(57)【要約】非修飾ブーゲニンタンパク質と比較した場合に、生物学的活性およびヒトT細胞を活性化する性向が低い修飾型のブーゲニンタンパク質が提供される。非修飾T細胞エピトープペプチドと比較して、ヒトT細胞を活性化する性向が低いブーゲニンのT細胞エピトープペプチド、および修飾T細胞エピトープペプチドもまた、提供される。癌に結合し、修飾ブーゲニンタンパク質に付着されるリガンドを含むサイトトキシンもまた、提供される。これらのサイトトキシンおよびヒトの癌を治療するための薬学的組成物を使用して、哺乳動物癌細胞を阻害または破壊する方法もまた、提供される。2008500811.tif 000033
2008500811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を活性化する性向が低い、修飾ブーゲニンタンパク質。
【請求項２】
T細胞を活性化する性向が低く、かつT細胞エピトープ中の1つまたは複数のアミノ酸残基で修飾されている、請求項1に記載の修飾ブーゲニン。
【請求項３】
以下からなる群より選択されるT細胞エピトープ中で1つまたは複数のアミノ酸残基が修飾されている、請求項2に記載の修飾ブーゲニン：
2008500811.tif 000027
。
【請求項４】
以下のようにX1、X2、X3、X4またはX5の1つまたは複数で修飾されており、X1〜X5は任意のアミノ酸であり得る、請求項3に記載の修飾ブーゲニン：
2008500811.tif 000028
。
【請求項５】
X1がTまたはAまたはQであり；
X2がGまたはAであり；
X3がQまたはGであり；
X4がNまたはDまたはTまたはAまたはRまたはQまたはEまたはGまたはHまたはKまたはSであり；かつ
X5がQまたはAである（SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10）、
請求項4に記載の修飾ブーゲニン。
【請求項６】
修飾ブーゲニンタンパク質のアミノ酸配列が
2008500811.tif 000029
を含み、X1〜X5は任意のアミノ酸であり得る、請求項1に記載の修飾ブーゲニンタンパク質。
【請求項７】
X1がTまたはAまたはQであり；
X2がGまたはAであり；
X3がQまたはGであり；
X4がNまたはDまたはTまたはAまたはRまたはQまたはEまたはGまたはHまたはKまたはSであり；かつ
X5がQまたはAである（SEQ ID NO:12）、
請求項6に記載の修飾ブーゲニン。
【請求項８】
以下の配列を有する、請求項1に記載の修飾ブーゲニンタンパク質：
2008500811.tif 000030
。
【請求項９】
（a）(b)に付着している、標的化部分；
（b）請求項1〜8のいずれか一項記載の修飾ブーゲニンタンパク質
を含む、サイトトキシン。
【請求項１０】
（a）(b)に付着している、癌細胞に結合するリガンド；
（b）請求項1〜8のいずれか一項記載の修飾ブーゲニンタンパク質
を含む、サイトトキシン。
【請求項１１】
リガンドが、癌細胞に結合する抗体または抗体フラグメントである、請求項10に記載のサイトトキシン。
【請求項１２】
抗体または抗体フラグメントが、癌細胞の表面上のEp-CAMに結合する、請求項11に記載のサイトトキシン。
【請求項１３】
Ep-CAMに結合する抗体または抗体フラグメントが、ヒトEp-CAMの細胞外ドメインに結合するヒト化抗体または抗体フラグメントであり、かつMOC-31抗体に由来する相補性決定領域配列を含む、請求項12に記載のサイトトキシン。
【請求項１４】
修飾ブーゲニンタンパク質に付着する癌結合リガンドの可変領域が4D5MOCBである、請求項12に記載のサイトトキシン。
【請求項１５】
SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含む、請求項14に記載のサイトトキシン。
【請求項１６】
抗体または抗体フラグメントが癌細胞の表面上の腫瘍関連抗原に結合する、請求項11に記載のサイトトキシン。
【請求項１７】
SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列を含む、請求項16に記載のサイトトキシン。
【請求項１８】
癌細胞を阻害または破壊するための医薬の製造における、請求項9〜17のいずれか一項記載のサイトトキシンの使用。
【請求項１９】
癌細胞が、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、膀胱癌、肝臓癌、腎臓癌、黒色腫、消化管癌、前立腺癌、小細胞および非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞およびB細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項18に記載の使用。
【請求項２０】
癌を治療するための医薬の製造における、請求項9〜17のいずれか一項記載のサイトトキシンの使用。
【請求項２１】
癌が、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、膀胱癌、肝臓癌、腎臓癌、黒色腫、消化管癌、前立腺癌、小細胞および非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞およびB細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
請求項9〜17のいずれか一項記載のサイトトキシン、および薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
以下の工程を含む、癌を有する動物を治療するための医薬を調製するプロセス：
（a）ブーゲニンのT細胞エピトープを同定する工程；
（b）T細胞を活性化する性向が低い修飾ブーゲニンを調製するために、T細胞エピトープ中の1つまたは複数のアミノ酸残基を修飾する工程；
（c）修飾ブーゲニンに付着した癌結合リガンドを有するサイトトキシンを調製する工程；および
（d）薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤中に該サイトトキシンを懸濁する工程。
【請求項２４】
癌が、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、膀胱癌、肝臓癌、腎臓癌、黒色腫、消化管癌、前立腺癌、小細胞および非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞およびB細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項23に記載のプロセス。
【請求項２５】
請求項1〜8のいずれか一項記載の修飾ブーゲニンをコードする核酸分子。
【請求項２６】
請求項9〜17のいずれか一項記載のサイトトキシンをコードする核酸分子。
【請求項２７】
以下の配列を有するT細胞エピトープペプチド：
2008500811.tif 000031
。
【請求項２８】
X1、X2、X3、およびX4の少なくとも1つが、Rなどの非修飾配列から、以下のように修飾される：
X1がTまたはAまたはQであり；
X2がGまたはAであり；
X3がQまたはGであり；かつ
X4がNまたはDまたはTまたはAまたはRまたはQまたはEまたはGまたはHまたはKまたはSである、
AKX1DRKX2LX3LGVX4K
を含む修飾配列（SEQ ID NO:8）を有する、請求項27に記載のT細胞エピトープペプチド。
【請求項２９】
X4がNまたはDまたはTまたはAまたはRまたはQまたはEまたはGまたはHまたはKまたはSである、
LGVX4KLEFSIEAIHG
を含む修飾配列（SEQ ID NO:9）を有する、請求項27に記載のT細胞エピトープペプチド。
【請求項３０】
X5がQまたはAである、
NGQEX5AKFFLIVIQM
を含む修飾配列（SEQ ID NO:10）を有する、請求項27に記載のT細胞エピトープペプチド。
【請求項３１】
請求項27〜30のいずれか一項記載のT細胞エピトープペプチドをコードする核酸配列分子。
【請求項３２】
70位のチロシン残基が修飾されている、修飾ブーゲニンタンパク質。
【請求項３３】
チロシンがアラニンで置換されている、請求項32に記載の修飾ブーゲニンタンパク質。
【請求項３４】
以下の配列を有する、請求項33に記載の修飾ブーゲニンタンパク質：
2008500811.tif 000032
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾ブーゲニンタンパク質および癌に対する治療剤として有用であるこの修飾タンパク質を含むサイトトキシンに関する。具体的には、T細胞エピトープは、ブーゲニントキシンの免疫原性を低下させるように除去または改変されている。
【背景技術】
【０００２】
治療タンパク質の効力が、治療タンパク質への望ましくない免疫反応によって限定される多くの例が存在する。いくつかのマウスモノクローナル抗体は、多数のヒト疾患事例における治療として見込みを示したが、しかし、特定の場合において、有意な程度のヒト抗マウス抗体（HAMA）の誘導に起因して失敗した［Schroff, R. W. et al (1985) Cancer Res. 45 : 879-885; Shawler, D. L. et al (1985) J. Immunol. 135 : 1530-1535］。モノクローナル抗体については、HAMA応答を低下させる試みにおいて多数の技術が開発されてきた［WO89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO91/06667］。これらの組換えDNAアプローチは、一般的に、最終抗体構築物中のヒトの遺伝情報を増加しながら、この最終抗体構築物中のマウスの遺伝情報を減少している。それにも関わらず、得られる「ヒト化」抗体は、いくつかの場合において、なお、患者における免疫応答を誘発してきた［Issacs J.D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P.R. et al (1999) Transplantation 68: 1417-1420］。
【０００３】
免疫応答の誘導に対する鍵は、MHCクラスII分子上での提示を介するT細胞の活性を刺激することができるペプチド、いわゆる「T細胞エピトープ」のタンパク質中での存在である。このようなT細胞エピトープは、MHCクラスII分子に結合する能力を有する任意のアミノ酸残基配列として、一般的に定義される。暗黙のうちに、「T細胞エピトープ」は、MHC分子に結合したときに、T細胞レセプター（TCR）によって認識されることができ、少なくとも原理的には、T細胞応答を促進するためにTCRと連動することによって、これらのT細胞の活性化を引き起こすことができるエピトープを意味する。
【０００４】
MHCクラスII分子は、ヘルパーT細胞選択および活性化において中心的な役割を果たす高度に多型性のタンパク質の群である。ヒト白血球抗原群DR（HLA-DR）は、このタンパク質の群の優勢なアイソタイプである。しかし、アイソタイプHLA-DQおよびHLA-DPは同様の機能を行う。ヒト集団において、個体は、2〜4個のDR対立遺伝子、2個のDQおよび2個のDP対立遺伝子を有する。多数のDR分子の構造が解明されており、これらは、ペプチドの疎水性残基（ポケット残基）を係合する多数の疎水性ポケットを有する開口的なペプチド結合溝として現れる［Brown et al (1993) Nature 364: 33; Stern et al (1994) Nature 368: 215］。クラスII分子の異なるアロタイプを同定する多型は、ペプチド結合溝内でのペプチドについての異なる結合表面の広範な多様性に寄与し、および集団レベルにおいては、外来性タンパク質を認識し、かつ病原性生物に対する免疫応答を開始する能力に関する最大限の柔軟性を保証する。
【０００５】
治療タンパク質に対する免疫応答は、MHCクラスIIペプチド提示経路を介して進行する。ここで、外因性タンパク質が包み込まれ、DR、DQ、またはDP型のMHCクラスII分子と関連した提示のために処理される。MHCクラスII分子は、とりわけ、マクロファージおよび樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞（APC）によって発現される。T細胞の表面上のコグネートT細胞レセプターによるMHCクラスIIペプチド複合体の係合は、CD4分子などの特定の他のコ-レセプターの架橋結合とともに、T細胞中での活性化状態を誘導することができる。活性化によって、B細胞などの他のリンパ球をさらに活性化するサイトカインが放出され、完全な細胞免疫応答として、抗体または活性化Tキラー細胞を産生される。
【０００６】
T細胞エピトープの同定は、WO98/52976; WO00/34317; WO02/069232; WO02/079232; およびWO02/079415において認識されるように、エピトープ排除のための最初の段階である。これらの教示において、予測されたT細胞エピトープは、関心対象のタンパク質中での慎重なアミノ酸置換の使用によって除去される。コンピュータ技術に加えて、MHCクラスII分子を結合する合成ペプチドの能力を測定するためのインビトロ方法が存在する。例示的な方法は、MHCクラスII結合表面の供給源として、規定されたMHCアロタイプのB細胞系統を使用し、これはMHCクラスIIリガンド同定に適用されてもよい［Marshall K.W. et al. (1994) J. Immunol. 152: 4946-4956; O'Sullivan et al (1990) J. Immunol. 145: 1799-1808; Robadey C. et al (1997) J. Immunol 159 :3238-3246］。しかし、このような技術は、MHCアロタイプの広範な多様性に対する複数の潜在的なエピトープのスクリーニングのためには適合されず、これらはまた、T細胞エピトープとして機能する結合ペプチドの能力を確認することもできない。
【０００７】
合成ペプチドと組み合わせた組換えMHC分子の可溶性複合体を開発する技術もまた、使用されるようになってきた［Kern, F. et al (1998) Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W.W. et al (2001) TRENDS in Immunol. 22 :583-588］。これらの試薬および手順は、特定のMHCペプチド複合体を結合することが可能であり、かつMHCアロタイプの広範な多様性に対して複数の潜在的なエピトープをスクリーニングために適合されていない、ヒトまたは実験用動物の対象からの末梢血試料からのT細胞クローンの存在を同定するために使用される。
【０００８】
T細胞活性化の生物学的アッセイは、免疫応答を誘発する試験ペプチド/タンパク質配列の能力の読み取りを与えるための実用的なオプションを提供する。この種のアプローチの例には、細菌タンパク質スタフィロキナーゼに対するT細胞増殖アッセイ、続いてT細胞系統を刺激するために合成ペプチドを使用するエピトープマッピングを使用するPetraらの研究［Petra, A.M. et al (2002) J. Immunol. 168: 155-161］が含まれる。同様に、破傷風毒素タンパク質の合成ペプチドを使用するT細胞増殖アッセイは、毒素の免疫優性エピトープ領域の決定を生じた［Reece J.C. et al (1993) J. Immunol. 151: 6175-6184］。WO99/53038は、それによって、試験タンパク質中のT細胞エピトープが、ヒト免疫細胞の単離されたサブセットを使用して決定され得、関心対象の合成ペプチドの存在下で、インビトロでのそれらの分化および細胞の培養、ならびに培養されたT細胞における任意の誘導された増殖の測定を促進するアプローチを開示する。同じ技術はまた、Sticklerら［Stickler,M.M. et al (2000) J. Immunotherapy 23: 654-660］によって記載されており、ここで、両方の例において、この方法は、細菌スブチリシン中のT細胞エピトープの検出に適用される。このような技術は、所望の免疫細胞のサブセット（樹状細胞、CD4+およびまたはCD8+ T細胞）を得るために、細胞単離技術の注意深い適用および複数のサイトカイン補充物を有する細胞培養を必要とし、複数のドナー試料を使用する迅速スループットスクリーニングにはつながらない。
【０００９】
最近、集団ベースのT細胞増殖アッセイ、およびエピトープ欠失タンパク質の設計においてペプチドMHC結合のインシリコシミュレーションを使用する組み合わせアプローチもまた、進歩してきた［WO03/104803］。
【００１０】
上記に記載したように、およびその結果として、原理的には治療的に価値があるが、もともと免疫原性であるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質からT細胞エピトープを同定および取り除き、または少なくとも低下させることが所望される。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要旨
本発明は、ヒトにおける治療的意図を持って導入される可溶性タンパク質が、可溶性タンパク質に結合する宿主抗体の発生を生じる免疫応答の引き金を引くことができるという実用上の現実を克服するために着想される。本発明は、免疫応答を誘発する性向が低い、ブーゲニンタンパク質を提供することによって、このことに取り組むことを追求する。本明細書に記載される方法に従って、本発明者らは、このタンパク質に対する免疫応答を駆動する決定的なT細胞エピトープを含むブーゲニン分子の領域を同定した。
【００１２】
本発明は、免疫応答を誘発する性向が低い、修飾ブーゲニンに関する。好ましい態様において、修飾ブーゲニンは、T細胞を活性化する性向が低く、かつT細胞エピトープ中の1つまたは複数のアミノ酸残基で修飾されている。このT細胞エピトープは、
2008500811.tif 000003
からなる群より好ましく選択される。
【００１３】
本発明はまた、本発明の修飾ブーゲニンタンパク質に付着した標的化部分を含むサイトトキシンに関する。1つの態様において、この標的化部分は、癌細胞に結合するリガンドである。さらなる態様において、このリガンドは、癌細胞に結合する抗体または抗体フラグメントである。特定の態様において、この抗体は、Ep-CAMまたは腫瘍関連抗原を認識する。最も特定の態様において、本発明は、VB6-845またはVB6-011を含むサイトトキシンを提供する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、癌細胞に本発明のサイトトキシンを投与する工程を含む、癌細胞を阻害または破壊する方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、その必要がある動物に、本発明のサイトトキシンを投与することによって癌を治療する方法に関する。
【００１６】
なおさらに、ブーゲニンのT細胞エピトープを同定する工程、T細胞を活性化する性向が低い、修飾ブーゲニンを調製するためにT細胞エピトープ中で1つまたは複数のアミノ酸残基を修飾する工程；修飾ブーゲニンに付着された癌結合リガンドを有するサイトトキシンを調製する工程；および薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤中にサイトトキシンを懸濁する工程を含む、癌を有する動物を治療するための医薬を調製するためのプロセスが提供される。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、本発明のサイトトキシンおよび薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む、癌を治療するための薬学的組成物を提供する。
【００１８】
本発明のサイトトキシン、組成物および方法は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、膀胱癌、消化管癌、前立腺癌、小細胞および非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞およびB細胞リンパ腫などの様々な形態の癌を治療するために使用することができる。
【００１９】
本発明はまた、ブーゲニンタンパク質のT細胞エピトープペプチドおよび本発明の修飾T細胞エピトープペプチドを提供する。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、本発明の精神および範囲内での種々の変更および改変が詳細な説明から当業者には明らかであるので、この詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示によってのみ与えられることが理解されるべきである。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明者らは、ブーゲニンにおいて同定されたT細胞エピトープを同定し、ならびに非修飾ブーゲニンタンパク質と比較して、ヒトT細胞を活性化する性向が低い、修飾ブーゲニンタンパク質を設計および作製した。
【００２２】
（A）修飾ブーゲニンタンパク質
本発明は、非修飾ブーゲニンタンパク質と比較して、免疫応答、好ましくはT細胞応答を誘発する性向が低いためにブーゲニンが修飾された、修飾ブーゲニンタンパク質に関する。成熟ブーゲニンタンパク質は、約26,200 Daの分子量を有する250アミノ酸の単一ポリペプチドである［DenHartog et al (2002) Eur.J. Biochem. 269: 1772-1779; 米国特許第6,680,296号］。ブーゲニンは、植物、ブーゲンビリア  スペクタビリス  ウィルド（Bougainvillea spectabilis Willd）からもともと単離された1型リボソーム不活性化タンパク質（RIP）である［Bolognesi et al (1997) Planta 203: 422-429］。植物からのRIPは、細胞の主要なリボソームRNAを脱プリン化するRNA N-グリコシダーゼであり、それによって、リボソームに損傷を与え、タンパク質合成の停止および細胞死をもたらす。
【００２３】
成熟ブーゲニンタンパク質のアミノ酸配列（一文字コードで示される）は、
2008500811.tif 000004
である。
【００２４】
「非修飾ブーゲニンタンパク質」という用語は、ブーゲニン蛋白質の免疫応答を誘発する性向を、低下させるために修飾されていない、ブーゲニンタンパク質を意味する。野生型または非修飾ブーゲニンの配列は、SEQ ID NO:1に示される。しかし、当業者は、このような修飾が免疫応答を誘発する性向を低下させない限りは、「非修飾ブーゲニンタンパク質」という用語はまた、SEQ ID NO:1に修飾を含むことを認識する。SEQ ID NO:1に作製することができる修飾の例には、ペプチドフラグメントおよびタンパク質の免疫原性を低下させない保存性アミノ酸置換が含まれる。
【００２５】
「修飾ブーゲニンタンパク質」という用語は、非修飾ブーゲニンタンパク質（前記）と比較して、修飾されているブーゲニンタンパク質を意味し、ここで、該修飾は、免疫応答を誘発するブーゲニンの性向を低下させる。修飾ブーゲニンタンパク質はまた、脱免疫ブーゲニンと呼ばれ得る。「修飾ブーゲニンタンパク質」は、非修飾ブーゲニンタンパク質の全長配列または修飾フラグメントであり得る。「修飾ブーゲニンタンパク質」はまた、ペプチドの免疫原性を変化させない、野生型ブーゲニン配列と比較して他の変化を含んでもよい。修飾ブーゲニンタンパク質は、好ましくは、非修飾ブーゲニンタンパク質と同じ生物学的活性を有する。
【００２６】
「免疫応答を誘発する性向の低下」という用語は、本願明細書において、修飾ブーゲニンタンパク質が非修飾ブーゲニンよりも低い免疫原性であることを意味する。
【００２７】
「免疫応答」という用語は、細胞性と体液性の両方の免疫応答を含む。好ましい態様において、修飾ブーゲニンは、T細胞を活性化する性向が低い。
【００２８】
「ヒトT細胞を活性化する性向の低下」という用語は、本願明細書において、修飾ブーゲニンタンパク質が、非修飾ブーゲニンタンパク質と比較して、ヒトT細胞を活性化する性向が低いことを意味する。当業者は、修飾ブーゲニンが、タンパク質の刺激インデックスを評価することを含む当技術分野において公知であるアッセイ法を使用して、T細胞を活性化する性向が低いか否かを試験することができる。
【００２９】
「刺激インデックス」は、本願明細書において、ヒトT細胞を活性化する修飾ブーゲニンタンパク質または非修飾ブーゲニンタンパク質の能力の尺度をいう。例えば、修飾ブーゲニンタンパク質または非修飾ブーゲニンタンパク質、またはそのペプチドを、インビトロで培養されたヒトT細胞中で、増殖応答を誘発するそれらの能力について試験することができる。この型のアプローチが、健常ドナーから取られた未処置のヒトT細胞を使用して行われる場合、本発明者らは、このようなアッセイの操作において、2.0以上の刺激インデックスが、誘導された増殖の有用な尺度であることを確立した。この刺激インデックスは、通常、試験ペプチドに対して測定された増殖スコア（例えば、3H-チミジン取り込みを使用する場合には、1分間あたりの放射能の計数）の、試験ペプチドと接触されていない細胞中で測定されたスコアによる除算によって導き出される。
【００３０】
1つの態様において、本発明は、生物学的活性を有し、かつ非修飾ブーゲニンタンパク質と比較して、ヒトT細胞を活性化する性向が低い修飾ブーゲニンタンパク質を提供する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、非修飾ブーゲニンタンパク質と比較してヒトT細胞を活性化する性向が低く、かつ非修飾ブーゲニンタンパク質よりも低い生物学的活性を有する修飾ブーゲニンタンパク質を提供する。なお別の態様において、本発明は、ヒトT細胞を活性化する性向が低く、かつ生物学的活性を有さない修飾ブーゲニンタンパク質を提供する。このような修飾タンパク質は、例えば、アッセイにおける対照として、または被験体を寛容化するために使用することができる。
【００３２】
「生物学的活性」は、本願明細書において、修飾ブーゲニンタンパク質または非修飾ブーゲニンタンパク質の、リボソーム上でのタンパク質合成の阻害能力として用いられ、多くの方法で評価することができる。修飾ブーゲニンタンパク質は、たとえ生物学的活性が非修飾タンパク質より低くても、このような活性をなお有するが、検出可能な、ある程度のレベルの活性を有する必要はないことが注目されるべきである。例えば、修飾ブーゲニンタンパク質または非修飾ブーゲニンタンパク質の生物学的活性は、N-グリコシダーゼ活性の同定によって、特に、タンパク質翻訳の有意な阻害を提供するための十分な活性によって、評価することができる。1つのこのような適切なアッセイには、無細胞タンパク質合成アッセイにおける非修飾ブーゲニンと比較して、改変体ブーゲニンタンパク質の活性を試験することが含まれる。メチオニン、レポータータンパク質ルシフェラーゼをコードするDNA、ならびに修飾ブーゲニンタンパク質および非修飾ブーゲニンタンパク質の段階希釈が、同時インキュベートされる。翻訳されたルシフェラーゼのレベルは、基質試薬の添加後に発光カウンターを使用して容易に検出される。測定された発光は、反応中に存在するブーゲニンN-グリコシダーゼ活性に逆比例する。通常、例えば、Y70A置換を含む、不活性ブーゲニンタンパク質などの陰性対照が提供される。
【００３３】
好ましい態様において、修飾ブーゲニンペプチドは、ブーゲニンタンパク質配列中で、1つまたは複数のT細胞エピトープで修飾される。
【００３４】
「T細胞エピトープ」という用語は、T細胞を刺激することが可能であり、および/またはMHCクラスIIと複合体形成したT細胞を結合可能である（測定可能に活性化する必要はない）、主要組織適合複合体（MHC）クラスIIを結合可能であるアミノ酸配列を意味する。
【００３５】
1つの局面において、修飾T細胞エピトープを含む修飾ブーゲニンタンパク質をもたらす本発明において使用され得る一般的方法は、以下の工程を含む：
（i）タンパク質のアミノ酸配列またはその一部を同定する工程；
（ii）インビトロもしくはインシリコ技術または生物学的アッセイを使用する、MHC分子へのペプチドの結合の決定などの方法によって、タンパク質のアミノ酸配列中の1つまたは複数の潜在的なT細胞エピトープを同定する工程；
（iii）インビトロもしくはインシリコ技術または生物学的アッセイを使用する、MHC分子へのペプチドの結合によって決定されるような、T細胞エピトープの活性を実質的に低下または除去するような方法で、同定された修飾された潜在的なT細胞エピトープ中で1つまたは複数のアミノ酸を有する新規な配列を設計する工程であって、このような配列変異体が、新規の可能性のあるT細胞エピトープを生成しないような方法で、作製される（ただし、このような新規の可能性のあるT細胞エピトープが、順々に、T細胞エピトープの活性を実質的に減少あるいは除去するような方法で修飾される場合を除く）、工程；
（iv）周知の組換え技術に従って、所望の特性を有する1つまたは複数の改変体を同定するために、組換えDNA技術によってこのような配列改変体を構築し、および該改変体を試験する工程；ならびに
（v）任意に、工程（ii）〜（iv）を反復する工程。
【００３６】
1つの例において、工程（iii）は、非修飾ブーゲニンタンパク質中のT細胞エピトープのいずれかにおけるアミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって実行される。別の例において、修飾ブーゲニンタンパク質を作製するための方法は、相同タンパク質配列に対する参照、および/またはインシリコモデリングを用いて作製される。
【００３７】
工程（ii）に従う潜在的なT細胞エピトープの同定は、以前に当技術分野において記載された方法に従って実行することができる。適切な方法は、WO98/59244; WO98/52976; WO00/34317; WO02/069232において開示されており、MHCクラスII分子へのブーゲニン由来ペプチドの結合性向を同定するために使用されてもよい。生物学的に関連するペプチドを同定するために、本発明者らは、エクスビボのヒトT細胞増殖アッセイを利用するアプローチを開発した。このアプローチは特に有効な方法であることが判明し、全体のブーゲニン配列をスキャンおよび試験するためのスキームにおいて、重複しているブーゲニン由来ペプチド配列を試験することを含んだ。合成ペプチドは、インビトロで培養されたヒトT細胞において増殖応答を誘発するそれらの能力について試験される。この型のアプローチが健常ドナーから取られた未処置のヒトT細胞を使用して行われる場合、本発明者らは、このようなアッセイの操作において、2.0以上の刺激インデックスが、誘導された増殖の有用な尺度であることを確立した。この刺激インデックスは、試験ペプチドに対して測定された増殖スコア（例えば、3H-チミジン取り込みを使用する場合には、1分間あたりの放射能の計数）の、試験ペプチドと接触されていない細胞中で測定されたスコアによる除算によって簡便に誘導される。
【００３８】
従って、本研究において、89個の15マーペプチド（表1に列挙される）が、未処置ドナー（すなわち、ブーゲニンに対する既知の感作がない）からのPBMC（末梢血単核細胞）を用いるT細胞増殖アッセイにおいて使用された。20ドナーのPBMC試料が、MHCクラスIIアロタイプの最適な範囲を達成するために選択された。PBMCは、増殖が3H-チミジン取り込みによって評価される７日前に、3連の培養で個々のペプチドを用いて刺激された。すべてのペプチドは、2つの異なる濃度：1μMおよび5μMで希釈された。刺激インデックス（SI）は、にせの刺激対照に取り込まれた3Hの量で除算した、細胞中に取り込まれた3Hの量として計算された。
【００３９】
この方法は、ヒトにおけるブーゲニン分子の大部分の免疫原性領域を同定した。従って、特定の態様において、修飾ブーゲニンタンパク質は、以下からなる群より選択されるT-細胞エピトープ中の１つまたは複数のアミノ酸残基で修飾される：
2008500811.tif 000005
。
【００４０】
これらのT細胞エピトープは、2つ以上のドナーPBMC試料中でSI>2を与えることに基づいて同定されてきた。上記に開示されたペプチド配列は、これらのエピトープの1つまたは複数が損なわれている修飾ブーゲニンタンパク質の構築のために必要である決定的な情報を提示する。
【００４１】
本発明の1つの態様において、本発明の修飾ブーゲニンタンパク質は、除外された少なくとも1つのT細胞エピトープを有する。別の態様において、本発明の修飾ブーゲニンタンパク質は、除外された1つ、2つまたは3つのT細胞エピトープを有する。本発明はまた、好ましくはT細胞エピトープ中で、1〜9個のアミノ酸残基が修飾されている、修飾ブーゲニンタンパク質を意図する。別の態様において、1〜5個の残基が修飾されている。「修飾」という用語は、本明細書で使用されるように、アミノ酸残基が、置換、付加または欠失によって、好ましくは置換によって修飾され、しかしブーゲニンタンパク質はヒトT細胞を活性化する性向が低いことを意味する。別の態様において、修飾タンパク質は生物学的活性を有する。より好ましくは、本発明の修飾ブーゲニンタンパク質は、上記の（a）、（b）または（c）において特定されるアミノ酸のいずれかに対応する位置での置換によって修飾される。
【００４２】
本発明の1つの態様は、エピトープR1〜R3のいずれかにおいて同定されたMHCクラスIIリガンドが、例えば、結合を除外するか、またはさもなくばペプチドが結合できるMHCアロタイプの数を減少するように修飾されるブーゲニンタンパク質を含む。結合を除外するか、またはさもなくばペプチドが結合できるMHCアロタイプの数を減少するためのR1〜R3領域におけるアミノ酸は、置換、付加または欠失によって修飾することができる。
【００４３】
T細胞エピトープの除外のために、アミノ酸置換が、T-細胞エピトープの活性の実質的な低下または除去を達成するために予測されたペプチド配列中での適切な点で作製される。実際上、適切な点は、1つの態様において、MHCクラスII結合溝中に提供されるポケットの1つの中で結合するにアミノ酸残基に一致する。
【００４４】
1つの態様において、いわゆるP1における間隙第1のポケット、すなわちペプチドのP1アンカー位置における結合が修飾される。ペプチドのP1アンカー残基とMHCクラスII結合溝の第1のポケットの間の結合相互作用の品質は、全体のペプチドについての全体的な結合親和性の主要な決定であるように認識される。ペプチドのこの位置における適切な置換は、ポケット内でより容易に適合されない残基のためであり、例えば、より親水性残基への置換である。MHC結合間隙中の他のポケット領域中の結合に一致する位置におけるペプチド中のアミノ酸残基もまた考慮され、本発明の範囲内にある。
【００４５】
所定のT細胞エピトープ中の単一のアミノ酸置換、欠失または付加は、エピトープがそれによって除去されてもよい、好ましい経路であることが理解される。単一のエピトープ中の修飾の組み合わせ（すなわち、置換、欠失および付加）が意図されてもよく、例えば、エピトープ領域R1およびR2が5残基重複する今回の場合のように、個々に定義されるエピトープが互いに重複する場合に特に適切であり得る。さらに、所定のエピトープ中でまたは単一のエピトープ中で組み合わせた単一のアミノ酸修飾は、MHCクラスII結合溝に関して「ポケット残基」に一致しない位置において、しかしペプチド配列中の任意の位置において作製されてもよい。修飾は、当技術分野において公知であるインシリコ技術を使用して産生される相同体構造または構造的方法を参照して作製されてもよく、本発明に従う分子の公知の構造的特徴に基づいてもよい。このようなすべての修飾は本発明の範囲内にある。
【００４６】
ブーゲニンのエピトープ領域R1〜R3を、それらのそれぞれの配列中に含まれるMHCクラスIIリガンドを示すために分析した。WO 98/59244およびWO 02/06232に概説されるスキームを利用するソフトウェアツールを、この分析のために使用した。このソフトウェアは、任意の所定のペプチド配列についての結合スコアを提供するために、ペプチドMHCクラスII結合相互作用のレベルで抗原提示のプロセスをシミュレートする。このようなスコアは、集団中の優勢に存在するMHCクラスIIアロタイプの多くについて決定される。このスキームが任意のペプチド配列を試験することが可能であるので、MHCクラスII結合溝と相互作用するペプチドの能力に関する、アミノ酸置換、付加または欠失の結果は予測することができる。結果として、MHCクラスIIと相互作用可能であるペプチドの数の減少を含む新規な配列組成が設計可能であり、それによって、免疫原性T細胞エピトープとして機能する。
【００４７】
このスキーム下で、エピトープ領域R1中の本発明の1つの態様において、置換は、V123位、D127位、および/またはE129位における変化を含む。同様に、エピトープ領域R2については、1つの態様において、置換は、Y133位においてである。この残基は、R1とR2の間の重複の領域に入るが、Y133における置換は、R2関連MHCクラスIIリガンドを除去するために十分であり、かつR1関連MHCクラスIIリガンドを除去するためにそれ自体十分ではない。エピトープ領域R3については、本発明の1つの態様において、置換は、残基E151、および/またはI152に対してである。
【００４８】
すべての例において、置換は、1つまたは複数の代替的なアミノ酸残基に対してである。MHC IIシミュレーション（stimulation）ソフトウェアを用いるR1の分析は、アミノ酸残基123、127、129および131が、MHC II分子への結合についてこのエピトープ中で鍵となる残基であることを示した。残基123は、R1領域の変異のために好ましい部位である。なぜなら、これは、活性部位から離れた、分子の表面上にあり、かつRIP配列アラインメントにおいて変動可能であるからである。それにも関わらず、すべての置換が活性な分子を生じるわけではなく、生物活性アッセイにおける変異を確証する必要性があるわけではない。従って、例えば、R1中での置換V123T、V123AおよびV123Qは、好ましい代替的置換の例である。残基131は、RIP中で絶対的に保存されていることが見い出され、従って、変異のために適切であることはありそうにない。残基127および129は、高度には保存されていないが、制限された数の残基のみが、MHC II結合に対して影響を有することが見い出された。置換のセット：D127G、D127A、E129QおよびE129Gもまた、好ましい置換である。R2は、残基133は、これがRIPにわたって高度には保存されておらず、これを変異のために良好な候補にしているという事実と合わせて、MHC II結合およびその見かけの表面局在化（モデリングによって決定されるような）を消滅させるための可能性のある候補であることが示された。好ましい代替的な置換は、Y133N、Y133T、Y133A、Y133R、Y133D、Y133E、Y133Q、Y133G、Y133K、Y133HおよびY133Sであることが見い出された。R3については、アミノ酸残基152、155および158は、MHC II結合についての鍵となる残基として同定された。しかし、残基155および158は、高度に保存された疎水性ストレッチの一部であり、従って、それらの変異が、生物活性分子を生じないことを示唆する。保存性の乏しい残基は、より可能性のある候補であることが見い出された。R3については、置換セット：I152QおよびI152Aはまた、好ましい置換である。
【００４９】
従って、本発明は、以下のようにX1、X2、X3、X4またはX5の1つまたは複数で修飾されている修飾ブーゲニンを提供する：
2008500811.tif 000006
ここで、X1からX5は任意のアミノ酸であり得る。
【００５０】
特定の態様において、X1はTまたはAまたはQであり；X2はGまたはAであり；X3はQまたはGであり；X4はNまたはDまたはTまたはAまたはRまたはQまたはEまたはGまたはHまたはKまたはSであり；かつX5はQまたはAである（エピトープ領域R1、SEQ ID NO:8；エピトープ領域R2、SEQ ID NO:9；エピトープ領域R3、SEQ ID NO:10）。
【００５１】
まとめると、最も好ましい置換セットは、エクスビボT細胞アッセイ、インシリコMHCペプチド結合シミュレーションおよび配列相同性分析からの構造的考慮を使用する、免疫原性エピトープマッピング研究に基づいてコンパイルされ得る。最後に、生物活性タンパク質が好ましい場合、次いで、インビトロ活性アッセイは、1つまたは複数の変異を含んでもよい修飾タンパク質上で実行することができる。
【００５２】
従って、別の態様において、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む、修飾ブーゲニンペプチドを提供する：
2008500811.tif 000007
ここで、X1からX5は任意のアミノ酸であり得る（SEQ ID NO: 11）。
【００５３】
好ましい態様において、X1はTまたはAまたはQであり；X2はGまたはAであり；X3はQまたはGであり；X4はNまたはDまたはTまたはAまたはRまたはQまたはEまたはGまたはHまたはKまたはSであり；かつX5はQまたはAである（SEQ ID NO: 12）。
【００５４】
特定の態様において、修飾ブーゲニンタンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む：
2008500811.tif 000008
【００５５】
なお別の態様において、修飾ブーゲニンタンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む：
2008500811.tif 000009
下線を付した残基は、非修飾ブーゲニンタンパク質とは異なる置換された残基である。
【００５６】
当業者には修飾の複数の代替セットが、望ましくないエピトープを除去する目的を達成する点に到達することができることが明らかである。しかし、得られる配列は、本明細書で開示される特定のタンパク質と広範な相同性を保持し、したがって、本明細書の範囲に含まれる。本発明によって開示された配列に対する明確な化学的等価物もまた、本発明の範囲内にあることが意図される。このような等価物は、実質的に同じ方法で、実質的に同じ機能を実行するタンパク質を含む。
【００５７】
別の態様において、本発明の修飾ブーゲニンタンパク質は、本発明のT細胞エピトープ中に1個、2個、3個、4個、5個またはそれ以上のアミノ酸修飾を有する。
【００５８】
さらなる態様において、本発明の修飾ブーゲニンタンパク質は、T細胞アッセイにおいて試験されたときに、非修飾ブーゲニンタンパク質と比較して、刺激インデックスの低下を誘発する。
【００５９】
本発明のさらなる態様において、ブーゲニンタンパク質のT細胞エピトープは、T細胞アッセイを使用してマッピングされ、次いで、T細胞アッセイにおける再試験の際に、修飾ブーゲニンタンパク質が、非修飾ブーゲニンタンパク質よりも低い刺激インデックス、好ましくは2.0より低い刺激インデックスを誘発するように修飾される。
【００６０】
修飾ブーゲニンタンパク質が実質的に生物学的活性を低下するか、または生物学的活性を有さない場合、修飾ブーゲニンタンパク質の生物学的活性を回復するために、アミノ酸残基の置換、付加または欠失によるさらなる修飾が必要とされるかもしれないことは当業者には明白である。しかし、実質的に低下した生物学的活性を有するか、または生物学的活性を有さないこのような修飾ブーゲニンタンパク質は、なお、本発明の範囲に含まれ、アッセイにおける対照として、または被験体を寛容化するための有用性を有する。
【００６１】
1つの態様において、修飾ブーゲニンは、70位のチロシン残基で変異され、不活性ブーゲニンを生じる。特定の態様において、70位のチロシン残基はアラニンで置き換えされる。好ましい態様において、修飾ブーゲニンは以下の配列を有する：
2008500811.tif 000010
。
【００６２】
本発明のスキームの下で、エピトープは、T-細胞エピトープとして機能することがもはや可能ではない配列を生じる変異によって損なわれる。標的配列の方向付けされた変異誘発を達成するために組換えDNA法を使用することが可能であり、多くのこのような技術が利用可能であり、かつ当技術分野において周知である。実際に、多数の修飾ブーゲニンタンパク質が産生され、所望の免疫応答および機能的な特性について試験される。意図された変化が新たな免疫学的エピトープを導入しないことが、タンパク質配列に修飾を導く際に特に重要である。この事象は、エピトープおよび/またはMHC-クラスIIリガンドの存在について、任意の適切な手段によって、意図された配列を再試験することによって実際に回避される。
【００６３】
本発明の修飾ブーゲニンタンパク質はまた、「ペプチド模倣物」を含むか、またはそれを得るようにもしくはそれを設計するように使用されてもよい。「ペプチド模倣物」は、分子間の相互作用においてペプチドの代わりの置換として働く構造である（概説として、Morgan et al (1989), Ann. Reports Med.Chem. 24: 243-252を参照されたい）。ペプチド模倣物は、アミノ酸および/またはペプチド結合を含んでもよいし、含まなくてもよい合成構造を含むが、生物学的活性およびヒトT細胞を活性化する性向の低下を含む本発明の構造的および機能的な特徴のタンパク質を保持する。ペプチド模倣物はまた、ペプトイド、オリゴペプトイドを含む（Simon et al (1972) Proc. Natl. Acad, Sci USA 89:9367）。
【００６４】
ペプチド模倣物は、Dアミノ酸によるL-アミノ酸の体系的な置き換え、異なる電子的特性を有する基を伴う側鎖の置き換え、およびアミド結合置き換えによる、ペプチド結合の体系的な置き換えによって得られた情報に基づいて設計されてもよい。局所的なコンホメーションの制約はまた、候補のペプチド模倣物の活性のためのコンホメーション的な要求を決定するために導入され得る。これらの模倣物は、逆方向ターンコンホメーションを安定化または促進するため、および分子の安定化を補助するために、イソステリックアミド結合、またはD-アミノ酸を含んでもよい。環状アミノ酸アナログは、アミノ酸残基を特定のコンホメーション状態に制約させるために使用されてもよい。これらの模倣物はまた、本発明のタンパク質の二次構造の模倣物を含み得る。これらの構造は、タンパク質の既知の二次構造に、アミノ酸残基の3次元配向をモデル化することができる。N置換アミノ酸のオリゴマーであるペプトイドが使用されてもよく、新規な分子の化学的に多様なライブラリーの生成のためのモチーフとして使用することができる。
【００６５】
本発明の分子は、いくつかの方法のいずれかにおいて調製することができるが、大部分は日常的な組換え方法を利用して好ましく実行される。好ましいタンパク質配列のいずれかをコードするポリヌクレオチド（DNA）を推定するために、タンパク質配列および本明細書に提供される情報を使用することは比較的直線的な手順である。これは、例えば、DNSstarソフトウェアスイート［DNAstar Inc, Madison, WI, USA］または同様のものなどのコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。本発明の好ましいポリペプチドまたはその有意なホモログをコードする能力を有する任意のこのようなDNA配列は、本発明の態様として見なされるべきである。
【００６６】
一般的スキームとして、好ましい修飾ブーゲニンタンパク質配列のいずれかをコードする遺伝子は、遺伝子合成を使用して作製することができ、かつ適切な発現ベクターにクローニングすることができる。順次、発現ベクターは宿主細胞に導入され、細胞が選択および培養される。本発明のタンパク質は、培養培地から精製され、治療的投与のための調製物に製剤化される。代替として、野生型ブーゲニン遺伝子配列は、例えば、ブーゲンビリア  スペクタビリス  ウィルド植物の根組織から調製されたRNAを使用するcDNAクローニングストラテジーに従って、入手することができる。この野生型遺伝子は、変異誘発、および好ましい改変体配列の構築のための鋳型として使用することができる。この点に関して、Higuchiら［Higuchi et al (1988) Nucleic Acids Res. 16:7351］によって記載される「重複伸長PCR」のストラテジーを使用することが特に便利であるが、他の方法論および系を容易に適用することができる。
【００６７】
本発明のタンパク質の生物学的活性は、多くの方法において等しく評価することができる。1つの態様において、修飾ブーゲニン分子は、N-グリコシダーゼ活性を用いて、特に、タンパク質翻訳の有意な阻害を提供するために十分な活性用いて同定される。1つのこのような適切なアッセイは、無細胞タンパク質合成アッセイにおける非修飾ブーゲニンに対する比較において、修飾ブーゲニンタンパク質の活性を試験することを含む。メチオニン、レポータータンパク質ルシフェラーゼをコードするDNA、ならびに非修飾ブーゲニンタンパク質および修飾ブーゲニンタンパク質の段階希釈を含む共役転写/翻訳混液を同時インキュベートする。翻訳されたルシフェラーゼのレベルは、基質試薬の添加後に発光カウンターを使用して容易に検出される。測定された発光は、反応中に存在するブーゲニンN-グリコシダーゼ活性に逆比例する。通常、例えば、Y70A置換を含む不活性ブーゲニンタンパク質などの陰性対照を提供される。
【００６８】
好ましくかつ活性なブーゲニン分子の構築は、組換えDNA技術によって達成されてもよく、これは、所望の抗体または他の標的化部分で融合されたブーゲニン分子を含む。融合タンパク質を含む組換えタンパク質を精製および操作するための方法は、当技術分野において周知である。必要な技術は、例えば、以下の文献に十分に説明されている：「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版 (Sambrook et al., 1989); 「Oligonucleotide Synthesis」(M.J. Gait編, 1984); 「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney編, 1987);「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.);「Handbook of ExperimentalImmunology」(D.M. Weir & C.C.Blackwell編);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M. Miller & M. P. Calos編, 1987);「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubel et al.編 1987);「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullis et al.編 1994);「Current Protocols in Immunology」 (J. E. Coligan et al., 編 1991)。
【００６９】
本発明のタンパク質およびペプチドは、組換えDNA法を使用して調製することができる。本発明のタンパク質はまた、固相合成などのタンパク質の化学において周知である技術を使用する化学合成（Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154）または均質溶液中での合成（Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, E. Wansch編, Vol. 51 I and II, Thieme, Stuttgart）によって調製してもよい。
【００７０】
本発明はまた、本発明の修飾ブーゲニンタンパク質またはペプチドをコードする配列、好ましくは、SEQ ID NO:13またはSEQ ID NO:14のような本明細書に記載されるタンパク質をコードする配列を含む、精製および単離された核酸分子を提供する。
【００７１】
「単離および精製された」という用語は、本明細書において、組換えDNA技術によって産生されたときに、細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まず、または化学的に合成されたときに、化学的前駆体、もしくは他の化学物質を含まない核酸をいう。「単離および精製された」核酸はまた、核酸がそこから由来する、核酸に天然に隣接する配列（その核酸の5'末端および3'末端に位置する配列）を実質的に含まない。
【００７２】
「核酸」という用語は、本明細書において、天然に存在する塩基、糖および糖間（バックボーン）連結からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドのモノマーの配列をいう。この用語はまた、同様に機能する、その天然には存在しないモノマーまたは部分を含む、修飾または置換された配列を含む。本発明の核酸配列は、リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）であってもよく、これは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む、天然に存在する塩基を含んでもよい。これらの配列はまた、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチル、2-プロピル、および他のアルキルアデニン、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、6-アザウラシル、6-アザシトシンおよび6-アザチミン、シュドウラシル、4-チオウラシル、8-ハロアデニン、8-アミノアデニン、8-チオールアデニン、8-チオ-アルキルアデニン、8-ヒドロキシルアデニンおよび他の8-置換アデニン、8-ハログアニン、8-アミノグアニン、8-チオールグアニン、8-チオアルキルグアニン、8-ヒドロキシルグアニンおよび他の8-置換グアニン、他のアザおよびデアザウラシル、チミジン、シトシン、アデニン、またはグアニン、5-トリフルオロメチルウラシルおよび5-フルオロシトシンなどの修飾塩基を含んでもよい。
【００７３】
1つの態様において、精製および単離された核酸分子は、本発明のタンパク質またはペプチド、好ましくは、SEQ ID NO:13またはSEQ ID NO:14をコードする配列を含み、これには以下が含まれる：
（a）TがまたUであり得る、核酸配列；
（b）(a)に対して相補的である核酸配列；
（c）(a)または（b）に対して相同である核酸配列；
（d）少なくとも15塩基、好ましくは20〜30塩基であり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（a）〜（c）にハイブリダイズする、（a）〜（c）のフラグメント；または
（e）遺伝コードの縮重に起因して、コドン配列において（a）〜（c）の核酸のいずれかが異なる核酸分子。
【００７４】
さらに、本発明は、本発明のタンパク質およびペプチド、およびそれらのフラグメントをコードする核酸配列の実質的な配列相同性を有する核酸配列を含む核酸分子を含むことが理解される。「実質的な配列相同性を有する配列」は、これらの配列からのわずかな、または重要ではない配列のバリエーションを有する核酸配列を意味し、すなわち、これらの配列は、機能的に等価なタンパク質を産生するために実質的に同じ様式で機能する。これらのバリエーションは、局所的変異または構造的修飾に起因する可能性がある。
【００７５】
実質的な相同性を有する核酸配列は、本発明のタンパク質およびペプチドをコードする核酸配列と、少なくとも80%、好ましくは90%の同一性を有する核酸配列を含む。
【００７６】
本発明の別の局面は、ハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸分子にハイブリダイズする、少なくとも15塩基を有する核酸分子およびそのフラグメントを提供する。DNAハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は当業者に公知であり、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6において見い出され得る。例えば、以下が利用され得る：6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）、約45℃、続いて2.0×SSC、50℃の洗浄。ストリンジェンシーは、洗浄工程において使用される条件に基づいて選択されてもよい。例えば、洗浄工程における塩濃度は、約0.2×SSC、50℃の高ストリンジェンシーから選択することができる。さらに、洗浄工程における温度は、高ストリンジェンシー条件、約65℃であり得る。
【００７７】
従って、本発明のタンパク質またはペプチドをコードする配列を有する本発明の核酸分子は、当技術分野において公知である手順に従って、タンパク質またはペプチドの良好な発現を保証する適切な発現ベクターに組み込まれてもよい。可能な発現ベクターには、そのベクターが、使用される宿主細胞と適合可能である限り、コスミド、プラスミド、または修飾ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）が含まれるが、これらに限定されない。「宿主細胞の形質転換のために適切であるベクター」という表現は、発現ベクターが、本発明の核酸分子、および、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される、核酸分子に作動可能に連結されている調節配列を含むことを意味する。「作動可能に連結されている」は、核酸が、その核酸の発現を可能にする様式で、調節配列に連結されていることを意味することを意図する。
【００７８】
それゆえに、本発明は、本発明の核酸分子を含む本発明の組換え発現ベクターまたはそのフラグメント、ならびに挿入されたタンパク質配列の転写および翻訳のために必要な調節配列を意図する。適切な調節配列は、細菌、真菌、またはウイルスの遺伝子を含む種々の供給源から誘導されてもよい（例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)において記載されている調節配列を参照されたい）。適切な調節配列の選択は、選択される宿主細胞に依存し、当業者によって容易に達成され得る。このような調節配列の例には、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはRNAポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が含まれる。加えて、選択される宿主細胞および利用されるベクターに依存して、他の配列、例えば、複製の起点、付加的なDNA制限部位、エンハンサー、および転写の誘導を付与する配列が、発現ベクターに組み込まれてもよい。必要な調節配列が、ネイティブタンパク質および/またはその隣接領域によって供給されてもよいこともまた理解される。
【００７９】
本発明の組換え発現ベクターはまた、本発明の組換え分子で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子を含んでもよい。選択マーカー遺伝子の例は、特定の薬物、例えば、G418およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するタンパク質、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼなどをコードする遺伝子である。選択マーカー遺伝子の転写は、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼなどの選択マーカーのタンパク質濃度を変化させることによってモニターされる。選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合、形質転換体細胞はG418を用いて選択することができる。選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞が生存するのに対して、他の細胞は死滅する。このことは、本発明の組換え発現ベクターの発現について、可視化およびアッセイを可能にし、特に発現および表現型に対する変異の効果を決定することを可能にする。選択マーカーは、関心対象の核酸から分離したベクター上に導入することができる。
【００８０】
組換え発現ベクターはまた、組換えタンパク質の発現の増加；組換えタンパク質の溶解性の増加を提供し；およびアフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによって、標的組換えタンパク質の精製を補助する、融合部分をコードする遺伝子を含んでもよい。例えば、タンパク質分解部位が、融合タンパク質の精製に続いて、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするために、標的組換えタンパク質に加えられてもよい。
【００８１】
組換え発現ベクターは、形質転換宿主細胞を産生するために、宿主細胞に導入することができる。「形質転換宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた真核生物細胞または原核生物細胞を含むことが意図される。「〜で形質転換された」、「〜でトランスフェクトされた」、「形質転換」および「トランスフェクション」は、当技術分野において公知である多くの可能な技術の1つによる、細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を含むことが意図される。原核生物細胞は、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム媒介形質転換によって、核酸で形質転換され得る。核酸は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションなどの従来的な技術を介して哺乳動物細胞に導入され得る。宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトするための適切な方法は、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)）または他のこのような実験用テキストブックにおいて見い出され得る。
【００８２】
適切な宿主細胞には、広範な種々の原核細胞生物および真核細胞生物が含まれる。例えば、本発明のタンパク質は、大腸菌、昆虫細胞（バキュロウイルスを使用）、酵母細胞または哺乳動物細胞などの細菌細胞中で発現されてもよい。他の適切な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991) において見い出され得る。
【００８３】
核酸は、それが別の核酸配列との機能的な関連に配置されるときに「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチドについてのDNAに作動可能に連結され；プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に連結され；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置される場合に、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結される」は、連結されるDNA配列が連続しており、および分泌リーダーの場合には、連続しておりかつリーディングフレーム中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、便利な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが、従来的な実務に従って使用される。
【００８４】
ある態様において、発現ベクターは、発現制御配列に作動可能に連結された、潜在的なT細胞エピトープの数の減少を有する修飾ブーゲニンをコードする核酸配列を含む。種々の態様において、発現ベクターは、本発明のタンパク質またはペプチド、またはその縮重改変体をコードする核酸配列を含み、適切な発現制御配列および選択配列と作動可能に連結された該核酸の少なくともRIPコードドメインを含む。ポリヌクレオチドに関する縮重とは、遺伝コードにおいて、1つより多いコドンによって特定されるという十分に認識されている事実をいう。コードの縮重は、DNAを含む4つの異なる塩基の64通りの異なる3つ組配列によってコードされる20個の異なるアミノ酸を説明する。
【００８５】
「RIPコードドメイン」または「リボソーム不活性化タンパク質コードドメイン」という用語は、本明細書で使用されるように、その生物学的活性をブーゲニンに与える機能的ドメインを意味する。
【００８６】
本発明の核酸分子はまた、標準的な技術を使用して化学合成されてもよい。ポリデオキシヌクレオチドを化学合成する種々の方法が公知であり、これには固相合成法が含まれ、これは、ペプチド合成と同様に、市販のDNAシンセサイザーで完全に自動化されている（例えば、Itakura et al.米国特許第4,598,049号; Caruthers et al. 米国特許第4, 458, 066号; およびItakura 米国特許第4,401,796号および同第4,373,071号を参照されたい）。
【００８７】
本発明はまた、本発明の新規タンパク質および選択されたタンパク質、または選択マーカータンパク質を含む、融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００８８】
本発明の別の局面は、少なくとも1つの前述のベクターを含む培養細胞である。
【００８９】
本発明のさらなる局面は、発現ベクターからの修飾ブーゲニンの発現を可能にする条件下で上記に言及した細胞を培養する工程、および細胞からブーゲニンを精製する工程を含む、修飾ブーゲニンを調製するための方法である。
【００９０】
（B）修飾ブーゲニンサイトトキシン；
以前に言及したように、ブーゲニンは、タンパク質合成の停止および細胞死をもたらす、細胞の主要なリボソームRNAを脱プリン化する、1型リボソーム不活性化タンパク質（RIP）である。このようなものとして、本発明の修飾ブーゲニンは、サイトトキシンを調製するために使用することができる。修飾ブーゲニンタンパク質を含むサイトトキシンは、非修飾ブーゲニンタンパク質を含むサイトトキシンよりも好ましい。前者はより免疫原性でなく、標的に到達する前に免疫系によって破壊される可能性がより少ないからである。
【００９１】
従って、本発明はまた、（b）本発明の修飾ブーゲニンタンパク質に付着された（a）標的部分を含むサイトトキシンを提供する。
【００９２】
「本発明の修飾ブーゲニンタンパク質」という用語は、参照の容易さのために使用され、（A）節において上記に記載される、ならびに図面および実施例において、修飾ブーゲニンタンパク質などの、本明細書に記載される任意またはすべての修飾ブーゲニンタンパク質を含む。
【００９３】
「標的化部分」という用語は、本明細書で使用されるように、標的細胞に修飾ブーゲニンタンパク質を送達する実体、手段、または技術をいう。1つの態様において、標的化部分は抗体である。1つの態様において、標的化部分はリポソームであり得る。1つの態様において、このリポソームは、抗体に連結され得る。別の態様において、標的化部分は、タンパク質を、特定の標的細胞への特異的結合相互作用に方向付けることができる。このようなタンパク質の部分には、特異的細胞表面レセプターがそのために存在する種々のポリペプチドリガンドが含まれ、それゆえに、多数のサイトカイン、ペプチドおよびポリペプチドホルモンならびに他の生物学的応答モディファイアーが含まれる。顕著な例には、血管上皮増殖因子、上皮増殖因子、ヘレグリン、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子および他のタンパク質などのタンパク質、および糖タンパク質分子などが含まれる。本発明のブーゲニンとのこれらおよび他の分子の融合タンパク質が意図され、これらは、タンパク質リガンドドメインに関して、N末端方向またはC末端方向のいずれかで修飾ブーゲニン部分を含んでもよい。標的化部分は、本発明のタンパク質に直接的に、またはリンカーを通して接続されてもよい。1つの態様において、リンカーは、ペプチドリンカーまたは化学リンカーである。同様に、修飾ブーゲニンタンパク質への精製リガンドの化学架橋が意図されてもよく、これは本発明の範囲内にあり得る。
【００９４】
好ましい態様において、本発明は、（b）本発明の修飾ブーゲニンタンパク質；に付着された、（a）癌細胞に結合するリガンドを含むサイトトキシンを提供する。
【００９５】
このリガンドは、タンパク質を含むがこれに限定されない、癌細胞に結合し得る任意の分子であり得る。1つの態様において、このリガンドは、癌細胞の表面を認識する抗体または抗体フラグメントである。
【００９６】
従って、本発明のサイトトキシンは、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、膀胱癌、消化管癌、前立腺癌、小細胞および非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞およびB細胞リンパ腫などの種々の型の癌を治療するために使用されてもよい。
【００９７】
1つの態様において、癌細胞結合リガンドは、癌細胞に結合する完全な免疫グロブリン分子を含む。癌細胞結合リガンドが抗体またはそのフラグメントである場合、サイトトキシンは、イムノトキシンと呼ばれることも可能である。別の態様において、癌細胞結合リガンドは、Fab、Fab'、scFv、単一ドメイン抗体フラグメント、またはジスルフィド安定化Fvフラグメントのダイマーである。別の態様において、癌抗体は、可変重鎖、可変軽鎖、Fab、Fab'、scFv、単一ドメイン抗体フラグメント、またはジスルフィド安定化Fvフラグメントを含む。癌細胞結合リガンドの部分は、1つまたは複数の種から誘導されてもよく、好ましくは、ヒト種から誘導された部分を含み、および最も好ましくは、完全にヒトまたはヒト化されている。精製を容易にするため、または毒素への結合のために設計された領域はまた、癌細胞-結合部分に含まれるか、またはそこに加えられてもよい。
【００９８】
特定の態様において、癌細胞結合リガンドはEP-CAMを認識する。Ep-CAM（上皮細胞付着分子、17-1A、KSA、EGP-2およびGA733-2としても公知）は、肺、乳房、卵巣、結腸直腸の癌腫、および頭頸部の扁平上皮癌を含む多くの固形腫瘍において高度に発現されているが、大部分の正常な上皮組織においては弱く発現されている膜貫通タンパク質である。
【００９９】
従って、1つの態様において、本発明は、（b）非修飾ブーゲニンタンパク質と比較して、T細胞を活性化するための性向が低い修飾ブーゲニンタンパク質に付着された、（a）癌細胞上のEp-CAMに結合する（抗体または抗体フラグメントなど）リガンドを含む、Ep-CAM-標的化-修飾ブーゲニンサイトトキシンを提供する。
【０１００】
特定の態様において、サイトトキシンは、（a）ヒトEP-CAMの細胞外ドメインに結合するヒト化抗体または抗体フラグメントを含み、および（b）非修飾ブーゲニンタンパク質と比較して、T細胞を活性化する性向が低い修飾ブーゲニンタンパク質に付着された、MOC-31抗体から誘導された相補性決定領域（CDR）を含む。
【０１０１】
本発明に従う適切なEp-CAM-標的化-修飾ブーゲニンは、非限定的に、VB6-845およびその改変体、Ep-CAMまたはその改変体を選択的に結合する、他の単鎖または二本鎖免疫グロブリンを含む他のサイトトキシンを含む。「VB6-845」という用語は、本明細書で使用されるように、修飾型のブーゲニン、Bou156（SEQ ID NO:13）に連結された抗-Ep-CAM scFv抗体のFabバージョンを含むサイトトキシンを意味する。VB6-845のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は図3Bに示される（それぞれSEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:15）。
【０１０２】
別の態様において、癌細胞結合リガンドは、新生物細胞上で特異的に見い出され、かつ正常細胞上では見い出されない腫瘍関連抗原を認識する。好ましい態様において、このリガンドは、腫瘍結合抗原を結合する抗体である。この抗腫瘍関連抗原抗体は、広範な種々の癌からの癌細胞を特異的に認識するが、正常な非癌性細胞を認識しない。
【０１０３】
従って、別の態様において、本発明は、（b）非修飾ブーゲニンタンパク質と比較して、T細胞を活性化する性向が低い修飾ブーゲニンタンパク質に付着された、（a）癌細胞上の腫瘍関連抗原に結合するリガンド（例えば、抗体または抗体フラグメントなど）を含むサイトトキシンを提供する。
【０１０４】
本発明に従う適切な腫瘍関連抗原標的化修飾ブーゲニンには、非限定的に、VB6-011およびその改変体、腫瘍関連抗原を選択的に結合する他の単鎖または二本鎖の免疫グロブリンを含む他のサイトトキシン、またはその改変体が含まれる。「VB8-011」という用語は、本明細書で使用されるように、修飾型のブーゲニン、BOU156（SEQ ID NO:13）に遺伝的に関連しているH11ヒトモノクローナル抗体のFabバージョンを含むサイトトキシンを意味する。H11抗体は、ハイブリドーマを産生するために、ヒトミエローマ細胞株と融合された、64歳の男性癌患者の末梢血リンパ球の融合によって得られた。ハイブリドーマNBGM1/H11は、VB6-011を作製するためのFab形式に再操作されたIgMkを産生する（H11抗体分泌ハイブリドーマの調製に際しては、米国特許第6,207,153号およびWO 97/44461を詳細に参照されたい）。VB6-011のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は図15に示される（それぞれ、SEQ ID NO:28およびSEQ ID NO:27）。
【０１０５】
特定の非限定的な態様において、サイトトキシンはVB6-845（図3B、SEQ ID NO:16）またはVB6-011（図15、SEQ ID NO:28）を含む。他の非限定的な態様において、サイトトキシンは、VB6-845またはVB6-011の改変体を含む。
【０１０６】
VB6-845改変体は、VB6-845によって結合されるのと同じEp-CAMエピトープ、または実質的に同様のEp-CAMエピトープに結合し、この改変体は、生理学的条件下で、Ep-CAMへのVB6-845結合を、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%、競合的に阻害し得る。VB6-845改変体は、VB6-845と同じ修飾ブーゲニンを含んでもよく、または本発明の異なる修飾ブーゲニンを含んでもよい。別の非限定的な態様において、サイトトキシンは、MOC31の可変領域、またはその改変体を含む、Ep-CAM-結合部分を含む。なお別の態様において、サイトトキシンは、4D5MOCBまたはその改変体を含む、Ep-CAM-結合部分を含む。Ep-CAMへのこれらのサイトトキシンのいずれかの結合は、生理学的条件下で、参照MOC31または4D5MOCB抗体との競合によって、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%低下し得る。
【０１０７】
VB6-011改変体は、VB6-011によって結合されるのと同じ腫瘍関連抗原エピトープ、またはそれと実質的に類似の腫瘍関連抗原エピトープに結合し、この改変体は、生理学的条件下で、腫瘍関連抗原へのVB6-011結合を、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%、競合的に阻害し得る。
VB6-011改変体は、VB6-011と同じ修飾ブーゲニンを含んでもよく、または本発明の異なる修飾ブーゲニンを含んでもよい。別の非限定的な態様において、サイトトキシンは、H11モノクローナル抗体、H11抗原結合フラグメント、またはその改変体を含む、腫瘍関連抗原結合部分を含む。VB6-011へのこれらのサイトトキシンのいずれかの結合は、生理学的条件下で、参照H11抗体との競合によって、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%低下してもよい。
【０１０８】
好ましい態様において、Ep-CAM結合部分または腫瘍関連抗原結合部分の結合親和性は、標準的な実験室技術によって測定される場合に、それぞれ、VB6-845またはVB6-011の結合親和性の、少なくとも4オーダーの規模、好ましくは少なくとも3オーダーの規模、より好ましくは2オーダー未満の規模である。非限定的な態様において、Ep-CAM結合部分は、例えば、PANOREX（商標）またはMT201であるがこれらに限定されない公知の抗Ep-CAM抗体のEp-CAMに対する結合を、少なくとも0.1%、1%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%、競合的にブロックし得る。非限定的な態様において、腫瘍関連抗原結合部分は、例えば、H11であるがこれに限定されない公知の抗腫瘍関連抗原結合部分抗体の腫瘍関連抗原に対する結合を、少なくとも0.1%、1%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%、競合的にブロックし得る。
【０１０９】
当業者は、特異性決定残基が決定され得ることを認識する。「特異性決定残基」という用語はまた、「SDR」としても知られ、抗体のパラトープの一部を形成する残基、特にCDR残基をいい、任意の他の範囲と独立した、アラニンによるその個々の置換は、少なくとも10倍、好ましくは100倍、より好ましくは少なくとも1000倍、エピトープについての抗体の親和性を低下させる。この親和性の損失は、エピトープを結合する抗体の能力における残基の重要性を強調する。例えば、Tamura et al., 2000,「Structural correlates of an anticarcinoma antibody: identification of specificity-determining residue (SDRs) and development of a minimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only」J. Immunol. 164 (3): 1432-1441を参照されたい。
【０１１０】
結合活性、特に、結合親和性に対する単一または複数の変異の効果は、結合相互作用に対する特定の一連のアミノ酸の重要性（例えば、結合に対する軽鎖または重鎖のCDR2の寄与）を評価するために同時に評価されてもよい。アミノ酸変異の効果はまた、個々に評価される場合に、単一のアミノ酸の寄与を評価するために連続して評価されてもよい。このような評価は、例えば、インビトロ飽和スキャニング（例えば、米国特許第6,180,341号; Hilton et al., 1996, 「Saturation mutagenesis of the WSXWS motif of the erythropoietin receptor」J Biol Chem. 271: 4699-4708を参照されたい）および部位特異的変異誘発（例えば、CunninghamおよびWells, 1989,「High-resolution epitope mapping of hGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis」Science 244: 1081-1085; Bass et al., 1991「A systematic mutational analysis of hormone-binding determinants in the human growth hormone receptor」Proc Natl Acad Sci. USA 88:4498-4502を参照されたい）によって実行されすることができる。アラニンスキャニング変異誘発技術において、単一アラニン変異が分子中の複数の残基に導入され、得られる変異分子が、分子の活性のために決定的であるアミノ酸残基を同定するために生物学的活性について試験する。
【０１１１】
リガンド-レセプターまたは他の生物学的相互作用の部位は、推定の接触部位アミノ酸の変異とともに、例えば、核磁気共鳴、結晶解析、電子回折、または光親和性標識によって決定されるような、構造の物理的解析によって同定され得る（例えば、de Vos et al., 1992「Human growth hormone and extracellular domain of its receptor: crystal structure of the complex」Science 255: 306-312; Smith et al., 1992「Human interleukin 4. The solution structure of a four-helix bundle protein」J Mol Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992「Crystal structure of human recombinant interleukin-4 at 2.25A resolution」FEBS Lett. 309:59-64を参照されたい）。特定の個々のアミノ酸、またはアミノ酸のシリーズの重要性は、関連するポリペプチドのアミノ酸配列または類似の結合部位との比較によって評価されてもよい。
【０１１２】
さらに、当業者は、アビディティーの増加がより低い結合親和性を補償し得ることを認識する。癌細胞レセプターについてのサイトトキシンのアビディティーは、複数の結合部位を有するEp-CAMのEp-CAM結合部分の結合の強度の尺度である。Ep-CAMと、Ep-CAM結合部分との間の機能的結合強度は、すべての親和性結合の合計の強度を表し、従って、個々の成分が比較的低い親和性で結合し得るが、しかし、このような成分のマルチマーは、強力な生物学的効果を実証し得る。実際、Ep-CAM結合部位と、Ep-CAMエピトープとの間の複数の相互作用は、相加的な生物学的効果よりもはるかに大きい効果を実証し得、すなわち、多価の利点は、平衡定数に関して多くのオーダーの規模であり得る。
【０１１３】
同様に、癌細胞レセプターについてのサイトトキシンのアビディティーは、複数の結合部位を有し得る、腫瘍関連抗原の、腫瘍関連抗原結合部分の結合の強度の尺度である。腫瘍関連抗原と、腫瘍関連抗原結合部分との間の機能的結合強度は、すべての親和性結合の合計の強度を表し、従って、個々の成分が比較的低い親和性で結合し得るが、しかし、このような成分のマルチマーは、強力な生物学的効果を実証し得る。実際、腫瘍関連抗原結合部位と、腫瘍関連抗原エピトープとの間の複数の相互作用は、相加的な生物学的効果よりもはるかに大きい効果を実証し得、すなわち、多価の利点は、平衡定数に関して多くのオーダーの規模であり得る。
【０１１４】
1つの非限定的な態様において、Ep-CAM結合部分は、4D5MOCBのそれと実質的に類似している構造を有する。実質的に類似している構造は、サイトトキシンのEp-CAM結合部分のEp-CAM分子への結合点を反映するエピトープマップを参照して特徴付けされ得る。別の非限定的な態様において、エピトープマップは、腫瘍関連抗原結合部分について生成され得、実質的に類似の構造が、サイトトキシンの腫瘍関連抗原結合部分の腫瘍関連抗原分子への結合点を反映するエピトープマップを参照して特徴付けされ得る。
【０１１５】
本発明のサイトトキシンは、固相合成（Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154 (1964)）または均質溶液中での合成（Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry, E. Wansch編, Vol 15 I and 11, Thieme, Stuttgart(1987)）などのタンパク質の化学において周知である技術を使用する化学合成によって調製されてもよい。1つの態様において、癌結合リガンドおよび修飾ブーゲニンは両方ともタンパク質であり、当技術分野において周知である技術を使用して結合体化され得る。2つのタンパク質を結合体化することができる数百種もの利用可能な架橋剤が存在している（例えば、「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking.」1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arborを参照されたい）。架橋剤は、一般的に、利用可能な反応性の官能基に基づいて選択されるか、またはリガンドもしくは毒素上に挿入される。加えて、反応性の基が存在しない場合は、光活性化可能な架橋剤が使用され得る。特定の例において、リガンドと毒素の間のスペーサーを含むことが所望されてもよい。当技術分野において公知である架橋剤には、ホモ二官能性剤：グルタルアルデヒド、ジメチルアジピミデートおよびビス(ジアゾベンジジン)、ならびにヘテロ二官能性剤：m マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ-m マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンミドが含まれる。
【０１１６】
リガンド-ブーゲニン毒素融合タンパク質もまた、組換えDNA技術を使用して調製されてもよい。このような場合において、癌結合リガンドをコードするDNA配列は、修飾ブーゲニンタンパク質をコードするDNA配列に融合され、キメラDNA分子が得られる。このキメラDNA配列は、リガンド-ブーゲニン融合タンパク質を発現する宿主細胞にトランスフェクトされる。この融合タンパク質は、細胞培養から回収することができ、および当技術分野において公知である技術を使用して精製することができる。
【０１１７】
Ep-CAMおよび腫瘍関連抗原などの細胞表面タンパク質についての特異性を有する抗体は、従来的な方法によって調製されてもよい。哺乳動物（例えば、マウス、ハムスター、またはウサギ）は、哺乳動物において抗体応答を誘発する免疫原性型のペプチドで免疫することができる。ペプチド上で免疫原性を付与するための技術には、キャリアへの結合体化、または当技術分野において周知である他の技術が含まれる。例えば、ペプチドは、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫の進行は、血漿または血清における抗体力価の検出によってモニターされ得る。標準的なELISAまたは他のイムノアッセイ手順は、抗体のレベルを評価するための抗原としての免疫原とともに使用することができる。免疫後、抗血清をえることができ、所望される場合、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。
【０１１８】
モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）を収集し、標準的な体細胞融合手順によってミエローマ細胞と融合させることができ、従って、これらの細胞を免疫し、およびハイブリドーマ細胞を産生する。このような技術は当技術分野において周知である（例えば、KohlerおよびMilsteinによってもともと開発されたハイブリドーマ技術（Nature 256: 495-497 (1975)）ならびにヒトB細胞ハイブリドーマ技術などの他の技術（Kozbor et al., Immunol. Today 4 : 72 (1983)）、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy Allen R., Bliss, Inc., 77-96頁 (1985)）、およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Huse et al., Science 246: 1275(1989)）。ハイブリドーマ細胞は、ペプチドと特異的に反応性である抗体の産生のために免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。
【０１１９】
用語「抗体」は、本明細書で使用されるように、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、FabおよびF(ab')2、ならびに単鎖抗体（scFv））、ならびにまた細胞表面成分と特異的に反応するキメラ抗体を含むことが意図される。抗体は、従来的な技術を使用してフラグメント化することができ、これらのフラグメントは、上記に記載したのと同じ様式で実用のためにスクリーニングすることができる。例えば、F(ab')2フラグメントは、Fab'フラグメントを産生するためにジスルフィド架橋を還元するように処理することができる。単鎖抗体は、単一の安定にフォールディングされたポリペプチド鎖上で抗体の抗原結合領域を合わせる。単鎖抗体は、組換え技術によって生成することができる。
【０１２０】
キメラ抗体誘導体、すなわち、非ヒト動物可変領域およびヒト定常領域を合わせる抗体分子もまた、本発明の範囲内で意図される。キメラ抗体分子には、ヒト定常領域を有する、マウス、ラット、または他の種の抗体からの抗原結合ドメインが含まれ得る。従来的な方法が、細胞表面抗原を認識する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体を作製するために使用されてもよい（例えば、Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314: 452 (1985), Cabilly et al., 米国特許第4,816,567号; Boss et al., 米国特許第4,816,397号; Tanaguchi et al., 欧州特許第171,496号; 欧州特許第173,494号、英国特許第GB2177096B号を参照されたい）。キメラ抗体は、対応する非キメラ抗体よりも、ヒト被験体において免疫原性が低いことが予想される。キメラ抗体は、Pluckthun et al., WO00/61635に記載されている方法によって安定化することができる。
【０１２１】
細胞表面成分に対して特異的に反応性であるモノクローナル抗体またはキメラ抗体は、ヒト定常領域キメラを産生することによってさらにヒト化することができ、ここで、可変領域の一部、特に、抗原結合ドメインの保存性フレームワーク領域はヒト起源のものであり、超可変領域のみが非ヒト起源である。このような免疫グロブリン分子は、当技術分野において公知である技術（例えば、Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today 4:7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92:3-16(1982)、およびPCT公開WO92/06193またはEP 239,400）によって作製されてもよい。ヒト化抗体もまた、商業的に製造され得る（Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain）。加えて、細胞表面成分に対して特異的に反応性であるモノクローナル抗体またはキメラ抗体は、潜在的なT細胞エピトープのそれらの数を減少することによって、免疫原性をより低く作製することができる。
【０１２２】
細胞表面成分に対して反応性である特異的抗体、または抗体フラグメントもまた、細胞表面成分とともに、細菌中で発現される、免疫グロブリン遺伝子、またはその一部をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることによって生成されてもよい。例えば、完全なFabフラグメント、VH領域およびFV領域は、ファージ発現ライブラリーを使用して細菌中で発現させることができる（例えば、Ward et al., Nature 341: 544-546(1989); Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); およびMcCafferty et al., Nautre 348:552-554 (1990)を参照されたい）。代替的には、SCID-huマウス、例えば、Genpharmによって開発されたモデルは、抗体またはそのフラグメントを産生するために使用することができる。
【０１２３】
修飾ブーゲニンタンパク質が抗体配列を用いて融合物中で作製されるすべての例において、MHCクラスII分子を結合し、またはT細胞を刺激し、またはMHCクラスII分子に付随するT細胞に結合することが可能であるT細胞エピトープまたは配列が除去されている抗体配列を使用することが最も望ましい。
【０１２４】
本発明のさらなる態様において、修飾ブーゲニンタンパク質は、非抗体タンパク質に連結され得るが、なおタンパク質が特定の標的細胞への特異的結合相互作用を指向することが可能である。このようなタンパク質部分には、特異的細胞表面レセプターが存在する種々のポリペプチドリガンドが含まれ、それゆえに、多数のサイトカイン、ペプチド、およびポリペプチドホルモンならびに他の生物学的応答モディファイアーが含まれる。顕著な例には、血管上皮増殖因子、上皮増殖因子、ヘレグリン、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子および他のタンパク質などのタンパク質、および糖タンパク質分子などが含まれる。本発明のブーゲニンとのこれらおよび他の分子の融合タンパク質が意図され、これらは、タンパク質リガンドドメインに関して、N末端方向またはC末端方向のいずれかで修飾ブーゲニン部分を含んでもよい。同様に、修飾ブーゲニンタンパク質への精製リガンドの化学架橋が意図されてもよく、これは本発明の範囲内にあり得る。
【０１２５】
さらなる態様において、本発明の修飾ブーゲニンタンパク質は、修飾ブーゲニンタンパク質がポリマーへの共有結合にあるか、またはポリマーとの非共有結合的相互作用にあるヒドロキシプロピルメタクリルアミドまたは他のポリマーなどのような水溶性ポリマーを含む複合体として、使用されてもよい。このような態様は、ポリマーブーゲニン複合体との組み合わせにおいて、抗体または抗体のフラグメントなどの抗原結合ドメインをさらに含んでもよい。
【０１２６】
（C）サイトトキシンの使用
本発明の修飾ブーゲニンタンパク質は、癌によってもたらされる哺乳動物細胞を特異的に阻害または破壊するために使用されてもよい。これらがより低い免疫原性を有し、RIPが細胞に入り、効果的に癌細胞を殺傷することを可能にすることが本発明のサイトトキシンの利点である。従って、このサイトトキシンは、癌細胞を特異的に標的とするために使用され得る。ブーゲニンは、一旦癌細胞に入ると、主要なリボソームRNAを脱プリン化し、それによって、リボソームに損傷を与え、タンパク質合成の停止および細胞死をもたらす。
【０１２７】
従って、1つの態様において、本発明は、その必要がある動物に、本発明のサイトトキシンを投与する工程を含む、癌細胞を阻害または破壊する方法を提供する。本発明はまた、癌細胞を阻害または破壊するために本発明のサイトトキシンの使用を含む。本発明はさらに、癌細胞を阻害または破壊するための医薬の製造における本発明のサイトトキシンの使用を含む。サイトトキシンによって阻害または破壊される癌細胞の型は、その抗体部分の抗原特異性によって決定される。
【０１２８】
別の態様において、本発明は、本発明のサイトトキシンを調製する工程、および細胞にそのサイトトキシンを投与する工程を含む、癌細胞を阻害または破壊する方法を提供する。癌は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、膀胱癌、肝臓癌、腎臓癌、黒色腫、消化管癌、前立腺癌、小細胞および非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞およびB細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されない、任意の型の癌であり得る。
【０１２９】
動物の癌細胞を選択的に阻害または破壊する本発明のサイトトキシンの能力は、動物癌細胞株を使用してインビボで容易に試験することができる。本発明のサイトトキシンの選択的な阻害効果は、例えば、癌細胞における細胞増殖の選択的阻害を実証することによって決定され得る。
【０１３０】
毒性は、細胞生存度に基づいて測定されてもよく、例えば、サイトトキシンに曝露された正常または癌性の細胞培養の生存度を比較することができる。細胞生存度は、トリパンブルー排除アッセイなどの公知の技術によって評価されてもよい。
【０１３１】
別の例において、多数のモデルが、サイトトキシンの細胞毒性を試験するために使用され得る。Thompson,E.W. et al. (Breast Cancer Res. Treatment 31:357-370 (1994)は、細胞外マトリックスの腫瘍細胞媒介タンパク質分解および再構成された基底膜（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、Matrigelまたはゼラチン）の腫瘍細胞侵襲を測定することによって、インビトロでのヒト乳癌細胞の侵襲性の測定についてのモデルを記載している。他の適用可能である癌細胞モデルには、培養卵巣腺癌細胞（Young, T. N. et al. Gynecol. Oncol. 62: 89-99 (1996); Moore, D.H. et al. Gynecol. Oncol. 65:78-82(1997)）、ヒト濾胞状甲状腺癌細胞（Demeure, M.J. et al., World J. Surg. 16:770-776 (1992)）、ヒト黒色腫（A-2058）および線維肉腫（HT-1080）細胞株（Mackay,A.R. et al. Lab. Invest. 70:781-783(1994)）および肺扁平上皮（HS-24）および腺癌（SB-3）細胞株（Spiess,E. et al. J. Histochem. Cytochem. 42:917-929 (1994)）が含まれる。胸腺欠損ヌードマウスにおける腫瘍の移植ならびに腫瘍増殖および転移の測定を含むインビボ試験系もまた記載されている（Thompson,E.W. et al., Breast Cancer Res. Treatment 31:357-370 (1994); Shi, Y. E. et al., Cancer Res. 53:1409-1415 (1993)）。
【０１３２】
本発明はまた、その必要がある動物に、本発明の1つまたは複数のサイトトキシンの有効量を投与する工程を含む、癌を治療する方法に関する。本発明は、癌を治療するための本発明のサイトトキシンの使用を含む。本発明はさらに、癌を治療するための医薬の製造における本発明のサイトトキシンの使用を含む。
【０１３３】
「動物」という用語は、ヒトを含む動物界のすべてのメンバーを含む。
【０１３４】
「癌を治療する」または「癌の治療」という用語は、癌細胞複製の阻害、癌の伝播（転移）の阻害、腫瘍増殖の阻害、癌細胞数もしくは腫瘍増殖の減少、癌の悪性度の低下、または癌関連徴候の改善をいう。
【０１３５】
好ましい態様において、動物はヒトである。別の態様において、癌は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、膀胱癌、肝臓癌、腎臓癌、黒色腫、消化管癌、前立腺癌、小細胞および非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞およびB細胞リンパ腫からなる群より選択される。
【０１３６】
本発明のサイトトキシンを使用する癌治療の臨床的結果は、医師などの関連分野における当業者によって容易に識別できる。例えば、癌の臨床マーカーを測定するための標準的な医学的試験は、治療の効力の強力な指標であり得る。このような試験には、非限定的に、身体検査、状態の評価、疾患マーカー、12-リードECG、腫瘍測定、組織生検、細胞検査、細胞診断、腫瘍計算の最大直径、放射線写真撮影、腫瘍のデジタル画像処理、バイタルサイン、体重、有害事象の記録、感染エピソードの評価、併用する医薬の評価、痛みの評価、血液または血清の化学、尿検査、CTスキャン、および薬理動態学的分析が含まれ得る。さらに、サイトトキシンおよび別の癌治療剤を含む組み合わせ治療の相乗的効果が、単独治療を受けている患者と用いる比較研究によって決定され得る。
【０１３７】
寛解悪性腫瘍は、当業者によって受容される判断基準を使用して評価され得る。例えば、Therasse et al., 2000「New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada」J Natl Cancer Inst. Feb2;92(3):205-16を参照されたい。
【０１３８】
特定のサイトトキシン構築物の有効用量は、癌の型、腫瘍のサイズ、癌の段階、患者に対するサイトトキシンの毒性、癌細胞への標的化の特異性、ならびに患者の年齢、体重、および健康を含む種々の要因に依存し得る。
【０１３９】
修飾ブーゲニンを含むサイトトキシンは、用量および注入物中のサイトトキシンの濃度に依存して、分から時間の期間にわたって静脈内注入によって投与され得る。
【０１４０】
1つの態様において、サイトトキシンは3時間の期間にわたって注入される。
【０１４１】
1つの態様において、サイトトキシンの静脈内投与による有効用量は、約1〜100mg/kg/用量の範囲であり得る。他の態様において、用量は、約2〜50mg/kg/用量の範囲であり得る。特定の態様において、用量は、少なくとも約2、4、8、13、20、28、40、50mg/kg/用量であり得る。
【０１４２】
1つの態様において、単回用量が、1、2、3、4、5、または6週間の間、ほぼ毎週投与される。単回用量は、連続週で投与され得るか、または代替的に、1週間または複数週がスキップされ得る。このサイクル後、引き続くサイクルが約1、2、4、6、または12週間後に開始されてもよい。治療レジメは、1、2、3、4、5、6またはそれ以上のサイクルを含んでもよく、各サイクルは、約1、2、4、6、または12週間間隔を空けられる。
【０１４３】
別の態様において、単回用量は、約1、2、3、4、5、または6ヶ月連続して毎月投与される。このサイクル後、引き続くサイクルが、約1、2、4、6、または12ヶ月後に開始されてもよい。治療レジメは、1、2、3、4、5、6またはそれ以上のサイクルを含んでもよく、各サイクルは、約1、2、4、6、または12ヶ月間隔を空けられる。
【０１４４】
特定の非限定的な態様において、サイトトキシンの有効用量は、約1から50mg/kg/腫瘍/日の間であり、ここで、患者は、1日あたり単回用量を投与される。この単回用量は、連続して約1、2、3、4、5、6または7日の間、ほぼ毎日（1日または複数日が任意にスキップされてもよい）投与される。このサイクル後、引き続くサイクルが約1、2、3、4、5、または6週間後に開始されてもよい。治療レジメは、1、2、3、4、5、6またはそれ以上のサイクルを含んでもよく、各サイクルは、約1、2、3、4、5、または6週間間隔を空けられる。
【０１４５】
注射量は、好ましくは、腫瘍の型および/または位置に対して適切である少なくとも有効量である。単回用量における最大注射量は、腫瘍体積の約25%から75%の間、例えば、見積もられた標的腫瘍体積の約4分の1、3分の1、または4分の3であり得る。特定の、非限定的な態様において、単回用量における最大注射量は、腫瘍体積の約30%である。
【０１４６】
別の態様において、サイトトキシンは、1〜10mgサイトトキシン/mLを含む溶液を用いて、1時間あたり100ccの速度で3時間注入される。サイトトキシンは、適切な生理学的に適合可能な溶液中で希釈される。
【０１４７】
サイクルの間にサイトトキシンとともに投与される別の癌治療剤の有効用量もまた、投与の様式に従って変化する。1種または複数の癌治療剤が、腫瘍内で、または他の投与の様式によって送達され得る。代表的には、化学療法剤が全身的に投与される。標準的な投薬量および治療レジメンは当技術分野において公知である（例えば、the Merck Index and the Physician's Desk Referenceの最新版; NCCN Practice Guidelines in Oncologyを参照されたい）。
【０１４８】
サイトトキシンとの組み合わせ治療は、さらなる癌治療の投与に対して、癌または腫瘍を感作し得る。従って、本発明は、減少した用量の癌治療剤の前に、その後に、またはそれと同時に、有効量のサイトトキシンを投与する工程を含む、癌を予防し、癌を治療し、および/または癌の再発を予防するための組み合わせ治療を意図する。例えば、サイトトキシンを用いる初期治療は、一定量の癌治療剤を用いるその後のチャレンジに対して、癌または腫瘍の感受性を増加させ得る。この用量は、癌治療剤が単独で、またはサイトトキシンの非存在下で投与されるときの標準的投薬量の下限の近くか、またはその下である。同時に投与される場合、サイトトキシンは、癌治療剤から別々に、および任意に、異なる投与の様式を経由して投与され得る。
【０１４９】
別の態様において、サイトトキシンは、少なくとも1種の他の免疫治療剤と組み合わせて投与される。
【０１５０】
別の態様において、サイトトキシンは、放射線治療のレジメンと組み合わせて投与される。この治療はまた、外科手術および/または化学療法を含み得る。例えば、サイトトキシンは、放射線治療およびシスプラチン（プラチノール）、フルオロウラシル（5-FU、アドルシル）、カルボプラチン（パラプラチン）、および/またはパクリタキセル（タキソール）と組み合わせて投与され得る。サイトトキシンを用いる治療は、より少ない放射線量の使用、および/またはより頻度の少ない放射線治療を可能にし得、これは例えば、望ましくない体重の減少または脱水症を潜在的に生じる、嚥下機能を妨害する重篤な咽頭炎の発症を減少し得る。
【０１５１】
別の態様において、サイトトキシンは、リンホカイン、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子様サイトカイン、リンホトキシン、インターフェロン、マクロファージ炎症タンパク質、顆粒球単球コロニー刺激因子、インターロイキン（非限定的に、インターロイキン-1、インターロイキン-2、インターロイキン-6、インターロイキン-12、インターロイキン-15、インターロイキン-18を含む）、および、それらの薬学的に許容される塩を含む、それらの改変体を非限定的に含む、1種または複数のサイトカインと組み合わせて投与される。
【０１５２】
なお別の態様において、サイトトキシンは、自系の細胞または組織、非自系の細胞または組織、癌胎児性抗原、α-フェトプロテイン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、BCG生ワクチン、メラノサイト系統タンパク質、および変異を有する腫瘍特異的抗原を非限定的に含む、癌ワクチンとと組み合わせて投与される。
【０１５３】
なお別の態様において、サイトトキシンは、ホルモン治療と関連させて投与される。ホルモン治療には、非限定的に、ホルモン性アゴニスト、ホルモン性アンタゴニスト（例えば、フルタミド、タモキシフェン、ロイプロリドアセテート（LUPRON））、およびステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、ベータメタゾン、コルチゾル、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）が含まれる。
【０１５４】
なお別の態様において、サイトトキシンは、癌を治療または予防するための遺伝子治療プログラムと関連付けて投与される。
【０１５５】
なお別の態様において、Ep-CAM標的化サイトトキシンは、関心対象の腫瘍細胞中のEp-CAMの発現を増加させる1種または複数の薬剤と組み合わせて投与される。Ep-CAM発現は、好ましくは、より多くの数のEp-CAM分子が腫瘍細胞表面上で発現されるように増加される。例えば、薬剤は、Ep-CAM抗原エンドサイトーシスの通常のサイクルを阻害し得る。このような組み合わせ治療は、Ep-CAM標的化サイトトキシンの臨床的効力を、単独で、または他の癌治療もしくは放射線治療を伴って改善し得る。特定の非限定的な態様において、腫瘍細胞中でEp-CAM発現を増加させる薬剤は、ビノレルビン酒石酸塩（ナベルビン）および/またはパクリタキセル（paclitax）（タキソール）である。例えば、Thurmond et al., 2003「Adenocarcinoma cells exposed in vitro to Navelbine or Taxol increase Ep-CAM expression through a novel mechanism.」Cancer Immunol Immunother. Jul;52(7):429-37を参照されたい。
【０１５６】
従って、組み合わせ治療は、投与されたサイトトキシンおよび/またはさらなる癌治療剤に対する癌または腫瘍の感受性を増加させ得る。この様式において、より短い治療サイクルが可能であり得、それによって、毒性事象を減少する。従って、本発明は、より短い治療サイクルで、有効量のサイトトキシンおよび少なくとも1種の他の癌治療剤を、その必要がある患者に投与する工程を含む、癌を治療または予防するための方法を提供する。サイクル期間は、使用における特定の癌治療剤に従って変化し得る。本発明はまた、連続的もしくは不連続的な投与、または数回の部分的投与に分割された1日の用量を意図する。特異的癌治療剤についての適切なサイクル期間は当業者によって認識され、本発明は、各癌治療剤についての最適な治療スケジュールの継続評価を意図する。当業者のための特定のガイドラインは当技術分野において公知である。例えば、Therasse et al., 2000「New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada」J Natl Cancer Inst. Feb2;92(3):205-16を参照されたい。
【０１５７】
代替として、より長い治療サイクルが所望されてもよい。従って、サイクル期間は、約10〜56日、約12〜48日、約14〜28日、16〜24日、または18〜20日の範囲であり得る。サイクル期間は、使用する特定の癌治療剤に従って変化してもよい。
【０１５８】
本発明は、単一の癌治療剤、または一連の治療剤が投与される間に、少なくとも1サイクル、好ましくは1サイクルより多くを意図する。適切な総サイクル数、およびサイクル間の間隔は、当業者によって認識される。サイクルの数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または21サイクルであり得る。サイクル間の間隔は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または21日間であり得る。本発明は、各サイトトキシンおよびさらなる癌治療剤についての最適な治療スケジュールの継続評価を意図する。
【０１５９】
別の態様において、活性化T細胞についての性向が低いブーゲニンのT細胞エピトープを同定する工程；T細胞エピトープの1つまたは複数を有する本発明のサイトトキシンを調製する工程、および薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤中にタンパク質を懸濁する工程を含む、癌を有する哺乳動物を治療するための医薬を調製するためのプロセスが提供される。
【０１６０】
本発明はまた、本発明のサイトトキシン、および薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、癌を有する哺乳動物を治療するための薬学的組成物を提供する。
【０１６１】
本発明のサイトトキシンは、インビボでの投与のために適切である、生物学的に適合性の形態での、被験体への投与のために薬学的組成物に製剤化され得る。「インビボでの投与のために適切である、生物学的に適合性の形態」は、治療効果が任意の毒性効果を上回っている、投与される物質の形態を意味する。この物質は、ヒトおよび動物を含む生きている生物に投与され得る。本発明の薬学的組成物の治療有効量の投与は、所望の結果を達成するために必要である投薬量および時間の間で、有効である量として定義される。例えば、ある物質の治療的活性量は、個体の疾患の状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力などの要因に従って変動し得る。投薬量レジメは、最適治療応答を提供するように調整され得る。例えば、数回に分割された用量が毎日投与されてもよく、または用量は、治療の状態の緊急度によって示されるように比例して減少され得る。
【０１６２】
活性物質は、注射（皮下、静脈内、筋肉内など）、経口投与、吸入、経皮投与（例えば、局所クリームまたは軟膏など）、または坐剤適用のような便利な様式で投与され得る。投与の経路に依存して、活性物質は、化合物を不活性化する可能性がある酵素、酸および他の天然の条件の作用から化合物を保護するための物質中でコートされてもよい。
【０１６３】
本明細書に記載される組成物は、有効量の活性物質が薬学的に受容可能な媒体との混合物中で合わせられるような、被験体に投与され得る薬学的に許容される組成物の調製のための、それ自体公知である方法によって調製され得る。適切な媒体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985)において記載されている。これに基づいて、組成物は、1種またはそれ以上の薬学的に許容される媒体または希釈剤と関連付けられた物質の溶液を含むがこれらに限らず、ならびに適切なpHを有しかつ生理学的液体と等張である緩衝化溶液中に含まれる。
【０１６４】
本発明の薬学的組成物は、癌を有する哺乳動物、好ましくはヒトを含む動物を治療するための方法において使用され得る。この組成物は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、膀胱癌、消化管癌、前立腺癌、小細胞および非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞およびB細胞リンパ腫を有する患者を治療するための特に有用であることが予測される。投与されるサイトトキシンの投薬量および型は、ヒト被験体において容易にモニターされ得る種々の要因に依存する。このような要因には、新生物の病因および重篤度（等級および段階）が含まれる。
【０１６５】
直接投与のために適合される薬学的組成物には、非限定的に、凍結乾燥粉末または水性もしくは非水性滅菌注射液または懸濁液が含まれ、これらはさらに、抗酸化剤、緩衝剤、抗菌剤、および組成物を意図されるレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含んでもよい。このような組成物中に存在してもよい他の成分には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が含まれる。即席注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。サイトトキシンは、例えば、しかしこれは限定ではなく、患者への投与の前に滅菌水または生理食塩水を用いて再構築される凍結乾燥粉末として供給されてもよい。
【０１６６】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容されるキャリアを含み得る。適切な薬学的に許容されるキャリアには、薬学的組成物の生物学的活性の有効性と干渉しない、本質的に化学的に不活性かつ非毒性の組成物が含まれる。適切な薬学的なキャリアの例には、水、生理食塩水溶液、グリセロール溶液、エタノール、N-(1(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）、ジオレシルホスホチジル-エタノールアミン（DOPE）、およびリポソームが含まれるがこれらに限定されない。このような組成物は、患者への直接的投与のための形態を提供するために、適切な量のキャリアとともに、治療有効量の化合物を含むべきである。
【０１６７】
別の態様において、薬学的組成物は、任意に、薬学的に許容されるキャリア中に、サイトトキシンおよび1種または複数のさらなる癌治療剤を含む。
【０１６８】
この組成物は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの遊離のアミノ基と形成されたもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第2鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離のカルボキシル基と形成されたものを含む、薬学的に許容される塩の形態であり得る。
【０１６９】
本発明が修飾ブーゲニンに関係する限りでは、このような修飾ブーゲニンタンパク質または修飾タンパク質のフラグメントを含む組成物および関連する組成物は、本発明の範囲内にあると見なされるべきである。この点において、関連のある例は、ペプチド媒介寛容性誘導ストラテジーの開発であり得、ここで、1つまたは複数の開示されたペプチドが、免疫治療的な意図を有する患者に投与される。従って、合成ペプチド分子は、上記に定義したようなエピトープ領域R1〜R3のいずれかのすべてまたは一部を含む1つまたは複数である。このようなペプチドは、本発明の態様と見なされる。
【０１７０】
本発明のさらなる局面は、修飾ブーゲニン組成物を使用する、ヒトの治療的処置のための方法に関する。個体への投与のために、修飾組成物のいずれかが、好ましくは少なくとも80%純粋であり、かつピロゲンおよび他の夾雑物質を含まないように産生される。
【０１７１】
本発明はまた、癌を治療するためのその使用のための説明書とともに、任意に、1つまたは複数の癌治療剤と組み合わせた、有効量のサイトトキシンを含むキットを提供する。
【０１７２】
（D）T細胞エピトープペプチド
本発明のさらなる態様は、T細胞エピトープペプチドである。1つの例において、T細胞エピトープペプチドは、T細胞アッセイにおいて1.8よりも大きな刺激インデックス、より好ましくは2.0よりも大きな刺激インデックスを誘発することが可能である。本発明のT細胞エピトープペプチドは、MHCクラスIIを結合することが可能である。
【０１７３】
本発明の1つの態様において、T細胞エピトープペプチドは、R1、R2またはR3（上記）の配列のいずれかから少なくとも9個の連続するアミノ酸残基を含む。別の態様において、T細胞エピトープペプチド配列は、ペプチド配列R1、R2またはR3のいずれか1つと、90%より大きなアミノ酸同一性を有し；より好ましくは、T細胞エピトープペプチドは、ペプチド配列R1、R2またはR3のいずれか1つと、80%より大きなアミノ酸同一性を有する。
【０１７４】
「ペプチド」という用語は、本明細書において、2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸は、ペプチド結合（本明細書以下で定義される）によって一緒に連結される。ペプチドの生物学的産生に関与する、20種の異なる天然に存在するアミノ酸が存在し、任意の数のアミノ酸が、ペプチド鎖または環を形成するために任意の順番で連結され得る。ペプチドの生物学的産生に利用される天然に存在するアミノ酸は、すべてL-配置を有している。合成ペプチドは、L-アミノ酸、D-アミノ酸、または2つの異なる配置のアミノ酸様々な組み合わせを使用して、従来的な合成方法を用いて調製し得る。あるペプチドは、わずかのみのアミノ酸単位を含む。例えば、10個未満のアミノ酸単位を有する短いペプチドは、時折、「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは、大きな数、例えば、100個以上のアミノ酸残基を含み、「ポリペプチド」と呼ばれる。慣習により、「ポリペプチド」は、3個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドと見なされ得るのに対して、「オリゴペプチド」は、通常、特定の型の「短い」ポリペプチドと見なされる。従って、本明細書で使用されるように、「ポリペプチド」とのいかなる言及もまた、オリゴペプチドを含むことが理解される。さらに、「ペプチド」とのいかなる言及もまた、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を含む。アミノ酸の各々の異なる配置は、異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。形成され得るポリペプチドの数、従って異なるタンパク質の数は、実際上制限されない。
【０１７５】
本発明の別の態様は、本発明の修飾ブーゲニンタンパク質および修飾T細胞エピトープペプチドを作製するための、本発明のT細胞エピトープペプチドの使用である。
【０１７６】
本発明のさらなる態様は、非修飾T細胞エピトープペプチドよりもヒトT細胞を活性化する性向が低いように修飾されている修飾T細胞エピトープペプチドである。1つの例において、本発明の修飾T細胞エピトープペプチドは、T細胞アッセイにおいて試験されたときに、非修飾T細胞エピトープペプチドと比較して、刺激インデックスの低下を誘発するような修飾を含む。
【０１７７】
本発明の1つの態様において、修飾T細胞エピトープペプチドは以下の配列：
AKX1DRKX2LX3LGVX4KL
を有し、ここで、X1、X2、X3、およびX4の少なくとも1つが、非修飾配列から、以下のように修飾される：
X1がTまたはAまたはQであり；
X2がGまたはAであり；
X3がQまたはGであり；かつ
X4がNまたはDまたはTまたはAまたはRまたはQまたはEまたはGまたはHまたはKまたはSである（SEQ ID NO:8）。
【０１７８】
本発明の別の態様において、修飾T細胞エピトープペプチドは以下の配列：
LGVX4KLEFSIEAIHG
を有し、ここで、X4がNまたはDまたはTまたはAまたはRまたはQまたはEまたはGまたはHまたはKまたはSである（SEQ ID NO:9）。
【０１７９】
本発明のさらなる態様において、修飾T細胞エピトープペプチドは以下の配列：
NGQEX5AKFFLIVIQM
を有し、ここで、X5はQまたはAである（SEQ ID NO:10）。
【０１８０】
本発明はまた、本発明のT細胞エピトープペプチドまたは修飾T細胞エピトープペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【０１８１】
以下の図面、配列表、および実施例は、本発明の理解を補助するために提供される。改変が、本発明の精神から逸脱することなく、示される手順でなされ得ることが理解される。
【０１８２】
以下の非限定的な実施例は、本発明を例示する。
【０１８３】
実施例
実施例1：未処置T細胞増殖アッセイを使用するブーゲニン中のエピトープをマッピングする方法
成熟ブーゲニンタンパク質の配列を網羅するペプチドを、Den Hartog et al［同書］によって記載されるように合成した。各ペプチドの長さは15アミノ酸であり、連続的なペプチドは12酸基重複する。これらのペプチドの配列およびそれらの番号付けを表1に示す。
【０１８４】
これらのペプチドを、未処置ドナー（すなわち、ブーゲニンに対する感作が知られていない）からのPBMC（末梢血単核細胞）を用いるT細胞増殖アッセイにおいて使用した。20例のドナーのPBMCを、MHCクラスIIアロタイプの最適な網羅を得るように選択した。アロタイプの網羅は85%超である。HLA-DRアロタイプを表2に示す。
【０１８５】
PBMCを、3連の培養中で、個々のペプチドを用いて7日間刺激し、その後、増殖を3H-チミジン（3H-Thy）取り込みによって評価した。すべてのペプチドを、2つの異なる濃度（1μMおよび5μM）で試験した。刺激インデックス（S.I.）を、にせの刺激対照細胞中に取り込まれた3Hの量で除算した、取り込まれた3Hの量として計算した。
【０１８６】
12時間未満保存されたヒト血液からのバフィーコートを、the National Blood Service（Addenbrooks Hospital, Cambridge, UK）入手した。フィコール-パークを、Amersham Pharmacia Biotech（Amersham, UK）から入手した。初代ヒトリンパ球の培養のためであり、L-グルタミン、50μg/mlストレプトマイシン、10μg/mlゲントマイシンおよび0.1%ヒト血清アルブミンを含む無血清AIM V培地は、Gibco-BRL（Paisley, UK）からであった。合成ペプチドは、Eurosequence（Groningen, The Netherlands）およびBabrahamTechnix（Cambridge, UK）から入手した。
【０１８７】
赤血球および白血球を、バフィーコートの穏やかな遠心分離によって、血漿および血小板から分離した。上層（血漿および血小板を含む）を取り出し、廃棄した。赤血球および白血球を、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中で1:1希釈し、その後、15mlのフィコール-パーク（Amersham Pharmacia, Amersham UK）に重層した。遠心分離を、製造業者が推奨する条件に従って行い、PBMCを、血清+PBS/フィコールパーク界面から収集した。PBMCをPBSを混合し（1:1）、遠心分離によって収集した。上清を除去および廃棄し、PBMCペレットを50ml PBS中に再懸濁した。細胞を再度遠心分離によってペレット化し、PBS上清を廃棄した。細胞を、50ml AIM V培地を使用して再懸濁し、この時点で計数し、トリパンブルー色素排除を使用して生存度を評価した。細胞を再度遠心分離によって収集し、上清を廃棄した。細胞を、3×107/mlの密度で、低温保存のために再懸濁した。保存媒体は、90%(v/v)熱不活化ABヒト血清（Sigma, Poole, UK）および10%(v/v)DMSO（Sigma, Poole, UK）であった。細胞を、調節冷凍コンテナ（Sigma）に移し、-70℃に一晩配置した。使用のために必要とされる場合には、細胞を37℃のウォーターバス中で急速に溶解し、その後10mlのあらかじめ温めた10mlのAIM V培地に移した。
【０１８８】
PBMCは、ウェルあたり2×105PBMCの密度で、96ウェル平底プレート中で、タンパク質およびペプチド抗原を用いて刺激した。PBMCは37℃で7日間インキュベートし、その後、3H-Thy（Amersham-Pharmacia, Amersham, UK）でパルスした。免疫原性であることが以前に示されている、C-32およびC-49と呼ばれる2つの対照ペプチド、ならびに、強力な全タンパク質非リコール抗原キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）を、各ドナーアッセイにおいて使用した。C-32 = Flu ヘマグルチニン残基307-319（SEQ ID N0:127）からの配列 PKYVKQNTLKLAT。C-49= クラミジアHSP60（SEQ ID NO:128）からの配列 KVVDQIKKISKPVQH。
【０１８９】
ペプチドを10mMの最終濃度までDMSO中に溶解し、次いで、これらのストック溶液を、AIM V培地中で1/500に希釈した（最終濃度20μM）。ペプチドを、平底96ウェルプレートに加え、100μl中で1μMおよび5μMの最終濃度を得た。溶解したPBMCの生存度をトリパンブルー色素排除によって評価し、次いで、細胞を、2×106細胞/mlの密度で再懸濁し、および100μl（2×105PBMC/ウェル）を、ペプチドを含む各ウェルに移した。3連のウェル培養を、各ペプチド濃度でアッセイした。プレートを、7日間、5%CO2の加湿大気中で、37℃にてインキュベートした。細胞に、18〜21時間、1μCi 3H-Thy/ウェルでパルスし、その後フィルターマット上で収集した。CPM値を、Wallacマイクロプレートベータトッププレートカウンター（Perkin Eimer）を使用して測定した。結果は、試験ペプチドと接触しなかった細胞において測定したスコアによる、試験ペプチドに対して測定された増殖スコア（例えば、1分間あたりの放射能の計数）の除算によって導かれた刺激インデックスとして表現した。
【０１９０】
上記のアッセイの結果の編集は、タンパク質の成熟型のプロセスされた領域におけるペプチド41、44および50、ならびにプロセスされていない型のペプチド88に対応する、4つのT細胞エピトープの存在を示す。ペプチド88におけるエピトープは成熟タンパク質の一部ではないので、これは本発明のスキーム下では無視される。
【０１９１】
ペプチド41（エピトープ領域R1と呼ばれる）については、このペプチドに対して応答性である4例のドナー；ドナー4、5、10および11が存在した。5μMにおけるこれらについてのS.I.は、それぞれ3.6、4.9、2.1および2.0である。
【０１９２】
ペプチド44について（エピトープ領域R2と呼ばれる）。このペプチドに対して応答性である2例のドナー；ドナー4（S.I.=3.5）および11（S.I.=2.3）が存在する。隣接するペプチド43および45は、より低いレベルのT細胞増殖を誘導した。なぜなら、これらの両方のペプチドは、ペプチド44と12アミノ酸重複しているからである。
【０１９３】
ペプチド50については、このペプチドに対して応答性である2例のドナー；ドナー4（S.I.=2.9）および14（S.I.=2.0）が存在した。ペプチド51は、より低いレベルのT細胞増殖をドナー14（S.I.>1.9）において誘導した。
【０１９４】
すべてのPBMC試料についての組織型は、市販の試薬系（Dynal, Wirral, UK）を使用してアッセイした。アッセイは、供給業者が推奨したプロトコールならびに標準的な付属的な試薬およびアガロース電気泳動系に従って行った。応答性ドナー試料の各々のアロタイプ特異性を表2に示す。
【０１９５】
実施例2：ブーゲンビリア  スペクタビリスからのブーゲニンのクローニング
総RNAをブーゲンビリア  スペクタビリスの葉から、'SV Total RNA Isolation Systemおよび供給業者（Promega, Southampton, UK）から提供されるプロトコールを使用して抽出した。新鮮な葉組織を、液体窒素下で微粉末まで粉砕し、約50mgの粉砕組織をRNA単離のために使用した。RNAの質および量を、1%アガロースゲル上での可視化によってチェックし、ブーゲニン遺伝子を、総RNAから、「Access RT-PCR System」（Promega）を使用して、反応あたり約1μgのRNAを使用して、および遺伝子特異的プライマーOL1032およびOL1033を用いて増幅した。プライマー配列は以下の表3に示す。この反応は、ネイティブリーダー配列および全長ブーゲニン配列を含む1242bpフラグメントを生成した。このフラグメントを、キットの説明書に従って、pGEM-T Easyベクター（Promega）にクローニングし、pBou1と名付けた。配列はDNA配列決定によって確認した。
【０１９６】
このブーゲニン遺伝子を、pBou1プラスミドをテンプレートとして使用するPCRクローニングによってpET21a（Novagen, Nottingham, UK）に移した。pelB（ペクチン酸リアーゼ）リーダー配列を5'末端に加え、6×ヒスチジンタグをコードする配列をブーゲニンコード配列の3'末端に加えた。pelBリーダーはベクターpPMI-his［Molloy, P. et al, (1995) J. Applied Bacteriology, 78: 359-365］から、プライマーOL1322（Nde1部位を組み込んでいる）およびプライマーOL1067を使用して増幅した。ブーゲニン-hisフラグメントを、OL1068およびOL1323（Not1部位を組み込んでいる）を使用して、pBou1から増幅した。pelBリーダーを、重複PCRを使用してブーゲニン-hisフラグメントにインフレームで融合させ、得られたフラグメントをpGEM-T Easy（Promega）にクローニングした。配列の確認後、pelB-ブーゲニン-hisフラグメントを、Nde1-Not1フラグメントとして、Nde1-Not1消化したpET21aにクローニングした。このクローンをpBou32と称した。
【０１９７】
実施例3：変異型ブーゲニンタンパク質の構築
T細胞エピトープマッピング手順によって提供されるデータ、およびヒトMHCクラスII結合溝とのペプチドの結合をシミュレート可能であるソフトウェアを用いて、多数の修飾（変異型）ブーゲニンタンパク質を設計した。後者のアプローチは、別に詳細に記載されている［WO02/069232］。改変体遺伝子を構築し、変異型タンパク質を機能的活性について試験した。一般的に、各々1つのアミノ酸置換を含む「単一変異」タンパク質を最初に構築および試験し、次いで、活性修飾タンパク質についての遺伝子を合わせて、複数置換された修飾タンパク質を産生した。
【０１９８】
変異型遺伝子を、重複PCR手順を使用して構築し、ここで、変異型アミノ酸コドンは、「重複プライマー」中の変異の使用によって、遺伝子に導入されるようになる。このスキームは当技術分野において十分に理解されており、かつ他の箇所で詳細に記載されている［Higuchi, et al (1900) Nucl. Acids Res. 16:7351］。全体で37個の単一変異修飾タンパク質を構築し、保持された機能的活性について試験した。加えて、置換Y70Aを含む陰性対照修飾タンパク質もまた構築し、すべてのアッセイにおいて試験した。37個の「単一変異」修飾タンパク質の1つが、実際、2つの直接隣接した置換（E151TおよびI152E）を有し、これは単一変異として本明細書では計算する。試験した置換および対応する活性の値を表4に示す。
【０１９９】
全体で11個の複数置換修飾タンパク質を構築し、保持された活性について試験した。試験した置換および対応する活性値を表5に示す。
【０２００】
表6は、置換修飾タンパク質の配列を記載する。表7はいくつかの特定の配列を列挙する。
【０２０１】
すべての場合において、タンパク質を精製し、以下の実施例4および5に概説される手順に従って試験した。
【０２０２】
実施例4：ブーゲニンタンパク質の発現および精製
プラスミドpBou32を、製造業者の説明書に従ってBL21(DE3)（Novagen）コンピテント細胞に形質転換し、50μg/ml カルベニシリンを含むLB（Invitrogen, Paisley, UK）プレート上で選択した。この形質転換からの新鮮なコロニーを使用して、5ml 2×YT（Invitrogen）を抗生物質なしで接種し、これをOD600 = 1.5-2.0まで、250rpm、37℃で振盪しながら増殖させた。次いで、培養物を2500rpm、15分間、室温にて遠心分離し、細胞を、5mlの新鮮な2×YTプラス少なくとも1mM IPTG中で再懸濁した。この培養物を300rpmで1.5時間振盪しながら30℃でインキュベートし、遠心分離によって細胞を収集し、上清を廃棄した。
【０２０３】
細胞ペレットを1mlのPEB2（50mM Tris-HCl, pH8、20%スクロース、1mg/mlリゾチーム、1×Complete Protease Inhibitor Tablet (Roche, Lewes, UK)）中に再懸濁し、穏やかに混合しながら、氷上で1時間インキュベートした。細胞細片を、14,000rpm、4℃にて遠心分離し、ペレットを廃棄した。ここで、得られる上清を「ペリプラズム画分」と称する。ブーゲニンタンパク質を、ペリプラズム画分から、市販の「スピンカラム」および製造業者の説明書（Qiagen, Crawle, UK）を使用して、ニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製した。得られる物質を、10000分子量カットオフ「Slide-A-Lyzer」（Pierce, Chester, UK）を使用して、4リットルのリン酸緩衝化生理食塩水（0.138M NaCl、0.0027M KCl、pH 7.4）に対して4℃で一晩透析した。透析後、タンパク質濃度をMicro BCA Assay Kit（Pierce）を使用して見積もり、試料を-20℃で保存した。
【０２０４】
ブーゲニンタンパク質濃度を、ELISAベースのアッセイ系を使用してさらに決定した。手短に述べると、ブーゲニンを発現するプラスミドでの2匹のラットの遺伝的免疫を通して、ブーゲニンに対する抗血清を生成した（Genovac, Freiburg, Germany）。ELISAのために、組換えブーゲニンを、そのHis-タグを介してNi-アガロースコートプレートに捕捉し、引き続き、ラット抗血清およびHRP-結合体化抗ラットFc二次抗体を用いて検出する（Sigma, Poole, UK）。標準として、大腸菌で発現させ、全タンパク質アッセイを使用して定量した野生型ブーゲニンの大規模調製物を、各測定において使用した。
【０２０５】
実施例5：ブーゲニン活性のアッセイ
野生型ブーゲニンタンパク質および修飾（変異型）ブーゲニンタンパク質の活性を、無細胞タンパク質合成アッセイにおけるタンパク質合成を阻害するそれらの能力を測定することによって試験した。
【０２０６】
12.5μlの最終容量である、10μl TNT共役転写/翻訳混合物（Promega）、20μMメチオニン、120ng pT7ルシフェラーゼDNA（Promega）、ならびにWTおよび変異型のブーゲニンタンパク質の段階希釈の混合物を、30℃で1時間インキュベートし、その後、反応を、100μlの「SteadyGlow」ルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega）の添加によって停止した。ルシフェラーゼ活性は、Wallac発光カウンターを使用して測定した。活性ブーゲニンタンパク質は、測定されたルシフェラーゼ活性の低下として検出される。各修飾ブーゲニンタンパク質を、少なくとも5つの濃度で試験し、各データ点は2連であった。陽性対照および陰性対照を各実験に含めた。
【０２０７】
単一変異タンパク質についての結果を表4に示す。複数変異修飾ブーゲニンタンパク質についての結果を表5に示す。各場合において、結果は、野生型活性と比較して表現される。すべてのアッセイを、Y70A置換を有する不活性変異ブーゲニンタンパク質を含めて実行した。
【０２０８】
加えて、ルシフェラーゼアッセイの結果をプロットすることができ、これは、加えたブーゲニンのタンパク質濃度を対照と比較したルシフェラーゼ活性%を示す。このようなプロットの例は図1に示され、これは、2つの異なる複数ブーゲニンタンパク質について決定された結果を示す。
【０２０９】
実施例6：T細胞エピトープの損失についての改変体ブーゲニン配列のアッセイ
Bou156と称する複数修飾タンパク質を、免疫原性アッセイを使用するさらなる試験のために選択した。この改変体は、置換V123A、D127A、Y133NおよびI152Aを含む。免疫原性試験は、全体のブーゲニンタンパク質を使用する試験によって損傷され得る生細胞の使用を含み、それゆえに、これらのアッセイは、改変体Bou156に取り込まれた置換を含む合成ペプチドを使用して行った。試験したペプチドは表8に列挙される。アッセイは、20例の個体のPBMCドナープールを使用して、実施例1（上記）に記載される手順に従って行った。ペプチドを、2つの異なる最終ペプチド濃度（1μMおよび5μM）において、各ドナー試料について、3連で試験した。
【０２１０】
結果は、ペプチドあたりドナー試料あたりのSIとして表現し、図2に示す。Del-41はペプチド配列
2008500811.tif 000011
であり、Del-44はペプチド配列
2008500811.tif 000012
である。Del-50はペプチド配列
2008500811.tif 000013
である。どの修飾ペプチドも、任意のドナーにおいてT細胞応答を誘導しなかった（S.I.<2）。対照的に、免疫原性対照ペプチドは、6例のドナーのT細胞を刺激した（S.I.>2）。
【０２１１】
実施例7：VB6-845：脱免疫ブーゲニン（デ-ブーゲニン）の最適送達のためのEp-CAM特異的Fab抗体の組換え操作
本実施例および実施例8のために、使用する脱免疫ブーゲニンはBou156である。
【０２１２】
腫瘍標的化サイトトキシンは、細菌、真菌または植物の毒素に連結された抗体の可変領域から構成される。本研究は、標的化部分に連結された脱免疫ブーゲニンを含む、本明細書の脱免疫ブーゲニン構築物が、それらの生物学的活性をなお保持しながら、免疫原性の低下を有することを例証する。表12は、いくつかの型の腫瘍へのEp-CAM抗体の結合を実証し、従って、これがこれらの型の癌を治療するために使用され得ることを示す。
【０２１３】
脱免疫ブーゲニン構築物：デ-ブーゲニンに連結されたEp-CAM指向性標的化部分
抗Ep-CAM scFv抗体のFabバージョンであるVB5-845は、ブーゲニンの脱免疫型（デ-ブーゲニン）Bou156、強力な植物由来のI型リボソーム不活性化タンパク質（RIP）に遺伝子で連結されて、抗体-毒素構築物VB6-845を作製した。図3は構築物VB6-845を図示する。図3Aは、pelBリーダー配列を有する、プロ-VB6-845のジシストロン単位を図示する。アミノ酸配列（SEQ ID NO:16）および核酸コード配列（SEQ ID NO:15）を、図3Bに提供する。図3Cは、アセンブルされたVB6-845タンパク質を図示し、これは以下により詳細に説明される。この構築物の試験は、この構築物がその生物学的活性（細胞毒性）および標的化部分（Ep-CAM抗体）の特異性を保持していたことを例証する。
【０２１４】
脱免疫ブーゲニン構築物の配向
最適な抗体-デ-ブーゲニンの配向を決定するために、いくつかの型のジシストロン性発現単位を生成し、発現し、および効力について試験した。
【０２１５】
各場合において、ジシストロン単位を、アラビノース誘導性araBADプロモーターの制御下のpING3302ベクター（図4）にクローニングし、E104大腸菌に形質転換した。誘導の際に、pelBリーダー配列の存在は、培養上清へのFab-デ-ブーゲニン融合タンパク質の分泌を方向付けた。切断リンカーは、デ-ブーゲニンを標的化部分から切断すること、およびその生物学的活性を発揮することを可能にした。1つの態様において、リンカーはフューリンリンカーであるが、当業者は、他の切断可能なリンカーが適切であることを認識している。好ましいリンカーは、標的特異性および環境に基づいて選択することができる。作製され、および試験された構築物の試料は以下の通りである：
【０２１６】
図3：VB6-845、ここで、デ-ブーゲニン（Bou156）は、フューリンリンカーを介してCHドメインのC末端に連結される。図3Aは、プロ-配列のジシストロン単位を図示し、図3Bは、プロ-配列の核酸コード配列（SEQ ID NO:15）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:16）を示し、ならびに図3Cは、pelB配列を伴わないアセンブルしたVB6-845タンパク質を図示する。
【０２１７】
図５は植物毒素、デ-ブーゲニン（VB5-845）を伴わない、対照Fab抗-Ep-CAM構築物を図示する。図5Aは、プロ-配列のジシストロン単位を図示し、図5Bは、プロ-配列の核酸コード配列（SEQ ID NO:17）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:18）を図示し、ならびに図5Cは、pelB配列を伴わないアセンブルしたVB6-845タンパク質を図示する。
【０２１８】
図６はFab抗-Ep-CAMデ-ブーゲニン構築物VB6-845-CL-デ-ブーゲニンを図示し、ここでBou156は、CLドメインのC末端で連結されている。図6Aは、プロ配列のジシストロン単位を図示し、図6Bは、プロ配列の核酸コード配列（SEQ ID NO:19）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:20）を図示し、ならびに図6Cは、pelB配列を伴わないアセンブルしたVB6-845-CL-デ-ブーゲニンタンパク質を図示する。
【０２１９】
図７はFab抗-Ep-CAM、デ-ブーゲニン構築物、VB6-845-NVH-デ-ブーゲニンを図示し、ここでBou156は、VHドメインのN末端に連結されている。図7Aは、プロ配列のジシストロン単位を図示し、図7Bは、プロ配列の核酸コード配列（SEQ ID NO:21）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:22）を図示し、ならびに図7Cは、pelB配列を伴わないアセンブルしたVB6-845-NVH-デ-ブーゲニンタンパク質を図示する。
【０２２０】
図８はFab抗-Ep-CAMデ-ブーゲニン構築物、VB6-845-NVH-デ-ブーゲニンを図示し、ここでBou156は、VLドメインのN末端に連結されている。図8Aは、プロ配列のジシストロン単位を図示し、図8Bは、プロ配列の核酸コード配列（SEQ ID NO:23）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:24）を図示し、ならびに図8Cは、pelB配列を伴わないアセンブルしたVB6-845-NVH-デ-ブーゲニンタンパク質を図示する。
【０２２１】
1つの態様において、デ-ブーゲニン分子は、重鎖または軽鎖のC末端に連結される。最適な配置は、第1の単位としてN末端ヒスチジンアフィニティータグを有するVH-CHドメインに隣接するpelBリーダー配列を含んだ。直後に、プロテアーゼ感受性リンカーによってデ-ブーゲニンに連結されたpelB-VL-CLを含む第2の単位が存在した。（図6）デ-ブーゲニンがN末端に再配置された構築物については、ウェスタンブロット分析は、検出可能な生成物を示さず、C末端連結デ-ブーゲニン（図3および6の構築物）は、フローサイトメトリーによって検出された反応性試験において例証されるように、Ep-CAM-陽性細胞株に対して良好な結合特性で、インタクトな可溶性タンパク質を生じた（図9）。ウェスタンブロット分析において、図9は、実験室スケールで、誘導されたE104細胞の上清におけるVB6-845およびVB6-845 CL-デ-ブーゲニンの発現を図示する。上清のアリコート、16マイクロリットルを、非還元条件下で、SDS-PAGEアクリルアミドゲル上にロードし、ウサギポリクローナル抗4D5抗体、続いてヤギ抗ウサギ（1/2000）、またはヤギ抗ヒトκ-軽鎖-HRP抗体（1/1000）のいずれかを使用するウェスタンブロットによって分析し、組換えタンパク質の同一性およびサイズを確認した。矢印は、全長VB6-845（図3の構築物）およびVB6-845-CL-デ-ブーゲニン（図6の構築物）を示す。誘導していないE104培養上清のウェスタンブロッティングは対応するバンドを示さず、抗体の特異性を実証する（データ示さず）。
【０２２２】
対照（Ep-CAM-陰性細胞株、A-375）と比較した場合の、Ep-CAM陽性細胞株CAL 27およびNIH:OVCAR-3に対する、VB6-845（図3）およびVB6-845-CL-デ-ブーゲニン（図6）を用いる反応性試験の結果を、図10Aに示す。結果は、デ-ブーゲニンが別の植物毒素、ゲロニンで置き換えられている別の抗Ep-CAM構築物、VB6-845-ゲロニン（そのアミノ酸配列（SEQ ID NO:26）および核酸配列（SEQ ID NO:25）を示す図14Cを参照されたい）を用いて行った同じ反応性試験と比較し得るものであった。ゲロニン構築物を用いた反応性試験の結果を図10Bに図示する。最適な配向を有する分子中の第2のデ-ブーゲニンドメインの付加は、生成物を生じなかった。
【０２２３】
フローサイトメトリー試験は、氷上で1時間、0.45×106細胞と、構築物または対照をインキュベートすることによって行った。洗浄後、細胞表面構築物は、ウサギ抗ブーゲニン（図10A）またはマウス抗Hisタグ（図10B）を用いて、氷上で1時間検出した。細胞を洗浄し、FITC結合体化ヒツジ抗ウサギIgG（図10A）およびFITC結合体化ヒツジ抗マウス（IgG）（図10B）とともに30分間氷上でインキュベートした。引き続いて、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによる抗体結合の評価のために、ヨウ化プロピジウムを含むPBS 5% FCSに再懸濁した。メジアン蛍光のシフトは、VB6-845およびA-375を伴うVB6-845-CL-デ-ブーゲニンとのインキュベーション後に検出されなかった。対照的に、メジアン蛍光の顕著なシフトが、Ep-CAM陽性細胞株、CAL 27およびNIH:OVCAR-3（図10A）を用いて観察された。上記に言及したように、VB6-845を用いた結果は、ゲロニン構築物と同様であった（図10B）。
【０２２４】
Ep-CAM特異性
VB6-845のscFv形式であるがシュードモナスエキソトキシンAを含む、Proxinium（商標）とのVB6-845（図3の構築物）の競合アッセイは、VB6-845のEp-CAM特異性がFab形式に操作されたときに変化しなかったことを実証した（図11）。
【０２２５】
図11は競合アッセイの結果を図示し、ここでは、1および10μg/mLのVB6-845ならびに0〜100μg/mLの範囲である増加濃度のProxinium（商標）を、NIH:OVCAR-3細胞（Ep-CAM陽性腫瘍細胞株）とともにインキュベートした。4℃での1時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、結合したVB6-845を、ビオチン化ウサギ抗ブーゲニン、次にストレプトアビジン-サイクロムで検出した。同じ実験を4B55-PEを用いて実行し、これを陰性対照として使用する。反応条件は図11に示したものと同じである。
【０２２６】
効力（生物学的活性）
加えて、無細胞（図12）およびMTS（図13AおよびB）アッセイは、Fabフラグメントに結合体化された場合に、デ-ブーゲニンがその効力を保持することを実証した。効力を測定するために使用したMTSアッセイは、当技術分野において公知であり、かつ実施例8において以下により十分に記載されている標準的な技術を使用して行った。Ep-CAM-陽性細胞株、CAL 27およびNIH:OVCAR-3を使用して、VB6-845のIC50は、それぞれ、3〜4nMおよび2〜3nMであった。VB6-845-CL-デ-ブーゲニンの場合において、CAL 27について1〜2nMで測定され、NIH:OVCAR-3に対しては0.6〜0.7nMで測定された。脱免疫ブーゲニンに連結されたヒト腫瘍標的化抗体フラグメントを含むFab抗Ep-CAM構築物の開発は、この薬物の反復全身投与を可能にするはずであり、従って、より大きな臨床的な利点を生じる。
【０２２７】
構築物の収集
この構築物は、当技術分野で公知である技術によって細胞培養から単離することができる。例えば、Hisタグがペプチド構築物のN末端に配置される場合、Fab-ブーゲニンタンパク質は、Ni2+-キレート捕捉法を使用して精製され得る。例として以下のプロトコールを使用し得る。
【０２２８】
VB6-845改変体の供給バッチ発酵の実行を、15LのCHEMAPファーメンター中で、TB培地を使用して実行した。20のOD600において（対数期中）、培養を、供給物ならびに50%グリセロールおよび200g/l L-アラビノースを含むインデューサーの混合物で誘導する。誘導の30分後、培養物を収集し、8000rpmで30分間遠心分離し、およびVB6-845改変体を、CMセファロースおよび金属荷電キレートセファロースカラム、続いてサイズ排除カラムを使用して精製した。手短に述べると、上清を濃縮し、20mM リン酸ナトリウムpH 6.9±0.1に対してダイアフィルトレーションを行う。次いで、ダイアフィルトレーションを行った濃縮上清を、20mM リン酸ナトリウム、25mM NaCl pH 6.9±0.1で平衡化したCMセルロースカラム上に適用する。このカラムを、20mM リン酸ナトリウム、25mM NaCl pH 6.9±0.1で洗浄し、結合したVB6-845を、20mM リン酸ナトリウム、150mM NaCl pH 7.5±0.1で引き続き溶出する。CMセファロース溶出物を、最終濃度0.25% Triton-X100を含むように調整し、荷電キレートセファロースカラムに適用する。次いで、キレートセファロースカラムを3つの異なる緩衝液-20mM リン酸ナトリウム、150mM NaCl、0.25% Triton-X100、pH 7.5±0.1で開始、続いて、20mM リン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH 7.5±0.1、および続いて20mM リン酸ナトリウム、150mM NaCl、10mMイミダゾール、pH 7.5±0.1で洗浄する。次いで、結合したVB6-845を、20mM リン酸ナトリウム、150mM NaCl、250mMイミダゾール、pH 7.5±0.1で溶出し、2mL画分で収集する。A280における吸光度を各画分について測定し、>80%の純度を得るために、プールした物質を含む画分を、サイズ排除カラムS200に適用する。1つの態様において、タンパク質の純度を増大させ、かつエンドトキシンを除去するために、プールしたSEC画分を、20mM NaPO4、pH 7.5で5倍に希釈し、20mM NaPO4、25mM NaCl pH 7.5で平衡化したQ-セファロース15mlファストフローカラムに、約5ml/分の流速で通過させる。カラムを通しての試料の適用後、カラムを10CVの平衡緩衝液で洗浄し、洗浄液を、最初のQ-セファロースのフロースルーとともにプールする。溶出液を、30kDa MWCOメンブレン（Sartorius hydrosart membrane］の使用を通して、7.5mg/mlの最終濃度を達成するように〜10倍まで濃縮する。次いで、Tween-80を、0.1%の最終濃度まで加える。この最終生成物を滅菌濾過し、-80℃で保存する。プロセスの各段階の試料を、抗4D5抗体を用いるイムノブロッティング後のウェスタンブロットによって分析する。純度を、コロイダルブルー染色によって確認する。VB6-845改変体の発現のレベルを、ウェスタンブロット分析およびELISAによって決定する。
【０２２９】
実施例8：VB6-845の機能的および生物学的特徴付け、脱免疫ブーゲニン（デ-ブーゲニン）と遺伝子で連結された組換えEp-CAM特異的Fab抗体
化学療法剤は、固形腫瘍癌の多くの治療において、しばしば注意基準を表す高度な細胞毒性薬剤である。これらの薬物の細胞毒性作用は、正常細胞と腫瘍の両方の急速に分裂している細胞を標的とし、従って、種々の有害な臨床的副作用を生じる。VB6-845は、植物由来の毒素ブーゲニンの脱免疫型に連結されたFab抗体である。規定された腫瘍標的特異性を欠く化学療法剤とは異なり、VB-845は、Ep-CAM-陽性腫瘍標的のみに対して、その細胞溶解性効果を制限する。本研究において、フローサイトメトリー分析および細胞毒性は、VB6-845の効力および選択性を評価するために測定した。
【０２３０】
フローサイトメトリー
本研究において使用される腫瘍細胞株はATCCから購入し、細胞株C-4I、TOV-112Dを、それぞれ、RPMI 1640または10% FCSを補充したDMEM中で増殖させた以外は、ATCCの推奨に従って増殖させた。腫瘍細胞を、90%を超える生存度で、60〜70%コンフルエンスで収集した。ヒト正常乳房上皮細胞（HMEC）をCAMBREXから購入し、CAMBREXから提供される手順に従う特定の培地中で維持した。細胞を、90%を超える生存度で、70%コンフルエンスで収集した。
【０２３１】
子宮内膜、卵巣、および子宮頸部の癌の徴候からの女性生殖器細胞株を、フローサイトメトリーで、VB6-845結合について試験した（表9）。10マイクログラム/mLのVB6-845を各細胞株に加え（3×105細胞）、4℃で2時間インキュベートした。A-375および CAL 27を、陰性対照および陽性対照の細胞株として使用した。未結合物質を洗浄した後、10%FCSを含むPBS中で1/800希釈したマウスモノクローナル抗-ヒスチジン抗体（Amersham Pharmacia, カタログ番号27471001）を加え、さらに4℃で1時間インキュベートした。次に、PBS-10% FCS中で1/100希釈したFITC標識抗マウスIgG（The Binding Site, カタログ番号AF271）を加え、4℃で30分間インキュベートした。最後に、細胞を、ヨウ化プロピジウム染色後にFACS Calibur上で分析し、死滅した細胞はゲートを開けて選別した。
【０２３２】
細胞毒性
フローサイトメトリー研究において列挙された、細胞中のVB6-845についての殺傷のレベルは表10に示す通りであり、これは、構築物が、Ep-CAM-陽性細胞株に対するそのデ-ブーゲニン細胞毒性活性を保持していたことを示した。この細胞毒性は、異なる植物由来の毒素であるゲロニンを含む別のFab VB6-845改変体と比較し得るものであった（図14）。図14Aは、ゲロニン、Fab 抗-Ep-CAM-ゲロニン構築物（VB6-845-ゲロニン）およびFab 抗-Ep-CAM-デ-ブーゲニン（Bou156）構築物（VB6-845）を、CAL27（図14A）およびNIH:OVCAR-3細胞（図14B）において比較する。VB6-845-ゲロニン構築物の核酸配列およびアミノ酸配列を、図14Cに図示する。
【０２３３】
VB6-845（図3の構築物）の特異性および選択性を研究するために、VB6-845(純度90%)の細胞毒性活性を、17種の化学療法薬物（LKB Laboratories Inc.）とともに、Ep-CAM-陽性（NIH:OVCAR-3）細胞株およびEp-CAM-陰性（HMEC、DAUDI、A-375）細胞株に対して試験した。
【０２３４】
MTSアッセイを、当技術分野において公知の標準的な技術を使用して実施した。より詳細には、50マイクロリットルの細胞（2×104細胞/ml）をウェルあたりに播種し、プレートを、5% CO2下で、37℃で2時間インキュベートした。次いで、50マイクロリットルのスパイク薬物（すなわち、試験される構築物または対照）を、増加濃度で培養培地に加えた。細胞を含むかまたは含まない培養培地は、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。プレートを、5% CO2下で、37℃で5日間放置した。5日目に、細胞増殖の阻害を、20マイクロリットルのMTS試薬（Promega, カタログ番号G5430）を加えることによって評価した。プレートを、5% CO2下で、37℃でさらに2時間インキュベートし、プレートリーダーの分光光度計を使用して、490nmでODを読み取った。バックグラウンド値を、各濃度について得られた試料の値から減算し、結果を、生存している細胞の割合として表した。各薬物についてのIC50値は、各細胞株について計算した。
【０２３５】
Ep-CAM陽性卵巣癌腫であるNIH:OVCAR-3に対する細胞毒性についてアッセイされたとき、標準的な化学療法剤のパネルを使用して、VB6-845は、試験された17種の薬物のうち12種の薬物よりも強力であることが示された（表11）。5種の化学療法剤はより細胞毒性が強かったが、これらは、任意の細胞特異的な殺傷を欠くという点で、はるかにより毒性が高いことが示された。卵巣癌の治療のための5種の推奨される化学療法剤（パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、ドキソルビシン、およびトポテカン）のうちで、2種のみ（パクリタキセルおよびトポテカン）がより細胞毒性であった。VB6-845は1〜2nMの範囲において高度に強力な細胞溶解活性を実証したが、強力な殺傷は、Ep-CAM-陽性腫瘍細胞株NIH:OVCAR-3に独占的に制限された。Ep-CAM陰性細胞株のある程度の殺傷は、VB6-845を用いて示されたが、細胞毒性効果は、少なくとも220倍、および最大で>1000倍毒性が弱かった。従って、VB6-845は、より低い毒性プロフィールと組み合わせたときに、多くの異なる型の固形腫瘍の治療においてはるかな有望性を保持する、化学療法剤に対して代替的な、強力な抗体指向性治療を表す。
【０２３６】
実施例9：VB6-011：脱免疫ブーゲニン（デ-ブーゲニン）の最適な送達のための腫瘍関連抗原特異的Fabの組換え操作
腫瘍標的化サイトトキシンは、細菌、真菌または植物の毒素に連結された抗体の可変領域から構成される。本研究は、標的化部分に連結された脱免疫ブーゲニンを含む本発明の脱免疫化ブーゲニン構築物が、生物学的活性をなお保持しながら、免疫原性の低下を有することを例証する。表13は、いくつかの型の腫瘍への、腫瘍関連抗原抗体の結合を実証し、従って、これは、これらの型の癌を治療するために使用され得ることを示す。
【０２３７】
脱免疫ブーゲニン構築物：デ-ブーゲニンに連結された腫瘍関連抗原指向性標的化部分
腫瘍関連抗原を認識するモノクローナル抗体であるH11抗体を、ブーゲニンの脱免疫型（デ-ブーゲニン）、Bou156、すなわち強力な、植物由来の、1型リボソーム不活性化タンパク質（RIP）に遺伝子で連結して、抗体-毒素構築物VB6-011を作製した。図15は、核酸コード配列およびアミノ酸配列を図示する。この構築物の試験は、この構築物がその生物学的活性（細胞毒性）を保持していたことを例証する。
【０２３８】
効力（生物学的活性）
MTSアッセイは、Fabフラグメントに結合体化されたときに、デ-ブーゲニンがその効力を保持していていたことを実証した（図16）。効力を測定するために使用したMTSアッセイは、当技術分野において公知である標準的な技術を使用して実行し、実施例8においてより完全に説明される。
【０２３９】
細胞毒性
VB6-011の特異性および選択性を研究するために、細胞毒性活性を、MB-435S細胞に対して試験した。MTSアッセイは、当技術分野において公知である標準的な技術を使用して実行した。より詳細には、50マイクロリットルの細胞（2×104細胞/ml）をウェルあたりに播種し、プレートを、5% CO2下で、37℃で2時間インキュベートした。次いで、50マイクロリットルのスパイク薬物（すなわち、試験される構築物または対照）を、増加濃度で培養培地に加えた。細胞を含むかまたは含まない培養培地は、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。プレートを、5% CO2下で、37℃で5日間放置した。5日目に、細胞増殖の阻害を、20マイクロリットルのMTS試薬（Promega, カタログ番号G5430）を加えることによって評価した。プレートを、5% CO2下で、37℃でさらに2時間インキュベートし、プレートリーダーの分光光度計を使用して、490nmでODを読み取った。バックグラウンド値を、各濃度について得られた試料の値から減算し、結果を、生存している細胞のパーセントとして表現した。結果は、VB6-011のIC50値が350nMであることを示す。
【０２４０】
本発明は、好ましい実施例であると現在見なされているものを参照して説明されてきたが、本発明が開示された実施例に限定されないことは理解されるべきである。それとは反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の改変および等価なアレンジメントを網羅することが意図される。
【０２４１】
すべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物、特許、および特許出願が、具体的にかつ個別に、それらの全体が参照により組み入れられことが示されるのと同じ程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４２】
（表１）
2008500811.tif 000014
ブーゲニン配列ペプチド。下線を付した残基は成熟タンパク質においては存在しない。
【０２４３】
（表２）
2008500811.tif 000015
PBMCドナーのMHCアロタイプ
【０２４４】
（表３）
2008500811.tif 000016
WTブーゲニン遺伝子の構築において使用したプライマーの配列
【０２４５】
（表４）構築および試験された単一置換ブーゲニン改変体
2008500811.tif 000017
*ルシフェラーゼ活性における活性：
++=WTタンパク質と同等か高い。+=WT活性の2倍以内。+/-=WT活性の3倍以内。--=WT活性の3分の1未満。WT=野生型タンパク質。
**クローンID。機能的活性改変体についての命名のみ。
【０２４６】
（表５）構築および試験された複数置換ブーゲニン改変体
2008500811.tif 000018
*ルシフェラーゼ活性における活性：
++=WTタンパク質と同等か高い。+=WT活性の2倍以内。+/-=WT活性の3倍以内。--=WT活性の3分の1未満。WT=野生型タンパク質。
【０２４７】
（表６）
2008500811.tif 000019
＊番号付けはブーゲニンリーディングフレームの残基1から開始し、それゆえに、大部分の構築物中に含まれるPelBリーダー配列を除外している。
【０２４８】
（表７）
2008500811.tif 000020
【０２４９】
（表８）T細胞アッセイにおいてさらに試験されたブーゲニンの修飾ペプチドおよびWTペプチド
2008500811.tif 000021
＊置換された（変異）残基に下線を付した。
【０２５０】
（表９）フローサイトメトリーによる女性生殖器細胞株へのVB6-845の結合
結果はMF±SEMで、倍数増加として表現する。
2008500811.tif 000022
【０２５１】
（表１０）MTSアッセイにおけるVB6-845媒介細胞毒性
2008500811.tif 000023
【０２５２】
（表１１）化学療法剤に対する、VB6-845の特異性および選択性
2008500811.tif 000024
【０２５３】
（表１２）VB6-845腫瘍細胞徴候
2008500811.tif 000025
1 Nは、徴候あたりに試験された細胞株の数を示す。
2 各徴候におけるすべての細胞株からの、対照抗体に対するメジアン蛍光の平均倍数増加
【０２５４】
（表１３）VB6-011腫瘍細胞徴候
2008500811.tif 000026
1 Nは、徴候あたりに試験された細胞株の数を示す。
2 値は、各徴候におけるすべての細胞株からの、対照抗体に対するメジアン蛍光の平均倍数増加の合計から計算した平均を示す。0値は、対照活性と比較して、測定可能な反応性がないことを意味する。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
本発明は、ここで図面を参照して説明される。
【図１】T細胞エピトープ欠失修飾ブーゲニンタンパク質Bou156（パネルA）およびBou157（パネルB）の活性アッセイの結果を示す。Bou156は、置換V123A、D127A、Y133NおよびI152Aを含む。Bou157は、置換V123A、D127A、Y133QおよびI152Aを含む。両方のアッセイセットは、対照として、野生型タンパク質および活性のない修飾ブーゲニン（Y70A）を使用して行われる。活性は、このアッセイにおけるブーゲニンタンパク質の濃度に対する、測定されたルシフェラーゼ活性%として表現される。
【図２】3つの合成ペプチドおよび2つの異なるPBMCドナー試料についてのT細胞増殖アッセイの結果を示す。Del-41、Del-44およびDel-50と称されたペプチドは、1μM最終濃度（パネルA）および5μM最終濃度（パネルB）で試験された。これらのペプチドは、ブーゲニン分子の免疫原性領域から導き出され、それらの免疫原性を除去するように設計された置換を含む。
【図３】Fab抗-Ep-CAMを有する修飾ブーゲニンサイトトキシンであるVB6-845を図示し、ここで、デ-ブーゲニン（Bou156）は、フューリンリンカーを介してCHドメインのC末端に連結される。図3Aは、プロ-配列をコードするジシストロン単位を図示し、図3Bは、プロ-配列の核酸コード配列（SEQ ID NO:15）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:16）を示し、ならびに図3Cは、pelB配列を伴わないアセンブルしたVB6-845タンパク質を図示する。
【図４】発現ベクターpING3302のマップを図示する。挿入された例は、EcoRIおよびXhoI制限部位を使用して3302ベクター中で連結された。
【図５】植物毒素、デ-ブーゲニン（VB5-845）を伴わない、対照Fab抗-Ep-CAM構築物を図示する。図5Aは、プロ-配列をコードするジシストロン単位を図示し、図5Bは、プロ-配列の核酸コード配列（SEQ ID NO:17）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:18）を図示し、ならびに図5Cは、pelB配列を伴わないアセンブルしたVB5-845タンパク質を図示する。
【図６】Fab抗-Ep-CAMデ-ブーゲニン構築物VB6-845-CL-デ-ブーゲニンを図示し、ここでBou156は、CLドメインのC末端で連結されている。図6Aは、プロ配列をコードするジシストロン単位を図示し、図6Bは、プロ配列の核酸コード配列（SEQ ID NO:19）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:20）を図示し、ならびに図6Cは、pelB配列を伴わないアセンブルしたVB6-845-CL-デ-ブーゲニンタンパク質を図示する。
【図７】Fab抗-Ep-CAM、デ-ブーゲニン構築物、VB6-845-NVH-デ-ブーゲニンを図示し、ここでBou156は、VHドメインのN末端に連結されている。図7Aは、プロ配列をコードするジシストロン単位を図示し、図7Bは、プロ配列の核酸コード配列（SEQ ID NO:21）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:22）を図示し、ならびに図7Cは、pelB配列を伴わないアセンブルしたVB6-845-NVH-デ-ブーゲニンタンパク質を図示する。
【図８】Fab抗-Ep-CAMデ-ブーゲニン構築物、VB6-845-NVL-デ-ブーゲニンを図示し、ここでBou156は、VLドメインのN末端に連結されている。図8Aは、プロ配列をコードするジシストロン単位を図示し、図8Bは、プロ配列の核酸コード配列（SEQ ID NO:23）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:24）を図示し、ならびに図8Cは、pelB配列を伴わないアセンブルしたVB6-845-NVL-デ-ブーゲニンタンパク質を図示する。
【図９】実験室スケールで誘導されたE104の上清中でのVB6-845（図3の構築物）およびVB6-845-CL-デ-ブーゲニン（Bou156）（図6の構築物）の発現を図示するウェスタンブロットである。
【図１０】フローサイトメトリー反応性研究の結果を図示する。図10Aは、EP-CAM-ポジティブ細胞株CAL27およびOVCAR-3ならびにEp-CAM-ネガティブ細胞株A-375中でのVB6-845（図3の構築物）およびVB6-845-CL-デ-ブーゲニン（Bou156）（図6の構築物）の反応性を図示するのに対して、図10Bは、VB6-845（図3の構築物）およびVB6-845-ゲロニン（図14Cの構築物）および対照（PBS）を用いて行った同じ試験の結果を図示する。
【図１１】NIH:OVCAR-3細胞における、かつ実施例7に記載されるような競合アッセイ-VB6-845およびProxinium（商標）の結果を図示するグラフである。
【図１２】実施例7の無細胞アッセイの結果を図示するグラフである。
【図１３】CAL27（図13A）およびNIH:OVCAR3（図13B）細胞における、VB6-845（図3の構築物）、VB6-845-CL-デ-ブーゲニン（図6の構築物）およびデ-ブーゲニン（Bou156）の細胞毒性を比較する、実施例8のMTS細胞語句性アッセイの結果を図示する。
【図１４】図14AおよびBは、CAL27（図14A）およびNIH:OVCAR3（図14B）細胞における、VB6-845（図3の構築物）、VB6-845-ゲロニン（図14Cの構築物）およびゲロニンの細胞毒性を比較する、実施例8のMTS細胞語句性アッセイの結果を図示する。図14Cは、VB6-845-ゲロニン構築物の核酸コード配列（SEQ ID NO:25）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:26）を図示する。
【図１５】VB6-011のプロ配列の核酸コード配列（SEQ ID NO:27）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO:28）を図示する。
【図１６】MB-435S細胞中のVB6-011の細胞毒性を示す実施例9のMTS細胞毒性アッセイの結果を図示する。
【図１】
2008500811.tif 000034
【図２】
2008500811.tif 000035
【図３Ａ】
2008500811.tif 000036
【図３Ｂ（２−１）】
2008500811.tif 000037
【図３Ｂ（２−２）】
2008500811.tif 000038
【図３Ｃ】
2008500811.tif 000039
【図４】
2008500811.tif 000040
【図５Ａ】
2008500811.tif 000041
【図５Ｂ（２−１）】
2008500811.tif 000042
【図５Ｂ（２−２）】
2008500811.tif 000043
【図５Ｃ】
2008500811.tif 000044
【図６Ａ】
2008500811.tif 000045
【図６Ｂ（３−１）】
2008500811.tif 000046
【図６Ｂ（３−２）】
2008500811.tif 000047
【図６Ｂ（３−３）】
2008500811.tif 000048
【図６Ｃ】
2008500811.tif 000049
【図７Ａ】
2008500811.tif 000050
【図７Ｂ（２−１）】
2008500811.tif 000051
【図７Ｂ（２−２）】
2008500811.tif 000052
【図７Ｃ】
2008500811.tif 000053
【図８Ａ】
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【図８Ｂ（２−１）】
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【図８Ｂ（２−２）】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ（３−１）】
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【図１４Ｃ（３−２）】
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【図１４Ｃ（３−３）】
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【図１５（３−１）】
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【図１５（３−２）】
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【図１５（３−３）】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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