【事件の表示】
　特許第２７７７４８９号「ペプチド、抗体、抗体の製法並びにα１−ミクログロブリンを測定する方法及び試験片」の請求項３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２７７７４８９号の請求項１ないし１０に係る特許を維持する。
【理由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第２７７７４８９号発明は、平成３年８月５日に特許出願され（優先日１９９０年８月６日）、平成１０年５月１日にその特許権の設定登録がなされ、その後、安富康男（以下、「申立人」という）より特許異議の申立てがなされ、当審により取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１１年１１月１５日に訂正請求がなされたものである。
ＩＩ．訂正の適否についての判断
　１．訂正事項ａについて
（１）訂正明細書の請求項３に係る発明
　訂正明細書の請求項３に係る発明（以下、単に「訂正発明」という。）は、その特許請求の範囲の請求項３に記載された次の事項により特定されるとおりのものである。
「請求項１又は２記載のペプチド及びヒトα１−ミクログロブリンと特異的に結合性であることを特徴とするモノクローナル抗体。」
　そして、同訂正明細書の請求項１及び２に係る発明は、特許登録されたとおりの、次のものである。
「［請求項１］　アミノ酸の長さが最高４０個であり、かつ構造Ａ−Ｒ−Ｂを有し、ここでＲはヒトα１−ミクログロブリンのアミノ酸１４４〜１８３：
のアミノ酸部分配列からの少なくとも６個の連続する、ヒトα１−ミクログロブリンに対する抗体に結合性のアミノ酸配列を含有し、Ａ及びＢは任意のアミノ酸配列であることを特徴とするペプチド。
［請求項２］
　Ｒがアミノ酸１５８〜１８３の部分配列からの少なくとも６個のアミノ酸を含有することを特徴とする請求項１によるペプチド。」
（２）訂正の目的の適否及び拡張・変更の存否等
　上記訂正は、特許請求の範囲の減縮に該当し、また、実質的に特許請求の範囲を拡張又は変更するものではない。
　また、上記訂正は、願書に添付した明細書又は図面に記載した事項の範囲内においてされたものである。
（３）独立特許要件の判断
ア．訂正発明に対して、当審が通知した取消理由で引用した刊行物１（特開昭５６−１０６１５３号公報）には、次の事項が記載されている。
▲１▼「α１−ミクログロブリンを得るための材料としては腎疾患の患者尿が用いられ」（第２頁右上欄第８〜１０行）
▲２▼「本発明の方法においては、どのような方法によって分離・精製されたα１−ミクログロブリンでも用いることができる。またα１−ミクログロブリン免疫血清の作製は、免疫動物として家兎、モルモット、山羊などいずれも用いることができ、免疫方法にも制約はなく、これらの動物にα１−ミクログロブリンを接種することによって行なわれる。」（第２頁右上欄第１８行から左下欄第６行）
▲３▼「抗ヒトα１−ミクログロブリン抗体を調製するには、上記のようにして得た抗血清を、…法など、抗体蛋白を分離、精製するための一般的に常用される手法が用いられる。このようにして得た抗ヒトα１−ミクログロブリン抗体溶液に、・・・」（第２頁左下欄第７〜１５行）
イ．　対比・判断
　刊行物１には、上記ア、▲１▼〜▲３▼の記載からみて、「（ヒトの）尿から単離したα１−ミクログロブリンで免疫化した免疫動物、これには羊も含まれると解される、から取得した抗血清から得られる抗体、即ちポリクローナル抗体」が記載されているものと認められる。
　一方、訂正発明は、上記のとおりの「請求項１又は２記載のペプチド及びヒトα１−ミクログロブリンと特異的に結合性であることを特徴とするモノクローナル抗体」である。
　そこで、訂正発明（前者）と刊行物１記載の発明（後者）とを対比すると、後者は、前者の必須の構成であるモノクローナル抗体については、記載も示唆もしていない。
　以上のとおりであるから、前者は後者と同一の発明であるとすることはできない。
　また、他に、前者が特許出願の際に独立して特許を受けることができないとすべき理由を発見しない。
　したがって、訂正発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものであると認められる。
　２．むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する同法１２６条第２〜４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
ＩＩＩ．特許異議の申立てについての判断
　１、申立ての理由の概要
　申立人は、甲第１号証（前記刊行物１）及び甲第２号証（「パラメータ関連出願の今後の運用方針について」特許庁審査第２部（平成９年９月２５日））を提出して、本件特許発明（請求項３）の抗体のうちのポリクローナル抗体については、甲第１号証に記載された発明と同一であるから、本件特許発明（請求項３）は特許法第２９条第１項第３号の規定に違反してなされたものである旨、及び
本件特許発明（請求項３）については、抗体のうちのポリクローナル抗体に係る部分について、明細書の発明の詳細な説明に当業者が容易に実施できる程度に発明の構成が記載されていないから、特許法第３６条第４項の規定に違反してなされたものである旨
、主張している。
　２、判断
　上記ＩＩ．１．（３）イ．で述べたとおりの理由により、本件特許請求の範囲の請求項３に係る発明は、甲第２号証記載の事項を考慮しても、甲第１号証に記載された発明と同一であるとすることはできない。
　また、同項に係る発明をモノクローナル抗体に限定したので、本件明細書の発明の詳細な説明において、当業者が容易に実施できる程度に発明の構成が記載されていないとすることもできない。
ＩＶ．むすび
　したがって、特許異議申立ての理由及び証拠によっては、本件発明に係る特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件発明に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年１１月２９日（１９９９．１１．２９）
【訂正の要旨】
　特許請求の範囲の請求項３に「請求項１又１よ２記載のペプチド及びヒトα１−ミクログブリンと特異的に結合性であることを特徴とする抗体。」とあるを「請求項１又は２記載のペプチド及びヒトα１−ミクログブリンと特異的に結合性であることを特徴とするモノクローナル抗体。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
　ペプチド、抗体、抗体の製法並びにα１−ミクログロブリンを測定する方法及び試験片
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　アミノ酸の長さが最高４０個であり、かつ構造Ａ−Ｒ−Ｂを有し、ここでＲはヒトα１−ミクログロブリンのアミノ酸１４４〜１８３：
のアミノ酸部分配列からの少なくとも６個の連続する、ヒトα１−ミクログロブリンに対する抗体に結合性のアミノ酸配列を含有し、Ａ及びＢは任意のアミノ酸配列であることを特徴とするペプチド。
　【請求項２】　Ｒがアミノ酸１５８〜１８３の部分配列からの少なくとも６個のアミノ酸を含有することを特徴とする請求項１によるペプチド。
　【請求項３】　請求項１又は２記載のペプチド及びヒトα１−ミクログロブリンと特異的に結合性であることを特徴とするモノクローナル抗体。
　【請求項４】　細胞系ＥＣＡＣＣ９００７１９０６から得られる請求項３記載の抗体。
　【請求項５】　公知方法で好適な動物を天然α１−ミクログロブリンか又は請求項１又は２記載のペプチドで免疫化し、抗体を取得し、かつ該抗体から天然ヒトα１−ミクログロブリン及び請求項１又は２記載のペプチドと特異的に結合性であるものを選択することを特徴とする請求項３又は４記載の抗体の製法。
　【請求項６】　イムノアッセイにより試料液体中のヒトα１−ミクログロブリンを測定する方法において、試料液体を規定量の成分である抗体及びペプチドと同時に又は順次に接触させ、その際に成分のうちの一方が標識されており、かつこの標識を介して測定を行ない、この際ペプチドはアミノ酸の長さが最高４０個であり、かつ構造Ａ−Ｒ−Ｂを有し、ここでＲはヒトα１−ミクログロブリンのアミノ酸１４４〜１８３：
のアミノ酸部分配列からの少なくとも６個の連続する、ヒトα１−ミクログロブリンに対する抗体に結合性のアミノ酸配列を含有し、Ａ及びＢは任意のアミノ酸配列であるペプチドであり、かつ抗体は前記ペプチド及びヒトα１−ミクログロブリンと結合性である抗体であることを特徴とするα１−ミクログロブリンの測定法。
　【請求項７】　Ｒがヒトα１−ミクログロブリンのアミノ酸１４４〜１８３のアミノ酸部分配列からの少なくとも６個の連続する、ヒトα１−ミクログロブリンに対する抗体に結合性のアミノ酸配列を含有し、かつ抗体成分が細胞系ＥＣＡＣＣ９００７１９０６から得られる抗体を含有する請求項６記載の測定法。
　【請求項８】　ベース層上に相互に平行に設けられていて、毛管作用物質より成り、相互に液体接触する数個のゾーンを包含する、試料液体中のα１−ミクログロブリンを分析測定するための試験片において、該試験片が成分であるペプチド及び抗体の一方を固定形で含有しかつ他方の成分を標識形で含有する第１試薬系を反応ゾーン中に包含し、この際、ペプチドはアミノ酸の長さが最高４０個であり、かつ構造Ａ−Ｒ−Ｂを有し、ここでＲはヒトα１−ミクログロブリンのアミノ酸１４４〜１８３：
のアミノ酸部分配列からの少なくとも６個の連続する、ヒトα１−ミクログロブリンに対する抗体に結合性のアミノ酸配列を含有し、Ａ及びＢは任意のアミノ酸配列であるペプチドであり、かつ抗体は前記ペプチド及びヒトα１−ミクログロブリンと結合性である抗体であり、かつ場合により、他方の成分の標識の測定を可能にする第２試薬系を包含する検出フィールドを有することを特徴とするα１−ミクログロブリンを測定する試験片。
　【請求項９】　Ｒがヒトα１−ミクログロブリンのアミノ酸１４４〜１８３のアミノ酸部分配列からの少なくとも６個の連続する、ヒトα１−ミクログロブリンに対する抗体に結合性のアミノ酸配列を含有し、かつ抗体成分が細胞系ＥＣＡＣＣ９００７１９０６から得られる抗体を含有する請求項８記載の試験片。
　【請求項１０】　試料液体中のα１−ミクログロブリンを測定する方法において、請求項８記載の試験片を使い、その際試料液体を反応ゾーンもしくは場合により存在する開始ゾーン上に施し、かつ基質フィールドに達した標識成分の標識を介して測定することを特徴とするα１−ミクログロブリンの測定法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、試料液体中のヒトα１−ミクログロブリンをイムノアッセイ法により測定する方法並びに試料液体中のα１−ミクログロブリンを分析測定するための試験担体及び試料液体を本発明による試験担体で分析試験する方法に使用することのできるペプチド及び抗体に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　タンパク質ＨＣとしても知られているα１−ミクログロブリンはヒト血清、脳脊髄液及び尿中に出現する。血しょう中ではα１−ミクログロブリンは遊離形でもまたＩｇＡとの複合体でも出現する。それはα２μ−グロビンータンパク質系に包含され、この系には例えばタンパク質α２μ−グロビン、β−ラクトグロブリン、レチノール結合タンパク質、アポリポタンパク質Ｄ、嗅上皮からのＢＧタンパク質及びα１−ミクログロブリンも包含される。これらのタンパク質の生物学的機能は体液中の疎水性低分子の結合及び輸送であると思われる［Ｈｕｎｔ及びその他共著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，１４９（１９８７），２８２〜２８８；Ｇｏｄｏｖａｃ−Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＩＢＳ　１３（１９８８），６４〜６６］。α１−ミクログロブリンはインタ−α−トリプシンインヒビターと一緒に“プレブロ”−タンパク質として合成されかつプロセシングにより遊離される［Ｋａｕｍｅｙｅｒ及びその他共著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４（１９８６），７８３９〜７８５０］。
　【０００３】
　α１−ミクログロブリン（以下α１Ｍとも記載する）はアミノ酸１８３個からのモノマータンパク質であり［Ｋａｕｍｅｙｅｒ及びその他共著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４（１９８６），７８３９〜７８５０、図２参照、ａａ２０〜ａａ２０２、Ｎ末端Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ、Ｃ末端Ｉｌｅ　Ｒｒｏ　Ａｒｇ］、このタンパク質は３つのアミノ酸部位５，１７及び９６で炭水化物側鎖を有しかつＣｙｓ７２及びＣｙｓ１６９の間でジスルフィド架橋を形成する［タカギ及びその他共著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９８（１９８１）、９９７〜１００１、Ｋａｕｍｅｙｅｒ及びその他によるアミノ酸部位、前記文献参照］。α１−ミクログロブリン−タンパク質と詳細不明の発色団が会合し、この発色団はタンパク質を黄褐色に着色する。
　【０００４】
　尿中のα１−ミクログロブリン濃度は健康者で＜１０ｍｇ／ｌである。腎臓に障害がある場合、分子量約３０ｋＤのα１−ミクログロブリンを含む低分子量タンパク質が不完全にしか吸収されずかつ尿中に多量に出現する（タンパク質尿）。α１−ミクログロブリンの場合は２００ｍｇ／ｌまでの濃度に達する［Ｗｅｂｅｒ及びその他共著、Ｋｌｉｎ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．６３（１９８５）、７１１〜７１７］。α１−ミクログロブリンは臨床的に重要な尿のｐＨ範囲４〜１０で安定であり［Ｙｕ及びその他共著、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３６（１９８３）、２５３〜２５９］かつ−２０℃で安定に貯蔵することができる［Ｗｅｂｅｒ及びその他共著、前記文献参照］。それ故、α１−ミクログロブリンは尿細管腎機能の好適な指標になる。
　【０００５】
　従来はα１Ｍの検出に関しては懸濁測定だけが知られている。その際に例えば試薬中に含まれているα１Ｍを場合によりラテックス結合している。α１Ｍに対する抗体と直接凝集させかつ生成した懸濁を比濁分析により測定する。しかしこの方法は比濁計でしか実施し得ない。
　【０００６】
　他の方法は、生成した懸濁を暗い背景に対して視覚的に測定することである。しかしこの方法は時間的ロスが大きく、数個の作業工程を必要とし、かつ定性的結果だけが得られる。
　【０００７】
　イムノアッセイでは単離したヒトα１−ミクログロブリンを使用することが不利である。それというのもこのタンパク質は単一の物質ではなく、顕著な負荷不均質性を呈しかつ既に記載したように従来詳細不明の発色団を含有しているからである「Ｇｒｕｂｂ及びその他共著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１９８３）、１４６９８〜１４７０７参照］。このタンパク質はヒト体液から取得しなければならない。それ故、多量にかつ均一な品質で製造することは困難である。
　【０００８】
　【発明が解決しようとする課題】
　それ故、本発明は、技術水準の欠点を排除し、かつ視覚的に実施可能であり、かつほぼ定量的結果をもたらすか又は自動分析計で規定通りに進行するα１Ｍ試験を開示することをベースとしていた。更に、α１−ミクログロブリンに類似の免疫特性を有し、かつそれ故α１−ミクログロブリンを測定するための免疫検定に簡単に使用することのできる物質を開示することが必要である。
　【０００９】
　【課題を解決するための手段】
　本発明によりこの課題は、最高でアミノ酸４０個の長さでありかつ構造Ａ−Ｒ−Ｂを有し、ここでＲはヒトα１−ミクログロブリンのアミノ酸１４４と１８３との間のアミノ酸部分配列：
からの少なくとも６個の連続する、ヒトα１−ミクログロブリンに対する抗体に結合性のアミノ酸配列を含有し、Ａ及びＢは任意のアミノ酸配列であるペプチドにより解決され、その際にこのペプチドがアミノ酸１５８〜１８３の部分配列からの少なくとも６個の長さのアミノ酸配列を含有すると優れている。
　【００１０】
　本発明中には、最高でアミノ酸４０個の長さでありかつ構造Ａ−Ｒ−Ｂを有し、ここでＲはヒトα１−ミクログロブリンのアミノ酸１〜２０：
のアミノ酸部分配列からの少なくとも６個のアミノ酸配列を含有し、Ａ及びＢは任意のアミノ酸配列であるペプチドに関しても記載する。
　【００１１】
　本発明によるペプチドはヒトα１−ミクログロブリンの特別な部分配列からの少なくとも６個のアミノ酸と共に、任意に選択することのできる総数最高４０までの他のアミノ酸を含有していてよい。本発明の優れた実施形ではこの他のアミノ酸は、天然ヒトα１−ミクログロブリン中の前記の少なくとも６個のアミノ酸に隣接しているものと同じである。
　【００１２】
　本発明の優れた実施形では、本発明によるペプチドは前記のアミノ酸に加えて担体タンパク質部分を有し、本発明によるペプチドは融合タンパク質である。このような融合タンパク質は高い発現性についても、担体タンパク質部分が関与する他の性質についても望ましい。例えば、この担体タンパク質部分は融合タンパク質を遺伝子工学的に製造する際に発現生成物の有利な局在化をもたらし、それ故簡単に取得することができる。その製造は公知方法で、例えば相応して融合されたＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、次に発現させかつ融合タンパク質を取得することにより行なうことができる。本発明範囲において担体タンパク質部分が３個のアミノ酸だけ短縮した、ガラクトース結合タンパク質ＧＢＰのタンパク質配列であると有利である。他の優れた実施形では担体タンパク質部分はα１Ｍの部分配列、殊に２０個までのアミノ酸を含有していてよい。担体タンパク質部分の発現に使われるＥ．コリ（ｃｏｌｉ）からのｍｇｌＢ遺伝子はクローン化されておりかつそのＤＮＡ配列は知られている［Ｎ．Ｍｕｅｌｌｅｒ著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８５（１９８２）、４７３〜４８０：Ｓｃｈｏｌｌｅ及びその他共著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０８（１９８７）、２４７〜２５３］。プラスミド−コード化ＧＢＰタンパク質（ｐＶＢ１プラスミド、Ｓｃｈｏｌｌｅ及びその他共著、前記文献参照）はｍｇｌＢプロモータの抑制解除後にＥ．コリ全タンパク質の３０％まで過剰発現した。比較可能な過剰発現は、３´末端に局在化した特異的なＥｃｏＲＩ制限切断部位の、ｍｇｌＢ構造遺伝子の停止コドンの前の１２個の塩基対を介して構成されたＧＢＰ融合タンパク質に関して見出された。これによりＣ末端で３個のアミノ酸が短縮したＧＢＰ融合成分（３０７アミノ酸）が生成する。分泌したＧＢＰ融合タンパク質は可溶性でありかつ簡単に浸透圧ショックにより宿主細胞の溶解なしに遊離する［Ｎｅｗ及びＨｅｐｐｅｌ共著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４（１９６５）、７５２９〜７５３３］。特に優れた融合タンパク質は担体タンパク質部分と共に、Ｎ末端配列内に（アミノ酸１〜２０）かつまたＣ末端配列内に（アミノ酸１４４〜１８３）存在する本発明によるペプチド配列を含有する。
　【００１３】
　本発明によるペプチドは化学的に合成するか又は相応するＤＮＡ配列をプラスミド中に導入しかつ好適な宿主細胞中で発現させることにより得られる。本発明によるペプチドは、α１−ミクログロブリンの免疫学的反応性を必要とするが、構成及び均質性に関して標準化された抗原が有利であるすべての使用分野に好適である。
　【００１４】
　本発明の他の優れた実施形ではペプチドは結合対の１つの成分と結合しており、その際にそれは有利にビオチンであり、結合対の他の成分は（ストレプト）−アビジンである。他の好適な結合対は例えばハプテンとこれに対して作用する抗−ハプテン−抗体である。
　【００１５】
　本発明の他の目的は、本発明によるペプチドとも、またヒトα１−ミクログロブリンとも特異的に結合性である抗体である。本発明範囲ではポリクローナル抗体もまたモノクローナル抗体も含まれる。しかし本発明の優れた実施形ではモノクローナル抗体である。特に優れているのは細胞系ＥＣＡＣＣ９００７１９０６から得られるようなモノクローナル抗体である。
　【００１６】
　本発明の他の目的は、公知方法で好適な動物を天然α１−ミクログロブリン又は本発明によるペプチドで免疫化し、抗体を取得し、かつ天然ヒトα１−ミクログロブリンともまた本発明によるペプチドとも特異的に結合性である抗体を選択する、本発明による抗体の製法である。
　【００１７】
　本発明方法はポリクローナル抗体の製法もまたモノクローナル抗体の製法も包含する。このような方法は当業者に公知である。
　【００１８】
　本発明によるモノクローナル抗体を取得するに当り、実験動物、例えばマウスを患者の尿からのヒトα１−ミクログロブリンで免疫化する。免疫化に当り、免疫原を例えばアジュバントと組合せて常法で投与する。アジュバントとしては水酸化アルミニウムをボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｉｓ）又はフロイントアジュバントと一緒に使用すると優れている。免疫化を数カ月間にわたって４〜６週間間隔で少なくとも４回免疫化すると有利である（腹腔内注射）。
　【００１９】
　このように免疫化した動物の脾臓からＢリンパ細胞を取得し、これを永久骨髄腫と融合させる。この融合は公知方法により行なう［Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ共著、Ｎａｔｕｒｅ２５６（１９７５）４９５〜４９７］。形成されたハイブリッド細胞の一次培養物を常法で、例えば市販の細胞選別機の使用下に又は“限界稀釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ）”によりクローン化する。好適な試験法で、例えば酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ法）で患者の尿から単離したα１−ミクログロブリンに対してもしくは例１〜８又は１３〜１４に挙げたペプチドに対してポジチブに反応する培養物をそれぞれ更に処理する。このようにして、本発明によるモノクローナル抗体を産生する数個のハイブリドーマ細胞系が得られる。公知方法によりこの細胞系を培養しかつそれから産生されたモノクローナル抗体を単離することができる。このようにして得られた細胞系の例はクローン６．０４５．７５（ＥＣＡＣＣ９００７１９０６）である。この細胞系は寄託機関ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に前記の番号で寄託されている。
　【００２０】
　本発明による抗体の選択は例１５に記載されているように行なうことができる。
　【００２１】
　本発明の他の目的は試料液体中のヒトα１−ミクログロブリンをイムノアッセイにより測定する方法であり、その際に試料液体を規定量の本発明による成分の抗体及びペプチドと同時に又は順次に接触させ、その際に成分の一方が標識化されておりかつこの標識を介して測定を行なう。イムノアッセイとしてはすべての公知の測定法が好適である。
　【００２２】
　例えば標識した本発明による抗体を試料液体と予備恒温保持することができ、その際に抗体は試料中のα１−ミクログロブリンの予測量に対して過剰量で存在し、その後で予め恒温保持したバッチを固相に結合した本発明によるペプチドと恒温保存すると、過剰分の標識抗体はこれにより分離される。相分離後、液相中で抗体の標識を測定し、それにより試料中に存在するα１−ミクログロブリンの量を求めることができる。成分の恒温保持を同時に行なうことができるが、この場合は抗体を試料中のα１−ミクログロブリンの予測される濃度とほぼ同量で添加する。試験を実施するための他の可能性は、第１工程で固相に結合している本発明によるペプチドを標識した本発明による抗体と恒温保持し、その後で試料液体を添加し、それによりペプチドは試料中のα１−ミクログロブリンと抗体に対して競合反応をし、かつ固相に結合している本発明によるペプチドに結合している抗体の一部が分離しかつ試料からのα１−ミクログロブリンに結合することである。検出は固相でも液相でも行なうことができる。
　【００２３】
　他の試験別法は、本発明による抗体を固体担体に結合させかつ標識した本発明によるペプチド及び試料液体と恒温保持することである。この場合も両方の抗原が抗体に対して競合し、検出は抗体を介して固相に結合した本発明によるペプチドの標識を介して行なう。最後に、ＦＰＩＡ原理（けい光−分極−イムノアッセイ）により実施する方法も好適である。この際に、けい光染料で標識した本発明によるペプチドを抗体及び試料液体からの抗原と恒温保持し、その際にペプチドの標識が抗体への結合により変化する。
　【００２４】
　本発明の優れた実施形では標識していない成分を固体担持材料に結合させかつ標識の測定は液相及び固相の分離後に行なう。
　【００２５】
　本発明で標識としては、酵素標識、けい光染料標識、放射性標識、金又は二酸化セレンによる標識もしくは着色重合体、例えばラテックス粒子による標識を適用することができる。しかし本発明では標識として酵素を使用しかつこれを酵素色素形成反応を介して検出すると優れている。特に優れている酵素はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ又はペルオキシダーゼであり、これらは基質のクロルフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−ニトロフェノール−ホスフェート及びＡＢＴＳを介して相応して検出される。本発明の他の優れた実施形では標識としてけい光染料を使用し、そのけい光量子収量又は脱分極能が試料液体中のα１−ミクログロブリンの濃度に相応する抗体への結合により変化する。
　【００２６】
　本発明方法では抗体としてモノクローナル抗体を使用すると優れている。固体担体への一方の成分の結合は特異的結合対を介して、つまり特異的結合対の一部を固体担体に結合させかつ結合対の他方の部分を成分と結合させて行なうと有利である。本発明範囲で特に優れた特異的結合対はビオチン／（ストレプト）−アビジン系である。
　【００２７】
　検出反応を微量滴定板又は試験管中で実施することも優れており、それらの固体担体としての凹部の底又は壁に一方の成分を結合させておく。
　【００２８】
　本発明は、ベース層上に相互に平均に設けられており、毛管作用物質より成り、相互に液体接触する数個のゾーンを有する、試料液体中のα１−ミクログロブリンを分析測定するための試験片にも関し、該試験片が、成分である本発明による抗体及び本発明によるペプチドの一方を固定形で含有しかつ他方の成分を標識形で含有する第１試薬系を１つの反応ゾーン中に包含し、かつ場合により、他方の成分の標識の測定を可能にする第２試薬系を包含する検出フィールドを有することを特徴とする。本発明による試験片のゾーンは、相互に液体接触するので液体搬送区間を形成し、この区間に沿って液体が毛管力により反応ゾーンから検出フィールドに流動する。その際に、試料液体は規定量の本発明による成分の抗体及びペプチドと同時に又は順次に接触し、その際に成分の一方は標識されておりかつ測定を検出フィールド上のこの標識を介して行なう。更に、標識成分は複合体とも表わされる。
　【００２９】
　このような試験担体、その成分及び試験担体を使って行なう原理的な試験は一般的にヨーロッパ特許公開第０３７４６８４号明細書、同第０３５３５７０号明細書及び同第０３５３５０１号明細書に記載されている。しかしながら本発明による試験担体はα１−ミクログロブリンの特異的測定のために構想されているのであり、それ故相応する本発明による抗体を含有する。
　【００３０】
　試験担体を構成するのに使われる材料については前記のヨーロッパ特許公開第０３７４６８４号明細書、同第０３５３５７０号明細書及び同第０３５３５０１号明細書に記載されている。
　【００３１】
　本発明による試験片では固定した抗体と標識した本発明によるペプチドとの組合せ物を複合体として又は固定した本発明によるペプチド及び標識した抗体を複合体として使用すると有利である。
　【００３２】
　本発明による試験片は基本的に２つの部分、即ち反応ゾーン及び検出ゾーンより成る。
　【００３３】
　反応ゾーンで試料液体を吸収させる。本発明の優れた実施形では反応ゾーンは最適な反応経過の条件（例えばイオン濃度、ｐＨ値）を調節することのできる他の物質を含んでいる。反応ゾーンで抗体と試料からのα１−ミクログロブリンとの間で免疫反応が行なわれる。この反応に基づいて試料中のα１Ｍ含量と相関関係にある、標識された複合体の量が検出フィールドに到達し、かつそこで標識を介して相応する検出法（例えばけい光又は反射）により検出する。
　【００３４】
　本発明による試験片の反応ゾーンは基本的に相互に並んで設けられている毛管作用の試験フィールド１個又は数個より成り、それは相互に液体接触するので、それが液体搬送区間を形成し、この区間に沿って液体が毛管力により搬送ゾーンを通って検出フィールドに流動する。反応ゾーンのフィールド数は絶対的ではなくかつ免疫反応に必要な試薬を別個に又は一緒にフィールドに施すべきかどうかに左右される。それ故、すべての試薬を一緒に唯一のフィールドに施すこともでき、または反応ゾーンを異なるフィールドに、例えば開始フィールド、緩衝液フィールド、複合体フィールド及び捕集フィールドに分割することもでき、これらは連続的に設けられていなければならない。隣接するフィールドは任意に組合せることもできる。例えば緩衝液フィールドと複合体フィールド又は吸収フィールド、緩衝液フィールド及び複合体フィールドが１つのフィールドを形成することができる。
　【００３５】
　それ故、本発明の優れた実施形では本発明による試験片は、反応ゾーンが種々のフィールドに区分されていて、そのフィールドが検出フィールド方向に開始フィールド、緩衝液フィールド、複合体フィールド及び捕集フィールドの順序を有し、その際に開始フィールドでは試料液体の採取が行なわれ、緩衝液フィールドは反応経過の最適化のための物質を含有し、複合体フィールドは第１試薬系の標識成分及び捕集フィールドは固定成分を含有し、かつ隣接するフィールドは記載の順序で任意に相互に組合わせうるように構成されている。
　【００３６】
　この実施形では、本発明による試験片は場合により第１フィールドとして開始フィールドを含む。開始フィールドは試料液体への接触をもたらす。それ故、このフィールドは液体を自然にかつ完全に吸収しかつ更に良好に導くかもしくは放出するようなものである。これを保証するために、試験片の開始フィールドを例えば測定の間常に試料液体中に含浸しておいてよい。
　【００３７】
　開始フィールドから場合により分離している緩衝液フィールドは、最適な反応経過の条件（例えばイオン濃度、ｐＨ値）をもたらす補助物質を含有する。緩衝液フィールドは多孔性材料、殊にセルロース、ポリエステル又はナイロンをベースとするフリースより成る。
　【００３８】
　緩衝液フィールドには場合により複合体フィールドが接続している。複合体フィールドは基本的に標識とα１−ミクログロブリンに対する抗体もしくは本発明によるペプチドとから複合体を分離可能な形で含有する。好適な担体材料及び複合体を施す方法は例えばヨーロッパ特許公開第０３５３５７０号明細書に記載されている。特に好適なのはポリエステル、セルロース又はガラス繊維をベースとする多孔性材料である。
　【００３９】
　複合体フィールドには場合により捕集フィールドが接続している。このフィールドは、複合体として抗体と標識とからの複合体を使用する場合には本発明によるペプチドを又は複合体として本発明によるペプチドと標識とからの複合体を使用する場合には固定化抗体を結合形で含有する。固定化は公知方法で、例えば化学的に又は免疫沈降により行なう。捕集フィールドの物質に生物学的結合成分、例えば（ストレプト）−アビジンが結合しかつ抗体もしくは本発明によるペプチドが他の生物学的結合成分、例えばビオチンに結合するように添加すると有利である。生物学的結合成分の結合（例えばビオチン／ストレプトアビジン−結合）を介して本発明によるペプチドもしくは抗体の固定化を達成する。このような固定化法は例えばヨーロッパ特許公開第０３７４６８４号明細書に記載されている。
　【００４０】
　優れた実施形では少なくとも複合体フィールドと緩衝液フィールドが組合わされている。他の優れた実施形では少なくとも複合体フィールドと捕集フィールドを組合せておく。その場合、免疫学的予備反応で固定化成分に既に複合体、つまり標識成分が結合している。試料の添加後に、試料中に含有されているα１−ミクログロブリンが複合体の部分量を圧排するかもしくは複合体として標識抗体を使用する場合には圧排反応においてこの抗体を固定化ペプチドから分離する。この圧排された複合体が検出フィールドに流動しかつそこで検出される。
　【００４１】
　他の優れた実施形では、反応ゾーンは少なくとも２つの分離したフィールドを包含する。第１フィールド（緩衝液／複合体フィールド）では反応誘導に最適な条件の調節並びに試料のα１−ミクログロブリンと標識抗体との間の免疫反応が行なわれる。反応ゾーンの第２フィールド（捕集フィールド）では免疫反応の固定化成分との反応が行なわれ、その際に試料中に含まれるα１−ミクログロブリンの量に相応する量の複合体が溶解しておりかつそれが検出フィールドに搬送される。
　【００４２】
　反応ゾーンに、場合によりその捕集フィールドに検出フィールドが接続している。この検出ゾーンが捕集フィールドの上方に又は下方に設けられていると有利である（ヨーロッパ特許公開第０３５３５００号明細書参照）。殊に、検出ゾーンは、標識成分と接触する際に観察することのできる変化を受ける、標識に好適である検出基質を含む試薬系を含有するか、あるいは直接測定することのできる標識（例えばけい光標識）を使用する際には複合体の直接的な検出に有用である。基質が含まれている場合、殊にこのゾーンは疎水性に封鎖されている溶出可能なフィルム又は織物もしくはフリースから成る。このような担体は例えばヨーロッパ特許公開第０３５３５０１号明細書に記載されている。こうすることにより、試料液体がフィールド末端に到達した後で基質を担体から溶出しかつ検出反応が開始される。
　【００４３】
　このような試験片はヨーロッパ特許公開第０３７４６８４号明細書に記載されている。
　【００４４】
　本発明の他の目的は本発明による試験片を試料液体中のα１−ミクログロブリンの測定に使用することであり、その際に試料液体を反応ゾーンもしくは場合により存在する開始ゾーンに施しかつ測定を基質フィールドに到達した標識成分の標識を介して行なう。
　【００４５】
　本発明によるペプチド、抗体及び試料液体中のα１−ミクログロブリンの定性的及び定量的検出法でその使用並びにこの検出を実施するための試験片により、尿中のα１−ミクログロブリンの量により明らかにすることのできる腎機能の試験系を開示することができる。本発明によるそのような試験片並びにそのような試験片を使用する測定により連続試験に好適な形で、腎機能に障害がある場合にはその障害について迅速に解明することができる。その際に例えば試料液体の尿を試験片の反応ゾーンと接触させるだけでかつ一定の作用時間後に検出フィールドの色の変化を測定する。
　【００４６】
　【実施例】
　次に本発明を添付図面の図１〜３並びに下記の配列番号ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１〜９により操作順に詳説する。
　【００４７】
　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１：α１Ｍ（ａａ１６１〜１８３）のＣ末端領域の合成に使用したオリゴデオキシヌクレオチド（例２．１）
　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２：ｍｇｌＢ−Δα１Ｍ−Ｃ−融合遺伝子のＤＮＡ配列及びそれから誘導したＧＢＰ−Δα１Ｍ−Ｃ−融合タンパク質のタンパク質配列（例２．１）
　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３〜８：α１−ミクログロブリン遺伝子の部分領域の合成に使用した（ａａ５４〜８７）−（ａａ１６１〜１８３）オリゴデオキシヌクレオチド（例２．２）
　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．９：ｍｇｌＢ−Δα１Ｍ−融合遺伝子のＤＮＡ配列及びそれから誘導したＧＢＰ−Δα１Ｍ−融合タンパク質のタンパク質配列（例２．２）
　ＤＮＡ操作に当っては標準法を使用した［例えばＭａｎｉａｔｉｓ及びその他共著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ出版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されている］。
　【００４８】
　略語：
　ＡＢＴＳ（登録商標）：２，２′−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリン−スルホン酸−（６）］ジアンモニウム塩
　ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
　ａａ：アミノ酸ツイーン（Ｔｗｅｅｎ：登録商標）２０：ポリエトキシソルビタンラウレート
　ＰＯＤ：ペルオキシダーゼ
　ＲＳＡ：牛血清アルブミン
　Ｆｃγ：ＩｇＧのＦｃフラグメント
　Ｍｔｒ：メトキシトリメチルフェニルスルホニル
　Ｏｔ　Ｂｕ：オキシ第三ブチル
　Ｓｔ　Ｂｕ：ｔ−ブチルスルフェニル
　【００４９】
　【化１】
　【００５０】
　【化２】
　【００５１】
　【化３】
　【００５２】
　【化４】
　【００５３】
　【化５】
　【００５４】
　【化６】
　【００５５】
　【化７】
　【００５６】
　【化８】
　【００５７】
　【化９】
　【００５８】
　【化１０】
　【００５９】
　【化１１】
　【００６０】
　例１
　基本発現プラスミドｐＶＢ１　ＥＨ（ＤＳＭ６０８１）の構成
　ハイブリッドタンパク質の発現のためにｐＶＢ１プラスミドもしくはその誘導プラスミドを使用する。ｐＶＢ１はＥ．コリプラスミドｐＢＲ３２２からの２．３ｋＢｐの長さのＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩＩ−ベクタ−フラグメント（アンピシリン耐性、複製開始点）及び付加的にＥ．コリからの完全なｍｇｌＢ遺伝子をコードする長さ２．２ｋＢｐのＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ−フラグメント［Ｓｃｈｏｌｌｅ及びその他共著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０８（１９８７）２４７〜２５７］を含有する。融合タンパク質を構成するに当り、停止コドンの前方で、３´末端に局在する単独のＥｃｏＲＩ制限切断部位１２Ｂｐを使用する。
　【００６１】
　ＧＢＰ融合タンパク質の構成に当り（ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメントの挿入）、ｐＶＢ１プラスミド中の単独ＤｒａＩＩ制限切断部位をクレノウポリメラーゼで埋めかつＨｉｎｄＩＩＩリンカー（ｄ（ＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧ））を使用する（構成：ｐＶＢ１ＥＨ；図１）。
　【００６２】
　例２
　ＧＢＰ−Δ１α−ミクログロブリン（ＧＢＰ−Δα１Ｍ）融合タンパク質の構成、発現及び分泌
　２．１　ＧＢＰ（ａａ１〜３０６）−α１Ｍ（ａａ１６１〜１８３）
　α１−ミクログロブリン遺伝子のＣ末端領域（アミノ酸部位１６１〜１８３）をハイブリッド化（反応緩衝液：１２．５ｍｍｏｌ／ｌ　トリス／ＨＣｌ，ｐＨ７．０及び１２．５ｍｍｏｌ／ｌ　ＭｇＣｌ２）により２つの化学合成したオリゴデオキシヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１）から製造した。
　【００６３】
　その後、“ＤＮＡ−アダプター”を長さ約４．５ｋＢｐのｐＶＢ１／ＥＨ　ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ベクターフラグメントに連結した（構成：ｐＶＢ１／ＥＨ−Δ１αＭ−Ｃ）。ＤＮＡ配列決定によりアダプターのＤＮＡ配列を固定した。ＧＢＰ−Δ１αＭ−Ｃ融合タンパク質及びコードするそのＤＮＡ配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２に詳しく記載されている。
　【００６４】
　２．２　ＧＢＰ（ａａ１〜３０６）−α１Ｍ（ａａ５４〜８７）−α１Ｍ（ａａ１６１〜１８３）融合タンパク質
　２．２．１　α１−ミクログロブリン遺伝子の部分領域の化学合成
　α１−ミクログロブリン遺伝子（約２００Ｂｐ）の中央部（ａａ５４〜８７）及び選択したＣ末端（ａａ１６１〜１８３）の領域をオリゴデオキシヌクレオチド６個を介して直接融合合成した。２つのバッチでそれぞれ３つの相補性オリゴヌクレオチドを“アニーリングし”かつ２つの所望のハイブリッド生成物をゲル電気泳動により精製した。両方の単離した約１００Ｂｐの長さの遺伝子ブロックを再度アニーリングした後で５′−もしくは３′末端で単独のＢａｍＨＩ−及びＨｉｎｄＩＩ１制限切断部位を有する長さ約２００Ｂｐの遺伝子ブロックを長さ４ｋＢｐのｐＢＲ３２２ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ−ベクターフラグメント（構成：ｐＢＲ３２２−Δα１Ｍ）に連結した。その後で挿入切片を配列決定した。使用したオリゴデオキシヌクレオチド及びクローニング戦略はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３〜８及び図２に示されている。遺伝子合成はＷｏｓｎｉｋ及びその他により研究された方法［Ｇｅｎｅ６０（１９８７）１１５〜１２７］により行なう。
　【００６５】
　２．２．２　プラスミドｐＶＢ１／ＥＨ−Δα１Ｍの構成
　プラスミドｐＢＲ３２２−Δα１ＭをＢａｍＨＩで消化させ、ＢａｍＨＩ切断部位の突出している５′末端をクレノウポリメラーゼで埋めかつＤＮＡ末端に適合するＥｃｏＲＩリンカー（ｄＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ）を設けた。その後ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで後切断しかつ長さ約２００ＢｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメントを長さ約４．５ｋＢｐのｐＶＢ１／ＥＨ−ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ベクタ−フラグメントに連結した（構成ｐＶＢ１／ＥＨ−Δα１Ｍ）。ＧＢＰ−Δα１−ミクログロブリン−融合タンパク質及びコードするそのＤＮＡ配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．９に記載されている。
　【００６６】
　２．３　Ｅ．コリ中で融合タンパク質の発現
　宿主菌株としてＥ．コリＫ１２菌株ＲＭ８２１ａｃ＋［ｍｅｔ＋，ｌａｃ＋ＥＤ８６５４の復帰突然変異体；Ｍｕｒｒａｙ及びその他共著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１５０（１９７７）５３〜６１、ＤＳＭ５４４６］を使用した。この菌株をプラスミドｐＶＢ１／ＥＨ−Δα１ＭもしくはｐＶＢ１／ＥＨ−Δα１Ｍ−Ｃで形質転換しかつアンピシリン５０ｍｇ／ｌ及び１％グルコースを含有するＤＹＴ培地［１．６％バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、１％イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％ＮａＣｌ］中で３０℃で発現させて５５０ｎｍで５〜８の光学密度まで培養した。ｍｇｌＢプロモータの抑制解除に当り遠心分離した細胞を１容量の醗酵培地からグルコースを含まず５０ｍｇ／ｌアンピシリンを含有する５〜１０容量の新しいＤＹＴ培地に移しかつ１４〜２０時間抑制解除した。その後、細胞をこの抑制培地１ｍｌから収穫しＧＢＰ−Δα１Ｍ−融合タンパク質の発現及び細胞局在化を例３に記載されているように細胞分別、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンプロット分析により解明した。細胞分別に当りペリプラズムタンパク質を浸透圧ショック［Ｎｅｕ及びＨｅｐｐｅｌ共著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４（１９６５）７５２９〜７５３３］によりＥ．コリ細胞から遊離させかつ残留する細胞ペレットを例３に記載されているように砕解した（細胞画分：ａ）ペリプラズムタンパク質：ｂ）残留可溶性Ｅ．コリタンパク質：ｃ）カオトロピック試薬で抽出可能な不溶性Ｅ．コリタンパク質）。
　【００６７】
　融合タンパク質は天然プラスミドコード化ＧＢＰタンパク質（３０８ａａ）と同様に試験宿主菌株中でＥ．コリ全タンパク質に対して３０％まで合成された。＞９０％がペリプラズム中に分泌され、可溶性であり、凝集せずかつ浸透圧ショックにより細胞から遊離した。ＧＢＰ−Δα１Ｍ−融合タンパク質のα１−ミクログロブリンエピトープは、天然α１Ｍタンパク質に対して作用するポリクローナル（Ｄａｃｏｐａｔｔｓ及びＳｅｒｏｔｅｃ社のα１Ｍ−抗血清）及びモノクローナル抗体により認識された。
　【００６８】
　２．４　ＧＢＰ−Δα１Ｍ−融合タンパク質の単離
　ローラ培地もしくは振盪培地（前記参照）５ｍｌ中での培養に基づいて、プラスミドｐＶＢ１／ＥＨ−Δα１Ｍで形質転換したＲＭ８２１ａｃ＋細胞を５１醗酵槽中で培養し（バイオマス収量：約２０ｇ／ｌ湿式重量）、ＧＢＰ−Δα１Ｍ融合タンパク質を浸透圧ショック［Ｎｅｕ及びＨｅｐｐｅｌ共著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４（１９６５）７５２９〜７５３３］により細胞から遊離しかつ残留細胞を遠心分離した。この簡単だがまさに効率的な精製工程の後で、所望のＧＢＰ−Δα１Ｍ−融合タンパク質を公知のタンパク質精製工程、例えばイオン交換クロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＨＩＣクロマトグラフィ（疎水性相互作用クロマトグラフィ）、ゲル濾過、親和性クロマトグラフィ及び沈殿により簡単に均質になるまで精製することができる。濾過した（ニトロセルロースフィルター、孔径０．４５μｍ）“浸透圧ショック調製物”からＧＢＰ−Δα１Ｍ−融合タンパク質をクロマトフォーカシング（平衡化緩衝液：２５ｍｍｏｌ／ｌピペラジン（ＨＣｌ）、ｐＨ５．５：ｐＨ範囲：５→４）、次にフェニルセファロースを用いる疎水性クロマトグラフィ［平衡化緩衝液：１０ｍｍｏｌ／ｌトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．０、４０％硫酸アンモニウム（４℃に対するＡＳ飽和値）：溶離勾配：１０ｍｍｏｌ／ｌトリス／ＨＣｌ展開緩衝液、ｐＨ７．０中でＡＳ４０％→０％、エチレングリコール０％→７０％（ｖ／ｖ）］及び透析により精製した。
　【００６９】
　例３
　細胞砕解、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンプロット分析
　遠心分離した培地１ｍｌからの細胞ペレットを１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液ｐＨ６．８及び１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ０．２５ｍｌ中に再懸濁させかつ細胞を超音波処理により破解した。遠心処理後、上澄みに１／５容量の５×ＳＤＳ−試料緩衝液（１×ＳＤＳ−試料緩衝液：５０ｍｍｏｌ／ｌトリス（ＨＣｌ）ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％メルカプトエタノール、１０％グリセリン、０．００１％ブロムフェノールブルー）を加え、不溶の細胞破解物フラクションを６〜８ｍｏｌ／ｌ尿素を含有する１×ＳＤＳ−試料緩衝液０．３ｍｌ中に再懸濁し、試料を９５℃で５分間恒温保持しかつ遠心処理した。その後、タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し［Ｌａｅｍｍｌｉ著、Ｎａｔｕｒｅ２２７（１９７０）６８０〜６８５］かつクマシーブリリアントブルーＲで着色した。
　【００７０】
　交互に平行して電気泳動で分離したタンパク質をニトロセルロースフィルター上に移し、固定し［Ｔｏｗｂｉｎ及びその他共著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６（１９７９）４３５０］かつＧＢＰ−Δα１Ｍ−融合タンパク質の免疫活性をポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体で測定した。
　【００７１】
　例４
　化学的に製造したα１Ｍタンパク質の部分領域をα１Ｍ−抗体により測定
　微量滴定板（Ｎｕｎｃ）を、鉢型容器（Ｎａｐｔ）１個当りリン酸塩緩衝液ｐＨ９．６中の１ｍｌ当り５μｇのポリハプテン（例１０，１２及び１４により製造）の溶液１００μｌと一緒に室温で２０時間恒温保持した。洗浄（洗浄液０．９％ＮａＣｌ、０．１％ツイーン２０）した後で試料緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液ｐＨ７．４、０．９％ＮａＣｌ、０．１％ツイーン２０）中のα１Ｍに対する抗血清（羊から、尿から単離したα１Ｍで免疫化）を稀釈度を高めながら添加した。抗血清の稀釈はリン酸塩緩衝液ｐＨ７．４中０．９％ＮａＣｌ及び０．１％ツイーン２０で行なった。
　【００７２】
　稀釈抗血清１２５μｌを加え、室温で１時間振盪下に恒温保持し、引続いて３回洗浄緩衝液で洗浄した。ＰＯＤと羊Ｅｃγに対するポリクローナル抗体（１０Ｕ／１）からの複合体１００μｌを添加した。基質溶液を加えた（１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩−クエン酸塩緩衝液ｐＨ４．４、３．２ｍｍｏｌ／ｌ過硼素酸ナトリウム、９ｍｍｏｌ／ｌ　ＡＢＴＳ）。
　【００７３】
　室温で３０分間恒温保持しかつＥＬＩＳＡ−ＲＥＡＤＥＲを用いて４０５／４９０ｎｍで呈色を測定した。
　【００７４】
　評価は半対数尺度で相応する抗血清稀釈度（Ｘ軸対数）に対して吸光度（Ｙ軸）をプロットした。抗血清の滴定は半最大吸光度から確定した。
　【００７５】
　Ｃ末端ペプチドからのポリハプテン（例１０）を使用する際に平均力価１：３２００が得られた。Ｎ末端ペプチドからのポリハプテン（例１４）の使用では平均力価は同様に１：３２００であった。α１Ｍの中央領域からのペプチド（例１２）を使う際にはもはや有意な力価は得られなかった。
　【００７６】
　例５
　微量滴定板のα１−ミクログロブリンの測定
　微量滴定板（Ｎｕｎｃ）をサーモ（Ｔｈｅｒｍｏ）−ＲＳＡ−ストレプタビジンの溶液（ヨーロッパ特許公開第０２６９０９２号明細書により製造、１００ｎｇ／ｍ　１．３００μｌ／鉢型容器）と室温で２０時間恒温保持した。洗浄（３×洗浄溶液：０．９％ＮａＣｌ、０．１％ツイーン２０）後、０．９％塩化ナトリウム、０．３％牛血清アルブミン及び２％サッカロースの溶液３５０μｌ／鉢型容器を添加しかつ室温で３０分間恒温保持した。引続いて３回洗浄溶液で洗浄した。
　【００７７】
　鉢型容器１個に対しビオチニル化融合タンパク質（２５ｎｇ／ｍｌ）［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５４（１９８６）３６８により製造］１００μｌを添加しかつ室温で１時間振盪した。引続いて洗浄溶液で３回洗った。
　【００７８】
　α１−ミクログロブリンに対するモノクローナル抗体の溶液（濃度約５〜１０ｎｇ／ｍｌ）１００μｌを添加し、室温で１時間振盪しかつ洗浄溶液で３回洗った。
　【００７９】
　ペルオキシダーゼ及びマウスＦｃγに対するポリクローナル羊抗体より成る複合体の溶液１００μｌ／鉢型容器を添加し（ペルオキシダーゼ活性２５ｍＵ／ｍｌ）かつ室温で１時間振盪した。引続いて洗浄溶液で３回洗いかつ鉢型容器１個当り基質溶液１００μｌ（１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩−クエン酸塩緩衝液ｐＨ４．４、３．２ｍｍｏｌ／ｌ過硼素酸ナトリウム、２．５ｍｍｏｌ／ｌ　Ｈ２Ｏ２中の１ｍｇ／ｍｌ　ＡＢＴＳ）を添加しかつ室温で５０分間振盪した。その後吸光度を４０５ｎｍで測定した。同様にしてビオチニル化融合タンパク質の代わりに例８からのビオチニル化ペプチドを使用することができる。
　【００８０】
　例６
　ペプチド１　ＨＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＶａｌＰｒｏＧｌｙＧｌｕＧｌｎＧｌｕＰｒｏＧｌｕＰｒｏＩｌｅＬｅｕＩｌｅＰｒｏＡｒｇＯＨの合成
　このペプチドは永久α−アミノ保護基としてフルオレニルメトキシカルボニル−（Ｆｍｏｃ）−基の使用下に固相合成により製造した［例えばＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ及びその他共著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．１３、３５〜４２（１９７９）に記載］。合成補助手段として半自動ペプチド合成装置ＳＰ６４０（Ｌａｂｏｒｔｅｃ社、スイス国Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ在）を使用した。
　【００８１】
　Ｆｍｏｃ−アミノ酸はＢａｃｈｅｍ社（スイス国Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ在）から入手した。
　【００８２】
　Ｃ末端Ｆｍｏｃ−アミノ酸Ｆｍｏｃ　Ａｒｇ（Ｍｔｒ）ＯＨはＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒが記載しているようにＰ−アルコキシペンジルアルコール樹脂（Ｂａｃｈｅｍ社、スイス国Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ在）に結合させた。
　【００８３】
　工程８〜１１による結合にはＦｍｏｃ−アミノ酸及びＤＣＣをそれぞれ開始樹脂の負荷に対して３倍モル量を使用し：ＨＯＢｔは４．５倍モル量である。
　【００８４】
　ペプチド１を合成するに当り開始樹脂Ｆｍｏｃ　Ａｒｇ（Ｍｔｒ）ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂１ｇを使用する：負荷度０．４ｍｍｏｌ／ｇ。合成サイクルにおいて次のＦｍｏｃアミノ酸を使用する：１．）ＦｍｏｃＰｒｏＯＨ；２．）ＦｍｏｃＩｌｅＯＨ；３．）ＦｍｏｃＬｅｕＯＨ；４．）ＦｍｏｃＩｌｅＯＨ；５．）ＦｍｏｃＰｒｏＯＨ；６．）ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ；７．）ＦｍｏｃＰｒｏＯＨ；８．）ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ；９．）ＦｍｏｃＧｌｎＯＨ；１０．）ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ；１１．）ＦｍｏｃＧｌｙＯＨ；１２．）ＦｍｏｃＰｒｏＯＨ；１３．）ＦｍｏｃＶａｌＯＨ；１４．）ＦｍｏｃＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ
　最後のＦｍｏｃ−アミノ酸の結合後、Ｆｍｏｃ保護基の脱離のために合成サイクルの工程１〜５を継続する。その後ペプチドを樹脂から分離する［例えばＳｉｂｅｒ著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２８、１６３７（１９８７）に記載］。
　【００８５】
　粗製生成物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ：登録商標）Ｇ−１０（溶離剤０．１％酢酸）でクロマトグラフィ処理することにより予備精製し、その後ポリゴシル（Ｐｏｌｙｇｏｓｉｌ：登録商標）Ｃ１８、５μｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）でクロマトグラフィ処理する（水中０．１％トリフルオル酢酸から０．１％トリフルオル酢酸含有水中の６５％までのイソプロパノールの傾斜溶液）。
　【００８６】
　収量：ペプチド１　１７７ｍｇ；
　ＦＡＢ質量スペクトルのＭＨ＋：１７６５
　例７
　ペプチド２　ＨＣｙｓＶａｌＰｒｏＧｌｙＧｌｕＧｌｎＧｌｕＰｒｏＧｌｕＰｒｏＩｌｅＬｅｕＩｌｅＰｒｏＡｒｇＯＨの合成
　システィン保護基を脱離するに当り、例６により得られたペプチド１を０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．５　１３０ｍｌ中に溶かし、数回排気しかつその都度窒素を通気する。この溶液にジチオトレイトール７８０ｍｇを加えかつ窒素下に２４時間放置する。引続いて塩酸でｐＨ５の酸性にしかつ例６と同様にポリゴシルＣ１８を用いてクロマトグラフィ処理を行なう。
　【００８７】
　収量：ペプチド２　１３３ｍｇ
　例８
　ペプチド３のビオチニル−６−アミノカプロイル−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）ＶａｌＰｒｏＧｌｙＧｌｕＧｌｎＧｌｕＰｒｏＧｌｕＰｒｏＩｌｅＬｅｕＩｌｅＰｒｏＡｒｇＯＨ
　ペプチド１　２５０ｍｇを０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．５　５０ｍｌ中に溶かす。これにＤＭＦ１２ｍｌ中のビオチニル−６−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル３９２．７ｍｇの溶液を加えかつ４０時間撹拌する。凍結乾燥しかつ例６に記載したようにポリゴシルＣ１８を用いてクロマトグラフィ処理をする。
　【００８８】
　収量：ペプチド３　１１０ｍｇ
　例９
　ペプチド２及びエデスチンから免疫原１の合成
　大麻の種子（Ｒｏｔｈ）からのエデスチン５ｇを０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０　５００ｍｌ中で撹拌しかつエタノール１００ｍｌ中のマレイミドヘキサン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５００ｍｇの溶液を加える。溶液を室温で９０分間撹拌し、固体物質を吸引濾取し、各１００ｍｌの水で２回、各１００ｍｌのエタノールで４回及び各１００ｍｌの水で２回洗浄する。固体物質を水１５０ｍｌ中に懸濁させかつ凍結乾燥する。
　【００８９】
　収量：マレイミドヘキサノイル−エデスチン４．３４ｇ
　マレイミドヘキサノイル−エデスチン１５５ｍｇ及びペプチド２　４２ｍｇをアルゴン下に０．０５ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５　１５ｍｌで懸濁させかつ室温で２．５日間撹拌する。遠心分離し、残渣を水５０ｍｌで洗いかつ２０ｍｌ中に懸濁している残渣を水に対して透析する。
　【００９０】
　凍結乾燥後、免疫原１　８０ｍｇが得られる。
　【００９１】
　例１０
　ペプチド２及び牛血清アルブミンからのポリハプテン１の合成
　牛血清アルブミン１ｇを０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５　３０ｍｌ中に溶かす。この溶液にエタノール１５ｍｌ中に溶かしたスクシンイミジルピリジルジチオプロピオネート２２６ｍｇを加える。室温で４０分間撹拌しかつ全反応溶液をウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）ＡＣＡ２０２（３１＊３ｃｍ）：（ＪＢＦ，ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ，フランス国）を介してクロマトグラフィ処理をする：溶離液０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０。
　【００９２】
　ペプチド２　１０ｍｇ及びピリジルジチオプロピオニル牛血清アルブミン溶液１．７５ｍｌをアルゴン下に１２時間撹拌する。０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０　６ｍｌで稀釈しかつ前記のようにウルトロゲルＡＣＡ２０２のカラムを介してクロマトグラフィ処理をする。
　【００９３】
　０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０中の濃度０．９３ｍｇ／ｍｌのポリハプテン１の溶液１０ｍｌが得られる。
　【００９４】
　例１１
　ペプチド４のＨＣｙｓＧｌｙＡｌａＴｙｒＧｌｕＬｙｓＴｈｒＡｓｐＴｈｒＡｓｐＧｌｙＬｙｓＰｈｅＬｅｕＴｙｒＨｉｓＬｙｓＳｅｒＬｙｓＯＨの合成
　ＨＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＧｌｙＡｌａＴｙｒＧｌｕＬｙｓＴｈｒＡｓｐＴｈｒＡｓｐＧｌｙＬｙｓＰｈｅＬｅｕＴｙｒＨｉｓＬｙｓＳｅｒＬｙｓＯＨを例６と同様にして固相合成により製造する。開始樹脂としてＦｍｏｃＬｙｓ（ＢＯＣ）ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂１ｇを、負荷度０．４４ｍｍｏｌ／ｇで使用する。合成サイクルで次のＦｍｏｃアミノ酸を使用する：１．）ＦｍｏｃＳｅｒ（ｔＢｕ）ＯＨ；２．）ＦｍｏｃＬｙｓ（ＢＯＣ）ＯＨ；３．）ＦｍｏｃＨｉｓ（Ｔｒｔ）ＯＨ；４．）ＦｍｏｃＴｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ；５．）ＦｍｏｃＬｅｕＯＨ；６．）ＦｍｏｃＰｈｅＯＨ；７．）ＦｍｏｃＬｙｓ（ＢＯＣ）ＯＨ；８．）ＦｍｏｃＧｌｙＯＨ；９．）ＦｍｏｃＡｓｐ（ＯｔＢｕ）ＯＨ；１０．）ＦｍｏｃＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ；１１．）ＦｍｏｃＡｓｐ（ＯｔＢｕ）ＯＨ；１２．）ＦｍｏｃＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ；１３．）ＦｍｏｃＬｙｓ（ＢＯＣ）ＯＨ；１４．）ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ；１５．）ＦｍｏｃＴｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ；１６．）ＦｍｏｃＡｌａＯＨ；１７．）ＦｍｏｃＧｌｙＯＨ；１８．）ＦｍｏｃＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ：
　その後ペプチドを樹脂から分離しかつ精製するために例６と同様に行なう。セファデックスＧ１０カラムの後で精製ペプチド４５４ｍｇが得られる。そのうちの５０ｍｇをポリゴシルＣ１８を用いて精製する。
　【００９５】
　収量：ペプチドＨＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＧｌｙＡｌａＴｙｒＧｌｕＬｙｓＴｈｒＡｓｐＴｈｒＡｓｐＧｌｙＬｙｓＰｈｅＬｅｕＴｙｒＨｉｓＬｙｓＳｅｒＬｙｓＯＨ　５．３ｍｇ
　ＨＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＧｌｙＡｌａＴｙｒＧｌｕＬｙｓＴｈｒＡｓｐＴｈｒＡｓｐＧｌｙＬｙｓＰｈｅＬｅｕＴｙｒＨｉｓＬｙｓＳｅｒＬｙｓＯＨ　２０５ｍｇを例７と同様にジチオトレイトール２７７ｍｇで処理しかつ後処理する。
　【００９６】
　収量：ペプチド４　１７１．６ｍｇ
　例１２
　ペプチド４及び牛血清アルブミンからのポリハプテンの合成
　牛血清アルブミン５ｇを０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０　３０ｍｌ中に溶解する。これにＤＭＦ２ｍｌ中のマレイミドヘキサン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル４４７ｍｇの溶液を加える。１．５時間撹拌しかつ全反応溶液をウルトロゲルＡＣＡ２０２（４５＊５ｃｍ）を介してクロマトグラフィ処理をする：溶離剤０．ｌｍｏ１リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０。
　【００９７】
　マレイミドヘキサノイル−牛血清アルブミンの溶液１８４ｍｌが得られる、ｃ＝２７．５ｍｇ／ｍｌ。
　【００９８】
　この溶液１１０ｍｇをペプチド４　６９．９ｍｇと０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０　１０ｍｌ中でアルゴン下に１５時間反応させる。例１０と同様に溶液をＡＣＡ２０２を介してクロマトグラフィ処理をする。
　【００９９】
　例１３
　ペプチド５　ＨＧｌｙＰｒｏＶａｌＰｒｏＴｈｒＰｒｏＰｒｏＡｓｐＡｓｎＩｌｅＧｌｎＶａｌＧｌｎＧｌｕＡｓｎＰｈｅＣｙｓＯＨの合成
　ペプチド５を例６と同様に固相合成により製造する。
　【０１００】
　開始樹脂としてＦｍｏｃＣｙｓ（Ｔｒｔ）ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂５ｇを負荷度０．６８ｍｍｏｌ／ｇで使用する。合成サイクルにおいて次のＦｍｏｃアミノ酸を使用する：
　１．）ＦｍｏｃＰｈｅＯＨ；２．）ＦｍｏｃＡｓｎＯＨ；３．）ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ；４．）ＦｍｏｃＧｌｎＯＨ；５．）ＦｍｏｃＶａｌＯＨ；６．）ＦｍｏｃＧｌｎＯＨ；７．）ＦｍｏｃＩｌｅＯＨ；８．）ＦｍｏｃＡｓｎＯＨ；９．）ＦｍｏｃＡｓｐ（ＯｔＢｕ）ＯＨ；１０．）ＦｍｏｃＰｒｏＯＨ；１１．）ＦｍｏｃＰｒｏＯＨ；１２．）ＦｍｏｃＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ；１３．）ＦｍｏｃＰｒｏＯＨ；１４．）ＦｍｏｃＶａｌＯＨ；１５．）ＦｍｏｃＰｒｏＯＨ；１６．）ＦｍｏｃＧｌｙＯＨ
　例６と同様にして樹脂から脱離しかつペプチドを精製する。
　【０１０１】
　ペプチド５が得られ、ＦＡＢ質量スペクトルのＭＨ＋：１８５４
　例１４
　ペプチド５及び牛血清アルブミンからのボリハプテン３の合成
　例１２と同様にして、マレイミドヘキサノイル−牛血清アルブミン溶液４．５ｍｌ及びペプチド５　３３ｍｇからポリハプテン３　７０ｍｌが得られる、ｃ＝０．５ｍｇ／ｍｌ
　例１５
　ヒトα１−ミクログロブリンに対するモノクローナル抗体の取得
　生後８〜１２週間のＢａｌｂ／ｃ−マウスをα１−Ｍ（患者の尿から単離）もしくはペプチド免疫原（例９により製造）又は免疫原としての融合タンパク質（例２により製造）１０μｇで完全フロイントアジュバントと共に腹腔内で免疫化する。６週間後、４週間間隔で更に３回免疫化する。その際にその都度免疫原１００μｇを水酸化アルミニウム及びボルデテラ・ペルツシスに吸着させて腹腔内に投与する。最後の免疫化から１週間後に採血しかつ実験動物の血清中の抗体力価を測定する。免疫化が明確に進行している場合は融合する。融合の４日前にそれぞれリン酸塩緩衝化食塩溶液中の免疫原１００μｇで再度静脈内で免疫化する。Ｇａｌｆｒｅ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７３（１９８１）３頁］が記載したように、免疫化したマウスの脾臓細胞１×１０６を骨髄腫細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８−６５３、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ８３７５）２×１０７と混合しかつＰＥＧ溶液と融合する。融合細胞を２４波型プレート（Ｎｕｎｃ社）の凹部１個当り細胞５×１０４個を播きかつ選択培地（ヒポキサンチン／アザセリン−培地）中で培養する。７〜１０日後に、クローンの成長が観察可能である場合、一次培養物の培養上澄みを特異性（α１−Ｍ、ペプチドもしくは融合タンパク質の認識）に関してＥＬＩＳＡ法で試験する。抗原特異性抗体を含有する一次培養物がけい光活性細胞により単一細胞沈殿（Ｅｉｎｚｅｌｚｅｌｌａｂｌａｇｅ）になる。このようにしてハイブリドーマ細胞系クローン６．０４６．７５を単離することができた（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ．９００７１９０６免疫原：患者の尿からのα１Ｍ）。
　【０１０２】
　抗体特異性の測定は次のように実施する：免疫化したマウスの血清又はハイブリッド細胞の培養上澄み中のα１−ミクログロブリン／ペプチド／融合タンパク質に対する抗体の存在及び特異性を確認するために試験原理としてＥＬＩＳＡ法を適用する。
　【０１０３】
　試験１：
　単離した天然α１−ミクログロブリンに対する抗体の結合の検査
　微量滴定板（Ｎｕｎｃ社）を被覆緩衝液（０．２ｍｏｌ／ｌ炭酸ナトリウム／−重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．４）中の４００ｎｇ／ｍｌポリクローナル抗α１−ミクログロブリン免疫グロブリン（羊−抗−ヒトα１−ミクログロブリン、Ｓｅｒｏｔｅｃ社）で塗布する。０．９％塩化ナトリウム溶液及び１％牛血清アルブミンで後塗布する。洗浄溶液（０．９％塩化ナトリウム溶液）で洗浄後、５０μｇ／ｍｌ抗原（尿から単離ヒトα１−ミクログロブリン）と共に恒温保持する。再度洗浄後、抗体試料（マウス血清もしくは培養上澄み）を添加しかつ恒温保持後再度洗浄する。検出用抗体としてポリクローナル羊−抗−マウス−Ｆｃγ、Ｆａｂ−ペルオキシダーゼー複合体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨ社、２５ｍＵ／ｍｌ）を使用する。洗浄溶液で更に洗浄した後で、ペルオキシダーゼ活性を常法でＡＢＴＳにより３０分間の恒温保持及び４０５ｎｍで吸光度差ｍＥの測定後に測定する。
　【０１０４】
　試験２
　ポリハプテンもしくは融合タンパク質に対する抗体の結合の検査
　微量滴定後（Ｎｕｎｃ社）を１μｇ／ｍｌポリハプテン（例１０及び１２により製造）もしくは融合タンパク質（例２により製造）と共に被覆緩衝液（試験１参照）中で恒温保持する。洗浄工程後、抗体試料（マウス血清もしくは培養上澄み）の恒温保持を行なう。再度洗浄した後、検出抗体をポリクローナル羊抗−マウス−Ｆｃγ、Ｆａｂ−ペルオキシダーゼ複合体と共に恒温保持し、更に洗浄しかつペルオキシダーゼ活性を試験１と同様にＡＢＴＳにより測定する。例１０によるポリハプテン及び融合タンパク質に結合するが例１２によるポリハプテンには結合しない多数の抗体が見出された。
　【０１０５】
　試験３
　患者尿試料中の天然α１−ミクログロブリンに対する抗体の結合の検査
　α１−ミクログロブリン含量を比濁分析法もしくは分割抗原試験（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）により測定した患者尿試料を使用する。
　【０１０６】
　初めに抗体の反応性を試験２で測定する。抗体と患者尿中のα１−ミクログロブリンとの結合及び壁結合のペプチドもしくは融合タンパク質との結合との間の競合試験において特異性を検査する。抗体試料を上昇する濃度でα１−ミクログロブリンを含有する尿試料もしくは陰性対照としての正常提供者尿試料と共に予備恒温保持する。試験２におけるように１μｇ／ｍｌポリハプテンで塗布した微量滴定板を予備恒温保持した試料で塗布する。洗浄後二次抗体複合体（羊−抗−マウスＦｃγ、Ｆａｂ−ペルオキシダーゼ、試験１及び２と同様に）を恒温保持する。壁結合ペプチドに対する抗体試料の残留結合の定量化を試験１及び２と同様にペルオキシダーゼ活性をＡＢＴＳにより測定することにより行なう。本発明によるモノクローナル抗体６．０４６．７５（ＥＣＡＣＣ９００７１９０６）は、それが例６，７及び８のペプチド、例２．１及び２．２の融合タンパク質及び患者の尿から単離した天然α１−ミクログロブリンと結合しもしくは認識する点で優れている。抗体とα１−ミクログロブリン含有患者尿試料との予備恒温保持によりペプチドもしくは融合タンパク質への結合を阻止することができる。抗体はサブクラスＩｇＧｌ，κに含まれる。
　【０１０７】
　例１６
　試験片によるα１−ミクログロブリンの測定
　１６．１　試験片の構成：開始フィールド（ＳＦ）
　開始フィールドは厚さ１．０ｍｍ及び吸収能１８００ｍｌ／ｍ２を有する、クラロン（Ｂｉｎｚｅｒ）１０％を含有するポリエステル１００％からのフリースより成る。
　【０１０８】
　緩衝液フィールド（ＰＦ）
　厚さ０．７ｍｍ及び吸収能４８０ｍｌ／ｍ２を有するフリース材料ＳＬ４２０７ＫＡ（Ｋａｌｆｆ社、ドイツ国、Ｅｕｓｋｉｒｃｈｅｎ在；ポリエステル９０％、ステープルファイバー１０％及び少量のアクリレートより成る）を次の溶液で含浸しかつ引続いて乾燥させる：−２００ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．８
　−１重量％牛血清アルブミン
　複合体フィールド（ＫＦ）クラロン１０％で厚さ０．２ｍｍに固化したガラス繊維１００％より成りかつ吸収能２００ｍｌ／ｍ２を有するガラス繊維フリースを次の溶液で含浸し、引続いて乾燥させる：
　−７０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．４
　−０．５重量％牛血清アルブミン
　−６ｋＵ／ｌ　β−ガラクトシダーゼ及び被分析物特異性抗体（ＩｇＧ）からの複合体
　捕集フィールド（ＡＦ）
　厚さ０．５ｍｍ及び吸収能４５０ｍｌ／ｍ２を有するポリエステル５０％、木綿リンター５０％及びエタジュリン（Ｅｔａｄｕｒｉｎ）３％より成る混合フリースを次の溶液で含浸し、引続いて乾燥させる：
　−１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．５
　−サーモ−ＲＳＡ−ストレプタビジン（２００ｍｇ／ｌ、ヨーロッパ特許公開第０２６９０９２号明細書により製造）
　サーモ−ＲＳＡ−ストレプタビジンの固定化はヨーロッパ特許公開第０３７４７７８号明細書に記載したように行なう。
　【０１０９】
　引続いて、予備含浸したスリースを次の溶液で再度含浸しかつ乾燥させる：
　−１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．５
　−ビオチニル化α１Ｍ−融合タンパク質、例２．１もしくは２．２により製造（１μｍｏｌ／ｌ）、例５によるビオチニル化
　検出フィールド（ＮＦ）
　厚さ０．１ｍｍのポリカーボネートシート上に次の処方の可溶性フィルムを施す：
　−モビオール（Ｍｏｗｉｏｌ）１８／８８　４．５ｇ（Ｈｏｅｃｈｓｔ社、ドイツ国、フランクフルト・アム・マイン在）
　−クロルフェノールレッドβ−Ｄ−ガラクトシド０．３ｇ
　フィールドをヨーロッパ特許公開第０３７４６８４号明細書に記載されているように溶融接着剤を用いて担体上に接着させる。
　【０１１０】
　１６．２　記載の試験片を用いて水溶液中のα１−ミクログロブリンの検出例１６．１により製造した試験片を吸収性フリースと共にα１Ｍ含有試料（例えば尿）中に配置する。５分後、試料濃度を検出フィールドで発生する色と相関させる。このようにして記載の試験片により被分析物を含まない溶液では黄色、被分析物５，２０，１００ｍｇ／ｌでは赤色濃度が濃くなる。このようにして被分析物を半定量的に視覚的に測定することができる。
　【０１１１】
　試験片を試料を施して５分後に拡散反射光度測定により測定する場合に定量測定が可能である。図３は例２．２によるα１Ｍ−融合タンパク質を使用する際に得られる検量曲線である。
　【０１１２】
　ビオチニル化融合タンパク質の代わりに例８によるビオチニル化ペプチド（１μｍｏｌ／ｌ）を使用する場合にも同じ結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　プラスミドｐＶＢ１　ＥＨの地図である。
　【図２】
　α１−ミクログロブリン部分領域の合成戦略を示す図である。
　【図３】
　例２．２によるα１Ｍ−融合タンパク質を使って得られた検量曲線である。
【図面】