(57)【要約】  糖蛋白質をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両者で作製するための方法及び組成物を提供する。１方法はＮ−アセチルガラクトサミン部分をもつ非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階を含み、場合により、Ｎ−アセチルガラクトサミン含有非天然アミノ酸を更に付加糖で修飾することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む組成物であって、前記Ｏ−ＲＳがＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む非天然アミノ酸で直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を優先的にアミノアシル化し、前記Ｏ−ＲＳが前記非天然アミノ酸と、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、配列番号１、２、３、４及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸でアミノアシル化する前記組成物。
【請求項２】
前記Ｏ−ＲＳが野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｏ−ＲＳが配列番号１、２、３、４に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
非天然アミノ酸がＮ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニンを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
非天然アミノ酸がＮ−アセチルガラクトサミン−α−セリンを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物をコードする核酸。
【請求項７】
核酸が配列番号６、７、８又は９に記載のヌクレオチド配列を含む請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項６に記載の核酸を含むベクターを含む細胞。
【請求項１１】
デフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用して決定した場合に配列番号５に対して少なくとも７０％の配列一致度をもつ直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）のアミノ酸配列を含む組成物であって、アミノ酸配列がＴｙｒ３２Ｐｈｅ、Ｔｙｒ３２Ｇｌｎ、Ｔｙｒ３２Ａｌａ、Ｔｙｒ３２Ｌｅｕ、Ａｌａ６７Ｐｒｏ、Ａｌａ６７Ｓｅｒ、Ａｌａ６７Ｔｈｒ、Ｈｉｓ７０Ｐｒｏ、Ｈｉｓ７０Ｌｙｓ、Ｌｅｕ９８Ｉｌｅ、Ｖａｌ１４９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ１５５Ｓｅｒ、Ａｓｐ１５８Ｖａｌ、Ｇｌｙ１６３Ｃｙｓ及びＡｌａ１６７Ｖａｌから構成される群から選択される１種以上のアミノ酸置換を含む前記組成物。
【請求項１２】
選択位置に非天然アミノ酸をもつ蛋白質を翻訳系で生産する方法であって、
ａ）ｉ）Ｎ−アセチルガラクトサミン部分を含む非天然アミノ酸と；
ｉｉ）少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記蛋白質をコードする核酸と；
ｉｉｉ）前記セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
ｉｖ）前記グリコシル化アミノ酸と、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、配列番号１、２、３、４及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む翻訳系を提供する段階と；
ｂ）蛋白質の翻訳中に前記核酸のセレクターコドンの位置に対応する蛋白質の選択位置にグリコシル化アミノ酸を組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項１３】
非天然アミノ酸を提供する前記段階がＮ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン、３，４，６−トリアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−セリン及び３，４，６−トリアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−セリンから構成される群から選択されるアミノ酸を提供する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
翻訳系を提供する前記段階が野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号１、２、３、４に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
翻訳系を提供する前記段階が宿主細胞を提供する段階を含み、前記宿主細胞が前記非天然アミノ酸と、前記Ｏ−ＲＳと、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、前記核酸を含み、前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
宿主細胞を提供する前記段階が大腸菌宿主細胞を提供する段階を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
非天然アミノ酸を提供する前記段階が非天然アミノ酸を蛋白質に組込む前に３，４，６−トリアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニンをＮ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニンに変換する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
非天然アミノ酸を提供する前記段階がＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する前に３，４，６−トリアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニンをＮ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニンに変換する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
Ｏ−ＲＳを提供する前記段階が配列番号１、２、３、４に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）Ｎ−アセチルガラクトサミン部分を含む非天然アミノ酸と；
（ｂ）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｃ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む翻訳系であって；
前記Ｏ−ＲＳが前記非天然アミノ酸と、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、配列番号１、２、３、４及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸でアミノアシル化する前記翻訳系。
【請求項２４】
前記非天然アミノ酸がＮ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン、トリアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−セリン、及びトリアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−セリンから構成される群から選択される請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２５】
前記Ｏ−ＲＳが野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２６】
前記Ｏ−ＲＳが配列番号１、２、３、４に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２７】
前記Ｏ−ｔＲＮＡがアンバーサプレッサーｔＲＮＡである請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２８】
該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、前記核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記セレクターコドンが前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２９】
前記翻訳系が宿主細胞を含み、前記宿主細胞が前記非天然アミノ酸と、前記Ｏ−ＲＳと、前記Ｏ−ｔＲＮＡを含む請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項３０】
前記宿主細胞が大腸菌細胞である請求項２９に記載の翻訳系。
【請求項３１】
前記宿主細胞が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項２９に記載の翻訳系。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチドが配列番号６、７、８又は９に記載のヌクレオチド配列を含む請求項３１に記載の翻訳系。
【請求項３３】
前記宿主細胞が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む請求項２９に記載の翻訳系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国仮特許出願第６０／６２０，８９８号（出願日２００４年１０月２０日）の優先権と特典を主張し、その明細書の開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明は国立衛生研究所助成番号ＧＭ４４１５４として米国政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利をもつことができる。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は蛋白質生化学の分野に関する。本発明は非天然アミノ酸を蛋白質に組込む直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及びその対を作製及び使用するための組成物及び方法に関し、非天然アミノ酸はＮ−アセチルガラクトサミン部分を含み、得られる蛋白質は糖蛋白質である。本発明は前記対を使用して細胞で蛋白質を生産する方法と関連組成物にも関する。本発明は糖ペプチド、糖蛋白質、及び関連ミメティクスと、糖ペプチド、糖蛋白質、及び関連ミメティクスの合成方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
グリコシル化は蛋白質の最も一般的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）の１つであり、多くの生体プロセスで重要な役割を果たす。例えば、グリコシル化による蛋白質の翻訳後修飾は蛋白質フォールディング及び安定性に影響を与え、蛋白質の固有活性を変化させ、他の生体分子とのその相互作用を変化させることができる。例えばＶａｒｋｉ，Ａ．（１９９３）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：９７−１３０；Ｄｗｅｋ（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：６８３−７２０；及びＳｅａｒｓ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（１９９８）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５４：２２３−２５２参照。天然糖蛋白質は多数の異なる糖形態の集団として存在することが多いので、グリカン構造の分析や、蛋白質構造及び機能に及ぼすグリコシル化効果の研究は困難である。従って、均質にグリコシル化された天然及び非天然蛋白質の合成方法は例えばグリカン機能の系統的解明と改良糖蛋白質治療薬の開発に有用なツールになると考えられる。
【０００５】
化学的及び酵素合成アプローチ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳、及び経路操作を含む糖蛋白質作製方法に多大な労力が注がれている。所望グリコシル化パターンをもつ蛋白質を作製するための従来公知のアプローチの１つはグリコシダーゼを使用して不均質天然糖蛋白質を単純な均質コアに変換し、糖をグリコシルトランスフェラーゼで順次グラフトできるようにしている。例えばＷｉｔｔｅ，Ｋ．ら，（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４−２１１８参照。このアプローチは、主要グリコシル化部位が蛋白質を発現させる細胞株により予め決定されるという欠点がある。あるいは、固相ペプチド合成により所望グリカン構造を含む糖ペプチドを合成することもできる。この糖ペプチドを天然化学的ライゲーション（例えばＳｈｉｎ，Ｙ．ら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１１６８４−１１６８９参照）、発現蛋白質ライゲーション（例えばＴｏｌｂｅｒｔ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５４２１−５４２８参照）、又は遺伝子組換えプロテアーゼにより他のペプチド又は組換え蛋白質フラグメントと結合し、より大きな糖蛋白質にすることができる。例えばＷｉｔｔｅ，Ｋ．ら，（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１９７９−１９８９参照。天然化学的ライゲーションと発現蛋白質ライゲーションはどちらも小蛋白質で最も有効であり、糖ペプチドのＮ末端にシステイン残基を必要とする。ペプチドを相互にライゲーションするためにプロテアーゼを使用する場合には、良好な結合収率のためにはライゲーション部位をグリコシル化部位から離して配置することが好ましい。例えばＷｉｔｔｅ，Ｋ．ら，（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１９７９−１９８９参照。第３のアプローチは化学的方法を使用して蛋白質を糖で直接修飾する方法である。ハロアセトアミド糖誘導体をシステインのチオール基と結合すると、良好な選択性を達成できる（例えばＤａｖｉｓ，Ｎ．Ｊ．ａｎｄ，Ｆｌｉｔｓｃｈ，Ｓ．Ｌ．（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３２：６７９３−６７９６；及びＭａｃｍｉｌｌａｎ，Ｄ．ら，（２００２）Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ  ４：１４６７−１４７０参照）が、この方法は２個以上のシステイン残基をもつ蛋白質では問題となる可能性がある。
【非特許文献１】Ｖａｒｋｉ，Ａ．（１９９３）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：９７−１３０
【非特許文献２】Ｄｗｅｋ（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：６８３−７２０
【非特許文献３】Ｓｅａｒｓ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（１９９８）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５４：２２３−２５２
【非特許文献４】Ｗｉｔｔｅ，Ｋ．ら，（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４−２１１８
【非特許文献５】Ｓｈｉｎ，Ｙ．ら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１１６８４−１１６８９
【非特許文献６】Ｔｏｌｂｅｒｔ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５４２１−５４２８
【非特許文献７】Ｗｉｔｔｅ，Ｋ．ら，（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１９７９−１９８９
【非特許文献８】Ｄａｖｉｓ，Ｎ．Ｊ．ａｎｄ，Ｆｌｉｔｓｃｈ，Ｓ．Ｌ．（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３２：６７９３−６７９６
【非特許文献９】Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｄ．ら，（２００２）Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ  ４：１４６７−１４７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、所望グリコシル化パターンをもつ糖蛋白質を作製するための改良方法が必要とされている。本発明は以下の開示から明らかなように、前記及び他の必要を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は糖蛋白質を作製するための方法と関連組成物を提供する。１側面では、本発明はＮ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニンやＮ−アセチルガラクトサミン−α−セリン等のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分をもつ非天然アミノ酸で直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを提供する。所定態様では、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来するシンテターゼ配列、例えば野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるアミノ酸配列から作製される。ＧａｌＮＡｃ含有非天然アミノ酸を利用することができる突然変異体Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  Ｔｙｒ−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）の例としては限定されないが、配列番号１〜４に記載のポリペプチド配列とその保存変異体が挙げられる。
【０００８】
所定態様では、Ｏ−ＲＳは非天然アミノ酸と、Ｏ−ｔＲＮＡと、配列番号１、２、３、４又はその保存変異体のアミノ酸配列をもつＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。
【０００９】
Ｏ−ＲＳポリペプチドをコードする核酸、例えば本発明の代表的直交ｔＲＮＡシンテターゼをコードする配列番号６〜９の核酸も提供する。更に、これらのＤＮＡ配列を含むベクター（例えば発現ベクター）と、前記ベクターを含む細胞も提供する。
【００１０】
関連側面では、本発明はデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用して決定した場合にＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  Ｔｙｒ−ｔＲＮＡシンテターゼ（配列番号５）に対して少なくとも７０％の配列一致度をもつ直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）のアミノ酸配列を提供し、アミノ酸配列は限定されないが、（配列番号５に比較して）Ｔｙｒ３２Ｐｈｅ、Ｔｙｒ３２Ｇｌｎ、Ｔｙｒ３２Ａｌａ、Ｔｙｒ３２Ｌｅｕ、Ａｌａ６７Ｐｒｏ、Ａｌａ６７Ｓｅｒ、Ａｌａ６７Ｔｈｒ、Ｈｉｓ７０Ｐｒｏ、Ｈｉｓ７０Ｌｙｓ、Ｌｅｕ９８Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１０７Ｐｒｏ、Ｖａｌ１４９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ１５５Ｓｅｒ、Ａｓｐ１５８Ｖａｌ、Ａｓｐ１５８Ｃｙｓ、Ｉｌｅ１５９Ｔｙｒ、Ｌｅｕ１６２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１６３Ｃｙｓ及びＡｌａ１６７Ｖａｌから構成される群から選択される１種以上のアミノ酸置換を含む。
【００１１】
本発明の他の側面は糖部分を含む非天然アミノ酸（例えばグリコシル含有アミノ酸）を蛋白質の選択位置に組込むことによる糖蛋白質の合成方法を含む。前記方法により生産された糖蛋白質も本発明の特徴である。前記方法は限定されないが、（ａ）ｉ）ＧａｌＮＡｃ部分をもつ非天然アミノ酸と；ｉｉ）少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記糖蛋白質をコードする核酸と；ｉｉｉ）前記セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；ｉｖ）Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系を提供する段階と；（ｂ）蛋白質の翻訳中に前記核酸のセレクターコドンの位置に対応する蛋白質の選択位置に前記グリコシル化アミノ酸を組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。
【００１２】
所定態様では、前記方法で使用されるＯ−ＲＳはグリコシル化アミノ酸と、Ｏ−ｔＲＮＡと、配列番号１、２、３、４及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
【００１３】
本発明のシンテターゼにより認識される非天然アミノ酸としては限定されないが、α−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、α−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−セリン、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、Ｃ−グリコシド及びグリコシル含有アミノ酸のチオグリコシル類似体（例えば、アノマー酸素を炭素又は硫黄原子で置換する組成物）、及び／又は同等物が挙げられる。前記方法で使用することができる非天然アミノ酸としては、更にＮ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン、３，４，６−トリアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−セリン及び３，４，６−トリアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−セリンが挙げられる。場合により、組込み段階はｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。
【００１４】
所定態様では、翻訳系は野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを使用する。
【００１５】
直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは直交対（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）として機能し、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸（この場合には、グリコシル含有アミノ酸）を蛋白質に組込む。場合により、本方法で使用されるＯ−ｔＲＮＡはｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒを含む。
【００１６】
ガラクトサミン含有アミノ酸をペプチド配列に組込むのに使用する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの例としては限定されないが、配列番号１〜４に記載のポリペプチドとその保存変異体、又は配列番号６〜９のいずれか１種（又はその保存変異体）のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが挙げられる。（例えば、１種以上のグルコサミン含有アミノ酸を認識する）本発明の付加的Ｏ−ＲＳ配列としては配列番号１１〜１３のいずれか１種を含むアミノ酸配列、又は配列番号１４〜１６のいずれか１種のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列が挙げられる。
【００１７】
本発明の糖蛋白質合成方法は更に糖供与体部分から糖部分に糖を転移させるために十分な時間と適切な条件下でグリコシルトランスフェラーゼ、糖供与体部分、及びグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体と非天然アミノ酸（又は非天然アミノ酸を組込んだ成長中のポリペプチド）の糖部分を接触させる段階を含む。この反応の生成物を所望により１種以上の付加グリコシルトランスフェラーゼ及び適当な糖供与体部分と接触させると、糖成分を更に延長することができる。
【００１８】
前記方法の所定態様では、翻訳系を提供する段階はＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳが発現されるか及び／又は機能する細胞（例えば、大腸菌細胞等の原核細胞）を提供する段階を含む。翻訳系を提供する段階は例えば、増殖培地で細胞を増殖させることにより達成することができ、場合によりＯ−ＲＳをコードする核酸配列及び／又はＯ−ｔＲＮＡをコードする核酸を細胞で同時発現させる段階を含むことができる。
【００１９】
場合により、グリコシル化アミノ酸を提供する段階は非天然アミノ酸の保護形態（例えば、３，４，６−トリアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン等のアセチル化形態）を非保護形態（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン）に変換する段階を含む。例えば細胞のサイトゾル（又は他の細胞翻訳系）における非特異的エステラーゼによる非天然アミノ酸の脱保護はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する前及び／又は非天然アミノ酸を蛋白質に組込む前に実施することが好ましい。
【００２０】
所定態様では、前記方法は更にグリコシルトランスフェラーゼ反応の生成物を少なくとも第２のグリコシルトランスフェラーゼ及び第２の糖供与体部分と接触させる段階を含む。１態様では、糖部分は末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分はＵＰＤ−ＧｌｃＮＡｃであり、グリコシルトランスフェラーゼはβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。別の態様では、糖部分は末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分はＵＤＰ−Ｇａｌであり、グリコシルトランスフェラーゼはβ−１−４−ガラクトシルトランスフェラーゼである。別の態様では、糖部分は末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＵＤＰ−Ｇａｌであり、グリコシルトランスフェラーゼは夫々（β１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及び／又はβ１−３−ガラクトシルトランスフェラーゼを含む。限定されないが、例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ等の適当なグリコシルトランスフェラーゼを使用することにより、場合により各種糖を非天然アミノ酸の糖部分に付加することができる。
【００２１】
別の側面では、本発明は糖蛋白質を作製するための翻訳系も提供する。本発明の翻訳系は限定されないが、少なくとも１個のセレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、糖部分（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分）を含む非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。保護又は脱保護組成物（例えば、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリアセチル−β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−セリン、α−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、トリアセチル−α−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、α−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−セリン、トリアセチル−α−ＧａｌＮＡｃ−セリン、対応する保護又は脱保護チオグリコシル類似体、及び／又は同等物）として、１種以上の糖含有非天然アミノ酸も提供する。所定態様では、翻訳系で使用されるＯ−ＲＳは野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される。所定態様では、翻訳系はアンバーサプレッサーｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを使用する。
【００２２】
所定態様では、翻訳系におけるＯ−ＲＳは非天然アミノ酸と、Ｏ−ｔＲＮＡと、配列番号１、２、３、４又はその保存変異体のアミノ酸配列をもつＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。
【００２３】
ガラクトサミン含有非天然アミノ酸の使用に関する態様では、翻訳系で使用されるＯ−ＲＳは配列番号１〜４とその保存変異体から構成される群から選択される１種以上のアミノ酸配列を含むことができる（又は配列番号６〜９のいずれか１種のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる）。グルコサミン含有アミノ酸基質に関する他の態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１１〜１３のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１４〜１６のいずれか１種のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。翻訳系は更に該当蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。所定態様では、翻訳系は大腸菌細胞等の細胞である。宿主細胞はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号６、７、８又は９）やＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド等の系成分を含むことができる。
【００２４】
本発明は更に例えば、本発明の方法及び翻訳系で新規直交ｔＲＮＡシンテターゼと併用するための、グリコシル含有非天然アミノ酸と糖部分をもつ非天然アミノ酸に結合したＯ−ｔＲＮＡ分子を提供する。本発明のグリコシル含有非天然アミノ酸としては限定されないが、α−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、α−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−セリン、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、グリコシル含有アミノ酸の保護形態、及びチオグリコシル類似体が挙げられる。
【００２５】
人工（例えば人為的に作製した非天然）ポリペプチド及びポリヌクレオチドも本発明の特徴である。例えば、本発明の人工ポリペプチドは例えば（ａ）配列番号１〜４及び１１〜１３のいずれか１種に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｂ）配列番号６〜９及び１４〜１６のいずれか１種に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）（ａ）、又は（ｂ）のポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的に免疫反応性のポリペプチド；並びに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の保存変異体を含むアミノ酸配列を含む。本発明の人工ポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体及び抗血清も提供する。本発明の人工ポリヌクレオチドは例えば（ａ）配列番号６〜９及び１４〜１６のいずれか１種に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列に相補的であるか又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号１〜４及び１１〜１３のいずれか１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｄ）人工ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｅ）核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸；（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）のポリヌクレオチドと少なくとも９８％一致するポリヌクレオチド；並びに（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）の保存変異体を含むポリヌクレオチドを含む。
（定義）
【００２６】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定装置又は生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの記載を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の細胞の組合せを含み、「細菌」と言う場合には細菌培養物を含み、「ポリペプチド」と言う場合には実際問題としてそのポリペプチドの多数のコピーを含み、他の用語についても同様である。
【００２７】
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、あるいは細胞の内在成分と共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働する能力に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率（例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率）でしか共働できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働する能力に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できないことを意味する。直交分子は細胞内に機能的に正常な相補的内在分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当細胞の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。第１の直交分子と共働する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対（例えばチロシル直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対））の効率に比較して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞中で共働する導入相補成分を含む。
【００２８】
直交チロシルｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交チロシルｔＲＮＡ（チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に対して直交性のｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは（１）天然に存在するチロシルｔＲＮＡと同一であるか又は実質的に類似しているか、（２）自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するチロシルｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）又は（２）の野生型又は突然変異体チロシルｔＲＮＡ配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型又は突然変異体チロシルｔＲＮＡと相同であるか；（５）表３にチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡと相同であるか、あるいは（６）表３にチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡの保存変異体である。チロシルｔＲＮＡはアミノ酸を負荷した状態でも負荷しない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、「チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼによりチロシン以外のアミノ酸（例えばＮ−アセチルガラクトサミンを含む非天然アミノ酸）を負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、本発明のチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに天然又は人工のいずれかに拘わらずほぼ任意アミノ酸を挿入するために有利に使用される。
【００２９】
直交チロシルアミノ酸シンテターゼ：本明細書で使用する直交チロシルアミノ酸シンテターゼ（チロシル−Ｏ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。チロシル−Ｏ−ＲＳがチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然、非天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本明細書では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するチロシルアミノ酸シンテターゼと同一又は相同であるか、あるいは表３にＯ−ＲＳとして指定するシンテターゼと同一又は相同である。例えば、Ｏ−ＲＳは表３のチロシル−Ｏ−ＲＳの保存変異体とすることができ、及び／又は表３のＯ−ＲＳと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上配列が一致することができる。
【００３０】
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共働する成分、例えば直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを意味する。これらの成分は「相補的」であると言うこともできる。
【００３１】
優先的にアミノアシル化する：本明細書で直交翻訳系に関して使用する場合に、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが発現系で任意内在ｔＲＮＡに負荷するよりも効率的にＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷するときにコグネイトＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡと所与の任意内在ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに負荷するよりも高頻度でＯ−ｔＲＮＡに負荷する。Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳにより負荷される内在ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましく、従って、Ｏ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡが等モル濃度で翻訳系に存在する場合にはＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に負荷することが好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００３２】
（ａ）Ｏ−ＲＳが内在ｔＲＮＡに比較してＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するとき、及び（ｂ）Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを任意天然アミノ酸でアミノアシル化する場合に比較してそのアミノアシル化が非天然アミノ酸に特異的であるときにＯ−ＲＳは「Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する」。即ち、非天然アミノ酸と天然アミノ酸がＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系に等モル量で存在するとき、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸よりも高頻度で非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する。非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましい。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に非天然アミノ酸を負荷することがより好ましい。天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者が等モル濃度で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ｔＲＮＡの非天然アミノ酸負荷とＯ−ｔＲＮＡの天然アミノ酸負荷の相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００３３】
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸等の非天然アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン）等のナンセンスコドン、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
【００３４】
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは例えばセレクターコドンに応答してポリペプチド鎖にアミノ酸を組込むためのメカニズムを提供することにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー又はオパールコドン）、４塩基コドン、レアコドン等を読み飛ばすことができる。
【００３５】
抑圧活性：本明細書で使用する「抑圧活性」なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドンや４塩基以上のコドンであるセレクターコドン）の翻訳読み飛ばしを行うｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力を意味する。サプレッサーｔＲＮＡの抑圧活性は第２のサプレッサーｔＲＮＡ又は対照系（例えばＯ−ＲＳをもたない対照系）に比較して観測される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。
【００３６】
本発明は抑圧活性を定量することが可能な種々の手段を提供する。該当セレクターコドン（例えばアンバーコドン）に対する特定Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの抑圧百分率とは、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及びセレクターコドンをもたない陽性対照構築物に比較して、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む該当翻訳系で発現され、そのコーディング核酸中にセレクターコドンを含む所与試験マーカー（例えばＬａｃＺ）の活性百分率を意味する。従って、例えば、セレクターコドンをもたない活性陽性対照マーカー構築物が所与翻訳系において該当マーカーアッセイに関連する単位で表した観測活性Ｘをもつ場合には、セレクターコドンを含む試験構築物の抑圧百分率は、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳを更に含む翻訳系で発現される以外は陽性対照マーカーが発現される環境条件とほぼ同一の環境条件下で試験マーカー構築物が示すＸの百分率である。一般に、試験マーカーを発現する翻訳系は更にＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡにより認識されるアミノ酸を含む。場合により、抑圧百分率測定値は、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳにより認識される該当アミノ酸を含まない系で試験マーカーと同一のセレクターコドンを含む「バックグラウンド」又は「陰性」対照マーカー構築物に試験マーカーを比較することにより精密化することができる。この陰性対照は該当翻訳系におけるマーカーからのバックグラウンドシグナル効果を考慮するように抑圧百分率測定値を正規化するのに有用である。
【００３７】
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【００３８】
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは例えば非真核細胞（例えば細菌（例えば大腸菌））、又は真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物）でｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系に付加するか又はその一部とすることができる。所定態様では、翻訳系はｉｎ  ｖｉｔｒｏとすることができ、宿主細胞の代わりに細胞抽出液を使用する。
【００３９】
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種の標準天然アミノ酸の１種又はセレノシステインもしくはピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）を意味する。
【００４０】
から誘導：本明細書で使用する「から誘導」なる用語は特定分子もしくは生物から単離されているか、あるいは特定分子もしくは生物を使用するか又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。例えば、第２のポリペプチドから誘導されるポリペプチドは第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に同様のアミノ酸配列を含む。ポリペプチドの場合には、誘導種は例えば自然突然変異誘発、人工的特異的突然変異誘発又は人工的ランダム突然変異誘発により得ることができる。ポリペプチドを誘導するために使用される突然変異誘発は意図的に特異的でも意図的にランダムでもよい。第１のポリペプチドから誘導される別のポリペプチドを作製するためのポリペプチドの突然変異誘発は（例えばポリメラーゼの非忠実性に起因する）ランダムなイベントとすることができ、誘導されたポリペプチドの同定は偶然とすることができる。ポリペプチドの突然変異誘発は一般にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。
【００４１】
ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）場合に、該当形質をもたない細胞からこの形質を含む細胞（例えばポジティブ選択マーカーをもつ細胞）を識別するマーカーを意味する。
【００４２】
ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）場合に、（例えば選択性質又は形質をもつ細胞に対して）選択性質又は形質をもたない細胞を識別することができるマーカーを意味する。
【００４３】
レポーター：本明細書で使用する「レポーター」なる用語は該当系のターゲット成分を同定及び／又は選択するために使用することができる成分を意味する。例えば、レポーターとしては蛋白質、例えば抗生物質耐性又は感受性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等）、蛍光スクリーニングマーカー（例えば緑色蛍光蛋白質（例えばＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ等）、発光マーカー（例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質）、アフィニティースクリーニングマーカー、又はポジティブもしくはネガティブ選択マーカー遺伝子（例えばｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２等）を挙げることができる。
【００４４】
真核生物：本明細書で使用する「真核生物」なる用語は真核生物界に属する生物を意味する。真核生物はその構成が一般に多細胞であり（但し、例えば酵母のように多細胞ではないものもある）、膜結合核と他の膜結合オルガネラが存在し、遺伝物質が線状であり（即ち染色体が線状）、オペロンが存在せず、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ  ｍＲＮＡが存在し、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に原核生物から区別できる。真核生物としては例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等）、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。
【００４５】
原核生物：本明細書で使用する「原核生物」なる用語はモネラ界（原核生物界とも言う）に属する生物を意味する。原核生物はその構成が単細胞であり、出芽又は分裂による無性生殖であり、膜結合核又は他の膜結合オルガネラをもたず、染色体が環状であり、オペロンが存在し、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ  ｍＲＮＡが存在せず、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に真核生物から区別できる。原核生物は真正細菌及び古細菌亜界を含む。シアノバクテリア（藍藻類）とマイコプラズマをモネラ界の別々の分類にする場合もある。
【００４６】
細菌：本明細書で使用する「細菌」及び「真正細菌」なる用語は「古細菌」から区別できる原核生物を意味する。同様に、古細菌は真核生物から区別できる原核生物を意味する。真正細菌と古細菌は多数の形態学的及び生化学的基準により区別することができる。例えば、リボソームＲＮＡ配列、ＲＮＡポリメラーゼ構造、イントロンの有無、抗生物質感受性、細胞壁ペプチドグリカン及び他の細胞壁成分の有無、膜脂質構造の分岐の有無、並びにヒストン及びヒストン様蛋白質の有無を使用して生物を真正細菌又は古細菌に分類する。
【００４７】
真正細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが挙げられる。古細菌の例としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔ）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ（Ａｐ）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ及びＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍが挙げられる。
【００４８】
保存変異体：翻訳成分に関して本明細書で使用する「保存変異体」なる用語は類似する基本成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）と同様に機能するが、参照Ｏ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに比較して配列に変異をもつ翻訳成分（例えば保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ＲＳ）を意味する。例えば、Ｏ−ＲＳ、又はこのＯ−ＲＳの保存変異体はコグネイトＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばＮ−アセチルガラクトサミン部分を含むアミノ酸）でアミノアシル化する。この例では、Ｏ−ＲＳと保存変異体Ｏ−ＲＳは同一アミノ酸配列をもたない。保存変異体はこの保存変異体が対応するＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに相補的である限り、例えば配列の１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所以上に変異をもつことができる。
【００４９】
所定態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳに比較して１カ所以上の保存アミノ酸置換を含む。所定態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳに比較して１カ所以上の保存アミノ酸置換を含むと共に、Ｏ−ＲＳ生物活性を維持し、例えば親Ｏ−ＲＳ分子の生物活性の少なくとも１０％を維持し、あるいは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％を維持する保存変異体Ｏ−ＲＳが挙げられる。所定の好ましい態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳ分子の生物活性の少なくとも５０％を維持する。保存変異体Ｏ−ＲＳの保存アミノ酸置換はアミノ酸結合ポケットを含むＯ−ＲＳの任意ドメインに生じることができる。
【００５０】
選択又はスクリーニング物質：本明細書で使用する「選択又はスクリーニング物質」なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択／スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、選択又はスクリーニング物質としては限定されないが、例えば栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現されたポリヌクレオチド等が挙げられる。選択物質は例えば濃度、強度等を変動させることができる。
【００５１】
〜に応答して：本明細書で使用する「〜に応答して」なる用語は本発明のｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡと結合したＧａｌＮＡｃアミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組込むのを媒介するプロセスを意味する。
【００５２】
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列鎖とは異なる第２の分子又は配列鎖の生産を誘導するためにポリマー巨大分子又は配列鎖中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。１側面では、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードするための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。
【００５３】
別の側面では、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生産を誘導するためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を含む転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスと同様にポリペプチドをコードすることができる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードするトリプレットコドンにも適用する。所定側面では、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面では、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を含む。
【００５４】
糖部分：本明細書で使用する「糖部分」なる用語は天然及び非天然糖部分を意味する（即ち、非天然糖部分、例えば１個以上のヒドロキシル又はアミノ位を修飾（例えば脱ヒドロキシル化、脱アミノ化、アセチル化、エステル化等）された糖部分、例えば２−デオキシＧａｌは非天然糖部分の１例である）。「糖質」なる用語は一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎをもち、限定されないが、例えば単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類が挙げられる。オリゴ糖は糖単位（糖とも言う）から構成される鎖である。糖単位は任意順序で配置することができ、２個の糖単位間の結合は約１０種の異なる方法の任意のものとすることができる。
【００５５】
本明細書ではグルコシルに関連する以下の略称を使用する：
Ａｒａ＝アラビノシル；
Ｆｒｕ＝フルクトシル；
Ｆｕｃ＝フコシル；
Ｇａｌ＝ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミニル；
Ｇｌｃ＝グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミニル；
Ｍａｎ＝マンノシル；及び
ＮｅｕＡｃ＝シアリル（一般にＮ−アセチルノイラミニル）。
【００５６】
本欄及び以下に特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
蛋白質の翻訳後修飾は代謝、シグナル伝達、及び遺伝子発現をはじめとする多数の生体プロセスを調節する。しかし、選択的に修飾された蛋白質の均質集団の作製に関連する合成の問題により、蛋白質構造及び機能に及ぼすこれらの修飾の効果に関する詳細な研究は妨げられている。例えば、グリコシル化は真核生物で最も一般的な蛋白質の翻訳後修飾の１種であり、フォールディングや分泌から生体分子認識及び血清半減期に至る広範な蛋白質機能に影響を与える。例えばＲ．Ａ．Ｄｗｅｋ，（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：６８３参照。
【００５８】
グリコシル化の効果の解明はかなり進んだが、オリゴ糖鎖の具体的な役割とその構造と機能の関係についてはまだ解明され始めたばかりである。例えば、Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，＆  Ｌ．Ｌ．Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：２３５７参照。主な問題は糖蛋白質が一般に糖形態の混合物として産生されるため、天然源から固有糖形態を単離しにくい点である。規定構造の糖形態を合成するために種々の方法が開発されているが、産生される糖蛋白質のサイズ、量、及び／又は品質に大きな制約がある。例えばＰ．Ｓｅａｒｓ，＆  Ｃ．Ｈ．Ｗｏｎｇ，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：２３４４；Ｍ．Ｗａｃｋｅｒら，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１７９０；Ｂ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：５７９；及びＨ．Ｃ．Ｈａｎｇ，＆  Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，（２００１）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７参照。
【００５９】
本発明はこの問題と他の問題を解決し、糖蛋白質及び糖蛋白質ミメティクス、並びに所望グリコシル化パターンをもつ糖蛋白質の高効率新規合成方法を提供する。本発明の糖蛋白質及び糖蛋白質ミメティクスは均質な糖形態の治療用糖蛋白質の生産及び／又はグリコシル化蛋白質の構造と機能に関する研究の助長に有用である。
【００６０】
本発明により提供される解決方法は直交翻訳成分を使用してＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む非天然アミノ酸を蛋白質にプログラム下で部位特異的に生合成的に組込む方法を使用する。このストラテジーの結果、遺伝コードを拡張し、Ｎ−アセチルガラクトサミンアミノ酸を生物翻訳レパートリーに付加する。このアプローチは宿主細胞（例えば真正細菌大腸菌細胞）のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質生合成機構を使用して成長中の蛋白質鎖に非天然アミノ酸を直接組込むために「直交」ｔＲＮＡと対応する新規「直交」アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用することにより実現可能になる。
【００６１】
本発明ではアンバーナンセンスコドンＴＡＧに応答して真正細菌宿主細胞（例えば大腸菌）で産生される蛋白質にＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）アミノ酸を高い効率で遺伝的に組込むための新規直交翻訳系の進化について報告する。本明細書に記載する新規組成物及び方法は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）系を利用し、直交系はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎａｓｃｈｉｉに由来する成分を使用し、これらの成分は該当蛋白質を生産するために真正細菌宿主系で使用される。Ｎ−アセチルガラクトサミンアミノ酸の蛋白質組込みはＮ−アセチルガラクトサミンアミノ酸の組込みを指示するセレクターコドンを含むように該当蛋白質をコードするポリヌクレオチドを組換えることにより任意所望位置で行われるようにプログラムすることができる。
直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ技術
【００６２】
本発明の新規組成物及び方法の理解は直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対に関連する活性を理解することにより容易になる。直交ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ技術については例えば、Ｗａｎｇら，（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｃｈｉｎら，（２００２），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４；及びＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０に記載されている。国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）も参照。これらの文献及び公開特許出願は各々その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。
【００６３】
付加反応性非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）を遺伝コードに付加するためには、宿主翻訳機構で効率的に機能することができるが、対が翻訳系に内在性のシンテターゼ及びｔＲＮＡから独立して機能するという意味で該当翻訳系に対して「直交性」のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと適切なｔＲＮＡを含む新規直交対が必要である。直交対の所望特徴としては、内在ｔＲＮＡによりデコードされない特定新規コドン（例えばセレクターコドン）のみをデコード又は認識するｔＲＮＡと、そのコグネイトｔＲＮＡをただ１種の特定非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化（又は負荷）するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡは一般に内在シンテターゼによりアミノアシル化されない。例えば大腸菌では、直交対は例えば大腸菌に存在する４０種の内在ｔＲＮＡのいずれとも交差反応しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、例えば大腸菌に存在する２１種の内在シンテターゼのいずれによってもアミノアシル化されない直交ｔＲＮＡを含む。
【００６４】
本発明は真正細菌（例えば大腸菌）の蛋白質にＧａｌＮＡｃアミノ酸を遺伝的にコードさせて組込むための直交対を提供し、直交成分は宿主細胞の翻訳機構の内在大腸菌成分と交差反応しないが、所望非天然アミノ酸を認識し、アンバーナンセンスコドンＴＡＧに応答して蛋白質に組込む。本発明により提供される直交成分としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、突然変異体チロシルｔＲＮＡＣＵＡアンバーサプレッサーが挙げられる。この系では、突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはサプレッサーｔＲＮＡを例えばＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンでアミノアシル化するが、２０種の標準アミノ酸にいずれでもアミノアシル化しない。
【００６５】
本発明はＧａｌＮＡｃアミノ酸を蛋白質に組込むために使用することができる付加直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対（例えばＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）の組成物と、前記対の同定及び作製方法を提供する。本発明のＯ−ｔＲＮＡはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質へのＧａｌＮＡｃアミノ酸の例えばｉｎ  ｖｉｖｏでの組込みを媒介することができる。Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。本発明の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはそのＯ−ｔＲＮＡをただ１種の特定ＧａｌＮＡｃアミノ酸で優先的にアミノアシル化（又は負荷）する。
【００６６】
例えば、本明細書に実証するように、アミノ酸ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンはセレクターコドン（例えばＴＡＧコドン）に応答して真正細菌細胞（大腸菌；Ｅ．ｃｏｌｉ）の蛋白質に選択的且つ効率的に組込まれた。ＧａｌＮＡｃアミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むことができると、蛋白質の研究を助長できると共に、新規特性をもつ蛋白質の開発が可能になる。
直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び翻訳系
【００６７】
１種以上の非天然アミノ酸を含む蛋白質の作製に適した翻訳系は例えば国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）に記載されている。これらの各出願はその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。このような翻訳系は一般に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸（本発明ではＧａｌＮＡｃアミノ酸）を含む細胞（例えば大腸菌等の非真核細胞又は酵母等の真核細胞とすることができる）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをＧａｌＮＡｃアミノ酸でアミノアシル化する。本発明の直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とＯ−ＲＳを含む。本発明は個々の成分も提供する。
【００６８】
本発明は例えば本発明の方法、翻訳系及び／又はキットを使用して糖蛋白質を作製するのに使用する新規直交ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を提供する。Ｏ−ＲＳに加え、前記方法、翻訳系及びキットは一般に更に直交ｔＲＮＡ（例えば、サプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）と、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化するのに使用するグリコシル含有非天然アミノ酸を含む。複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対（Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳ）が開発されるならば、各種コドンを使用して複数の非天然アミノ酸を同時に組込むことが可能になる。表３は本発明の代表Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ配列を示す。
【００６９】
一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷するとき、直交対はセレクターコドンを「抑圧」すると言う。即ち、翻訳系の（例えば細胞の）内在機構により認識されないセレクターコドンは通常翻訳されないので、非抑圧下で核酸から翻訳されるポリペプチドの生産を阻止することができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、本明細書の配列表に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを該当非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）でアミノアシル化する。細胞は例えば該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を介して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用し、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。所定の望ましい側面では、細胞は付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、付加Ｏ−ｔＲＮＡは付加Ｏ−ＲＳにより別の非天然アミノ酸を負荷される。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの一方は４塩基コドンを認識することができ、他方は終止コドンを認識することができる。あるいは、複数の異なる終止コドン又は複数の異なる４塩基コドンが異なるセレクターコドンを特異的に認識することができる。
【００７０】
本発明の所定態様では、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、ＧａｌＮＡｃアミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞（例えば大腸菌細胞）が提供され、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。翻訳系は無細胞系でもよく、例えば各種市販「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」転写／翻訳系の任意のものを本明細書に記載するようなＯ−ｔＲＮＡ／ＯＲＳ対及び非天然アミノ酸と併用することができる。
【００７１】
１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又は２５倍以上である。１側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率は本明細書の配列表に記載するような直交シンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも例えば約３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上である。
【００７２】
上記のように、本発明は場合により細胞又は他の翻訳系に複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含み、２種以上の非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸と別の非天然アミノ酸）を組込むことができる。例えば、細胞は更に別の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、この付加Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、この付加Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対（Ｏ−ｔＲＮＡは例えばアンバーセレクターコドンを認識する）を含む細胞は更に第２の直交対（例えばロイシル、リシル、グルタミル等）を含むことができる（第２のＯ−ｔＲＮＡは別のセレクターコドン、例えばオパールコドン、４塩基コドン等を認識する）。各直交対は異なるセレクターコドンの認識を助長できるように異なる起源に由来することが望ましい。
【００７３】
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物の任意のものに由来するｔＲＮＡのライブラリー及び／又はＲＳのライブラリーを作製するか及び／又は種々の利用可能な突然変異ストラテジーの任意のものを使用することにより、天然に存在するｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導してもよい。例えば、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための１つのストラテジーは例えば宿主細胞以外の起源又は多重起源に由来する（宿主に対して）異種のｔＲＮＡ／シンテターゼ対を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡは全宿主細胞シンテターゼに対して直交性である。
【００７４】
直交対を作製するための第２のストラテジーはＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
【００７５】
本発明の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸（例えば糖部分を含む非天然アミノ酸、例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）の例えばｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組込みを媒介することが望ましい。所望セレクターコドンに対応するアンチコドン配列を含むＯ−ｔＲＮＡは対応するＯ−ＲＳでしかアミノアシル化することができず、内在シンテターゼではアミノアシル化することができない。所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表のＯ−ｔＲＮＡ配列に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。
【００７６】
本発明の方法、翻訳系、及びキットで使用することができるＯ−ｔＲＮＡの１例は配列番号１７である。ｔＲＮＡ分子では、チミン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）に置換されるが、塩基に付加修飾を加えてもよい。本発明はＯ−ｔＲＮＡの保存変異体も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、配列番号１７のＯ−ｔＲＮＡと同様に機能し、ｔＲＮＡ  Ｌ形構造を維持するが、同一配列をもたない（と共に野生型ｔＲＮＡ分子でもない）分子が挙げられる。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。組換え直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法は国際特許出願ＷＯ２００２／０８６０７５，前出に記載されている。
【００７７】
組換え直交ｔＲＮＡの他の作製方法も例えば国際特許出願ＷＯ２００２／０８６０７５、Ｆｏｒｓｔｅｒら，（２００３）“Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ”  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，（２００３）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００（１０）：５６７６−５６８１に記載されている。
【００７８】
特定直交翻訳系（又は前記系の任意成分、例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）の抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【００７９】
本発明のＯ−ｔＲＮＡの例を本明細書の配列表に記載する。代表的Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ分子の配列については本明細書の表、実施例及び図面も参照。更に、本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。Ｏ−ＲＳ  ｍＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡ分子等のＲＮＡ分子では、所与配列又はその相補配列に対してチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置換されている（コーディングＤＮＡでは逆）。塩基に付加修飾を加えてもよい。
【００８０】
本発明は本明細書に記載する特定Ｏ−ｔＲＮＡに対応するＯ−ｔＲＮＡの保存変異体も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、例えば本明細書の配列表に記載するような特定親Ｏ−ｔＲＮＡと同様に機能し、適当な自己相補性によりｔＲＮＡ  Ｌ形構造を維持するが、例えば本明細書の配列表、図面又は実施例に記載する配列と同一配列をもたない分子が挙げられる（更に野生型ｔＲＮＡ分子以外のものであることが望ましい）。
【００８１】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができ、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの１種以上の組み合わせも細胞に加えることができる。
【００８２】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法も本発明の特徴である。本方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも本発明の特徴である。本発明の所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは突然変異体ライブラリーを作製することにより作製することができる。突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ｔＲＮＡは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。
【００８３】
ｔＲＮＡの所望ループ又は領域（例えばアンチコドンループ、受容体ステム、Ｄアーム又はループ、可変ループ、ＴＰＣアーム又はループ、ｔＲＮＡ分子の他の領域又はその組合せ）の特定位置（例えば非保存位置又は保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに付加突然変異を導入することができる。一般に、ｔＲＮＡの突然変異としてはセレクターコドンの認識を可能にするように突然変異体ｔＲＮＡライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させる方法が挙げられる。この方法は更にＯ−ｔＲＮＡの末端に付加配列（ＣＣＡ）を付加する段階を含むことができる。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは所望ＲＳに対するその親和性等を維持しながら、出発材料（例えば複数のｔＲＮＡ配列）に比較して所望生物に対する直交性が改善されている。
【００８４】
前記方法は場合によりｔＲＮＡ及び／又はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの配列の類似性（及び／又は推定相同性）を分析し、特定生物に対して直交性であると思われるＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はその対の潜在候補を決定する段階を含む。分析には、当分野で公知であり、本明細書に記載するコンピュータープログラム（例えばＢＬＡＳＴ及びｐｉｌｅｕｐプログラム）を使用することができる。１例では、大腸菌で使用するための潜在的直交翻訳成分を選択するためには、真正細菌生物に密接な配列類似性を示さないシンテターゼ及び／又はｔＲＮＡを選択する。
【００８５】
一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは複数の潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのメンバーを含む第１の種の細胞の集団に例えばネガティブ選択を実施することにより得られる。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に直交性のｔＲＮＡプールが得られる。
【００８６】
所定態様において、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー（例えば抗生物質耐性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ）、検出可能な産物を付与する酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、例えば毒性物質（例えばバルナーゼ））をコードするポリヌクレオチドの（例えば機能的バルナーゼを依然として産生する）非必須位置等にセレクターコドンを導入する。場合により選択物質（例えばアンピシリン等の抗生物質）の存在下で細胞集団を増殖させることによりスクリーニング／選択を実施する。１態様では、選択物質の濃度を変動させる。
【００８７】
例えば、サプレッサーｔＲＮＡの活性を測定するためには、セレクターコドンのｉｎ  ｖｉｖｏ抑圧（例えばネガティブ選択マーカー（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ））をコードするポリヌクレオチドに導入されたナンセンス又はフレームシフト突然変異）に基づく選択システムを使用する。例えば、所定位置（例えばＡ１８４）にセレクターコドンをもつポリヌクレオチド変異体（例えばｂｌａ変異体）を構築する。細胞（例えば細菌）をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内在大腸菌シンテターゼにより効率的に負荷することができない直交ｔＲＮＡの場合には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性）はプラスミドで形質転換されていない細菌と同等以下のはずである。ｔＲＮＡが非直交性の場合、又はｔＲＮＡに負荷することが可能な異種シンテターゼをシステムで同時発現させる場合には、より高レベルの抗生物質（例えばアンピシリン）耐性が観測される。プラスミドで形質転換されていない細胞と同等の抗生物質濃度のＬＢ寒天プレートで増殖することができない細胞（例えば細菌）を選択する。
【００８８】
毒性物質（例えばリボヌクレアーゼ又はバルナーゼ）の場合には、複数の潜在的ｔＲＮＡのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化されるとき（即ち、宿主（例えば大腸菌）シンテターゼに非直交性であるとき）には、セレクターコドンは抑圧され、生産される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死を生じる。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む細胞は生存する。
【００８９】
１態様では、所望生物に直交性のｔＲＮＡプールに次にポジティブ選択を実施し、セレクターコドンを例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子によりコードされるポジティブ選択マーカーに配置する。ポジティブ選択は細胞に直交性のｔＲＮＡプールのメンバーをコードするか又は前記メンバーを含むポリヌクレオチドと、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、コグネイトＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む細胞で実施される。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ポリヌクレオチドを細胞で発現させ、選択物質（例えばアンピシリン）の存在下で細胞を増殖させる。次に、同時発現させたコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。一般に、これらの細胞は非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識することができないｔＲＮＡを含む細胞に比較して高い抑圧効率を示す。非機能的ｔＲＮＡ又は該当シンテターゼにより効率的に認識されないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質ではなく；（ｉｉ）該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ；（ｉｉｉ）翻訳で機能的なｔＲＮＡが両者選択後に生存している。
【００９０】
従って、スクリーニングされる状況に応じて同一マーカーがポジティブマーカーにもネガティブマーカーにもなる。即ち、マーカーがポジティブスクリーニングされる場合にはポジティブマーカーであり、ネガティブスクリーニングされる場合にはネガティブマーカーである。
【００９１】
上記方法における選択（例えばポジティブ選択、ネガティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者）のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性蛋白質であるので、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入するか及び／又は誘導プロモーターを使用することによりネガティブ選択のストリンジェンシーを制御することができる。別の例では、選択又はスクリーニング物質の濃度（例えばアンピシリン濃度）を変動させる。本発明の１側面では、初期ラウンド中の所望活性は低いと思われるのでストリンジェンシーを変動させる。即ち、初期ラウンドでは低ストリンジェンシー選択基準を適用し、後期ラウンドの選択では高ストリンジェンシー基準を適用する。所定態様では、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はネガティブ選択とポジティブ選択の両方を複数回反復することができる。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はネガティブ選択マーカーとポジティブ選択マーカーの両方を使用することができる。所定態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一にすることができる。
【００９２】
本発明ではセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）を負荷する直交翻訳成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を作製するために他の型の選択／スクリーニングを使用することもできる。例えば、ネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両方として、適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するマーカーを使用することができる。別の態様では、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光によりマーカーの産物を検出する。場合により、マーカーはアフィニティースクリーニングマーカーを含む。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９０：１０４４４−８も参照。
【００９３】
組換え直交ｔＲＮＡの他の作製方法も例えば国際出願公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；及びＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒら，（２００３）Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＰＮＡＳ  １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，（２００３），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ，ＰＮＡＳ  １００（１０）：５６７６−５６８１も参照。
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
【００９４】
本発明のＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン等のＧａｌＮＡｃアミノ酸）で優先的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアミノアシル化する。本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳ又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば細胞）に提供することができる。例えば、Ｏ−ＲＳの１例は本明細書の配列表と実施例に記載するようなアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。別の例では、Ｏ−ＲＳ、又はその一部は本明細書の配列表又は実施例に記載する配列を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。例えば、代表的Ｏ−ＲＳ分子の配列については本明細書の表及び実施例参照。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
【００９５】
本発明のＯ−ＲＳは糖部分を含む非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアミノアシル化する。本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳ（又はその触媒部分）をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば細胞又はｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系）に提供することができる。本発明の糖蛋白質合成法で使用する代表的直交ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸配列を配列番号１〜４及び１１〜１３に示す。あるいは、Ｏ−ＲＳ、又はその一部は配列番号６〜９及び１４〜１６のいずれか１種のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号１〜４もしくは１１〜１３を含むアミノ酸をコードする他のポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【００９６】
Ｏ−ＲＳの作製方法は一般に野生型シンテターゼの構成から突然変異体シンテターゼのプールを作製する段階と、次に１種以上の選択非天然アミノ酸（例えば、グリコシル含有アミノ酸）に対するその特異性に基づいて突然変異ＲＳを選択する段階に基づく。Ｏ−ＲＳ（及びこれが認識するＯ−ｔＲＮＡ）は天然に存在するものでもよいし、資源と宿主のセクションに記載する種々の生物に由来する天然に存在するｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導してもよい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは同一生物に由来するものでもよいが、所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは第１の生物に由来する天然に存在するか又は天然に存在するものを突然変異させたｔＲＮＡから誘導し、Ｏ−ＲＳは第２の生物に由来する天然に存在するか又は天然に存在するものを突然変異させたＲＳから誘導する。
【００９７】
具体的には、これらの方法は（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡから誘導されるｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と、（ｂ）第１の生物に由来するＲＳの不在下で第２の生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡについてライブラリーをネガティブ選択することによりｔＲＮＡのプールを提供する段階と、（ｃ）導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについてｔＲＮＡのプールを選択することにより少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む。組換えＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、第２の生物に由来するＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。方法は更に、（ｄ）第３の生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）から誘導される突然変異体ＲＳのライブラリーを作製する段階と、（ｅ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸の存在下で組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーについてＲＳのライブラリーを選択することにより活性ＲＳのプールを提供する段階と、（ｆ）非天然アミノ酸の不在下で少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳについてプールをネガティブ選択することにより特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を提供する段階を含み、特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は非天然アミノ酸（例えば糖部分を含む非天然アミノ酸）に特異的な少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳと組換えＯ−ｔＲＮＡを含む。
【００９８】
直交対を作製するための１つのストラテジーは突然変異体ライブラリーを作製してこのライブラリーからＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択する方法である。直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を作製するための第２のストラテジーは異種ｔＲＮＡ／シンテターゼ対（例えば別の生物起源の対）を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の性質としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の性質としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアシル化されない（例えば、前記シンテターゼに対して直交性である）ことが挙げられる。
【００９９】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの作製方法はシンテターゼを（例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、シンテターゼの各種ドメインを組み合わせることにより各種部位等で）突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。一般に、ポジティブ及びネガティブ選択基準の併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択ラウンド中に、（ポジティブマーカーの非必須位置に導入した）セレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存することができる。選択段階は複数回、例えば少なくとも２回実施することが好ましく、場合により、選択物質の濃度を変動させる。従って、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。非天然アミノ酸の不在下（ネガティブ選択）では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。
【０１００】
これらのシンテターゼを場合により更に突然変異誘発（例えばＤＮＡシャフリング、他の帰納的突然変異誘発法、及び／又は当分野で公知の他の突然変異誘発技術）に付すことができる。例えば、部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、キメラ構築等により突然変異体ＲＳを作製することができる。ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。
【０１０１】
Ｏ−ＲＳの作製、シンテターゼの基質特異性の改変、及びＯ−ＲＳの他の例に関するその他の詳細については例えばＷＯ２００２／０８６０７５に記載されている。
【０１０２】
Ｏ−ｔＲＮＡと併用する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）（例えばＯ−ＲＳ）の同定方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は第１の種の細胞集団について選択（例えばポジティブ選択）を実施する段階を含み、前記細胞は１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）と；２）（例えば１種以上の種に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）（例えばポジティブ）選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞を選択又はスクリーニングする。抑圧効率は当分野で公知の技術及び本明細書に記載するように測定することができる。抑圧効率の高い細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。第１の種に由来する第１組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルを第２の種に由来する第２組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルと比較する。アミノアシル化レベルは検出可能な物質（例えば標識アミノ酸又は非天然アミノ酸、例えば標識ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン）により測定することができる。第１組のｔＲＮＡに比較して第２組のｔＲＮＡをより効率的にアミノアシル化する活性ＲＳを一般に選択することにより、Ｏ−ｔＲＮＡと併用する効率的（最適化）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが得られる。この方法により同定されたＯ−ＲＳも本発明の特徴である。
【０１０３】
アミノアシル化を測定するためには多数のアッセイの任意のものを使用することができる。これらのアッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイは例えばＨｏｂｅｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｌ（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：５５−５９に記載されている。アミノアシル化は直交翻訳成分と共にレポーターを使用し、蛋白質をコードする少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを発現する細胞でレポーターを検出することにより測定することもできる。ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」も参照。
【０１０４】
同定されたＯ−ＲＳを更に操作し、所望非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）のみをＯ−ｔＲＮＡに負荷し、２０種の標準アミノ酸のいずれをも負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変することができる。非天然アミノ酸に対して基質特異性をもつ直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの作製方法は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、シンテターゼの各種ドメインを組み合わせることによる各種部位等でシンテターゼを突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発（例えばＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法）に付すことができる。
【０１０５】
突然変異体Ｏ−ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳのライブラリーは２種以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さい「サブライブラリー」から作製することができる。ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物（例えば真正細菌又は古細菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー）（例えば米国特許第６，２３８，８８４号（Ｓｈｏｒｔら）；米国特許第５，７５６，３１６号（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら）；米国特許第５，７８３，４３１号（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら）；米国特許第５，８２４，４８５号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら）；米国特許第５，９５８，６７２号（Ｓｈｏｒｔら）参照）を構築し、直交対についてスクリーニングする。
【０１０６】
シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発することができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離することができ；（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードする１組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の１側面では、前記段階を複数回、例えば少なくとも２回実施する。
【０１０７】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、又はその対を作製するための本発明の方法では、付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはＯ−ＲＳを作製するための方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択／スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加ラウンドのポジティブ及び／又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の１種以上を含むこともできる。一般に、１種以上の変化は蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物における１個以上の遺伝子の突然変異に基づく。
【０１０８】
Ｏ−ＲＳの作製と、シンテターゼの基質特異性の改変に関するその他の一般的な詳細については国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」に記載されている。
資源及び宿主生物
【０１０９】
本発明の直交翻訳成分（Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳ）はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ成分と宿主系が直交に作用するという条件で他の任意種に由来する宿主翻訳系で使用するために任意生物（又は生物組み合わせ）に由来することができる。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは同一生物に由来する必要はない。１側面では、直交成分は真正細菌宿主系で使用するために古細菌遺伝子（即ち古細菌）に由来する。
【０１１０】
例えば、直交Ｏ−ｔＲＮＡは古細菌生物、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは生物又は生物組み合わせ、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。１態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの資源として使用することができる。
【０１１１】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来する。
【０１１２】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択又はスクリーニングすることができ、及び／又はＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞（例えば真正細菌細胞）で使用することができる。使用される真正細菌細胞は限定されないが、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等である。本発明の翻訳成分を含む真正細菌細胞の組成物も本発明の特徴である。
【０１１３】
別の種で使用するためにある種のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳをスクリーニングする方法については、国際出願公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」（出願日２００４年４月１６日）も参照。
セレクターコドン
【０１１４】
本発明のセレクターコドンは非天然アミノ酸（例えば糖部分を含む非天然アミノ酸）を組込むための蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、３個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して（例えば少なくとも１種のＧａｌＮＡｃアミノ酸を含む）複数の非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用することができる。
【０１１５】
６４種の遺伝コドンは２０種のアミノ酸と３種の終止コドンをコードする。翻訳終結には１個の終止コドンしか必要ないので、他の２個は主に非蛋白産生アミノ酸をコードするために使用することができる。アンバー終止コドンＵＡＧはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成系とアフリカツメガエル卵母細胞で使用して非天然アミノ酸の組込みを誘導することに成功している。３種の終止コドンのうちでＵＡＧは大腸菌での使用頻度が最も低い終止コドンである。大腸菌株にはＵＡＧを認識して天然アミノ酸を挿入する天然サプレッサーｔＲＮＡを含むものもある。更に、これらのアンバーサプレッサーｔＲＮＡは慣用蛋白質突然変異誘発でも使用されている。本発明の所定態様では、他の終止コドンを本発明で使用する。
【０１１６】
１態様では、本発明の方法及び系はグリコシル含有非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞組込みに終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止コドン（例えばＵＡＧ）を認識し、Ｏ−ＲＳによりＧａｌＮＡｃアミノ酸でアミノアシル化されるＯ−ｔＲＮＡを作製する。このＯ−ｔＲＮＡは天然に存在する宿主のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発法を使用して該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの該当部位に終止コドンを導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら，（１９８８），５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７９１−８０２参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び該当ポリペプチドをコードする核酸を例えばｉｎ  ｖｉｖｏで併用すると、ＧａｌＮＡｃアミノ酸は終止コドンに応答して組込まれ、特定位置にＧａｌＮＡｃアミノ酸を含むポリペプチドが得られる。本発明の１態様では、セレクターコドンとして使用される終止コドンはアンバーコドンＵＡＧ及び／又はオパールコドンＵＧＡである。１例では、セレクターコドンとしてＵＡＧとＵＧＡの両者を使用する遺伝コードは存在度が最も高い終結シグナルであるオーカーナンセンスコドンＵＡＡを保存しながら２２種のアミノ酸をコードすることができる。
【０１１７】
ＧａｌＮＡｃアミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みは宿主細胞をさほど撹乱せずに実施することができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加するか又はＲＦ１欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（終止コドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）真核放出因子１（例えばｅＲＦ）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。更に、付加化合物、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤も加えてもよい。
【０１１８】
ＧａｌＮＡｃアミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＭａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。更に、生物によっては全トリプレットコドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に使用されている。例えばＫｏｗａｌ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをｉｎ  ｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
【０１１９】
セレクターコドンは更に拡張コドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドン）も含むことができる。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）を同一蛋白質に挿入することができる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；及びＭａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  “Ｓｈｉｆｔｙ”  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９も参照。
【０１２０】
本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１個又は複数の非天然アミノ酸を同一蛋白質に挿入することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＭａら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７９３９；及びＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４参照。２個の化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジンに同時にｉｎ  ｖｉｔｒｏで組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用された。例えばＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４参照。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、ＭｏｏｒｅらはＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、カドラプレットＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３〜２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｍｏｏｒｅら，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。
【０１２１】
所与系では、セレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）。例えば、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡをもたない系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。
【０１２２】
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は既存遺伝子アルファベットを更に拡張する。塩基対が１個増えると、トリプレットコドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の性質としては安定的で選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び成長中の非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら，（２００２）Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２に記載されている。Ｗｕ，Ｙ．ら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。他の関連刊行物は以下に挙げる。
【０１２３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞内酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の報告はカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＳｗｉｔｚｅｒら，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する目的でＳｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｒｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対よりも安定していると認められており、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＭｃＭｉｎｎら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。生体機能に十分な効率と選択性でＫＦにより３ＭＮ：３ＭＮ自己対を合成することができる。例えばＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして作用するものである。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製することができる。例えばＴａｅら，（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法は天然コドンに直交性のｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
【０１２４】
翻訳バイパス系を使用して糖部分を含む非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に挿入されるが、蛋白質に翻訳されない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
【０１２５】
別法として又は糖部分を含む非天然アミノ酸をポリペプチドに組込みための他の上記方法と組み合わせてトランス翻訳系を使用することもできる。この系は大腸菌に存在するｔｍＲＮＡと呼ばれる分子を含む。このＲＮＡ分子はアラニルｔＲＮＡと構造的に関連しており、アラニルシンテターゼによりアミノアシル化される。ｔｍＲＮＡとｔＲＮＡの相違はアンチコドンループが特殊な大きい配列で置換されていることである。この配列はｔｍＲＮＡ内でコードされるオープンリーディングフレームを鋳型として使用し、停止している配列でリボソームに翻訳を再開させることができる。本発明では、直交シンテターゼで優先的にアミノアシル化され、非天然アミノ酸を負荷される直交ｔｍＲＮＡを作製することができる。この系を使用して遺伝子を転写することにより、リボソームは特定部位で停止し、非天然アミノ酸をこの部位に導入した後、直交ｔｍＲＮＡ内でコードされる配列を使用して翻訳が再開する。
非天然アミノ酸
【０１２６】
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種の遺伝的にコードされる以下のα−アミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。α−アミノ酸の一般構造は式Ｉ：
【化１】
2008516637.tif 000002
により表される。
【０１２７】
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種のα−アミノ酸以外の天然化合物でもよい。
【０１２８】
本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
【０１２９】
本発明ではＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む非天然アミノ酸が特に重要である。例えば、ＧａｌＮＡｃアミノ酸では、式ＩにおけるＲは任意Ｎ−アセチルガラクトサミン含有構造を含む。例えば、本発明ではＮ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン、トリアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−セリン、及びトリアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−セリンが利用される。本発明はＮ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン種を含む系に限定するものではない。例えば、他の各種ＧａｌＮＡｃアミノ酸が考えられる（例えば表１参照）。
【０１３０】
他の非天然アミノ酸では、例えば、式ＩにおけるＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、エーテル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、エノン、イミン、エステル、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、アミノ酸側鎖と結合した糖部分、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素等）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。
【０１３１】
別の側面では、本発明は下式ＩＶ：
【化２】
2008516637.tif 000003
により表される一般構造をもつＧａｌＮＡｃアミノ酸を提供する。
【０１３２】
この構造をもつＧａｌＮＡｃアミノ酸は一般にＲ１が２０種の天然アミノ酸の１種で使用される置換基であり、Ｒ２がＧａｌＮＡｃ置換基である任意構造である。従って、この種のアミノ酸は天然アミノ酸誘導体とみなすことができる。
【０１３３】
上記のように、本発明は非天然アミノ酸Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニンの使用に限定するものではない。実際に、真正細菌において本発明の直交翻訳系で使用することができる任意ＧａｌＮＡｃアミノ酸が本発明の範囲に含まれる。
【０１３４】
ＧａｌＮＡｃ基等の新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然ＧａｌＮＡｃアミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：
【化３】
2008516637.tif 000004
の構造により表されるような修飾主鎖構造も含み、上記式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩＩにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然ＧａｌＮＡｃ側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。
【０１３５】
チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはＧａｌＮＡｃ基、アルキニル基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分岐鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はアルキニル基、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、ニトロ、チオール基又はケト基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）、３，４，６−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４，５−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ニトロ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３−チオール−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられる。各種非天然ＧａｌＮＡｃアミノ酸の構造は本明細書に記載する。
【０１３６】
本発明の糖蛋白質の作製には、式ＩのＲが側鎖の一部として糖（グリコシル）部分を含む非天然アミノ酸が特に重要である。グリコシル含有非天然アミノ酸の例としては限定されないが、ＧａｌＮＡｃ−α−Ｏ−スレオニン、ＧａｌＮＡｃ−α−Ｏ−セリン、及びＧｌｃＮＡｃ−α−Ｏ−セリンと、（例えば１個以上のアセチル化ヒドロキシル残基を含む）対応する保護形態及びチオール類似体（アノマーＯをＳで置換）が挙げられる。
【０１３７】
本発明の組成物と方法で使用するのに適したグリコシル含有非天然アミノ酸としては、一般にアミノ酸側鎖に糖部分を結合したものが挙げられ、限定されないが、保護（例えばアセチル化）組成物と「脱保護」組成物の両者が挙げられる。１態様では、糖部分をもつ非天然アミノ酸としてはＭａｎ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、又はＧａｌ部分をもつセリン又はスレオニンが挙げられる。
【０１３８】
糖部分を含む非天然アミノ酸の例としては限定されないが、例えばトリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、α−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、Ｏ−Ｍａｎ−Ｌ−セリン、テトラアセチル−Ｏ−Ｍａｎ−Ｌ−セリン、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリアセチル−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−セリン、Ｇｌｃ−Ｌ−セリン、テトラアセチル−Ｇｌｃ−Ｌ−セリン、ｆｕｃ−Ｌ−セリン、トリアセチル−ｆｕｃ−Ｌ−セリン、Ｏ−Ｇａｌ−Ｌ−セリン、テトラアセチル−Ｏ−Ｇａｌ−Ｌ−セリン、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、トリアセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、Ｏ−Ｍａｎ−Ｌ−スレオニン、テトラアセチル−Ｏ−Ｍａｎ−Ｌ−スレオニン、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、トリアセチル−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、Ｇｌｃ−Ｌ−スレオニン、テトラアセチル−Ｇｌｃ−Ｌ−スレオニン、ｆｕｃ−Ｌ−スレオニン、トリアセチル−ｆｕｃ−Ｌ−スレオニン、Ｏ−Ｇａｌ−Ｌ−スレオニン、テトラアセチル−Ｏ−Ｇａｌ−セリン等が挙げられる。本発明のグリコシル含有組成物は上記の非保護形態と保護（アセチル化）形態の両者を含む。当業者に公知の付加及び／又は代替保護基（例えばｔ−ブチル部分、Ｆｍｏｃ保護基、フェニル基等）がグリコシル含有非天然アミノ酸の１個以上のヒドロキシル又はアミン部分に場合により存在していてもよい。代表的なグリコシルアミノ酸を表１に示す。ＷＯ２００３／０３１４６４Ａ２、発明の名称「ペプチドのリモデリングと糖結合（Ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」；及び米国特許第６，３３１，４１８号、発明の名称「糖組成物、その合成方法及び装置（Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」も参照。
【表１−１】
2008516637.tif 000005
【表１−２】
2008516637.tif 000006
非天然アミノ酸の化学的合成
【０１３９】
本明細書に記載するグリコシル含有非天然アミノ酸には例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）、Ｓｕｓｓｅｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｏｔｔａｗａ，ＣＡ）、Ｖ−Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，ＬＡ）、又は例えば固相ペプチド合成スキームで使用されるアミノ酸の他の供給業者から市販されているものがある。市販されていないものは必要に応じて下記実施例に記載する方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。非天然アミノ酸のその他の合成についてはＷＯ２００２／０８５９２３も参照。
【０１４０】
例えば、過アセチル化Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｏ−スレオニン２は実質的にＫｏｅｌｌｅｒら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：１０１７−１０２５に概説され、図２に示すような手順で合成することができる。ガラクトサミンＨＣｌ  １３を使用して過アセチル化アジド中間体１４を生成し、アノマー位置を選択的に脱アセチル化し、トリクロロアセトイミド酸誘導体１５に変換した。得られた１５のアノマー混合物をジクロロメタン：ジエチルエーテル（１：１）中、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチメルシリル（ＴＭＳＯＴｆ）で−３０℃にて活性化すると、中間体１７が主にα−アノマーとして得られた。アミノ部分とカルボニル部分を脱保護すると、過アセチル化Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｏ−スレオニン２が得られた。
【０１４１】
非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては例えばＭａｔｓｏｕｋａｓら，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．＆  Ｋｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．＆  Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら（１９８８）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．＆  Ｆｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．（１９９１）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら，（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｎｄ  Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら，（１９９２）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉ���ｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）も参照。
非天然アミノ酸の細胞取込み
【０１４２】
細胞による非天然アミノ酸取り込みは例えば蛋白質に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の１つである。例えば、α−アミノ酸は電荷密度が高いため、これらの化合物は細胞に浸透しにくいと思われる。天然アミノ酸は異なる程度のアミノ酸特異性を示すことが多い一連の蛋白質輸送システムにより細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取り込まれる場合にはどの非天然アミノ酸が取り込まれるかを判断する迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）；及びＬｉｕ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ  ９６：４７８０−４７８５における毒性アッセイ参照。取込みは種々のアッセイで容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産する生合成経路を提供する方法である。
非天然アミノ酸の生合成
【０１４３】
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば細胞中）には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は場合により新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより宿主細胞で作製される。付加新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、（ＷＯ２００２／０８５９２３、前出の実施例に記載されているような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこれらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。これらの遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。その他の酵素配列は例えばＧｅｎｂａｎｋに登録されている。人工的に進化させた酵素も場合により同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
【０１４４】
実際に、生合成経路で使用する新規酵素を生産するため又は非天然アミノを生産するように既存経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで進化させるためには種々の方法の任意のものを使用することができる。非天然アミノ酸を生産するため（又は、実際に新規基質特異性もしくは他の該当活性をもつようにシンテターゼを進化させるため）には、酵素及び他の生合成経路成分を進化させる方法として入手可能な多数の方法を本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸を生産（又は新規シンテターゼを生産）するように新規酵素及び／又は前記酵素の経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで開発するためには、場合によりＤＮＡシャフリングを使用する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４）ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１参照。関連アプローチは所望特性をもつ酵素を迅速に進化させるために関連（例えば相同）遺伝子のファミリーをシャフリングする。このような「ファミリー遺伝子シャフリング」法の１例はＣｒａｍｅｒｉら（１９９８）“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８−２９１に記載されている。（生合成経路成分であるか又はシンテターゼであるかを問わずに）新規酵素は例えばＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１２０５に記載されているような「ハイブリッド酵素作製用インクリメンタルトランケーション（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ＩＴＣＨＹ）」として知られるＤＮＡ組換え法を使用して作製することもできる。このアプローチは１種以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ組換え法の基質として使用することができる酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために使用することもできる。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７，及びＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，”  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ���ｓｔｒｙ，７：２１３９−４４も参照。別のアプローチは例えば非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産に関連する生合成反応を触媒する能力について選択する酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために指数的集合突然変異誘発を使用する。このアプローチでは、該当配列中の小群の残基を並行してランダム変異させ、機能的蛋白質をもたらすアミノ酸を各変異位置で同定する。非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産用新規酵素を作製するように本発明に応用することができるこのような方法の例はＤｅｌｅｇｒａｖｅ  ＆  Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１５４８−１５５２に記載されている。更に別のアプローチでは、例えばＡｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９７−３００；又はＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）“Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６の一般突然変異誘発法を使用することにより、酵素及び／又は経路成分操作にドープ又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム又は半ランダム突然変異誘発を使用することができる。ポリヌクレオチドリアセンブリと部位飽和突然変異誘発を使用する更に別のアプローチ（「非確率論的」突然変異誘発と呼ぶことが多い）を使用すると、酵素及び／又は経路成分を作製した後に、（例えば非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ生産のための）１種以上のシンテターゼ又は生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えばＳｈｏｒｔ「遺伝子ワクチン及び酵素の非確率論的作製（ＮＯＮ−ＳＴＯＣＨＡＳＴＩＣ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ）」ＷＯ００／４６３４４参照。
【０１４５】
このような突然変異法の代替方法は生物の全ゲノムを組換え、得られた子孫を特定経路機能について選択する方法である（「全ゲノムシャフリング」と呼ぶことが多い）。このアプローチは、例えばゲノム組換えと非天然アミノ酸（又はその中間体）の生産能に関する生物（例えば大腸菌又は他の細胞）の選択により本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産するように細胞で既存及び／又は新規経路を進化させるための経路設計には、以下の刊行物に教示されている方法を適用することができる：Ｐａｔｎａｉｋら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｃｉｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（７）：７０７−７１２；及びＺｈａｎｇら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒａｐｉｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ７，４１５（６８７２）：６４４−６４６。
【０１４６】
例えば所望化合物を生産するための他の生物及び代謝経路組換え技術も利用可能であり、同様に非天然アミノ酸の生産に適用することができる。有用な経路組換えアプローチを教示している刊行物の例としては、Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ（２００３）“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３  ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：４５４−９；Ｂｅｒｒｙら（２００２）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｄｉｇｏ”Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：１２７−１３３；Ｂａｎｔａら（２００２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（２０），６２２６−３６；Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａら（２００１）“Ｒａｐｉｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５、及び他の多数の文献が挙げられる。
【０１４７】
使用する方法に関係なく、一般に本発明の組換え生合成経路を使用して生産される非天然アミノ酸は効率的な蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然細胞量）で生産されるが、他の細胞内アミノ酸濃度を有意に変化させたり細胞資源を枯渇させる程ではない。このようにｉｎ  ｖｉｖｏ生産される典型的な濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するように細胞を組換え、非天然アミノ酸を作製した後、場合によりｉｎ  ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両方に適合するように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンを組込むための直交成分
【０１４８】
本発明はセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン、ナンセンスコドン、４塩基以上のコドン等）に応答して成長中のポリペプチド鎖にＧａｌＮＡｃアミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン）を例えばｉｎ  ｖｉｖｏで組込むための直交成分を作製する組成物及び方法を提供する。例えば、本発明は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）及びその対を提供する。これらの対は成長中のポリペプチド鎖にＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンを組込むために使用することができる。
【０１４９】
本発明の組成物は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンで優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１、２、３もしくは４を含むアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡよりもＯ−ｔＲＮＡを優先的にＧａｌＮＡｃアミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、ＧａｌＮＡｃアミノ酸を負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＧａｌＮＡｃアミノ酸を負荷される内在ｔＲＮＡの比は１：１を上回り、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。
【０１５０】
Ｏ−ＲＳを含む組成物は場合により更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含むことができ、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。一般に、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表（例えば配列番号１７）及び実施例に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍又はそれ以上である。１側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交チロシルｔＲＮＡシンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも４５％である。
【０１５１】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は場合により細胞（例えば大腸菌細胞等の真正細菌細胞）、及び／又は翻訳系を含むことができる。
【０１５２】
本発明は翻訳系を含む細胞（例えば真正細菌細胞）も提供し、前記翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；ＧａｌＮＡｃアミノ酸を含む。一般に、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡよりもＯ−ｔＲＮＡを優先的にＧａｌＮＡｃアミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、ＧａｌＮＡｃアミノ酸を負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＧａｌＮＡｃアミノ酸を負荷される内在ｔＲＮＡの比は１：１を上回り、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをＧａｌＮＡｃアミノ酸で優先的にアミノアシル化する。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号１７に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。１態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１、２、３、４の任意１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。
【０１５３】
本発明の細胞は場合により異なる付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を更に含むことができ、例えばこのＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、このＯ−ＲＳは対応するＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のアミノ酸はＧａｌＮＡｃアミノ酸と異なる。場合により、本発明の細胞は該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。
【０１５４】
所定態様では、本発明の細胞は直交−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、ＧａｌＮＡｃアミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン）と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む真正細菌細胞（例えば大腸菌細胞）であり、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率よりも高い効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
【０１５５】
本発明の所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表（例えば配列番号１７）及び実施例に記載するようなポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは本明細書の配列表に記載するようなアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳ又はその一部は本明細書の配列又は実施例に記載するようなアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１５６】
本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは種々の生物（例えば真核及び／又は非真核生物）の任意のものに由来することができる。
【０１５７】
ポリヌクレオチドも本発明の特徴である。本発明のポリヌクレオチドは本明細書の配列表に記載するようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む人工（例えば人為的に作製され、天然には存在しない）ポリヌクレオチドを含むか、及び／又は前記ポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードする。本発明のポリヌクレオチドは更に核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も含むことができる。本発明のポリヌクレオチドは更に天然に存在するｔＲＮＡ又は対応するコーディング核酸のポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致するポリヌクレオチドを含み（但し、本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡ又は対応するコーディング核酸以外のものである）、前記ｔＲＮＡはセレクターコドン（例えば４塩基コドン）を認識する。上記任意ポリヌクレオチド及び／又は上記任意ポリヌクレオチドの保存変異体を含むポリヌクレオチドと例えば少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
【０１５８】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも本発明の特徴である。例えば、本発明のベクターはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター及び／又は同等物を含むことができる。本発明のベクターを含む細胞も本発明の特徴である。
【０１５９】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の成分の作製方法も本発明の特徴である。これらの方法により作製された成分も本発明の特徴である。例えば、細胞に対して直交性である少なくとも１種のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法は突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と；セレクターコドンを認識できるように突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させることにより、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーを提供する段階と、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む第１の種の第１の細胞集団についてネガティブ選択を実施する段階を含む。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡプールが得られ、それにより少なくとも１種のＯ−ｔＲＮＡが得られる。本発明の方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも提供する。
【０１６０】
所定態様では、前記方法は更に第１の種の第２の細胞集団についてポジティブ選択を実施する段階を含み、前記細胞は第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡプールのメンバーと、コグネイトアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、ポジティブ選択マーカーを含む。ポジティブ選択を使用し、コグネイトアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化され、ポジティブ選択マーカーの存在下で所望応答を示すｔＲＮＡプールのメンバーを含む細胞について細胞を選択又はスクリーニングすることにより、Ｏ−ｔＲＮＡを得る。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。
【０１６１】
ＧａｌＮＡｃアミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの同定方法も提供する。例えば、方法は第１の種の細胞集団に選択を実施する段階を含み、前記細胞は、１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ、又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）のメンバーと；２）（例えば１種以上の種に由来する）直交−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）ポジティブ選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。
【０１６２】
複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞（例えば宿主細胞）を選択又はスクリーニングする。これらの選択／スクリーニングした細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。この方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼも本発明の特徴である。
【０１６３】
ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンを特定位置にもつ蛋白質を細胞（例えば大腸菌細胞等の真正細菌細胞）で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンを提供する段階と、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置にＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンを組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡをＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
【０１６４】
本発明は例えばＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンを組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は公知蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分）のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。場合により、組成物は医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。
糖蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏ合成
【０１６５】
本発明の方法及び翻訳系では直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対による非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。糖蛋白質をｉｎ  ｖｉｖｏ合成するためには、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと、グリコシル含有非天然アミノ酸と直交ｔＲＮＡの結合を触媒する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と共に、（糖部分の結合が所望される位置に１個以上のセレクターコドンを組込んだ）該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する。グリコシル含有アミノ酸は一般に宿主細胞の増殖培地に外部から添加されるが、場合により宿主細胞に生合成経路を挿入することによりｉｎ  ｖｉｖｏ合成することもできる。糖蛋白質を生産するために、Ｏ−ＲＳは非天然アミノ酸を直交ｔＲＮＡと結合した後に、翻訳機構により適当なセレクターコドンが提示されると、非天然アミノ酸を成長中の該当グリコポリペプチドに導入する。
【０１６６】
場合により、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び合成しようとする糖蛋白質をコードするポリヌクレオチドの１種以上を発現する１種以上のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分は単一ベクターに配置してもよいし、ベクターの組合わせに配置してもよい。場合により、ベクターはプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
【０１６７】
ターゲット核酸を細菌細胞に導入する方法としては数種の周知方法が利用可能であり、本発明ではその任意のものを使用することができる。これらの方法としては、ＤＮＡを含む細菌プロトプラストとレシピエント細胞の融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃及びウイルスベクターによる感染等が挙げられる。遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。
【０１６８】
直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出，及びＡｕｓｕｂｅｌ，前出参照。クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。シーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面のその他の基本手順と基礎理論事項もＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔに記載されている。
【０１６９】
例えば、糖蛋白質の生産方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、糖部分を含む非天然アミノ酸を提供する段階と、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。場合により、核酸は少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、又は１０個（以上）のセレクターコドンを含む。細胞は更に、セレクターコドンを認識するＯ−ｔＲＮＡと、グリコシル含有非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを含む。一般方法は参考資料として本明細書に組込むＰＣＴ国際公開ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」と国際公開ＷＯ２００４−０３５７６、発明の名称「ケトアミノ酸の部位特異的蛋白質組込み（Ｓｉｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｅｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」に記載されている。
【０１７０】
例えば細胞単離及び培養（例えば後期核酸単離）に有用な他の文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
【０１７１】
分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター、更に例えば非天然アミノ酸、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製に関連する他の多くの関連事項について記載している。
グリコシルトランスフェラーゼ
【０１７２】
本発明は更に糖部分をもつ非天然アミノ酸を更にグリコシル化する方法を提供する。これらのグリコシル化段階は例えばグリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、又は当業者に公知の他の酵素を使用して酵素により実施することが好ましい。所定態様では、２種以上の異なるグリコシルトランスフェラーゼを含む単一反応混合物で複数の酵素段階を実施する。例えば、シアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼの両者を反応混合物に加えることによりガラクトシル化段階とシアリル化段階を同時に実施することができる。
【０１７３】
グリコシルトランスフェラーゼ反応を含む酵素糖合成では、本発明の組換え細胞は場合によりグリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１個の異種遺伝子を含む。多数のグリコシルトランスフェラーゼとそのポリヌクレオチド配列が公知である。例えば“Ｔｈｅ  ＷＷＷ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ”参照（ワールドワイドウェブで閲覧可能）。グリコシルトランスフェラーゼアミノ酸配列とアミノ酸配列を推定することが可能なグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列もＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬ等の各種公開データベースから入手できる。
【０１７４】
本発明の細胞で使用することができるグリコシルトランスフェラーゼとして限定されないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ等が挙げられる。適切なグリコシルトランスフェラーゼとしては真核生物と原核生物から得られるものが挙げられる。
【０１７５】
グリコシル化反応は適切なグリコシルトランスフェラーゼと受容体に加え、グリコシルトランスフェラーゼの糖供与体として機能する活性化ヌクレオチド糖を含む。反応は更にグリコシルトランスフェラーゼ活性を助長する他の成分も含むことができる。これらの成分としては２価カチオン（例えばＭｇ＋２又はＭｎ＋２）、ＡＴＰ再生に必要な材料、リン酸イオン、及び有機溶媒が挙げられる。プロセスで使用される種々の反応体の濃度又は量は温度及びｐＨ値等の反応条件や、グリコシル化すべき受容体糖の選択と量などの多数の因子により異なる。反応媒体は更に必要に応じて溶解補助界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ又はＳＤＳ）と、メタノール又はエタノール等の有機溶媒を加えてもよい。
核酸及びポリペプチド配列と変異体
【０１７６】
本明細書に記載するように、本発明は例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列と、ポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ＲＳ）と、前記配列を含む組成物、方法、翻訳系及びキットを提供する。前記配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳアミノ酸及びヌクレオチド配列）の例を本明細書に開示する（表３、例えば配列番号１〜１７参照）。しかし、当業者に自明の通り、本発明は本明細書、例えば実施例や配列表に開示する配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は例えば本明細書に記載する機能をもつ（例えば本明細書に記載する機能をもつＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをコードする、例えばグリコシル含有非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷するＯ−ＲＳをコードする）多数の他の関連配列も提供する。Ｏ−ｔＲＮＡをＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンでアミノアシル化することが可能なＯ−ＲＳ種の構築と分析を実施例に記載する。これらの実施例は単離された４種のＯ−ＲＳ種について記載する。本明細書は更に本発明の範囲内に含まれる付加Ｏ−ＲＳ種（例えば単離されたＯ−ＲＳ種の保存変異体）を設計するために十分な手引きについても記載する。
【０１７７】
本発明はポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）とポリヌクレオチド（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はその部分をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチド等）を提供する。本発明のポリペプチドは更に人工ポリペプチドを含み、例えば（ａ）配列番号１〜４及び１１〜１３のいずれか１種に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｂ）配列番号６〜９及び１４〜１６のいずれか１種に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）（ａ）、又は（ｂ）のポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的に免疫反応性のポリペプチド；並びに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の保存変異体を含むアミノ酸配列が挙げられる。本発明の人工ポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体及び抗血清も提供する。１態様では、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含有する。
【０１７８】
本発明のポリヌクレオチドとしては１個以上のセレクターコドンを含み、本発明の該当蛋白質又はポリペプチドをコードするものが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは配列番号６〜９、１４〜１６のいずれか１種のポリヌクレオチド、又はその保存変異体と、配列番号１〜４又は１１〜１３を含むアミノ酸配列（又はこれらのアミノ酸配列の保存変異体）をコードする他のポリヌクレオチドも含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする人工核酸（天然ポリヌクレオチド以外のもの）も本発明のポリヌクレオチドである。人工ポリヌクレオチドは天然に存在しない人造ポリヌクレオチドである。
【０１７９】
本発明はポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）とポリヌクレオチド（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はその部分をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチド等）を提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、１個以上のセレクターコドンをもつ本発明の該当蛋白質又はポリペプチドをコードするものが挙げられる。更に、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号６、７、８又は９に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；そのポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは更に配列番号１、２、３又は４を含むアミノ酸配列をコードする任意ポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは更に本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする人工核酸（天然ポリヌクレオチド以外のもの）も本発明のポリヌクレオチドである。１態様では、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含有する。本発明は本発明のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清も提供する。人工ポリヌクレオチドは人為的に作製され、天然には存在しないポリヌクレオチドである。
【０１８０】
本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチド（但し、天然に存在するｔＲＮＡ以外のもの）も含む。ポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する（但し１００％は一致しない）人工ポリヌクレオチドも含む。
【０１８１】
所定態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）に本発明のポリヌクレオチドを組込む。１態様では、ベクターは発現ベクターである。別の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
【０１８２】
同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。少なくとも１種の開示配列とハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により判定した場合に本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であると判断される配列も本発明に含まれる。
保存変異
【０１８３】
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸を類似の化学的特性をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異体は本発明の特徴である。
【０１８４】
特定核酸配列の「保存変異体」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は「保存修飾変異」である。従って、本発明の指定ポリペプチド配列の「保存変異体」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満が同一保存置換基のアミノ酸で置換される場合が挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
【０１８５】
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知であり、このようなアミノ酸では、あるアミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば芳香族側鎖又は正荷電側鎖）をもつ別のアミノ酸残基に置換しているため、ポリペプチド分子の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似する天然アミノ酸を含む代表的グループを以下に示すが、これらのグループ内の置換は「保存置換」である。
【表２】
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核酸ハイブリダイゼーション
【０１８６】
本発明の核酸の保存変異体を含めて本発明の核酸（例えば配列番号６〜９及び１４〜１６）を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を識別する１好適方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で例えば配列番号６〜９及び１４〜１６により表される核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して１又は少数のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
【０１８７】
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも５０％の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。
【０１８８】
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）に記載されており、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １）と、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
【０１８９】
サザン又はノーザンブロットで１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間洗浄する（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
【０１９０】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件では、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。
【０１９１】
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的には、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
【０１９２】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１９３】
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高レベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１９４】
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
ユニークサブ配列
【０１９５】
１側面では、本発明は本明細書に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は任意公知Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【０１９６】
同様に、本発明は本明細書に開示するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は任意公知ポリペプチド配列に対応するポリペプチドに比較してユニークである。
【０１９７】
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを例えば突然変異により誘導した元の親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
配列比較、一致度及び相同度
【０１９８】
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度百分率」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
【０１９９】
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％又はそれ以上であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域、より好ましくは少なくとも約１００残基長の領域にわたって「実質的一致」が存在していることが好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
【０２００】
蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、１個以上のセレクターコドンを含むように任意天然核酸を利用可能な任意突然変異誘発法により改変することができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１種以上の非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２種以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上のより高レベルの配列類似度を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
【０２０１】
配列比較及び相同性判定には、一般にある配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
【０２０２】
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）参照）により実施することができる。
【０２０３】
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトから公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【０２０４】
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
突然変異誘発及び他の分子生物学技術
【０２０５】
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター、更に例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン）、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製に関連する他の多くの関連事項について記載している。
【０２０６】
例えばｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、ＧａｌＮＡｃアミノ酸をコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、本発明では各種突然変異誘発法を使用する。これらの方法としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の既知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）に基づいて突然変異誘発を誘導することができる。
【０２０７】
本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドを組込んだ構築物（例えばクローニングベクター又は発現ベクター等の本発明のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０−７３（１９８７））、及び／又は同等方法等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
【０２０８】
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９６）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。シーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面のその他の基本手順と基礎理論事項もＳａｍｂｒｏｏｋ（前出）、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）、及びＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ  ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，ワールドワイドウェブｇｅｎｃｏ．ｃｏｍで販売）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ワールドワイドウェブｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍで販売）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）及び他の多数の企業等の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
【０２０９】
遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。例えば細胞単離及び培養（例えば後期核酸単離）に有用な他の文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
該当蛋白質及びポリペプチド
【０２１０】
（例えばＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン等の少なくとも１種のＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込んだ）該当蛋白質又はポリペプチドは本発明の特徴である。本発明は本発明の組成物と方法を使用して生産された少なくとも１種のＧａｌＮＡｃアミノ酸を含むポリペプチド又は蛋白質も含む。賦形剤（例えば医薬的に許容可能な賦形剤）も蛋白質に添加することができる。場合により、本発明の蛋白質は単一アミノ酸位置又は複数の位置に翻訳後修飾（例えば付加糖部分の結合等のＧａｌＮＡｃアミノ酸部分の後期修飾）を含むことができるか、あるいは蛋白質は複数の異なる型の修飾をもつことができる。
【０２１１】
ＧａｌＮＡｃアミノ酸を特定位置にもつ蛋白質を細胞で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、ＧａｌＮＡｃアミノ酸を提供する段階を含み、細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡをＧａｌＮＡｃアミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
【０２１２】
所定態様では、Ｏ−ＲＳは発現系において内在ｔＲＮＡよりもコグネイトＯ−ｔＲＮＡのアミノアシル化を優先する。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【０２１３】
本発明はＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。
【０２１４】
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。その後、本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分を宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、ＧａｌＮＡｃアミノ酸が蛋白質に組込まれる。国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」、及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」はこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌細胞）に導入すると、前記対はセレクターコドンに応答してＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン等のＧａｌＮＡｃアミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質組込みを誘導する。系に付加されるＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンは合成アミノ酸（例えばスレオニン誘導体）であり、外部から増殖培地に添加することができる。場合により、本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、ｉｎ  ｖｉｖｏ系に導入してもよい。
【０２１５】
本発明の翻訳系（例えば宿主細胞を含む翻訳系）は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を大量の有用な量で合成することができる。１側面では、組成物は場合により、ＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込んだ蛋白質を例えば少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、又はそれ以上、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する（組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本明細書に記載する）。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中（例えば約１ｎｌ〜約１００Ｌの任意の容量中）に例えば少なくとも１０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも７５μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１ｍｇ蛋白質／ｌ、又は少なくとも１０ｍｇ蛋白質／ｌ以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも１種のＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で大量（例えば他の方法、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多量）に生産することも本発明の特徴である。
【０２１６】
ＧａｌＮＡｃアミノ酸の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、（例えば蛋白質アレーのための）部分へのターゲット等を変化させるように例えば蛋白質構造及び／又は機能の変化を調整するために実施することができる。ＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込んだ蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、ＧａｌＮＡｃアミノ酸を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期（例えば血清半減期）、他の分子との（例えば共有又は非共有）反応性等の性質を改変する。少なくとも１種のＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物は例えば新規治療薬、診断薬、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質（例えば抗体）、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。
【０２１７】
本発明の１側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸及び／又は他の非天然アミノ酸）を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を含有する。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個がＧａｌＮＡｃアミノ酸で置換された蛋白質を含有する。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
【０２１８】
本明細書に記載する組成物と方法を使用してガラクトサミン又はグルコサミン含有非天然アミノ酸を含むほぼ任意蛋白質（又はその部分）（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）を生産することができる。数十万種の公知蛋白質を列挙するには及ばないが、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを含むように入手可能な任意突然変異法を調整することにより、１種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
【０２１９】
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等）と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致しており、１種以上の非天然アミノ酸を含む。１種以上のＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」；及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」に記載されているものが挙げられる。１種以上のＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体（抗体の詳細については後述する）、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ並びに他の多数の蛋白質が挙げられる。
【０２２０】
本明細書に記載するＧａｌＮＡｃアミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込み用組成物及び方法を使用して生産することができる蛋白質の１類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
【０２２１】
本発明の蛋白質（例えば１種以上のＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込んだ蛋白質）の１類としてはサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物等の生体活性蛋白質が挙げられ、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４；シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）；並びに転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
【０２２２】
少なくとも１種のＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込んだ酵素（例えば産業用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
【０２２３】
これらの蛋白質の多くは市販されており（例えばＳｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ２００２カタログ及び価格表参照）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である（例えばＧｅｎｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って１種以上のＧａｌＮＡｃアミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の付加による）検出性、ＬＤ５０又は他の副作用の低減、胃管を経由して体内に導入できること（例えば経口利用性）等が挙げられる。診断特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能等が挙げられる。
【０２２４】
他の各種蛋白質も本発明の組成物と方法を使用して１種以上のＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する蛋白質において、１種以上のワクチン蛋白質中の１種以上の天然アミノ酸をＧａｌＮＡｃアミノ酸で置換することができる。
【０２２５】
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質もＧａｌＮＡｃアミノ酸修飾の適切なターゲットである。
【０２２６】
所定態様では、本発明の方法及び／又は組成物における該当蛋白質又はポリペプチド（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含む。
【０２２７】
該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込むための１個以上のセレクターコドンを付加するように本明細書の「突然変異誘発及び他の分子生物学技術」のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して突然変異誘発することができる。例えば、１個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、１種以上のＧａｌＮＡｃアミノ酸を挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも１種のＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体（例えば突然変異体、変形）を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち１種以上のＧａｌＮＡｃアミノ酸をコードする１個以上のセレクターコドンを含む任意核酸も含む。
【０２２８】
ＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するためには、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対によるＧａｌＮＡｃアミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質をコードするベクターを発現する１種以上のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベクターに配置してもよいし、２成分を第１のベクターに配置し、第３の成分を第２のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
免疫反応性によるポリペプチドの定義
【０２２９】
本発明のポリペプチドは種々の新規ポリペプチド配列（例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合にはＧａｌＮＡｃアミノ酸を含み、例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含むポリペプチド）を提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製及び前記抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴である。本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，１９９９，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。
【０２３０】
本発明は本明細書に記載する各種配列の１種以上から選択されるシンテターゼアミノ酸配列を含む免疫原に対して作製した抗体又は抗血清に特異的に結合するか又は特異的に免疫反応性である新規シンテターゼ蛋白質を含む。他の相同体との交差反応性を排除するために、野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）チロシルシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）等の入手可能なシンテターゼ又はＷＯ２００２／０８５９２３に記載されているもの等の公知人工シンテターゼを用いて抗体又は抗血清をサブトラクションする。野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）又は従来配列が核酸に対応する場合には、場合により核酸によりコードされるポリペプチドを作製し、抗体／抗血清サブトラクション目的に使用する。
【０２３１】
典型的な１フォーマットでは、イムノアッセイは本明細書に記載するシンテターゼ配列の１種以上又はその実質的サブ配列（即ち記載する全長配列の少なくとも約３０％）を含む１種以上のポリペプチドに対して作製したポリクローナル抗血清を使用する。これらの配列に由来する潜在的ポリペプチド免疫原群を以下の文中では「免疫原性ポリペプチド」と総称する。得られた抗血清を場合により対照シンテターゼ相同体（野生型ＴｙｒＲｓ、及び／又はＷＯ２００２／０８５９２３に記載のシンテターゼ）に対する交差反応性が低下するように選択し、ポリクローナル抗血清をイムノアッセイで使用する前に例えば免疫吸着により対照シンテターゼ相同体の１種以上に対するこのような交差反応性を排除する。
【０２３２】
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で生産することができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。抗体に関するその他の事項については本明細書にも記載し、本欄の免疫反応性によるポリペプチドの定義にも適用することができる）。例えば、国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０３５６０５、発明の名称「糖蛋白質合成（ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）」；及びＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」参照。
【０２３３】
あるいは、本明細書に開示する配列から誘導される１種以上の合成又は組換えポリペプチドをキャリヤー蛋白質にコンジュゲートし、免疫原として使用する。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細はＷＯ２００２／０８５９２３に記載されている。
【０２３４】
ポリクローナル血清を採取し、イムノアッセイ（例えば固体支持体に固定化した免疫原性蛋白質の１種以上を使用する固相イムノアッセイ）で免疫原性ポリペプチドに対する力価を測定する。１０６以上の力価をもつポリクローナル抗血清を選択し、プールし、対照シンテターゼポリペプチドでサブトラクションし、高力価ポリクローナル抗血清サブトラクションプールを作製する。
【０２３５】
高力価ポリクローナル抗血清サブトラクションプールを比較イムノアッセイで対照相同体に対する交差反応性について試験する。この比較アッセイでは、サブトラクション高力価ポリクローナル坑血清に差別的な結合条件を設定し、高力価ポリクローナル坑血清と免疫原性シンテターゼの結合のシグナル対ノイズ比を対照シンテターゼ相同体との結合に比較して少なくとも約５〜１０倍にする。即ち、アルブミン又は脱脂粉乳等の非特異的競合剤を加えるか及び／又は塩条件、温度、及び／又は同等条件を調節することにより結合反応のストリンジェンシーを調整する。これらの結合条件は、試験ポリペプチド（免疫原性ポリペプチド及び／又は対照ポリペプチドに比較するポリペプチド）がサブトラクションポリクローナル坑血清プールに特異的に結合するか否かを調べる後期アッセイで使用される。特に、差別的結合条件下で対照シンテターゼ相同体の少なくとも２〜５倍のシグナル対ノイズ比と、免疫原性ポリペプチドの少なくとも約１／２のシグナル対ノイズ比を示す試験ポリペプチドは公知シンテターゼに比較して免疫原性ポリペプチドと実質的な構造類似性をもつので、本発明のポリペプチドである。
【０２３６】
別の例では、競合的結合フォーマットのイムノアッセイを試験ポリペプチドの検出に使用する。例えば、上述のように、対照ポリペプチドの免疫吸着により坑血清混合物プールから交差反応性抗体を除去する。次に、免疫原性ポリペプチドを固体支持体に固定化し、支持体をサブトラクション坑血清プールに暴露する。試験蛋白質をアッセイに加え、サブトラクション坑血清プールとの結合を競合させる。試験蛋白質が固定化蛋白質に対してサブトラクション坑血清プールとの結合を競合する能力と、アッセイに加えた免疫原性ポリペプチドが結合を競合する能力を比較する（免疫原性ポリペプチドは坑血清プールとの結合を固定化免疫原性ポリペプチドと有効に競合する）。標準計算を使用して試験蛋白質の交差反応性百分率を計算する。
【０２３７】
平行アッセイでは、場合により対照蛋白質がサブトラクション坑血清プールとの結合を競合する能力を免疫原性ポリペプチドが坑血清との結合を競合する能力と比較測定する。この場合も、標準計算を使用して対照ポリペプチドの交差反応性百分率を計算する。試験ポリペプチドの交差反応性百分率が対照ポリペプチドの少なくとも５〜１０倍である場合又は試験ポリペプチドの結合が免疫原性ポリペプチドの結合とほぼ同一範囲である場合に、試験ポリペプチドはサブトラクション坑血清プールに特異的に結合すると言う。
【０２３８】
一般に、本明細書に記載する競合的結合イムノアッセイでは任意試験ポリペプチドを免疫原性及び／又は対照ポリペプチドに比較するために免疫吸着坑血清プールを使用することができる。この比較を行うためには、免疫原性、試験及び対照ポリペプチドを各々広い濃度範囲でアッセイし、サブトラクション坑血清と例えば固定化した対照、試験又は免疫原性蛋白質との結合の５０％を阻害するために必要な各ポリペプチドの量を標準技術により決定する。競合アッセイで結合に必要な試験ポリペプチドの量が免疫原性ポリペプチドの必要量の２倍未満であり、対照ポリペプチドの少なくとも約５〜１０倍である場合に、試験ポリペプチドは免疫原性蛋白質に対して作製した抗体に特異的に結合すると言う。
【０２３９】
特異性の付加試験として、得られる免疫原性ポリペプチドサブトラクション坑血清プールと免疫吸着に使用する免疫原性ポリペプチドの結合が殆ど又は全く検出できなくなるまで場合により坑血清プールに（対照ポリペプチドではなく）免疫原性ポリペプチドを完全に免疫吸着させる。この完全に免疫吸着させた坑血清を次に試験ポリペプチドとの反応性について試験する。反応性が殆ど又は全く観察されない場合（即ち完全に免疫吸着させた坑血清と免疫原性ポリペプチドの結合に観察されるシグナル対ノイズ比の２倍以下）には、試験ポリペプチドは免疫原性蛋白質により誘導される坑血清に特異的に結合する。
Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の使用
【０２４０】
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。その後、本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分を宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、ＧａｌＮＡｃアミノ酸が蛋白質に組込まれる。国際公開ＷＯ２００２／０８５９２３、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」はこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌細胞）に導入すると、前記対はセレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドン）に応答して外部から増殖培地に添加することができるＧａｌＮＡｃアミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質（例えばミオグロビン試験蛋白質又は治療用蛋白質）組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、細胞内ｉｎ  ｖｉｖｏ系に導入してもよい。ＧａｌＮＡｃアミノ酸を組込んだ蛋白質は多様な用途の任意のものに使用することができる。最も特筆すべき点として、蛋白質に組込まれたＧａｌＮＡｃ部分は例えば、他の蛋白質、小分子（例えばラベルや色素）及び／又は生体分子との架橋をはじめとする多様な修飾の任意のもののターゲットとして利用することができる。これらの修飾により、ＧａｌＮＡｃアミノ酸の組込みの結果、治療用蛋白質を改善することができ、更に酵素の触媒機能を改変又は改善するために使用することもできる。所定側面では、ＧａｌＮＡｃアミノ酸の蛋白質組込みとその後の修飾は蛋白質構造、他の蛋白質との相互作用等の研究を助長することができる。
キット
【０２４１】
キットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも１個の糖部分（例えばＧａｌＮＡｃアミノ酸）を組込んだ糖蛋白質を細胞で生産するためのキットが提供され、前記キットはＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ｔＲＮＡ、及び／又はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ＲＳを収容する容器を含む。１態様では、キットは更にＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン等のＧａｌＮＡｃアミノ酸を含む。別の態様では、キットは更に（例えば対照用の）セレクターコドンを含む１種以上のポリヌクレオチド配列、緩衝液、各種容器、糖蛋白質を生産するための説明書等を含む。
糖蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏ合成
【０２４２】
本発明の方法及び翻訳系では直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対による非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。糖蛋白質をｉｎ  ｖｉｖｏ合成するためには、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと、グリコシル含有非天然アミノ酸と直交ｔＲＮＡの結合を触媒する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と共に、（糖部分の結合が所望される位置に１個以上のセレクターコドンを組込んだ）該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する。グリコシル含有アミノ酸は一般に宿主細胞の増殖培地に外部から添加されるが、場合により宿主細胞に生合成経路を挿入することによりｉｎ  ｖｉｖｏ合成することもできる。糖蛋白質を生産するために、Ｏ−ＲＳは非天然アミノ酸を直交ｔＲＮＡと結合した後に、翻訳機構により適当なセレクターコドンが提示されると、非天然アミノ酸を成長中の該当グリコポリペプチドに導入する。
【０２４３】
場合により、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び合成しようとする糖蛋白質をコードするポリヌクレオチドの１種以上を発現する１種以上のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分は単一ベクターに配置してもよいし、ベクターの組合わせに配置してもよい。場合により、ベクターはプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
【０２４４】
ターゲット核酸を細菌細胞に導入する方法としては数種の周知方法が利用可能であり、本発明ではその任意のものを使用することができる。これらの方法としては、ＤＮＡを含む細菌プロトプラストとレシピエント細胞の融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃及びウイルスベクターによる感染等が挙げられる。遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。
【０２４５】
直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出，及びＡｕｓｕｂｅｌ，前出参照。クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。シーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面のその他の基本手順と基礎理論事項もＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔに記載されている。
【０２４６】
例えば、糖蛋白質の生産方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、糖部分を含む非天然アミノ酸を提供する段階と、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。場合により、核酸は少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、又は１０個（以上）のセレクターコドンを含む。細胞は更に、セレクターコドンを認識するＯ−ｔＲＮＡと、グリコシル含有非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを含む。一般方法は参考資料として本明細書に組込むＰＣＴ公開ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」と国際公開ＷＯ２００４−０３５７６、発明の名称「ケトアミノ酸の部位特異的蛋白質組込み（Ｓｉｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｅｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」に記載されている。
【０２４７】
例えば細胞単離及び培養（例えば後期核酸単離）に有用な他の文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
【０２４８】
分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター、更に例えば非天然アミノ酸、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製に関連する他の多くの関連事項について記載している。
糖蛋白質生産
【０２４９】
本発明の翻訳系（例えば細胞）は糖蛋白質を有用な量で合成又は生産することができる。１側面では、本発明の方法、翻訳系及び／又はキットにより生産される糖蛋白質組成物は場合により、１種以上の糖蛋白質を例えば少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ以上、又はそれ以上、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中（例えば約１ｎｌ〜約１００Ｌの任意の容量中）に例えば少なくとも１０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも７５μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１ｍｇ蛋白質／ｌ、又は少なくとも１０ｍｇ蛋白質／ｌ以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも１種のグリコシル含有非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で大量（例えば他の方法、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多量）に生産することも本発明の特徴である。
【０２５０】
糖部分を含む非天然アミノ酸の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、蛋白質部分へのターゲットアクセス、レクチン特異性、抗原性等を変化させるように例えば蛋白質構造及び／又は機能の変化を調整するために使用することができる。グリコシル含有非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は場合により抗原性、触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。
【０２５１】
本発明の１側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を含有しており、限定されないが、糖部分を含む非天然アミノ酸、及び／又は別の非天然アミノ酸（糖を結合することができる部分をもつ非天然アミノ酸を含む；例えば国際公開ＷＯ２００４−０３５７４３参照）が挙げられる。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個がグリコシル含有アミノ酸で置換された蛋白質を含有する。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
【０２５２】
本明細書に記載する組成物と方法を使用してガラクトサミン又はグルコサミン含有非天然アミノ酸を含むほぼ任意蛋白質（又はその部分）（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）を生産することができる。数十万種の公知蛋白質を列挙するには及ばないが、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを含むように入手可能な任意突然変異法を調整することにより、１種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
免疫反応性によるポリペプチドの定義
【０２５３】
例えば、本発明は本明細書に記載する各種配列の１種以上から選択されるシンテターゼアミノ酸配列を含む免疫原に対して作製した抗体又は抗血清に特異的に結合するか又は特異的に免疫反応性である新規シンテターゼ蛋白質を含む。他の相同体との交差反応性を排除するために、野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）チロシルシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）等の入手可能なシンテターゼ又はＷＯ２００２／０８５９２３に記載されているもの等の公知人工シンテターゼを用いて抗体又は抗血清をサブトラクションする。野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）又は従来配列が核酸に対応する場合には、場合により核酸によりコードされるポリペプチドを作製し、抗体／抗血清サブトラクション目的に使用する。
【０２５４】
典型的な１フォーマットでは、イムノアッセイは本明細書に記載するシンテターゼ配列の１種以上又はその実質的サブ配列（即ち記載する全長配列の少なくとも約３０％）を含む１種以上のポリペプチドに対して作製したポリクローナル抗血清を使用する。これらの配列に由来する潜在的ポリペプチド免疫原群を以下の文中では「免疫原性ポリペプチド」と総称する。得られた抗血清を場合により対照シンテターゼ相同体（野生型ＴｙｒＲｓ、及び／又はＷＯ２００２／０８５９２３に記載のシンテターゼ）に対する交差反応性が低下するように選択し、ポリクローナル抗血清をイムノアッセイで使用する前に例えば免疫吸着により対照シンテターゼ相同体の１種以上に対するこのような交差反応性を排除する。
【０２５５】
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で生産することができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。抗体に関するその他の事項については本明細書にも記載し、本欄の免疫反応性によるポリペプチドの定義にも適用することができる）。あるいは、本明細書に開示する配列から誘導される１種以上の合成又は組換えポリペプチドをキャリヤー蛋白質にコンジュゲートし、免疫原として使用する。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細はＷＯ２００２／０８５９２３に記載されている。
【０２５６】
ポリクローナル血清を採取し、イムノアッセイ（例えば固体支持体に固定化した免疫原性蛋白質の１種以上を使用する固相イムノアッセイ）で免疫原性ポリペプチドに対する力価を測定する。１０６以上の力価をもつポリクローナル抗血清を選択し、プールし、対照シンテターゼポリペプチドでサブトラクションし、高力価ポリクローナル抗血清サブトラクションプールを作製する。
【０２５７】
高力価ポリクローナル抗血清サブトラクションプールを比較イムノアッセイで対照相同体に対する交差反応性について試験する。この比較アッセイでは、サブトラクション高力価ポリクローナル坑血清に差別的な結合条件を設定し、高力価ポリクローナル坑血清と免疫原性シンテターゼの結合のシグナル対ノイズ比を対照シンテターゼ相同体との結合に比較して少なくとも約５〜１０倍にする。即ち、アルブミン又は脱脂粉乳等の非特異的競合剤を加えるか及び／又は塩条件、温度、及び／又は同等条件を調節することにより結合反応のストリンジェンシーを調整する。これらの結合条件は、試験ポリペプチド（免疫原性ポリペプチド及び／又は対照ポリペプチドに比較するポリペプチド）がサブトラクションポリクローナル坑血清プールに特異的に結合するか否かを調べる後期アッセイで使用される。特に、差別的結合条件下で対照シンテターゼ相同体の少なくとも２〜５倍のシグナル対ノイズ比と、免疫原性ポリペプチドの少なくとも約１／２のシグナル対ノイズ比を示す試験ポリペプチドは公知シンテターゼに比較して免疫原性ポリペプチドと実質的な構造類似性をもつので、本発明のポリペプチドである。
【０２５８】
別の例では、競合的結合フォーマットのイムノアッセイを試験ポリペプチドの検出に使用する。例えば、上述のように、対照ポリペプチドの免疫吸着により坑血清混合物プールから交差反応性抗体を除去する。次に、免疫原性ポリペプチドを固体支持体に固定化し、支持体をサブトラクション坑血清プールに暴露する。試験蛋白質をアッセイに加え、サブトラクション坑血清プールとの結合を競合させる。試験蛋白質が固定化蛋白質に対してサブトラクション坑血清プールとの結合を競合する能力と、アッセイに加えた免疫原性ポリペプチドが結合を競合する能力を比較する（免疫原性ポリペプチドは坑血清プールとの結合を固定化免疫原性ポリペプチドと有効に競合する）。標準計算を使用して試験蛋白質の交差反応性百分率を計算する。
【０２５９】
平行アッセイでは、場合により対照蛋白質がサブトラクション坑血清プールとの結合を競合する能力を免疫原性ポリペプチドが坑血清との結合を競合する能力と比較測定する。この場合も、標準計算を使用して対照ポリペプチドの交差反応性百分率を計算する。試験ポリペプチドの交差反応性百分率が対照ポリペプチドの少なくとも５〜１０倍である場合又は試験ポリペプチドの結合が免疫原性ポリペプチドの結合とほぼ同一範囲である場合に、試験ポリペプチドはサブトラクション坑血清プールに特異的に結合すると言う。
【０２６０】
一般に、本明細書に記載する競合的結合イムノアッセイでは任意試験ポリペプチドを免疫原性及び／又は対照ポリペプチドに比較するために免疫吸着坑血清プールを使用することができる。この比較を行うためには、免疫原性、試験及び対照ポリペプチドを各々広い濃度範囲でアッセイし、サブトラクション坑血清と例えば固定化した対照、試験又は免疫原性蛋白質との結合の５０％を阻害するために必要な各ポリペプチドの量を標準技術により決定する。競合アッセイで結合に必要な試験ポリペプチドの量が免疫原性ポリペプチドの必要量の２倍未満であり、対照ポリペプチドの少なくとも約５〜１０倍である場合に、試験ポリペプチドは免疫原性蛋白質に対して作製した抗体に特異的に結合すると言う。
【０２６１】
特異性の付加試験として、得られる免疫原性ポリペプチドサブトラクション坑血清プールと免疫吸着に使用する免疫原性ポリペプチドの結合が殆ど又は全く検出できなくなるまで場合により坑血清プールに（対照ポリペプチドではなく）免疫原性ポリペプチドを完全に免疫吸着させる。この完全に免疫吸着させた坑血清を次に試験ポリペプチドとの反応性について試験する。反応性が殆ど又は全く観察されない場合（即ち完全に免疫吸着させた坑血清と免疫原性ポリペプチドの結合に観察されるシグナル対ノイズ比の２倍以下）には、試験ポリペプチドは免疫原性蛋白質により誘導される坑血清に特異的に結合する。
【０２６２】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に示唆され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【０２６３】
本発明は付加糖残基を必要に応じて結合することができるグリコシル化アミノ酸を付加するように生物（例えば大腸菌）の遺伝コードを拡張することにより、特定グリコシル化部位をもつ糖蛋白質を作製することができるメカニズムを提供する。
【実施例１】
【０２６４】
グリコシル化アミノ酸を蛋白質に組込むためのシステム
真核生物では、ムチンが炎症と細胞認識に関与する多分散糖蛋白質及びプロテオグリカン群を構成する最も一般的な型のＯ−グリカンを含む（Ｈａｎｉｓｃｈ（２００１）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８２：１４３−１４９）。スレオニン又はセリンのヒドロキシル基にα結合したＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）糖がムチン型糖蛋白質のコア単位（「Ｔｎ抗原」）に相当する。Ｃ−３及び／又はＣ−６ヒドロキシル基のＧａｌＮＡｃ残基の順次グリコシル化により、各種ムチン型コア構造が生じる。
【０２６５】
本実施例はＮ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン（ＧａｌＮＡｃ−Ｔｈｒ）を作製し、この非天然アミノ酸を翻訳時に蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための方法と組成物について記載する。この官能基を大腸菌でＧａｌＮＡｃ−スレオニンとして遺伝的にコードさせるために、アンバーナンセンスコドンに応答して（且つ応答してのみ）このグリコシル含有アミノ酸を大腸菌の蛋白質に部位特異的に挿入することが可能な多数のｔＲＮＡ−シンテターゼ対を作製した。ｔＲＮＡ−シンテターゼ対は２０種の標準アミノ酸のその対応部分に対して直交性であり、即ち、直交シンテターゼ（且つこのシンテターゼのみ）が直交ｔＲＮＡ（且つこのｔＲＮＡのみ）を非天然アミノ酸のみでアミノアシル化し、得られるアシル化ｔＲＮＡはアンバーコドンに応答してのみ非天然アミノ酸を挿入する。
材料と方法
【０２６６】
特に明記しない限り、全化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＤＮＡシーケンシングはＳｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで実施した。質量スペクトル分析はＳｃｒｉｐｐｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ．Ｌｏｏ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ）、及びＹｕ−Ｊｕ  Ｃｈｅｎ教授（Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ，Ｔａｉｗａｎ）が実施した。
ＧａｌＮＡｃ−スレオニンの作製
【０２６７】
Ｋｏｅｌｌｅｒら（“Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＰＳＧＬ−１  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｕｌｆａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏ−ｇｌｙｃａｎ”（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：１０１７−１０２５）により記載されている化学合成アプローチを図２に示すように改変することにより、ガラクトサミンからＮ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニンの過アセチル化形２を作製した。
【０２６８】
Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−６００を使用して２のＮＭＲスペクトロスコピーデータを取得した：１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ１．４５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），３．７８（ｂｒｓ，１Ｈ），４．１８−４．２５（ｍ，２Ｈ），４．４２（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，３．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４９−４．５０（ｍ，２Ｈ），５．１０（ｄ，３．５Ｈｚ，１Ｈ），５．１９（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，２．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４５（ｂｒｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ２０．９０，２０．９１，２０．９７，４８．４９，５９．８６，６３．４４，６７．９９，６８．９２，６９．５６，７６．３７，１００．２２，１７２．５３，１７３．８９，１７４．２１，１７４．３８，１７５．２７；ＩｏｎＳｐｅｃ  ＦＴＭＳ質量分析計で２のＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳを取得した：ｍ／ｚ４７１．１５８６（Ｃ１８Ｈ２８Ｎ２Ｏ１１Ｎａ，［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値４７１．１５８５）。
突然変異体シンテターゼの誘導進化
【０２６９】
グリコシルアミノ酸（例えばＧａｌＮＡｃ−α−Ｏ−スレオニンとＧａｌＮＡｃ−α−Ｏ−セリン）を受容するｔＲＮＡシンテターゼの作製のための出発点として直交Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）と突然変異体チロシンアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ）を使用した。ｔＲＮＡにグリコシルアミノ酸を負荷するようにＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性を変化させるために、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ突然変異体を以下のように作製及びスクリーニングした。
【０２７０】
第１ラウンドポジティブスクリーニングでは、プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡ（Ｓａｎｔｏｒｏら（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１０４４−１０４８）を導入したコンピテント大腸菌ＤＨ１０β細胞をｐＢＫ−ｌｉｂ−ｍ（残基Ｔｙｒ３２，Ａｌａ６７，Ｈｉｓ７０，Ｇｌｎ１５５，Ａｓｐ１５８，及びＡｌａ１６７をランダムに変異）及びｐＢＫ−ｌｉｂ（残基Ｔｙｒ３２，Ｇｌｕ１０７，Ａｓｐ１５８，Ｉｌｅ１５９，及びＬｅｕ１６２をランダムに変異）の２種のＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳライブラリーの組合わせで形質転換した。ライブラリー合計で独立クローン約２．６×１０９とした。
【０２７１】
５０μｇ／ｍＬカナマイシン、２４μｇ／ｍＬテトラサイクリン、６８μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、及び１ｍＭ  ２を添加したロイシン含有グリセロール最少培地（ＧＭＭＬ，１×Ｍ９最少培地，１％グリセロール，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．５％  ＮａＣｌ，及び０．３ｍＭロイシン）５００ｍＬ中で形質転換細胞を３７℃で増殖させた。６０時間後にプラスミドを生存細胞から抽出し、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：８８３−８９０，２００２）により記載されているようにプラスミドｐＬＷＪ１７Ｂ３を含むＤＨ１０βに形質転換した。５０μｇ／ｍＬカナマイシン、６８μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、及び０．０２％Ｌ−アラビノースを添加したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉプレートに形質転換細胞を撒き、３７℃で１０時間インキュベートした。生存細胞を採取し、プラスミドを次ラウンドのポジティブスクリーニングのために精製した。
【０２７２】
ポジティブスクリーニング４ラウンドとネガティブスクリーニング３ラウンドを交互に実施した処、２の存在下でクロラムフェニコール耐性の増加を示すＭｊＴｙｒＲＳ突然変異体の４個のクローンが得られた。単離した突然変異体は細胞コロニーからの蛍光発光によると、グリコシルアミノ酸２の不在下よりも存在下で増殖させた場合のほうがＧＦＰｕｖの発現レベルも高かった。進化型シンテターゼ突然変異体の突然変異を表２に示す。
【表３】
2008516637.tif 000008
蛋白質発現、精製及び特性決定
【０２７３】
（Ｇｌｙ４をアンバーコドンＴＡＧに突然変異させた）突然変異ミオグロビン配列と、選択ＭｊＴｙｒＲＳ突然変異体（各々ＡＨ１及びＣ１０Ｆ）と、突然変異体Ｔｙｒ−ｔＲＮＡＣＵＡ遺伝子を大腸菌ＤＨ１０β細胞で同時発現させた。５０μｇ／ｍＬカナマイシン、２４μｇ／ｍＬテトラサイクリン、及び１ｍＭ  ２を添加したＧＭＭＬ５００ｍＬ中でＯＤ６００が０．６になるまで増殖させた。次にＬ−アラビノースを最終濃度０．０２％まで添加することにより蛋白質発現を誘導した後、８時間通気下に３０℃で増殖させた。細胞を回収し、溶解させ、変性条件下にＮｉ２＋−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して蛋白質を精製した。蛋白質を１０％  ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌにより分析し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で染色した。得られた蛋白質産物の分子量を逆相液体クロマトマグラフィーとエレクトロスプレーイオン化飛行時間（ＬＣ  ＥＳＩ−ＴＯＦ）質量分析の併用により分析した。
酵素によるレクチン結合アッセイ（ＥＬＬＡ）
【０２７４】
ＧａｌＮＡｃ−α−Ｔｈｒ特異的レクチンであるヘアリーベッチ（Ｖｉｃｉａ  Ｖｉｌｌｏｓａ）レクチン（ＶＶＬ）とホースグラム（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  Ｂｉｆｌｏｒｕｓ）レクチン（ＤＢＬ）をビオチン化コンジュゲートとしてＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）から購入した。精製ミオグロビンサンプルを高結合性マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）に分注した（６００ｎｇ）。３％  ＢＳＡを添加したＰＢＳでプレートをブロックした後、レクチン（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬ）で処理した。ＰＢＳで３回洗浄後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート（ＡＰ−Ｓｔ，Ｒｏｃｈｅ）を各ウェルに加えた（ＰＢＳ中１Ｕ／ｍＬ）。レクチン処理後、プレートを３回洗浄した後、ＡＰ基質ｐ−ニトロフェノールリン酸（ｐＮＰＰ）を加えた（０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した１０ｍＭジエタノールアミン緩衝液，ｐＨ９．５中ｐＮＰＰ  １ｍｇ／ｍＬ）。ＡＰ活性を４０５ｎｍでモニターした。図３に示すように、ＧａｌＮＡｃ−α−Ｔｈｒの存在下で増殖させたサンプルではミオグロビンシグナルの増加が検出された。
結果と考察
【０２７５】
セレクターコドンに対応する突然変異体ｔＲＮＡと進化型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  Ｔｙｒ−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）を併用し、Ｎ−アセチルガラクトサミンα−Ｏ−スレオニン（ＧａｌＮＡｃ−α−Ｔｈｒ，１）を大腸菌で遺伝的にコードさせた（配列番号１７）。非保護グリコシルアミノ酸１の細胞膜透過性を増すために、本明細書に記載するように過アセチル化ＧａｌＮＡｃ−α−Ｔｈｒ（２）を化学的に合成し、細胞のサイトゾルに一旦導入してから（例えば、非特異的エステラーゼにより）アセチル基を除去した。
【０２７６】
１）抗生物質耐性を付与するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子における非必須突然変異Ａｓｐ１１２ＴＡＧと、２）緑色蛍光蛋白質の発現を誘導するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子ＧＦＰｕｖ（Ｗａｎｇら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｓａｎｔｏｒｏ  ２００２，前出）における非必須突然変異Ｍｅｔ１ＴＡＧ及びＧｌｎ１０７ＴＡＧの抑圧に基づくポジティブ選択を使用して従来記載されている２種のＭｊＴｙｒＲＳ突然変異体ライブラリー（Ｚｈａｎｇ  ２００４，前出）から１に特異的な突然変異体ＭｊＴｙｒＲＳシンテターゼに進化させた。内在天然アミノ酸を受容するＭｊＴｙｒＲＳ突然変異体を除去するために毒性バルナーゼ遺伝子の３個の許容位置（Ｇｌｎ２，Ａｓｐ４４，及びＧｌｙ６５）のアンバーコドンの抑圧に基づくネガティブ選択も使用した。ポジティブ選択４ラウンドとネガティブ選択３ラウンド後に、２を補充した場合に高濃度のクロラムフェニコール下で細胞増殖が可能であった数個のＭｊＴｙｒＲＳ突然変異体が単離された（図１及び表１）。
【０２７７】
ＧａｌＮＡｃ−α−Ｔｈｒを受容する単離ＭｊＴｙｒＲＳクローンを配列決定した処、以下の突然変異が認められた。ＡＨ１：Ｔｙｒ３２Ｐｈｅ及びＡｌａ６７Ｐｒｏ；Ｃ８Ｆ：Ｔｙｒ３２Ｇｌｎ，Ａｌａ６７Ｐｒｏ，Ｇｌｙ１６３Ｃｙｓ，及びＡｌａ１６７Ｖａｌ；Ｃ１０Ｆ：Ｔｙｒ３２Ａｌａ，Ａｌａ６７Ｓｅｒ，Ｈｉｓ７０Ｐｒｏ，及びＬｅｕ９８Ｉｌｅ；Ｄ１０Ｂ：Ｔｙｒ３２Ｌｅｕ，Ａｌａ６７Ｔｈｒ，Ｈｉｓ７０Ｌｙｓ，Ｖａｌ１４９Ｉｌｅ，Ｇｌｎ１５５Ｓｅｒ，Ａｓｐ１５８Ｖａｌ，及びＡｌａ１６７Ｖａｌ。注目すべき点として、天然チロシン基質との２個の主要水素結合の一方を形成するＴｙｒ３２は全ＧａｌＮＡｃ−α−Ｔｈｒ突然変異体で突然変異している（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ（２００３）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４２５−４３２）。他方の主要水素結合供与体であるＡｓｐ１５８はＧｌｃＮＡｃ−β−ＳｅｒシンテターゼＩ−９０で突然変異している（表２）。グリコシル化アミノ酸を受容するシンテターゼの他の突然変異の大半はモデリングによると、活性部位の外側に生じるようである。
【０２７８】
上記ＭｊＴｙｒＲＳ突然変異体により示される表現型がＴＡＧに応答する２の組込みに起因することを確認するために、ミオグロビン突然変異体を進化型ＭｊＴｙｒＲＳクローンと同時発現させた（図３Ａ）。ミオグロビン遺伝子の４番目のアミノ酸のコドンをアンバーコドンＴＡＧに突然変異させ、Ｎｉ２＋−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによる全長蛋白質の精製を助長するために遺伝子のＣ末端に６×Ｈｉｓタグを付加した。２の存在下では、クローンＡＨ１及びＣ１０Ｆは夫々精製蛋白質２ｍｇ／Ｌ及び４ｍｇ／Ｌを産生したが、同一条件下で野生型ミオグロビンの収量は５．５ｍｇ／Ｌであった。ｔＲＮＡＣＵＡ又は突然変異体シンテターゼのどちらの不在下でも全長蛋白質は産生されなかったが、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると、２の不在下で増殖させた場合に弱いミオグロビンバンド（陽性サンプルの約１０％）が検出され、多少の残留バックグラウンド抑圧が残っていることが判明した。
【０２７９】
ヘアリーベッチ（Ｖｉｃｉａ  Ｖｉｌｌｏｓａ）（ＶＶＬ）とホースグラム（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  Ｂｉｆｌｏｒｕｓ）（ＤＢＬ）に由来するレクチンを使用する酵素によるレクチン結合アッセイを使用してＧａｌＮＡｃ−α−Ｔｈｒ組込みを更に確認した。ＶＶＬはＴｎ抗原に対して特異性をもつことがよく知られており、ＤＢＬはα結合ＧａｌＮＡｃ残基を検出するために頻用されている（例えば、Ｗｕ（２００４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５６２：５１−５８参照）。比色定量用ｐ−ニトロフェニルリン酸基質に対するストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ活性によりビオチン化レクチンとミオグロビン及びグリコミオグロビンサンプルの結合を測定した。ＶＶＬとＤＢＬで処理した場合には、グリコミオグロビンでは等価濃度のチロシン−ミオグロビンに対して夫々１０倍と５倍のシグナル増加が観察された（図４）。このデータはＧａｌＮＡｃ−α−Ｔｈｒがｉｎ  ｖｉｖｏ生合成中にミオグロビンに組込まれたことを裏付けるものである。グリコシルアミノ酸を翻訳時に蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための一般アプローチが開発された。
【実施例２】
【０２８０】
糖蛋白質合成ストラテジー
本発明の別の態様では、グリコシル化アミノ酸Ｎ−アセチルグルコサミン−β−セリン（ＧｌｃＮＡｃ−Ｓｅｒ）の翻訳時組込みにより生物（例えば大腸菌）で均質糖蛋白質を合成する。例えば、規定位置にβ−ＧｌｃＮＡｃ−セリンを含むミオグロビンを大腸菌で良好な収率と高い忠実度で発現させることができる。β−ＧｌｃＮＡｃ部分は糖質結合蛋白質により認識することができ、又はガラクトシルトランスフェラーゼで後期修飾することもできる。このアプローチは他の翻訳後修飾（例えば蛋白質リン酸化、アセチル化、メチル化等）にも適用可能であると思われる。
【０２８１】
新規化学的及び物理的性質をもつアミノ酸を大腸菌（例えばＬ．Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８；Ｌ．Ｗａｎｇら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１８３６；Ｚ．Ｚｈａｎｇら，（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４１：２８４０；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９：１１０２０；Ｓ．Ｗ．Ｓａｎｔｏｒｏら，（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１０４４；Ｌ．Ｗａｎｇら，（２００３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  １００：５６；及びＺ．Ｚｈａｎｇら，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５参照）と酵母（例えばＪ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００３年印刷中）参照）の遺伝コードに体系的に付加することを初めて可能にした数種の方法が従来開発されている。このアプローチでは、所望非天然アミノ酸のみを負荷するように、内在ｔＲＮＡ及びシンテターゼと交差反応しないアンバーサプレッサーＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ−ｍｕ  ｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ対に進化させている。この方法はグリコシル化、リン酸化、又はメチル化アミノ酸を蛋白質に直接組込み（例えばＴ．Ａｒｓｌａｎら，（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：１０８７７参照）、蛋白質の選択的酵素又は化学的翻訳後修飾を不要にすることもできる。
【０２８２】
β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン５（表２参照）を大腸菌の蛋白質に部位特異的に組込んだ。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾はほぼ全真核生物に遍在しており、細胞シグナリング、蛋白質トラフィキング及び細胞増殖の調節に関与しており、より複雑な糖質を生産するための基質でもある。例えばＬ．Ｗｅｌｌｓら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：２３７６；及びＮ．Ｌａｍａｒｒｅ−Ｖｉｎｃｅｎｔ，＆  Ｌ．Ｈｓｉｅｈ−Ｗｉｌｓｏｎ，（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：６６１２参照。残念ながら、遊離ヒドロキシル基をもつ糖誘導体は真核細胞の膜を通過しにくいので、基質５は細胞浸透性でないと思われる。例えばＡ．Ｋ．Ｓａｒｋａｒら，（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９２：３３２３参照。しかし、糖のヒドロキシル基をアセチル化すると、細胞膜を通過し易くなり、ヒドロキシルアセチル基を一旦細胞内に導入してから非特異的サイトゾルエステラーゼにより脱アセチル化できることが示されている。例えばＮ．Ｌａｍａｒｒｅ−Ｖｉｎｃｅｎｔ，＆  Ｌ．Ｈｓｉｅｈ−Ｗｉｌｓｏｎ，（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：６６１２参照。従って、これらの実験ではアセチル化誘導体トリアセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−セリン６（その前駆体であるＮ−Ｆｍｏｃ−トリアセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−セリンは市販されている）を使用した。上記化合物は下式で示される。
【化４】
2008516637.tif 000009
【０２８３】
一連のポジフィブ及びネガティブ選択を使用して活性部位突然変異体のライブラリーから大腸菌で直交ｍｕ  ｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒにβ−ＧｌｃＮＡｃ−セリンを特異的に負荷するＴｙｒＲＳを単離した。相同Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴｙｒＲＳのＸ線構造に基づき、活性部位残基をランダムに変異させた２種のライブラリー、即ちプラスミドｐＢＫ−ｌｉｂ−ｍによりコードされ、残基Ｔｙｒ３２、Ａｌａ６７、Ｈｉｓ７０、Ｇｌｎ１５５、Ａｓｐ１５８、及びＡｌａ１６７をランダムに変異させた第１のライブラリーと、プラスミドｐＢＫ−ｌｉｂによりコードされ、残基Ｔｙｒ３２、Ｇｌｕ１０７、Ａｓｐ１５８、Ｉｌｅ１５９、及びＬｅｕ１６２をランダムに変異させた第２のライブラリーを構築した。これらの残基はいずれもフェニル環から６．９Å以内にあり、基質結合ポケットを形成する主残基である。ライブラリー合計で独立クローン約２．６×１０９とした。このライブラリーを次に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のＡｓｐ１１２に導入したアンバーコドンの抑圧に基づくポジティブ選択にかけ、グリコシル化アミノ酸を組込むことが可能なＴｙｒＲＳ突然変異体を選択した。高濃度のクロラムフェニコールの存在下で生存する細胞はＡｓｐ１１２ＴＡＧアンバーコドンに応答してβ−ＧｌｃＮＡｃ−セリン又は内在アミノ酸を挿入する能力をもつ突然変異体ＴｙｒＲＳを発現すると考えられる。次に、毒性バルナーゼ遺伝子の３個のアンバーコドンの抑圧に基づくネガティブ選択を使用し、選択したクローンから内在アミノ酸を組込む突然変異体ＴｙｒＲＳを排除した。ポジティブ選択５ラウンドとネガティブ選択４ラウンド後に、高濃度のクロラムフェニコールの存在下で生存する３個のクローンが出現した。これらのクローンとその突然変異は以下の通りである。Ｓ１−９０（Ｇｌｕ１０７→Ｐｒｏ１０７，Ａｓｐ１５８→Ｃｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９→Ｔｙｒ１５９，Ｌｅｕ１６２→Ａｒｇ１６２）、Ｓ４−５（Ｔｙｒ３２→Ｇｌｙ３２，Ｇｌｕ１０７−Ｇｌｙ１０７，Ａｓｐ１５８→Ｃｙｓ１５８，Ｌｅｕ１６２→Ｈｉｓ１６２）、Ｓ１−５（Ｇｌｕ１０７→Ｃｙｓ１０７，Ａｓｐ１５８→Ｈｉｓ１５８，Ｉｌｅ１５９→Ａｓｐ１５９，Ｌｅｕ１６２→Ｍｅｔ１６２）。６の代わりに１ｍＭセリン、α−トリアセチル−ＧａｌＮＡｃ−スレオニン２、α／β−トリアセチル−ＧａｌＮＡｃ−セリン４又はβ−テトラアセチル−Ｇｌｕ−アスパラギンを使用すると、＞３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールで細胞増殖できないので、これらの全クローンはβ−ＧｌｃＮＡｃ−セリンに高度に選択的であると思われる。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝結果は、新規に選択された突然変異体ＴｙｒＲＳがβ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン５に対して優れた特異性をもつことを示唆している。
【０２８４】
５の組込み効率及び忠実度を試験するために、４位にアンバーコドンとＣ末端Ｈｉｓ６タグを含む突然変異体ミオグロビン遺伝子（Ｇｌｙ４ＴＡＧ）を作製した。例えばＳ．Ｗ．Ｓａｎｔｏｒｏら，（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１０４４参照。突然変異体シンテターゼＳ１−９０を最少培地で６の存在下にｍｕ  ｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ及びＧｌｙ４ＴＡＧミオグロビン遺伝子と同時発現させると、全長突然変異体ミオグロビン１ｍｇ／Ｌが産生された（図５参照）。比較のために、同様の条件下で野生型ミオグロビン５．５ｍｇ／Ｌが産生され、Ｓ１−９０の抑圧レベルが良好であることを示した。Ｓ１−９０、ｍｕ  ｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ、又は６の不在下では銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより全長ミオグロビンの発現は観察されなかった（図５参照）。
【０２８５】
図５ＡはＧｌｙ４−突然変異体ミオグロビン（〜１８．５ｋＤ）の発現を示す。蛋白質をＮｉ２＋−アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。ゲルを銀染色した。レーン１は直交ｔＲＮＡ、シンテターゼＳ１−９０、及び化合物６の存在下でミオグロビンが発現されたことを示す。〜１８ｋＤａバンドは全長ミオグロビンに対応する。レーン２は直交ｔＲＮＡとシンテターゼＳ１−９０の存在下で且つ基質６の不在下で発現後に溶出した蛋白質を示す。レーン３は直交ｔＲＮＡと基質６の存在下で且つシンテターゼＳ１−９０の不在下で発現後に溶出した蛋白質を示す。レーン４はシンテターゼＳ１−９０と基質６の存在下で且つ直交ｔＲＮＡの不在下で発現後に溶出した蛋白質を示す。レーン５は比較のために精製野生型ミオグロビンを含む。
【０２８６】
高分解能ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析（図５Ｂ）によると、Ｈｉｓ６タグ精製突然変異体ミオグロビンのモノアイソトピック質量は１８４３０．１Ｄａであり、Ｇｌｃ（ＯＨ）３Ｎａｃ−セリンを含み、メチオニンを欠失するミオグロビンの理論質量（Ｍｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝１８４２９．５Ｄａ）と３２ｐｐｍ以内で一致する。Ｎ末端Ｍｅｔの欠失は大腸菌で一般的であることに留意されたい。更に、Ｏ−アセチル化グリコミオグロビン又は野生型ミオグロビンに対応するシグナルは観察されなかった。質量スペクトルデータにより、ＧｌｃＮＡｃ−セリンのミオグロビン組込みの高度特異性が確認された（≧９６％）。
【０２８７】
突然変異体ミオグロビンを更に特性決定するために数種の付加実験を実施した。まず、ＥＬＩＳＡ様アッセイを使用し、ＧｌｃＮＡｃ特異的レクチンＢａｎｄｅｉｒａｅａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  ＩＩ（ＢＳＩＩ）（例えばＳ．Ｅｂｉｓｕら，（１９７８），Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．６１：１２９参照）と野生型ミオグロビン及びグリコミオグロビンの結合を分析した。図６ＡはＧｌｃＮＡｃ特異的レクチンバンデリアマメ（Ｂａｎｄｅｒｉｒａｅａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）  ＩＩ（ＢＳＩＩ）と野生型ミオグロビン及びグリコミオグロビンの結合を示す。野生型ミオグロビン、グリコミオグロビン、及び陰性対照（レクチン非添加）のＡ４０５値を示す。グリコシル含有突然変異体ミオグロビン（２００ｎｇ）と野生型ミオグロビン（２００ｎｇ）をマイクロタイタープレートウェルに固定化した後、ビオチン化ＢＳＩＩとストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートの存在下でインキュベートした。ウェルをｐ−ニトロフェニルリン酸の存在下でインキュベートし、４０５ｎｍの吸光度を測定することによりモニターした。２種の形態のミオグロビンをマイクロタイタープレートウェルに固定化した後、夫々ビオチン化ＢＳＩＩ、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート、及びｐ−ニトロフェニルリン酸の存在下でインキュベートした。野生型ミオグロビンを含むウェルは陰性対照ウェルと等価のシグナルを発生した。他方、グリコミオグロビンを含むウェルは野生型ミオグロビンの少なくとも２００倍のシグナルを発生し、ＧｌｃＮＡｃ特異的レクチンによる選択的認識が立証された。更に、このレクチンはＧｌｃＮＡｃに高度に選択的であるので、この結果から糖質はＧａｌＮＡｃやＭａｎＮＡｃ等の他の異性形に変異していないことも判明した（例えばＳ．Ｅｂｉｓｕら，（１９７８），Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．６１：１２９参照）。
【０２８８】
ミオグロビンのＯ−ＧｌｃＮＡｃ−セリン残基をガラクトシルトランスフェラーゼで選択的に修飾できるか否かについても検討した。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは糖ヌクレオチドＵＤＰ−Ｇａｌからガラクトース（Ｇａｌ）をＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の４位に転移させ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃを形成することが知られている。Ｏ−グリコシル化ミオグロビンをＵＤＰ−Ｇａｌで修飾できるか否かを調べるために、野生型ミオグロビンとＯ−グリコシル化ミオグロビンの両者をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、ＰＶＤ膜に転写させた。次に膜を牛乳ガラクトシルトランスフェラーゼと放射性ＵＤＰ−［Ｈ３］−ガラクトースの存在下に室温で２４時間インキュベートした。例えばＫ．Ｋａｍｅｍｕｒａら，（２００２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１９２２９参照。膜をＸ線フィルムに露光することにより［Ｈ３］−Ｇａｌの取込みをモニターした。グリコミオグロビンのみが標識され、野生型ミオグロビンでは検出可能なシグナルは観察されなかった。図６ＢはＵＤＰ−［Ｈ３］ガラクトースによるグリコミオグロビンのオンブロットガラクトシルトランスフェラーゼ標識を示す。野生型ミオグロビン（１μｇ）とグリコシル含有突然変異体ミオグロビン（１μｇ）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、ＰＶＤ膜に転写させた。次に膜を牛乳ガラクトシルトランスフェラーゼ（１Ｕ）、ＵＤＰ−［Ｈ３］−ガラクトース（０．５μＣｉ）及びウシ腸アルカリホスファターゼ（１Ｕ）で２４時間室温にて処理した。十分に洗浄後、エンハンストオートラジオグラフィーを使用して膜をＸ線フィルムに露光した。
【０２８９】
定量分析のために、更に溶液中で糖転移反応を実施した。例えばＫ．Ｗｉｔｔｅら，（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４参照。４８時間室温でインキュベーション後に、存在する放射性ラベルに基づいて７２％の二糖収率が得られた。図６Ｃは溶液中で実施したガラクトシルトランスフェラーゼ反応の定量分析を示し、１．０が１００％転移に対応するように放射性標識ガラクトースを正規化した。ＨＰＬＣ精製野生型ミオグロビン（１００μｇ）とグリコシル含有突然変異体ミオグロビン（１００μｇ）を含有する溶液にピルビン酸キナーゼ（５Ｕ）、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（１Ｕ）、無機ピロホスホリラーゼ（１０Ｕ）、ガラクトース−１−リン酸−ウリジルトランスフェラーゼ（１Ｕ）、牛乳ガラクトシルトランスフェラーゼ（２Ｕ）、グルコース−１−リン酸（３μｍｏｌ）、ウリジル二リン酸（３μｍｏｌ）、ホスホエノールピルビン酸（０．０１ｍｍｏｌ）、及びＤＴＴ（２μｍｏｌ）を加えた。反応溶液をｐＨ７．２に調整した後、［Ｈ３］−ガラクトース−１−リン酸（０．０１ｍｍｏｌ）を加えた。反応は室温で４８時間実施した。蛋白質産物をＰＤ−１０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２５カラムで分離した。放射性ラベル取込みを液体シンチレーションアナライザーで測定した。
【０２９０】
これらの試験の結果、β−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリンは優れた特異性と良好な収率で大腸菌の蛋白質に翻訳時組込みが可能であることが立証された。組込まれたβ−ＧｌｃＮＡｃ−セリンは糖をグリコシルトランスフェラーゼで順次付加することができる主グリコシル化部位として機能することができる。例えばＫ．Ｋａｍｅｍｕｒａら，（２００２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１９２２９。
材料と方法
【０２９１】
突然変異体ＴｙｒＲＳ酵素の誘導進化。ポジティブ及びネガティブ選択の一般手順は従来報告されている。例えばＺ．Ｚｈａｎｇら，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：６７３５参照。要約すると、プラスミドｐＲｅｐ（２）／ＹＣ（例えば、Ｓ．Ｗ．Ｓａｎｔｏｒｏら，（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１０４４参照）を導入したコンピテント大腸菌ＤＨ１０ＢにプラスミドｐＢＫ−ｌｉｂ−ｍ（例えば、Ｚ．Ｚｈａｎｇら，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５参照）とｐＢＫ−ｌｉｂ（例えば、Ｌ．Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８参照）の組み合わせを導入した。４０μｇ／ｍｌテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、６８μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、及び１ｍＭ化合物Ｂを添加したＧＭＭＬ培地（１％グリセロール，０．３ｍＭロイシン，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．５％  ＮａＣｌを含有する１×Ｍ９最少培地）５００ｍｌ中で形質転換細胞を６０時間３７℃で増殖させた。プラスミド（ｐＢＫ）を生存細胞から精製し、ｐＬＷＪ１７Ｂ３（例えば、Ｌ．Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８参照）を導入した大腸菌ＤＨ１０Ｂに導入し、ネガティブ選択を開始した。次に、４０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、及び０．０２％Ｌ−アラビノースを添加したＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）プレートに細胞を撒き、３７℃で８時間インキュベートした。プラスミドｐＢＫを生存細胞から精製し、後続ポジティブ及びネガティブ選択に使用した。ポジティブ選択５ラウンドとネガティブ選択４ラウンド後に、基質依存的クロラムフェニコール耐性を付与する３個の候補直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対を単離し、配列決定した。
【０２９２】
突然変異体ミオグロビンの発現と特性決定。カナマイシン、テトラサイクリン、０．０２％Ｌ−アラビノース、５μＭ  ＦｅＣｌ３、及び０又は１ｍＭ化合物６を加えたＧＭＭＬ培地５００ｍｌ中でｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧ（例えばＳ．Ｗ．Ｓａｎｔｏｒｏら，（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１０４４参照）とｐＳ１−９０を導入したＤＨ１０Ｂ細胞を増殖させた。細胞をペレット化し、溶解させ、天然条件下でＮｉ２＋−ＮＴＡビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより蛋白質を精製した。蛋白質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、銀染色した。精製蛋白質のアリコートを高分解能質量分析に付した。飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＳＴＲ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によるマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）を使用して蛋白質の分子量を測定した。３３７ｎｍ窒素レーザーから照射することにより蛋白質サンプルを脱離イオン化した。シナピン酸をＭＡＬＤＩマトリックスとして使用した。確立プロトコール（例えば、Ｋ．Ｋａｍｅｍｕｒａら，（２００２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１９２２９；及びＫ．Ｗｉｔｔｅら，（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４参照）に従ってレクチン結合及びグリコシルトランスフェラーゼ反応を実施した。
【実施例３】
【０２９３】
代表的Ｏ−ＲＳの配列
本発明で使用することができる代表的Ｏ−ＲＳとしては、配列番号１〜４及び１１〜１３（表３参照）が挙げられ、本発明で使用することができる代表的Ｏ−ｔＲＮＡとしては配列番号１７が挙げられる。Ｏ−ＲＳをコードする代表的ポリヌクレオチドとしては配列番号６〜９及び１４〜１６が挙げられる。
【０２９４】
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に示唆され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【０２９５】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【図面の簡単な説明】
【０２９６】
【図１】（例えば、非特異的サイトゾルエステラーゼによる）過アセチル化前駆体２のアセチル基の除去後のＴｙｒ−ｔＲＮＡＣＵＡへの非天然アミノ酸ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン１の「負荷」を模式的に示す。その後、ナンセンスアンバーコドンＵＡＧの読み飛ばしにより、（例えば大腸菌で）生合成中に組換え糖蛋白質にＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンをｉｎ  ｖｉｖｏ部位特異的に組込むことができる。
【図２】過アセチル化ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニンの作製の合成アプローチを模式的に示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは進化型ＡＨ１（図３Ａ）及びＣ１０Ｆ（図３Ｂ）ＭｊＴｙｒＲＳを組込んだミオグロビン４ＴＡＧ突然変異体遺伝子の発現を示し、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−Ｏ−スレオニン基質の存在下（＋）と不在下（−）における蛋白質産生レベルを実証する。Ｍ＝蛋白質マーカー（ｋＤａ）。図３ＣはＣ１０Ｆと共に発現されたミオグロビンの高分解能ＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示し、グリコシルアミノ酸２はＧａｌＮＡｃ−α−Ｔｈｒ組込み（予想平均値ＭＨ＋１８４４８．８）及びチロシン組込み（予想平均値ＭＨ＋１８４３１．２）に対応するピークを示す。サンプル混合物を逆相クロマトグラフィーにより分離した。
【図４】図４Ａ及び図４ＢはＧａｌＮＡｃ特異的レクチンであるヘアリーベッチ（Ｖｉｃｉａ  Ｖｉｌｌｏｓａ）レクチン（ＶＶＬ）及びホースグラム（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  Ｂｉｆｌｏｒｕｓ）レクチン（ＤＢＬ）とグリコミオグロビンサンプルの結合を示す。ＧａｌＮＡｃ−α−Ｔｈｒの存在下（＋）で発現させたミオグロビンサンプルではこのグリコシルアミノ酸の不在下（−）で増殖させたサンプルに比較してＶＶＬ及びＤＢＬで夫々１０倍及び５倍のＥＬＬＡシグナル増加が観察された。ＡＰ−Ｓｔを加えずにｐＮＰＰ基質のみから構成される対照サンプル（「ブランク」）はバックグラウンド加水分解を示す。
【図５】図５ＡはＧｌｙ４→Ａ突然変異体ミオグロビン（〜１８．５ｋＤ）の発現を示す。蛋白質をＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。ゲルを銀染色した。図５ＢはＧｌｙ４→Ａ突然変異体ミオグロビンの分子量のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｃはグリコシル化アミノ酸を含む精製突然変異体ミオグロビンの特性決定を示す。図６ＡはＧｌｃＮＡｃ特異的レクチンバンデリアマメ（Ｂａｎｄｅｒｉｒａｅａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）  ＩＩ（ＢＳＩＩ）と野生型ミオグロビン及びグリコミオグロビンの結合を示す。図６ＢはＵＤＰ−［Ｈ３］ガラクトースによるグリコミオグロビンのオンブロットガラクトシルトランスフェラーゼ標識を示す。図６Ｃは溶液中で実施したガラクトシルトランスフェラーゼ反応の定量分析を示し、１．０が１００％転移に対応するように放射性標識ガラクトースを正規化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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