(57)【要約】  新規なプロトオンコ遺伝子およびそこにコードされるタンパク質が開示される。ヒトの発癌に関与し、同時に癌転移を誘導する能力を有する新規な遺伝子である本発明のプロトオンコ遺伝子は、肺癌、白血病、子宮癌、リンパ腫、結腸癌、皮膚癌などを含む癌を診断すること、ならびに形質転換動物を作製する場合などのために効果的に使用してもよい。
2008525045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、および配列番号３４から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するヒトプロトオンコタンパク質。
【請求項２】
配列番号１のヌクレオチド配列の８９〜７０９位に対応するＤＮＡ配列、配列番号５のヌクレオチド配列の１１３〜１６２７位に対応するＤＮＡ配列、配列番号９のヌクレオチド配列の２３〜１２７６位に対応するＤＮＡ配列、配列番号１３のヌクレオチド配列の１１〜８４４位に対応するＤＮＡ配列、配列番号１７のヌクレオチド配列の６７〜１１２５位に対応するＤＮＡ配列、配列番号２１のヌクレオチド配列の２１５〜２２１２位に対応するＤＮＡ配列、配列番号２５のヌクレオチド配列の６５〜２９６５位に対応するＤＮＡ配列、配列番号２９のヌクレオチド配列の１５９〜７３７位に対応するＤＮＡ配列、および配列番号３３のヌクレオチド配列の１４３５〜１６８５位に対応するＤＮＡ配列から成る群より選択されるＤＮＡ配列を有し、前記ＤＮＡ配列の各々が請求項１で定義される前記ヒトプロトオンコタンパク質をコードする、ヒトプロトオンコ遺伝子。
【請求項３】
配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９および配列番号３３から成る群より選択されるＤＮＡ配列を有する、請求項２に記載のヒトプロトオンコ遺伝子。
【請求項４】
請求項２または３に定義される前記プロトオンコ遺伝子の各々を含むベクター。
【請求項５】
請求項１に定義される前記プロトオンコタンパク質の各々を含む癌および癌転移を診断するためのキット。
【請求項６】
請求項２または３に定義される前記プロトオンコ遺伝子の各々を含む癌および癌転移を診断するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以前に報告されたプロトオンコ遺伝子と相同性を有さないが、癌転移を誘導する能力を有する新規なプロトオンコ遺伝子；およびそこにコードされるタンパク質に関する。
【０００２】
背景技術
ヒトを含む高等動物は約３０，０００個の遺伝子を有しているが、しかし、これら遺伝子のうち約１５パーセントのみが各々の対象において発現することが一般的に知られている。したがって、すべての生命現象、すなわち、発生、分化、恒常性、刺激に対する反応、細胞分裂周期の調節、老化およびアポトーシス（プログラム細胞死）などは、いずれの遺伝子が選択され、発現するかに依存して決定される（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ａｎｄ  Ａ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９６７−９７１，１９９２）。
【０００３】
腫瘍形成のような病理学的現象は、遺伝的変異によって誘導され、遺伝子発現の変化を生じる。したがって、異なる細胞間における遺伝子発現の比較は、種々の生物学的メカニズムを理解するための基本的かつ基礎的な方法であり得る。例えば、Ｌｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｅｅ（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ａｎｄ  Ａ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９６７−９７１，１９９２）によって提案されたｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイ法は、腫瘍抑制遺伝子、細胞周期調節に関連する遺伝子、およびアポトーシスに関連する転写調節遺伝子などを検索するために有効に使用されており、また、１個の細胞においてのみ生じる種々の遺伝子の相関関係を特定するために広範に利用されている。
【０００４】
発癌の種々の結果を総合して、特定の染色体異型接合性の消失、プロトオンコ遺伝子の活性化、およびｐ５３遺伝子を含む他の腫瘍抑制遺伝子の不活化のような種々の遺伝的変化が腫瘍組織に蓄積され、ヒト腫瘍を発生すると報告されている（Ｂｉｓｈｏｐ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｅｌｌ  ６４：２３５−２４８，１９９１；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．，Ｃｅｌｌ  ６４：２４９−２７０，１９９１）。また、癌の１０〜３０％はプロトオンコ遺伝子を増幅することによって活性化されると報告された。結果として、プロトオンコ遺伝子の活性化は、多くの癌の病因学的研究において重要な役割を果たし、それにより、その役割を特定するための試みが行われてきた。
【０００５】
したがって、本発明者らは、肺癌および子宮頸癌が発生するためのメカニズムをプロトオンコ遺伝子レベルで研究し、その結果、ヒト移動−誘発（migration-inducing）遺伝子と命名されたプロトオンコ遺伝子が癌細胞中でのみ発現レベルの特異的な増加を示すことがわかった。プロトオンコ遺伝子は、肺癌、白血病、子宮癌、リンパ腫、結腸癌、皮膚癌のなど種々の癌を診断、予防および治療するために効果的に使用される場合がある。
【０００６】
発明の開示
したがって、本発明は、先行技術の問題を解決することを意図し、これにより、新規なプロトオンコ遺伝子およびそれらのフラグメントを提供することが本発明の目的である。
【０００７】
プロトオンコ遺伝子およびそれらのフラグメントの各々を含む組換えベクター；およびその組換えベクターの各々によって形質転換した微生物を提供することが、本発明の別の目的である。
【０００８】
プロトオンコ遺伝子；およびそれらのフラグメントの各々によってコードされるタンパク質を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【０００９】
プロトオンコ遺伝子またはそれらのフラグメントの各々を含む、癌および癌転移を診断するためのキットを提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１０】
タンパク質またはそれらのフラグメントの各々を含む、癌および癌転移を診断するためのキットを提供することが、本発明のまたさらに別の目的である。
【００１１】
上記の目的を達成するために、本発明は、配列番号１のＤＮＡ配列を有するプロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを提供する。
【００１２】
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター；およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
【００１３】
さらに別の目的において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのフラグメントを提供する。
【００１４】
本発明は、配列番号５のＤＮＡ配列を有するプロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを提供する。
【００１５】
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター；およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
【００１６】
さらに別の目的において、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質；またはそのフラグメントを提供する。
【００１７】
本発明は、配列番号９のＤＮＡ配列を有するプロトオンコ遺伝子；またはそのフラグメントを提供する。
【００１８】
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター；およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
【００１９】
さらに別の目的において、本発明は、配列番号１０アミノ酸配列を有するタンパク質；またはそのフラグメントを提供する。
【００２０】
本発明は配列番号１３のＤＮＡ配列を有するプロトオンコ遺伝子；またはそのフラグメントを提供する。
【００２１】
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター；およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
【００２２】
さらに別の目的において、本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するタンパク質；またはそのフラグメントを提供する。
【００２３】
本発明は、配列番号１７のＤＮＡ配列を有するプロトオンコ遺伝子；またはそのフラグメントを提供する。
【００２４】
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター；およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
【００２５】
さらに別の目的において、本発明は配列番号１８のアミノ酸配列を有するタンパク質；またはそのフラグメントを提供する。
【００２６】
本発明は、配列番号２１のＤＮＡ配列を有するプロトオンコ遺伝子；またはそのフラグメントを提供する。
【００２７】
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター；およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
【００２８】
さらに別の目的において、本発明は、配列番号２２のアミノ酸配列を有するタンパク質；またはそのフラグメントを提供する。
【００２９】
本発明は、配列番号２５のＤＮＡ配列を有するプロトオンコ遺伝子；またはそのフラグメントを提供する。
【００３０】
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター；およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
【００３１】
さらに別の目的において、本発明は、配列番号２６のアミノ酸配列を有するタンパク質；またはそのフラグメントを提供する。
【００３２】
本発明は、配列番号２９のＤＮＡ配列を有するプロトオンコ遺伝子；またはそのフラグメントを提供する。
【００３３】
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター；およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
【００３４】
さらに別の目的において、本発明は、配列番号３０のアミノ酸配列を有するタンパク質；またはそのフラグメントを提供する。
【００３５】
本発明は配列番号３３のＤＮＡ配列を有するプロトオンコ遺伝子；またはそのフラグメントを提供する。
【００３６】
別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子またはそのフラグメントを含む組換えベクター；およびその組換えベクターによって形質転換した微生物を提供する。
【００３７】
さらに別の目的において、本発明は、配列番号３４のアミノ酸配列を有するタンパク質；またはそのフラグメントを提供する。
【００３８】
さらに別の目的において、本発明は、上記プロトオンコ遺伝子およびそれらのフラグメントを含む、癌および癌転移を診断するためのキットを提供する。
【００３９】
さらに別の目的において、本発明は、上記プロトオンコタンパク質およびそれらのフラグメントを含む、癌および癌転移を診断するためのキットを提供する。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態のこれらおよび他の特徴、態様、および利点を、添付の図面を参照して、上記の詳細な説明において、より完全に説明する。
【００４１】
本明細書において以下では、本発明の好ましい態様を添付の図面を参照して詳細に記載する。
【００４２】
１．ＭＩＧ３
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子３（ＭＩＧ３）（本明細書において以下では、ＭＩＧ３プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。）は、配列番号１に示される２，２９５ｂｐ全長ＤＮＡ配列を有する。
【００４３】
配列番号１のＤＮＡ配列において、８９〜７０９位のヌクレオチド配列（７０７〜７０９位：終止コドン）に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号２に示され、２０６アミノ酸を含む（本明細書において以下では、「ＭＩＧ３タンパク質」と呼ぶ。）。
【００４４】
配列番号１のＤＮＡ配列は、米国国立衛生研究所（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ２３９２９３で寄託され（公開日：２００４年１２月３１日）、ＤＮＡ配列決定の結果は、そのＤＮＡ配列がアクセッション番号ＡＫ０２７１６６でこのデータベースに寄託されたＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ：ＦＬＪ２３５１３  ｆｉｓ，クローンＬＮＧ０３８６９遺伝子のＤＮＡ配列と類似していたことを明らかにした。本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は２０６アミノ酸を含み、そして配列番号２に示されるアミノ酸配列および約２３ｋＤａの分子量を有する。
【００４５】
２．ＭＩＧ８
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子８（ＭＩＧ８）（本明細書において以下では、ＭＩＧ８プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。）は、配列番号５に示される３，７３７ｂｐ全長ＤＮＡ配列を有する。
【００４６】
配列番号５のＤＮＡ配列において、１１３〜１６２７位のヌクレオチド配列（１６２５〜１６２７位：終止コドン）に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号６に示され、６６５アミノ酸を含む（本明細書において以下では、「ＭＩＧ８タンパク質」と呼ぶ。）。
【００４７】
配列番号５のＤＮＡ配列は、米国国立衛生研究所（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ３１１３８９で寄託され（公開日：２００４年１２月３１日）、ＤＮＡ配列決定の結果は、そのＤＮＡ配列がアクセッション番号ＮＭ＿００６５９５およびＮＭ＿０２１１１２でこのデータベースに寄託されたＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓアポトーシスインヒビター５（ＡＰＩ５）遺伝子のＤＮＡ配列と同一であったが、そのＤＮＡ配列のいくつかはＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓアポトーシスインヒビター５（ＡＰＩ５）遺伝子のＤＮＡ配列とは異なっていたことを明らかにした。
【００４８】
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は５０４アミノ酸を含み、そして配列番号６に示されるアミノ酸配列および約５７ｋＤａの分子量を有する。
【００４９】
３．ＭＩＧ１０
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子１０（ＭＩＧ１０）（本明細書において以下では、ＭＩＧ１０プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。）は、配列番号９に示される１，３２１ｂｐ全長ＤＮＡ配列を有する。
【００５０】
配列番号９のＤＮＡ配列において、２３〜１２７６位のヌクレオチド配列（１２７４〜１２７６位：終止コドン）に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号１０に示され、４１７アミノ酸を含む（本明細書において以下では、「ＭＩＧ１０タンパク質」と呼ぶ。）。
【００５１】
配列番号９のＤＮＡ配列は、米国国立衛生研究所（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ４２３７２５で寄託され（公開日：２００４年１２月３１日）、ＤＮＡ配列決定の結果は、そのＤＮＡ配列がアクセッション番号ＢＣ０２３２３４およびＮＭ＿０００２９１でそれぞれこのデータベースに寄託されたＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子およびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）遺伝子のＤＮＡ配列と同一であったことを明らかにした。
【００５２】
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は４１７アミノ酸を含み、そして配列番号１０に示されるアミノ酸配列および約４５ｋＤａの分子量を有する。
【００５３】
４．ＭＩＧ３
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子１３（ＭＩＧ１３）（本明細書において以下では、ＭＩＧ１３プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。）は、配列番号１３に示される１，０１９ｂｐ全長ＤＮＡ配列を有する。
【００５４】
配列番号１３のＤＮＡ配列において、１１〜８４４位のヌクレオチド配列（８４２〜８４４位：終止コドン）に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号１４に示され、２７７アミノ酸を含む（本明細書において以下では、「ＭＩＧ１３タンパク質」と呼ぶ。）。
【００５５】
配列番号１３のＤＮＡ配列は、米国国立衛生研究所（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ３３６０９０で寄託され（公開日：２００４年１２月３１日）、ＤＮＡ配列決定の結果は、そのＤＮＡ配列がアクセッション番号ＣＲ６１３０８７でこのデータベースに寄託されたＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）のＢ細胞（Ｒａｍｏｓ細胞株）  Ｃｏｔ  ２５−標準化の全長ｃＤＮＡクローンＣＳ０ＤＬ００１ＹＥ０２の遺伝子のＤＮＡ配列と類似していたことを明らかにした。
【００５６】
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は２７７アミノ酸を含み、そして配列番号１４に示されるアミノ酸配列および約３１ｋＤａの分子量を有する。
【００５７】
５．ＭＩＧ１４
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子１４（ＭＩＧ１４）（本明細書において以下では、ＭＩＧ１４プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。）は、配列番号１７に示される１，１４２ｂｐ全長ＤＮＡ配列を有する。
【００５８】
配列番号１７のＤＮＡ配列において、６７〜１１２５位のヌクレオチド配列（１１２３〜１１２５位：終止コドン）に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号１８に示され、２０６アミノ酸を含む（本明細書において以下では、「ＭＩＧ１４タンパク質」と呼ぶ。）。
【００５９】
配列番号１７のＤＮＡ配列は、米国国立衛生研究所（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ３３６０９１で寄託され（公開日：２００４年１２月３１日）、ＤＮＡ配列決定の結果は、そのＤＮＡ配列がアクセッション番号ＮＭ＿００３６１０およびＣＲ６２６７２８でそれぞれこのデータベースに寄託されたＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＲＡＥｌ  ＲＮＡ搬出１ホモログ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）（ＲＡＥｌ）およびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）の胎盤  Ｃｏｔ  ２５−正常化の全長ｃＤＮＡクローンＣＳ０ＤＩ００２ＹＰ１８の遺伝子のＤＮＡ配列と同一であったことを明らかにした。
【００６０】
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は３５２アミノ酸を含み、そして配列番号１８に示されるアミノ酸配列および約３９ｋＤａの分子量を有する。
【００６１】
６．ＭＩＧ１８
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子１８（ＭＩＧ１８）（本明細書において以下では、ＭＩＧ１８プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。）は、配列番号２１に示される３，６３３ｂｐ全長ＤＮＡ配列を有する。
【００６２】
配列番号２１のＤＮＡ配列において、２１５〜２２１２位のヌクレオチド配列（２２１０〜２２１２位：終止コドン）に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号２２に示され、６６５アミノ酸を含む（本明細書において以下では、「ＭＩＧ１８タンパク質」と呼ぶ。）。
【００６３】
ＤＮＡ配列決定の結果は、本発明のＭＩＧ１８プロトオンコ遺伝子が、ｃ−Ｃｂｌ遺伝子（Ｌａｎｇｄｏｎ，Ｗ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：  １１６８−１１７２，  １９８９）への結合によって上皮増殖因子に関連したシグナルを伝達するように機能するＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＳＨ３−ドメインキナーゼ結合タンパク質１（ＳＨ３ＫＢＰ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３１８９２）  （Ｔａｋｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６８：３２１−３２８，２０００）と同じタンパク質配列を有していたが、そのＤＮＡ配列のいくつかは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＳＨ３−ドメインキナーゼ結合タンパク質１遺伝子の配列とは異なっていたことを明らかにした。
【００６４】
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は６６５アミノ酸を含み、そして配列番号２２に示されるアミノ酸配列および約７３ｋＤａの分子量を有する。
【００６５】
７．ＭＩＧ１９
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子１９（ＭＩＧ１９）（本明細書において以下では、ＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。）は、配列番号２５に示される４，６３９ｂｐ全長ＤＮＡ配列を有する。
【００６６】
配列番号２５のＤＮＡ配列において、６５〜２９６５位のヌクレオチド配列（２９６３〜２９６５位：終止コドン）に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号２６に示され、９６６アミノ酸を含む（本明細書において以下では、「ＭＩＧ１９タンパク質」と呼ぶ。）。
【００６７】
配列番号２５のＤＮＡ配列は、米国国立衛生研究所（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ４５０３０８で寄託され（公開日：２００４年１２月３１日）、ＤＮＡ配列決定の結果は、そのＤＮＡ配列がアクセッション番号ＮＭ＿０３１８６２でこのデータベースに寄託されたＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ膜成分、１７染色体、表面マーカー２  （卵巣癌抗原ＣＡ１２５）（Ｍ１７Ｓ２）、転写変異体３遺伝子のＤＮＡ配列と同一であったが、その配列のいくつかは上記遺伝子の配列とは異なっていたことを明らかにした。
【００６８】
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は９６６アミノ酸を含み、そして配列番号２６に示されるアミノ酸配列および約１０７ｋＤａの分子量を有する。
【００６９】
８．ＭＩＧ５
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子５（ＭＩＧ５）（本明細書において以下では、ＭＩＧ５プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。）は、配列番号２９に示される８３３ｂｐ全長ＤＮＡ配列を有する。
【００７０】
配列番号２９のＤＮＡ配列において、１５９〜７３７位のヌクレオチド配列（７３５〜７３７位：終止コドン）に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号３０に示され、１９２アミノ酸を含む（本明細書において以下では、「ＭＩＧ５タンパク質」と呼ぶ。）。
【００７１】
配列番号２９のＤＮＡ配列は、米国国立衛生研究所（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ２７９３８４で寄託され（公開日：２００４年１２月３１日）、ＤＮＡ配列決定の結果は、そのＤＮＡ配列がアクセッション番号ＮＭ＿００６９０８でこのデータベースにそれぞれ寄託されたＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１（ｒｈｏファミリー、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ１）（ＲＡＣｌ）、転写変異体Ｒａｃ１遺伝子のＤＮＡ配列と同一であったことを明らかにした。
【００７２】
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は１９２アミノ酸を含み、そして配列番号３０に示されるアミノ酸配列および約２１ｋＤａの分子量を有する。
【００７３】
９．ＭＩＧ７
本発明のプロトオンコ遺伝子、移動−誘発遺伝子７（ＭＩＧ７）（本明細書において以下では、ＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子と呼ぶ。）は、配列番号３３に示される２，３６４ｂｐ全長ＤＮＡ配列を有する。
【００７４】
配列番号３３のＤＮＡ配列において、１４３５〜１８６５位のヌクレオチド配列（１６８３〜１６８５位：終止コドン）に対応するオープンリーディングフレームは全長タンパク質コード領域であり、タンパク質コード領域から導かれるアミノ酸配列は配列番号３４に示され、７６アミノ酸を含む（本明細書において以下では、「ＭＩＧ７タンパク質」と呼ぶ。）。
【００７５】
配列番号３３のＤＮＡ配列は、米国国立衛生研究所（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ３０５８７２で寄託され（公開日：２００４年１２月３１日）、ＤＮＡ配列決定の結果は、そのＤＮＡ配列のいくつかがアクセッション番号ＮＧ＿００１３３２で寄託された１４染色体上のＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｔ細胞受容体アルファデルタ遺伝子座（ＴＣＲＡ／ＴＣＲＤ）の遺伝子、アクセッション番号ＡＥ０００６５８、ＡＥ０００５２１およびＵ８５１９５で寄託された完全ヌクレオチド配列の１〜２５０５２９塩基（５つのうちのセクション１）からのＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｔ細胞受容体アルファデルタ遺伝子座、ならびにアクセッション番号ＡＦ２８３９９１で寄託されたＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｎ６−アデノシン）−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列と同一であったことを明らかにした。
【００７６】
本発明のプロトオンコ遺伝子から発現したタンパク質は７６アミノ酸を含み、そして配列番号３４に示されるアミノ酸配列および約９ｋＤａの分子量を有する。
【００７７】
一方、コドンの縮重のために、または生きている生物にとってのプロトオンコ遺伝子を発現するための優先度を考慮すると、本発明のプロトオンコ遺伝子は、コード領域から発現する発癌性タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなくコード領域中で様々に修飾されてもよく、そしてまた遺伝子発現に影響を与えない範囲でコード領域以外の領域中で様々に修飾もしくは変化してもよい。このような修飾された遺伝子もまた本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明はまた、プロトオンコ遺伝子およびプロトオンコ遺伝子のフラグメントと実質的に同じＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを含む。「実質的に同じポリヌクレオチド」という用語は、同じ翻訳されるタンパク質産物をコードし、かつ本発明のプロトオンコ遺伝子と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは９５％のＤＮＡ配列の相同性を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００７８】
また、１つ以上のアミノ酸もまた、タンパク質の機能を変化させない範囲内で、そのタンパク質のアミノ酸配列の中で置換、付加、または欠失されてもよく、そしてそれらの用法に依存してタンパク質のある部分のみを使用してもよい。このような修飾されたアミノ酸配列もまた本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明はまた、発癌性タンパク質およびそのタンパク質のフラグメントと実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「実質的に同じポリペプチド」という用語は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは９５％の配列相同性を有するポリペプチドを意味する。
【００７９】
本発明のプロトオンコ遺伝子またはプロトオンコタンパク質は、ヒト組織から分離されるか、ＤＮＡまたはペプチドを合成するための既知の方法に従って合成してもよい。また、このように調製した遺伝子は、発現ベクターを得るために、当該分野において公知である微生物中での発現のためにベクターに挿入してもよく、その後、この発現ベクターは、適切な宿主、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、酵母細胞などに導入してもよい。本発明の遺伝子のＤＮＡを大量に複製してもよく、またはそのタンパク質を、このような形質転換宿主において商業的な量で産生してもよい。
【００８０】
発現ベクターを構築する際に、プロモーターおよびターミネーター、自律的複製配列、分泌シグナルなどのＤＮＡ調節配列は、遺伝子またはタンパク質を産生する宿主細胞の種類に依存して、適切に選択および組み合わせしてもよい。
【００８１】
本発明の遺伝子は、肺癌の発生が可能である強力な発癌遺伝子であることが判明している。なぜなら、これらの遺伝子は、ノーザンブロッティングなどの分析方法において、正常肺細胞においてはほとんど発現しなかったが、肺癌組織および肺癌細胞株において過剰発現したからである。また、これらの遺伝子は、その発現が転移性リンパ節癌組織において増加していることを考慮すると、癌転移を誘導することが可能である癌転移関連遺伝子であることが判明している。肺癌などの上皮組織に加えて、本発明のプロトオンコ遺伝子は、白血病、子宮癌、リンパ腫、結腸癌、皮膚癌などの他の癌性腫瘍組織において高度に発現している。したがって、本発明のプロトオンコ遺伝子は、種々の発癌における共通の癌遺伝子であると見なされ、種々の癌を診断するため、および形質転換動物を作製するために使用してもよい。
【００８２】
例えば、プロトオンコ遺伝子を使用して癌を診断するための方法には、すべてまたはいくつかのプロトオンコ遺伝子がプローブとして使用し、被験体の体液から抽出した核酸とハイブリダイズした後で、種々の公知の方法においてプロトオンコ遺伝子を検出することによって、被験体が本発明のプロトオンコ遺伝子を有するか否かを決定する工程が含まれる。これらの遺伝子が組織試料中に存在することは、放射性同位元素、酵素などを用いて標識したプローブを使用することによって容易に確認することができる。したがって、本発明は、すべてまたはいくつかのプロトオンコ遺伝子を含む癌を診断するためのキットを提供する。
【００８３】
形質転換動物は、哺乳動物、例えば、ラットなどの齧歯類に本発明のプロトオンコ遺伝子を導入することによって得られてもよく、これらのプロトオンコ遺伝子は、好ましくは、少なくとも８細胞段階より前の受精卵段階で導入される。このように調製した形質転換動物は、発癌物質または抗癌物質、例えば、抗酸化剤を探索するために効果的に使用してもよい。
【００８４】
本発明のプロトオンコ遺伝子から導かれるタンパク質は、診断ツールとして抗体を産生するために効果的に使用してもよい。本発明の抗体は、本発明のプロトオンコ遺伝子またはそれらのフラグメントから発現したタンパク質を使用して、当該分野で公知の従来の方法に従って、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体として産生してもよく、この理由から、このような抗体は、当該分野において公知である方法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチアッセイ、ウェスタンブロッティング、またはポリアクリルアミドゲル上でのイムノブロッティングなどを使用して、本発明のタンパク質が被験体の体液試料中で発現されているか否かを決定することによって、癌または癌転移を診断するために使用してもよい。
【００８５】
また、本発明のプロトオンコ遺伝子は、制御されない様式で増殖し続けることができる癌細胞株を樹立するために使用してもよく、このような細胞株は、例えば、プロトオンコ遺伝子でトランスフェクトした線維芽細胞を使用して、ヌードマウスの背部に発生させた腫瘍組織から産生してもよい。このような癌細胞株は、抗癌剤などを探索するために効果的に使用してもよい。
【００８６】
本明細書において以下では、本発明は好ましい実施例を参照して詳細に説明する。
【００８７】
しかし、本明細書で提案される説明は、例示的目的のための好ましい実施例に過ぎず、本明細書の範囲を限定することを意図するものではない。
【００８８】
実施例１：腫瘍細胞の培養および総ＲＮＡの分離
１−１：ＭＩＧ３、ＭＩＧ１０、ＭＩＧ１３およびＭＩＧ１４
（工程１）腫瘍細胞の培養
ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイ法を行うために、正常肺組織を入手し、そして原発性肺癌組織および右肺に転移した癌組織を、以前に外科手術の際に抗癌剤治療および／または放射線治療を受けていない癌患者から入手した。Ａ５４９（アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）；ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）をディファレンシャルディスプレイ法におけるヒト肺癌細胞株として使用した。
【００８９】
入手した組織から得られた細胞およびＡ５４９肺癌細胞株は、２ｍＭグルタミン、１００  ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｕ．Ｓ）を含むＷａｙｍｏｕｔｈ′ｓ  ＭＢ  ７５２／１培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。本実験で使用した培養細胞は対数増殖期にある細胞であり、トリパンブルー色素排除試験によって少なくとも９５％の生存度を示す細胞をここで使用した（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）。
【００９０】
（工程２）ＲＮＡの分離およびｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイ法
総ＲＮＡ試料を、各々工程１から得られた正常肺組織、原発性肺癌組織、転移性肺癌組織およびＡ５４９細胞から、市販のシステムであるＲＮｅａｓｙ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分離し、その後、ＤＮＡ夾雑物をｍｅｓｓａｇｅ  ｃｌｅａｎキット（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｒｏｏｋｌｉｎｅ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）を使用してＲＮＡ試料から除去した。
【００９１】
１−２：ＭＩＧ８、ＭＩＧ１８、ＭＩＧ１９、ＭＩＧ５およびＭＩＧ９
（工程１）腫瘍細胞の培養
ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイ法を行うために、正常子宮外頸部（normal exocervical tissue）組織試料は子宮筋腫に罹患している患者から子宮摘出の間に入手し、原発性子宮頸部腫瘍組織試料および転移性腸骨リンパ節腫瘍組織試料は、外科手術の際に以前に放射線治療および抗癌剤治療を受けていない子宮癌患者から入手した。ＣＵＭＣ−６（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．６２：２３０−２４０，１９９６）を、ディファレンシャルディスプレイ法におけるヒト子宮頸部癌細胞株として使用した。
【００９２】
入手した組織から得られた細胞およびＣＵＭＣ−６細胞株は、２ｍＭグルタミン、１００  ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｕ．Ｓ）を含むＷａｙｍｏｕｔｈ′ｓ  ＭＢ  ７５２／１培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。本実験で使用した培養細胞は対数増殖期にある細胞であり、トリパンブルー色素排除試験によって少なくとも９５％の生存度を示す細胞をここで使用した（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）。
【００９３】
（工程２）ＲＮＡの分離およびｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイ法
総ＲＮＡ試料を、各々工程１から得られた正常子宮外頸部組織、原発性子宮頸部癌組織、転移性リンパ節腫瘍組織およびＣＵＭＣ−６細胞から、市販のシステムであるＲＮｅａｓｙ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分離し、その後、ＤＮＡ夾雑物をｍｅｓｓａｇｅ  ｃｌｅａｎキット（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｒｏｏｋｌｉｎｅ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）を使用してＲＮＡ試料から除去した。
【００９４】
実施例２：ディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）
２−１：ＭＩＧ３
ディファレンシャルディスプレイ逆転写は、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ａｎｄ  Ａ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅによって提案されたわずかに改変した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して実行した。
【００９５】
最初に、逆転写を、実施例１−１の工程１において得た各々の総ＲＮＡ  ０．２μｇに対して、固定（anchored）オリゴ−ｄＴプライマーとして配列番号３に示されるＤＮＡ配列を有する固定プライマーＨ−Ｔ１１Ａ（５−ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’，ＲＮＡｉｍａｇｅキット，Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ，Ｃｏｒ．，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）を使用して行った。
【００９６】
次いで、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭ［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム５′−１１−ｍｅｒプライマー（ＲＮＡｉｍａｇｅプライマーセット１−５）Ｈ−ＡＰ１〜４０の中の配列番号４に示されるＤＮＡ配列を有するプライマーＨ−ＡＰ２２（５’−ＡＡＧＣＴＴＴＴＧＡＴＣＣ−３’）を使用して実行した。ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った：９５℃で４０秒間の変性工程、４０℃で２分間のアニーリング工程、および７２℃で４０秒間の伸長工程から成る全体で４０回の増幅サイクル、続いて７２℃で５分間、１回の最終伸長工程。
【００９７】
ＰＣＲ反応において増幅したフラグメントは、ＤＮＡ配列のための６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
【００９８】
Ｌ２７６−８１１  ｃＤＮＡ（配列番号１の１８６２〜２１６６位の塩基）を有する３０５塩基対（ｂｐ）バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを１５分間加熱してＬ２７６−８１１  ｃＤＮＡを溶出させ、その後、ＰＣＲ反応を、［α−３５Ｓ］標識ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および２０μＭ  ｄＮＴＰをその中で使用しないこと以外はＬ２７６−８１１  ｃＤＮＡを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
【００９９】
２−２：ＭＩＧ８
ディファレンシャルディスプレイ逆転写は、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ａｎｄ  Ａ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅによって提案されたわずかに改変した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して実行した。
【０１００】
最初に、逆転写を、実施例１−２の工程１において得た各々の総ＲＮＡ  ０．２μｇに対して、固定オリゴ−ｄＴプライマーとして配列番号７に示されるＤＮＡ配列を有する固定プライマーＨ−Ｔ１１Ｃ（５−ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’，ＲＮＡｉｍａｇｅキット，Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ，Ｃｏｒ．，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）を使用して行った。
【０１０１】
次いで、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭ［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム５′−１１−ｍｅｒプライマー（ＲＮＡｉｍａｇｅプライマーセット１−５）Ｈ−ＡＰ１〜４０の中の配列番号８に示されるＤＮＡ配列を有するプライマーＨ−ＡＰ２３（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴＧ−３’）を使用して実行した。ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った：９５℃で４０秒間の変性工程、４０℃で２分間のアニーリング工程、および７２℃で４０秒間の伸長工程から成る全体で４０回の増幅サイクル、続いて７２℃で５分間、１回の最終伸長工程。
【０１０２】
ＰＣＲ反応において増幅したフラグメントは、ＤＮＡ配列のための６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
【０１０３】
ＣＣ２３１  ｃＤＮＡ（配列番号５の３１４２〜３４８３位の塩基）を有する３４２塩基対（ｂｐ）バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを１５分間加熱して、ＣＣ２３１  ｃＤＮＡを溶出させ、その後ＰＣＲ反応を、［α−３５Ｓ］標識ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および２０μＭ  ｄＮＴＰをその中で使用しないこと以外は、ＣＣ２３１  ｃＤＮＡを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
【０１０４】
２−３：ＭＩＧ１０
最初に、逆転写を、実施例１−１の工程１において得た各々の総ＲＮＡ  ０．２μｇに対して、固定オリゴ−ｄＴプライマーとして配列番号１１に示されるＤＮＡ配列を有する固定プライマーＨ−Ｔ１１Ｃ（５−ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’，ＲＮＡｉｍａｇｅキット，Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ，Ｃｏｒ．，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）を使用して行った。
【０１０５】
次いで、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭ［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム５′−１１−ｍｅｒプライマー（ＲＮＡｉｍａｇｅプライマーセット１−５）Ｈ−ＡＰ１〜４０の中の配列番号１２に示されるＤＮＡ配列を有するプライマーＨ−ＡＰ２３（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴＧ−３’）を使用して実行した。ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った：９５℃で４０秒間の変性工程、４０℃で２分間のアニーリング工程、および７２℃で４０秒間の伸長工程から成る全体で４０回の増幅サイクル、続いて７２℃で５分間、１回の最終伸長工程。
【０１０６】
ＰＣＲ反応において増幅したフラグメントは、ＤＮＡ配列のための６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
【０１０７】
Ｌ７８９  ｃＤＮＡ（配列番号９の１０２２〜１３０５位の塩基）を有する２８４塩基対（ｂｐ）バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを１５分間加熱してＬ７８９  ｃＤＮＡを溶出させ、その後、ＰＣＲ反応を、［α−３５Ｓ］標識ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および２０μＭ  ｄＮＴＰをその中で使用しないこと以外はＬ７８９  ｃＤＮＡを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
【０１０８】
２−４：ＭＩＧ１３
最初に、逆転写を、実施例１の工程１において得た各々の総ＲＮＡ  ０．２μｇに対して、固定オリゴ−ｄＴプライマーとして配列番号１５に示されるＤＮＡ配列を有する固定プライマーＨ−Ｔ１１Ｃ（５−ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’，ＲＮＡｉｍａｇｅキット，Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ，Ｃｏｒ．，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）を使用して行った。
【０１０９】
次いで、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭ［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム５′−１１−ｍｅｒプライマー（ＲＮＡｉｍａｇｅプライマーセット１−５）Ｈ−ＡＰ１〜４０の中の配列番号１６に示されるＤＮＡ配列を有するプライマーＨ−ＡＰ２１（５’−ＡＡＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＧ−３’）を使用して実行した。ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った：９５℃で４０秒間の変性工程、４０℃で２分間のアニーリング工程、および７２℃で４０秒間の伸長工程から成る全体で４０回の増幅サイクル、続いて７２℃で５分間、１回の最終伸長工程。
【０１１０】
ＰＣＲ反応において増幅したフラグメントは、ＤＮＡ配列のための６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
【０１１１】
Ｌ９８６  ｃＤＮＡ（配列番号１３の６８５〜９７９位の塩基）を有する２９５塩基対（ｂｐ）バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを１５分間加熱してＬ９８６  ｃＤＮＡを溶出させ、その後、ＰＣＲ反応を、［α−３５Ｓ］標識ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および２０μＭ  ｄＮＴＰをその中で使用しないこと以外はＬ９８６  ｃＤＮＡを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
【０１１２】
２−５：ＭＩＧ１４
最初に、逆転写を、実施例１の工程１において得た各々の総ＲＮＡ  ０．２μｇに対して、固定オリゴ−ｄＴプライマーとして配列番号１９に示されるＤＮＡ配列を有する固定プライマーＨ−Ｔ１１Ａ（５−ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ−３’，ＲＮＡｉｍａｇｅキット，Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ，Ｃｏｒ．，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）を使用して行った。
【０１１３】
次いで、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭ［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム５′−１１−ｍｅｒプライマー（ＲＮＡｉｍａｇｅプライマーセット１−５）Ｈ−ＡＰ１〜４０の中の配列番号２０に示されるＤＮＡ配列を有するプライマーＨ−ＡＰ２１（５’−ＡＡＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＧ−３’）を使用して実行した。ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った：９５℃で４０秒間の変性工程、４０℃で２分間のアニーリング工程、および７２℃で４０秒間の伸長工程から成る全体で４０回の増幅サイクル、続いて７２℃で５分間、１回の最終伸長工程。
【０１１４】
ＰＣＲ反応において増幅したフラグメントは、ＤＮＡ配列のための６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
【０１１５】
Ｌ１２８４  ｃＤＮＡ（配列番号１７の８２３〜１０９８位の塩基）を有する２７６塩基対（ｂｐ）バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを１５分間加熱してＬ１２８４  ｃＤＮＡを溶出させ、その後、ＰＣＲ反応を、［α−３５Ｓ］標識ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および２０μＭ  ｄＮＴＰをその中で使用しないこと以外はＬ１２８４  ｃＤＮＡを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
【０１１６】
２−６：ＭＩＧ１８
最初に、逆転写を、実施例１の工程１において得た各々の総ＲＮＡ  ０．２μｇに対して、固定オリゴ−ｄＴプライマーとして配列番号２３に示されるＤＮＡ配列を有する固定プライマーＨ−Ｔ１１Ａ（５−ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ−３’，ＲＮＡｉｍａｇｅキット，Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ，Ｃｏｒ．，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）を使用して行った。
【０１１７】
次いで、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭ［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム５′−１１−ｍｅｒプライマー（ＲＮＡｉｍａｇｅプライマーセット１−５）Ｈ−ＡＰ１〜４０の中の配列番号２４に示されるＤＮＡ配列を有するプライマーＨ−ＡＰ３６（５’−ＡＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＣＴ−３’）を使用して実行した。ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った：９５℃で４０秒間の変性工程、４０℃で２分間のアニーリング工程、および７２℃で４０秒間の伸長工程から成る全体で４０回の増幅サイクル、続いて７２℃で５分間、１回の最終伸長工程。
【０１１８】
ＰＣＲ反応において増幅したフラグメントは、ＤＮＡ配列のための６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
【０１１９】
ＣＡ３６７  ｃＤＮＡ（配列番号２１の２９２０〜３１４０位の塩基）を有する２２１塩基対（ｂｐ）バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを１５分間加熱してＣＡ３６７  ｃＤＮＡを溶出させ、その後、ＰＣＲ反応を、［α−３５Ｓ］標識ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および２０μＭ  ｄＮＴＰをその中で使用しないこと以外はＣＡ３６７  ｃＤＮＡを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
【０１２０】
２−７：ＭＩＧ１８
最初に、逆転写を、実施例１の工程１において得た各々の総ＲＮＡ  ０．２μｇに対して、固定オリゴ−ｄＴプライマーとして配列番号２７に示されるＤＮＡ配列を有する固定プライマーＨ−Ｔ１１Ａ（５−ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ−３’，ＲＮＡｉｍａｇｅキット，Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ，Ｃｏｒ．，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）を使用して行った。
【０１２１】
次いで、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭ［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム５′−１１−ｍｅｒプライマー（ＲＮＡｉｍａｇｅプライマーセット１−５）Ｈ−ＡＰ１〜４０の中の配列番号２８に示されるＤＮＡ配列を有するプライマーＨ−ＡＰ３３（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣ−３’）を使用して実行した。ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った：９５℃で４０秒間の変性工程、４０℃で２分間のアニーリング工程、および７２℃で４０秒間の伸長工程から成る全体で４０回の増幅サイクル、続いて７２℃で５分間、１回の最終伸長工程。
【０１２２】
ＰＣＲ反応において増幅したフラグメントは、ＤＮＡ配列のための６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
【０１２３】
ＣＡ３３５  ｃＤＮＡ（配列番号２５の４１２３〜４５０３位の塩基）を有する３８１塩基対（ｂｐ）バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを１５分間加熱してＣＡ３３５  ｃＤＮＡを溶出させ、その後、ＰＣＲ反応を、［α−３５Ｓ］標識ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および２０μＭ  ｄＮＴＰをその中で使用しないこと以外はＣＡ３３５  ｃＤＮＡを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
【０１２４】
２−８：ＭＩＧ５
ディファレンシャルディスプレイ逆転写は、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ａｎｄ  Ａ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅによって提案されたわずかに改変した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して実行した。
【０１２５】
最初に、逆転写を、実施例１の工程１において得た各々の総ＲＮＡ  ０．２μｇに対して、固定オリゴ−ｄＴプライマーとして配列番号３１に示されるＤＮＡ配列を有する固定プライマーＨ−Ｔ１１Ｇ（５−ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ−３’，ＲＮＡｉｍａｇｅキット，Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ，Ｃｏｒ．，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）を使用して行った。
【０１２６】
次いで、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭ［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム５′−１１−ｍｅｒプライマー（ＲＮＡｉｍａｇｅプライマーセット１−５）Ｈ−ＡＰ１〜４０の中の配列番号３２に示されるＤＮＡ配列を有するプライマーＨ−ＡＰ２６（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＴＧＧ−３’）を使用して実行した。ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った：９５℃で４０秒間の変性工程、４０℃で２分間のアニーリング工程、および７２℃で４０秒間の伸長工程から成る全体で４０回の増幅サイクル、続いて７２℃で５分間、１回の最終伸長工程。
【０１２７】
ＰＣＲ反応において増幅したフラグメントは、ＤＮＡ配列のための６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
【０１２８】
ＣＧ２６３  ｃＤＮＡ（配列番号２９の４７６〜７３８位の塩基）を有する２６３塩基対（ｂｐ）バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを１５分間加熱してＣＧ２６３  ｃＤＮＡを溶出させ、その後、ＰＣＲ反応を、［α−３５Ｓ］標識ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および２０μＭ  ｄＮＴＰをその中で使用しないこと以外はＣＧ２６３  ｃＤＮＡを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
【０１２９】
２−９：ＭＩＧ７
ディファレンシャルディスプレイ逆転写は、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ａｎｄ  Ａ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅによって提案されたわずかに改変した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して実行した。
【０１３０】
最初に、逆転写を、実施例１の工程１において得た各々の総ＲＮＡ  ０．２μｇに対して、固定オリゴ−ｄＴプライマーとして配列番号３５に示されるＤＮＡ配列を有する固定プライマーＨ−Ｔ１１Ｇ（５−ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ−３’，ＲＮＡｉｍａｇｅキット，Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ，Ｃｏｒ．，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）を使用して行った。
【０１３１】
次いで、ＰＣＲ反応を、０．５ｍＭ［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で、同じ固定プライマー、およびランダム５′−１１−ｍｅｒプライマー（ＲＮＡｉｍａｇｅプライマーセット１−５）Ｈ−ＡＰ１〜４０の中の配列番号３６に示されるＤＮＡ配列を有するプライマーＨ−ＡＰ２３（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴＧ−３’）を使用して実行した。ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った：９５℃で４０秒間の変性工程、４０℃で２分間のアニーリング工程、および７２℃で４０秒間の伸長工程から成る全体で４０回の増幅サイクル、続いて７２℃で５分間、１回の最終伸長工程。
【０１３２】
ＰＣＲ反応において増幅したフラグメントは、ＤＮＡ配列のための６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル中で解離し、その後オートラジオグラフィーを使用して、ディファレンシャルに発現したバンドの位置を確認した。
【０１３３】
ＣＧ２３３  ｃＤＮＡ（配列番号３３の１９０３〜２２２９位の塩基）を有する３２７塩基対（ｂｐ）バンドを、乾燥させたゲルから切り出した。抽出したゲルを１５分間加熱してＣＧ２３３  ｃＤＮＡを溶出させ、その後、ＰＣＲ反応を、［α−３５Ｓ］標識ｄＡＴＰ（１，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および２０μＭ  ｄＮＴＰをその中で使用しないこと以外はＣＧ２３３  ｃＤＮＡを再増幅するために上記に記載されるのと同じ条件下で、同じプライマーを用いて反復した。
【０１３４】
実施例３：クローニング
上記のようにすべて再増幅したＬ２７６−８１１  ＰＣＲ産物；ＣＣ２３１  ＰＣＲ産物；Ｌ７８９  ＰＣＲ産物；Ｌ９８６  ＰＣＲ産物；Ｌ１２８４  ＰＣＲ産物；ＣＡ３６７  ＰＣＲ産物；ＣＡ３３５  ＰＣＲ産物；ＣＧ２６３  ＰＣＲ産物；およびＣＧ２３３  ＰＣＲ産物を、製造業者のマニュアルに従ってＴＡクローニングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｕ．Ｓ．）を使用して、それぞれｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクターに挿入した。
【０１３５】
（工程１）ライゲーション反応
実施例２においてすべて再増幅したＬ２７６−８１１  ＰＣＲ産物；ＣＣ２３１  ＰＣＲ産物；Ｌ７８９  ＰＣＲ産物；Ｌ９８６  ＰＣＲ産物；Ｌ１２８４  ＰＣＲ産物；ＣＡ３６７  ＰＣＲ産物；ＣＡ３３５  ＰＣＲ産物；ＣＧ２６３  ＰＣＲ産物；およびＣＧ２３３  ＰＣＲ産物各２μｌ、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクター１μｌ（５０ｎｇ）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１０×緩衝液）１μｌ、ならびにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（３ワイス（ｗｅｉｓｓ）単位／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｌを０．５ｍｌ試験管に取り、蒸留水をそこに加えて最終容量を１０μｌにした。ライゲーション反応混液を１４℃で一晩インキュベートした。
【０１３６】
（工程２）ＴＡクローンの形質転換
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  （Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．）を、ＬＢブロス（バクト−トリプトン１０ｇ、バクト−酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ）１０ｍｌ中で、６００ｎｍにおける光学密度が０．３〜０．６に達するまでインキュベートした。このインキュベートした混液を約１０分間氷上に保持し、４，０００ｒｐｍで１０分間、４℃にて遠心分離し、その後上清を廃棄し、そして細胞を収集した。収集した細胞ペレットを０．１Ｍ氷冷ＣａＣｌ２１０ｍｌに約３０分間から約１時間曝露し、コンピテント細胞を生成する。この生成物を再度４，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃にて再度遠心分離し、その後、上清を廃棄し、細胞を収集し、０．１Ｍ氷冷ＣａＣｌ２２ｍｌに懸濁した。
【０１３７】
コンピテント細胞懸濁液２００μｌを新たな微量遠心管に移し、工程１で調製したライゲーション反応生成物２μｌをそこに加えた。得られた混液を４２℃で９０秒間ウォーターバス中でインキュベートし、その後０℃でクエンチした。ＳＯＣ培地（バクト−トリプトン２．０ｇ、バクト−酵母抽出物０．５ｇ、１Ｍ  ＮａＣｌ  １ｍｌ、１Ｍ  ＫＣｌ  ０．２５ｍｌ、ＴＤＷ  ９７ｍｌ、２Ｍ  Ｍｇ２＋  １ｍｌ、２Ｍグルコース１ｍｌ）８００μｌをそこに加え、得られた混液を３７℃で４５分間、２２０ｒｐｍの回転振盪インキュベーター中でインキュベートした。
【０１３８】
Ｘ−ｇａｌ  ２５μｌ（ジメチルホルムアミド４０ｍｇ／ｍｌ中に保存）を、アンピシリンを補充しかつ事前に３７℃のインキュベーター中に置いたＬＢプレート上にガラス棒を用いて広げ、形質転換細胞２５μｌをそこに加え、再度ガラス棒を用いて広げ、その後３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、３〜４個の白色コロニーを選択し、選択した細胞の各々をアンピシリンを補充したＬＢプレート中で種培養した。プラスミドを構築するために、ライゲーション反応生成物が導入されたコロニーと見なされるコロニー、すなわち、形質転換したＪＭ１０９／Ｌ２７６−８１１；ＪＭ１０９／ＣＣ２３１；ＪＭ１０９／Ｌ７８９；ＪＭ１０９／Ｌ９８６；ＪＭ１０９／Ｌ１２８４；ＪＭ１０９／ＣＡ３６７；ＪＭ１０９／ＣＡ３３５；ＪＭ１０９／ＣＧ２６３；およびＪＭ１０９／ＣＧ２３３をそれぞれ選択し、テリフィック（ｔｅｒｒｉｆｉｃ）ブロス（ＴＤＷ  ９００ｍｌ、バクト−トリプトン１２ｇ、バクト−酵母抽出物２４ｇ、グリセロール４ｍｌ、０．１７Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４、０．７２Ｎ  Ｋ２ＨＰＯ４  １００ｍｌ）１０ｍｌ中でインキュベートした。
【０１３９】
実施例４：リコンビナントプラスミドＤＮＡの分離
Ｌ２７６−８１１プラスミドＤＮＡ；ＣＣ２３１プラスミドＤＮＡ；Ｌ７８９プラスミドＤＮＡ；Ｌ９８６プラスミドＤＮＡ；Ｌ１２８４プラスミドＤＮＡ；ＣＡ３６７プラスミドＤＮＡ；ＣＡ３３５プラスミドＤＮＡ；ＣＧ２６３プラスミドＤＮＡ；およびＣＧ２３３プラスミドＤＮＡの各々を、製造業者のマニュアルに従ってＷｉｚａｒｄ（商標）  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｕ．Ｓ．）を使用して形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ株から分離した。
【０１４０】
分離した各プラスミドＤＮＡの一部を制限酵素ＥＣｏＲＩで処理し、Ｌ２７６−８１１；ＣＣ２３１；Ｌ７８９；Ｌ９８６；Ｌ１２８４；ＣＡ３６７；ＣＡ３３５；ＣＧ２６３；およびＣＧ２３３の部分配列をそれぞれプラスミドに挿入したことを、２％ゲル中で電気泳動を行うことによって確認した。
【０１４１】
実施例５：ＤＮＡ配列決定分析
５−１：ＭＩＧ３
実施例２で得たＬ２７６−８１１  ＰＣＲ産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたＬ２７６−８１１  ＰＣＲ産物を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡシークエンシングキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，Ｕ．Ｓ．）を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
【０１４２】
上記遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号１の１８６２〜２１６６位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「Ｌ２７６−８１１」と名付けた。
【０１４３】
上記で得られた３０５ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメント、例えば、Ｌ２７６−８１１は、５′ランダムプライマーＨ−ＡＰ２２および３′固定プライマーＨ−Ｔ１１Ａを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
【０１４４】
図１に示されるように、この遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびＡ５４９肺癌細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）から明らかにされた。図１において見られるように、３０５ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメントＬ２７６−８１１は、肺癌組織、転移性肺癌組織、およびＡ５４９肺癌組織において発現したが、正常肺組織においては発現されなかった。Ｌ２７６−８１１遺伝子は癌細胞、特に転移性癌組織において最も高度に発現した。
【０１４５】
５−２：ＭＩＧ８
実施例２で得たＣＣ２３１  ＰＣＲ産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたＣＣ２３１  ＰＣＲ産物を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡシークエンシングキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，Ｕ．Ｓ．）を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
【０１４６】
上記遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号５の３１４２〜３４８３位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「ＣＣ２３１」と名付けた。
【０１４７】
上記で得られた３４２ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメント、例えば、ＣＣ２３１は、５′ランダムプライマーＨ−ＡＰ２３および３′固定プライマーＨ−Ｔ１１Ｃを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
【０１４８】
図２に示されるように、この遺伝子が正常子宮外頸部組織、転移性リンパ節組織、およびＣＵＭＣ−６細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）から明らかにされた。図２において見られるように、３４２ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメントＣＣ２３１は、子宮頸部癌、転移性リンパ節組織、およびＣＵＭＣ−６細胞において発現したが、正常組織においては発現されなかった。
【０１４９】
５−３：ＭＩＧ１０
実施例２で得たＬ７８９  ＰＣＲ産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたＬ７８９  ＰＣＲ産物を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡシークエンシングキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，Ｕ．Ｓ．）を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
【０１５０】
上記遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号９の１０２２〜１３０５位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「Ｌ７８９」と名付けた。
【０１５１】
上記で得られた２８４ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメント、例えば、Ｌ７８９は、５′ランダムプライマーＨ−ＡＰ２３および３′固定プライマーＨ−Ｔ１１Ｃを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
【０１５２】
図３に示されるように、この遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびＡ５４９肺癌細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）から明らかにされた。図３において見られるように、２５５ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメントＬ２７６は、肺癌組織、転移性肺癌組織、およびＡ５４９肺癌組織において発現したが、正常肺組織においては発現されなかった。Ｌ２７６遺伝子は癌細胞、特に転移性癌組織において最も高度に発現した。
【０１５３】
５−４：ＭＩＧ３
実施例２で得たＬ９８６  ＰＣＲ産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたＬ９８６  ＰＣＲ産物を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡシークエンシングキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，Ｕ．Ｓ．）を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
【０１５４】
上記遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号１３の６８５〜９７９位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「Ｌ９８６」と名付けた。
【０１５５】
上記で得られた２９５ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメント、例えば、Ｌ９８６は、５′ランダムプライマーＨ−ＡＰ２１および３′固定プライマーＨ−Ｔ１１Ｃを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
【０１５６】
図４に示されるように、この遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびＡ５４９肺癌細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）から明らかにされた。図４において見られるように、２９５ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメントＬ９８６は、肺癌組織、転移性肺癌組織、およびＡ５４９肺癌組織において発現したが、正常肺組織においては発現されなかった。Ｌ２７６−８１１遺伝子は癌細胞、特に転移性癌組織において最も高度に発現した。
【０１５７】
５−５：ＭＩＧ１４
実施例２で得たＬ１２８４  ＰＣＲ産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたＬ１２８４  ＰＣＲ産物を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡシークエンシングキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，Ｕ．Ｓ．）を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
【０１５８】
上記遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号１７の８２３〜１０９８位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「Ｌ１２８４」と名付けた。
【０１５９】
上記で得られた２７６ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメント、例えば、Ｌ１２８４は、５′ランダムプライマーＨ−ＡＰ２１および３′固定プライマーＨ−Ｔ１１Ａを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
【０１６０】
図５に示されるように、この遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびＡ５４９肺癌細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）から明らかにされた。図５において見られるように、２７６ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメントＬ１２８４は、肺癌組織、転移性肺癌組織、およびＡ５４９肺癌組織において発現したが、正常肺組織においては発現されなかった。Ｌ１２８４遺伝子は癌細胞、特に転移性癌組織において最も高度に発現した。
【０１６１】
５−６：ＭＩＧ１８
実施例２で得たＣＡ３６７  ＰＣＲ産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたＣＡ３６７  ＰＣＲ産物を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡシークエンシングキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，Ｕ．Ｓ．）を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
【０１６２】
上記遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号２１の２９２０〜３１４０位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「ＣＡ３６７」と名付けた。
【０１６３】
上記で得られた２２１ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメント、例えば、ＣＡ３６７は、５′ランダムプライマーＨ−ＡＰ３６および３′固定プライマーＨ−Ｔ１１Ａを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
【０１６４】
図６に示されるように、この遺伝子が正常子宮外頸部組織、転移性リンパ節組織、およびＣＵＭＣ−６細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）から明らかにされた。図６において見られるように、２２１ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメントＡ３６７は、子宮頸部癌、転移性リンパ節組織、およびＣＵＭＣ−６細胞において発現したが、正常組織においては発現されなかった。
【０１６５】
５−７：ＭＩＧ１９
実施例２で得たＣＡ３３５  ＰＣＲ産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたＣＡ３３５  ＰＣＲ産物を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡシークエンシングキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，Ｕ．Ｓ．）を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
【０１６６】
上記遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号２５の４１２３〜４５０３位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「ＣＡ３３５」と名付けた。
【０１６７】
上記で得られた３８１ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメント、例えば、ＣＡ３３５は、５′ランダムプライマーＨ−ＡＰ３３および３′固定プライマーＨ−Ｔ１１Ａを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
【０１６８】
図７に示されるように、この遺伝子が正常子宮外頸部組織、転移性リンパ節組織、およびＣＵＭＣ−６細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）から明らかにされた。図７において見られるように、３８１ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメントＣＡ３３５は、子宮頸部癌、転移性リンパ節組織、およびＣＵＭＣ−６細胞において発現したが、正常組織においては発現されなかった。
【０１６９】
５−８：ＭＩＧ５
実施例２で得たＣＧ２６３  ＰＣＲ産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたＣＧ２６３  ＰＣＲ産物を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡシークエンシングキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，Ｕ．Ｓ．）を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
【０１７０】
上記遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号２９の４７６〜７３８位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「ＣＧ２６３」と名付けた。
【０１７１】
上記で得られた２６３ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメント、例えば、ＣＧ２６３は、５′ランダムプライマーＨ−ＡＰ２６および３′固定プライマーＨ−Ｔ１１Ｇを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
【０１７２】
図８に示されるように、この遺伝子が正常子宮外頸部組織、転移性リンパ節組織、およびＣＵＭＣ−６細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）から明らかにされた。図８において見られるように、２６３ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメントＣＧ２６３は、子宮頸部癌、転移性リンパ節組織、およびＣＵＭＣ−６細胞において発現したが、正常組織においては発現されなかった。
【０１７３】
５−９：ＭＩＧ７
実施例２で得たＣＧ２３３  ＰＣＲ産物を増幅し、クローニングし、その後従来の方法に従って再増幅した。得られたＣＧ２３３  ＰＣＲ産物を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡシークエンシングキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，Ｕ．Ｓ．）を使用して、ジデオキシチェーンターミネーション法に従って配列決定した。
【０１７４】
上記遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号３３の１９０３〜２２２９位のヌクレオチド配列に一致し、これを本発明では「ＣＧ２３３」と名付けた。
【０１７５】
上記で得られた３２７ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメント、例えば、ＣＧ２３３は、５′ランダムプライマーＨ−ＡＰ２３および３′固定プライマーＨ−Ｔ１１Ｇを使用するディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）に供し、その後、電気泳動を使用して確認した。
【０１７６】
図９に示されるように、この遺伝子が正常子宮外頸部組織、転移性リンパ節組織、およびＣＵＭＣ−６細胞においてディファレンシャルに発現したことが、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）から明らかにされた。図９において見られるように、３２７ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメントＣＧ２３３は、子宮頸部癌、転移性リンパ節組織、およびＣＵＭＣ−６細胞において発現したが、正常組織においては発現されなかった。
【０１７７】
実施例６：全長プロトオンコ遺伝子のｃＤＮＡ配列
６−１：ＭＩＧ３
３２Ｐ標識したＬ２７６−８１１をプローブとして使用して、バクテリオファージλｇｔ１１ヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）をスクリーニングした。ｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターに挿入されている２２９５ｂｐフラグメントの全長ＭＩＧ３  ｃＤＮＡクローンをヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーから得て、その後これを２００３年２月１９日にＵ．Ｓ．ＮＩＨのＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ２３９２９３で寄託した（公開日：２００４年１２月３１日）。
【０１７８】
λｐＣＥＶベクターに挿入されているＭＩＧ３クローンを制限酵素ＮｏｔＩによって切断し、アンピシリン耐性ｐＣＥＶ−ＬＡＣファージミドベクターの型でファージから単離した（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）。
【０１７９】
ＭＩＧ３遺伝子を含むｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターはＴ４  ＤＮＡリガーゼによってライゲーションを行ってＭＩＧ３プラスミドＤＮＡを得て、その後Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
【０１８０】
配列番号１のＤＮＡ配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは８９〜７０９位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号２の２０６アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
【０１８１】
６−２：ＭＩＧ８
３２Ｐ標識したＣＣ２３１をプローブとして使用して、バクテリオファージλｇｔ１１ヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）をスクリーニングした。ｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターに挿入された３７３７ｂｐフラグメントの全長ＭＩＧ８  ｃＤＮＡクローンをヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーから得て、その後これを２００３年６月１日にＵ．Ｓ．ＮＩＨのＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ３１１３８９で寄託した（公開日：２００４年１２月３１日）。
【０１８２】
λｐＣＥＶベクターに挿入されたＭＩＧ８クローンを制限酵素ＮｏｔＩによって切断し、アンピシリン耐性ｐＣＥＶ−ＬＡＣファージミドベクターの型でファージから単離した（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）。
【０１８３】
ＭＩＧ８遺伝子を含むｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターはＴ４  ＤＮＡリガーゼによってライゲーションを行ってＭＩＧ８プラスミドＤＮＡを得て、その後Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
【０１８４】
３７３７ｂｐから成るＭＩＧ１８の全長ＤＮＡ配列は配列番号５に示した。
【０１８５】
配列番号５のＤＮＡ配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは１１３〜１６２７位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号６の５０４アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
【０１８６】
６−３：ＭＩＧ１０
３２Ｐ標識したＬ７８９をプローブとして使用して、バクテリオファージλｇｔ１１ヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）をスクリーニングした。ｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターに挿入された１３２１ｂｐフラグメントの全長ＭＩＧ１０  ｃＤＮＡクローンをヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーから得て、その後これを２００３年９月２６日にＵ．Ｓ．ＮＩＨのＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ４２３７２５で寄託した（公開日：２００４年１２月３１日）。
【０１８７】
λｐＣＥＶベクターに挿入されたＭＩＧ１０クローンを制限酵素ＮｏｔＩによって切断し、アンピシリン耐性ｐＣＥＶ−ＬＡＣファージミドベクターの型でファージから単離した（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）。
【０１８８】
ＭＩＧ１０遺伝子を含むｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターはＴ４  ＤＮＡリガーゼによってライゲーションを行ってＭＩＧ１０プラスミドＤＮＡを得て、その後Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
【０１８９】
配列番号９のＤＮＡ配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは２３〜１２７６位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号１０の４１７アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
【０１９０】
６−４：ＭＩＧ１３
３２Ｐ標識したＬ９８６をプローブとして使用して、バクテリオファージλｇｔ１１ヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）をスクリーニングした。ｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターに挿入された１０１９ｂｐフラグメントの全長ＭＩＧ１３  ｃＤＮＡクローンをヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーから得て、その後これを２００３年７月７日にＵ．Ｓ．ＮＩＨのＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ３３６０９０で寄託した（公開日：２００４年１２月３１日）。
【０１９１】
λｐＣＥＶベクターに挿入されたＭＩＧ１３クローンを制限酵素ＮｏｔＩによって切断し、アンピシリン耐性ｐＣＥＶ−ＬＡＣファージミドベクターの型でファージから単離した（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）。
【０１９２】
ＭＩＧ１３遺伝子を含むｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターはＴ４  ＤＮＡリガーゼによってライゲーションを行ってＭＩＧ１３プラスミドＤＮＡを得て、その後Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
【０１９３】
配列番号１３のＤＮＡ配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは１１〜８４４位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号１４の２７７アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
【０１９４】
６−５：ＭＩＧ１４
３２Ｐ標識したＬ１２８４をプローブとして使用して、バクテリオファージλｇｔ１１ヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）をスクリーニングした。ｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターに挿入された１１４２ｂｐフラグメントの全長ＭＩＧ１４  ｃＤＮＡクローンをヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーから得て、その後これを２００３年７月４日にＵ．Ｓ．ＮＩＨのＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ３３６０９１で寄託した（公開日：２００４年１２月３１日）。
【０１９５】
λｐＣＥＶベクターに挿入されたＭＩＧ１４クローンを制限酵素ＮｏｔＩによって切断し、アンピシリン耐性ｐＣＥＶ−ＬＡＣファージミドベクターの型でファージから単離した（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）。
【０１９６】
ＭＩＧ１４遺伝子を含むｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターはＴ４  ＤＮＡリガーゼによってライゲーションを行ってＭＩＧ１４プラスミドＤＮＡを得て、その後Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
【０１９７】
配列番号１７のＤＮＡ配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは６７〜１１２５位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号１８の３５２アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
【０１９８】
６−６：ＭＩＧ１８
３２Ｐ標識したＣＡ３６７をプローブとして使用して、バクテリオファージλｇｔ１１ヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）をスクリーニングした。ｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターに挿入された３６３３ｂｐフラグメントの全長ＭＩＧ１８  ｃＤＮＡクローンをヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーから得て、その後これを２００３年９月３０日にＵ．Ｓ．ＮＩＨのＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ４２３７３４で寄託した（公開日：２００４年１２月３１日）。
【０１９９】
λｐＣＥＶベクターに挿入されたＭＩＧ１８クローンを制限酵素ＮｏｔＩによって切断し、アンピシリン耐性ｐＣＥＶ−ＬＡＣファージミドベクターの型でファージから単離した（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）。
【０２００】
ＭＩＧ１８遺伝子を含むｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターはＴ４  ＤＮＡリガーゼによってライゲーションを行ってＭＩＧ１８プラスミドＤＮＡを得て、その後Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
【０２０１】
３６３３ｂｐから成るＭＩＧ１８の全長ＤＮＡ配列は配列番号２１に示した。
【０２０２】
配列番号２１のＤＮＡ配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは２１５〜２２１２位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号２２の６６５アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
【０２０３】
６−７：ＭＩＧ１９
３２Ｐ標識したＣＡ３３５をプローブとして使用して、バクテリオファージλｇｔ１１ヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）をスクリーニングした。ｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターに挿入された４６３９ｂｐフラグメントの全長ＭＩＧ１９  ｃＤＮＡクローンをヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーから得て、その後これを２００３年１０月２６日にＵ．Ｓ．ＮＩＨのＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ４５０３０８で寄託した（公開日：２００４年１２月３１日）。
【０２０４】
λｐＣＥＶベクターに挿入されたＭＩＧ１９クローンを制限酵素ＮｏｔＩによって切断し、アンピシリン耐性ｐＣＥＶ−ＬＡＣファージミドベクターの型でファージから単離した（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）。
【０２０５】
ＭＩＧ１９遺伝子を含むｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターはＴ４  ＤＮＡリガーゼによってライゲーションを行ってＭＩＧ１９プラスミドＤＮＡを得て、その後Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
【０２０６】
４６３９ｂｐから成るＭＩＧ１９の全長ＤＮＡ配列は配列番号２５に示した。
【０２０７】
配列番号２５のＤＮＡ配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは６５〜２９６５位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号２６の９６６アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
【０２０８】
６−８：ＭＩＧ５
３２Ｐ標識したＣＧ２６３をプローブとして使用して、バクテリオファージλｇｔ１１ヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）をスクリーニングした。８３３ｂｐフラグメントのｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターに挿入された全長ＭＩＧ５  ｃＤＮＡクローンをヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーから得て、その後これを２００３年４月１９日にＵ．Ｓ．ＮＩＨのＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ２７９３８４で寄託した（公開日：２００４年１２月３１日）。
【０２０９】
λｐＣＥＶベクターに挿入されたＭＩＧ５クローンを制限酵素ＮｏｔＩによって切断し、アンピシリン耐性ｐＣＥＶ−ＬＡＣファージミドベクターの型でファージから単離した（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）。
【０２１０】
ＭＩＧ５遺伝子を含むｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターはＴ４  ＤＮＡリガーゼによってライゲーションを行ってＭＩＧ５プラスミドＤＮＡを得て、その後Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。
【０２１１】
８３３ｂｐから成るＭＩＧ５の全長ＤＮＡ配列は配列番号２９に示した。
【０２１２】
配列番号２９のＤＮＡ配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは１５９〜７３７位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号３０の１９２アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
【０２１３】
６−９：ＭＩＧ７
３２Ｐ標識したＣＧ２３３をプローブとして使用して、バクテリオファージλｇｔ１１ヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）をスクリーニングした。ｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターに挿入された２３６４ｂｐフラグメントの全長ＭＩＧ７  ｃＤＮＡクローンをヒト肺胚性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーから得て、その後これを２００３年５月２４日にＵ．Ｓ．ＮＩＨのＧｅｎＢａｎｋデータベースにアクセッション番号ＡＹ３０５８７２で寄託した（公開日：２００４年１２月３１日）。
【０２１４】
λｐＣＥＶベクターに挿入されたＭＩＧ７クローンを制限酵素ＮｏｔＩによって切断し、アンピシリン耐性ｐＣＥＶ−ＬＡＣファージミドベクターの型でファージから単離した（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６，１９８９）。
【０２１５】
ＭＩＧ７遺伝子を含むｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターはＴ４  ＤＮＡリガーゼによってライゲーションを行ってＭＩＧ７プラスミドＤＮＡを得て、その後Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをこのライゲーションしたクローンで形質転換した。２３６４ｂｐからなるＭＩＧ７の全長ＤＮＡ配列は配列番号３３に示した。
【０２１６】
配列番号３３のＤＮＡ配列において、本発明のプロトオンコ遺伝子の全長オープンリーディングフレームは１４３５〜１６６５位のヌクレオチド配列に対応し、配列番号４の７６アミノ酸から成るタンパク質をコードすることが推定される。
【０２１７】
実施例７：種々の細胞における遺伝子のノーザンブロッティング分析
７−１：ＭＩＧ３、ＭＩＧ１０、ＭＩＧ１３およびＭＩＧ１４
総ＲＮＡ試料を、正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、ならびにＡ５４９肺癌細胞株およびＮＣＬ−Ｈ３５８肺癌細胞株（アメリカンタイプカルチャーコレクション；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−５８０７）から、実施例１におけるものと同じ様式で抽出した。
【０２１８】
ＭＩＧ３；ＭＩＧ１Ｏ；ＭＩＧ１３およびＭＩＧ１４の遺伝子の各々の発現レベルを決定するために、各々の組織および細胞株から抽出した各々の総変性ＲＮＡ試料２０μｇを１％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動し、その後、得られたアガロースゲルをナイロンメンブレン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写した。次いで、このブロットを、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＩＩ  ランダムプライムラベリングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して調製した、３２Ｐ−標識されかつランダムプライムされた全長ＭＩＧ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。ノーザンブロッティング手順を２回反復し、こうして得られたブロットをデンシトメーターを用いて定量し、そしてβ−アクチンを用いて標準化した。
【０２１９】
図１０（ａ）は、ＭＩＧ３プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、肺癌組織、転移性肺癌組織、および肺癌細胞株（Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ３５８）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図１０（ａ）に示されるように、ＭＩＧ３プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、肺癌組織、転移性肺癌組織、ならびにＡ５４９肺癌細胞株およびＮＣＩ−Ｈ３５８肺癌細胞株において有意に増加したが、正常肺組織においては極めて低く検出されるかまたは検出されなかったことが明らかにされた。図１０（ａ）において、「正常」レーンは正常肺組織を表し、「癌」レーンは肺癌組織を表し、「転移」レーンは転移性肺癌組織を表し、そして「Ａ５４９」レーンおよび「ＮＣＩ−Ｈ３５８」レーンの各々は肺癌細胞株を表す。図１０（ｂ）は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
【０２２０】
図２４（ａ）は、ＭＩＧ３プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図２４（ｂ）は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図２４（ａ）に示されるように、ＭＩＧ３  ｍＲＮＡ転写物（約４．０ｋｂ）は正常組織において極めて弱く発現したことが明らかにされた。
【０２２１】
図３８（ａ）は、ＭＩＧ３プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、ＨＬ−６０、ＨｅＬａ、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ａ５４９、およびＧ３６１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図３８（ｂ）は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図３８（ａ）に示されるように、ＭＩＧ３プロトオンコ遺伝子は、前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０、ＨｅＬａ子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２、リンパ芽球性白血病株ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、結腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９、および皮膚癌細胞株Ｇ３６１において極めて高度に発現したことが明らかにされた。
【０２２２】
図１３（ａ）は、ＭＩＧ１０プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、肺癌組織、転移性肺癌組織、および肺癌細胞株（Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ３５８）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図１３（ａ）に示されるように、ＭＩＧ１０プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、肺癌組織、転移性肺癌組織、ならびにＡ５４９肺癌細胞株およびＮＣＩ−Ｈ３５８肺癌細胞株において有意に増加したが、正常肺組織においては極めて低く検出されるかまたは検出されなかったことが明らかにされた。図１３（ａ）において、「正常」レーンは正常肺組織を表し、「癌」レーンは肺癌組織を表し、「転移」レーンは転移性肺癌組織を表し、そして「Ａ５４９」レーンおよび「ＮＣＩ−Ｈ３５８」レーンの各々は肺癌細胞株を表す。図１３（ｂ）は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
【０２２３】
図２７（ａ）は、ＭＩＧ１０プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図２７（ｂ）は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図２７（ａ）に示されるように、ＭＩＧ１０  ｍＲＮＡ転写物（約２．０ｋｂ）は正常組織において極めて弱く発現したことが明らかにされた。
【０２２４】
図４１（ａ）は、ＭＩＧ１０プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、ＨＬ−６０、ＨｅＬａ、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ａ５４９、およびＧ３６１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図４１（ｂ）は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図４１（ａ）に示されるように、ＭＩＧ１０プロトオンコ遺伝子は、前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０、ＨｅＬａ子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２、リンパ芽球性白血病株ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、結腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９、および皮膚癌細胞株Ｇ３６１において極めて高度に発現したことが明らかにされた。２．９ｋｂ  ｍＲＮＡ転写物に加えて、約２．４ｋｂのｍＲＮＡ転写物もまた発現したこともまた認められた。
【０２２５】
図１４（ａ）は、ＭＩＧ１３プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、肺癌組織、転移性肺癌組織、および肺癌細胞株（Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ３５８）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図１４（ａ）に示されるように、ＭＩＧ１３プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、肺癌組織、転移性肺癌組織、ならびにＡ５４９肺癌細胞株およびＮＣＩ−Ｈ３５８肺癌細胞株において有意に増加したが、正常肺組織においては極めて低く検出されるかまたは検出されなかったことが明らかにされた。図１４（ａ）において、「正常」レーンは正常肺組織を表し、「癌」レーンは肺癌組織を表し、「転移」レーンは転移性肺癌組織を表し、そして「Ａ５４９」レーンおよび「ＮＣＩ−Ｈ３５８」レーンの各々は肺癌細胞株を表す。図１４（ｂ）は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
【０２２６】
図２８（ａ）は、ＭＩＧ１３プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図２８（ｂ）は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図２８（ａ）に示されるように、ＭＩＧ１３  ｍＲＮＡ転写物（約１．７ｋｂの優性転写物および１．４ｋｂの転写物）は正常組織において極めて弱く発現したかまたは検出されなかったことが明らかにされた。
【０２２７】
図４２（ａ）は、ＭＩＧ１３プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、ＨＬ−６０、ＨｅＬａ、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ａ５４９、およびＧ３６１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図４２（ｂ）は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図４２（ａ）に示されるように、ＭＩＧ１４  ｍＲＮＡ転写物（約１．７ｋｂの優性転写物および１．４ｋｂの転写物）は、前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０、ＨｅＬａ子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２、リンパ芽球性白血病株ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、結腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９、および皮膚癌細胞株Ｇ３６１において極めて高度に発現したことが明らかにされた。
【０２２８】
図１５（ａ）は、ＭＩＧ１４プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、肺癌組織、転移性肺癌組織、および肺癌細胞株（Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ３５８）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図１５（ａ）に示されるように、ＭＩＧ１４プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、肺癌組織、転移性肺癌組織、ならびにＡ５４９肺癌細胞株およびＮＣＩ−Ｈ３５８肺癌細胞株において有意に増加したが、正常肺組織においては極めて低く検出されるかまたは検出されなかったことが明らかにされた。図１５（ａ）において、「正常」レーンは正常肺組織を表し、「癌」レーンは肺癌組織を表し、「転移」レーンは転移性肺癌組織を表し、そして「Ａ５４９」レーンおよび「ＮＣＩ−Ｈ３５８」レーンの各々は肺癌細胞株を表す。図１５（ｂ）は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
【０２２９】
図２９（ａ）は、ＭＩＧ１４プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図２９（ｂ）は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図２９（ａ）に示されるように、ＭＩＧ１４  ｍＲＮＡ転写物（約１．３ｋｂの優性転写物および２ｋｂの転写物）は正常組織において極めて弱く発現したかまたは検出されなかったことが明らかにされた。
【０２３０】
図４３（ａ）は、ＭＩＧ１４プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、ＨＬ−６０、ＨｅＬａ、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ａ５４９、およびＧ３６１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図４３（ｂ）は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図４３（ａ）に示されるように、ＭＩＧ１４  ｍＲＮＡ転写物（約１．３ｋｂの優性転写物および２ｋｂの転写物）は、前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０、ＨｅＬａ子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２、リンパ芽球性白血病株ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、結腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９、および皮膚癌細胞株Ｇ３６１において極めて高度に発現したことが明らかにされた。
【０２３１】
７−２：ＭＩＧ８、ＭＩＧ１８、ＭＩＧ１９、ＭＩＧ５およびＭＩＧ７
総ＲＮＡ試料を、正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、ならびに子宮頸部癌細胞株ＣａＳｋｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５５０）およびＣＵＭＣ−６から、実施例１におけるものと同じ様式で抽出した。
【０２３２】
ＭＩＧ８；ＭＩＧ１８；ＭＩＧ１９；ＭＩＧ５およびＭＩＧ７の遺伝子の各々の発現レベルを決定するために、各々の組織および細胞株から抽出した各々の総変性ＲＮＡ試料２０μｇを１％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動し、その後、得られたアガロースゲルをナイロンメンブレン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写した。次いで、このブロットを、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＩＩ  ランダムプライムラベリングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して調製した、３２Ｐ−標識されかつランダムプライムされた全長ＭＩＧ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。ノーザンブロッティング手順を２回反復し、こうして得られたブロットをデンシトメーターを用いて定量し、そしてβ−アクチンを用いて標準化した。
【０２３３】
図１１は、ＭＩＧ８プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株（ＣａＳｋｉおよびＣＵＭＣ−６）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図１１に示されるように、ＭＩＧ８プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、子宮頸部癌組織ならびに子宮頸部癌細胞株ＣａＳｋｉおよびＣＵＭＣ−６において増加し、すなわち、約４．０ｋｂのＭＩＧ８  ｍＲＮＡ転写物および約１．３ｋｂのＭＩＧ８  ｍＲＮＡ転写物が過剰発現され、そしてＭＩＧ８プロトオンコ遺伝子は、とりわけ転移性子宮頸部リンパ節組織において最も高く発現したが、正常組織においては極めて低く発現したことが明らかにされた。図１１において、「正常」レーンは正常子宮外頸部組織を表し、「癌」レーンは子宮頸部癌組織を表し、「転移」レーンは転移性子宮頸部リンパ節組織を表し、そして「ＣａＳｋｉ」レーンおよび「ＣＵＭＣ−６」レーンの各々は子宮癌細胞株を表す。図１２は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
【０２３４】
図２５は、ＭＩＧ８プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図２６は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図２５に示されるように、ＭＩＧ８  ｍＲＮＡ転写物（約４．０ｋｂの優性ＭＩＧ８  ｍＲＮＡ転写物および約１．３ｋｂのＭＩＧ８  ｍＲＮＡ転写物）は、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球などの正常組織において極めて弱く発現したことが明らかにされた。
【０２３５】
図３９は、ＭＩＧ８プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、ＨＬ−６０、ＨｅＬａ、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ａ５４９、およびＧ３６１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図４０は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図３９に示されるように、ＭＩＧ８  ｍＲＮＡ転写物（約４．０ｋｂの優性ＭＩＧ８  ｍＲＮＡ転写物および約１．３ｋｂのＭＩＧ８  ｍＲＮＡ転写物）は、前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０、ＨｅＬａ子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２、リンパ芽球性白血病株ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、結腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９、および皮膚癌細胞株Ｇ３６１において極めて高度に発現したことが明らかにされた。しかし、約１．３ｋｂのＭＩＧ８  ｍＲＮＡ転写物は、皮膚癌細胞株Ｇ３６１において発現されなかった。
【０２３６】
図１６は、ＭＩＧ１８プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株（ＣａＳｋｉおよびＣＵＭＣ−６）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図１６に示されるように、ＭＩＧ１８プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、子宮頸部癌組織ならびに子宮頸部癌細胞株ＣａＳｋｉおよびＣＵＭＣ−６において増加し、そしてＭＩＧ１８プロトオンコ遺伝子は、とりわけ転移性子宮頸部リンパ節組織において最も高く発現したが、正常組織においては極めて低く発現したことが明らかにされた。図１６および１７において、「正常」レーンは正常子宮外頸部組織を表し、「癌」レーンは子宮頸部癌組織を表し、「転移」レーンは転移性子宮頸部リンパ節組織を表し、そして「ＣａＳｋｉ」レーンおよび「ＣＵＭＣ−６」レーンの各々は子宮癌細胞株を表す。図１７は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
【０２３７】
図３０は、ＭＩＧ１８プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図３１は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図３０に示されるように、ＭＩＧ１８  ｍＲＮＡ転写物（約４．０ｋｂ）は、心臓、筋肉、および肝臓などの正常組織において弱く発現したことが明らかにされた。
【０２３８】
図４４は、ＭＩＧ１８プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、ＨＬ−６０、ＨｅＬａ、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ａ５４９、およびＧ３６１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図４５は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図４４に示されるように、ＭＩＧ１８  ｍＲＮＡ転写物は、ＨｅＬａ子宮癌細胞株および慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２において極めて高度に発現され、そしてまた、前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０、リンパ芽球性白血病株ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、結腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９、および皮膚癌細胞株Ｇ３６１においてもまた増加レベルで発現したことが明らかにされた。
【０２３９】
図１８は、ＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株（ＣａＳｋｉおよびＣＵＭＣ−６）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図１８に示されるように、ＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、子宮頸部癌組織ならびに子宮頸部癌細胞株ＣａＳｋｉおよびＣＵＭＣ−６において増加し、すなわち、約４．７ｋｂの優性ＭＩＧ１９  ｍＲＮＡ転写物が過剰発現され、そしてＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子は、とりわけ転移性子宮頸部リンパ節組織において最も高く発現したが、正常組織においては極めて低く発現したことが明らかにされた。図１８および１９において、「正常」レーンは正常子宮外頸部組織を表し、「癌」レーンは子宮頸部癌組織を表し、「転移」レーンは転移性子宮頸部リンパ節組織を表し、そして「ＣａＳｋｉ」レーンおよび「ＣＵＭＣ−６」レーンの各々は子宮癌細胞株を表す。図１９は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
【０２４０】
図３２は、ＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図３３は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図３２に示されるように、ＭＩＧ１９  ｍＲＮＡ転写物（約４．７ｋｂの優性ｍＲＮＡ転写物）は、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球などの正常組織において極めて弱く発現したかまたは検出されなかったことが明らかにされた。
【０２４１】
図４６は、ＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、ＨＬ−６０、ＨｅＬａ、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ａ５４９、およびＧ３６１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図４７は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図４６に示されるように、ＭＩＧ１９  ｍＲＮＡ転写物（約４．７ｋｂの優性ｍＲＮＡ転写物）は、前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０、ＨｅＬａ子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２、リンパ芽球性白血病株ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、結腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９、および皮膚癌細胞株Ｇ３６１において非常に増加したレベルで発現したことが明らかにされた。しかし、約１．３ｋｂのＭＩＧ８  ｍＲＮＡ転写物は、皮膚癌細胞株Ｇ３６１において発現されなかった。
【０２４２】
図２０は、ＭＩＧ５プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株（ＣａＳｋｉおよびＣＵＭＣ−６）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。
【０２４３】
図２０に示されるように、ＭＩＧ５プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、子宮頸部癌組織ならびに子宮頸部癌細胞株ＣａＳｋｉおよびＣＵＭＣ−６において増加し、すなわち、約５．５ｋｂの優性ＭＩＧ５  ｍＲＮＡ転写物が過剰発現され、そしてＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子は、とりわけ転移性子宮頸部リンパ節組織において最も高く発現したが、正常組織においては発現されなかったことが明らかにされた。図２０および２１において、「正常」レーンは正常子宮外頸部組織を表し、「癌」レーンは子宮頸部癌組織を表し、「転移」レーンは転移性子宮頸部リンパ節組織を表し、そして「ＣａＳｋｉ」レーンおよび「ＣＵＭＣ−６」レーンの各々は子宮癌細胞株を表す。図２１は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
【０２４４】
図３４は、ＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図３５は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図３４に示されるように、ＭＩＧ５  ｍＲＮＡ転写物（約５．５ｋｂの優性ｍＲＮＡ転写物）は、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球などの正常組織においては発現されなかったことが明らかにされた。
【０２４５】
図４８は、ＭＩＧ５プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、ＨＬ−６０、ＨｅＬａ、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ａ５４９、およびＧ３６１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図４９は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図４８に示されるように、ＭＩＧ５  ｍＲＮＡ転写物（約５．５ｋｂの優性ｍＲＮＡ転写物）は、前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０、ＨｅＬａ子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２、リンパ芽球性白血病株ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、結腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９、および皮膚癌細胞株Ｇ３６１において非常に増加したレベルで発現したことが明らかにされた。しかし、約１．３ｋｂのＭＩＧ８  ｍＲＮＡ転写物は、皮膚癌細胞株Ｇ３６１において発現されなかった。
【０２４６】
図２２は、ＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株（ＣａＳｋｉおよびＣＵＭＣ−６）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図２２に示されるように、ＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子の発現レベルは、子宮頸部癌組織ならびに子宮頸部癌細胞株ＣａＳｋｉおよびＣＵＭＣ−６において増加し、すなわち、約１０ｋｂの優性ＭＩＧ７  ｍＲＮＡ転写物が過剰発現され、そしてＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子は、とりわけ転移性子宮頸部リンパ節組織において最も高く発現したが、正常組織においては極めて低く発現したことが明らかにされた。図２２および２３において、「正常」レーンは正常子宮外頸部組織を表し、「癌」レーンは子宮頸部癌組織を表し、「転移」レーンは転移性子宮頸部リンパ節組織を表し、そして「ＣａＳｋｉ」レーンおよび「ＣＵＭＣ−６」レーンの各々は子宮癌細胞株を表す。図２３は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。
【０２４７】
図３６は、ＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、例えば、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球の組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図３７は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図３６に示されるように、ＭＩＧ７  ｍＲＮＡ転写物（約１０ｋｂの優性ｍＲＮＡ転写物）は、脳、心臓、横紋筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球などの正常組織においては弱く発現したかまたは検出されなかったことが明らかにされた。
【０２４８】
図５０は、ＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株、例えば、ＨＬ−６０、ＨｅＬａ、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ａ５４９、およびＧ３６１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示す。図５１は、同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによってｍＲＮＡ転写物の存在を示すノーザンブロッティングの結果を示す。図５０に示されるように、ＭＩＧ７  ｍＲＮＡ転写物（約１０ｋｂの優性ｍＲＮＡ転写物）は、ＨｅＬａ子宮癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２、リンパ芽球性白血病株ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、結腸癌細胞株ＳＷ４８０、および肺癌細胞株Ａ５４９において非常に増加したレベルで発現したことが明らかにされた。
【０２４９】
実施例８：ヒトプロトオンコ遺伝子でＥ．ｃｏｌｉを形質転換した後に発現したタンパク質のサイズ決定
配列番号１のＭＩＧ３；配列番号５のＭＩＧ８；配列番号９のＭＩＧ１０；配列番号１３のＭＩＧ１３；配列番号１７のＭＩＧ１４；配列番号２１のＭＩＧ１８；配列番号２５のＭＩＧ１９；配列番号２９のＭＩＧ５；および配列番号３３のＭＩＧ７を、ｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｕ．Ｓ．）のマルチクローニングサイトに挿入し、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｕ．Ｓ．）を、得られたｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧベクターの各々で形質転換した。発現させるタンパク質ＨＴ−チオレドキシンを、ｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏベクターのマルチクローニングサイトの上流領域に挿入した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉ株の各々を、振盪しながらＬＢブロス中でインキュベートし、その後、得られた培養物の各々を１／１００の比率で希釈し、３時間インキュベートした。０．５ｍＭ  Ｌ−アラビノース（Ｓｉｇｍａ）をそこに加えて、タンパク質の産生を促した。
【０２５０】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をＬ−アラビノース誘導の前後で超音波処理し、その後、超音波処理したホモジネートを１２％ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
【０２５１】
図５２は、ｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ３ベクターで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ここで、約３８ｋＤａの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、Ｌ−アラビノース誘導後に明確に観察された。この３８ｋＤａタンパク質は、約１５ｋＤａの分子量を有するＨＴ−チオレドキシンおよび約２３ｋＤａの分子量を有するＭＩＧ３タンパク質を含む。各々のタンパク質はｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ３ベクターに挿入されている。
【０２５２】
図５３は、ｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ８ベクターで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ここで、約７２ｋＤａの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、Ｌ−アラビノース誘導後に明確に観察された。この７２ｋＤａタンパク質は、約１５ｋＤａの分子量を有するＨＴ−チオレドキシンタンパク質および約５７ｋＤａの分子量を有するＭＩＧ８タンパク質を含む。各々のタンパク質はｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ８ベクターに挿入されている。
【０２５３】
図５４は、ｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ１０ベクターで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ここで、約６０ｋＤａの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、Ｌ−アラビノース誘導後に明確に観察された。この６０ｋＤａタンパク質は、約１５ｋＤａの分子量を有するＨＴ−チオレドキシンタンパク質および約４５ｋＤａの分子量を有するＭＩＧ１０タンパク質を含む。各々のタンパク質はｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ１０ベクターに挿入されている。
【０２５４】
図５５は、ｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ１３ベクターで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ここで、約４６ｋＤａの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、Ｌ−アラビノース誘導後に明確に観察された。この４６ｋＤａタンパク質は、約１５ｋＤａの分子量を有するＨＴ−チオレドキシンタンパク質および約３１ｋＤａの分子量を有するＭＩＧ１３タンパク質を含む。各々のタンパク質はｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ１０ベクターに挿入されている。
【０２５５】
図５６は、ｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ１４ベクターで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ここで、約５４ｋＤａの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、Ｌ−アラビノース誘導後に明確に観察された。この５４ｋＤａタンパク質は、約１５ｋＤａの分子量を有するＨＴ−チオレドキシンタンパク質および約３９ｋＤａの分子量を有するＭＩＧ１４タンパク質を含む。各々のタンパク質はｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ１４ベクターに挿入されている。
【０２５６】
図５７は、ｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ１８ベクターで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ここで、約８８ｋＤａの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、Ｌ−アラビノース誘導後に明確に観察された。この８８ｋＤａタンパク質は、約１５ｋＤａの分子量を有するＨＴ−チオレドキシンタンパク質および約７３ｋＤａの分子量を有するＭＩＧ１８タンパク質を含む。各々のタンパク質はｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ１８ベクターに挿入されている。
【０２５７】
図５８は、ｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ１９ベクターで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ここで、約１２２ｋＤａの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、Ｌ−アラビノース誘導後に明確に観察された。この１２２ｋＤａタンパク質は、約１５ｋＤａの分子量を有するＨＴ−チオレドキシンタンパク質および約１０７ｋＤａの分子量を有するＭＩＧ１９タンパク質を含む。各々のタンパク質はｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ１９ベクターに挿入されている。
【０２５８】
図５９は、ｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ５ベクターで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ここで、約３６ｋＤａの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、Ｌ−アラビノース誘導後に明確に観察された。この３６ｋＤａタンパク質は、約１５ｋＤａの分子量を有するＨＴ−チオレドキシンタンパク質および約２１ｋＤａの分子量を有するＭＩＧ５タンパク質を含む。各々のタンパク質はｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ５ベクターに挿入されている。
【０２５９】
図６０は、ｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ７ベクターで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０株におけるタンパク質の発現パターンを決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ここで、約２４ｋＤａの分子量を有する融合タンパク質のバンドが、Ｌ−アラビノース誘導後に明確に観察された。この２４ｋＤａタンパク質は、約１５ｋＤａの分子量を有するＨＴ−チオレドキシンタンパク質および約９ｋＤａの分子量を有するＭＩＧ７タンパク質を含む。各々のタンパク質はｐＢＡＤ／ｔｈｉｏ−Ｔｏｐｏ／ＭＩＧ７ベクターに挿入されている。
【０２６０】
産業上の利用可能性
上記のように、ヒトの発癌に関与し、同時に癌転移を誘導する能力を有する新規な遺伝子である本発明のプロトオンコ遺伝子は、肺癌、白血病、子宮癌、リンパ腫、結腸癌、皮膚癌などを含む癌を診断すること、ならびに形質転換動物を作製することなどのために効果的に使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
図面の説明は以下の通りである。
【図１】Ｌ２７６８１１  ＤＮＡ  フラグメントが正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびＡ５４９肺癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示すゲルダイアグラムである。
【図２】ＣＣ２３１  ＤＮＡフラグメントが正常子宮外頸部組織、子宮頸部腫瘍組織、転移性リンパ節腫瘍組織、およびＣＵＭＣ−６癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示すゲルダイアグラムである。
【図３】Ｌ７８９  ＤＮＡフラグメントが正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびＡ５４９肺癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示すゲルダイアグラムである。
【図４】Ｌ９８６  ＤＮＡフラグメントが正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびＡ５４９肺癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示すゲルダイアグラムである。
【図５】Ｌ１２８４  ＤＮＡフラグメントが正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、およびＡ５４９肺癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示すゲルダイアグラムである。
【図６】ＣＡ３６７  ＤＮＡフラグメントが正常子宮外頸部組織、子宮頸部腫瘍組織、転移性リンパ節腫瘍組織、およびＣＵＭＣ−６癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示すゲルダイアグラムである。
【図７】ＣＡ３３５  ＤＮＡフラグメントが正常子宮外頸部組織、子宮頸部腫瘍組織、転移性リンパ節腫瘍組織、およびＣＵＭＣ−６癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示すゲルダイアグラムである。
【図８】ＣＧ２６３  ＤＮＡフラグメントが正常子宮外頸部組織、子宮頸部腫瘍組織、転移性リンパ節腫瘍組織、およびＣＵＭＣ−６癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示すゲルダイアグラムである。
【図９】ＣＧ２３３  ＤＮＡフラグメントが正常子宮外頸部組織、子宮頸部腫瘍組織、転移性リンパ節腫瘍組織、およびＣＵＭＣ−６癌細胞において発現するか否かを決定するためのディファレンシャルディスプレイ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示すゲルダイアグラムである。
【図１０】図１０（ａ）は、本発明のＭＩＧ３プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、ならびにＡ５４９肺癌細胞株およびＮＣＩ−Ｈ３５８肺癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すゲルダイアグラムであり、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図１１】本発明のＭＩＧ８プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングを示すゲルダイアグラムである。
【図１２】図１１におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図１３】図１３（ａ）は、本発明のＭＩＧ１０プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、ならびにＡ５４９肺癌細胞株およびＮＣＩ−Ｈ３５８肺癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すゲルダイアグラムであり、図１３（ｂ）は、図１３（ａ）におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図１４】図１４（ａ）は、本発明のＭＩＧ１３プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、ならびにＡ５４９肺癌細胞株およびＮＣＩ−Ｈ３５８肺癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すゲルダイアグラムであり、図１４（ｂ）は、図１４（ａ）におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図１５】図１５（ａ）は、本発明のＭＩＧ１４プロトオンコ遺伝子が正常肺組織、左肺癌組織、左肺から右肺に転移した転移性肺癌組織、ならびにＡ５４９肺癌細胞株およびＮＣＩ−Ｈ３５８肺癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すゲルダイアグラムであり、図１５（ｂ）は、図１５（ａ）におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図１６】本発明のＭＩＧ１８プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングを示すゲルダイアグラムである。
【図１７】図１６におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図１８】本発明のＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングを示すゲルダイアグラムである。
【図１９】図１８におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図２０】本発明のＭＩＧ５プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングを示すゲルダイアグラムである。
【図２１】図２０におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図２２】本発明のＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子が正常子宮外頸部組織、子宮癌組織、転移性子宮頸部リンパ節組織、および子宮頸部癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングを示すゲルダイアグラムである。
【図２３】図２２におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図２４Ａ】図２４（ａ）は、本発明のＭＩＧ３プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図２４Ｂ】図２４（ｂ）は、図２４（ａ）におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図２５】本発明のＭＩＧ８プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図２６】図２５におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図２７Ａ】図２７（ａ）は、本発明のＭＩＧ１０プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図２７Ｂ】図２７（ｂ）は、図２７（ａ）におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図２８Ａ】図２８（ａ）は、本発明のＭＩＧ１３プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図２８Ｂ】図２８（ｂ）は、図２８（ａ）におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図２９Ａ】図２９（ａ）は、本発明のＭＩＧ１４プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図２９Ｂ】図２９（ｂ）は、図２９（ａ）におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図３０】本発明のＭＩＧ１８プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図３１】図３０におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図３２】本発明のＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図３３】図３２におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図３４】本発明のＭＩＧ５プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図３５】図３４におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図３６】本発明のＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子が、正常ヒト１２レーンの複数組織において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図３７】図３６におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図３８Ａ】図３８（ａ）は、本発明のＭＩＧ３プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図３８Ｂ】図３８（ｂ）は、図３８（ａ）におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図３９】本発明のＭＩＧ８プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４０】図３９におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４１Ａ】図４１（ａ）は、本発明のＭＩＧ１０プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４１Ｂ】図４１（ｂ）は、図４１（ａ）におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４２Ａ】図４２（ａ）は、本発明のＭＩＧ１３プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４２Ｂ】図４２（ｂ）は、図４２（ａ）におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４３Ａ】図４２（ａ）は、本発明のＭＩＧ１３プロトオンコ遺伝子が、ヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４３Ｂ】図４２（ｂ）は、図４２（ａ）におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４４】本発明のＭＩＧ１８プロトオンコ遺伝子がヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４５】図４４におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４６】本発明のＭＩＧ１９プロトオンコ遺伝子がヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４７】図４６におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４８】本発明のＭＩＧ５プロトオンコ遺伝子がヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図４９】図４８におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図５０】本発明のＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子がヒト癌細胞株において発現するか否かを決定するためのノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図５１】図５０におけるものと同じ試料をβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせることによって得られたノーザンブロッティングの結果を示すダイアグラムである。
【図５２】図５２〜６０は、本発明のＭＩＧ３、ＭＩＧ８、ＭＩＧ１０、ＭＩＧ１８、ＭＩＧ１３、ＭＩＧ１４、ＭＩＧ１９、ＭＩＧ５、およびＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子をそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換した後、Ｌ−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示すダイアグラムである。
【図５３】図５２〜６０は、本発明のＭＩＧ３、ＭＩＧ８、ＭＩＧ１０、ＭＩＧ１８、ＭＩＧ１３、ＭＩＧ１４、ＭＩＧ１９、ＭＩＧ５、およびＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子をそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換した後、Ｌ−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示すダイアグラムである。
【図５４】図５２〜６０は、本発明のＭＩＧ３、ＭＩＧ８、ＭＩＧ１０、ＭＩＧ１８、ＭＩＧ１３、ＭＩＧ１４、ＭＩＧ１９、ＭＩＧ５、およびＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子をそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換した後、Ｌ−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示すダイアグラムである。
【図５５】図５２〜６０は、本発明のＭＩＧ３、ＭＩＧ８、ＭＩＧ１０、ＭＩＧ１８、ＭＩＧ１３、ＭＩＧ１４、ＭＩＧ１９、ＭＩＧ５、およびＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子をそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換した後、Ｌ−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示すダイアグラムである。
【図５６】図５２〜６０は、本発明のＭＩＧ３、ＭＩＧ８、ＭＩＧ１０、ＭＩＧ１８、ＭＩＧ１３、ＭＩＧ１４、ＭＩＧ１９、ＭＩＧ５、およびＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子をそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換した後、Ｌ−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示すダイアグラムである。
【図５７】図５２〜６０は、本発明のＭＩＧ３、ＭＩＧ８、ＭＩＧ１０、ＭＩＧ１８、ＭＩＧ１３、ＭＩＧ１４、ＭＩＧ１９、ＭＩＧ５、およびＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子をそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換した後、Ｌ−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示すダイアグラムである。
【図５８】図５２〜６０は、本発明のＭＩＧ３、ＭＩＧ８、ＭＩＧ１０、ＭＩＧ１８、ＭＩＧ１３、ＭＩＧ１４、ＭＩＧ１９、ＭＩＧ５、およびＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子をそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換した後、Ｌ−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示すダイアグラムである。
【図５９】図５２〜６０は、本発明のＭＩＧ３、ＭＩＧ８、ＭＩＧ１０、ＭＩＧ１８、ＭＩＧ１３、ＭＩＧ１４、ＭＩＧ１９、ＭＩＧ５、およびＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子をそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換した後、Ｌ−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示すダイアグラムである。
【図６０】図５２〜６０は、本発明のＭＩＧ３、ＭＩＧ８、ＭＩＧ１０、ＭＩＧ１８、ＭＩＧ１３、ＭＩＧ１４、ＭＩＧ１９、ＭＩＧ５、およびＭＩＧ７プロトオンコ遺伝子をそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換した後、Ｌ−アラビノース誘導の前後で発現したタンパク質のサイズを決定するためのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示すダイアグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008525045.tif 000007
【図６】
2008525045.tif 000008
【図７】
2008525045.tif 000009
【図８】
2008525045.tif 000010
【図９】
2008525045.tif 000011
【図１０】
2008525045.tif 000012
【図１１】
2008525045.tif 000013
【図１２】
2008525045.tif 000014
【図１３】
2008525045.tif 000015
【図１４】
2008525045.tif 000016
【図１５】
2008525045.tif 000017
【図１６】
2008525045.tif 000018
【図１７】
2008525045.tif 000019
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2008525045.tif 000022
【図２１】
2008525045.tif 000023
【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
2008525045.tif 000027
【図２５】
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【図２６】
2008525045.tif 000029
【図２７Ａ】
2008525045.tif 000030
【図２７Ｂ】
2008525045.tif 000031
【図２８Ａ】
2008525045.tif 000032
【図２８Ｂ】
2008525045.tif 000033
【図２９Ａ】
2008525045.tif 000034
【図２９Ｂ】
2008525045.tif 000035
【図３０】
2008525045.tif 000036
【図３１】
2008525045.tif 000037
【図３２】
2008525045.tif 000038
【図３３】
2008525045.tif 000039
【図３４】
2008525045.tif 000040
【図３５】
2008525045.tif 000041
【図３６】
2008525045.tif 000042
【図３７】
2008525045.tif 000043
【図３８】
2008525045.tif 000044
【図３８Ｂ】
2008525045.tif 000045
【図３９】
2008525045.tif 000046
【図４０】
2008525045.tif 000047
【図４１】
2008525045.tif 000048
【図４１Ｂ】
2008525045.tif 000049
【図４２】
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【図４２Ｂ】
2008525045.tif 000051
【図４３】
2008525045.tif 000052
【図４３Ｂ】
2008525045.tif 000053
【図４４】
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【図４５】
2008525045.tif 000055
【図４６】
2008525045.tif 000056
【図４７】
2008525045.tif 000057
【図４８】
2008525045.tif 000058
【図４９】
2008525045.tif 000059
【図５０】
2008525045.tif 000060
【図５１】
2008525045.tif 000061
【図５２】
2008525045.tif 000062
【図５３】
2008525045.tif 000063
【図５４】
2008525045.tif 000064
【図５５】
2008525045.tif 000065
【図５６】
2008525045.tif 000066
【図５７】
2008525045.tif 000067
【図５８】
2008525045.tif 000068
【図５９】
2008525045.tif 000069
【図６０】
2008525045.tif 000070
【配列表】
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【国際調査報告】
2008525045.tif 000071
2008525045.tif 000072
2008525045.tif 000073