(57)【要約】  ここでは、マンノースエピメラーゼにより形質転換された酵母からアスコルビン酸を製造する方法を開示する。別の態様において、酵母は更にミオイノシトールホスファターゼにより形質転換されてもよい。その方法においては、形質転換された酵母がＤ‐グルコースからＬ‐アスコルビン酸を生産しうる。形質転換された酵母は、適切な培地において培養された場合に、増加した増殖率、細胞密度、または生存性を有することが観察された。
2008536497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ‐アスコルビン酸の製造方法であって、
ａ）マンノースエピメラーゼ（ＭＥ）をコードするコード領域において機能的に形質転換された組換え酵母を得て、
ｂ）Ｄ‐グルコースを含む培地において前記組換え酵母を培養し、それによりＬ‐アスコルビン酸を形成させ、そして
ｃ）Ｌ‐アスコルビン酸を単離すること
を含んでなることを特徴とする、製造方法。
【請求項２】
前記組換え酵母が、ミオイノシトールホスファターゼ（ＭＩＰ）をコードするコード領域において更に機能的に形質転換されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵母が、属Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Debaromyces、Nadsonia、Lipomyces、Torulopsis、Kloeckera、Pichia、Schizosaccharomyces、Trigonopsis、Brettanomyces、Cryptococcus、Trichosporon、Aureobasidium、Lipomyces、Phaffia、Rhodotorula、Yarrowia、またはSchwanniomycesに属するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵母が種S.cerevisiae、K.lactis、またはZ.bailiiに属するものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵母が、S.cerevisiae株ＧＲＦ１８Ｕ、S.cerevisiae株Ｗ３０３１Ｂ、ＢＹ４７４２、およびＹＭＬ００７ｗ、K.lactis株ＣＢＳ２３５９、またはZ.bailii株ＡＴＣＣ６０４８３から選択されるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＥが配列番号１と少なくとも約９５％の同一性を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＥが配列番号１と少なくとも約９８％の同一性を有するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＩＰが配列番号２と少なくとも約９５％の同一性を有するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＩＰが配列番号２と少なくとも約９８％の同一性を有するものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵母が、Ｌ‐ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ‐アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ‐アラビノノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、またはＬ‐グロノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）から選択される酵素をコードするコード領域において更に機能的に形質転換されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記コード領域が、酵母において活性なプロモーターへ結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロモーターがS.cerevisiaeトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離工程が酵母を溶解させることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離工程が、遠心、濾過、マイクロ濾過、限外濾過、ナノ濾過、液体‐液体抽出、結晶化、ヌクレアーゼもしくはプロテアーゼによる酵素処理、またはクロマトグラフィーを更に含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離工程が、クロマトグラフィー、活性炭、マイクロ濾過、限外濾過、ナノ濾過、液体‐液体抽出、または結晶化を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵母が、マンノースエピメラーゼ（ＭＥ）をコードするコード領域において機能的に形質転換されたものである、組換え酵母。
【請求項１７】
前記組換え酵母が、ミオイノシトールホスファターゼ（ＭＩＰ）をコードするコード領域において更に機能的に形質転換されたものである、請求項１６に記載の組換え酵母。
【請求項１８】
前記ＭＥが配列番号１と少なくとも約９５％の同一性を有するものである、請求項１６に記載の組換え酵母。
【請求項１９】
前記ＭＩＰが配列番号２と少なくとも約９５％の同一性を有するものである、請求項１７に記載の組換え酵母。
【請求項２０】
前記酵母が、Ｌ‐ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ‐アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ‐アラビノノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、またはＬ‐グロノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）から選択される酵素をコードするコード領域において更に機能的に形質転換されたものである、請求項１６に記載の組換え酵母。
【請求項２１】
マンノースエピメラーゼ（ＭＥ）をコードするコード領域において微生物を機能的に形質転換することを含んでなる、発酵に際して微生物により生産される産物の生産高、生産力、または収率を増加させる方法。
【請求項２２】
更に、ミオイノシトールホスファターゼ（ＭＩＰ）をコードするコード領域において微生物を機能的に形質転換することを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物が、細菌、酵母、糸状菌、動物細胞、および植物細胞からなる群より選択されるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵母が種S.cerevisiae、K.lactis、またはZ.bailiiに属するものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵母が株S.cerevisiae ＧＲＦに属するものである、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、一般に、アスコルビン酸生産の分野に関する。更に詳細には、組換え酵母を含めた酵母からのＬ‐アスコルビン酸の生産方法に関する。
【０００２】
２．関連技術の説明
Ｌ‐アスコルビン酸（ビタミンＣ）は、ヒトにおいて全組織型(all tissue types)の成長および維持に不可欠な、強力な水溶性酸化防止剤である。アスコルビン酸の重要な役割の一つに、結合組織、筋肉、腱、骨、歯、および皮膚の必須細胞成分であるコラーゲンの生産への関与がある。コラーゲンは、血管、挫傷、および骨折の修復にも必要である。アスコルビン酸は血圧の調節に役立ち、コレステロールレベルの低下に寄与し、動脈壁からコレステロール沈着物の除去を助ける。アスコルビン酸は、葉酸の代謝も助け、鉄の取込みを調節し、ノルアドレナリンへのアミノ酸Ｌ‐チロシンおよびＬ‐フェニルアラニンの変換に必要とされる。睡眠、疼痛制御(pain control)、および幸福感に関与する神経ホルモン、セロトニンへのトリプトファンの変換にも、アスコルビン酸の十分な供給を必要とする。
【０００３】
アスコルビン酸の欠乏は、コラーゲンの生産を損ない、関節痛、貧血、神経質、および発育遅延へ至ることがある。他の影響には、免疫応答の低下および感染症をおこしやすくなることがある。アスコルビン酸欠乏症の最も極端な形態は、関節の腫脹、歯肉の出血、および皮膚の表面下において毛細血管の出血により顕在化される症状、すなわち壊血病である。未治療のままだと、壊血病は致命的である。腸はアスコルビン酸を容易に吸収するが、それは摂取から２〜４時間以内で尿へ排出される。したがって、それは体内において貯蔵されない。Ｌ‐アスコルビン酸は全ての高等植物とほとんどの高等動物の肝臓または腎臓において生産されるが、ヒト、コウモリ、一部の鳥類、および様々な魚類において生産されない。したがって、ヒトは、最良の健康を維持するために、十分な食物源または補助食品から十分量のアスコルビン酸を入手しなければならない。
【０００４】
アスコルビン酸の食物源には、シトラスフルーツ、ジャガイモ、コショウ、緑葉野菜、トマト、およびベリーがある。アスコルビン酸は、丸剤、錠剤、粉末、ウェハース(wafers)、およびシロップの形態により補助食品としても市販されている。
【０００５】
Ｌ‐アスコルビン酸は米国食品医薬品局により栄養補助食品および化学保存剤として使用承認され、一般的に安全と認められた物質のＦＤＡのリストが掲載されている。Ｌ‐アスコルビン酸は、ソフトドリンクのフレーバー成分用の酸化防止剤、肉および肉含有製品、保存加工およびピクリング、小麦粉の焼き具合改良、ビールの安定剤、油脂の酸化防止剤、および様々な食品のアスコルビン酸強化用に用いられている。Ｌ‐アスコルビン酸は、しみ抜き剤、ヘアケア製品、プラスチック製造、写真撮影、および水処理にも利用法を有しうる。
【０００６】
アスコルビン酸へ至る生合成経路の酵素は、まだ完全には特定されていない。植物における生理学的経路の現時点において判明していることを図１に示す。
【０００７】
二つの別々な経路が植物においてアスコルビン酸合成に関して報告された。一つの経路では、Ｌ‐アスコルビン酸はＤ‐グルコースからＬ‐ソルボソンを経由して合成される（Loewus M.W.et al.,1990,Plant.Physiol.,94,1492-1495）。現在までの証拠によると、主要な生理学的経路がＤ‐グルコースからＬ‐ガラクトースおよびＬ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンを経由してＬ‐アスコルビン酸へ進むことが示されている（Wheeler G.L.et al.,1998,Nature,393,365-369）。最後の二つの工程は、酵素Ｌ‐ガラクトースデヒドロゲナーゼおよびＬ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンデヒドロゲナーゼにより触媒される。最後の酵素が単離および特徴づけられ、Brassica oleraceaからの遺伝子が複製され、そして配列決定された（Ostergaard J.et al.,1997,J.Biol.Chem.,272,30009-30016）。
【０００８】
栄養補助食品としての用途では、アスコルビン酸は天然源から単離しても、またはReichstein工程のバリエーションの場合のようにＬ‐ソルボースの酸化により化学的に合成してもよい（米国特許第２，２６５，１２１号）。
【０００９】
利便性の高い工程によるアスコルビン酸の生産方法が望まれている。合成は、アスコルビン酸のＬ‐エナンチオマーのみが生物学的に活性であるため、エナンチオ選択的でなければならない。
【００１０】
一つの可能な方法は、微生物からのＬ‐アスコルビン酸の生産である。微生物は工業規模で容易に増殖させられる。微生物および真菌からのＬ‐アスコルビン酸の生産は過去に報告されたが、Ｌ‐アスコルビン酸ではなくＬ‐アスコルビン酸類似体であることが最近の証拠により明らかにされてる（Huh W.K.et al.,1998,Mol.Microbiol.,30,4,895-903、Hancock R.D.et al.,2000,FEMS Microbiol.Let.,186,245-250、Dumbrava V.A.et al.,1987,BBA,926,331-338、Nick J.A.et al.,1986,Plant Science,46,181-187）。酵母（CandidaおよびSaccharomyces種）においては、エリトロアスコルビン酸の生産が報告された（Huh W.K.et al.,1994,Eur.J.Biochem.,225,1073-1079、Huh W.K.et al.,1998,Mol.Microbiol.,30,4,895-903）。このような酵母においては、Ｄ‐グルコースからＤ‐アラビノースおよびＤ‐アラビノノ‐１，４‐ラクトンを経由してエリトロアスコルビン酸へと進行する生理学的経路が提案された（Kim S.T.et al.,1996,BBA,1297,1-8）。Candida albicansおよびS.cerevisiaeからの酵素Ｄ‐アラビノースデヒドロゲナーゼおよびＤ‐アラビノノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼの特性が明らかにされた。興味深いことに、Ｌ‐ガラクトースおよびＬ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンが、インビトロにおけるこれらの活性に対する基質である。
【００１１】
Ｌ‐アスコルビン酸のインビボにおける生産は、野生型Candida細胞へＬ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンを供給することにより得られた（国際特許出願ＷＯ８５／０１７４５号）。最近、Ｌ‐ガラクトース、Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトン、またはＬ‐グロノ‐１，４‐ラクトンとともに培養された場合に、野生型S.cerevisiae細胞がＬ‐アスコルビン酸を細胞内に蓄積することが示された（Hancock et al.,2000,FEMS Microbiol.Lett.,186,245-250、Spickett C.M.et al.,2000,Free Rad.Biol.Med.,28,183-192）。
【００１２】
Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンとともに培養された野生型Candida細胞は培地にＬ‐アスコルビン酸を蓄積し、この酵母が細胞内蓄積Ｌ‐アスコルビン酸の放出のための生物学的メカニズムを有することを示す、すなわち実際には、Ｌ‐アスコルビン酸は複雑な分子であり、培地中においてその蓄積が単純な拡散過程によるものではなく、促進または能動輸送に依存しているに違いない、と考えるのが合理的であろう。この結論は高等真核生物（哺乳動物）細胞においてＬ‐アスコルビン酸トランスポーターの特定および特徴づけにより支持される（Daruwala R.et al.,1999,FEBS Letters,460,480-484）。しかしながら、Ｌ‐アスコルビン酸トランスポーターは酵母属の中においてはこれまで記載されたことがない。それにもかかわらず、Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンを含有した培地において増殖するCandida細胞は培地にＬ‐アスコルビン酸を蓄積するが、野生型S.cerevisiae細胞からのＬ‐アスコルビン酸の培地中における蓄積は意外にもこれまで記載されたことがない。
【００１３】
アスコルビン酸の大量生産に関する望ましい方法は、遺伝子工学により処理された微生物（すなわち、組換え微生物）の使用である。原核および真核微生物は双方とも、今日では異種タンパク質の生産と異種代謝産物の生産により、容易にかつ成功して用いられている。原核生物の中では、Escherichia coliおよびBacillus subtillisが頻繁に用いられている。真核生物においては、酵母S.cerevisiaeおよびKluyveromyces lactisが頻繁に用いられる。
【００１４】
Ostergaardらは、酵母S.cerevisiaeにおいてカリフラワーのＬ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の複製を作成した（J.Biol.Chem.,1997,272,48,30009-30016）。インビトロにおいて、著者らは酵母細胞抽出物においてＬ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンデヒドロゲナーゼ活性を見出したが（シトクロムｃアッセイ、Ostergaardら参照）、Ｌ‐アスコルビン酸の生産はインビボにおいて証明されなかった。
【００１５】
Berryらの国際特許出願ＷＯ９９／６４６１８号はアスコルビン酸の植物生合成経路の使用可能性について論じている、ＧＤＰ‐Ｌ‐ガラクトースへのＧＤＰ‐Ｄ‐マンノースの変換を触媒する活性について特別な注目が払われている。しかしながら、この工程を触媒する酵素の特徴は詳細には掲載されていなかった。過剰発現されたE.coliホモログは不活性であることが判明した。
【００１６】
SmirnoffらのＷＯ９９／３３９９５号はアスコルビン酸の生産に際するＬ‐ガラクトースデヒドロゲナーゼの使用について論じている。前記酵素はエンドウ苗木から精製され、Ｎ末端タンパク質配列が決定された。
【００１７】
Rolandらの米国特許第４，５９５，６５９号および第４，９１６，０６８号は、Ｌ‐ガラクトン酸基質をＬ‐アスコルビン酸へ変換する上で、非組換えCandida株の使用について論じている。Rolandらは、Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼとしての能力を有する酵素を記載していた。
【００１８】
KumarらのＷＯ００／３４５０２号は生産に際する唯一の炭素源として２‐ケト‐Ｌ‐グロン酸を用いうるCandida blankiiおよびCryptococcus dimennae酵母におけるＬ‐アスコルビン酸の生産について論じている。Kumarは、Ｌ‐ガラクトノラクトンオキシダーゼを伴う経路による、またはＬ‐ガラクトン酸前駆体の変換による酵母からの生産を特に除外している。
【００１９】
以前、我々は、特にＬ‐ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｄ‐アラビノノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、または双方において形質転換され、Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトン、Ｌ‐グロノ‐１，４‐ラクトン、またはＬ‐ガラクトースのうち１種以上を含有した培地において増殖されたS.cerevisiaeによる、Ｌ‐アスコルビン酸の生産について報告した（米国特許第６，６３０，３３０号）。
【００２０】
利便性の高い発酵工程によるアスコルビン酸の生産方法が望まれている。Ｄ‐グルコースから出発するＬ‐アスコルビン酸の生産方法も望まれるであろう。
【発明の概要】
【００２１】
一つの態様において、本発明は、Ｌ‐アスコルビン酸の製造方法であって、
ａ）マンノースエピメラーゼ（ＭＥ）をコードするコード領域において機能的に形質転換された組換え酵母を得て、
ｂ）Ｄ‐グルコースを含む培地において前記組換え酵母を培養し、それによりＬ‐アスコルビン酸を形成させ、そして
ｃ）Ｌ‐アスコルビン酸を単離すること
を含んでなることを特徴とする、製造方法に関する。
【００２２】
他の態様において、本発明はマンノースエピメラーゼ（ＭＥ）をコードするコード領域において機能的に形質転換された組換え酵母に関する。前記方法および組換え酵母の別の態様において、酵母はミオイノシトールホスファターゼ（ＭＩＰ）をコードするコード領域において更に機能的に形質転換させてもよい。本発明は、利便性の高い発酵工程によるＤ‐グルコースからＬ‐アスコルビン酸への製造方法を提供する。
【発明の具体的説明】
【００２３】
一つの態様において、本発明は、Ｌ‐アスコルビン酸の製造方法であって、
ａ）マンノースエピメラーゼ（ＭＥ）をコードするコード領域において機能的に形質転換された組換え酵母を得て、
ｂ）Ｄ‐グルコースを含む培地において前記組換え酵母を培養し、それによりＬ‐アスコルビン酸を形成させ、そして
ｃ）Ｌ‐アスコルビン酸を単離すること
を含んでなることを特徴とする、製造方法に関する。
【００２４】
“組換え”酵母とは、酵母に天然において存在しない核酸配列または内在核酸配列の追加コピーを含有した酵母であり、前記核酸配列は酵母またはその祖先細胞へ人為的に導入される。組換えＤＮＡ技術、例えばSambrook et al.,Molecular Genetics:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Pressは周知であり、そこでは当業界において公知である、ここで記載された様々な技術に関する情報を更に提供する。この態様においては、同種および／または異種遺伝子のコード領域が、前記遺伝子を保有した生物から単離される。前記生物としては細菌、原核生物、真核生物、微生物、真菌、植物、または動物がある。
【００２５】
コード領域を含む遺伝物質はいかなる公知技術により生物の細胞から抽出してもよい。その後で、コード領域がいずれか適切な技術により単離される。一つの公知技術においては、最初にゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを作製し、次いでゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーによりコード領域を特定し、例えば前記コード領域と少なくとも部分的に相同的であるように選択された、またはそうであると思われる標識ヌクレオチドプローブにより前記ライブラリーを探査し、コード領域の発現が前記コード領域を含むライブラリー微生物へ検出可能な表現型を付与するか否かを調べるか、またはＰＣＲにより望ましい配列を増幅させることにより、前記コード領域が単離される。
【００２６】
形質転換される酵母は、いかなる公知の属または種の酵母から選択してもよい。酵母はN.J.W.Kreger-van Rij,”The Yeasts”,Vol.1 of Biology of Yeasts,Ch.2,A.H.Rose and J.S.Harrison,Eds.Academic Press,London,1987において記載されている。一つの態様においては、酵母属として特にSaccharomyces、Zygosaccharomyces、Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Debaromyces、Nadsonia、Lipomyces、Torulopsis、Kloeckera、Pichia、Schizosaccharomyces、Trigonopsis、Brettanomyces、Cryptococcus、Trichosporon、Aureobasidium、Lipomyces、Phaffia、Rhodotorula、Yarrowia、またはSchwanniomycesがある。別の態様においては、酵母としてSaccharomyces、Zygosaccharomyces、またはKluyveromyces種がある。更に別の態様においては、酵母としてS.cerevisiae、Z.bailii、またはK.lactisがある。更に別の態様において、酵母は、S.cerevisiae株ＧＲＦ１８Ｕ、Ｗ３０３１Ｂ、ＢＹ４７４２（ＭＡＴα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２、ｕｒａ３，EuroScarf受理Ｎｏ．Ｙ１００００）またはＹＭＬ００７ｗ（ＢＹ４７４２  ΔＹａｐ１）（ＭＡＴα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２、ｕｒａ３，Ｙａｐ１  EuroScarf受理Ｎｏ．Ｙ１０５６９）、Z.bailii ＡＴＣＣ６０４８３、またはK.lactis ＰＭ６‐７Ａである。
【００２７】
組換え酵母は、マンノースエピメラーゼ（Ｄ‐マンノース：Ｌ‐ガラクトースエピメラーゼ、ＭＥ）をコードするコード領域において機能的に形質転換される。ＭＥは、いかなるＧＤＰ‐マンノース‐３，５‐エピメラーゼ（５．１．３．１８）でもよく、これはＧＤＰ‐Ｌ‐ガラクトースへのＧＤＰ‐マンノースの変換を触媒する酵素を意味する。例示のＭＥが配列番号１として記載される。
【００２８】
一つの態様において、ＭＥは配列番号１と少なくとも約９５％の同一性を有するものである。別の態様において、ＭＥは配列番号１と少なくとも約９８％の同一性を有するものである。“同一性”はClustalWプログラムとそのデフォルト値、すなわち：ＤＮＡギャップ・オープン・ペナルティ＝１５．０、ＤＮＡギャップ・エキステンション・ペナルティ＝６．６６、ＤＮＡマトリックス＝同一性、タンパク質ギャップ・オープン・ペナルティ＝１０．０、タンパク質ギャップ・エキステンション・ペナルティ＝０．２、タンパク質マトリックス＝Gonnetを用いて行われる配列アライメントにより求められる。同一性は、ClustalW文書において記載された手順に従い計算される、すなわち“並べられる配列の全ペアについてペア方式スコアが計算される。これらのスコアの結果について表に掲載される。ペア方式スコアは、比較される残基の数で割った最良アライメント中、同一物の数として計算される（ギャップ位置は除外される）。これらスコアの双方が同一性スコア率として最初に計算され、部位当たりの相違数を求めるために１００で割り１．０から引くことにより距離へ変換される。我々はこれらの初期距離で多置換については補正しない。選択されるマトリックスおよびギャップとは無関係にペア方式スコアが計算されると、それは配列の特定ペアについて常に同じ値となる。”
【００２９】
更に別の態様において、ＭＥは配列番号１を有している。
【００３０】
一つの態様において、組換え酵母はミオイノシトールホスファターゼ（ＭＩＰ）をコードするコード領域において更に機能的に形質転換される。ＭＩＰはいかなるミオイノシトールホスファターゼ（３．１．３．２５）でもよく、これはＬ‐ガラクトースへのＬ‐ガラクトース‐１Ｐの変換を触媒する酵素を意味する。例えば、酵素Ｌ‐ガラクトース‐１‐ホスファターゼもＬ‐ガラクトースへのＬ‐ガラクトース‐１Ｐの変換を触媒し、この定義によるとＭＩＰである。一つの態様において、ＭＩＰは配列番号２として記載された配列を有する。
【００３１】
一つの態様において、ＭＩＰは配列番号２と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の態様において、ＭＩＰは配列番号２と少なくとも約９８％の同一性を有する。更に別の態様において、ＭＩＰは、配列番号２を有する。
【００３２】
一つの態様において、組換え酵母はＬ‐ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）、Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ‐アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、Ｄ‐アラビノノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）、またはＬ‐グロノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）から選択される酵素をコードするコード領域において更に形質転換される。
【００３３】
本発明は、植物、酵母、または他の生物においてＬ‐アスコルビン酸中間体またはＬ‐アスコルビン酸の生産に関して知られた経路の酵素に限定されない。
【００３４】
他の態様において、本発明は、ストレス抵抗性または頑強性(robust)である、ＭＥまたはＭＥおよびＭＩＰ双方において形質転換された微生物に関する。更に他の態様において、微生物はＬＧＤＨ、ＡＬＯ、ＭＥまたはＬＧＤＨ、ＡＬＯ、ＭＥ、およびＭＩＰにより形質転換してもよい。微生物はいかなる微生物でもよく、例えば細菌、酵母、または他の真菌（例えば糸状菌）、培養動物細胞または培養植物細胞である。一つの態様において、微生物は酵母である。
【００３５】
ストレスにより微生物（酵母）バイオプロセスの摂動(perturbation)へ至ることがある、と通常認められている。ストレスは、細胞（内部または細胞内）源、環境（外部または細胞外）源、または双方である。内部源ストレスの古典的な例としては、特に、タンパク質および代謝産物過剰生産高（重量／容量で）と、タンパク質および代謝産物過剰生産力（単位時間当たりの重量／容量で）とがある。
【００３６】
外部源ストレスの例としては、特に、高浸透性、高塩分、酸化ストレス、高または低温、高または低ｐＨ値、有機酸の存在、毒性化合物の存在、ならびに大および小栄養欠乏がある。
【００３７】
ストレスは、典型的にはストレス要因（または刺激）により引き起こされる。ストレス要因は、平衡を維持するために、ストレス要因の非存在下において要する以上の努力を細胞に求めさせる、細胞に及ぼす負の影響である。このより大きな努力は、特により高いまたは低い代謝活性、より低い成長率、より低い生存力、またはより低い生産力へつながりうる。ストレス要因は、所定生命体の通常の細胞内または細胞外条件において変化を表わす、物理的、化学的、または生物学的性質の要因である。すなわち、特定の条件（例えば、６５℃の温度）は通常３７℃において生きる、ある種類のものにとってストレスである（または致命的ですらある）が、それは好熱性生物には最適であろう。
【００３８】
供給源にかかわらず、特に、より高いまたは低い代謝活性、より低い成長率、より低い生存力、またはより低い生産力を含めて、ストレスは異なる効果を有しうる。細胞または分子レベルの効果としては、特に、ＤＮＡへの損傷、脂質への損傷、タンパク質への損傷、膜への損傷、他の分子および高分子への損傷、活性細胞種（ＲＯＳ）の生成、アポトーシス（計画的細胞死）の誘導、細胞壊死、細胞溶解、細胞統合性(cell integrity)の障害、および細胞生存力の障害がある。
【００３９】
ＲＯＳは、細胞内および細胞外双方の刺激により生じうる。内在ＲＯＳの大部分はミトコンドリア電子伝達連鎖からこれら種類の漏出により生じる。加えて、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを含めたサイトゾル酵素系とペルオキシソーム代謝の副産物もＲＯＳの内在源である。ＲＯＳの発生は、電離線（ＩＲ）、ＵＶ光、化学療法剤、環境毒素、ならびに高熱を含めた多くの外部要因および事象への暴露によっても生じうる。細胞内ＲＯＳに起因する酸化的損傷は、ＤＮＡ塩基修飾、一本および二本鎖断裂、ならびにアプリン酸／アピリミジン酸障害の形成を招くことがあり、その多くは毒性および／または変異原性である。したがって、生じるＤＮＡ損傷は有害な生物学的影響を及ぼす直接的原因でもある（Tiffany,B.et al.,Nucleic Acids Research,2004,Vol.32,No.12,3712-3723）。
【００４０】
生物が生産のための手段として用いられる工業的工程において、生物に加わるストレスは典型的には産物の低またはゼロ生産高、低またはゼロ生産力、産物の低またはゼロ収率、またはそれらの２以上につながる。したがって、ストレスは非常に望ましくない現象であり、それを最少化させる技術が有用となるであろう。
【００４１】
この態様に関して用いられている“生産”とは、微生物により１種以上の産物を製造させる工程を意味する（微生物自体が産物でも、あるいは微生物の代謝工程において生成または修飾された化合物、例えばタンパク質、有機酸、ビタミン、または抗生物質が産物でもよい）。微生物の増殖および生存が維持される培地の重量または容量、あるいは微生物のバイオマスの重量または容量当たりで生産される産物の重量を調べることにより、生産高は工程の開始後いつでも定量しうる。“生産力”とは、所定の時間にわたり、上記のように定量される、生産の量（例えば、ｇ／Ｌ／ｈｒ、ｍｇ／Ｌ／週、またはｇ／バイオマスのｇ／ｈｒのような割合）を意味する。“収率”とは、産物へ変換される基質の量当たりの生産された産物の量を意味する。ここで用いられている、株のストレス許容性、ストレス抵抗性、または構造安定性(robustness)とは、微生物が生産工程において高い工業性能を示す意味である。これは次の一つとして顕在化するであろう、すなわちストレスを相殺しうる高い能力、生物または生産力に及ぼすストレスの負の影響の減少、増殖率の増加または細胞密度の増加、生産力の抑制の減少、細胞死の減少（生存力の増加）、増殖阻止の減少、ストレス条件による細胞不活性化の防止である。我々は、ＭＥまたはＭＥおよびＭＩＰ双方において形質転換された酵母がＭＥまたはＭＥおよびＭＩＰ双方において形質転換されなかった酵母より大きなストレス抵抗性または構造安定性を有することを観察した。この抵抗性は多くのストレス要因に対抗しうる。この大きなストレス抵抗性は、培養においてＭＥまたはＭＥ＋ＭＩＰを発現する微生物のより速い増殖率、培養においてＭＥまたはＭＥ＋ＭＩＰを発現する微生物の高い細胞密度、培養においてＭＥまたはＭＥ＋ＭＩＰを発現する微生物の高い生存性、あるいは培養においてＭＥまたはＭＥ＋ＭＩＰを発現する微生物の高い生産高のうちの１以上として顕在化しうる。細胞生存性の尺度は（典型的には、細胞の総数に対する生存細胞の割合として与えられる）生存力である。生存力は、適切な寒天プレートにおいてコロニーを形成しうる、既知の細胞の能力（再現性能力）として決定される。細胞は更に、それらが代謝活性を示すか、またはそれらの細胞膜が無傷であれば、生存可能とみなすことができる。別の微生物群も生存可能と記せるであろうが、あるものから他への直接的結論は不可能であることが、理解されねばならない。例えば、なお代謝的に活性な細胞であっても、もはや再現性（コロニー形成性）でないかもしれない。結果的に、培養物の生存力を調べると異なる結果を示すことがある、異なる方法も適用しうる。典型的な方法においては、コロニー形成単位の数を調べるために寒天プレート上において培養し、トリパンブルーにより染色し、顕微鏡下において計数するが、そこでは死んだ細胞が青色に変わり、生きた細胞が無傷な膜のために無色のままである。他の方法としてフローサイトメトリーがあり、そこでは細胞が特にヨウ化プロピジウム（無傷な膜は侵入を阻止する）、臭化エチジウム（代謝活性細胞は染色を許さない）を含めた異なる化合物により染色される。
【００４２】
以下の理論に拘束されるわけではないが、酸化ストレスに大きな抵抗性を示す微生物においては、記載された態様により得られるような大きなストレス抵抗性が酸化防止剤レベル（特に、Ｌ‐アスコルビン酸）の増加から生じている、と我々は提唱している。この大きなストレス抵抗性が、そのままのまたは追加のコード領域において形質転換された、ＭＥまたはＭＥ＋ＭＩＰを発現する微生物を、特に工業的な発酵により代謝産物の生産に適したものにしている、と我々は考えている。
【００４３】
他の態様においては、発酵に際して酵母のような微生物により生産される産物の生産高、生産力、または収率が、マンノースエピメラーゼ（ＭＥ）をコードするコード領域において微生物を機能的に形質転換することにより高められる。更に他の態様では、発酵に際し、代謝活性または膜完全性として、コロニーを形成しうる能力として規定されるような、酵母のような微生物の生存力が、マンノースエピメラーゼ（ＭＥ）をコードするコード領域において微生物を機能的に形質転換することにより高められる。
【００４４】
要約すると、微生物生産工程に際して典型的に出会うストレスの負の効果は、本発明により減少または消滅させうるのである。すなわち、微生物の生産高、生産力、収率、または生存力は、上記酵素の発現を介した微生物のＬ‐アスコルビン酸含有率の確立または増加により高められる。
【００４５】
したがって、微生物が浸透ストレスの条件下において培養されるならば、微生物においてＭＥ、またはＭＥと次の酵素、すなわちＭＩＰ、ＡＬＯ、またはＬＧＤＨの１種以上とを発現させることが特に有用である。浸透ストレスとは、２５０ミリオスモル以上、特に５００ミリオスモル以上、または７５０ミリオスモル以上で、各微生物において規定される至適オスモル濃度から離れたオスモル濃度の違いに微生物が出会う条件のことである。酵母S.cerevisiaeの場合、オスモル濃度で５００ミリオスモル以上、７５０ミリオスモル以上、または１０００ミリオスモル以上の条件はストレス性である。
【００４６】
更に、微生物がｐＨストレスの条件下において培養されるならば、微生物においてＭＥ、またはＭＥと次の酵素、すなわちＭＩＰ、ＡＬＯ、またはＬＧＤＨの１種以上とを発現させることが特に有用である。ｐＨストレスとは、１より、２より、または３より大きなｐＨ単位により、各微生物の生産に際して至適ｐＨ値から離れたｐＨ値の違いに微生物が出会う条件のことである。酵母S.cerevisiaeの場合、バイオプロセスの実施における典型的な至適ｐＨは５である。４未満のｐＨ、３未満のｐＨ、２未満のｐＨ、６より大きなｐＨ、７より大きなｐＨ、または８より大きなｐＨはストレス性であり、本発明の関係では、このようなｐＨ条件下において生産宿主として用いられるならば、記載された遺伝子をS.cerevisiaeのような酵母において発現させることが有用であるらしい。
【００４７】
微生物が温度ストレスの条件下において培養される場合にも、微生物でＭＥ、またはＭＥと次の酵素、すなわちＭＩＰ、ＡＬＯ、またはＬＧＤＨの１種以上とを発現させることが特に有用である。温度ストレスとは、２℃以上、５℃以上、または更には１０℃以上において、各微生物の増殖または生産に際して至適温度値とは異なる培養温度に微生物が出会う条件のことである。酵母S.cerevisiaeの場合、３２℃以上、３５℃以上、または４０℃以上の温度がストレス性である。細菌E.coliの場合、３８℃以上、４１℃以上、または４６℃以上の温度がストレス性である。
【００４８】
更に、微生物が酸化ストレスの条件下において培養されるならば、微生物においてＭＥまたはＭＥと次の酵素、すなわちＭＩＰ、ＡＬＯ、またはＬＧＤＨの１種以上とを発現させることが特に有用である。酸化ストレスとは、活性細胞種（ＲＯＳ）に起因した、細胞中における酸化損傷の定常状態レベルを表わすために用いられる一般用語である。この損傷は特定の分子または生物全体に影響を与えうる。遊離基および過酸化物のような活性細胞種とは、酸素の代謝から誘導されて、全ての好気性生物において生来的に存在する分子の種類を表わす。酸化ストレスは酸化促進剤の形成と中和との不均衡から生じる。動物細胞は、他の例の中でも、標準培養条件に際して非常に大きな酸化ストレスへ曝されうる。したがって、動物細胞においてＭＥまたはＭＥと次の酵素、すなわちＭＩＰ、ＡＬＯ、またはＬＧＤＨの１種以上とを発現させることが特に有用であろう。
【００４９】
培養微生物が代謝産物またはタンパク質の過剰生産によりストレスに曝される場合も、微生物においてＭＥまたはＭＥと次の酵素、すなわちＭＩＰ、ＡＬＯ、またはＬＧＤＨの１種以上とを発現させることが特に有用である。このようなストレス条件の徴候は、当業界において知られているように、ＵＰＲ（未折畳みタンパク質応答）と関連した遺伝子の上方調節であろう。
【００５０】
ＭＥ、ＭＩＰ、または他の酵素をコードするコード領域は、いかなる供給源から単離してもよい。一つの態様において、ＭＥのコード領域はArabidopsis thalianaから単離される。一つの態様において、ＭＩＰのコード領域はA.thalianaから単離される。コード領域が生物の細胞から精製されたタンパク質の場合と実質的に同一のタンパク質配列をコードしていれば、前記コード領域は生物から“単離”されている、と言える。例えば、上記の具体的態様において、ＭＥコード領域またはＭＩＰコード領域は、必ずしもA.thalianaの核酸から単離し、またはA.thalianaから抽出された核酸の複製の１回以上の実施により生産しなくてよい。
【００５１】
好ましくは、望ましい酵素をコードするコード領域は、望ましい酵素が酵母において生産されて実質的に機能性であるように、酵母へ組み込まれる。このような酵母はここでは“機能的に形質転換された”と称されてもよい。
【００５２】
コード領域が生物の核酸から抽出されるかまたは化学的手段により合成されると、それは酵母への形質転換とそこでの発現のために調製される。最小限でも、これにはベクターへのコード領域の挿入と、ベクターでみられて酵母中において活性なプロモーターへの作動的結合を伴う。いかなるベクター（組込み、染色体性、またはエピソーム性）も用いうる。
【００５３】
標的宿主において活性なプロモーター（同種または異種（構成性、誘導性、または抑制性））も用いうる。このような挿入には、プロモーターへの作動的結合が可能な望ましい箇所においてベクターを“開く”制限エンドヌクレアーゼの使用と、それに次ぐ望ましい箇所へのコード領域の結合を伴う。所望であれば、ベクターへの挿入前に、コード領域は標的生物において使用向けに調製してもよい。これには、当業界において知られた他の可能な調製法の中でも、標的生物のコドン使用とより完全に合うようにコード領域において用いられるコドンを変えること、コード領域の転写もしくは翻訳またはコード領域のｍＲＮＡ転写物の安定性を損ないうるコード領域中の配列を変えること、あるいはシグナリングペプチド（タンパク質を特定位置（例えば、オルガネラ、細胞もしくはオルガネラの膜、または細胞外分泌）へ導くコード領域によりコードされたタンパク質の領域）をコードする部分を付加または除去することを含む。
【００５４】
コード領域が修飾されるか否かにかかわらず、コード領域がベクターへ挿入される場合、それは酵母において活性なプロモーターへ作動的に結合される。プロモーターとは、公知のように、隣接コード領域の転写を導くＤＮＡ配列のことである。既に記載されているように、プロモーターは、構成性、誘導性、または抑制性でもよい。構成性プロモーターは隣接コード領域の転写を連続的に導く。誘導性プロモーターは、プロモーターの同一性(identity)により定まる、適切なインデューサー分子の媒体への付加により誘導されうる。抑制性プロモーターは、プロモーターの同一性により決定される、適切なリプレッサー分子の媒体への付加により抑制されうる。一つの態様において、プロモーターは構成性である。別の態様において、構成性プロモーターはS.cerevisiaeトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーターである。
【００５５】
コード領域をプロモーターへ作動的に結合させるベクターは、酵母において使用に適すると当業界において知られているものの中でも、プラスミド、コスミド、または酵母人工染色体である。プロモーターへ作動的に結合されたコード領域に加えて、ベクターは他の遺伝要素も含んでよい。例えば、酵母ゲノムへ組み込むことがベクターに不要であれば、ベクターを含む酵母の子孫細胞へベクターを継代させうる複製起点をベクターに含ませてもよい。酵母ゲノムへのベクターの組込みが必要であれば、ベクターは酵母ゲノムにおいてみられる配列と相同的な配列を含み、組み込みを促進しうるコード領域も含みうる。どの酵母細胞が形質転換されたか否かを決定するために、例えばそれが未形質転換酵母に致命的な抗生物質を含んだ培地で生存するか、またはそれが他の表現型の中でも未形質転換酵母がもたない産物へ培地の成分を代謝するように、それを未形質転換酵母から区別する表現型を酵母へ付与する選択マーカーまたはスクリーンマーカーをベクターが含んでもよい。加えて、ベクターは、例えば制限エンドヌクレアーゼ部位およびベクターにおいて典型的に見られるその他のものなど、他の遺伝的要素を含んでもよい。
【００５６】
コード領域がプロモーターへ作動的に結合されてベクターが調製された後、酵母は前記ベクターにより形質転換される（すなわち、ベクターが酵母群の細胞の少なくとも一つへ導入される）。酵母形質転換の技術は確立されており、特にエレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント、およびＬｉＡｃ／ｓｓＤＮＡ／ＰＥＧ法がある。次いで、形質転換された酵母細胞は、ベクターによるスクリーンまたは選択マーカーの使用により調べられる。“形質転換された酵母”という語句は、前記のような“組換え酵母”と本質的に同様の意味を有していることに留意すべきである。形質転換酵母とは、形質転換技術によりベクターを受け取ったもの、またはこのような酵母の子孫である。
【００５７】
組換え酵母が得られた後、酵母は培地において培養される。酵母が培養される培地は、この目的に適することが当業界において公知のいかなる培地でもよい。培養技術および培地は当業界において周知である。一つの態様において、培養は適切な容器により水性発酵(aqueous fermentation)により行われる。酵母発酵用の典型的容器の例として振盪フラスコまたはバイオリアクター(bioreactor)がある。培地はＤ‐グルコースを含有しうる。それは酵母の増殖に必要な他の成分を更に含有しうる。Ｄ‐グルコースは、酵母の増殖に必要な成分であるが、なくてもよい。
【００５８】
培地は、Ｄ‐グルコース以外の炭素源、例えば特にスクロース、フルクトース、ラクトース、Ｄ‐ガラクトース、または植物質の加水分解産物を含有しうる。一つの態様において、培地は有機または無機分子として窒素源も含有しうる。別の態様において、培地は、特に、アミノ酸類、プリン類、ピリミジン類、コーンスティープリカー(corn steep liquor)、酵母エキス、タンパク質加水分解産物、水溶性ビタミン（例えば、ビタミンＢ複合体）、または無機塩（例えば、Ｃａ、Ｍｇ、Ｎａ、Ｋ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｍｏ、またはＺｎの塩化物、塩酸塩、リン酸塩または硫酸塩）のような成分も含有しうる。酵母の培養または発酵において有用である当業者に公知の別の成分も含有させてよい。培地は緩衝化させてもよいが、させなくともよい。
【００５９】
発酵の過程において、Ｄ‐グルコースは酵母に取り込まれ、多くの工程を経てＬ‐アスコルビン酸へ変換される。こうして生産されたＬ‐アスコルビン酸は酵母内に集められるか、または酵母により培地中へ分泌される。
【００６０】
好ましい培地は、Ｄ‐グルコースおよびＹＮＢを含む。
【００６１】
酵母、培地、または双方において望ましい濃度のＬ‐アスコルビン酸を生産するために十分な時間にわたり培養が進行した後、Ｌ‐アスコルビン酸が単離される。ここで用いられている“単離される”とは、酵母または培地の少なくとも１種の非Ｌ‐アスコルビン酸成分からのＬ‐アスコルビン酸の分離により、より高純度の状態とされることを意味する。好ましくは、単離されたＬ‐アスコルビン酸は少なくとも約９５％の純度、更に好ましくは少なくとも約９９％の純度である。
【００６２】
酵母からＬ‐アスコルビン酸を単離するために、単離の第一工程は、酵母が培地から分離された後で、化学処理もしくは酵素処理、ガラスビーズ処理、音波処理、凍結／解凍サイクリング、または公知の他の技術による酵母の溶解である。Ｌ‐アスコルビン酸は、特に、遠心、濾過、マイクロ濾過、限外濾過、ナノ濾過、液体‐液体抽出、結晶化、ヌクレアーゼもしくはプロテアーゼによる酵素処理、またはクロマトグラフィーのような適切な技術により、酵母溶解物の膜、タンパク質、および核酸フラクションから精製される。
【００６３】
培地に蓄積されたＬ‐アスコルビン酸を単離するために、単離に際して培地からアスコルビン酸を精製してもよい。精製は、特にイオン交換樹脂、活性炭、マイクロ濾過、限外濾過、ナノ濾過、液体‐液体抽出、結晶化、またはクロマトグラフィーの使用のような公知技術により行える。
【００６４】
Ｌ‐アスコルビン酸は、酵母および培地の双方から単離しうる。
【００６５】
酵母が培養工程に際して培地にＬ‐アスコルビン酸を蓄積するならば、好ましくはＬ‐アスコルビン酸の濃度は一定にされるかまたは増加する。
【００６６】
本発明の詳細な説明を理解する上で当業者の一助となるように次の定義を示す。
“バックグラウンドレベル以上のアスコルビン酸の蓄積”という用語は、ここで記載された操作を用いて調べた場合に、未検出レベル以上のアスコルビン酸の蓄積に関する。
【００６７】
ここで用いられている“アスコルビン酸”および“アスコルビン酸塩”とはＬ‐アスコルビン酸に関する。
【００６８】
“アスコルビン酸前駆体”とは、本発明の酵母により直接または１種以上の中間体を経てＬ‐アスコルビン酸へ変換されうる化合物のことである。
【００６９】
“増幅”とは、どのような手段であろうと、望まれる核酸分子のコピー数を増加させること、または酵素の活性を高めることに関する。
【００７０】
“コドン”とは、具体的なアミノ酸を特定するヌクレオチド３個の配列に関する。
【００７１】
“ＤＮＡリガーゼ”とは、二つの二本鎖ＤＮＡを共有結合させる酵素に関する。
【００７２】
“エレクトロポレーション”とは、宿主細胞の透過性を高めてそれらに染色体外ＤＮＡを取り込ませるために短時間の高電圧ＤＣの電荷を用いる、外来ＤＮＡを細胞へ導入する方法に関する。
【００７３】
“エンドヌクレアーゼ”とは、内部位置(internal locations)において二本鎖ＤＮＡを加水分解する酵素に関する。
【００７４】
酵素１．１．３．３７、Ｄ‐アラビノノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼとは、Ｄ‐エリトロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ２へのＤ‐アラビノノ‐１，４‐ラクトン＋Ｏ２の変換を触媒するタンパク質に関する。同酵素は、基質範囲の広さにより、Ｌ‐アスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ２へのＬ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトン＋Ｏ２の変換も触媒する。誤って、同酵素はＬ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（酵素１．１．３．２４）と称されている（Huh,W.K.et al.,1998,Mol.Microbiol.,30,4,895-903参照）。酵素１．３．２．３、Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンデヒドロゲナーゼは、Ｌ‐アスコルビン酸＋２フェロシトクロムＣへのＬ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトン＋２フェリシトクロムＣの変換を触媒するタンパク質に関する。
【００７５】
酵素１．１．３．８、Ｌ‐グロノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼは、Ｌ‐アスコルビン酸へ自然に異性化するＬ‐キシロ‐ヘキスロノラクトンへのＬ‐グロノ‐１，４‐ラクトンの酸化を触媒するタンパク質に関する。
【００７６】
酵素ＧＤＰ‐マンノース‐３，５‐エピメラーゼ（５．１．３．１８）は、ＧＤＰ‐Ｌ‐ガラクトースへのＧＤＰ‐マンノースの変換を触媒するタンパク質に関する。
【００７７】
酵素ミオイノシトールホスファターゼ（３．１．３．２３）は、Ｌ‐ガラクトースへのＬ‐ガラクトース‐１Ｐの変換を触媒するタンパク質に関する。
【００７８】
関係のある他の酵素およびそれらの分類番号は次の通りである：
ヘキソキナーゼ                                          ２．７．１．１
グルコース‐６‐Ｐイソメラーゼ                          ５．３．１．９
マンノース‐６‐Ｐイソメラーゼ                          ５．３．１．８
ホスホマンノムターゼ                                    ５．４．２．８
マンノース‐１‐Ｐグアニリルトランスフェラーゼ          ２．７．７．２２
ＧＤＰ‐マンノース  ３，５‐エピメラーゼ                ５．１．３．１８
糖ホスファターゼ                                        ３．１．３．２３
Ｌ‐ガラクトース‐デヒドロゲナーゼ                      ＊）
Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンデヒドロゲナーゼ        １．３．２．３
Ｄ‐マンノースキナーゼ                                  ２．７．１．１
ホスホグルコムターゼ                                    ５．４．２．２
ＵＴＰ‐グルコース‐１‐Ｐウリジリルトランスフェラーゼ  ２．７．７．９
ＵＤＰ‐Ｄ‐グルコースデヒドロゲナーゼ                  １．１．１．２２
ＵＤＰ‐グルクロン酸  ４‐エピメラーゼ                  ５．１．３．６
グルクロン酸‐１‐Ｐウリジリルトランスフェラーゼ        ２．７．７．４４
Ｄ‐グルクロノキナーゼ                                  ２．７．１．４３
Ｄ‐グルクロン酸レダクターゼ                            １．１．１．１９
アルドノラクトナーゼ                                    ３．１．１．１７
Ｌ‐グロノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ                １．１．３．８
ウロノラクトナーゼ                                      ３．１．１．１９
グルクロノラクトンレダクターゼ活性                      １．１．１．２０
Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトン  ３‐エピメラーゼ      ＊）
ガラクツロン酸‐１‐Ｐウリジリルトランスフェラーゼ      ＊）
ガラクツロノキナーゼ                                    ２．７．１．４４
ヘキスロン酸（Ｄ‐ガラクツロン酸）レダクターゼ          ＊）
ミオイノシトール  １‐Ｐシンターゼ                      ５．５．１．４．
ミオイノシトール  １‐Ｐモノホスファターゼ              ３．１．３．２５
ミオイノシトールオキシゲナーゼ                          １．１３．９９．１
Ｄ‐ガラクトキナーゼ                                    ２．７．１．６
ＵＴＰ‐ヘキソース  １‐Ｐウリジリルトランスフェラーゼ  ２．７．７．１０
ＵＤＰ‐グルコース  ４‐エピメラーゼ                    ５．１．３．２
Ｓｕｃシンターゼ                                        ２．４．１．１３
フルクトキナーゼ                                        ２．７．１．４
＊）分類番号がデータベースに入力されていない
【００７９】
“発現”という用語は、対応ｍＲＮＡを生じる遺伝子の転写と、対応遺伝子産物、すなわちペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を生じるこのｍＲＮＡの翻訳に関する。
【００８０】
“機能的に結合された”または“作動的に結合された”という語句は、コードまたは構造配列の転写がプロモーターまたはプロモーター領域により導かれるような配向および距離にある、プロモーターまたはプロモーター領域とコードまたは構造配列とに関する。
【００８１】
“遺伝子”という用語は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質をコードする染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡもしくは他のＤＮＡ、またはＲＮＡ分子と、発現の調節に関与するコード配列に隣接する領域とに関する。
【００８２】
“ゲノム”という用語は、宿主細胞内の染色体およびプラスミド双方を包含する。したがって、宿主細胞へ導入された本発明のコードＤＮＡは染色体へ組み込まれても、またはプラスミドに局在してもよい。
【００８３】
“異種ＤＮＡ”とは、レシピエント細胞のものとは異なる供給源からのＤＮＡに関する。
【００８４】
“同種ＤＮＡ”とは、レシピエント細胞のものと同じ供給源からのＤＮＡに関する。
【００８５】
“ハイブリッド形成”とは、塩基対合により相補鎖と結合しうる核酸の鎖の能力に関する。ハイブリッド形成は、二つの核酸鎖の相補的配列が互いに結合した場合に生じる。
【００８６】
“培地”という用語は、酵母または組換え酵母の増殖に必要な諸成分とアスコルビン酸の生産用の１種以上の前駆体とを含んでなる、酵母の化学的環境に関する。酵母の増殖用の諸成分とアスコルビン酸の生産用の前駆体とは同一でもまたはそうでなくてもよい。
【００８７】
“読取り枠（ＯＲＦ）”とは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの領域に関する。
【００８８】
“プラスミド”とは、環状で、染色体外の、ＤＮＡの複製可能な部分(piece)に関する。
【００８９】
“ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）”とは、核酸のある配列の多数のコピーを作成する酵素技術に関する。ＤＮＡ配列のコピーは、２アンプリマー間においてＤＮＡポリメラーゼを往復させることにより製造される。この増幅法の基礎は、アンプリマーを変性させてから再アニールさせる温度変化と、それに次ぐ隣接アンプリマー間に位置する領域において新たなＤＮＡ鎖を合成する伸長との多数サイクルである。
【００９０】
“プロモーター”または“プロモーター領域”という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位および／または正しい部位において転写の開始に必要な他の因子を設けることによって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の生産を制御することにより、コード配列の発現を制御する、コード配列の上流（５′）において通常みられるＤＮＡ配列に関する。
【００９１】
“組換え細胞”または“形質転換細胞”とは、細胞において自然に存在しない核酸配列または内在核酸配列の追加コピーを含有した細胞であり、ここで前記核酸配列は人為的に細胞またはその祖先へ導入される。
【００９２】
“組換えベクター”または“組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築体”という用語は、何らかの供給源に由来し、ゲノム組込みまたは自律複製でき、１以上の配列が機能上作動的に結合された核酸分子を含んでなる、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製配列、ファージ、または線状もしくは環状一本鎖または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオチド配列の物質に関する。このような組換え構築体またはベクターは、翻訳ひいては発現されるまたは発現されない機能性ｍＲＮＡへＤＮＡ配列が転写されるように、５′調節配列またはプロモーター領域と選択遺伝子産物用のＤＮＡ配列とを細胞中へ導入しうる。
【００９３】
“制限酵素”とは、二本鎖ＤＮＡにおいてヌクレオチドの特定配列を認識して、両鎖を開裂する酵素に関し、制限エンドヌクレアーゼとも称されている。開裂は典型的には制限部位内またはその近くにおいて生じる。
【００９４】
“選択マーカー”とは、その発現が核酸配列を含有した細胞の特定化を容易にさせる表現型を付与する、核酸配列に関する。選択マーカーとしては、毒性のある化学物質への耐性を付与するもの（例えば、アンピシリン、カナマイシン）、または栄養欠乏を補うもの（例えば、ウラシル、ヒスチジン、ロイシン）がある。
【００９５】
“スクリーンマーカー”とは、その発現が視覚的に区別できる特徴（例えば、変色、蛍光）を付与する、核酸配列に関する。
【００９６】
“転写”とは、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡコピーを生産する過程に関する。
【００９７】
“形質転換”とは、外在核酸が染色体へ取り込まれるまたは自律複製しうる細胞中へ外在核酸配列（例えば、ベクター、プラスミド、または組換え核酸分子）を導入する過程に関する。形質転換を受けた細胞またはこのような細胞の子孫は“形質転換”または“組換え”されている。外来の核酸が所望のタンパク質をコードするコード領域を含み、所望のタンパク質が形質転換酵母により生産され、実質的に機能性であれば、このような形質転換酵母は“機能的に形質転換”されている。
【００９８】
“翻訳”とは、メッセンジャーＲＮＡからのタンパク質の生産に関する。
【００９９】
“収率”という用語は、生産されたアスコルビン酸（モルまたは重量／容量）を消費された前駆体の量（モルまたは重量／容量）で割り１００を掛けた量に関する。
【０１００】
酵素の“単位”とは、酵素活性に関し、変換される基質マイクロモルの量／全細胞タンパク質ｍｇ／ｍｉｎを示す。
【０１０１】
“ベクター”とは、宿主細胞中へ核酸配列を運ぶ（特に、例えばプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、酵母人工染色体、またはウイルスなど）ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に関する。ベクターまたはその一部が宿主細胞のゲノムへ挿入される。
【０１０２】
略語のリスト：
Ａｓｃ                Ｌ‐アスコルビン酸（ビタミンＣ）
ＡＧＤ                Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンデヒドロゲナーゼ
（シグナリングペプチドなし）
ＡＬＯ                Ｄ‐アラビノノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ
ＡＲＡ                Ｄ‐アラビノースデヒドロゲナーゼ
Ｇａｌ                Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトン
Ｇｕｌ                Ｌ‐グロノ‐１，４‐ラクトン
ＬＧＤＨ              Ｌ‐ガラクトースデヒドロゲナーゼ
ＭＥ                  マンノースエピメラーゼ
ＭＩＰ                ミオイノシトールホスファターゼ
ＲＧＬＯ              Ｌ‐グロノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ
ＴＣＡ                トリクロロ酢酸
ＴＰＩ                トリオースリン酸イソメラーゼ
【実施例】
【０１０３】
下記例は、本発明の具体的態様を実証するために記載されている。下記例において開示された技術は本発明者らが開示した技術を表わし、本発明の実施に際してうまく機能する、従ってその実施において好ましい態様を構成していると考えられることは、当業者に自明である。しかしながら、本開示を見た当業者によれば、多くの変更が開示された具体的な態様により行え、本発明の精神および範囲から逸脱せずに同様または類似の結果をなお得ることが理解される。
【０１０４】
物質および方法
１．アスコルビン酸の測定
アスコルビン酸はSullivanら（1955,Assoc.Off.Agr.Chem.,38,2,514-518）の方法に従い分光光度法により測定した。試料１３５μＬをＨ３ＰＯ４（８５％）４０μＬとキュベット中において混合した。次いで、α，α′‐ビピリジル（０．５％）６７５μＬおよびＦｅＣｌ３（１％）１３５μＬを加えた。１０分後、吸光度を５２５ｎｍにおいて測定した。一部の実験においては、標準として純粋なＬ‐アスコルビン酸（Aldrich,A9,290-2）を用い、アスコルビン酸の同定をＨＰＬＣ（Tracer Extrasil Column Ｃ８，５μＭ，１５×０．４６ｃｍ，Teknokroma，S.Coop.C.Ltda.# TR-016077、溶離液：９５／５Ｈ２Ｏ／アセトニトリル中５ｍＭセチルトリメチルアンモニウムブロミド，５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ，Detection ＵＶ＠２５４ｎｍ）により行った。
【０１０５】
２．特定遺伝子配列の増幅
特定の遺伝子配列を増幅させるために、ＰｆｕTurbo ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene ＃６００２５２）がGeneAmp ＰＣＲ System 9700（PE Appl.Biosystems,Inc.）において用いられた。用いられた標準条件は４００μＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマー、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（緩衝液へ添加）、および３．７５Ｕ  Ｐｆｕ／１００μＬ反応液であった。
用いられた遺伝子の配列は、ＭＩＰを除き、次のようにGenbankにおいて公に報告されている。配列番号４として掲載されているＭＩＰ配列は、２箇所の翻訳サイレント点置換：ｂｐ２７１，Ａ（ＮＭ １１１１５５）→Ｔ（配列番号４）、ｂｐ６８５，Ｔ（ＮＭ １１１５５）→Ｇ（配列番号４）において、Genbank配列、受理ｎｏ．ＮＭ １１１１５５とは異なっていた。
【表１】
2008536497.tif 000003
【０１０６】
下記プログラムをＡＬＯの増幅に用いた：
【表２】
2008536497.tif 000004
【０１０７】
下記プログラムをＬＧＤＨの増幅に用いた：
【表３】
2008536497.tif 000005
【０１０８】
下記プログラムをＭＥの増幅に用いた：
【表４】
2008536497.tif 000006
【０１０９】
下記プログラムをＭＩＰの増幅に用いた：
【表５】
2008536497.tif 000007
【０１１０】
ＬＧＤＨ、ＭＥ、およびＭＩＰ用の鋳型ＤＮＡ：５０ｎｇプラスミドｃＤＮＡライブラリーｐＦＬ６１ Arabidopsis（ＡＴＣＣ＃７７５００（Minet M.et al.,1992,Plant J.,2,417-422））。ＡＬＯ用の鋳型ＤＮＡ：標準法を用いて抽出された、S.cerevisiae ＧＲＦ１８ＵからのゲノムＤＮＡ５０ｎｇ。Novagen Inc.の完全ブラントクローニングキット（＃７０１９１‐４）を用いて、ＰＣＲ産物をｐＳＴBlue‐１のＥｃｏＲＶ部位へブラント末端クローン化した。
用いられたオリゴヌクレオチド 増幅される遺伝子
配列番号８：tttcaccatatgtctactatcc
配列番号９：aaggatcctagtcggacaactc                    ＡＬＯ（酵母）
配列番号１０：atgacgaaaatagagcttcgagc
配列番号１１：ttagttctgatggattccacttgg                ＬＧＤＨ（植物）
配列番号１２：gcgccatgggaactaccaatggaaca
配列番号１３：gcgctcgagtcactcttttccatca               ＭＥ（植物）
配列番号１４：atccatggcggacaatgattctc
配列番号１５：aatcatgcccctgtaagccgc                   ＭＩＰ（植物）
【０１１１】
３．プラスミドの構築
ここで用いられている命名法によると、例えば多クローニング部位（ＭＣＳ）に関してセンス方向でＡＬＯを含有しているｐＳＴBlue‐１はｐＳＴＢ ＡＬＯ‐１と命名した。別の例においては、ＭＣＳに関してアンチセンス方向でＡＬＯを含有しているｐＳＴBlue‐１はｐＳＴＢ ＡＬＯ‐２と命名した、等である。ｐＹＸシリーズ（Ｒ＆Ｄ Systems,Inc.）または動原体発現プラスミドｐＺ３およびｐＺ４（P.Branduardi,M.Valli,L.Brambilla,M.Sauer,L.Alberghina and D.Porro.The Yeast Zygosaccharomyces bailii:a New Host for Heterologous Protein Production,Secretion and for Metabolic Engineering Applications,FEBS Yeast Research,FEMS Yeast Res.,4,493-504,2004）を用いてインサートをクローン化した。標準操作を全クローニング目的に用いた（Sambrook J.et al.,Molecular Genetics:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【表６】
2008536497.tif 000008
以下において行われた全作業について、酵母コントロール株は対応エンプティベクターにより形質転換した。
【０１１２】
４．酵母培養および試験：
用いられた酵母株はS.cerevisiae ＧＲＦ１８Ｕ（Brambilla,L.et al.,1999,FEMS Microb.Lett.,171,133-140）、S.cerevisiae ＧＲＦｃ（Brambilla et al.,1999,FEMS Microb.Lett.,171,133-140）、S.cerevisiae ＢＹ４７４２（ＭＡＴα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２、ｕｒａ３，EuroScarf受理Ｎｏ．Ｙ１００００）、S.cerevisiae ＹＭＬ００７ｗ（ＢＹ４７４２、ＭＡＴα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２、ｕｒａ３ ＹＭＬ００７ｗ：：ＫａｎＭＸ４，EuroScarf受理Ｎｏ．Ｙ１０５６９）であるか、または異なる開発プラスミドによる形質転換によりそれらから誘導した。全ての株を、振盪フラスコ中、標準条件下（３０℃において振盪）において最少培地（適切なアミノ酸またはアデニンもしくはウラシルを各々５０μｇ／Ｌまで添加した０．６７％ｗ／ｖ  ＹＮＢ（Difco Laboratories,Detroit,ＭＩ＃９１９‐１５）、２％ｗ／ｖグルコースまたはマンノース）および／または適切な抗生物質（Ｇ４１８またはヒグロマイシンを各々５００ｍｇ／Ｌおよび４００ｍｇ／Ｌまで）により培養した。６６０ｎｍの初期光学濃度は、アスコルビン酸測定の場合に約０．０５、酸化ストレスからの回復の動態の場合に０．１であった。細胞を４℃において４０００ｒｐｍで５分間の遠心により回収し、冷蒸留Ｈ２Ｏにより１回洗浄し、次のように処理した：細胞内アスコルビン酸測定の場合、細胞をペレットの約３倍容量の冷１０％ＴＣＡに再懸濁し、激しく攪拌し、氷上において約２０分間保ち、次いで上澄を遠心により細胞残骸(cell debris)から分離させた。
【０１１３】
５．酵母形質転換：
酵母細胞の形質転換を標準ＬｉＡｃ／ｓｓ‐ＤＮＡ／ＰＥＧ法（Gietz,R.D.and Schiestl,R.H.,1996,Transforming Yeast with DNA,Methods in Mol.and Cell.Biol.）に従い行った。形質転換された酵母はＡＴＣＣに寄託したが、カタログＮｏ．はまだ付与されていない。
【０１１４】
実験結果
ＧＲＦ１８ＵにおけるArabidopsis thaliana ＭＥ、ＭＩＰ、ＬＧＤＨ、およびS.cerevisiae ＡＬＯの発現
A.thaliana ＭＥ、S.cerevisiae ＡＬＯ、A.thaliana ＬＧＤＨ、およびA.thaliana ＭＩＰをコードする遺伝子を各々それ自体の組込みプラスミドにＴＰＩプロモーターのコントロール下で置いたが、但しＭＥは動原体プラスミドにおいてサブクローン化した。遺伝子の２種以上がS.cerevisiae ＧＲＦ１８ＵおよびＢＹ４７４２へ組み込まれた。各遺伝子はユニーク座(unique locus)において組み込まれた。
【０１１５】
図１は、植物におけるＤ‐グルコースからＬ‐アスコルビン酸へ至る生理学的生合成経路の現在の理解の略記を示す。次の酵素が関与する：Ａ，Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンデヒドロゲナーゼ（１．３．２．３）、Ｂ，Ｌ‐ガラクトースデヒドロゲナーゼ、Ｃ，ミオイノシトールホスファターゼ（３．１．３．２３）、Ｄ，ヒドロラーゼ（推定）、Ｅ，ＧＤＰ‐マンノース‐３，５‐エピメラーゼ（５．１．３．１８）、Ｆ，マンノース‐１‐リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（２．７．７．２２）、Ｇ，ホスホマンノムターゼ（５．４．２．８）、Ｈ，マンノース‐６‐リン酸イソメラーゼ（５．３．１．８）、Ｉ，グルコース‐６‐リン酸イソメラーゼ（５．３．１．９）、Ｊ，ヘキソキナーゼ（２．７．１．１）。図１において示された経路において、ＡＬＯは反応Ａを触媒し、ＬＧＤＨは反応Ｂを触媒し、ＭＥは反応Ｅを触媒し、ＭＩＰは反応Ｃを触媒する。野生型酵母細胞はＧＤＰ‐マンノースを生産して（図１において反応Ｆ〜Ｊ）、それを小胞体へ輸送することが知られている。
【０１１６】
下記表は、（ｉ）ＡＬＯおよびＬＧＤＨ、（ii）ＡＬＯ、ＬＧＤＨ、およびＭＥ、または(iii)ＡＬＯ、ＬＧＤＨ、ＭＥ、およびＭＩＰにおいて形質転換されたS.cerevisiae ＧＲＦｃ（コントロール）またはS.cerevisiae ＧＲＦ１８Ｕによるアスコルビン酸へのＤ‐グルコースおよびＤ‐マンノースの変換を示す。０．０５のＯＤ６６０から出発して最少培地（２％グルコースまたはマンノース、０．６７％ＹＮＢ）において細胞を増殖させた。２４時間の増殖後、アスコルビン酸を測定した。野生型ＧＲＦｃとＡＬＯおよびＬＧＤＨで形質転換されたＧＲＦ１８Ｕ細胞とは双方ともアスコルビン酸を蓄積しなかったが、ＡＬＯ、ＬＧＤＨ、およびＭＥ、またはＡＬＯ、ＬＧＤＨ、ＭＥ、およびＭＩＰにより形質転換された細胞は各々予想外に相当量の（すなわち、バックグラウンドレベルより多く）アスコルビン酸を蓄積した。形質転換された酵母をグルコースまたはマンノースベース培地で回分増殖(batch grown)させた：
【表７】
2008536497.tif 000009
コントロール株において求められた値は、野生型酵母により通常生産されるエリトロアスコルビン酸の生産高を示す。
【０１１７】
酵母がＧＤＰ‐Ｌ‐ガラクトースからＬ‐ガラクトースへの反応を非特異的に触媒しうる活性を内在的に有している、と我々は結論づけた（図１参照）。特に、理論に拘束されることなく、ＧＤＰ‐Ｌ‐ガラクトースがＬ‐ガラクトース‐１‐Ｐへ自然に加水分解し、非特異的ホスファターゼがＬ‐ガラクトースへのＬ‐ガラクトース‐１‐Ｐの変換を触媒し、次いでこれがＬＧＤＨおよびＡＬＯによりＬ‐アスコルビン酸へ変換された、と我々は結論づけた。ＭＩＰは推定非特異的ホスファターゼより優れたＬ‐ガラクトースへのＬ‐ガラクトース‐１‐Ｐの触媒作用を示した（ＡＬＯ、ＬＧＤＨ、ＭＥ、ＭＩＰ vs. ＡＬＯ、ＬＧＤＨ、ＭＥ）。我々は培地においてアスコルビン酸の蓄積を何ら観察しなかった。
【０１１８】
図２は、ＹＭＬ００７ｗ酵母宿主が特に酸化ストレスを受けやすいことを示す。Ｙａｐ１ｐは酸化ストレスへの応答に必要な遺伝子を活性化する、この遺伝子の欠損は観察された表現型へ至る（Rodrigues-Pousada CA,Nevitt T,Menezes R,Azevedo D,Pereira J,Amaral C.Yeast activator proteins and stress response:an overview.FEBS Lett.,2004 Jun 1;567(1):80-85）。
下記酵母株が分析された：
ＢＹ４７４２（▲）
ＹＭＬ００７ｗ（○）
図２Ａ．０．１のＯＤ６６０から出発して最少培地（２％グルコース、０．６７％ＹＮＢ）において酵母株を増殖させた。
図２Ｂ．０．８ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下において０．１のＯＤ６６０から出発して最少培地（２％グルコース、０．６７％ＹＮＢ）により酵母株を増殖させた。
図２Ｃ．１．０ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下において０．１のＯＤ６６０から出発して最少培地（２％グルコース、０．６７％ＹＮＢ）により酵母株を増殖させた。
２種の株はＨ２Ｏ２の非存在下において増殖したが（図２Ａ）、ＹＭＬ００７ｗ酵母宿主の増殖は０．８ｍＭの過酸化水素を含有した培地において著しく遅れ（図２Ｂ）、１ｍＭの過酸化水素を含有した培地において完全に損なわれた（図２Ｃ）。
【０１１９】
図３は、ＹＭＬ００７ｗ酵母の増殖感受性が培地へアスコルビン酸を加えることにより救済されうることを示す。
下記酵母株が分析された：
ＢＹ４７４２（▲）
ＹＭＬ００７ｗ（○）
図３Ａ．０．８ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下において０．１のＯＤ６６０から出発して最少培地（２％グルコース、０．６７％ＹＮＢ）により酵母株を増殖させた。アスコルビン酸を１５ｍｇ／Ｌの最終濃度でＴ＝０に加えた。
図３Ｂ．１．０ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下において０．１のＯＤ６６０から出発して最少培地（２％グルコース、０．６７％ＹＮＢ）により酵母株を増殖させた。アスコルビン酸を１５ｍｇ／Ｌの最終濃度においてＴ＝０に加えた。
添加アスコルビン酸の効果は濃度依存性である。事実、３０ｍｇ／Ｌまでアスコルビン酸濃度の増加は増殖欠陥のより速やかな救済を示した（図にデータ示さず）。
【０１２０】
図４は、ＹＭＬ００７ｗ酵母宿主の増殖欠陥がＡＬＯ、ＬＧＤＨ、ＭＥ、およびＭＩＰの発現後に救済されうることを示す。
下記酵母株が分析された：
ＢＹ４７４２（▲）
ＡＬＯ、ＬＧＤＨ、およびＭＥを発現するＹＭＬ００７ｗ（□）
ＡＬＯ、ＬＧＤＨ、ＭＥ、およびＭＩＰを発現するＹＭＬ００７ｗ（黒四角）
図４Ａ．０．８ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下において０．１のＯＤ６６０から出発して最少培地（２％グルコース、０．６７％ＹＮＢ）により酵母株を増殖させた。
図４Ｂ．１．０ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下において０．１のＯＤ６６０から出発して最少培地（２％グルコース、０．６７％ＹＮＢ）により酵母株を増殖させた。
クローン化遺伝子は、培地へアスコルビン酸を加えることで得られた場合と類似した、増殖感受性の救済をなしえた（図３参照）。
ＭＩＰの存在が、それなしの酵母細胞と比較して、速い回復をなしえたことは、注目に値する。
【０１２１】
ストレスの古典的な例として、我々は野生型酵母細胞をＨ２Ｏ２により刺激した。予想通りに、野生型細胞はＨ２Ｏ２の非存在下においてよく増殖するが（図５Ａ）、同酵母細胞はＨ２Ｏ２の存在下において増殖しない（図５Ｂ）。この外部ストレス要因は、細胞下構造の中でも、ＤＮＡへの損傷、脂質への損傷、タンパク質への損傷、および膜への損傷に至り、最終的には細胞生存力および細胞統合性の喪失へ至ることが、通常認められている。したがって、図５Ｂにおいて示されるように、このストレス要因の存在が産物（この場合には、野生型酵母バイオマス）のゼロ生産高、ゼロ生産力、およびゼロ収率につながることは意外ではない。（ｉ）ＬＧＤＨ、ＡＬＯ、およびＭＥまたは（ii）ＬＧＤＨ、ＡＬＯ、ＭＥ、およびＭＩＰにおいて野生型ＧＲＦ酵母の形質転換により、組換え酵母は上記のようにアスコルビン酸を生産したが、野生型酵母は自然にはアスコルビン酸を生産しない。意外にも、これらの組換え酵母に基づくバイオプロセスは産物、酵母バイオマスの高生産高、高生産力、および高収率を示した（図５Ｂ）。生産高、生産力、および収率の値は、０．００（コントロール株の値）より大きい。
【０１２２】
図５は、野生型ＧＲＦ酵母株が発酵ストレス条件（２ｍＭのＨ２Ｏ２を加えることで誘導されたストレス条件）に感受性であることを示す、意外にも、アスコルビン酸を生産する組換え酵母株は強い構造安定性(robustness)を示す。次の酵母株が分析された：ＧＲＦｃ（黒三角）、ＡＬＯ、ＬＧＤＨ、およびＭＥを発現するＧＲＦ１８Ｕ（白四角）、およびＡＬＯ、ＬＧＤＨ、ＭＥ、およびＭＩＰを発現するＧＲＦ１８Ｕ（黒四角）。
図５Ａ．０．１のＯＤ６６０から出発して最少培地（２％グルコース、０．６７％ＹＮＢ）において酵母株を増殖させた。
図５Ｂ．２．０ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下において０．１のＯＤ６６０から出発して最少培地（２％グルコース、０．６７％ＹＮＢ）により酵母株を増殖させた。野生型株はグルコースを消費しない。
【０１２３】
この実験において用いられた全ての株が同様の栄養要求性および同様の抗生物質耐性カセット（異なる異種遺伝子の発現に必要である）を有し、そのためそれらの全て、すなわち３または４種の異種遺伝子を発現するものまたは野生型株について同様の培地を用いることが可能であった。この実験においては、２種の組換えＧＲＦ酵母株が野生型ＧＲＦ酵母より頑強な株であり、したがってある工業的工程により適することを示す。理論に拘束されることなく、おそらくアスコルビン酸による活性細胞種（ＲＯＳ）の直接的な除去(scavenging)と、特にアポトーシス、細胞死、生存力喪失、および完全性喪失のような望ましくないストレス反応へのアスコルビン酸による干渉とにより、組換え酵母が多様なストレス要因にさほど感受性でなくなっているらしい、と我々は考察する。
【０１２４】
本発明の組成物、方法、および酵母株が具体的態様に関して記載されてきたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱せずにバリエーションを加えうることは、当業者に明らかである。
【０１２５】
参考文献
下記参考文献は、それらがここで記載されたものに補足的な例示の操作または他の詳細を示す限り、特に引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
2008536497.tif 000010
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2008536497.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、Ｄ‐グルコースからＬ‐アスコルビン酸の合成に関する、主要な植物経路(plant pathway)を示す。
【図２】図２は、酸化ストレスの非存在下（図２Ａ）および存在下（図２Ｂ〜２Ｃ）において、ＢＹ４７４２およびＹＭＬ００７ｗ酵母の６６０ｎｍにおける光学濃度を示す。Ｙａｐ１ｐは酸化ストレスへの応答に必要な遺伝子を活性化し、この遺伝子の欠損は観察された表現型へ至る。
【図３】図３は、酸化ストレスの存在下および培地へのアスコルビン酸の添加により、ＢＹ４７４２ｗｔおよびＹＭＬ００７ｗ酵母の６６０ｎｍにおける光学濃度を示す（図３Ａ〜３Ｂ）。
【図４】図４は、酸化ストレスの存在下において、ＢＹ４７４２ｗｔ、ＡＬＯ、ＬＧＤＨ、およびＭＥを発現するＹＭＬ００７ｗ、およびＡＬＯ、ＬＧＤＨ、ＭＥ、およびＭＩＰを発現するＹＭＬ００７ｗ酵母の６６０ｎｍにおける光学濃度を示す（図４Ａ〜４Ｂ）。
【図５】図５は、酸化ストレスの非存在下（図５Ａ）および存在下（２ｍＭのＨ２Ｏ２）において、野生型ＧＲＦｃ、ＡＬＯ、ＬＧＤＨ、およびＭＥを発現するＧＲＦ１８Ｕ、およびＡＬＯ、ＬＧＤＨ、ＭＥ、およびＭＩＰを発現するＧＲＦ１８Ｕ酵母株の６６０ｎｍにおける光学濃度を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2008536497.tif 000020
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
2008536497000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月19日(2007.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ‐アスコルビン酸の製造方法であって、
ａ）マンノースエピメラーゼ（ＭＥ）をコードするコード領域、Ｌ‐ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）をコードするコード領域、およびＤ‐アラビノノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域において機能的に形質転換された組換え酵母を得て、
ｂ）Ｄ‐グルコースを含む培地において前記組換え酵母を培養し、それによりＬ‐アスコルビン酸を形成させ、そして
ｃ）Ｌ‐アスコルビン酸を単離すること
を含んでなることを特徴とする、製造方法。
【請求項２】
前記組換え酵母が、ミオイノシトールホスファターゼ（ＭＩＰ）をコードするコード領域において更に機能的に形質転換されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵母が、属Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Debaromyces、Nadsonia、Lipomyces、Torulopsis、Kloeckera、Pichia、Schizosaccharomyces、Trigonopsis、Brettanomyces、Cryptococcus、Trichosporon、Aureobasidium、Lipomyces、Phaffia、Rhodotorula、Yarrowia、またはSchwanniomycesに属するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵母が種S.cerevisiae、K.lactis、またはZ.bailiiに属するものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵母が、S.cerevisiae株ＧＲＦ１８Ｕ、S.cerevisiae株Ｗ３０３１Ｂ、ＢＹ４７４２、およびＹＭＬ００７ｗ、K.lactis株ＣＢＳ２３５９、またはZ.bailii株ＡＴＣＣ６０４８３から選択されるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＥが配列番号１と少なくとも約９５％の同一性を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＥが配列番号１と少なくとも約９８％の同一性を有するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＩＰが配列番号２と少なくとも約９５％の同一性を有するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＩＰが配列番号２と少なくとも約９８％の同一性を有するものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵母が、Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ‐アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、またはＬ‐グロノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）から選択される酵素をコードするコード領域において更に機能的に形質転換されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記コード領域が、酵母において活性なプロモーターへ結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロモーターがS.cerevisiaeトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離工程が酵母を溶解させることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離工程が、遠心、濾過、マイクロ濾過、限外濾過、ナノ濾過、液体‐液体抽出、結晶化、ヌクレアーゼもしくはプロテアーゼによる酵素処理、またはクロマトグラフィーを更に含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離工程が、クロマトグラフィー、活性炭、マイクロ濾過、限外濾過、ナノ濾過、液体‐液体抽出、または結晶化を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵母が、マンノースエピメラーゼ（ＭＥ）をコードするコード領域、Ｌ‐ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）をコードするコード領域、およびＤ‐アラビノノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域において機能的に形質転換されたものである、組換え酵母。
【請求項１７】
前記組換え酵母が、ミオイノシトールホスファターゼ（ＭＩＰ）をコードするコード領域において更に機能的に形質転換されたものである、請求項１６に記載の組換え酵母。
【請求項１８】
前記ＭＥが配列番号１と少なくとも約９５％の同一性を有するものである、請求項１６に記載の組換え酵母。
【請求項１９】
前記ＭＩＰが配列番号２と少なくとも約９５％の同一性を有するものである、請求項１７に記載の組換え酵母。
【請求項２０】
前記酵母が、Ｌ‐ガラクトノ‐１，４‐ラクトンデヒドロゲナーゼ（ＡＧＤ）、Ｄ‐アラビノースデヒドロゲナーゼ（ＡＲＡ）、またはＬ‐グロノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（ＧＬＯ）から選択される酵素をコードするコード領域において更に機能的に形質転換されたものである、請求項１６に記載の組換え酵母。
【請求項２１】
マンノースエピメラーゼ（ＭＥ）をコードするコード領域、Ｌ‐ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＧＤＨ）をコードするコード領域、およびＤ‐アラビノノ‐１，４‐ラクトンオキシダーゼ（ＡＬＯ）をコードするコード領域において微生物を機能的に形質転換することを含んでなる、発酵に際して微生物により生産される産物の生産高、生産力、または収率を増加させる方法。
【請求項２２】
更に、ミオイノシトールホスファターゼ（ＭＩＰ）をコードするコード領域において微生物を機能的に形質転換することを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物が、細菌、酵母、糸状菌、動物細胞、および植物細胞からなる群より選択されるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵母が種S.cerevisiae、K.lactis、またはZ.bailiiに属するものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵母が株S.cerevisiae ＧＲＦに属するものである、請求項２４に記載の方法。
【国際調査報告】
2008536497.tif 000038
2008536497.tif 000039
2008536497.tif 000040