(57)【要約】本発明は、免疫応答を刺激するのに有用である特定のＣクラスセミソフトＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドに関する。特に、そのオリゴヌクレオチドは、アレルギー（例えば、アレルギー性鼻炎および喘息）、癌ならびに感染症（Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）を処置するのに有用である。また、本発明は、以下のオリゴヌクレオチドを提供する：５’  ＴＣ＿ＧＴＣ＿ＧＴＮ１ＴＣ＿ＧＧＣＧＣＮ１ＧＣＣＧ  ３’（配列番号２７）を含むヌクレオチドであって、ここで該オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして＿は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示し、そしてここでＮ１は、０ヌクレオチド長〜３ヌクレオチド長であり、Ｎは、任意のヌクレオチドを示す、オリゴヌクレオチド。
2008516634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドであって、以下：
５’  ＴＣ＿ＧＴＣ＿ＧＴＮ１ＴＣ＿ＧＧＣＧＣＮ１ＧＣＣＧ  ３’（配列番号２７）
を含み、ここで該オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして＿は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示し、そしてここでＮ１は、０ヌクレオチド長〜３ヌクレオチド長であり、Ｎは、任意のヌクレオチドを示す、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
Ｎ１は、３ヌクレオチド長である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号２）を含み、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号２）であり、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
Ｎ１は、０ヌクレオチド長である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号３）を含み、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号３）であり、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドであって、以下：
５’  ＴＣ＿ＧＴＣ＿ＧＡＣ＿ＧＡＴＣ＿ＧＧＣＧＣ＿ＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号４）
を含み、ここで該オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして＿は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す、オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号４）であり、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドであって、以下：
５’  ＴＴＣ＿ＧＴＣ＿ＧＴＴＴＸ１＿ＧＴＣ＿ＧＴＴ  ３’（配列番号２５）、
を含み、ここで該オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして＿は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示し、そしてここでＸ１は、ピリミジンである、オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
Ｘ１は、Ｔである、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ  ３’（配列番号５）を含み、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ  ３’（配列番号５）であり、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
Ｘ１は、Ｃである、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ  ３’（配列番号６）を含み、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ  ３’（配列番号６）であり、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
ＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号３）を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号２）を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号４）を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
ＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号５）を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
ＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴ（配列番号６）を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃを含むオリゴヌクレオチドであって、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、そして＿は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す、オリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ−Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ  ３’（配列番号２１）であり、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項２２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ  ３’（配列番号２２）であり、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項２２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ−Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ  ３’（配列番号２３）であり、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項２２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇを含むオリゴヌクレオチドであって、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、そして＿は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す、オリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ−Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号１５）であり、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ−Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号１６）であり、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ−Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号１７）であり、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ−Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号１８）であり、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ−Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号１９）であり、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ−Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号２０）であり、ここで５’は、該オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、該オリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の薬学的組成物であって、噴霧器をさらに含む、薬学的組成物。
【請求項３５】
請求項３３に記載の薬学的組成物であって、吸入器をさらに含む、薬学的組成物。
【請求項３６】
前記吸入器は、定量噴霧吸入器である、請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
前記吸入器は、粉末吸入器である、請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
請求項３３に記載の薬学的組成物であって、化学療法剤をさらに含有する、薬学的組成物。
【請求項３９】
請求項３３に記載の薬学的組成物であって、抗ウイルス剤をさらに含有する、薬学的組成物。
【請求項４０】
前記薬学的に受容可能なキャリアは、皮下投与のために処方されている、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記薬学的に受容可能なキャリアは、経口投与のために処方されている、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記薬学的に受容可能なキャリアは、鼻腔内投与のために処方されている、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
免疫応答を刺激するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項４４】
免疫応答を刺激するための医薬の製造における、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項４５】
喘息を処置するための医薬の製造における、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項４６】
前記喘息は、ウイルス感染によって増悪される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
アレルギーの処置のための医薬の製造における、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項４８】
癌の処置のための医薬の製造における、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項４９】
前記医薬は、化学療法剤と一緒に使用される、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
感染症の処置のための医薬の製造における、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項５１】
ウイルス性障害の処置のための医薬の製造における、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項５２】
前記ウイルス性障害は、肝炎である、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記肝炎は、Ｂ型肝炎である、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記肝炎は、Ｃ型肝炎である、請求項５２に記載の使用。
【請求項５５】
自己免疫疾患の処置のための医薬の製造における、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項５６】
気道リモデリングの処置のための医薬の製造における、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項５７】
前記医薬は、抗原と一緒に使用しないための医薬である、請求項４４に記載の使用。
【請求項５８】
前記医薬は、抗原と一緒に使用するための医薬である、請求項４４に記載の使用。
【請求項５９】
喘息を処置するための方法であって、喘息を有するか、または喘息を有する危険にある被験体に対して、喘息を処置するのに有効な量で、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項６０】
アレルギーを処置するための方法であって、アレルギーを有するか、またはアレルギーを有する危険にある被験体に対して、アレルギーを処置するのに有効な量で、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項６１】
前記被験体は、アレルギー性鼻炎を有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
免疫応答を調節するための方法であって、被験体に対して、免疫応答を調節するのに有効な量で、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項６３】
ウイルス感染によって増悪される喘息を処置するための方法であって、ウイルス感染によって増悪される喘息を有するか、または該喘息を有する危険にある被験体に対して、該喘息を処置するのに有効な量で、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項６４】
前記オリゴヌクレオチドは、被験体に送達されて、該被験体においてアレルギーを処置する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記オリゴヌクレオチドは、被験体に送達されて、該被験体において自己免疫疾患を処置する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記オリゴヌクレオチドは、被験体に送達されて、該被験体において気道リモデリングを処置する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記オリゴヌクレオチドは、被験体に抗原と一緒に投与されない、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記オリゴヌクレオチドが、口の経路、鼻の経路、舌下の経路、静脈内の経路、皮下の経路、粘膜の経路、呼吸器の経路、直接注入、および経皮的な経路からなる群より選択される経路によって送達される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
前記オリゴヌクレオチドは、前記被験体に対して、サイトカインの発現を誘導するのに有効な量で送達される、請求項６２に記載の方法。
【請求項７０】
前記サイトカインは、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮγおよびＩＰ−１０からなる群より選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記オリゴヌクレオチドは、前記被験体に対して、免疫応答をＴｈ２に偏った応答からＴｈ１に偏った応答へ変化させるのに有効な量で送達される、請求項６２に記載の方法。
【請求項７２】
癌を処置するための方法であって、癌を有する被験体に対して、該癌を処置するのに有効な量で請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項７３】
請求項７２に記載の方法であって、前記被験体に化学療法を施す工程をさらに包含する、方法。
【請求項７４】
請求項７２に記載の方法であって、前記被験体に照射を施す工程をさらに包含する、方法。
【請求項７５】
感染症を処置するための方法であって、感染症を有するか、または感染症を有する危険にある被験体に対して、該感染症を処置するのに有効な量で請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項７６】
前記被験体は、ウイルス感染を有する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ウイルス感染は、Ｂ型肝炎である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ウイルス感染は、Ｃ型肝炎である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
請求項７６に記載の方法であって、前記被験体に抗ウイルス剤を投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項８０】
免疫応答を刺激するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法。
【請求項８１】
癌を処置するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法。
【請求項８２】
喘息を処置するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法。
【請求項８３】
アレルギーを処置するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法。
【請求項８４】
感染症を処置するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、減少した腎臓の炎症効果を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド、その組成物、およびこの免疫刺激性オリゴヌクレオチドを使用する方法に関連する。特に、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、アレルギーおよび喘息、癌ならびに感染症の処置において特に有効であるＣクラスセミソフトオリゴヌクレオチドである。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
細菌ＤＮＡは、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化する免疫刺激効果を有するが、脊椎動物ＤＮＡは、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化しない（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４における概説）。細菌ＤＮＡのこれらの免疫刺激効果は、特定の塩基構成（ｂａｓｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ）における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ）の存在の結果であることが、新たに理解される。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、細菌ＤＮＡにおいて一般的であるが、脊椎動物ＤＮＡにおいてはメチル化されており、そして一般的に知られていない（非特許文献５；非特許文献６）。細菌ＤＮＡの免疫刺激効果は、これらのＣｐＧモチーフを含む合成のオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）によって模倣され得る。このようなＣｐＧ  ＯＤＮは、ヒトおよびマウスの白血球に対する高い刺激効果を有し、この刺激効果は、Ｂ細胞の増殖；サイトカインおよび免疫グロブリンの分泌；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞溶解活性およびＩＦＮ−γの分泌；ならびに樹状細胞（ＤＣ）の活性化および共起刺激分子の発現し、そしてサイトカイン（特に、Ｔｈ１様Ｔ細胞の応答の発生を促すのに重要であるＴｈ１様サイトカイン）を分泌する他の抗原提示細胞の活性化を誘導する。ネイティブなホスホジエステル骨格のＣｐＧ  ＯＤＮのこれらの免疫刺激効果は、そのＣｐＧモチーフが、メチル化されるか、ＧｐＣに変換されるか、または別の方法で除去されるか、もしくは変化する場合、上記効果を劇的に減少させる点で、高度にＣｐＧ特異的である（非特許文献５；非特許文献７）。
【０００３】
初期の研究において、免疫刺激性のＣｐＧモチーフは、式プリン−プリン−ＣｐＧ−ピリミジン−ピリミジンに従うと考えられた（非特許文献５；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。しかし、ここで、マウスリンパ球は、この「式」に従わないホスホジエステルＣｐＧモチーフと遜色なく反応し（非特許文献１１）、そして同じことが、ヒトのＢ細胞および樹状細胞についても当てはまる（非特許文献７；非特許文献１２）ことが、明らかである。
【０００４】
最近、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの数種の異なるクラスが、記載されている。１つのクラスは、強力にＢ細胞を活性化するが、ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞の活性化の誘導については、比較的弱く；このクラスは、Ｂクラスと称される。ＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドは、代表的に、完全に安定化され、そして特定の好ましい塩基構成内に非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。例えば、特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５；および特許文献６を参照のこと。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの別のクラスは、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、およびＩＦＮ−αを誘導し；このクラスは、Ｃクラスと称されている。ＣクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドは、最初に特徴付けられたように、代表的には完全に安定化され、Ｂクラス型の配列、およびＧＣリッチなパリンドロームまたはＧＣリッチなほぼ完全なパリンドロームを含む。このクラスは、同時係属中の特許文献７（２００２年８月１９日出願）、および特許文献８の下で公開された関連するＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／２６４６８号に記載されている。
【特許文献１】米国特許第６，１９４，３８８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２０７，６４６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２１４，８０６号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２１８，３７１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，２３９，１１６号明細書
【特許文献６】米国特許第６，３３９，０６８号明細書
【特許文献７】米国特許出願第ＵＳ１０／２２４，５２３号明細書
【特許文献８】国際公開第ＷＯ  ０３／０１５７１１号パンフレット
【非特許文献１】Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．ら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８８年、第７９巻、ｐ．６８２−６８６
【非特許文献２】Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．ら、ＪＮＣＩ、１９８４年、第７２巻、ｐ．９５５−９６２
【非特許文献３】Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１年、第１４７巻、ｐ．１７５９−１７６４
【非特許文献４】Ｋｒｉｅｇ、「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９８年、Ｃ．Ａ．ＳｔｅｉｎおよびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ｐ．４３１−４４８
【非特許文献５】Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５年、第３７４巻、ｐ．５４６−５４９
【非特許文献６】Ｋｒｉｅｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９９年、第９３３２１巻、ｐ．１−１０
【非特許文献７】Ｈａｒｔｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９９年、第９６巻、ｐ．９３０５−１０
【非特許文献８】Ｐｉｓｅｔｓｋｙ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６年、第１５６巻、ｐ．４２１−４２３
【非特許文献９】Ｈａｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９８年、第１７巻、ｐ．６２３０−６２４０
【非特許文献１０】Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９８年、第６巻、ｐ．４９６−５００
【非特許文献１１】Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８年、第１６０巻、ｐ．５８９８−５９０６
【非特許文献１２】Ｌｉａｎｇ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９６年、第９８巻、ｐ．１１１９−１１２９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
特定のヌクレオチドの間に１つ以上の安定化されていない結合を選択的に含む特定のＣクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫刺激性の特性は、顕著な活性を有し、そしてアレルギーおよび喘息の処置において特に有用であることが、見出されている。その安定化されていない結合は、好ましくは天然の結合（すなわち、ホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合）である。安定化されていない結合は、代表的に、ヌクレアーゼ消化に比較的影響されやすいが、必ずしもそうではない。本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、５’側のＣと隣接する３’側のＧとの間に位置する少なくとも１つの安定化されていない結合を含み、その５’側のＣおよびその３’側のＧの両方は、内部ヌクレオチドである。
【０００６】
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、Ｔｈ１様免疫応答を誘導するのに有用である。従って、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ワクチン接種のためのアジュバントとして有用であり、そしてそれらの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、癌、感染症、アレルギー、および喘息を含む疾患を処置するのに有用である。それらの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、任意の目的のために免疫刺激性オリゴヌクレオチドの長期または頻回の投与を必要とする任意の状態において特に有用であると考えられるが、喘息およびアレルギー性疾患（例えば、アレルギー性鼻炎）の処置において特に有用である。
【０００７】
本発明は、部分的に免疫刺激性ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドに関する。１つの局面において、本発明は、以下の式：
５’  ＴＣ＿ＧＸ１Ｃ＿ＧＸ２Ｎ１Ｘ３Ｃ＿ＧＮ２ＣＧ  ３’（配列番号２６）
を有するオリゴヌクレオチドである。上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの安定化されたヌクレオチド間結合を有する。「＿」は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す。Ｎ１は、０ヌクレオチド長〜３ヌクレオチド長であり、Ｎ２は、０ヌクレオチド長〜９ヌクレオチド長であり、Ｎは、任意のヌクレオチドを指す。Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、Ｔである。
【０００８】
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、５’  ＴＣ＿ＧＴＣ＿ＧＴＮ１ＴＣ＿ＧＧＣＧＣＮ１ＧＣＣＧ  ３’（配列番号２７）を含み得る。１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｎ１＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊ＣＮ１Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号２７）を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｎ１は、３ヌクレオチド長または２ヌクレオチド長である。他の実施形態において、Ｎ１は、０ヌクレオチド長である。
【０００９】
上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号２）を含み、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す。必要に応じて、特に示される場合、５’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し得、そして３’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示し得る。
【００１０】
他の実施形態において、上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号３）を含み得、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す。必要に応じて、特に示される場合、５’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し得、そして３’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示し得る。
【００１１】
別の局面において、上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、以下の式：ＴＣ＿ＧＸ１Ｃ＿ＧＸ２Ｃ＿ＧＸ３ＴＣ＿ＧＧＣＧＣ−ＧＮ３３’（配列番号２８）
を有する。
【００１２】
Ｎ３は、１ヌクレオチド長〜５ヌクレオチド長であり、Ｎは、任意のヌクレオチドを指す。１つの実施形態においてＮ３は、５ヌクレオチドである。Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｘ１およびＸ３は、Ｔである。
【００１３】
１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、５’  ＴＣ＿ＧＴＣ＿ＧＡＣ＿ＧＡＴＣ＿ＧＧＣＧＣ＿ＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号４）を含み得、ここで上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして＿は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す。１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号４）を含み得る。必要に応じて、特に示される場合、５’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し得、そして３’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示し得る。
【００１４】
本発明の別の局面に従って、以下の式：
５’  ＴＴＣ＿ＧＸ２Ｃ＿ＧＮ１Ｘ１＿ＧＸ３Ｃ＿ＧＴＴ  ３’（配列番号２４）
を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、提供される。上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの安定化されたヌクレオチド間結合を含み、そして＿は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す。Ｎ１は、１ヌクレオチド長〜３ヌクレオチド長であり、Ｎは、任意のヌクレオチドを指す。Ｘ１は、ピリミジンである。Ｘ２およびＸ３は、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｘ２およびＸ３は、Ｔである。
【００１５】
１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、５’  ＴＴＣ＿ＧＴＣ＿ＧＴＴＴＸ１＿ＧＴＣ＿ＧＴＴ  ３’（配列番号２５）を含み得る。別の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｘ１＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ  ３’（配列番号２５）を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｘ１は、ＴまたはＣである。
【００１６】
上記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ  ３’（配列番号５）含み得、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す。必要に応じて、特に示される場合、５’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し得、そして３’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示し得る。
【００１７】
上記オリゴヌクレオチドは、５’  Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ  ３’（配列番号６）を含み得、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示す。必要に応じて、特に示される場合、５’は、上記オリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し得、そして３’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示し得る。本発明のいくつかの局面において、そのオリゴヌクレオチドは、以下の式：
【００１８】
【化１】
2008516634.tif 000003
のうちの１つを有する。
【００１９】
本発明の他の局面において、上記オリゴヌクレオチドは、以下の式：
【００２０】
【化２】
2008516634.tif 000004
のうちの１つを有する。
【００２１】
本発明の他の局面において、上記オリゴヌクレオチドは、以下の式：
【００２２】
【化３】
2008516634.tif 000005
のうちの１つを有する。
【００２３】
本発明の他の局面において、以下：
Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ
を含むオリゴヌクレオチドであって、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、そして＿は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す、オリゴヌクレオチドが提供される。必要に応じて、上記オリゴヌクレオチドは、以下：
【００２４】
【化４】
2008516634.tif 000006
であり得、ここで５’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す。
【００２５】
他の局面において、以下：
Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ
を含むオリゴヌクレオチドであって、ここで＊は、安定化されたヌクレオチド間結合を示し、そして＿は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を示す、オリゴヌクレオチドが提供される。必要に応じて、上記オリゴヌクレオチドは、以下：
【００２６】
【化５】
2008516634.tif 000007
であり得、ここで５’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な５’末端を示し、そして３’は、そのオリゴヌクレオチドの自由な３’末端を示す。
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物が、提供される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、噴霧器または吸入器中に処方される。上記吸入器は、定量噴霧吸入器であり得る。代替的に、上記吸入器は、粉末吸入器である。
【００２９】
他の実施形態において、上記薬学的組成物は、化学療法剤を含有し得る。なお他の実施形態において、上記組成物は、抗ウイルス剤を含有し得る。
【００３０】
上記薬学的組成物は、皮下投与、経口投与または鼻腔内投与のために処方される薬学的に受容可能なキャリアを含有し得る。
【００３１】
１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物中にある。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、エアロゾルとして処方される。
【００３２】
１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、アジュバントまたはサイトカインをさらに含む。
【００３３】
１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、抗原をさらに含み、ここでそのオリゴヌクレオチドは、ワクチンアジュバントである。
【００３４】
１つの実施形態において、上記抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、および腫瘍抗原からなる群より選択される。１つの実施形態において、上記抗原は、核酸核酸ベクターによってコードされる。１つの実施形態において、上記抗原は、ペプチド抗原である。１つの実施形態において、上記抗原は、上記オリゴヌクレオチドまたは免疫刺激性核酸分子に共有結合される。別の実施形態において、上記抗原は、上記オリゴヌクレオチドまたは免疫刺激性核酸分子に共有結合されない。
【００３５】
１つの実施形態において上記ホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合は、ホスホジエステルである。１つの実施形態において、上記ホスホジエステル様結合は、ボラノホスホネート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）またはジアステレオマー的に純粋なＲｐホスホロチオエートであり得る。
【００３６】
１つの実施形態において、上記安定化された骨格は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される複数のヌクレオチド間結合を含む。１つの実施形態において、上記安定化された骨格は、複数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【００３７】
１つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、４ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長である。
【００３８】
他の局面において、本発明は、喘息を有するか、または有する危険にある被験体に対して、喘息を処置するのに有効な量で本発明のオリゴヌクレオチドを投与することによって喘息を処置するための方法である。
【００３９】
なお他の局面において、本発明は、アレルギーを有するか、または有する危険にある被験体に対して、アレルギーを処置するのに有効な量で本発明のオリゴヌクレオチドを投与することによってアレルギーを処置するための方法である。１つの実施形態において、上記被験体は、アレルギー性鼻炎を有する。１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、粘膜表面に投与される。他の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、アエロゾル処方物において投与される。必要に応じて、上記オリゴヌクレオチドは、鼻腔内に投与される。
【００４０】
サイトカイン産生を誘導するための方法が、本発明の別の局面に従って提供される。その方法は、被験体に対して、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、ＩＦＮ−α、ケモカイン、およびＩＦＮ−γからなる群より選択されるサイトカインを誘導するのに有効な量で、本明細書中に記載される免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチド投与することによって行なわれる。
【００４１】
別の局面において、本発明は、抗原または治療用化合物（例えば、抗微生物剤）と組み合わせた、本明細書中に記載されるＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの組成物である。上記抗微生物剤は、例えば、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、抗細菌剤または抗真菌剤であり得る。
【００４２】
本明細書中に記載されるＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを備える徐放性デバイスの組成物が、本発明の別の局面に従って提供される。
【００４３】
上記組成物は、必要に応じて、薬学的キャリアを含有し得、そして／または送達デバイス中に処方され得る。いくつかの実施形態において、上記送達デバイスは、カチオン性脂質、細胞浸透性タンパク質、および徐放性デバイスからなる群より選択される。１つの実施形態において、上記徐放性デバイスは、生分解性ポリマー、またはマイクロ粒子である。
【００４４】
本発明の別の局面によって、免疫応答を刺激する方法が、提供される。その方法は、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、被験体における免疫応答を誘導するのに有効な量で、その被験体に投与する工程を包含する。好ましくは、上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、経口的にか、局所的にか、徐放性デバイスによってか、経粘膜的にか、全身的にか、非経口的にか、または筋肉内に投与される。上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、粘膜表面に投与される場合、それは、粘膜の免疫応答または全身性の免疫応答を誘導するのに有効な量で送達され得る。好ましい実施形態において、上記粘膜表面は、口腔の表面、鼻腔の表面、直腸の表面、膣の表面、または眼の表面からなる群より選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、その方法は、上記被験体を抗原に曝す工程を包含し、その免疫応答は、抗原特異的な免疫応答である。いくつかの実施形態において、上記抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原およびペプチド抗原からなる群より選択される。
【００４６】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、広範囲の免疫応答を誘発し得る。例えば、これらのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、Ｔｈ２をＴｈ１免疫応答に変えるために使用され得る。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、リンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）、樹状細胞、およびＮＫ細胞のような免疫細胞を活性化するために使用され得る。上記活性化は、インビボ、インビトロ、またはエキソビボ、すなわち、上記被験体から免疫細胞を単離し、その免疫細胞と、その免疫細胞を活性化するのに有効な量のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドとを接触させ、そしてその活性化された免疫細胞をその被験体に再投与することによって行われ得る。いくつかの実施形態において、上記樹状細胞は、癌抗原を提示する。上記樹状細胞は、エキソビボにて上記癌抗原に曝され得る。
【００４７】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドによって産生される上記免疫応答はまた、サイトカイン産生（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、ＩＦＮ−α、ケモカイン、およびＩＦＮ−γの産生）の誘導を生じ得る。
【００４８】
さらに別の実施形態において、上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、癌を処置するのに有用である。本発明の他の局面に従って、上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、癌を発症する危険を有する被験体において癌を予防する（例えば、癌を発症する危険を減少させる）のに有用である。上記癌は、胆道癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、胃癌、上皮内新生物、リンパ腫、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞癌および非小細胞癌）、黒色腫、神経芽細胞種、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、甲状腺癌、および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫からなる群より選択され得る。いくつかの重要な実施形態において、上記癌は、骨の癌、脳の癌および中枢神経系の癌、結合組織の癌、食道癌、眼の癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、口腔癌、皮膚癌、および精巣癌からなる群より選択される。
【００４９】
必要に応じて、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、抗癌療法との組み合わせで投与される場合、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、癌治療（例えば、抗癌療法）に対する癌細胞の反応性を増加させるために使用され得る。上記抗癌療法は、例えば、化学療法、ワクチン（例えば、インビトロにてプライミングした樹状細胞のワクチンまたは癌抗原のワクチン）または抗体ベースの療法であり得る。この後者の療法はまた、例えば、癌細胞の細胞表面抗原に対して特異的な抗体を投与する工程を包含し、その免疫応答は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を生じる。１つの実施形態において、上記抗体は、以下からなる群より選択され得る：リブタキシン（Ｒｉｂｕｔａｘｉｎ）、ハーセプチン、クアドラメット（Ｑｕａｄｒａｍｅｔ）、パノレックス（Ｐａｎｏｒｅｘ）、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＢＥＣ２、Ｃ２２５、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）、ＳＭＡＲＴ  Ｍ１９５、ＡＴＲＡＧＥＮ、オバレックス（Ｏｖａｒｅｘ）、ベキサール（Ｂｅｘｘａｒ）、ＬＤＰ−０３、ｉｏｒ  ｔ６、ＭＤＸ−２１０、ＭＤＸ−１１、ＭＤＸ−２２、ＯＶ１０３、３６２２Ｗ９４、抗ＶＥＧＦ、ゼナパックス（Ｚｅｎａｐａｘ）、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−４４７、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−２、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１、ＣＥＡＣＩＤＥ、プレターゲット（Ｐｒｅｔａｒｇｅｔ）、ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２、ＴＮＴ、Ｇｌｉｏｍａｂ−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、ＥＭＤ−７２０００、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ、ＣＭＡ  ６７６、Ｍｏｎｏｐｈａｒｍ−Ｃ、４Ｂ５、ｉｏｒ  ｅｇｆ．ｒ３、ｉｏｒ  ｃ５、ＢＡＢＳ、抗ＦＬＫ−２、ＭＤＸ−２６０、ＡＮＡ  Ａｂ、ＳＭＡＲＴ  １Ｄ１０  Ａｂ、ＳＭＡＲＴ  ＡＢＬ  ３６４  ＡｂおよびＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡ。
【００５０】
従って、本発明のいくつかの局面によって、癌を有するか、または癌を有する危険にある被験体は、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与され、そして抗癌療法を施される。いくつかの実施形態において、上記抗癌療法は、化学療法剤、免疫療法剤および癌ワクチンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、癌治療薬（ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）は、タキソール、またはカルボプラチンとパクリタキセルとの組み合わせである。
【００５１】
癌の予防または処置を指向する方法のさらに別の実施形態において、上記被験体は、インターフェロン−αをさらに投与され得る。
【００５２】
他の局面における本発明は、被験体において疾患を予防するための方法に関連する。その方法は、免疫系の反応性を促進して、被験体において疾患を予防するために、その被験体に対してＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを定期的に投与する工程を包含する。本発明の予防方法を使用して予防されることが求められる疾患または状態の例としては、微生物感染（例えば、性感染症）、および食物アレルギー由来のアナフィラキシーショックが挙げられる。
【００５３】
他の局面において、本発明は、上記被験体に対して、生得的な免疫応答を活性化するのに有効な量でＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与することによって、生得的な免疫応答を誘導するための方法である。
【００５４】
本発明の別の局面によって、ウイルス感染またはレトロウイルス感染を処置するか、または予防するための方法が、提供される。その方法は、ウイルス感染またはレトロウイルス感染を有するか、またはそれらを有する危険がある被験体に対して、ウイルス感染もしくはレトロウイルス感染を処置するか、または予防するのに有効な量の、本発明の組成物のいずれかを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎）、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス、またはパピローマウイルスによって引き起こされる。
【００５５】
細菌感染を処置するか、または予防するための方法が、本発明の別の局面によって提供される。その方法は、細菌感染を有するか、または細菌感染を有する危険がある被験体に対して、細菌感染を処置するか、または予防するのに有効な量の、本発明の組成物のいずれかを投与する工程を包含する。１つの実施形態において、その細菌感染は、細胞内の細菌に起因する。
【００５６】
別の局面において、本発明は、寄生虫感染を有するか、または寄生虫感染を有する危険がある被験体に対して、寄生虫感染を処置するか、または予防するのに有効な量の、本発明の組成物のいずれかを投与することによって、寄生虫感染を処置するか、または予防するための方法である。１つの実施形態において、その寄生虫感染は、細胞内の寄生虫に起因する。別の実施形態において、その寄生虫感染は、非駆虫性の寄生虫に起因する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、上記被験体は、ヒトであり、そして他の実施形態において、その被験体は、犬、猫、馬、牛、豚、七面鳥、山羊、魚、猿、鶏、ラット、マウス、または羊からなる群より選択される非ヒト脊椎動物である。
【００５８】
別の局面において、本発明は、被験体に対して、ＴＨ１免疫応答をもたらすのに有効な量で本発明の組成物のいずれかを投与することによって、ＴＨ１型免疫応答を誘導するための方法に関連する。
【００５９】
別の局面において、本発明は、自己免疫疾患を有するか、または自己免疫疾患を有する危険がある被験体に対して、自己免疫疾患を処置するか、または予防するのに有効な量の、本発明の組成物のいずれかを投与することによって、自己免疫疾患を処置するための方法に関する。
【００６０】
他の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、上記被験体に対して、サイトカインの発現を誘導するのに有効な量で送達される。必要に応じて、そのサイトカインは、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮγおよびＩＰ−１０からなる群より選択される。他の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、上記被験体に対して、免疫応答をＴｈ２に偏った応答（ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）からＴｈ１に偏った応答へ変化させるのに有効な量で送達される。
【００６１】
いくつかの局面における本発明は、気道リモデリングを処置するための方法であり、その方法は、被験体に対して、その被験体において気道リモデリングを処置するのに有効な量で、ＣＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する。１つの実施形態において、その被験体は、喘息、慢性閉塞性肺疾患を有するか、または喫煙者である。他の実施形態において、その被験体は、喘息の症状を有さない。
【００６２】
免疫応答を刺激するための本発明のオリゴヌクレオチドの使用もまた、本発明の局面として提供される。
【００６３】
免疫応答を刺激するためおよび本発明の方法のいずれかを実施するための医薬の製造における本発明のオリゴヌクレオチドの使用もまた、提供される。
【００６４】
本発明のそれぞれの限界は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。これにより、本発明のそれぞれの限界は、いずれか１つの要素、または要素の組み合わせを含み、その限界は、本発明のそれぞれの局面に含まれ得ることが認められる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
（詳細な説明）
Ｃクラスセミソフト（ｓｅｍｉ−ｓｏｆｔ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドのサブセットが、本発明に従って提供される。本明細書中に記載される本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、同様のまたは増強された効力、腎臓、肝臓および脾臓に対する全身性曝露の低下を含む改善された特性を有し、そして注射部位での反応原性が低下し得る。出願人はある機構に拘束されることはないが、これらの改善された特性は、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドのホスホジエステル「ヌクレオチド間結合」またはホスホジエステル様「ヌクレオチド間結合」内の戦略上の位置に関連すると考えられる。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド間結合」という用語は、核酸分子における２つの隣接するヌクレオチドを接続する共有結合的な骨格の結合をいう。共有結合的な骨格の結合は、代表的には、改変されたリン酸結合または未改変のリン酸結合であるが、他の改変も可能である。従って、ｎヌクレオチド長の直鎖状オリゴヌクレオチドは、全部でｎ−１のヌクレオチド間結合を有する。これらの共有結合的な骨格の結合は、本発明の教示による免疫刺激性オリゴヌクレオチドにおいて改変されてもされなくてもよい。
【００６６】
特に、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、「内部ジヌクレオチド」を含む。内部ジヌクレオチドは、一般に、ヌクレオチド間結合によって接続される隣接するヌクレオチドの任意の対を意味するが、ここでヌクレオチドの対におけるどのヌクレオチドも末端ヌクレオチドではなく、すなわち、ヌクレオチドの対におけるどのヌクレオチドもオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端を規定するヌクレオチドではないものとする。従って、ｎヌクレオチド長である直鎖状オリゴヌクレオチドは、全部でｎ−１のジヌクレオチド、およびｎ−３だけの内部ジヌクレオチドを有する。内部ジヌクレオチドにおける各々のヌクレオチド間結合は内部ヌクレオチド間結合である。従って、ｎヌクレオチド長である直鎖状オリゴヌクレオチドは、全部でｎ−１のヌクレオチド間結合およびｎ−３だけの内部ヌクレオチド間結合を有する。従って、戦略的に位置されるホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合とは、核酸配列におけるヌクレオチドの任意の対の間に位置するホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合をいう。いくつかの実施形態では、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、５’末端または３’末端に最も近いヌクレオチドのいずれか対の間にも位置しない。
【００６７】
本発明は、少なくともいくつかの局面において、本明細書中に記載される特定のＣクラスセミソフトオリゴヌクレオチドが重要な免疫刺激性活性を有し、そして好ましくはアレルギーおよび喘息の処置において有用であるという驚くべき知見に基づく。これらの分子は、少なくとも同じ免疫刺激性活性を有するか、または多くの場合、同じヌクレオチド配列を有する対応する完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドより、高い免疫刺激性活性を有する。
【００６８】
セミソフトオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの内部ピリミジン−プリン（ＹＺ、好ましくはＣＧ）ジヌクレオチド内にのみ生じるホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を有する、部分的に安定化された骨格を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。セミソフトオリゴヌクレオチドは、一般に、対応する完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドに対して増加した免疫刺激性の効力を有する。セミソフトオリゴヌクレオチドのより高い効力に起因して、セミソフトオリゴヌクレオチドは、所望の生物学的効果を達成するために、従来の完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドより低い有効濃度で使用され得、そして従来の完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドより低い有効量を有する。
【００６９】
完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、最大の用量反応を示し得るのに対して、本発明のセミソフトオリゴヌクレオチドは、対応する完全に安定化した免疫刺激性オリゴヌクレオチドについての至適濃度を超えて、より高い濃度に及ぶ、単調に増加する用量反応曲線（ＴＬＲ９刺激によってアッセイされる場合）を有するようである。従って、本発明のセミソフトオリゴヌクレオチドは、完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドより高い免疫刺激を誘導し得ると考えられる。
【００７０】
２０ヌクレオチド長未満の完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、より長い（例えば、２４ヌクレオチド長）完全に安定化されたオリゴヌクレオチドと比較して低い免疫刺激性活性を有し得るのに対して、１６ヌクレオチド長の短さのセミソフトオリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチド長を超える完全に安定化されたオリゴヌクレオチドの免疫刺激性活性と少なくとも等しい免疫刺激性活性を有することが見出された。
【００７１】
いくつかの場合において、６マーのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫刺激性活性を欠くようである場合、ホスホロチオエート結合のホスホジエステルのただ１つの内部ＣＧヌクレオチド間結合による置換が、免疫刺激性活性を有し、対応する６マーを生じることを見出した。
【００７２】
従って、上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドのサイズ（すなわち、オリゴヌクレオチドの長さに従ったヌクレオチド残基の数）はまた、そのオリゴヌクレオチドの刺激活性に寄与し得る。細胞中への取り込みの促進に関して、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、最小で６ヌクレオチド残基の長さを有し得る。６ヌクレオチドより大きい任意のサイズのオリゴヌクレオチド（数ｋｂ長でさえ）は、十分な免疫刺激性モチーフが存在する場合、本発明に従って、免疫応答を誘導し得る。なぜなら、より大きい核酸は、細胞内で分解されるからである。４ヌクレオチド程度の短さのセミソフトオリゴヌクレオチドはまた、それらが細胞の内部に送達され得る場合に、免疫刺激性であり得ると本発明者らによって考えられる。本発明に従う特定の好ましい実施形態において、上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、４ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長である。代表的な実施形態において、上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド長と４０ヌクレオチド長との間であるか、または１０ヌクレオチド長と４０ヌクレオチド長との間である。本発明に従う特定の好ましい実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド長と１９ヌクレオチド長との間であるか、または６ヌクレオチド長と２４ヌクレオチド長との間である。
【００７３】
セミソフトオリゴヌクレオチドの上記の特性は、一般に、内部ＣＧジヌクレオチドに伴うホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合の増加性の「用量」によって増加することが考えられる。従って、例えば、５つの内部ＣＧジヌクレオチドを有する所与のオリゴヌクレオチド配列に関して、５つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部ＣＧヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、４つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部ＣＧヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドより免疫刺激性であり、次に、４つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部ＣＧヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、３つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部ＣＧヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドより、免疫刺激性であり、次に、３つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部ＣＧヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、２つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部ＣＧヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドより、免疫刺激性であり、次に、２つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部ＣＧヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、１つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部ＣＧヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドより、免疫刺激性である。重要なことには、１つでさえ、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部ＣＧヌクレオチド間結合を含むことは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部ＣＧヌクレオチド間結合を含まないより、有益であると考えられる。ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合の数に加えて、核酸の長さに沿った位置もまた、効力に影響し得る。
【００７４】
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、血清における急速な分解から一般に保護される。本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた一般に、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドを分解し得る特定のまたは過剰なヌクレアーゼ活性を有する特定の組織を除いて、ほとんどの組織において急速な分解から保護される。このことは、その特定の組織において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの減少が生じる。そうでなければこの免疫刺激性オリゴヌクレオチドの蓄積は、分解抵抗性オリゴヌクレオチドを利用する長期治療からの所望されない効果をもたらし得る。本発明のオリゴヌクレオチドは一般に、好ましい内部位置におけるホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間結合に加えて、分解に対して抵抗性である５’末端および３’末端を含む。このような分解抵抗性末端は、対応する未改変の末端を上回るエキソヌクレアーゼ消化に対する抵抗性の増大を生じる任意の適切な改変を含んでもよい。例えば、この５’末端および３’末端はこの骨格の少なくとも１つのリン酸塩の改変を含むことによって安定化され得る。好ましい実施形態において、各々の末端での骨格の少なくとも１つのリン酸塩修飾は独立して、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、ホスホロジチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合またはメチルホスホロチオエートヌクレオチド間結合である。別の実施形態では、この分解抵抗性末端は、３’末端でペプチド結合またはアミド結合によって接続された１つ以上のヌクレオチド単位を含む。さらに他の安定化末端としては、以下にさらに記載されるものが挙げられるがこれらに限定されず、この安定化末端は、本発明によって包含されることが意図される。
【００７５】
上記のように、本発明のオリゴヌクレオチドは、内部ＣＧジヌクレオチド内であり、かつ必要に応じて、内部ＣＧジヌクレオチドに隣接した、ホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合を含む。このようなＣＧジヌクレオチドは、頻繁に免疫刺激性モチーフの一部である。しかし、オリゴヌクレオチドがあらゆる免疫刺激性モチーフ内にホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合を含む必要はない。さらなるホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合はまた、これらの他の点では「安定化されたオリゴヌクレオチド」のより急速な腎臓消化のために維持されてもよい。
【００７６】
ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、天然に見出される核酸の結合特性の型である。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、酸素原子の２つの架橋によって隣接され、そしてまた２つのさらなる酸素原子（一方は荷電しており、そして他方は荷電していない）によって結合されたリン原子を含む。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、上記オリゴヌクレオチドの組織半減期を減少させることが重要である場合に、特に好ましい。
【００７７】
ホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、化学的に、そして／またはジアステレオマーとしてホスホジエステルに類似する、リン含有架橋基である。ホスホジエステルに対する類似性の尺度は、ヌクレアーゼ消化に対する感受性、およびＲＮＡｓｅ  Ｈを活性化する能力を含む。従って、例えば、ホスホジエステルのオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に対して感受性であるが、ホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に対して感受性ではない一方で、ホスホジエステルのオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドの両方は、ＲＮＡｓｅ  Ｈを活性化する。好ましい実施形態において、ホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、ボラノホスフェート（または同等に、ボラノホスホネート）結合である。米国特許第５，１７７，１９８号；同第５，８５９，２３１号；同第６，１６０，１０９号；同第６，２０７，８１９号；Ｓｅｒｇｕｅｅｖら、（１９９８）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２９：９４１７−２７。別の好ましい実施形態において、ホスホジエステル様ヌクレオチド間結合は、ジアステレオマーとして純粋なＲｐホスホロチオエートである。ジアステレオマーとして純粋なＲｐホスホロチオエートは、ヌクレアーゼ消化に対して、より感受性であり、そして混合型Ｓｐホスホロチオエート、またはジアステレオマーとして純粋なＳｐホスホロチオエートより、ＲＮＡｓｅ  Ｈを良好に活性化すると考えられる。本発明の目的のために、用語「ホスホジエステル様ヌクレオチド間結合」が具体的にはホスホロジチオエートヌクレオチド間結合およびメチルホスホネートヌクレオチド間結合を除外することに、留意すべきである。
【００７８】
本発明の免疫刺激性核酸分子は、キメラ骨格を有する。本発明の目的に関しては、キメラ骨格とは、部分的に安定化された骨格をいい、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホジエステルまたはホスホジエステル様であり、そして少なくとも１つの他のヌクレオチド間結合が安定化されたヌクレオチド間結合であり、この少なくとも１つのホスホジエステル結合またはホスホジエステル様結合および少なくとも１つの安定化された結合が異なる。ボラノホスホネート結合は、この骨格のキメラ的な性質の目的に関して、ホスホジエステル結合に比べて安定化されていることが報告されているので、ボラノホスホネート結合はその状況に応じて、ホスホジエステル様結合であるか、または安定化されている結合であるかのいずれかとして分類され得る。例えば、本発明によるキメラ骨格は、１つの実施形態において、少なくとも１つのホスホジエステル（ホスホジエステルまたはホスホジエステル様）結合および少なくとも１つのボラノホスホネート（安定化）結合を含む。別の実施形態において、本発明によるキメラ骨格は、ボラノホスホネート（ホスホジエステルまたはホスホジエステル様）結合およびホスホロチオエート（安定化）結合を含み得る。「安定化されたヌクレオチド間結合」とは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合に比べて、インビボの分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを介した）に比較的抵抗性であるヌクレオチド間結合を意味するものとする。好ましい安定化されたヌクレオチド間結合としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネートおよびメチルホスホロチオエートが挙げられるが、これらに限定されない。他の安定化されたヌクレオチド間結合としては、ペプチド、アルキル、デホスホおよび上記のその他が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
ホスホロチオエートのような改変された骨格は、ホスホラミデート化学反応またはＨ−ホスホネート化学反応のいずれかを利用する、自動化された技術を使用して合成され得る。アリール−ホスホネートおよびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されるように作製され得、そしてアルキルホスホトリエステル（荷電した酸素部分が、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されるようにアルキル化される）は、市販の試薬を使用する自動固相合成によって調製され得る。他のＤＮＡ骨格改変および他のＤＮＡ骨格置換をなすための方法が、記載されてきた。Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．ら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４，１９９０；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：１６５，１９９０。キメラオリゴヌクレオチドを調製するための方法もまた、公知である。例えば、Ｕｈｌｍａｎｎらに対して発行された特許が、このような技術を記載している。
【００８０】
混合型の骨格改変ＯＤＮは、市販されているＤＮＡ合成機および標準的なホスホラミダイト化学反応を使用して合成され得る。（Ｆ．Ｅ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９９１、ならびにＭ．Ｄ．ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２１、７１９（１９８０））。カップリングした後、ＰＳ結合が、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ、Ｗ．Ｅｇａｎ、Ｊ．Ｂ．ＲｅｇａｎおよびＳ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２、１２５３（１９９０））（アセトニトリル中に０．０７５Ｍ）またはフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を使用した硫化（ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ）を行い、次いで無水酢酸、２，６−ルチジンを含むテトラヒドロフラン（１：１：８；ｖ：ｖ：ｖ）、およびＮ−メチルイミダゾール（テトラヒドロフラン中に１６％）によりキャップ形成することによって導入される。このキャップ形成する工程は、ホスホロチオエート結合が配置されるべき位置における望ましくないホスホジエステル（ＰＯ）結合の形成を最小化するために硫化反応の後に行われる。例えば、ＣｐＧジヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合の導入の場合、中間体のリン（ＩＩＩ）は、水／ピリジン中のヨウ素の溶液を用いた処理によって酸化される。固体支持体からの切断および濃アンモニアを用いた処理による最終的な脱保護（５０℃にて１５時間）の後、上記ＯＤＮは、ＮａＣｌ勾配（例えば、緩衝液Ａ：アセトニトリル／水＝１：４／ｖ：ｖ（ｐＨ６．８）中の１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；緩衝液Ｂ：アセトニトリル／水＝１：４／ｖ：ｖ中の１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１．５Ｍ  ＮａＣｌ；１ｍｌ／分にて３０分間で５〜６０％のＢ）を使用したＧｅｎ−Ｐａｋ  Ｆａｘカラム上でのＨＰＬＣによってか、またはキャピラリーゲル電気泳動によって分析される。ＯＤＮは、ＨＰＬＣによってか、またはＳｏｕｒｃｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのＦＰＬＣによって精製され得る。ＨＰＬＣの均質な分画は、合わせられ、そしてＣ１８カラムを介してか、または限外濾過によって脱塩される。そのＯＤＮを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、予測された質量を確認した。
【００８１】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、他の改変を含み得る。これらは、非イオン性ＤＮＡアナログ（例えば、アルキル−ホスフェートおよびアリール−ホスフェート（ここで、荷電したホスホネートの酸素がアルキル基またはアリール基によって置換される）、ホスホジエステル、および荷電した酸素部分がアルキル化されるアルキルホスホトリエステル）を含む。いずれかの末端または両方の末端にてジオール（例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール）を含む核酸はまた、ヌクレアーゼ分解に対して十分に抵抗性であることを示した。
【００８２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫応答を排除することが見出された特定の配列を含む核酸である。免疫応答を排除するこれらの特定の配列は、「免疫刺激性モチーフ」と称され、そして免疫刺激性モチーフを含むオリゴヌクレオチドは、「免疫刺激性核酸分子」および同等に「免疫刺激性核酸」または「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」と称される。従って、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの免疫刺激性モチーフを含む。好ましい実施形態では、この免疫刺激性モチーフは、「内部免疫刺激性モチーフ」である。用語「内部免疫刺激性モチーフ」とは、この免疫刺激性モチーフ配列の５’末端および３’末端の両方に連結された少なくとも１つのヌクレオチドによって、このモチーフ配列よりも長い、さらに長い核酸配列内のモチーフ配列の位置をいう。
【００８３】
この免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、「ＣｐＧジヌクレオチド」である免疫刺激性モチーフを含む。ＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されてもメチル化されなくてもよい。少なくとも１つのメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、メチル化されていないシトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、リン酸結合によって連結される、メチル化されていない５’シチジン、およびそれに続く３’グアノシン）を含み、そして免疫系を活性化する核酸分子である；このような免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、米国特許第６，１９４，３８８号；同第６，２０７，６４６号；同第６，２１４，８０６号；同第６，２１８，３７１号；同第６，２３９，１１６号；および同第６，３３９，０６８号を含む、多数の発行された特許、公開された特許出願および他の刊行物において記載されている。少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、メチル化されたシトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、リン酸結合によって連結される、メチル化されていない５’シチジン、およびそれに続く３’グアノシン）を含み、そして免疫系を活性化するオリゴヌクレオチドである。
【００８４】
異なるクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドが存在することが、最近記載されている。１つのクラスはＢ細胞活性化について強力であるが、ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞の活性化を誘導するには比較的弱い；このクラスは、Ｂクラスと称されている。このＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドは、代表的に、完全に安定化され、そして特定の好ましい塩基構成内に、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；同第６，２０７，６４６号；同第６，２１４，８０６号；同第６，２１８，３７１号；同第６，２３９，１１６号および同第６，３３９，０６８号を参照のこと。別のクラスは、ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞の活性化を誘導するのに強力であるが、Ｂ細胞を刺激するには比較的弱い；このクラスは、Ａクラスと称されている。このＡクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドは、代表的に、５’末端および３’末端に安定化されたポリＧ配列、そして少なくとも６つのヌクレオチドからなる中心の回文構造のホスホジエステルＣｐＧジヌクレオチドを含む配列を有する。例えば、公開された特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２６５２７（ＷＯ０１／２２９９０）を参照のこと。
【００８５】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドのさらに別のクラスはＢ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、そしてＩＦＮ−αを誘導する；このクラスは、Ｃクラスと称されている。このＣクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドは、最初に特徴付けられたように、代表的には完全に安定化され、Ｂクラス型の配列、およびＧＣリッチなパリンドロームまたはＧＣリッチなほぼ完全なパリンドロームを含む。このクラスは、ＵＳ２００３／０１４８９７６として公開された同時係属中の米国特許出願１０／２２４，５２３（２００２年８月１９日出願）、およびＷＯ２００５／０４２０１８として公開された関連するＰＣＴ出願を伴うＵＳ１０／９７８，２８３（２００４年１０月２９日出願）（これらの内容の全体は、参考として本明細書中に援用される）に記載されている。
【００８６】
Ｃクラスオリゴヌクレオチドはまた、Ｃ型ＣｐＧ  ＯＤＮと称される。特定の実施形態において、このＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮは、モチーフの組み合わせを含み、１つのモチーフは、ＣＧリッチなパリンドロームまたは中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ）モチーフであり、そして別のモチーフは、刺激性モチーフ（例えば、ＣｐＧモチーフまたは配列ＴＣＧＴＣＧ）である。
【００８７】
上記Ｃ  ＣｐＧ  ＯＤＮは、以下の式を有し得る：５’Ｘ１ＤＣＧＨＸ２３’。Ｘ１およびＸ２は、独立して、０ヌクレオチド長〜１０ヌクレオチド長の任意の配列である。Ｄは、Ｃ以外のヌクレオチドであり。Ｃは、シトシンであり。Ｇは、グアニンである。Ｈは、Ｇ以外のヌクレオチドである。その核酸配列はまた、この核酸配列はまた、Ｘ１のすぐ５’側またはＸ２のすぐ３’側に位置する、ＰおよびＮからなる群より選択される核酸配列をさらに含む。Ｎは、Ｂ細胞中和配列である。Ｎは、ＣＧＧトリヌクレオチドで始まり、かつ少なくとも１０ヌクレオチド長である。Ｐは、ＧＣリッチなパリンドロームを含む少なくとも１０ヌクレオチド長の配列である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、上記免疫刺激核酸は、５’ＮＸ１ＤＣＧＨＸ２３’、５’Ｘ１ＤＣＧＨＸ２Ｎ３’、５’ＰＸ１ＤＣＧＨＸ２３’、５’Ｘ１ＤＣＧＨＸ２Ｐ３’、５’Ｘ１ＤＣＧＨＸ２ＰＸ３３’、５’Ｘ１ＤＣＧＨＰＸ３３’、５’ＤＣＧＨＸ２ＰＸ３３’、５’ＴＣＧＨＸ２ＰＸ３３’、または５’ＤＣＧＨＰＸ３３’である。Ｘ３は、０ヌクレオチド長〜１０ヌクレオチド長の任意の配列である。他の実施形態において、その免疫刺激核酸は、５’ＤＣＧＨＰ３’である。
【００８９】
必要に応じて、Ｄおよび／またはＨは、チミン（Ｔ）である。
【００９０】
他の実施形態において、ＨはＴであり、そしてＸ２は、ＣＧ、ＣＧＴ、ＣＧＴＴ、ＣＧＴＴＴ、またはＣＧＴＴＴＴである。
【００９１】
他の実施形態によると、ＨはＴであり、そしてＸ２は、ＣＧまたはＣＧＴＴＴＴである。
【００９２】
他の実施形態によると、Ｃは、メチル化されていない。
【００９３】
いくつかの実施形態において、Ｎは、少なくとも４つのＣＧジヌクレオチド、および２つ以下のＣＣＧトリヌクレオチドを含む。
【００９４】
必要に応じて、Ｐは、少なくとも１つのイノシンを含む。
【００９５】
上記核酸はまた、５’末端または３’末端にポリＴ配列を含み得る。
【００９６】
あるいは、Ｃ  ＣｐＧ  ＯＤＮは、以下の式を有し得る：５’Ｎ１ＰｙＧＮ２Ｐ３’。Ｎ１は、１ヌクレオチド長〜６ヌクレオチド長の任意の配列である。いくつかの実施形態において、Ｎ１は、少なくとも５０％がピリミジンであり、好ましくは、少なくとも５０％がＴである。他の実施形態において、Ｎ１は、少なくとも１つのＣＧモチーフ、少なくとも１つのＴＣＧモチーフ、少なくとも１つのＣＩモチーフ、少なくとも１つのＴＣＩモチーフ、少なくとも１つのＩＧモチーフ、または少なくとも１つのＴＩＧモチーフを含む。他の実施形態において、Ｎ１は、ＴＣＧＧまたはＴＣＧＨである。Ｈは、Ｇ以外のヌクレオチドである。
【００９７】
Ｐｙは、ピリミジンである。いくつかの実施形態において、Ｐｙは、非メチル化Ｃである。
【００９８】
Ｎ２は、０ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長の任意の配列である。いくつかの実施形態において、Ｎ２は、少なくとも５０％がピリミジンであるか、または少なくとも５０％がＴである。他の実施形態において、Ｎ２は、いかなるポリＧモチーフもポリＡモチーフも含まない。
【００９９】
Ｐは、少なくとも１０ヌクレオチド長の配列を含む、ＧＣリッチなパリンドロームである。いくつかの実施形態において、Ｐは、完全にパリンドロームである。他の実施形態において、Ｐは、１個と３個との間の個数連続する介在ヌクレオチドを有するパリンドロームである。必要に応じて、その介在ヌクレオチドは、ＴＧであり得る。他の実施形態において、Ｐは、少なくとも３つのＣヌクレオチド、少なくとも４つのＣヌクレオチド、もしくは少なくとも５つのＣヌクレオチド、および少なくとも３つのＧヌクレオチド、少なくとも４つのＧヌクレオチド、もしくは少なくとも５つのＧヌクレオチドを含む。他の実施形態によると、Ｐは、少なくとも１つのイノシンを含む。
【０１００】
１つの実施形態において、このＧＣリッチなパリンドロームは、少なくとも３分の２がＧおよびＣである塩基含量を有する。別の実施形態において、このＧＣリッチなパリンドロームは、少なくとも８１％がＧおよびＣである塩基含量を有する。いくつかの実施形態において、このＧＣリッチなパリンドロームは、少なくとも１２ヌクレオチド長である。このＧＣリッチなパリンドロームは、ＣおよびＧのみから構成され得る。いくつかの実施形態において、このＧＣリッチなパリンドロームは、ＣでもＧでもない少なくとも１つのヌクレオチドを含み得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、このＧＣリッチなパリンドロームは、少なくとも１つのＣＧＧトリマー、少なくとも１つのＣＣＧトリマー、または少なくとも１つのＣＧＣＧテトラマーを含む。いくつかの実施形態において、このＧＣリッチなパリンドロームは、少なくとも４つのＣＧジヌクレオチドを含む。特定の好ましい実施形態において、このＧＣリッチなパリンドロームは、中心にあるＣＧジヌクレオチドを有する。
【０１０２】
特定の実施形態において、このＧＣリッチなパリンドロームは、ＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号５８）、ＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧ（配列番号５９）、ＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧ（配列番号６０）またはＣＧＡＣＧＴＡＣＧＴＣＧ（配列番号６１）である。
【０１０３】
特定の実施形態において、このＧＣリッチなパリンドロームは、ＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧ（配列番号６２）、ＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣ（配列番号６３）、ＣＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号６４）、ＧＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＣ（配列番号６５）、ＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧ（配列番号６６）、またはＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣ（配列番号６７）である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、Ｎ１ＰｙＧＮ２は、ＴＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧＴ、ＴＴＣＧＴ、ＴＴＴＣＧＴ、およびＴＣＧＴＣＧＴからなる群より選択される、配列である。
【０１０５】
長さが１３ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの免疫刺激核酸が、本発明の他の局面に従って提供される。この核酸は、以下の式を有する：５’Ｎ１ＰｙＧ／ＩＮ２Ｐ３’。Ｇ／Ｉは、ＧまたはＩのいずれかである単一のヌクレオチドを指す。Ｇはグアニンであり、Ｉはイノシンである。
【０１０６】
Ｎ１は、１ヌクレオチド長〜６ヌクレオチド長の任意の配列である。Ｐｙは、ピリミジンである。Ｎ２は、０ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長の任意の配列である。
【０１０７】
Ｐは、パリンドロームを含む少なくとも１０ヌクレオチド長の配列である。いくつかの実施形態において、Ｐは、ＧＣリッチなパリンドロームである。他の実施形態において、Ｐは、ＩＣリッチなパリンドロームである。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、Ｎ１ＰｙＩＮ２は、ＴＣＩＴＣＩＴＴＴＴ（配列番号６２）である。本明細書中で改変Ｃクラスオリゴヌクレオチドと称されるクラスのオリゴヌクレオチドは、特徴的に、溶液中でモノマーである。これらの核酸分子は、インビトロで分子内の二重鎖構造を形成し得、それらをヌクレアーゼ消化に対して安定にすると考えられる。これらの同じ核酸分子は、分子間の二重鎖構造を形成し得、そしておそらく、これらの核酸分子がその生物学的活性を発揮すると考えられるエンドソーム内の区画の環境中で、さらに高い次数の構造を形成し得るとも考えられる。
【０１０９】
改変Ｃクラスオリゴヌクレオチドは、３つの一般式を有する。式Ｉ：
【０１１０】
【化６】
2008516634.tif 000008
ここで、Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３の各々は、独立して、必要に応じて非ヌクレオチド性リンカーまたは無塩基のｄＳｐａｃｅｒを含む、０ヌクレオチド長〜１２ヌクレオチド長の任意の配列であり；Ｘ１およびＸ２の各々は、独立して、チミジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシンまたは５−置換デオキシウリジンであり；Ｙ１およびＹ２の各々は、独立して、シトシン（Ｃ）または改変シトシンであり；Ｒ１およびＲ２の各々は、独立して、グアニン（Ｇ）または改変グアニンであり；ＮおよびＮ’の各々は、独立して、必要に応じて非ヌクレオチド性リンカーまたは無塩基のｄＳｐａｃｅｒを含む、０ヌクレオチド長〜１２ヌクレオチド長の任意の配列であり；Ｓ１は、非ヌクレオチド性リンカー、無塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール単位またはヘキサエチレングリコール単位であり、これらは、必要に応じて、２’５’−ヌクレオシド間結合、５’５’−ヌクレオシド間結合、３’３’−ヌクレオシド間結合、２’２’−ヌクレオシド間結合、または２’３’−ヌクレオシド間結合を提供し；Ｓ２は、１ヌクレオチド長〜１０ヌクレオチド長の任意の非パリンドローム配列、または非ヌクレオチド性リンカー、無塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール単位もしくはヘキサエチレングリコール単位であり；Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ＃の各々は、任意のヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドであり、Ｎ１は、Ｎ１＃と塩基対を形成し、Ｎ２は、Ｎ２＃と塩基対を形成し、．．．そしてＮｎは、Ｎｎ＃と塩基対を形成し；ｋは、０〜５の整数であり；ｎは、２〜１６の整数であり；ｐは、１〜６の整数であり；そしてｑは、０〜１０の整数であり、そしてここで（Ｎｎ）．．．（Ｎ２）（Ｎ１）Ｓ２（Ｎ１＃）（Ｎ２＃）．．．（Ｎｎ＃）は、１０ヌクレオチド長〜４２ヌクレオチド長であり、Ｓ２は、４ヌクレオチド長〜１０ヌクレオチド長であり、Ｓ２は、非ヌクレオチド性リンカー、無塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール単位またはヘキサエチレングリコール単位を含み、そして／または（Ｎｎ）．．．（Ｎ２）（Ｎ１）Ｓ２（Ｎ１＃）（Ｎ２＃）．．．（Ｎｎ＃）は、２／３未満であるＧＣ含量を有する。
【０１１１】
１つの実施形態において、Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ＃の各々は、Ｃ、Ｇ、またはそれらの改変物（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）から選択され、ここでＣは、Ｇと塩基対を形成する。
【０１１２】
１つの実施形態において、Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ＃の各々は、Ｔ、Ａ、またはそれらの改変物から選択され、そしてＴは、Ａと塩基対を形成する。
【０１１３】
これらの実施形態および他の実施形態において、Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＴの各々は、対応する塩基（シトシン、グアニン、アデニン、およびチミン）を有するデオキシヌクレオチドを指し得る。１つの実施形態において、Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ＃の各々は、Ｃ、Ｔ、Ａ、Ｇ、またはそれらの改変物から選択され、そしてＣは、Ｇと塩基対を形成し、Ｔは、Ｇと塩基対を形成し、Ａは、Ｔと塩基対を形成し、そしてＡは、Ｇと塩基対を形成する。
【０１１４】
１つの実施形態において、Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ＃の各々は、ワトソン−クリック型の塩基対を形成する、未改変ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドから選択される。
【０１１５】
１つの実施形態において、Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ＃の各々は、非ワトソン−クリック型の塩基対を形成する、未改変ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドから選択される。
【０１１６】
１つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、少なくとも１つのホスホジエステル結合を有する部分的に安定化された骨格を含む。
【０１１７】
１つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、少なくとも１つの安定化されたヌクレオチド間結合を有する骨格を含む。
【０１１８】
１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合は、全てのホスホロチオエート結合である。
【０１１９】
１つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、Ｙ１Ｒ１またはＹ２Ｒ２の少なくとも１つを連結するホスホジエステル結合を有する部分的に安定化された骨格を含む。
【０１２０】
１つの実施形態において、Ｙ１は、Ｃである。
【０１２１】
１つの実施形態において、Ｒ１は、Ｇである。
【０１２２】
１つの実施形態において、Ｙ１は、Ｃであり、そしてＲ１は、Ｇである。
【０１２３】
１つの実施形態において、Ｘ１またはＸ２は、Ｔである。
【０１２４】
１つの実施形態において、Ｘ１は、Ｔであり、Ｘ２は、Ｔであり、Ｙ１は、Ｃであり、Ｒ１は、Ｇであり、そしてｋは、１である。
【０１２５】
１つの実施形態において、Ｘ１は、Ｔであり、Ｘ２は、Ｔであり、Ｙ１は、Ｃであり、Ｒ１は、Ｇであり、ｋは、１であり、ｐは、１であり、ＮおよびＮ’およびＺ３は、それぞれ、０個のヌクレオチドを含み、そしてＺ２は、ＴＴＴＴまたはｄ（ＵＵＵＵ）である。
【０１２６】
１つの実施形態において、Ｓ２は、非ヌクレオチド性リンカーである。
【０１２７】
１つの実施形態において、Ｓ２は、少なくとも１つの無塩基のｄＳｐａｃｅｒ残基を含む。
【０１２８】
１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの分枝した非ヌクレオシド結合を含む。
【０１２９】
１つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、少なくとも１つのダブラー（ｄｏｕｂｌｅｒ）単位、少なくとも１つのトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）単位、または少なくとも１つのダブラー単位と少なくとも１つのトレブラー単位とを含む。
【０１３０】
１つの実施形態において、Ｓ１は、ダブラー単位またはトレブラー単位である。
【０１３１】
１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’５’−ヌクレオシド間結合、５’５’−ヌクレオシド間結合、３’３’−ヌクレオシド間結合、２’２’−ヌクレオシド間結合、または２’３’−ヌクレオシド間結合を含む。
【０１３２】
１つの局面において、本発明は、式ＩＩの免疫刺激性核酸分子を提供する。
【０１３３】
【化７】
2008516634.tif 000009
ここで、Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３の各々は、独立して、必要に応じて非ヌクレオチド性リンカーまたは無塩基のｄＳｐａｃｅｒを含む、０ヌクレオチド長〜１２ヌクレオチド長の任意の配列であり；Ｘ１およびＸ２の各々は、独立して、チミジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシンまたは５−置換デオキシウリジンであり；Ｙ１およびＹ２の各々は、独立して、シトシンまたは改変シトシンであり；Ｒ１およびＲ２の各々は、独立して、グアニンまたは改変グアニンであり；Ｎは、必要に応じて非ヌクレオチド性リンカーまたは無塩基のｄＳｐａｃｅｒを含む、０ヌクレオチド長〜１２ヌクレオチド長の任意の配列であり；Ｓ１は、非ヌクレオチド性リンカー、無塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール単位またはヘキサエチレングリコール単位であり、これらは、必要に応じて、２’５’−ヌクレオシド間結合、５’５’−ヌクレオシド間結合、３’３’−ヌクレオシド間結合、２’２’−ヌクレオシド間結合、または２’３’−ヌクレオシド間結合を提供し；Ｓ２は、１ヌクレオチド長〜１０ヌクレオチド長の任意の非パリンドローム配列、または非ヌクレオチド性リンカー、無塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール単位もしくはヘキサエチレングリコール単位であり；Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎ−１、Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ−１＃、Ｎｎ＃の各々は、任意のヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドであり、Ｎ１は、Ｎ１＃と塩基対を形成し、Ｎ２は、Ｎ２＃と塩基対を形成し、．．．そしてＮｎ−１は、Ｎｎ−１＃と塩基対を形成し；ｋは、０〜５の整数であり；ｎは、２〜１６の整数であり；ｐは、１〜６の整数であり；そしてｑは、０〜１０の整数であり、そしてここで（Ｎｎ）．．．（Ｎ２）（Ｎ１）Ｓ２（Ｎ１＃）（Ｎ２＃）．．．（Ｎｎ＃）は、１０ヌクレオチド長〜４２ヌクレオチド長であり、Ｓ２は、４ヌクレオチド長〜１０ヌクレオチド長であり、Ｓ２は、非ヌクレオチド性リンカー、無塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール単位またはヘキサエチレングリコール単位を含み、そして／または（Ｎｎ）．．．（Ｎ２）（Ｎ１）Ｓ２（Ｎ１＃）（Ｎ２＃）．．．（Ｎｎ＃）は、２／３未満であるＧＣ含量を有する。
【０１３４】
１つの実施形態において、Ｚ１（Ｎｎ）（Ｎｎ−１）は、ＴＹＲであり、Ｙは、シトシンまたは改変シトシンであり、そしてＲは、グアニンまたは改変グアニンである。
【０１３５】
１つの実施形態において、１つの実施形態において、Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎ−１、Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ−１＃、Ｎｎ＃の各々は、Ｃ、Ｇ、またはそれらの改変物から選択され、ここでＣは、Ｇと塩基対を形成する。
【０１３６】
１つの実施形態において、Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎ−１、Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ−１＃、Ｎｎ＃の各々は、Ｔ、Ａ、またはそれらの改変物から選択され、そしてＴは、Ａと塩基対を形成する。
【０１３７】
これらの実施形態および他の実施形態において、Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＴの各々は、対応する塩基（シトシン、グアニン、アデニン、およびチミン）を有するデオキシヌクレオチドを指し得る。
【０１３８】
１つの実施形態において、Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎ−１、Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ−１＃、Ｎｎ＃の各々は、Ｃ、Ｔ、Ａ、Ｇ、またはそれらの改変物から選択され、そしてＣは、Ｇと塩基対を形成し、Ｔは、Ｇと塩基対を形成し、Ａは、Ｔと塩基対を形成し、そしてＡは、Ｇと塩基対を形成する。
【０１３９】
１つの実施形態において、Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎ−１、Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ−１＃、Ｎｎ＃の各々は、ワトソン−クリック型の塩基対を形成する、未改変ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドから選択される。
【０１４０】
１つの実施形態において、Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎ−１、Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ−１＃、Ｎｎ＃の各々は、非ワトソン−クリック型の塩基対を形成する、未改変ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドから選択される。
【０１４１】
１つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、少なくとも１つのホスホジエステル結合を有する部分的に安定化された骨格を含む。
【０１４２】
１つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、少なくとも１つの安定化されたヌクレオチド間結合を有する骨格を含む。
【０１４３】
１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合は、全てのホスホロチオエート結合である。
【０１４４】
１つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、Ｙ１Ｒ１またはＹ２Ｒ２の少なくとも１つを連結するホスホジエステル結合を有する部分的に安定化された骨格を含む。
【０１４５】
１つの実施形態において、Ｙ１は、Ｃである。
【０１４６】
１つの実施形態において、Ｒ１は、Ｇである。
【０１４７】
１つの実施形態において、Ｙ１は、Ｃであり、そしてＲ１は、Ｇである。
【０１４８】
１つの実施形態において、Ｘ１またはＸ２は、Ｔである。
【０１４９】
１つの実施形態において、Ｘ１は、Ｔであり、Ｘ２は、Ｔであり、Ｙ１は、Ｃであり、Ｒ１は、Ｇであり、そしてｋは、１である。
【０１５０】
１つの実施形態において、Ｘ１は、Ｔであり、Ｘ２は、Ｔであり、Ｙ１は、Ｃであり、Ｒ１は、Ｇであり、ｋは、１であり、ｐは、１であり、ＮおよびＮ’およびＺ３は、それぞれ、０個のヌクレオチドを含み、そしてＺ２は、ＴＴＴＴまたはｄ（ＵＵＵＵ）である。
【０１５１】
１つの実施形態において、Ｓ２は、非ヌクレオチド性リンカーである。
【０１５２】
１つの実施形態において、Ｓ２は、少なくとも１つの無塩基のｄＳｐａｃｅｒ残基を含む。
【０１５３】
１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの分枝した非ヌクレオシド結合を含む。
【０１５４】
１つの実施形態において、上記免疫刺激性核酸分子は、少なくとも１つのダブラー単位、少なくとも１つのトレブラー単位、または少なくとも１つのダブラー単位と少なくとも１つのトレブラー単位とを含む。
【０１５５】
１つの実施形態において、Ｓ１は、ダブラー単位またはトレブラー単位である。
【０１５６】
１つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’５’−ヌクレオシド間結合、５’５’−ヌクレオシド間結合、３’３’−ヌクレオシド間結合、２’２’−ヌクレオシド間結合、または２’３’−ヌクレオシド間結合を含む。
【０１５７】
１つの局面において、本発明は、式ＩＩＩの免疫刺激性核酸分子を提供する。
【０１５８】
【化８】
2008516634.tif 000010
ここでＵは、Ｚ１［（Ｘ１Ｙ１Ｒ１）Ｎ（Ｘ２Ｙ２Ｒ２）ｋＺ２］ｐ（Ｓ１）ｑＮ’（Ｎｎ）．．．．（Ｎ３）（Ｎ２）（Ｎ１）Ｓ２（Ｎ１＃）（Ｎ２＃）（Ｎ３＃）．．．（Ｎｎ＃）であり；Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３の各々は、独立して、必要に応じて非ヌクレオチド性リンカーまたは無塩基のｄＳｐａｃｅｒを含む、０ヌクレオチド長〜１２ヌクレオチド長の任意の配列であり；Ｘ１およびＸ２の各々は、独立して、チミジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシンまたは５−置換デオキシウリジンであり；Ｙ１およびＹ２の各々は、独立して、シトシンまたは改変シトシンであり；Ｒ１およびＲ２の各々は、独立して、グアニンまたは改変グアニンであり；ＮおよびＮ’の各々は、独立して、必要に応じて非ヌクレオチド性リンカーまたは無塩基のｄＳｐａｃｅｒを含む、０ヌクレオチド長〜１２ヌクレオチド長の任意の配列であり；Ｓ１は、非ヌクレオチド性リンカー、無塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール単位またはヘキサエチレングリコール単位であり、これらは、必要に応じて、２’５’−ヌクレオシド間結合、５’５’−ヌクレオシド間結合、３’３’−ヌクレオシド間結合、２’２’−ヌクレオシド間結合、または２’３’−ヌクレオシド間結合を提供し；Ｓ２は、１ヌクレオチド長〜１０ヌクレオチド長の任意の非パリンドローム配列、または非ヌクレオチド性リンカー、無塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール単位もしくはヘキサエチレングリコール単位であり；Ｓ３は、直接もしくは間接の２’５’−ヌクレオシド間結合、５’５’−ヌクレオシド間結合、３’３’−ヌクレオシド間結合、２’２’−ヌクレオシド間結合、または２’３’−ヌクレオシド間結合、あるいはｍ配列部分の２’５’−結合、５’５’−結合、３’３’−結合、２’２’−結合、もしくは２’３’−結合を容易にする非ヌクレオチド性リンカー（この非ヌクレオチド性リンカーは、無塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒ）を含む）、トリエチレングリコール単位、またはヘキサエチレングリコール単位であり；Ｎ１、Ｎ２、．．．．Ｎｎの各々およびＮ１＃、Ｎ２＃、．．．Ｎｎ＃の各々は、任意のヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドであり、Ｎ１は、Ｎ１＃と塩基対を形成し、Ｎ２は、Ｎ２＃と塩基対を形成し、Ｎ３は、Ｎ３＃と塩基対を形成し、．．．そしてＮｎは、Ｎｎ＃と塩基対を形成し；ｋは、０〜５の整数であり；ｍは、２〜１０の整数であり；ｎは、２〜１６の整数であり；ｐは、１〜６の整数であり；そしてｑは、０〜１０の整数である。
【０１５９】
特定の実施形態において、Ｚ１［（Ｘ１Ｙ１Ｒ１）Ｎ（Ｘ２Ｙ２Ｒ２）ｋＺ２］ｐ（Ｓ１）ｑは、非パリンドローム配列である。
【０１６０】
特定の実施形態において、Ｚ１［（Ｘ１Ｙ１Ｒ１）Ｎ（Ｘ２Ｙ２Ｒ２）ｋＺ２］ｐ（Ｓ１）ｑはＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴ（配列番号２９）、ＴＣＧＴＣＧＴＴＤＤ（配列番号３０）、ＴＣＧＡ、ＴＣＧＡＣ、ＴＣＧＡＣＧＴＣ、またはＴＣＧＡＣＧＴＣＧであり、ここでＤは、ｄＳｐａｃｅｒである。
【０１６１】
特定の実施形態において、Ｚ１［（Ｘ１Ｙ１Ｒ１）Ｎ（Ｘ２Ｙ２Ｒ２）ｋＺ２］ｐ（Ｓ１）ｑは、パリンドローム配列である。
【０１６２】
特定の実施形態において、Ｚ１［（Ｘ１Ｙ１Ｒ１）Ｎ（Ｘ２Ｙ２Ｒ２）ｋＺ２］ｐ（Ｓ１）ｑは、ＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡ（配列番号３１）またはＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡ（配列番号３２）である。
【０１６３】
特定の実施形態において、Ｚ１［（Ｘ１Ｙ１Ｒ１）Ｎ（Ｘ２Ｙ２Ｒ２）ｋＺ２］ｐ（Ｓ１）ｑは、ＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴ（配列番号３３）またはＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴ（配列番号３４）である。
【０１６４】
１つの実施形態において、（Ｎｎ）．．．．（Ｎ２）（Ｎ１）Ｓ２（Ｎ１＃）（Ｎ２＃）．．．（Ｎｎ＃）Ｚ３は、以下の配列：
【０１６５】
【化９】
2008516634.tif 000011
を含み、ここでＤは、ｄＳｐａｃｅｒである。
【０１６６】
１つの実施形態において、（Ｎｎ）．．．．（Ｎ２）（Ｎ１）Ｓ２（Ｎ１＃）（Ｎ２＃）．．．（Ｎｎ＃）は、配列ＧＧＣＧＣＧＣＴＧＣＣＧ（配列番号５０）を含む。
【０１６７】
１つの実施形態において、上記核酸の５’末端は、（ＴＣＧ）ｎＮおよびＲＤＣＧＹ１Ｙ２Ｎから選択される免疫刺激性モチーフによって始まる。Ｔは、チミンであり、Ｃは、非メチル化シトシンであり、Ｇは、グアニンであり、Ｒは、プリンであり、Ｄは、Ｃではなく、Ｙ１およびＹ２の各々は、独立して、ピリミジンであり、ｎは、１および４を含めて１と４との間の整数であり、そしてＮは、０塩基長〜１２塩基長の任意の配列である。
【０１６８】
上記核酸の３’末端は、ヘアピン構造またはステム−ループ構造を形成し得る逆方向反復で終結する。用語「終結する」とは、３’末端か、または３’末端近傍における構造をいう。従って、ほぼパリンドロームの末端は、その分子の実際の３’末端に位置付けられ得るか、あるいは、その３’末端は、逆方向反復構造の一部ではない１個以上のさらなるヌクレオチドを含み得る。好ましくは、上記分子の３’末端は、逆方向反復構造の一部を形成しない３個以下のヌクレオチドを含む。
【０１６９】
１つの実施形態において、本明細書中で使用される場合、「ヘアピン構造またはステム−ループ構造を形成し得る逆方向反復」とは、２〜１０個の連続した塩基対の長さであるＧＣリッチなステムまたはヘアピンを形成し、そして少なくとも１個の調和しない塩基またはミスマッチの塩基を含むヌクレオチドの配列をいう。個々の実施形態において、そのＧＣリッチなステムは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の連続した塩基対の長さである。いくつかの実施形態において、そのＧＣリッチなステムは、少なくとも２個、３個、または４個のＧ−Ｃ塩基対を含む。
【０１７０】
１つの実施形態において、本明細書中で使用される場合、「ヘアピン構造またはステム−ループ構造を形成し得る逆方向反復」とは、２〜１０個の連続した塩基対の長さであるＡＴリッチなステムまたはヘアピンを形成し、そして少なくとも１個の調和しない塩基またはミスマッチの塩基を含むヌクレオチドの配列をいう。個々の実施形態において、そのＡＴリッチなステムは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の連続した塩基対の長さである。いくつかの実施形態において、そのＡＴリッチなステムは、少なくとも２個、３個、または４個のＡ−Ｔ塩基対を含む。
【０１７１】
いくつかの場合において、上記少なくとも１個の１個の調和しない塩基またはミスマッチの塩基は、ステムまたはヘアピンの末端を架橋する。これは、その分子中の順応性の点そのステムに提供して、塩基対を形成し、そしてヘアピンを形成することによって、二次構造の形成を可能にし得る。あるいは、その調和しない塩基またはミスマッチの塩基は、そのステム内にあり得る。好ましくは、ミスマッチの塩基が、そのステム内にある場合、そのステムは、少なくとも３塩基対の長さである。その調和しない塩基またはミスマッチの塩基は、任意のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、その調和しない塩基またはミスマッチの塩基は、Ｔである。二本鎖の末端における調和しないヌクレオチドはまた、二重鎖形成またはヘアピン形成を顕著に安定化し得る、突出ヌクレオチドまたはダングリング末端（ｄａｎｇｌｉｎｇ  ｅｎｄ）として公知である。Ｆｒｅｉｅｒ  ＳＭら、（１９８３）Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ３’  ｄａｎｇｌｉｎｇ  ｅｎｄ  ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＧＧＣＣ  ａｎｄ  ＣＣＧＧ  ｄｏｕｂｌｅ  ｈｅｌｉｘｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：６１９８−２０６。
【０１７２】
上記核酸はまた、少なくとも１つのホスホジエステル５’−ＣｐＧ−３’結合を含む部分的に安定化された骨格を含む。
【０１７３】
いくつかの場合において、上記分子の二本鎖部分はまた、天然に存在しない（非標準の）塩基対（例えば、キサントシンと対形成したジアミノピリジン）を含み得る。Ｌｕｔｚ  ＭＪら、（１９９８）  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｓｔａｎｄａｒｄ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｂｙ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ８：１１４９−５２。
【０１７４】
上記の式は、免疫を刺激する優れた特性を示した上記クラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドのサブセットを定義する。上記の式において、５’とは、オリゴヌクレオチドの自由な５’末端をいい、そして３’とは、オリゴヌクレオチドの自由な３’末端をいう。
【０１７５】
上記オリゴヌクレオチドは、１つ以上の接触可能（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）な５’末端または３’末端を有し得る。いくつかの実施形態において、３’末端は、別の３’末端に連結され得る。５’モチーフおよび３’モチーフの重要性が、見出され、そして本明細書中に記載されているので、２つのこのような５’末端または３’末端を有する改変オリゴヌクレオチドを作製することも、可能である。これは、例えば、３’−３’結合を介して２つのオリゴヌクレオチドを接続して、１つまたは２つの接触可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチドを生成することによって達成され得る。このような構造は、５’−ＲＤＣＧＹ１Ｙ２Ｎ−ＮＹ２Ｙ１ＧＣＤＲ−５’（ここでＤは、Ｃではないものを表す；配列番号５１）または５’−（ＴＣＧ）ｎＮ−Ｎ（ＧＣＴ）ｎ−５’（配列番号５２）のような式を有し得る。上記３’３’−結合または５’５’−結合は、ホスホジエステルヌクレオチド間架橋、ホスホロチオエートヌクレオチド間架橋、または任意の他の改変ヌクレオチド間架橋であり得る。このような結合を達成するための方法は、当該分野において公知である。例えば、このような結合は、Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｈら、（１９９１）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ３’−３’−ａｎｄ  ５’−５’−ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１０：４６９−７７およびＪｉａｎｇら、（１９９９）、「Ｐｓｅｕｄｏ−ｃｙｃｌｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｔｅｒｔｉｅｓ」、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、７、２７２７−３５に記載されている。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、以下の構造のうちの１つを有する：ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡ（配列番号５３）、ＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号５４）、ＣＧＧＣＧＴＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号５５）、ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号５６）、ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号５７）。
【０１７７】
１つの局面における本発明は、キメラ骨格を有するＣクラスＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの特定のサブクラスが、免疫刺激効果を媒介する工程において非常に効果的であるという発見に関係する。これらのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、癌、感染症、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、および他の障害を処置し、そして癌の化学療法後の日和見感染に対する保護を支援するために免疫系を刺激する工程に対して、治療的および予防的に有用である。ＣｐＧ刺激によって生じる強力であるがバランスのとれた、細胞性免疫応答および体液性免疫応答は、侵入する病原体および癌性細胞に対する身体自体の天然の防御システムを反映する。
【０１７８】
１つの局面において、本発明は、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドのサブセットは免疫刺激性の特性が改善されて、腎炎症の影響が低下されているという知見に関係する。いくつかの場合において、完全にホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドを投与されている被験体において腎炎症が観察されている。本明細書において記載されるキメラ核酸は、十分にホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドよりも腎炎症を生じることが少ないと考えられる。さらに、これらのオリゴヌクレオチドは免疫応答を刺激するのに非常に有効である。従って、この分子のホスホジエステル領域は、その有効性を低下させなかった。
【０１７９】
好ましいＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、以下の７つの一般式のうちの１つにおさまる：
５’  ＴＴＣ＿ＧＸ２Ｃ＿ＧＮ１Ｘ１＿ＧＸ３Ｃ＿ＧＴＴ  ３’（配列番号２４）；ここでＮ１は、１ヌクレオチド長〜３ヌクレオチド長であり、Ｎは、任意のヌクレオチドを示し、Ｘ１は、ピリミジンであり、Ｘ２およびＸ３は、任意のヌクレオチドである；
５’  ＴＴＣ＿ＧＴＣ＿ＧＴＴＴＸ１＿ＧＴＣ＿ＧＴＴ  ３’（配列番号２５）；ここでＸ１は、ピリミジンである；
５’  Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｘ１＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ  ３’（配列番号２５）；ここでＸ１は、ピリミジンである；
５’  ＴＣ＿ＧＸ１Ｃ＿ＧＸ２Ｎ１Ｘ３Ｃ＿ＧＮ２ＣＧ  ３’（配列番号２６）；ここでＮ１は、０ヌクレオチド長〜３ヌクレオチド長であり、Ｎ２は、０ヌクレオチド長〜９ヌクレオチド長であり、Ｎは、任意のヌクレオチドを示し、そしてＸ１、Ｘ２、およびＸ３は、任意のヌクレオチドである；
５’  ＴＣ＿ＧＴＣ＿ＧＴＮ１ＴＣ＿ＧＧＣＧＣＮ１ＧＣＣＧ  ３’（配列番号２７）；ここでＮ１は、０ヌクレオチド長〜３ヌクレオチド長である；
５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｎ１＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊ＣＮ１Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’（配列番号２７）；ここでＮ１は、０ヌクレオチド長〜３ヌクレオチド長である；
５’  ＴＣ＿ＧＸ１Ｃ＿ＧＸ２Ｃ＿ＧＸ３ＴＣ＿ＧＧＣＧＣ＿ＧＮ３  ３’（配列番号２８）；ここでＮ３は、１ヌクレオチド長〜５ヌクレオチド長であり、Ｎは、任意のヌクレオチドを示し、そしてＸ１、Ｘ２、およびＸ３は、任意のヌクレオチドである。
【０１８０】
必要に応じて、上記の式において明記される場合、５’とは、そのオリゴヌクレオチドの自由な５’末端をいい、そして３’とは、そのオリゴヌクレオチドの自由な３’末端をいう。
【０１８１】
上記の式において使用される記号＊は、安定化されたヌクレオチド間結合の存在を指す。これらの構造において、記号＿は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合の存在を指す。＊で印を付けられていないヌクレオチド間結合は、そのオリゴヌクレオチドが、少なくとも２つ〜３つのホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を含む限り、安定化されても、安定化されなくてもよい。いくつかの実施形態において、それらのオリゴヌクレオチドは、３つ〜６つのホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオチド間結合を含むことが好ましい。いくつかの場合において、上記ＣＧモチーフの間の結合は、ホスホジエステル結合であり、そして他の場合において、それらの結合は、ホスホロチオエート結合または他の安定化された結合である。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、以下の構造のうちの１つを有する：
【０１８３】
【化１０】
2008516634.tif 000012
【０１８４】
【化１１】
2008516634.tif 000013
用語「核酸」および用語「オリゴヌクレオチド」はまた、置換または改変（例えば、塩基および／もしくは糖における）を伴う、核酸またはオリゴヌクレオチドを包含する。例えば、それらとしては、骨格糖を有するオリゴヌクレオチドがあげられ、その骨格糖は、２’位におけるヒドロキシル基以外、および５’位における、リン酸基またはヒドロキシル基以外の低分子量の有機基に共有結合される。従って、改変された核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、改変された核酸は、リボースの代わりに、アラビノースまたは２’−フルオロアラビノースのような糖を含み得る。従って、その核酸は、骨格組成において不均一であり得、それによって、その骨格組成は、一緒に連結されたポリマー単位の任意の可能な組み合わせ（例えば、ペプチド−核酸（核酸塩基を伴うアミノ酸骨格を有する））を含む。
【０１８５】
核酸はまた、置換プリンおよび置換ピリミジン（例えば、Ｃ−５プロピンピリミジンおよび７−デアザ−７置換プリン改変塩基）を包含する。Ｗａｇｎｅｒ  ＲＷら、（１９９６）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４０−４。プリンおよびピリミジンとしては、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに天然に存在する他の核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）および天然に存在しない他の核酸塩基、置換芳香族部分および非置換芳香族部分が挙げられるが、これらに限定されない。他のこのような改変は、当業者に周知である。
【０１８６】
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、天然のＲＮＡおよびＤＮＡ（これらは、ホスホジエステルヌクレオチド間架橋、β−Ｄ−リボース単位および／または天然のヌクレオチド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル）を含む）と比較して種々の化学的改変および化学的置換を包含し得る。化学的改変の例は、当業者に公知であり、そして例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅら、（１９９０）、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４３；「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ＆  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＵＳＡ  １９９３；Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴら、（１９９６）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３６：１０７−１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ  Ｊら、（１９９５）、Ｍｏｄ  Ｓｙｎｔｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：３３１−４１７に記載される。本発明によるオリゴヌクレオチドは、１つ以上の改変を含み得、各改変は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡから構成される同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルヌクレオチド間架橋および／または特定のβ−Ｄ−リボース単位および／または特定の天然ヌクレオチド塩基位置に配置される。
【０１８７】
例えば、本発明は、１つ以上の改変を含み得るオリゴヌクレオチドに関連し、そして各改変は、独立して、以下から選択される：
ａ）改変ヌクレオチド間架橋による、ヌクレオチドの３’末端および／または５’末端に配置されるホスホジエステルのヌクレオチド間架橋の置換；
ｂ）デホスホ架橋によるヌクレオチドの３’末端および／または５’末端に配置されるホスホジエステル架橋の置換；
ｃ）別の単位による糖リン酸骨格由来の糖リン酸単位の置換；
ｄ）改変糖単位によるβ−Ｄ−リボースの置換；および
ｅ）改変ヌクレオチド塩基による天然のヌクレオチド塩基の置換。
【０１８８】
オリゴヌクレオチドの化学的改変についてのより詳細な例は、以下の通りである。
【０１８９】
ヌクレオチドの３’末端および／または５’末端に配置されるホスホジエステルのヌクレオチド間架橋は、改変ヌクレオチド間架橋によって置換され得、この改変ヌクレオチド間架橋は、例えば、ホスホロチオエート架橋、ホスホロジチオエート架橋、ＮＲ１Ｒ２−ホスホラミデート架橋、ボラノホスフェート架橋、α−ヒドロキシベンジルホスフェート架橋、ホスフェート−（Ｃ１〜Ｃ２１）−Ｏ−アルキルエステル架橋、ホスフェート−［（Ｃ６〜Ｃ１２）アリール−（Ｃ１〜Ｃ２１）−Ｏ−アルキル］エステル架橋、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルホスホネート架橋および／または（Ｃ６〜Ｃ１２）アリールホスホネート架橋、（Ｃ７〜Ｃ１２）−α−ヒドロキシメチル−アリール（例えば、ＷＯ９５／０１３６３に開示される）から選択され、（Ｃ６〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２０）アリールおよび（Ｃ６〜Ｃ１４）アリールは、必要に応じて、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノによって置換され、そしてＲ１およびＲ２は、互いに独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ１８）−アルキル、（Ｃ６〜Ｃ２０）−アリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルであり、好ましくは、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルであり、好ましくは、（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルおよび／もしくはメトキシエチルであるか、またはＲ１およびＲ２は、それらを担持する窒素原子と一緒になって、Ｏ、ＳおよびＮという基からのさらなるヘテロ原子をさらに含み得る５〜６員の複素環を形成する。
【０１９０】
ヌクレオチドの３’末端および／または５’末端に配置されるホスホジエステル架橋は、脱リン架橋（脱リン架橋は、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  ＥおよびＰｅｙｍａｎ  Ａ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第２０巻、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓ  Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ  １９９３、第１６章、ｐｐ．３５５  ｆｆに記載される）によって置換され、脱リン架橋は、例えば、デホスホ架橋ホルムアセタール基、３’−チオホルムアセタール基、メチルヒドロキシルアミン基、オキシム基、メチレンジメチル−ヒドラゾ基、ジメチレンスルホン基および／またはシリル基から選択される。
【０１９１】
糖リン酸単位（すなわち、一緒になって糖リン酸単位を形成するβ−Ｄ−リボースおよびホスホジエステルのヌクレオチド間架橋）は、糖リン酸骨格（すなわち、糖リン酸骨格は、糖リン酸単位から構成される）に由来し、この糖リン酸単位は、別の単位によって置換され得、他の単位は、例えば、「モルホリノ誘導体」オリゴマー（Ｓｔｉｒｃｈａｋ  ＥＰら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：６１２９−４１に記載されるような）を構築（すなわち、例えば、モルホリノ誘導体単位による置換）するのに適しているか、またはポリアミド核酸（「ＰＮＡ」；例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＰＥら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ５：３−７に記載される）を構築（すなわち、例えば、ＰＮＡ骨格単位（例えば、２−アミノエチルグリシン）による置換）するのに適している。
【０１９２】
β−リボース単位またはβ−Ｄ−２’−デオキシリボース単位は、改変糖単位によって置換され得、この改変糖単位は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボースから選択され、好ましくは、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボースは、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ヘキソ−ピラノース、ならびに炭素環式糖アナログ（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  Ｊ（１９９２）Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１４：８３２０に記載される）および／または開鎖糖アナログ（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：７２２３に記載される）および／またはビシクロ糖アナログ（例えば、Ｔａｒｋｏｖ  Ｍら（１９９３）Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ７６：４８１に記載される）である。
【０１９３】
いくつかの好ましい実施形態において、上記糖は、特に、ホスホジエステルもしくはホスホジエステル様のヌクレオチド間結合によって結合される一方または両方のヌクレオチドに関して、２’−Ｏ−メチルリボースである。
【０１９４】
改変塩基は、代表的にＤＮＡ中およびＲＮＡ中に見出されるＴ、Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＵのような天然の塩基と、化学的に区別される任意の塩基であるが、改変塩基は、これらの天然の塩基とは基本的化学構造を共にする。例えば、その改変ヌクレオシド塩基は、ヒポキサンチン、ウラシル、ジヒドロウラシル、プソイドウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、２，４−ジアミノ−プリン、８−アザプリン、置換された７−デアザプリン（好ましくは、７−デアザ−７−置換プリンおよび／または７−デアザ−８−置換プリン）、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン（例えば、Ｎ４−エチルシトシン）、５−ヒドロキシデオキシシチジン、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、Ｎ４−アルキルデオキシシチジン（例えば、Ｎ４−エチルデオキシシチジン）、６−チオデオキシグアノシン、およびニトロピロールのデオキシリボヌクレオチド、Ｃ５−プロピニルピリミジン、およびジアミノプリン（例えば、２，６−ジアミノプリン）、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチンまたは天然のヌクレオシド塩基の他の改変物より選択され得る。この一覧は、例示を意図するのであって、限定であると解釈されるべきではない。
【０１９５】
上記オリゴヌクレオチドは、１つ以上の接触可能な５’末端を有し得る。２つのこのような５’末端を有する改変オリゴヌクレオチドを作製することが、可能である。これは、例えば、３’−３’結合を介して２つのオリゴヌクレオチドを接続して、１つまたは２つの接触可能な５’末端を生成することによって達成され得る。上記３’３’−結合は、ホスホジエステルヌクレオチド間架橋、ホスホロチオエートヌクレオチド間架橋、または任意の他の改変ヌクレオチド間架橋であり得る。このような結合を達成するための方法は、当該分野において公知である。例えば、このような結合は、Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｈら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ３’−３’−ａｎｄ  ５’−５’−ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９１）、１０（１−３）、４６９−７７およびＪｉａｎｇら、「Ｐｓｅｕｄｏ−ｃｙｃｌｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｔｅｒｔｉｅｓ」、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）、７（１２）、２７２７−２７３５に記載されている。
【０１９６】
さらに、３’末端のヌクレオチドの間の結合がホスホジエステルでも、ホスホロチオエートでも他の改変された架橋でもない３’３’−結合したオリゴヌクレオチドは、さらなるスペーサー（例えば、トリ−エチレングリコールホスフェート部分またはテトラ−エチレングリコールホスフェート部分）を使用して調製され得る（Ｄｕｒａｎｄ，Ｍら、「Ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｏｎｅ（ｄＡ）１２  ａｎｄ  ｔｗｏ（ｄＴ）１２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｒｉｄｇｅｄ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｃｈａｉｎｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）、３１（３８）、９１９７−２０４、米国特許第５，６５８，７３８号および同第５，６６８，２６５号）。あるいは、非ヌクレオチド性リンカーは、標準的なホスホラミダイト化学反応を使用した、エタンジオール、プロパンジオール、または無塩基デオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）単位（Ｆｏｎｔａｎｅｌ，Ｍａｒｉｅ  Ｌａｕｒｅｎｃｅら、Ｓｔｅｒｉｃａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ  ５’−ａｔｔａｃｈｅｄ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）、２２（１１）、２０２２−７）に由来し得る。非ヌクレオチド性リンカーは、１回または複数回取り込まれ得るか、または互いに組み合わされ得、結合される２つのＯＤＮの３’末端の間に任意の望ましい距離を与える。
【０１９７】
最近、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）と相互作用することによってそれらの免疫刺激性効果を発揮するようであることが報告された。Ｈｅｍｍｉ  Ｈら、（２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４０−５。従って、ＴＬＲ９シグナル伝達活性は、ＮＦ−κＢシグナル、ＮＦ−κＢ関連性シグナル、ならびにＮＦ−κＢの上流または下流の適切な事象および中間体を測定することによって、ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは他の免疫刺激性オリゴヌクレオチドに対する応答において測定され得る。
【０１９８】
本発明における使用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の多数の手順のいずれかを使用して新規に合成され得る。例えば、ｂ−シアノエチルホスホロアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９，１９８１）；ヌクレオシドＨ−リン酸法（Ｇａｒｅｇｇら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１−４０５４，１９８６；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４０７，１９８６；Ｇａｒｅｇｇら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５−４０５８，１９８６，Ｇａｆｆｎｅｙら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９−２６２２，１９８８）。これらの化学反応は、市販されている種々の自動核酸合成機によって行われ得る。これらのオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドと称される。単離されたオリゴヌクレオチドとは、一般に、自然界において通常付随している成分から分離されているオリゴヌクレオチドをいう。例として、単離されたオリゴヌクレオチドは、細胞から分離されたものであっても、核から分離されたものであっても、ミトコンドリアから分離されたものであっても、またはクロマチンから分離されたものであってもよい。
【０１９９】
上記オリゴヌクレオチドは、分解に対して部分的に抵抗性であり得る（例えば、安定化される）。「安定化されたオリゴヌクレオチド分子」は、インビボ分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによって）に対して比較的抵抗性であるオリゴヌクレオチドを意味するものとする。核酸の安定化は、骨格の改変によって達成され得る。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、最大の活性を提供し得、そしてそのオリゴヌクレオチドを、細胞内の、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解から保護し得る。他の改変オリゴヌクレオチドとしては、ホスホジエステル改変オリゴヌクレオチド、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドとホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２００】
ホスホロチオエートのような改変された骨格は、ホスホラミデート化学反応またはＨ−ホスホネート化学反応のいずれかを利用する、自動化された技術を使用して合成され得る。アリール−ホスホネートおよびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されるように作製され得、そしてアルキルホスホトリエステル（荷電した酸素部分が、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されるようにアルキル化される）は、市販の試薬を使用する自動固相合成によって調製され得る。他のＤＮＡ骨格改変および他のＤＮＡ骨格置換をなすための方法が、記載されてきた。Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４，１９９０；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：１６５，１９９０。
【０２０１】
他の安定化されたオリゴヌクレオチドは、以下を含む：非イオン性ＤＮＡアナログ（例えば、アルキル−ホスフェートおよびアリール−ホスフェート（ここで、荷電したホスホネートの酸素がアルキル基またはアリール基によって置換される）、ホスホジエステル、および荷電した酸素部分がアルキル化されるアルキルホスホトリエステル）。いずれかの末端または両方の末端にてジオール（例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール）を含む核酸はまた、ヌクレアーゼ分解に対して十分に抵抗性であることを示した。
【０２０２】
ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドのサブセットが、ＰＢＭＣのようなヒト細胞に対して劇的な免疫刺激作用を有していることが、本発明によって発見された。このことは、これらのＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドが、ヒトのワクチン接種、ガンの免疫療法、喘息の免疫療法、免疫機能の全般的な強化、照射後または化学療法後の造血系の回復の促進、自己免疫疾患および他の免疫調節用途にとって、有効な治療剤であることを示唆している。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドのサブセットが、インビボで喘息およびアレルギー性鼻炎の処置に有用であることもまた、示された。
【０２０３】
アレルギーを有する被験体は、アレルゲンに対する応答におけるアレルギー反応を有するかまたはその反応を発症する危険のある被験体である。アレルギーとは、物質（アレルゲン）に対する後天性の過敏症をいう。アレルギー性状態としては、湿疹、アレルギー性鼻炎またはアレルギー性コリーザ、枯草熱、結膜炎、気管支喘息、じんま疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）（じんま疹（ｈｉｖｅｓ））および食物アレルギー、および他のアトピー性の状態が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
アレルギーは、一般的に、無害なアレルゲンに対するＩｇＥ抗体の生成によって引き起こされる。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの全身投与または粘膜投与によって誘導されるサイトカインは、主に、Ｔｈ１と呼ばれるクラスのものであり（例えば、ＩＬ−１２、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−γ）、これらは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答との両方を誘導する。ＩＬ−４およびＩＬ−５サイトカインの生産に関係している免疫応答の他の主要な型は、Ｔｈ２免疫応答と呼ばれる。一般に、アレルギー性疾患は、Ｔｈ２型の免疫応答によって媒介されるようである。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドがＴｈ２優勢（これはＩｇＥ抗体の生産およびアレルギーに関係している）からバランスのとれたＴｈ２／Ｔｈ１応答（これはアレルギー反応に対して防御的である）へと被験体の免疫応答を変化させる能力に基づいて、アレルゲンなしか、またはアレルゲンと組み合わせて単独の治療としてＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの免疫応答を誘導するための有効量が、喘息およびアレルギーを処置するために被験体に投与され得る。
【０２０５】
このように、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、喘息およびアレルギー性鼻炎のようなアレルギー性状態の処置において、有意な治療上の有用性を有する。Ｔｈ２サイトカイン（特に、ＩＬ−４およびＩＬ−５）は、喘息の被験体の気道において増大する。これらのサイトカインは、ＩｇＥアイソタイプの切り替え、好酸球の走化性および活性化、ならびに肥満細胞の増殖を含む、喘息の免疫応答の重要な局面を促進する。Ｔｈ１サイトカイン（特に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２）は、Ｔｈ２クローンの形成、およびＴｈ２サイトカインの生産を抑制し得る。喘息とは、炎症、気道の狭窄、および吸入される因子に対する気道の反応性の増大によって特徴付けられる、呼吸系の障害をいう。喘息は、多くの場合は、アトピー性症状またはアレルギー性症状に関係しているが、必ずしもそうとは限らない。
【０２０６】
喘息は、ウイルス感染によって増悪され得る。喘息とウイルス感染との組み合わせは、被験体においてその症状を顕著に悪化させる。本明細書中で使用されるオリゴヌクレオチドは、喘息のウイルス誘導性の増悪の処置に、重要な利益を提供する。このような療法の数種の例は、以下に示される。
【０２０７】
アレルギー性鼻炎は、アレルゲン（例えば、花粉または埃）によって引き起こされる、鼻粘膜の炎症を生じる障害である。この用語は、薬物性鼻炎、乾燥性鼻炎、およびアトピー性鼻炎を含む。アレルギー性鼻炎の２つの一般的な型（季節性および通年性）が存在する。季節性のアレルギー性鼻炎は、一般的には枯草熱と称され、そして通常、カビ（ｍｏｕｌｄ）または花粉によって引き起こされる。通年性のアレルギー性鼻炎は、通常、１つ以上の型のアレルゲンに対する生得的な感受性によって引き起こされる。この状態は、一般的に、一年中続くか、または患者がそのアレルゲンに曝される限り続く。両方の型のアレルギー性鼻炎は、炎症を生じる１型（ＩｇＥ媒介性）過敏症に関与する。この炎症は、特定のアレルゲンに対する応答における肥満細胞および血中の好塩基球の過剰な脱顆粒によって引き起こされると考えられる。これは、上昇したＩｇＥレベル、ならびに炎症メディエーター（例えば、ヒスタミン）および走化性因子（例えば、サイトカイン、プロスタグランジンおよびロイコトリエン）の同時放出を生じ、これらは、限局性の炎症反応をもたらす。
【０２０８】
上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、さらなる抗アレルギー／喘息の医薬も療法も伴わずに単独療法として投与されても、このような療法または医薬と組み合わせて投与されてもよい。代表的な抗アレルギー／喘息の医薬および療法としては、血管収縮剤の鼻腔内使用、抗ヒスタミン剤の鼻腔内使用および全身的使用、糖質コルチコイドの鼻腔内使用、肥満細胞安定化剤（例えば、クロモリン化合物）の使用、ならびに充血除去剤の経口使用が挙げられる。
【０２０９】
アレルゲンとは、感受性の被験体において、アレルギー反応または喘息の反応を誘導し得る物質（抗原）をいう。アレルゲンの一覧は、莫大な数であり、そしてアレルゲンとしては、花粉、昆虫の毒液、動物の鱗屑の塵（ｄａｎｄｅｒ  ｄｕｓｔ）、真菌の胞子、および薬物（例えば、ペニシリン）が挙げられ得る。天然の、動物性アレルゲンおよび植物性アレルゲンの例としては、以下の属：
【０２１０】
【化１２】
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に特異的なタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１１】
上記オリゴヌクレオチドはまた、免疫応答をＴｈ２型免疫応答からＴｈ１型免疫応答へ移行させるために有用である。このことは、比較的にバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２環境の産生を生じる。Ｔｈ２型免疫応答からＴｈ１型免疫応答への免疫応答の移行は、その核酸に対する反応において産生されたサイトカインのレベルを測定することによって（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを含む、単核細胞およびＴｈ１サイトカインを産生する他の細胞を誘導することによって）評価され得る。Ｔｈ２応答からＴｈ１応答への免疫応答の、移行またはリバランス（ｒｅｂａｌａｎｃｅ）は、喘息の処置または予防に、特に有用である。例えば、喘息を処置するのに有効な量は、喘息に関連するＴｈ２型の免疫応答を、Ｔｈ１型の免疫応答またはバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２環境に移行させるために有用な量であり得る。Ｔｈ２サイトカイン、特にＩＬ−４およびＩＬ−５は、喘息の被験体の気道において上昇する。本発明のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫系のリバランスを補助するＴｈ１サイトカインの増加を引き起こし、それは優勢なＴｈ２型免疫応答に関連する悪影響を防ぐか、または減少させる。
【０２１２】
上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、本発明のいくつかの局面において、アレルギーもしくは喘息に加えて、感染性の生物体による感染もしくは特定の癌抗原が確認された癌を発症する危険にある被験体の処置のためのワクチンとして有用である。そのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、感染、アレルギーもしくは癌に対する防御のための抗原またはアレルゲンを伴わずに投与され得る、そしてこの場合において、反復投与は、より長い期間の防御を可能にし得る。本明細書中で使用されるような危険にある被験体は、感染を引き起こす病原体、もしくは癌、もしくはアレルゲンに対する曝露の危険のいずれか、または癌を発症する危険を有する被験体である。例えば、危険にある被験体は、特定の型の感染因子が見出される地域への旅行を計画している被験体であり得るか、またはその危険にある被験体は、ライフスタイルまたは医療手順を通じて、感染性の生物体を含み得る体液に曝されるか、あるいは直接的にその生物に曝され得るか、または感染性の生物もしくはアレルゲンが確認されている地域に生きる任意の被験体でさえある。感染を発症する危険のある被験体はまた、医療機関が、特定の感染性の生物体の抗原を用いるワクチン接種を推奨する、一般的な集団を含む。その抗原が、アレルゲンであり、そしてその被験体が、その特定の抗原に対してアレルギー反応を発症し、そしてその被験体が、その抗原に曝露され得る（すなわち、花粉の季節の間）場合、その被験体は、上記抗原への曝露の危険にある。アレルギーから喘息を発症する危険にある被験体としては、アレルギーまたは喘息を有することが確認されてきた被験体が挙げられるが、その被験体は、上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドによる処置の間に、活動性の疾患を有さず、そして遺伝的要因または環境的要因に起因して、これらの疾患を発症する危険にあると考えられる被験体である。
【０２１３】
癌を発症する危険にある被験体は、癌を発症する高い確率を有する被験体である。例えば、これらの被験体としては、その存在が癌を発症するというより高い可能性に対して相関関係を有することが実証されてきた遺伝的異常を有する被験体、および癌を引き起こす因子（例えば、タバコ、アスベスト、もしくは他の化学的毒素）に曝露される被験体、またはこれまでに癌について処置され、そして表面上は回復状態にある被験体が挙げられる。癌を発症する危険のある被験体が、被験体が発症する危険のある癌の型に特異的な抗原、およびＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを用いて処置される場合、その被験体は、癌が発症するときに、その癌細胞を殺傷することが可能であり得る。上記被験体中で腫瘍の形成が始まる場合、その被験体は、その腫瘍抗原に対する特異的な免疫応答を発生する。
【０２１４】
予防的処置についての上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用に加えて、本発明はまた、感染、アレルギー、喘息、または癌を有する被験体の処置についてのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用を包含する。
【０２１５】
感染を有する被験体は、感染性病原体に曝された被験体であり、そしてその被験体は、身体の中に、急性的または慢性的な、その病原体の検出可能なレベルを有する。上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、抗原を伴うか、または伴わずに使用され得、その抗原は、抗原特異的な全身性免疫応答、または抗原特異的な粘膜の免疫応答を起こし、その免疫応答は、その感染性病原体のレベルの減少させること、またはその感染性病原体を根絶することができる。本明細書中で使用される場合、感染症は、身体の中の外来性の微生物の存在に起因する疾患である。有効なワクチンによる方法、および病原体侵入の主要な部位である身体の粘膜表面を保護するための処置を開発することは、特に重要である。
【０２１６】
癌を有する被験体は、検出可能な癌性細胞を有する被験体である。その癌は、悪性の癌または非悪性の癌であり得る。癌または腫瘍としては、胆道癌、脳の癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内新生物、リンパ腫、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞癌および非小細胞癌）、黒色腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、その癌は、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚のＴ細胞白血病、多発骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、扁平上皮癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱細胞癌または大腸癌である。
【０２１７】
被験体は、ヒト、または脊椎動物を意味するものとし、脊椎動物としては、犬、猫、馬、牛、豚、羊、山羊、七面鳥、鶏、霊長類（例えば、猿）、および魚（水産養殖の生物種）（例えば、鮭）が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、癌および腫瘍、感染、ならびに非ヒト被験体におけるアレルギー／喘息を処置するために使用され得る。癌は、コンパニオンアニマル（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ａｎｉｍａｌ）（例えば、猫および犬）の死の原因を導くものの１つである。
【０２１８】
本明細書中で使用される場合、用語「処置（ｔｒｅａｔ）」，用語「処置された（ｔｒｅａｔｅｄ）」、用語「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、障害（例えば、感染症、癌、アレルギー、または喘息）に関して使用される場合、予防的な処置（その処置は、疾患の発症に対する（例えば、病原体による感染に対する）被験体の抵抗性を増加し、または言い換えれば、その被験体が疾患を発症する（例えば、病原体に感染する）可能性を減少する)、および疾患と闘う（例えば、感染を軽減しまたは排除する）ためか、または疾患の悪化を防ぐための、被験体が疾患を発症した後の処置をいう。
【０２１９】
上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、抗原と一緒に投与される場合において、その被験体は、その抗原に曝され得る。本明細書中で使用される場合、用語「に曝される（ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ）」とは、上記被験体と抗原とを接触する能動的な工程、またはインビボでの、その抗原に対するその被験体の受動的な曝露のいずれかをいう。抗原に対する被験体の能動的な曝露のための方法は、当該分野で周知である。一般的に、抗原は、任意の手段（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、経皮投与、粘膜投与、鼻腔内投与、気管内投与、皮下投与）によって、その被験体に直接的に投与される。その抗原は、全身的または局所的に投与され得る。その抗原およびそのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与するための方法は、以下に、より詳細に記載される。抗原が被験体の身体において、免疫細胞に対する曝露に利用可能になる場合、被験体は、抗原に受動的に曝される。被験体は、例えば、その身体の中への、外来性の病原体の侵入によってか、またはその表面上で外来性の抗原を発現する腫瘍細胞の発生によって、抗原に受動的に曝露され得る。
【０２２０】
被験体が、抗原に対して受動的に曝露される方法は、特に、上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投与の時期に依存する。例えば、癌、または感染症、またはアレルギー性反応もしくは喘息の反応を発症する危険のある被験体において、その危険が、最も高い（すなわち、アレルギーの季節の間、または癌を引き起こす因子に対する曝露の後）場合、その被験体は、通常の基準でそのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与され得る。さらに、そのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、旅行者が、感染性因子への曝露の危険がある外国の土地へ旅行する前に、その旅行者に投与され得る。同様に、そのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、生物戦争への曝露の危険がある、軍人または一般人に投与され得、被験体が、それに曝された場合、抗原に対する、全身性免疫応答または粘膜の免疫疫応が誘導される。
【０２２１】
本明細書中で使用される抗原は、免疫応答を誘発し得る分子である。抗原としては、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖類の結合体、多糖類および他の分子の、ペプチド性模倣物（ｍｉｍｉｃ）および非ペプチド性模倣物、低分子、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルスおよびウイルス抽出物、ならびに多細胞生物（例えば、寄生虫およびアレルゲン）が挙げられるが、これらに限定されない。用語「抗原」は、外来性である場合、宿主免疫系によって認識される任意の分子の型を広く含む。抗原としては、癌抗原、微生物抗原、およびアレルゲンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２２】
本明細書中で使用される癌抗原は、腫瘍細胞表面または癌細胞表面と関係がある化合物（例えば、ペプチドまたはタンパク質）であり、そしてその化合物は、ＭＨＣ分子の状況において抗原提示細胞の表面上に発現されるときに、免疫応答を誘発し得る。癌抗原は、癌細胞の粗製抽出物を調製すること（例えば、Ｃｏｈｅｎら、１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４：１０５５に記載される）によってか、その抗原を部分的に精製することによってか、組換え技術によってか、または公知の抗原のデノボ合成によってかのいずれかで、癌細胞から調製され得る。癌抗原としては、組換え的（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ）に発現された抗原、それらの免疫原性部分、または腫瘍細胞の全体もしくは癌細胞の全体が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗原は、単離され得るか、または組換え的に調製され得るか、または当該分野で公知の任意の他の手段によって調製され得る。
【０２２３】
本明細書中で使用される微生物抗原は、微生物の抗原であり、そしてその微生物としてはウイルス、細菌、寄生虫および真菌が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗原としては、インタクトな微生物、ならびに天然の単離物および天然のフラグメントまたはそれらの誘導体、ならびに合成化合物も挙げられ、その合成化合物は、天然の微生物の抗原と同一であるか、または類似であり、その微生物に対して特異的な免疫応答を誘導する。化合物が、天然の微生物抗原に対する免疫応答（体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘導する場合、その化合物は、天然の微生物の抗原に類似する。このような抗原は、当該分野で慣用的に使用され、その抗原は、当業者にとって周知である。
【０２２４】
本明細書中で使用される用語「実質的に精製され（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」は、それが天然で結合している他のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質が実質的にないポリペプチドをいう。当業者は、タンパク質精製のための標準的な技術を使用して、ポリペプチド抗原を精製し得る。実質的に純粋なポリペプチドは、多くの場合、非還元のポリアクリルアミドゲル上に、単一の主要なバンドを生じる。部分的にグリコシル化されたポリペプチドの場合、またはいくつかの開始コドンを有するポリペプチドの場合、非還元のポリアクリルアミドゲル上に、いくつかのバンドが存在し得るが、それらのバンドは、そのポリペプチドに対する特有のパターンを形成する。そのウイルスポリペプチド抗原または細菌ポリペプチド抗原の純度はまた、アミノ末端のアミノ酸配列の分析によって決定され得る。核酸ベクターによってコードされない他の型の抗原（例えば、多糖類、低分子、模倣物など）は、本発明内に含まれる。
【０２２５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、抗微生物剤と一緒に、被験体に投与され得る。本明細書中で使用される場合、抗微生物剤とは、天然に存在する化合物または合成化合物をいい、それらは、感染性の微生物を、殺傷し得るか、または抑制し得る。本発明に従った有用な抗微生物剤の型は、被験体が、感染されるか、または感染される危険にある微生物の型に依存する。抗微生物剤としては、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および抗寄生虫剤が挙げられるが、これらに限定されない。「抗感染剤」、「抗細菌剤」、「抗ウイルス剤」、「抗真菌剤」、「抗寄生虫剤」および「駆虫薬」のような語句は、当業者にとって十分に確立された意味を有し、そしてその表現は、標準的な医学の教科書に定義される。簡単にいうと、抗細菌剤は、細菌を殺傷または抑制し、そして抗生物質ならびに類似の機能を有する他の合成化合物または天然化合物を含む。抗生物質は、微生物のような細胞によって二次代謝物として産生される低分子量の分子である。一般的に、抗生物質は、微生物に特異的でありかつ宿主細胞に存在しない１つ以上の細菌の機能または構造を妨害する。抗ウイルス剤は、天然供給源から単離され得るか、または合成され得、そしてウイルスを殺傷または抑制するために有用である。抗真菌剤は、表在性の真菌感染、ならびに日和見性および原発性の、全身性真菌感染を処置するために使用される。抗寄生虫剤は、寄生虫を殺傷または抑制する。
【０２２６】
ヒト投与のための有用な駆虫薬とも称される抗寄生虫剤の例としては、アルベンダゾール、アムホテリシンＢ、ベンズニダゾール、ビチオノール、クロロキンＨＣｌ、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、ジロキサニドフロエート、エフロルニチン、フラゾリダオン（ｆｕｒａｚｏｌｉｄａｏｎｅ）、糖質コルチコイド、ハロファントリン、ヨードキノール、アイバメクチン、メベンダゾール、メフロキン、メグルミンアンチモニエート、メラルソプロール、メトリホネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモックス、オキサムニキン、パロモマイシン、ペンタミジンイセチオネート、ピペラジン、プラジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル、ピランテルパモエート、ピリメタミンスルホンアミド（ｐｙｒｉｍｅｔｈａｎｍｉｎｅ−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、ピリメタミンスルファドキシン、キナクリンＨＣｌ、硫酸キニーネ、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコン酸ナトリウム（グルコン酸アンチモンナトリウム）、スラミン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（ｔｒｉｍｅｔｈｒｏｐｒｉｍ−ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、およびトリパルサミド（これらのいくつかは、単独で使用されるか、もしくは他のものと組み合わせて使用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２７】
抗細菌剤は、細菌を殺傷するか、または細菌の増殖または機能を抑制する。抗細菌剤の大きな分類は抗生物質である。広い範囲の細菌を殺傷または抑制するために有効である抗生物質は、広域スペクトル抗生物質と称される。他の型の抗生物質は、グラム陽性またはグラム陰性の分類の細菌に対して優先的に有効である。これらの型の抗生物質は、狭域スペクトル抗生物質と称される。単一の生物または疾患に対して有効であり、そしてその他のタイプの細菌に対しては有効でないその他の抗生物質は、限定スペクトル抗生物質と称される。抗細菌剤は、ときとして、それらの主な作用の様式に基づいて分類される。一般的に、抗細菌剤は、細胞壁合成インヒビター、細胞膜インヒビター、タンパク質合成インヒビター、核酸合成インヒビターまたは機能的インヒビター、および競合的インヒビターである。
【０２２８】
抗ウイルス剤は、ウイルスによる細胞の感染、または細胞内のウイルスの複製を防ぐ化合物である。抗ウイルス性薬物は、抗細菌剤よりはかなり少ない。なぜならば、ウイルス複製のプロセスは、宿主細胞内のＤＮＡ複製に密接に関係しており、非特異的な抗ウイルス剤は、多くの場合、宿主に毒性であるからである。抗ウイルス剤によって遮断され得るか、または阻害され得るウイルス感染のプロセス内のいくつかの段階が存在する。これらの段階としては、ウイルスの宿主細胞への付着（免疫グロブリンまたは結合性ペプチド）、ウイルスの脱殻（例えば、アマンタジン）、ウイルスｍＲＮＡの合成または翻訳（例えば、インターフェロン）、ウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡの複製（例えば、ヌクレオチドアナログ）、新しいウイルスタンパク質の成熟（例えば、プロテアーゼインヒビター）、およびウイルスの出芽およびウイルスの放出が挙げられる。
【０２２９】
ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドに類似している合成化合物であるが、不完全または異常な、デオキシリボース基またはリボース基を有している。一旦、ヌクレオチドアナログが細胞内に存在すると、それらは、リン酸化され、ウイルスＤＮＡ中またはウイルスＲＮＡ中への取り込みに関して正常ヌクレオチドと競合する、トリホスフェート形態を生成する。一旦、ヌクレオチドアナログのトリホスフェート形態が、伸長する核酸鎖中に取り込まれると、それは、ウイルスポリメラーゼと不可逆的な結合を引き起こし、それによって、鎖終結（ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）を引き起こす。ヌクレオチドアナログとしては、アシクロビル（単純ヘルペスウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスの処置に用いられる）、ガンシクロビル（サイトメガロウイルスの処置に有用である）、イドクスウリジン、リバビリン（ＲＳウイルスの処置に有用である）、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジドブジン（アジドチミジン）、イミキモッドおよびレスイミキモッド（ｒｅｓｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３０】
上記インターフェロンは、ウイルス感染細胞ならびに免疫細胞によって分泌されるサイトカインである。インターフェロンは、感染細胞に隣接する細胞上の特異的レセプターに結合することによって機能し、細胞において細胞をウイルス感染から保護する変化を引き起こす。α−インターフェロンおよびβ−インターフェロンはまた、感染細胞の表面上のクラスＩ  ＭＨＣ分子およびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の発現を誘導し、宿主免疫細胞認識のための増加した抗原提示を生じる。α−インターフェロンおよびβ−インターフェロンは、組換え形態として入手可能であり、そして慢性の、Ｂ型肝炎感染およびＣ型肝炎感染の処置のために使用されてきた。抗ウイルス療法のために有効である投薬量において、インターフェロンは、発熱、倦怠感および体重減少のような重篤な副作用を有している。
【０２３１】
本発明で有用な抗ウイルス剤としては、免疫グロブリン、アマンタジン、インターフェロン、ヌクレオチドアナログ、およびプロテアーゼインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。抗ウイルス剤の特定の例としては、アセマンナン、アシクロビル、アシクロビルナトリウム、アデフォビル、アロブジン（Ａｌｏｖｕｄｉｎｅ）、アルビルセプトスドトックス（Ａｌｖｉｒｃｅｐｔ  Ｓｕｄｏｔｏｘ）、塩酸アマンタジン、アラノチン（Ａｒａｎｏｔｉｎ）、アリルドン、アテビルジンメシレート（Ａｔｅｖｉｒｄｉｎｅ  Ｍｅｓｙｌａｔｅ）、アブリジン、シドフォビル、シパムフィリン（Ｃｉｐａｍｆｙｌｌｉｎｅ）、塩酸シタラビン、デラビルジンメシレート、デスシクロビル（Ｄｅｓｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ジダノシン、ジソキサリル、エドクスジン、エンビラデン、エンビロキシム、ファムシクロビル（Ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）、塩酸ファモチン（Ｆａｍｏｔｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、フィアシタビン、フィアルリジン、フォサリレート、フォスカーネットナトリウム、フォスフォネットナトリウム、ガンシクロビル、ガンシクロビルナトリウム、イドクスウリジン、ケトキサール（Ｋｅｔｈｏｘａｌ）、ラミブジン、ロブカビル、塩酸メモチン、メチサゾン、ネビラピン、ペンシクロビル、ピロダビル、リバビリン、塩酸リマンタジン、サキナビルメシレート、塩酸ソマンタジン、ソリブジン、スタトロン（Ｓｔａｔｏｌｏｎ）、スタブジン、塩酸チロロン、トリフルリジン、塩酸バラシクロビル、ビダラビン、リン酸ビダラビン、ビダラビンリン酸ナトリウム、ビロキシム（Ｖｉｒｏｘｉｍｅ）、ザルシタビン、ジドブジン、およびジンビロキシムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３２】
抗真菌剤は、感染性真菌の、処置および予防に有用である。抗真菌剤は、ときとして、それらの作用機構によって分類される。いくつかの抗真菌剤は、グルコース合成を阻害することによって、細胞壁インヒビターとして機能する。これらとしては、バシウンギン（ｂａｓｉｕｎｇｉｎ）／ＥＣＢが挙げられるが、これに限定されない。他の抗真菌剤は、膜の統合性を不安定化させることによって機能する。これらとしては、クロトリマゾール、セルタコンゾール（ｓｅｒｔａｃｏｎｚｏｌｅ）、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、およびボリコナコール（ｖｏｒｉｃｏｎａｃｏｌｅ）のようなイミダゾール系、ならびにＦＫ  ４６３、アンホテリシンＢ，ＢＡＹ  ３８−９５０２、ＭＫ  ９９１、プラディマイシン、ＵＫ  ２９２，ブテナフィン、およびテルビナフィンが挙げられるが、これらに限定されない。他の抗真菌剤は、キチンを分解すること（例えば、キチナーゼ）によってか、または免疫抑制（５０１クリーム）によって機能する。
【０２３３】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、アジュバントのような他の治療的因子と組み合わされて、免疫応答を向上させ得る。そのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび他の治療的因子は、同時にか、または連続して投与され得る。他の治療的因子が、同時に投与される場合、それらは、同一の処方物で投与されても、別の処方物において同時に投与されてもよい。上記他の治療的因子および上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投与が、一時的に分離される場合、上記他の治療的因子は、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドと連続して投与される。これらの化合物の投与の間の時間の隔たりは、数分であってもよいし、またはそれより長くてもよい。他の治療的因子としては、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３４】
本発明の組成物はまた、非核酸性アジュバントと共に投与され得る。非核酸性アジュバントは、本明細書中に記載されるＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを除く、任意の分子または任意の化合物であり、そのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を刺激し得る。非核酸性アジュバントとしては、例えば、デポ（ｄｅｐｏ）効果を引き起こすアジュバント、免疫刺激アジュバント、およびデポ効果を引き起こしかつ免疫系を刺激するアジュバントが挙げられる。
【０２３５】
上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、粘膜アジュバントとして有用である。これまでに、全身性免疫および粘膜免疫の両方が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの粘膜送達によって誘導されることが見出されてきた。従って、そのオリゴヌクレオチドは、他の粘膜アジュバントとの組み合わせで投与され得る。
【０２３６】
免疫応答はまた、サイトカイン（ＢｕｅｌｅｒおよびＭｕｌｌｉｇａｎ，１９９６；Ｃｈｏｗら、１９９７；Ｇｅｉｓｓｌｅｒら、１９９７；Ｉｗａｓａｋｉら、１９９７；Ｋｉｍら、１９９７）、もしくはＢ−７のような共起刺激性分子（Ｉｗａｓａｋｉら；１９９７；Ｔｓｕｊｉら、１９９７）とＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドとの同時投与または共直線性（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒ）発現によって、誘導または増強され得る。用語サイトカインは、ナノモル濃度からピコモル濃度で体液性調節因子として作用し、そして正常な条件下または病理学的条件下のいずれかにおいて、個々の細胞および組織の機能的活性を調節する可溶性タンパク質および可溶性ペプチドの種々の群についての一般的な名称として使用される。これらのタンパク質はまた、直接的に細胞間の相互作用を媒介し、そして細胞外環境で行われるプロセスを調節する。サイトカインの例としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（γ−ＩＦＮ）、ＩＦＮ−α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＧＦ−β、ＦＬＴ−３リガンド、およびＣＤ４０リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３７】
上記オリゴヌクレオチドはまた、樹状細胞の生存、分化、活性化および成熟を改善するするのに有用である。上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、細胞の生存、細胞の分化、細胞の活性化および樹状細胞の成熟を促進する固有の能力を有する。
【０２３８】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、ナチュラルキラー細胞の細胞溶解活性および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強する。ＡＤＣＣは、細胞標的（例えば、癌細胞）に対して特異的な抗体との組み合わせで、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを使用して行われ得る。そのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、その抗体との組み合わせで被験体に投与される場合、その被験体の免疫系が誘導されて、その腫瘍細胞を殺傷する。そのＡＤＣＣの手順に有用な抗体は、身体の中の細胞と相互作用する抗体を含む。細胞標的に対して特異的である多くのこのような抗体は、当該分野において記載されており、そしてその多くは市販されている。
【０２３９】
上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、抗癌療法と組み合わせて投与され得る。抗癌療法としては、癌治療薬、照射および外科的手順が挙げられる。本明細書中で使用される場合、「癌治療薬」とは、癌を処置する目的で被験体に投与される薬剤をいう。本明細書中で使用される場合、「癌を処置する」とは、癌の発症を防ぐこと、癌の症状を軽減させること、および／もしくは確立した癌の成長を阻害することを含む。他の局面において、その癌治療薬は、癌を発症する危険を有する被験体に、その癌を発症する危険を減少させる目的で投与される。癌の処置のための種々の型の医薬が、本明細書中に記載される。本明細書の目的のため、癌治療薬は、化学療法剤、免疫療法剤、癌ワクチン、ホルモン療法、および生物学的反応改変因子として分類される。
【０２４０】
１つの実施形態において、上記癌治療薬は、以下からなる群より選択される化学療法剤である：メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、クロロエチルニトロソ尿素を含む非糖成分、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン（ｆｒａｇｙｌｉｎｅ）、Ｍｅｇｌａｍｉｎｅ  ＧＬＡ、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔａｉｎｅ）およびポリフェルポサン（ｐｏｌｉｆｅｒｐｏｓａｎ）、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ  １２−９５６６、ＲＡＳファメシル（ｆａｍｅｓｙｌ）トランスフェラーゼインヒビター、ファメシルトランスフェラーゼインヒビター、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメテキソール（Ｌｏｍｅｔｅｘｏｌ）、グラモレック（Ｇｌａｍｏｌｅｃ）、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ハイカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール／ＰＳＣ８３３、ノバントロン／ミトキサントロン、メタレット（Ｍｅｔａｒｅｔ）／スラミン、バスチマスタット（Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、インセル（Ｉｎｃｅｌ）／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ  ６９８、ＴＡ  ２５１６／マーミスタット（Ｍａｒｍｉｓｔａｔ）、ＢＢ２５１６／マーミスタット、ＣＤＰ  ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナール（Ｌｅｍｏｎａｌ）ＤＰ  ２２０２、ＦＫ  ３１７、ピシバニール／ＯＫ−４３２、ＡＤ  ３２／バルルビシン、メタストロン（Ｍｅｔａｓｔｒｏｎ）／ストロンチウム誘導体、テモダール／テモゾロマイド、エバセット（Ｅｖａｃｅｔ）／リポソーム化ドキソルビシン、ユーロタキサン（Ｙｅｗｔａｘａｎ）／パクリタキセル、タキソール／パクリタキセル、キセロード（Ｘｅｌｏａｄ）／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパックス（Ｃｙｃｌｏｐａｘ）／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ  １２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳ癌遺伝子インヒビター、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金錯体製剤、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、エルガミゾール／レバミゾール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵエンハンサー、カンプト／レバミゾール、カンプトサール／イリノテカン、ツモデックス（Ｔｕｍｏｄｅｘ）／ラリトレキセド（Ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、リウスタチン／クラドリビン、パクセックス（Ｐａｘｅｘ）／パクリタキセル、ドキシル／リポソーム化ドキソルビシン、シーリクス（Ｃａｅｌｙｘ）／リポソーム化ドキソルビシン、フルダラ／フルダラビン、ファーマルビシン（Ｐｈａｒｍａｒｕｂｉｃｉｎ）／エピルビシン、ＤｅｐｏＣｙｔ、ＺＤ１８３９、ＬＵ  ７９５５３／ビス−ナフタルイミド（Ｂｉｓ−Ｎａｐｈｔａｌｉｍｉｄｅ）、ＬＵ  １０３７９３／Ｄｏｌａｓｔａｉｎ、シーティクス（Ｃａｅｔｙｘ）／リポソーム化ドキソルビシン、ジェムザール／ゲムシタビン、ＺＤ  ０４７３／アノルメッド（Ａｎｏｒｍｅｄ）、ＹＭ  １１���、ヨウ素種（ｌｏｄｉｎｅ  ｓｅｅｄ）、ＣＤＫ４インヒビターおよびＣＤＫ２インヒビター、ＰＡＲＰインヒビター、Ｄ４８０９／デキシフォスアミド（Ｄｅｘｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、イフェス（Ｉｆｅｓ）／Ｍｅｓｎｅｘ／イフォスファミド（Ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、ビューモン／テニポシド、パラプラチン／カルボプラチン、プランチノール（Ｐｌａｎｔｉｎｏｌ）／シスプラチン、ベプシド（Ｖｅｐｅｓｉｄｅ）／エトポシド、ＺＤ  ９３３１、タキソテール／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサンアナログ、ニトロソ尿素、メルフェラン（ｍｅｌｐｈｅｌａｎ）およびシクロフォスファミドのようなアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロムブシル（Ｃｈｌｏｒｏｍｂｕｃｉｌ）、塩酸シタラビン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ−放出因子アナログ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）、および硫酸ビンデシン。重要な実施形態において、上記癌治療薬は、タキソールである。別の実施形態において、上記癌治療薬は、カルボプラチンとパクリタキセルとの組み合わせである。
【０２４１】
別の実施形態において、上記癌治療薬は、以下からなる群より選択される免疫療法剤である：リブタキシン、ハーセプチン、クアドラメット、パノレックス、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＢＥＣ２、Ｃ２２５、オンコリム、ＳＭＡＲＴ  Ｍ１９５、ＡＴＲＡＧＥＮ、オバレックス、ベキサール、ＬＤＰ−０３、ｉｏｒ  ｔ６、ＭＤＸ−２１０、ＭＤＸ−１１、ＭＤＸ−２２、ＯＶ１０３、３６２２Ｗ９４、抗ＶＥＧＦ、ゼナパックス、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−４４７、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−２、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１、ＣＥＡＣＩＤＥ、プレターゲット、ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２、ＴＮＴ、Ｇｌｉｏｍａｂ−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、ＥＭＤ−７２０００、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ、ＣＭＡ  ６７６、Ｍｏｎｏｐｈａｒｍ−Ｃ、４Ｂ５、ｉｏｒ  ｅｇｆ．ｒ３、ｉｏｒ  ｃ５、ＢＡＢＳ、抗ＦＬＫ−２、ＭＤＸ−２６０、ＡＮＡ  Ａｂ、ＳＭＡＲＴ  １Ｄ１０  Ａｂ、ＳＭＡＲＴ  ＡＢＬ  ３６４  Ａｂ、およびＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡ。
【０２４２】
さらに、本発明の方法は、上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドとともに１種より多くの癌治療薬の使用を含むことが意図される。例として、適切な場合、そのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、化学療法剤および免疫療法剤の両方とともに投与され得る。あるいは、その癌治療薬は、癌を有するか、もしくは癌を発症する危険にある被験体を処置する目的で１個体の被験体に全て投与される、免疫療法剤と癌ワクチンとを含んでも、化学療法剤と癌ワクチンとを含んでも、化学療法剤と免疫療法剤と癌ワクチンとを含んでもよい。
【０２４３】
免疫療法剤（例えば、モノクローナル抗体）に組み合わせられた上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用は、ＡＤＣＣの顕著な増強、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化、およびＩＦＮαレベルの増加を含む多くの機構（上記で考察される）を通じて、長期生存を延長し得る。モノクローナル抗体と組み合わせて使用される場合、そのオリゴヌクレオチドは、生物学的結果を達成するのに必要とされる抗体の用量を減少させるように作用する。
【０２４４】
本明細書中で使用される場合、用語「癌抗原」および用語「腫瘍抗原」は、癌細胞によって差次的に発現された、それによって癌細胞を標的化するために利用され得る抗原を称するために、交換可能に使用される。癌抗原は、腫瘍特異的免疫応答を潜在的に、明白に刺激し得る抗原である。これらの抗原のいくつかは、正常な細胞によって、コードされるが、必ずしも発現されない。これらの抗原は、正常細胞において、普通は無症候性（すなわち、発現されない）である抗原、分化の特定の段階においてのみ発現される抗原および一時的に発現される抗原（例えば、胚性の抗原および胎性の抗原）として特徴付けられ得る。他の癌抗原は、癌遺伝子（例えば、活性化されたｒａｓ癌遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、変異ｐ５３）のような変異細胞内遺伝子によってコードされ、内部欠失または染色体転座から生じる融合タンパク質である。さらに他の癌抗原は、ウイルス遺伝子（例えば、ＲＮＡ腫瘍ウイルスおよびＤＮＡ腫瘍ウイルスに保持される遺伝子）によってコードされ得る。
【０２４５】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、自己免疫疾患を処置し、そして予防するために有用である。自己免疫疾患とは、被験体自身の抗体が宿主組織と反応し、免疫エフェクターＴ細胞が内因性自己ペプチドに対して自己反応性であって組織の破壊を生じるという疾患のクラスである。従って、免疫応答は自己抗原と称される被験体自体の抗原に対して惹起される。自己免疫疾患としては、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、グレーヴス病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を有する強皮症、混合結合組織疾患、多発性筋症、悪性貧血、突発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病、および自己免疫性糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４６】
本明細書において用いる場合、「自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、正常な宿主組織の抗原をいう。正常な宿主組織は、癌細胞を含まない。従って、自己抗原に対して惹起された免疫応答は、自己免疫疾患の状況では、所望されない免疫応答であって、正常な組織の破壊および障害に寄与するが、癌抗原に対して惹起される免疫応答は所望される免疫応答であり、腫瘍または癌の破壊に寄与する。従って、自己免疫障害を処置する目的の本発明のいくつかの局面において、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、自己抗原（特に、この自己免疫障害の標的である自己抗原）とともに投与されることは推奨されない。
【０２４７】
他の場合において、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、低用量の自己抗原とともに送達され得る。多数の動物研究によって、低用量の抗原の粘膜投与が免疫低応答または「寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」の状態を生じ得ることが実証されている。活性な機構は、Ｔｈ１から離れて、主にＴｈ２およびＴｈ３（すなわち、ＴＧＦ−β優勢）応答に向かうサイトカイン媒介性免疫偏移であると考えられる。低用量の抗原送達を用いる活性抑制はまた、無関係の免疫応答を抑制し得（バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）抑制）、これは自己免疫疾患、例えば、関節リウマチおよびＳＬＥの治療においてかなり興味深い。バイスタンダー抑制は、炎症誘発性サイトカインおよびＴｈ１サイトカインが抗原特異的様式または抗原非特異的様式のいずれかで放出される局所環境におけるＴｈ１カウンター調節性、サプレッサーサイトカインの分泌に関与する。本明細書中で使用される場合、「寛容」とは、この現象をいうために使用される。実際、経口寛容は：実験性自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験性自己免疫性筋無力症、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）およびインスリン依存性糖尿病を含む動物における多数の自己免疫疾患の処置に有用であった。これらのモデルにおいて、自己免疫疾患の予防および抑制は、Ｔｈ１応答からＴｈ２／Ｔｈ３応答への抗原特異的な体液性応答および細胞性応答における偏移に関連している。
【０２４８】
本発明はまた、抗原に非特異的な生得的免疫の活性化、および感染性の攻撃に対する広いスペクトルの抵抗性を誘導するための方法を包含し、それは、上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを使用する。本明細書中で使用される場合、用語「抗原に非特異的な生得的免疫の活性化」とは、Ｂ細胞以外の免疫細胞の活性化をいい、そして例えば、それは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞もしくは抗原非依存的な様式で応答し得る他の免疫細胞、またはこれらの細胞のいくつかの組み合わせの活性化を包含し得る。感染性の攻撃に対する広いスペクトルの抵抗性は、その免疫細胞が活性形態であり、そしてプライムされて、任意の侵入する化合物および任意の侵入する微生物に応答するので誘導される。その細胞は、特定の抗原に対して特異的にプライムされなくてもよい。このことは、生物兵器を用いた戦争、および上述のような他の状況（例えば、旅行者）において、特に有用である。
【０２４９】
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、被験体に直接投与されてもよいし、または核酸送達複合体と組み合わせて投与されてもよい。核酸送達複合体は、標的手段（例えば標的細胞に対してさらに高い親和性を生じる分子と会合する（例えば、イオン結合もしくは共有結合したか；または内部にカプセル化されて）核酸分子を意味するものとする。核酸送達複合体の例としては、ステロール（例えば、コレステロ−ル）、脂質（例えば、カチオン性脂質、ビロソームまたはリポソーム）、または標的細胞特異的結合因子（例えば、標的細胞特異的レセプターによって認識されるリガンド）と会合する核酸が挙げられる。好ましい複合体は、インビボで十分に安定であって、標的細胞による内在化の前に重大な脱共役を妨げ得る。しかし、この複合体は、細胞内の適切な条件下で切断可能であり得、それによって上記オリゴヌクレオチドは、機能的形態で放出される。
【０２５０】
表面に対して抗原およびオリゴヌクレオチドを送達するための送達ビヒクルまたは送達デバイスが、記載されている。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／または抗原および／または他の治療剤は、単独（例えば、生理食塩水または緩衝液中で）か、または当該分野で公知の任意の送達ビヒクルを用いて投与され得る。
【０２５１】
用語、「ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの有効な量」とは、望ましい生物学的効果を実現するのに、必要な量または十分な量をいう。例えば、粘液の免疫を誘導するために抗原と一緒に投与されるＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの有効量は、抗原に曝露した際に、抗原に応答してＩｇＡの発生を引き起こすのに必要な量であるのに対して、全身性免疫を誘導するために必要とされる量は、抗原に曝露した際に、抗原に応答してＩｇＧの発生を引き起こすのに必要な量である。本明細書中に提供される教示と組み合わせて、種々の活性化合物を選択し、そして因子（例えば、効力、相対的バイオアベイラビリティー、患者体重、有害な副作用の重篤度および投与の好ましい様式）を比較検討することによって、有効な予防処置レジメンまたは治療処置レジメン（実質的な毒性を引き起こさず、なお特定の被験体を処置するのに完全に有効である）が計画され得る。任意の特定の適用についての有効量は、処置される疾患または状態、投与される特定のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド、被験体のサイズ、または疾患もしくは状態の重篤度のような因子に依存して変動し得る。当業者は、過度な実験を必要とすることなく、特定のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／または抗原および／または他の治療剤の有効量を、経験的に決定し得る。
【０２５２】
粘膜送達もしくは局所送達のための本明細書中に記載される化合物の被験体用量は、代表的には、約０．１μｇ／投与〜１０ｍｇ／投与の範囲であり、これは、その適用が、毎日、毎週、または毎月、およびその間の他の任意の時間に投与され得ることに依存する。より代表的には、粘膜用量または局所用量は、約１０μｇ／投与〜５ｍｇ／投与の範囲であり、最も代表的には、約１００μｇ／投与〜１ｍｇ／投与であり、２回の投与〜４回の投与が、数日間または数週間の間隔を空けられる。より代表的には、免疫刺激用量は、約１μｇ／投与〜１０ｍｇ／投与の範囲であり、最も代表的には、約１０μｇ／投与〜１ｍｇ／投与の範囲であり、毎日または毎週投与される。抗原特異的免疫応答を誘導するために非経口送達のための本明細書中に記載される化合物の被験体用量（この化合物は、抗原と一緒に送達されるが、別の治療剤と一緒に送達されない）は、代表的には、ワクチンアジュバントまたは免疫刺激適用のための有効粘膜用量の５倍〜１０，０００倍高く、より代表的には１０倍〜１，０００倍高く、最も代表的には２０倍〜１００倍高い。このＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが他の治療剤と組み合わせてか、または特殊な送達ビヒクルにおいて投与される場合に、生得的な免疫応答を誘導する目的で、またはＡＤＣＣを増加する目的で、または抗原特異的な免疫応答を誘導する目的での、非経口送達のための本明細書中に記載される化合物の用量は、代表的には、約０．１μｇ／投与〜１０ｍｇ／投与の範囲であり、これは、その適用が、毎日、毎週、または毎月、およびその間の他の任意の時間に投与され得ることに依存する。より代表的には、これらの目的のための非経口用量は、約１０μｇ／投与〜５ｍｇ／投与の範囲であり、最も代表的には、約１００μｇ／投与〜１ｍｇ／投与であり、２回の投与〜４回の投与が、数日間または数週間の間隔を空けられる。しかし、いくつかの実施形態において、これらの目的のための非経口用量は、上記の代表的な用量よりも５倍〜１０，０００倍高い範囲で使用され得る。
【０２５３】
本明細書中に記載される任意の化合物について、その治療上有効な量は、最初に動物モデルから決定され得る。治療上有効な用量はまた、ヒトにおいて試験された（ヒトの臨床試験が開始された）ＣｐＧオリゴヌクレオチドについてのヒトのデータ、および同様の薬理学的活性を示すことが公知である化合物（例えば、他の粘膜アジュバント（例えば、ＬＴおよびワクチン接種用の他の抗原））についてのヒトのデータから、決定され得る。より高用量が、非経口投与のために必要とされ得る。適用される用量は、投与される化合物の相対的バイオアベイラビリティーおよび効力に基づいて、調整され得る。その用量を、上記の方法および当該分野で周知の他の方法に基づいて最大効力を達成するように調整することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２５４】
本発明の処方物は、薬学的に受容可能な溶液において投与され、この溶液は、慣用的には、薬学的に受容可能な濃度の塩、緩衝化剤、保存剤、適合性キャリア、アジュバント、および必要に応じて他の治療成分を含み得る。
【０２５５】
療法における使用のために、有効な量の上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、所望される表面（例えば、粘膜表面、全身表面）にその核酸を送達する任意の様式によって、被験体に投与され得る。本発明の薬学的組成物を投与することは、当業者に公知の任意の手段によって達成され得る。好ましい投与経路としては、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣、および直腸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５６】
経口投与については、化合物（すなわち、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド、抗原および他の治療因子）は、活性化合物と当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアとを合わせることによって容易に処方され得る。このようなキャリアは、本発明の化合物が、処置されるべき被験体による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などとして処方されることを可能にする。経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤として得ることが可能であり、所望の場合、錠剤または糖衣錠コアを得るために、必要に応じて、適切な補助剤を添加した後に、得られた混合物を粉砕して、顆粒のこの混合物を処理する。適切な賦形剤は、特に、フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）（例えば、糖）であり、これとしては、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカント（ｇｕｍ  ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウムのような）、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などが挙げられる。所望される場合、崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））が、添加され得る。必要に応じて、経口処方物はまた、内部の酸状態を中和するために、生理食塩水または緩衝液（すなわち、ＥＤＴＡ）において処方されてもよく、全くキャリアを伴わずに投与されてもよい。
【０２５７】
上記の成分の経口投薬形態がまた、特に企図される。この成分は、誘導体の経口送達が有効であるように化学的に改変され得る。一般に、企図される化学的改変は、成分の分子自体への少なくとも１つの部分の結合であり、ここでこの部分は、（ａ）タンパク質分解の阻害；および（ｂ）胃または腸からの血流への取り込みを可能にする。成分の全体的な安定性の増大、および身体内での循環時間の延長がまた、所望される。このような部分の例としては、以下が挙げられる：ポリエチレングリコール、エチレングリコールのコポリマー、およびプロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリン。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉおよび  Ｄａｖｉｓ、１９８１、「Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ」Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３６７〜３８３；Ｎｅｗｍａｒｋら、１９８２，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５〜１８９。使用され得る他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン、およびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）である。薬学的用途のために好ましいのは、上記で示されるように、ポリエチレングリコール部分である。
【０２５８】
成分について、放出の位置は、胃であっても、小腸（十二指腸、空腸または回腸）であっても、または大腸であってもよい。当業者は、胃で溶けないが、十二指腸または腸のいずれかにおいて物質を放出する、利用可能な処方物を有する。好ましくは、この放出は、オリゴヌクレオチドの保護によってか、または腸内のような胃の環境を通過してからの生物学的に活性な物質の放出によって、胃の環境の有害な影響を回避する。
【０２５９】
完全な胃の耐性を確保するために、少なくともｐＨ５．０までの不浸透性のコーティングが、必須である。腸溶性のコーティングとして用いられるさらに一般的な不活性成分の例は、トリメリト酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ  ５０、ＨＰＭＣＰ  ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ、およびＳｈｅｌｌａｃである。これらのコーティングは、混合されたフィルムとして使用され得る。
【０２６０】
コーティングまたはコーティングの混合物はまた、胃に対する保護に関しては意図してない錠剤上に使用され得る。これとしては、糖コーティング、または錠剤がより容易に嚥下されるようにするコーティングが挙げられ得る。カプセルは、乾燥した治療剤、すなわち粉末の送達のための硬性のシェル（例えば、ゼラチン）から構成され得る；液体形態のためには、軟ゼラチンのシェルが、使用され得る。カプレット（ｃａｃｈｅｔｓ）のシェルの材料は、粘性のデンプンであっても、または他の食用の紙であってもよい。丸剤、トローチ、成形錠剤または錠剤粉薬については、モイストマッシング（ｍｏｉｓｔ  ｍａｓｓｉｎｇ）技術を用いてもよい。
【０２６１】
治療剤は、顆粒または約１ｍｍサイズの粒子のペレットの形態で、微細なマルチパーティキュレート（ｍｕｌｔｉ−ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）として処方物に含まれ得る。カプセル投与のための物質の処方物はまた、粉末として、軽く圧縮されたプラグ、または錠剤としてでさえあり得る。治療剤は、圧縮によって調製されてもよい。
【０２６２】
着色剤および香料は、全て含まれ得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、処方され得（例えば、リポソームまたはマイクロスフェアカプセル化によって）、次いでさらに、着色剤および香料を含む清涼飲料のような食品に含まれてもよい。
【０２６３】
不活性物質を用いて治療剤の容積を希釈しても、増大させてもよい。これらの希釈剤としては、炭水化物（特に、マンニトール、ａ−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、改変デキストランおよびデンプン）が挙げられ得る。特定の無機塩はまた、フィラーとして用いられ得るが、これにとしては、三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムが挙げられる。いくつかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌである。
【０２６４】
崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）は、固体投薬形態への治療剤の処方物に含まれ得る。崩壊剤として用いられる物質としては、デンプンに基づく市販の錠剤崩壊物質（Ｅｘｐｌｏｔａｂ）を含む、デンプンが挙げられるが、これに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラマイロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、海綿およびベントナイトは全て用いることができる。崩壊剤の別の形態は、不溶性のカチオン交換樹脂である。粉末化ガムは、崩壊剤として、そして結合剤として用いられ得、そしてこれらとしては、寒天、カラヤまたはトラガカントのような粉末化ゴムが挙げられ得る。アルギン酸およびそのナトリウム塩はまた、崩壊剤として有用である。
【０２６５】
結合剤は、治療剤を一緒に保持して硬性の錠剤を形成するために用いられ得、そしてこれには、アカシア、トラガカント、デンプンおよびゼラチンのような天然産物由来の物質が挙げられる。他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は両方とも、治療剤を粒化するためにアルコール溶液に使用され得る。
【０２６６】
抗摩擦剤は、処方プロセスの間の固着を防止するために治療剤の処方物に含まれ得る。滑沢剤は、治療剤とダイ壁との間の層として用いられ得、そしてこれらとしては、ステアリン酸マグネシウムおよびカルシウムの塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、植物油およびワックスが挙げられるが、これらに限定されない。可溶性の滑沢剤、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ  ４０００およびＣａｒｂｏｗａｘ  ６０００もまた、使用され得る。
【０２６７】
処方の間の薬物の流動特性を改善し、そして圧縮の間の再配列を補助し得る流動促進剤が、添加され得る。流動促進剤としては、デンプン、タルク、発熱性シリカおよび水和シリコアルミン酸が挙げられ得る。
【０２６８】
水性の環境への治療剤の溶解を補助するために、サーファクタントが、湿潤剤として添加され得る。サーファクタントとしては、アニオン性界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウム）が挙げられ得る。カチオン性界面活性剤が、使用され得、これとしては、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトミウムが挙げられ得る。サーファクタントとして処方物に含まれ得る有力な非イオン性界面活性剤の一覧は、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油５０およびポリオキシエチレン水素化ヒマシ油６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５およびポリソルベート８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらのサーファクタントは、オリゴヌクレオチドまたは誘導体のいずれか単独の処方物中に存在し得るか、または異なる比の混合物として存在し得る。
【０２６９】
経口的に用いられ得る薬学的調製物としては、ゼラチンから作製される押込み嵌めカプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトール）から作製される密閉された軟カプセルが挙げられる。押込み嵌めカプセルは、フィラー（例えば、ラクトース）、結合剤（例えば、デンプン）、および／または滑沢剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム）、および必要に応じて安定化剤と混合されて活性成分を含み得る。軟カプセルにおいて、この活性化合物は、適切な液体、例えば、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールに溶解されてもよく、懸濁されてもよい。さらに、安定化剤が、添加され得る。経口投与のために処方されたマイクロスフェアもまた、用いられ得る。このようなマイクロスフェアは、当該分野で十分に規定されている。経口投与のための全ての処方物は、このような投与に適切な投薬量でなければならない。
【０２７０】
口腔内（ｂｕｃｃａｌ）投与のために、この組成物は従来の様式で処方される錠剤またはトローチの形態をとり得る。
【０２７１】
吸入による投与のために、本発明に従う使用のための化合物は、加圧パックまたは噴霧器からエアロゾルスプレーを提示する形態で、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体）を使用して、従来のように送達され得る。加圧エアロゾルの場合、その投薬単位は、計量した量を送達するための弁を提供することによって、決定され得る。吸入器または注入器において使用するために、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジが、その化合物と適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）との粉末混合物を含んで、処方され得る。
【０２７２】
オリゴヌクレオチド（またはその誘導体）の肺送達がまた、本明細書において企図される。オリゴヌクレオチドは、吸入の間に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮を横切って血流に入る。吸入された分子の他の報告としては、Ａｄｊｅｉら、１９９０、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：５６５〜５６９；Ａｄｊｅｉら、１９９０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，６３：１３５〜１４４（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら、１９８９、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１３（補遺．５）：１４３〜１４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら、１９８９、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第ＩＩＩ巻、２０６〜２１２頁（ａ１−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈら、１９８９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：  １１４５〜１１４６（ａ−１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら，１９９０、「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，Ｍａｒｃｈ，（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：  ３４８２〜３４８８（インターフェロン−ｇおよび腫瘍壊死因子α）およびＰｌａｔｚら、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が挙げられる。全身性の効果のための薬物の肺送達のための方法および組成物は、Ｗｏｎｇらの１９９５年９月１９日発行の米国特許第５，４５１，５６９号に記載されている。
【０２７３】
本発明の実施における使用について企図されるのは、治療製品の肺送達のために設計された広範な機構的デバイスであり、これらのデバイスとしては、全て当業者に周知である、噴霧器、定量吸入器、および粉末吸入器が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７４】
本発明の実施に適切な市販のデバイスのいくつかの特定の例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉによって製造された、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器；Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏによって製造されたＡｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧器；Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａによって製造されたＶｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器；ならびにＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって製造されたＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
【０２７５】
このようなデバイスの全ては、オリゴヌクレオチド（または誘導体）の分散のために適切な処方物の使用を必要とする。代表的には、各々の処方物は、使用されるデバイスのタイプに特異的であり、そして治療において有用な希釈剤、アジュバントおよび／またはキャリアに加えて、適切な噴霧剤物質の使用に関与し得る。また、リポソーム、マイクロカプセルまたはマイクロスフェア、包接複合体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）または他の型のキャリアの使用が考慮される。化学的に改変されたオリゴヌクレオチドはまた、化学的改変の型または利用されるデバイスの型に依存して異なる処方物において調製されてもよい。
【０２７６】
ジェットまたは超音波のいずれかの噴霧器を用いた使用に適切な処方物は、代表的には、溶液１ｍＬあたり約０．１〜２５ｍｇの生物学的に活性なオリゴヌクレオチドの濃度で、水に溶解されたオリゴヌクレオチドを含む。この処方物はまた、緩衝液および単糖を含み得る（例えば、オリゴヌクレオチド安定化、および浸透圧の調節のため）。噴霧器処方物はまた、エアロゾルの形成において溶液の微粒化によって生じるオリゴヌクレオチドの表面誘導性の凝集を軽減または防止するためにサーファクタントを含み得る。
【０２７７】
定量吸入器デバイスによる使用のための処方物は、一般に、サーファクタントの補助により噴霧剤に懸濁された上記オリゴヌクレオチドを含む微細に粉砕された粉末を含む。その噴霧剤は、この目的のために使用される任意の従来の物質（例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素）であり得、これとしては、トリクロロフルオロメタン、ジクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。適切なサーファクタントとしては、ソルビタントリオレエートおよび大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸もまた、サーファクタントとして有用であり得る。
【０２７８】
粉末吸入器デバイスから分散するための処方物は、オリゴヌクレオチドを含む、微細に粉砕された乾燥粉末を含み、そしてまた充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、ラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトール）を、デバイスからのこの粉末の分散を容易にする量（例えば，処方物の５０〜９０重量％の量）で含み得る。オリゴヌクレオチドは、肺の遠位への最も有効な送達のために、１０ｍｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５ｍｍの平均粒子サイズを有する粒子形態で最も有利に調製されるべきである。
【０２７９】
本発明の薬学的組成物の経鼻送達もまた、企図される。経鼻送達によって、鼻へこの治療製品を投与した後、肺にこの製品が沈着する必要なしに、本発明の薬学的組成物の血流への直接の通過が可能になる。経鼻送達のための処方物としては、デキストランまたはシクロデキストランを含む処方物が挙げられる。
【０２８０】
経鼻投与のために、有用なデバイスは、一定用量スプレイヤーが取り付けられる、小さい硬性のボトルである。１つの実施形態において、この定用量は、規定の容積のチャンバへ本発明の溶液の薬学的組成物を吸引することによって送達され、このチャンバは、このチャンバ中の液体が加圧される場合、スプレーを形成することによってエアロゾル化するための寸法決めされたアパーチャおよびエアロゾル処方物を有する。このチャンバは、本発明の薬学的組成物を投与するように加圧される。特定の実施形態において、このチャンバはピストン構成である。このようなデバイスは市販されている。
【０２８１】
あるいは、圧搾される場合に、噴霧を形成することによってエアロゾル処方物をエアロゾル化するように寸法決めされたアパーチャまたは開口部を有するプラスチックのスクイーズボトルが用いられる。この開口は、一般に、ボトルの頂部に見出され、この頂部は一般に、エアロゾル処方物の効率的な投与のために、鼻の経路において部分的に適合するように傾斜付けされる。好ましくは、経鼻吸入器は、この薬物の測定した用量の投与のために、エアロゾル処方物の一定量を提供する。
【０２８２】
この化合物は、全身的に送達することが望ましい場合に、注入（例えば、ボーラス注入または連続注入）による非経口投与のために処方され得る。注入のための処方物は、単位投与形態で（例えば、アンプルまたは複数用量容器中に）、添加された保存剤とともに提示され得る。その組成物は、油性ビヒクルもしくは水性ビヒクル中の懸濁物、溶液、またはエマルジョンのような形態をとり得、そして処方剤（例えば、懸濁剤、安定化剤、および／もしくは分散剤）を含み得る。
【０２８３】
非経口投与のための薬学的処方物としては、水溶性形態のその活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、その活性化合物の懸濁物が、適切な油性注入懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒または親油性ビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル、もしくはトリグリセリド）、またはリポソームが挙げられる。水性注入懸濁物は、その懸濁物の粘性を増加する物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン）を含み得る。必要に応じて、その懸濁物はまた、非常に濃縮された溶液の調製を可能にするために、適切な安定化剤またはその化合物の溶解度を増加する薬剤を含み得る。
【０２８４】
あるいは、その活性化合物は、適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌した水）を用いて使用前に構成するための、粉末形態であり得る。
【０２８５】
この化合物はまた、例えば、従来の坐剤基剤（例えば、カカオ脂または他のグリセリド）を含む）坐剤または貯留浣腸のような、直腸組成物または膣組成物の状態で処方され得る。
【０２８６】
上記の処方物に加えて、この化合物はまた、デポー（ｄｅｐｏｔ）調製物として処方され得る。そのような長期作用処方物は、適切なポリマー物質もしくは疎水性物質を用いて（例えば、受容可能な油中のエマルジョンとして）か、またはイオン交換樹脂を用いてか、または溶解性が乏しい誘導体（例えば、溶解性が乏しい塩）として、処方され得る。
【０２８７】
この薬学的組成物はまた、適切な固相もしくはゲル相の、キャリアもしくは賦形剤を含み得る。そのようなキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８８】
適切な液体もしくは固体の薬学的調製物形態は、例えば、吸入用の水溶液もしくは生理食塩水溶液であるか、マイクロカプセル化されているか、渦巻き状（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）になっているか、顕微的な金粒子上にコーティングされているか、リポソーム中に含まれるか、噴霧されるか、エアロゾルであるか、皮膚移植用のペレットであるか、または皮膚中に掻き入れるべき鋭利な物体上に乾燥されている。上記薬学的組成物はまた、顆粒、散剤、錠剤、コーティングされた錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁物、クリーム、活性化合物を長期放出する液滴もしくは調製物を包含し、その調製賦形剤および添加剤および／または補助剤（例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、香料、甘味料または溶解剤）は、上記のように慣習的に使用される。上記薬学的組成物は、種々の薬物送達系において使用するために適切である。薬物送達のための方法の簡略な概説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３、１９９０（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０２８９】
上記ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド、および必要に応じて他の治療剤、および／または抗原は、それ自体が（そのまま）投与され得るか、または薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。薬物中で使用される場合、その塩は、薬学的に受容可能であるべきであるが、薬学的に受容可能ではない塩が、その薬学的に受容可能な塩を調製するために簡便に使用され得る。そのような塩としては、以下の酸から調製された塩が挙げられるが、それらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、そのような塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩）として調製され得る。
【０２９０】
適切な緩衝化剤としては、酢酸および塩（１〜２％  ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％  ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％  ｗ／ｖ）；およびリン酸および塩（０．８〜２％  ｗ／ｖ）が挙げられる。適切な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％  ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％  ｗ／ｖ）；パラベン類（０．０１〜０．２５％  ｗ／ｖ）、およびチメロサール（０．００４〜０．０２％  ｗ／ｖ）が挙げられる。
【０２９１】
本発明の薬学的組成物は、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア中に含まれる、有効な量のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド、および必要に応じて、抗原および／または他の薬剤を含有する。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適切な、１つ以上の適合性である固体もしくは液体の、フィラー、希釈剤、またははカプセル化物質を意味する。用語「キャリア」とは、活性成分がその適用を容易にするために合わせられる、天然もしくは合成の、有機成分または無機成分を示す。その薬学的組成物の成分はまた、所望の薬学的有効性を実質的に損なう相互作用が存在しない様式で、本発明の化合物と互いに混合可能である。
【０２９２】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証される。以下の実施例は、いかようにも、さらなる限定として解釈されるべきではない。本明細書全体を通して引用された参考文献（文献参照物、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願）のすべての内容全体が、本明細書中に参考として明示的に援用される。
【実施例】
【０２９３】
（オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ））
以下のＯＤＮを、本実施例において使用する。
【０２９４】
【化１３】
2008516634.tif 000015
（材料および方法）
（オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ））
ＯＤＮを、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ  （Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＳｉｇｍａ−Ａｒｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＧｍｂＨ（Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって同一性および純度について管理した。ＯＤＮを、リン酸緩衝化生理食塩水（Ｓｉｇｍａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で希釈し、−２０℃で保存した。全ての希釈を、発熱物質を含まない試薬を用いて行った。配列番号１５〜２３のＯＤＮは、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された。
【０２９５】
（細胞の精製）
健常な男性および女性のヒトドナーに由来する末梢血軟膜の調製物を、Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、これらからＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）での遠心分離によって精製した。精製したＰＢＭＣを、新鮮なまま使用した（ほとんどのアッセイについて）か、または凍結培地中に懸濁して−７０℃で保存したかのいずれかであった。必要な場合には、これらの細胞のアリコートを解凍し、洗浄し、５％（ｖ／ｖ）の熱非働化ヒトＡＢ血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）または１０％（ｖ／ｖ）の熱非働化ＦＣＳ、２．０ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  （Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ））を補充したＲＰＭＩ  １６４０培養培地中に再懸濁した。
【０２９６】
（サイトカインの検出）
解凍したＰＢＭＣまたは新鮮なＰＢＭＣを、４８ウェル平底プレート、または９６ウェル丸底プレート上に播種し、示されるような濃度のＯＤＮと一緒に、加湿インキュベーター中で３７℃にてインキュベートした。培養上清を回収し、すぐに使用しない場合は、上清を必要になるまで−２０℃で凍結させた。上清中のサイトカインの量を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）か、または市販の抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ／ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはＰＢＬ）を用いて開発した自社製のＥＬＩＳＡを使用して評価した。
【０２９７】
実施例１３の研究を、以下の通りに行った：
脾臓を６匹のマウス（雄、ＢＡＬＢ／ｃ）から取り出した。各脾臓由来の脾細胞を、細胞ふるい（７０μｍポアサイズ）によって穏やかに押すことによって分離し、次いでその脾細胞をプールした。脾細胞を、培養プレートのウェルに添加した。９００μｌの容量の培地中の１×１０７個の細胞を、各ウェルに添加した。培地は、１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０であった。培地中のＣｐＧ  ＯＤＮ溶液の１００μｌのアリコートを、それらのウェル中の０．０１〜１０μｇ／ｍｌの最終濃度を与えるように、各ウェルに添加した。３６時間インキュベート（３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター）した後、培養上清を、回収し、そしてＬｕｍｉｎｅｘ多重化アッセイ（ＩＦＮγ、ＩＰ−１０、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＮＦα）またはＥＬＩＳＡ（ＩＦＮα）のいずれかを使用してサイトカインの濃度についてアッセイした。
【０２９８】
（モルモットの鼻の抵抗における抗原誘導性の増加の誘導）
モルモット（雄、Ｈａｒｔｌｅｙ）を、研究の０日目において抗原（オボアルブミン、５ｍｇで、腹腔内および皮下の両方）で感作した。ブーストの感作（５ｍｇ、腹腔内）を、研究の４日目において与えた。モルモットに、２週間連続して各週に２回、鼻腔内に投与される抗原に対する曝露によって抗原をチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した。最初のチャレンジは、研究の１４日目であった。配列番号７（ロット番号ＡＱＥ−０３Ｊ−００１−Ｍ、１５０μｌ／ｋｇの生理食塩水中に０．０３〜１ｍｇ／ｋｇ）を、各週に１度（その週の第１の抗原チャレンジの２日前）、鼻腔内に投与した。研究の２４日目における最後のチャレンジを除いては、抗原チャレンジは、オボアルブミン（１５０μｌ／ｋｇの生理食塩水中に１．５ｍｇ／ｋｇ）を用いた。動物を、チャレンジの３０分前にメピラミン（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を用いて前処置して、ヒスタミン誘導性のアナフィラキシーから保護した。研究の２４日目において、モルモットを、Ｂｕｘｃｏ呼吸力学システムおよびソフトウェアを使用して鼻の抵抗の測定を可能にするために麻酔した。次いで最後の抗原チャレンジを、上咽頭に送達されるオボアルブミン（２５０μｌの生理食塩水中に２．５ｍｇ）によって行った。動物を、チャレンジの３０分前にメピラミン（３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）によって前処置した。鼻の抵抗を、チャレンジ後に４０分間測定した。
【０２９９】
（マウスの鼻の抵抗における抗原誘導性の増加の誘導）
マウス（雄、ＢＡＬＢ／ｃ）を、水酸化アルミニウムアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｌｕｍ  ｉ．ｐ．）を伴う抗原（オボアルブミン、１００μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて、研究の０日目および７日目に感作した。マウスに、鼻腔内に投与される抗原（１０μｌの生理食塩水中に１ｍｇ）に対する曝露によって、毎日、抗原をチャレンジした。最初のチャレンジは、研究の１４日目であった。配列番号７を、鼻腔内に２回投与した。第１の用量を、第１の抗原チャレンジの２日前に与えた。第２の用量を、７日後に与えた。あるいは、ブデソニド（抗炎症性の、合成副腎皮質ステロイド）を、鼻腔内に毎日投与した。第１の用量を、第１の抗原チャレンジの２日前に与えた。それぞれの日において、ブデソニドの用量を、鼻腔内の抗原チャレンジの４時間前に、鼻腔内に投与した。エンドポイントを、研究の２６日目（すなわち、配列番号７の第２の用量の７日後）に測定した。鼻の組織を、炎症の組織病理学的な評価のために採取した。別個のマウスは、最後の抗原チャレンジを受容した。くしゃみの頻度および鼻を擦る頻度を、チャレンジ後に１０分間計測した。
【０３００】
（統計分析）
Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を、比較される集団が標準ではないデータセットの比較のために使用した。Ｄｕｎｎｉｔｔ多重比較検定を、単一のコントロールに対するデータセットの比較のために使用した。
【０３０１】
（インビボのマウスにおけるサイトカインの誘導）
マウス（雄、ＢＡＬＢ／ｃ）に、ＣｐＧ  ＯＤＮ（０．１ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ）またはコントロールビヒクル（生理食塩水、２５μｌ）を鼻腔内滴注によって投薬した。気管支肺胞洗浄液および血清（心穿刺によって得た血液から分離した）を、投薬の８時間後および１５時間後に回収した。気管支肺胞洗浄液中の細胞数を、Ａｄｖｉａ自動細胞カウンターによって計測した。気管支肺胞洗浄液および血清中のサイトカインならびにケモカインの濃度を、ＥＬＩＳＡ（ＩＦＮα、ＩＬ−１２ｐ４０）またはＬｕｍｉｎｅｘサイトカイン多重化システム（ＩＦＮγ、ＩＰ−１０、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα）のいずれかを使用してアッセイした。検出可能な最大濃度は、各分析物について異なるが、０．３〜１２ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【０３０２】
（マウスの気道における炎症のインフルエンザウイルスによる誘導）
インフルエンザウイルス（インフルエンザＡ型、サブタイプＨ１Ｎ１、マウス適応株ＰＲ８）は、Ｄａｖｉｄ  Ｗｏｏｄｈｏｕｓｅ、Ｔｒｕｄｅａｕ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓａｒａｎａｃ  Ｌａｋｅ、ＮＹからの寄贈品であった。インフルエンザの用量を滴定し、そして感染の時間経過を決定する予備研究として、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）を、研究の０日目における鼻腔内滴注によってインフルエンザウイルスに感染させた。マウスは、４０μｌの生理食塩水中のウイルスの５０、２００または５００の鶏卵感染量（ｅｇｇ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）（ＥＩＤ）５０を受容した。気道感染を、感染の１日後、３日後、６日後、９日後および１４日後に評価した。
【０３０３】
（ＣｐＧ  ＯＤＮの鼻腔内投与および気道感染の測定）
マウスは、２５μｌの生理食塩水中の鼻腔内滴注によって、ＣｐＧ  ＯＤＮ（０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇ）を受容した。それぞれのマウスに、２回（インフルエンザウイルス（２００のＥＩＤ５０、鼻腔内）による感染の６日後および２日後）投薬した。このウイルス用量は、予備研究から選択された。気道感染および肺におけるウイルスの負荷を、ウイルス感染の６日後に評価した。この時点は、予備研究から選択された。気道中の細胞を、気管支肺胞洗浄によって回収した。総白血球の計測を、Ａｄｖｉａ自動細胞カウンター（Ａｄｉｖａ、Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって行なった。分化細胞の計測を、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｚａ染色によって染色した細胞遠心分離調製物の光学顕微鏡法によって行なった。肺を取り出し、そして３００μｌの滅菌したＰＢＳを用いてホモジナイズした。上清を回収し、そしてウイルスの負荷を、製造業者の説明書を用いて、酵素免疫アッセイキット（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を使用してアッセイした。このアッセイは、固相としてインフルエンザＡウイルスの核タンパク質に対するモノクローナル抗体、およびポリクローナルの抗インフルエンザウイルス検出抗体を利用する。
【０３０４】
（実施例１：ＣｐＧ  ＯＤＮを用いて処理したヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ−α分泌に対する効果）
方法：３つのドナー（配列番号４、配列番号５、配列番号６）または７つのドナー（配列番号１、配列番号２、配列番号３）のいずれかに由来するヒト末梢血単核細胞を、ＣｐＧ  ＯＤＮと一緒に、示した濃度にて４８時間インキュベートした。ヒトＰＢＭＣによるインターフェロン−α分泌を測定した。
【０３０５】
結果：図１は、ＣｐＧ  ＯＤＮとのインキュベーションの際の、増加したＩＦＮ−αの産生を示す。データは、平均＋／−ＳＥＭを示す。異なるドナー由来のＰＢＭＣを使用し、そして各ドナーから生じる結果は可変性であるので、ｐｇ／ｍｌの絶対レベルが、直接比較できないことに留意すべきである。
【０３０６】
（実施例２：インビボのＴＬＲ９トランスフェクト細胞の刺激）
方法：ヒトＴＬＲ９によってトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３細胞を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６と一緒に、１６時間インキュベートした。そのシグナルを、ルシフェラーゼの読み値によって測定した。
【０３０７】
結果：結果を、表１に示す。ＥＣ５０を、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  ２００２  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  バージョン８．０）を使用して算出した。最大刺激指数（ｍａｘ  ＳＩ）を、あらゆるＯＤＮに対して試験した全ての濃度のうちの最も高い値と、培地のコントロールとの間の商として算出した。
【０３０８】
【表１】
2008516634.tif 000016
（実施例３：モルモットの鼻の抵抗における抗原誘導性の増加に対するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列番号７の効果）
方法：モルモットの鼻の抵抗における抗原誘導性の増加に対するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列番号７の効果を調査するために、モルモットを、抗原によって感作し、次いで鼻に抗原をチャレンジした。鼻の抵抗を、チャレンジの４０分後に測定した。
【０３０９】
【表２】
2008516634.tif 000017
結果：図２は、抗原チャレンジは、４０分間にわたる鼻の抵抗における進行性の増加を引き起こし、この増加が、配列番号７（０．０３〜１ｍｇ／ｋｇ）によって処置したモルモットにおいて有意に抑制されたことを示す。
【０３１０】
（実施例４：アレルギー性鼻炎のマウスモデルにおけるＣｐＧオリゴヌクレオチド配列番号７の効果）
方法：ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して、アレルギー性鼻炎の症状に対する配列番号７の効果を研究した。感作および抗原チャレンジの後、鼻の組織を、炎症の組織病理学的な評価のために採取した。別個のマウスは、最後の抗原チャレンジを受容した。くしゃみの頻度および鼻を擦る頻度を、チャレンジ後に１０分間計測した。
【０３１１】
【表３】
2008516634.tif 000018
【０３１２】
【表４】
2008516634.tif 000019
結果：抗原チャレンジは、くしゃみおよび鼻の擦りを引き起こした。図３に示されるように、両方の頻度は、配列番号７を用いて処置したマウスにおいて抑制された。
【０３１３】
（実施例５：マウスの肺におけるインフルエンザウイルス誘導性の気道炎症：クラスＣ  ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの効果）
導入：ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、抗喘息効果を提供するであろう免疫を改変するサイトカインを誘導する。クラスＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮは、これまでのクラスＢ  ＯＤＮより高いＩＦＮαの力価を誘導する。クラスＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮは、喘息のウイルス誘導性の増悪を抑制するさらなる利点を提供し得る。この研究は、マウスの肺におけるウイルス（インフルエンザ）の負荷およびウイルス誘導性の気道炎症を抑制する、３種のクラスＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮの能力を調査した。
【０３１４】
方法：インフルエンザウイルスを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて気道炎症を誘導した。ＣｐＧ  ＯＤＮを、鼻腔内に投与し、そしてその保護効果を、測定した。
【０３１５】
結果：図４は、インフルエンザ用量を滴定し、そして感染の時間経過を決定する予備研究において、インフルエンザウイルスが、気道における白血球の蓄積を引き起こしたことを示す。ピークの炎症は、６〜９日後に達成された。５００のＥＩＤ５０のウイルスに感染したマウスは、６日後に著しい体重減少を示し、そして屠殺された。
【０３１６】
図５は、ウイルスの負荷およびウイルス誘導性の気道炎症に対するＣｐＧ  ＯＤＮの保護効果を示す。インフルエンザウイルス（２００のＥＩＤ５０）による感染前のＣｐＧ  ＯＤＮを用いた前処置は、感染の６日後にアッセイされた通り、肺におけるウイルスの負荷を減少させた。図６は、インフルエンザウイルスによる感染が、６日後に気道において白血球の蓄積を引き起こしたことを示す。これらは、主に好中球および単核細胞（単球、マクロファージおよびリンパ球）であった。好酸球球は、ほとんど存在しなかった。細胞の蓄積は、上記ＣｐＧ  ＯＤＮのいずれかを用いて前処置したマウスにおいて有意に抑制された。
【０３１７】
（実施例６：マウスにおける抗原誘導性の気道炎症に対するクラスＣ  ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの効果）
３種のクラスＣ  ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の活性を、比較した。上記クラスＢ  ＣｐＧ  ＯＤＮ配列番号７を、比較のためにこの研究に含めた。
【０３１８】
方法：マウス（雄、ＢＡＬＢ／ｃ）を、水酸化アルミニウムアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｌｕｍ、腹腔内）を伴う抗原（ゴキブリ、１０μｇ、腹腔内）を用いて、研究の０日目および７日目に感作した。マウスに、２週間連続して各週に２回、鼻腔内に投与される抗原（４０μｌの生理食塩水中に１０μｇ）に対する曝露によって抗原をチャレンジした。最初のチャレンジは、研究の２１日目であった。ＣｐＧ  ＯＤＮ（１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇおよび１００μｇ／ｋｇ）を、各週に１度（その週の第１の抗原チャレンジの２日前）、鼻腔内に投与した。
【０３１９】
気道炎症を、最後の抗原チャレンジの４８時間後に評価した。気道中の細胞を、気管支肺胞洗浄によって回収した。分化細胞の計測を、Ａｄｖｉａ自動細胞カウンターによって行なった。Ｔ細胞の数（全ＣＤ３＋細胞、およびＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞）を、フローサイトメトリーによって計測した。
【０３２０】
【表５】
2008516634.tif 000020
【０３２１】
【表６】
2008516634.tif 000021
結果：抗原チャレンジは、気道中の好酸球およびＴ細胞の蓄積を引き起こした（図７および図８）。好中球の蓄積は、存在しなかった。ＣｐＧ  ＯＤＮの各々は、試験した最も高い用量（１００ｍｇ／ｋｇ）において好酸球の蓄積の有意な抑制をもたらした（図７）。Ｔ細胞の数も、低下したが、その減少は、一般に、統計的に有意ではなかった（図８）。
【０３２２】
（実施例７：マウスにおけるインビボのクラスＣ  ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドによるサイトカインの誘導）
３種のクラスＣ  ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の活性を、比較した。上記Ｂ  ＣｐＧ  ＯＤＮ配列番号７を、比較のためにこの研究に含めた。
【０３２３】
方法：気管支肺胞洗浄液および血清中のサイトカインならびにケモカインの濃度を、材料および方法において記載した通りにアッセイした。
【０３２４】
【表７】
2008516634.tif 000022
結果：図９は、気管支肺胞洗浄液中の細胞数を示す。上記Ｃ  ＯＤＮの各々の鼻腔内滴注（特に、１ｍｇ／ｋｇにおける）は、気管支肺胞洗浄液中白血球の非常に穏やかな蓄積を引き起こす傾向を示した。
【０３２５】
図１０〜図１５は、気管支肺胞洗浄液中のサイトカインの濃度を示す。上記ＣｐＧ  ＯＤＮの各々の鼻腔内滴注は、気管支肺胞洗浄液中のＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＰ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６およびＴＮＦαの測定可能な力価を誘導した。測定した他の分析物の力価は、検出可能な濃度またはバックグラウンドを上回る濃度に到達しなかった（代表的に、２０ｐｇ／ｍｌ未満、データ示さず）。これらのクラスＣ  ＯＤＮは、それぞれ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＰ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６およびＴＮＦαの誘導因子として、上記クラスＢ  ＯＤＮ配列番号７より強力であった。それらのクラスＣ  ＯＤＮの増加した効力は、特に、０．１ｍｇ／ｋｇの用量レベルにおいて明白であった。それらのクラスＣ  ＯＤＮのみが０．１ｍｇ／ｋｇにおける投薬後にＩＦＮαおよびＩＦＮγの任意の測定可能な力価を誘導し得るという観察は、特に重要である（図１０）。
【０３２６】
図１５〜図１８は、血清中のサイトカインの濃度を示す。上記ＣｐＧ  ＯＤＮの各々の鼻腔内滴注は、血清中のＩＦＮγ、ＩＬ−６およびＴＮＦαの測定可能な力価を誘導した。測定した他の分析物の力価は、検出可能な濃度に到達しなかった（代表的に、２０ｐｇ／ｍｌ未満、データ示さず）。上記クラスＢ  ＣｐＧ配列番号７と比較した場合、上記３種のクラスＣ  ＯＤＮの各々は、免疫を改変するサイトカインＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＰ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６およびＴＮＦαの、より強力な誘導因子であった。
【０３２７】
（実施例８：マウスにおける抗原誘導性のＩｇＥ産生に対するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列番号２および配列番号７の効果）
方法：マウス（雄、ＢＡＬＢ／ｃ）を、水酸化アルミニウムアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｌｕｍ，ｉ．ｐ．）を伴う抗原（オボアルブミン、１０μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて、研究の０日目および７日目に感作した。マウスは、研究の−２日目、０日目、５日目および７日目（すなわち、それぞれの感作の２日前および感作の当日）に、配列番号２または配列番号７を受容した。マウスを、研究の１８日目に、心穿刺によって出血させた。血清を、遠心分離によって回収し、そしてオボアルブミン特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ２ａに対するＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【０３２８】
【表８】
2008516634.tif 000023
【０３２９】
【表９】
2008516634.tif 000024
結果：抗原感作は、抗原（オボアルブミン）特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ２ａの血清力価を生じた。ＩｇＥの産生は、配列番号２または配列番号７のいずれかを用いて処置したマウスにおいて抑制された一方で、ＩｇＧ２ａの産生は、増強された（図１９）。
【０３３０】
結論：実施例８のデータは、配列番号２および配列番号７が、抗原感作に対する応答におけるＩｇＥのＴｈ２関連性の産生を抑制し、そしてＴｈ１関連性のＩｇＧ２ａ産生を増強することを示す。この研究の結果は、これらのＣｐＧオリゴが、マウスにおいて抗原曝露に対するＴｈ２型応答を抑制し得るさらなる証拠を提供する。
【０３３１】
（実施例９：インフルエンザ感染および抗原チャレンジを合わせることによって誘導される増悪した気道感染に対する配列番号２の効果）
導入：上記クラスＣ  ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列番号２は、マウスにおいて、インフルエンザウイルスの負荷およびウイルス誘導性の気道炎症を抑制し得る。本研究は、インフルエンザウイルス感染および抗原チャレンジを合わせることによって誘導される増悪した気道感染に対する配列番号２の保護効果を調べた。
【０３３２】
方法：抗原およびウイルスの投与：マウス（雄、ＢＡＬＢ／ｃ）を、水酸化アルミニウムアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｌｕｍ）を伴う抗原（ゴキブリ、１０μｇ、腹腔内）を用いて、研究の０日目および７日目に感作した。マウスに、３週間連続して各週に２回、鼻腔内に投与される抗原（４０μｌの生理食塩水中に１０μｇ）に対する曝露によって抗原をチャレンジした。最初のチャレンジは、研究の２１日目であった。マウスを、研究の３４日目（すなわち、抗原チャレンジの最後の対の前）において鼻腔内滴注によって、インフルエンザウイルス（インフルエンザＡ型、サブタイプＨ１Ｎ１、マウス適応株ＰＲ８、４０μｌの生理食塩水中に２００のＥＩＤ５０）に感染させた。あるいは、マウスの別個の群は、抗原チャレンジのみか、またはウイルス感染のみを受容した。
【０３３３】
配列番号２（１００μｇ／ｋｇ）を、各週に１回（その週の第１の抗原チャレンジの２日前）、鼻腔内に投与した。気道炎症を、最後の抗原チャレンジの４８時間後に評価した。気道中の細胞を、気管支肺胞洗浄によって回収した。分化細胞の計測を、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｚａ染色によって染色した細胞遠心分離調製物からの光学顕微鏡法によって行なった。
【０３３４】
【表１０】
2008516634.tif 000025
結果：図２０は、インフルエンザウイルス単独による感染または抗原チャレンジ単独が、それぞれ、気管支肺胞洗浄液中の白血球の総数の増加を引き起こしたことを示す。ウイルスに感染したマウスにおいて、この細胞の蓄積が、顕著な好中球増加を誘導したのに対して、抗原をチャレンジしたマウスにおいて、その蓄積は、顕著な好酸球増加を誘導した。抗原チャレンジのみを受容したマウスと比較した場合、抗原をチャレンジし、そしてウイルスを感染させたマウスは、気管支肺胞洗浄液中の白血球の増悪した蓄積を示した。この増加した蓄積は、好中球および単核細胞の両方を誘導した。しかし、これらのマウスは、軽減した好酸球増加を示した。他の研究者らは、インフルエンザ感染が、抗原をチャレンジしたマウスにおいて、気道の好酸球増加を抑制し得ることを同様に示しており、そしてこれは、Ｔｈ１媒介性の効果であると仮定している（例えば、Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎら、２００３）。
【０３３５】
配列番号２（１００μｇ／ｋｇ）を用いた処置は、ウイルス誘導性の好中球増加を抑制しなかった（図２０）。このネガティブな知見は、予想された。なぜなら初期の研究において、３００μｇ／ｋｇの、より高い用量が、抗ウイルス効果を示すのに最も望ましかったからである。さらに、配列番号２（１００μｇ／ｋｇ）は、抗原誘導性の好酸球増加を有意に抑制しなかった。このポジティブな知見は、初期の研究通りであった。
【０３３６】
配列番号２（１００μｇ／ｋｇ）は、ウイルス感染および抗原チャレンジの両方を行なわれたマウスにおいて誘導される増悪した気道炎症を有意に抑制した。好中球および単核細胞の増悪した蓄積は、両方とも抑制された。増悪した気道炎症に加えて、ウイルス感染および抗原チャレンジの両方を行なわれたマウスは、体重の顕著な減少を示した。これは、配列番号２を用いて処置したマウスにおいて、有意に抑制された。
【０３３７】
結論：存在する喘息を有する小児および成人の両方において、気道（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ）のウイルスによる感染は、気道（ａｉｒｗａｙ）狭窄および喘鳴に関して非常に性急なものである。関連する炎症のプロセスは、複雑である。しかし、ウイルス誘導性の好中球および単核細胞の漸増ならびに活性化は、これらの喘息の増悪に寄与する気道狭窄の悪化に関係する（ＧｅｒｎおよびＢｕｓｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００２によって概説される）。実施例９のデータは、配列番号２が、ウイルス感染および抗原チャレンジを合わせることによってマウスにおいて誘導される好中球および単核細胞の増悪した蓄積を、顕著に抑制するすることを示す。
【０３３８】
（実施例１０：モルモット研究）
（実施例１０ａ：モルモットＡＨＲプロトコルの概要）
雄モルモットを、研究の０日目および４日目に、水酸化アルミニウムアジュバントを伴う抗原（オボアルブミン、０．５ｍｌ、１％  ＯＶＡ  ｉ．ｐ．／ｓ．ｃ．）によって感作した。モルモットに、２週間連続して各週に２回、吸入型のオボアルブミンエアロゾルに曝露することによって抗原をチャレンジした。最初のチャレンジは、研究の１３日目であった。ＣｐＧ  ＯＤＮまたはビヒクル（生理食塩水、２０μｌ）を、各週に１回（その週の第１の抗原チャレンジの２日前）、鼻腔内に投与した。気道の過敏症を、最後の抗原チャレンジの２４時間後に、静脈内のメタコリンに対する気管支収縮（気道抵抗の増加）を測定することによって評価した。それぞれの動物に関して、メタコリンに対する用量反応曲線を入手し、そして気道の反応性を、曲線下面積として定量化した。図２１は、手順の概略図を示す。
【０３３９】
（実施例１０ｂ：モルモットにおける気道抵抗および肺コンプライアンスに対する配列番号７の効果）
方法：モルモットを、実施例１０に記載した通りに感作した。最初のチャレンジは、研究の１３日目であった。モルモットに、キャリア（生理食塩水）、ＯＶＡのみ、１０μｌ／ｋｇ、３０μｌ／ｋｇ、１００μｌ／ｋｇまたは３００μｌ／ｋｇ（ｉ．ｔ．）の濃度の配列番号７のいずれかを、鼻腔内に与えた。
【０３４０】
結果：図２２は、配列番号７が、ＡＵＣ−抵抗において用量依存性の減少を生じたことを示す。
【０３４１】
（実施例１０ｃ：モルモットにおける気道抵抗および肺コンプライアンスに対する配列番号７の効果の統計分析）
方法：Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定を使用して、実施例１０ｂにおける実験から得たデータを分析した。Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定は、単一のコントロール群に対する全てのサンプルの比較を可能にする。
【０３４２】
結果：図２３は、配列番号７が、ＡＵＣ−抵抗において用量依存性の減少を生じたことを示す。
【０３４３】
（実施例１０ｄ：モルモットにおける気道抵抗および肺コンプライアンスに対する配列番号２の効果）
方法：モルモットを、実施例１０に記載した通りに感作した。最初のチャレンジは、研究の１３日目であった。モルモットに、キャリア（生理食塩水）、ＯＶＡのみ、１０μｌ／ｋｇ、３０μｌ／ｋｇ、１００μｌ／ｋｇまたは３００μｌ／ｋｇ（ｉ．ｔ．）の濃度の配列番号２のいずれかを、鼻腔内に与えた。
【０３４４】
結果：図２４は、配列番号２が、ＡＵＣ−抵抗において用量依存性の減少を生じたことを示す。
【０３４５】
（実施例１０ｅ：モルモットにおける気道抵抗および肺コンプライアンスに対する配列番号２の効果の統計分析）
方法：Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定を使用して、実施例１０ｄにおける実験から得たデータを分析した。Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定は、単一のコントロール群に対する全てのサンプルの比較を可能にする。
【０３４６】
結果：図２５は、配列番号２が、ＡＵＣ−抵抗において用量依存性の減少を生じたことを示す。
【０３４７】
（実施例１１）
本明細書中に記載されるＣｐＧオリゴヌクレオチドに対する曝露後のヒトＰＢＭＣによってもたらされる、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、インターフェロン−γ、およびＩＬ−６のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を、添付の図２７〜図３１に示す。図２７に示す試験オリゴヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、および配列番号２を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度を、Ｘ軸に沿って記載する（μＭ）。
【０３４８】
図２７に示される通り、上記アッセイにおいて試験したオリゴヌクレオチドの各々は、ＩＬ−１０の異なるレベルおよび異なるパターンを生じ得た。配列番号１および配列番号２の試験したＯＤＮは、ＩＬ−１０の劇的に、より高い誘導をもたらした。
【０３４９】
図２８は、３つの代表的な用量における、ＴＮＦ−α、インターフェロン−γ、およびＩＬ−６に関するデータを示す。これらのサイトカインについての、より詳細なグラフを、さらなるオリゴヌクレオチドの投薬量と共に、図２９〜図３１に示す。
【０３５０】
（実施例１２：）
本明細書中に記載されるＣｐＧオリゴヌクレオチドに対する曝露後のＢ細胞、形質細胞様樹状細胞および単球の活性化のレベルを、添付の図３２〜図４２に示す。調べたオリゴヌクレオチドは、配列番号によって図に示され、そして配列番号９、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号３を含んだ。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度を、Ｘ軸に沿って記載する（μＭ）。
【０３５１】
図３２、図３４、図３５、図４０、および図４２に示される通り、上記アッセイにおいて試験したＣｐＧオリゴヌクレオチドは、試験したマーカーによって示されるように、Ｂ細胞を活性化し得た。図３２および図３３において、上記アッセイにおいて試験したＣｐＧオリゴヌクレオチドは、試験したマーカーによって示されるように、ＮＫ細胞を活性化し得た。図３６、図３７、図４０、および図４１において、上記アッセイにおいて試験したＣｐＧオリゴヌクレオチドは、試験したマーカーによって示されるように、単球を活性化し得た。図３６および図３９において、上記アッセイにおいて試験したＣｐＧオリゴヌクレオチドは、試験したマーカーによって示されるように、形質細胞様樹状細胞を活性化し得た。
【０３５２】
上記アッセイにおいて試験した、セミソフト骨格を有する５種全てのＯＤＮは、配列番号９（十分にホスホロチオエートの骨格）と比較して、そのアッセイ（ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０、ＩＬ−１０）において増加した効力を示した。これらのセミソフトＯＤＮの効力はまた、以下において増加される：単球の活性化（ＣＤ８０の発現、ＣＤ８６の発現）、ｐＤＣの活性化（ＣＤ８６の発現）、細胞内ＩＰ−１０（単球およびＢ細胞）、ＩＬ−６の分泌、およびＢ細胞の活性化（ＣＤ８０の発現、ＣＤ８６の発現）。例えば、ほぼ等しいか、またはより低い濃度において、試験したＯＤＮのほとんどは、完全にホスホロチオエートの配列番号９より良好な、細胞表面マーカーの誘導をもたらした。
【０３５３】
（実施例１３）
本研究の目的は、配列番号２の選択したフラグメント（推定上の代謝産物）の生物学的活性を調査することであった。活性を、インビボで、マウス脾細胞からのＴＬＲ９関連性サイトカインの分泌を誘導する各フラグメントの能力を測定することによって決定した。
【０３５４】
配列番号２のフラグメントによるサイトカイン分泌の刺激を、添付の図４３〜図４５に示す。調べたオリゴヌクレオチドは、配列番号によって図に示され、そして配列番号１５〜配列番号２３を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度を、Ｘ軸に沿って記載する（μＭ）。
【０３５５】
図４３〜図４５に示される通り、配列番号２および試験した全てのフラグメント（推定上の代謝産物、配列番号１５〜配列番号２３）は、インビボでマウス脾細胞から、ＴＬＲ９関連性サイトカインＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＰ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＮＦαを誘導した（図４３、図４４および図４５）。このデータは、それらのフラグメントの各々が、生物学的活性を保持したことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０３５６】
【図１】図１は、ＣｐＧ  ＯＤＮで処理されたヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ−α産生を示す一連のグラフである。
【図２】図２は、（Ａ）１ｍｇ／ｋｇおよび（Ｂ）（０．０３〜０．３ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与されたモルモットの鼻の抵抗における抗原誘導性の増加に対する、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列番号７の効果を示す一連のグラフである。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（（Ａ）＝ｎ＝５〜８；（Ｂ）＝ｎ＝１４〜１５）。＊試験ビヒクルを用いて処置された抗原をチャレンジした群と比較してＰ＜０．０５（ｔ検定）。
【図３】図３は、アレルギー性鼻炎のマウスモデルにおける抗原誘導性のくしゃみ（３Ａ）および鼻の擦り（３Ｂ）に対するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列番号７の効果を示す一連のグラフである。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝１０）。＊ビヒクル処置群と比較してＰ＜０．０５（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。
【図４】図４は、インフルエンザウイルスの滴定および感染の時間経過の決定を示すグラフである。気管支肺胞洗浄液中の細胞数。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝５）。５００のＥＩＤ５Ｏによって感染したマウスは、体重減少に起因して、６日後に屠殺された。
【図５】図５は、肺におけるウイルスの負荷に対するＣｐＧ  ＯＤＮの保護効果を示すグラフである。ウイルスの負荷は、酵素免疫アッセイによってアッセイした。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝５〜１０）。＊群Ｂと比較してＰ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、Ｄｕｎｎ’ｓ事後確率）、ｎ．ｄ．＝データ無し。
【図６−１】図６は、総白血球数（６Ａ）、総好中球数（６Ｂ）および総単核細胞数（６Ｃ）を測定して、ウイルス誘導性の気道炎症に対するＣｐＧ  ＯＤＮの保護効果を示す一連のグラフである。細胞は、気管支肺胞洗浄液中の細胞数。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝１０）。＊群Ｂと比較してＰ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、Ｄｕｎｎ’ｓ事後確率）。
【図６−２】図６は、総白血球数（６Ａ）、総好中球数（６Ｂ）および総単核細胞数（６Ｃ）を測定して、ウイルス誘導性の気道炎症に対するＣｐＧ  ＯＤＮの保護効果を示す一連のグラフである。細胞は、気管支肺胞洗浄液中の細胞数。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝１０）。＊群Ｂと比較してＰ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、Ｄｕｎｎ’ｓ事後確率）。
【図７】図７は、抗原誘導性の気道炎症における好酸球（７Ａ）および好中球（７Ｂ）の細胞数に対するＣｐＧ  ＯＤＮの保護効果を示す一連のグラフである。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝１０〜１４）。＊抗原をチャレンジし、ビヒクル処置した群と比較してＰ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ多重比較検定、Ｄｕｎｎ’ｓ事後確率）。
【図８】図８は、抗原誘導性の気道炎症におけるＣＤ３＋の細胞数（８Ａ）およびＣＤ３＋ＣＤ４＋の細胞数（８Ｂ）に対するＣｐＧ  ＯＤＮの保護効果を示す一連のグラフである。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝８）。＊抗原をチャレンジし、ビヒクル処置した群と比較してＰ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ多重比較検定、Ｄｕｎｎ’ｓ事後確率）。
【図９】図９は、０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（９Ａ）；０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（９Ｂ）；１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（９Ｃ）；および１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（９Ｄ）の気管支肺胞洗浄液中の細胞数を示す一連のグラフである。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝１０）。
【図１０】図１０は、０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１０Ａ）；０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１０Ｂ）；１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１０Ｃ）；および１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１０Ｄ）の気管支肺胞洗浄液中のＩＦＮαの濃度を示す一連のグラフである。
【図１１】図１１は、０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１１Ａ）；０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１１Ｂ）；１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１１Ｃ）；および１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１１Ｄ）の気管支肺胞洗浄液中のＩＦＮγの濃度を示す一連のグラフである。
【図１２】図１２は、０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１２Ａ）；０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１２Ｂ）；１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１２Ｃ）；および１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１２Ｄ）の気管支肺胞洗浄液中のＩＰ−１０の濃度を示す一連のグラフである。
【図１３】図１３は、０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１３Ａ）；０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１３Ｂ）；１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１３Ｃ）；および１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１３Ｄ）の気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−１２ｐ４０の濃度を示す一連のグラフである。
【図１４】図１４は、０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１４Ａ）；０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１４Ｂ）；１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１４Ｃ）；および１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１４Ｄ）の気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−６の濃度を示す一連のグラフである。
【図１５】図１５は、０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１５Ａ）；０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１５Ｂ）；１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１５Ｃ）；および１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１５Ｄ）の気管支肺胞洗浄液中のＴＮＦαの濃度を示す一連のグラフである。
【図１６】図１６は、０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１６Ａ）；０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１６Ｂ）；１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１６Ｃ）；および１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１６Ｄ）の血清中のＩＦＮγの濃度を示す一連のグラフである。
【図１７】図１７は、０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１７Ａ）；０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１７Ｂ）；１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１７Ｃ）；および１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１７Ｄ）の血清中のＩＬ−６の濃度を示す一連のグラフである。
【図１８】図１８は、０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１８Ａ）；０．１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１８Ｂ）；１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の８時間後（１８Ｃ）；および１ｍｇ／ｋｇのＯＤＮを用いた投薬の１５時間後（１８Ｄ）の血清中のＴＮＦαの濃度を示す一連のグラフである。
【図１９】図１９は、マウスにおける抗原誘導性のＩｇＥ産生（１９Ａ）およびＩｇＧ２ａ産生（１９Ｂ）に対するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドＯＤＮ配列番号２ならびにＯＤＮ配列番号７の効果を示す一連のグラフである。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝１０）。＊抗原によって感作し、ビヒクル処置した群と比較してＰ＜０．０５（Ｄｕｎｎ’ｓ事後確率を用いるＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）。
【図２０】図２０は、総白血球数（２０Ａ）、好酸球（２０Ｂ）、好中球（２０Ｃ）、単核細胞（２０Ｄ）、および体重（２０Ｅ）を示して、マウスにおけるアレルギー性気道炎症のインフルエンザ誘導性の増悪に対するＯＤＮ配列番号２の効果を示す一連のグラフである。
【図２１】図２１は、本明細書中で使用されるモルモットＡＨＲプロトコルである。
【図２２】図２２は、気道抵抗および肺コンプライアンスに対する配列番号７の効果を示す一連のグラフである。それぞれの動物に関して、用量反応曲線が、得られ、そして気道の反応性が、曲線下面積として定量化された。モルモットは、キャリア（生理食塩水）、ＯＶＡのみ、１０μｌ／ｋｇ、３０μｌ／ｋｇ、１００μｌ／ｋｇまたは３００μｌ／ｋｇ（ｉ．ｔ．）の濃度の配列番号７のいずれかを、鼻腔内に与えられた。このデータは、配列番号７が、ＡＵＣ−抵抗において用量依存性の減少を生じたことを示す。図２２Ａおよび図２２Ｂは、気道抵抗の増加（２２Ａ）または肺コンプライアンスの減少（２２Ｂ）の関数としてヒスタミン放出を示す。図２２Ｃおよび図２２Ｄは、生理食塩水、ＯＶＡまたは示される投薬量の配列番号７を用いた処置に対する応答における気道抵抗の増加（２２Ｃ）または肺コンプライアンスの減少（２２Ｄ）を示す棒グラフである。
【図２３−１】図２３は、気道抵抗（２３Ａ）および肺コンプライアンス（２３Ｂ）について本明細書中で使用される統計分析（図２２）の概要である。
【図２３−２】図２３は、気道抵抗（２３Ａ）および肺コンプライアンス（２３Ｂ）について本明細書中で使用される統計分析（図２２）の概要である。
【図２４】図２４は、気道抵抗および肺コンプライアンスに対する配列番号２の効果を示す一連のグラフである。それぞれの動物に関して、用量反応曲線が、得られ、そして気道の反応性が、曲線下面積として定量化された。モルモットは、キャリア（生理食塩水）、ＯＶＡのみ、１０μｌ／ｋｇ、３０μｌ／ｋｇ、１００μｌ／ｋｇまたは３００μｌ／ｋｇ（ｉ．ｔ．）の濃度の配列番号２のいずれかを、鼻腔内に与えられた。このデータは、配列番号２が、ＡＵＣ−抵抗において用量依存性の減少を生じたことを示す。図２４Ａおよび図２４Ｂは、気道抵抗の増加（２４Ａ）または肺コンプライアンスの減少（２４Ｂ）の関数としてヒスタミン放出を示す。図２４Ｃおよび図２４Ｄは、生理食塩水、ＯＶＡまたは示される投薬量の配列番号２を用いた処置に対する応答における気道抵抗の増加（２４Ｃ）または肺コンプライアンスの減少（２４Ｄ）を示す棒グラフである。
【図２５−１】図２５は、気道抵抗（２５Ａ）および肺コンプライアンス（２５Ｂ）について本明細書中で使用される統計分析（図２４）の概要である。
【図２５−２】図２５は、気道抵抗（２５Ａ）および肺コンプライアンス（２５Ｂ）について本明細書中で使用される統計分析（図２４）の概要である。
【図２６−１】図２６は、図２２および図２４におけるグラフの概要である。図２６Ａおよび図２６Ｂは、図２２Ｃおよび図２２Ｄに対応する。図２６Ｃおよび図２６Ｄは、図２４Ｃおよび図２４Ｄに対応する。
【図２６−２】図２６は、図２２および図２４におけるグラフの概要である。図２６Ａおよび図２６Ｂは、図２２Ｃおよび図２２Ｄに対応する。図２６Ｃおよび図２６Ｄは、図２４Ｃおよび図２４Ｄに対応する。
【図２７】図２７は、グラフの下側のＸ軸に沿って配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する４８時間にわたる曝露後の、ヒトＰＢＭＣ（３つのドナー）から分泌されたＩＬ−１０のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す一連のグラフである（３つのドナー由来のデータポイントは、黒三角、黒四角および×によって示される）。図２７に示される試験オリゴヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、および配列番号２を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｘ軸に沿って示される（μＭ）。上清が、回収され、そしてＩＬ−１０は、ＥＬＩＳＡによって測定された。全てのドナーのサイトカイン量の平均が、与えられる。
【図２８】図２８は、グラフの基調（ｋｅｙ）において配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する曝露後の、ヒトＰＢＭＣから分泌されたＴＮＦ−α（２８Ａ）、インターフェロン−γ（２８Ｂ）、およびＩＬ−６（２８Ｃ）のレベル（μＭ）を示す一連のグラフである。各データポイントは、３つのドナーのサイトカイン値から算出された平均である。ＰＢＭＣは、示されたＯＤＮ濃度と一緒にインキュベートされた。上清が、回収され、そしてサイトカインは、ＥＬＩＳＡによって測定された。全てのドナーのサイトカイン量から算出された平均が、与えられる。
【図２９】図２９は、グラフの下側のＸ軸に沿って配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する１６時間にわたる曝露後の、ヒトＰＢＭＣから分泌されたＴＮＦ−αのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す一連のグラフである。図２９に示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号３を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｘ軸に沿って示される（μＭ）。示されるデータは、３つのドナーの値を表す。配列番号の下は、ＯＤＮのクラスに関する表示である。Ｃｓｓ＝Ｃクラスセミソフト、Ｃ＝Ｃクラス、Ｂ＝Ｂクラス、非ＣｐＧ＝非メチル化ＣｐＧを含まないＯＤＮ。上清が、回収され、そしてＩＬ−６は、ＥＬＩＳＡによって測定された。全てのドナーのサイトカイン量の平均が、与えられる。
【図３０】図３０は、グラフの下側のＸ軸に沿って配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する２４時間にわたる曝露後の、ヒトＰＢＭＣから分泌されたＩＬ−６のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す一連のグラフである。図３０に示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号３を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｘ軸に沿って示される（μＭ）。示されるデータは、３つのドナーの値を表す。配列番号の下は、ＯＤＮのクラスに関する表示である。Ｃｓｓ＝Ｃクラスセミソフト、Ｃ＝Ｃクラス、Ｂ＝Ｂクラス、非ＣｐＧ＝非メチル化ＣｐＧを含まないＯＤＮ。
【図３１】図３１は、グラフの下側のＸ軸に沿って配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する４８時間にわたる曝露後の、ヒトＰＢＭＣから分泌されたＩＦＮ−γのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す一連のグラフである。図３１に示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号３を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｘ軸に沿って示される（μＭ）。示されるデータは、３つのドナーの値を表す。配列番号の下は、ＯＤＮのクラスに関する表示である。Ｃｓｓ＝Ｃクラスセミソフト、Ｃ＝Ｃクラス、Ｂ＝Ｂクラス、非ＣｐＧ＝非メチル化ＣｐＧを含まないＯＤＮ。上清が、回収され、そしてＩＦＮ−γは、ＥＬＩＳＡによって測定された。全てのドナーのサイトカイン量の平均が、与えられる。
【図３２】図３２は、グラフの基調において配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する２４時間または４８時間にわたる曝露後の、ＮＫ細胞の活性化（３２Ａ）の指標としてのＮＫ細胞上のＣＤ６９発現ならびにＢ細胞上のＣＤ８０（３２Ｂ）およびＣＤ８６（３２Ｃ）の発現のレベル（ＭＦＩ）を示す一連のグラフである。各データポイントは、３つのドナーの蛍光強度の平均である。その細胞は、２４時間または４８時間にわたって示されたＯＤＮ濃度と一緒にインキュベートされた。細胞は、染色され、そしてフローサイトメトリーによって分析された。
【図３３】図３３は、グラフの下側のＸ軸に沿って配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する２４時間にわたる曝露後の、ＮＫ細胞の活性化の指標としてＮＫ細胞上のＣＤ６９発現のレベルを示す一連のグラフである。図３３に示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号３を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｘ軸に沿って示される（μＭ）。示されるデータは、３つのドナーの値を表す。配列番号の下は、ＯＤＮのクラスに関する表示である。Ｃｓｓ＝Ｃクラスセミソフト、Ｃ＝Ｃクラス、Ｂ＝Ｂクラス、非ＣｐＧ＝非メチル化ＣｐＧを含まないＯＤＮ。その細胞は、ＣＤ３、ＣＤ５６、およびＣＤ６９に対する抗体によって染色され、そしてフローサイトメトリーによって分析される。提示されるデータは、蛍光強度の平均である。
【図３４】図３４は、グラフの下側のＸ軸に沿って配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する４８時間にわたる曝露後の、ヒトＰＢＭＣ上のＣＤ８６の発現を示す一連のグラフである。図３４に示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号３を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｘ軸に沿って示される（μＭ）。示されるデータは、３つのドナーの値を表す。配列番号の下は、ＯＤＮのクラスに関する表示である。Ｃｓｓ＝Ｃクラスセミソフト、Ｃ＝Ｃクラス、Ｂ＝Ｂクラス、非ＣｐＧ＝非メチル化ＣｐＧを含まないＯＤＮ。その細胞は、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ１９、およびＣＤ１４に対する抗体によって染色され、そしてフローサイトメトリーによって分析される。提示されるデータは、蛍光強度の平均である。
【図３５】図３５は、グラフの下側のＸ軸に沿って配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する４８時間にわたる曝露後の、ヒトＰＢＭＣ上のＣＤ８６の発現を示す一連のグラフである。図３５に示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号３を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｘ軸に沿って示される（μＭ）。示されるデータは、３つのドナーの値を表す。配列番号の下は、ＯＤＮのクラスに関する表示である。Ｃｓｓ＝Ｃクラスセミソフト、Ｃ＝Ｃクラス、Ｂ＝Ｂクラス、非ＣｐＧ＝非メチル化ＣｐＧを含まないＯＤＮ。その細胞は、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ１９、およびＣＤ１４に対する抗体によって染色され、そしてフローサイトメトリーによって分析される。提示されるデータは、蛍光強度の平均である。
【図３６】図３６は、グラフの基調において配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する曝露後の、形質細胞様樹状細胞上のＣＤ８６の発現（３６Ａ）ならびに単球上のＣＤ８０（３６Ｂ）およびＣＤ８６（３６Ｃ）の発現のレベルを示す一連のグラフである。各データポイントは、３つのドナーの蛍光強度から算出された平均である。その細胞は、示されたＯＤＮ濃度と一緒に４８時間インキュベートされた。細胞は、染色され、そしてフローサイトメトリーによって分析された。
【図３７】図３７は、グラフの下側のＸ軸に沿って配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する４８時間にわたる曝露後の、単球上のＣＤ８６発現のレベルを示す一連のグラフである。図３７に示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号３を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｘ軸に沿って示される（μＭ）。示されるデータは、３つのドナーの値を表す。配列番号の下は、ＯＤＮのクラスに関する表示である。Ｃｓｓ＝Ｃクラスセミソフト、Ｃ＝Ｃクラス、Ｂ＝Ｂクラス、非ＣｐＧ＝非メチル化ＣｐＧを含まないＯＤＮ。その細胞は、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ１９、およびＣＤ１４に対する抗体によって染色され、そしてフローサイトメトリーによって分析された。提示されるデータは、蛍光強度の平均である。
【図３８】図３８は、グラフの下側のＸ軸に沿って配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する４８時間にわたる曝露後の、単球上のＣＤ８０の発現を示す一連のグラフである。図３８に示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号３を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｘ軸に沿って示される（μＭ）。示されるデータは、３つのドナーの値を表す。配列番号の下は、ＯＤＮのクラスに関する表示である。Ｃｓｓ＝Ｃクラスセミソフト、Ｃ＝Ｃクラス、Ｂ＝Ｂクラス、非ＣｐＧ＝非メチル化ＣｐＧを含まないＯＤＮ。その細胞は、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ１９、およびＣＤ１４に対する抗体によって染色され、そしてフローサイトメトリーによって分析される。提示されるデータは、蛍光強度の平均である。
【図３９】図３９は、グラフの下側のＸ軸に沿って配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する４８時間にわたる曝露後の、形質細胞様樹状細胞上のＣＤ８０の発現を示す一連のグラフである。図３７に示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号３を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｘ軸に沿って示される（μＭ）。示されるデータは、３つのドナーの値を表す。配列番号の下は、ＯＤＮのクラスに関する表示である。Ｃｓｓ＝Ｃクラスセミソフト、Ｃ＝Ｃクラス、Ｂ＝Ｂクラス、非ＣｐＧ＝非メチル化ＣｐＧを含まないＯＤＮ。その細胞は、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲに対する抗体によって染色され、そしてフローサイトメトリーによって分析された。提示されるデータは、蛍光強度の平均である。
【図４０】図４０は、グラフの基調において配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する２４時間にわたる曝露後の、Ｂ細胞中の細胞内ＩＰ−１０（４０Ｂ）および単球中の細胞内ＩＰ−１０（４０Ａ）の発現のレベルを示す一連のグラフである。各データポイントは、３つのドナーの蛍光強度から算出された平均である。その細胞は、示されたＯＤＮ濃度と一緒に２４時間インキュベートされた。細胞は、染色され、そしてフローサイトメトリーによって分析された。
【図４１】図４１は、グラフの下側のＸ軸に沿って配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する２４時間にわたる曝露後の、単球中の細胞内ＩＰ−１０発現のレベルを示す一連のグラフである。図４１に示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号３を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｘ軸に沿って示される（μＭ）。示されるデータは、３つのドナーの値を表す。配列番号の下は、ＯＤＮのクラスに関する表示である。Ｃｓｓ＝Ｃクラスセミソフト、Ｃ＝Ｃクラス、Ｂ＝Ｂクラス、非ＣｐＧ＝非メチル化ＣｐＧを含まないＯＤＮ。その細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＩＰ−１０に対する抗体によって染色され、そしてフローサイトメトリーによって分析された。提示されるデータは、蛍光強度の平均である。
【図４２】図４２は、グラフの下側のＸ軸に沿って配列番号で列挙されるオリゴヌクレオチドに対する２４時間にわたる曝露後の、Ｂ細胞中の細胞内ＩＰ−１０発現のレベルを示す一連のグラフである。図４２に示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号３を含む。特定のデータポイントを作成するために使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｘ軸に沿って示される（μＭ）。示されるデータは、３つのドナーの値を表す。配列番号の下は、ＯＤＮのクラスに関する表示である。Ｃｓｓ＝Ｃクラスセミソフト、Ｃ＝Ｃクラス、Ｂ＝Ｂクラス、非ＣｐＧ＝非メチル化ＣｐＧを含まないＯＤＮ。その細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＩＰ−１０に対する抗体によって染色され、そしてフローサイトメトリーによって分析された。提示されるデータは、蛍光強度の平均である。
【図４３−１】図４３は、マウス脾細胞からのサイトカイン分泌を誘導する配列番号２およびそのフラグメント（配列番号１５〜配列番号１７）の能力の比較を示す一連のグラフである。分析されるサイトカインとしては、ＩＦＮα（４３Ａ）、ＩＦＮγ（４３Ｂ）、ＩＰ−１０（４３Ｃ）、ＩＬ−６（４３Ｄ）、ＩＬ−１０（４３Ｅ）、およびＴＮＦα（４３Ｆ）が挙げられる。
【図４３−２】図４３は、マウス脾細胞からのサイトカイン分泌を誘導する配列番号２およびそのフラグメント（配列番号１５〜配列番号１７）の能力の比較を示す一連のグラフである。分析されるサイトカインとしては、ＩＦＮα（４３Ａ）、ＩＦＮγ（４３Ｂ）、ＩＰ−１０（４３Ｃ）、ＩＬ−６（４３Ｄ）、ＩＬ−１０（４３Ｅ）、およびＴＮＦα（４３Ｆ）が挙げられる。
【図４４−１】図４４は、マウス脾細胞からのサイトカイン分泌を誘導する配列番号２およびそのフラグメント（配列番号１８〜配列番号２０）の能力の比較を示す一連のグラフである。分析されるサイトカインとしては、ＩＦＮα（４４Ａ）、ＩＦＮγ（４４Ｂ）、ＩＰ−１０（４４Ｃ）、ＩＬ−６（４４Ｄ）、ＩＬ−１０（４４Ｅ）、およびＴＮＦα（４４Ｆ）が挙げられる。
【図４４−２】図４４は、マウス脾細胞からのサイトカイン分泌を誘導する配列番号２およびそのフラグメント（配列番号１８〜配列番号２０）の能力の比較を示す一連のグラフである。分析されるサイトカインとしては、ＩＦＮα（４４Ａ）、ＩＦＮγ（４４Ｂ）、ＩＰ−１０（４４Ｃ）、ＩＬ−６（４４Ｄ）、ＩＬ−１０（４４Ｅ）、およびＴＮＦα（４４Ｆ）が挙げられる。
【図４５−１】図４５は、マウス脾細胞からのサイトカイン分泌を誘導する配列番号２およびそのフラグメント（配列番号２１〜配列番号２３）の能力の比較を示す一連のグラフである。分析されるサイトカインとしては、ＩＦＮα（４５Ａ）、ＩＦＮγ（４５Ｂ）、ＩＰ−１０（４５Ｃ）、ＩＬ−６（４５Ｄ）、ＩＬ−１０（４５Ｅ）、およびＴＮＦα（４５Ｆ）が挙げられる。
【図４５−２】図４５は、マウス脾細胞からのサイトカイン分泌を誘導する配列番号２およびそのフラグメント（配列番号２１〜配列番号２３）の能力の比較を示す一連のグラフである。分析されるサイトカインとしては、ＩＦＮα（４５Ａ）、ＩＦＮγ（４５Ｂ）、ＩＰ−１０（４５Ｃ）、ＩＬ−６（４５Ｄ）、ＩＬ−１０（４５Ｅ）、およびＴＮＦα（４５Ｆ）が挙げられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月13日(2007.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2008516634.tif 000096
2008516634.tif 000097
2008516634.tif 000098
2008516634.tif 000099
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