(57)【要約】【課題】【解決手段】ゲノム分析のための方法および装置が提供されている。マイクロ流体分配流路を備える微細加工構造は、配列決定テンプレートの複数の複製物を有するマイクロリアクタ要素を微細加工熱循環チャンバに分配するよう構成されている。マイクロリアクタ要素は、配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロキャリア要素を含んでよい。マイクロキャリア要素は、マイクロスフィアを含んでよい。１つの熱循環チャンバに１つだけのマイクロスフィアが流れ込むことを保証するために、熱循環チャンバの出口ポートに配置された自動弁、光学スキャナ、または、タイミング構成を用いてよく、熱循環チャンバ内では、熱循環伸長断片が生成される。伸長産物は、集積オリゴヌクレオチドゲル捕捉チャンバで、捕捉、精製、および、濃縮される。精製された伸長断片は、微細加工成分分離装置を用いて分析される。微細加工構造は、ＤＮＡまたはＲＮＡに関する配列決定やその他の遺伝分析を実行する処理で用いられてよい。【選択図】図９Ａ
2008500836.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細加工構造であって、
１つの熱循環チャンバ内に１つだけのマイクロリアクタ要素が入るように、クローン配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロリアクタ要素を複数の熱循環チャンバに分配する分配流路を備え、
マイクロリアクタ要素から熱循環伸長断片が生成され、
前記微細加工構造は、さらに、
前記熱循環チャンバに接続され、前記伸長断片を捕捉および濃縮する精製チャンバと、
前記精製チャンバに接続され、前記伸長断片を分析する成分分離流路と、を備える、微細加工構造。
【請求項２】
請求項１に記載の微細加工構造であって、前記マイクロリアクタ要素は、前記クローン配列決定テンプレートの前記複数の複製物を運ぶマイクロキャリア要素を備える、微細加工構造。
【請求項３】
請求項１に記載の微細加工構造であって、前記マイクロリアクタ要素は、ボーラスすなわちマイクロエマルジョン液滴である、微細加工構造。
【請求項４】
請求項３に記載の微細加工構造であって、前記マイクロリアクタ要素は、前記クローン配列決定テンプレートの前記複数の複製物を運ぶマイクロスフィアを備える、微細加工構造。
【請求項５】
請求項１に記載の微細加工構造であって、前記配列決定テンプレートは、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定テンプレートである、微細加工構造。
【請求項６】
配列決定を実行するためのシステムであって、
ＤＮＡまたはＲＮＡを断片にせん断する手段と、
前記断片をライゲーションさせて、所望の環状産物と不純物である線形産物との混合物を形成する手段と、
前記不純物である線形産物を選択的に除去する手段と、
１つの配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を運ぶマイクロリアクタ要素を生成する手段と、
配列決定テンプレートを有するマイクロリアクタ要素を選択する手段と、
配列決定テンプレートを有する選択されたマイクロリアクタ要素を熱循環チャンバに分配するマイクロ流体分配手段と、
１つの熱循環チャンバ内に１つだけのマイクロリアクタ要素が流れ込むことを保証する手段と、
前記熱循環チャンバを備え、前記配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶ前記マイクロリアクタ要素から熱循環伸長断片を生成する伸長手段と、
前記伸長断片を捕捉、精製、および、濃縮する精製チャンバ手段と、
前記伸長断片を分析する成分分離手段と、を備える、システム。
【請求項７】
請求項６に記載のシステムであって、前記マイクロリアクタ要素は、前記クローン配列決定テンプレートの前記複数の複製物を運ぶマイクロキャリア要素を備える、システム。
【請求項８】
請求項６に記載のシステムであって、前記マイクロリアクタ要素は、ボーラスすなわちマイクロエマルジョン液滴である、システム。
【請求項９】
請求項８に記載のシステムであって、前記マイクロリアクタ要素は、前記クローン配列決定テンプレートの前記複数の複製物を運ぶマイクロスフィアを備える、システム。
【請求項１０】
微細加工構造であって、
クローン配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶ複数のマイクロスフィアを複数の熱循環チャンバに分配する分配流路と、
熱循環チャンバの出口ポートに配置され、１つの熱循環チャンバ内に１つだけのマイクロスフィアが流れ込むことを保証する自動弁と、を備え、
マイクロスフィアから熱循環伸長断片が生成され、
前記微細加工構造は、さらに、
前記熱循環チャンバに接続され、前記伸長断片を捕捉および濃縮する精製チャンバと、
前記精製チャンバに接続され、前記伸長断片を分析する成分分離流路と、を備える、微細加工構造。
【請求項１１】
請求項１０に記載の微細加工構造であって、マイクロスフィアの直径は、約１から１００ミクロンの間である、微細加工構造。
【請求項１２】
請求項１１に記載の微細加工構造であって、マイクロスフィアの直径は、約１０ミクロンである、微細加工構造。
【請求項１３】
請求項１０に記載の微細加工構造であって、各熱循環チャンバと、分離流路との間で、流体が行き来するようになっている、微細加工構造。
【請求項１４】
請求項１０に記載の微細加工構造であって、前記配列決定テンプレートは、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定テンプレートである、微細加工構造。
【請求項１５】
微細加工構造であって、
配列決定テンプレートを運ぶマイクロスフィアを熱循環チャンバに分配するマイクロ流体分配流路手段と、
１つの熱循環チャンバに１つだけのマイクロスフィアが流れ込むことを保証する自動弁手段と、
前記熱循環チャンバを備え、配列決定テンプレートを運ぶマイクロスフィアから熱循環伸長断片を生成する伸長手段と、
前記伸長断片を捕捉、精製、および、濃縮する集積精製チャンバ手段と、
前記伸長断片を分析する成分分離手段と、を備える、微細加工構造。
【請求項１６】
請求項１５に記載の微細加工構造であって、前記伸長手段は、複数の熱循環チャンバを備えるサンガー伸長手段である、微細加工構造。
【請求項１７】
請求項１６に記載の微細加工構造であって、前記自動弁手段は、前記熱循環チャンバの出口ポートの自動弁を含む、微細加工構造。
【請求項１８】
請求項１７に記載の微細加工構造であって、前記精製チャンバ手段は、前記熱循環チャンバに接続された精製チャンバを備える、微細加工構造。
【請求項１９】
請求項１８に記載の微細加工構造であって、前記成分分離手段は、前記精製チャンバに接続された複数のマイクロ流路を備えるキャピラリアレイ電気泳動手段である、微細加工構造。
【請求項２０】
請求項１５に記載の微細加工構造であって、前記配列決定テンプレートは、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定テンプレートである、微細加工構造。
【請求項２１】
微細加工装置であって、
クローンテンプレートを運ぶマイクロスフィアを受け入れるよう構成され、流入ポートと流出ポートとを有する熱循環チャンバを備え、前記流出ポートは、前記チャンバ内でマイクロスフィアを捕捉して前記熱循環チャンバへのさらなる流入を実質的に遮断するよう構成された狭窄部を備える、微細加工装置。
【請求項２２】
請求項２１に記載の微細加工装置であって、前記狭窄部の形状は、実質的に円形である、微細加工装置。
【請求項２３】
請求項２１に記載の微細加工装置であって、前記狭窄部の形状は、実質的に半円形である、微細加工装置。
【請求項２４】
請求項２１に記載の微細加工装置であって、前記流入ポートとの間で流体が行き来する流入路には、第１の弁が配置されており、前記流出ポートとの間で流体が行き来する流出路には、第２の弁が配置されている、微細加工装置。
【請求項２５】
請求項２１に記載の微細加工装置であって、動作中、前記第２の弁が前記第１の弁より前に閉じられることで、熱循環の前に、マイクロスフィアを、前記狭窄部から前記熱循環チャンバの本体部分の中に移動させる、微細加工装置。
【請求項２６】
請求項２１に記載の微細加工装置であって、さらに、前記熱循環チャンバの前記流出ポートとの間で流体が行き来する精製チャンバと、成分分離装置との間で流体が行き来する前記精製チャンバの出力ポートとを備える、微細加工装置。
【請求項２７】
配列決定を実行するためのシステムであって、
ＤＮＡまたはＲＮＡを断片にせん断する手段と、
前記断片をライゲーションさせて、所望の環状産物と不純物である線形産物との混合物を形成する手段と、
前記不純物である線形産物を選択的に除去する手段と、
１つの配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を運ぶマイクロスフィアを生成する手段と、
配列決定テンプレートを有するマイクロスフィアを選択する手段と、
配列決定テンプレートを有する選択されたマイクロスフィアを熱循環チャンバに分配するマイクロ流体分配流路手段と、
統計的に１つの熱循環チャンバに１つだけのマイクロスフィアが流れ込むことを保証する手段と、
前記熱循環チャンバを備え、前記配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶ前記マイクロスフィアから熱循環伸長断片を生成する伸長手段と、
前記伸長断片を捕捉、精製、および、濃縮する精製チャンバ手段と、
前記伸長断片を分析する成分分離手段と、を備える、システム。
【請求項２８】
請求項２７に記載のシステムであって、前記保証手段は、前記熱循環チャンバに配置された自動弁と、光学検出器と、タイミング機構との内の少なくとも１つである、システム。
【請求項２９】
請求項２７に記載のシステムであって、前記光学検出器は、マイクロスフィアからの散乱光を検出する光学スキャナである、システム。
【請求項３０】
請求項２７に記載のシステムであって、前記タイミング機構は、熱循環チャンバの流入口に隣接して配置された空気入力を備える、システム。
【請求項３１】
ＤＮＡ配列決定を実行するためのシステムであって、
ＤＮＡをＤＮＡ断片にせん断する手段と、
前記ＤＮＡ断片をライゲーションさせて、所望の環状産物と不純物である線形産物との混合物を形成する手段と、
前記不純物である線形産物を選択的に除去するエキソヌクレアーゼ分解手段と、
１つのＤＮＡ配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を運ぶマイクロスフィアを生成するエマルジョンＰＣＲ反応手段と、
ＤＮＡ配列決定テンプレートを有するマイクロスフィアを選択する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）手段と、
ＤＮＡ配列決定テンプレートを有する選択されたマイクロスフィアを熱循環チャンバに分配するマイクロ流体分配流路手段と、
統計的に１つの熱循環チャンバに１つだけのマイクロスフィアが流れ込むことを保証する自動弁手段と、
前記熱循環チャンバを備え、前記ＤＮＡ配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶ前記マイクロスフィアから熱循環伸長断片を生成するサンガー伸長手段と、
前記伸長断片を捕捉、精製、および、濃縮する集積精製チャンバ手段と、
前記伸長断片を分析するキャピラリアレイ電気泳動手段と、を備える、システム。
【請求項３２】
配列決定を実行するための処理であって、
ＤＮＡまたはＲＮＡを断片にせん断する工程と、
前記断片をライゲーションさせて、所望の環状産物と不純物である線形産物との混合物を形成する工程と、
前記不純物である線形産物を選択的に除去する工程と、
配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を運ぶマイクロリアクタ要素を生成する工程と、
配列決定テンプレートを有するマイクロリアクタ要素を選択する工程と、
前記配列決定テンプレートを有する前記マイクロリアクタ要素を熱循環チャンバ内に分配する工程と、
前記配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶ前記マイクロリアクタ要素から熱循環伸長断片を生成する工程と、
前記伸長断片を捕捉および濃縮する工程と、
前記熱循環伸長断片を分析する工程と、を備える、処理。
【請求項３３】
請求項３２に記載の処理であって、前記マイクロリアクタ要素は、前記クローン配列決定テンプレートの前記複数の複製物を運ぶマイクロキャリア要素を備える、処理。
【請求項３４】
請求項３２に記載の処理であって、前記マイクロリアクタ要素は、ボーラスすなわちマイクロエマルジョン液滴である、処理。
【請求項３５】
請求項３４に記載の処理であって、前記マイクロリアクタ要素は、前記クローン配列決定テンプレートの前記複数の複製物を運ぶマイクロスフィアを備える、処理。
【請求項３６】
請求項３２に記載の処理であって、前記分配工程は、１つの熱循環チャンバに１つだけのマイクロリアクタ要素が入るように実行される、処理。
【請求項３７】
請求項３６に記載の処理であって、さらに、前記熱循環チャンバの出口ポートに配置された自動弁を用いて、１つの熱循環チャンバに１つだけのマイクロリアクタ要素が流れ込むことを保証する工程を備える、処理。
【請求項３８】
請求項３２に記載の処理であって、前記生成工程は、エマルジョンＰＣＲ反応またはフロースルー型ＰＣＲ処理によって、配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を生成する工程を備える、処理。
【請求項３９】
請求項３２に記載の処理であって、前記選択工程は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である、処理。
【請求項４０】
ＤＮＡ配列決定を実行するための処理であって、
ＤＮＡをＤＮＡ断片にせん断する工程と、
前記ＤＮＡ断片をライゲーションさせて、所望の環状産物と不純物である線形産物との混合物を形成する工程と、
エキソヌクレアーゼ分解によって、前記不純物である線形産物を選択的に除去する工程と、
エマルジョンＰＣＲ反応によって、ＤＮＡ配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を運ぶマイクロスフィアを生成する工程と、
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、ＤＮＡ配列決定テンプレートを有するマイクロスフィアを選択する工程と、
前記ＤＮＡ配列決定テンプレートを有する前記マイクロスフィアを熱循環チャンバに分配する工程と、
熱循環チャンバの出口ポートに配置された自動弁を用いて、統計的に１つの熱循環チャンバに１つだけのマイクロスフィアが流れ込むことを保証する工程と、
前記ＤＮＡ配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶ前記マイクロスフィアから熱循環伸長断片を生成する工程と、
前記伸長断片を捕捉、精製、および、濃縮する工程と、
前記熱循環伸長断片を分析する工程と、を備える、処理。
【請求項４１】
請求項４０に記載の処理であって、前記捕捉工程は、オリゴヌクレオチド捕捉マトリクスを用いる、処理。
【請求項４２】
配列決定で用いる処理であって、
熱循環チャンバの流入ポートにおいてクローンテンプレートを運ぶマイクロスフィアを受け入れる工程と、
前記チャンバの流出ポートに配置された狭窄部を用いて、前記チャンバ内で前記マイクロスフィアを捕捉して前記チャンバへのさらなる流入を実質的に遮断する工程と、を備える、処理。
【請求項４３】
分析のための方法であって、
配列決定テンプレートを運ぶマイクロスフィアを生成する工程と、
熱循環チャンバの出力ポートに配置された狭窄部を用いて、前記熱循環チャンバ内に前記マイクロスフィアを配置して、前記チャンバへのさらなる流入を実質的に遮断する工程と、を備える、方法。 
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記熱循環チャンバの流入ポートに、第１の弁が配置されると共に、前記熱循環チャンバの流出ポートに、第２の弁が配置されており、前記第２の弁が前記第１の弁より前に閉じられることで、熱循環の前に、マイクロスフィアを、前記狭窄部から前記熱循環チャンバの本体部分に移動させる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の説明］
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に従って、「ＭＩＣＲＯＢＥＡＤ  ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ  ＤＮＡ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＳＹＳＴＥＭ（ＭＩＮＤＳ）」と題され、２００４年６月１日に出願された米国特許仮出願第６０／５７６，１０２号（代理人整理番号ＵＣＡＬＰ０５４Ｐ）からの優先権を主張するものであり、ここに参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、微細加工構造およびマイクロ流体構造に関する。一例では、本発明は、ゲノム配列決定のための微細加工システムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
有機体のゲノムは、その有機体のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）によって、もしくは、一部のウイルスではＲＮＡ（リボ核酸）、によって規定されている。ゲノムの配列決定とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖のヌクレオチドすなわち塩基の順番を解読することである。
【０００４】
ＤＮＡのゲノム規模の配列決定のための現在の方法を、図１に示す。このショットガン配列決定法１００は、細菌形質転換、選択、および、培養によって、個々のゲノムＤＮＡ断片を操作する。この方法の最初の３工程、すなわち、せん断（シアリング）、ベクターライゲーション（vector ligation）、および、形質転換（工程１０２、１０４、および、１０６）は、１回だけ行えばよい。それらの工程自体は、特に問題を引き起こすものではない。最後の工程、すなわち、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）（工程１１４）は、微細加工によって小型化されている。それにより、この工程に関連するコストおよび処理時間が低減されている。しかしながら、植種（プレート）および培養（工程１０８）と、採取、増殖、および、抽出（工程１１０）には、問題がある。これらの工程は、サンガー伸長工程（工程１１２）に先行して、クローンの単離と挿入物の増幅とを実行する。増幅は、細菌による方法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、または、ＲＣＡ（ローリングサークル増幅）であってよい。これらの工程は、小型化および集積化ができていない。したがって、現在の巨視的なパラダイムは、これらの主要な工程を実現する技術としてのロボット工学の利用に依存している。しかしながら、これは、３，０００万以上のコロニーを採取および増殖して、ゲノムの配列決定のテンプレートを生成する必要があるため問題となる。さらに、かかるロボット技術によって準備される材料の最小量は、最新の微細加工ＣＥ分析システムが要求するよりも桁違いに大きい。
【０００５】
したがって、ゲノム配列決定の処理時間、体積の規模、および、集積化のレベルを改善することが望ましい。また、ゲノム配列決定に関するコストおよびスペースの要件を低減することが望ましい。
【発明の開示】
【０００６】
一態様では、本発明は、クローン配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロリアクタ要素を複数の熱循環チャンバに分配するための分配流路を備える微細加工構造を提供する。１つの熱循環チャンバには、１つだけのマイクロリアクタ要素が入り、マイクロリアクタ要素から熱循環伸長断片が生成される。熱循環チャンバには、精製チャンバが結合され、伸長断片の捕捉および濃縮を行う。精製チャンバには、成分分離流路が接続されており、伸長断片の分析を行う。
【０００７】
本発明の様々な実施例は、以下の特徴の１または複数を備えてよい。マイクロリアクタは、クローン配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロキャリア要素を備える。マイクロリアクタ要素は、ボーラス（bolus）すなわちマイクロエマルジョン液滴である。マイクロリアクタ要素は、クローン配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロスフィアを備える。配列決定テンプレートは、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定テンプレートである。
【０００８】
さらに別の態様では、本発明は、配列決定を実行するためのシステムに関する。そのシステムは、ＤＮＡまたはＲＮＡを断片にせん断する手段と、断片をライゲーションさせて、所望の環状産物と、不純物（コンタミネーティング）である線形産物との混合物を形成する手段とを備える。そのシステムは、さらに、不純物である線形産物を選択的に除去する手段と、１つの配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を運ぶマイクロリアクタ要素を生成する手段とを備える。そのシステムは、さらに、配列決定テンプレートを有するマイクロリアクタ要素を選択する手段と、１つの配列決定テンプレートを有する選択されたマイクロリアクタ要素を熱循環チャンバに分配するマイクロ流体分配手段とを備える。さらに、システムは、１つの熱循環チャンバに１つだけのマイクロリアクタ要素が流れ込むことを保証する手段と、熱循環チャンバを備え、配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロリアクタ要素から熱循環伸長断片を生成する伸長手段とを備える。また、そのシステムの一部として、伸長断片を捕捉、精製、および、濃縮する精製チャンバ手段と、伸長断片を分析する成分分離手段とが備えられている。
【０００９】
本発明の他の実施例は、以下の特徴の１または複数を備えてよい。マイクロリアクタ要素は、クローン配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロキャリア要素を備える。マイクロリアクタ要素は、ボーラスすなわちマイクロエマルジョン液滴である。マイクロリアクタ要素は、配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロスフィアを備える。
【００１０】
別の態様では、本発明は、クローン配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロスフィアを複数の熱循環チャンバに分配するための分配流路を備える微細加工構造を提供する。１つの熱循環チャンバ内に１つだけのマイクロスフィアが流れ込むことを保証するために、熱循環チャンバの出口ポートには自動弁が配置されており、熱循環チャンバでは、マイクロスフィアから熱循環伸長断片が生成される。熱循環チャンバには、精製チャンバが結合され、伸長断片の捕捉および濃縮を行う。精製チャンバには、成分分離流路が接続されており、伸長断片の分析を行う。
【００１１】
本発明の様々な実施例は、以下の特徴の１または複数を備えてよい。マイクロスフィアの直径は、約１から１００ミクロンの間である。マイクロスフィアの直径は、約１０ミクロンである。各熱循環チャンバと、分離流路との間では、流体が行き来する。配列決定テンプレートは、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定テンプレートである。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、配列決定テンプレートを運ぶマイクロスフィアを熱循環チャンバに分配するマイクロ流体分配手段を備える微細加工構造を提供する。１つの熱循環チャンバに１つだけのマイクロスフィアが流れ込むことを保証するために、自動弁手段が用いられる。熱循環チャンバを備える伸長手段が、配列決定テンプレートを運ぶマイクロスフィアから熱循環伸長断片を生成する。伸長断片は、集積化精製チャンバ手段を用いて、捕捉、精製、および、濃縮される。伸長断片を分析するために、成分分離手段が用いられる。
【００１３】
本発明の他の実施例は、以下の特徴の１または複数を備えてよい。伸長手段は、複数の熱循環チャンバを備えたサンガー伸長手段である。自動弁手段は、熱循環チャンバの出口ポートに配置された自動弁を備える。精製チャンバ手段は、熱循環チャンバに接続された精製チャンバを備える。成分分離手段は、精製チャンバに接続された複数のマイクロ流路を備えたキャピラリアレイ電気泳動手段である。配列決定テンプレートは、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定テンプレートである。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、熱循環チャンバを備える微細加工装置を提供する。熱循環チャンバは、クローンのテンプレートを運ぶマイクロスフィアを受け入れるよう構成されている。そのチャンバは、流入ポートと流出ポートを備えており、流出ポートは、チャンバ内にマイクロスフィアを捕捉して熱循環チャンバへのさらなる流入を実質的に遮断するよう構成された狭窄部を備える。
【００１５】
本発明の様々な実施例は、以下の特徴の１または複数を備えてよい。狭窄部の形状は、実質的に円形または半円形である。流入ポートとの間で流体が行き来する流入路には、第１の弁が配置されており、流出ポートとの間で流体が行き来する流出路には、第２の弁が配置されている。動作中、第１の弁より前に第２の弁を閉じることで、熱循環の前に、マイクロスフィアを、狭窄部からそのチャンバの本体部分の中に移動させる。精製チャンバと熱循環チャンバの流出ポートとの間で流体が行き来し、精製チャンバの出力ポートと成分分離装置との間で流体が行き来するようになっている。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、配列決定を実行するためのシステムを提供する。そのシステムは、ＤＮＡまたはＲＮＡを断片にせん断する手段と、断片をライゲーションさせて、所望の環状産物と、不純物である線形産物との混合物を形成する手段とを備える。そのシステムは、さらに、不純物である線形産物を選択的に除去する手段と、一つの配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を運ぶマイクロスフィアを生成する手段とを備える。そのシステムは、さらに、配列決定テンプレートを有するマイクロスフィアを選択する手段と、配列決定テンプレートを有する選択されたマイクロスフィアを熱循環チャンバに分配するマイクロ流体分配流路手段とを備える。さらに、そのシステムは、統計的に１つの熱循環チャンバ内に１つだけのマイクロスフィアが流れ込むことを保証する手段を備える。そのシステムは、さらに、熱循環チャンバを備えた伸長手段であって、配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロスフィアから熱循環伸長断片を生成する伸長手段を備える。また、そのシステムの一部として、伸長断片を捕捉、精製、および、濃縮する精製チャンバ手段と、伸長断片を分析する成分分離手段とが備えられている。
【００１７】
本発明の他の実施例は、以下の特徴の１または複数を備えてよい。保証手段は、熱循環チャンバ内に配置された自動弁と、光学検出器と、タイミング機構との内の少なくとも１つである。光学検出器は、マイクロスフィアからの散乱光を検出する光学スキャナである。タイミング機構は、熱循環チャンバの流入口に隣接して配置された空気入力を備える。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、ＤＮＡ配列決定を実行するためのシステムを提供する。そのシステムは、ＤＮＡをＤＮＡ断片にせん断する手段と、ＤＮＡ断片をライゲーションさせて、所望の環状産物と、不純物である線形産物との混合物を形成する手段とを備える。そのシステムは、さらに、不純物である線形産物を選択的に除去するエキソヌクレアーゼ分解手段と、１つのＤＮＡ配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を運ぶマイクロスフィアを生成するエマルジョンＰＣＲ反応手段とを備える。さらに、そのシステムは、ＤＮＡ配列決定テンプレートを有するマイクロスフィアを選択する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）手段を備える。ＤＮＡ配列決定テンプレートを有する選択されたマイクロスフィアを熱循環チャンバに分配するために、マイクロ流体分配流路手段が用いられる。統計的に１つの熱循環チャンバに１つだけのマイクロスフィアが流れ込むことを保証するために、自動弁手段が用いられる。ＤＮＡ配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロスフィアから熱循環伸長断片を生成するために、熱循環チャンバを備えたサンガー伸長手段が用いられる。伸長断片を捕捉、精製、および、濃縮するために、集積化精製チャンバ手段が用いられ、伸長断片を分析するために、キャピラリアレイ電気泳動手段が用いられる。
【００１９】
またさらに別の態様において、本発明は、配列決定を実行するための処理を提供する。その処理は、ＤＮＡまたはＲＮＡを断片にせん断する工程と、断片をライゲーションさせて、所望の環状産物と、不純物である線形産物との混合物を形成する工程と、不純物である線形産物を選択的に除去する工程とを備える。その処理は、さらに、配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を運ぶマイクロリアクタ要素を生成する工程と、配列決定テンプレートを有するマイクロリアクタ要素を選択する工程と、その配列決定テンプレートを有するマイクロリアクタ要素を熱循環チャンバに分配する工程とを備える。配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロリアクタ要素から、熱循環伸長断片が生成される。伸長断片は、捕捉、濃縮、および、分析される。
【００２０】
本発明の様々な実施例は、以下の特徴の１または複数を備えてよい。マイクロリアクタ要素は、クローン配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロキャリア要素を備える。マイクロリアクタ要素は、ボーラスすなわちマイクロエマルジョン液滴である。マイクロリアクタ要素は、クローン配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロスフィアを備える。分配工程は、１つの熱循環チャンバに１つだけのマイクロリアクタ要素が入るように実行される。１つの熱循環チャンバに１つだけのマイクロリアクタ要素が入ることを保証するために、熱循環チャンバの出口ポートに配置された自動弁が用いられる。例の生成工程は、エマルジョンＰＣＲ反応またはフロースルー型ＰＣＲ処理によって、配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を生成する工程を備える。選択工程は、ＦＡＣＳである。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、ＤＮＡ配列決定を実行するための処理を提供する。その処理は、ＤＮＡをＤＮＡ断片にせん断する工程と、ＤＮＡ断片をライゲーションさせて、所望の環状産物と、不純物である線形産物との混合物を形成する工程と、不純物である線形産物をエキソヌクレアーゼ分解によって選択的に除去する工程とを備える。ＤＮＡ配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を運ぶマイクロスフィアが、エマルジョンＰＣＲ反応によって生成される。ＤＮＡ配列決定テンプレートを有するマイクロスフィアが、ＦＡＣＳによって検出される。そのＤＮＡ配列決定テンプレートを有するマイクロスフィアは、熱循環チャンバに分配される。統計的に１つの熱循環チャンバ内に１つだけのマイクロスフィアが流れ込むことを保証するために、熱循環チャンバの出口ポートに配置された自動弁が用いられる。ＤＮＡ配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロスフィアから、熱循環伸長断片が生成される。伸長断片は、捕捉、精製、濃縮、および、分析される。
【００２２】
本発明の様々な実施例は、以下の特徴の１または複数を備えてよい。捕捉工程は、オリゴヌクレオチド捕捉マトリクスを用いる。
【００２３】
またさらに別の態様において、本発明は、配列決定のための方法を提供する。その方法は、熱循環チャンバの流入ポートにおいてクローンのテンプレートを運ぶマイクロスフィアを受け入れる工程と、チャンバの流出ポートに配置された狭窄部を用いて、チャンバ内でマイクロスフィアを捕捉してチャンバへのさらなる流入を実質的に遮断する工程とを備える。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、配列決定テンプレートを運ぶマイクロスフィアを生成する工程を備える分析方法を提供する。マイクロスフィアは、熱循環チャンバへのさらなる流入を実質的に遮断するように、熱循環チャンバの出力ポートに配置された狭窄部によって熱循環チャンバ内に配置される。
【００２５】
本発明の他の実施例は、以下の特徴の１または複数を備えてよい。熱循環チャンバの流入ポートに、第１の弁が配置されると共に、熱循環チャンバの流出ポートに、第２の弁が配置されており、第２の弁は、第１の弁よりも前に閉じられてよい。これにより、熱循環の前に、マイクロスフィアが、狭窄部から熱循環チャンバの本体部分に移動される。
【００２６】
本発明は、以下の利点の内の１または複数を備えうる。ショットガンゲノム配列決定に要求される面倒な細菌の操作の代わりに、自動化および集積化が容易なインビトロ（in vitro）の工程を用いることができる。それにより、数百万回の手動またはロボットによるコロニー採取動作が排除される。配列決定伸長断片を生成、精製、および、分離するために必要な流体および温度に関する制御構造すべてが、微細加工装置に集積される。コスト、時間、および、空間の大幅な節約を実現できる。他の遺伝子分析技術を実行することも可能である。
【００２７】
本発明に関する上述およびその他の特徴と利点は、本発明の原理を例示的に説明する本発明の明細書および添付の図面を参照して詳細に提示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
ここで、本発明を実施するために発明者が検討した最良の実施形態を含む本発明のいくつかの具体的な実施形態について詳細に説明する。これら具体的な実施形態の例は、添付の図面に示されている。本発明は、これら具体的な実施形態に関連して説明されているが、説明されている実施形態に本発明を限定する意図はない。逆に、添付の特許請求の範囲に規定された本発明の趣旨および範囲に含まれうる代替物、変形物、および、等価物を網羅するよう意図されている。
【００２９】
以下の説明では、本発明の完全な理解を促すために、数多くの具体的な詳細事項が記載されている。本発明は、これら具体的な詳細事項の一部あるいはすべてがなくとも実施可能である。また、本発明を不必要にわかりにくくすることを避けるために、周知の処理動作については、説明を省略した。
【００３０】
さらに、本発明の技術および機構は、明確にするために単数形で表す場合がある。しかしながら、一部の実施形態は、特に断らない限りは、１つの技術を複数回繰り返したり、１つの機構を複数回用いたりしてよいことに注意されたい。
【００３１】
本発明のシステムおよび方法は、ＤＮＡ配列決定に関連して説明されている。しかしながら、同じシステムおよび方法を、ＲＮＡ配列決定に利用してもよい。さらに、同じシステムおよび方法を、ＤＮＡまたはＲＮＡに関する他の遺伝分析に利用してもよい。
【００３２】
本発明のシステムおよび方法は、一部の実施形態ではマイクロスフィアやビーズなどのマイクロキャリア要素を含むマイクロエマルジョン液滴すなわちボーラスなどのマイクロリアクタ要素を用いる。マイクロキャリア要素は、ボーラスすなわちマイクロエマルジョン液滴の中に含まれており、ＤＮＡ産物またはＲＮＡ産物を捕捉するのに有用である。すなわち、増幅されたＤＮＡまたはＲＮＡを、マイクロキャリア要素に対して化学的に結合させることができる。あるいは、増幅されたＤＮＡまたはＲＮＡは、マイクロキャリア要素を利用せずに、マイクロリアクタ要素によって運ばれてもよい。例えば、ボーラスすなわちマイクロエマルジョン液滴の中でＰＣＲ反応を実行してよく、その後、結果として得られたボーラスすなわちマイクロエマルジョン液滴を、次の処理工程に送ってよい。
【００３３】
本発明の微細加工集積ＤＮＡ分析システム（a microfabricated integrated DNA analysis system：ＭＩＮＤＳ）は、マイクロ流体サンプル成分分離装置に容易に適合できるシステムおよび方法を提供する。図２に示すように、ＭＩＮＤＳ処理２００は、一実施形態において、ＤＮＡをＤＮＡ断片にせん断する工程（工程２０２）から始まる。次に、断片は、ライゲーション（ligate）を施されて、所望の環状産物と不純物である線形産物との混合物を形成する（工程２０４）。次に、不純物となる線形産物は、例えば、エキソヌクレアーゼ分解によって選択的に除去される（工程２０６）。次いで、ＤＮＡ配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を運ぶマイクロスフィアのコロニーが形成される（工程２０８）。コロニーは、例えば、エマルジョンＰＣＲ反応によって生成されてよい。次に、ＤＮＡ配列決定テンプレートを有するマイクロスフィアが特定される（工程２１０）。マイクロスフィアは、蛍光活性化細胞選別（a fluorescence activated cell sorting：ＦＡＣＳ）技術によって特定されてよい。かかる作業は１回だけ実行すればよく、６時間以内で完了できる。次に、ＤＮＡ配列決定テンプレートを有するマイクロスフィアは、伸長断片を生成する複数の熱循環すなわち配列決定反応チャンバに分配され、その後、断片は、精製および濃縮される（工程２１２）。次いで、伸長断片は、例えば、ＣＥ装置などのサンプル成分分離装置によって分析される（工程２１４）。
【００３４】
ＭＩＮＤＳの方法、処理、および、装置は、一実施形態において、熱循環、親和性による捕捉、サンプルの精製、および、キャピラリアレイ電気泳動（ＣＡＥ）の構成要素を集積した微細加工構造を備える。以下で説明するように、かかるシステムは、配列決定テンプレートの複数の複製物を運ぶマイクロスフィアを複数の熱循環すなわち配列決定反応チャンバに分配するためのマイクロ流体分配流路を備える。マイクロスフィアから熱循環伸長断片を生成する各チャンバにマイクロスフィアを確実に１つだけ流入させるように、熱循環チャンバの出口ポートに、自動弁を配置してよい。熱循環チャンバには、精製チャンバが接続され、伸長断片の捕捉、精製、および、濃縮を行う。精製チャンバには、伸長断片の分析を行うための微細加工ＣＥ分離流路が接続されている。
【００３５】
本発明は、従来の配列決定における、困難、高価、かつ、時間の掛かるインビボ（in vivo）でのクローニング、選択、コロニー単離、および、増幅の工程を排除する。これらの工程の代わりに、小型化および自動化が容易なインビトロ（in vitro）の工程を用いる。
【００３６】
マイクロスフィアは、理想的なキャリアであり、サイズ、表面、蛍光、および、磁気の特性を柔軟に制御できる。微細加工と、それに伴う試薬の体積の低減とによって、配列決定反応チャンバを小型化することで、単一のクローンマイクロスフィアを、十分なＤＮＡ配列決定テンプレートのキャリアとして利用することが可能になる。これにより、ナノリットルの伸長、浄化、および、配列決定の処理との直接的な統合に適した、クローンテンプレートの選択、増幅、および、選別を可能にする処理工程を用いることができるようになる。
【００３７】
図３は、ＭＩＮＤＳと共に利用可能なクローニング処理３００の概略を示す図である。その処理は、ライブラリの作成および選択を含む。一実施形態では、ゲノムＤＮＡが、全血から分離され、その後、ネブライザでせん断されて、ＤＮＡ断片を生成する（工程３０２および３０４）。次に、ＤＮＡ断片は、酵素処理を受けて、平滑末端ＤＮＡを生成する（工程３０６）。処理された断片は、ベクター内にライゲーションされて、所望の環状産物と不純物である線形産物との混合物を生成する（工程３０８および３１０）。次いで、エキソヌクレアーゼ分解によって、挿入物およびベクターと、不純物である線形産物とを、ライゲーション産物から除去して、残りのベクターの内の約９５％よりも多くが、挿入物を含み、所望の環状産物となるようにする（工程３１２）。
【００３８】
クローニング処理３００の最初の５つの工程（工程３０２から３１０）は、標準的なライブラリ作成の手順に従う。より具体的には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州カールズバッド）が、１ないし６Ｋｂの挿入ゲノムショットガンライブラリを２時間で作成できるＴＯＰＯサブクローニングキット（＃Ｋ７０００−０１）を供給している。そのサブクローニングキットは、Ｑｉａｇｅｎ社（ノルウェイ、オスロ）のＢｌｏｏｄ＆Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（＃１３３２３）を用いて、１ｍＬの全血から得られる約２０マイクログラム（μｇ）のゲノムＤＮＡを要求する。ＤＮＡは、ネブライザでせん断されて、１ないし６ＫｂのＤＮＡ断片を生成する。次に、断片は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびクレノウポリメラーゼと、仔牛小腸ホスファターゼ（calf intestinal phosphatase：ＣＩＰ）とによる酵素処理を受けて、脱リン酸化された平滑末端ＤＮＡを生成する。次いで、処理された断片は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＣＲ  ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター内にライゲーションされる。クローニングベクターに共有結合するワクシニアウイルストポイゾメラーゼＩ（vaccinia virus topoisomerase I）を用いることにより、迅速かつ効率的なライゲーション（５分間の室温でのライゲーションにより、９５％を超える形質転換体が生成される）が実行され、ライゲーションの前に挿入物の脱リン酸化が可能になるため、キメラクローンの形成が防止される。
【００３９】
標準ライブラリの作成における最後の工程（工程３１２）は、インビトロＭＩＮＤＳ処理に適合するよう修正されており、細菌形質転換と抗生物質選択とを含む。エキソヌクレアーゼ分解は、所望のライゲーション産物から挿入物およびベクターを選択的に除去する。λエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社の＃Ｍ０２６２Ｓ）は、５’−リン酸化および非リン酸化二本鎖ＤＮＡを分解するが、ライゲーション後のベクターに存在するニックにおいてＤＮＡの消化を開始できないため、上記の工程で利用可能である。開始ゲノムＤＮＡの回収が１％であると悲観的に仮定すると、結果としてのライブラリは、１０倍の配列カバー（sequence coverage）に必要な６，０００倍以上の余分な分子を含むが、この余分は、後述する１分子ＰＣＲ増幅工程において、希釈によって低減される。
【００４０】
ペア末端の全ゲノムデノボ配列決定（de novo sequencing）のために、挿入物のサイズを厳密に制御することが要求される場合には、ＤＮＡのせん断（工程３０４）後に、ゲルの分離およびバンドの精製の工程を実行できる。あるいは、挿入物のサイズは、ＰＣＲ増幅の間の伸長時間を制限することにより制限されてもよいし、狭い蛍光強度範囲内のマイクロスフィアをフローサイトメトリで選択することにより制限されてもよい。チアゾールオレンジ（ＴＯ）などの挿入色素でマイクロスフィアのクローンを標識（ラベル）すると、増幅産物（アンプリコン）のサイズに比例した蛍光信号が得られる。フローサイトメトリは、ＭＩＮＤＳ処理内の工程であるため、＞５％の再環状化ベクターも排除する魅力的なサイズ選択方法であり、唯一の欠点は、収率が低下することである。
【００４１】
サブクローニングキットで用いられるベクターは、Ｔ７およびＴ３プライミング部位が挿入部位から３３ｂｐ（base pairs：塩基対）離れるよう、配列決定に最適化されてよい。ＭＩＮＤＳのベクターには、生物学的制約がないため、配列決定のプライミング部位を、挿入部位の近くに移動して、ｐＵＣ  ｏｒｉ、ｆ１  ｏｒｉ、ｌａｃＺ、および、抗生物質抵抗性の遺伝子を除去してもよい。サンプルの浄化を改善し、プライマの二量体形成を低減するために、最適化されたアクリダイト捕捉配列（acrydite capture sequences）およびホモのＰＣＲプライミング部位を挿入してもよい。
【００４２】
ＭＩＮＤＳ処理における配列決定は、個々のマイクロスフィアまたはビーズに付着したクローンテンプレートＤＮＡを用いてよい。クローンの付着は、プライマの１つをマイクロスフィアに共有結合させることによって実現される。
【００４３】
単一分子の増幅（例えば、マイクロエマルジョンポロニー）または組み合わせハイブリダイゼーション方法による１，０００から１００，０００のＤＮＡ分子のクローン単離について示した。Ｍｉｔｒａ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．、「Ｄｉｇｉｔａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｐｌｙｍｅａｒａｓｅ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、２００３、１００（１０）、ｐ．５９２６−５９３１；Ｄｒｅｓｓｍａｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．、“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ”，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、２００３、１００（１５）：ｐ．８８１７−８８２２；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．、“Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  （ＭＰＳＳ）  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄ  ａｒｒａｙｓ”、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００、１８（６）：ｐ．６３０−６３４、を参照。これらは、それぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。従来のマイクロチップによる配列決定は、１反応あたり約１０億のテンプレートＤＮＡ分子を要求する。２０倍の線形サンガー配列決定の増幅後には、２００億の伸長断片が生成され、これは、共焦点ラジアルスキャナを用いた高い信号対雑音（Ｓ／Ｎ）検出（（１バンドあたり１００万の断片）×１，０００バンド＝１０億の分子）にとって２０倍の余分になる。クロスインジェクション（cross-injection）処理は、交点で等モル混合物が得られるまで分離カラムに伸長断片を流した後に、全サンプルの内の約５％を注入することを要求するため、上記の余分が必要である。以下で説明する親和性捕捉によるダイレクトインジェクション（direct-injection）の方法では、２０倍の余分は必要なく、要求される最初のテンプレートの複製物は５，０００万だけである。
【００４４】
ＣＰＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ニュージャージー州リンカーンパーク）は、８，０００万のＤＮＡ分子を確実に結合させることができるアミン修飾プライマへの共有結合のための長鎖アルキルアミンリンカーを備え、５ミクロン（μｍ）に制御された多孔ガラス常磁性マイクロスフィアを生産している。単一のＤＮＡ分子から始まり、３０サイクルのＰＣＲによって、理論的には、１０億のＤＮＡ分子が得られる。実際には、得られる分子は、各サイクルの効率が１００％未満であること、後半のサイクルで酵素の活性が落ちること、および、ｐＬ規模の反応では試薬が限られていることから、それほど多くはない。クローンマイクロスフィアを生成するためには、ＤＮＡ分子と、プライマが結合したマイクロスフィアとを、１つずつＰＣＲリアクタに配置する必要がある。効率的な単一分子ＰＣＲには、単一ＤＮＡ分子の有効濃度を増大させるために、極度に小さい容積のリアクタ（１−１０ｐＬ）が要求される。ヒトのサイズのゲノムの配列決定を行うには、約３，０００万のマイクロスフィアのクローンが必要である。チャンバにおける単一マイクロスフィアおよび単一ＤＮＡ分子の高スループットな組み合わせは、統計的に希釈されたマイクロエマルジョンの溶液を用いて実現できる。ＤＮＡ分子およびマイクロスフィアが、リアクタの容積の１０倍の体積に１つの種が存在するように、それぞれ希釈されれば、リアクタの内の１％では、高い可能性（９９％より大きい）で両者が同時に存在する（コンカレンス）。リアクタの９９％が非生産的であるため、３，０００万のマイクロスフィアのクローンを生成するために、１００倍（３０億）以上の反応が要求される。
【００４５】
多数の小容積の反応を起こすには、微細加工ＰＣＲ装置およびエマルジョンＰＣＲという２つの方法が可能である。しかしながら、ＰＣＲ装置は、要求される３０億の反応を実現するために、数千回の実行を必要とする。一方、エマルジョンＰＣＲは、従来のサーマルサイクラを用いて、１つのチューブ内で数百万から数十億の別個の区画に熱循環することができる。エマルジョンＰＣＲによって磁性粒子に付着されたクローンＰＣＲ増幅産物（アンプリコン）が生成される。平均して、各マイクロスフィアは、１０，０００を超える２５０ｂｐの増幅産物を含んでおり、これは、各５μｍ径の区画において利用可能なヌクレオシド三リン酸に基づく理論的な最大値６００，０００増幅産物よりも小さい値である。１５ミクロンのマイクロエマルジョンＰＣＲ区画については、１，０００ｂｐの増幅産物の最大数が、最初のテンプレートの複製物として最低限要求される５，０００万の１０分の１の値である５００万であることが示された。この問題は、様々な方法で解決できる。
【００４６】
第１に、ビーズに結合するＤＮＡの量を増大させるために、さらなるマイクロエマルジョンＰＣＲ工程を実行してよい。第２に、試薬に制限されない増幅工程を、蛍光フローサイトメトリ工程後に追加する必要があってもよい。補助的なＰＣＲ増幅は、常磁性マイクロスフィアが、個々のリアクタに送られて磁気的に保持されるオンチップで二重用途の熱循環チャンバで実行可能である。未使用のＰＣＲミックスをチャンバに通し、１５回熱循環させて、各マイクロスフィアを最大の８，０００万テンプレートまで飽和させる。この場合、サンガー配列決定反応ミックスが、チャンバ内に流されて、固相配列決定に続く際に、磁界が維持される。最終的に、スキャナのＳ／Ｎが１０倍まで改善されることで、上述の計算よりも約１０倍少ないテンプレートの配列決定を可能にできる。
【００４７】
約１，５００万の１５μｍ径の区画が、２５μＬ水相、７５μＬ油相のエマルジョン内に形成されてよい。コインシデントな単一ＤＮＡ分子および単一のマイクロスフィアの事象を３，０００万だけ生成するためには、３０億の区画が要求される。したがって、１００μＬの９６ウェルプレートでの反応が約２回要求される。反応が終了すると、３億の非標識マイクロスフィアのバックグラウンドから、３，０００万のマイクロスフィアのクローンを分離する必要がある。
【００４８】
上述のように、配列決定テンプレートを有するビーズは、ＦＡＣＳによって特定されてよい。利用可能なシステムとしては、カリフォルニア州サンノゼのＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社が供給するＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡｒｒａｙＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙのフローサイトメータは、１秒間に１５，０００までのイベントを処理することが可能であり、６時間未満で、１０倍の網羅範囲（カバー）である３０億のベースゲノムに要求されるすべてのクローンの単離を可能にする。ビーズは、ＴＯなどの挿入色素で処理される。挿入色素は、二本鎖ＤＮＡ内に挿入されるまでは、非蛍光性である。ＴＯの蛍光強度は、ＤＮＡの量に対して線形に比例するため、増幅されたＤＮＡを有するビーズとそうでないビーズとを簡単に区別できる。
【００４９】
図４Ａ、４Ｂ、および、４Ｃは、本発明に従った単一流路マイクロ装置４００を示す図である。その装置は、マイクロ流体弁と、ヒータと、抵抗温度検出器（ＲＴＤ）と、すべての反応、捕捉および浄化、ＣＥのための構造と、を備える４つの層、すなわち、ガラス−ガラス−ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）−ガラスのサンドイッチ構造として形成されてよい。その装置は、別の実施形態では、ガラス−ＰＤＭＳ−ガラス−ガラスのスタックとして形成されてもよい。弁と、ヒータと、ＲＴＤと、チャンバと、ＣＥ構造とを備える４層の微細加工システムについては、２００３年１２月２９日に出願された米国特許出願Ｎｏ．１０／７５０，５３３、「Ｆｌｕｉｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅｓ」に記載されている。この出願は、本願の譲受人に譲渡されたものであり、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５０】
マイクロ装置４００は、伸長断片の生成、反応の浄化、および、伸長断片の分離（図２の工程２１２および２１４）を含むＭＩＮＤＳ処理における後処理工程すべてを実行することができる。装置４００は、熱循環すなわち配列決定反応チャンバ４０２と、捕捉・精製チャンバ４０４と、分離流路４０７を有するＣＥシステム４０６とを備える。図に示すように、装置４００のこれらの構成要素は、様々な弁および流路によって接続されている。熱循環チャンバの内容物を加熱するために、ヒータ（図示せず）、例えば、カプトンヒータを用いてよい。チャンバのテンプレートは、ＲＴＤ４０５によって監視される。
【００５１】
図４Ｃに示すように、その装置４００は、流路層４３０と、ビア層４３２と、マニホルド層４３４とを含む３つのガラス層を備える。ビア層４３２とマニホルド層４３４との間には、ＰＤＭＳ膜層４３６が設けられている。最上層４３０は、熱循環リアクタと、捕捉チャンバと、ＣＥ形状とを含む。第２の層４３２は、ガラスウエハの上面にＲＴＤを備え、下面にエッチング形状を備えることで、下の膜層４３６と共に弁およびポンプを形成している。最後の層４３４は、ヒータを備えており、空気圧アクチュエーションラインおよび置換チャンバによって弁およびポンプ構造を完成させている。
【００５２】
一動作方法では、装置４００のポート４０８からマイクロ弁４１０を介して熱循環チャンバ４０２に、配列決定マスターミックスがロードされる。チャンバ４０２の容積は、約２５０ナノリットル（ｎＬ）でよい。ＣＥシステム４０６の分離流路は、ポート４１２からポート４１４まで、線形のポリアクリルアミドで満たされる。ＣＥシステムは、１６センチメートル（ｃｍ）のハイパーターンシステムであってよい。ポート４１６からポート４１８まで、アクリダイト（acrydite）の捕捉マトリクスをロードして、捕捉チャンバ４０４と、介在する狭まったチャンバ４１９とを満たす。チャンバ４０２の熱循環後、伸長断片と残った反応物質とを、弁４２０と流路４２２とを通して捕捉チャンバ４０４内に、電気動力学的に送り出す。次に、捕捉された伸長断片は、電気泳動によって洗浄され、流路４２４内に注入されて、ＣＥシステム４０６による分離に備える。
【００５３】
この親和性捕捉・サンプル浄化マイクロ装置の利点は、合成中に追加されたアクリダイトのモノマの量によって決まる濃度で、１−１０ｎＬ中に、精製された伸長断片を保持できる点である。図５Ａ、５Ｂ、および、５Ｃは、熱循環、捕捉、洗浄（精製）、サンプルの濃縮、および、分離が実行される装置４００と同様のマイクロ装置５００の動作から得られた蛍光画像（印加される相対電位を「＋」および「−」で示している）を示す図である。具体的には、５％ ｗ／ｖのアクリルアミドと、１×ＴＴＥ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＴＡＰＳ遊離酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．４）と、２０ｎｍｏｌのメタクリル酸塩修飾のオリゴとの２ｍＬ溶液内で、アクリダイト捕捉マトリクスを合成した（５’−アクリダイト−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡ−３’、ＴM＝６０．４℃、カリフォルニア州エメリービルのＯｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。その溶液は、０．０１５％ ｗ／ｖのＡＰＳおよびＴＥＭＥＤを加えて重合を開始する前に、２時間アルゴンで拡散した。次いで、重合された捕捉マトリクスを、１ｍＬシリンジを用いて捕捉チャンバ５０４に注入した。ポリマ配列決定マトリクス（ＣＥＱ、カリフォルニア州フラートンのＢｅｃｋｍａｎ社）を、高圧ゲルローダを用いて、ＣＥシステム５０６にロードした。８０ｎＭのＥＴプライマと、１×Ｃターミネータミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）と、４ｎＭのＰＣＲ産物とを含むＣ−トラック・マスターミックスを準備して、２５０ｎＬの熱循環チャンバすなわちリアクタ（図示せず）に注入した。ＬａｂＶＩＥＷプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、テキサス州オースチン）を用いてオンチップで、熱循環（３５回、９４℃  ３０秒、４５℃  ４０秒、７０℃  ４０秒）を実行した。
【００５４】
まず、５０℃に加熱されたステージ上で３０秒間、マイクロ装置の平衡を保つことにより、配列決定反応の浄化を実行した。次に、捕捉チャンバの出口（図４Ａのポート４１６）に２，０００Ｖを印加しつつ、リアクタの入り口（図４Ａのポート４０８）を接地することにより、サンプルの捕捉（図５Ａ）を開始した。このように、伸長断片および残留ヌクレオチドと、プライマと、塩とを含むサンプルを、熱循環チャンバから流路５２２を通して捕捉チャンバ５０４に電気泳動した。伸長断片は、捕捉チャンバ内でアクリダイトマトリックスにハイブリダイズするが、残留反応物質は、通過する。オリゴヌクレオチドの捕捉が完了すると、保持された伸長断片を３０秒間、電気泳動によって洗浄して（図５Ｂ）、捕捉チャンバ内に残った余分なプライマや他の不純物を除去した。電気泳動によって洗浄した後、ステージを傾斜させて７０℃にし、６０秒間平衡を保ち、産物−マトリクスの二本鎖（デュープレックス）を完全に変性させた。変性されたサンプルは、アノードに２，５００Ｖを印加しつつ、捕捉チャンバの出口を接地することにより、ＣＥ装置５０６の分離カラム５０７に直接注入される（図５Ｃ）。（ただし、流路の構造を強調して、蛍光の表面不純を除去するように、画像処理を行った）。
【００５５】
あるいは、まっすぐなクロスインジェクタと、３０ｃｍの分離キャピラリとを用いてもよい。これにより、分解能が向上される。
【００５６】
マイクロスフィアコロニーの生成手順と、単一リアクタのマイクロ装置とは、再配列決定の試みに適したシングル末端の読み取りを生成できる。複雑なゲノムのデノボ（de novo）全ゲノムショットガン配列決定を行うには、長短の挿入クローンからのペア末端の読み取りが要求される。マイクロスフィアのサブセットに対して、蛍光フローサイトメトリの前にロングレンジＰＣＲを用いて、長挿入物クローンを選択的に生成することができる。従来のペア末端の配列決定は、マイクロスフィアから、クローンＤＮＡを解放して、別個の順方向および逆方向の配列決定リアクタに送ることができるように、手順およびマイクロ装置を修正することを要求する。別の方法では、変更された塩基標識方法を用いて、塩基のサブセットに対して、同時に順方向および逆方向の配列決定を実行する。これらのペア末端読み取りは、配列アセンブリに４塩基シングル末端読み取りを固定するのに適した長い１塩基または２塩基の読み取りを生成する。
【００５７】
図６Ａ、６Ｂ、および、６Ｃに示すように、マイクロスフィア６００を用いて、配列決定反応が実行される熱循環すなわち配列決定反応チャンバ６０２に、クローンテンプレートを移送する。この処理では、各配列決定反応チャンバに１つのマイクロスフィアを導入することが要求される。そのために、個々に作動される弁や検知の必要なしに、配列決定反応チャンバ内に個々のマイクロスフィアを捕捉する自動弁技術を用いる。
【００５８】
図に示すように、反応チャンバ６０２は、導入流路すなわちアーム６０４と、出口流路すなわちアーム６０６とを備える。導入流路と、反応チャンバの流入ポート６０５との間で、流体が行き来するようになっており、出口流路と、反応チャンバの流出ポート６０７との間で、流体が行き来するようになっている。反応チャンバの流出端部すなわちポートに、狭窄部または狭窄領域６０８を形成することにより、自動弁を実現する。狭窄領域は、半円の形状を有する。
【００５９】
狭窄部は、マイクロスフィアを、チャンバを出る前に捕捉する。捕捉されたマイクロスフィアは、流速を低減することにより、さらなるマイクロスフィアがチャンバに流れ込むのを防止する。マイクロスフィアの希釈は、最初のマイクロスフィアがチャンバを閉塞する前に、別のマイクロスフィアが反応チャンバに流れ込む可能性が、約０．５％未満になるように選択される。この統計的な方法が、信頼できない、すなわち、選別率が低い場合には、ビーズの光散乱に対するオンチップ・センサを用いることが可能であり、選別ループに２つの弁を追加して、より時間的に一様なビーズ分布を実現することも可能である。
【００６０】
図６Ａないし６Ｃに示した装置を形成するために、ガラス加工処理を用いることができる。一例では、狭窄部を除くすべての形状を、３０μｍの深さまで等方性エッチングした。サンプルのための導入流路および出口流路は、７０μｍの幅と、１５ｍｍの長さを有するよう構成した。配列決定チャンバの容積は、２５０ｎＬであった。流路および反応チャンバのための基本的な加工処理が完了した後に、第２のマスクを用いて、狭窄部を加工した。このために、より粘性の高いフォトレジスト（ＳＪＲ  ５７４０、Ｓｈｉｐｌｅｙ社、マサチューセッツ州マールボロ）を、２５００ｒｐｍで３５秒間、ウエハ上に回転塗布する。この次に、７０℃で７分間および９０℃で６分間の弱い焼成を行った。より粘性の高いフォトレジストにより、形状を形成されたウエハ上に、より一様な被覆が施される。次に、コンタクトプリンタを用いて、被覆されたウエハに、狭窄部のパターンを転写した。位置決めマークを用いて、すでにエッチングされた流路およびチャンバに対して狭窄部の位置決めを行った（±１μｍ）。現像（ディベロップメント）後、プラズマエッチングによって、アモルファスシリコンのマスク層を除去し、５：１ＢＨＦを用いて、２μｍ／時の有効エッチング速度で１．５時間、露出されたガラスを湿式エッチングした。これにより、狭窄部の深さすなわち高さは、３μｍになった。狭窄部の幅は８μｍに設定され、長さは１５μｍに設定された。
【００６１】
１×Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の溶液に、６μｍ径のストレプトアビジン被覆フルオレスブライト（Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ）ＹＧカルボキシル化ポリスチレン・マイクロスフィア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルベニア州ウォリントン）をけん濁して、最終的に１マイクロスフィア／３μＬとなるように希釈した物を用いて、自動弁の構想の試験を行った。ポワソン分布を用いた計算によると、反応チャンバ容積の１０倍の希釈によって、最初のマイクロスフィアが狭窄部を閉塞する前に、別のマイクロスフィアが２５０ｎＬのチャンバに入る可能性が、約０．５％未満になる。
【００６２】
図６Ａないし６Ｃに示したものと同様の装置を、１×Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の溶液で事前に満たした。マイクロスフィア溶液（６μＬ）を、流入口にピペットで注入した。チャンバを通してビーズを引くために、真空ラインを用いた。マイクロスフィアが狭窄部で捕捉されると、圧力低下が、−６０ｋＰａから−７０ｋＰａに増大して、最初の６０秒以内に、閉塞が起きた。１２分間、実験を継続したが、その他のマイクロスフィアが、チャンバに入るのは観察されなかった。
【００６３】
図７Ａおよび７Ｂは、それぞれ、空の状態および溶液を満たした状態（マイクロスフィアを含まない）の熱循環チャンバ７０２の狭窄領域７０８の２０倍に拡大した明視野画像を示す図である。図７Ｃは、蛍光マイクロスフィア７００が狭窄部７０８に捕捉されて弁として機能している状態の熱循環チャンバ７０２の暗視野画像を示す図である。約６μｍ径のマイクロスフィアについて、実験を行った。この構想は、リアクタ内のテンプレートの数を増大するために、より大きいマイクロスフィアに容易に拡張することが可能である。また、より小さいマイクロスフィアを用いてもよい。特に、マイクロスフィアは、約１から１００μｍの直径を有してよい。一実施形態では、マイクロスフィアは、１０μｍの直径を有する。
【００６４】
完全に流れを遮断する別の自動弁の実施形態を、図８Ａおよび８Ｂに示す。この実施例では、反応チャンバ８０２は、チャンバの流出ポート８０７に形成されたほぼ円形の狭窄部または狭窄領域８０８を有する。チャンバおよび狭窄部は、ダブルエッチング、すなわち、２つの結合されたガラス面の両方にエッチングされる。これにより、図６Ａないし６Ｃの実施形態の半円形の狭窄部と異なり、ほぼ円形の狭窄部が形成される。これは、マイクロスフィア８００を捕捉するために、より良好な弁の機能を提供する。
【００６５】
上述のように、弁は、配列決定反応すなわち熱循環チャンバ４０２（図４Ａおよび４Ｂ参照）の両側に組み込まれる。マイクロスフィアは、狭窄部に捕捉されると、クローンテンプレートが、ポリメラーゼ、プライマ、ｄＮＴＰ、および、ｄｄＮＴＰに対して良好な接近性を有するように、熱循環のためにチャンバ内に押し戻される必要がある。流入弁４１０を閉じる前にチャンバの出口の弁４２０を閉じることにより、弁の限定されたデッドボリュームの結果、マイクロスフィアは、チャンバ内に押し戻される。この原理は、複数の流入弁および複数の流出弁を並行に（インパラレル）作動させることにより、簡単にアレイシステムに拡張できる。
【００６６】
ＤＮＡ分析のための高スループットで完全に集積されたシステムを実現するために、熱循環チャンバ、精製チャンバ、および、配列決定断片のＣＥ分析のための分離流路を組み込んだ集積分析器の微細加工アレイを提供する。かかるシステム９００の説明図を、図９Ａおよび９Ｂに示した。このシステムは、図４Ａないし４Ｃの単一流路装置を、高度な並列分析を実行できるアレイ構造に拡張したものである。
【００６７】
様々な実施形態によると、システム９００は、複数の熱循環チャンバ９０２と、それらに関連するサンプル精製すなわち捕捉チャンバ９０４とを、円の中心線の周りに配置して、放射状の並列システムを形成している。熱循環チャンバおよびサンプル精製チャンバは、すべて、分離流路すなわちマイクロ流路９０８を備えたＣＥ分析システム９０６と統合されている。ＣＥ分析器は、共通の中央アノード（Ａ）９１０と、カソード容器（Ｃ）９１２と、廃棄物容器（Ｗ）９１４とを備える。カソードおよびアノード容器は、隣接する分離流路９０８のセットに関連している。マイクロ流路９０８は、回転式共焦点蛍光スキャナを用いて検出を行うために、アノード９１０に結合されている。このスキャナは、「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ９６−ｓａｍｐｌｅ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ａｒｒａｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ」、Ｐｅｔｅｒ  Ｃ．Ｓｉｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９５、ｐｐ２２５６−２２６１、１９９８年３月、という論文に記載されている種類のものであり、この論文は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６８】
システム９００は、さらに、分配流路９１６と、集積ヒータ９１８ａおよび９１８ｂと、ＲＴＤ９２０とを備える。ヒータ９１８ａおよび９１８ｂは、それぞれ、複数の熱循環チャンバおよび複数の精製チャンバを並行に（インパラレル）扱う。このように、複数の熱循環チャンバおよびサンプル精製チャンバに対して、単純な環状のヒータを用いれば十分である。
【００６９】
これらの反応の温度は、ＲＴＤによって監視される。一実施形態では、等間隔に配置された４つのＲＴＤが、基板に組み込まれており、最適な熱循環性能を実現するために、ヒータ９１８ａの全体にわたって正確な温度検出を行う。同様に、等間隔に配置された４つのＲＴＤを用いて、ヒータ９１８ｂの温度を監視することができる。
【００７０】
システム９００は、さらに、システムにおける流れを制御するために集積された弁およびポートのアレイを備える。それらの弁は、モノリシックエラストマ（ＰＤＭＳ）膜の弁であってよい。そのシステムは、上述の米国特許出願Ｎｏ．１０／７５０，５３３（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているように加工されてよい。すなわち、システムは、マイクロ流体弁およびポンプと、ＲＴＤと、熱循環チャンバと、浄化および濃縮チャンバと、ＣＥ流路とを組み込んだ４つの層（ガラス−ガラス−ＰＤＭＳ−ガラス）のスタックを備えてよい。
【００７１】
システム９００は、一実施形態では、２４の熱循環チャンバと、２４の精製チャンバと、２４のＣＥ流路とを、１５０ｍｍ径のガラス基板の四分円状部分に配列されている。各熱循環チャンバ（〜２５０ｎＬ）は、ＰＤＭＳ膜の弁（Ｖ１）９２２によって分配流路から隔てられている。サンプルの動き、泡の形成、および、サンプルの蒸発は、性能に深刻な影響を与えるので、熱循環中に泡の発生なしにサンプルをロードして動かないようにするために、動作中の（アクティブ）弁によってチャンバの容積をしっかりと封じ込めることが必要である。
【００７２】
ＲＴＤは、チタン（Ｔｉ）およびプラチナ（Ｐｔ）から加工されてよい。スパッタリング蒸着や、熱および電子ビーム蒸着など、様々な金属蒸着技術を用いて、様々な材料（Ａｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ）で、ヒータを加工してよい。ニッケルヒータは、加熱の均一性や引っかきの抵抗性が良好であり、数百回の熱循環の後にも顕著な劣化がなく、加工が容易である。微細加工されたヒータと、熱循環チャンバとを、ＣＥマイクロ流路から離して配置することにより、カソード容器内のバッファの蒸発を防ぎ、熱循環の際の注入領域の加熱を最小限に抑えている。環状の抵抗ヒータを下部のウエハの裏側に加工することで、ヒータとチャンバとの間の良好な熱伝達を実現できる。等間隔のＲＴＤは、マイクロプレート上に組み込まれ、ヒータ全体にわたって均一な温度を保証することで性能を最適化するために精確に温度を検出する。
【００７３】
熱循環チャンバは、ＬａｂＶＩＥＷプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、テキサス州オースチン）によって循環を実行されてよい。（ＬａｂＶＩＥＷ  ＶＩ）。ＬａｂＶＩＥＷプログラム内の比例／積分／微分（ＰＩＤ）モジュールによって、温度の制御を実現できる。
【００７４】
動作中、一実施形態では、アノード９１０を通して、正圧を用いて、ＣＥ分離流路内に、配列決定分離マトリクスを導入する。分離マトリクスは、カソード容器９１２と、廃棄物容器９１４と、関連のサンプル精製チャンバにクロスインジェクション点を接続するアーム９２４とを満たす。満たす速度は、様々な相互接続流路の幅および長さを変えることによって調節することができる。カソード容器およびアノード容器と、接続アームとは、同じ速度で満たされてよい。例えば、分配流路９１６に接続されたロード用ポート（Ｌ）９２６から、水をロードして、熱循環チャンバ９０２と、サンプル精製チャンバ９０４とを満たし、後に続く処理の連続性を確保する。出口ポート（Ｅ）９３６は、両方の熱循環チャンバ９０２によって共有される。
【００７５】
サンプル精製チャンバには、ポート（Ｆ）９２８を通して、捕捉ゲルマトリクスがロードされる。ＦＡＣＳユニットを用いて選別および準備されたクローンＤＮＡビーズのライブラリが、例えば、シリンジポンプを用いて、ポート９２６から（弁（Ｖ１）９２２および（Ｖ２）９３０を開放して、弁（Ｖ３）９３２を閉じた状態で）ロードされる。上部圧力を監視するために、流入口内で圧力変換器を用いる。熱循環チャンバの出口ポートにおける自動弁は、上述のように、自動弁にビーズが捕捉されると、チャンバ内への流れを止める。各々の自動弁が各熱循環チャンバ内のビーズで満たされると、上部圧力が上昇し続ける。このように、上部圧力を監視することにより、各熱循環チャンバに１つのビーズをロードできる。
【００７６】
チャンバを満たす際には、弁（Ｖ２）９３０および（Ｖ１）９２２が閉じられて、熱循環反応が開始される。ビーズは、熱循環混合物内で直接的に選別されるため、熱循環の前に、さらなる工程は必要ない。あるいは、バッファ内で選別を実行した後に、熱循環混合物を熱循環チャンバに導入して、試薬の使用量を最小限に抑えてもよい。ヒータ９１８ａおよび９１８ｂは、上述のように、熱循環およびサンプル精製の反応を促進し、それらの反応温度は、ＲＴＤ９２０によって監視される。
【００７７】
熱循環産物は、弁（Ｖ１）９２２および（Ｖ３）９３２を開放した状態でポート（Ｌ）９２６およびサンプルポートすなわち電気的接点（Ｓ）９３４にわたって電界を掛けることにより、精製チャンバに送られる。ポート（Ｓ）９３４とポート（Ｆ）９２８との間に電界を掛けることにより、捕捉されなかった試薬の洗浄を実行する。その後、配列決定産物は、ポート（Ｓ）９３４と廃棄物容器（Ｗ）９１４との間に電位を印加することにより、ＣＥ分離のため、精製チャンバから、関連のマイクロ流路９８０に注入される。回転式共焦点蛍光スキャナを用いて、配列決定サンプルを検出する。スキャナは、スキャナヘッドの回転ごとに、複数の流路を順次走査する。
【００７８】
図に示すように、精製されたＤＮＡ配列決定産物の分離は、クロスインジェクションを用いて実現される。あるいは、ダイレクトインジェクションを用いてもよい。
【００７９】
別の実施形態では、コロニー形成のマイクロエマルジョンＰＣＲ法の代わりに、テンプレートの１分子ＰＣＲ増幅を実行するための複数のボーラスすなわち液滴を形成して増幅する連続フロースルー型ＰＣＲ技術を用いる。複数のボーラスすなわちプラグは、例えば、ＰＣＲ試薬と低濃度のテンプレート断片の水溶液を、キャリアとして機能する疎水性溶液と混合することにより形成される。この技術で生成されるボーラスは、統計的に、配列決定テンプレートの少数の複製物を含む。理想的には、濃度は、１０ボーラスの内の１つだけが、１つの配列決定テンプレートを含むよう選択される。これは、２つのテンプレートを同時に含む望ましくないボーラスが、１００に１つだけであることを意味する。ＰＣＲ反応のプライマの１つを運ぶマイクロスフィアすなわちビーズが、この技術を実行する処理におけるボーラスすなわち液滴に含まれてもよい。したがって、コロニーは、単一の配列決定テンプレートの複数のクローン複製物を運ぶボーラス、または、かかる複製物を運ぶマイクロスフィアを有するボーラスを含んでよい。
【００８０】
図１０Ａ、１０Ｂ、および、１０Ｃに示すように、連続フロースルー型微細加工ＰＣＲシステム１０００は、ポート１００２および１００４を備える。一実施形態では、マイクロスフィアと、ＰＣＲ試薬と、テンプレート断片との水溶液が、ポート１００２を通して「Ｔ字形」インジェクタ領域１００６に導入され、疎水性のキャリア溶液が、ポート１００４を通して「Ｔ字形」インジェクタに導入される。こうして、マイクロスフィアを含むボーラスすなわち液滴１０１２が、「Ｔ字形」インジェクタ領域の下流側で形成される。
【００８１】
システム１０００は、さらに、「Ｔ字形」インジェクタ領域の下流側における流路１０１４の入力側の近くに配置された光学センサ１００７（図１０Ｂ）を備える。そのセンサは、集束レーザビームと、軸外の光散乱を検出するための光ダイオードとを備えてよい。
【００８２】
センサは、ビーズを含むボーラスを選択し、ビーズを含まないボーラスと２以上のビーズを含むボーラスとを拒絶するよう構成される。拒絶されたボーラスは、弁１００９と廃棄ポートおよび流路１０１１とを通してシステムの外に排出される。弁１００９は、開いた時に、拒絶されたボーラスが廃棄ポート１０１１を通してシステムから出ることを可能にする４層のＰＤＭＳ弁であってよい。弁は、弁作動ポート１０１３によって作動されてよい。連続フロー型システムの流体の抵抗は非常に大きいため、主流路１０１４には弁が必要ない。
【００８３】
システム１０００は、アニーリング工程および伸長工程を組み合わせた２工程ＰＣＲ用に設計されている。したがって、そのシステムは、液滴１０１２が、流路１０１４を抜ける流れを介して通り過ぎる２つの温度領域１００８および１０１０を備える。装置１０００は、異なる温度領域の温度を監視するために、ＲＴＤ１０１６と、関連するＲＴＤコンタクトパッド１０１８とを備える。ボーラスおよびマイクロスフィアは、２つの温度のＰＣＲを受けた後、ポート１０２０を通してシステムから出る。
【００８４】
上述のように、マイクロスフィアは、ＴＯなどの挿入色素で処理される。挿入色素は、二本鎖ＤＮＡ内に挿入されるまでは、非蛍光性である。したがって、増幅されたＤＮＡを含むマイクロスフィアは、ポート１０２０を通り抜けた後に、例えば、ＦＡＣＳ技術によって特定可能である。その後、マイクロスフィアは、装置９００（図９Ａおよび９Ｂ）のような装置の分配流路内に導入される。一方、増幅されたＤＮＡを含まないマイクロスフィアは、廃棄される。
【００８５】
連続フロースルー型ＰＣＲシステム１０００は、一例では、ペルフルオロ炭化水素のキャリアにけん濁されたＰＣＲ試薬のナノリットルの液滴を用いる。Ｓｏｎｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．、「Ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  ｔｉｍｅ」、Angewandte Chemie-International Edition 42, 768-772 (2003)を参照。これは、参照によって本明細書に組み込まれる。非混和液によって互いに分離された状態で、マイクロスフィアと、ＰＣＲ試薬と、テンプレート断片とを含む液滴が、微細加工されたＴ字形インジェクタ１００６で形成される。その後、液滴は、アニーリング−伸長−変性の温度に保持された装置の領域１００８および１０１０を流れる。温度の異なる領域１００８および１０１０における流路１０１４の長さは、それらの温度で要求される滞留時間に基づいて選択される。流路の断面積と、所望の流速とは、安定した液滴の形成を実現できるように選択される。装置のパラメータは、９０秒間の変性温度でのホットスタートを実現し、その後に、１秒の自己伸長を伴う４５秒間のアニーリング／伸長を３５サイクルと、１５秒間の変性時間とを実行するように、設定されてよい。最後の１５サイクルは、８０秒間の一定のアニーリング／伸長時間を有するよう構成されてもよい。
【００８６】
装置１０００は、２つの１．１ｍｍ厚×１０ｃｍ径のボロフロートガラスのウエハを備えてよい。パターニングされたウエハ上の流路は、約２１０μｍの幅と約９５μｍの深さとを有するＤ字形の断面を有してよい。他方のウエハ上には、装置の異なる地点において温度勾配を監視するために、Ｔｉ／ＰｔのＲＴＤが加工されてよい。流路にアクセスするための穴が、開けられてよく、２つのウエハは、互いに熱接着されて、流路を密閉してよい。ナノポート１００２および１００４は、ＰＥＥＫ管を介してマイクロリットルのシリンジに装置を接続するために用いられる。流路のガラス表面は、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．、「Ａｌｋｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｆｉｌｍｓ  ｆｏｒ  ｓｔｉｃｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏｎ  ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ７、２５２−２６０、（１９９８）に記載された手順に基づいて、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシルトリクロロシランによるシラン処理で疎水化されてよい。この論文は、参照によって本明細書に組み込まれる。２つのシリンジポンプは、水と、ペルフルオロデカリン（シスおよびトランスの混合物、９５％、米国ニュージャージー州のＡｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ社）および１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクタノール（米国ニュージャージー州のＡｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ社）の１０：１の混合物とを、それぞれ０．５μｌ／分の流速で供給するために用いられる。図１０Ｂは、約１液滴／秒でのＴ字形インジェクタにおける液滴形成処理を示す図であり、図１０Ｃは、流路を通って移動する際の液滴を示す図である。
【００８７】
その技術は、一実施形態では、１０ｎＬ液滴に含まれたマイクロビーズを用いる。スループットは、１０液滴の内の１つが、１つのテンプレート分子と１つのビーズとの両方を含むように維持される。ＰＣＲミックスの水溶液は、１００ｎＬのミックス当たり１つのテンプレート分子が存在する（１０液滴ごとに１分子に相当）ように準備される。さらに、ＰＣＲミックスには、１０ｎＬのミックス当たり１つの濃度（平均して１液滴ごとに１ビーズに相当）で、マイクロビーズが存在する。ポワソン分布によって決定されるように、１０ｎＬの液滴の３７％は、マイクロビーズを１つだけ含み、残りの液滴は、１つも含まないか、２つ以上を含む。次いで、各液滴は、上述のように、光学的に走査されて、含有するビーズの数を決定される。液滴が含むマイクロビーズが１つでない場合には、弁１００９が開放されて、その液滴を廃棄する。液滴の約３分の１は、１つのビーズを含むため、主流路に送られる。したがって、平均流速は、１．５秒当たり約１液滴となる。このように、主流路内の液滴はすべて、１つのマイクロビーズを含み、１０の内１つは、さらに、１つのテンプレート分子を含む。
【００８８】
装置１０００の終点において、液滴は、ポート１０２０で収集されて、標準的なキャピラリを経由し、マイクロフュージ管に流入する。液滴は、遠心分離によって破壊される。マイクロビーズは、収集され、１ＸのＴＥで洗浄されて、再び、遠心分離される。マイクロビーズは、オンチップ検出を備えた能動（アクティブ）弁または自動弁によって、装置９００の熱循環チャンバ内に送られる。オンチップ検出は、マイクロスフィアが熱循環チャンバの流入口に近づいたことを判定する光学スキャナまたはタイミング構成を備えてよい。光学スキャナは、上述のように、ビーズの光散乱を用いて、分配流路内のマイクロスフィアの位置を決定してよい。タイミング構成は、分配流路内の流体が非圧縮性であることに基づく。すなわち、分配流路内のマイクロスフィアの位置（例えば、熱循環チャンバの流入口の近くの位置など）は、分配流路内でのマイクロスフィアの滞在時間から算出可能である。これは、分配流路から９６の入力の各々への弁による流入口を、例えば、単一の空気入力によって作動させることができるため有利である。また、空気入力は、検出されたビーズが、ビーズをまだ含まないリアクタの真正面（ディレクトリオポジット）に流されるまでは作動されない。
【００８９】
２温度ＰＣＲを用いて配列決定テンプレートを生成する実現可能性を示すために、高温プライマを設計して、従来の熱循環器で試験した。Ｍ１３ゲノムから９４３ｂｐの増幅産物を生成するために、２つのプライマ、すなわち、Ｍ１３＿２Ｔ＿Ｆ  ５’ＴＴＣＴＧＧＴＧＣＣＧＧＡＡＡＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡ−３’（Ｔm＝７０．３℃）、および、Ｍ１３＿２Ｔ＿Ｒ  ５’−  ＡＣＧＣＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＴＴＧＣＣＡ−３’（Ｔm＝７０．７℃）を設計した。１１ｎＬのエマルジョン区画内に１つのテンプレート分子が存在する濃度に近づけるために、１８．７５フェムトグラムのＭ１３テンプレートを、２５μＬのＰＣＲ反応に循環させた（９４℃で１．５分のＰＣＲ反応の後、９４℃で１０秒、７０℃で３０秒を、５０サイクル、１秒／サイクルの自己伸長で行った）。結果として生じる増幅産物は、約４０ｎｇ／μＬの収率で、期待されたサイズで単一のきれいなピークを示した。
【００９０】
かかるシステムをゲノムＤＮＡの増幅に用いた場合、１倍の網羅範囲（カバー）および１０００ｂｐｓの平均断片サイズに対して、約３００万の断片を増幅する必要がある。２つの異なる断片が最終的に１つの液滴内に含まれる可能性は、１０の液滴の内の平均１つの液滴が１つの断片を含むように、ＰＣＲ試薬内の断片を希釈することにより、０．０１未満に低減できる。したがって、システムは、３，０００万の液滴を処理する必要がある。この装置は、約１．５秒ごとに１つの液滴を生成するよう設計されている。２０の装置を並行に実行すれば、ゲノム全体を増幅して、１組の配列決定システム９００に適合させ、ほんの１ヶ月で１倍の網羅範囲を実現できる。
【００９１】
本発明は、具体的な実施形態を参照して詳細に図示および記載されているが、本発明の趣旨や範囲から逸脱せずに、開示された実施形態の形態および詳細事項を変更することができることは、当業者にとって明らかなことである。例えば、上述の実施形態は、様々な材料を用いて実施されてよい。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。
【００９２】
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載］
本発明の技術とメカニズムとは、整理番号ＨＧ００１３９９，ＰＯ１  ＣＡ７７６６４，Ｕ０１ＡＩ０５６４７２の米国国立衛生研究所の提供（ＮＩＨ  Ｇｒａｎｔ）による政府のサポートによって、なされた。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】従来のゲノム規模の配列決定動作が備える工程を示す説明図。
【図２】本発明に従って、ゲノム配列決定処理が備える工程を示す説明図。
【図３】本発明で利用可能なクローニング処理を示す説明図。
【図４Ａ】本発明に従って、単一流路マイクロ装置を示す説明図。
【図４Ｂ】図４Ａの装置の一部を示す拡大図。
【図４Ｃ】単一流路マイクロ装置を示す分解図。
【図５Ａ】伸長断片の捕捉の際の本発明の装置の蛍光画像を示す図。
【図５Ｂ】伸長断片の洗浄の際の本発明の装置の蛍光画像を示す図。
【図５Ｃ】伸長断片のサンプル注入の際の本発明の装置の蛍光画像を示す図。
【図６Ａ】反応チャンバの部分拡大図と共に、装置の配列決定反応チャンバを示す説明図。
【図６Ｂ】図６Ａの線分６Ｂ−６Ｂに沿った部分を示す図。
【図６Ｃ】配列決定されるＤＮＡを運ぶビーズの捕捉に用いられる図６Ａの反応チャンバの狭窄領域を示す説明図。
【図７Ａ】空の配列決定反応チャンバの狭窄領域の明視野画像を示す図。
【図７Ｂ】溶液で満たされているが狭窄領域にマイクロスフィアが存在しない状態の配列決定反応チャンバの狭窄領域の明視野画像を示す図。
【図７Ｃ】配列決定反応チャンバの狭窄領域に配置されたマイクロスフィアの暗視野画像を示す図。
【図８Ａ】ビーズの捕捉用に設計された配列決定反応チャンバの狭窄領域の別の実施形態を示す説明図。
【図８Ｂ】図８Ａの線分８Ｂー８Ｂに沿った部分を示す図。
【図９Ａ】集積配列決定アレイシステムの四分円状部分を示す説明図。
【図９Ｂ】図９Ａのシステムの一部を示す拡大図。
【図１０Ａ】連続フロースルー型ＰＣＲ微細加工装置を示す説明図。
【図１０Ｂ】図１０Ａの線分１０Ｂ−１０Ｂにおける微細加工装置の「Ｔ字形」インジェクタ領域を示す拡大図。
【図１０Ｃ】図１０Ａの線分１０Ｃ−１０Ｃにおける微細加工装置の流路の一部を示す拡大図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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