(57)【要約】  長期保存に適したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物は、炭水化物またはアミノ酸ガラス形成剤でｐＨが約４ないし約８のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の水性製剤を凍結乾燥することによって、形成することができる。これらの凍結乾燥組成物は、４０℃で保存した場合、３ヶ月以上安定である。本発明は、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と、（２）炭水化物またはアミノ酸ガラス形成剤とを含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物を提供し、この凍結乾燥組成物は、約４５％以上の凝集安定性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物であって、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、および（２）炭水化物またはアミノ酸ガラス形成剤を含有し、該凍結乾燥組成物が約４５％以上の凝集安定性を有する、凍結乾燥組成物。
【請求項２】
ＴＦＰＩ改変体を含有する請求項１に記載の凍結乾燥組成物であって、該ＴＦＰＩ改変体がＴＦＰＩ（配列番号１）に対して少なくとも約７０％以上の相同性を有する、凍結乾燥組成物。
【請求項３】
前記ＴＦＰＩ改変体がａｌａ−ＴＦＰＩである、請求項２に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項４】
前記ガラス形成剤が、単糖類、二糖類、三糖類、天然に存在するアミノ酸、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の凍結乾燥組成物であって、約４５％以上〜約９５％以上、約７０％以上〜約９５％以上、および約８５％以上〜約９６％以上の凝集安定性からなる群より選択される範囲の凝集安定性を有する、凍結乾燥組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の凍結乾燥組成物であって、約４５％以上〜約９６％以上の範囲の凝集安定性を有する、凍結乾燥組成物。
【請求項７】
凍結乾燥の前に、前記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体が、炭水化物またはアミノ酸ガラス形成剤を含む水性処方物中に存在し、該水性処方物が約４〜約８のｐＨを有する、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物。
【請求項８】
前記水性処方物が約５０ｍＭ〜約６００ｍＭのガラス形成剤を含有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記水性処方物が、約５ｍＭ〜約６００ｍＭの緩衝剤をさらに含有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記緩衝剤が、リン酸塩、コハク酸塩、グルタミン酸塩、イミダゾール、クエン酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記水性処方物のｐＨが約５．５〜約６．５である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記水性処方物が、以下：
約１０ｍｇ／ｍｌ以下の前記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、
約１ｍｇ／ｍｌ以下の前記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、および
約０．２ｍｇ／ｍｌ以下の前記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体
からなる濃度の群から選択されるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の濃度を含有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
前記水性処方物が、以下：
約３００ｍＭのアルギニンおよび約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムからなる処方物であって、ｐＨが約５．５である、処方物；
約３％（ｗ／ｖ）のアルギニンおよび約１０ｍＭのクエン酸ナトリウムからなる処方物であって、ｐＨが約６である、処方物；
約２％（ｗ／ｖ）のリジンおよび約１０ｍＭのクエン酸ナトリウムからなる処方物であって、ｐＨが約６である、処方物；
約８．５％（ｗ／ｖ）のショ糖、約０．１％（ｗ／ｖ）のポリリン酸塩、および約１０ｍＭのクエン酸ナトリウムからなる処方物であって、ｐＨが約６である、処方物；
約８．５％（ｗ／ｖ）のショ糖および約１０ｍＭのヒスチジンからなる処方物であって、ｐＨが約６である、処方物；ならびに
約８．５％（ｗ／ｖ）のショ糖および約１０ｍＭのイミダゾールからなる処方物であって、ｐＨが約６．５である、処方物；
の群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
前記水性処方物がさらに結晶形成剤を含有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１５】
前記結晶形成剤が、マンニトール、アラニン、グリシン、ＮａＣｌ、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記水性処方物が、約０．５％（ｗ／ｖ）〜約１６％（ｗ／ｖ）の結晶形成剤を含有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記水性処方物が、以下：
約３％（ｗ／ｖ）のアルギニン、約４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および約１０ｍＭのクエン酸ナトリウムからなる処方物であって、ｐＨが約６である、処方物；
約３％（ｗ／ｖ）のアルギニン、約２％（ｗ／ｖ）のグリシン、および約１０ｍＭのクエン酸ナトリウムからなる処方物であって、ｐＨが約６である、処方物；
約３％（ｗ／ｖ）のアルギニン、約４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および約１０ｍＭのクエン酸ナトリウムからなる処方物であって、ｐＨが約６である、処方物；
約１％（ｗ／ｖ）のショ糖、約４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および約１０ｍＭのＬ−ヒスチジンからなる処方物であって、ｐＨが約６である、処方物；
約１％（ｗ／ｖ）のショ糖、約２％（ｗ／ｖ）のグリシン、および約１０ｍＭのヒスチジンからなる処方物であって、ｐＨが約６である、処方物；
約１％（ｗ／ｖ）のショ糖、約４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および約１０ｍＭのイミダゾールからなる処方物であって、ｐＨが約６．５である、処方物；ならびに、
約１％（ｗ／ｖ）のショ糖、約２％（ｗ／ｖ）のグリシン、および約１０ｍＭのイミダゾールからなる処方物であって、ｐＨが約６．５である、処方物
の群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物であって、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、および（２）クエン酸塩緩衝剤を含有し、約４５％以上の凝集安定性を有する、凍結乾燥組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の凍結乾燥組成物であって、約４５％以上〜約９６％以上の範囲の凝集安定性を有する、凍結乾燥組成物。
【請求項２０】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物であって、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、（２）硫酸塩、および（３）リン酸緩衝剤を含有し、約４５％以上の凝集安定性を有する、凍結乾燥組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の凍結乾燥組成物であって、約４５％以上〜約９６％以上の範囲内の凝集安定性を有する、凍結乾燥組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、同時係属仮出願第６０／４３８，５２４号（２００３年１月８日出願）、第６０／４９４，５４７号（２００３年８月１３日出願）、第６０／５０９，２７６号（２００３年１０月８日出願）、および第６０／５１２，０９２号（２００３年１０月２０日出願）の恩恵を主張するとともに、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に安定化されたタンパク質製剤に関する。より詳しくは、本発明は組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）およびＴＦＰＩの安定化凍結乾燥組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）は、２７６アミノ酸長であり、組織因子によって媒介される血液凝固のインヒビターとして機能する。そのアミノ酸配列を配列番号１で示す。ＴＦＰＩのアミノ末端は負に帯電しており、またカルボキシ末端は正に帯電している。ＴＦＰＩタンパク質は、３つのクニッツ型酵素インヒビタードメインを含有する。ＴＦＰＩは、１８個のシステイン残基を含み、正しく折りたたまれた場合、９個のジスルフィド架橋を形成する。一次配列は、３つのＮ結合コンセンサス糖化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含む。一次配列は、３つのＮ結合コンセンサス糖化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含む。糖化部位のアスパラギン酸残基は、１４５、１９５、および２５６位に位置している。ＴＦＰＩもまた、リポ蛋白関連凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）、組織因子インヒビター（ＴＦＩ）、および外因経路インヒビター（ＥＰＩ）として知られている。
【０００４】
ＴＦＰＩを用いて、種々の適応症を治療することが提案された。例えば、敗血症（米国特許第６，０６３，７６４号およびＷＯ９３／２４１４３）、深部静脈血栓（米国特許第５，５６３，１２３号、米国特許第５，５８９，３５９号、およびＷＯ９６／０４３７８）、虚血（米国特許第５，８８５，７８１号、米国特許第６，２４２，４１４号、およびＷＯ９６／４０２２４）、再狭窄（米国特許第５，８２４，６４４号、およびＷＯ９６／０１６４９）、および癌（米国特許第５，９０２，５８２号およびＷＯ９７／０９０６３）が挙げられる。ＴＦＰＩ改変体（アミノ末端でのアラニン残基の付加によってＴＦＰＩとは異なる）（”ａｌａ−ＴＦＰＩ”）が敗血症治療のための動物モデルで有効であることが示されている（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｅ  Ｓｈｏｃｋ  １９９４  Ｎｏｖ；  ４４（３）：  １２６−３７）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＴＦＰＩは、水溶液中での溶解度が乏しい疎水性タンパク質である。溶液中でのＴＦＰＩの凝集は、生物活性の損失と相関していた。種々の製剤が作られた（例えば、米国特許第５，８８８，９６８号およびＷＯ９６／４０７８４を参照せよ）。しかし、安定化されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物が当技術分野で、いまだ求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の簡単な説明）
本発明は、少なくとも以下の実施形態を提供する。
【０００７】
本発明の一実施形態は、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と、（２）炭水化物またはアミノ酸ガラス形成剤とを含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物を提供する。この凍結乾燥組成物は、約４５％以上の凝集安定性を有する。
【０００８】
本発明の別の実施形態は、凍結乾燥に先立って、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体が、炭水化物またはアミノ酸ガラス形成剤を含む水性製剤に存在し、その水性製剤のｐＨが約４ないし約８であるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物である。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物を調製する方法である。この方法は、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と、（２）炭水化物またはアミノ酸ガラス形成剤とを含む水性製剤を凍結乾燥する工程を含み、前記水性製剤はｐＨが約４ないし約８であり、それによって、約４５％以上の凝集安定性を持つＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物を形成する。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、凍結乾燥のためにＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の組成物を調製する上で役立つプロセスである。このプロセスは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を含み基本的にカオトロープを含まない第２の製剤を形成するために、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と（２）カオトロープとを含む第１の製剤から、カオトロープを取り除くことで、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を含む第２の製剤を形成する工程を有し、上記第２の製剤はｐＨが約３．５ないし約４．５である。カオトロープを尿素とすることができる。いくつかの実施形態では、第２の製剤はｐＨが約４である。第１の製剤は、ｐＨが約５．５で約３００ｍＭのアルギニンおよび約２０ｍＭのクエン酸；ｐＨが７．２で約２Ｍの尿素、約１５０ｍＭの塩化ナトリウム、および約２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨが約７．２で約２Ｍの尿素、約２５０ｍＭの塩化ナトリウム、および約２０ｍＭのリン酸ナトリウム；またはｐＨが約７で約１Ｍの尿素、約１２５ｍＭの塩化ナトリウム、および約１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含むことができる。第２の製剤は、ｐＨが約５．５で約３００ｍＭのアルギニンおよび約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨが約６で約１％（ｗ／ｖ）のショ糖、約４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨが約４で約１％（ｗ／ｖ）のショ糖、約４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および約１０ｍＭのグルタミン酸塩；あるいはｐＨが約６で約３％（ｗ／ｖ）アルギニン、約４％（ｗ／ｖ）マンニトール、および約１０ｍＭのヒスチジンを含むことができる。上記除去工程は、ダイアフィルタレーション、透析、およびサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１つの方法によって、実施することができる。
【００１１】
本発明のさらに別の実施形態は、凍結乾燥のためにＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を調製する上で役立つプロセスである。（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と（２）第１製剤低分子量溶質とを含む第１の製剤に含まれる第１製剤低分子量溶質を第２溶液低分子量溶質によって置換して第２の製剤を形成する工程を有し、上記第２の製剤はｐＨが約３．５ないし約４．５である。プロセスは、第２製剤溶質を第３溶質製剤と置き換えて第３の製剤を形成する工程を含むことができる。置換の工程は、ダイアフィルトレーションによっておこなうことができる。第３の製剤は、医薬的に許容しうる製剤である。第２製剤溶質を置き換える工程を、ダイアフィルタレーション、透析、およびサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される方法で実施することができる。必要に応じて、第３の製剤は、ｐＨが約６で約１％（ｗ／ｖ）のショ糖、約４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および約１０ｍＭのヒスチジンと、約１％（ｗ／ｖ）のショ糖、約４％（ｗ／ｖ）マンニトール、およびｐＨが約６．５で１０ｍＭのイミダゾールとを含むことができる。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態は、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と  （２）クエン酸塩緩衝剤とを含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物であって、該凍結乾燥組成物が約４５％以上の凝集安定性を有する。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態は、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と、（２）硫酸塩と、（３）リン酸緩衝剤とを含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物であって、該凍結乾燥組成物が約４５％以上の凝集安定性を有する。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物を調製する方法である。この方法は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体およびクエン酸塩緩衝剤と、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、硫酸塩、およびリン酸塩緩衝剤とからなる群から選択される水性製剤を凍結乾燥する工程を含み、それによって約４５％以上の凝集安定性を持つＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物が形成される。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
高ｐＨ緩衝剤は、水性組成物でのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凝集に好都合である。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凝集は、分子の変性および不活化を生じる。低ｐＨ緩衝剤は、水性組成物でのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の酸接触加水分解を生じる。このように、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の安定な水性組成物にとって最適なｐＨ範囲は、ｐＨ４ないしｐＨ８である。ｐＨが約４ないし約８であり、かつガラス形成剤を含有するＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物を凍結乾燥することで、非常に安定組成物を得ることができる。
【００１６】
凍結乾燥（「フリーズ・ドライ」）は、製剤からの脱水である。凍結乾燥は、任意の周知の方法、例えば以下に説明するように、ハル・フリーズ・ドライヤー（Ｈｕｌｌ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ）を用いておこなうことができる。脱水は、水依存型崩壊反応が起こるのを防止する。そのような反応として、例えばペプチド結合加水分解とアミド分解とが挙げられる。
【００１７】
本発明の凍結乾燥組成物は、約１０ｍｇ／ｍｌ以下のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体（すなわち、１０、７．５、５、２．５、１、０．５、もしくは０．２ｍｇ／ｍｌ以下）とガラス形成剤とを含む水性製剤を凍結乾燥することによって作られる。この水性製剤は、凍結乾燥に先立って、ｐＨが約４ないし約８（すなわち、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、または８）、より好ましくはｐＨが約５ないし約８、それよりも好ましくはｐＨが約５．５ないし約６．５、さらにそれよりも好ましくはｐＨ６である。必要に応じて、水性製剤が緩衝剤および／または１種類以上の結晶形成剤を含むことができる。
【００１８】
他のＴＦＰＩおよびＴＦＰＩ組成物の調製は、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩ改変体と、（ａ）クエン酸塩緩衝剤、（ｂ）硫酸塩とリン酸塩緩衝剤との混合物、または（ｃ）硫酸塩と緩衝剤（ｐＨが約４ないし約８）を含む水性製剤を凍結乾燥することで、おこなうことができる。凍結乾燥組成物の成分は、以下に別々に説明する。
【００１９】
好ましい凍結乾燥産物は、２０ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、１０ｍｇ／ｍｌのポリリン酸塩、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（ｐＨ７）、４％のマンニトール、および１％のショ糖を含む。
【００２０】
（凍結乾燥組成物の凝集安定性）
本発明の凍結乾燥組成物の凝集安定性は、約４５％以上である。「凝集安定性率（ｐｅｒｃｅｎｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」は、４０℃促進安定性アッセイで測定される可溶性をもつＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体試料の比率のことをいう。４０℃促進安定性アッセイでは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体試料を４０℃で３ヵ月間インキュベートする。インキュベーション後、凍結乾燥されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体試料を滅菌水で元に戻し、０．２μｍフイルターで濾過し、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー  （ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）  にかけて、溶液に残存する可溶性ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の量を測定する。ＣＥＸ−ＨＰＬＣアッセイついては、後述する。このように、例えば、６０％の凝集安定性を持つＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物は、４０℃促進安定性アッセイで測定されるようにＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の６０％が可溶性である組成物である。８０％の凝集安定性を持つＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物は、４０℃促進安定性アッセイで測定されるように、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の８０％が可溶性である組成物である。本発明のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の凝集安定性率は、４０℃促進安定性アッセイで測定されるように、好ましくは約４５、５０、６０、７０、または７５％以上、より好ましくは８０、８２、８４、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％以上である。本発明のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の凝集安定性率は、例えば、約４５％以上から約９０％以上、約４５％から約９６％以上、５０％以上から約９９％以上、約５０％以上から約７０％以上、約６０％以上から約８０％以上、約７０％から約９５％以上、あるいは約８５％以上から約９６％以上の範囲に及ぶことができる。好ましくは、本発明の水溶性組成物に含まれるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体は、以下に説明するように、例えばプロトロビン時間アッセイによって測定される生物活性を有する。
【００２１】
（保存温度）
本発明の組成物に対する保存温度を、約−７０℃から約２５℃までの範囲（例えば、約−７０、−６０、−５０、−４０、−３０、−２０、−１０、５、１０、１５、２０、または２５℃）とすることができる。好ましくは、本発明の凍結乾燥組成物を約２５℃で保存することができる。
【００２２】
（ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩ改変体）
ＴＦＰＩは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を持つポリペプチドである。好ましくは、ＴＦＰＩは、微生物宿主で生ずる組み換え型のヒト・タンパク質である。ＴＦＰＩは、ＷＯ０１／２４８１４でその生物活性に関して、さらに特徴づけられ、かつ説明されている。
【００２３】
ＴＦＰＩ改変体として、ＴＦＰＩの類似体および誘導体、同様にＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ類似体、およびＴＦＰＩ誘導体のフラグメントが挙げられる。ＴＦＰＩ改変体は、ヒトまたは他の哺乳類源から得ることができ、また合成あるいは組み換え技術によっても得られる。類似体は、一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失、および／または付加を有するＴＦＰＩ分子である。保守的置換（アミノ酸が同様の特性を持つ別のアミノ酸と交換される）が好ましい。保守的置換の例として、限定されるものではないが、ＧｌｙとＡｌａとの間、ＶａｌとＩｌｅとＬｅｕとの間、ＡｓｐとＧｌｕとの間、ＬｙｓとＡｒｇとの間、ＡｓｎとＧｌｎとの間、およびＰｈｅとＴｒｐとＴｙｒとの間が挙げられる。これらは一般に、約１ないし５アミノ酸の範囲内である（すなわち、１、２、３、４、または５アミノ酸）。分子内の任意の位置、特にアミノ末端またはカルボキシ末端に、さらにアミノ酸を付加することができる。例えば、ＴＦＰＩ類似体の一つであるＮ−Ｌ−アラニル−ＴＦＰＩ（「ａｌａ−ＴＦＰＩ」）は、アミノ末端にアラニン残基が付加されている。アミノ酸付加は、１、２、５、１０、２５、１００，またはそれ以上の数のアミノ酸を付加することである。この定義のなかに、融合タンパク質も包含される。
【００２４】
フラグメントは、ＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ類似体、またはＴＦＰＩ誘導体の一部分である。フラグメントの例として、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）・ドメイン１、２、または３、クニッツ・ドメイン１および２または２および３、あるいはＮ末端、Ｃ末端、または両方の欠失が挙げられる。改変体の作製についての内容のある指導は、米国特許第５，１０６，８３３号に見いだされる。ＴＦＰＩのフラグメントは、配列番号１の少なくとも２０個の保守的アミノ酸から構成される。例えば、一つのフラグメントの長さを２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、または２７５個の保守的アミノ酸とすることができる。生物活性を持たないＴＦＰＩフラグメントが、米国特許第５，１０６，８３３号に開示されている。本発明でのそのようなフラグメントの使用もまた、検討する。
【００２５】
誘導体は、付加部分を持つＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ類似体、またはＴＦＰＩフラグメントとして、定義される。そのような付加として、そのような付加の例として、糖化、リン酸化反応、アセチル化、またはアミド化が挙げられる。
【００２６】
ＴＦＰＩ改変体と配列番号１との相同率の測定は、Ｂｌａｓｔ２アラインメント・プログラム（Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｅｘｐｅｃｔ１０、標準遺伝子コード、オープン・ギャップ１１、エクステンション・ギャップ１、ギャップｘドロップオフ５０、および低複雑度フイルター・オフ）を用いておこなう。ＴＦＰＩ改変体の配列番号１に対するアミノ酸の同一性は、一般に、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％ないし９５％（すなわち、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％）以上、最も好ましくは少なくとも９８％もしくは９９％である。
【００２７】
ＴＦＰＩをコードするＤＮＡ配列に変更を加えることで、ＴＦＰＩのアミノ酸配列改変体を調製することができる。ヌクレオチド配列に変更を加える方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，  ｅｄｓ．  （１９８３）  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、  Ｋｕｎｋｅｌ  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３６７−３８２、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）、米国特許第４，８７３，１９２号、および本明細書で引用される文献を参照せよ。
【００２８】
ＴＦＰＩ改変体は、相当量の生物活性を有するもので、以下に説明するＰＴアッセイで測定されるように、例えばＴＦＰＩの生物活性の１０％、３０％、５０％、６０％、８０％、９０％、またはそれ以上を有する。明らかに、ＴＦＰＩ改変体をコードするＤＮＡに加えられる変更は、その配列をリーディング・フレームから外すものであってはならず、好ましくは第２のｍＲＮＡ構造を作りうる相補的領域を生成しない。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の生物活性もしくは免疫活性を消失させることなく、どのアミノ酸を置換、挿入、または欠失させるかを判断する指針は、当技術分野で周知のコンピュータ・プログラム）例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア、もしくはＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．にあるもの）を用いることで見いだされる。生物活性のないＴＦＰＩ改変体の安定化についても検討する。
【００２９】
米国特許第４，９６６，８５２号に示すように、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を組み換え技術によって作ることが可能である。例えば、所望のタンパク質のｃＤＮＡを、原核生物または真核生物で発現させるプラスミドに取り込むことができる。微生物を用いたタンパク質の発現に対する詳細については、当業者に周知の多くの参考文献に記載されており、例えば、米国特許第４，８４７，２０１号およびＭａｎｉａｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）を参照せよ。
【００３０】
微生物の形質転換と、形質転換された微生物を用いたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の発現とに、種々の技術が利用できる。考えられるアプローチの単なる例を以下に示す。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体ＤＮＡ配列を適当な制御配列に結合させることができる。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体ＤＮＡ配列をプラスミド（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ等の会社から市販されているｐＵＣ１３またはｐＢＲ３２２）に取り込むことができる。いったんＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体ＤＮＡをベクターに取り込むことで、そのＤＮＡを適当な宿主にクローン化することができる。そのようなＤＮＡの増幅を、米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第４，６８３，１９５号等に示される技術を用いておこなうことができる。ｃＤＮＡは、ＨｅｐＧ２またはＳＫＨｅｐヘパトーマ細胞等の細胞でｍＲＮＡ産生を誘導し、そのｍＲＮＡを同定および単離し、さらにそれを逆転写してｃＤＮＡを得ることで、得てもよい。発現ベクターが宿主（例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ））に形質転換された後、その細菌を培養してタンパク質を発現させることが可能である。細菌は、好ましい原核微生物であり、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）が特に好ましい。本発明で有用な好ましい微生物は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２のＭＭ２９４株であり、この株は米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）  （現在の所在地：１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ）により１９８４年２月１４日付でブタベスト条約の条項に従って寄託された（寄託番号３９６０７）。
【００３１】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を細菌または酵母で作り、その後精製してもよい。一般に、米国特許第５，２１２，０９１号、米国特許第６，０６３，７６４号、および米国特許第６，１０３，５００号、もしくはＷＯ９６／４０７８４に示すような手順を用いることができる。ＷＯ０６／４０７８４およびＧｕｓｔａｆｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔ．  Ｅｘｐｒｅｓｓ．  Ｐｕｒ．  ５：２３３  （１９９４）にもとづいて、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を精製し、可溶化し、さらに再生することができる。例えば、ＷＯ９６／４０７８４の実施例９にもとづいて調製した場合、生物活性ａｌａ−ＴＦＰＩとして重量で全タンパク質の約８５％ないし９０％を含むａｌａ−ＴＦＰＩの製剤が得られる。
【００３２】
（ガラス形成剤）
「ガラス形成剤（ｇｌａｓｓ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」は、臨界温度（ガラス転移温度（Ｔｇ）を下回る温度でガラスを形成する能力を持つ化学薬品である。もし、ガラス形成剤がそのＴｇを下回る温度で凍結乾燥されるならば、ガラスが形成されて凍結乾燥組成物のままである。しかし、もしガラス形成剤がＴｇを上回る温度で凍結乾燥されるならば、ガラスは形成されない。ガラス形成の過程では、タンパク質がガラス構造に埋め込まれ得る。本発明による使用に適したガラス形成剤として、限定されるものではないが、荷電高分子、単糖類、二糖類、三糖類、および天然アミノ酸が挙げられる。炭水化物とアミノ酸ガラス形成剤とが好ましい。ガラス形成剤の組み合わせもまた、単一の製剤として検討する。
【００３３】
「荷電高分子（ｃｈａｒｇｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）」は、いくつかが正または負に帯電した化学基を持つ直鎖状または非直鎖状の形態で結合した複数の反復構造単位からなる一本の主鎖で構成される任意の化合物である。反復構造単位は、有機または無機のいずれであってもよい。また、反復構造単位の数は２から数百万に及ぶものであってもよい。
【００３４】
ガラス形成剤としての使用に適した荷電高分子として、限定されるものではないが、ポリリン酸塩、ヘパリン、硫酸デキストラン、アガロペクチン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ無機物、ポリアミノ酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸塩、ポリヒスチジン、ポリオーガニック、ＤＥＡＥデキストラン、ポリ有機アミン、ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミンセルロース、ポリアミン、ポリリジン、およびポリアルギニンが挙げられる。
【００３５】
「ポリリン酸塩（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」は、リン酸無水物結合で連結したオルト・リン酸塩の反復単位からなるポリマーである。反復単位の数を、２（ピロリン酸塩）ないし数千とすることができる。ポリリン酸塩は、ヘキサメタリン酸ソーダ（ＳＨＭＰ）と、しばしば言及される。他の慣用名として、グラハムズ（Ｇｒａｈａｍｓ）塩、カルゴン、リン酸塩ガラス、テトラメタリン酸ナトリウム、およびガラスＨが挙げられる。
【００３６】
ガラス形成剤として使用される単糖類として、限定されるものではないが、グリコールアルデヒド、グリセルアルデヒド、エリトロース、トレオース、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、アロース、タロース、グロース、マンノース、ブドウ糖、イドース、ガラクトース、アルトロース、ジヒドロキシアセトン、エリトロース、リブロース、キシロケトース、プシコース、タガトース、ソルボース、およびフルクトースが挙げられる。硫酸化単糖類を用いることも可能である。
【００３７】
単糖類を２つ結合させることで、二糖類が形成される。二糖類の形成に用いる２つの単糖類を、同一または異なるものとすることができる。ガラス形成剤として用いることができる二糖類の例として、ショ糖、トレハロース、ラクトース、マルトース、イソマルトース、ゲンチオビオース、ラミナリボース、およびセロビオースが挙げられる。硫酸化二糖類を用いることも可能である。
【００３８】
単糖類を３つ連結することで、三糖類が形成される。三糖類の形成に用いる３つの単糖類を、同一または異なるものとすることができる。ガラス形成剤としての使用に適した三糖類の例として、ラフィノースおよびメレチトースが挙げられる。硫酸化三糖類を用いることも可能である。
【００３９】
本発明でのガラス形成剤としての使用に適する天然アミノ酸として、限定されるものではないが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、リシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、プロリン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。アミノ酸は、Ｌ−立体異性体またはＤ−立体異性体のいずれであってもよい。Ｌ−アミノ酸が好ましい。
【００４０】
ガラス形成剤は、約５０ｍＭないし約６００ｍＭ（すなわち、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００ｍＭ）の量で、凍結乾燥用の水性製剤に存在する。好ましくは、ガラス製剤は、約１００ｍＭないし約５００ｍＭ、より好ましくは約２００ｍＭないし約４００ｍＭ、さらにより好ましくは約１００ｍＭないし約３００ｍＭ、最も好ましくは約３００ｍＭの量で、存在する。
【００４１】
高分子（例えば、ポリリン酸塩）は、一般に分子量に関しては十分に定まっていない。いくつかの高分子は長く、また他の高分子は短いことから、分子量は高分子間で変動する。もしガラス形成剤が十分に定まった分子でなければ、例えばポリリン酸塩のような高分子の場合、水性製剤に存在する量は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の重量と荷電高分子の重量との比として表される。好ましくは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と荷電高分子との比は、約８：１またはそれ以下であり、より好ましくは約６：１、最も好ましくは約２：１である。
【００４２】
（緩衝剤）
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物のｐＨは、タンパク質の溶解度に影響を及ぼし、それによってその安定性にも影響を及ぼす。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８８（９）：８８１−８８８を参照せよ。本発明の組成物にとって好ましいｐＨ範囲は、約４ないし約８（すなわち、約ｐＨ４、４．５、５．５、６、６．５、７、７．５、または８）、より好ましくは約５ないし約６．５である。ｐＨはＴＦＰＩ溶解度にとって重要な因子であることから、適当なｐＨに保つために緩衝剤を用いることで製剤の安定性をさらに改善し得る。したがって、本発明の水性組成物は、必要に応じて、溶液ｐＨを保つために緩衝剤をさらに含むことができる。
【００４３】
本発明による使用に適した典型的な緩衝剤として、限定されるものではないが、酢酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、グルタミン酸塩、Ｌ−グルタミン酸塩、イミダゾール、クエン酸塩、ヒスチジン、Ｌ−ヒスチジン、グリシン、アルギニン、Ｌ−アルギニン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい緩衝剤は、リン酸塩、Ｌ−グルタミン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンである。最も好ましい緩衝剤は、Ｌ−アルギニンおよびＬ−ヒスチジンである。緩衝剤は、約０ｍＭないし約６００ｍＭ（すなわち、約０、５、１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０、または６００ｍＭ）の量で、水性製剤に加えられる。好ましくは、緩衝剤の濃度は、約１０ｍＭないし約１００ｍＭ、より好ましくは約２０ｍＭないし約５０ｍＭである。
【００４４】
いくつかのガラス形成剤もまた、緩衝剤となり得る。そのようなガラス形成剤の例として、アルギニンがある。そのようなガラス形成剤は、水性製剤のｐＨを緩衝し、製剤が凍結乾燥される場合に該ガラス形成剤がガラスを形成してＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の安定化を助ける。緩衝剤でもあるガラス形成剤は、概して約５０ｍＭないし約６００ｍＭ（すなわち、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００ｍＭ）の量で凍結乾燥用の水性製剤に存在する。好ましくは、ガラス形成剤緩衝剤の濃度は、約１００ｍＭないし約５００ｍＭ、より好ましくは約２００ｍＭないし約４００ｍＭ、さらにより好ましくは約１００ｍＭないし約３００ｍＭ、最も好ましくは約３００ｍＭである。
【００４５】
（結晶形成剤）
必要に応じて、１種類以上の結晶形成剤を上記水性製剤に含有させることもできる。「結晶形成剤（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」は、結晶格子網様構造を形成する能力を持つ化学薬品である。概して、凍結乾燥される水性製剤に対して結晶形成剤を添加することで硬い構造が得られる。凍結乾燥後に残留する物質を「ケイク（ｃａｋｅ）」と称する。結晶形成剤が存在することなしに、ケイクは一般に硬くならず、通常は崩壊または収縮してケイク形態が損なわれる。結晶格子の硬い支持体によってケイクの崩壊が妨げられる。ケイク形態は、製品外観の態様から望ましい。凍結乾燥ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の安定性および生物活性は、一般にケイク形態による影響を受けない。
【００４６】
本発明による使用に適した結晶形成剤の例として、限定されるものではないが、マンニトール、アラニン、グリシン、塩化ナトリウム、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。結晶形成剤は、凍結乾燥用の水性製剤に、約０．５％ないし約１６％（ｗ／ｖ）（すなわち、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６％）の量で存在する。
【００４７】
（凍結乾燥のための製剤の調製）
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の大量調製は、該ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体が可溶性のままであることを確実にするためにカオトロープ（例えば、尿素）の使用を伴うものであってもよい。カオトロープは凍結乾燥に先立って除去することが望ましいか、または必要とされる可能性がある。したがって、本発明は凍結乾燥のためにＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を調製する上で役立つプロセスも提供する。
【００４８】
このプロセスの第１の工程は、第１の製剤低分子量溶質（通常はカオトロープ）を除去し、それを第２の製剤低分子量溶質（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、アルギニン、ヒスチジン、マンニトール、およびショ糖）と置換することである。第１の製剤低分子量溶質の除去にともなうＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凝集を防ぐために、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体タンパク質の凝集または沈殿をともなうことなくカオトロープの除去を可能にするｐＨの値まで、ｐＨを下げる。通常、ｐＨを約４まで減少させる。カオトロープは当技術分野で公知の任意の方法によって取り除くことができる。そのような方法の例として、限定されるものではないが、ダイアフイルトレーション、透析、またはサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。ダイアフィルトレーションが好ましい。大量調製で溶質を交換し、保存に先立って大量のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を凍結乾燥することが望ましいと思われる。
【００４９】
あるいは、カオトロープの濃度は、カオトロープを含まない製剤によってＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体標品を希釈することで減少させることができる。この工程は、好ましくは、しかし必然的ではないが、基本的にカオトロープ・フリーである製剤の形成に帰着する。
【００５０】
必要に応じて、結果として生じる製剤に含まれるいくつかの溶質を、他の溶質（例えば、ヒスチジン、イミダゾール、マンニトール、グリシン、またはショ糖）と交換することができる。この工程の間、通常、ｐＨを増加させてＴＦＰＩが水性製剤で安定する値にする。好ましくは、ｐＨを約６まで増加させる。その後、必要に応じて、製剤を当技術分野で公知の技術を用いて凍結乾燥させることができる。第３の製剤は、好ましくは医薬的に許容される製剤である。「意訳的に許容される（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」という表現は、製剤を患者に投与した場合、顕著な生物学的副作用がないという意味である。「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という表現は、ヒト患者および獣医学的患畜の両方を包含する。
【００５１】
本発明の凍結乾燥組成物を再構成してＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の水性製剤を提供することができる。凍結乾燥されたＴＦＰＩを、適当な媒体（例えば、食塩水または水）で再構成することができる。
【００５２】
この開示で引用される全ての特許、特許出願、および文献は、それらの全体が本明細書の一部をなすものとして、援用される。
【００５３】
以下の実施例は、例証を目的として提供され、本明細書中に開示された発明を限定するものではない。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
（一般的方法）
（ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩ改変体の大量調製）
ａｌａ−ＴＦＰＩバルクを、透析によって異なる製剤緩衝剤に調製した。透析は、３，５００ダルトンの分子量カットオフを持つＳｐｅｃ／Ｐｏｒ７透析チューブを用いて、４℃でおこなった。５０ないし１００倍過剰の透析緩衝剤を３時間毎に更新した（全部で３回更新）。透析後、０．２μｍフィルター・ユニットを通す濾過によって、凝集ＴＦＰＩから可能性ａｌａ−ＴＦＰＩを分離した。可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの濃度を、ＵＶ吸光度で測定し、必要とする製剤に応じて、その濃度を所望の値に調製した。無菌のラミナー・フロー・フードにおいて、複数の３ｃｃのＩ型ガラス・バイアルに、処方されたａｌａ−ＴＦＰＩ溶液１ｍｌを移した。これらのバイアルを１３ｍｍダイキョー（Ｄａｉｋｙｏ）Ｄ７１３フッ素樹脂積層ゴム栓で封じ、アルミニウム・シールでクリンピングして、スタビリティ・チャンバーに入れた。凍結乾燥するために、３ｃｃのガラス・バイアルに１ｍｌの配合ａｌａ−ＴＦＰＩ溶液を満たし、１３ｍｍウエスト（Ｗｅｓｔ）８９０グレイ（Ｇｒａｙ）凍結乾燥栓で、半分栓をされた。これらのバイアルを凍結乾燥器にセットした。
【００５５】
（ＨＰＬＣ）
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：  全てのＨＰＬＣ方法を、７１７ヒーター／クーラー・オートサンプラーを備えたウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）６２６ＬＣシステム上でおこなった。ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）４８６吸光度検出器でＵＶ吸光度をモニターし、日立（Ｈｉｔａｃｈｉ）Ｆ−１０５０またはＦ−１０８０蛍光分光光度計によって蛍光を記録した。データの収集および処理を、パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ターボクロム（Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍ）システム上でおこなった。
【００５６】
陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）：  ＣＥＸ−ＨＰＬＣ方法は、ファルマシア・モノ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｍｏｎｏ）−Ｓ  ＨＲ  ５／５−ガラス・カラムを使用した。カラムの平衡化は、８０％緩衝剤Ａ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム三水和物：アセトニトリル溶液（７０：３０  ｖ／ｖ）、ｐＨ  ５．４）と２０％緩衝剤Ｂ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム三水和物−１．０Ｍ塩化アンモニウム−アセトニトリル溶液（７０：３０  ｖ／ｖ）、ｐＨ  ５．４）とでおこなった。試料を注射した後、２１分で２０％緩衝剤Ｂから８５％緩衝剤Ｂに０．７ｍｌ／分の流速でＴＦＰＩが溶出するように、勾配を与えた。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度で検出または２８０ｎｍ励起および３２０ｎｍ発酵を用いた蛍光によって検出された。
【００５７】
サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）：  ＳＥＣ−ＨＰＬＣ方法は、フェノメネクス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）  ＢＩＯＳＥＰ−ＳＥＣＳ２０００カラム（３００  ｘ  ７．８  ｍｍ）を使用した。定組成溶離プロフィールを用いて、上記カラムからａｌａ−ＴＦＰＩを溶出した。ａｌａ−ＴＦＰＩの溶出は１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）と０．５ＭのＮａＣｌとでおこなった。タンパク質ピークを２７８ｎｍ吸光度によって検出し、タンパク質分子量を４６７ｎｍ励起および４６７ｎｍ発光を用いた蛍光によって測定した（Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ５９２：２１５−２２８，  １９９２）。
【００５８】
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）：  逆相ＨＰＬＣ法は、直列になった２本のレイニン・ダイナマクス（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ）  Ｃ８カラム（５ｘ４．６ｍｍ、５μｍ、３００Å）（５ｃｍ  ｘ  ４．６ｍｍ、５μｍ、３００Å）を使用した。カラムを８６％緩衝剤Ａ（３０％（ｖ／ｖ）アセトノトリル：０．４５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）と１４％緩衝剤Ｂ（６０％（ｖ／ｖ）アセトノトリル：０．４５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）で前平衡化した。注入されたタンパク質の溶出は、流速１ｍｌ／分で最初に緩衝剤Ｂを１３分以内に２１％に増加させ、つぎに３０分以内に１００％緩衝剤とすることで、おこなった。タンパク質溶出を２８０ｎｍ吸光度の測定によって検出した。
【００５９】
（プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイ）
ＰＴアッセイを、Ｃｏａｇ−Ａ−ＭａｔｅＲＡ４インストルメント（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）上でおこなった。最初に、ａｌａ−ＴＦＰＩ試料を緩衝剤（２Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で希釈して１５０μｇ／ｍｌとし、続いてＴＢＳＡ緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、ｐＨ７．５）で希釈して３０μｇ／ｍｌとし、最後にＴＢＳＡ緩衝剤によって希釈して１２ないし１５μｇ／ｍｌとした。アッセイのために、１０μｌの希釈試料を最初に９０μｌのプールされたベリファイ（Ｖｅｒｉｆｙ）Ｉ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５９５６６）と混合し、試験トレイ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３５０１４）に載せ、さらにＣｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅに入れた。つぎに、２００μｌのシンプラスチン・エクセル（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｅｘｃｅｌ）（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ，  Ｃａｔ．Ｎｏ．５２００１）を添加して凝固プロセスを開始させた。凝固時間を、数秒の凝固時間の対数と、標準のａｌａ−ＴＦＰＩ濃度の対数とからなる標準プロットと比較することよって、入力ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度に変換した。
【００６０】
（ＰＥＩの添加）
ＰＲ−ＨＰＬＣ分析およびＰＴアッセイに対するポリリン酸塩の干渉を排除するために、ＰＥＩをａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩試料に添加した。ＰＥＩ無しでは、ａｌａ−ＴＦＰＩは異常なＨＰＬＣ溶出プロフィールを示し、ポリリン酸塩存在下での生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）比活性（０．６〜０．９）を減少させた。０．８％（ｗ／ｖ）ＰＥＩの添加によって正常な溶出プロフィールおよび正常な生体内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）比活性が回復した。濃度０．２および０．４％（ｗ／ｖ）のＰＥＩを添加することでａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿が観察された。ＰＥＩの濃度が０．６ないし３．２％（ｗ／ｖ）ではａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿は生ずることがなく、単独で用いた場合にＰＴアッセイでの凝固時間に影響を及ぼすことがなかった。
【００６１】
（ダイアフィルトレーション）
ダイアフィルトレーション：  約１０ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、２Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体バルクを最初に１．２５ないし５ｍｇ／ｍｌポリリン酸塩（ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩重量比が約８：１から約２：１に変化）と混合した。尿素を６Ｍまで添加した。ダイアフィルトレーション膜は、ミリポア・ペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｉｃｏｎ）２ミニ（ｍｉｎｉ）１０Ｋ  ＰＬＧＣ再生セルロース膜（表面積０．１ｍ２）とした。ペリスタル型ポンプの入口圧、放出口圧、および流速は、製造元の推奨にしたがって設定した。
【００６２】
ダイアフィルトレーション効率：  ダイアフィルトレーション容器内の溶液量が全ダイアフィルトレーション・プロセス（すなわち、送り（ｆｅｅｄ−ｉｎ）ダイアフィルトレーション緩衝剤の量は、透過（ｐｅｒｍｅａｔｅ−ｏｕｔ）溶液の量に等しい）の過程で一定に保たれる場合、交換等式：
Ｃｎ／Ｃｏ＝ｅｘｐ（−α、Ｖｎ／Ｖｏ）を用いて各々の緩衝剤交換量でのダイアフィルトレーション効率を算出することができる。
【００６３】
ここで、ＣｎおよびＣｏは、それぞれ緩衝剤交換量ｎおよびゼロでのダイアフィルトレーション容器内の溶質濃度（しかし、送り（ｆｅｅｄ−ｉｎ）緩衝剤に存在しない）である。Ｖｏは、ダイアフィルトレーション容器内の開始ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩへにたい製剤の量であり、Ｖｎは送り込まれた緩衝剤もしくは透過したダイアフィルトレーション溶液の量である。したがって、ｎ＝Ｖｎ／Ｖｏ。ダイアフィルトレーション・カートリッジは、尿素、ＮａＣｌ、およびリン酸塩等の小さな溶質に対して完全に透過性を持つものとみなされる分子量カット・オフが１０キロダルトンである膜を使用した。したがって、透過因子αは、分子量カットオフよりも十分に下回る小さな溶質に対して、１に等しい。この等式は、各緩衝剤交換量でのダイアフィルトレーション効率の算出を可能にする。例えば、９８．２％および９９．８％開始緩衝剤成分がそれぞれ４および６容量の緩衝剤交換の後に「透過（ｐｅｒｍｅａｔｅｄ  ｏｕｔ）」する。
【００６４】
（透析）
いくつかの実験では、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体バルクは、透析によって異なる製剤緩衝剤に調製された。透析は、３，５００ダルトンの分子量カットオフでＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ７（登録商標）透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、４℃でおこなった。５０ないし１００倍過剰の透析緩衝剤を３時間毎に合計３回交換した。透析後、０．２μｍフィルター・ユニットで濾過することで、可溶性ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を凝集ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体から分離した。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の濃度を、ＵＶ吸光度によって測定し、求められる製剤にもとづいて所望の値に調製した。
【００６５】
（凍結乾燥（フリーズ・ドライ））
製剤化されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を含む複数のバイアルを複数のメタル・トレイ上に置いた。これらのトレイを、事前に１０℃に平衡化された保存温度のハル・フリーズ・ドライヤー（Ｈｕｌｌ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ）（Ｍｏｄｅｌ  ８ＦＳ  １２Ｃ）に入れてた。フリーズ・ドライ・サイクルは、３つの工程から構成される。すなわち、凍結、一次乾燥、および２次乾燥である。最初にバイアルを−５０℃に冷却して製品を凍結させる。続いて、一次乾燥を−２５℃で３０時間、また真空度１００ｍｔｏｒｒでおこなった。凍結乾燥完了後、保存温度を４℃まで下げ、凍結乾燥チェンバー内に窒素を流入させて真空状態を解き放した。つぎに、第２の乾燥を２０℃、１２時間、また真空度１００ｍｔｏｒｒで実施した。凍結乾燥完了後、保存温度を４℃に下げ、凍結乾燥チェンバー内に窒素を流入させて真空状態を解き放した。１２ｐｓｉ窒素圧で、バイアルを栓でふさいだ。これらのバイアルを凍結乾燥器から取り出し、１３ｍｍフリップ・オフ・アルミニウム・シールでクリンピングした。
【００６６】
（実施例１Ａ）
（ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩のダイアフィルトレーション）
ａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液は、ダイアフィルトレーションの前にａｌａ−ＴＦＰＩバルク（２Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）へポリリン酸塩を添加することによって調製された。その後、この混合物を水または緩衝剤に対してダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション中、尿素を６Ｍで用いることで、緩衝剤交換プロセス中でのタンパク質の可溶性を保った。
【００６７】
ダイアフィルトレーションしたａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液は、良好な安定性を示した。沈殿は、周囲温度で後であること記憶の間、観察されなかった。それに続く周囲温度での保存の過程で、沈殿は観察されなかった。対照的に、バルク緩衝剤（２Ｍ尿素のみ含む）から直接調製したａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液は、その後の保存後、不安定性を示した。すなわち、周囲温度での保存１日を経過した後、沈殿の形成がみとめられた。したがって、６Ｍ尿素は、バルク緩衝剤から水／ポリリン酸緩衝剤への緩衝剤の移動の過程で、ａｌａ−ＴＦＰＩ可溶化を助ける。
【００６８】
（実施例１Ｂ）
（凍結誘導ａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿）
ダイアフィルトレーション処理ａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液は、凍結融解または周囲温度でのインキュベーションのいずれかに対して、不安定性を示した。可視沈殿物は、−７０℃からの凍結融解後、または周囲温度での保存過程で、表Ａに示すように、いくつかのａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液で見つかった。
【００６９】
（表Ａ）
【表Ａ】
2008500942.tif 000002
【００７０】
これらの結果は、ａｌａ−ＴＦＰＩ安定性が保存条件および製剤中の緩衝剤に影響されることを示す。クエン酸塩およびリン酸塩緩衝剤は、周囲温度保存および凍結保存の両方で、ａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿をしばしば生じた。−７０℃でｐＨが変化したかどうか判断するために、凍結状態のｐＨは、フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入したユニバーサル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ｐＨ溶液を使用して染料の色変化で測定された。
【００７１】
ａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液が、イオン強度およびｐＨの変化に非常に影響されるとわかった。酸またはＮａＣｌのいずれによって滴定することで、ＴＦＰＩがｐＨ５．８未満または８０ｍＭを上回るＮａＣｌのいずれかでａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩中でＴＦＰＩが急激に沈殿したことが示された。別の実験では、５ｍＭＮａＣｌほど低いＮａＣｌの添加後、周囲温度で、最終的にａｌａ−ＴＦＰＩの沈殿物が形成されることが示された。ＮａＣｌをさらに加えることで、沈殿がより速くなった。ａｌａ−ＴＦＰＩが凍結融解と同時に沈殿した理由として、ポリリン酸塩存在下でのｐＨおよび塩の変化に対するａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩の感受性が考えられる。クエン酸塩およびリン酸塩等の緩衝剤のｐＨは、緩衝剤系で異なる塩形態の部分的な沈殿のため、凍結と同時に減少する。おそらく、凍結で生ずるｐＨシフトおよび／または塩の濃縮は、ａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩とのあいだの相互作用を弱めてａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿を生ずる。同様に、周囲温度での塩の添加もまた、ａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩とのあいだの静電的相互作用を弱めてａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿を生ずる。
【００７２】
Ｌ−ヒスチジンは、凍結と同時にｐＨを安定化させるための有用な緩衝剤である。Ｌ−ヒスチジンも、溶液中に単一の中性形状もしくはプロトン化形状として存在する。したがって、それはａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩との相互作用に、最小限の影響を及ぼさなければならない。
【００７３】
（実施例２）
（ａｌａ−ＴＦＰＩ水溶性組成物の安定性）
ａｌａ−ＴＦＰＩ水性製剤の長期安定性を測定するために、ａｌａ−ＴＦＰＩの凝集を高温で調べた。ａｌａ−ＴＦＰＩ試料（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート−８０、および１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７で処方）を種々の時間で４０℃で保存した。保存時間を増加にともなって試料の混濁が生じ、目視可能な沈殿物の形成が示された。０．２μｍフィルターによる濾過後、可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩを陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によって分析した。図１は、これらの試料のＣＥＸ−ＨＰＬＣのクロマトグラムである。図１のクロマトグラムは、単一タンパク質ピークが１８分で溶出したことを示す。このピークは、ａｌａ−ＴＦＰＩモノマーである。
【００７４】
図１のクロマトグラムで、ピーク下の面積を計算することによってａｌａ−ＴＦＰＩ濃度を算出した。ピーク面積の減少が観察され、これらの試料で可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの損失が示された。ピーク面積対保存時間の一つの指数関数当て嵌めを、可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩ損失の計算に用いた。算出された速度定数を、標準の一次反応速度式を使用して、保存寿命ｔ９０（可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩポリペプチドの１０％の損失と考えられる時間））に変換した（Ｃａｎｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，  ｅｄｓ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  １９８０）。同様に、保存寿命の算出は、プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイで測定される生物活性データを使用しておこなった。可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩに関する保存寿命は、生物活性に関する保存寿命（表１）と十分一致していた。可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの損失が生物活性の減少と平行していることから、凝集は最も可能性のある不活化経路であると考えられた。
【００７５】
（表１）
【００７６】
【表１】
2008500942.tif 000003
凝集形成を減少させ、それによってａｌａ−ＴＦＰＩ水性製剤の長期安定性を高めるために、ｐＨ安定性の研究をおこなった。ａｌａ−ＴＦＰＩを、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート−８０、および１０ｍＭリン酸ナトリウムで調製し、該製剤のｐＨをＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって４ないし９の異なる値に調整した。４０℃で保存後、これらの試料での可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの損失をＣＥＸ−ＨＰＬＣで測定した。図２は、ｐＨの関数としての可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩ損失の一次反応定数をプロットしたものである。ｐＨ６を下回ると凝集速度が遅くなり、基本ｐＨではかなり速くなる。したがって、ａｌａ−ＴＦＰＩ凝集は塩基で触媒されるものであった。
【００７７】
凝集反応がｐＨ  ６未満で最小化されたにもかかわらず、新たな崩壊反応が酸性ｐＨ条件で観察された。ａｌａ−ＴＦＰＩのより小さな２つの種が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（データ不図示）によって検出された。遅く溶出する種も、ＣＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラム（図３）上で、ｐＨ  ４で観察された。この種は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出される分解産物に対応しているように思われた。図３は、４０℃、酸性条件下で、ａｌａ−ＴＦＰＩをより長くインキュベートして現れた新たな種と、１８分で溶出している単量体ａｌａ−ＴＦＰＩとを示す。したがって、単量体ａｌａ−ＴＦＰＩ種がインキュベーション時間にともなって減少し、遅く溶出するピークが、おそらく増加するａｌａ−ＴＦＰＩを分解した。
【００７８】
ａｌａ−ＴＦＰＩの分解が酸加水分解によって触媒されたかどうか決定するために、異なるｐＨでａｌａ−ＴＦＰＩ試料をＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析にかけた。切断率は、高ｐＨ条件でより遅くなった（図４）。４０℃で１０日間保存した後、ＴＦＰＩの切断はｐＨがｐＨ４に減少するのにともなって増加した。したがって、ａｌａ−ＴＦＰＩの分解はポリペプチド内のペプチド結合が酸加水分解することによる。
【００７９】
前の２つの研究結果にもとづいて、さらにスクリーニングにかけている製剤は、約ｐＨ６に焦点を置いた。表１に挙げられた他の１１種類の製剤の安定性促進について評価した。試料を４０℃に保存し、可溶性の損失についてはＣＥＸ−ＨＰＬＣＶ分析によって、また生物活性の損失についてはＰＴアッセイにかけた。陽イオン交換ＨＰＬＣで測定される保存寿命（ｔ９０）が１日から２週間以上に及ぶことがわかり、またＰＴアッセイでは１日から約８日に及ぶことがわかった。アレニウス（Ａｒｒｅｈｎｉｕｓ）分析は、それら４０℃データを用いておこなった。１０ｋｃａｌ／ｍｏｌの活性化エネルギー（凝集反応のための合理的な見積である）を仮定した。結果は、これらの水性製剤のＴＦＰＩがより長い期間（例えば１８〜２４ヵ月）に対しては安定していないことを示唆している。
【００８０】
（実施例３）
（ａｌａ−ＴＦＰＩの水性製剤に対するポリリン酸塩の効果の安定化）
ａｌａ−ＴＦＰＩ製剤のポリリン酸塩の安定化効果を評価した。ポリリン酸塩は、ａｌａ−ＴＦＰＩに結合し、高次構造的にそれを安定させる。ポリリン酸塩による安定化を、２：１、６：１、および８：１のａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩の重量比で調べた。製剤の調製は、１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ７）における各ａｌａ−ＴＦＰＩ：ポリリン酸塩比でおこなった。また、ａｌａ−ＴＦＰＩ安定性に対するヒスチジンの効果を評価するために、水のみをもちいてａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩重量比（８：１）を設定した。さらに別の製剤では、ｐＨ６．５の１０ｍＭヒスチジンにより、ａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩重量比（８：１）を設定し、ａｌａ−ＴＦＰＩに対するｐＨの効果を評価した。
【００８１】
塩および他の荷電イオンがａｌａ−ＴＦＰＩ−ポリリン酸塩結合に干渉し得ることから、単糖および二糖類（例えば、マンニトール、ショ糖、およびソルビトール）がＴＦＰＩ製剤に用いられた。単糖または二糖類を含む製剤は、ａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩重量比８：１で調製した（製剤については表２を参照）。最後に、いくつかの高濃度ａｌａ−ＴＦＰＩ試料をセットアップしてそのような濃度でのＴＦＰＩ安定性を評価した。これらのａｌａ−ＴＦＰＩ製剤の安定性を３０℃および４０℃で検討した。バイアルは、あらかじめ選択された時点で取り出し、０．２２μｍフイルターで濾過し、沈殿物を除去した。濾過されたａｌａ−ＴＦＰＩ試料を、分解および吸収帯強度についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、可溶性の損失について上記したように逆相ＨＰＬＣによって、さらに生物活性の損失について上記したようにＰＴアッセイによって、続けて分析した。
【００８２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、ａｌａ−ＴＦＰＩの切断を示さなかったが、３ヵ月間４０℃に保存される製剤で吸収帯強度が減少することを示した。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析の結果を図５に示した。図５は、４０℃または３０℃でインキュベートし、３ヵ月間−７０℃で凍結した水溶性ポリリン酸塩製剤のクロマトグラムを示す。おおよそ１２．２分で溶出したａｌａ−ＴＦＰＩと、主要な種の前後いずれかにマイナーな種が溶出した。高温（３０℃または４０℃）でインキュベーションすると、試料中に目視可能な沈殿が生じた。目視可能な沈殿物を０．２２μｍフィルターで濾過することができ、それなりに、クロマトグラムは新たな種の出現なしにピーク面積の減少を示した。結果は、３０℃または４０℃での保存時の凝集によりａｌａ−ＴＦＰＩが損失したことを示している。
【００８３】
高温でのインキュベーション中に生ずる凝集は、６を超えるｐＨにおけるａｌａ−ＴＦＰＩの腫瘍分解経路として確認された。ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（図５）上でピーク面積を計算することによって、可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの濃度を算出した。残留する可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの比率を算出するために、これらのデータを、−７０℃保存した同一の製剤に対するデータに対して正規化した。結果を表２に示す。製剤１は水のみを含み、１０ｍＭヒスチジンによる対応の製剤（製剤２）よりも安定していた。３０℃では、ヒスチジンの有無により観察された試料で、残留可溶性タンパク質に１５％の違いがあった。３０℃データは、ヒスチジンによる明らかな安定性の減少が、マンニトールおよび／またはショ糖の添加（製剤４、５、および７）によって補正され得ることを示した。マンニトールおよびショ糖は、ヒスチジン存在下でａｌａ−ＴＦＰＩに対する弱い安定剤である。ａｌａ−ＴＦＰＩとヒスチジンとａｌａ−ＴＦＰＩとマンニトールまたはショ糖とのあいだの相互作用は、相加的であると思われる（（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ８５：４１９−４２２，  １９９６）。
【００８４】
（表２）
【００８５】
【表２】
2008500942.tif 000004
ａｌａ−ＴＦＰＩ−ポリリン酸塩製剤の安定性は、ｐＨ依存度が高い。表２の３０℃データは、ｐＨが７から６．５に変化した場合、ａｌａ−ＴＦＰＩ安定性が１／２に減少することを示している（製剤２および３）。また、ポリリン酸塩製剤でのａｌａ−ＴＦＰＩ安定性は、ａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩の比に依存している。表２の４０℃データは、ａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩の比が８：１から６：１、２：１に変化した場合に残留ａｌａ−ＴＦＰＩ率が０．９、２．７、および６．３になることを示している（製剤２、８、および９）。したがって、ａｌａ−ＴＦＰＩは、ａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩の比が２：１のときに最も安定である。
【００８６】
３０℃データは、ポリリン酸塩製剤（製剤１〜９）と高濃度ａｌａ−ＴＦＰＩ製剤（製剤１０および１１）とのあいだの差がほとんどないことを示している。４０℃データは、高濃度ＴＦＰＩ製剤（製剤１０および１１）がＴＦＰＩポリリン酸塩製剤に比べて、より安定していることを示している。３ヶ月保存後、ポリリン酸塩製剤（製剤１〜９）が１０％ＴＦＰＩ未満を残すだけであり、製剤１０および１１の残留ＴＦＰＩは４０％を上回る。したがって、長期安定性（例えば１８〜２３ヶ月におよぶ）を達成する代替え方法は、高濃度ＴＦＰＩ製剤を用いることである。
【００８７】
（実施例４）
（凍結融解サイクルでのａｌａ−ＴＦＰＩの安定性）
ａｌａ−ＴＦＰＩ製剤を−７０℃で保存できるかどうかを決定するために、ａｌａ−ＴＦＰＩ−ポリリン酸塩（６．１ｗ／ｗ）製剤（表３）を凍結融解サイクルにかけた。表３に示すように、−７０℃で凍結し融解した後、目視可能な沈殿物がいくつかのａｌａ−ＴＦＰＩ−ポリリン酸塩製剤で見られた。結果は、クエン酸塩およびリン酸塩緩衝剤が周囲温度保存および−７０℃保存の両方でＴＦＰＩ沈殿を生じ得ることを示す。
【００８８】
（表３）
【００８９】
【表３】
2008500942.tif 000005
−７０℃でｐＨが変化したかどうか判断するために、凍結状態のｐＨを、フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入したユニバーサル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ｐＨ溶液を使用して染料の色変化で測定した。ａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液が、イオン強度およびｐＨの変化に対して非常に感度が高かった。ａｌａ−ＴＦＰＩは、ｐＨ５．８未満または８０ｍＭを上回るＮａＣｌのいずれかで処方された場合に、急激に沈殿した。ａｌａ−ＴＦＰＩは、５ｍＭＮａＣｌほど低いＮａＣｌの添加後、周囲温度で、最終的に沈殿物を形成した。ＮａＣｌをさらに加えることで、沈殿がより速くなった。ａｌａ−ＴＦＰＩが凍結融解の過程で沈殿した理由として、ポリリン酸塩存在下でのｐＨおよび塩の変化に対するａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩の感受性が考えられる。クエン酸塩およびリン酸塩等の緩衝剤のｐＨは、緩衝剤系を作る異なる塩形態の部分的な沈殿のため、凍結と同時に減少する。凍結と同時に起こるｐＨまたは塩濃度の変化は、ａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩との相互作用を弱めることができる。その相互作用が弱められることで、ａｌａ−ＴＦＰＩの沈殿が生ずる。同様に、周囲温度での塩の添加もまた、ａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩とのあいだの静電的相互作用を弱めてａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿を生ずる。
【００９０】
試験した緩衝剤の種類のなかで、Ｌ−ヒスチジンは凍結と同時にｐＨを最も安定化させた。Ｌ−ヒスチジンも、溶液中に単一の中性形状もしくはプロトン化形状として存在する。したがって、それはａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩との相互作用に、最小限の影響を及ぼさなければならないことから、好ましい緩衝剤である。
【００９１】
（実施例５）
（凍結乾燥ａｌａ−ＴＦＰＩ製剤の開発）
（初期製剤スクリーニング）
凍結乾燥のための製剤のスクリーニングは、表４に示した１８種類の製剤を用いた。製剤成分の選択は、（１）溶質（例えばＬ−アルギニン、クエン酸塩、Ｌ−ヒスチジン、イミダゾール、およびポリリン酸塩）のａｌａ−ＴＦＰＩに対する可溶化効果、（２）凍結乾燥タンパク質を安定化させるガラス／マトリックスを形成する溶質（例えば、ショ糖）の傾向、（３）結晶ケイク構造を形成する溶質（例えば、マンニトールおよびグリシン）の能力にもとづいておこなわれる。ほとんどの製剤は、等張液よりもほぼ２倍である製剤２、３、および４を除いて、等張性に近い容量オスモル濃度を持つ。
【００９２】
（表４）
【００９３】
【表４】
2008500942.tif 000006
凍結乾燥産物の目視可能な特性を、フリーズ・ドライ（凍結乾燥）後、検討した。ケイク形態の評価は、目視によりおこなった。結果を表５に示す。収縮または崩壊がほとんどないケイクは、「良好な」ケイク形態を保持すると考えられた。製剤１０、１２、１３、１６、および１７は良好なケイク形態を示した。もちろん、結晶形成剤として、４種類がマンニトールを含み、１種類がグリシンを含んでいた。
【００９４】
（表５）
【００９５】
【表５】
2008500942.tif 000007
残留水分は、乾燥状態にあるタンパク質を保存する上で決定要因の一つである。残留水分が１％（ｗ／ｗ）未満であることが好ましい。１３種類の製剤に対して、カール・フィッシャー（Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）滴定法（Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍｉｅ  ４８：３９４  （１９３５））で残留水分含有量を測定した。その結果を表５に示す。製剤９、１０、１２、１３、および１５は、残留水分が１％（ｗ／ｗ）未満であり、また製剤１ないし８は残留水分が１％（ｗ／ｗ）を上回った。
【００９６】
凍結乾燥組成物の再構成は、「注射用水（Ｗａｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）」（ＷＦＩ）（すなわち、ヒト患者への注射についてＦＤＡによって承認されている水）を添加することによっておこなった。大部分の凍結乾燥組成物が１分以内に溶け、上記１８の再構成製剤のうち１６が透明であった（表５）。再構成製剤９および１０は混濁していた（表５）。このことは、凍結乾燥の過程でこれら２つの製剤でａｌａ−ＴＦＰＩ凝縮が生じたことを示唆している。
【００９７】
再構成された製剤１〜９および１３〜１８もまた、生物活性についてはＰＴアッセイで、また可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩについてはＣＥＸ−ＨＰＬＣによって、分析した。結果を表５に示す。製剤１０、１１、および１２はこの分析には含まれなかった。なぜなら、これらの製剤のポリリン酸塩は陽イオン交換ＨＰＬＣおよびＰＴアッセイによる干渉を受けたからである。
【００９８】
ＲＴアッセイの結果は、試験した１５の製剤全てが生物学的活性を有し、また非凍結乾燥水性対照群と見分けがつかなかった。したがって、これらの製剤に含まれるａｌａ−ＴＦＰＩは、凍結乾燥によるストレスに対して特に感受性があるわけではなかった。
【００９９】
可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの濃度をＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析によって測定したところ、凍結乾燥試料と水性対照群との差は１０％未満であった。ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度の微妙な変化は、再構成の過程での小さな変化によって最も起こりやすかった。製剤１３を例に挙げれば、５％容量増加が注射用水による最構築の際に生じた。
【０１００】
（長期保存安定性）
凍結乾燥組成物（表５の１、２、４、５、および１３〜１８）の長期保存安定性について検討した。これらの製剤の試料を異なる温度で保存し、崩壊分析のために所定の時間間隔で取り出した。
【０１０１】
最初に、凍結乾燥組成物での凝集の度合いを調べた。可溶性タンパク質の損失をＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析によって測定した。最大で３ヶ月間、４０℃または５０℃のいずれかで保存した試料について得られた結果を、表６に示す。ａｌａ−ＴＦＰＩはこれらの製剤ではかなり安定であった。凍結乾燥組成物の生物活性をＰＴアッセイによって測定し、表６に示す。最大で３ヶ月間、４０℃または５０℃のいずれかで保存した試料は、再構成に対して初期の生物学的活性の約４０〜１００％を保持した。４０℃または５０℃で最大３ヶ月保存した試料は、再構成に対して初期の生物活性の約４０〜１００％を保持した（表６）。
【０１０２】
（表６）
【０１０３】
【表６】
2008500942.tif 000008
＊製剤の定義については表４を参照のこと。
【０１０４】
先に述べたように、陽イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、サイズ除外ＨＰＬＣによる分析を目的として、製剤１３の選択をおこなった。図６は、３ヶ月にわたって異なる温度で保存されたこの製剤の試料に対するＣＥＸ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＳＥＣ−ＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【０１０５】
ａｌａ−ＴＦＰＩは、保持時間約１８分のシグナル・ピークとしてＣＥＸ−ＨＰＬＣから溶出した。ＣＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラム上のこのシグナル・ピークのプロフィールは、この製剤に関して全ての保存温度に対して不変のままであった（図６Ａ）。
【０１０６】
ａｌａ−ＴＦＰＩの溶離ＲＰＨＰＬＣプロフィールは、かなり複雑だった。主要なａｌａ−ＴＦＰＩ種は１９分で溶出し、２つの酸化されたａｌａ−ＴＦＰＩ種はわずか速く溶出し、いくつかのマイナーなアセチル化ＴＦＰＩ種はゆっくりと溶出した。図６Ｂに示すように、この溶出プロフィールもまた、種々の温度で３ヶ月にわたって保存される凍結乾燥ａｌａ−ＴＦＰＩの試料として観察された。
【０１０７】
種々の温度で保存した凍結乾燥ａｌａ−ＴＦＰＩのサイズ除外ＨＰＬＣ溶出プロフィールは、保存後、基本的に不変であった。８．２５分で溶出する単量体種および１１分頃に溶出される緩衝剤種について検出された変化は無かった。５０℃の試料は緩衝剤ピークにいくつかの変化を示した（図６Ｃ）．しかし、この変化は高温でのヒスチジン成分の酸化によって引き起こされたと思われる。
【０１０８】
促進的な安定性試験が製剤間での違いを示したにもかかわらず、２〜８℃で６ヶ月保存された異なる成分のリアルタイム安定性検査では陽イオン交換ＨＰＬＣ分析よる検出可能な変化は見られなかった。図７は、２〜８℃または５０℃のいずれかで６ヶ月にわたる保存後、５つの製剤の試料に対するＣＥＸ−ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。広範囲な分解が５０℃保存の試料のいくつか（例えば、製剤４および１７）で観察されたにもかかわらず、２〜８℃で保存された５つの試料では何ら変化が検出されなかった。
【０１０９】
ａｌａ−ＴＦＰＩの凝集は、目視可能な沈殿を生ずる。この沈殿は０．２２μｍフィルターで取り除くことが可能である。したがって、元のピークの積分面積（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｒｅａ）がＨＰＬＣクロマトグラム上に観察された。凝集以外の著しい変化は、これらのＨＰＬＣクロマトグラム上に検出されなかった。同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分解種はなんら観察されなかった。したがって、凝集は、凍結乾燥状態にあるタンパク質とって主要な分解経路であった。
【０１１０】
（実施例６）
（凍結乾燥ａｌａ−ＴＦＰＩの安定性に対する緩衝剤種、ｐＨ、およびａｌａ−ＴＦＰＩ濃度の効果）
凍結乾燥ａｌａ−ＴＦＰＩ組成物の安定性に対する緩衝剤種、ｐＨ、およびａｌａ−ＴＦＰＩ濃度の効果について調べた。緩衝剤種（Ｌ−ヒスチジン、クエン酸塩、およびイミダゾールを含む）を、１０ｍＭ緩衝剤および４％（ｗ／ｖ）マンニトールを含む製剤においてｐＨ６．５で比較した。表７は、４０℃または５０℃のいずれかで５週間にわたって保存した資料に対するＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析よって測定された可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの損失を示す。図７に示すように、Ｌ−ヒスチジンは可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの保存にとって最高の緩衝剤種であり、その後にクエン酸塩が続いた。例えば、５０℃での５週保存後にもかかわらず残っている可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの分画は、Ｌ−ヒスチジン、クエン酸塩、およびイミダゾールについて、それぞれ９５％、４１％、および１０％であった。このことは、この研究に用いた特定の凍結乾燥条件下でガラスを形成する傾向の順序と相関する。
【０１１１】
（表７）
【０１１２】
【表７】
2008500942.tif 000009
別々の実験では、クエン酸塩およびリン酸塩の効果を、１０ｍＭ緩衝剤（ｐＨ  ６．０）、３％（ｗ／ｖ）Ｌ−アルギニン、および４％（ｗ／ｖ）マンニトールを含む２つの製剤で比較した。クエン酸塩は、ａｌａ−ＴＦＰＩ安定性を保存する上でリン酸塩よりも優れていた（図７）。
【０１１３】
凍結乾燥されたａｌａ−ＴＦＰＩの安定性に対するｐＨの効果を、製剤１３（表４）を使用して試験した。試験したｐＨ範囲は、ｐＨ  ６．５からｐＨ  ５．５までの狭い範囲であった。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析とＰＴアッセイとの結果を表７に示した。試験したｐＨ値の範囲について安定性にわずかな差があった。低ｐＨ値（ｐＨ５．５）は、ｐＨ６．０またはｐＨ６．５よりも凍結乾燥ａｌａ−ＴＦＰＩの安定性が高かった。
【０１１４】
製剤１３でのａｌａ−ＴＦＰＩの安定性を、１００μｇ／ｍｌないし１，５００μｇ／ｍｌの範囲のタンパク質濃度で調べた。表８は、５０℃で保存した試料と２〜８℃で保存した試料とのあいだのタンパク質濃度の違いを示す。高濃度のＴＦＰＩを含む試料は、わずかながら、ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度が低い試料よりもわずかながら安定しており、５０℃でのａｌａ−ＴＦＰＩの損失がより少なかった。ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度が２５０μｇ／ｍｌを下回った場合にだけ、還元型の安定性が著しくなった。
【０１１５】
（表８）
【０１１６】
【表８】
2008500942.tif 000010
（実施例７）
（ａｌａ−ＴＦＰＩの凍結乾燥組成物に対するポリリン酸塩の安定化効果）
これらの研究では、ａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩との重量比２：１、６：１、および８：１を、ＴＦＰＩの凍結乾燥組成物を安定化させるポリリン酸塩の能力について、試験した。緩衝剤（例えば、１０ｍＭヒスチジンおよび１０ｍＭイミダゾール）を製剤に添加してｐＨを７に上げた。マンニトールおよびショ糖を特定の製剤に添加してケイク強度を高めるとともに安定性を強化した。ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度は、凍結乾燥に先立って２０ｍｇ／ｍｌに調製した。
【０１１７】
残留含水量およびケイク形態の結果を表９に示す。６つの製剤全てが１／２を下回る残留水分率を示す。ポリリン酸塩それ自体は、凍結乾燥にとって良好な薬剤と考えられ、なんら他の添加剤を必要とすることなくケイクをわずかながら収縮させる。ヒスチジンの添加によって、ケイク形態に対するさらなる改善は観察されなかった。しかし、製剤へのマンニトールおよびショ糖の添加によってケイク形態が改善された。後の実験では、４％（ｗ／ｖ）マンニトール単独による２：１の重量比でのａｌａ−ＴＦＰＩ−ポリリン酸塩製剤の乾燥凍結もまた、良好なケイク構造を生じた。したがって、マンニトールは製品をエレガンスなものにするために良好な結晶血清剤であることがわかった。
【０１１８】
（表９）
【０１１９】
【表９】
2008500942.tif 000011
促進的な安定性試験を、４０℃および５０℃で実施した。試験される試料の典型的ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを図８に示した。水性製剤と同様に、高温で保存される間、凝集によるａｌａ−ＴＦＰＩの損失が観察され、クロマトグラム上のピーク面積の減少をもたらした。
【０１２０】
試験される試料でａｌａ−ＴＦＰＩの損失を示しているＲＰ−ＨＰＬＣ分析の結果を表１０に示した。表１０に示す全ての製剤が水性高濃度製剤単独よりも安定していた。４０℃での３ヶ月保存後、水性製剤試料は、ＰＲ−ＨＰＬＣによれば可溶性ＴＦＰＩが５０％以下であり（表２）、一方全ての凍結乾燥製剤が含む可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩが８０％を上回った。
【０１２１】
（表１０）
【０１２２】
【表１０】
2008500942.tif 000012
表１０に示す６つの製剤のなかで、ａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩比が２：１である製剤が最良のａｌａ−ＴＦＰＩ安定性を示した。５０℃で３ヶ月保存後、この製剤はＲＰ−ＨＰＬＣによる５６％可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩをなおも含んでいたが、他の製剤ではほぼ完全に分解された。この製剤の５０℃での分解カイネティクスを高濃度製剤と比較したものを図９に示す。凍結乾燥製剤は、この促進的な安定性試験で試験したように、水性製剤よりも安定性が約１０倍高かった。
【０１２３】
示差走査熱量（ＤＳＣ）測定によって、ヒスチジン／マンニトール／ショ糖製剤に含まれるポリリン酸塩のガラス転移点（Ｔｇ）は約−２８℃であることがわかった。製品温度が−２８℃未満であったことから、図１０に示すように最初の１１時間の初期乾燥中、ポリリン酸塩は、好ましくは凍結乾燥されると直ちにガラスを形成した。したがって、凍結乾燥された形状であるａｌａ−ＴＦＰＩに対して提供されたポリリン酸塩の安定化は、なおもガラス安定化理論に従うことができ、該理論は強固なガラスが崩壊反応を除去する分子の拡散を著しく減らすことを述べる。
【０１２４】
ショ糖もまた、Ｔｇが約３２℃である良好なガラス形成剤であることから、ガラスを形成することでポリリン酸塩が単独で安定化できるかどうかを調べることが、興味深かった。別の実験では、２つの製剤（２０ｍｇ／ｍｌ  ａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍｇ／ｍｌポリリン酸塩、１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン（ｐＨ７）、および４％マンニトールを含み、１％ショ糖を含むものと含まないものとからなる）を調製して凍結乾燥した。両方の製剤とも類似のケイク形態と低残留水分量（１％ショ糖無しの場合０．６９％、１％ショ糖を含む場合、０．４９％）とを示した。ショ糖は、凍結乾燥のあいだ、ＴＦＰＩに対してほとんど影響を及ぼさなかった。
【０１２５】
これらの２つの製剤の安定性を、高温での保存に対してＲＰ−ＨＰＬＣによるタンパク質濃度およびＰＴアッセイによる生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）比活性の両方の減少を試験することで、比較した。表１１に示すように、これらの２つの製剤についての安定性の違いは、意味がない。これらの製剤は両方とも、６０℃、二週間にわたる保存の後、ａｌａ−ＴＦＰＩが２％損失したことが示された。５０℃で４週間、ショ糖を含む製剤およびショ糖を含まない製剤は、それぞれａｌａ−ＴＦＰＩ損失が１２％および１８％であった。また、５０℃で４週間のこれら２つの製剤の比活性を比較した。
【０１２６】
（表１１）
【０１２７】
【表１１】
2008500942.tif 000013
（実施例８）
（凍結乾燥のためのａｌａ−ＴＦＰＩ製剤の調製）
ａｌａ−ＴＦＰＩ製剤の製造は、しばしば緩衝剤交換プロセスを必要とする。バルクａｌａ−ＴＦＰＩは、例えば、１０ｍｇ／ｍｌタンパク質、２Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むものであってもよい。凍結乾燥された製剤は、通常、尿素またはＮａＣｌを含まない。尿素含有パルク由来のａｌａ−ＴＦＰＩを製剤緩衝剤（表４）のなかへ処理するために、尿素およびＮａＣｌを緩衝剤交換方法（例えば、透析、ゲル濾過、またはダイアフィルトレーション）によって取り除く必要がある。これらの方法のなかで、ダイアフィルトレーションは製造の観点から好ましい。なぜなら、大量のａｌａ−ＴＦＰＩが製造に関わっているからである。
【０１２８】
（一工程ダイアフィルトレーション）
いくつかのｐＨ６または６．５製剤緩衝剤に対して直接入れられるａｌａ−ＴＦＰＩバルク（例えば、１０ｍｇ／ｍｌタンパク質、２Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）のダイアフィルトレーションは、広範なタンパク質沈殿をもたらした。表１２に示すように、ｐＨ６または６．５のいずれかによる４種類の緩衝剤へのダイアフィルタレーションによって、混濁状溶液または低収率のいずれかが得られた。しかし、１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸塩、４％（ｗ／ｖ）マンニトール、および１％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むｐＨ４緩衝剤へのダイアフィルトレーションによって、高収率で混濁溶液が得られた。
【０１２９】
（表１２）
【０１３０】
【表１２】
2008500942.tif 000014
ダイアフィルトレーションで使用されるａｌａ−ＴＦＰＩ濃度（１ｍｇ／ｍｌ）は、出発緩衝剤と最終製剤緩衝剤との両方の溶解限度（５−１０ｍｇ／ｍｌの溶解度）よりもかなり低かった。これらの２つの緩衝剤系は、明らかに２つの異なる機構でａｌａ−ＴＦＰＩを可溶化する。開始緩衝剤は尿素および塩を含みイオン強度が比較的高く、一方製剤緩衝剤のいくつかはイオン強度が低い。ダイアフィルトレーションは、比較的遅いプロセスである。バルク緩衝剤の尿素および塩が徐々にダイアフィルトレーションによって取り出され、製剤緩衝液成分は徐々にダイアフィルトレーションによって取り込まれる。ダイアフィルトレーションの過程で、ａｌａ−ＴＦＰＩ可溶性またはａｌａ−ＴＦＰＩ安定性のいずれかに影響を及ぼす一時的な溶媒条件をａｌａ−ＴＦＰＩが経験することができる。
【０１３１】
本発明者らは、緩衝剤の各容量で、ダイアフィルトレーション容器でのａｌａ−ＴＦＰＩ製剤の混濁度変化を調べた。出発製剤は、１ないし１．５ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩを含む１Ｍ尿素、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、および１２５ｍＭ  ＮａＣｌである。結果を表１３に示す。
【０１３２】
（表１３）
【０１３３】
【表１３】
2008500942.tif 000015
＊「＋」は、わずかに混濁した溶液を示し、「＋＋」は混濁溶液を示し、さらに「−」は透明な溶液を示す。
【０１３４】
ｐＨ４でダイアフィルトレーションしたＡｌａ−ＴＦＰＩは、第１または第２の容量の緩衝剤交換での混濁度の一次的変化を示した。すなわち、それは透明になり、ダイアフィルトレーションの最後までそのまま残った。酢酸ナトリウムｐＨ５．５緩衝剤を用いて、混濁度の変化が１、２、および５容量の緩衝剤交換で観察された。ｐＨ６またはｐＨ６．５を用いたダイアフィルトレーションは、３％（ｗ／ｖ）Ｌ−アルギニンを含む溶液を除いて、ダイアフィルトレーションの後期で混濁溶液を生じた。したがって、低ｐＨとＬ−アルギニンとがダイアフィルトレーション中にａｌａ−ＴＦＰＩが沈殿するのを防いだ。
【０１３５】
（２工程ダイアフィルトレーション）
ダイアフィルトレーション中のａｌａ−ＴＦＰＩの沈殿を、ｐＨが約４である緩衝剤を用いることによって防ぐことができる。ｐＨが約４である緩衝剤がバルク緩衝剤と最終製剤緩衝剤との間の橋渡しとして用いられるかどうかについて調べるために、二工程のダイアフィルトレーション実験をおこなった。第１の工程で、４容量の緩衝剤交換のためのｐＨ４緩衝剤に対して、ＴＦＰＩをダイアフィルトレーションした。第２の工程では、ダイアフィルトレーション緩衝剤が製剤緩衝剤に切り替えられ、６容量の緩衝剤交換が実行された。いつかの２工程ダイアフィルトレーション緩衝剤系でのダイアフィルトレーション中での混濁度の変化を記録して表１４に示した。
【０１３６】
ｐＨ４緩衝剤は、好ましくはＬ−グルタミン酸塩緩衝剤である。
グルタミン酸塩緩衝剤による４通りの容量変化の後、適当な溶解剤による所望の最終産物緩衝剤は、第２の工程として導入される。この過程は、処理の間、生じたタンパク質のかなり少ない損失で、透明な配合最終産物を産生する。
【０１３７】
一実施形態では、上記出発溶液は、１ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＥを含む１Ｍ尿素、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７）であり、最初に４容量交換用のＬ−グルタミン酸塩緩衝剤（１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸／Ｌ−グルタミン酸塩、４％（ｗ／ｖ）マンニトール、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、ｐＨ４．０）によってダイアフィルトレーションをおこない（工程１）、つぎに追加の６容量交換のためのＬ−ヒスチジンもしくはイミダゾール緩衝剤によってダイアフィルトレーションをおこなった（工程２）。ダイアフィルトレーションした溶液の透明度を記録した。ダイアフィルトレーションした溶液を０．２２μｍフィルター・ユニットで濾過し、その濾過液のａｌａ−ＴＦＴ濃度を紫外線吸光度で測定してダイアフィルトレーション前の濃度を比較することで、再生を計算した。結果を表Ｂに示す。
【０１３８】
（表Ｂ）
【表Ｂ】
2008500942.tif 000016
【０１３９】
この手順を、適当な商業規模での治療的用途のためにＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の液体（または溶液）製剤の調製のために、用いることができる。
【０１４０】
（表１４）
【０１４１】
【表１４】
2008500942.tif 000017
＊「＋」は、わずかに混濁した溶液を示し、「＋＋」は混濁溶液を示し、さらに「−」は透明な溶液を示す。
【０１４２】
表１４に示すように、第１工程のダイアフィルトレーションが相対的に強イオン強度の緩衝剤（例えば１０ｍＭ  Ｌグルタミン酸塩、ｐＨ４，および１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いた場合、ダイアフィルトレーション中になんら一時的な混濁度変化が観察されなかった。しかし、ａｌａ−ＴＦＰＩが第２工程のダイアフィルトレーション（低イオン強度の緩衝剤を使用）で沈殿した。一方、第１工程のダイアフィルトレーションで低イオン強度緩衝剤（例えば、１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸塩、ｐＨ４、４％（ｗ／ｖ）マンニトール、および１％（ｗ／ｖ）ショ糖）を用いた場合、約１容量の緩衝剤交換で、ａｌａ−ＴＦＰＩ溶液が短い一時的な混濁工程を通過した後、なんら混濁度変化は観察されず、その後ダイアフィルトレーションの間、混濁度変化は検出されなかった。したがって、低イオン強度ｐＨ４緩衝剤を用いることで、２工程ダイアフィルトレーション・プロセスは透明な配合最終産物を産生する。
【０１４３】
（実施例９）
（５０℃促進化安定性アッセイ）
促進的な安定性テストを用いて、ａｌａ−ＴＦＰＩの種々の濃度の安定性を測定した。試料を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）および３００ｍＭアルギニンに調製した。Ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度は、約１ｍｇ／ｍｌから約７．４ｍｇ／ｍｌの範囲とした。水性試料を５０℃で最大約６ヶ月間インキュベートした。毎月、可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩ残留率を各濃度に対して測定した。可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの測定は、陽イオン交換ＨＰＬＣでおこなった。その結果を図１１に示す。図１１に示すように、ａｌａ−ＴＦＰＩは約４ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でわずかにより安定している。
【０１４４】
（実施例１０）
（生き残り研究）
マウスの盲腸結紮および穿刺研究をおこない、新たに調製された臨床等級ロットの組み換え型ａｌａ−ＴＦＰＩ（ｒＴＦＰＩ）（ＴＦＰＩ９２）と、部分的に脱アミド化および酸化された臨床等級材料（ＴＦＰＩ７８）とを比較した。このモデルは直接的な糞便汚染および盲腸壊死による多微生物性腹腔内および全身性感染を誘導し、密接に人間の腹腔内敗血症を模倣する（Ｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２９，  １３−１８，  ２００１）。
【０１４５】
両方のＴＦＰＩ標品の調製は、２００３年８月１３日出願の米国特許出願第６０／４９４，５４６号、２００３年１０月８日出願の米国特許出願第６０／５０９，２７７号、および２００３年１０月２０日出願の米国特許出願第６０／５１２，１９９号の記載通りにおこなった。これらの出願の各々の内容全体を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。ｒＴＦＰＩ７８、ｒＴＦＰＩ９２、または希釈剤対照群のいずれも、４８時間（ＳＱ  ｑ１２時間ｘ４用量）にわたる盲検形式で与えられた。外科的手技前およびその４８時間後に採血し、定量的菌血、内毒素、およびサイトカイン（腫瘍壊死因子アルファおよびインターロイキン‐６）のレベルを測定した。動物を毎日観察し、死亡が生じたらそれを記録した。全ての動物に対して、実験期間の終わりに、器官損傷および定量的細菌学を組織学的に明らかにするために剖検評価をおこなった。
【０１４６】
カプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存プロットを図１２に示す。部分的に酸化したもの（ｒＴＦＰＩの脱アミド化形態）を投与されたマウスと比較して、新たに調製されたｒｔＦＰＩを投与されたマウスは、生存上著しく有利であった。両方のｒＴＦＰＩ群は、希釈剤を投与された対照群のマウスよりも餌をよく食べた。予想通りに、見せかけの手術（疑似手術）をしたマウス（結紮および穿刺以外の盲端の識別による外科的処置）は、７日の研究期間を生き残った。２通りのｒＴＦＰＩ処置群間で、菌血症、内毒血症、またはサイトカイン産生の第２のエンドポイントに有意差が認められなかった。
【０１４７】
この研究によれば、ＴＦＰＩが細菌、内毒素、またはサイトカインの血中濃度によっては説明されない機構によって生存上の利点を提供しているように思われる。脱アミドされた酸化型のＴＦＰＩによって与えられる防御は、新たに調製されたＴＦＰＩよりも劣る。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、ｐＨ７で水性製剤に調製される試料の安定性を試験するために、ａｌａ−ＴＦＰＩの陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。水性製剤は、１５０μｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート−８０を含んだ。この水性製剤を、４０℃で０、３、５、１０、または２０日間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図２】図２は、水性製剤における４０℃でのｐＨの関数としての可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの損失に関する一次反応定数を示す。水性製剤は、１５０μｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート−８０を含んだ。
【図３】図３は、ｐＨ４で水性製剤に調製した試料の安定性を試験するためのａｌａ−ＴＦＰＩの陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。水性製剤は、１５０μｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート−８０を含んだ。水性製剤を、４０℃で０、３、５、１０、または２０日間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図４】図４は、種々のｐＨ値で水性製剤に調製される試料の安定性を試験するために、ａｌａ−ＴＦＰＩの陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。水性製剤は、１５０μｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート−８０を含んだ。水性製剤を、４０℃で１０日間保存した。ｐＨ値はｐＨ４、５、６、または７である（それぞれ上から下まで）。
【図５】図５は、ａｌａ−ＴＦＰＩ安定性に対するポリリン酸塩の効果について逆相高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。水性製剤は、５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（ｐＨ７）、および２．５ｍｇ／ｍｌのポリリン酸塩を含んだ。水性製剤を４０℃、３０℃または−７０℃で３ヶ月間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図６Ａ】図６Ａは、凍結乾燥組成物として調製したａｌａ−ＴＦＰＩ試料の陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー・クロマトグラムを示す。これらの凍結乾燥組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（ｐＨ６）、４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および１％（ｗ／ｖ）のショ糖を含んだ。凍結乾燥組成物を、５０℃、４０℃、３０℃、または−７０℃で３ヶ月間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、凍結乾燥組成物として調製したａｌａ−ＴＦＰＩ試料の逆相高速液体クロマトグラフィー・クロマトグラムを示す。これらの凍結乾燥組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（ｐＨ６）、４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および１％（ｗ／ｖ）のショ糖を含んだ。凍結乾燥組成物を、５０℃、４０℃、３０℃、または−７０℃で３ヶ月間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、凍結乾燥組成物として調製したａｌａ−ＴＦＰＩ試料のサイズ除外高速液体クロマトグラフィー・クロマトグラムを示す。これらの凍結乾燥組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（ｐＨ６）、４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および１％（ｗ／ｖ）のショ糖を含んだ。凍結乾燥組成物を、５０℃、４０℃、３０℃、または−７０℃で３ヶ月間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図７Ａ】図７Ａは、種々の凍結乾燥組成物として調製された試料（製剤２、４、１３、１５、および１７）の安定性を試験するためのａｌａ−ＴＦＰＩの陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。製剤の組成は表４を参照せよ。凍結乾燥組成物は５０℃で６ヶ月間保存した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、種々の凍結乾燥組成物として調製された試料（製剤２、４、１３、１５、および１７）の安定性を試験するためのａｌａ−ＴＦＰＩの陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。製剤の組成は表４を参照せよ。凍結乾燥組成物は２〜８℃で６ヶ月間保存した。
【図８】図８は、凍結乾燥組成物として調製される試料の安定性を試験するためのａｌａ−ＴＦＰＩの逆相高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。凍結乾燥組成物は、５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（ｐＨ７）４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、１％（ｗ／ｖ）のショ糖、および２．５ｍｇ／ｍｌのポリリン酸塩のを含んだ。凍結乾燥組成物は、５０℃、４０℃、または−７０℃で３ヶ月間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図９】図９は、高濃度のａｌａ−ＴＦＰＩ水性製剤と比較したａｌａ−ＴＦＰＩ凍結乾燥製剤の安定性比較を示す。このグラフでは、５０℃での保存後に残存する可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの比率が示されている。
【図１０】図１０は、ａｌａ−ＴＦＰＩと種々のポリリン酸塩製剤とを含む組成物の凍結乾燥のための温度記録を示す。実線は、凍結乾燥中の保存温度を示す。点線は、ａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩製剤の平均温度であり、この製剤が入ったバイアル（５ｃｃ）に挿入された４本の温度プローブで測定した。
【図１１】図１１は、最大で６ヶ月間にわたり５０℃でインキュベートした後の可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩ残存率を示す。水性製剤は、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）および３００ｍＭアルギニン中に種々の量のａｌａ−ＴＦＰＩを含んだ。示した時間にわたる５０℃でのインキュベーション後、可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩを陽イオン交換ＨＰＬＣでアッセイし、溶液に残存する可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩ量を測定した。
【図１２】図１２は、カプラン・マイヤー生存プロットであり、Ｘ軸は生存、Ｙ軸は時間（ｈ）を表す。
【図１】
2008500942.tif 000018
【図２】
2008500942.tif 000019
【図３】
2008500942.tif 000020
【図４】
2008500942.tif 000021
【図５】
2008500942.tif 000022
2008500942.tif 000023
2008500942.tif 000024
2008500942.tif 000025
2008500942.tif 000026
2008500942.tif 000027
【図８】
2008500942.tif 000028
【図９】
2008500942.tif 000029
【図１０】
2008500942.tif 000030
【図１１】
2008500942.tif 000031
【図１２】
2008500942.tif 000032
【配列表】
2008500942000001.xml
【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年12月7日(2006.12.7)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、同時係属仮出願第６０／４３８，５２４号（２００３年１月８日出願）、第６０／４９４，５４７号（２００３年８月１３日出願）、第６０／５０９，２７６号（２００３年１０月８日出願）、および第６０／５１２，０９２号（２００３年１０月２０日出願）の恩恵を主張するとともに、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に安定化されたタンパク質製剤の分野に関する。より詳しくは、本発明は組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）およびＴＦＰＩ改変体の安定化凍結乾燥組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）は、２７６アミノ酸長であり、組織因子によって媒介される血液凝固のインヒビターとして機能する。そのアミノ酸配列を配列番号１で示す。ＴＦＰＩのアミノ末端は負に帯電しており、またカルボキシ末端は正に帯電している。ＴＦＰＩタンパク質は、３つのクニッツ型酵素インヒビタードメインを含有する。ＴＦＰＩは、１８個のシステイン残基を含み、正しく折りたたまれた場合、９個のジスルフィド架橋を形成する。一次配列は、３つのＮ結合コンセンサス糖化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含む。糖化部位のアスパラギン酸残基は、１４５、１９５、および２５６位に位置している。ＴＦＰＩもまた、リポ蛋白関連凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）、組織因子インヒビター（ＴＦＩ）、および外因経路インヒビター（ＥＰＩ）として知られている。
【０００４】
ＴＦＰＩを用いて、種々の適応症を治療することが提案された。例えば、敗血症（米国特許第６，０６３，７６４号およびＷＯ９３／２４１４３）、深部静脈血栓（米国特許第５，５６３，１２３号、米国特許第５，５８９，３５９号、およびＷＯ９６／０４３７８）、虚血（米国特許第５，８８５，７８１号、米国特許第６，２４２，４１４号、およびＷＯ９６／４０２２４）、再狭窄（米国特許第５，８２４，６４４号、およびＷＯ９６／０１６４９）、および癌（米国特許第５，９０２，５８２号およびＷＯ９７／０９０６３）が挙げられる。ＴＦＰＩ改変体（アミノ末端でのアラニン残基の付加によってＴＦＰＩとは異なる）（”ａｌａ−ＴＦＰＩ”）が敗血症治療のための動物モデルで有効であることが示されている（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃ  Ｓｈｏｃｋ  １９９４  Ｎｏｖ；  ４４（３）：  １２６−３７）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＴＦＰＩは、水溶液中での溶解度が乏しい疎水性タンパク質である。溶液中でのＴＦＰＩの凝集は、生物活性の損失と相関していた。種々の製剤が作られた（例えば、米国特許第５，８８８，９６８号およびＷＯ９６／４０７８４を参照せよ）。しかし、安定化されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物が当技術分野で、いまだ求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の簡単な説明）
本発明は、少なくとも以下の実施形態を提供する。
【０００７】
本発明の一実施形態は、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と、（２）炭水化物またはアミノ酸ガラス形成剤とを含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物を提供する。この凍結乾燥組成物は、約４５％以上の凝集安定性を有する。
【０００８】
本発明の別の実施形態は、凍結乾燥に先立って、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体が、炭水化物またはアミノ酸ガラス形成剤を含む水性製剤に存在し、その水性製剤のｐＨが約４ないし約８であるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物である。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物を調製する方法である。この方法は、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と、（２）炭水化物またはアミノ酸ガラス形成剤とを含む水性製剤を凍結乾燥する工程を含み、前記水性製剤はｐＨが約４ないし約８であり、それによって、約４５％以上の凝集安定性を持つＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物を形成する。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、凍結乾燥のためにＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の組成物を調製する上で役立つプロセスである。このプロセスは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を含み基本的にカオトロープを含まない第２の製剤を形成するために、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と（２）カオトロープとを含む第１の製剤から、カオトロープを取り除く工程を有し、上記第２の製剤はｐＨが約３．５ないし約４．５である。カオトロープを尿素とすることができる。いくつかの実施形態では、第２の製剤はｐＨが約４である。第１の製剤は、ｐＨが約５．５で約３００ｍＭのアルギニンおよび約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム；ｐＨが約７．２で約２Ｍの尿素、約１５０ｍＭの塩化ナトリウム、および約２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨが約７．２で約２Ｍの尿素、約２５０ｍＭの塩化ナトリウム、および約２０ｍＭのリン酸ナトリウム；またはｐＨが約７で約１Ｍの尿素、約１２５ｍＭの塩化ナトリウム、および約１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含むことができる。第２の製剤は、ｐＨが約５．５で約３００ｍＭのアルギニンおよび約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨが約６で約１％（ｗ／ｖ）のショ糖、約４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨが約４で約１％（ｗ／ｖ）のショ糖、約４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および約１０ｍＭのグルタミン酸塩；あるいはｐＨが約６で約３％（ｗ／ｖ）アルギニン、約４％（ｗ／ｖ）マンニトール、および約１０ｍＭのヒスチジンを含むことができる。上記除去工程は、ダイアフィルタレーション、透析、およびサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１つの方法によって、実施することができる。
【００１１】
本発明のさらに別の実施形態は、凍結乾燥のためにＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の組成物を調製する上で役立つプロセスである。このプロセスは、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と（２）第１製剤低分子量溶質とを含む第１の製剤に含まれる第１製剤低分子量溶質を第２溶液低分子量溶質によって置換して第２の製剤を形成する工程を有し、上記第２の製剤はｐＨが約３．５ないし約４．５である。プロセスは、第２製剤溶質を第３溶質製剤と置き換えて第３の製剤を形成する工程を含むことができる。置換の工程は、ダイアフィルトレーションによっておこなうことができる。第３の製剤は、医薬的に許容しうる製剤である。第２製剤溶質を置き換える工程を、ダイアフィルタレーション、透析、およびサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される方法で実施することができる。必要に応じて、第３の製剤は、ｐＨが約６で約１％（ｗ／ｖ）のショ糖、約４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および約１０ｍＭのヒスチジンと、ｐＨが約６．５で約１％（ｗ／ｖ）のショ糖、約４％（ｗ／ｖ）マンニトール、および約１０ｍＭのイミダゾールとを含むことができる。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態は、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と  （２）クエン酸塩緩衝剤とを含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物であって、該凍結乾燥組成物が約４５％以上の凝集安定性を有する。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態は、（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と、（２）硫酸塩と、（３）リン酸緩衝剤とを含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物であって、該凍結乾燥組成物が約４５％以上の凝集安定性を有する。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物を調製する方法である。この方法は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体およびクエン酸塩緩衝剤と、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、硫酸塩、およびリン酸塩緩衝剤とからなる群から選択される水性製剤を凍結乾燥する工程を含み、それによって約４５％以上の凝集安定性を持つＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凍結乾燥組成物が形成される。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
高ｐＨ緩衝剤は、水性組成物でのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凝集に好都合である。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凝集は、分子の変性および不活化を生じる。低ｐＨ緩衝剤は、水性組成物でのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の酸触媒加水分解を生じる。このように、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の安定な水性組成物にとって最適なｐＨ範囲は、ｐＨ約４ないしｐＨ約８である。ｐＨが約４ないし約８であり、かつガラス形成剤を含有するＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物を凍結乾燥することで、非常に安定組成物を得ることができる。
【００１６】
凍結乾燥（「フリーズ・ドライ」）は、製剤からの脱水である。凍結乾燥は、任意の周知の方法、例えば以下に説明するように、ハル・フリーズ・ドライヤー（Ｈｕｌｌ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ）を用いておこなうことができる。脱水は、水依存型崩壊反応が起こるのを防止する。そのような反応として、例えばペプチド結合加水分解とアミド分解とが挙げられる。
【００１７】
本発明の凍結乾燥組成物は、約１０ｍｇ／ｍｌ以下のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体（すなわち、１０、７．５、５、２．５、１、０．５、もしくは０．２ｍｇ／ｍｌ以下）とガラス形成剤とを含む水性製剤を凍結乾燥することによって作られ得る。この水性製剤は、凍結乾燥に先立って、ｐＨが約４ないし約８（すなわち、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、または８）、より好ましくはｐＨが約５ないし約８、さらにより好ましくはｐＨが約５ないし約７、それよりも好ましくはｐＨが約５．５ないし約６．５、さらにそれよりも好ましくはｐＨ６である。必要に応じて、水性製剤が緩衝剤および／または１種類以上の結晶形成剤を含むことができる。
【００１８】
他のＴＦＰＩおよびＴＦＰＩ組成物の調製は、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩ改変体と、（ａ）クエン酸塩緩衝剤、（ｂ）硫酸塩とリン酸塩緩衝剤との混合物、または（ｃ）硫酸塩と緩衝剤（ｐＨが約４ないし約８）を含む水性製剤を凍結乾燥することで、おこなうことができる。凍結乾燥組成物の成分は、以下に別々に説明する。
【００１９】
好ましい凍結乾燥産物は、２０ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、１０ｍｇ／ｍｌのポリリン酸塩、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（ｐＨ７）、４％のマンニトール、および１％のショ糖を含む。
【００２０】
（凍結乾燥組成物の凝集安定性）
本発明の凍結乾燥組成物の凝集安定性は、約４５％以上である。「凝集安定性率（ｐｅｒｃｅｎｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」は、４０℃促進安定性アッセイで測定される可溶性をもつＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体試料の比率のことをいう。４０℃促進安定性アッセイでは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体試料を４０℃で３ヵ月間インキュベートする。インキュベーション後、凍結乾燥されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体試料を滅菌水で元に戻し、０．２μｍフイルターで濾過し、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー  （ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）  にかけて、溶液に残存する可溶性ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の量を測定する。ＣＥＸ−ＨＰＬＣアッセイついては、後述する。このように、例えば、６０％の凝集安定性を持つＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物は、４０℃促進安定性アッセイで測定されるようにＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の６０％が可溶性である組成物である。８０％の凝集安定性を持つＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物は、４０℃促進安定性アッセイで測定されるように、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の８０％が可溶性である組成物である。本発明のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の凝集安定性率は、４０℃促進安定性アッセイで測定されるように、好ましくは約４５、５０、６０、７０、または７５％以上、より好ましくは８０、８２、８４、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％以上である。本発明のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の凝集安定性率は、４０℃促進安定性アッセイで測定されるように、例えば、約４５％以上から約９０％以上、約４５％以上から約９６％以上、５０％以上から約９９％以上、約５０％以上から約７０％以上、約６０％以上から約８０％以上、約７０％から約９５％以上、あるいは約８５％以上から約９６％以上の範囲に及ぶことができる。好ましくは、本発明の水溶性組成物に含まれるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体は、以下に説明するように、例えばプロトロンビン時間アッセイによって測定される生物活性を有する。
【００２１】
（保存温度）
本発明の組成物に対する保存温度を、約−７０℃から約２５℃までの範囲（例えば、約−７０、−６０、−５０、−４０、−３０、−２０、−１０、０、５、１０、１５、２０、または２５℃）とすることができる。好ましくは、本発明の凍結乾燥組成物を約２５℃で保存することができる。
【００２２】
（ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩ改変体）
ＴＦＰＩは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を持つポリペプチドである。好ましくは、ＴＦＰＩは、微生物宿主で生ずる組み換え型のヒト・タンパク質である。ＴＦＰＩは、ＷＯ０１／２４８１４でその生物活性に関して、さらに特徴づけられ、かつ説明されている。
【００２３】
ＴＦＰＩ改変体として、ＴＦＰＩの類似体および誘導体、同様にＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ類似体、およびＴＦＰＩ誘導体のフラグメントが挙げられる。ＴＦＰＩ改変体は、ヒトまたは他の哺乳類源から得ることができ、また合成あるいは組み換え技術によっても得られる。類似体は、一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失、および／または付加を有するＴＦＰＩ分子である。保存的置換（アミノ酸が同様の特性を持つ別のアミノ酸と交換される）が好ましい。保存的置換の例として、限定されるものではないが、ＧｌｙとＡｌａとの間、ＶａｌとＩｌｅとＬｅｕとの間、ＡｓｐとＧｌｕとの間、ＬｙｓとＡｒｇとの間、ＡｓｎとＧｌｎとの間、およびＰｈｅとＴｒｐとＴｙｒとの間が挙げられる。これらは一般に、約１ないし５アミノ酸の範囲内である（すなわち、１、２、３、４、または５アミノ酸）。分子内の任意の位置、特にアミノ末端またはカルボキシ末端に、さらにアミノ酸を付加することができる。例えば、ＴＦＰＩ類似体の一つであるＮ−Ｌ−アラニル−ＴＦＰＩ（「ａｌａ−ＴＦＰＩ」）は、アミノ末端にアラニン残基が付加されている。アミノ酸付加は、１、２、５、１０、２５、１００，またはそれ以上の数のアミノ酸を付加することである。この定義のなかに、融合タンパク質も包含される。
【００２４】
フラグメントは、ＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ類似体、またはＴＦＰＩ誘導体の一部分である。フラグメントの例として、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）・ドメイン１、２、または３、クニッツ・ドメイン１および２または２および３、あるいはＮ末端、Ｃ末端、または両方の欠失が挙げられる。改変体の作製についての内容のある指導は、米国特許第５，１０６，８３３号に見いだされる。ＴＦＰＩのフラグメントは、配列番号１の少なくとも２０個の保存的アミノ酸から構成される。例えば、一つのフラグメントの長さを２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、または２７５個の保存的アミノ酸とすることができる。生物活性を持たないＴＦＰＩフラグメントが、米国特許第５，１０６，８３３号に開示されている。本発明でのそのようなフラグメントの使用もまた、検討する。
【００２５】
誘導体は、付加部分を持つＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ類似体、またはＴＦＰＩフラグメントとして、定義される。そのような付加の例として、糖化、リン酸化反応、アセチル化、またはアミド化が挙げられる。
【００２６】
ＴＦＰＩ改変体と配列番号１との相同率の測定は、Ｂｌａｓｔ２アラインメント・プログラム（Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｅｘｐｅｃｔ１０、標準遺伝子コード、オープン・ギャップ１１、エクステンション・ギャップ１、ギャップｘドロップオフ５０、および低複雑度フイルター・オフ）を用いておこなう。ＴＦＰＩ改変体の配列番号１に対するアミノ酸配列の同一性は、一般に、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％ないし９５％（すなわち、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％）以上、最も好ましくは少なくとも約９８％もしくは９９％である。
【００２７】
ＴＦＰＩをコードするＤＮＡ配列に変更を加えることで、ＴＦＰＩのアミノ酸配列改変体を調製することができる。ヌクレオチド配列に変更を加える方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，  ｅｄｓ．  （１９８３）  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、  Ｋｕｎｋｅｌ
（１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３６７−３８２、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）、米国特許第４，８７３，１９２号、およびこれらの文献で引用される文献を参照せよ。
【００２８】
ＴＦＰＩ改変体は、好ましくは、相当量の生物活性を有するもので、以下に説明するＰＴアッセイで測定されるように、例えばＴＦＰＩの生物活性の１０％、３０％、５０％、６０％、８０％、９０％、またはそれ以上を有する。明らかに、ＴＦＰＩ改変体をコードするＤＮＡに加えられる変更は、その配列をリーディング・フレームから外すものであってはならず、好ましくは第２のｍＲＮＡ構造を作りうる相補的領域を生成しない。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の生物活性もしくは免疫活性を消失させることなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失させるかを判断する指針は、当技術分野で周知のコンピュータ・プログラム）例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア、もしくはＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．にあるもの）を用いることで見いだされ得る。生物活性のないＴＦＰＩ改変体の安定化についても検討する。
【００２９】
米国特許第４，９６６，８５２号に示すように、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を組み換え技術によって作ることが可能である。例えば、所望のタンパク質のｃＤＮＡを、原核生物または真核生物で発現させるプラスミドに取り込むことができる。微生物を用いたタンパク質の発現に対する詳細については、当業者に周知の多くの参考文献に記載されており、例えば、米国特許第４，８４７，２０１号およびＭａｎｉａｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）を参照せよ。
【００３０】
微生物の形質転換と、形質転換された微生物を用いた種々の技術がＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の発現に、利用できる。考えられるアプローチの単なる例を以下に示す。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体ＤＮＡ配列を適当な制御配列に結合させることができる。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体ＤＮＡ配列をプラスミド（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ等の会社から市販されているｐＵＣ１３またはｐＢＲ３２２）に取り込むことができる。いったんＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体ＤＮＡをベクターに取り込むことで、そのＤＮＡを適当な宿主にクローン化することができる。そのようなＤＮＡの増幅を、米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第４，６８３，１９５号等に示される技術を用いておこなうことができる。ｃＤＮＡは、ＨｅｐＧ２またはＳＫＨｅｐヘパトーマ細胞等の細胞でｍＲＮＡ産生を誘導し、そのｍＲＮＡを同定および単離し、さらにそれを逆転写してｃＤＮＡを得ることで、得てもよい。発現ベクターが宿主（例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ））に形質転換された後、その細菌を培養してタンパク質を発現させることが可能である。細菌は、好ましい原核微生物であり、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）が特に好ましい。本発明で有用な好ましい微生物は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２のＭＭ２９４株であり、この株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（現在の所在地：１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ）により１９８４年２月１４日付でブタベスト条約の条項に従って寄託された（寄託番号３９６０７）。
【００３１】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を細菌または酵母で作り、その後精製してもよい。一般に、米国特許第５，２１２，０９１号、米国特許第６，０６３，７６４号、および米国特許第６，１０３，５００号、もしくはＷＯ９６／４０７８４に示すような手順を用いることができる。ＷＯ９６／４０７８４およびＧｕｓｔａｆｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔ．  Ｅｘｐｒｅｓｓ．  Ｐｕｒ．  ５：２３３  （１９９４）にもとづいて、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を精製し、可溶化し、さらにリフォールディングすることができる。例えば、ＷＯ９６／４０７８４の実施例９にもとづいて調製した場合、生物活性ａｌａ−ＴＦＰＩとして重量で全タンパク質の約８５％ないし９０％を含むａｌａ−ＴＦＰＩの製剤が得られる。
【００３２】
（ガラス形成剤）
「ガラス形成剤（ｇｌａｓｓ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」は、臨界温度（ガラス転移温度（Ｔｇ）を下回る温度でガラスを形成する能力を持つ化学薬品である。もし、ガラス形成剤がそのＴｇを下回る温度で凍結乾燥されるならば、ガラスが形成されて凍結乾燥組成物のままである。しかし、もしガラス形成剤がＴｇを上回る温度で凍結乾燥されるならば、ガラスは形成されない。ガラス形成の過程では、タンパク質がガラス構造に埋め込まれ得る。本発明による使用に適したガラス形成剤として、限定されるものではないが、荷電高分子、単糖類、二糖類、三糖類、および天然アミノ酸が挙げられる。炭水化物とアミノ酸ガラス形成剤とが好ましい。ガラス形成剤の組み合わせもまた、単一の製剤として検討する。
【００３３】
「荷電高分子（ｃｈａｒｇｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）」は、いくつかが正または負に帯電した化学基を持つ直鎖状または非直鎖状の形態で結合した複数の反復構造単位からなる一本の主鎖で構成される任意の化合物である。反復構造単位は、有機または無機のいずれであってもよい。また、反復構造単位の数は２から数百万に及ぶものであってもよい。
【００３４】
ガラス形成剤としての使用に適した荷電高分子として、限定されるものではないが、ポリリン酸塩、ヘパリン、硫酸デキストラン、アガロペクチン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ無機物、ポリアミノ酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸塩、ポリヒスチジン、ポリ有機物、ＤＥＡＥデキストラン、ポリ有機アミン、ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミンセルロース、ポリアミン、ポリリジン、およびポリアルギニンが挙げられる。
【００３５】
「ポリリン酸塩（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」は、リン酸無水物結合で連結したオルト・リン酸塩の反復単位からなるポリマーである。反復単位の数を、２（ピロリン酸塩）ないし数千とすることができる。ポリリン酸塩は、ヘキサメタリン酸ナトリウム（ＳＨＭＰ）と、しばしば言及される。他の慣用名として、グラハムズ（Ｇｒａｈａｍｓ）塩、カルゴン、リン酸塩ガラス、テトラメタリン酸ナトリウム、およびガラスＨが挙げられる。
【００３６】
ガラス形成剤として使用される単糖類として、限定されるものではないが、グリコールアルデヒド、グリセルアルデヒド、エリトロース、トレオース、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、アロース、タロース、グロース、マンノース、ブドウ糖、イドース、ガラクトース、アルトロース、ジヒドロキシアセトン、エリトロース、リブロース、キシロケトース、プシコース、タガトース、ソルボース、およびフルクトースが挙げられる。硫酸化単糖類を用いることも可能である。
【００３７】
単糖類を２つ結合させることで、二糖類が形成される。二糖類の形成に用いる２つの単糖類を、同一または異なるものとすることができる。ガラス形成剤として用いることができる二糖類の例として、ショ糖、トレハロース、ラクトース、マルトース、イソマルトース、ゲンチオビオース、ラミナリボース、およびセロビオースが挙げられる。硫酸化二糖類を用いることも可能である。
【００３８】
単糖類を３つ連結することで、三糖類が形成される。三糖類の形成に用いる３つの単糖類を、同一または異なるものとすることができる。ガラス形成剤としての使用に適した三糖類の例として、ラフィノースおよびメレチトースが挙げられる。硫酸化三糖類を用いることも可能である。
【００３９】
本発明でのガラス形成剤としての使用に適する天然アミノ酸として、限定されるものではないが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、リシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、プロリン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。アミノ酸は、Ｌ−立体異性体またはＤ−立体異性体のいずれであってもよい。Ｌ−アミノ酸が好ましい。
【００４０】
ガラス形成剤は、約５０ｍＭないし約６００ｍＭ（すなわち、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００ｍＭ）の量で、凍結乾燥用の水性製剤に存在する。好ましくは、ガラス形成剤は、約１００ｍＭないし約５００ｍＭ、より好ましくは約２００ｍＭないし約４００ｍＭ、さらにより好ましくは約１００ｍＭないし約３００ｍＭ、最も好ましくは約３００ｍＭの量で、存在する。
【００４１】
高分子（例えば、ポリリン酸塩）は、一般に分子量に関しては十分に規定されない。いくつかの高分子は長く、また他の高分子は短いことから、分子量は高分子間で変動する。もしガラス形成剤が十分に定まった分子でなければ、例えばポリリン酸塩のような高分子の場合、水性製剤に存在する量は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の重量と荷電高分子の重量との比として表される。好ましくは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体と荷電高分子との比は、約８：１またはそれ以下であり、より好ましくは約６：１、最も好ましくは約２：１である。
【００４２】
（緩衝剤）
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物のｐＨは、タンパク質の溶解度に影響を及ぼし、それによってその安定性にも影響を及ぼす。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８８（９）：８８１−８８８を参照せよ。本発明の組成物にとって好ましいｐＨ範囲は、約４ないし約８（すなわち、約ｐＨ４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、または８）、より好ましくは約５ないし約６．５である。ｐＨはＴＦＰＩ溶解度にとって重要な因子であることから、適当なｐＨに保つために緩衝剤を用いることで製剤の安定性をさらに改善し得る。したがって、本発明の水性組成物は、必要に応じて、溶液ｐＨを保つために緩衝剤をさらに含むことができる。
【００４３】
本発明による使用に適した典型的な緩衝剤として、限定されるものではないが、酢酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、グルタミン酸塩、Ｌ−グルタミン酸塩、イミダゾール、クエン酸塩、ヒスチジン、Ｌ−ヒスチジン、グリシン、アルギニン、Ｌ−アルギニン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい緩衝剤は、リン酸塩、Ｌ−グルタミン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンである。最も好ましい緩衝剤は、Ｌ−アルギニンおよびＬ−ヒスチジンである。緩衝剤は、約０ｍＭないし約６００ｍＭ（すなわち、約０、５、１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０、または６００ｍＭ）の量で、水性製剤に加えられる。好ましくは、緩衝剤の濃度は、約１０ｍＭないし約１００ｍＭ、より好ましくは約２０ｍＭないし約５０ｍＭである。
【００４４】
いくつかのガラス形成剤もまた、緩衝剤となり得る。そのようなガラス形成剤の例として、アルギニンがある。そのようなガラス形成剤は、水性製剤のｐＨを緩衝し、製剤が凍結乾燥される場合に該ガラス形成剤がガラスを形成してＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の安定化を助ける。緩衝剤でもあるガラス形成剤は、概して約５０ｍＭないし約６００ｍＭ（すなわち、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００ｍＭ）の量で凍結乾燥用の水性製剤に存在する。好ましくは、ガラス形成剤緩衝剤の濃度は、約１００ｍＭないし約５００ｍＭ、より好ましくは約２００ｍＭないし約４００ｍＭ、さらにより好ましくは約１００ｍＭないし約３００ｍＭ、最も好ましくは約３００ｍＭである。
【００４５】
（結晶形成剤）
必要に応じて、１種類以上の結晶形成剤を上記水性製剤に含有させることもできる。「結晶形成剤（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」は、結晶格子網様構造を形成する能力を持つ化学薬品である。概して、凍結乾燥される水性製剤に対して結晶形成剤を添加することで硬い構造が得られる。凍結乾燥後に残留する物質を「ケイク（ｃａｋｅ）」と称する。結晶形成剤が存在することなしに、ケイクは一般に硬くならず、通常は崩壊または収縮してケイク形態が損なわれる。結晶格子の硬い支持体によってケイクの崩壊が妨げられる。ケイク形態は、製品外観の態様から望ましい。凍結乾燥ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の安定性および生物活性は、一般にケイク形態による影響を受けない。
【００４６】
本発明による使用に適した結晶形成剤の例として、限定されるものではないが、マンニトール、アラニン、グリシン、塩化ナトリウム、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。結晶形成剤は、凍結乾燥用の水性製剤に、約０．５％ないし約１６％（ｗ／ｖ）（すなわち、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６％）の量で存在する。
【００４７】
（凍結乾燥のための製剤の調製）
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の大量調製は、該ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体が可溶性のままであることを確実にするためにカオトロープ（例えば、尿素）の使用を伴うものであってもよい。カオトロープは凍結乾燥に先立って除去することが望ましいか、または必要とされる可能性がある。したがって、本発明は凍結乾燥のためにＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の組成物を調製する上で役立つプロセスも提供する。
【００４８】
このプロセスの第１の工程は、第１の製剤低分子量溶質（通常はカオトロープ）を除去し、それを第２の製剤低分子量溶質（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、アルギニン、ヒスチジン、マンニトール、およびショ糖）と置換することである。第１の製剤低分子量溶質の除去にともなうＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の凝集を防ぐために、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体タンパク質の凝集または沈殿をともなうことなくカオトロープの除去を可能にするｐＨの値まで、ｐＨを下げる。通常、ｐＨを約４まで減少させる。カオトロープは当技術分野で公知の任意の方法によって取り除くことができる。そのような方法の例として、限定されるものではないが、ダイアフイルトレーション、透析、またはサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。ダイアフィルトレーションが好ましい。大量調製で溶質を交換し、保存に先立って大量のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を凍結乾燥することが望ましいと思われる。
【００４９】
あるいは、カオトロープの濃度は、カオトロープを含まない製剤によってＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体標品を希釈することで減少させることができる。この工程は、好ましくは、しかし必然的ではないが、基本的にカオトロープ・フリーである製剤の形成に帰着する。
【００５０】
必要に応じて、結果として生じる製剤に含まれるいくつかの溶質を、他の溶質（例えば、ヒスチジン、イミダゾール、マンニトール、グリシン、またはショ糖）と交換することができる。この工程の間、通常、ｐＨを増加させてＴＦＰＩが水性製剤で安定する値にする。好ましくは、ｐＨを約６まで増加させる。その後、必要に応じて、製剤を当技術分野で公知の技術を用いて凍結乾燥させることができる。第３の製剤は、好ましくは医薬的に許容される製剤である。「医薬的に許容される（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」という表現は、製剤を患者に投与した場合、顕著な生物学的副作用がないという意味である。「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という表現は、ヒト患者および獣医学的患者動物の両方を包含する。
【００５１】
本発明の凍結乾燥組成物を再構成してＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の水性製剤を提供することができる。凍結乾燥されたＴＦＰＩを、適当な媒体（例えば、食塩水または水）で再構成することができる。
【００５２】
この開示で引用される全ての特許、特許出願、および文献は、それらの全体が本明細書の一部をなすものとして、援用される。
【００５３】
以下の実施例は、例証を目的として提供され、本明細書中に開示された発明を限定するものではない。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
（一般的方法）
（ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の大量調製）
ａｌａ−ＴＦＰＩバルクを、透析によって異なる製剤緩衝剤に調製した。透析は、３，５００ダルトンの分子量カットオフを持つＳｐｅｃ／Ｐｏｒ７透析チューブを用いて、４℃でおこなった。５０ないし１００倍過剰の透析緩衝剤を３時間毎に更新した（全部で３回更新）。透析後、０．２μｍフィルター・ユニットを通す濾過によって、凝集ＴＦＰＩから可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩを分離した。可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの濃度を、ＵＶ吸光度で測定し、必要とする製剤に応じて、その濃度を所望の値に調製した。無菌のラミナー・フロー・フードにおいて、複数の３ｃｃのＩ型ガラス・バイアルに、処方されたａｌａ−ＴＦＰＩ溶液１ｍｌを移した。これらのバイアルを１３ｍｍダイキョー（Ｄａｉｋｙｏ）Ｄ７１３フッ素樹脂積層ゴム栓で封じ、アルミニウム・シールでクリンピングして、スタビリティ・チャンバーに入れた。凍結乾燥するために、３ｃｃのガラス・バイアルに１ｍｌの配合ａｌａ−ＴＦＰＩ溶液を満たし、１３ｍｍウエスト（Ｗｅｓｔ）８９０グレイ（Ｇｒａｙ）凍結乾燥栓で、半分栓をされた。凍結乾燥するために、これらのバイアルを凍結乾燥器にセットした。
【００５５】
（ＨＰＬＣ）
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：  全てのＨＰＬＣ方法を、７１７ヒーター／クーラー・オートサンプラーを備えたウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）６２６ＬＣシステム上でおこなった。ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）４８６吸光度検出器でＵＶ吸光度をモニターし、日立（Ｈｉｔａｃｈｉ）Ｆ−１０５０またはＦ−１０８０蛍光分光光度計によって蛍光を記録した。データの収集および処理を、パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ターボクロム（Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍ）システム上でおこなった。
【００５６】
陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）：  ＣＥＸ−ＨＰＬＣ方法は、ファルマシア・モノ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｍｏｎｏ）−Ｓ  ＨＲ  ５／５−ガラス・カラムを使用した。カラムの平衡化は、８０％緩衝剤Ａ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム三水和物：アセトニトリル溶液（７０：３０  ｖ／ｖ）、ｐＨ  ５．４）と２０％緩衝剤Ｂ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム三水和物−１．０Ｍ塩化アンモニウム−アセトニトリル溶液（７０：３０  ｖ／ｖ）、ｐＨ  ５．４）とでおこなった。試料を注射した後、２１分で２０％緩衝剤Ｂから８５％緩衝剤Ｂに０．７ｍｌ／分の流速でＴＦＰＩが溶出するように、勾配を与えた。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度で検出または２８０ｎｍ励起および３２０ｎｍ発光を用いた蛍光によって検出された。
【００５７】
サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）：  ＳＥＣ−ＨＰＬＣ方法は、フェノメネクス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）  ＢＩＯＳＥＰ−ＳＥＣＳ２０００カラム（３００  ｘ  ７．８  ｍｍ）を使用した。定組成溶離プロフィールを用いて、上記カラムからａｌａ−ＴＦＰＩを溶出した。ａｌａ−ＴＦＰＩの溶出は１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）と０．５ＭのＮａＣｌとでおこなった。タンパク質ピークを２７８ｎｍ吸光度によって検出し、タンパク質分子量を４６７ｎｍ励起および４６７ｎｍ発光を用いた蛍光によって測定した（Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ５９２：２１５−２２８，  １９９２）。
【００５８】
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）：  逆相ＨＰＬＣ法は、直列になった２本のレイニン・ダイナマクス（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ）  Ｃ８カラム（５ｃｍｘ４．６ｍｍ、５μｍ、３００Å）（５ｃｍ  ｘ  ４．６ｍｍ、５μｍ、３００Å）を使用した。カラムを８６％緩衝剤Ａ（３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル：０．４５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）と１４％緩衝剤Ｂ（６０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル：０．４５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）で前平衡化した。注入されたタンパク質の溶出は、流速１ｍｌ／分で最初に緩衝剤Ｂを１３分以内に２１％に増加させ、つぎに３０分以内に１００％緩衝剤Ｂとすることで、おこなった。タンパク質溶出を２８０ｎｍ吸光度の測定によって検出した。
【００５９】
（プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイ）
ＰＴアッセイを、Ｃｏａｇ−Ａ−ＭａｔｅＲＡ４インストルメント（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）上でおこなった。最初に、ａｌａ−ＴＦＰＩ試料を緩衝剤（２Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で希釈して１５０μｇ／ｍｌとし、続いてＴＢＳＡ緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、ｐＨ７．５）で希釈して３０μｇ／ｍｌとし、最後にＴＢＳＡ緩衝剤によって希釈して１２ないし１５μｇ／ｍｌとした。アッセイのために、１０μｌの希釈試料を最初に９０μｌのプールされたベリファイ（Ｖｅｒｉｆｙ）Ｉ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５９５６６）と混合し、試験トレイ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３５０１４）に載せ、さらにＣｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅに入れた。つぎに、２００μｌのシンプラスチン・エクセル（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｅｘｃｅｌ）（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ，  Ｃａｔ．Ｎｏ．５２００１）を添加して凝固プロセスを開始させた。凝固時間を、数秒の凝固時間の対数と、標準のａｌａ−ＴＦＰＩ濃度の対数とからなる標準プロットと比較することよって、入力ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度に変換した。
【００６０】
（ＰＥＩの添加）
ＰＲ−ＨＰＬＣ分析およびＰＴアッセイに対するポリリン酸塩の干渉を排除するために、ＰＥＩをａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩試料に添加した。ＰＥＩ無しでは、ａｌａ−ＴＦＰＩは異常なＨＰＬＣ溶出プロフィールを示し、ポリリン酸塩存在下での生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）比活性（０．６〜０．９）を減少させた。０．８％（ｗ／ｖ）ＰＥＩの添加によって正常な溶出プロフィールおよび正常な生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）比活性が回復した。濃度０．２および０．４％（ｗ／ｖ）のＰＥＩを添加することでａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿が観察された。ＰＥＩの濃度が０．６ないし３．２％（ｗ／ｖ）ではａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿は生ずることがなく、単独で用いた場合にＰＴアッセイでの凝固時間に影響を及ぼすことがなかった。
【００６１】
（ダイアフィルトレーション）
ダイアフィルトレーション：  約１０ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、２Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体バルクを最初に１．２５ないし５ｍｇ／ｍｌポリリン酸塩（ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩重量比が約８：１から約２：１に変化）と混合した。尿素を６Ｍまで添加した。ダイアフィルトレーション膜は、ミリポア・ペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｉｃｏｎ）２ミニ（ｍｉｎｉ）１０Ｋ  ＰＬＧＣ再生セルロース膜（表面積０．１ｍ２）とした。蠕動ポンプの入口圧、放出口圧、および流速は、製造元の推奨にしたがって設定した。
【００６２】
ダイアフィルトレーション効率：  ダイアフィルトレーション容器内の溶液量が全ダイアフィルトレーション・プロセス（すなわち、送り（ｆｅｅｄ−ｉｎ）ダイアフィルトレーション緩衝剤の量は、透過（ｐｅｒｍｅａｔｅ−ｏｕｔ）溶液の量に等しい）の過程で一定に保たれる場合、交換等式：
Ｃｎ／Ｃｏ＝ｅｘｐ（−α、Ｖｎ／Ｖｏ）を用いて各々の緩衝剤交換量でのダイアフィルトレーション効率を算出することができる。
【００６３】
ここで、ＣｎおよびＣｏは、それぞれ緩衝剤交換量ｎおよびゼロでのダイアフィルトレーション容器内の溶質濃度（しかし、送り（ｆｅｅｄ−ｉｎ）緩衝剤に存在しない）である。Ｖｏは、ダイアフィルトレーション容器内の開始ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体製剤の量であり、Ｖｎは送り込まれた緩衝剤もしくは透過したダイアフィルトレーション溶液の量である。したがって、ｎ＝Ｖｎ／Ｖｏ。ダイアフィルトレーション・カートリッジは、尿素、ＮａＣｌ、およびリン酸塩等の小さな溶質に対して完全に透過性を持つものとみなされる分子量カット・オフが１０キロダルトンである膜を使用した。したがって、透過因子αは、分子量カットオフよりも十分に下回る小さな溶質に対して、１に等しい。この等式は、各緩衝剤交換量でのダイアフィルトレーション効率の算出を可能にする。例えば、９８．２％および９９．８％開始緩衝剤成分がそれぞれ４および６容量の緩衝剤交換の後に「透過（ｐｅｒｍｅａｔｅｄ  ｏｕｔ）」する。
【００６４】
（透析）
いくつかの実験では、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体バルクは、透析によって異なる製剤緩衝剤に調製された。透析は、３，５００ダルトンの分子量カットオフでＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ７（登録商標）透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、４℃でおこなった。５０ないし１００倍過剰の透析緩衝剤を３時間毎に合計３回交換した。透析後、０．２μｍフィルター・ユニットで濾過することで、可溶性ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を凝集ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体から分離した。可溶性ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の濃度を、ＵＶ吸光度によって測定し、求められる製剤にもとづいて所望の値に調製した。
【００６５】
（凍結乾燥（フリーズ・ドライ））
製剤化されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を含む複数のバイアルを複数のメタル・トレイ上に置いた。これらのトレイを、事前に１０℃に平衡化された保存温度のハル・フリーズ・ドライヤー（Ｈｕｌｌ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ）（Ｍｏｄｅｌ  ８ＦＳ  １２Ｃ）に入れた。フリーズ・ドライ・サイクルは、３つの工程から構成される。すなわち、凍結、一次乾燥、および２次乾燥である。最初にバイアルを−５０℃に冷却して製品を凍結させる。続いて、一次乾燥を−２５℃で３０時間、また真空度１００ｍｔｏｒｒでおこなった。つぎに、第２の乾燥を２０℃、１２時間、また真空度１００ｍｔｏｒｒで実施した。凍結乾燥完了後、保存温度を４℃に下げ、凍結乾燥チェンバー内に窒素を流入させて真空状態を解き放した。１２ｐｓｉ窒素圧で、バイアルを栓でふさいだ。これらのバイアルを凍結乾燥器から取り出し、１３ｍｍフリップ・オフ・アルミニウム・シールでクリンピングした。
【００６６】
（実施例１Ａ）
（ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩のダイアフィルトレーション）
ａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液は、ダイアフィルトレーションの前にａｌａ−ＴＦＰＩバルク（２Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）へポリリン酸塩を添加することによって調製された。その後、この混合物を水または緩衝剤に対してダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション中、尿素を６Ｍで用いることで、緩衝剤交換プロセス中でのタンパク質の可溶性を保った。
【００６７】
ダイアフィルトレーションしたａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液は、良好な安定性を示した。沈殿は、周囲温度での後の保存の間、観察されなかった。対照的に、バルク緩衝剤（２Ｍ尿素のみ含む）から直接調製したａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液は、その後の保存後、不安定性を示した。すなわち、周囲温度での保存１日を経過した後、沈殿の形成がみとめられた。したがって、６Ｍ尿素は、バルク緩衝剤から水／ポリリン酸緩衝剤への緩衝剤の移動の過程で、ａｌａ−ＴＦＰＩ可溶化を助ける。
【００６８】
（実施例１Ｂ）
（凍結誘導ａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿）
ダイアフィルトレーション処理ａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液は、凍結融解または周囲温度でのインキュベーションのいずれかに対して、不安定性を示した。可視沈殿物は、−７０℃からの凍結融解後、または周囲温度での保存過程で、表Ａに示すように、いくつかのａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液で見つかった。
【００６９】
（表Ａ）
【表Ａ】
2008500942.tif 000035
【００７０】
これらの結果は、ａｌａ−ＴＦＰＩ安定性が保存条件および製剤中の緩衝剤に影響されることを示す。クエン酸塩およびリン酸塩緩衝剤は、周囲温度保存および凍結保存の両方で、ａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿をしばしば生じた。−７０℃でｐＨが変化したかどうか判断するために、凍結状態のｐＨは、フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入したユニバーサル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ｐＨ溶液を使用して染料の色変化で測定された。
【００７１】
ａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液が、イオン強度およびｐＨの変化に非常に影響されるとわかった。酸またはＮａＣｌのいずれによって滴定することで、ＴＦＰＩがｐＨ５．８未満または８０ｍＭを上回るＮａＣｌのいずれかでａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液中でＴＦＰＩが急激に沈殿したことが示された。別の実験では、５ｍＭＮａＣｌほど低いＮａＣｌの添加後、周囲温度で、最終的にａｌａ−ＴＦＰＩの沈殿物が形成されることが示された。ＮａＣｌをさらに加えることで、沈殿がより速くなった。ａｌａ−ＴＦＰＩが凍結融解と同時に沈殿した理由として、ポリリン酸塩存在下でのｐＨおよび塩の変化に対するａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液の感受性が考えられる。クエン酸塩およびリン酸塩等の緩衝剤のｐＨは、緩衝剤系で異なる塩形態の部分的な沈殿のため、凍結と同時に減少する。おそらく、凍結で生ずるｐＨシフトおよび／または塩の濃縮は、ａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩とのあいだの相互作用を弱めてａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿を生ずる。同様に、周囲温度での塩の添加もまた、ａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩とのあいだの静電的相互作用を弱めてａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿を生ずる。
【００７２】
Ｌ−ヒスチジンは、凍結と同時にｐＨを安定化させるための有用な緩衝剤である。Ｌ−ヒスチジンも、溶液中に単一の中性形状もしくはプロトン化形状として存在する。したがって、それはａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩との相互作用に、最小限の影響を及ぼすはずである。
【００７３】
（実施例２）
（ａｌａ−ＴＦＰＩ水溶性組成物の安定性）
ａｌａ−ＴＦＰＩ水性製剤の長期安定性を測定するために、ａｌａ−ＴＦＰＩの凝集を高温で調べた。ａｌａ−ＴＦＰＩ試料（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート−８０、および１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７で処方）を種々の時間で４０℃で保存した。保存時間の増加にともなって試料の混濁が生じ、目視可能な沈殿物の形成が示された。０．２μｍフィルターによる濾過後、可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩを上記のように陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によって分析した。図１は、これらの試料のＣＥＸ−ＨＰＬＣのクロマトグラムである。図１のクロマトグラムは、単一タンパク質ピークが１８分で溶出したことを示す。このピークは、ａｌａ−ＴＦＰＩモノマーである。
【００７４】
図１のクロマトグラムで、ピーク下の面積を計算することによってａｌａ−ＴＦＰＩ濃度を算出した。ピーク面積の減少が観察され、これらの試料で可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの損失が示された。ピーク面積対保存時間の一つの指数関数当て嵌めを、可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩ損失の計算に用いた。算出された速度定数を、標準の一次反応速度式を使用して、保存寿命ｔ９０（可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩポリペプチドの１０％の損失と考えられる時間））に変換した（Ｃａｎｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，  ｅｄｓ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  １９８０）。同様に、保存寿命の算出は、プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイで測定される生物活性データを使用しておこなった。可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩに関する保存寿命は、生物活性に関する保存寿命（表１）と十分一致していた。可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの損失が生物活性の減少と平行していることから、凝集は最も可能性のある不活化経路であると考えられた。
【００７５】
（表１）
【００７６】
【表１】
2008500942.tif 000036
凝集形成を減少させ、それによってａｌａ−ＴＦＰＩ水性製剤の長期安定性を高めるために、ｐＨ安定性の研究をおこなった。ａｌａ−ＴＦＰＩを、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート−８０、および１０ｍＭリン酸ナトリウムで調製し、該製剤のｐＨをＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって４ないし９の異なる値に調整した。４０℃で保存後、これらの試料での可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの損失をＣＥＸ−ＨＰＬＣで測定した。図２は、ｐＨの関数としての可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩ損失の一次反応定数をプロットしたものである。ｐＨ６を下回ると凝集速度が遅くなり、塩基性のｐＨではかなり速くなる。したがって、ａｌａ−ＴＦＰＩ凝集は塩基で触媒されるものであった。
【００７７】
凝集反応がｐＨ  ６未満で最小化されたにもかかわらず、新たな崩壊反応が酸性ｐＨ条件で観察された。ａｌａ−ＴＦＰＩのより小さな２つの種が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（データ不図示）によって検出された。遅く溶出する種も、ＣＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラム（図３）上で、ｐＨ  ４で観察された。この種は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出される分解産物に対応しているように思われた。図３は、４０℃、酸性条件下で、ａｌａ−ＴＦＰＩをより長くインキュベートして現れた新たな種と、１８分で溶出している単量体ａｌａ−ＴＦＰＩとを示す。したがって、単量体ａｌａ−ＴＦＰＩ種がインキュベーション時間にともなって減少し、遅く溶出するピークが、おそらく増加するａｌａ−ＴＦＰＩを分解した。
【００７８】
ａｌａ−ＴＦＰＩの分解が酸加水分解によって触媒されたかどうか決定するために、異なるｐＨでａｌａ−ＴＦＰＩ試料をＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析にかけた。切断率は、高ｐＨ条件でより遅くなった（図４）。４０℃で１０日間保存した後、ＴＦＰＩの切断はｐＨがｐＨ４に減少するのにともなって増加した。したがって、ａｌａ−ＴＦＰＩの分解はポリペプチド内のペプチド結合が酸加水分解することによる。
【００７９】
前の２つの研究結果にもとづいて、さらにスクリーニングにかけている製剤は、約ｐＨ６に焦点を置いた。表１に挙げられた他の１１種類の製剤の安定性促進について評価した。試料を４０℃に保存し、可溶性の損失についてはＣＥＸ−ＨＰＬＣＶ分析によって、また生物活性の損失についてはＰＴアッセイにかけた。陽イオン交換ＨＰＬＣで測定される保存寿命（ｔ９０）が１日から２週間以上に及ぶことがわかり、またＰＴアッセイでは約１日から約８日に及ぶことがわかった。アレニウス（Ａｒｒｅｈｎｉｕｓ）分析は、それら４０℃データを用いておこなった。１０ｋｃａｌ／ｍｏｌの活性化エネルギー（凝集反応のための合理的な見積である）を仮定した。結果は、これらの水性製剤のＴＦＰＩがより長い期間（例えば１８〜２４ヵ月）に対しては安定していないことを示唆している。
【００８０】
（実施例３）
（ａｌａ−ＴＦＰＩの水性製剤に対するポリリン酸塩の安定化効果）
ａｌａ−ＴＦＰＩ製剤に対するポリリン酸塩の安定化効果を評価した。ポリリン酸塩は、ａｌａ−ＴＦＰＩに結合し、高次構造的にそれを安定させる。ポリリン酸塩による安定化を、２：１、６：１、および８：１のａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩の重量比で調べた。製剤の調製は、１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ７）における各ａｌａ−ＴＦＰＩ：ポリリン酸塩比でおこなった。また、ａｌａ−ＴＦＰＩ安定性に対するヒスチジンの効果を評価するために、水のみをもちいてａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩重量比（８：１）を設定した。さらに別の製剤では、ｐＨ６．５の１０ｍＭヒスチジンにより、ａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩重量比（８：１）を設定し、ａｌａ−ＴＦＰＩ安定性に対するｐＨの効果を評価した。
【００８１】
塩および他の荷電イオンがａｌａ−ＴＦＰＩ−ポリリン酸塩結合に干渉し得ることから、単糖および二糖類（例えば、マンニトール、ショ糖、およびソルビトール）がＴＦＰＩ製剤に用いられた。単糖または二糖類を含む製剤は、ａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩重量比８：１で調製した（製剤については表２を参照）。最後に、いくつかの高濃度ａｌａ−ＴＦＰＩ試料をセットアップしてそのような濃度でのＴＦＰＩ安定性を評価した。これらのａｌａ−ＴＦＰＩ製剤の安定性を３０℃および４０℃で検討した。バイアルは、あらかじめ選択された時点で取り出し、０．２２μｍフイルターで濾過し、沈殿物を除去した。濾過されたａｌａ−ＴＦＰＩ試料を、分解および吸収帯強度についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、可溶性の損失について上記したように逆相ＨＰＬＣによって、さらに生物活性の損失について上記したようにＰＴアッセイによって、続けて分析した。
【００８２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、ａｌａ−ＴＦＰＩの切断を示さなかったが、３ヵ月間４０℃に保存される製剤で吸収帯強度が減少することを示した。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析の結果を図５に示した。図５は、４０℃または３０℃でインキュベートし、３ヵ月間−７０℃で凍結した水溶性ポリリン酸塩製剤のクロマトグラムを示す。おおよそ１２．２分で溶出したａｌａ−ＴＦＰＩと、主要な種の前後いずれかにマイナーな種が溶出した。高温（３０℃または４０℃）でインキュベーションすると、試料中に目視可能な沈殿が生じた。目視可能な沈殿物を０．２２μｍフィルターで濾過することができ、それなりに、クロマトグラムは新たな種の出現なしにピーク面積の減少を示した。結果は、３０℃または４０℃での保存時の凝集によりａｌａ−ＴＦＰＩが損失したことを示している。
【００８３】
高温でのインキュベーション中に生ずる凝集は、６を超えるｐＨにおけるａｌａ−ＴＦＰＩの主要な分解経路として確認された。ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（図５）上でピーク面積を計算することによって、可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの濃度を算出した。残留する可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの比率を算出するために、これらのデータを、−７０℃保存した同一の製剤に対するデータに対して正規化した。結果を表２に示す。製剤１は水のみを含み、１０ｍＭヒスチジンによる対応の製剤（製剤２）よりも安定していた。３０℃では、ヒスチジンの有無により観察された試料で、残留可溶性タンパク質に１５％の違いがあった。３０℃データは、ヒスチジンによる明らかな安定性の減少が、マンニトールおよび／またはショ糖の添加（製剤４、５、および７）によって補正され得ることを示した。マンニトールおよびショ糖は、ヒスチジン存在下でａｌａ−ＴＦＰＩに対する弱い安定剤である。ａｌａ−ＴＦＰＩとヒスチジンとａｌａ−ＴＦＰＩとマンニトールまたはショ糖とのあいだの相互作用は、相加的であると思われる（（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ８５：４１９−４２２，  １９９６）。
【００８４】
（表２）
【００８５】
【表２】
2008500942.tif 000037
ａｌａ−ＴＦＰＩ−ポリリン酸塩製剤の安定性は、ｐＨ依存度が高い。表２の３０℃データは、ｐＨが７から６．５に変化した場合、ａｌａ−ＴＦＰＩ安定性が１／２に減少したことを示している（製剤２および３）。また、ポリリン酸塩製剤でのａｌａ−ＴＦＰＩ安定性は、ａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩の比に依存している。表２の４０℃データは、ａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩の比が８：１から６：１、２：１に変化した場合に残留可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩ率が０．９、２．７、および６．３になることを示している（製剤２、８、および９）。したがって、ａｌａ−ＴＦＰＩは、ａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩の重量比が２：１のときに最も安定である。
【００８６】
３０℃データは、ポリリン酸塩製剤（製剤１〜９）と高濃度ａｌａ−ＴＦＰＩ製剤（製剤１０および１１）とのあいだの安定性の差がほとんどないことを示している。４０℃データは、高濃度ＴＦＰＩ製剤（製剤１０および１１）がＴＦＰＩポリリン酸塩製剤に比べて、より安定していることを示している。３ヶ月保存後、ポリリン酸塩製剤（製剤１〜９）が１０％ＴＦＰＩ未満を残すだけであり、製剤１０および１１の残留ＴＦＰＩは４０％を上回る。したがって、長期安定性（例えば１８〜２３ヶ月におよぶ）を達成する代替方法は、高濃度ＴＦＰＩ製剤を用いることである。
【００８７】
（実施例４）
（凍結融解サイクルでのａｌａ−ＴＦＰＩの安定性）
ａｌａ−ＴＦＰＩ製剤を−７０℃で保存できるかどうかを決定するために、ａｌａ−ＴＦＰＩ−ポリリン酸塩（６：１ｗ／ｗ）製剤（表３）を凍結融解サイクルにかけた。表３に示すように、−７０℃で凍結し融解した後、目視可能な沈殿物がいくつかのａｌａ−ＴＦＰＩ−ポリリン酸塩製剤で見られた。結果は、クエン酸塩およびリン酸塩緩衝剤が周囲温度保存および−７０℃保存の両方でＴＦＰＩ沈殿を生じ得ることを示す。
【００８８】
（表３）
【００８９】
【表３】
2008500942.tif 000038
−７０℃でｐＨが変化したかどうか判断するために、凍結状態のｐＨを、フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入したユニバーサル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ｐＨ溶液を使用して染料の色変化で測定した。ａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩溶液が、イオン強度およびｐＨの変化に対して非常に感度が高かった。ａｌａ−ＴＦＰＩは、ｐＨ５．８未満または８０ｍＭを上回るＮａＣｌのいずれかでａｌａ−ＴＦＰＩ−ポリリン酸塩製剤に処方された場合に、急激に沈殿した。ａｌａ−ＴＦＰＩは、ａｌａ−ＴＦＰＩ−ポリリン酸塩製剤への５ｍＭＮａＣｌほど低い濃度のＮａＣｌの添加後、周囲温度で、最終的に沈殿物を形成した。ＮａＣｌをさらに加えることで、沈殿がより速くなった。ａｌａ−ＴＦＰＩが凍結融解の過程で沈殿した理由として、ｐＨおよび塩の変化に対するａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩製剤の感受性が考えられる。クエン酸塩およびリン酸塩等の緩衝剤のｐＨは、緩衝剤系を作る異なる塩形態の部分的な沈殿のため、凍結と同時に減少する。凍結と同時に起こるｐＨまたは塩濃度の変化は、ａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩との相互作用を弱めることができる。その相互作用が弱められることで、ａｌａ−ＴＦＰＩの沈殿が生じ得る。同様に、周囲温度での塩の添加もまた、ａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩とのあいだの静電的相互作用を弱めてａｌａ−ＴＦＰＩ沈殿を生ずる。
【００９０】
試験した緩衝剤の種類のなかで、Ｌ−ヒスチジンは凍結と同時にｐＨを最も安定化させた。Ｌ−ヒスチジンも、溶液中に単一の中性形状もしくはプロトン化形状として存在する。したがって、それはａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩との相互作用に、最小限の影響を及ぼさなければならないことから、好ましい緩衝剤である。
【００９１】
（実施例５）
（凍結乾燥ａｌａ−ＴＦＰＩ製剤の開発）
（初期製剤スクリーニング）
凍結乾燥のための製剤のスクリーニングは、表４に示した１８種類の製剤を用いた。製剤成分の選択は、（１）溶質（例えばＬ−アルギニン、クエン酸塩、Ｌ−ヒスチジン、イミダゾール、およびポリリン酸塩）のａｌａ−ＴＦＰＩに対する可溶化効果、（２）凍結乾燥タンパク質を安定化させるガラスマトリックスを形成する溶質（例えば、ショ糖）の傾向、（３）結晶ケイク構造を形成する溶質（例えば、マンニトールおよびグリシン）の能力にもとづいておこなわれた。ほとんどの製剤は、等張液よりもほぼ２倍である製剤２、３、および４を除いて、等張性に近い容量オスモル濃度を持つ。
【００９２】
（表４）
【００９３】
【表４】
2008500942.tif 000039
凍結乾燥産物の目視可能な特性を、フリーズ・ドライ（凍結乾燥）後、検討した。ケイク形態の評価は、目視によりおこなった。結果を表５に示す。収縮または崩壊がほとんどないケイクは、「良好な」ケイク形態を保持すると考えられた。製剤１０、１２、１３、１６、および１７は良好なケイク形態を示した。もちろん、結晶形成剤として、４種類がマンニトールを含み、１種類がグリシンを含んでいた。
【００９４】
（表５）
【００９５】
【表５】
2008500942.tif 000040
残留水分は、乾燥状態にあるタンパク質を保存する上で決定要因の一つである。残留水分が１％（ｗ／ｗ）未満であることが好ましい。１３種類の製剤に対して、カール・フィッシャー（Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）滴定法（Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍｉｅ  ４８：３９４  （１９３５））で残留水分含有量を測定した。その結果を表５に示す。製剤９、１０、１２、１３、および１５は、残留水分が１％（ｗ／ｗ）未満であり、また製剤１ないし８は残留水分が１％（ｗ／ｗ）を上回った。
【００９６】
凍結乾燥組成物の再構成は、１ｍｌの「注射用水（Ｗａｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）」（ＷＦＩ）（すなわち、ヒト患者への注射についてＦＤＡによって承認されている水）を添加することによっておこなった。大部分の凍結乾燥組成物が１分以内に溶け、上記１８の再構成製剤のうち１６が透明であった（表５）。再構成製剤９および１０は混濁していた（表５）。このことは、凍結乾燥の過程でこれら２つの製剤でａｌａ−ＴＦＰＩ凝縮が生じたことを示唆している。
【００９７】
再構成された製剤１〜９および１３〜１８もまた、生物活性についてはＰＴアッセイで、また可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの喪失についてはＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析によって、分析した。結果を表５に示す。製剤１０、１１、および１２はこの分析には含まれなかった。なぜなら、これらの製剤のポリリン酸塩は陽イオン交換ＨＰＬＣおよびＰＴアッセイによる干渉を受けたからである。
【００９８】
ＲＴアッセイの結果は、試験した１５の製剤全てが生物学的活性を有し、また非凍結乾燥水性対照群と見分けがつかなかったことを示した。したがって、これらの製剤に含まれるａｌａ−ＴＦＰＩは、凍結乾燥によるストレスに対して特に感受性があるわけではなかった。
【００９９】
可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの濃度をＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析によって測定したところ、凍結乾燥試料と水性対照群との差は１０％未満であった。ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度の微妙な変化は、再構成の過程での小さな変化によって最も起こりやすかった。製剤１３を例に挙げれば、５％容量増加が注射用水による再構成の際に生じた。
【０１００】
（長期保存安定性）
１０個の凍結乾燥組成物（表５の１、２、４、５、および１３〜１８）の長期保存安定性について検討した。これらの製剤の試料を異なる温度で保存し、崩壊分析のために所定の時間間隔で取り出した。
【０１０１】
最初に、凍結乾燥組成物での凝集の度合いを調べた。可溶性タンパク質の損失をＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析によって測定した。最大で３ヶ月間、４０℃または５０℃のいずれかで保存した試料について得られた結果を、表６に示す。ａｌａ−ＴＦＰＩはこれらの製剤ではかなり安定であった。凍結乾燥組成物の生物活性をＰＴアッセイによって測定し、表６に示す。４０℃または５０℃で最大３ヶ月保存した試料は、再構成に対して初期の生物活性の約４０〜１００％を保持した（表６）。
【０１０２】
（表６）
【０１０３】
【表６】
2008500942.tif 000041
＊製剤の定義については表４を参照のこと。
【０１０４】
先に述べたように、陽イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、サイズ除外ＨＰＬＣによる分析を目的として、製剤１３の選択をおこなった。図６は、３ヶ月にわたって異なる温度で保存されたこの製剤の試料に対するＣＥＸ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＳＥＣ−ＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【０１０５】
ａｌａ−ＴＦＰＩは、保持時間約１８分のシグナル・ピークとしてＣＥＸ−ＨＰＬＣから溶出した。ＣＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラム上のこのシグナル・ピークのプロフィールは、この製剤に関して全ての保存温度に対して不変のままであった（図６Ａ）。
【０１０６】
ａｌａ−ＴＦＰＩの溶離ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールは、かなり複雑だった。主要なａｌａ−ＴＦＰＩ種は１９分で溶出し、２つの酸化されたａｌａ−ＴＦＰＩ種はわずか速く溶出し、いくつかのマイナーなアセチル化ＴＦＰＩ種はゆっくりと溶出した。図６Ｂに示すように、この溶出プロフィールもまた、種々の温度で３ヶ月にわたって保存される凍結乾燥ａｌａ−ＴＦＰＩの試料として観察された。
【０１０７】
種々の温度で保存した凍結乾燥ａｌａ−ＴＦＰＩサンプルのサイズ除外ＨＰＬＣ溶出プロフィールは、保存後、基本的に不変であった。８．２５分で溶出する単量体種および１１分頃に溶出される緩衝剤種について検出された変化は無かった。５０℃の試料は緩衝剤ピークにいくつかの変化を示した（図６Ｃ）。しかし、この変化は高温でのヒスチジン成分の酸化によって引き起こされたと思われる。
【０１０８】
促進的な安定性試験が製剤間での違いを示したにもかかわらず、２〜８℃で６ヶ月保存された異なる成分のリアルタイム安定性検査では陽イオン交換ＨＰＬＣ分析よる検出可能な変化は見られなかった。図７は、２〜８℃または５０℃のいずれかで６ヶ月にわたる保存後、５つの製剤の試料に対するＣＥＸ−ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。広範囲な分解が５０℃保存の試料のいくつか（例えば、製剤４および１７）で観察されたにもかかわらず、２〜８℃で保存された５つの試料では何ら変化が検出されなかった。
【０１０９】
ａｌａ−ＴＦＰＩの凝集は、目視可能な沈殿を生ずる。この沈殿は０．２２μｍフィルターで取り除くことが可能である。したがって、元のピークの積分面積（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｒｅａ）の減少がＨＰＬＣクロマトグラム上に観察された。凝集以外の著しい変化は、これらのＨＰＬＣクロマトグラム上に検出されなかった。同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分解種はなんら観察されなかった。したがって、凝集は、凍結乾燥状態にあるこのタンパク質の主要な分解経路であった。
【０１１０】
（実施例６）
（凍結乾燥ａｌａ−ＴＦＰＩの安定性に対する緩衝剤種、ｐＨ、およびａｌａ−ＴＦＰＩ濃度の効果）
凍結乾燥ａｌａ−ＴＦＰＩ組成物の安定性に対する緩衝剤種、ｐＨ、およびａｌａ−ＴＦＰＩ濃度の効果について調べた。緩衝剤種（Ｌ−ヒスチジン、クエン酸塩、およびイミダゾールを含む）を、１０ｍＭ緩衝剤および４％（ｗ／ｖ）マンニトールを含む製剤においてｐＨ６．５で比較した。表７は、４０℃または５０℃のいずれかで５週間にわたって保存した資料に対するＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析よって測定された可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの損失を示す。図７に示すように、Ｌ−ヒスチジンは可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの保存にとって最高の緩衝剤種であり、その後にクエン酸塩が続いた。例えば、５０℃での５週保存後にもかかわらず残っている可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの分画は、Ｌ−ヒスチジン、クエン酸塩、およびイミダゾールについて、それぞれ９５％、４１％、および１０％であった。このことは、この研究に用いた特定の凍結乾燥条件下でガラスを形成する傾向の順序と相関する。
【０１１１】
（表７）
【０１１２】
【表７】
2008500942.tif 000042
別々の実験では、クエン酸塩およびリン酸塩の効果を、１０ｍＭ緩衝剤（ｐＨ  ６．０）、３％（ｗ／ｖ）Ｌ−アルギニン、および４％（ｗ／ｖ）マンニトールを含む２つの製剤で比較した。クエン酸塩は、ａｌａ−ＴＦＰＩ安定性を保存する上でリン酸塩よりも優れていた（図７）。
【０１１３】
凍結乾燥されたａｌａ−ＴＦＰＩの安定性に対するｐＨの効果を、製剤１３（表４）を使用して試験した。試験したｐＨ範囲は、ｐＨ  ６．５からｐＨ  ５．５までの狭い範囲であった。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析とＰＴアッセイとの結果を表７に示した。試験したｐＨ値の範囲について安定性にわずかな差があった。低ｐＨ値（ｐＨ５．５）は、ｐＨ６．０またはｐＨ６．５よりも凍結乾燥ａｌａ−ＴＦＰＩの安定性が高かった。
【０１１４】
製剤１３でのａｌａ−ＴＦＰＩの安定性を、１００μｇ／ｍｌないし１，５００μｇ／ｍｌの範囲のタンパク質濃度で調べた。表８は、５０℃で保存した試料と２〜８℃で保存した試料とのあいだのタンパク質濃度の違いを示す。高濃度のＴＦＰＩを含む試料は、わずかながら、ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度が低い試料よりもわずかながら安定しており、５０℃でのａｌａ−ＴＦＰＩの損失がより少なかった。ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度が２５０μｇ／ｍｌを下回った場合にだけ、還元型の安定性が著しくなった。
【０１１５】
（表８）
【０１１６】
【表８】
2008500942.tif 000043
（実施例７）
（ａｌａ−ＴＦＰＩの凍結乾燥組成物に対するポリリン酸塩の安定化効果）
これらの研究では、ａｌａ−ＴＦＰＩとポリリン酸塩との重量比２：１、６：１、および８：１を、ＴＦＰＩの凍結乾燥組成物を安定化させるポリリン酸塩の能力について、試験した。緩衝剤（例えば、１０ｍＭヒスチジンおよび１０ｍＭイミダゾール）を製剤に添加してｐＨを７に維持した。マンニトールおよびショ糖を特定の製剤に添加してケイク強度を高めるとともに安定性を強化した。ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度は、凍結乾燥に先立って製剤中２０ｍｇ／ｍｌに調製した。
【０１１７】
残留含水量およびケイク形態の結果を表９に示す。６つの製剤全てが１／２を下回る残留水分率を示す。ポリリン酸塩それ自体は、凍結乾燥にとって良好な薬剤と考えられ、なんら他の添加剤を必要とすることなくケイクをわずかながら収縮させる。ヒスチジンの添加によって、ケイク形態に対するさらなる改善は観察されなかった。しかし、製剤へのマンニトールおよびショ糖の添加によってケイク形態が改善された。後の実験では、４％（ｗ／ｖ）マンニトール単独による２：１の重量比でのａｌａ−ＴＦＰＩ−ポリリン酸塩製剤の乾燥凍結もまた、良好なケイク構造を生じた。したがって、マンニトールは製品をエレガンスなものにするために良好な結晶血清剤であることがわかった。
【０１１８】
（表９）
【０１１９】
【表９】
2008500942.tif 000044
促進的な安定性試験を、４０℃および５０℃で実施した。試験される試料の典型的ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを図８に示した。水性製剤と同様に、高温で保存される間、凝集によるａｌａ−ＴＦＰＩの損失が観察され、クロマトグラム上のピーク面積の減少をもたらした。
【０１２０】
試験される試料でａｌａ−ＴＦＰＩの損失を示しているＲＰ−ＨＰＬＣ分析の結果を表１０に示した。表１０に示す全ての製剤が水性高濃度製剤単独よりも安定していた。４０℃での３ヶ月保存後、水性製剤試料は、ＰＲ−ＨＰＬＣによれば可溶性ＴＦＰＩが５０％以下であり（表２）、一方全ての凍結乾燥製剤が含む可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩが８０％を上回った。
【０１２１】
（表１０）
【０１２２】
【表１０】
2008500942.tif 000045
表１０に示す６つの製剤のなかで、ａｌａ−ＴＦＰＩ対ポリリン酸塩比が２：１である製剤が最良のａｌａ−ＴＦＰＩ安定性を示した。５０℃で３ヶ月保存後、この製剤はＲＰ−ＨＰＬＣによる５６％可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩをなおも含んでいたが、他の製剤ではほぼ完全に分解された。この製剤の５０℃での分解カイネティクスを高濃度製剤と比較したものを図９に示す。凍結乾燥製剤は、この促進的な安定性試験で試験したように、水性製剤よりも安定性が約１０倍高かった。
【０１２３】
示差走査熱量（ＤＳＣ）測定によって、ヒスチジン／マンニトール／ショ糖製剤に含まれるポリリン酸塩のガラス転移点（Ｔｇ）は約−２８℃であることがわかった。製品温度が−２８℃未満であったことから、図１０に示すように最初の１１時間の初期乾燥中、ポリリン酸塩は、好ましくは凍結乾燥されると直ちにガラスを形成した。したがって、凍結乾燥された形状であるａｌａ−ＴＦＰＩに対して提供されたポリリン酸塩の安定化は、なおもガラス安定化理論に従うことができ、該理論は強固なガラスが崩壊反応を除去する分子の拡散を著しく減らすことを述べる。
【０１２４】
ショ糖もまた、Ｔｇが約−３２℃である良好なガラス形成剤であることから、ガラスを形成することでポリリン酸塩が単独でａｌａ−ＴＦＰＩを安定化できるかどうかを調べることが、興味深かった。別の実験では、２つの製剤（２０ｍｇ／ｍｌ  ａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍｇ／ｍｌポリリン酸塩、１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン（ｐＨ７）、および４％マンニトールを含み、１％ショ糖を含むものと含まないものとからなる）を調製して凍結乾燥した。両方の製剤とも類似のケイク形態と低残留水分量（１％ショ糖無しの場合０．６９％、１％ショ糖を含む場合、０．４９％）とを示した。ショ糖は、凍結乾燥のあいだ、ＴＦＰＩに対してほとんど影響を及ぼさないようである。
【０１２５】
これらの２つの製剤の安定性を、高温での保存に対してＲＰ−ＨＰＬＣによるタンパク質濃度およびＰＴアッセイによる生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）比活性の両方の減少を試験することで、比較した。表１１に示すように、これらの２つの製剤についての安定性の違いは、意味がない。これらの製剤は両方とも、６０℃、二週間にわたる保存の後、ａｌａ−ＴＦＰＩが２％損失したことが示された。５０℃で４週間、ショ糖を含む製剤およびショ糖を含まない製剤は、それぞれａｌａ−ＴＦＰＩ損失が１２％および１８％であった。また、５０℃で４週間のこれら２つの製剤の比活性を比較した。
【０１２６】
（表１１）
【０１２７】
【表１１】
2008500942.tif 000046
（実施例８）
（凍結乾燥のためのａｌａ−ＴＦＰＩ製剤の調製）
ａｌａ−ＴＦＰＩ製剤の製造は、しばしば緩衝剤交換プロセスを必要とする。バルクａｌａ−ＴＦＰＩは、例えば、１０ｍｇ／ｍｌタンパク質、２Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むものであってもよい。凍結乾燥された製剤は、通常、尿素またはＮａＣｌを含まない。尿素含有バルク由来のａｌａ−ＴＦＰＩを製剤緩衝剤（表４）のなかへ処理するために、尿素およびＮａＣｌを緩衝剤交換方法（例えば、透析、ゲル濾過、またはダイアフィルトレーション）によって取り除く必要がある。これらの方法のなかで、ダイアフィルトレーションは製造の観点から好ましい。なぜなら、大量のａｌａ−ＴＦＰＩが製造に関わっているからである。
【０１２８】
（一工程ダイアフィルトレーション）
いくつかのｐＨ６または６．５製剤緩衝剤に対して直接入れられるａｌａ−ＴＦＰＩバルク（例えば、１０ｍｇ／ｍｌタンパク質、２Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）のダイアフィルトレーションは、広範なタンパク質沈殿をもたらした。表１２に示すように、ｐＨ６または６．５のいずれかによる４種類の緩衝剤へのダイアフィルタレーションによって、混濁状溶液または低収率のいずれかが得られた。しかし、１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸塩、４％（ｗ／ｖ）マンニトール、および１％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むｐＨ４緩衝剤へのダイアフィルトレーションによって、高収率で透明溶液が得られた。
【０１２９】
（表１２）
【０１３０】
【表１２】
2008500942.tif 000047
ダイアフィルトレーションで使用されるａｌａ−ＴＦＰＩ濃度（１ｍｇ／ｍｌ）は、出発緩衝剤と最終製剤緩衝剤との両方の溶解限度（５−１０ｍｇ／ｍｌの溶解度）よりもかなり低かった。これらの２つの緩衝剤系は、明らかに２つの異なる機構でａｌａ−ＴＦＰＩを可溶化する。開始緩衝剤は尿素および塩を含みイオン強度が比較的高く、一方製剤緩衝剤のいくつかはイオン強度が低い。ダイアフィルトレーションは、比較的遅いプロセスである。バルク緩衝剤の尿素および塩が徐々にダイアフィルトレーションによって取り出され、製剤緩衝液成分は徐々にダイアフィルトレーションによって取り込まれる。ダイアフィルトレーションの過程で、ａｌａ−ＴＦＰＩ可溶性またはａｌａ−ＴＦＰＩ安定性のいずれかに影響を及ぼす一時的な溶媒条件をａｌａ−ＴＦＰＩが経験することができる。
【０１３１】
本発明者らは、緩衝剤交換の各容量で、ダイアフィルトレーション容器でのａｌａ−ＴＦＰＩ製剤の混濁度変化を調べた。出発製剤は、１ないし１．５ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩを含む１Ｍ尿素、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、および１２５ｍＭ  ＮａＣｌである。結果を表１３に示す。
【０１３２】
（表１３）
【０１３３】
【表１３】
2008500942.tif 000048
＊「＋」は、わずかに混濁した溶液を示し、「＋＋」は混濁溶液を示し、さらに「−」は透明な溶液を示す。
【０１３４】
ｐＨ４でダイアフィルトレーションしたＡｌａ−ＴＦＰＩは、第１または第２の容量の緩衝剤交換での混濁度の一次的変化を示した。すなわち、それは透明になり、ダイアフィルトレーションの最後までそのまま残った。酢酸ナトリウムｐＨ５．５緩衝剤を用いて、混濁度の変化が１、２、および５容量の緩衝剤交換で観察された。ｐＨ６またはｐＨ６．５を用いたダイアフィルトレーションは、３％（ｗ／ｖ）Ｌ−アルギニンを含む溶液を除いて、ダイアフィルトレーションの後期で混濁溶液を生じた。したがって、低ｐＨとＬ−アルギニンとがダイアフィルトレーション中にａｌａ−ＴＦＰＩが沈殿するのを防いだ。
【０１３５】
（２工程ダイアフィルトレーション）
ダイアフィルトレーション中のａｌａ−ＴＦＰＩの沈殿を、ｐＨが約４である緩衝剤を用いることによって防ぐことができる。ｐＨが約４である緩衝剤がバルク緩衝剤と最終製剤緩衝剤との間の橋渡しとして役立つかどうかについて調べるために、二工程のダイアフィルトレーション実験をおこなった。第１の工程で、４容量の緩衝剤交換のためのｐＨ４緩衝剤に対して、ＴＦＰＩをダイアフィルトレーションした。第２の工程では、ダイアフィルトレーション緩衝剤が製剤緩衝剤に切り替えられ、６容量の緩衝剤交換が実行された。いくつかの２工程ダイアフィルトレーション緩衝剤系でのダイアフィルトレーション中での混濁度の変化を記録して表１４に示した。
【０１３６】
ｐＨ４緩衝剤は、好ましくはＬ−グルタミン酸塩緩衝剤である。
グルタミン酸塩緩衝剤による４通りの容量変化の後、適当な溶解剤による所望の最終産物緩衝剤は、第２の工程として導入される。この過程は、処理の間、生じたタンパク質のかなり少ない損失で、透明な配合最終産物を産生する。
【０１３７】
一実施形態では、上記出発溶液は、１ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＥを含む１Ｍ尿素、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７）であり、最初に４容量交換用のＬ−グルタミン酸塩緩衝剤（１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸／Ｌ−グルタミン酸塩、４％（ｗ／ｖ）マンニトール、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、ｐＨ４．０）によってダイアフィルトレーションをおこない（工程１）、つぎに追加の６容量交換のためのＬ−ヒスチジンもしくはイミダゾール緩衝剤によってダイアフィルトレーションをおこなった（工程２）。ダイアフィルトレーションした溶液の透明度を記録した。ダイアフィルトレーションした溶液を０．２２μｍフィルター・ユニットで濾過し、その濾過液のａｌａ−ＴＦＰＩ濃度を紫外線吸光度で測定してダイアフィルトレーション前の濃度を比較することで、再生を計算した。結果を表Ｂに示す。
【０１３８】
（表Ｂ）
【表Ｂ】
2008500942.tif 000049
【０１３９】
この手順を、適当な商業規模での治療的用途のためにＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の液体（または溶液）製剤の調製のために、用いることができる。
【０１４０】
（表１４）
【０１４１】
【表１４】
2008500942.tif 000050
＊「＋」は、わずかに混濁した溶液を示し、「＋＋」は混濁溶液を示し、さらに「−」は透明な溶液を示す。
【０１４２】
表１４に示すように、第１工程のダイアフィルトレーションが相対的に強イオン強度の緩衝剤（例えば１０ｍＭ  Ｌグルタミン酸塩、ｐＨ４，および１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いた場合、ダイアフィルトレーション中になんら一時的な混濁度変化が観察されなかった。しかし、ａｌａ−ＴＦＰＩが第２工程のダイアフィルトレーション（低イオン強度の緩衝剤を使用）で沈殿した。一方、第１工程のダイアフィルトレーションで低イオン強度緩衝剤（例えば、１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸塩、ｐＨ４、４％（ｗ／ｖ）マンニトール、および１％（ｗ／ｖ）ショ糖）を用いた場合、約１容量の緩衝剤交換で、ａｌａ−ＴＦＰＩ溶液が短い一時的な混濁工程を通過した後、なんら混濁度変化は観察されず、その後ダイアフィルトレーションの間、混濁度変化は検出されなかった。したがって、低イオン強度ｐＨ４緩衝剤を用いることで、２工程ダイアフィルトレーション・プロセスは透明な配合最終産物を産生する。
【０１４３】
（実施例９）
（５０℃促進化安定性アッセイ）
促進的な安定性テストを用いて、ａｌａ−ＴＦＰＩの種々の濃度の安定性を測定した。試料を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）および３００ｍＭアルギニンに調製した。Ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度は、約１ｍｇ／ｍｌから約７．４ｍｇ／ｍｌの範囲とした。水性試料を５０℃で最大約６ヶ月間インキュベートした。毎月、可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩ残留率を各濃度に対して測定した。可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの測定は、陽イオン交換ＨＰＬＣでおこなった。その結果を図１１に示す。図１１に示すように、ａｌａ−ＴＦＰＩは約４ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でわずかにより安定している。
【０１４４】
（実施例１０）
（生き残り研究）
マウスの盲腸結紮および穿刺研究をおこない、新たに調製された臨床等級ロットの組み換え型ａｌａ−ＴＦＰＩ（ｒＴＦＰＩ）（ＴＦＰＩ９２）と、部分的に脱アミド化および酸化された臨床等級材料（ＴＦＰＩ７８）とを比較した。このモデルは直接的な糞便汚染および盲腸壊死による多微生物性腹腔内および全身性感染を誘導し、密接に人間の腹腔内敗血症を模倣する（Ｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２９，  １３−１８，  ２００１）。
【０１４５】
両方のＴＦＰＩ標品の調製は、２００３年８月１３日出願の米国特許出願第６０／４９４，５４６号、２００３年１０月８日出願の米国特許出願第６０／５０９，２７７号、および２００３年１０月２０日出願の米国特許出願第６０／５１２，１９９号の記載通りにおこなった。これらの出願の各々の内容全体を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。ｒＴＦＰＩ７８、ｒＴＦＰＩ９２、または希釈剤対照群のいずれも、４８時間（ＳＱ  ｑ１２時間ｘ４用量）にわたる盲検形式で与えられた。外科的手技前およびその４８時間後に採血し、定量的菌血、内毒素、およびサイトカイン（腫瘍壊死因子アルファおよびインターロイキン‐６）のレベルを測定した。動物を毎日観察し、死亡が生じたらそれを記録した。全ての動物に対して、実験期間の終わりに、器官損傷および定量的細菌学を組織学的に明らかにするために剖検評価をおこなった。
【０１４６】
カプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存プロットを図１２に示す。部分的に酸化したもの（ｒＴＦＰＩの脱アミド化形態）を投与されたマウスと比較して、新たに調製されたｒＴＦＰＩを投与されたマウスは、生存上著しく有利であった。両方のｒＴＦＰＩ群は、希釈剤を投与された対照群のマウスよりも餌をよく食べた。予想通りに、見せかけの手術（疑似手術）をしたマウス（結紮および穿刺以外の盲端の識別による外科的処置）は、７日の研究期間を生き残った。２通りのｒＴＦＰＩ処置群間で、菌血症、内毒血症、またはサイトカイン産生の第２のエンドポイントに有意差が認められなかった。
【０１４７】
この研究によれば、ＴＦＰＩが細菌、内毒素、またはサイトカインの血中濃度によっては説明されない機構によって生存上の利点を提供しているように思われる。脱アミドされた酸化型のＴＦＰＩによって与えられる防御は、新たに調製されたＴＦＰＩよりも劣る。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、ｐＨ７で水性製剤に調製される試料の安定性を試験するために、ａｌａ−ＴＦＰＩの陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。水性製剤は、１５０μｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート−８０を含んだ。この水性製剤を、４０℃で０、３、５、１０、または２０日間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図２】図２は、水性製剤における４０℃でのｐＨの関数としての可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの損失に関する一次反応定数を示す。水性製剤は、１５０μｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート−８０を含んだ。
【図３】図３は、ｐＨ４で水性製剤に調製した試料の安定性を試験するためのａｌａ−ＴＦＰＩの陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。水性製剤は、１５０μｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート−８０を含んだ。水性製剤を、４０℃で０、３、５、１０、または２０日間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図４】図４は、種々のｐＨ値で水性製剤に調製される試料の安定性を試験するために、ａｌａ−ＴＦＰＩの陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。水性製剤は、１５０μｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート−８０を含んだ。水性製剤を、４０℃で１０日間保存した。ｐＨ値はｐＨ４、５、６、または７である（それぞれ上から下まで）。
【図５】図５は、ａｌａ−ＴＦＰＩ安定性に対するポリリン酸塩の効果について逆相高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。水性製剤は、５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（ｐＨ７）、および２．５ｍｇ／ｍｌのポリリン酸塩を含んだ。水性製剤を４０℃、３０℃または−７０℃で３ヶ月間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図６Ａ】図６Ａは、凍結乾燥組成物として調製したａｌａ−ＴＦＰＩ試料の陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー・クロマトグラムを示す。これらの凍結乾燥組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（ｐＨ６）、４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および１％（ｗ／ｖ）のショ糖を含んだ。凍結乾燥組成物を、５０℃、４０℃、３０℃、または−７０℃で３ヶ月間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、凍結乾燥組成物として調製したａｌａ−ＴＦＰＩ試料の逆相高速液体クロマトグラフィー・クロマトグラムを示す。これらの凍結乾燥組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（ｐＨ６）、４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および１％（ｗ／ｖ）のショ糖を含んだ。凍結乾燥組成物を、５０℃、４０℃、３０℃、または−７０℃で３ヶ月間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、凍結乾燥組成物として調製したａｌａ−ＴＦＰＩ試料のサイズ除外高速液体クロマトグラフィー・クロマトグラムを示す。これらの凍結乾燥組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（ｐＨ６）、４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および１％（ｗ／ｖ）のショ糖を含んだ。凍結乾燥組成物を、５０℃、４０℃、３０℃、または−７０℃で３ヶ月間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図７Ａ】図７Ａは、種々の凍結乾燥組成物として調製された試料（製剤２、４、１３、１５、および１７）の安定性を試験するためのａｌａ−ＴＦＰＩの陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。製剤の組成は表４を参照せよ。凍結乾燥組成物は５０℃で６ヶ月間保存した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、種々の凍結乾燥組成物として調製された試料（製剤２、４、１３、１５、および１７）の安定性を試験するためのａｌａ−ＴＦＰＩの陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。製剤の組成は表４を参照せよ。凍結乾燥組成物は２〜８℃で６ヶ月間保存した。
【図８】図８は、凍結乾燥組成物として調製される試料の安定性を試験するためのａｌａ−ＴＦＰＩの逆相高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。凍結乾燥組成物は、５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（ｐＨ７）４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、１％（ｗ／ｖ）のショ糖、および２．５ｍｇ／ｍｌのポリリン酸塩を含んだ。凍結乾燥組成物は、５０℃、４０℃、または−７０℃で３ヶ月間保存した（それぞれ上から下まで）。
【図９】図９は、高濃度のａｌａ−ＴＦＰＩ水性製剤と比較したａｌａ−ＴＦＰＩ凍結乾燥製剤の安定性比較を示す。このグラフでは、５０℃での保存後に残存する可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの比率が示されている。
【図１０】図１０は、ａｌａ−ＴＦＰＩと種々のポリリン酸塩製剤とを含む組成物の凍結乾燥のための温度記録を示す。実線は、凍結乾燥中の保存温度を示す。点線は、ａｌａ−ＴＦＰＩ／ポリリン酸塩製剤の平均温度であり、この製剤が入ったバイアル（５ｃｃ）に挿入された４本の温度プローブで測定した。
【図１１】図１１は、最大で６ヶ月間にわたり５０℃でインキュベートした後の可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩ残存率を示す。水性製剤は、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）および３００ｍＭアルギニン中に種々の量のａｌａ−ＴＦＰＩを含んだ。示した時間にわたる５０℃でのインキュベーション後、可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩを陽イオン交換ＨＰＬＣでアッセイし、溶液に残存する可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩ量を測定した。
【図１２】図１２は、カプラン・マイヤー生存プロットであり、Ｘ軸は生存、Ｙ軸は時間（ｈ）を表す。
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月15日(2006.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008500942000001.app
【国際調査報告】
2008500942.tif 000051
2008500942.tif 000052
2008500942.tif 000053