(57)【要約】  本発明は、より短い形態のコア＋１タンパク質と名づけられたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の新規な形態のコア＋１タンパク質に関する。Ｃ型肝炎ウイルスのより短い形態のコア＋１タンパク質は、図３Ｂに示されたＨＣＶのコア＋１ＯＲＦ内のヌクレオチド５９８からヌクレオチド９２０まで延びているヌクレオチド配列のすべて又は一部からなるコード配列の翻訳の産物である。本発明は、生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルスによる感染を検出する方法、ＨＣＶに感染した細胞におけるウイルス増殖と相互作用する化合物をスクリーニングする方法、又はより短い形態のコア＋１タンパク質の発現に対して影響を与える化合物のスクリーニング及びそれらの抗ウイルス活性のために有用な組成物を製造するためのこれらの化合物の使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図３Ｂに示されたＨＣＶのコア＋１ＯＲＦ内のヌクレオチド５９８からヌクレオチド９２０まで延びているヌクレオチド配列のすべて又は一部からなるコード配列の翻訳の産物であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のより短い形態のコア＋１タンパク質。
【請求項２】
ＨＣＶコア＋１コード配列の位置５９８に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を有するヌクレオチド配列又はＨＣＶコア＋１コード配列の位置６０６にＡＴＧを有するヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質。
【請求項３】
（ｉ）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド５９８からヌクレオチド８２６まで延びているヌクレオチド配列，又は
（ii）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド５９８からヌクレオチド８９７まで延びているヌクレオチド配列、又は
（iii）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６からヌクレオチド８２６まで延びているヌクレオチド配列、又は
（iv）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６からヌクレオチド８９７まで延びているヌクレオチド配列、又は
（ｖ）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６からヌクレオチド９２０まで延びているヌクレオチド配列、
によりコードされる、請求項１又は２に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質。
【請求項４】
図３Ｂに示されたヌクレオチド配列の位置３４２のヌクレオチドから位置９２０のヌクレオチドまで延びているヌクレオチド配列に含まれるコア＋１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のトランスフェクションされた細胞における発現によりin vivoで得ることができ、そして分子量が１０kDaより小さい、ＨＣＶのより短い形態のコア＋１タンパク質。
【請求項５】
哺乳動物細胞におけるコア＋１ＯＲＦの発現産物である、請求項４に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質。
【請求項６】
ＨＣＶに感染した患者の血清により認識される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質。
【請求項７】
ヌクレオチド５９８に対応するアミノ酸残基からヌクレオチド８２６又はヌクレオチド８９７又はヌクレオチド９２０に対応するアミノ酸残基まで延びているアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質。
【請求項８】
ヌクレオチド６０６に対応するアミノ酸残基からヌクレオチド８２６又はヌクレオチド８９７又はヌクレオチド９２０に対応するアミノ酸残基まで延びているアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質。
【請求項９】
エピトープを含む請求項１〜８のいずれか１項に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質内に含まれるペプチド。
【請求項１０】
下記のアミノ酸配列、
ＣＯＯＨ−Ｔ−Ｙ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−ＮＨ２
を含む請求項９に記載のペプチド、又は該ペプチド配列に対して指向される抗体と反応するそのバリアント。
【請求項１１】
図８の配列に由来する、請求項１０に記載のペプチドバリアント。
【請求項１２】
図３Ｂに示されたヌクレオチド３４２からヌクレオチド９２０まで延びているヌクレオチド配列の断片であって、発現条件下に哺乳動物細胞にトランスフェクションされるときＨＣＶのより短い形態のコア＋１タンパク質をコードすることができる断片からなるヌクレオチド配列。
【請求項１３】
請求項７又は８のいずれか１項に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１４】
図３Ｂに示されたコア＋１コード配列内のヌクレオチド５９８から又はヌクレオチド６０６からヌクレオチド８２６まで延びているヌクレオチド配列を含む、請求項１２又は１３に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１５】
（ｉ）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６からヌクレオチド８２６まで延びているヌクレオチド配列、
（ii）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６からヌクレオチド８９７まで延びているヌクレオチド配列、
（iii）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６からヌクレオチド９２０まで延びているヌクレオチド配列、
（iv）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド５９８からヌクレオチド８２６まで延びているヌクレオチド配列、
（ｖ）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド５９８からヌクレオチド８９７まで延びているヌクレオチド配列、
（vi）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド５９８からヌクレオチド９２０まで延びているヌクレオチド配列、
（vii）哺乳動物細胞における請求項１〜８のいずれか１項に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質又はそのエピトープをコードすることができる配列（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）又は（vi）の断片、
の中から選ばれるヌクレオチド配列。
【請求項１６】
下記：
９番目及び１１番目のコドンのそれぞれにおいて２つのＡのＧへの置換及びＡのＣへの置換のトリプル置換に対応する突然変異、又は
９番目、１０番目及び１１番目のコドンのそれぞれにおいて１つのＡのＧへの置換及び２つのＡのＣへの置換からなる突然変異、又は
９番目のコドンにおいてＡのＧへの置換からなる突然変異、又は
１０番目のコドンにおいてＡのＣへの置換からなる突然変異、又は
イニシエーターコドンのターミネーターコドンへの置換、又は
２５番目のコドンの停止コドンへの置換、又は
４３番目のコドンの停止コドンへの置換、又は
７９番目のコドンの停止コドンへの置換、又は
８７番目のコドンの停止コドンへの置換、又は
８５番目のコドンの停止コドンへの置換及び／又は８７番目のコドンの停止コドンへの置換、
の中から選ばれる１つ以上の突然変異の結果として図３Ｂに示されたヌクレオチド配列に由来するＨＣＶコアタンパク質コード配列を含むヌクレオチド配列。
【請求項１７】
該配列が少なくとも７０％の同一性を有するその機能的バリアントである、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列に対して相補性の配列であるヌクレオチド配列。
【請求項２０】
請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列の少なくとも相補性配列とストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列。
【請求項２１】
請求項１２〜１５及び１７〜２０のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列に作動的に連結されたプロモーターを含むキメラ遺伝子。
【請求項２２】
該プロモーターが、ラクトースプロモーターシステム、トリプトファンプロモーターシステム、ｔａｃプロモーター及びＣＭＶプロモーターからなる群より選ばれる、請求項２１に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２３】
第１シストロンにおけるＣＭＶ／Ｔ７プロモーター及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、並びに第２シストロンにおけるＬＵＣ遺伝子に融合されたＨＣＶコアコード配列の全体のＩＲＥＳ及び野生型コアコード配列の一部を含む、請求項２１に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２４】
０、＋１又は−１フレームにおいてＬＵＣ遺伝子がコア配列に融合されている、請求項２３に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のキメラ遺伝子を含むベクター。
【請求項２６】
プラスミド、コスミド、ファージ又はウイルスである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２７】
好ましくは、図１に示されたｐＨＰＩ−１３３３及びｐＨＰＩ−１３３５からなる群より選ばれるプラスミドである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列でトランスフェクションされた組換え細胞。
【請求項２９】
動物細胞、哺乳動物細胞又はヒト細胞である、請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３０】
ＢＨＫ−２１細胞又はＨｕｈ−１細胞である、請求項２９に記載の組換え細胞。
【請求項３１】
コアタンパク質及び／又はコア＋１タンパク質と交差反応することなく、請求項１〜８のいずれか１項に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質に特異的に結合する精製された抗体。
【請求項３２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質、及びコア＋１タンパク質及び場合によりコアタンパク質にとって共通のポリペプチド断片に特異的に結合する精製された抗体。
【請求項３３】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載のペプチドに特異的に結合する精製された抗体。
【請求項３４】
モノクローナル抗体である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の精製された抗体。
【請求項３５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質又はその断片を抗原として使用する、抗体を産生する方法。
【請求項３６】
請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の少なくとも１種の抗体又は請求項３５に記載の方法により産生された抗体に特異的に結合する精製されたポリペプチド。
【請求項３７】
生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルスによる感染のin vitro検出方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質の存在又は不存在を決定することを含む方法。
【請求項３８】
より短い形態のコア＋１タンパク質を、請求項１〜８のいずれか１項に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質と免疫学的に反応性である抗体により検出する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
より短い形態のコア＋１タンパク質を、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のペプチドと免疫学的に反応性である抗体により検出する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
生物学的サンプルにおいて、請求項１〜８のいずれか１項に記載のより短い形態のコア＋１タンパク質を認識する抗体を検出することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染のin vitro検出方法。
【請求項４１】
イムノアッセイ（直接の検出）又はＥＬＩＳＡ（間接の検出）によって抗原−抗体複合体の形成を検出する、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
化合物を、ＨＣＶにより感染された細胞におけるウイルス増殖と相互作用するその能力についてスクリーニングする方法であって、
ａ）該細胞を候補化合物と接触させること、
ｂ）該候補化合物とより短い形態のコア＋１タンパク質の発現との間の相互作用を決定すること、
を含む方法。
【請求項４３】
ＨＣＶ感染細胞を候補化合物と接触する前及び後に、より短い形態のコア＋１タンパク質の発現レベルを測定することにより相互作用を決定する、請求項４２に記載の化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４４】
ＨＣＶにより感染された該細胞が動物細胞、哺乳動物細胞又はヒト細胞である、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＨＣＶにより感染された該細胞がＢＨＫ−２１細胞又はＨｕｈ−１細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＨＣＶの感染により誘発された疾患又はＨＣＶの感染と関連した疾患の処置用の医薬を製造するための請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法に従って選ばれる化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、より短い形態のコア＋１タンパク質（shorter form core + 1 protein）と名付けられたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のコア＋１タンパク質の新規な形態に関する。本発明は、生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルスによる感染を検出する方法、ＨＣＶに感染した細胞におけるウイルス増殖と相互作用する化合物、有利には、ウイルス増殖を減少、抑制又は阻止する化合物をスクリーニングする方法及びより短い形態のコア＋１タンパク質の発現に対して影響する化合物のスクリーニング方法及びそれらの抗ウイルス活性に有用な組成物の製造のためのこれらの化合物の使用も提供する。本発明は、ＨＣＶ感染又はその結果に対する保護のための免疫原性組成物を誘導するために本発明のより短い形態のコア＋１タンパク質を使用することも提唱する。
【０００２】
肝炎Ｃは、原因作用物質が同定されるまで、「非Ａ非Ｂ肝炎」（ＮＡＮＢＨ）とも呼ばれてきた肝臓のウイルス感染症である。Ｃ型肝炎ウイルスは、一緒になってウイルス肝炎の症例の大多数の原因となるウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）の１つである。Ｃ型肝炎ウイルスは、１９８９年に初めて同定され（choo et al. 1989）そして感染した人々は世界中で１億７千万人と見積もられている肝臓疾患のよく知られた原因として定義された。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は肝臓を冒し、これは、肝炎、即ち、肝臓の炎症を引起す。ＨＣＶに感染した人の７５〜８５％は慢性感染へと進行し、これらの症例の約２０％は、感染の２０年後には肝臓の硬変又は肝細胞がんを含む慢性肝炎Ｃの合併症を発生する（Di Bisceglie 2000）。ＨＣＶ感染に対する最近の推奨される処置は、インターフェロン及びリバビリン薬物の組み合わせであるが、この処置はすべての症例において有効とはかぎらず、そして肝臓移植が肝炎Ｃ関連最終段階肝臓疾患において適用される。現在では、ＨＣＶ感染を阻止するのに入手可能なワクチンがなく、ゆえに、感染を回避するためにすべての予防手段を取らなければならない。
【０００３】
ＨＣＶはフラビウイルス科（flaviviridae family）内のHepacivirus属の（＋）センス一本鎖エンベロープドＲＮＡウイルス（(+) sense single-stranded enveloped RNA virus）である。ウイルスゲノムは、長さが約１０ｋｂでありそして３０１１アミノ酸のポリプロテイン前駆体をコードする。ＨＣＶゲノムは、独特なポリプロテインをコードする大きな単一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し、該ポリプロテインは、細胞プロテアーゼ及びウイルスプロテアーゼにより３つの構造タンパク質、即ち、コア、Ｅ１及びＥ２並びに少なくとも６つの非構造ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂタンパク質に翻訳と同時に及び翻訳後にプロセッシングされる（Houghton 1996 and Reed et al.2000）。
【０００４】
ＨＣＶゲノムの翻訳の開始は、主として、ヌクレオチド４２と３４１又は３５６との間の、ウイルスＲＮＡの５’非コード領域内に位置した内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）により制御されるが、この３’限界は議論を呼ぶ。ウイルスヌクレオカプシドを形成するコアタンパク質は、長さが１９１アミノ酸であると予言されそして２３kDaの分子質量を有することが予言される（ｐ２３）。Ｐ２３の更なるプロセッシングは、１７３〜１８２アミノ酸からなる成熟コアタンパク質（ｐ２１）を産生する。約１７kDaの分子量を有するタンパク質も、或るＨＣＶ単離物（HCV isolate）のコアタンパク質コード配列からin vitro及びin vivoで、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において発現されることが以前に報告された。最大１６０アミノ酸からなる１６／１７kDaのこの追加のＨＣＶポリペプチド（ｐ１６／ｐ１７）は、＋１フレームにおけるコア遺伝子にオーバーラップするオープンリーディングフレーム（コア＋１ＯＲＦ）によりコードされそして翻訳のための＋１リボソームフレームシフトの結果としてin vitroで合成される。
【０００５】
この１６／１７kDaポリペプチドは、オルタナティブリーディングフレームタンパク質（Alternative Reading Frame Protein）としてＡＲＦＰ、又はフレームシフトタンパク質としてＦ、又はこの新規なタンパク質の位置に従ってコア＋１タンパク質と名付けられる。ＡＲＦＰ／Ｆ／コア＋１タンパク質は、コアコドン８〜１４の領域で作用する（operating）＋１リボソームフレームシフトが後に続いているポリプロテイン配列のイニシエーターコドンからin vitroで合成される（Xu et al. 2001, Varaklioti et al. 2000）。
【０００６】
より最近では、コア＋１タンパク質の生物学的意義を調べるために、コア＋１タンパク質コード配列の発現が、哺乳動物細胞において、即ち、in vivoでアッセイされた。ウサギ網状赤血球溶解物（rabbit reticulocyte lysates）におけるＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）のコア＋１ＯＲＦの発現（in vitro）は、ＨＣＶ−１単離物（HCV-1 isolate）についてそれぞれ得ることができるが、これに対してＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物（HCV-1a(H) isolate）についてはそれは検出されないことが示された（Varakioti et al.2002）。実際、コア＋１タンパク質は、ＨＣＶ−１からのコア＋１ＯＲＦを発現させるときin vitroで合成されたが、ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）からのコア＋１ＯＲＦを発現させるとき検出されなかった。ＨＣＶのＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物は、同じ遺伝子型に属するけれども、ＨＣＶ−１のコドン８〜１４に位置したフレームシフト部位に異なる配列を有することが思い起こされる。その差は、特に、推定フレームシフト部位でＨＣＶ−１ａ（Ｈ）配列における１０個のＡヌクレオチド残基（10-A  nucleotide residues）の欠如からなる。コア＋１タンパク質の発現機構に関するいくらかのデータを与えるために、本発明者はin vivoでの該発現を研究した。
【０００７】
本発明で開示された結果は、in vitro発現の研究と違って、ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）コアコード配列の両方共トランスフェクションされた哺乳動物細胞においてコア＋１ＯＲＦの発現を効率的に可能とすることを示す。哺乳動物細胞で行われたトランスフェクション及び発現実験は、コア＋１ＯＲＦのin vivo発現が新規なタンパク質の合成と関連しており、該発現は、コア＋１タンパク質のin vitro発現のための同定された機構と比較して、コア＋１ＯＲＦの新規な別の翻訳開始機構（alternative translation initiation mechanism）に従うということを、本発明者が確認することも可能とした。この別の機構はin vivoでより短い形態のコア＋１タンパク質の合成を指向する。
【０００８】
ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）の特定の種は、それぞれ、参照番号Ｎｏ．Ｍ６２３２１及びＮｏ．Ｍ６７４６３の下にGenebankにおいて開示された。
【０００９】
ゲノムサイズ拘束（genome size constraints）にさらされているウイルスは、それらのコード能力を広げるための種々のストラテジー、例えば、リボソームフレームシフティング（ribosomal frameshifting）又は内部翻訳開始（internal translational initiation）を開発した。リボソームフレームシフティングは、そうしなければリボソームと遭遇したであろう終止コドンを回避することからなり、そしてその代わりにそのＣ末端に余分のアミノ酸配列を有するタンパク質を創生する。ゆえに、リボソームフレームシフティングにおいて、翻訳リーディングフレームの指向された変化は、２つ以上のオーバーラッピング遺伝子から単一タンパク質の合成を可能とする。内部翻訳開始は、リーキースキャニング（leaky scanning）及びリボソームシャンティング（ribosome shunting）及び内部リボソームエントリー部位（internal ribosome entry site）を含む種々の機構に従って上流のイニシエーターコドンから逃れることからなる。かかる機構が、より短い形態のコア＋１タンパク質のin vivo発現のために用いられていることは明らかである。
【００１０】
ゆえに、本発明は、より短い形態のコア＋１タンパク質と名付けられそして、特に哺乳動物細胞におけいて、コア＋１コード配列又はＯＲＦのin vivo発現により得られうるＨＣＶライフサイクルの新規なタンパク質を提供する。
【００１１】
本発明は、該より短い形態のコア＋１タンパク質をコードする核酸配列にも関する。
【００１２】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の証拠を与えるより短い形態のコア＋１タンパク質の存在又は不存在を個体の生物学的サンプルにおいて検出する方法も提供する。
【００１３】
本発明は、免疫原性組成物における本発明のより短い形態のコア＋１タンパク質の使用も提供する。本発明の免疫原性組成物は、患者におけるＨＣＶ感染に対するＣＴＬ応答を誘発するために有利に製造されうる。
【００１４】
より短い形態のコア＋１ＨＣＶタンパク質は、特に持続した感染が現れるとき、ＨＣＶ感染の結果と相互作用することを目的とする治療組成物の製造に関与することもできる。
【００１５】
本発明は、より短い形態のコア＋１タンパク質の翻訳を指向するコア＋１ＯＲＦのin vivo発現との相互作用の結果として、化合物、特に抗ウイルス活性を有する化合物をスクリーニングする手段も提供する。本方法のいくつかの利点の中でも、これらのスクリーニング方法は、ウイルス増殖及びウイルスのライフサイクルの制御と相互作用することができる化合物、特にウイルス増殖を抑制又阻止することができる化合物のルーチンな高スループットスクリーニングのために適切であることに留意されるべきである。
【００１６】
更に、本発明は、ウイルス増殖及びウイルスのライフサイクルの制御と相互作用することができる化合物、有利にはＨＣＶに感染した細胞中のより短い形態のコア＋１タンパク質の発現と相互作用することができることの結果として、特にウイルス増殖を抑制又は防止することができる化合物であって、Ｃ型肝炎ウイルスの感染により誘発される疾患又はＣ型肝炎ウイルスの感染と関連した疾患の処置用の薬物の製造に有用である化合物の使用も提供する。
【００１７】
ゆえに、本発明の第１の目的は、図３Ｂに示されたＨＣＶのコア＋１ＯＲＦ内のヌクレオチド５９８からヌクレオチド９２０まで延びているヌクレオチド配列のすべて又は一部からなるコード配列の翻訳の産物であるＨＣＶのより短い形態のコア＋１タンパク質である。
【００１８】
特定の態様では、ＨＣＶコア＋１コード配列の位置５９８に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を有するヌクレオチド配列又はＨＣＶコア＋１コード配列の位置６０６にＡＴＧを有するヌクレオチド配列によりコードされるより短い形態のコア＋１タンパク質。
【００１９】
特定の態様では、より短い形態のコア＋１タンパク質は、
（ｉ）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド５９８からヌクレオチド８２６まで延びているヌクレオチド配列，又は
（ii）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド５９８からヌクレオチド８９７まで延びているヌクレオチド配列、又は
（iii）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６からヌクレオチド８２６まで延びているヌクレオチド配列、又は
（iv）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６からヌクレオチド８９７まで延びているヌクレオチド配列、又は
（ｖ）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６からヌクレオチド９２０まで延びているヌクレオチド配列、
によりコードされる。
【００２０】
本明細書に使用された、「より短い形態のコア＋１タンパク質」又は「in vivoコア＋１タンパク質」という表現は、ＨＣＶに感染した細胞又はコアコード配列若しくはコア＋１ＯＲＦを含むＤＮＡ構築物でトランスフェクションされた細胞においてin vivoで得ることができるＣ型肝炎ウイルスタンパク質を指す。主なより短い形態のコア＋１は特にin vivoで産生され、これは１６／１７kDaコア＋１in vitro合成産物より小さい。何故ならば、１０kDaより小さい計算された分子量を有することが予言されるからである。更に、より短い形態のコア＋１タンパク質は、コアタンパク質の最初の１０個の連続したＡ残基を含まない。これらのＡ残基は、ＨＣＶ−１ゲノムのコドン８〜１１（ヌクレオチド３６４〜３７３）に位置しており、そしてコア＋１ＯＲＦの発現に対する大きな意義（importance）を有する。分子量のこの特異的な差は、「より短い形態のコア＋１タンパク質」という用語を説明する。
【００２１】
本明細書で使用した、「コア＋１ＯＲＦ」という表現は、ＨＣＶの「コアコード配列」内に含まれる本願の図３Ｂに示された如きヌクレオチド配列を指す。該コア＋１ＯＲＦは、ヌクレオチド３４２において翻訳開始コドンで始まりそして図３Ｂに示された配列において位置９２０におけるヌクレオチドまで延びている（US n°09/644,987）。
【００２２】
より短い形態のコア＋１タンパク質は、該ヌクレオチド配列がin vivoで発現されるときコア＋１ＯＲＦ又はコアコード配列によりコードされていることが指摘される。
【００２３】
本発明は、更に、図３Ｂに示されたヌクレオチド配列の位置３４２のヌクレオチドから位置９２０のヌクレオチドまで、好ましくは位置８２６のヌクレオチドまで延びているヌクレオチド配列に含まれるコア＋１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現によりin vivoで得られうるＨＣＶのより短い形態のコア＋１タンパク質であって、計算された分子量は１０kDaより小さい、より短い形態のコア＋１タンパク質に関する。
【００２４】
より短い形態のコア＋１タンパク質は、ＨＣＶポリプロテインの発現とは独立にそしてコア＋１タンパク質の発現からも独立にin vivoで得られうることが強調される。in vivoでの該発現は、コア＋１ＯＲＦにおけるコア＋１発現のために使用されるフレームと同じフレームを使用するが、コア＋１in vitro発現に必要なフレームシフトトランスフェクション機構を関与させない。
【００２５】
他の態様では、より短い形態のコア＋１タンパク質は、哺乳動物細胞におけるコア＋１ＯＲＦの発現産物である。
【００２６】
好ましい態様では、より短い形態のコア＋１タンパク質は、ＨＣＶで感染した患者の血清により認識される。同じ方法で、循環している抗コア＋１抗体が、ＨＣＶ感染した個体において検出されたが、これは、このタンパク質が自然のＨＣＶ感染期間中産生されることを示唆する。
【００２７】
好ましい態様では、より短い形態のコア＋１タンパク質は、図３Ｂに示された配列のヌクレオチド５９８に対応するアミノ酸残基からヌクレオチド８２６、又はヌクレオチド８９７又はヌクレオチド９２０に対応するアミノ酸残基まで延びているアミノ酸配列を含む。他の好ましい態様では、より短い形態のコア＋１タンパク質は、図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６に対応するアミノ酸残基からヌクレオチド８２６、又はヌクレオチド８９７又はヌクレオチド９２０に対応するアミノ酸残基まで延びているアミノ酸配列を含む。
【００２８】
より短いコア＋１タンパク質のために開示された開始コドン及び／又は停止コドンは、考慮されるＨＣＶ単離物に依存して変わることができる。開始コドン及び停止コドンの上記位置は図３のアミノ酸配列に関して与えられる。ヌクレオチド８２６に対応するコドンで終わるより短い形態のコア＋１タンパク質は該タンパク質の好ましい形態とみなすことができるけれども、上記したより長い配列が同時に又は替わりにコードされうる。
【００２９】
本発明は、更に、より短い形態のコア＋１タンパク質内に含まれたペプチド、特にエピトープとして有用なペプチドに関する。本発明の目的で、ペプチドに言及するとき「エピトープ」という用語は、抗原決定基又は該ペプチドの免疫学的に活性な領域と考えられるべきである。それは、抗体又はＴＣＲにより特異的に結合される該免疫原性ペプチドの部分である。ペプチド抗原上の該エピトープは、ペプチドの一次、二次、三次、さらに四次構造のエレメントを含むことができそして少なくとも３つの残基を含有する。本発明は、エピトープとして有用なそして下記の配列、
ＣＯＯＨ−Ｔ−Ｙ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−ＮＨ２
を有する興味ある特定のペプチドを提供する。
【００３０】
興味あるこのようなペプチドは、図３Ｂの配列においてヌクレオチド７４９に対応するアミノ酸残基からヌクレオチド７９３、又はヌクレオチド７９６に対応するアミノ酸残基まで延びているアミノ酸配列を含む。
【００３１】
このペプチドのバリアント（variants）、例えば、ペプチドにおけるアミノ酸の欠失、付加又は置換により得られるバリアントも、これらのバリアントが抗体を誘発することができるか又は上記配列に対して指向された抗体と免疫学的に反応することができるかぎり、本発明に包含されそして当該技術分野で知られた方法により得ることができる。
【００３２】
本発明により包含される興味あるこのペプチドのバリアントの例は、下記のとおり例示することができそして図８に従って例示することができる：
【００３３】
【表１】
2008500801.tif 000002
【００３４】
このようなペプチドは、ポリクローナル又はモノローナルのいずれかの抗体の製造に特に興味深い。
【００３５】
より短い形態のコア＋１タンパク質の翻訳開始コドンは、ＨＣＶ単離物に依存して変わることができる。ある単離物は、２つのＡＴＧを含有し、この両方共より短い形態のコア＋１タンパク質の合成のために使用されうる。他の単離物は、該タンパク質のための１つのみのＡＴＧを含有する。
【００３６】
種々のより短い形態のコア＋１タンパク質は、例えば、バリアントにより発現されるタンパク質に対応する図８に開示されたアミノ酸配列と図３Ｂの配列のタンパク質アラインメントから誘導することができる。
【００３７】
本発明は、ＨＣＶの上記したコアコード配列によりコードされたタンパク質のモザイクにも関する。このようなモザイクは、コアタンパク質、コア＋１タンパク質、より短い形態のコア＋１タンパク質又はそれらの誘導体の中から選ばれた少なくとも２つのタンパク質を含有し、これらは該配列によりコードされた誘導体を含みそしてコアコード配列の３’末端部分における更なるフレームシフト機構を含む。
【００３８】
これらのタンパク質の組成物は、同じ単離物のタンパク質又は異なるＨＣＶ単離物からのタンパク質を含むことができる。
【００３９】
本発明は、図３Ｂに示されたヌクレオチド３４２からヌクレオチド９２０まで延びているヌクレオチド配列の断片であって、発現条件下に哺乳動物細胞にトランスフェクションされるときＨＣＶのより短い形態のコア＋１タンパク質をコードすることができる断片からなるヌクレオチド配列にも関する。
【００４０】
更に詳しくは、より短い形態のコア＋１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、図３Ｂのコアコード配列内のヌクレオチド５９８から又はヌクレオチド６０６からヌクレオチド８２６まで延びているヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
特定の態様では、より短い形態のコア＋１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、
（ｉ）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６からヌクレオチド８２６まで延びているヌクレオチド配列、
（ii）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６からヌクレオチド８９７まで延びているヌクレオチド配列、
（iii）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド６０６からヌクレオチド９２０まで延びているヌクレオチド配列、
（iv）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド５９８からヌクレオチド８２６まで延びているヌクレオチド配列、
（ｖ）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド５９８からヌクレオチド８９７まで延びているヌクレオチド配列、
（vi）図３Ｂに示された配列のヌクレオチド５９８からヌクレオチド９２０まで延びているヌクレオチド配列、
（vii）哺乳動物細胞における上記したより短い形態のコア＋１タンパク質又はそのエピトープをコードすることができる配列（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）又は（vi）の断片、
の中から選ばれる。
【００４２】
本発明は、図８に示されたより短い形態のコア＋１タンパク質をコードする種々の単離物に由来するバリアントヌクレオチド配列も提供する。
【００４３】
かくして、本発明は、下記：
９番目及び１１番目のコドンのそれぞれにおいて２つのＡのＧへの置換及びＡのＣへの置換のトリプル置換に対応する突然変異、又は
９番目、１０番目及び１１番目のコドンのそれぞれにおいて１つのＡのＧへの置換及び２つのＡのＣへの置換からなる突然変異、又は
９番目のコドンにおいてＡのＧへの置換からなる突然変異、又は
１０番目のコドンにおいてＡのＣへの置換からなる突然変異、又は
イニシエーターコドンのターミネーターコドンへの置換、又は
２５番目のコドンの停止コドンへの置換、又は
４３番目のコドンの停止コドンへの置換、又は
７９番目のコドンの停止コドンへの置換、又は
８７番目のコドンの停止コドンへの置換、又は
８５番目のコドンの停止コドンへの置換及び／又は８７番目のコドンの停止コドンへの置換、
の中から選ばれる１つ以上の突然変異の結果として図３Ｂに示されたヌクレオチド配列に由来するＣ型肝炎ウイルスコアタンパク質コード配列を含むヌクレオチド配列も提供する。
【００４４】
本発明のヌクレオチド配列は、特に精製された形態下にあり、即ち、それらはＨＣＶにおけるそれらの自然の環境から単離される。
【００４５】
上記突然変異は、in vivoでのコア＋１発現にとって決定的に重要であるコドンを検出するために、ヌクレオチド配列の特定の位置においてミスセンスコドンを発生させることからなる。本明細書で言及した、「停止コドン」、「ミスセンスコドン」、「ナンセンスコドン」、「ターミネーターコドン及び「連鎖終結コドン（chain terminating codon）」は、翻訳を停止することができる。何故ならば、いかなるアミノ酸も該コドンに対応するからである。停止コドンのコード配列は、しばしばＵＡＡ、ＵＡＧ及びＵＧＡである。停止コドンの存在は、コア＋１コード領域を中断させ、そして該停止コドンがコア＋１コード領域のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するフレーム内にあろうとなかろうとコア＋１タンパク質の産生を支持しない。
【００４６】
本発明は、該ヌクレオチド配列の機能的バリアントでありそして少なくとも７０％同一性、好ましくは８０％若しくは９０％同一性を有するヌクレオチド配列も提供する。
【００４７】
本明細書で使用された、「バリアント」という用語は、ＨＣＶのより短い形態のコア＋１ヌクレオチド配列に実質的に相同性の、しかし突然変異、特に、１つ以上の欠失、挿入又は遺伝子コード縮重をもたらす置換を受けたヌクレオチド配列を指す。バリアントヌクレオチド配列は、ネイティブなより短い形態のコア＋１タンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一の、最も好ましくは少なくとも８０％又は９０％同一である。本発明に従うバリアント配列の決定は、ＧＡＰコンピュータープログラムを使用して行うことができる（Devereux et al Nucl.Acids.Res.12:387,1984）。バリアントは、特に、突然変異した配列の物理化学的特徴がネイティブなより短い形態のコア＋１ヌクレオチド配列の物理化学的特徴と実質的に同一であるような保存性置換を含むことができる。バリアントは、ネイティブなより短い形態のコア＋１タンパク質に対して指向される抗体により認識されるバリアントなより短い形態のコア＋１タンパク質（variant shorter form core +1 protein）をコードするそれらの能力についても選ばれうる。
【００４８】
図３Ｂのヌクレオチド配列の特定のバリアントは、遺伝子コードの縮重から生じる変動性を考慮することを含めて、図８のアミノ酸配列から誘導可能である。
【００４９】
本発明は、本明細書に開示されたヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列、このような単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ配列にも関する。これらのヌクレオチド配列は、コアタンパク質、より短い形態のコア＋１タンパク質、より短い形態のコア＋１タンパク質の断片及びそれらの誘導体を含むタンパク質のモザイクをコードするヌクレオチド配列の相補性配列も含む。
【００５０】
本発明は、少なくとも上記に開示されたいかなるヌクレオチド配列の相補性配列ともストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列にも関する。
【００５１】
本発明は、上記開示された配列の中から選ばれる配列に相補性のヌクレオチド配列にも関する。
【００５２】
本明細書で使用された「ストリンジエントな条件」という表現は、Sambrook et al. in molecular Cloning : a laboratory manual(1989)により定義されている如き厳しいストリンジェンシーの条件を指す。高いストリンジェンシーのこれらの条件は、下記のハイブリダイゼーション条件として定義される：即ち、ニトロセルロースフィルター用の予備洗浄溶液５Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０mM  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、４２℃での５０％ホルムアルデヒド、６Ｘ  ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件及び６８℃、０．２Ｘ  ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの洗浄条件を使用する。プロトコールは当業者に知られている。更に、当業者は、温度及び洗浄溶液塩濃度を実験的拘束に従って必要に応じて調節することができることを認識するであろう。
【００５３】
本発明は、上記した如きヌクレオチド配列に作動的に連結されたプロモーターを含むキメラ遺伝子を提供する。
【００５４】
よく使用されるプロモーター配列は、ラクトースプロモーターシステム、トリプトファンプロモーターシステム、ｔａｃプロモーター及びＣＭＶプロモーターからなる群より選ばれる。
【００５５】
本明細書で述べた、「キメラ遺伝子」又は「組換え遺伝子」は、天然には一緒に見出されない２つのＤＮＡソースの相互の組み合わせ又は連結から生じるＤＮＡ分子からなる。
【００５６】
より短い形態のコア＋１タンパク質は、より短い形態のコア＋１配列の適当な転写及び翻訳を可能とするようなプロモーターに「作動的に連結されており」、かくして該調節配列はより短い形態のコア＋１ＤＮＡ配列に機能的に関係する。
【００５７】
特定の態様では、キメラ遺伝子は、第１シストロンにおいてＣＭＶ／Ｔ７キメラプロモーター及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、並びに第２シストロンにおいてＬＵＣ遺伝子に融合されたＨＣＶコアコード配列の全体の内部リボソームエントリー部位（entire internal ribosome entry site）（ＩＲＥＳ）及び野生型コアコード配列の一部を含む。ジシストロンカセットＣＡＴ−ＩＲＥＳ−コア−ＬＵＣは、ＣＭＶ／Ｔ７（ここで、ＣＭＶはサイトメガロウイルスに由来しそしてＴ７はバクテリオファージに由来する）の制御下に置かれて、in vivo及びin vitroでの発現のための同じＤＮＡプラスミドの使用を可能とする。更に、ＬＵＣ遺伝子の開始コドンによりトリガーされる内部翻訳開始事象の可能性を排除するために、ＡＴＧはＧＧＧコドンに変えられた。上記修飾により、ＬＵＣ遺伝子の発現は、融合したコア及びコード配列の発現に直接関係する。更に、ＣＡＴ活性は、in vivoでのトランスフェクション効率又はin vitroでの転写物量の潜在的変動を標準化するために内部コントロールとして働く。
【００５８】
好ましい態様において、０、＋１又は−１フレームにおけるコア配列にＬＵＣ遺伝子が融合されている如きキメラ遺伝子が構築される。
【００５９】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、フレーム０、＋１又は−１においてポリペプチド鎖、即ち、この特定の場合にはＬＵＣポリペプチド、を得るために終止コドンにより翻訳が中断されないようなものである。
【００６０】
本発明の他の目的は、上記した如きキメラ遺伝子を含むベクターを提供することである。本発明に従うベクターは、ＤＮＡ配列、例えば、キメラ遺伝子を移すのに特に適当であり、そしてタンパク質発現を許容する性質を有する。
【００６１】
このベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ又はウイルスである。好ましい態様では、ベクターは、図１に示されたｐＨＰＩ−１３３３及びｐＨＰＩ−１３３５からなる群より選ばれるプラスミドである。
【００６２】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列でトランスフェクションされた組換え細胞、特に哺乳動物細胞にも関する。「トランスフェクション」又は「形質転換」とは、受容細胞へのＤＮＡの導入及び該受容細胞染色体ＤＮＡへのその後のその組み込みであると理解される。トランスフェクション又は形質転換の方法は、当該技術分野で周知された通常の方法、例えば、エレクトロポレーションである。トランスフェクションは一過性であるか又は安定であることができる。
【００６３】
ベクターによりトランスフェクション又は形質転換される組換え細胞は、好ましくは、動物、哺乳動物又はヒト細胞である。特定の態様では、組換え細胞はＢＨＫ−２１又はＨｕｈ−１である。
【００６４】
本発明は、より短い形態のコア＋１タンパク質に対して又はそのペプチドに対して生じる抗体も提供する。
【００６５】
本発明は、より短い形態のコア＋１タンパク質に特異的に、即ち、コアタンパク質及び／又はコア＋１タンパク質と交差反応することなく結合する精製された抗体に関する。
【００６６】
本明細書で使用された、「交差反応」は、１つの抗原に対する抗体が、非同一なしかし免疫学的に密接に関連した抗原と反応する血清学的反応である。本発明においては、抗原は、コアタンパク質及び／又はコア＋１タンパク質に近いポリペプチド配列を有するより短い形態のコア＋１タンパク質である。
【００６７】
かくして、より短い形態のコア＋１タンパク質に特異的に結合する抗体は、他のタンパク質中に、特にＨＣＶコアタンパク質又はＨＣＶコア＋１タンパク質中に存在しないか又は露出されない該タンパク質のエピトープに対して指向されうる。
【００６８】
本発明は、より短い形態のコア＋１タンパク質、コア＋１タンパク質及び場合によりコアタンパク質にとって共通のポリペプチド断片に特異的に結合する精製された抗体にも関する。好ましい態様では、上記タンパク質の共通のポリペプチド断片は、ヌクレオチド８９７からヌクレオチド９２０までの間に含まれる。好ましいポリペプチド断片は上記に例示される。
【００６９】
本発明の抗原に対して指向されるモノクローナル抗体を産生させることもできる。モノクローナル抗体を産生する方法は、ハイブリドーマの産生及び必要な結合アフィニティーを有する産生されたモノクローナル抗体を単離することを含む、当該技術分野で周知の通常の方法である。
【００７０】
本発明の観点内では、より短い形態のコア＋１タンパク質を使用してより短い形態のコア＋１タンパク質に特異的に結合する抗体を製造するのに使用される。
【００７１】
本発明は、より短い形態のコア＋１タンパク質又はそのポリペプチド断片にそれ自体結合する少なくとも１種の精製された抗体、又はより短い形態のコア＋１タンパク質若しくはそのポリペプチド断片を抗原として使用する方法により産生された抗体に、特異的に結合する精製されたポリペプチドにも関する。本明細書で使用された「精製されたポリペプチド」という表現は、上記した精製された抗体により認識されるポリペプチド少なくとも７０％、好ましくは、８０％又は９０％に相当するＣ型肝炎ウイルスのより短い形態のコア＋１タンパク質を指す。
【００７２】
Ｃ型肝炎ウイルスによる感染を検出する方法を下記した。より短い形態のコア＋１タンパク質の存在又は不存在を決定することにより、生物学的サンプルにおいてＣ型肝炎ウイルスによる個体の感染を検出することが可能である。好ましい態様では、より短い形態のコア＋１タンパク質は、抗原−抗体複合体を形成することにより該タンパク質と免疫学的に反応性である抗体により検出される。抗原に結合した抗体の量を決定する方法は、当該技術分野で周知されている。例えば、抗体は、検出可能なマーカーを担うことができ、次いで試験された抗原の既知の量及びマーカーにより発生されるシグナルの量を使用して標準曲線を発生させることができる。
【００７３】
本発明は、生物学的サンプル中のより短い形態のコア＋１タンパク質を認識する抗体を検出することからなるＣ型肝炎ウイルスによる感染のin vitro検出方法にも関する。より短い形態のコア＋１タンパク質は、抗原として使用して、物質中の該より短い形態を認識する抗体を同定することができそしてこれらのサンプル中の抗体の濃度を決定することができる。
【００７４】
本明細書に述べられたとおり、個体の生物学的サンプルは、尿及び血液サンプル又は組織及び細胞のような生物学的流体を含むがそれらに限定はされない。
【００７５】
特定の態様では、これらの方法は、イムノアッセイ（直接の検出）又はＥＬＩＳＡ（間接の検出）によってＨＣＶの検出のための抗原−抗体複合体の形成を使用する。イムノアッセイの使用又は二次反応による抗原−抗体の観察は、流体中の体液性成分を検出及び定量することなおいて周知である。
【００７６】
本発明は、ＨＣＶのより短い形態のコア＋１タンパク質又はそのペプチド（特異的免疫原性ペプチドを含む）を含む免疫原性組成物にも関する。
【００７７】
このような組成物は、患者において、免疫応答、抗体応答及び／又は好ましくはＣＴＬ応答を生じさせるのに有用である。有利には、ＣＴＬ応答は、それがＨＣＶ感染に対して又はその結果に対して患者を保護するようなＣＴＬ応答である。あるいは、核酸配列は、免疫原性組成物の製造に関与させることもできる。
【００７８】
本発明は、ＨＣＶ感染又はその結果の処置のための治療組成物に使用するためのより短い形態のコア＋１タンパク質にも関する。興味深いことに、より短い形態のコア＋１タンパク質は、ウイルスライフサイクルに干渉することができそして患者におけるＨＣＶ増殖を特異的にダウンレギュレートすることができる。
【００７９】
本発明は、ＨＣＶにより感染された細胞におけるウイルス増殖と相互作用するその能力について化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）該細胞を候補化合物と接触させ、
ｂ）該候補化合物と該より短い形態のコア＋１タンパク質の発現との間の相互作用を決定する、
ことを含む方法に関する。
【００８０】
本発明は、ＨＣＶ感染細胞を候補化合物と接触する前及び後に、より短い形態のコア＋１タンパク質の発現レベルを測定することにより相互作用が決定される、化合物をスクリーニングする方法にも関する。
【００８１】
別の翻訳機構（alternative translation mechanism）が、ウイルスにより使用されて、構造タンパク質及び酵素タンパク質の産生を調節しそして、そして最終的にウイルス増殖を調節する。これらの翻訳機構を変えることは、ウイルスライフサイクルを中断しし、そして該ウイルス増殖を排除又は減少させることによりウイルス産生と相互作用する。ゆえに、別の機構の翻訳は、抗ウイルス剤が作用することができる主要な標的を与える。
【００８２】
翻訳機構は、これらのプロセスの効率に影響を与える作用物質を同定するための魅力的な標的である。実際に、開始翻訳の変化（非ＡＴＧコドン、開始コドンの修飾）は、ウイルス産生に対する大きな効果を有することができる。更に、翻訳機構の効率を変化させる化合物は、翻訳装置又は例えばＨＣＶウイルスにより感染された細胞を妨害しない治療濃度に同等な低い濃度で機能する。
【００８３】
本明細書で使用した、「化合物」という用語は、天然（単離された）又は合成の無機若しくは有機化学的又は生物学的化合物を指し、特に核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖ペプチド、脂質、脂質タンパク質及び炭水化物を包含する。
【００８４】
コアＯＲＦの翻訳をブロックすることは、コア＋１ＯＲＦの発現のレベルの翻訳に対するポジティブな効果を有する。好ましい態様では、翻訳は、ＨＣＶポリプロテインのイニシエーターＡＴＧコドンが停止コドンに変換されようとされまいと、２倍増加する。このような突然変異は、コア発現をブロックするが、コア＋１in vivo発現のレベルを増加もさせる。
【００８５】
ヌクレオチド配列、キメラ遺伝子及びベクターがトランスフェクションされうるいかなる細胞も、本発明のスクリーニング方法において使用することができる。本発明の好ましい態様では、トランスフェクションされた細胞は動物細胞、哺乳動物細胞又はヒト細胞である．更なる好ましい態様では、化合物をスクリーニングする方法で使用される細胞は、ＢＨＫ−２１又はＨｕｈ−１である。
【００８６】
本発明は、スクリーニングの上記方法を行う結果として同定された化合物にも関する。
【００８７】
本発明の上記方法により同定されたこのような化合物は、Ｃ型肝炎ウイルスにより誘発された疾患又はＣ型肝炎ウイルスによる感染と関連した疾患の処置のために有用である。
【００８８】
上記スクリーニング方法に従って選ばれるこれらの化合物は、ＨＣＶの感染により誘発される疾患又はＨＣＶの感染と関連した疾患の処置用の薬物の製造に使用することができる。
【００８９】
これらの化合物のいくらかは、より短い形態のコア＋１タンパク質の翻訳を回復又は改良することによりＨＣＶの感染により誘発される疾患又はＨＣＶの感染と関連した疾患をモジュレートすることができる。宿主におけるＨＣＶ増殖をもたらす疾患の例は、硬変、肝細胞がん又は肝臓慢性感染に関連した疾患である。
【００９０】
実施例
１．材料及び方法
１．１部位特異的突然変異誘発及びプラスミド構築
Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）キット（Stratagene）を使用して、部位特異的突然変異誘発を行った。突然変異分析で使用されたテンプレート及びオリゴヌクレオチド並びに対応する突然変異体は図９に列挙される。すべての突然変異は配列分析により確かめられた。
【００９１】
このようにして得られたＨＣＶ−１ｃＤＮＡ配列を、Varaklioti et al.2002に記載のｐＨＰＩ−８８８においてクローニングした。ＨＣＶ−１ｃＤＮＡは、ＨＣＶＦ１７（ヌクレオチド９〜２７）と名付けられたセンスプライマー、５’−ＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣ−３’  プラス  ＨＣＶＲ３８（ヌクレオチド３４２〜３２２）と名付けられたアンチセンスプライマー、５’−ＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣ−３’並びに、ＨＣＶＦ３６（ヌクレオチド２６８〜２８７）と名付けられたセンスプライマー、５’−ＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧ−３’、ＨＣＶＲ２７（ヌクレオチド１０５２〜１０３０）と名付けられたアンチセンスプライマー、５’−ＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＴＣＡＣＧＡ−３’を使用するＰＣＲによりｐＨＰＩ−８８８から得られた。プラスミドｐＨＰＩ−８８８は、ｐＧＥＭ−３ｚｆ（＋）ベクター（Promega）に基づいておりそしてＨＣＶ−１単離物からのｃＤＮＡ配列（ヌクレオチド９〜１０５４）（ＩＲＥＳ−コアＨＣＶ−１配列：アクセッション番号Ｎｏ．Ｍ６２３２１）を含む。
【００９２】
ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）ｃＤＮＡ配列は、ｐＤＮＡ−Ｃ１からのＨＣＶ−１ａ（Ｈ）の配列を下記のプライマーを使用して増幅するＰＣＲにより得る。ＨＣＶ株Ｈの最初の１０６４ヌクレオチドのベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）への挿入によりｐＤＮＡ−Ｃ１プラスミドを創生する。クローニングされた配列は、５’−ＮＣＲ（ヌクレオチド１〜３４１）、ヌクレオカプシドコード配列（ヌクレオチド３４２〜９１４）及びエンベロープＥ１（ヌクレオチド９１５〜１０６４）の最初の５０アミノ酸をコードする１５０ヌクレオチドを含んでいた（Inchauspe et al.1991,ＩＲＥＳ−ｃｏｒｅ  ＨＣＶ  ｓｔｒａｉｎ  Ｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：アクセッション番号Ｎｏ：Ｍ６７４６３）。
【００９３】
ジシストロン構築物ｐＨＰＩ−１３３１、−１３３３及び−１３３２は、第１シストロンとしてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含有し、続いてそれぞれ、０、＋１及び−１フレームにおけるホタルＬＵＣ遺伝子に融合したプロトタイプＨＣＶ−１単離物からの野生型コアコード配列（ヌクレオチド９〜６３０）の全体ＩＲＥＳ及び野生型コアコード配列（ヌクレオチド９〜６３０）の一部を含有する。それらは、プライマー５’−ＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣ−３’（センス）及び５’−ＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡ−３’（アンチセンス）を使用して、それぞれ、ジシストロンｐＨＰＩ−１３１１、−１３１３及び−１３１２から部位特異的突然変異誘発により産生された。このプライマーのセットは、ルシフェラーゼコード領域の開始コドン（ＡＴＧ）をグリシンコドン（ＧＧＧ）に変換する。ｐＨＰＩ−１３１１、−１３１３及び−１３１２は、ＬＵＣ遺伝子の一部と融合したＩＲＥＳ−コア配列のヌクレオチド２４９〜４０７を担うジシストロンｐＨＰＩ−１０４６（Psaridi et al.1999）の２０３ｂｐＮｈｅＩ−ＸｂａＩ断片を、ＬＵＣ遺伝子の最初の５０ヌクレオチドと融合したＩＲＥＳコア配列のヌクレオチド２４９〜６３０を含有するｐＨＰＩ−７６６、−７６７、−７６８（Varaklioti et al.2002）の４３５ｂｐＮｈｅＩ−ＸｂａＩ断片で置き換えることにより構築された。ジシストロン構築物ｐＨＰＩ−１３３４、−１３３５及び−１３３６は、すべての３つのフレーム（それぞれ、０、＋１及び−１）においてＬＵＣ遺伝子に融合させたＨＣＶ−１ａ（Ｈ）からの野生型コアコード領域（ヌクレオチド９〜６３０）の全体ＩＲＥＳ及び野生型コアコード領域（ヌクレオチド９〜６３０）の一部を有する。それらは、テンプレートとして、それぞれ、ｐＨＰＩ−１３２８、−１３２９及び−１３３０を使用しそしてプライマー５’−ＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣ−３’（センス）及び５’−ＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡ−３’（アンチセンス）を使用して部位特異的突然変異誘発により誘導された。プライマーは、ルシフェラーゼコード領域の開始コドンをグリシンコドンに変える（ＡＴＧ→ＧＧＧ）。ｐＨＰＩ−１３２８、−１３２９及び−１３３０は、ｐＨＰＩ−１０４６の２０３ｂｐＮｈｅＩ−ＸｂａＩ断片を、それぞれ、ｐＨＰＩ−７４８、−７４９、−７５０（Varaklioti et al 2002）の４３５ｂｐＮｈｅＩ−ＸｂａＩｌ断片で置き換えることにより発生させた。プラスミドの特徴付けを容易にするために、野生型２０３ｂｐＮｈｅＩ−ＸｂａＩ断片を突然変異させたテンプレートの対応する断片で置き換えることにより、ジシストロン構築物ｐＨＰＩ−１３３３（ＨＣＶ−１）及びｐＨＰＩ−１３３５［ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）］に挿入された突然変異の大部分をｐＨＩＰ−１０４６に再クローニングした。モノシストロン構築物ｐＨＰＩ−１３６２及び−１３６３は、ｐＥＧＦＰＮ３（Clontech）のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＳａｌＩ部位との間にクローニングされた、それぞれ、ｐＨＰＩ−１３３３及び−１３３２と同じＩＲＥＳ−コア−ＬＵＣカセットを含有する。
【００９４】
１．２in vitro翻訳
すべてのプラスミドについて、１２０mM  ＫＣｌ及び０．５mM  Ｍｇ（ＯＡｃ）２を補充したＦｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解物（Promega）を使用した。各プラスミドからのＤＮＡ（３μg）を線状化しそして製造者のインストラクションに従ってＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりin vitroで転写した。野生型ｐＨＰＩ−１３３１、−１３３３、−１３３２、−１３３４、−１３３５、−１３３６及び対応する突然変異したジシストロン構築物をＰｓｔＩで線状化した。
【００９５】
［３５Ｓ］−メチオニン（Amersham Biosciences）を使用して２５μlの全容積においてキャップされていないＲＮＡｓで、in vitro翻訳実験を行った。翻訳産物（５μl）を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ニトロセルロース膜に移しそしてオートラジオグラフィーにより可視化した。
【００９６】
１．３細胞及びＤＮＡトランスフェクション
ＢＨＫ−２１及びＨｕｈ−７細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコの修正イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium）（ＤＭＥＭ）［ＤＭＥＭ／ＦＢＳ］中に５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃に維持した。６ウエルのプレート（６０％密集度）に接種された細胞を製造者のプロトコール（Invitrogen,Cat.No 10964-013）に従ってリポフェクタミンプラス（登録商標）試薬（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｐｌｕｓＴＭ  ｒｅａｇｅｎｔ）（invitrogen）の存在下にプラスミドＤＮＡ１μgでトランスフェクションした。培地をトランスフェクションの２４時間後に新しいＤＭＥＭ／ＦＢＳで置き換えた。細胞を、トランスフェクションの４８時間後にリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄しそして１×ルシフェラーゼ溶解緩衝液（Promega）２６０μlに溶解させた。抽出物２０μlをルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega）１００μlと混合しそして発光をＴｕｒｎｅｒ  ＴＤ−２０／２０ルミノメーターで直接測定することにより、ホタルＬＵＣを定量した。ジシストロン構築物の場合には、製造者のインストラクション（Roche,Cat. No.1363727）に従ってＣＡＴ−ＥＬＩＳＡキットでＣＡＴを定量した。
【００９７】
１．４抗体産生
ホタルルシフェラーゼに対するヤギポリクローナル抗体を、Promega Corporationからのキット（Promega,Cat.No.G7451）により１mg/mlの濃度で得た。
【００９８】
１．５免疫沈殿分析
ｐＨＰＩ−１３６２又はｐＨＰＩ−１３６３によるトランスフェクションの３６時間後に、ＢＨＫ−２１細胞の単層（〜１０７細胞）を、１％ＦＢＳを補充したメチオニンを含まない培地１ml当たり２０μＣｉ［３５Ｓ］−メチオニン（Amersham Biosciences）で１２時間代謝的に標識した。標識した細胞をＰＢＳで洗浄しそして５０mMトリス（ｐＨ８）、１５０mMＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム及び１００μg/mlフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）からなるトリプル洗剤緩衝液の全容積５００μlに溶解した。細胞溶解物をボルテックスすることにより混合し、そして４℃で１０分間１４０００×gで遠心した。透明化した溶解物を４℃で一夜ロッカー（rocker）上で抗ＬＵＣポリクローナル抗体１０μlとインキュベーションした。プロテインＧ＋アガロース（Protein G PLUS Agarose）（Santa Cruz Biotechnology）をこの混合物に加え（２０μl）そして反応を更に２時間同じ条件でインキュベーションした。ミクロ遠心後に、アガロースビーズを、５０mMトリス（ｐＨ８）、１５０mMＮａＣｌ、０．１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４及び１mMＥＤＴＡを含有する緩衝液で３回洗浄した。次いで１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより免疫沈殿を溶解し、ニトロセルロース膜上に移しそしてオートラジオグラフィーにより検出した。
【００９９】
２．結果
２．１コア＋１ＯＲＦはトランスフェクションされた細胞において効率的に発現される（in vivo）
in vitroアッセイは、ＨＣＶ−１コアコード領域からのみコア＋１ＯＲＦの検出可能な発現を示しそしてＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物からは発現を示さないことは、以前に報告された。
【０１００】
哺乳動物細胞におけるＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物からのコア＋１タンパク質の翻訳を分析した。コア＋１ＯＲＦの発現をウサギ網状赤血球溶解物に基づいたin vitroシステムと比較した。３つのすべてのフレームにおけるＬＵＣ遺伝子に融合したＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）からのコアコード配列（ヌクレオチド９〜６３０）の全体ＩＲＥＳ及びコアコード配列（ヌクレオチド９〜６３０）の一部を含有するｃＤＮＡ配列を、ＣＡＴが最初の遺伝子であるジシストロンベクターに移した。ジシストロンカセットＣＡＴ−ＩＲＥＳ−コア−ＬＵＣをＣＭＶ／ＳＰ６プロモーターの制御下に置いて、in vivo及びin vitroでの発現のための同じＤＮＡプラスミドの使用を可能とした。これらの構築物を本願の図１Ａに示す。ＬＵＣ遺伝子の発現は、融合したコア又はコア＋１コード配列の発現に直接関係しており、そしてＣＡＴ活性は、in vivoでのトランスフェクション効率又はin vitroでの転写物の量（transcript abundance）の潜在的変動（potential variations）を標準化するための内部コントロールとして役立つ。各構築物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションし、そして４８時間後にＬＵＣ及びＣＡＴ活性を測定した。
【０１０１】
ＨＣＶ−１の場合に、実質的な量のルシフェラーゼがｐＨＰＩ−１３３３のコア＋１ＬＵＣカセットから発現された。何故ならば、ルシフェラーゼ活性のレベルは、ｐＨＰＩ−１３３１に由来するコア−ＬＵＣ融合タンパク質のルシフェラーゼ活性のレベルと同様であったからである（図１Ｂ［ａ］）。ルシフェラーゼ活性のバックグラウンドレベルのみは、対応するネガティブコントロールコア−１ＬＵＣ構築物（ｐＨＰＩ−１３３２）の発現から検出された。驚くべきことに、in vitroとは対照的に、ＬＵＣ遺伝子に融合したＨＣＶ−１ａ（Ｈ）からのコア＋１ＯＲＦを含有する構築物ｐＨＰＩ−１３３５から、非常に高いレベルのルシフェラーゼ活性が観察された。レベルは、ｐＨＰＩ−１３３４から生じたＨＣＶ−１ａ（Ｈ）コア−ＬＵＣハイブリッドタンパク質の約２００％であった（図１Ｃ［ａ］）。対応するネガティブコントロールプラスミド（ｐＨＰＩ−１３３６）は、ルシフェラーゼ発現のバックグラウンドレベルをもたらした。かくして、ＨＣＶ−１コア＋１ＬＵＣ−タグ付タンパク質（HCV-1 core +1 LUC-tagged protein）は、コアコード配列と同様な翻訳レベルで、in vivoで効率的に産生される。
【０１０２】
これらの結果は、ウサギ網状赤血球溶解物における発現の研究とは対照的に、ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）及びＨＣＶ−１単離物も、一過性トランスフェクションされたＢＨＫ−２１細胞においてコア＋１ＯＲＦを効率的に発現することを示す。
【０１０３】
これらの結果は、in vitro及びトランスフェクションされた細胞におけるコア＋１ＯＲＦの発現を指向する翻訳機構の差も示す。
【０１０４】
２．２  コアコード配列のコドン８〜１１におけるＡに富んだ配列は、in vivoでのコア＋１タンパク質の発現に必須ではない。
ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）のコアコード領域は、リボソームフレームシフティングのための既知のずれやすい部位（slippery site）であるＨＣＶ−１ゲノムのコドン８〜１１（ヌクレオチド３６４〜３７３）を表す１０個の連続したＡ残基を欠くことが示された。トランスフェクションされた細胞におけるコア＋１ＯＲＦの発現に対する１０個のＡ残基領域の意義も分析しそしてウサギ網状赤血球溶解物におけるそれと比較した。
【０１０５】
１０個のＡ残基領域における突然変異の研究もin vivoでのコア＋１タンパク質の産生に対するそれらの効果を決定するために分析された。即ち、
−ＨＣＶ−１（図２Ａ）では、それぞれ、ヌクレオチド３６６、３６７及び３７３（コドン９及び１０）における２つのＡのＧへの置換及びＡのＣへの置換のトリプル置換を含有する突然変異Ｎ１８の挿入は、ｐＨＰＩ−１３８２を生じるが、これに対してそれぞれ、ヌクレオチド３６７、３６９及び３７３（コドン９、１０及び１１）におけるＡのＧへの変化及び２つのＡのＣへの変化からなる突然変異Ｎ１９は、ｐＨＰＩ−０１３８３をもたらし；
−ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）（図２Ｂ）では、位置３６６（コドン９）におけるＡからＧへの変化からなる突然変異１５は、ｐＨＰＩ−１３９５を生じ、そしてヌクレオチド３６９（コドン１０）におけるＡのＣへの置換を有するＮ１６は、ｐＨＰＩ−１３９６をもたらした。Ｎ１５及びＮ１６突然変異は単一置換を含有する。何故ならば、ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物は、位置３６７及び３７３においてＧ及びＣを既に有するからであり；
これらの突然変異のどれもがin vivoでのルシフェラーゼ活性に対する有意な効果を持たない。
【０１０６】
この結果は、ＨＣＶ−１単離物中にのみ見出されるコドン８〜１１における１０個の連続したアデニンの存在は、in vivoでのコア＋１発現にとって決定的に重要でもなければウサギ網状赤血球溶解物中のコア＋１タンパク質の発現にとっても決定的に重要ではないということを示唆する。
【０１０７】
２．３  ＨＣＶコアコード配列のＡＴＧイニシエーターコドンは、トランスフェクションされた細胞におけるコア＋１タンパク質の発現に必須ではない
コア＋１ＯＲＦのin vivo発現において示唆された分子機構を、ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物の両方のコア＋１−ＬＵＣ−タグ付構築物のコアコード領域に導入された２つの突然変異に従って更に研究する。
【０１０８】
突然変異Ｎ３は、コアＯＲＦのＡＴＧイニシエーターコドンをターミターコドンに変換し、そして突然変異Ｎ６はヌクレオチド４１４（Ｐ２５、ＣＣＧ）におけるコアコード配列の２５番目の位置に停止コドンを導入した。得られるプラスミドは、それぞれ、ＨＣＶ−１ではｐＨＰＩ−１３４３及びｐＨＰＩ−１３４４と名付けられそしてＨＣＶ−１ａ（Ｈ）ではｐＨＰＩ−１３４６及びｐＨＰＩ−１３４７と名付けられた。
【０１０９】
Ｎ３及びＮ６突然変異は、ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物の両方についてトランスフェクションされた細胞においてコア＋１発現をブロックしなかった。更に、該Ｎ３及びＮ６突然変異は、増加したレベルのルシフェラーゼ活性も有する。反対にそして先のin vitro研究と合致して、Ｎ３突然変異はＨＣＶ−１からの７２kDaコア＋１−ＬＵＣタンパク質の合成を妨げるが（図４Ａ［ｂ］、レーン２）、これに対してＮ６はコア＋１−ＬＵＣキメラタンパク質の産生に対する効果を持たない（図４Ａ［ｂ］、レーン３）。更に、先の研究に従って予想されるとおり、ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）からのコア＋１−ＬＵＣ構築物（ＷＴ、Ｎ３、Ｎ６）は、検出可能なレベルのキメラタンパク質を産生しなかった（図４Ｂ［ｂ］）。
【０１１０】
これらのデータは、ウサギ網状赤血球溶解物（in vitro）とトランスフェクションされた細胞（in vivo）とではコア＋１発現のための主要な翻訳機構間で差が現れることを示す。更に、これらのデータは、in vivoでのコア＋１ＯＲＦの発現はコアタンパク質の発現を必要としないことを示す。
【０１１１】
これらの結果は、コアＯＲＦの翻訳をブロックすることは、コア＋１ＯＲＦの翻訳に対するポジティブな効果を有すること及びリボソームフレームシフティングは、in vivoコア＋１発現を指向する主要な機構ではないことを示唆する。
【０１１２】
２．４  in vivoでのコア＋１ＯＲＦの効率的な翻訳は、内部開始（１つ又は複数）コドン（１つ又は複数）により媒介される。
in vivoでのコア＋１ＯＲＦの発現は、イニシエーターＡＴＧ又はＡに富んだ領域における変化により抑制されないことが上記実験で示された。ゆえに、下流のコドンがコア＋１ＯＲＦの発現のための翻訳開始部位として機能することができるかどうかを試験するために、突然変異誘発実験を行った。
【０１１３】
コア＋１ＯＲＦに影響を与える突然変異の説明を容易にするために、ヌクレオチド３４６におけるＧＣＡアラニンコドンは、コア＋１ＯＲＦの最初のコドンとして任意に定義される。３つのナンセンス突然変異を、ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）のコア＋１コード配列に別々に挿入された。即ち、
−突然変異Ｎ１は、ヌクレオチド４７２（Ｗ４３、ＴＧＧ）においてコア＋１ＯＲＦにＴＡＧ停止コドンを導入し、その結果ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）について、それぞれ、ｐＨＰＩ−１３４２及びｐＨＰＩ−１３４５を得；
−突然変異Ｎ２１は、ヌクレオチド５８０においてコア＋１ＯＲＦの７９番目のコドン（Ｇ７９、ＧＧＴ）をＴＡＧ停止コドンに変え、その結果ｐＨＰＩ−１３８０（ＨＣＶ−１）及びｐＨＰＩ−１３９８［ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）］を得；
−突然変異Ｎ２２は、ヌクレオチド６０４（Ｍ８７）において突然変異Ｎ２１の８コドン下流にＴＡＧターミネーターコドンを導入し、その結果ｐＨＰＩ−１３８１（ＨＣＶ−１）及びｐＨＰＩ−１３９７［ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）］を得た。
【０１１４】
突然変異Ｎ１及びＮ２１は、ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物の両方についてコア＋１−ＬＵＣ遺伝子のin vivo発現に対する有意な効果を持たなかった。反対に、Ｎ２２突然変異は、ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物の両方からの並びにＢＨＫ−２１及びＨｕｈ−７細胞系の両方からのコア＋１−ＬＵＣタンパク質の合成を殆ど完全に止めた。
【０１１５】
先の研究に従って予測されるとおり、突然変異Ｎ１、Ｎ２１及びＮ２２は、コア＋１ＯＲＦのin vitro発現を支持しなかった。
【０１１６】
これらのデータは、トランスフェクションされた細胞におけるコア＋１ＯＲＦの効率的な翻訳開始がほぼヌクレオチド５８０と６０４との間に位置することができる下流／内部開始コドンから媒介されることを示す。
【０１１７】
ヌクレオチド５８３と６０６との間の領域（コドン８０〜８７）は、２つのＡＴＧ（ヌクレオチド５９８−ＡＴＧＮＮＮＡＴＧ−６０６）を含有し、これは、in vivoでのコア＋１タンパク質の翻訳のための開始部位としてこれらのＡＴＧの機能的重要性を評価する。３つの下記の突然変異を試験した。即ち、
−突然変異Ｎ２５は位置８５及び８７の両メチオニンをグリシンに変え、その結果ｐＨＰＩ−１４０１を得、
−突然変異Ｎ２３はＭ８７のみを変更してｐＨＰＩ−１３９９を得、
−突然変異Ｎ２４はＭ８７のみを変更してｐＨＰＩ−１４００を得た。
【０１１８】
突然変異体ｐＨＰＩ−１３９９（Ｎ２３）及びｐＨＰＩ−１４００（Ｎ２４）によるＢＨＫ−２１及びＨｕｈ−７のトランスフェクションは、野生型構築物と同様なレベルのルシフェラーゼ翻訳を生じさせた。対照的に、突然変異Ｎ２５は、キメラコア＋１−ＬＵＣタンパク質の産生にひどく影響与え、該産生はＢＨＫ−２１細胞では野生型レベルの約２３％でありそしてＨｕｈ−７では約２６％であった。
【０１１９】
これらの結果は、コア＋１コード領域の２つのメチオニン（Ｍ８５及びＭ８７）がコア＋１発現に関与していることを示唆する。何故ならば、それらの両方のグリシンへの変換はルシフェラーゼ活性のレベルを有意に減少させたからである。
【０１２０】
２．５  in vivo及びin vitroで産生されたコア＋１タンパク質のサイズの比較
ジシストロン構築物ｐＨＰＩ−１３３３（ＨＣＶ−１）に含有されたＩＲＥＳ−コア＋１−ＬＵＣカセット並びにｐＨＰＩ−１３３２の対応するネガティブコントロールＩＲＥＳ−コア−１−ＬＵＣカセットを、ＣＭＶプロモーターの制御の下にモノシストロン発現ベクターに移し、その結果それぞれｐＨＰＩ−１３６２及びｐＨＰＩ−１３６３を得た（図７Ａ）。このシステムは、ルシフェラーゼタンパク質の検出を改良する。何故ならば、ＨＣＶ  ＩＲＥＳはモノシストロン構築物において活性がより高いからである。特に、翻訳の４８時間後にＢＨＫ−２１細胞におけるモノシストロンＩＲＥＳ−コア＋１−ＬＵＣ構築物ｐＨＰＩ−１３６２により示されたルシフェラーゼ活性は、それぞれのジシストロンｐＨＰＩ−１３３３から生じたルシフェラーゼ活性よりも約９倍高かった。ルシフェラーゼに対して生じたヤギポリクローナル抗体を使用して、ｐＨＰＩ−１３６２でトランスフェクションされたＢＨＫ−２１細胞の抽出物により、免疫沈殿実験を行った。
【０１２１】
約６２kDaの見かけの分子質量を有するタンパク質はポリクローナル抗体と強く反応し、このタンパク質は、ｐＨＰＩ−１３３３構築物からin vitroで産生されたキメラタンパク質コア＋１−ＬＵＣより明らかに小さかった。
【０１２２】
これらの結果は、上記突然変異誘発と合致しておりそして、哺乳動物細胞で産生されたコア＋１タンパク質はin vitroで産生されたコア＋１タンパク質よりも約１０kDa小さいことを示す。
【０１２３】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１Ａ】コア＋１−ＬＵＣキメラ遺伝子の発現分析  パネルＡ：タグ化実験のために使用されるＣＡＴ−ＬＵＣジシストロン構築物の略図の表現。ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）からの全体のＩＲＥＳ（ヌクレオチド９〜３４１）及びコアコード配列の一部（ヌクレオチド３４２〜６３０）を、ｐＨＰＩ−１０４６のＣＭＶ及びＴ７プロモーターの両方の制御下にＬＵＣ遺伝子と融合させた。コアとルシフェラーゼコード領域との間の接続部のヌクレオチド配列を示す。部位特異的突然変異誘発によるＡＴＧイニシエーターに由来するルシフェラーゼシストロンの第１コドン、ＧＧＧは四角で囲まれている。ＬＵＣ遺伝子は、０フレームでは、ｐＨＰＩ−１３３１（ＨＣＶ−１）及びｐＨＰＩ−１３３４［ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）］における先行するコアコード配列に対して融合され、＋１フレームでは、ＨＰＩ−１３３３（ＨＣＶ−１）及びｐＨＰＩ−１３３５［ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）］における先行するコアコード配列に対して融合され、そして−１フレームでは、ＨＰＩ−１３３２（ＨＣＶ−１）及びｐＨＰＩ−１３３６［ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）］における先行するコアコード配列に対して融合された。下線を施されたヌクレオチドは、チミジン残基の挿入を示しそして逆向き三角形はアデニン残基の欠失を示す。
【図１Ｂ】パネルＢ、Ｃ：ＨＣＶ−１（Ｂ）及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｃ）融合構築物のin vivo）ａ）発現及びin vitro（ｂ）発現。  （ａ）ＢＨＫ−２１細胞の二重の培養物（dupliate cultures）を各構築ブロックでトランスフェクションしそしてＬＵＣ活性対ＣＡＴ量の相対比を決定した。バーは、二重の２つの別々の実験で得られた平均を表す。誤差バーは標準偏差を現す。  （ｂ）各構築物をin vitroで転写しそして同等な量のすべてのＲＮＡｓをＦｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解物において翻訳した。翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより直接分離しそしてオートラジオグラフィーにより分析した。融合タンパク質は、黒く塗られた矢頭印により示される。開いた矢頭印はＣＡＴタンパク質を示す。ＮＣはネガティブコントロールを意味する。
【図１Ｃ】パネルＢ、Ｃ：ＨＣＶ−１（Ｂ）及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｃ）融合構築物のin vivo）ａ）発現及びin vitro（ｂ）発現。  （ａ）ＢＨＫ−２１細胞の二重の培養物（dupliate cultures）を各構築ブロックでトランスフェクションしそしてＬＵＣ活性対ＣＡＴ量の相対比を決定した。バーは、二重の２つの別々の実験で得られた平均を表す。誤差バーは標準偏差を現す。  （ｂ）各構築物をin vitroで転写しそして同等な量のすべてのＲＮＡｓをＦｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解物において翻訳した。翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより直接分離しそしてオートラジオグラフィーにより分析した。融合タンパク質は、黒く塗られた矢頭印により示される。開いた矢頭印はＣＡＴタンパク質を示す。ＮＣはネガティブコントロールを意味する。
【図２Ａ】コア＋１−ＬＵＣキメラ遺伝子の発現に対するＨＣＶ−１（Ｎ１８、Ｎ１９）及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｎ１５、Ｎ１６）コアコード配列のコドン８〜１１内の突然変異の効果。  パネルＡ、Ｂ：野生型ＨＣＶ−１（Ａ）及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｂ）プラスミド並びに対応する突然変異体バリアントＮ１８、Ｎ１９（ＨＣＶ−１（Ａ）及びＮ１５、Ｎ１６［ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）］（Ｂ）のコドン８〜１１の領域におけるコアヌクレオチド配列。コドン８〜１１の野生型配列は太字で示される。矢印は挿入された突然変異を示し、太字の文字は突然変異されたヌクレオチド及び影響を受けたアミノ酸を示す。括弧内の数字は突然変異したコドンの番号を示す。
【図２Ｂ】コア＋１−ＬＵＣキメラ遺伝子の発現に対するＨＣＶ−１（Ｎ１８、Ｎ１９）及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｎ１５、Ｎ１６）コアコード配列のコドン８〜１１内の突然変異の効果。  パネルＡ、Ｂ：野生型ＨＣＶ−１（Ａ）及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｂ）プラスミド並びに対応する突然変異体バリアントＮ１８、Ｎ１９（ＨＣＶ−１（Ａ）及びＮ１５、Ｎ１６［ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）］（Ｂ）のコドン８〜１１の領域におけるコアヌクレオチド配列。コドン８〜１１の野生型配列は太字で示される。矢印は挿入された突然変異を示し、太字の文字は突然変異されたヌクレオチド及び影響を受けたアミノ酸を示す。括弧内の数字は突然変異したコドンの番号を示す。
【図２Ｃ】パネルＣ、Ｄ：ＨＣＶ−１（Ｃ）及びＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｄ）野生型（それぞれ、ｐＨＰＩ−１３３３及びｐＨＰＩ−１３３５）並びに対応する突然変異体［それぞれ、ｐＨＰＩ−１３８２（Ｎ１８）、−１３８３（Ｎ１９）及びｐＨＰＩ−１３９５（Ｎ１５）、−１３９６（Ｎ１６）］を使用して、ＢＨＫ−２１細胞（ａ）をトランスフェクションし、又はin vitroで転写しそして等量のＲＮＡｓをＦｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解物（ｂ）において翻訳した。  （ａ）ＢＨＫ−２１細胞の二重の培養物を野生型又は突然変異した構築物でトランスフェクションした。各突然変異体の活性を、ＬＵＣ活性対ＣＡＴ量の比を決定することにより計算しそして野生型のそれの百分率として表す。バーは、各々二重に行われた３つの別別の実験で観察された平均を表す。誤差バーは標準偏差に対応する。  （ｂ）［３５Ｓ］−メチオニン標識されたin vitro翻訳産物５λを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しそしてオートラジオグラフィーにより分析した。融合タンパク質コア＋１−ＬＵＣは黒く塗られた矢頭により示される。開いた矢頭はＣＡＴタンパク質を示す。ＷＴ及びＮＣは、それぞれ、野生型及びネガティブコントロールを意味する。
【図２Ｄ】パネルＣ、Ｄ：ＨＣＶ−１（Ｃ）及びＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｄ）野生型（それぞれ、ｐＨＰＩ−１３３３及びｐＨＰＩ−１３３５）並びに対応する突然変異体［それぞれ、ｐＨＰＩ−１３８２（Ｎ１８）、−１３８３（Ｎ１９）及びｐＨＰＩ−１３９５（Ｎ１５）、−１３９６（Ｎ１６）］を使用して、ＢＨＫ−２１細胞（ａ）をトランスフェクションし、又はin vitroで転写しそして等量のＲＮＡｓをＦｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解物（ｂ）において翻訳した。  （ａ）ＢＨＫ−２１細胞の二重の培養物を野生型又は突然変異した構築物でトランスフェクションした。各突然変異体の活性を、ＬＵＣ活性対ＣＡＴ量の比を決定することにより計算しそして野生型のそれの百分率として表す。バーは、各々二重に行われた３つの別別の実験で観察された平均を表す。誤差バーは標準偏差に対応する。  （ｂ）［３５Ｓ］−メチオニン標識されたin vitro翻訳産物５λを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しそしてオートラジオグラフィーにより分析した。融合タンパク質コア＋１−ＬＵＣは黒く塗られた矢頭により示される。開いた矢頭はＣＡＴタンパク質を示す。ＷＴ及びＮＣは、それぞれ、野生型及びネガティブコントロールを意味する。
【図３Ａ】コア／コア＋１コード領域の突然変異分析  ０（Ａ）及び＋１（Ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）に影響を与える突然変異を含むＨＣＶ−１コアコード領域のヌクレオチド配列。挿入された突然変異は矢印により示される。突然変異したヌクレオチド及び影響を受けたアミノ酸は太字で示される。
【図３Ｂ】コア／コア＋１コード領域の突然変異分析  ０（Ａ）及び＋１（Ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）に影響を与える突然変異を含むＨＣＶ−１コアコード領域のヌクレオチド配列。挿入された突然変異は矢印により示される。突然変異したヌクレオチド及び影響を受けたアミノ酸は太字で示される。
【図４】コア＋１−ＬＵＣキメラ遺伝子の発現に対するＨＣＶ−１（Ａ）及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｂ）コアコード領域のコドン８〜１１にフランキング（flank）するヌクレオチド配列内の突然変異の効果。  それぞれ、野生型ｐＨＰＩ−１３３３（ＨＣＶ−１）及びｐＨＰＩ−１３３５［ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）］及びＮ３、Ｎ６突然変異体バリアントｐＨＰＩ−１３４３、ｐＨＰＩ−１３４４（ＨＣＶ−１）及びｐＨＰＩ−１３４６、ｐＨＰＩ−１３４７［ＨＣＶ−１ａ（Ｈ）］を使用して、ＢＨＫ−２１細胞（ａ）をトランスフェクションしそしてin vitroで転写し、そして等量のＲＮＡｓをＦｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解物（ｂ）中で翻訳した。  （ａ）ＢＨＫ−２１細胞の二重の培養物を野生型又は突然変異した構築物でトランスフェクションした。各突然変異体バリアントの相対的活性を、図２の説明に記載のとおりに決定した。バーは、各々二重に行われた２つの別々の実験からの平均を表す。誤差バーは標準偏差を示す。  （ｂ）翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しそしてオートラジオグラフィーにより分析した。黒く塗られた矢頭及び開いた矢頭は、それぞれ、キメラコア＋１−ＬＵＣ及びＣＡＴタンパク質を示す。ＷＴ及びＮＣは、それぞれ、野生型及びネガティブコントロールを意味する。
【図５Ａ】ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物のコア＋１コード配列内の突然変異分析。  ＨＣＶ−１（Ａ、Ｃ）及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｂ、Ｄ）野生型（それぞれ、ｐＨＰＩ−１３３３及びｐＨＰＩ−１３３５）並びに突然変異させたプラスミド［それぞれ、ｐＨＰＩ−１３４２（Ｎ１）、−１３８０（Ｎ２１）、−１３８１（Ｎ２２）及びｐＨＰＩ−１３４５（Ｎ１）−１３９８（Ｎ２１、−１３９７（Ｎ２２）］をＢＨＫ−２１（ａ）及びＨｕｈ−７（ｂ）細胞又はＦｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解物（ｃ）中で発現させた。  （ａ）及び（ｂ）実験を二重に行いそして少なくとも２回反復した。各突然変異体バリアントの相対的活性を図２の説明に記載のとおりに決定した。バーは平均を表す。誤差バーは標準偏差に対応する。  （ｃ）翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しそしてオートラジオグラフィーにより分析した。ハイブリッドコア＋１−ＬＵＣ及びＣＡＴタンパク質の位置は、それぞれ、黒く塗られた矢頭及び開いた矢頭により示される。ＷＴ及びＮＣは、それぞれ、野生型及びネガティブコントロールを意味する。
【図５Ｂ】ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物のコア＋１コード配列内の突然変異分析。  ＨＣＶ−１（Ａ、Ｃ）及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｂ、Ｄ）野生型（それぞれ、ｐＨＰＩ−１３３３及びｐＨＰＩ−１３３５）並びに突然変異させたプラスミド［それぞれ、ｐＨＰＩ−１３４２（Ｎ１）、−１３８０（Ｎ２１）、−１３８１（Ｎ２２）及びｐＨＰＩ−１３４５（Ｎ１）−１３９８（Ｎ２１、−１３９７（Ｎ２２）］をＢＨＫ−２１（ａ）及びＨｕｈ−７（ｂ）細胞又はＦｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解物（ｃ）中で発現させた。  （ａ）及び（ｂ）実験を二重に行いそして少なくとも２回反復した。各突然変異体バリアントの相対的活性を図２の説明に記載のとおりに決定した。バーは平均を表す。誤差バーは標準偏差に対応する。  （ｃ）翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しそしてオートラジオグラフィーにより分析した。ハイブリッドコア＋１−ＬＵＣ及びＣＡＴタンパク質の位置は、それぞれ、黒く塗られた矢頭及び開いた矢頭により示される。ＷＴ及びＮＣは、それぞれ、野生型及びネガティブコントロールを意味する。
【図５Ｃ】ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物のコア＋１コード配列内の突然変異分析。  ＨＣＶ−１（Ａ、Ｃ）及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｂ、Ｄ）野生型（それぞれ、ｐＨＰＩ−１３３３及びｐＨＰＩ−１３３５）並びに突然変異させたプラスミド［それぞれ、ｐＨＰＩ−１３４２（Ｎ１）、−１３８０（Ｎ２１）、−１３８１（Ｎ２２）及びｐＨＰＩ−１３４５（Ｎ１）−１３９８（Ｎ２１、−１３９７（Ｎ２２）］をＢＨＫ−２１（ａ）及びＨｕｈ−７（ｂ）細胞又はＦｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解物（ｃ）中で発現させた。  （ａ）及び（ｂ）実験を二重に行いそして少なくとも２回反復した。各突然変異体バリアントの相対的活性を図２の説明に記載のとおりに決定した。バーは平均を表す。誤差バーは標準偏差に対応する。  （ｃ）翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しそしてオートラジオグラフィーにより分析した。ハイブリッドコア＋１−ＬＵＣ及びＣＡＴタンパク質の位置は、それぞれ、黒く塗られた矢頭及び開いた矢頭により示される。ＷＴ及びＮＣは、それぞれ、野生型及びネガティブコントロールを意味する。
【図５Ｄ】ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）単離物のコア＋１コード配列内の突然変異分析。  ＨＣＶ−１（Ａ、Ｃ）及びＨＣＶ−１ａ（Ｈ）（Ｂ、Ｄ）野生型（それぞれ、ｐＨＰＩ−１３３３及びｐＨＰＩ−１３３５）並びに突然変異させたプラスミド［それぞれ、ｐＨＰＩ−１３４２（Ｎ１）、−１３８０（Ｎ２１）、−１３８１（Ｎ２２）及びｐＨＰＩ−１３４５（Ｎ１）−１３９８（Ｎ２１、−１３９７（Ｎ２２）］をＢＨＫ−２１（ａ）及びＨｕｈ−７（ｂ）細胞又はＦｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解物（ｃ）中で発現させた。  （ａ）及び（ｂ）実験を二重に行いそして少なくとも２回反復した。各突然変異体バリアントの相対的活性を図２の説明に記載のとおりに決定した。バーは平均を表す。誤差バーは標準偏差に対応する。  （ｃ）翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しそしてオートラジオグラフィーにより分析した。ハイブリッドコア＋１−ＬＵＣ及びＣＡＴタンパク質の位置は、それぞれ、黒く塗られた矢頭及び開いた矢頭により示される。ＷＴ及びＮＣは、それぞれ、野生型及びネガティブコントロールを意味する。
【図６】コア＋１コード配列のコドンＡＴＧ５９８及びＡＴＧ６０４を標的化する突然変異の効果。  ＢＨＫ−２１（Ａ）及びＨｕｈ−７（Ｂ）細胞の二重の培養物を、ジシストロンＨＣＶ−１野生型（ｐＨＰＩ−１３３３）並びに突然変異させた構築物：ｐＨＰＩ−１３９９（Ｎ２３）、ｐＨＰＩ−１４００（Ｎ２４）及びｐＨＰＩ−（Ｎ２５）によりトランスフェクションした。各突然変異体バリアントの相対的活性を図２の説明に記載したとおりに計算した。バーは各々二重に行われた２つの別々の実験からの平均を表す。誤差バーは標準偏差を示す。ＷＴ及びＮＣは、それぞれ、野生型及びネガティブコントロールを意味する。
【図７Ａ】トランスフェクションされた細胞におけるキメラコア＋１−ＬＵＣタンパク質の発現  パネルＡ：モノシストロン構築物ｐＨＰＩ−１３６２（コア＋１−ＬＵＣ）及びｐＨＰＩ−１３６３（コア−１−ＬＵＣ）の略図である。  パネルＢ：ＢＨＫ−２１細胞の二重の培養物を、モノシストロンコア＋１−ＬＵＣ構築物ｐＨＰＩ−１３６２又はジシストロンコア＋１−ＬＵＣｐＨＰＩ−１３３３でトランスフェクションし、そして相対的ルシフェラーゼ活性を決定した。バーは２つの別々の実験からの平均を示す。誤差バーは標準偏差を表す。  パネルＣ：抗ＬＵＣヤギポリクローナル抗体を使用する、一過性にトランスフェクションされたＢＨＫ−２１細胞からのコア＋１−ＬＵＣ及びコア−１−ＬＵＣ含有モノシストロン構築物の［３５Ｓ］−メチオニン標識された翻訳産物の免疫沈殿。免疫沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、続いてオートラジオグラフィーにより分析した。in vivoで産生されたハイブリッドコア＋１−ＬＵＣタンパク質をドットによりマークした。開いた矢頭は、ウサギ網状赤血球溶解物中で合成された［３５Ｓ］−メチオニン標識されたコア＋１−ＬＵＣタンパク質を示す。ＮＣはネガティブコントロールを意味する。
【図７Ｂ】トランスフェクションされた細胞におけるキメラコア＋１−ＬＵＣタンパク質の発現  パネルＡ：モノシストロン構築物ｐＨＰＩ−１３６２（コア＋１−ＬＵＣ）及びｐＨＰＩ−１３６３（コア−１−ＬＵＣ）の略図である。  パネルＢ：ＢＨＫ−２１細胞の二重の培養物を、モノシストロンコア＋１−ＬＵＣ構築物ｐＨＰＩ−１３６２又はジシストロンコア＋１−ＬＵＣｐＨＰＩ−１３３３でトランスフェクションし、そして相対的ルシフェラーゼ活性を決定した。バーは２つの別々の実験からの平均を示す。誤差バーは標準偏差を表す。  パネルＣ：抗ＬＵＣヤギポリクローナル抗体を使用する、一過性にトランスフェクションされたＢＨＫ−２１細胞からのコア＋１−ＬＵＣ及びコア−１−ＬＵＣ含有モノシストロン構築物の［３５Ｓ］−メチオニン標識された翻訳産物の免疫沈殿。免疫沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、続いてオートラジオグラフィーにより分析した。in vivoで産生されたハイブリッドコア＋１−ＬＵＣタンパク質をドットによりマークした。開いた矢頭は、ウサギ網状赤血球溶解物中で合成された［３５Ｓ］−メチオニン標識されたコア＋１−ＬＵＣタンパク質を示す。ＮＣはネガティブコントロールを意味する。
【図７Ｃ】トランスフェクションされた細胞におけるキメラコア＋１−ＬＵＣタンパク質の発現  パネルＡ：モノシストロン構築物ｐＨＰＩ−１３６２（コア＋１−ＬＵＣ）及びｐＨＰＩ−１３６３（コア−１−ＬＵＣ）の略図である。  パネルＢ：ＢＨＫ−２１細胞の二重の培養物を、モノシストロンコア＋１−ＬＵＣ構築物ｐＨＰＩ−１３６２又はジシストロンコア＋１−ＬＵＣｐＨＰＩ−１３３３でトランスフェクションし、そして相対的ルシフェラーゼ活性を決定した。バーは２つの別々の実験からの平均を示す。誤差バーは標準偏差を表す。  パネルＣ：抗ＬＵＣヤギポリクローナル抗体を使用する、一過性にトランスフェクションされたＢＨＫ−２１細胞からのコア＋１−ＬＵＣ及びコア−１−ＬＵＣ含有モノシストロン構築物の［３５Ｓ］−メチオニン標識された翻訳産物の免疫沈殿。免疫沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、続いてオートラジオグラフィーにより分析した。in vivoで産生されたハイブリッドコア＋１−ＬＵＣタンパク質をドットによりマークした。開いた矢頭は、ウサギ網状赤血球溶解物中で合成された［３５Ｓ］−メチオニン標識されたコア＋１−ＬＵＣタンパク質を示す。ＮＣはネガティブコントロールを意味する。
【図８Ａ】ＨＣＶの種々のバリアント中のより短い形態のコア＋１コード配列の変動性。
【図８Ｂ】ＨＣＶの種々のバリアント中のより短い形態のコア＋１コード配列の変動性。
【図９】突然変異分析で使用されるオリゴヌクレオチド及び構築物のリスト。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2008500801.tif 000007
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2008500801.tif 000010
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2008500801.tif 000012
【図４】
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【図５Ａ】
2008500801.tif 000014
【図５Ｂ】
2008500801.tif 000015
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
2008500801.tif 000019
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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