【事件の表示】
　特許第２７８１２７６号「マーカーとしての細胞表面レセプターの使用による真核細胞のマーキング方法」の請求項１ないし６に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７８１２７６号の請求項１ないし６に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第２７８１２７６号に係る発明についての出願は、１９９４年８月１１日（パリ条約による優先権主張１９９３年９月１日、イタリア国）を国際出願日とする出願であって、平成１０年５月１５日にその特許の設定登録がなされ、その後、ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフトより特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、訂正請求（後日取下げ）がなされた後、再度の取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１２年１２月６日に訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正請求
１．訂正の内容
(1)特許請求の範囲の請求項１に係る記載「自己移植及び／又は同種移植される細胞における使用のための、細胞表面レセプターをコードする核酸をその細胞内で発現させ、そしてその後に、その細胞表面においてそのレセプターを提示させることによる真核（哺乳類）細胞のマーキング方法であって、その表面に提示されたレセプターが、その結合性パートナーへの結合後に、いずれのシグナル伝達をももたらすことができないような方法でレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸を使用することを特徴とする方法。」を、「自己移植及び／又は同種移植される細胞における使用のための、細胞表面レセプターをコードする核酸をその細胞内で発現させ、そしてその後に、その細胞表面においてそのレセプターを提示させることによるヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞のマーキング方法であって、その表面に提示されたレセプターが、その結合性パートナーへの結合後に、いずれのシグナル伝達をももたらすことができないような方法でレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸を使用し、細胞内ドメインが全体的又は部分的に欠失又は修飾されたレセプターが、対応する生来のレセプターを通常発現しない形質導入されていない細胞と形質導入された細胞との区別をもたらすことを特徴とする方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。」と訂正する。
(2)特許請求の範囲の請求項２に係る記載「自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされた真核細胞のための選択マーカーとしてそのレセプターが使用されることができる方法で修飾された細胞表面レセプターを発現させ、そしてその細胞表面においてそのレセプターを提示させるための、細胞表面レセプターをコードし、そしてその中でその細胞内ドメインをコードする領域が、そのドメインがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的にもたらすことができないような方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸の使用方法。」を、「自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされたヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞のための選択マーカーとしてそのレセプターが使用されることができる方法で修飾された細胞表面レセプターを発現させ、そしてその細胞表面においてそのレセプターを提示させるための、細胞表面レセプターをコードし、そしてその中でその細胞内ドメインをコードする領域が、そのドメインがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的にもたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸の使用方法であって、細胞内ドメインが全体的又は部分的に欠失又は修飾されたレセプターが、対応する生来のレセプターを通常発現しない形質導入されていない細胞と形質導入された細胞との区別をもたらす、前記方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。」と訂正する。
(3)特許請求の範囲の請求項３に係る記載「自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされた細胞の免疫選択方法であって、そのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が、その表面に提示されたレセプターがその結合性パートナーへの結合後にいずれのシグナル伝達をももたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている細胞表面レセプターをコードする核酸をその細胞内に導入し、そのレセプターに特異的に結合するマークされた抗体と共にそれらの細胞をインキュベートすることによりトランスフェクトされた細胞を同定し、そしてその抗体／細胞複合体からの解裂によりそれらの細胞を回収することによる方法。」を、「自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされたヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞の免疫選択方法であって、そのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が、その表面に提示されたレセプターがその結合性パートナーへの結合後にいずれのシグナル伝達をももたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失され又は修飾されている細胞表面レセプターをコードする核酸をその細胞内に導入し、そのレセプターに特異的に結合するマークされた抗体と共にそれらの細胞をインキュベートすることによりトランスフェクトされた細胞を同定し、そしてその抗体／細胞複合体からの解裂によりそれらの細胞を回収することによる方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。」と訂正する。
(4)特許請求の範囲の請求項４に係る記載「自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされた細胞の免疫分離方法であって、そのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が、その表面に提示されたレセプターがその結合性パートナーへの結合後にいずれのシグナル伝達をももたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている細胞表面レセプターをコードするDNAをその細胞内に導入し、インキュベーションの前又は後に固定化されたレセプターに対する抗体と共にそれらの細胞をインキュベートし、非結合細胞からその抗体により固定化された細胞を分離し、そしてその抗体−レセプター結合を解裂させることによりそれらの細胞を単離することによる方法。」を、「自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされたヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞の免疫分離方法であって、そのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が、その表面に提示されたレセプターがその結合性パートナーの結合後にいずれのシグナル伝達をももたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失され又は修飾されている細胞表面レセプターをコードするDNAをその細胞内に導入し、インキュベーションの前又は後に固定化されたレセプターに対する抗体と共にそれらの細胞をインキュベートし、非結合細胞からその抗体により固定化された細胞を分離し、そしてその抗体−レセプター結合を解裂させることによりそれらの細胞を単離することによる方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。」と訂正する。
(5)特許請求の範囲の請求項５に係る記載「それにより、その細胞調製物が実質的にクローン原性腫瘍細胞を含まない、自己移植及び／又は同種移植において使用される造血細胞調製物の生産方法であって、細胞毒性剤又は照射を用いてパージングし、細胞表面レセプターをコードし、そして好ましくはその中でその細胞内ドメインをコードする領域が、そのドメインがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的にもたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されていない核酸を用いてこれらの細胞を形質導入し、そして非形質導入細胞からその細胞表面レセプターによりマークされた形質導入細胞を分離することによる方法。」を、「その細胞調製物が実質的にクローン原性腫瘍細胞を含まない、自己移植及び／又は同種移植において使用される造血細胞調製物の生産方法であって、細胞毒性剤又は照射を用いてパージングし、細胞表面レセプターをコードし、そしてその中でその細胞内ドメインをコードする領域が、そのドメインがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的にもたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸を用いてこれらの細胞を形質導入し、そして非形質導入細胞からその細胞表面レセプターによりマークされた形質導入細胞を分離することによる方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。」と訂正する。
(6)明細書１７頁８行「もたらすことができる」を「もたらすことができない」に訂正する。
　
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　訂正事項(1)乃至(4)の、「真核（哺乳類）細胞」を「ヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞」とする訂正は、上位概念を下位概念のものに特定するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当し、訂正事項(1)及び(2)の「細胞内ドメインが全体的又は部分的に欠失又は修飾されたレセプターが、対応する生来のレセプターを通常発現しない形質導入されていない細胞と形質導入された細胞との区別をもたらす」とする訂正は、用途を限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当し、訂正事項(1)乃至(5)の「（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）」と訂正することは、訂正された請求項１乃至５に係る発明が、医師による又は医師の指示による医療行為を除くものであることを明らかにするものであり、訂正事項(5)の「それにより」及び「好ましくは」を削除することは、明りょうでない記載の釈明に該当し、また、「欠失又は修飾されている核酸」と訂正することは、「そのドメインがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的にもたらすことができない方法」との記載を踏まえると「欠失又は修飾されていない核酸」という記載は、技術的に誤りであることは明らかであるから、誤記の訂正に該当し、訂正事項(6)は、誤記の訂正に該当する。
　そして、上記いずれの訂正も新規事項に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　
３．独立特許要件
　後述の「III.３．判断 」の項に記載のように、訂正された請求項１乃至６に係る発明（以下、「本件発明１乃至６」という。）は、甲第１号証乃至甲第８号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえず、また、本件発明１，２，及び６は、甲第１号証乃至甲第２号証に記載された発明であるとはいえないので、本件発明１乃至６は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４,２項、及び同条３項で準用する１２６条２項から４項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要
　訂正前の本件請求項１、２、及び６に係る発明は、甲第１乃至２号証に記載された発明であるから特許法２９条１項３号に該当、或いは、同請求項１乃至６に係る発明は、甲第１乃至８号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、同条２項の規定により特許を受けることができない。
　　　　　　　　　記
甲第１号証：U.R.Reddy et al.,Molecular Brain Res.,1990,Vol.8,137-141
甲第２号証：「分子細胞生物学辞典　第１版　第２刷」（1997.5.1.東京化学同人発行）302
甲第３号証：Bone Marrow Purging and Processing(1990)387-402
甲第４号証：Leukemia,1993Jun,7:6,898-908
甲第５号証：Haematologica,1992Jun-Aug,77:4,307-10
甲第６号証：Tissue Antigens,1986Jun,28:1,46-52
甲第７号証：Scand J Immunol,1986Apr,23:4,509-19
甲第８号証：J Clin Oncol,1987Dec,5:12,1900-11
２．甲各号証の記載内容
　甲第１号証には、次の記載がある。
「神経成長因子（NGF）レセプター及び該レセプターの突然変異体の同定を容易に成ならしめる為に、我々は、ＣＯＳ細胞を使用した迅速で効果的な一過性の発現系を構築した。ヒトＮＧＦレセプターは、疎水性のシグナル配列、222個のアミノ酸からなる細胞外ドメイン、単一の細胞膜貫通ドメイン、及び155個のアミノ酸からなる細胞内ドメインを有する427個のアミノ酸から成る蛋白質である。該ＮＧＦレセプター、及び細胞内ドメイン領域が欠失した端部切断体はＣＯＳ細胞発現系で発現された。これらの組換え蛋白質はその細胞表面及び該周辺部位で検出された。これらの組換え蛋白質に対する１２５Ｉ−ＮＧＦの特異的結合は化学的交差結合によって検出された。」（137頁要約1〜5行）、
「神経成長因子（NGF）は交感神経及び知覚神経の増殖及び発達において重要な役割を有する。ＮＧＦ作用はこれら神経細胞及び、・・・のようなその他の神経稜由来細胞上に見出される細胞表面特異的レセプターによって伝達される。」（137頁左欄1〜7行）、
「我々は、神経成長因子レセプター（NGF-R）及びＮＧＦ−Ｒの２種類の端部切断体のＣＯＳ細胞における一過性発現が成功したことを報告する。完全長ＮＧＦ−Ｒ、及び細胞内ドメインが欠失した突然変異体レセプターが合成され、細胞表面に輸送された。」（137頁右欄1〜5行）、
「ＣＯＳ細胞のトランスフェクション
　トランスフェクションに使用したすべてのプラスミドはＣｓＣｌエチジウムブロマイド勾配遠心分離によって精製した。ＣＯＳ細胞は、７５cm２の培養当たり１５μｇの全プラスミドDNAを使用したリン酸カルシウム沈殿法によってトランスフェクションした。細胞培養培地及びトランスフェクションされた細胞は６０時間後に回収した。」（138頁左欄下から9〜4行）、
「免疫蛍光顕微鏡
　カバースリップ上で培養しプラスミドでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞を５０％氷冷メタノール中で５分固定して浸透性にし、更に１００％氷冷メタノール中で５分間処理した。細胞を精製された抗NGF-R MAb ME82-11又は対象MAbP3X63Ag8(5μｇ/ml)と共にインキュベートし、ビオチヌル化ヤギ抗マウスIgG抗体と共にインキュベーションし、そして、製造者の指示に従って蛍光標識アビジンで染色した。その後、細胞核はヘキスト33258を使用して染色した。各トランスフェクションから少なくとも35個のＮＧＦ−Ｒ陽性細胞を細胞内局在化に関して試験した。」（138頁右欄18〜27行）
「細胞表面におけるNGF-R発現
　COS細胞を、完全長NGF-RをコードするpCMVX-7又は細胞内ドメインが欠失したレセプターの突然変異体をコードするpCMVPvuでトランスフェクトした。」（138頁右欄29〜32行）、
「pCMVX-7及びpCMVPvu蛋白質生産物をフローサイトメトリー（表１）によって細胞表面上で検出した。」（138頁右欄下から8〜6行）、及び
「pCMVPvu蛋白質生産物を用いた結果によれば、細胞内ドメインは細胞表面への輸送及びNGF-R結合には必要ではないことが示された。」（140頁右欄下から11〜8行）
　また、甲第２号証には、COS細胞がアフリカミドリザルの腎臓由来の細胞、即ち、真核細胞であることが、甲第３号証には、自己骨髄細胞移植に際して、細胞表面マーカーの一種であるCD34+細胞について、それに対するモノクロナール抗体を使用した優性選択・分離、及び得られた抗体/細胞複合体からの酵素による（解離）解裂に関する記載が、
　甲第４号証及び甲第５号証には、抗体被覆磁気微小球（ダイナビーズ）を使用するCD34+細胞の優性選択、及び優性として分離された細胞からこのビーズを迅速に化学的に解裂することの出来る方法の記載が、
　甲第６号証には、抗体被覆磁気含有ポリマーを使用するＣＤ８陽性細胞の優性選択方法の記載が、　
　甲第７号証には、抗体被覆磁気単分散ポリマー粒子を使用する優性選択・分離方法、及び、膜マーカーが活性化シグナルの伝達に関与しない細胞膜構造である場合に特に優れた結果が得られたことの記載が、
　甲第８号証には、自己骨髄移植の目的で使用される、クローン原性腫瘍細胞を含まない細胞調製物に関する記載がある。
　
３．判断
Ａ．特許法２９条１項３号について
　本件発明１、２，及び６は「ヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞」に係るものであるところ、甲第１号証及び甲第２号証には「ＣＯＳ細胞」についての開示はあるが、これと全く別異の細胞であるヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞について示唆するところはない。
　そうすると、本件発明１，２，及び６は、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明とはいえない。
Ｂ．特許法２９条２項について
　甲第１号証には、「細胞内ドメインが欠失した突然変異体」について記載されているが、甲第１号証は、該突然変異体を使用することにより、「細胞内ドメインは細胞表面への輸送及びNGF-R結合には必要ではないことが示された。」という知見を得たものであって、本件発明のように、細胞内ドメインを欠失させることによりシグナル伝達を欠失させることについて教示するところはない。
　そして、甲第３号証には、自己骨髄細胞移植に際しての優性選択・分離法が、甲第４号証及び甲第５号証には、抗体被覆磁気微小球を使用する優性選択法、甲第６号証には、抗体被覆磁気含有ポリマーを使用する優性選択方法が、甲第７号証には、抗体被覆磁気単分散ポリマー粒子を使用する優性選択・分離方法が、それぞれ記載されており、また、甲第８号証には、自己骨髄移植の目的で使用される、クローン原性腫瘍細胞を含まない細胞調製物に関して記載されているが、「細胞内ドメインが全体的又は部分的に欠失又は修飾されたレセプター」を使用することについて教えるところはない。
　そうすると、本件発明１のような構成を採用することは、当業者が容易に想到し得る域を超えているので、本件発明１は、甲第１号証乃至甲第８号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができとはいえない。
　また、本件発明２乃至６も、「細胞内ドメインが全体的又は部分的に欠失又は修飾されたレセプター」に係るものであるから、本件発明１についての判断と同様の理由により、甲第１号証乃至甲第８号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができとはいえない。
　
３．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１乃至６についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明１乃至６についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年１月１７日（２００１．１．１７）
【訂正の要旨】
（訂正の要旨）
（１）特許請求の範囲の請求項１に係る記載「自己移植及び／又は同種移植される細胞における使用のための、細胞表面レセプターをコードする核酸をその細胞内で発現させ、そしてその後に、その細胞表面においてそのレセプターを提示させることによる真核（哺乳類）細胞のマーキング方法であって、その表面に提示されたレセプターが、その結合性パートナーへの結合後に、いずれのシグナル伝達をももたらすことができないような方法でレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸を使用することを特徴とする方法。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として「自己移植及び／又は同種移植される細胞における使用のための、細胞表面レセプターをコードする核酸をその細胞内で発現させ、そしてその後に、その細胞表面においてそのレセプターを提示させることによるヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞のマーキング方法であって、その表面に提示されたレセプターが、その結合性パートナーへの結合後に、いずれのシグナル伝達をももたらすことができないような方法でレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸を使用し、細胞内ドメインが全体的又は部分的に欠失又は修飾されたレセプターが、対応する生来のレセプターを通常発現しない形質導入されていない細胞と形質導入された細胞との区別をもたらすことを特徴とする方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。」と訂正する。
（２）特許請求の範囲の請求項２に係る記載「自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされた真核細胞のための選択マーカーとしてそのレセプターが使用されることができる方法で修飾された細胞表面レセプターを発現させ、そしてその細胞表面においてそのレセプターを提示させるための、細胞表面レセプターをコードし、そしてその中でその細胞内ドメインをコードする領域が、そのドメインがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的にもたらすことができないような方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸の使用方法。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として「自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされたヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞のための選択マーカーとしてそのレセプターが使用されることができる方法で修飾された細胞表面レセプターを発現させ、そしてその細胞表面においてそのレセプターを提示させるための、細胞表面レセプターをコードし、そしてその中でその細胞内ドメインをコードする領域が、そのドメインがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的にもたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸の使用方法であって、細胞内ドメインが全体的又は部分的に欠失又は修飾されたレセプターが、対応する生来のレセプターを通常発現しない形質導入されていない細胞と形質導入された細胞との区別をもたらす、前記方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。」と訂正する。
（３）特許請求の範囲の請求項３に係る記載「自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされた細胞の免疫選択方法であって、そのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が、その表面に提示されたレセプターがその結合性パートナーへの結合後にいずれのシグナル伝達をももたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている細胞表面レセプターをコードする核酸をその細胞内に導入し、そのレセプターに特異的に結合するマークされた抗体と共にそれらの細胞をインキュベートすることによりトランスフェクトされた細胞を同定し、そしてその抗体／細胞複合体からの解裂によりそれらの細胞を回収することによる方法。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として「自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされたヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞の免疫選択方法であって、そのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が、その表面に提示されたレセプターがその結合性パートナーへの結合後にいずれのシグナル伝達をももたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失され又は修飾されている細胞表面レセプターをコードする核酸をその細胞内に導入し、そのレセプターに特異的に結合するマークされた抗体と共にそれらの細胞をインキュベートすることによりトランスフェクトされた細胞を同定し、そしてその抗体／細胞複合体からの解裂によりそれらの細胞を回収することによる方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。」と訂正する。
（４）特許請求の範囲の請求項４に係る記載「自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされた細胞の免疫分離方法であって、そのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が、その表面に提示されたレセプターがその結合性パートナーへの結合後にいずれのシグナル伝達をももたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている細胞表面レセプターをコードするＤＮＡをその細胞内に導入し、インキュベーションの前又は後に固定化されたレセプターに対する抗体と共にそれらの細胞をインキュベートし、非結合細胞からその抗体により固定化された細胞を分離し、そしてその抗体−レセプター結合を解裂させることによりそれらの細胞を単離することによる方法。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として「自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされたヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞の免疫分離方法であって、そのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が、その表面に提示されたレセプターがその結合性パートナーの結合後にいずれのシグナル伝達をももたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失され又は修飾されている細胞表面レセプターをコードするＤＮＡをその細胞内に導入し、インキュベーションの前又は後に固定化されたレセプターに対する抗体と共にそれらの細胞をインキュベートし、非結合細胞からその抗体により固定化された細胞を分離し、そしてその抗体−レセプター結合を解裂させることによりそれらの細胞を単離することによる方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。」と訂正する。
（５）特許請求の範囲の請求項５に係る記載「それにより、その細胞調製物が実質的にクローン原性腫瘍細胞を含まない、自己移植及び／又は同種移植において使用される造血細胞調製物の生産方法であって、細胞毒性剤又は照射を用いてパージングし、細胞表面レセプターをコードし、そして好ましくはその中でその細胞内ドメインをコードする領域が、そのドメインがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的にもたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されていない核酸を用いてこれらの細胞を形質導入し、そして非形質導入細胞からその細胞表面レセプターによりマークされた形質導入細胞を分離することによる方法。」を、明りょうでない記載の釈明及び誤記の訂正を目的として「その細胞調製物が実質的にクローン原性腫瘍細胞を含まない、自己移植及び／又は同種移植において使用される造血細胞調製物の生産方法であって、細胞毒性剤又は照射を用いてパージングし、細胞表面レセプターをコードし、そしてその中でその細胞内ドメインをコードする領域が、そのドメインがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的にもたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸を用いてこれらの細胞を形質導入し、そして非形質導入細胞からその細胞表面レセプターによりマークされた形質導入細胞を分離することによる方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。」と訂正する。
（６）明細書１７頁８行「もたらすことができる」を、誤記の訂正を目的として「もたらすことができない」に訂正する。
（５４）【発明の名称】
マーカーとしての細胞表面レセプターの使用による真核細胞のマーキング方法
（５７）【特許請求の範囲】
　　【請求項１】　自己移植及び／又は同種移植される細胞における使用のための、細胞表面レセプターをコードする核酸をその細胞内で発現させ、そしてその後に、その細胞表面においてそのレセプターを提示させることによるヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞のマーキング方法であって、その表面に提示されたレセプターが、その結合性パートナーへの結合後に、いずれのシグナル伝達をももたらすことができないような方法でレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸を使用し、細胞内ドメインが全体的又は部分的に欠失又は修飾されたレセプターが、対応する生来のレセプターを通常発現しない形質導入されていない細胞と形質導入された細胞との区別をもたらすことを特徴とする方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。
　　【請求項２】　自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされたヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞のための選択マーカーとしてそのレセプターが使用されることができる方法で修飾された細胞表面レセプターを発現させ、そしてその細胞表面においてそのレセプターを提示させるための、細胞表面レセプターをコードし、そしてその中でその細胞内ドメインをコードする領域が、そのドメインがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的にもたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸の使用方法であって、細胞内ドメインが全体的に又は部分的に欠失又は修飾されたレセプターが、対応する生来のレセプターを通常発現しない形質導入されていない細胞と形質導入された細胞との区別をもたらす、前記方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。
　　【請求項３】　自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされたヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞の免疫選択方法であって、そのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が、その表面に提示されたレセプターがその結合性パートナーへの結合後にいずれのシグナル伝達をももたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失され又は修飾されている細胞表面レセプターをコードする核酸をその細胞内に導入し、そのレセプターに特異的に結合するマークされた抗体と共にそれらの細胞をインキュベートすることによりトランスフェクトされた細胞を同定し、そしてその抗体／細胞複合体からの解裂によりそれらの細胞を回収することによる方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。
　　【請求項４】　自己移植及び／又は同種移植される細胞において使用されるトランスフェクトされたヒトＴ−リンパ球又はヒト造血細胞の免疫分離方法であって、そのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が、その表面に提示されたレセプターがその結合性パートナーの結合後にいずれのシグナル伝達をももたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失され又は修飾されている細胞表面レセプターをコードするＤＮＡをその細胞内に導入し、インキュベーションの前又は後に固定化されたレセプターに対する抗体と共にそれらの細胞をインキュベートし、非結合細胞からその抗体により固定化された細胞を分離し、そしてその抗体−レセプター結合を解裂させることによりそれらの細胞を単離することによる方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。
　　【請求項５】　その細胞調製物が実質的にクローン原性腫瘍細胞を含まない、自己移植及び／又は同種移植において使用される造血細胞調製物の生産方法であって、細胞毒性剤又は照射を用いてパージングし、細胞表面レセプターをコードし、そしてその中でその細胞内ドメインをコードする領域が、そのドメインがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的にもたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている核酸を用いてこれらの細胞を形質導入し、そして非形質導入細胞からその細胞表面レセプターによりマークされた形質導入細胞を分離することによる方法（但し、医師による又は医師の指示による医療行為を除く）。
　　【請求項６】　前記核酸又はＤＮＡが、ＬＮＧＦＲ核酸、配列番号：１である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
　本発明は、選択マーカーとしての修飾された細胞内ドメインをもつ細胞表面レセプターの使用による真核（哺乳類）細胞のマーキング方法に関する。
　あるＤＮＡ配列がその中に首尾よく導入された細胞の同定は、組換えＤＮＡ技術において不可欠の段階である。導入されるべきＤＮＡ配列は、必ずしも、簡単なやり方で選択されることができる表現型を導びかないであうから、選択可能な表現型をコードする追加のＤＮＡ配列が通常導入される。真核細胞の組換えＤＮＡ技術における使用のためのこのような選択マーカー遺伝子の数は未だひじょうに限定されている。これらの利用可能なマーカー遺伝子のほとんど、例えば、単純ヘルペス・ウイルスＩ型チミジン・キナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　１（１９７７）２２３）又はヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（Ｊｏｌｌｙ　ｅｔ　ａ１．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０（１９８３）４７７）は、遺伝子に対応し、又は遺伝子に高く関連し、これらは、ほとんどの正常細胞の内で構成的に発現され又はこのような遺伝子と同一である。
　それ故、これらのマーカー遺伝子は、その対応遺伝子を発現しない特殊な突然変異細胞内でのみ使用されることができる。好ましいマーカー遺伝子は、他方において、それらがこれらの細胞に関連する組換えＤＮＡ技術における選択マーカー遺伝子として使用されることができるように、ほとんどの哺乳類細胞内で発現されてはならず、又は特定の組織と細胞タイプ内で少なくとも発現されてはならない。
　Ｐａｗｌｉｎｋ　ｅｔ　ａ１．は、レトロウイルス仲介遺伝子移入における優性選択マーカーとしてのＣＤ２４細胞表面抗原の使用について記載している（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１７　Ｅ，ｐａｇｅ　２０３，ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｓ２１０）。このマーカーを用いて、ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞、ＢＡＦ−３ｐｒｅ−Ｂ細胞並びにネズミ骨髄細胞がレトロウイルス感染によりラベルされることができ、そしてこれらのラベルされた細胞は、蛍光活性化細胞セル・ソーティング分析により検出された。しかしながら、このＣＤ２４細胞表面抗原は通常いくつかの哺乳類細胞上で発現されるので、このマーカーの使用は、このＣＤ２４細胞表面抗原を通常発現する細胞とこのマーカーによりラベルされた細胞との間を識別することの困難性により限定されるであろう。
　さらに、異種発現後、ＣＤ２４細胞表面抗原は、ほんの僅かな程度にその細胞表面に提示されることが見出されている。
　それ故、本発明の目的は、細胞表面レセプターがその細胞表面にかなりの程度に提示され、それによりマークされた細胞の選択及び検出感度が増加されることができるような方法による、その細胞表面レセプターの使用により、真核細胞をマーキングする方法を提供することであった。
　この目的は、細胞表面レセプターをコードする核酸をその細胞内で発現させ、そしてその細胞表面にそのレセプターを提示することによる真核（哺乳類）細胞のマーキング方法であって、その方法が、その表面に提示されたレセプターがその結合性パートナーへの結合後にいずれのシグナル伝達をももたらすことができないようにそのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が完全に又は部分的に欠失され、又は修飾されている核酸の使用を特徴とする方法により、達成される。
　好ましくは、この細胞内ドメインは完全に欠失され、又は個体のヌクレオチドは修飾される。
　好ましくは、ＮＧＦ−，ＣＤ２４−若しくはＬＤＬ−レセプターをコードする核酸が使用される。
　以下、“低アフィニティー神経成長因子レセプター、ＬＮＧＦＲ”というヒトＮＧＦレセプターの配列は、Ｄ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｅｌｌ　４７（１９８６）５４５−５５４中に記載されている。好ましくは、（ヌクレオチド９３０に始まり）そのＣ−末端までのアミノ酸２４５をコードするＤＮＡ領域が欠失されている核酸（配列番号：１参照）が使用される。
　配列番号：１においては、その細胞外ドメインはヌクレオチド１１４（ＡＴＧ）−８６３によりコードされ、そのトランスメンブラン・ドメインはヌクレオチド８６４−９２９によりコードされ、そしてその細胞内ドメインはヌクレオチド９３０−１３９４によりコードされている（Ｒｅｄｄｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　８（１９９０）１３７−１４１）。
　その細胞内ドメインの欠失のために、その表面に提示されたレセプターがその結合性パートナーへの結合後にいずれのシグナル伝達をももたらすことができないように、そのドメイン全体又は機能的部分だけを欠失させることができる。例えば、ＰｖｕＩＩＩとＳｓｔＩによる制限酵素処理によりヌクレオチド９４３−１５１２を欠失させることができる。
　この核酸は、リポフェクション又はエレクトロポレーションにより、例えば、ウイルス・ベクター（好ましくは、レトロウイルス）を介して標的細胞内に導入されることができる。
　さらなる本発明の対象は、修飾されたＬＮＧＦＲをコードし、そして配列番号：１に図示されるＤＮＡ、並びにこのような核酸を含む真核細胞である。
　このタイプの核酸は、そのレセプターがトランスフェクトされた真核細胞のための選択マーカーとして使用されることができるような方法で、そのように修飾された細胞表面レセプターを発現し、そしてその細胞表面にそのレセプターを提示するために使用されることができる。
　レセプターをコードするＤＮＡ又はその誘導体は、本分野において公知の方法により真核発現ベクター内に導入されるであろう。好適な発現ベクターは、当業者に知られており、好ましくは、レトロウイルス・ベクターが使用される。また、他のウイルス・ベクターも本分野の技術水準に従って、レセプターＤＮＡの伝達のために使用されることができる（例えば、ヘルペス・ウィルス、アデノ−ウイルス、ワクシニア・ウイルス）。特定タイプのレトロウイルス、いわゆるダブル・コピー・ベクター（Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３（１９８６）３１９４−３１９８）を用いて、高頻度の再編成プロウイルス及びかなり低いウイルス・タイターが観察されている。ＸＳＮベクター・ウイルス（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７（１９８９）９８０−９９０）が好ましい。
　この組換え真核発現ベクターは、その後真核宿主細胞内に、遺伝子マーキング・プロトコールのために単独で、又は形質導入されることを予定されているが選択可能な表現型を全くもたないさらなるＤＮＡとの組合せのいずれかにおいて、導入される。さらに、このレセプター遺伝子の伝達は、非ウイルス移入法（例えば、エレクトロポレーション、リボソーム伝達、カルシウム沈降）を使用することにより達成されることもできる。外因性ＤＮＡを含む細胞は、次に、高レベルでレセプターを生産するそれらの能力により認識されることができる。本発明に従ってＤＮＡを制御する組換え真核細胞は、さらに、そのレセプターの誘導体を生産するそれらの能力によりより容易に検出されることができる。
　上述のように得られた真核細胞のレセプター・ラベルは、使用したレセプターに結合する抗体を使用することにより、このような細胞の容易な選択及び分離を許容する。このような抗体は、本分野において公知であり、そして例えば、Ａ．Ｒｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　８１（１９８４）６６８１−６６８５，ＥＰ−Ａ　０　２０２　０５５）により記載されている。さらに、これらのレセプターに対する抗体は、本発明に係るＤＮＡによりコードされたタンパク質により動物を免疫感作し、そしてその免疫感作された動物の血清からそれらの抗体を単離することにより、又は不死化細胞、例えばネズミ・ミエローマ・セルラインとその免疫感作動物の脾臓細胞を融合してモノクローナル抗体を得ることによって本分野において公知の方法により得られることができる。これらの抗体は、（例えば、Ｊ．Ｈ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｍｏｎｏｋｌｏｎａｌｅ　Ａｒｔｉｋｏｒｐｅｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８８，ｐａｇｅ　２８５　ｔｏ　３１５　中に記載されたような）本分野において公知の方法によりラベルされることができる。好適なラベルは酵素、蛍光又は化学発光染料であろう。
　免疫選択により、このような核酸を真核細胞内に導入することによりマークされた細胞を単離することができる。この目的のために、トランスフェクトされた細胞は同定され、本発明に従って使用されたレセプターに特異的に結合するマークされた抗体により選択され、そして抗体／細胞複合体の分割により単離される。
　マーク（ラベル）された抗体の代わりに固定化された抗体を使用することにより、トランスフェクトされた細胞を選択することができる。それ故、レセプターに対する固定化抗体をもつ固相がアフィニティー・クロマトグラフィーにおけるマトリックスとして使用される。レセプターを発現しない非トランス・フェクト細胞の分離後に、結合した細胞を、例えば、培養し、そして次にペトリ皿上で一夜増殖させる。
　上述のような方法は、遺伝子治療プロトコールにより哺乳類生物に導入された細胞の同定のための診断ツールとして特に重要であろう。いくつかの用途、例えば、骨髄移植のために、それは、骨髄移植に起源をもつ細胞と宿主の残りの細胞から得られる細胞との間を分けるための診断的価値を有するであろう。この場合において、レセプターをコードするＤＮＡを含む骨髄細胞が、移植されて、これらの細胞に細胞表面ラベルを提供する。好ましくは、本発明に係る遺伝子を含む本分野の技術水準に従って濃縮された前駆又は幹細胞（例えば、固定化抗−ＣＤ３４抗体）が移植されるであろう。移植後、細胞、特に最終的には生じた腫瘍細胞は、その移植された細胞又はその宿主生物の残りの細胞から生じるときに分けられることができる。
　本発明のさらなる態様は、それ故、レセプターをコードするＤＮＡの、特に本発明に係るＤＮＡの導入によりラベルされている細胞の診断的同定のための、本発明に係るトランスフェクトされた細胞の免疫選択方法の使用である。
　上記の修飾レセプターによる血液細胞／骨髄細胞のマーキングの主要な用途は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）移植からの、そしてまた同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）移植からの細胞のモニタリングであろう。白血病とリンパ腫の治療においては、細胞静止医薬の致死下投与量又は照射の妥当な投与量又はそれらの組合せにより患者を治療することがしばしば必要である。骨髄機能を回復するためには、治療前に移植される自己骨髄がその患者に移植されるか又はＨＬＡ適合ドナーからの同種骨髄が移植されるかのいずれかであろう。
　自己骨髄移植の場合においては、その再移植された材料中の腫瘍細胞の汚染は腫瘍の再発を導くことができるであろう。腫瘍細胞（クローン原性の腫瘍細胞）からその骨髄を精製するためのパージング方法が使用されるが、これらの技術は、今日、信頼できるものではない。再発の場合においては、腫瘍細胞を潜在的に含有するものと治療後に残った細胞により引き起こされた再発との間を区別することはもちろん不可能である。同種骨髄移植の場合においては、同種骨髄の拒絶が主要な問題である。パージング技術（Ｐｕｒｇｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）は、Ａｒｅｍａｎ　Ｅ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ　：Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　ａｎｄ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　：　Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｆ．Ａ．Ｄａｖｉｅｓ　Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９２）（これを引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されている。
　本発明は、さらに、造血細胞調製物（すなわち、骨髄又は移動性末梢血液前駆細胞及び／又は幹細胞）の調製方法であって、細胞毒性剤又は照射を使用してパージし、細胞表面レセプターをコードしている核酸及び、好ましくは、その細胞内ドメインをコードしている領域がそのドメインが本質的にもはやいずれのシグナル変換をももたらすことができないような方法で全体的に又は部分的に欠失又は修飾されているようなものによりそれらの細胞を形質導入し、そして非形質導入された細胞からその形質導入された細胞を分離することにより、それらの細胞が細胞表面レセプターによりマークされ、そしてそれによりその細胞調製物が実質的にクローン原性腫瘍細胞を含まないような方法を含んで成る。この分離は、好ましくは、インキュベーションの前又は後に固定化されたレセプターに対する抗体と共にそれらの細胞をインキュベートし、非結合細胞から抗体により固定化された細胞を分離し、そして抗体−レセプター結合の解裂によりその造血細胞調製物を単離することにより達成される。
　自己移植後に、その移植された細胞がこれらの細胞に一般的でない遺伝子により及びその後にそれから誘導された遺伝子生成物によりマークされる場合、移植後に直接的にこれらの細胞をトレースすることができ、そして再発の場合には、その移植された材料から誘導された腫瘍細胞と残りの腫瘍細胞との間を区別することができる。この知識は、再発の源に基づくさらなる治療のひじょうに早期の決定を導くであろう。この診断目的の他に、自己移植における遺伝子マーキングは、比較的小さな患者群における異なる除去方法の効力をモニターし、そして比較することをも許容するであろう。
　自己及び好ましくは同種移植のために、主要な適用分野は、移植された細胞の拒絶のモニタリングであろう。
　この臨床的なプロトコールは以下の段階を含むであろう。
　ａ）患者細胞の体外移植。
　ｂ）公知技術に従う体外移植された細胞のパージング。
　ｃ）本発明に係る修飾されたレセプター遺伝子を含むベクターによる上記患者細胞の形質導入。
　ｄ）選択的条件下、例えば、修飾レセプター遺伝子を含むベクター上にコードされたネオマイシン耐性遺伝子の発現を使用するＧ４１８を用いて、上記患者細胞の通性培養。
　ｅ）上記修飾遺伝子を発現し、そして上記細胞の表面上に上記レセプターを提示するマークされた細胞の免疫選択。
　ｆ）上記の濃縮され且つマークされた細胞の上記患者内への再移植。
　ｇ）ＦＡＣＳ分析又はＥＬＩＳＡ技術による上記マーキング遺伝子についての上記患者の血液／骨髄サンプルのモニタリング。
　本発明は、トランスフェクトされた細胞の免疫選択方法であって、その結合パートナーへの結合後に、その表面に提示されたレセプターがいずれのシグナル伝達をももたらすことができないような方法でそのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている細胞表面レセプターをコードする核酸をその細胞内に導入し、そのレセプターに特異的に結合するマークされた抗体と共にそれらの細胞をインキュベーションすることによりそのトランスフェクトされた細胞を同定し、そしてその抗体／細胞複合体からの解裂によりそれらの細胞を回収することによる、ような方法をさらに含んで成る。
　本発明は、さらに、トランスフェクトされた細胞の免疫分離方法であって、その結合パートナーへの結合後に、その表面に提示されたレセプターがいずれのシグナル変換をももたらすことができないような方法で、そのレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている細胞表面レセプターをコードするＤＮＡをその細胞内に導入し、インキュベーションの前又は後に固定化されたレセプターに対する抗体と共にそれらの細胞をインキュベートし、非結合細胞から上記抗体により固定化された細胞を分離し、そして抗体−レセプター結合を解裂させることによりそれらの細胞を単離することによる、ような方法を含んで成る。
　ひじょうに多くの研究が、レトロウイルス・ベクターが体細胞内への外来ＤＮＡの移入のための効率のよい道具であることを立証した１。マウス造血系においては、効率のよい遺伝子移入及び発現は、インビトロ及びインビボにおいて、前駆及び多能性幹細胞の両方において達成されている。低レベルの遺伝子移入は、培養におけるイヌとヒトの造血前駆細胞内で得られており、ここでは、形質導入された遺伝子のかなりのレベルの発現が立証されている（２中にレビューされる）。レトロウイルス−仲介遺伝子移入は、先天及び後天的疾患、例えば、アデノシン・デアミナーゼ−欠損（ＡＤＡ−）重度合併免疫不全（ＳＣＩＤ）及び進行癌の治療のための遺伝子治療プロトコールにおいて最近使用されている（３中にレビューされる。）。かなりの努力が、ヒト造血幹細胞の精製並びに遺伝子移入及び発現のための効率的な条件の発見のための手順を最適化するために捧げられているけれども、末梢血液リンパ球（ＰＢＬｓ）は、未だ、ヒトの遺伝子治療のための最も安全な細胞デリバリー媒質として考えられている。
　多数の異なるレトロウイルス・ベクターが、全てＭｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）背骨に基づき、ヒト造血細胞内への遺伝子移入のために遺伝子操作され、そして使用されてきた。着目の遺伝子の発現を駆動する異なるプロモーターの用い方、及びウイルス転写単位に関してのこれらの配列の位置は、別のベクターのデザインの作出において考慮に入れられたパラメーターの中のいくつかであった４　５　６。これらのベクターのいくつかが、異なる条件下でヒト・リンパ球細胞を形質導入するために使用された。ヒト腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬｓ）は、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ）遺伝子を担持する、Ｎ２レトロウイルス・ベクターにより形質導入され、そしてインビトロにおいて正常な表現型及び機能特性を保持された７　８。形質導入された細胞は、メラノーマ患者へのインビボにおける細胞投与の６４日後までに腫瘍部位から回収された９。遺伝子伝達は、ＴＩＬｓとＰＢＬｓから得られたＣＤ４＋とＣＤ８＋のヒトＴ−細胞サブセットの両方において得られた１０。ウイルスＬＴＲプロモーターにより駆動される、機能的ＣＤ１８遺伝子の発現のためのレトロウイルス・ベクターは、リンパ球接着不全（ＬＡＤ）を患った患者からのリンパ球を首尾よく形質導入し、そしてインビトロにおいてＬＡＤの矯正を導いた。ＡＤＡ−ＳＣＩＤを患った患者から得られたＰＢＬｓ中のダブル・コピー・ベクター６内へのＡＤＡプロモーターにより駆動されるヒトＡＤＡの発現も、この酵素の欠陥の矯正を導びき、免疫機能の再構築を許容する１２　１３。最後に、ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターにより駆動される、ＨＩＶ構造ＲＮＡ配列（トランス作用性応答性要素、ＴＡＲ、及びＲｅｖ−応答性要素、ＲＲＥ）の過剰発現のためのレトロウイルス構築物が、Ｔ−リンパ球セルライン内に首尾よく導入されて、ＨＩＶに対する部分的免疫感作を誘導した１４　１５。すべてのこれらの場合において、レトロウイルス・ベクターは、ヒト・リンパ球を形質導入し、そしてその伝達された遺伝子を発現することが示されたけれども、その形質導入された遺伝子の安定性、遺伝子移入の効率、及び発現について異なるベクター・デザインを直接的に比較する試みは未だ全く行われていない。
　ヒト低アフィニティー神経成長因子レセプター（ＬＮＧＦＲ）は、ほとんどのヒト造血細胞上で発現されず、これ故、単一細胞レベルにおいてさえ、免疫蛍光分析による各々のベクター及び各々の細胞標的についての形質導入された遺伝子発現の定量分析を許容する。骨髄及びリンパ起源の異なるヒト造血セルライン、並びに正常な末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）が、４つのベクターにより形質導入され、そしてＲＮＡとタンパク質レベルの両方において、ウイルス組み込み及びＬＮＧＦＲ発現の安定性と数について分析された。ＬＮＧＦＲと細胞表面マーカーの同時発現についての形質導入されたＴ−セルラインとクローンのＦＡＣＳ分析が特定のＴ細胞サブ集団内での遺伝子発現を研究するために行われた。適当な、高効率の感染条件下で、全てのレトロウイルス・ベクターが、正常な免疫能力をもつＴ細胞集団を形質導入することができた。それ故、本発明に従って、（その細胞内ドメインをもたない切り詰められた形態、又はその（本質的に）修飾されていない形態における）ＬＮＧＦＲは、それらの細胞をＬＮＧＦＲをコードする核酸によりトランスフェクトすることにより、細胞マーキングするための好ましいマーカーである。トランスフェクションのために、例えば、ベクター、例えば、レトロウイルス・ベクター又は生ＤＮＡが、例えばトランスフェクト剤としてリポソームを用いて使用される。ＬＮＧＦＲマーカーは、好ましくは、造血系の細胞の、特に造血幹細胞の、マーキングのために、使用される。特に好ましいのは、遺伝子治療及びパージング方法におけるマーキングのための使用である。
　造血幹細胞内への効率的なレトロウイルス・ベクター遺伝子伝達は、多くの先天的及び後天的失調のための遺伝子治療の主要な目的を未だ残したままである。媒体として、レトロウイルス・ベクターは、今日、ヒトの血液−リンパ球産生細胞内への外来ＤＮＡの伝達及び発現のための最も安全且つ有効なツールである。実際に、骨髄又は血液細胞内での遺伝子移入のための認可された臨床的プロトコールのすべてがレトロウイルス・ベクターに頼っている１，３。理想的な標的細胞は多能性幹細胞により代表されるけれども、適当な効率においてこのような細胞を形質導入し、そしてそれらの子孫において安定した遺伝子発現を維持する、そのレトロウイルス・ベクターの能力について決定的な証拠は全くない。骨髄遺伝子伝達に基づく進行中の臨床プロトコールの結果はこれらの問題を明確にするかもしれない１，３，３０。
　明らかに、少なくとも、免疫系の先天及び後天疾患のために、遺伝子移入は、末梢血液リンパ球、骨髄細胞に対する可能性のある代替物内で、より容易に達成されることができる。しかしながら、この目的のためには、その全免疫レパートリーを提示するためにＰＢＬｓのどれ程の割合が形質導入される必要があるか、そして、これがインビボにおいて安定して維持されることができるかどうか、この両方が治療関連にあるための遺伝子移入手順のための必要な先行条件である、を決定することが必要である。この目的のために、遺伝子発現の持続性とレベルの両方に影響する、遺伝子移入の効率とベクター・デザインが決定的な要因である。
　ヒトＰＢＬｓ内への遺伝子移入の全体的な効率は、その感染プロトコールに厳密に依存した。リンパ球のインビトロにおける短期間活性化による限定された細胞増殖、その後の、産生細胞上清への暴露によるＰＢＬｓ内への遺伝子移入は、限定された割合のＧ４１８−耐性細胞（感染サイクル当り約１％）をもたらした。追加の活性はベクター上清のタイターにより導入された。遺伝子移入の効率は、標的細胞のより延長されたインビトロにおける増殖により増加されることができる。
　ベクター含有上清による３サイクルのＰＢＬｓ感染の後の、ＰＢＬｓの集団におけるＶβ用法のレパートリーの分析、その後の、Ｇ４１８による形質導入された細胞の選択は、非形質導入／非選択のリンパ球の元の対照集団に比べてたとき、無傷のレパートリーを作り出した。これらのデータは、標的細胞の限定された増殖とベクター含有上清の使用は、少なくとも、ベクター上清が良好なウイルス・タイター（＞５×１０５）をもつとき、その比較的低頻度の遺伝子移入から独立して、適当な遺伝子移入を作り出す。しかしながら、ベクター上清中の低ウイルス・タイターは、限定されたＶβレパートリーを作り出した。これは、ＴＣＲ−β鎖再編成のサザン・プロット分析により、形質転換され／選択された集団においてオリゴクローンのパターンを示したということが確認された。この限定は、照射されたベクター産生細胞とのＰＢＬｓの同時培養により回避された。ウイルス・タイターとは独立して、この遺伝子伝達手順は、少なくとも１の大きさのオーダー程、有意により有効である。同時培養による高効率の遺伝子移入及び形質導入された発現ＬＮＧＦＲを利用して、簡単なプロトコールが、均質な形質導入された細胞の生産を許容する同時培養と免疫選択に関して改作された。
　同時培養プロトコールは臨床的使用のためには未だ安全でないと考えられているけれども、細胞と細胞の接触を回避しながらウイルスの通過を許容する、細孔性膜によりベクター産生細胞及びＰＢＬｓが分離されて維持されるような同時培養条件が案出された。このアプローチは、上清感染と比べたとき、いくつかの利点を提供する。
　ＬＮＧＦＲと異なるＴ細胞表面マーカーの同時発現のためのＧ４１８−選択Ｔ細胞の２重蛍光分析は、見かけの等しい効率の遺伝子移入をもつすべてのテストされたサブ集団の同様の感受性を示した。さらに、我々は、遺伝子移入が未熟になる決定的な証拠を通じて散発的な、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を得た。我々は、先に、ＴＣＲ再編成に先行するＴ細胞前駆細胞内へのレトロウイルス・ベクター仲介遺伝子移入について示した１３。本発明のデータは、低いが検出可能な頻度において循環前駆細胞内への遺伝子移入をＰＢＭＣｓのレトロウイルス感染が許容するということを示す。これは、インビトロにおける短時間培養と標的リンパ球の限定増殖を含む遺伝子移入プロトコールの追加の利点であることができる。
　さらに、遺伝子移入及び発現の効率に対するベクター構築物の影響を分析した。使用されたベクター構築物内では、そのリポーター遺伝子は、あるいは、内部ＳＶ４０又はＨＳＶ−ＴＫプロモーターの制御下のレトロウイルス転写ユニット内（それぞれ、ＮＳＶ−ＮとＮＴＫ−Ｎベクター）内に、ＭｏＭＬＶウイルスＬＴＲ下（ＬＮＳＮ／ＳＦＣＭ）、又はヒトＡＤＡプロモーターの制御下のレトロウイルス転写ユニット外（“ダブル・コピー”ベクターＤＣＮ）に置かれた。リポーター遺伝子としての本発明に係るレセプターの使用は、単一細胞分割により、異なるＰＢＬサブ集団内の遺伝子発現レベルの研究を許容した。
　選択された産生体クローンにおける異なるベクターについて得られたウイルス・タイターは、かなりのものであった。但し、そのＤＣＮ産生体細胞は一貫して他の３つのベクターについてのものよりも５倍まで低いタイターを作り出し、これは、ウイルスＬＴＲ内の余分の配列が、たぶん逆転写／組み込み工程を妨害することにより、その形質導入効率を減少させることができることを示唆している。これは、再編成プロウイルスとして組み込まれるＤＣＮの比較的高い傾向をも反映し、この再編成プロウイルスはさらに、このタイプのベクターにより得られることができる全体的な遺伝子移入効率をさらに減少させる。
　遺伝子発現のレベルは、内部転写単位に基づくベクターがｍＲＮＡ蓄積とタンパク質発現の両方に関して最小効率であったことを示した。この唯一の例外は、ＥＢＶ−感染Ｂ−細胞系ＲＩＭにおける２つの異なるベクター（ＮＳＶ−ＮとＬＮＳＮ／ＳＦＣＭ）内のＳＶ−４０プロモーターにより作られたひじょうに高レベルの転写であった。これは、ＳＶ−４０エンハンサーによるＥＢＶトランス−作用性タンパク質の相互作用を原因とすることができる。これに反し、報告された遺伝子の発現のためのＭｏＭＬＶ　ＬＴＲ及びヒトＡＤＡプロモーターに基づくベクターは全造血系においてひじょうに効率的に働いた。Ｔ−セルラインとクローンの分析は本質的に同じ結果を与えた。ＬＮＳＮとＤＣＮベクターの両方が、未熟前駆体を含む全Ｔ細胞サブ集団内の高レベルの遺伝子発現の指令においてひじょうに効率的であり、そして高数の継代を通じてこれらのレベルは変化せずに維持された。
　結論として、ＬＴＲ−べース・レトロウイルス・ベクターは、ヒトＰＢＬｓ内への遺伝子移入及び発現のためにたぶん最も信頼性があり、そして効率的であり、一方、遺伝子発現に関してはひじょうに良好であるが、上記ＤＣデザインは、低タイターとゲノム再編成への傾向の両方により一般的に低い遺伝子移入効率をもたらす。しかしながら、このタイプの構築物は、組織特異的、誘導性、又はその他ＬＴＲ−独立遺伝子発現が強制的な要求であり、又はその他ＬＴＲ失活が生じることができるかもしれない組織内にあるとき、選ばれるベクターであることができた。我々は本研究においてこの論点について言及しなかったけれども、ヒト造血幹細胞は、ネズミ造血系内で観察されたものに対する類似性により、これらの組織の中にあるであろう。
　レトロウイルス・ベクター−仲介細胞マーキングについて、いずれのシグナル伝達をも、その表面上に存在するレセプターがその結合性パートナーへの結合の後にはっきりと、もたらすことができないような方法で、そのレセプターの細胞内ドメインが全体的に又は部分的に欠失又は修飾されている細胞表面分子をコードし又は細胞表面分子ＬＮＧＦＲをコードする遺伝子の使用は、その細胞膜上で発現されないマーカー遺伝子、通常ＮｅｏＲ遺伝子を使用する先の遺伝子マーキング実験において使用されたベクターを超える重要な利点を提示した。このタイプのベクターは、細胞マーキングのインビボにおける臨床前及び臨床研究のための潜在的な利点を提示するであろう。
　　【実施例】
実施例１
レトロウイルス・ベクター
　リポーター遺伝子としてのＬＮＧＦＲの発現のためのさまざまなレトロウイルス・ベクターを、（例えば、ＰｖｕＩＩとＳｓｔＩによる制限酵素処理により）ヒトＬＮＧＦＲｃ　ＤＮＡ１６の全体コード１．５ｋｂ　ＳｓｔＩ断片又は細胞内ドメインをもたない切断ＬＮＧＦＲｃ　ＤＮＡを使用して、作った。ＮＳＶ−ＮとＮＴＫ−Ｎベクターを、それぞれ、ＮＳＶとＮＴＫベクターのユニークＨｉｎｄＩＩＩとＢｇ１ＩＩ部位内にそのＬＮＧＦＲ　ｃＤＮＡをクローニングすることにより得た。ＮＳＶベクターを、ＳＶ４０の初期プロモーター・エンハンサー及び上記ユニークＸｈｏＩクローニング部位への複製起点を含む０．４ｋｂ　ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の挿入によりその元のＮ２ベクター１７から得た。このＮＴＫベクターも、８５２塩基対の単純ヘルペス・ウイスル（ＨＳＶ）チミジン・キナーゼ（ＴＫ）プロモーターの挿入によりＮ２から得た。
　このＬＮＳＮベクターを、ＬＸＳＮベクター５のＨｐａＩ部位内への上記ＬＮＧＦＲ　ｃＤＮＡの挿入により構築した。
　ＤＣＮベクター（ダブル・コピーＬＮＧＦＲ）においては、このＬＮＧＦＲ　ｃＤＮＡは、Ｎ２Ａレトロウイルス・ベクター／ポリリンカー６のＢａｌＩＩ／ＳｎａＢＩ部位内にヒト・アデノシン・デアミナーゼ（ＡＤＡ）プロモーター１８の０．８ｋｂ　ＳｓｐＩ／ＮｃｏＩ断片の制御下で、クローン化された。
　全く同様に、ＮＳＶ−Ｎ，ＮＴＫ−Ｎ，ＬＮＳＮとＤＣＮベクターにおいて、ＬＮＧＦＲ　ｃＤＮＡの代わりに切断ＬＮＧＦＲ　ｃＤＮＡ（ΔＬＮＧＦＲ）を使用することができる。
　本発明に係るさまざまなベクター構築物を図３と４中に示す。
　ベクターＤＮＡを上記トランス感染プロトコールにより対応のベクターに変換した。簡単に言えば、ベクターＤＮＡを、トランスフェクション後４８時間標準的なリン酸カルシウム共沈法２０によりψ２環境向性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）パッケージング・セルライン１９内にトランスフェクトし、ψ２上清を収穫し、そして８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在中１６時間両向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）パッケージング・セルラインＰＡ３１７２１を感染させるために使用した。感染されたＰＡ３１７細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を補われ、そして０．８ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で選択し、そして次に１０４〜５×１０５ｃｆｕ／ｍｌのレンジにあるタイターをもつヘルパー不含ウイルス含有上清を作るために使用した。全てのベクターが、ネオマイシン・アナログＧ４１８に対する耐性をインビトロにおいて付与するネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＮｅｏＲ遺伝子を含む。
造血セルラインの感染
　この研究において記載される全てのセルラインは、ＲＩＭとＪ．Ｍ．を除いて、ＡＴＣＣから得て、そして１０％ＦＣＳを補ったＲＰＭＩ　１６４０（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。Ｋ５６２とＫＧ１は、それぞれ、慢性と急性骨髄原性白血病から得た骨髄セルラインであり；ＭＯＬＴ−４は、安定性Ｔ細胞白血病（ＣＤ８＋）であると考えられ；ＲＩＭはＥＢＶ−形質転換リンパ芽セルラインであり；Ｊ．Ｍ．はＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ−リンパ芽セルラインであり；Ａ８７５は〜１０６ＬＮＧＦＲ／細胞を発現するヒト・メラノーマ・セルラインである。
　５×１０５標的細胞を、８μｇ／ｍｌポリブレンを含む非希釈ウイルス上清により１６時間感染させ、完全培地中でさらに２４時間増殖させ、そして次にＧ４１８の先に決定した投与量（０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌ）の存在中で選択した。さらなる分析をＧ４１８選択細胞のバルク・カルチャーに対して行った。
ヒトＰＢＭＣの感染
　末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）グラジエント分離により健康なドナーから得て、そしてフィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ））とヒト組換えインターロイキン２（ｈｕ−ｒＩＬ２）刺激（２μｇ／ｍｌの精製ＰＨＡ，Ｗｅｌｌｃｏｍｅ，Ｌａｂｓ．，Ｄａｒｔｆｏｒｄ，ＵＫ；１００Ｕ／ｍｌのｈｕ−ｒＩＬ２，Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）の下で７２時間増殖させた。ウイルス感染を、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在中６時間無細胞ウイルス・ストックに刺激されたＰＢＬを晒すことにより行った。感染４８時間後に、ＰＢＬを、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１％非−必須アミノ酸、１％ピルビン酸Ｎａ、５％ヒト血清（ＨＳ）と１００Ｕ／ｍｌ　ｈｕ−ｒＩＬ２（完全培地）を補い、０．４ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８を含むＲＰＭＩ　１６４０中で選択した。細胞密度を、Ｇ４１８選択の２週間の間に一定（５×１０５細胞／ｍｌ）に維持した。レトロウイルス形質導入ヒトＴ−リンパ球も、支持細胞として照射ヒトＰＢＬの存在中０．４ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８を含む完全培地中各種細胞濃度（１−１０３細胞／ウェル）においてＴｅｒａｓａｋｉプレート内でクローン化した。
　レトロウイルス感染効率を改善するために、ヒトＰＢＬを完全培地中で４８−７２時間ウイルス産生細胞と同時培養した。この同時培養を、細胞と細胞の接触を妨ぐためにＴｒａｎｓｗｅｌｌプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）内でも行った。３×１０５産生体細胞を６ウェル皿のクラスター・プレート・ウェル内に接種し、そして３７℃において一夜インキュベートした。５×１０５刺激ＰＢＬをそのＴｒａｎｓｗｅｌｌ内に添加し、そして８μｇ／ｍｌポリブレンの存在中で４８−７２時間培養した。
　レトロウイルス形質導入細胞を、レセプター発現のためのフロー・サイトメトリーにより分析し、そしてさらなる分析のために増殖させた。
ＤＮＡ分析
　高分子量ＤＮＡを、標準的なフェノール／クロロホルム抽出２０により細胞から得て、適当な制限酵素（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を含む５μｇアリコート中で完全に消化し、トリス−アセテート−ＥＤＴＡバッファー中１．５Ｖ／ｃｍにおいて０．８％アガロース・ゲル中で電気泳動し、サザン・キャピラリー・ブロッティング２０によりナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に移写し、そして１０７ｄｐｍの〔３２Ｐ〕−標識・プローブにハイブリダイズさせた。
ＤＮＡ分析−サザン・ブロット
プローブ：
　１）ｐＳＶ２−ｎｅｏの断片及び
　２）ＴＣＲ−β−定常領域を含む断片。
　ＤＮＡプローブは、ヒトＴＣＲ−β定常領域２３を含む、ｐＳＶ２−ｎｅｏ２２の１．２ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓｍａ　Ｉ断片及びＹＴＪ−２　ｃＤＮＡクローンのＨｉｎｃＩＩ３′断片であった。フィルターを高ストリンジェント条件下で洗浄し、そして−７０℃においてＫｏｄａｋ　Ｘ−ＡＲ　５フィルムに露出させた。
ＲＮＡ分析−ノーザン・ブロット
プローブ：
　１）ｐＳＶ２ｎｅｏの断片及び
　２）ＬＮＧＦＲ　ｃＤＮＡの断片。
　全細胞ＲＮＡを、グアニジン−イソチオシアネート技術２４により抽出し、そしてオリゴ（ｄＴ）−セルロース・クロマトグラフィー２０によりｐｏｌｙ（Ａ）＋について選択した。５μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを、１％アガロース−ホルムアルデヒド・ゲル上でサイズ分画し、ノーザン・キャピラリー・ブロッティング２５によりナイロン膜上に転写し、そしてサザン・プロットについて記載したようにハイブリダイズさせ、洗浄し、そして露出させた。ＤＮＡプローブは、ｐＳＶ２−ｎｅｏの１．２ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓｍａ　Ｉ断片とＬＮＧＦＲ　ｃＤＮＡ１６の１．５ｋｂ　Ｓｓｔ　Ｉ断片であった。
細胞表面表現型
　１）蛍光標識をもつ抗ヒトＬＮＧＦＲ及び
　２）ＰＥ結合抗−ヒトＭｏＡｂｓ
を使用してフロー・サイトメトリーによりモニターされたＬＮＧＦＲの発現。
　ＬＮＧＦＲの細胞表面発現を、間接蛍光標識法によるネズミ抗−ヒトＬＮＧＦＲモノクローナル抗体２０．４（ＡＴＣＣ）を使用したフロー・サイトメトリーによりモニターした。Ｔ−リンパ球系及びクローンの細胞表面表現型を、ＰＥ−結合抗−ヒト−ＣＤ４（Ｔ４）、ＣＤ８（Ｔ８），ＣＤ５，Ｂ４，ＣＤ２５Ｒ，Ｌｅｕ７、ＣＤ３４モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）によるフロー・サイトメトリーにより測定した。簡単に言えば、５×１０５細胞を３０分間４℃において１００μｌの希釈抗体により染色し、ＦＣＳを含まない培地中で２回洗浄し、そしてＦＡＣＳ分析のために０．５ｍｌのＰＢＳ中に又は１００μｌの希釈ＦＩＴＣ−結合２次抗体中に再懸濁した。２重染色分析をＦＩＴＣ−及びＰＥ−結合抗体の順番のインキュベーションにより行った。
　ＰＣＲを介してのＴＣＲ　Ｖβ−鎖用法の分析
　全ＲＮＡを、ＧＴＣを使用してＰＢＬとＴセルラインから抽出し２６、オリゴｄＴとｄＧテイルを使用してｃＤＮＡに逆転写し２７、得られたＤＮＡの１／２０をＶβ−Ｃβ特異的オリゴヌクレオチドの使用によりＰＣＲに供し２８、そして参考文献２７中に記載されたような、Ｃβ−特異的オリゴヌクレオチド
（５′−ＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＡＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＴＴ−３′）
（配列番号：２）を使用してアンカーＰＣＲに供した。ＰＣＲ増幅サイクルを、９４℃において４５分間、５７℃において４５分間、そして７２℃において１時間で行った。増幅された生成物をゲル精製し、そしてブルースクリプト・プラスミド・ベクター内にクローン化した。Ｃβ陽性コロニーを異なるプレート上に複製し、そしてニトロセルロース・フィルターに転写し、そして以下の条件：６×ＳＳＣ、１％ｂｌｏｔｔｏ、０．１％ＳＤＳ及び５ｍＭ　ＥＤＴＡ、４２℃、３−６時間、の下でＶβ−特異的オリゴヌクレオチド２８，２９にハイブリダイズし、そして６×ＳＳＣ中で同一温度において１時間洗浄し、そして室温においてＸ−線フィルムに６−１２時間露出させた。
結果
ＬＮＧＦＲの発現のための組換えレトロウイルスの作出
　ＬＮＧＦＲ発現のためのさまざまなレトロウイルス・ベクター構築物を開発し、そしてウイルス産生セルラインの作出のために使用した。ＮＳＶ−Ｎ（図１Ａ）とＮＴＫ−Ｎ（図１Ｃ）構築物は、ＬＮＧＦＲ　ｃＤＮＡを駆動するプロモーター、すなわち、それぞれ、ＳＶ４０初期プロモーターとＨＳＶ−ＴＫプロモーターに基づくものであった。ＬＮＳＮベクター（図１Ｅ）においては、そのＬＮＧＦＲ遺伝子はそのウイルスのＬＴＲから発現される。ＤＣＮ構築物（図１Ｇ）においては、そのＬＮＧＦＲ　ｃＤＮＡは、その３′ＬＴＲのＶ３領域内の、ヒトＡＤＡプロモーターの制御下にある。ＳＦＣＭ構築物は、その細胞内ドメインが欠失している（ΔＬＮＧＦＲ）、切断ＬＮＧＦＲ遺伝子を含む。標的細胞の感染後、その切断遺伝子を２本鎖とし、そしてその５′ＬＴＲに転移させ６、このように、ＡＤＡ−ＬＮＧＦＲミニ遺伝子の２コピーを含むプロウイルスを作出する。全てのベクターが、ウイルスＬＴＲ（ＮＳＶ−Ｎ，ＮＴＫ−ＮとＤＣＮ）又はＳＶ４０初期プロモーター（ＬＮＳＮとＳＦＣＭ）のいずれかの制御下に、ＮｅｏＲ遺伝子を担持していた。
　これらのベクターを、異なる系統のヒト造血セルライン及びヒトＰＢＬ内にＬＮＧＦＲ遺伝子（及びその切断ＬＮＧＦＲ遺伝子のそれぞれ）を形質導入するために使用し、そしてそれらは全て、
　１）ヒト標的細胞を形質導入し、
　２）組み込み、そして無傷のプロウイルスを形成し、そして
　３）リポーター遺伝子を発現する、
ことができる。
　両向性産生体セルラインのウイルス・タイターは、ＮＳＶ−Ｎ，ＮＴＫ−Ｎ，ＬＮＳＮとＳＦＣＭベクターについて１×１０４〜５×１０５ｃｆｕ／ｍｌの、そしてＤＣＮについて５×１０３〜１×１０４ｃｆｕ／ｍｌのレンジにあった。
ヒト造血セルラインにおけるウイルス組み込みの分子分析
　各種ベクターの開始スクリーニングのために、血液−リンパ球産生起源をもつ多数の腫瘍セルラインを遺伝子移入のための標的細胞として使用した。２つの骨髄セルライン（Ｋ５６２とＫＧ１）、２つのバーキット・リンパ腫（ＲａｊｉとＤａｕｄｉ）、１つのＥＢＶ−形質転換リンパ芽セルライン（ＲＩＭ）、及び２つのＴ−リンパ芽セルライン（ＭＯＬＴ−４とＪ．Ｍ．）を４つのレトロウイルス・ベクターを用いて形質導入し、そしてＧ４１８の存在中で選択した。レトロウイルス組み込みの分子分析を、サザン・ブロッティングにより行って、組み込まれたウイルスのサイズとコピー数を検出した（約１〜５コピー／細胞）。ゲノムＤＮＡを、全てのベクターの５′と３′ＬＴＲの両方内で切断するＸｂａ　Ｉにより消化して（図１）、組み込まれたプロウイルスのサイズを検出し、そしてゲノムＤＮＡ内でのみ切断するＢｇｌＩＩにより消化して、組み込み部位の数を推定した。Ｘｂａ　Ｉ−及びＢｇｌＩＩ−消化ＤＮＡを順番にＮｅｏＲとＬＮＧＦＲ遺伝子特異的プローブにハイブリダイズさせた。
　ＮＳＶ−Ｎベクターの組み込みは、全てのＧ４１８−選択セルラインにおいて（図２Ａ）、無傷のプロウイルスに対応する、予想５．１ｋｂサイズの単一Ｘｂａ　Ｉバンドを作り出した。Ｒａｊｉ細胞においては、より小さなサイズの追加のバンドが観察され、これは、再編成されたプロウイルスの組み込みを示している（図２Ａ、レーン３）。
　同様に、ＸｂａＩ消化は、全ＮＴＫ−Ｎ−感染セルラインからのＤＮＡ内に予想された５．４ｋｂサイズの単一バンドを作り出した（図２Ｂ）。たぶん再編成プロウイルスの存在による追加のバンドがＲＩＭサンプル内にのみ検出された（図２Ｂ、レーン５）。４．５ｋｂの単一バンドは、ＬＮＳＮとＳＦＣＭベクターにより形質導入された全てのサンプル内で見られたが、ウイルス再編成の証拠はない（図２Ｃ）。これに反し、ＤＣＮにより感染された細胞からのＤＮＡ内でのウイルス組み込みのパターンは頻度のある再編成を特徴とした（図２Ｄ）。ＤＣＮ−形質導入セルラインの全ては、無傷のプロウイルスに対応する、５．４ｋｂバンドの存在を示したが、３．２ｋｂの追加のバンドを１（ＫＧ１）を除くすべてのセルライン内で検出された。２つのバンドの相対比は、分析されたサンプル中で変化し、無傷のプロウイルス優性（ＭＯＬＴ４、図２Ｄ、レーン６）から再編成されたものに広がる（Ｒａｊｉ、図２Ｄ、レーン３）までのレンジにあった。同一レトロウイルス・ストックによる反復感染は、無傷と再編成プロウイルスの間の比率が、ランダム、非−細胞−特異的事件であることを示していた。
　他の全てのベクターにより形質導入されたセルラインについて観察したとき、ＢｇｌＩＩパターンは、ＤＣＮ感染が全てのセルライン内でのポリクローナル組み込みを作り出したことを示した。
　ランダム・プロウイルスの作出の責任を負う性質と機構を調査するために、我々は、ＡＤＡ−ＬＮＧＦＲミニ遺伝子内で２回切断するＨｉｎｄＩＩＩによるゲノムＤＮＡの追加の消化、その後の、ＬＮＧＦＲプローブによるハイブリダイゼーションを行った。両プローブによるＸｂａＩとＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限パターンの比較分析は、３．２ｋｂバンドが、両ＬＴＲからＡＤＡ−ＬＮＧＦＲミニ遺伝子を欠く再編成プロウイルスに対応したことを示した。欠陥プロウイルスも、ＤＣＮ産生体セルラインの選択の間高頻度で検出された。全ての我々の実験において使用されたクローンは無傷のプロウイルスだけを宿し、これは、欠陥プロウイルスの生成が標的細胞内での組み込みの間に生じ、そしてその産生体セルラインの欠陥によるものではないということを示している。
　要約すれば、ＮＳＶ−Ｎ，ＮＴＫ−Ｎ，ＬＮＳＮ及びＳＦＣＭによる全てのセルラインの感染は、ほとんど再編成されていないプロウイルスの低コピー数を担持するＧ４１８−耐性集団を発生させ、一方、ＤＣＮベクターによる感染は、その組み込み過程の間にレトロウイルス・ベクターの３′ＬＴＲからのＡＤＡ−ＬＮＧＦＲミニ遺伝子の損失により最も多くは誘導される、高頻度において一般的に再編成されたプロウイルスを作り出した。この問題は、ウイルスＬＴＲ内の挿入遺伝子のサイズと性質に因るものであることができ、他の“ダブルーコピー”ベクター構築物による同様の限定が観察されなかった１２−１４。
ヒト造血セルライン内でのベクター−仲介ＬＮＧＦＲ発現
　各種レトロウイルス・ベクターにより形質導入さたＬＮＧＦＲの発現を、タンパク質とｍＲＮＡの両方のレベルにおいて評価した。Ｇ４１８−選択セルライン内でのＬＮＧＦＲの細胞表面発現を抗−ＬＮＧＦＲ　ＭｏＡｂを用いたフロー・サイトメトリーにより定量分析した。これらの結果を表１中に要約した。ＮＳＶ−Ｎ−とＮＴＫ−Ｎ−形質導入セルラインのほとんどは、相対平均蛍光（＜１００任意単位）として表される、低−中レベルの表面ＬＮＧＦＲを示した。高発現のＬＮＧＦＲ（２０２ａ．ｕ．）をＮＳＶ−Ｎにより形質導入されたＥＢＶ−感染ＲＩＭセルライン内でのみ観察された。ＬＮＧＦＲ発現を、ＮＴＫ−Ｎ−形質導入されたＭＯＬＴ−４セルライン内では検出されなかった。但し、プロウイルス・ゲノムの再編成はＸｂａ　Ｉ−消化ゲノムＤＮＡ内では全く検出されなかった（図２Ｂ、レーン６）。同一セルライン内でのこのベクターによる反復遺伝子移入は、一貫して陰性の結果を与えた。
　ＬＮＳＮとＳＦＣＭレトロウイルス・ベクターにより形質転換された全てのセルラインが、中一高レベル（５０−２００ａ．ｕ．）においてＬＮＧＦＲを発現した（表１）。
　ＤＣＮ−形質導入セルラインのほとんどが中又は高レベルのＬＮＧＦＲ（５０−２００ａ．ｕ．）を発現した。ＤＣＮ−形質転換セルラインのＦＡＣＳプロフィールは、サザン分析から得られた結果と相関し、ここで、無傷のものに加えて再編成されたプロウイルスを宿すセルラインは、それぞれ、無傷と再編成プロウイルスに対応するバンドの相対強度に比例する陰性と陽性ピークをもつ２相（ｂｉｐｈａｓｉｃ）曲線を示した。
　形質導入された細胞（Ｋ５６２）内でのベクター特異的ＲＮＡの発現を、ＬＮＧＦＲとＮｅｏプローブにハイブリダイズした。Ｇ４１８−選択セルラインから単離されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノーザン・プロッティングにより測定した。得られたパターンは、各々のレトロウイルス・ベクターの予想された転写プロフィールと矛盾しなかった。ＮＳＶ−Ｎ−及びＮＴＫ−Ｎ−形質導入細胞においては、非スプライス及びスプライスされたＲＮＡ種は、ＬＮＧＦＲとＮｅｏプローブの両方にハイブリダイズした。ＬＮＧＦＲ−特異的ｍＲＮＡを含むＳＶ−４０−及びＴＫ−誘導サブ−ゲノム転写は、ＬＮＧＦＲプローブヘのハイブリダイゼーション後にだけ観察された。ＬＮＳＮ−又はＳＦＣＭ−形質導入細胞は非スプライスＲＮＡ形態だけを発現し、これは、ＮｅｏＲとＬＮＧＦＲプローブの両方にハイブリダイズする。これは、ＬＮＳＮとＳＦＣＭがそれから誘導された５、ＬＸＳＮベクター内でのスプライス・ドナー部位の報告された失活と矛盾しない。ＳＶ４０−誘導ＮｅｏＲ　ｍＲＮＡに対するより短い転写物は、ＮｅｏＲプローブにだけハイブリダイズした。
　ＤＣＮベクターは、２つのＬＴＲ−誘導ゲノム転写物、それぞれ非スプライスとスプライスされた形態を作出した。第３のＲＮＡ種は、ＡＤＡプロモーターから転写され、そして最も多くは、ＬＮＧＦＲ合成のための主要なｍＲＮＡ鋳型として使用された。ＬＮＧＦＲ転写物に対する５′又は３′ＬＴＲ内のＡＤＡプロモーターの相対的な貢献は、この技術によっては評価されることができない。遅く転移するＲＮＡ形態は、５′ＬＴＲ内のＡＤＡプロモーターから開始され、そして３′ＬＴＲ内のポリ（Ａ）付加において終結する読み通し転写物を提示することができた。ＮｅｏＲプローブにだけハイブリダイズする２つの追加の、説明のできないＲＮＡ種も検出された。全てのＤＣＮ−形質導入セルライン内に存在するこれらの転写物は、Ｒａｊｉ細胞内で検出された唯一のＲＮＡ種であり、これは、ＬＮＧＦＲを発現せず、そしてサザン・プロット分析により立証されるように、再編成されたプロウイルスだけを担持していた。それ故、たぶん、これらの転写物は、ＡＤＡｐ−ＬＮＧＦＲミニ遺伝子を欠く再編成プロウイルスに特異的なものであろう。
　他のセルラインにおいて観察されたＲＮＡ発現パターンは、Ｋ５６２から得られたものに匹敵した。唯一の例外は、ＮＳＶ−Ｎ，ＬＮＳＮとＳＦＣＭからの、高レベルのＳＶ４０−誘導転写物を一貫して示すＥＢＶ−感染ＲＩＭセルラインであった。
ヒトＰＢＬ内へのベクター−仲介遺伝子移入の効率
　ヒトＰＢＬをＰＨＡとＩＬ−２刺激の下レトロウイルス・ベクターにより感染させた。感染頻度を推定するために、感染後４８時間、Ｔ細胞を限界希釈条件（１〜１０３細胞／ウェル）下で培養した。感染された及び非感染の対照細胞を０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在又は非存在中で培養した。細胞増殖をプレーティングの後１４日間評価した。このとき、Ｇ４１８の存在中で培養された非感染細胞を含むウェル内では生存細胞は全く検出されることができなかった。全体の感染頻度は、ベクター上清のウイルス・タイターに依存して、１％未満〜５．１％のレンジにあった。しかしながら、有意な変化性は、各種ドナー内で観察されなかった。遺伝子移入の効率は、多数の感染サイクル又は同時培養により増加されることができる。４８時間の、照射ウイルス−産生セルラインによるＰＢＬの同時培養は、良好な遺伝子移入効率（１０〜１５％）を一貫して提供した。ＬＮＧＦＲとＴ細胞マーカーの２重蛍光分析は、ＬＮＧＦＲ陽性集団内でのベクター産生細胞による汚染の可能性を除外した。この実験においては、ＬＮＧＦＲ発現の頻度は、全て、感染されたＰＢＬによる形質導入された遺伝子の発現によるものであった。なぜなら、ＦＡＣＳ分析において陽性な全ての細胞がヒトＣＤ３を同時に発現していたからである。遺伝子移入の開始効率から独立して、形質導入されたＰＢＬは、Ｇ４１８との陰性選択又は、ＬＮＧＦＲに対して向けられたモノクローナル抗体に結合された磁気ビーズによる陽性免疫選択のいずれかにより同質まで選択されることができる。代表的な実験においては、免疫選択の単一ラウンドは、非感染ＰＢＬからの形質導入された細胞の集団の分離のために十分であった。一旦、これらの磁気ビーズが除去されれば、形質導入されたリンパ球の均質集団を形質導入された細胞の有意な損失を伴わずに得られた。
　ヒトＰＢＬの感染におけるウイルス・ベクターの効率を評価するために、多数のＰＢＬバルク培養を、独立して、異なるレトロウイルス・ベクターを含む上清に晒すことにより形質導入し、そしてベクターの存在と発現についてＧ４１８により選択した。ベクター−形質導入カルチャーの中の１０（２×ＮＳＶ−Ｎ，　３×ＮＴＫ−Ｎ，　２×ＬＮＳＮ／ＳＦＣＭ及び３×ＤＣＮ）を、サザン・ブロッティングによりプロウイルスの組み込みについて分析した。全てのベクターの５′と３′ＬＴＲの両方の内で切断する代表的なＸｂａ　ＩのＮｅｏＲプローブヘのハイブリダイゼーション（図１）は、組み込まれたプロウイルスのサイズの検出を可能にし、そしてゲノムＤＮＡ内だけで切断するＢｇｌＩＩを用いて、組み込まれた部位の数の推定を可能ならしめた。ＮＳＶ−Ｎ，ＮＴＫ−Ｎ、及びＬＮＳＮ／ＳＦＣＭにより形質導入された全てのリンパ球カルチャーにおいて、無傷の組み込まれたプロウイルスに対応するバンドだけが検出され、一方、再編成されたプロウイルスに対応する追加のバンドが全てのＤＣＮ−形質導入されたカルチャーにおいて観察された。
　最終的に、プロウイルス組み込みの分析は、ＮＳＶ−Ｎ−，ＮＴＫ−Ｎ−及びＬＮＳＮ−／ＳＦＣＭ−形質導入Ｔ−細胞カルチャーが広くポリクローナルであり、一方、ＤＣＮ−形質導入されたカルチャーは、優性バンド及びほんの少しの小さなものの存在により示されるように、本質的にオリゴフローナルであった。先に示唆されたように、これは、たぶん低いウイルス・タイターに因り、そしてベクター−産生セルラインによる標的細胞の同時培養を含む異なる遺伝子移入プロトコールにより回避されることができたであろう。
ヒトＴ−リンパ球に対するＬＮＧＦＲのベクター−仲介発現
　ＬＮＧＦＲの細胞表面発現を、全部で２３のレトロウイルス・ベクター−形質導入Ｔ−リンパ球カルチャー（５ＮＳＶ−Ｎ−，８ＮＴＫ−Ｎ−，５ＬＮＳＮ−及び５ＤＳＮ−形質導入細胞系）においてＦＡＣＳ分析により検出した。ＬＮＧＦＲ発現は、全てのＮＳＶ−Ｎ−形質導入細胞において、そして８のＮＴＫ−Ｎ−形質導入細胞培養の中の６において低かった。残りの２つのＮＴＫ−Ｎ−形質導入されたＴ−セルラインは、中程度のレベルのＬＮＧＦＲ発現を示した。異種発現レベルがＬＮＳＮ−ＳＦＣＭ細胞培養において観察され、２つの系がＬＮＧＦＲの、低レベルを、２つが中程度のレベルを、そして１つが高程度のレベルを発現した。５つの系の中の４つが、ＬＮＧＦＲの、低いレベルを発現し、そして１つが中間レベルを発現した。
　感染細胞を特徴付けするために、我々は、モノクローナル抗体抗−ＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ５，Ｂ４，Ｌｅｕ７，ＣＤ２５Ｒ及びＣＤ３４を使用して、細胞表面リンパ球識別抗原の発現について１３の形質導入されたセルラインについてテストした。全てのテストされたセルラインはＣＤ５とＣＤ２５Ｒ発現について陽性に等級付けされ、そしてＬｅｕ７，Ｂ４とＣＤ３４発現において陰性に等級付けされた（データを示さず）。１３の分析されたカルチャーの中の８がＬＮＧＦＲ＋／ＣＤ８＋であり、１がＬＮＧＦＲ＋／ＣＤ４＋であり、そして４がＬＮＧＦＲについて陽性であり、そしてＣＤ８とＣＤ４を同時発現する異なるパーセンテージの細胞を含んでいた。ＰＨＡとＩＬ−２刺激カルチャー中のＣＤ８＋表現型の優勢も非感染対照セルラインにおいて観察され、そしてたぶんＴ細胞培養手順の一定のバイアスを提示する。一般的には、我々は、４つのレトロウイルス・ベクターの中のいずれかによる特定の細胞サブセットの選択的形質導入を観察しなかった。
　Ｔ細胞クローンを、約１％の平均感染頻度を考慮して、限界希釈（１０００，１００と１０細胞／ウェル）において細胞をプレーティングすることによりベクター形質導入Ｔ細胞カルチャーから得た。全ての検査されたクローンの７２％がＬＮＧＦＲ＋／ＣＤ４＋であり、そして２８％がＬＮＧＦＲ＋／ＣＤ８＋であった。ＣＤ４＋表現型の優勢も対照、同一ドナーからのクローン化された非感染Ｔ細胞において観察され、そして我々のクローニング条件下で標準的な発見として考えられている。さらに、レトロウイルス形質導入及びＬＮＧＦＲ発現が２重陽性、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋クローンにおいて達成された。これらの結果は、レトロウイルス感染が、成熟ＣＤ４＋とＣＤ８＋細胞において生じるだけでなく、未成熟ＣＤ４＋／ＣＤ８＋２重陽性末梢血液リンパ球においても生じることができたということを立証する。
ベクター形質導入Ｔ−リンパ球におけるＴ細胞レパートリーの分析
　先に示したように、ウイルス組み込みのサザン・プロット分析は、ベクター感染Ｔ細胞カルチャーのポリクローナルの性質を立証した。これは、ＴＣＲβ鎖定常領域に特異的なプローブにハイブリダイズしたＸｂａ・消化ＤＮＡサンプルに対するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）β鎖再編成の分子分析によりさらに確認された。生殖系列に加えて優勢バンドを全くもたないポリクローナル・パターンが、ＮＳＶ，ＮＴＫ−ＮとＬＮＳＮ／ＳＦＣＭにより形質導入されたＴ細胞カルチャーにおいて検出された。優勢再編成バンドの限定された数の存在は、オリゴクローナル細胞集団に関して、ＤＣＮ−感染カルチャーにおいて観察された。
　これらの観察に対するさらなる確認を、形質導入されたリンパ球におけるＴＣＲＶβ−鎖用法の系統的分析により得た。ベクター含有上清によるＰＢＬ感染の単一サイクル、その後の、Ｇ４１８による形質導入された細胞の選択の後、選択されたリンパ球集団の全ＲＮＡを逆転写し、そして得られたＤＮＡを、Ｖβ−Ｃβ特異的オリゴヌクレオチドの使用によりＰＣＲに供し、そして方法セクションにおいて記載したようにＣβ特異的オリゴヌクレオチドを使用してアンカーＰＣＲに供した。Ｖβ−特異的オリゴヌクレオチドによる増幅された生成物の分析は、非形質導入／非選択リンパ球の元の対照集団に比較したとき同一のレパートリーを示した。ＴＣＲ−β鎖再編成のサザン・プロット分析の結果と同様に、ベクター上清中の低ウイルス・タイターは、限定されたＶβレパートリーを作り出した（データを示さず）。低タイター・ベクターのこの限界は、産生体セルラインとのＰＢＬの同時培養又は多感染サイクルにより回避されることができた。
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６）Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓ　Ｐ．Ａ．，Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ　Ｂ．Ａ．，Ｕｎｇｅｒｓ　Ｇ．，Ｇｉｌｂｏａ　Ｅ．：レトロウイルス・ベクターの転写単位の外側へのアデノシン・デアミナーゼ・ミニ遺伝子の移入の間の改善された遺伝子発現。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：３５１９，１９８９
７）Ｋａｓｉｄ　Ａ．，Ｍｏｒｅｃｋｉ　Ｓ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ　Ｐ．，Ｃｏｒｎｅｔｔａ　Ｋ．，Ｃｕｌｖｅｒ　Ｋ．，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｓ．，Ｄｉｒｅｃｔｏｒ　Ｅ．，Ｌｏｔｚｅ　Ｍ．Ｔ．，Ｂｌａｅｓｅ　Ｒ．Ｍ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｗ．Ｆ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　Ｓ．Ａ．：ヒト遺伝子移入：ヒトにおけるレトロウイルス−仲介遺伝子移入のための媒体としてのヒト腫瘍浸潤の特徴付け。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：４７３，１９９０
８）Ｃｕｌｖｅｒ　Ｋ．，Ｃｏｒｎｅｔｔａ　Ｋ．，Ｍｏｒｇａｎ　Ｒ．，Ｍｏｒｅｃｋｉ　Ｓ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ　Ｐ．，Ｋａｓｉｄ　Ａ．，Ｌｏｔｚｅ　Ｍ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　Ｓ．Ａ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｂｌａｅｓｅ　Ｒ．Ｍ．：マウスとヒトにおける遺伝子治療のための細胞媒体としてのリンパ球。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：３１５５，１９９１
９）Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　Ｓ．Ａ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ　Ｐ．，Ｃｏｒｎｅｔｔａ　Ｋ．，Ｋａｓｉｄ　Ａ．，Ｍｏｒｇａｎ　Ｒ．Ａ．，Ｍｏｅｎ　Ｒ．，Ｋａｒｓｏｎ　Ｅ．Ｍ．，Ｌｏｔｚｅ　Ｍ．Ｔ．，Ｙａｎｇ　Ｊ．Ｃ．，Ｔｏｐａｌｉａｎ　Ｓ．Ｌ．，Ｍｅｒｉｎｏ　Ｍ．Ｊ．，Ｃｕｌｖｅｒ　Ｋ．，Ｍｉｌｌｅｒ　Ａ．Ｄ．，Ｂｌａｅｓｅ　Ｒ．Ｍ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．：レトロウイルス遺伝子形質導入により修飾された腫瘍浸潤性リンパ球を使用した進行メラノーマをもつ患者のヒト免疫治療への遺伝子移入。Ｎｅｗ　Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ　Ｍｅｄ．３２３：５７０，１９９０
１０）Ｍｏｒｅｃｋｉ　Ｓ．，Ｋａｒｓｏｎ　Ｅ．，Ｃｏｒｎｅｔｔａ　Ｋ．，Ｋａｓｉｄ　Ａ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ　Ｐ．，Ｂｌａｅｓｅ　Ｒ．Ｍ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　Ｓ．Ａ．：腫瘍浸潤性リンパ球と末梢血液単核細胞から得られたＣＤ４＋とＣＤ８＋ヒトＴ細胞内へのレトロウイルス仲介遺伝子移入。Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２：３４２，１９９１
１２）Ｆｅｒｒａｒｉ　Ｇ．，Ｒｏｓｓｉｎｉ　Ｓ．，Ｇｉａｖａｚｚｉ　Ｒ．，Ｍａｇｇｉｏｎｉ　Ｄ．，Ｎｏｂｉｌｉ　Ｎ．，Ｓｏｌｄａｔｉ　Ｍ．，Ｕｎｇｅｒｓ　Ｇ．，Ｍａｖｉｌｉｏ　Ｆ．，Ｇｉｌｂｏａ　Ｅ．，Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ　Ｃ．：ヒト重症合併免疫不全のための体細胞遺伝子治療のインビボ・モデル。Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３６３，１９９１
１３）Ｆｅｒｒａｒｉ　Ｇ．，Ｒｏｓｓｉｎｉ　Ｓ．，Ｎｏｂｉｌｉ　Ｎ．，Ｍａｇｇｉｏｎｉ　Ｄ．，Ｇａｒｏｆａｌｏ　Ａ．，Ｇｉａｖａｚｚｉ　Ｒ．，Ｍａｖｉｌｉｏ　Ｆ．，Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ　Ｃ．：ヒトＡＤＡ欠陥Ｔリンパ球内へのＡＤＡ遺伝子の移入は特異的な免疫機能を再構築する。Ｂｌｏｏｄ　８０：１２０，１９９２
１４）Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ　Ｂ．Ａ．，Ｇａｌｌａｒｄｏ　Ｈ．Ｆ．，Ｕｎｇｅｒｓ　Ｇ．Ｅ．，Ｇｉｌｂｏａ　Ｅ．：ＴＡＲ配列の過剰発現はヒト免疫不全ウイルス複製に対する耐性を細胞に付与する。Ｃｅｌｌ　６３：６０１，１９９０
１５）Ｌｅｅ　Ｔ．Ｃ．，Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ　Ｂ．Ａ．，Ｇａｌｌａｒｄｏ　Ｈ．Ｆ．，Ｕｎｇｅｒｓ　Ｇ．Ｅ．，Ｇｉｌｂｏａ　Ｅ．：ＲＲＥ−誘導配列の過剰発現はＣＥＭ細胞内でのＨＩＶ−１複製を阻害する。Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ．４：６６，１９９２
１６）Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｄ．，Ｌａｎａｈａｎ　Ａ．，Ｂｕｃｋ　Ｃ．Ｒ．，Ｓｅｇｈａｌ　Ａ．，Ｍｏｒｇａｎ　Ｃ．，Ｍｅｒｃｅｒ　Ｅ．，Ｂｏｔｈｗｅｌｌ　Ｍ．，Ｃｈａｏ，Ｍ．：ヒトＮＧＦレセプターの発現と構造。Ｃｅｌｌ　４７：５４５，１９８６
１７）Ｋｅｌｌｅｒ　Ｇ．，Ｐａｉｇｅ　Ｃ．，Ｇｉｌｂｏａ　Ｅ．，Ｗａｇｎｅｒ　Ｅ．Ｆ．：多能性造血前駆体から誘導された骨髄及びリンパ球細胞内での外来遺伝子の発現。Ｎａｔｕｒｅ　３１８：１４９，１９８５
１８）Ｗｉｇｉｎｔｏｎ　Ｄ．Ａ．，Ｋａｐｌａｎ　Ｄ．Ｊ．，Ｓｔａｔｅｓ　Ｊ．Ｃ．，Ａｋｅｓｏｎ　Ａ．Ｌ．，Ｐｅｒｍｅ　Ｃ．Ｍ．，Ｂｉｌｙｋ　Ｉ．Ｊ．，Ｖａｕｇｈｎ　Ａ．Ｊ．，Ｌａｔｔｉｅｒ　Ｄ．Ｌ．，Ｈｕｔｔｏｎ　Ｊ．Ｊ．：ヒト・アデノシン・デアミナーゼのための遺伝子の完全配列と構造。Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５：８２３４，１９８８
１９）Ｍａｎｎ　Ｒ．，Ｍｕｌｌｉｇａｎ　Ｒ．Ｃ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ　Ｄ．：レトロウイルス・パッケージング突然変異体の構築とヘルパー不含欠陥レトロウイルスを作出するためのその使用。Ｃｅｌｌ　３３：１５３，１９８３
２０）Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ　Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．　１９８９
２１）Ｍｉｌｌｅｒ　Ａ．Ｄ．，Ｂｕｔｔｉｍｏｒｅ　Ｃ．：ヘルパー・ウイルス生産を導く組換えを回避するためのレトロウイルス・パッケージング・セルラインのリデザイン。Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５，１９８６
２２）Ｓｏｕｔｈｅｒｍ　Ｐ．Ｊ．，Ｂｅｒｇ　Ｐ．：ＳＶ４０初期領域プロモーターの制御下のバクテリア遺伝子による抗生物質耐性への哺乳類細胞の形質転換。Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７，１９８２
２３）Ｙａｎａｇｉ　Ｙ．，Ｙｏｓｈｉｋａｉ　Ｙ．，Ｌｅｇｇｅｔｔ　Ｋ．，Ｃｌａｒｋ　Ｓ．Ｐ．，Ａｌｅｋｓａｎｄｅｒ　Ｉ．，Ｍａｋ　Ｔ．Ｗ．：免疫グロブリン鎖に広い相同性をもつタンパク質をコードするヒトＴ細胞特異的ｃＤＮＡクローン。Ｎａｔｕｒｅ　３０８：１４５，１９８４
２４）Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　Ｊ．Ｍ．，Ｐｒｚｙｂｙｌａ　Ａ．Ｅ．，ＭａｃＤｏｎａｌｄ　Ｒ．Ｊ．，Ｒｕｔｔｅｒ　Ｗ．Ｊ．：リボヌクレアーゼにおいて濃縮された源からの生物学的に活性な核酸の単離。Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：５２９４，１９７９
２５）Ｔｈｏｍａｓ　Ｐ．Ｓ．：ニトロセルロースに転写された変性ＲＮＡと小ＤＮＡ断片のハイブリダイゼーション。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：５２０１，１９８０
２６）Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　Ｐ．，Ｓａｃｃｈｉ　Ｎ．：酸グアニジウム・トリシアネート−フェノール・クロロホルム抽出によるＲＮＡ単離の１段階方法。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６２：１５６，１９８７
２７）Ｌｏｈ　Ｅ．Ｙ．，Ｅｌｌｉｏｔ　Ｊ．Ｆ．，Ｃｗｉｒｌａ　Ｓ．，Ｌａｎｉｅｒ　Ｌ．Ｌ．，Ｄａｖｉｓ　Ｍ．Ｍ．：ポリメラーゼの１方向特異性：Ｔ細胞レセプター∂鎖の分析。Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３：２１７，１９８９
２８）Ｃｈｏｉ　Ｙ．，Ｋｏｔｚｉｎ　Ｂ．，Ｈｅｒｒｏｎ　Ｌ．，Ｃａｌｌａｈａｎ　Ｊ．，Ｍａｒｒａｃｋ　Ｐ．，Ｋａｐｐｌｅｒ　Ｊ．：ヒトＴ細胞との、スタフィロコッカス・アウレウス（
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ
２９）Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　Ｗ．Ｍ．Ｃ．，ＰＡＨ．Ｍｏｓｓ，Ｂｅｌｌ　Ｊ．Ｉ．：ヒトＴ細胞レセプターＶβとＪβレパートリー内での変化：アンカー・ポリメラーゼ鎖反応を使用した分析。ａｎａｌｙｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ａｎｃｈｏｒ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５４１，１９９２
３０）Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ　Ｃ．：ＡＤＡ欠損ＳＣＩＤを患う患者の治療のための骨髄細胞と末梢血液リンパ球内へのＡＤＡ遺伝子の移入のための臨床プロトコール。Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）．
３１）Ａｒｅｍａｎ　Ｅ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ：骨髄及び幹細胞プロセシング。Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｆ．Ａ．Ｄａｖｉｅｓ　Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９２）
３２）Ｒｅｄｄｙ　ｅｔ　ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　８（１９９０）１３７−１４１