(57)【要約】  本発明は、ＧＡＢＡ受容体などのイオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定する方法に関し、この方法は、イオンチャンネル受容体とＰ２Ｘ受容体とを共発現する組換え細胞において、イオンチャンネル受容体に結合した場合のＰ２Ｘ受容体を介したカルシウム流入を、そのアゴニストＡＴＰの存在下で測定することによる。また、本発明は、本発明方法を実施するための必須の要素を含むキットまたは装置に関する。最後に、本発明は、前記選択された化合物を、前記イオンチャンネル受容体の機能不全に関連する疾患の予防または治療のために使用することに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定するための方法：
ａ）該イオンチャンネル受容体およびＰ２Ｘ受容体を発現する組換え細胞を用意する工程、
ｂ）該組換え細胞を、該Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストの存在下、または該Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストおよび該イオンチャンネル受容体のアゴニストの存在下で、試験すべき化合物に接触させる工程、
ｃ）Ｐ２Ｘ受容体を介したカルシウム流入を測定する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた測定値を、工程ｂ）において試験すべき化合物が存在しない第１の参照対照について同じ条件で得られた測定値と比較する工程、および
ｅ）工程ｄ）における比較により、該化合物の存在下で組換え細胞におけるカルシウム流入が有意に増加または減少することが示された場合、該化合物を選択する工程。
【請求項２】
工程ａ）において前記組換え細胞が、前記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニスト、または前記イオンチャンネル受容体のアゴニストにより調節されうる受容体を内在的に発現しない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）における前記組換え細胞が、哺乳動物細胞またはアフリカツメガエル卵母細胞である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記Ｐ２Ｘ受容体が天然のＰ２Ｘ受容体であるか、前記イオンチャンネル受容体と相互作用しうる変異型のＰ２Ｘ受容体である、請求項１〜３のいずれかの項記載の方法。
【請求項５】
前記Ｐ２Ｘ受容体が、Ｐ２Ｘ 1、Ｐ２Ｘ 2、Ｐ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ５、Ｐ２Ｘ６およびＰ２Ｘ７受容体、およびＡＴＰ活性化チャンネル−受容体機能を果たしうるＰ２Ｘサブユニット受容体の会合もしくは組み合わせにより得られる任意のＰ２Ｘ受容体からなる群より選ばれる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記イオンチャンネル受容体またはＰ２Ｘ受容体がヒト、ラットまたはマウス由来である、請求項１〜５のいずれかの項記載の方法。
【請求項７】
前記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストが、ＡＴＰ、α, βｍＡＴＰ（アルファベータ−メチルＡＴＰ）、ベンゾイルベンゾイックＡＴＰ（２’および３’混合異性体または２’，３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰ（ＢｚＡＴＰ）など）、および２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ＭｅＳＡＴＰ）からなる群より選ばれ、好ましくはＡＴＰである、請求項１〜６のいずれかの項記載の方法。
【請求項８】
工程ｃ）においてカルシウム流入が、カルシウムプローブにより測定される、請求項１〜７のいずれかの項記載の方法。
【請求項９】
カルシウム流入が、カルシウムグリーン、Ｆｌｕｏ−３もしくはＦｌｕｏ−４などの蛍光カルシウムプローブにより測定される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記試験すべき化合物が、前記Ｐ２Ｘ受容体と特異的に相互作用する能力について試験され、好ましくは該特異的相互作用が、第２の参照対照について同じ条件でカルシウム流入の有意な増加または低下が得られるかどうかを測定することにより証明され、ここで工程ａ）において該第２の参照対照に使用される組換え細胞は前記Ｐ２Ｘ受容体を発現し、前記イオンチャンネル受容体を発現しないものである、請求項１〜９のいずれかの項記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の参照対照について組換え細胞でカルシウム流入の有意な増加または低下が見られる場合、前記試験すべき化合物を選択しない、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
下記工程を含む、イオンチャンネル受容体のアゴニストを選択または同定する方法：
Ａ）工程ｂ）において前記組換え細胞を前記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストの存在下のみで試験すべき化合物と接触させることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法により、前記イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定する工程、および
Ｂ）請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法の工程ｄ）において行われる比較により、第１の参照対照について得られる結果と比べて、該化合物の存在下で組換え細胞においてカルシウム流入の有意な減少が見られることが示された場合、アゴニストとして該化合物を選択する工程。
【請求項１３】
下記工程を含む、イオンチャンネル受容体の正のモジュレーターを選択する方法：
Ａ）工程ｂ）において前記組換え細胞を前記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストおよび前記イオンチャンネル受容体のアゴニストの存在下で試験すべき化合物と接触させることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法により、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定する工程、および
Ｂ）請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法の工程ｄ）において行われる比較により、第１の参照対照について得られる結果と比べて、該化合物の存在下で組換え細胞においてカルシウム流入の有意な減少が見られることが示された場合、正のモジュレーターとして該化合物を選択する工程。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法の工程ｂ）において、前記イオンチャンネル受容体のアゴニストを、非飽和濃度で使用する、請求項１３記載のイオンチャンネル受容体の正のモジュレーターを選択する方法。
【請求項１５】
下記工程を含む、イオンチャンネル受容体の負のモジュレーター、インヒビターまたはアンタゴニストを選択または同定する方法：
Ａ）工程ｂ）において前記組換え細胞を前記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストおよび前記イオンチャンネル受容体のアゴニストの存在下で試験すべき化合物と接触させることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法により、前記イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択する工程、および
Ｂ）請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法の工程ｄ）において行われる比較により、第１の参照対照について得られる結果と比べて、該化合物の存在下で組換え細胞においてカルシウム流入の有意な増加が見られることが示された場合、正のモジュレーターとして該化合物を選択する工程。
【請求項１６】
第１の化合物を試験するために使用する同じ組換え細胞が、少なくとも第２の試験すべき化合物を試験するために使用できる、請求項１〜１５のいずれかの項記載の方法。
【請求項１７】
前記イオンチャンネル受容体が、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、アセチルコリン受容体およびセロトニン受容体からなる群より選ばれる、請求項１〜１６のいずれかの項記載の方法。
【請求項１８】
前記イオンチャンネル受容体がＧＡＢＡ受容体である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記イオンチャンネル受容体が、任意のＧＡＢＡ受容体サブユニット間のホモメリックまたはヘテロメリックな会合から生じるイオンチャンネルＧＡＢＡ受容体であり、該サブユニットがα１〜６、β１〜３、γ１〜３、δ、ε、θ、πおよびρ１〜３サブユニットからなるＧＡＢＡ受容体サブユニットの群から選ばれ、該ホモメリックまたはヘテロメリックな会合がＧＡＢＡにより活性化され得るイオンチャンネル受容体を形成する、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
前記イオンチャンネル受容体のアゴニストが、ＧＡＢＡまたは、ムシモールやイソガバシンなどの他の周知のＧＡＢＡ受容体アゴニストの任意のものである、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
以下を含む、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物の選択のためのキット：
−イオンチャンネル受容体およびＰ２Ｘ受容体を共発現しうる組換え細胞、または場合により該組換え細胞を得るための材料；
−ＡＴＰ、α, βｍＡＴＰ（アルファベータ−メチルＡＴＰ）、ベンゾイルベンゾイックＡＴＰ（２’および３’混合異性体または２’，３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰ（ＢｚＡＴＰ）など）および２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ＭｅＳＡＴＰ）からなる群より選ばれるＰ２Ｘ受容体のアゴニスト、好ましくはＡＴＰ；
−場合により、該イオンチャンネル受容体のアゴニスト、好ましくはＧＡＢＡ；および
−場合により、該組換え細胞においてカルシウム流入を測定するためのマーカーとしてのカルシウムプローブ、好ましくは蛍光カルシウムプローブ。
【請求項２２】
前記イオンチャンネル受容体、Ｐ２Ｘ受容体、組換え細胞およびカルシウムプローブが、請求項１〜２０に記載のものの中から独立に選択される、請求項２０記載のキット。
【請求項２３】
請求項１〜２２に記載の必須の要素を含む、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択するための装置。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれかの項記載の方法により選択または同定された化合物。
【請求項２５】
前記イオンチャンネル受容体がＧＡＢＡ受容体、特にＧＡＢＡ−Ａ受容体である請求項１〜２０のいずれかの項記載の方法により選択または同定された、請求項２４記載の化合物。
【請求項２６】
Ｐ２Ｘ受容体と機能的に相互作用しうるイオンチャンネル受容体に関連する、ヒトを含む哺乳動物の疾患または障害を診断、予防または治療するための、請求項２４または２５記載の化合物の使用。
【請求項２７】
Ｐ２Ｘ受容体と機能的に相互作用しうるイオンチャンネル受容体に関連する、ヒトを含む哺乳動物の疾患または障害の予防または治療への、あるいはそのための医薬の製造への、請求項２４または２５記載の化合物の使用。
【請求項２８】
ＧＡＢＡ−Ａ受容体の機能不全に関連する、ヒトを含む哺乳動物の疾患、障害または症状を診断、治療または予防するための、請求項２５記載の化合物の使用。
【請求項２９】
喘息、急性心疾患、低血圧、尿閉、骨粗鬆症、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、前立腺がん、パーキンソン病、精神病性および神経学的障害、不安、分裂病、躁病、鬱病、運動異常、記憶障害、睡眠障害、痙攣疾患または癲癇の予防または治療への、あるいはそのための医薬の製造への、請求項２５記載の化合物の使用、または請求項２８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＡＢＡ受容体などのイオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定する方法に関し、この方法は、イオンチャンネル受容体とＰ２Ｘ受容体とを共発現する組換え細胞において、イオンチャンネル受容体に結合した場合のＰ２Ｘ受容体を介したカルシウム流入を、そのアゴニストＡＴＰの存在下で測定することによる。また、本発明は、本発明方法を実施するための必須の要素を含むキットまたは装置に関する。最後に、本発明は、前記選択された化合物を、前記イオンチャンネル受容体の機能不全に関連する疾患の予防または治療のために使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体は、受容体のリガンド依存性イオンチャンネル（本明細書では「イオンチャンネル受容体」と称する）のスーパーファミリーのメンバーである、哺乳動物ニューロン組織中の内在性の膜糖タンパク質である。ＧＡＢＡ受容体は、ＧＡＢＡ放出性およびＧＡＢＡ受容性ニューロンの広い分布により、中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロン活性の抑制において主要な役割を果たしている。
【０００３】
ＧＡＢＡ受容体は２つの主要なクラス：ＧＡＢＡ−ＡおよびＧＡＢＡ−Ｃ受容体サブタイプ並びにＧＡＢＡ−Ｂ受容体タイプに分けられ、エフェクター作用機作および薬理学における違いにより区別される。ＧＡＢＡ−ＡおよびＧＡＢＡ−Ｃ受容体は、ＧＡＢＡにより活性化され塩化物イオンチャンネルを開口させる、伝達物質作動（tramsmitter-operated）塩化物イオンチャンネルである。
【０００４】
ニューロンの表面に存在するタンパク質であるＧＡＢＡ受容体チャンネルは、中枢神経系の主要な抑制的受容体であり、５個のサブユニットから構成され、これらのサブユニットは集合して、陰イオン、主として塩化物イオンに対して透過性のチャンネルを形成する。
【０００５】
６種のαサブユニット、３種のβサブユニット、３種のγサブユニット、１種のεサブユニット、１種のδサブユニット、１種のπサブユニットおよび３種のρサブユニットが存在する。ＧＡＢＡ−Ａ受容体のほとんどは、２つのαサブユニット、２つのβサブユニットおよび１つのγサブユニットから形成されると考えられるが、その他の組み合わせも可能である。これらの全ての組み合わせは異なる性質をもつ受容体を生じる。これらのサブユニットはすべて、大きい細胞外ドメイン、４つの膜貫通ドメイン、およびＭ３とＭ４の膜貫通ドメインを結合する１つの主要な細胞内ドメインをもつ類似の立体配置を有する。
【０００６】
イオンチャンネル受容体複合体を介するイオンの動きにより生じる電流は小さく、これらの塩化物イオンの細胞への流入を定量するための蛍光プローブの直接的使用はできない。これらの電流の電気生理学的記録を可能にする方法および装置は複雑である。例えば、一定の電圧をかけ、１つの細胞に作動させることも必要である。
【０００７】
従って、電気生理学的記録を用いるこの方法は、かかる受容体チャンネルを調節しうる化合物、即ち医薬分野で非常に有用でありうる化合物を一次スクリーニングするのに用いることはできない。
【０００８】
Ｐ２Ｘ受容体はリガンド依存性イオンチャンネルであるのに対し、別の「Ｐ２受容体」、Ｐ２Ｙ受容体は一般的にＧタンパク質結合系を介して作用する。複数のＰ２Ｘ受容体サブタイプ（Ｐ２Ｘ１−Ｐ２Ｘ７）がホモメリックおよびヘテロメリックチャンネルを形成し、これは、カルシウムを含む陽イオンに透過性であり、細胞外ＡＴＰ、即ちアゴニストにより特異的に活性化される。この受容体は、比較的高いカルシウム透過性をもつリガンド依存性イオンチャンネルとして作用する（Egan et al., Neurosciences, 24(13):3413-3420, 2004) 。Ｐ２Ｘ受容体は、膜の脱分極およびＣａ++流入を媒介し、興奮シナプス伝達や痛み受容から血管収縮までの生理学的役割を有する。ＡＴＰはＰ２Ｘ受容体を通して、中枢および末梢神経系において興奮性神経伝達物質として作用する。
【０００９】
電気生理学的記録法を用いて（即ち、開いたチャンネルを通したイオン輸送による電流を測定することにより）、ＧＡＢＡ受容体とＰ２Ｘ受容体は、これらが異種発現系（両方の受容体ファミリーを発現するアフリカツメガエル卵母細胞、トランスフェクトされた哺乳動物細胞またはニューロン) において共発現される場合、機能的および物理的に関連することが既に示された (Boue-Grabot et al., Jounal of Biological Chemistry, 279:6967-6975, 2004; Boue-Grabot et al., Jounal of Biological Chemistry, 279:52519-52525, 2004) 。
【００１０】
また、Ｐ２Ｘがニコチン性アセチルコリン受容体および５−ＨＴ３受容体とも相互作用することが示された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、高処理能力のスクリーニングにより、ＧＡＢＡ受容体などのイオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択するために使用できる、低コストで容易に実施できる効率的方法を提供することが望まれる。これが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
予想外にも、本発明者等は、蛍光カルシウムプローブを用いて測定して、ＧＡＢＡ−Ａ受容体の活性化が、開口したＰ２Ｘ受容体を介するカルシウム流入を直接減少させることを実証した。
【００１３】
本発明者等はまた、電気生理学的記録法により以下のことも見出した：
−ＡＴＰおよびＧＡＢＡを共に作動させた場合、観察される電流は個々の電流の合計よりも少なく、これはそれらが共に活性化されると相互抑制を示すことを実証している。この機能的抑制は、それぞれの細胞内ドメインでの受容体の分子的結合に基づく。本発明者等は、各受容体の性質が他のタイプの受容体の存在によって変化しないことにも気付いた。このように、Ｐ２Ｘ受容体の存在は、ＧＡＢＡ受容体の性質をそのアゴニスト（ＧＡＢＡ）に関して変えない。ＧＡＢＡ受容体の存在はＰ２Ｘ受容体の性質をそのアゴニスト（ＡＴＰ）に関して変えない。各受容体の応答の大きさのみが、それらが同時に活性化された場合に減少する；
−全てのＧＡＢＡ受容体（その分子組成に関係なくＧＡＢＡ−ＡおよびＧＡＢＡ−Ｃ）は共活性化によりＰ２Ｘ２などのＰ２Ｘ受容体を抑制する；
−Ｐ２Ｘ２受容体のＡＴＰに対する応答は作動の間安定で（感度の低下なし）かつ時間経過後も安定（良好な回復）である。従って、これは単一の細胞を用いて迅速に多数の化合物を試験するのに使用できる；および
−ＡＴＰ活性化Ｐ２Ｘ受容体は、静止電位に維持された細胞への顕著なカルシウム流入を媒介する。
【００１４】
その結果、ある細胞モデルにおいてＧＡＢＡおよびＰ２Ｘ受容体を共発現させることにより、ＧＡＢＡ受容体の活性化の後に、ＡＴＰまたは他の周知の任意のＰ２Ｘアゴニストにより生じるＰ２Ｘ受容体の応答の蛍光強度の変化が生じるであろう。
【００１５】
従って、本発明は第１の面において、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定するための方法に関し、この方法は以下の工程を含む：
ａ）該イオンチャンネル受容体およびＰ２Ｘ受容体を発現する組換え細胞を用意する工程、
ｂ）該組換え細胞を、該Ｐ２Ｘ受容体のアゴニスト、好ましくはＡＴＰなどの存在下、または該Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストおよび該イオンチャンネル受容体のアゴニストの存在下で、試験すべき化合物に接触させる工程、
ｃ）Ｐ２Ｘ受容体を介したカルシウム流入を測定する工程、
【００１６】
ｄ）工程ｃ）で得られた測定値を、工程ｂ）において試験すべき化合物が存在しない第１の参照対照について同じ条件で得られた測定値と比較する工程、および
ｅ）工程ｄ）における比較により、該化合物の存在下で組換え細胞におけるカルシウム流入が有意に増加または減少することが示された場合、該化合物を、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物として選択または同定する工程。
【００１７】
試験または選択した化合物の構造が最初は既知でなければ、その構造は、質量分析または紫外線分光測定、ＬＣ−ＭＳ、配列決定などの当業者に周知の構造決定方法により、上記の本発明の化合物選択または同定方法の工程ｅ）の後に同定することができる。
【００１８】
好ましい態様において、工程ａ）で使用する組換え細胞は、前記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニスト、好ましくはＡＴＰなどにより、またはイオンチャンネル受容体がＧＡＢＡ受容体である場合はＧＡＢＡなどの前記イオンチャンネル受容体のアゴニストにより調節されうる受容体を内在的に発現しない。
【００１９】
より好ましい態様においては、工程ａ）で使用する組換え細胞は、ＧＡＢＡ、または好ましくはＡＴＰなどの前記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストにより活性化される受容体を内在的に発現しない卵母細胞である。
【００２０】
好ましくは、工程ａ）で使用する組換え細胞は哺乳動物細胞またはアフリカツメガエル卵母細胞である。細胞モデル（哺乳動物細胞またはアフリカツメガエル卵母細胞）は、関心あるＧＡＢＡ受容体およびＰ２Ｘ受容体を安定なまたは一過性の状態で共発現するのがより好ましい。
【００２１】
好ましくは、上記哺乳動物細胞はヒト、ラットまたはマウス由来である。
本明細書においてＰ２Ｘ受容体とは、アミノ酸配列として哺乳動物Ｐ２Ｘ受容体の野生型のアミノ酸配列を有する天然のＰ２Ｘ受容体、または上記イオンチャンネル受容体と相互作用しうる変異型の哺乳動物Ｐ２Ｘ受容体を意味する。
【００２２】
上記Ｐ２Ｘ受容体の中で、Ｐ２Ｘ 1、Ｐ２Ｘ 2、Ｐ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ５、Ｐ２Ｘ６およびＰ２Ｘ７受容体サブユニット、およびＡＴＰ活性化チャンネル−受容体機能を果たしうるＰ２Ｘ受容体サブユニットの会合もしくは組み合わせにより得られる任意のＰ２Ｘ受容体からなる群より選ばれるＰ２Ｘ受容体が好ましい。
【００２３】
Ｐ２Ｘ受容体は、受容体ポリペプチドの多量体からなると考えられ、これらの多量体は同じまたは異なるサブタイプからなるものでよい。従って、「Ｐ２Ｘ受容体」なる用語は、場合により、個々の受容体サブユニットや複数のサブユニット、およびそれより構成されるホモメリックもしくはヘテロメリック受容体も意味する。
【００２４】
また、ある特定の面によれば、上記イオンチャンネル受容体またはＰ２Ｘ受容体はヒト、ラットまたはマウス由来である。
Ｐ２Ｘ受容体（Ｐ２ＲＸとも言う）のこれらのサブタイプのアミノ酸（またはｍＲＮＡ）配列は当業者に周知であり、例えば以下の受託番号でＧｅｎｂａｎｋなどのデータバンクにおいて見ることができる（表１参照）。
表１：ラット、マウスおよびヒト起源のＰ２Ｘ受容体サブタイプまたはそのスプライシング変異体の完全な配列を記載したＧｅｎＢａｎｋ受託番号の例
【００２５】
【表１】
2008522608.tif 000003
【００２６】
本明細書において、Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストとは、ＡＴＰ、α, βｍＡＴＰ（アルファベータ−メチルＡＴＰ）、ベンゾイルベンゾイックＡＴＰ（２’および３’混合異性体または２’，３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰ（ＢｚＡＴＰ）など）、または２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ＭｅＳＡＴＰ）（Zao et al., J Pharmacol Exp Ther., 311(3):1211-7, 2004; Bianchi et al., Eur J Pharmacol. 2;376(1-2):127-38, 1999；Gendron et al. J Neurochem., 87(2):344-52, 2003)などの当業者に周知のＰ２Ｘ受容体アゴニストの１つを意味し、ＡＴＰがより好ましいＰ２Ｘ受容体アゴニストである。
【００２７】
好ましい態様において、上記イオンチャンネル受容体は、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、アセチルコリン受容体およびセロトニン受容体（５−ＨＴ３受容体）からなる群より選択され、ＧＡＢＡ受容体が最も好ましい。
【００２８】
イオンチャンネルＧＡＢＡ受容体とは、任意のＧＡＢＡ受容体サブユニット間のホモメリックまたはヘテロメリックな会合から生じるイオンチャンネルＧＡＢＡ受容体を意味し、このサブユニットはα１〜６、β１〜３、γ１〜３、ε、δ、π、θおよびρ１〜３サブユニットからなるＧＡＢＡ受容体サブユニットの群から選択され、このホモメリックまたはヘテロメリックな会合はＧＡＢＡにより活性化され得るイオンチャンネル受容体を形成する。
【００２９】
これらのＧＡＢＡ受容体サブユニットのアミノ酸（またはmRNA）配列は当業者に周知であり、例えば以下の受託番号でＧｅｎｂａｎｋなどのデータバンクにおいて見ることができる（表２参照）。
表２：ラット、マウスおよびヒト起源のＧＡＢＡ受容体（「ＧＡＢＡＲ」）サブユニットまたはそのスプライシング変異体の完全な配列を記載したＧｅｎＢａｎｋ受託番号の例
【００３０】
【表２】
2008522608.tif 000004
【００３１】
イオンチャンネル受容体がＧＡＢＡ受容体である場合、このイオンチャンネル受容体のアゴニストは、ＧＡＢＡまたは、ムシモールやイソガバシンなどの他の周知のＧＡＢＡ受容体アゴニストの任意のものである。
【００３２】
本発明の方法において、工程ｃ）で測定されるカルシウム流入は、カルシウムプローブ、好ましくはカルシウムグリーン、Ｆｌｕｏ−３もしくはＦｌｕｏ−４プローブなどの蛍光カルシウムプローブにより測定される。
【００３３】
好ましい態様において、上記試験すべき化合物は、上記Ｐ２Ｘ受容体と特異的に相互作用する能力について試験される。この特異的相互作用は、第２の参照対照について同じ条件でカルシウム流入の有意な増加または低下が得られるかどうかを測定することにより証明され、ここで工程ａ）において第２の参照対照に使用される組換え細胞は上記Ｐ２Ｘ受容体を発現し、上記イオンチャンネル受容体を発現しないものである。
【００３４】
詳しくは、上記試験すべき化合物は、上記第２の参照対照について組換え細胞でカルシウム流入の有意な増加または低下が見られる場合、選択されないであろう。
第２の面において、本発明は、以下の工程を含む、イオンチャンネル受容体のアゴニストを選択または同定する方法に関する：
Ａ）工程ｂ）において上記組換え細胞をＡＴＰなどの上記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストの存在下のみで試験すべき化合物と接触させることを特徴とする、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定するための本発明方法により、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択する工程、および
Ｂ）本発明方法の工程ｄ）において行われる比較により、第１の参照対照について得られる結果と比べて、該化合物の存在下で組換え細胞においてカルシウム流入の有意な減少が見られることが示された場合、アゴニストとして該化合物を選択する工程。
【００３５】
以下の工程を含む、イオンチャンネル受容体の正のモジュレーターを選択または同定する方法もまた好ましい：
Ａ）工程ｂ）において上記組換え細胞をＡＴＰなどの上記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストおよび上記イオンチャンネル受容体のアゴニストの存在下で試験すべき化合物と接触させることを特徴とする、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定するための本発明方法により、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定する工程、および
Ｂ）本発明方法の工程ｄ）において行われる比較により、第１の参照対照について得られる結果と比べて、該化合物の存在下で組換え細胞においてカルシウム流入の有意な減少が見られることが示された場合、正のモジュレーターとして該化合物を選択する工程。
【００３６】
より好ましい態様では、イオンチャンネル受容体の正のモジュレーターを選択または同定する本発明方法において、イオンチャンネル受容体のアゴニストを、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定する本発明方法の工程ｂ）において非飽和濃度で使用する。
【００３７】
第３の面において、本発明は、以下の工程を含む、イオンチャンネル受容体の負のモジュレーター、インヒビターまたはアンタゴニストを選択または同定する方法に関する：
Ａ）工程ｂ）において上記組換え細胞をＡＴＰなどの上記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストおよびイオンチャンネル受容体のアゴニストの存在下で試験すべき化合物と接触させることを特徴とする、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定するための本発明方法により、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定する工程、および
Ｂ）本発明方法の工程ｄ）において行われる比較により、第１の参照対照について得られる結果と比べて、該化合物の存在下で組換え細胞においてカルシウム流入の有意な増加が見られることが示された場合、正のモジュレーターとして該化合物を選択する工程。
【００３８】
第４の面において、本発明は、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物、アゴニスト、正または負のモジュレーターを選択または同定する本発明方法に関し、第１の化合物を試験するために使用する同じ組換え細胞を、試験すべき少なくとも第２の化合物を試験するために使用できることを特徴とする方法に関する。実際、Ｐ２Ｘ２受容体のそのアゴニスト（例ＡＴＰ）に対する応答は適用の間安定で（感度が低下しない）かつ時間経過後も安定（良好な回復）である。従って、この方法は１つの細胞を用いて多数の化合物を迅速に試験するのに使用できる。
【００３９】
第５の面において本発明は、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物の選択のためのキットに関し、このキットは以下を含む：
−イオンチャンネル受容体およびＰ２Ｘ受容体を共発現しうる組換え細胞、または場合により組換え細胞を得るための材料；
−ＡＴＰまたは、α, βｍＡＴＰ（アルファベータ−メチルＡＴＰ）、ベンゾイルベンゾイックＡＴＰ（２’および３’混合異性体もしくは２’，３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰ（ＢｚＡＴＰ）など）もしくは２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ＭｅＳＡＴＰ）などの任意の他のＰ２ＸＲアゴニスト；
【００４０】
−場合により、ＧＡＢＡなどの上記イオンチャンネル受容体のアゴニスト；
−場合により、上記組換え細胞においてカルシウム流入を測定するためのマーカーとしてのカルシウムプローブ、好ましくは蛍光カルシウムプローブ；
−場合により、ビデオ顕微鏡や蛍光イメージプレートリコーダー（ＦＣＩＰＲ）アッセイなどの蛍光を測定するシステム。
【００４１】
本発明のキットにおいて、上記イオンチャンネル受容体、Ｐ２Ｘ受容体、組換え細胞およびカルシウムプローブは、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定するための本発明方法について上で明らかにしたものの中から独立に選択される。
【００４２】
本発明はまた、装置または系に関し、かかる系は高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）によりイオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物の選択のために使用できる系であり、該装置はイオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物の選択のための本発明の方法またはキットに関して上で明らかにした必須の要素を含む装置である。
【００４３】
本発明は、カルシウムの指標を、特にＰ２Ｘ受容体を介したカルシウム流入を測定しうる蛍光カルシウムプローブで測定することにより、Ｐ２Ｘ受容体と機能的に結合した、ＧＡＢＡ受容体などのイオンチャンネル受容体を活性化、調節または抑制しうる化合物を選択するために使用できる。
【００４４】
最後の面において、本発明は上記本発明の選択または同定方法により選択または同定された新規な化合物または既知化合物を含み、これらの新規化合物または既知化合物は、イオンチャンネル受容体の活性のモジュレーター、例えばアゴニスト、正または負のモジュレーターとして新たに同定され、該イオンチャンネル受容体は好ましくは、ＧＡＢＡ、グリシン、セロトニンおよびアセチルコリン受容体などの、Ｐ２Ｘ受容体と機能的に相互作用しうる受容体である。
【００４５】
ある特定の態様において、上記新規な化合物または既知の化合物は、ＧＡＢＡ受容体、特にＧＡＢＡ−Ａ受容体の活性の正のモジュレーターとして新たに同定される化合物であり、イオンチャンネル受容体がＧＡＢＡ受容体、特にＧＡＢＡ−Ａ受容体である本発明の方法により選択または同定される。
【００４６】
さらに本発明は、Ｐ２Ｘ受容体と機能的に相互作用しうるイオンチャンネル受容体に関連する、ヒトを含む哺乳動物の疾患や障害を診断、予防および治療するための、本発明化合物の使用にも関する。
【００４７】
好ましくは本発明は、Ｐ２Ｘ受容体と機能的に相互作用しうるイオンチャンネル受容体に関連する、ヒトを含む哺乳動物の疾患、障害または症状の予防または治療への、あるいはそのための医薬の製造への、本発明化合物の使用も含む。より好ましくは、この疾患、障害または症状はＧＡＢＡ−Ａ受容体の機能不全に関連する。
【００４８】
上記疾患、障害または症状がＧＡＢＡ受容体の機能不全、特にＧＡＢＡ−Ａ機能不全に関連する場合、喘息、急性心疾患、低血圧、尿閉、骨粗鬆症、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、前立腺がん、パーキンソン病、精神病性および神経学的障害、不安、分裂病、躁病、鬱病、運動異常、記憶障害、睡眠障害、痙攣疾患および癲癇からなる群より選択される疾患、障害または症状であるのが好ましい。
【００４９】
本発明を用いて同定した新規化合物は、ヒトを含む哺乳動物における疾患および障害の診断、予防および治療に有用であろう。特にＧＡＢＡ受容体に関しては、本発明を用いて同定したこれらの新規化合物は、喘息、低血圧、高血圧、尿閉、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、パーキンソン病、神経学的障害、不安、分裂病、鬱病、運動異常、認識障害、睡眠障害、痙攣疾患および癲癇などの疾患、障害、機能不全の診断、予防および治療において有用であろう。
【００５０】
本発明の方法を用いて同定した試験化合物またはその薬剤に許容される塩は、進行がＧＡＢＡ、グリシン、セロトニンおよびアセチルコリン受容体などの、Ｐ２Ｘ受容体と機能的に相互作用しうるイオンチャンネル受容体により形成されるイオンチャンネルの透過性の欠如または過多と関連する疾患に罹患している患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与される。ここで「治療」とはある疾患もしくは少なくとも１つのその識別しうる症状の改善、または必ずしも患者が識別しうるものではない少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善、あるいは疾患の発症の遅れを言う。ここで「予防」とは、ある疾患にかかるリスクの減少をいう。この態様によれば、患者は疾患の家族歴などの疾患の遺伝的素因、または疾患の非遺伝的素因を有することがある。
【００５１】
患者に投与される場合、試験化合物またはその薬剤に許容される塩は、場合により薬剤に許容される担体を含む組成物の成分として投与されるのが好ましい。組成物は経口的にまたは他の任意の都合よい経路により投与でき、そして別の生物学的に活性な薬剤とともに投与してもよい。投与は全身性でも局所性でもよい。各種の供給系が知られ、例えばリポソーム封入、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどがあり、本発明の選択された化合物またはその薬剤に許容される塩を投与するのに使用できる。
【００５２】
投与方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、大脳内、膣内、経皮、直腸、吸収または局所があるが、これらに限定されない。投与の方法は実施者に任される。ほとんどの場合、投与は試験化合物またはその薬剤に許容される塩の血流への放出となるであろう。
【００５３】
本発明の方法により選択された試験化合物、またはその薬剤に許容される塩を含む組成物−これも本発明の一部を形成する−は、患者に適切に投与するための形態となるよう適宜量の薬剤に許容される担体をさらに含みうる。「薬剤に許容される」とは管轄する機関により認可されたか、あるいは動物、哺乳動物、殊にヒトにおける使用のための国のまたは認可された薬局方に載っていることを意味する。「担体」とは、それと共に本発明化合物を投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、基剤を意味する。かかる薬剤担体は、水、または石油、動物、植物起源もしくは合成によるものを含むオイル、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体でありうる。医薬担体は食塩水、ゼラチン、デンプンなどであってもよい。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤を使用してもよい。食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた液体担体、特に注射可能な溶液として使用できる。適当な医薬担体にはまた、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水などの賦形剤がある。所望により、試験化合物の組成物には少量の湿潤剤や乳化剤、またはpH緩衝剤を含有させてもよい。選択された化合物を含む本発明の組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、液体含有カプセル剤、粉末剤、持効性処方、座薬、エマルジョン、エアロゾル、スプレー、懸濁液の形態、または使用に適した任意の他の形態をとり得る。この組成物は一般的に、経口投与または静脈内投与用のヒトに適した薬剤組成物として常法に従い処方される。ある特定の疾患の治療に効果的であろう、選択された化合物またはその薬剤に許容される塩の量は、疾患の性質に依り異なり、標準的臨床技術により決定できる。さらに、場合によりin vitroまたはin vivo アッセイを、最適な用量範囲の決定の補助に使用してもよい。使用すべき正確な用量は、投与経路および疾患の重篤度にもより、実施者の判断および各患者の状況により決定されるべきである。しかし、経口、鼻腔内、皮内または静脈内投与に適した用量範囲は一般的に１日当たり体重１kgに対して約０．０１mgから約７５mg、より好ましくは１日当たり体重１kgに対して約０．５mgから５mgである。
【００５４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例の記載および以下に説明する図面に示される。
【実施例１】
【００５５】
（材料および方法）
自動ナノインジェクターを用いて、ラットＰ２Ｘ２受容体および／または例えばラットａ２およびラットｂ３サブユニットからなるＧＡＢＡ受容体をコードするcDNAを、Boue-Grabot et al.,2004 (Jounal of Biological Chemistry, 279:52517-52525, 2004) に既報のアフリカツメガエル卵母細胞の核に注入した。
【００５６】
注入の１〜３日後に、遊離の細胞内カルシウムの濃度に感受性のカルシウムグリーン蛍光プローブを、Ｐ２Ｘ２受容体のみ、もしくはＰ２ＸおよびＧＡＢＡ受容体を発現するか、または何ら受容体を発現しない（注入しない）卵母細胞に注入した。次いで、ビデオ顕微鏡（ニコン）を用いて、３ml／分で灌流させた標準溶液（1.8mM 塩化カルシウムを含むリンゲル液）に維持された卵母細胞から発生する蛍光を記録した。同じ緩衝液中に希釈した物質（ＡＴＰ100mM 、ＧＡＢＡ 100μM 、ＡＴＰ＋ＧＡＢＡ各100 μM)をアプリケーションシステム (BPS8-AlaScientific) を用いて適用した。蛍光の変化をIpLab ソフトウェアを用いて解析した。
【実施例２】
【００５７】
(受容体を発現しない卵母細胞) 
Ｐ２ＸおよびＧＡＢＡ受容体を発現しない卵母細胞へのＡＴＰおよびＧＡＢＡの適用では蛍光の変化は見られなかった（図１) 。これらの実験は、卵母細胞がＡＴＰまたはＧＡＢＡに感受性のある内在性受容体は発現しないことを確認するものである。
【実施例３】
【００５８】
(Ｐ２Ｘ２受容体のみを発現する卵母細胞からの記録) 
ＡＴＰの適用は蛍光の一時的増加を誘導し、これはＰ２Ｘ２受容体チャンネルの開口によるカルシウムの流入を実証する。ＧＡＢＡは蛍光に関し何ら影響をもたず、このことはＧＡＢＡがＰ２Ｘ２受容体を活性化しないことを示している。ＡＴＰとＧＡＢＡを共に適用してもＡＴＰ単独で得られたと同様の蛍光の増加となる。
【００５９】
Ｐ２Ｘ２受容体のみを発現する卵母細胞に対するＡＴＰの適用により誘導される蛍光の増加はＧＡＢＡによって変化することはない (図２) 。
【実施例４】
【００６０】
(Ｐ２Ｘ２およびＧＡＢＡ−Ａ受容体を共発現する卵母細胞での記録）
ＡＴＰの適用（１００μＭ）はカルシウムプローブの蛍光の著しい一時的増加を誘導し、これはＰ２Ｘ受容体の活性化とそれに続くカルシウム流入を実証する（図２）。ＡＴＰの連続適用は同様の大きさの応答を誘導する。この蛍光における増加が細胞の静止電位で見られることに注意することは重要である。
【００６１】
ＧＡＢＡ単独の適用（１００μＭ）は、蛍光強度を変化させない。これは、ＧＡＢＡ受容体の活性化が塩化物イオンチャンネルを開口させるが、細胞内カルシウム濃度には何ら影響しないという事実により説明できる。
【００６２】
ＡＴＰとＧＡＢＡ（各１００μＭ）の溶液を共に適用すると、ＡＴＰ単独の適用により得られるよりも低いカルシウム応答が得られ、従ってＧＡＢＡチャンネルの開口はＰ２Ｘ受容体により媒介されるカルシウム流入を抑制することを示す。
【００６３】
この蛍光の減少はＧＡＢＡ−Ａ受容体の活性化を示す（図３）。
得られる抑制の割合（これらの実験では２０〜２５％）はＰ２ＸおよびＧＡＢＡ受容体の発現の比率を反映するものである。我々が電気生理学方法により示したように、Ｐ２Ｘ２受容体とＧＡＢＡ受容体の比が１：１の場合、ＡＴＰにより媒介される応答のＧＡＢＡによる電流抑制は５０％に達する。カルシウムイメージングでは、Ｐ２Ｘチャンネルの開口のみが測定される。従って、ＧＡＢＡ−Ａ受容体が、発現したＰ２Ｘ２受容体と相互作用するならば、ＧＡＢＡ受容体の活性化はすべてのＰ２Ｘ受容体の閉口につながると仮定できる。
【実施例５】
【００６４】
（Ｐ２Ｘ２およびＧＡＢＡ−Ａ受容体を共発現する卵母細胞の、Ｐ２Ｘ受容体活性化の間のＧＡＢＡ受容体の活性化または抑制の記録）
Ｐ２Ｘ受容体の活性化の間の、ＧＡＢＡ受容体の活性化または抑制を監視することもできる（図４参照）。
【００６５】
ＡＴＰ応答のピーク時にＧＡＢＡを適用すると、蛍光強度における低下が観察され、これはＧＡＢＡ受容体が開口すると、既に開口しているＰ２Ｘ受容体の閉口をもたらすことを示す。同様に、ＡＴＰおよびＧＡＢＡを共に適用している間、ＧＡＢＡの適用を停止すると、蛍光の増加が見られる。これは、ＧＡＢＡ受容体の閉口がいくつかのＰ２Ｘ受容体の抑制を解除する、即ちＰ２Ｘ受容体を開口させることを示す（図４）。
【００６６】
このことは、アゴニストが適用される順に関係なく、ＧＡＢＡ−Ａ受容体の開口または閉口が、ＡＴＰにより誘導されるＰ２Ｘチャンネルのカルシウムの流れ（カルシウム感受性プローブの蛍光により測定）を直接調節することを示す。従って、Ｐ２Ｘ受容体からのカルシウムの流入の測定は、ＧＡＢＡ受容体の活性化を監視するための新規な方法となる。
【００６７】
これらの実験は、ＧＡＢＡ−Ａα２β３とＰ２Ｘ２受容体の共発現を示すが、本発明は、Ｐ２Ｘ２受容体、またはＧＡＢＡ受容体と相互作用する能力を維持した他の任意の野生型もしくは変異型Ｐ２Ｘ受容体を用いてラット、マウスまたはヒトのＧＡＢＡ−Ａ受容体をスクリーニングするのに使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】Ｐ２ＸおよびＧＡＢＡ受容体を発現しない卵母細胞上にＡＴＰまたはＧＡＢＡを適用した後に測定した蛍光強度を示す。
【図２】Ｐ２Ｘ２受容体を発現する卵母細胞上にＡＴＰ＋ＧＡＢＡ、ＧＡＢＡまたはＡＴＰを適用した後に測定した蛍光強度を示す。
【図３】ＧＡＢＡ−Ａ受容体およびＰ２Ｘ２受容体を共発現する卵母細胞上にＡＴＰ＋ＧＡＢＡ、ＡＴＰまたはＧＡＢＡを適用した後に測定した蛍光強度を示す。
【図４】ＧＡＢＡ−Ａ受容体およびＰ２Ｘ２受容体を共発現する卵母細胞上にＡＴＰ応答と異なる時間にＧＡＢＡを適用した後に測定した蛍光強度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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