(57)【要約】  眼膜除去を行う際の眼膜染色のための染色組成物であって、染色組成物はブリリアントブルーＧ（ＢＢＧ）誘導体を主要成分として構成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼膜除去を行う際の眼膜染色のための染色組成物であって、前記染色組成物はブリリアントブルーＧ（ＢＢＧ）誘導体、薬理学的に許容されるその塩あるいはその水和物を主要成分として構成され、
前記ＢＢＧ誘導体が構造式［Ｉ］で表される、眼膜除去を行う際の眼膜染色のための染色組成物。
【化１】
2008522953.tif 000012
式中、Ｒ１はＣ１−１０アルコキシ基、水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、ヒドロキシＣ２−１０アルキル基、ハロゲノＣ１−１０アルコキシ基あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表し、
ｎは１から５のいずれか一つを表し、
Ｒ２及びＲ２´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、ヒドロキシC２−１０アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表し、
ｍ及びｍ´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ３、Ｒ３´及びＲ３´´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、ヒドロキシC２−１０アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表し、
ｐ、ｐ´及びｐ´´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ４、及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは2つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、ヒドロキシC２−１０アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは2つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、ヒドロキシC２−１０アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表す。
【請求項２】
前記ＢＢＧ誘導体が前記構造式［Ｉ］で表され、前記構造式［Ｉ］中、
Ｒ１はＣ１−６アルコキシ基、水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、ハロゲノＣ１−６アルコキシ基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｎは１から５のいずれか一つを表し、
Ｒ２及びＲ２´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−OH、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシC２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｍ及びｍ´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ３、Ｒ３´及びＲ３´´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシC２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｐ、ｐ´及びｐ´´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ４、及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは2つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシC２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは2つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシC２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表す、
請求項１に記載の染色組成物。
【請求項３】
前記ＢＢＧ誘導体が構造式［ＩＩ］で表され、
【化２】
2008522953.tif 000013
式中、
Ｒ１は水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｎは１から５のいずれか一つを表し、
Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ＝、−ＯＣ（＝Ｏ）−、あるいは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−を表す。
Ｒａは水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ２及びＲ２´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、ハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｍ及びｍ´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つをし、
Ｒ３、Ｒ３´及びＲ３´´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｐ、ｐ´及びｐ´´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、あるいはＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子、Ｃ１−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表す、
請求項１に記載の染色組成物。
【請求項４】
前記ＢＢＧ誘導体が前記構造式［ＩＩ］で表され、前記構造式［ＩＩ］中、
Ｒ１は水素原子、あるいはＣ１−６アルキル基を表し、
ｎは１から５のいずれか一つを表し、
Ｚは−Ｏ−を表し、
ＲａはＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ２及びＲ２´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、あるいはＣ１−６アルキル基を表し、
ｍ及びｍ´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
ｐ、ｐ´及びｐ´´は４を表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子、Ｃ１−６アルキル基を表す、
請求項１に記載の染色組成物。
【請求項５】
前記ＢＢＧ誘導体が構造式［ＩＩＩ］で表され、
【化３】
2008522953.tif 000014
式中、
Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ＝、−ＯＣ（＝Ｏ）−、あるいは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−を表し、
Ｒａは水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、あるいはＣ１−６アルキル基を表す、
請求項１に記載の染色組成物。
【請求項６】
前記ＢＢＧ誘導体が前記構造式［ＩＩＩ］で表され、前記構造式［ＩＩＩ］中、
Ｚは−Ｏ−を表し、
ＲａはＣ１−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基を表す、
請求項１に記載の染色組成物。
【請求項７】
前記ＢＢＧ誘導体が前記構造式［ＩＩＩ］で表され、前記構造式［ＩＩＩ］中、
Ｚは−Ｏ−を表し、
ＲａはＣ１−３アルキル基を表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−３アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれＣ１−３アルキル基を表す、
請求項１に記載の染色組成物。
【請求項８】
前記ＢＢＧ誘導体、薬理学的に許容されるその塩あるいはその水和物が、ＢＢＧ色素である、
請求項１に記載の染色組成物。
【請求項９】
前記眼膜が、内境界膜（ＩＬＭ）である、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項１０】
前記眼膜が、前嚢である、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項１１】
前記染色組成物が、前記眼膜を染色するために効果的な濃度のＢＢＧを有する、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項１２】
前記染色組成物が、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの範囲の前記ＢＢＧ濃度を有する、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項１３】
前記染色組成物が、０．１ｍｇ／ｍｌから１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の前記ＢＢＧ濃度を有する、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項１４】
前記染色組成物が、前記ＢＢＧを０．１ｍｇ／ｍｌから０．２５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で含有する、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項１５】
前記染色組成物が、２９８ｍＯｓｍの浸透圧を有する、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項１６】
請求項１の前記染色組成物を調製し、
前記染色組成物の所定の濃度を用いて前記眼膜を染色し、
前記染色された膜を剥がす、
眼膜染色及び除去する方法。
【請求項１７】
前記染色組成物の所定の濃度が、前記ＢＢＧの０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの範囲である、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記染色組成物の所定の濃度が、前記ＢＢＧの０．１ｍｇ／ｍｌから１．０ｍｇ／ｍｌの範囲である、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記染色組成物の所定の濃度が、前記ＢＢＧの０．１ｍｇ／ｍｌから０．２５ｍｇ／ｍｌの範囲である、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
眼疾患の治療用染色組成物を製造するためのブリリアントブルーＧ誘導体の使用。
【請求項２１】
前記治療が内境界膜（ＩＬＭ）の染色及び除去を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記治療が前嚢の染色及び除去を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記治療中の前記染色組成物が、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの範囲の前記ＢＢＧ濃度を有する、請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
前記治療中の前記染色組成物が、０．１ｍｇ／ｍｌから１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の前記ＢＢＧ濃度を有する、請求項２０に記載の使用。
【請求項２５】
前記治療中の前記染色組成物が、０．１ｍｇ／ｍｌから０．２５ｍｇ／ｍｌの範囲の前記ＢＢＧ濃度を有する、請求項２０に記載の使用。
【請求項２６】
前記治療中の前記染色組成物が、２９８ｍＯｓｍの浸透圧を有する、請請求項２０に記載の使用。
【請求項２７】
眼科手術用のアジュバントとしてのブリリアントブルーＧの使用。
【請求項２８】
網膜除去を行う際の網膜染色のための染色組成物であって、前記染色組成物はブリリアントブルーＧ色素で構成される、網膜除去を行う際の網膜染色のための染色組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権出願
本願は２００４年１２月６日に出願された米国仮出願番号６０／６３３，５９２及び２００５年１月２７日に出願された米国仮出願番号６０／６４７，５０４の優先権を主張する。これらの内容は参照することにより全体が本書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は眼膜染色に用いる染色組成物に関する。より詳細には、本発明は特に膜を除去するために眼膜を染色するアジュバントとして利用される染色組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
内境界膜（ＩＬＭ）の染色は黄斑円孔及び網膜上膜（ＥＲＭＳ）のような硝子体網膜疾患の外科処置における重要な進歩の一つである（Indocyanine  green−assisted  peeling  of  the  retinal  internal  limiting  membrane.  Burk  SE  et  al.  Ophthalmology.  2000;107:2010−2014.)。ＩＬＭ及びＥＲＭＳが見え難いため、現在では外科的なアジュバントを使用せずに膜を除去することは非常に困難であると広く認識されている。特に、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）及びトリパンブルー（ＴＢ）染色は様々な硝子体網膜疾患におけるＩＬＭ及びＥＲＭＳ除去を非常に容易にし、結果としてこの技術は現在多数の外科医に広く受け入れられている。しかしながら、実験的及び臨床的利用の両方においてＩＣＧ及びＴＢの硝子体内投与に起因する網膜損傷に関する報告が近年多数なされている。（Morphological  and  functional  damage  of  the  retina  caused  by  intravitreous  indocyanine  green  in  rat  eyes.  Enaida  H,  et  al.  Graefes  Arch  Clin  Exp  Ophthalmol.  2002;  240:209−213.  ;  Uemura  A,et  al.  Visual  field  defects  after  uneventful  vitrectomy  for  epiretinal  membrane  with  indocyanine  green−assisted  internal  limiting  membrane  peeling.  Am  J  Ophthalmol.  2003;136:252−257.  ;  Veckeneer  M,  et  al.  Ocular  toxicity  study  of  trypan  blue  injected  into  the  vitreous  cavity  of  rabbit  eyes.  Graefes  Arch  Clin  Exp  Ophthalmol.  2001;239:698−704.）
【０００４】
更に、白色成熟白内障の眼の連続環状嚢切開（ＣＣＣ）を行うことは前嚢と下層にある白質とを識別しづらいために困難であった。嚢が見えづらいためにＣＣＣが不完全あるいは不適切となり、その結果嚢の裂傷、硝子体消失及び眼内レンズ（ＩＯＬ）脱臼にいたる傾向がある。赤色反射がほとんどあるいは全く無い白内障の眼球においてＣＣＣを施術する際の前嚢染色のために色素を眼内投与することがますます一般的になってきている。Ｄａｄａは嚢染色によってＣＣＣが未成熟白内障においてさえ容易になること、及び外科研修医に対して有用な補助となりうることを示した。０．１％及び０．０６％のトリパンブルーが嚢染色に用いられ、インビボで目立った毒性が無いことが示されている。しかしながら、トリパンブルーはインビトロの厳しい条件下では角膜内皮に対し毒性を持つと報告されている。インドシアニングリーン（ＩＣＧ）もまた嚢染色に頻繁に用いられる色素である。ＭｃＥｎｅｒｎｅｙ及びＰｅｙｍａｎ  はＩＣＧのウサギ角膜内皮細胞の計数への利用を記述しており、色素が生体内の内皮を損傷しないと示唆している。しかしながら、発明者らはＩＣＧが網膜細胞に対し毒性を持つ可能性を２００２年に報告しており、ＩＣＧの毒性は網膜色素上皮、ガングリオン細胞、光受容体において報告されている。（Indocyanine  green  induces  apoptosis  in  human  retinal  pigment  epithelial  cells.  Rezai  KA,  et  al.  Am  J  Ophthalmol.  2004;137:931−933.  ;  Trypan  blue  induces  apoptosis  in  human  retinal  pigment  epithelial  cells.  Rezai  KA  et  al.  Am  J  Ophthalmol.  2004;138:492−495.）
【０００５】
前述の通り、眼膜、特に内境界膜及び前嚢の染色に用いられる色素（例えばＩＣあるいはＴＢ）は、その安全性に疑問が生じてきた。このような懸念は、網膜細胞に対する毒性、催奇形性などの可能性に関する報告によって高まった。更に、低濃度で充分な着色を得ることが困難であること及び煩雑な染色法といった技術的な問題があった。このため、このような問題が眼科手術をより困難なものにしていた。
【０００６】
従って、眼科手術の改善を推進するために、特に眼膜を染め、低濃度で対象をよく染色できる安全性の高い色素の開発が非常に望まれていた。
【発明の開示】
【０００７】
そのため、本発明の目的は従来眼膜の染色に使用されていた色素の代替となる染色組成物を提供することにある。更に詳細な目的は、特に内境界膜あるいは前嚢を染色し、それらの膜の除去手術のアジュバントとして利用可能な組成物を提供することにある。
【０００８】
このような目的を達成する染色組成物を提供するため、現在、生物には用いられていない色素を含め、すべての色素を用い、候補となる色素をスクリーニングした。加えて、スクリーニング条件に関して、安全性と染色の親和性に特に注意した。その後、絞り込んだ候補となる色素の安全性の評価を、ラットを用いて行った。高い染色親和性及び安全性に基づき、ブリリアントブルーＧ（ＢＢＧ）が最終候補として選ばれた。
【０００９】
更に、BBGを含む染色組成物に眼膜染色のための最適な条件を検証するため、様々な実験を行い、本発明の染色組成物が決定された。ＢＢＧは未だ臨床的に、特に人間に関しては利用されたことがないことは注意すべき点である。しかしながら、本発明に最適な条件においては、臨床的な利用に安全で、かつ高い染色親和性をもつ色素を提供することができる。
【００１０】
そのため、本発明の第一の主要な側面によれば、ＢＢＧを主要成分とした染色組成物が、眼膜除去の際の眼膜染色用に提供される。
【００１１】
本発明の一つの側面は眼膜除去を行う際の眼膜染色のための染色組成物についてのものであり、染色組成物はブリリアントブルーＧ（ＢＢＧ）誘導体、薬理学的に許容されるその塩あるいはその水和物を主要成分として構成される。
【００１２】
好ましいＢＢＧ誘導体を構造式［Ｉ］に示す。
【化４】
2008522953.tif 000002
式中、Ｒ１はＣ１−１０アルコキシ基、水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、ヒドロキシＣ２−１０アルキル基、ハロゲノＣ１−１０アルコキシ基あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表し、
ｎは１から５のいずれか一つを表し、
Ｒ２及びＲ２´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−OH、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、ヒドロキシC２−１０アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表し、
ｍ及びｍ´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ３、Ｒ３´及びＲ３´´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、ヒドロキシC２−１０アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表し、
ｐ、ｐ´及びｐ´´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ４、及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは2つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、ヒドロキシC２−１０アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは2つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、ヒドロキシC２−１０アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表す。
【００１３】
構造式［Ｉ］で表されるより好ましいＢＢＧ誘導体においては、
Ｒ１はＣ１−６アルコキシ基、水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、ハロゲノＣ１−６アルコキシ基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｎは１から５のいずれか一つを表し、
Ｒ２及びＲ２´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｍ及びｍ´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ３、Ｒ３´及びＲ３´´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｐ、ｐ´及びｐ´´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ４、及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは2つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシC２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは2つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシC２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表す。
【００１４】
好ましいＢＢＧ誘導体を構造式［ＩＩ］に示す。
【化５】
2008522953.tif 000003
式中、
Ｒ１は水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｎは１から５のいずれか一つを表し、
Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ＝、−ＯＣ（＝Ｏ）−、あるいは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−を表す。
Ｒａは水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ２及びＲ２´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、ハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｍ及びｍ´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つをし、
Ｒ３、Ｒ３´及びＲ３´´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｐ、ｐ´及びｐ´´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、あるいはＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子、Ｃ１−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表す。
【００１５】
構造式［ＩＩ］において、
Ｒ１は水素原子、あるいはＣ１−６アルキル基を表し、
ｎは１から５のいずれか一つを表し、
Ｚは−Ｏ−を表し、
ＲａはＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ２及びＲ２´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、あるいはＣ１−６アルキル基を表し、
ｍ及びｍ´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
ｐ、ｐ´及びｐ´´は４を表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子、Ｃ１−６アルキル基を表すことが好ましい。
【００１６】
好ましいＢＢＧ誘導体を構造式［ＩＩＩ］に示す。
【化６】
2008522953.tif 000004
式中、
Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ＝、−ＯＣ（＝Ｏ）−、あるいは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−を表し、
Ｒａは水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、あるいはＣ１−６アルキル基を表す。
【００１７】
構造式［ＩＩＩ］においては、
Ｚは−Ｏ−を表し、
ＲａはＣ１−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基を表すことが好ましい。
【００１８】
構造式［ＩＩＩ］においては、
Ｚは−Ｏ−を表し、
ＲａはＣ１−３アルキル基を表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−３アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれＣ１−３アルキル基を表すことが好ましい。
【００１９】
さらに好ましいＢＢＧ誘導体、薬理学的に許容されるその塩あるいはその水和物は、ＢＢＧ色素である。
【００２０】
Ｃ１−１０アルキル基とは、１から１０個の炭素原子を持つ直鎖アルキル基、３から１０個の炭素原子を持つ分鎖アルキル基、あるいは３から１０個の炭素原子を持つ環状アルキル基を意味する。直鎖アルキル基の例はメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基を含む。分鎖アルキル基の例はイソプロピル基、イソブチル基、１−メチルプロピル基、ｔ−ブチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１−エチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、５−メチルヘキシル基、３−エチルペンチル基、１−プロピルブチル基、１，４−ジメチルペンチル基、３，４−ジメチルペンチル基、１，２，３−トリメチルブチル基、１−イソプロピルブチル基、４，４−ジメチルペンチル基、５−メチルペンチル基、６−メチルヘプチル基、４−エチルヘキシル基、２−プロピルペンチル基、２，５−ジメチルヘキシル基、４，５−ジメチルヘキシル基、2−エチル−３−メチルペンチル基、１，２，４−トリメチルペンチル基、２−メチル−１−イソプロピルブチル基、３−メチルオクチル基、２，５−ジメチルヘプチル基、１−（１−メチルプロピル）−２−メチルブチル基、１，４，５−トリメチルヘキシル基、１，２，３，４−テトラメチルペンチル基、７−メチルオクチル基、６−メチルノニル基、８−メチルノニル基、５−エチル−２−メチルヘプチル基、２，３−ジメチル−１−（１−メチルプロピル）ブチル基、シクロプロピルメチル基、２−（シクロプロピル）エチル基、３，７−ジメチルオクチル基、３−（シクロブチル）ペンチル基、シクロペンチルメチル基及びシクロヘキシルメチル基を含む。環状アルキル基の例はシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基及びシクロオクチル基を含む。Ｃ１−１０アルキル基においては、Ｃ１−６アルキル基が好ましく、Ｃ１−１３アルキル基がより好ましい。
【００２１】
Ｃ２−１０アルケニル基は２から１０個の炭素原子を有し、少なくとも１つの二重結合を有する直鎖アルケニル基、３から１０個の炭素原子を有する分鎖アルケニル基あるいは５から１０個の炭素原子を有する環状アルケニル基を意味する。この例としては、ビニル基、アリール基、３−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、６−ヘプテニル基、７−オクテニル基、８−ノネニル（ｎｏｎｅｙｌ）基、９−デセニル基、１−メチル−２−ブテニル基、２−メチル−２−ブテニル基、２−メチル−３−ブテニル基、２−ペンテニル基、２−メチル−２−ヘキセニル基、及び２−シクロペンテニル基を含む。Ｃ２−１０アルケニル基においては、Ｃ２−６アルケニル基が好ましく、Ｃ２−３アルケニル基がより好ましい。
【００２２】
Ｃ２−１０アルキニル基とは２から１０個の炭素原子を有し少なくとも１つの三重結合を有する直鎖アルキニル基あるいは４から１０個の炭素原子を有する分鎖アルキニル基を意味する。この例としては、２−プロピニル基、３−ブチニル基、４−ペンチニル基、５−ヘキシニル基、６−へプチニル基、７−オクチニル基、８−ノニニル基、９−デシニル基、３−ペンチニル基及び４−メチル−２−ペンチニル基を含む。Ｃ２−１０アルキニル基においては、Ｃ２−６アルキニル基が好ましく、Ｃ２−３アルキニル基がより好ましい。
【００２３】
１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基とは、例としてベンジル基、ジフェニルメチル基、２−フェニルエチル（ｐｈｅｎｙｅｔｈｙｌ）基、２−フェニルプロピル基、１−メチル−１−フェニルエチル（ｐｈｅｎｙｅｔｈｙｌ）基、１−メチル−２−フェニルペンチル基、２−ニトロベンジル基、３−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、２，４−ジニトロベンジル基、２，４，６−トリニトロベンジル基、２−フェニルベンジル基、３−フェニルベンジル基、４−フェニルベンジル基、２−ヒドロキシベンジル基、３−ヒドロキシベンジル基、４−ヒドロキシベンジル基、２−クロロベンジル基、３−クロロベンジル基、４−クロロベンジル基、２−フルオロベンジル基、３−フルオロベンジル基、４−フルオロベンジル基、２−ブロモベンジル基、３−ブロモベンジル基、４−ブロモベンジル基、２−ヨ−ドベンジル基、２，３−ジクロロベンジル基、２，４−ジクロロベンジル基、２，５−ジクロロベンジル基、２，６−ジクロロベンジル基、３，４−ジクロロベンジル基、３，５−ジクロロベンジル基、２−メチルベンジル基、３−メチルベンジル基、４−メチルベンジル基、２−エチルベンジル基、３−エチルベンジル基、４−エチルベンジル基、２−イソプロピルベンジル基、３−イソプロピルベンジル基、４−イソプロピルベンジル基、２−メトキシベンジル基、３−メトキシベンジル基、４−メトキシベンジル基、２，３−ジメトキシベンジル基、２，４−ジメトキシベンジル基、２，５−ジメトキシベンジル基、２，６−ジメトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、３，５−ジメトキシベンジル基、２−エトキシベンジル基、３−エトキシベンジル基、４−エトキシベンジル基、２−イソプロポキシベンジル基、３−イソプロポキシベンジル基、４−イソプロポキシベンジル基、２−メトキシメチルベンジル基、３−メトキシメチルベンジル基、４−メトキシメチルベンジル基、２−イソプロポキシメチルベンジル基、３−イソプロポキシメチルベンジル基、４−イソプロポキシメチルベンジル基、２−トリフルオロメチル基、３−トリフルオロメチル基、４−トリフルオロメチル基、２−ヒドロキカルボニルベンジル基、３−ヒドロキカルボニルベンジル基、４−ヒドロキカルボニルベンジル基、２−アミノベンジル基、３−アミノベンジル基、４−アミノベンジル基、２−アミノメチルベンジル基、３−アミノメチルベンジル基、４−アミノメチルベンジル基、２−シアノベンジル基、３−シアノベンジル基、４−シアノベンジル基、２−ヒドロキシメチルベンジル基、３−ヒドロキシメチルベンジル基、４−ヒドロキシメチルベンジル基、２−フェノキシベンジル基、３−フェノキシベンジル基、及び４−フェノキシベンジル基を含む。１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基におけるＣ１−１０アルキル基として、Ｃ１−６アルキル基が好ましく、Ｃ１−３アルキル基がさらに好ましい。
【００２４】
アリール基とは、フェニル基、置換されたフェニル基または１−ナフチル基あるいは２−ナフチル基のような多環芳香族を意味する。
【００２５】
ヒドロキシＣ２−１０アルキル基は少なくとも１つのヒドロキシ基で置換されたＣ２−１０アルキル基を意味する。この例としては、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基、７−ヒドロキシヘプチル基、８−ヒドロキシオクチル基、９−ヒドロキシノニル基、１０−ヒドロキシデシル基、２−ヒドロキシプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、及び２−ヒドロキシ−３−メチルブチル基を含む。ヒドロキシＣ２−１０アルキル基においては、ヒドロキシＣ２−６アルキル基が好ましく、ヒドロキシＣ２−３アルキル基がさらに好ましい。
【００２６】
ハロゲノＣ１−１０アルキル基とはフッ素原子、塩素原子、臭素原子あるいはヨウ素原子の少なくとも１つで置換されたＣ１−１０アルキル基を意味する。この例としては、２−クロロエチル基、２−ブロモエチル基、２−ヨ−ドエチル基、３−クロロプロピル基、３−ブロモプロピル基、３−ヨ−ドプロピル基、４−クロロブチル基、４−ブロモブチル基、４−ヨ−ドブチル基、５−クロロペンチル基、６−クロロヘキシル基、７−クロロヘプチル基、８−クロロオクチル基、９−クロロノニル基、１０−クロロデシル基、２−クロロプロピル基、２−クロロブチル基、２，４−ジクロロブチル基及び２−クロロ−３−メチルブチル基を含む。ハロゲノＣ１−１０アルキル基においては、ハロゲノＣ１−６アルキル基が好ましく、ハロゲノＣ１−１０アルキル基がさらに好ましい。
【００２７】
Ｃ１−１０アルコキシＣ１−１０アルキル基とは１から１０個の炭素原子を有し１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルコキシ基、３から１０個の炭素原子を有する分鎖アルコキシ基あるいは３から１０個の炭素原子を有する環状アルコキシ基で置換されたアルキル基を意味する。この例としては、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基、２−プロポキシエチル基、２−イソプロポキシエチル基、２−ブトキシエチル基、２−イソブトキシエチル基、２−ｔ−ブトキシエチル基、２−ペンチルオキシエチル基、２−ヘキセニルオキシブチル基、３−エトキシプロピル基。４−エトキシブチル基、４−エトキシ−３−メトキシブチル基及び４−エトキシ−３−メチルペンチル基を含む。Ｃ１−１０アルコキシＣ１−１０アルキル基においては、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基が好ましく、  Ｃ１−３アルコキシＣ１−３アルキル基がさらに好ましい。
【００２８】
ハロゲノＣ１−１０アルコキシ基とは少なくとも１つのフッ素原子、塩素原子、臭素原子あるいはヨウ素原子で置換されたＣ１−１０アルコキシ基を指す。ハロゲノＣ１−１０アルコキシ基においては、ハロゲノＣ１−６アルコキシ基が好ましく、ハロゲノＣ１−３アルコキシ基がさらに好ましい。
【００２９】
本発明のＢＢＧ誘導体の好ましい立体構造は絶対構造を有する光学活性体であるが、本発明のＢＢＧ誘導体はエナンチオマ−あるいはラセミ体のようなエナンチオマ−混合物として存在しうる。そのため、本発明のＢＢＧ誘導体は、構造式Ｉに示したＢＢＧ誘導体の光学活性体、ラセミ体のようなエナンチオマ−混合物、ジアステレオマ−混合物のすべてを含む。
【００３０】
薬理学的に許容される塩の例は、無機塩基、アンモニア、有機塩基、無機酸、有機酸、塩基性アミノ酸、ハロゲンイオン等から成る塩、及び分子内塩を含む。無機塩基の例はアルカリ金属（Ｎａ，Ｋ等）及びアルカリ土類金属（Ｃａ，Ｍｇ等）を含む。有機塩基の例はトリメチルアミン、トリエチルアミン、コリン、プロカイン、エタノールアミン等を含む。無機酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、及びリン酸等を含む。有機酸の例はｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸及びマレイン酸等を含む。塩基性アミノ酸の例にはリジン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン等を含む。化合物は薬理学的に許容される水和物であってもよい。
【００３１】
本発明の好ましい態様の一つによれば、前記染色組成物は黄斑円孔、高度近視性（ｈｙｍｙｏｐｉｃ）黄斑円孔による網膜剥離、網膜上膜、増殖性糖尿病網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性硝子体網膜症、及び過熟白内障、及び先天性白内障等の特異的白内障、及び分層角膜移植等の硝子体網膜疾患等の眼疾患における外科手術の外科的アジュバントとして用いることができる。本発明の染色組成物により、識別しがたい眼膜をより明確に確認することが可能となり、外科手術における安全性を向上させることができる。
【００３２】
本発明のより好ましい態様においては、前記染色組成物は眼膜及び、より好ましくは、内境界膜及び／あるいは前嚢の染色に利用される。
【００３３】
本発明の好ましい態様の一つにおいては、本発明の染色組成物はＢＢＧ誘導体を０．１−１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１−１．０ｍｇ／ｍｌの濃度、最も好ましくは０．１−０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で含有することが望ましい。この態様においては、低濃度及び少量で高い染色親和性を持つ染色組成物を提供する。
【００３４】
さらに、本発明の染色組成物の態様の一つによれば、浸透圧が２９８ｍＯｓｍ近傍であることが好ましい。この態様によれば、本発明の染色組成物は生理食塩水に等しい浸透圧である。このように、浸透圧の違いにより起こる問題は解消される。
【００３５】
本発明の好ましい態様の一つにおいては、本発明の染色組成物は中性のｐＨ、すなわち、ｐＨ＝７．４近傍のｐＨを示すことが望ましい。
【００３６】
本発明の第二の主要な側面によれば、眼膜を染色及び除去する方法が提供される。この方法はＢＢＧ誘導体を主要成分とする染色組成物を調整するステップと予め規定された濃度の先述の染色組成物を用いて眼膜を染色するステップ及び染色された眼膜を除去するステップから構成される。
【００３７】
本発明の好ましい態様の一つにおいて、眼膜とは内境界膜及び／あるいは前嚢であるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００３８】
本発明の第三の主要な側面によれば、眼膜疾患の治療のための染色組成物の製造におけるＢＢＧ誘導体の利用法が提供される。
【００３９】
更に、本発明の第四の主要な側面によれば、眼科手術のための外科的なアジュバントとしてＢＢＧ誘導体の利用法が提供される。
【００４０】
ここに提供された材料、方法及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図していない。発明のその他の特徴及び利点は後述の詳細な叙述及び請求項から明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
先述の通り、評価は従来用いられてきたＩＣＧあるいはＴＢといった色素の代替品となる眼膜染色のための色素を提供することに重点を置いた。従って、以下に記述するように、多くの特性を兼備し、高い染色親和性と高い安全性を持った染色組成物が達成された。
【００４２】
本発明の一つの側面は眼膜除去を行う際の眼膜染色のための染色組成物についてのものであり、染色組成物はブリリアントブルーＧ（ＢＢＧ）誘導体、薬理学的に許容されるその塩あるいは水和物を主要成分として構成される。
【００４３】
好ましいＢＢＧ誘導体を構造式［Ｉ］に示す。
【化７】
2008522953.tif 000005
式中、Ｒ１はＣ１−１０アルコキル基、水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、ヒドロキシＣ２−１０アルキル基、ハロゲノＣ１−１０アルコキシ基あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表し、
ｎは１から５のいずれか一つを表し、
Ｒ２及びＲ２´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−１０アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表し、
ｍ及びｍは、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ３、Ｒ３´及びＲ３´´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−１０アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表し、
ｐ、ｐ´及びｐ´´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ４、及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは2つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−１０アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、１つあるいは2つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−１０アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−１０アルキル基を表す。
【００４４】
構造式［Ｉ］で表されるより好ましいＢＢＧ誘導体においては、
Ｒ１はＣ１−６アルコキシ基、水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、ハロゲノＣ１−６アルコキシ基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｎは１から５のいずれか一つを表し、
Ｒ２及びＲ２´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基をし、
ｍ及びｍ´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ３、Ｒ３´及びＲ３´´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｐ、ｐ´及びｐ´´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ４、及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは2つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１つあるいは2つのアリール基で置換されたＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表す。
【００４５】
好ましいＢＢＧ誘導体を構造式［ＩＩ］に示す。
【化８】
2008522953.tif 000006
式中、
Ｒ１は水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｎは１から５のいずれか一つを表し、
Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ＝、−ＯＣ（＝Ｏ）−、あるいは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−を表す。
Ｒａは水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ２及びＲ２´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｍ及びｍ´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
Ｒ３、Ｒ３´及びＲ３´´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
ｐ、ｐ´及びｐ´´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表す。
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、あるいはＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子、Ｃ１−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表す。
【００４６】
構造式［ＩＩ］において、
Ｒ１は水素原子、あるいはＣ１−６アルキル基を表し、
ｎは１から５のいずれか一つを表し、
Ｚは−Ｏ−を表し、
ＲａはＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ２及びＲ２´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、あるいはＣ１−６アルキル基を表し、
ｍ及びｍ´は、同一または異なり、それぞれ１から４のいずれか一つを表し、
ｐ、ｐ´及びｐ´´は４を表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ５は水素原子、Ｃ１−６アルキル基を表すことが好ましい。
【００４７】
好ましいＢＢＧ誘導体を構造式［ＩＩＩ］に示す。
【化９】
2008522953.tif 000007
式中、
Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ＝、−ＯＣ（＝Ｏ）−、あるいは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−を表し、
Ｒａは水素原子、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシＣ２−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれ水素原子、あるいはＣ１−６アルキル基を表す。
【００４８】
構造式［ＩＩＩ］においては、
Ｚは−Ｏ−を表し、
ＲａはＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基、あるいはハロゲノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれＣ１−６アルキル基を表すことが好ましい。
【００４９】
構造式［ＩＩＩ］においては、
Ｚは−Ｏ−を表し、
ＲａはＣ１−３アルキル基を表し、
Ｒｂ及びＲｃは、同一または異なり、それぞれＣ１−３アルキル基を表し、
Ｒ４及びＲ４´は、同一または異なり、それぞれＣ１−３アルキル基を表すことが好ましい。
【００５０】
さらに好ましいＢＢＧ誘導体、薬理学的に許容されるその塩あるいはその水和物は、ＢＢＧ色素である。
【００５１】
Ｃ１−１０アルキル基とは、１から１０個の炭素原子を持つ直鎖アルキル基、３から１０個の炭素原子を持つ分鎖アルキル基、あるいは３から１０個の炭素原子を持つ環状アルキル基を意味する。直鎖アルキル基の例はメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基を含む。分鎖アルキル基の例はイソプロピル基、イソブチル基、１−メチルプロピル基、ｔ−ブチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１−エチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、５−メチルヘキシル基、３−エチルペンチル基、１−プロピルブチル基、１，４−ジメチルペンチル基、３，４−ジメチルペンチル基、１，２，３−トリメチルブチル基、１−イソプロピルブチル基、４，４−ジメチルペンチル基、５−メチルペンチル基、６−メチルヘプチル基、４−エチルヘキシル基、２−プロピルペンチル基、２，５−ジメチルヘキシル基、４，５−ジメチルヘキシル基、2−エチル−３−メチルペンチル基、１，２，４−トリメチルペンチル基、２−メチル−１−イソプロピルブチル基、３−メチルオクチル基、２，５−ジメチルヘプチル基、１−（１−メチルプロピル）−２−メチルブチル基、１，４，５−トリメチルヘキシル基、１，２，３，４−テトラメチルペンチル基、７−メチルオクチル基、６−メチルノニル基、８−メチルノニル基、５−エチル−２−メチルヘプチル基、２，３−ジメチル−１−（１−メチルプロピル）ブチル基、シクロプロピルメチル基、２−（シクロプロピル）エチル基、３，７−ジメチルオクチル基、３−（シクロブチル）ペンチル基、シクロペンチルメチル基及びシクロヘキシルメチル基を含む。環状アルキル基の例はシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基及びシクロオクチル基を含む。Ｃ１−０アルキル基においては、Ｃ１−６アルキル基が好ましく、Ｃ１−１３アルキル基がより好ましい。
【００５２】
Ｃ２−１０アルケニル基は２から１０個の炭素原子を有し、少なくとも１つの二重結合を有する直鎖アルケニル基、３から１０個の炭素原子を有する分鎖アルケニル基あるいは５から１０個の炭素原子を有する環状アルケニル基を意味する。この例としては、ビニル基、アリール基、３−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、６−ヘプテニル基、７−オクテニル基、８−ノネニル（ｎｏｎｅｙｌ）基、９−デセニル基、１−メチル−２−ブテニル基、２−メチル−２−ブテニル基、２−メチル−３−ブテニル基、２−ペンテニル基、２−メチル−２−ヘキセニル基、及び２−シクロペンテニル基を含む。Ｃ２−１０アルケニル基においては、Ｃ２−６アルケニル基が好ましく、Ｃ２−３アルケニル基がより好ましい。
【００５３】
Ｃ２−１０アルキニル基とは２から１０個の炭素原子を有し少なくとも１つの三重結合を有する直鎖アルキニル基あるいは４から１０個の炭素原子を有する分鎖アルキニル基を意味する。この例としては、２−プロピニル基、３−ブチニル基、４−ペンチニル基、５−ヘキシニル基、６−へプチニル基、７−オクチニル基、８−ノニニル基、９−デシニル基、３−ペンチニル基及び４−メチル−２−ペンチニル基を含む。Ｃ２−１０アルキニル基においては、Ｃ２−６アルキニル基が好ましく、Ｃ２−３アルキニル基がより好ましい。
【００５４】
１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基とは、例としてベンジル基、ジフェニルメチル基、２−フェニルエチル（ｐｈｅｎｙｅｔｈｙｌ）基、２−フェニルプロピル基、１−メチル−１−フェニルエチル（ｐｈｅｎｙｅｔｈｙｌ）基、１−メチル−２−フェニルペンチル基、２−ニトロベンジル基、３−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、２，４−ジニトロベンジル基、２，４，６−トリニトロベンジル基、２−フェニルベンジル基、３−フェニルベンジル基、４−フェニルベンジル基、２−ヒドロキシベンジル基、３−ヒドロキシベンジル基、４−ヒドロキシベンジル基、２−クロロベンジル基、３−クロロベンジル基、４−クロロベンジル基、２−フルオロベンジル基、３−フルオロベンジル基、４−フルオロベンジル基、２−ブロモベンジル基、３−ブロモベンジル基、４−ブロモベンジル基、２−ヨ−ドベンジル基、２，３−ジクロロベンジル基、２，４−ジクロロベンジル基、２，５−ジクロロベンジル基、２，６−ジクロロベンジル基、３，４−ジクロロベンジル基、３，５−ジクロロベンジル基、２−メチルベンジル基、３−メチルベンジル基、４−メチルベンジル基、２−エチルベンジル基、３−エチルベンジル基、４−エチルベンジル基、２−イソプロピルベンジル基、３−イソプロピルベンジル基、４−イソプロピルベンジル基、２−メトキシベンジル基、３−メトキシベンジル基、４−メトキシベンジル基、２，３−ジメトキシベンジル基、２，４−ジメトキシベンジル基、２，５−ジメトキシベンジル基、２，６−ジメトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、３，５−ジメトキシベンジル基、２−エトキシベンジル基、３−エトキシベンジル基、４−エトキシベンジル基、２−イソプロポキシベンジル基、３−イソプロポキシベンジル基、４−イソプロポキシベンジル基、２−メトキシメチルベンジル基、３−メトキシメチルベンジル基、４−メトキシメチルベンジル基、２−イソプロポキシメチルベンジル基、３−イソプロポキシメチルベンジル基、４−イソプロポキシメチルベンジル基、２−トリフルオロメチル基、３−トリフルオロメチル基、４−トリフルオロメチル基、２−ヒドロキカルボニルベンジル基、３−ヒドロキカルボニルベンジル基、４−ヒドロキカルボニルベンジル基、２−アミノベンジル基、３−アミノベンジル基、４−アミノベンジル基、２−アミノメチルベンジル基、３−アミノメチルベンジル基、４−アミノメチルベンジル基、２−シアノベンジル基、３−シアノベンジル基、４−シアノベンジル基、２−ヒドロキシメチルベンジル基、３−ヒドロキシメチルベンジル基、４−ヒドロキシメチルベンジル基、２−フェノキシベンジル基、３−フェノキシベンジル基、及び４−フェノキシベンジル基を含む。１つあるいは２つのアリール基で置換されたＣ１−１０アルキル基におけるＣ１−１０アルキル基として、Ｃ１−６アルキル基が好ましく、Ｃ１−３アルキル基がさらに好ましい。
【００５５】
アリール基とは、フェニル基、置換されたフェニル基または１−ナフチル基あるいは2−ナフチル基のような多環芳香族を意味する。
【００５６】
ヒドロキシＣ２−１０アルキル基は少なくとも１つのヒドロキシ基で置換されたＣ２−１０アルキル基を意味する。この例としては、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基、７−ヒドロキシヘプチル基、８−ヒドロキシオクチル基、９−ヒドロキシノニル基、１０−ヒドロキシデシル基、２−ヒドロキシプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、及び２−ヒドロキシ−３−メチルブチル基を含む。ヒドロキシＣ２−１０アルキル基においては、ヒドロキシＣ２−６アルキル基が好ましく、ヒドロキシＣ２−３アルキル基がさらに好ましい。
【００５７】
ハロゲノＣ１−１０アルキル基とはフッ素原子、塩素原子、臭素原子あるいはヨウ素原子の少なくとも１つで置換されたＣ１−１０アルキル基を意味する。この例としては、２−クロロエチル基、２−ブロモエチル基、２−ヨ−ドエチル基、３−クロロプロピル基、３−ブロモプロピル基、３−ヨ−ドプロピル基、４−クロロブチル基、４−ブロモブチル基、４−ヨ−ドブチル基、５−クロロペンチル基、６−クロロヘキシル基、７−クロロヘプチル基、８−クロロオクチル基、９−クロロノニル基、１０−クロロデシル基、２−クロロプロピル基、２−クロロブチル基、２，４−ジクロロブチル基及び２−クロロ−３−メチルブチル基を含む。ハロゲノＣ１−１０アルキル基においては、ハロゲノＣ１−６アルキル基が好ましく、ハロゲノＣ１−１０アルキル基がさらに好ましい。
【００５８】
Ｃ１−１０アルコキシＣ１−１０アルキル基とは１から１０個の炭素原子を有し１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルコキシ基、３から１０個の炭素原子を有する分鎖アルコキシ基あるいは３から１０個の炭素原子を有する環状アルコキシ基で置換されたアルキル基を意味する。この例としては、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基、２−プロポキシエチル基、２−イソプロポキシエチル基、２−ブトキシエチル基、２−イソブトキシエチル基、２−ｔ−ブトキシエチル基、２−ペンチルオキシエチル基、２−ヘキセニルオキシブチル基、３−エトキシプロピル基。４−エトキシブチル基、４−エトキシ−３−メトキシブチル基及び４−エトキシ−３−メチルペンチル基を含む。Ｃ１−１０アルコキシＣ１−１０アルキル基においては、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基が好ましく、Ｃ１−３アルコキシＣ１−３アルキル基がさらに好ましい。
【００５９】
ハロゲノＣ１−１０アルコキシ基とは少なくとも１つのフッ素原子、塩素原子、臭素原子あるいはヨウ素原子で置換されたＣ１−０アルコキシ基を指す。ハロゲノＣ１−１０アルコキシ基においては、ハロゲノＣ１−６アルコキシ基が好ましく、ハロゲノＣ１−３アルコキシ基がさらに好ましい。
【００６０】
本発明の好ましいＢＢＧ誘導体の立体構造は絶対構造をもつ光学活性体であるが、本発明のＢＢＧ誘導体はエナンチオマ−あるいはラセミ体のようなエナンチオマ−混合物として存在する。それゆえ、本発明のＢＢＧ誘導体は先述の構造式［Ｉ］で表されるＢＢＧ誘導体のすべての光学活性体、ラセミ体のようなエナンチオマ−混合物及びジアステレオマ−混合物を含む。
【００６１】
薬理学的に許容される塩の例は、無機塩基、アンモニア、有機塩基、無機酸、有機酸、塩基性有機酸、ハロゲンイオン等から成る塩、及び分子内塩を含む。無機塩基の例はアルカリ金属（Ｎａ、Ｋ等）及びアルカリ土類金属（Ｃａ、Ｍｇ等）を含む。有機塩基の例はトリメチルアミン、トリエチルアミン、コリン、プロカイン、エタノールアミン等を含む。無機酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、及びリン酸等を含む。有機酸の例はｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、トリフルオロ酢酸及びマレイン酸等を含む。塩基性アミノ酸の例はリジン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン等を含む。化合物は薬学的に許容される水和物であってもよい。
【００６２】
本発明のＢＢＧ誘導体、薬理学的に許容されるその塩あるいはその水和物、特にＢＢＧは購入及び有機化学の一般的知識に基づき製造することができる。更に、これらは米国特許第６，０５７，１６０号の明細に開示される方法によって製造することができ、この文献は参照することにより本書の一部に含まれる。
【００６３】
本発明の一つの態様を、実施例及び図面を用いて以下に説明する。
【００６４】
始めに、現在生物に用いられていない色素も含め、すべての色素を用い、候補色素のスクリーニングを行った。スクリーニングされた色素はエバンスブルー、アシッドブルー９、ファストグリーン、ブリリアントブルーＦＣＦ、インディゴ−カーミン、メチルブルー、メチレンブルー、ブリリアントブルーＧ（ＢＢＧ）である。スクリーニング条件は特に染色親和性及び安全性に重点を置いた。有力候補のうち、安全性に優位性を示すが標的物を染色できないもの、逆に、よく染色できるが網膜に毒性を示すものは候補から除外した。絞り込まれた候補に対する安全性の評価はラットを用いて行い、より良い染色親和性及び安全性に基づき、ＢＢＧが最終候補として選ばれた。以下にＢＢＧが本発明の最終候補となった理由を詳細に記述する。
【００６５】
始めに、ＢＢＧ染色の質はＩＣＧと比較して非常に類似しており、さらに標的物を非常に低濃度で染色することが可能である（１／１０−１／２０）。眼球内に残留する非常に高濃度の溶液の検査においても、眼球に対する明らかな毒性に関する見解は立証できなかった。加えて、ＢＢＧは（ＩＣＧと異なり）蛍光色素ではないため、強い光源による眼球内照明によって起こると考えられている網膜に対する光毒性もほとんど無いと考えられる。更に、洗浄後に組織表面に残る色素もＩＣＧと比較して非常に少なかった。また、ＢＢＧは寒色系の色素であり、眼球内組織は暖色系であるため、色素のコントラストが強調できる。
【００６６】
次に、様々な実験を行い、眼膜染色のためのＢＢＧを含む染色組成物の最適な条件を評価した。更に、ＢＢＧは今まで臨床的に、特にヒトに関しては用いられたことがない。しかしながら、本発明に最適な条件においては、臨床目的の利用に安全かつ高い染色親和性を持った組成物を提供することができる。
【００６７】
それゆえ、本発明の第一の主要な側面によれば、ＢＢＧ誘導体を主要成分として含む染色組成物が、眼膜除去の際の眼膜染色用に提供される。
【００６８】
本発明の好ましい態様の一つによれば、前記染色組成物は例として、黄斑円孔、高度近視性（ｈｙｍｙｏｐｉｃ）黄斑円孔による網膜剥離、網膜上膜、増殖性の糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性硝子体網膜症、過熟白内障及び先天性白内障のように特異的な白内障といった硝子体網膜疾患、及び分層角膜移植等、眼球の疾患の眼科手術において外科的アジュバントとして利用できる。本発明の染色組成物に従えば、識別し難い眼膜をより明確に確認し、外科手術中の安全性を向上させることが可能となる。
【００６９】
本発明のより好ましい態様においては、前記染色組成物は眼膜及び、より好ましくは、内境界膜及び／あるいは前嚢の染色に用いることができる。
【００７０】
また、本発明の態様の一つによれば、本発明の染色組成物は薬理学的に許容される担体と組み合わせて用いることができる。溶解液及び薬品粉末との一式として、あるいは注射器中に満たされた溶液の形として、及びヒアルロン酸と組み合わせてゲル状溶液として調合できる。最も好ましくは、溶液として調合されるが、必ずしもこれに限定されない。
【００７１】
本発明の態様の一つによれば、前記染色組成物は薬学的に許容される溶液として調合されるが、必ずしもこれに限定されない。これはＢＢＧの直接かつ容易に眼内洗浄液に溶解され、またシリンジフィルターによって滅菌できるという特性による。
【００７２】
更に、本発明の態様の一つによれば、前記染色組成物は眼内灌流液、平衡塩類溶液（ＢＳＳ）、生理食塩水、あるいは最も好ましくは、眼内灌流液（眼内洗浄液）であるＯＰＥＧＵＡＲＤ−ＭＡ（千寿製薬株式会社、大阪府、日本）に溶解した溶液として調合できる。しかしながら、必ずしもこの形式に限定されない。
【００７３】
本発明の態様の一つにおいては、染色組成物はＢＢＧ誘導体を０．１−１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１−１．０ｍｇ／ｍｌの濃度、最も好ましくは０．１−０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で含有することが望ましい。本発明の実施例の一つにおいては、前記染色組成物では、霊長類のＩＬＭを染色するために必要とされるＢＢＧ濃度はＩＣＧと比較して１／１０である。さらに、前嚢を染色するためには、ＩＣＧでは５ｍｇ／ｍｌ、ＴＢでは１ｍｇ／ｍｌの濃度が必要であるのに対し、前記染色組成物中のＢＢＧは０．２５ｍｇ／ｍｌの低濃度で充分な染色が可能である。言い換えれば、この態様により、低濃度かつ低容量で高い染色親和性を持つ染色組成物が提供される。
【００７４】
更に、本発明の染色組成物の態様の一つによれば、浸透圧が２９８ｍＯｓｍ近傍であることが好ましい。この態様によれば、本発明の染色組成物は生理食塩水に等しい浸透圧である。以前ＩＣＧによる網膜色素上皮の障害はその溶液の低浸透圧性に由来する可能性があることが報告されていた。これに関連して、本発明の一つの態様における染色組成物は、網膜色素上皮において浸透圧の差により起こる障害といった、細胞膨張あるいは脱水症状に関する組織障害（細胞脱落あるいは細胞死等）を引き起こさないという点において、優れた効果を有する。
【００７５】
本発明の好ましい態様の一つにおいては、本発明の染色組成物は中性のｐＨ、すなわち、ｐＨ＝７．４近傍のｐＨを示すことが望ましい。
【００７６】
本発明の第二の主要な側面によれば、眼膜を染色及び除去する方法が提供される。この方法はＢＢＧ誘導体を主要成分とする染色組成物を調整するステップと予め規定された濃度の先述の染色組成物を用いて眼膜を染色するステップ及び染色された眼膜を除去するステップから構成される。
【００７７】
本発明の態様の一つに対し、前記眼膜染色法は、当該技術、例として、注射、輸液、洗浄、確認、除去といった技術に熟達した者容易に理解される方法を用いることができる。本発明の実施例の一つとして、前記眼膜染色法に前記染色組成物が含まれることが好ましい。この実施例では、ＴＢを眼膜に投与する際必要とされる液−ガス置換等の付加的なステップを必要としない。例として、眼科手術中に利用する際に容易に染色することが可能である。
【００７８】
本発明の第三の主要な側面によれば、眼科疾患の治療のための染色組成物の製造におけるＢＢＧ誘導体の利用法が提供される。
【００７９】
加えて、本発明の第四の主要な側面によれば、眼科手術のための外科的アジュバントとしてＢＢＧ誘導体の利用法が提供される。
【００８０】
更に、本発明の態様の一つにおいて、前記染色組成物及び／あるいはそれを利用する染色法は眼科手術の一部として適切に用いられる。本発明の好ましい態様により、先述の眼科疾患手術は黄斑円孔、近視性黄斑円孔による網膜剥離、網膜上膜、増殖性糖尿病網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性硝子体網膜症、成熟白内障及び先天性白内障等の特異的白内障、及び分層角膜移植等の治療に行われる外科手術であり、最も好ましくは、硝子体−網膜疾患（特に黄斑円孔及び網膜上膜（ＥＲＭＳ））及び白内障に対して行われるものである。
【００８１】
更に、本発明の好ましい態様の一つとして、前記眼科手術は哺乳類の眼球に対して施行され、より好ましくは、ヒトの眼球に対して施行される。
【００８２】
後述の実施例は本発明をより詳細に記述するために提供される。これらは本発明を例証することを意図するものであって、制限するものではない。
【実施例１】
【００８３】
安全性と膜染色能に重点をおいた様々な候補色素のスクリーニング
目的を達成する染色組成物を提供するため、現在生物に使用されていない色素も含め、すべての色素を使用し、候補色素を選別した。選別された色素はエバンスブルー、アシッドブルー９、ファストグリーン、ブリリアントブルーＦＣＦ、インディゴカーミン、メチルブルー、メチレンブルー、ブリリアントブルーＧ（ＢＢＧ）である。加えて、スクリーニングの条件として、安全性及び染色親和性に特に注目した。
【００８４】
いくつかの有力な候補のうち、安全面では優れているが標的物を染色できないもの、あるいは反対によい染色親和性を示すが網膜に対し有毒なものは候補から除外した。
【００８５】
次に、絞り込まれた候補の安全性評価をラットを用いて行った。より高い染色親和性と安全性に基づき、ＢＢＧが最終候補となった。
【００８６】
次に、ＢＢＧを含有する染色組成物の最適条件を検討する目的で、様々な実験を行った。このようにして本発明の染色組成物が得られた。
【実施例２】
【００８７】
２．  網膜に対する硝子体内のＢＢＧの効果
すべての手順は眼科と視覚に関する研究会議（ＡＲＶＯ）の眼科と視覚研究における動物の使用に関する声明に準拠し、日本、福岡、九州大学の動物保護ガイドラインに従った。
【００８８】
２．１  ＢＢＧ溶液の特性
ＢＢＧは、アシッドブルー９０あるいはクーマシーブリリアントブルーＧとしても知られている。我々の以前の報告を除いては、ＢＢＧの眼科利用に対する毒性を検証する報告は存在しない。表１は異なる濃度におけるＢＢＧ溶液の浸透性及びｐＨを示す。ＢＢＧ溶液の浸透性及びｐＨは眼内灌流液と同様であることが判明した。
【００８９】
【表１】
2008522953.tif 000008
コントロールはＯＰＥＧＵＡＲＤ（登録商標）−ＭＡである。
【００９０】
２．２．  ラット眼球におけるＢＢＧ硝子体内投与の外科的手順
ブラウンノルウェイラット（標本数＝７８オス、８週齢、九動株式会社、福岡県、日本）を投与量７５ｍｇ／ｋｇ体重の塩酸ケタミン腹腔内投与によって麻酔した。各個体（各投与量群につき合計標本数＝６）から１つの眼球に対し、先述の通り０．０５ｍｌの純粋ＳＦ６ガスを用いて硝子体切除を行った。ガス投与に続き、０．０５ｍｌのＢＢＧ溶液を外科手術中拡大するために顕微鏡を用いて硝子体を切除した各眼球の硝子体腔に投与した。ＢＢＧ溶液（ブリリアントブルーＧ、クーマシー（登録商標）、ブリリアントブルーＧ２５０；Ｓｉｇｎａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス、アメリカ合衆国）は眼内灌流液（ＯＰＥＧＵＡＲＤ（登録商標）−ＭＡ、千寿製薬株式会社、大阪府、日本）中に希釈し、０．０１、０．１、１．０、及び１０ｍｇ／ｍｌの濃度で調整し、０．２２μｍシリンジフィルターで滅菌した。平均の浸透性は浸透圧計（ＯＳＭＯ  ＳＴＡＴＩＯＮ、アークレイ株式会社、京都府、日本）を用いて測定し各溶液のｐＨは調整したすべての濃度について測定した（表１）。ラットに対し安全でさらによく染色されるＢＢＧの投与量を提供するため、最終濃度は人間の硝子体切除手術に用いられるＩＣＧ溶液（２．５−５．０ｍｇ／ｍｌ）に従って決定した。擬似手術を施した２４個の眼球（ＳＦ６投与後０．０５ｍｌ眼内灌流液を投与）をコントロ−ルとして用いた。
【００９１】
２．３．光学顕微鏡法
眼球を摘出し、１０％パラホルムアルデヒド中で固定する操作を手術後１４日目（標本数３０；投与群及びコントロ−ル群について６）及び２ヶ月目において（標本数：３０；投与群及びコントロ−ル群について６）行った。眼球全体を大体垂直子午線に沿って切断した。パラフィンに包埋した切片はヘマトキシン−エオジン（ＨＥ）にて染色し、各切片を、光学顕微鏡を用いて観察した。
【００９２】
ＢＢＧを硝子体中に投与した後、角膜浮腫、深刻な網膜浮腫、あるいは眼内炎等ＢＢＧによる毒性は外科的な顕微鏡検査では２ヶ月以上の期間にわたって観察されなかった。眼球は手術後１４日目及び２ヶ月目に摘出された。最も高い量のＢＢＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）が投与された眼球を術後１４日目及び２ヶ月目に観察したところ、通常の網膜構造が維持されていた。加えて、炎症細胞の浸潤は観察されなかった（図１、１４日目）。網膜の正常な構造はよりＢＢＧ投与量の低い群においても維持されており、術後１４日目あるいは２ヵ月後の切片において細胞変性は観察されなかった。
【００９３】
２．４．透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
眼球を手術後１４日目及び２ヶ月目に摘出し、リン酸緩衝食塩水中１％グルタルアルデヒド及び１％パラホルムアルデヒドにて固定した。試料はベロナ−ル酢酸緩衝溶液四酸化オスミウム（２％）にて後固定後、エタノール及び水で脱水処理し、エポン包埋した。超薄切片をブロックから切り出し、銅格子上に乗せた。試料をＪＥＭ  １００ＣＸ電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ）にて観察した。
【００９４】
最もＢＢＧの投与量が高かった（１０ｍｇ／ｍｌ）試料では、１４日目においても（図２Ａ、１４日目）２ヶ月目においてもガングリオン細胞及びミューラー細胞の神経線維の突起に空胞化が見られた。同様の変化は１ｍｇ／ｍｌのＢＢＧを投与した群においても認められたが、空胞化の度合いは１０ｍｇ／ｍｌを投与した群と比較して低かった（図２Ｂ）。空胞化はよりＢＢＧ投与量がより低い群あるいはコントロ−ルにおいては観察されなかった。すべての群において、内顆粒層、外核層及び網膜色素上皮細胞層を含め網膜に顕著な変化は認められなかった。
【００９５】
２．５．  ＴｄＴ−ｄＵＴＰ末端ニック−エンド標識（ＴＵＮＥＬ）
アポトーシスによる細胞死を、先述のとおりＴｄＴ−ｄＵＴＰタ−ミナルニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）法を用いて検出した。４％パラホルムアルデヒドにて固定し、パラフィン中に包埋した試料からクライオスタットを用いて４μｍの切片を作製した。ＴＵＮＥＬ染色はＡｐｏｐＴａｇ（登録商標）蛍光ダイレクト  ｉｎ  ｓｉｔｕ  アポトーシス検出キット（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク、アメリカ合衆国）を用いて製造業者のプロトコルに従って行った。切片をヨウ化プロピジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ユージーン、オレゴン州、アメリカ合衆国）と共染色し、蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社、東京都）による細胞核の観察ができるようにした。各眼球より無作為に１０枚の切片を選択し、顕微鏡観察した。
【００９６】
もっともＢＢＧ投与量の高かった群（１０ｍｇ／ｍｌ）においては、１０枚の切片のうちアポトーシスによる細胞死が一例観察された。しかしながら、アポトーシスによる細胞死の比率はコントロ−ル切片で観察されたものと比較して優位な差はなかった（図３、１４日目）。よりＢＢＧ投与量の低い群においては、１４日目の網膜中ＴＵＮＥＬ染色で染まったものは観察されなかった。さらに、あらゆるＢＢＧ投与量の群において２ヶ月後の段階でアポトーシスによる細胞死をしている網膜細胞はなかった。
【００９７】
２−６．  電子網膜写真
ガス投与に続き、０．０５ｍｌのＢＢＧ溶液（１ｍｇ／ｍｌ及び１０ｍｇ／ｍｌ）あるいは眼内灌流液を硝子体腔に投与した。各投与群及び６つのコントロールには６匹のラットを用いた。測定を行う前にすべてのラットについて、白内障が存在しないことを確認した。１４日後の時点、及び２ヵ月後の時点において、ラットを一晩赤色の弱い照明のみの暗室下に置き、ケタミン(１ｍｇ／ｍｌ)、キシラジン（０．４ｍｇ／ｍｌ）、及び（４０ｍｇ／ｍｌ）を含有する生理食塩水を体重１ｇにつき１５μｌ腹膜内投与して麻酔した。その後網膜写真（ＥＲＧ）を先述のとおり行った。瞳孔を２．５%フェニルエフリンＨＣｌ及び１%トロピカミド滴下によって拡張し、ＥＲＧ記録の前に最大に拡張させた。角膜は１％塩酸プロパラカイン滴下によって麻酔し、実験期間中ラットを加温パッド上に置いた。１％メチルセルロースでコートされたワイヤー電極を角膜上に配置し、ＥＲＧを記録した。同様のワイヤー電極を比較電極として口の中に配置し、一方で尾部に挿入した電極針を接地した。応答は差動的に増幅され（０．８から１，２００Ｈｚ）、平均化され、コンピュ−タ−によって記録された。ホワイト（キセノン）ストロボフラッシュを、Ｇｒａｎｚｆｅｌｄ刺激装置（ＶＰＡ−１０；Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｋｅｎｎｅｗｉｃｋ，ワシントン、アメリカ合衆国）から無彩色の順応領域に向かって照射した。初めに両方の強度における応答の安定性を確認する目的で暗順応した(桿体細胞を介して)ＥＲＧを記録した。各ラットを、安定したレベルの応答を達成するのに充分な期間である２０分間、暗い背景輝度に順応させた。その後、暗順応したａ（桿体細胞を介して）及び暗順応したｂ（両極細胞及びミュ−ラ−細胞を介して）のＥＲＧをフラッシュ輝度１．３０ｌｏｇ  ｃｄ  ｓｅｃ／ｍ２にて反応させた。刺激間隔を１分間として５回連続したストロボフラッシュに対する応答を平均化し暗順応反応を測定した。その後ラットを白色光の明順応条件下（１．５０ｌｏｇ  ｃｄ／ｍ２）に少なくとも２５分間置き、明順応したｂ（錐体細胞を介した）ＥＲＧをフラッシュ輝度１．３０ｌｏｇ  ｃｄ  ｓｅｃ／ｍ２(ラットにおける桿体細胞の脱感作条件)の条件で反応させた。２Ｈｚで５０回連続したフラッシュに対する応答を平均化した。ＥＲＧの大きさはスチュ−デントのｔ検定によって評価し、ｐ値０．０５未満のものを統計的に有意とした。
【００９８】
図４Ａは、術後１４日目においてコントロ−ル群及び高濃度投与群の暗及び明順応した応答ＥＲＧ波形を示す。実験の初めにおいて得られた暗順応の大きさは、グル−プ間でばらつきが少なかった。１４日目に平均の暗順応したａ波の最大振幅が投与量に依存性を示す形で高濃度投与群でわずかに減少することが観察された（図４Ｂ、１４日目）が、コントロ−ル群（１０ｍｇ／ｍｌ：ｐ＝０．０５４及び１．０ｍｇ／ｍｌ：ｐ＝０．０６３；ｔ検定）に比較して最大振幅に有意な差はなかった。また、暗順応したｂ波（１０ｍｇ／ｍｌ：ｐ＝０．５５３及び１．０ｍｇ／ｍｌ：ｐ＝０．５０８；ｔ検定）及び明順応したｂ波ＥＲＧ（１０ｍｇ／ｍｌ：ｐ＝０．４５１及び１．０ｍｇ／ｍｌ：ｐ＝０．５５０；ｔ検定）も顕著な減少は示さず、振幅に統計的有意な差は見られなかった（図４Ｂ、１４日目）。２ヵ月後同じＢＢＧ投与量（１．０ｍｇ／ｍｌ及び１０ｍｇ／ｍｌ）の群のＥＲＧを記録し暗順応したａ波の振幅の減少はコントロ−ル群と同様に回復するのが認められた。
【００９９】
２．７．  霊長類の眼球におけるＢＢＧによるＩＬＭ染色
ＩＬＭの除去はラット眼球においては不可能であるため、発明者らはＢＢＧによるＩＬＭ染色を霊長類の眼球で検討した。２匹の３歳のカニクイザルの眼球２つを本研究で使用した。カニクイザルを追い込みケ−ジに拘束し、太腿における塩酸ケタミン（三共エール薬品株式会社、日本）筋肉注射にて全身麻酔した。続いてサルを手術室に搬送した。外科手術は３カ所の標準的経毛様体扁平部硝子体切除手術から構成され,これに伴い硝子体を可視化するため、トリアムシノロンアセトニド投与を行い、硝子体カッターでの吸引による後部硝子体剥離の誘導を行った。
【０１００】
１０ミリグラムのＢＢＧを２０ｍｌの眼内灌流液に溶解しシリンジフィルターにて滅菌した。ＢＢＧの最終濃度は０．５ｍｇ／ｍｌであった。調整したＢＢＧ溶液（０．５ｍｌ）は硝子体腔に穏やかに注入し、速やかに平衡塩類溶液（ＢＳＳ  ｐｌｕｓ（登録商標）、参天製薬株式会社、大阪府、日本）で洗い流した。ＩＬＭの除去はＩＬＭ鉗子を用いて行った。器具を取り除き、７−０ポリガラチン縫合糸を用いて強膜切開口を閉じた。術後の検査は１、３、１４日後のスリットランプ顕微鏡検査および検眼鏡検査を含んだ。蛍光血管造影法は１４日目に行った。
【０１０１】
硝子体腔洗浄の後、ＩＬＭを淡青色で染色した。ＩＬＭの端及び皮弁はＩＬＭ除去の間明瞭に可視化された（図５Ａ）。ＩＬＭの下に存在する環状の領域はＩＬＭ除去の後明確に見られた（図５Ｂ）。
【０１０２】
術後、角膜浮腫、深刻な網膜浮腫及び眼内炎等、ＢＢＧの有毒作用は１４日目のスリットランプ顕微鏡検査及び検眼鏡検査においては観察されなかった。蛍光血管造影法もまた１４日目にはＢＢＧによる明確な網膜障害はないことを示した（図５Ｃ）。さらなる眼球顕微鏡検査は６ヶ月の追跡調査においても網膜にこれ以上の変化がないことを示した。
【実施例３】
【０１０３】
３．  膜除去のための染色溶液となりうるＢＢＧの介入臨床例
インドシアニングリーン（ＩＣＧ）及びトリパンブルー（ＴＢ）染色法は様々な硝子体−網膜疾患におけるＩＬＭ除去を大いに容易なものにした。しかしながら、多数の報告が最近ＩＣＧ及びＴＢの実験的及び臨床的使用における網膜障害性を伝えている。
【０１０４】
［０１１７］臨床の前段階の研究として、ＢＢＧはＩＬＭ染色のための候補として選別された。これは明らかにヒト眼球におけるＢＢＧの最初の臨床検査である。
【０１０５】
３．１．  ＩＬＭ染色におけるＢＢＧの利用及びヒト眼球での効果及び安全性（初めての試み）
黄斑円孔（ＭＨ）及び網膜上膜（ＥＲＭＳ）を患う１６人の被験者の１６個の眼球が２００４年８月から９月の間に九州大学病院（福岡県、日本）の外来部門から採用された。緑内障、ブドウ膜炎、及び角膜異常等眼球の疾患を伴う患者は除外された。患者の特性を表１に示す。本研究は適切な倫理委員会機構の承認及び１９８９年のヘルシンキ宣言において設けられた倫理基準に従って実施された。本治療により生じうる利益及び危険性は外科手術の前に患者に説明され、すべての患者から同意書を得た。外科手術はトリアムシノロンアセトアニド投与を行い、硝子体カッターでの吸引による後部硝子体剥離の導入を伴う３カ所の経毛様体扁平部硝子体切除手術から構成された。２０ミリグラムのＢＢＧ（ブリリアントブルーＧ  ２５０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス、アメリカ合衆国）を１０ｍｌの眼内灌流液（ＯＰＥＧＵＡＲＤ（登録商標）−ＭＡ、千寿製薬株式会社、大阪府、日本）に溶解し、シリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ（登録商標）ザルトリウス  ＡＧ，  ゲッティンゲン、ドイツ）を用いて滅菌した。ＢＢＧの最終濃度は０．２５ｍｇ／ｍｌである。調整された０．５ｍｌＢＢＧ溶液（２８９ｍＯｓｍ、ｐＨ＝７．４４）を硝子体腔に穏やかに注入し、速やかに平衡塩類溶液（ＢＢＳ  ｐｌｕｓ（登録商標），参天製薬株式会社、大阪府、日本）で洗い流した。ＩＬＭは淡青色に染色された。ＩＬＭの除去はＩＬＭ鉗子（Ｄ．Ｏ．Ｒ．Ｃ．；Ｄｕｔｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｂ．ｖ．、オランダ）を用いて行った。しかしながら、ＥＲＭＳの染色はこの濃度においては確認できなかった。
【０１０６】
術後の検査はスリットランプ顕微鏡検査、検眼鏡検査、最良矯正視力検査（ＢＣＶＡ）及び眼圧検査を含んだ。視野の評価はＨｕｍｐｈｒｅｙ  Ｆｉｅｌｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ダブリン、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を用いて２ヵ月後に行った。
【０１０７】
外科手術の手順は成功に終わった。視力はすべての事例において回復した。眼圧の上昇した患者は見られなかった。明確な視野の強度の減少及び障害は観察されなかった。ＢＢＧによるその他いかなる副作用も観察期間には観察されなかった（表２）。
【０１０８】
【表２】
2008522953.tif 000009
表２の略記
ＭＨ：黄斑円孔、ＥＲＭ：網膜上膜、ＢＣＶＡ：最良矯正視力、ｐｒｅｏｐ．：手術前、ｐｏｓｔｏｐ．：手術後、ＩＯＬ：眼内レンズ、ＩＯＰ：眼圧、ＶＦ：視野
【０１０９】
３．２．  ＩＬＭ染色におけるＢＢＧの使用及びヒト眼球での効果と安全性（二度目の試み）
本発明者らは臨床利用例の詳細な調査を続け、後述の結果を得た。
【０１１０】
２００４年８月から１１月にかけて、黄斑円孔（ＭＨ：５人の男性及び５人の女性からなる１０人の患者からの１０個の眼球）あるいは網膜上膜（ＥＲＭ：５人の男性及び５人の女性からなる１０人の患者からの１０個の眼球）を患う２０人の連続した患者の２０個の眼球について、ＢＢＧ染色を用いて膜除去を伴う硝子体切除を行った。緑内障、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、及び角膜疾患等の眼球疾患を持つ患者は除外した。患者年齢の平均標本デ−タは６７±１１．９歳で、３３歳から８５歳の範囲にあった。追跡調査の期間は平均７．３±１．０ヶ月であった。患者の詳細を表３及び４に示した。術前及び術後の眼科検査は、スリットランプ顕微鏡検査、検眼鏡検査、最良矯正視力検査（ＢＣＶＡ）及び眼圧検査(ＩＯＰ）を含んだ。ＭＨの閉鎖及び中心窩の厚さ（ＥＲＭの場合）は光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ３：Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，サン・リーンドロ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）によって測定した。平均の中心窩の厚さは全部で４つのスキャン画像から算出した。
【０１１１】
ＩＬＭの存在を確認するため、４つの眼球（ＭＨ患者から２つ、ＥＲＭ患者から２つの眼球）から切除した試料を透過型電子顕微鏡にて検査した。試料をベロナ−ル酢酸緩衝液四酸化オスミウム（２％）にて固定し、エタノール及び水にて脱水処理し、エポン包埋した。超薄切片をブロックより切り出し銅格子上に乗せた。試料をＪＥＭ  １００ＣＸ電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、東京都）で観察した。
【０１１２】
本研究は施設内倫理委員会の承認を得て１９８９年のヘルシンキ宣言における倫理基準に従って行われた。本治療により生じうる利益及び危険性については外科手術前にすべての患者に説明し、同意書を得た。
【０１１３】
必要とされる場合には標準的水晶体超音波乳化吸引術を行った。外科手術は必要とされる場合はトリアムシノロンアセトアニド（Ｋｅｎａｋｏｌｔ−Ａ（登録商標）Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＫＫ、東京都、日本）投与を行い、硝子体カッターでの吸引による後部硝子体剥離（ＰＶＤ）の導入を伴う３カ所の経毛様体扁平部硝子体切除手術から構成された。ＢＢＧ（ブリリアントブルーＧ  ２５０；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、アメリカ合衆国）を眼内灌流液（ＯＰＥＧＵＡＲＤ（登録商標）−ＭＡ、千寿製薬株式会社、大阪府、日本）に溶解した。その後溶液は０．２２μｍシリンジフィルターを用いて滅菌した。ＢＢＧの最終濃度を０．２５ｍｇ／ｍｌ(２８９ｍＯｓｍ，ｐＨ＝７．４４)とした。調整したＢＢＧ溶液（０．５ｍｌ）をその後硝子体腔に穏やかに投与し（図６Ａ）、速やかに平衡塩類溶液（ＢＢＳ  ｐｌｕｓ（登録商標）、参天製薬株式会社、大阪府、日本）にて洗浄した。ＭＨの症例においては、ＩＬＭは即時に明るい青色に染色された。ＩＬＭの除去はＩＬＭ鉗子を用いて行われた（図６Ｂ、Ｃ）。ＩＬＭ除去の後、ＩＬＭが除去された領域及び周辺領域における網膜表面の色の差異が明瞭に見られた（図６Ｄ）。しかしながらＥＲＭの症例においては、ＥＲＭの染色はこの濃度においては確認できなかった（図７Ａ）。ＥＲＭ除去の後（図７Ｂ）、ＢＢＧ溶液を再度投与し、速やかに硝子体腔を洗浄した。ＥＲＭが除去された領域のＩＬＭはＢＢＧでよく染色された（図７Ｃ）。しかしながら、残留したＥＲＭ及び後部硝子体の領域は染色されなかった。よく染色されたＩＬＭは染色されない残りのＥＲＭ及び後部硝子体と共に容易に除去することが出来た（図７Ｄ）。
【０１１４】
最後に、すべての場合において眼球内レンズを挿入した。ＭＨの場合、液体−ガス交換を行い１５％六フッ化硫黄に置換した。患者は一週間うつぶせ姿勢をとるよう勧告された。
【０１１５】
ＥＲＭを含むＩＬＭは２０個外科手術の過程ですべての眼球から順調に切除された。透過型電子顕微鏡検査により、切除された試料すべてにおいてＩＬＭの存在が確認された（標本数＝４）(図８)。術後、角膜浮腫、深刻な網膜浮腫及び眼内炎等の深刻な眼球内の炎症等のいかなるＢＢＧ投与により起こる深刻な毒性も１４日後でのスリットランプ顕微鏡検査及び検眼鏡検査においては認められなかった。
【０１１６】
すべてのＭＨ症例は検眼鏡検査及びＯＣＴ検査において解剖学的には完全に閉鎖された。術前のＢＣＶＡ中央値は２０／１００（範囲；２０／２００−２０／５０）であった。術後のＢＣＶＡ中央値は２０／３２（範囲；２０／２００−２０／２０）であった。視力は９個(９０％)の眼球においてスネレン線で２あるいはそれ以上改善し、１個の眼球では変化がなかった。２つの例において、医原性周辺部網膜裂孔を含む合併症が見られたが、これは手術中の眼内レ−ザ−により光凝固処置した。ＭＨの１つの症例についてのみＩＯＰの上昇（２６ｍｍＨｇ）が６ヵ月後の時点で認められ、これについてはラタノプロストで治療した（表３）。
【０１１７】
ＥＲＭの外科治療例においては、OCTで測定した網膜中心窩の厚さの平均は４５４．７±１４１．３μｍ（術前）から２４９．４±７１．３μｍ（術後）に減少した。ＥＲＭの例においては、術後のＢＣＶＡ（２０／１００−２０／１２．５；中央値：２０／３２）は術前のＢＣＶＡ（２０／１００−２０／４０；中央値：２０／５０）より改善した（表４）。８人の患者（８０％）についてはスネレン視力表で２ラインあるいはそれ以上改善したが、他の２患者においてはＢＣＶＡは同様あるいは１ラインの改善に留まった。唯一の合併症は硝子体出血の延長の一例であり、これは発見後吸収した。その他網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮等のいかなる副作用もすべての例の追跡調査期間において認められなかった。  
【０１１８】
【表３】
2008522953.tif 000010
表３の略記
ＭＨ：黄斑円孔、ＢＣＶＡ：最良矯正視力、ｐｒｅｏｐ．：手術前、ｐｏｓｔｏｐ．：手術後、ＩＯＬ：眼内レンズ、ＩＯＰ：眼圧
【０１１９】
【表４】
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表４の略記
ＥＲＭ：網膜上膜、ＭＨ：黄斑円孔、ＢＣＶＡ：最良矯正視力、ｐｒｅｏｐ．：手術前、ｐｏｓｔｏｐ．：手術後、ＩＯＬ：眼内レンズ、ＩＯＰ：眼圧
【実施例４】
【０１２０】
４．  ＢＢＧの生体適合性：莢膜染色のための補助剤としてのＢＢＧの臨床前研究
４．１．  ＢＢＧの莢膜染色能
ＢＢＧの莢膜染色能はブタ眼球で勾配をつけた色素を用いて評価した。
【０１２１】
ブタ眼球は地域の食肉処理場から入手し、氷上で研究室に搬入された。外眼筋及び結合組織を注意深く切断し作業用チャンバーに置いた。ＢＢＧ溶液は先述の方法を用いて調整した。２０ミリグラムのＢＢＧ（クーマシー、ブリリアントブルーＧ  ２５０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、アメリカ合衆国）を１０ｍｌの眼内灌流液（ＯＰＥＧＵＡＲＤ−ＭＡ，千寿製薬株式会社、大阪府、日本）で溶解し、シリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ，Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ  ＡＧ，ゲッティンゲン、ドイツ）にて滅菌した。手術用顕微鏡下で、ＢＢＧによる莢膜染色は以下のとおり調べられた。シリンジに装着した２６ゲ−ジ針にて透明角膜を通し前眼房に挿入した。ＢＢＧは前嚢に同じ入り口を通して挿入された２６ゲ−ジ針から投与された（１０、１、０．５、０．２５、０．１及び０．０１ｍｇ／ｍｌ）。前眼房を速やかに強化平衡塩類溶液（ＢＢＳ  Ｐｌｕｓ（登録商標）、，参天製薬株式会社、大阪府、日本）にて洗浄し、過剰の色素は容易に洗い流すことが出来た。
【０１２２】
前眼房を深くするため、１％ヒアルロン酸ナトリウム（Ｈｅａｌｏｎ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を投与した。ＣＣＣは粘弾性シリンジに装着した、折り曲げた２６ゲ−ジの使い捨て針を用いて三角形の前嚢皮弁を調整することによって開始された。ＣＣＣは水晶体切開刀あるいは嚢切開鉗子を用いて達成された。
【０１２３】
色素は前嚢を均一に染色し、ＣＣＣの末端は明確に手術用顕微鏡下で認識できた。染色は色素濃度が上昇するに従って濃くなり（０．２５ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、図９）明確に可視化でき良質な染色をするために必要な最小濃度は０．２５ｍｇ／ｍｌと判明した（図９、上右）。０．１ｍｇ／ｍｌ及び０．０１ｍｇ／ｍｌでは、前嚢染色は不明瞭であり、色素を使用する利点が全く見られなかった。（図９、中央左及び下左）。前眼房投与によって開口部も同様に染色された。
【０１２４】
４．２．  ＢＢＧの生体適合性
生後８ヶ月のブラウンノルウェイラット（九動株式会社、福岡県、日本）が以下の通り研究された。ラットはペントバルビタ−ルの腹腔内投与による麻酔及びトピカル１％トロピカミド、２．５％塩酸フェニレフリンによる瞳孔の拡張を受けた。シリンジに装着した３０−ゲ−ジ針を用い透明角膜を通して眼前房に侵入した。その後ＢＢＧ（１０、１、０．５、０．２５、０．１及び０．０１ｍｇ／ｍｌ）、ＩＣＧ（５ｍｇ／ｍｌ）、トリパンブルー（１ｍｇ／ｍｌ）、及びコントロ−ルＯＰＥＧＵＡＲＤ．溶液（各色素につき標本数＝６、合計５４個の眼球）のそれぞれの色素について前眼房への投与を一回実施した。各溶液の平均浸透性及びｐＨは表１に示す。
【０１２５】
色素は前眼房に残留し続いて２ヶ月に及んで生体顕微鏡検査が実施された。術後２週間及び２ヶ月の時点で眼球を摘出した。眼球を光学顕微鏡、透過型及び走査型電子顕微鏡にて解析した。
【０１２６】
４．３．  光学顕微鏡法
眼球を４％パラホルムアルデヒドにて固定し半分に切断し、パラフィンに包埋、キシレンで脱パラフィン後、エタノールで脱水し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。４μｍ厚の切片をヘマトキシリン及びエオジン染色し、光学顕微鏡で観察した。
【０１２７】
ヘマトキシリン及びエオジン染色した角膜切片は各グル−プ（ＢＢＧ、ＩＣＧ、ＴＢ；図１０）においていかなる顕著な違いも示さなかった。光学顕微鏡検査では内皮細胞消失又は角膜浮腫の兆候は全く見られなかった。層状コラ−ゲン層、間質細胞及び上皮細胞層はよく保全されていた。すべての角膜層において炎症性細胞浸潤は観察されなかった。
４．４．ＴｄＴ−ｄＵＴＰ終末ニック−エンド標識法（ＴＵＮＥＬ）
【０１２８】
アポトーシスによる細胞死はＴｄＴ−ｄＵＴＰ終末ニック−エンド標識法（ＴＵＮＥＬ）によって検出された。試料から作った４μｍ厚の切片を４％パラホルムアルデヒド中で固定しパラフィン中に包埋したサンプルより作製した。ＴＵＮＥＬ染色はＡｐｏｐＴａｇ（登録商標）蛍光ダイレクトｉｎ  ｓｉｔｕアポトーシス検出キット（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、アメリカ合衆国）にて製造業者のプロトコルに従い行った。
【０１２９】
切片はヨウ化プロピジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ユージーン、オレゴン州）にて共染色し、蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社、東京都）によって細胞核の観察ができるようにした。各眼球試料から１０切片を無作為に選択し観察した（標本数＝３）。結果を平均値±標準偏差として示した。
【０１３０】
すべての群において、生理学的な代謝回転による角膜上皮のアポトーシス細胞死が時折観察された（図１１、矢頭）。ＢＢＧの群においては、角膜間質細胞、内皮細胞、毛様体、及びレンズ細胞においてＴＵＮＥＬ染色は認められなかった（図１１）。ＩＣＧの群においては、５ｍｇ／ｍｌ濃度において明瞭な細胞死は認められなかった。ＴＢの群においては、角膜内皮細胞のアポトーシス細胞死がすべての内皮細胞のうち２％について検出された。ＴＢ群のそのほかの細胞は細胞死を起こしていなかった。
【０１３１】
４．５．  透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
眼球を摘出し前部をＰＢＳ中１％グルタルアルデヒド及び１％パラホルムアルデヒド中で後固定した。試料をベロナ−ル酢酸緩衝液四酸化オスミウム（２％）中で固定し、エタノール及び水で脱水処理し、エポン包埋した。超薄切片をブロックより切り出し銅格子上に乗せた。試料はＪＥＭ  １００ＣＸ電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ）を用いて観察した。
【０１３２】
ＢＢＧ群においては、最も濃度が高い１０ｍｇ／ｍｌ（図１２、左）において角膜細胞及びコラ−ゲン細胞マトリクスの超微細構造がよく保存されていた。角膜内皮、細胞膜、明確に区別される核、細胞小器官にはいかなる退行性変化も見られなかった（図１２、下左）。ＩＣＧ群ではよく保存された内皮細胞構造が見られたが、一部の内皮細胞はミトコンドリア膨張の兆候を示していた（図１２、中、矢印）。ＴＢ投与群では細胞間が分離したことにより内皮細胞層に嚢胞形成が見られ（図１２、右）、ところどころ角膜内皮の退行が斑点状に見られた（図１２、下右）。
【０１３３】
４．６．  走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）
眼球を摘出し前部をＰＢＳ中１％グルタルアルデヒド及び１％パラホルムアルデヒド中で固定した。試料をベロナ−ル酢酸緩衝液四酸化オスミウム（２％）中で固定し、エタノール及び水で脱水処理した。試料をｔ−ブチルアルコ−ル中で飽和し、臨界点乾燥法（Ｅｉｋｏ、Ｔｏｋｙｏ）を行った。試料をその後スタブ上に粘着性炭素タブによって載せ、アルゴンプラズマ塗付装置（Ｅｉｋｏ）を用いて厚さ２０ｎｍのＡｕでスパッタした。次に、角膜内皮表面をＪＥＭ  ８４０走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ）にて観察した。
【０１３４】
ＢＢＧに露出された角膜について、ＳＥＭではコントロ−ル中のものと同様の正常細胞が見られた。ＳＥＭ画像によって、内皮細胞は正常な六角形で境界も損なわれておらず、内皮細胞の膨張がないことが明らかになった（図１３、上）。ＩＣＧ投与群ではまた角膜内皮細胞層で一部細胞膨張が認められた。時折、変性した内皮細胞が本来の位置から離れた場所に観察された。ＴＢ投与群においては、内皮細胞の収縮が角膜中央部に認められた。細胞収縮により散発的な内皮細胞損失に至った。
【実施例５】
【０１３５】
５．  ブリリアントブルーを補助剤とした連続環状嚢切開
先述の通り、発明者らは低濃度かつ最小限の毒性で前嚢を染色できる新規色素、ブリリアントブルーＧ（ＢＢＧ）を含む臨床前研究の結果を報告した。本例はヒト眼球嚢染色におけるＢＢＧの効果を示す。
【０１３６】
２００４年８月、白色成熟白内障をもつ７０歳女性にＢＢＧを補助としたＣＣＣ、及び眼内レンズ（ＩＯＬ）移植を伴う水晶体超音波乳化吸引術を施術した。患者には緑内障、ブドウ膜炎あるいは角膜疾患等その他の眼疾患はなかった。クーマシー（登録商標）ＢＢＧ  ２５０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、アメリカ合衆国）を眼内灌流液（ＯＰＥＧＵＡＲＤ（登録商標）−ＭＡ；千寿製薬株式会社、大阪府、日本）に０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、シリンジフィルターで滅菌した。ＢＢＧ溶液を穏やかに前房に注入し平衡塩類溶液（ＢＢＳ）にて速やかに洗浄した。
【０１３７】
図１４に見られるように、連続環状嚢切開の外科的処置間において、明るい青色に染色された前嚢は明瞭に識別できた。ＢＢＧ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を眼前房に投与し速やかに洗浄した。（Ａ）矢印は白内障を持つ眼に形成されたＣＣＣを示す。（Ｂ）矢頭はＣＣＣ終了後の周辺部を示す。（Ｃ）水晶体超音波乳化および吸引の後、ＩＯＬを挿入した。翌日、深刻な副作用（角膜浮腫、深刻な炎症あるいは眼圧の上昇等）は観察されなかった。患者の視力は光覚（ＬＰ）から２０／２０に改善し、２ヵ月後の検査では０．８％の最小限の角膜内皮細胞の損失が観察された。
【０１３８】
本研究は施設内倫理委員会の承認を得、１９８９年のヘルシンキ宣言における倫理基準に従って行われた。本治療により生じうる利益及び危険性については外科手術前に患者に説明し、同意書を得た。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明のその他の特性及び利点は先述の詳細な記述から、当業者には明確であろう。ここで用いられた専門語及び表現は解説する用語として使用されたものであり、制限するものではない。しかしながら、本発明の特許請求の範囲において様々な修正が可能であると認識される。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１はＢＢＧ（１０ｍｇ／ｍｌ、眼球につき０．０５ｍｌ）を硝子体内注射したラット眼球を１４日目に視覚化した光学顕微鏡写真を示す。（原倍率Ａ：×２００，Ｂ：×４００）
【図２】図２はＢＢＧ（１０ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌ、眼球につき０．０５ｍｌ）を硝子体内注射したラット眼球を１４日目に視覚化した透過電子顕微鏡写真を示す。（原倍率×２０００）
【図３】図３はＴＵＮＥＬ法により検出されたアポトーシスによる細胞死を表す写真を示す。（原倍率×４００）
【図４】図４はラット眼球におけるＥＲＧの波形と最大振幅を表すグラフを示す。
【図５】図５は霊長類眼球のＢＢＧによるＩＬＭ染色写真を示す。
【図６】図６はＭＨにおけるＢＢＧを用いたＩＬＭ除去の写真を示す。
【図７】図７はＥＲＭにおけるＢＢＧを用いた膜除去の写真を示す。
【図８】図８はＩＬＭの透過電子顕微鏡写真を示す。
【図９】図９はＢＢＧによる前嚢染色の代表的な生体顕微鏡像を示す。（原倍率×４）
【図１０】図１０は前房への色素投与後ヘマトキシリン及びエオシン染色した角膜切片を示す。（原倍率×４００）
【図１１】図１１はＴＵＮＥＬ法により検出されたアポトーシスによる細胞死を表す写真を示す。
【図１２】図１２は透過型電子顕微鏡による角膜細胞及びコラ−ゲン細胞間マトリクスの超微細構造写真を示す。
【図１３】図１３は走査型電子顕微鏡による角膜内皮細胞の超微細構造写真を示す。
【図１４】図１４はＢＢＧを用いたＣＣＣの写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月1日(2007.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼膜除去を行う際の眼膜染色のための染色組成物であって、前記染色組成物はブリリアントブルーＧ（ＢＢＧ）、薬理学的に許容されるその塩又はその水和物を主要成分として含有する、染色組成物。
【請求項２】
前記眼膜が、内境界膜（ＩＬＭ）である、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項３】
前記眼膜が、前嚢である、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項４】
前記染色組成物が、前記ＢＢＧ、薬理学的に許容されるその塩又はその水和物を０．１ｍｇ／ｍｌから０．２５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で含有する、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項５】
前記染色組成物が、２９８ｍＯｓｍの浸透圧を有する、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項６】
眼疾患の治療用染色組成物を製造するためのブリリアントブルーＧ誘導体、薬理学的に許容されるその塩又はその水和物の使用。
【請求項７】
前記治療が内境界膜（ＩＬＭ）の染色及び除去を含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記治療が前嚢の染色及び除去を含む、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記治療中の前記染色組成物が、０．１ｍｇ／ｍｌから０．２５ｍｇ／ｍｌの範囲の前記ＢＢＧ濃度を有する、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記治療中の前記染色組成物が、２９８ｍＯｓｍの浸透圧を有する、請請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
眼科手術用のアジュバントとしてのＢＢＧ、薬理学的に許容されるその塩又はその水和物の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月28日(2008.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼膜除去を行う際の眼膜染色のための染色組成物であって、前記染色組成物はブリリアントブルーＧ（ＢＢＧ）、薬理学的に許容されるその塩又はその水和物を主要成分として含有する、染色組成物。
【請求項２】
前記眼膜が、内境界膜（ＩＬＭ）である、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項３】
前記眼膜が、前嚢である、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項４】
前記染色組成物が、前記ＢＢＧ、薬理学的に許容されるその塩又はその水和物を０．１ｍｇ／ｍｌから１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で含有する、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項５】
前記染色組成物が、前記ＢＢＧ、薬理学的に許容されるその塩又はその水和物を０．１ｍｇ／ｍｌから０．２５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で含有する、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項６】
前記染色組成物が、２９８ｍＯｓｍの浸透圧を有する、請求項１に記載の染色組成物。
【請求項７】
ブリリアントブルーＧ誘導体、薬理学的に許容されるその塩又はその水和物を用いた眼疾患の治療用染色組成物の製造方法。
【請求項８】
前記眼疾患の治療用染色組成物は、内境界膜（ＩＬＭ）の染色及び除去を含む眼疾患の治療用染色組成物である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記眼疾患の治療用染色組成物は、治療が前嚢の染色及び除去を含む眼疾患の治療用染色組成物である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記治療中の前記染色組成物が、０．１ｍｇ／ｍｌから１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の前記ＢＢＧ濃度を有する、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記治療中の前記染色組成物が、０．１ｍｇ／ｍｌから０．２５ｍｇ／ｍｌの範囲の前記ＢＢＧ濃度を有する、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記治療中の前記染色組成物が、２９８ｍＯｓｍの浸透圧を有する、請求項７に記載の製造方法。
【国際調査報告】
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