(57)【要約】  本発明は、βチューブリン遺伝子またはタンパク質中の１個以上のヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体の存在を決定することによる、特定の治療薬剤に対する対象の応答能を決定する方法に関する。また、治療薬剤に対する応答能を評価した対象を処置する方法を提供する。本発明の方法に使用するための、βチューブリン遺伝子の変異体、βチューブリンタンパク質の変異体、変異βチューブリン核酸分子および変異βチューブリンタンパク質のそれぞれに結合する核酸分子および薬剤、ならびにこれを含むキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬剤に対する対象の応答能を決定する方法であって、図１に示す対象のβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７０、２７４、２７６、２９３および３６４位の１個以上でのアミノ酸変異体の存在を決定することを含み、変異体の存在または不存在が当該治療薬剤に対する抵抗性または過敏性の指標である、方法。
【請求項２】
図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７０、２７４、２７６、２９３および／または３６４位でのアミノ酸変異を引き起こすβチューブリンをコードする核酸配列における、ヌクレオチド変異体の存在を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
図２に示すβチューブリンをコード化する核酸配列の７８７、８０３、８０８、８２１、８２７、８７８および／または１０９１位の１個以上でのヌクレオチド変異体の存在を決定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
図１および２にそれぞれ示すβチューブリンタンパク質または遺伝子における変異体の存在を最初に確立することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
変異体の存在を、βチューブリンをコード化する核酸配列またはそのフラグメントのヘテロ２本鎖分析によって確立することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
変異体の存在をＤＨＰＬＣ、ミスマッチ検出、ゲル電気泳動またはＳＳＣＰによって確立する、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）試験する核酸試料のストランドを分離する工程；
（ｂ）図２の７８７、８０３、８０８、８２０、８２１、８７８および／または１０９１位の１個以上で変異体ヌクレオチドを含まないことが知られているストランドと２本鎖を形成させる工程；そして
（ｃ）２本鎖の融解プロファイル（melting profile）を作成する工程、ここで前記プロファイルは試験ストランド中に１個以上の変異体が存在することを示す：
をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
βチューブリンをコード化する核酸配列をヌクレオチド変異体の存在を決定する前に増幅する、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ヌクレオチド変異体の存在をＰＣＲ産物のシークエンシング、直接プロービング直接クローニングおよびシークエンシング、アレル特異的ハイブリダイゼーション、変異アレル特異的増幅（ＭＡＳＡ）、ＲＦＬＰ、ポリメラーゼ媒介性プライマー伸長、１塩基伸長、または回転サイクル増幅後アレル特異的ライゲーションによって決定する、請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ヌクレオチド変異体の存在をＭＡＳＡによって決定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
野生型アレルまたは標準アレルに特異的であって、増幅を媒介することができないプライマーをさらに使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アミノ酸変異体の存在を質量分析によって、またはタンパク質結合薬剤の使用によって決定する、請求項１、および４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
治療薬剤がβチューブリンを標的とするか、またはβチューブリンを介してその作用を媒介するものである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
治療薬剤がβチューブリンまたは微小管に関連するプロセスの脱制御からもたらされる疾患の処置に使用するためのものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象の疾患を処置する方法であって、
（ａ）治療薬剤に対する対象の応答能を請求項１〜１４のいずれかに記載の方法で決定すること、ここで、ヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体の存在が当該治療薬剤に対する抵抗性または過敏性の指標である；および
（ｂ）対象が抵抗性でない治療薬剤を投与すること
を含んでなる方法。
【請求項１６】
図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７６および／または２９３位で変異を引き起こすヌクレオチド変異体を有するβチューブリンをコード化する核酸配列またはそれに相補的な核酸配列を含む、単離核酸分子または組み換え核酸分子；またはそのフラグメント。
【請求項１７】
ヌクレオチド変異体が図２に示す核酸配列の７８７、８０３、８２７および／または８７８位に対応する位置に存在する、請求項５に記載の単離核酸分子または組み換え核酸分子；またはそのフラグメント。
【請求項１８】
核酸分子が図２に示すβチューブリンをコード化する核酸配列、またはその相補鎖とハイブリダイズすることができる核酸配列を含む、単離核酸分子または組み換え核酸分子。
【請求項１９】
図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７６および／または２９３位で変異を引き起こすヌクレオチド変異体または当該変異体と隣接する領域とハイブリダイズすることができる、請求項７に記載の単離核酸分子または組み換え核酸分子。
【請求項２０】
２６３、２６８、２７６および／または２９３位でアミノ酸置換を有する、単離された図１に示すβチューブリンタンパク質。
【請求項２１】
図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７６および／または２９３位での変異体に特異的な、タンパク質結合薬剤。
【請求項２２】
適当な治療薬剤をスクリーニングする方法であって、
ａ）図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７０、２７４、２７６、２９３および３６４位の１個以上でのアミノ酸変異体を含む細胞；またはβチューブリンをコード化し、１個以上のアミノ酸変異を引き起こす変異体を有する核酸配列を含む細胞を得ること；そして
ｂ）当該細胞を治療薬剤に曝露すること；そして
ｃ）治療薬剤への曝露による細胞のβチューブリンの重合および／または脱重合を観察すること；
ここで、適当な治療薬剤は細胞のβチューブリンの重合および／または脱重合に影響することができるものである、
を含んでなる方法。
【請求項２３】
重合および／または脱重合の観察を細胞の増殖を観察することによって行う、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１６〜１９のいずれかに記載の核酸配列および／またはタンパク質結合薬剤を含む、図１に示すβチューブリンタンパク質のβチューブリン２６３、２６８および／または２７６、２９３位の１個以上での変異体の存在を決定するための、ヌクレオチドまたはアミノ酸変異体と治療薬剤に対する対象の抵抗性の関係を示す標準チャートが付随したキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、βチューブリン遺伝子またはタンパク質中の１種以上のヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体の存在を決定することによる、特定の治療薬剤に対する対象の応答能を決定する方法に関する。また、治療薬剤に対する応答能を評価した対象を処置する方法を提供する。本発明の方法に使用するための、βチューブリン遺伝子の変異体、βチューブリンタンパク質の変異体、変異βチューブリン核酸および変異βチューブリンタンパク質のそれぞれに結合する核酸分子および薬剤、ならびにこれを含むキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
βチューブリンは関連するタンパク質であるαチューブリンと２量体化して、微小管に重合するヘテロダイマーを形成する。細胞運動、細胞内輸送および細胞構造の維持の役割を果たすため、微小管は動性の構造であり、細胞が要求する通りに縮小または増大することができる。この動性はαチューブリンとβチューブリンのヘテロダイマーの重合および脱重合の進行によって達成される。伸長が必要なときは、ヘテロダイマーが微小管に取り込まれ、短縮が必要なときはヘテロダイマーが細胞質に放出される。
【０００３】
微小管の最も重要な役割の１つは細胞分裂であり、有糸分列における染色体の移動を媒介する紡錘体を形成する。
【０００４】
様々なタンパク質が微小管に関連し、微小管関連タンパク質、あるいはＭＡＰと呼ばれる。これらのタンパク質は微小管に結合し、それらの細胞内での安定性および運動性の両方に影響を及ぼす。例えば、ＭＡＰ２およびＭＡＰ４は重合微小管を安定化するが、スタンチン（stanthim）を含む他のものは脱重合を誘導する。
【０００５】
αおよびβチューブリンは複数の遺伝子ファミリーによってコード化された関連タンパク質である。今日まで、６個のβチューブリンのアイソタイプが同定されており、これは高度に保存されている。ヒトアイソタイプＭ４０はがん細胞を含む全ての細胞で普遍的に発現しており、最も一般的なアイソフォームである。様々なアイソタイプに加えて、βチューブリンの偽遺伝子も発見されている。
【０００６】
有糸分列の紡錘体形成における重要な役割の結果、チューブリンは有糸分列、したがって細胞分裂を妨げる薬剤にとって重要な標的であると長い間認識されていた。これらの薬剤は、しばしば抗分裂剤と呼ばれ、細胞分裂の阻害が必要な状態、例えばがんの処置に重要である。
【０００７】
抗分裂剤の４つの大きなファミリーが同定され、がんの処置での使用が提案されている。これらは、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））およびドセタキセルを含む、イチイに由来するタキサン類；ツルニチニチソウに由来するビンカアルカロイド類；土壌のバクテリアに由来するエポチロン類；そしてドラスタチン類である。タキサン類およびエポチロン類は、いずれも微小管を安定化し、脱重合を阻害する。他方、ビンカアルカロイド類およびドラスタチン類は、脱重合を促進し、そして微小管の安定性を減少させる。証拠はこれらの薬剤がその効果をチューブリンとの結合によって媒介していることを示し、したがって、チューブリンの機能的結合部位の維持がそれらの抗分裂効果に重要であると思われる（Nishio et al, Anti-Cancer Drug Design (1999) 14 133-141）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
がんのような状態の処置についてのそれらの能力にもかかわらず、抗分裂剤への抵抗性の増加が観察される。これは、細胞内の薬剤の蓄積が不十分であること、チューブリンとの結合の変化、薬剤の代謝の増大、およびＭＡＰの変化を含む、様々な原因によると考えられる。抗分裂剤に対するこの抵抗性の性質を調べるため、抵抗性細胞株を確立し、調査用ツールとして使用した。かかる細胞株のいくつかにおいて、βチューブリンの遺伝子およびタンパク質の変異を含むチューブリンの変化が観察された。今日まで同定されてきた変異を再調査すると、Ｂｅｒｒｉｅｍａｎら（The Lancet, Vol 5 March 2004）が、タンパク質配列を変化させる遺伝子変異体のみが抗分裂剤に対する応答性に何らかの影響を有すると予期され得ると結論していた。かかる遺伝子変異は個人に固有であり得、またはおそらく処置中のがんの部位で表れるかもしれない。
【０００９】
ヌクレオチド多型は、平均して、ゲノムを通じて１キロベース毎に１個発生し、そして腫瘍群の遺伝的多様性の多くの原因を占める。かかる遺伝的多様性は遺伝子発現に影響を与え、したがって疾患の感受性または発症に関与すると考えられていたが、本発明において、この遺伝的多様性は特定の処置に対する個体の応答性をも決定する役割を有し得ることが見出された。
【００１０】
ゲノムの多型は、制限断片長変異多型、縦列反復、超可変領域、ミニサテライト、２−または複数ヌクレオチド反復、挿入因子、および１塩基変異多型を示し得る。後者はＳＮＰといい、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって、遺伝子変異が起こる単独の位置である。ＳＮＰ部位での異なる変異体はアレルといい、最初に同定されたアレルが標準アレルまたは野生型アレルと呼ばれる。ＳＮＰ部位でのヌクレオチド代替物の数に依存して、２−または３―アレル性であり得る。例えば、野生型アレルが「Ｔ」残基であり、他のアレルが「Ｃ」、「Ｇ」または「Ａ」を当該部位で含み得る。１塩基変異多型はアミノ酸配列に対応する変化をもたらし得る。例えば、ヌクレオチド残基の置換はコドンを変化させ、アミノ酸の変化をもたらすことがある。同様に、核酸配列中の３個の連続する塩基の欠失または挿入は、１個のアミノ酸残基の挿入または欠失をもたらし得る。
【００１１】
したがって、遺伝子のタンパク質コード配列中で起こるＳＮＰは、タンパク質の構造または機能に影響することがある。影響は、環境に依存して、中立、有利または不利であり得る。遺伝子の非コーディング５’または３’非翻訳領域で起こるＳＮＰはタンパク質配列には影響しないだろうが、ＲＮＡ転写、プロセッシングおよび／または翻訳に影響することによって表現型の効果に影響し得る。多型は１個以上の表現型形質に影響することもあり、または特定の表現型に関連することもある。
【００１２】
がんのような状態は高度に侵襲性であり得て、生存の機会を最大にするため、しばしば素早くそして効果的に処置する必要がある。多くの抗がん治療は、本質的に、好ましくない副作用が厳しい。さらに、それらは高価であり、病院に経済的負担を強いる。これらの理由のため、対象が最も応答するであろう治療薬剤を、好ましくは処置の開始前に同定することが益々望まれる。
【００１３】
薬剤標的の分子変化を、例えば遺伝子配列および特徴的な多型によって理解することで、どのように対象間で薬剤の効果が変化するのかをよりよく理解できるだろう。究極的には、かかる変化の基礎を理解することによって薬剤を対象により適合させることができ、したがって処置を改善し、医療の費用対効果を増加させることができる。
【００１４】
本発明は、βチューブリン遺伝子およびタンパク質で新たに同定された多型を使用すること、および治療薬剤に抵抗性または過敏性であるかもしれない対象を同定するための試験を提供することが目的である。このように、本発明は、当該技術分野の欠陥を克服し、個人の必要に応じた処置プログラムを可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の説明
したがって、本発明の第１の局面において、治療薬剤に対する対象の応答能を決定する方法であって、対象の図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７０、２７４、２７６、２９３および３６４位の１個以上でのアミノ酸変異体の存在を決定することを含む方法を提供する。変異体の存在または不存在が当該治療薬剤に対する抵抗性または過敏性の指標である。
【００１６】
アミノ酸変異体の存在を、タンパク質のアミノ酸配列またはタンパク質をコードする核酸配列の試験によって決定することができる。したがって、本発明の第２の局面において、図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７０、２７４、２７６、２９３および／または３６４位でのアミノ酸変異を引き起こすβチューブリンをコードする核酸配列における、ヌクレオチド変異体の存在を決定することを含む、治療薬剤に対する対象の応答能を決定する方法を提供する。好ましくは、前記方法は図２に示すβチューブリンをコード化する核酸配列の７８７、８０３、８０８、８２１、８２７、８７８および／または１０９１位の１個以上でのヌクレオチド変異体の存在を決定することを含む。
【００１７】
第３の局面において、本発明は対象の疾患を処置する方法であって、
（ａ）図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７０、２７４、２７６、２９３および／または３６４位の１個以上でのアミノ酸変異の存在を、または上記位置の１個以上でのアミノ酸変異を引き起こすβチューブリンをコードする核酸配列におけるヌクレオチド変異体の存在を決定することで、治療薬剤に対する対象の応答能を決定すること、ここで、ヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体の存在が当該治療薬剤に対する抵抗性または過敏性の指標である；および
（ｂ）対象が抵抗性ではない治療薬剤を投与すること
を含んでなる方法を提供する。
【００１８】
本発明の第４の局面において、図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７６および／または２９３位で変異を引き起こすか、あるいは図２に示す核酸配列の７８７、８０３、８２７および／または８７８位に対応する位置に存在するヌクレオチド変異体を有する、βチューブリンをコード化する核酸配列またはそれに相補的な核酸配列を含む、単離核酸分子または組み換え核酸分子；およびそのフラグメントを提供する。
【００１９】
第５の局面において、図２に示すβチューブリンをコード化する核酸配列またはその相補鎖とハイブリダイズすることができる核酸配列を提供する。これらの核酸配列は、好ましくは、変異部位を増幅するため、図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７６および／または２９３位での変異を引き起こすヌクレオチド変異体と、または当該変異体と隣接する領域とハイブリダイズすることができる。
【００２０】
第６の局面において、２６３、２６８、２７６および／または２９３位でのアミノ酸置換を有する、図１に示す単離βチューブリンタンパク質を提供する。
【００２１】
第７の局面において、図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７６および／または２９３位での変異体に特異的なタンパク質結合薬剤を提供する。
【００２２】
本発明の第８の局面において、適当な治療薬剤をスクリーニングする方法であって、
ａ）図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７０、２７４、２７６、２９３および３６４位の１個以上でのアミノ酸変異体；またはβチューブリンをコード化し、１個以上のアミノ酸変異を引き起こす変異体を有する核酸配列を含む、細胞を得ること；そして
ｂ）当該細胞を治療薬剤に曝露すること；そして
ｃ）治療薬剤への曝露による細胞のβチューブリンの重合および／または脱重合を観察すること；
ここで、適当な治療薬剤は細胞のβチューブリンの重合および／または脱重合に影響することができるものである、
を含んでなる方法を提供する。
【００２３】
最後に、本発明は、本明細書に記載の核酸配列および／またはタンパク質結合薬剤を含む、本明細書に記載のβチューブリンのヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体の存在を検出するための、ヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体と特定の治療薬剤に対する対象の応答能の関係を示す標準チャートが付随した、本発明の方法に使用するためのキットを提供する。
【００２４】
図面の説明
本発明は、図面を参照しながら、以下に詳細に記載する：
図１はヒトＭ４０βチューブリンｃＤＮＡのｃＤＮＡ配列のインフレーム翻訳を示す。タンパク質は最初の開始メチオニン残基から最初の停止残基まで伸長する。変異体アミノ酸は太字で示し、全ての可能性のある開始メチオニン残基および停止位置をイタリック体で示す。
【００２５】
図２はβチューブリン遺伝子のｃＤＮＡ転写を示し、ここで、好適なプライマーはイタリック体の配列と結合し、変異体ヌクレオチド部位は太字で示す。
【００２６】
図３および３ａはＭＨ４０βチューブリン遺伝子の単位複製配列を、プライマーと結合する配列をイタリック体で示し、エキソンには下線を付し、そしてイントロンは通常の字体で示す。
【００２７】
図４はＡＣ００６１６５のフラグメントに関する変異体の位置を示す。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、チューブリンを介して作用を媒介するような治療薬剤に応答する能力に影響すると考えられるヒトＭ４０βチューブリン遺伝子の多型の同定に基づく。ＨＭ４０ヒトβチューブリン遺伝子のゲノム配列は同定されており、ジェンバンク受託番号ＡＣ００６１６５で得られる。このクロモソーム６の４４，１１８塩基対配列は、４４４アミノ酸、約４９ｋＤａの重量のタンパク質をコード化する４つのエキソンを含む。βチューブリンのｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ転写において、４つのエキソンはヌクレオチド１〜５７、５８〜１６６、１６７〜２７７、そして２７８〜１３３５に掛かる。
【００２９】
βチューブリンタンパク質は図２のｃＤＮＡ配列によってコード化され、ユニプロット受託番号０５２１８の配列に対応する。
【００３０】
本発明の変異体ヌクレオチドおよびアミノ酸は、それぞれ図１および／または２における位置指標（positional reference）を割り当てられている。ヌクレオチド変異体は図２に示すｃＤＮＡ配列の７８７、８０３、８０８、８２０、８２１、８２７、８７８および１０９１位に位置する。これらの多型は７８７Ｃ＞Ａ、８０３Ｔ＞Ａ、８０８Ｔ＞Ｇ、８２１Ｃ＞Ｔ、８２０Ａ＞Ｃ、８２７Ｇ＞Ａ、８７８Ｔ＞Ａおよび１０９１Ｇ＞Ａのヌクレオチド変化をそれぞれもたらし、同意ではなく、図１のβチューブリンタンパク質において２６３Ｌ＞Ｉ、２６８Ｐ＞Ｈ、２７０Ｆ＞Ｖ、２７４Ｔ＞Ｉ、２７４Ｔ＞Ｐ、２７６Ｒ＞Ｈ、２９３Ｖ＞Ｄ、および３６４Ａ＞Ｔの対応するアミノ酸の変化をもたらす。
【００３１】
βチューブリン遺伝子をＡＣ００６１６５で得られる配列と逆方向に転写する。したがって、説明を簡単にするため、本発明のヌクレオチド変異体を、ｃＤＮＡ配列について説明する。ゲノム配列のヌクレオチド変異体の対応する位置は、配列比較方法、例えばＢＬＡＳＴ分析を使用して、容易に確認することが出来る。この後者の方法は、ＡＣ００６１６５の配列を逆転した、逆配列の３５２７３、３５２５７、３５２５２、３５２３９、３５２３３、３５１８２および３４９７０位に対応するｃＤＮＡ配列の７８７、８０３、８０８、８２０、８２１、８２７、８７８および１０９１位でのヌクレオチド変異体を明らかにした。
【００３２】
抗分裂剤に対する抵抗性または過敏性は、薬剤のβチューブリンへの結合の変化によって起こると考えられる。配列の変化が薬剤の結合部位の変化を引き起こすことはよくある。図１の２７０および２７４位のアミノ酸変異体は、βチューブリンのエポチロン類および／またはタキサン類結合部位にある。これらの変異は、これらのクラスの抗分裂剤への抵抗性を付与すると考えられる（Wartmann et al; Curr. Med. Chem - Anti Cancer Agents (2002) 2 123-148）。
【発明の効果】
【００３３】
特定の治療薬剤に対する対象の応答能は、治療薬剤に対する対象の抵抗性または過敏性の指標である。したがって、本明細書に記載のβチューブリン遺伝子またはタンパク質の１個以上の変異体について対象をスクリーニングすることによって、特定の治療薬剤に対して抵抗性または過敏性であるかを予測することができる、すなわち、対象の応答能を評価することができる。本発明はβチューブリン安定化薬剤に対する抵抗性を付与し、また、βチューブリン脱安定化薬剤に対して過敏性を付与する、あるいはその逆の、βチューブリン遺伝子の変異体を見出した。したがって、本明細書に記載の変異体を分析することによって、異なるクラスの薬剤に対する抵抗性および過敏性の両方の観点から、処置に対する対象の応答能を決定することができる。
【００３４】
治療薬剤に対する応答能は、一部では、先天的な性質であるため、対象の、とりわけ疾患状態にある細胞、例えば疾患ががんであるとき腫瘍細胞の、遺伝子プロファイルに一般的に依存すると現在考えられている。対象の遺伝子プロファイルを決定することによって、先天的に治療薬剤に応答することができるかの指標を得ることができる。したがって、遺伝子プロファイルによると治療薬剤に対して応答することができると考えられる対象であるが、臨床的に応答が得られないときに、応答性に影響する他の要素を分析することができる。これは、多くの疾患、例えばがんの処置に含まれる多くの試行錯誤を効果的に減少させるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
対象の治療薬剤に対する予期される臨床的応答を、状態の改善、有害な症状を減少させ、および／または疾患の進行を遅らせるという意味で決定することができる。例えば疾患ががんであるとき、臨床的応答は腫瘍サイズ、悪性腫瘍、または他の非腫瘍関連症状の減少を含む。
【００３６】
任意の具体的な治療薬剤に対する抵抗性および／または過敏性の程度は遺伝子プロファイルに依存して異なり得る。したがって、本明細書に記載のβチューブリン遺伝子またはタンパク質の変異体の分析は、対象が特定の治療薬剤に対して応答能を有するかだけでなく、予期され得る応答の程度をも示すために使用することができる。
【００３７】
抵抗性なる用語において、これが完全であるとき、対象は、特定の処置する疾患に対して、あらゆる能力において治療薬剤に応答することができないと見なされる。しかし、この文脈において、部分的抵抗性は、対象が、全く抵抗性でないときよりも低い程度ではあるが、治療薬剤に応答し得ることを意味する。同様に、この文脈において、過敏症は、対象が遺伝的に過敏性ではないと予期される場合と比較して、治療薬剤に対してポジティブな臨床的応答の上昇である。
【００３８】
遺伝子プロファイルによって決定される対象の抵抗性または過敏性のレベルは、どの薬剤が有効であるか、そしてどの程度の用量を投与するべきかの決定を補助する。抵抗性または過敏性の程度、したがって治療薬剤の用量を評価するため、対象の遺伝子プロファイルを「標準」と比較することが望まれ得る。かかる標準は、多くの対象および特定の遺伝子プロファイルの抵抗性または過敏性の程度を平均化することによって作成することができる。
【００３９】
処置の開始前に、対象の特定の治療薬剤に対する応答能を決定して、対象の遺伝子プロファイルに基づき適当な治療薬剤を選択することが、一般的に好ましい。したがって、当該方法は任意の好適な時点、好ましくは疾患の診断後、そして好ましくは処置の開始前に行い得る。
【００４０】
しかし、対象の応答性が処置の間に変化することが観察されるため、必要に応じて処置を変更することができるように処置プログラムの間これを観察することが望まれ得る。これは、できるだけ対象が応答可能な処置のみを投与することを保証する。この方法での観察は、任意の時点で、あるいは好ましくは対象が抵抗性の徴候を示し始めたとき、または処置プログラムの間の特定の間隔、例えば１日、１週間、または１ヶ月に１回、行うことができる。
【００４１】
本発明は、好ましくは対象から採取した好適な試料で行う。好適な試料は、核酸またはタンパク質を含むものである。好ましくは、それは外科的処置の必要なく、患者から容易に採取できるか、または予め、例えば生検で患者から採取した保存組織である。好ましい試料には、全血、精液、尿、便、唾液、皮膚、毛髪、涙、または頬側細胞が含まれる。ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質を分析することが望まれるとき、試料は、好ましくはβチューブリン遺伝子が発現しているもの、例えばまたは、βチューブリンタンパク質もしくは遺伝子産物を含むものである。試料から核酸またはタンパク質を当業者に利用可能な方法で抽出することができる。
【００４２】
本発明において、上記βチューブリンｃＤＮＡまたはタンパク質の変異体の位置、およびその使用が新規かつ臨界的特徴であることは明らかである。標準の図１および２の配列は、変異体がβチューブリンにあることを確認するために指標でしかない。本発明で試験された核酸またはタンパク質配列が図１または２のものと同一である必要がないと予測される。したがって、本明細書の標準のβチューブリン遺伝子には、図２のものと配列が異なり得るゲノム、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ配列、例えばβチューブリンのアイソタイプ、例えばBerriemanら(上記）に記載のものが含まれる。標準のβチューブリンタンパク質には、図１のものとは異なり得るタンパク質配列を含む。試験される配列が図１または２のものと同一ではないとき、変異が予期される位置は、図１または２のもの、または他の利用可能なクローンと、当業者に利用可能な方法、例えばＤＮＡＳＩＳ、Ｗｏｒｄ  ＳｅａｒｃｈまたはＦＡＳＴＡのようなコンピュータープログラムを使用して、配列を比較することによって容易に決定することができる。ヌクレオチド変異体とＡＣ００６１６５のゲノム配列のアラインメントは、図４の配列でのＢＬＡＳＴ分析を使用して行うことができる。
【００４３】
本発明において、「変異体」は、任意の特定の位置での、図１および２に記載の標準配列の残基とはそれぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸残基である。変異体はヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失、置換または挿入であってもよく、また、多型または変異を意味し得る。図２またはＡＣ００６１６５の配列のＤＮＡ相補鎖で起こるヌクレオチド変異体とは、特定の位置での変異体はそれが対となっている野生型残基と相補的ではない残基である。図２に示すＤＮＡストランドの特定の位置の残基が変異体であるとき、逆ストランドと対である残基は、それが野生型残基か変異体であるかに依存して、相補的であり得るかまたはそうでない。簡単に説明すると、変異体が遺伝子配列の挿入または欠失であるとき、図２の番号付けは維持される。
【００４４】
βチューブリン遺伝子またはタンパク質の「変異体の存在を決定すること」とは、どの特異的アミノ酸またはヌクレオチド残基がその部位に存在するかを決定するため、特定の位置での遺伝子またはタンパク質の配列を確認することを意味する。βチューブリンの１個以上のアミノ酸またはヌクレオチド変異体の存在を決定するための、あらゆる好適な方法を使用することができる。
【００４５】
本発明の方法は、βチューブリン遺伝子、遺伝子産物またはタンパク質の全長について行う必要はなく、簡便さのために、１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸変異体を含むそのフラグメントについて行うことができる。フラグメントは、当該フラグメントがβチューブリンフラグメントであると確認できる、および／またはその中に１個以上の変異体が存在することを決定できる程度の長さであれば、いかなるサイズでもよい。フラグメントがチューブリンであるか、またはそれが由来する遺伝子のどの部分であるかを決定するため、フラグメントを図１もしくは２の配列またはＡＣ００６１６５のゲノム配列と整列させて、例えばＤＮＡＳＩＳ（Hitachi Engineering Inc）、Ｗｏｒｄ  ＳｅａｒｃｈまたはＦＡＳＴＡ（Genetic Computer Group, Madison W1）のようなコンピュータープログラムで比較することができる。このようにして、図１または２の配列の変異体に使用する位置指標を、これらの配列のフラグメントを参照するときに維持することができる。好ましいフラグメントは少なくとも１個の遺伝子のエキソンを含み、図３に示される。好適なフラグメントは、好ましくは１０〜４００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０、５０、８０、１００、２００、３００または３５０ヌクレオチド長である。好ましくは、フラグメントは少なくとも１個の本明細書に記載の変異体またはβチューブリンを含むかまたはコード化する。
【００４６】
ヌクレオチド変異体を決定するとき、最初に核酸試料を増幅することが一般的に好ましく、これはあらゆる利用可能な技術、例えばＰＣＲまたはＰＣＲ利用技術、リガーゼ媒介反応、転写増幅、自己維持配列複製および核酸利用配列増幅を使用して行うことができる。後者２つの方法は、等温転写に基づく等温反応を含む。好ましくは、βチューブリン遺伝子のサイズのため、遺伝子のフラグメントを増幅し、変異体をスクリーニングする。好適な増幅する遺伝子のフラグメントを、螺旋度の％、塩濃度、単位複製配列の長さ、ＧＣ残基の％、および移動相の濃度のような分析条件を含む基準に基づいて選択する。遺伝子の任意の好適な位置を、１個以上の変異体配列を含む単位複製配列を増幅することができる。好ましくは、単位複製配列は、１個以上のエキソン配列またはその一部を含む。単位複製配列の例を、図３および３ａに示す。βチューブリン遺伝子の一部の増幅のための好適なプライマーの製造は、当業者の能力の範囲内である。βチューブリン遺伝子を増幅するとき、偽遺伝子の同時増幅を避ける方法で行うことが好ましい。好適な方法は、当業者に既知である。好適な方法には、βチューブリン遺伝子のイントロン、好ましくは第３〜第４エキソン間のイントロンにある１個の増幅プライマーを設置することを含む。任意の好適なイントロンベースのプライマーを使用することができ、そして本明細書に記載のプライマー設計基準または当業者に利用可能な方法論を使用して、当業者が設計することができる。好ましいイントロンベースのβチューブリン偽遺伝子の増幅予防プライマーには、実施例に記載のものが含まれる。
【００４７】
本発明の１個以上のヌクレオチド変異体の存在を決定するための好適な方法には、限定されないが、ＰＣＲ産物のシークエンシング、直接プロービング直接クローニングおよびシークエンシング、アレル特異的ハイブリダイゼーション、変異アレル特異的増幅（ＭＡＳＡ）、ＲＦＬＰ、ポリメラーゼ媒介性プライマー伸長、１塩基伸長、または回転サイクル増幅後アレル特異的ライゲーションが含まれる。
【００４８】
好ましい変異体の存在を決定するための方法は、ＭＡＳＡである。したがって、本発明の好ましい態様において、特定の治療薬剤に対する対象の応答能を予測する方法には、変異体アレルに特異的な対のプライマーでβチューブリン遺伝子を増幅すること、および／または標準アレルの野生型と同じ位置で特異的な第２の対のプライマーでβチューブリン遺伝子を増幅することを含む。変異体アレルに特異的なプライマーを使用して増幅が起こったとき、変異体が存在する。逆に、野生型アレルに特異的なプライマーを使用して増幅が起こったとき、その位置には野生型アレルが存在する。両方の反応での増幅は、その位置のヘテロ接合型の遺伝子型を示す。
【００４９】
本発明のＭＡＳＡに使用する好ましいプライマーは、コンピュータープログラムおよび当業者に利用可能な方法論を使用して設計することができる。好ましいプライマーは実施例に詳述している。
【００５０】
好ましい態様において、野生型アレルの増幅は、野生型アレルに特異的であるが、増幅を媒介することができない第３のプライマーを使用することで予防または阻止することができる。このプライマーは、好ましくは、変異体アレル特異的プライマーと配列が同じであるが、野生型アレルに特異的であり、さらにプライマー伸長を媒介することができない。例えば、この第３のプライマーはその３’末端で阻止することができ、したがってプライマー伸長および増幅を媒介することができない。好適なプライマーは、遺伝子配列および野生型アレルを考慮に入れて、当業者によって容易に設計される。
【００５１】
アミノ酸変異体を決定するとき、好ましくはタンパク質結合薬剤の変異体アミノ酸への結合を検出することによって行う。好適な結合薬剤には、アプタマーおよび抗体が含まれる。好ましくは、変異体アミノ酸への結合の検出を補助するために、結合薬剤を標識化し、あるいは本明細書に記載の通りに検出することができる第２の抗体、酵素または分子とカップリングする。
【００５２】
本発明の好ましい態様において、βチューブリン遺伝子またはタンパク質は、変異体を決定する前に、いずれかの変異体が存在するかどうかを確立するためにスクリーニングすることができる。このスクリーニング工程は、とりわけいずれの変異体配列も発見されず、したがってどの変異体が存在するかを決定するためにさらに試験をする必要がなく、速やかに処置を開始することができる対象について、薬剤および処置方法の選択を早めるために使用する。好適なスクリーニング方法には、ヘテロ２量体分析に依存するものが含まれる。好ましい方法には、例えばE. coli mutSもしくはリボプローブ、ゲル電気泳動、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）および１本鎖コンホメーション多型分析（ＳＳＣＰ）を使用した、ミスマッチ検出が含まれる。本発明の最も好ましい態様において、ＤＨＰＬＣを、βチューブリン遺伝子またはタンパク質のいずれかの変異体の存在を決定するために使用する。したがって、本発明の方法は、好ましくはさらなる工程を含む：
（ａ）試験する核酸試料のストランドを分離する工程；
（ｂ）図２の７８７、８０３、８０８、８２０、８２１、８７８および／または１０９１位の１個以上で変異体ヌクレオチドを含まないことが知られているストランドと２本鎖を形成させる工程；そして
（ｃ）２本鎖の融解プロファイル（melting profile）を作成する工程、ここで前記プロファイルは試験ストランド中に１個以上の変異体が存在することを示す。
【００５３】
好ましくは、ＤＨＰＬＣをＷＡＶＥ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Transgenomic)またはＨｅｌｉｘ  Ｓｙｓｔｅｍ(Varian)を使用して行う。
【００５４】
本発明のアミノ酸またはヌクレオチド変異体の１個以上の存在を、上記βチューブリンヌクレオチド変異体の１個以上と連鎖不平衡な他の変異体の存在を決定することによって、間接的に決定することができる。変異部位は、１個の変異体の存在が第２の変異体の存在の機会を増加させるとき、連鎖不平衡である。したがって、１個の変異体の存在を決定することによって、第２の変異体の存在を推測すること、そして実際に第２の変異体の存在を確認することなしにそれに基づいて進めることが可能である。本発明のヌクレオチド変異体の１個以上と連鎖不平衡であり得る変異体が、既知であり、そして他の遺伝子またはβチューブリンと関係ない他のゲノムの一部に位置し得ることは明らかである。
【００５５】
本発明は、βチューブリンを標的とするか、またはβチューブリンを介してその作用を媒介する治療薬剤に対象が応答することができるかどうかを評価するのに好適である。かかる治療薬剤には、チューブリンを安定化するもの、例えばタキサン類、エポチロン類（epothilane）、ディスコデルモリド類、およびチューブリンを脱安定化するもの、例えばコルヒチン類および他のコルヒチン部位結合剤、ビンカアルカロイド類等が含まれる。抗分裂剤には、エポチロン類、ビンカアルカロイド類、およびドラスタチン類が含まれる。
【００５６】
対象の遺伝子プロファイルを一度確認すると、適当な治療薬剤を選択し、用量を確立することができる。したがって、遺伝子プロファイルが、対象が特定の薬剤に完全に抵抗性であることを示すとき、これは候補薬剤から削除することができる。対象が抵抗性を示さないか、または過敏性であり得る他の薬物をその代わりに選択することができる。遺伝子プロファイルが、対象が薬物に部分的に抵抗性であるかまたは過敏性であることを示すとき、これは投与する薬剤の用量に影響し得る。例えば、用量を増加または減少、あるいは投与の頻度を変更することができる。
【００５７】
したがって、本発明はまた、好ましくは本明細書に記載の通りに治療薬剤に対する応答能を一度決定した対象を処置する方法を提供する。したがって、一度遺伝子プロファイルを作成すると、この方法は、好ましくは患者が完全に抵抗性ではないか、または過敏性である治療薬剤を投与することを含む。
【００５８】
したがって、本発明は、治療薬剤に完全に抵抗性ではない対象の疾患の処置に使用するために当該治療薬剤を提供する。
【００５９】
あるいは、本発明は、薬剤に完全に抵抗性ではない対象の疾患の処置用医薬の製造における、治療薬剤の使用を提供する。
【００６０】
本発明は、βチューブリンまたは微小管が関係するプロセスの脱制御、またはβチューブリンを標的とすることによって処置される疾患の、応答能を評価するか、あるいは当該疾患を処置するのに好適であり得る。かかる疾患には、がん、例えば乳がん、卵巣がん、肺がん、膵臓がん、腎臓がん、肝臓がん、子宮がん、胃がん、腸がん、食道がん、血液のがん、膀胱がん、骨のがん、頸がん、皮膚がんおよび他のいずれかの臓器のがんが含まれる。好ましくは、この方法は非卵巣がん、例えば乳がんに使用される。
【００６１】
本発明はまた、βチューブリンをコード化する核酸配列、またはそれと相補的な核酸配列を含み、図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２６８、２７０、２７４、２７６、２９３および／または３６４位で、または図２の７８７、８０３、８０８、８２０、８２１、８２７、８７８および／または１０９１位に対応する位置で変異を引き起こすヌクレオチド変異体を含む、単離核酸分子または組み換え核酸分子；およびそのフラグメントを提供する。
【００６２】
核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであり得る。
【００６３】
核酸分子は図２に示すＡＣ００６１６５の全βチューブリン遺伝子もしくは転写産物、またはそのフラグメントを含んでいてもよい。フラグメントは好ましくは、少なくとも１個の変異体を上記位置の１個で含む。好ましいフラグメントは、１０〜４００ヌクレオチド長、好ましくは２０、５０、８０、１００、２００、３００、または３５０ヌクレオチドである。
【００６４】
核酸分子はインビボまたはインビトロでの発現を可能とするため、ベクター中で提供することもできる。好適なベクターは当業者に既知であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、Ｌａｍｂｄａ  Ｚａｐ、およびｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔを含む。核酸分子は、プロモーターまたはエンハンサーのような制御配列、および複製起点、１個以上の制限部位、マーカー、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、転写終結領域、重合部位および３’ポリアデニル化部位のような１個以上のクローニングまたは発現を促進する他の配列、および核酸分子または生成物、例えばＧＦＰのようなタグの検出および精製を促進する配列を含む、１個以上のさらなる核酸配列と、作動可能なように結合していてもよい。
【００６５】
制御配列および他の配列の具体的な選択は、使用する発現系に大きく依存し、当該技術分野において利用可能なあらゆるものから選択されてよい。
【００６６】
また、βチューブリン遺伝子と、および好ましくは本発明の変異体ヌクレオチドのアレルとハイブリダイズする核酸配列を提供する。かかるアンチセンス配列はアレルを検出するプローブまたはプライマーとして、あるいは疾患の診断または処置に、有用である。
【００６７】
本発明の方法におけるプローブとして有用であるために、アンチセンスヌクレオチド配列はβチューブリン遺伝子の変異体核酸配列（nucleiticles）の異なるアレルを、当該技術分野において利用可能な方法を使用して、区別できなければならない。したがって、プローブは、好ましくは変異体部位を含む領域とハイブリダイズし、そしてプローブはその位置で変異体部位の正確な補体を含む。
【００６８】
１塩基ミスマッチを検出するための特異的なハイブリダイゼーションが可能なアンチセンス配列は、当業者に既知であるか、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor, NY、およびBerger et al., Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) Academic Press Inc. San Diego, CA；Gibbs et al., Nuc Acids Res., 17:2437(1989)；Kwok et al., Nucl Acids Res 18:999；およびMiyada et al., Methods Enzymol. 154: 94 (1987)に記載の方法によって設計することができる。これらのアンチセンス配列の配列変動は本発明の目的のために許容されるが、変異体アレルを区別するアンチセンス配列の能力は損なわれない。プライマー配列についての変動は許容されるが、選択領域の増幅を媒介する能力は損なわれない。好ましくは、プライマー配列は下記定義のストリンジェンとな条件下で、βチューブリン遺伝子とハイブリダイズする。
【００６９】
本発明との関係において、「ストリンジェンとな条件」とは、ハイブリダイゼーションプロトコルにおいて使用される洗浄条件を意味する。一般的に、洗浄条件は、変性温度が研究下で計算された核酸のＴｍよりも約５〜２０℃低いように、温度および塩濃度の組合せであるべきである。２０塩基以下の核酸プローブのＴｍを、［４℃×（Ｇ＋Ｃ）＋２℃×（Ａ＋Ｔ）］として、標準的な条件（１Ｍ  ＮａＣ１）下で、短オリゴヌクレオチドに関するＷａｌｌａｃｅ則によって計算する。長ＤＮＡフラグメントについては、固体熱力学および実験データのを組み合わせた最も近似の方法を、Breslauer et al., PNAS 83: 3746-3750 (1986)に記載の原理によって使用することができる。
【００７０】
ハイブリダイゼーションに最適な塩および温度条件を、フィルターに固定したＤＮＡ試料を目的のプローブにハイブリダイズし、ストリンジェントではない条件下で洗浄する、予備実験によって容易に決定することができる。ＰＣＲ条件は標準的な条件とは異なり得るが、Ｔｍは予想されるプライマーの相対的安定性についての指標として使用され得る。約１４ヌクレオチドの短プライマーについては、約４４℃〜５０℃の低アニーリング温度を使用する。温度は使用するプライマー配列の塩基組成に依存して高くなり得る。
【００７１】
プローブは合成的に、またはニックトランスレーションと呼ばれる方法で製造することができる。βチューブリン遺伝子の領域と結合した後でプローブの可視化を可能とするため、好ましくはプローブを、例えば放射線標識、酵素、フッ素標識、およびビオチン−アビジン結合体を使用して標識化する。βチューブリン核酸と結合すると、プローブを標識の検出が可能な方法を使用して検出することができる。例えば、標識が放射線標識のとき、プローブをオートラジオグラフを使用して検出することができる。
【００７２】
例えば上記の、βチューブリン遺伝子の一部を増幅することが可能な好ましいプライマーを、当業者であれば容易に設計することができる。好ましくは、かかるプライマーはエキソン配列と隣接するかまたはエキソン配列中のイントロン領域と結合する。好適なゲノム配列の増幅部分のプライマーは、図３および／または３ａの下線部の配列またはその相補鎖と、増幅が可能な条件下で結合するものである。エキソン４の全部または一部の増幅に好ましいゲノムプライマーは下記のものである：
【表１】
2008519588.tif 000002
【００７３】
表中のプライマー：
4afはgaaacatcatgtatcttccatacであり
4xはgaaacatcatgtatcttccataccであり
4crはtccattccacaaagtagctgであり
4cr inv/compはcagctactttgtggaatggaであり
4arはaggcataaagaaatggagacgであり
4ar inv/compはcgtctccatttctttatgcctであり
4dfはcatggaggaggtcgatgagであり
4b/4cfはgtcaccacctgcctccgttであり
4b/4drはcctgtatttctttctggtgcccであり
4b/dr inv/compはgggcaccagaaagaaatacaggである。
【００７４】
別のプライマーはSale et al., Molecular Cancer therapeutics 2002に記載のものである。
これらのプライマーの使用によって図３ａに示す単位複製配列がもたらされる。
【００７５】
βチューブリン転写産物またはｃＤＮＡの増幅に好適なプライマーには、図２の下線部とハイブリダイズするもの、例えば下記のものが含まれる：
フォワード： CTTGCCCCATACATACCTTGAG
リバース  ： CCCAGACTGACCAAATACAAAG
フォワード： GACCTGCAGCTGGACCGC
リバース  ： TCAGGGTATTCTTCTCGGATCTT
フォワード： TGGTTGATTCTGTCCTGGATG
リバース  ： GTTGGTGTGGTCAGCCTCAGAG
フォワード： TACAATGCCACCCTCTCCGT
リバース  ： GCATCTGCTCATCGACCTCCT
フォワード： GGAAGCCAGCAGTATCGAGC
リバース  ： CTCACCGAAATCCTCCTCCTC
フォワード： CTGAGAGCAACATGAACGACC
リバース  ： GAGCGCCTACTATTGCCAG
フォワード： GACCTCCGCAAGTTGGCAGT
リバース  ： CAGGCAGCCATCATGTTCTTG
【００７６】
βチューブリン遺伝子を増幅するとき、偽遺伝子の同時増幅を減少させるかまたは好ましくは完全に回避するような方法で行うのが好ましい。好適な方法は当業者に既知である。好ましい方法には、βチューブリン遺伝子のイントロン、好ましくは第３エキソンと第４エキソンの間のエキソン中に１個の増幅プライマーを配置することが含まれる。あらゆる好適なイントロンベースのプライマーを使用することができ、そして本明細書に記載のプライマー設計基準または当該技術分野において利用可能な方法を使用して、当業者が設計することができる。
【００７７】
多くの場合、１体の対象に由来する試料の複数の変異体を分析することが、または逆に、多くの対象に由来する試料の１個以上の変異体の存在を決定することが、望まれ得る。この場合、プローブプライマーまたはβチューブリン核酸を共有的にまたは非共有的に支持体に固定し、核酸アレイに基づく分析を行うことが望まれ得る。配列は任意の好ましい形態であり得る。既知のアレイには、ウェル、スライド、チップ、シート、ビーズ、背におよび膜が含まれる。アレイの繊維は好ましくは固体、例えば紙、シリコン、プラスチック、およびガラスである。支持体への核酸の結合をあらゆる好適な方法によって媒介することができる。既知の方法には抗体−抗原相互作用、ストレプトアビジンまたはアビジン−ビオチン結合体、疎水性相互作用、ＵＶ架橋および化学結合が含まれる。
【００７８】
あるいは、本発明の方法は、図１に示すβチューブリンタンパク質の２６３、２９３および／または２９４位での変異体の存在を決定することができる。また、アミノ酸配列の変異体を決定するあらゆる好適な方法を使用することができ、これには質量分析（Verdiner-Pinard et al Biochemistry (2003) 42 5319 - 5357）が含まれる。好ましい方法には、異なるタンパク質配列と結合することができ、区別することができる、抗体または抗体フラグメント、もしくはアプタマーの使用が含まれる。
【００７９】
本発明に使用する好適な抗体は、アミノ酸配列に結合するものである。抗体には標準的な方法として記載されている方法（Harlow and Lane, “Antibodies; A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1998）によって製造することができる。精製した抗原を動物に、免疫応答を誘発するのに十分な量と間隔で注射することができる。抗体を直接精製することができ、あるいは脾臓細胞を動物から得ることができる。細胞を不死細胞系と融合し、抗体分泌についてスクリーニングする。抗体を、抗原を発現または分泌している細胞またはファージについてのＤＮＡクローンライブラリーのスクリーニングに使用することができる。これらの陽性クローンを、例えば、Kellys et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)およびBebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)に記載の通りにシークエンシングすることができる。抗体は、好ましくは本発明の変異体アミノ酸配列に特異的であり、そして好ましくは、抗体は標準βチューブリンタンパク質と上記位置での変異体を区別できる程度に十分に特異的である。好ましくは、特定の抗体を検出および／または製造するのに使用する抗原には、本明細書に記載のβチューブリンタンパク質またはタンパク質フラグメントが含まれる。
【００８０】
抗体、抗体フラグメントまたはアプタマーの結合を、免疫蛍光アッセイ、ＥＬＩＳＡまたは免疫ブロットのような適当な方法を使用することによって検出することができる。好ましくは、１次抗体と結合する２次抗体またはリガンドを使用することができる。２次抗体またはリガンドを、例えば放射標識、蛍光または西洋わさびペルオキシダーゼのような好適な酵素で標識化する。
【００８１】
適当な治療薬剤を同定するスクリーニング法は、好ましくは細胞に対して行い得るが、あるいは適当なβチューブリン核酸および／またはタンパク質を含むインビトロ系で行うこともできる。細胞またはインビトロ系を、いずれかの好適な方法によって試験する治療薬剤に曝露する。適当な治療薬剤はチューブリンを安定化または脱安定化し、その結果βチューブリンの重合および／または脱重合に影響するものである。かかる重合および／または脱重合を、それと関係する適当な細胞マーカー、例えば細胞の増殖（細胞を使用するとき）を使用して観察することができる。
【００８２】
好ましくは、本発明のキットは、本明細書の本発明の第３〜第６の局面に記載の核酸分子、タンパク質、核酸および／またはタンパク質結合薬剤を含む。最も好ましくは、キットは、本明細書に記載のプローブもしくはプライマーのようなβチューブリン遺伝子とハイブリダイズすることができる核酸配列、またはβチューブリンタンパク質変異体に特異的なタンパク質結合薬剤を含む。キットはさらに、存在する具体的なヌクレオチドまたはタンパク質変異体と、１種以上の治療薬剤に対する抵抗性または過敏性のレベルの関係を示す標準チャートを含んでいてもよい。
【００８３】
キットはまた、好ましくは、核酸配列またはタンパク質結合薬剤を検出する手段、および核酸配列またはタンパク質結合薬剤に結合する基質、例えば本明細書に記載のアレイを含む。
【００８４】
各局面の好ましい態様は、他の局面に準用することができる。
【００８５】
本発明の製造および適用のより完全な理解を、下記実施例から得ることができる。これは説明のみを目的としており、本発明の技術的範囲をいかなる方法でも限定することがない。
【実施例】
【００８６】
実施例
変異分析のためのＨＭ４０タイプ１  βチューブリン領域の製造。
５個の対照ゲノムＤＮＡ試料から下記プライマーで増幅したＰＣＲ産物を配列決定した。ＤＮＡ配列を分析した４つの領域の全てで１００％のマッチを示すＡＣ００６１６５標準配列と整列させた。配列をＪ００３１４エントリーのシークエンシングまたは注釈エラーに関連し得るいくつかの不一致領域を示すＪ００３１４エントリーとも整列させた。これらのＰＣＲ産物をクローニングし、各エキソンを示す１５個のクローンをシークエンシングすると、プライマーおよび条件がＡＣ００６１６５遺伝子座またはＡＣ００６１６５と１００％同一の領域を含む遺伝子座から配列を増幅するのみであることを示す同一の結果が得られた。
エキソン１プライマー：
cctctcctttctccctctcおよびtcttggcaggcacattt
エキソン２プライマー：
ctgggacttgacctgttgtおよびcttccctgtctcccacttat
エキソン３プライマー：
ccttcccttctgccagatttctおよびgaaacatcatgtatcttcca
エキソン４プライマー：
表１に示す通り。
【００８７】
Ｎａｖｉｇａｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Transgenomic, Inc.）を使用して、ＨＭ４０配列を分析し、ＰＣＲおよびＤＨＰＬＣ分析に最適な単位複製配列を設計した。ソフトウェアは固有アルゴリズムを使用して、選択された温度および融解プロファイルを作成するための分析条件（移動相濃度、塩濃度、単位複製配列の長さ、％ＧＣ）でのＤＮＡのセグメントの％ヘリシティを定義する配列内用に基づいて単位複製配列を選択する。
【００８８】
表１のプライマーセットおよび本明細書に記載の単位複製配列を、ＨＭ４０エキソン４分析で使用した。これはＤＨＰＬＣ分析および確認ＤＮＡシークエンシングのためのＰＣＲプライマーを含む。
【００８９】
変異体を調査するために使用した配列は、ＡＣ００６１６１のフラグメント３８４６６〜３８７７５、３６２４６〜３６７４４、３５８１８〜３６２５０、３５２５６〜３５８４１および３４４６７〜３５３５４、および図１を含むエキソンである。各フラグメントのＰＣＲプライマーは参考文献（Sale, et. al., Molecular Cancer Therapeutics, 2002）から得る。エキソン４は３〜４個のフラグメントに分割されなければならないが、文献には２個が記載されている。所望により、よりよいプライマー設計のために増幅領域を伸長することができる。
【００９０】
βチューブリンエキソン４反転イントロンアンカーＭＡＳＡアッセイ設計
ＤＮＡを５〜１０μｍの厚みのスライドから抽出する。１〜５μｌのＤＮＡ調製物を５０μｌのＰＣＲ反応に使用した。プライマーを１０ｍＭの濃度で使用した。Ｈｏｔｍａｓｔｅｒ  ＴａｑまたはＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄをＤＮＡポリメラーゼとして使用した。ＭＡＳＡのアニーリング温度を陽性対照および陰性対照を使用して経験的に決定した。最適アニーリング温度は陽性対照から強いシグナルが得られ、陰性対照からはシグナルが検出されないものである。勾配熱循環器を使用して最適アニーリング温度を選択し、試験試料のＭＡＳＡのために選択した。
【００９１】
５μｌのＭＡＳＡ  ＰＣＲ産物を、５〜１０ｐｇのｄｓＤＮＡを検出することができるＷＡＶＥ−ＨＳ系のｄｓＤＮＡのサイズ分析のために注入した。
【００９２】
ＢＴ  ４  Ｆ２７０Ｖ
変異：コドン２７０でＴＴＴからＧＴＴ、ＰｈｅからＶａｌ
配列：ATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCACCAGCCGTGGAAGCCAGCA
ＭＡＳＡフォワードプライマー：GAAACATCATGTATCTTCCATACCCTG  予定温度：70.2℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃３：CTGGTGAGAGGGGCAAC  予定温度：58.8℃
ＰＣＲ条件：
工程    温度        時間
１      ９５℃      ２分
２      ９５℃      １５秒
３      ６２．５℃  １５秒
４      ６８℃      １５秒
５      工程２に３９回戻る
６      ６８℃      ５分
７      ４℃        ホールド
ポリメラーゼ：Ｈｏｔｍａｓｔｅｒ（Eppendorf）。
備考：このアッセイは約１０ｎｇのｇＤＮＡを使用して開発した。より多くのＤＮＡはバックグラウンドの増加および偽陽性を引き起こし得る。
【００９３】
ＢＴ  ４  Ｔ２７４Ｉｌｅ
変異：コドン２７４でＡＣＣからＡＴＣ、ＴｈｒからＩｌｅ
配列：ATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCACCAGCCGTGGAAGCCAGCA
ＭＡＳＡフォワードプライマー：GAAACATCATGTATCTTCCATACCCTG  予定温度：70.2℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃２：TGGCTTCCACGGCTGA  予定温度：61.6℃
ＰＣＲ条件：
工程    温度        時間
１      ９５℃      ２分
２      ９５℃      １５秒
３      ６３．５℃  １５秒
４      ６８℃      １５秒
５      工程２に３９回戻る
６      ６８℃      ５分
７      ４℃        ホールド
ポリメラーゼ：Ｈｏｔｍａｓｔｅｒ（Eppendorf）。
備考：このアッセイは約１０ｎｇのｇＤＮＡを使用して開発した。より多くのＤＮＡはバックグラウンドの増加および偽陽性を引き起こし得る。
【００９４】
ＢＴ  ４  Ｒ２７６Ｈ
変異：コドン２７６でＣＧＴからＣＡＴ、ＡｒｇからＨｉｓ
配列：ATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCACCAGCCGTGGAAGCCAGCA
ＭＡＳＡフォワードプライマー：GAAACATCATGTATCTTCCATACCCTG  予定温度：70.2℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃４：GATACTGCTGGCTTCCAT  予定温度：56.0℃
ＰＣＲ条件：
工程    温度        時間
１      ９５℃      ２分
２      ９５℃      １５秒
３      ６２℃      １５秒
４      ６８℃      １５秒
５      工程２に３９回戻る
６      ６８℃      ５分
７      ４℃        ホールド
ポリメラーゼ：Ｈｏｔｍａｓｔｅｒ（Eppendorf）。
備考：このアッセイは約１０ｎｇのｇＤＮＡを使用して開発した。より多くのＤＮＡはバックグラウンドの増加および偽陽性を引き起こし得る。
【００９５】
プライマーを５’フォワードイントロンアンカープライマーおよび３’変異アレル特異的プライマーを使用するＨＭ−４０  βチューブリン変異アレル特異的増幅（ＭＡＳＡ）に使用する。
【００９６】
βチューブリンエキソン４  ＭＡＳＡアッセイプライマー
βチューブリンエキソン４
５’フォワードイントロンアンカープライマー配列：
フォワードプライマー＃１：GAAACATCATGTATCTTCCATACCCTG  温度：70.2℃
フォワードプライマー＃２：GAGCTTTTCTCCTGACTGCATTCCAG  温度：74.5℃
フォワードプライマー＃３：CATCCGAGGGAATTATTTGAAAAGTTG  温度：73.8℃
フォワードプライマー＃４：CCGAGGGAATTATTTGAAAAGTTG  温度：69.3℃
【００９７】
ＢＴ  ４  Ｆ２７０Ｖ    配列：TttgcccctctcAccagcCgtggaagccagcagtatcgagctctcacagtgccgg
変異：ＴＴＴからＧＴＴ、ＰｈｅからＶａｌ
ＭＡＳＡリバースプライマー通常：GGCTGGTGAGAGGGGCAAA  予定温度：69.4℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃１：GGCTGGTGAGAGGGGCAAC  予定温度：68.7℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃２：GCTGGTGAGAGGGGCAAC  予定温度：64.1℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃３：CTGGTGAGAGGGGCAAC  予定温度：58.8℃
【００９８】
ＢＴ  ４  Ｔ２７４Ｐ    配列：TttgcccctctcAccagcCgtggaagccagcagtatcgagctctcacagtgccgg
変異：ＡＣＣからＣＣＣ、ＴｈｒからＰｒｏ
ＭＡＳＡリバースプライマー通常：CTGGCTTCCACGGCTGGT  予定温度：67.6℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃１：CTGGCTTCCACGGCTGGG  予定温度：70.6℃
【００９９】
ＢＴ  ４  Ｔ２７４Ｉｌｅ    配列：TttgcccctctcAccagcCgtggaagccagcagtatcgagctctcacagtgccgg
変異：ＡＣＣからＡＴＣ、ＴｈｒからＩｌｅ
ＭＡＳＡリバースプライマー通常：CTGGCTTCCACGGCTGGT  予定温度：67.6℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃１：CTGGCTTCCACGGCTGA  予定温度：63.7℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃２：TGGCTTCCACGGCTGA  予定温度：61.6℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃３：GGCTTCCACGGCTGA  予定温度：57.6℃
【０１００】
ＢＴ  ４  Ｒ２７６Ｈ    配列：CGTGGAAGCCAGCAGTATCGAGCTCTCACAGTGCCGGACC
変異：ＣＧＴからＣＡＴ、ＡｒｇからＨｉｓ  実験温度
ＭＡＳＡリバースプライマー通常：TCGATACTGCTGGCTTCCAC
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃１：CTCGATACTGCTGGCTTCCAT  予定温度：66.3℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃２：TCGATACTGCTGGCTTCCAT  予定温度：64.6℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃３：CGATACTGCTGGCTTCCAT  予定温度：62.3℃
ＭＡＳＡアレルリバースプライマー＃４：GATACTGCTGGCTTCCAT  予定温度：56.0℃
【０１０１】
ＢＴ  ｃＤＮＡ分析
ＨＭ−４０  βチューブリン転写のためのプライマーおよび条件
ＢＴ  ｃＤＮＡプライマー：
ＢＴ配列１フォワード：CTTGCCCCATACATACCTTGAG
ＢＴ配列１リバース：CCCAGACTGACCAAATACAAAG
ＢＴ配列２フォワード：GACCTGCAGCTGGACCGC
ＢＴ配列２リバース：TCAGGGTATTCTTCTCGGATCTT
ＢＴ配列３フォワード：TGGTTGATTCTGTCCTGGATG
ＢＴ配列３リバース：GTTGGTGTGGTCAGCCTCAGAG
ＢＴ配列４フォワード：TACAATGCCACCCTCTCCGT
ＢＴ配列４リバース：GCATCTGCTCATCGACCTCCT
ＢＴ配列５フォワード：GGAAGCCAGCAGTATCGAGC
ＢＴ配列５リバース：CTCACCGAAATCCTCCTCCTC
ＢＴ配列６フォワード：CTGAGAGCAACATGAACGACC
ＢＴ配列６リバース：GAGCGCCTACTATTGCCAG
ＢＴ  ＨＺ配列フォワード：GACCTCCGCAAGTTGGCAGT
ＢＴ  ＨＺ配列リバース：CAGGCAGCCATCATGTTCTTG
【０１０２】
ＲＴ反応をAmbion's Retroscript First Strand Synthesis Kit（物件＃１７１０）を使用して、製造業者の指示書にしたがって、このキットに含まれるランダム１０量体を使用して行った。
【０１０３】
テンプレート−２マイクロリットルの上記ｃＤＮＡ反応
ＰＣＲ条件：
工程    温度        時間
１      ９５℃      ２分
２      ９５℃      １５秒
３      ５６℃      １５秒
４      ６８℃      １５秒
５      工程２に３９回戻る
６      ６８℃      ５分
７      ４℃        ホールド
ポリメラーゼ：Ｈｏｔｍａｓｔｅｒ（Eppendorf）。
【０１０４】
βチューブリンエキソン４  ＭＡＳＡプライマー（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ分析）−非イントロンアンカーＭＡＳＡ
βチューブリンエキソン４
ＢＴ  ４  Ｆ２７０Ｖ    配列：ATGGTCCCCTTCCCACGTCTCCATTTCTTTATGCCTGGCTTT
変異：ＴＴＴからＧＴＴ、ＰｈｅからＶａｌ                            実験温度
ＭＡＳＡフォワード２プライマー変異：CATTTCTTTATGCCTGGCG  温度：63.5℃  64℃
ＭＡＳＡフォワード２プライマー通常：CATTTCTTTATGCCTGGCT  温度：59.6℃
ＭＡＳＡフォワード３プライマー変異：CCATTTCTTTATGCCTGGCG  温度：67.7℃
ＭＡＳＡフォワード３プライマー通常：CCATTTCTTTATGCCTGGCT  温度：64.1℃  62〜63℃
ＭＡＳＡフォワード４プライマー通常：TCCATTTCTTTATGCCTGGCT  温度：66.2℃
ＭＡＳＡリバースプライマー：CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC  温度：77.0℃
生成物サイズ：２１０ｂｐ  ｖ．２および２１１ｂｐ  ｖ．３
【０１０５】
ＢＴ  ４  Ａ２７１Ｐ    配列：ATGGTCCCCTTCCCACGTCTCCATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCC
変異：ＧＣＣからＣＣＣ、ＡｌａからＰｒｏ
ＭＡＳＡフォワードプライマー変異：ATTTCTTTATGCCTGGCTTTC  温度：63.3℃
ＭＡＳＡフォワードプライマー通常：ATTTCTTTATGCCTGGCTTTG  温度：64.1℃
ＭＡＳＡフォワード２プライマー変異：CATTTCTTTATGCCTGGCTTTC  温度：66.1℃
ＭＡＳＡフォワード２プライマー通常：CATTTCTTTATGCCTGGCTTTG  温度：66.9℃
ＭＡＳＡリバースプライマー：CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC  温度：77.0℃
生成物サイズ：２０９ｂｐ  ｖ．１および２１０ｂｐ  ｖ．２．
【０１０６】
ＢＴ  ４  Ｔ２７４Ｐ    配列：GTCCCCTTCCCACGTCTCCATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCACC
変異：ＡＣＣからＣＣＣ、ＴｈｒからＰｒｏ
ＭＡＳＡフォワード２プライマー変異：CTGGCTTTGCCCCTCTCC  温度：66.5℃
ＭＡＳＡフォワード２プライマー通常：CTGGCTTTGCCCCTCTCA  温度：65.2℃
ＭＡＳＡフォワード３プライマー変異：CCTGGCTTTGCCCCTCTCC  温度：70.7℃
ＭＡＳＡフォワード３プライマー通常：CCTGGCTTTGCCCCTCTCA  温度：69.6℃
ＭＡＳＡフォワード４プライマー変異：TGGCTTTGCCCCTCTCC  温度：64.7℃
ＭＡＳＡフォワード４プライマー通常：TGGCTTTGCCCCTCTCA  温度：63.3℃
ＭＡＳＡ  リバースプライマー：CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC  温度：77.0℃
生成物サイズ：１９８ｂｐ  ｖ．２および１９７ｂｐ  ｖ．３
【０１０７】
ＢＴ  ４  Ｔ２７４Ｉｌｅ    配列：GTCCCCTTCCCACGTCTCCATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCATC
変異：ＡＣＣからＡＴＣ、ＴｈｒからＩｌｅ                              実験温度
ＭＡＳＡフォワード２プライマー変異：TGGCTTTGCCCCTCTCAT  温度：64.6℃
ＭＡＳＡフォワード２プライマー通常：TGGCTTTGCCCCTCTCAC  温度：64.9℃
ＭＡＳＡフォワード３プライマー変異：CTGGCTTTGCCCCTCTCAT  温度：66.4℃  66℃
ＭＡＳＡフォワード３プライマー通常：CTGGCTTTGCCCCTCTCAC  温度：66.7℃  68〜69℃
ＭＡＳＡリバースプライマー：CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC  温度：77.0℃
生成物サイズ：１９８ｂｐ  ｖ．２および１９７ｂｐ  ｖ．３
【０１０８】
ＢＴ  ４  Ｖａｌ２９３Ａｓｐ    配列：GCAGTATCGAGCTCTCACAGTGCCGGAACTCACCCAGCAGGTC
変異：ＧＴＣからＧＡＣ、ＶａｌからＡｓｐ
ＭＡＳＡフォワードプライマー１変異：CGGAACTCACCCAGCAGGA  温度：67.6℃
ＭＡＳＡフォワードプライマー１通常：CGGAACTCACCCAGCAGGT  温度：66.7℃
ＭＡＳＡフォワードプライマー２変異：GGAACTCACCCAGCAGGA  温度：61.5℃
ＭＡＳＡフォワードプライマー２通常：GGAACTCACCCAGCAGGT  温度：60.6℃
ＭＡＳＡリバースプライマー：CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC  温度：77.0℃
生成物サイズ：１３８ｂｐ  ｖ．１および１３７  ｖ．２
【０１０９】
ＢＴ  ４  Ａ３６４Ｔ    配列：TCTGTGACATCCCACCTCGTGGCCTCAAGATGGCA
変異：ＧＣＡからＡＣＡ、ＡｌａからＴｈｒ
ＭＡＳＡフォワード１プライマー変異：CACCTCGTGGCCTCAAGATGA  温度：69.6℃
ＭＡＳＡフォワード１プライマー通常：CACCTCGTGGCCTCAAGATGG  温度：71.5℃
ＭＡＳＡフォワード２プライマー変異：ACCTCGTGGCCTCAAGATGA  温度：66.5℃
ＭＡＳＡフォワード２プライマー通常：ACCTCGTGGCCTCAAGATGG  温度：68.6℃
ＭＡＳＡリバースプライマー：CAGAGACGAGGTCGTTCATGTTGCT℃  温度：75.6℃
生成物サイズ：１９２ｂｐ  ｖ．１および１９１ｂｐ  ｖ．２
【０１１０】
ＢＴ  ４  Ｐ２６８Ｈ    配列：ATGGTCCCCTTCCCACGTCTCCATTTCTTTATGCCT
変異：ＣＣＴからＣＡＴ、ＰｒｏからＨｉｓ
ＭＡＳＡフォワード１プライマー変異：CACGTCTCCATTTCTTTATGCA  温度：65.1℃
ＭＡＳＡフォワード１プライマー通常：CACGTCTCCATTTCTTTATGCC  温度：66.2℃
ＭＡＳＡフォワード２プライマー変異：CCACGTCTCCATTTCTTTATGCA  温度：69.0℃
ＭＡＳＡフォワード２プライマー通常：CCACGTCTCCATTTCTTTATGCC  温度：70.0℃
ＭＡＳＡリバースプライマー：CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC  温度：77.0℃
生成物サイズ：２１８ｂｐ  ｖ．１および２１９ｂｐ  ｖ．２
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ヒトＭ４０βチューブリンｃＤＮＡのｃＤＮＡ配列のインフレーム翻訳を示す。タンパク質は最初の開始メチオニン残基から最初の停止残基まで伸長する。変異体アミノ酸は太字で示し、全ての可能性のある開始メチオニン残基および停止位置をイタリック体で示す。
【図２】βチューブリン遺伝子のｃＤＮＡ転写を示し、ここで、好適なプライマーはイタリック体の配列と結合し、変異体ヌクレオチド部位は太字で示す。
【図３】ＭＨ４０βチューブリン遺伝子の単位複製配列と、イタリック体で示すプライマーと結合する配列、下線を付したエキソン、そして通常の字体のイントロンを示す。
【図４】ＡＣ００６１６５のフラグメントに関する変異体の位置を示す。
【図１】
2008519588.tif 000003
【図２】
2008519588.tif 000004
【図３−１】
2008519588.tif 000005
【図３−２】
2008519588.tif 000006
【図３−３】
2008519588.tif 000007
【図３−４】
2008519588.tif 000008
【図３−５】
2008519588.tif 000009
【図３−６】
2008519588.tif 000010
【図３−７】
2008519588.tif 000011
【図３−８】
2008519588.tif 000012
【図４−１】
2008519588.tif 000013
【図４−２】
2008519588.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月5日(2007.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008519588000001.app
【国際調査報告】
2008519588.tif 000015
2008519588.tif 000016
2008519588.tif 000017
2008519588.tif 000018
2008519588.tif 000019
2008519588.tif 000020