(57)【要約】  ニーム（Ｎｅｅｍ／Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）及びニルグンディ（Ｎｉｒｇｕｎｄｉ／Ｖｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ）由来の細胞を産生する植物細胞培養物を確立することを含むペルオキシダーゼの製造方法であって、前記ペルオキシダーゼは、以前に報告されていないような高い酵素活性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ（ニーム）及びＶｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ由来の新規なペルオキシダーゼ酵素であって、以下の特性を有するペルオキシダーゼ酵素。
天然源：Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ
ｉ．部位：細胞外
ｉｉ．分子量：３６ｋＤ
ｉｉｉ．最適ｐＨ：４．５
ｉｖ．安定性：酢酸ナトリウム又はリン酸緩衝液中、４℃で１年後、３０％以上の活性が保持される
ｖ．ヘムピーク：λｍａｘ４０３ｎｍ
ｖｉ．Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈ（ＲＺ）値：２．０５
ｖｉｉ．等電点（ｐＩ）：１０以上
ｖｉｉｉ．最も高い酵素活性：１２０４６Ｕ／ｍｇ（ＡＢＴＳ）
ｉｘ．最も高い酵素活性：３２００Ｕ／ｍｇ（グアイアコール）
ｘ．グリコシル化：グリコシル化なし
天然源：Ｖｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ
ｉ．部位：細胞内のみならず細胞外
ｉｉ．分子量：３４ｋＤ
ｉｉｉ．ｐＨ範囲：３．５〜８．５
ｉｖ．最適ｐＨ：４．５
ｖ．最適温度：５０℃
ｖｉ．安定性：細胞懸濁液上清と同様に粗抽出液を酢酸ナトリウム又はリン酸緩衝液中で４℃、６ヶ月間保存した後であっても８０％以上の活性が保持される
ｖｉｉ．ヘムピーク：λｍａｘ４０９ｎｍ
ｖｉｉｉ．Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈ（ＲＺ）値：２．１０
【請求項２】
ニーム（Ｎｅｅｍ／Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）及びニルグンディ（Ｎｉｒｇｕｎｄｉ／Ｖｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ）の植物カルス並びに細胞培養物からペルオキシダーゼを製造する方法であって、下記（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法。
（ａ）固形ＭＳ培地又はＢ５培地中で葉のコンパクトカルスアグリゲート（ＣＣＡｓ）を開始させる工程、
（ｂ）約０．０５〜２ｍｇ／Ｌの範囲で種々の成長ホルモンの組合せを含むＭＳ又はＢ５液体培地（すなわち、寒天がない培地）であって、炭素源が約５％である培地１００ｍｌに５ｇＦＷ（新鮮重）のＣＣＡｓを移し、続いて旋回シェーカーで１２０ｒｐｍで攪拌することによってＣＣＡｓの増殖を最適化する工程、
（ｃ）工程（ｂ）のＣＣＡｓを、最適化された成長ホルモンの組合せをココナッツ水（ＣＷ）及び異なる誘導因子とともに含む新鮮な培地で、１４日おきに、二次培養する工程、
（ｄ）工程（ｂ）及び（ｃ）で液体培地中に産生された最大の細胞外ペルオキシダーゼを得る工程、及び、
（ｅ）従来の方法による硫酸アンモニウム沈殿によってペルオキシダーゼ酵素を精製する工程。
【請求項３】
前記工程（ａ）から（ｃ）における細胞が、好気的な条件下、温度約３０℃、約ｐＨ５〜７の範囲で培養される請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記（ａ）から（ｃ）における細胞が、好気的な条件下、温度約２５±２℃、約ｐＨ５．６〜６の範囲で培養される請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記誘導因子が、Ｋ、Ｍｇ、Ｎａ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｈｇ及びＣａからなる群から選択される金属イオンである請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記成長ホルモンが、ＩＡＡ、ＮＡＡ、ＢＡ、２，４−Ｄ及びＫｎからなる群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記成長ホルモンが、約０．１〜１．５ｍｇ／Ｌの範囲である請求項２記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｂ）において選択される炭素源が、スクロースである請求項２記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）における炭素源が、約２％である請求項２記載の方法。
【請求項１０】
前記ココナッツ水が、約５％である請求項２記載の方法。
【請求項１１】
前記ココナッツ水が、約１％である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｅ）における硫酸アンモニウムが、約６０〜７０％である請求項２記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｅ）における従来の方法が、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを含む請求項２記載の方法。
【請求項１４】
Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ由来のペルオキシダーゼが、以下の特性を示すペルオキシダーゼを有する請求項２記載の方法。
ｉ．部位：細胞外
ｉｉ．分子量：３６ｋＤ
ｉｉｉ．最適ｐＨ：４．５
ｉｖ．安定性：酢酸ナトリウム又はリン酸緩衝液中、４℃で１年後、３０％以上の活性が保持される
ｖ．ヘムピーク：λｍａｘ４０３ｎｍ
ｖｉ．Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈ（ＲＺ）Ｒ．Ｚ値：２．０５
ｖｉｉ．等電点ｐＩ：１０以上
ｖｉｉｉ．最も高い酵素活性：１２０４６Ｕ／ｍｇ（ＡＢＴＳ）
ｉｘ．最も高い酵素活性：３２００Ｕ／ｍｇ（グアイアコール）
ｘ．グリコシル化：グリコシル化なし
【請求項１５】
Ｖｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ由来のペルオキシダーゼが、以下の特性を有する請求項２記載の方法。
ｉ．部位：細胞内のみならず細胞外
ｉｉ．分子量：３４ｋＤ
ｉｉｉ．ｐＨ範囲：３．５〜８．５
ｉｖ．最適ｐＨ：４．５
ｖ．最適温度：５０℃
ｖｉ．安定性：細胞懸濁液上清と同様に粗抽出液を酢酸ナトリウム又はリン酸緩衝液中で４℃、６ヶ月間保存した後であっても８０％以上の活性が保持される
ｖｉｉ．ヘムピーク：λｍａｘ４０９ｎｍ
ｖｉｉｉ．Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈ（ＲＺ）値：２．１０
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシダーゼの製造方法であって、ニーム（Ｎｅｅｍ／Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）及びニルグンディ（Ｎｉｒｇｕｎｄｉ／Ｖｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ）由来の細胞を産生する植物細胞培養物を確立することを含み、単離されたペルオキシダーゼが並外れて高い酵素活性を有する。
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシダーゼ酵素は、植物に広く分布し、多種多様の植物種によって製造される。主に市販されているペルオキシダーゼ酵素の原料はホースラディッシュ（Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）及びダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）である。ホースラディッシュの根を収穫し、発芽させた根を粉砕し、水と機械的に混合し、精製のため一連の硫酸アンモニウム及びエタノール沈殿を行う。高純度のホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素（ＨＲＰ）は、一般的なクロマトグラフ技術によって得られる。しかし、この植物全体からの抽出操作は、多量の廃棄物の分散による環境問題を引き起こし、また、エタノール及び硫酸アンモニウム沈殿のため酵素活性の著しい不可逆的な損失がある（文献：Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，７２８，５５０号明細書（特許文献１））。ペルオキシダーゼの製造のために、種々のその他の原料が文献において提案されている。例えば、ヘベアブラジリエンシス（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）の樹皮からのペルオキシダーゼの製造が報告されている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７、ｖｏｌ４４、Ｎｏ．２、ｐｐ２３７−２４１（非特許文献１））。しかしながら、正確な比活性が示されていない。その他の報告において、ラディッシュ（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）の植物細胞培養物が細胞外ペルオキシダーゼの商業的な原料として提案されている（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９８９、１８：３２１−３２７（非特許文献２））。しかしながら、製品酵素の収率及び比活性が比較的低い。
【０００３】
ペルオキシダーゼの原料としてカルスの使用のために様々な文献をあげることができる。それらのうちの多くは、カルスの培養物は、大規模に量産することはできないという見解を示すものである。このような提案は、以下の日本特許出願に記載されている。特開平１−２２２７６号公報（原料種：シロツメクサ、パパイア、キハダ、オオマツヨイグサ、ハシリドコロ、ムラサキ、ダイズ、及びアマチャズル）、特開昭６３−２３３７８２号公報（原料種：一般的なもの）、特開平１−２２２７７７号公報（原料種：シバ及びオニシバ）、特開昭６２−１３８１８８号公報（原料種：ヨウサイ）、特開平１−２２２７８号公報（原料種：カンゾウ、サツマイモ、ステビア及びミシマサイコ）（特許文献２〜６）。
【０００４】
文献［Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、ｖｏｌ４９、ｐｐ１２１９−１２２５］を参照できる（非特許文献３）。同文献では、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）の細胞懸濁培養液において、植物成長因子と酵素活性との間に相関関連があることを示している。文献［Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９０、Ｖｏｌ２４／２５、ｐｐ２１３−２２２］では、細胞外ペルオキシダーゼの産生と植物細胞の成長との間の相関関連が、アーテミシア・アニュア（Ａｒｔｅｍｅｓｉａ ａｎｎｕａ）、コリウス・ブルメイ（Ｃｏｌｅｕｓ ｂｌｕｍｅｉ）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、及びセージ（Ｓａｌｖｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の植物培養物を用いて示されている（非特許文献４）。いずれにしても、商業的な原料として使用できることは示唆されていない。
【０００５】
国際特許出願公開ＷＯ９１／１０７２９を参照できる（特許文献７）。同文献には、容易に回収できるペルオキシダーゼの便利な原料として、セイヨウカエデ（Ａｃｅｒ ｐｓｅｕｄｏｐｌａｔａｎｕｓ）の植物細胞懸濁（根）培養液の製造が記載されている。米国特許第５７２８５５０号明細書（Ｆｏｌｗｅｒ  ｅｔ．  ａｌ、１９９８）を参照できる（特許文献１）。同文献では、製菓廃棄物を含む液体培地中に分散させたＡｃｅｒ ｐｓｅｕｄｏｐｌａｔａｎｕｓのカルスからペルオキシダーゼを製造することが報告されている。欠点は、酵素の製造が増殖因子によって最適化されていない点である。
【０００６】
米国特許第５，７０，３５７号明細書（５９−０２８４７６、Ｓｔｅｐａｎ−Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）を参照できる（特許文献８）。同文献には、細胞外ペルオキシダーゼ活性が、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ．ｃａｃａｏ）及びキンランジソ（Ｃｏｌｅｕｓ．ｂｌｕｍｅｉ）、並びに、ビャクダン（Ｓａｎｔａｌｕｍ．ａｌｂａ）における細胞内酵素において見出されたことが記載されている。下記２つのタイトルの文献［“Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｉｕｉｎ ｍｙｒｉｔｉｌｌｕｓ”Ｍｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０６（１９９５）１７７−１８４］及び［“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ．”Ｍｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１２２（１９９７）１−１０］を参照できる（非特許文献５及び６）。これらの欠点は、酵素の比活性がほぼ７５Ｕ／ｍｇ程度と極めて低いことである。文献［“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｂａｓｉｃ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  ｃａｌｌｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９（２００１）４７９−４８６］を参照できる（非特許文献７）。この欠点は、比活性が０．５６ｎ  Ｋａｔａｌｓ／ｍｇと非常に低く、採算があわない点である。
【０００７】
水性−有機相分離によってペルオキシダーゼを精製する方法が、Ｐｏｌｏｒａら（米国特許第４，９９２，３７２号明細書）によって開示されている（特許文献９）。同文献には、さらなる精製や精製した酵素の比活性についての言及はない。
【特許文献１】米国特許第５，７２８，５５０号明細書
【特許文献２】特開平１−２２２７６号公報
【特許文献３】特開昭６３−２３３７８２号公報
【特許文献４】特開平１−２２２７７７号公報
【特許文献５】特開昭６２−１３８１８８号公報
【特許文献６】特開平１−２２２７８号公報
【特許文献７】国際公開９１／１０７２９号パンフレット
【特許文献８】米国特許第５，７０，３５７号明細書
【特許文献９】米国特許第４，９９２，３７２号明細書
【非特許文献１】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７、ｖｏｌ４４、Ｎｏ．２、ｐｐ２３７−２４１
【非特許文献２】Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９８９、１８：３２１−３２７
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８、ｖｏｌ４９、ｐｐ１２１９−１２２５）
【非特許文献４】Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９０、Ｖｏｌ２４／２５、ｐｐ２１３−２２２
【非特許文献５】Ｍｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ、  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０６（１９９５）１７７−１８４
【非特許文献６】Ｍｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ、  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１２２（１９９７）１−１０
【非特許文献７】Ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９（２００１）４７９−４８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（本発明の目的）
本発明の主な目的は、Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ及びＶｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ由来の新規なペルオキシダーゼ酵素を提供することである。
【０００９】
本発明のその他の目的は、Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ及びＶｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏの植物培養物からペルオキシダーゼを製造する方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらにその他の目的は、現地で利用可能かつ豊富な植物源を用いる植物細胞培養技術によるペルオキシダーゼ酵素の商業用抽出のための代替原料を提供することである。
【００１１】
本発明のさらにその他の目的は、細胞外酵素産生のためのより優れた添加物および成長調節物質を選択することによって培地からの酵素の回収を単純化することである。
【００１２】
本発明のさらにその他の目的は、並外れて高いレベルのペルオキシダーゼ活性を示すペルオキシダーゼ酵素を産生可能なニーム（Ｎｅｅｍ／Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）及びニルグンディ（Ｎｉｒｇｕｎｄｉ／Ｖｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ）の植物細胞培養のプロトコルを提供することである。
【００１３】
さらにその他の目的は、単離された形態において、ＨＲＰの活性レベルよりも実質的に高い活性レベルを有する新規なペルオキシダーゼ酵素を提供することである。
【００１４】
本発明のさらにその他の目的は、バイオトランスフォーメーション及びバイオセンサー用の純粋な酵素の製造である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（詳細な説明）
前記ペルオキシダーゼ酵素は、植物全体や根のような植物の特定の部分から抽出される。このような処理によりこの抽出物を単離する間、その植物の破壊だけでなく廃棄物の蓄積がもたらされる。ペルオキシダーゼ産生用細胞懸濁培養液の製造についての報告があるが、本発明の方法は、利用されていない植物及びそのカルスからコンパクトカルスアグリゲートを製造するための独特かつ新規な方法を提供する。このプロトコルは優れた活性を示すため、前記コンパクトカルスアグリゲートはあまり活性を損失することなく再利用できる。このコンパクトカルスアグリゲートは、また、容易に回収もできる。本発明において最も重要な部分は、最適なバイオマス生成及び酵素活性のためのホルモンの組合せや不確定補助剤（undefined supplement）（ココナッツ水）の組合せが最適化されている点である。
【００１６】
驚異的な酵素活性を示すコンパクトカルスアグリゲートが、回収及び再利用できるように誘導された。これに対し、従前の研究において使用された細胞懸濁物は、容易に回収できない。多くの市販の調製品は、植物全体が酵素の抽出のために使用され、このためその植物の破壊だけでなく廃棄物の蓄積をもたらす。それはそれとして、植物全体／微生物からの酵素精製は非常に難しく、通常精製された酵素の価格の約７０％が精製コストといっても過言ではない。
【００１７】
本発明において、バイオマス成長及び酵素産生を最適化するために、ホルモンの組合せの濃度及び不確定補助剤（ココナッツ水）を変化させることによって方法が開発された。
【００１８】
前述のとおり、植物によって得られたカルス、特に、本発明の植物（これらの植物からのペルオキシダーゼ単離は今まで報告されていない）は、その他の確認されている報告と比較して著しい活性を示す。さらには、本発明から単離された酵素は粗形態のものであっても、市販の製造物に使用する実現可能性を高める。通常、細胞懸濁培養液が、酵素産生に使用される。我々は、酵素の回収及び再利用を実効ならしめるプロトコルを確立することによって、コンパクトカルスアグリゲートを引き起こした。
【００１９】
成長調節因子の影響は、非常に大きな方法で酵素産生を変化させることができる。例えば、Ｖｉｔｅｘの場合、植物全体それ自体はなんら酵素活性を欠くのに対し、Ｖｉｔｅｘのカルスは、ホルモンの組合せ及び濃度を変化させることで変化させうる活性を示す。植物調節因子は、環境保護局によって「生理作用を通じて、成長若しくは成熟の速度を促進若しくは遅らせるか、又は、植物又はその産生物の性質を変えるための任意の物質又は物質の混合物」と規定されている。さらに、植物調節因子は、適用量が低いこと、及び、適用量が高くなると、それらの多くが除草剤として機能するため、通常、成長速度が減少することによって特徴付けられる。植物で同定されたホルモンは、ほとんどの場合、細胞の分裂、伸長及び分化を調節する。植物ホルモンは、非常に少ない濃度で働き、膜特性に作用し、遺伝子発現を制御し、酵素活性に影響を及ぼす。
【００２０】
サイトカイニンは、ＤＮＡにおける分子の１つである。生物学者は、まだ、植物において見出されたサイトカイニンの遺伝子を同定していない。組織培養で増殖した柔細胞は、サイトカイニン及びオーキシンが存在していないと分裂や分化を生じない。サイトカイニンは、ＲＮＡ及びタンパク質合成を刺激し、クロロフィルの分解を遅らせる。オーキシンは、その他のホルモンの産生を促進させる。オーキシンは、形成層細胞を刺激して分裂させ、二次木部を刺激して分化させる。ホルモンを欠如する研究において、酵素活性が低い理由は、ホルモンの組合せを調節することによる良好なプロトコルの確立の失敗に起因するだろう。さらには、成長調節因子を使用することなくカルス培養物を確立し保持することは通常可能ではない。
【００２１】
研究した双方の植物の比活性及び収率は、植物全体とカルス培養物の双方からのその産生物を考慮すると、我々が参照した全ての既報告よりもよい。もっとも後者のタイプを利用する文献はほとんどない。以下の表１では、我々のカルスの酵素活性とその他の植物の酵素活性を比較する（我々の植物ではＡＢＴＳを用いたものの方が高かったが、画一性を得るために、基質としてグアイアコールを使用した値を示す）。
【００２２】
【表１】
2008500038.tif 000002
【００２３】
前述の通り、これらの酵素は、市販の純粋な酵素よりも格段によい非常に良好な活性を示す。産生されたコンパクトカルスアグリゲートは、再利用することができ、高い活性に起因して連続的な産生に利用できる。加えて、市販の酵素はＡｒｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ（ホースラディッシュ）のような植物から抽出される。この植物は、通常、より寒い気候のみに分布されており、熱帯のような地方では商業的に利用することはできない。このためその他の原料の必要性が重要視されている。これらの酵素の生産コストは、市販の酵素のコストと比較して非常に少ない。
【００２４】
研究中の植物由来の酵素のコストを大まかに換算すると、約２ラークの酵素単位の生産に２ドルで十分であった。一方、市販のＨＲＰの同一の単位のためのコストは４５０ドルである。
【００２５】
コンパクトカルスアグリゲート（ＣＣＡｓ）は、異なる割合のオーキシン（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール−３−酪酸）及びサイトカイニン（６−フルフリルアミノプリン及びベンジルアミノプリン）で増強した全強度のＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地中、炭素源としてスクロースを使用した制御された条件下、Ａ．ｉｎｄｉｃａ及びＶ．ｎｅｇｕｎｄｏの植物の葉組織を用いて確立する。前記カルスの懸濁培養液を樹立し、液体Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地を用いて三角フラスコ中で保持する。産生培養は、産生物、すなわち、ペルオキシダーゼの回収のために培地及び／又は細胞を周期的又は連続的に回収しながら、バッチベース、半連続又は連続培養の技術により行うことができる。
【００２６】
各種の最適条件が異なっているにもかかわらず、すべての場合において、ｐＨは５．６〜６．０の範囲、温度は２３〜２７℃で行った。酵素分析を頻繁に行った結果、約７〜１５日後にペルオキシダーゼの最適な産生を示した。小規模の実験研究のために、前記培養物を、１００ｍＬの培地あたり重量、例えば、３〜５ｇの新鮮重ごとに二次培養する。さらにスケールアップした培養は、反応容器中の新鮮な培地１０Ｌ中に１２日培養した物を２Ｌまで注ぐことにより行うことができる。培地からのペルオキシダーゼの抽出は、従来の後処理技術によって行うことができる。濃縮された粗抽出物を商業用の用途に直接使用することができる。しかしながら、硫酸アンモニウム又は溶媒沈殿、透析、限外濾過、従来のクロマトグラフ精製方法及び凍結乾燥によってより優れる活性を実現できる。細胞内ペルオキシダーゼは、適当な緩衝液中でカルスを均質化（ホモジナイズ）することによって回収され、その後精製される。しかしながら、ＣＣＡ懸濁液又は細胞懸濁培養液の場合には均質化の必要はなかった。細胞外ペルオキシダーゼは、培養した植物細胞組織を、遠心又は超遠心によって培地から分離することによって回収される。残存する植物細胞組織は、植物細胞を破壊した後、続いてエタノールで抽出し、抽出した細胞内ペルオキシダーゼを硫酸アンモニウムで沈殿させることによって分離産物として細胞内ペルオキシダーゼを回収するために使用できる。
【００２７】
ペルオキシダーゼは、過酸化水素が特異的な酸化剤であり、広範な基質が電子の受容体となる反応の多くを触媒する。
Ｈ2Ｏ2＋ＸＨ→ＸＯＨ＋Ｈ2Ｏ
【００２８】
本願明細書に記載されている分析に使用される電子の受容体は、グアイアコール、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）及びオルト−フェニレンジアミン（ｏ−ＰＤＡ）である。
【００２９】
１．天然源：Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ
部位：細胞外
分子量：３６ｋＤ
最適ｐＨ：４．５
安定性：酢酸ナトリウム又はリン酸緩衝液中、４℃で１年後、３０％以上の活性が保持される
ヘムピーク：λｍａｘ４０３ｎｍ
Ｒ．Ｚ値：２．０５
ｐＩ：１０以上
最も高い酵素活性：１２０４６Ｕ／ｍｇ（ＡＢＴＳ）
最も高い酵素活性：３２００Ｕ／ｍｇ（グアイアコール）
グリコシル化：グリコシル化なし
【００３０】
２．天然源：Ｖｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ
部位：細胞内のみならず細胞外
分子量：３４ｋＤ
ｐＨ範囲：３．５〜８．５
最適ｐＨ：４．５
最適温度：５０℃
安定性：細胞懸濁液上清と同様に粗抽出液を酢酸ナトリウム又はリン酸緩衝液中で４℃、６ヶ月間保存した後であっても８０％以上の活性が保持される
ヘムピーク：λｍａｘ４０９ｎｍ
Ｒ．Ｚ値：２．１０
比活性：基質ＡＢＴＳ、グアイアコール及びｏ−ＰＤＡを使用することによって示された比活性は、標準的なアッセイ手順の条件下で、それぞれ１５７２、５４４、３８２０であった。
粗酵素の最も高い比活性：４８６４Ｕ／ｍｇ（ＡＢＴＳ）
阻害剤：ＨｇＣｌ2（ＮａＮ3、ＭｎＳＯ4及びＺｎＳＯ4、ＥＤＴＡ、並びに、ＮａＣｌが促進剤として機能する。ＭｇＳＯ4及びＣａＣｌ2は比較して活性になんら変化を与えない。）
【００３１】
細胞培地又は細胞由来の粗ペルオキシダーゼ試料の比活性を、シグマ化学薬品（Ｓｔ．  Ｌｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入したホースラディッシュペルオキシダーゼの純試料（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ８３７５）のそれと比較した。タンパク質のレベルは、ローリー法を用いて粗ペルオキシダーゼ試料とまったく同じ方法で測定した。酵素アッセイは、グアイアコール及びＡＢＴＳを基質として用いて行った。得られた結果を表１に示す。
【００３２】
Ａ．ｉｎｄｉｃａ酵素は、基質がＡＢＴＳで最も高い比活性を有するように思われる。粗形態であっても純粋なホースラディッシュ酵素よりも大幅に大きい活性である。一方、Ｖ．Ｎｅｇｕｎｄｏ酵素は、基質がｏ−ＰＤＡで最も高い比活性（３８２０Ｕ）を示し、粗形態であっても良好な活性を示す。
【００３３】
Ａ．ｉｎｄｉｃａ酵素の凍結乾燥させた試料による安定性の研究では、酵素は室温で非常に安定であるが、最適な安定性には安定化剤及び凍結防止剤、例えば、スクロース又はトレハロースの添加が必要であるかもしれない。
【００３４】
表２には、従来技術によって単離したペルオキシダーゼと本発明の方法で単離したペルオキシダーゼの比較を示す。
【００３５】
【表２】
2008500038.tif 000003
【００３６】
したがって、本発明の主な実施形態は、Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ（ニーム）及びＶｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ由来の新規なペルオキシダーゼ酵素であって、以下の特徴を有する酵素に関する。
【００３７】
天然源：Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ
（ａ）部位：細胞外
（ｂ）分子量：３６ｋＤ
（ｃ）最適ｐＨ：４．５
（ｄ）安定性：酢酸ナトリウム又はリン酸緩衝液中、４℃で１年後、３０％以上の活性が保持される
（ｅ）ヘムピーク：λｍａｘ４０３ｎｍ
（ｆ）Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈ（ＲＺ）値：２．０５
（ｇ）等電点ｐＩ：１０以上
（ｈ）最も高い酵素活性：１２０４６Ｕ／ｍｇ（ＡＢＴＳ）
（ｉ）最も高い酵素活性：３２００Ｕ／ｍｇ（グアイアコール）
（ｊ）グリコシル化：グリコシル化なし
【００３８】
天然源：Ｖｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ
（ａ）部位：細胞内のみならず細胞外
（ｂ）分子量：３４ｋＤ
（ｃ）ｐＨ範囲：３．５〜８．５
（ｄ）最適ｐＨ：４．５
（ｅ）最適温度：５０℃
（ｆ）安定性：細胞懸濁液と同様に粗抽出液を酢酸ナトリウム又はリン酸緩衝液中で４℃、６ヶ月間保存した後であっても８０％以上の活性が保持される
（ｇ）ヘムピーク：λｍａｘ４０９ｎｍ
（ｈ）Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈ（ＲＺ）値：２．１０
【００３９】
本発明のその他の実施形態は、ニーム（Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）及びｎｉｒｇｕｎｄｉ（Ｖｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ）の植物カルス並びに細胞培養物からペルオキシダーゼを製造するための方法であって、以下の工程を含む方法に関する。
（ａ）固形ＭＳ培地又はＢ５培地中で葉のコンパクトカルスアグリゲート（ＣＣＡｓ）を開始させる工程、
（ｂ）約０．０５〜２ｍｇ／Ｌの範囲で種々の成長ホルモンの組合せを含むＭＳ又はＢ５液体培地（すなわち、寒天がない培地）であって、炭素源が約５％である培地１００ｍｌに５ｇＦＷ（新鮮重）のＣＣＡｓを移し、続いて旋回シェーカーで１２０ｒｐｍで攪拌することによってＣＣＡｓの増殖を最適化する工程、
（ｃ）工程（ｂ）のＣＣＡｓを、最適化された成長ホルモンの組合せをココナッツ水（ＣＷ）及び異なる誘導因子とともに含む新鮮な培地で、１４日おきに、二次培養する工程、
（ｄ）工程（ｂ）及び（ｃ）で液体培地中に産生された最大の細胞外ペルオキシダーゼを得る工程、及び、
（ｅ）従来の方法による硫酸アンモニウム沈殿によってペルオキシダーゼ酵素を精製する工程。
【００４０】
本発明のさらにその他の実施形態は、前記（ａ）から（ｃ）工程における細胞であって、前記細胞が、好気的な条件下、温度約３０℃、約ｐＨ５〜７の範囲で培養されることに関する。
【００４１】
本発明の１つ以上の実施形態は、前記（ａ）から（ｃ）における細胞であって、前記細胞が、好気的な条件下、温度約２５±２℃、約ｐＨ５．６〜６の範囲で培養されることに関する。
【００４２】
本発明のさらにその他の実施形態は、前記誘導因子に関し、前記誘導因子は、Ｋ、Ｍｇ、Ｎａ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｈｇ及びＣａからなる群から選択される金属イオンである。
【００４３】
本発明のさらにその他の実施形態は成長ホルモンに関し、前記成長ホルモンは、ＩＡＡ、ＮＡＡ、ＢＡ、２，４−Ｄ及びＫｎからなる群から選択される。
【００４４】
本発明の１つ以上の実施形態は前記成長ホルモンに関し、前記成長ホルモンは約０．１〜１．５ｍｇ／Ｌの範囲である。
【００４５】
本発明のさらにその他の実施形態は炭素源に関し、前記工程（ｂ）において選択される炭素源はスクロースである。
【００４６】
本発明のその他の実施形態は前記炭素源に関し、前記工程（ｂ）における炭素源は約２％である。
【００４７】
本発明のさらにその他の実施形態は前記ココナッツ水に関し、前記ココナッツ水は約５％である。
【００４８】
本発明のさらにその他の実施形態は前記ココナッツに関し、前記ココナッツ水は約１％である。
【００４９】
本発明の１以上の実施形態は硫酸アンモニウムに関し、工程（ｅ）における硫酸アンモニウムが約６０〜７０％である。
【００５０】
本発明のその他の実施形態は、工程（ｅ）における従来の方法がイオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを含むことに関する。
【００５１】
本発明のさらにその他の実施形態は、Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａからペルオキシダーゼを単離する方法に関し、単離されたペルオキシダーゼが、以下の特性を示すペルオキシダーゼを有することに関する。
（ａ）部位：細胞外
（ｂ）分子量：３６ｋＤ
（ｃ）最適ｐＨ：４．５
（ｄ）安定性：酢酸ナトリウム又はリン酸緩衝液中、４℃で１年後、３０％以上の活性が保持される
（ｅ）ヘムピーク：λｍａｘ４０３ｎｍ
（ｆ）Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈ（ＲＺ）Ｒ．Ｚ値：２．０５
（ｇ）等電点ｐＩ：１０以上
（ｈ）最も高い酵素活性：１２０４６Ｕ／ｍｇ（ＡＢＴＳ）
（ｉ）最も高い酵素活性：３２００Ｕ／ｍｇ（グアイアコール）
（ｊ）グリコシル化：グリコシル化なし
【００５２】
本発明のさらにその他の実施形態は、Ｖｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏからペルオキシダーゼを単離する方法に関し、単離されたペルオキシダーゼが以下の特性を有することに関する。
（ａ）部位：細胞内のみならず細胞外
（ｂ）分子量：３４ｋＤ
（ｃ）ｐＨ範囲：３．５〜８．５
（ｄ）最適ｐＨ：４．５
（ｅ）最適温度：５０℃
（ｆ）安定性：細胞懸濁液と同様に粗抽出液を酢酸ナトリウム又はリン酸緩衝液中で４℃、６ヶ月間保存した後であっても８０％以上の活性が保持される
（ｇ）ヘムピーク：λｍａｘ４０９ｎｍ
（ｈ）Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈ（ＲＺ）値：２．１０
【００５３】
以下の実施例は、説明の目的として記載したものであり、そのため、本発明の範囲を限定するために解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００５４】
（実施例１）
コンパクトカルスアグリゲート（ＣＣＡｓ）を、Ａ．ｉｎｄｉｃａ及びＶ．ｎｅｇｕｎｄｏの植物の葉組織を用いて、異なる割合のオーキシン（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール−３−酪酸）及びサイトカイニン（６−フルホリルアミノプリン及びベンジルアミノプリン）で増強された十分な強度のＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地中、炭素源としてスクロースを使用した制御された条件下で確立する。前記カルスの懸濁培養液を樹立し、液体Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地を用いて三角フラスコ中で保持する。産生培養は、産物、すなわち、ペルオキシダーゼの回収のために培地及び／又は細胞を周期的又は連続的に回収しながら、バッチベース、半連続又は連続培養の技術を用いて行うことができる。
【００５５】
各種の最適条件が異なっているにもかかわらず、すべての場合において、ｐＨは５．６〜６．０の範囲、温度は２３〜２７℃で行った。酵素分析を頻繁に行った結果は、約７〜１５日後のペルオキシダーゼの最適な産生を示す。小規模の実験研究のために、前記培養物を、１００ｍＬの培地あたり重量、例えば、３〜５ｇの新鮮重ごとに二次培養する。さらにスケールアップした培養は、反応容器中の新鮮な培地１０Ｌ中に１２日培養物を２Ｌまで注ぐことにより行うことができる。培地からのペルオキシダーゼの抽出は、従来の下流の処理技術によって行うことができる。濃縮された粗抽出物を商業用の用途に直接使用することができる。しかしながら、硫酸アンモニウム又は溶媒沈殿、透析、限外濾過、従来のクロマトグラフ精製方法及び凍結乾燥によってより優れた活性を実現することができる。細胞内ペルオキシダーゼは、精製後、適当な緩衝液中でカルスを均質化することによって回収される。ＣＣＡ懸濁液又は細胞懸濁培養液の場合には均質化の必要はない。細胞外ペルオキシダーゼは、培養した植物細胞組織を、遠心又は超遠心によって培地から分離することによって回収される。残存する植物細胞組織は、植物細胞を破壊した後、続いてエタノールで抽出し、抽出した細胞内ペルオキシダーゼを硫酸アンモニウムで沈殿させることによって分離産物として細胞内ペルオキシダーゼを回収するために使用できる。
【００５６】
ペルオキシダーゼは、過酸化水素が特異的な酸化剤であり、広範な基質が電子の受容体となる反応の多くを触媒する。
Ｈ2Ｏ2＋ＸＨ→ＸＯＨ＋Ｈ2Ｏ
【００５７】
本願明細書に記載されているアッセイに使用される電子の受容体は、グアイアコール、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）及びオルト−フェニレンジアミン（ｏ−ＰＤＡ）である。
【００５８】
１．天然源：Ａｚａｒｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ
部位：細胞外
分子量：３６ｋＤ
最適ｐＨ：４．５
安定性：酢酸ナトリウム又はリン酸緩衝液中、４℃で１年後、３０％以上の活性が保持される
ヘムピーク：λｍａｘ４０３ｎｍ
Ｒ．Ｚ値：２．０５
ｐＩ：１０以上
最も高い酵素活性：１２０４６Ｕ／ｍｇ（ＡＢＴＳ）
最も高い酵素活性：３２００Ｕ／ｍｇ（グアイアコール）
グリコシル化：グリコシル化なし
【００５９】
２．天然源：Ｖｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ
部位：細胞内のみならず細胞外
分子量：３４ｋＤ
ｐＨ範囲：３．５〜８．５
最適ｐＨ：４．５
最適温度：５０℃
安定性：細胞懸濁液上清と同様に粗抽出液を酢酸ナトリウム又はリン酸緩衝液中で４℃、６ヶ月間保存した後であっても８０％以上の活性が保持される
ヘムピーク：λｍａｘ４０９ｎｍ
Ｒ．Ｚ値：２．１０
比活性：基質ＡＢＴＳ、グアイアコール及びｏ−ＰＤＡを使用することによって示された比活性は、標準的な分析条件下で、それぞれ１５７２、５４４、３８２０であった。
粗酵素の最も高い比活性：４８６４Ｕ／ｍｇ（ＡＢＴＳ）
阻害剤：ＨｇＣｌ2（ＮａＮ3、ＭｎＳＯ4及びＺｎＳＯ4、ＥＤＴＡ、並びに、ＮａＣｌが促進剤として機能する。ＭｇＳＯ4及びＣａＣｌ2は比較して活性になんら変化を与えない。）
【００６０】
細胞培地又は細胞由来の粗ペルオキシダーゼ試料の比活性を、シグマ化学薬品（セントルイス、米国）から購入したホースラディッシュペルオキシダーゼの純試料（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ８３７５）のそれと比較した。タンパク質のレベルは、ローリー法を用いて粗ペルオキシダーゼ試料とまったく同じ方法で測定した。酵素アッセイは、グアイアコール及びＡＢＴＳを基質として用いて行った。得られた結果を表３に示す。
【００６１】
【表３】
2008500038.tif 000004
【００６２】
Ａ．ｉｎｄｉｃａ酵素は、基質がＡＢＴＳで最も高い比活性を有するように思われる。粗形態であっても純粋なホースラディッシュ酵素よりも大幅に大きい活性である。一方、Ｖ．Ｎｅｇｕｎｄｏ酵素は、基質がｏ−ＰＤＡで最も高い比活性（３８２０Ｕ）を示し、粗形態であっても良好な活性を示す。
【００６３】
Ａ．ｉｎｄｉｃａ酵素の凍結乾燥させた試料による安定性の研究では、酵素は室温で非常に安定であるが、最適な安定性には安定化剤及び凍結防止剤、例えば、スクロース又はトレハロースの添加が必要であるかもしれない。
【００６４】
（実施例３）
ニームからのペルオキシダーゼ酵素の製造
１．カルス培養の開始及び維持
Ａ．ｉｎｄｉｃａを葉組織からセットアップした。葉のカルスは、ホルモンである２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（１ｍｇ／Ｌ）及びキネチン（０．１ｍｇ／Ｌ）、炭素源として２％（ｗ／ｖ）スクロースを含むＢ５寒天培地で開始した。滅菌前にｐＨを５．８に調製した。この確立した懸濁系から、１０日培養液２０ｍＬを２５０ｍＬの三角フラスコ中の１００ｍＬの新鮮な培地に無菌状態で移すことによって新しい培養物をセットアップした。前記フラスコを、１５０ｒｐｍ、２５℃、明るい所で旋回シェーカー上に配置した。前述の培養は１９９４年６月に開始し（Ａ．ｉｎｄｉｃａ）、それ以降定期的に二次培養させている。その間中、培養物は生存能力を保持し、だいたい一定のレベルでのペルオキシダーゼ産生を示している。
【００６５】
２．増殖パラメータ
Ａ．ｉｎｄｉｃａ培養物のための新鮮重及び乾物重の測定は、Ｓｔｅｐａｎ−Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎに記載されている方法によって行った。
【００６６】
３．ペルオキシダーゼ活性の評価
各フラクション（細胞及び培地）の全体の培養物の活性に対するパーセンテージの分布を決定するために、ペルオキシダーゼ活性は培地及び細胞集団の双方で評価した。予め冷やしておいたモータ及び乳棒を用い、予め冷蔵し、酸で洗浄した約１０％（ｗ／ｖ）の砂及び氷冷した０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．７）で、細胞を氷上でバラバラにした。得られた上清を清潔なチューブに移し、さらに５分間遠心した。上清を遠心チューブから注意深く除去し、使用するまで氷上に保持した。
【００６７】
（ａ）基質：グアイアコール
酵素のペルオキシダーゼ活性は、４７０ｎｍ（ε４７０＝２６．６ｍＭ-1ｃｍ-1）でのグアイアコールの酸化によってモニターした。反応は、６０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．１）、１ｍＭ  Ｈ2Ｏ2、１６ｍＭ基質及び適当な量の酵素を含む１．３ｍＬの反応混合物中で、２５℃で行った。反応はＨ2Ｏ2を添加することによって開始させた（Ｓｈａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６６）。１活性単位（Ｕ）は、標準的な条件下で、１分間に１μｍｏｌのテトラグアイアコールを産出する酵素の量である。
【００６８】
（ｂ）基質：ＡＢＴＳ
一定分量の酵素溶液を、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中の０．２ｇｌ-1ＡＢＴＳ及び５ｍＭ  Ｈ2Ｏ2を含む溶液に加えた。１ＡＢＴＳ活性単位（Ｕ）は、標準的な条件下で、１分間に１μｍｏｌのＡＢＴＳの酸化（ε４０５＝３６．８ｍＭ-1ｃｍ-1）を触媒するペルオキシダーゼの量である（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。活性は４０５ｎｍでの吸収の増加をモニターすることによって測定した。
【００６９】
４．細胞培養物によるペルオキシダーゼの産生
Ａ．ｉｎｄｉｃａ培養物によるペルオキシダーゼの産生は、ＡＢＴＳを基質として使用しモニターした。すべての場合において、生産力は１１日目がピークであった。活性の大部分は培地で見出された。ペルオキシダーゼの産生は、グルコース培養した培養物でより優れていた。
【００７０】
５．粗ペルオキシダーゼ調製物の特性
細胞培地の体積単位又は培養した細胞の重量に対して表されるペルオキシダーゼ活性は、培養系の生産力を評価するための有用な手段である。しかしながら、異なる原料からのペルオキシダーゼの活性、比活性又はタンパク質（ｍｇ）あたりの活性を測定しなければならない。ペルオキシダーゼの多くの商業的な用途、特に、酵素のマトリックス又は抗体との接合体が必要とされる用途には、酵素の比活性は重要なパラメータである。さらには、精製ファクターは、酵素の比活性を調査することによってのみ測定することができる。
【００７１】
粗ペルオキシダーゼ試料のタンパク質を評価するために、ローリー試験を使用した。
【００７２】
６．ペルオキシダーゼの精製
粗酵素調製物から活性を示すペルオキシダーゼを精製する試みが行われた。この第一の目的は、それらの特性が、比活性、安定性及び有用なｐＨ範囲の観点においてホースラディッシュ酵素によりも優れているか否かを問わず、種々のペルオキシダーゼの試料を大量に単離して確立することであった。第二の目的は、可能なイソ酵素を分離し、それらの個々の特性を研究することであった。純度の判断基準は、比活性の増加、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの単一バンドの出現、及びＲＺ値（４０３ｎｍのヘム吸収ピークと２８０ｎｍでのタンパク質吸収のピークの割合）である。純粋なＨＲＰのＲＺ値は約３．０である。
【００７３】
タンパク質レベルの評価は、ワールブルグ及びクリスチャンの単純式、すなわち１．５５×ＯＤ280−０．７６×ＯＤ260＝１ｍｇ／ｍｌタンパク質に基づいて行った。ＨＲＰもまた同様な方法で評価した。非常に控えめな見積であっても、Ａ．ｉｎｄｉｃａは純粋なホースラディッシュペルオキシダーゼよりも相当に活性が大きい。
【００７４】
安定性試験：凍結乾燥させたＡ．ｉｎｄｉｃａ粗ペルオキシダーゼは、活性を失うことなく３７℃２ヶ月保存できた。一部分の精製された酵素の試料を溶液中で、４℃で１年にわたって保存した。
【００７５】
結論として、前記データは、本発明の植物細胞培養物は、高い収率でペルオキシダーゼ酵素を産生でき、ホースラディッシュペルオキシダーゼよりも優れた特性を示し、特に比活性レベルを大幅に改善した。
【００７６】
（実施例４）
Ｎｉｒｇｕｎｄｉからのペルオキシダーゼ酵素の製造
１．ｎｉｒｇｕｎｄｉ（Ｖｉｔｅｘ ｎｅｇｕｎｄｏ）のカルス培養の開始及び維持
葉組織をカルス開始のための外植片として採取した。１０％ラボレン（Ｌａｂｏｌｅｎ）で葉組織を適当に洗浄した後、無菌条件下、０．１％塩化水銀中で表面を滅菌し、３％スクロース、０．８％寒天を含み、キネチン（６−フルフリルアミノプリン）、ＢＡＰ（ベンジルアミノプリン）、２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）、ＮＡＡ（ナフタレン酢酸）、ＩＢＡ（インドール−３−酪酸）のような植物成長因子を単独、及び、異なる組合せで添加したＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地に播種した。二次培養は、増殖のために同一のホルモンの組合せで行った。ホルモンを培地に供給しなかった場合は、良好なペルオキシダーゼ活性を示すが、カルスの増殖が非常にゆっくりであった。ＩＡＡ／ＮＡＡ／２，４−Ｄのようなオーキシンが、カルス増殖及び酵素活性の双方を減少させることがわかった。一方、ＢＡのようなサイトカイニンだけが良好なカルスの増殖及び酵素活性を示した。１．５ｍｇ／ＬのＢＡ及び１．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄが、最適な活性及びバイオマス生成を得るために最善の組合せであることがわかった。１％ｖ／ｖＣＷ（ココナッツ水）が、良好なカルスの増殖にとってよいことがわかった。すべての実験において、ｐＨは５．８に維持した。一旦確立した後、液体懸濁液は、２５０ｍＬの三角フラスコ中の新鮮な培地１００ｍｌ中に７日間培養したものを１０ｍｌずつ二次培養することによって保持した。また、ＣＣＡｓは新鮮な液体培地中に試料を５ｇずつ二次培養することによって保持し、フラスコは、１２０ｒｐｍ、２５℃、明るい所で旋回シェーカー上に配置した。生存率及び活性は、６ヶ月間後においても保持された。
【００７７】
２．増殖パラメータ
Ｖ．ｎｅｇｕｎｄｏ培養物のための新鮮重及び乾物重の測定は、Ｓｔｅｐａｎ−Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎに記載されている方法によって行った（１９９０、米国特許第５７０３５７号）。
【００７８】
３．ペルオキシダーゼ活性の評価
細胞外及び細胞内の双方の酵素活性を、ＣＣＡｓ及び懸濁培養液のそれぞれにおいて決定した。予め冷やしておいたモータ及び乳棒を用い、予め冷蔵し、酸で洗浄した約１０％（ｗ／ｖ）の砂及び氷冷した０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．７）とともに、細胞を氷上でバラバラにした。得られた上清を清潔なチューブに移し、さらに５分間遠心した。上清を遠心チューブから注意深く除去し、使用するまで氷上に保持した。
【００７９】
ペルオキシダーゼは、過酸化水素が特異的な酸化剤であり、フェノール及び芳香族アミンのような広範な基質が電子の受容体となる反応の多くを触媒する。ＡＢＴＳ及びグアイアコールに加えて、ｏ−ＰＤＡもまた基質として使用した。
【００８０】
基質：ｏ−ＰＤＡ
分析は１ｍｌのキュベット内で行った。ペルオキシダーゼ活性は、クエン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）中の５ｍＭのｏ−ＰＤＡ及び０．５ｍＭのＨ2Ｏ2で分析した。ｏ−ＰＤＡの酸化に伴う吸収の増加を４５０ｎｍで観察した（ε＝１．０５ｍＭ-1ｃｍ-1）（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。
【００８１】
酵素活性は下記式を用いて計算した。
式Ｖ×（δＥ／δｔ）／ε×ｄ×ｖμ／ｍｌ
Ｖ：アッセイ体積
（δＥ／δｔ）：１分あたりに増加した吸収
ε：減数係数
ｄ：光路長（１ｃｍ）
ｖ：試料の体積
比活性＝タンパク質１ｍｇあたりの酵素活性ＩＵ（タンパク質の評価はローリー法によって行った）
【００８２】
４．細胞培養物によるペルオキシダーゼの産生
Ｖ．ｎｅｇｕｎｄｏ培養物によるペルオキシダーゼの産生は、ＡＢＴＳを基質として使用しモニターした。最適な活性が、播種後１２日で、ＣＣＡｓ及び懸濁培養液により示された。双方の場合において、サイトカイニンは、オーキシンよりもカルス増殖及びペルオキシダーゼ生成により優れていることがわかった。最もよい組合せは、１．５ｍｇ／ｌのＢＡと１．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄである。
【００８３】
５．粗ペルオキシダーゼ調製物の特性
比活性の測定は、酵素の精製をモニターできるただ１つの方法である。比活性は、タンパク質１ｍｇあたりの全酵素活性として計算することができる。細胞内及び細胞外の活性はＶｉｔｅｘカルス培養物により示される。１％ｖ／ｖのＣＷ（ココナッツ水）を加えた１．５ｍｇ／ｌのＢＡと１．０ｍｇ／ｌの２．４−Ｄとの組合せが最適な活性及びバイオマス生成を得るために最善の組合せであることがわかった。最適な酵素活性は２７日目に観察された。一方、最大のバイオマスは４５日目に得られた。１５７２、５４４および３８２０が、標準的な分析条件下で、ＡＢＴＳ，グアイアコール及びｏ−ＰＤＡのそれぞれを基質として用いた粗抽出物の活性であった。粗ペルオキシダーゼ試料のタンパク質を評価するために、標準としてＢＳＡを使用してローリー試験を行った（Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ。）。
【００８４】
凍結乾燥させたＶｉｔｅｘ粗ペルオキシダーゼは、活性を失うことなく３７℃で６ヶ月保存できた。また、粗酵素（懸濁液上清）を、酢酸ナトリウム及びリン酸緩衝液中で、４℃で６ヶ月間保持した後でさえ、Ｖｉｔｅｘペルオキシダーゼは８０％以上の活性を保持していた（図１）。
【００８５】
ｐＨの影響を、酵素を３０分間、ｐＨ３．５〜９．０の範囲の緩衝液中で培養することによって詳しく調べた。ｐＨの許容範囲が８．５までであることとともに、最適ｐＨは４．５であることがわかった（図２及び３）。
【００８６】
３５〜９０℃の異なる温度で温度安定性を試験した。３５〜５０℃で処理した酵素は安定性を示した。すなわち、１時間後であっても活性を保持した。最適温度は４５℃であった。５０℃以上では、活性が減少し、６５℃以上の温度で１時間処理した後は活性が失われることが示された（図４及び５）。２．４ｍｌの全アッセイ体積に１ｍＭアジ化ナトリウムを０．１ｍｌ加えると、３０％の阻害が示された（すなわち、活性が３０％減少した）。ＨｇＣｌ2では６０％の阻害を示した。ＮａＮ3、ＭｎＳＯ4及びＺｎＳＯ4、ＥＤＴＡ並びにＮａＣｌは、促進剤として機能したが、はＭｇＳＯ4及びＣａＣｌ2は、比較的して活性になんら変化を与えなかった（表４）。
【００８７】
【表４】
2008500038.tif 000005
【００８８】
６．Ｖｉｔｅｘペルオキシダーゼの精製
カルス及び懸濁液の粗抽出液を、冷却遠心し、ついで硫酸アンモニウム沈殿し、その後、塩を除去するため透析して、精製した。イオン交換クロマトグラフィー及び凍結乾燥は、電気泳動の前に行った。
【００８９】
（有利な点）
１．調査されていなかった植物及びそのカルスを用いてペルオキシダーゼを製造する。
２．前記カルスは、活性をあまり損失することなく再利用できる。
３．前記カルスは、容易に回収できる。
４．本発明におけるペルオキシダーゼの製造は、ホルモンの組合せで最適化される。
５．前記方法は、最適なバイオマス生成及び酵素活性のための不確定な補助剤を利用する。
６．得られた酵素の酵素活性は、並外れて高い。
７．前記方法は、非常に費用効率が高い。約２ラーク単位の前記酵素の製造に２ドル必要であるのに比較して、同一単位の市販のＨＲＰの製造には４５０ドル必要である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、Ｖｉｔｅｘのペルオキシダーゼ活性及びバイオマス成長における時間経過の影響を示すグラフである。
【図２】図２は、Ｖｉｔｅｘの細胞外ペルオキシダーゼの最適ｐＨを示すグラフである。
【図３】図３は、Ｖｉｔｅｘの粗ペルオキシダーゼのｐＨ安定性を示すグラフである。
【図４】図４は、Ｖｉｔｅｘの細胞外ペルオキシダーゼの最適温度を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｖｉｔｅｘの粗ペルオキシダーゼの温度安定性を示すグラフである。
【図１】
2008500038.tif 000006
【図２】
2008500038.tif 000007
【図３】
2008500038.tif 000008
【図４】
2008500038.tif 000009
【図５】
2008500038.tif 000010
【国際調査報告】
2008500038.tif 000011
2008500038.tif 000012
2008500038.tif 000013
2008500038.tif 000014
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