(57)【要約】  本発明は、抗ＣＤ２０抗体とＢＡＦＦアンタゴニストの組合せ療法を用いたＢ細胞ベースの悪性腫瘍及びＢ細胞制御性自己免疫疾患の治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合した細胞集団をＢＡＦＦアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体に接触させることを含んでなる、混合細胞集団からＢ細胞を枯渇する方法。
【請求項２】
Ｂ細胞がヒトＢ細胞であり、混合細胞集団にＢＡＦＦアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体をインビボで接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＢＡＦＦアンタゴニストがイムノアドヘシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
イムノアドヘシンが、ＢＲ３の細胞外ドメインを含んでなるＢＲ３イムノアドヘシン、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるＴＡＣＩイムノアドヘシン、及びＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるＢＣＭＡイムノアドヘシンからなる群から選択したものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＢＲ３イムノアドヘシンが配列番号２のＢＲ３−Ｆｃである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＢＡＦＦアンタゴニストが抗ＢＡＦＦ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗ＢＡＦＦ抗体がＢＡＦＦの残基１６２−２７５を含むＢＡＦＦ領域内に結合する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＢＡＦＦアンタゴニストが抗ＢＲ３抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗ＢＲ３抗体がヒトＢＲ３の残基２３−３８を含むＢＲ３領域内に結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗ＣＤ２０抗体がリツキサンTMである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗ＣＤ２０抗体が、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６の軽鎖及び重鎖配列を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＢＡＦＦアンタゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体が相乗的に働いてＢ細胞を枯渇する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍又は悪性腫瘍に罹患している患者に治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストを投与することを含む、ＣＤ２０を発現するＢ細胞により特徴付けられるＢ細胞腫瘍又は悪性腫瘍の治療方法。
【請求項１４】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストが同時に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストが連続的に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＢＡＦＦアンタゴニストがＣＤ２０結合抗体より前に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
Ｂ細胞腫瘍が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、リンパ球支配的ホジキン病（ＬＰＨＤ）、濾胞性中心細胞（ＦＣＣ）リンパ腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び毛様細胞白血病である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
Ｂ細胞腫瘍が非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）又は慢性リンパ球性白血病である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＢＡＦＦアンタゴニストがイムノアドヘシンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
イムノアドヘシンが、ＢＲ３の細胞外ドメインを含んでなるＢＲ３イムノアドヘシン、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるＴＡＣＩイムノアドヘシン、及びＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるＢＣＭＡイムノアドヘシンからなる群から選択したものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＢＲ３イムノアドヘシンが配列番号２のｈＢＲ３−Ｆｃである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＢＡＦＦアンタゴニストが抗ＢＡＦＦ抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
抗ＢＡＦＦ抗体がＢＡＦＦの残基１６２−２７５を含むＢＡＦＦ領域内に結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
ＢＡＦＦアンタゴニストが抗ＢＲ３抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
抗ＢＲ３抗体がヒトＢＲ３の残基２３−３８を含むＢＲ３領域内に結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＤ２０結合抗体が、ヒト抗体の定常領域に融合したマウス抗体の可変領域を含んでなるキメラ抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
キメラ抗体がリツキサンTMである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＣＤ２０結合抗体がヒト化抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
ヒト化抗体が、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６の軽鎖及び重鎖配列を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＣＤ２０結合抗体が、リツキサンTM又はそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６の軽鎖及び重鎖配列を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
ＢＲ３−Ｆｃが約２−５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、リツキサンが約３７５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＢＡＦＦアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体の投与によりＢ細胞を枯渇するための相乗効果が生じる、請求項１３に記載の方法。
【請求項３３】
ＢＡＦＦアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体が化学療法と組み合わせて投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項３４】
Ｂ細胞制御性自己免疫疾患の寛解方法において、該疾患に罹患している患者に治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項３５】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストが連続的に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＢＡＦＦアンタゴニストがＣＤ２０結合抗体より前に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓症血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫血小板減少、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レーノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
自己免疫疾患が慢性関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＢＡＦＦアンタゴニストがイムノアドヘシンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
イムノアドヘシンが、ＢＲ３の細胞外ドメインを含んでなるＢＲ３イムノアドヘシン、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるＴＡＣＩイムノアドヘシン、及びＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるＢＣＭＡイムノアドヘシンからなる群から選択したものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＢＲ３イムノアドヘシンが配列番号２のＢＲ３−Ｆｃである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＢＡＦＦアンタゴニストが抗ＢＡＦＦ抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
ＢＡＦＦアンタゴニストが抗ＢＲ３抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
ＣＤ２０結合抗体が、ヒト抗体の定常領域に融合したマウス抗体の可変領域を含んでなるキメラ抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
キメラ抗体がリツキサンTMである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＣＤ２０結合抗体がヒト化抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
ヒト化抗体が、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６の軽鎖及び重鎖配列を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
ＣＤ２０結合抗体が、リツキサンTM又はそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６の軽鎖及び重鎖配列を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
ＢＲ３−Ｆｃが約２−５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、リツキサンが約２．５−１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＢＡＦＦアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体の投与によりＢ細胞を枯渇するための相乗効果が生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項５１】
ＢＡＦＦアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体が、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド、プレドニゾン、及び疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）から選択された薬剤を用いた療法と組み合わせて投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
Ｂ細胞腫瘍又はＢ細胞制御性自己免疫疾患罹患患者の辺縁帯又は胚中心Ｂ細胞を枯渇させる方法であって、それを必要とする患者に、治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストを投与することを含んでなる方法。
【請求項５３】
ＢＡＦＦアンタゴニストが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０の配列を有するポリペプチドからなる群から選択される、請求項１、１３、３４及び５２の何れか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストを含んでなる組成物。
【請求項５５】
ＣＤ２０結合抗体と、ＢＡＦＦアンタゴニストと、ラベルを含んでなり、該ラベルが、組成物がＢ細胞腫瘍又はＢ細胞制御性自己免疫疾患の治療のためのものであることを示す、製造品。
【請求項５６】
ＢＲ３イムノアドヘシンが図３３の配列番号１４５−１６５の何れか一の配列又はその最小領域を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項５７】
ＢＲ３イムノアドヘシンが図３３の配列番号１４５−１６５の何れか一の配列又はその最小領域を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項５８】
ＢＲ３イムノアドヘシンが図３３の配列番号１４５−１６５の何れか一の配列又はその最小領域を含む、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍並びに自己免疫疾患の治療のための新規併用療法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
リンパ球は幾つかの白血球細胞集団の一つである；リンパ球は外来の抗原を特異的に認識してそれに反応する。リンパ球の３つの主な分類は、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。Ｂリンパ球は抗体産生を担う細胞で、体液性免疫をもたらす。Ｂ細胞は骨髄内で成熟して、髄をしてその細胞表面上に抗原結合抗体を発現させる。未処置のＢ細胞がその膜結合抗体が特異的な抗原と初めて遭遇すると、細胞は速やかに分裂を開始し、その子孫はメモリーＢ細胞と「プラズマ細胞」と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。メモリーＢ細胞はより長い寿命を持ち、元の親細胞と同じ特異性を有する膜結合性抗体を発現し続ける。プラズマ細胞は、膜結合性抗体を発現しないがその代わりに抗体の分泌型を産生する。分泌型抗体は、体液性免疫の主要なエフェクター分子である。
ＣＤ２０抗原（ヒトＢリンパ球制限分化抗原Ｂｐ３５とも呼ばれる）はプレＢ及び成熟Ｂリンパ球上に位置するおよそ３５ｋＤの分子量を持つ疎水性膜貫通型タンパク質である（Valentine等, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)；及びEinfeld等, EMBO J. 7(3):711-717 (1988)）。その抗原はまたＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％以上に発現されるが（Anderson等, Blood 63(6):1424-1433 (1984)）、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常なプラズマ細胞又は他の正常な組織上には見出されない（Tedder等, J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)）。ＣＤ２０は分化及び細胞分裂周期の開始の活性化過程における初期段階を調節し（上掲のTedder等）、おそらくはカルシウムイオンチャネルとして機能すると思われる（Tedder等, J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)）。
【０００３】
Ｂ細胞リンパ腫ではＣＤ２０が発現されるため、この抗原はこのようなリンパ腫を治療するための有用な治療標的であった。合衆国ではＢ細胞ＮＨＬの人々は３０００００人以上であり、毎年５６０００人以上の人々が新しく診断されている。例えば、ヒトＣＤ２０抗原に対する遺伝子的操作を施したキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体であるリツキシマブ(rituximab)（リツキサン(RITUXAN)(登録商標)）（ジェネンテック・インク, サウスサンフランシスコ,カリフォルニア, 合衆国より販売）は、再発性もしくは低抵抗性の（refractory low-grade）又は濾胞性の（follicular）、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫患者の治療に使用されている。リツキシマブは１９９８年４月７日に発行された米国特許第５７３６１３７号（Anderson等）において「Ｃ２Ｂ８」と呼ばれている抗体である。インビトロの作用機序の研究は、リツキサン(登録商標)がヒト補体に結合し補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を通してリンパＢ細胞系を溶解することを実証している（Reff等, Blood 83(2):435-445 (1994)）。加えて、その抗体は抗体依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）のアッセイにおいて有意な活性を有している。インビボ前臨床研究では、リツキサン(登録商標)が、おそらく補体及び細胞媒介性過程を通してカニクイザルの骨髄、末梢血、リンパ節からのＢ細胞を消耗させることを示している(Reff等 Blood 83(2):435-445 (1994))。ＮＨＬ治療に効能があるとされる他の抗ＣＤ２０抗体には、放射性同位体Ｙｔｔｒｉｕｍ-９０に結合させたマウス抗体ＺｅｖａｌｉｎＴＭ(IDEC Pharmaceuticals、サンフランシスコ、カリフォルニア州), Ｉ-１３１に結合させた別の完全なマウス抗体であるＢｅｘｘａｒＴＭ (Corixa、ワシントン州)が含まれる。
【０００４】
ＢＬｙＳＴＭ(BAFF、TALL-l、THANK、TNFSF13B又は zTNF4としても知られている)は、Ｂ細胞の生存及び成熟に必須であるＴＮＦ１リガンドスーパーファミリーのメンバーである。トランスジェニックマウスでのＢＡＦＦ過剰発現によりＢ細胞過形成及び深刻な自己免疫疾患が進行する(Mackay等 (1999) J. Exp. Med. 190, 1697-1710；Gross等 (2000) Nature 404, 995-999；Khare等 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97,3370-33752-4)。ＢＡＦＦレベルは様々な自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチ及びシェーグレン症候群のヒト患者において亢進している(Cheema, G. S等, (2001) Arthritis Rheum. 44, 1313-1319；Groom, J.等, (2002) J. Clin. Invest. 109, 59-68；Zhang, J.等, (2001) J. Immunol. 166, 6-10)。更に、ＢＡＦＦレベルは疾患の重症度に相関していることから、ＢＡＦＦがこれらの疾患の病理に直接の役割を担っていることが示唆される。ＢＡＦＦはＢ細胞上でＴＮＦレセプタースーパーファミリーの３つのメンバーであるＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ及びＢＲ３(BAFF-Rとしても知られる)に結合することによって作用する(Gross等, 上掲；Thompson, J. S.等, (2001) Science 293, 2108-2111；Yan, M.等, (2001) Curr. Biol. 11, 1547-1552；Yan, M.等, (2000) Nat. Immunol. 1, 37-41；Schiemann, B.等, (2001) Science 293, 2111-2114)。３つのうち、ＢＲ３のみがＢＡＦＦ特異的であり；他の２つも関連のＴＮＦファミリーメンバーであるＡＰＲＩＬに結合する。ＢＡＦＦ及びレセプターノックアウト又は突然変異マウスの表現型を比較すると、ＢＲ３を介するシグナル伝達がＢＡＦＦのＢ細胞生存機能を媒介することが示されている(Thompson等, 上掲；Yan, (2001), 上掲；Schiemann, 上掲)。対照的に、ＴＡＣＩは阻害レセプターとして作用するようである(Yan, M.(2001) Nat. Immunol. 2, 638-643)一方、ＢＣＭＡの役割は不明である(Schiemann, 上掲)。
【０００５】
ＢＲ３はＢ細胞表面上に発現される１８４残基のタイプＩＩＩ膜貫通タンパク質である(Thompson等, 上掲；Yan, (2002), 上掲)。細胞内領域は既知の構造的ドメイン又はタンパク質間相互作用モチーフに配列類似性を持たない。にもかかわらず、ＢＲ３を介したＢＡＦＦ誘導性シグナル伝達により転写因子NF-B2/p100がp52へとプロセシングされる(Claudio, E等, (2002) Nat. Immunol. 3, 958-965；Kayagaki, N.等, (2002) Immunity 10, 515-524)。ＢＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はまた多岐である。ＴＮＦＲファミリーメンバーは、通常、その細胞外領域の多数のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の存在により特徴づけられる；各々のＣＲＤは典型的には３つのジスルフィド結合中の６つのシステインによって安定化された〜４０残基からなる。このファミリーの通常のメンバーは、リガンド表面の２の異なった部分(パッチ)と相互作用する２つのＣＲＤを介してリガンドと接触する(Bodmer, J.-L.等, (2002) Trends Biochem. Sci. 27, 19-26に概説)。しかしながら、ＢＲ３ ＥＣＤは、最大でもＣＲＤの一部を形成するにとどまる４つのシステイン残基を含むのみであるので、このような小さなレセプターがどのようにして高い親和性リガンド結合を与えているのかという疑問が生じる。
既に、ＢＲ３のＢＡＦＦ結合ドメインが２６残基のコア領域内にあることが示されている(Kayagaki等,上掲)。６つのＢＲ３残基は、βヘアピンペプチド（ｂｈｐＢＲ３）内にある場合、十分にＢＡＦＦ結合をもたらし、ＢＲ３媒介性シグナル伝達をブロックした。他に、ＢＡＦＦと相互作用することを意図したポリペプチドが報告されている(例えば、国際公開第０２／２４９０９号、同第０３／０３５８４６号、同第０２／１６３１２号、同第０２／０２６４１号)。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、混合した細胞集団をＢＡＦＦアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体に接触させることを含む、混合細胞集団からＢ細胞を枯渇する方法を提供する。この方法は、Ｂ細胞をＢＡＦＦアンタゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体に接触させることによって、例えば、混合細胞集団からＢ細胞を効果的かつ選択的に枯渇させるための商業的インビトロアッセイに有用である。前述のＢ細胞枯渇方法の他の側面は、胚中心Ｂ細胞及び周辺帯（辺縁体）Ｂ細胞等の特定のＢ細胞サブセットを特異的に枯渇させることである。特定の実施態様では、胚中心Ｂ細胞は脾臓及びパイエル板にある。本発明の更に他の態様は、Ｂ細胞をＢＡＦＦアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体に接触させることによってインビトロ又はインビボで全てのＢ細胞サブセットを枯渇させる方法である。
また本発明は、全てのＢ細胞集団を枯渇させるために有効な量のＢＡＦＦアンタゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体を哺乳動物に投与することにより、脾臓中の全てのＢ細胞集団を枯渇させる方法を提供する。特定の実施態様では、該方法は脾臓、リンパ節及びパイエル板の周辺帯及び胚中心Ｂ細胞を枯渇させるのに有効である。
【０００７】
また本発明では、腫瘍又は悪性腫瘍に罹患している患者に治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストを投与することを含む、ＣＤ２０を発現するＢ細胞により特徴付けられるＢ細胞腫瘍又は悪性腫瘍の治療方法が提供される。一実施態様では、ＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストは同時に投与される。異なる実施態様では、ＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストは連続的に投与される。特定の実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストはＣＤ２０結合抗体より前に投与される。ある実施態様では、Ｂ細胞腫瘍が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、リンパ球支配的ホジキン病（ＬＰＨＤ）、濾胞性中心細胞（ＦＣＣ）リンパ腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び毛様細胞白血病である。この治療方法では、ＢＲ３−Ｆｃ及びリツキサンを用量のセクションで開示する用量で投与する。他の実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体は化学療法と組み合わせて投与する。
本発明の更に他の態様は、Ｂ細胞制御性自己免疫疾患に罹患している患者に治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストを投与することを含む、該疾患の寛解方法である。一実施態様では、自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓症血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫血小板減少、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レーノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択される。ここで自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ又は全身性エリテマトーデスであり、一実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体は、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド、プレドニゾン、及び疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）から選択される薬剤を用いた療法と組み合わせて投与する。
ＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストを患者に投与する疾患の治療又は寛解方法の任意のものにおいて、ＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストは同時に又は連続して投与することができる。特定の実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストはＣＤ２０結合抗体の前に投与する。
【０００８】
また、ＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストを含んでなる組成物が提供される。
更に、ＣＤ２０結合抗体と、ＢＡＦＦアンタゴニストと、ラベルを含んでなり、該ラベルが、組成物がＢ細胞腫瘍又はＢ細胞制御性自己免疫疾患の治療のためのものであることを示す、製造品が本発明により提供される。
本発明の方法、組成物及び製造品の実施態様の任意のものにおいて、抗ＣＤ２０抗体には、キメラ及びヒト化抗体が含まれる。抗ＣＤ２０抗体の特定の実施態様には、そのアミノ酸配列を有する、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、ｍ２Ｈ７（マウス２Ｈ７）、ｈｕ２Ｈ７（ヒト化２Ｈ７）、及びその全ての機能的変異体、ｈｕ２Ｈ７．ｖ１６（ｖは型を表す）、ｖ３１、ｖ９６、ｖ１１４、ｖ１１５が含まれる。インタクトなｈｕ２Ｈ７．ｖ１６は成熟した配列番号１５のＬ鎖配列及び配列番号１６のＨ鎖配列を有する。
本発明の方法、組成物及び製造品の実施態様の任意のものにおいて、ＢＡＦＦアンタゴニストは一実施態様ではイムノアドヘシンである。特定の実施態様では、イムノアドヘシンはＢＲ３の細胞外ドメイン又は図３３の配列番号１４５−１６５の何れかの配列又はその「最小領域」を含むＢＲ３イムノアドヘシン；ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含むＴＡＣＩイムノアドヘシン；及びＢＣＭＡの細胞外ドメインを含むＢＣＭＡイムノアドヘシンからなる群から選択される。他の実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストは抗ＢＡＦＦ抗体、特に残基１６２−２７５を含むＢＡＦＦの領域内でＢＡＦＦに結合する抗ＢＡＦＦ抗体である。他の実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストはヒトＢＲ３の残基２３−３８を含む領域でＢＲ３に結合するものを含む抗ＢＲ３抗体である。特許請求の範囲で言うヒトＢＲ３のアミノ酸位置は、定義「ＢＲ３」に開示したヒトＢＲ３又は別のヒトＢＲ３の配列番号付けに従う。
【０００９】
特定の実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストは、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、又はECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）の配列を有する１７ｍｅｒポリペプチド並びにこれら１７ｍｅｒのペグ化(PEGylated)型；
以下の配列を有するポリペプチド
MLPGCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGSGSTASSGSGSATHMLPGCKWDLLIKQWVCDPLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１０）；
以下の配列を有するｈＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシン
MSALLILALVGAAVASTRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQESQVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２）
からなる群から選択される。
本発明の前述の方法の任意のもののにおいて、一実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体はＢ細胞枯渇に相乗的に作用する。
【００１０】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
抗ＣＤ２０ＭＡｂ処置によりある種のＢ細胞サブセットが枯渇する一方、周辺帯Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞及びプラズマ細胞は保存されることを我々は既に知見している。これに対して、ＢＲ３−ＦｃでのＢ細胞生存シグナルの遮断も、程度は異なるがＢ細胞を枯渇するか又はＢ細胞数を調節する。ＢＲ３は全Ｂ細胞の生存に影響を及ぼすと考えられている。ここに記載した実験より、抗ＣＤ２０抗体をＢＡＦＦアンタゴニストと組み合わせて投与すると驚くべき相乗効果が生じ、その結果インビボでＢ細胞を枯渇することが発見された。抗ＣＤ２０抗体をＢＡＦＦ経路に直接関する治療と組み合わせると、Ｂ細胞ベースの悪性腫瘍及びＢ細胞制御性自己免疫疾患を含むＢ細胞媒介性疾患の新規の治療方法となる。抗ＣＤ２０抗体とＢＡＦＦアンタゴニストの併用療法は、ある種の疾患、例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び小リンパ性白血病（ＳＬＬ）の現在の治療法より効果的で毒性の低い代替療法を提供しうる。
ここでの「自己免疫疾患」は、非悪性腫瘍性疾患又は個体が持つ（個体自身の）抗原及び／又は組織から生じ、それに対する疾患である。
【００１１】
ここで用いる場合、「Ｂ細胞枯渇」は、処置前のレベルと比較して、薬剤又は抗体処置後に動物又はヒトにおいてＢ細胞レベルが減少することを意味する。Ｂ細胞レベルは、全血球計算値を求め、既知のＢ細胞マーカーに対して染色するＦＡＣＳ分析により、また実験的実施例に記載したような方法などのよく知られたアッセイを用いて測定可能である。Ｂ細胞枯渇は部分的か又は完全なものであり得る。一実施態様では、ＣＤ２０発現Ｂ細胞の枯渇は少なくとも２５％である。Ｂ細胞枯渇薬剤を投与されている患者では、Ｂ細胞は、一般的には、薬剤が患者体内を循環しているときとＢ細胞が回復する時間の間枯渇される。
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血又はリンパ系器官のＢ細胞の９０％以上の表面に見出される分子量がおよそ３５ｋＤの非グルコシル化膜結合型リンタンパク質である。ＣＤ２０は初期のプレＢ細胞発育中に発現し、プラズマ細胞分化まで残る；ヒトの幹細胞、リンパ球祖先細胞（プロジェニタ）又は正常プラズマ細胞には見出されない。ＣＤ２０は正常なＢ細胞並びに悪性Ｂ細胞の双方に存在する。文献中でのＣＤ２０の他の名称には「Ｂリンパ球限局性分化抗原」及び「Ｂｐ３５」がある。ＣＤ２０抗原は、例えば、Clark及びLedbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989)及びValentine等, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)に記載されている。
【００１２】
ＣＤ２０結合抗体及び抗ＣＤ２０抗体はここで交換可能に用いられ、抗体が抗原発現細胞を標的とした治療薬剤として有効なように十分な親和性をもってＣＤ２０に結合する全ての抗体を包含し、以下に記載のアッセイのネガティブコントロールタンパク質などの他のタンパク質と有意には交差反応をしない。また、抗体の一アームがＣＤ２０に結合する二重特異性抗体が考えられる。このＣＤ２０結合抗体の定義にまた包含されるものは前述の抗体の機能的断片である。ＣＤ２０結合抗体は＜１０ｎＭのＫｄでＣＤ２０に結合するであろう。好ましい実施態様では、結合は＜７．５ｎＭ、より好ましくは＜５ｎＭ、更により好ましくは１−５ｎＭの間、最も好ましくは＜１ｎＭのＫｄでなされる。
ＣＤ２０抗原に結合する抗体の例には次のものが含まれる：現在「リツキシマブ」（「リツキサン（登録商標）」）と呼ばれる「Ｃ２Ｂ８」（出典明示によりここに明示的に援用される米国特許第５７３６１３７号）；「Ｙ２Ｂ８」又は「イブリツモマブチウキセタン(Ibritumomab Tiuxetan)」ゼバリン（登録商標）と命名された「イットリウム-[90]標識２Ｂ８マウス抗体（出典明示によりここに明示的に援用される米国特許第５７３６１３７号）；「トシツモマブ(Beckman Coulter)とも呼ばれ、場合によっては１３１Ｉで標識して「１３１Ｉ−Ｂ１」抗体(ヨードＩ１３１トシツモマブ、 BEXXARTM)となるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」出典明示によりここに明示的に援用される米国特許第５５９５７２１号）；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(Press 等 Blood 69(2):584-591 (1987)及び「フレームワーク部分」又はヒト化１Ｆ５を含む変異体(国際公開第03/002607号, Leung, S.)；ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−９６４５０)；マウス２Ｈ７及びキメラ２Ｈ７抗体（出典明示によりここに明示的に援用される米国特許第５６７７１８０号）；ヒト化２Ｈ７；huMax-CD20 (Genmab, Denmark)；ＡＭＥ−１３３(Applied Molecular Evolution)；Ａ２０抗体又はその変異体、例えばキメラ又はヒト化Ａ２０抗体(それぞれcA20、hA20) (ＵＳ２００３／０２１９４３３、Immunomedics)；及びInternational Leukocyte Typing Workshopより入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８−２、９３−１Ｂ３、Ｂ−Ｃｌ又はＮＵ−Ｂ２(Valentine等, Leukocyte Typing III (McMichael編, p.440, Oxford University Press (1987))が含まれる。
【００１３】
ここで「リツキシマブ」又は「リツキサン（登録商標）」なる用語は、一般的にＣＤ２０抗原に対し、出典明示によって明示的にここに援用される米国特許第５７３６１３７号において「Ｃ２Ｂ８」と命名された遺伝子操作キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体であり、ＣＤ２０に結合する能力を保持するその断片を含むものを意味する。
特定の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体はヒト及び霊長類のＣＤ２０に結合する。特定の実施態様では、ＣＤ２０に結合する抗体はヒト化又はキメラである。ＣＤ２０結合抗体には、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、ｍ２Ｈ７（マウス２Ｈ７）、ｈｕ２Ｈ７（ヒト化２Ｈ７）、及び限定するものではないが、ｈｕ２Ｈ７．ｖ１６（ｖは型を表す）、ｖ３１、ｖ７３、ｖ７５並びにフコース欠乏性変異体を含むその全ての機能的変異体が含まれる。ｈｕ２Ｈ７変異型抗体の幾つかの配列を、Ｎ末端配列の成熟ポリペプチドでは取り除かれるリーダー配列に下線を付けて以下に示す：
hu2H7.v16 Ｌ鎖[232 aa]（配列番号３）
MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGK APKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
hu2H7.v16 H 鎖[471 aa]（配列番号４）
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
hu2H7.v31 H 鎖[471 aa]（配列番号１１）
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ｖ３１のＬ鎖は上記のｖ１６のもの、すなわち配列番号３と同じである。
【００１４】
純粋にここでの目的のために、「ヒト化２Ｈ７ｖ．１６」は、可変軽鎖配列を含んでなるインタクトな抗体又は抗体断片を意味する：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR
（配列番号１３）；及び
可変重鎖配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS
（配列番号１４）
ヒト化２Ｈ７ｖ．１６抗体がインタクトな抗体の場合、好ましくはｖ１６軽鎖アミノ酸配列を含む：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC（配列番号１５）；及び
v16 重鎖アミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１６）。
【００１５】
ｖ１６をベースとした全ての他の変異体のＶ領域は、以下の表に示したアミノ酸置換の位置を除いてｖ１６のアミノ酸配列を有するであろう。特に示さなければ、２Ｈ７変異体はｖ１６と同じＬ鎖を有するであろう。
2008525449.tif 000002
【００１６】
前述のヒト化２Ｈ７ｍＡｂの変異型は上記配列番号１５と同じＬ鎖配列と以下のＨ鎖アミノ酸配列を有する２Ｈ７ｖ．３１である：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP
GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１７）。
マウス抗ヒトＣＤ２０抗体ｍ２Ｈ７は、ＶＨ配列：
QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSY NQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVS（配列番号２３）
及びＶＬ配列
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGAGTKLELK（配列番号２４）を有する。
示さない限り、ここに開示したヒト化２Ｈ７ｖ．１６及びその変異体の配列は、成熟ポリペプチド、すなわちリーダー配列を持たないものである。
【００１７】
ＣＤ２０抗体に関する特許及び特許文献には、米国特許第５７７６４５６号、同第５７３６１３７号、同第５８４３４３９号、同第６３９９０６１号、及び同第６６８２７３４号、並びに米国特許出願公開第２００２／０１９７２５５Ａ１号、同第２００３／００２１７８１Ａ１号、同第２００３／００８２１７２Ａ１号、同第２００３／００９５９６３Ａ１号、同第２００３／０１４７８８５Ａ１号（Anderson等）；米国特許第６４５５０４３Ｂ１号及び国際公開第００／０９１６０号(Grillo-Lopez, A.)；国際公開第００／２７４２８号（Grillo-Lopez及びWhite）；国際公開第００／２７４３３号（Grillo-Lopez及びLeonard）；国際公開第００／４４７８８号（Braslawsky等）；国際公開第０１／１０４６２号（Rastetter, W.）；国際公開第０１／１０４６１号（Rastetter及びWhite）；国際公開第０１／１０４６０号（White及びGrillo-Lopez）；米国出願公開第２００１／００１８０４１号、米国出願公開第２００３／０１８０２９２号、国際公開第０１／３４１９４号（Hanna及びHariharan）；米国出願第２００２／０００６４０４号及び国際公開第０２／０４０２１号（Hanna及びHariharan）；米国出願公開第２００２／００１２６６５号及び国際公開第０１／７４３８８号（Hanna, N.）；米国出願公開第２００２／００５８０２９号（Hanna, N.）；米国出願公開第２００３／０１０３９７１号（Hariharan及びHanna）；米国出願公開第２００２／０００９４４４号、及び国際公開第０１／８０８８４号（Grillo-Lopez, A.）；国際公開第０１／９７８５８号（White, C.）；米国出願公開第２００２／０１２８４８８号及び国際公開第０２／３４７９０号（Reff, M.）；国際公開第０２／０６０９５５号（Braslawsky等）；国際公開第０２／０９６９４８号（Braslawsky等）；国際公開第０２／０７９２５５号（Reff及びDavies）；米国特許第６１７１５８６号、及び国際公開第９８／５６４１８号（Lam等）；国際公開第９８／５８９６４号（Raju, S.）；国際公開第９９／２２７６４号（Raju, S．）；国際公開第９９／５１６４２号、米国特許第６１９４５５１号、米国特許第６２４２１９５号、米国特許第６５２８６２４号及び米国特許第６５３８１２４号（Idusogie等）；国際公開第００／４２０７２号（Presta, L.）；国際公開第００／６７７９６号（Curd等）；国際公開第０１／０３７３４号（Grillo-Lopez等）；米国出願公開第２００２／０００４５８７号及び国際公開第０１／７７３４２号（Miller及びPresta）；米国出願第２００２／０１９７２５６号（Grewal, I.）；米国出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.)；米国特許第６５６５８２７号、同第６０９０３６５号、同第６２８７５３７号、同第６０１５５４２号、同第５８４３３９８号、及び同第５５９５７２１号（Kaminski等）；米国特許第５５００３６２号、同第５６７７１８０号、同第５７２１１０８号、同第６１２０７６７号、同第６６５２８５２号（Robinson 等）；米国特許第６４１０３９１号（Raubitschek等）；米国特許第６２２４８６６号及び国際公開第００／２０８６４号（Barbera-Guillem, E.）；国際公開第０１／１３９４５号（Barbera-Guillem, E.）；国際公開第００／６７７９５号（Goldenberg）；米国出願公開第２００３／０１３３９３０号及び国際公開第００／７４７１８号（Goldenberg及びHansen）；国際公開第００／７６５４２号（Golay等��；国際公開第０１／７２３３３号（Wolin及びRosenblatt）；米国特許第６３６８５９６号（Ghetie等）；米国特許第６３０６３９３号及び米国出願公開第２００２／００４１８４７号（Goldenberg, D.）；米国出願公開第２００３／００２６８０１号（Weiner及びHartmann）；国際公開第０２／１０２３１２号（Engleman, E．）；米国特許出願第２００３／００６８６６４号（Albitar等）；国際公開第０３／００２６０７号（Leung, S.）；国際公開第０３／０４９６９４号、米国出願公開第２００２／０００９４２７号、及び米国出願公開第２００３／０１８５７９６号（Wolin等）；国際公開第０３／０６１６９４号（Sing及びSiegall）；米国特許出願公開第２００３／０２１９８１８号（Bohen等）；米国特許出願公開第２００３／０２１９４３３号及び国際公開第０３／０６８８２１号（Hansen等）；米国特許出願公開第２００３／０２１９８１８号（Bohen等）；米国特許出願公開第２００２／０１３６７１９号（Shenoy等）；国際公開第２００４／０３２８２８号（Wahl等）が含まれ、それぞれが出典明示によりここに明示的に援用される。また、米国特許第５８４９８９８号及び欧州特許出願第３３０１９１号（Seed等）；米国特許第４８６１５７９号及び欧州特許出願公開３３２８６５号（Meyer及びWeiss）；米国特許第４８６１５７９号（Meyer等）；国際公開第９５／０３７７０号（Bhat等）；米国特許出願公開第２００３／０２１９４３３号（Hansen等）を参照のこと。
【００１８】
ＣＤ２０抗体は、そのままの抗体であるか又は細胞障害性化合物、例えば放射性同位元素又は毒素などに抱合したものでありうる。このような抗体には、放射性同位元素イットリウム-９０に結合した抗体ＺｅｖａｌｉｎＴＭ(IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA)とＩ-１３１を抱合したＢｅｘｘａｒＴＭ(Corixa, WA)が含まれる。ヒト化２Ｈ７変異体には、ＦＲにアミノ酸置換を有するものと移植ＣＤＲに変異を持つ親和性成熟変異体が含まれる。ＣＤＲ又はＦＲの置換アミノ酸は、ドナー又はアクセプタ抗体にあるものには限定されない。他の実施態様では、本発明の抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ機能及びＢ細胞殺傷（ここではまたＢ細胞枯渇とも称される）の亢進を含むエフェクター機能の改善に導くＦｃ領域のアミノ酸残基変化を更に含む。特に、記載されているように(Idusogie等, 上掲(2001)；Shields等, 上掲)、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性を改善するための３つの突然変異が同定されている：Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（またここでは３つのＡｌａ突然変異又は変異体と称される；Ｆｃ領域の番号付けはＥＵ番号付け系に従う；Kabat等, 上掲)。
本発明の他の抗ＣＤ２０抗体には、安定性を改善する特定の変化を有するものが含まれる。一実施態様では、キメラ抗ＣＤ２０抗体はマウスＶ領域及びヒトＣ領域を有する。一つのそのような特定のキメラ抗ＣＤ２０抗体はリツキサン（登録商標）(リツキシマブ（登録商標）；ジェネンテック社)である。リツキシマブ及びｈｕ２Ｈ７は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞性細胞障害（ＡＤＣＣ）の両方を介してＢ細胞の溶解を媒介しうる。改変したＦｃ領域アミノ酸配列及び亢進又は減弱したＣ１ｑ結合能を有する抗体変異体は米国特許第６１９４５５１号及び国際公開第９９／５１６４２に記載されている。それら特許文献の内容は出典明示によって特にここに援用される。また、Idusogie等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
【００１９】
国際公開第００／４２０７２号(Presta) には、ＦｃＲへの結合を向上又は減弱させたポリペプチド変異型が記載されている。この特許公報の内容は出典明示によりここに特に援用される。Shields等 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
ＩｇＧのＮグリコシル化部位はＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７である。Ｆｃ領域を有するヒト化ＣＤ２０結合抗体をここに包含し、ここで組成物中の約８０−１００％（好ましくは約９０−９９％）の抗体はフコースを欠損し、糖タンパク質のＦｃ領域に結合した成熟コア糖鎖構造を含む。このような抗体は、ヒトＩｇＧと相互作用する際にＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）ほど効果的ではないが、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）への結合の改善を示す。
「抗体」なる用語は、最も広義に用いられ、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多エピトープ特異性を有する抗体、一本鎖抗体、及び抗体の断片を特に包含する。幾つかの実施態様によると、本発明のポリペプチドは、抗体がＢＡＦＦに結合しＢＡＦＦのＢＲ３への結合又はＢＡＦＦシグナル伝達を阻害しうるように抗体フレームワーク内、例えば可変領域内、ＣＤＲ内に融合される。本発明のポリペプチドを含む抗体は、キメラ、ヒト化、又はヒトのものでありうる。本発明のポリペプチドを含む抗体は抗体断片でありうる。そのような抗体及びそれらを産生する方法は以下に詳細に記載する。あるいは、本発明の抗体は、動物を本発明のポリペプチドで免疫化することにより産生させることができる。よって、本発明のポリペプチドに対する抗体が考慮される。
【００２０】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンと交わらない点で利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による産生を必要とすると解釈されてはいけない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
ここでのモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ対応配列に一致するか又は相同であり、残りの鎖は他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ対応配列に一致するか又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。キメラ抗体の産生方法は当業者に知られている。
【００２１】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２又は抗体の他の抗原結合サブ配列）である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギなどの所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種のＣＤＲの残基（ドナー抗体）によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、導入したＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練させ最大にするために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、たとえＦＲ領域が結合特性を改善するような一又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでも、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ＦＲのこれらのアミノ酸置換の数は典型的にはＨ鎖では６個以下、Ｌ鎖では３個以下である。ヒト化抗体はまた最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。ヒト化抗体には、抗体の抗原結合領域が、例えば興味ある抗原でマカクザルを免疫化することによって産生した抗体由来のものであるＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体が含まれる。ヒト化抗体の作製方法は当該分野において知られている。
【００２２】
また、ヒト化抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当該分野で知られている様々な技術を用いて産生することができる。Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。Cole等及びBoerner等の技術がまたヒトモノクローナル抗体の調製に有用である。Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)。
本発明のＣＤ２０結合抗体の「機能的断片」は、それ自体が由来するインタクトな完全鎖分子と実質的に同じ親和性でのＣＤ２０への結合を維持している断片であり、ここで開示するもののようなインビトロ又はインビボアッセイにより測定して、Ｂ細胞を枯渇することができるものである。抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００２３】
「抗体依存性細胞媒介性障害活性」又は「ＡＤＣＣ」は、ある細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上にあるＦｃレセプター(ＦｃＲ）に結合した分泌Ｉｇによりその細胞障害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒でその標的細胞を死滅させるという細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害性細胞を「武装させ（arm）」、そのような死滅に絶対に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦＣγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦＣγＲＩ、ＦＣγＲＩＩ及びＦＣγＲＩＩＩを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
「補体依存性細胞傷害性」又は「ＣＤＣ」は、補体存在下での標的細胞の溶解を意味する。古典的な補体経路の活性化は、同系の抗原に結合する（適切なサブクラスの）抗体に補体系(Ｃ１ｑ）の最初の構成物が結合することによって、開始される。補体の活性化を評価するためには、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているようにして、実施することができる。
【００２４】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、（１）ローリー(Lowry)法により定量して、９５重量％の抗体より多くなるまで、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、（３）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一性が得られるまで、精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００２５】
ここで用いられる「ＢＡＦＦ」、「ＢＡＦＦポリペプチド」、「ＴＡＬＬ-１」又は「ＴＡＬＬ-１ポリペプチド」、「ＢＬｙｓ」、「ＴＨＡＮＫ」なる用語は、「天然配列ＢＡＦＦポリペプチド」及び「ＢＡＦＦ変異体」を包含する。「ＢＡＦＦ」は、以下：
ヒトＢＡＦＦ配列（図３；配列番号２９）
1 mddstereqs rltsclkkre emklkecvsi lprkespsvr sskdgkllaa tlllallscc
61 ltvvsfyqva alqgdlaslr aelqghhaek lpagagapka gleeapavta glkifeppap
121 gegnssqnsr nkravqgpee tvtqdclqli adsetptiqk gsytfvpwll sfkrgsalee
181 kenkilvket gyffiygqvl ytdktyamgh liqrkkvhvf gdelslvtlf rciqnmpetl
241 pnnscysagi akleegdelq laiprenaqi sldgdvtffg alkll
マウスＢＡＦＦ配列（配列番号４７）
1 mdesaktlpp pclcfcsekg edmkvgydpi tpqkeegawf gicrdgrlla atlllallss
61 sftamslyql aalqadlmnl rmelqsyrgs atpaaagape ltagvklltp aaprphnssr
121 ghrnrrafqg peeteqdvdl sappapclpg crhsqhddng mnlrniiqdc lqliadsdtp
181 tirkgtytfv pwllsfkrgn aleekenkiv vrqtgyffiy sqvlytdpif amghviqrkk
241 vhvfgdelsl vtlfrciqnm pktlpnnscy sagiarleeg deiqlaipre naqisrngdd
301 tffgalkll
及び図３に示すアミノ酸配列の何れか一によりコードされるポリペプチドと、天然配列ＢＡＦＦの生物学的活性を有するそれらの相同体及び断片及び変異体に与えられた名称である。ＢＡＦＦの生物学的活性は、Ｂ細胞生存の促進、Ｂ細胞成熟の促進、及びＢＲ３への結合からなる群から選択されうる。ＢＡＦＦの変異体は、ＢＡＦＦポリペプチドの天然配列と好ましくは少なくとも８０％又は１００％までの任意の連続整数、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。「天然配列」ＢＡＦＦポリペプチドは、天然由来の対応するＢＡＦＦポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。例えば、ＢＡＦＦはフューリン型のプロテアーゼにより細胞表面から切断された後の可溶型で存在する。そのような天然配列のＢＡＦＦポリペプチドは天然から単離するか、組換え及び／又は合成手段により産生することができる。「天然配列ＢＡＦＦポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子型を特に包含する。「ＢＡＦＦ」なる用語は、Shu等, J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999)；GenBank受託番号AF136293；１９９８年５月７日公開の国際公開第９８／１８９２１号；１９９８年１０月７日公開の欧州特許出願公開第８６９１８０号；１９９８年６月２５日公開の国際公開第９８／２７１１４号；１９９９年３月１８日公開の国際公開第９９／１２９６４号；１９９９年７月８日公開の国際公開第９９／３３９８０号；Moore等, Science, 285:260-263 (1999)；Schneider等, J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999)；Mukhopadhyay等, J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)に記載のポリペプチドを含む。
【００２６】
ここで用いられる「ＢＡＦＦアンタゴニスト」なる用語は、最も広義に用いられ、（１）天然配列ＢＡＦＦポリペプチドに結合し又は天然配列ＢＲ３ポリペプチドに結合してＢＡＦＦポリペプチドとのＢＲ３相互作用を部分的に又は完全にブロックし、及び（２）天然配列ＢＡＦＦシグナル伝達を部分的に又は完全にブロックし、阻害し、又は中和する任意の分子を含む。とりわけ、天然配列ＢＡＦＦポリペプチドシグナル伝達はＢ細胞生存及びＢ細胞成熟を促進する。とりわけ、ＢＡＦＦシグナル伝達の阻害、ブロック又は中和によりＢ細胞数が減少する。本発明に係るＢＡＦＦアンタゴニストはインビトロ又はインビボでＢＡＦＦポリペプチドの一又は複数の生物学的活性を部分的に又は完全にブロックし、阻害し、又は中和するであろう。一実施態様では、生物学的に活性なＢＡＦＦはインビトロ又はインビボで次の事象の何れか一又は組合せを増強する：Ｂ細胞の生存増大、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭレベルの増加、プラズマ細胞数の増加、及び脾臓Ｂ細胞でのＮＦ-κｂ２／１００のｐ５２ＮＦ-κｂへのプロセシング(例えば、Batten, M等, (2000) J. Exp. Med. 192:1453-1465；Moore等, (1999) Science 285:260-263；Kayagaki等, (2002) 10:515-524)。本発明に係るＢＡＦＦアンタゴニストを試験するのに有用な幾つかのアッセイをここに記載する。
【００２７】
上述のように、ＢＡＦＦアンタゴニストは直接的又は間接的な形で機能して、インビトロ又はインビボでＢＡＦＦシグナル伝達を部分的に又は完全にブロックし、阻害し又は中和しうる。例えば、ＢＡＦＦアンタゴニストは直接ＢＡＦＦに結合する。例えば、抗体がＢＡＦＦのＢＲ３への結合を立体的に妨げるようにヒトＢＡＦＦの残基１６２−２７５及び／又は、１６２、１６３、２０６、２１１、２３１、２３３、２６４及び２６５からなる群から選択される残基の近傍残基を含んでなるヒトＢＡＦＦの領域内に結合する抗ＢＡＦＦ抗体が考えられる。他の例では、直接の結合体は、ＴＡＣＩ、ＢＲ３及びＢＣＭＡなどのＢＡＦＦレセプターの細胞外ドメインを含んでなるか、又は図３３に示すＥＣＤのボックス内の最小領域を含んでなるポリペプチドである。他の例では、ＢＡＦＦアンタゴニストには、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）のものの配列、又はここに記載のような図３２及び図３３に挙げられた配列を有するポリペプチドが含まれる。あるいは、ＢＡＦＦアンタゴニストは天然配列ＢＲ３の細胞外ドメインのＢＡＦＦ結合領域に結合して、インビトロ、インサイツ又はインビボでのＢＲ３へのＢＡＦＦの結合を部分的に又は完全にブロックし、阻害し又は中和することができる。例えば、そのような間接的なアンタゴニストは、ヒトＢＲ３のＢＡＦＦへの結合を立体的に妨げるようにヒトＢＲ３の残基２３−３８又はそれら残基の近傍領域を含むＢＲ３の領域に結合する抗ＢＲ３抗体である。
【００２８】
ある実施態様では、本発明に係るＢＡＦＦアンタゴニストには、抗ＢＡＦＦ抗体、（イムノアドヘシン及びペプチドを含む）ＢＡＦＦ結合ポリペプチド、及びＢＡＦＦ結合小分子が含まれる。ＢＡＦＦアンタゴニストには、国際公開第０２／０２６４１号に記載されたＢＡＦＦ結合抗体（例えば表１の配列番号１−４６、３２１−３２９、８３４−８７２、１５６３−１５９５、１８８１−１９０５の任意のもののアミノ酸を含んでなる抗体）が含まれる。更なる実施態様では、イムノアドヘシンはＢＡＦＦレセプターのＢＡＦＦ結合領域（例えば、ＢＲ３、ＢＣＭＡ又はＴＡＣＩの細胞外ドメイン、又は図３３の配列番号１４６−１６５に示す配列のその最小領域）を含む。また更なる実施態様では、イムノアドヘシンはＢＲ３-Ｆｃ、又は式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）のものの配列、又は図３２もしくは図３３に挙げる配列又はその最小領域を有するポリペプチドで、場合によっては免疫グロブリンのＦｃ部位を融合又は抱合しているものである。
一実施態様によると、ＢＡＦＦアンタゴニストは１００ｎＭ以下の結合親和性でＢＡＦＦポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドに結合する。他の実施態様によると、ＢＡＦＦアンタゴニストは１０ｎＭ以下の結合親和性でＢＡＦＦポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドに結合する。更に他の実施態様によると、ＢＡＦＦアンタゴニストは１ｎＭ以下の結合親和性でＢＡＦＦポリペプチド又はＢＲ３ポリペプチドに結合する。
【００２９】
ここで用いられる「ＢＲ３」、「ＢＲ３ポリペプチド」又は「ＢＲ３レセプター」なる用語は、「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」及び「ＢＲ３変異体」（ここで更に定義される）を包含する。「ＢＲ３」は次のポリヌクレオチド配列及びその相同体：
（ａ）ヒトＢＲ３配列（配列番号３３）
1 MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGASS PAPRTALQPQ
61 ESVGAGAGEA ALPLPGLLFG APALLGLALV LALVLVGLVS WRRRQRRLRG ASSAEAPDGD
121 KDAPEPLDKV IILSPGISDA TAPAWPPPGE DPGTTPPGHS VPVPATELGS TELVTTKTAG
181 PEQQ
（ｂ）別のヒトＢＲ３配列（配列番号４８）
1 MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGAAS SPAPRTALQP
61 QESVGAGAGE AALPLPGLLF GAPALLGLAL VLALVLVGLV SWRRRQRRLR GASSAEAPDG
121 DKDAPEPLDK VIILSPGISD ATAPAWPPPG EDPGTTPPGH SVPVPATELG STELVTTKTA
181 GPEQQ
（ｃ）マウスＢＲ３配列（配列番号３５）
1 MGARRLRVRS QRSRDSSVPT QCNQTECFDP LVRNCVSCEL FHTPDTGHTS SLEPGTALQP
61 QEGSALRPDV ALLVGAPALL GLILALTLVG LVSLVSWRWR QQLRTASPDT SEGVQQESLE
121 NVFVPSSETP HASAPTWPPL KEDADSALPR HSVPVPATEL GSTELVTTKT AGPEQ
（ｄ）ラットＢＲ３配列（配列番号４９）
1 MGVRRLRVRS RRSRDSPVST QCNQTECFDP LVRNCVSCEL FYTPETRHAS SLEPGTALQP
61 QEGSGLRPDV ALLFGAPALL GLVLALTLVG LVSLVGWRWR QQRRTASLDT SEGVQQESLE
121 NVFVPPSETL HASAPNWPPF KEDADNILSC HSIPVPATEL GSTELVTTKT AGPEQ
の何れか一を含むポリペプチド及びそれらの変異体又は断片を意味する。本発明のＢＲ３ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源などの様々な供給源から単離するか、又は組換え及び／又は合成法によって調製することができる。ＢＲ３なる用語には、国際公開第０２／２４９０９号、国際公開第０３／１４２９４号、及び米国特許出願公開第２００３／００９９９９０号及び国際公開第２００３／０２４９９１号の図８（クローン７１１、７１３、７０６及び７１０によってコードされるポリペプチド）に記載のＢＲ３ポリペプチドが含まれる。
【００３０】
「天然配列」ＢＲ３ポリペプチドは、天然由来の対応するＢＲ３ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列のＢＲ３ポリペプチドは天然から単離するか、組換え及び／又は合成方法により生成することができる。「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型、可溶型もしくは分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異型を特に包含する。本発明のＢＲ３ポリペプチドには、ヒトＢＲ３のアミノ酸残基１−１８４の近接配列からなるか又はこれを含むＢＲ３ポリペプチドが含まれる。
ＢＲ３「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを本質的に含まないＢＲ３ポリペプチドの型を意味する。ＢＲ３のＥＣＤ型には、ＢＲ３のアミノ酸１−７７、２−６２、２−７１、１−６１及び２−６３の何れか一を含んでなるものが含まれる。
ミニ-ＢＲ３はＢＲ３のＢＡＦＦ結合ドメインの２６残基のコア領域である：
TPCVPAECFD LLVRHCVACG LLRTPR（配列番号５０）。
【００３１】
「ＢＲ３変異体」は、天然配列完全長ＢＲ３又はＢＲ３ ＥＣＤのアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＢＲ３ポリペプチドを意味し、天然配列ＢＡＦＦポリペプチドに結合する。場合によっては、ＢＲ３変異体は単一のシステインリッチドメインを含む。そのようなＢＲ３変異体ポリペプチドには、例えば完全長アミノ酸配列のうちの一以上のアミノ酸残基がＮ及び／又はＣ末端で、並びに一以上の内部ドメイン内で付加又は欠失しているＢＲ３ポリペプチドが含まれる。ＢＲ３変異体ポリペプチドには、他の種の対応する位置からの残基で置換された一又は複数の残基を有する天然配列ＢＲ３、例えばＢＡＦＦへの結合又は凝集の低減を含むヒトＢＲ３の生物学的又は物理的性質を改善可能なマウスＢＲ３残基のアミノ酸置換を有するヒトＢＲ３がまた含まれる。例えば国際公開第０２／２４９０９号の図２０を参照のこと。天然配列ＢＡＦＦポリペプチドに結合するＢＲ３ ＥＣＤの断片、例えばヒトＢＲ３の残基２−７１よりも長さが短く図３３に示された配列番号１４６−１６５の一の最小領域を含むＥＣＤの一部もまた考えられる。ＢＡＦＦに結合する国際公開第２００３／０２４９９１号に記載されたポリペプチドのＥＣＤ及びＥＣＤ断片もまた考えられる。ＢＲ３変異体にはまた国際公開第０２／０９２６２０号に記載のＴＡＬＬ-１結合ペプチドが含まれる。通常は、ＢＲ３変異体ポリペプチドは、ヒトＢＲ３ポリペプチド又はその特定の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、更により好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＢＲ３変異体ポリペプチドは天然のＢＲ３ポリペプチド配列を包含しない。通常は、ＢＲ３変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、頻繁には少なくとも約２０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約３０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約４０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約６０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約７０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約８０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約９０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約１００アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約１５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約２００アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約２５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００３２】
ここで用いられる「ＴＡＣＩ」、「ＴＡＣＩポリペプチド」又は「ＴＡＣＩレセプター」なる用語は、「天然配列ＴＡＣＩポリペプチド」及び「ＴＡＣＩ変異体」（ここで更に定義する）を包含する。「ＴＡＣＩ」は、図１Ａ−１Ｂのアミノ酸配列、図５Ｂのアミノ酸１−２４６及び図８のアミノ酸配列、図１Ａ−１Ｂ及び５Ａに示すポリヌクレオチド配列を含む核酸分子及びその相同体、変異体及び断片、図１Ａ−１Ｂ及び５Ａに示す配列を含む核酸分子及びその変異体によってコードされるポリペプチド、並びに上記の断片を含むポリペプチドに与えられる名称である。本発明のＴＡＣＩポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源などの様々な供給源から単離し、又は組換え及び／又は合成法によって調製することができる。
「天然配列」ＴＡＣＩポリペプチドは、天然由来の対応するＴＡＣＩポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列のＴＡＣＩポリペプチドは天然から単離するか、組換え及び／又は合成法により生成することができる。「天然配列ＴＡＣＩポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型、可溶型又は分泌型（例えば細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。本発明のＴＡＣＩポリペプチドには、限定するものではないが、von Bulow等, 上掲、及び１９９８年９月１１日公開の国際公開第９８／３９３６１号に記載のポリペプチド、スプライス変異型（上では「ｈＴＡＣＩ（２６５）」と称し図８に示され、図８のアミノ酸残基１−２９３の近接配列を含んでなるＴＡＣＩポリペプチド）が含まれる。
【００３３】
ＴＡＣＩ「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを本質的には含まないＴＡＣＩポリペプチドの型を意味する。ＴＡＣＩのＥＣＤ型には、von Bulow等, 上掲、国際公開第９８／３９３６１号、国際公開第００／４０７１６号、国際公開第０１／８５７８２号、国際公開第０１／８７９７９号、国際公開第０１／８１４１７号に記載のもの、図１のアミノ酸残基１−１６６、図１のアミノ酸残基１−１６５、図１のアミノ酸残基１−１５４、図１のアミノ酸残基１−１１４、図５Ｂのアミノ酸残基１−１１９、図５Ｂのアミノ酸残基１−１２０、及び図５Ｂのアミノ酸残基１−１２６が含まれる。
「ＴＡＣＩ変異体」は、天然配列完全長ＴＡＣＩ又はＴＡＣＩ ＥＣＤのアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＴＡＣＩポリペプチドを意味し、天然配列ＢＡＦＦポリペプチドに結合する。そのようなＴＡＣＩ変異体ポリペプチドには、例えば完全長アミノ酸配列のうちの一又は複数のアミノ酸残基がＮ及び／又はＣ末端で、並びに一又は複数の内部ドメイン内で付加又は欠失しているＴＡＣＩポリペプチドが含まれる。天然配列ＢＡＦＦポリペプチドに結合するＴＡＣＩ ＥＣＤの断片もまた考えられる。通常は、ＴＡＣＩ変異体ポリペプチドは、図１Ａに示す核酸分子によってコードされるＴＡＣＩポリペプチド又はその特定の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、更により好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＴＡＣＩ変異体ポリペプチドは天然のＴＡＣＩポリペプチド配列を包含しない。通常は、ＴＡＣＩ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、頻繁には少なくとも約２０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約３０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約４０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約６０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約７０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約８０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約９０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約１００アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約１５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約２００アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約２５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００３４】
ここで用いられる「ＢＣＭＡ」、「ＢＣＭＡポリペプチド」又は「ＢＣＭＡレセプター」なる用語は、「天然配列ＢＣＭＡポリペプチド」及び「ＢＣＭＡ変異体」を包含する（ここで更に定義する）。「ＢＣＭＡ」は、図２に示すポリヌクレオチド配列を含む核酸分子及びその変異体、図２に示す配列を含む核酸分子及びその変異体によってコードされるポリペプチド、並びに上記の断片を含むポリペプチドを意味する。本発明のＢＣＭＡポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源などの様々な供給源から単離する、又は組換え及び／又は合成法によって調製することができる。
「天然配列」ＢＣＭＡポリペプチドは、天然由来の対応するＢＣＭＡポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列のＢＣＭＡポリペプチドは天然から単離するか、組換え及び／又は合成法により生成することができる。「天然配列ＢＣＭＡポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。本発明のＢＣＭＡポリペプチドには、Laabi等, EMBO J., 11:3897-3904 (1992)；Laabi等, Nucleic Acids Res., 22:1147-1154 (1994)；Gras等, Int. Immunology, 7:1093-1106 (1995)；Madry等, Int. Immunology, 10:1693-1702 (1998)に記載のポリペプチド；及び図２（配列番号２７）のアミノ酸残基１−１８４の近接配列を含むＢＣＭＡポリペプチドが含まれる。
ＢＣＭＡ「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを本質的に含まないＢＣＭＡポリペプチドの型を意味する。ＴＡＣＩのＥＣＤ型には、Laabi等, EMBO J., 11:3897-3904 (1992)；Laabi等, Nucleic Acids Res., 22:1147-1154 (1994)；Gras等, Int. Immunology, 7:1093-1106 (1995)；Madry等, Int. Immunology, 10:1693-1702 (1998)に記載のもの、図２のアミノ酸残基４−５５、図２のアミノ酸残基１−４８、図２のアミノ酸残基８−４１、図２のアミノ酸残基４−５１又は図２のアミノ酸残基２１−５３が含まれる。
【００３５】
「ＢＣＭＡ変異体」は、天然配列ＢＣＭＡ又はＢＣＭＡ ＥＣＤのアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＢＣＭＡポリペプチドを意味し、天然配列ＢＡＦＦポリペプチドに結合する。そのようなＢＣＭＡ変異体ポリペプチドには、例えば完全長アミノ酸配列のうちの一又は複数のアミノ酸残基がＮ及び／又はＣ末端で、並びに一又は複数の内部ドメイン内で付加又は欠失しているＢＣＭＡポリペプチドが含まれる。天然配列ＢＡＦＦポリペプチドに結合するＢＣＭＡ ＥＣＤの断片もまた包含される。通常は、ＢＣＭＡ変異体ポリペプチドは、図２に示す核酸分子によってコードされるＢＣＭＡポリペプチド又はその特定の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、更により好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＢＣＭＡ変異体ポリペプチドは天然のＢＣＭＡポリペプチド配列を包含しない。通常は、ＢＣＭＡ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、頻繁には少なくとも約２０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約３０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約４０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約６０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約７０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約８０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約９０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約１００アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約１５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約２００アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約２５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００３６】
ＢＡＦＦは、脾臓、リンパ節、ＰＢＬ、単球、マクロファージ、ＤＣ、Ｔ細胞、Ｋ５６２、ＨＬ-６０及びＧ３６１に発現する。ＡＰＲＩＬは、脾臓、膵臓、大腸でわずかに発現する。ＡＰＲＩＬは、ＰＢＬ及び様々な腫瘍細胞株及び組織で発現する。ＢＣＭＡは、脾臓、リンパ節、胸腺、ＰＢＬ、肝臓、副腎及びＢ細胞で発現する。ＴＡＣＩは、脾臓、胸腺、ＰＢＬ、小腸、Ｂ細胞及び活性化Ｔ細胞で発現する。ＢＡＦＦ-Ｒは、脾臓、リンパ節、胸腺、ＰＢＬ、Ｂ細胞で発現する。ＢＡＦＦ-Ｒは、休止Ｔ細胞で低レベルに発現する。(Mackay及びBrowning, 2002年7月, Nature Reviews, Immunology, 2: 465-475)。
【００３７】
アミノ酸はその側鎖の性質の類似性に応じて分類される（A. L. Lehninger, Biochemistry, 第２版, pp.73-75, Worth Publishers, New York (1975)）：
(1) 非極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) 
(2) 非荷電の極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) 
(3) 酸性：Asp (D), Glu (E)
(4) 塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づきグループに分けることができる：
(1) 疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(2) 中性親水性：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln；
(3) 酸性：Asp, Glu；
(4) 塩基性：His, Lys, Arg；
(5) 鎖配向に影響する残基：Gly, Pro；
(6) 芳香族：Trp, Tyr, Phe。
本発明で用いる「保存的」アミノ酸置換という用語は、機能的に均等なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を指すことを意味する。保存的アミノ酸変化により、生じるペプチドのアミノ酸配列にサイレント変化が生じる。例えば、類似の極性の一又は複数のアミノ酸は機能的均等物として作用し、ペプチドのアミノ酸配列内にサイレント変化を生じる。一般的に、グループ内の置換は構造及び機能に関して保存されているとみなされる。しかしながら、当業者は、特定の残基の役割が、生じた分子の三次元構造内の関係によって決定されることを認識するであろう。例えば、Ｃｙｓ残基は酸化（ジスルフィド）型に生じ、それは還元（チオール）型より極性が小さい。Ａｒｇ側鎖の長鎖脂肪族部分は構造的又は機能的役割の重要な特徴を構成しており、これは、他の塩基性残基よりもむしろ非極性の置換によって最も保存されうる。また、芳香族基（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅ）を含む側鎖はイオン性芳香族又は「陽イオン-ｐｉ」相互作用に関与しうる。これらの場合、酸性又は非荷電性の極性基を有する側鎖の一置換は構造及び機能に関して保存されるであろう。Ｐｒｏ、Ｇｌｙ及びＣｙｓ（ジスルフィド型）などの残基は主鎖形成に直接影響し、しばしば構造的歪みを伴うことなしには置換され得ない。
【００３８】
ここで同定されたリガンド又はレセプターポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、ここで同定したリガンド又はレセプター配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ-２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって以下に記載のように得られ、こでＡＬＩＧＮ-２プログラムのための完全なソースコードは下記の表に提供される。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表に示したソースコードはワシントンD.C.,20559の米国著作権庁に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、あるいは下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００３９】
突然変異誘発の好ましい位置であるタンパク質中の所定の残基又は領域の特定のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）に置換され、アミノ酸と結合標的との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精巧にされる。しかして、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
「二面角」なる用語は、一結合についての回旋度を意味する。例えば、Creighton, T.E., (1993) Protein:Structures and Molecular Properties, 2版., W. H. Freeman and Company, New York, NYを参照。
「φ（ｐｈｉ）」なる用語は、アミノ酸のＮ-Ｃα結合についての回旋度を示す二面角である。例えば、Creighton, T.E., (1993) Protein:Structures and Molecular Properties, 2版., W. H. Freeman and Company, New York, NYを参照。
タイプＩβターンは、Hutchinson, E. G. & Thornton, J. M. (1994) A revised set of potentials for beta turn formation in proteins. Protein Science 3, 2207-2216に記載されている。
【００４０】
「融合タンパク質」及び「融合ポリペプチド」は、互いに共有結合した２つの部位を有するポリペプチドを意味し、それぞれの部位は異なる性質を有するポリペプチドである。その性質はインビトロ又はインビボなどの生物学的性質であるかもしれない。また、その特性は標的分子への結合、反応の触媒などの単一の化学的又は物理学的性質かもしれない。２つの部位は、単一のペプチド結合によって直接的に、又は一以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して連結してもよい。一般的に、２つの部位とリンカーは各々のリーディングフレーム内にあるであろう。
「抱合（コンジュゲート）」は、融合タンパク質、並びにアミノ酸ないしタンパク質部位と非タンパク質部位の両方を含む分子を含む任意のハイブリッド分子を意味する。抱合は、例えば組換えＤＮＡ技術、固相合成法、液相合成法、有機化学合成技術又はこれら技術の組合わせなどを含む、当該分野で知られている様々な技術により合成することができる。合成法の選択は生成される特定の分子に依存するであろう。例えば、性質は完全には「タンパク質」ではないハイブリッド分子は、組換え技術と液層合成法を組み合わせて合成することができる。
【００４１】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能に異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を組み合わせた抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。例えば、本発明の有用なイムノアドヘシンは、ＢＡＦＦレセプターの膜貫通又は細胞質配列を持たないＢＡＦＦレセプターのＢＡＦＦ結合部位を含むポリペプチドである。一実施態様では、ＢＲ３、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの細胞外ドメインは免疫グロブリン配列の定常ドメインに融合している。例えば、本発明のマウスＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシン及びヒトＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンは式：
ｍＢＲ３−Ｆｃ（配列番号１）：
MSALLILALVGAAVASTGARRLRVRSQRSRDSSVPTQCNQTECFDPLVRNCVSCELFHTPDTGHTSSLEPGTALQPQEGQVTGDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSEL
PIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHH TEKSLSHSPGK
ｈＢＲ３−ｈＩＧｇ１  Ｆｃ（配列番号２）
MSALLILALVGAAVASTRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQESQVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
で表すことができる。
【００４２】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)などの抗生物質；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、及びフロキシウリジン(floxuridine)、５−ＦＵ；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチ��ウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；オキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)：ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＫＳ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２&quot;-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；シトシンアラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、カルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantron)；テニポシド；ダウノマイシン；カルミノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＴＰ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、トレミフェン(Fareston)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)及びニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド(bicalutamide)、リュープリン(leuprolide)、及びゴセレリン；上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００４３】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬は下記に記載されている。
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にＣＤ２０発現癌細胞の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期でＰＳＣＡ発現細胞の割合を有意に減少させるものでありうる。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
【００４４】
「哺乳動物」なる用語は、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む。好ましくは、ここでの哺乳動物はヒトである。
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「寛解」又は「治療」するのに効果的な抗体又はアンタゴニスト薬剤の量を指す。癌の場合、治療的に有効量の薬は癌細胞の数を減じ；腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速し、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速し、好ましくは停止）し；腫瘍成長をある程度まで阻害し；及び／又は癌に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。以下の「治療する」の定義を参照せよ。薬が存在する癌細胞の成長を妨げ及び／又は死滅させる程度で、それは、細胞分裂停止及び／又は細胞障害性であり得る。
本発明の抗ＣＤ２０抗体は、ＣＨＯ細胞などの一過性又は安定な形質移入真核宿主細胞により生成されうる。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(登録商標)を含む。
【００４５】
１．ポリペプチドＢＡＦＦアンタゴニスト
ＢＡＦＦのアンタゴニストとして有用なポリペプチドには、例えば国際公開第０２／０９２６２０号の配列番号１２３としてＴＡＬＬ−１１２−３と称され、アミノ酸配列：
MLPGCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGSGSTASSGSGSATHMLPGCKWDLLIKQWVCDPLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１０）
をここに提供するポリペプチドが含まれる。
このポリペプチドはＢＡＦＦに結合し、ＢＲ３のＢＡＦＦへの結合を阻害する。
ある実施態様では、１７ｍｅｒのペプチドは可溶性であり（好ましくは膜結合性でない）、コア配列として用いられるか、さもなければ以下に記載の多様な構造と結合ないし抱合されるであろう。１７ｍｅｒポリペプチド内の幾つかのアミノ酸は、保存的置換及び非保存的置換について無作為化してスクリーニングした。当業者に理解されここに記載されているように、付加及び置換は、結果として生じる１７ｍｅｒのペプチドのＢＡＦＦ結合及び１７ｍｅｒのペプチドを含む構造を損なうことなく限られた塩基上に起こるであろう。ＢＡＦＦ結合機能を与えると思われる置換については、以下及び実施例で示す。幾つかの実施態様では、構造的又は結合的親和性関係に関わる残基は保存されており、このことは式及び以下の解説に記載のようにアミノ酸同一性が維持されているか保存的置換が起こっていることを意味する。
本発明のＢＡＦＦポリペプチドアンタゴニストは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、図３２に記載の配列、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）、及びそれらの混合物からなる群から選択される配列を含む。
【００４６】
本発明の一態様では、ポリペプチドは、式Ｉ：
Ｘ１−ＣＮ−Ｘ３−Ｄ−Ｘ５−Ｌ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−ＣＴ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（式Ｉ）（配列番号１４３）
のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７はシステインを除くアミノ酸配列であり；Ｘ１６はＬ、Ｆ、Ｉ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；及びここでのポリペプチドは式ＩのＣＮ（システインＮ末端）への７アミノ酸残基Ｎ末端及びＣＴ（システインＣ末端）への７アミノ酸残基Ｃ末端内にシステインを含まない。
ある実施態様では、式Ｉの配列を含むポリペプチドは、ジスルフィド結合により結合したＣＮ及びＣＴを有する；Ｘ５ＬＸ７Ｘ８はＬ及びＸ７間に回転中心を有するタイプＩβターン構造の高次構造を形成し；Ｘ８の二面角φに対して正の値を持つ。
ある実施態様では、Ｘ１０はＷ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｍ及び非極性アミノ酸からなる群から選択される。ある実施態様では、Ｘ１０はＷである。ある実施態様では、Ｘ３はＭ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｆ、Ｗ及び非極性のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である。ある実施態様では、Ｘ５はＶ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｉ、Ａ及びＲからなる群から選択される。ある実施態様では、Ｘ７はＶ、Ｔ、Ｉ及びＬからなる群から選択される。ある実施態様では、Ｘ７はＴでもＩでもない。ある実施態様では、Ｘ８は任意のＲ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、Ｈ及びＤアミノ酸からなる群から選択される。ある実施態様では、Ｘ９はＨ、Ｋ、Ａ、Ｒ及びＱからなる群から選択される。ある実施態様では、Ｘ１１はＩ又はＶである。ある実施態様では、Ｘ１２はＰ，Ａ，Ｄ、Ｅ及びＳからなる群から選択される。ある実施態様では、Ｘ１６はＬである。
特定の実施態様では、式Ｉの配列は、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）からなる群から選択される配列である。
【００４７】
本発明の他の態様では、ポリペプチドは、式ＩＩ：
Ｘ１−ＣＮ−Ｘ３−Ｄ−Ｘ５−Ｌ−Ｖ−Ｘ８−Ｘ９−Ｗ−Ｘ１１−Ｘ１２−ＣＴ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｌ−Ｘ１７（式ＩＩ）（配列番号１４４）
のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５、及びＸ１７はシステインを除く任意のアミノ酸配列であり；及びここでのポリペプチドは式ＩＩのＣＮ（システインＮ末端）への７アミノ酸残基Ｎ末端及びＣＴ（システインＣ末端）への７アミノ酸残基Ｃ末端内にシステインを含まない。
ある実施態様では、式ＩＩの配列を含むポリペプチドは、ジスルフィド結合により結合したＣＮ及びＣＴを有する；Ｘ５ＬＶＸ８がＬ及びＸ７間に回転中心を有するタイプＩβターン構造の高次構造を形成し；Ｘ８の二面角φに対して正の値を持つ。
式ＩＩのある実施態様では、Ｘ３はＭ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｆ、Ｗ及び非極性のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ５はＶ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｉ、Ａ及びＲからなる群から選択される。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ８はＲ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、Ｈ及びＤアミノ酸からなる群から選択される。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ９はＨ、Ｋ、Ａ、Ｒ及びＱからなる群から選択される。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ１１はＩ及びＶからなる群から選択される。式ＩＩのある実施態様では、Ｘ１２はＰ、Ａ、Ｄ、Ｅ及びＳからなる群から選択される。
他の態様では、ポリペプチドは図３２に記載の何れかの配列から選択される配列を含む。
【００４８】
本発明の他の態様では、式ＩＩＩ：
Ｅ−ＣＮ−Ｆ−Ｄ−Ｘ５−Ｌ−Ｖ−Ｘ８−Ｘ９−Ｗ−Ｖ−Ｘ１２−ＣＴ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（式ＩＩＩ）（配列番号１４５）
のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５、及びＸ１７はシステインを除く任意のアミノ酸配列であり；Ｘ１６はＬ、Ｆ、Ｉ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；ここでのポリペプチドは式ＩＩＩのＣＮ（システインＮ末端）への７アミノ酸残基Ｎ末端及びＣＴ（システインＣ末端）への７アミノ酸残基Ｃ末端内にシステインを含まず；及びＣＮ及びＣＴはジスルフィド結合で結合している。
式ＩＩＩのある実施態様では、式ＩＩＩの近接する配列を含むポリペプチドは、ＣＮとＣＴ間にジスルフィド結合を有し、Ｘ５ＬＶＸ８でＬ及びＶ間に回転中心を有するタイプＩβターン構造を形成し；Ｘ８の二面角φに対して正の値を持つ。
式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１７はＬ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ及びＧからなる群から選択される。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ５はＬで、Ｘ８はＲである。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ９はＨ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｒ及びＱからなる群から選択される。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ１２はＰ、Ａ、Ｄ、Ｅ及びＳからなる群から選択される。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ１２はＰである。式ＩＩＩのある実施態様では、Ｘ１６はＬである。
特定の実施態様では、式ＩＩＩの配列は、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）及びECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）からなる群から選択される。
【００４９】
また、ECFDLLVRAWVPCSVLK、ECFDLLVRHWVPCGLLR、ECFDLLVRRWVPCEMLG、ECFDLLVRSWVPCHMLR、及びECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号５から９）からなる群から選択される近接したポリペプチド配列を含むポリペプチドが含まれる。また、本発明は、図３２に記載の何れかの配列から選択される配列を含むポリペプチドに関する。好ましくは、図３２に記載の何れか一の配列を含むポリペプチドは、ジスルフィド結合により配列のシステインを結合している。ある実施態様では、配列の５番目と８番目の残基の間の配列はＬとＸ７の間に回転中心を有するタイプＩβターン構造の高次構造を形成し、８番目の残基は二面角φに対して正の値を持つ。
ある実施態様では、本発明のＢＡＦＦポリペプチドは近接配列である。また、本発明は、ECFDLLVRAWVPCSVLK、ECFDLLVRHWVPCGLLR、ECFDLLVRRWVPCEMLG、ECFDLLVRSWVPCHMLR、及びECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号５−９）からなる群から選択される近接した１７ｍｅｒのポリペプチドと少なくも８８％の配列同一性を含むポリペプチドに関する。他の実施態様では、配列同一性は、最大の相同性を得られるように配列した後に少なくとも６４％から１００％までの連続した整数である。最大の相同性が得られるように配列した配列間隙と本発明の１７ｍｅｒより少ない配列を入れることで相同性が低くなる。Ｎ末端又はＣ末端の伸展も挿入も相同性を低くするとはみなさない。
本発明のある実施態様によると、ポリペプチドは５０アミノ酸長未満、２５アミノ酸長未満であり、又は１７ｍｅｒである。
【００５０】
ある実施態様では、本発明のポリペプチドは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）の配列、又は図３２に挙げる配列の、Ｎ末端、Ｃ末端又はその両方に付加的ポリペプチドを含む。付加的ポリペプチド配列は、天然配列ＢＲ３ポリペプチドに非相同で、例えば免疫グロブリンのＦｃ部分を含む。
本発明の他の態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストポリペプチドは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）の配列、又は図３２に挙げる配列を含むポリペプチドの少なくとも一、より好ましくは一以上を含む。互いに連結するポリペプチドは同じ配列又は異なる配列を持ちうる。ある実施態様では、これらのポリペプチドは互いに、場合によってはリンカーを介して結合しうる。リンカーはスペーサーとして機能し、多種の化学的化合物からなりうる。ある実施態様では、リンカーは、約１から５０アミノ酸、より好ましくは１から３０アミノ酸を含むポリペプチドである。リンカー配列は当業者に知られている。例えば、リンカー配列は、GGGKGGGG及びGGGNSSGGなどを含む。特定の実施態様では、互いに連結したポリペプチドは同じ配列を持ち、式：ＰＰ１−Ｌ１−ＰＰ１−Ｌ２−ＰＰ１を含むもので、ここでＰＰ１は式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）、及び図３２に挙げる配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｌ１及びＬ２は配列が異なるリンカー配列である。
ここで示したポリペプチドなどのＢＡＦＦのＢＲ３への結合のアンタゴニストは、好ましくは配列番号５１のＢＲ３  ＥＣＤ又は配列番号５０のミニＢＲ３などの天然のＢＲ３配列と同じかそれよりも大きい親和性でＢＡＦＦに結合する。ある実施態様では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）のものの配列、又は図３２に挙げる配列を有するポリペプチドは、ＢＡＦＦに対して、約１００ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下の結合親和性を持つ。結合親和性を測定する一方法は実施例に示す。
【００５１】
ＢＡＦＦアンタゴニストを見つけるために本発明で使用される方法は、ＢＲ３の１７残基のコア配列を同定すること、修飾すること、及び選択的に無作為化することを含む。用いられる特定の技術は更に以下及び実施例で記載する。ある実施態様では、位置Ｘ２でのＮ末端システイン残基（ＣＮ）及び位置Ｘ１３でのＣ末端システイン（ＣＴ）は保存されており、好ましくはジスルフィド架橋を形成する。ある実施態様では、ＣＮ及びＣＴは１０の近接するアミノ酸により分離されている。好ましくは、１７ｍｅｒ配列は位置Ｘ２及びＸ１３以外に全くシステインを含まない。加えて、１７ｍｅｒが大きな構造に包含される場合、好ましくは１７ｍｅｒに隣接する配列はＣＮ又はＣＴの７アミノ酸内に全くシステイン残基を含まない。Ｘ１０はシステインを除く任意の非極性アミノ酸；例えば：Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ又はＭに置換される。ある実施態様では、Ｘ１０はＷである。
【００５２】
ある実施態様では、モチーフＤ−Ｘ５−Ｌ−Ｘ７は立証されたＢＡＦＦ結合への寄与によって保存される。ある実施態様では、ＣＮとＣＴ間に位置するβターンはＸ４とＸ７の間に形成される。ある実施態様では、βターンの中心はＬ−Ｘ７間に位置する。ある実施態様では、本発明の１７ｍｅｒペプチドの構造は、一般的に、ＣＮとＣＴ間のジスルフィド結合により連結されるβヘアピンを形成するタイプＩβターンにより連結される２つのβ鎖である。加えて、ある実施態様では、Ｘ８の残基は、βヘアピン構造のタイプＩβターンを収容するようにＸ８の二面角φに正の値を与える。
付加的な構造情報により、Ｘ４のＤ及びＸ６のＬはＢＡＦＦ−ＢＲ３複合体のＢＡＦＦ−ＢＲ３境界面内に埋没していることが示される。ある実施態様では、これらの残基は保存されている。また、Ｘ７の残基もＢＡＦＦ−ＢＲ３境界面内に埋没している。ある実施態様では、Ｘ７はＶ、Ｔ、Ｉ及びＬからなる群から選択することができる。ある実施態様では、好ましくはＸ７はＶである。ある実施態様では、Ｘ４からＸ７のモチーフはＤＬＬＶである。
ある実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストの結合領域の長さは１７アミノ酸である。ある実施態様では、ポリペプチドＢＡＦＦアンタゴニストは１７アミノ酸である。ある実施態様では、４つのアミノ酸、Ｘ１４−Ｘ１７は、Ｃ末端のＣＴに続く。ある実施態様では、１７ｍｅｒが結合し保存されている場合、Ｘ１６はＢＡＦＦと疎水性接触を生じる。ある実施態様では、Ｘ１６はＬである。
【００５３】
２．ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
ある実施態様によると、本発明のＢＡＦＦアンタゴニストポリペプチドは、ここに示す１７ｍｅｒのペプチド、一又は複数の１７ｍｅｒのペプチドをコア領域として組み込んでいるポリペプチド、及び１７ｍｅｒのペプチドとポリペプチドの共有結合的に修飾した型（例えば、イムノアドヘシン、標識ポリペプチド、保護ポリペプチド、抱合ポリペプチド、融合タンパク質など）からなる群から選択される。これらの型のポリペプチドを作製するために用いる様々な技術をここに記載する。ポリペプチドを標識する方法及びポリペプチドに分子を抱合する方法は当該分野で知られている。
本発明の組成物は、当該分野で知られている組換え技術を用いて調製することができる。以下の記載は、コード化核酸を包含するベクターを形質移入又は形質転換した宿主細胞を培養し、細胞培養物からポリペプチドを回収することによってそのようなポリペプチドを生成する方法に関する。（例えば、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)；Dieffenbach等, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)を参照）。
所望のポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入してもよい。様々なベクターが公然に入手できる。一般的にベクター成分は、限定するものではないが、以下のもの：シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモータ、及び転写終末配列の一又は複数を含み、その各々について以下に記載する。用いることができる任意のシグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント及び転写終末配列は当該分野で知られており、国際公開第９７／２５４２８号に更に詳述されている。
【００５４】
通常、発現及びクローニングベクターは宿主生物によって認識されるプロモーターを含み、コード化核酸配列に作用可能に結合している。プロモーターは、特定の核酸配列の転写と翻訳を制御する構造的遺伝子（一般的に約１００から１０００ｂｐ内）の開始コドンの上流（５’）に位置して、作用可能に結合している非翻訳領域である。そのようなプロモーターは典型的には２つのクラス、誘発性と恒常性に分類される。誘発性プロモータは、培養条件、例えば栄養の有無や温度の変化などのいくつかの変化に応じた制御下でＤＮＡからの転写レベル亢進を惹起するプロモーターである。現在、様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素消化によって元のＤＮＡからプロモーターを除去して単離したプロモーターをベクター内に挿入することによってコード化ＤＮＡに作用可能に結合している。
上に列挙した成分の一又は複数を含む適切なベクターの作成には標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を切断し、整え、必要とされるプラスミドを産生するために望ましい型に再ライゲーションする。構築されたプラスミド中において正しい配列であることを確認する解析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）に形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、成功した形質転換細胞を選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により解析し、及び／又は当該分野で知られている標準的な技術を用いて解析する。［例えば、Messing等, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)；Maxam等, Methods in Enzymology, 65:499（1980）を参照］。
【００５５】
哺乳動物細胞でコード化ＤＮＡを一過的に発現するために提供される発現ベクターを用いることができる。一般的に、一過性発現は宿主細胞内で効率よく複製することができる発現ベクターを用いることを含み、そうして宿主細胞は発現ベクターをたくさんコピーして順に、発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを高レベルに合成する［Sambrook等, 上掲］。好適な発現ベクター及び宿主細胞を含む一過性の発現系により、クローン化したＤＮＡによってコードされるポリペプチドを簡便にポジティブ同定するだけでなく、所望の生物学的又は生理学的性質についてポリペプチドを素速くスクリーニングすることができる。
組換え脊椎動物細胞培養での所望のポリペプチドの合成への適合化に適した他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981)；Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979)；欧州特許出願公開第１１７０６０号；及び欧州特許出願公開第１１７０５８号に記載されている。
ここでベクターにＤＮＡをクローニング又は発現するのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母又は高等の真核生物を含む。本発明の目的に適した原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば、エシェリキア属などの腸内細菌科、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャン(marcescans)、及び赤痢菌属、並びに枯草菌（B. subtilis）やバシラス・リケニホルミス等の桿菌（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に開示されたバシラス・リケニホルミス４１Ｐ）、緑膿菌等のシュードモナス属、及びストレプトマイシンが挙げられる。好ましくは、宿主細胞は最小限量のタンパク質分解性酵素を分泌する。
【００５６】
原核生物に加えて、糸状の菌類又は酵母菌のような真核生物微生物が、ベクターのための好適なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は多細胞生物体から得られる。全てのこのような宿主細胞の例は更に国際公開第９７／２５４２８号に記載されている。
宿主細胞は、上述の発現又はクローニングベクターを形質移入し好ましくは形質転換して、プロモータの誘導に適するように改変した栄養培地で培養して、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコード化している遺伝子を増幅する。
形質移入（トランスフェクション）とは、任意のコード配列が実際に発現されるかどうかにかかわらず、宿主細胞に発現ベクターが取り込まれることを意味する。数多くの形質転換法が当業者に知られており、例えばＣａＰＯ４や電気穿孔法などである。宿主細胞内でこのベクターの何らかの働きが生じたときに、一般的に形質転換が成功していると認識される。
形質転換（トランスフォーメーション）とは、ＤＮＡが複製するように、染色体外成分として又は染色体成分によって生物体内にＤＮＡを導入することを意味する。用いる宿主細胞に応じて、その細胞に適する標準的技術を用いて形質転換を行う。一般的に、上掲のSambrook等に記載のような塩化カルシウムを用いたカルシウム処理、又は電気穿孔法が原核生物又は実質的な細胞壁障壁を持つ他の細胞に用いられる。Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開第８９／０５８５９号に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換にはアグロバクテリウム・ツメファシエンスでの感染を用いる。加えて、植物は、１９９１年１月１０日に公開の国際公開第９１／００３５８号に記載のように、超音波処理を用いて形質移入してもよい。
【００５７】
そのような細胞壁のない哺乳動物細胞には、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を用いることができる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的な態様は、米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母菌内への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977) 及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、細胞へのＤＮＡ導入のための他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、電気穿孔法、インタクトな細胞とのバクテリアプロトプラスト融合、又はポリブレンやポリオルニチンなどのポリカチオンもまた用いることができる。哺乳動物細胞の形質転換のための様々な技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及びMansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
上掲のSambrook等に一般的に記載されているように、原核細胞は好適な培養培地で培養することができる。市販の培養培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「MEM」,シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)、及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」,シグマ)がある。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００５８】
一般に、哺乳動物細胞培養の生産性を最大にするための原則、プロトコール及び実質的技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler編 (IRL Press, 1991)に見い出すことができる。
発現したポリペプチドは、分泌シグナルを持たずに直接産生された場合には宿主細胞溶解物から回収することができるが、分泌したポリペプチドとして培養培地から回収することができる。ポリペプチドが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて膜から切り離すか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を切り離すことができる。
ポリペプチドがヒト由来のもの以外の組換え細胞内で生成される場合、ヒト由来のタンパク質又はポリペプチドは含まない。しかしながら、通常は実質的に均一な調製物を得るために組換え細胞タンパク質又はポリペプチドからポリペプチドを回収又は精製することが必要である。第一工程として、培養培地又は可溶化物を遠心分離して粒子状の細胞破壊物を取り除くことができる。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過；及びＩｇＧのような汚染物を除くためのプロテインＡセファロースカラムである。
【００５９】
ファージディスプレイ
ある実施態様によると、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）、及び図３２に挙げる配列からなる群から選択される本発明のポリペプチドは、ファージディスプレイに用いることができる。
ファージディスプレイ技術の使用により、高い親和性で標的分子に結合する配列について迅速に分類することができるタンパク質変異体の大きなライブラリを作製することができる。変異体ポリペプチドをコードしている核酸をウイルス性コートタンパク質、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質をコードしている核酸配列に融合する。タンパク質又はポリペプチドをコードしている核酸配列を遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合した一価ファージディスプレイ系が開発された。(Bass, S., Proteins, 8:309 (1990)；Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991))。一価ファージディスプレイ系では、遺伝子融合が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も粒子の感染性が維持されるように発現している。ペプチドライブラリーを作製してそのライブラリーをスクリーニングする方法は多くの特許に開示されている(例えば、米国特許第５７２３２８６号、米国特許第５４３２０１８号、米国特許第５５８０７１７号、米国特許第５４２７９０８号及び米国特許第５４９８５３０号)。
ある実施態様では、式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩはファージ上でペプチドライブラリーとして発現する。ついで、式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩのポリペプチドのライブラリーを発現するファージはＢＡＦＦ結合に基づいて選択することを目的としている。ある実施態様では、選択の過程はニュートラビジン(neutravidin)プレートに続いて結合されるビオチニル化ＢＡＦＦへ幾つかのファージが結合することを含む。ＢＡＦＦ-ビオチン-ニュートラビジン結合を介するプレートへのファージ結合を回収し、増殖させる。ある実施態様では、ファージに数回の選別を施す。ある実施態様では、ファージをＢＡＦＦ-ビオチンと共にインキュベートし、ついで競合的結合体として非ビオチン化ＢＡＦＦを付加する。本発明におけるファージディスプレイの使用の更なる解説は実施例で与える。
【００６０】
異種性ポリペプチドへ融合又は抱合したポリペプチド
本発明のポリペプチドを含むイムノアドヘシン分子がここでいう方法への使用について更に考えられる。ある実施態様では、分子は免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域と本発明のポリペプチドとの融合体を含む。イムノアドヘシンの一価型に対しては、そのような融合体は通常はＩｇＧ分子のＦｃ領域を含む。更なる実施態様では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１分子由来である。ある実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５４２８１３０号及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60 (1996)も参照のこと。
最も簡単で最も素直なイムノアドヘシンのデザインは、しばしば、アドヘシンの結合ドメイン（例えば、本発明のアンタゴニストポリペプチド）を免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域と組み合わせるものである。例えば、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）の配列、又は図３２に挙げる配列を含むポリペプチドを、免疫グロブリンのＦｃ部位に共有的に結合させうる。加えて、これらポリペプチドの一又は複数を互いに連結し、免疫グロブリンのＦｃ部位に連結することができる。
通常、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸のＣ末端を免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に融合させるが、Ｎ末端の融合もまた可能である。
【００６１】
典型的には、そのような融合体では、コードされたキメラポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持するであろう。融合体は、また、定常ドメインのＦｃ部位のＣ末端に対して、あるいは重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域に対して直ぐにＮ末端を融合させて、作製される。融合体が作製される正確な部位は重要でない；特定の部位はよく知られており、イムノアドヘシンの生物学的活性、分泌又は結合特性を最適化するために選択することができる。
好ましい実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域のＮ末端に融合させる。重鎖定常領域の全体をアドヘシン配列に融合させることは可能である。しかしながら、より好ましくは、ＩｇＧ  Ｆｃを化学的に定義するパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域で始まる配列（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基と１１４として、残基２１６）、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合に用いられる。特に好ましい実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列は、ＩｇＧ重鎖の（ａ）ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３、又は（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合させる。
二重特異性イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは、多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として構築される。一般的に、これらの集合した免疫グロブリンは既知の単位構造を有するであろう。基本的な４鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する形態である。４鎖単位は高分子量の免疫グロブリンにおいて反復されている；一般的にＩｇＭはジスルフィド結合でまとまった４基本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、時にはＩｇＧグロブリンもまた血清中で多量体形態で存在する。多量体の場合、４つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
【００６２】
ここでいう範囲の様々な例示的集合イムノアドヘシンは、以下に概略的に図示する：
（ａ）ＡＣＬ−ＡＣＬ；
（ｂ）ＡＣＨ−(ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、又はＶＬＣＬ−ＡＣＨ)；
（ｃ）ＡＣＬ−ＡＣＨ−(ＡＣＬ−ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、ＶＬＣＬ−ＡＣＨ、又はＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ)
（ｄ）ＡＣＬ−ＶＨＣＨ−(ＡＣＨ、又はＡＣＬ−ＶＨＣＨ、又はＶＬＣＬ−ＡＣＨ)；
（ｅ）ＶＬＣＬ−ＡＣＨ−(ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、又はＶＬＣＬ−ＡＣＨ)；及び
（ｆ）(Ａ−Ｙ)ｎ−(ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ)２
ここで、各々のＡは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）のアミノ酸配列、又は図３２に挙げる配列又はその組み合わせを含む同一又は異なるポリペプチドを表し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１を越える整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を表す。
【００６３】
簡潔のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないし、ジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３'末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様のコンストラクトがHoogenboom等, Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時にハイブリッド重鎖及び軽鎖が共有的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４８１６５６７号に開示されている。
【００６４】
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンｃＤＮＡ配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等, Cell 61:1303-1313 (1990)；及びStamenkovic等, Cell 66:1133-1144 (1991)を参照のこと)。融合の後者のタイプには、発現のためにＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は抹消血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーからの刊行された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法により、単離することができる。イムノアドヘシンの「アドヘシン」及び免疫グロブリン部分をコードするｃＤＮＡが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手（例えば、ロイシンジッパーが融合するか、又は連結する配列又は分子）の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンリッチな配列を意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988)；米国特許第５７１６８０５号；国際公開第９４／１０３０８号；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994)；Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照のこと。当業者であれば、ロイシンジッパー配列を本発明のポリペプチドの５'末端又は３'末端に融合しうることは理解するであろう。
【００６５】
また、本発明のポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に該ポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。ある実施態様によると、そのような異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。ある実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとポリペプチドの融合体を含む。エピトープタグは、一般的にはポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティー精製によって容易に精製できるようにする。様々なタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例には、ポリ-ヒスチジン（poly-his）又はポリ-ヒスチジン-グリシン（poly-his-gly）タグ；フルＨＡ(flu HA)タグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；ｃ-ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
【００６６】
ペプチド-ポリマー抱合体の構築
ある実施態様では、合成ペプチドのポリマー（例えば、ペグ化(PEGylation))の抱合の方法は、溶液中で抱合連結を形成することによって、各々が他方に対して相互に反応する特別な機能を保持するペプチドとＰＥＧ分子を結合させることからなる。ペプチドは一般的な固相合成法を用いて簡単に調製することができる。ペプチドは特定の部位の適した官能基で「前活性化」される。前駆体はＰＥＧ部分と反応する前に精製して、完全に特徴付ける。通常、ペプチドとＰＥＧとのライゲーションは液体中で起こり、逆相分析用ＨＰＬＣによって容易にモニターすることができる。ペグ化ペプチドは、調製用ＨＰＬＣによって簡単に精製し、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析法によって特徴付けすることができる。
【００６７】
ａ．ペプチド反応部位
ある実施態様では、ペプチドは、主に反応条件、ポリマーの分子量などに応じてペプチドのアミノ酸残基の一又は複数を介してポリマーの末端反応基に共有結合させる。反応基を持つポリマーはここでは活性化ポリマーと称する。反応基は、ペプチド上の遊離アミノ基又は他の反応基と選択的に反応する。潜在的な反応部位には、Ｎ末端アミノ基、リジン残基上のεアミノ基、並びに他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシル及び他の親水性基が含まれる。しかしながら、最適な結果を得るために選択される反応基のタイプや量、並びに用いるポリマーのタイプは、反応基がペプチド上のあまりに多くの特定の活性基と反応するのを防ぐために用いる特定のペプチドに依存することが理解されるであろう。ある実施態様では、反応基（例えば、リジン（Ｋ）、修飾した非中性のアミノ酸、又は他の小分子）は抱合に適する位置で置換されうる。
ある実施態様では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）の配列、又は図３２に挙げる配列を含むペプチドは末端反応基を有する。ある実施態様では、ペプチドは、少なくとも一、より好ましくは一以上の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK（配列番号５）、ECFDLLVRHWVPCGLLR（配列番号６）、ECFDLLVRRWVPCEMLG（配列番号７）、ECFDLLVRSWVPCHMLR（配列番号８）、ECFDLLVRHWVACGLLR（配列番号９）の配列、又は図３２に挙げる配列を含むポリペプチドを含んでなる。互いに連結しているポリペプチドは同じ配列を持つか、異なる配列及び末端反応基を有しうる。ある実施態様では、これらのポリペプチドは、場合によってはリンカーを介して、互いに接合することができる。
【００６８】
抱合がポリペプチド上の任意の反応性アミノ酸で起こる一方で、ある実施態様では、反応性アミノ酸は、その遊離εアミノ基を介して活性化ポリマーの反応基に連結するリジンであり、又はアミド結合を介してポリマーに連結するグルタミン酸又はアスパラギン酸である。ある実施態様では、ペプチドの反応性アミノ酸は位置Ｘ２及びＸ１２のシステイン残基ではない。
各ペプチドとのポリマー抱合の程度は、ペプチド上の反応性部位の数、ポリマーの分子量、親水性及び他の性質、及び選択される特定のペプチド誘導体化部位によって異なるであろう。ある実施態様では、抱合体は、ペプチド分子当たり最終モル比１から１０ポリマー分子であるが、本発明のペプチドに接着するポリマー分子がより多いものもまた考えられる。ある実施態様では、各抱合体は一ポリマー分子を含む。誘導体化の所望の量は、サイズ排斥クロマトグラフィや当該分野で知られている他の方法によって抱合体のポリマー置換のレベルを決定した後、時間、温度及び他の反応条件を変えて置換の程度を変化させるといった実験的マトリクスを用いて容易に達成される。
【００６９】
ｂ．活性化ポリマー
ある実施態様では、ポリマーは反応性である単一の基しか含まない。これによってタンパク質分子の架橋を防ぐ。しかしながら、架橋を減らすために反応条件を最大にすること、又は実質的に均一な誘導体を回収するためにゲル濾過又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて反応生成物を精製することは本発明の範囲内である。他の実施態様では、ポリマーは複数のペプチドをポリマー骨格に連結するために２以上の反応基を含む。再び、実質的に均一な形態で所望の誘導体を回収するために、ゲル濾過又はイオン交換クロマトグラフィーを用いることができる。ある実施態様では、ポリマーは、多官能性（通常は二官能性）架橋剤を使用しないでペプチドに直接共有結合させる。ある実施態様では、ＰＥＧ鎖とペプチドは１：１のモル比である。
共有的修飾反応は、ペプチド上の反応性基がリジン基の場合、好ましくは約ｐＨ５−９、より好ましくはｐＨ７−９で生物学的活性な物質を不活性ポリマーと反応させるために一般的に用いられる適当な方法によって起こりうる。一般的に、そのプロセスには、活性化ポリマー（典型的には活性化される少なくとも一の末端ヒドロキシル基を有するポリマー）を調製すること、該ポリマーから活性な基質を調製すること、及びその後に製剤に適するペプチドを生成するためにペプチドを活性基質と反応させることを含む。上記の修飾反応は、一又は複数の工程を伴う様々な方法によって行うことができる。一工程反応で活性化ポリマーを生成するために用いることができる修飾剤の例には、塩化シアヌル酸（２,４,６-トリクロロ-Ｓ-トリアジン）及びシアヌル酸フルオライドが含まれる。
【００７０】
ある実施態様では、修飾反応は二工程で行い、その工程は、初めにカルボキシル酸を形成させるためにコハク酸無水物ないしグルタル無水物などの酸性無水物とポリマーを反応させ、ついで、ペプチドと反応可能な反応性エステル基を有する活性化ポリマーを形成させるためにカルボキシル酸と反応可能な化合物とカルボキシル酸を反応させる。そのような化合物の例には、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド、４-ヒドロキシ-３-ニトロベンゼンスルホン酸などが含まれ、好ましくはＮ-ヒドロキシスクシンイミド又は４-ヒドロキシ-３-ニトロベンゼンスルホン酸が用いられる。例えば、モノメチル置換ＰＥＧは、高い温度、好ましくは約１００−１１０℃で４時間、グルタル無水物と反応させうる。ついで、そのようにして生成したモノメチルＰＥＧグルタル酸を、ついでＧＨと反応させうる活性化ポリマー、すなわちメトキシポリエチレングリコリル-Ｎ-スクシンイミジルグルタラートを生成するために、ジシクロヘキシル又はイソプロピルカルボジイミドのようなカルボジイミド試薬の存在下でＮ-ヒドロキシスクシンイミドと反応させる。この方法は、Abuchowski等, Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984)に詳しく記載されている。他の例では、モノメチル置換ＰＥＧは、活性化ポリマーを生成するために、ジシクロヘキシルカルボジイミド存在下で、グルタル酸無水物と反応させて、続いて４-ヒドロキシ-３-ニトロベンジンスルホン酸（ＨＮＳＡ）と反応させてもよい。ＨＮＳＡは、Bhatnagar等, Peptides: Synthesis-Structure-Function. Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich 等(編) (Pierce Chemical Co., Rockford Ill., 1981), p.97-100, 及び Nitecki等, High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986), タイトル "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications"に記載されている。
【００７１】
ある実施態様では、アミノ基への共有結合は、シアヌル酸塩化物、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基（ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧ＋ＤＭＳＯ及び無水酢酸又はＰＥＧ塩化物＋４-ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、活性化スクシンイミジルエステル類、活性化ジチオ炭酸塩ＰＥＧ、２,４,５-トリクロロフェニルクロロホルメート又はＰ-ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧ）に基づく既知のケミストリーによって達成される。カルボキシル基は、カルボジイミドを用いてＰＥＧ-アミンをカップリングさせることによって誘導体化される。スルフヒドリル基は、１９９７年３月２７日公開の国際公開第９７／１０８４７号に記載されているように、マレイミド置換ＰＥＧ（例えばアルコキシＰＥＧアミン＋スルホスクシンイミジル４-(Ｎマレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート）に、又はNektar Technologies, San Carlos, CA (以前はShearwater Polymers, Inc.)から市販されているＰＥＧ-マレイミドへのカップリングによって誘導体化される。あるいは、ペプチド上の遊離アミノ基（例えばリジン残基上のεアミノ基）は、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジル置換ＰＥＧ（Nektar Technologiesから入手可能なＰＥＧ-ＮＨＳ）に結合させるか、又は２-アミノチオラン（トラウトの試薬）にチオール基を導入してから、Pedley等, Br. J. Cancer, 70: 1126-1130 (1994)に記載のように、ＰＥＧのマレイミド含有誘導体にカップリングさせることができる。
【００７２】
限定するものではないが、ＰＥＧを含む多くの不活性ポリマーが薬剤への使用に適している。例えば、Davis等, Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, pp.441-451 (1980)を参照のこと。本発明のある実施態様では、非タンパク質性ポリマーが用いられる。非タンパク質性ポリマーは典型的には親水性の合成ポリマー、すなわち天然では特に見い出されないポリマーである。しかしながら、天然に存在し組換え又はインビトロ法によって生成されるポリマーも、天然源から単離されるポリマーと同様に有用である。例えばポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンなどの親水性のポリビニルポリマーは本発明の範囲内である。特に有用なのは、ポリアルキレンエーテル、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、及びポリオキシエチレンとポリオキシプロピレン(Pluronics)のブロックコポリマー）；ポリメタクリレート；カルボマー；ホモ多糖及びヘテロ多糖、例えば酸性のムコ多糖、例えばヒアルロン酸のラクトース、アミロペクチン、澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン又は多糖類サブユニットを含む、糖単量体Ｄ-マンノース、Ｄ-及びＬ-ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ-キシロース、Ｌ-アラビノース、Ｄ-グルクロン酸、シアル酸、Ｄ-ガラクツロン酸、Ｄ-マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸又はアルギン酸）、Ｄ-グルコサミン、Ｄ-ガラクトサミン、Ｄ‐グルコース、及びノイラミン酸を含んでなる分岐又は非分岐の多糖類；ポリソルビトール及びポリマンニトールなどの糖質アルコール類のポリマー；ヘパリン又はヘパロン(heparon)である。
【００７３】
抱合前のポリマーは、必要ではないが好ましくは水溶性であるが、最終的な抱合体は好ましくは水溶性である。好ましくは、抱合体は、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、更により好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶解度である。加えて、ポリマーは抱合体形態で高度に免疫原性であってはならないし、静脈内注入、注射又は吸入によって抱合体を投与するつもりがある場合に、それらの投与経路に適合しない粘性を持っていてはいけない。
ポリマーの分子量は、約１０００００Ｄまでの範囲、好ましくは少なくとも約５００Ｄ、又は少なくとも約１０００Ｄ、又は少なくとも約５０００Ｄである。ある実施態様では、ＰＥＧ又は他のポリマーは５０００から２００００Ｄの範囲の分子量である。選択される分子量は、達成される抱合体の効果的な大きさ、ポリマーの性質（例えば、線状や分枝状などの構造）、及び誘導体化の程度、すなわちペプチド当たりのポリマー分子の数やペプチド上のポリマー接着部位又は部位群に依存しうる。ある実施態様では、分枝ＰＥＧはペプチドの効果的な大きさを大幅に増加させるために用いることができる。ＰＥＧ又は他のポリマー抱合体は、半減期の延長、溶解性の増加、タンパク質分解性作用に対する安定化、及び免疫原性の減少に用いることができる。
【００７４】
本発明のペプチドを修飾するための官能化ＰＥＧポリマーはNektar Technologies of San Carlos, CA (以前はShearwater Polymers, Inc.)より入手可能である。そのような市販のＰＥＧ誘導体には、限定するものではないが、アミノＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル類、ＰＥＧ-Ｎ-ヒドロキシスクシンアミドケミストリー（ＮＨＳ）、ＰＥＧ-ヒドラジド、ＰＥＧ-チオール、ＰＥＧ-コハク酸塩、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ-プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧ-コハク酸スクシンイミジル、ＰＥＧプロピオン酸スクシンイミジル、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧのスクシンイミジル炭酸塩、アミノ酸ＰＥＧのスクシンイミジルエステル類、ＰＥＧ-キシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ-炭酸ニトロフェニル、ＰＥＧトレシレート(tresylate)、ＰＥＧ-グリシジルエーテル、ＰＥＧ-アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ-マレイミド、ＰＥＧ-オルトピリジル-ジスルフィド、ヘテロ官能性ＰＥＧ、ＰＥＧビニル誘導体、ＰＥＧシラン、及びＰＥＧホスホリドが含まれる。これらのＰＥＧ誘導体をカップリングさせるための反応条件は、タンパク質、所望するペグ化の程度、及び用いるＰＥＧ誘導体に依存して異なるであろう。ＰＥＧ誘導体の選択に関与する幾つかの要因には、所望される結合位置（例えばリジン又はシステインＲ基）、加水分解安定性と誘導体の反応性、安定性、結合の毒性及び抗原性、分析の適性などが含まれる。特定の誘導体の使用についての特定の注意書きは製造者より入手可能である。
【００７５】
ｃ．抱合体の特徴付け
抱合体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ＮＭＲ、トリプシンのマッピング、液体クロマトグラフィー-質量分析法、及びインビボ生物学的アッセイによって特徴付けすることができる。例えば、ＰＥＧ抱合体の度合いは、ＳＤＳ-ＰＡＧＥやゲル濾過によって示され、ついでＮＭＲで分析することができ、これはＰＥＧのメチレン水素に特定の共鳴ピークを持つ。各分子上のＰＥＧ基の数はＮＭＲスペクトル又は質量分析から算出することができる。溶出緩衝液として１０ｍＭトリス-ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌにて１０％ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動を適切に行う。どの残基がペグ化されたかを確認するために、トリプシンのマッピングを行うことができる。したがって、ペグ化ペプチドは、１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、１ｍＭ 塩化カルシウム、ｐＨ８．３中で、タンパク質／酵素をｍｇ単位で１００対１の比にして３７℃で４時間、トリプシンにて消化し、ｐＨ＜４まで酸性化して消化を停止させた後、ＨＰＬＣ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ-１８（４．６ｍｍ．ｔｉｍｅｓ．１５０ｍｍ、５ｍｕ、１００Ａ）にて分離する。クロマトグラムを非ペグ化の開始物質のものと比較する。ついで、各ピークを質量分析法にて分析してピークにある断片の大きさを確認することができる。通常、ＰＥＧ基を持つ断片は注入後ＨＰＬＣカラム上に残らず、クロマトグラムから消失する。このようなクロマトグラムからの消失は、少なくとも一リジン残基を含む特定の断片上がペグ化されたことを示す。ついで、ペグ化されたペプチドは、一般的な方法によってＢＡＦＦへの結合能について分析することができる。
【００７６】
ある実施態様では、抱合体は、イオン交換クロマトグラフィー（例えばイオン交換ＨＰＬＣ）によって精製する。多くの求電子性活性化ＰＥＧのケミストリーは、ペグ化産物のアミノ基荷電の減少を生じる。よって、高分解能イオン交換クロマトグラフィーは、遊離したタンパク質と抱合したタンパク質を分離するため、及びペグ化の程度に応じて化学種を分離するために用いることができる。実際、異なる化学種（例えば１又は２のＰＥＧ残基を含む）の分離もまた、未反応アミノ酸のイオン特性の違いに応じて可能となる。一実施態様では、ペグ化の程度が異なる化学種は国際公開第９６／３４０１５号（１９９６年１０月３１日に公開の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５５５０号）に記載の方法に従って分離される。抱合体の異種性種は同じようにして互いに精製される。
ある実施態様では、ＰＥＧ-Ｎ-ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）は第一級アミン（例えばリジン及びＮ末端）と反応する。ある実施態様では、ＰＥＧ-ＮＨＳはポリペプチドのＣ末端のリジン（Ｋ）と反応する。ある実施態様では、リジン残基は１７ｍｅｒのポリペプチドのＣ末端に付加される一方、他の実施態様では、Ｘ１７はリジンで置換される。ある実施態様では、ポリマーはＮ末端と反応する。好ましい実施態様では、抱合体は、以下の実施例に記載の誘導体化と精製方法を用いて生成される。
一態様では、本発明は、その構成成分によって形成される上述の何れかの抱合体、すなわち抱合体の共有分子構造内に異質の物質を全く含むことなく一又は複数のポリマー分子に共有的に結合した一又は複数のペプチドを提供する。
【００７７】
抗体の産生
本発明の方法及び製造品は、ＣＤ２０に結合する抗体を用い又は組み込む。従って、そのような抗体を産生する方法をここにまた実施例に記載する。
抗体の産生又はそのスクリーニングに使用されるＣＤ２０は、例えば所望のエピトープを含む抗原又は抗原の一部の可溶型であってもよい。ヒトＣＤ２０の配列は知られており、図１０及び図１１を参照のこと。ヒトＣＤ２０のクローニング及び配列決定は、少なくとも以下の文献に記載されている：Stamenkovic I., Seed B., J. Exp. Med. 167, 1975-1980, 1988. Analysis of two cDNA clones encoding the B lymphocyte antigen CD20 (B 1, Bp35), a type III integral membrane protein."；Tedder T.F., Streuli M., Schlossman S.F., Saito H., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 208-212, 1988. "Isolation and structure of a cDNA encoding the B1 (CD20) cell-surface antigen of human B lymphocytes"；Tedder T.F., Klejman G., Schlossman S.F., Saito H., J. Immunol. 142, 2560-2568, 1989. "Structure of the gene encoding the human B lymphocyte differentiation antigen CD20 (B1)"；Einfeld D.A., Brown J.P., Valentine M.A., Clark E.A., Ledbetter J.A., EMBO J. 7, 711-717, 1988.: "Molecular cloning of the human B cell CD20 receptor predicts a hydrophobic protein with multiple transmembrane domains."。細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のペプチド断片は免疫源として用いることができる。これら既知の配列及びドメイン描写に基づいて、当業者はＣＤ２０ポリペプチド及びその断片を発現させ、抗体産生に用いることができる。
【００７８】
ヒトＣＤ２０に対する抗体を生成するために、細胞外ドメインアミノ酸残基１４２−１８８及び６以上の残基長のペプチド断片を、マウス、ハムスター及びラットを含む齧歯類、ウサギ、ヤギないし他の適当な動物内で抗体を生じさせるために免疫源として用いることができる。可溶型ＣＤ２０ポリペプチド又はその免疫原性断片を、細菌や真核生物などの適切な宿主細胞内で発現させることができる。一実施態様では、ヒト及びマウスの界面活性剤溶解性完全長ＣＤ２０を大腸菌内で産生して（以下の実施例を参照）、免疫化するために用いて、抗ＣＤ２０抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。
あるいは、又は加えて、細胞表面上にＣＤ２０を発現するＢ細胞や細胞株を抗体の生成、及び／又はスクリーニングに用いることができる。一つのこのような細胞株はヒトリンパ芽球腫細胞株ＳＢ(ATCC受託番号ATCC CCL 120、ATCC, Rockville, Mdより入手)である。抗体はヒトの治療のためにヒトＣＤ２０に対して産生される。抗体産生に有用なＣＤ２０の他の型は当業者に明らかであろう。
またファージディスプレイ方法をＣＤ２０結合抗体を産生するために使用することができる。
ＣＤ２０に結合する抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体でもよい。そのような抗体及びその産生方法を以下に詳述する。
【００７９】
(ｉ)  ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより抱合させることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００８０】
(ｉｉ)  モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかながら存在する起こりうる天然に生じる突然変異体を除いて同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１５６７号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００８１】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【００８２】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
【００８３】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。よって、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 81:6851 (1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００８４】
(ｉｉｉ)  ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野で記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾らかの高頻度可変領域残基及び場合によっては幾らかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００８５】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を調べることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００８６】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒト化のための別法として、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えばマウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５９１６６９号、同第５５８９３６９号及び同第５５４５８０７号を参照のこと。
【００８７】
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子の何れかにインフレームでクローニングする。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性の幾つかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントの幾つかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原(自己抗原を含む)の多様なアレイに対する抗体を、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同第５５７３９０５号を参照のこと。
またヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞により生産してもよい(例えば米国特許第５５６７６１０号及び同第５２２９２７５号を参照)。
【００８８】
(ｖ)  抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。
【００８９】
(ｖｉ)  二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、Ｂ細胞表面上のマーカーの２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では一方のＢ細胞マーカーと更に他方のＢ細胞表面上のマーカーが結合しうる。あるいは、抗Ｂ細胞マーカー結合アームは、Ｂ細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＢ細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＢ細胞マーカー結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【００９０】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なるアプローチ法に従って、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００９１】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照のこと。米国特許第５７３１１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００９２】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること（米国特許第４６７６９８０号）及びＨＩＶ感染の治療（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号及び欧州特許出願公開第０３０８９号）等の用途が提案されている。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当該分野において適切な架橋剤は周知であり、多くの架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に記載されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００９３】
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発すると同時に、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞へ結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられている。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J. Immunol. 147:60(1991)。
【００９４】
ここに記載のタンパク質又はペプチドアンタゴニスト及び抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、ＣＤ２０結合抗体ないしアンタゴニストの結合親和性及び／又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。アンタゴニストのアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化をアンタゴニスト核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、アンタゴニストのアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終コンストラクトが所望の特徴を有するとして、最終コンストラクトに達するまでなされる。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化など、アンタゴニストの翻訳後過程を改変しうる。
突然変異誘発のための好ましい位置であるアンタゴニストの残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン）に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。よって、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現されたアンタゴニスト変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００９５】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合体、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ末端メチオニル残基を持つアンタゴニスト又は細胞障害ポリペプチドに融合したアンタゴニストを含む。アンタゴニスト分子の他の挿入変異体は、アンタゴニストの血清半減期を向上させる酵素又はポリペプチドのアンタゴニストのＮ末端又はＣ末端への融合体を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、アンタゴニスト分子において少なくとも一つのアミノ酸残基に異なる残基が挿入されている。抗体アンタゴニストの置換突然変異について最も関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ交互変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
【００９６】
表１
2008525449.tif 000003
【００９７】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
（２）中性の親水性：cys、ser、thr、
（３）酸性：asp、glu；
（４）塩基性：asn、gln、his、lys、arg；
（５）鎖配向に影響する残基：gly、pro； 及び
（６）芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
アンタゴニストの適切な配置の維持に関与しない任意のシステイン残基は、一般にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する。逆に、アンタゴニストにシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい（特にアンタゴニストが抗体断片、例えばＦｖ断片である場合）。
【００９８】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、更なる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異である。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
アンタゴニストのアミノ酸変異の他の型は、アンタゴニストの元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、アンタゴニストに見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び／又はアンタゴニストに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
【００９９】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン（ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸）のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
アンタゴニストへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元のアンタゴニストの配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。アンタゴニストのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又は初期に調製されたアンタゴニストの変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
【０１００】
エフェクター機能、例えばアンタゴニストの抗原依存性細胞媒介性細胞障害性(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ)を向上させるために、本発明のアンタゴニストを修飾することが望ましい。このことは、抗体アンタゴニストのＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することで達成される。代わりに又は加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。よって、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上及び／又は補体媒介性細胞障害及び抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を増強する。Caron等, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまたWolff等 Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能性交差結合を用いて調製されうる。あるいは、抗体を二重のＦｃ領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解及びＡＤＣＣ能を亢進した。Stevenson等Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照のこと。
アンタゴニストの血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載されているようにアンタゴニスト（特に抗体断片）内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【０１０１】
アッセイ
末梢血Ｂ細胞濃度は、ＣＤ３−／ＣＤ４０＋細胞を数えるＦＡＣＳ法によって決定する。試料中の全リンパ球におけるＣＤ３−ＣＤ４０＋Ｂ細胞の割合は、以下のゲーティング(gating)法によって得ることができる。領域１（Ｒ１）を定義するために前方散布／側方散布の散布図上のリンパ球集団に印を付ける。Ｒ１内の事象を用いて、ＣＤ４０及びＣＤ３マーカを表す蛍光強度ドット図とする。ＣＤ４０及びＣＤ３陽性についてそれぞれのカットオフ値を求めるために、蛍光標識アイソタイプコントロールを用いる。
【０１０２】
ＦＡＣＳ分析
５０万個の細胞を洗浄して、５μｌの染色した抗体ないしコントロール抗体を含有する１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水である１００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁する。アイソタイプコントロールを含む全ての染色した抗体は、PharMingen, San Diego, CAより入手する。ヒトＣＤ２０発現は、ＦＩＴＣ抱合抗ヒトＩｇＧ１二次抗体と共にリツキサン（登録商標）にて染色することによって評価する。ＦＡＣＳ分析は、FACScan及びCell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA)を用いて行う。全リンパ球は前方及び側方軽散布で定義される一方、Ｂリンパ球は細胞表面上にＢ２２０を発現していることで定義される。
Ｂ細胞の枯渇と回復は、注射後初めの１週間を毎日及びその後を週毎に脾臓、リンパ節及び骨髄におけるＦＡＣＳにより末梢血Ｂ細胞数の分析とｈＣＤ２０＋Ｂ細胞の分析によって評価する。注射した２Ｈ７変異体抗体の血清レベルをモニターする。
【０１０３】
医薬製剤
本発明に従って使用されるＣＤ２０結合抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、任意の薬剤的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合して、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で貯蔵するために調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編(1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）又はトゥイーン(TWEEN)（商標）、プルロニクス(PLURONICS)（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１０４】
例示的な抗ＣＤ２０抗体製剤は、出典明示によりここに援用される国際公開第９８／５６４１８号に記載されている。他の製剤は、２−８℃で２年間の最小限の貯蔵期間を持つ抗ＣＤ２０抗体４０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭトレハロース、０．９％ベンジルアルコール、ｐＨ  ５．０の０．０２％ポリソルベート２０を含む液状複数回用量製剤である。興味ある他の抗ＣＤ２０製剤は、抗体１０ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び注入用の滅菌水を含むｐＨ  ６．５のものである。更に、他の水性医薬製剤は、ｐＨ約４．８からｐＨ約５．５、好ましくはｐＨ５．５の１０−３０ｍＭ酢酸ナトリウム、界面活性剤として約０．０１−０．１％ｖ／ｖ量のポリソルベート、約２−１０％ｗ／ｖ量のトレハロース、及び保存剤としてベンジルアルコールを含む（米国特許第６１７１５８６号）。皮下投与に適合化させた凍結乾燥製剤は国際公開第９７／０４８０１号に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は適当な希釈剤で高タンパク質濃度に再構成され得、また再構成製剤はここで治療される哺乳動物に皮下投与されうる。
ヒト化２Ｈ７変異体の一製剤は、１２−１４ｍｇ／ｍｌ抗体、１０ｍＭヒスチジン、６％スクロース、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ５．８である。特定の実施態様では、２Ｈ７変異体、特に２Ｈ７．ｖ１６は、ｐＨ５．８で、２０ｍｇ／ｍｌ抗体、１０ｍＭヒスチジン硫酸塩、６０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、及び注射用の滅菌水で製剤化される。
【０１０５】
ここでの製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものをまた含みうる。例えば、細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカイン又は免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン又はＴ細胞結合抗体、例えばＬＦＡ-１に結合するもの等のＴ細胞作用性のもの）を更に提供することが望まれる。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、疾患又は疾病又は治療のタイプ、及び上で検討した他の因子に依存する。これらは一般に同じ用量でここに記載された投与経路又はこれまで用いられている用量の約１〜９９％量で用いられる。
また活性成分は、例えばコアセルべーション技術又は界面重合化により調製したマイクロカプセル、例えば、コロイド状のドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョン中に、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中に封入されうる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
【０１０６】
徐放製剤を調製することができる。徐放製剤の好適な例は、アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの半透過性基質を含むものであり、該基質は、成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性基質の例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号), Ｌ-グルタミン酸及びＬ-グルタミン酸エチルの共重合体、非分解性のエチレンビニル酢酸塩、分解性の乳酸・グリコール酸共重合体、例えばLUPRON DEPOTＴＭ(乳酸・グリコール酸共重合体及びロイプロリド酢酸塩からなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリＤ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
インビボ投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって直ぐに達成できる。
【０１０７】
疾患治療
疾患
本発明のＣＤ２０結合抗体及びＢＡＦＦアンタゴニストは、Ｂ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞制御性自己免疫疾患の治療に有用である。
Ｂ細胞制御性自己免疫疾患には、限定されないが、関節炎（関節リウマチ、例えば急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム病関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、脊椎関節炎、及び若年発症関節リウマチ、骨関節炎、関節炎慢性化、関節炎変形、関節炎慢性原発、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬、花粉症及びＪｏｂ症候群のようなアトピー性疾患を含むアトピー、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状の皮膚炎、及びアトピー性皮膚炎、ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症(全身強皮症を含む)、硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症(ＭＳ)、例えば脊椎-眼(spino-optical) ＭＳ)、原発性進行性ＭＳ(ＰＰＭＳ)及び再発性寛解ＭＳ(ＲＲＭＳ)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、硬化症汎発、及び失調性硬化症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)(例えばクローン病、自己免疫媒介性胃腸疾患、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、微細な大腸炎、膠原性大腸炎、大腸ポリープ、壊死性全腸炎及び貫壁性大腸炎、及び自己免疫炎症性腸疾患)、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、例として成人性又は急性の呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液疾患、リウマチ様脊椎炎、突発性聴力障害、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎(ＧＮ)、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性ＧＮ、免疫性ＧＮ、膜性ＧＮ(膜性ネフロパシ)、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性ＧＮ(ＭＰＧＮ)(タイプＩ及びタイプＩＩを含む)、及び急速進行性ＧＮ、アレルギー性症状、アレルギー性反応、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球接着不全症、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)又は全身性ループスエリテマトーデス、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性の皮膚ＳＬＥ、新生児期ループス症候群(ＮＬＥ)、紅班性狼瘡汎発、ループス(例としてループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛症ループス)、若年発症(Ｉ型)真正糖尿病、例として小児インシュリン依存性真正糖尿病(ＩＤＤＭ)、成人発症型真正糖尿病(ＩＩ型糖尿病)、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏���と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、ヴェゲナーの肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例として血管炎、(大脈管脈管炎(リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中脈管脈管炎(川崎病及び結節性動脈周囲炎を含む)、微小多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性血管炎、皮膚性血管炎又は過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、及びＡＮＣＡ関連の脈管炎、例としてチャーグ-ストラウス脈管炎又は症候群(ＣＳＳ))、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血(ＡＩＨＡ)、悪性貧血(貧血症悪性熱)、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全(ＰＲＣＡ)、第ＶＩＩＩ因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット(Bechet)又はベーチェット(Behcet)病、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば類水疱性天疱瘡及び類天疱瘡皮膚、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデスを含む)、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少(例えば心筋梗塞患者によるもの)、例えば血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、輸血後紫斑病(ＰＴＰ)、ヘパリン誘発血小板減少症、及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少症、例えば慢性及び急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、多腺性症候群、例として自己免疫多腺性症候群(又は多腺性内分泌障害症候群)、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート-イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン(stiff-man)又はスティッフマン(stiff-person)症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群(ＯＭＳ)及び感覚系神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ系間隙間質性肺炎(ＬＩＰ)、閉塞性細気管支炎(非移植)対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病(ＩｇＡネフロパシ)、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆管萎縮症、肺���維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアック病、コエリアック病、脂肪便症(グルテン腸疾患)、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症(ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症(ルー・ゲーリック病))、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患(ＡＩＥＤ)、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直徴候(ＯＭＳ)、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増多症、モノクローナルＢ細胞リンパ球増多症(例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び意義未確定のモノクローナル免疫グロブリン血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance)ＭＧＵＳ)を含む原発性リンパ球増多症、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄疾患、例として、自己免疫脱髄性病及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、糖尿病性ネフロパシ、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群(石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症)、雌雄自己免疫性不妊性、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス(kypanosomiasis)、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア(flariasis)、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎又はＦｕｃｈの毛様体炎、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、エコーウィルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァン症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性及び乏血-再灌流障害、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、アスペルミオジェネース(aspermiogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、癩性結節性紅斑、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ��熱、ハンマンリッチ病、感覚器性(sensoneural)聴力障害、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感神経(symphatica)眼炎、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、抗精子抗体による不妊性、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタインバーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群(エイズ)、寄生虫病、例えばリーシュマニア属、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球接着不全症、サイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、末梢性神経障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(ＡＯＩＨ)、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(ＥＢＡ)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、脈管拡張(antgiectasis)、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎
又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。
【０１０８】
Ｂ細胞悪性腫瘍には、リンパ球優位型ホジキン病（ＬＰＨＤ）を含むＣＤ２０陽性ホジキン病；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；濾胞性中心細胞（ＦＣＣ）リンパ腫；急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病が含まれる。非ホジキンリンパ腫には、軽度の／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中程度の／濾胞性ＮＨＬ、中程度の拡散性ＮＨＬ、重度の免疫芽細胞ＮＨＬ、重度のリンパ芽球ＮＨＬ、重度の非正円形細胞でない小細胞性ＮＨＬ、バルキー疾患(bulky disease)性ＮＨＬ、形質細胞様リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれる。これら癌再発の治療も考慮される。ＬＰＨＤは、放射線照射や化学療法にも関わらずたびたび再発するホジキン疾患のタイプであり、ＣＤ２０陽性悪性腫瘍細胞に特徴があるものである。ＣＬＬは白血病の主要な４タイプのうちの一つである。リンパ球と呼称される成熟したＢ細胞の癌であるＣＬＬは、血液、骨髄及びリンパ系組織での細胞の蓄積に現れる。無痛性リンパ腫は、低成長性で難治性疾患であり、多くの緩解と再発を繰り返して患者の平均生存率は６〜１０年となる。
特定の実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストとＣＤ２０結合抗体は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、リンパ球優位型ホジキン病（ＬＰＨＤ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、一種の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、狼瘡腎炎を含む全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫血小板減少、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎の治療に用いられる。
【０１０９】
Ｂ細胞枯渇の所望のレベルは疾患に依存するであろう。ＣＤ２０陽性癌の治療の場合、本発明の抗ＣＤ２０抗体の標的であるＢ細胞の枯渇を最大限にすることが望まれる。よって、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞悪性腫瘍の治療の場合、Ｂ細胞を十分枯渇して、例えば腫瘍の成長（大きさ）、癌性細胞タイプの増殖、転移、特定の癌の他の兆候や症状をモニターすることによって技量のある医者によって評価できる疾患の進行を少なくとも防ぐことが望まれる。好ましくは、Ｂ細胞の枯渇は、少なくとも２か月、より好ましくは３か月、更により好ましくは４か月、より好ましくは５か月、更により好ましくは６か月以上の間、疾患の進行を防ぐために十分な程度である。更により好ましい実施態様では、Ｂ細胞の枯渇は、少なくとも６か月、より好ましくは９か月、より好ましくは１年、より好ましくは２年、より好ましくは３年、更により好ましくは５年以上緩解の時間を増やすのに十分な程度である。最も好ましい実施態様では、Ｂ細胞枯渇は十分に疾患を治癒する。好ましい実施態様では、癌患者のＢ細胞の枯渇は、治療の前の基本の値の少なくとも約７５％、及びより好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９９％及び更に１００％である。
自己免疫疾患の治療の場合、個々の患者の疾患及び／又は症状の重症度に応じて、ＣＤ２０結合抗体の用量を調節することによってＢ細胞の枯渇の程度を調節することが望ましい。よって、Ｂ細胞の枯渇は完全にできるが完全でなければならないものではない。あるいは、全Ｂ細胞の枯渇は初期治療で望まれるかもしれないが、続く治療では部分的な枯渇のみを達成するように用量を調節してもよい。一実施態様では、Ｂ細胞枯渇は少なくとも２０％であり、すなわち治療前のベースライン値と比較して８０％以下のＣＤ２０陽性Ｂ細胞が残っている。他の実施態様では、Ｂ細胞枯渇は２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれ以上である。好ましくは、Ｂ細胞枯渇は、疾患の進行を停止させるのに、より好ましくは治療の元で特定の疾患の兆候や症状を緩解するのに、更により好ましくは疾患を治癒するのに、十分である。
【０１１０】
リツキシマブでの治療法に関する文献には：Perotta及びAbuel 「Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab」 Abstract #3360 Blood 10(1)(part 1-2): p. 88B(1998)；Stasi等 「Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura」 Blood 98(4):952-957 (2001)；Matthews, R. 「Medical Heretics」 New Scientist (7 April, 2001)；Leandro等 「Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion」 Ann Rheum Dis 61:833-888 (2002)；Leandro等 「Lymphocyte depletion in thrumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response.  Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001)；Leandro等 「An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus」, Arthritis & Rheumatism 46(1):2673-2677 (2002)；Edwards and Cambridge 「Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes」 Rhematology 40:205-211 (2001)；Edwards等 「B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders」 Biochem. Soc. Trans. 30(4):824-828 (2002)；Edwards等 「Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002)；Levine and Pestronk 「IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab」 Neurology 52: 1701-1704 (1999)；DeVita等 「Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis」 Arthritis & Rheum 46:2029-2033 (2002)；Hidashida等 「Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab.」  Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; Ne Orleans, LA 2002；Tuscano, J. 「Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab」  Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002.が含まれる。
【０１１１】
治療的応用の場合、本発明の抗ＣＤ２０抗体及びＢＡＦＦアンタゴニスト組成物は、例えば化学療法剤、ホルモン、抗血管形成物質、放射標識化合物、あるいは手術、凍結療法及び／又は放射線療法と組み合わせて用いることができる。前の治療法は、一般的な治療法と同時に、その前又はその後に、一般的な治療法の他の形態と組み合わせて投与することができる。抗ＣＤ２０抗体とＢＡＦＦアンタゴニストは、治療的有効量の化学療法剤と共に投与するであろう。他の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体とＢＡＦＦアンタゴニストは、化学療法剤の活性や効能を亢進させるために化学療法と組み合わせて投与される。医師用卓上参考書（Physicians' Desk Reference）では、様々な癌の治療に用いられている化学療法剤の用量が開示されている。治療的に有効である前述の化学療法剤の投与計画及び用量は、治療される特定の癌、疾患の程度、及び技量のある医師によく知られている他の因子に依存し、医師により決定されうる。
本発明の組成物の投与後に治療前と比較して症状や他の適応基準に測定可能な改善がみられる場合に、患者は、本発明の方法によってＢ細胞腫瘍又はＢ細胞制御性自己免疫疾患が緩解し又は成功裏に治療される。治療の効果は、本発明の組成物の投与後３−１０週間後に現れうる。各疾患の適応基準は適切な分野の技量のある医師にはよく知られているであろう。例えば、医師は治療した患者を、臨床学的に、又は疾患の血清学的証拠、例えば疾患の血清学的マーカー、Ｂ細胞数を含む完全血球数及び血清免疫グロブリンレベルについてモニターすることができる。ＩｇＧ及びＩｇＭの血清レベルはＢＲ３-Ｆｃ処置マウスで減少する。ＢＲ３-Ｆｃ又は抗ＣＤ２０抗体処置、あるいはその両方に応答するヒト患者が血清ＩｇＧ及びＩｇＭレベルも同様に減少を示すことが予測される。患者は次のものの一又は複数における観察可能な及び／又は測定可能な減少あるいは消失を示すかもしれない：癌細胞数の減少又は癌細胞の消失；腫瘍サイズの減少；癌細胞の器官への浸潤抑制（すなわち、ある程度の減退、好ましくは停止）；腫瘍転移の抑制（すなわち、ある程度の減退、好ましくは停止）；ある程度の腫瘍成長の抑制；及び／又は、特定の癌に伴う一又は複数の症状のある程度の除去；罹患率及び死亡率の減少、及び生活の質の改善。好ましくは、本発明の組成物の投与後、本発明の方法によって治療する前に得た特定の症状又は基準のベースラインより少なくとも２０％、より好ましくは２５−３０％、更により好ましくは３０−３５％、最も好ましくは４０％及びそれ以上の改善がある。
【０１１２】
腫瘍治療の効果又は成功を評価するパラメータは適切な疾患に技量のある医師には知られているであろう。一般に、技量のある医師は特定の疾患の兆候や症状の減少を求めるであろう。パラメータには、疾患増悪の中央値、寛解期間及び安定期間が含まれる。Ｂ細胞腫瘍の場合、測定可能な基準には、例えば疾患進行時間、全体的及び／又は進行しない生存継続時間の延長が含まれる。白血病の場合には、寛解の程度を決定するために骨髄生検が行われうる。完全な寛解は、治療後３０日の患者の骨髄に見い出される全細胞のうちの５％未満を白血病細胞が構成しているものとして定義できる。
次の文献は、リンパ腫及びＣＬＬ、それらの診断、治療、及び治療効果を測定するための標準的な医学的手法について記載している。Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998；van Besien K及びCabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, 第70章, pp 1293-1338, Hematology, Basic Principles and Practice, 第3版 Hoffman 等(編者) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000；及びRai, K及びPatel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, 第72章, pp1350-1362, Hematology, Basic Principles and Practice, 第3版 Hoffman 等(編者) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000。
自己免疫又は自己免疫関連疾患の治療の効果又は成功を評価するためのパラメータは適切な疾患に技量のある医師には知られているであろう。一般に、技量のある医師は特定の疾患の兆候や症状の減退を求めるであろう。次に例を示す。
【０１１３】
関節リウマチ（ＲＡ）は、病因が未知の自己免疫疾患である。大部分のＲＡ患者は、治療を行っても、結果として進行性関節破壊、奇形、身体障害及び更に早死になりうるという疾患の慢性経過に悩まされる。ＲＡ治療の目的は、関節損傷の予防又は管理、機能の損失の予防及び疼痛の軽減にある。通常、ＲＡの初期治療は、以下の薬剤の一又は複数の投与を含む：非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、糖質コルチコイド（関節注入による）及び低用量プレドニゾン。「Guidelines for the management of rheumatoid arthritis」 Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)を参照のこと。新しくＲＡと診断された大多数の患者は、診断から３ヵ月以内に疾患修飾性抗リウマチ剤（ＤＭＡＲＤ）により治療を始める。ＲＡで一般に用いられているＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、メトトレキセート、レフルノミド、エタネルセプト（etanercept）、インフリキシマブ（＋経口及び皮下メトトレキセート）、アザチオプリン、Ｄ-ペニシラミン、ゴールド（Gold）（経口）、ゴールド（筋肉内）、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌プロテインＡ免疫吸着である。
ＲＡの間、体内で腫瘍壊死因子α（TNFα）を産生するので、ＴＮＦαインヒビターがその疾患の治療に使用されていた。エタネルセプト（ENBREL（登録商標））は、活性なＲＡの治療のための米国で承認されている注射可能な薬剤である。エタネルセプトはＴＮＦαと結合して及び関節及び血液から大部分のＴＮＦαを取り除くように働き、それによって、ＴＮＦαが炎症及び関節リウマチの他の症状を促進するのを防止する。エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に結合しているヒトの７５ｋＤ（ｐ７５）腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなる「イムノアドヘシン」融合タンパク質である。商品名REMICADE（登録商標）として販売されているインフリキシマブは、ＲＡ及びクローン病を治療するために処方される免疫抑制剤である。インフリキシマブは、ＴＮＦαに結合するキメラモノクローナル抗体で、炎症をもたらすＴＮＦαを標的としそれに結合することによって身体の炎症を軽減する。
【０１１４】
これまでＤ２Ｅ７として知られているアダリムマブ（adalimumab）（ＨＵＭＩＲＡＴＭ、Abbott Laboratories）は、ＴＮＦαに結合するヒトモノクローナル抗体であり、一又は複数の伝統的な疾患修飾性ＤＭＡＲＤに十分に反応を示さなかった中程度から重度の活性なＲＡを有する成人において、兆候及び症状を軽減し、構造的障害の進行を抑制することに対して認可されている。
抗ＣＤ２０抗体とＢＡＦＦアンタゴニストを投与することによる関節リウマチの治療は、ＲＡのための前述の薬剤の一又は複数を用いた治療と組み合わせて実施することができる。
関節リウマチの場合、例えば治療の進行状況の測定手段には、腫大して弱い関節の数や朝のこわばりの長さが含まれる。患者は、手と足の関節がどの程度腐食しているかについて、Ｘ線やシャープスコア(Sharp score)として知られているスコアシステムを用いて検査することができる。他のスコアシステムは、治療法に対する応答性を評価するためのアメリカリウマチ学会の判定基準に基づくものである。
【０１１５】
ＲＡの治療効果を評価する一方法は、American College of Rheumatology (ACR)基準に基づくものであり、これはとりわけ圧痛及び腫大した関節の改善の割合を測定するものである。ＲＡ患者は、無抗体治療（例えば、治療前のベースライン）又はプラセボ治療と比較して例えばＡＣＲ２０（２０パーセントの改善）でスコア付けをすることができる。抗体治療の効果を評価する他の方法は、Ｘ線画像、例えば骨の侵食及び関節腔の狭小化等の構造的傷害のスコア付けに用いられるSharpＸ線スコアを含む。また、患者は、治療期間中又は治療後の時間期間においてHealth Assessment Questionnaire [HAQ]スコア、AIMSスコア、SF-36に基づいて能力障害の予防又は改善について評価をすることができる。ＡＣＲ２０基準は、圧痛（痛み）関節数と腫大関節数の両方に２０％の改善があり、かつ５つの追加測定のうち少なくとも３つに２０％の改善があることを含みうる。
１．視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）による患者の痛み評価
２．疾患活動性の患者の全体評価（ＶＡＳ）
３．疾患活動性の医師の全体評価（ＶＡＳ）
４．Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、及び
５．急性反応物質、ＣＲＰ又はＥＳＲ
ＡＣＲ５０及び７０も同様に定義される。好ましくは少なくともＡＣＲ２０のスコア、好ましくは少なくともＡＣＲ３０、より好ましくは少なくともＡＣＲ５０、更により好ましくは少なくともＡＣＲ７０、最も好ましくは少なくともＡＣＲ７５より高いスコアに達する用量の本発明のＣＤ２０結合抗体を患者に投与する。
【０１１６】
乾癬性関節炎は独特で明瞭なＸ線撮影像的特徴を有する。乾癬性関節炎の場合、関節侵食及び関節腔狭小化も同様にシャープ(Sharp)スコアにより評価しうる。ここに開示したヒト化ＣＤ２０結合抗体は関節傷害の予防だけでなく疾患の兆候及び疾病の症状の減弱に用いることができる。
本発明の更に他の側面は、本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体の治療的有効量を、ＳＬＥ患者に投与することによるループス又はＳＬＥの治療方法である。ＳＬＥＤＡＩスコアは疾患の活動性を数量で表す。ＳＬＥＤＡＩは疾患活動性に相関することが知られている２４の臨床及び治験パラメータの荷重指数であり、０−１０３の数的範囲である。Bryan Gescuk及びJohn Davis, “Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus” Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521を参照のこと。二本鎖ＤＮＡに対する抗体は腎性発赤及び他のループスの症状を引き起こすと信じられている。抗体治療を受けている患者を、血清クレアチニン、尿タンパク、又は尿中の血液の有意で再現可能な増加として定義される腎性発赤までの時間についてモニターすることができる。あるいは又は加えて、抗核抗体及び二本鎖ＤＮＡに対する抗体のレベルについて患者をモニターできる。ＳＬＥの治療は高用量の副腎皮質ステロイド及び／又はシクロホスファミド(ＨＤＣＣ)を含む。
【０１１７】
脊椎関節症は一群の関節疾患であり、硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病を含む。治療成果は、確認された患者及び医師の全体的評価測定ツールによって決定しうる。
全身性エリテマトーデスの場合、患者を、抗核抗体及び二本鎖ＤＮＡに対する抗体のレベルについてモニターすることができる。
様々な医薬が乾癬治療に用いられる；治療は疾患重症度に直接的に関連して異なる。より軽度な感染患者は典型的には局所治療、例として局所ステロイド、アンスラリン(anthralin)、カルシポトリエン(calcipotriene)、クロベタゾール(clobetasol)、及びタザロテン(tazarotene)を利用して疾患を管理する一方、中度及び重症乾癬患者では全身的（メトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、ＰＵＶＡ及びＵＶＢ）治療を用いる場合が多い。タールもまた使用される。これらの治療は、安全性の考慮、時間消費計画、又は不便な治療過程を複合して有する。更に、幾つかは高価な設備及び設置のための場所を必要とする。全身性医薬は、高血圧、高脂血症、骨髄抑制、肝疾患、腎疾患、及び消化器系不調を含む深刻な副作用を引き起こしうる。また、光線療法の使用は皮膚癌の発症を増加させうる。局所療法の使用に伴う不便及び不快感に加え、光線療法及び全身性治療は患者を処置及び非処置の周期におき、その副作用のために生涯曝露をモニターする必要がある。
【０１１８】
乾癬の治療効果は、医師の包括的評価（ＰＧＡ）変化、及び乾癬領域及び重症度指数（ＰＡＳＩ）スコア、乾癬症状評価（ＰＳＡ）を含む臨床兆候及び疾患の症状の変化をモニターし、ベースライン症状と比較することによって評価する。特定の時点で経験した掻痒の程度を表すために用いられる視覚的アナログ尺度で処置を通して定期的に患者を測定することができる。
【０１１９】
用量
治療すべき症状及び当該分野で技量のある医師によく知られた用量に関連した因子に応じて、毒性及び副作用を最小にしながらその症状の治療に効果的な用量で本発明のＢＡＦＦアンタゴニストとＣＤ２０結合抗体が投与されるであろう。Ｂ細胞腫瘍、例えば非ホジキンリンパ腫に罹患している患者の治療の場合、特定の実施態様では、本発明の抗ＣＤ２０抗体は１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは２．５ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲でヒト患者に投与されるであろう。好ましい実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は、１０ｍｇ／ｋｇ又は３７５ｍｇ／ｍ２の用量で投与されるであろう。ＮＨＬの治療の場合、ある用量投与計画は、３７５ｍｇ／ｍ２の抗ＣＤ２０抗体を２−４用量で隔週に、あるいは治療の初めの１週間は抗体組成物を一用量を投与し、２週間の間隔の後、同量の第二用量抗体を投与する。一般に、ＮＨＬ患者は１年に１度このような治療を受けるが、リンパ腫が再発するとこのような治療が繰り返されうる。ＮＨＬの治療では、抗ＣＤ２０抗体＋ＢＡＦＦアンタゴニスト療法をＣＨＯＰなどの化学療法と組み合わせることができる。他の実施態様では、ＣＬＬやＳＬＬなどのＢ細胞腫瘍の治療の場合、ＢＲ３-Ｆｃ投与の前又は後に週当たり３７５ｍｇ／ｍ２のリツキサンを４週間患者に投与することができる。再発性のＣＬＬ、ＣＬＬには、例えばフルダラビン及びシトキサン(cytoxan)などの化学療法と組み合わせて、抗ＣＤ２０抗体とＢＡＦＦアンタゴニストにて治療することができる。
関節リウマチの治療の場合、一実施態様では、キメラ抗体であるリツキサンＴＭを一用量当たり５００ｍｇで隔週、全２用量を投与する。ヒト化抗ＣＤ２０抗体、例えばｈｕ２Ｈ７ｖ．１６又はここで開示したｈｕ２Ｈ７の任意の他の変異体を、一用量当たり５００ｍｇ未満で、例えば一用量当たり約２００−５００ｍｇ、約２５０ｍｇ−４５０ｍｇ、あるいは３００−４００ｍｇで隔週あるいは３週毎に２−４用量を投与することができる。
【０１２０】
ＢＲ３-Ｆｃは、０．５ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１．５ｍｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与することができる。一実施態様では、ＢＲ３-Ｆｃは、治療の第１日目から第１２日目まで隔日にて５ｍｇ／ｋｇ投与することができる。また、毎２−３日ごとに約２−５ｍｇ／ｋｇで全２−５用量を投与することも考えられる。
本発明の治療方法は、抗ＣＤ２０抗体とＢＡＦＦアンタゴニスト（ここでは両方とも薬剤という）の同時投与と連続投与の組合せを含む。連続的投与では、薬剤は何れの投与順番でもよい、すなわち初めにＢＡＦＦアンタゴニストでついで抗ＣＤ２０抗体を投与することができる。患者は一薬剤で治療し、一薬剤での治療前に効能についてモニターする。例えば、ＢＡＦＦアンタゴニストにより部分的な反応を生じた場合、完全な反応を達成するために続いて抗ＣＤ２０抗体で治療することができ、また逆の場合も同様である。イムノアドヘシンであるＢＲ３-Ｆｃは完全長の抗ＣＤ２０抗体と比較して半減期が短い。関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療では、抗ＣＤ２０抗体がリツキサンでＢＡＦＦアンタゴニストがＢＲ３-Ｆｃである場合、好ましい実施態様では、治療を必要とする患者にリツキサンでの治療前にＢＲ３-Ｆｃを受ける。あるいは、初めに患者に両方の薬剤を投与し、続く投薬は一方のみあるいは他の薬剤で行うことができる。
【０１２１】
患者を順応させて薬剤耐性にするため及び／又は治療用化合物の初回投与や持続投与から生じる注入関連症状などの副作用の発生を減らすために、それを必要とする哺乳動物に一方又は両薬剤の第一又は初回の順化用量を投与し、ついで少なくとも第二の治療的有効量の一方又は両薬剤を投与することができ、ここで第二及びそれに続く用量は初回用量より多い。初回用量は、より多い用量の第二治療用量に対して哺乳動物に耐性を与える。このようにして、哺乳動物は初回に投与されうる量よりも高い用量の治療用化合物に耐性ができる。「順化用量」とは、治療用化合物の投与に伴う初回投与副作用の頻度や重症度を減弱又は減少させる用量である。順化用量は、治療的用量、治療以下用量、対症用量又は対症以下用量でもよい。治療的用量は、患者に治療的効果を示す用量であり、治療以下用量は治療する患者に治療的効果を示さない用量である。対症用量は投与に少なくとも一の副作用を起こす用量であり、対症以下用量は副作用を起こさない用量である。幾つかの副作用は、発熱、頭痛、吐き気、嘔吐、呼吸困難、筋肉痛及び悪寒である。
【０１２２】
投与経路
ＢＡＦＦアンタゴニストと抗ＣＤ２０抗体は既知の方法で、例えば静脈内投与、例えばボーラス又は一定期間の連続注入、皮下的、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、動脈血管内、滑膜内、クモ膜下腔内、又は吸入経路でヒト患者に投与される。一般的に、抗ＣＤ２０抗体は、静脈内又は皮下投与される。薬剤は同じか又は異なる経路で投与することができる。
【０１２３】
製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、先に開示したＢ細胞ベースの悪性腫瘍又はＢ細胞制御性自己免疫疾患の治療に有用なＢＡＦＦアンタゴニストと抗ＣＤ２０抗体を含む製造品である。特定の実施態様では、製造品は、非ホジキンリンパ腫の治療のための配列番号２のＢＲ３-Ｆｃとｈｕ２Ｈ７ｖ．１６抗体を含む。
製造品は、少なくとも一の容器と容器上又は容器に付属するラベル又はパッケージ挿入物を含む。好適な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状の治療に有効な本発明の組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穿孔可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内溶液バッグであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は、リツキサンＴＭ又はｈｕ２Ｈ７ｖ．１６などの本発明のＣＤ２０結合抗体であり、他の活性剤はＢＲ３-ＦｃなどのＢＡＦＦアンタゴニストである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状、例えば非ホジキンリンパ腫又は関節リウマチの治療のために使用されることを示している。更に、ラベル又はパッケージ挿入物は組成物を患者へ投与するための説明書を更に含むであろう。加えて、製造品は薬剤的に受容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストラン溶液を含む第二の容器を更に含んでもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を含んでいてもよい。
【０１２４】
様々な目的、例えばＢ細胞死滅アッセイに有用であるキットがまた提供される。製造品と同様に、キットは容器と容器上又は容器に付随したラベル又はパッケージ挿入物を含む。容器は少なくとも一の抗ＣＤ２０抗体と本発明の一のＢＡＦＦアンタゴニストを含む組成物を収容する。例えば希釈剤及び緩衝液、コントロール抗体を含む付加的な容器を含めることができる。ラベル又はパッケージ挿入物は組成物の説明並びにインビトロ又は診断的使用を意図した指示書を提供しうる。
【０１２５】
実験的実施例
実施例１
ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体の開発
６匹のBalb／cマウス、３匹のLewisラット(Charles River Laboratories, Hollister, CA)及び３匹のArmenianハムスター(Cytogen Research and Development, Inc., Boston, MA)を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で過渡的にマウスＣＤ２０(ジェネンテック・インク, South San Francisco, CA)を発現するアデノウイルス感染ヒト２９３細胞で過剰免疫化した。大腸菌内で内在性レベルのマウスＣＤ２０と組換えｍＣＤ２０を発現するマウス細胞からなる前融合促進物質(pre-fusion boosts)(ジェネンテック社, South San Francisco, CA)を融合の３日前に投与した。全ての動物由来のＢ細胞を、既に記載されている方法(Kohler及びMilstein, 1975；Hongo等., 1995)と類似の変更プロトコールを用いてマウス骨髄腫細胞(X63.Ag8.653；アメリカ培養細胞系統保存機関、Manassas, VA)と融合した。１０−１４日後、マウスとハムスター融合体の上清を回収し、直接的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）にて抗マウスＣＤ２０と抗ヒトＣＤ２０抗体産生についてスクリーニングした。ｍＣＤ２０ ＥＬＩＳＡスクリーニングによりハムスター融合体から５９のポジティブハイブリドーマが（ｈＣＤ２０との２交差反応）、マウス融合体から１のポジティブハイブリドーマ（ｈＣＤ２０との２交差反応）が同定された。限定希釈によるサブクローニング後に高い免疫結合を示すポジティブクローンを、Ｍａｂのインビボ産生のためのPristane-初回抗原刺激マウス(Freund及びBlair, 1982)への注入か、インビトロでの培養の何れかを行った。腹水液及び／又は上清を回収し、既に記載されている(Hongo等, 1995)ようなアフィニティークロマトグラフィー(Pharmacia急速タンパク質液性クロマトグラフィー[FPLC]；Pharmacia, Uppsala, Sweden)あるいは既に記載されているプロトコールの変更法を用いて精製した。精製した抗体調製物を滅菌濾過（０．２μｍ孔径；Nalgene, Rochester NY）しＰＢＳ中にて４℃で保存した。
【０１２６】
免疫血清の評価のための直接ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート(NUNC)を１００μｌ／ウェルのマウス又はヒトＣＤ２０(１μｇ／ｍｌ；ジェネンテック社, South San Francisco, CA)、０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液,ｐＨ９．６にてコートした。コートしたプレートをＥＬＩＳＡ洗浄用緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて３度洗浄し、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ(PBS/BSA/T20)にて少なくとも１時間ブロックした。ついで、ブロック用緩衝液を除去して、１００μｌの希釈試料とコントロールを加え、室温にて１時間インキュベートした。ついで、そのプレートを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ抱合種特異的抗ＩｇＧ抱合体(Sigma, St. Louis, MO又はICN Cappel, Durham, NC)を添加し（１００μｌ／ウェル）、室温にて１時間インキュベートした。そのプレートを洗浄して、テトラメチルベンジジン基質(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)と共に５−１０分インキュベートした後、停止用溶液(１００μｌ／ウェル；BioFX Laboratories)を添加した。ついで、プレートを自動プレートリーダー(EL808, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT)にて読み込んだ。
【０１２７】
参考文献：
Hongo, J.S., Mora-Worms, M., Lucas, C.及びFendly, B.M.: Development and characterization of murine monoclonal antibodies to the latency-associated peptide of transforming growth factor β1. Hybridoma 1995; 14:253-260。
Kohler, G.及びMilstein, C.: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256: 495-497。
Freund YR 及びBlair PB: Depression of natural killer activity and mitogen responsiveness in mice treated with pristane. J Immunol 1982; 129:2826-2830。
【０１２８】
実施例２
２Ｈ７抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のヒト化
マウス抗ヒトＣＤ２０抗体の２Ｈ７（ここではマウスをｍとしてｍ２Ｈ７とも呼ぶ）のヒト化を一連の部位特異的突然変異誘発工程で実施した。２Ｈ７のＣＤＲ残基は、マウス２Ｈ７可変ドメインのアミノ酸配列（米国特許第５８４６８１８号に開示）を既知の抗体の配列と比較することにより同定された（Kabat等, Sequences of proteins of immunological interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。軽鎖と重鎖のＣＤＲ領域は配列高頻度可変性（上掲のKabat等）に基づいて定まり、図１２及び図１３にそれぞれ示す。合成オリゴヌクレオチド（表２）を用いて、部位特異的突然変異誘発（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492 (1985)）を使用して、プラスミドｐＶＸ４に含まれるコンセンサス配列ＶｋＩ,ＶＨＩＩＩ（ＶＬカッパサブグループＩ，ＶＨサブグループＩＩＩ）に対応する完全ヒトＦａｂフレームワーク中に６つ全てのマウス２Ｈ７ＣＤＲ領域を導入した。ファージミドｐＶＸ４を突然変異誘発並びに大腸菌中でのＦ(ａｂ)の発現に使用した。ｐＢ０４７５の誘導体（Cunningham等, Science 243: 1330-1336 (1989)）であるファージミドｐｂ０７２０に基づいて、ｐＶＸ４は、ヒト化コンセンサスκ-サブグループＩ軽鎖（ＶＬκＩ-ＣＬ）とヒト化コンセンサスＩＩＩ重鎖（ＶＨＩＩＩ-ＣＨ１）抗ＩＦＮ-α（インターフェロンα）抗体をコードするＤＮＡ断片を含む。ｐＶＸ４はまた共に別の過去に開示されたｐＵＣ１１９ベースのプラスミドｐＡＫ２（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992)）から誘導されたアルカリホスファターゼプロモーター及びシャイン-ダルガーノ配列を有している。独特のＳｐｅｌ制限部位をＦ(ａｂ)軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ間に導入した。抗ＩＦＮ-α重鎖及び軽鎖双方の最初の２３のアミノ酸はＳｔＩＩ分泌シグナル配列である（Chang等, Gene 55: 189-196 (1987)）。  
【０１２９】
２Ｈ７のＣＤＲスワップ型（２Ｈ７．ｖ２）を構築するために、部位特異的突然変異誘発をｐＶＸ４のデオキシウリジン含有鋳型で実施した；抗ＩＦＮ-αの６つ全てのＣＤＲがマウス２Ｈ７ＣＤＲに変化した。得られた分子をヒト化２Ｈ７型２（２Ｈ７.ｖ２）又は２Ｈ７の「ＣＤＲスワップ型」と呼ぶ；これは図１２及び１３に示されるコンセンサスヒトＦＲ残基を有するｍ２Ｈ７ＣＤＲ残基を有する。ヒト化２Ｈ７.ｖ２は更なるヒト化に用いた。
表２はＨ及びＬ鎖においてマウス２Ｈ７（ｍ２Ｈ７）ＣＤＲのそれぞれを作製するために用いたオリゴヌクレオチド配列を示す。例えば、ＣＤＲ-Ｈ１オリゴヌクレオチドを使用してｍ２Ｈ７のＨ鎖ＣＤＲ１を再作製した。ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及びＣＤＲ-Ｈ３はＨ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ意味する；同様に、ＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２及びＣＤＲ-Ｌ３はＬ鎖ＣＤＲのそれぞれを意味する。ＣＤＲ-Ｈ２における置換はＣＤＲ-Ｈ２ＡとＣＤＲ-Ｈ２Ｂの二つのオリゴヌクレオチドを用いる二工程で行った。
表２．ｐＶＸ４のヒトフレームワーク中へのマウス２Ｈ７ＣＤＲのＣＤＲスワップの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。各オリゴヌクレオチドによって変化する残基に下線を付している。
2008525449.tif 000004
【０１３０】
ヒトＶｋＩ,ＶＨＩＩＩコンセンサスフレームワーク（図１２及び１３）及び過去のヒト化抗体（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992)）とのマウス２Ｈ７フレームワーク残基の配列比較に基づいて、幾つかのフレームワーク変異を部位特異的突然変異誘発によって２Ｈ７.ｖ２Ｆａｂコンストラクト中に導入した。これらの変異により、ＣＤＲコンフォメーション又は抗原接触に影響を及ぼすかも知れない部位において、あるヒトコンセンサスフレームワーク残基がマウス２Ｈ７フレームワークに見出されたものに変化した。型３はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）を、型４はＶＨ（Ｒ７１Ｖ）を、型５はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ）を、型６はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ，Ｌ４７Ｗ）を含んでいた。
ｍ２Ｈ７抗体のヒト化及びキメラＦａｂ型を次のようにして大腸菌中で発現させ、精製した。二本鎖及び一本鎖ＤＮＡの調製のためにプラスミドを大腸菌株ＸＬ-１ブルー（Stratagene, San Diego, CA）中に形質転換した。各変異体に対して、軽鎖と重鎖の双方をジデオキシヌクレオチド法（Sequenase, U.S. Biochemical Corp.）を使用して完全に配列決定した。プラスミドを、ＭＭ２９４の誘導体である大腸菌株１６Ｃ９に形質転換し、５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレート上に蒔き、単一のコロニーをタンパク質発現のために選択した。その単一のコロニーを３７℃で５−８時間、５ｍｌのＬＢ-１００μｇ／ｍｌカルベニシリン中で成長させた。５ｍｌの培養物を５００ｍｌのＡＰ５-１００μｇ／ｍｌカルベニシリンに添加して、３７℃で４Ｌの邪魔板振盪フラスコ中で１６時間成長させた。ＡＰ５培地は１．５ｇのグルコース、１１．０のHycaseＳＦ、０．６ｇの酵母エキス（保証付き）、０．１９ｇの無水ＭｇＳＯ４、１．０７ｇのＮＨ４Ｃｌ、３．７３ｇのＫＣｌ、１．２ｇのＮａＣｌ、１２０ｍｌの１Ｍトリエタノールアミン、ｐＨ７．４からなり、１Ｌの水に加えた後、０．１μｍのSealkeenフィルターを通して滅菌濾過した。
【０１３１】
細胞を、３０００×ｇにて１Ｌの遠心分離瓶（Nalgene）で遠心分離によって収集し、上清を除去した。１時間の凍結後、ペレットを２５ｍｌの１０ｍＭ 冷ＭＥＳ-１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０（バッファーＡ）中に再懸濁させた。２５０μｌの０．１Ｍ ＰＭＳＦ（シグマ）を添加してタンパク質分解を阻止し、３．５ｍｌの原液１０ｍｇ／ｍｌのニワトリの卵の白色リゾチーム（シグマ）を添加して細菌細胞壁の溶解を補助した。氷上で１時間、穏やかに振盪した後、試料を４００００ｘｇで１５分、遠心分離した。上清をバッファーＡを用いて５０ｍｌにし、バッファーＡで平衡にした２ｍｌのＤＥＡＥカラムに充填した。ついで、バッファーＡで平衡にしたプロテインＧセファロースＣＬ-４Ｂ（ファルマシア）カラム（０．５ｍｌ床容積）に流通させた。カラムを１０ｍｌのバッファーＡで洗浄し、１．２５ｍｌの１Ｍトリス、ｐＨ８．０に入れた３ｍｌの０．３Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出させた。ついで、Ｆ(ａｂ)をセントリコン-３０（アミコン）を使用してＰＢＳ中にバッファー交換し、０．５ｍｌの最終容積まで濃縮した。全てのＦ(ａｂ)のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを実施して純度を確保し、各変異体の分子量をエレクトロスプレー質量分析法によって証明した。
【０１３２】
完全長ＩｇＧの発現のためのプラスミドは、キメラＦａｂのＶＬ及びＶＨドメイン並びにｈｕ２Ｈ７抗体のヒト化Ｆａｂを、哺乳動物細胞の発現のための過去に記載されたｐＲＫベクター（Gorman等, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)）中にサブクローニングすることによって構築した。簡単に述べると、各ＦａｂコンストラクトをＥｃｏＲＶ及びＢｌｐＩを用いて消化させてＶＬ断片を切除し、これを、完全な軽鎖（ＶＬ-ＣＬドメイン）の発現のためにプラスミドｐＤＲ１のＥｃｏＲＶ／ＢｌｐＩ部位にクローニングした。また、各ＦａｂコンストラクトをＰｖｕＩＩ及びＡｐａＩで消化させてＶＨ断片を切除し、これを、完全な重鎖（ＶＨ-ＣＨ１-ＣＨ２-ＣＨ３ドメイン）の発現のためにプラスミドｐＤＲ２のＰｖｕＩＩ／ＡｐａＩ部位中にクローニングした。各ＩｇＧ変異体に対して、軽鎖発現プラスミドと重鎖発現プラスミドをアデノウイルス形質転換ヒト胎児腎臓細胞株２９３（Graham等, J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977)）中に同時形質移入することによって、一過性トランスフェクションを実施した。簡単に述べると、２９３細胞をトランスフェクションの前の日に分裂させ、血清含有培地に蒔いた。次の日に、リン酸カルシウム沈殿物として調製した二本鎖ＤＮＡと、続いてｐＡｄＶＡｎｔａｇｅＴＭＤＮＡ（Promega, Madison, WI）を添加し、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。細胞を無血清培地で培養し４日後に収集した。抗体を、プロテインＡ-セファロースＣＬ-４Ｂを使用して培養上清から精製した後、バッファーを１０ｍＭコハク酸ナトリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に交換し、セントリコン-１０（アミコン）を使用して濃縮した。タンパク質濃度は定量アミノ酸分析法によって決定した。
【０１３３】
実施例３
この実施例は、ヒトＣＤ２０ ＢＡＣトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの産生及び、ｈＣＤ２０＋マウスでの抗ＣＤ２０抗体又はＢＡＦＦアンタゴニスト単独の効果を研究するための実験を示す。
ヒトのＣＤ２０トランスジェニックマウスは、ヒトＣＤ２０  ＢＡＣ  ＤＮＡ (Invitrogen, Carlsbad, CA)から産生した。マウスはヒトＣＤ２０発現のＦＡＣＳ分析に基づいてスクリーニングした。図１４のＦＡＣＳプロット線からわかるように、導入遺伝子に関して半接合（Ｔｇ＋／−）及びホモ接合（Ｔｇ＋／＋）マウスは、Ｂ２２０＋Ｂ細胞上でヒトＣＤ２０を発現する。図１５は、Ｂ細胞分化及び成熟の間の様々な細胞表面マーカー（ＣＤ４３、ＩｇＭ、ＩｇＤ）の発現を示す。Ｔｇ＋マウスでは、ｈＣＤ２０は、ｐｒｅ-Ｂ及び未成熟Ｂ細胞上、及び主に成熟したＢ細胞上で発現する。Ｔｇ＋マウスは、骨髄、脾臓、腸間膜ＬＮ及びパイエル板のＢ細胞でのヒトＣＤ２０発現についてスクリーニングした；結果は図１６−１９に示す。Ｂ２２０及びＣＤ４３上での細胞のゲーティングによって、多種のＢ細胞集団が描写される。ついで、図２０の模式図で概説されるように、Ｂ細胞に対する効果を見るために、Ｔｇ＋マウスを、抗ＣＤ２０ｍＡｂ（１ｍｇ総量＝５０ｍｇ／ｋｇ、７０ｋｇの男性では３．５ｍｇに相当）で処理した。ＦＡＣＳ分析は、末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄及びパイエル板について行った。抗ＣＤ２０ｍＡｂの血清レベルをモニターした。マウスでのＢ細胞枯渇は、抗ＣＤ２０抗体を用いた治療の３−４日以内に生じる。理論に基づくものではないが、Ｂ細胞死は、ＡＤＣＣ又はアポトーシスあるいはその両方が関与しているようである。抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ（ｍ２Ｈ７）単独でＴｇ＋マウスを処置すると、末梢血でのＢ細胞、成熟した周辺リンパ節Ｂ細胞、脾臓でのＴ２及び濾胞性Ｂ細胞の枯渇が生じる（図２１−２４を参照）。しかしながら、特定のＢ細胞サブセットは、細胞表面上での抗ＣＤ２０抗体が非常に多く、適度に飽和しているレベルであるにもかかわらず、抗ＣＤ２０抗体による殺傷に抵抗すると思われた。これらの抵抗性Ｂ細胞は、脾臓（図２３）の辺縁帯Ｂ細胞及び、パイエル板（図２５）及び脾臓（図２７）の胚中心Ｂ細胞である。ある実験（図２７）では、マウスに、第１日目に初回用量の１００ｕｇの抗ＣＤ２０ｍＡｂを注射し、その後、第３日目に２回目の１００ｕｇ用量を投与した（５０ｕｇの単回用量がＢ細胞の飽和に十分であったようである）；Ｔ２／濾胞性Ｂ細胞は枯渇したが、パイエル板由来の胚中心Ｂ細胞は抗ＣＤ２０ｍＡｂとの結合を示し、殺傷に対して抵抗性を示した。
【０１３４】
抗ＣＤ２０抗体治療に続いてＢ細胞の回復が起こった。第１日目にマウスに抗体を投与した。図２６は、抗体治療６日後には、末梢血でＢ細胞が検出されなかったことを示す。第６週に、抗体のクリアランスに応じて、ｈＣＤ２０＋細胞は検出され始め、第１４週までにＢ細胞は正常レベルに回復したと思われる。回復は、ＣＤ２０＋成熟Ｂ細胞に発達するＣＤ２０を発現しない前駆Ｂ細胞から起こる。
図２７は、短期間の（単回注射）抗ＣＤ２０ｍＡｂ治療に対して脾臓胚中心Ｂ細胞の抵抗性を表すＦＡＣＳプロット線を示す。脾臓の胚中心を誘導するために、マウスを免疫化しないものと、第１日目にヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を腹腔内注射することによって免疫化するものとに分けた。胚中心は第７日目に出現した。第８日目に、一方のマウスのグループを、ヒトＣＤ２０に対するｍ２Ｈ７ｍＡｂで処置した。マウスのコントロール群はｍＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール抗体で処置した。マウス由来の脾臓細胞は第１２日目に分析した。ＰＮＡ（ピーナッツ凝集素）は胚中心を染色する。免疫化マウスの脾臓が０．３％ＰＮＡの染色細胞を示すのに対して、ＳＲＢＣで免疫化しなかったマウスの脾臓では胚中心細胞は検出されなかった。Ｔ２／濾胞性Ｂ細胞が抗ＣＤ２０抗体処置によって枯渇する一方、脾臓の辺縁中心のＢ細胞は抗体に対して耐性を示す。
次に、Ｂ細胞枯渇の際に、マウスがＴ非依存性免疫応答を起こすことができるかどうかについて試験した。マウスは、第０日目にｍ２Ｈ７又はアイソタイプコントロール抗体ｍＩｇＧ２ａで処置した。第３−７日目にＢ細胞枯渇が生じた。第７日目に、多糖類への反応を誘発するために、マウスに、肺炎連鎖球菌ＩＶを静脈内注射した。Ｔ細胞非依存性応答は第１１日目に開始した。図２８に示す結果は、抗ＣＤ２０（２Ｈ７又はリツキサン）での治療が脾臓の辺縁帯及び胚中心由来のＢ細胞応答に影響を及ぼさない。すなわち、枯渇しないＭＺ及びＢ１Ｂ細胞がＴ非依存性抗原に対して保護されることを実証している。このデータは、抗ＣＤ２０ｍＡｂでの治療にもかかわらず、体液性免疫-特異的にＴ非依存性Ｂ細胞応答（この場合）が維持されることを実証している。
【０１３５】
実施例４
この実施例は、Ｂ細胞変調／枯渇のための抗ＣＤ２０ｍＡｂ及びＢＡＦＦアンタゴニスト治療の間での相乗効果を実証する。
ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＡＬＬ−１（ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー）は、未成熟のＴ２、ＦＯ及びＭＺ Ｂ細胞の生存及び成熟において重要な役割を果たし、自己応答性Ｂ細胞の生存を競合的に亢進する（S. Mandala等, Science 296, 346-9 (2002)；F. Mackay, P. Schneider, P. Rennert, J. Browning, Annu Rev Immunol 21, 231-64 (2003)；P. A. Moore等, Science 285, 260-3 (1999)）。マウスでＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＡＬＬ-１の可溶型の過剰発現が起こると、Ｂ細胞過形成、高ガンマグロブリン血症及び自己免疫ループス様症候群となる（S. A. Marsters等, Curr Biol 10, 785-8 (2000)）。逆にいえば、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳを中和するＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃ融合タンパク質でループス易発性マウスを処置すると、自己免疫血清学、腎臓病理学及び死亡率が改善する（R. Lesley等, Immunity 20, 441-53 (2004)）。
【０１３６】
材料及び方法：
実験実施例において、用いられるＢＲ３−Ｆｃ又はＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃは、配列番号２のｈＢＲ３−Ｆｃである。図２９に示す実験のために、ヒトＣＤ２０をコードする細菌人工染色体を発現するＦＶＢマウス（ｈＣＤ２０＋マウスと呼称）を、抗ＣＤ２０ｍＡｂ（第９日目に１００μｇを単回注射）、ＢＲ３−Ｆｃ（第１日目から１２日目まで隔日１００μｇ）、又は抗ＣＤ２０ｍＡｂ及びＢＲ３−Ｆｃの組合せを腹腔内注射により処置した。各グループは４匹のマウスとした。最後の注射後２日目に、マウスを屠殺し、ｈＣＤ２０＋Ｂ細胞について分析した。脾臓、血液、リンパ節及びパイエル板のＦＡＣＳ分析により、Ｂ細胞マーカー（ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋）について分析した。
図３０に示す実験のために、ｈＣＤ２０ Ｔｇ＋マウスを、コントロールＩｇＧ２ａ、ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃ（マウス当たり１００μｇ、１２日間毎日ＩＰ）、抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ（マウス当たり１００μｇ、第９日目にＩＰ）又はＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃ及び抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ（単一処置群として同じ投薬）の組合せで処置した。Ｂ２２０＋脾細胞は、第１３日目に単離して、ＣＤ２１及びＣＤ２３について染色した。一群当たりＮ＝５マウス。図３０は、ヒトＣＤ２０  Ｔｇ＋マウスにおける抗ｈＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３−Ｆｃの組合せのＢ細胞枯渇に対する相乗効果を示す。図３１は、ｈＣＤ２０  Ｔｇ＋マウス由来のＢ２２０＋総脾臓Ｂ細胞、辺縁帯（ＭＺ）及び濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞の枯渇の定量化を示す。マウスを、０．１ｍｇのコントロールＩｇＧ２ａ、ＢＡＦＦ／ＢＲ３−Ｆｃ又は抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの単回用量で処置した。脾細胞を第４日目に分析した。Ｎ＝５マウス／群。
【０１３７】
結果：
これらの結果を、図２９、図３０及び図３１に示す。
１．抗ＣＤ２０ｍＡｂ治療により、血液及びリンパ節の成熟循環Ｂ細胞の＞９９％が枯渇する。
２．ＢＲ３−Ｆｃは、血液及びリンパ節の成熟循環Ｂ細胞を減少させる。
３．抗ＣＤ２０ｍＡｂ治療により、脾臓の辺縁帯Ｂ細胞でなく、Ｔ２及び濾胞性Ｂ細胞が枯渇する。
４．ＢＲ３−Ｆｃは、脾臓のＴ２／濾胞性及び辺縁帯Ｂ細胞を減少させる。
５．抗ＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３−Ｆｃの併用は相乗的に作用して、脾臓の全てのＢ細胞集団を枯渇する。
〜２週間の間ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−ＦｃでｈＣＤ２０＋マウスを処置すると、ＭＺ及びＴ２／ＦＯ Ｂ細胞が著しく減少した（図３０、パネル３）。ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃと抗ｈＣＤ２０ｍＡｂを併用して処置すると、驚くべきことに、全ての脾臓Ｂ細胞サブセットが枯渇した（図３０、パネル４）。更にＢＡＦＦ中和と抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの潜在的相乗効果を調べるために、抗ｈＣＤ２０ｍＡｂとＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃの単回投与での処置後４日のＢ細胞損失の程度を定量化した。抗ｈＣＤ２０ｍＡｂとＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃの単回投与で処置すると、ＭＺ Ｂ細胞の〜４０−５０％の消失、及びＦＯ Ｂ細胞の〜３３−７０％の消失となり、抗ｈＣＤ２０ｍＡｂとＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃの組合せによって、ＭＺ及びＦＯ Ｂ細胞の＞９０％が消失した（図３１）。したがって、生存因子もまた抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ媒介Ｂ細胞枯渇への感受性の決定において重要な役割を果たす。
【０１３８】
実施例５
ＢＡＦＦアンタゴニストの産生
ＢＡＦＦ８２−２８５産生
ヒトＢＡＦＦ（残基８２−２８５）をコードするＤＮＡ断片をｐＥＴ１５ｂ(Novagen)発現ベクター中にクローニングし、Ｎ末端基Ｈｉｓ−タグの後ろにトロンビン切断部位を有する融合体を作製した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）培養物を、５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含むＬＢ培地にて３７℃で対数中間期(mid-log phase)まで生育させ、ついで１．０ｍＭ ＩＰＴＧでの誘導前に、１６℃に冷却した。更に１２時間生育した後細胞を遠心分離によって収集し、−８０℃で保存した。細胞ペレットを５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０及び５００ｍＭのＮａＣｌ中に再懸濁して、氷上で超音波破壊した。遠心分離後、上清を、Ｎｉ-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen）に流した。カラムを、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのイミダゾールにて洗浄し、ついで、２５０ｍＭイミダゾールを含む同じ緩衝液にてステップ勾配で溶出させた。ＢＡＦＦを含む分画を貯留し、トロンビンを添加して、試料を２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０及び５ｍＭのＣａＣｌ２にて４℃で終夜透析した。更に、タンパク質を、ｍｏｎｏＱ(Pharmacia)カラムにて、最後に２０ｍＭトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２のＳ-２００サイズ排除カラムにて精製した。得られたＢＡＦＦタンパク質を以下に記載のようにして用いた。
ＢＲ３細胞外ドメイン産生
ヒトＢＲ３（残基１〜６１）の細胞外ドメインをｐＥＴ３２ａ発現ベクター(Novagen)中にサブクローニングして、Ｎ末端基チオレドキシン（ＴＲＸ）-Ｈｉｓ-タグの後にエンテロキナーゼプロテアーゼ部位を有する融合体を作製した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Novagen）を３０℃で生育し、ＩＰＴＧによってタンパク質発現を誘発した。ＴＲＸ−ＢＲ３は、Ｎｉ-ＮＴＡカラム（Qiagen）を通じて精製し、イミダゾール勾配にて溶出し、エンテロキナーゼ（Novagen）によって切断した。ついで、ＢＲ３をＳ-セファロースカラムで精製し、３ｍＭの酸化グルタチオンと１ｍＭの還元グルタチオンの存在下でＰＢＳ、ｐＨ７．８中にて終夜リフォールドさせ、ＰＢＳに対して透析し、ＭｏｎｏＳカラムにて再精製し、濃縮してＰＢＳ中に透析した。
【０１３９】
ペプチド合成
標準のＦｍｏｃケミストリーを用いてパイオニアペプチド合成機(PE Biosystems)にて、ミニＢＲ３をＣ末端アミドとして合成した。システイン１９及び３２の側鎖チオールをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）安定アセトアミドメチル（Ａｃｍ）誘導体として保護した。ペプチドを、５％トリイソプロピルシランを含むＴＦＡで１．５−４時間室温にて処理することによって、樹脂から切断した。回転蒸発によってＴＦＡを除去した後、ペプチドをエチルエーテルの添加によって沈殿させ、ついで逆相ＨＰＬＣ（アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ）にて精製した。エレクトロスプレー質量分析によってペプチド同一性を確認した。凍結乾燥後、酸化型ペプチドをＨＰＬＣにて精製した。還元型ミニＢＲ３を含むＨＰＬＣ分画を、ＮＨ４ＯＨにて〜９のｐＨに調整した；ついで、Ｋ３Ｆｅ(ＣＮ)６を少し過剰に添加することによってシステイン２４と３５間をジスルフィド結合し、酸化型ペプチドをＨＰＬＣによって精製した。少し過剰なＩ２を用いて〜４時間にわたってＨＰＬＣ溶出処理をすることによってＡｃｍ基を除去した（第２のジスルフィドが付随的に形成される）。分析的ＨＰＬＣによって酸化の進行をモニターし、最終産物をＨＰＬＣによって再び精製した。１０倍モル過剰のスルホ-ＮＨＳ-ビオチン(Pierce Chemical, Co.)を用いた反応によって樹脂上でミニＢＲ３のアミノ末端をビオチン化した。ついで、ビオチン化したミニＢＲ３を樹脂から切断して、ビオチン化されなかったミニＢＲ３のために上記の通りに精製した。
【０１４０】
以下のペプチドECFDLLVRHWVACGLLR (ＢＬｙＳ００２７)（配列番号９）、ECFDLLVRHWVPCGLLR (ＢＬｙＳ００４８)（配列番号６）及びECFDLLVRAWVPCSVLK (ＢＬｙＳ００５１)（配列番号５）を、一般的には以下のようにして合成した。Ｒｉｎｋアミド樹脂を用いたRainin Symphonyペプチド合成機システムと、５倍過剰量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）含有の２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾン-１-イル)-１,１,３,３-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）で活性化した３倍過剰量の９-フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護アミノ酸でペプチドを合成した。アミノ酸を各位置で２回結合させ、ピペリジンを２０％含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液によって脱保護し、次の残基へ移動した。各結合工程の間にジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）にて洗浄した。ペプチド上に最終アミノ酸を結合させて２０％ピペリジンを含むＤＭＦにて脱保護した後、３当量の無水酢酸と５当量のＤＩＰＥＡを含むＤＭＡを用いてペプチドのアミノ末端をアシル化した。あるいは、アミノ末端を、５-カルボキシフルオレセインにて、(＋)-ビオチンにて、あるいは、他のフルオロフォア又はリポーター分子にてアシル化することによって修飾した。ついで、２．５％水と２．５％トリイソプロピルシランを含む９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液にて９０分間処理することによって樹脂から切断した。減圧下で揮発性物質を除去し、ジエチルエーテルを加え、固形物を濾過した。得られた沈殿物をジエチルエーテルにて再度洗浄し、結合した有機物質を除いた。ついで、洗浄した固形物を酢酸、酢酸及びアセトニトリル１：１混合液、酢酸、アセトニトリル及び水１：１：１混合液、酢酸、アセトニトリル及び水１：１：８混合液で連続的に洗浄して、最後に水で洗浄した。結合した洗浄物を凍結乾燥し、毎分１５ｍｌの流量で、各々の溶媒液中に０．１％のトリフルオロ酢酸を含有する水で１０％から７０％の勾配を付けたアセトニトリルにて３０分間のＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィーを行うことによって、得られた粗ペプチドを精製した。所望のペプチドを含む分画に、溶液が着色されるまで酢酸のヨウ素飽和溶液を添加して酸化した。ついでこの溶液を凍結乾燥した。最後に、凍結乾燥された粗酸化型ペプチドを同一条件で２回目の精製をし、所望のペプチドを含む分画を凍結乾燥した。４倍過剰量のアミノ酸を用い残基当たり一度だけ結合させてPerSeptive自動合成機で合成を実施したことを除き同じ条件でペプチドの幾つかを合成した。
【０１４１】
実施例６
１７ｍｅｒのファージディスプレイ
ライブラリーの構築。  ＳＴＩＩ分泌シグナル配列（「STII ss」）、リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ、配列番号６１）、及びＭ１３ファージの微量タンパク質ＩＩＩのＣ末端残基をコードする配列（例えば残基２６７−４２１）（以下、「ｃＰ３」）をコードするファージミドをライブラリー構築の鋳型として用いた。Kunkel突然変異誘発法と、「１７ｍｅｒＣ３２Ｗ」としても知られているＣ３２Ｗ変異を持つヒトＢＲ３の残基２３−３９に対応する断片を導入し、１７ｍｅｒＣ３２Ｗ領域内に更に変異をコードしたオリゴヌクレオチドを用いて、二組のライブラリーを構築した。すなわち、ライブラリー１は ３１、３４及び３６−３９（置換コドン：ＮＮＳ＝任意のコドン）の番号の残基をコードし、ライブラリー２は 置換コドン残基２７、３０、３１、３４及び３６−３９（置換コドン：ＶＮＣ＝アミノ酸Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ及びＧをコード）をコードしていた。置換コドンにおいて：Ｎは２５％Ａ、２５％Ｃ、２５％Ｇ、２５％Ｔ；Ｓは５０％Ｇ／５０％Ｃ；Ｖは３３％Ｇ／３３％Ａ／３３％Ｃ；及びＣは１００％Ｃである。ライブラリー１は１．１×１０９メンバーをコードし、ライブラリー２は４．３×１０８メンバーをコードしていた。
【０１４２】
ライブラリー選別。  そのファージを４ラウンドの選別にかけた。一般に、１ラウンド当たりのファージインプットは第一回ラウンド（固相選別）に対して１０１４ファージ、更なるラウンド（液相選別）に対して３×１０１２ファージであった。
ファージ選別。  第一選別ラウンドは固相選別法であった。マキシソープ(Maxisorp)イムノプレート（９６ウェル）を４℃にて一晩かけて上述のようにして調製したＢＬｙＳ８２−２８５（５０ｍＭの炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍｌで１００μｌ）でコートした。ついで、ウェルを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを用いて１時間ブロックし、３−５回、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄した。ファージ粒子（（ＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）中１００μｌ／ウェル）をウェルに添加した。２時間後、ウェルをＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で数回洗浄した。ウェルに結合したファージを室温（ＲＴ）で１０分間０．１ＮのＨＣｌを用いて溶出させた。溶出させたファージを、１／２０容量の２Ｍトリス（ｐＨ１１．０）を加えることによって中和した。
ファージをタイターするために、対数期ＸＬ-１（ＯＤ６００ｎｍ〜０．３）を３７℃で３０分、溶出したファージに感染させた。ついで、感染した細胞を１０倍の増分で２ＹＴによって段階希釈した。感染した細胞の１０μｌのアリコートをカルベニシリンプレート毎に播種した。各ライブラリーから〜１０８のファージを第一ラウンドの選別から取得した。
ファージを増殖させるために、溶出したファージを用いて３７℃で３０分間、対数期ＸＬ-１（ＯＤ６００ｎｍ〜０．３）を感染させた。ヘルパーファージＫＯ７とカルベニシリンを１×１０１０ｐｆｕ／ｍｌＫＯ７及び５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリンの最終濃度で３７℃にて更に３０分間、感染体に加えた。その培養物をカルベニシリン５０ｕｇ／ｍｌ及び２５ｕｇ／ｍｌカナマイシンを有する２ＹＴ培地中で最終容積２５ｍｌまで３７℃で一晩成長させた。
そのファージを１００００ｒｐｍで１０分間細胞をスピンすることによって精製した。上清を集めた。２０％のＰＥＧ／２．５ＭのＮａＣｌを上清容積の１／５まで加えて、混合し、室温で５分静置させた。そのファージを１００００ｒｐｍで１０分間スピンさせてペレットにした。上清を捨て、ファージペレットを５０００ｒｐｍで５分間再びスピンさせた。そのペレットを０．７ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、１３０００ｒｐｍで１０分間スピンさせて、細胞片を破棄した。再懸濁されたファージペレットのＯＤを２６８ｎｍで読み取った。
【０１４３】
第２−第４選択ラウンドは溶液選別法を利用した。第２ラウンドでは、マキシソープのＮｕｎｃ９６-ウェルプレートを、４℃で一晩かけて５ｕｇ／ｍｌのニュートラアビジン（Pierce）で被覆した。次に、プレートをＰＢＳ中２００μｌ／ｍｌのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Pierce）を用いて室温で３０分間、ブロックした。Ｔｗｅｅｎ２０を０．２％（ｖ／ｗ）の最終濃度まで各ウェルに添加し、室温で更に３０分間ブロックした。第１選択ラウンドからの増幅した精製ファージを、室温で１時間、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ０．５％及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１５０ｕｌバッファー中の５０ｎＭのビオチン化ＢＡＦＦ（最終濃度）と共にインキュベートした。ついで、混合物をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで５−１０Ｘに希釈し、ニュートラアビジン被覆プレートに１００μｌ／ウェルで塗布した。そのプレートを室温で５分間穏やかに振とうして、ビオチン化ＢＡＦＦに結合したファージをウェル中に捕捉させた。ついで、ウェルをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で数回洗浄した。結合したファージを０．１ＮのＨＣｌで１０分間溶出させ、中和し、滴定し、増殖させ、上述のようにして精製した。各ライブラリーから〜３×１０６ファージが第２選択ラウンドから得られた。
第３選択ラウンドは、２ｎＭの濃度のビオチン化ＢＡＦＦを希釈と各ウェルへの添加の前にファージと共にインキュベートした点を除いて、第２ラウンドと同様である。結合ファージを１０分間、０．１ＮのＨＣｌで溶出させ、中和し、滴定し、上述のようにして増殖させた。各ライブラリーから〜１０４ファージを第３選択ラウンドから得た。
第３選択ラウンドからのファージを、ついで第４ラウンドの二種の異なる選択方法にかけた。方法４ａは、０．５ｎＭのビオチン化ＢＡＦＦの存在下で室温で１時間インキュベートした点を除いて第２及び第３選択ラウンドと同様であった。ついで、混合物を、希釈及び被覆ウェルへの添加の前に１０００倍過剰（５００ｎＭ）の未ビオチン化ＢＡＦＦの存在下で室温で更に１５分間インキュベートした。方法４ｂは、０．２ｎＭのＢＡＦＦを希釈と各ウェルへの添加の前にファージと共にインキュベートした点を除いて第２及び第３選択ラウンドと同様である。第４ラウンドの選択からの結合ファージを１０分間、０．１ＮのＨＣｌで溶出させ、中和し、滴定し、上述のようにして増殖させた。〜１０３ファージが第４ラウンド（４ａ及び４ｂ）の選択のそれぞれから各ライブラリーに対して得られた。
【０１４４】
クローン分析。  第４ラウンドの選別後、個々のクローンを、カルベニシリン及びＫＯ７ヘルパーファージを補填した４００μＬの２ＹＴ培地中、９６ウェル形式で成長させた。これらの培養物の上清をファージＥＬＩＳＡにおいて使用した。ファージＥＬＩＳＡに対して、Ｎｕｎｃマキシソープ９６-ウェルプレートを炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６中のＢＡＦＦの２μｇ／ｍｌ溶液１００μｌで一晩かけて４℃で被覆した。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡで２時間の間ブロックした。ファージ上清を５０ｎＭのＢＡＦＦの不存在又は存在下でＥＬＩＳＡ結合バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）で１：４に希釈し、室温で１時間インキュベートした。１００ｕｌの希釈したファージ上清をついで被覆プレートに移し、ファージを捕捉するために２０分間穏やかに振とうした。ついで、プレートをＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ２０を用いて数回洗浄した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（１：５０００）中ＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体のウェル当たり１００μｌをプレートに移し、２０分インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎの後ＰＢＳによって洗浄した後、プレートを、０．８ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ(Sigma)と０．０１％のＨ２Ｏ２を含む１００μｌのＰＢＳ基質溶液と共に５分インキュベートした。反応を１００μｌ／ウェルの１ＭのＨ３ＰＯ４で停止させ、プレートを４９０ｎｍで読み取った。ついで、試験したクローンの配列を先に記載されているようにして(Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A.及びSidhu, S. S. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 8950-8954)決定した。許容できる品質の配列を翻訳し整列させた。１７ｍｅｒの配列を図３２に示す。
１４のクローンを更にＢＡＦＦ結合アッセイにおいて分析してＩＣ５０値を決定した。クローン２及び７は第４ラウンドで多い数の同胞（同一配列のクローン）を有していた。ファージＥＬＩＳＡアッセイによれば、クローン１３、１９、２２、２６、３２、３９及び４４は５０ｎＭのＢＡＦＦによってプレートへの結合が大きく阻害された（図１１）。クローン３５、４５、６８、８２及び９０の結合もまたファージＥＬＩＳＡアッセイにおいて大きく阻害された（図１１）。これらの１４クローンのファージ上清を、上述のようにして増殖させ精製した対数期ＸＬ-１を感染させるために用いた。
ディスプレイ及びファージ収量を正規化し、ＩＣ５０測定のためのファージの適切な希釈度を決定するために、各クローンからの精製ファージの段階希釈物を室温で１時間ＥＬＩＳＡ結合バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）中でインキュベートした。１００μｌの各希釈物をＢＡＦＦ被覆プレートに移し、上述のようにして２０分間ファージを捕捉するために穏やかに振とうした。結合したファージをＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体とついでＯＰＤ／Ｈ２Ｏ２基質反応によって検出し、急冷し、上述のように４９０ｎｍで読み取った。このプロセスによって、４９０ｎｍで〜１Ｏ.Ｄ.を示した各クローンの希釈を決定し、ＩＣ５０アッセイにおいて使用した。
１４クローンのそれぞれのＩＣ５０値を決定するために、Ｎｕｎｃマキシソープ９６-ウェルプレートを炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６に入れたＢＡＦＦの２μｇ／ｍｌの溶液を１００μｌ用いて４℃で一晩被覆し、上述のようにして洗浄しブロックした。１４クローンのそれぞれに対して増幅し精製したファージの希釈物を１３０ｕｌのＥＬＩＳＡ結合バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中０．００３−１０００ｎＭの範囲のＢＡＦＦの濃度列の存在下で室温にて１時間インキュベートした。これらの濃度列のそれぞれ１００μｌをＢＡＦＦ被覆プレートに移し、捕捉し、洗浄し、ＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体で検出し、上述のようにしてプロセシングした。ＩＣ５０値は１４クローンのそれぞれに対してＥＬＩＳＡシグナルの４変数フィットによって決定した。ＩＣ５０値は０．４（クローン４４）から１１ｎＭ（クローン２２）の範囲であった。  
【０１４５】
競合置換ＥＬＩＳＡ。  次の１７ｍｅｒ、Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ-ＮＨ２（配列番号９）（「ＢＬｙＳ００２７」）、Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ-ＮＨ２（配列番号６）（「ＢＬｙＳ００４８」）、Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ-ＮＨ２（配列番号５）（「ＢＬｙＳ００５１」）を上述のようにして合成した。Ｎｕｎｃマキシソープ９６-ウェルプレートを、炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）中ＢＡＦＦの２μｇ／ｍｌ溶液を１００μｌ用いて４℃で一晩かけて被覆した。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％の脱脂乳でブロックした。ＢＲ３ ＥＣＤ（残基１−６１）と上記の１７ｍｅｒペプチドの段階希釈物を、３ｎｇ／ｍｌのビオチン化ミニＢＲ３を含むＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で調製した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎでの洗浄後、１００μｌ／ウェルの各希釈物を移し、室温で１時間インキュベートした。そのプレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、１００μｌ／ウェルの０．１Ｕ／ｍｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中ストレプトアビジン-ＰＯＤ(Boehringer Mannheim)と共に１５分インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ＴｗｅｅｎとついでＰＢＳでの洗浄後、プレートを、０．８ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ(Sigma)と０．０１％のＨ２Ｏ２を含む１００μｌのＰＢＳ基質溶液と共に５分インキュベートした。反応を１００μｌ／ウェルの１Ｍ、Ｈ３ＰＯ４で停止させ、４９０ｎｍでプレートを読み取った。ＩＣ５０値は競合置換ＥＬＩＳＡシグナルの４変数フィットによって決定した。ミニＢＲ３及びＢＲ３細胞外ドメインの初期原液の濃度は定量アミノ酸分析によって決定した。
ＢＲ３ ＥＣＤ、ＢＬｙＳ００２７、ＢＬｙＳ００４８及びＢＬｙＳ００５１のＩＣ５０を示す。１７ｍｅｒペプチドは全て６２ｍｅｒＢＲ３ ＥＣＤよりもＢＡＦＦに対してより大なる親和性を有していた。
【０１４６】
実施例４
ペプチド-ＰＥＧ抱合体
ＢＬｙＳ８２−２８５産生とペプチド合成。上の実施例５に記載の通り。
ペプチドへのポリマーの抱合。  第一級アミン（リジンとＮ末端）と反応させるためにＮ-ヒドロキシスクシンイミドケミストリー（ＮＨＳ）で修飾した線状ＰＥＧを用いてペグ化１７ｍｅｒペプチドを生成した。全てのＰＥＧ-ＮＨＳ（ＰＥＧ-ＳＰＡ）試薬はNektar Therapeutics, San Carlos, CAから購入し、−７０℃の窒素下で保存した。ペプチドを１ｍｇ／ｍＬでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。ペプチド溶液の０．４ｍＬアリコートに固形２ＫＰＥＧ−ＳＰＡ、５ＫＰＥＧ−ＳＰＡ又は２０ＫＰＥＧ−ＳＰＡを添加した。ＰＥＧ-ＳＰＡとペプチドを３：１のモル比となるように十分な固形物を加えた。これらの溶液を室温で１時間インキュベートし、ついで反応の進行を、５０μＬ分の溶液を用いた逆相分析用ＨＰＬＣによって分析した。全てのペプチドが修飾されるまでＰＥＧの添加とインキュベートを２度繰り返した。ペグ化ペプチドを、更なる精製をしないでＢＡＦＦ結合について試験した。精製した抱合ペプチド中のＰＥＧ：ペプチドの比はおよそ１：１である。
【０１４７】
競合的置換ＥＬＩＳＡ。  １７ｍｅｒのＡｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ-ＮＨ２（配列番号６）（「ｂｌｙｓ００４８」）を前述のようにして合成した。ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＫ（ｂｌｙｓ００９５）（配列番号６２）を前述のように合成し、２Ｋ、５Ｋ及び２０ＫのＰＥＧ−ＮＨＳの各々に結合させた。Nunc Maxisorp９６ウェルプレートを、２μｇ／ｍｌのＢＬｙＳ溶液１００μｌを含む炭酸塩緩衝液,ｐＨ９．６にて終夜４℃でコートした。プレートをＰＢＳで洗浄して、１％脱脂乳含有のＰＢＳにてブロックした。３ｎｇ／ｍｌのビオチン化ミニＢＲ３含有のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて、ミニＢＲ３（配列番号５０）と上記の１７ｍｅｒペプチドとＰＥＧ-ペプチド抱合体の連続的希釈液を調製した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎにて洗浄した後、各希釈液１００μｌ／ウェルを移し、室温にて１時間インキュベートした。そのプレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎにて洗浄し、１ウェル当たり１００μｌの０．１Ｕ／ｍｌストレプトアビジン-ＰＯＤ(Boehringer Mannheim)含有ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎと共に１５分インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ついでＰＢＳにて洗浄した後、プレートを０．８ｍｇ／ｍｌ  ＯＰＤ(Sigma)と０．０１％Ｈ２Ｏ２含有の１００μｌＰＢＳ基質溶液と共に５分間インキュベートした。反応を１００μｌ／ウェルの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４にて停止させ、プレートを４９０ｎｍで読み込みを行った。競合的置換ＥＬＩＳＡシグナルを４つのパラメータに当てはめてＩＣ５０値を決定した。式は以下の通りである：ｙ＝ｍ１＋（ｍ２−ｍ１）／（１＋ｍ０／ｍ４）＾ｍ３、ここでｍ１は無限の競合体濃度での吸光度、ｍ２は添加競合体がないときの吸光度、ｍ３は中間値付近のカーブの傾き、ｍ４はＩＣ５０値、ｍ０は競合体、この場合はペプチドの濃度である。ビオチン化したミニＢＲ３の濃度は約１０ｐＭであった。ミニＢＲ３の初期保存用溶液の濃度は定量アミノ酸分析法にて決定した。
【０１４８】
結果
競合的置換ＥＬＩＳＡシグナルを４パラメータへ当てはめることにより、ｂｌｙｓ００９５に対して１９ｎＭ、ｂｌｙｓ００４８に対して１４ｎＭ、及びｂｌｙｓ００９５−２ｋＰＥＧ抱合体に対して４３ｎＭ、及びｂｌｙｓ００９５−５ｋＰＥＧ抱合体に対して５１ｎＭのＩＣ５０値が得られた。同様に、別の実験について競合的置換ＥＬＩＳＡシグナルを４パラメータへ当てはめることにより、ｂｌｙｓ００９５−２０ｋＰＥＧ抱合体に対して９９ｎＭ及びｂｌｙｓ００４８に対して１５ｎＭのＩＣ５０値が得られた。
１７ｍｅｒペプチド-ＰＥＧ抱合体（２ｋ、５ｋ及び２０ｋ）のＢＡＦＦへの結合能を実証した。ＰＥＧのｂｌｙｓ００９５への抱合は、抱合していない同じペプチドと比較してその結合能を有意には減少させなかった。
結論
ここでの実験により、抗ＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３−Ｆｃを組み合わせることによってＢ細胞の全てのサブセットの枯渇に大きな相乗的効果を示すという驚くべき結果が証明された。
参考文献
特許、公開公報及び他の出版物を含む本明細書内に挙げる参考文献は、出典明示によりここに援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１Ａ】天然配列ヒトＴＡＣＩをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１２）及びそのアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。
【図１Ｂ】天然配列ヒトＴＡＣＩをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１２）及びそのアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。
【図２】天然配列ヒトＢＣＭＡをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号２６）及びそのアミノ酸配列（配列番号２７）を示す。
【図３】天然配列ヒトＢＡＦＦをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号２８）及びそのアミノ酸配列（配列番号２９）を示す。
【図４Ａ】天然配列ヒトＡＰＲＩＬをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号３０）及びその予測されるアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。
【図４Ｂ】天然配列ヒトＡＰＲＩＬをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号３０）及びその予測されるアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。
【図５】図５Ａは天然配列ヒトＴＡＣＩをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号５２）（開始コドンと停止コドンに下線を付す）を示し、図５Ｂはそのアミノ酸配列（配列番号５３）を示す。
【図６】図６Ａは天然配列ヒトＢＲ３をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号３２）（開始コドンと停止コドンに下線を付す）を示し、図６Ｂは図６Ａのアミノ酸配列（配列番号３３）を示し、図６ＣはマウスＢＲ３をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号３４）（開始コドンと停止コドンに下線を付す）を示し、図９はそのアミノ酸配列（配列番号３５）を示す。
【図７】図７Ａ−７Ｂは、「比較タンパク質」と命名したアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と命名したアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の例示的算出方法を示す。ここでの目的のために、「ＰＲＯ」は、この図で言うところのＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ又はＢＲ３配列でありうる。
【図８】スプライス変異型と思われる「ｈＴＡＣＩ（２６５）」（配列番号３６）と称され、及び図１Ａ−１Ｂ（配列番号２５）にまた示す「ｈＴＡＣＩ」であるＴＡＣＩレセプターの２つのアミノ酸配列の比較を示す。
【図９】ヒト（配列番号３３）とマウスＢＲ３（配列番号３５）の配列アラインメントを示し、同一アミノ酸を文字で、保存アミノ酸を＋記号でその下に示す。
【図１０】予測される膜貫通領域（囲み）と細胞外領域（下線）を示すヒトＣＤ２０アミノ酸配列（配列番号６３）を示す。潜在的ドメインは、１−６３：細胞質；６４−８４：膜貫通；８５−１０５：膜貫通；１０６−１２０：細胞質；１２１−１４１：膜貫通；１４２−１８８：細胞外；１８９−２０９：膜貫通；２１０−２９７：細胞質；８１−１６７：ジスルフィド結合である。
【図１１】ヒトＣＤ２０のヌクレオチド配列（配列番号６４）を示す。
【図１２】マウス２Ｈ７（配列番号３７）、ヒト化２Ｈ７ｖ１６変異体（配列番号１５）、及びヒトκ軽鎖サブグループＩ（配列番号３８）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列を比較する配列アラインメントである。２Ｈ７とｈｕ２Ｈ７．ｖ１６のＶＬのＣＤＲは以下の通りである：ＣＤＲ１（配列番号３９）、ＣＤＲ２（配列番号４０）、及びＣＤＲ３（配列番号４１）。
【図１３】マウス２Ｈ７（配列番号２３）、ヒト化２Ｈ７ｖ１６変異体（配列番号１６）、及びヒト重鎖サブグループＩＩＩのコンセンサス配列（配列番号４２）のＶＨ配列を比較する配列アラインメントである。２Ｈ７とｈｕ２Ｈ７．ｖ１６のＶＨのＣＤＲは以下の通りである：ＣＤＲ１（配列番号４３）、ＣＤＲ２（配列番号４４）、及びＣＤＲ３（配列番号４５）。図１２−１３において、各々の鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は括弧の範囲内で囲み、示されるように、フレームワーク領域、ＦＲ１−ＦＲ４が隣接している。２列の配列間の星印は２つの配列の間で異なる位置を示す。残基番号付けは、Kabat等, Sequences of Immunological Interest. 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従い、挿入をａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅで示す。
【図１４】ｈＣＤ２０ＢＡＣ Ｔｇ＋マウスのマウスＢ２２０＋細胞（Ｂ細胞）中でのヒトＣＤ２０導入遺伝子の発現を示す。
【図１５】ｈＣＤ２０ ＢＡＣＴｇマウスにおけるＢ細胞成熟の間のヒトＣＤ２０の発現を示す。図１５−１９において、赤い線はネガティブなコントロールを示し、導入遺伝子ネガティブな（Ｔｇ−）同腹仔由来の細胞を抗ｈＣＤ２０ｍＡｂで染色した。緑の線はＴｇ＋マウスでのヒトＣＤ２０の染色を示す。Ｔｇ＋マウスはｈＣ２０ ＢＡＣトランスジェニックマウスを意味する。
【図１６】Ｔｇ＋マウスの骨髄での異なる成熟／分化過程にあるＢ細胞（成熟、プレＢと未成熟Ｂ、プロＢ、及び祖先細胞（プロジェニタ）Ｂ）でのヒトＣＤ２０の発現を示すＦＡＣＳプロットである。
【図１７】Ｔｇ＋マウス脾臓Ｂ細胞でのヒトＣＤ２０の発現を示すＦＡＣＳプロットを示す。細胞をＢ細胞を得るためにＢ２２０＋上でゲートした。ＩｇＭとＣＤ２１により、Ｔ２／濾胞性、辺縁帯及びＴ１の様々なＢ細胞サブセット内に描写された。
【図１８】Ｔｇ＋マウス腸間膜リンパ節（ＬＮ）でのヒトＣＤ２０の発現を示すＦＡＣＳプロットを示す。
【図１９】Ｔｇ＋マウスパイエル板でのヒトＣＤ２０の発現を示すＦＡＣＳプロットを示す。細胞をＢ２２０＋についてゲートした。ＣＤ３８マーカにより胚中心Ｂ細胞と成熟のものを区別する。
【図２０】ヒトＣＤ２０Ｔｇ＋マウスでの抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの効果についての実験の概要を示す。第０日目にマウスに１．０ｍｇ（５０ｍｇ／ｋｇに相当）の抗ＣＤ２０抗体を注射し（水平線の上の黒い矢印）、水平線の下の赤い矢印で示した日に細胞を分析した。末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄及びパイエル板についてＦＡＣＳ分析を行った。抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの血清レベルをモニターした。
【図２１】抗ｈＣＤ２０ｍＡｂでの末梢血Ｂ細胞の枯渇を示すＦＡＣＳプロットを示す。左のパネルはＩｇＧコントロール、すなわち非特異的なアイソタイプ一致抗体で処理した動物を示す。
【図２２】右のパネルに抗ｈＣＤ２０ｍＡｂによる成熟末梢ＬＮ Ｂ細胞の枯渇を示すＦＡＣＳプロットを示す。左のパネルはＩｇＧコントロール、すなわち非特異的なアイソタイプ一致抗体で処理した動物を示す。全てのＢ細胞のＣＤ２１＋ＣＤ２３＋をゲートした。
【図２３】抗ｈＣＤ２０ｍＡｂによって、辺縁帯Ｂ細胞でなくＴ２ Ｂ細胞の枯渇を実証するＦＡＣＳプロットを示す。
【図２４】抗ｈＣＤ２０ｍＡｂによって、未成熟／プレＢ又はプロＢ細胞でなく再環流成熟Ｂ細胞の枯渇を実証するＦＡＣＳプロットを示す。赤はＩｇＧ処理群、緑はｈＣＤ２０を発現する抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ処理マウス群を表す。ＩｇＧ処理マウス群（赤）はｈＣＤ２０発現成熟Ｂ細胞を保持しているが、抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ処理群はｈＣＤ２０保持細胞を枯渇した。ヒトＣＤ２０発現を未結合及びＡｂ結合ＣＤ２０両方の検出のためにモニターした。
【図２５】抗ｈＣＤ２０ｍＡｂに対するパイエル板胚中心Ｂ細胞の耐性を実証するＦＡＣＳプロットを示す。左のパネルはコントロールＩｇＧ処理マウス群由来の細胞を示す。右のパネルは抗ＣＤ２０ｍＡｂ処理Ｔｇ＋マウス群由来の細胞を示す。
【図２６】Ｔｇ＋マウスの抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ処理後の末梢血中でのＢ細胞の枯渇と回復を実証するＦＡＣＳプロットを示す。上のパネルはコントロールｍＡｂ処理マウス群由来の細胞の染色を示す。第１日目にマウスに抗体を投与した。時間と共に、ｈＣＤ２０を発現しない前駆Ｂ細胞はＣＤ２０＋成熟Ｂ細胞に分化した（第６及び第１４週目の染色を参照のこと）。
【図２７】短期（単回投与）の抗ＣＤ２０ｍＡｂ処理に対する脾臓胚中心Ｂ細胞の耐性を実証するＦＡＣＳプロットを示す。胚中心形成を誘導するためにヒツジ赤血球細胞で免疫化して８日後に、一群のマウスをヒトＣＤ２０に対するｍ２Ｈ７ｍＡｂで処理した。マウスのコントロール群はｍＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール抗体で処理した。第１２日目にマウスの脾臓細胞を分析した。胚中心のＰＮＡ（ピーナッツ凝集素）を染色した。胚中心Ｂ細胞は抗ＣＤ２０処理で枯渇しなかった。
【図２８】枯渇されない辺縁帯（ＭＺ）とＢ１Ｂ細胞がＴ非依存性の抗原に対する保護を付与することを実証するＦＡＣＳプロットを示す。右の３つのパネルでは、脾臓細胞を連鎖球菌多糖類ホスファチジル基コリン（ＴＩ抗原）について染色した。ＣＤ１３８はプラズマ細胞に対するマーカーである。
【図２９】実施例４に記載のように動物モデルをＢＡＦＦアンタゴニスト、ＢＲ３−Ｆｃ、及び抗ＣＤ２０ｍＡｂであるｍ２Ｈ７の組合せで処理したときの異なる生物学的効果を示す。脾臓、血液、リンパ節Ｂ細胞（ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋でゲート）についてＦＡＣＳ分析を行った。併用して処置するとＢ細胞、特に脾臓の辺縁帯、Ｔ２及び濾胞性Ｂ細胞の枯渇において明らかに相乗効果が見られた。
【図３０】実施例４に記載のように、ヒトＣＤ２０ Ｔｇ＋マウスを抗ｈＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３−Ｆｃを組み合わせたときのＢ細胞枯渇に対する相乗効果を示す。マウスをコントロールＩｇＧ２ａ、ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃ（マウス当たり１００μｇ、１２日間毎日ＩＰ）、抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ（マウス当たり１００μｇ、第９日目にＩＰ）又はＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃ及び抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ（単一処置群として同じ投薬）の組合せで処置した。Ｂ２２０＋脾細胞は第１３日目に単離して、ＣＤ２１及びＣＤ２３について染色した。一群当たりＮ＝５マウス。
【図３１】実施例４と図３０に記載のように、０．１ｍｇのコントロールＩｇＧ２ａ、ＢＡＦＦ／ＢＲ３−Ｆｃ又は抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの単回用量で処置したマウスを除き、ｈＣＤ２０ Ｔｇ＋マウス由来のＢ２２０＋総脾臓Ｂ細胞（ＭＺ＋ＦＯ＋Ｔ１＋Ｔ２の全てのサブセット）、辺縁帯（ＭＺ）及び濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞の枯渇の定量化を示す。脾細胞を第４日目に分析した。一群当たりＮ＝５マウス。
【図３２Ａ】高親和性ＢＡＦＦ結合についてファージディスプレイライブラリーから選択した１７ｍｅｒのアミノ酸配列（配列番号６５−１４２）を示す。
【図３２Ｂ】高親和性ＢＡＦＦ結合についてファージディスプレイライブラリーから選択した１７ｍｅｒのアミノ酸配列（配列番号６５−１４２）を示す。
【図３２Ｃ】高親和性ＢＡＦＦ結合についてファージディスプレイライブラリーから選択した１７ｍｅｒのアミノ酸配列（配列番号６５−１４２）を示す。
【図３３】ヒト及びマウスＢＲ３（配列番号１４６及び１４７）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のアミノ酸配列並びにＢＲ３ ＥＣＤの変異体の配列（配列番号１４８−１６５）のアラインメントを示す。「最小領域」はボックスで囲んでいる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月28日(2007.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合した細胞集団をＢＲ３イムノアドヘシン及びＣＤ２０結合抗体に接触させることを含み、前記ＢＲ３イムノアドヘシンが図３３中の配列番号１４６−１６５の何れか一の配列又はその最小領域を含む、混合細胞集団からＢ細胞を枯渇する方法。
【請求項２】
Ｂ細胞がヒトＢ細胞であり、混合細胞集団にＢＲ３イムノアドヘシン及びＣＤ２０結合抗体をインビボで接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗ＣＤ２０抗体がリツキサン(登録商標)抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗ＣＤ２０抗体が、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６の軽鎖及び重鎖配列を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＢＲ３イムノアドヘシン及び抗ＣＤ２０抗体が相乗的に働いてＢ細胞を枯渇する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍又は悪性腫瘍に罹患している患者に治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＲ３イムノアドヘシンを投与し、前記ＢＲ３イムノアドヘシンが図３３中の配列番号１４６−１６５の何れか一の配列又はその最小領域を含む、ＣＤ２０を発現するＢ細胞により特徴付けられるＢ細胞腫瘍又は悪性腫瘍の治療方法。
【請求項７】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＲ３イムノアドヘシンが同時に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＲ３イムノアドヘシンが連続的に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＢＲ３イムノアドヘシンがＣＤ２０結合抗体より前に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
Ｂ細胞腫瘍が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、リンパ球支配的ホジキン病（ＬＰＨＤ）、濾胞性中心細胞（ＦＣＣ）リンパ腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び毛様細胞白血病である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
Ｂ細胞腫瘍が非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）又は慢性リンパ球性白血病である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤ２０結合抗体が、ヒト抗体の定常領域に融合したマウス抗体の可変領域を含んでなるキメラ抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
キメラ抗体がリツキサン(登録商標)抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ２０結合抗体がヒト化抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト化抗体が、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６の軽鎖及び重鎖配列を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＤ２０結合抗体が、リツキサン(登録商標)抗体又はそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６の軽鎖及び重鎖配列を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
ＢＲ３イムノアドヘシンが約２−５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、リツキサン(登録商標)抗体が約３７５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＢＲ３イムノアドヘシン及びＣＤ２０結合抗体の投与によりＢ細胞を枯渇するための相乗効果が生じる、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
ＢＲ３イムノアドヘシン及びＣＤ２０結合抗体が化学療法と組み合わせて投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
Ｂ細胞制御性自己免疫疾患の寛解方法において、該疾患に罹患している患者に治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＲ３イムノアドヘシンを投与することを含み、前記ＢＲ３イムノアドヘシンが図３３中の配列番号１４６−１６５の何れか一の配列又はその最小領域を含む方法。
【請求項２１】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＲ３イムノアドヘシンが連続的に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＢＲ３イムノアドヘシンがＣＤ２０結合抗体より前に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓症血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫血小板減少、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レーノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
自己免疫疾患が慢性関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＤ２０結合抗体が、ヒト抗体の定常領域に融合したマウス抗体の可変領域を含んでなるキメラ抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
キメラ抗体がリツキサン(登録商標)抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＤ２０結合抗体がヒト化抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
ヒト化抗体が、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６の軽鎖及び重鎖配列を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
ＣＤ２０結合抗体が、リツキサン(登録商標)抗体又はそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６の軽鎖及び重鎖配列を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
ＢＲ３イムノアドヘシンが約２−５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、リツキサン(登録商標)が約２．５−１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＢＲ３イムノアドヘシン及びＣＤ２０結合抗体の投与によりＢ細胞を枯渇するための相乗効果が生じる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
ＢＲ３イムノアドヘシン及びＣＤ２０結合抗体が、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド、プレドニゾン、及び疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）から選択された薬剤を用いた療法と組み合わせて投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
Ｂ細胞腫瘍又はＢ細胞制御性自己免疫疾患罹患患者の辺縁帯又は胚中心Ｂ細胞を枯渇させる方法であって、それを必要とする患者に、治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＲ３イムノアドヘシンを投与することを含み、前記ＢＲ３イムノアドヘシンが図３３中の配列番号１４６−１６５の何れか一の配列又はその最小領域を含む方法。
【請求項３４】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＲ３イムノアドヘシンを含んでなり、前記ＢＲ３イムノアドヘシンが図３３中の配列番号１４６−１６５の何れか一の配列又はその最小領域を含む組成物。
【請求項３５】
ＣＤ２０結合抗体と、ＢＲ３イムノアドヘシンであって、図３３中の配列番号１４６−１６５の何れか一の配列又はその最小領域を含むＢＲ３イムノアドヘシンと、ラベルを含んでなり、該ラベルが、組成物がＢ細胞腫瘍又はＢ細胞制御性自己免疫疾患の治療のためのものであることを示す、製造品。
【国際調査報告】
2008525449.tif 000042
2008525449.tif 000043
2008525449.tif 000044
2008525449.tif 000045