(57)【要約】より広範囲のＡＴＰ濃度を検出することができる発光アッセイを提供する。本発明は、甲虫ルシフェラーゼたとえばホタルルシフェラーゼのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に対するＫｍを増加させることにより、０．０５ｍＭを超えるたとえば０．１ｍＭを超えるＡＴＰ濃度の、生物学的サンプル等のサンプル中のＡＴＰまたはＡＴＰ消費酵素等の分析物を検出するための発光組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、甲虫ルシフェラーゼ反応におけるＡＴＰ検出のための直線範囲を増加させることにより、生理学的サンプルを含む生物学的サンプル等のサンプル中の中程度、たとえば０．０５ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ濃度を測定することを提供する。
2008536519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のＡＴＰの存在または量を検出するための方法であって、
ａ）サンプルと、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物と、少なくとも２つのＡＴＰインヒビターとを接触させて光生成反応混合物を得る工程であって、前記インヒビターの１つがアデノシン誘導体であり、前記アデノシン誘導体が、前記甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを、前記アデノシン誘導体非存在下での前記ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍに比べて増加させるのに効果的な量で存在し、前記光生成反応混合物中の前記インヒビターの量が、前記少なくとも２つのインヒビターを欠いた対応する光生成反応の直線範囲を超えるＡＴＰ濃度を検出することができる光生成反応を提供する工程および
ｂ）前記光生成反応混合物中の発光の存在または量を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
第２のインヒビターがＡＴＰ非競合的インヒビターである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記少なくとも２つのインヒビターと前記サンプルとを、前記甲虫ルシフェラーゼ反応混合物と接触させる前に互いに接触させる、請求項１の方法。
【請求項４】
前記少なくとも２つのインヒビターと前記甲虫ルシフェラーゼ反応混合物とを、前記サンプルと接触させる前に互いに接触させる、請求項１の方法。
【請求項５】
前記ＡＴＰに対するＫｍが相乗的に増加する、請求項１の方法。
【請求項６】
前記甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍが、前記アデノシン誘導体非存在下での前記甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍに比べて約１．５倍を超えて増加する、請求項１の方法。
【請求項７】
発光が、前記サンプル中のＡＴＰの存在または量に関連づけられる、請求項１の方法。
【請求項８】
前記サンプルが、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の反応混合物を含み、前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素のＡＴＰに対するＫｍが、前記インヒビター非存在下での前記甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍと同じまたはそれより大きい、請求項１の方法。
【請求項９】
サンプル中の非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素の活性を検出するための方法であって、
ａ）非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の反応混合物を含むサンプルと、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物と、甲虫ルシフェラーゼ反応における少なくとも１つのＡＴＰ競合的インヒビターとを接触させて光生成反応混合物を得る工程であって、前記少なくとも１つのインヒビターが、前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素のＡＴＰに対するＫｍと同じまたはそれより大きい前記甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍをもたらす量で存在する工程および
ｂ）前記光生成反応混合物中の発光の存在または量を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記光生成反応混合物が第２のＡＴＰインヒビターをさらに含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記インヒビターが、前記甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを相乗的に増加させる、請求項８または１０の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのインヒビターがアデノシン誘導体である、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記光生成反応混合物が、前記アデノシン誘導体および第２のＡＴＰインヒビターを含む、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記光生成反応混合物における発光の存在または量と、前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素を含まない対応する光生成反応混合物または効果的な量の前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素のインヒビターを含む対応する光生成反応混合物とを比較する、請求項８または９の方法。
【請求項１５】
発光の存在または量が、前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素の存在または活性に関連づけられる、請求項８または９の方法。
【請求項１６】
前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素が、Ｐ糖タンパク質（Ｐｇｐ）、アデニリルシクラーゼ、またはキナーゼである、請求項８または９の方法。
【請求項１７】
前記甲虫ルシフェラーゼが耐熱性甲虫ルシフェラーゼである、請求項１または９の方法。
【請求項１８】
前記甲虫ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、請求項１または９の方法。
【請求項１９】
前記アデノシン誘導体がＡＭＰ、５’ＡＭＰＳ、ＡＤＰβＳ、またはデオキシアデノシン三リン酸である、請求項１または１２の方法。
【請求項２０】
前記アデノシン誘導体の濃度が約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項１または１２の方法。
【請求項２１】
前記インヒビターのうちの１つがＰＰｉである、請求項１または１０の方法。
【請求項２２】
前記光生成反応混合物が無機ピロホスファターゼのインヒビターをさらに含む、請求項２１の方法。
【請求項２３】
ＰＰｉの濃度が、約１０μＭ〜５００μＭである、請求項２１の方法。
【請求項２４】
前記サンプルが、単離された非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素を含む、請求項８または９の方法。
【請求項２５】
前記単離された非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素が、単離されたＰｇｐ、単離されたアデニリルシクラーゼ、または単離されたキナーゼである、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記サンプルが細胞溶解物である、請求項１または９の方法。
【請求項２７】
溶解した細胞が培養細胞である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記溶解した細胞が哺乳動物細胞である、請求項２６の方法。
【請求項２９】
前記サンプルが細胞下画分である、請求項１または９の方法。
【請求項３０】
非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素の１つまたは複数のモジュレーターを検出するための方法であって、
ａ）第１の光生成反応混合物からの発光と第２の光生成反応混合物からの発光とを比較する工程であって、
該第１の光生成反応混合物からの発光は、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素ならびに試験すべき１つまたは複数の化合物および／または反応条件を含む前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の反応混合物と少なくとも１つのＡＴＰインヒビターを含む甲虫ルシフェラーゼ反応混合物とを含み、
該第２の光生成反応混合物からの発光は、前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素を含むが、前記１つまたは複数の化合物を欠くおよび／または異なる反応条件にさらされる前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の反応混合物と前記少なくとも１つのインヒビターを含む甲虫ルシフェラーゼ反応混合物とを含み、
前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素のＡＴＰに対するＫｍが、前記少なくとも１つのインヒビター非存在下での前記甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍより大きく、各光生成反応における前記少なくとも１つのＡＴＰインヒビターが、前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素のＡＴＰに対するＫｍと同じまたはそれより大きい前記ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍをもたらす量で存在する工程、ならびに
ｂ）前記第１の光生成反応混合物における前記１つまたは複数の化合物および／または反応条件により前記第１の光生成反応混合物における発光が前記第２の光生成反応混合物に比べて変わるかどうかを検出するまたは測定する工程
を包含する、方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのインヒビターがアデノシン誘導体である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
２つのＡＴＰインヒビターが使用される、請求項３０の方法。
【請求項３３】
前記インヒビターが、前記ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを相乗的に増加させる、請求項３２の方法。
【請求項３４】
前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素が、Ｐｇｐ、アデニリルシクラーゼ、またはキナーゼである、請求項３０の方法。
【請求項３５】
前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の前記反応混合物が単離された非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素を含む、請求項３０の方法。
【請求項３６】
前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の前記反応混合物が細胞溶解物を含む、請求項３０の方法。
【請求項３７】
溶解した細胞が培養細胞である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記溶解した細胞が哺乳動物細胞である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
前記甲虫ルシフェラーゼ反応混合物が、少なくとも１つの因子を、前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素反応を選択的に消光する量でさらに含む、請求項３０の方法。
【請求項４０】
前記１つの因子が非イオン洗剤である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記１つの因子が、前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素反応のインヒビターである、請求項３９の方法。
【請求項４２】
関心のある別の分子の存在または量を検出する工程または測定する工程をさらに含む、請求項１または３０の方法。
【請求項４３】
前記光生成反応混合物が、無機ピロホスファターゼのインヒビターをさらに含む、請求項３０の方法。
【請求項４４】
組成物を備えるキットであって、該組成物は、
甲虫ルシフェラーゼ反応における少なくとも２つのＡＴＰインヒビターであって、１つのインヒビターがアデノシン誘導体であるＡＴＰインヒビターならびに
必要に応じて、１つまたは複数の以下の試薬：単離された甲虫ルシフェラーゼ、単離された非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素、甲虫ルシフェラーゼ基質および／または前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の基質、を含み、前記１つまたは複数の試薬が存在する場合、必要に応じて、別々に包装される、キット。
【請求項４５】
第２のインヒビターがＡＴＰ非競合的インヒビターである、請求項４４のキット。
【請求項４６】
前記甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを前記ＡＴＰインヒビターが増加させる光生成反応を行なうための使用説明書をさらに含む、請求項４４のキット。
【請求項４７】
前記組成物が置かれる適切な容器をさらに含む、請求項４４のキット。
【請求項４８】
前記単離された甲虫ルシフェラーゼ、前記単離された非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素、前記甲虫ルシフェラーゼ基質または前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素の基質が置かれる適切な容器をさらに含む、請求項４４のキット。
【請求項４９】
非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素反応用の選択的な消光試薬をさらに含む、請求項４４のキット。
【請求項５０】
前記アデノシン誘導体、前記第２のインヒビター、前記単離された甲虫ルシフェラーゼ、前記単離された非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素、前記甲虫ルシフェラーゼ基質、または前記非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素の前記基質のうちの少なくとも１つが凍結乾燥される、請求項４４のキット。
【請求項５１】
前記第２のインヒビターがＰＰｉである、請求項４４のキット。
【請求項５２】
無機ピロホスファターゼのインヒビターをさらに含む、請求項４４のキット。
【請求項５３】
ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを変える二価カチオン濃度を同定するための方法であって、
ａ）複数の二価金属の１つまたは複数の濃度での光生成反応における１つまたは複数のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを提供する工程であって、前記Ｋｍが、必要に応じて、ＡＴＰインヒビター非存在下のものである工程および
ｂ）前記光生成反応における前記反応の直線範囲において、選択されたＡＴＰに対するＫｍを有する少なくとも１つの二価金属および少なくとも１つのルシフェラーゼの濃度を同定する工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
ルシフェラーゼは、ホタル、発光細菌、クラゲ、およびその他多くのものを含む種々様々な生物中で発見されている。ルシフェラーゼは、生物発光として一般に知られているプロセスで、基質たとえばルシフェリンをオキシルシフェリンに酸化することにより光の生成を触媒する酵素である。ルシフェリン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、およびＯ２を消費する２段階反応を介してルシフェラーゼによる光子の生成が生じる。第１段階において、ルシフェラーゼは、ルシフェリンおよびＡＴＰからのルシフェリルアデニレートの形成を触媒する。この第１段階において、ピロリン酸が放出され、ルシフェラーゼが適切に作用するためにＭｇ２＋補因子または他の二価カチオンが必要とされる。ルシフェリルアデニレートは形成されるとルシフェラーゼの活性部位内にとどまる。次の段階において、ルシフェラーゼは、酸素の消費を伴って、ルシフェリルアデニレートを電子的に励起したオキシルシフェリンに酸化する。電子的に励起したオキシルシフェリンが基底状態のオキシルシフェリンに減衰するとき、光の生成が生じる。励起状態から基底状態への減衰が光子の放出と同時に起こる。生成される光の色は、ルシフェラーゼの源によって異なり、様々なルシフェラーゼの構造の相違によって決定されるように思われる。全反応については以下のとおりである。
【０００２】
【化１】
2008536519.tif 000003
非制限的な濃度のＤ−ルシフェリンおよびＭｇ２＋存在下で、反応のＡＴＰ依存性は、特徴的な最大反応速度の２分の１（Ｋｍ）および最大反応速度（Ｖｍａｘ）を有するミカエリス  メンテンの飽和反応速度式に従う。ＡＴＰを制限したルシフェラーゼ−ＡＴＰ量曲線の範囲内で、生じた発光の量の変化としてＡＴＰ濃度の変化を検出することができる。ＡＴＰ量曲線の直線または見かけ上の直線の部分（ＫｍまたはＫｍ未満）でＡＴＰ濃度を測定することは特に好都合である。発光は、ここで、ＡＴＰ濃度に正比例して変化する（たとえば、ＡＴＰが倍増すると発光が倍増する）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、サンプル中のＡＴＰの存在を検出するための１つの方法はＡＴＰ駆動型ルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を利用することである。無視できるくらいの少量のＡＴＰを検出するためにルシフェラーゼを使用することができるが、ＡＴＰ量曲線の上端ではＡＴＰ濃度が変化しても発光は変化しないので、ＡＴＰ濃度を検出するためのルシフェラーゼベースのアッセイはＡＴＰ量曲線の上端において（たとえばＡＴＰ曲線における飽和範囲において）制限されることになる。
【０００４】
必要となるのは、サンプル中のより高濃度のＡＴＰをたとえばサンプルを希釈することなく検出するための生物発光アッセイである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、甲虫ルシフェラーゼたとえばホタルルシフェラーゼのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に対するＫｍを増加させることにより、０．０５ｍＭを超えるたとえば０．１ｍＭを超えるＡＴＰ濃度の、生物学的サンプル等のサンプル中のＡＴＰまたはＡＴＰ消費酵素等の分析物を検出するための発光組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、甲虫ルシフェラーゼ反応におけるＡＴＰ検出のための直線範囲を増加させることにより、生理学的サンプルを含む生物学的サンプル等のサンプル中の中程度、たとえば０．０５ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ濃度を測定することを提供する。
【０００６】
本明細書に記載されているように、無機ピロリン酸（たとえばＰＰｉ）およびアデノシン誘導体等の甲虫ルシフェラーゼインヒビターを含む因子は、発光アッセイにおけるＡＴＰ検出のための直線範囲を拡大することができる。たとえば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン５’−Ｏ−チオ一リン酸（５’−ＡＭＰＳ）、アデノシン５’−［β−チオ］二リン酸（ＡＤＰβＳ）、およびデオキシアデノシン三リン酸はそれぞれ、ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍをたとえば１０倍増加させたので、耐熱性甲虫ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ１４６−１Ｈ２と呼ばれる耐熱性ルシフェラーゼを含む多数の耐熱性ルシフェラーゼについて記載している米国特許第６６０２６７７号を参照）媒介光生成反応の競合的インヒビターとされた。ＰＰｉはルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍに著しく影響を及ぼすことなく（２倍以下）、Ｖｍａｘを減少させたので、光生成反応における耐熱性ルシフェラーゼのＰＰｉによる阻害は明らかに非競合的なものであり、一方、光生成反応における天然の甲虫ルシフェラーゼのＰＰｉによる阻害は、ある種の二価金属存在下で競合的なものであった。驚いたことに、ＰＰｉおよびＡＭＰ、５’−ＡＭＰＳ、またはＡＤＰβＳをホタルルシフェラーゼ反応混合物中で組み合わせることにより、ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍが相乗的に増加し、値は、ＰＰｉ存在下ではＰＰｉの非存在下よりも何倍も高かった。このように、ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを、天然の低度のレベル（通常１０〜２０μＭ）からはるか高度のレベル（約３０ｍＭまたは４０ｍＭまで）まで増加させ、ＡＴＰ検出のための直線範囲を拡大することができる。したがって、甲虫ルシフェラーゼ光生成反応における１つまたは複数のＡＴＰインヒビターの濃度を変動させることにより、ＡＴＰ検出のための直線範囲を選択することができる。特に、ＰＰｉおよびアデノシン誘導体の組み合わせによるＫｍの増加は、アデノシン誘導体のみで達成されたものよりも著しく大きい。ルシフェラーゼによるＡＴＰ検出のための直線範囲の増加率は、ＰＰｉおよびアデノシン誘導体存在下でのＫｍの増加率とほぼ同じである。さらに、いくつかの反応については、Ｍｇ以外の二価カチオンたとえばＣａおよび１つのＡＴＰインヒビターたとえばＡＭＰを甲虫ルシフェラーゼ光生成反応において使用することにより、ＡＴＰ検出のための直線範囲を拡大することができる光生成反応（ｌｕｍｉｎｏｇｅｎｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）混合物が得られる。
【０００７】
このように、本発明は、サンプル中の分析物の存在または量を直接的または間接的に検出するための方法を提供する。一実施形態において、本発明は、サンプル中のＡＴＰの存在または量を検出するための方法を提供する。この方法は、サンプルたとえばＡＴＰを有すると思われるサンプル、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物、および少なくとも１つのたとえば２つ以上のＡＴＰインヒビター（複数可）を接触させて光生成反応混合物を得ることを含む。一実施形態において、インヒビターはＡＴＰの非競合的インヒビターであってもよい。一実施形態において、インヒビターは、無機ピロリン酸たとえばＰＰｉまたはμ−モノチオピロリン酸等のその誘導体であってもよい（Ｈａｌｋｉｄｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：１０３１３頁（１９９１年））。一実施形態において、インヒビターはＡＴＰ競合的インヒビターであってもよい。一実施形態において、インヒビターはアデノシン誘導体であってもよい。一実施形態において、光生成反応混合物は１種以上のインヒビターを含んでおり、インヒビターのうちの一方がＡＴＰ非競合的インヒビターであり、他方がＡＴＰ競合的インヒビターである。一実施形態において、ＡＴＰ競合的インヒビターであるアデノシン誘導体および必要に応じて他のＡＴＰインヒビターは、サンプルと接触する前に、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物と接触させる。他の実施形態において、競合的インヒビターであるアデノシン誘導体および必要に応じて他のインヒビターは、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物と接触する前に、サンプルと接触する。本明細書において使用されている「甲虫ルシフェラーゼ反応混合物」は、甲虫ルシフェラーゼ光生成反応のための試薬たとえばキタアメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）、ヒカリコメツキ（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）、またはフォツリス  ペンシルバニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）のルシフェラーゼ等の甲虫ルシフェラーゼであって、組換え耐熱性ルシフェラーゼおよび／または突然変異甲虫ルシフェラーゼ等の組換え甲虫ルシフェラーゼを含む甲虫ルシフェラーゼ、適切なルシフェラーゼ基質たとえばＤ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリン等の修飾ルシフェリン基質、ならびに二価カチオンを含んでいる。一実施形態において、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物は実質的にＡＴＰを欠いていてもよく、たとえば約０．０１ｐｇ未満（２×１０−１７モル未満）のＡＴＰを有していてもよく、そのため、甲虫ルシフェラーゼ光生成反応のためのＡＴＰはサンプルにより全般的に提供されることになる。しかしながら、他の実施形態において、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物が０．０１ｐｇを超えるＡＴＰを含んでいてもよく、その場合、たとえばサンプル中のＡＴＰを定量するために、対照の光生成反応すなわち試験サンプルなしの反応からの発光の量を、試験サンプルを含む光生成反応における発光から差し引いてもよい。光生成反応混合物中にＡＴＰ競合的インヒビターであるアデノシン誘導体が存在すると、その量は、たとえば少なくとも１．５、２、５、１０、１００、もしくは１０００倍またはそれより大きく、ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを、アデノシン誘導体非存在下のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍに比べて増加させるのに効果的となる。一実施形態において、光生成反応混合物中に、２つ以上のＡＴＰインヒビターたとえばＡＴＰ非競合的インヒビターおよびＡＴＰ競合的インヒビターが存在することにより、ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍが相乗的に増加する。サンプル中のＡＴＰの存在または量が、たとえば発光を検出または測定することにより検出または測定される。０．１ｍＭ〜５ｍＭおよび０．２５ｍＭ〜５ｍＭを含む０．０５〜５ｍＭならびに約４０ｍＭまでのサンプル中のＡＴＰ濃度を本発明の方法および組成物を使用して測定することができる。
【０００８】
本発明は、さらに、ＡＴＰ消費酵素反応における分析物の存在または量を検出するための方法も提供する。一実施形態において、この方法は、サンプル中の非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素の存在、量、または活性を検出することを含む。この方法は、光生成反応混合物を産出するために、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の反応混合物を有し、必要に応じて、細胞溶解物または細胞下画分を含む他の成分を含んでもよいサンプル、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物、および甲虫ルシフェラーゼ反応における１つまたは複数のＡＴＰインヒビターたとえば２つのＡＴＰインヒビターを接触させることを含む。一実施形態において、インヒビターはＡＴＰ非競合的インヒビターであってもよい。一実施形態において、インヒビターは無機ピロリン酸であってもよい。一実施形態において、インヒビターはＡＴＰ競合的インヒビターであってもよい。一実施形態において、インヒビターはアデノシン誘導体であってもよい。他の実施形態において、２つのＡＴＰインヒビターが光生成反応において使用されており、一方がＡＴＰ非競合的インヒビターであり、他方が、ＡＴＰ競合的インヒビターであるアデノシン誘導体である。本明細書において使用されている「非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の反応混合物」は、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素を含み、必要に応じて、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素反応用の１つまたは複数の他の試薬を含んでおり、たとえば、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用のＡＴＰおよび／または基質がサンプル中に存在してもよくまたはサンプルに加えられてもよい。非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の反応混合物中のＡＴＰは、１つまたは複数のＡＴＰインヒビターを含まない甲虫ルシフェラーゼ反応混合物と後に組み合わせたときに甲虫ルシフェラーゼ媒介反応の直線範囲の外側になる量で存在する。光生成反応混合物中にアデノシン誘導体等の競合的インヒビターが存在すると、その量は、ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを、競合的インヒビター非存在下のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍに比べて増加させるのに効果的な量である。発光の存在または量が検出または測定される。一実施形態において、光生成反応混合物中に２つのインヒビターたとえばＡＴＰ非競合的インヒビターおよびＡＴＰ競合的インヒビターが存在することにより、ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍが相乗的に増加する。必要に応じて、発光の存在または量を、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素を欠く対応する光生成反応における発光または非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素および効果的な量の非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素インヒビターを含んでいる対応する光生成反応における発光と比較する。
【０００９】
本発明の範囲内における非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素は、１つまたは複数の甲虫ルシフェラーゼよりも高い、ＡＴＰに対するＫｍを有する酵素である。一実施形態において、非制限的なＡＴＰ濃度（Ｖｍａｘ）で非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素を検出するために、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素は、（インヒビター（複数可）非存在下の）甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍよりも少なくとも５倍たとえば少なくとも１０倍高い、ＡＴＰに対するＫｍを有している。他の実施形態において、ＫｍのＡＴＰ濃度で非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素を検出するために、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素は、ＡＴＰに対するＫｍが、（インヒビター（複数可）非存在下の）甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍの２倍以下である。一実施形態において、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素は、ＡＴＰに対するＫｍが約０．０１ｍＭ〜約３ｍＭである。一実施形態において、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素は膜結合タンパク質である。他の実施形態において、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素はアデニリルシクラーゼである。さらに他の実施形態において、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素は、キナーゼたとえばプロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、またはＰＩ３キナーゼであり、チロシンキナーゼ、カルシウム／カルモジュリンプロテインキナーゼ、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、またはｃｄｃ２キナーゼを含んでいる。サンプル中の非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素は、単離されたまたは精製された非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素であってもよい。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、サンプル中の非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素の活性を検出するための方法を提供する。この方法は、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の反応混合物を含むサンプルを提供することを含む。次いで、光生成反応混合物を得るために、この反応混合物を、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物および甲虫ルシフェラーゼ反応における少なくとも１つのＡＴＰ競合的インヒビターと接触させる。少なくとも１つのインヒビターが、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素のＡＴＰに対するＫｍと同じまたはそれより高い、甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍをもたらす量で存在する。次いで、光生成反応混合物中の発光の存在または量が検出または測定される。
【００１１】
１つあるいは複数のモジュレーターたとえば１つあるいは複数のインヒビターあるいは活性剤あるいはｐＨまたはイオン強度等の反応条件は、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素の活性を変えるが、これらを検出するための方法もさらに提供される。この方法は、酵素ならびに１つまたは複数の化合物および／または試験条件を有する非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の反応混合物ならびに少なくとも１種のＡＴＰインヒビターたとえばＡＴＰ非競合的インヒビターおよび／またはアデノシン誘導体等のＡＴＰ競合的インヒビターを含む甲虫ルシフェラーゼ反応混合物を含む第１の光生成反応混合物からの発光を、酵素を含む（が、いかなる化合物をも含まないまたは試験反応条件下ではない）非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素用の反応混合物および対応するＡＴＰインヒビター（複数可）を有する甲虫ルシフェラーゼ反応混合物含む第２の光生成反応混合物からの発光と比較することを含んでいる。各光生成反応混合物中にアデノシン誘導体等の競合的インヒビターが存在すると、その量は、ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを、アデノシン誘導体非存在下のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍに比べて増加させるのに効果的な量であり、また、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素のＡＴＰに対するＫｍと同じにまたはそれより高くするためにルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを増加させるのに効果的な量である。次いで、１種または複数の化合物および／または反応条件により、第１の光生成反応における発光が第２の光生成反応に比べて変わるかどうかについて測定する。一実施形態において、各光生成反応混合物中に、２つのＡＴＰインヒビターたとえばＡＴＰ非競合的インヒビターおよびＡＴＰ競合的インヒビターが存在することにより、ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍが相乗的に増加する。第１の光生成反応混合物における発光の相対的な増加は、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素のインヒビターによるものであることを示し、相対的な減少は活性剤によるものであることを示す。一実施形態において、甲虫ルシフェラーゼが耐熱性甲虫ルシフェラーゼである。一実施形態において、甲虫ルシフェラーゼが天然の甲虫ルシフェラーゼである。
【００１２】
一実施形態において、本発明はキットを提供する。このキットは、ＡＴＰ競合的インヒビターであるアデノシン誘導体およびＡＴＰの非競合的または他の競合的インヒビター等の甲虫ルシフェラーゼ光生成反応における少なくとも２つのＡＴＰインヒビターを含む組成物を含んでいる。この組成物は、必要に応じて適切な容器中に置かれ、必要に応じて、組成物またはキットが、甲虫ルシフェラーゼ、甲虫ルシフェラーゼ基質、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素、および／または非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素の基質のうちの少なくとも１つを含んでいる。組成物は、凍結乾燥されてもよく、または水溶液としてもよい。
【００１３】
ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを変える二価カチオンの濃度を同定する方法もさらに提供される。この方法は、複数の二価金属の１つまたは複数の濃度での光生成反応における、１つまたは複数のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを、必要に応じてＡＴＰインヒビター非存在下で提供することを含んでいる。次いで、光生成反応において選択されたＡＴＰに対するＫｍを有する少なくとも１つの二価金属および少なくとも１つのルシフェラーゼの濃度が特定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
定義
「分析物」は、試験サンプル中の検出される物質であるが、本明細書において使用されている場合、甲虫ルシフェラーゼまたはこれに対応するルシフェリン基質を含んでいない。発光反応は、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ＡＴＰアーゼ、グリコシダーゼ、およびＡＴＰまたはＮＡＤＨ等の様々な代謝産物等の分析物を検出し、定量するために使用することができる。
【００１５】
本明細書において使用されている「光生成アッセイ」は、特定の分子の存在に基づいて光を生成し、甲虫ルシフェラーゼを使用する任意のアッセイを含む。光生成アッセイにより、他の分子（分析物）の量または存在を直接的または間接的に検出たとえば測定してもよい。たとえば、一実施形態において、ＡＴＰを検出するために、甲虫ルシフェラーゼおよび適切なルシフェリン基質を光生成アッセイに使用してもよく、一方、他の実施形態において、ＡＴＰを生成するまたは消費する分析物を検出するために、甲虫ルシフェラーゼおよび適切なルシフェリン基質を光生成アッセイに使用してもよい。
【００１６】
本明細書において使用されている用語「消光する」は、酵素触媒反応を阻害するまたは阻止することを意味し、この阻害または阻止は直接的にまたは間接的にのどちらで生じてもよい。反応を消光するために使用することができる因子が「消光剤」として知られている。選択的に反応を消光する因子とは、少なくとも１つの濃度で１つの反応を消光するがすべての反応を消光するわけではない因子のことをいう。たとえば、一実施形態において、選択的なクエンチ剤は、非甲虫ルシフェラーゼ触媒反応を阻害する量で存在するが、甲虫ルシフェラーゼ触媒反応に対する消光作用を実質的に有していない。
【００１７】
「アデノシン誘導体」には、塩基としてアデニンあるいは修飾アデニンたとえばアジドアデニンおよびリボース、デオキシリボース、あるいは２’位にメトキシ基（ＭｅＯ）のあるリボース等のこれらの修飾体を含む糖を有する一リン酸型ヌクレオチド、二リン酸型ヌクレオチド、または三リン酸型ヌクレオチドが含まれる。
【００１８】
用語「単離された」は、酵素に関して使用される場合、少なくとも１つの混在物質から特定され分離される、通常混在物質と共に存在する分子のことを言う。したがって、単離された酵素は、自然界で発見されるものとは異なる形態または環境で存在していることになる。
【００１９】
本明細書において使用されているように、「実質的に純粋な」または「精製された」とは、目的種が主に存在する種であることを意味し（つまり、モルベースまたは目的種の活性ベースで、目的種は、組成物中の他のいかなる個々の種よりも豊富である）、好ましくは、実質的に精製された画分は、存在するすべての高分子種のうち少なくとも約５０パーセント（モルベースで）を目的種が構成する組成物である。通常、実質的に純粋な組成物または精製された組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種が約８０パーセント超、より好ましくは約８５％、約９０％、約９５％、および約９９％超を構成するであろう。最も好ましくは、目的種は本質的に均質に精製されており（混在物質種は、組成物中で、従来の検出方法により検出することができない）、この組成物は本質的に単一の高分子種からなる。
【００２０】
本発明は、ＡＴＰ消費酵素反応においてより高度なレベルのＡＴＰまたは分析物を検出するのに使用するために、ルシフェラーゼベースの発光における既存のＡＴＰ検出技術の有用性を広げるための組成物および方法を提供する。たとえば、上記の組成物および方法は、検出システムの直線範囲にＡＴＰレベルを至らせるための希釈段階なしでサンプル中のより高度なＡＴＰレベルを測定するのに有用である。さらに、この組成物および方法は、ＡＴＰを消費する酵素たとえば甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍとほぼ同じまたはそれよりも高い、ＡＴＰに対するＫｍを有する酵素等の分析物の量または活性を検出するまたは測定するのにも有用である。一実施形態において、非甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍは、少なくとも１０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、またはそれより大きい。例示的な非甲虫ルシフェラーゼ酵素には、他のＡＴＰ依存性の輸送体およびイオンポンプだけでなくＰ糖タンパク質、アデニリルシクラーゼ、およびキナーゼも含まれる。非制限的なＡＴＰ濃度で非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素をアッセイすることは概して望ましく、このＡＴＰ濃度は、ＡＴＰに対するルシフェラーゼ用量反応の直線範囲の外側にあってもよい。甲虫ルシフェラーゼ反応において、ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを増加させるのに効果的な量で、ＡＴＰ非競合的インヒビターおよび／またはＡＴＰ競合的インヒビターである１つまたは複数の甲虫ルシフェラーゼインヒビターを使用することにより、ＡＴＰ飽和濃度を含む関心のある酵素に関するより高いＡＴＰ濃度を包含するようＡＴＰ検出のための直線範囲を調節することができる。したがって、甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ検出システムおよび１つまたは複数のＡＴＰインヒビターを使用して、より高い濃度のＡＴＰおよび／または関心のある酵素の活性を検出してもよい。たとえば、甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ検出システムおよび１つまたは複数のＡＴＰインヒビターを使用し、ＡＴＰを消費する酵素の活性を、ルシフェラーゼの直線範囲よりも高いＡＴＰ濃度でのＡＴＰ消費と相関する発光シグナルの減少として観察してもよい。
【００２１】
一実施形態において、サンプル中のＡＴＰの存在または量を検出するために、光生成反応混合物が調製される。この光生成反応混合物は、サンプル、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物、および少なくとも１種のたとえば少なくとも２つのＡＴＰインヒビターを含んでいる。一実施形態において、光生成反応混合物は、ＡＴＰ非競合的インヒビターおよび／またはＡＴＰ競合的インヒビターを含んでいる。他の実施形態において、光生成反応混合物は、少なくとも２つのＡＴＰ競合的インヒビターを含んでいる。サンプルは、細胞サンプル、細胞溶解物、膜画分、Ｓ１０画分、Ｓ１００画分、もしくはＳ１５０画分等の細胞下画分、単離されたもしくは精製されたＡＴＰ、生理学的流体サンプル、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳における混合物または精製されたＡＴＰアーゼもしくはキナーゼ等の精製された酵素であってもよい。サンプルを、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物と混合する前に、非競合的インヒビターおよび／または競合的インヒビターを含む１つまたは複数のインヒビター（複数可）と混合してもよい。あるいは、１つまたは複数のインヒビターたとえば非競合的インヒビターおよび／または競合的インヒビター（複数可）をサンプルと混合する前に甲虫ルシフェラーゼ反応と混合してもよい。さらに他の実施形態において、サンプル、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物、ならびに１つまたは複数のインヒビターたとえば非競合的および／または競合的インヒビター（複数可）は同時に組み合わせられる。次いで、発光が検出または測定される。必要に応じて、サンプル、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物、および１つもしくは複数のインヒビターのいずれかが接触する前からまたはサンプル、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物、ならびに非競合的インヒビターおよび／あるいは競合的インヒビターを含む１つあるいは複数のインヒビターのうちの２つ以下のものが接触する前から（対照として）１つまたは複数の時点で発光測定がなされてもよく、また、サンプル、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物、および／または１つもしくは複数のインヒビターが組み合わされた後いつでも（１つまたは複数の時点で）発光測定がなされてもよい。一実施形態において、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物および１つまたは複数のインヒビターと様々な濃度のＡＴＰをそれぞれ組み合わせ、標準曲線を作成する。上記曲線を、サンプルたとえば細胞溶解物中のＡＴＰ濃度を測定するために使用してもよい。本明細書に記載された拡大された直線性のＡＴＰアッセイにおける発光がＡＴＰ濃度に比例するので、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物およびインヒビター（複数可）で希釈した後にも中程度になるＡＴＰ濃度を含んでもよいサンプル中のＡＴＰ濃度を測定することができる。一実施形態において、少なくとも２つのインヒビターがアッセイに使用され、一方のインヒビターが、甲虫ルシフェラーゼ反応におけるＡＴＰ競合的インヒビターたとえばアデノシン誘導体であり、他方が、ＰＰｉ等の無機ピロリン酸である。インヒビター（複数可）の量は、甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを、ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍに比べて、たとえば、インヒビター（複数可）非存在下のルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍに比べて少なくとも１．５倍増加させるのに効果的である。
【００２２】
中程度のまたは高いＡＴＰ濃度により最大活性がもたらされるＡＴＰアーゼ（すなわち、中程度のまたは高い、ＡＴＰに対するＫｍを有する酵素）によるＡＴＰ消費量を測定するために、ＡＴＰ検出のために増加させた直線範囲に適した発光反応混合物を使用することができる。上記酵素の１つの例として、多剤排出トランスポーターであるＰ糖タンパク質（ＰｇｐまたはＭＤＲ１）が挙げられる。Ｐｇｐは、広範囲の薬物に対するＡＴＰ依存性の排出ポンプであり、多重薬物抵抗性およびある種の有害な薬物−薬物相互作用に重要な役割を果たしている。Ｐｇｐにより輸送される薬物は、ＡＴＰアーゼ活性の刺激物質として同定することができる。４〜５ｍＭのＡＴＰが最大のＰｇｐ  ＡＴＰアーゼ活性をもたらし、このＡＴＰ濃度は、ＡＴＰ検出のための甲虫ルシフェラーゼたとえば耐熱性ルシフェラーゼの直線範囲よりも高い。甲虫ルシフェラーゼ反応混合物にＡＭＰ等のアデノシン誘導体およびＰＰｉを加えることにより、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰアーゼの最大活性とするより高いＡＴＰ濃度を含むよう直線範囲を拡大することができる。Ｐｇｐ  ＡＴＰアーゼアッセイは、Ｐｇｐ  ＡＴＰアーゼを有するまたは有すると思われるサンプルにＡＴＰを最初に加えることにより行なってもよい。一般に、陽性対照サンプルは単離されたＰｇｐを含んでおり、単離されたＰｇｐは、Ｐｇｐを発現させる細胞からの膜画分として通常提供される。非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費アッセイを任意の期間たとえば０分から１時間以上までインキュベートしてもよい。次いで、この第１の反応は、１つまたは複数のＡＴＰインヒビターたとえばＡＴＰ非競合的インヒビターおよび／またはＡＴＰ競合的インヒビターを含む甲虫ルシフェラーゼ反応混合物ならびに必要に応じて非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費反応の１つまたは複数のクエンチャーと組み合わせられ、拡大された直線範囲が提供される。必要に応じて、非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素反応は、非競合的インヒビターおよび／または競合的インヒビターを含むインヒビター（複数可）ならびに／あるいは甲虫ルシフェラーゼ反応混合物を加える前に消光される。甲虫ルシフェラーゼ反応混合物はさらに、必要に応じて、１種または複数のピロホスファターゼインヒビターを含んでいてもよい。ＰｇｐによるＡＴＰ消費は、Ｐｇｐ  ＡＴＰアーゼ活性を欠くサンプルに比べて、甲虫ルシフェラーゼ反応からの発光の減少として検出される。Ｐｇｐ  ＡＴＰアーゼを刺激する薬物により、発光が、薬物なしのサンプルに比べてより大きく減少し得る。Ｐ糖タンパク質は、多数の薬物の排出に影響を及ぼすＡＴＰ依存性の薬物排出ポンプであるので、この糖タンパク質の基質およびインヒビターもまたＡＴＰアーゼ活性に対する影響により同定することができる。
【００２３】
類似するアッセイを他のＡＴＰアーゼに使用してもよい。一実施形態において、最大活性に対し比較的高いＡＴＰ濃度を有するキナーゼ（すなわち、ＡＴＰに対して高いＫｍを有する酵素）によるＡＴＰ消費量を測定するために、ＡＴＰ検出のために増加させた直線範囲を使用することができる。さらに他の実施形態において、最大活性に対し比較的高いＡＴＰ濃度を有するアデニリルシクラーゼによりＡＴＰ消費量を測定するために、ＡＴＰ検出のために増加させた直線範囲を使用することができる。アッセイはまた、それらＡＴＰアーゼの基質、活性剤、および／またはインヒビターを同定するまたは検出するために使用することもできる。
【００２４】
ＡＴＰまたは非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素が、サンプルたとえば細胞を含むまたは細胞溶解物であるサンプル中に存在してもよい。本発明の範囲内の細胞には、植物細胞および脊椎動物細胞たとえば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ネコ、イヌ、ミンク、げっ歯類、または鳥類の細胞を含むがこれらに限定されない哺乳動物細胞を含む原核細胞および真核細胞が含まれる。一般に、細胞を含むサンプルは、サンプル中の細胞を透過処理するまたは溶解させるために処理される。このように、ＡＴＰまたは細胞表面に存在しないもしくはそうでなければアッセイ試薬に到達できない細胞質ゾルもしくは他の酵素を検出するために、それらの細胞または細胞下画分を破壊することが好ましい。それらの細胞または細胞下画分を透過処理、溶解、または破壊するための方法は当技術分野においてよく知られている。超音波処理器（超音波発生装置）およびフレンチプレスを含む種々様々の機器が機械的な破壊に利用可能である。浸透圧衝撃により、一連の凍結融解サイクルまたは周囲のイオン強度の急速な変更等の処理により、あるいはリゾチームのような酵素または洗剤もしくは界面活性剤等の化学因子等の細胞膜を直接破壊する因子ならびにポリミキシンＢおよびクロルヘキシジン等の抗菌性物質の使用により、細胞を破壊することができる。上記化学試薬は市販で入手可能であり、通常、「エクストラクタント」と呼ばれている。代表的なエクストラクタントとして、ＣＴＡＢ（セチルトリメチル臭化アンモニウム）等の一般的なカチオン洗剤、ドデシル硫酸ナトリウム等のアニオン洗剤、ポロキシエチレンアルキルフェニルエーテル等の非イオン界面活性剤（たとえば、Ｔｒｉｔｏｎｓ（商標）、Ｓｉｇｍａ社より、セントルイス、Ｍｏ．）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）、たとえばＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９、ノノキシノール、あるいは硫酸ポリミキシンＢまたはクロルヘキシジン等の他の物質、ならびにＥｘｔｒａｃｔａｎｔ（商標）（Ｆ３５２Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、Ｗｉｓ．）およびＣｅｌｓｉｓ−Ｌｕｍａｃ（１２９０１４２、Ｃｅｌｓｉｓ社、エバンストン、Ｉｌｌ．）等の所有権付き配合成分が挙げられる。細胞を破壊するのに使用する上記浄剤の代表的な濃度は水溶液中約０．０１％〜１０．０％である。カチオン洗剤は、他のすべての種類の細胞の内容物に加えて真核細胞の内容物も放出させることが知られている。対照的に、非イオン洗剤の使用が、他の種類の細胞を妨害することなく真核細胞から物質を放出させるのに効果的である。したがって、細菌細胞と真核細胞を区別することができる。
【００２５】
一実施形態において、サンプルは単離されたまたは精製されたＡＴＰあるいは単離されたまたは精製された非甲虫ルシフェラーゼＡＴＰ消費酵素を含んでおり、たとえば、サンプルは膜画分等の細胞下画分である。
【００２６】
ルシフェラーゼ／ルシフェリン反応は当技術分野においてよく知られており、必要な試薬を使用するためのプロトコールだけでなく必要な試薬を市販している供給源もある。たとえば、ルシフェラーゼと共にいくつかのルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬がＰｒｏｍｅｇａ社、マディソン、Ｗｉｓ．から入手可能である。市販で入手可能なルシフェラーゼには、野生型ルシフェラーゼおよびたとえば変異誘発または組換えによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで修飾されたルシフェラーゼを含む組換えルシフェラーゼが含まれる。一実施形態において、耐熱性ルシフェラーゼが使用されてもよい。耐熱性ルシフェラーゼは、細胞を透過処理するために使用される物質の不安定化作用に通常抵抗性があり、いくつかの混在活性を熱変性により低下させてもよい。
【実施例】
【００２７】
本発明について、以下の非限定的な実施例により説明することとする。
（実施例Ｉ）
直線性の拡大された発光ＡＴＰアッセイにおける２つの異なるルシフェラーゼの使用
ＡＴＰに対するＫｍおよび飽和濃度の増加をもたらす甲虫ルシフェラーゼ発光反応混合物を作製し、それにより直線的なＡＴＰ検出範囲を増加させるために、可能性のあるＡＴＰ競合的ルシフェラーゼインヒビターについて試験した。競合的酵素インヒビターは競合する基質のＫｍをＶｍａｘに影響を及ぼさずに増加させるものと思われる。アデノシン誘導体およびＰＰｉを、ルシフェラーゼインヒビターとして、甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍに対する効果について試験した。
【００２８】
材料と方法
図１および表１に示すデータの反応混合物には、０．２ｍｇ／ｍｌの耐熱性ルシフェラーゼ（米国特許第６６０２６７７号を参照；Ｌｕｃ１４６−１Ｈ２）、２０ｍＭのＮａ３Ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ６．０）、５５ｍＭのモルホリノエタンスルホン酸（ｐＨ６．０）、１１ｍＭのＭｇＳＯ４、２．５ｍＭの（４Ｓ）−４，５−ジヒドロ−２−（６−ヒドロキシベンゾチアゾリル）−４−チアゾールカルボン酸（Ｄ−ルシフェリン）、０．６ｍＭの１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、１％のブタコラーゲン（Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標））、および０〜２．５ｍＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が含まれた。ＡＭＰおよびＰＰｉが存在する場合、それらをそれぞれ１ｍＭおよび５０μＭとした。室温（２３℃）で反応を実行した。
【００２９】
結果
ホタルルシフェラーゼ反応混合物中にＡＭＰおよびＰＰｉが存在することにより、ＡＴＰ濃度が増加するにつれて直線的に増加する相対発光量（ＲＬＵ）がもたらされた。図１および表１について、示した１ｍＭのＡＭＰおよび５０μＭのＰＰｉを加えた状態でまたはＡＭＰおよびＰＰｉの非存在下（ＮＴ）で、耐熱性ルシフェラーゼ（フォツリス  ペンシルバニカからのルシフェラーゼの組換え突然変異型）反応を、０〜２．５ｍＭのＡＴＰ濃度で行った。線形回帰を、ＡＴＰ濃度の全範囲およびＡＴＰ濃度の様々な部分的な範囲で行った。Ｒ２値を直線性の定量的測度として表１に示す。さらに、ＡＴＰに対するＫｍを算出するために双曲線関数（Ｙ＝Ｖｍａｘ・Ｘ／（Ｋｍ＋Ｘ）、式中Ｘ＝［ＡＴＰ］、Ｙ＝ＲＬＵ）にデータをフィットさせた。双曲線フィットから求めたＫｍ（μＭ）値を括弧中に示す。この分析により、Ｋｍが増加することに明確に関連して直線性が向上することが明らかとなり、ＡＭＰおよびＰＰｉが相乗的に作用し、ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍが相乗的に増加することにより直線性が向上することが示唆された。
【００３０】
【化２】
2008536519.tif 000004
ＡＭＰおよびＰＰｉの組み合わせに加えて、アデノシン５’−［β−チオ］二リン酸（ＡＤＰβＳ）、アデノシン５’−Ｏ−チオ一リン酸  （５’ＡＭＰＳ）、およびデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）とＰＰｉとの組み合わせもまた、直線性を向上させ、耐熱性ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを増加させるよう相乗的に作用した（表２）。これは、ＡＭＰに加え、二リン酸および三リン酸を含む他のアデノシン誘導体がルシフェラーゼアッセイにおいてＰＰｉと相乗作用を示し、ＡＴＰ検出のための直線性を向上させることができることを実証するものである。ＡＴＰ濃度の範囲が０〜１．６７ｍＭであることを除き上記に説明したように表２のデータを導き出した。表３のデータは、０〜１．６７ｍＭおよび０〜２．５ｍＭのＡＴＰ濃度の範囲を含んでいる。
【００３１】
【化３】
2008536519.tif 000005
【００３２】
【化４】
2008536519.tif 000006
耐熱性ルシフェラーゼのさらなる実験において、ＭｇＳＯ４を、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＳｒＣｌ２、またはＮｉＣｌ２と置換した（表４）。様々な金属で基本的なＫｍに差異がほとんどなかった。表４のデータは、非Ｍｇ金属をＡＭＰおよびＰＰｉと共に使用した場合、ＣｏおよびＮｉならびにある程度ＣａおよびＳｒがＫｍを相乗的に増加させたことを示す。非Ｍｇ金属をＡＭＰと共に使用した場合、いくつかの金属、すなわちＭｎ、Ｓｒ、Ｃａ、およびＮｉはＭｇよりも大きくＫｍを増加させた。非Ｍｇ金属をＰＰｉと共に使用した場合、Ｎｉが、ＡＴＰに対するＫｍを約１０倍増加させた。金属およびインヒビター（複数可）の他の組み合わせではそれほど作用しなかった。
【００３３】
【化５】
2008536519.tif 000007
ＡＴＰに対するＫｍを相乗的に増加させ、ＡＴＰの発光検出のための直線性を向上させるＡＭＰおよびＰＰｉの効果は、耐熱性ルシフェラーゼに限られたものではなかった。この効果は、０〜２．５  ｍＭのＡＴＰ濃度の範囲にわたりキタアメリカホタルからの野生型ルシフェラーゼ（ＱｕａｎｔｉＬｕｍ（登録商標）組換えルシフェラーゼ）においても観察された（表５）。この酵素を用い、ＰＰｉなしまたはＡＭＰなしの反応と比較すると、ＰＰｉのみで、Ｒ２およびＫｍがわずかに増加し（２００μＭのＰＰｉによりＲ２が９％増加し、Ｋｍが２８％増加した）、ＡＭＰのみで、Ｒ２およびＫｍが減少する一般的傾向を示した（３ｍＭのＡＭＰでＲ２が２．５％減少し、Ｋｍが６５％減少した）。しかしながら、ＰＰｉおよびＡＭＰを組み合わせることにより、Ｒ２およびＫｍの両方が実質的に増加した（２００μＭのＰＰｉおよび３ｍＭのＡＭＰで、Ｒ２が１．６４倍増加し、Ｋｍが３．９倍増加した）。ＱｕａｎｔｉＬｕｍ（登録商標）および１つまたは複数のＡＴＰインヒビターを有する反応において、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＳｒＣｌ２、またはＮｉＣｌ２とＭｇＳＯ４を置換した場合、ＰＰｉおよびＣｏまたはＮｉを有する反応だけでなく、ＺｎおよびＡＭＰまたはＺｎ、ＡＭＰ、およびＰＰｉを有する反応においてＫｍが増加した（表６）。
【００３４】
【化６】
2008536519.tif 000008
表１〜６の結果に基づき、特定の二価金属および甲虫ルシフェラーゼを選択することにより、甲虫ルシフェラーゼのＡＴＰに対するＫｍを選択することができる。
【００３５】
（実施例ＩＩ）
非ルシフェラーゼＡＴＰアーゼを検出するための拡大された直線性の発光ＡＴＰアッセイの使用
Ｐｇｐは、ＭＤＲ１およびＡＢＣＢ１としても知られ、ＡＴＰ依存性の薬物排出ポンプとして機能する１７０ｋＤａの必須の形質膜タンパク質である。Ｐｇｐにより輸送される薬物および他の化学物質は通常、ＰｇｐのＡＴＰアーゼ活性を刺激する。Ｐｇｐは、ＡＴＰに対するＫｍが高い（約０．５〜１．０ｍＭ）。このことは、Ｖｍａｘでの活性において、アッセイ反応混合物が約≧４ｍＭ  ＡＴＰを含むことを意味する。拡大された直線性が形成されていない甲虫ルシフェラーゼたとえば耐熱性甲虫ルシフェラーゼによるＡＴＰ検出のための直線範囲はおよそ≦５０μＭ  ＡＴＰである。≧４ｍＭ  ＡＴＰで、Ｐｇｐは、甲虫ルシフェラーゼの直線範囲の外側にあるＡＴＰを消費するであろう。以下に説明するように、ルシフェラーゼ反応混合物にＰＰｉおよびＡＭＰを加え、ＰｇｐによるＡＴＰ消費量を最適に検出するためにＡＴＰ検出のための直線性を拡大することができる。
【００３６】
材料と方法
図２〜５に示したデータを得るために使用したＰｇｐ  ＡＴＰアーゼ反応混合物には、以下のものを含んだ：６６０μｇ／ｍｌの組換えヒトＰｇｐ（昆虫細胞発現系からの膜画分）、５０ｍＭのモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２ｍＭのエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、２ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのアジ化ナトリウム、およびｐＨをｐＨ６．８にするために加えたトリス塩基。示した濃度で、ベラパミルのアイソマー＋および−の混合物を加えた。反応容量は、白色の不透明な９６ウェルプレート中に加えた４ｍＭのＭｇＡＴＰを含めて５０μｌであった。
【００３７】
等量の甲虫ルシフェラーゼ反応混合物（５０μｌ）を加える前に反応を２０分間３７℃でインキュベートした。図２〜５に示したデータを得るために使用した甲虫ルシフェラーゼ反応混合物には、０．４ｍｇ／ｍｌの耐熱性ルシフェラーゼ、４０ｍＭのＮａ３Ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ６．０）、１１０ｍＭのモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ６．０）、２２ｍＭのＭｇＳＯ４、４ｍＭのＮａＦ、２０ｍＭのＩＤＰ、５．０ｍＭの（４Ｓ）−４，５−ジヒドロ−２−（６−ヒドロキシベンゾチアゾリル）−４−チアゾールカルボン酸（Ｄ−ルシフェリン）、１．２ｍＭの１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、２％のブタコラーゲン（Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）、２％のＴｅｒｇｉｔｏｌ、２ｍＭのＡＭＰ、および１００μＭのＰＰｉが含まれた。Ｐｇｐ  ＡＴＰアーゼ活性のアッセイ計画において、これらのすべての成分の濃度を、等量の耐熱性ルシフェラーゼ反応混合物を加えて半分に希釈する。両混合物がＭＥＳを含み、したがって、ＭＥＳの最終濃度は８０ｍＭであったことに留意されたい。
【００３８】
結果
Ｐｇｐを含む膜画分中でのＰｇｐ  ＡＴＰアーゼ活性を検出するために甲虫ルシフェラーゼベースＡＴＰ検出アッセイを使用した。図２〜５に示す実施例において、ＡＴＰアーゼ反応混合物中の４ｍＭのＡＴＰにＰｇｐ  ＡＴＰアーゼ膜画分を最初に暴露させた。３７℃２０分間のＰｇｐによるＡＴＰ消費後に、等量のルシフェラーゼ反応混合物をＰｇｐ反応に加え、最大のＡＴＰ濃度を２ｍＭまで引き下げた。発光反応を開始させ、さらに、非イオン洗剤（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）を導入しＰｇｐ反応を停止させるのにルシフェラーゼ反応混合物が役立った。発光の明るさがＡＴＰ濃度依存性であるので、ＡＴＰが消費されない場合、最も明るい反応が生じることになる（対照反応）。ＡＴＰが消費された反応における発光は対照に比べて減少し、この減少は、消費されたＡＴＰ量に比例する。すなわち、Ｐｇｐ依存性の発光の減少はＰｇｐによるＡＴＰ消費を反映している。基本的なＰｇｐ  ＡＴＰアーゼ活性が発光の減少として観察され、Ｐｇｐによる輸送で知られている基質であるベラパミルがある状態で比較的大きく減少することがわかった。
【００３９】
（実施例ＩＩＩ）
拡大されたＡＴＰアッセイにおける発光シグナルの安定性
上記実施例において記載したＰｇｐ  ＡＴＰアーゼアッセイ（図２〜５）で、３７℃でインキュベートしていたサンプルに甲虫ルシフェラーゼ反応混合物を加え、次いで、発光を読み取る前に温度を２０分間室温（約２３℃）に平衡化させた。しかしながら、甲虫ルシフェラーゼ反応混合物を加えた後、直ちに発光を読み取り、次いで、その後、一定の時間間隔で繰り返し発光を読み取ると、発光シグナルは一定のままではなく、むしろ、経時的に増加することが観察された（図６Ａ）。これは、Ｐｇｐ形質膜試料中に存在するピロホスファターゼ活性（複数可）によるＰＰｉの分解によるものかもしれない。ＰＰｉが分解されていたとすると、これは、ルシフェラーゼの阻害を軽減させ、発光シグナルの増加をもたらしていたのであろう。この影響を最小限にするために、ピロホスファターゼインヒビターであるイミド二リン酸（ＩＤＰ）をルシフェラーゼ反応混合物に加えた。ＩＤＰは、シグナル増加率を著しく低下させることにより、実質的にシグナルの安定性を向上させた（図６Ｂ）。したがって、ピロホスファターゼを含むサンプルを使用する場合、発光シグナルを安定化するために、ＩＤＰ等のピロホスファターゼインヒビターを使用することができる。ＩＤＰなしの図６Ａを１０ｍＭのＩＤＰありの図６Ｂと比較することにより、長い間にわたり発光シグナルを安定化するＩＤＰの効果について十分に理解することができる。
【００４０】
刊行物、特許、および特許出願はすべて、参照によって本明細書に組み込まれるものとする。前述の明細書において、本発明について、ある種の好ましい実施形態に関連して説明しているが、多数の細部は例証の目的のために記載されたものであり、本発明は、実施形態を追加することが可能であり、本明細書において説明したある種の細部について本発明の基本原理を逸脱することなく少なからず変更してもよいということは当業者に明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、ルシフェラーゼインヒビター非存在下（ＮＴ；パネルＡ）またはルシフェラーゼインヒビター存在下（パネルＢ〜Ｄ）における、増加するＡＴＰ濃度に対する相対発光量（ＲＬＵ）を示す。
【図２】図２は、Ｐｇｐ  ＡＴＰアーゼによるＡＴＰ消費に関連した発光におけるＰ糖タンパク質（Ｐｇｐ）依存性の変化を示す。膜試料よりＰｇｐを得た。１００μＭのＮａ３ＶＯ４ありおよびなしのサンプルならびにＮａ３ＶＯ４ありおよびなしで３００μＭベラパミルプラスのサンプルを比較することにより、Ｐｇｐ  ＡＴＰアーゼ活性へのベラパミル（Ｐｇｐ  ＡＴＰアーゼ活性化薬物）の影響について試験した。Ｎａ３ＶＯ４はＰｇｐ選択的インヒビターである。したがって、ベラパミルなしでＮａ３ＶＯ４マイナスおよびプラスのサンプル間の発光の差異（△ＲＬＵｂａｓａｌ）は、基本的なＰｇｐのＡＴＰ消費量（ＡＴＰアーゼ活性）を反映し、ベラパミルありでＮａ３ＶＯ４マイナスおよびプラスのサンプル間の発光の差異（△ＲＬＵｖｅｒ）は、ベラパミルに刺激されたＰｇｐのＡＴＰ消費量を反映する。Ｎａ３ＶＯ４存在下でのＡＴＰ消費は、膜試料中に存在する微量の非Ｐｇｐ  ＡＴＰアーゼ活性に起因する。
【図３】図３は、拡大された直線性の発光反応におけるＡＴＰ標準物質（ＳＴＤＳ）を示す。ＡＴＰ標準曲線との比較によりＰｇｐ反応のＲＬＵをＡＴＰ濃度に変換することができるよう曲線を実現した。ＭｇＡＴＰなしのＰｇｐ  ＡＴＰアーゼ反応混合物を、図２、４、および５に示されるＰｇｐ反応と並行して３７℃でインキュベートした。これらの標準サンプルに耐熱性ルシフェラーゼ反応混合物を加えた後、図表に示した最終濃度までＭｇＡＴＰを加えた。次いで、プレートリーディングルミノメーターで発光を読み取る前に、サンプルを２０分間Ｐｇｐ反応させるのに加え、室温（約２３℃）に移動させた。線形回帰分析を行い、標準曲線と比較することによりＰｇｐ反応のＡＴＰ濃度を補間した。
【図４】図４は、基本的なおよびベラパミルに刺激されたＰｇｐ  ＡＴＰアーゼ活性を示す。ベラパミルなしおよび３００μＭベラパミルありの図２に示すＰｇｐ  ＡＴＰアーゼ反応からのＲＬＵ値をＡＴＰ標準曲線（図３）と比較し、ＡＴＰ濃度を決定した。これらのＡＴＰ濃度から、Ｐｇｐにより消費されたＡＴＰ量および比活性（消費されたＡＴＰ  ピコモル／Ｐｇｐ  μｇ／分）を算出した。
【図５】図５は、ベラパミルによるＰｇｐ  ＡＴＰアーゼ刺激の用量依存性を示す。図表に示すベラパミル濃度なしおよびありのＰｇｐ  ＡＴＰアーゼ反応からのＲＬＵ値をＡＴＰ標準曲線（図３）と比較し、ＡＴＰ濃度を決定した。これらのＡＴＰ濃度から、Ｐｇｐにより消費されたＡＴＰ量および比活性（消費されたＡＴＰ  ピコモル／Ｐｇｐ  μｇ／分）を算出した。
【図６Ａ】図６Ａは、ベラパミル存在下またはバナジン酸およびベラパミル存在下でのＰｇｐ  ＡＴＰアーゼに対するＲＬＵを経時的に示す。昆虫細胞において発現され形質膜画分として調製された組換えヒトＰｇｐを３７℃で２０分間、４ｍＭのＡＴＰに暴露させた。図２〜５に記載したように、Ｐｇｐ  ＡＴＰアーゼアッセイを行った。反応混合物に耐熱性ルシフェラーゼを加えた後、直ちに発光を測定し、その後６５分間５分間隔で発光を測定した。対照の膜は、組換えヒトＰｇｐ発現に使用した昆虫細胞発現系からのＰｇｐなしの形質膜画分である。バナジン酸プラスおよびマイナスのサンプルを比較することにより、Ｐｇｐ  ＡＴＰアーゼ活性プラスおよびマイナスのＡＴＰ消費量を測定することができる。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｐｇｐ  ＡＴＰアーゼアッセイからの発光シグナルを安定化するための１０ｍＭイミド二リン酸（ＩＤＰ）の使用を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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