(57)【要約】  増殖性疾患を治療することにおいて適用可能な、有害な細胞を破壊するための方法が提供される。細胞は、化学発光剤とリガンド−光感作物質コンジュゲートとの組み合わせた治療によって破壊される。化学発光剤はその場に存在する酸素種と反応するときに光を放射し、コンジュゲートはそのリガンドを通して細胞に結合して、放射された光によって活性化され、それによって細胞を破壊する。本方法は、ルミノールの存在下で癌性細胞を破壊するトランスフェリン−ヘマトポルフィリンのコンジュゲートについて示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）化学発光剤（ＣＡ）によって光活性化されたときにエネルギーを分子状酸素に伝達して反応性酸素種を生成する光感作物質（Ｐｓ）を含むリガンド−毒素コンジュゲート（ＬＴＣ）を標的細胞に結合する工程；
ｉｉ）その場に存在する酸素種と反応して化学発光光を生成するＣＡに前記標的細胞を曝露し、それによって前記標的細胞の細胞構成要素に直接的な損傷を与える工程
を含む、選択された標的細胞を破壊するための方法。
【請求項２】
前記工程ｉ）およびｉｉ）は任意の順序でまたは同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＴＣ中のリガンドはペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドは前記標的細胞の表面上の受容体によって認識される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドはトランスフェリンである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｐｓはヘマトポルフィリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＬＴＣはトランスフェリンおよびヘマトポルフィリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＡはルミノールまたはルミノール誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＡは前記ＬＴＣに結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞は増殖性疾患に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は癌性細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞は内部身体組織に属する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は皮膚に属する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞は細胞培養物に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＡと、Ｐｓを含むＬＴＣとを対象に投与し、それによって細胞集団中の細胞を破壊することを含む、細胞集団の望ましくない活動に関連する疾患を対象において治療する方法。
【請求項１６】
前記望ましくない活動は増強された増殖である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＬＴＣの投与および前記ＣＡの投与は、任意の順序でまたは同時に行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＬＴＣはトランスフェリンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｐｓはヘマトポルフィリンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＬＴＣはトランスフェリンおよびヘマトポルフィリンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＡはルミノール誘導体またはルミノールを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＡは前記ＬＴＣに結合される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患は、癌または過形成に関連する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
Ｐｓを含むＬＴＣと、ＣＡとの、癌を治療するための組み合わせられた使用。
【請求項２５】
前記ＬＴＣはトランスフェリンおよびヘマトポルフィリンを含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記ＣＡは前記ＬＴＣに共有結合される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
その場でリガンド−毒素コンジュゲートを活性化する化学発光剤を含む、増殖性疾患の治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２８】
リガンド−毒素コンジュゲートを含む、増殖性疾患の治療における使用のための医薬組成物であって、前記リガンドはペプチドであり、前記毒素は光感作物質であり、そして前記光感作物質は化学発光剤によってその場で活性化される、医薬組成物。
【請求項２９】
有害な細胞を破壊するための方法であって、光感作物質（Ｐｓ）を含むリガンド−毒素コンジュゲート（ＬＴＣ）を前記細胞に結合する工程；および前記細胞を化学発光剤（ＣＡ）に曝露し、それによって前記Ｐｓを活性化し、反応性酸素種を生成し、前記有害な細胞の細胞溶解を誘導する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘマトポルフィリンのような光感作物質を含むリガンド−毒素コンジュゲートと化学発光剤を使用する組み合わせられた治療によって、選択された標的細胞を破壊するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学治療剤の低い標的特異性は、標的細胞特異的受容体に指向された輸送リガンドにエフェクター分子を結合させることを含むリガンド−毒素コンジュゲート（ＬＴＣ）のような標的化薬物送達戦略の開発を刺激してきた［例えば、Ｍｒｓｎｙ  Ｒ．Ｊ．：Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４（２００４）６５−７３を参照のこと］。小分子のようなリガンドは、抗体のような大分子より有利である。本発明者らは、形質細胞の標的化された破壊のための小分子含有ＬＴＣの使用について最近報告し［Ｆｉｒｅｒ  Ｍ．Ａ．ら：Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４４（２００３）６８１−９］、このアプローチが多発性骨髄腫療法に適用できるかもしれないことを示唆した。ＬＴＣ戦略は、本発明の１つの側面を示す。別の側面は、結合して細胞溶解に導く膜の変性を誘導する２つの非毒性成分に基づく２段階手順である光力学的療法（ＰＤＴ）に関する。第１の成分は光感作（Ｐｓ）分子、通例はポルフィリン誘導体であり、それは光活性化されたときにエネルギーを分子状酸素に伝達して細胞構成要素、特に膜リン脂質に直接的に損傷を与える反応性酸素種を生成する。ＰＤＴは、以下の少なくとも２つのさらなる機構によって腫瘍細胞の破壊を媒介すると考えられる：腫瘍脈管細胞の破壊、および炎症と免疫抗腫瘍反応の両方の誘導。ＰＤＴの歴史、作用機構、および生物医学的な適用はいくつかの概説の主題であった［例えば、Ｓｈａｒｍａｎ  Ｗ．Ｍ．ら：Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．５６（２００４）５３−７６を参照のこと］。２つの主要な問題が、治療様式としてのＰＤＴのより広範な適用を制限する。第１に、光感作物質は腫瘍組織中に蓄積する傾向があるので、毒性の副作用がそれらの臨床的使用を妨げるだろう。この問題を克服するために、ＰｓはＰＤＴ効果を標的細胞に局在化させるためにキャリア分子に共有結合された［例えば、Ｂｒｏｗｎ  Ｓ．Ｂ．ら：（２００４）．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．５（２００４）４９７−５０８］。この目的のための１つの魅力的なキャリアタンパク質−受容体システムは、鉄輸送体トランスフェリン（Ｔｆ）とその細胞表面受容体（ＴｆＲ、ＣＤ７１）との間の高親和性相互作用を利用する。全ての分裂する細胞は代謝のために鉄の継続的な供給を必要とするので、ＴｆＲが種々の悪性細胞の表面で過剰発現されることは驚きではなく［Ｐｏｎｋａ  Ｐ．ら：Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３５（１９９８）３５−５４］、従ってＴｆ−ＴｆＲシステムは、Ｐｓ化合物を異なるタイプの悪性細胞に標的化するためにいくつかの形式で使用されてきた［Ｈａｍｂｌｉｎ  Ｍ．Ｒ．ら：Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２６（１９９４）４５−５６；Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ−Ｄｉａｋｕｎ  Ｋ．ら：Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６１（１９９５）５２３−８；Ｃａｖａｎａｕｇｈ  Ｐ．Ｇ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．７２（２００２）１１７−３０；Ｇｉｊｓｅｎｓ  Ａ．ら：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１０１（２００２）７８−８５；Ｌｉ  Ｈ．ら：Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２２（２００２）２２５−５０］。ＰＤＴに関する第２の主要な��題は、外部光の制限された組織透過力である。光線療法のための外部光装置の開発における進歩、および末梢の癌および皮膚科学におけるＰＤＴの臨床的使用の成功にもかかわらず、内部身体組織の治療はカテーテルの使用のような侵襲性の手順に限定されたままである。Ｐｓ活性化への分子的なアプローチの開発が試みられてきた。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ［Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｓ．ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１９９４）１２２７３−７］はヒペリシンの細胞内生物発光活性化および続いて起こるウマ皮膚細胞の破壊を利用し、一方Ｐｈｉｌｌｉｐ［Ｐｈｉｌｌｉｐ  Ｍ．Ｊ．ら：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４６（１９８９）２６６−７２］は乳腺癌において細胞内ＣＬを誘導するためにヘマトポルフィリン誘導体（フォトフィリン  ＩＩ）および多成分溶液を使用した。しかしながら、現在のシステムはＰＤＴの十分な特異性および有効性を提供しない。従って、本発明の目的は有意に改善されたパラメータを有するバイオコンジュゲートを提供することである。
【０００３】
ルミノール（５−アミノ−２−３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）は種々のＣＬベースのアッセイシステムにおいて成功裏に使用されてきた［Ｋｒｉｃｋａ  Ｊ．Ｌ．：Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９（２００２）１１４−２９；Ｔｅｍｐｌｉｎ  Ｍ．Ｆ．ら：Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ７（２００２）８１５−２２］。ルミノールのＣＬ反応の機構はしばらく前から知られており、マクロファージにおけるルミノール活性化のいくつかの物理化学的側面が調査されてきたが［Ｎｅｍｅｔｈ  Ａ．ら：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５５（１９９９）３６０−６］、ルミノールとＰＤＴの結合はこれまで一度も腫瘍細胞においてＰＤＴ細胞毒性を誘導するために利用されてこなかった。従って、本発明のもう１つの目的はＬＴＣおよび化学発光剤を含むＰＤＴを提供することである。
【０００４】
本発明の他の目的および利点は以下の説明から明らかになるだろう。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、選択された標的細胞を破壊するための方法であって、ｉ）化学発光活性化剤（ＣＡ）に前記細胞を曝露する工程、およびｉｉ）光感作物質（Ｐｓ）を含むリガンド−毒素コンジュゲート（ＬＴＣ）を前記細胞に結合する工程を含む方法を提供する。前記ＣＡは化学発光光を生成し、この化学発光光は前記Ｐｓを活性化し、このＰｓはエネルギーを分子状酸素に伝達して反応性酸素種を生成し、前記標的細胞に損傷を与える。前記ＣＡは、その場に存在する酸素種と反応することによって前記光を生成する。本発明の方法において、前記工程ｉ）およびｉｉ）は任意の順序でまたは同時に行われることができる。さらに、ＣＡとＬＴＣは種々の手段によって結合されることができる。前記ＬＴＣは、小分子、ペプチドもしくはタンパク質、または標的細胞上のトランスフェリン受容体のような特定の細胞受容体に結合するように意図される、標的化細胞の表面上の構成要素に対して親和性を有する他の因子（例えば、トランスフェリン）を含む。前記ＬＴＣは好ましくは、Ｐｓとしてヘマトポルフィリンを含む。本発明の好ましい実施形態において、標的細胞を破壊するための方法におけるＬＴＣは、トランスフェリンおよびヘマトポルフィリンを含む。破壊される細胞は好ましくは、増殖性疾患に関連する。前記細胞は、血液、皮膚、深部身体組織、あるいは細胞培養物の一部であってもよい。本発明は、癌性細胞を破壊するための方法を提供する。
【０００６】
本発明はさらに、Ｐｓを含むＬＴＣと、ＣＡの２つの成分を対象に投与することを含む、望ましくない細胞増殖または細胞活動に関連する疾患を対象において治療する方法に関する。前記ＬＴＣの投与および前記ＣＡの投与は、任意の順序でまたは同時に行われることができる。前記ＬＴＣとＣＡはまた、相互に結合されても良い。前記ＬＴＣは好ましくはトランスフェリンを含む。前記Ｐｓは好ましくはヘマトポルフィリンを含む。本発明の好ましい実施形態において、トランスフェリンおよびヘマトポルフィリンは前記ＬＴＣ中でコンジュゲート化される。前記疾患は、癌性疾患または過形成であることができる。前記疾患は、アテローム性動脈硬化、慢性関節リウマチ、乾癬、突発性肺線維症、硬皮症、硬変症、子宮内膜症、新血管形成、および腫瘍を含む、細胞の増殖が病因に寄与する状態を含むことができる。
【０００７】
本発明はまた、Ｐｓを含むＬＴＣと、ＣＡとの、癌を治療するための組み合わせられた使用に関し、前記ＬＴＣは好ましくはトランスフェリンおよびヘマトポルフィリンを含む。前記ＣＡは、例えば共有結合によって前記ＬＴＣに結合されることができる。
【０００８】
本発明は、リガンド−毒素コンジュゲートを含む、増殖性疾患の治療における使用のための医薬組成物を提供し、前記リガンドはトランスフェリンであり、前記毒素は光感作物質であり、前記光感作物質は化学発光剤によってその場で活性化される。本発明はまた、その場でリガンド−毒素コンジュゲートを活性化する化学発光剤を含む、増殖性疾患の治療における使用のための医薬組成物を提供する。
【０００９】
本発明はまた、有害な細胞を破壊するための方法であって、ｉ）光感作物質（Ｐｓ）を含むリガンド−毒素コンジュゲート（ＬＴＣ）を前記細胞に結合する工程；およびｉｉ）前記細胞を化学発光剤（ＣＡ）に曝露し、それによって前記光感作物質を活性化し、反応性酸素種を生成し、前記有害な細胞の細胞溶解を誘導する工程を含む方法に向けられる。
【００１０】
図面の簡単な記述
本発明の上記および他の特徴および利点は、以下の実施例および添付の図面を参照することによって容易に明らかになるだろう。
図１は、ＰＢＳ中のＴｆ、Ｈｐ、およびＴｆ−ＨｐのＵＶ可視吸収スペクトルを示す。
図２は、細胞ＦＬ（Ａ）、Ｋ５６２（Ｂ）、およびＵ−７６．（Ｃ）に対するＨｐおよびＴｆ−Ｈｐの用量依存性細胞毒性を示す；０．５〜１×１０５細胞／ｍｌは、培地のみにおいてまたはＨｐもしくはＴｆ−Ｈｐ（０〜３μＭ）を含有する培地において暗所で２時間培養され、洗浄され、室温で１６時間周囲の蛍光に曝露され、次いで２４時間完全培地において再培養された。細胞生存度はトリパンブルー排除によって評価された。データは、少なくとも３回の実験からの平均および標準偏差を示す。
図３は、３つの細胞系についてのＴｆ−ＨｐまたはＨｐによって誘導されたＰＤＴの細胞毒性効率の比較を示す表１である。
図４は、ＰＤＴ効果の分子的細胞内活性化を示す。ＦＬ細胞は、１０μＭルミノールと合わせた、ヘマトポルフィリン（Ｈｐ）またはヘマトポルフィリン−トランスフェリンコンジュゲート（Ｔｆ−Ｈｐ）（０〜３μＭ）で３７℃で４８時間暗所で培養された。細胞の外部放射または他の操作は行われなかった。培養期間の終わりに細胞生存度がトリパンブルー排除によって決定された。
図５は、ＰＤＴにおける細胞内活性化に対する２つの成分の効果を示すグラフである。ＦＬ細胞は、ヘマトポルフィリン−トランスフェリンコンジュゲート（Ｔｆ−Ｈｐ）（０〜３μＭ）およびルミノール（０〜１０μＭ）の異なる濃度の組合せで３７℃で４８時間暗所で培養された。細胞の外部放射または他の操作は行われなかった。培養期間の終わりに細胞生存度がトリパンブルー排除によって決定された。
図６は、細胞毒性に対する２つの成分のＬＴＣと化学発光剤の効果を、それらの適用における遅延およびそれらの適用の順序に関して示す。図６Ａは、Ｔｆ−Ｈｐ処理されたＦＬ細胞の細胞毒性に対するルミノールによる遅延したＰＤＴ活性化の効果を示す。細胞は、Ｔｆ−Ｈｐ（３μＭ）で３７℃で暗所で２時間培養され、洗浄された。種々の遅延時間（０分、３０分、６０分、または９０分）の後、ルミノール（５μＭ）が添加され、細胞はさらに暗所で１６時間培養された。図は誘導された細胞毒性の百分率を示す。０遅延点は細胞の洗浄のためおよびそれらを培養に戻すための時間（約１５分）を含む。図６Ｂは、Ｔｆ−Ｈｐによる細胞増殖阻害に対する、ルミノールによってＦＬ細胞を予め処理することの効果を示す。細胞はまず、２４時間暗所で１０μＭのルミノールの存在下で培養され、洗浄されまたは洗浄されずに、次いで３７℃でＴｆ−Ｈｐ（０〜３μＭ）の存在下でさらに２４時間培養された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ヘマトポルフィリン（Ｈｐ）およびキャリアタンパク質トランスフェリン（Ｔｆ）を含むバイオコンジュゲートは、ルミノールと共に適用されたときに赤白血病細胞に対するＰＤＴの特異性および有効性を有意に改善することが今や見出された。観察された相乗的な毒性効果は、細胞が化学発光剤およびリガンド−光感作物質コンジュゲートと接触される順序に依存しない。
【００１２】
ルミノール、イソルミノール、またはルシゲニンのような化学発光剤（ＣＬ）は、酸化されるときに光を放射することが知られている。理論によって縛られたくないのだが、本発明による方法において、ルミノールはその場に存在する酸化因子による活性化後に光を放射するように誘導されるようであり、この酸化因子には、分子状酸素、または酸素原子を提供することができる化学的な基および分子、過酸化物、または他の反応性酸素種（ＲＯＳ）が含まれる。酸素またはＲＯＳのような前記酸化因子は、光放射を誘導し、それは、リガンド−毒素コンジュゲートのＰｓ成分を活性化し、そして細胞破壊で終わる、さらなるＲＯＳの形成を含む事象のカスケードを開始させる。このＲＯＳおよび酸素供給源は、代謝的に生成されようが外部の酸素供給によって提供されようが、ＰＤＴサイクルを長くする。それ自身は毒性を予期されない驚くほど低濃度のＣＬ剤は、標的細胞を死滅させるのに十分である。さらに、本発明のＰＤＴ成分は同時に存在する必要がないので、先行技術ＰＤＴのもう１つの問題、すなわち細胞において複数の因子が調整されて存在する必要性は取り除かれる。
【００１３】
本発明の好ましいコンジュゲート、Ｔｆ−Ｈｐコンジュゲートは、ＴｆおよびＨｐからＨＰＬＣによって分離され、紫外可視分光測光法によって特徴付けられた（図１）。Ｔｆスペクトルは、λ＝２８０ｎｍで特有の最大点を示し、一方Ｈｐの吸収最大点はλ＝３７５ｎｍにある。Ｈｐ−Ｔｆコンジュゲートは、λ＝２８０ｎｍおよびλ＝４１２ｎｍで２つの吸収ピークを有し、スペクトルは最大の赤方偏移によって特徴付けられ、その成分のスペクトルの単なる重ね合わせではない。
【００１４】
図２は、ＦＬ細胞、Ｋ５６２細胞、およびＵ−７６細胞の細胞生存度に対するＨｐまたはＴｆ−Ｈｐ  ＬＴＣ処理の用量依存性効果を示す。暗所で種々の濃度のＨｐまたはＴｆ−Ｈｐで細胞を培養した後、一晩周囲の蛍光に曝露することは、全ての細胞タイプについてＨｐ単独よりもＴｆ−Ｈｐの方がはるかに毒性であることを示した。図３（表１）は、ＬＤ５０を達成するために必要とされるＴｆ−Ｈｐの濃度はＨｐより６倍以上低かったことを示す。さらに、ＬＤ１００値は、Ｔｆ−Ｈｐによってのみ得られた。Ｕ−７６ハイブリドーマ細胞は、ＰＤＴに対して比較的感受性ではなかった。これらの細胞におけるＬＤ９０を達成するために必要とされるＴｆ−Ｈｐの濃度は、ＦＬ細胞に対するよりも１９．４倍以上高く、Ｋ−５６２細胞に対するよりも３．５倍以上高かった。この感受性の順序は、ＬＤＭＡＸについて必要とされる濃度でも保持された（ＦＬに対して３．３７、Ｋ５６２に対して０．８）。さらに、１００％の細胞毒性は、コンジュゲートが赤白血病細胞系に対して使用された場合にのみ得られた。類似の感受性のパターンはまた、遊離Ｈｐ処理でも見られた。両方の赤白血病系に対して類似（９０％）のＬＤＭＡＸが達成されたが、ＦＬ細胞はＫ−５６２よりも１６．６倍感受性が高かった。
【００１５】
遊離Ｈｐより増強されたＴｆ−Ｈｐの細胞毒性についてのさらなる証拠は、ＨｐまたはＴｆ−Ｈｐのいずれかで４５分および６０分培養された後にＦＬ細胞中のＰｓの存在および位置を示す蛍光顕微鏡検査から得られた。両方の時点で、（抗漂白溶液は使用されなかったので）比較的かすかなＨｐ蛍光が原形質膜領域に主に限定されて観察された。Ｔｆ−Ｈｐで処理された細胞において、有意に強い蛍光が見出された。４５分後、コンジュゲートは膜パッチ（あるいは、境界を画定するリソソーム内の区画）中に局在化され、６０分までに細胞質の多くに浸透した。
【００１６】
さらに、ＰＤＴを誘導する細胞内化学発光光シグナルの能力が試験された。図４は、ＨｐまたはＴｆ−Ｈｐ単独でまたはそれを１０μＭルミノールと合わせて暗所で培養されたＦＬ細胞において誘導される細胞毒性を示す。細胞は手順のいかなる段階においても周囲の蛍光に曝されなかった。以下のことが見出された：ｉ）ルミノール単独では約１５％の細胞毒性を誘導した、ｉｉ）Ｈｐ単独では細胞生存度に対してほとんど効果がなかった、ｉｉｉ）細胞毒性はＨｐとルミノールの存在下で最大の３０％に達した、およびｉｖ）ルミノールはＴｆ−Ｈｐの添加で有意な（９５％）ＰＤＴ効果を誘導した。図５は、細胞毒性ルミノール誘導されたＰＤＴ効果が、Ｔｆ−Ｈｐおよびルミノールの両方の濃度に依存し、１０μＭのルミノールと３μＭのコンジュゲートの組合せで最大の細胞毒性を生成することをさらに示す。Ｔｆ−Ｈｐ濃度の減少は、ルミノールのレベルを下げることほどは細胞毒性に対して効果がなかった。ルミノールおよびＴｆ−Ｈｐに対する曝露における同時性がこの細胞毒性のための必要条件かどうかは、細胞をまずＴｆ−Ｈｐで培養し、洗浄し、次いで細胞を種々の遅延時間の後にルミノールに曝露することによって確認された。細胞を洗浄し、そして細胞を培養に戻すまでの時間は約１５分であった。３０分間のルミノールに対する曝露の遅延は細胞毒性に対して効果がなかったが（図６Ａ）、６０分の遅延後、ＰＤＴ効果は５０％減少された。しかしながら、プロトコルを逆にすると（図６Ｂ）、２４時間のルミノールでの前培養はＴｆ−Ｈｐへの遅延された曝露に対して細胞を敏感にし、ＰＤＴ効果は用量依存的であることが見出された。
【００１７】
本発明は、ＰＤＴ技術の２つの問題に取り組む。第１の問題は、標的細胞へのＰｓ送達の効率を増強するＰＤＴシステムの開発に関する。標的化されたＰＤＴ研究の大半は、アドレス部分としてモノクローナル抗体を使用していた。抗体の使用はいくつかの実際的な制限を引き起こすので、代替的なアプローチはＴｆ−ＰｓコンジュゲートをＴｆ受容体に標的化してもよい。Ｔｆタンパク質［Ｗｅａｖｅｒ  Ｍ．ら：Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．６５（２００３）３−１３］およびＴｆ化学物質［Ｓｉｎｇｈ  Ｍ．ら：Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８（１９９８）１４２３−７］毒素コンジュゲートの治療上の可能性は、既に試験されてきたが、Ｔｆ−Ｐｓコンジュゲートについて、特にＨｐに関しては、１０年以上にわたって病院において遊離形態で成功裏に使用されてきた［Ｄｏｌｍａｎｓ  Ｄ．Ｅ．ら：Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ３（２００３）  ３８０−７］にもかかわらず、ほとんど知られておらず、標的化ＰＤＴにおいてほとんど試験されてこなかった［Ｈａｍｂｌｉｎ  Ｍ．  Ｒ．ら：Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２６（１９９４）４５−５６］。本発明は、ＬＤ５０レベルであっても、細胞死の誘導において少なくとも６倍効果的なＴｆ−Ｈｐコンジュゲートを提供する（図２および表１）。
【００１８】
標的特異性および有効性の増大を別として、ＰＤＴ誘導された細胞死はＴｆ−Ｈｐが使用されるときに早くなる。例えば、ＬＴＣ細胞毒性アッセイの最適化の間に、Ｔｆ−Ｈｐへのたった３０分間の曝露後にほぼ１００％の細胞毒性が達成されたが、遊離Ｈｐの最大活性（２４％）に対しては約２時間が必要とされることが本発明者らによって見出された。さらに、ＨｐおよびＴｆ−Ｈｐ処理されたＦＬ細胞の蛍光顕微鏡検査は、Ｔｆ−Ｈｐがより急速に取り込まれて細胞内細胞小器官に到達し、これは細胞内膜の崩壊をより効果的に提供するだろうということを示した。
【００１９】
本発明によって取り組まれるＰＤＴ技術の第２の問題は、Ｐｓに送達される発光活性化シグナルの供給源に関する。外部放射は組織培養物においてまたは皮下注射の間にＰｓの均質な励起を提供するが、内部組織内への可視光の浸透は数ミリメートルに限定されており、より深い組織標的に対するＰＤＴの使用を妨げている。この制限を克服するための努力は新しい外部光装置または改善されたカテーテルに注がれてきた。本発明の目的は、Ｐｓが添加された標的細胞内で分子的な光放射機構を提供することであった。この戦略は、非侵襲的であり、正常な組織を照射に曝露せず、分子的発光体は生体内で標的細胞に輸送されることができる。本発明者らは、このような分子的システムを説明するためにＰＤＴの細胞内活性化（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＤＴ）（ＩＡＰ）という用語を使用する。
【００２０】
ルミノールは、金属イオンと過酸化水素によって触媒される光放射プロセスを経験する化学発光活性体である。このプロセスは、化学発光検出技術および細胞生理学研究において利用されるが、本発明は癌細胞のＰＤＴの現場におけるエネルギー供給源としてルミノールを利用する。ルミノールの放射スペクトルは、４２４ｎｍおよび４８５ｎｍで２つの主要なピークを含む。本発明者らによって、第１のピークはＴｆ−Ｈｐの吸収スペクトルにおけるクレストに一致することが観察され（４１２ｎｍ、図１）、これはＨｐに対して増強されたＴｆ−Ｈｐの細胞内取り込みと合わせて、ルミノールを含むＩＡＰが効果的であることを示唆している。初めに、ＨｐまたはＴｆ−Ｈｐはルミノールと混合され、暗所でＦＬ細胞培養物に添加された（図４）。先行する報告と一致して、高濃度のＴｆ−Ｈｐは単独で低いレベルの細胞毒性を誘導し［Ｓｕｐｉｎｏ  Ｒ．ら：Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．５７（１９８６）２５８−９４；Ｌｕｋｓｉｅｎｅ  Ｚ．ら：Ｍｅｄｉｃｉｎａ  ３９（２００３）６７７−８２］、これはタンパク質キナーゼＣの活性を阻害するＨｐの能力と関連しうる効果であった。Ｔｆ−Ｈｐおよびルミノールの両方が細胞に添加されたとき、有意なＰＤＴ効果があるだけでなく、Ｈｐに対するＴｆ−Ｈｐの細胞毒性の有効性は外部光供給源で見られる以上に増強された（図２）。しかしながら、ＩＡＰシステムにおいてＬＤＭＡＸを達成するために必要とされるＴｆ−Ｈｐの濃度は、外部放射より６．７倍高かった（図４および表１）。先行研究において、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ［Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｓ．ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１９９４）１２２７３−７］は、ルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化に引き続くヒペリシンの活性化を含む、ウイルスに感染した細胞の死滅を誘導するＰＤＴのための生物発光ＩＡＰシステムを記載した。
【００２１】
さらなる実験は、ＰｓとＩＡＰシステムが効果的なＰＤＴ応答を生成するためには同時に適用されることが必要であるかどうかを評価した（図６）。Ｔｆ−Ｈｐを添加された細胞への４５分遅れのルミノールの添加は細胞毒性を減少しない。また、細胞はルミノールへの曝露の前に入念に洗浄されたので、これらの結果は膜にゆるく結合している物質よりも細胞内Ｔｆ−Ｈｐの活性化を反映する。さらなる３０分のルミノールへの曝露の遅延は、ＰＤＴ効果を半分減少し、Ｔｆ−Ｈｐ残留時間がこのシステムにおける制限因子であることを示唆する。成分が逆の順序で添加されたとき、ルミノールを添加された細胞はＴｆ−Ｈｐが２４時間遅れて添加された場合でさえＰＤＴに対して非常に感受性が高いままであった。
【００２２】
述べてきたように、光力学的療法（ＰＤＴ）は２段階のプロセスを含む。第１の工程において、光吸収光感作物質（Ｐｓ）（例えば、ヘマトポルフィリン、Ｈｐ）はエンドサイトーシスによって取り込まれる。第２の工程において、Ｐｓは光によって活性化され、エネルギーを細胞質の受容体分子に伝達し、この受容体分子は分子状酸素を活性化し、反応性酸素種（ＲＯＳ）を生じ、この反応性酸素腫は細胞構成要素、特に膜リン脂質に損傷を与える。このプロセスの結果は細胞溶解につながる。病院におけるＰＤＴの使用を拡大する努力は、Ｐｓ標的細胞特異性の欠如および外部光放射の組織浸透力の欠如によって妨げられてきた。本発明は、キャリアタンパク質トランスフェリンおよびＨｐを含むバイオコンジュゲート（Ｔｆ−Ｈｐ）を提供し、これは赤白血病細胞に対するＰＤＴの特異性および有効性をＬＤ５０レベルで約２０倍有意に改善する。蛍光顕微鏡検査は、コンジュゲートがエンドサイトーシスによって取り込まれて細胞内小胞中に蓄積し、一方遊離Ｈｐがほとんど膜に結合したことを示した。さらに、本発明者らによってＰｓ活性化のための外部放射の使用は、Ｔｆ−Ｈｐに先立ってかまたはＴｆ−Ｈｐと共にルミノールで細胞を培養することによって回避されることができることが示された。ルミノールは細胞内で活性化されて、細胞の９５％においてＰＤＴ誘導された細胞毒性を刺激する化学発光放射を生じる。これらの戦略はより安全でより効果的なＰＤＴの適用を提供する。
【００２３】
本発明は、ＰＤＴ適用の制限を克服する新しいアプローチを提供する。Ｔｆ−Ｈｐシステムを使用する標的化ＬＴＣ戦略の有効性がまず確立され、次いでルミノールの生体内での適用可能性が実証され、ここで、ルミノールは白血病細胞の破壊のための細胞内ＣＬの強力な分子的誘導物質として使用されることができ、ＰＤＴにおける外部光供給源の使用を不要にする。
【００２４】
結論として、本発明はＰＤＴ誘導された細胞毒性のための実現性のあるビヒクルとしてＴｆ−Ｈｐコンジュゲートを提供する。エンドサイトーシスによって効果的に取り込まれるキャリアタンパク質を使用したＰｓの増強された標的化は、投薬量を減少することおよび遊離Ｐｓで必然的に生成される正常組織への毒性を克服することによってＰＤＴの治療有効性を増大する。従って、本発明は例えば癌のような増殖性疾患に関連する細胞を破壊するための手段を提供する。
【００２５】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明され、例示される。
【実施例】
【００２６】
一般的手順
Ｈｐ、ウサギ抗ヒトトランスフェリン、ヤギ抗ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、およびルミノールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入された。Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａから購入された。ウマ血清（ＨＳ）、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン、および組み合わせられた抗生物質は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．（Ｂｅｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）から購入された。ＨＰＬＣ溶媒はＭｅｒｃｋから購入された。
【００２７】
細胞
Ｕ−７６は、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）に対してＩｇＧ１抗体を分泌するマウスハイブリドーマであり、Ｅｓｈｈａｒ教授（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）の好意による寄贈品であった。これらの細胞ならびにＦｒｉｅｎｄ白血病（ＦＬ）細胞は、１５％  ＨＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および組み合わせられた抗生物質を含有するＤＭＥＭ中で増殖された。ヒトＫ５６２細胞は、ＲＰＭＩ／１５％  ＨＳ／グルタミン／抗生物質中で増殖された。全ての細胞は６％  ＣＯ２を含有する加湿された培養器中で３７℃で維持された。
【００２８】
Ｈｐ含有ＬＴＣの調製
０．１１ミリモルのヘマトポルフィリン塩酸塩は、１０ｍｌクロロホルム中に溶解され、０．１７３ミリモルのＮＨＳおよび０．１１ミリモルのＤＣＣの添加によって活性化された。混合物は２．５時間室温で攪拌された。空気流による蒸発後、残留物は２ｍｌのＴＨＦに溶解され、活性化されたＨｐは氷上で冷却された１０ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中に溶解された１５ｍｇのトランスフェリンの溶液にゆっくりと添加された。溶液は室温まで温められ、ｐＨ７．５に調整され、一晩激しく攪拌された。Ｈｐを含有する試験管は光曝露から保護された。コンジュゲート溶液は遠心分離され（７２００×ｇ、３０分、４℃）、上清はタンパク質（λ＝２８０ｎｍ）およびＨｐ（λ＝４００ｎｍ）の含有量について分光器によって分析された。透析後、粗反応生成物のごくわずかな量は５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．０）または１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で平衡化されたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０上で色層分析された。２８０ｎｍおよび４００ｎｍで吸収ピークを有する物質を含有する画分は回収され、４℃で保存された。
ＨＰＬＣ：Ｔｆ、Ｈｐ、およびＴｆ−Ｈｐは、ＪＡＳＣＯ  １５７５  紫外可視検出器と共にＨＰＬＣ  ＪＡＳＣＯー１５８０を用いてＣ−１８カラム（３．９ｍｍ×３００ｍｍ  Ｂｏｎｄｃｌｏｎｅ、粒子直径１０μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で色層分析された。溶媒系は１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水から構成され、化合物は直線勾配（２０〜１００％アセトニトリル）で溶出された。
吸収スペクトル：Ｈｐ（０．０２ｍｇ／ｍｌ）、Ｔｆ（１．４ｍｇ／ｍｌ）、およびＴｆ−Ｈｐ（１．４ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＳ溶液の吸収スペクトルは、ＣＣＤアレイ検出器を備えた、１ｎｍの光学解像度およびミリメートルあたり６００本の格子を有するＣＨＥＭＵＳＢ２−紫外可視分光計で記録された。サンプルは２５０ｎｍ〜５００ｎｍの吸収領域で走査された。
生物学的活性：これは抗トランスフェリン抗体または抗ＢＳＡ抗体のＰＤＴ誘導細胞毒性を阻害する能力によって評価され、Ｔｆ−Ｈｐに単独であるいは異なる濃度の各抗体と合わせて曝露されたＦＬ細胞を用いて試験された。
【００２９】
ＬＴＣ細胞毒性アッセイ
後期対数増殖期の細胞は３７℃まで予め温められたＤＭＥＭで洗浄され、０．５〜１×１０５細胞／ｍｌで単独でまたは増大する濃度のＴｆ−Ｈｐ  ＬＴＣと合わせて６％ＣＯ２において３７℃で２時間培養された。細胞は、次いでＤＭＥＭで洗浄され、１２〜１６時間周囲の蛍光（フルエンス率＝０．５ｍＷ／ｃｍ２）に曝露され、次いで２４時間完全培地において再培養された。細胞生存度はトリパンブルー排除によって決定された。実験は少なくとも３回繰り返された。Ｐｓおよび蛍光放射への細胞の最適曝露時間は、予備的な経時実験において決定された。
【００３０】
ＨｐおよびＴｆ−Ｈｐエンドサイトーシスの蛍光顕微鏡検査
ＦＬ細胞は、ＨｐまたはＴｆ−Ｈｐと一緒に組織培養皿中のスライドガラス上で増殖され、取り込まれた蛍光は、励起のための高圧水銀ランプおよび青紫励起（バンドパス４２０〜４８０ｎｍ）のための一組のフィルタ、ダイクロイックミラー（４５５ｎｍ）、およびカットオン赤色放射バリアフィルタ（５８０ｎｍ）を備えたＡＸ７０  Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を用いて種々の時間間隔で追跡された。蛍光は、いかなる抗漂白溶液も加えることなく６０倍対物レンズで分析され、ＣＣＤカメラによって記録された。
【００３１】
ルミノールによる細胞内ＰＤＴ活性化
ＦＬ細胞は、洗浄され、ルミノール（０〜１０μＭ）と一緒に異なる濃度のＨｐまたはＴｆ−Ｈｐ（０．０７、０．１５、または０．３μＭ）で２０時間培養された。細胞および成分の操作は部屋の電灯を消して行われた。培養期間の間、培養プレートはアルミニウム箔を巻きつけられた。その後、実験は、ＰＤＴ効果がルミノールまたはＴｆ−Ｈｐコンジュゲートのいずれかへの細胞の曝露を互い違いに行なうことによって得ることができるかどうかを試験することを目的とした。ＦＬ細胞は、Ｔｆ−Ｈｐ（３μＭ）で３７℃で暗所で２時間培養され、洗浄され、標準的な培養濃度の培地に再懸濁された。この手順は約１５分かかった。次いで、細胞はさらに０分間、３０分間、６０分間、または９０分間３７℃で保たれ、ルミノール（１０μＭ）が添加され、培養物はさらに１６時間暗所で培養された。あるいは、細胞はまず１０μＭのルミノールの存在下で暗所で２４時間培養され、洗浄され、または洗浄されずに、次いで３７℃でＴｆ−Ｈｐ（０〜３μＭ）の存在下でさらに２４時間培養された。洗浄手順および細胞取扱いの間、暗環境に細胞を維持するために特別な配慮がなされた。
【００３２】
本発明はいくつかの特定の実施例によって説明されてきたが、多くの変更および変形が可能である。従って、添付の特許請求の範囲内で、本発明は具体的に記載されたのとは違うように実現されてもよいことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＰＢＳ中のＴｆ、Ｈｐ、およびＴｆ−ＨｐのＵＶ可視吸収スペクトルを示す。
【図２Ａ−Ｂ】細胞ＦＬ（Ａ）およびＫ５６２（Ｂ）に対するＨｐおよびＴｆ−Ｈｐの用量依存性細胞毒性を示す。
【図２Ｃ】細胞Ｕ−７６．（Ｃ）に対するＨｐおよびＴｆ−Ｈｐの用量依存性細胞毒性を示す。
【図３】３つの細胞系についてのＴｆ−ＨｐまたはＨｐによって誘導されたＰＤＴの細胞毒性効率の比較を示す表１である。
【図４】ＰＤＴ効果の分子的細胞内活性化を示す。
【図５】ＰＤＴにおける細胞内活性化に対する２つの成分の効果を示すグラフである。
【図６】細胞毒性に対する２つの成分のＬＴＣと化学発光剤の効果を、それらの適用における遅延およびそれらの適用の順序に関して示す。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月26日(2007.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された標的細胞を選択的に破壊するための医薬の製造における、その場に存在する酸素種と反応して化学発光光を生成する化学発光剤と組み合わせた、光感作物質（Ｐｓ）およびそれに結合された輸送リガンドを含むリガンド−毒素コンジュゲート（ＬＴＣ）の使用。
【請求項２】
細胞集団の望ましくない活動と関連する疾患を治療するための医薬の製造における、その場に存在する酸素種と反応して化学発光光を生成する化学発光剤と組み合わせた、光感作物質（Ｐｓ）およびそれに結合された輸送リガンドを含むリガンド−毒素コンジュゲート（ＬＴＣ）の使用。
【請求項３】
前記望ましくない活動は増強された増殖である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記疾患は、癌または過形成に関連する、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記リガンド−毒素コンジュゲートおよび前記化学発光剤は、任意の順序でまたは同時に使用される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記リガンド−毒素コンジュゲート中の前記輸送リガンドはペプチドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記ペプチドは前記標的細胞の表面上の受容体によって認識される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ペプチドはトランスフェリンである、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記光感作物質は化学発光剤（ＣＡ）によって光活性化されたときにエネルギーを分子状酸素に伝達して反応性酸素種を生成する、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記Ｐｓはヘマトポルフィリンを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記リガンド−毒素コンジュゲートはトランスフェリンおよびそれに結合されたヘマトポルフィリンを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記ＣＡはルミノールまたはルミノール誘導体を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記化学発光剤はルミノールまたはルミノール誘導体を含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記化学発光剤はルミノール、イソルミノール、およびルシゲニンからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記化学発光剤は前記リガンド−毒素コンジュゲートに結合される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記細胞は増殖性疾患に関連する、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
前記細胞は癌性細胞である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記細胞は内部身体組織に属する、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記細胞は皮膚に属する、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
前記細胞は細胞培養物に属する、請求項１に記載の使用。
【請求項２１】
前記リガンド−毒素コンジュゲートは細胞内小胞に蓄積することができるように選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
標的細胞に対する前記リガンド−毒素コンジュゲートの特異性と、標的細胞に対する前記光感作物質単独の特異性との比率は２より大きい、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
前記比率は２０である、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
前記リガンド−毒素コンジュゲートおよび前記化学発光剤は、標的細胞の破壊において相乗的に作用する、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
リガンド−毒素コンジュゲートと組み合わせられた、増殖性疾患の治療における使用のための医薬組成物であって、前記組成物はその場で前記リガンド−毒素コンジュゲートを活性化する化学発光剤としてルミノールまたはその誘導体を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
リガンド−毒素コンジュゲートを含む医薬組成物であって、前記組成物は光感作物質およびそれに結合された輸送リガンドを含み、前記リガンド−毒素コンジュゲートはそれに結合された化学発光剤を有する、医薬組成物。
【国際調査報告】
2008536912.tif 000009
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