(57)【要約】  本発明は、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原をコードする核酸を宿す低中和組換えアデノウイルスベクター及び適切なアジュバントとの関連でＲＴＳ，Ｓのような精製組換えタンパク質ワクチンを用いる特定の初回免疫／追加免疫の処方計画を利用する新規なワクチンの処方計画に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスがマラリアを引き起こす寄生虫由来のスポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原をコードする異種性の核酸を含むことを特徴とする製薬学的に許容される賦型剤中の複製欠損組換えアデノウイルスと、
アジュバント化タンパク質性抗原とを備え、
前記組換えアデノウイルスをヒトアデノウイルスの抗原型１１、２４、２６、３４、３５、４８、４９及び５０からなる群より選択することを特徴とするパーツのキット。
【請求項２】
前記組換えアデノウイルスがヒトアデノウイルスの抗原型３５であることを特徴とする請求項１記載のパーツのキット。
【請求項３】
前記タンパク質性抗原がマラリアを引き起こす寄生虫由来のＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントからなることを特徴とする請求項１又は２記載のパーツのキット。
【請求項４】
前記タンパク質性抗原が、ＨＢｓＡｇとのリポタンパク質粒子の形態でＢ型肝炎ウイルス（ＨＢｓＡｇ）由来の表面抗原に融合したＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントのハイブリッドタンパク質からなることを特徴とする請求項３記載のパーツのキット。
【請求項５】
前記タンパク質性抗原がＲＴＳ，Ｓからなることを特徴とする請求項４記載のパーツのキット。
【請求項６】
前記タンパク質性抗原をＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬを含むアジュバントでアジュバント化することを特徴とする請求項１−５の何れか一項記載のパーツのキット。
【請求項７】
アジュバントが更に含コレステロールリポソームを含むことを特徴とする請求項６記載のパーツのキット。
【請求項８】
前記マラリアを引き起こす寄生虫が熱帯熱マラリア原虫であることを特徴とする請求項１−７の何れか一項記載のパーツのキット。
【請求項９】
前記異種性の核酸が、哺乳動物、特にヒトにおいてコードされたタンパク質の生成を上昇させるためにコドンが最適化されていることを特徴とする請求項１−８の何れか記載のパーツのキット。
【請求項１０】
前記組換えアデノウイルスがアジュバントとの混合物として存在することを特徴とする請求項１−９の何れか記載のパーツのキット。
【請求項１１】
アデノウイルスが熱帯熱マラリア原虫のコドンを最適化されたスポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原をコードする異種性の核酸を含む製薬学的に許容される賦型剤中の類人猿、イヌ科又はウシ科の複製欠損組換えアデノウイルスと、
ＲＴＳ，Ｓからなるアジュバント化タンパク質性抗原
とを備えるパーツのキット。
【請求項１２】
前記タンパク質性抗原をＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬを含むアジュバントでアジュバント化することを特徴とする請求項１１記載記載のパーツのキット。
【請求項１３】
前記アジュバントが更に含コレステロールリポソームを含むことを特徴とする請求項１２記載のパーツのキット。
【請求項１４】
前記複製欠損組換えアデノウイルスが初回免疫配合物、また前記アジュバント化タンパク質性抗原が追加免疫配合物であることを特徴とする請求項１−１３の何れか一項記載のパーツのキット。
【請求項１５】
マラリアを引き起こす寄生虫由来のＣＳ抗原をコードする異種性の核酸からなる複製欠損組換えアデノウイルスとアジュバント化タンパク質性抗原とのマラリアの治療又は予防用薬剤の製造への使用であって、前記組換えアデノウイルスを類人猿、イヌ科若しくはウシ科のアデノウイルス又はヒトアデノウイルスの抗原型１１、２４、２６、３４、３５、４８、４９もしくは５０であることを特徴とする複製欠損組換えアデノウイルスとアジュバント化タンパク質性抗原との使用。
【請求項１６】
前記複製欠損組換えアデノウイルスを初回免疫配合物として使用し、前記アジュバント化タンパク質性抗原を追加免疫配合物として使用することを特徴とする請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
前記タンパク質性抗原が、マラリアを引き起こす寄生虫由来のＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントからなることを特徴とする請求項１５又は１６記載の使用。
【請求項１８】
前記マラリアを引き起こす寄生虫が熱帯熱マラリア原虫であることを特徴とする請求項１５−１７の何れか一項記載の使用。
【請求項１９】
前記タンパク質性抗原が、ＨＢｓＡｇとのリポタンパク質粒子の形態でＢ型肝炎ウイルス由来の表面抗原に融合したＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントのハイブリッドタンパク質からなることを特徴とする請求項１５−１８の何れか記載の使用。
【請求項２０】
前記アジュバント化タンパク質性抗原がＲＴＳ，Ｓからなることを特徴とする請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
前記タンパク質性抗原をＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬでアジュバント化することを特徴とする請求項１５−２０の何れか一項記載の使用。
【請求項２２】
前記異種性の核酸が哺乳動物、好ましくはヒトにおいてコート゛しているタンパク質の生成を増加させるためにコドンを最適化していることを特徴とする請求項１５−２１の何れか記載の使用。
【請求項２３】
アデノウイルスがマラリアを引き起こす寄生虫由来のＣＳ抗原をコードする異種性の核酸を含む製薬学的に許容される賦型剤中の複製欠損組換えアデノウイルスで哺乳動物を初回免疫するステップと、
前記哺乳動物に、ＨＢｓＡｇとのリポタンパク質粒子の形態でＢ型肝炎ウイルス（ＨＢｓＡｇ）由来の表面抗原に融合したＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントのハイブリッドタンパク質を備えるアジュバント化タンパク質性抗原を追加免疫するステップ
とを供えるマラリア感染に対する哺乳動物の予防接種の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質性抗原がＲＴＳ，Ｓからなることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記組換えアデノウイルスがヒト、類人猿、イヌ又はウシのアデノウイルスであることを特徴とする請求項２３又は２４記載の方法。
【請求項２６】
前記組換えアデノウイルスがヒトアデノウイルスの抗原型１１、２４、２６、３４、３５、４４、４８、４９及び５０からなる群から選択したヒトアデノウイルスであることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質性抗原をＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬでアジュバント化することを特徴とする請求項２３−２６の何れか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記マラリアを引き起こす寄生虫が熱帯熱マラリア原虫であることを特徴とする請求項２３−２７の何れか一項記載の方法。
【請求項２９】
前記異種性の核酸が哺乳動物、特にヒトにおいてコードしているタンパク質の生成を増加させるためにコドンが最適化されていることを特徴とする請求項２３−２８の何れか一項記載の方法。
【請求項３０】
請求項１−１４の何れか一項記載のパーツのキットを用いるマラリア感染に対する哺乳動物の予防接種の方法。
【請求項３１】
追加免疫の後に一回以上の追加免疫を行うことを特徴とする請求項１４記載のパーツのキットを使用するマラリア感染に対する哺乳動物の予防接種の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬分野に関する。具体的には、本発明は、アジュバントとの関連で組換え技術によって製造されたアデノウイルスベクター及び精製タンパク質を用いる熱帯熱マラリアの予防用の新規初回免疫/追加免疫ワクチン戦略に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアはこれまで世界中の熱帯及び亜熱帯地域において最も流行している感染症の一つである。マラリア感染は、発展途上国及び新興国において一年あたり２７００万に及ぶ人々の命を奪っている。マラリアの広範な発生及び罹患率の上昇は薬剤耐性寄生虫及び殺虫剤耐性寄生虫ベクターの数が増加した結果である。他の要因としては、環境及び気候の変化、内紛及び人々の移動の増加が挙げられる。
【０００３】
マラリアは、蚊によって運ばれるプラスモジウム属に属する住血原虫である寄生虫によって引き起こされる。プラスモジウム原虫の４つの種（Ｐ．ファルシパラム、Ｐ．ビバックス、Ｐ．オバール及びＰ．マラリアエ(P.falciparum, P.vivax, P.ovale and P.malariae)）はヒトの疾病に関与する。Ｐ．ヨエリ及びＰ．バーゲイ（P.yoelii and P.berghei）のような他の多くは動物内で疾病を引き起こす。Ｐ．ファルシパラムはヒトにおいて多くの感染症の原因となり、また最も致死率が高い型である。マラリア原虫は４つの別々の段階からなるライフサイクルを持つ。これら段階のそれぞれが寄生虫及びこれに伴って生じる段階に特異的な抗原に対する特定の免疫応答を誘導できるが、自然に誘導されたマラリアは再感染を予防しない。
【０００４】
マラリア原虫は、数種類のメスのハマダラカによってヒトに伝染する。感染した蚊は、スポロゾイト形態のマラリア原虫を哺乳動物の血流中に注入する。スポロゾイトは、肝細胞を侵す前数分間は血流中にとどまる。この段階において、寄生虫が細胞外環境に位置し、スポロゾイト表面の主成分であるスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質を主に対象にする抗体による攻撃にさらされる。一度肝臓に入ると、寄生虫は複製し、スキゾントになる。この段階の間に、侵入した寄生虫は無性増殖し、感染細胞当たり２０，０００に至る娘メロゾイトを産出する。寄生虫の細胞内段階の間において、宿主の免疫応答の主たる演者はＴ−リンパ細胞、特にＣＤ８＋Ｔリンパ球である（ロメロ等、１９８９年）。肝臓への感染の約一週間後、数千のメロゾイトが血流中に放出され、赤血球（ＲＢＣ’ｓ）に侵入し、抗体を介した免疫応答及びＴ細胞分泌サイトカインの標的となる。赤血球に侵入した後、メロゾイトは数段階の複製を受けて栄養型及びスキゾントに変態し、引き続き新規ＲＢＣ’ｓに感染する新世代のメロゾイトを生み出す。この赤血球段階は顕在的な臨床疾患に関連する。栄養型の数がより少ないと、寄生虫の有性生殖段階であるオス又はメスの生殖母細胞に分化する。感染性の蚊が生殖母細胞を取り込んだ場合、これら配偶子の受精は接合体形成、及びその後のオーキネート、次にオーシスト、最後にスポロゾイトに形質転換し、これは唾液腺に移動し生活環を完了する。
【０００５】
寄生虫の生体内への侵入によって生じる病原体特異的免疫応答の２つの主たる機関は細胞性及び体液性のものである。一機関である細胞応答は、免疫応答に関与するＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞に関する。細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ’ｓ）はＣＤ８を発現しており、その表面に病原性抗原を発現している感染細胞を特異的に殺すことができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞は、ＣＴＬ’ｓの分化を援助し、種々のサイトカインを産生し、またＢ細胞を誘導して分裂すること及び抗原に特異的な抗体を産生することを助ける。体液性反応の間に、特定の抗原に対して特異的なＢ細胞が活性化され、複製され分化し、また抗原特異的な抗体を産生する。
【０００６】
両機関の免疫応答はマラリア感染に対する防御に関連する。感染性のスポロゾイトが肝臓に移動し肝細胞に侵入する場合、スポロゾイトは短時間感染細胞外で過ごしてから細胞内病原体となる。この段階では、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞が特に重要である。その理由は、これらＴ細胞及びこれらの生成するインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）のようなサイトカインが感染した宿主肝細胞を殺すことに寄与するからである。マウスのマラリアモデルにおける肝臓の細胞内寄生虫の除去は、肝臓段階の寄生虫により発現したペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答に依存することが見出されている（ホフマン及びドーラン著、２０００年）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の減少はスポロゾイトの攻撃に対する防御を阻害し、また未感染動物に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の養子免疫伝達は防御を提供する。
【０００７】
マラリア感染がＲＢＣｓ中でメロゾイトが複製する赤血球段階に及ぶ場合、メロゾイトが血流中で自由に循環するのがまた見出されている。赤血球はＴ細胞との同種の相互作用に必要なクラスＩ又はクラスＩＩのＭＨＣ分子の何れかを発現しないので、抗体反応がこの段階で最も適切であると思われる。結論として、寄生虫がヒトの体内で発生する種々の段階に対処するために、強力な体液性免疫応答と同様に強力な細胞性免疫応答を誘導するのであれば、実現可能なマラリアワクチンへの取り組みが最も有益であろう。
【０００８】
マラリアワクチン開発の最近の取り組みは、上記のような寄生虫の種々の分化の段階によって分類できる。実現可能なワクチンの３つのタイプを区別することができる。
−スポロゾイト及び／又はスキゾント感染肝細胞に対する赤血球外型ワクチン。歴史的に、この取り組みは（ＣＳ）に基づく方法が主流であった。感染の赤外段階は無症候性であるので、赤外型ワクチンが体液性及び細胞性免疫応答を介して感染自体を防ぐこと、及びマラリアの潜伏感染を完全に防ぐことが理想的である。
−感染したＲＢＣ又はメロゾイト自身の何れかに対するもので、臨床的悪性度を最小化するように設計された無性血液期ワクチン。かかるワクチンは、罹患率及び致死率を減少させるであろうし、また寄生虫の赤血球への侵入及び／又は分化を予防することを意味するであろう。
−宿主の蚊において寄生虫の分化を阻害するように設計した移動阻害ワクチン。この型のワクチンは、人々に広がったマラリア感染率を減少させるのに有利であろう。
【０００９】
最後に、寄生虫生活環の多くの段階を標的にする混合マラリアワクチンを開発する実現可能性については、いわゆる多成分及び／又は多段階ワクチンによって追求されている。
【００１０】
マラリアに対するワクチンの開発は３０年以上前に始められているが、これまでのところマラリアに対して利用可能な市販のワクチンがない。放射線で減衰したスポロゾイトによる齧歯動物、非ヒトの霊長類及びヒトの免疫は、生育可能なスポロゾイトによるその後の攻撃に対する保護を付与する（ヌッセンツワイグ等、１９６７年；クライド等、１９７３年）。しかしながら、この放射線照射したスポロゾイトの製造用の費用及び実現可能な大規模培養系がないことが、これまでのところこのワクチンの広範な適用を妨げている（ルーク等、２００３年）。
【００１１】
今までのところ、ヒトに試験した最も見込みのあるワクチンの候補は、少数のスポロゾイト表面抗原に基づくものであった。ＣＳタンパク質は、蚊によって運ばれる感染症のヒトに対する能動免疫法の原理に基づいて使用された際に、しばしば不十分なレベルであるが、マラリアを絶えず予防することが立証された唯一のＰ．パルシパラムの抗原である。理論分析は、ワクチン効率と同様にワクチンの被覆率が８５％以上であるべきことを示し、さもなければ毒性の強い突然変異体が流行地を脱出し得ることを示していた（ゴードン等、２００１年）。
【００１２】
哺乳動物の免疫応答を誘導する一つの方法は、そのゲノム中で抗原をコードする核酸を宿す感染性ベクターを投与することである。こうしたキャリアの一つは、Ｅ１領域のような通常複製に必須であるゲノム中の領域を除去することによって複製欠損にした組換えアデノウイルスである。抗原をコードしている遺伝子を含む組換えアデノウイルスの例は当業者に既知である（国際公開第９６／３９１７８号）。例えば、ＨＩＶ由来の抗原成分は、組換えアデノウイルスで送達した場合免疫応答を生じることが証明されている（国際公開第０１／０２６０７；国際公開第０２／２２０８０号；米国特許第６，７３３，９９３号）。哺乳動物において、組換えアデノウイルスに基づくワクチンが開発されている。これらのベクターは、マウスマラリアモデルの一つであるＰ．ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）のＣＳタンパク質全長を発現し、これらのベクターは単一免疫量の応答によりマウス中でウイルス感染自体を防御する免疫（sterile immunity）を誘導できることを示した（ブルナ−ロメロ等、２００１年）。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、このアデノウイルスで誘導された防御を主として仲介することが証明されている。
【００１３】
個人の多くの割合がアデノウイルス抗原型５（Ａｄ５）のような一般に使用されるアデノウイルスベクターに対して前もって免疫を有しているので、組換え複製欠損アデノウイルスが、わずかな割合の健常人においてのみ中和抗体の形態で前もって存在する免疫に遭遇する抗原型に基づくことを特徴とする新技術が当業者によって開発されている。これら抗原型を一般に低中和抗原型、又は希少抗原型と称する。Ａｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９及びＡｄ５０が特に有用であることが分かっている（国際特許第００／７００７１号、国際特許第０２／４０６６５号、国際特許第２００４／０３７２９４号、国際特許第２００４／０８３４１８号、ボーゲル等、２００３年）。
【００１４】
Ｐ．ファルシパラムのＣＳタンパク質を発現するプラスミドを含むＤＮＡに基づくワクチンが、ビカル（Ｖｉｃａｌ）社、サンディアゴ、カルフォルニア、米国、及びナーバルメディカルリサーチセンター（Ｎａｖａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）によって開発された（ホルン等、１９９５年）。マウスモデルにおける研究は、プラスミドＤＮＡ免疫後の抗原特異的なＣＴＬ及び抗体反応の誘導を証明した（ドーラン等、１９９８年）。しかしながら、これまでのところＤＮＡワクチンの単独使用は、ヒトの防御免疫応答の誘導に関して次善の策であることが証明されている。ＤＮＡワクチンを用いると、空気乾燥スポロゾイトに対する間接蛍光抗体試験（ＩＦＡＴ）及び組換え合成ペプチドに対するイライザ法で評価されているように（ワン等、２００１年）、ＣＴＬ応答は顕著であるにもかかわらず、予防接種志願者はＣＳタンパク質に対する抗体を発現しないことが見出されている。
【００１５】
一方、 ＲＴＳ，Ｓ（精製タンパク質）マラリアワクチンによる取り組み（ゴードン等、１９９５年、米国特許第６，３０６，６２５号、国際公開第９３／１０１５２号）は、Ｔｈ１型の体液性及び細胞性免疫の強力な誘導剤であるけれども、ＣＳタンパク質に対する強い抗体反応を誘導できる（ケスター等、２００１年、ストート等、１９９７年及び１９９８年）。このワクチンが受容者の約半数を繰り返し保護することが最も重要なことである。しかしながら、ＲＴＳによって誘導される保護は持続期間が短い（ストート等、１９９８年）。ＲＴＳ，Ｓによる免疫は抗ＣＳ抗体及びＣＤ４＋Ｔ細胞依存的ＩＦＮ−γの応答を誘導するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞依存的ＣＴＬ又はＩＦＮ−γの応答は弱い（ラルバニ等、１９９９年）。しかしながら、生成するこれらごく少量のＣＤ８＋反応は、臨床試験における予防に関連することが証明されてきている（サン等、２００３年）。従って、合理的な改良は、ＲＴＳ，Ｓによって誘導されるＣＳに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答の誘導の増強に集中するであろう。
【００１６】
少なくとも８５％の予防効果を有する熱帯熱マラリアワクチンの開発するという課題はまだ達成されていない。この課題は、はしか及び天然痘のようなしばしば致死的である他の疾患と異なり、マラリアの事前露曝及び自然免疫の発達がその後のマラリア感染を予防しないため特に困難である。最近試験された全てのワクチンの候補及びワクチンの送達方法の中で、ＲＴＳ，Ｓのみが、あるレベルの持続的な予防性を有する。他の試験された候補は、免疫原性が不十分であるか、又は免疫原性であるが予防性がないかの何れかであった。本願は、組み換え体の複製欠損アデノウイルスベクターによって提供される細胞反応の優れた誘導性を有し、タンパク質／アジュバント法の最適な血清学上の免疫原性を生かすように設計したワクチン処方物の有利な組み合わせについて記載する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、アデノウイルスがマラリアを引き起こす寄生虫由来のスポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原をコードする異種性の核酸をからなる適当な賦型剤中の複製欠損組換えアデノウイルスと、好ましくはマラリアを引き起こす寄生虫由来のアジュバント化タンパク質性抗原とを備えるパーツのキットに関し、前記組換えアデノウイルスをヒトアデノウイルスの抗原型１１、２４、２６、３４、３５、４８、４９及び５０からなる群より選択することを特徴とする。好ましいタンパク質性抗原はＲＴＳ．Ｓからなる。前記マラリアを引き起こす寄生虫は熱帯熱マラリア原虫であることが好ましい。
【００１８】
他の実施態様において、本発明は、熱帯熱マラリア原虫ようなマラリアを引き起こす寄生虫由来のＣＳタンパク質をコードする異種性の核酸からなる複製欠損組換えアデノウイルスと、好ましくは該マラリアを引き起こす寄生虫由来であるアジュバント化タンパク質性抗原とのマラリアの治療又は予防用の薬剤の製造への使用に関し、該組換えアデノウイルスが類人猿アデノウイルス若しくは、ヒトアデノウイルスの抗原型１１、２４、２６、３４、３５、４８、４９又は５０であることを特徴とする。
【００１９】
本発明は、ある種の好ましい初回免疫−追加免疫の処方計画を開示し、この場合複製欠損組換えアデノウイルスを初回免疫配合物として使用し、アジュバント化タンパク質性抗原を追加免疫配合物として使用するのが好ましい。
【００２０】
また、本発明は、哺乳動物にマラリア感染に対する予防接種をする方法に関し、該哺乳動物をアデノウイルスがマラリアを引き起こす寄生虫由来のＣＳ抗原をコードする異種性の核酸をからなる適当な賦型剤中の複製欠損組換えアデノウイルスで初回免疫するステップと、前記哺乳動物をアジュバント化タンパク質性抗原、好ましくはＲＴＳ，Ｓで追加免疫するステップとを備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、アデノウイルスがマラリアを引き起こす寄生虫由来のスポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原をコードする異種性の核酸からなる製薬学上望ましい賦型剤中の複製欠損組換えアデノウイルスと、アジュバント化タンパク質性抗原とを備えるパーツのキットに関し、前記組換えアデノウイルスをヒトアデノウイルスの抗原型１１、２４、２６、３４、３５、４８、４９及び５０からなる群より選択することを特徴とする。該組換えアデノウイルスはヒトアデノウイルスの抗原型３５であることが好ましい。また、本発明のキットは、前記タンパク質性抗原がマラリアを引き起こす寄生虫由来のＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントからなることが好ましい。該タンパク質性抗原は、ＨｂｓＡｇを具えるリポタンパク質粒子の形態でＢ型肝炎ウイルス（ＨｂｓＡｇ）の表面抗原と融合したＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントのハイブリッドタンパク質からなることが好ましい。更に好ましい実施態様において、タンパク質性抗原はＲＴＳ，Ｓからなる。また、タンパク質性抗原をＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬで、好ましくは含コレステロールリポソームとの処方でアジュバント化するのが好ましい。
【００２２】
種々の寄生虫がヒトにマラリアを引き起こすことが当業界で既知であるけれども、本発明の一つの実施態様は、前記マラリアを引き起こす寄生虫が熱帯熱マラリア原虫であることを特徴とする本発明によるパーツのキットである。
【００２３】
適切な免疫応答のために、前記異種性の核酸は、哺乳動物、特にヒトにおいてコードされているタンパク質の生成を上昇させるためにコドンが最適化されていることが好ましい。組換えアデノウイルスはアジュバントとの混合物中に存在していてもよい。
【００２４】
ヒト遺伝子治療又はワクチン接種への使用に対する類人猿のアデノウイルスの適用について、当業者はよく理解している。これに加えて、イヌ科及びウシ科のアデノウイルスのような他の非ヒトアデノウイルスがインビトロで人に感染することが見出され、従ってヒトサンプルにおける血清陽性率が低いためにヒトへの使用に適用可能でもある。従って、また本発明は、アデノウイルスはコドンを最適化した熱帯熱マラリア原虫由来のスポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原をコードする異種性の核酸からなる製薬学上適合する賦型剤中の複製欠損組み換え類人猿、イヌ科又はウシ科のアデノウイルスと、ＲＴＳ，Ｓからなるアジュバント化タンパク質性抗原とを備えるパーツのキットに関し、この場合前記タンパク質性抗原を含コレステロールリポソームとの処方でＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬでアジュバント化することが好ましい。
【００２５】
開示したパーツのキットの種々の成分を特定の順で投与した場合、免疫応答に関する思いがけない、また飛躍的な結果をもたらすある種の初回免疫−追加免疫の処方計画を本発明により開示する。従って、本発明は、前記複製欠損組換えアデノウイルスが初回免疫配合物で、また前記アジュバント化タンパク質性抗原が追加免疫配合物であることを特徴とする本発明によるパーツのキットにも関する。ワクチンの単回投与（初回免疫）により誘発された免疫応答は、しばしば効果的に及び／又は持続的に有効保護を提供するためには十分ではない。繰り返し投与（追加投与）は、ワクチン抗原（例えば、エストコート等、２００２年を見ること）に対する体液性及び細胞性の応答を著しく増強できる。
【００２６】
また、本発明は、において、本発明は、マラリアを引き起こす寄生虫由来のＣＳ抗原をコードする異種性の核酸からなる複製欠損組換えアデノウイルスと、アジュバント化タンパク質性抗原とのマラリアの治療又は予防用の薬剤の製造への使用に関し、この場合前記組換えアデノウイルスが類人猿、イヌ科、ウシ科アデノウイルス又はヒトアデノウイルスの抗原型１１、２４、２６、３４、３５、４８、４９もしくは５０であることを特徴とし、ここで前記複製欠損組換えアデノウイルスを初回免疫配合物として使用し、前記アジュバント化タンパク質性抗原を追加免疫配合物として使用することが好ましい。本発明の１つの実施態様によれば、前記タンパク質性抗原がマラリアを引き起こす寄生虫、好ましくは熱帯熱マラリア原虫由来のＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントであることを特徴とする本発明の使用に関する。前記タンパク質性抗原は、ＨｂｓＡｇとのリポタンパク質粒子の形態でＢ型肝炎ウイルス（ＨｂｓＡｇ）由来の表面抗原と融合したＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントのハイブリッドタンパク質からなるのが好ましい。ＲＴＳ，Ｓは好ましいアジュバント化タンパク質性抗原であり、また好ましいアジュバントは、好ましくは含コレステロールリポソームとの処方でＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬである。
【００２７】
哺乳動物、好ましくはヒトにおける最適の発現に続く最適の免疫応答に対しては、本発明で使用する異種性の核酸を、哺乳動物、好ましくはヒトにおいてコードしているタンパク質の生成を増加させるためにコドンを最適化している。
【００２８】
他の実施態様において、本発明は、前記哺乳動物をマラリアを引き起こす寄生虫由来のＣＳ抗原をコードする異種性の核酸を含む製薬学的に許容される賦型剤中の複製欠損組換えアデノウイルスで初回免疫するステップと、前記哺乳動物をＨｂｓＡｇとのリポタンパク質粒子の形態でＨｂｓＡｇに融合したＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントからなるアジュバント化タンパク質性抗原を追加免疫するステップとを備えるマラリア感染に対する哺乳動物の予防接種の方法に関する。タンパク質性抗原はＲＴＳ，Ｓからなることが好ましく、アジュバントは、好ましくは含コレステロールリポソームとの処方でＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬであることが好ましく、一方、マラリアを引き起こす寄生虫は熱帯熱マラリア原虫であることが好ましい。
【００２９】
組換えアデノウイルスを産生するのに用い、かつ本発明の方法に用いるのに好ましいアデノウイルスは、組み換えウイルスを投与すべき宿主（ヒト）において前もって存在する免疫に遭遇しないアデノウイルスを使用することが非常に好ましいので、類人猿、イヌ科又はウシ科アデノウイルスのようなヒト又は非ヒトのアデノウイルスとすることができる。サルアデノウイルス及びヒトアデノウイルスのある種の抗原型が、ここに開示されているとおり、この目的に非常に適している。本発明の方法、使用及びパーツのキットに使用するのに好ましいヒトアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスの抗原型１１、２４、２６、３４、３５、４４、４８、４９及び５０である。
【００３０】
更に、本発明は、本発明によるパーツのキットを用いるマラリア感染のための哺乳動物の予防接種の方法に関する。本発明のパーツのキットを、ここに開示した好ましい初回免疫−追加免疫の処方計画を用いて哺乳動物のマラリア感染に対する予防接種に使用した場合、追加免疫はその後に１回以上の追加免疫を続けることが好ましい。
【００３１】
本発明は、組み換えアデノウイルスの少なくとも一つのマラリア抗原のキャリアとしての使用、及び初回免疫／追加免疫の処方計画における１つのアジュバント化タンパク質との異種性の組み合わせでの使用に関する。意外にも、異種性の初回免疫／追加免疫の処方計画におけるウイルスベクターとアジュバント化タンパク質との組み合わせが、霊長類における初期Ｔ細胞の応答及び免疫応答の寿命の観点で優れた免疫応答をもたらすことを見出した。特に、抗原をコードする核酸を担持するウイルスベクターで哺乳動物を初回免疫し、次いで単回又は複数回の何れかでタンパク質性抗原を注射することにより追加免疫すると、定性及び／又は定量的な免疫応答の観点で優れた結果をもたらすことを見出した。好ましいウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであり、ヒトアデノウイルスベクターが更に好ましく、投与された哺乳動物宿主において低レベルの中和活性をもたらすヒトアデノウイルスベクターがまた更に好ましい。非常に好ましい抗原型はアデノウイルス１１、２４、２６、３４、３５、４４、４８、４９及び５０である。
【００３２】
１つの好ましい実施態様によれば、タンパク質性抗原及びウイルスベクターがコードしている抗原はマラリア抗原であり、更に好ましくは熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質、又はその免疫原性の誘導体及び／又はフラグメントである。この考え方の一例として、ウイルスベクターがコードしているポリペプチドはＮ末端部分、中央部繰り返し領域、及びＣ末端部分（１４個の最末端のＣ末端アミノ酸、すなわちＧＰＩアンカー配列の欠失を有する）を含むＰ．ファルシパラムのＣＳタンパク質をコードする核酸からなり、タンパク質性抗原はＮ末端領域を欠失したＲＴＳ，Ｓのコンストラクトからなる。
【００３３】
本発明のいくつかの又は全ての態様において使用するためのアジュバント化タンパク質性抗原は、Ｐ．ファルシパラム由来のＣＳタンパク質、又はその免疫原性フラグメントを含んでもよく、これは融合タンパク質の形態でもよい。例えば、抗原はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢｓＡｇ）由来の表面抗原と融合したＣＳタンパク質又は免疫原性フラグメントのハイブリッドタンパク質とすることができ、該ハイブリッドタンパク質は原核生物又は真核生物の宿主に発現させてもよく、又リポタンパク粒子の形態を取ってもよい。融合タンパク質は、例えばＣＳタンパク質の実質的にすべてのＣ末端部分、すなわち免疫優性領域の４以上のタンデムリピート及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢｓＡｇ）由来の表面抗原を含んでもよい。例えば、ハイブリッドタンパク質はＣＳタンパク質のＣ末端部分と実質的に相同な少なくとも１６０アミノ酸を含む配列からなり、ＣＳタンパク質のＣ末端由来の末端アミノ酸、例えば最後の１０−１２アミノ酸を欠いてもよい。ハイブリッドタンパク質は、例えばＨＢｓＡｇとの混合リポタンパク粒子の形態でもよい。
【００３４】
特に、“ＲＴＳ＊”と表示されているが、本願では“ＲＴＳ”と言及している国際公開第９３／１０１５２号で開示されているようなハイブリッドタンパク質を提供するが、これは本願でＲＴＳ，Ｓと示しているＨＢｓＡｇとの混合リポタンパク粒子の形態でもよい。混合粒子中のハイブリッドタンパク質：Ｓ抗原の比率は例えば１：４である。
【００３５】
本願で“ＲＴＳ”と表すハイブリッドタンパク質は、Ｐ．ファルシパラムＮＦ５４（クローン  ３Ｄ７；カスパース等、１９８９年）由来のＣＳタンパク質遺伝子配列を用いて生成し、Ｐ．ファルシパラムＮＦ５４由来のＣＳタンパク質の領域２０７から３９５の実質的全長を含む。ＲＴＳに含まれるＮＦ５４（３Ｄ７）ＣＳタンパク質配列の部分は、以下の１８９アミノ酸の配列である。
【００３６】
【化１】
2008516926.tif 000002
【００３７】
特に、ＲＴＳは、
・サッカロマイセス  セレビシエＴＤＨ３遺伝子配列（このヌクレオチド１−１０５８の読み枠はＴＤＨ３プロモーターそれ自体を構成する）由来のヌクレオチド１０５９−１０６１でコードされるメチオニン遺伝子（ムスチ等、１９８３年）。
・３つのアミノ酸：ハイブリッド遺伝子を構成するのに使用したクローニング手順によって作ったヌクレオチド配列（１０６２−１０７０）由来のメチオニン  アラニン  プロリン
・Ｐ．ファルシパラムのＮＦ５４株のＣＳタンパク質のアミノ酸２０７から３９５を示す１０７１−１６３７によってコードされている１８９アミノ酸の範囲（上記の配列ＩＤ  ＮＯ：１によって与えられる）（クローン３Ｄ７，カスパール等、１９８９年）
・ハイブリッド遺伝子を構築するのに使用したクローニング手順によって作ったヌクレオチド１６３８から１６４０でコードされるアミノ酸（Ｇｌｙ）
・ヌクレオチド１６４１から１６５２でコードされ、Ｂ型肝炎ウイルス（アデノウイルスの抗原型）のｐｒｅＳ２タンパク質の４つのカルボキシ末端残基を表す４つのアミノ酸であるプロリン  バリン  トレオニン  アスパラギン（バレンズエラ等、１９７９年）
・ヌクレオチド１６５３から２３３０でコードされ、Ｂ型肝炎ウイルス（アデノウイルスの抗原型）のＳタンパク質を特定する２２６アミノ酸の範囲（バレンズエラ等、１９７９年）
【００３８】
ＲＴＳは、ＲＴＳ：Ｓの比率が例えば１：４の混合粒子であるＲＴＳ，Ｓの形態でもよい。
【００３９】
本発明はマラリア抗原に特に限定されないが、アジュバント化タンパク質性マラリア抗原と組み合わせたマラリア抗原をコードするウイルスベクターを用いて本発明を詳細に説明する。当業者は、寄生虫、バクテリア、ウイルス、酵母又は更に、特に限定されないが、腫瘍抗原（例えばＰＳＡ、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）などの自己抗原を含む他の病原体由来の異なる抗原の挿入及びその対応するタンパク質性抗原を用いることにより、ここに提供した一般的な教唆を修正することが可能であろう。
【００４０】
本発明は熱帯熱マラリア原虫の抗原をコードする異種性の核酸配列を備える複製欠損組み換えアデノウイルスベクターに関する。好ましい実施態様において、前記ウイルスベクターはＡｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９及びＡｄ５０からなる群から選択した抗原型に由来するアデノウイルスである。このようにヒトアデノウイルスを選択する理由は、概して、アデノウイルスのワクチンとしての使用が、通常、ヒトは風邪のような軽度の又は不顕在性の病気を生じる野生型のアデノウイルスに感染しているという事実に妨害されるからである。アデノウイルスを適用したマラリアに対するワクチンのようなその後の組み換えワクチンベクターとして使用する場合に、親の野生型の抗原型での感染中に上昇する免疫応答は、組み換えアデノウイルスの抗原型の有効性に負の影響を及ぼしうる。ヒトの世界人口における種々のアデノウイルス抗原型の蔓延は、ある地域とその他の地域で異なっている。当業者のいくつかの報告に概説されているとおり、一般に、好ましい抗原型は世界の多くの地域の宿主において低い中和活性に遭遇する。
【００４１】
本発明者等は、異種性の初回免疫／追加免疫と呼ばれる連続的なワクチン接種スキームにおける組み換えアデノウイルスと精製タンパク質間の新規な組み合わせを作製してきており、このスキームは初回免疫／追加免疫ワクチンの種々の成分によって誘導される種々の免疫応答を利用する。組換えベクターの選択は、ワクチン接種を必要とする低い割合のヒト人口において活性を中和するのに遭遇するものにより影響を受ける。驚くべきことに、アデノウイルスベクターの抗原及びアジュバント化タンパク質抗原の組み合わせが、何れかのワクチンのみを用いたときに見られるものを超えて免疫応答に著しい改善をもたらす。免疫の増強は、ここに開示したように、アカゲザルの生体内に付与された免疫応答をインビトロで検出することによって説明される。
【００４２】
他の実施態様において、組み換え複製欠損アデノウイルスはチンパンジーから単離されたような類人猿のアデノウイルスである。適当な例としてはＣ６８（米国特許第６，０８３，７１６号のＰａｎ ９として知られている）並びにＰａｎ５， ６及び７（国際公開第０３／０４６１２４号）が挙げられる。
【００４３】
本発明の一つの特定の態様において、複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、ＣＳタンパク質若しくはその免疫原性部分又はフラグメントをコードしている核酸配列からなる。前記異種性の核酸配列は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて発現を上昇させるためにコドンを最適化していることが好ましい。コドンの最適化は必要な核酸の内容、すなわち関心のある哺乳類における一般的な最適コドン使用頻度及び適切な発現を保証するために避けるべき態様の数に基づく。かかる態様には、スプライシングの供与サイト又は受容サイト、終止コドン、Ｃｈｉサイト、ポリ（Ａ）配列、ＧＣ−及びＡＴ−の豊富な配列、内部のＴＡＴＡボックスなどでもよい。哺乳類宿主に対するコドン最適化の方法は当業者に周知で、また分子生物学文献中の様々な箇所で見出すことができる。
【００４４】
好ましい実施態様において、本発明は本発明による複製欠損組換えアデノウイルスベクターに関し、この場合前記異種性の核酸中のアデニンとチミンの含量がシトシンとチミンの含量と比べて８７％未満、好ましくは８０％未満、更に好ましくは５９％未満、また最も好ましくは約４５％に等しい。本発明は、一つの実施態様において複製欠損組換えアデノウイルスベクターを提供し、ここでＣＳタンパク質が国際公開第２００４／０５５１８７号中で開示されたようなＣＳタンパク質の何れかであり、最も好ましくはＰ．ファルシプラム由来のＣＳタンパク質又はその免疫原性のフラグメントである。
【００４５】
異種性の遺伝子を宿す組換えアデノウイルスベクターの作製は当業者に周知で、通常パッケージング細胞株、アダプターコンストラクト及びコスミドの利用、並びにアデノウイルスゲノム由来のＥ１領域の少なくとも機能性部分の欠失を含む（また、以下のパッケージング系及び好ましい細胞株を参照）。
【００４６】
また、本発明は、一方の成分として宿主において低い中和活性に遭遇する組換えアデノウイルスベクター、また他方として精製タンパク質を備えるキットに関し、この場合精製タンパク質をアジュバントとの混合物で供給することが好ましい。好ましいアジュバントはＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬであり、含コレステロールリポソームとの処方物が好ましい。これら成分を異種性の初回免疫／追加免疫ワクチン送達方法に使用し、ここで組換えアデノウイルスベクターを初回免疫剤として先ず投与し、次いで精製たんぱく質を追加免疫剤として投与するのが好ましく、追加免疫は１回を超えて繰り返すことができる。前記成分は、通常製薬学的に許容されるキャリアに保持される。製薬学的に許容されるキャリアは当業者に周知で、幅広い治療薬において広く使用されている。ワクチン中でよく機能するキャリアを適用することが好ましい。アジュバントを更に含むワクチンがより好ましい。アジュバントは適用した抗原に対する応答を更に増強することについて当業者は既知である。また、本発明は、マラリアの治療、予防又は診断への本発明によるキットの使用に関する。
【００４７】
本発明は、マラリアに感染した哺乳動物を治療する方法又は哺乳動物へのマラリアの感染を予防する方法に関し、該方法はＰ．ファルシパラムの抗原を運ぶ組換えアデノウイルスを（何れかの順で、又は同時に）投与するステップと、及び少なくとも一つの精製Ｐ．ファルシパラムの抗原を投与するステップとを備え、ここで前記タンパク質をアジュバントと混合する。組み換えアデノウイルスをＡｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９及びＡｄ５０からなる群から選択することが好ましく、また組換えアデノウイルスがＣＳタンパク質をコードしている遺伝子、又はその免疫原性のフラグメントを宿していることが好ましい。組換えアデノウイルスと組み合わせて使用する精製タンパク質はＲＴＳ，Ｓが好ましく、アジュバントは好ましくは含コレステロールリポソームとの処方でのＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬが好ましい。
【００４８】
免疫応答の発達を手助けする駆動力は、サイトカイン、すなわち免疫系の細胞を助け、またＴｈ１又はＴＨ２反応の何れかに対する最終免疫応答を導くために働く多数の同定されたタンパク質メッセンジャーである。従って、高レベルのＴｈ１型サイトカインは所定の抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を助ける傾向があり、一方高レベルのＴｈ２型サイトカインは抗原に対する体液性免疫応答の誘導を助ける傾向がある。Ｔｈ１型及びＴｈ２型の免疫応答の区別が絶対的でないことを思い出すことが重要である。実際のところ、個々が主にＴｈ１又は主にＴｈ２であるとされる免疫応答に対応するであろう。しかしながら、モスマン及びコフマン（Mosmann and Coffman）（１９８９年）によりマウスＣＤ４＋Ｔ細胞クローンに記載されたものに関連してサイトカインのファミリーを検討することがしばしば便利である。伝統的に、Ｔｈ１型の応答は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γ及びＩＬ−２サイトカインの生成に関連する。しばしばＴｈ１型の免疫応答の誘導に直接関連したＩＬ−１２のような他のサイトカインは、Ｔ細胞によって産生されない。それに対して、Ｔｈ２型の応答はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及び腫瘍回壊死因子（ＴＮＦ−ｓｓ）の分泌に関連する。
【００４９】
本発明の使用に適するアジュバントとしては水酸化アルミニウムゲル（ａｌｕｍ）又はリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩が挙げられるが、またカルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩でもよく、或いはアシル化チロシンの不溶性分散液、又はアシル化糖、陽イオン的にもしくは陰イオン的に誘導したポリサッカライド、ポリホスファゼン、もしくはモンタニドリポソームでもよい。
【００５０】
本発明で使用するためのワクチンの処方物において、アデノウイルスベクターとの関連で、アジュバントを投与してもよいし、又は投与しなくてもよい。組合わせ物のタンパク質成分の場合、アジュバント配合物を選択して優先的なＴｈ１応答を誘導することができる。更に、他の体液性応答を含む別の応答を誘導することもできる。
【００５１】
ある種のワクチンアジュバントが、Ｔｈ１又はＴｈ２型サイトカイン応答の何れかの刺激に特に適している。伝統的に、ワクチン接種又は感染後の免疫応答におけるＴｈ１：Ｔｈ２のバランスの最もよい尺度としては、抗原による再刺激後のＴリンパ球によるＴｈ１又はＴｈ２サイトカインの生成のインビトロでの直接測定及び／又は抗原特異的抗体反応のＩｇＧ１：ＩｇＧ２の比率の測定が挙げられる。すなわち、Ｔｈ１型アジュバントは、インビトロで抗原によって再刺激した際に、単離したＴ−細胞集団を刺激して高レベルのＴｈ１型サイトカインを生成し、Ｔｈ１型イソタイプに付随した抗原特異的な免疫応答を誘導するものの一つである。例えば、本発明の使用に適したアジュバントを生成するのに処方し得るＴｈ１型免疫賦活剤は、モノホスフォリル脂質Ａ、特に３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスフォリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）を含むことができる。３Ｄ−ＭＰＬはリビイミュノケミストリー社（Ribi Immunochem、モンタナ）によって製造された周知のアジュバントである。化学的に、これは４、５又は６アシル鎖の何れかを具える３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスフォリル脂質Ａの混合物としてしばしば提供される。これは英国特許第２１２２２０４Ｂ号に教示された方法によって精製及び調製でき、またこの参考文献はジホスフォリル脂質Ａ及びその３−Ｏ−脱アシル化変異体も開示している。他の精製及び合成リポ多糖体が記載されている（米国特許第６，００５，０９９号、欧州特許第０，７２９，４７３  Ｂｌ、欧州特許第０５４９０７４  Ｂｌ）。一つの実施態様において、３Ｄ−ＭＰＬは直径０．２μｍ未満の小粒径を有する粒状処方物の形態であり、その製造方法が欧州特許第０６８９４５４号に開示されている。
【００５２】
サポニンは、本発明と共に使用できるＴｈ１免疫賦活剤の別の例である。サポニンは周知のアジュバントである。例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ （南アメリカの木であるシャボンノキ（キラヤ）の樹皮に由来する）及びこの留分が、米国特許第５，０５７，５４０号及び欧州特許第０３６２２７９  Ｂｌ号に開示されている。溶血性のサポニンＱＳ２１及びＱＳ１７（Ｑｕｉｌ  Ａの高速液体クロマトグラフィー精製画分）が、効能のある全身性アジュバントとして記載されており、その製造方法が米国特許第５，０５７，５４０号及び欧州特許第０３６２２７９  Ｂｌ号に開示されている。また、これらの参考文献にＱＳ７（Ｑｕｉｌ  Ａの非溶血性画分）の使用が記載されており、これは全身性ワクチン用の効能のあるアジュバントとして働く。ＱＳ２１と、ポリソルベート又はシクロデキストリンとの組み合わせもまた既知である（国際公開第９９／１０００８号）。ＱＳ２１及びＱＳ７のようなＱｕｉｌＡ画分を備える粒状アジュバント系が国際公開第９６／３３７３９号及び国際公開第９６／１１７１１号に記載されている。
【００５３】
免疫賦活剤の別の例は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（”ＣｐＧ“）を含有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧはＤＮＡ中に存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略語である。ＣｐＧは全身性経路及び粘膜性経路の両方で投与する場合のアジュバントとして当業者に既知である（国際公開第９６／０２５５５号、欧州特許第０４６８５２０号）。歴史的に、バチルス  カルメット−グエリン（ＢＣＧ）のＤＮＡ画分が抗腫瘍効果を発揮しうることが観察された。更なる研究において、ＢＣＧ遺伝子配列由来の合成オリゴヌクレオチドが免疫刺激性の効果を（インビトロ及びインビボの両方で）誘導できることを示した。これら研究の著者達は、中央のＣＧモチーフを含むある種の回文配列がこの活性を担っていると結論を下した。詳細な分析は、ＣＧモチーフが特定の配列関係になければならないこと、またかかる配列が細菌のＤＮＡにおいて一般的であるが脊椎動物のＤＮＡにおいて希であることを示した。免疫刺激性配列はしばしばプリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジンであり、ここでＣＧモチーフがメチル化されないが、他の非メチル化ＣｐＧ配列が免疫刺激性であることが知られており、本発明で使用してもよい。
【００５４】
６つのヌクレオチドのある種の組み合わせにおいては回文配列が存在しているかもしれない。一つのモチーフの繰り返し又は異なるモチーフの組み合わせの何れかであるこれらのモチーフのいくつかは、同じヌクレオチド中に存在しうる。オリゴヌクレオチドを含む一以上のこれら免疫刺激性配列の存在は、ナチュラルキラー細胞（インターフェロンγを産出し、細胞溶解活性を有する）及びマクロファージを含む様々な免疫小集団を活性化することができる。また、このコンセンサス配列を持たない配列を含む他の非メチル化ＣｐＧは、これまでのところ免疫調節性であることを示している。ワクチン中に処方する場合、ＣｐＧは一般に遊離の抗原と共に自由溶液中で投与する（国際公開第９６／０２５５５号、６８）か、又は抗原に共役共有結合する（国際公開第９８／１６２４７号）か、若しくは水酸化アルミニウムのようなキャリアで処方する（肝炎表面抗原）。
【００５５】
上記のような免疫賦活剤は、例えばリポソーム、水中油エマルジョン及び／又はアルミニウム塩（水酸化アルミニウムのような）を含む金属塩と共に処方してもよい。例えば、3Ｄ−ＭＰＬは水酸化アルミニウム（欧州特許第０６８９４５４号）又は水中油エマルジョン（国際公開第９５／１７２１０号）で処方することができ、ＱＳ２１は含コレステロールリポソーム（国際公開第９６／３３７３９号）、水中油エマルジョン（国際公開第９５／１７２１０号）又はａｌｕｍ（国際公開第９８／１５２８７号）で有利に処方することができ、ＣｐＧはａｌｕｍ又は他の陽イオン性キャリアで処方することができる。
【００５６】
また、モノホスフォリル脂質Ａとサポニン誘導体の組み合わせ（国際公開第９４／００１５３号、国際公開第９５／１７２１０号、国際公開第９６／３３７３９号、国際公開第９８／５６４１４号、国際公開第９８／０５３５５号、国際公開第９９／１２５６５号、国際公開第９９／１１２４１号）又は国際公開第９４／００１５３号に開示されているように ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせのような免疫賦活剤の組み合わせを使用しても良い。或いは、本発明において、ＣｐＧとＱＳ２１のようなサポニンとの組み合わせを使用しても良い。従って、適当なアジュバント系は、例えば３Ｄ−ＭＰＬのようなモノホスフォリル脂質Ａとアルミニウム塩との組み合わせを含む。他の実施態様は、国際公開第９４／００１５３号に開示されたＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせのようなモノホスフォリル脂質Ａとサポニン誘導体、又は国際公開第９６／３３７３９号に開示された含コレステロールリポソーム中でＱＳ２１を失活させた反応性の低い配合物とを組み合わせる。水中油エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェノールを含む他のアジュバント処方物が国際公開第９５／１７２１０号に開示されている。他の実施態様においては、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを単独で又はアルミニウム塩と共に使用する。
【００５７】
本発明の使用に適したアジュバントは選択的Ｔｈ１刺激性アジュバント、例えばＱＳ２１のようなサポニン又は３Ｄ−ＭＰＬのようなモノホスフォリル脂質Ａ誘導体を備えるアジュバント又はこれら両方を任意に含コレステロールリポソームと共に含むアジュバントである。含コレステロールリポソームとの処方におけるＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせは、例えば国際公開第９６／３３７３９号に記載されている。
【００５８】
本発明の利点は多種多様である。組み換えアデノウイルスのような組み換えウイルスは、安全であると見なされ、また動物又はヒト由来の如何なる成分も含まない培地を用いる高容量の懸濁液中で生育できる細胞を用いて非常に高い力価に産生することができる。また、組み換えアデノウイルスは、アデノウイルスゲノム中の異種性の核酸の配列によってコードされているタンパク質に対して、劇的な免疫応答を引き出すことが既知である。本発明は、Ｐ．ファルシパラムのスポロゾイト周囲遺伝子を宿すベクターにおけるこれらの特徴を追加免疫応答に対するアジュバント化タンパク質の使用と組み合わせる。更に、遺伝子のコドンを最適化してヒトにおける適切な応答を付与するに適した発現レベルを提供する。本発明は、高力価の中和抗体に遭遇しないアデノウイルスを使用することによりマラリア感染に対するワクチンを提供する。この目的に著しく好適なアデノウイルスは、抗原型１１及び３５（Ａｄ１１及びＡｄ３５、国際公開第００／７００７１号及び国際公開第０２／４０６６５号を見ること）である。
【００５９】
Ｐ．ファルシパラムのようなマラリアを引き起こす寄生虫と、ヒトのような興味のある宿主との間の核酸の内容は大きく異なる。本発明は、ヒトのような哺乳動物において高い発現レベルをもたらすコドンに最適化した核酸を提供する。
【００６０】
ここに開示するような初回免疫／追加免疫の処方計画のための異なる構成要素の使用は、免疫系の細胞性及び体液性部分の両方の適切な免疫応答をもたらすワクチン方法を提供する。これはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞又及び抗体を含む。これらワクチン単独では、抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び抗体の適正水準を生じる持続的な免疫応答を確立しない。更に、異なった成分を投与する順序は、これら免疫応答を変え、また将来の感染に対してなし得る防御の異なる期間を引き起こす可能性がある。本発明の方法及びキットは、自由に循環しているスポロゾイト及びメロゾイトから感染した肝細胞及びＲＢＣｓまでのヒトの中での寄生虫の生活環のすべての異なる段階に対応する免疫応答を引き起こすことができる。更に、長期間にわたるマラリア感染に対する持続的な防御を提供する。
【００６１】
好ましい実施態様において、本発明は、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１領域を除去することによる複製に欠陥のある組み換えアデノウイルスの利用に関するが、これはＥ１領域が新規に精製されるウイルスの複製−、転写−、翻訳−及びパッケージング過程に必要であるからである。Ｅ１除去ベクターは、一般に除去したＥ１機能を補完する細胞株で作成する。組み換えウイルスの作成用のこういった細胞株及びその利用については、当業者によって広く記述され、またよく知られている。応用微生物学研究センター（ＣＡＭＲ、英国）の欧州動物培養細胞コレクション（ＥＣＡＣＣ）でＥＣＡＣＣ番号第９６０２２９４０号として寄託されている細胞によって代表されるＰＥＲ．Ｃ６細胞（著作権）、又はこの変異体を使用することによって複製可能なアデノウイルス（ｒｃａ）の生成を予防することが好ましい。別の好ましい実施態様において、細胞はアデノウイルスの抗原型５（Ａｄ５）に由来するもの以外の組み換えアデノウイルスの増殖を支持するために適用されている。ＨＥＲ細胞をＡｄ３５由来のＥ１で不死化させること、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞（著作権）がＢ型アデノウイルスの適切な相補性を提供するように更にＡｄ３５のＥ１遺伝子を含ませることにより作製した組み換え複製欠損Ａｄ３５で作成される組み換え複製欠損Ａｄ３５のような他のアデノウイルスの抗原型と同様に、Ａｄ５のｒｃａを含まないアデノウイルスストックを得る方法及び手段に関する参考文献は、国際特許第９７／００３２６号、国際特許０１／０５９４５号、国際特許０１／０７５７１号、国際特許  ００／７００７１号、国際特許０２／４０６６５号及び国際特許９９／５５１３２号として発行されている。
【００６２】
既刊の文献である国際公開第００／０３０２９号、国際公開第０２／２４７３０号、国際公開第００／７００７１号及び国際公開第０２／４０６６５号においては、誤ってＡｄ５０がＡｄ５１と命名されていることに注意すべきである。言及した文献中で述べられている抗原型Ａｄ５１は、デ  ヨン等（１９９９年）による出版物中でＢ型アデノウイルスとして示されているＡｄ５０抗原型と同じである。明確にすると、ここで使用したＡｄ５０は、デ  ヨン等（１９９９年）によって言及されたＢグループのＡｄ５０抗原型である。
【００６３】
本発明のワクチンは、通常、例えばＡｄ／タンパク質、タンパク質／Ａｄ、タンパク質／Ａｄ／Ａｄ、Ａｄ／タンパク質／Ａｄ、Ａｄ／Ａｄ／タンパク質、Ａｄ／タンパク質／タンパク質／タンパク質、Ａｄ／タンパク質／ウイルスベクター／タンパク質などのような初回免疫／追加免疫の順序で使用する。更にもう一種類のワクチン（アデノウイルスと異なる裸のＤＮＡ又は組み換えウイルスベクターのような）を、本発明の初回免疫／追加免疫薬剤との組み合わせに適用してもよいと予想される。更に、マラリア抗原又は（ポリ）ペプチドを使用してもよい。
【００６４】
核酸は、鋳型としてＤＮＡの別々の断片を用いるＰＣＲによっても得ることができるけれども、野生型ウイルスから得た野生型の配列から直接クローニングすることによって得ることができるのであれば、配列は、ここで使用したように、‘由来する’。また、このことはこのような配列が野生型及び変異型であるかもしれないことも意味する。同様の結果を得るための別の選択肢は合成ＤＮＡを組み合わせることによる。‘由来する’というのは、野生型ＤＮＡを直接クローニングすることのみを意味するものでないことが理解されるであろう。又、当業者は、特定の断片の核酸変異体を分子生物学的に得られることを知っているであろう。‘機能性部分、その誘導体及び／又は類似体’は、それらに関連する核酸配列に相当するものとして理解されるであろう。当業者は、ある種の欠失、組換え、（点）変異、付加などは、元の核酸配列と同様の機能を有する配列を生じ、かつて翻訳されたのと同様のもしくは同一のポリペプチドを生成するという事実を理解するであろう。従って、こういった核酸配列の機能を著しく変更しない改変は本発明の範囲内である。もし特定のアデノウイルスベクターが特定の最適なアデノウイルスの抗原型に由来するのであれば、最終生成物は直接クローニングすること及びゲノムＤＮＡの特定の断片の合成のような当業者に既知の方法を用いる間接的な方法により得てもよいことが理解されるであろう。本発明の特定の態様を変更しないゲノム成分のある種の欠失、変異及びその他の変更もまた本発明の一部分であると見なされる。このような変更の例は、例えば異種性の核酸の断片のクローニングを可能にするウイルス骨格内の欠失である。こういった変異の例は、例えばＥ３の欠失或いはアデノウイルスのＥ２及び／又はＥ４タンパク質をコードしている領域の欠失及び／又は変更である。空間がアデノウイルスを詰め込むための制限要素であるため、こういったアデノウイルス骨格に適用する変更は当業者に既知でありしばしば適用される。このことがアデノウイルスゲノムの特定の部分を欠失させる主な理由である。ゲノムのＥ２、Ｅ３及び／又はＥ４領域を変更する他の理由は、例えば国際公開第０３／１０４４６７号及び国際公開第２００４／００１０３２号に記載されているようなアデノウイルスベクターの安定性又は完全性に関係しているかもしれない。これらの適用は、その他アデノウイルスベクターの一つの細胞株の複製及びパッキング中におけるＥ４又はｆ６活性とＥ１Ｂ−５５Ｋ活性の間の適合性を保証するための、あるサブグループ由来のウイルス骨格中での別のサブグループ由来の抗原型のＥ４又はｆ６遺伝子の使用に関する。更に、それらは、ｐＩＸのより高い発現レベル及びアデノルイスベクターの更なる安定性を獲得するため、適切に機能するｐＩＸプロモーターの使用に関する。
【００６５】
ここで用いる‘複製欠損’は、非相補性細胞内で複製されないウイルスベクターを意味する。相補性細胞において、複製、従ってウイルスベクターの生産に必要な機能は相補性細胞によって提供される。本発明の複製欠損ウイルスベクターは、相補性細胞以外の如何なる宿主細胞中において複製を可能にする要素のすべては宿していない。
【００６６】
核酸と共にここで用いる‘異種性の’は、核酸配列が異種性の核酸をクローン化した野生型ウイルスベクター以外の別の起源に由来することを意味する。例えばアデノウイルスの場合、複製欠損ウイルスベクター中にクローン化した異種性の核酸はアデノウイルスの核酸配列ではなく、他の興味ある病原体に由来する。
【００６７】
初回免疫−追加免疫ワクチン方法と組み合わせてここで用いる‘異種性の’は、これまでのところ業界で一般的な複数回投与される一成分というよりも、むしろ熟慮された組み合わせにおいて使用される一つの組み換え非複製アデノウイルスベクター及び一つのアジュバント化タンパク質によって例示される、２以上の別々の成分を意味する。
【００６８】
ここで用いる‘抗原’は、決定要因が送達（投与）された宿主に応答を引き起こす起源に由来する如何なる抗原も意味する。抗原は例えば病原体、寄生虫のような外部起源、又は更に自己抗原に由来してもよい。本発明の複製欠損組み換えウイルスを用いて送達できる属原虫の抗原の例は、スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳ）、ＳＥ３６ポリペプチド、メレゾイト表面タンパク質−１の１９ｋＤａのＣ末端ペプチド（ＭＳＲ−１ｐ１９）、ＭＳＰ−１、ＭＳＰ−１ｐ４２、アピカルメトロゾイトアンチゲン−１（ＡＭＡ−１）、肝臓期抗原１（ＬＳＡ−１）又は肝臓期抗原−３（ＬＳＡ−３）、又は前記の何れかのフラグメントである。好ましい態様において、本発明はＰ．ファルシパラム由来のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質に関する。
【００６９】
ここで用いる‘コドンへの最適化’は、前記タンパク質をコードする遺伝子を送達する興味ある宿主中で、興味あるタンパク質を十分に高発現させるために変化させた配列の核酸成分を意味する。この文脈における十分に高い発現レベルとは、宿主中で感染及び疾病に対して防御のための応答を引き起こすために十分高いタンパク質のレベルを意味する。いくつかのワクチンがヒトに応答をもたらし、これにより予防接種した個人の約６０％が病原体（例えばスポロゾイト）のその後の攻撃によって誘導される病気から防御されることが当業者に既知である。従って、発現レベルは、治療した個体の６０％以上を次の感染から防御すれば十分であると考える。ここに記載したような適用可能なアデノウイルスの特徴と抗原の選択との組み合わせで上記割合を達成することができると思われる。個体の８５％を防御することが好ましく、予防接種した宿主の９０％を超えてその後の攻撃への防御がなされることが最も好ましい。本発明に開示した核酸をヒトでの発現のためにコドンへ最適化する。ナラム等（２００１年）によれば、ヒトのＤＮＡにおけるアデニンとチミン（Ａ＋Ｔ）の含量は、シトシンとグアニン（Ｃ＋Ｇ）の割合と比較すると約５９％である。Ｐ．ファルシパラムにおけるアデニンとチミンの含量は約８０％である。Ｐ．ファルシパラムのＣＳ遺伝子におけるアデニンとチミンの含量は約８７％である。十分な防御を得るために、宿主において防御レベルを改善することが必要であると思われる。これを達成するための一つの方法は、同一の最終的なアミノ酸配列を維持するが、哺乳動物での発現のより典型的なコドン配列を使用するようにコドン使用頻度を調整することである。このために、本発明による複製欠損組み換えウイルスベクターは、本発明の異種性の核酸におけるアデニンとチミンの含量が８７％未満、好ましくは８０％未満、また更に好ましくは約５９％未満又はそれに等しい。ヒトにおけるコドン使用頻度並びにＰ．ファルシパラム及びヨエリ（yoelii）のＣＳ遺伝子の核酸の成分に基づいて、コドンを最適化した遺伝子の割合は幾分低く、本発明によって開示したアミノ酸含量に対して約４５％に達していた。従って、ＣＳ遺伝子に関する限りは、約４５％のアデニンとチミンの含量を有することが好ましい。異なるアデニンとチミンの濃度（５９％未満又は以上）、及び／又は異なるコドン使用頻度を有するヒト以外の別の動物を治療する場合、本発明のＣＳタンパク質をコードしている遺伝子を特定の宿主のために必要としている含量に適合させ、望ましい発現レベルを生じさせるように調整することができると理解すべきである。もちろん、世界中の異なる地域において、含量のわずかな変化がわずかな発現レベルの変化を生じる可能性を排除することができない。また、繰り返し数のわずかな変化がタンパク質のアミノ酸配列中に含まれ、その割合はそれぞれ異なることを理解すべきである。興味のある他の抗原を同様に修正してもよい。これら調整された含量のすべてが本発明の一部である。
【００７０】
ＲＴＳ，Ｓによって示されるタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を有する融合タンパク質として発現するＰ．ファルシパラムのＣＳタンパク質のＣ末端の半分（４１のＮＡＮＰ−と多くのＣ末端部分の部分）からなる融合タンパク質である。
【００７１】
複製能力のないアデノウイルスベクターによって提供される明確な利点の一つは、免疫が低下しているヒトを含むあらゆる個体において、これらベクターによる親ウイルスのより小さい病原性及び証明されている重大な疾患がないことである。マラリア、Ｐ．ヨエリのマウスモデルの研究は、組み換えアデノウイルスのコンストラクトが感染に対する優れた防御を提供する優れた細胞性応答を引き起こすだけではないことを示している。従って、Ｔ細胞応答の強度及びＣＳに対する前記の応答の寿命を改善する取り組みにおいて、本発明者等は、新規異種初回免疫−追加免疫方法において、アデノウイルスによる取り組みに組み換えタンパク質の取り組みを組み合わせている。
【００７２】
残念なことに、マウスはヒトでの応答を予測するための理想的なモデルではない。このことは、とりわけアデノウイルス３５（Ａｄ３５）に当てはまる。標準的な複製能力のないベクターはアデノウイルス５（Ａｄ５）であり、このウイルスの広範に及ぶ風土病に起因するベクターの能力を最適化するのにいくつかの問題及び地球上の多くのヒト人口のかなりの割合が親ウイルスに対して前もって存在する免疫を有しているという事実を示している。Ａｄ３５はワクチンベクターとして強化された有用性を示す可能性を有している。Ａｄ５及びＡｄ３５両方のＣＳＰを持つコンストラクトの有用性が、特にＣＳ免疫性の疑問に対する異なるコンストラクトを有する配列上異種性の２つのアデノウイルスの予防接種の評価を可能にした。
【００７３】
樹状細胞（ＤＣ）は、生体内における最も有力な抗原提示細胞であり、またＡｄ５及びＡｄ３５の両方がヒト及びアガゲザルのＤＣを標的とすることがそれらを優れたワクチンベクターにしている生物学の態様の一つである。しかし、Ａｄ５のみが効率的にマウスＤＣに感染し、Ａｄ３５のみが霊長類ＤＣに確実に感染する。それ故、Ａｄ３５のコンストラクトについての基本的な有効性の疑問については小動物のモデルによって答えられるけれども、Ａｄ３５を含む現実の免疫原性の疑問については、非ヒトの霊長類においてのみ答えることができる。
【００７４】
本発明者等は、抗マラリア細胞性及び／又は体液性応答がＲＴＳ，Ｓのみに見られる応答の改善であるかを求めるために、ＲＴＳ，ＳとＣＳ遺伝子を含むアデノウイルスベクターとの初回免疫−追加免疫の組み合わせを検討することを決定した。さらに、アデノウイルスワクチンのみの２回投与の処方計画を最適化した。
【実施例】
【００７５】
（アカゲザルにおける組み換えアデノウイルスベクター及び精製アジュバント化タンパク質を用いた異種性の初回免疫−追加免疫のワクチン接種）
実験の目的は、標準的な３回服用のＲＴＳ，Ｓ予防接種の処方計画と標準的な２回服用のＡｄ３５の処方計画との直接比較による、ＲＴＳ，Ｓの後にＡｄ３５、またＡｄ３５の後にＲＴＳ，Ｓを投与することを評価することにある。第２の目的は、２回服用のアデノウイルスの処方計画を最適化することにある。これらコンストラクトのいくつかの異なる処方計画の間及びその後の血清性及び細胞性の応答を検討した。
【００７６】
アカゲザル (Macaca mulatta)は、その非常に近縁の系統発生関係によりヒト免疫応答の優れたモデルになる。ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子は特によく保存されている。いくつかの共通対立遺伝子の発生は２５００万年前、すなわちヒトとアカゲザルの種分化に先立つと見積もられている。従って、Ｔｈ細胞に対する抗原提示において同様のエピトープ使用があり、このことはモデルの予測値を大いに高める。更に重要なことに、アカゲザルのモデルは、マラリア抗原及びＨＩＶの両方に対するヒトの応答、応答の複雑さゆえワクチン開発の遅れている他のヒトの病気を高度に予示することが過去に証明されている。
【００７７】
予備実験は、マウスマラリアＰ．ヨエリのアデノウイルス−ＣＳコンストラクトのマウスにおいて既に行われており、優れた免疫原性及び予防効果を示した。しかしながら、熱帯熱マラリアに対するワクチン開発のために、ヒトに対するマウスマラリアモデルから直接的に推定することの成功しなかった試行の長い歴史は、非ヒトの霊長類モデルによる中間ステップを要求している。アカゲザルは、この種におけるこれらワクチンの先行情報に関する広範なデータベースがあるため、また系統発生学的にヒトと近縁であるため、その大きさが応答を適切な評価を確保するための十分量の血液サンプルを可能にするため、またこの種に対して既に最適化された試薬及び検定法が既に存在しているので補助的な手順及び長年の開発を必要としないため、最良の種の選択を意味する。更に、アデノウイルス３５コンストラクトは、このウイルスが他の哺乳類の樹状細胞に効率よく侵入することができないため、非ヒトの霊長類において適切に試験することのみできる。
【００７８】
本例で使用した遺伝子（Ａｄ５ＣＳ及びＡｄ３５ＣＳ）をコードしているＰ．ファルシパラムＣＳを宿す組み換え複製欠損アデノウイルスのコンストラクト及び製造は、国際公開第２００４／０５５１８７号（クローン０２−６５９、図２を参照）の実施例中に詳細に記載されている。つまり、これらのアデノウイルスベクターは、ＮＦ５４株のＣＳタンパク質、すなわちその他の中にＮ末端シグナル配列、２７ＮＡＮＰ繰り返し、３つのＮＶＤＰ繰り返し及び離れた１つのＮＶＤＰ繰り返しのクラスター、普遍的なエピトープ（ロックラー等、１９８９年、ゼバーリング等、１９９４年、ナージン等、２００１年）、並びに最後の１４アミノ酸の欠失（Ｃ末端部分における）を有する３Ｄ７クローンと同様のアミノ酸配列を有するＣＳタンパク質をコードしている異種遺伝子からなる。ＲＴＳ，Ｓのタンパク質との違いは、ＲＴＳ，Ｓが、またアデノウイルスコンストラクト中にないＣ末端部分に位置するＧＰＩアンカーシグナル配列の大部分と同様、Ｎ末端シグナル配列及び大部分の繰り返し配列を欠失していることである。
【００７９】
実験は、ＲＴＳ，ＳとＣＳを持つＡｄ５及びＡｄ３５ＣＳコンストラクト（Ａｄ５ＣＳ及びＡｄ３５ＣＳ）の初回免疫−追加免疫方法の最適化並びにＡｄ５ＣＳ及びＡｄ３５ＣＳのみの最適化のための様々な組み合わせ及びタイミングによる、不作為抽出し、盲検性が確保された免疫原性の検討であった。新しい方法と比較する従来の最良の処方計画は０、１、及び３ヶ月に施されるアジュバントを有するＲＴＳ，Ｓ５０μｇの３回の筋中投与であった。これはグループ１の正のコントロールグループである。すべてのグループを表ＩＡに概説する。すべての場合において、アジュバントは、国際公開第９６／３３７３９号に記載されているような、含コレステロールリポソームとの処方における５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬ、５０μｇのＱＳ２１から製造した。
【００８０】
グループ２は、０及び１ヶ月でのＲＴＳ，Ｓ／アジュバントの２回の服用並びに３ヶ月でのＡｄ３５ＣＳの１回の服用を受容した。グループ３は、０ヶ月でのＡｄ３５ＣＳの１回の服用、その後１及び３ヶ月でのＲＴＳ，Ｓ／アジュバントの２回の服用を受容した。グループ４、５、及び６はアデノウイルスコンストラクトのみを受容した。異なる病気においてアデノウイルス５コンストラクトの２回の服用を含む先行実験は、最適な血清学的及び細胞性免疫応答を免疫付与の間隔が少なくとも６ヶ月である場合に得ることを示した。ヒト又は非ヒト霊長類においてＡｄ３５コンストラクトを評価するために不可欠なため、このベクターの服用間の最適時間はまだ確立されていなかった。従って、グループ４は（タンパク質グループの直接制御のために）０、３ヶ月の日程でＡｄ３５ＣＳの２回の服用を受容し、またグループ５は０、６ヶ月の日程で２回の服用を受けた。同じアデノウイルスコンストラクトを２回服用することがその代わりとなるＣＳタンパク質のコンストラクトに劣るかどうかの疑問を評価するために、グループ５を、０、６ヶ月の日程でＡｄ５ＣＳの後にＡｄ３５ＣＳを受容したグループ６と比較した。最後に、コントロールのグループ７は、免疫原性評価のための免疫付与コントロールグループとして、０、３ヶ月の日程で（マラリア遺伝子の挿入のない）Ａｄ３５そのままを２回服用した。
【００８１】
ワクチン反応の発生の観察を容易にするため、注射部位を切り、はっきりと印を付けた。更に、動物を沈静化して、注射の２４、４８、７２時間後、７及び１４日後に、硬結、隆起、熱、赤み又はその他の異常について注射部位を直接検査した。全身毒性の兆候は予期されなかったが、動物を沈静化し、これらの時点においてリンパ節症、蜂巣炎、膿炎、関節炎、拒食症、及び体重減少を検査し、またそれらの血清学的な臨床化学値の変化を測定した。完全血球算定並びにＢＵＮ、クレアチン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＧＴ、及びＣＫの測定（特に限定されないが）を含む一団の臨床化学検定のために、注射時及び各注射の２４、４８、７２時間後、７、１４日後に採血した。その後のアデノウイルスの試験のために、非複製ベクターの漏れがないことを確認するため０−１０の各アデノウイルス注射についてそれぞれの日に糞便のサンプルを回収し、−７０℃で保存した。
【００８２】
各注射時に、また各注射の１、２、４週間後の時に血清１−３ｍｌを回収し、その後少なくとも月１回、イライザ法でＣＳ  Ｒ３２（ＣＳタンパク質の繰り返し領域をＣＳタンパク質に対する標準化したイライザ検定の現像に使用した。以下を見ること）に対する抗体反応の性質及び強度について測定した。血清サンプルは、使用するまで−７０℃で保存し、検定中のばらつきをできるだけ抑えるため、サンプルは実験終了までバッチ操作した。回収した血清の量は適切な量であり、各アデノウイルス注射の０、１、７、１４日目及び少なくともその後４週間ごとに血清０．５−１．０ｍｌの抗アデノウイルス抗体力価を決定するために使用可能である。細胞採集のために、初回免疫の前、２回目免疫の４週間後（もし容量が許すのであれば）、３回目免疫の４週間後、及び３回目免疫の６ヶ月後に、多量（２０−４０ｍｌ）のＥＤＴＡ−又はヘパリン−抗凝固血液を回収した。密度遠心分離の標準的な方法を用いて、これらのサンプルから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を濃縮した。細胞の収率はある個体の動物と別の動物で大きく変化するけれども、一般にサンプルの容量が多いほど回収されるサンプルの数もより多くなる。正確な細胞の回収率を予想することは不可能なので、統計的妥当性のために検定を繰り返すための十分な細胞を得られるように、可能であればより多くのサンプルを採取することが好ましい。細胞は、その後のバッチ処理を可能にし、その結果として品質管理を改良するために凍結する。細胞を、１０％のＤＭＳＯを含む自己血清中で、制御した温度降下率において凍結させ、液体窒素の気相中で使用前の少なくとも一週間貯蔵した。
【００８３】
ＣＢＣのデータが良好な耐容性を示すより大きい動物からは、細胞採集のための更なるサンプルを、追加免疫の前ではなく初回免疫の後に回収する。ＲＴＳ，Ｓ／アジュバントの２回投与を受けた１４匹のサル（２グループ）及び８週間前にＡｄ３５ＣＳの１回投与を受けた１４匹のサルがいたので、少なくとも半分をサンプリングし、これにより統計的有意性が確保されることが期待された。細胞採集は注射の４週間後すぐに実行する予定であった。アデノウイルスコンストラクトのみを受けたグループは２回の注射のみ受容したので、その結果として３回の注射を受けたサルよりも採血日程が厳しくなかったため、２回の注射の間の細胞採集間隔は困難ではないと予期された。
【００８４】
細胞性免疫応答の分析としては、抗原特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の定量のための短期エリスプロット検定が挙げられる。抗原によって刺激した細胞のフローサイトメトリーによる分析は、反応性の抗原特異的細胞の表現形について更なる情報をもたらすけれども、エリスポット分析において収集したデータを裏付けることのみはできない。従って、細胞内染色及びフローサイトメトリーによる抗原特異的ＣＤ８＋ＩＮＦ−γを分泌する小集団の測定を更に詳細に調べる。
【００８５】
実行する追加の検定としては、更なるサイトカインのためのバルクエリスポット分析、更なるサイトカインのＴ細胞サブセット網羅的な細胞内染色、抗原特異的Ｔ細胞サブセットのサイトカイン産生についての他のフローサイトメトリーに基づく定量検定、及び他の方法と相関させるための定量ＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。
【００８６】
サルは、年齢、性別、体重及び地理的起源に一様に適合するグループに分け、その後にグループをランダム化した。すべての臨床的評価及び安全性評価項目の判定は、サルのグループの割り当てを知ることなく測定した。同様にして、すべての免疫学的検定は、個々のサンプルの属するグループを前もって知ることなく実行した。この盲検定の方法の例外は、０、１、３ヶ月とは対照的に０及び６ヶ月において免疫を受容した動物であった。しかしながら、盲検定はある特定の注射について維持した。
【００８７】
試験グループ当たりの７匹（及びコントロールグループでは４匹）の動物というグループの大きさは、グループの大きさを最小化しつつ、同様の、しかしわずかに関連のある実験による先のデータに基づいて、グループ間の違いをそれでもなお正確に検出するために理想的である。
【００８８】
イライザ法検定の結果の相乗平均は、均等な分散及び２つの試行を前提にするスチューデントＴ検定及び分散分析（ＡＮＯＶＡ）のような標準的な分析を用いて媒介変数的に比較される。２００，０００細胞当たりのスポットで表されたエリスポット検定の結果は同様に処理し、更にクラスカル−ウォーリス試験のような媒介変数を使用しない分析を用いて検討する。グループ間の比較が必要な場合、一対のグループ間の差異を決定するために、生のデータ又は対数に変換したデータに関するスチューデントＴ検定を使用する。
【００８９】
注射の前には毛をクリップ止めし皮膚を７０％消毒用アルコールで清潔にし、その後の触診及び反応原性評価のための注射部位を探すのを容易にするため、皮膚上に安全インクで２．５−３ｃｍの輪を書いた。ＲＴＳ，Ｓの注射は、サルの廊下に入る直前にアジュバントと混合した。最終的な注射量は０．５ｍlであり、２５−２９ゲージの注射針を通して大腿前部筋肉組織に送達した。アデノウイルスのコンストラクトは（国際公開第２００４／０５５１８７号に）記載と同様に緩衝食塩水中で調製し、更に筋中の同じ場所に終容量０．５ｍｌで投与した。
【００９０】
主な生サンプルは、血清又は細胞の何れかのための血液である。採血日程を表ＩＢにまとめる。動物の血液学上の状態を観察した。これは、繰り返される生サンプル回収を持続する個々の能力又は計画した生サンプルの回収日程を減らせることを示していた。採血の度にクールター自動血球数カウンター（＜５０μｌの非凝固血液が必要な）を用いて完全血球算定（ＣＢＣ）を行った。製造業者が推奨する医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）のような指針を整備及び維持のために実施した。動物が貧血になっていないことを厳密に確かめるために、ヘマトクリット値、ヘモグロビン、平均赤血球容量（ＭＣＶ）、赤血球（ＲＢＣ）数、及び網状赤血球の割合を追跡した。
【００９１】
２０−２４ゲージの注射針及びシリンジ又は真空チューブを用いて、大腿静脈、伏在静脈又は橈側皮静脈から静脈血を回収した。一般に、伏在静脈又は橈側皮静脈は１０ｍｌ未満の採血に好ましく、大腿静脈は１０ｍｌを超える量を採る場合、溶血を避け前静脈穿刺時間を短くすることが好ましい。
【００９２】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を免疫前、最終免疫の２週間後、及び最終免疫の３ヶ月後の動物から採集する。この方法においては、ＰＢＭＣｓは密度遠心分離の標準的な方法により分離し、また４５％の自己血清（４５％食塩水及び１０％ＤＭＳＯ）中で凍結保存する。つまり、リンホプレップ（登録商標）（アクシス−シールド、オスロ、ノルウェー）フィコール−ハイパック細胞分離培養液上で層状をなしていた全血を６５０ｇで２０分間遠心した。細胞層を除去し、殺菌リン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）（バイオウィタッカー（BioWhittaker）、ウォーカーズビル、メリーランド）４００ｇで１５分間２回洗浄した。クールターＡＣＴ＊１０血球計算板を用いて生存細胞の数を数えた。沈殿を５０％ｄＰＢＳ、５０％食塩水中で１×１０７／ｍｌになるように再懸濁した。終濃度１０％となるようにＤＭＳＯを滴下して加えた。細胞はそれぞれ０．５５ｍｌ中で正確に５００万細胞となるように分け、−７０℃の冷凍庫内で温度降下を制御したイソロパノール浴中に置くことにより一晩凍結させ、使用まで液体窒素の気相中で保存した。
【００９３】
最後のワクチン接種後、別々のサル由来の血液サンプル中のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を分泌しているＴ細胞を、全部の抗原並びにＣ−及びＮ−末端特異的ペプチドプール（詳細に後述するように）で刺激した後に、酵素結合免疫ポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）検定することにより同定した。結果を図１（最後のワクチン接種の２週間後）及び図２（最後のワクチン接種の３ヶ月後）にプロットし、また１００万細胞当たりの中央値スポット形成単位（median spot forming units(SFU)）として、それぞれ表２及び表４に表した。対数変換データの分散の分析（アノーバ）を使用して統計比較を行った。すべてのグループを比較した。統計的有意性を決定した場合、群対群の比較のための事後解析を行うことができた（データは示さない）。
【００９４】
異なる処理方法間のエリスポットの結果を比較するために、初回免疫処理としてＡｄ３５による方法に対して相乗平均力価の比率を計算した。これらの比率において、ＲＴＳ，Ｓのみでの処理（０、２、３ヶ月における）により得た相乗平均力価は、参照処理として解釈される（図５及び６、表１０）。同様に、更に追加免疫処理としてＡｄ３５を用いた方法に対する比率を計算した（図７及び８、表１１）。
【００９５】
Ｎ末端特異的に刺激したＴ細胞のエリスポットの結果に対して同様の分析をした。結果はそれぞれ図９及び１０、並びに表１２及び１４にプロットする。最後に比率を計算し、図１１（Ａｄ３５の初回免疫方法）及び図１２（Ａｄ３５追加免疫方法）並びに表１６及び１７にそれぞれ表す。
【００９６】
ＰＶＤＦ底のマルチスクリーンＩＰエリスポットプレート（ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ）上において標準的な手順を用いて、融解した凍結保存ＰＢＭＣｓのエリスポットを行った。最終スポットの現像を行った２日目に細胞をはがすまで、無菌的手法に厳格に従った。
【００９７】
使用した培養液：完全培地（ｃＲＰＭＩ）は、１：１００のペニシリン／ストレプトマイシン、１：１００のＬ−グルタミン、１：２００の炭酸水素ナトリウム（シグマ、セントルイス、ミズーリ）、１：１００の非必須アミノ酸、１：１００のピルビン酸塩、及び１：３００の２−メルカプトエタノール（ギブコ）を加えることにより、ＲＰＭＩ−１６４０（バイオウィタッカー、ウォーカーズビル、メリーランド）から新たに調製した。わずかな促進のバックグラウンドはあるもののサル細胞の良好な増殖を支持することを非特異的増殖分析によって前もって特徴付けたロットのウシ胎児血清（ＦＣＳ、ハイクローン（HyClone）社）、ローガン、ユタ）を終容量１０％で加えてｃＲＰＭＩ−１０とし、２０％のものをｃＲＰＭＩ−２０などとした。培養液プラス（Ｍ＋）は、１：５００で抗サルＣＤ２８抗体及び抗サルＣＤ４９Ｄ抗体（ＢＤファーミンジェン、サンホセ、カルフォルニア）を更に補った。
【００９８】
以下の刺激物は、血清を加えていないＭ＋での所望の終濃度で新たに２回調製した。
Ｃｏｎ  Ａ：全バイアルの正のコントロールとして、２．５μｇ／ｍｌ（終濃度１．２５μｇ／ｍｌ）のコンカナバリンＡ（シグマ）
ＣＳ−Ｃ：１１種類のアミノ酸により重複し、２．５μｇ／ｍｌ（終濃度１．３５μｇ／ｍｌ）の各ペプチドでＰｆＣＳ分子（ＧＳＫ、リクセンサート（Rixensart）、ベルギーが供給する）のＣ末端部分を被覆する１５マーのペプチドのプール
ＣＳ−Ｎ：１１種類のアミノ酸により重複し、ＰｆＣＳ分子のＮ末端部分を被覆する同様の１５マーのペプチドのプール
ＲＴＳ，Ｓ：２μｇ／ｍｌ（終濃度１μｇ／ｍｌ）において細胞培養（ＧＳＫ）に適する精製全長タンパク質複合体のＲＴＳ，Ｓ抗原
ＨＥＦ：２３．２μｇ／ｍｌ（終濃度１１．６μｇ／ｍｌ）において細胞培養に適する精製Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨｂＳ）の全長タンパク質（ＲＴＳ，Ｓの“Ｓ”成分）
ＨｂＳ−Ｐ：２．５μｇ／ｍｌ（終濃度１．２５μｇ／ｍｌ）の各ペプチドにおけるＨｂＳの１５マーのペプチド（ＧＳＫ）のプール
負のコントロールは、更なる補充物を含まないＭ＋であった。
【００９９】
プレートは以下のように調製した。プレートを、無菌ｄＰＢＳで１：１００希釈した抗サルＩＦＮ−γのモノクローナル一次抗体（ユシテック（UcyTech）、#21-43-09、ユトレヒト、オランダ）を５０μｌ／ウェルで被覆し、ビニール袋内で４℃で５−６時間インキュベートした。使用の１時間前に、被覆抗体を取り除き、細胞培養インキュベーターで制御した３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％において、プレートをｃＲＰＭＩ−１０でブロッキングした。使用直前にブロッキング培養液を除去した。
【０１００】
冷凍保存したＰＢＭＣの解凍：冷凍したバイアルを湯沸かし器の水（３７−４０℃）の中でわずかに解凍するまで振り、０．５５ｍｌの内容物を８ｍｌのＲＰＭＩ−２０に直ちに移した。細胞を３５０ｇで１３分間洗浄し、沈殿を２．０ｍｌのｃＲＰＭＩ−２０中で注意深く再懸濁した。その後、４０μｌの無菌水を取り除いて生存細胞数を確認し、２×１０６細胞／ｍｌの単一細胞懸濁液を生じに必要なものとして量を調整した。
【０１０１】
前刺激：ｃＲＰＭＩ−２０の細胞懸濁液とＭ＋中の刺激物の等量をポリプロピレンの細胞培養チューブ内で混合し、すべての試薬を所望の終濃度にした。その後、ガス交換を促進するために緩くキャップを閉めて傾けた状態で、細胞をインキュベーター内で５時間保存した。
【０１０２】
最終刺激：インキュベーションの５−６時間後、細胞を４００ｇで１０分間遠心し、上清を捨てた。その後、細胞を半量のｃＲＰＭＩ−２０及び半量の刺激物中で直ちに再懸濁した。これらを１０−２０分間インキュベーターに戻し、ｐＨを安定させた。その後、細胞を少しの間混合し、２００μｌ（２００，０００細胞）をブロック状の空プレート上の適切なウェルに注意深くピペットで移した。すべての段階においてウェルが乾いてしまわないように注意を払った。その後、プレートを静置して一晩（＞１６時間）インキュベートした。
【０１０３】
スポットの現像：抗サルＩＦＮ−γのポリクローナル二次抗体（ＵＣｙＴｅｃｈ社製）の１：１００希釈液を２％ＦＣＳを含むｄＰＢＳ中で調製した。細胞及び培養液をプレートから弾き飛ばした。ウェルをｄＰＢＳ−０．５％ツイン２０（シグマ）で８回洗浄し、希釈した二次抗体５０μｌをロードした。プレートをビニール袋内の振動パネル上で室温３時間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳ−０．５％ツイン２０で８回洗浄し、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ複合体（サザンバイオテック、#7100-04、バーミンガム、アラバマ）の１：１０００希釈液の５０μｌ／ウェルでロードした。次いで、プレートをビニール袋内の振動パネル上で更に室温２時間インキュベートした。最後に、プレートを上記同様に８回洗浄し、その後蒸留水で１回洗浄し、原色体であるＮＢＴ−ＢＣＩＰ基質（ピエルスバイオテック、ロックフォード、イリノイ）１００μl／ウェルを加えた。バックグラウンドが暗くなるなるまで１０−２０分間発色させた。その後、プレートを蒸留水３００μｌで少なくとも２回洗ってすすぎ、読み取り前に一晩空気乾燥した。
【０１０４】
プレートの読み取り：プレートをＡＩＤエリスポットリーダー  バージョン３．１．１を用いてＡＩＤ  ＥＬＨＲ０１エリスポットリーダーで読み取った。全てのウェルを目で観察し、不適切なスポット（糸くず又はその他の破片）のカウントを手動で取り除いた。データをエクセルのワークシートに保存した。２つ又は３つのウェルを平均し、この数に５をかけてスポット数／１００万細胞における最終的な生データを得た。
【０１０５】
品質管理：凍結／融解後の回復した平均生存細胞は９５％を超えていた。培養液のコントロールのウェルの平均が２０スポット／１００万細胞、又はＣｏｎＡのウェルが５００スポット／１００万細胞未満である場合、実験を繰り返した。また、全体として、７−ＡＡＤダイによる排除を用いたフローサイトメトリー及び表面染色を使用した評価によるＣＤ４＋及びＣＤ８＋の生存率が全て９０％を超えている必要があり、さもなければ実験を繰り返した（データは含まない）。
【０１０６】
表１Ａ．  Ｐ．ファルシパラムのＣＳタンパク質をコードする遺伝子を含む抗原型５及び３５に基づく組み換えアデノウイルスベクター並びにタンパク質性抗原成分としてアジュバント化ＲＴＳ，Ｓを用いるアカゲザルの初回免疫／追加免疫の処方計画のための実験的処方計画
【０１０７】
【表１Ａ】
2008516926.tif 000003
【０１０８】
表１Ｂ．  血液採取日程。ＣＢＣ及び細胞採集は全血を必要とする。化学検定及びイライザ法は血清を必要とする。１ｍｌの血清は２ｍｌの全血に相当すると見込まれる。全血量のみを示す。範囲は、より大きいサルからはより多量のサンプルを回収してもよいことを示す。ＣＢＣ／Ｃｈｅｍカラムの“０．５”は当日ＣＢＣのみ実行したことを示す。＊は、この時点において全てのサルから採血したわけではないことを示す。
【０１０９】
【表１Ｂ−１】
2008516926.tif 000004
【０１１０】
【表１Ｂ−２】
2008516926.tif 000005
【０１１１】
以下の表においては、ＲＴＳ，Ｓは単に“ＲＴＳ”と言及する。
【０１１２】
表２．  追加免疫の２週間後におけるＰｆＣＳのＣ末端特異的なＴ細胞の免疫。中央値及び相乗平均のＩＦＮ−γのエリスポット（ＳＦＵ／１００万細胞中）並びに分散分析の比較。異なる初回免疫／追加免疫の処方計画を与える（左）。
【０１１３】
【表２】
2008516926.tif 000006
【０１１４】
表３．  スチューデントＴ検定。追加免疫（最終ワクチン接種）の２週間後の、表２に示したのと同様のＰｆＣＳのＣ末端特異的なＩＦＮ−γのエリスポット比較のためのｐ値。
【０１１５】
【表３】
2008516926.tif 000007
【０１１６】
表４.  追加免疫の３ヶ月後におけるＣ末端特異的なＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞の免疫性。中央値及びエリスプロット（ＳＦＵ／１００万細胞中）の相乗平均及び分散分析の比較。異なる初回免疫／追加免疫投与計画を与える（左）。
【０１１７】
【表４】
2008516926.tif 000008
【０１１８】
表５．スチューデントＴ検定。追加免疫（最終ワクチン接種）の３ヶ月後の、表４に示したのと同様のＰｆＣＳのＣ末端特異的なＩＦＮ−γのエリスポットの比較のためのｐ値。
【０１１９】
【表５】
2008516926.tif 000009
【０１２０】
表６.  最終追加免疫後２週間のＢ細胞の免疫性（抗繰り返し抗体の力価）。中央値及びイライザ力価の相乗平均及び分散分析の比較。異なる初回免疫／追加免疫の処方計画を与える（左）。
【０１２１】
【表６】
2008516926.tif 000010
【０１２２】
表７．  スチューデントＴ検定。最終追加免疫（最終ワクチン接種）の２週間後の表６に示したのと同様の抗体比較のためのｐ値。
【０１２３】
【表７】
2008516926.tif 000011
【０１２４】
表８．  Ｐ．ファルシパラムのＣＳに関する追加免疫の３ヶ月後のＢ細胞の免疫性（抗体力価）。中央値及びイライザ（ＳＦＵ中）の相乗平均及び分散分析の比較。異なる初回免疫／追加免疫の処方計画を与える（左）。
【０１２５】
【表８】
2008516926.tif 000012
【０１２６】
表９．  スチューデントＴ検定。追加免疫（最終ワクチン接種）の３ヶ月後の表８に示したのと同様の抗体比較のためのｐ値。
【０１２７】
【表９】
2008516926.tif 000013
【０１２８】
表１０．  相乗平均の比率＊。Ｔ細胞及びＢ細胞の応答。Ａｄ３５を初回免疫ワクチンとして用いた。
【０１２９】
【表１０】
2008516926.tif 000014
【０１３０】
表１１．  相乗平均の比率＊。Ｔ細胞及びＢ細胞の応答。Ａｄ３５を初回免疫ワクチンとして用いた。
【０１３１】
【表１１】
2008516926.tif 000015
【０１３２】
表１２．  最終ワクチン接種の２週間後におけるＰｆＣＳのＮ末端特異的なＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞の免疫性。中央値及び相乗平均ののエリスポット（ＳＦＵ／１００万細胞中）並びに分散分析比較。異なる初回免疫／追加免疫の処方計画を与える（左）。
【０１３３】
【表１２】
2008516926.tif 000016
【０１３４】
表１３．  スチューデントＴ検定。追加免疫（最終ワクチン接種）の２週間後の表１２に示したのと同様のエリスポット比較のためのｐ値。
【０１３５】
【表１３】
2008516926.tif 000017
【０１３６】
表１４．  最終ワクチン接種の３ヶ月後におけるＰｆＣＳのＮ末端特異的なＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞の免疫性。中央値及び相乗平均ののエリスポット（ＳＦＵ／１００万細胞中）並びに分散分析比較。異なる初回免疫／追加免疫の処方計画を与える（左）。
【０１３７】
【表１４】
2008516926.tif 000018
【０１３８】
表１５．  スチューデントＴ検定。追加免疫（最終ワクチン接種）の３ヶ月後の表１４に示したのと同様のエリスポット比較のためのｐ値。
【０１３９】
【表１５】
2008516926.tif 000019
【０１４０】
表１６．  ＰｆＣＳのＮ末端に対するＴ細胞応答の相乗平均の比率＊。Ａｄ３５ＣＳを初回免疫ワクチンとして用いた。
【０１４１】
【表１６】
2008516926.tif 000020
【０１４２】
表１７．  ＣＳのＮ末端に対するＴ細胞応答の相乗平均の比率＊。Ａｄ３５ＣＳを初回免疫ワクチンとして用いた。
【０１４３】
【表１７】
2008516926.tif 000021
【０１４４】
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ゼバリング（Zevering）Ｙ等著、Ｔ細胞活性化におけるスポロゾイト抗原多型の効果、リサーチオブイミュノロジー、第１４５巻、ｐ．４６９−４７６
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】異種性の初回免疫／追加免疫ワクチン接種の処方計画、その後のＣＳのＣ末端に関するＩＦＮ−γエリスポット分析におけるＴ細胞の応答の測定。応答は最後の追加免疫後２週間測定した。水平バーは相乗平均を表す。
【図２】ＣＳのＣ末端に関するＩＦＮ−γエリスポット分析にいて測定したＴ細胞の応答。水平バーは相乗平均を表す。
【図３】追加免疫の２週間後にＣＳの繰り返し領域に関してイライザ法で測定した抗体反応。
【図４】追加免疫の３ヶ月後にＣＳの繰り返し領域に関してイライザ法で測定した抗体反応。水平バーは相乗平均を表す。
【図５】組み換え体のＡｄ３５−ＣＳベクターの初回免疫及びＲＴＳ，Ｓ又はＡｄ３５−ＣＳの追加免疫をした実験において、２週間後（左）又は３ヶ月後（右）にＩＦＮ−γのエリスポットによって測定したＴ細胞の応答。初回免疫／追加免疫／追加免疫と同様の処方計画でのＲＴＳ，Ｓ／ＲＴＳ，Ｓ／ＲＴＳ，Ｓを参照として用いた。
【図６】組み換え体のＡｄ３５−ＣＳベクターの初回免疫及びＲＴＳ，Ｓ又はＡｄ３５−ＣＳの追加免疫をした実験において、２週間後（左）又は３ヶ月後（右）にイライザ法で測定した抗体反応。初回免疫／追加免疫／追加免疫と同様の処方計画でのＲＴＳ，Ｓ／ＲＴＳ，Ｓ／ＲＴＳ，Ｓを参照として用いた。
【図７】組み換え体のＡｄ３５−ＣＳベクターの追加免疫及びＲＴＳ，Ｓ又はＡｄ３５−ＣＳの初回免疫をした実験において、２週間後（左）又は３ヶ月後（右）に測定したＴ細胞の応答。初回免疫／追加免疫／追加免疫と同様の処方計画でのＲＴＳ，Ｓ／ＲＴＳ，Ｓ／ＲＴＳ，Ｓを参照として用いた。
【図８】組み換え体のＡｄ３５−ＣＳベクターの追加免疫及びＲＴＳ，Ｓ又はＡｄ３５−ＣＳの初回免疫をした実験において、２週間後（左）又は３ヶ月後（右）に測定した抗体反応。初回免疫／追加免疫／追加免疫と同様の処方計画でのＲＴＳ，Ｓ／ＲＴＳ，Ｓ／ＲＴＳ，Ｓを参照として用いた。
【図９】追加免疫の２週間後にＣＳのＮ末端に関するＩＦＮ−γのエリスポット分析で測定したＴ細胞の応答。水平バーは相乗平均を表す。
【図１０】追加免疫の３ヶ月後にＣＳのＮ末端に関するＩＦＮ−γのエリスポット分析で測定したＴ細胞の応答。水平バーは相乗平均を表す。
【図１１】組み換え体のＡｄ３５−ＣＳベクターの初回免疫及びＲＴＳ，Ｓ又はＡｄ３５−ＣＳの追加免疫をした実験において、２週間後（左）又は３ヶ月後（右）に測定したＴ細胞の応答。初回免疫／追加免疫／追加免疫と同様の処方計画でのＲＴＳ，Ｓ／ＲＴＳ，Ｓ／ＲＴＳ，Ｓを参照として用いた。
【図１２】組み換え体のＡｄ３５−ＣＳベクターの追加免疫及びＲＴＳ，Ｓ又はＡｄ３５−ＣＳの初回免疫をした実験において、２週間後（左）又は３ヶ月後（右）に測定したＴ細胞の応答。初回免疫／追加免疫／追加免疫と同様の処方計画でのＲＴＳ，Ｓ／ＲＴＳ，Ｓ／ＲＴＳ，Ｓを参照として用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2008516926000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月18日(2007.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスがマラリアを引き起こす寄生虫由来のスポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原をコードする異種性の核酸からなる製薬学的に許容される賦型剤中の複製欠損組換えアデノウイルスと、
アジュバント化タンパク質性抗原とを備え、
前記組換えアデノウイルスをヒトアデノウイルスの抗原型１１、２４、２６、３４、３５、４８、４９及び５０からなる群より選択し、また前記複製欠損組み替えアデノウイルスが初回免疫組成物及び前記アジュバント化タンパク質性抗原が追加免疫組成物であることを特徴とするパーツのキット。
【請求項２】
前記組換えアデノウイルスがヒトアデノウイルスの抗原型３５であることを特徴とする請求項１記載のパーツのキット。
【請求項３】
前記タンパク質性抗原が、マラリアを引き起こす寄生虫由来のＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントからなることを特徴とする請求項１又は２記載のパーツのキット。
【請求項４】
前記タンパク質性抗原が、ＨＢｓＡｇとのリポタンパク質粒子の形態で、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢｓＡｇ）由来の表面抗原に融合したＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントのハイブリッドタンパク質からなることを特徴とする請求項３記載のパーツのキット。
【請求項５】
前記タンパク質性抗原がＲＴＳ，Ｓからなることを特徴とする請求項４記載のパーツのキット。
【請求項６】
前記タンパク質性抗原をＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬを含むアジュバントでアジュバント化することを特徴とする請求項１−５の何れか一項記載のパーツのキット。
【請求項７】
アジュバントが更に含コレステロールリポソームを含むことを特徴とする請求項６記載のパーツのキット。
【請求項８】
前記マラリアを引き起こす寄生虫が熱帯熱マラリア原虫であることを特徴とする請求項１−７の何れか一項記載のパーツのキット。
【請求項９】
前記異種性の核酸は、哺乳動物、特にヒトにおいてコードするタンパク質の生成を上昇させるためにコドンを最適化することを特徴とする請求項１−８の何れか記載のパーツのキット。
【請求項１０】
前記組換えアデノウイルスがアジュバントとの混合物中に存在することを特徴とする請求項１−９の何れか記載のパーツのキット。
【請求項１１】
アデノウイルスが熱帯熱マラリア原虫のコドンを最適化されたスポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原をコードする異種性の核酸を含む製薬学的に許容される賦型剤中の類人猿、イヌ科又はウシ科の複製欠損組換えアデノウイルスと、
ＲＴＳ，Ｓからなるアジュバント化タンパク質性抗原とを備えるパーツのキットであって、
前記複製欠損組み替えアデノウイルスが初回免疫組成物及び前記アジュバント化タンパク質性抗原が追加免疫組成物であることを特徴とするパーツのキット。
【請求項１２】
前記タンパク質性抗原をＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬを含むアジュバントでアジュバント化することを特徴とする請求項１１記載記載のパーツのキット。
【請求項１３】
前記アジュバントが更に含コレステロールリポソームを含むことを特徴とする請求項１２記載のパーツのキット。
【請求項１４】
マラリアを引き起こす寄生虫のＣＳ抗原をコードする異種性核酸を含む複製欠損組み替えアデノウイルスと、アジュバント化タンパク質性抗原とのマラリアの治療又は予防用薬剤の製造への使用であって、前記組み替えアデノウイルスが類人猿、イヌ科若しくはウシ科のアデノウイルス又はヒトアデノウイルスの抗原型１１、２４、２６、３４、３５、４８、４９もしくは５０であり、また前記複製欠損組み替えアデノウイルスを初回免疫組成物として使用し、前記アジュバント化タンパク質性抗原を追加免疫組成物として使用することを特徴とする複製欠損組み替えアデノウイルスとアジュバント化タンパク質性抗原との使用。
【請求項１５】
前記タンパク質性抗原がマラリアを引き起こす寄生虫のＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントであることを特徴とする請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記マラリアを引き起こす寄生虫が熱帯熱マラリア原虫であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記タンパク質性抗原が、ＨＢｓＡｇとのリポタンパク質粒子の形態でＢ型肝炎ウイルス由来の表面抗原に融合したＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントのハイブリッドタンパク質からなることを特徴とする請求項１４−１６の何れか一項記載の使用。
【請求項１８】
前記アジュバント化タンパク質性抗原がＲＴＳ，Ｓからなることを特徴とする請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
前記タンパク質性抗原をＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬでアジュバント化することを特徴とする請求項１４−１８の何れか一項記載の使用。
【請求項２０】
前記異種性の核酸は哺乳動物、好ましくはヒトにおいてコードするタンパク質の生成を増加させるためにコドンが最適化されていることを特徴とする請求項１４−１９の何れか一項記載の使用。
【請求項２１】
アデノウイルスがマラリアを引き起こす寄生虫由来のＣＳ抗原をコードする異種性の核酸を含む製薬学的に許容される賦型剤中の複製欠損組み替えアデノウイルスで哺乳動物を初回免疫する工程と、
前記哺乳動物を、ＨＢｓＡｇとのリポタンパク質粒子の形態でＢ型肝炎ウイルス（ＨＢｓＡｇ）由来の表面抗原に融合したＣＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントのハイブリッドタンパク質を含むアジュバント化タンパク質性抗原で追加免疫する工程
とを備えるマラリア感染に対する哺乳動物の予防接種の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質性抗原がＲＴＳ，Ｓからなることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記組み替えアデノウイルスがヒト、サル、イヌ又はウシのアデノウイルスであることを特徴とする請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２４】
前記組み替えアデノウイルスがヒトアデノウイルスの抗原型１１、２４、２６、３４、３５、４４、４８、４９及び５０からなる群から選択されるヒトアデノウイルスであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質性抗原をＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬでアジュバント化することを特徴とする請求項２１−２４の何れか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記マラリアを引き起こす寄生虫が熱帯熱マラリア原虫であることを特徴とする請求項２１−２５の何れか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記異種性の核酸は哺乳動物、特にヒトにおいてコード化したタンパク質の生成を増加させるためにコドンへ最適化されていることを特徴とする請求項２１−２６の何れか一項記載の方法。
【請求項２８】
請求項１−１３の何れか一項記載パーツのキットを用いるマラリア感染に対して哺乳動物を予防接種する方法。
【請求項２９】
追加免疫の後に一以上の追加免疫を行うことを特徴とする請求項２８記載の哺乳動物を予防接種する方法。
【国際調査報告】
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