(57)【要約】興味の製薬活性分子からなるヘリコバクターベース製剤が開示され、更には該製剤の調剤法と使用法が開示される。特に疾患の治療処置及び／又は予防接種に有用な興味の製薬活性分子のコード化配列を含有するピロリ菌ベクター、ベクタープラスミド及び組み換え型細胞を提供する。製薬活性分子は胃粘膜や鼻腔膜のような粘膜表面に送達され、製薬活性分子が有効且つ継続して送達される。ベクターとシャトルベクター作成物も又提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター配列と興味の非ヘリコバクター製薬活性分子のコード化非ヘリコバクター配列を有するヘリコバクター分子作成物からなる組成。
【請求項２】
ヘリコバクターがピロリ菌である請求項１に従う組成。
【請求項３】
興味の製薬活性分子がピロリ菌種に異種である請求項１又は請求項２に従う組成。
【請求項４】
更にプロモーター配列を含む請求項１乃至３のいずれか一つに従う組成。
【請求項５】
興味の製薬活性分子がグレリン、アミリン又はその類似体である請求項１乃至４のいずれか一つに従う組成。
【請求項６】
ピロリ菌が弱毒ピロリ菌である請求項２乃至５のいずれか一つに従う組成。
【請求項７】
興味の製薬活性分子がタンパク質、ペプチド又は核酸分子からなる請求項２乃至６のいずれか一つに従う組成。
【請求項８】
請求項４に従う組成と製薬容認担体溶液からなるワクチン。
【請求項９】
請求項４に従う組成からなるベクタープラスミド。
【請求項１０】
ワクチンからなる組成で、該ワクチンが
（a）興味の非ヘリコバクター製薬活性分子のコード化配列の発現を調節できるプロモーター配列からなるヘリコバクターヌクレオチド配列と
（ｂ）興味の非ヘリコバクター製薬活性分子のコード化配列
からなるヘリコバクターベクタープラスミドからなる組成。
【請求項１１】
更にアジュバントを含む請求項１０に従う組成。
【請求項１２】
更に粘膜への送達に適するように記載の請求項１０又は請求項１１に従う組成。
【請求項１３】
興味の非ヘリコバクター製薬活性分子がタンパク質、ペプチド又は核酸分子からなる請求項１０乃至１２いずれか一つに従う組成。
【請求項１４】
興味の非ヘリコバクター製薬活性分子がグレリン、アミリン、拮抗物質又はその類似体である請求項１０乃至１２のいずれか一つに従う組成。
【請求項１５】
非ヘリコバクター免疫原からなる免疫原性組成の製剤法で、
（a）プラスミドベクターで形質転換可能なピロリ菌細胞からなる培養物を提供し、
（ｂ）該培養物にプロモーター配列と非ヘリコバクター免疫原のコード化配列からなるプラスミドベクターを適切条件で導入し、形質転換ピロリ菌細胞を提供し、且つ
（ｃ）該非ヘリコバクター免疫原を発現する形質転換細胞を選択して、免疫原性組成を提供することからなり、
該プロモーター配列が非ヘリコバクター免疫原のコード化配列の発現を調節できる方法。
【請求項１６】
プロモーター配列が誘発性プロモーターを含む請求項１５に従う方法。
【請求項１７】
更に非抗生物質耐性遺伝子マーカーを含む請求項１５又は請求項１６に従う方法。
【請求項１８】
プロモーターがピロリ菌で恒常的に発現される請求項１５に従う方法。
【請求項１９】
プロモーターがアラビノース誘発性プロモーターである請求項１５に従う方法。
【請求項２０】
ピロリ菌が２６６９５株である請求項１５乃至１９のいずれか一つに従う方法。
【請求項２１】
プラスミドベクターが更にオペロン作成物を含むと定義する請求項１５乃至２０のいずれか一つに従う方法。
【請求項２２】
動物治療法が
（a）請求項１０乃至１５のいずれか一つに従う組成を提供し、且つ
（ｂ）動物に有効量の該組成を投与する
段階からなる方法。
【請求項２３】
動物がヒトである請求項２２に従う方法。
【請求項２４】
治療動物が増強免疫反応を有する請求項２２に従う方法。
【請求項２５】
組成を動物の粘膜表面に投与する請求項２２乃至２４のいずれか一つに従う方法。
【請求項２６】
一つ以上の有効量組成を動物に投与する請求項２２乃至２５のいずれか一つに従う方法。
【請求項２７】
興味の非ピロリ菌製薬活性分子のコード化配列を含む組み換え型細胞からなる組成が
（a）少なくとも一つの興味の製薬活性分子のコード化非ヘリコバクター配列、及び
（ｂ）非ヘリコバクター配列発現を調節できるプロモーター配列を有するヘリコバクター配列からなり
組み換え型細胞が該核酸の発現又は標的細胞の核酸分子発現を起こすことが可能な組成。
【請求項２８】
組み換え型細胞のコード化ヌクレオチド配列が更に分泌シグナルペプチドを含む請求項２７に従う組成。
【請求項２９】
該組み換え型細胞が組み換え型ピロリ菌である請求項２７に従う組成。
【請求項３０】
該組み換え型ピロリ菌がｐＴＭ１０３−８である請求項２９に従う組成。
【請求項３１】
組み換え型ピロリ菌からなる組成で、
（a）興味の非ヘリコバクター製薬活性分子とヘリコバクター配列からなる融合タンパク質のコード化配列、及び
（ｂ）誘発性ピロリ菌プロモーター配列からなる組成。
【請求項３２】
請求項３１に従う組成を含むプラスミドベクター。
【請求項３３】
活性成分として、製薬容認希釈剤、担体、アジュバント又はそれらの組み合わせと共に、請求項３２のプラスミドベクターからなる製薬組成。
【請求項３４】
組み換え型ピロリ菌製剤法が
（）ピロリ菌培養物を提供し、且つ
（ｂ）請求項３２に従うプラスミドベクターを培養物に提供して組み換え型ピロリ菌を提供することからなり、
該組み換え型ピロリ菌が標的細胞で該非ヘリコバクター製薬活性分子を発現か発現を起こすことが可能な方法。
【請求項３５】
請求項３１に従う組成で、該組み換え型ヘリコバクターが更に免疫調節ポリペプチドのコード化第二核酸分子からなり、該組み換え型ヘリコバクターが標的細胞で該第二核酸分子を発現できる組成。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は体内での生物活性薬剤の送達に関する。特に本発明は生物活性薬剤の体内の解剖学的位置へ直接送達するための細菌デリバリシステムを用いた疾患治療、緩和又は防止に関する。一実施形態では細菌デリバリシステムは異種核酸が発現される動物又は動物細胞に異種核酸を送達するヘリコバクターかヘリコバクター特性を示す細菌からなる。更なる実施形態ではこのヘリコバクターは異種核酸をコードするDNAベクターを含むように操作し、感染すると生物活性薬剤が動物体、特に粘膜に送達されるように核酸ベクターが発現する。
【背景技術】
【０００２】
先天性疾患と後天性疾患をもつ個体への薬物や免疫薬剤送達は長期的に継続する必要性がある。大抵の場合これは治療化合物投与を一日数回、毎日又は時々繰り返すことになる。しかしいずれの長期治療法や予防療法は服薬遵守、副作用及び薬物耐性のような問題を有する。その結果通常１００％有効で、副作用がなく安価な治療を確認する必要が常にある。
最近研究された種々の治療薬剤や予防薬送達の一形式は微生物の使用である。細菌、ウイルス、寄生虫、更には哺乳類を含む種々生物での興味の遺伝子を、例えばこれら微生物が異種タンパク質を発現するか又はある所望性質を与えるように導く目的で、種々の細菌、ウイルスや放線菌にクローンされた。これらの微生物はワクチン接種計画、遺伝子置換治療や治療組成送達で用いられてきた。
微生物は又動物（宿主）細胞の体内形質変換に用いられてきた。宿主細胞の形質変換は複製能力のないウイルス含有遺伝子送達ベクター（例えば米国特許５，８２４，５４４参照）、裸DNA（例えば米国特許６，２６１、８３４参照）、組換え型発現カセット含有リポソーム（例えば米国特許６，２７１，２０７参照）を用いて達成できる。他の分子的機序の治療組成送達手段としては、異種表面タンパク質を発現するようデザインした複製能力のない組換え型ウイルスの使用がある（例えば米国特許６，３７６，２３６参照）。
最近製薬研究者により又組換え型生物体使用ベクター、無生物ベクター及び裸DNAを用いて体内治療組成発現法の開発が試みられた。組換え型生物体使用ベクターの例としては、組換え型細菌（例えば米国特許５，５４７，６６４参照）、アルファウイルスのようなウイルス（例えば米国特許６，３９１，６３２参照）、ワクシニアウイルス（例えば米国特許６，２６７，９６５参照）、アデノウイルス（例えば米国特許５，６９８，２０２参照）及びアデノウイルス随伴ウイルス（AAV）（例えば米国特許６，１７１、５９７参照）がある。無生物ベクターとしてはDNA／カチオン性リポソーム複合体、中性リポソームかアニオン性リポソーム封入DNAやリポソーム取り込みのポリカチオン凝縮DNA（LPDIとLPDII）のような脂質遺伝子送達ベクター作成物がある。（ロペルト（Ropert）、１９９９年、ブラジリアンジャーナルオブメディカルアンドバイオロジカルリサーチ（Braz. J. Med. Biol. Res.）、３２巻（２号）、１６３−９頁参照。）
【０００３】
種々の細菌で送達した他遺伝子の例では、正常非侵襲性大腸菌赤痢菌浸潤遺伝子をクローンした大腸菌を侵襲性にし、その結果ワクチン株使用により適するようにするか、熱帯熱マラリア遺伝子をネズミチフス菌にクローンし、次いでこれらマラリアタンパク質を発現し、この細菌の経口投与に続いてマウスにマラリア誘発に対する特異的細胞傷害性T細胞の免疫と保護の誘導する（例えばホーン等（Hone, et al.）、１９９２年、ワクチン（Vaccine）、９巻、８１０−８１６頁；タケット等（Tacket et al.）、１９９２年、インフェクションアンドインミュノロジー（Infect. Immun.）、６０巻、５３６−５４１頁；ホーン等（Hone, et al.）、１９９２年、ジャーナルオブクリニカルインベスティゲーション（J. Clin. Invest.）、９０巻、４１２−４２０頁；チャットフィールド等（Chatfield, et al.）、ワクチン（Vaccine）、１０巻、８−１１頁；タケット等（Tacket, et al.）、１９９２年、ワクチン（Vaccine）、１０巻、４４３−４４６頁；及びミムス等（Mims, et al.）、１９９３年、医微生物学（Medical Microbiology）、モズビーイヤーブックヨーロッパ社（Mosby-Year Book Europe Ltd.）、ロンドン（London）；サドッフ等（Sadoff, et al.）、１９８８年、サイエンス（Science）、２４０巻、３３６−３３８頁；アグラワル等（Aggrawal, et al.）、１９９０年、ジャーナルオブエクスペリメンタルメディシン（J. Exp. Med.）、１７２巻、１０８３―１０９０頁）。
弱毒性赤痢菌かより低毒性の赤痢菌（例えばノリエガ等（Noriega, et al）、１９９４年、インフェクションアンドインミュノロジー（Infect. Immun.）、６２巻、５１６８−５１７２頁、米国特許出願２００２０１７６８４８参照）、サルモネラ菌（例えば米国特許６，５３１，３１３、米国特許出願２００３０１７０２１１参照）、リステリア（例えばシェーファー等（Schafer et al.）、１９９２年、ジャーナルオブインミュノロジー（J. Immunol.）、１４９巻、５３−５９頁、米国特許出願２００３０００８８３９参照）及び他細菌を経口投与して、より高毒性形のこれら細菌による後続感染に対し免疫性を与えた。同様にカルメットーゲラン桿菌（BCG）のような弱毒細菌性生物体や放線菌生物体（ラグランデリー等（Lagrandeie, et al.）、１９９３年、ワクチン（Vaccine）、１１巻、１２８３−１２９０頁；フリン（Flynn）、１９９４年、セルアンドモレキュラーバイオロジー（Cell Molec. Biol.）、４０巻（補巻１）、３１−３６頁）を非経口投与して結核菌のような関連生物体から保護した。
ベクターとして用いた他の細菌種のいくつかとしては、エンテロコリチカ菌（バンダーメ等（van Dame, et al.）、１９９２年、ガストロエンテロロジー（Gastroenterolo.）、１０３巻、５２０−５３１頁）やコレラ菌（レバイン等（Levine, et al.）、１９９４年、“コレラ菌、分子からグロバールな視点”（Vibrio chloerae, Molecular to Global Perspective's）,ワズミュース等編（Wachsmuth,et al）、エイエスエムプレス（ASM Press）、ワシントン、ディシィ（Washington, D.C.）、３９４−４１４頁）がある。
これほどの研究にも関わらず上記細菌デリバリシステムの全ては、体内で使用する以前に解決する必要がある技術的困難を有する。実際大部分の細菌系は機能性分子を産生するのに細菌自身が必要であり、ヒト使用に十分安全なだけ弱毒化され、なお且つ生物活性薬剤を産生できる細菌に依存する。しかし以前に用いた弱毒性細菌株の全ては、副作用を起こすことなしに体内で長期間生存すできない。より重要なのはこれら細菌種の多く治療薬や予防薬を動物粘膜上皮細胞に送達できないことである。しかし最も重要な治療薬の多くは粘膜から吸収する。それ故生物活性薬剤を直接粘膜に送達できる細菌デリバリシステムの必要性がある。
【０００４】
パウエル等（Powell, et al.）の米国特許５，８７７，１５９では、増殖性感染を確立したり病気を引き起こすことなしに粘膜細胞に浸潤でき、その結果動物細胞が発現できる抗原をコードする真核生物発現カセットを導入できる生細菌を開示している。この方法により途上国でのワクチン送達の関心事である容易な投与も含む粘膜表面へのDNAワクチン送達が可能になるが、興味遺伝子をコードする増幅可能な伝令RNAの供与という利点はない。更にパウエル等（Powell, et al.）が開示した細菌は送達の持続性がない。
以前に非病原性、非コロニー形成性、非侵襲性食品用細菌の乳酸菌を用いた薬剤を粘膜に送達した（例えば英国特許GB―２２７８３５８B参照）。しかし乳酸菌は非侵襲性であるが、治療薬が粘膜上皮細胞に直接継続送達できる慢性感染は確立できない。
従って生物活性薬剤を動物の粘膜上皮細胞に送達できるように、その近辺に非侵襲性慢性感染症が確立できるデリバリシステムの必要性が継続的にある。更に粘膜表面へ薬理的活性分子を有効且つ有益な免疫原性反応を引き起こすに十分な改良送達機構の必要性が継続的にある。これにより薬理的活性薬の有効な体内デリバリシステムと、更には予防接種、即ち一般体液性粘膜免疫反応を起こすに十分な粘膜表面での抗原の暴露に対する有効法が提供される。
（特許文献）
以下の文献を具体的に文献としてここに取り入れる。
【特許文献１】米国特許６，５７０，００４―ブレイサー等（Blaser, et al.）（２００３年）
【特許文献２】米国特許６，６８０，１７９―コリンズ等（Collins, et al.）
【特許文献３】米国特許６，３８３，４９６―カーティス等（Curtiss, et al.）（２００２年）
【特許文献４】米国特許６，１５０、１７０―パウエル等（Powell, et al.）（２０００年）
【特許文献５】米国特許６，４１０，０１２―サイズモア等（Seizmore, et al.）（２００２年）
【特許文献６】米国特許６，５５０，４１９―ホーン等（Hone, et al.）（２００２年）
【特許文献７】米国特許６，５３１，３１３―グードスミット等（Goudsmit, et al.）（２００３年）
【特許文献８】米国特許６，６８２，７２９―パウエル等（Powell, et al.）（２００４年）
【特許文献９】米国特許公開２００５／００７５２９８Ａ１―チェン等（Chen, et al.）（２００５年）
【特許文献１０】米国特許公開２００２／０１７６８４８Ａ１―サイズモア等（Seizmore, et al.）（２００２年）
【特許文献１１】米国特許公開２００５／００９６２８８Ａ１―ゲバラ等（Guevara, et al.）（２００５年）
【特許文献１２】米国特許公開２００４／０２３６０７２Ａ１―オルムステッド等（Olmsted, et al.）（２００４年）
【特許文献１３】米国特許公開２００４／０２０３０３９Ａ１―ヘンセル等（Hensel, et al.）（２００４年）
【特許文献１４】米国特許公開２００４／０００５３２５Ａ１―カスターズ等（Kusters, et al.）（２００４年）
【特許文献１５】米国特許公開２００２／００３２１５２Ａ１―トロシアン等（Torossian, et al.）（２００２年）
【特許文献１６】米国特許公開２００３／０１７０２６４Ａ１―ターナー等（Turner, et al.）（２００３年）
【特許文献１７】米国特許公開２００３／０２０４０６８―ブラセック等（Blasec, et al.）（２００３年）
【特許文献１８】米国特許公開２００２／０１６１１９２Ａ１―マイヤー等（Meyer, et al.）（２００２年）
【特許文献１９】ＷＯ９６／３３２７４―コバッシ等（Covacci, et al.）（１９９６年）
【特許文献２０】ＷＯ９９／２１９５９―エリス等（Ellis, et al.）（１９９９年）
【特許文献２１】ＷＯ０１／９４５９９―ブルマン等（Burman, et al.）（２００１年）
【特許文献２２】ＷＯ２００５  ０２１０２６―バロン等（Baron, et al.）（２００５年）
【特許文献２３】グラーム等（Graham, et al.）、（２００２年）、ガストロエントトロジー（Gastroenterology）、１２３巻、１６３７−１６４８頁
【特許文献２４】リュ等（Liu, et al.）、（２００５年）、ワールドジャーナルオブガストロエントトロジー（World Journal Gastroenterology）、１１巻（１４号）、２１５４−２１５６頁
【特許文献２５】コンウエイ、ビーアール（Conway, BR）、（２００５年）、カレントファーマスティカルリサーチ（Curr. Pharm. Res.）、１１巻（６号）、７７５−９０頁
【特許文献２６】ソウカー等（Sawker, et al.）、（２００２年）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブユウエスエイ（PNAS USA）、９９巻（２４号）、１５４２８−１５４３３頁
【特許文献２７】サットン、ピー等（Sutton, P. et al.）、（２００４年）、ワクチン（Vaccine）、２２巻（２０号）、２５４１−６頁
【特許文献２８】カン等（Kang, et al.）、（２００５年）、ワールドジャーナルオブガストロエントトロジー（World Journal Gastroenterology）、１１巻（３号）、４５４−４５６頁
【特許文献２９】モスチョス等（Moschos, et al.）、（２００４年）、インミュノロジーアンドセルバイオロジー（Immunology and Cell Biology）、８２巻（６号）、６２８−６３７頁
【特許文献３０】レディ等（Reddy, et al.）、（２００４年）、インターナショナルジャーナルオブアンチミクロビアルエイジェント（International Journal Antimicrob. Agents）、２４巻（６号）、５３６−４７頁
【特許文献３１】バイ等（Bai et al.）、（２００３年）、シェンウーゴングクスバオ（Sheng Wugong Cheng Xu Bao）、１９巻（４号）、４３８―８頁
【特許文献３２】ノルタ等（Nolta, et al.）、（１９９２年）、ジャーナルオブクリニカルインベスティゲーション（Journal of Clin. Invest.）、９０巻（２号）、３４２−３４８頁
【特許文献３３】シー等（Shi, et al.）、（２００５年）、ヘリコバクター（Helicobacter）、１０巻（１号）、７１−９頁
【特許文献３４】デムル等（Deml, et al.）、（２００５年）、インフェクションインミュニティ（Infection Immunity）、７３巻（８号）、４７３２−４２頁
【特許文献３５】コシマ等（Cosima, et al.）、（２００５年）、トレンドインインミュノロジー（Trends in Immunology）、２６巻（４号）、１９９−２０７頁
【特許文献３６】ベリン等（Velin, et al.）、（２００５年）、ガストロエントロロジー（Gastroenterology）、１２９巻（１号）、１４２−１５５頁
【特許文献３７】コング等（Kong, et al.）、（２０００年）、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Research）、２８巻（１７号）、３２１６−３２２３頁
【特許文献３８】マオ等（Mao, et al.）、（２００３年）、ワールドジャーナルオブガストロエントトロジー（World Journal Gastroenterology）、９巻（７号）、１５２９―１５３６頁
【特許文献３９】チュー等（Chu, et al.）、（２００５年）、ワールドジャーナルオブガストロエントトロジー（World Journal Gastroenterology）、１１巻（２３号）、３５１８−２２頁
【特許文献４０】キャシーパートン（Kathy Parton）、（２０００年）、獣医学、動物、生物医学科学研究所（Institute of Veterinary, Animal and Biomedical Sciences）、“オコジョの生物的調節に関するベクターとしてのヘリコバクタームステレー（Helicobacter mustelae）”、野生生物衛生と保護研究プログラム（Wildlife Health and Conservation Research Program）、ランドケアリサーチ（Landcare Research）（財源団体）
【特許文献４１】フォレスター、エヌティ（Forrester, NT）、パートン、ケイ（Parton, K）、（２０００年）、ニュージーランドベテリナリージャーナル（New Zealand Veterinary Jrounal）、４８巻、６５−６９頁、表題“ニュージーランドの白イタチからのヘリコバクタームステレー（Helicobacter mustelae）の単離”
【特許文献４２】スプランガー等（Spranger, et al.）、（２００５年）、ブリティッシュジャーナルオブニュートリション（Br. J. Nutr.）、９３巻（６号）、７６５−７１頁
【特許文献４３】ガーボム等（Garbom, et al.）（２００４年）、インフェクションアンドインミューニティ（Infect. Immun.）、７２巻（３号）、１３３３−１３４０頁
【特許文献４４】ツショップ等（Tschop, et al.）、（２０００年）、ネーチャー（Nature）、４０７巻、９０８−１３頁。
【特許文献４５】チョイ等（Choi et al.）、（２００３年）、エンドクリノロジー（Endcrinology）、１４４頁（３号）
【特許文献４６】レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）、２０版、マック出版社（Mack Publishing Company）
【特許文献４７】ジョーンズ等（Jones, et al.）、（２００５年）、ネーチャーメディシン（）、１１巻（７号）、７８６−９０頁
【発明の開示】
【０００５】
本発明は上記の課題を克服することを目的とし、多くの実施と応用で実証され、そのうちのいくつかを以下に要約する。
該発明者等は驚くべきことにヘリコバクター、特に慢性感染を形成できるピロリ菌を用いて継続性ドラッグデリバリーを作成できることを見いだした。更に本発明のヘリコバクターは様々な時期に活性化と不活性化が可能で、その慢性性のためこのヘリコバクターを用いて薬剤を胃粘膜を通して薬剤を送達できる。
ピロリ菌は殆どヒト胃粘膜にのみ見られるらせん状グラム陰性細菌である。ヒトの胃の酸性度によりヘリコバクター種以外の実質的に全細菌によるコロニー形成の有効障壁となる。
ピロリ菌は粘膜炎症や免疫反応発生にもかかわらず、ヒトの胃粘膜内に数十年コロニー形成し持続する独特の能力を有する。この特性によりピロリ菌は粘膜から選択薬剤の送達に関する興味ある候補となる。
ある様態によると、プロモーター領域を有するヘリコバクター配列と、非ヘリコバクター薬理的活性分子のコード化非ヘリコバクター配列からなるヘリコバクスター作成物を産生使用する組成、方法及びシステムが提供される。ある実施形態ではこの作成物はベクターかプラスミドベクターとして記載され、プロモーター配列は興味の非ヘリコバクター薬理的活性分子の発現を調節できる。
従って第一様態では本発明は細胞が一つ以上の生物活性薬剤を発現するヘリコバクター細胞か、ヘリコバクター特性を有する細菌性細胞の有効量、好ましくは治療的予防的に有効量を被験者に投与する段階からなる一個以上の生物活性薬剤の被験者への送達法を提供する。
第二様態では本発明は一つ以上の異種生物活性薬剤を発現する非侵襲性か非病原性ヘリコバクター細胞を提供する。
このヘリコバクターはピロリ菌種である。
生物活性薬剤はヘリコバクター属と相同でも送達に用いるヘリコバクター細胞属か種細胞に異種でも良い。異種薬剤は真核生物源か原核生物源のいずれに由来しても良い。
ある様態ではヘリコバクターベースのベクター作成物とベクタープラスミド作成物は、抗原、有機か無機分子か物質のような生物活性薬剤と、薬物、例えば遺伝子産物や遺伝子配列物（単離核酸）のような治療薬か予防薬からなる。一例としてこの薬剤としては、免疫調節剤、ホルモン、リガンド、酵素かアンチセンスRNA、触媒性RNA、タンパク質、ペプチド又は動物か動物細胞に送達できるよう細菌性細胞上に存在するか放出される任意の他分子が挙げられる。
ある実施形態では生物活性薬剤は好ましくは単離形で取得した核酸分子でコードし、次いで該発明の細菌送達媒体に挿入する。本発明の単離核酸分子が相補DNA、ゲノムDNA、RNAやそれらの混成分子でも良いことは技術の熟知者には分かる。好ましくは核酸は相補ＤＮＡである。
【０００６】
一例として興味のタンパク質及び／又はペプチドはグレリン、アミリン、インスリン、モチリン、β―グルコシダーゼ、化学シャペロンやゴーシェ病、細胞消耗、ヒト免疫不全症（エイズ）、食欲抑制の治療に有効な他分子、糖尿病治療に有効な製剤などが含まれる。
単離核酸は好ましくはヘリコバクター細胞に形質転換し維持できる発現ベクターに組み入れる。
従って第三様態では、本発明は必要とする解剖学的位置に生物活性薬剤を直接送達する組み換えベクターを提供する。好ましくは本発明のヘリコバクター細胞を用いてその表面に生物活性薬剤を分泌及び／発現する。
第四様態では、本発明は
a）生物活性薬剤のコード化ヌクレオチド配列と
ｂ）ベクター含有送達媒体を被験者に送達した場合、生物活性薬剤が体内で産生されるように、（a）のヌクレオチド配列の発現を調節できるこれと操作可能に連結した調節配列か制御配列を
含む有効量の生物活性薬剤を体内で送達するベクターか作成物を提供する。
このベクターは化学処理や酵素処理を用いて化学的に、或いは修飾ベクターや変異ベクターを産生する組み換えDNA技術を用いて体内で修飾しても良い。
このような作成物は例えば一つ以上のヌクレオチドが置換、欠失又は挿入されるが、該発明によるその作成物、核酸分子やそのコード化産生物の所望生物活性を実質的に保持する点で開示されたものとは異なる。
本発明の他実施形態では、ヘリコバクターベクターや作成物は構成的プロモーターを発現して発現ベクターにクローンし、選別手段として用いる一つ又は複数のレポーター遺伝子を備える。ここでの使用に適したレポーター遺伝子の制限のない例としては、緑色蛍光タンパク質（GFP）、β―ガラクトシダーゼ、アミラーゼ及びクロラムフェニルアセチルトランスフェラーゼ（CAT）が挙げられる。
本発明の他実施形態では、ヘリコバクター細胞を用いて興味の異種遺伝子をそれが必要な被験者に送達する。興味の遺伝子は、限定はされないがペプチドホルモン（限定はされないが、α―メラニン細胞刺激ホルモン（α―MSH）、インスリン、成長ホルモンや副甲状腺ホルモンのような）を含む治療産物（遺伝子導入産物）、限定はされないがインターフェロン、インターロイキン（IL）―２、IL-4、IL―１０、IL―１２、顆粒球コロニー刺激因子（C―CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM―CSF）及びエリスロポイエチン（EPO）を含むサイトカインをコードしても良い。
更に他実施形態では本発明は被験者の病気治療、緩和、防止法を提供する。これらの方法は治療組成か予防組成の使用で促進される。従って第五様態では、本発明は（a）生物活性薬剤を発現及び／又は分泌する非病原性ヘリコバクター生細胞と（ｂ）治療に有効な担体とを一緒に含有の薬組成を提供する。
【０００７】
第六様態では本発明は生物活性薬剤を発現する有効量の本発明ヘリコバクター細胞を必要とする被験者に投与することからなる病気治療、予防、緩和法を提供する。
本発明が使用できる被験者の制限のない例としては、霊長類、ウマ類、ウシ類、ブタ類、ヒツジ類や齧歯類のような哺乳類が挙げられる。又魚や鳥類も意図される。
本発明の一実施形態では治療、予防又は緩和する疾患は癌、免疫／造血系疾患や症状、生殖系疾患や症状、筋骨格系疾患や症状、心臓血管系疾患や症状、混合胎児と記述される疾患や症状、排泄系疾患や症状、神経／感覚系疾患や症状、内分泌系疾患や症状、呼吸器系疾患や症状、消化器系疾患や症状及び結合組織／上皮組織関連疾患や症状、細菌感染、ウイルス感染や寄生虫感染で起こる疾患や症状がある。
本発明は経胃的、経口的或いは鼻腔内的に患者に送達する種々の調合した薬剤容認製剤を提供する。特定の実施形態では、その組成は粘膜表面への送達に適する。特定の実施形態では、その組成は腸粘膜表面への送達に適する。
一例ではこの粘膜は胃表面、膣表面、鼻表面、口表面や眼球表面や浸透性粘膜表面か裏層が存在する特徴を持つ身体の任意の他部粘膜でも良い。ある実施形態では、粘膜表面は胃粘膜表面である。
ここに記載の特定ヘリコバクター、ヘリコバクター作成物や他送達媒体の特定形式と割合と、本文をここに具体的に取り入れたレミントン（Remington）の薬科学（Pharmaceutical Sciences）、２０版、マック出版社（Mack Publishing Company）に記載のような製剤技術者に既知の製剤法を用いて本発明の実施に使用する組成の種々な送達形式が容易に作成できる。
このデリバリシステムは動物、特にヒト、ウマ類、ウシ類、ヒツジ類や齧歯類を含む霊長類、魚や鳥類に使用できることが想像される。この製剤を幼児と大人の両者、更には親から又は妊娠動物や授乳動物投与に用いても良いことが又予期される。この製剤と方法が更に雄性動物と雌性動物両者に適すると記載できる。
更に他様態では動物の予防接種法を提供する。ある実施形態ではこの方法は、ここに記載のヘリコバクターベースのプラスミドベクター及び／又は複数のプラスミドベクターで形質転換した細胞含有ワクチンからなる組成を投与することからなる。他実施形態では動物の疾患や生理的条件を除去阻害するに十分な、或いは興味の薬理活性分子に特異な免疫反応を引き起こすに十分な有効量の興味薬理活性分子の送達法が提供される。
一例としてワクチンに有効な興味の非ヘリコバクター薬理活性分子は、哺乳類タンパク質、ペプチド、酵素、ホルモンやこれらのいずれかの組み合わせを含んでも良い。特定の実施形態では、興味の薬理活性分子は更に興味のヒト薬理活性分子と定義する。ある実施形態では興味の薬理活性分子はヒト病原体分子／抗原、アミリン、類似体やその誘導体のようなヒトタンパク質抗原、グレリン、類似体やその誘導体である。
【０００８】
特定の実施形態ではこのワクチンはヒト病原体、エボラウイルス、エイズウイルス、マールブルグウイルス、インフルエンザウイルスや類似体に対して免疫性を移す。エボラ糖タンパク質とマールブルグ糖タンパク質を含む弱毒性組み換え型水疱性口内炎ウイルスベクターに基づく制限増殖型ワクチンがジョーンズ等（Jones, et al.）（２００５年、ネーチャーメディシン（Nat Med）、１１巻、７８６−９０頁）により記載さている。それ故これらやヒト病原体関連の他糖タンパク質を有するヘリコバクターベースのベクター系やプラスミドベクター系を用いた作成物が、ここに提供の開示と共に本発明で提供されることが予期される。
（配列の簡単な説明）
以下の核酸配列とアミノ酸配列が本発明の記載全体を通して参照される。
配列番号１（SEQ ID No:1）―プラスミドｐHP1のヌクレオチド配列（２７９６個のヌクレオチド）；
配列番号２（SEQ ID No:2）―ｐHP1のヌクレオチド配列（２７９６個のヌクレオチド）；
配列番号３（SEQ ID No:3）―プラスミドｐHP３のヌクレオチド配列（３４４４個のヌクレオチド）；
配列番号４（SEQ ID No:4）―C型肝炎ウイルス（HCV）は抗原ヌクレオチド配列である；
配列番号５（SEQ ID No:5）―C型肝炎ウイルス（HCV）コア抗原のヌクレオチド配列１３５ｂｐ（４５個のアミノ酸）病原性コード配列；
配列番号６（SEQ ID No:6）―ピロリ菌のHopE遺伝子（nt504位、aa位置１６８）の表面暴露ループヌクレオチド配列；
配列番号7（SEQ ID No:7）―上流プライマー（２９個のヌクレオチド）；
配列番号８（SEQ ID No:8）―下流プライマー（２８個のヌクレオチド）；
配列番号９（SEQ ID No:9）―オリゴヌクレオチドプライマー（1５個のヌクレオチド）。
（用語の定義）
該発明を説明する前に、以後に用いるある用語の定義を説明することでその理解に役立つであろう。
ここに定義の“抗生物質耐性遺伝子”はベクターに意図的に提供し選択系として用いる異種核酸配列を含む。“抗生物質耐性遺伝子”という用語は自然発生の微少植物生物体に抗生物質耐性を与える他機構や遺伝子は含まれない。
例えば細菌株、特に大腸菌やピロリ菌のようなヘリコバクター株を記述するのに用いる“弱毒性”という用語は、天然野生型細菌株より悪性及び／又は毒性（侵襲性）が低い株と定義する。
ここで使用の“生物活性”という用語は、生物機能の実施能力を意味し、ポリペプチドに関してはポリペプチドが未変性コンフォメーションと同じか非常に類似の安定高次構造（“折り畳み形状“）を選ぶことを意味する。例えば適切な折り畳み単位のαヘリックス、βシート、ドメインやジスルフィド架橋形成により正しく或いは実質的に正しく折り畳まれると、ポリペプチドはその自然機能の実施能力を有するはずである。通常ポリペプチドの機能単位はドメインである。
【０００９】
免疫反応誘発有りか無しのいずれかで抗体や他受容体の結合能だけでは受動的であるか、“生物活性”を構成しない。いずれの抗原も抗体との結合能を有するが、必ずしも生物活性ではない。
ここで用いた“臨床用ベクター”とはヘリコバクターかヘリコバクター特性を持つように操作した非病原性細菌で発現できるプラスミドか他発現ベクターを意味する。本発明の臨床用ドベクターは選択に抗生物質耐性マーカーを用いず、且つ／又は例えば自殺ベクターのような宿主外複製を防止するように修飾されている。
ピロリ菌の自殺系の一例は、パンセル等（Panthel, et al.）により２００３年に（インフェクションアンドインミューニティ（Infection & Immunity）、７１巻、１０９−１１６頁）記載されている。この系ではプラスミドをPhiX174溶解遺伝子Ｅ含有ピロリ菌に導入する。４２℃で５時間のインキュベートションを用いてその株を根絶した。これは体内で動物が４５−５０℃で飲み物を飲んで、４２℃以上の胃環境温度に昇温することを意味する。
第二の例は通常補充プレートで細菌の突然変異株が生存可能なように用いるL-ジアミノピメリン酸（L-Dap）系である（例えば、キラタ等（Kirata, et al.）、１９９７年、インフェクションアンドインミューニティ（Infection & Immunity）、６５巻、４１５８―４１６４参照）。この系では動物被験者はDapE欠乏ピロリ菌の突然変異株が生存するために欠損基質、即ちジアミノピメリン酸（DAP）で自身の食餌を補充する必要がある。これらを根絶するためにDAP消費が停止する。
第三の可能な系はｒｄｘA遺伝子のためにピロリ菌のメトロニダゾール感受性と関連する。ｒｄｘA遺伝子の過剰複製は哺乳類細胞と大腸菌に有害である。しかし細菌は複製を許容できる。それ故本発明のヘリコバクター種を操作して、正常な突然変異依存性ｒｄｘA損失を防ぐｒｄｘAの二つのコピーを含有できる。少なくとも二つの機能性ｒｄｘA遺伝子のヘリコバクターゲノムへ導入することで、メトロニダゾールにいつまでも鋭敏なヘリコバクター株になる必要がある。ジェオン等（Jeong, et al.）は２０００年（ジャーナルオブバクテリオロロジー（J. Bacteriol.）、１８２巻、５０８２−５０９０頁）に、機能性ｒｄｘA遺伝子産生のニトロ還元酵素によりメトロインダゾールをプロドラッグから殺菌性化合物に変換することを示した。活性化合物の作用様式によりヘリコバクターゲノムのDNA切断を起こす。
ここに用いた“検出可能な免疫反応”は、抗原に応答する動物内形成の抗体（液性）応答か細胞傷害（細胞性）応答のいずれかであり、限定はされないが酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、放射性免疫測定法（RIA）、エリスポット（ELISPOT）、免疫蛍光測定法（IFA）、補体結合測定法（CF）、ウエスタンブロット（WB）やその同等物を含む日常的実験室法を用いて測定できる。
ここに用いた“興味の遺伝子”とはその発現が望まれるポリペプチドかタンパク質をコード化する任意の核酸配列を意味する。興味の遺伝子はプロモーターや他の調節成分を含むか含まなくても良い。興味の遺伝子は又アンチセンスRNAを産生できる作成物を含む。
ここに用いた“遺伝子治療”は組み換え型ベクターを用いて興味の遺伝子を必要動物に送達すると定義する。興味の遺伝子は限定されないが、サイトカイン、抗炎症性物質、抗増殖性物質、抗生物質、代謝阻害剤／代謝活性化剤及び免疫活性化抗原とその断片を含む治療又は予防タンパク質やポリペプチドをコード化する導入遺伝子でも良い。更にここに用いた“遺伝子治療”は遺伝性疾患と非遺伝性疾患両者に向けた遺伝子置換技術も含む。
ヘリコバクターという用語はピロリ菌とヘリコバクタームステレーを含むヘリコバクター属の全細菌を含む。この用語は又霊長類の胃粘膜に住むことが可能且つ／又は慢性だが粘膜の孤立感染が可能なピロリ菌類似の生物学を有する細菌を含む。この用語は又細菌が胃粘膜に住む能力のようなピロリ菌特性を有するように修飾した細菌をも含む。
“異種”ポリペプチドとはヘリコバクターを原産ではないもの、即ち天然又はヘリコバクターに導入前のヘリコバクター、又は生物活性薬剤用核酸をコード化するその祖先により発現されていないものである。
【００１０】
ここで用いた“宿主”は本発明の治療組成の意図した受取人と定義する。宿主は動物全部を含む。具体的には宿主は限定はしないが、霊長類（ヒトを含む）、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、齧歯類、鳥類及び魚類を含む。
ここで用いた“免疫学的に不活性な”は、宿主内で有意な免疫反応を誘発しないミクロフローラのような微生物を含む、任意の物質を意味する必要がある。ここで用いた免疫学的に不活性な材料の例としては、ステンレススチール、Ｌ−ポリラクチドのような生体適合性ポリマー、医薬用プラスチック及び本発明のミクロフローラ生物体が挙げられる。“有意な免疫”反応とは、本発明の教えに従い用いる材料又は生物体の体内での実用性を制限又は禁止する任意の免疫反応である。検出可能な免疫反応は必ずしも“有意な免疫反応”ではない。
“単離核酸”は天然に存在する任意の核酸構造や分離遺伝子スパンが三個以上の天然に存在するゲノム核酸の任意断片構造と同一でない構造の核酸である。それ故この用語は、例えば（a）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の部分配列を有するが、天然に存在する生物体ゲノム分子の一部を側面にするコード配列の両者により挟まれないＤＮＡ分子、（ｂ）生成分子が天然に存在する任意のベクターやゲノムＤＮＡと同一でないようなベクターか原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに取り込んだ核酸、（ｃ）相補ＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により産生の断片や制限酵素断片のような分離分子及び（ｄ）雑種遺伝子の一部、即ち融合タンパク質のコード化遺伝子の組み換えヌクレオチド配列に及ぶ。具体的にこの定義から除外されるものは、（i）ＤＮＡ分子、（ii）形質移入細胞及び（iii）細胞クローン、例えば相補ＤＮＡやゲノムＤＮＡライブラリーのようなＤＮＡライブラリーで起こるものの混合物に存在する核酸である。
二個のアミノ酸配列又は二個の核酸の“同一性パーセント（相同性）”はカーリン、アルトシュル（Karlin and Altschul）（プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、９０巻、５８７３−５８７７頁、１９９３年）に改良されたカーリン、アルトシュル（Karlin and Altschul）, １９９０年、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８７巻、２２６４−２２６８頁、１９９０年のアルゴリズムを用いて決定する。このアルゴリズムはアルトシュル等（Altshul, et al.）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに取り入れられている（ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（J. Mol. Biol.）、２１５巻、４０３−４１０頁、１９９０年）。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は該発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、スコア＝１００、ワード長＝１２でＮＢＬＡＳＴプログラムで実行する。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は参照ポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得るために、スコア＝５０、ワード長＝３でＸＢＬＡＳＴプログラムで実行する（例えば配列番号２（SEQ ID NO:2）。比較目的でギャップ配列を得るために、アルトシュル等（Altschul, et al.）が記載したギャップＢＬＡＳＴ（Gapped BLAST）を用いる（ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Res.）、２５巻、３３８９−３４０２頁、１９９７年）。ＢＬＡＳＴとギャップＢＬＡＳＴ（Gapped BLAST）プログラムを用いる場合、各プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴとＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用する。これらはワールドワイドウエブのユーアールエル（URL）“ncbi.nim.nih.gov.”に見出される。
【００１１】
ここで用いた“レポーター遺伝子”という用語は、興味の遺伝子を発現する形質転換ベクターに同定可能な表現型を与える興味の遺伝子をコード化する異種遺伝子に組み入れた（又は隣接した）核酸配列である。レポーター遺伝子の限定されない例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β―ガラクトシダーゼ、アミラーゼ及びクラムニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）が挙げられる。
ここで用いた“スクリーニングマーカー”は本発明の教えに従い作成されて形質転換ベクターに与える同定特性（表現型）を意味する。本発明の一実施形態ではスクリーニングマーカーはレポーター遺伝子である。
ここで用いた“選択可能マーカー”、“選択可能遺伝子”、“レポーター遺伝子”及び“レポーターマーカー”（以後“選択可能マーカーと呼ぶ）は形質転換細菌性ベクターの迅速な同定単離が可能な表現形質をコード化する核酸配列を意味する。通常”臨床用“と見なされ且つ本発明の教えに従い作成された細菌性ベクターは、抗生物質耐性に関しコード化しない選択可能マーカーを有するそれらのベクターである。
ここで用いた“導入遺伝子”は相補ＤＮＡを用いて正常遺伝子としての機能、複製及び伝達を保証するように細胞に挿入した遺伝子を意味する。
ここで用いた“形質転換核酸配列”とはプラスミド又は興味の遺伝子のコード化核酸配列含有の他発現カセットを意味する。本発明のある実施形態では、核酸配列は一個以上の治療薬をコード化する。“形質転換核酸配列”は又本発明のある実施形態に従い“導入遺伝子”の意味にも使用できる。本発明の他実施形態では形質転換核酸配列として、プロモーター及び／又は他調節エレメントをコード化する核酸配列が挙げられる。
ここで用いた“癌”という用語は腫瘍性疾患を意味する（例えば白血病、癌及び“過剰増殖障害“）。腫瘍は、大腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、前立腺、腹膜、肺、血液（例えば白血病）、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、子宮、眼、頭頸部、神経（中枢性及び末梢性）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部及び泌尿生殖器からなる一群から選んだ組織に位置する。
一実施形態では“癌”という用語は又、過形成（例えば子宮内膜増殖症）、化成（例えば結合組織異化成及び／又は異形性（例えば子宮頚部異形成症及び気管支肺異形成症）からなる一群から選んだ新生物発生前状態も含む。
他実施形態では“癌”という用語は又良性腫瘍、線維嚢胞性状態及び組織肥大からなる一群から選んだ良性過増殖性疾患も含む。
ここで用いた“免疫／造血系疾患又は状態”という用語は、貧血、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、白血症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、プラズマ細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、関節炎、喘息、エイズ、自己免疫疾患、関節リュウマチ、肉芽腫症、免疫不全、炎症性腸疾患、敗血症、好中球減少症、好中球増多症、乾癬、移植臓器及び組織に対する免疫反応、全身性エリテマトーデス、血友病、凝固性亢進、糖尿病、心内膜炎、髄膜炎、ライム病、セリアック病及びアレルギーからなる一群から選んだ疾患や状態を意味する。
ここで用いた“生殖器官疾患又は状態”という用語は、睾丸停留、前立腺炎、鼠径ヘルニア、精索静脈瘤、ライディヒ細胞腫瘍、疣状癌、前立腺炎、マラコプラキア、ペーロニ病、陰茎癌、扁平上皮過形成、月経困難症、卵巣腺癌、ターナー症候群、粘液膿性子宮頸管炎、セルトリーライディヒ腫瘍、卵巣癌、子宮癌、骨盤内感染症、睾丸癌、前立腺癌、クラインフェルター症候群、ヤング症候群、早漏、糖尿病、嚢胞性線維症、カールタジュナー症候群、精巣萎縮、睾丸性女性化症、無睾丸症、異所性精巣、精巣上体炎、精巣炎、淋病、梅毒、睾丸捻転、結節性精管炎、胚細胞腫瘍、間質腫瘍、月経困難症、後傾子宮、子宮内膜症、子宮筋腫、腺筋症、無排卵性出血、無月経、クッシング症候群、胞状奇胎、アッシャーマン症候群、早発月経、性的早熟、子宮ポリープ、不正子宮出血、子宮頸管炎、慢性子宮頸管炎、粘液膿性子宮頸管炎、子宮頚部形成異常、頚管ポリープ、ナボチアン嚢胞、子宮腟部糜爛、頸管無力症、頚管腫瘍、仮性半陰陽及び月経前症候群からなる一群から選んだ疾患や状態を意味する。
【００１２】
ここに用いた“筋骨格系疾患や状態”という用語は、骨肉腫（例えば骨軟骨腫、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、巨細胞腫、多発性骨髄腫、骨肉腫）、パジェット病、関節リュウマチ、全身性エリマトーデス、骨髄炎、ライム病、痛風、滑液包炎、腱炎、骨粗鬆症、変形性関節症、筋ジストロフィー、ミトコンドリア性筋障害、悪液質及び多発性硬化症からなる一群から選んだ疾患や状態を意味する。
ここに用いた“心臓血管系疾患や状態”は、粘液腫、線維腫、横紋筋腫、心臓血管異常（例えば先天的心臓欠陥、脳動静脈奇形、中隔欠損）、心疾患（例えば心不全、鬱血性心疾患、不整脈、頻脈、細動、心膜疾患、心内膜炎）、心停止、心臓弁膜症（例えば狭窄、逆流、脱出症）、血管疾患（例えば高血圧、冠動脈疾患、狭心症、動脈瘤、動脈硬化、末梢血管障害）、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症及び高カリウム血症からなる一群から選んだ疾患や状態を意味する。
ここで用いた“混合胎児生”と記述した疾患や状態“という用語は、脊椎披裂、内水頭症、神経線維腫症、胎児期アルコール症候群、糖尿病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ダウン症候群、パトー症候群、エドワーズ症候群、ターナー症候群、アペール症候群、カーペンター症候群、コンラーディ症候群、クルーゾン症候群、皮膚弛緩症、コルネリヤドランゲ症候群、エリスファンクレフェルト症候群、ホルト・オーラム症候群・、カルタゲナー症候群、メッケル・グルーバー症候群、ヌーナン症候群、パリスター・ホール症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、三日月刀症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、血小板減少・橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トレチャー・コリンズ症候群、ウイリアムス症候群、ヒルシュスプルング病、メッケル憩室、多発性嚢胞腎、ターナー症候群、性器発育異常症、クリッペル・ファイル症候群、骨形成不全症、筋ジストロフィー、ティ・サックス病、ウイルム腫瘍、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫からなる一群から選んだ疾患や状態を意味する。
ここで用いた“排泄系疾患や状態”という用語は、膀胱癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、膀胱障害（例えば尿失禁、尿閉、尿路閉鎖、尿路感染症、間質性膀胱炎、前立腺炎、過敏膀胱、血尿）、腎機能異常（例えば水腎症、タンパク尿、腎不全、腎孟腎炎、尿路結石症、逆流性腎症及び片側閉鎖性尿路疾患）からなる一群から選んだ疾患や状態を意味する。
ここで用いた“神経／感覚系疾患や状態”という用語は、脳腫瘍（例えば脳幹グリオーマ、脳腫瘍、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳状細胞腫、神経変性障害（例えばアルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病及び特発性初老期痴呆）、脳脊髄炎、脳マラリア、髄膜炎、代謝性脳疾患（例えばフェニルケトン尿症及びピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症）、小脳性運動失調症、毛細血管拡張性運動失調症、エイズ痴呆、統合失調症、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害、自閉症及び強迫性障害からなる一群から選んだ疾患や状態を意味する。
【００１３】
ここで用いた“呼吸器系疾患や状態”という用語は、喉頭癌、咽頭癌、気管癌、喉頭蓋癌、肺ガン、扁平上皮細胞癌、小細胞（燕麦細胞）癌、大細胞癌及び腺癌のような呼吸器系癌、アレルギー反応、嚢胞性疾患、サルコイドーシス、組織球症Ｘ、浸潤性肺疾患（例えば肺線維症及びリンパ球様間質性肺炎）、閉鎖性気道疾患（例えば喘息、気腫、慢性又は急性気管支炎）、職業性肺疾患（例えば硅肺及び石綿沈着症）、肺炎及び肋膜炎からなる一群から選んだ疾患や状態を意味する。
ここで用いた“内分泌系疾患や状態”という用語は、内分泌組織と内分泌器官の癌（例えば視床下部、下垂体、甲状腺、副甲状腺、脾臓、副腎、卵巣及び睾丸の癌）、糖尿病（例えば尿崩症、Ｉ型とＩＩ型糖尿病）、肥満症、下垂体関連障害（例えば下垂体機能亢進症、下垂体機能低下症及び下垂体性小人症）、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫、繁殖障害（例えば男性及び女性不妊）、副腎関連障害（例えばアジソン病、コルチコステロイド欠損症及びクッシング症候群）、腎臓癌（例えば腎細胞癌、移行上皮癌及びウイルム腫瘍）、糖尿病性ネフロパチー、間質性腎炎、多発性嚢胞腎、糸球体腎炎（例えばグッドパスチャー症候群のような自己免疫障害で起こる免疫グロブリンＭメサンギウム増殖性糸球体腎炎及び膜性増殖性糸球体腎炎）及び腎石灰沈着症からなる一群から選んだ疾患や状態を意味する。
ここで用いた“消化器系疾患や状態”という用語は、潰瘍性大腸炎、虫垂炎、クローン病、肝炎、肝性脳炎、門脈圧亢進症、胆石症、消化器系癌（例えば胆管癌、胃ガン、大腸癌、胃ガン、膵臓癌、胆管癌、大腸腫瘍（例えばポリープ又は癌）及び肝硬変、膵炎、潰瘍性疾患、幽門狭窄、胃腸炎、胃けいれん、胃萎縮症、十二指腸の良性腫瘍、膨張、過敏性腸症候群、吸収不良、小腸の先天性疾患、細菌及び寄生虫感染症、巨大結腸、ヒルシェスプルング病、先天性巨大結腸、後天性巨大結腸、大腸炎、肛門直腸障害（例えば痔瘻、痔核）、肝臓の先天性障害（例えばウイルソン病、ヘモクロマトーシス、嚢胞性線維症、胆道閉鎖症及びアルファ１−坑トリプシン欠乏症）、門脈圧亢進症、胆石症及び黄疸からなる一群から選んだ疾患や状態を意味する。
ここで用いた“結合性／上皮性疾患と状態”という用語は、結合組織化成、混合結合組織病、局所性上皮性肥厚、上皮化成、粘膜上皮性異形成、移植片対宿主病、多発性筋炎、膿疱性過形成、脳異形成、組織肥大、アルツハイマー病、リンパ増殖症候群、ワルデンストロンマクログロブリン血症、クローン病、悪性貧血、特発性アジソン病、糸球体腎炎、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、糖尿病、嚢胞性線維症、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、骨粗鬆症、変形性関節炎、歯周病、創傷治癒、再発性多発性軟骨炎、脈管炎、結節性多発性動脈炎、ヴェグナー肉芽腫炎、蜂巣炎、関節リュウマチ、乾癬性関節炎、円盤状紅斑性狼瘡、強皮症、クレスト症候群、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合結合組織病、再発性多発性軟骨炎、脈管炎、ヘーノホ・シェーンライン症候群、結節性紅斑、多発性動脈炎、側頭（巨細胞性）動脈炎、高安動脈炎、ヴェグナー肉芽腫炎、ライター症候群、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、蜂巣炎、ケロイド、エーラー・ダンロス症候群、マルファン症候群、弾性線維性仮性黄色腫、骨形成不全症、軟骨異形成、表皮水疱症、アルポート症候群及び皮膚弛緩症からなる一群から選んだ疾患や状態を意味する。
【００１４】
本記述で用いた“一つの‘及び”その“という用語は一つ（単数）と一つ以上（複数）”両者を含むことを意図する。
ここに記載の一つの活性薬剤又は薬剤の組み合わせの“治療有効量”とは、期待応答を起こすは有効だが毒性反応を起こすには不十分な量と考える。期待応答は、例えば血液試料に十分且つ／又は許容範囲の検出可能な抗体力価レベルを形成することからなっても良い。被験者に投与する製剤の用量と治療期間は、治療を必要とするこの被験者を看護する医療従事者により決定され、且つこの被験者の年齢、性別、体重、現在の病状及び／又は組織損傷の程度、及びこの被験者治療に用いるヘリコバクター及び関心の産生物遺伝子の特定処方を考慮する。
“有効レベル”という語句はこの分子の所望活性レベルを意味するが、必ずしも分子数に限定はされない。例えばアミリンの有効レベルは、被験者に存在する遊離アミリン量の必然的な付随減少なしに、アミリン拮抗物質を用いてグレリン分泌刺激を減じても良い。
“グレリン関連疾患及び障害”という語句は、グレリン活性の調節を通して治療、防止又は回復できる任意の状態を意味する。これらとしてはグレリンにより増強、悪化又は刺激する状態、例えば成長ホルモン放徐や食欲が挙げられる。グレリンの生理作用としては一例として、成長ホルモン放徐の刺激、乳腺刺激物及び副腎皮質刺激因子からのホルモン分泌の刺激、食欲促進作用と心血管作用、甲状腺癌と乳癌に対する坑増殖性効果及び迷走神経仲介による胃運動性と酸分泌の調節を挙げられることが分かる。（WO２００５０２１０２６参照。）
文脈に別の必要がなければ、明細書を通じて“からなる”という用語又は“一つからなる”や“からなっている”のような変形は記載の一整数又は複数の整数群を包含するが、他の任意の整数や複数の整数群を排除しないことを示唆すると考える。
用語の定義がその用語の通常使用の意味からはずれる場合には、具体的に指示しない限り出願者はここに付与した定義の使用を意図する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明を詳細に記載する前に、該発明は特に例示法に限定はされず、勿論変えても良いと解釈する。又ここに用いた専門用語は該発明の特定実施形態を記述する目的のためだけで、付随特許請求項によってのみ限定される用語を制限する意図はないと解釈する。
ここに列挙した出版物、特許及び特許出願は、前掲又は後述の引用に関わらず全体をここに取り入れる。しかしここに列挙の出版物は出版物に報告され、且つ該発明に関連して用いても良いプロトコル、試薬及びベクターを記述開示する目的で列挙する。ここでのいずれのものも先行発明に基づく開示を許すとは見なさない。
更に本発明を実行するには、別に指示しない限り技術の技量内で在来免疫法、分子生物学法及び薬理学を使用する。このような技法は熟練者にはよく知られており、文献に十分説明されている。例えばコリガン等（Coligan, et al.）、“タンパク質科学における最近のプロトコル（Current protocols in Protein Science）”、１９９９年、I巻とII巻（ジョンワイリーアンドサンズ社（John Wiley & Sons Inc.）；サンブルック等（Sambrook, et al.）、“分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第２版と第３版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年、２００１年；及びベイリー、ジェイイー（Bailey, J.E.）、オリス、ディエフ（Ollis, D.F.）、生化学工学の基礎（Biochemical Engineering Fundamentals）、マックグロウーヒル出版社（McGraw-Hill Book Company）、ニューヨーク、１９８６年を参照。
この明細書と付随特許請求項で用いるように、子音での“一つ（a）”、母音での“一つ（a）”及び“その（the）”という単数形は、文脈に別に明確に指示しない限り複数の引例をも含むことを留意する必要がある。従って例えば“一つの核酸”と云う引例はこの複数の核酸をも含み、“一つの単離ペプチド”と云う引例は一個以上のペプチドの引例でもある、等々。別に定義しない限りここで用いた技術用語と科学用語の全ては、該発明が属する技術の一般技能の一つで通常解釈されるのと同じ意味を有する。ここに記述のものと類似か同等の任意の材料及び方法を用いて、本発明を実施又は試験できるが、好ましい材料と方法を次に記載する。
【００１６】
動物体内の特定標的部位への治療組成と核酸の送達は、薬剤開発産業が対面する継続的な挑戦である。本発明者は生物活性薬剤が細菌表面で発現するかそこから分泌する薬剤のコード化ベクターを保有できるヘリコバクターベースの細菌デリバリシステムを開発した。一実施形態ではこの細菌はヘリコバクター種である。より好ましくはピロリ菌である。ある実施形態ではピロリ菌株は現場で既知のいずれの株でも良い。ある実施形態ではこのピロリ菌株はゲノム株２６６９５のような非病原性株である。
他実施形態では、宿主に有意毒性なしに胃粘膜や消化管、尿路、気管支上皮や他の粘膜器官の他領域を慢性的にコロニー化する能力を備えたヘリコバクターかピロリ菌を有する細菌を遺伝子組み換えしたヘリコバクター以外の細菌を使用する。
一実施形態ではこのピロリ菌を操作して、病原性特性のいくつかを除去及び／又は弱毒化する。例えば空胞化細胞毒素とcag病原因子群島遺伝子を除去し、ピロリ菌の病原性を弱めることができる。一実施形態ではこのピロリ菌を操作して、病原性特性のいくつかを除去及び／又は弱毒化する。例えば空胞化細胞毒素とcag病原因子群島遺伝子を除去し、ピロリ菌の病原性を弱めることができる。N―メチルーN―ニトローニトロソクワニジンを用いる化学的な非特異性突然変異誘発を用いるか、組み換えDNA技術を用いてヘリコバクターへ弱毒化の突然変異が導入できる。
熟練者には一連の生物活性薬剤の送達に本発明の方法が使用できることが分かる。適切薬剤例としては、局所的か全身で機能できるもの、例えば局所か全身代謝に影響する内分泌活性を発揮できる薬剤、及び／又は免疫／造血系に属する細胞活性を調節できる薬剤、及び／又は身体の種々の正常又は腫瘍細胞の生存率、成長及び分化に影響できるか、又は損傷及び感染に対する急性相炎症応答の免疫制御又は誘発に影響できる薬剤、及び／又は標的細胞受容体に作用する細胞組織の感染に対する抵抗、又は上皮細胞増殖又は創傷治癒の促進を増強又は誘発できる薬剤、及び／又は身体細胞により物質発現又は産生を操作する薬剤が挙げられる。
この生物活性薬剤の具体例としては、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管活性腸管ポリペプチド、インターロイキン（IL）−２、IL―３、IL―４、IL―５、IL―６、IL―７、IL―８、IL―９、IL―１０、IL―１１、IL―１２、IL―１３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、SCF、インターフェロン（IFN）ーγ、エリスロポエチン（EPO）、顆粒球コロニー刺激因子（G-SCF）、白血病抑制因子（LIF）、オンコスタチンM（OSM）、繊毛様神経栄養因子（CNTF）、成長ホルモン（GH）、プロラクチン（PRL）又はIFNαβのような逆平行４αらせん束状構造適応のグループ１型構造サイトカイン、サイトカインファミリーの腫瘍壊死因子（TNF）のようなしばしば細胞表面に関連し対称ホモ三量体を形成し、且つそのサブユニットがあるウイルス外殻タンパク質を記述するβ―ゼリーロール配座をとるグループ２型構造サイトカインで、例えばTNFα、TNFβ、CD４０、CD２７又はFASリガンド、サイトカインファミリーのIL―１、線維芽細胞成長因子ファミリー、血小板由来増殖因子、形質転換成長ホルモンβ及び神経成長因子、それぞれが細胞外領域に少なくとも一つの上皮細胞成長因子（EGF）を含む巨大膜貫通先駆分子として産生する短鎖α／β分子からなるグループ３型構造サイトカイン、例えばサイトカインのEGFファミリー、保存システイン残基周り（Ｃ―――Ｃ又はーＣ――Ｘ――Ｃケミカインサブグループ）に集まるアミノ酸配列保持の特徴を持つケモカインやインスリン関連サイトカイン、異なるドメインからなるヘレグリンやニューレグレンのようなモザイク構造を示すグループ４型構造サイトカイン、例えばEGF、免疫グロブリン類似体及びクリングルドメインが挙げられる。
代わりにこの生物活性薬剤は上に定義のように生物活性薬剤用の受容体又は拮抗物質であっても良い。
【００１７】
ある実施形態ではこのピロリ菌ベースのベクター及び／又はベクタープラスミド作成物を用いて、形質転換細胞製剤を投与する宿主粘膜表面でその中に含まれる単離核酸分子から生物活性薬剤を発現及び又は分泌できる形質転換細胞（ピロリ菌又はヘリコバクター細胞のような）を創生する。この形質転換細胞（又はベクター）内に含まれる単離核酸は、生物活性薬剤のコード化核酸がピロリ菌発現に適する配列の調節下にある一個以上の核酸作成物からなっても良い。
ピロリ菌導への導入用核酸からなる適切なベクターとシャトルベクターは、必要に応じてプロモーター配列、ターミネーター断片、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他配列を含む適切制御配列を含有するように選択又は作成しても良い。ベクターは必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えばファージやファージミドでも良い。より詳細には、例えば上記のサンブルック等（Sambrook et al.）を参照のこと。核酸操作用の多くの既知技法とプロトコル、例えば核酸作成物の製剤、突然変異誘発、配列決定、DNAの細胞への導入及び遺伝子発現及びタンパク質分析がアスベル等（Ausubel, et al.）の“分子生物学におけるショートプロトコール（Short Protocol in Molecular Biology）”、第２版、ジョンワイリーアンドサンズ（John Wiley & Sons）、１９９２年に詳細に記載されている。上記のサンブルック等（Sambrook et al.）及びアスベル等（Ausubel, et al.）の開示は文献としてここに取り入れている。
ある実施形態では生物活性薬剤用コード配列はオペロン、即ち多シストロン発現用核酸作成物中に含まれる。オペロンではこのプロモーターからの転写により、それぞれ自身が適切位にあるリボソーム結合部位上流を有する一つ以上のコード配列からなる伝令RNAをもたらす。従って一つ以上の薬剤が単一伝令RNAから翻訳できる。オペロンの使用により協調する生物活性薬剤発現が可能になる。
本発明の生物活性薬剤用コード配列からなる核酸作成物又はベクターは、好ましくはピロリ菌の発現用プロモーターの制御下にある。
一実施形態では本発明に従い用いるプロモーターはピロリ菌で恒常的に発現する。恒常的プロモーターの使用により発現を起こすのに誘発物質や他の調節信号の必要が避けられる。好ましくはプロモーターはピロリ菌宿主細胞が生存可能なレベルの発現を命令する、即ち成長が低下しなくてもいくらかの代謝活性を保持する。好都合にはこの発現は低レベルにできる。例えば発現産生物が細胞内に蓄積すると、発現レベルは発現産生物の蓄積を細胞タンパク質の約１０％より低く、好ましくは約５％か以下に、例えば約１−３％にする。
プロモーターは使用ピロリ菌株に相同でも良く、即ち自然にあるピロリ菌株で見出されるものである。ある実施形態ではプロモーターはアラビノーズ誘発性プロモーターである。他のプロモーターとしては、ＦｌａＢシグマ５４プロモーター（ジョンセンハンス等（Jsoenhans, et al.）、１９９８年、エフイーエムエスマイクロバイオロジーレター（FEMS Microbiol Lett.）、１６１巻（２号）、２６７−７３頁）、Ｔ７プロモーター及びサルモネラのnirＢプロモーター（チャットフィールド等（Chatfield, et al.）、１９９２年、バイオテクノロジー（Biotechnolgy）、１０巻（８号）、８８８−９２頁）が挙げられる。
【００１８】
他実施形態では臨床用ベクターと共に使用できる誘発プロモーターとしては、制限はされないが、カレン等（Kullen, et al.）に公布された米国特許６，２４２，１９４に記載のｐＨ誘発性プロモーター、大腸菌プラスミドで使用のようなラクトース誘発プロモーター（例えばピーブルースクリプトＴＭ（pBluescriptTR）、ストラタゲン社（Stratagene）製）、乳酸桿菌の内在性ラクトースプロモーター、アリスタルコフ等（Aristarkhov, et al.）、（１９９９年、ジャーナルオブバクテリオロジー（J. Bactriology）、１７８巻（０１４号）、４３３７―４３３２頁）に記載のアルコール脱水素酵素（adhE）用プロモーターのような嫌気性成長時に誘発されるプロモーターが挙げられる。
一実施形態では本発明の作成物は毒性遺伝子を又含む。これら毒性遺伝子は好ましくは誘発性プロモーター制御下にあり、その結果処理完了時に本発明のヘリコバクターが毒性遺伝子発現誘発し容易に除去できる。毒性遺伝子の制限のない例としては、誘発性プロモーター制御下での細菌性自己溶菌酵素が挙げられる。自家融解遺伝子が次いで直ぐ上に記載の一つ以上の誘発性プロモーターを用いて消化管に適切時と適切位で引き起こされる。
ある実施形態では操作ヘリコバクターベクター及びプラスミドベクター作成物は酸素に鋭敏である。この酸素感受性は本発明の臨床用ベクターの内転移を制限する他の方法である。ヒトの腸環境は酸素が非常に低濃度で、ヘリコバクターを含む嫌気性微好気性微生物の成長に適する。従って腸廃棄物が酸素が豊富な外部環境に放出する際、人体から放出されるヘリコバクター送達媒体除去の有効な手段は、酸素感受性を与える形質転換微生物に遺伝子操作することである。
本発明の核酸作成物又は複数の作成物は分泌シグナル配列を含んでも良い。従ってある実施形態では生物活性薬剤、例えば非ヘリコバクターポリペプチドのコード化核酸により、分泌シグナル配列のコード化核酸配列をこの分子（ポリペプチド）のコード化核酸配列と適切に抱合して、細胞膜でこの薬剤を分泌しても良い。ポリペプチド分泌のための核酸を宿すヘリコバクターの性能は、ヘリコバクター生存率を維持する培養条件で体外試験しても良い。
【００１９】
適切な分泌シグナル配列としては、エシェリキア菌、クレブシエラ菌及ぶサルモネラ菌のようなグラムネガティブ生物体で活性を有するもののいずれかが挙げられる。分泌シグナル配列としては、グラムポジティブとグラムネガティブ宿主両者で機能することが知られたブドウ球菌属のある株が分泌するスタフィロキナーゼの分泌リーダーが挙げられる（ラポポルト（Rapoport）、１９９０年、バシラス属使用の遺伝子発現（Gene Expression Using Bacillus）、カレントオピニオンインバイオテクノロジー（Curr. Opin. Biotech.）、１巻、２１−２７頁参照。）
使用できる他の分泌シグナル配列としては、例えばβ―ラクタム分解酵素（タラマッジ等（Talmadge, et al.）、１９８０年、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサインエスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、７７巻、３３６９−３３７３頁）や侵入性大腸菌溶血素A（ｈｌｙA）（スー等（Su et al.）、１９９２年、ミクロビアルパソーゲン（Microbial Pathogen）、１３巻、４６５−４７６頁）が挙げられる。分泌シグナル配列の例示リストはパッグスリー（Pugsley）、１９８８年のグラムネガティブ細菌外膜全域のタンパク質分泌、ダンド、アールシー（Dand, R.C.）、ロビンズ、ピータブリュ（Robbins, P.W.）編、“タンパク質転移と細胞小器官生合成”（Protein Transfer and Organelle Biogenesis）、アカデミックプレス社（Academic Press, Inc.）、サンディエゴ（San Diego）、６０７−６５２頁に紹介されている。
選択可能マーカーにより形質転換微生物を混合群の非形質転換微生物と区別する便利な方法が研究者と技術者に提供される。形質転換生物体を区別する一手段は選択可能マーカー核酸配列を興味の遺伝子含有プラスミドに組み入れることである。この選択可能マーカー配列は通常興味遺伝子下流に挿入して、同一プロモーターに撃退される。その結果興味遺伝子とうまく形質転換した細胞は、選択可能マーカー核酸配列で又形質転換される。この選択可能マーカーとして抗生物質耐性を用いる場合、形質転換細胞のみがこの抗生物質含有媒体で生き残り且つ／又は成長する。
【００２０】
従って形質変換体を発生する場合、抗生物質耐性は便利で良く用いられる表現型である。しかし選択性マーカーとして抗生物質耐性遺伝子を有するベクターは、抗生物質耐性表現型を他の生物体に与えられる遺伝子水平伝播が可能である。ヘリコバクターを治療ベクターの一部として使用する場合、この危険は特に重大である。
ヘリコバクターを動物の遺伝子デリバリーシステムに用いるために、ある実施形態では本開示により抗生物質選択マーカーを用いない医療用ベクター系が提示される。現在のデリバリーシステムが提供する抗生物質耐性遺伝子使用の代替え物としては、必須“ハウスキーピング”遺伝子の染色体欠失か、致死突然変異を有する臨床用ベクターが挙げられる。次いで機能的類似のハウスキーピング遺伝子を興味遺伝子のコード化プラスミドに挿入する。その結果“ハウスキーピング”遺伝子は形質転換体の迅速な単離と同定が可能な選択可能マーカーとなる。
必須“ハウスキーピング”遺伝子の例としては、限定はされないがキナーゼ、プロテアーゼ、合成酵素、脱水素酵素及びその他を含む代謝調節体及び／又は酵素をコードするいくらでもの遺伝子が挙げられる。本発明が提供する抗生物質耐性遺伝子の他の代替え物としては、興味の遺伝子含有プラスミドに取り込んだレポーター遺伝子を有する医療用ベクターが挙げられる。本発明の教えに従って用いるレポーター遺伝子の限定されない他例としては、緑色蛍光タンパク質（GFP）、β―ガラクトシダーゼ及びアミラーゼが挙げられる。
一実施形態では生物活性ポリペプチドは好ましくはサイトカイン活性を有する。サイトカインはカラード（Callard）、ギアリング（Gearing）、１９９４年、“サイトカイン事実書”（The Cytokine Facts Book）、アカデミックプレス（Acaemic Press）に検討されている。サイトカイン活性を有する好ましいポリペプチドは、インターロイキン２（IL―２）及びインターロイキン６（IL―６）を含むインターロイキンである。
ある実施形態では上述のように核酸産生物からなるヘリコバクターデリバリーシステム、ベクター又はベクタープラスミドシステムは、ヘリコバクター又は他の適切宿主細胞に導入して形質転換細胞を与える。従って本発明の更なる様態により、開示の核酸を非病原性ヘリコバクターに導入することからなる方法が提供される。ヘリコバクターのような宿主細胞培養物の形質変換には、任意の利用可能技術が使用できる。ピロリ菌細胞に対する適切な技術としては、塩化カルシウム形質変換、電気穿孔及びバクテリオファージ使用の形質移入が挙げられる。
【００２１】
ヘリコバクター細胞へのベクタープラスミド導入に続いて、核酸の発現が、例えばこの遺伝子発現条件でピロリ菌の培養により起こるか可能になる。生物活性ポリペプチド発現条件で培養液のヘリコバクターの成長を用いて、このヘリコバクターがコード核酸を含有し、コード化材料を産生できることを証明できる。
更なる様態では本発明により体内で生物活性薬剤の治療用量か予防用量の送達法が提供され、その方法は有効量の本発明ピロリ菌組成とワクチンの非病原性製剤を被験者に投与することからなる。
ここに記載の本発明の方法と非侵襲性ヘリコバクターか非病原性ヘリコバクターの使用により、熟練者が例えば被験者の免疫反応を操作できる広範囲な治療法が与えられることが分かる。従って一様態では本発明により被験者にここに定義の非侵襲性ヘリコバクターか非病原性ヘリコバクターを投与することからなる細胞又は組織の生存、成長、分化、エフェクター機能又は感染感受性の調節法が提供される。
他の様態では被験者にここに定義の非侵襲性ヘリコバクターか非病原性ヘリコバクターを投与することからなる腫瘍細胞、又は粘膜表面、隣接又は遠位組織のコロニー形成感染に対する免疫反応を高める方法が提供される。
更なる他実施形態では被験者にここに定義の非侵襲性ヘリコバクターか非病原性ヘリコバクターを投与することからなる病原性感染性薬剤に対する免疫反応（抗体体細胞媒介）型調節法が提供される。
他の様態では被験者にここに定義の非侵襲性ヘリコバクターか非病原性ヘリコバクターを投与することからなる正常組織の炎症細胞か腫瘍細胞による浸潤調節法が提供される。
ある様態では被験者にここに定義の非侵襲性ヘリコバクターか非病原性ヘリコバクターを投与することからなる腫瘍細胞の成長速度、浸潤速度又は生存の調節法が提供される。
更なる他様態では被験者にここに定義の非侵襲性ヘリコバクターか非病原性ヘリコバクターを投与することからなる腫瘍細胞のアポトーシス誘発法が提供される。
【００２２】
被験者に生物活性薬剤を発現する非侵襲性ヘリコバクターか非病原性ヘリコバクターを投与することからなる免疫反応の下方制御法の他様態が提供される。
他様態では被験者に生物活性薬剤を発現する非侵襲性ヘリコバクターか非病原性ヘリコバクターを投与することからなるアレルギー性自己免疫疾患状態か他の免疫無調節疾患状態の治療法が提供される。
被験者としては任意の霊長類、ウマ類、ウシ類、ブタ類、ヒツジ類、齧歯類、魚類又は鳥類が可能である。一実施形態では被験者はヒトである。経鼻か経口で好都合に投与できる。
治療状況、即ち被験者への生物活性薬剤送達の生物学的効果が被験者に有益である場合、被験者に利益を示すに十分量の“治療有効量”を好ましくは投与する。この利益は少なくとも一つの症状の回復か重症度又は発症率を減少するものである。予防状況ではその量は、例えば免疫反応の強化により、後の病原の挑戦で被験者に有害な影響を減少するに十分な量で良い。実際の投与量と投与速度と投与の時間経過は、投与目的、例えば課題の性質と重症度に照らして求められる生物学的効果に依存し、最適化についての日常課題である。予防接種を含む治療処方、例えば投与量の決定等は、一般開業医や他の医師の責任範囲内である。
ヘリコバクターからなる組成は本発明に従い単独又は他の治療と組み合わして、同時又は逐次に投与できる。
本発明は又開示のヘリコバクターからなる製薬組成を提供する。この製薬組成は一実施形態では、好ましくは粘膜適用に適する。
本発明により且つ本発明により使用する製薬組成は、ヘリコバクター以外に技術の熟知者にはよく知られた製薬容認の賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤や他材料を含んでも良い。これら材料は無毒でなければならず、活性成分の有効性を妨げない必要がある。担体や他材料の正確な性質は投与経路に依存しても良い。経口投与に関しては、発熱物質なしで、適切なｐH、等張性及び安定性を有する非経口容認の水溶液を用いても良い。技術の関連技能者には適切な溶液を良く調整できる。
必要に応じて保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を含有しても良い。検討したように本発明に従う投与用のヘリコバクターからなる製薬は、一つ以上の栄養物質、例えばブドウ糖、アミノ酸などのエネルギー源を含んでも良い。
他様態では本発明により、個体への投与に適する適切担体媒体と一緒に、開示のヘリコバクターを処方することからなる製薬処方の製造法が提供される。一実施形態ではこの製薬は個体粘膜への適用に適する。
【００２３】
他様態では本発明により、製薬使用、例えば予防（“接種”）を含む手術や治療によるヒト身体又は動物体治療法の使用で、異種生物活性ポリペプチドを発現する非病原性ヘリコバクターが提供される。
一実施形態では本発明の方法を用いて、癌のような疾患を治療、予防又は軽減できる。この方法とデリバリシステムを用いて、又癌、免疫／造血系疾患や症状、生殖系疾患や症状、筋骨格系疾患や症状、心臓血管系疾患や症状、混合胎児と記述される疾患や症状、排泄系疾患や症状、神経／感覚系疾患や症状、内分泌系疾患や症状、呼吸器系疾患や症状、消化器系疾患や症状及び結合組織／上皮組織関連疾患や症状、細菌感染、ウイルス感染や寄生虫感染で起こる疾患や症状を治療又は予防できる。
他実施形態ではここに記載のヘリコバクターデリバリーシステムにより、ここに記載の多数の状態や疾患が治療可能な産生物をコードする多数の異なる核酸分子の同時送達か逐次送達が可能である。更に好ましいデリバリーシステムは、又食欲抑制や食欲増進のような追加の好ましい生理効果をもたらすことが可能な組成を送達できるであろう。
ピロリ菌の自殺システム例はパンテル等（Panthel, et al.）により２００３年（インフェクションアンドイミュニティ（Infection & Immunity）、７１巻、１０９−１１６頁）に記載されている。このシステムはプラスミドをPhilX174溶解遺伝子E含有のピロリ菌に導入する。この株を根絶するために４２℃で５時間インキュベーションした。これは体内でこの動物が４５−５０℃で飲み物を消費し、胃環境温度が４２℃より高く昇温することを意味する。
第二の例は補充プレートで菌突然変異株を生存させるのに通常用いるL―アミノピメリン酸（L―Dap）選択システムである（例えばキラタ等、（Kirata, et al.）、１９９７年、インフェクションアンドイミュニティ（Infection & Immunity）、６５巻、４１５８−４１６４頁参照）。このシステムでは動物被験体はその食餌に欠落基質、即ちアミノピメリン酸（DAP）をDapE欠如のピロリ菌突然変異株が生存するために補充する必要がある。この突然変異株を根絶するためにDAP消費は止まる。
第三の可能なシステムはそのｒｄｘA遺伝子にためにピロリ菌のメトロニダゾール感受性と関連する。ｒｄｘA遺伝子の過剰複製は哺乳類細胞と大腸菌に有害である。しかし細菌は重複に耐えうる。それ故本発明のヘリコバクター種は正常の突然変異依存体ｒｄｘAの損失を防ぐｒｄｘAの二つのコピーを含有するように操作できる。少なくとも二つの機能性ｒｄｘA遺伝子のヘリコバクターゲノムへの導入により、メトロニダゾールに永続的に鋭敏なヘリコバクター株をもたらす。ジェオン等（Jeong, et al.）は２０００年（ジャーナルオブバクテリオロジー（J. Bactriol）、１８２巻、５０８２―５０９０頁）に機能性ｒｄｘA遺伝子が産生したニトロ還元酵素によりメトロニダゾールがプロドラッグから殺菌性化合物に変わることを示した。この活性化合物の作用様式はヘリコバクターゲノムのDNA切断を起こすことである。
【００２４】
次いで該発明について更に以下の制限のない例だけを参照して記述する。しかし以下の例は例示的なものであり、ここに記載の該発明の一般性を決して制限するものと考えてはならない。特に該発明では特定ピロリ菌株の使用について詳細に記載するが、ここでの知見はこの株に限定されないことは明白に理解される。
実施例１  異種タンパク質の安定発現用ベクターと遺伝子導入ピロリ菌生物体
ピロリ菌の遺伝子操作はまれである。本実施例により遺伝子組換えヘリコバクター、特に形質転換ピロリ菌を提供する該発明の実用性を示す。形質転換細菌は大腸菌のような非ヘリコバクター生物体での先行操作に従ったヘリコバクター由来プラスミド及びプラスミドベクターを用いて産生する。
文献記載のいくつかのピロリ菌プラスミドはピロリ菌／大腸菌シャトルベクターにうまく変換できる。多くの大腸菌株は自然にDNA取り込み能力がある。ストレプトマイシン、リファンピン及びメトロニダゾールに対する抵抗性マーカーが又大部分のピロリ菌株にうまく形質転換された。しかし大腸菌や他生物体のプラスミドDNAはピロリ菌に導入できるが、これらプラスミドは安定に維持できない。更にピロリ菌プラスミドは大腸菌やヘリコバクター種には形質転換できない。従ってピロリ菌シャトルベクターを作成する必要がある。
ピロリ菌の二つのプラスミドの模式を図１と図２に示す。ベクターｐＨPA1（２．８ｋｂ）（図１）とｐHP3（３．４ｋｂ）（図２）の配列が決定され、ｐHPA1がシータ形式のプラスミド複製によることが明らかになった。ローリングサークル複製プラスミドとは対称的に、シータプラスミドは複製中一本鎖DNA中間体を生成せず、非正統的組み換えを受けにくいためより安定なベクター候補である。更にｐHPA1起源の複製（ori）は複製調節に預かり安泰なコピー数を維持する一連の直接反復配列（“インターロン”（interons））と名付ける）を含有する。ベクターｐH623はこの特性の多くを共有する。
これら二つのベクターのヌクレオチド配列を以下に示す。
二本鎖形で示したプラスミドｐHP1（トップストランドは配列番号１（SEQ  ID  NO:.1）であり、ボトムストランドは配列番号２（SEQ  ID  NO：２）である。）
2008509168.tif 000003
2008509168.tif 000004
（２）一本鎖形で示したプラスミドｐHP３（配列番号３（SEQ  ID  NO：３））
2008509168.tif 000005
クローンした追加ヌクレオチド配列は配列番号４（SEQ  ID  NO：4）に提供され、４５個のアミノ酸ペプチドをコードした１３５ｂｐ断片を含む（配列番号５（SEQ  ID  NO：５）このより小さな４５個のアミノ酸ペプチドはC型肝炎ウイルス（HCV）コア抗原の免疫原性ポリペプチドである。この４５個のアミノ酸ペプチドのコード化核酸配列を下線を引いた指示１３５ヌクレオチドと共に以下に示す（配列番号５（SEQ  ID  NO:５））。
2008509168.tif 000006
配列番号４（SEQ ID  NO:4）の核酸はピロリ菌２６６９５のhopE遺伝子（配列番号６（SEQ  ID  NO:6）、以下に示す）に配列番号４（SEQ  ID  NO:４）のnt５０４でクローンし（ボールド体／下線で示す：タンパク質産生物のアミノ酸残基１６８に相当）、その結果発現産生物はHoｐE遺伝子産生物の暴露表面ループの一部に位置する。ｐTMI03-08ベクター（図６）と命名したこの産生物は大腸菌表面で発現した。
2008509168.tif 000007
【００２５】
つまりhopE遺伝子の単離を完成する一方法は、TagDNAポリメラーゼを用いてピロリ菌２２６９５を増幅する。BamHI部位含有上流プライマーの5'AAFFATCCGATAGGAATGTAAAGGAATGG-3'（ 配列番号７（SEQ  ID  NO:7））と、EcoRI部位含有下流プライマーの5'-CCGAATTCTAAAGGCATGAACGCTTGCA-3'（ 配列番号８（SEQ  ID  NO:8））はパーキンエルマーアプライドバイオシステム社（Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc.）の３３２型（ABI；ミッシソーガ（Mississauga）、オンタリオ（Ontario）、カナダ）のようなDNAシンセサイザーを用いて産生できる。生成PCR断片はlacプロモーターと同じ配向のｐBluescript  II  KS（＋）のEcoRV部位に平滑末端でクローンできる。
次いでPCRプライマーをデザインして、二つのユニークな制限酵素部位をC型肝炎ウイルス（HCV）コア抗原の１３５ｂｐ免疫原性コード配列を挿入するためのhopE遺伝子に挿入できる。TagDNAポリメラーゼを用いるPCR増幅は以下のタッチダウン増幅法を用いて行う。PCRサーマルサイクラー（PCR thermocycler）を初期変性温度を９６℃で４分間プログラムし、次いで初期徐冷温度を６５℃（９０秒間）で、各連続サイクルごとに０．５℃だけ降温するサイクル１８回で徐冷し、７２℃で伸展ステップを６分間、次いで９６℃で１分間変性した。最初の１８回サイクル完了に続いて、アラビノーズ誘発プロモーター調節下にｐTM１０３．８のような適切ベクターに１４個のサイクルを再連結し、大腸菌JM105に形質転換する。
組み換え型クローンはオリゴヌクレオチドプライマー5'-AGATCTAAGGACGTC-3'（ 配列番号９（SEQ  ID  NO:９））プラスPCR増幅反応の逆方向配列プライマーを用いて同定できる。同定クローンを配列決定して挿入制限酵素部位が枠内にありhopE遺伝子にエラーが導入されていないことが証明できる。次いでC型肝炎ウイルス（HCV）コア抗原の１３５ｂｐ免疫原性配列コードが標準法を用いて挿入できる。
一旦ｐTMI03-8ベクターが生まれると、大腸菌に形質転換し３７℃で成長した。次いで細胞を収集してHCV挿入物の発現ｗウエスタンブロット法で確認した。
つまりこの方法は以下の通りである。細胞を約２０個のプレートから収集し、１０ｍMトリスー塩酸（ｐH８．０）中のDNA分解酵素Ｉ（DnaseＩ）（ベリンジャーマンハイム社（Boehringer Mannheim））５０ｍｇと２０％蔗糖に再懸濁した。次いで細胞をフレンチ圧力セルで１５０００ポンド／平方インチで分裂した。分裂細胞が１０ｍMトリスー塩酸（ｐH８．０）の７０％蔗糖１ｍｌと６ｍｌの蔗糖濃度段階勾配上を覆った。外膜画分を収集し、１５０，０００ｘｇでペレット化し、そのペレットを蒸留水１００μｌに再懸濁する。
代わりに対数期培養物５００ｍｌの外膜を１０ｍMトリスー塩酸（ｐH８．０）―３％ｎ―オクチルポリオキシエチレン中に可溶化し、２３℃で１時間インキュベートし、１７３，０００ｘｇで３０分間遠心分離する。このペレットを１０ｍMトリスー塩酸―３％ｎ―オクチルポリオキシエチレンー５ｍM  EDTA中に再懸濁し、１７３，０００ｘｇで３０分間遠心分離し、上澄みを収集する。ウエスタン免疫ブロットは第二可溶化段階の上澄み液にHCV／hopCの存在を示した。HCV／hopC含有上澄みを等容積の０．１２５Mトリスー塩酸（ｐH６．８）、４％（重量／体積）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）及び２０％（体積／体積）グリセロールと混合し、SDA―１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にかける。必要があればHCV／hopEバンドをゲル未染色部から切り取り、１０ｍMトリスー塩酸（ｐH８．０）―１ｍM  EDTA（ｐH８．０）及び１００ｍM食塩で４℃で一夜溶出する。次いで溶出上澄み液をSDS―PAGEゲル上に流し純度を確認し、標準法を用いてウエスタン免疫ブロットを行う。例えば単離外膜を濃度１５μｇ／レーンで負荷する。次いでSDS-PAGEを用いて１２％不連続ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行う。次いでタンパク質をクーマシーブリリアントブルーで染色する。ウエスタン免疫ブロットを行うために、未染色ゲルをイモビロンーP（Immobilon-P）膜（ミリポア社（Millipore）、ベッドフォード（Bedford）、マサチューセッツ(Massachusetts)）上で電気ブロットできる。リン酸緩衝食塩水（PBS）中の３％ウシ血清アルブミン（BSA、ベリンジャーマンハイム社（Boehringer Mannheim）―０．１％ツィーン（Tween）２０（シグマ社（Sigma））で２３℃、２時間遮断した後、この膜をPBS中の１％BSA―０．０５％ツィーン（Tween）２０の１／１００００希釈坑HCVウサギ抗血清で３７℃、１時間インキュベートする。次いで膜をＰＢＳで洗浄し、１／５０００希釈アルカリ性ホスファターゼ複合二次抗体（バイオラド社（BioRad）、リッチモンド（Richmond）、カルフォルニア（California））で３７℃、１時間インキュベートする。結合抗体が５−ブロモー４−クロロー３−インドリルリン酸塩（ＢＣＩＰ，カルバイオケム社（Calbiochem）、ラホラ（La Jolla））とニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、シグマ社（Sigma）、（カルフォルニア（California））で検出される。
【００２６】
実施例２ 発現ベクターと安定発現用抗体の選択
HopEはピロリ菌の未変性タンパク質なので、この生物体に耐え且つピロリ菌中の異種抗原や他の異種遺伝子産物発現に有効な作成物を形成できる。上述のように容易に発生できる他のピロリ菌／大腸菌シャトルベクターとしては、例えば互いの宿主に適した二つのプラスミドori部位とマーカーからなるベクターが挙げられる。マーカーとしてはクロラムフェニコール／カナマイシン耐性用遺伝子と同様に、大腸菌転写系とピロリ菌転写系両者で認識できるプロモーターが挙げられる。
大腸菌の複製必要条件はいくらでもある既知大腸菌プラスミド（例えばｐＢＲ３２２）を用いて達成できる。
作成シャトルベクターが大腸菌とピロリ菌両者の複製に関して体外で試験でき、文献記載の現存シャトルプラスミドと比較できる。
発現される抗原か他の異種遺伝子産生物の選択は、理想的にはピロリ菌と大腸菌に毒性でなく、且つ哺乳類の選択部位に送達した場合非常に免疫原生（又は他の好ましい性質を保有する）ものである。哺乳類接種用の発現抗原の場合、その部位は粘膜部位でも良い。
実施例１で記載のようにhopeE／ＨＣＶコア抗原融合タンパク質は大腸菌表面で発現できる。ｐＴＭＩ０３−８産生物（図３）は好ましくはピロリ菌外膜を標的とし、その結果粘膜環境でＨＣＶコア抗原を示すであろう。
破傷風トキソイド（ＴＴ）はヒト抗原として広く研究され、それに対する免疫反応はよく特定されている。ＴＴは経口か経鼻投与し、細胞胞子表面で示されると良い粘膜免疫反応を誘発する（ダック（Duc）、カッティング（Cutting）、エクスパートオピニオンオンバイオロジカルセラピー（Expert Opinion Biol.Ther.）、３巻（８号）、１２６３−７０頁）。破傷風毒素Ｃ断片は上述のようにhopE遺伝子産物と融合でき、又膜錨と細胞表面標的配列を含有するように操作できる。このシステムの利点は接種法の有効性評価用が良く、特性付けられたマウスモデルがあることである一方、ＨＣＶの場合には既知ネズミモデルは通常免疫不全マウスに依存する。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｇＢタンパク質は、ｇＢ抗原を発現する操作ワクシニアウイルスの致死量に対しマウスが免疫されることが示された。従ってＨＣＶ抗原の代わりのｇＢ抗原からなるここに記載のようなシャトルベクターが、実施例１に記載のプロトコルを用いて作成できる。
【００２７】
多くのプロモーターがシャトルベクターで使用できる。理想的には使用プロモーターはヘリコバクターの体内自然コロニー形成機構か、又は消費可能な無害な食糧や化学薬品誘発のいずれかにより誘発できる。例えば酸性で誘発できると報告され、胃粘膜コロニー形成に関わる病原性因子でも良いピロリ菌ヒスチジンキナーゼＨＰ１６５のプロモーターはこのプロモーターの一つである。このプロモーターの利点は、作成物が胃粘膜の酸性環境に暴露された場合にのみ発現される異種抗原により体外で作成できることである。
他のプロモーターとしては、ｐＴＭＩ０３．８とＦｌａＢシグマ５４プロモーター（ジョセンハンス等（Josenhans, et al.）、１９９８年、エフイーエムエスミクロビアルレター（FEMS Microbial Lett.）、１６１巻（２号）、２６３−７３頁）で使用のアラビノーズ誘発性プロモーター、多くの恒常的誘発可能大腸菌系で用いられる広く研究されたＴ７プロモーター、及び嫌気雰囲気で誘発されるサルモネラのnirＢプロモーター（チャットフィールド等（Chatfield, et al.）、１９９２年、バイオテクノロジー（Biotechnology）、１０巻（８号）、８８８−９２頁）が挙げられる。ピロリ菌でのこれらプロモーターのいずれかの機能能力は、ピロリ菌プラスミドベクターでのプロモーター活性の読み取りとして、ＣＡＴレポーターとＧＦＰレポーターを用いたアンジェリーニ等（Angelini, et al.）（プラスミド（Plasmid）、２００４年、５１巻、１０１−１０７頁）が開発したシステムを用いて試験できる。
発現の標的部位は用いる抗原や他遺伝子産物に依存する。最初の研究はピロリ菌細胞表面に対する発現ポリペプチド（例えば抗原）を標的とするHopEタンパク質と融合ポリペプチドに集中した。
プラスミドの安定性も又非常に重要で、プラスミド維持のために選択決定因子として抗生物質耐性遺伝子を用いるのは、体外では有効であるが体内では実用性はより低い。代替え物としては平衡致死系があり、例えば活性化サルモネラ菌で用いるasd遺伝子がある。ピロリ菌に自然に存在するasd遺伝子は、アスパラギン酸―β―セミアルデヒド脱水素酵素（ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）用の生合成経路での酵素で、グラムネガティブ細菌の細胞壁ペプチドグリカンの必須成分）をコードする。ＤＡＰ不在ではasd突然変異株は溶解する。ＤＡＰは哺乳類組織には存在しないので、この平衡致死系により組み換え型asd遺伝子含有プラスミドを保有するために全ての生きたピロリ菌の必要条件を課する。
asd遺伝子系を用いるには、標準の遺伝子ノックアウトプロトコルを用いてasd遺伝子のゲノムコピーを不活性化する。次いでこのピロリ菌株はＤＡＰ供給又はasd遺伝子含有プラスミドと一緒でのみ成長する。
【００２８】
同様の目的に使用できる他のシステムとしては、粘膜アジュバントとしての大腸菌エンテロトキシン又はコレラ毒素（ＣＴ）が挙げられる。又アジュバントを用いて粘膜免疫反応を高めることもできる。このような二つのアジュバントとしてはＣＴと大腸菌エンテロトキシン（ＬＴ）があり、発現抗原がその強い粘膜免疫賦活性を維持するが、毒性は非常に低下したＬＴＢ突然変異株とＣＴＢ突然変異株と融合する。
実施例３  毒性、ＬＤ５０
実施例１と２に記載のようにｐＨＰ３とｐＨＰ１のようなヘリコバクターベースのベクターはマウスやヒトのような哺乳類の感染防止が提供できる。本実施例ではネズミモデルを用いて、ヒトを含む哺乳類へ興味の薬理活性分子送達できるヘリコバクターベースのシステムを用いる実用性を示す。ネズミモデルを用いて、発現表面抗原に対し体内血清応答を発現するピロリ菌遺伝子導入株の活性を示す。
マウスを野生型ピロリ菌で感染させる一方、他のマウスを実施例２で記載の温度感受性ピロリ菌で胃管栄養法により接種する。対照動物とテスト動物両者の血清を抗体に関してアッセイし、表１に示したスケジュールに従い屠殺動物の胃組織診断を行った。マウスの尿素呼気試験も又使用する。
表２に示すように毒性の５０％低下（７５％から４０％）が観察された。特異抗体力価はベースラインから４倍増加し、血清応答を示唆する。血清試料をベースライン、１２週、２４週、４８週で採取した。これらの時期で１０匹、１０匹及び２０匹の動物を屠殺し胃組織診断を行った。
表１
体内研究
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Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌、４０匹テストと１０匹対照。
表２
パワー計算毒性の研究
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実施例４  数個の温度感受性ピロリ菌株の毒性と抗原性の比較
外膜タンパク質の発現／修飾に関する毒性の大きな変化を検出するために、マウスを実施例３に記載の温度感受性ピロリ菌で接種した。同じサイズの対象集団マウスを野生型ピロリ菌株で接種した。非観血法を用いてピロリ菌の有無を決定した。マウスを抗体評価のために３ヶ月と６ヶ月で出血した。屠殺に際し胃炎を検査のために組織診断を行い、コロニー形成を確認した。表３に使用マウスの血清学と組織診断を示す。
表３
毒性と血清学の比較研究
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実施例５  肺炎球菌抗原に対する温度感受性ピロリ菌の接種効率評価のためのＬＤ５０研究
標準病原菌（肺炎球菌）でのヘリコバクターベースワクチンの保護効果を示すために、胃管栄養法によりマウスを温度感受性ピロリ菌で接種した。同じサイズの対象集団を野生型ピロリ菌株で接種した。非観血法を用いて実施例４に記載のようにピロリ菌の有無を決定した。感染６ヶ月後、アーバージ等（Aaberge, et al.）（１９９５年、ミクロビアルパソゲネシス（Microb. Pathog）、１８巻、１４５−１５２頁）の方法により、全マウスの腹腔内で生毒性４型肺炎球菌のＬＤ５０の１０倍量（約２０ＣＦＵ／マウス）で挑戦した。
表４に示すように対照が死亡率７５％と考えると、この研究は死亡率５０％低下検出でパワー０．８を有する（７５％対５０％）。
表４
接種マウスの肺炎球菌に対するＬＤ５０
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実施例６  マウスのピロリ菌状態の決定：呼気試験法
本実施例ではヒトに用いる尿素呼気試験をマウスに適用した。
マウス十匹にウレアーゼ抜きの食餌（未調理大豆）を与えた。次いでマウスに胃管栄養法により味付きクエン酸２００μｌ中の１．７ｋＢｑ１４Ｃ尿素を投与し、空気充満した２Ｌプラスチックジップロックバッグに２０分間置いた。次いでこのバッグ内空気を交換することなしにマウスを取りだした。次いで０．１mmolハイアミンエタノール溶液を導入し、シンチレーション剤をハイアミン溶液に加え、１０００ｄｐｍカウントまで１０分間数えた。
実施例７  ヒトでの研究
人手の毒性と抗体応答を確認するため、“ベイラー株”のようなピロリ菌株を用いて以下の判定基準を適用する。
感染個体は病徴はなく、軽微以上の組織損傷はなく、且つ肝炎ウイルス又はＨＩＶ感染の証拠はない。
単離物は単一株のcagAネガティブで、メトロニダゾール、クラリスロマイシン、テトラサイクリン及びアモキシシリンに鋭敏である。
挑戦を受けるボランティアは正常な胃組織診断を有し、消化性潰瘍病歴はなく、家には幼児はいなく、幼児との定常的な接触はなく、且つこの感染治療に必要な抗生物質にアレルギーでない。
挑戦は就寝時でのファモチジン４０ｍｇに続く朝のピロリ菌ビーフスープの経口投与からなる。被験者と毎日１４日間接触する。７日後と１４日後に１３Ｃ尿素呼気試験（ＵＢＴ）を行い、２週間後と３ヶ月後に定量的培養物を有する内視鏡検査と組織検査を行った。感染を根絶するために抗生物質を用いた。
実施例８  野生型及び／又はＴＳＨＰの体内検出用外部化学マーカーの開発
野生型及び／又は遺伝子導入型ピロリ菌（ＴＳＨＰ）の体内検出に使用できる化学マーカー例はスルファサラジン（ＳＳＮ）で、その構造を図４に示す。無菌マウスと従来ラットの研究により、腸内細菌のみがジアゾ結合還元に関与し、ＳＳＮの還元性異化とサルファピリジンと５−アミノサルチル酸放出となることが示された。この反応を触媒する一つ又は複数の酵素は一つ又は複数のジアゾリダクターゼと呼ぶ（一つ又は複数のアゾリダクターゼの同義語）。
ＳＳＮを与えた従来ラットは、尿と糞便に５−アミノサルチル酸とサルファピリジン（及びそれぞれの複合物）を排泄する一方、無菌ラットはＳＳＮ分解の証拠は示さない。
いくつかの細菌種はジアゾリダクターゼ（ＡＺＲ）を有することが示された。予備的生物情報的研究によりピロリ菌はＡＺＲ遺伝子を含有できないことが示唆された。類似配列の存在では又否定的結果は生じなかった。このような環境のもとで生存可能な機能性アゾリダクターゼを有するピロリ菌（azr＋ＴＳＨＰ）遺伝子導入株（ＴＳＨＰ）を用いてこれらマーカー使用が評価できる。
【００２９】
プラスミドｐＴＭＩ０３−０２をＥｃｏｒＲ  ＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＥｃｏｒＲ  ＩとＨｉｎｄＩＩＩ処理枯草菌のアゾリダクターゼ（ＡＺＲ）遺伝子と連結し、HopE  １６８aaとＡＺＲ両者含有のｐＴＭＩ１０３―azrという名前のベクターを産生した。このプラスミドを大腸菌に形質転換してHopEと枯草菌ＡＺＲの発現が起こるか否かを評価した。全長のＣ型肝炎コア抗原（ＨＣＣＡ）で同様に処理場合、ウエスタンブロット法と坑HopE Absを用いて、ｐＴＭＩ０２はHopE：：ＨＣＣＡから大腸菌外膜への輸送を示した。
マウス（ｎ＝３０）を胃管栄養法でazr＋ＴＳＨＰで感染し、５−アミノサルチル酸とサルファピリジン（及びそれぞれの複合物）の尿と糞便内へ産生する体内でのＡＺＲ発現が一旦確立されると、人体試験が始められる。
実施例９  マーカーとしてのダイアグネックスの使用
診断薬“ダイアグネックスブルー（Dianex Blue）”は染料（アズール（Azure）ーＡ）とその複合化イオン交換樹脂（アンバーライト（Amberlite）ＸＥ−９６）からなる。この試験は樹脂―染料組み合わせが２．５より低いｐＨで解離し、染料を吸収して尿に現れるという事実に基づいている。尿に染料がないヒトは無酸性である。この原理を図５に示す。
同じ原理を用いてピロリ菌のテストができる。例えばこの樹脂が尿素と一緒に与えれば、ｐＨ＞７．０で解離する染料―樹脂組み合わせがウレアーゼを検出できるであろう。これによりピロリ菌が住む粘膜層でｐＨ＞７．０を生じ、その結果この染料を放出するであろう。
マウス（ｎ＝３０）を野生型ピロリ菌株で接種する一方、無菌マウス（ｎ＝３０）を対照として用いる（予備的研究）。ピロリ菌の活性感染確立が可能な最適期後に、試験集団と対照に所定量の樹脂―染料組み合わせを胃管栄養法により導入した。次いで尿素溶液導入が続く（範囲：０．０１Ｍ乃至０．５Ｍ）。このマウスを代謝用ケージに保ち、アズール染料の排出を監視し定量した。樹脂濃度と尿素濃度の異なる比で試験して、使用の最適組み合わせを立証した。
実施例１０  送達処方
エアロゾルによる投与に関しては、本発明は適切な噴射剤を用いて加圧パックか噴霧器からエアロゾル噴霧提示形で送達できる。加圧エアロゾルの場合、測定量を送達するバルブを備えることで用量単位が決められる。この処方は吸入投与用の粉末に製剤もできるであろう。吸入投与は又該発明に従う組成含有溶液又は懸濁液の噴霧化により実施できる。
該発明の組成は又静脈内製剤として被験者投与用の経口消化用液体に処方しても良い。
該発明の種々の製剤全ては、更に適切な製薬助剤を適切に使用している場合、技術の熟知者にはよく知られた方法で調剤できる。該発明の組成は、好都合にヘリコバクター種単独か、他の所望成分との組み合わせで含有する。
【００３０】
上記の単独又は組み合わせのヘリコバクター処方のいずれもが、該発明に従う製薬容認組成からなる製薬組成に含まれても良い。ここに記載の製薬組成は、固体（例えば粉末、粒子、顆粒、小袋、錠剤、カプセルなど）、半固体（ゲル、ペーストなど）又は液体（溶液、分散液、懸濁液、エマルジョン、混合物など）形状でも良く、例えば消化管と胃粘膜経由投与に適応しても良い。従って製薬組成は使用前に溶液媒体に分散できる粉末か微粒子形状でも良い。
液状の製薬組成はヘリコバクター組成と、例えば生理条件に適応する組成、例えば生理的容認溶液のような電解質溶液からなる分散液形状でも良い。
該発明に従う製剤組成は更に他の治療的に、予防的に及び／又は診断的に活性な物質を含んでも良い。
他実施形態では該発明は第一容器と第二容器からなる製薬キットに関連し、第一容器は該発明によるプラスミド及び／又はプラスミドベクターからなる組み換え型ヘリコバクター組成からなり、第二容器はこのヘリコバクター組成用分散媒体からなり、使用前の分散媒体にヘリコバクター組成の投与及び／又は服用に関する使用説明書を備えている。
キットに含まれる本発明によるヘリコバクター組成は粉末又は微粒子形状でも良い。
本発明に従う製薬キットは、ヘリコバクター組成の分散媒体に分散後、投与しなければならない期間に関する勧告付きの使用説明書を含んでも良い。
実施例１１  ヘリコバクターワクチン製剤による免疫調節
ＴＨ１応答（１型Ｔヘルパー細胞）は細胞媒介性応答である。これの過活性は関節リュウマチ（ＲＡ）と狼瘡のような疾患の考えられる原因である。その一方ＴＨ−２はワクチンの抗体型血清応答特性である。本実施例により、本発明に従うヘリコバクターベースワクチン治療製剤で治療した場合、動物でＴＨ−２型応答が得られる技法が提供される。
ここに記載のヘリコバクターベクターとベクタープラスミドシステム使用は動物の抗体反応を引き起こすのに使用できる。一例として細菌クロストリジウムの形質転換を提供する作成物の遺伝子発現カセットと、タンパク質（表面層タンパク質）の後続分泌を用いる系で、これにより粘膜接種の開始をもたらす系は、ＷＯ０１９４５９９に記載しここにその全体を取り入れている。これらの作成物は又ＯＲＦ１、ＯＲＦ３、ＯＲＦ５−７、ＯＲＦ７又はＯＲＦ１１から選んだ分泌リーダー配列を含んでも良い。
【００３１】
このワクチンのいくつかの実施形態に従うと、ヘリコバクターベースのベクターとベクタープラスミドは、細菌表面層タンパク質のコード化配列を含んでも良い。表面層タンパク質とは、ここでは例えば細菌外膜に生じ、且つ細菌表面に暴露できるタンパク質、糖タンパク質又はリポタンパク質を含むいずれかのタンパク質性分子と定義する。表面層（Ｓ−layer）タンパク質はその細胞のいかなる他種タンパク質より大量に継続して自然に産生できる。
表面層（S―layered）タンパク質を有するグラムネガティブ宿主細胞のクロストリジウムを含む組み換え型細胞製剤の調剤法は又ＷＯ９７／２８２６３で提供した。表面タンパク質（Ｓ−protein）を本発明のヘリコバクター作成物に組み入れるために、ここに記載の方法でそのプロセスを修正し従っても良い。
従ってベクターとベクタープラスミド作成物のいくつかでは、ヘリコバクター配列と興味の非ヘリコバクター製薬活性分子からなる融合タンパク質が提供される。本発明のヘリコバクター作成物使用ワクチンの免疫原性を増強するために、融合タンパク質のヘリコバクター配列は表面層（S―layer）タンパク質のコード化配列からなっても良い。融合タンパクの一部として表面層（S―layer）タンパク質含有桿菌作成物が、桿菌表面で表面層（S―layer）タンパク質を発現することが報告され（バチルススファエリクスの記載はＷＯ９５／１９３７１参照）、この製剤の免疫原性が増強される。
粘膜接種は既に経口ポリオワクチンとコレラと大腸菌による下痢に対する経口（飲用）ワクチンを含むいくつかの疾患に対して提供されている。ある実施形態では該発明のワクチンは不活性化ワクチンからなることが意図される。
本発明により担体生物体のヘリコバクターが抗原、即ち興味の非ヘリコバクター製薬活性分子を産生し続け、体内免疫性を高めので、単回投与の持続性ワクチン接種を提供する生ワクチンが意図される。更にワクチンはアジュバントと組み合わして投与する。これらのアジュバントとしては投与での除去が強い部位で減速することでワクチンへの暴露時間を増加する水酸化アルミや脂質小胞のような分子を含む。アジュバントは又サイトカインとケモカインと呼ばれる免疫調節ペプチドの産生を引き起こす作用をする（ブリューワー等（Brewer, et al.）、１９９７年、ジャーナルオブサイトカインセルモレキュラーセラピューティック（J. Cytokines Cell Mol. Ther.）、４巻、２２３−２４６頁）。従って本ワクチンは免疫反応を増加するサイトカインアジュバントを含んでも良い。
形質転換ヘリコバクター菌か大腸菌をヒトや動物のような哺乳類に経口投与する場合、自然なコロニー形成部位である胃壁を通して消化管のコロニー形成と所望ポリペプチドの産生と提供を行う。消化管は種々の形の免疫反応開始に特化した協力な免疫装置で囲まれている。従って組み換え型ヘリコバクターワクチンやペプチド産生株は、従来のワクチン接種より遙かに長期の免疫刺激が可能である。更に抗原が優先的に腸壁か管腔に提供される。
【００３２】
実施例１２  食欲抑制剤としてのヘリコバクターとその使用
食欲抑制をもたらす調剤と治療計画でのヘリコバクター使用法として、本発明の実用性を示す本実施例が提供される。特に弱毒化ヘリコバクターとグレリン（ホルモンの一つ）又はグレリン作用薬のレベルを調節する興味の非ヘリコバクター製薬活性分子を一緒に含む作成物の腸粘膜への送達により、食欲と健全さを調節する腸―脳系を抑制する有効手段の提供が期待される。
研究によりグレリンは食欲刺激剤、即ちグレリンはマウスの食餌摂取量を増加することが示唆された（浅川等、２００３年、ガット（Gut）、５２巻（７号）、９４７−５２頁）。グレリンは又齧歯類の脂肪組織での脂肪の利用を減少する（ツショップ等（Tschop, et al.）、２０００年、ネーチャー（Nature）、４０７巻、９０８−１３頁）と同様に、ラットの脂肪生成に関与することが報告された（チョイ等（Choi, et al.）、２００３年、エンドクリノロジー（Endocrinology）、１４４巻（３号）、７５１−９頁）。グレリンは又食餌入手の可能性が低い場合、被験者に食べるのを勧める空腹信号であると報告された。
成長ホルモン分泌促進物質受容体（ＧＨＳ−Ｒ）用の内在性リガンドであるグレリンは、培養下垂体細胞からの成長ホルモン（ＧＨ）放徐を用量に依存して刺激し、主として胃底酸分泌腺に見られるＡ−ライク細胞（A-like cell）から産生分泌される。グレリンはＧＨ放徐だけでなく、食欲と体重調節でも役割を果たすことが知られている。
非経口且つ脳室内投与のグレリンで、これらのＧＨ欠乏動物のマウスとラットでも、フリーアクセスの食餌により食摂取量と体重の増加が示された。食欲と体重調節はＧＨ放徐に依存しない。
２８個のアミノ酸ペプチドのグレリンは、その第三セリン残基がｎ―オクタン酸によりアシル化されると活性化され、ＧＨＳ−Ｒが全グレリンペプチドのオクタニル化セリン残基を含む第一の４残基又は５残基に応答する。ＧＨＳ−Ｒが下垂体腺、視床下部、副腎、甲状腺、膵臓、心筋、脾臓及び睾丸に存在することが示された。グレリンは視床下部のニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）とアグーティ関連ペプチド（ＡＧＲＰ）伝令ＲＮＡの発現を刺激する。グレリンの中枢食欲促進効果は、視床下部のＮＰＹ／ＡＧＲＰ発現ニューロンにより仲介される。グレリンは又迷走神経求心性活性を抑制することが報告されている。グレリンの末梢食欲促進効果は少なくともその一部は、迷走神経求心活性への抑制効果により仲介できる。
ＩＬ−１βは、レプチンの発現放徐を刺激及び／又はレプチンによるシグナル伝達の過剰の負フィードバックで視床下部への効果を模倣することで、悪液質プロセスを仲介する炎症誘発性サイトカインである。
グレリンに対する拮抗物質が動物の腸粘膜に提供されると、動物の食餌摂取量は減少し、体重増加も減少することを提案する。
実施例１３  細胞消耗付随癌とエイズ
本実施例で細胞消耗、特にエイズと癌の病状に関連する細胞消耗を防止又は阻害する製剤として使用する場合の本発明の実用性を示す。
悪液質は消耗、るいそう、弱さ及び飢餓衰弱により特徴付けられる状態である。最近胃のグレリンペプチドとグレリン伝令ＲＮＡ両者のレベルが、癌悪液質のマウスモデルで上方制御されることが報告された。ＩＬ−１βの血漿レベルが増加した悪液質マウスでは、グレリンの血漿濃度も又悪液質の進行と共に増加した。この結果はグレリン動力学とＩＬ−１仲介の悪液質プロセス間に密接な関連性があることを示唆する。ＩＬ−１βは丁度コレシストキニン（ＣＳＫ）、レプチン、ガストリン関連タンパク質及びボンベシンのような食欲不振誘発性物質であり、グレリン作用に拮抗する。
【００３３】
荒川等は非経口投与のＩＬ−１βにより、視床下部のＮＰＹ伝令ＲＮＡ発現と胃のプリプログレリン伝令ＲＮＡ発現が減少し、腹腔内投与のグレリンはＩＬ−１β誘発摂食障害の重症度を阻害すると報告した。ピロリ菌感染は胃炎、消化性潰瘍疾患及び胃悪性腫瘍発生の主な病原性因子であることが知られている。
ピロリ菌の胃粘膜への付着によりＩＬ−１βを含む種々のサイトカイン放出と関連する炎症を誘発する。
ピロリ菌根絶に続いて、体重と全コレステロール、全タンパク質とアルブミンの血清レベルのようないくつかの栄養パラメーターがしばしば改善されることが臨床的に観察されている。ピロリ菌感染はスナネズミの血漿と胃グレリン動力学を修飾できると報告されている。しかしヒトでは、ピロリ菌根絶である場合には血漿グレリンレベル増加と関連することが示されているが、ピロリ菌感染は血漿グレリンレベル変化には全く関連しないと報告されている。
ピロリ菌は、例えば胃粘膜へのグレリン分泌を提供する働きにより、必要な患者にアミリンを提供する担体として用いられることを提案する。いくつかの実施形態ではグレリンレベルを低下するように、アミリン、アミリン類似体及び／又はその誘導体、アミリン作用物質（カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド及びその類似体を含む）のコード化配列を含むヘリコバクターベクターを作成する。
アミリン拮抗物質はグレリンレベルを増加できる。アミリン、アミリン作用物質又はアミリンの有効レベルを低下する他類似化合物の有効レベルの調節により、拮抗物質と抗体の場合にはグレリン分泌を阻害又は刺激できる。それ故この方法のいくつかの実施例では、体内アミリンかアミリン作用物質の有効レベルを直接的又は間接的手段で増加するか、アミリン拮抗物質を用いるかアミリン産生を阻害してアミリン有効レベルを低下して、グレリン内在レベルの調節に向けられる。
【００３４】
実施例１４  ゴーシェ病治療
本実施例でゴーシェ病のような酵素欠損で生ずる疾患治療で使用した場合の該発明の実用性を示す。ゴーシェ病はヒトの最も通常のリソソーム蓄積障害であり、酵素のグルコセレブロシダーゼ（ＧＣ）欠損で生ずる。（ノルタ等（Nolta, et al.）、１９９２年、ジャーナルオブクリニカルインベスティゲーション（J. Clin. Invest.）、９０巻（２号）、３４２−３４８頁。）
化学シャペロンのコード化配列からなるヘリコバクターワクチン作成物（ソウカー等（Sawker, et al.）、２００２年、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブユウエスエイ（PNAS USA）、９９巻（２４号）、１５４２８−１５４３３頁）、又はグルコセレブロシダーゼからなるヘリコバクターワクチン作成物による酵素置換治療法が提供される。従って増強レベルの機能性β―グルコシダーゼ（β―Ｇｌｕ、グルコセレブロシダーゼ）が得られる。特に化学シャペロンデオキシノジリマイシン（ＮＮ−ＤＮＪ）のコード化配列をピロリ菌作成物に用い、患者に経口又は胃内投与しても良い。
更に他実施形態の一部として、興味の非ヘリコバクター製薬活性分子を有するベクター、この場合はコード化グルコセレブロシダーゼ（ＧＣ）からなるヘリコバクターベースの作成物を提供する。グルコセレブロシダーゼ培養ゴーシェ病骨髄のレトロウイルス仲介輸送がノルタ等（Nolta, et al.）によりゴーシェ病治療の一提案として記載されている（１９９２年）。しかしこの提案は非常に観血的である。欠損酵素のグルコセレブロシダーゼのコード化配列を含有する本発明のヘリコバクターベース作成物を用いる代替え酵素置換治療により、この治療に遙かに魅力的でより安価な代替えが提供される。
実施例１６
ここに記載のヘリコバクターベクター及び／又はプラスミドベクターからなる予防接種製剤を用いて、リンパ腫、特にモルトリンパ腫（ＭＡＬＴ）のような細菌誘発悪性腫瘍の治療及び／又は阻害に適する有効な製剤を提供する本発明の実用性を示す本実施例を提示する。
サットン等（Sutton, et al.）（２００４年、ワクチン（Vaccine）、２２巻（２０号）、２５４１―６頁）はヘリコバクターフェリスに対する動物へのワクチン接種／予防接種の結果、細菌誘発悪性腫瘍、具体的には原発性胃モルトリンパ腫に対する保護を報告している。それ故ヘリコバクターフェリス以外に対する免疫製剤の提供に適したベクター及び／又はベクタープラスミド含有の本発明のピロリ菌作成物を用いて、又細菌誘発悪性腫瘍、特に原発性胃モルトリンパ腫に対するワクチン接種保護が提供できる。
本応用で挙げた文書、特許、学術論文及び他材料はここに文献として取り入れる。
本発明は付随図面に関連してこのいくつかの実施例との関連で十分に記述したが、技術の熟知者には種々の変形と修正が明らかなことを理解する必要がある。そのような変形と修正は付随特許請求項で定義した本発明の範囲から逸脱しない限り、その範囲内であると理解する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１はプラスミド作成物ｐHPA1（２．８ｋｂ）の概略図である。
【図２】図２はプラスミド作成物ｐHP3（３．４ｋｂ）の概略図である。
【図３】図３はプラスミドベクターｐTMI０３−８の概略図である。
【図４】図４はスルファサラジン（SSN）の構造を示す。
【図５】図５は染料（アズールーA（Azure-A））と複合化したイオン交換樹脂（アンバーライト（Amberlite）XE-96）の使用を示す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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