(57)【要約】  親発酵肉汁の細胞塊からＫ−２５２ａを分離する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｋ−２５２ａをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
（ａ）親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外Ｋ−２５２ａを伴っている段階；
（ｂ）前記親発酵肉汁およびＫ−２５２ａが溶解度を有し前記親発酵肉汁が実質的に分離可能な乳濁液を形成する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびＫ−２５２ａを含む段階；および
（ｃ）前記溶媒で段階（ｂ）を繰り返すか繰り返さず、そして前記Ｋ−２５２ａを単離する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記溶媒がアセトン、酢酸メチル、メチルテトラフランまたはそれらの混合物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶媒が酢酸メチルである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶媒がメチルテトラヒドロフランである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記溶媒がアセトンである請求項２に記載の方法。
【請求項６】
Ｋ−２５２ａをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
（ａ）親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外Ｋ−２５２ａを伴っている段階；
（ｂ）前記親発酵肉汁および酢酸メチルを混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記酢酸メチル、水およびＫ−２５２ａを含む段階；および
（ｃ）前記肉汁からの単離抽出物で段階（ｂ）を繰り返すか繰り返さず、そして前記Ｋ−２５２ａを単離する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項７】
Ｋ−２５２ａをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
（ａ）親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外Ｋ−２５２ａを伴っている段階；
（ｂ）前記親発酵肉汁およびメチルテトラヒドロフランを混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記酢酸メチル、水およびＫ−２５２ａを含む段階；および
（ｃ）前記肉汁からの単離抽出物で段階（ｂ）を繰り返すか繰り返さず、そして前記Ｋ−２５２ａを単離する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項８】
Ｋ−２５２ａをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
（ａ）親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外Ｋ−２５２ａを伴っている段階；
（ｂ）前記親発酵肉汁およびアセトンを混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記酢酸メチル、水およびＫ−２５２ａを含む段階；および
（ｃ）前記肉汁からの単離抽出物で段階（ｂ）を繰り返すか繰り返さず、そして前記Ｋ−２５２ａを単離する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項９】
Ｋ−２５２ａをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
（ａ）親発酵肉汁から単離細胞塊を提供する段階であって、前記単離細胞塊が、水および細胞内または細胞外Ｋ−２５２ａを伴っている段階；
（ｂ）前記細胞塊およびＫ−２５２ａが溶解度を有する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびＫ−２５２ａを含む段階；および
（ｃ）前記溶媒で段階（ｂ）を繰り返すか繰り返さず、そして前記Ｋ−２５２ａを単離する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
Ｋ−２５２ａをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
（ａ）親発酵肉汁から単離細胞塊を提供する段階であって、前記単離細胞塊が、水および細胞内または細胞外Ｋ−２５２ａを伴っている段階；
（ｂ）前記細胞塊およびＫ−２５２ａが溶解度を有する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびＫ−２５２ａを含む段階；および
（ｃ）前記単離抽出物で段階（ｂ）を繰り返すか繰り返さず、そして前記Ｋ−２５２ａを単離する段階
を有することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親発酵肉汁からＫ−２５２ａを分離する方法に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
本明細書においてＫ−２５２ａとされる化合物は、医薬として有用な化合物の合成における中間体である。しかしながら、Ｋ−２５２ａの大量生産では、それが親発酵肉汁の細胞塊から容易に分離できないことが障害となっている。従って、Ｋ−２５２ａをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法が、工程および治療の業界において現在も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
従って本発明の１実施形態は、Ｋ−２５２ａをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
（ａ）親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外Ｋ−２５２ａを伴っている段階；
（ｂ）前記親発酵肉汁およびＫ−２５２ａが溶解度を有し前記親発酵肉汁が実質的に分離可能な乳濁液を形成する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびＫ−２５２ａを含む段階；および
（ｃ）前記溶媒で段階（ｂ）を繰り返すか繰り返さず、そして前記Ｋ−２５２ａを単離する段階
を有することを特徴とする方法に関するものである。
【０００４】
別の実施形態は、Ｋ−２５２ａをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
（ａ）親発酵肉汁を提供する段階であって、前記親発酵肉汁が水および細胞塊を含み、前記細胞塊が細胞内または細胞外Ｋ−２５２ａを伴っている段階；
（ｂ）前記親発酵肉汁およびＫ−２５２ａが溶解度を有し前記親発酵肉汁が実質的に分離可能な乳濁液を形成する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびＫ−２５２ａを含む段階；および
（ｃ）前記肉汁からの単離抽出物で段階（ｂ）を繰り返すか繰り返さず、そして前記Ｋ−２５２ａを単離する段階
を有することを特徴とする方法に関するものである。
【０００５】
さらに別の実施形態は、Ｋ−２５２ａをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
（ａ）親発酵肉汁から単離細胞塊を提供する段階であって、前記単離細胞塊が水および細胞内または細胞外Ｋ−２５２ａを伴うものである段階；
（ｂ）前記細胞塊およびＫ−２５２が溶解度を有する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびＫ−２５２ａを含む段階；および
（ｃ）前記溶媒で段階（ｂ）を繰り返すか繰り返さず、そして前記Ｋ−２５２ａを単離する段階
を有することを特徴とする方法に関するものである。
【０００６】
さらに別の実施形態は、Ｋ−２５２ａをそれの親発酵肉汁の細胞塊から分離する方法において、
（ａ）親発酵肉汁から単離細胞塊を提供する段階であって、前記単離細胞塊が水および細胞内または細胞外Ｋ−２５２ａを伴うものである段階；
（ｂ）前記細胞塊およびＫ−２５２が溶解度を有する溶媒を混合し、抽出物を単離する段階であって、前記抽出物が前記溶媒、水およびＫ−２５２ａを含む段階；および
（ｃ）前記肉汁からの単離抽出物で段階（ｂ）を繰り返すか繰り返さず、そして前記Ｋ−２５２ａを単離する段階
を有することを特徴とする方法に関するものである。
【０００７】
さらに別の実施形態は、前記のいずれかの方法によって製造されるＫ−２５２ａに関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本明細書で使用される「Ｋ−２５２ａ」という用語は、下記式（Ｉ）を有する化合物を意味する。
【０００９】
【化１】
2008536521.tif 000002
【００１０】
本発明に関して、Ｋ−２５２ａには、（１Ｒ，２Ｓ，４Ｒ）−２，４−（６，７，１２，１３−テトラヒドロ−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５−オンジイル）−１−ヒドロキシ−２−メチルテトラヒドロフランカルボン酸メチルという名称が割り当てられている。
【００１１】
Ｋ−２５２ａは、乾癬または急性骨髄性白血病の治療において有用であり得る下記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）を有する化合物の合成における有用な中間体である。
【００１２】
【化２】
2008536521.tif 000003
【００１３】
親発酵肉汁は、１ｋｇ当たり約１ｇ〜４ｇのＫ−２５２ａを含むことが認められている。親発酵肉汁の細胞塊からＫ−２５２ａを分離するのが困難なことは、文献で報告されている（Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(8), 1627-1629, 1998）。理論に拘束されるものではないが、その困難さは、少なくとも一部において、肉眼で観察できる界面層の形成を妨害する実質的に分離できない乳濁液の形成によるものであると考えられている。従って、本明細書で使用される「実質的に分離可能な乳濁液」という表現は、それぞれ肉眼観察可能な界面層または層を有する２以上の相を意味する。本明細書で使用される「界面層」という用語は、２以上の本質的に不混和性の溶媒の混合物中でそれらの溶媒が出会う箇所を意味する。
【００１４】
本明細書で使用される「溶媒」という用語は、液体物質または複数の液体物質の混合物を意味する。本発明の実施における溶媒の例には、アセトン、エタノール、イソプロパノール、メタノール、酢酸エチル、メチルテトラヒドロフラン（ＭＴＨＦ）、酢酸メチル、それらの混合物および前記のものと水の混合物などがあるが、それらに限定されるものではない。
【００１５】
理解すべき点として、多くの溶媒が不純物を含むことから、不純物が存在する場合、本発明の実施における溶媒中の不純物のレベルは、それらを含む溶媒の所期の用途をそれらが妨害しないだけの低濃度である。
【００１６】
さらに理解すべき点として、本質的に不混和性の溶媒の混合物の場合、一つの溶媒が別の溶媒中に若干可溶である可能性があるが、肉眼観察可能な界面層が形成される上で十分な溶媒間の溶解度差がある。
【００１７】
表１は、２２℃での各種溶媒中のＫ−２５２ａの溶解度を示している。
【００１８】
【表１】
2008536521.tif 000004
【００１９】
親発酵肉汁が実質的に分離可能な乳濁液を形成する一つの液体物質で親発酵肉汁を抽出する場合に、本発明の実施において好ましい溶媒には、メチルテトラヒドロフランおよび酢酸メチルなどがあるがこれらに限定されるものではない。
【００２０】
親発酵肉汁が実質的に分離可能な乳濁液を形成する複数の液体物質の混合物で親発酵肉汁を抽出する場合に、本発明の実施において好ましい溶媒には、ＴＨＦ、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールと組み合わせた酢酸エチルまたは酢酸イソプロピルなどがあるがこれらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明の方法の際に、実質的に細胞塊の凝集、単離および除去を含む段階を用いて、Ｋ−２５２ａの抽出、単離または精製を容易にすることができる。細胞塊の凝集、単離または除去は、限外濾過膜を用いたり、または遠心および傾斜法除去によって行うことができる。これらの技術のいずれかを親発酵肉汁について用いる場合、少量の残留水および細胞内または細胞外Ｋ−２５２ａを伴う単離細胞塊を得ることができる。親発酵肉汁の抽出に代えて単離細胞塊を抽出する利点は、その場合には、より広い範囲の溶媒を使用可能であるという点である。
【００２２】
例えば、肉汁／溶媒比が約１：≦１での酢酸エチル、酢酸イソプロピルまたはＴＨＦによる親発酵肉汁の単独抽出では、分離できない乳濁液が形成された。しかしながら同じ肉汁／溶媒比でのＴＨＦ、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールと組み合わせた酢酸エチルまたは酢酸イソプロピルによって、肉汁／溶媒比約１：２で酢酸メチル単独での場合のように、実質的に分離可能な乳濁液が得られた。
【００２３】
最終肉汁／溶媒比が約１：８での酢酸メチルによる親発酵肉汁の連続２回抽出では、Ｋ−２５２ａがほぼ定量的に回収されたが、より好ましい方法では、最初の抽出からの単離抽出物を、同じ親発酵肉汁の第２の抽出に用いて、同様の結果を得た。理論に拘束されるものではないが、第１の抽出物中の水がＫ−２５２ａの溶解度を高めて、より好適な第２の抽出媒体を与えたと考えられる。
【００２４】
Ｋ−２５２ａの単離は、溶媒除去によって行うことができ、それ以上の精製は行う場合と行わない場合がある。Ｋ−２５２ａの精製は、濾過、再結晶、カラムクロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせなどの当業界で公知の従来の手段によって行うことができる。
【００２５】
下記の実施例および表は、本発明の手順および概念的な態様の最も有用かつ容易に理解される説明であると考えられているものを提供するためのものである。
【００２６】
（実施例１）
酢酸メチルによる抽出
肉汁基準のパーセント
Ｋ−２５２ａを含むノカルディオプシス（Nocardiopsis）種が産生した親発酵肉汁を酢酸メチル（体積比１：４）と混合し、第１の抽出物を単離した。肉汁を再度新鮮な酢酸メチルで抽出し（体積比１：４）、第２の抽出物を単離した。Ｋ−２５２ａを含む別の親発酵肉汁を第１の抽出物と混合し、第３の抽出物を単離した。次に、第２の親発酵肉汁を第２の抽出物で抽出し、第４の抽出物を単離した。これらの４つの抽出物を用いて各肉汁を再抽出し、合わせ、ブラインで２回洗浄し、濃縮した。
【００２７】
注：抽出は、肉汁および酢酸メチルを混合し、沈降（重力）または遠心後に抽出物を単離することで行うことができる。
【００２８】
濃縮物をメチルテトラヒドロフラン（１．０：０．０６７（重量比））に溶かし、その溶液をＦＩＬＴＲＯＬ（登録商標）（１．０：０．００１７（重量比））で処理し、７０℃で少なくとも１５分間攪拌し、濾過し、濃縮した。濃縮物のメタノール溶液（１．０：０．０３（重量比））を少なくとも１時間還流させ、冷却して２２℃とし、４時間攪拌し、濾過した。濾過物をメタノール（１．０：０．０１（重量比））で洗浄し、６０℃で１６時間乾燥させて、Ｋ−２５２ａの推定量の８８％および９４％を得た。
【００２９】
（実施例２）
メチルテトラヒドロフランによる抽出
肉汁基準のパーセント
Ｋ−２５２ａを含む親発酵肉汁を遠心および傾斜法分離した（その後、残った細胞塊を水で処理し（１：２重量比）、５分間攪拌し、遠心し、傾斜法分離しても良い）。残りの細胞塊をメチルテトラヒドロフラン（１：１．２５（重量比））で５分間抽出し、遠心し、傾斜法分離し、この手順を繰り返した。合わせた抽出物をブライン（１：０．３７５（重量比））で２回洗浄し、ＦＩＬＴＲＯＬ（登録商標）フィルター助剤（１：０．００２５（重量比））で処理し、７０℃で１５分間攪拌し、熱濾過し、濃縮した。濃縮物のメタノール溶液（１．０：０．０３（重量比））を１時間還流し、冷却して２２℃とし、４時間攪拌し、濾過した。濾過物をメタノール（１．０：０．０１（重量比））で洗浄し、６０℃で１６時間乾燥させて、Ｋ−２５２ａの推定量の１００％を得た。
【００３０】
（実施例３Ａ）
アセトンによる抽出
肉汁基準のパーセント
Ｋ−２５２ａを含む親発酵肉汁を遠心および傾斜法分離した（その後、残った細胞塊を水で処理し（１：２重量比）、５分間攪拌し、遠心し、傾斜法分離しても良い）。残りの細胞塊をアセトン（１：１．０５（重量比））で５分間抽出し、遠心し、傾斜法分離し、この手順を繰り返した。合わせた抽出物をＦＩＬＴＲＯＬ（登録商標）（１：０．００２（重量比））で処理し、２２℃で１５分間攪拌し、濾過し、濃縮して、最初の容量の約２／１０とした。メタノール（１：０．０５（重量比））を加え、蒸留することで最初の容量とすることによって、残ったアセトンを除去した。濃縮物をメタノール（１：０．１（重量比））で処理し、７０℃で１時間、次に２２℃で４時間攪拌し、濾過し、水またはメタノールで洗浄し（１：０．０２（重量比））、風乾して、湿ケーキを得た。
【００３１】
（実施例３Ｂ）
湿ケーキ基準のパーセント
前記湿ケーキを２５％（重量基準）メタノール／アセトン（１：２０（重量比））およびＦＩＬＴＲＯＬ（登録商標）（１：０．５（重量比））で処理し、得られたスラリーを１時間還流し、熱濾過し、２５％（重量比）メタノール／アセトン（１：５（重量比））で洗浄し、濃縮して半分の容量とし、メタノール（１：１０（重量比））で処理し、１時間還流し、冷却して２２℃とし、４時間攪拌し、濾過した。濾過物をメタノール（１：５（重量比））で洗浄し、６０℃〜６５℃で１６時間真空乾燥して、Ｋ−２５２ａの推定量の９５％を得た。
【００３２】
（実施例４）
酢酸エチル／エタノール混合物による抽出
Ｋ−２５２ａを含む親発酵肉汁（１００ｍＬ；肉汁力価：１．４２ｍｇ／ｍＬ）を酢酸エチル（１０ｍＬ）／エタノール（５０ｍＬ）で抽出し、次に酢酸エチル（７０ｍＬ）／エタノール（１０ｍＬ）で２回抽出して、それぞれＫ−２５２ａ（ＨＰＬＣ）を８２％、１５％および３％含む抽出物を得た。抽出物を合わせ、ハイフロ（hyflo）層で濾過し、濃縮してほぼ乾固させた。濃縮物をメタノール（６ｍＬ）で処理し、冷却して室温とし、濾過した。濾過物を最少量のメタノールで洗浄し、６０℃で真空乾燥してＫ−２５２ａを得た（１３６ｍｇ）。
【００３３】
（実施例５）
酢酸イソプロピル／イソプロパノールによる抽出
Ｋ−２５２ａを含有する親発酵肉汁（１００ｍＬ；肉汁力価：１．４２ｍｇ／ｍＬ）を酢酸イソプロピル（９０ｍＬ）／イソプロパノール（５０ｍＬ）で抽出し、次に酢酸イソプロピル（８０ｍＬ）／イソプロパノール（２０ｍＬ）で２回抽出して、それぞれＫ−２５２ａ（ＨＰＬＣ）を７８％、１１％および１１％含む抽出物を得た。抽出物を合わせ、ハイフロ層で濾過し、濃縮してほぼ乾固させた。残留物をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶かし、ハイフロ層で濾過し、濃縮してほぼ乾固させた。濃縮物をメタノール（５ｍＬ）で処理し、冷却して室温とし、濾過した。濾過物をメタノール（４ｍＬ）で洗浄し、６０℃で真空乾燥してＫ−２５２ａを得た（１４７ｍｇ）。
【００３４】
表２、表３および表４に、他の抽出方法の結果をまとめてある。
【００３５】
【表２】
2008536521.tif 000005
【００３６】
【表３】
2008536521.tif 000006
【００３７】
【表４】
2008536521.tif 000007
【００３８】
以上の内容は本発明を説明するためのものであって、本発明を開示の実施形態に限定するものではない。当業者には自明である改変および変更は、特許請求の範囲で定義の本発明の範囲および性質の範囲内であるものとする。
【国際調査報告】
2008536521.tif 000008
2008536521.tif 000009