(57)【要約】  哺乳動物個体の前立腺癌を治療する方法であって、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK-3)のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを該個体に投与するステップを含む方法。追加の抗癌剤を投与することもできる。前立腺癌を治療するための医薬の調製における、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドの使用。この医薬は追加の抗癌剤を含むことができる。
2008509978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物個体の前立腺癌を治療する方法であって、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK-3)のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを該個体に投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前立腺癌を治療するための医薬の調製における、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項３】
哺乳動物個体の前立腺癌細胞の増殖を抑制する方法であって、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを該個体に投与するステップを含む方法。
【請求項４】
前立腺癌細胞の増殖を抑制する医薬の調製における、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項５】
前立腺癌細胞の増殖をex vivoで抑制する方法であって、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを前立腺癌細胞に投与するステップを含む方法。
【請求項６】
前立腺癌または前立腺癌細胞がARを発現しているかどうかを判定する事前ステップを含む、請求項1、3、または5に記載の方法。
【請求項７】
前立腺癌または前立腺癌細胞がアンドロゲン受容体(AR)を発現している、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項８】
前立腺癌または前立腺癌細胞がアンドロゲン依存性である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項９】
前立腺癌または前立腺癌細胞がアンドロゲン非依存性である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１０】
GSK-3のインヒビターが選択的GSK-3インヒビターである、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１１】
GSK-3のインヒビターが、SB415286または3-インドリル-4-フェニル-1H-ピロール-2,5-ジオン誘導体のような関連のGSK-3阻害化合物;SB216763;AxinのGSK-3結合ドメインまたはGSK-3を阻害するその変異体;FRATのGSK-3結合ドメインまたはGSK-3を阻害するその変異体;CHIR98023;CHIR99021;CHIR99014;RO318220;GF10923X;およびGSK-3特異的siRNA分子から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１２】
追加の抗癌剤を投与するステップをさらに含む、請求項1、3、及び5から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
医薬が追加の抗癌剤をさらに含む、請求項2、4、及び7から11のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
追加の抗癌剤が、ビカルタミド、フルタミドのような抗アンドロゲン、またはロイプロレリン、ゴセレリン、ブセレリンのようなGnRHアゴニストである、請求項12または13(請求項9に従属する場合は除く)に記載の方法または使用。
【請求項１５】
追加の抗癌剤が、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、デキサメタゾンのようなステロイド、またはミトザントロン、エストラムスチン、ドセタキソールのような化学療法剤である、請求項12または13に記載の方法または使用。
【請求項１６】
追加の抗癌剤がTRAILではない、請求項12または13に記載の方法または使用。
【請求項１７】
GSK-3インヒビターおよび抗アンドロゲンまたはGnRHアナログを含む組成物。
【請求項１８】
GSK-3インヒビターおよび抗アンドロゲンまたはGnRHアナログを含む医薬組成物。
【請求項１９】
医薬に使用するための、GSK-3インヒビターおよび抗アンドロゲンまたはGnRHアナログを含む組成物。
【請求項２０】
前立腺癌を治療するための、GSK-3インヒビターおよび抗アンドロゲンまたはGnRHアナログを含む組成物。
【請求項２１】
抗アンドロゲンがビカルタミドまたはフルタミドである、請求項17から20のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
GnRHアナログが、ロイプロレリン、ゴセレリンまたはブセレリンのようなGnRHアゴニストである、請求項17から21のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
GSK-3インヒビターが請求項10または11に規定されるものである、請求項17から22のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌細胞の増殖を抑制し、前立腺癌を治療するための方法および医薬に関する。特に、本発明は、このような方法および医薬において使用するためのグリコーゲンシンターゼキナーゼ3インヒビターに関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺の癌は、極めて重大な疾患であり、その死亡率レベルは肺癌に次いで第2位である。前立腺細胞の増殖および発達は、アンドロゲン、および核内受容体スーパーファミリーのメンバーであるアンドロゲン受容体(AR)によって媒介される。進行前立腺癌患者は、抗アンドロゲン療法(アンドロゲン除去)による治療が有効であるが、病状悪化に対する効果は一時的なものにすぎないことが多く、最終的にアンドロゲン除去に前立腺癌が不応性となる恐れがある。次いで、この疾患は、いまだ治療法が見付かっていないホルモン抵抗性(アンドロゲン非依存性)前立腺癌として分類される。したがって、新規治療薬の開発が前立腺癌治療にとっての緊急課題である。
【０００３】
ARの転写活性は、様々なコレギュレーターとの相互作用によって制御されており(Cheshire & Isaacs、2003、Cronauerら、2003によって総説されている)、そのうちの1つがβカテニンである。ホルモン抵抗性腫瘍の38%までにおいてβカテニンがその細胞質および/または核内で異常に発現されることを示す報告により、前立腺癌におけるβカテニンの役割への興味が刺激された。βカテニンレベルの上昇がARの転写活性の活性化をもたらす証拠は、βカテニンを過剰発現させる研究によるところが大きい(Chesireら、2002、Mulhollandら、2002、Truicaら、2000、Yangら、2002)。しかし、内因性βカテニンレベルは前立腺癌細胞においてすでに極めて高く、変異型βカテニンの安定発現で、アンドロゲンに対する癌細胞の増殖反応が変更されない(Chesireら、2002)。したがって、前立腺癌細胞内で内因性βカテニンがAR転写活性にどのように作用するかを決定することが重要であると考えられた。
【０００４】
本発明者らは、本明細書で、AxinおよびRNA干渉を使用して、内因性βカテニンの枯渇によるアンドロゲン受容体活性への影響を調べる試験を記載する。βカテニン分解を促進するAxinは、アンドロゲン受容体の転写活性を抑制した。しかし、この抑制には、Axinのβカテニン結合ドメインが必要ではなかった。RNA干渉を使用してβカテニンを枯渇させると、アンドロゲン受容体活性が低下するのではなく増大することから、内因性βカテニンはアンドロゲン受容体の転写コアクチベーターでないことが示唆された。
【０００５】
驚いたことに、また予想外に、本発明者らの結果から、βカテニンではなくグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK-3)がAR転写活性の重要な内因性レギュレーターであることが示される。
【０００６】
GSK-3は、グリコーゲン代謝および糖尿病、Wntシグナル伝達経路、免疫系、ならびに神経疾患におけるその役割で知られているセリン/トレオニンキナーゼである(Doble & Woodgett(2003)、Frame & Cohen(2001)、Grimes & Jope(2001)およびWoodgett(2001)によって総説されている)。GSK-3は、大部分の静止細胞において活性であることが示されており、外的刺激による負の調節を受ける。増殖因子による刺激に応答して、例えば、Aktなどのキナーゼは、セリン9に対するリン酸化によりGSK-3を阻害する(Cross et al、1995;Stambolic & Woodgett、1994)。ある例では、GSK-3は、チロシン216に対するリン酸化を促進する薬剤によって活性化されることが示された(Bhatら、2000)。GSK-3は、タンパク質Axin、FRAT(進行性T細胞リンパ腫における頻繁な再編成(Frequently rearranged in advanced T-cell lymphomas))/GBP、およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスの潜伏期関連核抗原への結合によっても調節され得る(Fujimuroら、2003、Ikedaら、1998、Yostら、1998)。GSK-3は、c-Jun、c-myc、C/EBP(CCAATエンハンサー結合タンパク質)、NF-ATc(活性化T細胞の核因子(nuclear factor of activated T cells))など多くの転写因子を含めた多数の基質を有する。GSK-3によるリン酸化の作用には、阻害性の傾向があり、分解の促進および核外輸送の増強が含まれる(参考のため、Frame & Cohen(2001)参照)。したがって、GSK-3を阻害した結果、遺伝子発現が増大することが多い。しかし、GSK-3が、例えばCREBをリン酸化することにより遺伝子発現を正に調節する例がある(Salasら、2003)。
【特許文献１】WO99/65897
【特許文献２】WO03/074072
【特許文献３】US20050054663
【特許文献４】US20020156087
【特許文献５】WO02/20495
【特許文献６】US20030008866
【特許文献７】US20010044436
【特許文献８】WO01/44246
【特許文献９】US20010034051
【特許文献１０】WO98/16528
【特許文献１１】WO02/22598
【特許文献１２】US20040077707
【特許文献１３】US20040138273
【特許文献１４】US20050004152
【特許文献１５】US20040034037
【特許文献１６】WO94/10323
【非特許文献１】Kuoら(2003)J Med Chem 46(19):4021〜31頁
【非特許文献２】Hannonら、Nature、418(6894):244〜51頁(2002)
【非特許文献３】Brummelkampら、Science 21、21(2002)
【非特許文献４】Suiら、Proc,Natl Acad.Sci.USA 99、5515〜5520頁(2002)
【非特許文献５】Elbashirら(2001)Nature 411:494〜498頁
【非特許文献６】Yuら(2003;Mol Ther.7(2):228〜36頁)
【非特許文献７】Sambrookら(2001)「Molecular Cloning,a Laboratory Manual」、第3版、Sambrookら(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、USA
【非特許文献８】Kuriyamaら(1991)、Cell Struc.and Func.16、503〜510頁
【非特許文献９】Culverら(1992)Science 256、1550〜1552頁
【非特許文献１０】Miller & Vile(1995)Faseb J.9、190〜199頁
【非特許文献１１】Nassanderら(1992)Cancer Res.52、646〜653頁
【非特許文献１２】Curiel(1993)Prog.Med.Virol.40、1〜18頁
【非特許文献１３】Wagnerら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87、3410〜3414頁
【非特許文献１４】Cottonら(1992)Proc.Natl.Acad Sci.USA 89、6094〜6098頁
【非特許文献１５】Ledley(1995)Harman Gene Therapy 6、1129〜1144頁
【非特許文献１６】Michaelら(1995)Gene Therapy 2、660〜668頁
【非特許文献１７】Bischoffら(1946)Science 274、373〜376頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、今回、GSK-3がARの転写活性を正に調節することを示す。AxinのGSK-3相互作用ドメインは、GSK-3/アンドロゲン受容体複合体の形成を妨げ、アンドロゲン受容体依存性転写の抑制に必要かつ十分である。第2のGSK-3結合タンパク質であるFRATも、GSK-3インヒビターSB216763およびSB415286と同様にアンドロゲン受容体転写活性を抑制する。最後に、GSK-3の阻害は、アンドロゲン受容体を発現している前立腺癌細胞系の増殖を低減する。GSK-3インヒビターは、前立腺癌細胞の増殖を抑制するので、このような薬物は前立腺癌患者の治療に有用であることが期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第1の態様は、哺乳動物個体の前立腺癌を治療する方法を提供し、この方法は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK-3)のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを該個体に投与するステップを含む。
【０００９】
一実施形態において、GSK-3のインヒビターは、投与する唯一の抗癌剤である。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを、TRAILを投与していない個体に投与することにより、前立腺癌を治療することを含む。言い換えれば、本発明は、GSK-3のインヒビターおよびTRAILを両方ともある個体に投与するステップを含まない。
【００１１】
酵素GSK-3(EC2.7.1.37)は、2つのアイソフォームGSK-3αおよびGSK-3βを有することが認識されている。文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、GSK-3には、GSK-3αおよびGSK-3βが両方とも含まれる。
【００１２】
GSK-3には、ヒトGSK-3遺伝子の、自然に生じるその変異体を含めた産物という意味が含まれる。ヒトGSK-3βのmRNAに対応するcDNA配列は、Genbankアクセッション番号NM 002093の下にある。ヒトGSK-3βには、Genbankアクセッション番号NM_002093およびNP_002084に記載されているアミノ酸配列、ならびに自然に生じるその変異体が含まれる。ヒトGSK-3αのmRNAに対応するcDNA配列は、Genbankアクセッション番号NM_019884の下にある。ヒトGSK-3αには、Genbankアクセッション番号NM_019884およびNP_063937に記載されているアミノ酸配列、ならびに自然に生じるその変異体が含まれる。
【００１３】
GSK-3には、他の種のGSK-3遺伝子由来の相同遺伝子産物も含まれる。
【００１４】
GSK-3のインヒビターがGSK-3に対して選択的である場合が好ましい。
【００１５】
GSK-3の「選択的」なインヒビターには、インヒビターのGSK-3に対するIC50値が他のプロテインキナーゼに対する値よりも低いという意味が含まれる。GSK-3の選択的インヒビターのIC50値が、他の少なくとも1種のプロテインキナーゼに対する値の少なくとも5分の1または10分の1、好ましくは100分の1または500分の1未満であることが好ましい。GSK-3の選択的インヒビターのIC50値が、他の少なくとも1種のプロテインキナーゼに対する値の1000分の1または5000分の1未満であることがより好ましい。他の少なくとも1種のプロテインキナーゼが、哺乳動物の、より好ましくはヒトのタンパク質キナーゼであることが好ましい。また、GSK-3の選択的インヒビターのIC50値が、他の少なくとも2、3、4、5または10種のプロテインキナーゼに対する値よりも低いことが好ましい。GSK-3インヒビターの選択性を判定する方法が、20種の異なるプロテインキナーゼに関するRingら(2003)に記載されており、他の少なくとも1種のプロテインキナーゼは、そのうちの任意の1種または複数であってもよい。
【００１６】
GSK-3の選択的インヒビターのIC50値が、最も密接な関係があるキナーゼの1つであるcdc2に対する値の少なくとも10分の1、好ましくは少なくとも100分の1または500分の1である場合が好ましい。GSK-3の選択的インヒビターのIC50値が、cdc2に対する値の1000分の1または5000分の1未満であることがより好ましい。
【００１７】
GSK-3の選択的インヒビターのIC50値が、他のすべてのヒトプロテインキナーゼに対する値の少なくとも5分の1、好ましくは少なくとも10分の1、50分の1、100分の1または500分の1であることが好ましい。
【００１８】
GSK-3のインヒビターは、ペプチド薬物または非ペプチド薬物であってよい。このインヒビターは、GSK-3α、GSK-3β、またはこの両方を阻害することができる。このインヒビターは、GlaxoSmithKline社製のSB415286、または関連のGSK-3阻害化合物、例えば3-インドリル-4-フェニル-1H-ピロール-2,5-ジオン誘導体、または他社製の他のピリジンもしくはピリミジン誘導体であってもよい。
【００１９】
塩化リチウムはGSK-3のインヒビターであるが、本発明のGSK-3のインヒビターは塩化リチウムでないことが好ましい。塩化リチウムは、高いIC50値を有し、GSK-3を阻害するのと類似する程度でイノシトールモノホスファターゼを阻害することで知られている。
【００２０】
当分野の技術者にはGSK-3インヒビターのさらなる例が知られている。例えば、WO99/65897およびWO03/074072、ならびにその引用文献に例が記載されている。例えば、様々なGSK-3阻害化合物、およびそれを合成および使用する方法が、米国および国際特許出願公開US20050054663、US20020156087、WO02/20495およびWO99/65897(ピリミジン系およびピリジン系化合物)、US20030008866、US20010044436およびWO01/44246(二環式化合物)、US20010034051(ピラジン系化合物)、ならびにWO98/16528(プリン系化合物)で開示されている。さらなるGSK-3阻害化合物には、WO02/22598(キノリノン系化合物)、US20040077707(ピロール系化合物)、US20040138273(炭素環式化合物);US20050004152(チアゾール化合物)、およびUS20040034037(ヘテロアリール化合物)に記載されているものも含まれる。
【００２１】
さらなるGSK-3阻害化合物には、大環状マレイミド選択的GSK-3βインヒビターが含まれ、これは、Johnson & Johnson社によって開発され、例えば、Kuoら(2003)J Med Chem 46(19):4021〜31頁に記載されている。ビス-7-アザインドリルマレイミド#28および#29は、50種からなるプロテインキナーゼの一群に対してほとんどまたはまったく阻害作用を示さないと報告されている。化合物#29はほとんどの場合、GSK-3βに特異的なインヒビターとして挙動した。GS細胞ベースのアッセイにおいて#28および#29はどちらも良好な効力を示した。特定の一例は、10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-デカヒドロ-9,4:24,29-ジメト-1H-ジピリド(2,3-n:3',2'-t)ピロロ(3,4-q)-(1,4,7,10,13,22)テトラオキサジアザシクロテトラコシン-1,3(2H)-ジオンである。
【００２２】
Pharmaprojectsデータベースに、以下の会社によって開発されたさらなるGSK-3インヒビターが示されている:Cyclacel社(英国)、Xcellsyz社(英国)、例えばXD-4241、Vertex Pharmaceuticals社(米国)、例えばVX-608、Chiron社(米国)、例えばCHIR-73911、Kinetek社(カナダ)、例えばKP-354。
【００２３】
Ringら(2003)は、ヒトGSK-3を強力に阻害し、選択性が他の20種のプロテインキナーゼの少なくとも500倍である置換アミノピリミジン誘導体CHIR98014およびCHIR99021(Kiはそれぞれ0.87および9.8nmol/l)を記載している。また、Clineら(2003)は、ヒトGSK-3を選択的に阻害し、Kiが5nmol/lである置換アミノピリミジン誘導体CHIR98023を記載している。
【００２４】
Liaoら(2004)は、GSK-3インヒビターRO318220およびGF10923Xの使用を記載している(本明細書の参考文献28および29を参照)。
【００２５】
Pierceら(2005)は、タンパク質と特異的に水素結合できるように設計されたGSK-3インヒビター、キナゾリン-4-イルチアゾール-2-イルアミンを記載している。
【００２６】
本発明に有用であり得る他の多くのGSK-3インヒビターはCalbiocheme(登録商標)社から市販されている。例えば、以下のものがある。
【００２７】
AR-A014418(N-(4-メトキシベンジル)-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)尿素(カタログ番号361549)は、GSK-3βの強力な高特異性ATP競合的インヒビター(IC50=104nM、Ki=38nM)として作用する細胞透過性のチアゾール含有尿素化合物であり、その特異性は、Cdk2およびCdk5を含めた28種からなるキナーゼの一群を使用して確認されている(IC50>100mM)(Bhatら2003)。
【００２８】
(5-メチル-1H-ピラゾール-3-イル)-(2-フェニルキナゾリン-4-イル)アミン(カタログ番号361555)は、GSK-3の強力なATP結合部位インヒビターとして作用し、Kiが24nMであるアミノピラゾール化合物である(Pierceら2005)。
【００２９】
TDZD-8(4-ベンジル-2-メチル-1,2,4-チアジアゾリジン-3,5-ジオン、カタログ番号361540)は、GSK-3βの高選択性ATP非競合的インヒビター(IC50=2mM)であり、Cdk-1/サイクリンB、CK-II、PKA、およびPKCの活性に著しい影響を及ぼさない(IC50>100mM)(Barryら2003、Martinezら2002)。
【００３０】
2-チオ(3-ヨードベンジル)-5-(1-ピリジル)-[1,3,4]-オキサジアゾール(カタログ番号361541)は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3βの強力なインヒビター(IC50=390nM)として作用する2-チオ-[1,3,4]-オキサジアゾール-ピリジル誘導体である(Naerumら、2002)。
【００３１】
3-(1-(3-ヒドロキシプロピル)-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジル-3-イル)-4-ピラジン-2-イル-ピロール-2,5-ジオン(カタログ番号361553)は、GSK-3βの強力な特異的かつATP競合的インヒビター(Ki=25nM)として作用する細胞透過性のアザインドリルマレイミド化合物であり、数種のPKCアイソザイムを含めた、一般に研究されている79種からなるプロテインキナーゼの一群を最小限に阻害する(O'Neillら2004)。
【００３２】
(2'Z,3'E)-6-ブロモインジルビン-3'-オキシム(カタログ番号361550)は、GSK-3α/βの極めて強力な選択的、可逆的かつATP競合的インヒビター(IC50=5nM)として作用する細胞透過性のビス-インドロ(インジルビン)化合物であり、その特異性は、様々なCdk群(Cdk5/p25、Cdk2/A、Cdk1/BおよびCdk4/D1に関してそれぞれIC50=83、300、320および10,000nM)、ならびにMAPキナーゼ、PKA、PKC isoforms、PKG、CK、およびIRTKを含めた、一般に研究されている他の多くのキナーゼ(IC50≧10μM)に対して試験されている(Polychronopoulosら2004、Satoら2004、Meijerら2003)。
【００３３】
BIO-アセトオキシム((2'Z,3'E)-6-ブロモインジルビン-3'-アセトキシム、カタログ番号361551)は、Cdk5/p25、Cdk2/AおよびCdk1/B(それぞれIC50=2.4mM、4.3mMおよび63mM)よりもGSK-3α/β(IC50=0.01mM)に対してより高い選択性を示す。これがCdk4/D1および他の多くのキナーゼの活性に及ぼす影響は弱い(IC50≧10mM)(Knockaertら2004、Polychronopoulosら2004、Meijerら2003)。
【００３４】
トリフルオロ酢酸塩として供給されるL803-mtsは、GSK-3βの選択的、基質特異的かつ競合的インヒビター(IC50=40mM)として作用する細胞透過性ミリストイル化ペプチドのGSK-3βインヒビターであり(カタログ番号361546)、in vivo安定性を示す。これは、Cdc2、PKBおよびPKCの活性に影響を及ぼさない(Plotkinら2003)。
【００３５】
1-アザケンポーロン(azakenpaullone)(カタログ番号191500)は、GSK-3βの強力なATP競合的インヒビター(IC50=18nM)として作用し、Cdk1/BおよびCdk5/p25よりも約100〜200倍高い選択性を示す(それぞれIC50=2.0mMおよび4.2mM)(Kunickら2004)。
【００３６】
GSK-3インヒビターは、低分子干渉RNA(siRNA;Hannonら、Nature、418(6894):244〜51頁(2002)、Brummelkampら、Science 21、21(2002)、およびSuiら、Proc,Natl Acad.Sci.USA 99、5515〜5520頁(2002))であってよい。RNA干渉(RNAi)は、サイレンシングされる遺伝子に配列が相同である二本鎖(dsRNA)によって開始される動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程である。配列特異的なmRNA分解のメディエーターは通常、リボヌクレアーゼIIIによる長鎖dsRNAからの切り出しによってin vivoで生成され得る21および22ヌクレオチドの低分子干渉RNA(siRNA)である。21ヌクレオチドのsiRNA二重鎖は、内因性かつ異種の遺伝子の発現を特異的に抑制することが示されている(Elbashirら(2001)Nature 411:494〜498頁)。哺乳動物細胞では、より長い二本鎖(ds)RNAがPKR(dsRNA依存性プロテインキナーゼ)を活性化し、タンパク質合成全体を抑制するので、siRNAは、下記の通り2本の相補的な21mer分子からなる必要があると考えられている。
【００３７】
GSK-3αおよびGSK-3βに対して選択的な二重鎖siRNA分子は、そのcDNA配列を参照することによって容易に設計することができる。通常、メチオニン開始コドンの少なくとも120ヌクレオチド下流にあるAAジヌクレオチドから始まる最初の21merの配列が選択される。この配列に完全に相補的なRNA配列は、第1のRNAオリゴヌクレオチドになる。第2のRNA配列は、第1のヌクレオチドのうちの最初の19残基に完全に相補的で、その3'末端に追加のUUジヌクレオチドを有するべきである。設計されると、合成RNA分子は、当技術分野で周知の方法を使用して合成することができる。
【００３８】
Liaoら(2003)は、特異的GSK-3βインヒビターとして作用するsiRNA分子を記載している。こうした分子には、(5'-3')AAG AAT CGA GAG CTC CAG ATC(配列番号1)およびAAG TAA TCC ACC TCT GGC TAC(配列番号2)が含まれる。GSK-3のsiRNAは、Yuら(2003;Mol Ther.7(2):228〜36頁)を含む他の多くのグループによって記載されており、市販されているGSK-3(αおよびβ)のsiRNA(Upstate社)もある。さらなるGSK-3特異的siRNA分子は、当分野の技術者によって容易に同定および調製することができる。
【００３９】
他の特異的GSK-3インヒビターには、アンチセンスもしくはトリプレット形成核酸分子またはリボザイムが含まれる。GSK-3に対して選択的なアンチセンス核酸分子およびおよびリボザイムは、当技術分野で知られている通り、cDNAまたは遺伝子の配列を参照することによって設計することができる。
【００４０】
さらなる潜在的可能なGSK-3インヒビターには、抗GSK-2中和抗体、すなわちGSK-3の関連する生物活性を抑制する抗体が含まれる。「抗体」という用語には、それだけに限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーによって産生されるフラグメントが含まれる。このようなフラグメントには、標的物質に対するその結合活性を保持している抗体全体のフラグメント、すなわち、Fv、F(ab')およびF(ab')2フラグメント、ならびに単鎖抗体(scFv)、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質および他の合成タンパク質が含まれる。さらに、抗体およびそのフラグメントは、当技術分野で現在周知のヒト化抗体であってよい。
【００４１】
GSK-3インヒビターに関する上記の文書を参照により本明細書に特に組み込む。
【００４２】
さらなるGSK-3インヒビターには、AxinのGSK-3結合ドメイン(GSK-3相互作用ドメイン、すなわちGIDとしても知られている)またはGSK-3を阻害するその変異体、およびFRATのGSK-3結合ドメインまたはGSK-3を阻害するその変異体が含まれる。GSK-3の阻害率または阻害レベルを求める、したがって、ある化合物がGSK-3を阻害するかどうか、またどの程度まで阻害するのかを判定する方法およびアッセイは、実施例および上記の文書、例えばLiaoら2003、2004に記載されている。
【００４３】
FRATのGIDおよびGSK-3結合ドメインの「変異体」には、これらの分子のフラグメント、配列変異体、改変体、もしくは融合体、またはその組合せが含まれる。
【００４４】
技術的には、AxinおよびFRATのGSK-3結合ドメインは、GSK-3キナーゼの触媒活性を抑制することが示されていないので、GSK-3インヒビターではないと認められている。しかし、このドメインは、GSK-3を隔離してそのARとの相互作用を妨げ、このようにしてGSK-3の活性を抑制すると考えられている。
【００４５】
こうした変異体は、タンパク質化学技法、例えば部分的なタンパク質分解を使用して(外因性分解または内因性分解のいずれか)、またはde novo合成によって作製することができる。あるいは、この変異体は、組換えDNA技術によって作製することもできる。核酸をクローニング、操作、修飾、および発現し、ならびに発現されたタンパク質を精製するための適当な技法は、当技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるSambrookら(2001)「Molecular Cloning,a Laboratory Manual」、第3版、Sambrookら(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、USAに記載されている。
【００４６】
試験した前立腺癌細胞系のうち、GSK-3インヒビターに対して応答しない細胞系は、PC3およびDU145であり、これらはいずれもARを発現しない。理論に縛られることなく、GSK-3インヒビターが、ARを発現しない腫瘍を有する患者で作用し得ないことが認められる。したがって、この個体は通常、ARを発現している前立腺癌の個体であることが好ましい。
【００４７】
一実施形態において、本発明は、前立腺癌がARを発現しているかどうかを判定する事前ステップを含む。しかし、ARを発現していない前立腺癌はまれであるので(事例の10%未満)、この事前ステップは必ずしも必要ではない。
【００４８】
本発明者らはまた、GSK-3インヒビターがアンドロゲン依存性の(AD)前立腺癌細胞系、例えばLNCaP、ならびにアンドロゲン非依存性(AI)の前立腺癌細胞系、例えば22Rv1の増殖を抑制することを示した。
【００４９】
したがって、GSK-3インヒビターは、AD前立腺癌を治療するのに有用であり得る。また、GSK-3インヒビターは、AI前立腺癌を治療するのにも有用であり得る。
【００５０】
一実施形態において、本発明は、前立腺癌がADであるかまたはAIであるかを判定する事前ステップを含む。GSK-3インヒビターを使用して、ADおよびAI前立腺癌を両方とも治療することができるので、この事前ステップは必ずしも必要ではない。しかし、AD癌は、抗アンドロゲン療法に感受性があり、すなわち、この療法は、腫瘍がAIになり、このような療法がもはや機能しなくなるまでの約2年間は患者の大多数で有効である。したがって、前立腺癌がアンドロゲン感受性の状態であるかどうかを判定することは、適切な追加の治療薬を投与すべきかどうかを決定する上で重要であり得る。前立腺癌がADであるかまたはAIであるかを判定する方法は、当分野の技術者に周知である。
【００５１】
実施例に示す通り、GSK-3インヒビターは、LNCaP細胞に対する作用が低減するが、これは、GSK-3がこの細胞系であまり活性ではないためであると考えられる。理論に縛られることなく、GSK-3インヒビターは、活性なGSK-3を有する前立腺癌患者に治療上有用であると考えられる。GSK-3の活性は、キナーゼアッセイによって直接的に測定することができ、または当分野の技術者に周知である、市販の抗体で染色することによって間接的に測定することができる(抗GSK-3セリン9リン酸化抗体は、より活性が低いGSK-3を認識し、抗GSK-3チロシン216リン酸化抗体は、より活性が高いGSK-3を認識する)。
【００５２】
哺乳動物個体はヒトであることが好ましい。あるいは、この個体は、動物、例えばペット動物(例えばイヌまたはネコ)、実験動物(例えば実験用の齧歯類、例えばマウス、ラット、またはウサギ)、または農業において重要な動物(すなわち家畜)、例えばウシ、ヒツジ、またはヤギであってもよい。
【００５３】
前立腺癌を「治療する」には、本発明を使用して、障害の症状を軽減する(すなわち緩和的使用)か、障害を治癒するか、または障害を予防する(すなわち予防的使用)ことができるという意味が含まれる。
【００５４】
GSK-3のインヒビターまたはその配合物は、経口および注射(例えば皮下または筋肉内)を含めた従来からの任意の方法によって投与することができる。好ましい経路には、経口、鼻腔内、または筋肉内注射が含まれる。GSK-3インヒビターに関してすでに知られている経路を使用してもよいが、異なる局所治療経路が、(例えば)糖尿病を治療する場合よりも前立腺癌を治療するのに適している可能性があると認められている。この治療は、単回投与またはある期間にわたる多回投与からなるものであってよい。
【００５５】
一実施形態において、GSK-3のインヒビターは、アンドロゲン受容体を介して非特異的に前立腺を標的として送り込むことができる。
【００５６】
GSK-3インヒビターは、他のある方法によって前立腺癌治療が行われている対象に投与してもよい。したがって、この治療方法は単独で使用してもよいが、これは、例えば、従来からの予防的、治療的または緩和的方法と一緒に補助療法として使用することが望ましい。このような方法には、外科手術、近接照射療法を含めた放射線療法、および化学療法が含まれ得る。
【００５７】
したがって、一実施形態において、GSK-3インヒビターを患者に投与し、さらにこの患者に追加の抗癌剤を投与する。癌化学療法薬には、メクロレタミン(HN2)、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン(L-サルコリシン)、クロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード類;ヘキサメチルメラミン、チオテパなどのエチレンイミン類およびメチルメラミン類;ブスルファンなどのスルホン酸アルキル類;カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、セムスチン(メチル-CCNU)、ストレプトゾシン(ストレプトゾトシン)などのニトロソウレア類;ならびにダカルバジン(DTIC、ジメチルトリアゼノイミダゾール-カルボキサミド)などのトリアゼン類を含めたアルキル化剤と、メトトレキセート(アメトプテリン)などの葉酸アナログ;フルオロウラシル(5-フルオロウラシル、5-FU)、フロクスウリジン(フルオロデオキシウリジン、FUdR)、シタラビン(シトシンアラビノサイド)などのピリミジンアナログ;ならびにメルカプトプリン(6-メルカプトプリン、6-MP)、チオグアニン(6-チオグアニン、TG)、ペントスタチン(2'-デオキシコホルマイシン)などのプリンアナログおよび関連インヒビターを含めた代謝拮抗剤とが含まれる。ビンブラスチン(VLB)、ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド類;エトポシド、テニポシドなどのエピポドフィロトキシン類;ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシン(ダウノマイシン、ルビドマイシン)、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)、マイトマイシン(マイトマイシンC)などの抗生物質;L-アスパラギナーゼなどの酵素;およびインターフェロンαなどの生物学的応答調節物質を含めた天然産物が含まれる。シスプラチン(シス-DDP)、カルボプラチンなどの白金配位錯体;ミトキサントロン、アントラサイクリンなどのアントラセンジオン;ヒドロキシ尿素などの置換尿素;プロカルバジン(N-メチルヒドラジン、MIH)などのメチルヒドラジン誘導体;ならびにミトタン(o,p'-DDD)、アミノグルテチミドなどの副腎皮質機能抑制剤;タキソールおよびアナログ/誘導体;ならびにフルタミド、タモキシフェンなどのホルモンアゴニスト/アンタゴニストを含めた種々の薬剤が含まれる。
【００５８】
他の適当な薬剤には、GnRHおよびそのアナログが含まれ、GnRHアゴニストおよびアンタゴニストは両方とも、血清アンドロゲンレベルを低下させるように作用することができる。
【００５９】
しかし、追加の抗癌剤は、ロイプロレリン、ゴセレリン、ブセレリンなどのGnRHアゴニスト;ビカルタミド、フルタミドなどの抗アンドロゲン;ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、デキサメタゾンなどのステロイド;およびミトザントロン、エストラムスチン、ドセタキソールなどの化学療法剤から選択される場合が好ましい(Schellhammer & Davis 2004、Assikis & Simons、2004、Gulley & Dahut、2004)。
【００６０】
通常、前立腺癌がADである場合、追加の抗癌剤は抗アンドロゲンである。
【００６１】
一実施形態において、追加の抗癌剤はTRAILではない。言い換えれば、本発明は、GSK-3インヒビターおよびTRAIL以外の追加の抗癌剤を投与することによりある個体の前立腺癌を治療することを含む。
【００６２】
本明細書に記載の治療用分子を単独で投与することも可能であるが、それらを1種または複数の許容される担体と共に製剤として提供することが好ましい。1種(複数)の担体は、治療用分子と適合し、そのレシピエントに有毒でないという意味で「許容される」ものでなければならない。通常、担体は、滅菌された、もしくは発熱物質を含まない水または生理食塩水である。
【００６３】
製剤は、好都合には、単位投与形態で提供することができ、製薬学の分野で周知のいかなる方法によって調製することもできる。このような方法に、有効成分(本発明の抗原分子、構築物、またはキメラポリペプチド用の有効成分)を、1種または複数の補助成分を構成する担体と混合するステップを含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体、微粉固体担体、またはその両方と均一によく混合し、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【００６４】
経口投与に適した本発明の配合物は、それぞれ所定の量の有効成分を含有するカプセル剤、カシェ剤または錠剤などの別個の単位として、散剤または顆粒剤として、水溶液または非水溶液中の液剤または懸濁液剤として、あるいは水中油型液体乳剤または油中水型液体乳剤として提供することができる。有効成分は、ボーラス、舐剤またはパスタ剤として提供することもできる。
【００６５】
錠剤は、1種または複数の補助成分と場合によっては一緒に、圧縮または成形によって製造することができる。圧縮錠剤は、易流動性の散剤または顆粒剤などの有効成分を、場合によっては結合剤(例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム)、界面活性剤または分散剤と混合して適当な機械で圧縮することによって調製することができる。成形した錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末化合物の混合物を適当な機械で成形することによって製造することができる。錠剤は、場合によってはコーティングし、または刻み目を入れることもでき、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な割合で使用し、その中の有効成分の持続放出または徐放性をもたらすように配合して所望の放出プロファイルを提供することもできる。
【００６６】
口腔内への局所投与に適した製剤には、有効成分をフレーバード基剤、通常ショ糖およびアラビアゴムまたはトラガカントゴム中に含むトローチ剤、有効成分をゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアラビアゴムなどの不活性基剤中に含む香錠、ならびに有効成分を適当な液体担体中に含む洗口剤が含まれる。
【００６７】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および配合物を対象のレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる無菌の水性および非水性注射剤、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含有することができる無菌の水性および非水性懸濁剤が含まれる。製剤は、単回投与容器または多回投与容器、例えば密封アンプルおよびバイアルに入れて提供することができ、無菌の液体担体、例えば注射用水を使用の直前に添加するだけよい凍結乾燥(フリーズドライ)状態で保存することができる。即時の注射液剤および懸濁剤は、先に記載した種類の無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製することができる。
【００６８】
好ましい単回投与製剤は、1日用量または単位1日部分用量または適切なその画分のGSK-3インヒビターを含有するものである。
【００６９】
例えば、SB216763のKiは3μMであり、これは、CWR-R1細胞中で前立腺癌増殖を抑制するための至適用量であることが判明した。より低い用量のCHIR98014をラットに投与した(Ringら、2003)。投与すべきGSK-3インヒビターの用量は、前立腺癌での有効な濃度0.1μMから10μM、好ましくは1μMから10μMをもたらす用量である。
【００７０】
本発明の製剤は、先に詳述した成分に加え、当該の製剤の種類を考慮して当技術分野で通常用いられている他の作用物質を含むことができ、例えば、経口投与に適した製剤は、矯味剤を含むことができることは理解されるはずである。
【００７１】
好ましい一実施形態において、治療用分子は経口投与される。
【００７２】
治療用分子は、薬物の局所投与に適した任意の手段により前立腺の領域に送達できることは理解されよう。例えば、治療用分子の溶液は、前立腺に直接注射することができ、または注入ポンプを使用した注入によって送達することができる。治療用分子は、所望の部位に位置すると治療用分子が周囲の場所に放出されるようになる移植デバイス中に含めることもできる。
【００７３】
治療用分子は、ヒドロゲル材料を介して投与することもできる。ヒドロゲルは非炎症性であり、生分解性である。現在、天然および合成ポリマー製のものを含めてこのような多くの材料が知られている。好ましい一実施形態において、本発明の方法は、体温以下で液体であるが、体温または体温付近で保形半固体ヒドロゲルを形成するゲルであるヒドロゲルを利用する。好ましいヒドロゲルは、エチレンオキシド-プロピレンオキシド反復単位のポリマーである。このポリマーの特性は、ポリマーの分子量およびポリマー中のポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドの相対的割合に依存する。好ましいヒドロゲルは、約10重量%から約80重量%のエチレンオキシドおよび約20重量%から約90重量%のプロピレンオキシドを含有する。特に好ましいヒドロゲルは、約70%のポリエチレンオキシドおよび30%のポリプロピレンオキシドを含有する。使用することができるヒドロゲルは、例えば、BASF社(ニュージャージー州Parsippany)からPluronic(登録商標)という商品名で市販されている。
【００７４】
現在、前立腺に特異的な表面抗原で知られているものはない。前立腺に特異的な膜抗原は、他の器官の他の上皮細胞との高度な交差反応性を有する。しかし、適当な前立腺特異的抗原が同定されれば、GSK-3のインヒビターを、前立腺癌の部位に結合するかまたは留まるターゲティング部分を使用して、必要な部位を標的として送り込むことができる。例えば、前立腺は、GSK-3インヒビターとの切断可能なリンカーを有する前立腺特異的抗体を使用すればターゲティングできるはずである。ターゲティングとプロドラッグを組み合わせた手法が有用であり得る。
【００７５】
プロドラッグによる手法は、ターゲティングを行わずに使用することもできる。したがって、GSK-3インヒビターへの言及には、GSK-3インヒビタープロドラッグへの言及が含まれる。
【００７６】
GSK-3インヒビターはそれ自体ポリヌクレオチドであってよく、またはポリヌクレオチドによってコードされるものであってもよいことが理解されよう。ポリヌクレオチドは、任意の効果的な方法により、例えば非経口的に(例えば静脈内、皮下、筋肉内)、または経口、経鼻、またはオリゴヌクレオチドが患者の血流に接近し循環することを可能にする他の手段によって投与することもできる。全身投与されるポリヌクレオチドは、局所投与されるポリヌクレオチドに加えて投与することが好ましいが、局所投与しない場合にも有用である。一般に、成人ヒトへの投与あたり約0.1gから約10gの範囲の用量がこのために有効である。
【００７７】
ポリヌクレオチドは、下記の通り適当な遺伝子構築体として投与することもでき、この構築体を発現させる患者に送達される。通常、遺伝子構築体中のポリヌクレオチドは、細胞中で化合物を発現させることができるプロモーターに作動可能に連結される。本発明の遺伝子構築体は、当技術分野で周知の方法、例えばSambrookら(2001)に記載の方法を使用して調製することができる。
【００７８】
樹状細胞ワクチンによる手法は、前立腺癌を治療するための遺伝子治療に有用であり得る。
【００７９】
ポリヌクレオチドを送達するための遺伝子構築体はDNAまたはRNAとすることができるが、DNAであることが好ましい。
【００８０】
遺伝子構築体は、ヒト細胞に送達するように適合されることが好ましい。
【００８１】
遺伝子構築体を動物体の細胞中に導入する手段および方法は当技術分野で知られている。例えば、本発明の構築体は、細胞のゲノム中に挿入されるように任意の好都合な方法、例えばレトロウイルスが関与する方法によって導入することもできる。例えば、Kuriyamaら(1991)、Cell Struc.and Func.16、503〜510頁では、精製されたレトロウイルスが投与されている。上記のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスDNA構築体は、当技術分野で周知の方法を使用して作製することができる。このような構築体から活性なレトロウイルスを産生するために、10%ウシ胎児血清(FCS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で増殖させたエコトロピックなpsi2パッケージング細胞系を使用することが有用である。この細胞系のトランスフェクションは、好都合には、リン酸カルシウム共沈法によるものであり、安定な形質転換体は、G418を最終濃度1mg/mlまで添加することによって選択される(レトロウイルス構築体がneoR遺伝子を含有すると仮定する)。独立のコロニーを単離し、増殖させ、培養上清を除去し、0.45μm孔径フィルターでろ過し、-70℃で保存する。レトロウイルスを腫瘍細胞中に導入するためには、10μg/mlポリブレンを添加したレトロウイルス上清を直接注射することが好都合である。直径が10mmを超える腫瘍に対しては、0.1mlから1ml、好ましくは0.5mlのレトロウイルス上清を注射するのが適切である。
【００８２】
あるいは、Culverら(1992)Science 256、1550〜1552頁に記載の通り、レトロウイルスを産生する細胞を注射する。こうしてウイルスを導入したレトロウイルス産生細胞は、レトロウイルスベクター粒子を活発に産生するように遺伝子工学的処理を行い、その結果ベクターの連続的な産生が腫瘤内でin situで起こった。したがって、増殖性表皮細胞へのin vivoでの形質導入は、レトロウイルスベクター産生細胞と一緒に混合すると成功することができる。
【００８３】
また、標的化レトロウイルスは、本発明における使用に利用可能であり、例えば、特異的な結合親和性を与える配列を遺伝子操作により既存のウイルスenv遺伝子中に挿入することができる(このベクターおよび遺伝子治療用の他の標的化ベクターの総説に関するMiller & Vile(1995)Faseb J.9、190〜199頁参照)。
【００８４】
他の方法は、細胞中で限られた期間、またはゲノム中に組み込んだ後により長い期間発現させるために、構築体を細胞中に簡単に送達することを含む。後者の手法の一例にはリポソームが含まれる(Nassanderら(1992)Cancer Res.52、646〜653頁)。
【００８５】
他の送達方法には、抗体ポリリジン架橋を介して外部DNAを運ぶアデノウイルス(Curiel(1993)Prog.Med.Virol.40、1〜18頁参照)、および担体であるトランスフェリンポリカチオン複合体(Wagnerら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87、3410〜3414頁)が含まれる。こうした方法では最初に、本発明のDNA構築体または他の遺伝子構築体とのポリカチオン抗体複合体が形成され、この抗体は、野生型アデノウイルス、または抗体と結合する新たなエピトープが導入された変異型アデノウイルスのいずれかに特異的である。ポリカチオン部分は、リン酸骨格との静電相互作用によってDNAと結合する。アデノウイルスは、変更されていないファイバーおよびペントンタンパク質を含有するので、細胞内部に移行し、細胞中にこのタンパク質と共に本発明のDNA構築体を運ぶ。このポリカチオンはポリリジンであることが好ましい。
【００８６】
アデノウイルスによってポリヌクレオチドを送達することもでき、このポリヌクレオチドは、例えば下記のアデノウイルス粒子内に存在する。
【００８７】
代替的な一方法において、受容体介在型エンドサイトーシスを使用してDNA高分子を細胞中に運ぶ高性能の核酸デリバリーシステムが使用される。これは、輸送タンパク質トランスフェリンを核酸と結合するポリカチオンに結合させることによって達成される。ヒトトランスフェリンまたはニワトリホモログであるコナルブミン、またはその組合せを低分子DNA結合タンパク質プロタミンと、またはジスルフィド結合を介して様々なサイズのポリリジンと共有結合させる。こうした修飾トランスフェリン分子は、その同族受容体に結合し、細胞中への効率的な鉄輸送を媒介するその能力を維持している。トランスフェリンポリカチオン分子は、核酸サイズに依存せず(短鎖オリゴヌクレオチドから21キロ塩基対のDNAまで)、本発明のDNA構築体または他の遺伝子構築体と電気泳動で安定な複合体を形成する。トランスフェリンポリカチオンと本発明のDNA構築体または他の遺伝子構築体との複合体を腫瘍細胞に供給すると、この構築体が細胞中で高レベルで発現されることが期待される。
【００８８】
Cottonら(1992)Proc.Natl.Acad Sci.USA 89、6094〜6098頁に記載の方法によって作製された欠陥または化学的に不活化されたアデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を使用して、本発明のDNA構築体または他の遺伝子構築体の高効率の受容体介在型送達を使用することもできる。この手法は、アデノウイルスが、そのDNAを、例えば、アデノウイルス粒子と同一の経路によって細胞により取り込まれた本発明のDNA構築体または他の遺伝子構築体に結合したトランスフェリンの存在下で、リソソームを経過せずにエンドソームから放出できるように適合される事実を利用しているように思われる。
【００８９】
この手法には、複雑なレトロウイルス構築体を使用する必要がなく、レトロウイルス感染によって生じるゲノムの永久的な修飾がなく、また標的化発現系を標的化デリバリーシステムと組み合わせることにより他の細胞型に対する毒性が低減するという利点がある。
【００９０】
「裸のDNA」および陽イオン性および中性脂質と複合体を形成したDNAは、本発明のDNAを治療すべき個体の細胞中に導入するのに有用であり得ると理解されよう。ウイルスを用いない遺伝子治療へのアプローチは、Ledley(1995)Harman Gene Therapy 6、1129〜1144頁に記載されている。
【００９１】
DNAが通常アデノウイルス粒子またはアデノウイルス様粒子内に運ばれるWO94/10323に記載の改変アデノウイルス系など代替の標的化デリバリーシステムも知られている。Michaelら(1995)Gene Therapy 2、660〜668頁は、細胞選択的部分をファイバータンパク質に付加する、アデノウイルスの改変を記載している。p53欠損ヒト腫瘍細胞中で選択的に複製する変異型アデノウイルス、例えばBischoffら(1996)Science 274、373〜376頁に記載されているウイルスも、本発明の遺伝子構築体を細胞に送達するのに有用である。したがって、本発明のさらなる態様は、本発明の遺伝子構築体を含むウイルス粒子またはウイルス様粒子を提供することが理解されよう。他の適当なウイルス、ウイルスベクター、またはウイルス様粒子には、レンチウイルスおよびレンチウイルスベクター、HSV、アデノ随伴ウイルス(AAV)およびAAV系ベクター、ワクシニアウイルス、ならびにパルボウイルスが含まれる。
【００９２】
本発明の第2の態様は、前立腺癌を治療するための医薬の調製における、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００９３】
本発明は、前立腺癌を治療するための医薬の調製における、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドおよび追加の抗癌剤の使用を含む。
【００９４】
本発明は、追加の抗癌剤を投与した個体の前立腺癌を治療するための医薬の調製における、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドの使用を含む。したがって、該個体に、追加の抗癌剤を先に投与してもよく、または該医薬と同時に追加の抗癌剤を投与するかまたは該医薬の後に追加の抗癌剤を投与する。
【００９５】
本発明はまた、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを投与した個体の前立腺癌を治療するための医薬の調製における、追加の抗癌剤(GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチド以外)の使用を含む。したがって、該個体に、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチド先に投与してもよく、または該医薬と同時にGSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを投与するかまたは該医薬の後にGSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを投与する。
【００９６】
本発明のこの態様および続く態様において、前立腺癌、個体、追加の抗癌剤、投与経路、製剤などに関して優先されるものは、本発明の第1の態様に関して先に記載した通りである。一実施形態において、追加の抗癌剤はTRAILではない。
【００９７】
本発明の第3の態様は、哺乳動物個体の前立腺癌細胞の増殖を抑制する方法を提供し、この方法は、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを該個体に投与するステップを含む。
【００９８】
本発明の第4の態様は、前立腺癌細胞の増殖を抑制する医薬の調製における、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００９９】
本発明は、前立腺癌細胞の増殖を抑制する医薬の調製における、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドおよび追加の抗癌剤の使用を含む。
【０１００】
本発明は、追加の抗癌剤を投与した個体の前立腺癌細胞の増殖を抑制する医薬の調製における、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドの使用を含む。したがって、該個体に、追加の抗癌剤を先に投与してもよく、または該医薬と同時に追加の抗癌剤を投与するかまたは該医薬の後に追加の抗癌剤を投与する。
【０１０１】
本発明はまた、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを投与した個体の前立腺癌細胞の増殖を抑制する医薬の調製における、追加の抗癌剤(GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチド以外)の使用を含む。したがって、該個体に、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチド先に投与してもよく、または該医薬と同時にGSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを投与するかまたは該医薬の後にGSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを投与する。
【０１０２】
本発明の第5の態様は、前立腺癌細胞の増殖をex vivoで抑制する方法を提供し、この方法は、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを前立腺癌細胞に投与するステップを含む。
【０１０３】
前立腺癌細胞は、樹立された前立腺癌細胞系であってよく、または前立腺癌生検試料由来の初代培養物であってよい。
【０１０４】
本発明の第6の態様は、GSK-3インヒビターおよび追加の抗癌剤を含む組成物を提供する。該組成物は、医薬組成物であってよい。したがって、本発明は、医薬に使用するための、GSK-3インヒビターおよび抗アンドロゲンを含む組成物を含んでいる。通常、該組成物は、前立腺癌を治療するためのものである。
【０１０５】
GSK-3インヒビターおよび追加の抗癌剤に関して優先されるものは、本発明の第1の態様に関して先に記載した通りである。一実施形態において、追加の抗癌剤はTRAILではない。追加の抗癌剤は抗アンドロゲンであることが好ましい。好ましい抗アンドロゲンには、ビカルタミドおよびフルタミドが含まれる。あるいは、該抗癌剤はGnRHアナログである。好ましいGnRHアナログには、ロイプロレリン、ゴセレリン、ブセレリンなどのGnRHアゴニストが含まれる。
【０１０６】
本明細書に引用されたすべての文書の全体を参照により本明細書に組み込む。
【０１０７】
本明細書のすでに公開されている文書の一覧または考察は、この文書が現況技術の一部である、または共通の一般知識であるという認識として必ずしも解釈すべきではない。
【０１０８】
次に、本発明を以下の非限定的な図面および実施例を参照しながらより詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０９】
(実施例)
材料および方法
プラスミド
GFP-Axin構築体、pOTルシフェラーゼ、およびRSV-β-Galは記載されている(Gianniniら、2000、Ormeら、2003)。MMTV-ルシフェラーゼおよびpSG5 ARはCharlotte Bevanから頂いた(インペリアルカレッジ、ロンドン)。pTERおよびpTERβi(van de Weteringら、2003)は、Marc van de Wetering and Hans Clevers(Hubrecht Lab、オランダユトレヒト)によって寛大にも提供された。
【０１１０】
pTER対照1のsiRNAプラスミドは、ヒト遺伝子との相同性が認められてないsiRNAを発現する。これは以下のオリゴヌクレオチド(5'→3')を使用して作製した:
GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGGAAA(配列番号3)および
GGGAAGAGGCTTGCACAGTGCAAAGTTCTCTTGCACTGTGCAAGCCTCTTAAAAACCTTTTCGA(配列番号4)。
【０１１１】
pTER対照2のsiRNAプラスミドは、ヒト遺伝子(NM_004626)に対するsiRNAを発現する。これは、以下のオリゴヌクレオチド(5'→3')を使用して作製した:
GATCCCCGGACTCGGAACTCGTCTATTTCAAGAGAATAGACGAGTTCCGAGTCCTTTTTGGAAA(配列番号5)および
GGGCCTGAGCCTTGAGCAGATAAAGTTCTCTTATCTGCTCAAGGCTCAGGAAAAACCTTTTCGA(配列番号6)。
【０１１２】
アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化し、BglIIおよびHinDIIIで切断し子ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化したpTER中にライゲートした。
【０１１３】
AX2(FlagAx-(501-560))、AX2P、FRAT、およびGSK-3β構築体(Franca-Kohら、2002、Fraserら、2002、Smalleyら、1999)は、Trevor Dale(Cardiff School of Biosciences、英国)によって寛大にも提供された。
【０１１４】
細胞培養および細胞増殖アッセイ
細胞系は、Christopher Gregory(ノースカロライナ大学、ノースカロライナ州チャペルヒル)から親切にも提供されたCWR-R1細胞(Gregoryら、2001)を除き、American Type Culture Collection(米国基準菌株保存機構)(メリーランド州ロックビル)から入手した。細胞を5%CO2、37℃で増殖させた。COS7、HEK-293、およびHCT-116細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS、Invitrogen)および抗生物質(100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、Sigma)を含むDMEM(Invitrogen)中で増殖させた。LNCaP、PC3、およびDU145細胞は、10%FBSを含むRPMI-1640培地(Invitrogen)中で増殖させた。CWR-R1細胞は、20ng/mlのEGF、10mMニコチンアミド、5μg/mlインシュリン、5μg/mlトランスフェリン、2%FBS、および抗生物質を含むリヒター改良(Richter's Improved)MEM,Znオプション(Invitrogen)中で増殖させた。22Rv1細胞(Sramkoskiら、1999)は、20%FCSを含む1:1 RPMI/DMEM中で増殖させた。R1881を使用した実験では、フェノールレッドを含まず、5%(LNCaP、HCT116および22Rv1用)または2%(CWR-R1用)活性炭処理血清(CSS、First Link Ltd.、英国)を含有する培地中で細胞を増殖させた。R1881(メチルトリエノロン、DuPont-NEN)を1nMで使用し、対照培養物に等量の担体(エタノール)を加えた。GSK-3インヒビターSB216763およびSB415286は、それぞれSigma社およびBiomol Research Labs社(ペンシルベニア州プリマスミーティング)から入手した。
【０１１５】
細胞増殖アッセイはGregoryら(2001)に従って行った。簡単に言えば、細胞(1.5×105/ウェル)を12ウェルプレート(各条件に対して3つのウェルを使用した)に播種し、一晩プレートに結合させた。次いで、担体またはGSK-3インヒビターを添加し、必要であれば30分後にR1881(または担体)を添加した。細胞を必要な時点でトリプシン処理によって収集し、コールターカウンターまたは血球計数器を使用して計数した。
【０１１６】
トランスフェクション
すべての細胞に6ウェル組織培養用プレートで3連でトランスフェクションを行った。トランスフェクションを行うまでは細胞を無血清Optimem-1(Invitrogen)中でインキュベートした。製造元の使用説明書(Invitrogen)に従ってウェルあたり3.5μlのPlus試薬、2μlのリポフェクタミンおよび1μgのDNAを使用して細胞にトランスフェクションを行った。転写アッセイでは、6ウェルプレートの各ウェルで、RSVプロモーター駆動βガラクトシダーゼ(前立腺癌細胞系では200ng、HCT116およびHEK293細胞では20ng)、300ngのpOTルシフェラーゼ(またはpOFルシフェラーゼ、データは示さず)または400ngのMMTVルシフェラーゼを用いてトランスフェクションを行った。必要であれば、空のプラスミドDNAを使用してDNA全量を1μgにした。ウェルあたりのトランスフェクトしたプラスミドDNAの量は、200ngのpSG5 AR(または対照としてpSG5ベクター)、100ngのGFP-Axin、GFP-Axin変異体、GFP-FRATおよびGFP-FRATΔC(または対照としてGFP)、600ngのAX2、AX2P(または対照としてpcDNA3)、50ngもしくは500ngのGSK-3β構築体(または対照としてpcDNA1ベクター)であった。RNAi実験では、まず、細胞に1μgのpTERβiまたはpTER対照1もしくは対照2をトランスフェクトし、24時間後レポーターベクターを200ngのpTERプラスミドと一緒にトランスフェクトした。GSK-3βインヒビターの実験では、細胞にレポータープラスミドのみをトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションで、トランスフェクション試薬を用いてインキュベートした後、細胞を標準的な増殖培地中で40〜42時間またはホルモン枯渇培地中で18時間増殖させ、その後、R1881またはエタノールを添加し、細胞をさらに24時間増殖させた。
【０１１７】
転写アッセイ
細胞をPBSでリンスし、Reporter Lysis Buffer(Promega)を使用して溶解させた。ルシフェラーゼ/βガラクトシダーゼアッセイは、それぞれLucLite Plus(PerkinElmer Life Sciences)およびGalactolight Plus(Applied Bio systems)キットを使用して製造元の使用説明書に従い実施した。プレートをNXT TopCountルミノメーター(Packard Bioscience)で読み取った。示された値は、βガラクトシダーゼ活性に正規化されたルシフェラーゼ活性である。
【０１１８】
細胞抽出、免疫沈降およびウェスタンブロッティング
細胞を50〜70%コンフルエントになるまで100mmディッシュまたは6ウェルプレートで増殖させた。以下のステップを使用して溶解産物を得た。細胞を冷却TBSでリンスし、改変RIPA緩衝液(0.5%デオキシコレート、1%トリトンX-100、20mMトリスpH8.0、0.1%SDS、100mM NaCl、50mM NaF)またはノニデットP-40緩衝液(1%NP-40、20mMトリスpH8.0、150mM NaCl、50mM NaF)中で10分間溶解させ、15,000×gで12分間遠心分離した。次いで、細胞抽出物を等量のSDS試料緩衝液(Sigma Aldrich)と混合し、95℃で3分間加熱した。トランスフェクトされたCOS7細胞における免疫沈降(IP)アッセイでは、NP-40溶解緩衝液を使用して細胞抽出物を調製し、一次抗体と共に氷上で1時間インキュベートした。これに続いて、冷蔵室の回転輪で20μlのプロテインA/G-アガロース(Cambridge Biosciences)と共に30分間インキュベートした。溶解緩衝液で4回、TBSで1回洗浄した後、ビーズを10μlのSDS試料緩衝液で再懸濁させ、上記の通り加熱した。ウェスタンブロッティングでは、抽出物およびIPをSDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に転写し、ブロッキング溶液(3%フラクションV BSA、TBS-T中1%オボアルブミン(20mMトリスpH7.5、100mM NaCl、0.1%Tween-20))中で1時間インキュベートした。抗体でプローブし、TBS-Tで洗浄した後、化学発光(ECL、Amersham Biosciences)およびフィルムへの暴露を使用して抗原を視覚化した。各実験を少なくとも3回反復し、示された結果は代表的なものである。
【０１１９】
抗体
特に明記しない限り、1000倍希釈した抗体を使用してウェスタンブロットをプローブした。ウェスタンブロッティングには以下の抗体を使用した:9E10 mAb(Sigma Aldrich)、P111Aウサギ抗AR(Affinity Bioreagents)、抗βカテニンmAb(Transduction Labs)、および抗γチューブリンmAb(Sigma Aldrich)。免疫沈降には以下の抗体を使用した:50倍希釈P110ウサギ抗AR(Affinity Bioreagents)、対照として5μl抗GFPポリクローナル抗体(Kyptaら、1996)、2μgの9E10、および対照として2μgの抗GFP mAb(Roche)。HRP結合二次抗体(Jackson Laboratories)を10000倍希釈で使用した。
【０１２０】
(実施例1:AxinによるAR転写活性の抑制)
Axinは、スカフォールドタンパク質として働き、βカテニン、APCおよびGSK-3を含めた多くのタンパク質と一緒になり、それによりβカテニンのリン酸化および分解を促進することによってWntシグナル伝達経路を阻害する(参考のため、(Gregoryら、2001、Kikuchi、2000)を参照)。Axinの異所発現は、Wnt/βカテニンシグナル伝達を抑制するのに十分であり、したがって内因性βカテニン機能を抑制するためのツールとして使用されることが多い(Hsuら、2001、Reyaら、2003、Rossら、2000)。内因性βカテニンが前立腺癌細胞においてARのコアクチベーターとして機能しているかどうかを判定するために、CWR-R1細胞においてAxinを発現させた。これは、内因性AR(Gregoryら、2001)および高レベルのβカテニン(Chesire & Isaacs、2002)を発現する前立腺癌のCWR22異種移植モデル由来の細胞系である。こうした試験では、アンドロゲン受容体結合部位を含有する、MMTVプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポータープラスミド、R1881(ARの合成リガンド)、およびすでに特徴付けられているGFP-Axin発現構築体の一群(Ormeら、2003)を使用した(図1a)。GFPを陰性対照として使用した。
【０１２１】
GFPを発現させ担体で処理した細胞(図1b、レーン1)と比較して、R1881を添加すると、予想された通りAR転写活性の増大がもたらされた(図1b、レーン2)。GFP-Axinを発現させると、AR転写活性の低下がもたらされた(図1b、レーン3)。これは、βカテニン過剰発現がARを活性化することが示された研究結果(Chesireら、2002、Mulhollandら、2002、Pawlowskiら、2002、Truicaら、2000、Yangら、2002)と一致した。GSK-3への結合を妨げ、βカテニンへの結合をも低減する(Smalleyら、1999)、AxinのGSK-3結合ドメインにおける保存プロリン残基の変異(GFP-AxinP)は、AR転写活性の抑制を妨げた(図1b、レーン4)。ARの発現におけるAxinのβカテニン結合ドメインの重要性を決定するために、βカテニンおよびAPC結合ドメインを両方とも欠いているAxinの変異型GFP-AxinΔAPC/Δβを使用した。この変異体は、内因性APCを介してβカテニンと間接的に相互作用することができないので有用である(Hinoiら、2000)。GFP-AxinΔAPC/Δβは、APC結合ドメインだけを欠いている変異体GFP-AxinΔAPC(図1b、レーン5)およびGFP-Axinそれ自体と同じ程度までAR転写活性を抑制した(図1b、レーン6)。
【０１２２】
こうした結果から、AxinによるAR転写活性の抑制はβカテニンに依存しておらず、GFP-AxinPにおける抑制活性の喪失は、GSK-3と結合できないことに起因することが示唆される。AxinのGSK-3結合ドメインは、AR活性を抑制するのに十分であるかどうかを判定するために、GSK-3結合ドメインAX2だけを含むAxinの構築体(Smalleyら、1999)を発現させた。空のベクター(図1c、レーン2)に比べて、AX2はAR転写活性を抑制した(図1c、レーン3)。対照として、GSK-3結合に必要とされる保存プロリン残基の変異を有するAX2(AX2P)を使用し、AX2PがAR活性を抑制しないことが認められた(図1c、レーン4)。さらに、構成的に活性なGSK-3をAX2と同時発現させると、AR転写活性に対するAX2の抑制作用が奪われた(図1c、レーン5)。総合すれば、こうした結果から、βカテニンではなくGSK-3が、AR転写活性に対するAxinの抑制作用に関与することが示される。
【０１２３】
(実施例2:内因性βカテニンの枯渇は、前立腺癌細胞における内因性AR転写活性を抑制しない)
Axinを使用した結果から、前立腺癌細胞における内因性βカテニンはAR活性に影響を及ぼさないことが示唆される。この可能性を試験するために、内因性βカテニンの除去によるAR転写活性に対する影響を判定する第2の手法を使用した。こうした試験では、βカテニンタンパク質レベルを低下させβカテニン/Tcf転写活性を抑制することが示されている(van de Weteringら、2003)、十分に特徴付けられたβカテニンsiRNA発現ベクターを使用した。まず、βカテニンにおいて安定化変異を有するHCT116大腸癌細胞、およびTcf/LEF-1結合部位を有するレポータープラスミドであるpOTルシフェラーゼを使用した。予想された通り、βカテニンsiRNAは、HCT116細胞におけるβカテニン/Tcf依存性の転写を抑制した(図2a)。βカテニンsiRNA発現は、Tcf結合部位に変異を有するpOTプロモーターを含むpOFルシフェラーゼの活性に影響を及ぼさなかった(データは示さず)。βカテニンsiRNA発現は、CWR-R1細胞、LNCaP細胞および22Rv1細胞におけるβカテニン/Tcf依存性の転写をも抑制した(図2b、データは示さず)。次に、ARを対照siRNA発現ベクターまたはβカテニンsiRNA発現ベクターのいずれかおよびMMTVルシフェラーゼと一緒にHCT116細胞において発現させた。βカテニンの過剰発現に関する研究から予想された通り、βカテニンの枯渇により、HCT116細胞においてトランスフェクトされたARの転写活性の低下がもたらされた(図2b、レーン1および2、ならびに図2c)。第2の対照siRNA発現ベクター(対照2)は、AR転写活性に対して影響を及ぼさず、ホルモンなしでは抑制作用が観察されなかった(図2c)。βカテニンsiRNAによる影響が、コトランスフェクトされたARの発現レベルの低下に起因するのかどうかを判定するために、トランスフェクションの後にウェスタンブロッティングを行った(図2e)。βカテニンsiRNAの発現により、βカテニンタンパク質が有意に低減した(図2e上図、レーン3および4)。細胞集団の半分より多くを占めるトランスフェクトされていない細胞のβカテニンをも抽出物が含んでいたので、βカテニンの枯渇は、ウェスタンブロッティングによって示される程度よりも効率的であ
る可能性がある。同じ抽出物において、ARの発現レベルはβカテニンsiRNAの発現によって影響を受けず(図2e下図)、βカテニンの枯渇後のARの阻害が、ARタンパク質レベルの低下に起因したものではないことが示された。
【０１２４】
また、前立腺癌細胞におけるβカテニンの枯渇による内因性AR活性に対する影響を試験した。前立腺癌細胞系のトランスフェクション効率が低いと、βカテニンsiRNAが発現した後のβカテニンタンパク質レベルの変化を検出することが困難になる。したがって、βカテニンsiRNAの効率の測度としてβカテニン/Tcf転写活性の低減を使用した(図2a)。βカテニンの枯渇は、CWR-R1細胞、LNCaP細胞(図2b)、または22Rv1細胞(図2d)における内因性AR転写活性を抑制しなかった。実際、AR活性は有意に増大した。こうした結果から、内因性βカテニンによる内因性AR転写活性の調節は、これらのタンパク質のうちの1つまたは両方が異所的に発現される実験において観察されたものと異なることが示唆される。
【０１２５】
(実施例3:GSK-3はAR転写活性を増大させる)
Axin欠失分析により、AR活性の調節におけるGSK-3の重要な役割が示唆された。したがって、GSK-3の過剰発現によるAR転写活性に対する影響を評価した。こうした試験では、野生型GSK-3、抑制性リン酸化部位であるセリン9で変異を有する構成的に活性な種類のGSK-3(S9A)、および触媒作用がない種類のGSK-3(K216R)を使用した。AR転写活性は、22Rv1細胞においてこうした構築体のいずれの発現によっても有意な影響を受けなかった(図3a)。GSK-3 S9Aの発現は、CWR-R1細胞においてAR転写活性のわずかな増大をもたらした(データは示さず)。
【０１２６】
GSK-3によるAR活性に対する影響が弱いのは、こうした細胞系において内因性GSK-3がすでに活性であるからであろうことが推測された。したがって、LNCaP細胞におけるGSK-3発現によるAR転写活性に対する影響を試験した。この細胞では、GSK-3が、セリン9でのリン酸化の結果、不活性であることが分かっている(Salasら、2004)。野生型GSK-3は、高レベルで発現すると、LNCaP細胞においてAR転写活性を有意に増大させた(図3b、レーン6)。構成的に活性なGSK-3は、低レベルおよび高レベルのどちらの発現でもAR転写活性を増大させた(図3b、それぞれレーン8および10)。こうした結果から、野生型GSK-3は、LNCaP細胞においてセリン9でのリン酸化によって阻害されることが示唆される。触媒作用がないGSK-3は、AR転写活性に影響を及ぼさなかった(図3b、レーン12)。総合すれば、こうした結果から、GSK-3は前立腺癌細胞においてAR転写活性を正に調節することが示される。
【０１２７】
(実施例4:GSK-3の阻害はAR転写活性を低下させる)
AxinによるAR転写活性の抑制が、AxinによるGSK-3に対する作用に特異的であり、他の手段によっては誘発し得ないかどうかを判定するために、さらに2つの手法を使用した。第1に、GSK-3に結合しこれを隔離することによりWntシグナル伝達経路を活性化させる癌原遺伝子であるFRATを発現させた(Yostら、1998)。公開されているデータと一致して(Franca-Kohら、2002、Liら、1999)、FRATの発現は、HEK293細胞におけるβカテニン/Tcf依存性の転写を増大させたが、GSK-3に結合することができないFRAT変異体(FRATΔC)の発現はそれを増大させなかった(図4a)。FRATおよびFRATΔCの発現は、変異したTcf結合部位を有するレポーターの活性に影響を及ぼさなかった(Smalleyら、(1999)、データは示さず)。
【０１２８】
次に、CWR-R1細胞におけるFRAT発現によるAR転写活性に対する影響を試験した。Axinを使用した実験から予測される通り、FRATはAR転写活性を抑制し、FRATΔCを使用すると抑制の程度は有意に減少した(図4b)。しかし、FRATΔCは、特に高レベルで発現するとAR活性をある程度まで抑制した(データは示さず)。FRATΔCは、Axinを介してGSK-3に結合するdishevelledと結合することができるので(Liら、1999)、この結果は、GSK-3に対する間接的な作用の現れと解釈される。要約すると、FRATとAxinは、βカテニン/Tcf転写活性に対して逆の影響を及ぼすが、どちらもAR転写活性を抑制し、どちらの場合でもこの抑制には、そのGSK-3結合ドメインが必要である。
【０１２９】
第2の手法では、市販されている2つGSK-3インヒビター、SB415286およびSB216763を使用した(Coghlanら、2000)。まず、こうしたインヒビターによるβカテニン/Tcf依存性のシグナル伝達に対する影響を試験した。CWR-R1細胞にレポーターベクターpOT-Lucをトランスフェクトし、GSK-3インヒビターを24時間処理した。他の細胞型における結果(Coghlanら、2000)と一致して、どちらのインヒビターもβカテニン/Tcf依存性の転写活性を増大させた(図4c)。それとは対照的に、内因性GSK-3がARを活性化するモデルと一致して、どちらのインヒビターもAR転写活性を低下させた(図4d)。総合すれば、こうした結果から、AxinによるARに対する阻害性作用は、Axinに特有のどんな機能よりもGSK-3を調節するその能力に起因することが示される。
【０１３０】
(実施例5:GSK-3の阻害は前立腺癌細胞の増殖を低減する)
次に、GSK-3インヒビターによる前立腺癌細胞の増殖に対する影響を試験した。まず、以前に記載されている通り(Gregoryら、2001)、アンドロゲンに対して過敏性であり、2%FCSを含有する培地中で最適に増殖するCWR-R1細胞を使用した。CWR-R1細胞をGSK-3インヒビターで処理し、6日間にわたって計数した(図5a)。SB415286およびSB216763は両方ともCWR-R1細胞の増殖を抑制した。SB216763による細胞増殖に対する抑制作用は、3μMで最大であった(図5b)。これは、ニューロンをアポトーシス細胞死から防御できるこの薬物にとっての最適の濃度と同じである(Crossら、2001)。SB415286による抑制作用は、試験した最大用量まで用量と共に増大した(50μM、データは示さず)。
【０１３１】
GSK-3の阻害がAR陽性の前立腺癌細胞の増殖を特異的に抑制したかどうかを判定するために、SB216763による、ARを発現するCWR-R1、22Rv1およびLNCaP細胞の増殖に対する影響と、ARを発現しないDU145およびPC3細胞の増殖に対する影響とを比較した(図5c)。22Rv1およびCWR-R1細胞は両方ともCWR22前立腺癌異種移植片に由来するが、異なる増殖条件下で選択された(Gregoryら、2001、Sramkoskiら、1999)。SB216763は、CWR-R1細胞および22Rv1細胞の増殖を同様に低減させた。それとは対照的に、SB216763は、ARが増殖抑制応答に必要とされる可能性に一致して、DU145またはPC3細胞の増殖に有意な影響を及ぼさなかった。LNCaP細胞の増殖は、この細胞系においてGSK-3活性が低いことと一致して、SB216763によって弱く抑制された。総合すれば、こうした結果から、GSK-3の阻害は、AR陽性の前立腺癌細胞の増殖を低減することが示される。
【０１３２】
GSK-3の阻害がアンドロゲン依存性の細胞増殖に特異的に影響を及ぼすかどうかを判定するために、R1881が存在するまたは存在しないホルモン枯渇培地中での22Rv1細胞の増殖を使用して類似の実験を行った(図5d)。22Rv1細胞はホルモン枯渇培地中で増殖できるが、その増殖をアンドロゲンによって刺激することができる(Sramkoskiら、1999)。R1881が22Rvl細胞の増殖を刺激し、これがSB216763の処理によって阻害されることが認められた。しかし、SB216763は、22Rv1細胞のホルモン非依存性の増殖をもある程度まで抑制した。
【０１３３】
(実施例6:GSK-3の阻害によりARタンパク質レベルが低下する)
GSK-3がAR転写活性を調節する機序を決定する第1のステップとして、GSK-3インヒビターに処理したCWR-R1細胞におけるARタンパク質の発現レベルを試験した。CWR-R1細胞にGSK-3インヒビターを24時間処理し、ウェスタンブロッティングにより全細胞抽出物をARに対してプローブした(図6上図)。興味深いことに、ARのタンパク質レベルは、未処理の細胞(レーン1)と比較すると、SB216763(レーン2)およびSB415286(レーン3)を処理した後で両方とも低下した。SB415286は、SB216763よりもARタンパク質レベルを大きく低下させるようであるが、このブロットをチューブリンに対してリプローブすることにより(下図)、この低下の一部がこの薬物による細胞の数に対する影響に起因することが示された。それでも、ローディングコントロールを考慮すれば、どちらのインヒビターもCWR-R1細胞においてARタンパク質レベルを低下させた。
【０１３４】
(実施例7:ARとGSK-3の間の結合およびAX2によるその妨害)
GSK-3によるARに対する作用がこうしたタンパク質間の相互作用を含むかどうかを判定するために、GSK-3およびARが複合体を形成する可能性を試験した。ARおよびmycエピトープタグ付きGSK-3をCOS7細胞において同時発現させ、次いでこうしたタンパク質を免疫沈降させ、ウェスタンブロッティングによってプローブした(図7)。GSK-3は、抗AR免疫沈降物中で検出されたが、対照の免疫沈降物中で検出されず(図7a)、また、ARは、抗GSK-3免疫沈降物中で検出されたが、対照の免疫沈降物中で検出されなかった(図7b)。こうした結果は、GSK-3がARと複合体を形成することによりAR転写活性を増大させるモデルを支持する。AxinによるAR活性の抑制に関する可能な機序を決定するために、COS7細胞においてAX2またはAX2PをGSK-3およびARと一緒に発現させた(図7c)。ARは、AX2Pを発現しているCOS7細胞からのGSK-3免疫沈降物中で容易に検出された。それとは対照的に、AX2を発現している細胞においてARとGSK-3の複合体は検出できなかった。このことから、AX2は、GSK-3とARの相互作用を妨げることによりAR転写活性を抑制することが示唆され、さらにこれは、GSK-3とARの結合によりAR転写活性が上昇するモデルを支持する。
【０１３５】
実施例1〜7の考察
いくつかの報告でβカテニンがARの転写コアクチベーターであること示唆している(Chesireら、2002、Mulhollandら、2002、Truicaら、2000、Yangら、2002)。しかし、AxinおよびβカテニンsiRNA発現ベクターを使用してβカテニンを枯渇させる我々の実験から得られた結果から、内因性βカテニンは、前立腺癌細胞系で高度に発現されるが、内因性ARの転写コアクチベーターではないことが示唆される。野生型ARを使用してHCT116細胞においてsiRNA実験を実施し、これによりβカテニンの枯渇に対する異所性および内因性ARの異なる反応は、LNCaPおよびCWR-R1細胞における内因性ARの変異に起因する可能性があることが示唆される。しかし、ARの野生型およびLNCaP変異体型を両方とも使用したHCT116細胞においても類似の結果が得られた(観察結果は公開せず)。我々の観察結果から、異所的に発現したタンパク質を使用して得られた結果を内因性タンパク質の機能を試験することによって確認する重要性が強調される。AR転写活性の調節における内因性βカテニンの機能を決定するためのさらなる実験が必要であることは明らかである。
【０１３６】
Axinを使用した我々の実験結果から、AR転写活性の調節におけるGSK-3の役割が示唆される。AxinによるAR活性の抑制は、GSK-3結合ドメインにおける点突然変異によって妨げられるのでこのドメインが無傷であることを必要とする。実際、GSK-3結合ドメインだけの発現で、AR活性を抑制するのに十分であり、構成的に活性なGSK-3の同時発現によりこのドメインによるARの抑制が奪われた。さらに、AxinのGSK-3結合ドメインは、GSK-3とARの複合体の形成を妨げた。AxinがGSK-3に結合することによりAR転写活性を抑制するという仮説を支持して、第2のGSK-3結合タンパク質FRATもAR活性を抑制した。内因性AxinまたはFRATがAR転写活性の調節においてある役割を果たしているかどうか、または我々が出した観察結果が、GSK-3が過剰発現されると内因性AxinまたはFRATがそれに結合できることに単に起因するのかどうかを判定するためにはさらなる研究が必要とされる。
【０１３７】
AR転写活性の調節および前立腺癌細胞の増殖におけるGSK-3の役割は、GSK-3インヒビターを使用してさらに検討される。こうした実験の結果から、GSK-3活性は、CWR-R1細胞および22Rv1細胞における最大のAR転写活性および増殖に必要とされることが確認された。興味深いことに、CWR-R1細胞にGSK-3インヒビターを処理すると、ARタンパク質のレベルが低下した。こうしたデータの可能な1つの解釈は、GSK-3がARを直接リン酸化し、このリン酸化がARの安定性を増大させるというものである。GSK-3は、多くのタンパク質の安定性を調節することが示されている(参考のため、(Doble & Woodgett、2003、Frame & Cohen、2001、Woodgett、2001)を参照)。大多数の場合、GSK-3によるリン酸化はその標的物質(βカテニン、サイクリンD1、およびc-mycが例に含まれる)の分解を促進する。しかし、GSK-3によるリン酸化が、Axinなどタンパク質の安定性を促進する例もある(Yamamotoら、1999)。結局は、GSK-3は、タンパク質の安定性に対する正および負の影響を両方とも有することができる。例えば、GSK-3は、核因子κB1/p105を静止条件下で安定化させ、p105をTNF-α処理による分解のために刺激する(Demarchiら、2003)。この一連の論証を継続するために、GSK-3インヒビターを処理した細胞におけるAR転写活性の低下は、実験で観察された通り(図6)、ARタンパク質レベルの低下に起因するはずである。GSK-3は、多数の核タンパク質の転写活性を抑制するが(参考のため、(Doble & Woodgett、2003、Frame & Cohen、2001、Woodgett、2001)を参照)、直接的なリン酸化により少なくとも1種の転写因子CREBを活性化する(Salasら、2003)。GSK-3が、直接的なリン酸化によりARを活性化するかどうか、また次いでこれによりARタンパク質レベルが上昇するかどうかについてはまだ判明していない。しかし、ARおよびGSK-3を免疫共沈降させることができるという観察結果はこのような可能性を支持する。
【０１３８】
他の3つのグループがGSK-3によるARの調節を試験した実験から結果を最近報告している。Salasら(2004)は、GSK-3がARをリン酸化し、トランスフェクトされたCOS-1細胞においてAR転写活性を抑制することを示した。Wangら(2004)は、COS-1細胞およびLNCaP細胞を両方とも使用して類似の結果を報告し、GSK-3によるARの阻害が塩化リチウムによって阻害されることも示した。それとは対照的に、Liaoら(2004)は、化学的インヒビターまたはGSK-3のsiRNAのいずれかを使用したGSK-3の阻害によりAR転写活性が低下することを示した。興味深いことに、このグループは、siRNAによるβカテニンの枯渇によりAR転写活性が増大することも見出した。GSK-3の異なる化学的インヒビターならびにGSK-3結合タンパク質AxinおよびFRATを使用して得られた我々の結果は、Liaoらによる報告と一致している。転写アッセイの異なる系の使用(COS-1細胞におけるトランスフェクトされたARと対照的な前立腺癌細胞系における内因性AR)により、我々の結果とGSK-3がARを阻害するというその示唆との間の多くの差を説明することが可能である。
【０１３９】
LNCaP細胞におけるWangら(2004)の結果も我々の結果と異なる。細胞継代数が、GSK-3を阻害することができるキナーゼAktによるAR活性の調節に影響を及ぼすことが判明しているので(Linら、2003)、それらの結果が細胞継代数の差を反映している可能性がある。Aktは、継代数の少ないLNCaP細胞においてAR転写活性を抑制するが、継代数の多いLNCaP細胞においてAR活性を増強する。我々の実験は、AR活性に対するAktの抑制作用と一致して、継代数の少ないLNCaP細胞(25代より少ない継代数)に制限した。Wangらによる別の重要な観察結果は、CWR22細胞(CWR-R1および22Rv1細胞と同一の患者に由来する)における誘導型のGSK-3 S9Aの発現がその増殖を抑制することである。これは、GSK-3の阻害によりCWR-R1および22Rv1細胞の増殖が低減する我々の観察結果と対照的である。この差は、細胞数を求めるのに使用した方法の違いを反映している可能性がある(MTTアッセイに対して細胞計数)。
【０１４０】
要約すると、タンパク質およびGSK-3の化学的インヒビターを使用して、GSK-3活性はARの最大活性に必要とされること、及びGSK-3の阻害によりARタンパク質レベルおよびある前立腺癌細胞系の増殖が両方とも低減することが示された。このことから、前立腺癌の治療におけるGSK-3インヒビターの新規の治療的応用が示唆される。
【０１４１】
(実施例8:GSK-3のインヒビターを投与することによる前立腺癌患者の治療)
GSK-3インヒビターを含む医薬組成物の生理食塩水溶液の静脈内注入により前立腺癌患者を治療する。3〜6カ月の期間毎週この注入液を投与する。
【０１４２】
(実施例9:GSK-3のインヒビターおよび抗アンドロゲンを投与することによるAD前立腺癌患者の治療)
GSK-3インヒビターおよび抗アンドロゲンを含む医薬組成物の生理食塩水溶液の静脈内注入によりAD前立腺癌患者を治療する。3〜6カ月の期間毎週この注入液を投与する。
(参考文献)
2008509978.tif 000003
2008509978.tif 000004
2008509978.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】(a)  使用したAxin構築体の概略図である。Pは、AxinとGSK-3との結合を妨害するL521P変異を示す。数字は、(b)で使用される構築体を示す。(b)  AxinによるAR転写活性の抑制を示す図である。GSK-3結合ドメインはAxinによるAR活性の抑制に必要である(βカテニンまたはAPC結合ドメインは必要でない)。CWR-R1前立腺癌細胞にGFP(1および2)、GFP-Axin(3)、GFP-AxinP(4)、GFP-AxinΔAPC(5)or GFP-AxinΔAPC/Δβカテニン(6)、MMTV-ルシフェラーゼ、およびRSV-β-Galをトランスフェクトした。10nMのR1881が存在しない(-)または存在する(+)ホルモン枯渇培地中で増殖させた細胞の抽出物においてAR転写活性を求めた。(c)  AxinによるAR転写活性の抑制を示す図である。AxinのGSK-3相互作用ドメイン(GID、AX2としても知られている)は、AR活性の抑制に十分である。CWR-R1細胞に空のベクター(1および2)、AX2(3)、AX2P(4)、またはAX2およびpMT23 GSK-3 S9A(5)、MMTVルシフェラーゼ、ならびにRSV-β-Galをトランスフェクトした。トランスフェクション5と直接比較できるように空のベクター(pMT23)をトランスフェクション1〜4に含めた。10nMのR1881が存在しない(-)または存在する(+)ホルモン枯渇培地中で増殖させた細胞の抽出物においてAR転写活性を求めた。すべての実験を3連で3回以上行った。エラーバーは標準偏差を示す。
【図２Ａ】(a)  内因性βカテニンの枯渇が前立腺癌細胞における内因性AR転写活性を抑制しないことを示す図である。HCT116大腸癌細胞、CWR-R1細胞、およびLNCaP細胞に、βカテニン/Tcf転写活性を測定するレポーターベクターpOTルシフェラーゼ、RSV-β-Gal、および対照1(1、3および5)またはβカテニン(2、4および6)のsiRNA発現ベクターのいずれかをトランスフェクトした。標準的な増殖培地中で増殖させた細胞の抽出物においてβカテニン/Tcf転写活性を求めた。対照1 siRNA発現ベクターをトランスフェクトした各細胞系と比較した活性として結果を示す。(b)  内因性βカテニンの枯渇が前立腺癌細胞における内因性AR転写活性を抑制しないことを示す図である。HCT116細胞、CWR-R1細胞、およびLNCaP細胞に、MMTVルシフェラーゼ、RSV-β-Gal、pSG5 AR(HCT116細胞のみ)、および対照1(1、3、5)またはβカテニン(2、4、6)のsiRNA発現ベクターのいずれかをトランスフェクトした。10nM(CWR-R1細胞)または1nM(HCT116およびLNCaP細胞)のR1881が存在するアンドロゲン枯渇培地中で増殖させた細胞の抽出物においてAR転写活性を求めた。対照1をトランスフェクトした各細胞系と比較した活性として結果を示す。βカテニンsiRNA発現ベクターは、AR活性をCWR-R1細胞(P=0.004)およびLNCaP細胞(P=0.003)において有意に増大させ、HCT116細胞(P=0.01)において有意に低下させた。
【図２Ｂ】(c)内因性βカテニンの枯渇が前立腺癌細胞における内因性AR転写活性を抑制しないことを示す図である。HCT116細胞にMMTVルシフェラーゼ、RSV-β-Gal、pSG5 AR、および対照1(1、2)、βカテニン(3、4)または対照2(5、6)のsiRNA発現ベクターのいずれかをトランスフェクトした。1nMのR1881が存在しない(-)または存在する(+)アンドロゲン枯渇培地中で増殖させた細胞の抽出物においてAR転写活性を求めた。(d)  内因性βカテニンの枯渇が前立腺癌細胞における内因性AR転写活性を抑制しないことを示す図である。27Rv1細胞にMMTVルシフェラーゼ、RSV-β-Gal、および対照1(1、2)またはβカテニン(3、4)または対照2(5、6)のsiRNA発現ベクターのいずれかをトランスフェクトした。1nMのR1881が存在しない(-)または存在する(+)アンドロゲン枯渇培地中で増殖させた細胞の抽出物においてAR転写活性を求めた。すべての実験を3連で3回以上行った。エラーバーは標準偏差を示す。
【図２Ｃ】(e)  内因性βカテニンの枯渇が前立腺癌細胞における内因性AR転写活性を抑制しないことを示す図である。HCT116細胞にpSG5 AR、および対照1(レーン1および2)、βカテニン(レーン3および4)または対照2(レーン5および6)のsiRNA発現ベクターのいずれかをトランスフェクトし、この細胞を1nMのR1881が存在しない(-)または存在する(+)アンドロゲン枯渇培地中で24時間増殖させた。抽出物をβカテニンに対してプローブし(上図)、次いで剥離し、ARに対してリプローブした(下図、上方のバンド)。抗ARのブロットでのより速く移動したバンドはARの分解産物である。
【図３】(a)  GSK-3がAR転写活性を増大させることを示す図である。22Rv1細胞に空のベクター(1、2)、野生型GSK-3(3、4)、GSK-3 S9A(5、6)、またはGSK-3 K216R(7、8)およびMMTVルシフェラーゼ、ならびにRSV-β-Galをトランスフェクトした。1nMのR1881が存在しない(-)または存在する(+)ホルモン枯渇培地中で増殖させた細胞の抽出物においてAR転写活性を求めた。(b)  GSK-3がAR転写活性を増大させることを示す図である。LNCaP細胞に空のベクター(1、2)、野生型GSK-3(3〜6)、GSK-3 S9A(7〜10)、またはGSK-3 K216R(11、12)およびMMTVルシフェラーゼ、ならびにRSV-β-Galを図示された量でトランスフェクトした。1nMのR1881が存在しない(-)または存在する(+)ホルモン枯渇培地中で増殖させた細胞の抽出物においてAR転写活性を求めた。AR活性は、高用量の野生型GSK-3(P=0.02)、ならびに低用量(P=0.0006)および高用量(P=0.0004)のGSK-3 S9Aによって有意に増大した。実験を3連で2回行った。エラーバーは標準偏差を示す。
【図４Ａ】(a)  GSK-3の阻害がAR転写活性を低下させることを示す図である。HEK293細胞にpOTルシフェラーゼ、RSV-β-Gal、およびGFP対照ベクター(1)またはGFP-FRAT(2)またはGFP-FRATΔC(GSK-3結合部位を欠いているFRATの欠失変異体)(3)のいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、標準的な増殖培地中で増殖させた細胞の抽出物においてβカテニン/Tcf転写活性を求めた。(b)  GSK-3の阻害がAR転写活性を低下させることを示す図である。CWR-R1細胞にMMTVルシフェラーゼ、RSV-β-Gal、およびGFP対照ベクター(1、2)、GFP-FRAT(3、4)またはGFP-FRATΔC(5、6)のいずれかをトランスフェクトした。10nMのR1881が存在しない(-)または存在する(+)ホルモン枯渇培地中で増殖させた細胞の抽出物においてAR転写活性を測定した。
【図４Ｂ】(c)  GSK-3の阻害がAR転写活性を低下させることを示す図である。CWR-R1細胞にpOTルシフェラーゼおよびRSV-β-Galをトランスフェクトした。細胞に担体(1)、20μM SB415286(2)、または5μM SB216763(3)を24時間処理し、標準的な増殖培地中で増殖させた細胞の抽出物においてβカテニン/Tcf転写活性を求めた。(d)  GSK-3の阻害がAR転写活性を低下させることを示す図である。CWR-R1細胞にMMTV-ルシフェラーゼおよびRSV-β-Galをトランスフェクトした。トランスフェクション後、担体(1、2)、20μM SB415286(3、4)、または5μM SB216763(5、6)のいずれかが存在し、10nMのR1881が存在しない(-)または存在する(+)ホルモン枯渇培地中で細胞を24時間インキュベートした。次いで、細胞抽出物からAR転写活性を求めた。すべての実験を3連で3回以上行った。エラーバーは標準偏差を示す。
【図５】(a)  GSK-3の阻害が前立腺癌細胞の増殖を低減することを示す図である。CWR-R1細胞を担体(ut)、5μM SB216763(SB21)、または20μM SB415286(SB41)の存在下で最高6日間増殖させ、細胞を計数した。この実験を3連で2回行った。エラーバーは標準偏差を示す。未処理および処理細胞における細胞数の差は統計的に有意であった(6日目、SB216763に関してはP=0.02、SB415286に関してはP=0.008であった)。(b)  GSK-3の阻害が前立腺癌細胞の増殖を低減することを示す図である。CWR-R1細胞を、図示された濃度のSB216763が存在する完全増殖培地中で72時間増殖させ、細胞を計数した。この実験を3連で行った。エラーバーは標準偏差を示す。未処理および処理細胞における細胞数の差は有意であった(3μMでP=0.0007)。(c)  GSK-3の阻害が前立腺癌細胞の増殖を低減することを示す図である。CWR-R1、22Rv1、DU145、PC3、およびLNCaP細胞を、担体(ut)または5μM SB216763(21)のいずれかと共に1nM R1881が存在する標準的な増殖培地(DU145、PC3、およびCWR-R1細胞)またはホルモン枯渇培地(22Rv1およびLNCaP細胞)中で増殖させた。72時間後(またはLNCaP細胞に関しては5日後)、細胞を計数した。実験を3連で行った。エラーバーは標準偏差を示す。CWR-R1、22Rv1、およびLNCaP細胞の数は、SB216763での処理によって有意に減少した(LNCaP細胞に関してはP=0.002)。(d)  GSK-3の阻害が前立腺癌細胞の増殖を低減することを示す図である。22Rv1細胞を、ホルモンが存在しない(1および4)、または10-12M R1881(2および5)または10-9M R1881(3および6)が存在し、担体(1〜3)または5μM SB216763(4〜6)のいずれかを共に含むホルモン枯渇培地中で増殖させた。72時間後、細胞を計数した。実験を3連で行った。エラーバーは標準偏差を示す。
【図６】GSK-3の阻害によりARタンパク質レベルが低下することを示す図である。CWR-R1細胞に、担体(ut、レーン1)、5μM SB216763(SB21、レーン2)、または20μM SB415286(SB41、レーン3)のいずれかを24時間処理した。全細胞抽出物のウェスタンブロットをARに対してプローブし(上図)、内部ローディングコントロールであるγチューブリンに対してリプローブした(下図)。
【図７】(a)  ARとGSK-3の間の結合およびAX2によるその妨害を示す図である。ARおよびmycエピトープタグ付きGSK-3をトランスフェクトしたCOS7細胞の抽出物をポリクローナル対照抗体またはポリクローナル抗AR抗体で免疫沈降させ、抗myc抗体(9E10)でプローブした。矢印は、細胞抽出物中のGSK-3の位置を示す。(b)  ARとGSK-3の間の結合およびAX2によるその妨害を示す図である。ARおよびmycエピトープタグ付きGSK-3をトランスフェクトしたCOS7細胞の抽出物を対照mAbまたは9E10抗体で免疫沈降させ、抗AR抗体でプローブした。矢印は、細胞抽出物中のARの位置を示す。(c)  ARとGSK-3の間の結合およびAX2によるその妨害を示す図である。AR、mycエピトープタグ付きGSK-3、およびAX2またはAX2PのいずれかをトランスフェクトしたCOS7細胞の抽出物を9E10抗体で免疫沈降させ、抗AR抗体でプローブし、次いで9E10でリプローブした。上方の矢印は、細胞抽出物中のARの位置を示し、下方の矢印は、細胞抽出物中のGSK-3の位置を示す。GSK-3の上方に移動したバンドは、二次抗体によって認識されたIgGである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月31日(2007.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物個体の前立腺癌を治療するための医薬であって、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK-3)のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを有効成分とすることを特徴とする医薬。
【請求項２】
哺乳動物個体の前立腺癌細胞の増殖を抑制するための医薬であって、GSK-3のインヒビターまたはGSK-3のインヒビターをコードするポリヌクレオチドを有効成分とすることを特徴とする医薬。
【請求項３】
前記前立腺癌または前立腺癌細胞がアンドロゲン受容体(AR)を発現していることを特徴とする請求項1または2に記載の医薬。
【請求項４】
前記前立腺癌または前立腺癌細胞がアンドロゲン依存性であることを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の医薬。
【請求項５】
前記前立腺癌または前立腺癌細胞がアンドロゲン非依存性であることを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の医薬。
【請求項６】
前記GSK-3のインヒビターが選択的GSK-3インヒビターであることを特徴とする請求項1から5のいずれかに記載の医薬。
【請求項７】
前記GSK-3のインヒビターが、SB415286または関連のGSK-3阻害化合物、例えば3-インドリル-4-フェニル-1H-ピロール-2,5-ジオン誘導体;SB216763;AxinのGSK-3結合ドメインまたはGSK-3を阻害するその変異体;FRATのGSK-3結合ドメインまたはGSK-3を阻害するその変異体;CHIR98023;CHIR99021;CHIR99014;RO318220;GF10923X;およびGSK-3特異的siRNA分子から選択されることを特徴とする請求項1から5のいずれかに記載の医薬。
【請求項８】
追加の抗癌剤をさらに含むことを特徴とする請求項1から7のいずれかに記載の医薬。
【請求項９】
前記追加の抗癌剤が、ビカルタミド、フルタミドなどの抗アンドロゲン、またはロイプロレリン、ゴセレリン、ブセレリンなどのGnRHアゴニストであることを特徴とする請求項8に記載の医薬(請求項5に従属する場合は除く)。
【請求項１０】
前記追加の抗癌剤が、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、デキサメタゾンなどのステロイド、またはミトザントロン、エストラムスチン、ドセタキソールなどの化学療法剤であることを特徴とする請求項8に記載の医薬。
【請求項１１】
前記追加の抗癌剤がTRAILではないことを特徴とする請求項8に記載の医薬。
【請求項１２】
GSK-3インヒビターおよび抗アンドロゲンまたはGnRHアナログを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
GSK-3インヒビターおよび抗アンドロゲンまたはGnRHアナログを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
医薬に使用するための、GSK-3インヒビターおよび抗アンドロゲンまたはGnRHアナログを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１５】
前立腺癌を治療するための、GSK-3インヒビターおよび抗アンドロゲンまたはGnRHアナログを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１６】
前記抗アンドロゲンがビカルタミドまたはフルタミドであることを特徴とする請求項12から15のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記GnRHアナログが、ロイプロレリン、ゴセレリンまたはブセレリンなどのGnRHアゴニストであることを特徴とする請求項12から16のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記GSK-3インヒビターが請求項6または7で定義した通りであることを特徴とする請求項12から17のいずれかに記載の組成物。
【国際調査報告】
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