(57)【要約】本発明は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子を提供する。巨大分子の2つの残基間に単一のチオエーテル結合を含むチオエーテル架橋。本発明の巨大分子は、増強された安定性、薬学的特性、及び機能的特性を示し得る。特に、本発明は、特定の抗原に特異的に結合する、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体を提供する。また、本発明は、巨大分子を含む実質的に変性試薬を含まない組成物を提供し、該巨大分子は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。加えて、本発明は、本発明の巨大分子及び組成物を産生するための方法を提供する。【選択図】  図１Ａ−Ｂ
2008536815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を含む実質的に変性試薬を含まない組成物であって、前記抗体が少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記抗体が前記組成物中の抗体の2%、5%、10%又は15%を上回る、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Fab断片、Fab'断片又はF（ab）'2断片である、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体が複数のチオエーテル架橋を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項５】
前記チオエーテル架橋が、前記抗体のFab部分又はFc部分にある、請求項2記載の組成物。
【請求項６】
前記チオエーテル架橋が分子内又は鎖間にある、請求項2記載の組成物。
【請求項７】
前記チオエーテル架橋が、前記抗体の重鎖と軽鎖とを連結する、請求項2記載の組成物。
【請求項８】
前記チオエーテル架橋が、前記抗体の2つの重鎖を連結する、請求項2記載の組成物。
【請求項９】
前記チオエーテル架橋が、前記重鎖のシステイン残基と前記軽鎖の残基とを連結する、請求項2記載の組成物。
【請求項１０】
前記チオエーテルが、前記抗体の前記重鎖の残基と前記軽鎖のシステイン残基とを連結する、請求項2記載の組成物。
【請求項１１】
前記チオエーテル架橋が、前記重鎖のシステイン残基と前記軽鎖のシステイン残基とを連結する、請求項7記載の組成物。
【請求項１２】
前記チオエーテル架橋が、前記重鎖のCH1領域のシステイン残基と前記軽鎖のCL領域のシステイン残基とを連結する、請求項11記載の組成物。
【請求項１３】
前記重鎖のCH1領域のシステイン残基が、Kabat番号付け系に従ってアミノ酸位223にある、請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
前記軽鎖のCL領域のシステイン残基が、Kabat番号付け系に従ってアミノ酸位213にある、請求項12記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗体が、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）抗原、ヒトメタニューモウイルス（hMPV）抗原、インテグリンαVβ3、CD2、CD19、Eph受容体、又はIL-9に特異的に結合する、請求項２記載の組成物。
【請求項１６】
抗体を含む実質的に変性試薬を含まない組成物であって、前記抗体がランチオニンを含む、前記組成物。
【請求項１７】
前記抗体が、前記組成物中の抗体の2%、5%、10%、15%又は20%を上回る、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
組成物中の少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む抗体の量を増加させる方法であって、4℃よりも高い温度にて、及び／又は7よりも高いpHにて、前記少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む抗体の量を増加させるために十分な時間、前記組成物をインキュベートすることを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記工程が、37℃よりも高い温度にて前記組成物をインキュベートすること、8よりも高いpHにて前記組成物をインキュベートすること、及び／又は前記組成物を還元剤と接触させることを含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
組成物中の抗体の量を減少させる方法であって、前記抗体は、第1の精製法により生じる組成物中に少なくとも１つのチオエーテル架橋を含み、前記方法は、第2の精製法の少なくとも１つの工程が前記第1の精製法の対応する工程よりも低い温度及び／又はより低いpHにて実施することを除いて、前記第1の精製法と同一の前記第2の精製法を行うことを含み、前記第2の精製法は、前記第1の精製法よりも低レベルの、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む前記抗体を生じさせる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれ2005年3月14日及び2005年7月13日に出願した米国仮出願第60/661,724号及び第60/699,138号の優先権の利益を主張し、その内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子、例えばポリペプチド、例えば抗体を含む組成物を提供する。この新たなクラスの巨大分子は、増強された安定性、薬学的特性及び機能的特性を示し得る。また、本発明は、特定の抗原に特異的に結合する少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体を提供する。加えて、本発明は、本発明の巨大分子及び組成物を作製するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
抗体は、我々の免疫応答において重要な役割を果たす。これらは、ウイルス及び細菌毒素を不活性化することができ、侵入する微生物及び大きな寄生虫を死滅させるために補体系及び様々なタイプの白血球を補充するのに必須である。抗体は、専らBリンパ球によって合成され、何百万もの形態で産生され、それぞれが異なるアミノ酸配列及び抗原に対して異なる結合部位をもつ。
【０００４】
典型的な抗体は、2つの同一の重（H）鎖（それぞれ約440アミノ酸を含む）及び2つの同一の軽（L）鎖（それぞれ約220アミノ酸を含む）をもつY字型分子である。パパイン及びペプシンなどのタンパク質分解酵素により、抗体分子を種々の特徴的断片に分割することができる。パパインは、それぞれが1つの抗原結合部位をもつ2つの分離した同一の、Fab断片と1つのFc断片とを産生する。ペプシンは、1つのF（ab'）2断片を産生する。Albertsらの文献, 『細胞の分子生物学（Molecular Biology of the Cell）』, 第２版, 1989, Garland Publishing社。
【０００５】
L鎖及びH鎖は両方とも、これらのアミノ末端に可変配列を有するが、これらのC末端に定常配列を有する。L鎖は、約110アミノ酸の長さの定常領域と同一サイズの可変領域とを有する。H鎖も約110アミノ酸の長さの可変領域を有するが、H鎖のクラスに応じて、H鎖の定常領域は、約330又は440アミノ酸の長さである。Albertsらの文献, 『細胞の分子生物学（Molecular Biology of the Cell）』, 第２版, 1989, Garland Publishing社。
4つの鎖間の会合には、共有結合性及び非共有結合性の相互作用を含む。共有結合性相互作用は、軽鎖のカルボキシ末端のシステイン残基と重鎖のCH1ドメインとの間に形成されるジスルフィド結合、及び2つの重鎖のヒンジ領域のシステイン残基間で形成されるジスルフィド結合である。
【０００６】
天然の免疫グロブリンは、アッセイ、診断、及びより限定された範囲で治療に使用されてきた。しかし、このような使用は、特に治療では、天然の免疫グロブリンのポリクローナル性によって妨げられていた。特異性の定義されたモノクローナル抗体の出現により、治療的使用の機会が増大した。治療的モノクローナル抗体は、通常、翻訳後修飾、並びに生産過程の間に、及び生物薬剤製品の保存寿命の全体にわたって生じる分解イベントによって生じるいくらかの微小な不均一性をもつ。本発明は、モノクローナル抗体の新規修飾を提供する。
本明細書における参照文献の引用又は考察は、そのようなものが本発明に対する従来技術であることを承認するものとして解釈されるべきではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、チオエーテル架橋を含む巨大分子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、チオエーテル架橋を含む巨大分子を提供する。一部の実施態様において、巨大分子は、単鎖又は多鎖ポリペプチドのいずれかのポリペプチドである。さらなる実施態様において、ポリペプチドは抗体である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fab断片、F（ab）'断片、F（ab）'2断片、単鎖抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であってもよいが、これらに限定されるわけではない。
【０００９】
簡潔に述べると、チオエーテル架橋は、巨大分子の2つの残基間に単一のチオエーテル結合を含むチオエーテルである。ある実施態様において、チオエーテル架橋は、式I：-OOC-CH（NH-）-R1-S-R2-CH（NH-）-COO-に従った構造を有し、式中、R1及びR2は、独立に、アミノ酸残基などの大分子の残基の側鎖である。好ましいR1及びR2基は、メチレン、エチレン、プロピレン及びブチレンを含む。特に好ましくは、メチレンである。
一つの態様において、本発明は、ポリペプチドを含む実質的に変性試薬を含まない組成物であって、該ポリペプチドは、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む組成物を提供する。一部の実施態様において、ポリペプチドは、組成物のポリペプチド分子の2%、5%、10%又は15%を上回る。ある実施態様において、ポリペプチドは抗体である。
【００１０】
チオエーテル架橋は、ポリペプチドの任意の２残基、又は2つのポリペプチド鎖の任意の2残基を連結することができる。例えば、特定の実施態様において、チオエーテル架橋に含まれる残基は、以下の任意の一対であり得る：システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、メチオニン、チロシン、又は他の任意の天然存在型アミノ酸、若しくは非天然存在型アミノ酸。ある実施態様において、チオエーテルは、重鎖のシステイン残基と軽鎖のシステイン残基とを連結する。システイン残基は、重鎖又は軽鎖のいずれの領域にあり得る。ある実施態様において、重鎖のシステイン残基はCH1領域にあり、軽鎖のシステイン残基はCL領域にある。一つの実施態様において、重鎖のCH1領域のシステイン残基は、Kabat番号付け系に従ってアミノ酸位223にあり、重鎖のCL領域のシステイン残基は、Kabat番号付け系に従ってアミノ酸位213にある。
【００１１】
チオエーテル架橋は、巨大分子の任意の位置にあり得る。例えば、チオエーテル架橋は、分子間又は分子内にあり得る。一部の実施態様において、チオエーテル架橋は、分子内である。例えば、チオエーテル架橋は、抗体の2つのポリペプチド鎖を連結することができる。一部の実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖と軽鎖とを連結する。
チオエーテル架橋は、ポリペプチドの任意の位置に位置させることができる。例えば、チオエーテル架橋は、ポリペプチド鎖のN末端、C末端、又はN末端とC末端との間にあり得る。一部の実施態様において、チオエーテル架橋は、ポリペプチド鎖のN末端とC末端との間に位置する。
【００１２】
ある実施態様において、本発明は、抗体又はその断片を含む組成物を提供し、該抗体又はその断片は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含み、該抗体又はその断片は、1つ以上の特定の抗原に特異的に結合する。
ある実施態様において、本発明の抗体は、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）の抗原に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、パリビズマブ又はモタビズマブの可変重鎖（VH）及び可変軽鎖（VL）アミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、パリビズマブ又はモタビズマブのVH鎖及びVL鎖の相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルス（hMPV）の抗原に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、hMPVの抗原に特異的に結合するヒト化抗体である。
ある実施態様において、本発明の抗体は、インテグリンαVβ3に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、MEDI-522（ビタキシン（登録商標））のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、MEDI-522（ビタキシン（登録商標））のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。
【００１４】
ある実施態様において、本発明の抗体は、CD2に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、シプリズマブのVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、シプリズマブのVH鎖及びVL鎖の相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、本発明の抗体は、CD 19に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、MT 103のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、MT 103のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。
【００１５】
ある実施態様において、本発明の抗体は、Eph受容体に特異的に結合する。ある実施態様において、本発明の抗体は、EphA2に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、EA2又はEA5のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、EA2又はEA5のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、本発明の抗体は、EphA4に特異的に結合する。一部の実施態様において、本発明の抗体は、EphB4に特異的に結合する。
ある実施態様において、本発明の抗体は、IL-9に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、MEDI-528のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、MEDI-528のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。
【００１６】
ある実施態様において、本発明は、融合タンパク質を含む組成物を提供する。一部の実施態様において、融合タンパク質は、抗体又はその断片のFcドメインを含み、該Fcドメイン断片のFcドメインは、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。他の実施態様において、融合タンパク質は、抗体のCH1、CH2、CH3及び／又はCLドメインを含み、該CH1、CH2、CH3又はCLドメインは、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。別の実施態様において、融合タンパク質は、CH1、CH2、CH3又はCLのドメインの2つ、3つ又は全てを含む。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、ポリペプチドを含む実質的に変性試薬を含まない組成物であって、ポリペプチドは、ランチオニンを含む組成物を提供する。ランチオニン残基は、（-OOC-CH（NH-）-CH2-S-CH2-CH（NH-）-COO-）の構造を有する硫黄架橋アラニン二量体として当業者に公知である。一部の実施態様において、ポリペプチドは、組成物のポリペプチド分子の2%、5%、10%又は15%を上回る。ある実施態様において、ポリペプチドは、抗体である。組成物における抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fab断片、F（ab）'断片、F（ab）'2断片、単鎖抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であってよいが、これらに限定されるわけではない。ランチオニンは、ポリペプチドの任意の位置に位置させることができる。例えば、チオエーテル架橋は、ポリペプチド鎖のN末端、C末端、又はN末端とC末端との間にあり得る。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、抗体の集団、すなわち2つ、3つ、4つ、5つ以上の抗体を含む、実質的に変性試薬を含まない組成物であって、該抗体の少なくとも2%、5%、10%、15%又は20%が、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む組成物を提供する。一部の実施態様において、抗体の約2〜20%、2〜15%、2〜10%、2〜5%、5〜20%、10〜15%、10〜30%、20〜30%、10〜40%、10〜50%、20-50%又は10〜75%が、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。
【００１９】
ある実施態様において、抗体の少なくとも2%、5%、10%、15%又は20%が、少なくとも2つのチオエーテル架橋を含む。一部の実施態様において、抗体の約2〜20%、2〜15%、2〜10%、2〜5%、5〜20%又は10〜15%が、少なくとも2つのチオエーテル架橋を含む。
ある実施態様において、組成物は医薬組成物である。一部の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体をさらに含む。
ある実施態様において、抗体の集団は、全て同じVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、抗体の集団は、全て同じVH鎖及びVL鎖のCDRを有する。
ある実施態様において、抗体の集団は、VH鎖及びVL鎖の異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、抗体の集団は、VH鎖及びVL鎖の異なるCDRを有する。
【００２０】
本発明は、融合タンパク質の集団、すなわち2つ、3つ、4つ、5つ以上の融合タンパク質を含む、実質的に変性試薬を含まない組成物を提供し、少なくとも2%、5%、10%、15%又は20%の融合タンパクが、少なくともチオエーテル架橋を含むFcドメイン又はその断片を含む。一部の実施態様において、抗体の約2〜20%、2〜15%、2〜10%、2〜5%、5〜20%、10〜15%、10〜30%、20〜30%、10〜40%、10〜50%、20〜50%又は10〜75%が、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。ある実施態様において、融合タンパク質の集団は、同じアミノ酸配列を有する。他の実施態様において、融合タンパク質の集団は、異なるアミノ酸配列を有する。具体的実施態様において、組成物は医薬組成物である。
【００２１】
本発明は、抗体の集団、すなわち2つ、3つ、4つ、5つ以上の抗体を含む組成物であって、集団における抗体の2%、1.5%、1%又は0.5%未満が、チオエーテル架橋を含む組成物を提供する。ある実施態様において、抗体の集団は、同じアミノ酸配列を有する。他の実施態様において、抗体の集団は、異なるアミノ酸配列を有する。具体的実施態様において、組成物は医薬組成物である。
【００２２】
本発明は、組成物、融合タンパク質の集団、すなわち2つ、3つ、4つ、5つ以上の融合タンパク質であって、集団の2%、1.5%、1%又は0.5%の融合タンパク未満がチオエーテル架橋を含む融合タンパク質の集団を提供する。ある実施態様において、抗体の集団は、同じアミノ酸配列を有する。他の実施態様において、融合タンパク質の集団は、異なるアミノ酸配列を有する。具体的実施態様において、組成物は医薬組成物である。
【００２３】
別の態様において、本発明は、単離された抗体を提供を提供し、該抗体は少なくとも１つのチオエーテル架橋を含み、1つ以上の特定の抗原と結合する。ある実施態様において、本発明の抗体は、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）の抗原に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、パリビズマブ又はモタビズマブの可変重（VH）鎖及び可変軽（VL）鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、パリビズマブ又はモタビズマブのVH鎖及びVL鎖の相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列を含む。
【００２４】
ある実施態様において、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルス（hMPV）の抗原に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、hMPVの抗原に特異的に結合するヒト化抗体である。
ある実施態様において、本発明の抗体は、インテグリンαVβ3に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、MEDI-522（ビタキシン（登録商標））のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、MEDI-522（ビタキシン（登録商標））のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。
【００２５】
ある実施態様において、本発明の抗体は、CD2に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、シプリズマブのVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、シプリズマブのVH鎖及びVL鎖の相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、本発明の抗体は、CD19と特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体はMT 103のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、MT 103のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。
【００２６】
ある実施態様において、本発明の抗体は、Eph受容体に特異的に結合する。ある実施態様において、本発明の抗体は、EphA2に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体はEA2又はEA5のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、EA2又はEA5のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、本発明の抗体は、EphA4に特異的に結合する。一部の実施態様において、本発明の抗体は、EphB4に特異的に結合する。
【００２７】
ある実施態様において、本発明の抗体は、IL-9に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、MEDI-528のVH鎖及びVL鎖アミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体はMEDI-528のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む融合タンパク質を提供する。一部の実施態様において、融合タンパク質は、抗体又はその断片のFcドメインを含み、該Fcドメイン又はFcドメイン断片は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。他の実施態様において、融合タンパク質は、抗体のCH1、CH2、CH3及び／又はCLドメインを含み、CH1、CH2、CH3又はCLドメインは、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。別の実施態様において、融合タンパク質は、CH1、CH2、CH3又はCLドメインの2つ、3つ又は全てを含む。
【００２８】
別の態様において、本発明は、組成物中の抗体の量を増加させる方法を提供し、該抗体は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。本明細書に記述したように、組成物中の抗体は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む任意の抗体であり得る。ある実施態様において、本方法は、4℃よりも高い温度にて、又は7よりも高いpHにて、前記抗体種の量を増加させるために十分な時間、組成物をインキュベートすることを含む。一部の実施態様において、本方法は、組成物を還元剤と接触させることをさらに含む。
【００２９】
更なる態様において、本発明は、抗体が濃縮された組成物を産生するための方法を提供し、該抗体は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。組成物中の抗体は、本明細書に記述したように、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む任意の抗体であり得る。ある実施態様において、本発明の方法は、4℃よりも高い温度にて、又は7よりも高いpHにて、前記抗体種を濃縮するために十分な時間、組成物をインキュベートすることを含む。一部の実施態様において、本方法は、組成物を還元剤と接触させることをさらに含む。
【００３０】
別の態様において、本発明は、組成物中の抗体の量を減少させる方法を提供し、前記抗体は、精製法によって生じる組成物中に少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。ある実施態様において、該方法は、前記第1の精製法よりも、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含むより低レベルの前記抗体を生じさせる前記精製法の少なくとも１つの工程のpH及び／又は温度を低減させることを含む。
【００３１】
更なる態様において、本発明は、融合物が濃縮された組成物を産生するための方法を提供し、該融合タンパク質は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。組成物有の融合タンパク質は、本明細書に記述したように、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む任意の融合タンパク質であり得る。ある実施態様において、本発明の方法は、4℃よりも高い温度にて、又は7よりも高いpHにて、前記融合タンパク質種を濃縮するために十分な時間、組成物をインキュベートすることを含む。一部の実施態様において、本方法は、組成物を還元剤と接触させることをさらに含む。
【００３２】
別の態様において、本発明は、組成物中の融合タンパク質の量を減少させる方法を提供し、前記融合タンパク質は、精製法によって生じる組成物中に少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。ある実施態様において、該方法は、前記第1の精製法よりも、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含むより低レベルの前記融合タンパク質を生じさせる前記精製法の少なくとも１つの工程のpH及び／又は温度を減少させることを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
（5. 発明の詳細な記載）
本発明は、部分的に、異なるモノクローナル抗体の重鎖と軽鎖との間の還元されないチオエーテル架橋の発見及び特性付けに基づいている。従って、本発明は、チオエーテル架橋を含む巨大分子を提供し、該チオエーテル架橋は、巨大分子の2つの残基を連結する単一のチオエーテル結合を含むチオエーテルである。
【００３４】
（5.1. 定義）
本明細書に使用される「単離された」という用語は、タンパク質性薬剤（例えば、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質又は抗体）の文脈において、それが由来する細胞若しくは組織源に由来する細胞物質若しくは混入タンパク質を実質的に含まないか、又は化学的に合成されたときに、化学物質前駆体若しくはその他の化学物質を実質的に含まないタンパク質性薬剤をいう。「実質的に細胞物質を含まない」という専門用語には、タンパク質性薬剤が単離され、又は組換えで産生される細胞の細胞成分から分離されたタンパク質性薬剤の標品を含む。従って、細胞物質を実質的に含まないタンパク質性薬剤は、異種タンパク質（また、本明細書において、「混入タンパク質」とも称される）の約30%、20%、10%又は5%未満（乾燥重量に対して）を有するタンパク質性薬剤の標品を含む。タンパク質性薬剤が組換えで産生されるとき、これはまた好ましくは、培地を実質的に含まない、すなわち培地がタンパク質標品の体積の約20%、10%又は5%未満である。タンパク質性薬剤が化学合成によって産生されるとき、これは好ましくは、化学物質前駆体又はその他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、タンパク質性薬剤の合成に含まれる化学物質前駆体又はその他の化学物質から分離されている。従って、このようなタンパク質性薬剤の標品は、関心対象のタンパク質性薬剤以外に、約30%、20%、10%、5%（乾燥重量に対して）未満の化学物質前駆体又は化合物を有する。
【００３５】
本明細書に使用される「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態をいう。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域残基が所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の高頻度可変領域残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（FR）残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体において、又はドナー抗体において見いだされない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、高頻度可変領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつFRの全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである及び少なくとも１つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。また、ヒト化抗体は、任意に免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部、典型的にはアミノ酸残基置換、欠失又は付加の導入（すなわち、突然変異）によって変化された、EphA2ポリペプチドと免疫特異的に結合するヒト免疫グロブリンのものを含む。一部の実施態様において、ヒト化抗体は誘導体である。このようなヒト化抗体は、非ヒトCDRに1つ以上のアミノ酸残基置換、欠失又は付加を含む。ヒト化抗体誘導体は、非誘導体ヒト化抗体と比較したときに、実質的に同じ結合、より優れた結合又はより劣った結合を有していてもよい。特定の実施態様において、CDRの1、2、3、4又は5アミノ酸残基が、置換され、欠失され、又は付加され（すなわち、変異され）ている。抗体をヒト化する際の詳細については、欧州特許番号EP 239,400、EP 592,106及びEP 519,596；国際公開番号WO91/09967及びWO93/17105；米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、第5,565,332号、第5,585,089号、第5,766,886号及び第6,407,213号；Padlanの論文, 1991, Molecular Immunology 28（4/5）:489-498; Studnickaらの論文, 1994, Protein Engineering 7（6）:805-814; Roguskaらの論文, 1994, PNAS 91:969-973; Tanらの論文, 2002, J. Immunol. 169:1119-25; Caldasらの論文, 2000, Protein Eng. 13:353-60; Moreaらの論文, 2000, Methods 20:267-79; Bacaらの論文, 1997, J. Biol. chem. 272:10678-84; Roguskaらの論文, 1996, Protein Eng. 9:895-904; Coutoらの論文, 1995, Cancer Res. 55 （23 Supp）:5973s-5977s; Coutoらの論文, 1995, CancerRes. 55:1717-22; Sandhu, 1994, Gene 150:409-10; Pedersenらの論文, 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73; Jonesらの論文, 1986, Nature 321:522-525; Reichmannらの論文, 1988, Nature 332:323-329;及びPrestaの論文, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596、並びに2004年2月24日に公開されたWuらの文献, 米国特許出願公開第2005/0042664号を参照されたい）。
【００３６】
本明細書に使用される「単鎖Fv」又は「scFv」という用語は、抗体のVH及びVLドメインを含む抗体断片をいう。これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Fvポリペプチドは、抗原結合のためにscFvが所望の構造を形成するのを可能にする、VHとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。sFvの総説については、『モノクローナル抗体の薬理学（The Pharmacology of Monoclonal Antibodies）』第113巻中のPluckthun, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, 269〜315頁（1994）を参照されたい。具体的実施態様において、scFvsは、二重特異性scFvs及びヒト化scFvsを含む。
【００３７】
本明細書に使用される「抗原」という用語は、抗体によって認識されて、免疫応答を惹起することができる巨大分子をいう。抗原は、タンパク質又は多糖体であり得るが、これはまた、任意のタイプの分子であり得、より大きな担体に結合される場合にはさらに小分子でもあり得る。
【００３８】
本明細書に使用される「エピトープ」という用語は、動物において、好ましくは哺乳類において、及び最も好ましくはヒトにおける、抗原性又は免疫原性の活性を有するポリペプチド又はタンパク質の断片をいう。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗体反応を誘発するポリペプチド又はタンパク質の断片である。抗原性活性を有するエピトープは、当業者に周知の任意の方法、例えば免疫アッセイ法によって、抗体が免疫特異的に結合することが決定されたポリペプチド又はタンパク質の断片である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性であることを必要としない。
本明細書に使用される「タンパク質」という用語及び「ポリペプチド」という用語は、可換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基で構成される複合有機化合物をいう。
【００３９】
本明細書に使用される「抗原に特異的に結合する」という用語及び類似の用語は、抗原又はその断片に特異的に結合しなどの抗原に特異的に結合しないペプチド及びポリペプチド（例えば、融合タンパク質及び抗体）をいう。抗原に特異的に結合するペプチド又はポリペプチド（例えば、融合タンパク質及び抗体）は、例えば免疫アッセイ法、BIAcore又は当該技術分野において公知のその他のアッセイ法によって低い親和性をもつペプチド又はポリペプチドに対して結合し得る。抗原と特異的に結合するペプチド及びポリペプチド（例えば、融合タンパク質及び抗体）は、関連抗原と交差反応し得る。好ましくは、抗原に特異的に結合する抗体は、他の抗原と交差反応しない。
【００４０】
巨大分子、このような巨大分子を含む組成物、並びにこのような巨大分子及び組成物を使用する方法を記述するときは、以下の用語は、特に明記しない限り以下の意味を有する。
「アシル」は、ラジカル-C（O）Rをいい、式中Rは、本明細書で定義したような、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルである。代表例には、ホルミル、アセチル、シクロヘキシルカルボニル、シクロヘキシルメチルカルボニル、ベンゾイル、ベンジルカルボニルその他を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４１】
「脂肪族」は、構成炭素原子の直鎖状の、分枝の、又は環状の配置及び芳香族不飽和の非存在によって特徴づけられるヒドロカルビル有機化合物又は基をいう。脂肪族には、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル及びアルキニレンを含むが、これらに限定されるわけではない。脂肪族基は、典型的には1個、又は2〜約12個の炭素原子を有する。
【００４２】
「アルキル」は、特に約11個までの炭素原子、より詳細には低級アルキルとして、1〜8炭素原子、及びさらに詳細には特に1〜6炭素原子を有する一価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基をいう。炭化水素鎖は、直鎖又は分枝のいずれであってもよい。この用語は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル,n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ヘキシル、n-オクチル、tert-オクチルなどの基によって例示される。「低級アルキル」という用語は、1〜6炭素原子を有するアルキル基をいう。また、「アルキル」という用語には、下記に定義したような「シクロアルキル」を含む。
【００４３】
「アルキレン」は、直鎖又は分枝であり得る、特に約11個までの炭素原子、より詳細には1〜6炭素原子を有する二価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基をいう。この用語は、メチレン（-CH2-、）エチレン（-CH2CH2-）、プロピレン異性体（例えば、-CH2CH2CH2-及び-CH（CH3）CH2-）などの基によって例示される。
【００４４】
「アリール」は、親芳香環系の単一炭素原子からの1つの水素原子の除去に由来する一価の芳香族炭化水素基をいう。典型的なアリール基は、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、as-インダセン、s-インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ-2,4-ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなどに由来する基を含むが、これらに限定されるわけではない。特に、アリール基は、6〜14炭素原子を含む。
【００４５】
「アラルキル」又は「アリールアルキル」は、先に記載したような1つ以上のアリール基で置換された、上記記載のとおりのアルキル基をいう。
「アミノ」は、ラジカル-NH2をいう。
「アミノカルボニル」又は「アミド」は、それぞれのRが独立に、水素、アルキル、アリール及びシクロアルキルである基-C（O）NRRか、又はR基がアルキレン基を形態するように連結された基-C（O）NRRをいう。
【００４６】
「カルバモイル」は、それぞれのR基が、本明細書で定義したように、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、任意に本明細書で定義したように置換されていてもよい、ラジカル-C（O）N（R）2をいう。
「シクロアルキル」は、3〜約10炭素原子を有し、かつ単環状環又は融合環系及び架橋環系を含む複数の縮合環を有する環状ヒドロカルビル基をいい、これは、任意に1〜3アルキル基で置換することができる。このようなシクロアルキル基は、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル、1-メチルシクロプロピル、2-メチルシクロペンチル、2-メチルシクロオクチルなどの単一環構造、及びアダマンタニルなどの複数の環構造などを含む。
【００４７】
「ヘテロ」は、化合物に存在する基を記述するために使用されるときは、化合物又は基の1つ以上の炭素原子が窒素、酸素又は硫黄ヘテロ原子によって置換されていることを意味する。ヘテロは、1〜5個及び特に1〜3個のヘテロ原子を有するアルキル、例えばヘテロアルキル、シクロアルキル、例えばシクロヘテロアルキル、アリール、例えばヘテロアリール、シクロアルケニル、シクロヘテロアルケニルなどの上記したヒドロカルビル基に適用してもよい。
【００４８】
「ヘテロアリール」又は「複素環式芳香族化合物」は、親複素環式芳香族化合物環系の単一の原子からの1つの水素原子の除去に由来する一価の複素環式芳香族化合物基をいう。典型的なヘテロアリール基には、アクリジン、アルシンドール、カルバゾール、-カルボリン、クロマン、クロメン、シンノリン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、テトラヒドロイソキノリン、イソチアゾール、イソキサゾール、ナフチリジン、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、テトラヒドロキノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、キサンテンなどに由来する基を含むが、これらに限定されるわけではない。特に、ヘテロアリールはなどの飽和環系を含むことができ、従って、インドリン、インドリジン、テトラヒドロキノリン及びテトラヒドロイソキノリンに由来することができる。ヘテロアリール基は、好ましくは5〜20員の間のヘテロアリールであり、5〜10員のヘテロアリールが特に好ましい。特定のヘテロアリール基は、チオフェン、ピロール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、インドール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、テトラヒドロキノリン、イソキノリン、テトラヒドロイソキノリン、イミダゾール、オキサゾール及びピラジンに由来するものである。
【００４９】
「ヘテロ置換基」とは、本発明の化合物のW又はZ上に直接置換基として存在するCR4基にR4として存在していてもよく、又は本化合物に存在する「置換された」アリール、ヘテロアリール及び脂肪族基の置換基として存在していてもよい、ハロ、O、S又はN原子含有官能性をいう。
ヘテロ置換基の例には、以下を含む：
-ハロ、
-NO2、-NH2、-NHR、-N（R）2、
-NRCOR、-NRSOR、-NRSO2R、OH、CN、CO2R、
-COOH、
-O-R、
CON（R）2、-CONROR、
-SO3H、-S-R、-SO2N（R）2、
-S（O）R、及び-S（O）2R、
式中、それぞれのRは、独立に、アリール又は脂肪族であり、任意に置換を伴う。
R基を含むヘテロ置換基の中で、本明細書で定義したようなアリール及びアルキルR基を有する材料が優先される。可能な場合、それぞれのRには、水素を含んでいてもよい。また、可能な場合、2つのR基は、同じ原子上にあるときに、3〜8原子の複素環式環を形成するように連結していてもよい。例えば、NR2、SO2NR2及びCONR2の2つのR基は、N原子と共に、N-モルホリノ、N-ピロロ、N-ピペリジノ及びN-ピラゾリロ環を形成するように連結していてもよい。好ましいヘテロ置換基は、上に収載したものである。
【００５０】
本明細書に使用される「チオエーテル架橋」という用語は、巨大分子の2つの残基間の単一のチオエーテル結合をいう。本発明の目的のためには、巨大分子の2つの残基は、一個の硫黄原子によって連結される。2つ以上硫黄原子を含む連結（例えば、ジスルフィド架橋）は、本発明のチオエーテル架橋ではない。好ましいチオエーテル架橋は、一個の硫黄原子が、2つのアミノ酸の側鎖を架橋する場合に、ランチオニン残基に見出すことができる。一個の硫黄原子を有するその他の連結は、本明細書に詳細に記述してある。当業者によって認識されるように、チオエーテル架橋の形成は、残基の一方又は両方から、1つ以上の硫黄又は水素原子などの原子の欠失を生じ得る。特定のチオエーテル架橋は、式I：-OOC-CH（NH-）-R1-S-R2-CH（NH-）-COO-に従った構造を有し、式中、R1及びR2は、独立に、アミノ酸残基などの巨大分子残基の側鎖である。残基は、天然型又は非自然型であり得る。ある実施態様において、R1及びR2は、1つ以上の原子（例えばチオエーテル架橋の形成における硫黄又は水素原子）を欠失させることができる。好ましいR1及びR2基には、メチレン、エチレン、プロピレン及びブチレンを含む。特に好ましくは、メチレンである。「チオエーテル架橋」という用語は、仮出願第60/661,724号の「ゼロ次のチオエーテル」という用語と交換可能であることを意図し、その内容は、その全体が引用により組み込まれる。
【００５１】
本明細書に使用される「実質的に変性試薬を含まない」とは、組成物が変性試薬を含まないか、又は組成物中の巨大分子がそれらの三次元構造を維持するような量の変性試薬だけを有する組成物をいう。ある実施態様において、組成物における巨大分子の少なくとも50%は、それらの天然の状態にある。
本明細書に使用される「疾患」又は「障害」という用語は、可換的に使用され、被験体の状態、例えば病原性状態をいう。
【００５２】
本明細書に使用される「療法群」及び「療法」（例えば、予防薬又は治療薬）という用語は、障害又はその1つ以上の症候の予防、治療、管理又は寛解に使用することができる全てのプロトコル、方法及び／又は薬剤をいうことができる。
本明細書に使用される「予防薬」及び「予防薬類」という用語は、障害の予防又は障害の再発若しくは伝播の予防に使用することができる全ての薬剤をいう。
【００５３】
本明細書に使用される「予防的有効量」という用語は、疾患の再発若しくは伝播、又は疾患に罹りやすくなったものを含むが、これらに限定されるわけではない患者において、それらの発生を予防するために十分な予防薬の量を指し得る。また、予防的有効量は、疾患の予防において予防利益を提供する予防薬の量を指し得る。さらに、本発明の予防薬に関する予防的有効量は、疾患の予防において予防的利益を提供する、予防薬単独又はその他の薬剤と併用したその量を意味する。
【００５４】
本明細書に使用される「治療薬」及び「治療薬類」という用語は、障害又はその1つ以上の症候の治療、管理又は寛解に使用することができる全ての薬剤をいう。
本明細書に使用される「治療上有効量」とは、障害又はこれらの症候を治療し、又は管理するために十分な治療薬のその量をいう。治療上有効量は、障害の発症を遅延させる、又は最小限にするために十分な療法の量、例えば癌の伝播を遅延させる、又は最小限にするために十分な療法の量を指し得る。また、治療上有効量は、障害の治療又は管理において治療的利益を提供する療法の量を指し得る。また、治療上有効量は、障害の治療又は管理における進行、重症度及び／又は期間を低減させる療法の量を指し得る。
【００５５】
本明細書に使用される「予防する」、「予防すること」及び「予防」という用語は、治療薬の投与の文脈において、予防薬又は治療薬の投与の結果として、被験体における障害若しくはその1つ以上の症候の再発又は発症の予防をいう。
本明細書に使用される「治療する」、「治療すること」及び「治療」という用語は、療法を施す文脈において、1つ以上の療法を施すことによって生じる、障害の進行、重症度及び／若しくは期間の低減若しくは回復又は障害の症候の根絶、減少若しくは回復（例えば、原発性、局所性若しくは転移性の癌組織の根絶、除去、修飾又は制御）をいう。ある実施態様において、このような用語は、このような疾患をもつ被験体に対する1つ以上の治療薬の投与によって生じる癌の伝播を最小限にし、又は遅延させることをいう。
【００５６】
本明細書に使用される「管理する」、「管理すること」及び「管理」という用語は、療法を施す文脈において、被験体が障害の治癒を生じない療法を得る有益効果をいう。ある実施態様において、被験体には、障害の進行又は悪化を予防する（すなわち、疾患進行を保持する）ために、障害を「管理する」ための1つ以上の療法が施される。
本明細書に使用される「併用して」という用語は、1つ以上の療法の使用をいう。「併用して」という用語の使用は、予防薬及び／又は治療薬が障害をもつ被験体に投与される順序を制限しない。第一の療法は、障害をもつ被験体に対する第二の療法を施す前（例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、72時間、96 時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間又は12週間前）に、同時に、又は後（例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、72時間、96 時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間又は12週間後）に施すことができる。
【００５７】
本明細書に使用される「被験体」及び「患者」という用語は、可換的に使用される。本明細書に使用される被験体は、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットその他）及び霊長類（例えば、サル及びヒト）などの哺乳類、最も好ましくはヒトである。
【００５８】
（5.2. チオエーテル架橋を含む巨大分子）
下記の節に詳述したように、本発明は、チオエーテル架橋を含む巨大分子及び該巨大分子を含む組成物を提供する。また、本発明は、巨大分子を使用する方法を提供する。さらに、本発明は、巨大分子を含む組成物の製造方法、及び使用方法を提供する。
本発明の巨大分子は、当業者によって認識されるような任意のタイプの巨大分子であり得る。一部の実施態様において、本発明の巨大分子は、ポリペプチドである。本発明の巨大分子は、酵素、抗体、膜関連タンパク質又は分泌タンパク質などの、当業者によって認識される任意のタイプのポリペプチドであり得る。ある実施態様において、本発明は、サイトカインを包含し、インターロイキン及びインターフェロン含むが、これらに限定されるわけではない。別の実施態様において、本発明は、膜結合タンパク質、例えば受容体又はイオンチャネルを包含する。さらに別の実施態様において、本発明は、抗体を提供し、前記抗体をチオエーテル架橋を含む。
【００５９】
チオエーテル架橋は、本明細書で提供される定義に則した任意のチオエーテル結合である。先に検討したように、チオエーテル架橋は、ポリペプチドの残基間の連結であり、該連結は、一個の硫黄原子を有する。重要なことに、チオエーテル架橋は、当業者によく知られたジスルフィド架橋などの複数の硫黄原子を含む連結を特に含まない。その代わりに、チオエーテル架橋は、巨大分子の残基を架橋する一個の硫黄原子を有する。
【００６０】
巨大分子の残基を架橋する原子は、当業者によって認識されるように、1つの残基をもう一つの残基に連結する原子である。好ましい実施態様において、これらの原子は、巨大分子の1つの残基の一部を巨大分子のその他の残基に結合する原子の最も小数のものからなる。好ましい実施態様において、巨大分子の残基に結合する原子は、当業者によって理解されるように、骨格原子ではない。これらの原子は、これらが一個の硫黄原子だけを含むときに、チオエーテル架橋を形成する。
【００６１】
例えば、特定の実施態様において、チオエーテル架橋は、巨大分子の残基の側鎖を連結する。1つの側鎖をその他の側鎖に連結する原子は、一個の硫黄原子だけを含むべきである。連結された側鎖が、一個の硫黄原子を含むときに、側鎖がチオエーテル架橋によって連結される。ある実施態様において、該残基には、その他の硫黄原子が残基を架橋するために必要とされない限り、他の硫黄原子を含んでいてもよい。更なる実施態様において、残基は、一個の硫黄原子だけを含む。
【００６２】
チオエーテル架橋によって連結される残基は、天然型残基又は非天然型残基であり得る。チオエーテル架橋の形成は、残基からの原子の欠失を生じ得るし、そのことは当業者によって認識されるであろう。例えば、2つのシステイン残基の側鎖間のチオエーテル架橋の形成は、残基から硫黄原子及び水素原子の欠失を生じ得るが、それでも、生じるチオエーテル架橋は、システイン残基を連結するものと当業者により認識されるであろう。
【００６３】
チオエーテル架橋は、ポリペプチドの任意の2つの残基を連結することができる。好ましい実施態様において、チオエーテル架橋によって連結される残基は、天然型残基である。詳細な実施態様において、残基の一方又は両方は、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、メチオニン及びチロシンからなる群より選択される。さらなる実施態様において、該2残基は、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、メチオニン及びチロシンからなる群より選択される。より好ましい実施態様において、該2残基は、システイン残基である。
【００６４】
本発明の巨大分子は、1つ以上のチオエーテル架橋を含むことができる。一部の実施態様において、巨大分子は、1つのチオエーテル架橋のみを含む。他の実施態様において、巨大分子は、2つ、3つ又はそれ以上のチオエーテル架橋を含む。
特定の実施態様において、チオエーテル架橋は、式（I）：-OOC-CH（NH-）-R1-S-R2-CH（NH-）-COO-の構造、又はそのいずれかの塩若しくは溶媒和物を有する。式Iにおいて、ダッシュは、結合を示す。カルボキシル基及びアミノ基由来のダッシュは、巨大分子のその他の部分、又は水素、又は巨大分子のアミノ末端若しくはカルボキシ末端を修飾することが当業者に知られている基に対して結合することができる。R1及び、R2は、それぞれ独立に、式Iのチオエーテル架橋の形成により生じるであろう天然型アミノ酸又は非天然型アミノ酸の側鎖である。ある実施態様において、R1及びR2のそれぞれは、独立に、結合、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルキルアシル、アルキルアミノ及びアルキルアシルアミノからなる群より選択される。当業者によって認識されるように、硫黄は、化学的に可能な場合、R1及びR2のいずれの原子に結合することもできる。好ましい実施態様において、R1及びR2のそれぞれは、独立に、C1-C7アルキル、C1-C6アルキル、C1-C5アルキル、C1-C4アルキル、C1-C3アルキル、C1-C2アルキル又はC1アルキルである。特に好ましい実施態様において、R1及びR2のそれぞれは、独立にメチレンである。
【００６５】
チオエーテル架橋は、当業者の知識に従って可能な場合、巨大分子の任意の位置であり得る。例えば、チオエーテル架橋は、分子間又は分子内であり得る。一部の実施態様において、チオエーテル架橋は分子間である。例えば、チオエーテル架橋は、抗体の2つのポリペプチド鎖を連結することができる。一部の実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖と軽鎖とを連結する。他の実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の2つの重鎖又は2つの軽鎖を連結する。
【００６６】
ポリペプチド鎖の中で、チオエーテル架橋の残基は、当業者に明らかな任意の位置にも位置させることができる。一部の実施態様において、チオエーテル架橋の残基は、ポリペプチドのN末端に位置する。他の実施態様において、チオエーテル架橋の残基は、ポリペプチドのC末端に位置する。さらなる実施態様において、チオエーテル架橋の残基は、ポリペプチドのN末端とC末端との間に位置させることができる。一部の実施態様において、チオエーテル架橋は、ポリペプチドの中央にある残基をポリペプチドのN末端又はC末端の残基に対して連結させることができる。特定の実施態様において、チオエーテル架橋を、ポリペプチドのN末端の残基を同じポリペプチドのC末端の残基に連結させ、これにより環状ポリペプチドを形成することができる。
【００６７】
特定の抗体の実施態様において、チオエーテルは、重鎖のシステイン残基と軽鎖のシステイン残基とを連結する。システイン残基は、重鎖又は軽鎖のいずれの領域にもあり得る。ある実施態様において、重鎖のシステイン残基はCH1領域におあり、軽鎖のシステイン残基はCL領域にある。一つの実施態様において、重鎖のCH1領域のシステイン残基はアミノ酸位223にあり、重鎖のCL領域のシステイン残基はアミノ酸位213にある。
【００６８】
ある実施態様において、本発明は、ランチオニンを含む巨大分子、又はランチオニンを含む巨大分子を含む組成物を提供する。当業者によって認識されるように、ランチオニンは、スルフィド架橋されたアラニン二量体（-OOC-CH（NH-）-CH2-S-CH2-CH（NH-）-COO-）である。ランチオニン、及びランチオニンを含む巨大分子は、本明細書によって記述された方法、又は当業者に明らかな方法によって調製することができる。例えば、ランチオニンは、ペプチドの翻訳後修飾によって、システインとデヒドロアラニンから、又はシステインとシステインから調製することができる。ある実施態様において、巨大分子は、ポリペプチドである。さらなる実施態様において、ポリペプチドは抗体である。
【００６９】
一部の実施態様において、ポリペプチド、好ましくは、抗体は、本発明に従ってチオエーテル架橋を取り込むように修飾することができる。例えば、任意の残基を当業者に公知の技術によって、システインと置換することができる。例えば、部位特異的変異誘発及びPCR介在性突然変異誘発を含む標準的技術を使用して、例えば、抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入し、これによりアミノ酸置換を生じさせることができる。好ましい実施態様において、ポリペプチドの1つ以上の非必須アミノ酸残基をシステインで置換することができる。ある実施態様において、抗体の1つ以上の非必須アミノ酸残基をシステインで置換した。ある実施態様において、システインでの置換は、1つ以上の非必須アミノ酸と予測される残基（すなわち、抗体が抗原と免疫特異的に結合するために重要でないアミノ酸残基）にて行われる保存的アミノ酸置換である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の電荷をもつ側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の電荷をもつアミノ酸残基鎖を有する側鎖のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性の側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）をもつアミノ酸を含む。
【００７０】
（5.3. チオエーテル架橋を含む巨大分子を含む組成物）
一つの実施態様において、本発明は、巨大分子を含む、実質的に変性試薬を含まない組成物を提供し、前記巨大分子は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。ある実施態様において、巨大分子は、2つ、3つ、4つ、5つ又はそれ以上のチオエーテル架橋を含む。他の実施態様において、巨大分子は、1〜3、1〜5、2〜5、2〜4、1〜10、5〜10又は2〜6個のチオエーテル架橋を含む。一部の実施態様において、巨大分子は、ポリペプチドである。いくつかの更なる実施態様において、巨大分子は抗体である。少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む抗体は、第5.2節及び第5.4節に詳述してある。
【００７１】
「実質的に変性試薬を含まない」組成物は、変性試薬を含まないか、又は組成物中の巨大分子がそれらの三次元構造、従ってそれらの特徴的な折り畳み構造を維持するような量の変性試薬だけを有する組成物をいう。一部の実施態様において、組成物中の巨大分子の少なくとも50%は、それらの天然型状態にある。一部の実施態様において、組成物中の巨大分子の少なくとも60%は、それらの天然型状態にある。一部の実施態様において、組成物中の巨大分子の少なくとも70%は、それらの天然型状態にある。一部の実施態様において、組成物中の巨大分子の少なくとも80%は、それらの天然型状態にある。一部の実施態様において、組成物中の巨大分子の少なくとも90%は、それらの天然型状態にある。一部の実施態様において、組成物中の巨大分子の少なくとも95%は、それらの天然型状態にある。一部の実施態様において、組成物中の巨大分子の少なくとも99%は、それらの天然型状態にある。一部の実施態様において、組成物中の巨大分子の約50%〜99.99%、50%〜99%、50%〜95%、50%〜90%、50%〜80%、50%〜70%、50%〜60%、60%〜99%、70%〜99%、80%〜99%、90%〜99%、60%〜95%又は70%〜90%は、それらの天然型状態にある。
【００７２】
変性試薬は、酸、塩基又は洗浄剤を含むが、これらに限定されるわけではない、巨大分子の構造変化を生じさせるであろう任意の試薬である。例示的変性試薬には、例えばドデシル硫酸ナトリウム、尿素及びグアニジンを含む。「実質的に変性試薬を含まない」と認定される組成物中の変性試薬の量は、組成物中の変性試薬の性質及び特定の抗体に依存する。変性試薬がより強力であるほど、組成物中の変性試薬を少なくすべきである。一部の実施態様において、変性試薬は、組成物の50%未満である。一部の実施態様において、変性試薬は、組成物の25%未満である。一部の実施態様において、変性試薬は、組成物の10%未満である。一部の実施態様において、変性試薬は、組成物の5%未満である。一部の実施態様において、変性試薬は、組成物の2.5%未満である。一部の実施態様において、変性試薬は、組成物の1%未満である。一部の実施態様において、変性試薬は、組成物の0.5%未満である。一部の実施態様において、変性試薬は、組成物の0.25%未満である。一部の実施態様において、変性試薬は、組成物の0.1%未満である。一部の実施態様において、変性試薬は、組成物の約0.1%〜50%、0.1%〜25%、0.1%〜10%、0.1%〜5%、0.1%〜2.5%, 0.1%〜1%、0.1%〜0.5%、0.1%〜0.25%、0.25%〜50%、0.25%〜25%、0.5%〜10%又は0.5%〜1%である。
【００７３】
一部の実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の2%、5%、10%、15%、25%、35%、45%、50%又は75%を上回る。ある実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の2%を上回る。ある実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の5%を上回る。ある実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の10%を上回る。ある実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物に中の総巨大分子の15%を上回る。一部の実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の約2%〜15%、2%〜10%、2%〜5%、5%〜15%、5%〜10%、10%〜15%、10〜30%、20〜30%、10〜40%、10〜50%、20〜50%又は10〜75%である。
【００７４】
他の実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の4%、2%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.1%及び0.05%未満である。ある実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の4%未満である。ある実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の2%未満である。ある実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の1%未満である。ある実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の0.75%未満である。ある実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の0.5%未満である。ある実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の0.25%未満である。ある実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の0.1%未満である。ある実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は、組成物中の総巨大分子の0.05%未満である。一部の実施態様において、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子は組成物における総巨大分子の、約0.05%〜4%、0.05%〜2%、0.05%〜1%、0.05%〜0.5%、0.05%〜0.25%、0.05%〜O.1%、0.1%〜4%、0.25%〜2%、0.5%〜1%である。
【００７５】
さらなる態様において、本発明は、抗体を含む、実質的に変性試薬を含まない組成物を提供し、該抗体は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含み、かつ1つ以上の特定の抗原に特異的に結合する。別の態様において、本発明は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体を提供し、該抗体は、1つ以上の特定の抗原に特異的に結合する。
ある実施態様において、本発明の抗体は、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）の抗原に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、パリビズマブ又はモタビズマブの可変重鎖（VH）及び可変軽（VL）鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、パリビズマブ又はモタビズマブのVH鎖及びVL鎖の相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
ある実施態様において、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルス（hMPV）の抗原に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、hMPVの抗原に特異的に結合するヒト化抗体である。
ある実施態様において、本発明の抗体は、インテグリンαVβ3に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、MEDI-522（ビタキシン（登録商標））のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、MEDI-522（ビタキシン（登録商標））のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。
【００７７】
ある実施態様において、本発明の抗体は、特異的にCD2に結合する。一部の実施態様において、抗体は、シプリズマブのVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、シプリズマブのVH鎖及びVL鎖の相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、本発明の抗体は、特異的にCD19に結合する。一部の実施態様において、抗体は、MT103のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、MT103のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。
【００７８】
ある実施態様において、本発明の抗体は、特異的にEph受容体に結合する。ある実施態様において、本発明の抗体は、EphA2に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、EA2又はEA5のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、EA2又はEA5のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、本発明の抗体は、EphA4に特異的に結合する。一部の実施態様において、本発明の抗体は、EphB4に特異的に結合する。
【００７９】
ある実施態様において、本発明の抗体は、IL-9に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、MEDI-528のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、MEDI-528のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。
少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む特定の抗体は、下記の第5.4節に詳述してある。
さらなる態様において、本発明は、抗体の集団（すなわち2つ、3つ、4つ、5つ以上の抗体）を含む、実質的に変性試薬を含まない組成物を提供し、少なくとも2%、5%、10%、15%又は20%の該抗体は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。一部の実施態様において、抗体の約2〜20%、2〜15%、2〜10%、2〜5%、5〜20%、10〜15%、10〜30%、20〜30%、10〜40%、10〜50%、20〜50%又は10〜75%は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。
【００８０】
ある実施態様において、抗体の少なくとも2%、5%、10%、15%又は20%は、少なくとも2つのチオエーテル架橋を含む。一部の実施態様において、抗体の約2〜20%、2〜15%、2〜10%、2〜5%、5〜20%、10〜15%、10〜30%、20〜30%、10〜40%、10〜50%、20〜50%又は10〜75%は、少なくとも2つのチオエーテル架橋を含む。
ある実施態様において、組成物は医薬組成物である。一部の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体をさらに含む。
【００８１】
ある実施態様において、抗体の集団は、全て同じVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、抗体の集団は、全て同じVH鎖及びVL鎖のCDRを有する。
ある実施態様において、抗体の集団は、VH鎖及びVL鎖の異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、抗体の集団は、VH鎖及びVL鎖の異なるCDRを有する。
本発明は、融合タンパク質を含む組成物を提供する。一部の実施態様において、融合タンパク質は、抗体又はその断片のFcドメインを含み、該Fcドメイン又はFcドメイン断片は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。他の実施態様において、融合タンパク質は、抗体のCH1、CH2、CH 3及び／又はCLドメインを含み、該CH1、CH2、CH 3又はCLは、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。別の実施態様において、融合タンパク質は、CH1、CH2、CH3若しくはCLドメインの2つ、3つ又は全てを含む。
【００８２】
本発明は、実質的に変性試薬を含まない組成物を提供し、該組成物は融合タンパク質の集団、すなわち2つ、3つ、4つ、5つ以上の融合タンパク質を含み、該融合タンパク質の少なくとも2%、5%、10%、15%又は20%は少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、Fcドメイン又はその断片を含み、チオエーテル架橋は、Fcドメイン又はFcドメイン断片にある。他の実施態様において、融合タンパク質は、CH1、CH2、CH3及び／又はCLドメインを含み、該ドメインは、チオエーテル架橋を含む。
【００８３】
本発明は、実質的に変性試薬を含まない組成物であって、該組成物が抗体の集団、すなわち2つ、3つ、4つ、5つ以上の抗体を含み、該集団の抗体の2%、1.5%、1%又は0.5%未満がチオエーテル架橋を含む組成物を提供する。ある実施態様において、抗体の集団は、同じアミノ酸配列を有する。他の実施態様において、抗体の集団は、異なるアミノ酸配列を有する。具体的実施態様において、組成物は医薬組成物である。
【００８４】
本発明は、実質的に変性試薬を含まない組成物を提供し、該組成物は融合タンパク質の集団、すなわち2つ、3つ、4つ、5つ以上の融合タンパク質を含み、該集団の融合タンパク質の2%、1.5%、1%又は0.5%未満はチオエーテル架橋を含む。一部の実施態様において、融合タンパク質は、Fcドメイン又はその断片を含み、チオエーテル架橋は、該Fcドメイン又はFcドメイン断片内にある。他の実施態様において、融合タンパク質は、CH1、CH2、CH3及び／又はCLドメインを含み、該ドメインは、チオエーテル架橋を含む。ある実施態様において、抗体の集団は、同じアミノ酸配列を有する。他の実施態様において、融合タンパク質の集団は、異なるアミノ酸配列を有する。具体的実施態様において、組成物は医薬組成物である。
【００８５】
（5.3.1 医薬組成物及び製剤）
本発明は、障害若しくはその1つ以上の症候を予防、治療、管理、若しくは寛解において、及び／又は研究において、障害を診断、検出若しくはモニターするのに使用するための巨大分子、例えば本発明のポリペプチド（例えば、抗体又は融合タンパク質）を含む組成物を提供する。具体的実施態様において、組成物は、本発明の1つ以上の抗体又は融合タンパク質を含む。別の実施態様において、組成物は、1つ以上の本発明抗体融合タンパク質及び本発明の抗体融合タンパク質以外の1つ以上の予防薬又は治療薬を含む。好ましくは、予防薬又は治療薬は、障害若しくはその1つ以上の症候の予防、治療、管理若しくは寛解に有用であることが公知か、又は使用されてきたか、若しくは現在使用されている。これらの実施態様によれば、組成物は、担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含んでいてもよい。
【００８６】
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用なバルク製剤組成物（例えば、純粋でない組成物又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の製造に使用することができる医薬組成物（すなわち、被験体又は患者に投与のために適している組成物）を含むが、これらに限定されるわけではない。このような組成物は、本明細書に開示した予防薬及び／若しくは治療薬の予防的若しくは治療的有効量又はこれらの薬剤と医薬として許容し得る担体との併用を含む。好ましくは、本発明の組成物は、医薬組成物であり、かつ本発明の1つ以上の有効量の抗体、医薬として許容し得る担体及び任意に、別の有効量の予防薬又は治療薬を含む。
【００８７】
具体的実施態様において、「医薬として許容し得る」という用語は、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されたか、又は米国薬局方若しくは動物に、及び特にヒトに使用するためのその他の一般に認可された薬局方に収載されたことを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤又は治療薬が共に含まれるか、若しくは投与される媒体をいう。このような医薬担体は：水；並びに、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等の、石油、動物、植物又は合成起源のものを含む油；などの滅菌液であり得る。医薬組成物を静脈内に投与するときは、水が好ましい担体である。また、食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、液体担体、特に注射用溶液として使用することができる。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアリン酸、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。また、組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤若しくは乳化剤又はpH緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとることができる。
【００８８】
医薬組成物は、即時放出又は延長性放出用の、経口又は非経口剤形として製剤することができる。組成物には、希釈剤、充填剤、崩壊剤、甘味料、潤滑剤及び香味料などの通常医薬品製剤に使用される不活性成分を含むことができる。医薬組成物を、好ましくは大量瞬時投与若しくは持続性ドリップのいずれかによる静脈内投与用に、又は移植されたカプセルからの放出用に製剤する。静脈内投与用の典型的な製剤では、希釈剤として生理食塩水を利用する。
【００８９】
本発明の組成物は、中性又は塩形態として製剤することができる。医薬として許容し得る塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンと形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの陽イオンと形成されるものを含む。
【００９０】
また、本発明の組成物は、治療薬として投与することができる抗体についての臨床情報、投薬量及びスケジュール、及び／又は患者に対する本発明の抗体の投与についての禁忌を記述する印刷物を含むことができる。
一般に、本発明の組成物の成分を、別々に、又は例えば単位剤形において共に混合して、活性薬剤の量を示すアンプル又は包みなどの気密的に密封された容器内に、乾燥凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として供給する。組成物を注入により投与する場合は、無菌の薬品級の水又は食塩水を含有する注入ボトルで投与する。組成物を注射によって投与する場合、成分を投与の前に混合し得るように、注射用滅菌水又は塩類溶液のアンプルを提供することができる。
【００９１】
特に、本発明はまた、本発明の予防薬若しくは治療薬又は医薬組成物の1つ以上を、該薬の量を示すアンプル又は包みなどの気密的に密封した容器内に詰める。一つの実施態様において、本発明の予防薬若しくは治療薬又は医薬組成物の1つ以上を、気密的に密封した容器内に乾燥滅菌された凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として供給し、被験体に投与するために適した濃度に（例えば、水又は塩類溶液で）再構成することができる。好ましくは、本発明の予防薬若しくは治療薬又は医薬組成物の1つ以上は、少なくとも5mg、より好ましくは少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、少なくとも75mg又は100mgの単位投薬量にて気密的に密封した容器内に乾燥滅菌された凍結乾燥粉末として供給される。本発明の凍結乾燥された予防薬若しくは治療薬又は医薬組成物は、その元の容器内に2℃〜8℃の間で貯蔵されるべきであり、本発明の予防薬若しくは治療薬又は医薬組成物は、再構成された後1週以内に、好ましくは5日以内に、72時間以内に、48時間以内に、24時間以内に、12時間以内に、6時間以内に、5時間以内に、3時間以内に、又は1時間以内に投与されるべきである。代替的実施態様において、本発明の予防薬若しくは治療薬又は医薬組成物の1つ以上は、薬剤の量及び濃度を示す気密的に密封した容器内に液体の形態で供給される。好ましくは、投与される組成物の液体状態は、気密的に密封された容器内に少なくとも0.25mg/ml、より好ましくは少なくとも0.5mg/ml、少なくとも1mg/ml、少なくとも2.5mg/ml、少なくとも5mg/ml、少なくとも8mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/kg、少なくとも25mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも75mg/ml又は少なくとも100mg/mlにて供給される。液体状態は、その元の容器内に2℃〜8℃の間で貯蔵されるべきである。
【００９２】
一般に、本発明の組成物の成分は、このような組成物のレシピエントと同じ種起源又は種反応性である被験体に由来する。従って、好ましい実施態様において、ヒト又はヒト化抗体は、療法又は予防のためにヒト患者に投与される。
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤される。投与経路の例には、静脈内、非経口的、例えば皮内、皮下、経口、鼻腔内（例えば、吸入法）、経皮（例えば、局所的）、経粘膜及び直腸の投与を含むが、これらに限定されるわけではない。具体的実施態様において、組成物は、ヒトに対して静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内又は局所的な投与するのに適応した医薬組成物として日常的手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物は、また溶解剤及び注射の部位における疼痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含んでいてもよい。
【００９３】
本発明の組成物を、局所投与してもよい。このような組成物は、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョン又は当業者に周知のその他の形態の形態で製剤することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. （1995）を参照されたい。非スプレー可能局所剤形については、局所適用に適合し、かつ好ましくは水よりも大きい動粘性率を有する担体若しくは1つ以上の賦形剤を含む半固体又は固体の形態に対する粘稠性のものが、典型的には使用される。適切な製剤には、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、糊膏、膏薬などを含むが、これらに限定されるわけではなく、これらは、必要に応じて、滅菌され、又は例えば浸透圧などの種々の特性に影響を及ぼすための補助薬（例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液又は塩）と共に混合される。その他の適切な局所剤形には、活性成分が、好ましくは固体又は液体の不活性担体と併用して加圧揮発性物質（例えば、フレオンなどのガス状噴霧剤）との混合物に、又はスクイーズボトルに充填されたスプレー可能エアロゾル製剤を含む。また、加湿剤又は湿潤剤を必要に応じて医薬組成物及び剤形に添加することができる。このようなさらなる成分の例は、当技術分野において周知である。
【００９４】
本発明の組成物を、鼻腔内に投与してもよい。このような組成物は、エアロゾル形態、スプレー、ミストの形態で、又は液滴で処方することができる。特に、本発明に従う使用のための予防薬又は治療薬は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適切なガス）を用いて、加圧パック又は噴霧器からエアゾールスプレー提示の形態で都合よく送達することができる。加圧式エアゾールの場合、定量を送達するためのバルブを備えることにより、用量単位を測定することができる。吸入器又は通気器に使用するためのカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンで構成される）には、化合物と乳糖又はデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末配合物を含めて製剤してもよい。
【００９５】
本発明の組成物を、経口投与してもよい。このような組成物は、錠剤、カプセル、カシェ剤、ジェルキャップ、溶液、懸濁液などの形態で経口的に処方することができる。錠剤又はカプセルは、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶性セルロース又はリン酸カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）又は湿潤剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）などの医薬として許容し得る賦形剤と共に従来の手段によって調製することができる。錠剤は、当技術分野において周知の方法によってコーティングしてもよい。経口投与用の液状製剤は、溶液、シロップ若しくは懸濁液の形態をとってもよく、又はこれらは、使用前に水若しくはその他の適切な媒体と共に構成するための乾燥製品として提示してもよい。このような液状製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素付加された食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水溶媒体（例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール又は分画された植物油）；及び防腐剤（例えば、メチル若しくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾアート又はソルビン酸）などの医薬として許容し得る添加物で従来の手段によって調製してもよい。また、製剤は、適切な緩衝塩、香味料、着色料及び甘味料を含んでいてもよい。経口投与のための調製は、予防薬又は治療薬（類）の遅延放出、制御放出又は徐放用に適切に製剤してもよい。
【００９６】
例えば、本発明の組成物は、吸入器又は噴霧器を使用することによって肺投与するために使用してもよい。このような組成物は、エアロゾル化する薬剤と共に処方することができる。例えば、米国特許第6,019,968号、第5,985,320号、第5,985,309号、第5,934,272号、第5,874,064号、第5,855、913号、第5,290,540号及び第4,880,078号；並びにPCT公開番号WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/3 1346及びWO99/66903を参照されたく、これらのそれぞれは、引用によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。具体的実施態様において、本発明の巨大分子、本発明の併用療法及び／又は組成物は、Alkermes AIR（商標）肺ドラッグデリバリー技術（Alkermes社, Cambridge、Mass.）を使用して投与される。
【００９７】
本発明の組成物を、注射による（例えば、大量瞬時投与又は連続注入による）、非経口投与用に製剤してもよい。注射用製剤は、保存剤が添加された単位剤形で（例えば、アンプルで、又は複数投与容器で）提示してもよい。組成物は、油性又は水性媒体中の懸濁液、溶液又はエマルジョンなどの形態をとっていてもよく、並びに懸濁薬、安定化薬及び／又は分散薬などの製剤化薬を含んでいてもよい。或いは、活性成分は、使用前に適切な媒体（例えば、滅菌の発熱性物質を含まない水）と共に構成するための粉末形態であってもよい。
【００９８】
本発明の組成物を、デポー製剤として製剤することができる。このような長時間作用性の製剤は、移植によって（例えば、皮下に、又は筋肉内に）、又は筋肉内注射によって投与してもよい。従って、例えば、本組成物は、適切な重合性又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂と共に、又はやや溶けにくい誘導体（例えば、やや溶けにくい塩として）として製剤してもよい。
【００９９】
（5.3.2 投与方法）
種々の送達系が公知であり、かつこれらを使用して：本発明の1つ以上の抗体；、又は本発明の1つ以上の抗体と、障害若しくはその1つ以上の症候を予防、管理、治療若しくは寛解させるために有用な予防薬若しくは治療薬、例えばリポソームのカプセル化、微小粒子、マイクロカプセル、抗体若しくは抗体断片を発現することができる組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシス（例えば、Wu及びWuの論文, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 （1987）を参照されたい）、レトロウイルス又はその他のベクターの一部としての核酸の構築物などとの組み合わせ；を投与するために使用することができる。本発明の予防薬又は治療薬を投与する方法には、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与及び粘膜投与（例えば、鼻腔及び経口経路）を含むが、これらに限定されるわけではない。加えて、肺投与は、例えば吸入器又は噴霧器により、またエアロゾル化薬と共に製剤を使用することによって使用することができる。肺投与の記述については、例えば米国特許第6,019,968号、第5,985,320号、第5,985,309号、第5,934,272号、第、5,874,064号、第5,855,913号、第5,290,540号及び第4,880,078号；並びにPCT公開番号WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346及びWO99/66903を参照されたく、これらのそれぞれは引用により全体が本明細書に組み込まれる。一つの実施態様において、本発明の抗体、本発明の併用療法又は組成物は、Alkermes AIR（商標）肺ドラッグデリバリー技術（Alkermes社, Cambridge、Mass.）を使用して投与する。具体的実施態様において、本発明の予防薬又は治療薬は、筋肉内投与、静脈内投与、腫瘍内投与、経口的投与、鼻腔内投与、肺投与又は皮下投与される。予防薬又は治療薬を、例えば注入又は大量瞬時投与によって、上皮又は粘膜皮膚の裏打ち（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜など）を介した吸収によって、任意の便利な経路によって投与してよく、他の生物活性物質と共に投与していてもよい。投与は、全身的又は局部的であり得る。
【０１００】
具体的実施態様において、本発明の予防薬又は治療薬を、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい可能性がある；これは、例えば、限定するためにではないが、局部注入によって、注射によって、又はインプラントによって達成していてもよく、前記インプラントは、シラスティック膜、重合体、線維マトリックス（例えば、Tissuel.RTM.）又はコラーゲン母体などの膜及びマトリックスを含む多孔性又は非多孔性材料のものである。一つの実施態様において、障害又はこれらの症候を予防、治療、管理及び／又は寛解させるために、本発明の1つ以上の抗体の有効量が被験体に対して患部に局所投与する。別の実施態様において、障害又はその1つ以上の症候を防止、治療、管理及び／又は寛解させるために、本発明の1つ以上の抗体の有効量が本発明の抗体以外の1つ以上の療法（例えば、1つ以上の予防薬又は治療薬）の有効量と併用して、被験体の患部に局所投与する。
【０１０１】
別の実施態様において、予防薬又は治療薬は、制御放出系又は徐放系で送達することができる。一つの実施態様において、ポンプを使用して、制御放出又は徐放を達成してもよい（Langer、上記；Seftonの論文, 1987, CRC Crit. Ref.Biomed. Eng. 14:20; Buchwaldらの論文, 1980, Surgery 88:507; Saudekらの論文, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい）。別の実施態様において、重合物質を使用して、本発明の療法の制御放出又は徐放を達成するために使用することができる（例えば、『制御放出の医学的適用（Medical Applications of Controlled Release）』, Langer及び Wise（編）の文献, CRC Pres., Boca Raton, Fla.（1974）; 『制御された薬剤生体利用性、薬剤産物設計及び性能（Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance）』, Smolen及びBall（編）の文献, Wiley, New York （1984）; Ranger及びPeppasの論文, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい; また、Levyらの論文, 1985, Science 228:190; Duringらの論文, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howardらの論文, 1989, J. Neurosurg. 71:105；米国特許第5,679,377号；米国特許第5,916,597号；米国特許第5,912,015号；米国特許第5,989,463号；米国特許第5,128,326号；PCT公開番号WO99/15154；及びPCT公開番号WO99/20253を参照されたい）。徐放性製剤に使用される重合体の例には、ポリ（2-ヒドロキシメタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン-コ-酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）ポリグリコリド（PLG）、ポリ無水物、ポリ（N-ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリ乳酸（PLA）、ポリ（ラクチド-共同-グリコリド）（PLGA）及びポリオルトエステルを含むが、これらに限定されるわけではない。好ましい実施態様において、徐放性製剤に使用される重合体は、不活性で、濾過可能な不純物がなく、貯蔵安定で、滅菌で、及び生体分解性である。さらに別の実施態様において、制御放出系又は徐放性放出系を、予防的又は治療的な標的の近くに配置することができ、従って、全身用量の一部のみが必要とされる（例えば、前述のGoodsonの文献, 『制御放出の医学的適用（Medical Applications of Controlled Release）』、第２巻, 115〜138頁 （1984）を参照されたい）。
【０１０２】
制御放出系は、Langer（1990, Science 249：1527-1533）による総説で論議されている。本発明の1つ以上の治療薬を含む徐放性製剤を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用することができる。例えば、米国特許第4,526,938、PCT公報WO91/05548、PCT公報WO96/20698、Ningらの論文, 1996, 『徐放性ゲルを使用する、ヒト結腸癌異種移植片の腫瘍内放射性免疫治療（Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel）』, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Songらの論文, 1995, 『長時間循環型エマルジョンの抗体介在性肺標的化（Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions）』, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleekらの論文, 1997, 『心血管適用のためのbFGF抗体用生分解性重合体キャリアー（Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application）』, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854,及び、Lamらの論文, 1997, 『局所的送達用の組換えヒト化モノクローナル抗体のマイクロカプセル化（Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery）』, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたく、これらのそれぞれは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
具体的実施態様において、本発明の組成物が予防薬又は治療薬をコードする核酸である場合、該核酸を、インビボで投与して、それが細胞内に入るように、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築して：例えばレトロウイルスベクター（米国特許第4,980,286を参照されたい）を使用することによって；又は直接注射によって；又は微小粒子照射（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）を使用することによって；又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクト薬でコーティングして；又は核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに結合させて；投与することによって（例えば、Joliotらの論文, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868を参照されたい）、そのコードされた予防薬又は治療薬の発現を促進させることができる。或いは、核酸を細胞内に導入して、相同的組換えによる発現のために宿主細胞DNA内に組み込ませることができる。
【０１０４】
（5.3.3 投薬量及び投与頻度）
障害又はその1つ以上の症候の治療、管理、予防又は寛解に有効であろう本発明の予防薬若しくは治療薬又は組成物の量は、標準的な臨床面によって決定することができる。頻度及び投薬量は、投与される具体的療法又は治療（例えば、具体的又は予防薬又は治療薬）、疾患、障害又は状態の重症度、投与経路、並びに年齢、体、体重、反応、患者の免疫状態及び患者の過去の病歴に応じて、それぞれの患者に特異的な要因に従って変化する。例えば、障害又はその1つ以上の症候の治療、予防、管理又は寛解に有効であろう本発明の予防薬若しくは治療薬又は組成物の投薬量は、例えば本明細書に開示されているか、又は当業者に知られている動物モデルなどの動物モデルに該組成物を投与することによって決定することができる。加えて、最適な用量範囲を同定するのを補助するために、任意にインビトロでのアッセイ法を使用していてもよい。適切な投与計画は、これらのような因子を考慮することによって、並びに例えば文献で報告された投薬量、及び医師用卓上参考書（第57版, 2003）で推奨された投薬量に従うことによって、当業者が選択することができる。
【０１０５】
例えば、本発明の予防及び／又は治療プロトコルの毒性及び／又は有効性は、細胞培養又は実験動物におけるLD50（集団の50%に致死的な用量）及びED50（集団の50%において治療的に有効な用量）を決定するための標準的な薬学的手順によって決定することができる。中毒性と治療有効性との間の用量比が治療係数であり、これは、LD50／ED50比として表すことができる。大きな治療係数を示す療法が好ましい。中毒性副作用を示す療法を使用していてもよいが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小にすることにより、副作用を減少させるために、このような薬剤を患部組織の部位に標的化する送達系を設計するように配慮すべきである。
【０１０６】
ヒトに使用するための予防薬及び／又は治療薬の投薬量の範囲を策定する際に、細胞培養アッセイ法及び動物試験から得られるデータを使用することができる。このような薬剤の投薬量は、好ましくはほとんど又は全く毒性のないED50を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変更してもよい。本発明の方法に使用されるいずれの療法についても、治療的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイ法により見積もることができる。用量は、細胞培養において決定されるIC50（すなわち、症候の最大半減の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで策定してもよい。このような情報は、ヒトで有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０１０７】
本発明の少なくとも１つのチオエステル架橋を含む巨大分子について、患者に投与される投薬量は、典型的には患者の体重1kgに対して0.01mg〜100mgである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重1kgに対して0.1mg〜20mg、より好ましくは、患者の体重1kgに対して1mg〜10mgの間である。一般に、ヒト及びヒト化抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答のためなどの種に由来する抗体よりも人体内で長い半減期を有する。従って、ヒト抗体の投薬量を低下させ、頻回投与をより少なくできることが多い。
【０１０８】
小分子の例示的用量は、被験体又は試料重量のキログラムあたり、ミリグラム又はマイクログラム量の小分子を含む（例えば、1キログラムあたり約1マイクログラム〜1キログラムあたり約500ミリグラム、1キログラムあたり約100マイクログラム〜1キログラムあたり約5ミリグラム又は1キログラムあたり約1マイクログラム〜1キログラムあたり約80マイクログラム）。
予防薬又は治療薬の投薬量は、医師用卓上参考書（第56版, 2002）に記述されている。
【０１０９】
（5.4. 本発明の抗体）
本発明の抗体には、抗体モノクローナル抗体、合成抗体、多特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Fvs（scFv）（二重特異性scFvsを含む）、単鎖抗体、Fab断片、F（ab'）断片、ジスルフィド結合したFvs（sdFv）、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を含むが、これらに限定されるわけではない。特に、本発明の抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子を含む。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ（例えば、IgG、IgE、1gM、IgD、IgA及びIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2）又はサブクラスであり得る。好ましくは、本発明の抗体は、IgG、より好ましくはIgG1である。
【０１１０】
ある実施態様において、本発明の抗体は、4つのポリペプチド鎖-2つの軽鎖及び2つの重鎖を含む。他の実施態様において、本発明の抗体は、VH鎖及び／又はVL鎖を含む。さらに別の実施態様において、本発明の抗体は、エピトープ-結合断片である。
本明細書の全体にわたって、IgG軽鎖又は重鎖の残基の番号付けは、Kabatらの論文, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD （1991）（明白に引用により本明細書に組み込まれる）と同様のEUインデックスである。「Kabatと同様のEUインデックス」とは、ヒトIgG1 EU抗体の番号付けをいう。
【０１１１】
本発明の抗体は、鳥類及び哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリ）を含むいずれの動物起源に由来していてもよい。好ましくは、抗体は、ヒト又はヒト化されたモノクローナル抗体である。本明細書に使用される「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、又はヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウス若しくはその他の動物から単離された抗体を含む。
【０１１２】
本発明の抗体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体又はより多特異性抗体であってもよい。多特異性抗体は、ポリペプチドの種々のエピトープと免疫特異的に結合してもよく、又はポリペプチドに加えて、異種ポリペプチド又は固体支持物質などの異種エピトープの両方に免疫特異的に結合してもよい。例えば、国際公開番号WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360及びWO92/05793；Tuttらの論文, 1991, J. Immunol. 147:60-69；米国特許番号第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号及び第5,601,819号；並びにKostelnyらの論文, 1992, J. Immunol. 148:1547-1553を参照されたい. 
【０１１３】
本発明の抗体は、当業者に公知の抗体の誘導体を含む。当業者に公知の標準的技術を使用して、本発明の方法で使用される抗体をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することができ、該技術は、例えばアミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発及びPCR媒介突然変異誘発を含む。好ましくは、誘導体は、本来の分子と比較して、25未満のアミノ酸置換、20未満のアミノ酸置換、15未満のアミノ酸置換、10未満のアミノ酸置換、5未満のアミノ酸置換、4未満のアミノ酸置換、3未満のアミノ酸置換又は2未満のアミノ酸置換を含む。好ましい実施態様において、誘導体は、1つ以上の予測される非必須アミノ酸残基にてなされている保存的アミノ酸置換を有する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を同様の電化をもつ側鎖を有するアミノ酸残基で置換したものである。同様の電荷をもつアミノ酸残基鎖を有する側鎖のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。或いは、突然変異は、飽和突然変異誘発などにより、コード配列の全部又は一部に沿ってランダムに導入することができ、結果として生じる突然変異体を生物活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発に続いて、コードされるタンパク質を発現させて、タンパク質の活性を決定することができる。
【０１１４】
本発明の抗体は修飾された誘導体、すなわち共有結合と同様の、抗体に対する任意のタイプの分子の共有結合によって修飾された誘導体を含む。例えば、限定するためではないが、抗体誘導体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンド又はその他のタンパク質に対する結合などによって修飾された抗体を含む。特異的化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの存在下での合成などを含むが、これらに限定されない公知技術によって、任意の多くの化学修飾を行ってもよい。加えて、誘導体は、1つ以上の非古典的アミノ酸を含んでいてもよい。
【０１１５】
また、本発明は、当業者に公知のフレームワーク領域を含む本発明の抗体を提供する。特定の実施態様において、本発明の方法に使用される抗体又はその断片の1つ以上のフレームワーク領域、好ましくはフレームワーク領域の全てがヒトである。本発明の一定の他の実施態様において、本発明の抗体の断片領域は、ヒト化されている。ある実施態様において、本発明の方法で使用される抗体は、合成抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化キメラ抗体、ヒト化抗体、グリコシル化された抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である。
【０１１６】
本発明のある実施態様において、本発明の抗体は、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、12時間を上回る、1日を上回る、3日を上回る、6日を上回る、10日を上回る、15日を上回る、20日を上回る、25日を上回る、30日を上回る、35日を上回る、40日を上回る、45日を上回る、2月を上回る、3月を上回る、4月を上回る、又は5月を上回る半減期を有する。インビボでの半減期が増加した抗体又はその抗体結合性断片は、当業者に公知の技術によって作製することができる。例えば、インビボの半減期が増加した抗体又はその抗体結合性断片は、FcドメインとFcRn受容体との間の相互作用に関与することが同定されたアミノ酸残基を修飾すること（例えば、置換すること、欠失させること、又は付加すること）によって作製することができる（例えば、PCT公開番号WO97/34631、Johnsonらにより2001年12月12日に出願された、表題『延長された半減期を有する分子、その組成物及び使用（Molecules with Extended Half-Lives, Compositions and Uses Thereof）』の米国特許出願第10/020,354号、及びLosonskyにより2005年10月31日に出願された、表題『RSV感染及びその関連状態の予防方法及び治療方法（Methods of Preventing and Treating RSV Infections and Related Conditions）』の米国特許出願第11/263,230号を参照されたく、これらは、その全体が引用により本明細書に組み込まれる）。このような抗体又はその抗体結合性断片は、当業者に公知の方法を使用して、例えば本明細書に記述した免疫アッセイ法によって、抗原に対する結合活性について、並びにインビボでの有効性について試験することができる。
【０１１７】
さらに、インビボ半減期が増大された抗体は、高分子量ポリエチレングリコール（PEG）などの重合体分子を前記抗体又は抗体断片に付着させることによって作製することができる。PEGは、多官能性リンカーの有無にかかわらず、前記抗体のN末端又はC末端に対するPEGの部位特異的な抱合を介して、又はリジン残基に存在するイプシロン-アミノ基を経て、前記抗体に付着することができる。最小限の生物活性の欠失を生じさせる直鎖状又は分枝重合体誘導体化が使用されるであろう。抗体に対するPEG分子の適当な抱合を保証するために、抱合の程度をSDS-PAGE及び質量分析によって念入りにモニターする。反応していないPEGは、例えばサイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーによって抗体-PEG抱合体から分離することができる。例えば本明細書に記述した免疫アッセイ法による、当業者に公知の方法を使用して、RSV抗原に対する結合活性、並びにインビボでの有効性について、PEG誘導体化された抗体又はその抗体結合性断片を試験することができる。
【０１１８】
本発明の抗体は、単鎖抗体であり得る。単鎖抗体の設計と構成はMarascoらの論文, 1993, Proc Natl Acad Sci 90:7889-7893に記述されており、これは、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
ある実施態様において、本発明の抗体は、細胞内エピトープに結合する、すなわち細胞内抗体である。細胞内抗体は、抗原に免疫特異的に結合することができる抗体の少なくとも一部を含み、かつ好ましくはその分泌用のコード配列を含まない。このような抗体は、細胞内においてその抗原に結合する。一つの実施態様において、細胞内抗体には、単鎖Fv（「sFv」）を含む。
【０１１９】
さらなる実施態様において、細胞内抗体は、好ましくは作動可能な分泌配列をコードせず、従って細胞内に残る（一般に、Marascoの文献, WA, 1998, 『細胞内抗体：基礎研究及び臨床的遺伝子治療適用（Intrabodies: Basic Research and Clinical Gene Therapy Applications）』 Springer: New Yorkを参照されたい）。
sFvは、抗体のVH及びVLドメインを含む抗体断片であるり、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。一般に、Fvポリペプチドは、VHとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、sFvが抗原結合のために望ましい構造を形成することができる。sFvの総説については、『モノクローナル抗体の薬理学（The Pharmacology of Monoclonal Antibodies）』第113巻中のPluckthun, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, 269〜315頁（1994）を参照されたい。
【０１２０】
（5.4.1 抗体複合体）
また、本発明は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、擬態の薬剤、合成薬、無機分子及び有機分子を含むが、これらに限定されるわけではない、1つ以上の部分に抱合され、又は融合された抗体を包含する。
本発明は、融合タンパク質を産生するために、異種タンパク質又はポリペプチド（又はその断片、好ましくは少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100アミノ酸のポリペプチド）に、組換え的に融合された抗体、又は化学的に抱合された（共有結合性及び非共有結合性の抱合を含む）抗体を包含する。融合は、必ずしも直接的であることは必要でなく、リンカー配列を介して生じさせてもよい。例えば、抗体を使用して、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に対して、抗体を融合、又は抱合させることによって特定の細胞型に対して異種ポリペプチドをターゲットするために使用していてもよい。また、異種ポリペプチドに融合され、又は抱合された抗体は、当該技術分野において公知の方法を使用するインビトロでの免疫アッセイ法及び精製法に使用していてもよい。例えば、国際公開番号WO93/21232；欧州特許番号EP 439,095；Nararnuraらの論文, 1994、Immunol. Lett. 39：91-99；米国特許第5,474,981号；Gilliesらの論文, 1992、PNAS 89：1428-1432；及びFellらの論文, 1991, J. Immunol. 146：2446-2452を参照されたく、これらは、その全体が引用により組み込まれる。
【０１２１】
本発明は、抗体断片に融合され、若しくは抱合された異種タンパク質、ペプチド又はポリペプチドを含む組成物を更に含む。例えば、異種ポリペプチドは、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F（ab）2断片、Fcドメイン、VHドメイン、VLドメイン、VH CDR、VL CDR、若しくはそれらの断片に融合され、又は抱合されていてもよい。抗体部分にポリペプチドを融合し、又は抱合するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号及び第5,112,946号；欧州特許番号EP 307,434及びEP 367,166；国際公開番号WO96/043 88及びWO91/06570；Ashkenaziらの論文, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zhengらの論文, 1995, J. Immunol. 154:5590-5600;及び、Vilらの論文, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい（前記参照文献は、それらの全体が引用により組み込まれる）。また、PCT公開番号WO97/34631、Johnsonらにより2001年12月12日に出願された、表題『延長された半減期を有する分子、その組成物及び使用』の米国特許出願第10/020,354号、及びLosonskyにより2005年10月31日に出願された、表題『RSV感染及びその関連状態の予防方法及び治療方法』の米国特許出願第11/263,230号を参照されたく、これらの内容は、その全体が引用により組み込まれる。
【０１２２】
ある実施態様において、本発明は、抗体のFcドメイン又はその断片を含む融合タンパク質を提供し、Fcドメイン又はFcドメイン断片は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。このような融合タンパク質は、Morelandらの論文, 2000, New Eng. J. Med. 343:15869-93に記載されているような、ヒト腫瘍壊死因子受容体Fc融合タンパク質；又はLiuらの論文, 2005, Cancer Research 11（23）: 8492-8502に記載されているようなB7.1 Fc融合タンパク質などの、当該技術分野において公知のFcドメイン又はFcドメイン断片を含む任意の融合タンパク質であることができ、これらの内容は、その全体が引用により組み込まれる。
【０１２３】
一部の実施態様において、Fcドメインは、1つ以上のアミノ酸置換（Fc変異体）をさらに含んでいてもよい。一部の実施態様において、Fc変異体は、少なくとも１つ以上のFcリガンド（例えば、FcγRs、c1q）に対する結合親和性の変化を示す。例示的なFc変異体及びこのようなものを作製する方法は、例えば米国特許出願公開第2006/0039904号及び第2006/0040325号（両方とも、2006年2月23日に公開され、その内容は、その全体が引用により組み込まれる）に記述されている。
ある実施態様において、本発明は、CH1、CH2、CH3又はCLドメインが少なくとも１つのチオエーテル架橋を含むCH1、CH2、抗体のCH3 及び／又はCLドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【０１２４】
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング及び／又はコドンシャフリング（ひとまとめにして「DNAシャフリング」と呼ばれる）技術を介して作製していてもよい。DNAシャフリングは、本発明の抗体又はその断片の活性を変化させるために使用してもよい（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度をもつ抗体又はその断片）。一般に、米国特許第5,605,793号；第5,811,238号；第5,830,721号；第5,834,252号；及び第5,837,458号、並びにPattenらの論文, 1997, Curt. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayarna, 1998, Trends Biotechnol. 16（2）:76-82; Hansson,らの論文, 1999, J. Mol. Biol.287:265-76; and Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24（2）:308-3 13を参照されたい（これらの特許及び刊行物のこれらのそれぞれは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。）。抗体若しくはその断片又はコードされた抗体若しくはその断片は、組換えの前に、エラープローンPCR、ランダムヌクレオチド挿入又はその他の方法によって、ランダム突然変異誘発に供することによって変化させてもよい。抗体又は抗体断片をコードするポリヌクレオチドの1つ以上の部分は、1つ以上の異種の分子の1つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、断片などと再結合していてもよい。
【０１２５】
さらに、抗体をペプチドなどのマーカー配列に融合させ、精製を容易にさせることができる。実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけpQEベクター（QIAGEN社, 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311）で提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、これらの多くが市販されている。Gentzらの論文, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記述されたように、例えばヘキサヒスチジンにより、融合タンパク質の便利な精製がもたらされる。精製のために有用なその他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素「HA」タグ（Wilsonらの論文 , 1984, Cell 37:767）及び「flag」タグを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１２６】
他の実施態様において、本発明の抗体、その類似体若しくは誘導体を、診断薬又は検出可能な薬剤に抱合することができる。このような抗体は、特定の療法の有効性の決定などの臨床試験工程の一部として、障害の発症若しくは進行をモニターし、又は予測するために有用であり得る。このような診断及び検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼなどの（しかし、これらに限定されるわけではない）種々の酵素；ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンなどの（しかし、これらに限定されるわけではない）補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンなどの（しかし、これらに限定されるわけではない）蛍光物質；ルミノールなどの（しかし、これらに限定されるわけではない）発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンなどの（しかし、これらに限定されるわけではない）生物発光材料；放射性物質、ヨウ素（131I、125I、l23I、121I）、炭素（14C）、硫黄（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（115In、113In、112In、111In）及びテクネチウム（99Tc）、タリウム（201Ti）、ガリウム（68Ga、67Ga）、パラジウム（103Pd）、モリブデン（99Mo）、キセノン（33Xe）、フッ素（8F）、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、53Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及び117Tin；種々のポジトロン放出断層撮影、非放射性常磁性金属イオン及び放射標識されたか、又は特定の放射性同位元素に抱合された分子を使用するポジトロン放射金属；を含む検出可能な物質に抗体を結合させることによって達成することができる。
【０１２７】
本発明は、治療的部分に抱合された抗体をさらに包含する。抗体又はその断片は、細胞毒、例えば細胞分裂停止薬若しくは細胞破壊薬、治療薬又は放射性金属イオン、例えばα放射体などの治療的部分に抱合されていてもよい。細胞毒又は細胞障害薬は、細胞に有害である任意の薬剤を含む。治療的部分には、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、6‐メルカプトプリン、6‐チオグアニン、シタラビン、5‐フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロランブシル、メルファラン、カルムスチン（BCNU）及びロムスチン（CCNU）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC及び白金（II）シスジクロロジアミン（DDP）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前にはダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前にはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン（AMC））、オーリスタチン分子（例えば、オーリスタチンPHE、ブリオスタチン1及びソラスタチン10；Woykeらの論文, Antimicrob. Agents Chernother. 46:3802-8 （2002）, Woykeらの論文, Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 （2001）, Mohammadらの論文, Anticancer Drugs 12:735-40 （2001）, Wallらの論文, Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76-80 （1999）, Mohammadらの論文, Int. J. Oncol. 15:367-72 （1999）を参照されたい（これらの全ては、引用により本明細書に組み込まれる）、ホルモン（例えば、糖質コルチコイド、プロゲスチン、アンドロゲン及びエストロゲン）、DNA修復酵素阻害剤（例えば、エトポシド又はトポテカン）、キナーゼ阻害剤（例えば、化合物ST1571、イマチニブメシレート（Kantaijianらの論文, Clin Cancer Res. 8（7）：2167-76（2002））、細胞障害薬（例えば、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにその類似体又は相同体）、並びに米国特許第6245,759号、第6,399,633号、第6,383,790号、第6,335,156号、第6,271,242号、第6,242,196号、第6,218,410号、第6,218,372号、第6,057,300号、第6,034,053号、第5,985,877号、第5,958,769号、第5,925,376号、第5,922,844号、第5,911,995号、第5,872,223号、第5,863,904号、第5,840,745号、第5,728,868号、第5,648,239号、第5,587,459号に開示された化合物、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、R115777、BMS-214662、及び例えば米国特許第6,458,935号、第6,451,812号、第6,440,974号、第6,436,960号、第6,432,959号、第6,420,387号、第6,414,145号、第6,410,541号、第6,410,539号、第6,403,581号、第6,399,615号、第6,387,905号、第6,372,747号、第6,369,034号、第6,362,188号、第6,342,765号、第6,342,487号、第6,300,501号、第6,268,363号、第6,265,422号、第6,248,756号、第6,239,140号、第6,232,338号、第6,228,865号、第6,228,856号、第6,225,322号、第6,218,406号、第6,211,193号、第6,187,786号、第6,169,096号、第6,159,984号、第6,143,766号、第6,133,303号、第6,127,366号、第6,124,465号、第6,124,295号、第6,103,723号、第6,093,737号、第6,090,948号、第6,080,870号、第6,077,853号、第6,071,935号、第6,066,738号、第6,063,930号、第6,054,466号、第6,051,582号、第6,051,574号及び第6,040,305号により開示されたもの）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトセシン；イリノテカン；SN-38；トポテカン；9-アミノカンプトセシン；GG-211（GI 147211）；DX-895If；IST-622；ルビテカン；ピラゾロアクリジン；XR-5000；サイントピン；UCE6；UCE1O22；TAN-1518A；TAN-1518B；KT6006；KT6528；ED-110；NB-506；ED-110；NB-506；及びレベッカマイシン）；ブルガレイン；ヘキスト色素33342及びヘキスト色素33258などのDNA副溝結合剤；ニチジン；ファガロニン；エピベルベリン；コーラリン；β-ラパコン；BC-4-1；ビスホスホネート（例えば、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オルパンドロネート、リセドロネート、ピリドロネート、パミドロネート及びゾレンドロネート）、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤（例えば、ロバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、スタチン、セリバスタチン、レスコール、ルピトール、ロスバスタチン及びアトルバスタチン）、並びにそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、クラスレート及びプロドラッグ。例えばRothenberg, M. L., Annals of Oncology 8:837-855（1997）;及びMoreau, P.らの論文, J. Med. Chem. 41:1631-1640（1998）を参照されたい）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば米国特許第6,277,832号、第5,998,596号、第5,885,834号、第5,734,033号及び第5,618,709号に開示されたもの）、免疫調節物質（例えば抗体及びサイトカイン）、抗体、並びにアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、リン酸ルダラビン及び2-クロロデオキシアデノシン）。
【０１２８】
さらに、抗体又はその断片を、所与の生物反応を修飾する治療的部分又は薬物部分に抱合させてもよい。療法的部分又は薬物部分は、古典的な化学治療薬に限定されるものと解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質には、例えば以下のものを含んでいてもよい：アブリン、リシンA、プソイドモナス外毒素、コレラ毒素又はジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲンアクチベータなどのタンパク質、アポトーシス薬、例えばTNFα、TNFβ、AIM I（国際公開番号WO97/33899を参照されたい）、AIM II（国際公開番号WO97/34911を参照されたい）、Fasリガンド（Takahashiらの論文, 1994, J. Immunol., 6：1567-1574）及びVEGI（国際公開番号WO99/23105を参照されたい）、血栓薬若しくは抗血管新生薬、例えばアンジオスタチン、エンドスタチン若しくは凝固経路の成分（例えば組織因子）；又は例えばリンホカイン（例えばインターロイキン1（「IL-1」）インターロイキン-2（「IL-2」）インターロイキン6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）及び顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）などの生体応答修飾因子、成長因子（例えば成長ホルモン（「GH」））又は凝固薬（カルシウム、ビタミンKや、Hagerman因子（第XII因子）、高分子キニノーゲン（HMWK）、プレカリクレイン（PK）、凝固タンパク質因子II（プロトロンビン）、プロアクセレリン、第V因子、第XIIa因子、第VIII因子、第XIIIa因子、第XI因子、第XIa因子、第IX因子、第IXa因子、第X因子、リン脂質、フィブリノーゲンのα鎖及びβ鎖からの線維素ペプチドA及びB、フィブリン単量体などの組織因子）。
【０１２９】
さらに、抗体を、213Biなどのα-放射体などの放射性金属イオン、又は131In、131LU、131Y、131Smを含むが、これらに限定されない放射性金属イオンを結合させるために有用な大環状キレート剤などの療法的部分に抱合することができる。ある実施態様において、大環状キレート剤は、1,4,7,10-テトラアアシクロドデカン-N,N',N'',N’’’-四酢酸（DOTA）であり、これは、リンカー分子を介して抗体に付着することができる。このようなリンカー分子は、当該技術分野において一般に公知であり、Denardoらの論文, 1998, Clin Cancer Res. 4（10）:2483-90; Petersonらの論文, 1999, Bioconjug. Chem. 10（4）:553-7; and Zimmermanらの論文, 1999, Nucl. Med. Biol. 26（8）:943-50に記述されており、それぞれ、その全体が引用により組み込まれる。
【０１３０】
療法的部分を抗体に抱合するのための技術は、周知であり、例えば、Anionらの論文,『モノクローナル抗体及び癌治療（Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy）』中の 『癌治療における薬物の免疫標的化用モノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy）』, Reisfeldら（編）, 243-56頁 （Alan R. Liss社 1985）; Hellstrornらの文献,『制御薬物送達（Controlled Drug Delivery）（第２版）』中の『薬剤送達用抗体（Antibodies For Drug Delivery）』, Robinsonら（編）, 623-53頁 （Marcel Dekker社 1987）; Thorpeの文献, 『モノクローナル抗体  ８４：生物学的用途及び臨床的用途（Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications）』中の『癌治療における細胞傷害剤の抗体キャリアー：総説（Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review）』, Pincheraら（編）, 475-506頁 （1985）; 『癌の検出及び治療のためのモノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy）』中の『癌治療における放射性標識抗体の治療的使用の解析、結果及び将来的展望（Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy）』, Baldwinら（編）, 303-16頁（Academic Press 1985）,及び Thorpeらの論文, 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。
【０１３１】
或いは、Segalによる米国特許第4,676,980号（これはその全体が引用により本明細書に組み込まれる）によって記述されたように、抗体を第二の抗体に抱合させて抗体異種抱合体を形成することすることができる。
抗体又はその断片に抱合される治療的部分又は治療薬は、被験体における特定の障害に対して所望の予防効果又は治療効果を達成するように選択すべきである。臨床医又はその他の医療関係者は、抗体又はその断片に対してどの治療的部分又は治療薬を抱合するべきかについて決定するときに、疾患の性質、疾患の重症度及び被験体の状態を考慮すべきである。
【０１３２】
また、抗体は、固体支持体に付着していてもよく、これは特に標的抗原の免疫アッセイ法又は精製のために有用である。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ビニル又はポリプロピレンを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１３３】
（5.4.2  特定の抗原に特異的に結合する少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体、並びに該抗体含む組成物）
さらなる実施態様において、本発明は、単離された抗体又は抗体を含む組成物を提供し、前記抗体は少なくとも1つのチオエーテル架橋を含み、かつ1つ以上の特定の抗原に特異的に結合する。
【０１３４】
ある実施態様において、本発明の抗体は、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）の抗原に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、パリビズマブ又はモタビズマブの可変重鎖（VH）及び可変軽（VL）鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、パリビズマブ又はモタビズマブのVH鎖及びVL鎖の相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列を含む。
【０１３５】
ある実施態様において、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルス（hMPV）の抗原に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、hMPVの抗原に特異的に結合するヒト化抗体である。
ある実施態様において、本発明の抗体は、インテグリンαVβ3に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、MEDI-522（ビタキシン（登録商標））のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、MEDI-522（ビタキシン（登録商標））のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。
【０１３６】
ある実施態様において、本発明の抗体は、CD2に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、シプリズマブのVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、シプリズマブのVH鎖及びVL鎖の相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、本発明の抗体は、CD19に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、MT 103のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、MT 103のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。
【０１３７】
ある実施態様において、本発明の抗体は、Eph受容体に特異的に結合する。ある実施態様において、本発明の抗体は、EphA2に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、EA2又はEA5のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、EA2又はEA5のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、本発明の抗体は、EphA4に特異的に結合する。一部の実施態様において、本発明の抗体は、EphB4に特異的に結合する。
ある実施態様において、本発明の抗体は、IL-9に特異的に結合する。一部の実施態様において、抗体は、MEDI-528のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、MEDI-528のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
ある実施態様において、本発明の抗体は、RSV（ヒトヒトメタニューモウイルス（hMPV）の抗原、インテグリンαVβ3、CD2、CD19、Eph受容体（例えば、EphA2、EphA4又はEphB4）又はIL-9の抗原に特異的に結合する抗体以外のこれらの抗体である。ある実施態様において、本発明の抗体は、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）の抗原に、特異的に結合する抗体ではない。他の実施態様において、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルス（hMPV）の抗原に特異的に結合する抗体ではない。ある実施態様において、本発明の抗体は、インテグリンαVβ3に特異的に結合する抗体ではない。ある実施態様において、本発明の抗体は、CD2に特異的に結合する抗体ではない。ある実施態様において、本発明の抗体は、CD19に特異的に結合する抗体ではない。更なる実施態様において、本発明の抗体は、EphA2に特異的に結合する抗体ではない。ある実施態様において、本発明の抗体は、EphA4に特異的に結合する抗体ではない。ある実施態様において、本発明の抗体は、IL-9に特異的に結合する抗体ではない。
【０１３９】
一部の実施態様において、抗体は、パリビズマブではない。他の実施態様において、抗体は、モタビズマブではない。一部の実施態様において、抗体は、MEDI-522（ビタキシン（登録商標））ではない。一部の実施態様において、抗体は、シプリズマブではない。一部の実施態様において、抗体はMTl03（登録商標）ではない。一部の実施態様において、抗体は、ヒトのEA2又はEA5若しくはヒト化EA2又はEA5ではない。一部の実施態様において、抗体は、MEDI-528ではない。
【０１４０】
本発明の抗体は、高力価抗体でもよい。本明細書に使用される「高力価」という用語は、生物活性（例えば、抗原の中和）についての種々のアッセイ法で決定したときに高力価を示す抗体をいう。高力価抗体は、適切な抗体遺伝子配列を遺伝子操作し、適切な宿主において抗体配列を発現することによって産生することができる。2002年7月25日に公表された米国出願公開番号2002/0098189号を参照されたく、その内容は、引用によりその全体が組み込まれる。産生された抗体を選別し、例えばBIAcoreアッセイ法で高kon値をもつ抗体を同定することができる。
【０１４１】
具体的実施態様において、本発明の抗体は、少なくとも105M-1s-1、少なくとも5×105 M-1s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5×106 M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5×107M-1s-1又は少なくとも108M-1s-1の会合速度定数又はkon速度（抗体（Ab）+抗原（Ag）kon→Ab-Ag）を有する。好ましい実施態様において、本発明の抗体は、少なくとも2×105M-1s-1、少なくとも5×105M-1s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5×106M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5×107M-1s-1又は少なくとも108M-1s-1のkonを有する。一部の実施態様において、本発明の抗体は、105M-1s-1〜108M-1s-1の間、105M-1s-1〜108M-1s-1の間、105M-1s-1〜107M-1s-1の間、105M-1s-1〜106M-1s-1の間又は106M-1s-1〜107M-1s-1の間のkon速度を有する。
【０１４２】
別の実施態様において、本発明の抗体は、5×10-1s-1未満、10-1s-1未満、5×10-2s-1未満、10-2s-1未満、5×10-3s-1未満、10-3s-1未満、5×10-4s-1未満、10-4s-1未満、5×10-5s-1未満、10-5s-1未満、5×10-6s-1未満、10-6s-1未満、5×10-7s-1未満、10-7s-1未満、5×10-8s-1未満、10-8s-1未満、5×10-9s-1未満、10-9s-1未満又は10-10s-1未満のkoff速度（抗体（Ab）+抗原）を有する。好ましい実施態様において、5×10-4s-1未満、10-4s-1未満、5×10-5s-1未満、10-5s-1未満、5×10-6s-1未満、10-6s-1未満、5×10-7s-1未満、10-7s-1未満、5×10-8s-1未満、10-8s-1未満、5×10-9s-1未満、10-9s-1未満又は10-10s-1未満のkoff速度を有する。一部の実施態様において、本発明の抗体は、5×10-4s-1〜10-9s-1の間、5×10-4s-1〜10-8s-1の間、5×10-7s-1〜10-7s-1の間、10-4s-1〜10-10s-1の間、10-6s-1〜10-9s-1の間のkoff速度を有する。
【０１４３】
ある実施態様において、本発明の抗体は、1つ以上の抗原に対して高結合親和性を有する。米国特許第6,656,467号を参照されたく、その内容は、引用によりその全体が組み込まれる。ある実施態様において、本発明の抗体は、少なくとも102M-1、少なくとも5×102M-1、少なくとも103M-1、少なくとも5×103M-1、少なくとも104M-1、少なくとも5×104M-1、少なくとも105M-1、少なくとも5×105M-1、少なくとも106M-1、少なくとも5×106M-1、少なくとも107M-1、少なくとも5×107M-1、少なくとも108M-1、少なくとも5×108M-1、少なくとも109M-1、少なくとも5×109M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも5×1010M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも5×1011M-1、少なくとも1012M-1、少なくとも5×1012M-1、少なくとも1013M-1、少なくとも5×1013M-1、少なくとも1014M-1、少なくとも5×1014M-1、少なくとも1015M-1、少なくとも5×1015M-1の親和定数又はKa（kon／koff）を有する。また、本発明は、少なくとも2×108M-1、少なくとも2.5×108M-1、少なくとも5×108M-1、少なくとも109M-1、少なくとも5×109M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも5×1010M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも5×1011M-1、少なくとも1012M-1、少なくとも5×1012M-1、少なくとも1013M-1、少なくとも5×1013M-1、少なくとも1014M-1、少なくとも5×1014M-1、少なくとも1015M-1の親和定数で抗原に免疫特異的に結合する1つ以上の抗体を含む組成物を提供する。ある実施態様において、本発明の抗体は、102M-1〜5×1015M-1の間、107M-1〜5×1015M-1の間、106M-1〜5×1015M-1の間、108M-1〜5×1015M-1の間、1010M-1〜5×1015M-1の間、1012M-1〜5×1015M-1の間、1014M-1〜5×1015M-1の間、104M-1〜1014M-1の間、106M-1〜1012M-1の間又は108M-1〜1010M-1の間のKa（kon／koff）を有する。
【０１４４】
さらに別の実施態様において、本発明の抗体は、5×10-2M未満、10-2M未満、5×10-3M未満、10-3M未満、5×10-4M未満、10-4M未満、5×10-5M未満、10-5M未満、5×10-6M未満、10-6M未満、5×10-7M未満、10-7M未満、5×10-8M未満、10-8M未満、5×10-9M未満、10-9M未満又は10-10M未満。5×10-11M未満、10-11M未満、5×10-12M未満、10-12M未満、5×10-13M未満、10-13M未満、5×10-14M未満、10-14M未満、5×10-15M未満若しくは10-15M未満の解離常数又はKd（koff／kon）を有する。一部の実施態様において、本発明の抗体は、10-2M〜5×10-15Mの間、10-5M〜ｖ10-15Mの間、10-8M〜5×10-15Mの間、10-11M〜5×10-15Mの間、10-4M〜10-14Mの間、10-6M〜10-12Mの間、10-8M〜10-10Mの間のKdを有する。
【０１４５】
ある実施態様において、本発明の抗体は、インビトロでのマイクロ中和アッセイ法において、0.01nM未満、0.025nM未満、0.05nM未満、0.1nM未満、0.25nM未満、0.5nM未満、0.75nM未満、1nM未満、1.25nM未満、1.5nM未満、1.75nM又は2nM未満の半有効濃度（EC50）を有する。半有効濃度は、インビトロでのマイクロ中和アッセイ法において、抗原の50%を中和する抗体又は抗体断片の濃度である。好ましい実施態様において、本発明の抗体は、インビトロでのマイクロ中和アッセイ法において、0.01nM未満、0.025nM未満、0.05nM未満、0.1nM未満、0.25nM未満の0.5nM未満、0.75nM、1nM未満、1.25nM未満、1.5nM未満、1.75nM未満又は2nM未満のEC50を有する。ある実施態様において、本発明の抗体は、0.01nM〜2nMの間、0.025nM〜1.75nMの間、0.05mM〜1.5nMの間、0.1nM〜1.25nMとの間、又は0.25nM〜1nMの間のEC50を有する。
【０１４６】
（5.4.2.1.  吸器合胞体ウイルス（RSV）の抗原に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む抗体、及び該抗体を含む組成物）
本発明は、吸器合胞体ウイルス（RSV）の抗原に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体、及び該抗体を含む組成物を提供する。チオエーテル架橋は、第5.2節に詳述してある。本発明の抗体は、1つ以上のチオエーテル架橋を含むことができる。チオエーテル架橋により、抗体の任意の2つの残基を連結することができる。ある実施態様において、チオエーテル架橋によって連結される残基は、天然型残基である。好ましい実施態様において、残基のうちの2つは、システイン残基である。チオエーテル架橋は、当業者に知識に従って可能な、抗体の任意の位置にあり得る。好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖と軽鎖とを連結する。特定の好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖のシステインと軽鎖のシステインとを連結する。
【０１４７】
本発明のこの抗体は、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）の抗原に特異的に結合する。「抗RSV抗原抗体」という用語は、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体をいう。RSV抗原は、RSV核タンパク質、RSVリンタンパク質、RSV基質タンパク質、RSV小疎水性タンパク質、RSV RNA依存性RSVポリメラーゼ、RSV Fタンパク質及びRSV Gタンパク質などのRSVポリペプチド又はその断片をいう。また、RSV抗原は、RSV核タンパク質、RSVリンタンパク質、RSV基質タンパク質、RSV小さな疎水性タンパク質、RSV RNA依存性のRSVポリメラーゼ、RSV Fタンパク質及びRSV Gタンパク質などのRSVポリペプチド又はそれらの断片と比較して、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ある実施態様において、抗体は、RSV融合（F）タンパク質のA抗原性部位のエピトープに特異的に結合する。
【０１４８】
本発明の抗RSV抗原抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。一部の好ましい実施態様において、本発明は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含むパリビズマブを提供する。特に好ましい実施態様において、パリビズマブは、SYNAGIS（登録商標）である。
パリビズマブは、RSVの融合（F）タンパク質の抗原性部位のエピトープに特異的に結合する組換えDNA技術によって産生されるヒト化モノクローナル抗体である。これは、ヒト（95%）及びマウス（5%）抗体配列の合成物である。パリビズマブは、インビトロでRSVに対して高い比活性を有し、広範なRSV単離対をを中和することが公知である。これは、ヒト血漿に由来しないので、パリビズマブでの予防的治療は、血液媒介病原体を伝達する潜在的リスクを有さない。パリビズマブのアミノ酸配列は、Johnsonらの論文, 1997, J. Infectious Disease 176:1215-1224及びYoungらの論文による、表題『予防及び治療のための抗RSV抗体の投与／投薬方法（Methods of Administering/Dosing Anti-RSV Antibodies for Prophylaxis and Treatment）』の国際出願公開番号WO02/43660に開示されており、これらは、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。また、パリビズマブの特性及び使用は、例えばその他の出願にも開示されており、例えば2000年11月28日に出願された米国特許出願第09/724396号；2001年11月28日に出願された米国特許出願第09/996265号及び2003年3月31日に出願された米国特許出願第10/403,180を参照されたく、これらの全てが、引用により本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
一部の実施態様において、抗体は、パリビズマブのVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、パリビズマブのVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。パリビズマブのVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列及びパリビズマブのVH鎖及びVL鎖のCDRは、表1に収載されており、Losonskyにより2005年10月31日に出願された、表題『RSV感染及びその関連状態の予防方法及び治療方法』の米国特許出願第11/263,230号に提供されており、その内容は、引用によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
更なる実施態様において、本発明は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含むモタビズマブを提供する。モタビズマブのアミノ酸配列、特性及び使用は、米国特許第6,818,216号及びYoungらの論文に開示されている。一部の実施態様において、モタビズマブのアミノ酸配列は、重鎖及び軽鎖についてそれぞれ配列番号254及び255によってコードされ、米国特許第6,818,216号に開示されている。
【０１５１】
一定の特定の実施態様において、抗RSV-抗原抗体は、AFFF；P12f2 P12f4；P11d4；Ale9；A12a6；A13c4；A17d4；A4B4；1X-493L1；FR H3-3F4；M3H9；Y1OH6；DG；AFFF（1）；6H8；L1-7E5；L2-15B10；A13a11；A1h5；A4B4（1）；A4B4-F52S；又はA4B4L1FR-S28Rである。これらの抗体は、Youngらによる、表題『予防及び治療のための抗RSV抗体の投与／投薬方法』の国際出願公開番号WO02/43660、及びLosonskyによる2005年10月31日に出願の、表題『RSV感染及びその関連状態の予防方法及び治療方法』の米国特許出願第11/263,230号に開示されており、これらは、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
一部の実施態様において、抗体は、モトビズマブのVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、モトビズマブのVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。パリビズマブのVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列、並びにモトビズマブのVH鎖及びVL鎖のCDRは、表1に収載されており、Losonskyによる2005年10月31日に出願された"Methods of Preventing and Treating RSV Infections and Related Conditions,"の表題の米国特許出願第11/263,230号に提供されており、その内容は、引用によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
この節の抗RSV-抗原抗体は、米国特許第5,824,307号；米国特許第6,818,216号；2000年11月28日に出願された米国特許出願第09/724396号；2000年11月28日に出願された米国特許出願第09/724,531号； 2001年11月28日に出願された米国特許第出願第09/996265号；2003年3月31日に出願された米国特許出願第10/403,180号；2001年3月1日に出願され、2002年7月25日に米国特許出願公開第2002/0098 189号として公開された米国特許出願第09/796848号；2002年4月29日に出願され、2003年5月29日に米国特許出願公開第2002/0097974号として公開された米国特許出願第10/135,636号； 2003年6月13日に出願された米国特許出願第10/461,904号； 2003年6月13日に出願され、2004年1月29日に米国特許出願公開第2004/0018200号として公開された米国特許出願第10/461,863号及びLosonsky により2005年10月31日に出願された、表題『RSV感染及びその関連状態の予防方法及び治療方法』の米国特許出願第11/263,230号（これらの内容は、引用によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されたように作製し、製剤し、投与し、治療的に又は予防的に使用することができる。
【０１５４】
【表１】
2008536815.tif 000003
【０１５５】
（5.4.2.2.  ヒトメタニューモウイルス（hMPV）の抗原に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む抗体、及び該抗体を含む組成物）
本発明は、ヒトメタニューモウイルス（hMPV）の抗原に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体、及び該抗体を含む組成物を提供する。チオエーテル架橋は、第5.2節に詳述してある。本発明の抗体は、1つ以上のチオエーテル架橋を含むことができる。チオエーテル架橋により、抗体の任意の2つの残基を連結することができる。ある実施態様において、チオエーテル架橋によって連結される残基は、天然型残基である。好ましい実施態様において、残基のうちの2つは、システイン残基である。チオエーテル架橋は、当業者に知識に従って可能な、抗体のいずれの位置にあり得る。好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖と軽鎖とを連結する。特定の好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖のシステインと軽鎖のシステインとを連結する。
【０１５６】
本発明のこの抗体は、ヒトメタニューモウイルス（hMPV）の抗原に特異的に結合する。「抗hMPV-抗原抗体」という用語は、hMPV抗原に免疫特異的に結合する抗体又はその抗体断片をいう。hMPV抗原は、hMPV核タンパク質、hMPVリンタンパク質、hMPV基質タンパク質、hMPV小疎水性タンパク質、hMPV RNA依存性hMPVポリメラーゼ、hMPV Fタンパク質及びhMPV Gタンパク質などのhMPVポリペプチド又はそれらの断片をいう。また、hMPV抗原は、hMPV核タンパク質、hMPVリンタンパク質、hMPV基質タンパク質、hMPV小さな疎水性タンパク質、hMPV RNA依存性hMPVポリメラーゼ、hMPV Fタンパク質及びhMPV Gタンパク質などのhMPVポリペプチド又はそれらの断片と比較して、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。
【０１５７】
本発明の抗hMP V-抗原抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。一部の好ましい実施態様において、本発明の抗hMPV抗体は、2003年7月25日に出願され、2004年5月20日に米国特許出願公開第US2004/009645 1 Alとして公開された米国特許出願第10/6088号に開示された抗体である。
この節の抗hMPV抗原抗体は、2003年7月25日に出願され、2004年5月20日に米国特許出願公開第2004/0096451 Alとして発行された米国特許出願第10/628,088（その内容は、引用によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように作製し、製剤し、投与し、治療的に使用又は予防的に使用することができる。
【０１５８】
（5.4.2.3. インテグリンαVβ3に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む抗体、及び該抗体を含む組成物）
本発明は、インテグリンαVβ3に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体、及び該抗体を含む組成物を提供する。チオエーテル架橋は、第5.2節に詳述してある。本発明の抗体は、1つ以上のチオエーテル架橋を含むことができる。チオエーテル架橋により、抗体の任意の2つの残基を連結することができる。ある実施態様において、チオエーテル架橋によって連結される残基は、天然型残基である。好ましい実施態様において、残基のうちの2つは、システイン残基である。チオエーテル架橋は、当業者に知識に従って可能な、抗体のいずれの位置にあり得る。好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖と軽鎖とを連結する。特定の好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖のシステインと軽鎖のシステインとを連結する。
【０１５９】
本発明のこの抗体は、インテグリンαVβ3に特異的に結合する。抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。一部の好ましい実施態様において、本発明の抗インテグリンαVβ3抗体は、MEDI-522（ビタキシン（登録商標））である。ビタキシン（登録商標）、及びビタキシン（登録商標）を含む組成物又は製剤は、例えば国際公開番号WO98/33919、WO00/78815及びWO02/070007；米国特許出願第09/33922号；2002年3月4日に出願され、2002年11月12日に米国特許出願公開第US2002/0168360として公開された米国特許出願第10/091,236に開示されており、そのそれぞれが、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
さらなる実施態様において、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体は、ビタキシン（登録商標）又はビタキシン（登録商標）の抗体結合性断片ではない。インテグリンαVβ3と免疫特異的に結合する公知の抗体の例は、11D2（Searle社）、マウスモノクローナルLM609（Scripps社、国際公開番号WO89/05155及び米国特許第5,753,230号、これらは、その全体が引用により本明細書に組み込まれる）、国際公開番号WO98/33919及びWO00/78815、これらのそれぞれが、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）、17661-37E及び17661-37E 1-5（USBiological）、MON 2032及び2033（CalTag）、ab7166（BV3）及びab 7167（BV4）（Abcam）、並びにWOW-1（Kiossesらの論文, Nature Cell Biology, 3:316-320）を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１６１】
インテグリンのαVβ3は、新血管、並びに多くの固形腫瘍、活性化マクロファージ、単球及び破骨細胞の表面上に見いだされた。従って、この節の抗インテグリンαVβ3抗体は、例えば研究用抗体として、又はいくつかの破壊的疾患の予防又は治療に使用することができる。
この節の抗インテグリンαVβ3抗体は、2002年3月4日に出願され、2002年11月12日に米国特許出願公開第2002/0168360として公開された米国特許出願第10/091,236号；2004年1月30日に出願された米国特許出願第10/769,712号；2004年1月30日に出願され、2004年9月9日米に国特許公開番号US2004/0176272として公開された米国特許出願第10/769,720号；2003年3月4日に出願された米国特許出願第10/379,145号；2003年3月4日に出願され、米国特許出願公開第US2004/0001835として公表された米国特許出願第101379,189；2004年1月30日に出願されたPCT出願番号PCT/USO4／02701；Huseらによる、表題『抗αVβ3組換えヒト抗体、該抗体をコードする核酸及び方法（Anti-αVβ3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same and methods）』の国際出願公開番号：WO00/78815 A1；及びHuseらの論文による、表題『抗αVβ3組換えヒト抗体、該抗体をコードする核酸及びその使用方法（Anti-αVβ3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same and methods of use）』の国際出願公開番号：WO98/33919 Al；国際公開番号WO89/05155（これらの内容は、（引用によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、作製し、製剤し、投与し、治療的に又は予防的に使用することができる。
【０１６２】
（5.4.2.4. CD2に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む抗体、及び該抗体を含む組成物）
本発明は、CD2に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体、及び該抗体を含む組成物を提供する。チオエーテル架橋は、第5.2節に詳述してある。本発明の抗体は、1つ以上のチオエーテル架橋を含むことができる。チオエーテル架橋により、抗体の任意の2つの残基を連結することができる。ある実施態様において、チオエーテル架橋によって連結される残基は、天然型残基である。好ましい実施態様において、残基のうちの2つは、システイン残基である。チオエーテル架橋は、当業者に知識に従って可能な、抗体のいずれの位置にあり得る。好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖と軽鎖とを連結する。特定の好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖のシステインと軽鎖のシステインとを連結する。
【０１６３】
本発明のこの抗体は、CD2に特異的に結合する。抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。一部の好ましい実施態様において、本発明の抗CD2抗体は、シプリズマブ（MEDI-507）である。シプリズマブは、CD2抗原を発現する細胞（具体的には、T細胞、ナチュラルキラー細胞及び胸腺細胞）に選択的に結合して、例えばT細胞リンパ腫又はその他の関連した状態の予防及び治療に使用することができる。MEDI-507は、例えば国際特許公開番号WO99/03502、国際出願番号PCT/US02/22273及びPCT／US02／06761、並びに米国出願公開番号09/462140、10/091,268及び10/091,313に開示されており、これらのそれぞれは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。MEDI-507は、ヒトCD2ポリペプチドに免疫特異的に結合するヒト化のIgG1κクラスモノクローナル抗体である。MEDI-507は、ラットモノクローナル抗体LO-CD2a/BTI-322由来のCDRをヒトIgG1フレームワーク内に挿入するための分子技術を使用して構築した。LO-CD2a/BTI-322は、例えば米国特許第5,730,979号、第5,817,311号及び第5,951,983号；並びに米国特許出願第09/056072号及び第09/462140号（これらのそれぞれは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されたアミノ酸配列又はアクセッション番号HB 11423として1993年7月28日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC（登録商標））10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209に寄託された株化細胞によって産生されるモノクローナル抗体のアミノ酸配列を有する。
【０１６４】
一部の実施態様において、抗体は、シプリズマブ（MEDI-507）のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、シプリズマブ（MEDI-507）のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。シプリズマブ（MEDI-507）のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列は、2003年3月6日に公開された米国特許出願公開第2003/0044406号（この内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に提供されている表1に収載されている。
【０１６５】
この節の抗CD2抗体は、2002年3月4日に出願され、米国特許出願公開第2003/0068320として2003年4月15日に公開された米国特許出願第10/091,268号；2002年3月4日に出願され、米国特許出願公開第2003/0044406号とし2003年3月6日に公開された米国特許出願第10/091,313号；及び2003年9月5日に出願され、米国特許出願公開第米国2004/0265315号として2004年12月30日に公開された米国特許出願第10/657,006号（これらの内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、作製し、製剤し、投与し、治療的若しくは予防的に又はその他の状況に使用することができる。
【０１６６】
（5.4.2.5. CD19に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む抗体、及び該抗体を含む組成物）
本発明は、CD19に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体、及び該抗体を含む組成物を提供する。チオエーテル架橋は、第5.2節に詳述してある。本発明の抗体は、1つ以上のチオエーテル架橋を含むことができる。チオエーテル架橋により、抗体の任意の2つの残基を連結することができる。ある実施態様において、チオエーテル架橋によって連結される残基は、天然型残基である。好ましい実施態様において、残基のうちの2つは、システイン残基である。チオエーテル架橋は、当業者に知識に従って可能な、抗体のいずれの位置にあり得る。好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖と軽鎖とを連結する。特定の好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖のシステインと軽鎖のシステインとを連結する。
【０１６７】
本発明のこの抗体は、CD19に特異的に結合する。抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。本発明の抗CD19抗体は、MT103（商標）である。MT-103（商標）は、二重特異性T細胞結合剤（BiTE（商標））と呼ばれる抗体誘導体の新規クラスの最も進んだ臨床上代表的なものである。BiTE化合物MT10（商標）は、癌細胞に対して患者自身の免疫系を向けかつ活性化させ、T細胞（白血球の非常に強力なタイプ）がB腫瘍細胞（癌性白血球）を破壊するように刺激する。MT-1O3（商標）は、癌性B細胞上に存在するが、それは他のタイプの血液細胞又は健康な組織上には存在しない特定のタンパク質（CD19抗原）を特異的に標的化し、従って従来の化学療法の副作用を回避する。
【０１６８】
この節の抗CD19抗体は、米国特許第6,723,538及び米国特許出願公開第2004/0162411（これらは、引用によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、作製し、製剤し、投与し、治療的若しくは予防的に又はその他の状況に使用することができる。MT-1O3（商標）のVH及びVLドメインのアミノ酸配列は、表1に収載されており、米国特許出願公開第2004/0162411号に提供されている。
【０１６９】
（5.4.2.6. Eph受容体に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む抗体、及び該抗体を含む組成物）
本発明は、Eph受容体に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体、及び該抗体を含む組成物を提供する。チオエーテル架橋は、第5.2節に詳述してある。本発明の抗体は、1つ以上のチオエーテル架橋を含むことができる。チオエーテル架橋により、抗体の任意の2つの残基を連結することができる。ある実施態様において、チオエーテル架橋によって連結される残基は、天然型残基である。好ましい実施態様において、残基のうちの2つは、システイン残基である。チオエーテル架橋は、当業者に知識に従って可能な、抗体の任意の位置にあり得る。好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖と軽鎖とを連結する。特定の好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖のシステインと軽鎖のシステインとを連結する。
【０１７０】
本明細書に使用される「Eph受容体」又は「Eph受容体チロシンキナーゼ」という用語は、Eph命名法委員会（Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90:403-404）によって同定され、及び認識されたか、又はされるであろう任意のEph受容体をいう。本発明のEph受容体には、EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB5及びEphB6を含むが、これらに限定されるわけではない。具体的実施態様において、Eph受容体ポリペプチドは、任意の種に由来する。好ましい実施態様において、Eph受容体ポリペプチドは、ヒトのポリペプチドである。Eph受容体ポリペプチドのヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列は、文献又は公共データベース（例えば、GenBank）において見つけることができ、又はヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列は、当業者に公知のクローニング及びシーケンシング技術を使用して決定することができる。ヒトEph受容体のヌクレオチド及びアミノ酸配列についてのGenBankアクセッション番号は、下記の表2に要約してある。
【０１７１】
【表２】
2008536815.tif 000004
【０１７２】
一部の実施態様において、本発明は、EphA2に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体、及び該抗体を含む組成物を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。一部の実施態様において、本発明の抗EphA2抗体は、EA2である。一部の好ましい実施態様において、EA2抗体は、ヒトのものであるか、又はヒト化されている。他の実施態様において、それは、EA5である。一部の好ましい実施態様において、EA5抗体は、ヒトのものであるか、又はヒト化されている。本発明の抗EphA2抗体を産生するハイブリドーマは、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC、私書箱1549、Manassas、VA 20108）に寄託されており、表3に示したとおりのアクセッション番号が割り当てられており、これらは、引用により組み込まれる。
【０１７３】
【表３】
2008536815.tif 000005
【０１７４】
EphA2は、成人上皮に発現される130kDaの受容体チロシンキナーゼであり、これは、低レベルで見いだされ、細胞-細胞接着部位内に豊富に存在する（Zantek,らの論文, Cell Growth & Differentiation 10:629, 1999; Lindberg,らの論文, Molecular & Cellular Biology 10: 6316, 1990）。EphA2は、多数の攻撃的なカルシノーマ細胞上でアップレギュレートされる。本発明の抗EphA2抗体は、例えば乳房、結腸、前立腺、肺及び皮膚癌を含む種々の腫瘍の治療に、並びに転移を予防するために使用することができる。
【０１７５】
この節の抗EphA2抗体は、2004年4月12日に出願された米国特許出願第10/823,259号；2004年4月12日に出願された特許米国出願第10/823,254号；2003年5月12日に出願され、2004年2月12日に米国特許出願公開第2004/0028685号として公開された米国特許出願第10/436,782号；2003年5月12日に出願され、2004年5月13日に米国特許出願公開第2004/009 1486としてとして公開された米国特許出願第10/436,783号； 2004年12月3日に出願された米国特許出願第11/004794号； 2004年11月19日に出願された米国特許出願第10/994,129号；2004年12月3日に出願された米国特許出願第11/004795号；及び2004年10月27日に出願された米国仮出願第60/662,517号、第60／622,711号、第60／622,489号（これらの内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、作製し、製剤し、投与し、及び治療的に使用又は予防的に使用することができる。
【０１７６】
一部の実施態様において、抗体は、EA2のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、EA2のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。EA2のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列及びEA2のVH鎖及びVL鎖のCDRは、表1に収載されており、2004年2月12日に公開された米国特許出願第2004/0028685号において提供されており、その内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７７】
本発明は、EphA4に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体、及び該抗体を含む組成物を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。本発明の抗EphA4抗体を産生するハイブリドーマは、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定の下で2004年6月4日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC、私書箱1549、Manassas、VA 20108）に寄託されており、アクセッション番号PTA-6044及びPTA-4381が割り当てられおり、これらは、引用により組み込まれる。
【０１７８】
EphA4は、脳、心臓、肺、筋肉、腎臓、胎盤、膵臓（Fox,らの論文 Oncogene 10:897, 1995）及びメラニン形成細胞（Easty,らの論文, Int. J. cancer 71:1061, 1997）に発現する受容体チロシンキナーゼである。EphA4は、多数の癌に過剰発現されている。この節の抗EphA4抗体は、例えば膵癌その他の治療においてEphA4の発現を減少させるために使用することができる。
【０１７９】
この節の抗EphA4抗体は、2004年6月7日に出願された米国特許出願第10/863,729号； 2004年12月3日に出願された米国特許出願第11/004794号； 2004年12月3日に出願された米国特許出願第11/004,794号及び11/004795号（これらの内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、作製し、製剤し、投与し、及び治療的に又は予防的に使用することができる。
【０１８０】
本発明は、EphB4の抗原に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体、及び該抗体を含む組成物を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。
この節の抗EphB4抗体は、米国特許出願公開第2003/0207447号、第2005/0249736号、第2005/0164965号及び第2005/0084873号、国際出願公開番号WO99/52541、米国特許第6,864,227号及び第6,579,683号（これらの内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように作製し、製剤し、投与し、及び治療的に又は予防的に使用することができる。
【０１８１】
（5.4.2.7. IL-9に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む抗体、及び該抗体を含む組成物）
本発明は、IL-9受容体に特異的に結合する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体、及び該抗体を含む組成物を提供する。チオエーテル架橋は、第5.2節に詳述してある。本発明の抗体は、1つ以上のチオエーテル架橋を含むことができる。チオエーテル架橋により、抗体の任意の2つの残基を連結することができる。ある実施態様において、チオエーテル架橋によって連結される残基は、天然型残基である。好ましい実施態様において、残基のうちの2つは、システイン残基である。チオエーテル架橋は、当業者に知識に従って可能な、抗体のいずれの位置にあり得る。好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖と軽鎖とを連結する。特定の好ましい実施態様において、チオエーテル架橋は、抗体の重鎖のシステインと軽鎖のシステインとを連結する。
【０１８２】
本発明のこの抗体は、IL-9に特異的に結合する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。一部の好ましい実施態様において、抗IL-9抗体MEDI-528である。一部の好ましい実施態様において、抗IL-9抗体は、7F3com-2H2である
一部の実施態様において、抗体は、7F3com-2H2のVH鎖及びVL鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗体は、7F3com-2H2のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。7F3com-2H2のVH鎖及びVL鎖のCDRのアミノ酸配列は、表1に収載され、かつ2005年1月16日に公開された米国特許出願第2005/002934号に提供されており、その内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８３】
IL-9は、喘息の重要なメディエーターであろうこと、並びに慢性閉塞性肺疾患（COPD）及び嚢胞性線維症を含むその他の呼吸器疾患にも寄与しているであろうことが示されている。この節の抗IL-9抗体は、喘息の予防又は治療に使用してもよい。
この節の抗IL-9抗体は、2004年4月12日に出願され、米国特許出願公開第2005/0002934 Al号として2005年1月6日に公表された米国特許出願第10/823,253；2004年4月12日に出願された10/823,810号2002年4月12日に出願された；米国仮出願第60/371,728号及び第60/371,683号；並びに2004年4月12日に出願された米国仮出願番号第60/561,845号（これらの内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように作製し、製剤し、投与し、及び治療的に又は予防的に使用することができる。
【０１８４】
（5.4.2.8. 治療的有用性を有する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む抗体、及び該抗体を含む組成物）
また、本発明は、表4に収載された抗体を含むが、これらに限定されない治療的有用性を有する少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む抗体を包含する。これらの表3に収載された抗体は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含むように設計し、及び／又は濃縮することができる。
【０１８５】
【表４】
2008536815.tif 000006
2008536815.tif 000007
2008536815.tif 000008
2008536815.tif 000009
2008536815.tif 000010
【０１８６】
（5.4.2.9. 炎症性疾患又は自己免疫疾患に使用することができる少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む抗体、及び該抗体を含む組成物）
本発明は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療及び／又は予防用の、当該技術分野において公知の任意の抗体を意図し、該抗体は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。本発明に従って操作することができる炎症性疾患の治療又は予防用に使用される抗体の非限定的な例を表5Aに示し、自己免疫疾患の治療又は予防用に使用される抗体の非限定的な例を、表5Bに示す。表5A及び5Bに収載されたこれらの抗体は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含むように設計し、及び／又は濃縮することができる。
【０１８７】
【表５Ａ】
2008536815.tif 000011
2008536815.tif 000012
2008536815.tif 000013
【０１８８】
【表５Ｂ】
2008536815.tif 000014
2008536815.tif 000015
【０１８９】
（5.5.ポリペプチドの産生）
本発明の巨大分子は、当該技術分野において公知の任意の方法又は技術によって産生することができる。例えば、ポリペプチドは、化学的に合成可能であり、又は組換え的に産生することができる。例えばSambrookらの文献, 1990. 『分子クローニング：研究室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）』（Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）を参照されたい。
【０１９０】
（5.5.1抗体の産生方法）
本発明の抗体は、抗体の合成のために当該技術分野において公知の任意の方法で産生可能であり、特に化学合成、又は好ましくは組換え発現技術で産生することができる。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術の使用又はこれらの組み合わせを含む、当該技術分野において公知の多種多様な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野において公知のもの、例えばHarlowらの文献, 『抗体：研究室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）』, （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版. 1988）; Hammerling,らの文献, 『モノクローナル抗体及びＴ細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas）』中の563-681頁（Elsevier, N.Y., 1981）（前記文献は、参照によりこれらの全体が援用される）に教示されるものを含むハイブリドーマ技術を使用して産生することができる。本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されるわけではない。「モノクローナル抗体」という用語は、真核生物の、原核生物の、又はファージのクローンを含む単一クローンに由来する抗体をいい、それらを産生する方法ではない。
【０１９１】
ハイブリドーマ技術を使用する特異的抗体産生方法、及びスクリーニング方法は、ルーチンであり、当技術分野において周知である。手短に述べると、マウスを抗原（全長タンパク質又はこれらのドメイン、例えば細胞外ドメイン又はリガンド結合ドメイン）で免疫し、一旦免疫応答が検出されたならば、例えば特定の抗原に特異的な抗体がマウス血清において検出されたならば、マウス脾臓を収集し、脾細胞を単離する。次いで、脾細胞を任意の適切な骨髄腫細胞、例えばATCCから入手可能な株化細胞SP2O由来の細胞に、周知の技術により融合させる。ハイブリドーマを限外希釈によって選択し、クローニングする。次いで、ハイブリドーマクローンを、当該技術分野において公知の方法により、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌する細胞についてアッセイする。一般に高レベルの抗体を含む腹水液は、マウスを陽性ハイブリドーマクローニングで免疫することによって産生することができる。
【０１９２】
従って、モノクローナル抗体は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することによって産生することができ、この場合、好ましくは、ハイブリドーマを：抗原を免疫したマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合させること；及び次いで融合により生じるハイブリドーマを、抗原に結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすること；によって産生する。
【０１９３】
本発明の抗体断片を、当業者に公知の任意の技術によって産生してよい。例えば、本発明のFab及びF（ab'）2断片を、パパイン（Fab断片を産生するため）又はペプシン（F（ab'）2断片を産生するため）などの酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク分解性切断によって産生してよい。F（ab'）2断片は、重鎖可変領域、軽鎖定常領域及びCH1ドメインを含む。さらに、本発明の抗体を、当該技術分野において公知の種々のファージディスプレイ法を使用して産生することもできる。
【０１９４】
ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に示される。特に、VH及びVLドメインをコードするDNA配列を、動物cDNAライブラリー（例えば、リンパ組織のヒト又はマウスcDNAライブラリー）から増幅させる。VH及びVLドメインをコードするDNAをPCRによってscFvリンカーと共に再結合させ、ファージミドベクター（例えば、pCANTAB 6又はpComb 3 HSS）内にクローン化する。ベクターを大腸菌に電気穿孔して、大腸菌をヘルパーファージで感染させる。これらの方法に使用されるファージは、典型的にはfd及びM13を含む繊維状ファージであり、通常、VH及びVLドメインを、組換えでファージ遺伝子III又は遺伝子VIIIのいずれかに融合させる。関心対象のエピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えばラベルされた抗原又は固体表面若しくはビーズに結合された抗原、若しくは固体表面若しくはビーズに捕獲された抗原を使用して選択又は同定することができる。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ方法の例は、Brinkmanらの論文, 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Amesらの論文, 1995, J. Immunol. Methods 184:177; Kettleboroughらの論文, 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-95 8; Persicらの論文, 1997, Gene 187:9; Burtonらの論文, 1994, Advances in Immunology 57:191-280; 国際出願番号PCT/GB91/01134；国際公開番号WO90/02809、WO91/10737、WO92/01047、WO92/18619、WO93/11236、WO95/15982、WO95/20401及びW097/13844；及び米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号及び第5,969,108号；に開示されたものを含み、これらのそれぞれは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９５】
ファージを、抗原結合活性についてスクリーニングしてもよい。上記の文献に記載されているように、ファージ選択後に、ファージから抗体コード領域を単離し、これを使用して、ヒト抗体又はその他の所望の抗原結合断片を含む抗体全体を産生し、例えば後述するように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む任意の所望の宿主で発現させることができる。また、国際特許公開番号WO92/22324；Mullinaxらの論文, 1992, BioTechniques 12:864; Sawaiらの論文, 1995, AJRI 34:26;及びBetterらの論文, 1988, Science 240:1041（前記文献は、引用によりこれらの全体が組み込まれる）に開示されたものなどの当該技術分野において公知の方法を使用して、Fab、Fab'及びF（ab'）2断片を組換えで産生する技術を使用することができる。
【０１９６】
抗体全体を産生するためには、VH又はVLヌクレオチド配列、制限部位及び制限部位を保護するためのフランキング配列を含むPCRプライマーを使用して、scFvクローンのVH又はVL配列を増幅することができる。当業者に公知のクローン技術を利用して、PCR増幅されたVUドメインをVH定常領域、例えばヒトγ4定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、PCR増幅されたVLドメインは、VL定常領域、例えばヒトκ又はλ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。好ましくは、VH又はVLドメインを発現するためのベクターは、EF-1αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメイン、定常ドメインのためのクローニング部位及びネオマイシンなどの選択マーカーを含む。また、VH及びVLドメインを、1つの必要な定常領域を発現するベクター内にクローン化していてもよい。次いで、当業者に公知の技術を使用して、重鎖変換ベクター及び軽鎖変換ベクターを株化細胞に同時トランスフェクトし、全長抗体、例えばIgGを発現する安定な株化細胞、又は一過性の株化細胞を作成する。
【０１９７】
インビボでのヒトにおける抗体の使用及びインビトロでの検出アッセイ法を含む、いくつかの使用に関しては、ヒト抗体又はキメラ抗体を使用することが好ましいであろう。完全ヒト抗体は、特にヒト被験体の治療的処置にとって望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用して、上記のファージディスプレイ法を含む当該技術分野において公知の種々の方法によって作製することができる。また、米国特許第4,444,887号及び第4,716,111号；並びに国際公開番号WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735及びWO91/10741を参照されたく；これらのそれぞれは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９８】
また、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して、ヒト抗体を産生することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに、又は相同的組換えによってマウス胚幹細胞に導入してもよい。或いは、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域及び多様性領域を、マウス胚幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えにより、ヒト免疫グロブリン座位の導入とは別々に、又は同時に非機能的にしてもよい。特に、JH領域のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生を防げる。修飾された胚幹細胞を、増殖させ、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを産生する。次いで、キメラマウスを繁殖させ、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を産生する。トランスジェニックマウスに、選択した抗原、例えば本発明のポリペプチドの全部又は一部を正常な様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが内部に保持するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の間に再編成して、その後にクラススイッチ及び体細胞突然変異を受ける。従って、このような技術を使用して、治療的に有用なIgG、IgA、1gM及びIgE抗体を産生することができる。このヒト抗体を産生するための技術の概要については、Lonberg及びHuszarを参照されたい（1995, Int. Rev. Immunol.13:65-93）。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術及びこのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば国際公開番号WO98/24893、WO96/34096及びWO96/33735；並びに米国特許第5,413,923号、第5、625号、第126、5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号及び第5、939、598号を参照されたく、これらは、引用によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。加えて、Abgenix社 （Fremont, CA）及び Medarex社 （Princeton, NJ）などの会社は、上に記述したのと同様の技術を使用して、選択された抗原に向けられたヒト抗体を提供する契約をすることができる。
【０１９９】
キメラ抗体は、非ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン定常領域に由来する可変領域を有する抗体などの、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を産生するための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229:1202; Oiらの論文, 1986, BioTechniques 4:214; Gilliesらの論文, 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202；並びに米国特許第6,311,415号、第5,807,715号、第4、816,567号及び第4,816,397号を参照されたく、これらは、引用によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。非ヒト種由来の1つ以上のCDR及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を含むキメラ抗体は、例えばCDR移植（EP 239,400；国際特許公開番号WO91/09967；並びに米国特許第5,225,539号、5,530,101及び5,585,089）、ベニヤリング（veneering）又はリサーフェーシング（resurfacing）（EP 592,106；EP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28（4/5）:489-498; Studnickaらの論文, 1994, Protein Engineering 7:805; and Roguskaらの論文, 1994, PNAS 9 1:969）；及び鎖混合（米国特許第5,565,332号）を含む、当該技術分野において公知の種々の技術を使用して産生することができる。
【０２００】
しばしば、フレームワーク領域のフレームワーク残基をCDRドナー抗体由来の対応する残基と置換し、抗原結合を変化させる、好ましくは改善させる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知方法によって、例えば抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基の相互作用のモデリング及び特定位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される。（例えば、米国特許第5,585,089号；及びRiechmannらの論文, 1988, Nature 332:323を参照されたく、これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２０１】
ヒト化抗体は、予め定められた抗原に結合することができ、かつ実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワーク領域と実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するCDRとを含む抗体又はその変異体若しくはその断片である。ヒト化抗体は、CDR領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のものに対応し、かつフレームワーク領域の全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも１つの、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。また、好ましくは、ヒト化抗体は、少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。通常、抗体は、軽鎖、並びに少なくとも重鎖可変ドメインの両方を含む。また、抗体は、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3及びCH4領域を含んでいてもよい。ヒト化抗体は、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含む免疫グロブリンの任意のクラス、並びにIgM、IgG、IgD、IgA及びIgEを含む任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体が細胞毒性活性を示し、かつ該クラスが典型的にはIgG1であることが望まれる場合、通常、定常ドメインは、補体結合定常ドメインである。このような細胞毒性活性が望ましくない場合、定常ドメインは、IgG2クラスのものであってもよい。ヒト化抗体は、複数のクラス又はアイソタイプ由来の配列を含んでいてもよく、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当技術分野における通常の技術の範囲内である。ヒト化抗体のフレームワーク及びCDR領域は、親配列、例えばドナーCDRに正確に一致する必要はなく、又はコンセンサスフレームワークは、その部位におけるCDR又はフレームワーク残基が、コンセンサス又は移入抗体のいずれにも対応しないように、少なくとも１つの残基の置換、挿入又は欠失により突然変異誘発されていてもよい。しかし、このような突然変異は、広範囲にわたることはないであろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも75%は、親フレームワーク領域（FR）及びCDR配列のものに対応すると考えられ、90%を超えることが多く、及び最も好ましくは95%を超える。ヒト化抗体は、例えばCDR移植（EP 239,400；国際特許公開番号WO91/09967；並びに米国特許第5,225,539号、5,530,101及び5,585,089）、ベニヤリング（veneering）又はリサーフェーシング（resurfacing）（EP 592,106；EP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28（4/5）:489-498; Studnickaらの論文, 1994, Protein Engineering 7:805; and Roguskaらの論文, 1994, PNAS 9 1:969）；鎖混合（米国特許第5,565,332号）及び例えば米国特許第6,407,213号、第5,766,886号、第5,585,089号、国特許公開番号WO9317105、Tanらの論文, 2002, J. Immunol. 169:1119-25, Caldasらの論文, 2000, Protein Eng. 13:353-60, Moreaらの論文, 2000, Methods 20:267-79, Bacaらの論文, 1997, J. Biol. Chem. 272: 10678-84, Roguskaらの論文, 1996, Protein Eng. 9:895-904, Coutoらの論文, 1995, Cancer Res. 55 （23 Supp）:5973s-5977s, Coutoらの論文, 1995, Cancer Res. 55:1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150:409-10, Pedersenらの論文, 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73, Jonesらの論文, 1986, Nature 321:522-525, Riechrnannらの論文, 1988, Nature 332:323,及び、Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biot. 2:593-596に開示された技術を含むが、これらに限定されるわけではない当該技術分野において公知の種々の技術を使用して産生することが��きる。しばしば、フレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させるため、好ましくは改善するために、CDRドナー抗体由来の対応する残基と置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知方法によって、例えば抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基の相互作用のモデリング及び特定位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される。（例えば、米国特許第5,585,089号；及びRiechmannらの論文, 1988, Nature 332:323を参照されたく、これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２０２】
さらに、本発明の抗体を順次利用して、当業者に周知の技術を使用して抗イディオタイプ抗体を産生することができる。（例えば、Greenspan及びBonaの論文, 1989, FASEB J. 7:437-444;及び、Nissinoffの論文, 1991, J. Immunol. 147:2429-2438を参照されたい）。本発明は、本発明の抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの使用の利用方法を提供する。
【０２０３】
（5.5.2抗体の組換え発現）
本発明の抗体、その誘導体、類似体又は断片（例えば、本発明の抗体若しくはその一部の重鎖若しくは軽鎖又は本発明の単鎖抗体）の組換え発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。一旦、本発明の抗体分子若しくは抗体の重鎖若しくは軽鎖をコードするポリヌクレオチド又はその一部（好ましくは、しかし必然的ではないが、重鎖又は軽鎖可変ドメインを含む）が得られれば、抗体分子の産生のためのベクターは、当技術分野において周知の組換えDNA技術を使用する技術によって産生させてもよい。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を製造するための方法を本明細書に記述してある。当業者に周知の方法を使用して、抗体コード配列、並びに適切な転写及び翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えばインビトロでの組換えDNA技術、合成技術及びインビボでの遺伝的組換えを含む。従って、本発明は、機能的にプロモーターに連結された、本発明の抗体分子をコードするヌクレオチド配列、抗体の重鎖若しくは軽鎖、抗体の重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン又はその一部、又は重鎖若しくは軽鎖CDRを含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく（例えば、国際公開番号WO86/05807及びWO89/01036；並びに米国特許第5,122,464号を参照されたい）、抗体の可変ドメインは、重鎖全体、軽鎖全体、又は重鎖及び軽鎖の両方の全体の発現のために、このようなベクターにクローン化してもよい。
【０２０４】
発現ベクターを従来技術によって宿主細胞に導入し、次いでトランスフェクト細胞を従来技術によって培養して本発明の抗体を産生する。従って、本発明は、機能的に異種プロモーターに連結された、本発明の抗体若しくはその断片、又はその重鎖若しくは軽鎖又はその一部、又は本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現のための実施態様において、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述するように、免疫グロブリン分子全体の発現のために、宿主細胞に同時発現させてもよい。
【０２０５】
種々の宿主-発現ベクター系を利用して、本発明の抗体分子を発現させてもよい（例えば、米国特許第5,807,715号を参照されたい）。このような宿主-発現系は、関心対象のコード配列が産生された後に精製されるであろう媒体を表すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換、又はトランスフェクトしたときに、インサイチューで本発明の抗体分子を発現するであろう細胞も表す。これらには、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA若しくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換されるた細菌（例えば、大腸菌及び枯草菌）などの微生物；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換させた酵母（例えば、サッカロマイセス・ピチア）；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）を感染させた植物株化細胞、若しくは抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換させた植物株化細胞；又は哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）に、若しくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含む組換え発現構築物を内部にもつ哺乳動物細胞系（例えば、COS、dO、BHK、293、NSO及び3T3細胞）を含むが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、大腸菌などの細菌細胞を組換え抗体分子の発現用に使用し、及びより好ましくは、特に組換え抗体分子全体の発現用に、真核細胞を組換え抗体分子の発現用に使用する。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）などの哺乳動物細胞は、抗体のための有効な発現系である（Foeckingらの論文, 1986, Gene 45:101; and Cockettらの論文, 1990, BioTechnology 8:2）。具体的実施態様において、免疫特異的に結合して、アゴナイズする抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターによって調節される。
【０２０６】
細菌系では、発現される抗体分子に関して意図される用途に応じて、多数の発現ベクターを都合に合わせて選択してよい。例えば、抗体分子の医薬組成物の産生のために、大量にこのようなタンパク質を産生するときは、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましいであろう。このようなベクターには、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列がlac Zコード領域とインフレームでベクターに個々に結合され得る大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherらの論文, 1983, EMBO 12:1791）；pINベクター（（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）；などを含むが、これらに限定されるわけではない。また、pGEXベクターを使用して、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させてもよい。一般に、このような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオン-アガロース・ビーズに対する吸着及び結合、それに続く遊離グルタチオンの存在下における溶出によって、溶解した細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングされる標的遺伝子産物をGST部分から放出させることができるように、トロンビン又は第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０２０７】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa calfornica）核多角体病ウィルス（AcNPV）をベクターとして使用し、外来遺伝子を発現させる。ウイルスをスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞において増殖させる。抗体コード配列を、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）内に個々にクローニングしてもよく、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置してもよい。
【０２０８】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスに基づいた発現系を利用してもよい。アデノウイルスを、発現ベクターとして使用する場合、関心対象の抗体コード配列をアデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーター及び三部リーダー配列に結合させてもよい。次いで、このキメラ遺伝子をインビトロ又はインビボでの組換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1又はE3）の挿入により、感染宿主において生存可能で、かつ抗体分子を発現することができる組換えウイルスが生じる（例えば、Logan及びShenkの論文, 1984, PNAS 81:355-359を参照されたい）。また、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために、特異的な開始シグナルが必要とされるかもしれない。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接する配列を含む。さらにまた、開始コドンは、挿入全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠と同相でなければならない。これらの外来翻訳制御シグナル及び開始コドンは、種々の起源の、天然型及び合成型のいずれかであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強してもよい。（例えばBittnerらの論文, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544を参照されたい）。
【０２０９】
加えて、挿入配列の発現を調整し、又は所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾してプロセスする宿主細胞株を選択してもよい。このようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）が、タンパク質の機能に重要であってもよい。種々の宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的、並びに特異的なメカニズムを有する。発現される外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確実にするように適切な株化細胞又は宿主系を選ぶことができる。この目的のために、転写一次産物の適当なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物の宿主細胞を使用してもよい。このような哺乳動物宿主細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O、NS1、T47D、NS0（全ての免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫株化細胞）、CRL7O3O及びHsS78Bst細胞を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２１０】
少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む抗体は、当業者に公知の抗体を産生用の任意の株化細胞によって組換えで産生することができる。黒色腫細胞において本発明の抗体を産生することが有利なことが見いだされている。ある実施態様において、本発明の抗体は、黒色腫細胞において組換えで産生される。一部の実施態様において、本発明の抗体は、CHO細胞において組換えで産生されない。他の実施態様において、本発明の抗体は、NSO株化細胞において組換えで産生されない。
【０２１１】
組換えタンパク質の長期多収産生のためには、安定発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する株化細胞を設計してもよい。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを使用する以外に、適切な発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択可能なマーカーによって制御されたDNAで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入に続いて、設計された細胞を濃縮培地中で1〜2日間培養させてもよい、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能マーカーが、選択に対する耐性を与えて、細胞がこれらの染色体に安定にプラスミドを組み込んで増殖し、対象を形成し、これを次にクローン化して、株化細胞内で増殖させることができる。この方法を都合に合わせて使用し、抗体分子を発現する株化細胞を設計してよい。このように設計された株化細胞は、特に抗体分子と直接又は間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価に有用であろう。
【０２１２】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerらの論文, 1977, Cell 11:223）、グルタミン合成酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyらの論文, 1980, Cell 22:8-17）遺伝子を含むが、これらに限定されるわけではない多くの選択系は、それぞれtk-、gs-、hgprt-又はaprt-細胞で使用することができる。また、代謝拮抗剤耐性を以下の遺伝子の選択の基礎として使用することができる：メトトレキセートに対する耐性を与えるdhfr（Wiglerらの論文, 1980, PNAS 77:357; O'Hareらの論文, 1981, PNAS 78:1527）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt（Mulligan及びBergの論文, 1981, PNAS 78:2072）；アミノ配糖体G-418に対する耐性を与えるneo（Wu及びWuの論文, 1991, Biotherapy 3:87; Tolstoshevの論文, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573; Mulliganの論文, 1993, Science 260:926;並びに、Morgan及びAndersonの論文, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191; May, 1993, TIB TECH 11:155-）；及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro（Santerreらの論文, 1984, Gene 30:147）。組換えDNA技術の技術分野において一般に公知の方法をルーチン的に適用して所望の組換えクローンを選択してもよく、このような方法は、例えばAusubelらの文献（編）, 『分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）』, John Wiley & Sons, NY （1993）; Krieglerの文献, 『遺伝子転移及び発現、研究室マニュアル（Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual）』, Stockton Press, NY （1990）;並びに、 Dracopoliらの文献（編）, 『ヒト遺伝学の最新プロトコル（Current Protocols in Human Genetics）』中の第１２章及び第１３章, John Wiley & Sons, NY （1994）; Colberre-Garapinらの論文, 1981, J. Mol. Biol. 150:1に記述されており、これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大させることができる（総説については、Bebbington及びHentschelの文献, 『ＤＮＡクローニングにおいて哺乳動物細胞でのクローン化遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの使用（The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning）』,第３巻.（Academic Press, New York, 1987）を参照されたい）。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能なときは、宿主細胞の培養に存在する阻害剤のレベルの増大により、マーカー遺伝子のコピーの数が増大する。増幅される領域には抗体遺伝子が付随するので、抗体の産生も増大されると考えられる（Crouseらの論文, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
【０２１４】
宿主細胞は、本発明の2つの発現ベクターで共感染させてよく、該第1のベクターは重鎖由来ポリペプチドをコードし、かつ該第2のベクターは軽鎖由来のポリペプチドをコードする。該2つのベクターには、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含んでいてもよい。或いは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、かつ発現を可能にさせる単一のベクターを使用してもよい。このような状況において、過剰な有毒な遊離重鎖を回避するために、軽鎖は、重鎖の前に配置するべきである（Proudfootの論文, 1986, Nature 322:52; 及び、Kohlerの論文, 1980, PNAS 77:219）。重鎖及び軽鎖のためのコード配列には、cDNA又はゲノムDNAを含んでいてもよい。
【０２１５】
一旦、本発明の抗体分子が組換え発現によって産生されたら、これを免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野において公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインA後の特異的抗原に対する親和性及びサイズカラムクロマトグラフィーによる）、遠心分離、差動的溶解度によって、又はタンパク質の精製のためのその他の任意の標準的技術によって精製してもよい。さらに、本発明の抗体又はその断片は、本明細書に記述されたか、又はさもなければ精製を容易にすることが当該技術分野において公知の異種ポリペプチド配列に融合してもよい。
【０２１６】
（5.6. 少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子及びその組成物を産生/濃縮する方法）
本発明は、巨大分子が濃縮された組成物を産生するための方法を提供し、該巨大分子は少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む。当業者に公知の巨大分子を産生するための任意の方法によって、巨大分子を産生することができる。ある実施態様において、巨大分子は、当業者に公知のポリペプチド産生用の任意の方法で産生可能なポリペプチドである。さらなる実施態様において、ポリペプチドは、上記の方法を含む、当業者に公知の抗体産生用の任意の方法によって産生することもできる抗体である。本明細書に記述したように、組成物中の抗体は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含むいずれの抗体でもあり得る。
また、本発明は、組成物中の少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子の量を増加させる方法を提供する。組成物中の巨大分子は、本明細書に詳細に記載されているように、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含むいずれの巨大分子であり得る。
【０２１７】
一部の実施態様において、本発明の方法は、4℃よりも高い温度にて、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子を濃縮するために十分な時間、組成物をインキュベートすることを含む。ある実施態様において、組成物は、室温でインキュベートされる。ある実施態様において、組成物は、10℃よりも高い温度にてインキュベートされる。ある実施態様において、組成物は、15℃よりも高い温度にてインキュベートされる。ある実施態様において、組成物は、20℃よりも高い温度にてインキュベートされる。ある実施態様において、組成物は、30℃よりも高い温度にてインキュベートされる。ある実施態様において、組成物は、37℃よりも高い温度にてインキュベートされる。ある実施態様において、組成物は、4℃〜40℃間の温度、4℃〜37℃の間、4℃〜30℃の間、15℃〜40℃の間、20℃〜37℃の間、30℃〜37℃の間又は37℃〜40℃の間にてインキュベートされる。
【０２１８】
いくつかのさらなる実施態様において、組成物を、37℃よりも高い温度にて3分以上の間インキュベートする。いくつかのさらなる実施態様において、組成物を、約37℃の温度にて複数日インキュベートする。いくつかのさらなる実施態様において、組成物を、約37℃の温度にて3分〜1日の間、3分〜1月の間又は1日〜1月の間インキュベートする。
ある実施態様において、組成物を、約40℃の温度にてインキュベートする。いくつかのさらなる実施態様において、組成物を、約40℃の温度にて3分以上インキュベートする。いくつかのさらなる実施態様において、組成物を、約40℃の温度にて複数日インキュベートする。いくつかの更なる実施態様において、組成物を、約40℃の温度にて複数ヵ月インキュベートする。いくつかのさらなる実施態様において、組成物を、約40℃の温度にて3分〜1日の間、3分〜1月の間又は1日〜1月の間インキュベートする。
【０２１９】
別の実施態様において、本発明の方法は、組成物を7よりも高いpHにて、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子を濃縮するために十分な時間インキュベートすることを含む。ある実施態様において、本発明の方法は、組成物を8よりも高いpHにてインキュベートすることを含む。いくつかのさらなる実施態様において、本発明の方法は、組成物を9よりも高いpHにてインキュベートすることを含む。別の実施態様において、本発明の方法は、組成物を10よりも高いpHにてインキュベートすることを含む。ある実施態様において、本発明の方法は、組成物を7〜10の間、7〜9の間、8〜9の間及び8〜10の間のpHにてインキュベートすることを含む。ある実施態様において、本発明の方法は、組成物を7よりも高いpHにて3分以上の間インキュベートすることを含む。いくつかのさらなる実施態様において、本発明の方法は、組成物を7よりも高いpHにて複数時間インキュベートすることを含む。いくつかのさらなる実施態様において、本発明の方法は、組成物を7よりも高いpHにて3分〜1時間の間、3分〜1日の間及び1時間〜1日との間インキュベートすることを含む。
【０２２０】
別の実施態様において、本方法は、組成物を還元剤と接触させることを含む。還元剤は、当業者に公知のように、タンパク質の調製と関連した任意の還元剤であり得る。ある実施態様において、還元剤は、β-メルカプトエタノール（BME）、ジチオスレイトール（DTT）、NEM、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）及びジチオエリトリトール（DTE）からなる群より選択される。
さらなる実施態様において、本発明の方法は、組成物を4℃よりも高い温度にて、かつ7よりも高いpHにて、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子を濃縮するために十分な時間インキュベートすること、を含む。
【０２２１】
別の実施態様において、本発明の方法は、組成物を4℃よりも高い温度にて、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子を濃縮するために十分な時間インキュベートすること、及び組成物を還元剤と接触させること、を含む。
別の実施態様において、本発明の方法は、組成物を7よりも高いpHにて、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子を濃縮するために十分な時間インキュベートすること、及び組成物を還元剤と接触させることを含む。
【０２２２】
本発明は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子を産生するための方法を提供し、該方法は、リン酸緩衝液又は類似の緩衝液などの緩衝液成分中で巨大分子をインキュベートすることを含む。また、本発明は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子を濃縮するための方法を提供し、該方法は、リン酸緩衝液又は類似の緩衝液などの緩衝液成分中で巨大分子をインキュベートすることを含む。ある実施態様において、緩衝液成分は、リン酸緩衝液である。特定の実施態様において、緩衝液成分は、His緩衝液ではない。本発明によれば、インキュベーションは、上に開示したpH及び／又は温度にて行ってもよい。さらに、特定の実施態様において、巨大分子は、上記のものなどの変性試薬と接触させてもよい。
【０２２３】
ある実施態様において、本発明は、チオエーテル架橋を含む巨大分子を単離する方法を提供する。チオエーテル架橋を含む巨大分子は、上記の方法のいずれに従っても製造することができる。巨大分子は、当業者に明らかな巨大分子を精製するためのいずれの方法によって単離することもできる。例えば、チオエーテル架橋を含むポリペプチドは、当業者に明らかな、標準的ポリペプチド精製技術に従って精製することができる。このような技術は、クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２２４】
ある実施態様において、チオエーテル架橋を含む巨大分子を、チオエーテル架橋を含まない巨大分子から変性条件下で精製することができる。有用な技術には、ゲル電気泳動、SDS-PAGE及びキャピラリーゲル電気泳動を含む。チオエーテル架橋を含む精製された巨大分子は、当業者に公知の技術に従って再生することができる。好都合なことに、チオエーテル架橋の安定性は、ジスルフィド結合を含む巨大分子によって許容的されるであろうものよりも、より強力に変性させ、再生することができる。
【０２２５】
さらなる実施態様において、チオエーテル架橋を含む巨大分子は、チオエーテル架橋を含まない巨大分子から天然条件下で精製することができる。精製は、当業者に明らかな任意の精製法に従うことができる。例えば、チオエーテル架橋を含む巨大分子とチオエーテル架橋を含まない巨大分子とを含む特定の組成物を還元条件でインキュベートすることができる。チオエーテル架橋を含まない巨大分子の還元により、四次構造又は三次構造の変化を生じ、チオエーテル架橋を含まない巨大分子からチオエーテル架橋を含む巨大分子の分離が可能になり得る。さらなる実施態様において、チオエーテル架橋を含む巨大分子は、チオエーテル架橋に特異的なアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。例えば、特定の実施態様において、当業者に公知の抗体親和性精製技術に従って、チオエーテル架橋結合に特異的な抗体を使用して、チオエーテル架橋を含む巨大分子を精製することができる。チオエーテル架橋結合に特異的な抗体は、例えばチオエーテル架橋を含む免疫原性分子を使用する標準的な免疫学的技術に従って調製することができる。このような免疫原性分子、例えばペプチド又はポリペプチドは、本明細書に記述された技術に従って調製することができる。
【０２２６】
さらなる実施態様において、チオエーテル架橋を含む巨大分子は、当業者に明らかな技術に従って、合成的に、又は準合成的に調製することができる。例えば、チオエーテル架橋を含むペプチド又はポリペプチドは、標準的な液相又は固相合成技術によって調製することができる。チオエーテル架橋を含む活性化された前駆体残基は、当業者に明らかな合成技術に従って調製することができる。ペプチド又はポリペプチドはそれ自体を使用することができ、又は当業者に公知の技術に従って、ペプチド又はポリペプチドをより大きな巨大分子内に取り込むことができる。
【０２２７】
（5.7. 少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子の量を減少させる方法）
本発明は、第1の精製法により生じる組成物中に少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む抗体の量を減少させる方法をさらに提供する。ある実施態様において、本方法は、第2の精製法の少なくとも１つの工程が前記第1の精製法の対応する工程よりも低温及びpHにて実施されることを除き、前記第1の精製法と同じ第2の精製方法での実施を含み、前記第2の精製法は、前記第1の精製法よりも低レベルの前記抗体種を生じる方法を実施することを含む。本精製法は、当該技術分野において公知の全ての抗体の精製法であり得る。例示的精製法には、クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２２８】
（5.8. 本発明の抗体及び組成物の使用）
本発明は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む巨大分子、及び本発明の巨大分子を含む組成物を提供する。本発明の巨大分子及び組成物は、当業者が認識する全ての状況、例えば診断又は療法などに使用することができる。
本発明は、少なくとも１つのチオエーテル架橋を含む単離された抗体及び本発明の抗体を含む組成物を提供する。本発明の抗体及び組成物は、当業者が認識する全ての状況に使用することができる。例えば、本発明の抗体及び組成物は、特定の抗原に対して直接使用することができる。また、本発明の抗体及び組成物は、被験体若しくは生体試料（例えば、細胞又は組織）における抗原の発現の検出／同定のために、インビボ又はインビトロのいずれかでの診断アッセイ法に使用することができる。本発明の抗体及び組成物は、障害又はその1つ以上の症候を治療、管理、予防、又は寛解させるために、単独で、又はその他の療法と併用して使用することができる。
【０２２９】
本発明は、融合タンパク質及び融合タンパクを含む組成物を提供し、該融合タンパク質は、抗体又はその断片のFcドメインを含み、かつ該Fcドメイン又はFcドメイン断片は、少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む。また、本発明は、抗体のCH1、CH2、CH3及び／又はCLドメインを含む融合タンパク質及び組成物を提供し、該CH1、CH2、CH3及び／又はCLドメインは、少なくとも1つのチオエーテル架橋を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、CH1、CH2、CH3及び／又はCLドメインの2つ、3つ又は全てを含む。本発明の融合タンパク質及び組成物は、当業者が認識する全ての状況、例えば診断又は療法その他に使用することができる。
【０２３０】
本発明は、障害を予防、管理、治療、又は寛解させるために方法を提供し、該方法は、その必要がある被験体に対して、本発明の1つ以上の抗体を、単独で又は本発明の抗体以外の1つ以上の療法（例えば、1つ以上の予防薬又は治療薬）と併用して投与することを含む。また、本発明は、本発明の1つ以上の抗体と本発明の抗体以外の1つ以上の予防薬又は治療薬を含む組成物、並びに前記組成物を利用して障害又はその1つ以上の症候を予防、管理、治療、又は寛解させる方法を提供する。治療薬又は予防薬には、小分子、合成薬、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸（例えば、アンチセンスヌクレオチド配列、3重らせん体、RNAi及び生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むが、これらに限定されるわけではないDNA及びRNAヌクレオチド）、抗体、合成型又は天然型の無機分子、擬態薬及び合成又は天然型の有機分子を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２３１】
障害又はその1つ以上の症候の予防、管理、治療又は寛解のために有用であることが公知か、又は使用されてきたか、若しくは現在使用されている全ての療法を、本明細書に記述した本発明に従った抗体又は本発明の組成物と併用して使用することができる。障害又は1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させるために使用されてきたか、又は現在使用されている療法（例えば、予防薬又は治療薬）に関する情報については、例えばGilmanらの論文, Goodman及びGilman'sの文献: 『治療における薬理学的基礎（The Pharmacological Basis of Therapeutics）』, 第１０版, McGraw-Hill, New York, 2001; 『診断及び治療におけるメルクマニュアル（The Merck Manual of Diagnosis and Therapy）』, Berkow, M. D.らの文献（編）, 第１７版, Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, N.J., 1999;『薬のセシルテキストブック（Cecil Textbook of Medicine）』, 第２０版, Bennett及びPlumの文献 （編）, W. B. Saunders, Philadelphia, 1996を参照されたい。このような療法の例には、免疫調節薬、抗炎症薬（例えば、副腎コルチコイド、副腎皮質ステロイド（例えば、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン）、糖質コルチコイド、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク及びCOX-2阻害剤）、抗癌剤、鎮痛剤、ロイコトリエンアンタゴニスト（例えば、モンテルカスト、メチルキサンチン、ザフィルルカスト及びジロートン）、β2-アゴニスト（例えば、アルブテロール、ビテロール、フェノテロール、イソエタリン、メタプロテレノール、ピルブテロール、サルブタモール、テルブタリンフォルモテロール、サルメテロール及びサルブタモールテルブタリン）、抗コリン作用薬（例えば、臭化イプラトロピウム及び臭化オキシトロピウム）、サルファサラジン、ペニシラミン、ダプソン、抗ヒスタミン剤、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン）、抗ウイルス薬及び抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン、ミトラマイシン及びアントラマイシン（AMC））を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２３２】
具体的実施態様において、本発明は、被験体においてRSV感染又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させる1つ以上のヒト化抗RSV抗体を、被験体、好ましくはヒト被験体に投与することを提供する。一つの実施態様において、本発明は、RSV感染又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させる方法を包含し、前記方法は、その必要な被験体に、予防的又は治療的に有効量の1つ以上のヒト化抗RSV抗体の用量を投与することを含む。別の実施態様において、本発明は、RSV感染又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させる方法を提供し、予防的に、前記方法は、予防的又は治療的に有効量の1つ以上のヒト化抗RSV抗体を投与すること、及び別の療法を含む。
【０２３３】
具体的実施態様において、本発明は、被験体においてT細胞リンパ腫に関連した状態又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理又は寛解させる1つ以上のヒト化抗CD2抗体を、被験体、好ましくはヒト被験体に投与することを提供する。一つの実施態様において、本発明は、T細胞リンパ腫に関連した状態又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させる方法を包含し、前記方法は、その必要な被験体に、予防的又は治療的に有効量の1つ以上のヒト化抗CD2抗体の用量を投与することを含む。別の実施態様において、本発明は、T細胞リンパ腫に関連した状態又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させる方法を提供し、前記方法は、予防的又は治療的に有効量の1つ以上のヒト化抗CD2抗体を投与すること、及び別の療法を含む。
【０２３４】
具体的実施態様において、本発明は、呼吸状態又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させるための1つ以上のヒト化抗IL-9抗体を、被験体、好ましくはヒト被験体に投与することを提供する。一つの実施態様において、本発明は、呼吸器疾患又はその1つ以上の症候（例えば、アレルギー、喘鳴及び喘息）を予防、治療、管理、又は寛解させる方法を包含し、前記方法は、その必要な被験体に、予防的又は治療的に有効量の1つ以上のヒト化抗IL-9抗体の用量を投与することを含む。別の実施態様において、本発明は、呼吸器感染又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させる方法を提供し、前記方法は、予防的又は治療的に有効量の1つ以上のヒト化抗IL-9抗体を投与することを含む。
【０２３５】
具体的実施態様において、本発明は、高増殖性細胞疾患又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させる1つ以上のヒト化抗EphA2抗体を、被験体、好ましくはヒト被験体に投与することを提供する。一つの実施態様において、1つ以上のヒト化抗EphA2抗体は、癌又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させるために、被験体に対して単独で、又はその他の薬剤と併用して投与される（例えば、米国特許出願第10/436,782号参照されたく、これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の実施態様において、1つ以上のヒト化抗EphA2抗体は、非腫瘍性高増殖性細胞、特に高増殖性上皮及び内皮細胞又はその1つ若しくは症候を含む障害を予防し、治療し、管理し、又は寛解させるために、被験体に対して単独で、又はその他の薬剤と併用して投与される（例えば、米国特許出願第60/462,024号を参照されたく、これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに別の実施態様において、1つ以上のヒト化抗EphA2抗体は、診断目的又はスクリーニング目的で使用される。
【０２３６】
具体的実施態様において、本発明は、被験体における膵癌などの癌又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させるために、被験体、好ましくはヒト被験体に、1つ以上のヒト化抗EphA4抗体を投与することを提供する。一つの実施態様において、本発明は、膵癌などの癌又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させる方法を包含し、前記方法は、その必要な被験体に、予防的又は治療的に有効量の1つ以上のヒト化抗EphA4抗体の用量を投与することを含む。別の実施態様において、本発明は、膵癌などの癌又はその1つ以上の症候を予防、治療、管理、又は寛解させる方法を提供し、前記方法は、予防的又は治療的に有効量の1つ以上のヒト化抗EphA4抗体を投与すること、及び別の療法を含む。
【０２３７】
具体的実施態様において、本発明は、癌若しくはその1つ以上の症候を予防し、療法し、管理し、若しくは寛解させるか、又は被験体における血管形成の阻害するための、被験体、好ましくはヒト被験体に対する1つ以上のヒト化抗EphB4抗体の投与を提供する。一つの実施態様において、本発明は、癌若しくはその1つ以上の症候を予防し、療法し、管理し、若しくは寛解させるか、又は被験体における血管形成の阻害するための方法を包含し、前記方法は、その必要な被験体に対して1つ以上のヒト化抗EphB4抗体の予防的又は治療的に有効量の用量を投与することを含む。別の実施態様において、本発明は、癌若しくはその1つ以上の症候を予防し、療法し、管理し、若しくは寛解させるか、又は被験体における血管形成の阻害するための方法を提供し、前記方法は、1つ以上のヒト化抗EphB4抗体及び別の療法の予防的又は治療的に有効量を投与することを含む。
【０２３８】
本発明の抗体及び組成物を、特定の抗原に対して直接使用することができる。一部の実施態様において、本発明の抗体及び組成物は、抗体が結合する細胞の溶解を媒介することができるサブクラス又はアイソタイプに属する。具体的実施態様において、本発明の抗体は、細胞表面タンパク質との複合体形成により、血清補体を活性化させ、及び／又はナチュラルキラー細胞又はマクロファージなどのエフェクター細胞を活性化させることにより抗体依存的細胞障害作用（ADCC）を媒介するサブクラス又はアイソタイプに属する。
【０２３９】
抗体の生物活性は、大部分は、抗体分子の定常ドメイン又はFc領域によって決定されることが公知である（Uananue及びBenacerrafの文献, 『免疫学のテキストブック（Textbook of Immunology）』, 第２版, Williams & Wilkins, p. 218（1984））。これは、前記ドメイン又はFc領域が補体を活性化し、及び白血球によって遂行されるような抗体依存的細胞障害（ADCC）を媒介する能力を含む。異なるクラス及びサブクラスの抗体は、この点で異なり、同じサブクラスではあるが、種が異なるものに由来する抗体も同様であり：本発明に従えば、所望の生物活性を有するこれらのクラスの抗体が調製される。これらの抗体の調製には、公知の技術による抗体定常ドメインの選択及びヒト化抗体へのこれらの組み込みを含む。例えば、IgG3及びIgG2aクラスのマウス免疫グロブリンは、同族の抗原を発現する標的細胞に対して結合することにより血清補体を活性化することができ、従って、IgG3及びIgG2aエフェクター機能を取り込むヒト化抗体は、特定の治療適用にとって望ましい。
一部の実施態様において、本発明の抗体及び組成物は、患者を受動免疫させるのに有用である。
【０２４０】
また、被験体若しくは生体試料（例えば、細胞又は組織）における抗原の発現の検出／同定のために、本発明の抗体及び組成物をインビボ又はインビトロのいずれかでの診断アッセイ法に使用することができる。本抗体又は抗体を含む組成物の診断アッセイ法における使用の非限定的な例は、米国特許第6,392,020号；第6,156,498号；第6,136,526号；第6,048,528号；第6,015,555号；第5,833,988号；第5,811,310号；第8 5,652,114号；第5,604,126号；第5,484,704号；第5,346,687号；第5,318,892号；第5,273,743号；第5,182,107号；第5,122,447号；第5,080, 883号；第5,057,313号；第4,910,133号；第4,816,402号；第4,742,000号；第4,724,213号；第4,724,212号；第4, 624,846号；第4,623,627号；第4,618,486号；第4,176,174号に示されており、これらの全ては、引用により本明細書に組み込まれる。抗原及びその抗体のために適した診断アッセイ法は、使用される特定の抗体に依存する。非限定の例には、ELISA法、サンドイッチアッセイ法及び立体阻害アッセイ法がある。本発明の抗体を使用するインビボでの診断アッセイ法用に、抗体をX線、コンピュータ断層撮影法（CT）超音波又は磁気共鳴映像法（MRI）などの撮像技術によって検出することができるラベルに抱合させてもよい。また、本発明の抗体は、組換え細胞培養物又は天然の供与源からの抗原の親和性精製用にも使用することができる。
【実施例】
【０２４１】
（6. 実施例）
以下の実施例は、本発明を例証するために提示するものであり、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
【０２４２】
（6.1. チオエーテル架橋を含み、かつRSV抗原に特異的に結合する抗体の同定、単離、特徴付け）
本実施例は、チオエーテル架橋を含み、かつRSV抗原に特異的に結合する抗体の、同定、単離、特徴付けを例証する。本実施例では、モタビズマブを使用する。上述の節で考察したように、モタビズマブは組換えDNA技術によって産生されるIgG1モノクローナル抗体であり、RSVの融合（F）タンパク質のA抗原性部位のエピトープに特異的に結合する。モタビズマブ抗体は、ヒト化抗体であり、かつ標的となる抗原に特異的なCDR領域、並びにヒトγ1重鎖及びκ軽鎖の定常領域からなる。モノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖を連結する2つの分子間ジスルフィド結合とヒンジ領域における別の2つの分子間ジスルフィド結合とを有する。
【０２４３】
（6.1.1 チオエーテル架橋を含む抗体の同定）
（6.1.1.1. 還元CGEによる抗体の同定）
還元キャピラリーゲル電気泳動（rCGE）を実施した。モノクローナル抗体（Mab）試料をβメルカプトエタノールの存在下、SDSを含む試料希釈緩衝液中に希釈し、沸騰水浴中で10分間加熱して、冷却後にHP 3Dキャピラリー電気泳動システム（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）に注入した（12-14）。電気泳動注入は、-10 kVで40秒間行った。分離は、Hewlett-Packardの拡張光路溶融シリカキャピラリー（直径50μm、全長38.5cm、有効長さ30cm）で、390 V/cmの電場にて、50℃で20分間実施した。検出は、220nmであった。分子量マーカー：リゾチーム（14,400 Da）、トリプシンインヒビター（21,500Da）、炭酸脱水酵素（31,000Da）、卵白アルブミン（45,000Da）、血清アルブミン（66,200Da）、ホスホリラーゼB（97,000Da）、β-ガラクトシダーゼ（116,000Da）、及びミオシン（200,000Da）も解析した。
【０２４４】
CGEは、従来のスラブゲル電気泳動に使用される架橋ポリアクリルアミド篩分けに類似した動的篩分け効果をもたらす専売の高分子溶液を利用する。CGE及びSDS-PAGEゲルシステムの両方は、分子量マーカーで系を較正することにより、モノクローナル抗体の断片化又は凝集事象などの類似の情報を提供する。しかし、モノクローナル抗体が還元条件下のCGEで解析される場合、結果は、より再現性良く、かつ定量しやすいものとなる。rCGEは、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の移動時間に相当するピークパターンを生じる。rCGEによるMabの解析により、3つの主要なバンド：重鎖、軽鎖及び内部標準（安息香酸）を示すバンドが予想される。rCGEによるMabの解析を図1Aに示す。バンド（ピーク）は、5.6分、11分、13分に見られ、それぞれ内部標準、軽鎖及び重鎖に対応する。加えて、予想外のバンドが14.5分に観察され、これは分子量マーカーに基づいて見かけの分子量92 kDaに相当した（図示せず）。このさらなるバンドは、通常総タンパク質の0.5〜2%のレベルで存在した。
【０２４５】
（6.1.2  SDS-PAGEによる抗体の同定）
また、さらなるバンドが関連産物であることを検証するために、モノクローナル抗体を還元条件下のSDS-PAGE（図1B）、それに続いくウエスタンブロッティングによって解析した。
SDA-PAGE解析において、Mab試料を5%の2-メルカプトエタノール存在下又は不在下で、2%のSDSを含む試料希釈緩衝液に希釈した。生じた試料を80℃にて10分間加熱し、冷却して、1レーンあたり2μgのタンパク質を4〜20％のポリアクリルアミド濃度勾配ゲル（Novex）で分離した（15）。次いで、ゲルをクマシーブルーで染色、脱色し、濃度測定を行った。使用した分子量マーカーは、以下の通りであった：ミオシン（200,000Da）、β-ガラクトシダーゼ（116,000Da）、ホスホリラーゼb（97,400Da）、ウシ血清アルブミン（66,200Da）、卵白アルブミン（45,000Da）、炭酸脱水酵素（31,000Da）、ダイズトリプシンインヒビター（21,500Da）、リゾチーム（14,400Da）、及びアプロチニン（6,500Da）。
【０２４６】
ウエスタンブロットを実施した。25mM トリス、192mMグリシン及び20%のメタノール溶液中で30分間エレクトロブロッティング（定電流250mA／ブロット）することによって、SDS-PAGEゲルをポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜（Pierce社）に転写した（16）。PVDF膜を室温にて１時間、1×トリス緩衝生理食塩水（Bio-Rad社, Hercules, CA）及び0.05%のTween-20（TBST）中でブロッキングした。該ブロットを1：1000希釈のビオチン標識された軽鎖又は重鎖特異的IgG（Kirkegaard & Perry社, Gaithersburg, MD）と共に2時間インキュベートした。膜をTBSTで3回洗浄した後、1：5000希釈のストレプトアビジン及びアルカリホスファターゼ（Pierce社）と共に室温で2時間インキュベートした（17）。アルカリホスファターゼ活性を、5-ブロモ4-クロロ-3'-インドールリン酸p-トルイジン塩／ニトロブルーテトラゾリウム・クロライド（BCIP/NBT）現像液（Kirkegaard & Perry社）によって示した。
【０２４７】
rCGEから得られる結果と同様に、重鎖及び軽鎖に加えて、92kDaの見かけの分子量を有するさらなるバンドが還元SDS-PAGEゲルで観察された（図1B）。92kDaのバンドをさらにウエスタンブロッティングによって評価して、重鎖及び軽鎖の両方に特異的な抗体に反応することが示された。より強力な還元剤（例えば、DTTやNEM）を使用したときも、92 kDaバンドに変化は認められなかった。この結果は、92 kDaバンドが重鎖及び軽鎖の架橋種である可能性を示した（図1C）。
【０２４８】
（6.1.3  サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）による抗体架橋種の分離）
rCGE及び還元SDS-PAGEで観察された92 kDaバンドの性質をさらに調べるために、重鎖-軽鎖（H-L）分子種をSECによる詳細な特徴づけのために分離した。
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を実施し、Mab試料（53mg/mL、10mg）を630μLの8M 塩酸グアニジン及び130mM トリス（pH 7.6）、40μlの水、並びに120μlの500mM DTTと混合し、37℃にて１時間インキュベートした。原液の4-ビニルピリジン（20μL）を試料に添加して、暗所において室温にてさらに１時間インキュベートした。還元アルキル化された抗体を500mLの6Mグアニジン塩酸中で、10,000 MWCO透析カセットを使用して、4℃にて2時間透析し、サイズ排除G3000 SWXLカラム（5μm、300Å、7.8×300 mm、TosoHaas）に注入した。移動相は、6M 塩酸グアニジン及び1M リン酸（pH 6.8）であり、0.5mL/分の流速にて均一濃度で流した。280 nmにおける紫外線吸収で、重鎖及び軽鎖のピークの前により早い溶出画分が検出され、さらなる特徴付けのために回収した。回収したSEC画分をMicrocon-YM-30フィルターユニットを使用して濃縮し、TosoHaas G3000 SWXLカラムに再注入して、同定及び純度を検証した。サイズ排除クロマトグラフィーによる架橋種の分離。
【０２４９】
rCGEによって示されたように、タンパク質種は、低レベルで存在しており、抗体が還元された後でのみ分離された：従って、特徴付けのために必要な十分量を得ることは困難であった。SECをH-L種を回収するための選択方法とした。変性し、還元し、アルキル化したモノクローナル抗体を、修飾された種を含む還元された重鎖及び軽鎖が沈殿及び凝集しないように、6 M塩酸グアニジンを含む移動相を使用するSECによって分離した（図2）。重鎖及び軽鎖のピークは、それぞれ12.7分及び15.4分に検出され、さらなるピークが、12分に観察された。この早く溶出するピークは、2.1%のレベルで存在し、一方で、重鎖は75.4%で、軽鎖は22.4%であった。分子量が高い化合物ほど、より早くカラムを通過するため、早く溶出するピークは、重鎖及び軽鎖よりも高い分子量を有するはずである。この早く溶出するピークをその後の特徴付けのために回収した。
【０２５０】
（6.1.4   SEC精製から得られたチオエーテル架橋を含む抗体の特徴付け）
SECプロフィール中の早期溶出するピークを還元SDS-PAGE、ウエスタンブロット、LC-MS及びタンデム型質量分析計によるトリプシンペプチドマッピングで解析した。SEC画分では、還元SDS-PAGEにより、92 kDaの見かけの分子量をもつバンドが示された。ウエスタンブロットでは、このバンドは、重鎖及び軽鎖に特異的な検出抗体に反応性を示した。このデータは、SEC画分がrCGE及び還元SDS-PAGEで検出された架橋種であることを示した。
【０２５１】
（6.1.4.1. LC-ESI-MSによる分子量決定）
抗体のFab断片を調製した。Mab（1mg）を1:100の酵素対タンパク質の比で、2.45 mg/mLシステインを含む500μLのリン酸緩衝液、pH 7.1中で、37℃にて１時間、パパイン（Sigma社）によって消化した。パパイン消化物を2mMリン酸、pH 7.2を使用して、プロテインLと結合したHiTrap NHS活性型HPアフィニティーカラムに充填した。プロテインLカラムに結合したFab部分を、100mMリン酸、pH 2.0によって溶出し、回収して、2Mトリス（pH10）で中和し、30,000 MWCO Microconフィルターユニットで濃縮した。
【０２５２】
SEC画分及びFab断片のオンラインLC-MS解析は、Agilent 1100 HPLCシステム（Agilent Technologies, Palo Alto, Ca）及びThermo Electron LCQDuo又はLTQイオントラップ質量分析計（Thermo Electron社, San Jose, Ca）を使用して行った。SEC画分は、UV検出器、続いてLCQ質量分析計に接続された逆相C18カラム（Jupiter、5μm、300Å、2×250 mm、Phenomenex）で解析した。Fab断片は、LTQ質量分析計が接続されたPoroshell逆相300-SB-C3カラム（5μm、300Å、2.1×75 mm、Agilent Technologies）で解析した。HPLCシステムには、2つの異なる移動相：移動相A（0.1% TFA水溶液）及び移動相B（0.1% TFAを含むアセトニトリル）を使用した。試料を200μL／分の流速で、移動相Bの直線濃度勾配を使用して分離した。溶出したタンパク質を220 nmでの紫外線検出によってモニターして、陽イオンモードで作動している質量分析計に誘導した。Bioworksバージョン3.1（Thermo Electron）のデコンボリューションプログラムを使用して質量スペクトルをデコンボリュートし、タンパク質の分子量を得た。
【０２５３】
SECプロフィールにおいて早く溶出するピークの実際の分子量を、LC-ESI-MS解析で決定した。質量スペクトルのデコンボリューションの後、アルキル化重鎖及び軽鎖の合計の分子量に一致する75,860 Daの分子量が得られた。この結果により、rCGE及び還元SDS-PAGEで観察された92 kDaバンドが75 kDaの実際の分子量をもつ、１つの重鎖及び１つの軽鎖を含む架橋種であることが判明した。文献では、SDS-PAGE解析の過程で、半分の抗体分子が加熱なしで64kDaにて移動するが、SDS中での加熱により92kDaに移動することが報告されていた（9）。この現象は、非変性条件下においてタンパク質はその重量の90〜100％の重量のSDSと結合するが、存在するすべてのジスルフィド結合が還元されると、より多く（タンパク質の重量の1.4倍まで）のSDSが結合することを証明したPitt-Rivers及びImpiombato（19）の研究によって説明されるかもしれない。これは、還元SDS-PAGEにおいて、半分の抗体（熱処理後）の見かけのMWが、その実際のMWよりも高くなるという観察と一致している。
【０２５４】
（6.1.4.2. タンデム型質量分析計によるペプチドマッピング）
架橋修飾の性質をさらに調べるために、SEC画分を消化して、タンデム型質量分析でのトリプシンペプチドマッピングで解析した。
ペプチドマッピング用に、2つの異なる手順：還元した試料についてのトリプシンペプチドマッピング；及び非還元Fab試料についてのLys-Cペプチドマッピング；を使用した。トリプシンペプチドマッピング法において、還元アルキル化された抗体及び関心対象の濃縮されたSEC画分をそれぞれ10,000 MWCO透析カセットを使用して100mMトリス緩衝液、pH 8.0を含む6 M尿素に中で4℃にて2時間透析した。透析した画分を試料／トリス緩衝液1:2v/vの比で50mMトリス緩衝液（pH 8.1）と混合した。トリプシン（1mM塩酸中の1μg/μLトリプシン）を直ちに25:1のタンパク質基質対酵素の比で添加した。37℃にて4〜5時間消化を行い、2%の終濃度にまでトリフルオロ酢酸（TFA）を添加することによって反応を停止させた。Lys-Cマッピング法については、Fab画分をLys-C（Wako Chemicals）により、5M尿素、25mMトリス塩酸緩衝液、1mM EDTA（pH 8.5）中、10:1のタンパク質対酵素比で37℃にて8時間消化した。
【０２５５】
トリプシンペプチドのオンラインLC-MS/MS解析を、Agilent 1100 HPLCシステム及びThermo Electron LTQイオントラップ質量分析計を使用して実施した。HPLCシステムは、UV検出器、それに続く質量分析計に接続されたPolaris C 18-Aカラム（5μm、4.6×250mm、Varian）を備えていた。HPLCシステムには、2つの異なる移動相：移動相A（0.02% TFA水溶液）及び移動相B（0.02% TFAを含むアセトニトリル）を使用した。70分にわたって0〜20%移動相Bの、90分にわたって20〜36%勾配を使用して、0.7mL／分の流速でペプチドを溶出した。溶出したペプチドは、2つの異なる直結した検出システム：220 nmにおけるUV検出；及び陽イオンモードでのLCQ質量分析計；でモニターした。質量分析計は、ダイナミックエクスクルージョンを可能にしたデータ依存的「トリプルプレイ」モードで作動させた。このモードでは、この装置は、常にフルスキャン質量スペクトル（m/z 300-2000）を取得する。シグナルが予め定めた閾値を越えたときに、高分解能ズームスキャン及びMS/MSスキャンを取得した。
チオエーテル連結及びジスルフィド連結したペプチドの正確な質量を得るために、Lys-C消化物を、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（FTM）をインターフェースで接続したThermo Electron LTQを使用して解析した。
【０２５６】
SEC画分を消化し、タンデム型質量分析でのトリプシンペプチドマッピングによって解析した。早く溶出するSEC画分のペプチドマッププロフィールを、分画していないモノクローナル抗体のペプチドマッププロフィールと比較した（図３）。提案した架橋種は、半分の抗体であるので、そのペプチドマッププロフィールは、モノクローナル抗体のペプチドマッププロフィールに一致するはずであり、相違点があれば修飾部位を示すはずである。SEC画分のペプチドマッププロフィール（図3A）において、トリプシンペプチドH19、H20、L20及びL19-L20は、有意に減少しており、その一方で、それぞれ1228及び4152の分子量を有する2つの新たなペプチドが観察された。強度が減少したペプチドであるH19（SCDK）及びL19-L20（SFNRGEC）は、観察された1228の質量がL19-20とH19との間で架橋されたペプチドよりも32 Da小さいものに相当することを説明し得る。4152の分子量は、架橋ペプチドSFNRGEC-SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK（L19-L20及びH19-H20）よりも32Da減少したものに相当する。SEC画分は、還元工程後に回収したので、これらの2つの架橋ペプチドは、非還元性連結を含んでいた。32Daの減少は、重鎖ペプチドH19（SCDK）のCys残基と軽鎖ペプチドL20（GEC）のC末端のCys残基との間のジスルフィド結合からの1つの硫黄残基の欠失を示しており、2つの架橋ペプチドがなぜ還元され得ないかを説明することができるであろう。質量割当をタンデム型質量分析によって確認した。
【０２５７】
（6.1.4.3.  軽鎖と重鎖との間のチオエーテル連結の位置）
新たなトリプシンペプチドのタンデム型質量分析により、正確な修飾の位置の説得力のある証拠がもたらされた。m/z 615.6+2（L19-L20及びH19）の2価イオンの断片質量スペクトル（MS/MS）を図４Aに示してある。使用した番号付け系は、Roepstorff及びFohiman（20）によって記述されている。C末端断片のyシリーズ、y1〜y7の質量は、2つのシステイン残基間のチオエーテル連結（ジスルフィド結合からの硫黄の欠失）によってペプチドSFNRGECにSCDKが付着した断片と一致している。ペプチドSFNRGECのN末端断片bシリーズ、b1〜b6の質量及びペプチドSCDK由来の断片イオンシリーズbh1〜bh4及びyh1からyh4は、SFNRGEC及びSCDKの2つのシステイン残基間のチオエーテル連結の存在を裏付けている。2つのペプチド間の連結の開裂により生じるいくつかの断片イオン（e7-SH2、eh2-SH2、e7、及びeh2）並びにa、c、及びxシリーズもまたMS/MSスペクトルに存在している。H19-20及びH19-20のMS／MSスペクトルは、H19-20とL19-20との間のチオエーテル連結の存在を裏付けた（図示せず）。従って、モノクローナル抗体の修飾された種は、重鎖のCys-223と軽鎖のC末端のCys残基との間の非還元性チオエーテル結合によって架橋された重鎖及び軽鎖である（図1C）。
【０２５８】
（6.1.4.4.  Fab断片の分子量決定）
ジスルフィド結合修飾が、還元条件でのゲル電気泳動による試料調製によって生じる人為的産物ではないことをさらに証明するために、非還元条件を使用して修飾部位を検証した。rCGEにおける92kDaのバンドは、40℃でのインキュベーションの間に時間とともに増加することが見いだされた。40℃にて5.5ヶ月の貯蔵の後、92kDaバンドの約8％がrCGE解析によって形成された。解析をより容易にするために、4℃（対照）或いは40℃（熱ストレス下）のいずれかで貯蔵したモノクローナル抗体をパパインによって消化してFab断片を得た。Fab断片をプロテインL親和性カラム（抗体軽鎖に特異的）によって精製した。次いで、2つのFab断片の分子量をLC-MSによって決定した（図5）。
【０２５９】
対照モノクローナル抗体及びストレス下のモノクローナル抗体の両方でデコンボリュートされた質量スペクトルにおいて最強度のイオン（図5、m/z 47628.9及び47629.4）は、ジスルフィド結合を介して重鎖断片（1-227）に連結された無処置の軽鎖からなるFab断片についての理論値47626と一致した。LC-MSによる分子量測定は、±3Daの変動を有する。熱ストレス下の抗体については、主成分（m/z 47629.4Da）の質量よりも31Da少ない47598.4 Daのm/zをもつ微量成分も観察された。この質量は、Fab断片における軽鎖のCys-213と重鎖のCys-233との間でのチオエーテル結合の連結と一致した。イオン強度に基づいて、チオエーテル連結されたFab（47598.4 Da）の相対的割合は、熱ストレス下の抗体の14.5%である。従って、これらのデータは、チオエーテル結合が、非還元条件下のモノクローナル抗体に存在したことを裏付けている。
【０２６０】
（6.1.5 非還元条件下でのチオエーテル連結結合の確認）
チオエーテル連結の位置を同定するために、対照抗体及び熱ストレス下の抗体を非還元条件でLys-Cによって消化し、逆相HPLC、それに続くLTQイオントラップ装置でのオンラインタンデム質量分析計によって解析した。1260.4 Daのm/zをもつペプチドは、対照抗体及び熱ストレス下の抗体の両方のLys-C消化物において同定され、これは、予想されるジスルフィド結合連結ペプチドSFNRGEC-SCDKと一致した（データ示さず）。これは、Fab断片の主成分の分子量と一致する。1228.4 Da（32 Da少ない）のm/z及びより早い保持時間をもつ別のペプチドが、対照及び熱ストレス下の抗体の両方のLys-C消化物において同定され、これは、チオエーテル連結ペプチドSFNRGEC-SCDKと一致した。これは、熱ストレス下の抗体についての微量のチオエーテル連結したFabの分子量と一致した。チオエーテル連結ペプチドの相対的割合は、対照と熱ストレス下の抗体との間で劇的に異なった。チオエーテル連結ペプチドは、熱ストレス下の抗体について13.6%であったが、4℃にて貯蔵された抗体については0.4%だけであった。対照抗体の無処置のFabの質量スペクトルには、チオエーテル連結Fabに対応するイオンは観察されず、これは、その割合が低いこと及びフルスキャンモードにおけるLTQのユニット分解能に起因していた。
【０２６１】
図4は、トリプシン及びLys-C消化物の両方に見いだされた、ジスルフィド結合及びチオエーテル結合によって連結されたペプチドSFNRGEC-SCDKのタンデム質量スペクトルの直接比較を示している。y1〜y7、b7、yh3〜yh4、bh2〜bh4、ch2、及びch3などのチオエーテル連結を含む断片イオンは、ジスルフィド結合連結を含む対応するイオンよりも32Da小さい。一方、b1-b6及びyh2などのチオエーテル、又はジスルフィド連結を含んでいない断片イオンは、両方のペプチドについて同じ質量を有する。2つのペプチド間のの連結の開裂によって生じる断片イオンについて、ジスルフィド連結したペプチドは、余分の硫黄残基のために、2つのさらなるイオンe7+S及びeh2+Sを有するが、その一方でなどの4つの断片イオンe7-SH2、eh2-SH2、e7、及びeh2は、ジスルフィド連結及びチオエーテル連結したペプチドに共通である。この直接の比較は、ペプチドSFNRGECとSCDKとの間のチオエーテル連結についての証拠をも提供する。
【０２６２】
本実施例は、IgG1モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖との間における新たな非還元性チオエーテル結合が、還元rCGE及びSDS-PAGE解析において92kDaの見かけの分子量を有するバンドの供与源であることを例証する。SEC画分及びモノクローナル抗体のFab断片の解析により、結論的に、重鎖及び軽鎖が、重鎖のCys-223と軽鎖のC末端のCys残基（Cys-213）との間で非還元性チオエーテル結合によって架橋されたことを証明した。このデータは、チオエーテル連結が非ストレス下の抗体に存在し、その含量は40℃でのインキュベーションの期間と共に増大することを裏付けている。
【０２６３】
（7. 均等物）
当業者であれば、本明細書に記述された本発明の特定の実施態様に対する多くの均等物を認識することができるか、又はルーチン試験のみを使用して確認することができるであろう。これらのような均等物が、特許請求項によって包含されることを意図する。本明細書で言及した全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的及び個々に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ範囲で、本明細書での引用により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２６４】
【図１】図1A〜１Cは、IgG1モノクローナル抗体の還元CGE（パネルA）及びSDS-PAGE（パネルB）解析を示す。レーン1は、分子量マーカーであり；レーン2及びレーン3は、還元モノクローナル抗体である。パネルCは、重鎖、軽鎖及び92kDaの架橋種のグラフ図を示す。
【図２】図2は、還元アルキル化されたモノクローナル抗体モタビズマブのサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図３】図3A及び3Bは、早期溶出SEC画分（パネルA）、及び分画していないモノクローナル抗体（パネルB）のトリプシンペプチドマッププロフィールを示す。
【図４】図4A及び4Bは、チオエーテル結合連結（パネルA）（m／z 6 15.6+2のイオン）及びジスルフィド結合連結（m／z 63 1.6+2のイオン）（パネルB）をもつL19-L20（SFNRGEC）及びH19（SCDK）の架橋ペプチドの断片イオンのMS／MSスペクトル及び割当を示す。注：図の「e」は、Cys上の側鎖切断を指し、アミノ酸骨格をさすものではない。「2」は、CSDKペプチド鎖のCysを指す。「7」は、SFRNGECペプチド鎖のCysを指す。
【図５】図5A及び5Bは、4℃（パネルA）にて、及び40℃（パネルB）にて貯蔵したモノクローナル抗体のFab断片のデコンボリュートした質量スペクトルを示す。
【図１Ａ−Ｂ】
2008536815.tif 000016
【図１Ｃ】
2008536815.tif 000017
【図２】
2008536815.tif 000018
【図３】
2008536815.tif 000019
【図４Ａ−Ｂ】
2008536815.tif 000020
【図５】
2008536815.tif 000021
【配列表】
2008536815000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月10日(2007.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５６】
SEC画分を消化し、タンデム型質量分析でのトリプシンペプチドマッピングによって解析した。早く溶出するSEC画分のペプチドマッププロフィールを、分画していないモノクローナル抗体のペプチドマッププロフィールと比較した（図３）。提案した架橋種は、半分の抗体であるので、そのペプチドマッププロフィールは、モノクローナル抗体のペプチドマッププロフィールに一致するはずであり、相違点があれば修飾部位を示すはずである。SEC画分のペプチドマッププロフィール（図3A）において、トリプシンペプチドH19、H20、L20及びL19-L20は、有意に減少しており、その一方で、それぞれ1228及び4152の分子量を有する2つの新たなペプチドが観察された。強度が減少したペプチドであるH19（SCDK（配列番号：43））及びL19-L20（SFNRGEC（配列番号：44））は、観察された1228の質量がL19-20とH19との間で架橋されたペプチドよりも32 Da小さいものに相当することを説明し得る。4152の分子量は、架橋ペプチドSFNRGEC-SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK（L19-L20及びH19-H20（配列番号：45））よりも32Da減少したものに相当する。SEC画分は、還元工程後に回収したので、これらの2つの架橋ペプチドは、非還元性連結を含んでいた。32Daの減少は、重鎖ペプチドH19（SCDK（配列番号：43））のCys残基と軽鎖ペプチドL20（GEC）のC末端のCys残基との間のジスルフィド結合からの1つの硫黄残基の欠失を示しており、2つの架橋ペプチドがなぜ還元され得ないかを説明することができるであろう。質量割当をタンデム型質量分析によって確認した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
（6.1.4.3.  軽鎖と重鎖との間のチオエーテル連結の位置）
新たなトリプシンペプチドのタンデム型質量分析により、正確な修飾の位置の説得力のある証拠がもたらされた。m/z 615.6+2（L19-L20及びH19）の2価イオンの断片質量スペクトル（MS/MS）を図４Aに示してある。使用した番号付け系は、Roepstorff及びFohiman（20）によって記述されている。C末端断片のyシリーズ、y1〜y7の質量は、2つのシステイン残基間のチオエーテル連結（ジスルフィド結合からの硫黄の欠失）によってペプチドSFNRGEC（配列番号：44）にSCDK（配列番号：43）が付着した断片と一致している。ペプチドSFNRGEC（配列番号：44）のN末端断片bシリーズ、b1〜b6の質量及びペプチドSCDK（配列番号：43）由来の断片イオンシリーズbh1〜bh4及びyh1からyh4は、SFNRGEC（配列番号：44）及びSCDK（配列番号：43）の2つのシステイン残基間のチオエーテル連結の存在を裏付けている。2つのペプチド間の連結の開裂により生じるいくつかの断片イオン（e7-SH2、eh2-SH2、e7、及びeh2）並びにa、c、及びxシリーズもまたMS/MSスペクトルに存在している。H19-20及びH19-20のMS／MSスペクトルは、H19-20とL19-20との間のチオエーテル連結の存在を裏付けた（図示せず）。従って、モノクローナル抗体の修飾された種は、重鎖のCys-223と軽鎖のC末端のCys残基との間の非還元性チオエーテル結合によって架橋された重鎖及び軽鎖である（図1C）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６０】
（6.1.5 非還元条件下でのチオエーテル連結結合の確認）
チオエーテル連結の位置を同定するために、対照抗体及び熱ストレス下の抗体を非還元条件でLys-Cによって消化し、逆相HPLC、それに続くLTQイオントラップ装置でのオンラインタンデム質量分析計によって解析した。1260.4 Daのm/zをもつペプチドは、対照抗体及び熱ストレス下の抗体の両方のLys-C消化物において同定され、これは、予想されるジスルフィド結合連結ペプチドSFNRGEC-SCDK（配列番号：46）と一致した（データ示さず）。これは、Fab断片の主成分の分子量と一致する。1228.4 Da（32 Da少ない）のm/z及びより早い保持時間をもつ別のペプチドが、対照及び熱ストレス下の抗体の両方のLys-C消化物において同定され、これは、チオエーテル連結ペプチドSFNRGEC-SCDK（配列番号：46）と一致した。これは、熱ストレス下の抗体についての微量のチオエーテル連結したFabの分子量と一致した。チオエーテル連結ペプチドの相対的割合は、対照と熱ストレス下の抗体との間で劇的に異なった。チオエーテル連結ペプチドは、熱ストレス下の抗体について13.6%であったが、4℃にて貯蔵された抗体については0.4%だけであった。対照抗体の無処置のFabの質量スペクトルには、チオエーテル連結Fabに対応するイオンは観察されず、これは、その割合が低いこと及びフルスキャンモードにおけるLTQのユニット分解能に起因していた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６１】
図4は、トリプシン及びLys-C消化物の両方に見いだされた、ジスルフィド結合及びチオエーテル結合によって連結されたペプチドSFNRGEC-SCDK（配列番号：46）のタンデム質量スペクトルの直接比較を示している。y1〜y7、b7、yh3〜yh4、bh2〜bh4、ch2、及びch3などのチオエーテル連結を含む断片イオンは、ジスルフィド結合連結を含む対応するイオンよりも32Da小さい。一方、b1-b6及びyh2などのチオエーテル、又はジスルフィド連結を含んでいない断片イオンは、両方のペプチドについて同じ質量を有する。2つのペプチド間のの連結の開裂によって生じる断片イオンについて、ジスルフィド連結したペプチドは、余分の硫黄残基のために、2つのさらなるイオンe7+S及びeh2+Sを有するが、その一方でなどの4つの断片イオンe7-SH2、eh2-SH2、e7、及びeh2は、ジスルフィド連結及びチオエーテル連結したペプチドに共通である。この直接の比較は、ペプチドSFNRGEC（配列番号：44）とSCDK（配列番号：43）との間のチオエーテル連結についての証拠をも提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６４】
【図１】図1A〜１Cは、IgG1モノクローナル抗体の還元CGE（パネルA）及びSDS-PAGE（パネルB）解析を示す。レーン1は、分子量マーカーであり；レーン2及びレーン3は、還元モノクローナル抗体である。パネルCは、重鎖、軽鎖及び92kDaの架橋種のグラフ図を示す。
【図２】図2は、還元アルキル化されたモノクローナル抗体モタビズマブのサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図３】図3A及び3Bは、早期溶出SEC画分（パネルA）、及び分画していないモノクローナル抗体（パネルB）のトリプシンペプチドマッププロフィールを示す。
【図４】図4A及び4Bは、チオエーテル結合連結（パネルA）（m／z 6 15.6+2のイオン）及びジスルフィド結合連結（m／z 63 1.6+2のイオン）（パネルB）をもつL19-L20（SFNRGEC（配列番号：44））及びH19（SCDK（配列番号：43））の架橋ペプチドの断片イオンのMS／MSスペクトル及び割当を示す。注：図の「e」は、Cys上の側鎖切断を指し、アミノ酸骨格をさすものではない。「2」は、CSDK（配列番号：47）ペプチド鎖のCysを指す。「7」は、SFRNGEC（配列番号：44）ペプチド鎖のCysを指す。
【図５】図5A及び5Bは、4℃（パネルA）にて、及び40℃（パネルB）にて貯蔵したモノクローナル抗体のFab断片のデコンボリュートした質量スペクトルを示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ａ−Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ａ−Ｂ】
2008536815.tif 000022
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008536815000001.app
【国際調査報告】
2008536815.tif 000023
2008536815.tif 000024
2008536815.tif 000025