(57)【要約】  本発明は、上皮成長因子（ＥＧＦ）によって病原性感染症を治療又は予防することに係る。ＥＧＦは、種々の組織又は細胞型において病原体の定着を阻害する能力を有する。病原体定着は病原体感染に必須であるため、ＥＧＦを種々の病原性感染症、特に粘膜表面における病原性感染症の有効な予防及び治療薬剤として使用することが出来る。上皮成長因子を投与することによって動物における体重増加を増大させる方法も記載される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＥＧＦを動物に投与することを含む、動物における体重増加を促進する方法。
【請求項２】
該ＥＧＦが、動物の食餌の中において投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ＥＧＦが、動物の飲用水の中において投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該ＥＧＦが経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１日当り１０から１０，０００μｇ／ｋｇのＥＧＦが、動物に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１日当り１０から１００μｇ／ｋｇのＥＧＦが、動物に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該ＥＧＦが少なくとも９日間投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該動物が成体の動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該動物が動物の新生児ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該動物が若い動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該動物が若年の動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該動物が健康な動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該動物が感染症に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該動物が畜産動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該動物が食品生産動物である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
該動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該ＥＧＦが組換え型ＥＧＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該ＥＧＦが、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、２つのＣ末端アミノ酸の欠失及び５１位における中性アミノ酸置換を有する組換え型修飾ＥＧＦ、ＥＧＦ−Ｘ１６、ＥＧＦ−Ｄ、ＥＧＦ−Ｂ、ＥＧＦ−Ｃ、ＥＧＦ−Ａ、ＨＢ−ＥＧＦ及び上記のいずれかを含む融合タンパク質から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
該ＥＧＦが、天然ＥＧＦ、ＥＧＦ５１ｇｌｎ５１、ＥＧＦ−Ｄ、ＥＧＦ−Ｘ１６、ＴＧＦ及びＨＢ−ＥＧＦから成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
有効量のＥＧＦ活性阻害剤を動物に投与することを含む、肥満症を治療する方法。
【請求項２１】
該阻害剤が、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＥＧＦ活性阻害剤を動物に投与することを含む、有害物質の吸収を防止する方法。
【請求項２３】
該阻害剤が、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該有害物質が毒素である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
有効量の上皮成長因子（ＥＧＦ）を動物に投与することを含む、動物の粘膜表面の病原性感染症を阻害又は治療する方法。
【請求項２６】
該感染症が、細菌感染症、酵母感染症、寄生生物感染症及びウイルス感染症から成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該ＥＧＦが局所投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
該ＥＧＦが組換え型ＥＧＦである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
該ＥＧＦが、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、２つのＣ末端アミノ酸の欠失及び５１位における中性アミノ酸置換を有する組換え型修飾ＥＧＦ、ＥＧＦ−Ｘ１６、ＥＧＦ−Ｄ、ＥＧＦ−Ｂ、ＥＧＦ−Ｃ、ＥＧＦ−Ａ、ＨＢ−ＥＧＦ及び上記のいずれかを含む融合タンパク質から成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
該ＥＧＦが、天然ＥＧＦ、ＥＧＦ５１ｇｌｎ５１、ＥＧＦ−Ｄ、ＥＧＦ−Ｘ１６、ＴＧＦ及びＨＢ−ＥＧＦから成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該粘膜表面が、動物の消化管、呼吸器管、尿生殖路、眼表面、乳腺又は前立腺に位置する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
動物における体重増加を促進させるための、有効量のＥＧＦの使用。
【請求項３３】
肥満症を治療するための、有効量のＥＧＦ活性阻害剤の使用。
【請求項３４】
有害物質の吸収を防止するための、有効量のＥＧＦ活性阻害剤の使用。
【請求項３５】
動物の粘膜表面の病原性感染症を阻害又は治療するための、有効量のＥＧＦの使用。
【請求項３６】
該ＥＧＦが、組換え型ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、２つのＣ末端アミノ酸の欠失及び５１位における中性アミノ酸置換を有する組換え型修飾ＥＧＦ、ＥＧＦ−Ｘ１６、ＥＧＦ−Ｄ、ＥＧＦ−Ｂ、ＥＧＦ−Ｃ、ＥＧＦ−Ａ、ＨＢ−ＥＧＦ、上記のいずれかを含む融合タンパク質、天然ＥＧＦ、ＥＧＦ５１ｇｌｎ５１、ＥＧＦ−Ｘ１６、ＴＧＦ、及びＨＢ−ＥＧＦから成る群から選択される、請求項３２乃至３５のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００４年１２月１０日に提出された１１／００９，４９０に対する優先権を主張するものである。米国については、本出願は、１１／００９，４９０、１０／２８０，１３０及び６０／３３０，６５０に対する優先権を主張するものである。１１／００９，４９０（２００４年１２月１０日提出）は、６０／３３０，６５０（２００１年１０月２６日提出）に対する優先権を主張する１０／２８０，１３０（２００２年１０月２５日提出）の継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、上皮成長因子によって病原性感染症を治療又は予防することに係る。本発明はまた、上皮成長因子を経口投与することによって体重増加を促進させ且つ胃腸管内での病原体の定着を防止する方法に係る。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
粘膜表面は、外部環境に連接する、動物の内部導管の湿潤した内部被覆層であり、例えば消化管全体（口鼻腔から肛門に到るまで）、呼吸器管、尿生殖路、眼表面、乳腺及び前立腺が挙げられる。粘膜表面は、上皮細胞、最も多くは単層円柱上皮又は重層上皮によって被覆され、粘液を分泌する場合が多い。外部環境と接触する場合が多いため、粘膜表面は、特に病原体による感染を受け易い。
【０００４】
病原性感染症は、病原体の接着及び定着から始まるが、その機構は明らかではない。しかしながら、微生物病原体は典型的に、効率的な感染を生起させるためには宿主細胞表面と結合する必要がある。接着及び定着に引き続き、微生物は定着した表面で増殖、及び/又は宿主細胞に侵入する。疾病を惹起するには必ずしも十分ではないが、病原体と宿主とのこの相互作用が、微生物の病原性の決定因子の１つである。従って、病原体の定着を阻害することは、病原性感染症を予防及び/又は治療する効率的な方法となる。
【０００５】
現在のところ、抗生物質は病原体に対して最も広範に使用される抗感染剤である。抗生物質は、細菌の増殖又は複製に対し典型的に有効な阻害剤であり、これによって細菌感染により惹起される疾患の諸症状を迅速に緩和することが出来る。しかしながら、抗生物質の過剰使用によって、多くの細菌が抗生物質に対する耐性を発現しており、使用することが出来る抗生物質の数は劇的に減少している。更に、抗生物質は細菌に対して有効であるが、例えばウイルスなどの他の病原体によって惹起される感染症を治療することは依然として困難である。従って、種々の病原体に対する抗感染症剤に対する要求が残存している。
【０００６】
多くの腸内成長因子が、上皮の成熟及び再生を促進する。これらの内の１つである上皮成長因子（ＥＧＦ）は、唾液及び腸管分泌物並びにその他の体液中に天然に存在しており、初乳及び乳汁中には大量に産生される。ＥＧＦは、ａ）幼少期における腸細胞の増殖及び分化、ｂ）離乳前の腸の機能的成熟、並びにｃ）成人腸管内での上皮増殖、を促進する（Ｗｅａｖｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９０；  ９８：８２８−８３７；Ｏ‘Ｌｏｕｇｈｌｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９８５；２４９：Ｇ６７４−Ｇ６７８；Ｇｏｏｄｌａｄ，  ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ  １９９１；９９４−９９８；Ｗａｌｋｅｒ−Ｓｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  １９８５；ｉｉ：１２３９−１２４０；  Ｈａｒｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９３；２６４：Ｇ３１２−Ｇ３１８）。更には、ＥＧＦは電解質及び栄養素の小腸内吸収を急激に（数分以内に）上方に調節するが、この効果は、同時に起こる腸細胞の頂端微絨毛の延長に関係することが示された（Ｏ’Ｌｏｕｇｈｌｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９４；１０７：８７−９３）。ＥＧＦが持つ潜在的な治療上の便益は、幾つかの研究においてＥＧＦを用いた局所的治療によって創傷治癒が促進されたことで注目されており（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  １９８９；３２１（２）：７６−７９）、また最近では、ＥＧＦの投与によって、大幅な切除手術後に残存する腸における栄養素吸収が増大する旨の観察によって注目されている（Ｐｏｔｈｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｎａｒｄ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １９８８；２２８（１）１１３−１１７）。小腸と比較して、ＥＧＦに対するより多くの受容体が結腸において認められており（Ｂｒａｋｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８４；８１：４６４２−４６４６）、ここは例えば大腸菌などの微生物による感染の際に最も重い細菌負荷が観察される。ＥＧＦは、結腸を含む腸管全体において機能を上方に調節するのである（Ｇｏｏｄｌａｄ，  ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ  １９９１；９９４−９９８；Ｐｏｔｈｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｎａｒｄ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９８８；２２８（１）１１３−１１７）。
【０００７】
ＥＧＦは種々の機能を有する旨報告されているが、病原体の腸内定着の防止、又は体重増加の促進におけるＥＧＦの役割は、これまでに報告されたことがなかった。これら２つの新規に発見されたＥＧＦの特性によって、ＥＧＦは、若い畜産動物における治療剤として極めて有用となる。
【０００８】
ＥＧＦの投与によって、病原体の腸への定着を防止出来ることを証明したばかりでなく、本発明者らはまた、ＥＧＦが動物の体重増加を促進出来ることを示した。後者の効果は、幾つかの報告によってＥＧＦが体重増加には全く効果がないことが示されていただけに、思いがけないことである（Ｂｉｒｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｕｔｒ  １９９４；１２４：２３１−２４０；Ｏｐｌｅｔａ−Ｍａｄｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９１；２６０：Ｇ８０７−Ｇ８１４）。ブタにおけるＥＧＦの効果を検討するその他の研究（Ｊａｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９８７；３９３：５６９−５８２；Ｊａｅｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．  １９９０；５（３）：４７１−４７４）では、腸管内ジサッカリダーゼのレベルが同時に増加したにも拘わらず、成長速度の加速を証明することは出来なかった。
【０００９】
上記において検討したように、ＥＧＦは、諸栄養素の腸管吸収を増加させるのである。他方では、ＥＧＦシグナリングカスケードを阻害することは、諸栄養素の腸管吸収を低減させるのである。しかしながら、胃腸管栄養吸収の調節においてＥＧＦシグナリングカスケードを阻害することの臨床上の利益が評価されることはこれまでになかった。ＥＧＦ受容体又はＥＧＦシグナリングカスケードの拮抗剤を胃腸管用の治療剤として使用することにより、例えば肥満症の治療において、又は有毒もしくは有害物質の腸管吸収を低下させるために、腸管吸収の低下を保障し得ることが予想される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
本発明は、胃腸管用治療剤としての上皮成長因子（ＥＧＦ）の使用、及びＥＧＦの新しい用法に係る。
【００１１】
上皮成長因子（ＥＧＦ）は、胃腸管における病原体定着を阻害することが示されている（米国特許第５，７５３，６２２号）。ＥＧＦが、胃腸管内に大量に存在し且つ胃腸管上で多様な生物学的活性を有することについては、十分に文書化され証明されている。従って、ＥＧＦがかかる胃腸管における病原体の定着に及ぼす阻害効果から、ＥＧＦは胃腸管内において上皮細胞を特異的に認識し且つこれらと相互作用することによって、病原体と上皮細胞との相互作用を妨害する可能性があることが示唆される。驚くべきことに、本発明者らは、ＥＧＦが膀胱及び腎臓を含む他の組織及び器官の型における病原体定着も阻害することが出来ることを見出したのである。本発明者らの知見は従って、ＥＧＦが、広範な組織及び器官の形態、特に尿生殖路における病原性感染症に対する有効な予防剤又は治療剤であることを示す。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明の１つの局面は、動物の尿生殖路の病原性感染症を阻害するか又は治療する方法であって、有効量の上皮成長因子（ＥＧＦ）を当該動物に投与することを含む方法を提供する。特に、当該感染症は、細菌、酵母、寄生生物又はウイルスによる感染であり得る。
【００１３】
本発明の別の局面においては、ＥＧＦは、疾病又は症状の病因学的因子である病原性感染症を治療又は予防するために使用されてもよく、但し病原体は同定されていなくてもよく、及び/又は当該感染症が当該疾病又は病状において無症状であってもよい。具体的には、当該疾病又は症状は、前立腺炎又は膀胱炎である。前立腺炎は、急性の細菌性前立腺炎、慢性の細菌性前立腺炎又は慢性の特発性前立腺炎であってもよい。好ましくは、当該前立腺炎は、（急性又は慢性の）細菌性前立腺炎である。当該膀胱炎は、細菌性膀胱炎又は間質性膀胱炎であってもよく、好ましくは細菌性膀胱炎である。
【００１４】
上皮成長因子は、当技術分野において確立された如何なる方法によっても投与することが出来、好ましくは局所又は全身投与、より好ましくは局所投与することが出来る。上皮成長因子は、天然のＥＧＦとの実質的なアミノ酸配列同一性を有し、同時にＥＧＦの生物学的活性を有するポリペプチドであれば如何なるものでもよく、好ましくは天然のＥＧＦ、ＥＧＦ５１ｇｌｎ５１、ＥＧＦ-Ｄ、ＥＧＦ-Ｘ１６，ＨＢ−ＥＧＦ，ＴＧＦ及びこれらの融合タンパク質から成る群から選択される。
【００１５】
かかる病原性感染症は、無症状又は症候性であってもよい。当該感染症はまた、疾病又は医学的症状に対する二次的なものであってもよい。特に、当該感染症は、創傷後に生起するものであってもよい。病原体感染を受け易い創傷は如何なるものも、本発明において対象として意図される。該創傷は好ましくは、皮膚又は粘膜表面に所在する。特に、該創傷は、火傷、切り傷、穿孔、潰瘍又は裂傷から成る群から選択される。
【００１６】
別の局面において、本発明は、動物において体重増加を増大させる方法を提供する。
【００１７】
更に別の局面において、本発明は、ＥＧＦの活性を阻害する薬剤を動物に投与することを含む、栄養素の腸管吸収を減少させる方法を提供する。かかる方法は、例えば肥満症を治療する場合又は毒素の腸管吸収を低減させる場合など、腸管吸収の低減が要望される状況において有用であり得る。
【００１８】
かかるＥＧＦは好ましくは経口により、例えば動物の食餌において投与される。更には、凍結乾燥したＥＧＦを飲用水に添加したものが安定であることが判明しており、従ってそのように投与することが出来る。
【００１９】
本発明の１つの局面は、有効量のＥＧＦを動物に投与することを含む、動物における体重増加を促進させる方法を提供することである。かかるＥＧＦは、動物の食餌、又は例えば動物の飲用水において投与してもよい。ＥＧＦは、経口的に投与してもよい。１日当り１０から１０，０００μｇ／ｋｇのＥＧＦを動物に投与してもよく、又は１日当り１０から１００μｇ／ｋｇのＥＧＦを動物に投与してもよい。ＥＧＦは少なくとも９日間投与されてもよい。当該動物は、成体動物であってもよい。当該動物は、動物の新生児ではなくてもよい。当該動物は、若い動物、例えば若年の動物であってもよい。当該動物は、健康な動物又は感染症に罹患した動物であってもよい。当該動物は、畜産動物、例えば食料生産動物などであってもよい。当該動物は、ヒトであってもよい。ＥＧＦは、組換え型ＥＧＦであってもよい。ＥＧＦは、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、２つのＣ末端アミノ酸の欠失及び５１位における中性アミノ酸置換を有する組換え型修飾ＥＧＦ、ＥＧＦ−Ｘ１６、ＥＧＦ−Ｄ、ＥＧＦ−Ｂ、ＥＧＦ−Ｃ、ＥＧＦ−Ａ、ＨＢ−ＥＧＦ及び上記のいずれかを含む融合タンパク質から成る群から選択されてもよい。ＥＧＦは、天然ＥＧＦ、ＥＧＦ５１ｇｌｎ５１、ＥＧＦ−Ｄ、ＥＧＦ−Ｘ１６、ＴＧＦ及びＨＢ−ＥＧＦから成る群から選択されてもよい。
【００２０】
本発明の別の局面は、有効量のＥＧＦ活性阻害剤を動物に投与することを含む、肥満症を治療する方法を提供することである。該阻害剤は、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤であってもよい。
【００２１】
本発明の別の局面は、ＥＧＦ活性の阻害剤を動物に投与することを含む、有害物質の吸収を防止する方法を提供することである。該阻害剤は、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤であってもよい。該有害物質は、毒素であってもよい。
【００２２】
本発明の別の局面は、有効量の上皮成長因子（ＥＧＦ）を動物に投与することを含む、動物の粘膜表面の病原性感染症を阻害するか又は治療する方法を提供することである。該感染症は、細菌感染症、酵母感染症、寄生生物感染症及びウイルス感染症から成る群から選択されるものであってもよい。ＥＧＦは局所的に投与されてもよい。ＥＧＦは組換え型ＥＧＦであってもよい。ＥＧＦは、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、２つのＣ末端アミノ酸の欠失及び５１位における中性アミノ酸置換を有する組換え型修飾ＥＧＦ、ＥＧＦ−Ｘ１６、ＥＧＦ−Ｄ、ＥＧＦ−Ｂ、ＥＧＦ−Ｃ、ＥＧＦ−Ａ、ＨＢ−ＥＧＦ及び上記のいずれかを含む融合タンパク質から成る群から選択されるものであってもよい。該ＥＧＦは、天然ＥＧＦ、ＥＧＦ５１ｇｌｎ５１、ＥＧＦ−Ｄ、ＥＧＦ−Ｘ１６、ＴＧＦ及びＨＢ−ＥＧＦから成る群から選択されるものであってもよい。該粘膜表面は、当該動物の消化管、呼吸器管、尿生殖路、眼表面、乳腺又は前立腺に位置していてもよい。
【００２３】
本発明の別の局面は、動物における体重増加を促進するための、有効量のＥＧＦの使用を提供することである。
【００２４】
本発明の別の局面は、肥満症を治療するための、有効量のＥＧＦ活性阻害剤の使用を提供することである。
【００２５】
本発明の別の局面は、有害物質の吸収を防止するための、有効量のＥＧＦ活性阻害剤の使用を提供することである。
【００２６】
本発明の別の局面は、動物の粘膜表面の病原性感染症を阻害又は治療するための、有効量のＥＧＦの使用を提供することである。
【００２７】
ＥＧＦは、組換え型ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、２つのＣ末端アミノ酸の欠失及び５１位における中性アミノ酸置換を有する組換え型修飾ＥＧＦ、ＥＧＦ−Ｘ１６、ＥＧＦ−Ｄ、ＥＧＦ−Ｂ、ＥＧＦ−Ｃ、ＥＧＦ−Ａ、ＨＢ−ＥＧＦ、上記のいずれかを含む融合タンパク質、天然ＥＧＦ、ＥＧＦ５１ｇｌｎ５１、ＥＧＦ−Ｘ１６、ＴＧＦ、及びＨＢ−ＥＧＦから成る群から選択されてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、病原性感染症を上皮成長因子（ＥＧＦ）によって治療又は予防することに係る。ＥＧＦは、胃腸管において病原体定着を阻害することが示されており、この現象は、ＥＧＦが胃腸管内において豊富に存在すること及び多様な生物学的活性を有することと一致する。驚くべきことに、ＥＧＦがまた、膀胱及び腎臓を含む他の組織又は器官においても病原体の定着を阻害出来ることを本発明者らは発見したのである。従って本発明者らの知見によれば、ＥＧＦは、多種類の組織及び器官型における病原性感染症に対して効果的な予防剤又は治療剤であることが示される。
【００２９】
ＥＧＦが病原体による胃腸管内での定着を防止し、動物における体重増加を促進することが示されている。従ってＥＧＦは、例えば牛肉、豚肉及び鶏肉の生産産業などの畜産業において生産量を増加させるために使用することが出来る、極めて有用な薬剤である。加えてＥＧＦ治療は、（クローン病、胃腸感染症、旅行者下痢などの際の）ヒトにおける臨床上の利益を有する可能性がある。ＥＧＦの阻害剤は、腸内における栄養素吸収を低減させ、またかくして肥満症の治療又は毒素の吸収防止において有用である可能性がある。
【００３０】
本発明を更に詳細に説明するに先だって、本願において使用する用語は、別段の指示がない限り以下の通り定義される。
【００３１】
定義
病原性感染症を“阻害又は治療する”とは、感染症発症後に、又は予防的治療として感染の程度を低減させることを意味する。感染の程度は、当業界において確立されたあらゆる方法、例えば当該感染に関連した症状を観察することによって、又は感染部位に存在する病原体を培養して数を算出することによって決定されてもよい。感染の程度は、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２０％、なおより好ましくは少なくとも約３０％、また最も好ましくは少なくとも約５０％減少させられる。
【００３２】
“病原体”とは、動物に感染する能力を有するあらゆる微生物である。病原体の例としては、細菌類、菌類（酵母を含む）、ウイルス及び原生動物の寄生生物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
“病原性感染”は、病原体によってもたらされる感染である。感染とは、病原体が宿主動物体内で増殖し及び/又は病原性産物を生成し、その結果当該感染に関連した諸症状を惹起する状態を示す。かかる病原性産物の例は、細菌によって産生される毒素である。
【００３４】
“粘膜表面”又は“粘膜”は、外部に開放されている体腔、例えば消化管、呼吸器管又は尿生殖路などの内層である。いずれの場合においても、かかる粘膜は、分泌物又は泌尿粘膜の場合は尿に浸漬されている、濡れた又は湿潤した表面である。全ての粘膜は、上皮層の直下に、固有層、すなわち基底膜の深部までの緩い結合組織層が存在して成るものである。粘膜の細胞組成にはばらつきがある。しかしながら、粘膜の大半は、重層扁平上皮又は単層円柱上皮のいずれかを含む。多くの粘膜は粘液を分泌するが、このことは必要要件ではない。消化管及び呼吸器管の粘膜は保護性の潤滑性粘液を大量に分泌するが、泌尿管の粘膜は分泌しない。粘膜の他の例としては、眼表面、乳腺及び前立腺が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３５】
“尿生殖路”は、泌尿器及び生殖器並びに関連付帯する構造、例えば腎臓、尿管、膀胱、尿道、及び男女の生殖構造などを意味する。メスの動物においては、生殖構造としては、卵巣、卵管、子宮、子宮頸及び膣が挙げられる。オスの動物においては、生殖構造としては、精巣、精嚢、輸精管、前立腺及びペニスが挙げられる。
【００３６】
“創傷”とは、物理的手段により惹起された、構造の通常の連続性が破壊に至る身体的傷害である。創傷としては特に、皮膚又は粘膜表面の火傷、切り傷、穿刺創、潰瘍及び裂傷が含まれる。
【００３７】
“有効量”とは、意図された目的を達成するために充分な量である。例えば、特定の大腸菌感染症を阻害又は治療するためのＥＧＦの有効量とは、当該感染症に関連する症候又は大腸菌の数を低減させるために充分な量である。当該有効量は、投与経路、投与されるＥＧＦの形状、治療対象動物、当該病原体の性質及び当該感染症などの要因によって変動する。従って、有効量は、当該業界において確立された方法に従って経験的又は臨床的に決定される必要がある。
【００３８】
“上皮成長因子”、即ちＥＧＦは、（１）天然のＥＧＦと実質的な配列類似性を共有する；及び（２）天然ＥＧＦの生物学的活性を有するポリペプチドである。天然のＥＧＦは、好ましくは哺乳動物のＥＧＦである。例えば、天然のヒトＥＧＦは、主として正常なヒトの唾液腺及び十二指腸において合成される５３アミノ酸ポリペプチドである（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９；米国特許第６，１９１，１０６号）。天然ＥＧＦと“実質的な配列類似性”を有するポリペプチドとは、当該天然ＥＧＦとアミノ酸レべルで少なくとも約３０％同一である。当該ＥＧＦは好ましくは、当該天然ＥＧＦとアミノ酸レべルで少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、また最も好ましくは少なくとも約８０％同一である。天然ＥＧＦとの“パーセント同一”又は“％同一”なる句は、２つの配列を整列した場合に当該ＥＧＦ類似体においても見出される、天然ＥＧＦにおけるアミノ酸配列の百分率をいう。パーセント同一性は、例えばＬＡＬＩＧＮ又はＢＬＡＳＴなどの当業界において確立された任意の方法又はアルゴリズムによって求めることが出来る。
【００３９】
あるポリペプチドが、ＥＧＦ受容体と結合する能力を有するか、又は当該天然ＥＧＦに対して産生されたポリクロナール抗体によって認識されることが可能である場合、“ＥＧＦの生物学的活性”を有するものである。好ましくは、当該ポリペプチドは、受容体結合アッセイにおいてＥＧＦ受容体と特異的に結合する能力を有する。
【００４０】
即ち、“ＥＧＦ”なる用語は、天然ＥＧＦの欠失、挿入又は置換変異体であるＥＧＦ類似体を包含する。ＥＧＦとしては特に、あらゆる動物種の天然ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、又は組換え型修飾ＥＧＦが挙げられる。特定の例としては、以下に限定されることはないが、２つのＣ末端アミノ酸の欠失及び５１位における中性アミノ酸置換を有する組換え型修飾ＥＧＦ（特に、ＥＧＦ５１ｇｌｎ５１；米国特許出願公報第２００２００９８１７８Ａ１号）、１６位におけるＨｉｓ残基が中性又は酸性アミノ酸で置換されたＥＧＦ突然変異タンパク質（ＥＧＦ−Ｘ１６）（米国特許第６，１９１，１０６号）、天然ＥＧＦのアミノ末端残基を欠落したＥＧＦの５２−アミノ酸欠失変異体（ＥＧＦ−Ｄ）、Ｎ末端残基及び２つのＣ末端残基（Ａｒｇ−Ｌｅｕ）が欠失したＥＧＦ欠失変異体（ＥＧＦ−Ｂ）、２１位におけるＭｅｔ残基が酸化されたＥＧＦ−Ｄ（ＥＧＦ−Ｃ）、２１位におけるＭｅｔ残基が酸化されたＥＧＦ−Ｂ（ＥＧＦ−Ａ）、へパリン結合性ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、又は上記の内のいずれかを含む融合タンパク質が挙げられる。かかるＥＧＦはまた、天然ＥＧＦ又はＥＧＦ突然変異タンパク質に付加される付加的なアミノ酸を含んでもよい。例えば、ＥＧＦフラグ誘導体は、Ｎ末端に８アミノ酸“フラグ”配列を有し、その結果抗フラグモノクローナル抗体（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を含むカラムを使用したアフィニティクロマトグラフィーによるペプチドの迅速な精製が可能になる。その他の有用なＥＧＦ類似体又は変異体は、米国特許出願公報第２００２００９８１７８Ａ１号並びに米国特許第６，１９１，１０６号及び第５，５４７，９３５号に記載されている。
【００４１】
“胃腸系”とは、小腸及び大腸全体を含む、胃から大腸までの消化系の部分を意味する。
【００４２】
“無症状の感染症”とは、臨床上の症候を伴わないあらゆる病原体による感染症である。
【００４３】
本明細書において使用される“動物”なる用語は、魚及び哺乳動物など、動物界のすべてのメンバー（畜産動物及びヒトをも含む）を包含することが意図される。
【００４４】
方法
ＥＧＦは、胃腸管の病原性感染症を阻害又は治療するために使用することが出来る（米国特許第５，７５３，６２２号）。実施例１において示すように、ＥＧＦで事前処置したウサギは、ＥＧＦ処置を受けていないウサギにおいて下痢を惹起させた大腸菌を投与しても下痢を発症しなかった。ＥＧＦで事前処置された動物群はまた、未処置群よりも１日早く当該大腸菌を排出し、また処置動物の腸内における大腸菌定着は、ＥＧＦによって有意に低減した。従ってＥＧＦは、腸内の細菌定着を防止し、その結果当該細菌をより早期に除去し、かくして当該動物を細菌感染及び下痢から防御した。
【００４５】
同様の保護効果が、胃潰瘍モデルにおいて観察された。実施例２において示すように、ラットに潰瘍を誘発させて、ＥＧＦを潰瘍保持ラット群に７日後に与えた。対照ラットには、ＥＧＦに代えて同体積の滅菌水を与えた。比較のために、第３群には、２つの広域抗生物質、即ちストレプトマイシン及びペニシリンの組合せを与えた。予期されたとおり、抗生物質処置したラットは、潰瘍部位における細菌定着が有意に少なく、また潰瘍は対照ラットよりも早く治癒した。ＥＧＦ処置ラットにおける細菌定着の程度も低く、抗生物質処置ラットと比肩し得るものであり、ＥＧＦが効果的に細菌の定着を阻害することが判明した。この結果と一致して、ＥＧＦ処置群における潰瘍は、滅菌水のみを与えた対照ラットにおける潰瘍よりも早く治癒した。従ってＥＧＦは、胃腸上皮に対する抗感染活性及び創傷治癒活性を発揮した。
【００４６】
ＥＧＦの抗感染効果は、直接的な細菌増殖阻害を介するものではない。実施例３において示すように、ＥＧＦ存在下で培養した細菌は、ＥＧＦ非存在下の細菌と比肩し得る増殖速度を示した。従ってＥＧＦは、細菌の増殖を直接的に阻害することによって細菌の定着及び感染を阻害するのではなく、ＥＧＦは、胃腸管における上皮細胞に対する細菌の結合及びその後の定着を妨害する可能性が最も高いことが判明した。
【００４７】
正常なヒトにおいては、大量のＥＧＦが胃腸管の管腔全体において見出され得る（Ｋｏｎｔｕｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。ＥＧＦを慢性的に投与することによって、胃腸粘膜のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質含量が有意に増加し、このようなＥＧＦの増殖作用は、胃腸管内における粘膜の完全性を正常に維持することに寄与するものと信じられる。ＥＧＦが胃腸管に対して及ぼすその他の効果もまた、充分に文献で証明済みである。例えば、ＥＧＦは、幼年期における腸細胞の増殖及び分化、離乳前の腸の機能的な成熟及び成人腸管内における上皮増殖を促進するのである（Ｏ‘Ｌｏｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｇｏｏｄｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；  Ｗａｌｋｅｒ−Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）。ＥＧＦはまた、電解質及び栄養素の小腸内吸収を上方調節することが示されている（Ｏ’Ｌｏｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。これらの結果は、ＥＧＦが主として胃腸管内においてその機能を発揮することを示すものであり、またＥＧＦが病原体の胃腸上皮への接着を特異的に阻害出来る、という概念を支持するものである。
【００４８】
驚くべきことに本発明者らは、ＥＧＦが胃腸管外において病原体感染を阻害する能力をも有することを見出したのである。実施例４及び５において示すように、本発明者らは、種々の他の粘膜系を使用してＥＧＦの効果を試験した。得られた結果は、ＥＧＦが膀胱組織及び腎臓上皮細胞において病原体の定着を阻害する能力を有することを示すものである。従ってＥＧＦは、以前の予期を超える組織においても病原体の定着及び感染を阻害し、かくして極めて広範囲の感染状態における病原性感染症を予防又は治療するために使用することが出来るのである。更には、実施例６も、ＥＧＦが広範に異なる病原体の感染に対して有効であることを示す。
【００４９】
従って本発明は、有効量の上皮成長因子を動物に投与することを含む、動物における病原性感染症を阻害又は治療する方法を提供する。好ましくはかかる感染症は、腎臓、尿管、膀胱、尿道、前立腺、精巣、卵巣、卵管、子宮、子宮頸管及び膣を含む尿生殖路に生起するものである。
【００５０】
本発明は、病因学的因子が病原体感染である疾患又は医学的症状の予防又は治療に対して特に有用であるが、原因となる病原体を同定すること又は感染の徴候を検知することは困難である。例えば、前立腺炎は、時には有効な治療が困難な一般的泌尿器症状である。全ての男性の最大で半数が、人生のある時期に前立腺炎の症状を経験するものと推定されている（Ｄｏｍｉｎｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。
【００５１】
前立腺炎には３種類がある：急性細菌性前立腺炎、慢性細菌性前立腺炎及び慢性特発性前立腺炎である。急性細菌性前立腺炎の培養診断は簡単であるが、慢性細菌性前立腺炎はより微妙な疾患であり、再発、頻発する尿管感染症及び、複数回の抗菌剤治療にも拘わらず前立腺分泌系における細菌の持続性があることによって特徴付けられる。他方、慢性特発性前立腺炎は、前立腺分泌液中の過剰数の炎症細胞の存在又は培養によって立証される細菌尿を伴うことも伴わないこともある。事実、多くの患者からの前立腺分泌液は正常であるように見える。最近、慢性特発性前立腺炎は病原性感染に関連している旨が示唆されている。種々の細菌、また程度はより低いがマイコバクテリア、真菌、寄生生物及びウイルスがこの疾病に関連付けられている（Ｄｏｍｉｎｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。ＥＧＦは広範な種類の病原体の感染を阻害する能力があるため、前立腺炎の治療にＥＧＦを使用することは、原因微生物が同定不可能であったとしても、理想的である。
【００５２】
膀胱炎は、膀胱内における炎症の状態であり、通常は２つの種類、細菌性膀胱炎と間質性膀胱炎とに分類される。細菌性膀胱炎は細菌感染によるものであり、従ってＥＧＦは細菌性膀胱炎の治療において理想的な治療薬剤である。間質性膀胱炎は十分理解されていない医学的症状であるが、本発明は、かかる症状に対しても特に有用であり得る。間質性膀胱炎は女性に多くみられる膀胱の状態の一種である。間質性膀胱炎の診断について一般的に合意されている基準は、排尿の頻度、緊急性及び痛覚；すなわち、膀胱の容量が少なく過敏性であること及び粘膜出血と膀胱膨張時の裂傷とである。しかしながら、間質性膀胱炎の診断に役立つ特異的な組織病理学上の変化は全くない。８０年以上前から報告されているにも拘わらず、間質性膀胱炎は依然として、病因が不明の疾病であり、治療成果もはかばかしくない。感染が、恐らくはこの病状の初期段階において役割を果たすことによって病因学的因子となっている旨が示唆されてきたが、光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、血清学及び分子生物学的技術を用いた研究では、一貫して如何なる微生物も単離されたことはない（Ｒｏｓａｍｉｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。従ってＥＧＦは、間質性膀胱炎の治療、特にこの疾患の進行を初期の段階以上に亢進させるのを防止するために使用することが出来る。
【００５３】
ＥＧＦはまた、別の医学的症状、例えば創傷に罹患した後で生起する病原性感染症を予防又は治療するために使用することが出来る。本発明において意図される創傷は典型的には皮膚又は粘膜表面における創傷であり、例えば火傷、切り傷、穿刺創、潰瘍及び裂傷などが挙げられる。しかしながら、ＥＧＦは、病原体感染を受ける可能性のある如何なる創傷に対しても有用であり得る。病原性感染症を防止するためには、創傷を負った対象者に病原性感染症の兆候が生じないうちにＥＧＦを投与することが好ましい。ＥＧＦは、当業界において確立された任意の方法又は経路に従って投与されてもよい。好ましくは、ＥＧＦは経口投与されるか又は創傷部位若しくはその近傍に局所的に投与される。病原性感染症が発症した場合でもなお、当該感染症を改善及び治療するためにＥＧＦを投与することが出来る。
【００５４】
天然ＥＧＦに加えて、病原体の定着を阻害する活性を有するあらゆるＥＧＦ類似体が本発明において有用であることが意図される。天然ＥＧＦと実質的に同一の配列及び生物学的活性を有するあらゆるＥＧＦ類似体が病原体定着を阻害する能力は、本明細書において開示される方法に従って決定されてもよい。
【００５５】
かかるＥＧＦは、目的に一致した処方及び経路で投与されるべきである。例えば泌尿生殖器感染症については、ＥＧＦは好ましくは、内腔及び管腔内投与を含めて局所的に投与される。例えば、ＥＧＦはかんすいドーシュ、溶液、乳化液、クリーム、軟膏、ゲル、ペースト、坐薬又はカテーテル送達の形状で投与されてもよい。ＥＧＦは又、目的組織内にＥＧＦが出現するに到るあらゆる態様で送達されてもよい。例えば、ＥＧＦは、全身的に投与されてもよく、又はＥＧＦを放出させるに到るビヒクルを用いて送達されてもよい。かかるビヒクルとしては、これに限定されることはないが、例えばＥＧＦをコードする発現ベクター、ＥＧＦを発現する遺伝子的に修飾された細菌、酵母若しくは特にウイルス、又はＥＧＦを発現する遺伝子的に修飾された植物若しくはその部分が挙げられる。
【００５６】
下記する実施例は、本発明を具体的に説明するために述べるものであり、如何なる意味においても本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５７】
実施例
下記する実施例において、下記する略号は下記する意味を有する。ここで定義されない略号は、一般的に受容される意味を有する。
°Ｃ      ＝  摂氏度
ｈｒ又はｈ  ＝  時間
ｍｉｎ  ＝  分
μＭ  ＝  マイクロモル
ｍＭ  ＝  ミリモル
Ｍ  ＝  モル
ｍｌ  ＝  ミリリットル
μｌ＝  マイクロリットル
ｍｇ  ＝  ミリグラム
μｇ  ＝  マイクログラム
ｒｐｍ  ＝  １分当りの回転数
ＦＢＳ  ＝  ウシ胎児血清
ＦＣＳ  ＝  ウシ胎児血清
ＤＴＴ  ＝  ジチオトリエトール
ＤＭＥＭ  ＝  ダルベッコ改変イーグル培地
ＣＦＵ  ＝  コロニー形成単位
ＰＢＳ  ＝  リン酸緩衝生理食塩水
ＥＧＦ  ＝  上皮成長因子
ＰＤＧＦ  ＝  血小板由来成長因子
【００５８】
実施例１
腸管感染に及ぼすＥＧＦの影響
１５匹のニュージーランド白色ウサギ（６週令、５００−７００ｇ）を使用した予備研究を実施して、ＥＧＦがこれらの動物を大腸菌による腸内定着から保護し得る、という仮説を検証した。動物を３つの群に分けた：１）未処理対照、２）大腸菌に経口感染させた動物、及び３）大腸菌に経口感染させ、感染の３日前から開始して１０日間毎日６０μｇの組換え型ヒトＥＧＦ（Ａｕｓｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，  Ｃａｌｉｆ．  ９４５８３）を含む経口用量を与えた動物。全ての動物を、体重増加、食餌摂取量、大腸菌の直腸通過量及び下痢の有無について毎日チェックした。得られた結果を表１にまとめて示す。
【００５９】
【表１】
2008522987.tif 000003
数値は、接種７日後における動物群当り５匹の動物の、平均値±平均値からの標準誤差である、「％」は細菌除去パーセントである
１：グラム
２：食餌摂取量／体重増加
３：ミリグラム／ｃｍ
４：Ｌｏｇ１０ＣＦＵ  （近位結腸１ｃｍ当り）
【００６０】
臨床的に見て、未処置の感染動物においては、直腸スワブは、接種２日後では大腸菌に対してプラスであり、また５匹のウサギの内３匹は、7日後までに下痢の徴候を示した。これとは逆に、１日当りの用量として６０μｇのＥＧＦを投与した感染動物は、１日早く大腸菌を排出し、下痢の徴候を示さなかった。対照は、下痢又は大腸菌を有さなかった（直腸スワブからも検死時の腸内においても）。対照と比較して、感染７日後の感染動物は累積体重増加が少なく、食餌転換効率が悪く、また回腸及び近位結腸における粘膜湿潤重量が減少していた。ＥＧＦ処置によって、近位結腸における細菌定着が６２％減少し、回腸及び結腸における粘膜重量が保護され、また給餌転換効率及び体重増加が改善された（表１）。処置感染動物における給餌効率と体重増加とは、非感染動物に比肩し得るものであった。
【００６１】
実施例２
胃潰瘍の細菌定着に及ぼすＥＧＦの影響
胃潰瘍を誘発させることによって、潰瘍部位における細菌定着のレベルが顕著に増加し、その結果潰瘍の治癒を遅延させる（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。潰瘍部位における既存の細菌定着に及ぼすＥＧＦの影響を調べるために、下記するラットの潰瘍モデルを用いて潰瘍を誘発させた。
【００６２】
体重１７５−２００ｇのオスＷｉｓｔａｒラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ，  ＰＱ，  Ｃａｎａｄａ）から得た。これらの動物には、実験期間中は標準のペレット餌と水道水とを自由に摂取させた。但し、潰瘍誘発に先立つ１８−２４時間の絶食期間は食物を与えなかった。潰瘍は、以前記載されたモデル（Ｏｋａｂｅ  ａｎｄ  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，  １９７２）から改変した方法を用いて誘発させた。簡単に言えば、ハロタン麻酔下に正中線開腹術を行い、胃をそっと取り出した。３ミリリットルシリンジの胴体部を切断してやすり掛けしたものを、身体部領域において胃の漿膜表面に載置した。０．５ミリリットルの８０％酢酸（ｖｏｌ／ｖｏｌ）をシリンジの胴体部内に点滴注入して、この胃と１分間接触させ、その後吸引除去してこの領域を次いで滅菌食塩水で緩やかに洗浄した。酢酸に暴露した面積は５９．７平方ミリメートルであった。胃潰瘍面積は、以下の通りにして定めた。ラットを頸椎脱臼によって殺し、胃を取出してワックスブロックにピン止めした。面積が２５平方ミリメートルである紙グリッドを潰瘍に沿って載置し、次いで写真を撮影した。潰瘍面積は、写真の５倍拡大を用いた面積測定法によって定めた。画素での潰瘍化の面積を、基準として紙グリッドを用いて平方ミリメートル単位に変換した。面積測定法の判定はすべて、観察者がラットの受けた処置に気付かないようにコード化した写真を用いて行った。
【００６３】
潰瘍誘発後７日目に、７日間の処置期間を開始し、その間ＥＧＦ（１又は１００μｇ／ｋｇ）を毎日１回経口投与した。ＥＧＦのビヒクルは滅菌水であり、対照ラットにはＥＧＦに代えて同一体積の滅菌水を与えた。比較のために、ラットの第３群には、何れも細菌感染症を阻害することが知られる広域抗生物質であるストレプトマイシン（３３６ｍｇ／ｍｌ；０．２５ｍｌ）とペニシリン（１６８ｍｇ／ｍｌ；０．２５ｍｌ）との組合せを毎日２回経口処置した。７日間の処置期間の終了時点で、ラットを頸椎脱臼によって殺し、胃を取出して潰瘍面積を判定し、組織試料を採取して細菌培養に供した。ＥＧＦ処置ラット又は抗生物質処置ラットから回収され細菌レベルを算出し、対照群（ビヒクル単独）から回収された細菌の平均数の百分率として表した。
【００６４】
得られた結果は以下の通りである。７日の処置期間全体に亘ってビヒクルを与えられたラットの潰瘍部位における平均細菌レベルは６．５  ｌｏｇＣＦＵ／ｇ組織であったが、このレベルは潰瘍を有さないラットの胃から採取した組織培養物から得た細菌レベル（３−４  ｌｏｇＣＦＵ／ｇ組織、Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８を参照）よりも有意に（ｐ＜０．０１）高かった。１又は１００μｇ／ｋｇのいずれかでＥＧＦを投与した結果、ビヒクル単独を与えたラットに比べて有意に（ｐ＜０．０１）細菌レベルが減少した（それぞれ５．０±０．４及び５．３±０．３  ｌｏｇＣＦＵ／ｇ組織）。ストレプトマイシン／ペニシリンの組合せによる処置によっても、潰瘍部位における細菌の定着が顕著に減少した（４．９±０．３  ｌｏｇＣＦＵ／ｇ組織）。従って胃潰瘍部位における細菌定着に対する影響において、ＥＧＦは抗生物質に匹敵した。
【００６５】
実施例３
ＥＧＦは細菌増殖を直接的に阻害しない
ＥＧＦが細菌増殖に及ぼす影響をインビトロで決定した。これらの研究のために３種の単離細菌株を用いた：１）新鮮なラットの糞からＴＳＢ寒天プレート上で３７°Ｃで１８ｈ増殖させた単一コロニーとして単離したグラム陽性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、２）新鮮なラットの糞からＴＳＢ寒天プレート上で３７°Ｃで１８ｈ増殖させた単一コロニーとして単離したグラム陰性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、及び３）ラットにおける胃潰瘍の治癒を遅延させることが以前に示された大腸菌（Ｃ−２５）のストレプトマイシン耐性株（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。新鮮な糞から単離されたＥ．ｆａｅｃａｌｉｓと大腸菌とは、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （Ａｌｂｅｒｔａ，  Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，ＡＢ，Ｃａｎａｄａ）によって標準細菌同定感受性アッセイを用いてその旨同定されたものである。全ての細菌の保存株は、Ｍｉｃｒｏｂａｎｋ多孔性ビーズ（Ｐｒｏ−Ｌａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ｈｉｌｌ，  ＯＮ，  Ｃａｎａｄａ）にコートしたＴＳＢ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ）中において−７０°Ｃにて保存した。３つの実験シリーズにおいて、ＥＧＦを含まない（対照）か又は１０μＭのＥＧＦを含むＴＳＢを含有する９６ウエルプレートのウエルに、対数増殖期細菌（１０３ＣＦＵ／ｍｌ）を２重に添加して全容量１００μｌ／ウエルとした。この濃度は、インビボで胃腸管内細菌が遭遇する可能性があるＥＧＦレベルの高端側（ｈｉｇｈｅｒ  ｅｎｄ）を反映するために選択されたものであり（Ｇｒｅｇｏｒｙ，  １９８５）、感染動物におけるＥＧＦの経口投与の類似の実験プロトコルを用いた以前の研究（Ｂｕｒｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）に一致するものである。１ｈの間隔をおいて（接種後０−５ｈ）、各ウエル内における生菌細胞を、連続希釈及びＴＳＢ寒天プレート（球菌について）又はマッコンキー（ＭｃＣｏｎｋｅｙ）寒天プレート（桿菌及び大腸菌について）上での３７°Ｃにて１８ｈの培養によってカウントした。細菌数は、ミリリットル当りのｌｏｇ１０ＣＦＵで表される。
【００６６】
実施例４
ＥＧＦは膀胱組織内における大腸菌の定着を阻害する
１ｃｍ２の膀胱組織試料をニュージーランド白色ウサギから切除し、２４ウエルプレートに入れた。次にウエルの半数にヒト組換え型ＥＧＦ（Ａｕｓｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、  最終濃度は１０μＭ）を入れ、残りの半数にはビヒクルである滅菌ＰＢＳを入れて対照とした。１５分後に、２ｘ１０８の大腸菌（ヒト泌尿器管感染症単離株  Ｋ１：０８ＡＣ：Ｈ７）を各ウエルに加えて、９００μｌのＤＭＥＭ組織培養培地で３０°Ｃ及び５％ＣＯ２で３時間共培養した。次いで組織試料を滅菌ＰＢＳで洗浄し、計量して均質化した。大腸菌の定着は、連続希釈及びマッコンキー寒天プレートへのスポット平板培養に続く一晩培養によって評価した。
【００６７】
得られた結果から、ＥＧＦ処置によって大腸菌による膀胱定着が低減されることが示される（表２）。
【００６８】
【表２】
2008522987.tif 000004
【００６９】
これらの結果から、ＥＧＦが膀胱感染症における細菌定着を有意に阻害することが示される。
【００７０】
実施例５
上皮由来の他の細胞に及ぼすＥＧＦの影響
ウシ腎臓上皮細胞（ＭＤＢＫ及びＮＢＬ-1）又はヒト腸上皮細胞（ＣａＣｏ２及びＳＣＢＮ）に対する原生動物寄生生物Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍの定着に及ぼすＥＧＦの影響を調べた。これらの細胞に１μＭのＥＧＦを与えるか、又はビヒクルのみを与えて対照とした。１５分後に寄生生物を細胞に加えて、定着の程度（寄生生物に感染した細胞の％）を２４時間後に定めた。
【００７１】
得られた結果から、ＥＧＦの投与によって、全ての細胞株においてＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍの定着が有意に減少したことが示される。従ってＥＧＦは、腸上皮細胞及び他の粘膜系由来の細胞、この場合には腎臓上皮細胞において抗感染活性を有する。ＥＧＦはまた、細菌以外の病原体、この場合には寄生生物であるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍの感染を阻害するうえで有効である。更に、ＥＧＦは種を超えて有効であり、ヒト及びウシ細胞において病原体感染を阻害する。
【００７２】
実施例６
他の細菌及び寄生生物に及ぼすＥＧＦの影響
本実験は、他の病原体、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２などのヒト上皮細胞における定着に及ぼすＥＧＦの影響を評価するために行った。
【００７３】
Ａ．  ２ｘ１０８個のヒト病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ又は大腸菌を、トランスウエル膜（多孔度３．０μｍ）上で生育させた集密的ヒトＣａＣｏ２単分子層の頂面に添加した。単分子層には、感染の１５分前に頂端ＥＧＦ（１００μｍ又は１０μｍ）又はＰＢＳを与えた。感染後１時間ごとに（０−７ｈ）、当該膜の下の培地を取り換え、細菌の上皮貫通移動速度（ＣＦＵ／ｈ）を算出した。
【００７４】
得られた結果から、１００μｍのＥＧＦは、大腸菌の最初のトランスロケーションを１ｈだけ遅延させ、その後侵入を９５％より多く阻害したことが示される。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのトランスロケーションは、１００μｍのＥＧＦで処理した単分子層においては完全に止められ、１０μｍのＥＧＦによって９０％より多く阻害された。
【００７５】
Ｂ．  ＥＧＦが寄生生物に及ぼす影響を更に調べるために、下記する実験を実施して、アレチネズミにおける寄生生物感染に及ぼすＥＧＦの影響を判定した。
【００７６】
アレチネズミに２００，０００個の栄養体（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ，  Ｓ２単離株）を感染させた。１つの群には毎日ＰＢＳの経口投与を行い、得られた結果を感染３日前に開始された毎日のＥＧＦ（１００μｇ／ｋｇ）の経口投与を行った動物から得られたデータと比較した。空腸試料を感染後６日に採取し、腸粘膜に定着した栄養体をカウントした。
【００７７】
得られた結果を下記表３にまとめて示すが、この結果からＥＧＦ処理は、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ（ランブル鞭毛虫）による腸内定着を有意に阻害することが判る。
【００７８】
【表３】
2008522987.tif 000005
【００７９】
次いで本発明者らは、ヒト小腸の上皮細胞株ＳＣＢＮを使用して、ランブル鞭毛虫症における宿主細胞と寄生生物との相互作用及びＥＧＦの影響を研究したところ、ランブル鞭毛虫がＳＣＢＮ細胞の密着結合ＺＯ−１を破壊し、また細胞外透過性を有意に増大させることを見出した。しかしながらＥＧＦによる事前処理によって、これらの異常が防止され、且つ生栄養体の細胞への接着が阻害された。
【００８０】
Ｃ．  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ感染に及ぼすＥＧＦの影響も評価した。メスの６−８週令のＣ５７ＢＬ／６マウスをオートクレーブ処理したケージ内に入れ、滅菌餌及び水を無制限に与えた。動物を無作為に下記する群の１つに割当てた：１）非感染の対照、２）感染−未処置（ビヒクル）、及び３）感染−ＥＧＦ処置。動物は、０、２及び４日目において、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁させた１ｘ１０９個のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（ＳＳＩ株）生菌を含む０．２ｍｌの接種物で経口・経胃により感染させた。
【００８１】
処置は、殺す前の１０日間にわたり毎日経口投与して行った。ＥＧＦ処置動物には、マウス組換え型ＥＧＦ（滅菌ＰＢＳ中１００μｇ／ｋｇ）を与え、また偽処置動物には滅菌ＰＢＳを与えた。殺す時に胃から組織を採取して、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの定着を以下のように評価した。
【００８２】
組織試料を滅菌ＰＢＳ中で１：１０（ｗ：ｖ）に希釈し、均質化し、次いで選択的Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｂｌｏｏｄ    Ａｇａｒプレート（７％の熱不活性化ウマ血清、１０ｍｇ／Ｌのバンコマイシン、５ｍｇ／Ｌのトリメトプリム、２０ｍｇ／Ｌのバシトラシン、１０ｍｇ／Ｌのナリジクス酸、２５００ＩＵ／ＬのポリミキシンＢを含有する）で連続希釈した。プレートを微好気性チャンバー内で３７°Ｃで培養し、５日後にコロニー形成単位を評価した。
【００８３】
得られた結果から、ＥＧＦは感染動物から単離したＨ．ｐｙｌｏｒｉの数を劇的に減少させたことが分かる。即ち、感染−処置群は、感染−未処置群よりも数オーダーも低いＨ．ｐｙｌｏｒｉを産生した。期待通り、非感染対照には、細菌は全く認められなかった。従って、ＥＧＦは病原性感染症に対して極めて効果的である。
【００８４】
実施例７
体重増加に及ぼすＥＧＦの影響
体重増加に対する潜在的な利益についてＥＧＦを試験した。ニュージーランド白色ウサギ（６週令、５００−７００ｇ）の１つの群に経口用量の組換え型ヒトＥＧＦ（１００μｇ／ｋｇ体重）を毎日与え、また対照動物には食塩水のみを与えた。９日目に、ＥＧＦ処置動物の平均累積体重増加は４２２±２７ｇ（ｎ＝１０）であったが、対照の増加は僅か３９４±１６ｇ（ｎ＝１１）であった。図１を参照して、ＥＧＦ処置動物における体重増加の線形回帰曲線の勾配は、非処置の対照のそれよりも有意に大きかった（Ｐ０．００２）。２つの曲線の線形的外観を考慮すると、ＥＧＦの継続的供給は、体重増加を着実に増加させる効果をもたらすようである。
【００８５】
これらの結果から、ＥＧＦは食品添加物として、又胃腸治療薬剤として健康な動物における体重増加の加速を促進させ得ることが示される。
【００８６】
実施例８
体重増加を減少させるためのＥＧＦの阻害
ＥＧＦシグナリングカスケードの特定の成分のダウンレギュレーションによって栄養素の吸収が阻害される可能性があるという仮説に基づいて、チロフォスチン（ｔｙｒｏｐｈｏｓｔｉｎ）５１（Ｓｉｇｍａ）（チロシンキナーゼ阻害剤）が栄養素吸収と刷子縁の超微細構造とに及ぼす影響を試験した。チロフォスチン５１は、ＥＧＦシグナリングカスケードの決定的な要素であるチロシンキナーゼの特異的阻害剤である。１ｃｍのブラインドループで分離された２つの実験用１０ｃｍ空腸ループをニュージーランド白色ウサギ（８週令、７００−１０００ｇ）において縛り止めた。チロフォスチン（食塩水１．５ｍＬ中に１０μＭ）を一方の実験用ループに注入した。他方のループには、対照としてビヒクルのみを入れた。１時間後に、両方のループから刷子縁膜小胞を調製し、栄養素（Ｄ−グルコース）吸収を評価した。更に透過型電子顕微鏡法を用いて、刷子縁微絨毛の高さを測定した。刷子縁微絨毛の高さは、本発明者の以前の研究において刷子縁の総表面積の制限因子として確立されたパラメーターである。これらの予備的知見から、チロフォスチン５１による処置によって、対照値（輸送＝３６．６±１．８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  Ｐｒｏｔ；微絨毛の高さ＝１．９０±０．１５μｍ）と比較して栄養素の吸収が低減し（２６．９±２．８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  Ｐｒｏｔ）、また微絨毛の高さ（１．０５±０．２０μｍ）も低下することが分かる。本発明者の研究は以前に、腸内栄養素吸収及び散在性微絨毛膜表面積のレベルは、いくつかの異なるモデルにおいて体重増加と相関関係があることを明らかにしている。即ち、チロフォスチンによる処置によって、体重増加の低減又は体重減少を促進させ得るために、肥満症の治療において有用であり得ることが予測される。また、こうした処置を用いて、有毒又は有害物質の腸管吸収を低下させられるかもしれない。
【００８７】
上述はＥＧＦの新規の有用性を記載するものである。特に、ＥＧＦは、病原体による胃腸管定着を防止し、動物における体重増加を促進させることが明かにされたのである。従って、ＥＧＦは極めて有用な薬剤であって、牛肉、豚肉及び鶏肉の生産業などの畜産業において生産を増加させるために使用することが出来る。加えて、ＥＧＦ処置はヒトに対して臨床上の利益をもたらす可能性がある（即ち、クローン病、胃腸感染症、旅行者下痢などの際）。
【００８８】
ＥＧＦの阻害剤は、腸における栄養素吸収を低減させ、従って肥満症の治療又は毒素の吸収防止において有用であり得る。
【００８９】
当業者は、本発明がＥＧＦ及びＥＧＦ阻害剤の新規の有用性に係ることを理解するであろう。記載した実施例は、本発明を例示するためのモデルであることが意図されるものであって、本発明を制限することは意図されない。ＥＧＦ又はＥＧＦ阻害剤の投与方式、配合物及び用量は、特定の実用性に依存して変更出来る。例えば、若い畜産動物を治療するときには、かかるＥＧＦを当該動物の餌又は飲用水中にて経口投与することが出来る。用量の範囲は、１日当り１０−１０，０００μｇ／ｋｇに変更することが出来る。
【００９０】
実施例９
眼上皮細胞の感染に対するＥＧＦの影響
実験を行って、眼上皮細胞の感染に対するＥＧＦの影響を検討した。
【００９１】
ウサギ角膜上皮（ＳＩＲＣ）細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６０；Ｐａｓｓａｇｅ＃４０６）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。培養細胞を１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２００ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ  Ｇ７５１３）及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、並びに１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ４３３３）を有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ;Ｓｉｇｍａ  Ｄ５５４６）で増殖させた。培地を３日毎に取り換えて、集密になると細胞を継代培養した（約５日）。
【００９２】
緑膿菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｕｒｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ＃２７８５３）を細菌病原体として利用した。増殖挙動は、ＯＤ６００及び５％のヒツジ血液を有するＣｏｌｕｍｂｉａ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ（ＰＭＬ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐ１３５０）で平板培養した連続希釈液を用いてＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ  ２３７５０）にて特徴付けた。
【００９３】
初期実験を行って、ＳＩＲＣ細胞株における感染倍率（ＭＯI）及び緑膿菌定着の相対的経時変化を定めた。
【００９４】
ＳＩＲＣ細胞（１−５ｘ１０５）を２４ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種して、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）を用いて集密状態にまで増殖させた。次いで細胞を、細菌：上皮細胞比が１：１０と１０：１との間となる濃度範囲で緑膿菌を含む、抗生物質を含まないＤＭＥＭ（５％ＦＣＳ）で処理した。８時間にわたり１時間間隔で、事前加温した抗生物質を含まない５％ＤＭＥＭで感染ウエルを３回洗浄し、その後トリプシン処理して血清でブロックし、次に超音波処理した。この細胞懸濁液の連続希釈液をＣｏｌｕｍｂｉａ  ｂｌｏｏｄ  ａｇａｒで平板培養し、ＳＩＲＣ細胞に侵入するか又は接着した細菌の濃度を定めた。ＭＯＩとしては１：１０が最適であることが判った。
【００９５】
ウサギ角膜上皮での緑膿菌の定着に及ぼすＥＧＦの影響を定めるために、ＳＩＲＣ細胞単分子層を４つの２４ウエルプレートにおいて集密状態にまで増殖させた。各プレートを４つの実験群の１つに割り当てた：感染＋３つの異なる濃度のＥＧＦ（ヒト組換え型ＥＧＦ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，  Ｊａｐａｎ）；及び感染＋滅菌ＰＢＳ；対照として。実験を開始するために、全ての培地を吸引して除き、細胞を滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で緩やかに３回洗浄した。細菌の挑戦の１５分前に、組換え型ヒトＥＧＦ（０．１ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬまでにわたる用量で）又は滅菌ＰＢＳ（対照）をこれら単分子層の頂端面に添加した。初期実験で定めたＭＯＩを用いて、約６ｘ１０３の緑膿菌を滅菌５％ＤＭＥＭに懸濁し、各単分子層の頂端面に添加した。非感染の対照単分子層には、等体積の滅菌５％ＤＭＥＭのみを加えた。
【００９６】
これらの単分子層を、３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養した。培養後、頂端面を滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、次いで超音波処理して細胞をウエルから?した。これらの懸濁上皮細胞の連続希釈液を５％のヒツジ血液を有するＣｏｌｕｍｂｉａ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒで平板培養して、各ウエル内の定着細菌の数を求めた。
【００９７】
眼上皮細胞単分子層を１０００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで処理した結果、感染させビヒクル処理した対照単分子層と比較して緑膿菌の定着が有意に減少した。
【００９８】
図２は、緑膿菌に感染させた眼上皮細胞単分子層の定着に及ぼすＥＧＦ処理の影響を示す。＊＝Ｐ＜０．０５−感染させビヒクル処理した対照単分子層との比較。全ての群についてｎ＝８。
【００９９】
本出願において上記又はそれ以外の場所で引用したすべての刊行物、特許及び特許出願はその全体が、各個別の刊行物、特許出願又は特許の開示が特定的且つ個別にその全体が引用により合体・一体化されることが示されているのと同程度に、本明細書に引用により合体・一体化される。
【０１００】
参考文献
1. U.S. Patent No. 5,547,935.
2. U.S. Patent No. 5,753,622.
3. U.S. Patent No. 6,191,106.
4. U.S. Patent Application Publication No. 20020098178A1.
5. Buret, A., M.E. Olson, D. G. Gall, and J. Hardin, "Effects of orally administered epidermal growth factor on enteropathogenic Escherichia coli infection in rabbits",  Infect. Immun. 66: 4917-4923  (1998).
6. Carpenter et al., "Epidermal growth factor", Ann. Rev. Biochem. 48: 193-216 (1979).
7. Domingue, Sr., G.J. et al., "Prostatitis", Clinical Microbiology Rev. 11(4): 604-613 (1998).
8. Elliott, S.N. et al., "Bacteria rapidly colonize and modulate healing of gastric ulcers in rats", Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 275: G425-G432 (1998).
9. Goodlad, R.A. et al. (1991) "Effects of Urogastrone-Epidermal Growth Factor on  Intestinal Brush Border Enzymes and Mitotic Activity", Gut 32(9): 994-998.
10. Gregory, H. "In vivo aspects of urogastrone-epidermal growth factor", J. Cell Sci. 3: 11-17 (1985).
11. Konturek et al., "Role of growth factors in gastroduodenal protection and healing of peptic ulcers", Gastroenterol. Clin. North Am. 19: 41-65 (1990).
12. O'Loughlin, E.V. et al. (1985) "Effect of Epidermal Growth Factor on Ontogeny of the Gastrointestinal Tract", Am. J. Physiol. 249:G674-G678.
13. O'Loughlin, E.V. et al. (1994) "Structural and Functional Adaptation Following JeJunal Resection in Rabbits: Effect of Epidermal Growth Factor", Gastroenterology 107:87-93.
14. Okabe, S. and C.J. Pfeiffer, "Chronicity of acetic acid ulcer in the rat stomach", Am. J. Dig. Dis. 17: 619-629 (1972).
15. Rosamilia, A. et al., "Pathophysiology of interstitial cystitis", Current Opin. Obstetrics and Genecology 12: 405-410 (2000).
16. Walker-Smith, J.A. et al. "Intravenous Epidermal Growth Factor/Urogastrone Increases Small Intestinal Cell Proliferation in Congenital Microvillous Atrophy", Lancet  2(8466):1239-1240 (1985).
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ウサギにおいてＥＧＦが体重増加に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】緑膿菌に感染した眼上皮細胞単分子層の定着に及ぼすＥＧＦ処理の影響を示すグラフである。＊＝Ｐ＜０．０５、感染させビヒクル処理した対照単分子層との比較。全ての動物群についてｎ＝８。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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