(57)【要約】本発明は、血小板媒介性血栓形成を測定する方法に関する。具体的には、本発明は、(i) 血液試料を採取し、これを血栓形成を阻害するのに有効な量の抗凝固剤と任意に混合する段階；(ii) 容器内で試料を、凝固を惹起するのに有効な微量の開始剤と混合して、混合試料を得る段階；(iii) 容器内部の混合試料を回転させ、それによって容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；(iv) 付着した血小板の、前記表面における血栓形成を測定する段階を含む、血液試料中の血小板媒介性血栓形成を測定する方法を提供する。本方法は特に、凝固因子機能障害を有する対象における凝固障害を決定するための種々の用途を有する。2008525790.tif 000003
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、血液試料中の血小板媒介性血栓形成を測定する方法：
(a) 血栓形成を阻害するのに有効な量の抗凝固剤を血液試料に添加する段階；
(b) 容器中の試料を、凝固を惹起するのに有効な微量の開始剤と混合して、混合試料を得る段階；
(c) 容器内部の混合試料を回転させ、それによって該容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を該容器表面で発生させる段階；
(d) 付着した該血小板の、前記表面における血栓形成を測定する段階。
【請求項２】
凝固因子機能障害を有する対象における凝固障害を決定するための請求項1記載の方法であって、以下の段階：
(a) 該対象から血液試料を採取し、血栓形成を阻害するのに有効な量の抗凝固剤を血液試料に任意に添加する段階；
(b) 容器中の試料を、凝固を惹起するのに有効な微量の開始剤と混合して、混合試料を得る段階；
(c) 容器内部の混合試料を回転させ、それによって該容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を該容器表面で発生させる段階；
(d) 付着した該血小板の、前記表面における血小板媒介性血栓形成を測定する段階；
を含み、
それによって、付着した血小板の該表面における有意に異常なフィブリン塊形成により、該対象が凝固因子機能障害を有することが示される方法。
【請求項３】
血液試料が全血であるか、または健常対象から採取された全血試料と任意に混合した血漿試料である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
血栓形成が、血栓による容器の表面被覆率(SC)および血栓の平均サイズ(AS)から選択されるパラメータの測定により決定される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
血栓形成が有意に減少していることにより、凝固因子の欠乏または自己免疫障害が示される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
血栓形成が有意に増加していることにより、凝固阻害因子または凝固阻害因子の活性化因子の欠乏が示される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
凝固障害を有する対象における凝固エフェクター機能障害を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
(a) 該対象から血液試料を採取し、血栓形成を阻害するのに有効な量の抗凝固剤を血液試料に任意に添加する段階；
(b) 容器中の試料を、血栓形成を惹起するのに有効な微量の開始剤と混合して、混合試料を得る段階；
(c) 凝固因子、活性化凝固阻害因子、凝固阻害因子の成分、または凝固阻害因子の活性化因子の1つである、欠乏していることが疑われる凝固エフェクターの、血小板媒介性フィブリン塊形成に影響するのに十分な量を該混合試料に添加して、処理試料を得る段階；
(d) 容器内部の該処理試料を回転させ、それにより該容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を該容器表面で発生させる段階；
(e) 付着した該血小板の、前記表面における血小板媒介性フィブリン塊形成を測定する段階。
【請求項８】
血液試料が全血であるか、または健常対象から採取された全血試料と任意に混合した血漿試料である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
フィブリン塊形成が、血栓による容器の表面被覆率および血栓の平均サイズから選択されるパラメータの測定により決定される、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
凝固エフェクターが凝固因子である、血小板媒介性フィブリン塊形成の増加を測定する段階を含む方法であって、
（i） 参照試料(添加した因子を欠いている)と比較して前記表面で形成されたフィブリン塊が有意に増加していることにより、前記障害が該凝固因子の欠乏に関連していることが示される；
（ii） 参照試料と比較して前記表面で形成されたフィブリン塊が有意に増加していないことにより、前記障害が別の凝固因子の欠乏に関連していることが示される、
請求項7記載の方法。
【請求項１１】
第II因子、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、第XIII因子から選択される凝固因子の欠乏を同定するための、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
凝固因子の滴定曲線を確立するために、漸増濃度で該因子を添加する複数の容器を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
凝固エフェクターが活性化凝固阻害因子、凝固阻害因子の成分、または凝固阻害因子の活性化因子である、血小板媒介性フィブリン塊形成の減少を測定する段階を含む方法であって、参照試料と比較して前記表面で形成された血栓が有意に減少していないことにより、前記障害が該エフェクターに対する異常な応答に関連していることが示される、請求項7記載の方法。
【請求項１４】
凝固エフェクターがプロテインC、プロテインS、またはアンチトロンビンIIIから選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
抗血栓剤の血中濃度をモニターする方法であって、以下の段階を含む方法：
(a) 対象から血液試料を採取する段階；
(b) 漸増量の薬物対抗試薬（drug-counter reagent）で容器中の該試料を滴定する段階；
(c) 該容器中の滴定試料を回転させ、それにより該容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(d) 薬物対抗試薬の濃度の関数として血栓形成に関連したパラメータを規定する、該薬物対抗試薬の滴定曲線を決定する段階；
(e) 該滴定曲線から該抗血栓剤の血中濃度を決定する段階。
【請求項１６】
クマジン、ヘパリン、またはヒルジンから選択される抗血栓剤の血中濃度をモニターするための、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
薬物対抗試薬が第VIIa因子、第Xa因子、またはトロンビンから選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
血液試料が全血であるか、または健常対象から採取された全血試料と任意に混合した血漿試料である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
血栓形成が、血栓による容器の表面被覆率および血栓の平均サイズから選択されるパラメータの測定により決定される、請求項15記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血栓症および止血、より具体的には凝固障害を診断および治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
創傷が生じると、失血を最小限に抑えるために、止血反応と呼ばれるいくつかの変化が起こる。最初に、血管が創傷部位を通過する血流を遅らせる。次に、血液中を循環する血小板が創傷部位に収集され、血栓を形成する。最後に、フィブリン塊を形成するために協調して働く複数のタンパク質(凝固因子と称される)の作用に基づく第二の系(凝固カスケード)が活性化される。これら2つの系(「一次止血」および「二次止血」という用語でも知られる)が協調して働き、血栓を形成する。いずれかの系に障害が起こると、過度のまたは不足した凝固をもたらす状態が生じ得る。
【０００３】
血小板は3つの主要な機能を果たす。血管に破損が生じた場合、通常は血流と直接接していない物質が露出する。これらの物質(主にコラーゲンおよび固定化フォンウィルブランド因子)により、血小板が損傷表面に付着できるようになる(第1機能)。血小板が表面に付着すると、血小板は、さらなる血小板を損傷部位に誘引する化学物質を放出するが、これは血小板凝集と称される(第2機能)。これら2つの過程が、出血を停止するための一次反応である。血小板凝集塊は次いで、凝固カスケードの過程の支持体として機能する(第3機能)。タンパク質に基づく系(凝固カスケード)は、形成された血栓を安定化し、さらに創傷を閉じる役割を果たす。
【０００４】
凝固カスケード(「二次止血」)の目的は、血小板凝集塊内にフィブリン網を形成して、血栓を安定化することにある。凝固因子はすべて、不活性型および活性型を有する。ひとたび活性化されると、因子はフィブリンが形成されるまで、順序内の次の因子を活性化するように働く。
【０００５】
血栓を形成するために必要な凝固カスケード内の多くの反応が記載されている[Hematology- basic principles and practice, editors: Hoffman R, Benz EJ, Shattil SJ, Furie B, Cohen HJ, Silberstein LE Churchill Livingstone 1995, P-1569]（非特許文献1）。
【０００６】
凝固カスケードは、フィブリン(F)塊の形成をもたらす一連の酵素反応である[Platelets, Editor Michelson AD, Academic Press 2002, P- 230]（非特許文献2）。生理的カスケードは、血管損傷部位においてまたは血液細胞(内皮細胞、単球など)の活性化時に、組織因子(TF)の露出により外因性経路において惹起される。組織因子は第FVII因子と複合体を形成し、これをその活性型(FVIIa)に変換する。この複合体は次いで、「外因性テナーゼ」として知られる複合体を形成することにより第X因子(FX)を、および第IX因子(FIX)を活性化し得る。これらの活性化因子(FIXaおよびFXa)は次いで、内因性(FIXa)および共通(FXa)経路において酵素的カスケードを継続する。第Xa因子は、カルシウムの存在下でプロトロンビン(PT)、活性化第V因子(FVa)、およびリン脂質(活性化血小板由来)と複合体を形成し(この複合体は「プロトロンビナーゼ」と命名されている)、プロトロンビンのトロンビン(T)への活性化を引き起こす。トロンビンは凝固カスケード内の中心的存在であり、以下の段階を含む多くの段階を促進する：a) フィブリノーゲン(F)をフィブリン単量体に切断し、次いでこれが自発的にポリマーを形成する段階、b) フィブリンポリマーを架橋する第XIII因子を活性化して、不溶性のフィブリン塊を形成する段階、c) 第FXI因子、第FVIII因子、および第FV因子を活性化することにより、正のフィードバックループにおいて内因性カスケードを促進する段階、ならびにd) 血小板を活性化する段階。
【０００７】
内因性経路は第XI因子(FXI)を活性化することにより惹起され、これはFIXの活性化を引き起こし、この因子は次にカルシウムの存在下でFX、第VIIIa因子(FVIIIa)、およびリン脂質と複合体(「内因性テナーゼ複合体」として知られる)を形成する。この複合体は第X因子(FXa)の活性化を引き起こし、これは次にプロトロンビナーゼ段階(共通経路)へと反応を継続する。
【０００８】
凝固カスケードは、反応の異なる段階を阻害する天然の抗凝固因子によって調節を受ける。このように、アンチトロンビンIII(ATIII)は、主にトロンビンおよび第Xa因子を、それらの酵素機能を妨げる複合体を形成することによって阻害する。この効果はヘパリンによって媒介され、ヘパリンはATIIIを活性化し2つのタンパク質を会合して、より優れた抗凝固効果を可能にする。
【０００９】
別の抗凝固経路にはプロテインC(PC)およびプロテインS(PS)が含まれ、これらは協同して第V因子および第VIII因子を切断し、それによってテナーゼ段階およびプロトロンビナーゼ段階を阻害し得る。
【００１０】
活性化血小板は負に荷電したリン脂質をその表面上に発現し、凝固因子の会合を可能にしてこれらの複合体の形成を引き起こす。これらの複合体(内因性および外因性テナーゼ、ならびにプロトロンビナーゼ)が形成されることにより、血小板膜上の密接に会合した凝固因子の相互作用が増強され、凝固反応の速度が顕著に増加する。したがって、生理的血栓形成は主に、損傷した血管壁部位に最初に付着および凝集する活性化血小板の表面上で起こる。
【００１１】
血栓形成に関与する種々の因子は、血栓形成を促進する因子と血栓形成を阻止する因子に分類され得る。
【００１２】
血液凝固障害は、血小板障害に関連した障害と凝固カスケード障害に関連した障害に分類され得る。凝固系が適切に血栓を形成し得ない場合には、結果として出血性疾患(血友病)となる；凝固系が血栓を容易に形成しすぎる場合には、結果として過剰の血栓が形成される(栓友病)。
【００１３】
血小板障害は、血小板が少なすぎる場合、血小板が多すぎる場合、または正常に機能しない血小板が正常数存在する場合に起こる。血小板が少なすぎるか、または良好に機能しない血小板を有する(例えば、アスピリン使用)場合には、出血傾向を招き得る。同様に、血小板が多すぎる場合には、過度に凝固する傾向を生じ得る。
【００１４】
凝固カスケードもまた、血栓形成不能(血友病)および血栓形成能力過剰(栓友病)を引き起こす可能性を有する。凝固因子のレベルが減少した場合に、出血状態が起こる。2つの原発性疾患、血友病Aおよび血友病Bが存在する。血友病Aは低レベルの第VIII因子に起因し、血友病Bは低レベルの第IX因子に起因する。実質的にいずれの因子(第XII因子を除く)が低レベルであっても、血栓を形成し得なくなり；そのため過度の出血を招く。
【００１５】
血友病以外の遺伝性出血性疾患は、他の特定の凝固因子の欠乏または欠損に起因して起こり得る。そのような疾患は、特定の実験室試験によって診断され、因子置換によって処置される。
【００１６】
第V因子、第VII因子、第X因子、および第XIII因子などの他の因子の欠乏は血友病よりも稀であるが、同様の症状を生じる。第XI因子の欠乏はアシュケナージ系ユダヤ人によく見られる出血性疾患であり、彼らの約10%が罹患している。診断は、出血症状の検出、家族歴、および実験室試験に基づく。治療は通常、輸血、特に欠損している凝固因子の置換、デスモプレシン(DDAVP)などの薬物療法、ならびにε-アミノカプロン酸(アミカール(Amicar))およびトラネキサム酸(TA)などの抗線溶薬物療法を含む。
【００１７】
遺伝性フォンウィルブランド病は、血小板機能およびフィブリン塊形成に必要なフォンウィルブランド因子(vWf)を損なう遺伝性出血性疾患である。フォンウィルブランド病では、vWfを産生する身体能力に欠陥がある。これにより、鼻、子宮、膀胱、および直腸などの体腔の粘膜から過度の出血が起こる。
【００１８】
別の凝固障害は異常フィブリノーゲン血症である。フィブリノーゲンは、最終的に主要な血液凝固タンパク質であるフィブリンになる分子である。フィブリノーゲンは肝臓および骨髄で産生されて、血中に放出され、最終的にフィブリンになる。異常フィブリノーゲン血症は、フィブリノーゲン産生における遺伝的問題によって生じる。異常なフィブリノーゲンが産生され、これが一部の個体において凝固問題をもたらす。
【００１９】
米国特許第5,523,238号（特許文献1）は、一次止血における血小板機能を測定するための方法および機器について記載している。その方法は、全血試料または血液の血小板含有画分(任意に抗凝固剤と混合する)を取得する段階、ならびに表面への血小板の付着および凝集を誘導し得る物質で内部表面が被覆された平底を有する容器に試料を導入する段階を含む。剪断力が容器の表面で発生するように、容器内部の混合物を回転させる。次いで、一次止血に関連するパラメータを測定する。そのようなパラメータには、とりわけ付着した血小板の量、凝集物のサイズ、凝集物の形態、凝集物により被覆された総面積、および付着した血小板または凝集物のサイズ分布が含まれる。
【００２０】
【特許文献１】米国特許第5,523,238号
【非特許文献１】Hematology- basic principles and practice, editors: Hoffman R, Benz EJ, Shattil SJ, Furie B, Cohen HJ, Silberstein LE Churchill Livingstone 1995, P-1569
【非特許文献２】Platelets, Editor Michelson AD, Academic Press 2002, P- 230
【発明の開示】
【００２１】
発明の概要
第1の局面に従って、本発明は、以下の段階を含む、血液試料中の血小板媒介性血栓形成を測定する方法を提供する：
(a) 血栓形成を阻害するのに有効な量の抗凝固剤を血液試料に添加する段階；
(b) 容器中の試料を、凝固を惹起するのに有効な微量の開始剤と混合して、混合試料を得る段階；
(c) 容器内部の混合試料を回転させ、それによって容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(d) 付着した血小板の、前記表面における血栓形成を測定する段階。
【００２２】
この局面に従って、本発明は、凝固因子機能障害を有する対象における凝固障害を決定するために適用することができ、その方法は以下の段階：
(a) 対象から被験血液試料を採取し、血栓形成を阻害するのに有効な量の抗凝固剤を血液試料に任意に添加する段階；
(b) 容器中の試料を、凝固を惹起するのに有効な微量の開始剤と混合して、混合試料を得る段階；
(c) 容器内部の混合試料を回転させ、それによって容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(d) 付着した血小板の、前記表面に関連する血栓形成を測定する段階
を含み、
それによって、付着した血小板の、前記表面における有意に異常なフィブリン塊形成により、対象が凝固因子機能障害を有することが示される。
【００２３】
第2の局面に従って、本発明は、凝固障害を有する対象における凝固エフェクター機能障害を同定する方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：
(a) 対象から血液試料を採取し、血栓形成を阻害するのに十分な量の抗凝固剤を試料に任意に添加する段階；
(b) 容器内で試料を、血栓形成を惹起するのに有効な微量の開始剤と混合して、混合試料を得る段階；
(c) 試料中に欠乏していることが疑われる凝固因子、活性化凝固阻害因子、凝固阻害因子の成分、および凝固阻害因子の活性化因子から選択される凝固エフェクターの、血小板媒介性フィブリン塊形成に影響するのに十分な量を混合試料に添加して、処理試料を得る段階；
(d) 容器内部の処理試料を回転させ、それにより容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(e) 付着した血小板の、前記表面における血小板媒介性フィブリン塊形成を測定する段階。
【００２４】
この局面によると、凝固エフェクターが凝固因子である場合、本方法は血小板媒介性フィブリン塊形成の増加を測定する段階を含み：
（i） 参照試料(添加した因子を欠いている)と比較して前記表面で形成されたフィブリン塊が有意に増加していることにより、前記障害がそのような凝固因子の欠乏に関連していることが示される；
（ii） 参照試料と比較して前記表面で形成されたフィブリン塊が有意に増加していないことにより、前記障害が別の凝固因子の欠乏に関連していることが示される。
【００２５】
この局面によると、凝固エフェクターが活性化凝固阻害因子、凝固阻害因子の成分、または凝固阻害因子の活性化因子である場合、本方法は血小板媒介性フィブリン塊形成の減少を測定する段階を含み、
参照試料(上記の添加した因子を欠いている)と比較して表面で形成された血栓が有意に減少していないことにより、障害がそのようなエフェクターに対する異常な応答に関連していることが示される。
【００２６】
さらなる別の局面に従って、本発明は、抗血栓剤の血中濃度をモニターする方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：
(a) 対象から血液試料を採取する段階；
(b) 漸増量の薬物対抗試薬（drug-counter reagent）で容器中の試料を滴定する段階；
(c) 容器中の滴定試料を回転させ、それにより容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(d) 薬物対抗試薬の濃度の関数として血栓形成に関連したパラメータを規定する、薬物対抗試薬の滴定曲線を決定する段階；
(e) 滴定曲線から抗血栓剤の血中濃度を決定する段階。
【００２７】
第5の局面に従って、本発明は、凝固障害(凝固因子欠乏)を有する対象の凝固因子による治療を設計する方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：
(a) 対象から血液試料を採取する段階；
(b) 容器内で、漸増濃度の凝固因子を用いて試料を滴定する段階；
(c) 容器中の滴定試料を回転させ、それにより容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(d) 凝固因子の濃度の関数として血栓形成に関連したパラメータを規定する、凝固因子の滴定曲線を決定する段階；
(e) 滴定曲線に基づいて対象の治療を設計する段階。
【００２８】
発明の詳細な説明
1つの態様に従って、本発明の方法は、コーンおよび血小板分析計(Cone and Platelet Analyzer：CPA)の使用により実行される。1つのそのような分析計の構造は、WO02/071037に記載されている。一般に、CPAは、円筒型容器および底部が逆円錐型をした回転要素を含むコーンプレート装置を有する機器を含む。容器の底面は、細胞外基質(ECM)によって被覆され得る。
【００２９】
本発明は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,523,238号に記載されているコーンおよびプレート(血小板)分析計(Cone and Plate(let) Analyzer：CPA)に基づく。一般に、CPAは、円筒型容器および底部が逆円錐型をした回転要素を含むコーンプレート装置を有する機器を含む。図9は、本発明に従って用いられ得る機器の略図である。機器は、ポリスチレン円筒型容器11および逆円錐型をした底部13を有する回転要素12を含むコーンプレート装置10を含む。回転要素12は内部に磁気棒14を保持する。要素12の上部15はストッパー16の内部に保持され、これにより要素12は、ポリスチレン製であるかまたは(例えば)細胞外基質(ECM)18によって被覆されている容器11の内部でストッパーから懸垂される。装置10は、磁気撹拌機19上に設置されている。
【００３０】
ECMは、通常ウシまたはヒト源から得られた角膜または血管内皮細胞などの内皮細胞により産生される基質である。ECMは、細胞を容器内部で培養し、次いでECMの産生後に細胞を除去することによって生成され得る[Gospodarowicz D., et al., Endocr. Rev., 1:201-207 (1980)]。さらに、ECMを使用するのではなく、表面を、一次止血を誘導し得る種々のその成分または人工的に生成された類似体、例えば、基底膜基質[例えば、MATRIGEL(商標)、Flow Laboratories Inc.、米国；Kleinman H., et al.,  Biochemistry, 25:312-318 (1986)]、種々の型の線維性および非線維性コラーゲン、フォンウィルブランド因子(VWF)、フィブロネクチン(Fib)などで被覆してもよい。または、ポリスチレンも魅力的な表面として機能することができ、この表面にVWFおよびFibのような血漿タンパク質が付着して、次いでこれらが血小板が付着する表面を提供する[Savion. N. et al. Brit. J. Hematol., 112:1055-1061 (2001)]。
【００３１】
米国特許第5,523,238号に記載される機器が、例えば凝固機能不全に起因する凝固障害を管理するために使用され得ることが現在認められている。上記で使用した「管理する」という用語は、血小板媒介性凝固疾患/障害の影響を受けやすい対象におけるそのような疾患/障害の検出ばかりでなく、その状態の原因の同定および凝固疾患/障害に特異的な薬物による対象の治療をモニターすることを示す。
【００３２】
したがって第1の局面により、本発明は、以下の段階を含む、血液試料中の血小板媒介性血栓形成を測定する方法を提供する：
(a) 血液試料を採取し、血栓形成を阻害するのに有効な量の抗凝固剤を血液試料に添加する段階；
(b) 容器中の試料を、凝固を惹起するのに有効な微量の開始剤と混合して、混合試料を得る段階；
(c) 容器内部の混合試料を回転させ、それによって容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(d) 付着した血小板の、前記表面における血栓形成を測定する段階。
【００３３】
本発明の1つの特定の態様に従って、凝固因子機能障害を有する対象における凝固障害を決定する方法であって、以下の段階：
(a) 対象から血液試料を採取し、血栓形成を阻害するのに十分な量の抗凝固剤を血液試料に任意に添加する段階；
(b) 容器中の試料を、凝固を惹起するのに有効な微量の開始剤と混合して、混合試料を得る段階；
(c) 容器内部の混合試料を回転させ、それによって容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(d) 付着した血小板の、前記表面における血栓形成を測定する段階
を含み、
それによって、付着した血小板の、前記表面における有意に異常なフィブリン塊形成により、対象が凝固因子機能障害を有することが示される方法を提供する。
【００３４】
本方法により、血液試料中の因子の濃度を決定することも可能になる。これに応じて、漸増濃度で凝固因子を添加する複数の容器を使用し、それによって滴定曲線を得る。健常対象による結果と比較することにより滴定曲線から、薬物中の因子の濃度を決定することができる。
【００３５】
本明細書において上記および下記で使用する「異常なフィブリン塊形成」という用語は、典型的に健常対象由来の試料から決定された凝固の参照(標準)値と比較した場合の低凝固、過凝固、および統計的に有意な血栓が全く形成されない状態を含む。
【００３６】
本明細書において上記および下記で使用する「統計的に有意な」という用語、または手短に「有意な」という用語は、当業者に公知の考慮および有意性試験によって決定される。有意性試験は、観察された値が規定値または仮定値(本明細書では「標準参照値」と称する)と十分に異なるかどうかを決定するために行われる。結果の有意性はp値とも称される。本発明に従って、異常な血栓形成は標準値との0.05未満のp値(p＜0.05)と定義する。
【００３７】
血栓が形成されるのに必要な時間の測定に基づく、凝固障害を決定するために通常行われる方法に反して、本発明は、そのサイズ、表面被覆率などの血栓自体のパラメータに基づき、その形成時間に依存しない。
【００３８】
被験血液試料は好ましくは、全血試料、すなわちその細胞成分およびタンパク質成分をすべて含む血液、または健常対象である、すなわち凝固障害を有さないドナーの自身の血漿を除去した血液に添加した患者の血漿である。
【００３９】
試料は任意に、止血機構の影響を中和するために添加される抗凝固剤と混合する。したがって、その量は凝固を阻害するのに十分であるべきであり、標準的に実施するものである。例えば、この目的には、一般的に使用される抗凝固剤であるクエン酸ナトリウムが0.32%〜0.38%の濃度で提供される。しかし、本発明の方法が血液採取後直ちに行われる場合には、抗凝固剤の使用が回避され得ることが当業者に理解されるべきである。
【００４０】
この局面によると、血栓形成を惹起するために、開始剤を容器内部の試料に添加する。凝固開始剤は当技術分野において公知であり、例えばトロンビン、第Xa因子、aPTT試薬、PT-フィブリノーゲン試薬、CaCl2から選択され得る。「微量の」開始剤は、当業者に公知の考慮により決定される。例えば、第Xa因子を使用する場合、凝固を惹起することが判明している濃度は1.0 X 10-3単位/mlである。
【００４１】
この段階で、米国特許第5,523,238号に記載されているように発生させた剪断力下において、試料を容器内部で回転させる。容器内部の液体の回転、故に剪断力は、多くの手段によって誘導することができる。例えば、剪断力は容器の回転により生じ、この場合、容器は好ましくは円筒型である。または、容器は固定されてもよく、液体の回転は容器内部の回転要素により生じる。回転要素は円筒型であってよい。このような場合、容器内部で作用する剪断力は、容器の中央から周辺に向かって徐々に増加する。または、回転要素は逆円錐型を有する。
【００４２】
回転要素は、多くの手段により、例えば回転モーターに機械的に直接結合することにより、または外部の磁気駆動手段(例えば、磁気撹拌機)に磁気的に結合する手段により駆動され得る。
【００４３】
本発明の1つの態様によれば、血液試料を容器内に設置した後、血液を例えば50〜3000秒-1の範囲、好ましくは100〜2000秒-1の範囲であり得る剪断力で、10秒〜10分間、例えば約2分間回転させる。
【００４４】
剪断力により、容器表面における血小板の付着が可能になる。血小板が表面に付着しない場合、アッセイを行う医師は、凝固障害が血小板機能障害に起因すると結論づけ得る。したがって、異常な血小板媒介性血栓形成を測定するために、本発明の方法は血小板が表面に付着することを条件とする。
【００４５】
容器表面上への血小板の付着およびフィブリン塊の形成は、適切な染色後に光学顕微鏡を使用する光学的検査、光吸収または光透過率の変化の測定など、それ自体公知である多くの手段にいずれかにより測定される。この測定はまた、種々の画像解析システム(IAS)を使用する画像解析を含み得る。可視化する前に試料を含む容器を洗浄してもよく、形成されたフィブリン塊を、メイ・グルンワルド(May-Gruenwald)染色液または抗フィブリン抗体に結合した特異的免疫-(プラスチック)ビーズなどのフィブリン色素で染色する。
【００４６】
血栓形成の程度は、定量的または定性的に測定することができる。定量的評価の場合、血栓形成の測定はやはり、系に組み込まれている画像解析システムを使用し得る。画像解析システムを使用することにより、血小板媒介性血栓形成の程度を反映する種々のパラメータが測定され得る。そのようなパラメータには、これらに限定されないが、血栓によって被覆される総面積の割合(表面被覆率、SC%)、観察される血栓の平均サイズ(平均サイズ、AS)、血栓の表面被覆率および平均サイズのそれぞれが含まれる。これらのパラメータを使用して、特定の薬物に対する応答−非応答を示すことができる。これらのパラメータにより、参照ウェルを使用することによって特定の凝固因子のレベルも測定され得る。
【００４７】
凝固の程度を、(血栓形成の標準レベルを規定する)標準参照値と比較する。参照値は、健常対象由来の血液試料を用いることにより規定され得る。凝固の程度が参照値よりも有意に低い場合、対象は凝固因子が欠乏していることが疑われる。凝固の程度が参照値よりも有意に高い場合、対象は過凝固状態であることが疑われる。有意に高い血栓形成および有意に低い血栓形成はいずれも、「異常な血栓形成」という用語によりまとめて規定される。
【００４８】
統計的に有意である異常な血小板媒介性血栓が認められたならば、本方法は、異常な状態の原因を定性的または定量的に決定することにより完了し得る。
【００４９】
したがって第2の局面により、本発明は、凝固障害を有する対象における凝固エフェクター機能障害を同定する方法を提供する。「凝固エフェクター」という用語は、凝固因子および凝固阻害因子の両方を指し、これには、その欠乏が血小板媒介性フィブリン塊の形成に影響し得る活性化凝固因子/阻害因子、凝固因子または阻害因子の成分、および凝固因子または阻害因子の活性化因子、ならびに凝固カスケードに関与することが当技術分野において公知である任意の他の物質が含まれる。
【００５０】
1つの態様によれば、凝固エフェクターは凝固因子であり、上記方法は凝固因子欠乏(本発明の上記方法において統計的に低度の血栓形成により認められる)を同定するためのものである。この態様に従って、本方法は以下の段階を含む：
(a) 対象から血液試料を採取し、血栓形成を阻害するのに十分な量の抗凝固剤を血液試料に任意に添加する段階；
(b) 容器中の試料を、血栓形成を惹起するのに有効な微量の開始剤と混合して、混合試料を得る段階；
(c) 試料中に欠乏していることが疑われる凝固因子の、血小板媒介性フィブリン塊形成を達成するのに十分な量を混合試料に添加して、処理試料を得る段階；
(d) 容器内部の処理試料を回転させ、それにより容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(e) 付着した血小板の、前記表面における血小板媒介性フィブリン塊形成を測定する段階であって、
（i） 参照試料と比較して前記表面で形成されたフィブリン塊が有意に増加していることにより、前記障害がそのような凝固因子の欠乏に関連していることが示される；
（ii） 参照試料と比較して前記表面で形成されたフィブリン塊が有意に増加していないことにより、前記障害が別の凝固因子の欠乏に関連していることが示される段階。
【００５１】
実質的な凝固が認められない場合には、本発明の方法を段階(c)において別の凝固因子を使用して繰り返す。
【００５２】
試料に添加する、すなわちその欠乏を決定しようとする凝固因子は、当業者が入手可能である考慮すべき事項により選択される。例えば、試験する第1の因子は、最初の結果(例えば、上記の測定方法による)に基づいて選択され得る。または、試験する因子は、疾患/障害の症状、対象の種族的出身(場合により特定の欠乏と相関する)、および他の要因に基づいて示唆され得る。例えば、凝固機能障害を有するアシュケナージ系ユダヤ人は、第XI因子(FXI)について試験される。
【００５３】
その欠乏が本発明の方法によって測定され得る凝固因子の非限定的な例には、第VIII因子および第IX因子(血友病に関連している)、血友病よりも稀であるが同様の症状を生じる第V因子、第VII因子、第X因子、および第II因子、ならびに第XI因子が含まれる。
【００５４】
試験した因子がいずれも血小板媒介性血栓形成を誘導し得ない場合、凝固因子に対する阻害因子は、凝固障害(後天性自己免疫疾患と関連した凝固障害における抗体など)、または阻害系の構成要素(すなわち、プロテインC系またはその成分)の欠乏/機能障害である場合が疑われる。そのような阻害因子を同定するためには、混合試験を実施する。具体的には、患者の血漿試料をドナーの血漿除去血液と混合し、上記のアッセイを繰り返す。血栓形成が阻害される場合、患者の血漿はそのような阻害抗体を含むと結論づけられる。
【００５５】
本発明の方法は、プロテインC、プロテインS、アンチトロンビンIII、またはプロテインC系の成分などの、天然の凝固阻害因子の機能障害に関連した障害の決定を提供する。
【００５６】
したがって第3の局面により、本発明は、過凝固障害を有する対象における、活性化凝固阻害因子もしくはその成分または凝固阻害因子の活性化因子の1つである凝固エフェクターの機能障害を決定する方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：
(a) 対象から血液試料を採取し、血栓形成を阻害するのに十分な量の抗凝固剤を試料に添加する段階；
(b) 容器中の試料を、血栓形成を惹起するのに有効な量の開始剤；および正常血液試料(すなわち、健常対象由来)に添加した場合に血栓形成を阻害するのに有効な量のエフェクターもしくはその活性化因子または凝固阻害因子基質と混合して、混合試料を得る段階；
(c)容器内部の血液試料を回転させ、それにより容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(d) 付着した血小板の、前記表面における血小板媒介性フィブリン塊形成を測定する段階であって、参照試料と比較して表面で形成された血栓が有意に減少していないことにより、障害がそのようなエフェクターに対する異常な応答に関連していることが示される段階。
【００５７】
「凝固エフェクターに対する異常な応答」という用語は一般に、健常対象由来の全血で得られた参照試料と比較して、正常な血小板媒介性血栓形成を起こさない応答を示す。
【００５８】
選択された活性化阻害因子または活性化因子が、参照値と比較して血栓形成の有意な阻害を起こさない場合には、本発明の方法を、想定される別の阻害因子または阻害因子の活性化因子もしくは基質を用いて繰り返す。
【００５９】
プロテインCの活性化因子の非限定的な例は、プロタック(protac)(プロテインCを活性化するために用いられる毒液)である。本方法の好ましい態様によると、併用される開始剤はCaCl2である。
【００６０】
プロテインC系とは、プロテインC経路としても知られる一連の反応を指す。この経路の重要性は、プロテインCならびに凝固第V因子および第VIII因子などのその基質、第V因子ライデン、プロテインSなどのような経路の要素の欠乏/機能障害、ならびにこれらの要素の組み合わせの欠乏を有する個体における血栓症の発症において認められる。したがって本方法により、第V因子の異常な形態である第V因子ライデン(活性化プロテインCによる分解に抵抗性である第V因子変異)の存在に関与する状態を決定することも可能になる。
【００６１】
1つの特定の態様に従って、以下の段階を含む本発明の方法は、血液試料、好ましくは全血試料中の活性化第X因子(Xa)の阻害を決定する手段を提供する：
(a) 対象から血液試料を採取し、血栓形成を阻害するのに有効な量の抗凝固剤を試料に添加する段階；
(b) 容器中の血液試料を、血栓形成を誘導するのに有効な量(健常対象から得られた参照血液試料により決定される)の第Xa因子と混合する段階；
(c) 容器内部の試料を回転させ、それにより容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(d) 容器表面における血小板媒介性フィブリン塊形成を測定する段階であって、それによって、標準参照値と比較して前記表面における血栓形成が有意に減少していることにより、対象が第Xa因子阻害効果に関連した状態を有することが示される段階。
【００６２】
本態様によれば、標準参照値は、第Xa因子を試料に添加しない第2の血液試料を採取することによって得られ得る。したがって、「正常な」血栓が誘導される。
【００６３】
第4の局面に従って、本発明はまた、クマジン、ヘパリン、抗Xa、ヒルジン、および他の直接トロンビン阻害剤などの抗血栓剤の血中濃度をモニターする方法を提供する。この目的のためには、血液試料を、抗血栓剤の効果を補正するのに必要なそれぞれの試薬で滴定する。本発明のこの局面による試薬は、その活性が対象の血液中の薬物の存在によって影響を受ける、凝固因子または血小板媒介性血栓形成に影響を及ぼす任意の他の薬剤であってよい。以下の方法との関連において、その試薬は「薬物対抗試薬」という用語である。
【００６４】
この局面に従って、本方法は以下の段階を含む：
(a) 対象から血液試料を採取する段階；
(b) 漸増量の薬物対抗試薬で容器中の試料を滴定する段階；
(c) 容器中の滴定試料を回転させ、それにより容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(d) 薬物対抗試薬の濃度の関数として血栓形成に関連したパラメータを規定する、薬物対抗試薬の滴定曲線を決定する段階；
(e) 滴定曲線から抗血栓剤の血中濃度を決定する段階。1つの特定の態様によると、濃度は、血栓のサイズまたは表面被覆率が健常ドナーから得られた血栓の正常なサイズ/被覆率と相関する濃度を選択することによって決定される。
【００６５】
この局面によれば、付着した血小板の、前記表面におけるフィブリン塊の有意な増加が生じる薬物対抗試薬の最小濃度は、標準参照滴定曲線と比較することにより決定される。フィブリン塊の有意な増加(規定のパラメータのいずれか1つを測定することにより決定される)が見られる最小濃度は、対象の血液中の薬物の濃度と相関する。
【００６６】
本発明のこの局面によれば、薬物対抗試薬は、これらに限定されないが、PTT試薬(例えば、ヘパリンの血中レベルをモニターするため)、PT試薬(例えば、クマジンの血中濃度をモニターするため)、第Xa因子(例えば、抗Xa剤の血中レベルをモニターするため)、およびトロンビン(特定のトロンビン阻害剤の血中レベルをモニターするための)、ならびに第VIIa因子であってよい。
【００６７】
さらに本発明はまた、対象における凝固障害の治療を設計するために適用することができ、治療は、対象で欠乏していることが判明している凝固因子の血栓形成を達成するのに有効な量を対象に提供することを含む。
【００６８】
この局面に従って、本方法は以下の段階を含む：
(a) 対象から血液試料を採取する段階；
(b) 漸増濃度の凝固因子で容器中の試料を滴定する段階；
(c) 容器中の滴定試料を回転させ、それにより容器表面における血小板の付着を可能にするのに十分な様式で、かつ血小板の付着を可能にするのに十分な時間、剪断力を容器表面で発生させる段階；
(d) 凝固因子の濃度の関数として血栓形成に関連したパラメータを規定する、凝固因子の滴定曲線を決定する段階；
(e) 滴定曲線に基づいて対象の治療を設計する段階。
【００６９】
本明細書において上記で規定したように、パラメータは血栓の表面被覆率および平均サイズであってよい。
【００７０】
いくつかの特定の実施例の説明
実施例1−第Xa因子媒介性血栓形成
ウシ第Xa因子を0.5% BSAを含有する生理食塩水に溶解し、7 単位/mlの保存液を得た。保存液は、少量分割量で-20℃にて保存した。使用前に、分割量を37℃で融解し、第Xa因子を生理食塩水BSA溶液で1:100に希釈して、0.07 単位/mlを含む溶液を得た。希釈溶液1μlは、7x10-5 単位の第Xa因子を含んだ。
【００７１】
磁気撹拌機に取り付けられたCPAウェルセットの上部キャップ上に、1 M CaCl2溶液1.5μlおよび希釈第Xa因子溶液2μl(1.5x10-5 U)を配置した。対照としては、同様の血液試料に第Xa因子もCaCl2も添加しなかった。
【００７２】
健常対象から採取された全血130μlを含むCPAウェル内に撹拌アッセンブリーを設置し、約750 rpmで直ちに回転を開始した。2分後に回転を停止し、磁石およびキャップをウェルから除去し、ウェルを水道水で洗浄して残存した血液をすべて除去した。洗浄したウェルを生物学的染色液、メイ・グルンワルド染色液で染色し、画像分析器、例えばImpact-R画像解析システム、DiaMed、スイスに接続された顕微鏡を用いて血栓表面被覆率および血栓平均サイズを定性的に測定した。
【００７３】
図1A〜1Dに得られた結果を示す。具体的には、血液試料に第Xa因子もCaCl2も添加しない場合には、付着血小板の典型的な視野が得られ、フィブリン塊の形成は認められない(図1A)。(表示濃度の)第Xa因子およびCaCl2の存在下では、正常なフィブリン塊が形成される(図1B)。
【００７４】
凝固カスケードが血小板媒介性であるかどうかを調べるため、血小板が欠乏した血液を使用した。具体的には、血小板が欠乏した血液をXaおよびCaCl2で処理した(図1C)。しかしながら図1Cに示すように、血栓は形成されなかった。したがって、フィブリン塊形成は付着血小板に依存する、および図1Dの共焦点顕微鏡像によって示されるようにフィブリン塊は活性化血小板の表面上に形成されると結論づけられた。
【００７５】
別のアッセイ法は、血小板被覆表面を作製するために正常血液試料をプレートに供する段階、プレートを洗浄する段階、および血小板被覆プレートに関心対象の血漿試料を添加し、これに凝固開始剤を補充して付着正常血小板上で剪断する段階を含む。この形態の試験は、血小板数が少ない患者由来の血液試料に、および保存血漿試料の試験に適用できる。
【００７６】
実施例2−表面被覆率/血栓サイズと血栓開始剤の濃度との相関関係の決定
このアッセイでは、フィブリン塊形成を促進するトロンビンの漸増濃度を正常血液試料に供した。具体的には、回転円錐ディスクの先端に、図3Aおよび図3Bに表示の点に準じた最終濃度を生じる量のトロンビンを配置した。次いで、クエン酸全血130μLを含有するウェルに円錐ディスクをはめて、720 rpmで2分間回転させ、その後ウェルを洗浄および染色した。フィブリン塊形成を定量的に測定するため、画像解析(Impact-R画像解析システム、DiaMed、スイスを使用)を行った。
【００７７】
被覆された表面の%の観点による血栓の量(SC、%)および染色された血栓の平均サイズ(AS、μm2)を表す、染色されたフィブリン塊の画像解析を行った。
【００７８】
図2Aから、フィブリン塊の平均サイズとトロンビン濃度(国際単位/ml)の間に有意な相関関係(R2＝0.9845)があることが示される。
【００７９】
図2Bから、同様に被覆率とトロンビン濃度の間に有意な相関関係(R2＝0.8748)があることが示される。
【００８０】
実施例3−第VIII因子欠乏を決定するためのaPTT反応の使用
以下のアッセイでは、非希釈aPTT試薬Diacelin(Daimed、スイス)を使用して、血栓形成を惹起した。具体的には、磁気撹拌機に取り付けられたCPAウェルセットの上部キャップ上に、1 M CaCl2 1.6μlおよびDiacelin 3μlを配置した。全血130μlを含むウェル内に撹拌アッセンブリーを設置し、約720 rpmで直ちに回転を開始した。
【００８１】
2.5分後に回転を停止し、磁石およびキャップをウェルから除去し、ウェルを水道水で洗浄して残存した血液をすべて除去した。次いで、洗浄したウェルをメイ・グルンワルド染色液(Sigma)を用いて染色し、画像解析システム(Impact-R)を用いて血栓%表面被覆率および血栓平均サイズを定量的に測定した。
【００８２】
図3Aに、血液にaPTT試薬もCaCl2も添加しなかった場合のアッセイの結果を示す。結果として、単一の吸着血小板および血小板凝集塊のみが示され、フィブリン塊の形成は認められない。画像解析システムを用いて、表面被覆率7.4%および平均血栓サイズ45と測定された。
【００８３】
上記したようにaPTT試薬およびCaCl2を添加した場合には、表面被覆率18.4%および平均血栓サイズ104の広範な血栓形成が認められ、これらの条件下では正常血液において凝固が起こることが示された(図3B)。
【００８４】
上記と同じ条件下であるが血友病患者由来の血液を用いた場合には、aPTT試薬およびCaCl2の存在下において血栓形成は起こらなかった(図3C)。この特定の事例では、表面被覆率6.3%および平均サイズ36と測定された。これらの結果から、FVIIIが欠乏している血友病患者が、下層では正常な血小板付着をなお有することも示される。
【００８５】
さらに、aPTT試薬およびCaCl2の存在下でのアッセイを行う前に、約1 単位/ml(FVIIIの正常レベル)の第VIII因子レベルが得られるように、Hemate-P(第VIII因子濃縮物)を血友病患者の血液に添加すると、正常血漿で得られた凝固と同様の広範の凝固が認められた(図3D)。具体的には、表面被覆率21.3%および血栓平均サイズ74と測定された。
【００８６】
したがって、上記のアッセイによって第VIII因子欠乏を決定することが可能である。同様の様式で、第IX因子、第XI因子(および他の因子)欠乏を決定することもできる(それぞれの因子濃縮物を使用して)。
【００８７】
実施例4−クマジン使用または因子欠乏を実証するためのPT反応の使用
本アッセイでは、PT-フィブリノーゲン試薬(Instrumentation Laboratories)を0.5% BSAを含有する生理食塩水で1：10希釈して、10%溶液を得た。磁気撹拌機に取り付けられたCPAウェルセットの上部キャップ上に、1 M CaCl2 1.6μlおよび希釈PT試薬3.8または4.0μlを添加した。
【００８８】
全血130μlを含むCPAウェル内に撹拌アッセンブリーを設置し、約720 rpmで直ちに回転を開始した。2分後に回転を停止した。次いで、上記の通りにウェルを洗浄および染色し、血栓%表面被覆率および血栓平均サイズを測定した。
【００８９】
図4Aに、試薬もCaCl2も添加しなかった場合の、健常対象由来の全血(INR 1.3、INRは正常血漿試料と被験血漿試料のPT凝固時間の比であり、INR 0.8〜1.3は正常状態を表し、INR＞1.4はクマジンまたは欠損因子、通常FVIIの影響を示す異常を表す)による結果を示す。結果として、単一の吸着血小板および血小板凝集塊のみが示され、フィブリン塊の形成は認められない。
【００９０】
図4Bは、全血にPT試薬およびCaCl2を添加した効果を示しており、結果として、表面被覆率14.3%および血栓平均サイズ115を有してフィブリン塊が広範に形成された。
【００９１】
クマジン治療を受けている患者由来の血液(INR 3.0)に同様の条件を適用した。図4Cから、血栓開始剤およびCaCl2の非存在下では、健常対象由来の全血で得られた結果(図4A)と同様に血栓が形成されないことが示される。クマジン処置患者由来の血液試料にPT試薬を添加した場合にも、血栓形成は認められなかった(図4D)。
【００９２】
上記の結果から、PTに基づくアッセイ法が、ビタミンK依存性凝固因子(II、VII、IX、およびX)の減少に感受性があることが示される。この実験は、ビタミンK依存性凝固因子がすべて減少している(INR＝3.0に関して、それらは25〜40%の範囲である)、クマジン治療を受けている患者由来の血液で実施した。したがってこのアッセイ法はまた、欠損因子のレベルが正常の0〜20%である、第II因子、第VII因子、第IX因子、または第X因子の先天性欠損を有する個体を同定するのにも有用であり得る。
【００９３】
実施例5−第Xa因子血栓形成のヘパリン阻害
以下の実験では、ウシ第Xa因子(Sigma)およびCaCl2を用いて、全血において血栓形成を惹起した。CPAウェルセットの上部キャップ上に、第Xa因子溶液(7x10-3 単位/ml) 2.2μlおよび1 M CaCl2 1.6μlを配置した。全血130μlを含むウェル内に撹拌アッセンブリーを設置し、約720 rpmで直ちに回転を開始した。2分後に回転を停止した。次いで、ウェルを洗浄および染色し、血栓%表面被覆率および血栓平均サイズを測定した。
【００９４】
図5Aは、血栓開始剤を(第Xa因子もCaCl2も)添加しなかった場合の、健常対象由来の全血から得られた像である。結果として、単一の吸着血小板および血小板凝集塊のみが示され、フィブリン塊は認められない。具体的には、表面被覆率は9.8%であり、血栓平均サイズは38であった。同じ条件下で、ヘパリン治療を受けている患者由来の血液(PTT＝130秒、正常26〜34秒)を使用した場合にも、図5Cに示されるように同様の結果が得られた。この特定の事例では、表面被覆率は8.2%であり、血栓平均サイズは24であった。
【００９５】
しかしながら、健常対象由来の血液に第Xa因子およびCaCl2を添加すると、明らかなフィブリン塊が形成され、表面被覆率14.3%および血栓平均サイズ115であった(図5B)。同様のアッセイを、ヘパリンで処置した患者由来の血液に適用した場合には、血栓形成は認められず、表面被覆率3.0%および血栓平均サイズ30であった(図5D)。
【００９６】
上記の結果から、この種のアッセイ法を用いてヘパリン使用を同定できること、およびいずれも特異的ヘパリン阻害剤であるポリブレンまたは硫酸プロタミンの測定量を添加することによって、ヘパリンレベルを測定できることが示される。
【００９７】
同様のアッセイ法でトロンビンを用いて血栓形成を惹起したところ、得られた結果は第Xa因子による結果と類似していた(データは示さず)。
【００９８】
実施例6−全血中の合成特異的第Xa因子阻害剤のレベル
以下の実験では、合成第Xa因子阻害剤のレベルを、阻害剤を既知量の第Xa因子で滴定することにより測定した。磁気撹拌機に取り付けられたCPAウェルセットの上部キャップ上に、第Xa因子(7x10-1 単位/mlを9〜11μlまたは7x10-3 U/mlを2μl)および1 M CaCl2 1.6μlを配置した。全血130μlを含むウェル内に撹拌アッセンブリーを設置し、約720 rpmで直ちに回転を開始した。2分後に回転を停止し、上記の通りにウェルを洗浄および染色した。次いで、血栓表面被覆率および血栓平均サイズを測定した。
【００９９】
図6Aから、全血試料に阻害剤を添加しなかった場合、正常な血小板沈着および凝集が起こり、表面被覆率14%および血栓平均サイズ45であったことが示される。しかしながら、全血試料に第Xa因子(1x10-3 単位/ml)およびCaCl2を添加すると、表面被覆率16%および血栓平均サイズ146の広範な凝固が認められた(図6B)。
【０１００】
経口抗第Xa因子剤(Bayer)投与患者の血液に第Xa因子および1 M CaCl2を添加した場合には、表面被覆率6.6%および血栓平均サイズ23と測定され、凝固は認められなかった(図6C)。
【０１０１】
患者の血液を第Xa因子(4.5x10-1 単位/ml)で処理すると、表面被覆率2.1%および血栓平均サイズ29のごくわずかな凝固が認められた(図6D)。この低い表面被覆率は、使用した開始剤が低濃度であることによって説明することができ、低濃度では実質的な血栓形成を伴わずに血小板活性化のみを(または場合により表面被覆率の減少さえ)招き得る。このことはまた、トロンビンに対する用量反応における表面被覆率を示す図3からも明らかである。表面被覆率はある種のS字型を有し、初期には表面被覆率が減少する傾向にあり、高濃度でこれが克服されることを反映している。
【０１０２】
上記の結果から、患者の血液中の阻害剤の濃度は＞4.4x10-1 抗Xa単位/mlであることが示される。図7Eおよび7Fから、1x10-3 単位/mlの第Xa因子を含む健常対象由来の全血の凝固に相当する患者の血液中の凝固の程度は、5.8x10-1〜6.4x10-1 単位/mlの第Xa因子で起こることが示される。したがって、患者の全血中の第Xa因子阻害剤のレベルは5.8x10-1〜6.4x10-1 抗Xa単位/mlであると結論づけられた。
【０１０３】
上記の結果から、本発明の方法を用いて患者の全血中の合成第Xa因子阻害剤のレベルを測定できること、およびしたがって本発明の方法を用いてこれらの患者における薬物治療をモニターおよび管理できることが示される。
【０１０４】
実施例7−全血中の特異的トロンビン阻害剤のレベルの測定
ヒルジンおよびその類似体のようなトロンビン阻害剤のレベルを、全血試料中のトロンビン阻害剤をトロンビンで滴定することによって測定した。健常対象由来の全血試料に、ヒルジン(Sigma)を5x10-1 抗トロンビン単位/mlのレベルになるように添加した。次いで、ウシトロンビン(Sigma)(5 単位/mlまたは10 単位/ml)を、ヒルジン処理およびヒルジン未処理全血に添加した。トロンビンは、磁気撹拌機に取り付けられたCPAウェルセットの上部キャップ上に配置した。全血130μlを含むウェル内に撹拌アッセンブリーを設置し、約720 rpmで直ちに回転を開始した。2分後に回転を停止した。上記のようにウェルを洗浄および染色し、血栓%表面被覆率および血栓平均サイズを測定した。
【０１０５】
図7Aから、全血にヒルジンもトロンビンも添加しない場合に、正常な血小板沈着および凝集が起こることが示される。ヒルジン(5x10-1 抗トロンビン単位/ml)を含む全血試料も同様の結果を示した(データは示さず)。
【０１０６】
ヒルジンを含む全血にトロンビンを添加した場合、4x10-2 単位/mlのトロンビン濃度を生じると予想される濃度では凝固は認められなかった(図7B)。
【０１０７】
全血にトロンビンを添加した場合、その濃度が1x10-2 単位/mlであるように添加したトロンビン量で凝固が始まった(図7C)。
【０１０８】
添加したトロンビンが6x10-2 単位/mlの濃度である場合、凝固が認められた。
【０１０９】
上記の結果から、全血中のヒルジンは3.5x10-2〜5x10-2 単位/mlのトロンビンを阻害し得ると結論づけられた。これは、全血試料中のヒルジンが5x10-2 抗トロンビン単位/mlのレベルであることと一致する。
【０１１０】
したがって上記の実験から、第Xa因子阻害剤の場合と同様に、凝固を用いて抗トロンビン剤治療をモニターおよび管理できることが実証される。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】本発明の方法および系によって試験した、種々の条件下における血液試料の顕微鏡像である：図1Aは、一次止血の形成を表す、表面上に付着および凝集した血小板の典型的な視野を示す；図1Bは、この特定の態様においては活性化第X因子(第Xa因子)である血栓開始剤の添加に際したフィブリン塊形成を示す；図1Cは、血小板減少血液試料では凝固が起こらないことを示す；図1Dは、付着血小板凝集塊に付随したフィブリン塊の共焦点顕微鏡像を示す。血小板は、モノクローナル抗GPIIb抗体(Dako、デンマーク、クロストルップ)およびその後FITC結合二次抗体で染色した。
【図２】血液試料に添加したトロンビンに対するフィブリン塊形成の用量反応を示す。被験試料へのトロンビンの添加に応答して、平均サイズ(図2A)および表面被覆率(図2B)は、付着血小板に付随するフィブリン塊の結果として増加する。この系の感度は、0.005 IU/mlのトロンビンを添加した際の平均サイズおよび表面被覆率の急増により実証される。
【図３】健常対象由来および血友病患者由来の全血におけるフィブリン塊形成に及ぼすaPTT試薬Diacelin(Diamed)およびCaCl2の効果を示す像である：図3Aは、健常対象由来の血液にaPTT試薬もCaCl2も添加しない場合の結果を示す(SC；図3Bは、健常対象由来の血液にaPTT試薬[DiaCelin(DiaMed、スイス) 2〜4μl/130μl反応量]およびCaCl2(12 mM)を添加する場合の結果を示す；図3Cは、aPTT試薬[DiaCelin(DiaMed、スイス) 2〜4μl/130μl反応量]およびCaCl2(12 mM)で処理した血友病患者由来の血液での結果を示す；図3Dは、aPTT試薬およびCaCl2を添加する前に、約1 U/mlの第VIII因子レベルが得られるように血友病患者の血液にHemate-P(第VIII因子濃縮物)を添加する場合の結果を示す。
【図４】健常対象由来およびクマジン治療を受けている患者由来の全血におけるフィブリン塊形成に及ぼすPT-フィブリノーゲン試薬(Instrumentation Laboratories)およびCaCl2の効果を示す：図4Aは、健常対象由来の血液にPT-フィブリノーゲン試薬およびCaCl2を添加しない場合の結果を示す；図4Bは、健常対象由来の血液にPT-フィブリノーゲン試薬(0.4〜0.5μl/130μl反応量)およびCaCl2(12 mM)を添加する場合の結果を示す；図4Cは、PTフィブリノーゲン試薬およびCaCl2の非存在下における、クマジン治療を受けている患者由来の血液による結果を示す；および図4Dは、図5BのようにPT-フィブリノーゲン試薬およびCaCl2を補充した、クマジン治療を受けている患者由来の血液による結果を示す。
【図５】健常対象およびヘパリン治療を受けている患者における血栓形成に及ぼす第Xa因子およびCaCl2の効果を示す：図5Aは、健常対象由来の血液に第Xa因子もCaCl2も添加しない場合の結果を示す；図5Bは、健常対象由来の血液を第Xa因子(1.5 x 10-4 単位/ml)およびCaCl2(12 mM)で処理する場合の結果を示す；図5Cは、ヘパリン治療を受けている患者の血液(PTT＝130秒、正常範囲26〜34秒)に第Xa因子もCaCl2も添加しない場合の結果を示す；図5Dは、この患者由来の血液に第Xa因子(1.5 x 10-4 単位/ml)およびCaCl2(12 mM)を補充した場合の結果を示す。
【図６】フィブリン塊形成に及ぼす合成第Xa因子阻害剤の影響、および全血試料中のこの阻害剤のレベルを測定するための滴定アッセイを示す：図6Aは、健常対象由来の血液に第Xa因子もCaCl2も添加しなかった場合の結果を示す；図6Bは、この健常対象由来の血液に第Xa因子(1x10-3 単位/ml)およびCaCl2(12 mM)を添加した場合の結果を示す；図6Cは、抗第Xa因子剤を経口投与された患者由来の血液に第Xa因子(1x10-3 単位/ml)およびCaCl2(12 mM)を添加した場合の結果を示す；図6Dは、抗第Xa因子処理血液に、より高濃度の第Xa因子(4.5x10-1 単位/ml)およびCaCl2(12 mM)を添加した場合の結果を示す；図6Eは、抗第Xa因子処理血液に第Xa因子(5.8x10-1 単位/ml)およびCaCl2(12 mM)を添加した場合の結果を示す；図6Fは、抗第Xa因子処理血液に第Xa因子(6.4x10-1 単位/ml)およびCaCl2(12 mM)を添加した場合の結果を示す。
【図７】全血中の、この特定の態様ではヒルジンである特異的トロンビン阻害剤のレベルを測定するための滴定アッセイを示す：図7Aは、健常対象由来の全血にヒルジンもトロンビンも添加しない場合の結果を示す；図7Bは、ヒルジン(5x10-2 抗トロンビン単位/ml)で処理した全血にトロンビン(4x10-2 単位/ml)を添加した場合の結果を示す；図7Cは、ヒルジン(5x10-2 抗トロンビン単位/ml)で処理した全血にトロンビン(1x10-2 単位/ml)を添加した場合の結果を示す；図7Dは、ヒルジン(5x10-2 抗トロンビン単位/ml)で処理した全血にトロンビン(6ｘ10-2 単位/ml)を添加した場合の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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