(57)【要約】  本発明は、ａ）酵母細胞の懸濁液を酵素加水分解に供することによって前記酵母細胞が分解され、かつマンノプロテインおよび他の酵母成分が可溶化されるとともに分解された酵母細胞から遊離されるステップ、ｂ）可溶化されたマンノプロテインを回収するステップ、および場合によりｃ）回収されたマンノプロテインを少なくともｐＨ９の塩基性溶液で処理するステップ、を含む方法により得ることのできる新規マンノプロテインについて記載する。新規マンノプロテインはワインに非常に可溶であるとともに酒石酸沈殿またはタンパク質混濁形成に抗しワインの安定化において非常に効果的であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノプロテインの生産方法であって、前記方法が
ａ）酵母細胞の懸濁液を酵素加水分解に供することによって前記酵母細胞が分解され、かつマンノプロテインおよび他の酵母成分が可溶化されるとともに前記分解された酵母細胞から遊離されるステップ、
ｂ）前記可溶化されたマンノプロテインが回収されるステップ、および場合により、
ｃ）前記回収されたマンノプロテインを少なくともｐＨ９の塩基性溶液で処理するステップ、を含む方法。
【請求項２】
ステップａ）における前記酵素加水分解が前記酵母細胞の懸濁液を自己融解に供することにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｄ）限外濾過により前記処理されたマンノプロテインを精製するステップ、
をさらに含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）における前記可溶化されたマンノプロテインが限外濾過により回収される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）における前記可溶化されたマンノプロテインの回収に先立ち、不溶性材料が固液分離方法により、好ましくは遠心分離または濾過により除去される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｃ）における前記処理が少なくとも１０、好ましくは１０から１３まで、より好ましくは１１から１３までのｐＨで実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｃ）における前記処理が室温から１２０℃まで、好ましくは室温から１００℃までの温度で実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記処理が１時間から１週間までの期間実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ）における前記処理が、Ｄ２Ｏ中ｐＨ８、２７℃で測定され、グリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）をＧＰＣの化学シフト値が０．４３をとる内部標準として使用する、ステップｃ）において得られる産物の３１Ｐ−ＮＭＲが、同じ条件下で測定される前記処理前前記マンノプロテインの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルと比較した時、ホスホマンナンモノエステルによる４．５と５．５ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークの出現または強度増加およびホスホマンナンジエステルによる−１と−２ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークの強度減少または消失を示す温度、期間およびｐＨの条件下で実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記塩基性溶液での前記処理が、前記３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルにおけるホスホマンナンジエステルによる−１と−２ｐｐｍとの間の前記１つまたはそれ以上のピークの面積とホスホマンナンモノエステルによる４．５と５．５ｐｐｍとの間の前記１つまたはそれ以上のピークの面積との間の比が少なくとも９０：１０、好ましくは少なくとも７５：２５、より好ましくは少なくとも５０：５０、さらにより好ましくは少なくとも２５：７５、さらにより好ましくは少なくとも１０：９０、最も好ましくは約０：１００となる条件下で実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｃ）における前記処理が、ＲＮＡ、オリゴ−およびポリリボヌクレオチドによる不純物もまた少なくともある部分、好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは完全にモノリボヌクレオチドに分解されるような温度、期間およびｐＨの条件下で実施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により得ることのできるマンノプロテイン。
【請求項１３】
Ｄ２Ｏ中ｐＨ８、２７℃で測定され、グリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）をＧＰＣの化学シフト値が０．４３をとる内部標準として使用する、前記マンノプロテインの前記３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルが、ホスホマンナンジエステルによる−１と−２ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークおよび／またはホスホマンナンモノエステルによる４．５と５．５ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークを含み、より好ましくは、前記３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルにおけるホスホマンナンジエステルによる−１と−２ｐｐｍとの間の前記１つまたはそれ以上のピークの面積とホスホマンナンモノエステルによる４．５と５．５ｐｐｍとの間の前記１つまたはそれ以上のピークの面積との比が少なくとも９０：１０、好ましくは少なくとも７５：２５、より好ましくは少なくとも５０：５０、さらにより好ましくは少なくとも２５：７５、さらにより好ましくは少なくとも１０：９０、最も好ましくは約０：１００である、請求項１２に記載のマンノプロテイン。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のマンノプロテインおよび１つまたはそれ以上のワイン添加剤を含む組成物。
【請求項１５】
ワインの安定化における請求項１２または１３に記載のマンノプロテインまたは請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
酒石酸塩の結晶化を防止または遅延することによりワインを安定化する方法であって、請求項１２または１３に記載のマンノプロテインまたは請求項１４に記載の組成物がワインまたはワインの生産において使用されるべきブドウマストへ添加される、方法。
【請求項１７】
タンパク質混濁の形成を防止および／または低減することによりワインを安定化する方法であって、請求項１２または１３に記載のマンノプロテインまたは請求項１４に記載の組成物がワインまたはワインの生産に使用されるべきブドウマストへ添加される、方法。
【請求項１８】
請求項１２または１３に記載のマンノプロテインを含むワイン。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、新規なマンノプロテイン、それを生産するための方法およびワインの安定化におけるその使用に関する。
【０００２】
［背景技術］
酒石塩、酒石酸水素カリウム（ＫＨＴ）、酒石酸カルシウム（ＣａＴ）の存在およびタンパク質混濁の発生がワインの不安定性の主な原因である。
【０００３】
酒石酸はブドウ液果によりその発育中に産生される主な有機酸である。これは液果の加工中、カリウム塩およびカルシウム塩の形でブドウマスト中に可溶化される。発酵中、酒石酸塩の溶解性は、エタノール濃度（糖の発酵による）の上昇に伴い低下する。
【０００４】
未熟なワインでは、酒石酸水素カリウム（ＫＨＴ）は常に過飽和濃度において存在するとともに自然に結晶化する。ワインの瓶詰め後、ＫＨＴ不安定性は結晶化の予測不可能な特性のため商業上の問題となり得る。さらに、消費者は瓶中の結晶の存在をワインの低級品質の表れと受け止めることが多い。酒石酸の結晶化を防止するため物理的処理がワインの瓶詰め前に使用され得る。これらの処理は、ワインを−４℃まで冷却することにより結晶化を促進する、もしくは電気透析法またはイオン交換樹脂によりカリウムイオンおよび酒石イオンを脱離することになる。しかしながら、これらの時間およびエネルギーのかかる方法はワインのコロイド平衡を変えるとされる。
【０００５】
ワインの物理的処理における代案は、ＫＨＴ結晶の核形成および／または成長を防止する添加剤を使用することである。
【０００６】
カルボキシメチルセルロースおよびメタ酒石酸がＫＨＴ結晶の成長を阻害する添加剤群に属する。残念なことに、カルボキシメチルセルロースは、処理済みワインに対するその推定される負の官能効果のため、ワイン界に受け入れられていない。一方、メタ酒石酸はワインのｐＨおよびワインの保存される温度において不安定である。経時に伴い、メタ酒石酸は加水分解するであろうとともにその保護効果も消失するであろう。それゆえ、その使用は短期消費用低品質ワインに限定されている。もう１つの欠点は、理想的には添加剤はワインの天然成分であるべき点である。これはメタ酒石酸またはカルボキシメチルセルロースには全く当てはまらない。
【０００７】
ワインの不安定性のもう１つの原因は、不安定なワインタンパク質の凝集であり、これはタンパク質混濁を生じさせるとともにワインの知覚品質が低減するのを助長する。現在、タンパク質混濁形成はベントナイトを使用してワインから除去される。しかしながらこの処理はワインの官能特性に対し負の効果を有する。さらにその上、この処理はワイン生産者に余分な仕事を要求するとともに、ベントナイトにより吸収されたままとなってワインの損失に至る。
【０００８】
タンパク質混濁形成に抗し、かつＫＨＴ結晶の核形成および成長速度の双方に対し活性のある天然添加剤は、化学添加剤より好ましい。
【０００９】
天然添加剤の例はマンノプロテインである。マンノプロテインは、グルカンと共に、酵母の細胞壁の主成分である（リプケ（Ｌｉｐｋｅ）Ｐ．Ｎ．ら，「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」（１９９８年）１８０（１５）：３７３５−３７４０頁）。マンノプロテインは主として、酵母細胞から２種類の方法、物理的方法および酵素的方法、により得られる。マンノプロテインを得るための最も一般的な物理的方法は、ピート（Ｐｅａｔ）Ｓ．ら，「Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ」（１９６１年）２８−３５頁に記載されるもので、酵母はクエン酸緩衝液中で１３８℃、２時間オートクレーブされるとともに、細胞壁の除去後、産物がエタノール添加により沈殿し、さらに透析により精製されるとともに凍結乾燥により単離される。酵母からマンノプロテインを得るための酵素的方法は国際公開第９６／１３５７１号パンフレットおよび国際公開第９７／４９７９４号パンフレットに記載されるとともに、本質的に、単離された酵母細胞壁のβ−グルカナーゼ製剤による処理および限外濾過を介する産物の単離を含む。
【００１０】
周知の方法により生産される、例えばオートクレーブにより得られるマンノプロテインは、ワインに添加されると、望ましくない濁り、およびある場合には、副産物の沈殿が生じるという不利点を有する。さらに、ＫＨＴ結晶の核形成および／または成長を防止する、またはタンパク質混濁形成を防止するための前記マンノプロテインの有効性は、必ずしも十分ではない。
【００１１】
欧州特許出願第１０９４１１７Ａ号明細書は、マンノプロテイン製剤中に存在する副産物により引き起こされる濁りの問題が低減される可溶性マンノプロテインを生産する方法について記載する。この方法では、酵母細胞壁が自己融解後に単離されるとともに、続いて９５〜１００℃で１５〜３０時間選択的加水分解に供されることにより、マンノプロテインおよび他の不純物が可溶化される。可溶化されたマンノプロテインを精製するには限外濾過を含め数ステップが必要であり、後に０〜６℃数時間の保管および清澄化遠心分離によるコロイド副産物の分離が続く。この方法は煩雑であるとともに商業規模でのマンノプロテイン生産にはそれほど適さない。
【００１２】
それゆえ、ワインに添加されても、副産物起因の濁りおよび／または副産物沈殿といった欠点を有さずともよい新規（可溶性）マンノプロテイン（またはその製剤）の必要性がある。このマンノプロテインは、ＫＨＴ結晶の形成またはタンパク質混濁形成に抗する改良された活性を示し得る。また新規マンノプロテインの生産のためのより効率的な方法の必要性もある。
【００１３】
［発明の詳細な説明］
本発明は、第１の態様において、マンノプロテインの生産のための方法を提供し、本方法は、
ａ）酵母細胞の懸濁液を酵素加水分解に供することによって前記酵母細胞が分解され、かつマンノプロテインおよび他の酵母成分が可溶化されるとともに分解された細胞から遊離されるステップと、
ｂ）可溶化されたマンノプロテインが回収されるステップと、および場合により、
ｃ）回収されたマンノプロテインを少なくともｐＨ９の塩基性溶液で処理するステップと、を含む。
【００１４】
本発明の文意において「マンノプロテイン」は、本発明による方法をもって酵母に由来するとともに標準的な分析方法（アミノ酸分析、炭水化物分析等といった）により同定され得る、タンパク質部分および主にマンノースのポリマーを含む炭水化物部分の組み合わせとしての産物を定義する。炭水化物部分およびタンパク質部分は必ずしも互いに共有結合される必要はない。
【００１５】
本発明のステップａ）において、酵母細胞の懸濁液が酵素加水分解に供されることにより前記酵母細胞は分解され、かつマンノプロテインおよび他の酵母成分が可溶化されるとともに分解された酵母細胞から遊離される。
【００１６】
任意の種類の酵母が本発明の方法において使用され得る。特に、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）に属する酵母株が好適に使用され得る。サッカロミセス属に属する酵母株は、例えば出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株が好ましい。
【００１７】
本発明の方法は水性液中の酵母細胞の懸濁液、例えば当該酵母細胞の発酵ブロスから開始し得る。酵母細胞の懸濁液に至る好適な発酵方法は当該技術分野において周知である。ある場合には、発酵ブロスは本方法における使用前に、例えば遠心分離または濾過により、濃縮され得る。例えば、クリーム酵母（乾燥物質含有量１５〜２７％ｗ／ｗに濃縮されているパン酵母）が使用され得る。
【００１８】
ステップａ）において酵母細胞の懸濁液の酵素加水分解は、前記懸濁液を天然酵母酵素および／または添加された外因性酵素の作用に供することにより実施され得る。
【００１９】
酵素加水分解の実施に使用される条件は、使用される酵素の種類に依存するとともに当業者により容易に決定され得る。一般に、酵素加水分解は、４と１０との間のｐＨで４０℃と７０℃との間の温度において実施されるであろう。一般に酵素加水分解は、１と２４時間との間に含まれる時間だけ実施されるであろう。
【００２０】
場合により、天然酵母酵素は、任意の外因性酵素の添加に先立ち不活性化される。当業者にはいかに天然酵母酵素を不活性化するかは周知である。不活性化は例えば、ｐＨ処理または熱ショックによりもたらされ、後者の方法が好ましい。熱ショックは酵母細胞懸濁液を８０〜９７℃の温度で５から１０分間処理することにより好適に実施され得る。天然酵母酵素が不活性化されると、酵素加水分解を実施するため外因性酵素が酵母細胞の懸濁液に添加され得る。好ましくはプロテアーゼ、より好ましくはエンドプロテアーゼがこの目的のため使用される。場合により、５’−Ｆダーゼ（Ｆｄａｓｅ）のような、ＲＮＡを５’リボヌクレオチドへと形質転換するため酵素が使用されるとともに、場合により、デアミナーゼ、例えばアデニルデアミナーゼが上述の酵素による処理と共に、またはそれに続いて使用され得る。
【００２１】
好ましい実施形態において、酵素加水分解は酵母細胞の懸濁液を自己融解に供することにより実施される。自己融解は、酵母細胞および高分子酵母材料の分解が、酵母細胞壁の（部分的な）損傷および／または破壊による酵母細胞の切開後培地中に遊離される活性天然酵母酵素により、少なくとも部分的になされるプロセスである。
【００２２】
自己融解は当該技術分野において周知の方法に従い実施され得る（例えば、コンウェイ（Ｃｏｎｗａｙ）Ｊ．ら，「Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」（２００１年）４７：１８−２４頁）。
【００２３】
典型的には、酵母細胞の自己融解は、機械的、化学的または酵素的処理による酵母細胞壁の（部分的な）損傷および／または破壊による酵母細胞の切開により惹起される。好ましくは、微生物細胞壁の（部分的な）損傷および／または破壊による酵母細胞の切開は酵素的に成される。数酵素が使用され得るものの、好ましくはプロテアーゼが、より好ましくはエンドプロテアーゼが使用される。一般に、酵母細胞を切開しかつ微生物細胞壁を酵素的に損傷および／または破壊するために使用される条件は、微生物の自己融解中に適用されるものに対応するであろう。酵素が酵母細胞壁の（部分的な）損傷および／または破壊により酵母細胞を切開するため使用される時、該酵素はまた酵母細胞および高分子酵母材料の分解にも寄与する。
【００２４】
ステップｂ）に先立ち、ステップａ）において使用される酵素は一般には、例えば上述されるとおりの方法を使用して不活性化され得る。
【００２５】
本発明の方法のステップｂ）において、可溶化されるとともに分解された酵母細胞から遊離されるマンノプロテインが回収される。好ましくは、例えば酵母細胞壁由来の、不溶性材料が、ステップｂ）におけるマンノプロテインの回収に先立ち、一般には固液分離方法により、好ましくは遠心分離または濾過により除去される。マンノプロテインはそれに好適な任意の方法により回収され得る。好ましくは、マンノプロテインは限外濾過（ＵＦ）により回収される。ＵＦがマンノプロテインを回収するため使用される場合には、分子量カットオフが１００ｋＤまたはそれ以下もしくは好ましくは３から５０ｋＤまで、より好ましくは３から１０ｋＤまでのフィルターが使用され得る。マンノプロテイン画分が限外濾過ステップの結果として保持液中に残る。不溶性材料が限外濾過に先立ち除去されない時、マンノプロテインおよび不溶性材料を含む保持液は再懸濁され得る（溶液中に）とともに好ましくは不溶性材料が除去される。
【００２６】
場合により、ステップｂ）の後だがステップｃ）に先立ち、回収されたマンノプロテインは一部の残存ＲＮＡを除去するためＦダーゼ（Ｆｄａｓｅ）により処理され得る。
【００２７】
本発明の方法のステップｃ）において、回収されたマンノプロテインは少なくともｐＨ９の塩基性溶液で処理される。好ましくは、処理は少なくとも１０、好ましくは１０から１３まで、より好ましくは１１から１３までのｐＨで実施される。一般にステップｃ）における処理は室温（例えば２０℃）と１２０℃との間、より好ましくは室温（例えば２０℃）と１００℃との間の温度で実施される。一般に処理は温度に依存して１時間から１週間までの期間実施される。一般に、高いｐＨほど低い反応温度を必要とするであろう一方、高い反応温度ほど短い反応時間を必要とするであろう。それゆえ、例えば室温で１週間実施されるｐＨ１２での処理は、ｐＨ１２でかつ７０℃２時間またはｐＨ１０でかつ７０℃２４時間の処理とともに、本発明の範囲に該当する。任意の好適な食品級塩基がｐＨ処理を実施するため使用され得る。好適な塩基の例は水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム、もしくは水酸化アンモニウムである。水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムが好ましい。
【００２８】
好ましくは、ステップｃ）における処理は、Ｄ２Ｏ中ｐＨ８、２７℃で測定されるとともにグリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）を内部標準として使用する（ＧＰＣの化学シフト値が０．４３をとる）、ステップｃ）において得られる産物の３１Ｐ−ＮＭＲが、同じ条件下で測定される処理前マンノプロテインの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルと比較した時、ホスホマンナンモノエステルによる４．５と５．５ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークの出現または強度増加およびホスホマンナンジエステルによる−１と−２ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークの強度減少または消失を示すような温度、期間およびｐＨの条件下で実施される。好ましくは、塩基性溶液での処理は、前記３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルにおけるホスホマンナンジエステルによる−１と−２ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークの面積とホスホマンナンモノエステルによる４．５と５．５ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークの面積との間の比が少なくとも９０：１０、好ましくは少なくとも７５：２５、より好ましくは少なくとも５０：５０、さらにより好ましくは少なくとも２５：７５、さらにより好ましくは少なくとも１０：９０、最も好ましくは約０：１００となる条件下で実施される。それゆえ最も好ましくは、反応は、ホスホマンナンジエステルによる−１と−２ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークが（ほぼ）完全に消失するとともにホスホマンナンモノエステルによる４．５と５．５ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークに置き換わる条件下で実施される。当業者は、例えば、ホスホマンナンのホスホモノエステルおよびホスホジエステルによるピークを、例えばＲＮＡ、モノ−、オリゴ−およびポリリボヌクレオチドのような他の成分に属する他のホスホモノエステルおよびホスホジエステルによるピークと二次元ＮＭＲにより区別し得る（例えば３１Ｐ−１Ｈ相関分光法により、例えば、シャリー（Ｃｈａｒｙ）Ｋ．Ｖ．Ｒ．ら，「Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ」（１９９３年）１０２：８１−８３頁を参照）。
【００２９】
好ましい実施形態において、ステップｃ）における処理は、ＲＮＡ、オリゴ−およびポリリボヌクレオチドによる不純物もまた少なくともある部分、好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは完全にモノリボヌクレオチドへ分解される温度、期間およびｐＨの条件下で実施される。この分解は３１Ｐ−ＮＭＲにより検証され得る。上記と同じ条件下で測定されるＲＮＡ、オリゴ−およびポリリボヌクレオチドによるホスホジエステルの３１Ｐ−ＮＭＲは、約０ｐｐｍでの１つまたはそれ以上のピークを含み、一方モノリボヌクレオチドによるホスホモノエステルの３１Ｐ−ＮＭＲは、約５ｐｐｍでの、一般には約４〜５ｐｐｍでの、ホスホマンナンモノエステルよりやや高めの領域での１つまたはそれ以上のピークを含む。
【００３０】
場合により、塩基処理が完了されると、反応混合物は当業者に周知の食品級酸を使用して中和され得る。
【００３１】
好ましくは、本発明の方法はさらに、ｄ）処理されたマンノプロテインを限外濾過により精製するステップを含む。
【００３２】
典型的には、ステップｄ）はステップｃ）において得られる処理されたマンノプロテインを１つまたはそれ以上の限外濾過ステップに供することにより実施される。上記に指示されるとおりの分子量カットオフを備える限外濾過膜が使用され得る。
【００３３】
ステップｃ）における処理中、一部の不溶物が形成され得る。この場合かかる不溶物は、ステップｃ）の後だがステップｄ）に先立ち実施される、および／またはステップｄ）の後に実施される濾過または遠心分離などの一般的な固液分離方法により除かれ得る。
【００３４】
ステップｃ）またはｄ）の後に得られるマンノプロテインは一般に、当該技術分野において周知の方法により、例えば、マンノプロテイン溶液を減圧下で濃縮することによるとともに濃縮された溶液を噴霧乾燥または凍結乾燥することにより、さらに濃縮および／または乾燥され得る溶液として得られる。
【００３５】
第２の態様において、本発明は第１の態様の方法により得ることのできるマンノプロテインを提供する。
【００３６】
本発明によるマンノプロテインは、好ましくは最大でも１００ｋＤａの分子量、より好ましくは１〜５０ｋＤａの間の、さらにより好ましくは３〜３０ｋＤａの間の分子量を有する。本発明のマンノプロテインは好ましくは、マンノプロテイン乾燥物質に基づいて少なくとも５０％ｗ／ｗの炭水化物含有量であって、総炭水化物含有量に基づいてそのうち少なくとも７０％ｗ／ｗがマンノースオリゴマーまたはポリマーの形の残存マンノースからなることを特徴とする。
【００３７】
上記に指示されるとおり測定される、本発明によるマンノプロテインの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、好ましくはホスホマンナンジエステルによる−１と−２ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークおよび／またはホスホマンナンモノエステルによる４．５と５．５ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークを含む。より好ましくは、前記３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルにおけるホスホマンナンジエステルによる−１と−２ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークの面積とホスホマンナンモノエステルによる４．５と５．５ｐｐｍとの間の１つまたはそれ以上のピークの面積との比が少なくとも９０：１０、好ましくは少なくとも７５：２５、より好ましくは少なくとも５０：５０、さらにより好ましくは少なくとも２５：７５、さらにより好ましくは少なくとも１０：９０、最も好ましくは約０：１００である。
【００３８】
非常に驚くことに、本発明の方法により得ることのできるマンノプロテインがワインに有効量で添加される時、最小限の目視的濁りおよび／または副産物沈殿が生じるのみであり得る。ワインに有効量で添加される時の本発明のマンノプロテイン（例えば、ステップｃにおいて得られる）は、結果として濁りまたは副産物沈殿が完全に不在に、さらには高マンノプロテイン濃度（例えば、８００ｍｇ／ｌ）にさえなる。これらの結果は周知の方法で生産されるマンノプロテインで得られるものとは対照的である。例えば、上述のピート（Ｐｅａｔ）らの方法で得られるマンノプロテインはワインに添加される時、混濁形成および不要な沈殿が生じる。
【００３９】
ワイン中のマンノプロテインの高進された溶解性および場合によりワイン安定剤として高められた活性は、本発明によるとともに上記に指示されるとおり測定されるマンノプロテインの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルにおける、ホスホマンナンモノエステルによる４．５〜５．５ｐｐｍでのピークの増加面積と相関することが観測されている。
【００４０】
本発明によるマンノプロテインのワインへの改良された溶解性により、このマンノプロテインは特にワインの安定化における添加剤として使用されるのに好適となる。
【００４１】
本発明によるマンノプロテインはワインに対する単独の添加剤として、または組成物の形で使用され得る。それゆえ、第３の態様において本発明は、第２の態様のマンノプロテインおよび１個またはそれ以上のワイン添加剤を含む組成物を提供する。ワイン添加剤の例はメタ酒石酸またはアラビアゴムである。好ましい組成物は本発明によるマンノプロテインおよびアラビアゴムを含む。
【００４２】
第４の態様において本発明は、ワインの安定化における第２の態様のマンノプロテインまたは第３の態様の組成物の使用を提供する。
【００４３】
特に、本発明は酒石酸塩の結晶化を防止および／または遅延することによりワインを安定化する方法を提供し、ここでは本発明によるマンノプロテインまたは本発明による組成物がワインまたはワインの生産において使用されるべきブドウマストへ添加される。マンノプロテインまたはその組成物は好ましくは熟成中、すなわち発酵後だが瓶詰め前に、ワインへ添加される。本発明は白ワインおよびロゼワインにもだが、赤ワインにも、極めて好適である。
【００４４】
本発明のマンノプロテインは安定化効果を実現するに十分な量で添加される。前記安定化効果は、同量で使用される周知のマンノプロテインにおいて実現される安定化効果に匹敵するかまたはそれより優れている。一般に、本発明のマンノプロテインは、ワイン１リットル当たり１０〜１０００ｍｇの間の濃度でワインに添加され得る。ワイン１リットル当たり１０から４００ｍｇのワイン中最終濃度までマンノプロテインを添加することにより良好な結果が既に得られている。当業者は添加される量がまた、添加剤または例えば他のワイン安定剤の存在にも、および添加に先立つワイン中のＫＨＴ過飽和度にも依存するであろうことを理解するであろう。
【００４５】
ワイン中の核形成およびＫＨＴの結晶成長は次の方法により測定され得るとともに定量化され得る（ムトゥネ（Ｍｏｕｔｏｕｎｅｔ）ら：アクチュアリテ・エノロジーク（Ａｃｔｕａｌｉｔｅｓ  ＯＥｎｏｌｏｇｉｑｕｅｓ）１９９９年  第５回ボルドーワイン醸造学国際シンポジウム（Ｖｉｅｍｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄ‘Ｏｅｎｏｌｏｇｉｅ  ｄｅ  Ｂｏｒｄｅａｕｘ）（ロンボー−フューネル（Ｌｏｎｖａｕｄ−Ｆｕｎｅｌ）編））。
【００４６】
第１の方法は、結晶核形成の示標で、−４℃で保存時のワイン中の結晶の出現時間を測定する。目視検査が毎日実施されるとともに結晶の出現を検出するまでに要する時間（Ｔｃｒｙｓ）が日数で表される。
【００４７】
第２の方法は、結晶成長の示標で、ワインの酒石不安定度（ＤＴＩ）を測定する。本明細書において、ワインは−４℃で攪拌されるとともに初期伝導率が測定される。続いて、較正されたＫＨＴ結晶が添加されるとともに、次に安定値に達した後に伝導率が測定される。ＤＴＩは初期伝導率の百分率減少として定義される。
【００４８】
第３の方法は、真正な溶存酒石酸濃度を測定する。精確なワイン容積がガラスバイアルへと移されるとともに正確に知られているマレイン酸濃度を含有するＤ２Ｏの精確な同容積と混合される。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが完全緩和条件で実行されるとともに、内部標準（マレイン酸）の積分が酒石酸の積分と比較される。このような方法で溶存酒石酸濃度が非常に高い精度および精確さで決定され得る。
【００４９】
本発明はさらにタンパク質混濁の形成を防止および／または低減することによりワインを安定化する方法を提供し、ここで本発明によるマンノプロテインまたは本発明による組成物がワインまたはワインの生産に使用されるべきブドウマストへ添加される。またこの場合も本発明のマンノプロテインは安定化効果を実現するに十分な量で添加される。本発明のマンノプロテインのワインへの添加後のタンパク質混濁形成に関するワインの安定化は次の方法により測定され得る。ワイン試料が６時間８０℃で加熱され、次に４℃まで冷却される。不安定タンパク質により誘起された混濁を受け、比濁法（８６０ｎｍでの）または吸光度（５４０ｎｍでの）測定が続く。
【００５０】
酒石酸塩の結晶化に関し不安定なワインは、０．５と１５日との間を変化し得るＴｃｒｙｓを有する。本発明のさらなる態様により安定化されたワインは、ワインまたはワインの生産のための発酵において使用されるべきブドウマストへ、酒石酸塩の結晶化を防止および／または遅延するのに好適な濃度における第２の態様のマンノプロテインを添加することにより得ることができる。前記安定化されたワインは、方法１により測定されるとき少なくとも２、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは２０と４０との間のＴｃｒｙｓｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｗｉｎｅ／Ｔｃｒｙｓｕｎｓｔａｂｌｅ  ｗｉｎｅを特徴とする。
【００５１】
本発明の一態様の好ましい特徴は、適切であれば、他の態様に等しく適用可能である。
【００５２】
本発明はこれより、いかようにも限定されることは意図しない次の実施例により説明されるであろう。
【００５３】
［実施例］
本発明のマンノプロテイン中のタンパク質量はケルダール法での総窒素を測定することにより、およびこの値を因数６．２５で乗じることにより決定され得る。
【００５４】
本発明のマンノプロテイン中の炭水化物量(マンノプロテイン乾燥物質に基づく)は十分に周知のアンスロン比色法により決定され得る。
【００５５】
本発明のマンノプロテイン中のマンノース量はイオン交換クロマトグラフィーを使用して測定され得る。マンノプロテインの４Ｎ  ＴＦＡによる４時間１００℃での加水分解後、加水分解産物が、基準としての純マンノースに対照し、インライン前処理ＡｍｉｎｏＴｒａｐＴＭカラム（米国ダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ））、注入バルブ前にＢｏｒａｔｅＴｒａｐＴＭカラム（米国ダイオネクス）を備えるＣａｒｂｏＰａｃＴＭＰＡ１０陰イオン交換カラム（米国ダイオネクス）を使用して、およびＮａＯＨ増加勾配を使用して分析される。マンノースの検出はパルスアンペロメトリック検出器を使用することにより実施される。
【００５６】
マンノプロテイン中のリン量は十分に周知のＡＥＳ−ＩＣＰ法（誘導結合プラズマを用いる原子発光分光）により測定され得る。
【００５７】
実施例１
酵母からの自己融解酵母抽出方法を通じたマンノプロテイン生産
２ｌの出芽酵母由来クリーム酵母が５１℃まで加温された。続いて３．０ｍｌのペスカラーゼ（Ｐｅｓｃａｌａｓｅ）（登録商標）（オランダＤＳＭフード・スペシャルティズ（Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）からの市販セリンプロテアーゼ）が添加されるとともに混合物が２４時間ｐＨ５．１、５１．５℃でインキュベートされた。次に、自己融解物が１時間６５℃で加熱されて全ての酵素活性が不活性化された。抽出物（可溶性画分）が不溶性細胞壁から遠心分離によって分離された。
【００５８】
可溶性画分に存在する高分子量マンノプロテインが他の可溶物からカットオフ１０ｋＤａのフィルター透過の限外濾過により単離された。マンノプロテインがＵＦ保持液画分から回収された。
【００５９】
マンノプロテインの回収データ（ＭＰ−０）が表１に提示される。
【００６０】
【表１】
2008525001.tif 000002
【００６１】
上述の条件下において測定されるＭＰ−０の３１Ｐ−ＮＭＲは、δ＋０．１４からδ−１．１４までの幅の広いシグナル（ポリヌクレオチド）およびδ−１．３３とδ−１．４０との２つの鋭いシグナル（マンナンのホスホジエステル）を含む。
【００６２】
実施例２
実施例１において得られるマンノプロテインの塩基処理
実施例１の方法により得られる粗マンノプロテイン溶液が濃度２０ｇ／ｌにて調製された。溶液のｐＨは４Ｍの水酸化ナトリウム溶液で１２．０に調整されるとともに、溶液は室温で１週間保存された。この期間の経過においてｐＨが１２．０に２回調整された。１週間後溶液は４Ｍの塩酸溶液で中和された。最終的に、塩および分解産物がカットオフ１０ｋＤの膜を使用する限外濾過によって除去された。保持液（ＭＰ−１）は凍結乾燥された。
【００６３】
ＭＰ−１の３１Ｐ−ＮＭＲはδ＋５．１３とδ＋５．０１との２つの鋭いシグナル（マンナンのホスホモノエステル）を含む。
【００６４】
実施例３
実施例１および２において得られるマンノプロテインの、不安定ワインにおけるＫＨＴ結晶に対する効果
ＭＰ−０およびＭＰ−１の実績が、上述のピート（Ｐｅａｔ）らの方法での標準的な熱抽出により得られる分子量３〜１００ｋＤのマンノプロテインＭＰ−２の実績と比較された。
【００６５】
ＭＰ−２の３１Ｐ−ＮＭＲは、δ＋０．１４からδ−１．１４までの幅の広いシグナル（ポリヌクレオチド）、およびδ−１．３２とδ−１．３８との２つの鋭いシグナル（マンナンのホスホジエステル）を含む。
【００６６】
ＭＰ−０、ＭＰ−１およびマンノプロテインＭＰ−２が濃度２０ｇ／ｌの水中に溶解された。小容積が、最終濃度１００、１５０、２００、３００、４００および６００ｍｇ／ｌに達するよう、不安定白ワインへ添加された。溶液は−４℃で保存された。
【００６７】
ＭＰ−０およびＭＰ−２はワインへの添加時に不要な混濁、濁りおよび沈殿が生じることから、ＭＰ−０およびＭＰ−２マンノプロテイン溶液のワインへの所望濃度における添加後、試料は２時間、＋４℃で保存された。この期間中、発生した有意な沈殿が遠心分離により除去された。ＭＰ−０およびＭＰ−２の清澄な上清が−４℃で再保存された。全溶液がＫＨＴ結晶の出現について毎日モニタされた。
【００６８】
表２は上記のとおりの方法１により測定されるＴｃｒｙｓとして表される結果を要約している。
【００６９】
表２は、ＭＰ−０はそれ以上濁りを生じなかったとともに、沈殿物が４℃２時間で形成された後に該沈殿物は遠心分離後除去されたことを示す。一方ＭＰ−２は最初の沈殿物が除去された後にもまだ大量の沈殿物を生じた。これは、本発明のマンノプロテインがオートクレーブにより生産されるマンノプロテインより高いワイン可溶性であることを明確に示している。さらにその上、表１は、ＭＰ−１が濁りおよび沈殿の除去を必要としなかったとともに何日も後にさえ、かつ高濃度においてさえ、完全にワイン可溶性のままであった、唯一のマンノプロテイン試料であったことを明確に示している。さらに、ＭＰ−１は他の全ての産物と比較した時、ワイン安定剤として非常に効果的であった。ＭＰ−２もまたワイン安定剤として効果的であったが、この産物はワインへの添加時に望ましくない副作用である混濁および副産物沈殿を生じた。
【００７０】
【表２】
2008525001.tif 000003
【００７１】
実施例４
実施例２に記載されるとおりの方法で得られるマンノプロテインのキャラクタリゼーション
実施例１に記載されるとおりと同じ方法で最初に粗マンノプロテインとして得られるとともに続いて実施例２に記載されるとおりと同じ方法で処理されるマンノプロテインが、その炭水化物、タンパク質およびリンの含有についてキャラクタライズされた。結果が表３に報告される。
【００７２】
【表３】
2008525001.tif 000004
【００７３】
Ｐ２Ｏ５で表されるリンの量は、乾燥物質に基づけば０．７７％ｗ／ｗに対応する。
【国際調査報告】
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