(57)【要約】  本発明は、市販されているステビアレバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）出発材料から、すべての商業的用途に許容できる水溶性のあるレバウジオシドＡ（「Ｒｅｂ」）を単離及び精製する高処理能力、高純度、高収率システム及び方法を提供する。また、本発明は、ステビア出発材料の所与のバッチの属性に基づき、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａの収率を最大限に高める手段を提供する。本発明によって製造されるＲｅｂ Ａは、水溶性であり、これまでレバウジオシド甘味料に付随していた苦味がなく、ノンカロリーであり、試薬として、並びに経口消費できる製品中の成分として、例えば、甘味料、風味増強剤、及び風味修飾剤として、使用するのに適している。
2008516990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビア出発材料からレバウジオシドＡを精製する方法であって、（ｉ）選択ＥｔＯＨ溶媒を処方するためのＥｔＯＨ処方段階、（ｉｉ）ステビア出発材料を用いる第一還流段階、及び、場合により、還流混合物又は撹拌洗浄混合物から単離された保持物を用いる追加の還流段階、（ｉｉｉ）場合により、１つ以上の撹拌洗浄段階、並びに（ｉｖ）エタノールパージ及び乾燥段階を用いてステビア出発材料を処理することを含む方法。
【請求項２】
ステビア出発材料からレバウジオシドＡを精製する方法であって、
ステビア出発材料のための選択ＥｔＯＨ溶媒を処方すること、
還流混合物を作製するため、選択ＥｔＯＨ溶媒中でステビア出発材料を混合及び還流すること、
還流混合物を濾過することにより保持物を分離すること、
撹拌洗浄混合物を作製するため、エタノール中で保持物を混合及び撹拌すること、
撹拌洗浄混合物を濾過することにより保持物を分離すること、並びに
エタノールをパージすること及び保持物を乾燥することを含み、乾燥保持物はレバウジオシドＡである方法。
【請求項３】
ステビア出発材料からレバウジオシドＡを精製する方法であって、
ステビア出発材料のための選択ＥｔＯＨ溶媒を処方すること、
還流混合物を作製するため、選択ＥｔＯＨ溶媒中でステビア出発材料を混合及び還流すること、
還流混合物を濾過することにより保持物を分離すること、並びに、場合により、撹拌混合物を作製するためエタノール中で保持物を混合及び撹拌すること、及び撹拌洗浄混合物を濾過することにより保持物を分離すること、
還流混合物を作製するため、保持物を選択ＥｔＯＨ溶媒中で混合及び還流すること、
還流混合物を濾過することにより保持物を分離すること、並びに、場合により、撹拌混合物を作製するためエタノール中で保持物を混合及び撹拌すること、及び撹拌洗浄混合物を濾過することにより保持物を分離すること、
場合により、前記２ステップを１回以上繰り返すこと、並びに
エタノールをパージすること及び保持物を乾燥することを含み、乾燥保持物はレバウジオシドＡである方法。
【請求項４】
選択ＥｔＯＨ溶媒を処方する方法が、出発材料アッセイ又は還流溶媒近似を含み、場合により、質量対体積比アッセイが含まれる請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項５】
ステビア出発材料を混合及び還流する方法が、
還流混合物を作製するため、ステビア出発材料１質量部を、選択ＥｔＯＨ溶媒３〜１０体積部、より好ましくは４〜６体積部、最も好ましくは約４体積部と混合すること、及び
還流混合物を適切な機器中で、ほぼエタノールの沸点にて約１時間還流することを含む請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項６】
１つ以上の追加還流において保持物を混合及び還流する方法が、
還流混合物を作製するため、保持物１質量部を、選択ＥｔＯＨ溶媒３〜１０体積部、より好ましくは４〜６体積部、最も好ましくは約４体積部と混合すること、及び
還流混合物を適切な機器中で、ほぼエタノールの沸点にて約１時間還流することを含む請求項１又は３に記載の方法。
【請求項７】
還流混合物又は撹拌洗浄混合物を濾過することにより保持物を分離する方法が、
還流混合物の体積及び必要とされる処理能力に適した、及び約２．０μｍを超える、より好ましくは１．５μｍを超える、最も好ましくは０．１μｍ以上の軸又は直径の粒子を分離する濾過手段を用いて混合物を濾過すること、並びに
濾過手段からの分離粒子を集めることを含む、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項８】
前のステップからの撹拌洗浄保持物において混合及び撹拌し、撹拌洗浄混合物を濾過することにより保持物を分離する方法が、
洗浄混合物を作製するため、単離レバウジオシドＡ１質量部を、エタノール３〜１０体積部、より好ましくは４〜６体積部、最も好ましくは約４体積部と混合すること、
洗浄混合物を適切な機器中で約１５分間撹拌すること、
還流混合物の体積及び必要とされる処理能力に適した、及び約２．０μｍを超える、より好ましくは１．５μｍを超える、最も好ましくは０．１μｍ以上の軸又は直径の粒子を分離する濾過手段を用いて洗浄混合物を濾過すること、並びに
濾過手段からの分離粒子を集めることを含む、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項９】
エタノールをパージし、単離レバウジオシドＡを乾燥する方法が、本発明の実験室実施形態では、オーブン、好ましくは送風オーブン中で７９℃以上にて単離レバウジオシドＡを乾燥すること、及び、本発明の工業的実施形態では、
還流混合物又は撹拌洗浄混合物を濾過することにより前のステップにおいて単離された保持物１質量部を、最終的な混合物体積が保持物の質量の約２倍になるように水と混合すること、
撹拌しながら通気式容器中で混合物を少なくとも７９℃まで加熱すること、
混合物のエタノール含有量が、関連する噴霧乾燥機によって許容される最大エタノール含有量以下になるまで混合物を撹拌すること、
混合物を噴霧乾燥機にフィードすること、及び
乾燥レバウジオシドＡを集めることを含む請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項１０】
ＥｔＯＨ溶媒を処方する際及び選択ＥｔＯＨ溶媒において使用されるエタノールが、無水エタノールか変性エタノールのどちらかである請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項１１】
エタノール以外のアルカノールが、選択ＥｔＯＨ溶媒におけるエタノールの代わりに使用される請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項１２】
アルカノールが、選択ＥｔＯＨ溶媒におけるエタノールの代わりに、及びいずれかの撹拌洗浄段階において使用される請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項１３】
第一のアルカノールが、選択ＥｔＯＨ溶媒において使用され、第二のアルカノールが、いずれかの撹拌洗浄段階において使用される請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１、２、又は３に記載の方法を用いて製造されるレバウジオシドＡ。
【請求項１５】
請求項１、２、又は３に記載の方法を用いて製造され、場合により開放容器、缶、瓶又は他のパッケージに分配されている炭酸、非炭酸、冷凍、半冷凍、非冷凍、すぐに飲める、濃縮、乳、非乳、ハーブ、非ハーブ、カフェイン含有、カフェイン非含有、アルコール、非アルコール、味付け、非味付け、野菜ベース、果実ベース、根／塊茎／球茎ベース、ナッツベース、他の植物ベース、コーラベース、チョコレートベース、肉ベース、シーフードベース、他の動物ベース、藻類ベース、カロリー増強、カロリー低減、及びカロリーゼロ製品を含む群から選択される飲料、ブロス、及び飲料調製物において使用されるレバウジオシドＡ。
【請求項１６】
請求項１、２、又は３に記載の方法を用いて製造され、乳ベース、穀類ベース、焼上、野菜ベース、果実ベース、根／塊茎／球茎ベース、ナッツベース、他の植物ベース、卵ベース、肉ベース、シーフードベース、他の動物ベース、藻類ベース、加工、保存、及び合成製品を含む群から選択される食品及び食品調製物において使用されるレバウジオシドＡ。
【請求項１７】
請求項１、２、又は３に記載の方法を用いて製造され、乳ベース、穀類ベース、焼上、野菜ベース、果実ベース、根／塊茎／球茎ベース、ナッツベース、ガムベース、他の植物ベース、卵ベース、肉ベース、シーフードベース、他の動物ベース、藻類ベース、加工、保存、及び合成製品を含む群から選択されるキャンディー、菓子、デザート、及びスナックにおいて使用されるレバウジオシドＡ。
【請求項１８】
請求項１、２、又は３に記載の方法を用いて製造され、処方薬及び店頭医薬品、アッセイ、診断キット、並びに体重管理、栄養補給剤、ビタミン、乳児食、糖尿病食、アスリート食、老人食、低炭水化物食、低脂肪食、低タンパク食、高炭水化物食、高脂肪食、高タンパク食、低カロリー食、ノンカロリー食、口腔衛生製品、パーソナルケア製品、専門的歯科製品、医用、獣医用、及び外科用製品、並びに充填剤、シロップ剤、カプセル剤、ゲル剤、及びコーティング製品を混ぜ合わせる医薬品を含む群から選択される治療法において使用されるレバウジオシドＡ。
【請求項１９】
請求項１、２、又は３に記載の方法を用いて製造され、プラスチックフィルム、熱硬化性及び熱可塑性樹脂、ガム、ホイル、紙、瓶、箱、インク、塗料、接着剤、及びパッケージ用コーティング製品を含む群から選択される消費財パッケージ用材料及び容器において使用されるレバウジオシドＡ。
【請求項２０】
請求項１、２、又は３に記載の方法を用いて製造され、甘味料、補助甘味料、コーティングされた甘味料スティック、冷凍菓子スティック、医用スプーン（ヒト及び動物使用）、歯科用器具、加糖使い捨て食器及び用具、サシェ、食用サシェ、ポプリ、食用ポプリ、ごった煮、食用ごった煮、造花、食用造花、衣料、食用衣料、マッサージオイル、及び食用マッサージオイルを含む群から選択される商品において使用されるレバウジオシドＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、「Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ａ」というタイトルの発明に関して、米国特許商標局において２００４年１０月１８日に出願された第６０／６２０，２８０号、及び２００５年５月６日に出願された第６０／６７８，６５３号という２件の仮特許出願の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、植物ステビアレバウディアナベルトーニ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ｌ．Ｂｅｒｔｏｎｉ）（「ステビア」）からの粗抽出物からレバウジオシドＡ（本明細書では、別名「Ｒｅｂ Ａ」及び「ＲＡ」）を精製する技術分野に含まれる。Ｒｅｂ Ａは、ステビア抽出物中に、多くの他の配糖体、ステレビン（ｓｔｅｒｅｂｉｎｓ）、及び他の化合物と一緒に見出されるジテルペン配糖体である。Ｒｅｂ Ａは、ステビア中の最も甘味のある（食料品において使用される甘味料濃度でショ糖の甘味のおおよそ２５０〜４５０倍）配糖体であり、ノンカロリー甘味料として膨大な商業的可能性を有する。一般的に言えば、レバウジオシドＡを除くステビア配糖体は、望ましくない後味を有し（一部は、苦い後味を有する）、一般的に、そのような非Ｒｅｂ Ａ配糖体の甘味料としての使用を制限している。さらに、ステビア抽出物中のステレビン（「イエローオイル」として一般に知られている一群のジテルペン化合物）は、ごくわずかな濃度においても極めて苦い味を有する。手短にいえば、技術分野、及び技術的問題は、粗ステビア抽出物から９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを、特に工業的規模で単離することであり、そのような純度は、すべての現在入手可能なステビア甘味料を特徴付ける苦味又はオフテイスト（ｏｆｆ−ｔａｓｔｅ）を解消する。
【背景技術】
【０００３】
６種のレバウジオシド（Ａ〜Ｆ）、ステビオシド（野生型ステビアからの抽出物における主要な配糖体）、ズルコシド、及びステレビンは、溶液中で分離するのが困難である。特に、６種のレバウジオシドは、同一のジテルペン骨格を共有し、配糖体部分のみが異なり、Ｒｅｂ Ａ以外はすべて、ある程度の苦い後味を有する。多くの特許及び学術論文が、純粋な（すなわち、９９＋％純度）レバウジオシドＡを製造するための努力について記載しているが、今日まで、実験室で、ましてや商業的量で純粋なＲｅｂ Ａを製造する方法は一切報告されていない。報告された製造方法の多くは、イオン交換カラム又はガスの使用を必要とし、その経済性は、飲料、パッケージされた食品、ベーキング、キャンディー、パーソナルケア製品、医薬品、及び他の産業に必要とされる甘味料の商業的量への規模拡大を鈍らせている。
【０００４】
ステビアからジテルペン配糖体を抽出及び精製するための大部分の方法は、粗抽出物の複雑な処理を用い、出発材料中に高濃度のレバウジオシドＡを必要とするにもかかわらず、レバウジオシドＡの収率及び純度（＜９５％）は低い。いくつかの方法は、溶媒としてアルカノール及び／又は含水アルカノールを使用している。例えば、Ｋｉｔａｚｕｍｅ他の米国公開特許出願第２００３／０１３８５３８Ａ１号の段落４９〜５３には、ステビアレバウディアナからの植物又は乾燥葉を、メタノール、含水メタノール、又は含水エタノール（しかし、還流プロセスは用いない）及びカラム精製を用いて処理し、最低限レバウジオシドＡ４０重量％を含有し、レバウジオシドＡ対ステビオシド比が１．５：１である抽出物を製造する方法が記載されている。Ｋｉｔａｚｕｍｅの方法では、出発植物材料が、レバウジオシドＡ４０重量％でないか、レバウジオシドＡ対ステビオシド比が１．５：１（「Ｋｉｔａｚｕｍｅ閾値純度（Ｋｉｔａｚｕｍｅ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｐｕｒｉｔｙ）」）でない場合、Ｋｉｔａｚｕｍｅ特許出願の目的（β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素を用いるβ−１，４−ガラクトシルのレバウジオシドＡ上での置換）を支援するのに必要とされる十分な純度のレバウジオシドＡを製造するのに、カラム精製又は再結晶を用いなければならない。Ｋｉｔａｚｕｍｅにおける好ましい出発材料は、Ｒｅｂ Ａ含有量が少なくとも７０％であるステビア抽出物である。Ｋｉｔａｚｕｍｅ法では、再結晶を用い、トランスフェラーゼ反応のため、Ｋｉｔａｚｕｍｅ閾値純度のレバウジオシドＡを製造する場合、ステビア抽出物を、溶媒中に水を含まないメタノール又はエタノールなどの親水性有機溶媒に飽和するまで溶かし、溶液を濃縮又は冷却し、次いで、高純度レバウジオシドＡの沈殿を集めるため濾過されるが、Ｒｅｂ Ａの精製に関するプロセスパラメーター、例えば、加熱及び冷却速度、濾過規格などは開示されていない。また、Ｋｉｔａｚｕｍｅは、再結晶によって製造されるＲｅｂ Ａの純度を開示しておらず、出発材料がＫｉｔａｚｕｍｅ閾値純度以下の場合に再結晶を使用できることだけを開示している。重要なことに、Ｋｉｔａｚｕｍｅでは、すべてのＲｅｂ Ａ材料が、すべての結晶化又は再結晶ステップ後に陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂ステップ（段落５０）を用いて製造される。９１．３％（実施例３）より高いＲｅｂ Ａ純度は開示されておらず、ＫｉｔａｚｕｍｅのＲｅｂ Ａの溶解度も開示されていない。実際、Ｋｉｔａｚｕｍｅは、実施例で使用される９１．３％純度Ｒｅｂ Ａが、再結晶を用いて製造されたか、或いはカラム精製のみにより製造されたかを開示していない。９１．３％純度のＲｅｂ Ａは、トランスフェラーゼ反応にとって許容できるが、食品及び飲料における商業的用途には許容できない。
【０００５】
Ｐａｙｚａｎｔ他による米国特許第５，９６２，６７８号は、２つのイオン交換カラムによる処理、及びメタノール溶液からの析出を含む、ステビア植物材料からのＲｅｂ Ａの７ステップの抽出及び精製について記載している。Ｒｅｂ Ａの精製については、第二のイオン交換カラムから混合甘味配糖体をメタノールで取り出した後、集めた溶離液を乾燥する。メタノール溶液中で乾燥固体を還流し、次いで溶液を冷却すると、ステビオシドが析出し、濾過により捕捉する。次いで、濾液を濃縮し（おそらく溶媒を蒸発させることにより）、冷却すると、レバウジオシドＡが析出する。Ｐａｙｚａｎｔの実施例５における方法は、純度が９８．６％までのレバウジオシドＡを生じるように記載されている。しかしながら、出発材料として８０％純度Ｒｅｂ Ａステビア抽出物を用いると、Ｒｅｂ ＡのＰａｙｚａｎｔの精製を再現するための本発明の発明者による度重なる努力は失敗し、典型的な結果は、５重量％未満のＲｅｂ Ａ収率と顕著な苦い後味の無定形結晶であった。Ｐａｙｚａｎｔを再現するための第三者による試みも失敗した（未発表データ）。実施例５を再現する試みでは、メタノール溶液から熱を取り除いてから４０時間を超えるまで、Ｒｅｂ Ａの析出は始まらなかった。実施例５におけるＰａｙｚａｎｔ精製方法は、市販されているステビア抽出物を入手することによってより、むしろＰａｙｚａｎｔ請求項１（メタノールを用いる７ステップのプロセス）におけるステップに従うことによって得られるＲｅｂ Ａ出発材料を明らかに必要とする。したがって、Ｐａｙｚａｎｔ法は、ステビア抽出物に一般的に適用可能でもなく、Ｒｅｂ Ａの商業的製造に拡張可能でもない。
【０００６】
再現可能でないことに加えて、Ｐａｙｚａｎｔは、含水溶媒を使用することを避けて教示している。Ｐａｙｚａｎｔは、ステビオシドを精製するための還流溶媒として無水メタノールを使用している。実施例２において、Ｐａｙｚａｎｔは、「甘味配糖体は、水からＸＡＤ−７樹脂上に吸収されたため、この樹脂の表面内又は表面上に含まれている水があり、この水は、メタノールで取り出される。乾固まで進む唯一の理由は、この水を除去するためである。微量の水がそこに無かったか、微量の水が他の何らかの手段により除去された場合には、メタノールを、あるレベルまで蒸発により除去し、その結果、甘味配糖体は、溶液から晶出するであろう」と述べている。実施例３において、Ｐａｙｚａｎｔは、「無水であるか、或いは可能な限り水を含まないことにより、結晶収率は最大限に高められ、晶出時間は最小限に抑えられる。例えば、この最初の晶出におけるメタノール中の０．５％の水は、収率を著しく低下させるはずである。望ましい場合、以下の実施例５に記載されている精製技法を用いることにより、ステビオシドをさらに精製することができる」と述べている。実施例５において、Ｐａｙｚａｎｔは、９０．２％Ｒｅｂ Ａを含有するステビア抽出物（しかしながら、実施例３では、最終製品は、７．９％Ｒｅｂ Ａ含有量であった）を、質量で８６．６７％メタノール及び１３．３３％水の溶媒中で還流する精製を開示しており、この手順は、９８．６％Ｒｅｂ Ａをもたらすといわれているが、加熱速度、冷却速度、撹拌、及び温度は開示されていない。Ｐａｙｚａｎｔは、実施例５において使用される抽出物が「実施例４由来でない」と記述しているが、他の場所では、７．９％純度Ｒｅｂ Ａのみを得ることを開示している。Ｐａｙｚａｎｔは、実施例５において、溶媒に水を含めることが「実験室における利便性」であるが、「商業的規模では、無水溶媒がより好都合かもしれない」と述べている。実施例３及び５において、Ｐａｙｚａｎｔは、ステビア配糖体の精製のために含水アルカノール溶媒を用いることを避けて明確に教示している。Ｐａｙｚａｎｔは、実施例５において使用される９０．２％純度Ｒｅｂ Ａを得た方法を開示しておらず、すなわち、Ｒｅｂ Ａ純度を７．９％から９０．２％まで改善する方法は実行不可能であり、したがって、実施例５は実行不可能である。Ｐａｙｚａｎｔは、特許請求の範囲に記載されているＲｅｂ Ａ純度を決定するのに使用される方法も開示していない。Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ（ｗｗｗ．ｃｈｒｏｍａｄｅｘ．ｃｏｍ）又はＷａｋｏ（ｗｗｗ．ｗａｋｏ−ｃｈｅｍ．ｃｏ．ｊｐ）から現在入手可能なＲｅｂ Ａ参照標準品によれば、Ｐａｙｚａｎｔの特許請求の範囲に記載された純度は、誇張されていると考えられる。前述のように、ＰａｙｚａｎｔのＲｅｂ Ａ精製方法は、既存の商業品質ステビア抽出物を出発材料として用いた場合には失敗した。Ｒｅｂ Ａを精製するＰａｙｚａｎｔ法は、メタノール還流中にステビオシドをまず析出させることを必要とし、したがって、Ｐａｙｚａｎｔは、参照用に限定すべきである。９０．２％Ｒｅｂ Ａ純度が得られた方法の脱落、参照標準品の欠如、及び無水溶媒を使用する命令は別にして、Ｐａｙｚａｎｔ法におけ���プロセスの複雑さ、低い処理能力、及び低収率は、工業的プロセスとして使用することができないことを意味している。さらに、Ｒｅｂ Ａを単離する際のメタノール還流の使用は、最終製品におけるメチル化混入物の付随する危険性と共に、食品に関する政府の規制当局から「一般的に安全と認識される」状況を得る際の障壁となることがある。
【０００７】
高純度レバウジオシドＡを製造する既存技術は、複雑な一連のイオン交換カラム及び他の低処理能力手順を使用している。Ｋｉｔａｚｕｍｅ、Ｐａｙｚａｎｔ他により使用された既存方法は、結晶化、再結晶、カラム精製、又はそれらの組合せによるかどうかにかかわらず、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造していない。これまで、Ｒｅｂ Ａ最終製品における容認し難いほど高レベルの混入の原因になってきた未解決の問題がある。レバウジオシドＡを含むステビア配糖体の工業的製造における既存技術は、通常、ステビア植物材料から始まり、様々なステビア配糖体及び「イエローオイル」が混ざった４０％〜９０％純度Ｒｅｂ Ａを有するステビア抽出物を製造し、そのような抽出物は、「ステビア抽出物粉末」又は「ステビア抽出物」と一般に呼ばれ、本明細書では「ステビア出発材料」と呼ぶ。図面では、ステビア出発材料を「ＳＳＭ」と省略する。９９＋％純度レバウジオシドＡを製造する工業的方法の欠如は、今日、ステビア甘味料が、通常、他の矯味剤がステビア甘味料中の残留混入物に起因する苦い又は渋い後味をマスクする場合に（例えば、ピクルスにする際に）使用されることを意味してきた。他のステビア化合物による１％の混入でさえ、Ｒｅｂ Ａ甘味料において顕著な苦い後味を生じ、そのため米国特許第４，６１２，９４２号では、Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎは、経口消費できる組成物中のステビア配糖体の使用が組成物の味を修飾するが甘みとして知覚できないレベル（「甘味レベル閾値」）に限定するようにした。本明細書で使用する用語「経口消費できる組成物」は、口に入れられ、続いて口から出される物質及び飲まれ、食べられ、嚥下され、さもなければ摂取される物質を含む、ヒト又は動物の口と接触する物質を意味する。食材、喫煙組成物、咀嚼組成物、経口衛生組成物、及び薬用組成物などの経口消費できる組成物の風味を甘くし、修飾し、又は増強し、それらの感覚的知覚を改善又は変更することができるノンカロリー材料が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
食材、飲料、医薬、タバコ製品、キャンディーなどで使用するためのノンカロリーの天然甘味料についての膨大な市場に鑑みて、９９＋％純度レバウジオシドＡを得る方法が長い間模索されてきた。９９＋％純度Ｒｅｂ Ａは、試薬として、食品及び飲料中の成分として、単独の甘味料として、及び補助甘味料として有用である。（１）実験室において１００％純粋水溶性レバウジオシドＡを製造する方法、並びに（２）試薬として、食品及び飲料中の成分として、単独の甘味料として、及び補助甘味料として使用するのに適している工業的量の９９＋％純度水溶性レバウジオシドＡを製造する方法に対する未充足の需要がある。Ｐａｙｚａｎｔの教示に反して、還流溶媒中に有意な含水量を有することは、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造し、すべての他の研究者によって報告されている混入を避けるのに不可欠であることを明らかにする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
解決すべき主要な技術的問題、及び本発明の主要な目的は、市販されているステビア出発材料を用い、すべての商業的用途に許容できる水溶性のあるＲｅｂ Ａを単離及び精製する高処理能力、高純度、高収率システム及び方法を提供することである。本発明によって解決すべき第二の技術的問題は、ステビア出発材料の所与のバッチの属性に基づいて９９＋％純度Ｒｅｂ Ａの収率を最大限に高めることである。技術的問題の解決策は、実験室規模の体積並びに工業的製造の体積で使用可能でなければならない。工業的製造は、バッチ当たり数百又は数千キログラムのステビア出発材料を処理するものである。本明細書に開示されている本発明の進歩性の数量的証拠は、本発明のＲｅｂ Ａ最終製品が、入手可能な最高純度のレバウジオシドＡのための現在の主要な分析標準品（すなわち、Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ参照標準品、カタログ番号ＡＳＢ−０００１８２２６、ｗｗｗ．ｃｈｒｏｍａｄｅｘ．ｃｏｍ）より高い純度を有することであるが、Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ標準品は、９８．７％の認定純度を有する。引用したＣｈｒｏｍａｄｅｘ参照標準品を超える純度のＲｅｂ Ａは、開示されている他のどの方法もそのような純度を得ていないことから、本明細書に開示されている発明が用いられると思われたサインである。本発明によって製造されるＲｅｂ Ａのより高い純度は、以下に記載するように、「出発材料アッセイ」及び「選択ＥｔＯＨ溶媒」の使用に起因する。非修飾単語「エタノール」は、１％酢酸エチルで変性されているエタノールを意味する。語句「無水（ａｂｓｏｌｕｔｅ）エタノール」は、１００％非変性無水（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）エタノールを意味する。「ＥｔＯＨ」は、エタノール及び水からなる溶媒を意味し、エタノール及び水の割合は、それぞれ、「ｘｘＥｔ／ｘｘＷ」で示される。例えば、９２％エタノール及び８％水からなる溶媒は、「９２Ｅｔ／０８Ｗ」で示され、９２％エタノール及び８％水の中の固体の混合物は、「９２Ｅｔ／０８Ｗ混合物」で示されるであろう。「Ｒｅｂ Ａ」及び「ＲＡ」は共に、レバウジオシドＡを意味する。用語「ＲＡｘｘ」は、レバウジオシドＡ含有量が約ｘｘパーセントの材料を意味する。例えば、ＲＡ８０は、レバウジオシドＡ含有量が約８０％の材料を意味する。用語「ＲＡｘｘ．ｙｙ」は、レバウジオシドＡ含有量が約ｘｘ．ｙｙパーセントの材料を意味する。例えば、ＲＡ８１．５８は、レバウジオシドＡ含有量が約８１．５８％の材料を意味する。
【００１０】
本発明の実験室実施形態では、ステビア出発材料を、体積で４％〜１５％の水及び残りのパーセンテージのエタノールを含む溶媒と混合し、還流し、次いで、撹拌洗浄後に濾過する。「水」は、飲料水、好ましくは栄養補助食品製造に適用可能な政府標準品に準拠している濾過水を意味する。「固体」は、文脈により、中間製品、すなわち還流若しくは洗浄混合物を濾過することにより得られる保持物か、最終製品のどちらかを意味する。語句「１００％純粋Ｒｅｂ Ａ」は、実施例のＨＰＬＣ法の項で定義される。本明細書に記載されている出発材料及び最終製品のＲｅｂ Ａ純度は、実施例のＨＰＬＣ法の項に記載されているように、Ｒｅｂ ＡのＣｈｒｏｍａＤｅｘ参照標準品を用いて決定する。「製造者」は、ステビア出発材料を処理し精製Ｒｅｂ Ａを製造する事業体を意味する。「高品質ステビア出発材料」は、Ｒｅｂ Ａ含有量が約８５％以上のステビア出発材料を意味する。「低品質ステビア出発材料」は、Ｒｅｂ Ａ含有量が約８５％未満のステビア出発材料を意味する。以下で定義されるように、１つ以上の還流段階及び撹拌洗浄段階を用い、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａ最終製品を得る。ＲＡ９０及びより高いＲｅｂ Ａ純度ステビア出発材料を用いると、単一還流段階と単一撹拌洗浄段階の組合せは、通常、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造する。所与のステビア出発材料について、後述のように、任意の質量対溶媒比アッセイと共に出発材料アッセイを用いることにより、処理コストを最小限に抑えながら、最終製品Ｒｅｂ Ａ純度、及びＲｅｂ Ａ収率を標的とし、得ることができる。最低限の処理コストで特定の最終製品Ｒｅｂ Ａ純度（「標的純度」）を得ることを「プロセス最適化」と呼ぶ。
【００１１】
通常、選択ＥｔＯＨ溶媒における単一還流と、続く無水エタノールにおける１つ又は２つの撹拌洗浄は、高品質ステビア出発材料から９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造する。Ｒｅｂ Ａのそのような高純度は、今までに達成されたことはなく、そのような純度を達成するための直感に反したプロセス（Ｐａｙｚａｎｔは、還流溶媒に水を加えることを避けるべきであると教示している）の使用は、従来技術からの急進的な脱却である。プロセスから水を排除せずに、出発材料分析を用いて決定される意味のある注意深く制御された量の水は、還流段階中に不可欠である。
【００１２】
標的純度に達するのに必要とされる還流段階及び撹拌洗浄段階の数は、ステビア出発材料の所与のバッチにおける混入物のレベル及びタイプを反映する。本発明の工業的実施形態では、時間、労力、試薬、加熱、及び冷却コストの点から見て、還流段階は、撹拌洗浄段階よりもはるかに高価である。通常、ステビア出発材料の所与のバッチのための工業的プロセスは、標的純度、収率、及び製造コストのバランスを保っている。
【００１３】
本発明において、典型的な還流段階は、選択ＥｔＯＨ溶媒４ｍｌごとにステビア出発材料１グラムを使用する。一般的に言えば、ステビア出発材料のＲｅｂ Ａ含有量が低ければ低いほど、（ｉ）９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造するのに必要とされる還流溶媒中の含水量は高くなり（４％〜１５％の範囲内）、（ｉｉ）９９＋％純度Ｒｅｂ Ａ最終製品を製造するために２つ以上の還流段階が必要になる可能性は大きくなる。しかしながら、還流溶媒中の含水量が高ければ高いほど、用いられる還流段階が多ければ多いほど、Ｒｅｂ Ａの収率は低くなる。還流段階とは対照的に、撹拌洗浄段階は、溶媒として無水エタノールを使用することが好ましい。変性エタノール又は他のアルカノールは、撹拌洗浄段階における溶媒として使用することができ、撹拌洗浄段階において変性エタノール又は無水エタノールを使用することは、他のアルカノールに伴う食品安全性問題を回避する。
【００１４】
本発明の一実験室実施形態では、ＲＡ８９．９５ステビア出発材料（本明細書では、Ｒｅｂ Ａ約９０重量％であるステビア出発材料を「ＲＡ９０出発材料」と呼び、同様に、本明細書では、Ｒｅｂ Ａ約８０重量％であるステビア出発材料を「ＲＡ８０出発材料」と呼び、同様に、本明細書では、Ｒｅｂ Ａ約７０重量％であるステビア出発材料を「ＲＡ７０出発材料」と呼ぶ）を、ＲＡ９０出発材料１グラム対選択ＥｔＯＨ溶媒４ｍｌの比で９４％エタノール、６％水に溶かす。選択ＥｔＯＨ溶媒を「還流溶媒」とも呼ぶ。ステビア出発材料と還流溶媒の混合物を「還流混合物」と呼ぶ。「出発材料」は、最初の還流の場合にはステビア出発材料を意味し、最初の還流段階後の段階の場合には、還流混合物又は撹拌洗浄を濾過することにより得られる保持物を意味する。ＲＡ９０出発材料と還流溶媒の混合物を、激しく撹拌しながら、冷却器（ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ）を備えた還流機器中で室温から約７９℃〜８０℃まで（無水エタノールの沸点は７９℃であり、還流混合物の沸点は通常８０℃以下である）加熱する。還流混合物温度が、１気圧において７９℃〜８０℃まで上昇して維持されると、レバウジオシドＡの結晶が析出し始めるにつれて混合物は、乳白色かつ粘稠になる。通常、混合物を１時間還流し、次いで濾過し（実験室実施形態では、紙又はガラス繊維濾過材、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａ濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、ＮＪ））、湿潤固体を、湿潤固体１グラム対通常は無水エタノールである洗浄溶媒４ｍｌの比で１００％無水エタノールに入れ、「洗浄混合物」を作製する。洗浄混合物を室温にて１５分間撹拌する。撹拌した後、洗浄混合物を濾紙で濾過し、保持物固体を８０℃にてオーブン中で乾燥する。乾燥固体は、１００％Ｒｅｂ Ａであり、出発材料中のＲｅｂ Ａの約８１％の回収に相当する。最終製品は、３３％という水へのおおよその溶解度（最終体積３ｍｌ中に１グラム）を有し、これは、すべての商業的用途に適している。
【００１５】
通常、本発明の工業的実施形態において使用される機器は、１つ又は複数のジャケット付きのステンレス製圧力容器（「タンク」又は「混合タンク」）を含み、各々は、通常、数千リットルの容量で、混合（例えば、フレキシブルスクレーパーブレードを備える）、加熱（ジャケット内の蒸気）、及び冷却（ジャケット内の冷水）することに備え、注入及び排出経路並びに還流冷却器を備えている。付加的設備には、１つ又は複数の遠心デカンター（通常は連続流モデル）、ポンプ、バルブ、貯蔵タンク、１つ又は複数のタンク、１つ又は複数のデカンター、及び機器の他の要素を相互接続するパイプ、及び好ましくはプロセス制御システムが含まれる。本発明の工業的プロセスは、実験室プロセスと同一のパラメーターを使用するが、ただし、濾紙の代わりに遠心デカンターを使用し、出発材料及び溶媒の質量及び体積は、それぞれ、かなり多く（主としてタンク容量により制限される）、還流後には、通常、冷水冷却が使用され、最終還流又は撹拌洗浄段階後には、「エタノールパージ及び乾燥」段階が使用され、デカンター保持物を溶かし、８０℃の水の中で撹拌し、噴霧乾燥前に残留エタノールを蒸発させる。工業的プロセスの最終製品は、通常、水への溶解度が約３３％の９９＋％純度Ｒｅｂ Ａである。Ｒｅｂ Ａ純度のこのレベルは、ステビア処理における、特に工業的量における飛躍的進歩である。
【００１６】
以下で定義されるように、２つ以上の還流段階及び撹拌洗浄段階を使用し、本発明を用いて低品質ステビア出発材料を処理し、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａの最終製品を製造することができる。低品質ステビア出発材料を使用することは、収率を低下させ、９９＋％Ｒｅｂ Ａ純度最終製品を得るためのより多くの還流を必要とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、（ｉ）ステビア出発材料を用いて１００％純粋レバウジオシドＡを提供する高純度、高収率実験室プロセス；（ｉｉ）ステビア出発材料を用いて商業的量の９９＋％純度レバウジオシドＡを提供する、実験室プロセスから直接導かれる高処理能力、高純度、高収率工業的プロセス；（ｉｉｉ）それらのプロセスによって製造されるレバウジオシドＡ；（ｉｖ）そのようなレバウジオシドＡの用途；及び（ｖ）ステビア出発材料の所与のロットの属性に基づいて標的純度のＲｅｂ Ａの収率を最大限に高める手段を含む。
【００１８】
実験室プロセスの有用性は、研究、分析、及び合成目的で１００％純粋、水溶性Ｒｅｂ Ａを製造する能力にある。工業的プロセスの有用性は、飲料、食品、ベーキング、キャンディー、パーソナルケア製品、医薬品、タバコ、及び他の産業、並びに研究、分析、及び合成のために商業的量（例えば、数千キログラム）の９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造する能力にある。極めて低濃度の純粋Ｒｅｂ Ａの知覚される甘味の結果、飲料を含む大部分の用途にとって、１％未満のＲｅｂ Ａ水溶性は許容できる（濃縮物は、より高い溶解度を必要とするが、本発明により提供される最終製品溶解度範囲内である）。
【００１９】
本発明がはるかに高い純度のＲｅｂ Ａを製造するにもかかわらず、Ｒｅｂ Ａは、既存プロセスと比べて本発明を用いて製造するのが著しく安上がりである。ステビア出発材料の所与のロットの属性に基づいて９９＋％純度Ｒｅｂ Ａの収率を最大限に高める本明細書において提供される手段は、既存プロセスに比べて製造コストのより大きな節約さえ可能にする。本発明で使用するには、４０％超純度Ｒｅｂ Ａ含有量のステビア出発材料が好ましく、ＲＡ４０品質未満のステビア出発材料に通常必要とされる追加還流段階は、通常、プロセスを経済的に不利にし、４０％超純度Ｒｅｂ Ａのステビア出発材料は容易に入手可能である。ＲＡ４０以上のステビア出発材料は、Ｓｈａｎｄｏｎｇ  Ｃｈｅｎｇｗｕ  Ａｏｘｉｎｇ  Ｓｔｅｖｉａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｄａｔｉａｎｊｉ  Ｔｏｗｎ、Ｃｈｅｎｇｗｕ  Ｃｏｕｎｔｙ、Ｓｈａｎｄｏｎｇ、Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ、並びに当技術分野において知られている他の供給源から入手可能である。ステビア出発材料は、通常、ＲＡ８０を超えないが、Ｍｏｒｉｔａ  Ｋａｇａｋｕ  Ｋｏｇｙｏｕ，Ｌｔｄ．、Ｊｏｔｏ−ｋｕ、Ｏｓａｋａ、ＪａｐａｎによりＲｅｂａｕｄｉｏの製品名で販売されているものなどの、少数の市販されている著しく高価なステビア抽出物は、約９０％Ｒｅｂ Ａ含有量を有する。本発明の還流及び撹拌洗浄段階において、変性エタノールは、通常、コスト理由で、特に本発明の工業的実施形態にとって通常好ましく、無水エタノールは、米国では変性エタノールの約１０倍も高価であるが、変性エタノールと無水エタノールとが実質的に同じコストを有する場所では、唯一の溶媒として及び還流溶媒成分として使用するのには変性エタノールより無水エタノールの方が好ましい。１％酢酸エチル以外の添加物を含有する変性エタノール（例えば、５％イソプロパノールで変性されたエタノール）を本発明で使用できるが、通常、最終製品の収率及び純度の低下をもたらす。エタノール以外のアルカノールを使用できるが、エタノールを使用することは、他のアルカノールに関連する食品安全性問題を回避する。
【００２０】
図１は、本発明の概略を示している。高品質ステビア出発材料で使用される基本的実施形態は、３つ又は４つの段階、すなわち、ＥｔＯＨ処方段階、還流段階、任意選択の撹拌洗浄段階（通常、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造するのに必要とされる）、並びにエタノールパージ及び乾燥段階を含む。低品質ステビア出発材料を使用する実施形態では、通常、第二還流段階を撹拌洗浄段階前に加え、Ｒｅｂ Ａ最終製品の純度を最大限に高める。第一還流に単一撹拌洗浄段階又はより多くの還流段階を付け加えるか否かの判定ポイント（中間又は最終撹拌洗浄段階の有無にかかわらず）を図１（及び、特定の他の図）に示し、「反復判定」と標示する。ＥｔＯＨ処方段階には、常に出発材料アッセイが含まれ、質量対溶媒比アッセイが含まれてもよい。用語「出発材料アッセイ」には、還流段階又は撹拌洗浄段階後の湿潤固体保持物のアッセイが含まれ、ステビア出発材料は、第一還流段階のための出発材料であり、湿潤固体保持物は、第一還流段階後の段階のための出発材料である。出発材料アッセイを、図面では「ＳＭＡ」と省略する。
【００２１】
Ｒｅｂ Ａ最終製品の収率と純度の間には逆相関があるため、所与のステビア出発材料から標的Ｒｅｂ Ａ純度、例えば９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造するための最もコスト効率の高い方法を決定することは、プロセス最適化及び製造の経済性において重要である。プロセス最適化は、まず実験室実施形態を用いることにより行われ、プロセスが実験室規模で最適化された場合、最適化の結果は、工業的規模で適用される。プロセス最適化の好ましい実施形態は、少なくとも１つの出発材料アッセイを用いること、標的純度以上の最終製品Ｒｅｂ Ａ純度を実現すること、及び任意の１つ又は複数の還流段階（「追加還流段階」は、以下でさらに詳細に記載し、図６に示すように、第一還流段階以外の還流段階である）を、（ｉ）１つ以上の撹拌洗浄段階、（ｉｉ）残りの還流段階及び／又は以上撹拌洗浄段階における異なる質量対溶媒比の使用、又は（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せで漸進的に置き換えることを含む。追加還流又は撹拌洗浄を行うか否か、又はエタノールパージ及び乾燥段階を進めるか否かの判定ポイントを、図面では「反復判定」で示す。例えば、最初に所与の高品質ステビア出発材料を処理する場合、単一還流（通常は、１対４の質量対体積比）段階及び１つの撹拌洗浄段階が、本発明の実験室実施形態において９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造しない場合、第二撹拌洗浄段階又は第二還流段階なしに標的純度を得る目的で、通常、第一還流段階溶媒、場合により第一撹拌洗浄段階溶媒の質量対体積比アッセイをＥｔＯＨ処方段階中に導入する。撹拌洗浄段階の処理コストは、還流段階のコストよりかなり少なく、単一撹拌洗浄段階の処理コストは、２つの撹拌洗浄段階のコストより少ない。
【００２２】
最終製品のＲｅｂ Ａ純度が標的純度以上である場合、及び最終追加還流段階を撹拌洗浄段階で置き換えることが標的純度を実現しない場合、前者の最後から２番目の（及びより早い）還流段階におけるより高い質量対溶媒比は、標的純度を達成し、最終追加還流段階の必要性を回避することがある。より高い質量対溶媒比は、通常、標的純度が得られる限り、還流段階において追加エタノールを使用及び回収するコストが、元の質量対溶媒比を用いる追加還流段階において加熱及び冷却するコストより少ないならば、この環境で使用される。
【００２３】
最終追加還流段階を撹拌洗浄及び／又は還流段階における異なる質量対溶媒比と置き換えた後で、最終製品のＲｅｂ Ａ純度が依然として標的純度以上である場合、製造者は、還流段階の代わりに撹拌洗浄段階を用いることにより、及び／又は残りの還流段階若しくは撹拌洗浄段階において異なる質量対溶媒比を用いることにより、処理コストをさらに軽減することを選択することができる。最終還流段階を撹拌洗浄で置き換えた、又は異なる質量対溶媒比を用いた後で、最終製品のＲｅｂ Ａ純度が、問題となっている追加還流段階を用いて以前に達成された標的純度以下である場合、製造者は、標的純度がその還流段階なしには達成できないことから、削除された追加還流段階を用いることに戻る。このように、ＥｔＯＨ処方、還流の異なる順列、及び撹拌洗浄段階によって導かれ、所与のステビア出発材料を用いて所与の標的純度を実現するコストは、最小限に抑えられる。プロセス最適化は、通常、本発明の実験室実施形態を用いて行われ、次いで、所与のステビア出発材料に最適なプロセスは、工業的規模で適用される。低品質ステビア出発材料では、単一還流及び単一撹拌洗浄を用いる処理が９９＋％純度Ｒｅｂ Ａ最終製品を製造することは無理のようである。実施例１が示すように（実施例１は、ＲＡ４０を含有するステビア出発材料のブレンドを使用した）、「頑固な」混入物を含有する低品質ステビア出発材料を処理することは、２つのＥｔＯＨ還流段階及び撹拌洗浄段階の代わりに、少なくとも２つのＥｔＯＨ還流段階及び無水エタノール還流段階を必要とすることがある。
【００２４】
図２に示すように、ステップＡは、ＥｔＯＨ処方段階を含み、ステップＢ〜Ｅは、本発明の実験室実施形態の還流段階を含む。所与のステビア出発材料のために処方された選択ＥｔＯＨ溶媒中で、ステビア出発材料を混合及び還流し、次いで、還流混合物を濾過することによりレバウジオシドＡを単離することは、「還流段階」である。追加還流段階は、所与のステビア出発材料又は保持物のために処方された選択ＥｔＯＨ溶媒中で保持物（直前の段階からの混合物を濾過することにより単離される固体）を混合及び還流し、次いで、還流混合物を濾過することによりレバウジオシドＡを単離することを含む。
【００２５】
図３に示すように、ステップＦ〜Ｉは、本発明の実験室実施形態の撹拌洗浄段階を含む。変性又は無水エタノール中で単離レバウジオシドＡを混合及び撹拌し、次いで、洗浄混合物を濾過することによりレバウジオシドＡを単離することは、「撹拌洗浄段階」である。前述のように、撹拌洗浄における溶媒としては無水エタノールが好ましいが、コスト管理は、撹拌洗浄段階において変性エタノールを使用することを指示することがある。ステップＪ〜Ｋは、本発明の実験室実施形態のエタノールパージ及び乾燥段階を含む。実験室実施形態において、ステップＪ〜Ｋ、エタノールパージ及び乾燥段階は、別名「エタノールをパージすること及び単離保持物を乾燥すること」である。
【００２６】
図２に示すように、実験室使用のための本発明の実施形態では、ステビア出発材料を、エタノール及び水を含む溶媒（体積で水４％〜１５％）と混合する。実験室実施形態におけるステップＡは、還流溶媒において使用すべき溶媒中の水対エタノールバランスの決定である。水対エタノールバランスを決定する好ましい手段は、後述のように、ステビア出発材料のアッセイである（「出発材料アッセイ」）。水対エタノールバランスを決定する代替手段は、本明細書で「還流溶媒近似」と呼ぶガイドラインを使用することであり、すなわち、ステビア出発材料のあるバッチの主張又は標示純度に基づき、ステビア出発材料において９０％Ｒｅｂ Ａ純度より下へＲｅｂ Ａ純度が５％低下するごとに、還流溶媒の含水量を６％水のベースラインより上に１％増加させ、還流溶媒の残りの体積はエタノールである。例えば、還流溶媒近似は、ＲＡ８０出発材料を処理し、最終的に１００％純粋Ｒｅｂ Ａを製造するために、体積対体積で８％水、９２％水の還流溶媒を使用することを教示する（そのような純度を得ることは、ＲＡ８０ステビア出発材料を用いる場合、通常、少なくとも２つの還流段階を必要とする）。還流溶媒近似は、出発材料アッセイを完成させる際に集められた経験的データから第一発明者により導かれた。
【００２７】
出発材料アッセイは、標的純度、例えば、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造する（１つ以上の撹拌洗浄段階と併せて）のに必要とされる還流溶媒中の含水量の近似値だけでなく最小値を明らかにすることから、還流溶媒中の水対エタノールバランスを決定する好ましい手段である。最小値を上回る含水量は、Ｒｅｂ Ａ最終製品の収率を著しく低下させる。図４及び５に示すように、出発材料アッセイは、含水量が０．５％から１５％、又はその範囲内のサブセット、例えば２％から１０％の範囲において、一様に増加するように調整された溶媒を用いて行われ、各溶媒の残りは、エタノールである（本明細書では、水とエタノールの各組合せを「試験溶媒」と呼ぶ）。ステビア出発材料の主張又は標示純度は、主張又は標示Ｒｅｂ Ａ純度及び還流溶媒近似が初期の試験溶媒セットを集中するために使用できるという程度の、アッセイにおける入力値である。例えば、ＲＡ８０と標示されたステビア出発材料のための出発材料アッセイは、通常、約８％水及び９２％エタノールに集中した一連の試験溶媒を用いるであろう。出発材料アッセイでは、所与のバッチ又はロットから採取されたステビア出発材料の試料（「サンプルバッチ」）を、ステビア出発材料１ｇ対試験溶媒４ｍｌの質量対体積比で一連の試験溶媒（例えば、２％水及び９８％エタノール、４％水及び９６％エタノール、６％水及び９４％エタノールなど）と混合する。
【００２８】
以下でさらに詳細に説明するように、ステビア出発材料の還流溶媒に対する比は、ステビア出発材料１質量部当たりＥｔＯＨ溶媒２〜１０体積部以上の範囲にわたって変えることができるが、ステビア出発材料１質量部当たりＥｔＯＨ溶媒３〜６体積部であることが好ましく、ステビア出発材料１質量部当たりＥｔＯＨ溶媒約４体積部であることが最も好ましい。実施例７に示すように、ステビア出発材料の選択ＥｔＯＨ溶媒に対する１：４比は、一般的に、高品質ステビア出発材料を用いる単一還流、単一撹拌洗浄プロセスにおいてＲｅｂ Ａの収率を最大限に高める。ステビア出発材料と試験溶媒の各混合物（各々、「試験混合物」）を、１気圧において室温から約７９℃〜８０℃まで、冷却器を備えた還流機器中で激しく撹拌しながら加熱し（４℃／ｍｉｎの典型的な加熱速度）、約１時間還流し、次いで、約１時間冷却し（通常、フラスコを氷浴に入れる）、濾紙で濾過する。各試験混合物からの湿潤固体、又は保持物を、各々、湿潤固体保持物１グラム対溶媒約４ｍｌの比で１００％無水エタノールに入れる（各々、「試験洗浄混合物」）。
【００２９】
１：４以外のステビア出発材料のＥｔＯＨ溶媒に対する比を還流において使用した場合、試験洗浄混合物には、各試験混合物からの湿潤固体保持物対１００％無水エタノールの同じ比を使用することができる。しかしながら、通常、より高い比は、通常、最終的Ｒｅｂ Ａ純度に対してほとんど影響せず、Ｒｅｂ Ａ収率を低下させることがあるため、試験洗浄混合物では、ステビア出発材料対エタノールの１：４比を用いる。
【００３０】
各試験洗浄混合物を室温にて１５分間撹拌する。撹拌した後、各試験洗浄混合物を濾紙で濾過し、濾過することからの保持物固体を、オーブン、好ましくは送風オーブン中で７９℃にて、又は最低限７９℃以上で乾燥し、乾燥試料（各々、「試験試料」）を作製する。オーブン温度は、試験試料が分解するか、或いは残留エタノールに着火するのを避けるため、８０℃以上にしてはならない。以下の実施例のＨＰＬＣ法の項に記載されているＨＰＬＣ分析法を用い、Ｒｅｂ Ａ純度について各試験試料を試験する。標的純度の１００％純粋Ｒｅｂ Ａ最終製品の場合、（ｉ）ＨＰＬＣ分析において１００％純粋Ｒｅｂ Ａ（又は、万一、単一還流、単一撹拌洗浄が１００％純粋Ｒｅｂ Ａを製造することができない場合は最高のＲｅｂ Ａ純度）として示される試験試料に対応し、（ｉｉ）最低の含水量を含む試験溶媒を、サンプルバッチの残部を処理するための溶媒として選択する（「第一反復結果」）。例えば、６％、８％、及び１０％水を含有する試験溶媒（各試験溶媒の残りは、エタノールである）が、各々、１００％純粋Ｒｅｂ Ａの試験試料を製造する場合、６％水、９４％エタノール溶媒が第一反復結果であり（出発材料アッセイの第二反復を用いて結果を精緻化しない限り）、サンプルバッチの残部を処理するのに用いられることになる。
【００３１】
出発材料アッセイを多重反復し、１００％純粋Ｒｅｂ Ａの収率をさらに最適化する溶媒を選択することができる。出発材料アッセイの第二反復では、調整された一連の試験溶媒における含水量を、第一反復結果の含水量以下に、より小さな増分、例えば、０．５％水の減分で一様に減少させる。例えば、第一反復結果が６％水、９４％エタノールである場合、第二反復における試験溶媒は、６．０％、５．５％、５．０％、及び４．５％水になるであろう。前述のようなプロセスの残部（第一還流、撹拌洗浄、乾燥及びＨＰＬＣ分析）は、第二反復試験溶媒、試験混合物、及び試験洗浄混合物を用いて行われる。（ｉ）ＨＰＬＣ分析において１００％純粋Ｒｅｂ Ａ（又は、万一、単一還流、単一撹拌洗浄が１００％純粋Ｒｅｂ Ａを製造することができない場合は最高のＲｅｂ Ａ純度）として示される試験試料に対応し、（ｉｉ）最低の含水量を含む第二反復試験溶媒を、サンプルバッチの残部を処理するための溶媒として選択し、第一反復結果を交換する。例えば、６．０％、５．５％、及び５．０％水を含有する試験溶媒（各試験溶媒の残りは、エタノールである）が、各々、１００％純粋Ｒｅｂ Ａの試験試料を製造する場合、５％水、９５％エタノール溶媒がサンプルバッチの残部を処理するのに用いられることになる。出発材料アッセイの３回以上の反復を行い、還流溶媒の選択をより細かく最適化することができ、例えば、第三反復は、第二反復結果以下の含水量０．１％減分を使用することができる。
【００３２】
還流溶媒近似又は出発材料アッセイを用いて選択される水及びエタノール溶媒を「選択ＥｔＯＨ溶媒」と呼ぶ。「ＥｔＯＨ」は、エタノールと水のブレンドに対する慣用名である。便宜上、選択ＥｔＯＨ溶媒（たとえ還流溶媒近似を用いて選択された場合でも）を用いて処理すべきステビア出発材料を「サンプルバッチ」と呼ぶ。出発材料アッセイは、通常、還流溶媒近似よりもはるかに正確な結果を生じ、選択ＥｔＯＨ溶媒を決定する好ましい方法である。
【００３３】
その多重反復を含む出発材料アッセイ又は還流溶媒近似を用いることを、「出発材料のための選択ＥｔＯＨ溶媒を処方すること」と呼び、「ＥｔＯＨ処方段階」とも呼ぶ。出発材料アッセイにおいてステビア出発材料の代わりに還流混合物（又は撹拌洗浄混合物）を濾過することにより得られる湿潤固体保持物を代用することにより、ＥｔＯＨ処方段階を追加還流段階（又は撹拌洗浄段階）前に行うことができる。各還流前にＥｔＯＨ処方段階を行うことは、通常、極めて多量の湿潤固体保持物が処理されている場合、又は前の還流段階の収率及び純度が予想を満たさなかった場合にのみ行われる。
【００３４】
Ｒｅｂ Ａ収率を最大限に高める比を決定するため、場合により、ＥｔＯＨ処方段階には、選択ＥｔＯＨ溶媒を決定した後に、ＥｔＯＨ溶媒のステビア出発材料に対する比を変化させるか（初回還流段階前）、又はＥｔＯＨ溶媒の湿潤固体保持物に対する比を変化させること（追加還流段階又は撹拌洗浄段階前）が含まれうる。このアッセイを「任意選択質量対体積比アッセイ」と呼ぶ。ステビア出発材料又は湿潤固体保持物の質量の選択ＥｔＯＨ溶媒の体積に対する比は、出発材料１質量部当たり選択ＥｔＯＨ溶媒の少なくとも３体積部から開始する制約のない範囲にわたって変化させることができるが、出発材料１質量部当たり選択ＥｔＯＨ溶媒３〜１０体積部であることが好ましく、出発材料１質量部当たり選択ＥｔＯＨ溶媒４〜６体積部であることがより好ましく、出発材料１質量部当たり選択ＥｔＯＨ溶媒約４体積部であることが最も好ましい。高品質ステビア出発材料を使用すると、最高Ｒｅｂ Ａ収率は、通常、ステビア出発材料（初回還流段階前）、又は湿潤固体保持物（追加還流段階前）１質量部当たり選択ＥｔＯＨ溶媒４体積部の比において、又はその極めて近くで得られる。極めて多量の湿潤固体保持物が処理されている場合、又は前の還流段階の収率及び純度が予想を満たさなかった場合、ＥｔＯＨ処方段階及び任意の質量対体積比アッセイを追加還流前に繰り返すことができる。高品質ステビア出発材料を処理するには、第一の任意の質量対体積比アッセイを、通常、１：４に近い比の小さな増分を用いて行い、最高のＲｅｂ Ａ収率を実現する質量対溶媒比を決定する。例えば、高品質ステビア出発材料を処理する場合には、１：３．８、１：３．９、１：４．０、１：４．１、及び１：４．２（ｍ／ｖ）の比を、第一の任意の質量対体積比アッセイで使用することができる。
【００３５】
１：６又は１：８（ｍ／ｖ）などの還流におけるステビア出発材料のＥｔＯＨ溶媒に対するより高い比は、標的純度が９９＋％純度又は１００％純粋Ｒｅｂ Ａである場合に低品質ステビア出発材料（例えば、ＲＡ４０〜ＲＡ８５）を処理するのに必要とされることがある。実施例７に示すように、Ｒｅｂ Ａ収率は、通常、還流におけるステビア出発材料の選択ＥｔＯＨ溶媒に対する、及び撹拌洗浄或いは第二若しくは後続還流における湿潤固体保持物のエタノールに対するより高い比を使用すると低下し、コストも、より多くの試薬及びより大きいタンクを使用することから、より高い比を使用すると増加する。実施例７に示すように、そのようなより高い比は、２つの還流段階を用いて低品質ステビア出発材料から１００％純粋Ｒｅｂ Ａ最終製品を製造するのに必要なことがある。１：３．５（ｍ／ｖ）以下の、第一還流段階におけるステビア出発材料の選択ＥｔＯＨ溶媒に対する、又は追加還流段階における湿潤固体保持物の選択ＥｔＯＨ溶媒に対する比は、通常、処理するのが困難で、Ｒｅｂ Ａの低収率を生じ、低純度Ｒｅｂ Ａを生じる極めて粘稠な混合物を生じる。１：３（ｍ／ｖ）以下の、第一還流段階におけるステビア出発材料の選択ＥｔＯＨ溶媒に対する、又は後続還流段階における湿潤固体保持物の選択ＥｔＯＨ溶媒に対する比は、冷却した場合にクラスト形成又は固化する混合物を生じ、処理を非常に複雑化する。
【００３６】
一般的な法則として、１：４又はそれに極めて近い、第一還流段階におけるステビア出発材料の選択ＥｔＯＨ溶媒に対する、又は追加還流段階における湿潤固体保持物の選択ＥｔＯＨ溶媒に対する質量対体積比は、最高Ｒｅｂ Ａ収率が、１：４（ｍ／ｖ）比で、又はその極めて近くで得られることから、高品質ステビア出発材料については特に、最も好ましい比である。
【００３７】
図１１及び１２に示すように、質量対溶媒比アッセイにおいて使用されるステップは、出発材料アッセイにおけるステップと極めて類似しているが、ただし、質量対溶媒比アッセイにおけるステビア出発材料の所与の質量（又は、第一還流後は湿潤固体保持物の質量）について、ステビア出発材料の所与の質量（又は、第一還流後は湿潤固体保持物の質量）について、選択ＥｔＯＨ溶媒の体積は変化し、最終製品のＲｅｂ Ａ純度を最大限に高める質量対体積比は、通常、サンプルバッチを処理するために選択される。質量対体積比アッセイは、任意選択であり、通常、低品質ステビア出発材料でのみ使用され、実施例７に示すように、還流における出発材料の選択ＥｔＯＨ溶媒に対するより高い質量対体積比（例えば、１：６）は、少ない還流で１００％純粋Ｒｅｂ Ａを製造することがある。質量対体積比アッセイを反復し（選択ＥｔＯＨ溶媒体積のより小さな増分及び減分を用い）、所与のステビア出発材料又は保持物のための質量対体積比の確度を最適化することができる。
【００３８】
実施例１におけるデータが示すように、最適含水量以上の還流溶媒中の１％多い水は、１００％純粋Ｒｅｂ Ａの収率を１％以上低下させることがある。最適含水量の微調整は、工業的プロセスの経済性において極めて重要である。ステビア出発材料の主張又は標示Ｒｅｂ Ａ含有量は、実際のＲｅｂ Ａ含有量と実質的に異なることがあり、ステビア出発材料の所与のバッチは、多くの供給源からのステビア抽出物のブレンドであることが多い。出発材料アッセイにより決定される選択ＥｔＯＨ溶媒は、ステビア出発材料の所与のバッチに特異的である。本発明の実験室実施形態の主要な用途の１つは、本発明の工業的実施形態のために出発材料アッセイを行うことである。
【００３９】
図２に示すように、ＥｔＯＨ溶媒が選択された後、本発明の実験室実施形態では、以下の通り、製造者が決定した量のサンプルバッチを、還流及び撹拌洗浄段階を用いて処理する。サンプルバッチのステビア出発材料を、ステビア出発材料１ｇ対選択ＥｔＯＨ溶媒４ｍｌの質量対体積比（又は、任意の質量対体積比アッセイを含むＥｔＯＨ処方段階を用いて決定される他の比）で選択ＥｔＯＨ溶媒と混合する。ステビア出発材料と選択ＥｔＯＨ溶媒の混合物（「還流混合物」）を、１気圧において室温から約７９℃〜８０℃まで、冷却器を備えた還流機器中で激しく撹拌しながら加熱し（通常、４℃／ｍｉｎ）、通常、１時間還流を維持し、次いで、還流混合物を１時間冷却し（通常、−１．８℃／ｍｉｎの冷却速度、例えば、フラスコを氷浴に入れることにより）、次いで、濾紙で濾過する。還流の完了後及び濾過する前に溶媒混合物を放置することは、高品質ステビア出発材料を処理する場合にＲｅｂ Ａ収率をわずかに増加させるが、低品質ステビア出発材料を処理する場合にＲｅｂ Ａ収率を著しく増加させる。
【００４０】
図３に示すように、第一還流段階からの湿潤固体保持物を、湿潤固体１ｇ対溶媒４ｍｌの比（又は、任意の質量対体積比アッセイを含むＥｔＯＨ処方段階を用いて決定される他の比）で１００％無水エタノールに入れる（「洗浄混合物」）。洗浄混合物を室温にて１５分間撹拌する。撹拌洗浄段階における１：３．５（ｍ／ｖ）以下の湿潤固体保持物のエタノールに対する比は、処理を妨げる混合物粘稠性を生じることがある。高品質ステビア出発材料を使用すると、撹拌洗浄段階における１：４（ｍ／ｖ）以上の湿潤固体保持物のエタノールに対する比は、Ｒｅｂ Ａ純度に無視できる改善を生じ、通常、Ｒｅｂ Ａ収率を低下させる。したがって、１：４又はそれに極めて近い撹拌洗浄段階における湿潤固体保持物のエタノールに対する質量対体積比は、高品質ステビア出発材料を用いる場合に最も好ましい比である。撹拌した後、洗浄混合物を濾紙で濾過し、濾過することからの保持物固体を、オーブン、好ましくは送風オーブン中で７９℃にて、又は最低限７９℃以上で２時間まで乾燥し、乾燥固体を製造する。８０℃のオーブン温度は、エタノールに着火することなく洗浄混合物中のエタノールを安全に蒸発させ、保持物固体のエタノールをパージする。撹拌洗浄の完了後及び濾過する前に洗浄混合物を放置することは、高品質ステビア出発材料を処理する場合にＲｅｂ Ａ収率をわずかに増加させるが、低品質ステビア出発材料を処理する場合にＲｅｂ Ａ収率を著しく増加させる。粉末最終製品が望ましい場合、乾燥固体を３０メッシュのスクリーンに通すと、粗い白色粉末の最終製品（Ｒｅｂ Ａ最終製品）が得られる。
【００４１】
高品質ステビア出発材料及び単一還流、単一撹拌洗浄プロセスを用いて製造される最終製品、乾燥固体は、通常、１００％Ｒｅｂ Ａであり、通常、出発材料中のＲｅｂ Ａ約８１％の回収率に相当する。最終製品は、３３％（最終体積３ｍｌ中に１グラム）の水への溶解度を有し、これは、濃縮物を含むすべての商業的用途に適している。実施例３に示すように、撹拌洗浄段階は、通常、約９６％純度Ｒｅｂ Ａ（第一還流段階後及び撹拌洗浄段階前の純度）を１００％純粋Ｒｅｂ Ａ（撹拌洗浄段階後）まで増加させる。最終製品の用途が、９９％純度未満のＲｅｂ Ａの残留苦味を容認することができる場合、撹拌洗浄段階を省略することができ、還流混合物を濾過することからの保持物を乾燥し、商業的に使用することができる。しかしながら、撹拌洗浄段階は、すべての知覚可能な苦味を取り除くのに好ましい。
【００４２】
実施例１及び２に示すように、ステビア出発材料が８５％未満Ｒｅｂ Ａである場合、１００％純粋Ｒｅｂ Ａを製造するには、通常、好くなとも１つの追加還流段階が必要である。ＲＡ８５未満純度のステビア出発材料を処理するため、選択ＥｔＯＨ溶媒を用いて第一還流段階を行うが、通常、還流混合物を濾過することからの湿潤固体保持物は、撹拌洗浄に入れられる代わりに第二還流のための出発材料として使用される。追加第二還流段階（及び標的Ｒｅｂ Ａ純度を達成するのに必要なそれ以上の追加還流段階）のための処理パラメーターは、ＥｔＯＨ処方段階を含む記載されている第一還流段階と同じである。場合により、撹拌洗浄段階（しかし、湿潤固体を乾燥することなく）を還流段階の間に行うことができ、その場合、洗浄混合物を濾過することからの固体保持物（「中間撹拌洗浄段階」）を、続く還流段階のための出発材料として使用する。中間撹拌洗浄段階は、ＲＡ８０以下の品質のステビア出発材料を処理する場合に必要とされることがある。
【００４３】
便宜上、第一還流において使用される選択ＥｔＯＨ溶媒を、追加還流段階において使用することができる。しかしながら、収率をさらに最適化するため、出発材料アッセイを、各還流段階を終了させる濾過ステップにおいて製造される湿潤固体保持物から採取される試料に対して行うことができる（中間撹拌洗浄段階が還流段階の間に挿入される場合、中間撹拌洗浄段階洗浄混合物を濾過することからの湿潤固体保持物を、出発材料アッセイのための出発材料として使用する）。最終還流段階後、通常、前述のように、撹拌洗浄段階を行い（次いで、エタノールパージ及び乾燥段階）、１００％純粋Ｒｅｂ Ａを製造する。しかしながら、各追加還流段階は、最終製品の収率を低下させる。最終製品の用途が、９９％純度未満のＲｅｂ Ａの残留苦味を容認することができる場合、還流段階（及び任意の中間撹拌洗浄段階）の数は、所与の用途に必要とされる標的純度及び収率を生じるように選択される。
【００４４】
４℃／ｍｉｎの加熱速度、及び−１．８℃／ｍｉｎの冷却速度について記載されているが、最終製品におけるＲｅｂ Ａの収率又は純度を著しく低下させることなく、典型的な実験設備で得られる他の冷却及び加熱速度を使用することができる。極めて高い加熱速度は、出発材料の燃焼又は加水分解を防ぐために、混合物の激しい撹拌を必要とする。得られる加熱及び冷却速度は、バッチサイズによって異なることがある。例えば、実験室における強制冷却は、反応フラスコを氷上又は氷水中に置くことによって達成することができ、所与のフラスコサイズにおけるより大きな反応体積を氷上又は氷水中で冷却するには、さらに時間がかかる。一般的に言えば、還流後、任意の放置ステップ中に、室温より低いが０℃を超える混合物温度（水を含有する混合物の場合）及び長い放置時間は、低品質ステビア出発材料を処理する場合には特に、Ｒｅｂ Ａの収率を改善するはずである。長い放置時間中、特に、室温以下の還流後混合物温度では、混合物のゲル化、クラスト形成、又は固化を避けるために混合物を撹拌することが重要であり、ゲル化、クラスト形成、又は固化が起きた場合、収率及び／純度が悪影響を受けることがある。還流後混合物を冷却し、１２時間を超える放置時間中に撹拌が不十分な場合、混合物は、ゲル化、クラスト形成、又は固化することがあり、起きた場合には、混合物の一部又はすべてを、その後、さらなる処理のためにポンプ注送可能なスラリーへ容易に転換することができない。撹拌洗浄後、０℃以下及びエタノールの凝固点に近づく混合物温度を使用することができる。たとえＲＡ４０ステビア出発材料を処理する場合でも、９６時間より長い還流又は撹拌洗浄後の放置時間は、収率の改善をほとんど提供しない。
【００４５】
５％〜１５％水及び残部がエタノールの溶媒で、ステビア出発材料は、撹拌により直ちに溶液になる。しかしながら、無水エタノール溶媒において、ステビア出発材料は、加熱によってのみ溶液になり、最終製品におけるＲｅｂ Ａの収率と純度は共に、還流溶媒として無水エタノールを用いると低い。溶媒中の５％〜１５％の水により、溶媒とステビア出発材料の混合物が５０℃に達した場合、Ｒｅｂ Ａが溶液から析出し始め、しかしながら、対照的に、無水エタノール溶媒では、溶媒とステビア出発材料の混合物が５０℃に達した場合、ステビア出発材料は依然として溶けており、Ｒｅｂ Ａの析出は始まらなかった。各還流段階後、熱の除去後に混合物を強制冷却することよりむしろ、混合物を室温まで単に空気冷却させることができるが、Ｒｅｂ Ａの収率は、強制冷却に比べて（例えば、室温に達した後のより長い放置時間、例えば、９６時間でも）より低い。言い換えれば、還流混合物の強制冷却は、低品質ステビア出発材料の収率を改善する。
【００４６】
図７は、本発明の工業的実施形態において使用される機器の概略を示している。高品質ステビア出発材料を処理するための基本的な工業的実施形態は、３つ又は４つの段階、すなわち、ＥｔＯＨ処方段階、還流段階、任意の撹拌洗浄段階（通常、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造するのに必要とされる）、並びにエタノールパージ及び乾燥段階を含む。第一還流に単一撹拌洗浄段階又は１つ若しくは複数の追加還流段階をさらに付け加えるか否かの（より多くの撹拌洗浄段階の有無にかかわらず）判定ポイントを図１（及び、他の図）に示し、「反復判定」で示す。低品質ステビア出発材料を使用する実施形態では、通常、最終撹拌洗浄段階の前に少なくとも１つの追加還流段階を加え、Ｒｅｂ Ａ最終製品の純度を最大限に高める。図８〜１０にそれぞれ示すように、ステップＩは、ＥｔＯＨ処方段階を含み、ステップＩＩ〜Ｖは、還流段階を含み、ステップＶＩ〜ＩＸは、撹拌洗浄段階を含み、ステップＸ〜ＸＩＩＩは、本発明の工業的実施形態のエタノールパージ及び乾燥段階を含む。工業的実施形態では、ステップＸ〜ＸＩＩＩ、エタノールパージ及び乾燥段階は、別名「エタノールをパージすること及び保持物を乾燥すること」である。
【００４７】
図７に示すように、工業的実施形態を実施するための典型的機器には、１つ又は複数のジャケット付きのステンレス製圧力容器（「タンク」又は「混合タンク」）が含まれ、各々は、通常、３，０００リットルの容量で、混合（フレキシブルスクレーパーブレード）、加熱（ジャケット内の蒸気）、及び冷却（ジャケット内の冷水）することに備え、注入及び排出経路並びに還流冷却器を備えている（図７では個別に図示せず）。以下のステップＸＩ以降以外のすべてのタンクプロセスステップでは、混合タンクに接続されている還流冷却器の排出経路を、もとの混合タンクに連結する。工業的実施形態では、還流冷却器がない適切に評価された圧力容器を使用することができるが、優れた混合物撹拌及び混合物過熱の軽減のために還流冷却器が好ましい。すべてのタンク、シェル、チューブ、バルブ、モーターなどは、爆発性の液体及び蒸気での使用が認証されているＡＳＴＭ圧力容器である。各タンクは、圧力及び温度センサー並びに流量及び／又は量指示器；吸入流量計量付きの粉末ホッパー及びフィーダー；吸入流量計量付きのエタノール及び水フィード；遮断バルブ；並びに１つ又は複数の遠心デカンター（通常、連続流モデル）、メンブランフィルター（任意）、ポンプ、貯蔵タンク、ポンプ、噴霧乾燥機、ホッパーフィーダー、機器、フィルターなどの要素を相互接続するパイプ、及びプロセス制御システムなどの圧力容器中で処理する技術分野において知られている常用の他の固定物を有する。
【００４８】
図８に示すように、本発明の工業的実施形態におけるステップＩは、還流溶媒における水対エタノールバランスの決定である。選択ＥｔＯＨ溶媒を決定する好ましい手段は、前述のように、及び図４及び５に説明されているように、出発材料アッセイの１〜３回の反復を行うことである。選択ＥｔＯＨ溶媒を決定する代替手段は、前述のように、還流溶媒近似を用いることである。出発材料アッセイが好ましいのは、出発材料アッセイが、高品質ステビア出発材料を使用する場合に１００％純粋Ｒｅｂ Ａを製造するのに（最終撹拌洗浄段階後）必要とされる還流溶媒中の含水量の近似値だけではなく、最小値を提供するからである。工業的プロセスにおいて使用される多量のステビア出発材料、エタノール、及びエネルギーを考えると、選択ＥｔＯＨ溶媒を最適化することにより収率を最適化することは、製造者の収益性にとって極めて重要であることが多い。したがって、出発材料アッセイは、通常、前述のように、多重反復され、所与のステビア出発材料のための（場合により、１つ又は複数の追加還流前の所与の保持物のための）選択ＥｔＯＨ溶媒を最適化する。上記で議論されたように、各出発材料アッセイには、場合により、選択ＥｔＯＨ溶媒が決定された後に、Ｒｅｂ Ａ収率を最大限に高める選択ＥｔＯＨ溶媒の質量の体積に対する比を決定するための質量対体積比アッセイが含まれていてもよい。
【００４９】
図８に示すように、本発明の工業的実施形態では、ＥｔＯＨ溶媒が選択された後、還流及び撹拌洗浄段階（又は、低品質ステビア出発材料を処理する場合には、１つ以上の追加還流、各々の追加還流段階は、中間撹拌洗浄段階の有無にかかわりない）を用い、製造者が決定した量のサンプルバッチを処理する。工業的プロセスにおけるステップＩＩは、第一タンク（「タンク１」）にエタノール及び水を供給して混合し、選択ＥｔＯＨ溶媒である還流溶媒を作製することである。エタノール含有量は、プロセスステップＩＩ〜ＩＶの間中、還流冷却器を用いて反応蒸気を捕捉及び冷却し、凝縮物をタンク１に戻すことにより選択ＥｔＯＨ溶媒中のエタノール含有量の約＋／−２％に維持する。ステップＩＩでは、１対４の質量対体積比（ステビア出発材料対選択ＥｔＯＨ溶媒）で、又は前述のように任意の質量対体積比アッセイを用いて決定される質量対体積比で、ステビア出発材料を選択ＥｔＯＨ溶媒に加えて混合する。ステップＩＩＩでは、タンク１中で連続的に混合しながら、混合物を７９℃まで加熱する（タンク１のジャケットにフィードされた蒸気、通常の加熱速度は１℃／ｍｉｎ）。典型的な工業的実施形態におけるすべての反応は、１気圧にて行う。
【００５０】
タンク１混合物が７９℃に達した後、７９℃〜８０℃の還流混合物温度を維持しながら還流中の混合を１時間続ける（タンク１内のエタノールは沸騰し、還流冷却器により回収される）。ステップＩＩＩでは、還流混合物温度が５０℃以上に上がると、Ｒｅｂ Ａが、通常、溶液から析出し始める。タンク１が、最大混合容量まで満たされていない場合、濃厚なクリーム状物質（主に、析出するＲｅｂ Ａ結晶）が生成し、タンク１の内面を覆う。クリーム状物質を混合物に戻すには、スクレーピングブレードを使用することが好ましい。ステップＩＶでは、還流混合物を４℃〜２０℃、通常は１４℃の温度まで冷却する（タンク１ジャケットにフィードされた冷水（４℃）、通常の冷却速度−０．３℃／ｍｉｎ）。ステップＩＶでは、ＲＡ８０未満品質のステビア出発材料を処理する場合、混合物を、通常、混合しながら、一定温度（通常１４℃）にて冷却しておき、収率を改善する。そのような場合、冷却放置時間が長ければ長いほど、放置時間約９６時間までは、析出Ｒｅｂ Ａの回収率は大きくなる。この放置時間の間、混合ブレードは、タンク１の内面を掻き取り、タンク１の底にスラリーを維持する。放置時間中に冷却して撹拌しない場合、混合物は、ゼラチン状又はクラスト状にさえなることがあり、混合物がゼラチン状又はクラスト状になった場合には、その後で、収率及び／又は純度に悪影響を及ぼすことなく、さらなる処理のためのポンプ注送可能なスラリーへ転換することができない。ステップＩＶでは、高品質ステビア出発材料を処理する場合、放置時間は、通常、還流混合物を冷却した後（通常、１４℃まで）には不必要である。タンク１について前述したように、及び後述するように、ステビア出発材料のバッチ処理は、他の利用可能なタンク中で同時に行うことができる。通常、商業的製造設備では、２つ以上のタンクが使用され、バッチは、労働力及び製品需要に基づいて段階的に行われる。
【００５１】
次に、十分な無水エタノール（無水エタノール）をタンク１の内容物に加え、ポンプ注送可能なスラリーを作製する。いったんタンク１内の冷却スラリーがポンプ注送可能になったら（ポンプ注送可能性は、ポンプのタイプに左右され、通常、ダイヤフラムポンプは、インペラーポンプよりも粘稠な液体を取り扱う）、タンク１内のスラリーを連続流遠心デカンターにポンプ注送する。遠心デカンターにスラリー流を供給し、ステップＶでは、エタノールは、「軽量分（ｌｉｇｈｔｓ）」吐出口にデカントされ、保持物は、保持物、すなわち「重量分（ｈｅａｖｉｅｓ）」吐出口の外へフィードされる（通常、重力フィード）。通常、大規模製造では、「軽量分」吐出流を、「軽量分」吐出流中のエタノールから小さな固体を分離する手段（例えば、メンブランフィルター又は流下液膜式蒸発器）によりポンプ注送する。通常、回収エタノールは、蒸留されて再利用される。分離手段によって捕捉された小さな固体は、通常、さらなる処理のために混合タンクに戻される（例えば、撹拌洗浄段階又は追加還流段階において）。
【００５２】
遠心デカンターは、本当のフィルターではないとはいえ、「軽量分」と「重量分」を分離する（すなわち、液体及び小さな固体、すなわち軽量分を、より重い粒子、すなわち重量分から分離する）フィルター様機能を行う。したがって、本発明における遠心デカンターの使用を「濾過」と呼ぶ。濾過は、濾過手段が、濾過されている混合物から、約２．０μｍを超える、より好ましくは１．５μｍを超える、最も好ましくは０．１μｍ以上の軸又は直径の粒子を分離することを必要とする。メンブランフィルター又は流下液膜式蒸発器などの固体から液体を分離する他の機器を、遠心デカンターの代わりに使用することができるが、ただし、機器における所与の投資については、代替技術の処理能力は、遠心デカンターの処理能力に比べて著しく低いことが多い。選択される濾過手段は、濾過すべき混合物の体積及び必要とされる処理能力に適していなければならない。この理由のため、遠心デカンターが、代替技術に比べ、処理能力がはるかに高く、目詰まりの問題がはるかに少なく、コストがかからないので、遠心デカンターが、通常、本発明の工業的実施形態において還流混合物及び撹拌洗浄混合物を濾過する際に使用するにはメンブランフィルター及び流下液膜式蒸発器よりも好ましい。
【００５３】
図９に示すように、ステップＶＩでは、利用可能なタンク（「タンク２」）に、通常は湿潤固体１グラム対エタノール４ｍｌの比又はその近くで、遠心デカンターの保持物吐出口からの湿潤固体及び１００％無水エタノールを供給することにより洗浄段階が開始する（「洗浄混合物」）。撹拌洗浄段階における１：３．５（ｍ／ｖ）以下の湿潤固体保持物のエタノールに対する比は、処理が妨げられるほど粘稠になることがある。撹拌洗浄段階における１：４（ｍ／ｖ）以上の湿潤固体保持物のエタノールに対する比は、通常、Ｒｅｂ Ａ純度に無視できる改善を生じ、Ｒｅｂ Ａ収率を低下させることが多い。したがって、撹拌洗浄段階における１：４又はそれに極めて近い湿潤固体保持物のエタノールに対する質量対体積比は、高品質ステビア出発材料を用いる場合に最も好ましい比である。ステップＶＩＩでは、洗浄混合物を、それ以上加熱も冷却もすることなく（すなわち、周囲温度にて）１５分間、タンク２の混合ブレードを用いて撹拌する。混合物を放置すると（ステップＶＩＩＩ）、低品質ステビア出発材料を用いる場合には収率を改善する。ステップＩＸでは、撹拌及び任意の放置時間後、タンク２内の洗浄混合物を、連続流遠心デカンターにポンプ注送する。遠心デカンターには、流入として洗浄混合物が供給され、エタノールは、「軽量分」吐出口にデカントされ、保持物は、「重量分」（保持物）吐出口の外へフィードされる（通常は、重力フィード）。撹拌洗浄中に洗浄混合物を冷却し、撹拌洗浄の完了後及びデカントする前に、通常は撹拌しながら洗浄混合物を放置しておくこと（ステップＶＩＩＩ）は、高品質ステビア出発材料を処理する場合に収率をわずかに増加させるが、低品質ステビア出発材料を処理する場合に収率を著しく増加させる。
【００５４】
図１０に示すように、最終製品を粉末として製造するためのエタノールパージ及び乾燥段階、ステップＸでは、デカンターからの保持物を、利用可能なタンク（「タンク３」）にフィードし（通常は、重力フィード）、最終体積が、タンク３に供給される保持物の質量の約２倍となるように水と混ぜ合わせる。例えば、保持物５００ｋｇに、十分な飲料（好ましくは、濾過）水を加え、混合物（「水混合物」）の最終体積を約１，０００リットルとする。ステップＸＩでは、タンク３の内容物を、蒸気吐出口を備えた容器中で７９℃まで加熱し（加熱速度１℃／ｍｉｎ）、次いで７９℃〜８０℃を維持し、混合物中の残留エタノールを蒸発させるために混合する。その温度（エタノールの沸点）にてタンク３の内容物を混合することは、混合物中に残っているすべてのエタノールを蒸発させ、吐出蒸気中のエタノールは、捕捉され再循環されることが好ましい（しかし、タンク３から廃棄流として放出することができる）。混合は、混合物のエタノール含量が噴霧乾燥に対して安全になるまで続く。ステップＸＩＩＩにおいて使用される噴霧乾燥機の製造者は、噴霧乾燥すべき液体中の可燃物の最大含有量を指定しており、それはタンク３から噴霧乾燥機にフィードされるエタノール含有量の上限である。防爆噴霧乾燥機などの溶媒の事前除去を必要としない乾燥の代替手段を用いることができるが、そのような代替手段は、より多くのオペレーターの注意を必要とすることがある。防爆噴霧乾燥機は、製造時間を短縮し、エネルギー消費を軽減するであろう。実施例６に記載されているように、工業的規模（例えば、ステビア出発材料５００ｋｇ）において、噴霧乾燥前にエタノールを沸騰除去することは、エタノールをパージするのに１０時間以上を必要とすることがある。
【００５５】
ステップＸＩＩでは、タンク３の内容物を、タンク３の内容物を噴霧乾燥機にポンプ注送しながら、６０℃〜９９℃（好ましくは、７９℃〜８０℃）に維持する（ステップＸＩＩＩ）。ステビア出発材料は、ＥｔＯＨ溶媒中で還流されるため、いかなる病原体も還流を生き延びることはおぼつかない（最終製品における微生物含有量は、第三者の実験室試験に基づき、検出不可能である）。噴霧乾燥する前に、混合物を、場合により、メンブランフィルター又はあらゆる粒子状混入物を除去するための分離の等価の手段によりポンプ注送することができる。噴霧乾燥機は、通常、自動制御されたエアロックバルブによりフィードホッパー（通常、スクリューフィードバッグローダーを備えた）中に吐出する。フィードホッパー内の固体は、粉末形態の最終製品、水溶性、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａである。以下の実施例４（２つの還流、工業的プロセス）に示すように、乾燥重量でステビア出発材料の６８％が、ＲＡ８９．９５ステビア出発材料を処理した場合に回収され、回収固体は、９９＋％Ｒｅｂ Ａであった。実施例４は、ステビア出発材料中のＲｅｂ Ａの７５．２５％の回収率に相当する。以下の実施例６（ＲＡ８３．１４ステビア出発材料を用い、単一撹拌洗浄付きの単一還流プロセス）に示すように、乾燥重量でステビア出発材料の５９．０４％が回収され、回収固体は、９９＋％Ｒｅｂ Ａであった。実施例６は、ステビア出発材料中のＲｅｂ Ａの７０．５９％の回収率に相当する。
【００５６】
工業的実施形態の９９＋％純度Ｒｅｂ Ａ最終製品は、通常、３３％の水への溶解度（最終体積３ｍｌ中に１グラム）を有する。実施例４に示すように、撹拌洗浄段階は、通常、約９６％純度Ｒｅｂ Ａ（第一還流段階後及び撹拌洗浄段階前の純度）から１００％純粋Ｒｅｂ Ａ（撹拌洗浄段階後）までＲｅｂ Ａ純度を増加させる。最終製品の用途が、例えば、ピクルスにするか、或いは甘味閾値以下の風味修飾で使用する場合に、９９％純度未満のＲｅｂ Ａの残留苦味を容認することができる場合、撹拌洗浄段階を省略することができ、還流混合物を濾過することからの保持物を乾燥し、商業的に使用することができる。しかしながら、撹拌洗浄段階は、すべての知覚可能な苦味を取り除くのに好ましい。約３３％の水への溶解度は、濃縮物を含むすべての商業的用途に適している。
【００５７】
以下の実施例１、５、及び７に示すように、低品質ステビア出発材料を使用する場合、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａ（撹拌洗浄段階の最終製品）を製造するには、通常、少なくとも１つの追加還流段階が必要である。２つの還流段階を用いてステビア出発材料を処理するため、第一還流段階は、選択ＥｔＯＨ溶媒を用いて行うが、還流混合物を濾過することからの湿潤固体保持物は、撹拌洗浄に入れられる代わりに第二の還流のための出発材料として使用される。１つ以上の追加還流及び／又は撹拌洗浄を行うための判定を、「反復判定」と呼び、いくつかの図では、「反復判定」で示す。図６に示すように、１つ以上のＥｔＯＨ処方段階を含む追加還流段階（及び、標的Ｒｅｂ Ａ純度を達成するのに必要とされる場合は、それ以上の追加還流段階）のための処理ステップは、前述の通りである。
【００５８】
図６では、追加還流段階の混合、加熱、還流、冷却、及び放置ステップ（すなわち、ステップＣ’〜Ｅ’）は、通常、タンク１Ａ（図７に示すような）で行われることになる。場合により、中間撹拌洗浄段階を、還流段階の間に行うことができ、その場合、中間撹拌洗浄混合物をデカントすることからの湿潤固体保持物を、任意選択のＥｔＯＨ処方段階（ステップＢ’）において、さもなければ追加還流段階（ステップＣ’〜Ｅ’）のための出発材料として使用する。冷却した後、混合物を濾過する（ステップＦ’）。追加還流段階に続いて、別の追加還流段階、撹拌洗浄段階、又はエタノールパージ及び乾燥段階を行う。出発材料アッセイの反復は、Ｒｅｂ Ａ純度の改善をモニターするため、各々の追加還流段階の始めに行われることが好ましい。一般的に、還流段階後に、保持物Ｒｅｂ Ａ純度が９６％を上回っている場合、撹拌洗浄段階並びにエタノールパージ及び乾燥段階は、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａ最終製品を製造するはずである。
【００５９】
通常、第一還流において使用される選択ＥｔＯＨ溶媒を、任意の追加還流段階でも使用する。しかしながら、収率をさらに最適化するため、各還流段階を終了させるデカントするステップにおいて製造される湿潤固体保持物から採取される試料に対してＥｔＯＨ処方段階を行うことができる（中間撹拌洗浄段階が還流段階の間に挿入される場合、中間撹拌洗浄段階をデカントすることからの湿潤固体保持物を、ＥｔＯＨ処方段階のための出発材料として使用する）。工業的プロセスにおける最終還流段階後、前述のように、撹拌洗浄段階並びにエタノールパージ及び乾燥段階を行い、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造する。しかしながら、各追加還流段階は、最終製品の収率を減少させる。
【００６０】
工業的プロセスでは、１℃／ｍｉｎの加熱速度及び−０．３℃／ｍｉｎの冷却速度が記載されているが、最終製品におけるＲｅｂ Ａの収率又は純度を著しく減少させることなく、典型的な工業的設備で得られる他の冷却及び加熱速度を使用することができる。極めて高い加熱速度は、出発材料の燃焼又は加水分解を防ぐための混合物の激しい撹拌を必要とする。得られる加熱及び冷却速度は、バッチサイズ、加圧加熱及び冷却、並びに（冷却する場合には）冷水に代わる冷媒の使用によって異なることがある。例えば、強制冷却は、圧力容器ジャケット中で温度が０℃以下の冷媒を用いることにより（少なくとも、混合物温度を０℃よりかなり高くしながら激しく混合する最初の冷却期間中は）行うことができる。第一又は追加還流ステップ後の４℃より低いが０℃よりも高い（混合物における氷生成を避ける）任意選択放置ステップ中の混合物温度及び長い放置時間は、ＲＡ８０未満純度のステビア出発材料を処理する場合には特に、Ｒｅｂ Ａの収率をわずかに改善するはずである。しかしながら、ＲＡ４０ステビア出発材料を処理する場合でさえ、９６時間より長い還流又は撹拌洗浄後の放置時間は、収率の改善をほとんど提供しない。
【００６１】
実験室及び工業的プロセスにおける還流冷却器の使用よりむしろ、混合成分のほぼ望ましい濃度を維持するために、他の方法（例えば、蒸気を放出して新たなエタノールと水を供給すること、又は溶媒蒸気を捕捉及び凝縮し、それを混合物に戻す他の機器）を用いることができる。
【００６２】
ＥｔＯＨの代わりに、本発明において使用される還流溶媒は、ＥｔＯＨ以外の含水アルカノールであってもよいが、ＥｔＯＨの代わりに他の含水アルカノールを用いる場合には、純度及び収率が低下する。同様に、撹拌洗浄溶媒は、エタノール以外のアルカノールであってもよい。還流溶媒としての他の含水アルカノール、及び撹拌洗浄溶媒としての他のアルカノールの使用は、ヒト消費のための組成物における使用に不適合なアルキル化混入物をもたらすことがある。他の含水アルカノールを使用する場合、出発材料アッセイ（又は還流溶媒近似）、及び任意選択の質量対体積比アッセイを行い、それぞれ所与の還流及びステビア出発材料のための還流溶媒の含水量並びに質量対溶媒比を決定する。
【００６３】
前述のように、標的Ｒｅｂ Ａ純度を達成するのに必要な還流段階及び撹拌洗浄段階の最小数は、所与のステビア出発材料及び標的Ｒｅｂ Ａ純度のための還流（低品質ステビア出発材料については、質量対溶媒比が、１対４より高いことがある）及び撹拌洗浄の順列を用いて経験的に決定される。一般的な法則として、単一還流段階及び１つ又は２つの撹拌洗浄段階が、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造しない場合、１つ又は複数のＥｔＯＨ処方段階には質量対体積比アッセイが含まれる。前述のように、本発明において高品質ステビア出発材料を使用することは、通常、単一還流及び単一撹拌洗浄並びに１対４の質量対体積比を用いて９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを提供する。低品質ステビア出発材料の場合、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａ最終製品の標的純度に関して、好ましいアプローチは、１対４の質量対体積比及び必要な数の還流（「選択還流反復カウント」）を用い、ＥｔＯＨ処方段階において約９６％〜９８％純度Ｒｅｂ Ａ最終製品を得ることである。次いで、選択ＥｔＯＨ反復カウントによるＥｔＯＨ処方段階、及び撹拌洗浄段階を行い、最終撹拌洗浄を加えることが標的純度を提供するかどうかを決定し、そうでなければ、選択肢は、別の還流段階を加えることか、或いは１つ以上のＥｔＯＨ処方段階において質量対溶媒比を（質量対溶媒比アッセイを用い）調整し、標的純度に達したかどうかを再び決定することである。実施例７が示すように、標的純度が、ＲＡ８２．３ステビア出発材料を使用する１００％純度Ｒｅｂ Ａ最終製品であり、標的純度が、２つの還流、単一撹拌洗浄、及び１：４の質量対体積比を用いて到達できない場合、還流における質量対体積比を１：６まで増加させることは、標的純度を提供することがある。低品質ステビア出発材料は、高品質ステビア出発材料よりもかなり安価である。エタノール及びエネルギーのコストが低い場所では、低品質ステビア出発材料を、コスト効率よく９９＋％純度Ｒｅｂ Ａまで処理することができる。エタノール及びエネルギーのコストが高い国では、通常、高品質ステビア出発材料がコスト効率の面で必要とされる。
【００６４】
７９℃〜８０℃の還流混合物温度は、通常、最短の許容できる還流時間（通常は１時間）を生じる。７９℃より低い還流混合物温度を使用することができるが、そのような低い還流混合物温度は、通常、より長い還流時間を必要とし、Ｒｅｂ Ａのかなり低い収率を生じる。例えば、還流混合物温度を５０℃以上に上げると、還流混合物は、Ｒｅｂ Ａが析出し始めるにつれて乳白色になる。還流混合物を５０℃〜６０℃に維持すると、還流時間に応じて、加熱コストを軽減するが、Ｒｅｂ Ａの収率は、７９℃〜８０℃の還流混合物温度に比べてかなり低下するであろう。しかしながら、ある場所、例えば、太陽加熱を用いる場所では、より低い還流混合物温度のみが実現可能であることがある。
【００６５】
Ｒｅｂ Ａ製品の用途。本発明によって製造される９９＋％純度Ｒｅｂ Ａ（「Ｒｅｂ Ａ製品」）は、食品、飲料、薬、タバコ、医薬品、及びパーソナルケア製品の唯一の甘味料として使用するか、或いはそのような製品中の他の甘味料（すなわち、「補助甘味料」として）と混合することができる。２種以上の甘味料は、通常、特定の味覚プロフィール及び／又は物理的特性を得るために使用される。そのような甘味料には、従来の甘味料（ショ糖、ビート糖、ハチミツ、シロップ、及び他の「天然」甘味料）及び強力甘味料（チクロ、サッカリン、スクラロース、アスパルテーム、ステビア、並びに他の化学的に製造された及び／又は天然強力甘味料）が含まれる。
【００６６】
Ｒｅｂ Ａ製品を含有する経口消費できる組成物の知覚される甘味を修飾するために、ガラクトシドなどの味覚修飾部分の付加によってＲｅｂ Ａ製品を修飾することができる。例えば、当業者に知られている反応において、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素を用い、Ｒｅｂ Ａ製品上でβ−１，４−ガラクトシルを置換することができる。経口消費される組成物において使用される場合に快い感覚的知覚のある化合物を製造するために１つ以上の官能基によって修飾されている本発明によって製造される９９＋％純度Ｒｅｂ Ａは、用語「Ｒｅｂ Ａ製品」に含まれる。
【００６７】
補助甘味料として使用する場合、Ｒｅｂ Ａ製品を、甘味料の技術分野において知られている方法（例えば、水蒸気、エタノール、又はアルカノールでエアロゾル化したＲｅｂ Ａ製品の補助甘味料上への蒸気沈着）で使用し、顆粒状及び粉末状の砂糖及び人工甘味料などの他の固体甘味料をコーティングするか、或いはそれらに浸透させ、そのような固体甘味料と別々の粉末として混合するか、他の固体甘味料と共結晶化させるか、又はコーンシロップ及びハチミツなどの液体甘味料に懸濁若しくは溶解することができる。工業的実施形態のエタノールパージ及び乾燥段階で使用される市販の噴霧乾燥機は、通常、使用目的にふさわしい粒径のＲｅｂ Ａ製品を製造するように構成することができる。
【００６８】
本明細書で使用する用語「風味」又は「風味特性」は、味、臭い、及び／又はテクスチャの成分を合わせた感覚的知覚である。本明細書で使用する用語「増強する」には、その性質又は品質を変化させることなく風味特性の感覚的知覚を増大、強化、強調、拡大、及び増強することが含まれる。本明細書で使用する用語「修飾する」には、そのような特性の質又は持続時間が不十分であった場合に、風味特性の感覚的知覚を変更、変化、抑制、抑圧、強化及び補完することが含まれる。
【００６９】
食材及び医用組成物に風味付けする技術分野では、食材及び薬用製品の受入及び需要が、一般的にそれらの感覚的知覚に関連しているため、そのような材料の風味を修飾及び改善することができる組成物の継続的必要性がある。含嗽剤及び練り歯磨きなどの口腔衛生組成物に風味付けする技術分野、並びに噛みタバコ、嗅ぎタバコ及びチューインガムなどの咀嚼組成物に風味付けする技術分野では、非齲蝕性であり、連鎖球菌、乳酸菌などを生じる虫歯の成長を支えない風味修飾剤又は増強剤でそのような咀嚼組成物の風味特性を改善する必要性がある。同様に、喫煙組成物の風味特性を改善する必要性がある。
【００７０】
用語「経口消費できる組成物」には、食材、薬用組成物、喫煙組成物、咀嚼組成物並びに含嗽剤及び練り歯磨きを含む口腔衛生組成物が含まれる。用語「食材」には、通常、栄養的価値を有するが、必要ではなく、ヒト又は動物による消費を目的とする固体と液体双方の摂取可能な材料が含まれる。食材の代表例には、コーヒー、茶、ハーブティー、焼上商品、天然及び合成香料、スパイス、香辛料、スープ、シチュー、コンビニエンスフード、飲料（炭酸と非炭酸双方）、乳製品、キャンディー、野菜、穀類、果実、フルーツドリンク、スナック、カカオ製品、チョコレート、動物飼料などが含まれる。用語「薬用組成物」には、咳止めシロップ、咳止めドロップ、薬用スプレー、ビタミン、及びチュアブルタイプの薬用錠剤などの薬用価値を有する摂取可能な材料である固体、気体及び液体が含まれる。用語「咀嚼組成物」には、噛みタバコ、無煙タバコ、嗅ぎタバコ、チューインガム及び咀嚼され、続いて吐出される他の組成物が含まれる。チューインガムには、ジェルトン、ガッタカイ（ｇｕｔｔａｋａｙ）ゴム又はある種の食料品天然合成樹脂若しくはワックスを含むチクル又はその代用品などの実質的に水不溶性のチュアブルタイプのガム基剤を含む組成物が含まれる。用語「口腔衛生組成物」には、含嗽剤、口内洗浄剤、練り歯磨き、歯磨き、歯磨剤、口内スプレー、及び口内リフレッシャーが含まれる。本明細書で使用する用語「喫煙組成物」には、紙巻き、パイプ及び葉巻タバコ、並びに細かく刻まれたフィラー、葉、茎、柄、均質化した干葉、再構成した結合剤、並びにシート、ペレット又は他の形態のタバコダスト、微粉、又は他の供給源から再構成したタバコなどのすべての形態のタバコが含まれる。また、「喫煙組成物」には、米国特許第３，５２９，６０２号、第３，７０３，１７７号及び第４，０７９，７４２号並びにそれらの中で引用されている参考文献に記載されている代表的なタバコ代用品などの、非タバコ材料から処方されたタバコ代用品が含まれる。
【００７１】
本発明の一実施形態によれば、Ｒｅｂ Ａ製品によって増強又は修飾される風味を有する経口消費できる組成物が提供される。Ｒｅｂ Ａ製品は、甘い、フルーツのような、花の、草本の、スパイシーな、芳香性の、辛味の、「ナッツ様の」（例えば、アーモンド、ペカン）、「スパイシーな」（例えば、シナモン、クローブ、ナツメグ、アニス及びウィンターグリーン）、「非柑橘果実」風味（例えば、イチゴ、サクランボ、リンゴ、ブドウ、干しブドウ、トマト、西洋スグリ及びクロイチゴ）、「柑橘果実」風味（例えば、オレンジ、レモン及びグレープフルーツ）、並びにコーヒー、カカオ、ペパーミント、スペアミント、バニラ及びカエデを含む他の有用な風味である風味特性を修飾又は増強することができる。
【００７２】
本発明の一変形形態によれば、経口消費できる組成物は、経口消費できる組成物を甘くするか、或いはそれらの味、臭い、及び／又はテクスチャを修飾又は増強するのに有効な量でＲｅｂ Ａ製品を含む。
【００７３】
用語法「有効な量」又は「有効量」は、感覚的知覚を生じる量を意味する。過剰量のＲｅｂ Ａ製品の使用は、ちょうど食材又は飲料に多すぎる砂糖を加えることがあるように、風味の修飾又は増強にとって望ましくないかもしれない甘味を生じるはずである。用いられるＲｅｂ Ａ製品の量は、経口消費できる組成物について達成すべき望ましい感覚的効果及び最初の組成物の性質により、比較的広い範囲にわたって変化することがある。
【００７４】
Ｒｅｂ Ａ製品は、Ｒｅｂ Ａ製品を経口消費できる組成物と混合すること、又はＲｅｂ Ａ製品を経口消費できる組成物の成分と混合することにより経口消費できる組成物に添加することができる。
【００７５】
Ｒｅｂ Ａ製品は、紙巻きタバコ、葉巻、嗅ぎタバコ、噛みタバコ、他のタバコ商品、フィルター、喫煙紙、及び他の喫煙組成物を含む群から選択されるタバコ及びタバコ関連製品において使用することができる。加糖、増強、又は修飾された風味を有する喫煙組成物は、タバコ、再構成タバコ、非タバコ代用品及びそれらの混合物から選択される喫煙用フィラー材料を含み、有効量のＲｅｂ Ａ製品を含有する。「含有すること」は、成分として含まれていることと材料に吸着されていることの双方を意味する。本発明の一変形形態において、喫煙組成物は、Ｒｅｂ Ａ製品を含有するフィルター手段を含む。本明細書で使用する用語「フィルター手段」には、その中に組み入れられている濾過又は風味付けモジュールを有する葉巻又は紙巻きタバコなどの喫煙装置手段が含まれ、アセテート、綿、活性炭及び他の繊維、フレーク又は粒子濾過手段が含まれる。本発明の別の変形形態において、喫煙組成物は、Ｒｅｂ Ａ製品を含有する包装紙手段を含む。本発明のこの実施形態の一変形形態では、Ｒｅｂ Ａ製品０．００３〜０．３０重量部を、喫煙用フィラー材料１００重量部に添加する。本発明のこの実施形態の好ましい変形形態では、Ｒｅｂ Ａ製品０．０１５〜０．３０重量部を、喫煙用フィラー材料１００重量部に添加する。
【００７６】
タバコに風味付けする当業者は、喫煙組成物に添加されるＲｅｂ Ａ製品の有効量は、Ｒｅｂ Ａ製品を喫煙組成物に添加する方法及び喫煙組成物のどの部分にＲｅｂ Ａ製品を添加するかによって異なることがあることを理解している。Ｒｅｂ Ａ製品は、喫煙組成物の喫煙用フィラー材料、フィルター手段、又は包装紙手段に直接添加することができる。Ｒｅｂ Ａ製品は、フィルター手段の繊維、フレーク又は粒子の間にＲｅｂ Ａ製品を組み入れること、繊維フィルター手段の繊維の２つ以上の層の間にＲｅｂ Ａ製品を充填し３重のフィルター手段を形成すること、又はシガレットホルダーなどの喫煙装置手段内にＲｅｂ Ａ製品を挿入することを含むがこれらに限定されない、フィルター手段に風味付けする当業者に知られている任意の方法により喫煙組成物のフィルター手段に添加することができる。
【００７７】
当業者には当然のことながら、ブレンドすること又は他の操作を用い、Ｒｅｂ Ａ製品の濃度の有効な、又は望ましい範囲内に最終的又は究極的な喫煙組成物を調整することができるため、喫煙用フィラー材料又はフィルター手段の一部のみがＲｅｂ Ａ製品で処理される。Ｒｅｂ Ａ製品に加えて、喫煙組成物矯味技術において知られている他の矯味剤又は芳香添加物をＲｅｂ Ａ製品と一緒に使用し、喫煙組成物にＲｅｂ Ａ製品と一緒に添加することができる。喫煙組成物矯味技術において使用される代表的矯味剤には、酢酸エチル、酢酸イソアミル、イソ酪酸プロピル、酪酸イソブチル、酪酸エチル、吉草酸エチル、ギ酸ベンジル、メントール、リモネン、シメン、ピネン、リナロール、ゲラニオール、シトロネロール、シトラール、ペパーミント油、オレンジ油、コリアンダー油、レモン油、ボルネオール、カカオ抽出物、タバコ抽出物、甘草抽出物及び果実抽出物が含まれる。
【００７８】
Ｒｅｂ Ａ製品は、噴霧乾燥後のその精製状態で、一般的に、細かい粉末であり、約１〜１００ミクロンの範囲の粒径を有する。細かい粉末は、取り扱うのが困難であり、茶葉、タバコ製品、薬草葉、コーヒーなどの経口消費できる組成物及び他の経口消費できる組成物と混合するのが困難である。また、一般的に、Ｒｅｂ Ａ製品が風味修飾剤若しくは増強剤、甘味料、又は補助甘味料として使用される場合、相対的にほんの少量のＲｅｂ Ａ製品が経口消費できる組成物で使用される。
【００７９】
本発明の別の実施形態によれば、経口消費できる組成物にＲｅｂ Ａ製品を添加するためのプロセスは、Ｒｅｂ Ａ製品を担体と混合し、Ｒｅｂ Ａ製品−担体混合物を生成することを含む。好ましい担体には、水、エタノール、食品加工において使用される他のアルカノール、又はそれらの混合物が含まれる。そのようにして生成されたＲｅｂ Ａ製品溶液を、経口消費できる組成物と接触させ、蒸発により経口消費できる組成物から担体を除去するか、さもなければ、Ｒｅｂ Ａ製品残渣を経口消費できる組成物と一緒に沈着させる。このプロセスは、茶葉、ハーブ植物葉、及び他の甘味料、特に顆粒状のショ糖（テーブルシュガー）に、Ｒｅｂ Ａ製品を添加するのに特に有用である。
【００８０】
本発明のさらに別の実施形態によれば、経口消費できる組成物で使用するのに適している液体フィルター材料が、Ｒｅｂ Ａ製品により調製される。本明細書で使用する用語「液体フィルター」は、ティーバッグ、コーヒーフィルター又はフィルターディスクなどの経口消費できる組成物を調製するのに使用される多孔性又は半多孔性フィルター材料を指す。用語「フィルターディスク」は、経口消費できる組成物に矯味又は甘味組成物を添加するための媒体として働くことを目的として経口消費できる組成物に添加される多孔性又は半多孔性の不活性物品を指す。フィルター材料及びＲｅｂ Ａ製品を含む液体フィルターを調製するためのプロセスは、通常、Ｒｅｂ Ａ製品を担体と混合してＲｅｂ Ａ製品−担体混合物を生成すること、Ｒｅｂ Ａ製品−担体混合物をフィルター材料と接触させること、及びフィルター材料から担体を除去し、それによってフィルター材料上にＲｅｂ Ａ製品残渣を沈着させることによる。
【００８１】
Ｒｅｂ Ａ製品は、場合により開放容器、缶、瓶又は他のパッケージに分配されている炭酸、非炭酸、冷凍、半冷凍（「スラッシュ」）、非冷凍、すぐに飲める、濃縮（粉末、冷凍、又はシロップ）、乳、非乳、ハーブ、非ハーブ、カフェイン含有、カフェイン非含有、アルコール、非アルコール、味付け、非味付け、野菜ベース、果実ベース、根／塊茎／球茎ベース、ナッツベース、他の植物ベース、コーラベース、チョコレートベース、肉ベース、シーフードベース、他の動物ベース、藻類ベース、カロリー増強、カロリー低減、及びカロリーゼロ製品を含む群から選択される飲料、ブロス、及び飲料調製物において使用することができる。そのような飲料及び飲料調製物は、すぐに飲める、すぐに調理できる、すぐに混合できる、生の、又は成分形態であってよく、唯一の甘味料として又は補助甘味料としてＲｅｂ Ａ製品を使用することができる。
【００８２】
Ｒｅｂ Ａ製品は、乳ベース、穀類ベース、焼上、野菜ベース、果実ベース、根／塊茎／球茎ベース、ナッツベース、他の植物ベース、卵ベース、肉ベース、シーフードベース、他の動物ベース、藻類ベース、加工（例えば、スプレッド）、保存（例えば、すぐに食べられる食事の配給）、及び合成（例えば、ゲル）製品を含む群から選択される食品及び食品調製物（例えば、甘味料、スープ、ソース、矯味剤、香辛料、油、脂肪、及び調味料）において使用することができる。そのような食品及び食品調製物は、すぐに食べられる、すぐに調理できる、すぐに混合できる、生の、又は成分形態であってよく、唯一の甘味料として又は補助甘味料としてＲｅｂ Ａ製品を使用することができる。
【００８３】
Ｒｅｂ Ａ製品は、乳ベース、穀類ベース、焼上、野菜ベース、果実ベース、根／塊茎／球茎ベース、ナッツベース、ガムベース、他の植物ベース、卵ベース、肉ベース、シーフードベース、他の動物ベース、藻類ベース、加工（例えば、スプレッド）、保存（例えば、すぐに食べられる食事の配給）、及び合成（例えば、ゲル）製品を含む群から選択されるキャンディー、菓子、デザート、及びスナックにおいて使用することができる。そのようなキャンディー、菓子、デザート、及びスナックは、すぐに食べられる、すぐに調理できる、すぐに混合できる、生の、又は成分形態であってよく、唯一の甘味料として又は補助甘味料としてＲｅｂ Ａ製品を使用することができる。
【００８４】
Ｒｅｂ Ａ製品は、処方薬及び店頭医薬品、アッセイ、診断キット、並びに体重管理、栄養補給剤、ビタミン、乳児食、糖尿病食、アスリート食、老人食、低炭水化物食、低脂肪食、低タンパク食、高炭水化物食、高脂肪食、高タンパク食、低カロリー食、ノンカロリー食、口腔衛生製品（例えば、練り歯磨き、含嗽剤、リンス剤、フロス、歯ブラシ、他の道具）、パーソナルケア製品（例えば、石鹸剤、シャンプー剤、リンス剤、ローション剤、バルム剤、サルブ剤、軟膏剤、紙商品、香水、口紅、他の化粧品）、味又は香りが一要因である専門的歯科製品（例えば、液剤、チュアブル剤、吸入剤、注射剤、サルブ剤、樹脂剤、リンス剤、パッド剤、フロス、道具）、味又は香りが一要因である医用、獣医用、及び外科用製品（例えば、液剤、チュアブル剤、吸入剤、注射剤、サルブ剤、樹脂剤、リンス剤、パッド剤、フロス、道具）、並びに充填剤、シロップ剤、カプセル剤、ゲル剤、及びコーティング製品を混ぜ合わせる医薬品を含む群から選択される治療法において使用することができる。
【００８５】
Ｒｅｂ Ａ製品は、プラスチックフィルム、熱硬化性及び熱可塑性樹脂、ガム、ホイル、紙、瓶、箱、インク、塗料、接着剤、及びパッケージ用コーティング製品を含む群から選択される消費財パッケージ用材料及び容器において使用することができる。
【００８６】
Ｒｅｂ Ａ製品は、甘味料、補助甘味料、コーティングされた甘味料スティック、冷凍菓子スティック、医用スプーン（ヒト及び動物使用）、歯科用器具、加糖使い捨て食器及び用具、サシェ、食用サシェ、ポプリ、食用ポプリ、ごった煮、食用ごった煮、造花、食用造花、衣料、食用衣料、マッサージオイル、及び食用マッサージオイルを含む群から選択される商品において使用することができる。
【実施例】
【００８７】
ＨＰＬＣ法
高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を用い、本発明によって製造される最終製品の純度を決定した。実施例及び上記の説明において使用されるＨＰＬＣ分析法では、乾燥固体（例えば、本発明を用いて製造される最終製品）０．１グラムを、５０％アセトニトリル／５０％水２５ｍｌに溶かし、試料を作製する。試料を、０．４５μｍナイロンフィルターに通し、濾液１０μｌをＨＰＬＣ注入ポートに注入する。ＨＰＬＣ機器は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−１０ＡＳポンプ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、ｗｗｗ．ｓｓｉ．ｓｈｉｍａｄｚｕ．ｃｏｍ）、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＳＣＬ−１０Ａコントローラー及びＳｈｉｍａｄｚｕ  ＳＰＤ−１０Ａ可変波長検出器を含む。生データは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＣＲ５０１  Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃインテグレーターで集めた。４．２ｍｍ  ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ、１０μｍアミンカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．、ｗｗｗ．ａｌｌｔｅｃｈ．ｃｏｍ）を、７２．５％アセトニトリル／２７．５％水からなる定組成移動相及び０．８ｍｌ／ｍｉｎの流速で使用した。ピークは２１０ｎｍにて検出した。配糖体（ステビオシド及びレバウジオシドＡ）は、それぞれステビオシド（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘカタログ番号ＡＳＢ−０００１９３５１）かレバウジオシドＡ（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘカタログ番号ＡＳＢ−０００１８２２６）のどちらかの既知濃度から構築された標準線形回帰曲線（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）との比較により定量化した。ステビア出発材料及び本発明によって製造される固体を分析するため、参照標準品を使用した。ステビオシド及びレバウジオシドＣは、後述のように、本発明を用いて製造される最終製品において検出の下限であった。本発明書に記載されている最終製品は、９８．７％の保証純度を有する現在の主要な分析標準品より高い純度を有する。（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、Ｃａｌｉｆ．、ｗｗｗ．ｃｈｒｏｍａｄｅｘ．ｃｏｍ）Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ標準品は、ほぼ２００２年に確立された。本発明によって製造されるＲｅｂ Ａの高純度は、前述のように、主に、ＥｔＯＨ処方段階の使用及び選択ＥｔＯＨ溶媒に起因する。語句「１００％純粋Ｒｅｂ Ａ」は、本発明を用いて製造される最終製品の試料の前述の高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）分析からのクロマトグラフが、ステビオシド及びレバウジオシドＣの非常に小さいブリップ（保持時間による）、Ｒｅｂ Ａの単一の強いピークを示し、ＨＰＬＣインテグレーターが、純粋Ｒｅｂ ＡのＣｈｒｏｍａｄｅｘ参照標準品のみの試料についてＨＰＬＣインテグレーターにより報告された２１０ｎｍにおける最低値（通常、９８．７％）以上の値を報告することを意味する。２００２年以前の一般的使用における純度用の多くのＲｅｂ Ａ参照標準品は、Ｒｅｂ Ａ純度を誇張していることが分かっており、例えば、２００２年以前にカナダで一般使用された標準品は、Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ標準品を用いる分析結果に比べ、Ｒｅｂ Ａ純度を約６％誇張していると考えられる。
【００８８】
ＨＰＬＣ機器における２１０ｎｍの吸収は、溶離化合物及び化合物の１つ以上の発色団の性質に基づいて変化するため、既知純度の参照化合物（例えば、Ｃｈｒｏｍａｄｅｘカタログ番号ＡＳＢ−０００１８２２６）から構築される標準線形回帰曲線以外の分析法を用いることは、一定しない結果をもたらすはずである。
【００８９】
（実施例１）
実施例１。一連の試験溶媒を用いる２つの還流段階と、続く無水エタノール還流。
【００９０】
実施例１は、固体収率及びレバウジオシドＡ純度に対する還流溶媒中の含水量の影響を明らかにする。実施例１では、０％、２％、４％、６％、８％、及び１０％水並びに残るパーセンテージのエタノール（体積／体積）を含有する一連の６溶媒を処方した。溶媒の各ブレンドを「試験溶媒」と呼ぶ。３組の（ｉ）７１．８５％ＲＡ、１３．５５％ステビオシド；（ｉｉ）７６．１３％ＲＡ、６．９６％ステビオシド；及び（ｉｉｉ）８１．５８％レバウジオシドＡ、４．４９％ステビオシドを含有する（各々の残部は、様々な濃度のズルコシド、レバウジオシド、及びステレビン化合物からなっていた）ステビア出発材料の６つの５グラム試料を、２種の市販ステビア抽出物、ＲＡ８１．５８及びＲＡ４０．２７を混ぜ合わせることにより調製した。３組のステビア出発材料のブレンド（各々、「ステビアブレンド」）すべてを、送風オーブン中で８０℃にて一夜乾燥し、処理する前に０％水分を含有すると仮定した。
【００９１】
各ステビアブレンド５グラムを、各々、３組の６つの１００ｍｌガラス丸底フラスコに入れ、フラスコの組にそれぞれ各試験溶媒２０ｍｌを加え、各ステビアブレンドの１００Ｅｔ／００Ｗ、９８Ｅｔ／０２Ｗ、９６Ｅｔ／０４Ｗ、９４Ｅｔ／０６Ｗ、９２Ｅｔ／０８Ｗ、及び９０Ｅｔ／１０Ｗ「試験混合物」を作製した。試験混合物を室温にて混合した。１００Ｅｔ／００Ｗ試験混合物を除いて、すべてのステビア出発材料は溶液になった。各試験混合物を８０℃にて１時間還流した。次いで、各混合物を、氷上で１時間冷却した。次いで、各試験混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバーフィルター（細孔サイズ１．６μｍ）で濾過した。各試験混合物の濾過からの固体（「第一保持物」）を集め、各第一保持物を、対応する試験混合物の第一還流に使用したのと同じ試験溶媒２０ｍｌと混合し、「第二試験混合物」を作製した。各第二試験混合物を８０℃にて１時間還流した。次いで、各第二試験混合物を４℃にて９６時間保存した。次いで、各第二試験混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバーフィルターで濾過し、湿潤固体の保持物（「第二保持物」）を作製し、各第二保持物を、一定重量に達するまで送風オーブン中で８０℃にて乾燥した。所与の第二試験混合物からの乾燥第二保持物の各グラムを、１００ｍｌガラス丸底フラスコ中で無水エタノール４ｍｌと混合し、「第三試験混合物」を作製した。各第三試験混合物を８０℃にて１時間還流した。次いで、各第三試験混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバーフィルターで濾過し、固体（「第三保持物」）を集め、次いで、一定重量が観察されるまで送風オーブン中で８０℃にて乾燥した。収率を測定するため、各乾燥第三保持物の重量を決定した。純度を測定するため、各第三保持物の０．１グラム試料を、前述のＨＰＬＣ法を用いてレバウジオシドＡ及びステビオシド含有量について分析した。
【００９２】
結果：
表１は、ＲＡ７１．８５、ＲＡ７６．１３、及びＲＡ８１．５８ステビア出発材料からの固体収率に対する試験溶媒中の含水量の影響を示している。
【００９３】
グラフ１は、ＲＡ７１．８５、ＲＡ７６．１３、及びＲＡ８１．５８ステビア出発材料からの固体収率に対する試験溶媒中の様々な含水量の影響をプロットしている。
【００９４】
表１から分かるように、試験溶媒中の含水量が８％まで増加するにつれて、固体収率は徐々に低下した。しかしながら、試験溶媒中の含水量が８％を超した場合、すべての場合において、固体収率は、著しくかつ低い含水量よりもはるかに大きな割合で低下した。このことは、ＲＡ７０以上のステビア出発材料で収率を維持するためには、最大含水量が体積で８％を超えてはならないことを示唆している。Ｒｅｂ Ａ収率とステビア出発材料のレバウジオシドＡ含有量との間には正の相関が認められ、より高い最初のＲｅｂ Ａ含有量は、すべての試験溶媒においてより高い固体収率を与えた。ステビア出発材料中の水分は、試験溶媒の総含水量に寄与し、結果的に固体収率に対して影響を与えるはずである。したがって、試験混合物中の総含水量を制御するため、すべてのステビア出発材料を、試験混合物を処方する前に乾燥した。
【００９５】
表２は、ＲＡ７１．８５、ＲＡ７６．１３、及びＲＡ８１．５８ステビア出発材料からのレバウジオシドＡ純度に対する試験溶媒中の含水量の影響を示している。
【００９６】
グラフ２は、ＲＡ７１．８５、ＲＡ７６．１３、及びＲＡ８１．５８ステビア出発材料からのレバウジオシドＡ純度に対する試験溶媒中の含水量の影響をプロットしている。
【００９７】
表２及びグラフ２から分かるように、最終製品のＲｅｂ Ａ純度は、一般的に、試験溶媒中の含水量が増加するのに伴って増加した。例外は、２％含水量であり、その場合、試験溶媒中に水がないことに比べ、Ｒｅｂ Ａ純度が低下するかＲｅｂ Ａ純度が極めてわずかに増加するかどちらかであった。９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを含有する最終製品を得るために、表２は（ボールド数字）、ＲＡ８１．５８ステビア出発材料については、試験溶媒中の６％水分が、最高収率で望ましい９９＋％Ｒｅｂ Ａ純度を与えたことを示している。ＲＡ７６．１３ステビア出発材料では、８％含水量が、最高収率で望ましい９９＋％Ｒｅｂ Ａ純度を与えた。ＲＡ７１．８５ステビア出発材料では、１０％含水量が、最高収率で望ましい９９＋％Ｒｅｂ Ａ純度を与えた。しかしながら、表１からのデータによって示されるように、低品質ステビア出発材料で望ましい９９＋％Ｒｅｂ Ａ純度に到達することは、より低い絶対収率をもたらす。
【００９８】
実施例１は、使用される各ステビア出発材料に最適な試験溶媒中の含水量を経験的に決定する必要性を説明している。これらの経験的知見は、前述の出発材料アッセイ及び還流溶媒近似につながった。
【００９９】
（実施例２）
実施例２。一連の試験溶媒を用いる１つの還流段階と、続く撹拌洗浄段階。
【０１００】
実施例２は、ＲＡ８０以上のステビア出発材料を使用する場合、実施例１における第二還流を削除することができ、無水エタノールによる還流を、無水エタノール中のより短時間の撹拌洗浄で置き換えることができることを明らかにする（ステビア出発材料が、「頑固な」混入物を含有せず、追加還流段階を必要としない場合）。実施例２の結果は、ＲＡ９０を使用すると、単一還流段階及び単一洗浄段階が、通常、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造することを示している。
【０１０１】
実施例２では、実施例１と同様に、０％、２％、４％、６％、８％、及び１０％水並びに残るパーセンテージのエタノール（体積／体積）を含有する一連の６溶媒を処方した。溶媒の各ブレンドを「試験溶媒」と呼ぶ。ＲＡ８９．９５ステビア出発材料５グラムを、６つの１００ｍｌガラス丸底フラスコの各々に入れ、１００Ｅｔ／００Ｗ、９８Ｅｔ／０２Ｗ、９６Ｅｔ／０４Ｗ、９４Ｅｔ／０６Ｗ、９２Ｅｔ／０８Ｗ、及び９０Ｅｔ／１０Ｗ試験溶媒２０ｍｌと混合し、ステビア出発材料の１００Ｅｔ／００Ｗ、９８Ｅｔ／０２Ｗ、９６Ｅｔ／０４Ｗ、９４Ｅｔ／０６Ｗ、９２Ｅｔ／０８Ｗ、及び９０Ｅｔ／１０Ｗ「試験混合物」を作製した。１００Ｅｔ／００Ｗ試験混合物を除いて、すべてのステビア出発材料は溶液になった。各試験混合物を８０℃にて１時間還流した。次いで、各試験混合物を、室温にて９６時間放置し、次いで、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバーフィルター（細孔サイズ１．６μｍ）で濾過した。各試験混合物中の固体（「主要保持物」）を集め、各主要保持物を、無水エタノール１６ｍｌと混合し、室温にて１５分間撹拌（スターバー）した（「撹拌洗浄」）。実施例２の第一還流及び９６時間放置時間後に元の固体の２０％（すなわち、１グラム）が溶液中に残っていると仮定し、したがって、試験混合物の１：４質量対体積比を維持するため、各撹拌洗浄についてＥｔＯＨ溶媒１６ｍｌを使用した。撹拌した後、各試験混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバーフィルターで濾過し、固体（「撹拌洗浄保持物」）を集め、次いで、撹拌洗浄保持物が一定重量を維持するまで送風オーブン中で８０℃にて乾燥した。各々の乾燥した撹拌洗浄保持物を秤量し、０．１ｇ試料を、前述のＨＰＬＣ法を用いてレバウジオシドＡ含有量について分析した。
【０１０２】
結果：
表３は、ＲＡ８９．９５ステビア出発材料を使用する単一ＥｔＯＨ還流及び撹拌洗浄後の最終固体（乾燥した撹拌洗浄保持物）重量、レバウジオシドＡ回収率、及び純度を示している。
【０１０３】
実施例２の方法を、ＲＡ８９．９５ステビア出発材料の代わりにＲＡ８１．６７ステビア出発材料を用い、他の条件を一定にして繰り返した。結果を、表４に示す。
【０１０４】
表４は、ＲＡ８１．６７ステビア出発材料を使用する単一ＥｔＯＨ還流及び撹拌洗浄後の最終固体（撹拌洗浄段階からの乾燥保持物）重量、レバウジオシドＡ回収率、及びＲｅｂ Ａ純度を示している。表３から分かるように、高品質ステビア出発材料（ＲＡ９０）については、単一ＥｔＯＨ還流と、続く無水エタノール中の短い洗浄は、１００％純粋Ｒｅｂ Ａ最終製品を得るのに十分である。高品質ステビア出発材料では、第二ＥｔＯＨ還流及び無水エタノール中の還流は必要ない。無水エタノール中の１５分洗浄で十分である。
【０１０５】
しかしながら、約１０％低いＲｅｂ Ａ純度ステビア出発材料（すなわち、ＲＡ８０）での同一方法論（１つのＥｔＯＨ還流、１つの撹拌洗浄）では、レバウジオシドＡ含有量が９６．２４％を超える最終製品をもたらさない。さらに、ＲＡ８０ステビア出発材料を使用する収率は、約１０％低い（表４）。したがって、低品質ステビア出発材料については、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造するために追加還流段階を用いることが必要である。
【０１０６】
（実施例３）
実施例３。撹拌洗浄段階なしの１つの還流段階。
【０１０７】
実施例３は、最終製品のレバウジオシドＡ純度に対する撹拌洗浄段階を省略する影響を明らかにする。
【０１０８】
実施例３では、２つのＲＡ８９．９５ステビア出発材料の５グラム試料を、それぞれ２つの１００ｍｌガラス丸底フラスコに入れ、各々を、９２Ｅｔ／０８Ｗ試験溶媒２０ｍｌと混合し、試験混合物を作製した（この実験は、出発材料アッセイがまだ完了していない間に行った）。各試験混合物を８０℃にて１時間還流した。両試験混合物を、室温にて９６時間放置し、次いで、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバーフィルター（細孔サイズ１．６μｍ）で濾過した。各試験混合物の固体（「還流保持物」）を集めた。一方の還流保持物を、送風オーブン中で８０℃にて乾燥し（「非撹拌保持物」）、もう一方の還流保持物を、１００％エタノール１６ｍｌと混合し、室温にて１５分間撹拌（スターバー）し、次いでＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバーフィルターで濾過し、固体（「撹拌保持物」）を集めた。非撹拌保持物及び撹拌保持物を、保持物が一定重量を維持するまで送風オーブン中で８０℃にて乾燥した。次いで、両保持物からの０．１ｇ試料を、前述のＨＰＬＣ法を用いてレバウジオシドＡ含有量について分析した。
【０１０９】
結果：
乾燥した非撹拌保持物は、９６．３２％レバウジオシドＡを含有していた。乾燥した撹拌保持物は、１００％レバウジオシドＡを含有していた。したがって、単一ＥｔＯＨ還流に加えて、無水アルコール中の１５分撹拌洗浄ステップは、ＲＡ９０ステビア出発材料を使用して最終製品の望ましい９９＋％Ｒｅｂ Ａ純度を得るのに必要である。
【０１１０】
（実施例４）
実施例４。実験室プロセスの撹拌洗浄段階と並行した工業的プロセスのエタノールパージ及び乾燥段階付きの２つの還流段階。
【０１１１】
実施例４は、高品質ステビア出発材料を使用すると、無水エタノール中の１５分撹拌洗浄が、望ましい溶解度の９９＋％Ｒｅｂ Ａ最終製品を得るのに十分であることを明らかにする。実施例４では、ＲＡ８９．９５ステビア出発材料を、本発明の工業的実施形態の２つの還流段階により処理し、工業的プロセスの最終製品の試料を、本発明の実験室実施形態の撹拌洗浄段階における出発材料として使用した。具体的には、ＲＡ９０ステビア出発材料１００キログラムを、９０Ｅｔ／１０Ｗ溶媒４００リットルと混合し（この実験は、出発材料アッセイがまだ完了していない間に行った）、８０℃にて１時間還流し、次いで冷却し（タンクジャケット内の冷水）、混合物温度を４℃〜２０℃に維持しながら最低限２時間放置した。混合物を遠心デカンターにより濾過し、保持物を９０Ｅｔ／１０Ｗ溶媒４００リットルに加え、８０℃にて１時間還流した。第二還流からの混合物を遠心デカンターにより濾過した。第二還流混合物を濾過する保持物を、混合物の体積が保持物の質量の約２倍になるまで水と混合した（例えば、総混合物体積７００リットル中に保持物３５０ｋｇ）。水中の混合物を８０℃まで約１時間加熱し、混合物からすべての残留エタノールをパージし、次いで、混合物を噴霧乾燥した。噴霧乾燥する前に無水エタノール中で還流しなかった。噴霧乾燥製品を秤量し、０．１ｇ試料を、前述のＨＰＬＣ法を用いてレバウジオシドＡ含有量について分析した。噴霧乾燥材料５グラムを、１００ｍｌ丸底フラスコ中で無水エタノール２０ｍｌと混合し、８０℃にて１時間還流し（「還流試料」）、次いで、室温まで冷却させた。噴霧乾燥材料の第二５グラム試料を、無水エタノール２０ｍｌと混合し、室温にて１５分間撹拌した（「撹拌試料」）。両試料を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスファイバーフィルター（細孔サイズ１．６μｍ）で濾過し、両試料の保持固体を、固体が一定重量を維持するまで送風オーブン中で８０℃にて乾燥した。還流試料及び撹拌試料の各々１グラムを１５ｍｌガラス遠心管に入れた。各管に０．１ｍｌずつ水を加え、混合物を十分に振盪して最大可溶化を保証した。溶液中に観察可能な懸濁固体が全くないことで分かるような完全な可溶化が達成されるまで、増分量の水を加えた。各試料において完全な可溶化が起きた最終体積を記録した。
【０１１２】
結果：
表５は、本発明の工業的実施形態のエタノールパージ及び乾燥段階付きの２つの還流を用いて達成されるレバウジオシドＡ純度及び固体収率を示している。
【０１１３】
表６は、還流試料及び撹拌試料の水への溶解度を示している。
【０１１４】
本発明の工業的実施形態のエタノールパージ及び乾燥段階と並行した２つの還流段階を用いることは、９９．６％Ｒｅｂ Ａ純度製品を製造した。しかしながら、室温におけるその製品の水への溶解度は、２％に過ぎなかった。この溶解度は、一部の商業的応用に有用なことがある。無水エタノール中の１時間還流によって得られる溶解度増加（４０％、室温にて）は、全てではないが、大部分の商業的応用の溶解度要件を満たしているであろう。しかしながら、１時間還流を室温における無水エタノール中の１５分撹拌洗浄に置き換えることは、濃縮物を含む大部分の商業的必要性に対して許容できる３３％溶解度（室温にて）の製品をもたらすことが分かった。
【０１１５】
（実施例５）
実施例５。放置時間を短縮し冷却しない１つの還流段階及び撹拌洗浄段階。
【０１１６】
実施例５は、レバウジオシドＡの純度及び収率に対する放置時間の短縮及び冷却の省略の影響を明らかにする。
【０１１７】
実施例５では、ＲＡ８１．５８ステビア出発材料の５つの５グラム試料及びＲＡ８９．９５ステビア出発材料の５つの５グラム試料を、それぞれ、２組の５つの１００ｍｌ丸底ガラスフラスコに入れ、各試料を、９２Ｅｔ／０８Ｗ溶媒２０ｍｌと混合した（各々、「試験混合物」）。試験混合物を８０℃にて１時間還流した。還流後、所与の組における５つの試験混合物を、室温にて０、１８、２４、３６、及び１６０時間放置し（撹拌することなく）、１放置時間当たり１組につき１つの試験混合物とした。各試験混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバーフィルター（細孔サイズ１．６μｍ）で濾過し、各保持物を集め、無水エタノール１６ｍｌと混合し（各々、「試験試料」）、室温にて１５分間撹拌した（スターバー）。当該放置時間後、所与の試験試料を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバーフィルターで濾過し、保持物を集め、固体が一定重量を維持するまで８０℃にて乾燥した。次いで、各試料を秤量し、０．１ｇ試料を、前述のＨＰＬＣ法を用いてＲｅｂ Ａ含有量について分析した。
【０１１８】
結果：
表７は、様々な放置時間後の最終製品の収率及びレバウジオシドＡ純度を示している。
【０１１９】
ＲＡ８１．５８純度ステビア出発材料については、１８時間の最低限の放置時間は、最高固体収率を達成させた。ＲＡ８９．９５純度ステビア出発材料については、ゼロ放置時間は、９９＋純度Ｒｅｂ Ａ最終製品を製造した。低ＲＡ純度ステビア出発材料については、還流段階後の放置時間を増やすことは、最終製品の収率を増加させる（低品質ステビア出発材料を使用する場合、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａを製造するには、通常、複数の還流が必要とされる）。
【０１２０】
（実施例６）
実施例６。エタノールパージ及び乾燥段階付きの１つの還流段階及び２つの撹拌洗浄段階、工業的規模。
【０１２１】
実施例６は、噴霧乾燥付きの単一還流及び２つの撹拌洗浄が、低品質ステビア出発材料を使用する場合に、工業的規模で許容できる水溶性の９９＋％純度レバウジオシドＡを製造できることを明らかにする。
【０１２２】
実施例６では、ＲＡ８３．１４ステビア出発材料５００キログラムを、９２Ｅｔ／０８ＷＥｔＯＨ溶媒２０００リットルと混合し、７９℃にて１時間還流し、次いで、２９℃まで冷却（タンクジャケット内の冷水）する（還流の終了からデカントし始めるまでの経過時間は、７時間１５分）。冷却した還流混合物を、遠心デカンターにより濾過し、保持物に、室温（２９℃）にてエタノール１，６００リットル（４００ｋｇの保持物質量、１：４質量対体積比）を加え、１５分間撹拌した（撹拌洗浄段階）。撹拌洗浄混合物を、遠心デカンターにより濾過し、次いで、撹拌洗浄段階を繰り返し、すなわち、遠心デカンターからの保持物に、室温（２９℃）にてエタノール１，６００リットル（１：４質量対体積比）を加え、１５分間撹拌した（第二撹拌洗浄段階）。第二撹拌洗浄混合物を、遠心デカンターにより濾過し、保持物を、混合物の体積が保持物の質量の約２倍になるまで水と混合した（例えば、総混合物体積１，６００リットル中に保持物８００ｋｇ）。エタノールバージ及び乾燥ステップでは、水性混合物を８０℃まで加熱し、その温度にて約１０時間維持して混合物から全ての残留エタノールをパージし、次いで、混合物を噴霧乾燥した。噴霧乾燥機の限られた処理能力のため、噴霧乾燥プロセスは６．５時間を要した。ステビア出発材料５００ｋｇから、乾燥重量で、固体３０２．３ｋｇ、すなわちステビア出発材料の６０．４６％が回収された。ステビア出発材料５００ｋｇは、ＲＡ８３．１４であり、すなわち、Ｒｅｂ Ａ４１５．７ｋｇを含有していた。固体３０２．３ｋｇの回収は、ステビア出発材料中のＲｅｂ Ａ７２．３％の回収率に相当する。最終製品は、９９．４％純度Ｒｅｂ Ａであり、前述のＨＰＬＣ法を用いて決定された。溶解度は、５９．０％（２５℃にて）であった。
【０１２３】
（実施例７）
実施例７。純度及び収率に対する固体重量の溶媒体積に対する様々な比の影響。
【０１２４】
実施例７は、任意選択の質量対溶媒比分析を示す。
【０１２５】
８２．３％レバウジオシドＡを含有するオーブン乾燥ステビア出発材料の１０グラム試料を、５つの１００ｍｌガラス丸底フラスコの各々に入れ、各フラスコに、それぞれ、９２Ｅｔ／０８Ｗ選択ＥｔＯＨ溶媒２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、及び６０ｍｌを加え、１：２〜１：６の質量対溶媒比とした。
【０１２６】
磁気スターバーを各フラスコに加え、混合物を、撹拌しながら８０℃にて１時間還流した。次いで、試料を、氷上に１時間置くことにより冷却した。次いで、各混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスファイバーフィルターで濾過した。次いで、湿潤固体保持物を、１００％無水エタノール４０ｍｌを加えて室温にて１５分間撹拌することにより洗浄した。次いで、混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスファイバーフィルターで濾過し、湿潤固体保持物を、送風オーブン中で８０℃にて乾燥した。次いで、得られた乾燥固体を秤量し、前述のように、ＨＰＬＣ法によりレバウジオシドＡ含有量について分析した。
【０１２７】
２組の、各々が、１フラスコ当たり、ＲＡ８２．３ステビア出発材料１０ｇ及びそれぞれの体積の前述の９２Ｅｔ／０８Ｗ溶媒を含む５つの１００ｍｌガラス丸底フラスコを、同様に混合し、８０℃にて１時間還流し、冷却し、次いで、濾過した。湿潤固体保持物を、組になった５つの１００ｍｌガラス丸底フラスコに戻し、フラスコ当たりそれぞれの体積の９２Ｅｔ／０８Ｗ溶媒を加え、前述のように混合した。混合物を、８０℃にて１時間還流し、冷却し、次いで、濾過し、次いで、無水エタノール４０ｍｌ中で洗浄した。次いで、各洗浄混合物を濾過し、得られた湿潤固体保持物を、送風オーブン中で８０℃にて乾燥した。乾燥固体を秤量し、レバウジオシドＡ含有量について前述のＨＰＬＣ法により分析した。
【０１２８】
以下の表７は、１つの還流段階及び撹拌洗浄段階を用いて処理された各試料について得られた収率及び純度データを示している。
【０１２９】
【表１】
2008516990.tif 000003
【０１３０】
表８は、２つの還流段階及び撹拌洗浄段階を用いて処理された各試料について得られた収率及び純度データを示している。
【０１３１】
【表２】
2008516990.tif 000004
【０１３２】
前述の実験手順中、注目すべきことに、１：４未満の質量対溶媒比を使用することは、還流後にフラスコ中の混合物の固化をもたらした。したがって、工業的規模で１：４未満の比を使用することは、還流後の混合タンクからの混合物の移動を著しく妨げるであろう。上の表７から分かるように、単一還流及び撹拌洗浄は、一般的に、レバウジオシドＡ純度を高めるが、１：６質量対溶媒比（ｍ／ｖ）でさえ、この特定のＲＡ８２．３ステビア出発材料を使用して９９％＋純度Ｒｅｂ Ａの最終製品を得るには十分ではない。さらに、単一還流及び撹拌洗浄により、固体収率は、質量対溶媒比が３倍に増加すると７．１％のみ低下した。Ｒｅｂ Ａ収率は、固体質量の還流溶媒に対する比の増加に伴って直線的に変化するようには見えなかった。このことは、還流溶媒の量を増加させることが、試料を単に希釈するのではなく、又は還流後に溶液中に残っている固体の量を直接比例して増加させるのではなく、Ｒｅｂ Ａの優先的析出を可能にする還流中の化学的相互作用が、実施例１及び２に示すように、選択ＥｔＯＨ溶媒における水のエタノールに対する比とより直接関係していることを示唆している。
【０１３３】
表８は、ＲＡ８２．３ステビア出発材料、２つの還流、及び撹拌洗浄を使用して得られる結果を示している。最終製品におけるレバウジオシドＡ純度は、１：４以上の比を使用した場合に９９％を超えたに過ぎなかった。固体回収率は、質量対溶媒比（ｍ／ｖ）を３倍に増加させると１３．４％低下した。収率のこの低下は、単一還流及び単一撹拌洗浄で見られた低下の約２倍であり、追加還流段階の使用を反映している。さらにレバウジオシドＡ収率は、使用された質量対溶媒比の範囲（１：２〜１：６（ｍ／ｖ））で８．４％低下した。特に、１：６質量対溶媒比は、ＲＡ８２．３ステビア出発材料から１００％純粋レバウジオシドＡ最終製品を与えた。
【０１３４】
実施例７におけるデータに基づき、最低限１：４の質量対溶媒（ｍ／ｖ）比は、９９＋％Ｒｅｂ Ａの標的純度にとって好ましい。より高い質量対溶媒比を使用できるが、消費される合計溶媒、並びに加熱及び冷却用のより大きな混合タンクに関するコスト増加は、望ましい標的純度とのバランスを保っていなければならない。また、実施例７は、この特定の低品質ステビア出発材料を使用して９９＋％純度Ｒｅｂ Ａ製品を得るには、２つの還流段階並びにエタノールパージ及び乾燥段階が必要であったことを示している。
【０１３５】
ＲＡ８２．３ステビア出発材料を使用する実施例７において必要とされた２つの還流段階及び単一撹拌洗浄段階に比べ、ＲＡ８３．１４ステビア出発材料、単一還流、及び２つの撹拌洗浄を用いて９９＋％純度Ｒｅｂ Ａ最終製品を得る実施例６における経験は、プロセス最適化（通常、処理コストを最小限に抑えながら９９＋％純度最終製品にてＲｅｂ Ａ収率を最大限に高めること）における任意選択の質量対溶媒比アッセイ付きのＥｔＯＨ処方段階の重要性を説明している。
【０１３６】
（実施例８）
実施例８は、質量対溶媒比を変化させる２つの撹拌洗浄段階と併せ、１つの還流段階を用いてＲＡ８２．３ステビア出発材料（実施例７において使用したのと同じバッチ）を処理することを示す。
【０１３７】
単一還流段階後の２つの撹拌洗浄段階における溶媒比を変化させる影響を決定するため、ＲＡ８２．３ステビア出発材料１０グラム試料を、４つの１００ｍｌ丸底フラスコ（磁気スターバーを加えた）の各々に入れた。９２Ｅｔ／０８Ｗ４０ｍｌを、４つのフラスコの各フラスコに加え、混合物を撹拌して固体を溶かした。各混合物を、撹拌しながら８０℃にて１時間還流した。還流後、各混合物を、氷上に１時間置き、次いで、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバー濾紙で濾過した。各混合物からの湿潤固体保持物を、１００％エタノール、それぞれ３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、又は６０ｍｌと共に１００ｍｌ丸底フラスコ（磁気スターバーを加えた）に入れ、室温にて１５分間磁気スターラーで撹拌した。次いで、各混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバー濾紙で濾過し、湿潤固体保持物の４つの試料を作製した。各試料の小試料（約０．１グラム）を、一定重量に達するまで送風オーブン中で８０℃にて乾燥し、次いで、前述のＨＰＬＣ法を用いてレバウジオシドＡ含有量について分析した。各混合物からの残りの湿潤固体保持物を、１００％エタノール、それぞれ３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、又は６０ｍｌと共に１００ｍｌ丸底フラスコ（磁気スターバーを加えた）に入れ、室温にて１５分間磁気スターラーで撹拌した。最後に、各混合物を濾過し、各試料の湿潤固体保持物を、一定重量に達するまで８０℃にて乾燥した。乾燥固体の各試料を秤量し、乾燥固体の試料を、前述のＨＰＬＣ法を用いてレバウジオシドＡ含有量について分析した。
【０１３８】
【表３】
2008516990.tif 000005
【０１３９】
表９におけるデータに基づき、第二洗浄ステップを含めることは、最終レバウジオシドＡ純度を２．３〜７．７％上昇させ、最大の純度増加は、追加１：４（質量対溶媒比）洗浄で見られた。しかしながら、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａの標的製品は、撹拌洗浄段階における質量対溶媒比に関係なく、単一還流及び２つの撹拌洗浄を用いて得られなかった。使用された比に関係なく、第二撹拌洗浄段階後の最終純度は、１．９８％変化したに過ぎなかった。このことは、撹拌洗浄段階において質量対溶媒比を単に上げることは、Ｒｅｂ Ａ純度を上げることに対して有意に影響を与えないことを示唆している。同様に、収率は、撹拌洗浄段階における質量対溶媒比を増加させることにより有意には影響されなかった。
【０１４０】
（実施例９）
実施例９は、最終撹拌洗浄段階（１：４質量対溶媒比）と併せ、質量対溶媒比を変化させる２つの還流段階を使用してＲＡ８２．３ステビア出発材料（実施例７において使用したのと同じバッチ）を処理することを示す。
【０１４１】
２つの還流段階における溶媒比を変化させる影響を決定するため、ＲＡ８２．３ステビア出発材料１０グラム試料を、１１の１００ｍｌ丸底フラスコ（磁気スターバーを加えた）の各々に入れた。１１のフラスコのうちの３つに、それぞれ、９２Ｅｔ／０８Ｗ溶媒４０ｍｌをフラスコに加え（まとめて、「４ｘ／シリーズ」）、混合物を撹拌して固体を溶かした。１１のフラスコのうちの４つに、それぞれ、９２Ｅｔ／０８Ｗ溶媒５０ｍｌをフラスコに加え（まとめて、「５ｘ／シリーズ」）、混合物を撹拌して固体を溶かした。１１のフラスコのうちの残りの４つに、それぞれ、９２Ｅｔ／０８Ｗ溶媒６０ｍｌをフラスコに加え（まとめて、「６ｘ／シリーズ」）、混合物を撹拌して固体を溶かした。各混合物を、撹拌しながら８０℃にて１時間還流した。還流後、各混合物を、氷上に１時間置き、次いで、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバー濾紙で濾過した。４ｘ／シリーズの３試料における湿潤固体保持物を、９２Ｅｔ／０８Ｗ溶媒、それぞれ４０ｍｌ、５０ｍｌ、又は６０ｍｌと混合し、試料を、撹拌しながら８０℃にてもう一度還流した。５ｘ／シリーズの４試料における湿潤固体保持物を、９２Ｅｔ／０８Ｗ溶媒、それぞれ３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、又は６０ｍｌと混合し、試料を、撹拌しながら８０℃にてもう一度還流した。６ｘ／シリーズの４試料における湿潤固体保持物を、９２Ｅｔ／０８Ｗ溶媒、それぞれ３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、又は６０ｍｌと混合し、試料を、撹拌しながら８０℃にてもう一度還流した。各混合物を、氷上に１時間置き、次いで、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバー濾紙で濾過した。最後に、各試料の湿潤固体保持物を無水エタノール４０ｍｌと混合し、室温にて１５分間撹拌し、次いで、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバー濾紙で濾過した。次いで、各試料からの湿潤固体保持物を、送風オーブン中で８０℃にて一定重量まで乾燥した。次いで、すべての試料を秤量し、前述のＨＰＬＣ法を用いてレバウジオシドＡについて分析した。
【０１４２】
【表４】
2008516990.tif 000006
【０１４３】
表１０におけるデータは、２つの還流ステップの各々において質量対溶媒比を変化させることが、純度に対して大きな影響を与えず、事実上すべての最終製品が、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａの望ましい標的純度に達したことを示している。しかしながら、固体収率を考慮した場合、レバウジオシドＡ回収率は、比を変化させることにより影響を受けた。質量対溶媒比１：４と１：４、及び１：５と１：４を用いて処理された試料は、９９＋％純度Ｒｅｂ Ａの標的純度でレバウジオシドＡの最高回収率を与えた。したがって、最高収率及び標的純度を達成する最も経済的な手段は、１：４の質量対溶媒比による第一還流段階と、続く１：４の質量対溶媒比による第二還流段階を用いることによる手段である。
【０１４４】
表及びグラフ  代理人整理番号：ＳＡＦ−ＲＥＢＡ−０３Ｐ  Ｈｉ Ｙｉｅｌｄ Ｐｕｒｅ Ｒｅｂ Ａ  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．
【０１４５】
【表５】
2008516990.tif 000007
【０１４６】
【表６】
2008516990.tif 000008
【０１４７】
表及びグラフ  代理人整理番号：ＳＡＦ−ＲＥＢＡ−０３Ｐ  Ｈｉ Ｙｉｅｌｄ Ｐｕｒｅ Ｒｅｂ Ａ  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．
【０１４８】
【表７】
2008516990.tif 000009
【０１４９】
【表８】
2008516990.tif 000010
【０１５０】
表及びグラフ  代理人整理番号：ＳＡＦ−ＲＥＢＡ−０３Ｐ  Ｈｉ Ｙｉｅｌｄ Ｐｕｒｅ Ｒｅｂ Ａ  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．
【０１５１】
【表９】
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【０１５２】
【表１０】
2008516990.tif 000012
【０１５３】
【表１１】
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【０１５４】
表及びグラフ  代理人整理番号：ＳＡＦ−ＲＥＢＡ−０３Ｐ  Ｈｉ Ｙｉｅｌｄ Ｐｕｒｅ Ｒｅｂ Ａ  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．
【０１５５】
【表１２】
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【０１５６】
【表１３】
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【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】本発明の実験室実施形態の全体図を示す図である。
【図２】実験室プロセスの還流段階におけるステップを示す図である。
【図３】実験室プロセスの撹拌洗浄段階におけるステップを示す図である。
【図４】出発材料アッセイの前半を示す図である。
【図５】出発材料アッセイの後半を示す図である。
【図６】追加還流段階におけるステップを示す図である。
【図７】本発明の工業的実施形態において使用される機器の全体図を示す図である。
【図８】工業的プロセスの還流段階におけるステップを示す図である。
【図９】工業的プロセスの撹拌洗浄段階におけるステップを示す図である。
【図１０】工業的プロセスのエタノールパージ及び乾燥段階におけるステップを示す図である。
【図１１】質量対体積比アッセイの前半を示す図である。
【図１２】質量対体積比アッセイの後半を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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