５４】
他の実施態様では、レポーター配列に機能的に結合されたシス調節エレメントを有するRTUを含む、単離されたポリヌクレオチドの集団が提供される。集団内の与えられたRTUで同じシス調節エレメントが同じレポーター配列と使用されるように、RTUはポリヌクレオチドの集団内で異なる。レポーター配列及びシス調節エレメントの間のこの関係は、与えられたシス調節エレメントの活性を転写されたレポーター種のレベルと関連させることを可能にする。更に、集団内の各RTUは、固有のプロセシングタグをレポーター配列内に含み、このプロセシングタグは集団内の各RTUのレポーター種を識別することができる。例えば、プロセシングタグは、集団の各RTU内の異なる位置でレポーター配列に挿入することができる。他の例として、プロセシングタグはヌクレオチド数又はヌクレオチド型が異なることができ、また、RTUのレポーター配列内の異なる場所に置くことができる。具体的な実施態様では、与えられた集団内の各RTUは、プロセシングタグの外部に実質的に同一又は完全に同一のレポーター配列を含む。
【００５５】
本明細書で使用するように、「プロセシングタグ」は、レポーター種又は相補性検出プローブの既定部位又は複数の既定部位でのプロセシングを可能にして、集団内の各レポーター配列のプロセシングされたレポーター種を識別する手段を提供する任意のヌクレオチド、又はヌクレオチドの任意の組合せを意味する。「プロセシング」は、レポーター種又は相補性検出プローブのプロセシングタグによって規定された位置でのプロセシングを可能にして、識別可能なレポーター種又は識別可能な相補性検出プローブを生成する任意の方法を意味する。代表的なプロセシングタグとしては、それらには限定されないが、特有のチミン、アデニン、シトシン又はグアニンのヌクレオチド残基、エンドヌクレアーゼ認識部位、及び一般的なプライマー配列がある。これらの標識をプロセシングして、それによってレポーター配列を識別する方法は、本明細書の他の場所で詳述する。集団で使用される「特有の」プロセシングタグは、一般的な標識でよい(即ち、標識は集団内の各レポーター配列で同一であり、レポーター配列内のその位置だけが異なる)。或いは、集団で使用される「特有の」プロセシングタグは、集団内の他の標識非同一であってよい。「非同一の」プロセシングタグは、同じクラスのプロセシングタグに分類される異なるプロセシングタグを包含する(即ち異なる制限酵素認識配列、異なるプライマー配列、その他)。非同一のプロセシングタグは、異なるクラスのプロセシングタグに分類される、異なるプロセシングタグも包含する。そのような異なるクラスのプロセシングタグは、本明細書の他の場所で述べる。複数の特有なプロセシングタグが、単一のRTUに存在する可能性も認識されている。従って、単一のRTUが1、2、3、4、5、6、7、10又はそれ以上の特有のプロセシングタグを有することもあり、与えられたRTU内の複数のプロセシングタグのそれぞれはお互いに同じであるか、或いは、RTUの標識の1つ又は複数はお互いに非同一であってよい。
【００５６】
ある実施態様では、プロセシング後、個々のレポーター配列のレポーター種は、識別可能な断片を生成する。本明細書の他の場所で議論されるように、現在の分離方法は非常に高い精度でDNA及びRNA種を分離することを可能にする。従って、具体的な実施態様において、レポーター種の多数の識別可能なプロセシング生成物を、比較的短い一般的なレポーター配列から調製することができる。例えば、一般的な、2,000bpの長さのレポーター配列内で1塩基対のステップでプロセシングタグの位置を変えることにより、2,000の識別可能なレポーター種を生成することが可能である。従って、一般的なプロセシングタグの相対位置は、レポーター配列の集団内でわずか1、2、5、10、25、50、95、100、150、200又はそれ以上のヌクレオチドが異なることができる。ヒトゲノムは推定で約1,000〜2,000の転写因子を含むので、すべてのヒト転写因子のプロファイリングを可能にするRTUの集団を生産することはまったく可能である。従って、2、10、50、100、500、1000、1500、2000、2500、又はそれ以上より多くのシス調節エレメント及び/又はトランス作用性因子の活性を決定することができる。
【００５７】
ある実施態様では、個々のレポーター配列のレポーター種は、レポーター種を1つ又は複数の検出プローブと接触させ、任意選択で、検出プローブ及びレポーター種のヘテロ二本鎖をプロセシングすることによって識別される。一般的に、与えられた検出プローブ(又はその中の部分)は、プロセシングタグを含むかそれと重なる特定のレポーター種内で、相補配列と共に二重鎖を形成する。一部の実施態様では、与えられた検出プローブ(又はその中の部分)は、プロセシングタグ及びプロセシングタグに隣接するレポーター配列の1つ(複数)の部分の両方を含むかそれらと重なる特定のレポーター種内で、相補配列と共に二重鎖を形成する。一部の実施態様では、検出プローブはプロセシングタグの両側に位置するレポーター配列の部分に相補性である。検出プローブは一般的にオリゴヌクレオチドを含み、更に、1つ又は複数の標識、失活剤、などを含むことができる。
【００５８】
「集団」は、2つ以上(例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、250又はそれ以上)の異なるポリヌクレオチドを含む群又は集合を意味する。
【００５９】
具体的な実施態様では、RTUの集団内のレポーター配列は、同等の効率で転写される。「同等の転写効率」は、それらの配列が同一の転写調節エレメントの制御下にあるときに、各レポーター配列(1つ又は複数のプロセシングタグを含む)がほぼ等しい効率で発現されることを意味する。同等の転写効率としては、約0.1%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45% 50%未満の発現量の差がある。
【００６０】
「実質的に同一の」レポーター配列は、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1つのヌクレオチド塩基の置換及び/又は内部ヌクレオチド付加及び/又は欠失の点で異なる、ポリヌクレオチドを意味する。或いは、「実質的に同一の」レポーター配列は、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を示すことができる。同一性割合を測定する方法は、本明細書の他の場所で開示される。具体的な方法及び組成物において、集団内の実質的に同一のレポーター配列は、5未満の、2未満の、又は1つのヌクレオチド塩基の置換及び/又は内部ヌクレオチド付加及び/又は欠失の点で異なる。
【００６１】
一般的に、「実質的に同一の」レポーター配列の間の差は、レポーター配列内のプロセシングタグによる。例えば、ある実施態様において、プロセシングタグ外のレポーター配列は、集団内の任意の2つのRTUの間で同一である。しかし、ある実施態様において、「実質的に同一の」レポーター配列は10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1つのヌクレオチド塩基の置換及び/又は内部ヌクレオチド付加及び/又は欠失の点で異なるか、或いは、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を示すことができ、その場合、レポーター配列の差はプロセシングタグを含まない。
一部の実施態様ではRTU集団が提供され、そこでは各RTUのレポーター配列は分泌されたアルカリホスファターゼ(SEAP)配列のcDNAの断片、及びHpaI制限部位プロセシングタグを含む。
【００６２】
一部の実施態様では、RTUはレポーター配列の一部の5'末端(即ち5'プライマー配列)及び3'末端(即ち3'プライマー配列)に隣接するプライマー配列を更に含む。一実施態様では、プライマー配列はレポーター配列全体の両端に位置する。しかし、プライマー配列はレポーター配列全体の両端に位置する必要はなく、むしろ5'及び3'プライマーはレポーター配列の任意の適当な領域が増幅されるように位置することができると認識されている。具体的な組成物及び方法において、与えられた集団では、各RTUで使用されるプライマー配列は同一である。これは、集団内の各RTUからのレポーター配列転写産物の、同一のPCR増幅条件での増幅を可能にする。5'及び3'プライマーは、PCRで効果的に使用される任意のポリヌクレオチドを含むことができる。そのような配列は、当技術分野において既知である。例えば、本明細書で参照により完全に組み込まれているSaikiらの論文((1986)Science 230:1350-54)、Sambrookらの著書((1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Harbor Laboratory Press,New York)及び米国特許第6653079号を参照されたい。
【００６３】
本発明の組成物及び方法は、トランス作用性因子の活性を検出することができる。「トランス作用性因子」は、in transのシス調節エレメントの活性を調整することによって、生物系でレポーター種のレベルを調整する、任意の因子を意味する。トランス作用性因子は、直接的又は間接的に、シス調節エレメントの活性を調整することができる。シス調節エレメントは複数のトランス作用性因子によって調節されることがあると、認識される。従って、このクラスのRTUは、シス調節エレメントの活性を調整する経路のより複雑な活性を評価するために用いることができる。そのようなトランス作用性因子としては、それらには限定されないが、転写因子、RNA安定性を調節する因子、核内受容体、転写アクチベーター、転写リプレッサー、異種トランス活性化ドメインにインフレームで融合するDNA結合ドメインを含むキメラタンパク質、RNA安定性を調節する因子及びRNA成熟を調節する因子がある。更に、トランス作用性因子の活性は、様々な刺激、例えばそれらには限定されないが、炎症性刺激、ストレス刺激、発達若しくは細胞分化シグナル、発癌シグナル、毒素、生体異物又は薬剤によって調整することができる。
【００６４】
対応するシス調節エレメントがRTU内に存在する限り、任意のトランス作用性因子の活性を分析することができる。具体的な実施態様では、トランス作用性因子は転写因子である。他の実施態様では、トランス作用性因子は真核生物転写因子である。そのような転写因子のいくつかのクラスが存在し、例としては、ホメオドメインタンパク質、ジンクフィンガータンパク質(C2H2ジンクフィンガー、C4ジンクフィンガー、C6ジンクフィンガー)、ウイングド(winged)ヘリックス(フォークヘッド)タンパク質、ロイシンジッパータンパク質及びヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質がある。
【００６５】
具体的な方法及び組成物において、1つ又は複数の炎症性及び/又はストレス反応性トランス作用性因子の活性がモニタリングされる。「炎症性又はストレス反応性のトランス作用性因子」は、ストレス又は炎症性反応の条件下でレポーター種のレベルを調整するトランス作用性因子を意味する。具体的な実施態様において、そのような転写因子としては、それらには限定されないが、NF-κB、NF-AT、AP-1、C/EBP、Ets-1、Elk、GR、PPAR、c-Rel、ATF2、c-Fos、CREB-1又はRXRがある。
【００６６】
他の方法及び組成物では、1つ又は複数の増殖性腫瘍関連トランス作用性因子の活性がモニタリングされる。「増殖性腫瘍関連トランス作用性因子」は、その活性が細胞周期、細胞増殖及び/又はアポトーシスを調整するトランス作用性因子を意味する。無調節なシグナル伝達は、癌の証明である。腫瘍形成の多段過程の間、細胞は、最終的に情報伝達経路の異常調節に導く変化を蓄積する。シグナル伝達網の異常調節は、細胞増殖、アポトーシス及び分化に関係する多数の遺伝子の発現を制御する転写因子の構成的活性化に至る。腫瘍形成に緊密に関係するいくつかのトランス作用性因子の特徴は、かなり明らかにされている。そのような因子としては、それらには限定されないが、腫瘍形成の抑制で重要な役割を演ずる、網膜芽細胞腫(Rb)腫瘍サプレッサータンパク質がある。Rbの重要な調節標的は、S期への移行及びDNA複製の開始の重要な調節因子である、転写因子E2Fである。Rb/E2F経路の調整は、実質的にすべてのヒト癌で見られる(Nevinsの論文((2001)Hum Mol Genet 10(7):699-703))。腫瘍形成の他の調節因子は、TP53遺伝子の生成物である転写因子p53である。p53は、細胞周期停止及びアポトーシスを誘導することによってゲノム不安定性及び癌遺伝子発現から保護する、腫瘍サプレッサーの役目を果たす。p53は多くの化学療法薬に応じて潜在的に活性化され、特定のプロアポトーシス遺伝子の調節を通して細胞死を促進する。腫瘍発達の予防におけるp53の重要性は、それがすべてのヒト癌の約50%で不活性化される事実により示される(Hollsteinらの論文((1991)Science 253(5015);49-53)、O'Connorらの論文((1997)Cancer Res.57:4285-4300)、Levineのレビュー((1997)Cell 88(3):323-31)、Hickmanらの論文((2002)Curr.Opin.Genet.Dev.12(1)60-6)、Vogelstein及びKinzlerの論文((2004)Nat.Med.10(8):789-99))。プロトオンコジーンc-Mycは、重要な細胞周期調節因子の発現を刺激又は抑制することによって、生育調節及び細胞周期進行で重要な役割を演ずる転写因子である。Mycの無秩序な発現は、細胞増殖及びアポトーシスを誘導して、分化を抑制する(Lutzらの論文((2002)Biochim.Biophys.Acta 1602(1):61-71))。c-myc対立遺伝子の変異又は増幅の活性化は多くのヒト癌でしばしば見られ、腫瘍形成におけるc-Mycの重要な役割を示している(Nesbitらの論文((1999)Oncogene 18(19):3004-16))。Wnt経路の標的であるプロトオンコジーンβ-カテニンは、細胞接着及び細胞極性の制御に関係する。β-カテニンは、TCF/LEFファミリーのDNA結合タンパク質との結合後に転写を活性化する、転写補活性化因子である。β-カテニンを活性化する(β-カテニン安定性の負の調節因子、例えば腫瘍サプレッサーAPCの不活化、又は、β-カテニン自体の構成的活性化により)変異は、癌と関連するβ-カテニン/TCF依存性遺伝子、例えばサイクリンD1、c-Myc、シクロオキシゲナーゼ(COX)-2、その他の構成的発現をもたらす。β-カテニン/TCFで媒介される遺伝子転写の活性化は、結直腸癌及び黒色腫ではありふれた現象である(Korinekらの論文((1997)Science 275(5307):1784-7)、Morinらの論文((1997)Science 275(5307):1787-90)、Rubinfeldらの論文((1997)Science 275(5307):1790-2)、Foddeらのレビュー((2001)Nature Rev Cancer 1(1):55-67)、Polakisの論文((2000)Genes Dev 14(15):1837-51)、Vogelstein及びKinzlerの論文((2004)Nat Med 10(8):789-99))。転写因子NF-κBは、病原体及びストレスへの炎症性反応の重要な調節因子である。最近の開発により、癌におけ���NF-κBの重要な役割が明らかになった。NF-κB経路の活性化は、細胞周期制御に関係するタンパク質、例えばc-Myc及びサイクリンD1の発現を活性化することによって、また、癌細胞でアポトーシスを抑制することで、腫瘍形成に寄与する(Baldwinの論文((2001)J Clin Invest 107:241-246))。NF-κBの構成的活性化は、小児急性リンパ芽球性白血病(ALL)(Kordesらの論文((2000)Leukemia 14(3):399-402))、ホジキン病腫瘍細胞(Bargouらの論文((1997)J Clin Invest 100(12):2961-9))、及び原発性乳腺腫瘍(Nakshatriらの論文((1997)Mol Cell Biol.17(7):3629-39)、Romieu-Mourezらの論文((2001)Cancer Res 61(9):3810-8))を含む多くのヒト癌で見られる。レトロウイルスv-junオンコジーンの細胞祖先c-junプロトオンコジーンは、Jun、Fos又はATFタンパク質ファミリーメンバーからなる二量体の集合を表す転写因子AP-1の主成分をコードする。AP-1による遺伝子調節は細胞の増殖及び分化にとって重要であり、構成的AP-1活性化は腫瘍形成へ至る可能性がある(Vogtの論文((2001)Oncogene 20:2365-2377))。AP-1によって調節される異なるケラチン遺伝子は様々な癌腫で一貫して過剰発現され(Oshimaらの論文((1996)Metastasis Rev.15,445-471))、AP-1のトランス活性化機能は表皮細胞での腫瘍促進に必要である(Youngらの論文((1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9827-9832))。c-fosプロトオンコジーンは、皮膚腫瘍の悪性進行のために必要である(Saezらの論文((1995)Cell 82:721-732))。転写因子環状AMP応答エレメント結合タンパク質(CREB)は、細胞内cAMPの上昇に続いてcAMP応答エレメント(CRE)含有プロモーターの転写を活性化する。CREBの発現及び転写活性並びに強く関連する転写因子ATF-1は転移性黒色腫細胞で上方制御され、CREBの支配的陰性形態はそれらの腫瘍形成能及び転移能力を抑制する(Jean及びBar-Eliの論文((2001)Crit.Rev.Immunol.21(1-3):275-86))。これらの数例は、トランス作用性因子活性の異常な調節が癌の開始及び進行の中心にあることを示すのに役立つ。腫瘍形成との関係が示唆される多数のトランス作用性因子には、他の転写因子、例えばGli(Ruiz i Altabaらの論文((2002)Nat.Rev.Cancer 2(5):361-72))、フォークヘッド/HNF-3(Hromas及びCostaの論文((1995)Crit.Rev.Oncol.Hematol.20(1-2):129-40)、Accili及びArdenの論文((2004)Cell 117(4):421-6))、及びある種のSMAD(Piek及びRobertsの論文((2001)Adv.Cancer Res.83:1-54))も含まれる。更に、いくつかの転写因子(p53を含む)は、化学療法及び放射線に応答して活性化される。例えば、NF-κBは癌療法に曝露した後に癌細胞内で強力に活性化され、この応答は「誘導可能な化学的抵抗」として知られる機構を制御する(Baldwinの論文((2001)J.Clin.Invest.107:241-246))。表1〜3は、代表的な転写因子及び代表的なDNA結合部位の、非限定的リストを提供する。
【００６７】
上記のように、シス調節エレメントの変異体も本発明で使用することができる。「変異体」は、実質的に類似した配列を意味する。ポリヌクレオチドについては、変異体は5'及び/若しくは3'末端の欠失(即ちトランケーション)、未変性のポリヌクレオチドの1つ又は複数の内部部位の1つ又は複数のヌクレオチドの欠失及び/若しくは付加、並びに/又は未変性のポリヌクレオチドの1つ又は複数の部位の1つ又は複数のヌクレオチドの置換を有するポリヌクレオチドを含む。本発明が包含する変異体ポリヌクレオチド(即ち変異体シス調節エレメント)は生物学的に活性であり、即ち未変性のポリヌクレオチドの所望の生物的活性を所有し続け、即ち、それらはレポーター配列からの転写産物のレベルを調整する能力を保持する。例えば、生物学的に活性なプロモーター配列は、転写活性を調整する能力、転写因子を結合する能力、又は基本転写機構を起用する能力を保持する。生物学的に活性なRNA安定エレメントは、RNA転写物の安定性に影響を及ぼす能力を保持する。
【００６８】
例えば表1及び3で示唆されているように、ある転写因子は変異体シス調節エレメントと結合することができる。従って、ある実施態様において、集団内の異なるRTUは、同一のレポーター配列/プロセシングタグの組合せに機能的に結合した、非同一のシス調節配列を有することができる。例えば、これは、2つの異なるシス調節配列と結合することが既知である、与えられた転写因子の活性を評価する場合に役立つ。通常、異なる転写因子の活性を区別する能力が維持されるまで、そのようなリダンダンシーをRTU集団に導入することができる。
【００６９】
本明細書で使用するように、「未変性の」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、それぞれ天然のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドでは、これらのような天然の変異体は、周知の分子生物学手法を使って、例えば、下で概説するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及びハイブリダイゼーション手法で特定することができる。変異体ポリヌクレオチドとしては、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて生成したような、合成的に誘導したポリヌクレオチドも挙げられる。通常、本発明の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明細書の他の場所で記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定されるように、その特定のポリヌクレオチドと少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の配列同一性を有する。本発明の方法で使用されるポリヌクレオチドの生物学的に活性な変異体は、そのタンパク質とはわずか1〜15ヌクレオチド塩基、わずか1〜10、例えば6〜10、わずか5、わずか4、3、2又は1つのヌクレオチド塩基が異なるだけでもよい。
【００７０】
突然変異誘発及びポリヌクレオチド改変のための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Kunkelの論文((1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492)、Kunkelらの論文((1987)Methods in Enzymol.154:367-382)、米国特許第4873192号、Walker及びGaastra編((1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,New York))及びその中の引用文献を参照されたい。
【００７１】
変異体ポリヌクレオチドは、DNAシャフリングのような突然変異誘発及び組換えの手法に由来する配列も包含する。そのような手法により、1つ又は複数の異なるポリヌクレオチド配列を操作して、基本転写機構の起用を促進するか又は転写因子のための結合部位である、新しい最小限のポリヌクレオチド配列を生成することができる。このように、組換えポリヌクレオチドのライブラリーは、実質的な配列同一性を有し、in vitro又はin vivoで相同的に組み換えることができる配列領域を含む関連した配列ポリヌクレオチドの集団から生成される。そのようなDNAシャフリング手法は、当技術分野において既知である。例えば、Stemmerの論文((1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751)、Stemmerの論文((1994)Nature 370:389-391)、Crameriらの論文((1997)Nature Biotech 15:436-438)、Mooreらの論文((1997)J.Mol.Biol.272:336-347)、Zhangらの論文((1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4504-4509)、Crameriらの論文((1998)Nature 391:288-291)、並びに米国特許第5605793号及び5837458号を参照されたい。
【００７２】
本明細書で使用するように、「参照配列」は配列比較の基礎として用いる、定義済みの配列である。参照配列は特定の配列のサブセット又は全体であることができ、例えば、完全長cDNA若しくは遺伝子配列の部分、又は完全なcDNA若しくは遺伝子配列などでよい。本明細書で使用するように、「比較ウィンドウ」はポリヌクレオチド配列の連続している特定の部分を指し、その比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列は、それらの2つの配列の最適アラインメントに関して参照配列(付加及び欠失を含まない)と比較して付加又は欠失(即ちギャップ)を含むことができる。通常、比較ウィンドウは長さが少なくとも20の連続したヌクレオチドであり、任意選択に、30、40、50、100以上でもよい。当業者は、ポリヌクレオチド配列内にギャップが含まれることが原因の参照配列との高い類似性を避けるために、一般的にギャップペナルティが導入されてマッチ数から引かれることを理解する。
【００７３】
配列関係は、コンピュータで実行されるアルゴリズムを使用して分析及び記載することができる。2つ以上のポリヌクレオチド又は2つ以上のポリペプチドの間の配列関係は、その配列の最良のアラインメントを決定してアラインメント内のマッチ及びギャップを評価することにより決定することができ、これから配列同一割合及び配列類似割合が求められる。ポリヌクレオチドの関係も、それぞれがコードするポリペプチドの比較に基づいて記載することができる。配列の比較及び分析のための多くのプログラム及びアルゴリズムは、当技術分野で周知である。
【００７４】
特に明記しない限り、本明細書で提供される配列同一性/類似性の値は、以下のパラメータを使ってGAP Version 10(GCG、Accelrys、San Diego、CA)で得られた値:50のGAP Weight及び3のLength Weight、並びにnwsgapdna.cmpスコアリングマトリックスを用いたヌクレオチド配列の同一性割合及び類似性割合、8のGAP Weight及び2のLength Weight、並びにBLOSUM62スコアリングマトリックスを用いたアミノ酸配列の同一性割合及び類似性割合(Henikoff及びHenikoffの論文((1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:10915)、又はその任意の同等プログラムで得られた値を指す。「同等プログラム」は、問題の任意の2つの配列のために、GAP Version 10によって生成された対応するアラインメントと比較して、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のマッチ及び同一の配列同一性割合を有するアラインメントを生成する、任意の配列比較プログラムを意味する。
【００７５】
GAPは、Needleman及びWunsch((1970)J.Mol.Biol.48:443-453)のアルゴリズムを使用して、マッチ数を最大にしてギャップ数を最小にする2つの完全な配列のアラインメントを見つける。GAPはすべての可能なアラインメント及びギャップ位置を考慮して、マッチした塩基が最多でギャップが最少のアラインメントを作成する。それは、マッチした塩基の単位での、ギャップ生成ペナルティ及びギャップ伸長ペナルティの提供を可能にする。GAPは、それが挿入する各ギャップについてマッチのギャップ生成ペナルティ数から利ざやを稼がなければならない。0を超えるギャップ伸長ペナルティが選択されるならば、GAPは、挿入された各ギャップについてギャップの長さ掛けるギャップ伸長ペナルティを利用しなければならない。タンパク質配列のためのGCG Wisconsin Genetics Software PackageのVersion 10におけるデフォルトギャップ生成ペナルティ値及びギャップ伸長ペナルティ値は、それぞれ8及び2である。ヌクレオチド配列では、デフォルトギャップ生成ペナルティは50であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは3である。ギャップ生成及びギャップ伸長ペナルティは、0から200の整数からなる群から選択される整数で表すことができる。従って、例えば、ギャップ生成及びギャップ伸長ペナルティは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65以上であることができる。
【００７６】
本明細書で使用するように、2つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列との関連で「配列同一性」又は「同一性」は、特定の比較ウィンドウにわたって最大の対応のために整列させたときに、その2つの配列内で同じ残基を指す。本明細書で使用するように、「配列同一性割合」は、比較ウィンドウにわたって2つの最適に整列させた配列を比較することによって決定された値を意味し、その比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の一部は、それらの2つの配列の最適アラインメントに関して参照配列(付加及び欠失を含まない)と比較して付加又は欠失(即ちギャップ)を含むことができる。百分率は、両方の配列で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が見られる位置の数を求めてマッチした位置の数を出し、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に100を掛け算して配列同一性の百分率を求めることにより計算される。
【００７７】
RTUを含むポリヌクレオチドの集団は、少なくとも1つの較正用RTUを更に含むことができる。本明細書の他の場所で更に詳細に議論されるように、具体的な実施態様において、集団内の較正用RTUはトランス作用性因子活性プロファイルを決定するときに用いることができる。本明細書で使用するように、「較正用RTU」はレポーター配列に機能的に結合された転写調節領域を有するポリヌクレオチドを含む。転写調節領域は、RTU集団を評価する細胞型で、及び発育段階で、転写を指示することができるポリヌクレオチド配列を含む。較正用RTU及びRTUの集団は同じ実験条件下で検出され、同じプライマー対で増幅されるので、較正用RTUからの転写産物の評価は、RNAの完全性、PCR阻害剤の存在の可能性及びPCR増幅の効力のための内部標準を提供する。較正用RTUは、定量的評価のための参照シグナルを提供するのに用いることもできる。
【００７８】
構成的転写調節領域の例としては、ウイルス遺伝子及び/又はハウスキーピング遺伝子の調節領域がある。そのような調節領域としては、βアクチンプロモーター(Miyamotoらの論文((1987)Nucleic Acid Research 15:9095)及びGenBank Acc.No.Y00474)、β-2-ミクログロブリンプロモーター(GenBank Acc.No.AF092744、ホモサピエンス、及びGenBank Acc.No.AY04812、ハツカネズミ)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ウイルスCMVプロモーター、バクチンプロモーター並びにウイルスSV40プロモーターがある。
【００７９】
与えられた集団は、複数の較正用RTUを含むことができる。複数の較正用RTUが使用されるとき、集団内で同じ構成的転写調節領域が同じレポーター配列と使用される。与えられたRTU集団は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の較正用RTUを含むことができる。
【００８０】
5.2.3.ベクター及び生物系
一態様では、上記のサブセクションで記載されるポリヌクレオチドの集団を含む、ベクター及び生物系が提供される。
【００８１】
用語「ポリヌクレオチド」の使用は、本発明を、DNAを含むポリヌクレオチドに限定することを意図するものではない。当業者は、ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの組合せを含むことができることを認識する。そのようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは、天然分子及び合成類似体を含む。本発明のポリヌクレオチドは、それらには限定されないが一本鎖形及び二本鎖形を含むすべての形態の配列も包含する。
【００８２】
RTUを含むポリヌクレオチド又はレポーター配列を含むDNA構築物は、対象となる生物系への配列の導入のために、ベクター内で提供することができる。「ベクター」は、それと結合する他の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。そのようなベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージミド、他のDNA部分を連結することができる環状二本鎖DNAループ、又は他のDNA部分をウイルスのゲノムに連結することができるウイルスのベクターがある。ベクターは宿主細胞内での自律複製に役立つか、又は宿主細胞への導入後に宿主細胞のゲノムに組み込むことができて、それによって宿主ゲノムと共に複製される(例えば非エピソーム哺乳動物ベクター)。一般には、組換えDNA技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミド(ベクター)の形態である。しかし、本発明はウイルスベクター(例えば複製欠陥レトロウイルス、レンチウイルスベクター、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)などの、同等機能を有する他の形態の発現ベクターを含むものとする。ベクターは、選択可能なマーカーなどの、生物を同時形質転換する少なくとも1つの他の遺伝子を、更に含むことができる。或いは、更なる遺伝子は別のベクターで提供することができる。
【００８３】
一部の実施態様ではベクターの集団が提供され、各ベクターはマルチクローニングサイトなどの部位を含み、プロセシングタグを有するシス調節配列及び/又はレポーター配列をベクターに導入することができる。
【００８４】
例えば、ある実施態様ではベクターの集団が提供され、各ベクターはi)実質的に同一のレポーター配列の集団のメンバー、但しレポーター配列集団の各レポーター配列は特有の位置に置かれたプロセシングタグを有し、及びii)シス調節配列がその部位に導入されてレポーター配列に機能的に結合するようにマルチクローニングサイトを含む。他の例としてベクターの集団が提供され、各ベクターはシス調節配列及びマルチクローニングサイトを含み、レポーター配列をマルチクローニングサイトに導入してシス調節配列に機能的に結合することができる。  
【００８５】
一部の実施態様では、本発明はベクターの集団を提供し、ベクター集団内の各ベクターは前のサブセクションで記載されるようなRTU集団のメンバーを含む。
本発明の方法は、生物系に対してポリヌクレオチドを提供する。「生物系」は、シス調節エレメント又はトランス作用性因子の相対活性の測定を可能にする、任意の系を意味する。そのような系としては、それらには限定されないが、無細胞抽出液、タンパク質の混合、細胞、器官培養又は多細胞生物がある。
【００８６】
「導入する」は、その配列が宿主細胞の内部に接近するように、宿主細胞にポリヌクレオチドを提供することを意味する。本発明の方法は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するために、特定の方法によらない。ポリヌクレオチドを様々な生物に導入する方法は当技術分野で既知であり、例としては、それらには限定されないが、安定的トランスフェクション法、一時的なトランスフェクション法及びウイルス媒介による方法がある。「安定的トランスフェクション」は、宿主細胞に導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その後代によって受け継がれることを意味する。「一時的トランスフェクション」は、ポリヌクレオチドが宿主細胞に導入され、宿主のゲノムへ組み込まれずにその配列が発現されることを意味する。
【００８７】
トランスフェクションプロトコル並びにポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するプロトコルは、標的細胞の型に従い異なる可能性がある。例えば、裸のDNA構築物は、エレクトロポレーション、注射、微粒子銃送達又は自発的取り込みにより、細胞に送達することができる。トランスフェクション効力は、リポソーム(リポフェクション)、デンドリマー、タンパク質、ペプチド、沈殿、その他を含む様々なトランスフェクション試薬を使って高めることもできる。或いは、レポーター構築物は組換えウイルス送達系、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ関連、アデノウイルス、又は細胞内への外来性DNAの送達に適当である他のいかなるベクターへ挿入して、結果として生じるレポーターウイルス構築物で細胞を感染させることができる。例示的な形質転換プロトコルとしては、リン酸カルシウムトランスフェクション(Chenらの論文((1987)Mol.Cell Biol.7:2745-2752)、Chenらの論文((1988)BioTechniques 6:632-638)、Ishiuraらの論文((1982)Mol.Cell.Biol.2:607-616))、DEAE-デキストラントランスフェクション(Yangらの論文((1997)Biotechnol.Appl.Biochem 25:47-51)、Puchalskiらの論文((1992)Cytometry 13:23-30)、Fregeauらの論文((1991)Somatic Cell Mol.Genet.17:239-257))、エレクトロポレーション(Changらの論文((1989)Biophys.J.56;641-65)、Neumannらの論文((1982)EMBO J.1:841-845)、Potterらの論文((1988)Anal.Biochem 174:361-373)及びPotterの論文((1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81:7161-7165))、リポソーム媒介によるトランスフェクション(Krieglerらの著書((1990)Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual,Stockton Press,New York)、Life Technologiesの出版物((1999)Guide to Eukaryotic Transfections with Cationic Lipid Reagents,2nd ed.Life Technologies,Inc.,Rockville,Md.)、Tilkinsらの著書(Cell Biology;A Laboratory Handbook,vol.4,2nd ed.(J.E.Celis編)pp.145-154,Academic Press,New York)、Felgnerらの論文((1987)Proc.Natl.Acad.Sci.84:7413-7417))、及びウイルスベクター(Waltherらの論文((2000)Drugs 60:249-70)、Pengらの論文((1999)Curr Opin Biotechnol 10:454-7)、米国特許第6613892号、米国特許第6627442号、米国特許第6573092号、米国特許第6498033号、及び米国特許第6468771号がある。Sambrookらの著書((1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual)2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NY)及び他の実験マニュアルも参照されたい。
【００８８】
哺乳動物細胞の安定的トランスフェクションについては、用いる発現ベクター及びトランスフェクション手法により、一部のわずかな細胞だけが外来性DNAをそれらのゲノムに組み込むことができると知られている。これらの構成要素を特定して選択するために、通常、選択マーカー(例えば、抗生物質耐性について)をコードする遺伝子を、対象となるポリヌクレオチドと共に宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーとしては、G418、ハイグロマイシン及びメトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を付与するものがある。選択マーカーをコードする核酸は、RTUを含むのと同じベクターに乗せて宿主細胞に導入することができ、又は、別のベクターで導入することができる。導入された核酸で安定的にトランスフェクションされた細胞は、薬剤選択によって特定することができる(例えば、選択マーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生存し、他の細胞は死ぬ)。
【００８９】
宿主細胞は、任意の細胞培養、組織又は任意の関心臓器に由来することができる。一実施態様では、細胞は一次細胞である。当業者は、与えられたRTU集団のために使用する適当な宿主細胞を認識する。用語細胞は特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代又は潜在後代も指すと理解されている。ある変化が変異又は外界の影響のために後世代で起こることがあるので、そのような後代は、実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で使用する用語の範囲に含まれる。宿主細胞の非限定的例としては、それらには限定されないが、脊椎動物、植物(単子葉植物及び双子葉植物)及び哺乳動物(ヒト及びヒト以外の細胞、例えばマウス、イヌ、ヒツジ、ウシ、ヤギなどの細胞)、鳥類(ニワトリ)、酵母、両生類、その他からの細胞を含む任意の真核細胞がある。他の対象となる宿主細胞としては、細菌及び真菌がある。具体的な実施態様では、対象となる細胞型としては、それらには限定されないが、胚幹細胞、及び脾臓、肺、結腸、肝臓、子宮、子宮内膜、脳、皮膚、骨髄、心臓、血管、胸腺、腎臓、乳腺、精巣、前立腺、甲状腺、骨格筋、膵臓、小腸又は卵巣に由来する細胞又は細胞系がある。他の対象となる細胞としては、T細胞、B細胞及び骨化成細胞(骨原性細胞、骨芽細胞及び骨細胞)がある。更に、任意の臓器又は組織からの生検材料(即ち生検試料、検死試料又は組織切片培養)を用いることができる。他の対象となる細胞としては、自然又は人工の形質転換細胞系、例えば哺乳動物の3T3細胞系、293細胞系、ヒーラ細胞系、CHO細胞系及びCOS細胞系を挙げることもできる。
【００９０】
従って、RTUを含むポリヌクレオチドの集団を有する細胞及び組織が提供される。本明細書の他の場所で議論されるように、これらの細胞は様々なスクリーニング法のために適当である。一実施態様では、その活性が炎症性刺激、ストレス刺激、細胞若しくは発達上の刺激、毒素、生体異物、又は薬剤によって調整される少なくとも1つのトランス作用性因子又はシス調節エレメントの活性をプロファイリングするために使用される細胞系が提供される。炎症及び/又はストレス刺激によって調整される例示的な、しかし非限定的なトランス作用性因子としては、NF-κB、NF-AT、AP-1、C/EBP、Ets-1、Elks、c-Rel、ATF2、c-Fos、CREB-1及び様々な核内受容体、例えばGR、PPAR、RXR、その他がある。その活性が癌細胞内で調整されるか又は細胞周期、細胞増殖及びアポトーシスの調節に影響するトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントをプロファイリングするために使用される細胞系が提供される。癌細胞内で調整される活性を有するか又は細胞周期、細胞増殖及びアポトーシスに影響する例示的な、しかし非限定的なトランス作用性因子としては、c-Myc、p53、E2F、Forkhead、TCF/b-カテニン、NF-κB、SRE、CRE、DP-1、E2F-1、Rb、p107、Sp-1、c-Myb、Max、USF-1、Egr-1、Oct 1、Oct 11又はエストロゲン受容体、その他がある。細胞は、胚発生、疼痛反応、神経発達及び機能、その他に関係する因子によって調整されるシス調節エレメントを有するRTUを含むように、生産することもできる。これらの細胞系は、様々なトランス作用性因子及びシス調節エレメントの活性のハイスループットプロファイリングのために適当である。
【００９１】
本発明の細胞は、本発明のレポーター配列の集団を有する動物を生産するのに用いることもできる。具体的な実施態様では、配列集団は動物のゲノムに安定的に組み込まれる。それに従う、ヒト以外のトランスジェニック動物が提供される。例えば、一実施態様では、本発明の宿主細胞はRTU集団が導入された受精卵母細胞又は胚幹細胞である。そのような宿主細胞は、次に、RTUを有するポリヌクレオチドの集団がそれらのゲノムに導入されている、ヒト以外のトランスジェニック動物を作製するのに用いることができる。そのような動物は、対象となるトランス作用性因子、対象となるシス調節エレメントの活性を研究することに役立つので、異なる細胞型、発達期、治療体制、その他の分子署名を得るのに用いることができる。本明細書で使用するように、「トランスジェニック動物」はその動物の細胞の1つ又は複数が導入遺伝子を含む、ヒト以外の動物である。トランスジェニック動物の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類、げっ歯類、その他がある。導入遺伝子は、プロモーターが活性であり配列がトランスジェニック動物の1つ又は複数の細胞型又は組織で発現される条件の下で、そこからトランスジェニック動物が発生し、成熟動物のゲノムに残留する細胞のゲノムに組み込まれる外来性DNAである。
【００９２】
胚操作及びマイクロインジェクションを通してトランスジェニック動物を、特にマウスのような動物を生成する方法は当技術分野で常用されており、例えば、米国特許第4736866号、4870009号及び4873191号、並びにHoganの著書((1986)Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1986)で記載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の生産のために用いられる。トランスジェニック創始動物は、そのゲノム内のRTU集団の存在に基づいて特定することができる。トランスジェニック創始動物は、次に、そのポリヌクレオチドを有する更なる動物を育種するのに用いることができる。更に、対象となるRTUを有する導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に更に改良することができる。
【００９３】
更に、RTUを含むポリヌクレオチドの集団は、実験動物のある組織及び臓器の細胞に導入することができる。それを実行する多くの手法は、当業者に利用できる。例えば、RTUは裸のDNAの直接適用により、エレクトロポレーション、微粒子銃送達、ウイルス媒介によるin vivo遺伝子導入、その他により、in vivoでトランスフェクションすることができる。そのような宿主は、対象となる組織/臓器で、また、様々な疾病状態で、転写因子活性プロファイルの調査を可能にする。そのような動物を様々な生物学的製剤へ曝露させることにより、in vivoでの薬剤の評価が可能になる。
【００９４】
RTUを含むポリヌクレオチドの集団は、診断又はスクリーニングの目的のために、ヒトのある組織に、例えば皮膚、癌、その他に導入することができる。例えば、ヒト皮膚に導入されるRTUのレポーター種は、生検材料から抽出して、ヒトで病勢、治療の効力、評価化合物の安全性、その他を評価するために用いることができる。
【００９５】
本明細書で開示される組成物はトランス作用性因子又はシス調節エレメントの活性のプロファイリングに用いることができるので、一実施態様では、少なくとも1つのトランス作用性因子又は少なくとも1つのシス調節エレメントの相対活性を検出することができる系を生成する方法が提供される。そのような系の生成は、単離されたポリヌクレオチドの集団を提供することを含み、各ポリヌクレオチドはRTUを含む。そのような集団は、本明細書の他の場所で詳述する。この単離されたポリヌクレオチドの集団は、本明細書の他の場所で記載される、様々な手法を用いる生物系に提供される。この系は、事実上無制限の数のトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性のプロファイリングが可能であり、これは現存の技術では達成不可能な特徴である。
【００９６】
5.2.4.キット及びシステム
本発明の組成物は、様々なキットを更に含む。例えば、プロセシングタグを有するレポーター配列を含むポリヌクレオチドの集団を含むキットが提供され、そのプロセシングタグは様々なレポーター配列をお互いから区別することができる。他の実施態様では、RTU集団を含むキットが提供される。キットは、対象となる宿主細胞及び/又は適当なベクターを更に含むことができる。或いは、キットはポリヌクレオチドの集団を有するベクターを含むことができ、又は、キットはポリヌクレオチドの集団を有する細胞を含むことができる。いかなるキットも参照プロファイル、RTU集団内のレポーター配列とプロモーターを相関させるキー、及び/又は使用説明書を更に含むことができる。
【００９７】
更に、キットは、トランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの任意の所望の群をプロファイリングすることができる、RTUを有するポリヌクレオチドの集団を含むように設計することができる。例えば、キットは転写因子の任意の所望の群をプロファイリングすることができる。炎症性刺激、ストレス刺激、発達若しくは細胞分化シグナル、発癌シグナル、毒素、生体異物又は薬剤に対して調整される、少なくとも1つのトランス作用性因子又は少なくとも1つのシス調節エレメントをプロファイリングするキットも提供される。他の実施態様では、キットは、細胞周期、細胞増殖及びアポトーシスの調節に関与するか又はそれによって調整される、少なくとも1つのトランス作用性因子及び/又は少なくとも1つのシス調節エレメントをプロファイリングすることができる。キットは、胚発生、疼痛反応、神経発達及び機能、その他に関係するトランス作用性因子又はシス調節エレメントによって調整されるRTUを含むように、生産することもできる。
【００９８】
複数のシス調節エレメント及び/又はトランス作用性因子のための参照プロファイルを有するデータベースも、更に提供される。本明細書の他の場所で詳述するように、様々な細胞型、治療体系、疾患状態、薬剤開発、その他の分子署名の同定のための方法及び組成物が提供される。一実施態様では、様々なヒト癌系統及びそれらの正常な細胞系対応物内の、トランス作用性因子プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルのデータベースが提供される。そのようなデータベースは異なる型の癌と関連するトランス作用性因子及び経路の特定を可能にするので、薬剤開発のための潜在標的となる可能性がある。
【００９９】
様々な化合物、例えばそれらには限定されないが、生体作用物質、化合物、処方薬、環境毒素、その他のための参照プロファイルを有するデータベースが更に提供される。一実施態様では、参照化合物による治療に応じた、様々な細胞型のインキュベーションに応じたトランス作用性因子プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルのデータベースが提供される。細胞型は、例えば、癌系統及び原発癌細胞を含むことができる。そのようなデータベースは、例えば、評価される化合物によって導き出されるシス調節エレメント及びトランス作用性因子の変化を参照データベースからの既知化合物によって導き出されるものに関係付けることによって評価される未知化合物を分類し、このように評価される化合物の毒性学的特性及び治療特性、並びにその作用様式を予測するのに用いることができる。
【０１００】
トランス作用性因子プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルは、人々の間で伝えることができる伝達可能な形で成型することができる。そのような伝達可能な形は変えることができ、有形でも無形でもよい。例えば、プロファイルはテキスト、表、図、写真、グラフ、チャート、電子メール、画像、その他いかなる視覚形態でも、具体化することができる。プロファイルは、紙、プラスチック透明シート、フィルム、などの有形媒体上に記録することができるか、又は、コンピュータ読取式形態(例えば電子、電磁気、光学、又は他のシグナル)で具体化することができる。コンピュータ可読形式のデータは、コンピュータで使用可能な記憶媒体(例えばCD、光ディスク、磁気テープ、デジタルビデオディスクなど)で記憶することができ、また、その情報を記憶するコンピュータに一時的又は恒久的に入れることができる。更に、プロファイルは「生の」データ(即ち、収集後、未分析の)、部分的に分析されたデータ、又は完全に分析されたデータとして伝達又は記憶することができる。データ分析はコンピュータ又は他の自動化装置によってもよく、又は手動で行うこともできる。
【０１０１】
図22は、上述の機能性を支える例示的な系を詳細に示す。
系は、好ましくはコンピュータシステム(10)であり、以下を備える。
・  中央処理装置(22)。
・  ソフトウェア及びデータを記憶するためのハードディスクドライブなどの不揮発性主記憶装置(14)。記憶装置(14)は記憶コントローラ(12)によって制御される。
・  不揮発性記憶装置(14)からロードされたプログラム及びデータを含む、システム制御プログラム、データ及びアプリケーションプログラムを記憶するためのシステムメモリ(36)、好ましくは高速ランダムアクセスメモリ(RAM)。システムメモリ(36)には、リードオンリーメモリ(ROM)を含めることもできる。
・  ユーザインタフェース(32)。1つ又は複数の入力装置(例えばキーボード(28))及び表示装置(26)又は他の出力装置を含む。
・  任意の有線又は無線の通信ネットワーク(34)(例えばインターネットのようなワイドエリアネットワーク)へ接続するためのネットワークインターフェースカード(20)。
・  この系の前記要素を相互接続するための内部バス(30)。
・  前記エレメントに電力を供給するための電源(24)。
【０１０２】
コンピュータ(10)の動作は、中央処理装置(22)によって実行されるオペレーティングシステム(40)によって主に制御される。オペレーティングシステム(40)は、システムメモリ(36)内に記憶することができる。オペレーティングシステム(40)に加えて、典型的実行システムメモリ(36)は以下を含む。
・  本発明により用いられる様々なファイル及びデータ構造へのアクセスを制御するためのファイルシステム(42)。
・  本発明に従ってファイルを記憶するためのデータ構造(44)。
・  本発明に従ってプロファイルを比較するためのデータ分析アルゴリズムモジュール(54)。
【０１０３】
図22で例示されるように、コンピュータ(10)はソフトウェアプログラムモジュール及びデータ構造を含む。各データ構造物は、それらには限定されないがフラットASCII若しくはバイナリファイル、Excel表計算ソフト、リレーショナルデータベース(SQL)、又はオンラインアナリティカルプロセシング(OLAP)データベース(MDX及び/又はその変形)を含むいかなる形態のデータ記憶システムを含むことができる。一部の具体的な実施態様では、そのようなデータ構造はそれぞれ階層構造(例えばスタースキーマ)を含む1つ又は複数のデータベースの形態である。一部の実施態様では、そのようなデータ構造はそれぞれ明白な階層を有しないデータベース形態である(例えば階層的に配置されないディメンションテーブル)。
【０１０４】
一部の実施態様では、システム(10)に記憶されるかアクセス可能な各データ構造は、単一のデータ構造である。他の実施態様では、そのようなデータ構造は実際、同じコンピュータ(10)をすべてホストとすることができるかできない複数のデータ構造(例えばデータベース、ファイル、アーカイブ)を含む。例えば、一部の実施態様において、データ構造(44)は、コンピュータ(10)で、及び/又はワイドエリアネットワーク(34)越しにコンピュータ(10)がアドレス可能なコンピュータで記憶される、複数のExcel表計算を含む。他の実施例において、データ構造(44)は、コンピュータ(10)で記憶されるか、又はワイドエリアネットワーク(34)越しにコンピュータ(10)がアドレス可能な1つ又は複数のコンピュータに分配される、データベースを含む。
【０１０５】
図22で例示されるモジュール及びデータ構造の多くは、1つ又は複数のリモートコンピュータ上に位置することができることはいうまでもない。例えば、本出願の一部の実施態様は、ウェブサービス型の実施態様である。そのような実施態様では、データ分析アルゴリズムモジュール(54)及び/又は他のモジュールは、ネットワーク(34)を通してコンピュータ(10)と繋がっているクライアントコンピュータに置くことができる。一部の実施態様では、例えば、データ分析アルゴリズムモジュール(54)は双方向性ウェブページであってよい。
【０１０６】
本発明は、コンピュータシステム又はコンピュータプログラム製品として実施することができる。コンピュータプログラム製品の実施態様としては、コンピュータ可読型の記憶媒体に内蔵されたコンピュータプログラム機構がある。例えば、本明細書で開示される方法のいずれかは、コンピュータプログラム製品として具体化することができる。コンピュータプログラム製品は、CD-ROM、磁気ディスク記憶装置製品、又は他のいかなるコンピュータ可読型のデータ若しくはプログラムの記憶製品でよい。コンピュータプログラム製品内のソフトウェアは、インターネット又はその他を通して、搬送波上のコンピュータデータシグナル(そこにソフトウェアモジュールが内蔵される)の伝達によって電子的に配信することもできる。
【０１０７】
5.3.方法
5.3.1.トランス作用性因子又はシス調節エレメントの活性をプロファイリングする方法
少なくとも1種のシス調節エレメントの活性を評価する方法及び/又は少なくとも1種のトランス作用性因子の活性を評価する方法を提供する。特定の実施態様では、複数のシス調節エレメント及び/又はトランス作用性因子の活性を同時に測定して、目的とする生物系の分子特性を提供する。本発明では、RTU集団中の個別のレポーター配列を、それらのレポーター配列内にある可変位置の特有のプロセシングタグに基づいて識別する。プロセシング時に、個別のレポーター配列のレポーター種により識別可能な断片が得られる。従って、生物系において少なくとも1種のトランス作用性因子又は少なくとも1種のシス調節エレメントの活性を検出する方法を提供する。
【０１０８】
提供されている本方法の実施態様では、検出しようとする活性は、第5.2節に記載したようなポリヌクレオチドの集団(例えば、RTU集団)を含んでいる生物系にある。特定の実施態様では、レポーター配列のレポーター種をプロセシングし、少なくとも2種のプロセシングしたレポーター種を検出する。それにより、少なくとも1種のトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの相対活性が決定される。
【０１０９】
一部の実施態様では、レポーター配列のレポーター種をプロセシングし、プロセシングしたレポーター種の量を定量し、次いで、基準と比較してトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性を決定する。
【０１１０】
基準RTUとしては、例えば、ハウスキーピング遺伝子の非誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター等を含有するRTU、或いは比較してトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性を決定することができるすべてのRTUを挙げることができる。
【０１１１】
本明細書では、レポーター配列の「レポーター種」という用語には、生物系で産生される実質のRNA産物だけでなく、増幅ステップ、プロセシングステップ、検出ステップ及び/又は定量ステップ中に産生されるすべての誘導核酸(例えば、cDNA又は任意の増幅産物など)が含まれる。
【０１１２】
上述のように、各種のプロセシングタグは、レポーター配列中で使用することができる。このタグは、適切な方法を用いてプロセシングされた場合にレポーター種を検出することが可能で、続いて、トランス作用性因子の活性又はシス調節エレメントの活性を検出及び/又は定量することができる。例えば、プロセシングタグは、レポーター配列中の特有の突然変異、エンドヌクレアーゼ認識部位、終止コドン、共通のプライマー配列、又は所定部位においてプロセシングに対してレポーター種をマークすることができる他のすべての配列を含み得る。プロセシングは、このプロセシングタグの性質に応じて、酵素反応、化学反応、熱反応又はその組合せにより実施することができる。またプロセシングは、増幅により、増幅の終止により、或いは個別のレポーター種の識別可能な産物を産生又は同定する他の任意の方法により達成することができる。これらのプロセシングタグの使用に関する実施例(但しこれらに限定されるものではない)については、以下に詳細に記載する。
【０１１３】
特定の方法では、プロセシングは、生物系におけるレポーター配列の発現後、その生物系から単離精製される、レポーターRNA転写産物で実施することができる。単離精製方法は公知であり、例えば、トリゾール抽出、カラムクロマトグラフィー、polyAアフィニティカラム、セシウム勾配又は他の利用可能な手段を挙げることができる。或いは、レポーター転写産物のプロセシングは、事前の精製を行うことなく、例えば、細胞溶解物、組織ホモジェネートなどで実施することができる。
【０１１４】
本発明の特定の実施態様では、レポーターRNA転写産物を相補的DNAに変換した後にプロセシングを行うのが望ましい場合がある。これは逆転写により行うことができるが、これに関しては多くの酵素が利用可能であり、ウイルス逆転写酵素(MoMLV、SuperScript、PowerScriptなど)が挙げられる。逆転写には、3'ポリアデニル化配列に結合するプライマー、レポーター配列に相補的なプライマー、ランダムプライマーの組合せ、又は逆転写に好適な他のプライマーなどの各種プライマーが利用可能である。
【０１１５】
特定の実施態様では、プロセシングステップの前又はプロセシングステップ中に、レポーター配列の転写産物を増幅させて検出過程における感度を高めることができる。核酸に用いられる「増幅」又は「増幅した(させた)」という用語は、核酸の1種又は複数のコピーが形成されるすべての方法を意味し、この場合、増幅は、指数関数的であるのが最適である。
【０１１６】
DNAの特定配列を酵素により増幅する方法の1つは、Saikiらの論文(1986)Science 230:1350-54によって記載のポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)として公知である。例えば、レポーター配列を、PCR増幅で使用可能な5'プライマー配列及び3'プライマー配列と共に提供することができる。PCRで使用するプライマーの長さは、約10〜50個又はそれ以上のヌクレオチド長で変動し得るが、これは、増幅しようとするRTU中に存在するプライマー配列に一致する。PCR増幅から産生される二本鎖断片は「単位複製配列」と呼ばれ、約30個程度のヌクレオチドから20,000個以上のヌクレオチド長で変動し得る。
【０１１７】
1つの方法では、レポーター種に対して逆転写を行ってからPCR増幅を行う。RNAの二本鎖DNAへの酵素的変換は、多数の異なる方法により実施することができる。一般に、それらのプロトコルでは、逆転写酵素及びcDNA合成を刺激するオリゴヌクレオチドを用いる。例えば、Gublerらの論文(1983)Gene 25:263-269;Huseらの論文(1988)Strategies(Stratagene)1:1-3;及びOkayamaらの論文(1982)Mol.Cell.Biol.2:161-170を参照されたい。また、Freemanらの論文(1999)Biotechniques 26:112-22;Ambion's Armored RNA(登録商標)Technology;及びUllmannらの論文(2001)Quiagen News 2:13-16(これらのすべての文献は、本明細書にその全体が組み込まれているものとする)も参照されたい。RT-PCRは、精製済みのトータルRNA試料中で、又は全細胞溶解物中で実施することができる。
【０１１８】
プロセシングしたレポーター種(即ち、レポーターRNA転写産物、cDNA、それらの増幅産物など)の検出を容易にするため、レポーター種を任意の適切な手段により標識化することができる。例えば、標識は、レポーター種の増幅に使用するプライマーへ組み入れることができる。放射性ヌクレオチド、蛍光標識又は色素標識などの様々な標識が利用可能である。またプライマーは、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの異なる色調発生酵素又は蛍光発生酵素と結合させるか、或いは、その後の免疫検出による検出で利用可能なビオチンなどのリガンドと結合させることもできる。レポーターcDNA又は増幅産物は、標識ヌクレオチドを増幅混合物へ加えることにより標識化することができる。またプロセシングしたレポーター種は、例えばDNA染色又はRNA染色による検出方法でも標識化することができる。
【０１１９】
本発明では、プロセシングしたレポーター種間の検出及び識別に、多数の検出方法を用いることができる。検出ステップは、定性的であってもよく(即ち、目的が検出のみ)、又は定量的であってもよい(即ち、プロセシングした各レポーター種の量を測定する)。個別のレポーターのプロセシングしたレポーター種については、プロセシングの性質に応じて、利用可能な多くの手段により評価することができる。各種のプロセシング技術により得られた、プロセシングしたレポーター種は、これらに限定されるものではないが、大きさ、分子量、電荷、移動度又はその任意の組合せを含めた種々の特性により分離することができる。別の実施態様では、プロセシングしたレポーター種は、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、クロマトグラフィー、或いはプロセシングしたレポーター種を検出及び/又は定量することができるようにそれらを十分に分離することができるすべての他の方法によって分離する。かかる方法については、本明細書の別のところで記載する。また、Ronaiらの論文(2000)American Laboratory 7:28-31;6,127,124;及び5,167,783(これらのすべての文献は参照により本明細書に組み込まれているものとする)も参照されたい。分離したバンド中のプロセシングしたレポーター種の量は、レポーター種へ組み入れた標識を使用することにより定量的に評価することができる。プロセシングした種は、分離方法の実施前、実施中又は実施後に、臭化エチジウム、PicoGreenなど利用可能な多数のDNA染色を用いてそれらを染色することにより視覚化することができる。
【０１２０】
図1〜9は、これに限定されるものではないが、各種プロセシング技術とプロセシングしたレポーター種の検出方法の実施例を提供する。
【０１２１】
図1で図示した実施例は、これに限定されるものではないが、複数のトランス作用性因子又はシス調節エレメントの活性を評価するための実施例を提供する。記載のように、それぞれ、プロセシングタグ(6)を含んでいるレポーター配列(4)に機能的に結合しているシス調節配列(2)を含む、RTU A及びRTU Bを生物系へ導入する。その結果、シス調節配列(2)は、対応するトランス作用性因子の活性に応答してレポーター配列(4)のRNA転写産物の存在量をモジュレートする。レポーター配列間の実質的な同一性は、各レポーター配列に対して実質的に同一な転写効率を付与する。その結果、レポーターRNA情報(8)の相対存在量がRTU中のそれらの各シス調節配列の活性を反映する。レポーターRNA情報(8)又はその誘導体(例えばcDNA)は単離され、別々に評価することができる識別可能なプロセシングしたレポーター種(9)が得られる、プロセシングタグ(6)で判断されるプロセシングに供する。
【０１２２】
N個の異なるシス調節配列又はトランス作用性因子の評価を行うには、N個の個別のレポーターのライブラリーを生物系へ導入し、レポーター種を同時に処理することができる。
図2は、プロセシングタグが、二本鎖(ds)DNA切断エンドヌクレアーゼ(18)により所定部位で切断するためにレポーター種をマークする配列(7)を含む、本発明の実施態様(これに限定するものではない)を提供する。集団の各RTUは、レポーター配列(4)中に特有のプロセシングタグ(7)を含み、そのプロセシングタグの位置は、集団の各RTUで異なっている。この目的において、EcoRI、BamHI、SmaI、Hind III、又はプロセシングタグ(7)を特異的に認識し切断する他のエンドヌクレアーゼをはじめとする、種々のDNAエンドヌクレアーゼが利用可能である。一実施形態では、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼがレポーター配列を1回のみ切断するように、本レポーター配列において特有である。更に別の実施態様では、エンドヌクレアーゼは、個別のレポーター種の識別可能なプロセシングしたレポーター種が得られるならば、複数部位でレポーター配列を切断することができる。
【０１２３】
RTUは、生物系へ導入された場合、シス調節配列(2)の活性に比例したレポーターRNA転写産物(8)を産生する。レポーター転写産物(8)は、ds DNA切断エンドヌクレアーゼ(18)により切断可能なエンドヌクレアーゼ認識部位(7)を含有しているds DNA(16)を得るための鋳型としての機能を果たす、1本鎖(ss)cDNA(10)へ逆転写される。ss cDNAは、各種手段によってds DNAへ変換することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)での指数関数的増幅を用いることにより、1本鎖レポーターDNAを2本鎖レポーターDNAに変換することができる。この場合、フォワードプライマー(13)若しくはリバースプライマー(14)、又は両プライマーは、標識(12)して提供することができる。或いは、ds DNAは、例えばDNAポリメラーゼ触媒によるプライマー伸長による直鎖的増幅によって得ることができる。得られた2本鎖レポーターDNAは、制限エンドヌクレアーゼ(18)と共にインキュベーション処理し、それにより各レポーターに対する一組の特有のDNA消化産物が得られる。これらの消化産物は、その分子量により、例えば、ゲル電気泳動法、キャピラリー若しくはカラムクロマトグラフィーを用いることによって、又は他の利用可能な手段によって分離することができる。バンド中のDNA産物の相対量は、DNA標識(12)を用いることにより、又はDNA染色でDNA断片を染色することにより定量的に評価することができる。
【０１２４】
更に別の実施態様では、プロセシングタグは、集団の個別の各レポーター配列に対して特有である部位で、レポーター配列中に突然変異を含む。突然変異には、1個又は複数のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失が含まれ得る。特定の実施態様では、集団のレポーター配列は、実質的に相互に同一である。本方法の概略図を、これに限定するものではないが、図3に示す。具体的には、集団のRTUは、レポーター配列(4)中に突然変異を含んでいる特有のプロセシングタグ(24)を含み、この場合、そのプロセシングタグ(24)の位置は各RTUで異なり、且つプロセシングタグ(24)は、集団の各RTUのレポーター種を識別することができる。レポーター転写産物(8)を過剰量の野生型(wt)非突然変異型DNA(26)とハイブリダイズすると、プロセシングタグ(24)の位置でミスマッチを含有している、二本鎖ヘテロデュプレックスのRNA/cDNAが得られる。或いは、レポーター転写産物を野生型非突然変異型レポーターRNAの相補鎖にハイブリダイズさせると、それによりプロセシングタグ(24)の位置でミスマッチを含有している二本鎖RNAヘテロデュプレックスを得ることができる。デュプレックスを切断、分離すると、標識(12)によって標識断片(20)及び未標識断片(22)が分離され、集団の各RTUについて個別に評価することができる。
【０１２５】
RNA/RNA、RNA/cDNA又はcDNA/cDNAのヘテロデュプレックスは、異なる手段によって、例えば、ヘテロデュプレックス中のミスマッチ部位を特異的に認識し切断する酵素を用いることにより、ミスマッチ部位で選択的に切断することができる。かかるいくつかの酵素を利用することができる(Oleykowskiらの論文(1998)Nucl.Acid Res.26:4597-4602、並びにTaylor及びDeebleの論文(1999)Genet.Anal.14:181-6)。例えば、S1ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、T4エンドヌクレアーゼVII、T7エンドヌクレアーゼI、CEL 1、又はMutY-チミングリコシラーゼ系などのin vitroで再構築されたミスマッチ修復複合体を用いることができる。使用可能な化学反応としては、ミスマッチチミン及びシトシンが挙げられるが、これらはそれぞれ、四酸化オスミウムによる、及びヒドロキシルアミンによる修飾を受けやすい。次いで、ピペリジンによりこれらの修飾塩基を特異的に切断することができる(Taylorの論文(1999)Electrophoresis 20:1125-30)。切断されたレポーター種(例えば、ds RNA、ds DNA、又はRNA/DNAヘテロデュプレックス)は、上述ように分離され、個別に評価される。目的が検出の場合には、プロセシングしたレポーター種を各種手段によって、例えば、標識アニーリングwt RNA若しくはcDNAを用いることによって、又は転写レベルで標識をレポーターRNAに導入することによって、例えば、標識ヌクレオチドを有する生物系を供給することによって、或いは任意の他の手段によって標識化することができる。
【０１２６】
感度を高めるには、プロセシングの前に、例えば、RT-PCRによって、又はDNAポリメラーゼを用いる直鎖的増幅によってレポーター種を増幅させることができる。増幅させたDNAの相補鎖は、変性により分離し、過剰量の相補的なwt RNA又はwt DNAとハイブリダイズさせ、上述のようにプロセシングし検出する。
【０１２７】
本発明のRTU集団の特定の実施態様では、各RTUはプロセシングタグを含有している共通のレポーター配列を含み、前記プロセシングタグは共通のレポーター配列の突然変異を含み、その突然変異は所与のRTUに特有である。突然変異は、1個又は複数のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失を含み得る。
【０１２８】
別の実施態様では、プロセシングタグは、一本鎖のレポーター配列に導入される特有のチミジン残基を含む。この実施態様の概略図を図4に示すが、これに限定されるものではない。この実施態様では、プロセシングタグ(32)は、複数のアデニン(A)、グアニン(G)及びシトシン(C)残基を含んでいる、特に転写鎖(5)内の一本鎖のレポーター配列(4)に導入されている特有のチミジン(T)残基を含む。レポーター転写産物(8)を逆転写し、直鎖的に増幅させるか、又はdATP、dGTP、及びdCTP、並びにデオキシウラシル(dUTP)ヌクレオチドの混合物を含有する反応物中でPCR増幅させると、T成分がウラシル(U)で置換されているds DNA産物(34)が得られる。
【０１２９】
U成分を、熱不安定性の脱グリコシル化ウラシル成分(37)を生じるウラシル-脱グリコシダーゼ(UDG)(36)で処理する。得られたDNAは、例えば75℃におけるインキュベーションなどの熱分解によって、脱グリコシル化ウラシル成分(37)で切断することができる。このプロセシングにより、DNAの転写鎖に切断が1カ所と、相補鎖に切断が複数カ所導入される。検出を容易にするには、DNAの転写鎖に標識(12)を導入することができる。標識したプロセシングしたレポーター種(38)は、その分子量により、例えば電気泳動により分離され、定量的に評価される。
【０１３０】
他の実施態様では、プロセシングタグは伸長終止コドンを含み、レポーター種のプロセシングは、終止コドンで伸長反応を終結させることができる条件下でレポーター種をインキュベートすることを含む。図5はこのプロセシングタグの実施例を提供するが、これに限定されるものではない。この実施態様では、プロセシングタグ(42)は増幅終止コドンを表す。レポーター配列(4)は、転写鎖(「D」をヌクレオチドとして表示)が4種類のヌクレオチドのうち1種類を含有していないように設計されている。例えば、図5Aで記載した実施態様では、転写鎖は、アデニン(A)、グアニン(G)及びチミジン(T)を含有しているが、個別の各レポーターに対して特有である位置で導入されているプロセシングタグ以外は、シトシン(C)残基を含有していない。レポーター転写産物(8)は、4種類のヌクレオチド(dATP、dGTP、dCTP及びdTTP)をすべて含有している反応混合物中で逆転写され、それにより、レポーター配列(4)の転写鎖中の特有のC残基(42)位置に対応する位置に特有のG残基を含む、完全長の相補的DNA(10)を得ることができる。このcDNAは、標識フォワードプライマー(13)と3種類のヌクレオチドを含有している混合物(この例では、dATP、dGTP及びdTTPヌクレオチドは含むが、dCTPヌクレオチドは含んでいない)を用いるDNAポリメラーゼ触媒の直鎖的増幅反応により実施する、その後のプロセシングにおいて鋳型として機能する。DNAポリメラーゼが、cDNA鋳型中の特有のG残基に到達した場合に、必要とされる相補的ヌクレオチド(dCTP)を利用することができないことから、レポーターcDNAの相補鎖の合成が終止する。従って、このプロセシングでは、鎖長がプロセシングタグ(42)の位置によって予め決定されている標識一本鎖DNA(44)が生じる。
【０１３１】
或いは、増幅の終止は、図5Bに示したように、増幅混合物へ終止ヌクレオチドを入れることにより達成することができる。この実施例では、終止ヌクレオチドは、シークエンシング反応の終止に慣用されている、dCTPのジデオキシ(ddCTP)誘導体を表す(Sangerらの論文(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74:5463-5467、及びSangerらの論文(1980)J.MoI.Biol.143:161-178)。或いは、ポリメラーゼ反応を停止させるすべての修飾ヌクレオチド類似体を用いることができる。記載した実施態様では、プロセシングタグとして、A、G、C及びTのヌクレオチドのいずれかを使用することができることは理解されよう。感度を高めるには、PCR増幅によるプロセシングの前に、逆転写されたcDNA(10)を増幅させることができる。
【０１３２】
更に別の実施態様では、プロセシングタグは、レポーター配列に対して配置され、且つ集団の各RTUによって異なる、プライマー配列を含む。かかるレポーター種のプロセシングは、その長さがプロセシングタグの可変位置により決定される増幅産物を産生する条件下でレポーター種を増幅することを含む。この実施態様の実施例を図6に示すが、これに限定されるものではない。この実施態様では、プロセシングタグはプライマー配列(46)を含み、レポーター配列(4)に対するその位置は、集団の各RTUによって異なる。逆転写されたレポーターcDNA(10)は、プロセシングタグ(46)の配列に相補的なリバースプライマー(48)の存在下でDNAポリメラーゼが触媒する直鎖的増幅によって行われる、プロセシングの鋳型として機能する。このプロセシングでは、その鎖長がプロセシングタグ(46)の位置により決定される一本鎖DNA(50)が得られる。或いは、プロセシングは、1つが位置タグ(46)の配列に相補的であり、もう1つのプライマーがレポーターcDNAの共通領域に相補的である、1対のプライマーを用いるPCRによってcDNA鋳型の指数関数的増幅させることにより実施することができる。プロセシングしたレポーター種はその異なる分子量により分離され、定量的に評価される。
【０１３３】
特定の実施態様では、プロセシングタグ配列と、そのプロセシングタグ配列に隣接しているレポーター配列の1つの隣接配列又は両隣接配列とを含んでいる、レポーター種の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを、提供している本方法で使用することができる。図7は、本明細書で提供している本方法でレポーター種を識別する際のオリゴヌクレオチドプローブの使用について図示している。RTUは、シス調節配列(2)がレポーター配列(4)のRNA転写産物の存在量を決定するように、レポーター配列(4)に機能的に結合されているシス調節配列(2)を含んでいる。複数の転写因子活性を評価するには、N個のRTUの集団を構築し、実質的に同一のレポーター配列(4)内のプロセシングタグ(6)の位置が、非同一のトランス作用性因子により転写的にモジュレートされるレポーター配列を有する任意の2種類のRTUを識別する。レポーター転写産物(8)の検出には、蛍光特性がプローブのプロセシングによりモジュレートされ得る蛍光標識(55)を含むオリゴヌクレオチドプローブ(51)の集団を含む検出アレイを使用することができる。アレイ内の個別の各プローブは、特定の1つのRTUのレポーター種を選択的に検出する。そのためには、プローブの配列が、プロセシングタグを含んでいる特定のRTUのレポーター配列の一部に相補的である。アレイをアニーリング条件下でレポーター種と接触させて、レポーター種を検出プローブとヘテロデュプレックス形成させる。実質的に同一のレポーター配列のため、種々のRTUのレポーター種は各検出プローブとヘテロデュプレックスを形成し得るが、しかし、プローブ中のプロセシングタグの位置がレポーター種中のプロセシングタグの位置とマッチするヘテロデュプレックスのみがプロセシングされ得る。その結果、検出アレイ内の個別のプローブの蛍光変化は、特定の1つのRTUのレポーター種量に比例する。
【０１３４】
図8は、プロセシングタグがエンドヌクレアーゼ認識部位(7)を含む、図7に図示した検出法の実施態様を示すが、これに限定されるものではない。この実施例では、RTUの集団は、同一のレポーター配列(4)と、位置がRTU A及びRTU Bでは異なるプロセシングタグ(7)を有しているRTU A及びRTU Bを含む。RTUの集団により産生されるレポーター転写産物(8)は相補的DNA(10)へ逆転写され、2種類の検出プローブ(51)(プローブA及びプローブB)を含んでいる検出アレイにハイブリダイズさせる。プローブAは、RTU A中にプロセシングタグ(7)を含むレポーター配列の一部を含み、一方プローブBの配列は、RTU B中にプロセシングタグ(7)を含むレポーター配列の一部を含んでいる。両検出プローブは、蛍光標識(55)及び蛍光消光剤(57)を含む蛍光ドナーアクセプター対を備えている。完全なプローブでは、消光剤(57)が、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)として知られている機序を介して励起エネルギーを吸収するので、蛍光標識(55)を非蛍光にする。
【０１３５】
レポーターcDNA AがプローブAにハイブリダイズされた場合、制限酵素(18)で消化することにより処理され得るヘテロデュプレックスが形成される。制限酵素は、蛍光標識(55)を消光剤(57)付近から遊離し、それによりこの蛍光収量の上昇を確認することができる。一方、レポーターcDNA B及びプローブAによって形成されたミスマッチヘテロデュプレックスは、酵素消化に耐性がある。しかし、ハイブリダイゼーションし、次いで酵素消化を行うと、プローブB及びcDNA Bによって形成されたヘテロデュプレックスから蛍光的に検出可能なプローブ(55)が遊離されるが、プローブB及びcDNA Aから形成されたヘテロデュプレックスからは遊離されない。
【０１３６】
図9は、プローブのプロセシングが5'-ヌクレアーゼ消化により行われる、図7に図示した検査法の別の実施態様を示すが、これに限定されるものではない。この例では、蛍光性ドナー(55)アクセプター(57)対を含んでいるアレイ検出プローブ(51)を、レポーター配列(4)の非可変領域に相補的な共通のプライマー(13)の存在下で、レポーターcDNAとハイブリダイズさせる。得られるヘテロデュプレックスは、5'-エキソヌクレアーゼ活性を持つDNAポリメラーゼ(例えばTaqポリメラーゼ)により触媒されるプライマー伸長反応に供する。DNAポリメラーゼは、ハイブリダイズされたプローブ(51)の方向へプライマー(13)を伸長する。プローブがレポーターcDNAと完全なマッチングを形成しているならば、DNAポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性がプローブを分解し、それにより、蛍光プローブ(55)が消光剤(57)付近から遊離され、その結果、標識(55)の蛍光収率が上昇する。レポーターcDNAとプローブの間にミスマッチがある場合には、DNAポリメラーゼで合成された鎖は、分解されることなくプローブ(51)が鋳型から置き換わり、その結果、蛍光シグナルは増加しない。5'-ヌクレアーゼ分解は当業者に公知であり、例えば、Hollandらの論文(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88:7276-7280に記載のTAQMANアッセイがある。
【０１３７】
検出プローブを検出アレイへ配置することができる方法は多数ある。例えば、検出プローブは、例えば、レポーター種とハイブリダイゼーションさせ、プロセシングを行うための、例えば、96ウェルプレート、384ウェルプレート、1,536ウェルプレートのウェル中の液相中に存在し得る。或いは、プローブは、例えばガラス上、ニトロセルロースフィルター上、ビーズ表面上、カラム上などの表面上に固定化することができる。プローブのレポーター種へのハイブリダイゼーションはその表面上で行うことができるが、蛍光検出は、溶液へ遊離させたプローブを、又はその表面上に残っているプローブ上で分析することにより実施することができる。
【０１３８】
上述の検出プローブの標識化に、任意のドナーアクセプター対を用いることができる。例えば、蛍光標識には、フルオレセイン、6-FAM、ローダミン、量子ドットなどのすべての蛍光標識試薬を含むことができる。更に、消光剤は、励起スペクトルが第1の蛍光分子の発光スペクトルとオーバーラップする蛍光分子と置き換えることができる。例えば、図8又は図9に図示したように、励起は第1の蛍光分子(55)から第2の蛍光分子(57)にFRETを介して伝えられる。その結果、プローブの発光スペクトルを第2の蛍光分子(57)の特性により測定することができる。プロセシング後、蛍光プローブは分離されると、FRETは除かれる。その結果、蛍光の発光スペクトルが、第1の蛍光分子(55)の特性によって測定されるスペクトル範囲へシフトし、一方、第2の蛍光分子(57)によって放出されている蛍光シグナルは減少する。従って、プロセシングは、異なる波長で複数の蛍光シグナルの強度の比を測定することにより評価することができる。
【０１３９】
プローブの蛍光を変化させることができる、検出プローブのプロセシングに関する多数の別法を利用することができることは、当業者には理解されよう。例えば、5'-エキソヌクレアーゼ分解/鎖置換アッセイをインベーダーアッセイに換えることができる。別の例では、レポーター配列の特定の位置に配置されているプロセシングタグを認識することができる、別の標識検出プローブのアレイを用いることができる(例えば、プロセシングタグをはじめとする配列を含んでいるMOLECULAR BEACONプローブなど)。
【０１４０】
また、DNA結合配列が未知である複数の転写因子の活性を評価する方法も提供する。かかる方法で使用する例示的なRTUを図10に示す。例えば、図10Aでは、キメラコード配列(52)は、既知のDNA結合特異性を持つタンパク質由来のDNA結合ドメイン(「DBD」)が付加された転写因子「A」のインフレーム融合タンパク質(58)をコードするように構築することができる。生物系での内在性遺伝子発現の干渉を回避するため、DBDは、かけ離れた生物種から選択的に取得する。例えば、哺乳動物細胞での転写因子の試験には、哺乳動物ゲノムで調節エレメントと結合しない酵母転写因子Gal4を用いることができる。Gal4 DNA結合ドメインがDNA結合特異性を提供するのに対して、評価済み転写因子Aは融合タンパク質の転写活性を決定する。キメラコード配列(52)は、構成的にプロモーター(54)から発現される。このプロモーターは、ウイルス(例えば、CMV若しくはSV40)由来のプロモーター、又はハウスキーピング遺伝子のプロモーター、又は他の好適なプロモーターであってもよい。Gal4 DBD融合タンパク質により特異的に認識されるシス調節配列(56)を含有するRTUに、このキメラコード配列(52)をプロモーター(54)と共に挿入する。挿入された構成的プロモーター(54)は、例えば、レポーター配列(4)の転写方向とは反対方向にプロモーター(54)を方向付けすることによって、又は別の例としては、シス調節エレメント(56)の上流にインシュレーター(例えば転写のターミネーター)を挿入することによって、レポーター配列(4)の転写に影響を与えないようにすることが重要である。調節配列(56)は、プロセシングタグ(6)が付加されているレポーター配列(4)に機能的に結合されている。このレポーター構築物を細胞にトランスフェクトした場合、キメラコード配列(52)から発現される融合タンパク質(58)が調節配列(56)に結合し、それにより、評価済み転写因子Aの転写活性に比例したレポーター配列(4)の転写が活性化される。
【０１４１】
2種類の転写因子(A及びB)の活性を同時に測定するには、2種類のRTUを用いる。1つのRTUは図10Aに図示したものであり、もう1つのRTUは、融合タンパク質TF B-Gal4(60)をコードしているキメラコード配列(53)を発現する、図10Bに図示したものである。図10Bでは、図10Aで図示したレポーター構築物中のものとは識別可能な位置にプロセシングタグ(6)が付加されているレポーター配列(4)に機能的に結合されている調節配列(56)を含有している構築物に、キメラコード配列(53)を挿入する。転写因子A及びBを同時に判定するため、2種類のRTUの混合物を生物系にトランスフェクトする。共通の調節配列(56)上に対する融合タンパク質(58)及び(60)のクロストークを回避するには、トランスフェクト細胞のレポーター構築物のコピーの受け取りが平均して1個未満であるように、レポーター構築物を低多重度のトランスフェクションでトランスフェクトする。或いは、トランスフェクト細胞を引き続きプールすることができる細胞中で、個別のレポーター構築物を別々にトランスフェクトする。レポーター種は、上述のようにプロセシングし分析する。一部の実施態様では、細胞へ別々にトランスフェクトした異なるRTUから得たレポーター種を別々に評価することができる。この方法は、かなりの数の転写因子を評価できるよう、対応するRTUを集団に入れることにより拡張することができる。
【０１４２】
図10に図示した方法は、転写因子の転写活性化機能の試験に使用することができる。ほとんどの転写因子の転写活性は、DNA結合親和性のモジュレーション、並びに、一般的に転写活性化機能と呼ばれている、コアクチベーター、コリプレッサー及び基本転写装置に対する転写因子の補強能力のモジュレーションなど、多くのレベルで調節されている。転写活性化機能(これは、DNA結合活性から独立して調節される場合が多い)は、重要な生体情報を伝える。例えば、転写因子NF-kBの調節はNF-kBの核移行により介在されており、且つIkBとして知られている抑制分子の分解によって調節されている。しかし、NF-kBサブユニットの転写活性化機能をモジュレートする別のIkB非依存性経路が存在する。本発明は、図10に図示したものと同様のレポーター構築物を用いた、複数の転写因子の転写活性化機能の試験法を提供する。これらの構築物の場合、評価済みの転写因子の転写活性化ドメインを、既知のDNA結合特異性を持つ異種タンパク質(例えばGal4)由来のDNA結合ドメインとインフレームで融合させる。例えば、RelAの転写活性化機能を判定するには、RelAの転写活性化ドメインとDBD Gal4との融合タンパク質をコードするキメラDNAを構築する。かかるレポーターの転写はNF-kBのDNA結合活性とは独立しており、RelAの転写活性化機能によって判定される。
【０１４３】
また本発明は、本質的に類似のDNA結合配列を有している、異なる転写因子の活性を評価するのに使用することもできる。例えば、異なるファミリーの核受容体は、同一DNA配列に結合し得る場合が多い。複数の核受容体の転写活性化機能の識別には、RTUを、図10に図示したものと同様に設計することができる。これらのレポーター構築物では、核受容体の転写活性化ドメインを、既知のDNA結合特異性を持つ異種タンパク質(例えばGal4)由来のDBDとインフレームで融合させ、レポーターライブラリーを上述のようにして評価する。重複DNA結合特異性を持つ核ホルモン受容体の活性を検出する例示的な方法は、実際の実施例に記載している。
【０１４４】
本方法及び組成物は、タンパク質の混合物、無細胞抽出物、細胞培養物、組織、器官、動物全体、バイオプシー試料及び解剖試料などの各種生物系において、並びに本組成物及び方法から得られるキット及びアッセイにおいて、シス調節配列及びトランス作用性因子の活性を評価するのに使用することができる。
【０１４５】
また、本RTUの集団は、ex vivoにおける複数のシス調節エレメント及び/又はトランス作用性因子の活性の評価に使用することができる。例えば、動物又はヒトから取得した一次細胞の外植体にRTUの集団を導入することができる。またRTUの集団は、外植細胞及び外植組織(例えば、血液試料、各種器官及び組織のバイオプシー及びオートプシー)に導入することもできる。外植体は、レポーター転写が起こるのに十分な期間、培養液中でインキュベートする。遺伝子導入自体及びレポーター転写は急速に起こるので(1〜2時間)、トランス作用性因子又はシス調節エレメントの活性は、外植組織をそのままの状態に保ちながら調べることができるはずである。また高感度のPCR検出により、少量の生物標本試料でトランス作用性因子又はシス調節エレメントのプロファイルを決定することもできるはずである。
【０１４６】
或いは、RTU集団とのトランスフェクションを行った後、トランスフェクトした一次試料を宿主へ再導入し、in vivoでトランス作用性因子及びシス調節エレメントのプロファイルをモニタリングすることができる。望ましい時期に、レポーター種を再導入試料から単離し、上述のようにしてプロセシングし、検出することができる。
【０１４７】
外植体をin vitroで目的の処置により刺激し、シス調節エレメント及び/又はトランス作用性因子に対するこれらの処置の効果を評価することができる。外植組織の特定の解剖学的部位における複数のシス調節エレメント及び/又はトランス作用性因子の活性の評価にRTUの集団を使用することができる。この目的のため、外植組織を切除し、レポーター種を目的の解剖学的部位から単離する。
【０１４８】
in vivoにおける複数のシス調節エレメント及び/又はトランス作用性因子の活性の評価にRTUの集団を使用することができる。この目的のため、生きている動物又はヒトの分析済み組織又は器官に、適切な送達ビヒクルを用いてRTUの集団を導入する。トランスフェクトした動物又はヒトからバイオプシー試料を回収し、レポーター種を単離、処理する。
【０１４９】
胚発生期間中の複数のシス調節エレメント及び/又はトランス作用性因子の活性の評価に、本方法及び組成物を使用することができる。この実施態様では、胚幹(ES)細胞のゲノム中へRTUの集団を組み入れた後、得られるレポーターES細胞を子宮内に移植する。異なる発生段階で、レポーター胚/胎児を顕微解剖し、トランス作用性因子又はシス調節エレメントの分析に用いる。或いは、子宮内遺伝子送達により胎児へRTUの集団を送達することができる。
【０１５０】
また、動物の各細胞中にRTUの集団を含むレポータートランスジェニック動物を作製するのにレポーターES細胞を用いることができる。これらのレポーター動物は、生後発育における、胚発生における、疾患の各種のモデルにおける各種組織、細胞及び器官中の複数のシス調節エレメント及び/又はトランス作用性因子の活性のプロファイリングに、in vivoにおける医薬品評価に、並びに全動物のin vivoにおける各種治療の効果(各種化合物投与、ストレス、病原菌、疼痛刺激、各種疾患、腫瘍変化など)の調査に用いることができる。
【０１５１】
5.3.2.試料中のトランス作用性因子活性又はシス調節エレメント活性のプロファイルに基づく細胞型及び/又は病態の特性決定方法
本発明は、生物系におけるトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性を検出及び/又は定量することによって、どの活性化トランス作用性因子が存在し、どのレベルで存在するのかに基づき、速やかに生物系を特性決定することができる。更に、正常細胞と比較した場合に発現されている特定の遺伝子又は発現されない特定の遺伝子により、特定の病態を起こし、且つ/又は特性決定することができる。また、正常細胞と比較した場合に異なるレベルで転写されている特定の遺伝子により、別の病態をもたらし、且つ/又は特性決定することができる。本発明は、複数のトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性を速やかにモニタリングすることが可能であることにより、1種又は複数のトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性の欠如、活性の低下、及び/又は活性の上昇と関連していることが知られている特定の病態を診断する正確な方法を提供する。反対に、本発明は、正常細胞及び異常細胞において1種又は複数のトランス作用性因子又はシス調節エレメントの活性の欠如、活性の低下、及び/又は活性の上昇を比較することにより、特定の病態とトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメントプロファイル活性の関連付けを容易にする。更に、特定の病態が1種又は複数のトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの異なる活性(高活性又は低活性)により生じることを理解することによって、適切な治療を施すことで、1種又は複数のトランス作用性因子の発現を増加又は減少させ、病態を改善することができるはずである。
【０１５２】
「トランス作用性因子活性プロファイル」は、目的の生物系において異なるレベルで存在する1種又は複数のトランス作用性因子の絶対活性又は相対活性を表す値の集合である。「シス調節エレメント活性プロファイル」は、目的の生物系において異なるレベルで存在する1種又は複数のシス調節エレメントの絶対活性又は相対活性を表す値の集合である。トランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルは、一試料と他の試料との識別、或いは一リスク群にある被験体と他のリスク群にある被験体との識別にプロファイルを用いることができるような、十分な数の値を含有するのが好ましい。一部の実施態様では、1つの値が一試料と他の試料との識別に十分であってもよい。
【０１５３】
特定の実施態様では、トランス作用性因子活性プロファイルは、N個のRTUの活性を表すn個の値の集合である。一部の実施態様では、Nは10個以上、20個以上、50個以上、100個以上、1000個以上、10〜1000個の間、又は4,000個未満である。プロファイルを、N次元空間(この場合、各転写因子の活性はベクトルの座標である)のベクトルとして特性決定することができる。異なる2種類の生物系のトランス作用性因子活性プロファイルを定量的に比較することができる。2種類のプロファイル間の類似度は、広範囲の距離計量を用いて定量的に評価することができる。例えば、これらに限定されるものではないが、ユークリッド距離、マンハッタン距離、チェビシェフ距離、ベクトル間の角度(又は角の関数、例えばコサイン)、相関距離(例えばピアソン相関距離)、ユークリッド平方距離、標準化ユークリッド距離、マハラノビス距離、及びミンコフスキー距離が挙げられる。例えば、ベクトルに関するかかる距離計量の考察については、Draghiciらの論文「DNA微量分析用のデータ分析ツール」(2003,Chapman & Hall/CRC,New York,pp.264-276)(これによりその全体が本明細書に組み込まれている)を参照されたい。一部の実施態様では、対応するN次元ベクトル(いわゆる、ユークリッド距離)の終端間の距離を測定する。一部の実施態様では、ベクトル間の角度(これは、ピアソン相関係数Cor(A、B)(下記の式Iを参照)としても知られている)を測定する。ピアソン相関分析は、アレイハイブリダイゼーションによって得られた2つ以上の遺伝子発現のプロファイルを比較する、転写学における遺伝子発現のプロファイル比較に用いられてきた(例えば、Scherfらの論文(2000)Nature Genetics 24:236-244(これにより、その全体が本明細書に組み込まれているものとする)を参照されたい)。
【０１５４】
ピアソン相関の式は下記の通りである。
【数１】
2008519605.tif 000004
ピアソン相関係数Corの値は、+1.0(完全に一致しているプロファイル)から-1.0(完全に相違しているプロファイル)まで変動する。例えば、A及びBが、N個の個別のトランス作用性因子の値を含んでいる2つの異なるトランス作用性因子活性プロファイルを表す場合、それらの座標はそれぞれ、
(A1、A2、A3  AN);及び、
(B1、B2、B3  BN)であり、ここで、
A1、A2、A3等は、プロファイルAのトランス作用性因子TF1、TF2、TF3などの活性の値であり、
B1、B2、B3等は、プロファイルBのトランス作用性因子TF1、TF2、TF3などの値であり、
＜A＞及び＜B＞は、プロファイルA及びBのすべての個別のトランス作用性因子活性の値の平均値を表す。一部の実施態様では、AとBの間のピアソン相関係数が0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、0.9以上、0.95以上、又は0.99以上である場合に、プロファイルA及びBはマッチングしているとみなされる。上述のように、ノンパラメトリック順位序列相関、チェビシェフ距離などのトランス作用性因子活性プロファイルを比較する他の距離もまた利用可能である。
【０１５５】
1つの方法では、既知試料に対する基準プロファイルを作成し、その基準プロファイルを、未知試料又は特性決定されていない試料のトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルと比較することにより、細胞型及び/又は病態を特性決定する。本明細書では、「基準プロファイル」とは、特定の生物系(即ち、細胞型及び/又は病態)の特性であるトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメントプロファイルである。この基準プロファイルの作成方法は、既知の生物系又は特性決定された生物系(即ち、既知の細胞型又は特性決定された細胞型)に、本明細書の他の箇所に記載のRTUを含んでいるポリヌクレオチドの集団を導入することを含む。トランス作用性因子の活性及び/又はシス調節エレメントの活性を検出する。本明細書の他の箇所に記載したようにして、トランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルは、生物系に存在する1種若しくは複数のトランス作用性因子及び/又は1種若しくは複数のシス調節エレメントの活性レベルを表す値を含む、生物系のトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルを作成する。このトランス作用性因子活性及び/又はシス調節エレメント活性のプロファイルは、各種生物系を特性決定する基準プロファイルとして用いることができる。特定の基準生物系に関する基準プロファイルが確立されたならば、そのプロファイルは、特性決定されていない生物系が基準生物系と同じ生物系(即ち、細胞型及び/又は同じ病態)であるかどうかを決めるのに用いることができる。目的の生物系のトランス作用性因子活性プロファイル及び/又はシス調節エレメント活性プロファイルが基準プロファイルに十分に類似しているかどうかを決めるには、目的の生物系由来のトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルを基準プロファイルと比較する。或いは、目的の生物系のトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメントプロファイルに最も類似している基準プロファイルを選択するには、試験生物系のトランス作用性因子活性プロファイル及び/又はシス調節エレメント活性プロファイルを複数の基準プロファイルと比較する。
【０１５６】
特定の実施態様では、基準プロファイルの作成に用いられるRTUの集団は、少なくとも1種又は複数の較正用RTUを含む。それにより、トランス作用性因子活性又はシス調節エレメント活性のレベルが較正用RTUからのレポーター種のレベルに対して標準化される。較正用RTUを必ずしも含んでいる必要はなく、各種のトランス作用性因子又はシス調節エレメントの相対活性を決定し、続いて試料中の同じトランス作用性因子又はシス調節エレメントの相対活性と比較することができることは理解されよう。
【０１５７】
別の方法では、胚幹細胞のゲノムに本ポリヌクレオチドの集団を安定的に組み入れた場合に、胚発生及び生後発育中の各種組織で、並びに病態の各種実験モデルで、目的のトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性をモニタリングすることができるレポーター遺伝子組み換え動物が得られる(Gilthorpeらの論文(1999)Methods Mol Biol.97:159-182、及びTrainorらの論文(1999)Methods Mol Biol.97:183-200)。
【０１５８】
細胞型の同定方法を提供する。本方法は、各基準プロファイルが特定の細胞型及び/又は病態の特性を示し、且つ細胞型及び/又は病態での少なくとも2種のトランス作用性因子又は少なくとも2種のシス調節エレメントのレベルを表わす数値を含む、1種又は複数の基準プロファイルを提供する。また、目的の細胞及び/又は目的の病態に関するトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルも提供する。このプロファイルは、2種以上のトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性を表す数値を含み、数値もまた基準プロファイル中に含まれる。次いで、目的の細胞及び/又は目的の病態からのトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルが1種又は複数の基準プロファイルに類似しているかどうかを決定し、それにより細胞型及び/又は病態を同定する。
【０１５９】
基準プロファイルとトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルの間の相関の強さは、統計的有意性検定によって決定することができる。かかる統計的検定により、2種類のプロファイル間の相関の強さを示すスコアが得られる。かかるスコアは、トランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルの診断又は予測の精度向上のため、或いは、トランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルの診断又は予測の精度を保持しながら、トランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルに含まれている数値の数を減らすために、活性が特定の細胞型との最強相関を有している1種又は複数のトランス作用性因子又はシス調節エレメントの選択に用いることができる。
【０１６０】
基準プロファイルは、種々の試料の同定に使用することができる。例えば、基準プロファイルは、胚幹細胞、及び脾臓、肺、結腸、肝臓、子宮、子宮内膜、脳、皮膚、骨髄、心臓、血管、胸腺、腎臓、乳房、精巣、前立腺、甲状腺、骨格筋、膵臓、小腸又は卵巣由来の細胞又は細胞系などの種々の細胞型の同定に使用することができる。目的の他の細胞としては、T細胞、B細胞及び造骨細胞(骨原性細胞、骨芽細胞及び骨細胞)が挙げられる。更に、任意の器官又は組織からのバイオプシー試料、オートプシー試料又は切片組織培養物を用いることができる。また更なる目的の細胞系としては、哺乳動物293細胞、Hela細胞系、CHO細胞系及びCOS細胞系が挙げられる。
【０１６１】
また、正常細胞対病的細胞;成長又は分化の種々の段階の細胞;或いは細胞周期の異なる部分の細胞の同定に基準プロファイルを使用することができる。本発明の方法で同定可能な病的細胞又は病態は、これらに限定されるものではないが、老化、頭痛、心臓肥大、筋ジストロフィー症、異化障害、1型糖尿病、2型糖尿病、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、心臓病、乏血/再灌流、狭心症、肺疾患、酸誘発肺障害、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、腎臓病、レプトスピラ症腎臓病、腸疾患、皮膚病、色素失調症、喘息、関節炎、クローン病、眼アレルギー、虫垂炎、膵臓炎、歯周炎、炎症性腸疾患、敗血症、シリカ誘発、睡眠時無呼吸、エイズ(HIV-1)、自己免疫病、狼瘡、神経病理学的疾患、又はアルツハイマー病が挙げられる。
【０１６２】
癌細胞もまた本発明の方法で同定することができる。本明細書では、「癌」、「過剰増殖性」及び「腫瘍性」という用語は、自律的増殖能力を有する細胞、即ち、急速に増殖する細胞増殖を特徴とする異常な状態又は病態を意味する。過剰増殖性疾患症状及び腫瘍疾患の病態は、病理学的なものとして(即ち、病態の特徴又は構成があるものとして)分類することができる。或いは、非病理学なものとして(即ち、正常からは逸脱しているが病態には関係していないものとして)分類することができる。この用語は、組織病理学的種類又は侵襲性の段階に関係なく、すべての種類の癌増殖又は発癌過程、転移組織又は悪性形質転換した細胞、組織若しくは器官を含むものとする。「病理学的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍増殖を特徴とする病態を引き起こす。非病理学的過剰増殖性細胞の例としては、創傷治癒に関連する細胞増殖が挙げられる。これらに限定されるものではないが、乳癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、膵癌、食道癌/胃癌(gastric)、消化器癌(stomach)、結腸癌、甲状腺癌、黒色腫癌、頭頸部癌、円柱腫症、口腔癌、星状細胞腫/膠芽腫、神経芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性T細胞白血病(HTLV-1)、慢性リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫(EBV)、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫などの各種癌細胞を本発明の方法で同定又は特性決定することができる。
【０１６３】
本発明の方法は、病変のある生物系で転写因子活性プロファイルを試験することにより、例えば、これらの病変の分子特性の同定及び診断に使用することができる。例えば、本明細書に記載した実際の実施例で明らかにした通り、癌細胞は転写因子活性の異なるパターンを持っているため、同じ種類の組織由来のものであっても、癌細胞系の差分解析を行うことができる。従って、本明細書で提供した方法は、病変の特定の種類及び段階で極めて重要な役割を果たしているシグナル伝達/転写因子経路の同定に用いることができる。病的細胞及び正常細胞中の複数の転写因子プロファイルを比較することによって、特定の病変の根底にあるシグナル伝達の変化を見つけることができる。更に、かかるプロファイルは、ヒトをはじめとする生物体に存在する病変の診断にも有用である。
【０１６４】
また、本方法は、疾患の診断マーカーの同定にも有用である。正常な試料又は細胞と比較した場合に細胞試料又は疾患の培養細胞で相違するトランス作用性因子活性及び/又はシス調節エレメント活性は、診断マーカーとして用いることができる。一般に、最も良いのは、統計的に有意な試料集団の試料を正常試料と比較することである。この方法では、病変を示すすべての細胞又はかなりの数の細胞に共通の診断マーカーを同定するための情報をプールすることができる。またトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルは、細胞中の特定の病原菌又は病原株の存在を示し得るか、或いは、特定の疾患に対する感受性、又は所定の治療を受けた場合の好ましくない副作用に対する感受性と相関関係があり、その予測に使用することができる。
【０１６５】
特定の方法では、生後発育における各種組織、細胞及び器官のトランス作用性因子活性及び/又はシス調節エレメント活性のプロファイリングに、また、全動物におけるin vivoでの各種治療の効果(例えば、各種化合物投与、ストレス、病原菌、疼痛刺激、各種疾患、腫瘍変化)の調査に、RTUを含んでいるポリヌクレオチドの集団を保持するトランスジェニック動物を用いることができる。
【０１６６】
更に別の方法では、細胞活性化の各種インデューサーの主要標的であるトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの同定に、RTUを含んでいるポリヌクレオチドの集団を使用することができる。この方法では、RTUを含んでいるポリヌクレオチドの集団を細胞に一過性に又は安定的にトランスフェクトする。トランスフェクト細胞は、タンパク質合成阻害剤で事前処理し、目的のインデューサーで刺激する。
【０１６７】
別の方法では、RTUを含んでいるポリヌクレオチドの集団を遺伝子送達ビヒクル(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、又はアデノ関連ベクター)に挿入し、細胞活性化、変換、分化、アポトーシス、老化などのプロセス中のトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性をプロファイリングするための細胞に導入することができる。
【０１６８】
また、被験体におけるトランス作用性因子活性及び/又はシス調節エレメント活性のプロファイルの決定に本発明の組成物を使用することもできる。この方法では、RTUを含んでいるポリヌクレオチドの集団を適当なベクターに挿入し、バイオプシー試料にトランスフェクトする。遺伝子導入自体及びレポーター転写は急速に(1〜2時間の間に)起こるので、トランス作用性因子活性プロファイル及び/又はシス調節エレメント活性プロファイルは、外植組織をそのままの状態に保ちながら決定することができる。また高感度のPCR検出により、少量の生物標本でトランス作用性因子又はシス調節エレメントのプロファイルを決定することもできる。
【０１６９】
また別の方法では、胚発生におけるトランス作用性因子活性及び/又はシス調節エレメント活性のプロファイルの調査にRTUの集団を使用することができる。この方法では、RTUを含んでいるポリヌクレオチドの集団を胚幹細胞へ導入し、子宮内に移植する。種々の成長段階でレポーター胚/胎児を顕微解剖し、トランス作用性因子活性又はシス調節エレメント活性の分析に供する。
【０１７０】
ヒトゲノムプロジェクトは何千もの遺伝子を同定してきている。それらの大部分については、その生物学的機能は未知である。本発明は、新しく発見された遺伝子をシグナル伝達/転写因子ネットワーク内に入れることができる方法を提供する。従って、生物系での目的のポリヌクレオチド又はポリペプチドの生物学的機能を評価する方法を提供する。この方法では、目的のポリヌクレオチド又はポリペプチドのレベル/活性をモジュレートする効果の評価に、RTUを含んでいるポリヌクレオチドの集団を保持している生物系を使用することができる。トランス作用性因子活性及び/又はシス調節エレメント活性のプロファイルを分析することにより、目的のポリヌクレオチド又はポリペプチドのレベル及び/又は活性のモジュレーション(上昇又は低下)に影響されるトランス作用性因子経路(即ち、シグナル伝達経路)を決定することができる。
【０１７１】
他の実施態様では、シグナル伝達のレベルで目的のポリヌクレオチド又はポリペプチドの変化がある動物の表現型の変化の分析に本発明の方法及び組成物を用いることができる。例えば、改変した細胞でのシス調節配列及び/又はトランス作用性因子の活性プロファイルを野生型細胞のものと比較するため、RTUの集団を、目的のポリヌクレオチド又はポリペプチドに改変のある動物由来の細胞へin vitroで導入することができる。この方法により、決定しようとする所定のトランス作用性因子経路(即ちシグナル伝達)におけるポリヌクレオチド又はポリペプチドの生物学的機能を同定することができる。
【０１７２】
他の実施態様では、全動物の種々の組織における目的の遺伝子の不活性化又は過剰発現の効果の評価に、(上述したような)レポーター動物を用いることができる。この実施態様では、ゲノムに安定的に組み入れられたRTUの集団を保持するレポーター動物を、ポリペプチド又はポリヌクレオチドのレベル及び/又は活性が低下又は上昇している動物と交雑させる。得られる動物におけるRTUの発現を分析することにより、種々の器官及び組織におけるトランス作用性因子経路(即ちシグナル伝達経路)での目的のポリペプチド又はポリヌクレオチドの生物学的機能を確立することができる。
【０１７３】
その機能の評価において、目的のポリヌクレオチド又はポリペプチドに各種改変を行うことができることは認識されよう。例えば、改変を行うと、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性が低下する。かかる改変としては、これらに限定されるものではないが、遺伝学的ノックアウト、アンチセンス配列による処理、干渉RNA、ドミナントネガティブ変異の発現、又は目的のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの活性/レベルを阻害可能な他の手段が挙げられる。他の実施態様では、改変を行うと、目的のポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性又はレベルが上昇する。かかる改変としては、これらに限定されるものではないが、ポリヌクレオチドの過剰発現、ドミナントポジティブ変異の発現、又は目的のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドのレベル及び/又は活性を上昇する他の手段が挙げられる。
【０１７４】
例えば、トランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性に対する医薬品(例えば、薬剤、化合物)などの各種治療の効果をモニタリングすることにより、基本的薬剤スクリーニングだけでなく臨床試験にも利用することができる。例えば、標準状態と病的状態の両方に対する基準プロファイルを作成することができる。治療の効果は、被験体のトランス作用性因子活性プロファイル及び/又はシス調節エレメントプロファイルをモニタリングし、そのプロファイルを、正常状態及び病的状態の基準プロファイルと比較することにより、被験体の臨床試験でモニタリングすることができる。
【０１７５】
目的のいかなる治療も本発明の各種方法で用いることができる。特定の実施態様では、本治療は、生物系を物理的刺激、機械的刺激、化学的刺激又は生物学的刺激に曝露することを含む。更に別の方法では、本治療は、生物系を有機分子、無機分子、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、電離放射線、電磁界、重力又は圧力に曝露することを含む。一実施態様では、本治療は化学療法剤である。
【０１７６】
ある方法では、被験体の治療効果をモニタリングする方法は、(1)治療を行う前に被験体から治療前細胞試料を取得するステップと;(2)前記試料のトランス作用性因子又はシス調節エレメントの活性を検出し、それにより、トランス作用性因子活性プロファイル及び/又はシス調節エレメント活性プロファイルを作成するステップと;(3)被験体から1種又は複数の治療後試料を取得するステップと;(4)前記試料のトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性を検出し、それにより、トランス作用性因子活性プロファイル及び/又はシス調節エレメント活性プロファイルを作成するステップと;(5)治療後細胞試料のトランス作用性因子活性プロファイル又はシス調節エレメント活性プロファイルを、治療前試料細胞又は試料と比較するステップ、及び/又は、治療後細胞試料を、事前に作成しておいた健全状態又は病的状態の基準プロファイルと比較するステップと;(6)被験体への治療を変更し、それにより所望の効果をもたらすステップ(例えば、トランス作用性因子活性又はシス調節エレメント活性の適当なモジュレーション)とを含む。従って、本発明の方法は、薬物毒性及び薬剤の有効量の評価に使用が見出される。
【０１７７】
生物系において目的の細胞型の機能をモニタリングする方法であって、(1)ポリヌクレオチドの集団のシス調節エレメントの活性が対応するトランス作用性因子の存在下でモジュレートされる、本発明のRTUを含んでいるポリヌクレオチドの集団を保持する細胞を提供するステップと、(2)前記細胞を目的の生物系へ導入するステップと;(3)前記生物系のトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性を検出し、それにより、前記生物系に対する第1のトランス作用性因子活性プロファイル及び/又は第1のシス調節エレメント活性プロファイルを作成するステップと;(4)発生時よりも後の時点で、又は目的の治療の後で、前記生物系のトランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性を検出し、それにより、前記生物系に対する第2のトランス作用性因子活性プロファイル又は第2のシス調節エレメント活性プロファイルを作成するステップと;(5)第1のシス調節エレメント活性プロファイルが第2のシス調節エレメント活性プロファイルに似ているかどうかを決定し、且つ/又は、第1のトランス作用性因子活性プロファイルが第2のトランス作用性因子活性プロファイルに似ているかどうかを決定し、それにより、シス調節エレメント活性のプロファイルの一時的且つ因果的変化を評価し、生物系内の前記細胞型の機能を評価するステップとを含む方法を提供する。
【０１７８】
5.3.3.トランス作用性因子活性及び/又はシス調節エレメント活性をモジュレートする治療に関する分析
トランス作用性因子又はシス調節エレメントの活性をモジュレートする各種治療をスクリーニングする方法及び組成物を提供する。本方法と組成物は、望ましい生物学的効果及び望ましくない生物学的効果などの各種治療効果の同定に用いることができる。本発明の方法及び組成物は、少なくとも1種のトランス作用性因子及び/又は少なくとも1種のシス調節エレメントの活性に対する治療効果の評価に用いることができる。この方法では、本発明のRTUの集団を保持している生物系を提供する。生物系に目的の治療を行い、続いてレポーター配列のレポーター種を処理する。特定の実施態様では、少なくとも2種のプロセシングしたレポーター種を検出する。この方法により、少なくとも1種のトランス作用性因子及び/又は少なくとも1種のシス調節エレメントの活性をモジュレートする治療を同定することができる。この方法で同定された治療は、レポーター種のレベルを上昇又は低下させることができる。一部の実施態様では、プロセシングしたレポーター種の検出量を標準又は基準プロファイルと比較して、トランス作用性因子及び/又はシス調節エレメントの活性をモジュレートする治療を同定する。
【０１７９】
目的のすべての治療を本発明の方法で用いることができる。特定の実施態様では、本治療は、生物系を物理的刺激、機械的刺激、化学的刺激又は生物学的刺激に曝露することを含む。更に別の方法では、本治療は、生物系を有機分子、無機分子、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、電離放射線、電磁界、重力又は圧力に曝露することを含む。一部の実施態様では、本治療は化学療法剤である。特定の実施態様では、生物系を既知の薬剤に曝露する。
【０１８０】
特定の実施態様では、本発明の方法は、癌治療のスクリーニング法としての用途を持っている。この目的のために、ラージアレイのデータが利用可能である、1組の基準化学療法剤をスクリーニングすることができる。例えば、癌腫由来の数多くの細胞系に対しては、特定の細胞系を死滅させる20〜30種類又はそれ以上の薬剤、及び細胞の生存率に影響を及ぼさないほぼ同数の基準薬剤を選択することができる。薬剤による治療時に起こる転写因子のプロファイルにおける変化を評価し、それらの薬剤の分子識別特性の新規データベースの作成に用いる。次いで、有望な抗癌剤候補の同定を目的として、スクリーニング済みの化学的ライブラリーのプロファイリングと比較する基準プロファイルとしてこのデータベースシステムを利用する。
【０１８１】
目的の生物系が細胞を含み、治療が候補化合物を含む場合、各種方法は、候補化合物の細胞への接触(例えば、細胞培養培地中での候補化合物のインキュベーション、細胞を保持する動物への候補化合物の投与、或いは、細胞又は細胞を保持する被験体への候補化合物(又は候補化合物をコードするヌクレオチド配列)の導入など)に用いることができる。かかる方法は当技術分野で公知であり、本明細書の別の箇所に記載している。
【０１８２】
また本発明の方法及び組成物は、種々の治療に曝露された2種類の同一生物系の試験に有用である。例えば、本方法は、毒性スクリーニングで、且つ/又は化合物の細胞における遺伝子発現のモジュレート能力の試験で有用である。かかる方法では、1つの試料を候補化合物に曝露し、もう1つの細胞は曝露しない。次いで、試料のトランス作用性因子活性プロファイル及び/又はシス調節エレメントプロファイルを作成し、比較する。
【０１８３】
シス調節エレメント活性のモジュレーターを同定するためにスクリーニングすることができる候補化合物には、すべての分子、例えば、小型無機分子及び小型有機分子(例えば、コンビナトリアルライブラリー及び天然産物ライブラリーから得られる分子)が含まれる。かかる分子としては、例えば、ポリペプチド(抗体及びペプチドを含む)、並びに核酸分子又は多糖類が挙げられる。候補化合物が多数の化学的分類を包含することは理解されよう。
【０１８４】
特定の方法では、候補化合物は、シグナル伝達分子(即ちキナーゼ)などのポリペプチドである。トランス作用性因子活性のプロファイルを分析することにより、シグナル伝達分子によって優先的に活性化されるトランス作用性因子を決定することができる。同様に、本発明の組成物は、(例えば、DNA突然変異体cDNAの発現による、又は選択的化学抑制剤を用いた細胞の処理による)特定のシグナル伝達経路の選択的阻害が、種々のトランス作用性因子にどの程度影響を及ぼすのかを評価するのに用いることができる。
【０１８５】
当技術分野で明らかであるように、候補化合物は、合成化合物及び天然化合物のライブラリーをはじめとする、種々の供給源から取得することができる。従って、本明細書に記載の方法は、候補化合物の任意のライブラリーをスクリーニングするための迅速で簡便な方法を提供する。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野で、例えば、DeWittらの論文(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909;Erbらの論文(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422;Zuckermannらの論文(1994).J.Med.Chem.37:2678;Choらの論文(1993)Science 261:1303;Carellらの論文(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carellらの論文(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;Gallopらの論文(1994)J.Med.Chem.37:1233;並びに、Ghose及びVishwanadhan編(2001)Combinatorial Library Design and Evaluation:Principles,Software Tools,and Applications in Drug Discovery(Marcel Dekker,New York)、WO94/24314、及びWO94/24314(これらの各文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれているものとする)で確認することができる。
【０１８６】
上述のように、組成物には、トランス作用性因子又はシス調節エレメントに対応するRTUを含むポリペプチドの集団を保持するトランスジェニック動物が含まれる。従って、トランスジェニック動物に候補化合物を投与し、目的のトランス作用性因子の活性を検出することができる。従って、高スループットのin vivoにおける薬剤スクリーニングが可能な方法を提供する。
【０１８７】
一部の実施態様では、病的状態にある個体が治療に応答を示すか否かを決定する方法を提供する。例えば、個体の病変の原因となっている細胞(例えば、バイオプシーで個体から取り出された細胞、或いは別の例としては、個体が罹患している病変のモデルとして一般に用いられる培養細胞系)にRTU集団を導入し、前記細胞を有望な治療と接触させた後、レポーター種を処理し検出して基準プロファイルと比較可能なプロファイルを作成し、それにより、プロファイルで類似度又は差異を確認した場合に、病的状態にある個体が治療に応答を示すかどうかを決定することができる。
【０１８８】
5.3.4.細胞集団の大きさの決定方法
細胞集団の混合物中に存在する目的の細胞集団の大きさを決定する方法を提供する。これらの方法は、各種レポーター配列と提供されているもう1つの別のものとを識別可能なプロセシングタグを有するレポーター配列を含んでいるDNA構築物を含むポリヌクレオチドを用いる。かかるDNA構築物の集団についても上記に記載している。
【０１８９】
細胞集団の大きさの決定方法は、(1)各細胞集団の細胞が特有のレポーター配列を含み、各レポーター配列がレポーター配列中に共通のプロセシングタグを含み、プロセシングタグの位置が各レポーター配列において異なっており、プロセシングタグが細胞集団の各レポーター配列を識別可能である、2つ以上の細胞集団を提供するステップと;(2)細胞集団を組み合わせるステップと;(3)組み合わせた細胞集団に目的の治療を行うステップと;(4)レポーター配列のプロセシングを行うステップと;(5)プロセシングしたレポーター配列を検出し、それにより、細胞集団の相対存在量を決定するステップとを含む。目的の治療、プロセシングタグ、細胞集団、並びにこの実施態様を実施するための他の組成物及び方法については、本明細書の他の箇所に詳細に記載している。
以下の実施例で本発明の態様を説明するが、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１９０】
（6.1.実施例1）
以下の実施例で用いる材料と一般法を下記に記載する。
核酸操作。核酸を用いる操作は、例えば、Sambrook及びRussellの論文,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)、並びにCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、John Wiley & Sons,1994-1998,Current Protocols,1987-1994,(2005年7月に補完されたもの(補遺71)などの当技術分野で公知の標準分子生物学技術を用いて実施した。オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies(Coralville,IA,USA)に発注した。
【０１９１】
細胞。HEK293、239、HCT116、SW480、HepG2及びMDA-MBA-231の各細胞は、10%FBS(HyClone,Logan,UT,USA)及び抗生物質を補充したDME培地(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)上に保持した。ヒト組換え型TNFα及びIL-1βは、Roche(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)から購入した。エトポシド、ホルスコリン、3,3',5-トリヨード-L-サイロニン(T3)、25-ジヒドロキシビタミンD3、エストラジオール、デキサメタゾン及び4α-ホルボール-12-ミリスチン酸-13-酢酸塩(PMA)は、Sigma(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)から購入した。1,4-ジアミノ-1,4-ビス(2-アミノフェニルチオ)-ブタジエン(U0126)は、A.G.Scientific(San Diego,CA,USA)から入手した。
【０１９２】
トランスフェクション。トランスフェクトしようとする細胞を、6ウェルプレートのウェル中にサブコンフルエント密度(1×106/ウェル)でプレーティングした。18時間後、FuGene 6試薬(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)を細胞にトランスフェクトし、これを、メーカーのプロトコルに従って、各トランスフェクションに対し3.0μl/1.0μgのトータルプラスミドDNAの比率でプラスミドDNAと混合した。トランスフェクションの翌日、培地を新しい増殖培地1mlに換えた。
【０１９３】
細胞RNAの単離。トータル細胞RNAは、TriZol試薬(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)をメーカーのプロトコルに従って用いて単離し、水中に再溶解した。慣例的に、TriZol試薬1mlを用いて、6ウェルプレートのウェル中に存在する細胞のコンフルエント単層からRNAを抽出した。
【０１９４】
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)。トータルRNAの試料を、メーカーの取扱説明書に従ってDNAse I(Ambion,Austin,TX USA)で処理した。残留のDNAseは、70℃で15分間加熱することにより不活性化した。DNAseで処理したRNAは、オリゴ-dTポリヌクレオチド及びMo-MLV逆転写酵素(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)をメーカーの取扱説明書に従って用いて逆転写した。逆転写したRNAの10分の1をTaq DNAポリメラーゼ(Invitrogen Carlsbad,CA,USA)と以下のレポーター配列特異的プライマーを用いることにより、PCR反応で増幅した(フォワードプライマー1:5'-AAATACGAGATCCACCGAGACTCC-3'(配列番号１１)、及びリバースプライマー2:5'-GCAGGAACAGCGCCGATACAAT-3'(配列番号１２))。PCR反応は、ABI 9700 GENEAMP サーモサイクラー上で実施した。サイクルパラメーターは、95℃で20秒、65℃で20秒、及び72℃で2分であった。
【０１９５】
PCR産物の標識化。終了した各PCR反応産物の10分の1を、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)5'-標識レポーターポリヌクレオチド特異的プライマー(プライマー2:5'-GCAGGAACAGCGCCGATACAAT-3'(配列番号１２))を含有する新しいPCR反応混合物で希釈し、次いで、95℃で2分間、68℃で20秒間、及び72℃で10分間インキュベートした。
【０１９６】
エンドヌクレアーゼ制限。Hpa I制限エンドヌクレアーゼ(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)は、反応当たり5Uの濃度で標識PCR産物に直接添加した。試料を2時間消化し、Qiaquick PCR精製カラム(Qiagen,Hilden,Germany)を用い、メーカーのプロトコルに従って精製した。
【０１９７】
キャピラリー電気泳動法。Hpa Iで消化した各試料の連続希釈物を、ABI Prizm 3100遺伝学的アナライザー(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)を用いてキャピラリー電気泳動法により分析した。1組のX-ローダミン標識MAPMARKER 1000分子量基準(Bio Ventures,Murfreesboro,TN,USA)を分子量スタンダードとして分析試料に同時に電気泳動にかけた。
キャピラリー電気泳動法データ分析は、GENSCAN(登録商標)ソフトウェア(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)又はATTAGRAPHソフトウェア(Attagene,NC,USA)のいずれかを用いて実施した。
【０１９８】
（6.2.実施例2）
本実施例では、複数の転写因子活性を評価するための複数の個別RTUの構築を示す。特に、本実施例では、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)遺伝子配列を使用して、別のレポーター配列中のプロセシングタグ位置とは異なる位置に配置されているHpaIエンドヌクレアーゼ切断部位プロセシングタグを各々有する、32種類のレポーター配列を調製することについて記載する。
【０１９９】
SEAP遺伝子を含むpSEAP2-コントロールプラスミドベクターは、Clontech(Palo Alto,CA,USA)から購入した。HpaIエンドヌクレアーゼ切断部位は、PCRによるin vitro部位特異的突然変異誘発法を用いて、SEAP遺伝子の転写領域の様々な位置で生じさせた。簡単に説明すると、個々の1対の各プライマーがHpaI切断部位によって切断されたSEAP遺伝子の異なる領域に相同な配列を含んでいる、1組が32対の自己相補的オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。個別の各HpaIタグ付きレポーターポリヌクレオチドを得るため、1×Pfuバッファー(Stratagene,La Jolla,CA,USA)、200μMの4種類の各dNTP、それぞれ20pMのHpaI切断部位を含有している2種類の自己相補的SEAP特異的プライマー、及び2uのPfuポリメラーゼ(Stratagene,La Jolla,CA,USA)を含有するPCR反応物中で、100ngのpSEAP2-コントロールDNAを鋳型として用いた。PCRは、12サイクルを全容量50ulで行った。サイクルパラメーターは、95℃で20秒、55℃で20秒、及び68℃で10分であった。オリジナルのpSEAP2-コントロールプラスミドDNA鋳型の除去については、完了したPCR反応物を、同じ1×Pfuバッファーに溶解したDpnI制限酵素(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)10単位で2時間処理した。DpnI処理した反応物のアリコートを用いて、UltraMax efficiency DH5α大腸菌コンピテント細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を直接形質転換した。プラスミドDNAのミニ調製物を細菌クローンから単離し、HpaI制限消化によって分析し、HpaI部位の出現を確認した。本実施例で得られた32種類すべてのレポーターポリヌクレオチドの配列を確認した。親のSEAPレポーター配列(配列番号13)の配列とプロセシングタグを持つ32種類のレポーター配列(配列番号14〜45)を図11A〜Kに記載した。
【０２００】
（6.3.実施例3）
本実施例は、比較可能な転写効率を有する識別可能なRTUの集団の調製について記載する。
前の実施例で記載した32種類のレポーター配列を、構成的(シミアンウィルス40由来の)SV40プロモーターと共にプラスミドへサブクローニングした。得られるRTUライブラリー(SV40-RTUという)は32種類の個別のレポーター構築物(ここで、各構築物は、特異的に配置されているHpaIプロセシングタグを有するレポーター配列に機能的に結合されている同一のSV40プロモーターを含んでいる)を含んでいた(図12A)。個別のSV40-RTUの等モル混合物を、上述の第6.1節に記載したヒト腎臓上皮HEK293細胞に一過性にトランスフェクトした。翌日、トータル細胞RNAを上述の第6.1節に記載したようにして単離し、5μgのトータルRNAを含有している試料を37℃で1時間DNAse Iで処理し、続いて70℃で15分間インキュベーションし、残留DNAse活性を不活性化した。全容量20μl中に1×RTバッファー(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、1μMのオリゴ-dTプライマー(16個のチミジン残基を含む)、500μMの4種類の各dNTP、及びMo-MLV逆転写酵素(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を含有する逆転写(RT)反応物中で、1μgのDNAse処理したRNAを鋳型として用いた。RT反応を42℃で1時間行い、続いて75℃で20分間更なるインキュベーションを行い、逆転写酵素の残存活性を不活性化した。全容量50μl中に1×PCRバッファー(Invitrogen Carlsbad,CA,USA)、200μMの4種類の各dNTP、各20pMのフォワードプライマー1(配列番号11)及びリバースプライマー2(配列番号12)、0.2単位のTaq DNAポリメラーゼ(Invitrogen Carlsbad,CA,USA)を含有するPCR反応物中で、2μlの逆転写RNAのアリコートを鋳型として用いた。PCR反応は、上述の第6.1節に記載したサイクルパラメーターで、ABI 9700 GeneAmpサーモサイクラーにて30サイクルを実施した。増幅したレポーター配列は、上記第6.1節に記載したように、完了した各PCR反応物の5μlアリコートを、20pMの6-カルボキシフルオロセイン(6-FAM)5-標識レポーターポリヌクレオチド特異的プライマー2(配列番号12)を補充した新しいPCR反応混合物45μlで希釈することにより蛍光標識した。標識PCR反応生成物対して、上述のように、Hpa I制限エンドヌクレアーゼ反応及びキャピラリー電気泳動法を実施した。電気泳動図が得られ、GENSCAN(登録商標)断片分析ソフトウェアを用いて分析した。電気泳動図では、個別の各レポーターポリヌクレオチドは6-FAM蛍光強度位置のピークとして検出され、その位置は、レポーターヌクレオチド内のHpaIプロセシングタグの位置により決定される(図12B)。
【０２０１】
個別のRTUの相対活性は、電気泳動図上の対応する個別ピークの蛍光値として算出され、すべてのレポーターピークの平均値で標準化した(図12C)。32種類のレポーター構築物のうち26種類のレポーター配列は、平均発現レベルからの解離が20%未満のほぼ等しい効力で発現されており、一方、6種類の構築物(図12Cにおいて標識番号7、14、22、23、26及び31)は、実質的に異なるレベルの発現であった。選択したこれらの26種類のレポーター配列を用いて、下に記載した実施例で用いる複数の転写因子RTUのライブラリーを構築した。
【０２０２】
（6.4.実施例4）
本実施例は、本明細書で提供しているRTUの集団が細胞中に存在する特定のトランス因子活性に対して適合度を示し、RTU集団のレポーター種のプロファイルに再現性があり、検出用のレポーター種の調製における変更は本発明のRTU集団を用いて対応することができることについて記載する。
【０２０３】
6.4.1.15種類のRTUライブラリーの構築
前の実施例で記載した、等しい転写効率を示したHpaIタグ付けレポーター配列のうち15種類を用いて、15種類の異なるシス調節エレメントの1つ(この場合、プロモーター)が含まれている構築物に各レポーター配列を挿入することにより、RTUの集団を調製した。RTUのプロモーター(括弧内の記載は個別のRTUに関する用語を示す)は、(1)転写因子NF-κB(Zabelらの論文(1991)J.Biol.Chem.266:252-260;Baldwinらの論文(1991)Mol Cell Biol.11:4943-4951)(NF-κB RTU)、p53(Funkらの論文(1992)Mol Cell Biol.12(6):2866-71)(p53 RTU)、又はcAMP応答エレメント(CRE)(Benbrook及びJonesの論文(1994)Nucleic Acids Res.22:1463-1469)(CRE RTU)に対する結合部位のコンカテマー;(2)核受容体PPARα(Evansらの論文(2004)Nat Med.10(4):355-361)(PPRE RTU)、エストロゲン受容体(ER)(Naarらの論文(1991)Cell 65(7):1267-1279)(ERE RTU),グルココルチコイド受容体(GR)(McEwanの論文(1997)Bioessays 19(2):153-160)(GRE RTU)、アリール炭化水素受容体(AhR)(McLane及びWhitlockの論文(1994)Receptor 4(4):209-222)(AHR RTU)、又はプレグナンX受容体(PXR)(Lehmannらの論文(1998)J Clin Invest.102(5):1016-1023)(PXR RTU)に対する複数の結合部位;(3)INFγ(ISRE)(Kesslerらの論文(1990)Genes Dev 4:1753-1765)(ISRE RTU)、TCf/β-カテニンシグナル伝達(van der Weteringらの論文(1997)Cell 88(6):789-799)(Tcf/β-cat RTU)、TGFβシグナル伝達(Dennlerらの論文(1998)EMBO J.17(11):3091-3100)(TGFβ RTU)、熱ショックタンパク質(Kroeger及びMorimotoの論文(1994)Mol.Cell.Biol.14:7592-7603)(HSE RTU)、又は骨形態形成タンパク質(BMP)シグナル伝達(Korchynskyi及びDijkeの論文(2002)J Biol Chem 277(7):4883-91)(BRE RTU)により誘導可能な合成プロモーター;或いは、(4)改変型金属誘導性メタロチオネイン(MT)プロモーター(Makarovらの論文(1994)Nucleic Acids Res 22(8):1504-1505;Koizumiらの論文(1999)Eur J Biochem.259(3):635-642)(MTΔRTU);又は網膜芽細胞腫特異的抑制エレメント(Robbinsらの論文(1990)Nature 346(6285):668-671)(pRb RTU)を含有していた。これらのプロモーターに関する更なる詳細は表2に記載している。更に、サイトメガロウィルスプロモーターを含有する、2種類の構成的CMV RTUを構築した。3種類のウイルスSV40 RTUの他に、CMV RTUをキャリブレーション及び標準化目的で用いた。対応するインデューサーによる個別の各RTUの誘導性(例えば、NF-κB RTUに対するTNFα及びIL-1β、CRE RTUに対するホルスコリン、ISREに対するIFNγ等)は、RT-PCRを用いて一過性レポーターアッセイで試験した。
【０２０４】
【表２】
2008519605.tif 000005
【０２０５】
6.4.2.写因子活性に対するRTU集団の適合度
上述の11種類のRTU(PPRE RTU、GRE RTU、ISRE RTU、MTΔRTU、NF-kB RTU、CRE RTU、AhrE RTU、ERE RTU、HSE RTU、p53 RTU及びBRE RTU)は、等モル比で混合した。キャリブレーション目的の場合には、本集団は、1:3:9の比で混合されている、異なるHpaIタグ付きレポーター配列を含む3種類のSV40 RTUも含有していた。RTUのライブラリーをHEK293細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、NF-κBインデューサー、IL-1β(1ml当たり100u)、CREBインデューサー、ホルスコリン(1ml当たり1μg)、又はZnCl2(金属感受性MTΔRTUの特異的インデューサー)(100μM)により細胞を6時間刺激した。上記第6.1節で記載したように、トータルRNAを細胞から単離し、RT-PCRによりレポーター転写産物を増幅し、蛍光標識し、HpaIで消化し、キャピラリー電気泳動法によって分離した。
【０２０６】
HpaIで消化したPCR産物の電気泳動プロファイルを図13のA〜Dに示す(図面左上)。個別のRTUの転写活性の相対的値は、対応するピーク値に基づいて求めた。PCR増幅のリニアリティを調節する場合には、個別のピーク値を3種類の較正SV40 RTUから導いた検量線を用いることにより算出した(図13A〜Dの図面右上)。個別のRTU活性における変化の定量的評価を提供するため、内部標準化を導入した。この場合、(cDNAアレイハイブリダイゼーションの標準化方法と同様に)その系内のすべてのRTU活性の合計で各RTUの活性を割り算する。刺激した細胞(図13B〜D、図面中央)の個別のRTUの標準化活性を未刺激の細胞のものと比較した(図13A、図面中央)。図13Eは、刺激していない細胞に対する刺激した細胞の個別のRTUの発光量(fold-induction)を表す。便宜上、発光量を対数目盛で示す。負のlog値は阻害(発光量数値＜1)を示し、正のlog値は活性化(発光量数値＞1)を示す。
【０２０７】
これらの結果は、NF-κB RTUがIL-1β刺激細胞中で特異的に活性化され、CRE RTUがホルスコリン刺激細胞中で特異的に活性化され、MTΔRTUがZnCl2処理細胞中で誘導されたことを示す(図13E)。これは、IL-1β、ホルスコリン及びZnCl2の活性と一致している。従って、RTU集団は転写因子活性に関して有意な適合度を示す。
【０２０８】
6.4.3.転写因子活性を検出するためのRTU集団の再現性の証明
本発明の本方法によるレポーター種産生の再現性を評価するため、15種類のRTU(上記の第6.4.1節で記載したもの)の基礎活性プロファイルをHCT 116ヒト結腸直腸癌細胞中で評価した、複数の独立した実験結果を分析した。15種類のRTU集団を別々の組織培養プレート中のHCT116細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、トータルRNAを単離し、相対的基礎RTU活性のプロファイルを上述のようにして測定した。
【０２０９】
図14Aに示した結果は、2つの独立した実験で得られたプロファイルは、実質的に同一であることを示唆している。標準偏差は3%未満であった。この比較を他の細胞で数回繰り返したところ、同様な結果であった。慣用のルシフェラーゼ系転写アッセイの差異は例外的に15〜20%未満であると考えられるので、当業者には、これに注目に値する再現性があることが理解されよう。
【０２１０】
6.4.4.レポーターRNAの調製において、異なるRNA分解などの変動にもかかわらず本明細書に記載されているRTU集団を用いて均一な結果が達成されることの証明。
239ヒト腎臓上皮細胞の2種類の培養物に、既に第6.4.1節に記載した15種類のRTU集団を、同時にそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、各培養物からトータルRNAを単離した。上述の方法に従って、相対的転写因子活性の基礎プロファイルを決定した。逆転写を実施する前に、その2種類の各培養物から得られたトータルRNA試料中のトータルRNA保全を、臭化エチジウムの存在下でアガロースゲル電気泳動によって調べた(図14B、図面左)。1つの細胞培養物から得た試料(図14Bの試料#2)において、28SリボソームRNA画分の染色度が、別の細胞培養物から得た試料(図14Bの試料#1)と比較して有意に低下していることが確認され、試料#2のRNA分解のレベルが高いことが示唆された。更に、両試料から得られた個別のRTUの相対活性プロファイルは、本質的には同一であった(図14B、図面右)。これは、本発明のRTU集団は、レポーター種の調製において変動があるにもかかわらず、異なる試料にわたって一定の結果をもたらし得ることを証明している。
【０２１１】
6.4.5.トランスフェクトしたRTUの量に広範囲の変動があるにもかかわらず、本明細書で提供したRTU集団を用いて一定の結果が達成されるという証明。
本実施例は、トランス作用性因子及びシス調節エレメント活性の再現性の高いプロファイルが、RTU集団を用いて、実験条件における非常に広範囲の変動下で取得することができることを証明する。また本実施例は、非常に高感度の方法が提供されることを証明する。更に、導入したRTUは細胞機構を阻害せず、その結果、RTU集団により、内因性のトランス作用性因子及びシス調節エレメント活性プロファイルの適当な評価を得ることができることを証明する。
【０２１２】
上述の14種類の誘導性RTU(PPRE RTU、TGFβ RTU、TCF/β-cat RTU、PXR RTU、GRE RTU、ISRE RTU、MTΔRTU、NF-κB RTU、CMV RTU、CRE RTU、Ahr RTU、ERE RTU、p53 RTU及びBRE RTU)の等モル混合物を含んでいる、17種類のRTU集団を構築した。更に、1:3:9のモル比で、異なるHpaIタグ付きレポーター配列を含有している、3種類の較正SV40 RTUも含めた。RTU集団を、上述の条件と同様の条件を用いることにより、6ウェル組織培養プレートのウェル中のHEPG2細胞にトランスフェクトした。ある実験条件では、細胞に1マイクログラムのRTUプラスミドDNAをトランスフェクトした。別の条件では、プラスミドRTUを無関係のプラスミドDNAで1,000倍まで希釈し、RTUプラスミドDNAを1ナノグラム含有する1マイクログラムのトータルプラスミドDNAを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、トータルRNAを単離し、相対的な基礎RTU活性プロファイルを上述のようにして決定した。
【０２１３】
レポーター種のプロセシング及び検出時に、レポーター種の相対量を評価した。図14Cに示したように、トランスフェクトしたRTU量の極端な変動にもかかわらず、得られたプロファイルは事実上一致している。このことは、本明細書で提供した方法の再現性及び感度を証明している。
【０２１４】
（6.5.実施例5）
この実施例は、本願明細書で提供しているRTU集団を用いて、速やか且つ正確に、異なる細胞型に存在する複数の転写因子活性を評価することができることを証明する。更に、これらの結果から、所定の細胞型のRTU集団から作成された活性プロファイルを用いて、プロファイル中の不在及び存在が観察される特定の活性に基づいて特定の細胞の同定することができることを証明する。
【０２１５】
5種類の異なるヒト癌細胞系、即ち、HEK 293上皮腎臓細胞;HCT116及びSW480 結腸直腸癌細胞;MDA-MB-231乳癌細胞;並びに、HepG2肝臓癌細胞に、第6.4.1節に記載の15種類のRTU集団をトランスフェクトした。各細胞系において、個別のRTUの活性を上述のようにして評価し、すべてのRTU活性の合計に関して内部標準化によって標準化した。15種類のRTU(較正CMV RTU及びSV40 RTUを含む)の相対活性のプロファイルを図15に示す。
【０２１６】
得られたプロファイルは文献の報告と一致している。APC腫瘍抑制遺伝子(Korinekらの論文(1997)Science 275(5307):1784-7)中の突然変異によって、高レベルのβ-カテニンタンパク質と、高い基礎活性のTCF/β-カテニンレポーターを有することが予測されたSW480細胞は、最も高いTCF/β-カテニンRTU活性を示した(図15)。ドミナントポジティブβ-カテニンタンパク質中に生じている変異は、HepG2細胞(de la Costeらの論文(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(15):8847-51)中、及びHCT116細胞(Morinらの論文(1997)Science 275(5307):1787-90)中で起こることは周知であり、図15に記載した結果は、これらの細胞型において高い活性があることを示している。
【０２１７】
最大の基礎NF-κB活性がMDA-MB-231細胞で確認されたが、これは文献データと一致している(Nakshatriらの論文(1997)Mol Cell Biol.17(7):3629-39)。
p53 RTUプロファイルもまた文献データと一致している。HepG2、HCT116及び293細胞はすべてwt p53タンパク質を有しており、検出可能なp53 RTU活性を示した。一方、p53-突然変異体SW480及びMDA-MB-231細胞は、活性が非常に低いか検出が不可能であった。
従って、これらの結果は、癌細胞をそれらの基本転写因子活性プロファイルにより同定することができることを示唆している。
【０２１８】
（6.6.実施例6）
この実施例では、本発明の方法及び組成物を用いて、抗癌剤関連の薬剤及び癌細胞型と接触させた癌細胞における転写因子活性プロファイルの変化を検出し、追跡することができることを明らかにする。更に、本実施例は、細胞のRTU集団の活性プロファイルを用いて、特定の細胞で作動するシグナル伝達経路を解明することができることを明らかにする。
【０２１９】
抗癌剤の腫瘍壊死因子α(TNFα)及びエトポシド(VP-16)で処理した細胞の転写因子の活性プロファイルにおける変化を評価するため、HEK293、HCTl16、SW480、HepG2及びMDA-MB231細胞に上述の15種類のRTU集団をトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、TNFα(20ng/ml)又はエトポシド(100μg/ml)のいずれかで細胞を6時間刺激した。刺激後、上述のようにして、レポーターポリヌクレオチドを検出し、転写因子活性の標準化値を算出した。処理による発光量の値は、基準として基礎レベル活性を用いることにより算出した。発光量の値(図16)は、基礎活性に対する活性化(正のlog値)と阻害(負のlog値)を区別するために対数目盛で表している。転写因子活性のプロファイルの変化のパターンは、薬剤に対して、及び細胞系に対して高度に特異的であるように思われる。
【０２２０】
上述の実施例は、レポーター構築物のHpaIタグ付きライブラリーにより、15種類の癌関連転写因子の高い再現性と定量的評価が得られることを示している。これらの実施例は、この系を用いることによって、癌細胞をそれらの転写因子活性のプロファイルにより明確に識別することができることを明らかにしている。更に、特定の抗癌剤を試験したところ、転写因子活性のプロファイルの変化が、薬剤に対して、及び細胞に対して高度に特異的であるということが分かった。
【０２２１】
（6.7.実施例7）
本実施例では、5種類からなるRTU集団の調製物は、複数の核ホルモン受容体による転写活性のモジュレーションを検出することができることを明らかにする。更に、本実施例は、核ホルモン受容体のDNA結合ドメイン(DBD)の類似度が高いにもかかわらず、本出願で提供しているRTU集団を用いると、特定の核ホルモン受容体による転写モジュレーションを識別できることを明らかにする。
【０２２２】
核ホルモン受容体(以下、核受容体又は「NR」と記載)は、様々な過程(例えば、成長及び細胞分化の制御、癌、内分泌機能、コレステロール、脂肪酸及びグルコースの代謝及び輸送、並びに薬剤の生体内変換など)に関与しているリガンド活性型転写因子の大きな群を構成している。核ホルモン受容体は、一般に、受容体を特定のDNA配列に対して標的とする、高度に保存された主要なDNA結合ドメイン(DBD)とリガンド結合領域(LBD)(これはホルモン又はリガンドと直接的に相互作用し、またホルモン又はリガンド依存性転写活性化ドメインを更に含んでいる)を含むC末端部分を有している。
【０２２３】
6.7.1.核受容体RTUの構築
核受容体RTU集団の調製で用いられる方法においては、核受容体のLBDをGal4のDBD(十分に特性決定され、且つ高度に特異的なDNA結合特性を持つ酵母転写因子)とインフレームで結合させ、Gal4-DBD-NR-LBDキメラ発現構築物を取得する。次に、Gal4-DBD-NR-LBDキメラ発現構築物を、レポーター遺伝子に機能的に結合されているGal4 DNA結合エレメントを含んでいるレポーター構築物と共に目的の細胞へ同時導入し、NR RTUを取得する。その結果、NR RTU由来のレポーター配列の発現は、キメラ核受容体のリガンド活性型転写活性を示す。α型エストロゲン受容体(ERα)、ビタミンD受容体(VDR)、α型甲状腺ホルモン受容体(THRα)、グルココルチコイド受容体(GR)、及び構成的アンドロスタン受容体(CAR)を含む、5種類の異なるNR RTUを調製した。
【０２２４】
CAR(ジーンバンクアクセッション番号BC069626)、VDR(ジーンバンクアクセッション番号BC060832)、GR(ジーンバンクアクセッション番号BC015610)及びTHRα(ジーンバンクアクセッション番号BC006560)をコードしているプラスミドcDNAクローンは、Open Biosystems(Huntsville,AL,USA)から入手した。ERαのcDNAは、MCF-7細胞から単離したトータルRNAを用いて、RT-PCRにより増幅した。このcDNAは、ERα cDNA(ジーンバンクアクセッション番号NM_000125)に対応することが確認されている配列であった。Gal4 DNA結合ドメイン(Gal4DBD)発現ベクター(PM DNA-BD)はBD Biosciences(Palo Alto,CA,USA)から購入し、4xGal4-ルシフェラーゼレポーター構築物はPromega(Madison,WI,USA)から購入した。
【０２２５】
インフレームGal4DBD-GR融合発現ベクターを取得するため、GRのホルモン結合ドメイン(アミノ酸486〜777)を、hGR-Bam(ctc cGG ATC Cag gct gga atg aac ctg gaa(配列番号57))及びhGR-Hind(ctc AAG CTT tca ctt ttg atg aaa cag aag(配列番号58))プライマーを用いてPCRにより増幅し、BamH I及びHind III制限エンドヌクレアーゼ認識部位間のPM DNA-BDベクターの多重クローニング部位(MCS)へクローニングした。
【０２２６】
インフレームGal4DBD-ER融合発現ベクターを取得するため、ERαのホルモン結合ドメイン(アミノ酸264〜595)を、hERα-Eco(ctc GAA TTC atg ttg aaa cac aag cgc cag(配列番号５９))及びhERα-Bam(ctc GGA TCC tca gac tgt ggc agg gaa acc(配列番号６０))プライマーを用いてPCRにより増幅し、Eco RI及びBam HI制限エンドヌクレアーゼ認識部位間のPM DNA-BDベクターのMCSへクローニングした。  
【０２２７】
インフレームGal4DBD-VDR融合発現ベクターを取得するため、VDRのホルモン結合ドメイン(アミノ酸87〜427)を、hVDR-Eco(ctc GAA TTC atc ggc atg atg aag gag ttc(配列番号６１))及びhVDR-Hind(ctc AAG CTT tca gga gat ctc att gcc aaa c(配列番号６２))プライマーを用いてPCRにより増幅し、Eco RI及びHind III制限エンドヌクレアーゼ認識部位間のPM DNA-BDベクターのMCSへクローニングした。
【０２２８】
インフレームGal4DBD-THRα融合発現ベクターを取得するため、THRαのホルモン結合ドメイン(アミノ酸119〜410)を、hTHRα-Eco(ctc GAA TTC ggc atg gcc atg gac ttg gtt(配列番号63)及びhTHRα-Hind(ctc AAG CTT tta gac ttc ctg atc ctc aaa g(配列番号６４))プライマーを用いてPCRにより増幅し、Eco RI及びHind III制限エンドヌクレアーゼ認識部位間のPM DNA-BDベクターのMCSへクローニングした。
【０２２９】
インフレームGal4DBD-CAR融合物を取得するため、CARのホルモン結合ドメイン(アミノ酸103〜348)を、hCAR-Eco(CTC GAA TTC atg agg aaa gac atg ata ctg(配列番号65))及びhCAR-Hind(CTC AAG CTT tca gct gca gat ctc ctg gag(配列番号66))プライマーを用いてPCRにより増幅し、Eco RI及びHind III制限エンドヌクレアーゼ認識部位間のPM DNA-BDベクターのMCSへクローニングした。
【０２３０】
5種類の異なる4xGal4 RTUを取得するため、4xGal4-ルシフェラーゼベクター中のルシフェラーゼ遺伝子を、各レポーターポリヌクレオチドに特有の位置に1つのHpaI制限エンドヌクレアーゼ切断部位をそれぞれ持つ、5種類のSEAP誘導型レポーターポリヌクレオチドと置換した。
【０２３１】
各Gal4DBD-CAR、Gal4DBD-GR、Gal4DBD-THR、Gal4DBD-VDR及びGal4DBD-ER融合発現カセットを、そのプラスミド主鎖から切り出し、1つの4xGal4 RTUの主鎖に挿入し、5種類の異なるNR RTUを得た。得られるNR RTUの概略図を図17に示す。従って、5種類の各NR RTUは、NR LBD-Gal4DBD融合発現カセット及び4xGal4レポーター転写単位の両方が含まれているベクター主鎖を含むように作製された。NR LBD-Gal4DBDキメラタンパク質の発現は、シミアンウィルス40(SV40)プロモーターの調節下にある。Hpa I制限エンドヌクレアーゼ切断部位は、特有の位置でレポーターポリヌクレオチド配列内に配置された。
【０２３２】
6.7.2.5種類のヒト核受容体のトランス活性化電位のプロファイリング。
実験方法のアウトラインを図18に示す。NR RTUはすべて同一のGal4 DBDを用いて構築されているので、5種類のNR RTUのすべてをHEK293細胞に個別にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞を再懸濁し、まとめ合わせ、5枚の各組織培養プレートへ再プレーティングした。翌日、混合し再プレーティングした後、THRαに対する特異的リガンド(3,3,5-トリヨード-L-サイロニン T3、20ng/ml)、VDRに対する特異的リガンド(25-ジヒドロキシビタミン D3、1ug/ml)、ERαに対する特異的リガンド(エストラジオール、100nM)、又はGRに対する特異的リガンド(デキサメタゾン、10uM)のいずれかにより細胞を誘導した。誘導はすべて6時間であった。誘導細胞及び非誘導(対照)細胞からトータルRNAを単離した。レポーター転写産物を上述のようにしてRT-PCRにより増幅し、標識し、Hpa I制限エンドヌクレアーゼで消化した。各試料の連続希釈物をキャピラリー電気泳動法により分析した。キャピラリー電気泳動図を図19Aに示す。レポーターピークの数量化によると、対照細胞の他のNR RTUに対してCAR RTUの基本転写活性が強いことが明らかである。異なるNRリガンドを添加すると、対応するNR RTUにより生じるレポーターピークの相対値に非常に特異的な変化が生じた。その結果、VDR特異的リガンド(25-ジヒドロキシビタミンD3)は、VDR RTUに特異的なレポーターのピーク値を上昇させた(20倍)。デキサメタゾンは、GR RTUにより生じるレポーターピークを特異的に増加させた(10倍)。エストラジオール及びT9は、それらの対応するRTUをそれぞれ15倍及び10倍まで刺激した(図19B)。
【０２３３】
（6.8.実施例8）
本実施例は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼの活性をプロファイリングするためのRTU及び方法について説明する。
【０２３４】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)は、胚発生、細胞分化、細胞増殖及び細胞死などの多くの生物学的プロセスを調節する。MAPKは、増殖因子、サイトカイン及びDNA損傷剤などの様々な細胞外刺激に応じたシグナル伝達を仲介する、セリン/スレオニンプロテインキナーゼを多数含んでいる。MAPKは、タンパク質改変カスケードが関係している共通の機序により、シグナルをシグナル伝達ネットワークの上流部分から下流の標的まで行きわたらせることに関与している(図20A)。MAPキナーゼにはチロシン及びスレオニンリン酸化が必要であるが、双方ともMAPキナーゼキナーゼ(MAPKK)により触媒されて、それらの生物活性が働く。細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK 1、2)、ストレス活性化プロテインキナーゼp38(p38α、β、γ、δ)、c-Junアミノ末端キナーゼ(JNK 1、2、3)、ERK3、及びERK5の、5つの異なるMAPK群が同定されている。
【０２３５】
下流の標的に既知の転写因子が含まれている、キナーゼの活性を分析するための転写系の方法が開発されている。キナーゼ介在性タンパク質の改変は、DNAに結合する転写因子の能力と、コアクチベーターを強化する能力(トランス活性化電位)の両方に影響を及ぼす可能性がある。転写系のキナーゼアッセイは、通常、改変したDNA結合特異性を持つキメラ転写因子を利用する。この方法の最も一般的な実施態様では、キメラは、転写因子のトランス活性化ドメイン(TAD)とGal4タンパク質のDNA結合ドメイン(DBD)(十分に特性決定され、且つ高特異的DNA結合特性を持つ、酵母転写因子)とのインフレーム融合物を含む。典型的な実験計画においては、Gal4-DBD-TADキメラ発現構築物を、レポーター遺伝子に機能的に結合されているGal4 DNA結合シスエレメントを含むレポーター構築物と共に、目的の細胞へ同時導入する(図20B)。その結果、レポーター遺伝子の発現レベルは、キメラ因子のTADのトランス活性化電位の尺度として有用であり、従って、TAD変化が起こるまでのキナーゼ経路の状態を示すことができる。
【０２３６】
個別のTADレポーター転写単位(TAD RTU)を構築するため、ヒトc-Jun(ジーンバンクアクセッション番号BC006175)、ATF2(ジーンバンクアクセッション番号BC026175)、及びElk-1(ジーンバンクアクセッション番号BC056150)をコードしているプラスミドcDNAクローンをOpen Biosystems(Huntsville,AL,USA)から入手した。Gal4 DNA結合ドメイン(Gal4DBD)発現ベクター(PM DNA-BD)は、BD Biosciences(Palo Alto,CA,USA)から購入し、4xGal4-ルシフェラーゼレポーター構築物はPromega(Madison,WI,USA)から購入した。
【０２３７】
各転写因子のトランス活性化ドメイン(TAD)はPCRによって増幅し、PM DNA-BDベクターへクローニングして、SV40プロモーターに機能的に結合した機能性インフレームGal4DBD-TAD融合遺伝子を取得した。
【０２３８】
c-JunのTAD(アミノ酸1〜246)は、Jun-Eco(CTCT GAA TTC ATGACTGCAAAGATGGAAACG(配列番号67))及びJun-Bam(CTCT AAG CTT GTCGATGGGGGACAGGGGCGG(配列番号68))プライマーを用いてPCRにより増幅し、PM DNA-BDのMCSへEcoRI及びBam HI制限エンドヌクレアーゼ部位間でクローニングした。
【０２３９】
ATF2のTAD(アミノ酸1〜110)は、ATF2-Bam(CTCT GGATC Ctgaaattcaagttacatgtgaat(配列番号69))及びATF2-Xba(aagaggggataaatctagaggcat(配列番号70))プライマーを用いてPCRにより増幅し、Bam HI及びXba I制限エンドヌクレアーゼ部位間のPM DNA-BDのMCSへクローニングした。
【０２４０】
Elk-1のTAD(アミノ酸307〜428)は、Elk1-Eco(tctc GAA TTC ATCTCCCAGCCGCAGAAGGGC(配列番号71))及びElk1-Hind(tctc AAG CTT TCATGGCTTCTGGGGCCCTGG(配列番号72))プライマーを用いてPCRにより増幅し、Eco RI及びHind III制限エンドヌクレアーゼ部位間のPM DNA-BDのMCSへクローニングした。
【０２４１】
3種類の異なる4xGal4 RTUを取得するため、4xGal4-ルシフェラーゼベクター中のルシフェラーゼ遺伝子を、各レポーターポリヌクレオチドに特有の位置に1つのHpaI制限エンドヌクレアーゼ切断部位をそれぞれ持つ、上述のような3種類のSEAP誘導型レポーターポリヌクレオチドと置換した。
【０２４２】
各Gal4DBD-Jun、Gal4DBD-ATF2、及びGal4DBD-Elk1融合発現カセットを、SV40プロモーター及びポリアデニル化シグナルと共にそのプラスミド主鎖から切り出し、割り当てられた4xGal4 RTUの主鎖に挿入して、3種類のTAD RTUを得た。得られるNR RTUの概略図を図20Bに示す。
【０２４３】
6.8.1.キナーゼ阻害剤の特性決定におけるHpaIタグ付きレポーターRTUライブラリーの使用。
ホルボールエステル(PMA)は、MAPキナーゼのERK 1/2ファミリーメンバーの選択的活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを起こす。Elk-1転写因子は、ERKの特異的下流標的である。ERKによるElk-1転写活性化ドメイン(TAD)のSer 383残基のリン酸化は重要な役割を果たし、その活性構造を引き起こす。U0126(MEK1/2活性化の非競合的阻害剤)は、ERK1/2経路の刺激依存的活性化を特異的に阻害する。
【０２４４】
前のサブセクションに記載したHpaIタグ付けレポーターRTUライブラリーを用いて、3種類の主要なMAPK経路の状態を同時に評価した。上述の3種類すべてのTAD RTUは、同一のGal4 DBD及び同一のシス作用性gal4 DNA結合部位を用いて構築されているので、TAD RTUをHEK293細胞に個別にトランスフェクトするよう、別々にトランスフェクションを行った。トランスフェクションの24時間後、細胞をまとめ合わせ、5枚の個別の組織培養プレートへ再プレーティングした。翌日、再プレーティング後、PMA単独(10uM)か、阻害剤U0126(2.5uM)の存在下のPMAによるいずれかで細胞を誘導した。誘導は6時間実施した。誘導細胞及び非誘導(対照)細胞からトータルRNAを単離した。RT-PCRによりレポーター転写産物を増幅し、標識し、Hpa I制限エンドヌクレアーゼで消化した。各試料の連続希釈物をキャピラリー電気泳動法によって分析した。個別の各TAD RTUに対応するレポーターピークの数量化は第6.1節に記載のようにして実施した。2つの独立した実験の代表的な結果を図21に示す。対照細胞では、c-Jun及びATF2 TAD RTUの基本転写活性が比較的強いことが確認された。PMAを添加するとElk-1 TAD RTUの活性化が非常に強くなり(〜20倍)、一方、ATF2及びc-Jun TAD RTUの活性に変化がなかったのは、公表されている報告と一致している。予想通り、U0126を添加した場合にはPMA誘導が特異的に阻害されたが、Elk-1 TAD RTUの基本活性は阻害されなかった。従って、これらの結果から、本明細書で提供した方法の正確性、感度及び特異性が明らかである。
【０２４５】
（6.9.実施例9）
本実施例は、表現型をプロファイリングための40種類のRTU集団の構築について記載する。
【０２４６】
6.9.1.RTUシス調節エレメント
40種類のRTUによって調べることができる標的のリストには、種々の生物学的プロセス(例えば、細胞周期、炎症、分化、及び酸化型異化代謝)を調節する転写因子が含まれる。これらの大部分のRTUを表3に示す。一部の転写因子(例えば、c-myc、E2F、HIF-1a)は、多くの癌の型で無調節であるように思われるが、他の因子は癌のより具体的な集合に関与しているようである。これらの転写因子を評価するには、minimal TATAボックスが転写因子の結合部位の多量体コピーと融合されている、合成プロモーターを用いることができる。その結果、これらのRTUの転写は、目的の単一転写因子の活性を大体示すことができる。無調節転写が多数の癌の型で検出された遺伝子の天然プロモーターを含むRTUをいくつか構築することができる。これらの遺伝子の中には、DNA損傷時に活性化されるGADD45及びGADD 153と、ほとんどの癌で転写的に活性化されるテロメラーゼの触媒サブユニット(hTERT)がある。天然の遺伝子プロモーターは複数の転写因子により調節されるので、この群のRTUは、単一の転写因子活性だけでなく、むしろ、特定の癌における遺伝子発現を調節する経路のより複雑な活性を評価するために用いることができる。
【０２４７】
【表３】
2008519605.tif 000006
2008519605.tif 000007
【０２４８】
6.9.2.RTUレポーター配列
上述の第6.3節に記載の通り、ほとんどの場合、プロセシングタグのレポーター配列中の可変位置(例えばHpaI部位)での導入は、レポーター配列転写効率に対して有意な影響はない。実際、この設計によって得られるレポーターの85%超は、20%未満の標準偏差で、比較可能な転写効率を有している。従って、更なるRTUに関して適切なレポーター配列を構築することは問題ないはずである。また、この多重系に更なるRTUを含むことに伴う問題もないはずである。この系が提供できるRTUの最大数は、検出の解析度によって決まる。例えば、この系では、ABIシークエンサーのキャピラリーゲル電気泳動法を用いることによりHpI消化断片を分離する。メーカーに従ってABIシークエンサーを使用した場合、1bpの解析度で100〜600bpの範囲のDNA断片のピークを定量的に評価することができる。言い換えれば、この系は、1bpだけ異なるRTUを500種類まで提供することができる。取得可能な本RTU集団では、プロセシングした産物は5bpだけ異なる可能性がある、それらのレポーターを100種類提供することができる。
【０２４９】
6.9.3.40種類のRTU集団の構築と試験。
構築したRTUは、シーケンシングによって確認することができる。個別のRTUに関する最初の機能的試験は、上述の実施例6〜8で行ったように、適当なインデューサーで細胞を刺激することにより、或いは、目的の転写因子又はプロモーターのドミナントネガティブ阻害剤又はドミナントポジティブアクチベーターで発現ベクターを共トランスフェクションすることにより、トランジエントトランスフェクションアッセイで実施することができる。RTUは、レポーター配列mRNAのRT-PCRによって評価することができる。
【０２５０】
40種類のRTU集団は、RTUの等モル混合物として調製し、標的細胞系(例えば、293細胞)に一過性にトランスフェクトすることができる。トランスフェクト細胞のバッチは、個別のRTUに対する既知のインデューサーで同時に刺激することができる。レポーターRNAは、上述の実際の実施例で記載したように、RT-PCRにより増幅し、HpaIで消化し、分離することができる。増幅のリニアリティは、上述の実際の実施例にあるように、各種モル比でこの系に加えられた複数の較正SV40又はCMV RTUのピーク値を調べることによって評価することができる。PCR増幅がリニア範囲にある場合、較正用RTUのピークの比は、この系内のこれらの構築物の濃度の比に対応する。ピーク比が偏っている場合は過剰増幅を示す。
【０２５１】
（6.10.実施例10）
本実施例は、癌研究及び創薬における本RTU集団の用途について記載する。
6.10.1.病態の同定
本実施例は、NCI60採取のヒト癌系及び正常な対照物における転写因子プロファイルデータベースの作成をどのようにして用いて、病態が不明の細胞において病態(例えば、患者のバイオプシーから得た細胞など)を同定できるかについて記載する。
【０２５２】
表4には、正常な初代上皮細胞と、使用可能な同一起源のマッチング癌細胞系を挙げている。これらの細胞は、(1)初代上皮細胞の有効性;(2)NCI 60採取から得た同一組織起源の十分に特性決定された癌細胞系のマッチングセットの有効性;(3)これらの細胞に関するデータのラージアレイの有効性(何万もの化合物で治療した際の細胞生存率のデータベース及び医薬品誘導性遺伝子発現プロファイルのデータベースを含む)に基づいて選択された。
【０２５３】
正常上皮細胞の基準プロファイルは、本明細書に記載のRTU集団を用いて作成する。RTUの活性プロファイルは、上述の実際の実施例で記載したプロトコルに従って得ることができる。例えば、種々の初代細胞に、等モルの30種類のRTU混合物、並びに種々の濃度で得た一連の較正SV40 RTU及びCMV RTUを含有しているレポーター系を並行バッチにてトランスフェクトする。翌日、レポーターRNAを増幅し、HpaI消化によりプロセシングし、キャピラリーゲル電気泳動法で分離した。個別のRTUの転写活性の相対値は、電気泳動図の対応するピーク値を用いて算出することができる。PCR増幅の起こり得る非リニアリティを考慮するには、実施例に記載したのと同様にして、一連の較正SV40 RTUのピーク値から導かれる検量線を用いることによりピーク値を算出することができる。
【０２５４】
実際の実施例で明らかにしたように、転写因子活性のプロファイルは、樹立癌細胞系で高度に再現され得る。これが一次細胞に関する状況であるかどうかを明らかにするには、異なる継代で各細胞型について複数の評価を行い、細胞が再現可能な転写因子活性のパターンを示す場合にその条件を確立することができる。
【０２５５】
標準化したRTUの相対値が得られたならば、異なる起源の初代細胞の転写因子活性プロファイルを作成することができる。異なる細胞におけるトランスフェクション及び検出の効率の変動を考慮するには、そのトランスフェクションにおける転写因子活性の平均レベルに基づいた標準化を用いることができる(即ち、内部標準化)。実際の実施例でこの標準化方法を利用したところ、異なる細胞系の転写因子活性プロファイルの正確な評価が提供されることが明らかになった。この内部標準化は、cDNAアレイハイブリダイゼーション技術向きに改良された。cDNAアレイハイブリダイゼーションから類推して、レポーター系内にある個別のRTUが多いほど、内部標準化作業を一層行われなければならない。
【０２５６】
正常細胞の転写因子活性の作成プロファイルの他に、同一起源の癌細胞系の転写因子プロファイル(例えば、本実施例の表4で提供したもの)を評価することができる。
正常細胞(又は非罹患細胞)及び癌細胞系の双方のプロファイルが作成されたならば、それらのプロファイルを用いて、未知の病態の細胞から(例えばバイオプシーから)作成されたプロファイルと比較することができる。マッチングプロファイルが確認された場合、未知の病態の細胞に対して病態の同定(非罹患又は罹患)が行われる。
【０２５７】
【表４】
2008519605.tif 000008
【０２５８】
6.10.2.医薬品のスクリーニング
本実施例は、抗癌剤で処理した細胞で作成したRTU活性のプロファイルをどのように用いて有望な新規医薬品治療を同定するのかについて記載する。具体的には、NCIのDevelopmental Therapeutic Program(DTP)の1組の基準抗癌剤をNCI60細胞系で評価し、医薬品により誘導される活性プロファイルのデータベースを作成する。
【０２５９】
十分に特性決定された基準抗癌剤のリストは、米国国立衛生研究所の国立がん研究所のウェブサイトで確認することができる(http://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/cancer_data.htmlを参照されたい)。試験しようとする各細胞系に対して、特定の細胞系を死滅させる15〜25種類の医薬品と、その細胞生存率に影響を及ぼさない同数の基準医薬品を選択することができる(特定の細胞の医薬品に対する感受性に関するデータも、前述のウェブサイトで利用可能である。)
【０２６０】
医薬品の評価を行うには、本明細書に記載のようにして、標的細胞系にRTU集団を一過性にトランスフェクトする。96ウェルプレートのウェルへ細胞をアリコートする。実際の実施例では6ウェルプレートを用いたが、PCRによる検出が高感度であるため、単離したRNAの約1/20のみを用いた。従って、96ウェルプレートの1ウェルには、分析に十分な量のRNAが提供されるはずである。トランスフェクションの1日後、cDNAアレイ遺伝子発現プロファイリングに関するこれまで公表されている研究で用いられてきた濃度と期間で、試験医薬品を細胞へ加える(例えば、Scherfらの論文(2000)Nat Genet.24(3):236-44を参照されたい)。96ウェルの1枚のプレートで、二連で実施する1種類の細胞系に対して30〜50種類の医薬品アッセイを提供することができるはずである。
【０２６１】
インキュベーションの終わりに、上記の実際の実施例で記載したように、細胞を溶解し、トータルRNAを単離し、増幅し、プロセシングし、検出した。個別のRTUの相対活性は、算出し、標準化することができる。また発光量(又は阻害量)は、前述のプロトコルに従って評価することができる。RTU集団を使用すると、本明細書に記載のように、ラージダイナミックレンジを有しているが、一部のRTUのピーク値が極端に高いか、平均より低い場合には、いくつかの状況が発生し得る。この状況は、エラーが多くなるので望ましくない。ピーク頂部を同じにするには、系内の特定のRTUプラスミドの濃度をそれに応じて調節することができる。
【０２６２】
癌細胞及び正常細胞の多数の転写因子の活性を分析することにより、癌生物学における多数の転写因子の活性と経路に関するこれまで利用不可能であったデータを取得することができる。また医薬品への応答時のシグナル伝達変化を試験することにより、数種類の異なる癌細胞系における医薬品の分子プロファイルを含む転写因子活性のデータベースを作成することができる。有望な新規医薬品に対して処理された細胞で作成した活性プロファイル(この場合、有望な新規医薬品のプロファイルは、既知の抗癌剤によって得られたものと一致する)を用いて、癌に対して効果を有する可能性があるものを同定することができる。
【０２６３】
理解をより明瞭にするため、例示及び実施例により上述の発明をかなり詳しく記載したが、本発明の一定の変更と改変を行うことができることは当業者に明らかであり、それは添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【０２６４】
本願明細書に記載されているすべての刊行物及び特許出願(アクセッション番号又はその他により記載されている任意の及びすべての核酸配列を含む)は、任意の及びすべての目的においてその全体が参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２６５】
【図１】本明細書で提供した方法で、どのようにして2種類のレポーター配列からのレポーター種を識別することができるのかについて例示した非限定的な概略図である。2種類のRTUのレポーター配列中に特異的に配置されているプロセシングタグ(6)を有するレポーター配列(4)に機能的に結合されているシス調節配列(2)を含み、その結果、レポーター転写産物(8)が発現されるプロセシング時に、プロセシングタグの異なる位置に基づいて識別することができるプロセシングしたレポーター種(9)が得られ、個別のレポーター転写単位(RTU)(レポーターA及びレポーターB)が描かれている。
【０２６６】
【図２】プロセシングタグがエンドヌクレアーゼ認識部位を含む、本発明の非限定的な実施態様を示す図である。図に記載したエレメントは以下の通りである:(2)シス調節配列;(4)レポーター配列;(7)エンドヌクレアーゼ認識部位を含むプロセシングタグ;(8)レポーターRNA転写産物;(10)レポーターcDNA;(12)標識;(13)レポーターcDNAを増幅するためのフォワードプライマー;(14)レポーターcDNAを増幅するためのリバースプライマー;(16)標識PCR産物;及び(18)DNAエンドヌクレアーゼ。
【０２６７】
【図３】プロセシングタグがレポーターDNA配列中に突然変異を含む(これは、プロセシングタグを含有していない野生型の相補的標識cDNAとハイブリダイズした場合に、鎖中でミスマッチを形成する)、本発明の非限定的な実施態様を示す図である。ミスマッチ特異的ヌクレアーゼを用いて、相補的な標識cDNAを切断する。次いで、これらの配列を大きさに基づいて分離する。図に示したエレメントは以下の通りである:(2)シス調節配列;(4)レポーター配列;(24)突然変異を含むプロセシングタグ;(8)レポーターRNA転写産物;(12)標識;(26)野生型(wt)レポーターDNA;(30)ミスマッチ特異的ヌクレアーゼ;(28)二本鎖ヘテロデュプレックス中のミスマッチ部位;(20)プロセス型DNAの標識断片;及び(22)プロセシングしたDNAの未標識断片。
【０２６８】
【図４】プロセシングタグがレポーターDNAの鎖の1本に特有のチミジン残基を含む、本発明の非限定的な実施態様を示す図である。示したエレメントは以下の通りである:(2)シス調節配列;(4)レポーター配列;(5)レポーター配列の転写鎖;(32)特有のチミジン残基を含むプロセシングタグ;(8)レポーターRNA転写産物;(10)レポーターcDNA;(12)標識;(34)ウラシル含有PCR産物;(14)レポーターcDNAを増幅するためのリバースプライマー;(36)ウラシル-グリコシダーゼ;(37)脱グリコシル化ウラシル残基;(38)1個の脱グリコシル化ウラシル残基を含有している、増幅レポーターcDNAの標識鎖;及び(40)増幅レポーターDNAの未標識断片。
【０２６９】
【図５Ａ】プロセシングタグが終止部位を含む、本発明の非限定的な実施態様を示す図である。エレメントは以下の通りである:(2)シス調節配列;(4)レポーター配列;(8)レポーターRNA転写産物;(10)レポーターcDNA;(13)レポーターcDNAを増幅するためのフォワードプライマー;及び(44)プロセシング部位(42)で終止したレポーターcDNAの伸長標識断片鎖。
【０２７０】
【図５Ｂ】プロセシングタグが終止部位を含む、本発明の非限定的な実施態様を示す図である。エレメントは以下の通りである:(2)シス調節配列;(4)レポーター配列;(8)レポーターRNA転写産物;(10)レポーターcDNA;(13)レポーターcDNAを増幅するためのフォワードプライマー;及び(44)プロセシング部位(42)で終止したレポーターcDNAの伸長標識断片鎖。
【０２７１】
【図６】プロセシングタグが定義したプライマー伸長用のオリゴヌクレオチド配列を含む、実施態様を示す図である。エレメントは以下の通りである:(2)シス調節配列;(4)レポーター配列;(46)定義したプライマー配列を含むプロセシングタグ;(8)レポーターRNA転写産物;(10)レポーターcDNA;(48)定義したプライマー配列に相補的な標識プライマー;及び(50)標識プライマー伸長産物。
【０２７２】
【図７】本明細書で提供した方法でどのようにしてN個のレポーター種を識別することができるかを例示した非限定的な概略図である。個別のRTUが、RTU中に特異的に配置されているプロセシングタグ(6)を有するレポーター配列(4)に機能的に結合されているシス調節配列(2)を含む、レポーター転写単位(RTU)を記載している。レポーター種は、アレイのオリゴヌクレオチド検出プローブ(51)とアニールされ、個別の検出プローブは、個別のRTU中のプロセシングタグ部位(Xで表示)にまたがるRTUレポーター配列を含み、更に、蛍光がプロセシングによりモジュレートされ得る蛍光標識(55)を含む。レポーター種及び検出プローブのデュプレックスは、プロセシングタグの性質に応じて適切にプロセシングされる。オリゴヌクレオチド検出プローブ(51)がレポーター種に完全に相補的であるデュプレックスの場合のみ、プロセシングされ得る。その結果、変化した蛍光観測により検出することができる。
【０２７３】
【図８】オリゴヌクレオチド検出プローブへのハイブリダイゼーションを利用し、プロセシングタグが、レポーター種が識別され得るエンドヌクレアーゼ制限部位を含む、本発明の非限定的な実施態様を示す図である。エレメントは以下の通りである:(2)シス調節配列;(4)レポーター配列;(7)エンドヌクレアーゼ制限部位を含むプロセシングタグ;(8)レポーターRNA転写産物;(10)レポーターcDNA;(51)検出プローブ;(55)蛍光標識;(57)消光剤;及び(18)制限酵素。
【０２７４】
【図９】オリゴヌクレオチド検出プローブへのハイブリダイゼーションを利用し、プロセシングタグが、共通のレポーター配列の突然変異を含む、本発明の非限定的な実施態様を示す図である。エレメントは以下の通りである:(2)シス調節配列;(4)レポーター配列;(24)突然変異を含むプロセシングタグ;(8)レポーターRNA転写産物;(10)レポーターcDNA;(51)検出プローブ;(55)蛍光標識;(57)消光剤(57);及び(13)5'〜3'エキソヌクレアーゼ活性を持つDNAポリメラーゼによるレポーターcDNAのプライマー伸長用フォワードプライマー。
【０２７５】
【図１０】詳細な説明に記載したように、未知のDNA結合配列又は重複のDNA結合配列を持つ複数の転写因子の活性を検出するための本発明の非限定的な実施態様を示す図である。
【図１１Ａ】プロセシングタグを欠損している分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の配列を含む共通の野生型レポーター配列(配列番号13)の配列と、HpaI制限部位を含む変更可能に配置されたプロセシングタグ(配列番号14〜45)を持つ32種類の代表的なレポーター配列(この場合、太字で記載されたヌクレオチドがプロセシングタグを同定する)を示す図である。
【０２７６】
【図１１Ｂ】プロセシングタグを欠損している分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の配列を含む共通の野生型レポーター配列(配列番号13)の配列と、HpaI制限部位を含む変更可能に配置されたプロセシングタグ(配列番号14〜45)を持つ32種類の代表的なレポーター配列(この場合、太字で記載されたヌクレオチドがプロセシングタグを同定する)を示す図である。
【０２７７】
【図１１Ｃ】プロセシングタグを欠損している分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の配列を含む共通の野生型レポーター配列(配列番号13)の配列と、HpaI制限部位を含む変更可能に配置されたプロセシングタグ(配列番号14〜45)を持つ32種類の代表的なレポーター配列(この場合、太字で記載されたヌクレオチドがプロセシングタグを同定する)を示す図である。
【０２７８】
【図１１Ｄ】プロセシングタグを欠損している分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の配列を含む共通の野生型レポーター配列(配列番号13)の配列と、HpaI制限部位を含む変更可能に配置されたプロセシングタグ(配列番号14〜45)を持つ32種類の代表的なレポーター配列(この場合、太字で記載されたヌクレオチドがプロセシングタグを同定する)を示す図である。
【０２７９】
【図１１Ｅ】プロセシングタグを欠損している分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の配列を含む共通の野生型レポーター配列(配列番号13)の配列と、HpaI制限部位を含む変更可能に配置されたプロセシングタグ(配列番号14〜45)を持つ32種類の代表的なレポーター配列(この場合、太字で記載されたヌクレオチドがプロセシングタグを同定する)を示す図である。
【０２８０】
【図１１Ｆ】プロセシングタグを欠損している分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の配列を含む共通の野生型レポーター配列(配列番号13)の配列と、HpaI制限部位を含む変更可能に配置されたプロセシングタグ(配列番号14〜45)を持つ32種類の代表的なレポーター配列(この場合、太字で記載されたヌクレオチドがプロセシングタグを同定する)を示す図である。
【０２８１】
【図１１Ｇ】プロセシングタグを欠損している分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の配列を含む共通の野生型レポーター配列(配列番号13)の配列と、HpaI制限部位を含む変更可能に配置されたプロセシングタグ(配列番号14〜45)を持つ32種類の代表的なレポーター配列(この場合、太字で記載されたヌクレオチドがプロセシングタグを同定する)を示す図である。
【０２８２】
【図１１Ｈ】プロセシングタグを欠損している分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の配列を含む共通の野生型レポーター配列(配列番号13)の配列と、HpaI制限部位を含む変更可能に配置されたプロセシングタグ(配列番号14〜45)を持つ32種類の代表的なレポーター配列(この場合、太字で記載されたヌクレオチドがプロセシングタグを同定する)を示す図である。
【０２８３】
【図１１Ｉ】プロセシングタグを欠損している分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の配列を含む共通の野生型レポーター配列(配列番号13)の配列と、HpaI制限部位を含む変更可能に配置されたプロセシングタグ(配列番号14〜45)を持つ32種類の代表的なレポーター配列(この場合、太字で記載されたヌクレオチドがプロセシングタグを同定する)を示す図である。
【０２８４】
【図１１Ｊ】プロセシングタグを欠損している分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の配列を含む共通の野生型レポーター配列(配列番号13)の配列と、HpaI制限部位を含む変更可能に配置されたプロセシングタグ(配列番号14〜45)を持つ32種類の代表的なレポーター配列(この場合、太字で記載されたヌクレオチドがプロセシングタグを同定する)を示す図である。
【０２８５】
【図１１Ｋ】プロセシングタグを欠損している分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の配列を含む共通の野生型レポーター配列(配列番号13)の配列と、HpaI制限部位を含む変更可能に配置されたプロセシングタグ(配列番号14〜45)を持つ32種類の代表的なレポーター配列(この場合、太字で記載されたヌクレオチドがプロセシングタグを同定する)を示す図である。
【０２８６】
【図１２】(A)個別のRTUが、実施例で例示したように、共通のSV40プロモーターと図11に例示したレポーター配列(配列番号:14〜45)の1つを含む、32種類のRTUを含む集団の設計;(B)キャピラリー電気泳動法を用いてプロセシングしたレポーター種を検出することにより評価した、個別のRTUの発現の代表的データ;及び(C)32種類のレポーター種の各々の標準化ピーク値の非限定的な各概略図を示す。
【０２８７】
【図１３】細胞に対する処理効果を評価するためのRTU集団を使用した非限定的な例を示す図である。HEK293に、誘導性プロモーターを含む11種類のRTUとSV40プロモーターを含む3種類の較正用RTUをトランスフェクトした。この場合、RTUのレポーター配列はHpaIプロセシングタグを含有していた。細胞は、未処理(A)とするか、100U/mlのIL-1β(B)、1μg/mlのホルスコリン(C)、又は100μM Zn++(D)で処理した。個別のRTU活性は、キャピラリー電気泳動法を用いて、プロセシングした(HpaI消化済み)レポーター種を評価することにより検出し(A〜D、左図面);個別のRTUレポーター種の電気泳動ピークの標準化値を算出し(A〜D、中央図面);各処理条件における較正SV40 RTUの相対値を調べた(A〜D、右図面)。各RTUレポーター種の発光量比は、所定の処理群のRTUレポーター種に関して標準化した値を、未刺激細胞(E)のRTUレポーター種に関して標準化した値で割り算して求めた。
【０２８８】
【図１４】実施例で説明したように、本発明が複数の転写因子及び/又は複数のシス調節エレメント活性の高度に再現し得るプロファイルを提供することを明らかにした、代表的な結果を示す図である。複数の転写因子及びシス調節エレメントの基本活性は、2種類の非依存性個体実験でHCT116細胞により評価した(A)。基本の239細胞における基本転写因子及びシス調節エレメント活性プロファイルは、単離レポーターRNAの質に関して広範な差異を持つ試料中で評価した(B)。基本転写因子及びシス調節エレメント活性プロファイルは、1マイクログラムのレポーターRTU、又は1ナノグラムのレポーターRTUをトランスフェクトしたHepG2細胞で検出した(C)。
【０２８９】
【図１５】5種類のヒト癌細胞系(HEK293、HCT116、MDA-MB-231、SW480及びHepG2)で15種類のRTUを使用している、複数の転写因子の活性基本プロファイルを示す図である。
【図１６】抗癌剤TNFα(A)又はエトポシド(B)で癌細胞系を処理した際に生じる転写因子の活性プロファイルを示す図である。
【図１７】これに限定されるものではないが、核受容体(NR)リガンドを評価するためのRTUの概略図である。
【図１８】これに限定されるものではないが、細胞系におけるNR RTU活性のプロファイリング方法の概略図である。
【０２９０】
【図１９】HEK293細胞におけるNRリガンドの具体的な評価結果を示す図である。NR RTUライブラリーを含む細胞を、THRリガンド(3,3',5-トリヨード-L-サイロニン(T3))、VDRリガンド(25-ジヒドロキシビタミンD3(25D3))、ERリガンド(エストラジオール(Estr))、GRリガンド(デキサメタゾン(Dex))又は左の未処理(基本)で処理した。
【０２９１】
【図２０】3つの主要なMAPKシグナル伝達経路の図解(A)と、MAPKシグナル伝達経路の活性の決定に有用な具体的RTU(B)を示す図である。
【図２１】MAPK経路の活性の試験に有用なRTUを含むHEK293細胞におけるERK MAPKシグナル伝達経路の化学抑制剤(UO126)に関する具体的な評価結果を示す図である。
【図２２】本発明の実施態様によるコンピュータシステムを示す図である。
【図１】
2008519605.tif 000009
【図２】
2008519605.tif 000010
【図３】
2008519605.tif 000011
【図４】
2008519605.tif 000012
【図５】
2008519605.tif 000013
【図６】
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【図７】
2008519605.tif 000015
【図８】
2008519605.tif 000016
【図９】
2008519605.tif 000017
【図１０】
2008519605.tif 000018
【図１１Ａ】
2008519605.tif 000019
【図１１Ｂ】
2008519605.tif 000020
【図１１Ｃ】
2008519605.tif 000021
【図１１Ｄ】
2008519605.tif 000022
【図１１Ｅ】
2008519605.tif 000023
【図１１Ｆ】
2008519605.tif 000024
【図１１Ｇ】
2008519605.tif 000025
【図１１Ｈ】
2008519605.tif 000026
【図１１Ｉ】
2008519605.tif 000027
【図１１Ｊ】
2008519605.tif 000028
【図１１Ｋ】
2008519605.tif 000029
【図１２】
2008519605.tif 000030
【図１３】
2008519605.tif 000031
【図１４】
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【図１５】
2008519605.tif 000033
【図１６】
2008519605.tif 000034
【図１７】
2008519605.tif 000035
【図１８】
2008519605.tif 000036
【図１９】
2008519605.tif 000037
【図２０】
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【図２１】
2008519605.tif 000039
【図２２】
2008519605.tif 000040
【配列表】
2008519605000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月17日(2007.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008519605000001.app
【国際調査報告】
2008519605.tif 000067
2008519605.tif 000068
2008519605.tif 000069