(57)【要約】本発明は、約６から約８．５のｐＨでＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体を含み、この類似体が特異的ＩｇＧ４−Ｆｃ誘導体に融合された安定溶液製剤を提供する。これらの製剤により、前記範囲外のｐＨにおいてＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体と比較すると、予想外に、かなり高い化学的安定性がもたらされる。ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体を含む製剤は、糖尿病、肥満症、過敏性腸症候群、並びに血漿グルコースの低下、胃及び／若しくは腸運動の阻害並びに胃及び／若しくは腸内容排出の阻害、又は食品摂取の阻害にとって有益であると思われる他の症状の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約ｐＨ６から約ｐＨ８．５のｐＨにおいて治療上有効量のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体を含み、前記ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体が、
ａ）（配列番号１）Ｈｉｓ−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（式中、Ｘａａ８がＧｌｙ及びＶａｌから選択される）、
ｂ）（配列番号２）Ｈｉｓ−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（式中、Ｘａａ８がＧｌｙ及びＶａｌから選択される）、
ｃ）（配列番号３）Ｈｉｓ−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（式中、Ｘａａ８がＧｌｙ及びＶａｌから選択される）、
ｄ）（配列番号４）Ｈｉｓ−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（式中、Ｘａａ８がＧｌｙ及びＶａｌから選択される）、
ｅ）（配列番号５）Ｈｉｓ−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（式中、Ｘａａ８がＧｌｙ及びＶａｌから選択される）、及び
ｆ）（配列番号６）Ｈｉｓ−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（式中、Ｘａａ８がＧｌｙ及びＶａｌから選択される）からなる群から選択される配列を含むＧＬＰ−１類似体を含み、
前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号７：
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｘａａ８０−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｘａａ２３０（配列番号７）
［式中、１６位のＸａａがＰｒｏ又はＧｌｕであり、
１７位のＸａａがＰｈｅ、Ｖａｌ、又はＡｌａであり、
１８位のＸａａがＬｅｕ、Ｇｌｕ、又はＡｌａであり、
８０位のＸａａがＡｓｎ又はＡｌａであり、及び
２３０位のＸａａがＬｙｓ又は欠失している］
の配列を含む免疫グロブリンのＦｃ部分に融合される、安定溶液製剤。
【請求項２】
前記ｐＨが、約ｐＨ６から約ｐＨ７．５である、請求項１に記載の安定溶液製剤。
【請求項３】
前記ｐＨが、約ｐＨ６から約ｐＨ７である、請求項２に記載の安定溶液製剤。
【請求項４】
前記ｐＨが、約ｐＨ６から約ｐＨ６．５である、請求項３に記載の安定溶液製剤。
【請求項５】
前記ｐＨが約ｐＨ６である、請求項４に記載の安定溶液製剤。
【請求項６】
前記ｐＨが約ｐＨ６．５である、請求項４に記載の安定溶液製剤。
【請求項７】
前記製剤が、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を更に含む、請求項１に記載の安定溶液製剤。
【請求項８】
前記製剤が、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）を更に含む、請求項１に記載の安定溶液製剤。
【請求項９】
前記製剤が、ＮａＣｌを更に含む、請求項１に記載の安定溶液製剤。
【請求項１０】
前記製剤が、ｍ−クレゾールを更に含む、請求項１に記載の安定溶液製剤。
【請求項１１】
前記製剤が、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、ＮａＣｌ、及びｍ−クレゾールを更に含む、請求項１に記載の安定溶液製剤。
【請求項１２】
前記製剤が、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）、ＮａＣｌ、及びｍ−クレゾールを更に含む、請求項１に記載の安定溶液製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合蛋白質を安定化させる効果を有する蛋白質に融合したグルカゴン様ペプチド類似体の製剤に関する。これらの製剤は、糖尿病のみならず、他の様々な症状又は障害を治療するのに使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）類似体及び誘導体は、２型糖尿病の治療において、臨床試験で有望性が示されている。ＧＬＰ−１は、インスリン分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害、胃内容排出の阻害、胃運動若しくは腸運動の阻害、及び体重減少などの多くの生物学的作用を誘発する。ＧＬＰ−１の重要な特徴は、インスリン療法、又はインスリン発現を高めることによって作用するいくつかの種類の経口療法を用いる場合に認められる低血糖の危険性を伴わずに、インスリン分泌を刺激する能力である。
【０００３】
ＧＬＰ−１（１−３７）の活性は低く、また天然由来の２種の切欠型ペプチドであるＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ及びＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２はｉｎ  ｖｉｖｏで急速に排除され生体内半減期が極めて短いという事実から、ＧＬＰ−１ペプチドを用いた治療の有用性には限界があった。内在的に産生されるジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）は、Ｎ末端ヒスチジン及びアラニン残基を除去することによって血中ＧＬＰ−１ペプチドを不活性化し、生体内半減期が短くなる主因としてことが周知である。
【０００４】
ＧＬＰ−１ペプチドの排除半減期を延長するか、又は生物活性を維持しながらも身体からのペプチドのクリアランスを低減するために、種々のアプローチが行われている。１つのアプローチには、ＧＬＰ−１ペプチドを免疫グロブリンのＦｃ部分に融合することが包含される。通常、免疫グロブリンはｉｎ  ｖｉｖｏでの血中半減期が長い。
【０００５】
例えば、ＩｇＧ分子はヒトで２３日までにすることができる。免疫グロブリンのＦｃ部分は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのこのような安定性にある程度関与している。ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合蛋白質では、ＧＬＰ−１分子の生物活性を維持しながらも、免疫グロブリンのＦｃ部分によりもたらされる安定性が活用される。
【０００６】
このアプローチはＧＬＰ−１治療剤に対して実行可能である（国際公開第０２／４６２２７号パンフレット参照）が、長期にわたり繰り返して投与する場合には、種々の融合蛋白質の抗原性に関する一般的な懸念が生じてくる。これは、一旦この疾患と診断されると、糖尿病の患者は生涯治療を受けねばならない場合における特にＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体治療剤に対する懸念である。更に、Ｆｃ融合蛋白質治療剤は、Ｆｃ部分が望ましくないエフェクタ機能を保持する場合、懸念の対象になる可能性がある。このアプローチは、ＰＣＴ／ＵＳ０４／１５５９５（国際公開第２００５／０００８９２号パンフレット）の焦点であり、反復及び長期投与後に免疫応答を誘発する危険性が低減され、エフェクタ機能が維持されていない特異的ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合蛋白質を同定することによって、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体の投与に伴う潜在的免疫原性及びエフェクタ活性に関する問題が解決されることを示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この種の融合蛋白質を、合成又は細菌細胞での組換えにより産生するには、技術上あまりにも大きく且つ複雑すぎる。これらの融合蛋白質は、通常、ＣＨＯ、２９３、又はＮＳ０などの哺乳動物細胞において産生される。哺乳動物細胞で産生される融合蛋白質は、細菌細胞で産生される非融合蛋白質よりも内在性プロテアーゼによる分解と化学的変化を受けやすいことが観察された。本発明は、この問題を解決しようとしたものである。ｐＨ約６からｐＨ約８．５に緩衝したＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体を含む製剤によって、化学的安定性が高められることが発見されている。
【０００８】
（発明の要約）
ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体の化学的安定性の問題を解決するために、本発明者らは安定溶液製剤を開発している。具体的には、本発明者らは、ｐＨ約６からｐＨ約８．５、好ましくはｐＨ約６からｐＨ約７．５、ｐＨ約６からｐＨ約７、ｐＨ約６．５からｐＨ約７．５、又はｐＨ約６からｐＨ約６．５のｐＨ、更に好ましくは、ｐＨ約６又は約６．５において治療上有効量のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体を含む製剤により、これらの範囲外のｐＨのＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体と比較すると、予想外に、かなり高い化学的安定性がもたらされることを見出している。本発明は、非インスリン依存性のみならずインスリン依存性糖尿病、肥満、並びに種々の他の障害及び症状に見舞われている患者を治療する方法であって、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体の製剤を投与する工程を含む方法にも関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
融合蛋白質は、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＦｃ部分の類似体、又は免疫グロブリンのＦｃ部分の断片に融合したＧＬＰ−１化合物を含む。ＧＬＰ−１化合物のＣ末端を、直接、又はペプチドリンカーによって、Ｆｃ蛋白質のＮ末端に融合させてもよい。これらの融合蛋白質は生物活性を有し、天然型ＧＬＰ−１に比べて半減期が長い。膵臓のβ細胞のＧＬＰ−１受容体への結合によってそれらがインスリン分泌活性を呈するように、融合蛋白質の一部をなすＧＬＰ−１化合物には、天然型ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨとの充分な相同性を有する約２５から約３９個の天然由来又は非天然由来のアミノ酸を有するポリペプチドが包含される。ＧＬＰ−１化合物には、通常、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの類似体、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの断片又はＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ類似体の断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
【００１０】
製剤における有用な融合タンパク質の例には、
ａ）（配列番号１）Ｈｉｓ−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（式中、Ｘａａ８がＧｌｙ及びＶａｌから選択される）、
ｂ）（配列番号２）Ｈｉｓ−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（式中、Ｘａａ８がＧｌｙ及びＶａｌから選択される）、
ｃ）（配列番号３）Ｈｉｓ−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（式中、Ｘａａ８がＧｌｙ及びＶａｌから選択される）、
ｄ）（配列番号４）Ｈｉｓ−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（式中、Ｘａａ８がＧｌｙ及びＶａｌから選択される）、
ｅ）（配列番号５）Ｈｉｓ−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（式中、Ｘａａ８がＧｌｙ及びＶａｌから選択される）、及び
ｆ）（配列番号６）Ｈｉｓ−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（式中、Ｘａａ８がＧｌｙ及びＶａｌから選択される）からなる群から選択される配列を含むＧＬＰ−１類似体を含み、
前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号７：
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｘａａ８０−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｘａａ２３０（配列番号７）
［式中、１６位のＸａａがＰｒｏ又はＧｌｕであり、
１７位のＸａａがＰｈｅ、Ｖａｌ、又はＡｌａであり、
１８位のＸａａがＬｅｕ、Ｇｌｕ、又はＡｌａであり、
８０位のＸａａがＡｓｎ又はＡｌａであり、及び
２３０位のＸａａがＬｙｓ又は欠失している］
の配列を含む免疫グロブリンのＦｃ部分に融合される、融合タンパク質が含まれる。
【００１１】
融合蛋白質のＧＬＰ−１類似部分のＣ末端とＦｃ部分のＮ末端とは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号８）の配列を有する、Ｇを多く含むペプチドリンカーの１、１．５又は２のリピートによって一体に融合されるのが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の製剤において有用な融合蛋白質は、ＧＬＰ−１類似体部分とＦｃ部分とを含む。ＧＬＰ−１類似部分及びＦｃ部分は、天然型ＧＬＰ−１配列及びヒトＩｇＧ４配列への置換をそれぞれ含み、ヒトでの長期及び反復投与後に抗体形成を誘発する潜在性を低減しながらも、天然型ＧＬＰ−１又はＦｃ配列に融合されないＧＬＰ−１類似体と比較して効力及びｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性が向上した蛋白質を提供する。
【００１３】
天然型ＧＬＰ−１は、その分子から最初の６アミノ酸が切断されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏでプロセッシングを受ける。よって、当該技術分野の慣例によれば、ＧＬＰ−１のアミノ末端は第７位が充てられ、カルボキシ末端は３７位が充てられる。そのポリペプチドの他のアミノ酸は、配列番号９に示すように連続して付番されている。例えば、第８位アラニンであり第２２位はグリシンである。プロセッシングを受けたペプチドは、Ｃ末端グリシン残基が除去されてアミド基に置き換わるように、更にｉｎ  ｖｉｖｏで修飾されることがある。よって、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ及びＧＬＰ−１（７−３６）アミドが、分子の２つの天然型を表す。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨは、配列番号９のアミノ酸配列：
７Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１０Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−１５Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−２０Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−２５Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−３０Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−３５Ｇｌｙ−Ａｒｇ−３７Ｇｌｙ（配列番号９）を有する。
【００１４】
融合蛋白質のＧＬＰ−１類似部分は、天然型ＧＬＰ−１（７−３７）に対して第８、２２、及び３６位の３箇所での主要な置換がある。第８位の置換は、内在性酵素ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）が類似体を不活性化する速度を低下させる。ＤＰＰ−ＩＶは、第２及び第３番目のアミノ酸（第８位と第９位）の間で天然型ＧＬＰ−１を切断し、この結果得られる分子は活性が低い。従って、本発明の製剤において有用な融合蛋白質は、ＤＰＰ−ＩＶ抵抗性である。第２２位の置換によって、分子が凝集する潜在性が低下し、分子の効力は増大する。第８位及び２２位が変化した類似体にあっても、また全体の融合蛋白質にあっても、融合蛋白質がヒトにおける反復及び長期投与後の中和免疫応答を誘導する危険性が、第３６位の置換によって低減する。
【００１５】
ＧＬＰ−１類似体のＣ末端は、好ましくは以下の配列のうち１つである。Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１０）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１１）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ配列番号１２）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１３）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１４）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１５）
【００１６】
本発明の製剤において有用な融合蛋白質は、ヒトＩｇＧ４から誘導されるが、野生型ヒト配列と比較すると１又は複数が置換されているＦｃ部分を含んでいる。本願明細書で用いる、免疫グロブリンのＦｃ部分は、免疫学の分野における用語に通常充てられる意味を有する。具体的には、この用語は、抗体由来の２つの抗原結合領域（Ｆａｂ断片）を含まない抗体断片をいう。Ｆｃ部分は、非共有相互作用及びジスルフィド結合により会合する両方の重鎖由来の抗体の定常領域からなる。Ｆｃ部分はヒンジ領域を含み、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを通って抗体のＣ末端にまで伸びることができる。Ｆｃ部分は、更に１又は複数のグリコシル化部位を含むことができる。
【００１７】
異なるエフェクタ機能及び薬物動態特性を有するヒト免疫グロブリンには５つの型がある。ＩｇＧは５つの型のうち最も安定しており、ヒトでの血清半減期は約２３日である。４種のＩｇＧサブクラス（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、及びＧ４）があり、各々がエフェクタ機能として知られる異なる生物学的機能を有している。これらのエフェクタ機能は、一般的にＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用、又はＣ１ｑの結合及び補体の固定により媒介される。ＦｃγＲへの結合により、抗体依存性の細胞が媒介する細胞溶解を引き起こすことができ、一方補体因子への結合により、補体が媒介する細胞溶解を引き起こすことができる。Ｆｃ部分が半減期を延長するその能力のためのみに利用されるＦｃ融合蛋白質の設計において、いずれのエフェクタ機能も最低限にすることが重要である。よって、本発明の製剤において有用な融合蛋白質はヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域に由来するが、これは他のＩｇＧサブタイプに比べてＦｃγＲ及び補体因子に結合する能力が低いためである。しかしながら、ＩｇＧ４は、ヒトにおいて標的細胞を激減させることが示されている［Ｉｓｓａｃｓら、（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６：４２７−４３３］。融合蛋白質は膵臓のβ細胞を標的にしてインスリン発現を誘導するので、Ｆｃ融合蛋白質でＩｇＧ４由来領域を使用すると、膵臓ベータ細胞上に存在するＧＬＰ−１受容体との融合蛋白質の相互作用を通じて膵臓ベータ細胞に対する免疫応答を惹起する可能性がある。従って、融合蛋白質の一部であるＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、エフェクタ機能を排除するように置換されている。融合蛋白質のＩｇＧ４  Ｆｃ部分は、残基２３３でプロリンからグルタミン酸への置換、残基２３４でアラニン又はバリンからフェニルアラニンへの置換、及び残基２３５でアラニン又はグルタミン酸からロイシンへの置換の１種以上を含んでよい。（ＥＵ番号付け、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、
米国保健社会福祉省、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ、ＮＩＨ出版、Ｎｏ．９１−３２４２）。これらの残基は、配列番号７の第１６、１７及び１８位に対応する。更に、配列番号７の第８０位に対応する残基２９７（ＥＵ番号付け）のＡｌａをＡｓｎに置換することによる、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域におけるＮ−結合型グリコシル化部位の除去は、融合蛋白質に即して残余のエフェクタ活性が排除されることを確実にする別の方法である。
【００１８】
加えて、融合蛋白質のＩｇＧ４  Ｆｃ部分は、重鎖の二量体形成を安定化して半分のＩｇＧ４  Ｆｃ鎖の形成を防ぐように置換されている。融合蛋白質は、好ましくは、ジスルフィド結合及び種々の非共有相互作用によって結合される二量体として存在する。野生型ＩｇＧ４は、残基２２４（ＥＵ番号付け）で始まるＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（配列番号１６）モチーフを含む。１本のＧＬＰ−１類似体−Ｆｃ鎖において、このモチーフは別のＧＬＰ−１類似体−Ｆｃ鎖の対応するモチーフとジスルフィド結合を形成する。しかしながら、このモチーフにセリンが存在すると、単鎖の融合蛋白質の形成が引き起こされる。本発明は、ＩｇＧ４配列が、第２２８位（ＥＵ番号付け）のセリンがプロリン（配列番号７のアミノ酸残基１１）に置換されるように更に修飾されているＦｃ融合蛋白質を包含する。
【００１９】
天然型分子に存在するＣ末端リジン残基は、本願明細書に述べる融合蛋白質のＩｇＧ４誘導体Ｆｃ部分で欠失されていてよい（配列番号７の第２３０位；ｄｅｓ−Ｋと称する、欠失リジン）。リジンがＣ末端コドンによってコードされる、ある細胞型（ＮＳ０細胞など）で発現される融合蛋白質は、分子の一部がＣ末端アミノ酸としてリジンを有し、一部ではリジンが欠失しているという点で不均一である。この欠失は、哺乳動物細胞のある型における発現の際のプロテアーゼ作用に起因している。従って、この不均一性を回避するために、Ｆｃ融合体発現構築体はリジンに対するＣ末端コドンを欠くことが好ましい。
【００２０】
本願明細書に述べるＧＬＰ−１類似部分のＣ末端アミノ酸は、グリシンを多く含むリンカーによってＩｇＧ４  Ｆｃ類似部分に融合されることが好ましい。融合蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏでの機能及び安定性は、小ペプチドリンカーを付加して、潜在的に望ましくないドメイン相互作用を防ぐことによって至適化できる。更に、グリシンを多く含むリンカーは、ＧＬＰ−１類似部分が膵臓のベータ細胞などの標的細胞上のＧＬＰ−１受容体と産生的に相互作用できるよう、ある程度の構造的柔軟性をもたらす。しかしながら、これらのリンカーは、融合蛋白質がｉｎ  ｖｉｖｏで免疫原性となるリスクを著しく高める可能性がある。従って、その長さは、望ましくないドメイン相互作用を防止し、並びに／又は生物活性及び／若しくは安定性を至適化するのに必要な以上に長くないことが好ましい。グリシンを多く含む好ましいリンカーは、配列：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号８）を含む。このリンカーのコピーを融合蛋白質で更に多数用いてもよいが、長期及び反復投与に伴う免疫原性のリスクを最小限にするために、リンカーのコピーを１つ用いることが好ましい。
【００２１】
好ましいＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体には、以下の蛋白質及びこれら全てのＶａｌ８及びｄｅｓ−Ｋの形を含む。Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｙ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｙ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｙ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｎ２９７Ａ）Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｙ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｎ２９７Ａ）Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｙ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｙ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｙ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｎ２９７Ａ）Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｙ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｎ２９７Ａ）Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｙ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｙ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｙ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｎ２９７Ａ）Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｙ３６−ＧＬＰ−１（７−３７）−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｎ２９７Ａ）
【００２２】
特異的融合蛋白質を言及するのに本願明細書で用いる表記法は、融合蛋白質のＧＬＰ−１部分への特異的置換は、置換される特異的アミノ酸の後に残基番号を記したものを用いて示して規定する。ＧＬＰ−１（７−３７）は、成熟融合蛋白質のＧＬＰ−１部分がＨｉｓ第７位のＨｉｓで始まり第３７位のＧｌｙで終わることを示す。Ｌとは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号８）の配列を有するリンカーをいう。Ｌの直前に記す番号は、Ｆｃ部分からＧＬＰ−１部分を分かつリンカーの数を示す。１．５Ｌと特定するリンカーとは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１７）の配列をいう。ＩｇＧ４とは、配列番号７で示されるヒトＩｇＧ４  Ｆｃ配列の類似体をいう。融合蛋白質のＩｇＧ４  Ｆｃ領域における置換は、括弧内に示す。野生型アミノ酸は、その慣用略記に続けて、ＩｇＧ４の全配列に即した位置番号を、ＥＵ番号付けシステムを用いて付記し、その後に当該慣用略記により特定される位置で置換されているアミノ酸を付記することによって特定する。
【００２３】
融合蛋白質は、生物活性を有する。生物活性とは、融合蛋白質がｉｎ  ｖｉｖｏでＧＬＰ−１受容体に結合してこれを活性化させ、応答を誘発する能力をいう。応答として、インスリンの分泌、グルカゴンの抑制、食欲の阻害、体重減少、満腹感の誘発、アポトーシスの阻害、膵臓ベータ細胞増殖の誘発、及び膵臓ベータ細胞の分化が挙げられるが、これらに限定されることはない。代表的な数のＧＬＰ−１融合蛋白質を、インビトロだけでなくｉｎ  ｖｉｖｏの活性についても試験した。ヒトＧＬＰ−１受容体と相互作用してこれを活性化する融合蛋白質の能力に基づくインビトロ活性が示されている（ＰＣＴ／ＵＳ０４／１５５９５（国際公開第２００５／０００８９２号パンフレット）参照）。ヒトＧＬＰ−１受容体を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞が用いられる。これらの細胞におけるＧＬＰ−１受容体の活性化は、アデニリルシクラーゼの活性化を引き起こし、次に、サイクリックＡＭＰ応答性エレメント（ＣＲＥ）によって駆動されるレポーター遺伝子の発現を誘導する。
【００２４】
ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体製剤のｐＨは、許容できる安定性をもたらし、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体の溶解性及びインスリン分泌活性を維持し、腸管外投与に相応しいものになるように調整する。ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体製剤のｐＨは、ｐＨ約６からｐＨ約８．５、好ましくはｐＨ約６からｐＨ約７．５、ｐＨ約６からｐＨ約７、ｐＨ約６．５からｐＨ約７．５、又はｐＨ約６からｐＨ約６．５、更に好ましくは、ｐＨ約６又は約６．５に調整するのが好ましい。
【００２５】
本発明のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体を含む製剤は、薬理学的に許容できる緩衝液を任意に含んでよい。しかしながら、緩衝液の選択及び濃度は、許容できる安定性及びインスリン分泌活性を提供する前記範囲に製剤を調整できるものとすべきである。薬理学的に許容できる緩衝液の例として、第二リン酸ナトリウムのようなリン酸塩緩衝液、トリス、酢酸ナトリウムなどの酢酸塩、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸塩、酒石酸ナトリウム、ヒスチジン、リジン若しくはアルギニンなどの塩基性アミノ酸、又はグリシン及びグリシルグリシンなどの中性アミノ酸が挙げられる。他の薬理学的に許容できる緩衝液は、当該技術分野において周知である。好ましくは、緩衝液は、クエン酸塩、リン酸塩及びトリスからなる群より選択される。当業者であれば、緩衝液の選択が、前記ｐＨ範囲及びその緩衝液のｐＫａに依存することを認識するであろう。好ましくは、緩衝液の濃度は約１ｍＭから３０ｍＭである。更に好ましくは、この濃度は約４ｍＭから１４ｍＭ、又は約５ｍＭから２０ｍＭである。更に好ましくは、この濃度は約１０ｍＭから２０ｍＭである。更に好ましくは、この濃度は約１０ｍＭ又は約２０ｍＭである。
【００２６】
本発明の製剤は、保存剤を任意に含んでよい。しかしながら、保存剤の選択及び濃度は、許容できる安定性及びインスリン分泌活性を提供する前記範囲に製剤を調整できるものとすべきである。保存剤とは、医薬製剤に添加して抗菌剤として作用するような化合物をいう。腸管外用製剤は、商業的に存続可能な多用途製品となるよう、保存有効性に対する指針に適合しなければならない。腸管外用製剤において有効であり許容できるものとして当該技術分野において周知である保存剤には、フェノール保存剤、アルキルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、レソルシノール、及び他の類似の保存剤、並びにその種々の混合物がある。フェノール誘導体の例として、クレゾール及びフェノール又はクレゾールとフェノールとの混合物が挙げられる。クレゾールの例として、メタ−クレゾール、オルト−クレゾール、パラ−クレゾール、クロロ−クレゾール、又はその混合物が挙げられる。アルキルパラベンとは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルパラベン、又はその混合物をいう。アルキルパラベンの例として、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、又はブチルパラベンが挙げられる。保存剤の濃度は、当該技術分野において周知である。その濃度は、微生物の成長を遅延させ、保存有効性を維持するのに充分なものでなければならない。
【００２７】
好ましい保存剤は、メタ−クレゾール又はフェノールである。一般的に、メタ−クレゾールの濃度は約２．０から約８．０ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬから約４．５ｍｇ／ｍＬ、及び約２．０ｍｇ／ｍＬから約４．０ｍｇ／ｍＬである。製剤中の保存剤の最も好ましい濃度は、約２．７ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態において、フェノールの濃度は約２．０から約１０．０ｍｇ／ｍＬ、及び約４．０から約８．０ｍｇ／ｍＬである。製剤中の保存剤の最も好ましい濃度は、約５．０ｍｇ／ｍＬである。
【００２８】
本発明の製剤は、等張剤を任意に含んでよい。しかしながら、等張剤の選択及び濃度は、許容できる安定性及びインスリン分泌活性を提供する前記範囲に製剤を調整できるものとすべきである。等張剤とは、生理学的に寛容であり、製剤に好適な張度を付与して、水が細胞膜を通って純流動するのを妨げる化合物をいう。このような化合物の例として、グリセリン（又はグリセロール）、塩、例えば、ＮａＣｌ、及び糖、例えば、デキストロース、マンニトール、及びスクロースが挙げられる。これらの化合物は一般に、上記目的のために既知濃度で用いられる。１種以上の等張剤を添加して、イオン強度又は張度を調整してもよい。
【００２９】
好ましい等張剤はＮａＣｌである。ＮａＣｌの濃度は、好ましくは約１０ｍＭから５００ｍＭ、より好ましくは約５０ｍＭから２００ｍＭ、最も好ましくは約１５０ｍＭである。別の実施形態において、好ましい等張剤はマンニトールである。マンニトールの濃度は、好ましくは約１％（重量（ｗ）／体積（ｖ））から１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、約２％（ｗ／ｖ）から８％（ｗ／ｖ）である。別の実施形態において、好ましい等張剤はグリセリンである。グリセリンの濃度は、好ましくは約１２ｍｇ／ｍＬから２５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１２ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１７ｍｇ／ｍｌである。
【００３０】
本発明の製剤は、溶解性増強剤を任意に含んでよい。しかしながら、溶解性増強剤の選択及び濃度は、許容できる安定性及びインスリン分泌活性を提供する前記範囲に製剤を調整できるものとすべきである。溶解性増強剤は、保管条件下にＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体が長期間にわたり可溶性を保つように、安定性をもたらす。好ましくは、溶解性増強剤はニコチンアミドである。一般的に、ニコチンアミドの濃度は０．０１から２モル濃度である。ニコチンアミド濃度の他の好ましい範囲は、０．０５モル濃度から１．５モル濃度、０．１モル濃度から１．０モル濃度、０．１モル濃度から０．５モル濃度、０．５モル濃度から１．０モル濃度、及び０．１５モル濃度から０．２５モル濃度である。
【００３１】
Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（登録商標）（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような薬理学的に許容できる可溶化剤などの他の添加剤も、製剤に任意に添加してよい。好ましくは、可溶化剤はＴｗｅｅｎ２０（登録商標）又はＴｗｅｅｎ８０（登録商標）である。一般的に、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）又はＴｗｅｅｎ８０（登録商標）の濃度は、０．００１％から０．０５％である。Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）又はＴｗｅｅｎ８０（登録商標）の濃度の好ましい他の範囲は、０．００５％から０．０５％、０．００７５％から０．０５％、及び０．０１％から０．０５％である。
【００３２】
製剤の投与は、当業者である医師によって有効性が認められている、何れの経路を介してもよい。このような方法として挙げられるのが末梢腸管外法である。腸管外投与は、無菌シリンジ、又は注入ポンプなどの何らかの他の機械的装置による体内への剤形の注射として、医学文献で広く了知されている。末梢腸管外経路として挙げることができるのは、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内の投与経路である。
【００３３】
製剤は、非腸管外経路である、経口、経直腸、経鼻、又は下気道経路による投与が可能なものであってもよい。これらの非腸管外経路のうち、下気道経路及び経口経路が好ましい。
【００３４】
ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体を含む製剤は、多種多様な疾患及び症状を治療するために使用することができる。ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体は主に、「ＧＬＰ−１受容体」と称される受容体で作用することにより生物学的効果を奏する。従って、ＧＬＰ−１受容体刺激又はＧＬＰ−１化合物の投与に良好に応答する疾患及び／又は症状の被検者を、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体で処置することができる。これらの被検者は、「ＧＬＰ−１化合物での処置をする必要がある」又は「ＧＬＰ−１受容体刺激の必要がある」と称される。非インスリン依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、脳梗塞症（国際公開第００／１６７９７号パンフレット参照）、心筋梗塞症（国際公開第９８／０８５３１号パンフレット参照）、肥満症（国際公開第９８／１９６９８号パンフレット参照）、術後の代謝変化（米国特許第６，００６，７５３号明細書参照）、機能性消化不良及び過敏性腸症候群（国際公開第９９／６４０６０号パンフレット参照）の被検者が挙げられる。さらに、ＧＬＰ−１化合物での予防的処置を必要としている被検者、例えば、非インスリン依存性糖尿病を発症する危険がある被検者（国際公開第００／０７６１７号パンフレット参照）が挙げられる。耐糖能異常又は空腹時血糖障害の被検者、被検者の身長及び体躯に対する正常体重の約２５％以上を上回る体重の被検者、膵部分切除の被検者、親の１名以上が非インスリン依存性糖尿病である被検者、妊娠性糖尿病の病歴がある被検者、及び急性又は慢性膵炎の病歴がある被検者は、非インスリン依存性糖尿病を発症する危険がある。
【００３５】
前記製剤に即したＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体の有効量とは、ＧＬＰ−１受容体刺激の必要がある被検者に投与すると、許容できない副作用を起こすことなく所望の治療及び／又は予防効果が得られる量である。「所望の治療効果」には、以下の１種以上が含まれる。
１）疾患又は症状に関わる症状（１種以上）の寛解
２）疾患又は症状に関わる症状の発現の遅延
３）未治療時と比較した場合の寿命の延長
４）未治療時と比較した場合の生活の質の向上
例えば、糖尿病の治療に対するＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体の「有効量」は、未処置時よりも血中グルコース濃度の充分な制御がなされ、この結果、網膜症、神経障害、又は腎臓病などの糖尿病合併症の発現の遅延がもたらすと考えられる量である。糖尿病の予防に対するＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体の「有効量」は、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、インスリン及び／又はビスグアニジンなどの抗血糖降下剤での処置が必要な高血糖の発現を未処置時に比べて遅延させると考えられる量である。
【００３６】
患者の血糖を正常にするのに有効な融合蛋白質の用量は、多くの因子に依存する。これら因子に含まれるものとして、被検者の性、体重及び年齢、血糖調節不能の重症度、投与の経路及び生物学的利用能、融合蛋白質の薬物動態プロファイル、効力、並びに製剤が挙げられるが、これらに限定されない。用量は、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。
【００３７】
融合蛋白質は、２週間ごとに１回か、週１回のいずれかにて投与されることが好ましい。治療すべき疾患によっては、１週間に２〜３回など、更に高頻度での融合蛋白質の投与を必要とすることもある。
【００３８】
以下の実施例を参照して、本発明を非限定例により説明する。
【実施例】
【００３９】
インビトロＧＬＰ−１受容体活性化アッセイ：
ヒトＧＬＰ−１受容体を発現しているＨＥＫ−２９３細胞を、ポリ−ｄ−リジンが被覆された９６ウェルの透明底、黒色プレートに、２０，０００〜４０，０００細胞数／ウェル／１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地１００μｌで、ＣＲＥ−ＢＬＡＭシステムを用いて播種する。播種の翌日に、培地を振り落とし、８０μｌの無血漿ＤＭＥＭ培地を加える。播種後三日目に、異なる濃度の種々のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合蛋白質を含む０．５％ＢＳＡ含有無血漿ＤＭＥＭ培地を各ウェルに２０μｌ加えて、用量応答曲線を作成する。一般的に、３ナノモル濃度から３０ナノモル濃度のＧＬＰ−１Ｆｃ融合蛋白質を含有する１４種の希釈物を用いて用量応答曲線を作成し、これよりＥＣ５０値を求めることができる。融合蛋白質とのインキュベーションを５時間行った後、２０μｌのβ−ラクタマーゼ基質（ＣＣＦ２／ＡＭ、ＰａｎＶｅｒａ  ＬＬＣ）を添加してインキュベーションを１時間継続し、この時点で細胞蛍光を定量する。アッセイは更に、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８：８４−８８に記載されている。
【００４０】
インビトロＧＬＰ−１受容体活性化アッセイ：
ヒトＧＬＰ−１受容体を安定的に発現しているＨＥＫ−２９３細胞を、９６ウェルプレートに、３０，０００細胞数／ウェル／低血清ＤＭＥＭ  Ｆ１２培地８０μｌで、ＣＲＥ−ルシフェラーゼシステムを用いて播種する。播種の翌日に、０．５％ＢＳＡに溶解した被検蛋白質の分割量２０μｌを混合して、細胞と５時間インキュベートする。一般的に、細胞への添加前の各被検蛋白質につき５倍濃度にて、３ｐＭから３ｎＭを含有する１２種の希釈物を調製して用量応答曲線を作成し、これよりＥＣ５０値を求める。インキュベーション後に、１００μｌのルシフェラーゼ試薬を各プレートに直接添加して、２分間穏やかに混合する。プレートをＴｒｉ−ｌｕｘルミノメータに入れて、ルシフェラーゼ発現に起因する光の出力を計測する。
【００４１】
Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）の安定性に対するＴｗｅｅｎ、ＮａＣｌ、及びｐＨの効果：
０．５ｍｇ／ｍＬのＧｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）の化学的安定性に対するＴｗｅｅｎ２０（＋０．０１％）、ＮａＣｌ（０、１５０、及び５００ｍＭ）、並びにｐＨ（６．５、７．５、及び８．５）の効果を求める。それぞれの２ｘバッファストック液を、２０ｍＭリン酸塩、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５に溶解した１ｍｇ／ｍＬのＧｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）溶液と混合することによって、これらの条件の完全マトリックスを調製する。最終的な溶液状態のものを、０．２ミクロンＭｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルタを通してＨＰＬＣバイアルに末端濾取して、３７℃でインキュベートする。一定の時間間隔で取り出し、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及びゲル電気泳動によって分析する。
【００４２】
試料Ａ〜Ｒ（すべて、０．５ｍｇ／ｍＬのＧｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、２０ｍＭリン酸塩、及び２０ｍＭトリスを含有）についての製剤成分の同定
【表１】
2008525452.tif 000002
【００４３】
サイズ排除ＨＰＬＣのモニターによる、種々のＧＬＰ−Ｆｃ溶液状態のものについての３７℃での主ピーク率の変化
【表２】
2008525452.tif 000003
【表３】
2008525452.tif 000004
【表４】
2008525452.tif 000005
【００４４】
逆相ＨＰＬＣのモニターによる、種々のＧＬＰ−Ｆｃ溶液状態のものについての３７℃での主ピーク率の変化
【表５】
2008525452.tif 000006
【表６】
2008525452.tif 000007
【表７】
2008525452.tif 000008
【００４５】
サイズ排除又は逆相ＨＰＬＣのモニターによる、分解の線形速度（３７℃インキュベーションでの１週間当たりの主ピークの率変化）
【表８】
2008525452.tif 000009
【００４６】
サイズ排除ＨＰＬＣ法：
１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）を含む１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４の移動相緩衝液（Ａ−ポンプ緩衝液）で予備平衡化済のＴｏｓｏｈａｓ  ＴＳＫ３０００−ＳＷ−ＸＬ（５ミクロン、７．８ｘ３００ｍｍ）カラムに試料を注入する。Ａ−緩衝液を０．５ｍＬ／分（無勾配）で流しながら、蛋白質を２１４ｎｍで検出した。
【００４７】
逆相ＨＰＬＣ法：０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）移動相緩衝液（Ａ−ポンプ緩衝液）で予備平衡化済のＺｏｒｂａｘ３００ＳＢ−Ｃ８（４．６ｘ５０ｍｍ）カラムに試料を注入する。Ｂ−ポンプ緩衝液は、０．０８５％ＴＦＡを含むアセトニトリル（ｖ／ｖ）からなる。以下の勾配を実行して、２１４ｎｍで物質を検出した。
【００４８】
【表９】
2008525452.tif 000010
【００４９】
ゲル電気泳動法：
各時点の試料を４ｘＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ試料用緩衝液で希釈し（１ｘ最終濃度）、９５℃で５分間加熱する。冷却した試料を４−１２％ビス−トリスＮｕＰａｇｅゲルにロードした。ゲルを一定電圧（２００ボルト）で５０〜６０分間、ＭＯＰＳ緩衝液中で泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＳａｆｅＳｔａｉｎで染色する。
【００５０】
Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）の安定性及びＴｗｅｅｎ２０の効果：
３５０ｎｍでの濁度の増加を応力促進状態下（ＰＢＳ中３７℃で、疎水性撹拌子を用いて攪拌）に監視することにより、ｐＨ７．５の１ｘＰＢＳにおける０．３ｍｇ／ｍＬのＧｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）の安定性を評価する。
【００５１】
凝集の低減に対するＴｗｅｅｎ２０の効果
【表１０】
2008525452.tif 000011
【００５２】
溶液のｐＨに応じたＧｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）の溶解性：
異なるｐＨ値の種々の緩衝溶液で貯蔵溶液を希釈し、その溶液を平衡化させ、遠心分離して沈殿物をすべて除き、次いで残存している可溶性蛋白質濃度について上清を分析することにより、ｐＨに応じたＧｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）の溶解性を求める。ＰＢＳ中で凍結された貯蔵蛋白質を、およそｐＨ８で水に対して透析する。透析後に、蛋白質のストックを０．２２ミクロンＭｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルタに通して濾過し、リンス後のＵｌｔｒａｆｒｅｅ遠心分離装置（４ｍｌ、５０００ダルトンＭＷＣＯ）を用いて７０００ｘＧにて、およそ１２ｍｇ／ｍＬで濃縮した。この濃縮溶液を２ｘ貯蔵用緩衝溶液（０．５ｍＬエッペンドルフチューブ中、最終体積５０μＬ）で１：１に希釈して、室温にて１５〜３０分間平衡化させる。溶液を遠心分離（１４，０００ｘＧ、５分間）して、不溶性物質をすべてペレット化する。上清を１０μＬ取り出してｐＨ８の水４０μＬと合わせる。各試料に対して２度の反復実験を実施する。標準曲線に対して、逆相ＨＰＬＣにより可溶性ＧＬＰ−Ｆｃの濃度を定量する。
【００５３】
溶解性に対する溶液状態の効果
【表１１】
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【００５４】
逆相ＨＰＬＣ監視による、安定性に対する溶液のｐＨの効果：
およそｐＨ８に調整した水に対して、Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を透析する。透析後に、この蛋白質の貯蔵品を濾過し（０．２ミクロンＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ）、リンス後のＵｌｔｒａｆｒｅｅ遠心分離装置を用いて２ｍｇ／ｍＬより高濃度になるまで濃縮する。最終蛋白質濃度をＵＶによって定量して、１ｘに希釈した２ｘ製剤用バッファストック液により最終蛋白質濃度を１ｍｇ／ｍＬに保つように種々の製剤を作製する。溶液のｐＨをチェックし、必要に応じて調整する。これらの溶液を、１．８ｍＬのネジ蓋付き無菌ＨＰＬＣバイアルに末端濾過（０．２２ミクロンＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ、４ｍｍ）する。バイアルを３７℃に置き、各時点の試料を抜き取って、逆相、サイズ排除、及びゲル電気泳動により分析する。サイズ排除クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣ監視による、主ピーク率の変化を示す。３７℃でのインキュベーション時間に対する主ピークの純度のプロットを、サイズ排除及び逆相ＨＰＬＣデータに対してフィッティングすることによって得られる直線的分解速度を表に示す。
【００５５】
製剤パラメータの同定
【表１２】
2008525452.tif 000013
【００５６】
３７℃における保管での主ピーク率の変化
データは、サイズ排除クロマトグラフィーにより分析する。
【００５７】
【表１３】
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【表１４】
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【００５８】
３７℃における保管での主ピーク率の変化
データは、逆相クロマトグラフィーにより分析する。
【表１５】
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【表１６】
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【００５９】
３７℃サイズ排除又は逆相ＨＰＬＣのモニターによる、３７℃での分解速度。
【表１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月10日(2007.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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