(57)【要約】本発明は、ＰＥＧ部分がヒトＩＦＮα−１ｂ結合対のＣｙｓ８６に共有結合している、ＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体を提供する。炎症性疾患、感染および癌を処置するための、このようなＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体を含有する薬学的組成物、ならびにこのようなＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体を用いる方法もまた、提供される。本発明はさらに、インターフェロン分子中の遊離のシステイン残基へのＰＥＧ部分の結合体化による、インターフェロンの改変のための方法に関する。
2008509889.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターフェロンα−１ｂのＣｙｓ８６に共有結合する部分を有する、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項２】
請求項１に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体であって、前記インターフェロンα−１ｂは、ヒト細胞もしくはヒト組織から単離されている、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項３】
請求項１に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体であって、前記インターフェロンα−１ｂは、組換えタンパク質である、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項４】
請求項３に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体であって、前記インターフェロンα−１ｂは、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞、酵母細胞ならびにトランスジェニック動物からなる群より選択される宿主において発現される、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項５】
請求項２または請求項３に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体であって、前記インターフェロンα−１ｂは、配列番号２に記載のアミノ酸を含む、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項６】
請求項２または請求項３に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体であって、前記インターフェロンα−１ｂは、配列番号２に記載のアミノ酸の、ホモログ、オルソログ、改変体、アナログ、誘導体、生物学的に活性であるフラグメント、薬学的に活性であるフラグメント、もしくは変異を含む、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項７】
請求項２または請求項３に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体であって、前記インターフェロンα−１ｂは、配列番号１に記載のＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項８】
請求項１に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体であって、前記ポリオール部分は、ポリエチレングリコール部分である、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項９】
請求項１に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体であって、前記ポリオール部分は、一本鎖ポリオール部分である、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体であって、前記ポリオール部分は、分枝鎖ポリオール部分である、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体であって、前記ポリオール部分は、ポリアルキレングリコール部分である、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体であって、前記ポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体は、天然のヒトインターフェロンα−１ｂに対して同等であるかまたはより高いインビボインターフェロン−α活性を有する、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体であって、前記ポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体は、均質な分子量を有する、ポリオール−インターフェロン−α結合体。
【請求項１４】
ヒトインターフェロンα−１ｂのＣｙｓ８６に共有結合するポリオール部分を有するポリオール−インターフェロン−α結合体、および薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または助剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の薬学的組成物であって、前記ポリオール部分は、ポリエチレングリコール部分である、薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１４に記載の薬学的組成物であって、前記ポリオール部分は、一本鎖ポリオール部分である、薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項１４に記載の薬学的組成物であって、前記ポリオール部分は、分枝鎖ポリオール部分である、薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１４に記載の薬学的組成物であって、前記ポリオール部分は、ポリアルキレングリコール部分である、薬学的組成物。
【請求項１９】
ポリオール−インターフェロン結合体を産生する方法であって、該方法は、以下の工程：
インターフェロンを提供する工程であって、該インターフェロンは、１つの遊離システインを含む、工程；
マレイミドポリオールを提供する工程；および
該インターフェロンを、該マレイミドポリオールに接触させる工程であって、ここで、該マレイミドポリオールは、前記遊離のシステインと共有チオエーテル結合を形成し、それによってポリオール−インターフェロン結合体を産生する工程
を、包含する方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記インターフェロンは、ヒトαインターフェロンである、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記αインターフェロンは、組換えヒトインターフェロンα−１ｂである、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記インターフェロンα−１ｂは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法であって、前記インターフェロンα−１ｂは、配列番号２に記載のアミノ酸の、ホモログ、オルソログ、改変体、アナログ、誘導体、生物学的に活性であるフラグメント、薬学的に活性であるフラグメント、もしくは変異を含む、方法。
【請求項２４】
請求項１９に記載の方法であって、前記インターフェロンは、天然に存在するインターフェロン、遺伝子操作されたインターフェロン、およびキメラインターフェロンからなる群より選択される、方法。
【請求項２５】
請求項１９に記載の方法であって、システイン残基が、１つの遊離のチオール基を含む、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記インターフェロンは、ジスルフィド結合したシステイン残基をさらに含む、方法。
【請求項２７】
請求項２１に記載の方法であって、ヒトインターフェロンα−１ｂのＣｙｓ８６は、１つの遊離のチオール基を含む、方法。
【請求項２８】
インターフェロン−αによって媒介されるプロセスを調節する方法であって、有効量の請求項１に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、インターフェロン−αによって媒介される前記プロセスは、炎症、ウイルス感染、細菌感染もしくは癌を含む、方法。
【請求項３０】
インターフェロン−α−応答性状態またはインターフェロン−α−応答性疾患を有する患者を処置する方法であって、請求項１９に記載の方法に従って調製された、有効量の請求項１に記載のポリオール−インターフェロン−α結合体を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記患者は、炎症性障害、ウイルス感染、細菌感染または癌に罹患している、方法。
【請求項３２】
請求項２９または請求項３１に記載の方法であって、前記ウイルス感染は、Ｃ型肝炎感染、Ｂ型肝炎感染もしくはＨＩＶ感染を含む、方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、前記炎症性障害は、多発性硬化症、関節炎、ぜん息、嚢胞性線維症、または間質性肺疾患である、方法。
【請求項３４】
請求項２９または請求項３１に記載の方法であって、前記癌は、骨髄腫、リンパ腫、肝臓癌、乳癌、メラノーマおよびヘアリーセル白血病より選択される、方法。
【請求項３５】
ポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体を精製するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体と疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂とを接触させる工程であって、ここで、該ポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体は、該クロマトグラフィー樹脂に結合する、工程；
（ｂ）該ポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体を、該疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程；
（ｃ）溶出された該ポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体を、サイズ排除クロマトグラフィーカラムに供する工程；ならびに
（ｄ）精製されたポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体を、該サイズ排除クロマトグラフィーカラムから収集する工程であって、該工程により、該ポリオール−インターフェロンα−１ｂを精製する工程
を、包含する方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記工程（ｃ）の前記サイズ排除クロマトグラフィーカラムに供する前に、前記工程（ｂ）の溶出された前記ポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体を濃縮する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、前記濃縮工程は、限外濾過およびダイアフィルトレーションを包含する、方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法であって、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は、ブチルアガロース樹脂である、方法。
【請求項３９】
請求項３５に記載の方法であって、前記サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、架橋アガロース、架橋デキストランまたはこれらの混合物を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願第６０／５８４，５０４号（２００４年６月３０日出願）および米国仮特許出願第６０／６８９，１５５号（２００５年６月９日出願）の優先権を主張し、これらの米国出願は、本明細書中でその全体が任意の目的のために参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、血清半減期、薬物速度論プロフィール、インビボ生物学的活性および安定性を上昇させ、かつこのタンパク質に対するインビボの免疫反応を低減させるための、ヒトインターフェロンの改変に関する。より具体的には、本発明は、ヒトインターフェロンα−１ｂの遊離のチオール基（Ｃｙｓ８６）へのモノプロピレングリコールの部位特異的共有結合に関する。本発明はまた、インターフェロンのシステイン特異的改変のためのプロセスに関し、そして、細菌感染、ウイルス感染、自己免疫疾患、自己免疫状態、炎症性プロセスおよびその結果としての疾患もしくは状態、ならびに癌の、治療、処置、予防、緩和および／または診断における、上記プロセスの使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
（インターフェロン）
インターフェロンは、例えばウイルス感染および他の抗原性刺激により、ほとんどの有核細胞によって、産生され、そして分泌される、天然に存在する小タンパク質および糖タンパク質のファミリーである。インターフェロンは、種々の細胞型において広い範囲の抗ウイルス活性、抗増殖活性および免疫調節活性を示し、そして多くの疾患を処置するために使用されている。これらの疾患としては、ウイルス感染（例えば、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、ＨＩＶ）、炎症性障害および炎症性疾患（例えば、多発性硬化症、関節炎、ぜん息、嚢胞性線維症、間質性肺疾患）、ならびに癌（例えば、骨髄腫、リンパ腫、肝臓癌、乳癌、メラノーマ、ヘアリーセル白血病）が挙げられ、また、他の治療分野にも適用されている。インターフェロンは、細胞をウイルス感染に対して抵抗性にし、そして細胞上で広範な種々の作用を示す。インターフェロンは、細胞表面上の特定の膜レセプターに結合することにより、その細胞性活性を発揮する。一旦細胞膜に結合すると、インターフェロンは、一連の複雑な細胞内事象を開始する。これらの事象としては、酵素の誘導、細胞増殖の抑制、免疫調節活性（例えば、マクロファージの食作用活性の増強および標的細胞についてのリンパ球の特異的細胞傷害性の増強）ならびにウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害が挙げられる。
【０００４】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、その化学的特性、免疫学的特性および生物学的特性に従って、少なくとも４つの群に分類されている：α（白血球）、β（線維芽細胞）、γおよびω。インターフェロンは、正常細胞および異常細胞の両方において、種々の細胞機能（ＤＮＡ複製ならびにＲＮＡ合成およびタンパク質合成が挙げられる）に影響を及ぼすことが公知である。従って、インターフェロンの細胞傷害性作用は、腫瘍もしくはウイルス感染細胞に制限されず、正常な、健康な細胞においても発揮される。結果として、インターフェロン治療の間（特に、高用量が必要とされる場合）に、望ましくない副作用が生じる。インターフェロンの投与は、骨髄抑制をもたらし得、骨髄抑制は、赤血球レベル、白血球レベルおよび血小板レベルの低下をもたらす。より高用量のインターフェロンは、一般に、インフルエンザ様症状（例えば、発熱、疲労、頭痛および悪寒）、胃腸障害（例えば、拒食症、悪心および下痢）、めまい感ならびに咳を引き起こす。
【０００５】
（αインターフェロン）
ＨｕＩＦＮ−αは、約２０の遺伝子からなる多重遺伝子ファミリーによってコードされており、これらの遺伝子は、約８０〜８５％のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質をコードする。ＨｕＩＦＮ−αポリペプチドは、多くのヒト細胞株およびヒト白血球によって、ウイルスもしくは二本鎖ＲＮＡへの曝露後に産生されるか、または形質転換した白血球細胞株（例えば、リンパ芽球細胞株）において産生される。
【０００６】
１９８６年の始め、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、慢性肝炎、慢性骨髄性白血病およびヘアリーセル白血病の処置のために、ＩＮＦα−２ｂおよびＩＮＦα−２ａを含む多くのインターフェロン薬物を認可した。
【０００７】
（インターフェロンα−１ｂ）
インターフェロンα−１ｂの一次配列は、Ｍａｎｔｅｉら（非特許文献１）およびＮａｇａｔａら（非特許文献２）（これらの内容は、その全体が本明細書によって参考として援用される）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２４０１３．１；ＧＩ：１３１２８９４９；およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０７６９１８．１；ＧＩ：１３１２８９５０）によって最初に発表された。インターフェロンα−１ｂは、１６６個のアミノ酸の一本鎖ポリペプチドであると同定されており、これは、インターフェロンα−２ａおよびインターフェロンα−２ｂと８３％の相同性を共有する。インターフェロンα−１ｂは、５つのシステイン残基を、アミノ酸の１位、２９位、８６位、９９位および１３９位に有する。その天然の構造において、インターフェロンα−１ｂは、２対の分子内ジスルフィド結合（Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ９９；Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ１３９）を形成し、Ｃｙｓ８６残基に遊離のチオール基を残す（非特許文献３）。
【０００８】
インターフェロンα−１ｂは、インターフェロンα−２ａおよびインターフェロンα−２ｂと同じ生物学的特性および治療特性を有することが報告されている。これらの特性としては、免疫調節特性、抗ウイルス特性および抗癌特性が挙げられる。ＩＦＮα−１ｂは、治療特性および有害反応を決定するために、中国において何百人もの患者による臨床試験で試験されている。インターフェロンα−１ｂ（Ｓｉｎｏｇｅｎ）は、中国の公衆衛生省によって１９９２年に認可された、最初の組換えタンパク質薬物である。インターフェロンα−１ｂ（Ｓｉｎｏｇｅｎ）は、１０年以上の間、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ウイルス感染および癌を有する、数百万人の患者を処置するために使用されている。
【０００９】
（インターフェロンのペグ化）
インターフェロンは、種々の治療指示のために非経口的に投与され得る。しかし、非経口投与されたタンパク質は、免疫原性であり得、かつ、短い薬物速度論半減期を有し得る。従って、患者において、このタンパク質の治療的に有用な血液レベルを達成することは困難であり得る。これらの問題は、このタンパク質を、ポリエチレングリコールのようなポリマーと結合体化させることによって克服され得る。
【００１０】
不活性な、非毒性の、生分解性のポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）としても知られる）の分子への共有結合は、バイオテクノロジーおよび医薬において、重要な用途を有する。生物学的に活性であるタンパク質および薬学的に活性であるタンパク質のペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）は、薬物速度論を改善し、持続時間を延長し、安全性を改善し（例えば、より低い毒性、免疫原性および抗原性）、効力を増大し、投薬頻度を減少し、薬物溶解性および安定性を改善し、タンパク質分解を減少しそして制御薬物放出を容易にする。
【００１１】
現在使用されている治療用ＰＥＧ−タンパク質結合体としては、以下が挙げられる：重症複合型免疫不全疾患を処置するために使用されるペグ化アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＧＥＮ（登録商標），Ｅｎｚｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；急性リンパ芽球性白血病を処置するために使用されるペグ化Ｌ−アスパラギナーゼ（ＯＮＣＡＰＳＰＡＲ（登録商標），Ｅｎｚｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ならびに、Ｃ型肝炎を処置するために使用されるペグ化インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標），Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）およびペグ化インターフェロンα−２ａ（ＰＥＧＹＳＹＳ，Ｒｏｃｈｅ）。臨床的効力を有するＰＥＧ−タンパク質結合体の概説について、非特許文献４（その全体は本明細書中で参考として援用される）を参照されたい。
【００１２】
タンパク質上に見出される反応基にＰＥＧを結合することは、代表的に、親電子的に活性化されたＰＥＧ誘導体を用いて行われる。例えば、ＰＥＧは、ポリペプチド鎖のリジン残基上のε−アミノ基およびＮ末端上のα−アミンに結合され得る。
【００１３】
一般に、ＰＥＧ結合体は、タンパク質１分子あたり可変の数（０からタンパク質中のアミノ基の数までの範囲である）の結合するＰＥＧ分子を含む集団からなる（「ＰＥＧマー」）か、または、タンパク質１分子あたり可変の部位に結合する１つのＰＥＧ分子を含む（位置的異性体（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒ））。しかし、非特異的ペグ化は、部分的に不活性であるか、または実質的に不活性である結合体をもたらし得る。活性の低下は、タンパク質の活性レセプター結合ドメインを遮蔽することによって生じ得る。例えば、大過剰のメトキシ−ポリエチレングリコリルＮ−スクシンイミジルグルタレート（ｇｌｕｔｅｒａｔｅ）およびメトキシ−ポリエチレングリコリルＮ−スクシンイミジルスクシネートによる組換えＩＦＮ−βおよび組換えＩＬ−２のペグ化は、報告されているように、溶解性の増大をもたらすが、また、活性のレベルの低下および収量の減少をももたらす。
【００１４】
治療用ペグ化インターフェロンα（ＩＦＮα）は、コア（ｃｏｒｅ）ＩＦＮα−２ｂ分子上（非特許文献５）およびコアＩＦＮα−２ａ分子上（非特許文献６、非特許文献７）の特定の部位で一ペグ化（ｍｏｎｏ−ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）されている、位置的異性体の混合物である。インビトロの抗ウイルス活性および抗増殖活性は、ペグ化の部位および結合したＰＥＧの大きさの結果として、変動する（非特許文献８）。
【００１５】
（部位特異的ペグ化）
ポリペプチドのＮ末端のα−アミンは、このＮ末端が活性レセプター結合ドメインに関与しているか否かに依存してペグ化される、１つの部位である。例えば、Ｇ−ＣＳＦのＮ末端のα−アミンは、生物学的活性を維持して一ペグ化される（特許文献１：Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ｏ．Ｂ．ら，１９９８年，「Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」）。インターフェロンα−２ｂのＮ末端Ｃｙｓ１のα−アミンは、一ペグ化されて、ＳＴＡＴトランスロケーションアッセイにおいて、一ペグ化されたＨｉｓ３４、Ｌｙｓ１３４、Ｌｙｓ８３、Ｌｙｓ１３１、Ｌｙｓ１２１、Ｌｙｓ３１と比較して最低の生物学的活性を示す（非特許文献８）。
【００１６】
タンパク質の部位特異的一ペグ化は、望ましい目標であるが、ほとんどのタンパク質は、タンパク質のＮ末端のα−アミンまたはタンパク質の遊離のシステイン残基以外に、１つのＰＥＧポリマーの結合のための天然の特異的部位を有さない。従って、タンパク質のペグ化は、部分的にもしくは完全に不活性である異性体を産生する可能性が高い。
【００１７】
チオール選択的ＰＥＧ誘導体は、部位特異的ペグ化について報告されている。パラピリジルジスルフィド反応基の形態である安定的なチオール保護ＰＥＧ誘導体は、タンパク質パパイン中の遊離のシステイン残基と特異的に結合体化することが示された。パパインとＰＥＧとの間に新規に形成されたジスルフィド結合は、穏やかな還元条件下で切断されて、天然のタンパク質を再産生し得る。チオール反応性ＰＥＧ化剤であるオルトピリジルジスルフィドによる部位特異的ペグ化のプロセスによってＰＥＧ部分がヒトＩＦＮ−βのＣｙｓ１７と共有結合している、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β結合体が、報告されている（特許文献２（ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９１６１）：Ｅｌ  Ｔａｙａｒ，Ｎ．，ら，１９９９年，「Ｐｏｌｙｏｌ−ＩＦＮ−Ｂｅｔａ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」）。
【００１８】
（ＰＥＧ  ＩＦＮ−α結合体）
特許文献３（本明細書中でその全体が参考として援用される）は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α結合体の調製を記載する。この特許において記載されるペグ化反応は、部位特異的ではなく、従って、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α結合体の位置的異性体の混合物が得られた（また、非特許文献９（この全体は、本明細書中で参考として援用される）も参照されたい）。
【特許文献１】米国特許第５，８２４，７８４号明細書
【特許文献２】国際公開第９９／５５３７７号パンフレット
【特許文献３】欧州特許出願公開第５９３８６８号明細書
【非特許文献１】Ｍａｎｔｅｉら，Ｇｅｎｅ，１９８０年，第１０巻，ｐ．１−１０
【非特許文献２】Ｎａｇａｔａら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８０年，第２８７巻，ｐ．４０１−４０８
【非特許文献３】Ｗｅｉｓｓｍａｎｎら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−α  ｇｅｎｅｓ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．，１９８２年，第２９９巻，ｐ．７−２８
【非特許文献４】Ｂｕｒｎｈａｍ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．，１９９４年，第１５巻，ｐ．２１０−２１８
【非特許文献５】Ｇｒａｃｅら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１年，第２１巻，ｐ．１１０３−１１１５
【非特許文献６】Ｂａｉｌｏｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ，２００１年，第１２巻，ｐ．１９５−２０２
【非特許文献７】Ｍｏｎｋａｒｓｈら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年，第２４７巻，ｐ．４３４−４４０
【非特許文献８】Ｇｒａｃｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５年，第２８０巻，ｐ．６３２７−６３３６
【非特許文献９】Ｍｏｎｋａｒｓｈら，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，１９９７年，第６８０巻，ｐ．２０７−２１６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って、ヒト疾患を処置するために利用可能な薬学的インターフェロンの備蓄を補うために、部位特異的に改変されたＰＥＧ  ＩＦＮ−α結合体（特にα−１ｂ結合体）の需要、ならびにこれらの産生のための方法の需要が存在する。
【００２０】
本明細書中で引用された刊行物および参考文献の完全な開示は、本明細書中でその全体が参考として援用されるものであり、先行技術として認められるものではない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトインターフェロンα−１ｂのＣｙｓ８６に共有結合したポリオール部分を有するポリオール−インターフェロン−α結合体を提供する。インターフェロンは、ヒト細胞もしくは組織から単離されてもよく、または、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、またはトランスジェニック動物のような宿主において発現された組換えタンパク質であってもよい。
【００２２】
本発明に従うと、このポリオール部分は、例えば、ポリエチレングリコール部分もしくはポリアルキレングリコール部分であり得る。特定の実施形態において、本発明のポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体は、天然のヒトインターフェロンα−１ｂに対して同等であるかまたはより高いインビボインターフェロン−α活性を有する。本発明の好ましい局面において、ポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体は、他の位置的異性体を有さず、均一な分子量を有する。
【００２３】
本発明はまた、ヒトインターフェロンα−１ｂのＣｙｓ８６に共有結合したポリオール部分を有するポリオール−インターフェロン−α結合体、ならびに薬学的に受容可能であるキャリア、賦形剤もしくは助剤を含有する薬学的組成物を提供する。
【００２４】
ポリオール−インターフェロン結合体を産生するための方法もまた提供され、この方法において、１つの遊離のシステインを有するインターフェロンはマレイミドポリオールもしくはマレイミドビス−ポリオールと結合体化されて、ポリオールと遊離のシステインとの間で共有結合を形成する。
【００２５】
この方法は、天然に存在するインターフェロン、遺伝子操作された（例えば、組換え）インターフェロン、部位特異的変異誘発されたインターフェロン、およびキメラインターフェロンの結合体（組換えヒトインターフェロンα−１ｂのようなヒトαインターフェロンの結合体を含む）を産生するために使用され得る。
【００２６】
インターフェロン−αによって媒介されるプロセスを調節するための方法、およびインターフェロン−α−応答性状態またはインターフェロン−α−応答性疾患を有する患者を処置するための方法もまた、提供される。これらの方法は、有効量のポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体を患者に投与する工程を包含する。このプロセス、疾患および状態は、炎症、ウイルス感染、細菌感染または癌を含み得る。より具体的には、このプロセス、疾患および状態は、Ｃ型肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、ＨＩＶ感染、多発性硬化症、関節炎、ぜん息、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、骨髄腫、リンパ腫、肝臓癌、乳癌、メラノーマおよびヘアリーセル白血病であり得る。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ポリオール部分（特にＰＥＧ部分）のヒトＩＦＮα−１ｂのＣｙｓ８６残基への結合が、天然のヒトインターフェロンα−１ｂのＩＦＮα−１ｂ生物学的活性を保存するという知見に基づく。従って、Ｃｙｓ８６残基に結合したポリオール部分を有するＩＦＮα−１ｂは、ＩＦＮα−１ｂ生物学的活性のみを示すのではなく、このポリオール−ＩＦＮα−１ｂ結合体はまた、このポリオール部分によって与えられた望ましい性質（例えば、薬物速度論の改善および抗原性の低減）をも提供し得る。
【００２８】
インターフェロンα−１ｂの遊離のチオール基は、（例えば、ポリエチレングリコールへの）スルフヒドリル特異的結合体化に利用可能である。さらに、マレイミド−チオールを介した結合体化は、穏やかな中性水溶液中で非常に特異的である。チオール−特異的一ペグ化は、複数部位のペグ化（例えば、リジン残基を介したペグ化）から生じる位置的異性体の不均一性を回避する。
【００２９】
特別な定義が提供されない限り、本明細書中で記載される関連の学術用語、研究室手順、技術および方法は、当該分野で公知である。標準的化学記号および略称は、そのような記号によって表される正式名称と相互交換可能に使用される。従って、例えば、「炭素」および「Ｃ」は、同一の意味を有することが理解される。標準的技術が、化学合成、化学分析、薬学的調製、処方、送達および患者の処置のために使用され得る。標準的技術は、組換えＤＮＡ方法論、オリゴヌクレオチド合成、組織培養などについて使用され得る。反応および精製技術は、例えば、キットを使用して製造業者の指示に従って実施されても、一般に当該分野で達成されているように実施されても、または本明細書中で記載されるように実施されてもよい。上記の技術および手順は、一般に、種々の一般的参考文献もしくはより特定の参考文献（これらは、本特許出願を通して引用されかつ考察される）に記載されるように、当該分野で周知の従来の方法によって実施され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）），ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８））（これらは、本明細書中でその全体が任意の目的のために参考として援用される）を参照されたい。
【００３０】
「ＩＦＮ−α」または「インターフェロン−α」は、本明細書中で使用される場合、生物学的液体、細胞、組織もしくは細胞培養物からの単離によって得られるか、または原核生物宿主細胞もしくは真核生物宿主細胞（細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物および昆虫細胞が挙げられる）における組換えＤＮＡ技術によって得られる、ヒト白血球インターフェロン、ならびにその塩、機能的誘導体、前駆体および活性部分（ａｃｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を意味する。
【００３１】
ヒト「ＩＦＮα−１ｂ」とは、配列番号２（図１Ｂ）として与えられるアミノ酸配列、すなわちＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０７６９１８．１  ＧＩ：１３１２８９５０において特定されるアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。ヒトＩＦＮα−１ｂについてのヌクレオチド配列は、図１Ａ（配列番号１）において示され、かつ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２４０１３．１；ＧＩ：１３１２８９４９において特定される。本発明に従い、ヒトＩＦＮα−１ｂは、図１Ａおよび図１Ｂに示される配列および以下の表１に記載される配列、ならびに、ＩＦＮα−１ｂの任意のホモログ、オルソログ、改変体、アナログ、誘導体、（例えば、生物学的にもしくは薬学的に）活性であるフラグメントもしくは変異体を包含する。例えば、本明細書中でＩＦＮα−１ｂと呼ばれるものは、当該分野において、白血球インターフェロン、ＩＦＬ、ＩＦＮ、ＩＦＮα１、ＩＦＮアルファおよびＩＦＮ−アルファとしても知られる。ＩＦＮα−１ｂの配列（配列番号１および配列番号２）と、科学文献において記載される２つのＩＦＮ−α配列（Ｍａｎｔｅｉら，１９８０，Ｇｅｎｅ  １０：１−１０；Ｇｅｏｄｄｅｌら，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：２０−２６）との比較を、表１に示す。表１に列挙されたＩＦＮ−α配列は、本発明の組成物の調製における使用のために、同等に適し得ると予測される。
【００３２】
（表１．種々の出典に由来するＩＦＮα１遺伝子）
【００３３】
【表１】
2008509889.tif 000003
注記：
（１）Ｍａｎｔｅｉ，Ｎ．，Ｓｃｈｗａｒｚｓｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｓｔｒｅｕｌｉ，Ｍ．，Ｐａｎｅｍ，Ｓ．，Ｎａｇａｔａ，Ｓ．，およびＷｅｉｓｓｍａｎｎ，Ｃ：Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｃｌｏｎｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｃＤＮＡ．（１９８０）Ｇｅｎｅ  １０，１−１０
（２）Ｎａｇａｔａ，Ｓ．，Ｍａｎｔｅｉ，Ｎ．およびＷｅｉｓｓｍａｎｎ，Ｃ，Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｉｇｈｔ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ  ２８７，４０１−４０８．
（３）Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｄｕｌｌ，Ｔ．Ｊ．，Ｇｒｏｓｓ，Ｍ．，Ｌａｗｎ，Ｒ．Ｍ．，ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ，Ｒ．，Ｓｅｅｂｕｒｇ，Ｐ．Ｈ．，Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．，Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ，Ｅ．，およびＧｒａｙ，Ｐ．Ｗ．：Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｅｉｇｈｔ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｌｏｎｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｃＤＮＡｓ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９０，２０−２６
（４）Ｌｉ，Ｍ．Ｆ．，Ｊｉｎ，Ｑ．，Ｈｕ，Ｇ．，Ｇｕｏ，Ｈ．Ｙ．，およびＨｏｕ，Ｙ．Ｄ．：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα１  ｇｅｎｅ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ（Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ）３５，２００−２０６
（５）Ｄｉｎｇ，Ｘ．Ｓ．，Ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  α１ｂ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｄｒｕｇｓ（Ｃｈｉｎｅｓｅ）（１９９６），１５４−１５７
（６）Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｈ．およびＹｕ，Ｘ．Ｂ．：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ  １ｂ  ｇｅｎｅ，ｐａｒｔｉａｌ  ｃｄｓ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ（ＡＦ４３９４４７），Ｖｅｒｓｉｏｎ（ＡＦ４３９４４７，ＧＩ：１７０６３９４８），ＮＣＢＩ（２００１年１０月２４日登録），Ｓｕｎ  Ｙａｔ−Ｓｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ
本発明のＩＦＮα−１ｂポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、ＩＦＮα−１ｂポリペプチドをコードする内因性配列もしくはその一部分）を含んでもよく、あるいはそのような配列の改変体、または生物学的機能等価物もしくは抗原性機能等価物を含んでもよい。ポリヌクレオチド改変体は、以下にさらに記載されるように、天然のポリペプチドに対して、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。用語「改変体」はまた、外因性起源の相同遺伝子をも包含する。代表的に、ＩＦＮα−１ｂ改変体は、全ての生物学的活性、実質的な割合の生物学的活性、もしくは少なくとも部分的な生物学的活性を保持し、このような活性は、例えば、以下の実施例６で記載されるインターフェロンバイオアッセイなどを用いて決定され得る。Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：７５５１（１９８１）（本明細書中でその全体が参考として援用される）もまた参照されたい。
【００３４】
本発明のＩＦＮα−１ｂのアナログは、当該分野で周知であるように、機能的に等価な分子を提供するように、タンパク質配列を、置換、付加もしくは欠失によって改変することにより、作製され得る。これらは、機能的に等価なアミノ酸残基が配列内の残基と置換され、静かな変化（ｓｉｌｅｎｔ  ｃｈａｎｇｅ）をもたらす、配列の改変を含む。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、機能的な等価物として作用する極性が類似する別のアミノ酸によって置換され得、例えば、静かな改変（ｓｉｌｅｎｔ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）をもたらす。配列内のアミノ酸についての置換は、このアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。保存的置換を含む天然に存在する改変体および遺伝子操作された（例えば組換え）改変体、ならびに、生物学的活性のために本質的に必要ではないタンパク質の領域における置換を含む天然に存在する改変体および遺伝子操作された（例えば組換え）改変体の両方が、機能的に等価なＩＦＮα−１ｂポリペプチドを生じることが想定され、これらは、本発明によって包含される。
【００３５】
ポリオールに結合体化したＩＦＮα−１ｂのフラグメントもまた、本発明によって包含される。本明細書中で使用される場合、ＩＦＮα−１ｂの「フラグメント」は、任意の方法によって作製されたＩＦＮα−１ｂの部分をいう。これらの方法としては、ＩＦＮα−１ｂの酵素消化および化学的切断（例えば、ＣＮＢｒ）およびポリペプチドの物理的剪断が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＦＮα−１ｂのフラグメントもまた、例えば、組換えＤＮＡ技術によって産生され得、そしてアミノ酸合成によって産生され得る。
【００３６】
本発明に従うポリオール−ＩＦＮα−１ｂ結合体におけるポリオール部分は、直鎖または分枝鎖を有する、一官能性もしくは二官能性の任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド
）であり得る。代表的に、ポリオールは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）のような、ポリ（アルキレングリコール）である。しかし、当業者は、例えばポリ（プロピレングリコール）ならびにポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマーのような他のポリオールが適切に使用され得ることを、理解する。
【００３７】
他のインターフェロン結合体は、インターフェロンの水溶性ポリマーへの結合によって調製され得る。このようなポリマーの非限定的な列挙としては、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、これらのコポリマーおよびこれらのブロックコポリマーのような、他のポリアルキレンオキシドホモポリマーが挙げられる。ポリアルキレンオキシド−ベースのポリマーの代替として、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物−ベースのポリマーなどのような、事実上非抗原性の物質が使用され得る。
【００３８】
「ＰＥＧ」は、本明細書中で使用される場合、以下の一般式の分子を含む：
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−
ＰＥＧは、各末端にヒドロキシル基を有する直鎖ポリマーを含む：
【００３９】
【化１】
2008509889.tif 000004
この式は、簡潔にＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨと表され得、ここで、−ＰＥＧ−は、末端基を有さないポリマー骨格を表す。
【００４０】
ＰＥＧは、メトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ、（ｍ−ＰＥＧ）として一般に使用され、ここで、１つの末端は、比較的不活性なメトキシ基であり、一方、他の末端は、化学的改変に供されるヒドロキシル基である。メトキシＰＥＧの式は、以下に示される：
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
分枝鎖ＰＥＧもまた、一般的に使用される。分枝鎖ＰＥＧは、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍと表され得、ここで、Ｒは、ペンタエリトリトール、グリセロールもしくはリジンのような中核部分（ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｏｒｅ  ｍｏｉｅｔｙ）を表し、そしてｍは、分枝する腕（ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ａｒｍ）の数を表す。分枝する腕の数（ｍ）は、３から１００以上までにおよび得る。ヒドロキシル基は、さらに化学的改変に供される。
【００４１】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／２１４６９に記載されるような別の分枝鎖形態は、化学的改変に供される１つの末端を有する。この型のＰＥＧは、（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−）ｐＲ−Ｘと表され、ここでｐは、２もしくは３であり、Ｒは、リジンもしくはグリセロールのような中核を表し、そしてＸは、カルボキシル基のような官能基を表し、このＸは化学的活性化に供される。なお別の分枝形態である「ペンダントＰＥＧ」は、例えばカルボキシル基のような反応基を、ＰＥＧ鎖の末端ではなくＰＥＧ骨格に沿って有する。
【００４２】
これらの形態のＰＥＧに加えて、ポリマーはまた、骨格における弱い結合すなわち分解性の結合によって調製され得る。例えば、Ｈａｒｒｉｓは、米国特許出願第０６／０２６，７１６号（本明細書中でその全体が参考として援用される）において、ＰＥＧは、ポリマー骨格中のエステル結合によって調製され得、この結合は、加水分解を受けることを示した。この加水分解は、以下の反応スキームに従って、ポリマーのより低分子量のフラグメントへの切断を生じる：
【００４３】
【化２】
2008509889.tif 000005
用語ポリエチレングリコールもしくはＰＥＧは、天然のＰＥＧおよび上述の全ての誘導体を包含することを意味する。
【００４４】
エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマーは、その化学においてＰＥＧと密接に関連し、そして、これらは、多くの用途においてＰＥＧの代わりに使用され得る。これらは、以下の一般式を有する：
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨＲＯ（ＣＨ２ＣＨＲＯ）ｎＣＨ２ＣＨＲ−ＯＨ
ここで、Ｒは、ＨもしくはＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）ｍＣＨ３である。
【００４５】
ＰＥＧは、高い水溶性および多くの有機溶媒中における高い溶解性の特性を有する、有用なポリマーである。ＰＥＧは、一般に、非毒性かつ非免疫原性である。ＰＥＧが水溶性化合物に化学的に結合（「ペグ化」）される場合、得られる結合体は、一般に水溶性かつ多くの有機溶媒中に溶解性になる。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＰＥＧ部分」は、直鎖ＰＥＧおよび分枝鎖ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、加水分解可能なＰＥＧもしくは酵素分解可能なＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ、デンドリマーＰＥＧ、ＰＥＧと１つ以上のポリオールとのコポリマー、ならびにＰＥＧとＰＬＧＡ（ポリ（乳酸／グリコール酸））とのコポリマーを含むが、これらに限定されない。本発明に従って、用語ポリエチレングリコールすなわちＰＥＧは、天然のＰＥＧおよび本明細書中で記載される全ての誘導体を含むことを意味する。
【００４７】
「塩」は、本明細書中で使用される場合、公知の方法によって入手可能である、カルボキシル基の塩および化合物のアミノ官能基の塩の両方をいう。カルボキシル基の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩のような無機塩と、トリエタノールアミン、アルギニンもしくはリジンのようなアミンによって形成されるような有機塩基を有する塩とが挙げられる。アミノ基の塩には、例えば、塩酸のような無機酸による塩および酢酸のような有機酸による塩が含まれる。
【００４８】
「機能的誘導体」は、本明細書中で使用される場合、アミノ酸部分の側鎖上またはＮ末端基もしくはＣ末端基上に存在する官能基から、公知の方法に従って調製され得る誘導体をいい、これらが薬学的に受容可能である場合、すなわちこれらがタンパク質活性を損なわない場合もしくはこれらを含有する薬学的組成物に毒性を与えない場合、これらは、本発明に包含される。このような誘導体としては、例えば、カルボキシル基のエステルもしくは脂肪族アミド、および遊離のアミノ基のＮ−アシル誘導体もしくは遊離のヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含み、そして例えば、アルカノイル基もしくはアロイル基のようなアシル基によって形成される。
【００４９】
「前駆体」は、ヒトの体内もしくは動物の体内において、ＩＦＮα−１ｂに変換される化合物をいう。
【００５０】
本発明のタンパク質の「活性部分（ａｃｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）」とは、化合物自体のポリペプチド鎖の任意のフラグメントもしくは前駆体を、単独でいうか、または関連の分子もしくはこれに結合する残基（例えば、糖もしくはリン酸の残基）と組み合わせていうか、あるいはこのようなフラグメントもしくは前駆体が医薬としてのＩＦＮα−１ｂの同じ活性を示す場合、ポリペプチド部分の凝集体をいう。
【００５１】
本発明の結合体は、当該分野で公知の方法のいずれかによって調製され得る。本発明の実施形態に従い、ＩＦＮα−１ｂは、適切な溶媒中でペグ化剤と反応させられ、そして所望の結合体が、例えば１種以上のクロマトグラフィー方法の適用により、単離されそして精製される。
【００５２】
「チオール反応性ペグ化剤」とは、本明細書中で使用される場合、システイン残基のチオール基と反応可能である、任意のＰＥＧ誘導体をいう。チオール反応性ペグ化剤は、例えば、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、マレイミド、およびヨードアセトイミドのような官能基を含むＰＥＧ、ならびにオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）誘導体であり得る。本発明の１つの局面において、ペグ化剤は、スルフヒドリル選択的ＰＥＧである。本発明の１つの実施形態において、ペグ化剤は、ｍＰＥＧ−ＭＡＬであり、これは、以下の式によって表される：
【００５３】
【化３】
2008509889.tif 000006
別の実施形態において、ペグ化剤は、ｍＰＥＧ２−ＭＡＬであり、これは、以下の式によって表される：
【００５４】
【化４】
2008509889.tif 000007
好ましい実施形態において、ペグ化剤は、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製のｍＰＥＧ−ＭＡＬもしくはｍＰＥＧ２ＭＡＬである。
【００５５】
本発明の結合体の調製のための代表的な反応スキームは、図２Ａおよび図２Ｂにおいて示される。
【００５６】
タンパク質とＰＥＧ部分との間で産生されるチオエーテルの型は、循環において安定であることが示されているが、これは、細胞環境への侵入の際に、還元され得る。本発明をいかなる１つの理論もしくは作用様式に限定することも望まないが、本発明の１つの実施形態において、細胞内に入らない結合体は、排出されるまで循環において安定である。
【００５７】
８６位のＣｙｓがｍＰＥＧ−ＭＡＬ試薬との相互作用のために利用可能であり、ヒトＩＦＮα−１ｂの天然に存在する形態において１位、２９位、９９位および１３９位のアミノ酸に出現する他のＳｙｓ残基は、ジスルフィド結合（すなわち、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ９９、Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ１３９）を形成するが故にペグ化剤と反応しないので、上記の反応は、ＩＦＮα−１ｂについて部位特異的であることに留意するべきである。
【００５８】
特定の実施形態において、本発明のポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体は、天然のヒトインターフェロンα−１ｂと同じかまたはより高いインターフェロン−α活性を有する。別の実施形態において、ポリオールＩＦＮα−１ｂは、天然のヒトインターフェロンα−１ｂの部分的な活性かもしくは実質的な活性を有する。他の実施形態において、ポリオールＩＦＮα−１ｂは、少なくとも測定可能な量の活性を有する。結合体化インターフェロンα−１ｂと未結合体化インターフェロンα−１ｂとの比較活性は、インターフェロン活性を決定するために利用可能である任意の方法（例えば、生物学的な抗ウイルス特性、抗炎症特性もしくは抗腫瘍特性のインビトロもしくはインビボでの測定）によって決定され得る。本発明における使用のために適した１つのアッセイにおいて、細胞変性効果阻害が測定される。Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：７５５（１９８１）を参照。インターフェロンは、細胞をウイルス感染（細胞変性効果）から保護し、それによって、ウイルス感染における宿主細胞の生存度を上昇させる。従って、この方法に従い、インターフェロンは、宿主細胞におけるウイルス性の細胞変性効果（ＣＰＥ）を阻害し、この阻害は、細胞増殖もしくは生存度にとって測定される。
【００５９】
本発明の１つの局面において、ポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体は、均一な分子量を有する。分子量は、当該分野で利用可能である任意の方法によって決定され得る。これらの方法としては、非変性ゲル電気泳動もしくは変性ゲル電気泳動、ゲル濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過および質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
「クロマトグラフィー方法」もしくは「クロマトグラフィー」とは、溶媒（移動相）の流れを介して混合物を支持体（固定相）に供することによって、混合物の成分を分離するために使用される任意の技術をいう。クロマトグラフィーの分離の原理は、固定相および移動相の異なる物理的性質に基づく。
【００６１】
文献において周知である、幾つかの特定の型のクロマトグラフィー方法としては、以下が挙げられる：液相クロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸収クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過クロマトグラフィー、もしくは薄層クロマトグラフィー。
【００６２】
ペグ化剤は、結合体化のために１つの末端しか利用可能でない一メトキシル化（ｍｏｎｏ−ｍｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ）形態で使用され得るか、または結合体化のために両末端が（例えば、１つのＰＥＧ部分に共有結合される２つのＩＦＮα−１ｂとの結合体の形成において）利用可能である二官能性形態で使用され得る。ペグ化剤は、代表的に、５００と１００，０００との間の分子量を有する。
【００６３】
本発明はまた、ポリオール−インターフェロン結合体の調製のための方法に関する。この方法は、１つの遊離のシステイン基を有するインターフェロンおよびマレイミドポリオールもしくはマレイミドビス−ポリオールを提供する工程、ならびにこのインターフェロンとマレイミドポリオールもしくはマレイミドビス−ポリオールとを、ポリオールと任意の位置の遊離のシステインとの間の共有結合（すなわち、チオエーテル結合）の形成を可能にする条件下で接触させ、それによってポリオール−インターフェロン結合体を作製する工程を、包含する。この方法に従って、このインターフェロンは、１つの遊離のシステインを有する任意のインターフェロンであり得る。１つの実施形態において、このインターフェロンは、１つの遊離のシステインを有する天然に存在するタンパク質であるが、天然に分子内ジスルフィド結合を形成するさらなるシステインを含み得る。別の実施形態において、このインターフェロンは、例えば組換えＤＮＡ方法論によって、所望されないシステインを排除するか、またはヌクレオチド配列に付加するかもしくはこれを変異させて新規なシステインをコードすることにより、１つの遊離のシステインを有するように操作されている。インターフェロンはまた、２つ以上のタンパク質が組み合わさって複数種の所望の特性（ペグ化のための遊離のシステイン部位が挙げられるが、これらに限定されない）の利益を得る、融合タンパク質もしくはキメラタンパク質として操作され得る。本発明のインターフェロンを操作するための方法は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（２００３））（これらの内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照されたい。
【００６４】
本発明の方法の特定の実施形態において、インターフェロンは、１つの遊離のシステインを含む、ＩＦＮα−１ｂのようなαインターフェロンである。
【００６５】
さらに、一般的方法論は、利用可能なスルフヒドリル残基を有する任意のタンパク質に適用可能である。本発明の１つの局面に従って、この方法は、１つのスルフヒドリル残基（例えば、１つの遊離のシステイン残基）を有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを改変するために使用される。別の局面において、このタンパク質もしくはペプチドは、システイン残基の各対がジスルフィド結合を形成し、そして残ったシステインは、例えばｍＰＥＧ−ＭＡＬもしくはｍＰＥＧ２−ＭＡＬを用いる改変のために遊離であるような、多くのシステイン残基を含む。従って、本発明の局面に従って、３つのシステイン残基を含むタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドは、ジスルフィド結合した対を形成し、１つの遊離のシステインを残す。一方、７つのシステインを含有する種類は、スルフヒドリル結合した３つの対を形成し、ペグ化のための１つの遊離のシステインを残す。
【００６６】
本発明のＰＥＧ−ポリペプチド結合体は、このポリペプチドが活性成分として有効であるような疾患、状態もしくは障害を処置するために有用な医薬もしくは薬学的組成物を産生するために使用され得る。従って、本発明はまた、ヒトインターフェロンα−１ｂのＣｙｓ８６に共有結合したポリオール部分を有するポリオール−インターフェロン−α結合体、および薬学的に受容可能であるキャリア、賦形剤もしくは助剤を含有する薬学的組成物を提供する。
【００６７】
本発明のＩＦＮα−１ｂ結合体およびその薬学的に受容可能な塩、溶媒和物および水和物は、インターフェロンα−１ｂによって媒介され得る疾患もしくは状態の処置において有効であることが予測される。従って、本発明の化合物およびその薬学的に受容可能な塩、溶媒和物もしくは水和物は、炎症性疾患、感染および癌において有効であると考えられる。
【００６８】
本発明の１つの実施形態において、細菌感染およびウイルス感染、ならびに自己免疫疾患、炎症性疾患および腫瘍の処置、診断および予後のための活性成分としての薬学的組成物における使用に適するように、実質的に精製された結合体が提供される。上述の疾患の非限定の例としては、敗血症性ショック、ＡＩＤＳ、慢性関節リウマチ、エリテマトーデスおよび多発性硬化症が挙げられる。
【００６９】
本発明はまた、インターフェロン−αによって媒介されるプロセスを調節する方法を提供する。この方法は、有効量のポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体を患者に投与する工程を包含する。このようなプロセスとしては、炎症、ウイルス感染、細菌感染および癌が挙げられるが、これらに限定されない。なお別の実施形態において、本発明は、インターフェロン−α−応答性状態もしくは疾患を有する患者を処置する方法を提供する。この方法は、有効量のポリオール−インターフェロンα−１ｂ結合体を患者に投与する工程を包含する。この処置は、インターフェロン治療が処置、寛解、緩和などを提供し得る任意の疾患もしくは状態に有用であり得ることが想定される。この疾患もしくは状態としては、炎症性障害（例えば、多発性硬化症、関節炎、ぜん息、嚢胞性線維症もしくは間質性肺疾患）、ウイルス感染（例えば、Ｃ型肝炎感染、Ｂ型肝炎感染もしくはＨＩＶ感染）、当該分野で周知の細菌感染（特に従来処置（例えば抗生物質）に対して不応性であるかもしくは抵抗性である細菌感染）、ならびに癌（例えば、骨髄腫、リンパ腫、肝臓癌、乳癌、メラノーマおよびヘアリーセル白血病）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明の１つの実施形態は、例えば上に列挙した疾患のうちの１種を発症する危険のある患者もしくはそのような症状を既に示している患者への、薬理学的に活性な量の本発明の結合体の投与である。
【００７１】
活性成分に適合性である任意の経路の投与が、使用され得る。本発明の特定の実施形態において、皮下注射、筋肉内注射もしくは静脈内注射のような非経口投与が、好ましい。投与される活性成分の用量は、患者の年齢、体重および個々の反応に従う、医学的処方箋に基づいて変化する。
【００７２】
本発明のＩＦＮα−１ｂ結合体は、薬学的に受容可能なキャリアと混合されて、本明細書中で記載の生物学的状態もしくは障害を哺乳動物（特にヒト患者）において処置するために有用な薬学的組成物を提供し得る。これらの薬学的組成物において使用される特定のキャリアは、所望される投与の型に依存して、広範な種々の形態を取り得る。適切な投与経路としては、腸内投与（例えば、経口投与）、局所投与、座剤投与、吸入可能な投与、および非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与および皮下投与）が挙げられる。
【００７３】
経口液体投薬形態（例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤）の組成物の調製において、水、グリコール、油、アルコールのような代表的な薬学的媒体、香料添加剤、保存剤、着色剤などが使用され得る。同様に、経口固体投薬形態（例えば、散剤、錠剤およびカプセル剤）を調製する場合、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などのようなキャリアが、使用される。投与の容易さに起因して、錠剤およびカプセル剤は、本発明の薬学的組成物のための望ましい経口投薬形態を代表する。
【００７４】
非経口投与のための薬学的組成物は、活性成分および適切なビヒクルを含有する注射可能形態で調製され得る。非経口投与のために、キャリアは、代表的に、滅菌水を含み得るが、溶解性を補助する他の成分もしくは保存剤として作用する他の成分もまた含まれ得る。さらに、注射可能懸濁剤もまた調製され得る。この場合、適切な液体キャリア、懸濁化剤などが使用され得る。非経口投与のためのビヒクルは、当該分野で周知であり、例えば、水、生理食塩水、リンガー液および／またはデキストロースが挙げられる。このビヒクルは、薬学的調製物の溶解性および等張性を維持するために、少量の賦形剤を含有し得る。液剤の調製は、一般的な様式に従って実施され得る。
【００７５】
局所投与のために、本発明のＩＦＮα−１ｂ結合体は、無刺激性の加湿ベース（例えば、軟膏ベースもしくはクリームベース）を使用して処方され得る。軟膏ベースの例は、ワセリン、揮発性シリコーンを加えたワセリン、ラノリンおよびＢｅｉｅｒｓｄｏｒｆ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）から入手可能であるＥｕｃｅｒｉｎＴＭのような油中水エマルジョンである。適切なクリームベースの例は、Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）から入手可能であるＮｉｖｅａＴＭクリーム、コールドクリーム（ＵＳＰ）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）から入手可能であるＰｕｒｐｏｓｅ  ＣｒｅａｍＴＭ、親水性軟膏（ＵＳＰ）およびＷａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）から入手可能であるＬｕｂｒｉｄｅｒｍＴＭである。
【００７６】
本発明のＩＦＮα−１ｂ結合体の薬学的組成物は、一般に、投薬単位の形態（例えば、液剤、錠剤、カプセル剤など）で投与される。本発明の化合物は、一般に、約０．０１μｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で、毎日、毎週および毎月投与される。代表的に、本発明のＩＦＮα−１ｂ結合体は、約０．１μｇ／ｋｇ体重〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で、毎日、毎週および毎月投与される。多くの場合、本発明のＩＦＮα−１ｂ結合体は、約１μｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で、毎日、毎週および毎月投与される。投薬量は、７５ｋｇの体重につき、平均で毎日１０μｇと１ｍｇとの間であり得、そして１つの実施形態において、日用量は、２０μｇと２００μｇとの間である。さらに、改変ＩＦＮα−１ｂ結合体の拡張された作用は、例えば、週１回もしくは２週間に１回の投薬スケジュールを容易にし得る。例えば、１週間につき１人あたり約１０〜約５００μｇであり得る。特定の実施形態において、週１回の投薬量は、１人あたり約５０〜約２５０μｇであり得る。他の実施形態において、投薬量は、１週間につき１人あたり約１００〜約２００μｇであり得る。当業者に理解されるように、本発明に従って患者に投与される薬学的組成物の特定の量は、多くの要因に依存する。これらの要因としては、所望される生物学的活性、患者の状態、および薬物についての耐性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明は、特定の実施形態に関して記載されているが、明細書の内容は、当業者が特許請求の範囲の意味および目的を超えることなく実施可能である全ての改変および置換を包含する。
【実施例】
【００７８】
本発明は、ここで、以下の実施例によって記載されるが、この実施例は、いかなる意味でも本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【００７９】
（実施例１．組換えヒトインターフェロンα−１ｂの調製）
組換えヒトインターフェロンα−１ｂ（「ＩＦＮα−１ｂ」もしくは「ｒｈＩＦＮα−１ｂ」と呼ぶ）を、図１（配列番号１、配列番号２、および配列番号３）に示すＩＦＮα−１ｂ  ＤＮＡ配列を発現するように遺伝子操作したＥ．ｃｏｌｉの発酵によって調製した。発酵させた細胞を収集し、そして遠心分離して、細胞ペーストを形成した。次いで、ＩＦＮα−１ｂを、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＩＦＮα−１ｂはまた、市販の供給源から得ることができる。特定の実験において、ＩＦＮα−１ｂは、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ  Ｋｅｘｉｎｇ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏ．（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｃｈｉｎａ）によって提供された。
【００８０】
（実施例２．ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂの調製）
ＩＦＮα−１ｂを、活性型メトキシポリエチレングリコールの一本鎖Ｎ−マレイミド誘導体（ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＭＡＬ）（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）と結合体化させた。このＰＥＧポリマーは、平均２１．５ｋＤの分子量を有した。
【００８１】
（ＩＦＮα−１ｂと一本鎖ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−マレイミドとの結合体化）
１ｇのＩＦＮα−１ｂを、ＹＭ−１０膜を備えたＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ（３５０ｍＬ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）を用いて、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にダイアフィルトレーションした。ＩＦＮα−１ｂの濃度を、最終的におよび１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＭＡＬを、モル過剰で（ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＭＡＬ：ＩＦＮα−１ｂは３モル：１モル）加え、この溶液を、穏やかに室温で２時間撹拌した。この反応を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタリングし、結合体の量を決定した。これらの条件の下で、ＩＦＮα−１ｂ上の８６位におけるシステインの遊離のスルフヒドリル基は、安定的なチオエーテル結合を介して、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＭＡＬの活性型マレイミド基に特異的に結合した。ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＭＡＬの分子構造およびＣｙｓ−特異的結合体化メカニズムを、図２Ａに示す。
【００８２】
結合体化の最終産物は、主に、一ペグ化したＩＦＮα−１ｂ、高分子量種、未結合体化ＩＦＮα−１ｂ、および未結合体化ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＭＡＬを含んだ。
【００８３】
（ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂの精製）
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して、以下のように、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂを未結合体化ＩＦＮα−１ｂおよび未結合体化ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＭＡＬから分離した。結合体化後の溶液にクエン酸ナトリウムを加え、終濃度を０．４Ｍにした。この溶液を、緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中０．４Ｍクエン酸、ｐＨ６．８）で平衡化したＢｕｔｙｌ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）カラム（５．０ｃｍ×１３．５ｃｍ；総容積２６５ｍＬ）に入れた。このカラムを、５カラム用量の緩衝液Ａで洗浄し、未結合体化ＩＦＮα−１ｂおよび未結合体化ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＭＡＬを除去した。一ペグ化したｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂを、０〜５０％の緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．８）からの線形勾配を用いて、１０カラム容量にわたって溶出した。溶出物のタンパク質含量を、２８０ｎｍでモニタリングした。このカラムを、３０ｍｌ／分の流速で溶出し、そしてｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ画分を回収し、そして総量１１５０ｍＬのｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂがプールされるようにプールした。
【００８４】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用し、一ペグ化ＩＦＮα−１ｂを高分子量種から分離した。ＨＩＣからプールされた画分を、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム／０．１４Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ６．０）中にダイアフィルトレーションし、そして６〜８ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。次いで、濃縮した溶液を、緩衝液Ｃ中に事前に平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ７５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）カラム（１６×５３ｃｍ；総容量１０６ｍＬ）上に入れた。一ペグ化ＩＦＮα−１ｂを、緩衝液Ｃにより、流速１ｍｌ／分で溶出した。溶出物のタンパク質含量を、２８０ｎｍでモニタリングした。ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ画分を収集し、そして総容量２０ｍＬをプールした。およそ０．２ｇの一ペグ化ＩＦＮα−１ｂを、結合体化および精製の後に得、これは、全体の収量が約２０％であることを表していた。
【００８５】
（実施例３．ｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂの調製）
ＩＦＮα−１ｂを、分枝鎖メトキシポリエチレングリコール｛ビス［（メトキシポリ（エチレングリコール）平均ＭＷ４０，０００］のマレイミドプロピオンアミド、改変グリセロール｝（ｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＭＡＬ）（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）の活性型Ｎ−マレイミド誘導体と、実施例２でｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂについて上述したように結合体化させた。このＰＥＧポリマーは、４２．４ｋＤの平均分子量を有した。ｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＭＡＬの分子構造およびＣｙｓ特異的結合体化メカニズムを、図２Ｂに図示する。ｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂの精製は、実施例２に記載の通りであった。
【００８６】
（実施例４：ｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体の性質決定）
ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂおよびｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂを、以下に記載するように性質決定し、結合体の純度および分子量を決定した。
【００８７】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）
未結合体化ＩＦＮα−１ｂ、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ、およびｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂの分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって決定した。１０μｇに相当する未結合体化ＩＦＮα−１ｂのサンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５（１９７０））の方法に従って４〜１２％  ＢｉｓＴｒｉｓ  ＮｕＰａｇｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にかけ、そしてクーマシーブルー染色によって可視化した。図３に示されるように、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂおよびｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂの見かけの（ａｐｐａｒｅｎｔ）分子量は、それぞれ４９．７ｋＤおよび７４．６ｋＤであった。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の間のｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体の見かけの分子サイズは、長い直鎖ＰＥＧポリマー鎖の結合によって、（未結合の球形ＩＦＮα−１ｂタンパク質と比較して）有意に増大した。
【００８８】
（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析）
精製ｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体を、ＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ１２ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）カラム（１０×３００ｍｍ；粒子サイズ１０μｍ）を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄシリーズ１１００分析用ＨＰＬＣシステムを用いて、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって分析した。移動相は、０．１Ｍリン酸ナトリウム／０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）であり、そして流速は、０．５ｍＬ／分であった。シグナルを、２１４ｎｍでモニタリングした。
【００８９】
図４Ａ〜Ｃにおいて示されるように、ｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体を、ＩＦＮα−１ｂおよび高分子量種から分離した。ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂおよびｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂの見かけの分子量を、それぞれ３１２ｋＤおよび７６９ｋＤであると測定した。サイズ排除クロマトグラフィーの間に観察したｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体の水力学的容量は、長い直鎖ＰＥＧポリマー鎖の結合によって、（球形ＩＦＮα−１ｂタンパク質と比較して）有意に増大した。ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂおよびｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂの純度を、それぞれ９８．９％および９６．８％であると決定した。
【００９０】
（質量分析）
ｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体の分子量を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ質量分析計上で遅延引き出し（ｄｅｌａｙｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を用いて実施したマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型質量分析によって決定した。シナピン酸マトリックスと共にサンプルプレート上に配置したサンプルに、３３７ｎｍで操作した窒素レーザー（Ｌａｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を照射した。レーザービームを、可変減衰器によって減衰させ、そしてサンプル標的に集束させた。イオン源において産生されるイオンを、２５，０００Ｖの偏向電圧によって加速させた。次いで、イオンを、飛行時間型質量分析計を用い、そのｍ／ｚに従って識別した。
【００９１】
図５Ａは、観察されたｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ（４１．１ｋＤ）の主なピークを示す。より小さい２０．６ｋＤのピークは、同じ一ペグ化ＩＦＮα−１ｂを表し、これは、２Ｈ＋によって荷電されていた。１９．４ｋＤのピークは、サンプル中の残留ＩＦＮα−１ｂを表していた。
【００９２】
図５Ｂは、観察されたｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ（６２．２ｋＤ）の主なピークを示す。より小さい３１．１ｋＤのピークは、同じ一ペグ化ＩＦＮα−１ｂを表し、これは、２Ｈ＋によって荷電されていた。１９．４ｋＤのピークは、サンプル中の残留ＩＦＮα−１ｂを表していた。
【００９３】
ｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体の分子量を、異なる方法によって決定した。これを、表２にまとめる。
【００９４】
【表２】
2008509889.tif 000008
（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析）
精製ｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体を、Ｍｏｎｋａｒｓｈら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：４３４−４４０（１９９７）、本明細書中でその全体が参考として援用される）の高速カチオン交換クロマトグラフィー方法の改変によって、ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＳＰ−５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）ＨＰＬＣカラム（７．５×７５ｍｍ，１０μｍ）を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄシリーズ１１００分析用ＨＰＬＣシステムを用いて分析した。このカラムを、少なくとも１０カラム容量の緩衝液Ａ（５ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ４．１）によって事前に平衡化した。ｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体を適用し、そして０％〜１００％の緩衝液Ｂ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ５．９）の線形上昇ｐＨ勾配（４．１〜５．９）により、流速０．６ｍＬ／分で１２０分間にわたって溶出した。タンパク質を、２１４ｎｍにおける吸光度によってモニタリングした。
【００９５】
図６Ａに示すように、未改変ＩＦＮα−１ｂ（ピーク２）は、適用したサンプルの９２％超を表していた。ピーク１およびピーク３の実体は、決定されなかった。
【００９６】
図６Ｂに示されるように、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ（ピーク２）は、適用したサンプルの９０％超を表していた。ピーク１およびピーク３の実体は、決定されなかった。これらの結果は、ｍＰＥＧ−ＭＡＬのマレイミド基が、ＩＦＮα−１ｂ上の残基Ｃｙｓ８６の遊離のスルフヒドリル基に特異的に結合体化したことを確認した。
【００９７】
図６Ｃに示されるように、ｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ（ピーク２）は、適用したサンプルの８７％超を表していた。ピーク１およびピーク３の実体は、決定されなかった。これらの結果は、ｍＰＥＧ２−ＭＡＬのマレイミド基が、インターフェロンα−１ｂ上の残基Ｃｙｓ８６の遊離のスルフヒドリル基に特異的に結合体化したことを確認した。複数の位置的異性体は、観察されなかった。
【００９８】
（実施例５：ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂのＣｙｓ８６特異的一ペグ化の性質決定）
（概要）
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）によって還元したｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂを、ヨード酢酸（ｉｄｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）によってＳ−カルボキシメチル化した。このＳ−カルボキシメチル化ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂを、５つの一Ｃｙｓ含有ペプチド（ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｙｓ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）および他の非Ｃｙｓ含有ペプチドを産生するように選択したエンドプロテナーゼＧｌｕ−Ｃによって切断した。図７は、ＩＦＮα−１ｂのｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−マレイミドによるＣｙｓ８６特異的一ペグ化の確認を、エンドヌクレアーゼＧｌｕ−ＣによるペプチドマッピングおよびＧｌｕ−Ｃ切断産物から単離したＣｙｓ８６ペグ化ペプチドのＮ末端配列決定によって示す。単離したＣｙｓ８６ペグ化ペプチドを、逆相ＨＰＬＣおよびサイズ排除ＨＰＬＣによって純度について分析し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分子量について分析した。単離されたペプチドのＣｙｓ８６残基を、最後に、Ｎ末端ペプチド配列決定によって、ペグ化されていることを確認した。
【００９９】
（還元アルキル化およびエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃによる切断）
５ｍｇのｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂおよび５ｍｇのＩＦＮα−１ｂ標準を、緩衝液交換し、０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／６Ｍ  グアニジウム／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．４）中１ｍｇ／ｍＬの濃度にした。ＤＴＴを添加し、ＩＦＮα−１ｂのジスルフィド結合を還元した。ヨード酢酸を添加し、そしてこの溶液を、３７℃で２０分間インキュベートして、遊離のスルフヒドリル基をＳ−カルボキシメチル化した。サンプルを、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．８）（切断緩衝液）で緩衝液交換した。Ｓ−カルボキシメチル化ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂを、切断緩衝液中で酵素対タンパク質の比１：１０（ｗ／ｗ）のエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃによって、２５℃で切断した。
【０１００】
（ペプチドマッピング）
エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ切断混合液を、Ｃ８−ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）カラム（４．６×２５０  ｍｍ，５μｍ）を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄシリーズ１１００分析用ＨＰＬＣシステムを用い、逆相ＨＰＬＣによって分析した。ペプチドを、２１４ｎｍでの吸光度によってモニタリングした。移動相Ａ（Ｈ２Ｏ／０．１％  ＴＦＡ）および移動相Ｂ（１０％  Ｈ２Ｏ／９０％アセトニトリル／０．１％  ＴＦ）を、ペプチドの分離のために、区分勾配系（ｓｅｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）において使用した：
時間（分）        ０    ７０    ８０    ８２    ８５    １００
Ｂ％              ０    ８０    ９２    ９２      ０        ０
未改変ＩＦＮα−１ｂ標準（図８Ａ）およびｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ（図８Ｂ）のペプチドマッピングフィンガープリントを、未改変Ｃｙｓ８６含有ペプチドの消失およびＣｙｓ８６−ペグ化ペプチドの出現について比較した。図８Ａに示されるように、２９．１分においてピークが観察され、これは、未改変Ｃｙｓ８６含有ペプチドに対応していた。図８Ｂにおいて示されるように、２９．１分のピークが消失した一方、４３．７分（別の実験におけるｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＭＡＬの保持時間に類似する）において出現した新たなピークが、ペグ化ペプチドであることを決定した。Ｃｙｓ８６含有ペプチドについての２９．１分間からＣｙｓ８６−ペグ化ペプチドについての４３．７分間に延長した保持時間は、原則的に、長い非極性ＰＥＧポリマーの結合に起因する。このＰＥＧポリマーは、小さいＣｙｓ８６含有ペプチドの極性を、実質的に還元している。ペプチドマッピングフィンガープリントにおいて、有意な相違のみが存在した。このことは、１つのＣｙｓ８６残基がペグ化されたことを示す。
【０１０１】
（Ｃｙｓ８６−ペグ化ペプチドの単離）
Ｃｙｓ８６−ペグ化ペプチド（４３．７分のピーク）を、逆相Ｃ８−ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって、上述のように、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ切断産物から単離し、そしてＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ１２ＨＲカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーを用いてさらに精製した。Ｃｙｓ８６−ペグ化ペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ質量分析を用いて分子量を測定することによって確認した。Ｃｙｓ８６−ペグ化ペプチドの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーおよびサイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって決定し、その後、Ｎ末端ペプチド配列決定を行った。
【０１０２】
（Ｎ末端ペプチド配列決定）
上記のペプチドマッピングから単離したＣｙｓ８６−ペグ化ペプチドを、Ｎ末端配列決定し、ＡＢＩ  Ｐｒｏｃｉｓｅ（登録商標）４９４シーケンサーを用いて、Ｅｄｍａｎ手順（Ｅｄｍａｎ，Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．４：２８３（１９５０）、本明細書中でその全体が参考として援用される）によってそのアミノ酸配列を決定した。この装置は、ポリペプチドがＰＶＤＦ膜上に固定化されている、正確な容量の試薬をカートリッジに運ぶ。各周期において、ＰＴＨ−アミノ酸を、分析および定量のために、ＨＰＬＣに移した。
【０１０３】
ペプチドを、１６周期にわたって配列決定した。以下のペプチド配列が、検出された：
【０１０４】
【表３】
2008509889.tif 000009
１４回目の周期において、Ｃｙｓ８６は検出されなかったが、このことは、Ｃｙｓ８６が８６位でペグ化されたことを示す。
【０１０５】
使用した切断条件下で、Ｇｌｕ−Ｃは、インターフェロン分子上のＡｓｐ７２残基およびＧｌｕ８８残基において切断し、ペグ化されるＳｅｒ７３−Ｇｌｕ８８含有ペプチドを産生した。タンパク質上に結合した長い直鎖ＰＥＧポリマー分子は、インターフェロンタンパク質上のＧｌｕ７９残基をエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ切断から遮蔽し得ることもまた、理解される。
【０１０６】
（実施例６．ＷＩＳＨ−ＶＳＶ細胞変性性アッセイによる、ｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体のインビトロ抗ウイルス活性）
ＩＦＮα−１ｂおよびペグ化ＩＦＮα−１ｂ結合体のインビトロ抗ウイルス活性を、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）によって惹起されたＷＩＳＨ細胞を用いる細胞変性効果アッセイ（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：７５５，１９８１）によって決定した。このＷＩＳＨ−ＶＳＶアッセイにおいて使用した材料は、ＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＶＳＶウイルス（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＩＦＮα−１ｂ、ならびに、実施例１、実施例２および実施例３において記載した方法によって調製したペグ化ＩＦＮα−１ｂ結合体を含んでいた。
【０１０７】
インターフェロンサンプルの２倍希釈系列を、マイクロタイタープレート中の増殖培地（ＤＭＥＭ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％  ＦＢＳ）中で調製した。このウェルを、２．５×１０４のＷＩＳＨ細胞によって播種し、３７℃、５％  ＣＯ２にて１８〜２４時間インキュベートした。次いで、細胞を、１０７ｐｆｕの水疱性口内炎ウイルスに感染させ、そして３７℃でさらに２４時間インキュベートした。このアッセイサンプルを分析し、比色分析ＸＴＴアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａ）を用いて細胞増殖を決定した。
【０１０８】
インターフェロンの抗ウイルス活性を、細胞変性効果の５０％阻害を得るために必要なインターフェロンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）（ＩＣ５０）として決定した。インターフェロンサンプルの特異的活性を、インターフェロンサンプルのＩＣ５０値を内部参照標準としてのＩＦＮα−２ｂ（ＷＨＯ）のＩＣ５０値と比較することによって、以下の式に従って計算した。
【０１０９】
【数１】
2008509889.tif 000010
インビトロ抗ウイルスアッセイからの結果を、以下の表４に示す。
【０１１０】
【表４】
2008509889.tif 000011
ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂは、約１．６％の残留ＩＦＮα−１ｂ活性を有した。ｍＰＥＧ２（４ＯｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂは、約２．２％の残留ＩＦＮα−１ｂ活性を有した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析結果（実施例４）は、ｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ調製物中の未改変ＩＦＮα−１ｂの比較的高い含量を示していた。この細胞変性効果アッセイにおいて、ペグ化インターフェロンの抗ウイルス活性の低下は、インターフェロン分子の周りを取り巻くＰＥＧポリマーの結合の結果（この結合により、インターフェロンとＷＩＳＨ細胞とのリガンド／レセプター相互作用を妨げる）であり得る。ペグ化インターフェロンのインビトロ活性は、インビボ薬理学的活性を必ずしも反映しないが、循環においてインターフェロンからＰＥＧ部分が除去され得、それによって、分子のより活性な形態を曝露し得る。本発明を１つの理論もしくは作用様式に制限することを望まないが、インビボでペグ化インターフェロンの安定性の増大をもたらすのと同じメカニズム（以下の図７参照）が、インビトロで観察される低い活性レベルの原因であり得る。ＷＩＳＨアッセイにおけるインビトロ生物学的活性の低下はまた、他のペグ化インターフェロン産物（例えば、ペグ化ＩＦＮα−２ａ；例えばＢａｉｌｏｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１２：１９５−２０２  （２００１）参照、およびペグ化ＩＦＮα−２ｂ；例えば、Ｗａｎｇら，Ａｄｖａｎｃｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，５４：５４７−５７０  （２００２）参照）によっても観察された。
【０１１１】
（実施例７：ラットにおける薬物速度論研究）
未改変ＩＦＮα−１ｂ、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体およびｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体の薬物速度論パラメータを、表５に示す薬物速度論プロトコールを実施することによって決定した。
【０１１２】
【表５】
2008509889.tif 000012
６匹のラット（コントロール群）の各々に、２０８μｇのＩＦＮ  α−１ｂ／Ｋｇ体重を皮下注射した。２つの試験群の６匹のラット（コントロール群）の各々に、１０００μｇ用量のｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体／Ｋｇ体重（ＩＦＮα−１ｂ用量に等価なタンパク質）を、ｓ．ｃ．注射した。試験タンパク質の１回の皮下投与後、血液サンプルを、１１の時点で、ラット尾部の種々の叢から収集した。血清サンプルを、微小遠心分離によって全血から分離し、全てのサンプルが収集されるまで、−８０℃で凍結して保存した。血清におけるインターフェロンαを、ヒトインターフェロンα−特異的ＥＬＩＳＡサンドイッチイムノアッセイ（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ．）を用いて定量的に決定した。このイムノアッセイは、ラットＩＦＮ−αと交差反応がないことを実証する。
【０１１３】
ｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体の薬物速度論プロフィールを、図９に示し、主な薬物速度論データを、表６にまとめる。
【０１１４】
【表６】
2008509889.tif 000013
ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体およびｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体の主な薬物速度論パラメータは両方とも、未改変ＩＦＮα−１ｂについて観察されたパラメータとは異なっていた。曲線下面積（ＡＵＣ）は、未改変ＩＦＮα−１ｂのＡＵＣと比較して、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂについて４５倍、ｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂについて７５倍増大した。Ｔｍａｘは、未改変ＩＦＮα−１ｂのＴｍａｘと比較して、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂについて２０倍、ｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂについて２５倍増大した。Ｔ１／２（β）は、ｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体の両方について、９倍増大した。
【０１１５】
ＴｍａｘおよびＴ１／２（β）において、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体とｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体との間に統計的に有意な相違はなかった。しかし、ｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂについてのＡＵＣ、ＭＲＴおよびＣＬ／Ｆは、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂについてのＡＵＣ、ＭＲＴおよびＣＬ／Ｆより、有意に高かった。
【０１１６】
（実施例８：ｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂのインビボ抗腫瘍活性）
ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂおよびインターフェロンα−１ｂのインビボ抗腫瘍特性を、ヒト腫瘍細胞を移植したマウスにおける腫瘍増殖の阻害において決定した。胸腺欠損Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスに、２×１０６個のヒト腎臓腫瘍ＡＣＨＮ細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を皮下移植した。３週間置いて、腫瘍を確立させた。マウスに、反対側側腹部において、週１回（月曜日）各々５０μｇ、１５０μｇおよび３００μｇのｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂの投薬量を皮下注射したか、または、週３回（月曜日、水曜日および金曜日）５０μｇのＩＦＮα−１ｂを皮下注射した（表７）。マウスを、５週間処置した。腫瘍体積を、毎週月曜日に処置前に測定した。
【０１１７】
【表７】
2008509889.tif 000014
図１０に示されるように、処置の最初の４週間において、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂおよびＩＦＮα−１ｂは、偽薬コントロール群と比較して、ＡＣＨＮ腫瘍細胞を移植したマウスの腫瘍増殖を有意に阻害した。処置の５週目に、腫瘍増殖の阻害におけるｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂの初期用量応答が観察された。腫瘍増殖の阻害は、１５０μｇのｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂの週１回の注射と、５０μｇのＩＦＮα−１ｂの週３回の注射との間で、類似していた。
【０１１８】
本発明は、ここで完全に記載されたが、等価なパラメータ、濃度および条件の広い範囲内で、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、かつ過度の実験をせずに同じことが実施され得ることが、当業者によって理解される。
【０１１９】
本発明は、本発明の特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる改変が可能であることが理解される。本出願は、一般的な本発明の原則に従う、本発明の任意の変更、使用もしくは適合を網羅すること、ならびに、公知であるかまたは本発明が属する分野の範囲内で慣用的に実施され、かつ、特許請求の範囲に従う本明細書中上記の本質的な特徴に適用され得るような本開示からの発展を包含することを、意図される。
【０１２０】
本明細書中に引用された、雑誌の記事もしくは要旨、米国もしくは他国の公開または未公開の特許出願、発行された米国もしくは他国の特許、または任意の他の参考文献を含む全ての参考文献は、引用された参考文献中に存在する全てのデータ、表、図面および文章を含めて、本明細書中で参考として完全に援用される。さらに、本明細書中で引用された参考文献において引用されている参考文献の内容の全体もまた、参考として完全に援用される。
【０１２１】
公知の方法工程、従来の方法工程、公知の方法もしくは従来の方法の参照は、関連分野において、本発明の任意の局面、記載または実施形態が開示され、教示され、または示唆されていることをいかなる意味においても認めるものではない。
【０１２２】
特定の実施形態の上記記載は、他者が、当業者の知識（本明細書中に引用される参考文献の内容を含む）を当てはめることにより、過度の実験を行うことなく、本発明の一般概念から逸脱することなく、種々の用途のために特定の実施形態を容易に改変し得かつ／または適合させ得るという、本発明の一般的性質を完全に明らかにする。従って、このような適合および改変は、本明細書中に提示された教示および手引きに基づいて、本開示の実施形態の均等の意味および範囲の内にあることを意図される。本明細書中の専門語もしくは用語は、説明の目的であって限定の目的ではなく、本明細書中の専門語もしくは用語が、本明細書中の教示および手引きの観点において、当業者の知識と組み合わせて、当業者に解釈されるものであることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
以下の図面は、本発明の実施形態の説明であり、特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲を制限することを意図されない。
【図１Ａ】図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、ヒトインターフェロンα−１ｂのヌクレオチド配列（図１Ａ）、アミノ酸配列（図１Ｂ）、ならびにヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメント（図１Ｃ）を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、ヒトインターフェロンα−１ｂのヌクレオチド配列（図１Ａ）、アミノ酸配列（図１Ｂ）、ならびにヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメント（図１Ｃ）を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、ヒトインターフェロンα−１ｂのヌクレオチド配列（図１Ａ）、アミノ酸配列（図１Ｂ）、ならびにヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメント（図１Ｃ）を示す。
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂは、一本鎖ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−マレイミド（図２Ａ）および分枝鎖ｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−マレイミド（図２Ｂ）を有するインターフェロンα−１ｂのＣｙｓ８６−特異的一ペグ化についての結合体化メカニズムを示す。マレイミドの二重結合は、スルフヒドリル基によるアルキル化反応を受けて、安定的なチオエーテル結合を形成する。マレイミド二重結合に隣接する１つの炭素は、チオエーテルアニオンによる求核攻撃を受けて、さらなる産物を産生する。ｐＨ７において、スルフヒドリルとマレイミドとの反応は、アミンとマレイミドとの反応の速度よりも１０００倍早い速度で進行する。
【図２Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂは、一本鎖ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−マレイミド（図２Ａ）および分枝鎖ｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−マレイミド（図２Ｂ）を有するインターフェロンα−１ｂのＣｙｓ８６−特異的一ペグ化についての結合体化メカニズムを示す。マレイミドの二重結合は、スルフヒドリル基によるアルキル化反応を受けて、安定的なチオエーテル結合を形成する。マレイミド二重結合に隣接する１つの炭素は、チオエーテルアニオンによる求核攻撃を受けて、さらなる産物を産生する。ｐＨ７において、スルフヒドリルとマレイミドとの反応は、アミンとマレイミドとの反応の速度よりも１０００倍早い速度で進行する。
【図３】図３は、ｍＰＥＧ−ＩＦＮα−１ｂ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示す。レーン１およびレーン５は、タンパク質分子量マーカーを示し、レーン２は、未改変ＩＦＮα−１ｂを示し、レーン３は、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体を示し、そしてレーン４は、ｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体を示す。
【図４】図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃは、未改変ＩＦＮα−１ｂ（図４Ａ）、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体（図４Ｂ）、およびｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体（図４Ｃ）の、サイズ排除ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体（図５Ａ）、およびｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体（図５Ｂ）の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析を示す。
【図６】図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃは、未改変ＩＦＮα−１ｂ（図６Ａ）、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体（図６Ｂ）、およびｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体（図６Ｃ）の、カチオン交換ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図７】図７は、ＩＦＮα−１ｂのＣｙｓ８６−特異的一ペグ化の性質決定スキームを示す。精製されたｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体は、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃによって切断されて、Ｃｙｓ８６−ペグ化ペプチドを生成した。このＣｙｓ８６−ペグ化ペプチドは、アセトニトリル／ＴＦＡの勾配を用いる逆相ＨＰＬＣによって単離され、そしてサイズ排除ＨＰＬＣによってさらに精製された。Ｃｙｓ８６−ペグ化ペプチドの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣによって分析した。Ｃｙｓ８６−ペグ化ペプチドの分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−質量分析によって決定した。ペプチドのＣｙｓ８６−特異的一ペグ化は、Ｎ末端配列決定によって確認された。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、未改変ＩＦＮα−１ｂ（図８Ａ）およびｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ（図８Ｂ）を追跡した、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃペプチドマッピングの逆相ＨＰＬＣプロフィールを示す。未改変Ｃｙｓ８６含有ペプチドとして２９．１分のピークが示され（図８Ａ）、一方、Ｃｙｓ８６−ペグ化ペプチドとして４３．７分のピークが示される（図８Ｂ）。
【図９】図９は、１回の皮下投与後のラットにおける、未改変ＩＦＮα−１ｂ、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂおよびｍＰＥＧ２（４０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体の薬物速度論プロフィールを示す。
【図１０】図１０は、ヒト腎臓腫瘍ＡＣＨＮ細胞を皮下移植された胸腺欠損Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスにおける、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体および未改変ＩＦＮα−１ｂのインビボ抗腫瘍活性を示す。挿入部分は、腫瘍を移植されたマウスの処置において使用された、ｍＰＥＧ（２０ｋＤ）−ＩＦＮα−１ｂ結合体および未改変ＩＦＮα−１ｂの投薬量を示す。Ｘ軸およびＹ軸は、週および対応する腫瘍体積をそれぞれ示す。
【図１Ａ】
2008509889.tif 000015
【図１Ｂ】
2008509889.tif 000016
【図１Ｃ】
2008509889.tif 000017
【図２Ａ】
2008509889.tif 000018
【図２Ｂ】
2008509889.tif 000019
【図３】
2008509889.tif 000020
【図４】
2008509889.tif 000021
【図５】
2008509889.tif 000022
【図６】
2008509889.tif 000023
【図７】
2008509889.tif 000024
【図８】
2008509889.tif 000025
【図９】
2008509889.tif 000026
【図１０】
2008509889.tif 000027
【配列表】
2008509889000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月15日(2007.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008509889000001.app
【国際調査報告】
2008509889.tif 000030