(57)【要約】【課題】  配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２で規定されるアミノ酸配列を含むペプチドが提供される。ペプチドは長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基である。かかるペプチドを使用する治療的適用も提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるペプチド。
【請求項２】
ペプチドは線状ペプチドまたは環状ペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチド。
【請求項４】
ペプチドは線状ペプチドまたは環状ペプチドである、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号１３、配列番号２７または配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を含み、かつ、長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基であるペプチド。
【請求項６】
ペプチドは配列番号２、配列番号６、配列番号８、および配列番号１２からなる群から選択される、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号６および配列番号１２からなる群から選択される、請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
ペプチドは線状ペプチドまたは環状ペプチドである、請求項５に記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群からそれぞれが独立して選択される、少なくとも２つのペプチドを含む組成物。
【請求項１０】
配列番号１３、配列番号２７または配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を有すペプチドであって、長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドの治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドは、配列番号２、配列番号６および配列番号１２からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号６および配列番号１２からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドは線状ペプチドまたは環状ペプチドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるペプチドの治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドの治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
対象の組織における血管形成を促進させる方法であって、配列番号１３、配列番号２７または配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を有するペプチドであって、長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドの治療効果的な量を対象に与え、それにより対象における血管形成を促進させることを含む方法。
【請求項１７】
前記ペプチドは、配列番号２、配列番号６および配列番号１２からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号６および配列番号１２からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドは線状ペプチドまたは環状ペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
対象は、動脈硬化症、網膜症、再構成障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病および／または遺伝性出血性毛細血管拡張症に罹患している、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
対象の組織における血管形成を促進させる方法であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるペプチドの治療効果的な量を対象に与え、それにより対象における血管形成を促進させることを含む方法。
【請求項２２】
対象は、動脈硬化症、網膜症、再構成障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病および／または遺伝性出血性毛細血管拡張症に罹患している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象の組織における血管形成を促進させる方法であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドの治療効果的な量を対象に与え、それにより対象における血管形成を促進させることを含む方法。
【請求項２４】
対象は、動脈硬化症、網膜症、再構成障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病および／または遺伝性出血性毛細血管拡張症に罹患している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項２６】
プロモーターをさらに含む、請求項２５に記載の核酸構築物。
【請求項２７】
請求項５に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項２８】
プロモーターをさらに含む、請求項２７に記載の核酸構築物。
【請求項２９】
請求項７に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項３０】
プロモーターをさらに含む、請求項２５に記載の核酸構築物。
【請求項３１】
薬物を内皮細胞に対して標的化するための組成物であって、配列番号１３、配列番号２７または配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を有するペプチドであって、長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドに融合された薬物を含む組成物。
【請求項３２】
薬物はトキシン、化学療法剤および放射性同位体からなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
薬物を内皮細胞に対して標的化するための組成物であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるペプチドに融合された薬物を含む組成物。
【請求項３４】
薬物を内皮細胞に対して標的化するための組成物であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドに融合された薬物を含む組成物。
【請求項３５】
推定される血管形成分子を特定する方法であって：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有し、かつ、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドが結合している内皮細胞を提供する；および
（ｂ）前記内皮細胞から前記ペプチドを追い出すことができる分子を特定し、それにより、推定される血管形成分子を特定する
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管形成を促進させることができるペプチド、および、虚血性血管疾患などの血管形成依存疾患の処置におけるその使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成は、新しい毛細血管を生じさせるプロセスであり、細胞と可溶性因子との間での相互作用を伴う（１）。簡単に記載すると、活性化された内皮細胞が遊走し、増殖して新しい血管を形成し、その血管の周りが内皮周囲細胞によって取り囲まれる。このとき、小さい血管は周皮細胞によって取り囲まれ、大きい血管は平滑筋細胞によって取り囲まれる。
【０００３】
非常に多数の因子により、血管形成プロセスは調節される。これらの因子には、可溶性因子および組織の酸素が含まれる。過去２０年間で、血管形成プロセスを正に調節する数多くの血管形成分子が解明された。これらには、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性ＦＧＦ／ＦＧＦ−１および低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）などが含まれる（２）。述べられたように、酸素状態もまた、生理学的および病理学的な血管形成プロセスのための重要な関わりを有する。低酸素状態のもとでは、ＶＥＧＦ遺伝子の発現が内皮細胞および周皮細胞の両方で誘導され、分泌型形態のＶＥＧＦを産生させる。その後、ＶＥＧＦは、オートクリン様式またはパラクリン様式で内皮細胞上に発現されるＶＥＧＦ受容体−２（Ｋｄｒ）またはＶＥＧＦ受容体−１（ＶＥＧＦＲ；Ｆｌｔ−１）に結合することができ、それにより、血管形成をもたらし得る内皮細胞の増殖を引き起こす。正常酸素状態のもとで合成された血管ＶＥＧＦの基礎的な量により、微小血管の恒常性の維持が促進される（５）。ＶＥＧＦ受容体１のｍＲＮＡ（Ｆｌｔ−１）の発現が、虚血周囲の内皮細胞において、また、内皮細胞および周縁部の梗塞したコア部においてアップレギュレーションされ、ＶＥＧＦＲ−１の最大発現が内皮細胞においてであったことが見出された。ＶＥＧＦＲ−１の遺伝子発現が、ＶＥＧＦの場合のように、低酸素状態によって直接的に誘導される。ＶＥＧＦＲ−１遺伝子およびＶＥＧＦＲ−２（Ｋｄｒ）遺伝子の発現と一致した、低酸素状態により誘導されたＶＥＧＦ遺伝子発現の２４時間後、内皮細胞は増殖を開始する（６、７）。
【０００４】
これらの細胞応答に関係する、低酸素状態により誘導され得る遺伝子産物には、エリスロポイエチン、ＶＥＧＦおよび解糖酵素が含まれる（８）。低酸素状態は周皮細胞におけるｂＦＧＦのｍＲＮＡ発現を直接的に高めることができる。ｂＦＧＦの増大した発現は、周皮細胞の増殖において、また、周皮細胞および平滑筋細胞の分化において重要な役割を果たしていると考えられる（９）。
【０００５】
血管形成依存疾患は、血管形成プロセスの調節障害が起こるときに生じ、これにより、過度な量の新しい血管または不十分な数の血管がもたらされる。不十分な血管形成が非常に多数の疾患および状態（例えば、冠状動脈疾患および遅れた創傷治癒など）に関連づけられる。今日まで、心臓血管疾患は、米国、欧州およびイスラエルにおける死因の第一位である。米国では、年間約百万人の死亡が心臓原因に起因すると考えられ、その５０パーセントが冠状動脈疾患（ＣＡＤ）に起因すると考えられている。ＣＡＤによるこの大量の死亡は、閉塞性の冠状動脈狭窄化およびそれにより生じる心筋虚血の結果である。１３００万人を超える人々がＣＡＤに襲われ、その年間の経済的負担は６００億ドルを超えている。
【０００６】
経皮的内径血管形成術およびステント移植を含む経皮的技術による閉塞性冠状動脈狭窄の機械的な血管再生が、正常な冠状動脈血流に戻すために使用されている。加えて、冠状動脈閉塞バイパス手術が、動脈導管および静脈導管を冠状動脈樹への移植片として使用して行われている。これらの処置様式は、散在性アテローム硬化性疾患者または重症の小血管冠状動脈疾患者において、また、糖尿病患者において、同様にまた、手術的処置または経皮的処置を既に受けている人において、著しく制限される。
【０００７】
これらの理由のために、新しい血管成長を刺激することを目指した治療的血管形成が非常に望ましい。血管形成治療の治療的概念は、血管組織に本来備わっている血管成長のための存在する潜在的可能性が、新しい血管の発達を適切な血管形成分子の影響のもとで促進させるために利用できるという前提に基づいている。
【０００８】
治療的血管形成は、虚血性血管疾患の処置のために血管新生を刺激または誘導することによって局所的な低血管分布を処置するために使用される介入であることを規定する。
【０００９】
動物研究では、血管形成化合物により側副の灌流および機能を高めることの実現可能性が立証されている。そのような実験では、血管形成性増殖因子またはその遺伝子構築物の外部からの投与は慢性的虚血の実験モデルにおいて側副血管の成長を促進し得ることが立証された。そのような研究は概念の証拠を実証したが、さらなる研究では、依然として解消されていない問題、例えば、血管形成因子に対する血管の暴露の継続期間、および、そのようなタンパク質の短い半減期などが提起されている（１０）。
【００１０】
タンパク質の一部分を含む合成ペプチドは、タンパク質の生物学的機能に関連する分子的機構を理解するための支援する道具になってきている。増殖因子ファミリーメンバーの生物学的機能を効率的に作動または中和する能力を有する、ヒトのＦＧＦおよびＶＥＧＦの特定の領域から構築された短いペプチドの使用が記載されている（１１）。いくつかのグループが、細胞表面に結合するペプチドを特定するためにファージディスプレーペプチドライブラリーをスクリーニングするための無傷細胞の使用を報告している（１２）。ＶＥＧＦファミリーの、ペプチドに基づくリガンド受容体マップが、ＶＥＧＦにより刺激されたヒト内皮細胞を、ペプチドライブラリーを用いてスクリーニングすることによって構築された（１３）。別の研究では、ＶＥＧＦ−２受容体タンパク質に対する１２量体ファージディスプレーペプチドライブラリーのスクリーニングが記載されている（１４）。
【００１１】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、正常酸素状態または低酸素状態のもとでインキュベーションされた内皮細胞の細胞表面と結合することができるペプチドを発見するために１２量体ファージディスプレーペプチドライブラリーを使用した。そのようなペプチドは、内皮細胞の増殖および血管化を含む血管形成プロセスを開始させることが示された。そのため、これらのペプチドは、虚血性血管疾患などの様々な血管形成依存疾患を処置するために使用することができる。その上、これらのペプチドによる内皮細胞のシグナル伝達の性質を特徴づけることにより、冠状動脈疾患などの病的状態に対する標的化された血管形成治療を開発するための基礎が提供される。
【発明の開示】
【００１２】
本発明の１つの態様によれば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるペプチドが提供される。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドが提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の態様によれば、配列番号１３、配列番号２７または配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を含み、かつ、長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドが提供される。
【００１５】
本発明のなおさらに別の態様によれば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群からそれぞれが独立して選択される少なくとも２つのペプチドを含む組成物が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる態様によれば、配列番号１３、配列番号２７または配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を有し、かつ、長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドの治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。
【００１７】
本発明のさらにさらなる態様によれば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるペプチドの治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。
【００１８】
本発明のなおさらにさらなる態様によれば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドの治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。
【００１９】
本発明のさらなる態様によれば、対象の組織における血管形成を促進させる方法が提供され、この場合、この方法は、配列番号１３、配列番号２７または配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を有し、かつ、長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドの治療効果的な量を対象に与え、それにより対象における血管形成を促進させることを含む。
【００２０】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ペプチドは、配列番号２、配列番号６および配列番号１２からなる群から選択される。
【００２１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号６および配列番号１２からなる群から選択される。
【００２２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、ペプチドは線状ペプチドまたは環状ペプチドである。
【００２３】
本発明のさらにさらなる態様によれば、対象の組織における血管形成を促進させる方法が提供され、この場合、この方法は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるペプチドの治療効果的な量を対象に与え、それにより対象における血管形成を促進させることを含む。
【００２４】
本発明のなおさらにさらなる態様によれば、対象の組織における血管形成を促進させる方法が提供され、この場合、この方法は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドの治療効果的な量を対象に与え、それにより対象における血管形成を促進させることを含む。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、対象は、動脈硬化症、網膜症、再構成障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病および／または遺伝性出血性毛細血管拡張症に罹患している。
【００２６】
本発明のなおさらにさらなる態様によれば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物が提供される。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、核酸構築物はさらにプロモーターを含む。
【００２８】
本発明のなおさらにさらなる態様によれば、薬物を内皮細胞に対して標的化するための組成物が提供され、この場合、この組成物は、配列番号１３、配列番号２７または配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を有し、かつ、長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドに融合された薬物を含む。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、薬物は、トキシン、化学療法剤および放射性同位体からなる群から選択される。
【００３０】
本発明のなおさらにさらなる態様によれば、薬物を内皮細胞に対して標的化するための組成物が提供され、この場合、この組成物は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるペプチドに融合された薬物を含む。
【００３１】
本発明のなおさらにさらなる態様によれば、薬物を内皮細胞に対して標的化するための組成物が提供され、この場合、この組成物は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドに融合された薬物を含む。
【００３２】
本発明のなおさらにさらなる態様によれば、推定される血管形成分子を特定する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）ペプチドのそれぞれが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドが結合している内皮細胞を提供すること；および（ｂ）内皮細胞からペプチドを追い出すことができる分子を特定し、それにより、推定される血管形成分子を特定することを含む。
【００３３】
本発明は、血管形成を促進させることができ、そのため、虚血性血管疾患などの血管形成依存疾患を処置するために使用することができるペプチドを提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００３４】
本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、特に断らない限り、本発明の属する技術分野の当業者が共通して理解しているのと同じ意味を持っている。本明細書に記載されているのと類似の又は均等の方法と材料は本発明を実施又は試験するのに使用できるが、適切な方法と材料は以下に述べる。争いが生じた場合、定義を含めて本特許明細書が基準である。さらに、本明細書の材料、方法および実施例は例示することだけを目的とし本発明を限定するものではない。
【００３５】
図面の説明
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１ａ〜図１ｂは、正常酸素状態下のＥＣ、ならびに、低酸素状態の３時間後、６時間後および２４時間後のＥＣに対する、１ウエルあたり１０９個のファージ（図１ａ）または１０１０個のファージ（図１ｂ）の濃度でのペプチド提示ファージの結合を示す棒グラフである。棒は、２時間のインキュベーションの後における、１５の異なるペプチド提示ファージ（ＶＬ、ＬＰ、ＴＲ、ＳＴ、ＱＦ、ＮＳ、ＳＰ、ＹＲ、ＬＴ、ＨＲ、ＨＹ、ＳＶ、ＴＰ、ＮＲおよびＳＡ）およびコントロール（ＮＯ（非改変Ｍ１３ファージ））のＥＣに対する結合を表す。ＥＣに結合しているペプチド提示ファージをテトラメチルベンジジンの液体基質の存在下で検出する抗Ｍ１３  ＨＲＰ抗体によってもたらされる４５０ｎｍにおける吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して測定した。
図２は、ＥＣの増殖に対するペプチド提示ファージの影響を示す棒グラフである。６つのペプチド提示ファージ（ＶＬ、ＴＲ、ＹＲ、ＱＦ、ＬＴ、ＳＰ）を、それぞれ１０６個の濃度で、血清非含有培地においてＥＣと２４時間インキュベーションした。データが、インキュベーションの終わり６時間でＥＣ内への放射性［３Ｈ］−チミジン取り込み（ｃｐｍ／分）を測定することによって得られた。データは、コントロールファージ（ＮＯ（非改変Ｍ１３ファージ））により誘導されるＥＣ増殖を上回るパーセントとして示される。
図３ａ〜図３ｂは、ＥＣの遊走に対するペプチド提示ファージの直接的な活性化の影響を示す棒グラフである。ＥＣの遊走を１ウエルあたり１０５個のペプチド提示ファージ（図３ａ）または１０６個のペプチド提示ファージ（図３ｂ）の存在下でアッセイし、陰性コントロール（ＥＣ、または、ＮＯファージ（非改変Ｍ１３ファージ）の存在下でのＥＣ）または陽性コントロール（血管形成分子、ＶＥＧＦ）と比較した。棒は、遊走チャンバーでの５時間のインキュベーションの後における、１２のペプチド提示ファージ（ＶＬ、ＬＰ、ＱＦ、ＳＰ、ＴＲ、ＮＳ、ＳＶ、ＬＡ、ＬＴ、ＹＲ、ＴＰおよびＳＡ）により誘導されたＥＣ遊走を比較する。データは、４８０／５２０ｎｍで蛍光ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、溶解された遊走細胞の細胞核酸に結合したＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ色素分子プローブの蛍光増強を測定することによって得られた。データは相対蛍光ユニット（ＲＦＵ）として表される。
図４ａ〜図４ｂは、遊走チャンバーのフィーダートレイに加えられたペプチド提示ファージによるＥＣの化学的誘引を示す棒グラフである。ペプチド提示ファージを１ウエルあたり１０５個のファージ（図４ａ）または１０６個のファージ（図４ｂ）の濃度で使用し、また、陰性コントロール（ＥＣ、または、ＮＯファージ（非改変Ｍ１３ファージ）の存在下でのＥＣ）と比較した。棒は、遊走チャンバーでの５時間のインキュベーションの後における、１２のペプチド提示ファージ（ＶＬ、ＬＰ、ＱＦ、ＳＰ、ＴＲ、ＮＳ、ＳＶ、ＬＡ、ＬＴ、ＹＲ、ＴＰおよびＳＡ）により誘導されたＥＣの化学的誘引を比較する。データは、図３ａ〜図３ｂについて本明細書中上記に記載されるように得られ、示された。
図５は、陰性コントロール（ＮＯファージ（非改変Ｍ１３ファージ））および陽性コントロール（血管形成分子（ＦＧＦ））と比較したときの、ペプチド提示ファージ（１０６個）の存在下での動脈リングにおけるＥＣの増殖を示す棒グラフである。棒は、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭでの７日間のインキュベーション（５％ＣＯ２を伴う３７℃）の後における、６つのペプチド提示ファージ（ＳＰ、ＬＴ、ＹＲ、ＴＲ、ＶＬおよびＱＦ）により誘導されたＥＣの分化を比較する。データはＸＴＴアッセイ（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）によって得られた。
図６ａ〜図６ｉは、末梢血リンパ球（ＰＢＬ、図６ａ）またはＥＣ（図６ｂ）に対する合成ペプチドの特異的な結合を示すグラフである。グラフは、４μｇまたは６μｇの合成ペプチドと２時間インキュベーションされた１０００００個の細胞のフローサイトメトリー分析を表す。図６ａ〜図６ｂは、（図６ａ）末梢血リンパ球の分析または（図６ｂ〜図６ｉ）内皮細胞の分析のいずれかのために選ばれたゲートを示すフローサイトメトリー分析の結果である。ドットは、ＦＩＴＣ標識した細胞の分散をその顆粒化（垂直軸）に対するそのサイズ（水平軸）に従って表す。図６ｃ〜図６ｉは、ＥＣに対するパーセント結合および合成ペプチドの平均蛍光を示すフローサイトメトリー分析の結果である：図６ｃ−ペプチドなし；図６ｄ−ＳＰ；図６ｅ−ＱＦ；図６ｆ−ＬＴ；図６ｇ−ＹＲ；図６ｈ−ＴＲ；図６ｉ−ＶＬ。これらのグラフは、４μｇの合成ペプチド（緑色線）、６μｇの合成ペプチド（赤色線）またはイソタイプコントロール（黒色線）と２時間インキュベーションされた１０６個のＥＣのフローサイトメトリー分析を表す。
図７は、ＰＢＬおよびＥＣに対する合成ペプチドの結合を明らかにする棒グラフである。グラフは、１０００００個のＰＢＬおよびＥＣに結合した５μｇのＦＩＴＣ標識した合成ペプチド（ＳＰ、ＹＲ、ＬＴ、ＶＬ、ＱＦおよびＴＲ）のフローサイトメトリー分析を表す。棒は平均蛍光（ＰＢＬまたはＥＣとの２時間のインキュベーションの後で標識合成ペプチドによって放出される）を比較する。データは、ＦＡＣＳを使用して集められた。
図８ａ〜図８ｂは、細胞増殖に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。図８ａは、ＥＢＭ−２での２４時間のインキュベーションの後における、０．０５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＬＰ、ＳＴ、ＴＲおよびＶＬにより誘導されたＥＣの増殖を例示する。図８ｂは、ＥＢＭ−ＭＶでの２４時間のインキュベーションの後における、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＬＴ、ＳＰまたはＹＲにより誘導されたＭＶＥＣの増殖を例示する。結果が、（ペプチドとインキュベーションされた細胞による［３Ｈ］−チミジン取り込み−コントロール（それぞれ、ＥＢＭ−２およびＥＢＭ−ＭＶ中でインキュベーションされた細胞））として表される。データは、インキュベーションの終わり６時間で、細胞内への放射性［３Ｈ］−チミジン取り込みをシンチレーションβカウンターでｃｐｍ／分により測定することによって得られた。
図９ａ〜図９ｃは、ＥＣの遊走に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。図９ａ〜図９ｃは、遊走チャンバーでの５時間のインキュベーションの後における、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＬＴ（図９ａ）、ＳＰ（図９ｂ）、または、ＶＬおよびＴＲ（図９ｃ）により誘導されたＥＣの遊走を例示する棒グラフである。データは、図３ａ〜図３ｂについて本明細書中上記に記載されるように得られ、示された。
図１０は、ＥＣの遊走に対するペプチドインキュベーションの時間依存的な影響を示すグラフである。図は、遊走チャンバーでの５時間および１５時間のインキュベーションの後における、１ｎｇ／ｍｌの合成ペプチド（ＬＴ、ＱＦ、ＳＰ、ＴＲ、ＶＬおよびＹＲ）により誘導されたときのＥＣの遊走を示す。データは、図３ａ〜図３ｂについて本明細書中上記に記載されるように得られ、示された。
図１１ａ〜図１１ｂは、ＭＶＥＣの遊走に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。グラフは、遊走チャンバーでの５時間のインキュベーションの後における、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＬＴ、ＳＰ、ＹＲ、ＴＲ、ＶＬ、ＱＦおよびＦＧＦにより誘導されたＭＶＥＣの遊走（図１１ａ）およびＭＶＥＣの遊走活性化（図１１ｂ）を例示する。データは、図３ａ〜図３ｂについて本明細書中上記に記載されるように得られ、示された。
図１２は、動脈リング出芽に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。グラフは、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭでの７日間のインキュベーション（５％ＣＯ２を伴う３７℃）の後における、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌで、４つの合成ペプチド（すなわち、ＱＦ、ＹＲ、ＬＴおよびＶＬ）により誘導された動脈リングにおけるＥＣの増殖を示す。データは、ＸＴＴアッセイ（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）によって細胞増殖を見積もることによって得られた。
図１３ａ〜図１３ｊは、細胞の管形成に対するペプチドを示す顕微鏡写真である。図１３ａ〜図１３ｅは、非処理コントロール（図１３ａ）と比較したときの、ＶＥＧＦ（図１３ｂ）、ＹＲ（図１３ｃ）、ＱＦ（図１３ｄ）、ＶＬ（図１３ｅ）の８時間のインキュベーションにより誘導されたＭＶＥＣの管形成を明らかにする。写真が８時間のインキュベーションの後で撮影された倍率は×１００。図１３ｆ〜図１３ｊは、非処理コントロール（図１３ｆ）と比較したときの、ＦＧＦ（図１３ｇ）、ＹＲ（図１３ｈ）、ＱＦ（図１３ｉ）、ＶＬ（図１３ｊ）の２０時間のインキュベーションにより誘導されたＥＣの管形成を明らかにする。
図１４ａ〜図１４ｅは、ＭＶＥＣにおける下記遺伝子の遺伝子発現に対する合成ペプチドの影響を示す棒グラフである：図１４ａ、ＶＥＧＦ−Ａ；図１４ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ；図１４ｃ、ＦＬＴ−１；図１４ｄ、ＫＤＲ；図１４ｅ、ＨＩＦ−１α。合成ペプチド（１ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＴ、ＱＦ、ＳＰ、ＴＲ、ＹＲおよびＶＬ）またはＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌの濃度）を細胞に加え、遺伝子発現を、ペプチド添加後またはＶＥＧＦ添加後の１．５時間および６時間でリアルタイムＰＣＲを使用して測定した。結果は、非処理コントロールと比較したときの、処理された細胞の正味の発現比率として示される。
図１５は、低酸素状態処理の影響にさらされたＥＣに対する合成ペプチドの結合の強度を明らかにする棒グラフである。フローサイトメトリー分析を、１０５個の未処理のＥＣまたは低酸素状態後のＥＣに対する、６μｇのＦＩＴＣ標識した合成ペプチド（ＬＴ、ＱＦ、ＳＰ、ＴＲ、ＶＬおよびＹＲ）の結合について行った。棒は、ＦＩＴＣ標識した合成ペプチドとＥＣとの２時間のインキュベーションの後で得られた平均蛍光（４８８ｎｍ）を比較する。データは、ＦＡＣＳを使用して得られた。
図１６ａ〜図１６ｂは、低酸素状態の影響にさらされたＥＣに対する合成ペプチドの結合の強度を示すグラフである。グラフは、２時間のインキュベーションの後における１０５個のＥＣに対する６μｇのＦＩＴＣ標識したＳＰペプチド（図１６ａ）およびＬＴペプチド（図１６ｂ）のフローサイトメトリー分析を示す。赤色線−低酸素状態を伴わないＥＣ；緑色線−低酸素状態後のＥＣ；黒色線−イソタイプコントロール。
図１７ａ〜図１７ｆは、細胞増殖に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。図１７ａ〜図１７ｃは、ＥＢＭ−２での２４時間のインキュベーションの後における、０．０１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＬＴ（図１７ａ）、ＳＰ（図１７ｂ）またはＱＦ（図１７ｃ）により誘導されたＨＵＶＥＣの増殖を例示する。図１０ｄ〜図１０ｆは、ＥＢＭ−ＭＶでの２４時間のインキュベーションの後における、０．０１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＬＴ（図１７ｄ）、ＳＰ（図１７ｅ）またはＱＦ（図１７ｆ）により誘導されたＭＶＥＣの増殖を例示する。プロットは、正常な状態（コントロール）下と、低酸素状態下、または、低酸素状態後での細胞の増殖を比較する。データは、インキュベーションの終わり６時間で、細胞内への放射性［３Ｈ］−チミジン取り込みをシンチレーションβカウンターでｃｐｍ／分により測定することによって得られた。
図１８ａ〜図１８ｅは、低酸素状態のもとでのＨＵＶＥＣの管形成（図１８ａ〜図１８ｃ）およびＭＶＥＣの管形成（図１８ｄ〜図１８ｅ）に対するＳＰの影響を示す顕微鏡写真である。図１８ａ〜図１８ｃは、コントロール（図１８ａ）と比較したときの、ＦＧＦ（図１８ｂ）またはＳＰ（図１８ｃ）との１８時間のインキュベーションにより誘導されたＥＣの管形成を明らかにする。図１８ｄ〜図１８ｅは、ＦＧＦ（図１８ｄ）またはＳＰ（図１８ｅ）との１８時間のインキュベーションにより誘導されたＭＶＥＣの管形成を明らかにする。写真が１８時間のインキュベーションの後で撮影された。倍率は、×１００。
図１９ａ〜図１９ｅは、マウスの耳の血管化に対する合成ペプチドの影響を示す顕微鏡写真である。図は、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／マウス耳；図１９ａ）、ＬＴ（１０ｎｇ／耳；図１９ｂ）、ＹＲ（１０ｎｇ／耳；図１９ｃ）、ＱＦ（１ｎｇ／耳；図１９ｄ）またはＳＰ（図１９ｅ；０．１ｎｇ／耳）の皮下注射により誘導されたときの血管化を明らかにする。それぞれの注射を、１０μｌの最終体積で、すなわち、１０μｇ／１０μｌのＰＢＳ、０．１μｇ／１０μｌのＰＢＳ、または１０μｌのＰＢＳ（コントロール）で行った。写真は注射後２日目に撮影された。
図２０ａ〜図２０ｂは、マウスの耳の血管化に対するＴＲペプチドの影響を示す顕微鏡写真である。コントロール（図２０ａ）と比較したときの、１０μｇのＴＲにより誘導された血管化および血管新生（図２０ｂ）を明らかにする組織学切片が示される。ＴＲペプチドの注射は、単一赤血球細胞を伴う毛細血管によって明らかにされるように、大きな血管形成および血管新生を明らかにすることに留意すること。
図２１は、ラット虚血性後肢モデルにおける虚血性後肢／コントロールのメジアン流束を示す棒グラフである。図は、４日目、７日目、９日目および１３日目で測定された虚血性後肢の血流を示す。結果は、反対側の足と比較して、虚血性足への６００μｇのＶＬ、ＬＴ、ＱＦ、ＴＲ、ＳＰ、ＹＲ、ＦＧＦまたはＰＢＳの注射の後におけるペプチド接種後４日目、７日目、９日目および１３日目の平均である。結果が、ＯＰ／コントロール×１００のメジアン流束（手術していないコントロール足に対する手術した足のパーセントメジアン流束）として表される。データは、レーザードップラー血流分析計を使用して、４日目、７日目、９日目および１３日目に得られた。
図２２ａ〜図２２ｃは、本発明のペプチドと、マウスＶＥＧＦ−Ｂ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセション；ＶＥＧＢ＿ＭＯＵＳＥ）とが互いに有する保存された配列モチーフを発見したことを例示する。図２２ａは、本発明のペプチドのアミノ酸配列；図２２ｂは、ＶＬ、ＱＦ、ＹＲおよびＴＲのアミノ酸配列のアラインメントであり、ｅ−Ｍｏｔｉｆによる走査により、保存されたモチーフ「ｐｗ［ｉｌ］［ｄｅ］．ｙ」を明らかにする。図２２ｃは、マウスＶＥＧＦ−Ｂとの、ＶＬ、ＱＦ、ＹＲおよびＴＲのアミノ酸配列のアラインメントである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明は、組織の血管形成を促進させるために使用することができるペプチドに関する。具体的には、本発明は、虚血性血管疾患などの血管形成依存疾患を処置するために使用することができる。
【００３７】
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解することができる。
【００３８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
【００３９】
血管形成は、細胞と可溶性因子との間での相互作用を伴う、新しい毛細血管を生じさせるプロセスである（１）。このプロセスは、増殖して、新しい血管（小さい血管については周皮細胞、および、大きい血管については平滑筋細胞を含む内皮周囲細胞の層で取り囲まれる）を形成する活性化された内皮細胞の遊走によって特徴づけられる。
【００４０】
血管形成依存疾患は、過度な量の新しい血管または不十分な数の血管をもたらす、バランスの崩れた血管形成プロセスの結果である。不十分な血管形成が非常に多数の疾患および状態（例えば、冠状動脈疾患および遅れた創傷治癒など）に関連づけられている。
【００４１】
治療的血管形成は、新しい血管成長を刺激することを目的としている。そのような治療の概念は、本来備わっている血管組織の血管化の可能性が、適切な血管形成分子の影響下で促進するために新しい血管の発達を利用できるという前提に基づいている。
【００４２】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、１２量体ファージディスプレーペプチドライブラリーを使用し、正常酸素状態または低酸素状態のもとでインキュベーションされた内皮細胞の細胞表面と結合することができるペプチドを発見した。
【００４３】
下記の実施例の節において例示されるように、本発明のペプチドは、内皮細胞の増殖および遊走、大動脈リング出芽、管形成、ならびにインビボ血管化を含む血管形成反応を引き起こした。これらの知見は、本発明のペプチドが虚血性血管疾患などの様々な血管形成依存疾患の処置において使用できることを示唆している。その上、これらのペプチドによる内皮細胞のシグナル伝達の性質を特徴づけることにより、冠状動脈疾患などの疾患に対する目標とされた血管形成治療を開発するための基礎が提供される。
【００４４】
従って、本発明の１つの態様によれば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２に示されるようなアミノ酸配列を含むペプチドが提供され、このペプチドは長さが、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、および最大でも５０個のアミノ酸残基である。
【００４５】
本発明の別の態様によれば、配列番号１３、配列番号２７または配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが提供され、このペプチドは長さが、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、および最大でも５０個のアミノ酸残基である。
【００４６】
実施例の節の実施例６に示されるように、本発明のこの態様のペプチドは、哺乳動物の血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬアクセション：ＶＥＧＢ＿ＭＯＵＳＥ）との保存されたアミノ酸配列（配列番号１３、配列番号２７または配列番号３２）を互いに有しており、それにより、本発明のこの態様のペプチドに起因すると考えられる血管形成機能を立証している。
【００４７】
好ましくは、本発明のペプチドは、配列番号２、配列番号６、配列番号８または配列番号１２によって示される配列を含み、より好ましくは、本発明のペプチドは、配列番号６または配列番号８によって示される配列を含む。
【００４８】
本発明のこの態様の別の好ましい実施形態によれば、アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号６、配列番号８または配列番号１２に示される通りであり、好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号６または配列番号８に示される通りである。
【００４９】
本発明ではまた、配列番号１４で提供されるようなコンセンサス配列を２つ以上含有するペプチドの使用が考えられる。
【００５０】
本発明のさらに別の態様によれば、配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列を含むペプチドが提供され、このペプチドは長さが、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、および最大でも５０個のアミノ酸残基である。
【００５１】
本明細書中および請求項の節で使用される用語「ペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。
【００５２】
これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【００５３】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【００５４】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチレンアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【００５５】
上述のことに加えて、本発明のペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【００５６】
本明細書中および請求項の節で使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【００５７】
下記の表１および表２には、本発明で使用される天然に存在するアミノ酸（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（例えば合成アミノ酸、表２）が示される。
2008500015.tif 000002
2008500015.tif 000003
2008500015.tif 000004
2008500015.tif 000005
【００５８】
本発明のペプチドは、好ましくは、線状形態で利用される。しかし、環化がペプチドの特性をひどく妨害しない場合、ペプチドの環状形態もまた利用できることが理解される。環状ペプチドは環状形態に合成されるか、または所望の条件（例えば生理学的条件）の下で環状形態を備えるように形成されることも可能である。
【００５９】
短いペプチドフラグメントを治療で使用する際の大きな障害の１つは、立体特異的な細胞プロテアーゼによるそのタンパク質分解的な分解であるので、本発明のペプチドは、好ましくは、天然アミノ酸のＤ−異性体から合成されることが理解される［すなわち、インベルソ（ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチドアナログ、Ｔｊｅｒｎｂｅｒｇ（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：１２６０１〜５；Ｇａｚｉｔ（２００２）、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、９：１６６７〜１６７５］。
【００６０】
加えて、本発明のペプチドには、そのレトロアナログ、インベルソアナログおよびレトロ−インベルソアナログが含まれる。ホルモンの完全なレトロ−インベルソアナログまたは延長された部分的レトロ−インベルソアナログは生物学的活性を保持または増強することが一般には見出されていることが理解される。レトロ反転化はまた、酵素阻害剤の合理的な設計の分野では適用されている（米国特許第６２６１５６９号を参照のこと）。
【００６１】
本明細書中で使用される「レトロペプチド」は、生来的なペプチド配列とは反対方向で組み立てられる、Ｌ−アミノ酸残基から構成されるペプチドを示す。
【００６２】
天然に存在するポリペプチドのレトロインベルソ改変では、α−炭素の立体化学が対応するＬ−アミノ酸のα−炭素の立体化学とは反対であるアミノ酸（すなわち、Ｄ−アミノ酸またはＤ−ａｌｌｏ−アミノ酸）からの生来的なペプチド配列とは逆の順序での合成の組み立てを伴う。従って、レトロインベルソアナログは、逆になった末端および逆方向のペプチド結合を有しており、その一方で、生来的なペプチド配列におけるような側鎖のトポロジーを本質的には維持している。
【００６３】
本発明のペプチドのアミノ酸残基における保存された変化を含む上記アミノ酸修飾体のいずれかの取り込みは、本発明のペプチドの血管形成機能（例えば、内皮細胞の増殖、遊走、血管出芽、血管化）が保持される限り行われ得ることが理解される。このことを調べるために、本明細書中下記および下記の実施例の節に記載される血管形成アッセイのいずれかを行うことができる。
【００６４】
本発明のペプチドは、標準的な固相技術を使用することなどによって生化学的に合成することができる。これらの方法には、限定的固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合、古典的な溶液合成が含まれる。これらの方法は、好ましくは、ペプチドが比較的短い（すなわち、１０ｋＤａ）とき、および／または、ペプチドが組換え技術によって作製することができないとき（すなわち、核酸配列によってコードされ得ないとき）に利用され、従って、異なる化学を伴う。
【００６５】
固相ペプチド合成手法はこの分野では広く知られており、また、Ｊｏｈｎ  Ｍｏｒｒｏｗ  ＳｔｅｗａｒｔおよびＪａｎｉｓ  Ｄｉｌｌａｈａ  Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ（第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８４年）によってさらに記載される。
【００６６】
合成ペプチドは調製用高速液体クロマトグラフィーによって精製することができ［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  Ｔ．（１９８３）：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ＮＹ］、また、その組成をアミノ酸配列決定によって確認することができる。
【００６７】
組換え技術が、好ましくは、大量のペプチドが要求されるときには使用される。そのような組換え技術が、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜５４４；Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：６０〜８９；Ｂｒｉｓｓｏｎ他（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：５１１〜５１４；Ｔａｋａｍａｔｓｕ他（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：３０７〜３１１；Ｃｏｒｕｚｚｉ他（１９８４）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１６７１〜１６８０；およびＢｒｏｇｌｉ他（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８〜８４３；Ｇｕｒｌｅｙ他（１９８６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：５５９〜５６５；ならびに、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、、ＮＹ、第ＶＩＩＩ節、４２１頁〜４６３頁によって記載される。
【００６８】
組換え技術を使用して本発明のペプチドを作製するために、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１）が、本明細書中下記においてさらに記載されるように、核酸発現構築物に連結され、この場合、核酸発現構築物は、そのようなポリヌクレオチド配列を、構成的な組織特異的転写または誘導可能な転写を宿主細胞において行わせるために好適なプロモーター配列の転写制御下に含む。
【００６９】
挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現構築物はまた、発現ポリペプチドの安定性、産生、精製、収量または毒性を高めるために操作された配列を含むことができる。そのような融合タンパク質は、融合タンパク質がアフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、異種タンパク質について特異的なカラムでの固定化によって容易に単離され得るように設計することができる。切断部位がペプチド成分と異種タンパク質との間で操作される場合、ペプチドは、切断部位を分断する適切な酵素または薬剤を用いた処理によってクロマトグラフィーカラムから遊離させることができる［例えば、Ｂｏｏｔｈ他（１９８８）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９：６５〜７０；およびＧａｒｄｅｌｌａ他（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１５８５４〜１５８５９を参照のこと］。
【００７０】
様々な原核生物細胞または真核生物細胞を、ペプチドのコード配列を発現させるための宿主−発現系として使用することができる。これらには、微生物、例えば、ペプチドのコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌など；ペプチドのコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞系、または、ペプチドのコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換された植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現系もまた、本発明のペプチドを発現させるために使用することができる。細菌系が、好ましくは、本発明に従って組換えペプチドを産生させるために使用することができ、それにより、低コストでの大きな生産量を可能にする。
【００７１】
当業者に広く知られている他の発現系（例えば、昆虫および哺乳動物宿主細胞系など）もまた本発明によって使用することができる。
【００７２】
いずれの場合においても、形質転換された細胞が、大量の組換えペプチドの発現を可能にする効果的な条件のもとで培養される。効果的な培養条件には、タンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素の条件が含まれるが、これらに限定されない。効果的な培地は、細胞が、本発明の組換えペプチドを産生させるために培養される任意の培地を示す。そのような培地には、典型的に、資化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源と、適切な塩、ミネラル、金属と、他の栄養分（例えば、ビタミンなど）とを有する水溶液が含まれる。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリプレートにおいて培養することができる。培養は、組換え細胞について適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量において行うことができる。そのような培養条件は当業者の専門的技能の範囲内である。
【００７３】
産生のために使用されるベクターおよび宿主の系に依存して、得られる本発明のタンパク質は組換え細胞内に留まり得るか、または、発酵培地中に分泌され得るか、または、２つの細胞膜間の空間（例えば、大腸菌におけるペリプラスム空間など）に分泌され得るか、または、細胞膜もしくはウイルス膜の外側表面に保持され得るかのいずれかである。
【００７４】
培養での一定時間の後、組換えタンパク質の回収が行われる。表現「組換えタンパク質を回収する」は、タンパク質を含有する発酵培地全体を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を意味する必要はない。本発明のタンパク質は、様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差的可溶化を使用して精製することができるが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明のペプチドは、好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収される。本明細書中で使用される「実質的に純粋な」は、本明細書中に記載される様々な適用における本発明のタンパク質の効果的な使用を可能にする純度を示す。
【００７６】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のペプチドは、低酸素状態下でさえ対象の組織における血管形成（すなわち、血管化）を促進させるために使用することができる。
【００７７】
本明細書中で使用される用語「対象」は哺乳動物を示し、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマなどを示す。好ましくは、本発明の対象はヒトである。
【００７８】
本発明のこの態様の対象は、血管形成に依存した疾患または障害に罹患している場合がある。例には、遅発性の創傷治癒、遅発性の潰瘍治癒、生殖関連障害、動脈硬化症、心筋虚血、末梢虚血、脳虚血、網膜症、再構成障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病および遺伝性出血性毛細血管拡張症が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明のペプチドはまた、本明細書中上記で記載された任意の好適な投与様式を用いて対象に投与された核酸構築物から発現され得ることが理解される（すなわち、インビボ遺伝子治療）。あるいは、核酸構築物が、必要に応じて、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、相同組換えなど）および発現系によって好適な細胞に導入され、その後、改変された細胞が培養で拡大され、個体に戻される（すなわち、エクスビボ遺伝子治療）。しかしながら、本発明のペプチドの分泌を可能にするために、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１）は、好ましくは、読み枠が一致するシグナルペプチド（例えば、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬアクセション、ＶＥＧＢ＿ＨＵＭＡＮ）のシグナルペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。
【００８０】
本発明のペプチドの細胞発現を可能にするために、本発明の核酸構築物はさらに、少なくとも１つのシス作用調節エレメントを含む。本明細書中で使用される表現「シス作用調節エレメント」は、トランス作用調節因子と結合し、その下流側に位置するコード配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列（好ましくはプロモーター）を示す。
【００８１】
任意の利用可能なプロモーターを本発明の方法論によって使用することができる。本発明の好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物により利用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において活性である。細胞タイプ特異的プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターの例には、例えば、肝臓特異的であるアルブミンなどのプロモーター［Ｐｉｎｋｅｒ他（１９８７）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１：２６８〜２７７］、リンパ系特異的プロモーター［Ｃａｌａｍｅ他（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４３：２３５〜２７５］、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター［Ｗｉｎｏｔｏ他（１９８９）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、８：７２９〜７３３］および免疫グロブリンのプロモーター［Ｂａｎｅｒｊｉ他（１９８３）、Ｃｅｌｌ、３３７２９〜７４０］、ニューロン特異的プロモーター、例えば、ニューロフィラメントプロモーター［Ｂｙｒｎｅ他（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：５４７３〜５４７７］など、膵臓特異的プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈ他（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：９１２〜９１６］、または、乳腺特異的プロモーター、例えば、乳清プロモーター（米国特許第４８７３３１６号および欧州特許出願公開第２６４１６６号）が含まれる。本発明の核酸構築物はさらにエンハンサーを含むことができ、このエンハンサーはプロモーター配列に隣接し得るか、または、プロモーター配列から離れて存在することができ、かつ、プロモーターからの転写をアップレギュレーションすることにおいて機能し得る。
【００８２】
本発明の方法論の核酸構築物は、好ましくは、適切な選択マーカーおよび／または複製起点をさらに含む。好ましくは、利用される構築物はシャトルベクターであり、これは、大腸菌（この場合、構築物は適切な選択マーカーおよび複製起点を含む）において両方で増殖することができ、また、細胞における増殖のために、または、選ばれた遺伝子および組織における組み込みのために適合可能であり得る。本発明による構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が可能である。
【００８３】
現在好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルス構築物または非ウイルス構築物（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、および、脂質に基づく系など）を用いたトランスフェクションが含まれる。遺伝子の脂質媒介移入のための有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＡＭ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４〜５６（１９９６）］。遺伝子治療で使用されるほとんどの好ましい構築物はウイルスであり、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。ウイルス構築物（例えば、レトロウイルス構築物など）は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座規定エレメント、あるいは、他の手段（例えば、選択的スプライシング、ＲＮＡ核外輸送、または、メッセンジャーの翻訳後修飾など）によって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。そのようなベクター構築物はまた、ウイルス構築物に既に存在しない限り、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその一部、ならびに、使用されるウイルスに対して適切なプラス鎖プライマー結合部位およびマイナス鎖プライマー結合部位を含む。加えて、そのような構築物は、典型的に、構築物が置かれている宿主細胞からペプチドまたは抗体を分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物のシグナル配列である。場合により、構築物はまた、ポリアデニル化を行わせるシグナル、ならびに、１つまたは複数の制限部位、および翻訳終結配列を含むことができる。例として、そのような構築物は、典型的に、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’ＬＴＲまたはその一部を含む。非ウイルス性である他のベクターを使用することができる（例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマーなど）。
【００８４】
本発明のペプチドまたはそれをコードする核酸構築物は、それ自体で、あるいは、１つまたは複数のペプチドが医薬的に許容され得るキャリアと混合される医薬組成物の一部として個体に与えることができる。
【００８５】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【００８６】
本明細書中において、用語「有効成分」は、生物学的効果を説明することができるペプチド調製物またはそれをコードする核酸構築物を示す。
【００８７】
以降、交換可能に使用されうる表現「医薬的に許容され得るキャリア」および表現「生理学的に許容され得るキャリア」は、生物に対する著しい刺激を生じさせず、投与された化合物の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に含まれる。生理学的に許容され得るキャリアに含まれる成分の一つは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、有機媒体および水性媒体の両方における広範囲の溶解性を備える生物と共存可能なポリマーであることができる。
【００８８】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００８９】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００９０】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。
【００９１】
あるいは、例えば、患者の身体の特定部位に直接的に調製物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に調製物を投与しうる。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【００９３】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の医薬的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合することできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【００９４】
注射の場合、本発明の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【００９５】
経口投与の場合、化合物は、活性化合物をこの分野で広く知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に配合され得る。そのようなキャリアは、本発明の化合物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【００９６】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【００９７】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【００９８】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【００９９】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１００】
本明細書中に記載される調製物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、また、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１０１】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態での活性調製物の水溶液が含まれる。また、有効成分の懸濁物を適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１０２】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン非含有水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０１０３】
本発明の調製物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１０４】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、その意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、治療されている対象の病状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、治療されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分の量を意味する。
【０１０５】
治療効果的な量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１０６】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量は、最初はインビトロでアッセイから推定することができる。例えば、用量は動物モデルにおいて配合することが可能であり、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１０７】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における、インビトロで標準的な薬学的手法によって、明らかにすることができる。これらのインビトロでの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する投薬量範囲を決定するために使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ  ａｌ，（１９７５年）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ｐ．１参照）。
【０１０８】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行うことができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１０９】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている患者、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０１１０】
適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、適応される状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０１１１】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。
【０１１２】
内皮細胞に対するその選択的な結合のために、本発明のペプチドは、それに融合された薬剤をＥＣに対して標的化するために使用することができ、従って、過度な血管化によって特徴づけられる血管形成依存疾患の症状を処置するために、すなわち、そのような血管形成依存疾患の症状を治療し、または防止し、または実質的に軽減するために使用することができる。例えば、薬物を含むそのような融合物は、腫瘍の脈管構造を破壊することにより腫瘍成長を阻害するために使用することができる。
【０１１３】
そのような組成物に含めることができる薬物の例には、例えば、トキシン、例えば、細菌起源、菌類起源、植物起源または動物起源の酵素活性なトキシンまたはそのフラグメント［例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）のタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュウヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）のタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ［ニガウリ］（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）の阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセン類］、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、２１２Ｂｉおよび１９８Ｒｅ）および化学療法剤（例えば、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝拮抗剤、抗生物質、ピリミジンアナログ、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、またはコルチコステロイド類）が含まれるが、これらに限定されない。具体的な例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（すなわち、Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソール、トクソテレ、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、エスペラミシン類（米国特許第４６７５１８７号を参照のこと）、メルファランおよび他の関連するナイトロジェンマスタードが含まれる。この定義にはまた、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用するホルモン剤が含まれる（例えば、タモキシフェンおよびオナプリストンなど）。
【０１１４】
本発明のペプチドと薬物との融合物は、様々な二機能性のタンパク質カップリング剤を使用して、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣＬなど）、活性なエステル類（例えば、ジスクシンイミジルスベラートなど）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアナートなど）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などを使用して作製することができる。例えば、リシン融合物を、Ｖｉｔｅｔｔａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：１０９８（１９８７）に記載されるようにして調製することができる。炭素−１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドをペプチドにコンジュゲート化するための例示的なキレート化剤である。国際特許出願公開ＷＯ９４／１１０２６；米国特許第６４２６４００号；Ｌａｓｋｅ，Ｄ．Ｗ．、Ｙｏｕｌｅ、Ｒ．Ｊ．およびＯｌｄｆｉｅｌｄ，Ｅ．Ｈ．（１９９７）、悪性脳腫瘍患者における標的化されたトキシンＴＦ−ＣＲＭ１０７の局所的分布による腫瘍退行、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３：１３６２〜１３６８を参照のこと。
【０１１５】
増大しつつある一連の証拠は、血管形成がガンの進行にとって必須であることを示している。実際、新生血管分布の広がりは、原発性乳ガン、膀胱ガン、前立腺ガン、非小細胞肺ガン、皮膚メラノーマおよび子宮頸ガンにおける転移と強く相関させられる［Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、３６：１２７〜１３７（１９９５）］。従って、腫瘍の血管形成表現型を評価することにより、疾患の結果が強く示される。過度な血管化または不十分な血管化によって特徴づけられる他の疾患または状態には、本明細書中上記に記載される疾患だけでなく、網膜の血管新生、アテローム硬化性斑における血管新生、血管腫、関節炎および乾癬が含まれるが、これらに限定されない。Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜６３（１９９５）を参照のこと。
【０１１６】
従って、内皮細胞の細胞表面に特異的に結合する本発明のペプチドの能力は、血管化を強力に検出するものとしてのその使用を示唆する。このことは、血管形成依存疾患の存在を検出するために、または、血管形成依存疾患に対する素因を評価するために、または、血管形成依存疾患の進行をモニターするために重要であり得る。
【０１１７】
従って、本発明ではまた、生物学的サンプルにおける内皮細胞の存在または非存在を検出する方法が考えられる。
【０１１８】
この方法は、生物学的サンプルを、内皮細胞の細胞表面に結合することができる本発明のペプチドとインキュベーションすること、および、そのペプチドを検出し、それにより生物学的サンプルにおける内皮細胞の存在または非存在を検出することによって行われる。
【０１１９】
検出のために利用される生物学的サンプルは、好ましくは、生検試料などの組織サンプルである。組織生検物を哺乳動物から得る様々な方法がこの分野では広く知られている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅａｌｔｈａｔｏｚ．ｃｏｍ／ｈｅａｌｔｈａｔｏｚ／Ａｔｏｚ／ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔｍｌを参照のこと）。
【０１２０】
本発明の少なくとも１つのペプチドが、複合体形成のために好適な条件（すなわち、緩衝液、温度、インキュベーション時間など）のもとで生物学的サンプルと接触させられる。好適な条件が実施例の節の実施例１に記載される。
【０１２１】
生物学的サンプル内のペプチド−細胞複合体を、この分野で知られているいくつかの方法のいずれか１つによって検出することができ、そのような方法では、生化学的および／または光学的な検出スキームを用いることができる。
【０１２２】
複合体の検出を容易にするために、本発明のペプチドは、好ましくはタグまたは抗体によって目立つように標識される。標識化は、標識化方法に依存して、複合体形成の前に、または、複合体形成と同時に、または、複合体形成の後で行われ得ることが理解される。本明細書中で使用される用語「タグ」は、定量可能な活性または特徴を示す分子を示す。タグは、化学的蛍光体（例えば、フルオレセインなど）またはポリペプチド蛍光体（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または関連したタンパク質など）などが含まれる蛍光性分子である（ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）。そのような場合、タグは、好適な励起光を当てたときに生じるその蛍光によって定量することができる。あるいは、タグはエピトープタグ（特異的な抗体が、他の細胞エピトープと実質的に交差反応することなく結合することができるかなり特有のポリペプチド配列）である。そのようなエピトープタグには、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、ロイシンタグ、ＩｇＧタグおよびストレプトアビジンタグなどが含まれる。
【０１２３】
本発明のペプチドはまた、内皮細胞を強力に検出するものとしてインビボで使用され得ることが理解される。内皮細胞と結合することができる設計されたペプチドは、非放射能的に標識されている場合、または放射性同位体により標識されている場合であっても、この分野では広く知られているように、本明細書中上記で議論された血管形成依存疾患の発症または存在を診断するために個体に投与することができる。内皮細胞に対する投与後におけるそのような標識ペプチドの結合を、この分野で知られているインビボ画像化技術によって検出することができる。
【０１２４】
そのような検出方法はまた、血管形成の阻害または促進において有用な潜在的薬物を発見するためのアッセイにおいて利用され得ることが理解される。例えば、本発明は、試験化合物（すなわち、推定される血管形成分子）のハイスループットスクリーニングのために使用することができる。典型的に、本発明のペプチドは、アッセイ体積を減少させるために放射能標識される。本発明のペプチドは、試験化合物と結合させる前に、または、試験化合物と結合させるのと同時に、または、試験化合物と結合させた後で、内皮細胞と結合することができる。その場合、競合的アッセイが、試験化合物による標識の追い出しをモニターすることによって行われる［Ｈａｎ（１９９６）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１８：４５０６〜７；Ｅｓｌｅｒ（１９９６）、Ｃｈｅｍ．、２７１：８５４５〜８］。
【０１２５】
推定される血管形成分子が特定されると、その分子は、この分野では広く知られている血管形成アッセイを使用してさらに評価される。例には、ニワトリ漿尿膜、ウサギ角膜アッセイ、スポンジインプラントモデル、マトリゲルおよび腫瘍モデルが含まれるが、これらに限定されない（下記の実施例の節に記載されるアッセイもまた参照のこと）。
【０１２６】
本発明のペプチドは診断キットまたは治療キットに含めることができる。例えば、本発明のペプチドは、適切な緩衝液および保存剤とともに１つまたは複数の容器に詰めることができ、また、診断のために、または、治療的処置を導くために使用することができる。従って、本発明のペプチドは、例えば、それぞれを１つだけの容器において混合することができ、または、個々の容器に入れることができる。好ましくは、容器は標識を含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。
【０１２７】
加えて、他の添加剤（例えば、安定化剤、緩衝剤およびブロッキング剤など）もまた加えることができる。
【０１２８】
そのようなキットのペプチドはまた、固体支持体（例えば、ビーズおよびアレイ基板（例えば、チップ）など）に結合させ、診断目的のために使用することができる。
【０１２９】
キットに含まれるペプチド、または、基板に固定化されたペプチドは検出可能な標識（例えば、本明細書中上記に記載される標識など）にコンジュゲート化することができる。
【０１３０】
キットはまた、検査された対象が、調節障害が起こる血管形成に関連する状態、障害または疾患に罹患しているか、あるいは、そのような状態、障害または疾患を発症する危険性にあるかどうかを明らかにするための説明書を含むことができる。
【０１３１】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１３２】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１３３】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉ��ｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１３４】
実施例１
新規な潜在的血管形成誘導性ファージディスプレーペプチドの選択
血管形成を潜在的に誘導する新規なペプチドを、ヒト臍帯静脈内皮細胞［ＨＵＶＥＣ、ＥＣ（これら２つの略号は本明細書中を通して交換可能に使用される）］を使用するランダムなファージディスプレーペプチドライブラリーの陽性のアフィニティー選択（すなわち、バイオパンニング）、および続いてのＥＣに対する陽性ファージクローンの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により特定した。
【０１３５】
材料および実験方法
ファージディスプレーペプチドライブラリー。この研究で用いられたランダムファージディスプレーペプチドライブラリーをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、米国）から購入した。このファージディスプレーライブラリーは、Ｍ１３ファージの副コートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合されたランダムペプチド（１２量体）のコンビナトリアルライブラリーに基づいている。提示される１２量体ペプチドはｐＩＩＩのＮ末端において発現される。このライブラリーは約２．７×１０９個のエレクトロポレートされた配列からなり、一回増幅されると、１０μｌのファージ懸濁物に２０コピーの各配列をもたらす。
【０１３６】
ファージディスプレーペプチドライブラリーを、下記の異なるように処理されたＥＣを使用する５回の陽性のアフィニティー選択（バイオパンニング）によってスクリーニングした：ａ）処理を伴わない（正常酸素状態下の）ＥＣ、ｂ）３時間の低酸素状態処理後のＥＣ、およびｃ）２４時間の低酸素状態処理後のＥＣ。それぞれの陽性選択の前に、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を使用する負の選択を行った。各回のバイオパンニングを、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌによる結合ファージの溶出、および、第２のＥＣプレートにおける非結合ファージのインキュベーションによって行った。この手順を３回実行した。３回の溶出工程のファージを２回目およびそれ以降のバイオパンニングのためにプールした。５回目のバイオパンニングの後、スクリーニングされた各細胞群に由来する４０個の個々のクローンを単離し、その結果、合計で１２０個の個々のクローンを得た。
【０１３７】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）。ＨＵＶＥＣ（ＥＣ）を、以前の記載［Ｊａｆｆｅ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、５２（１１）：２７５７〜６４、１９７３］のようにコラゲナーゼ処理によって単離した。ＥＣを、２０％ＦＣＳ、１０４ユニットのペニシリン、１０ｍｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン、１０ｍｇ／ｍｌの硫酸ネオマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）、２５μｇ／ｍｌのＥＣ成長補充物（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｉｎｃ．、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ、米国）、および５Ｕ／ｍｌのヘパリン（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）が補充されたＭ１９９を用いて培養した。ＨＵＶＥＣを、トリプシン（０．２５％）、ＥＤＴＡ（０．０５％、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）を用いて集め、１％ゼラチンにより被覆された６０ｍｍペトリディッシュで２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、１０％ＦＣＳが補充されたＭ１９９を用いてインキュベーションした。ＥＣを４つの異なる処理に供した：ａ）非処理、ｂ）３時間の低酸素状態、ｃ）６時間の低酸素状態、またはｄ）２４時間の低酸素状態。その後、単層物をＰＢＳにより洗浄し、一晩乾燥させた。細胞を、５％ＦＣＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳにより再水和し、バイオパンニングまで４℃で維持した。
【０１３８】
低酸素状態処理。ＥＣを、低酸素状態チャンバー（Ｂｉｌｌｕｐｓ−Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ、Ｄｅｌｍａｒ、ＣＡ、米国）において、９４％Ｎ２、５％ＣＯ２および１％Ｏ２を含有する気体混合物中で、３時間、６時間または２４時間の低酸素状態に供した。
【０１３９】
ＥＬＩＳＡによる陽性クローンのスクリーニング。各群に由来する陽性クローンの結合をＥＬＩＳＡによって再評価した。この目的のために、正常酸素状態下のＥＣ、３時間、６時間または２４時間の低酸素状態の後のＥＣ、あるいは、ヒトＰＢＬ（コントロールとして）を２０×１０３細胞／ウエルで９６ウエルプレートに置床した。プレートを、３％ＢＳＡが補充されたＰＢＳにおける４℃での一晩のインキュベーションによって再水和させ、その後、ＰＢＳにより３回洗浄した。単離された１２０個のクローンのそれぞれに由来するファージを、１ウエルあたり１０１０個、１０９個または１０８個のファージの濃度でＥＬＩＳＡプレートに分散させ、室温で２時間インキュベーションした。その後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳにより３回洗浄し、その後、再蒸留水（ＤＤＷ）により３回洗浄した。洗浄後、抗Ｍ１３  ＨＲＰ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を１：５０００の希釈度で加え、室温で２時間インキュベーションし、その後、プレートをＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０の存在下で５回洗浄した。１００μｌのテトラメチルベンジジン液体基質（ＤＡＫＯ  ＴＭＢ基質発色原、ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、米国）を用いたＨＲＰ反応を１５分のインキュベーション時間の間行い、その後、反応を５０μｌの１Ｍ  ＨＣｌの添加によって停止させた。プレートを４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー（ＳＬＴ  ４００ＡＴＣ、ＳＬＴ  ＬＡＢ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オーストリア）で読み取った。
【０１４０】
統計学的方法およびグラフ的方法。統計学的分析を、適切な事後検定（一般に、コントロールに対する比較についてはＤｕｎｎｅｔｔ検定、または、多重比較についてはＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ＨＳＤ）を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行った。結果は、ｐ＜０．０５で統計学的に有意であると見なされた。
【０１４１】
結果
ＥＣと結合するペプチドを、ファージディスプレーペプチドライブラリーを使用して選択した。ファージディスプレーペプチドライブラリーを、生理学的状態（すなわち、正常酸素状態）下のＥＣまたは低酸素状態後のＥＣを使用する５回の陽性のアフィニティー選択（バイオパンニング）に供した。ペプチド提示ファージの選択の２番目の工程を、ＥＣおよびリンパ球被覆プレートをコントロールとして使用するＥＬＩＳＡによって行った。１５の異なるペプチド提示ファージを、１ウエルあたり１０９個のファージ（図１ａ）および１０１０個のファージ（図１ｂ）の濃度、４つの異なるＥＣ調製物（正常酸素状態にあるＥＣ、ならびに、３時間、６時間および２４時間の低酸素状態の後のＥＣ）に対するＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。図１ａおよび表３（下記）は、示された１０９個の選択されたファージのＡＮＯＶＡ分析を使用して明らかにされるように、統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）を、ＮＯファージ（すなわち、非改変Ｍ１３ファージ）の結合と、特定のペプチド提示ファージの結合との間で示した選択されたペプチドを例示する。
2008500015.tif 000006
【０１４２】
同様に、１０１０個のファージに対して行われたＡＮＯＶＡ分析を使用して選択された統計学的に有意なペプチド（ｐ＜０．０５）を図１ｂに示す。
【０１４３】
まとめると、これらの知見は、正常酸素状態または低酸素状態のいずれかのもとでＥＣと特異的に結合することができる特異的なペプチド提示ファージの特定を明らかにしている。
【０１４４】
実施例２
選択されたペプチド提示ファージは血管形成をインビトロで誘導することができる
血管形成をインビトロで誘導する選択されたペプチド提示ファージの能力を、ＥＣの増殖、遊走、または大動脈リングの出芽を誘導することによって評価した。
【０１４５】
材料および実験方法
選択されたペプチド提示ファージに由来するＤＮＡ配列の同定。すべての単離された選択クローンに由来するＤＮＡを、製造者の説明書（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、米国）に従ってヨウ化物緩衝液およびエタノールとのインキュベーションによって精製した。この迅速手法により、色素で標識されたジデオキシヌクレオチドを用いる自動化されたＤＮＡ配列決定のための十分な純度のテンプレートが得られる。９６ｇＩＩＩ（ＮＥＢ）配列決定プライマーが、Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ大学（Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ、イスラエル）の配列決定施設で自動化されたＤＮＡ配列決定のために利用された。
【０１４６】
ＥＣおよび低酸素状態処理。ＥＣを、本明細書中上記の実施例１に記載されるように、単離し、培養し、低酸素状態処理に供した。
【０１４７】
ＥＣ増殖アッセイ。ＥＣ（４０×１０３細胞／ウエル）を、１％ゼラチンにより被覆された２４ウエルプレートに播種し、２０％ＦＣＳ、１０４ユニットのペニシリン、１０ｍｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン、１０ｍｇ／ｍｌの硫酸ネオマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｋｉｂｂｕｔｚ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）、２５μｇ／ｍｌの内皮細胞成長補充物（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ、米国）、および５Ｕ／ｍｌのヘパリン（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）が補充されたＭ１９９培地の存在下でさらに培養した。２４時間後、細胞を、無血清培地（ＳＦＭ）を用いて洗浄し、ＳＦＭと３７℃でさらに２４時間インキュベーションした。その後、１ウエルあたり１０６個の選択されたファージを加え、プレートをさらに２４時間インキュベーションした。不成功のファージ（クローン化されたペプチドを有しないファージ）を陰性コントロールとして使用し、これをＮＯと呼ぶ。２μＣｉ／ウエルの［３Ｈ］−チミジン（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）をインキュベーションの終わりの６時間にわたって加え、その後、細胞を、１０％ＴＣＡを用いて４℃で１６時間固定し、無水エタノールを用いて洗浄した。細胞溶解のために、３７℃での１５分間、ＮａＯＨ（１ウエルあたり３００μｌの０．５Ｍ）をインキュベーションするために細胞に加え、その後、細胞溶解物を、２ｍｌのシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ、米国）を含有するシンチレーションバイアルに移し、βカウンター（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎβカウンター１６００ＴＲ、Ｐａｃｋａｒｄ  Ａ  Ｃａｍｂｅｒｒａ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ、米国）で計数した（ｃｐｍ／分）。
【０１４８】
ＥＣ遊走アッセイ。ＥＣの遊走を、製造者の説明書に従って、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＱＣＭ  ９６ウエル遊走アッセイ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国）によって評価した。簡単に記載すると、キットの遊走チャンバーは、８μｍの細孔を有するインサート膜と、ペプチドを化学誘引剤として含有するフィーダートレイとを含む。細胞の遊走を、細胞を遊走チャンバーに入れ、膜の底部へのその遊走を追跡することによって評価した。
【０１４９】
遊走／化学的誘引アッセイのために、継代数３に由来するＥＣを、Ｍ１９９ＳＦＭの存在下、ゼラチン被覆プレートで２４時間インキュベーションした。トリプシン処理の後、２×１０４個のＥＣを遊走チャンバーの９６ウエルのそれぞれにおいて５時間インキュベーションした。ペプチド提示ファージ（１０５個または１０６個）を、細胞と物理的に接触させることなくフィーダートレイに加えて、細胞を化学的に誘引させた。膜の底部に到達した細胞（すなわち、遊走細胞）を、細胞剥離緩衝液とのインキュベーションの後、膜から分離した。その後、遊走細胞を溶解し、細胞の核酸に結合したときに緑色蛍光の増強をもたらす分子プローブ（ＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ色素）によって検出した。
【０１５０】
活性化遊走アッセイのために、１０５個または１０６個のペプチド提示ファージを遊走チャンバーにおいてＥＣと（５時間）インキュベーションした。ＮＯファージ（非改変Ｍ１３ファージ）は両方の遊走アッセイにおいて陰性コントロールとして役立った。結果を４８０／５２０ｎｍで蛍光ＥＬＩＳＡリーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ  ＢＭＧ  Ｌａｂ  Ｔｅｃｋ）によって測定した。結果は、コントロールの値が引かれた正味の値で示される。
【０１５１】
大動脈リング形成アッセイ。ヒト哺乳動物の橈骨動脈の外膜をはぎ取り、１ｍｍの長さのリングに切断した。無菌の９６ウエルプレートの各ウエルの底を２０μｇのフィブロネクチン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）により被覆し、リングを、１０％ＦＣＳが補充された１５０ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含有する各ウエルの中心に設置した。大動脈リング形成のために、１０６個のペプチド提示ファージを各ウエルに加え、プレートを、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で７日間インキュベーションした。非改変Ｍ１３ファージ（ＮＯ）を陰性コントロールとして使用した。動脈リングを取り出し、細胞増殖の程度を、ＸＴＴアッセイ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を製造者の説明書に従って使用して見積もった。
【０１５２】
実験結果
様々なＥＣ処理細胞に由来する同一のＥＣ結合ペプチドの特長づけ。陽性で選択されたペプチド提示ファージのクローン化された領域のＤＮＡ配列分析により、様々なＥＣの中に、同一のクローンが存在することが明らかにされた。その上、いくつかのペプチド提示ファージ（例えば、ＶＬ、ＬＰ、ＴＲ）は、正常酸素状態下で成長した細胞（ＥＣ）および低酸素状態下で成長した細胞（Ｈ２４）の両方で共通していた。他のペプチド提示ファージ（例えば、ＹＲまたはＬＴ）が、３時間または２４時間の低酸素状態にさらされたＥＣからそれぞれ得られた。他方で、ＳＰは、３時間および２４時間の低酸素状態にさらされたＥＣに共通していたが、他のペプチド提示ファージ（例えば、ＳＴ、ＱＦ、ＮＳ）が、正常酸素状態下で成長したＥＣから得られた（表４、下記）。
2008500015.tif 000007
【０１５３】
ペプチド提示ファージはＥＣの増殖および遊走を誘導することができる。６個の個々のクローン（ＶＬ、ＬＴ、ＱＦ、ＳＰ、ＹＲおよびＴＲ）を、ＥＣの増殖および遊走を誘導する提示されたペプチドの能力について、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＱＣＭ  ９６ウエル遊走アッセイを使用して調べた。選択されたペプチドのＤＮＡ配列およびタンパク質配列を表５（下記）に示す。
2008500015.tif 000008
【０１５４】
図２に示されるように、６個の選択されたペプチド提示ファージのすべてが、改変されていない空のファージ（ＮＯ）と比較して、ＥＣの増大した増殖を（１０６個／ウエルの濃度で）誘導した。
【０１５５】
選択されたペプチド提示ファージはＥＣの遊走を誘導することができる。活性化されたＥＣのＥＣ遊走を誘導するペプチド提示ファージの能力を、ペプチド提示ファージをＥＣと一緒に遊走チャンバーに入れることによって調べた。調べられたペプチド提示ファージの２つ（ＱＦおよびＬＴ）が、活性化されたＥＣの遊走を１ウエルあたり１０５個のファージ（図３ａ）または１０６個のファージ（図３ｂ）の濃度で誘導した。他方で、ペプチド提示ファージを２つの異なる濃度でフィーダートレイに置くことにより、１ウエルあたり１０５個のファージで化学誘引剤として遊走を誘導する（６個のペプチド提示ファージのうちの）ＹＲの能力（図４ａ）、そして、１ウエルあたり１０６個のファージの濃度で化学誘引剤として遊走を誘導するＱＦ、ＳＰ、ＴＲおよびＬＴの能力（図４ｂ）が明らかにされた。
【０１５６】
ペプチド提示ファージによる大動脈リング出芽。大動脈リングを、ペプチド提示ファージの存在下での出芽について調べた。図５は、ペプチド提示ファージにより誘導された、大動脈リングに起源を有する細胞の増殖を明らかにする。６個のペプチド提示ファージを比較するＡＮＯＶＡ分析では、大動脈リングに由来する細胞の増殖における全体的な明らかな差が示された（Ｐ＝０．０００３）。加えて、事後検定では、統計学的に有意な差が、ＶＬペプチド提示ファージと、Ｓ２４空ファージコントロール（すなわち、ＮＯ）との間で示された。
【０１５７】
これらの結果は、本発明のペプチド提示ファージはＥＣの遊走および増殖を誘導することができること（すなわち、血管形成をインビトロで誘導することができる）を明らかにしている。
【０１５８】
実施例３
合成ペプチドは血管形成を正常酸素状態下でインビトロで誘導することができる
選択されたペプチド提示ファージに対応するペプチドを合成し、血管形成をインビトロで誘導するその能力を下記のように評価した。
【０１５９】
材料および実験方法
ペプチド合成。ペプチドはＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ、米国）によって合成された。ＨＰＬＣ純度分析により、各合成ペプチドの純度は９７％を超えていたことが明らかにされた。ペプチドＱＦを５０％水／５０％アセトニトリルに溶解した。他のペプチドはすべて、水に溶解した。
【０１６０】
合成ペプチドのフルオレセイン標識。フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）は、第一級アミンとアルカリ性環境において反応して、安定な蛍光性誘導体を形成するアミノ反応性プローブである。０．５Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解された１ｍｇのペプチドあたり１２．５μｌのＦＩＴＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、暗所で２時間撹拌した。その後、１ｍｌの反応混合物あたり０．１ｍｌの１．５Ｍヒドロキシルアミンを加え、室温でさらに３０分間撹拌した。非結合のＦＩＴＣをＰＢＳの存在下での透析によって除いた。
【０１６１】
ＥＣに対するペプチド結合。ＥＣを、１０％ＦＣＳが補充されたＭ１９９において培養した。ペプチド結合アッセイのために、細胞をトリプシン処理し、１０５個の細胞を、５％ＦＣＳおよび０．１％アジ化ナトリウムが補充されたＰＢＳに懸濁した。細胞を、１μｇ〜６μｇのＦＩＴＣ標識したペプチドの存在下で２時間（氷上、暗所で）インキュベーションし、その後、染色された細胞をＰＢＳにより２回洗浄した。サンプルを、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳｃａｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）によって分析した。コントロールについては０．５×１０６個のＰＢＬを利用した。
【０１６２】
合成ペプチドの存在下でのＥＣの増殖。補充物を含有するＥＢＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、米国）の存在下でＥＣをインキュベーションした。細胞を、０．２５％トリプシン／０．０５％（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いて集め、細胞を２５ｃｍ２フラスコあたり１０４個の細胞の濃度で再置床することによって細胞を３日毎に継代した。継代数３に由来するＥＣを増殖実験のために使用した。
【０１６３】
ＥＣ（１２×１０３細胞／ウエル）を、補充物を含有するＥＢＭ−２培地において２４ウエルプレートに播種した。２４時間のインキュベーションの後、細胞を、補充物を含まない培地（ＳＦＭ）での２４時間の飢餓に供した。合成ペプチド（ＳＰ、ＬＴ、ＴＲおよびＶＬ）をそれぞれ、０．０５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌの濃度で２４時間加えた。増殖アッセイのために、６時間、２μＣｉ／ウエルの［３Ｈ］−チミジン（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）をインキュベーションするために加え、その後、プレートをＰＢＳにより３回洗浄した。細胞溶解のために、プレートを３００μｌ／ウエルの０．５Ｍ  ＮａＯＨと３７℃で１５分間インキュベーションした。その後、細胞溶解物を、２ｍｌのシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ、米国）を含有するシンチレーションバイアルに移し、βカウンター（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎβカウンター１６００ＴＲ、Ｐａｃｋａｒｄ  Ａ  Ｃａｍｂｅｒｒａ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ、米国）で計数した（ｃｐｍ／分）。
【０１６４】
合成ペプチドの存在下での皮膚微小血管内皮細胞（ＭＶＥＣ）の増殖。ＭＶＥＣが、補充物を含有するＥＢＭ−ＭＶ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に播種され、かつ、（継代数３ではなく）継代数４に由来するＭＶＥＣが増殖実験のために使用されたことを除いて、ＭＶＥＣを、ＨＵＶＥＣ（ＥＣ）について上記に記載されるように、合成ペプチド（ＬＴ、ＳＰおよびＹＲ）とインキュベーションした。
【０１６５】
合成ペプチドの存在下での遊走アッセイ。ＥＣの遊走を、本明細書中上記の実施例２に記載されるように評価した。トリプシン処理後、ＥＣ（２５×１０３個）を遊走チャンバーにおいてインキュベーションした。化学誘引遊走アッセイのために、合成ペプチドを、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌでフィーダートレイに加え、細胞と５時間または１５時間インキュベーションした。遊走活性化アッセイのために、合成ペプチドを、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌで、遊走チャンバーにおいて細胞と５時間または１５時間インキュベーションした。
【０１６６】
ＭＶＥＣの遊走を、継代数３に由来するＭＶＥＣがＥＢＭ−ＭＶ  ＳＦＭでインキュベーションされたことを除いて、上記のように評価した。合成ペプチドを、化学誘引遊走アッセイのために、同様にまた、遊走アッセイの活性化のために、フィーダートレイに１０ｎｇ／ｍｌで加えた。遊走細胞の存在が、本明細書中上記の実施例２に記載されるように、４８０／５２０ｎｍで蛍光ＥＬＩＳＡリーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ  ＢＭＧ  Ｌａｂ  Ｔｅｃｋ）を使用して検出された。
【０１６７】
合成ペプチドによる大動脈リングの出芽。ヒト哺乳動物の橈骨動脈を、本明細書中上記の実施例２に記載されるように、９６ウエルプレートにおいて調製した。ペプチドを、大動脈リングを含有する各ウエルに、増大する濃度（１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌ）で加えた。プレートを、５％ＣＯ２の存在下、７日間、３７℃でインキュベーションした。動脈リングを取り出し、細胞増殖を、ＸＴＴアッセイ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を製造者の説明書に従って使用して評価した。
【０１６８】
管形成アッセイ。継代数３に由来するＥＣ、または、継代数４に由来するＭＶＥＣを、トリプシンを用いて集め、ＳＦＭで２４時間インキュベーションした。２４ウエルプレートを、還元された増殖因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）とともに２５０μｌのＣｕｌｔｒｅｘ基底膜抽出物により事前に被覆した。１０６個の細胞を含有する５００マイクロリットルの培地を被覆ウエルに移した。合成ペプチド（ＦＧＦ、ＹＲ、ＱＦまたはＶＬ）をＥＣに１０ｎｇ／ｍｌで加え、ＶＥＧＦ、ＹＲ、ＱＦまたはＶＬをＭＶＥＣに１０ｎｇ／ｍｌで加えた。プレートを、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で２４時間インキュベーションした。ＨＵＶＥＣおよびＭＶＥＣを、２０時間および８時間でそれぞれ、光学顕微鏡により写真撮影した。
【０１６９】
リアルタイムＰＣＲ。継代数３に由来するＭＶＥＣを、補充物を含まないＥＢＭ−ＭＶ培地（飢餓培地）で２４時間インキュベーションした。飢餓後、１ｎｇ／ｍｌの合成ペプチド（ＬＴ、ＱＦ、ＳＰ、ＴＲ、ＹＲおよびＶＬ）および１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦをプレートに加えた。１．５時間または６時間、インキュベーションした後、総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ、米国）を使用して抽出し、抽出されたＲＮＡの０．８μｇを、ランダムプライマー（ＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ、米国））を製造者の説明書に従って使用する逆転写（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）のためのテンプレートとして使用した。得られたｃＤＮＡを、ＡＢＩプリズム７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を使用してリアルタイムＰＣＲ増殖に供した。オリゴヌクレオチドプライマーを、ＶＥＧＦ−Ａ（アクセション番号：ＮＭ＿００３３７６）、ＶＥＧＦ−Ｃ（アクセション番号：ＮＭ＿００５４２９）、ＫＤＲ（アクセション番号：ＮＭ＿００２２５３）、ＦＬＴ−１（アクセション番号：ＮＭ＿００２０１９）、ＨＩＦ−α（アクセション番号：ＨＳＵ２２４３１）およびＧＡＰＤＨ（アクセション番号：ＮＭ＿００２０４６）の翻訳された領域に従って、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を使用して設計した。これらのオリゴヌクレオチドプライマーを表６（下記）に列挙する。簡単に記載すると、ＤＤＷ、オリゴヌクレオチドプライマー（５００ｎＭ）、ｃＤＮＡ（３μｌ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）からなる２０μｌの反応混合物を、４０サイクルについて９５℃で１５秒および６０℃で６０秒の増幅プログラムに供した。結果を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒソフトウエアバージョン１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。
2008500015.tif 000009
【０１７０】
統計学的方法およびグラフ的方法−実施例１（上記）を参照のこと。
【０１７１】
実験結果
合成ペプチドはインビトロでＥＣと結合する。６個の合成ペプチド（ＬＴ、ＱＦ、ＳＰ、ＴＲ、ＶＬおよびＹＲ；表５に示される）を、血管形成をインビトロおよびインビボで誘導する能力を評価するために合成した。ＥＣに対する上記合成ペプチドの特異的な結合を調べた。ペプチドをＦＩＴＣで標識し、ＥＣに対する結合をＦＡＣＳによって分析した。図６ａ〜図６ｉおよび図７に示されるように、合成ペプチドは、リンパ球（ＰＢＬ）に対してではなく、ＥＣに対して特異的に結合した。増大する濃度のペプチド（図６ｃ〜図６ｉ、赤色線）は、より低い濃度（図６ｃ〜図６ｉ、緑色線）と比較して、ＥＣに対する増大した結合（９４％〜９６％の結合）をもたらした。
【０１７２】
合成ペプチドは正常酸素状態下で増殖を誘導することができる。合成ペプチドを、正常酸素状態下でのＨＵＶＥＣの増殖に対するその影響についてアッセイした。ＥＣを２４ウエルプレートにＳＦＭ中で２４時間にわたって播種し、その後、合成ペプチドを、増大する濃度でさらに２４時間加えた。［３Ｈ］−チミジン取り込みの著しい用量依存的な増大が、ＬＴ、ＳＰ、ＴＲおよびＶＬのペプチドとインキュベーションされたＥＣにおいて認められた（図８ａ）。ＬＴ、ＴＲおよびＳＰのペプチドは、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌで、最大の増殖応答を誘導し、それぞれ、１．７倍、１．８倍および１．６倍の増大をもたらした。他方で、ＶＬは、１ｎｇ／ｍｌで、最大の増殖応答を誘導し、１．８倍の増大をもたらした。
【０１７３】
［３Ｈ］−チミジン取り込みにおける著しい増大がまた、ＬＴ、ＳＰまたはＹＲとインキュベーションされたＭＶＥＣについて明らかにされた（図８ｂ）。その増大は用量依存的な様式であり、最大の増殖応答が３つすべてのペプチドについて１ｎｇ／ｍｌの濃度においてであった。この濃度において、ＬＴ、ＹＲおよびＳＰは、ＭＶＥＣの増殖応答を、１．８倍、１．７倍および１．４倍、それぞれ増大させた（図８ｂ）。
【０１７４】
合成ペプチドによる細胞遊走。ＥＣ細胞遊走に対する合成ペプチドの影響を調べるために、合成ペプチドを、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌの濃度でフィーダートレイに加えた。用量依存的な誘導された遊走がＬＴ（図９ａ）およびＳＰ（図９ｂ）について認められた。影響は、高い濃度ではプラトーに達するようである（このことは薬物動態学に基づいて予測されると考えられる）。この誘引の正確な薬理学的プロフィルはさらなる研究を要する。誘導された遊走のより小さい作用が、化学誘引剤として使用されたとき、ＶＬおよびＴＲについて認められた（図９ｃ）。
【０１７５】
合成ペプチドはＥＣ細胞の遊走を活性化することができる。遊走を活性化することにおける合成ペプチドの有効性をさらに調べるために、合成ペプチドを遊走チャンバーにおいてＥＣとインキュベーションした。図１０は、これらのペプチドのそれぞれが、５時間の期間で、ペプチドが存在しないコントロールのＥＣよりも統計学的に有意な大きいＥＣ遊走を誘導することを例示する。しかしながら、１５時間までに、細胞の遊走は減少しており、その結果、統計学的な差が、いずれのペプチド処理された細胞と、コントロールの内皮細胞との間でも見られない（図１０）。
【０１７６】
ＭＶＥＣもまた、合成ペプチドの誘導により遊走することが示された。様々な試験ペプチドを用いて行われた実験では、ＭＶＥＣの遊走を用量依存的な様式で誘導する化学誘引剤としてのそれらの有効性が明らかにされた。図１１ａは、試験ペプチドのそれぞれが、５時間の期間で、ペプチドが存在しないコントロールの内皮細胞よりも大きい細胞遊走を誘導したことを例示する（結果は、コントロールの値が引かれた正味の値である）。１０ｎｇ／ｍｌにおいて、ＬＴ、ＱＦ、ＹＲ、ＳＰ、ＴＲおよびＶＬは、ＭＶＥＣの遊走において、３．５倍の増大、２．４倍の増大、２．４倍の増大、２倍の増大、２倍の増大および２倍の増大をそれぞれ誘導した。
【０１７７】
ＭＶＥＣはまた、合成ペプチドによって直接的に活性化された。ＴＲ、ＳＰ、ＱＦおよびＹＲはすべてが、１ｎｇ／ｍｌでＭＶＥＣの遊走を誘導することが示された（それぞれ、２．６倍、２．１倍、２．３倍および１．８倍）（図１１ｂ）。
【０１７８】
合成ペプチドによる大動脈リング出芽。ペプチド提示ファージについて以前に記載されたように、大動脈リングの誘導された出芽を、培養された大動脈リングに精製された合成ペプチドを異なる濃度で加えることによって評価した。４つのペプチド（ＱＦ、ＹＲ、ＬＴおよびＶＬ）を、大動脈リングにおける細胞増殖を誘導するそれらの能力について比較した。ペプチド間の（コントロールの光学濃度について補正された後での）明らかな差が、示されたペプチド濃度で認められた（図１２）。
【０１７９】
管形成。ＥＣおよびＭＶＥＣを、ペプチドの存在下、マトリゲル上でインキュベーションし、アレイ形成を分析した。ペプチド（ＹＲ、ＱＦおよびＶＬ）は、ＭＶＥＣに１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えられたとき、非処理の細胞（図１３ａ）と比較して、管形成の著しい増大をもたらした（図１３ｃ〜図１３ｅ）。この増大は、これらの細胞に対するＶＥＧＦの影響と類似していた（図１３ｂ）。ＥＣに加えられたとき、非処理の細胞（図１３ｆ）と比較して、増大した管形成の同じ作用が、これらのペプチドによって誘導された（図１３ｈ〜図１３ｊ）。この増大は、ＥＣに対するＦＧＦの作用と類似していた（図１３ｇ）。
【０１８０】
ペプチド提示ファージについて記載されたように、合成ペプチドは、ＥＣにおけるインビトロ血管形成作用をもたらし、誘導することができた。試験されたすべての血管形成作用において、調べられた合成ペプチドの少なくとも１つ（ほとんどの場合にはさらに多くではあったが）が、コントロールを上回る著しい作用を示した。これらの結果は、これらのペプチドはまたインビボ血管形成が可能であり得ることを示している。
【０１８１】
ＭＶＥＣにおける遺伝子発現に対するペプチドの影響。ＶＥＧＦ経路（血管形成プロセスに関係した主要な経路）に関連づけられる選択された遺伝子（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＫＤＲ、ＦＬＴ−１およびＨＩＦ−１α）のＭＶＥＣにおける遺伝子発現に対する合成ペプチドの影響を調べた。合成ペプチドを１ｎｇ／ｍｌで１．５時間および６時間にわたって加えた。ペプチドとのインキュベーションの後、ＲＮＡをＭＶＥＣから抽出し、リアルタイムＰＣＲを行った。遺伝子発現をペプチド／コントロール（ペプチド処理を伴わない細胞）の比率として計算した。
【０１８２】
異なるペプチドが、図１４ａ〜図１４ｅにおいて明らかにされるように、また、表７（下記）にまとめられるように、調べられた遺伝子の発現に対して様々な影響を示した。
2008500015.tif 000010
【０１８３】
本明細書中上記の表７に示されるように、調べられた６個のペプチドのすべてが、調べられた遺伝子のいくつかの発現を誘導することが示された。これらの結果から、これらのペプチドが血管形成を誘導する分子的機構がもたらされ得る。
【０１８４】
実施例４
合成ペプチドによるインビトロ誘導された血管形成に対する低酸素状態の影響
血管形成を誘導する選択されたペプチドの能力を、低酸素状態下での細胞結合、増殖、遊走および管形成の誘導によって評価した。
【０１８５】
材料および実験方法
ペプチド合成およびフルオレセイン標識。本明細書中上記の実施例３を参照のこと。
【０１８６】
ＥＣおよび低酸素状態。ＥＣを、本明細書中上記の実施例１に記載されるように、単離し、培養し、低酸素状態に供した。
【０１８７】
低酸素状態処理を伴うＥＣおよび低酸素状態処理を伴わないＥＣに対するペプチド結合のＦＡＣＳ分析。本明細書中上記の実施例３に記載されるように、ＥＣを低酸素状態にさらし、その後、ＦＡＣＳ分析のために調製した。細胞を６μｇのＳＰ標識ペプチドまたはＬＴ標識ペプチドにより染色した。サンプルを蛍光活性化細胞分取装置（ＦＡＣＳｃａｎ  Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣＡ、米国）によって分析した。
【０１８８】
合成ペプチドは低酸素状態処理後および低酸素状態処理下において増殖または遊走を誘導した。細胞増殖アッセイまたは細胞遊走アッセイを、細胞を３つの群（コントロール細胞、低酸素状態にさらされた後での細胞、または、低酸素状態下で増殖する細胞）に分けたことを除いて、本明細書中上記の実施例３に記載されるように行った。細胞増殖アッセイのために、ＥＣを、ＱＦ、ＬＴおよびＳＰとインキュベーションし、ＭＶＥＣを、ＬＴ、ＳＰおよびＹＲとインキュベーションした。細胞遊走アッセイのために、ＥＣをＥＢＭ−Ｍ２とインキュベーションし、ＭＶＥＣをＥＢＭ−ＭＶ培地とインキュベーションした。
【０１８９】
低酸素状態処理後および低酸素状態処理下での管形成アッセイ。管形成アッセイを、細胞を３つの群（コントロール細胞、低酸素状態にさらされた後での細胞、および、低酸素状態処理下で管を形成するマトリゲル基礎上の細胞）に分けたことを除いて、本明細書中上記の実施例３に記載されるように行った。
【０１９０】
統計学的方法およびグラフ的方法。本明細書中上記の実施例１に記載される通りに行った。
【０１９１】
実験結果
合成ペプチドは低酸素状態処理後のＥＣに結合する。ペプチド結合アッセイを、正常酸素状態下で成長したＥＣ、または、低酸素状態後のＥＣに対して行った。図１５および図１６ａ〜図１６ｂに示されるように、ＬＴおよびＳＰは、低酸素状態にさらされたＥＣに対する増大した結合を示したが、それ以外のペプチド（すなわち、ＱＦ、ＴＲ、ＶＬおよびＹＲ）は、両方の状態のもとでのＥＣに対する類似した強さの結合を示した。
【０１９２】
合成ペプチドは低酸素状態処理下および低酸素状態処理後において増殖を誘導した。ＥＣの増殖に対する合成ペプチド（ＱＦ、ＬＴおよびＳＰ）の影響を、コントロールと比較して、低酸素状態処理下および低酸素状態処理後において調べた。ＥＣを２４ウエルプレートに無血清培地において２４時間にわたって播種し、その後、合成ペプチドを様々な濃度でさらに２４時間にわたって細胞に加えた。
【０１９３】
図１７ａ〜図１７ｂは、低酸素状態処理下および低酸素状態処理後においてＬＴおよびＳＰのペプチドとインキュベーションされたＥＣにおける［３Ｈ］−チミジン取り込みの著しい用量依存的な増大を明らかにする。図１７ａに示されるように、ＬＴ（１０ｎｇ／ｍｌの濃度で）は低酸素状態処理後において細胞増殖の３．５倍の増大をもたらしたが、１ｎｇ／ｍｌでのＬＴは低酸素状態処理下において細胞増殖の１．７倍の増大をもたらした。同様に、ＳＰ（１０ｎｇ／ｍｌの濃度で）は低酸素状態処理後において細胞増殖を２倍増大させた（図１７ｂ）。他方で、ＱＦは、低酸素状態処理後または低酸素状態処理下において、内皮細胞の増殖における増大を示さなかった（図１７ｃ）。
【０１９４】
同じ状態のもとでのＭＶＥＣの増殖に対するこれらの合成ペプチド（ＱＦ、ＬＴおよびＳＰ）の影響もまた調べた。図１７ｄ〜図１７ｅは、低酸素状態処理後および低酸素状態処理下においてＬＴおよびＳＰのペプチドとインキュベーションされたＭＶＥＣにおける［３Ｈ］−チミジン取り込みの著しい用量依存的な増大を明らかにする。ＬＴは、１ｎｇ／ｍｌで低酸素状態後において、また、１０ｎｇ／ｍｌで低酸素状態下において、ＭＶＥＣの増殖を１．７倍増大させた（図１７ｄ）。ＳＰは、１０ｎｇ／ｍｌで、低酸素処理後のＭＶＥＣの増殖を１．５倍増大させ、１ｎｇ／ｍｌでは、低酸素状態下において１．９倍増大させた（図１７ｅ）。ＱＦは、正常酸素状態（図１７ｆ）と比較して、低酸素状態下におけるＭＶＥＣの増殖の増大を示さなかった。
【０１９５】
表８（下記）には、正常酸素状態のもと、低酸素状態の後、または、低酸素状態のもとでのＨＵＶＥＣまたはＭＶＥＣの細胞増殖に対する本発明の合成ペプチドの影響を調べる一群の実験がまとめられる。
2008500015.tif 000011
【０１９６】
表９（下記）には、ＨＵＶＥＣまたはＭＶＥＣの細胞遊走に対する本発明の合成ペプチドの影響を調べる一群の実験がまとめられる。
2008500015.tif 000012
【０１９７】
低酸素状態処理後および低酸素状態処理下での管形成アッセイ。ＥＣおよびＭＶＥＣの管形成に対する本発明の合成ペプチドの影響を、ＬＴ、ＳＰおよびＱＦのペプチドの存在下でのマトリゲル上でのそれらのインキュベーションによって調べた。
【０１９８】
正常酸素状態下での１０ｎｇ／ｍｌのＱＦペプチドの添加は、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦの作用と同様に、非処理のＥＣと比較して、管形成の著しい増大をもたらした（図１３ｄおよび図１３ｉ）。ＳＰおよびＬＴは正常酸素状態下では管形成を誘導しなかった（データは示されず）。しかしながら、ペプチドＳＰは、低酸素状態下での管形成においてのみ効果的であった（図１８ａ〜図１８ｅ）。
【０１９９】
表１０（下記）には、管形成に対する本発明の合成ペプチドの影響を調べる一群の実験がまとめられる。
2008500015.tif 000013
【０２００】
実施例５
ペプチド誘導によるインビボ血管形成
本発明の合成ペプチドを、マウスの耳モデルおよびラットまたはマウスの虚血性後肢モデルにおいてインビボ血管形成を誘導させるために使用した。
【０２０１】
材料および実験方法
マウスの耳モデルにおけるインビボ血管形成。耳血管形成研究は、以前に記載された方法（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、２０００）の改変であった。合成ペプチドを、マウスあたり１μｇ／１５μｌ、１０μｇ／１５μｌおよび２０μｇ／１５μｌの濃度で、ヌードマウスおよびＢａｌｂ／Ｃマウスの耳に皮下注射した。反対側の耳にはＰＢＳのみを注射した。デジタル写真を、注射後２日目、４日目、６日目および２０日目に得た。ペプチド接種後２日目に、ペプチドの血管形成作用を認めることができる。
【０２０２】
組織学的切片。血管形成ペプチドが注射されたマウス耳の組織学的切片を、組織を４％緩衝化ホルマリンにおいて固定することによって行った。切片をパラフィンブロックに包埋し、厚さ４μｍの層に切片化し、ヘマトキシリン−エオシンにより染色した。
【０２０３】
ラット虚血性後肢モデルおよびレーザードップラー画像装置分析。ラット虚血性後肢モデルを、選択された合成ペプチドにより誘導される血管形成のインビボ可能性を評価するために使用した。虚血を大腿動脈の結紮によってラットの左後肢に生じさせた。右後肢はコントロールとして役立った。手術後１日目に、ペプチドのそれぞれを、結紮に近い２カ所、および、結紮から遠い１カ所に注射した。各ラットを６００μの総量でペプチドのそれぞれにより処置した。
【０２０４】
血流を、ペプチド注射後２日、６日、９日および１３日で、レーザードップラー血流分析計（ＭｏｏｒＬＤＩ、Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅ）を使用して測定した。各足の平均灌流をコンピューター処理し、血流を虚血（左）／コントロール（右）の血流量比として表した。
【０２０５】
マウス虚血性後肢モデル。虚血を大腿動脈の結紮によってマウスの左後肢に生じさせた。右後肢はコントロールとして役立った。手術後１日目に、ペプチドのそれぞれを、結紮に近い１カ所、および、結紮から遠い１カ所に注射した。各マウスを１０μの総量でペプチドのそれぞれにより処置した。
【０２０６】
生理学的観察。虚血マウスを、手術後の１日目、４日目、７日目および１０日目に、はしごを登るその能力について評価した。スコア化システムは下記の通りであった：１−歩行し、かつ登る；２−歩行するが、若干の困難を伴って登る；３−歩行するが、はしごを登ることができない；４−歩行困難であり、はしごを登ることができない。
【０２０７】
虚血マウスにおける血液灌流。血液灌流パーセントを、ペプチド注射後の１４日および１９日で、レーザードップラー画像装置（ＰｅｒｉＭｅｄ、スウェーデン）を使用して測定した。各足の平均パーセント灌流をコンピューター処理し、虚血（左）／コントロール（右）の血流灌流比として表した。
【０２０８】
統計学的方法およびグラフ的方法。本明細書中上記の実施例１に記載される通りに行った。
【０２０９】
実験結果
マウス耳モデルにおけるインビボ血管形成。ヌードマウスまたはＢａｌｂ／Ｃマウスの耳への合成ペプチドまたはＶＥＧＦの注射は、１０μｇのＬＴ、ＹＲ、ＱＦおよびＳＰ（図１９ｂ〜図１９ｅ）またはＶＥＧＦ（図１９ａ）が注射されたマウスの耳における増大した数の血管をもたらした。耳の染色された切片の組織学的検査により、ペプチドが注射された耳において、血管の数の増大、および、血管新生の出現が明らかにされた（図２０ａ〜図２０ｂ、表１１、下記）。
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【０２１０】
表１２（下記）には、インビボでの耳の血管形成に対する本発明のペプチドの影響を調べる一群の実験から得られたデータがまとめられる。
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【０２１１】
ラット虚血性後肢モデルにおけるレーザードップラー分析。虚血性後肢の血流を、６００μｇのペプチドの注射の後、レーザードップラー血流分析計（ＭｏｏｒＬＤＩ、Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して、４つの時点（２日目、６日目、９日目および１３日目）において測定した。ペプチドにより処置されたラットの手術足／コントロール足のメジアン流束パーセントを、注射された各ペプチドについて計算した。ＱＦおよびＹＲのペプチドによるラットの処置は、虚血性足／コントロール足のメジアン流束の１１２．５パーセントの増大および１０８．２パーセントの増大をそれぞれ示した。
【０２１２】
はしごを登る虚血性マウスの能力の生理学的評価を、手術後の１日目、４日目、７日目および１０日目に行った。結果が表１３（下記）にまとめられる。
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【０２１３】
表１３（上記）に示される結果は、虚血マウスに存在する生理学的困難さの少なくともいくつか（例えば、はしごを登ること）を防止する本発明のペプチドの能力を明らかにしている。
【０２１４】
本発明の合成ペプチドの注射は虚血マウスにおける血液灌流を増大させる。血管形成をインビボで誘導する本発明の合成ペプチドの可能性をさらに調べるために、血液灌流パーセントを、ペプチド注射後１４日および１９日で、レーザードップラー画像装置（ＰｅｒｉＭｅｄ、スウェーデン）を使用して虚血マウスにおいて測定した。各足の平均パーセント灌流をコンピューター処理し、虚血（左）／コントロール（右）の血液灌流比として表した。著しい差がペプチド間で認められた（Ｐ＝０．０１０２）。表１４（下記）に示されるように、血液灌流比パーセントの著しい増大が、ＱＦおよびＹＲが注射されたマウスにおいて認められた。
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【０２１５】
まとめると、これらの結果は、本発明の合成ペプチド（特に、ＱＦおよびＹＲ）が血管形成性の抗虚血剤として使用されることを強く示唆している。
【０２１６】
実施例６
保存された配列モチーフ（配列番号１３）は、本発明のペプチドに起因すると考えられる血管形成機能を支援する
単離されたペプチドの配列分析により、本発明のペプチドのうちの３個〜４個（ＶＬ；ＱＦ、ＴＲ、および、おそらくはＹＲ）が共有する保存されたアミノ酸配列（配列番号２７または配列番号３２）が明らかにされた（図２２ａ〜図２２ｃを参照のこと）。
【０２１７】
この配列は、非常に類似するヒトホモログであるマウスの血管内皮増殖因子Ｂ前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセション：ＶＥＧＢ＿ＭＯＵＳＥ）も共有することが、ｅＭＯＴＩＦ走査ソフトウエア（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ大学、ｈｔｔｐ：／／ｄｎａ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｅｍｏｔｉｆ／ｅｍｏｔｉｆ−ｓｃａｎ．ｈｔｍｌ）によって見出された。下記のペプチド配列ＹＲ（共有）；ＬＴおよびＳＰは異なる群に属し得る。興味深いことに、これら２つのペプチド群が、２つの異なる試験条件のもとで単離され、第１のペプチド群（ＶＬ、ＱＦおよびＴＲ）が正常酸素状態のもとで単離され、第２のペプチド群（ＹＲ、ＬＴおよびＳＰ）が低酸素状態のもとで選択された。このことは、これら２つの群が、異なる細胞決定因子に結合するか、または、異なる親和性により結合することを示唆している。
【０２１８】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２１９】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許および特許願はすべて、個々の刊行物、特許および特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
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【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】図１ａ〜図１ｂは、正常酸素状態下のＥＣ、ならびに、低酸素状態の３時間後、６時間後および２４時間後のＥＣに対する、１ウエルあたり１０９個のファージ（図１ａ）または１０１０個のファージ（図１ｂ）の濃度でのペプチド提示ファージの結合を示す棒グラフである。
【図２】ＥＣの増殖に対するペプチド提示ファージの影響を示す棒グラフである。
【図３ａ】ＥＣの遊走に対するペプチド提示ファージの直接的な活性化の影響を示す棒グラフである。
【図３ｂ】ＥＣの遊走に対するペプチド提示ファージの直接的な活性化の影響を示す棒グラフである。
【図４】図４ａ〜図４ｂは、遊走チャンバーのフィーダートレイに加えられたペプチド提示ファージによるＥＣの化学的誘引を示す棒グラフである。
【図５】陰性コントロール（ＮＯファージ（非改変Ｍ１３ファージ））および陽性コントロール（血管形成分子（ＦＧＦ））と比較したときの、ペプチド提示ファージ（１０６個）の存在下での動脈リングにおけるＥＣの増殖を示す棒グラフである。
【図６】図６ａ〜図６ｉは、末梢血リンパ球またはＥＣに対する合成ペプチドの特異的な結合を示すグラフである。
【図７】ＰＢＬおよびＥＣに対する合成ペプチドの結合を明らかにする棒グラフである。
【図８】図８ａ〜図８ｂは、細胞増殖に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。
【図９ａ−ｂ】ＥＣの遊走に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。
【図９ｃ】ＥＣの遊走に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。
【図１０】ＥＣの遊走に対するペプチドインキュベーションの時間依存的な影響を示すグラフである。
【図１１】図１１ａ〜図１１ｂは、ＭＶＥＣの遊走に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。
【図１２】動脈リング出芽に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。
【図１３ａ】細胞の管形成に対するペプチドを示す顕微鏡写真である。
【図１３ｂ】細胞の管形成に対するペプチドを示す顕微鏡写真である。
【図１３ｃ】細胞の管形成に対するペプチドを示す顕微鏡写真である。
【図１３ｄ】細胞の管形成に対するペプチドを示す顕微鏡写真である。
【図１３ｅ】細胞の管形成に対するペプチドを示す顕微鏡写真である。
【図１３ｆ】細胞の管形成に対するペプチドを示す顕微鏡写真である。
【図１３ｇ】細胞の管形成に対するペプチドを示す顕微鏡写真である。
【図１３ｈ】細胞の管形成に対するペプチドを示す顕微鏡写真である。
【図１３ｉ】細胞の管形成に対するペプチドを示す顕微鏡写真である。
【図１３ｊ】細胞の管形成に対するペプチドを示す顕微鏡写真である。
【図１４ａ−ｂ】ＭＶＥＣにおける下記遺伝子の遺伝子発現に対する合成ペプチドの影響を示す棒グラフである。
【図１４ｃ−ｄ】ＭＶＥＣにおける下記遺伝子の遺伝子発現に対する合成ペプチドの影響を示す棒グラフである。
【図１４ｅ】ＭＶＥＣにおける下記遺伝子の遺伝子発現に対する合成ペプチドの影響を示す棒グラフである。
【図１５】低酸素状態処理の影響にさらされたＥＣに対する合成ペプチドの結合の強度を明らかにする棒グラフである。
【図１６】図１６ａ〜図１６ｂは、低酸素状態の影響にさらされたＥＣに対する合成ペプチドの結合の強度を示すグラフである。
【図１７ａ−ｂ】細胞増殖に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。
【図１７ｃ−ｄ】細胞増殖に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。
【図１７ｅ−ｆ】細胞増殖に対する合成ペプチドの影響を示すグラフである。
【図１８ａ−ｂ】低酸素状態のもとでのＨＵＶＥＣの管形成に対するＳＰの影響を示す顕微鏡写真である。
【図１８ｃ−ｄ】低酸素状態のもとでのＨＵＶＥＣの管形成（図１８ｃ）およびＭＶＥＣの管形成（図１８ｄ）に対するＳＰの影響を示す顕微鏡写真である。
【図１８ｅ】低酸素状態のもとでのＭＶＥＣの管形成に対するＳＰの影響を示す顕微鏡写真である。
【図１９ａ】マウスの耳の血管化に対する合成ペプチドの影響を示す顕微鏡写真である。
【図１９ｂ−ｃ】マウスの耳の血管化に対する合成ペプチドの影響を示す顕微鏡写真である。
【図１９ｄ−ｅ】マウスの耳の血管化に対する合成ペプチドの影響を示す顕微鏡写真である。
【図２０ａ】マウスの耳の血管化に対するＴＲペプチドの影響を示す顕微鏡写真である。
【図２０ｂ】マウスの耳の血管化に対するＴＲペプチドの影響を示す顕微鏡写真である。
【図２１】ラット虚血性後肢モデルにおける虚血性後肢／コントロールのメジアン流束を示す棒グラフである。
【図２２】図２２ａ〜図２２ｃは、本発明のペプチドと、マウスＶＥＧＦ−Ｂ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセション；ＶＥＧＢ＿ＭＯＵＳＥ）とが互いに有する保存された配列モチーフを発見したことを例示する。
【配列表フリーテキスト】
【０２２１】
配列番号１、３、５、７、９および１１はファージ提示ペプチドのＤＮＡ配列である。
配列番号２、４、６、８、１０および１２はファージ提示ペプチドである。
配列番号１３、２７および３２は保存された配列モチーフである。
配列番号１４は合成ペプチドである。
配列番号１５〜２６は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008500015.tif 000027
【図８】
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【図９ａ−ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４ａ−ｂ】
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【図１４ｃ−ｄ】
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【図１４ｅ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ−ｂ】
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【図１７ｃ−ｄ】
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【図１７ｅ−ｆ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１３ｅ】
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【図１３ｆ】
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【図１３ｇ】
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【図１３ｈ】
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【図１３ｉ】
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【図１３ｊ】
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【図１８ａ−ｂ】
2008500015.tif 000054
【図１８ｃ−ｄ】
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【図１８ｅ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ−ｃ】
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【図１９ｄ−ｅ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月4日(2006.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
配列番号６および配列番号１０からなる群から選択されるペプチド。
【請求項３】
配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、長さが最大でも５０アミノ酸残基である環状ペプチド。
【請求項４】
ペプチドは長さが最大でも５０アミノ酸残基である、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号２７または配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を含み、かつ、長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基である環状ペプチド。
【請求項６】
配列番号２７または配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を含み、かつ、長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基であるペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号６または配列番号１２によって示される、請求項５に記載の環状ペプチド。
【請求項８】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群からそれぞれが独立して選択される、少なくとも２つのペプチドを含む組成物。
【請求項９】
請求項６に記載のペプチドの治療効果的な量と、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
活性成分としての、配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドと、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
血管形成を促進させるために特定された医薬品の製造のための、請求項６に記載のペプチドの使用。
【請求項１２】
血管形成を促進させるために特定された医薬品の製造のための、配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドの使用。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のペプチドであって、配列番号６または配列番号１０によって示されるようなペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項１４】
請求項５または７に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項１５】
薬物を内皮細胞に対して標的化するための組成物であって、配列番号２または配列番号４のペプチドに融合された薬物を含む組成物。
【請求項１６】
推定される血管形成分子を特定する方法であって：
（ａ）配列番号１、配列番号６、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有し、かつ、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドが結合している内皮細胞を提供する；および
（ｂ）前記内皮細胞から前記ペプチドを追い出すことができる分子を特定し、それにより、推定される血管形成分子を特定する
ことを含む方法。
【請求項１７】
ペプチドは線状ペプチドである、請求項２または６に記載のペプチド。
【請求項１８】
ペプチドは線状ペプチドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ペプチドは線状ペプチドである、請求項１２に記載の使用。
【請求項２０】
ペプチドは環状ペプチドである、請求項２または６に記載のペプチド。
【請求項２１】
ペプチドは環状ペプチドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ペプチドは環状ペプチドである、請求項１２に記載の使用。
【請求項２３】
前記ペプチドは環状ペプチドであり、前記アミノ酸配列は配列番号２、配列番号６および配列番号１２からなる群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ペプチドは環状ペプチドであり、前記アミノ酸配列は配列番号２、配列番号６および配列番号１２からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項２５】
ペプチドは配列番号２、配列番号６または配列番号１２によって示される、請求項５に記載の環状ペプチド。
【請求項２６】
アミノ酸配列は配列番号６によって示される、請求項６に記載のペプチド。
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月14日(2007.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
配列番号６および配列番号１０からなる群から選択されるペプチド。
【請求項３】
配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、長さが最大でも５０アミノ酸残基である環状ペプチド。
【請求項４】
ペプチドは長さが最大でも５０アミノ酸残基である、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号２７または配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を含み、かつ、長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基である環状ペプチド。
【請求項６】
配列番号２７または配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を含み、かつ、長さが少なくとも６アミノ酸残基で、最大でも５０アミノ酸残基であるペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号６または配列番号１２によって示される、請求項５に記載の環状ペプチド。
【請求項８】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群からそれぞれが独立して選択される、少なくとも２つのペプチドを含む組成物。
【請求項９】
有効成分として請求項６に記載のペプチドと、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
有効成分としての、配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドと、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
血管形成を促進させるために特定された医薬品の製造のための、請求項６に記載のペプチドの使用。
【請求項１２】
血管形成を促進させるために特定された医薬品の製造のための、配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであって、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドの使用。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のペプチドであって、配列番号６または配列番号１０によって示されるようなペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項１４】
請求項５または７に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項１５】
薬物を内皮細胞に対して標的化するための組成物であって、配列番号２または配列番号４のペプチドに融合された薬物を含む組成物。
【請求項１６】
推定される血管形成分子を特定する方法であって：
（ａ）配列番号１、配列番号６、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有し、かつ、長さが最大でも５０アミノ酸残基であるペプチドが結合している内皮細胞を提供する；および
（ｂ）前記内皮細胞から前記ペプチドを追い出すことができる分子を特定し、それにより、推定される血管形成分子を特定する
ことを含む方法。
【請求項１７】
ペプチドは線状ペプチドである、請求項２または６に記載のペプチド。
【請求項１８】
ペプチドは線状ペプチドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ペプチドは線状ペプチドである、請求項１２に記載の使用。
【請求項２０】
ペプチドは環状ペプチドである、請求項２または６に記載のペプチド。
【請求項２１】
ペプチドは環状ペプチドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ペプチドは環状ペプチドである、請求項１２に記載の使用。
【請求項２３】
前記ペプチドは環状ペプチドであり、前記アミノ酸配列は配列番号２、配列番号６および配列番号１２からなる群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ペプチドは環状ペプチドであり、前記アミノ酸配列は配列番号２、配列番号６および配列番号１２からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項２５】
ペプチドは配列番号２、配列番号６または配列番号１２によって示される、請求項５に記載の環状ペプチド。
【請求項２６】
アミノ酸配列は配列番号６によって示される、請求項６に記載のペプチド。
【国際調査報告】
2008500015.tif 000069
2008500015.tif 000070
2008500015.tif 000071
2008500015.tif 000072