(57)【要約】ポリマー分子を分析する方法が本明細書に記載される。これらの方法は、単一の分子の感度で、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の高スループットな読み取りのために使用される。本発明の方法は、（１）ＤＮＡ（または、ＲＮＡ）二本鎖の電気的に制御された解離、および（２）１つ以上の分子シグナル検出を使用して、分子の正体（またはコード）の読み取りを包含する。本発明は、配列決定法に関し、この方法は、標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を設計されたポリヌクレオチドポリマー（または、単純に「設計ポリマー」）へ変換することを包含する。この設計ポリマーは、検出器により読み取られる二進コードによりコードされ、それにより、元の標的ポリヌクレオチドを反映する配列情報を提供する。
2008509671.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の標的ポリヌクレオチド分子を分析する方法であって、該方法は：
（ａ）該標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して、１つ以上の設計モノマーを設計する工程であって、ここで、個々の設計モノマーは「０」または「１」のいずれかにさらに対応し、２つの個々の設計モノマーは、所定のヌクレオチド塩基と対応し、該個々の設計モノマーは、１つ以上のシグナル分子を有する、工程；
（ｂ）複数の該設計モノマーを連結することにより、１つ以上の設計ポリマーを形成する工程；
（ｃ）１つ以上の所定の設計ポリマーが構築されるまで、工程（ａ）と工程（ｂ）とを反復する工程；
（ｄ）該設計ポリマーとシグナル分子とを混合することによって、ハイブリダイゼーションに適切な条件下で、設計ポリマー−シグナル複合体を形成する工程；および
（ｅ）（ｄ）の複合体を分析に供する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡが、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡのいずれかである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的ポリヌクレオチドが、一本鎖、二本鎖、またはそれらの両方の組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記標的ポリヌクレオチドが、真核生物または原核生物のものであり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的ポリヌクレオチドが、植物または動物のいずれかのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標的ポリヌクレオチドが、約１０ヌクレオチド塩基〜約１００，０００ヌクレオチド塩基の範囲に及ぶサイズを有し得る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記設計モノマーが、１つ以上のヌクレオチド塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記設計モノマーが、約１ヌクレオチド塩基〜約１００ヌクレオチド塩基に及ぶヌクレオチド塩基の範囲を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記設計モノマーが、約５ヌクレオチド塩基〜約１０ヌクレオチド塩基に及ぶヌクレオチド塩基の範囲を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記設計モノマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを含み得る、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的ポリヌクレオチドの各々個々の単位が、二進コードにより表される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記個々の単位が、アデニン、シトシン、ウラシル（ｕｒｉｃｉｌ）、グアニン、チミンおよびこれらの改変からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記二進コードが「０」と「１」から構成され、ここで、該「０」と該「１」との特定の配列が、前記個々の単位に対応する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記設計ポリマーが、前記標的ポリヌクレオチドに対応する特定の配列で整列された１つ以上の設計モノマーから構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記シグナル分子が前記設計モノマーにハイブリダイズされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが、約９０％以上である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが、約８０％〜約９０％の間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが、約７０％〜約８０％の間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが、約６０％〜約７０％の間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記シグナル分子が分子ビーコンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子ビーコンが、１つ以上のフルオロフォアと１つ以上のクエンチャーとを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ビーコンの５’末端上のヌクレオチド配列が、該ビーコンの３’末端上のヌクレオチド配列と相補的である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
２つの分子ビーコンが存在し、各々のビーコンが特定の設計モノマーに対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
第一の分子ビーコンが第一の設計モノマーに対応し、第二の分子ビーコンが第二の設計モノマーに対応する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ａ）と工程（ｂ）とが、前記設計ポリマーを生成するためのサイクルを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
１つのサイクル後に、前記設計ポリマーが６個の設計モノマーを含み、それによって、各々のサイクルの完了後に、該設計ポリマーが、少なくとも６個の設計モノマーにより伸長されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記設計モノマーが、前記設計ポリマー内で互いに共有結合されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｂ）における前記設計ポリマーが二本鎖のポリヌクレオチド分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｄ）における前記設計ポリマーが部分的に一本鎖であるか、または完全に一本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｅ）が、ナノ細孔システムへ前記設計ポリマー−シグナル複合体を導入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ナノ細孔システムが、複数のナノ細孔と１つ以上の検出システムとを備える、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ナノ細孔が、１つ以上のチャネルと脂質二重層とを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ナノ細孔が、α溶血素、バクテリオファージλに対するレセプター、グラミシジン、バリノマイシン、大腸菌、赤痢菌属、Ｔｓｘ、Ｆ線毛、ミトコンドリアポーリンからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ナノ細孔がα溶血素である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記α溶血素が前庭とチャネルとを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記前庭が、約２．５ｎｍの直径を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記チャネルが、約１．５ｎｍの直径を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記チャネルが、約０．５ｎｍ〜約２．０ｎｍの範囲に及ぶ細孔サイズを有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記設計ポリマー−シグナル複合体の解離をさらに包含し、それにより該設計ポリマーの一本鎖部分が、前記ナノ細孔システムのチャネルに侵入し、それを通過する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記解離が、ナノ細孔システムを横切って確立された電場によりもたらされる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記チャネルへ、かつ該チャネルを通っての前記一本鎖の設計ポリマーの移動が、前記ナノ細孔システムを横切る電場により促進される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記解離プロセスが１つ以上のシグナル分子の遊離をもたらす、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記遊離されたシグナル分子が、検出可能なエネルギーを放出する分子とクエンチャー分子とを含み、該遊離されたシグナル分子が自己ハイブリダイズし、それにより該放出する分子をクエンチする、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記放出する分子がフルオロフォアである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記フルオロフォアが、ＴＭＲ、Ｃｙ５およびＣＰＭなどからなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記クエンチング分子が、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）、メチルレッドおよびＥｌｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒなどからなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
工程（ｅ）の分析が、前記シグナル分子からのエネルギーの検出を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記検出が蛍光の検出を包含する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記検出システムが光学的な検出システムである、請求項３３に記載の方法。
【請求項５２】
前記光学的な検出システムが蛍光検出器である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
１つ以上の標的ポリヌクレオチド分子を分析するための方法であって、該方法は：
（ａ）該標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して、１つ以上の設計モノマーを設計する工程であって、ここで、個々の設計モノマーは、「０」または「１」のいずれかにさらに対応し，２つの個々の設計モノマーは、所定のヌクレオチド塩基に対応し、該個々の設計モノマーは、１つ以上のシグナル分子を有する、工程；
（ｂ）複数の該設計モノマーを連結することにより、１つ以上の設計ポリマーを形成する工程；
（ｃ）１つ以上の所定の設計ポリマーが構築されるまで、工程（ａ）と工程（ｂ）とを反復する工程；
（ｄ）ハイブリダイゼーションに適切な条件下で、該設計ポリマーとシグナル分子とを混合することにより、設計ポリマー−シグナル複合体を形成する工程；
（ｅ）ナノ細孔システムへ（ｄ）の該複合体を導入する工程であって、ここで、該複合体は解離され、かつ該設計ポリマーの一本鎖部分が該ナノ細孔システムに進入し通過する、工程；および
（ｆ）（ｅ）の該一本鎖の設計ポリマーを分析する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ポリマー分子を分析するためのシステムを提供する。詳しくは、本発明は、一本鎖のポリヌクレオチド分子の配列決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋが１９５３年にＤＮＡ分子の構造を解明して以来、遺伝学研究者は、個々のＤＮＡ分子を配列決定する、迅速かつ効率的な方法を見出そうとしてきた。Ｓａｎｇｅｒ／ＢａｒｒｅｌｌおよびＭａｘａｍ／Ｇｉｌｂｅｒｔは、１９７５と１９７７との間に、配列決定技術において、主要なブレークスルーを代表する２つの新規のＤＮＡ配列決定法を開発した。現在広範に使用される方法は全て、Ｓａｎｇｅｒ／Ｂａｒｒｅｌｌ法に基づき、最近２３年間におけるＤＮＡ配列決定の開発は、大体、この方法の改変であった。
【０００３】
ポリヌクレオチドは、直線状の様式で互いに結合したヌクレオチドの反復性単位を含む、ポリマー分子である。ポリヌクレオチドの例は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）である。ＤＮＡポリマーは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）として公知な４つの異なるヌクレオチド塩基のストリングから構成される。所定の遺伝子における、これらの塩基の特定の順序、すなわち「配列」は、遺伝子にコードされるタンパク質の構造を決定する。さらに、遺伝子の周囲の塩基配列は、代表的に、どの細胞型において、特定のタンパク質がどの程度の頻度で作られる筈かなど、についての情報を含む。遺伝子内およびその周囲のＤＮＡ配列の知見は、遺伝子の構造および機能、それがコードするタンパク質、ならびに他の遺伝子およびタンパク質に対するその関連性についての価値のある情報を提供する。ＲＮＡは、ＤＮＡと構造的かつ化学的に関連するが、（デオキシリボースであるＤＮＡとは対照的に）ＲＮＡの糖成分はリボースであり、塩基であるチミンはウラシル（ｕｒｉｃｉｌ）と置換される。
【０００４】
特定のＤＮＡ配列と特定の疾患状態との間の直接的な関連性が存在することが当業者により認識される。この事実は、多くの製薬企業が、ゲノム研究の分野において、これらの疾患の根底に存在する遺伝学的性質を発見する望みに多大な投資をすることを助長してきた。
【０００５】
配列情報は重要であるという別の理由は、個体の遺伝学的な配列に基づいて、特定の疾患に対するその個体の感受性を決定する能力が期待されることである。遺伝学的な診断の分野は、ゲノム中のその存在が特定の障害の発症または特徴と関連するヌクレオチド配列要素を同定することに寄与する。集団中で観察されるゲノム配列要素について、利用可能な情報が多ければ多いほど、この分野がより強力となる。さらに、一般的な集団中の罹患率および配列要素の浸透率、ならびに試験されている特定の個体のゲノム中のこのような要素の存在についての情報が迅速であればあるほど、分析がより有効となる。
【０００６】
配列情報は価値があるというなお別の理由は、多くの製薬企業が、個体の遺伝学的プロフィールに対し特別注文（ｃｕｓｔｏｍ−ｔａｉｌｏｒｅｄ）される薬物を開発しようとしていることである。この望みは、おそらく低減された投薬レベル（これは、薬物が投与される特定の個体の遺伝学的な特徴に適切である）で、標的化された強力な薬物を提供するはずである。
【０００７】
大半の現在利用可能なヌクレオチド配列決定技術は、異なる長さの相補鎖の収集物（この収集物は、標的配列の各々の塩基において終結し、そして標的分子のほんの数個のヌクレオチドから全長のヌクレオチドのサイズに及ぶ分子を含む）を生じることによって所定のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド配列を決定する。続いて、標的分子の配列は、短縮型の相補鎖を分析し、各々、４つのＤＮＡヌクレオチドのうちのどれで終結するかを決定することにより決定される。「梯子（ｌａｄｄｅｒ）」は、長さによる順序で短縮型の分子を並べることにより構築され、そして各々の梯子の末端残基が読み取られ、標的ポリヌクレオチド配列の相補体を提供する。
【０００８】
現在利用可能なＤＮＡ配列決定システムは非常に強力である。しかしながら、これらは、速度、複雑さおよびコストにより制限される。現在利用可能な自動シークエンサーの速度は、一回に数百（代表的に、約６００）ヌクレオチドの配列より多くは機械が分析できないことにより制限される。１０００塩基長未満の鎖を正確につなぎ合わせるのに必要とされる重なりを可能にするために、標準的な配列決定プロセスは、ヒトゲノム配列を決定するために７千万回も実行されなければならない（非特許文献１；これは参考として本明細書に援用される）。一日あたり、１億塩基の理論的な速度において、一度ヒトゲノムを配列決定するのに少なくとも１年間かかる。これらの技術を使用しては、大規模な配列決定は、臨床的なツールとはなり得ない。臨床的な場面において遺伝学的な診断が実用的になるためには、配列決定速度を少なくとも３オーダー〜５オーダーの大きさで増大させる必要がある。
【０００９】
現在の配列決定技術の複雑さは、配列決定される遺伝学的な分子を増幅し、かつ改変する必要性から生じる。この改変は、化学的または酵素的のいずれかによって実行され、増幅は、加熱と冷却との多数のサイクルにより達成される。配列決定されるＤＮＡを増幅および改変する最も一般的な方法の一つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することである。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、変性、アニーリングおよび伸長の連続的なラウンドを包含し、ＤＮＡの元の鎖の指数関数的な増幅をもたらす。サイクルの各々の部分に伴う時間の長さは、流体の体積および増幅されるＤＮＡの長さに依存する。代表的な時間は、大体、変性工程が１０〜３０秒間、アニーリング工程が５〜３０秒間、そして伸長工程が１〜４分間である。このサイクルは、通常１５〜３０回実行される。それゆえ、通常のＰＣＲの時間は、増幅されるＤＮＡの長さに依存して、１時間〜３時間である。変性、アニーリングおよび標識化を束縛する、この基本的な物理的プロセスは、必要とされる検出可能な鎖の個数、このプロセスを実行するのに必要とされる時間、および酵素の処理能力（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）である。この全体的なプロセスは、時間がかかり、それに続く関連手順を必要とする。
【非特許文献１】Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗ、１９９９  Ｍａｒ／Ａｐｒ  １０２（２）：６４〜６８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現在、ポリヌクレオチドを配列決定するためのより有効な方法に対する必要性が存在する。本発明は、このような方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（要旨）
本発明は、ポリマー分子を分析するため方法に関する。これらの方法は、単一の分子の感度でのＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の高スループットな読み取りに使用される。本発明の方法は、以下を包含する：（１）ＤＮＡ（またはＲＮＡ）二本鎖の電気的に制御された解離（ｕｎｚｉｐｐｉｎｇ）、（２）１つ以上の分子シグナル検出を使用する、分子の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）（またはコード）の読み取り、および（３）核酸とハイブリダイズしたプローブとの間の分子の相互作用（例えば、強力に相互作用するプローブは、移行速度にさらなる低下を生じる）による、ナノ細孔通過プロセス（ｎａｎｏ  ｐｏｒｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）の制御された減速。
【００１２】
本発明は、配列決定法に関し、この方法は、標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を設計されたポリヌクレオチドポリマー（または、単純に「設計ポリマー」）へ変換することを包含する。この設計ポリマーは、検出器により読み取られる二進コードによりコードされ、それにより、元の標的ポリヌクレオチドを反映する配列情報を提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態において、標的二本鎖ポリヌクレオチドは、設計ポリマーに変換される。一局面において、標的の一本鎖が加工される。この変換は、標的ポリヌクレオチドの各々のヌクレオチド塩基を２つの設計モノマーに置き換え、それによってそれらの塩基を二進コードとして表現することを包含する。例えば、塩基アデニンは０＋０により、塩基シトシンは０＋１により、塩基グアニンは１＋０により、そして塩基チミンは１＋１により表現され得る。特定の局面において、各々の設計モノマーは二本鎖ポリヌクレオチド配列である。設計モノマーの各々は、「０」または「１」のいずれかを表現する。したがって、標的ポリヌクレオチドの各々かつ全ての塩基に対して、２つの対応する二本鎖の設計モノマーが存在する。一局面において、設計モノマーは、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を反映するような様式で結合し、それによって設計ポリマーを形成する。一局面において、二本鎖の設計ポリマーは、一本鎖の分子に変換される。一本鎖の設計ポリマーは、適切な分子ビーコンとハイブリダイズされる。この各々の分子ビーコンは、１つ以上のシグナル分子と１つ以上のクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）分子とを含む。
【００１４】
本発明の一局面において、設計ポリマーは、２つのセットの設計モノマーのみを含む：（１）一方のセットの設計モノマーは「０」をコードし、（２）他方のセットの設計モノマーは「１」をコードする。本発明の特定の局面において、２つのセットのみの分子ビーコンを使用する。一方のセットの分子ビーコンは「０」を表す設計モノマーにハイブリダイズする一方で、第二のセットの分子ビーコンは「１」を表す設計モノマーにハイブリダイズする。一局面において、２つのセットの分子ビーコンは固有のシグナル分子を含み、その結果、「０」設計モノマーにハイブリダイズする分子ビーコンは、「１」設計モノマーにハイブリダイズする分子ビーコンとは異なるシグナル分子を有する。個々の設計モノマーへの設計ポリマーのハイブリダイゼーションは、ビーコン−設計ポリマー複合体（または単純に「ＢＤＰ複合体」）を形成する。
【００１５】
本発明の一局面において、分子ビーコンは、シグナル分子として適切なフルオロフォアを含む。別の局面において、分子ビーコンは、フルオロフォアのみならず、クエンチャーも含む。特定の局面において、フルオロフォアは、ビーコンの５’末端に位置するが、クエンチャーは、その３’末端に位置する。
【００１６】
本発明の方法は、電気的に駆動される二本鎖の核酸の解離を使用する。電気的に駆動されるナノ細孔解離方法を使用することにより、解離時間の制御を維持することができ、例えば、広範に使用される分子ビーコンのような自己クエンチされる蛍光プローブの使用を許容する。有利なことに、解離事象により定められる蛍光プローブの読み取りの瞬間まで、蛍光プローブがクエンチされる異なる測定スキームを使用することができる。
【００１７】
本発明の一実施形態は、ナノ細孔システムに関する。一局面において、ナノ細孔は、α溶血素を含む。本発明のナノ細孔を使用して、ポリヌクレオチドの配列情報を得ることができる。ＢＤＰ複合体を本発明のナノ細孔に導入することができる。一局面において、本発明のナノ細孔に導入される設計ポリマー（ＢＤＰ複合体）の３’突出が存在する。この３’突出配列は、ＢＤＰ複合体の二本鎖部分が細孔の入り口と並列されるまでナノ細孔を通過し得る。ナノ細孔の寸法は、一本鎖のポリヌクレオチドのみが通過し得、それによって二本鎖のＢＤＰ複合体の侵入を防止するようになっている。ナノ細孔を横切る電圧を印加して、二本鎖のＢＤＰ複合体を解離することができる。この二本鎖の解離は、設計ポリマーからの分子ビーコンの除去を容易にし、それによって、シグナル分子（例えば、フルオロフォア）がそのシグナル（例えば、ルミネセンス）を産生することを可能にする。さらに、解離は、ナノ細孔への、かつナノ細孔を通っての一本鎖の設計ポリマーの侵入を可能にする。シグナルは、適切な検出器により検出され得る。適切な時間後、遊離された分子ビーコンは、自己ハイブリダイズし、それによって自身のシグナルをクエンチする。
【００１８】
これは反復プロセスである。印加された電圧は、一本鎖の設計ポリマーの次の部分が完全に通り抜けるまで、細孔を通っての解離された一本鎖の設計ポリマーのトランスロケーションを続ける。その際、適切な検出器によりシグナルが記録され、配列中の次の分子ビーコン由来のその次のシグナルが発せられる。その後、ＢＤＰ複合体から遊離されると分子ビーコンは自己クエンチする。この様式で、設計されたポリマー全体を読むことができる。
【００１９】
また、本発明は、単一の分子の検出に使用することができる光学系にも関する。この光学系は、１つ以上のナノ細孔システムと組み合わせて使用することができる。この光学系は、ナノ細孔支持体と２つの電極とを有する特製（ｃｕｓｔｏｍ  ｍａｄｅ）のフローセルを備える。電極を使用して、解離プロセスに必要とされる電場を印加する一方で、支持体は、ガラスカバースリップの近位でリン脂質二重層を懸架することを可能にし、高倍率の顕微鏡対物レンズを使用して、この二重層の画像化（ｉｍａｇｉｎｇ）を可能にする。フローセルは、倒立顕微鏡内のＸＹＺナノポジショナー（ｎａｎｏｐｏｓｉｔｉｏｎｅｒ）上にマウントされ、平行移動ステージを使用して、光軸と正確に位置合わせするために移動され得る。
【００２０】
特定の実施形態の以下の説明において、説明の一部をなす添付の図面に対して参照がなされ、これらは、本発明が実施され得る特定の実施形態を例示する手段として示される。他の実施形態が利用され得、かつ構造的な変化が本発明の範囲を逸脱することなくなされ得ることが理解されなければならない。任意の構造の場合、これらの図が幾分単純化されることが理解されなければならない。なぜなら、これらは、示される構造についての全ての従来の詳細を示しておらず、関連する要素のみを示しているにすぎないからである。さらに、本明細書で特定の実施形態が示されるが、これは、限定するとは意図されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（詳細な説明）
本発明は、ポリマー分子を分析する方法に関する。これらの方法は、単一の分子の感度での、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の高スループットな読み取りに使用される。本発明の方法は、以下を包含する：（１）ＤＮＡ（またはＲＮＡ）二本鎖の電気的に制御された解離、（２）１つ以上の分子シグナル検出を使用する分子の正体（またはコード）の読み取り、および（３）核酸とハイブリダイズしたプローブとの間の分子の相互作用（例えば、強力に相互作用するプローブは、移行速度にさらなる低下を生じる）による、ナノ細孔通過プロセスの制御された減速。
【００２２】
２種類の単一の分子の検出法の利用が本明細書に記載される：（１）ナノ細孔の検出、および（２）単一の分子シグナルの探索（例えば、蛍光の探索）。ナノ細孔に印加された電場の能動的な制御を使用して、二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、二重ヘリックスＤＮＡ）を解離することができる。この二本鎖ポリヌクレオチドの解離は、ナノ細孔のチャネルを通過し得る一本鎖の要素を生成する一方で、二本鎖部分が侵入することは防止される。それゆえ、ポリヌクレオチドの一本鎖の要素が侵入することは、その分析（例えば、配列情報を取得すること）を容易にする。
【００２３】
本発明の方法は、二進コードの設計ポリマーへ標的ポリヌクレオチド分子を変換することを包含する。標的ポリヌクレオチドは、あらゆる供給源から取得することができる。一局面において、標的ポリヌクレオチドは、二本鎖のポリヌクレオチド分子（例えば、二重ヘリックスＤＮＡ）であり得る。他のポリヌクレオチドもまた本発明の範囲内であり、それらとしては、ＲＮＡ分子およびＰＮＡ分子が挙げられるが、それらに限定されない。標的ポリヌクレオチドは一本鎖であってもよい。標的分子は、天然のヌクレオチド塩基と改変ヌクレオチド塩基との両方を含み得る。標的はあらゆる起源であってもよい。例えば、標的は、超高密度な様式で任意の情報をコードするように使用される、ｃＤＮＡ配列であっても、ｇＤＮＡ配列であっても、人工（ｍａｎ−ｍａｄｅ）（合成）配列であってもよい。標的ポリヌクレオチドは、部分的に合成されても、完全に合成されてもよい。標的は、天然起源（植物および動物を含む）のヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであってもよい。例えば、そのサイズの範囲は、約１０ヌクレオチド塩基〜約１０万ヌクレオチド塩基以上であってもよい。
【００２４】
図１を参照して、標的ポリヌクレオチド１０が取得される（図１ａ）。この標的ポリヌクレオチド１０は、生化学的な変換に供される。Ｌｅｘｏｗに対する米国特許第６，７２３，５１３号（この全体の教示は、参考として本明細書に援用される）を参照のこと。例示的な目的のために、例えば、３つのヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドから単離されている（図１ｂ）。３つのヌクレオチドは、「Ｇ」、「Ｔ」および「Ａ」（それぞれ、グアニン、チミンおよびアデニン）である。これらの３つのヌクレオチドのみを使用して、変換プロセスを説明する。
【００２５】
この変換プロセスにおいて、各々のヌクレオチドは、「１」と「０」とを使用する二進コードにより表される。したがって、例えば、グアニン（Ｇ）は二進コード「１＋０」により表され得、チミン（Ｔ）は「１＋１」により表され得、アデニン（Ａ）は「０＋０」により表され得、そしてシトシン（Ｃ）は「０＋１」により表され得る。二進コードの「１」と「０」とは、「設計モノマー」１２と呼ばれる、それら固有のポリヌクレオチドにより表される。図１ｂを参照のこと。図１ｂは、このような設計モノマー１２の一例を提供する。図１ｂに示されるものは、「０」に対する設計モノマー１２’および「１」に対する設計モノマー１２’’である（設計モノマーについての正確なポリヌクレオチド配列は、熟練者によって決定することができる）。したがって、設計ポリマー１２は二進コードからなるので、各々「１」または「０」のいずれかを表すが、同時には「１」と「０」との両方を表さない、２つの設計モノマー１２’、１２’’が存在する。
【００２６】
図１に示される例において、「０」に対する設計モノマー１２’と「１」に対する設計モノマー１２’’とが存在する。もし各々のヌクレオチドが二進コードにより表されるとするならば、各々のヌクレオチドが２つの設計モノマーに表されることを必要とする。例えば、グアニンは、二進コード「１＋０」により表されると、グアニンは、設計モノマー１２’’により「１」と表され、設計モノマー１２’により「０」と表される。しかしながら、設計モノマーは、それらが表している特定のヌクレオチドを反映するように適切な配列でなければならない。したがって、グアニンに対して、設計モノマー１２’’「１」の次に設計モノマー１２’「０」が続かなければならない（５’→３’の従来のマップ割り当て（ｍａｐ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）を使用して）。
【００２７】
設計ポリマー１４は、特定の配列で整列された設計モノマー１２’、１２’’からなる。図１ｃを参照のこと。設計モノマー１２’、１２’’が、元の標的ポリヌクレオチド１０内のそれらの同起源のヌクレオチドにより見出される同じ順序で５’〜３’に並べられるという点において、設計ポリマー１４の配列は、元の標的ポリヌクレオチド１０のヌクレオチド配列を反映する。
【００２８】
図１に示されるプロセスを、全体のポリヌクレオチド分子について反復することができる。標的ポリヌクレオチドのサイズは、便宜上操作され得るが、その原理は同一なままである。
【００２９】
本発明の設計モノマーは、ポリヌクレオチド分子からなる。設計モノマーのサイズは変動してもよい。一局面において、設計モノマーのサイズは、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの範囲に及び得る。別の局面において、設計モノマーは、二本鎖のポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、ＰＮＡであってもよい。設計モノマーのヌクレオチドの構成要素は、天然であっても、改変されていても、それらの組み合わせであってもよい。これらは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルおよびそれらの改変などからなる群から選択され得る。熟練者は、所定のプロトコルのパラメータに基づいて設計モノマーを構築することができる。本発明の二進コードの特徴を達成するために、少なくとも２つの異なる設計モノマーを構築しなければならないことが重要である。
【００３０】
本発明の設計ポリマーは、複数の設計モノマーからなる。設計ポリマーは、生化学的に変換された標的ポリヌクレオチドを表す。設計ポリマーと元の標的ポリヌクレオチドとの間の関連性は、設計ポリマーのみを使用して、熟練者が元の標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができるようなものである。設計ポリマーの設計モノマーは、互いに連結（例えば、共有結合）されて、ポリヌクレオチド分子を形成する。再度、設計モノマーを連結することの順序は、その連結した配列が標的内のヌクレオチドの元の配列を反映するようなものである。
【００３１】
ハイブリッドのシステムもまた本発明の範囲内である。例えば、標的ポリヌクレオチドはＲＮＡ分子であり、二進コードを構築するのに使用される設計モノマーはデオキシリボヌクレオチド（ｄｅｏｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）から構成され得る。その逆も等しく有効である。熟練者が望む場合、ハイブリッドの構築物であってもよい。例えば、設計モノマー（単数または複数）は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとのハイブリッドを含んでもよい。種々のハイブリッドの置換もまた十分に本発明の範囲内である。
【００３２】
図２を参照して、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド（そのサイズに関してのみ異なる）は、上記の方法にしたがって処理することができる。図１に記載される方法は反復的なプロセスであり得、それによってオリゴマーを設計ポリマーへ変換することを可能にする。図２は、このような状況を示す。この例に関して、２１塩基対のオリゴマー１６を使用して、本方法を例示する。種々のサイズのオリゴマーは、本発明の範囲内である。例えば、約１０ヌクレオチド〜約５０００ヌクレオチドに及ぶオリゴヌクレオチドを処理することができる。先に記載されるように、当業者に周知の従来法を使用して、相当な長さのポリヌクレオチドを消化し、より短いオリゴヌクレオチドを形成することができる。
【００３３】
図２ａは、２つの設計モノマーを示す。一方の１２’は「０」を表し、他方の１２’’は「１」を表す。より詳細な試験の際に、２つの設計モノマー１２’、１２’’が異なるヌクレオチド配列から構成されることが観察され得る。この特定の例において、各々の設計モノマーは、１０塩基対から構成される。ここで、これらの２つの設計モノマー１２’、１２’’を使用して、二進コードにより標的ヌクレオチド１６配列を表すことができる。図２ｂは、二進コードの割り当てを例示し、また図２ｂは、設計モノマー１２’、１２’’を互いに連結することにより形成される設計ポリマー１４を示す。設計モノマー１２’、１２’’の長さと配列とは可変性であり、これらは、生じる設計ポリマー１４が注文どおりに作製される（ｔａｉｌｏｒｅｄ  ｍａｄｅ）ことを可能にする。
【００３４】
図２ｃは、設計ポリマーへの標的の変換サイクルを示す。標的ポリヌクレオチド１６は、３つの酵素的な工程（Ａ、ＢおよびＣ）により循環され得る。この図において、１サイクルあたり、３つの標的塩基が変換される。この図中の標的ポリヌクレオチド１６は２１塩基対から構成され、したがって、標的を完全に変換するのに全部で７回のサイクルが必要とされる。図２ｃにおいて、上側の鎖（太字）がこの図中で変換される。
【００３５】
酵素的な工程Ａは、変換および設計ポリマーの連結のための突出を生成するために、少なくとも２つのＩＩｓ制限酵素（例えば、ＮｌａＩＩＩ）による標的１６の消化を含む。当該分野で公知の他の制限酵素を使用して、標的ポリヌクレオチドの消化を達成することができることは、当業者により十分に認識される。
【００３６】
工程Ｂは、連結（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）工程であり、ここで、二進法の設計ポリマー配列が、その５’末端と対応する配列を有する標的フラグメントの３’末端に特異的に結合される。この工程は、別個のウェルへの標的フラグメントの分割を包含し、ここで、ウェルの個数は、変換されている塩基の置換の個数に一致する（例えば、３つの塩基の変換には６４個のウェルを必要とする）。各々のウェルにおいて、その特定のウェル内で変換されるべき配列と一致する、設計ポリマー配列および特異的なアダプター（示さず）が存在する（すなわち、各々のフラグメントの３’末端への設計ポリマーの非特異的な結合と正しいフラグメントの５’末端へのアダプターの特異的な連結とが存在する）。連結後、これらのウェルは、一つの容器にプールされ得る。
【００３７】
工程Ｃは、増幅工程である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）工程を実行して、設計ポリマーと特異的なアダプターとに首尾よく結合したフラグメントを増幅および選択する。
【００３８】
この変換法を、大量に並行して実行することができ、ここで、数十億の異なる標的分子が同一の反応で変換される。米国特許第６，７２３，５１３号を参照のこと。
【００３９】
一度、設計ポリマーを形成すると、１つ以上のシグナル分子が設計ポリマーに結合する。一局面において、シグナル分子は分子ビーコンである。一本鎖の設計ポリマーは、当業者に周知の手段によって取得される。一本鎖の設計ポリマーは、ハイブリダイゼーションに適切な条件（例えば、緩衝液（１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ  ８．０）中でのゆっくりとした温度の低下（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）による）下で分子ビーコンと混合され、ビーコン−設計ポリマー複合体（ＢＤＰ複合体）を形成する。
【００４０】
図３は、代表的な分子ビーコン１８を概略的に示す（Ｔｙａｇｉ  Ｓ，Ｋｒａｍｅｒ  ＦＲ．１９９６  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ：Ｐｒｏｂｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ  ｕｐｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−８；Ｂｏｎｎｅｔ  Ｇ，Ｔｙａｇｉ  Ｓ，Ｌｉｂｃｈａｂｅｒ  Ａ，ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ  ＦＲ．１９９９．Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：６１７１−７６を参照のこと）。分子ビーコン（または、単純に「ビーコン」）は、フルオロフォア（「Ｆ」）２０をオリゴヌクレオチドのある位置（例えば、その５’末端）に、そしてクエンチャー（「Ｑ」）２２をオリゴヌクレオチドの別の位置（例えば、その３’末端）に有する、オリゴヌクレオチドである。図３ａを参照のこと。図３ａに示されるように、フルオロフォア２０は、蛍光シグナルを発することができる。なぜなら、それは、クエンチャー２２により妨害されていないからである。しかしながら、ビーコン１８の５’末端と３’末端とは、それらが相補的な塩基を有することにより自己ハイブリダイズすることができる。図３ｂを参照のこと。５’末端と３’末端とがハイブリダイズするか、または緊密に接近する場合に、クエンチャー２２がフルオロフォア２０をクエンチし、それによってシグナルが生成されることを防止する。
【００４１】
本発明の方法において、少なくとも２つの異なる分子ビーコンを使用する。ある分子ビーコンは、「０」を表す設計モノマーにハイブリダイズする一方で、別の分子ビーコンは、「１」を表す設計モノマーにハイブリダイズする。設計モノマー「０」にハイブリダイズする分子ビーコンは、シグナル（例えば、フルオロフォア）を含み、このシグナルは、設計モノマー「１」にハイブリダイズする分子ビーコンとは異なる。例えば、分子ビーコン「０」（すなわち、設計モノマー「０」にハイブリダイズする分子ビーコン）はフルオロフォア「Ｆ０」を有し得、分子ビーコン「１」はフルオロフォア「Ｆ１」を有し得る。これらの両方は、互いに異なりかつ識別可能なシグナルを発する。
【００４２】
一局面において、ビーコンと設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントは、約９０％以上である。別の局面において、設計モノマーに対するビーコンのハイブリダイゼーションのパーセントは、約８０％〜約９０％である。なお別の局面において、設計モノマーに対するビーコンのハイブリダイゼーションのパーセントは、約７０％〜約８０％である。さらなる局面において、設計モノマーに対するビーコンのハイブリダイゼーションのパーセントは、約６０％〜約７０％である。
【００４３】
図４は、ＢＤＰ複合体２４を形成する、分子ビーコン「Ｍｌ」１８’’または「Ｍ０」１８’と一本鎖の設計ポリマー２４とのハイブリダイゼーションを示す。このＢＤＰ複合体２４において、Ｍｌ分子ビーコン１８’’は設計モノマー「１」１２’’にハイブリダイズする一方で、Ｍ０分子ビーコン１８’は設計モノマー「０」１２’にハイブリダイズする。図４に示されるように、Ｍ１分子ビーコン１８’’はフルオロフォア「Ｆｌ」を有するが、Ｍ０分子ビーコン１８’はフルオロフォア「Ｆ０」を有する。これらの２つのフルオロフォアは、異なる波長のシグナルを発する（例えば、Ｆｌは青色を発し得る一方で、Ｆ０は橙色を発し得る）。
【００４４】
本方法は、二進コードベースのポリマー（すなわち、設計ポリマー）への標的ポリヌクレオチドの変換を包含するので、本方法は２つのフルオロフォアのみを必要とする。一方のフルオロフォアは「０」を表し、他方のフルオロフォアは二進コード「０」＋「１」の「１」を表す。当業者は、他のシグナル分子を、本明細書に記載されているものと矛盾することなく使用し得ることを認識する。
【００４５】
ここで、ビーコン−設計ポリマー複合体がナノ細孔システムに導入され得る。本発明のナノ細孔システム（例えば、細菌のα溶血素（α−ＨＬ）のようなタンパク質チャネル）を使用して、ポリヌクレオチドの長さおよび配列についての情報を取得し、細孔の改変された部分に対する種々の分析物の確率論的な結合動態（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を検出することができる。Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ，Ｊら、１９９６，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９３，１３７７０−３；Ａｋｅｓｏｎ，Ｍ．ら、１９９９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７７，３２２７−３３；Ｍｅｌｌｅｒ，Ａ．ら、２００１，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９７，１０７９−１０８４；およびＭｅｌｌｅｒ，Ａ．ら、２００１，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ，８６，３４３５−３８（これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用される）を参照のこと。一局面において、ポリヌクレオチドは、一本鎖の分子（例えば、一本鎖の設計ポリマー）である。複数のナノ細孔を使用し得、そして多くの設計ポリマー、それゆえ多くの標的ポリヌクレオチドの分析を可能とし得ることに留意することが重要である。一局面において、ナノ細孔システムに使用される細孔の個数は、５個〜約１０個の範囲に及ぶ。より多くの細孔を使用することができることが当業者により認識されるはずである。
【００４６】
ナノ細孔システムは、設計ポリマーを受容し、所定のプロトコルに基づいてそれらを分析することができる。ナノ細孔システムは、当該分野で周知の種々のデバイス（検出器が挙げられる）を備え得る。ナノ細孔システムを分子（例えば、レセプターなど）に結合させてもよい。
【００４７】
当業者は、当該分野で周知の方法を利用し、薬品（または、ペプチド）（例えば、ナイスタチン）；イオノフォア（例えば、Ａ２３１８７（Ｃａｌｃｉｍｙｃｉｎ）、ＥＴＨ  ５２３４、ＥＴＨ  １５７（全てＦｌｕｋａ，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，Ｎ．Ｙ．から利用可能な薬品））；ペプチドチャネル（例えば、Ａｌａｍｅｔｈｉｃｉｎなど）を使用して、化学的なチャネルまたは細孔を脂質二重層中に形成することができることを認識する。
【００４８】
本発明の範囲内であるナノ細孔システムとしては、米国特許第５，７９５，７８２号、同第６，０１５，７１４号、ＷＯ  ０１／８１８９６  Ａ１、およびＷＯ  ０１／８１９０８  Ａ１（これらの教示は、参考として本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。
【００４９】
本発明のナノ細孔システムは、細孔分子（例えば、バクテリオファージλ（ＬａｍＢ）またはα溶血素に対するレセプター）を有し得る。ナノ細孔システムに使用される装置は以下を備える：（ａ）イオン伝導性細孔またはチャネル；（ｂ）設計ポリマーを特徴付けるのに必要な試薬；および（ｃ）設計ポリマーが細孔に侵入し前進するにつれての、細孔を横切ってのコンダクタンスの変化を検出するための記録機構。種々の電子デバイスが利用可能である。それらは、本発明に使用される測定を実行するのに十分に感度がよく、コンピュータによる取得の収集（ｒａｌｅｓ）能力および保管能力は、迅速な速度の配列データの蓄積に適している。
【００５０】
他の細孔形成タンパク質としては、グラミシジン（例えば、グラミシジンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＳ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ由来；Ｆｌｕｋａ，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，Ｎ．Ｙ．から利用可能）；バリノマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｌｖｉｓｓｉｍｕｓ由来；Ｆｌｕｋａから利用可能）、大腸菌、赤痢菌属および他の腸内細菌科由来のＯｍｐＦ、ＯｍｐＣまたはＰｈｏＥ、Ｔｓｘ、Ｆ線毛、およびミトコンドリアポーリン（ＶＤＡＣ）が挙げられる。
【００５１】
本発明で有用なチャネルおよび細孔は変動し得る（例えば、最小の細孔サイズは約２ｎｍ〜９ｎｍである）。ポリマーを引き込む細孔サイズは、例えば、一本鎖のＤＮＡに対して、約０．５ｎｍ〜２．０ｎｍである。
【００５２】
同一のメンブレンに包埋された複数の細孔が存在してもよい。同一のメンブレンに包埋された多くの細孔（例えば、ナノ細孔）の組み合わせ、または「ナノ細孔アレイ」により、本発明に記載の光学的な読み取りプラットフォームは、大量の並行するシグナルの読み取りに適している。最近、研究者は、最先端の電子増幅ＣＣＤカメラを使用して、毎秒２００フレームより速いフレームレートで２５６×２５６画素領域の読み取りを達成できることを示した。重要なことに、このフレームレートで、個々のフルオロフォアから発せられる光を解析し得ることが示されている。このことは、高度に並行化された（ｐａｒａｌｌｅｌｅｄ）読み取りを達成できることを実証する。原理上は、半導体（ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ）フィルム内に製造された１００×１００個の細孔のアレイは、単一のＣＣＤカメラを使用して画像化され得る。したがって、読み取りのスループットは、単一のナノ細孔のスループットと比較して、約４桁の大きさで加速され得る。
【００５３】
ヒトゲノムは、約３×１０９塩基対を含む。迅速かつ安価なゲノム配列決定を可能にする方法は、高度に並行化されなければならない。一局面において、１つのナノ細孔あたり、毎秒５００塩基の本発明の読み取り速度は、１００×１００個の細孔を含む単一のチップ内で、全部で毎秒５×ｌ０６ヌクレオチドの読み取りをもたらす。このことは、約１０分以内にヒトゲノム全体を単回で読み取ることに等しく、最先端の方法よりも、４〜５桁の大きさでの増大である。
【００５４】
改変された電位型チャネル（天然か、または不活化を除去するための改変後のいずれか）もまた本発明で使用することができ、かつ、例えば、ポリメラーゼの付着（組換え融合タンパク質）に適した物理的パラメータを有するか、またはポリマーの通過に適した細孔の直径を有する。電位型チャネルの不活化特徴を変更する方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｐａｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９０５−０９（１９９２）；Ｗｅｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１０−１４（１９９２）；Ａｕｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：３２３−２７（１９９０）；Ｌｏｐｅｚら、Ｎｅｕｒｏｎ，７：３２７−３６（１９９１）；Ｈｏｓｈｉら、Ｎｅｕｒｏｎ，７：５４７−５６（１９９１）；Ｈｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：５３３−３８（１９９０）（これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。
【００５５】
本方法の一局面において、ナノ細孔はα−ＨＬである。米国特許第６，５２８，２５８号（これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用される）を参照のこと。
【００５６】
α−ＨＬ細孔は、２つの主要な部分から構成される：約２．５ｎｍの直径の空洞（「前庭」）および約１．５ｎｍの直径のチャネル（「基部（ｓｔｅｍ）」）（これは細胞膜を貫通している）。二本鎖のポリヌクレオチドドメインは、２．５ｎｍの前庭部分に留まることができるが、１．５ｎｍのチャネルには侵入することはできない（ｄｓＤＮＡの直径は大体２．２ｎｍである）。最近、短い平滑末端ＤＮＡヘアピン（３〜８塩基対）の開閉（ｃｌｏｓｉｎｇ−ｏｐｅｎｉｎｇ）動態が、ナノ細孔を使用して、α−ＨＬの前庭にヘアピンを留まらせ、ヘアピンの熱的に活性化された開口に必要とされる時間を検出することによって、直接測定され得ることが実証されている。ヘアピンの自発的な開口の際に、一本鎖のＤＮＡは１．５ｎｍのチャネルに侵入し、細孔を通って流れるイオン電流の短時間（だが、識別可能な）の遮断を生じ、それによって、ヘアピン（または、二本鎖ポリヌクレオチド）の滞留からその最初の開口までの時間間隔の検出を可能にする。
【００５７】
図５を参照して、ビーコン−設計ポリマー複合体２４’は、ナノ細孔システム２６に導入される。示されるように、設計ポリマー１６’’の一本鎖２８が、ナノ細孔システム２６の細孔３０を通過する。一局面において、一本鎖部分は、設計ポリマー１６’’の３’末端である。一本鎖２８（設計ポリマー１６’’）の移動のための駆動力は、ナノ細孔２６を横切って確立される電場により提供される。２つの電極を使用することにより、電場を印加および使用して、二本鎖のビーコン−設計ポリマー複合体２４’を「解離させる」。この電場（ｆｉｅｌｄ）はまた、生じる一本鎖の設計ポリマー１６’’がナノ細孔に侵入するための駆動力を提供する。解離が起こるにつれ、分子ビーコンの部分３２、３４は、システム２６自身のチャネル３０においてか、またはその近傍で、設計ポリマー１６’’との相互作用から遊離される。最初の先導する（ｌｅａｄｉｎｇ）ビーコンがＢＤＰ複合体２４’から外れるにつれて、それに続くフルオロフォアが最初のビーコンのクエンチャーから遊離され、それにより、フルオロフォアが発光し得、適切な検出器により検出され得る。例えば、図５における分子ビーコン３２は、クエンチャー２２’’を有し、これは、フルオロフォアＦ２  ２０’’のシグナルをクエンチし、分子ビーコン３４上に位置する。最初の分子ビーコン３２が解離され、Ｂ−Ｄ複合体から外れる場合、フルオロフォアＦ２  ２０’’は、クエンチャー２２’’の作用から遊離され、それによりそのシグナルを発する。図５ｂを参照のこと。最初の分子ビーコン３２は自己ハイブリダイズし、その結果、そのクエンチャー２２’’部分が、そのフルオロフォアＦ１  ２０’をクエンチする。この自己クエンチ機構は、バックグラウンドのノイズを最小限にする。このプロセスは、設計ポリマー１６’’全体が分析されるまで反復させることができる。
【００５８】
まとめると、設計ポリマーからハイブリダイズしたビーコンを解離（または、融解（ｍｅｌｔ  ｏｆｆ））させるために、電圧ランプ（ｒａｍｐ）を印加するのと同時に、（設計ポリマーへ）ハイブリダイズした分子ビーコンの一番目のフルオロフォアが検出され、記録される。先に記載されるように、解離は、電圧ランプの開始からほぼ１０ｍｓ後に生じ、フルオロフォアの記録に十分な時間を提供する。解離は、最初のビーコンの遊離と、設計ポリマーにハイブリダイズした次のフルオロフォアの即時の露出（クエンチされないこと（ｕｎ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ））をもたらす。遊離されたビーコンは、直ちに自己ハイブリダイズし、そして自身のフルオロフォアを自己クエンチングする。蛍光強度（２つの色のうちのいずれか）の変化は、次の電圧ランプの印加により検出および誘発される。このサイクルは、設計ポリマー全体が読み取られるまで反復する。一局面において、設計ポリマーはヘアピンを有する。最終的なヘアピンは、設計ポリマーの５’末端に配置され、分子が一方の方向（すなわち、一本鎖の３’末端）でのみ、ナノ細孔システムに侵入することを強いる。ナノ細孔システムへの、かつそれを通っての設計ポリマーのトランスロケーション完了の際に、イオン電流が開口（ｏｐｅｎ）細孔レベルに上昇し、光学系（以下で考察される）は、ポリマーの読み取りが終了したこと（ＤＮＡが細孔を通過したこと）を検知する。
【００５９】
ＤＮＡのより長い二本鎖ヘリックスドメイン（５０ｂｐ）の力（ｆｏｒｃｅ）に誘発される解離は、α−ＨＬの細孔を使用して実証されている。Ｓａｕｅｒ−Ｂｕｄｇｅ，Ａ．Ｆ．ら、２００３，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．，９０，２３８１０１（これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用される）を参照のこと。特徴的な通過（細孔への一本鎖の滑走（ｓｌｉｄｉｎｇ）を含む）時間とそれらの解離時間とが、印加される電圧（１４０ｍＶ〜１８０ｍＶの範囲）に対する指数関数的な相関関係にしたがうことが見出されている。したがって本発明において、ビーコンを解離させるために印加される電圧を、繊細な制御パラメータとして使用して、（ＤＮＡに沿う連続的なビーコンの）各々の解離工程の間の時間遅延を決定することができる。このことは、本発明者らの最近のデータにより詳細に示されている（図１０〜図１５）。
【００６０】
電圧に制御される解離は、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｍａｔｈｅ  Ｊ．ら、２００４  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８７，３２０５−１２（この全体の教示は、参考として本明細書に援用される）に記載されている。この論文は、長い相補的な一本鎖のＤＮＡにハイブリダイズした短いオリゴヌクレオチド（約１０塩基）が、電圧に制御される様式によりナノ細孔内で解離され得、この解離プロセスの特徴的な時間スケールが電圧に強く依存し、さらに、この時間を、１ｍｓ〜１０ｍｓの範囲内であるように選択することができることを実証する。この時間スケールは、非常に重要であり、これは、以下のことを示す：（ａ）細孔内のＤＮＡのトランスロケーション速度を制御することができ、特に、これは、ＤＮＡプローブの解離により減速され得る。トランスロケーションが減速される量は、ＤＮＡとハイブリダイズしたプローブとの相互作用の強さおよび印加された電圧に指数関数的に依存する。したがって、プローブの配列を選択することにより、異なるレベルの「減速」を達成することができる。印加される電圧を使用して、解離、それゆえトランスロケーション速度を調整することができることも示されている。ＤＮＡトランスロケーションの減速は、この分野において長年にわたる課題である；ならびに（ｂ）研究者は、単一のフルオロフォアの光学的な検出に適合する速度（１塩基あたり、０．１ｍｓ〜５０ｍｓ）の範囲までトランスロケーションを減速することができた。この減速がない場合、読み取り時に光子のノイズが著しく目立ち、既存の技術を使用して、単一のフルオロフォアの読み取りを実現することはできない。
【００６１】
本発明にしたがう使用のための光学因子（ｏｐｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）は、例えば、クエンチャー分子と近接した場合にクエンチされる蛍光分子を含む。蛍光および、この挙動を示す他の型の分子、ならびにこれらの化合物の特定の特性（例えば、蛍光減衰時間、吸光スペクトル、発光スペクトル、光安定性、および量子効率）を記載する、広範な文献が利用可能である（例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１；Ｌａｘｏｗｉｃｚ，ＪＲ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（第２版），Ｋｌｕｗｅｒ  ａｃａｄｅｍｉｃ  １９９９（これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。蛍光のクエンチングの詳細な説明が利用可能である（例えば、Ｋａｖａｒｎｏｓら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．８６：４０１，１９８６；Ｗａｇｏｎｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４６：３６２，１９９５；Ｍｉｌｌａｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：６３７，１９９６；Ｐｅｔｉｔら、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ７８：１，１９９３（これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用される））。
【００６２】
近年、単一の蛍光分子の検出において、大きな進展がなされている（例えば、Ｍａｔｈｉｓら、Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ５：１１６−１２８，１９９７；Ｈａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６２６４−６２６８，Ｊｕｎｅ  １９９６；Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：６０７，１９９６；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２６２：７１６，１９９６；Ｓａｕｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２５４：２２３，１９９６（これらの全体の教示は、参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。このような分子は、特徴的な蛍光減衰時間を有し、かつ分子の電子的な環境に感受性であり、それゆえ、その環境を変更するポリマーとの会合よりクエンチされ得る。
【００６３】
本発明において使用することができるフルオロフォアの例としては、ＴＭＲおよびＣｙ５が挙げられる。使用され得る他の型の蛍光分子は、ＣＰＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．からのＡｌｅｘａシリーズの蛍光マーカー、ローダミンファミリー、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄである。当業者に公知の他のシグナル分子は、本発明の範囲内である。本発明において、多くの他のフルオロフォアが使用され得、それらとしては、米国特許第６，５２８，２５８号（この全体の教示は、参考として本明細書に援用される）に列挙されるものが挙げられる。
【００６４】
本発明で使用され得るクエンチング分子としては、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）、メチルレッドおよびＥｌｌｅ  ＱｕｅｎｃｈｅｒＴＭが挙げられる。当業者に公知の他のクエンチャー分子は、本発明の範囲内である。
【００６５】
本発明で使用される検出システムは、使用されている光学因子に依存する。検出システムは、本明細書に記載の配列決定法に関連する、時間スケール上での光学因子の光学特性の変化を検出することが可能でなければならない。一局面において、フルオロフォアは、光学因子として使用される。したがって、適切な蛍光検出器が妥当である。当業者は蛍光検出器を熟知する。
【００６６】
図６を参照して、パネル（ａ）は、印加された電圧  対  時間（ミリ秒）を示す。単一のナノ細孔チャネルを通って流れるイオン電流のリアルタイム分析において、一本鎖のポリヌクレオチドが細孔に侵入するのにつれて、ナノ細孔システムの電圧ランプが引き起こされる。ナノ細孔への一本鎖のポリヌクレオチドの侵入（細孔電流の急落により合図される）から約０．１ｍｓ以内に、電圧は「保持（ｈｏｌｄｉｎｇ）」レベルへ低下し、その後一定の割合で上昇する。図６ｂは、測定された、細孔を通るイオン電流を示す。チャネルへ分子の一本鎖部分が侵入した後、細孔電流は、その閉鎖（ｂｌｏｃｋｅｄ）レベル（開口細孔電流の約１０％または約１０ｐＡ）まで低下する。電圧ランプが始まると、電流は最初は、閉鎖レベルに留まるが、ｔ〜１０ｍｓにおいて、電流が開口細孔レベルまで急激に上昇する。なぜなら、二本鎖ポリヌクレオチドが解離し、迅速に細孔を通過するからである（細孔の通過は、０．０５ｍｓ未満続く）。解離電圧（破線）は、容易に測定することができる。
【００６７】
図７を参照して、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）により表される４つの異なる工程が示され、これらはサンプルポリヌクレオチドの代表的な分析において生じる。これらの工程は、配列決定が完了するまで反復され得る。上部のパネルは、ナノ細孔チャネル３０を通ってのＢＤＰ複合体  ２４’’の侵入および移行を示す。中央のパネルは、光子カウント／ｍｓ  対  時間を示し、そして下部のパネルは、記録されている電圧を示す。
【００６８】
工程（Ａ）において、設計ポリマー２８’の一本鎖の突出が、電場により引き入れられるにつれて細孔３０’が侵入する場合に、読み取りを開始する。細孔３０’を通って流れるイオン電流の急激な低下（これは、設計ポリマー２８’の侵入に起因する）は、以下により読み取りを始動させる：１）「駆動（ｄｒｉｖｉｎｇ）」レベルから「保持（ｈｏｌｄ）」レベルまで電圧を低下させ、最初の電圧ランプを開始すること；および２）例えば、蛍光分析用のレーザーの電源を入れる。設計ポリマーにハイブリダイズした最初のビーコンはクエンチされないので、それに対応する蛍光レベルの即時の上昇を引き起こす（中央パネルの薄いトレースとして示される）。代表的な解離時間は約１０ｍｓであることに留意すること。この時点で、最初のクエンチされていないフルオロフォアから発せられた光子が適切な検出器により記録される。
【００６９】
工程（Ｂ）は、最初のビーコン３２’が解離された直後に開始される。分子ビーコン３２’の解離は、一本鎖の設計ポリマー１６’’’がナノ細孔２６のさらに内部へ移動することを可能にする。この解離プロセスは、分子ビーコンを遊離することにより、次のフルオロフォアがクエンチされないことをもたらす。遊離したビーコンは、熱力学的な力によって自動的に自己ハイブリダイズし、それゆえ、ビーコン自身のフルオロフォアがクエンチされる。自己ハイブリダイズしたビーコンは、最終的に拡散する。有利なことに、この特徴は、バックグラウンドのノイズを回避するか、最小限にするのに役立つ。生じる蛍光シグナル（中央パネル）は、フルオロフォア３４に対応する赤色（暗色）発光の増大、ならびに分子ビーコン３２’の喪失および自己ハイブリダイゼーションに対応する橙色（明色）発光の低下を示す。ビーコンが自己クエンチするのにかかる限定された時間によって、最初のビーコン３２’のクエンチングにわずかな遅延（約５０μｓ）が存在する。このわずかな遅延時間の間に、移行を正確に指し示すのに使用することができる、フルオロフォア３２’と３４との両方からの蛍光強度が存在し、これを、  電圧ランプを始動させるのに使用することができる。
【００７０】
工程（Ｃ）において、最初のビーコン３２’に対する類似の読み取りが存在し、これは、より明るい線により示される。同一の型に由来する両方のビーコンが読み取られる工程（Ｃ）と工程（Ｄ）との間に、橙色の強度（明灰色）に一過的な急上昇（ｓｐｉｋｅ）が存在することに留意すること。これは、先に説明されるように、２つのフルオロフォアの寄与に起因する。この方法で、システムは、設計ポリマー全体を読み取る。設計ポリマー１６’’’がその５’（その３’ではなく）から細孔に侵入することを防止するために、７塩基のヘアピン３６を、設計ポリマー１６’’’の変換プロセスの間に付加することができる。このヘアピン２６は、最終的に解離され、設計ポリマー１６’’’がナノ細孔システム２６の内部または前庭へ完全にトランスロケーションすることを可能にする。
【００７１】
本発明はまた、ポリヌクレオチドの配列を決定するための装置にも関する。メンブレンに包埋されたナノ細孔の内部を通過した、個々のＤＮＡ分子からの蛍光シグナルの検出のための光学系３００が、本明細書に記載される。
【００７２】
図８は、本発明の配列決定法と組み合わせて使用することができる光学系３００の概略図であり、ここで、システム３００は、光学的なシグナルの検出に必要とされる構成要素を備える。詳しくは、図８は、１つ以上の二重層メンブレンを使用する、単一の分子の光学的な検出のための光学的な構成を示す。
【００７３】
本光学系３００は、ナノ細孔支持体３０４と２つの電極３０６および３０８とを含む特製のフローセル３０２を備える。電極３０６および３０８を使用して、解離プロセスに必要な電場を印加する一方で、支持体３０４は、ガラスカバースリップ３１２の近位にリン脂質二重層３１０を懸架することを可能にし、それにより、高倍率の顕微鏡の対物レンズ３１４を使用して二重層３１０の画像化を可能にする。フローセル３０２を、特製の倒立顕微鏡内のＸＹＺナノポジショナー３１６にマウントされ、平行移動ステージを使用して、光軸２０８と正確に位置合わせするために移動され得る。
【００７４】
フルオロフォアは、ダイオードレーザー３１８から光学系３００へ放射された光により励起され得る。レーザー３１８は、単一モード、偏光保存性光ファイバー３２０と連結された、５３２ｎｍの半導体レーザー（例えば、Ｎｅｗ  Ｆｏｃｕｓ  ３９５１−２０またはＰｏｉｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｉＦＬＥＸ  ２０００）であり得る。レーザー光は、ミラー３２１を介して、自家製（ｈｏｍｅ  ｍａｄｅ）の調整可能なビームエクスパンダー（５×）３２２に向けられ、拡大され、ミラー３２４および３２６ならびにダイクロイックミラー３２８（Ｃｈｒｏｍａ  ｚ５３２  ｒｄｃ）を使用して、対物レンズ３１４の背後の開口部に向かう。
【００７５】
レーザー光は、対物レンズ３１４の焦点でわずかに拡大され、より大きな照射面積を可能にする。ビームの拡大は、入射する拡大されたレーザー光を顕微鏡の対物レンズ３１４への入り口でわずかに発散させることにより達成される。ビームエクスパンダー３２２上のレンズの一つを他方のものに対して動かすことにより、ビームは、対物レンズ３１４の焦点でわずかに焦点を外され（ｄｅｆｏｃｕｓｅ）、より大きな照射面積（約１０μｍ）を達成する。蛍光の発光は、同一の対物レンズ３１４を使用して収集され、ロングパス（ｌｏｎｇ  ｐａｓｓ）フィルター３３０（Ｃｈｒｏｍａ  ｈｑ５６０  ｌｐ）を使用してフィルター処理される（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）。次に、光は、フレーム転送バック照射（ｂａｃｋ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ）冷却ＣＣＤカメラ３３２、または、まずピンホール３３４に光の焦点をあわせ、２つの高速検出用のアバランシェ光ダイオード点検出器３３６および３３８（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳＰＣＭ  ＡＱＲ−１４）上でピンホールを画像化することのいずれかにより画像化される。光学系３００（励起経路と発光経路を除く）は、遮蔽された銅製の箱（示さず）に完全に封入され、ひろいあげる電磁気ノイズを低減する。ＣＣＤカメラを使用することにより、数個の細孔が、同時に画像化されること可能にし、それにより検出システム３００のスループットを増大させる。
【００７６】
機器制御およびデータ収集のソフトウェアを使用して、自動的な位置決めおよび単一の分子の画像化ならびにリアルタイムのナノ細孔力（ｆｏｒｃｅ）分光法を制御する。蛍光と電流との両方のデータ収集のための主要なトリガーは、ナノ細孔３０２に侵入する単一の分子の閉鎖電流シグナルである。ハードウェアの電気機器は、以下の３つのＰＣボードを備える：ＰＺＴコントローラを有するインターフェースへの高速デジタルＩ／Ｏ（Ｐｈｙｓｉｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ  ＰＩ−Ｅ７１０）、光子計数ボード（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＰＣＩ−６６０２）、およびイオン電流をサンプリングし、細孔を横切ってのプログラム可能な電圧勾配を生成する高速Ａ／Ｄボード（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＰＣＩ−６０５２Ｅ）。
【００７７】
機器は、約２０μｍのリン脂質二重層を水平に支持し、緩衝溶液を交換するために使用される特製の微小流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）セルから構成される。図９を参照して、微小流体セル４０２が示され、これは、以下を備える：（ａ）石英基板４０４、（ｂ）特製の（ｃｕｓｔｏｍ  ｍａｃｈｉｎｅｄ）ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）フィルム４０６、（ｃ）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のチャンバー４０８、（ｄ）覆い４１０、ならびに（ｅ）電極４１２および４１４。２０〜３０μｍの開口部４１６は、機械的なインプリントによりＰＴＦＥフィルム４０６内に製造される。挿入図４１６は、ＲＮＡ分子４２２を含むメンブレン４１８とα−ＨＬ細孔４２０とを示し、メンブレン４１８は、開口部４１６により支持される。
【００７８】
図１０は、ＰＴＦＥフィルム４０６内に製造された約３０μｍの開口部４１６のＳＥＭ像を示す。メンブレン４１８は、１２μｍ厚のテフロン（登録商標）フィルム４０６内の円状開口部４１６に懸架され、約１００μｍ、ガラスカバースリップ４２４の上方にある。このことは、６０×／１．２  Ｎ．Ａ．水浸顕微鏡対物レンズ４２６（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＵＰＬＡＰＯ６０ＸＷ）を使用して、メンブレン４１８の高分解能の蛍光画像化を可能にする。これは、油浸を使用する先行技術の設計とは対照的である。油浸対物レンズではなく水浸顕微鏡対物レンズ４２６（高ＮＡ）を使用することは、より長い作業用距離を提供する（約２５０μｍ）。テフロン（登録商標）フィルム４０６は、特別なチュービング（ｔｕｂｉｎｇ）による流体の交換に利用できる２つの小型のチャンバー４２８と４３０（それぞれ約５０μｌ）とを分ける。２つのＡｇ／Ａｇ−Ｃｌ電極４１２および４１４は、流体チャンバー４２８および４３０と接触し、高分解能のパッチクランプ上部ステージ（ｈｅａｄ−ｓｔａｇｅ）の増幅器（示さず）（例えば、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ２００Ｕ）に接続される。これらを使用して、メンブレンを横切っての電圧を印加する。
【００７９】
図９を参照して、ナノ細孔（例えば、α−ＨＬ細孔４２０）は、文献（例えば、Ｍｅｌｌｅｒ，Ａ．ら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７，１０７９−１０８４；Ｍｅｌｌｅｒ，Ａ．ら、（２００１）Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．８６，３４３５−３４３８（全て、参考として援用される）を参照のこと）に記載される方法を使用して、メンブレン４１８に包埋され、そして細孔４２０を通って流れるイオン電流が、パッチクランプ増幅器を使用して測定され、リアルタイムで分析される。先に検討されるように、セル４０２は、ＸＹＺナノポジショナー（例えば、Ｐｏｌｙｔｅｃ  ＰＩ−Ｐ５２７．３ＣＬ）上にマウントされ、対物レンズの視野でセル４０２とナノ細孔４２０とを正確に位置合わせし、シグナルのリアルタイム分析に基づいて側面で蛍光標識されたナノ細孔４２０を追跡することを可能にする。
【００８０】
メンブレンセルの少なくとも２つの異なる実施形態が存在し、これらは本発明の範囲内である。メンブレンセルは、上部の流体チャンバーおよび下部の流体チャンバーを有する特製のＰＤＭＳガスケットにテフロン（登録商標）フィルムを包埋することによって作製され得る。ＰＤＭＳガスケットは、支持プラスティックキャップに収容される。セルは、幅約２５ｍｍ、厚み約３ｍｍである。これは、チュービングを使用するのに利用可能な下部チャンバー（約１０μｌ）を備える。下部チャンバーのＡｇ／ＡｇＣｌ電極およびテフロン（登録商標）フィルムは、ＰＤＭＳガスケットに包埋される。セルは、ガラスカバースリップにより底面から覆われ、このガラスカバースリップを通して画像化が行われる。
【００８１】
あるいは、メンブレンセルは、２つの同軸シリンダー、上部チャンバーおよび下部チャンバーからなり得、これらは、互いに数ミリメータースライドし得る。上部チャンバーの底面において、テフロン（登録商標）フィルムは熱により融合される。上部チャンバーは、テフロン（登録商標）フィルムがカバースリップに達するまで、下部チャンバー内を自由にスライドし、顕微鏡により下から画像化され得る。約２０μｍの円状開口部が、脂質二重層を支持するために使用されるテフロン（登録商標）フィルム内に製造され得る。下部チャンバーは、幅約２０ｍｍのチャンバー（高さ６ｍｍ）であり、その底面に配置される薄いガラスカバースリップを支持する。セルは、流体チュービングと２つの電極とに接続される。
【００８２】
本発明の一実施形態は、所定のサンプルマトリクスにおいて、ポリマーの個数または量を定量化することに関する。例えば、ポリマーは、ポリヌクレオチドであってもよい。一局面において、所定のポリマーがサンプル内にあると推定される。この局面において、少なくとも一部の配列が既知である。この部分は、約５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド以上の範囲に及び得る。本発明の方法を使用して、設計モノマーは、目的のポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計され得、そして本明細書に記載されるナノ細孔システムを使用して、標的ポリヌクレオチドが検出および測定され得る。
【００８３】
本発明の別の実施形態は、サンプルマトリクスにおいて、ポリヌクレオチドの検出に関する。所定のヌクレオチド配列に特異的な設計モノマーが構築され得る。これらの設計モノマーは、ポリヌクレオチドを含むサンプルへ導入され得る。サンプルは、異種サンプルであっても、同種サンプルであってもよい。設計モノマーは、当業者に周知のハイブリダイゼーションに適切な条件下でサンプルに導入される。したがって、本発明の方法を使用して、所定の設計モノマーにハイブリダイズするポリヌクレオチドが単離および／または加工され得る。
【００８４】
特定のポリヌクレオチド配列の検出は、本発明の方法により達成され得る。例えば、ＰＣＲに使用されるポリメラーゼのフィデリティは１００％ではなく、それゆえＰＣＲを使用して生成されるポリヌクレオチドは、配列のフィデリティについてモニタリングされなければならない。本明細書に記載される方法を使用して、熟練者は、ポリメラーゼおよびＰＣＲプロセス全体のフィデリティを確かめることができる。標的ポリヌクレオチドの一部を反映し、続いて本方法を使用して配列決定され得る設計ポリマーを形成する、所定の設計モノマーが構築され得る。
【００８５】
一実施形態は、所定のポリヌクレオチド配列内の単一または複数の突然変異の検出に関する。標的配列が部分的に既知であるか、またはその全体が既知であると仮定すると、ポリヌクレオチド配列の試験を達成することができるように設計モノマーが構築され得る。設計モノマーは、設計ポリマーを形成するハイブリダイゼーションに適切な条件下で、推定標的ポリヌクレオチドを有するサンプルマトリクスに導入され得る。次に、この構築物は、配列決定のための本発明の方法に供され得る。突然変異は、１つ以上の設計モノマーのミスマッチにより反映される。
【００８６】
本発明の一実施形態は、情報の保管に関する。本発明が任意のポリヌクレオチド配列に対する二進コードを利用することを考えると、ヌクレオチド配列を、二進コードのみを使用して保存することができる。一局面において、設計ポリマーは、ちょうどコンピュータファイルのように数（「０」および「１」）の配列をコードするように設計され得る。ある意味では、ＤＮＡを、静的な、超高密度の保存媒体とみなすことができる。本発明のナノ細孔システムは、配列にコードされる情報を回収する（読み取る）のに有効な手段である。
【００８７】
本明細書に記載される方法は多くの実用的な応用を有し、これらは本発明から逸脱しないことが当業者により理解されるべきである。
【実施例】
【００８８】
（実施例：α−ＨＬを使用する、個々のＤＮＡヘアピン分子のナノ細孔解離）
時間依存的な電場によるナノ細孔測定（例えば、配列決定法）を可能にするために、解離法を開発した。本解離法は、解離電圧を可変にしたまま、細孔への侵入速度を最適化する高い電圧を使用する。したがって、数百の個々の分子を、短い間の時間（数秒間）で調べることができる。本方法は、ポリヌクレオチドの通過の間に、熟練者が、ナノ細孔を横切って印加される電場を迅速に変化させることを可能にする。
【００８９】
この解離法は、３０ｍＶ〜１５０ｍＶにわたる広範囲の電圧、そして異なる負荷速度（０．５Ｖ／ｓ〜１００Ｖ／ｓ）で、個々のＤＮＡヘアピン分子の解離動態を研究するのに特に有利である。さらに、本方法は、一定の力ではなく一定の負荷速度が印加される動態作用の測定を可能とする。これら２つの相補的な測定は、ＤＮＡヘアピンの小さなエンタルピー変化を１ｋｃａｌ／ｍｏｌに至るまで決定することを可能にする。
【００９０】
ＤＮＡヘアピンのナノ細孔解離プロセスには、以下の３つの連続的な工程が存在する：（Ａ）  それ自身の二本鎖（ヘリックス）部分がα−ＨＬの２．５ｎｍ前庭に滞留するまで、一本鎖のＤＮＡ突出（５０ｎｔ）が進入およびスライドすること；（Ｂ）  ヘリックス部分の解離；ならびに（Ｃ）解離された一本鎖部分が細孔を通ってトランスロケーションすること。
【００９１】
図１１〜１７を参照して、異なる電圧で、代表的な時間スケールを決定するための工程を特徴付けた。能動的な電圧制御法を使用することにより、突出の侵入（部分Ａ）は、その他の工程から切り離され得、そして、解離された鎖（部分Ｃ）のトランスロケーション時間は、代表的な解離時間より大幅に短いので、これを無視することができる。
【００９２】
最初に、実験により、１０ｂｐヘアピンの解離についての代表的な時間スケールがｓｓＤＮＡの通過時間よりもかなり短いことを示すことによって、電圧の関数として、細孔内の一本鎖のＤＭＡ（「ｓｓＤＮＡ」）通過に伴う時間スケールを特徴付けた。次に、３０ｍＶ〜１５０ｍＶの範囲に及ぶ定常（または、工程の作用）電圧についての解離動態の情報を示し、細孔内のＤＮＡ鎖についての有効電荷を決定した。最後に、実験により、負荷速度に対する解離動態の依存性を示した。データは、他の単一の分子（「ＳＭ」）解離（ｕｎｂｉｎｄｉｎｇ）実験のために開発されたものと類似する、単純な理論的なモデルを使用して解釈した。
【００９３】
（材料と方法）
ＰＡＧＥで精製されたｓｓＤＮＡおよびＤＮＡヘアピン（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．５溶液中で緩衝化させ、測定の前に、１０分間、７５℃まで加熱し、その後、４℃まで急冷した。ヘアピン分子は、３’の一本鎖の突出（５０マーのポリ−ｄＡ）、以下の配列（自己相補的な部分には下線が施してある）を有し、介在する６塩基ループを含む１０ｂｐのヘリックス部分から構成されている：
【００９４】
【化１】
2008509671.tif 000003
さらに、５’末端から５番目の塩基に単一の（ＴＴ）ミスマッチを有する、同様なヘアピン（ＨＰ２）を、以下の配列とともに調製した：
【００９５】
【化２】
2008509671.tif 000004
また、７ｂｐのヘリックスヘアピン（ＨＰ３）は、以下の配列を有する：
【００９６】
【化３】
2008509671.tif 000005
（水平に支持された平面状脂質二重層にα−ＨＬチャネルを再構成するのに使用される基本的な装置および実験法は、先に記載される）。システムの温度を、特注のセル設計を使用して、１５．０±０．１℃に維持した。緩衝溶液は、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８．５であった。これらの条件下でのα−ＨＬ開口細孔コンダクタンスは、順方向バイアス（ｆｏｒｗａｒｄ  ｂｉａｓ）で０．８２ｐＳであった。パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ，Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、イオン電流を測定し、１００ｋＨｚローパス（ｌｏｗ−ｐａｓｓ）４極Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈフィルター（Ｋｒｏｈｎ  Ｈｉｔｅ  ３３０２，Ａｖｏｎ，ＭＡ）を使用して、シグナルをフィルター処理した。ＤＡＱカードを使用して、シグナルを１ＭＨｚ／２２ビットでデジタル処理した。全ての制御ソフトウェアおよび取得ソフトウェアを、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ’Ｌａｂ  Ｖｉｅｗを使用して作成した。装置は、膜を貫通する印加電圧を制御するために使用するフィードバックループを内蔵する。制御電圧による、工程に対する膜電位の応答時間は、４±１μｓであった。各々の実験（電圧または電圧ランプにより設定される所定の条件で実行された）において、代表的にデータを、１，０００回より多い解離事象を収集した。ソフトウェアおよびハードウェアは、高スループットの無人のデータ収集を可能にし、その結果、各々の実験についての総取得時間は約１０分間であった。
【００９７】
各々の解離事象は、以下の３つの部分からなる：１）ヘリックス部分がα−ＨＬの前庭の内部に引っかかるまで、一本鎖の突出が通過およびスライドすること；２）低電圧で細孔内にヘアピンを保持すること；および３）二本鎖ＤＮＡを解離させること。
【００９８】
第一の部分と第二の部分とを設計して、第三の部分のためのシステムを調製し、その結果、解離が、細孔に対する分子の所定の構成で常に開始する。
【００９９】
あらゆる単一の分子の実験と同様に、分子間または事象間のバリエーションは不可避である。コントロールの測定のセット（以下に記載される）が存在し、データの散乱を低減するために、多数回の解離実験を反復した。解離部分は、以下の２つの型の測定からなった：定常の力での解離、および固定の負荷速度での解離。これらの実験は、「結果」のセクションで記載される。
【０１００】
最初の２つの部分（スライドおよび保持）について選択した電圧および時間は、全ての実験において変えなかった。図１１は、一定の力で実行した代表的な解離事象の最初の数ミリ秒（ｍｓ）を示す。上部のパネルは、時間の関数として印加される電圧を示し、下部パネルは、生じた細孔電流である。事象は、細孔内での一本鎖のポリ（ｄＡ）末端の通過から始まる。チャネルへのポリヌクレオチドの侵入は、開口細孔電流の急激な低下により検出され、これは取得システムのトリガーを作動させ、かつｔ＝０の点（破線）を規定する。分子は、Ｖ＝２２０ｍＶでチャネル内に、ｔｄ＝３００μｓの時間で引き込まれる。結果に示されるように、この時間は、４０マーのＤＮＡについて最も可能性のあるトランスロケーション時間（ｔｐ）よりもわずかに長いように選択した。したがって、ｔ＝ｔｄにおいて、大半のＤＮＡヘアピンがα−ＨＬの前庭内に完全に滞留することが予測される。この仮定を、以下の２つの相補的な測定により確かめた：最初の実験において、ｔｄは５０〜７００μｓまで変動し、ｔ＝ｔｄにおいて、Ｖ＝−１２０ｍＶへの電圧の逆転に際しての、遊離（ｅｓｃａｐｅ）時間の分布を測定した。５０μｓと３００μｓとのｔｄ値の間に分子が細孔から引き抜かれるのに必要とされる代表的な時間に単調な増加が存在した。しかし、ｔｄ＞３００μｓに関して、曲線は一定のレベルに飽和し（ｓａｔｕｒａｔｅ）、このことは、ＤＮＡの一本鎖の突出がチャネルを通過し、その後、二本鎖のヘリックス部分が前庭に侵入した場合に停止したことを示した。さらに、証拠は、ｔｄの間における、閉鎖イオン電流のレベルの分析から得られた。詳しくは、平均の電流（ｔｄ＝３００μｓ）は、明確な２つのピークを示した：約６ｐＡでの低電流の主要なピーク、および通常のポリ（ｄＡ）閉鎖レベル（約１１ｐＡ）における副次的なピーク。より低い電流のピークは、α−ＨＬの前庭を占めるヘアピンのヘリックス部分による、細孔のさらなる閉鎖に起因した。
【０１０１】
ｔ＝ｔｄ＝３００μｓでの解離したヘアピンの画分はほんのわずかであった。Ｖ＝１２０ｍＶでのヘアピン分子のトランスロケーションの確率分布を測定することにより、この画分を定量化した（データは示していない）。この分布から、ｔ＝ｔｄ＝３００μｓでの解離したヘアピンの画分は０．５％未満であることを推定した。ｔ＝ｔｄでのＤＮＡの最初のスライドに続いて、時間ｔＨ＝５００μｓの間、電圧を、低い「保持」電位（２０ｍＶ）まで低下させた。この電圧は、前庭内にヘアピンを保持するのに十分大きいが、以下に示されるデータから明らかなように、著しい解離を誘発するには小さいことが見出されている。５００μｓを選択したことは、便利ゆえであった（実験の別のセットにおいて、５秒間まで、ヘアピンを細孔に保持した）。保持期間の終わりにおいて、解離電圧であるＶＵ（または、負荷速度）
【０１０２】
【化４】
2008509671.tif 000006
を印加した。
【０１０３】
（結果）
（ｓｓＤＮＡのトランスロケーション時間の分布）
各々個々のＤＮＡのトランスロケーション時間（ｔＴ）は、α−ＨＬの細孔のチャネル部分内へ最初の数塩基のＤＮＡ分子の侵入から、チャネルの他方の側から分子が抜け出るまでの時間間隔として規定される。これらの事象は、開口細孔電流の約１０％までの、細孔を通って流れるイオン電流の急激な低下により明確に観察される。ヘアピンの場合に、ＤＮＡは、その一本鎖の３’突出によりチャネルに侵入することしかできない。なぜなら、その他方の末端のループは、細孔に侵入するには大きすぎるからである。この場合において、ｔＴは、上記の３つの連続的なプロセスの合計である（すなわち、ｔＴ＝ｔｓ１＋ｔｕｎｚｉｐ＋ｔｓ２、ここで、ｔｓ１は、一本鎖の突出（ポリ（ｄＡ）５０）のスライド時間であり、ｔｓ２は、解離したヘアピン＋ループ（２６塩基）のスライド時間であり、そしてｔｕｎｚｉｐは解離時間である）。
【０１０４】
図１２は、Ｖ＝１２０ｍＶおよび１５℃で測定される、一本鎖のＤＮＡ（ポリ（ｄＡ）９０）のトランスロケーション時間の分布を示す。ヒストグラムを約１，５００回の個々の事象から構築した。ｓｓＤＮＡの分布は、ｔＰ＝０．５ｍｓでの顕著なピークを示し、これを使用してプロセスを特徴付けた。ｔＴ＞ｔＰ＝０．５ｍｓ（最も可能性のあるトランスロケーション時間）の後、分布は、０．３２ｍｓの時間定数を有する、単一の指数関数にフィットする。先の研究は、ｔＰが塩基の個数（２２マー以上）とともに線形に上昇することを実証した。したがって、ポリ（ｄＡ）９０のトランスロケーション分布から、ｔｓ１が０．２８ｍｓ（０．５ｍｓ×５０／９０）であることを推定した。この時間は、同様な方法で測定されるＤＮＡヘアピンの特徴的なｔＴ（約２ｍｓ〜１０ｍｓ）（データは示していない）よりも大幅に短いことに留意すること。それにもかかわらず、以下に記載されるように、解離プロセスから最初のスライドを切り離すことが可能であり、それにより、ｔｓ１を完全に除去する。
【０１０５】
解離プロセスへのｔｓ２の寄与を、Ｖの関数として、ポリ（ｄＡ）のトランスロケーション時間の研究から推定することができる。これらの測定に基づいて、２６ヌクレオチドに関して、ｔｓ２は３０ｍＶで約６６０μｓ、１５０ｍＶで約１００μｓと推定される。電圧の関数としてのｔｓ２の推定値を、各々の事象で測定される解離時間全体から引くことができ、ｔｕｎｚｉｐについてのより正確な推定を得ることができる。この補正は小さく（以下参照のこと）、結果に影響しない。
【０１０６】
ｔｓ２の測定はまた、１ヌクレオチドあたりの平均スライド時間（例えば、１００ｍＶで６μｓ）についての考えを与える。以下に示されるように、この時間スケールは、細孔内での解離機構の解明に重要である。ヘアピンが細孔内で滞留される場合、その解離動態は、再会合（ｒｅ−ｚｉｐｐｉｎｇ）とスライドプロセスとの間の競合により影響される（解離したヌクレオチドは、ヘアピンと再会合（ｒｅｊｏｉｎ）し得るか、またはチャネルに沿ってスライドし得、それによって再会合をブロックする）。再会合時間と比べて、スライド時間が短い場合、再会合が阻害される。対照的に、スライド時間が長い場合、解離を完了する前に、ヘアピンは、開閉（ｏｐｅｎｉｎｇ−ｃｌｏｓｉｎｇ）の移行を頻発する。
【０１０７】
（１．一定の力での解離動態）
定常電圧（または、力）でのＤＮＡヘアピンの解離を研究した。電圧の急激な変化をナノ細孔を横切って印加し、そして解離動態を測定した。この実験で使用した代表的な電圧および電流のトレースを図１３に示す。ＤＮＡは、時間ｔ＝０でチャネルに侵入する。図１０に説明されるように、分子は、短時間の間、細孔内に引き込まれ、保持される。ｔ＝０．８ｍｓにおいて、解離電圧（９０ｍＶ）を印加するが、解離がｔ＝ｔＵ＝７０ｍｓ（電流の急激な上昇により示される）で生じるまで、電流はブロックされる（より低いレベル）。解離電圧ＶＵを印加すると、電流は、その適切な閉鎖細孔レベルまでわずかに上昇し（細孔電流の拡大図については、図１１を参照のこと）、ｔ〜７０ｍｓ（解離電圧の印加から測定される）まで、この閉鎖レベルに留まった。この時点において、電流は、この電圧に対応する開口細孔電流レベルまで急激に上昇した。解離したヘアピンのスライド時間は、図１３の時間スケールで決定するには短すぎるので、この移行は、ヘアピンの解離の瞬間を示す。１分間あたり約１００回の個別の解離事象を累積する自動化手順を使用して、解離プロセスを反復した。
【０１０８】
時間間隔［０〜ｔ］（ここで、ｔ＝０は、ＶＵが印加される瞬間として規定される）内で解離事象が生じる確率を計算することによって、データを分析した。この計算のために、約１０００回の解離事象を取得し、時間ｔを中心とする５０μｓの時間枠（ｔｉｍｅ  ｗｉｎｄｏｗ）内に測定された平均細孔電流をプロットした。電流の分布は、ブロックされた細孔の状態および空の細孔の状態にそれぞれ関する、２つの良好に分離したピークを示す（図１３の挿入図）。事象の総数に対する「空の細孔」（高電流）事象の個数の比を計算することによって、時間ｔにおける累積の解離の確率を取得した。以下の電圧レベルを使用した：（円）３０ｍＶ、（正方形）６０ｍＶ、（三角形）９０ｍＶ、（逆三角形）２２０ｍＶおよび（菱形）１５０ｍＶ。上記の測定をＶＵの種々の値（３０ｍＶ、６０ｍＶ、９０ｍＶ、２２０ｍＶおよび１５０ｍＶ）で反復し、同様の分析手順を適用した。探索時間の関数として、１１ヘアピンを解離する確率を表すデータを、図１４に示す。ＰＵＮＺＩＰを、各々の探索時間に関して、事象の総数に対する、高い電流ピーク下での事象の個数の比として計算した（図１３の挿入図を参照のこと）。短時間（すなわち、ｔ＜１ｍｓ）で、ＶＵの振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）に関係なく、解離の確率は非常に低い。ｔ〜１０ｍｓにおいて、小さなＶＵ値と大きなＶＵ値との間の解離の確率に明確な差異が存在する。解離の直後に、細孔を通っての２６ｎｔ（一本鎖）のトランスロケーションが続くので、測定した解離時間は、以下の２つの期間を含む：真の解離時間および２６マーのスライド時間（ｔｓ２）。先に説明されるように、ｔｓ２を推定することにより、測定を補正した。しかしながら、補正は、解離時間よりもはるかに小さい（約１％）ので、結果に非常にわずかな影響しか与えない。
【０１０９】
図１４に示される解離の確率分布を、単一の指数関数によってフィットさせ、種々の電圧レベルでの特徴的な解離時間τＵを得た。図１５において、解離電圧ＶＵに対するτＵの依存性を、それぞれＨＰ１（完全な円）、ＨＰ２（三角形）およびＨＰ３（正方形）に対してプロットする。直線フィットから明らかなように、τＵがＶＵに指数関数的に依存することに留意すること。この依存性は、改変Ｋｒａｍｅｒｓ速度モデルから予測される：
【０１１０】
【化５】
2008509671.tif 000007
は、０電圧転移時間であり、Ｅｂは、ヘアピンの解離についてのエネルギー障壁（ｅｎｅｒｇｙ  ｂａｒｒｉｅｒ）であり、そして、Ｖβ＝ｋＢＴ／Ｑｅｆｆ。図１１の線の傾きは、Ｖβ＝２２±２ｍＶの単一の値を与え、これを使用して、有効なＤＮＡ電荷
【０１１１】
【化６】
2008509671.tif 000008
を推定することができる。この電荷は、α−ＨＬのチャネルにまたがる約２２ヌクレオチドに伴い、したがって、１ヌクレオチドあたりの有効電荷は：１．１３／１２＝０．０９４ｅである。このフィットと縦軸との切片から、τＵ（Ｏ）（力が０）の値を推測することができる。実験結果は、ＨＰｌについてτＵ（Ｏ）＝２．１±０．２ｓ、ＨＰ２について１．２±０．１ｓ、そしてＨＰ３について０．３４±０．０５であることを示した。
【０１１２】
（２．一定の負荷速度での解離動態）
能動的な制御法によって、任意の時間依存的な電圧Ｖ（ｔ）を印加して、結合の切断の動態を測定することができる。特に、力分光法の測定を、代表的に、一定の負荷速度または
【０１１３】
【化７】
2008509671.tif 000009
で実行する。以下の段落では、まず、任意の所定の
【０１１４】
【化８】
2008509671.tif 000010
に対する解離電圧の予測された分布の誘導の結果、および
【０１１５】
【化９】
2008509671.tif 000011
に対する臨界電圧（または、最も可能性のある解離電圧）の依存性を示す。分析は、ナノ細孔の場合に適合されたＥｖａｎｓおよびＲｉｔｃｈｉｅのアプローチにしたがう。結果は、大きな負荷速度についてはこの単純化モデルに一致するが、より低い速度ではこのモデルから外れる。単一のエネルギー障壁とともに、印加された力の方向に沿う理想的な１Ｄエネルギー地形（ｅｎｅｒｇｙ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ）を仮定する。平衡（力を印加しない）において、閉じたヘアピン状態は、エネルギー地形の深い最小値として表され、エネルギー障壁Ｅｂにより開口状態から隔てられている。ヘアピンを解離させるために、分子はこのエネルギー障壁を横切らなければならない。バイアスをかけた電圧（または、力）の存在下で、障壁は低減され、Ｋｒａｍｅｒｓ時間（τ０）は、
【０１１６】
【化１０】
2008509671.tif 000012
（ここで、τ０およびＶβは先に定義される）にしたがって改変される。ここで、Ｖ＝Ｖ（ｔ）は時間依存性である。解離がｔとｔ＋ｄｔとの間で生じている単位時間あたりの確率は、
【０１１７】
【化１１】
2008509671.tif 000013
により与えられる。この式は、Ｖ（ｔ）＝Ｖｔに関して表現され得、解離電圧の分布を与える：
【０１１８】
【化１２】
2008509671.tif 000014
臨界解離電圧（Ｖｃ）は、この分布の最大値により規定され、これは：
【０１１９】
【化１３】
2008509671.tif 000015
である。
【０１２０】
図１６は、４．５Ｖ／ｓの一定の負荷速度で実行した、代表的な解離事象を示す。上部のパネルは印加された電圧を示し、下部のパネルは細孔電流を示す。解離は、電圧のランプの間の、閉鎖細孔電流レベルから開口細孔電流レベルへの電流の急上昇により容易に観察可能である。解離電圧ＶＵは、各々の事象から直接取得される。先の実験と同様に、細孔へのＤＮＡの最初の侵入を行った（すなわち、細孔内の分子の０．３ｍｓのスライドおよび０．５ｍｓの保持）。電圧ランプを印加すると、電流は閉鎖レベルのままだが、ｔ〜２２ｍｓ（ランプの開始から測定される）において、解離された鎖が迅速に細孔へスライドし、そして細孔電流に鋭い上昇が存在する。曲線から、解離電圧ＶＵ（この場合、１３０ｍＶ）を直接測定することができる。スライド時間（ｔｓ２）は、見かけの解離時間（それゆえＶＵ）をわずかに長くする。しかしながら、先に検討されるように、これは、ほんのわずかな影響である：ここで示される場合において、ｔｓ２〜０．１２ｍｓであり、したがって補正は、０．１２／２２＝０．００５（観察した時間の微小な画分）。
【０１２１】
十分な統計データを取得するために、解離実験を、任意の所定のランプ値について、少なくとも１，０００回反復した。測定したＶＵ値の代表的な分布は、図１７の挿入図に示される。この分布は、式１により良好に近似される（挿入図の実線）。分布のピークは、最も可能性のある解離力（ｕｎｚｉｐｐｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ）（または、臨界電圧、Ｖｃ）である。ＨＰｌ（単一のミスマッチを有するヘアピン）、ＨＰ２およびＨＰ３（７ｂｐヘリックス）について、測定を反復し、０．５〜１００Ｖ／ｓの範囲の電圧ランプに対するＶｃの依存性を取得した。データを、図１４の片対数プロット上に示す（ＨＰｌ、ＨＰ２およびＨＰ３に対して、それぞれ円、三角形および正方形）。中程度および高い電圧ランプ（５〜１００Ｖ／ｓ）において、Ｖｃは、式２により予測される
【０１２２】
【化１４】
2008509671.tif 000016
への対数的な相関関係にしたがう。式２にしたがって、図１７の直線の傾きは、単純にＶβである。対数フィットからＶβは、ＨＰｌについては２４．７±１．０ｍＶ、ＨＰ２については２２．５±１．１ｍＶ、そしてＨＰ３については２３．３±１．９ｍＶであり、これらは、上記の一定電圧の測定と良好に一致する。Ｖβが細孔内のＤＮＡの有効電荷にのみ依存する事実から予測されるように、全ての分子はほとんど同じ傾きを有した。より低いランプの方式において、データが、式２により予測される、単純な対数的な相関関係から外れることに留意すること。この偏差は、以下で議論される。式２へデータ（ランプ＞１．６Ｖ／ｓ）をフィットさせることにより、ＨＰｌおよびＨＰ２について、それぞれ、τＵ（０）＝０．７２ｓおよび０．４９ｓを得、これらの値は、一定の電圧の方法を使用して得た値よりも小さい。
【０１２３】
先の研究は、次のことを実証した。２．４ｎｍのα−ＨＬの前庭に滞留した、短い平滑末端のＤＮＡヘアピンの開閉動態が、単一の工程プロセスとして記載され得、計算されたヘアピン全体の自由エンタルピーに近いエネルギー障壁を超えての急上昇に対応する時間スケールを得ることができる。これらの実験において、ほとんど力を印加しないか、または力を印加せずに、分子を変性させる。なぜなら、平滑末端ＤＮＡは、α−ＨＬのチャネル部分に侵入することができないからである。電流実験において、ＤＮＡヘアピンの一方の末端から伸長する一本鎖の突出がチャネル内を通過し、それゆえ、おそらく鎖に力を印加することによってヘアピンの動態に偏りが生じる。
【０１２４】
能動的な制御法により、２２０ｍＶ以上から、より小さな電圧で実行される解離の測定を延長することができ、それゆえ、０の力と強力な力の限界とのギャップを埋めることができる。任意の所定の電圧Ｖにおいて、ＱｅｆｆＶ／ｄによりＤＮＡ鎖に印加される力を推定することができる（ここで、Ｑｅｆｆはチャネル内のｓｓＤＮＡの有効電荷であり、そしてｄ（約５ｎｍ）はチャネルの長さである）。比較的小さな電圧（小さなバイアスをかける力（ｂｉａｓｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ））においてさえも、熱的に「融解した」塩基対の迅速な再アニーリングが、ほとんどこの再アニーリング同じ速さの、細孔内の対合していない鎖の進行によりブロックされ得ることに留意すること。特徴的なｓｓＤＮＡのスライド時間を、トランスロケーション実験から推定した。この「歯止め（ｒａｔｃｈｅｔ）」機構は、ヘアピン全体の解離を数個の連続的な工程へ分けることができる。したがって、この場合における１５の総解離時間は、０のバイアス動態（ｂｉａｓ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）と比較して、著しく短いことが予測される。
【０１２５】
実験は、一定の力（τＵ）で測定した特徴的な解離時間が解離電圧レベルＶＵにより指数関数的に減少することを示す。直線フィットの傾きが、ヘアピンの配列（したがって、そのエンタルピー）とは無関係であることが見出され、チャネル内のｓｓＤＮＡフラグメント上の有効電荷を推定することを可能にした。ＶＵ＝０に対する指数関数フィットの切片が、τＵ（Ｏ）の推定を提供する。これらの値と、ヘアピンの完全な変性移行に十分近くするのにかかる、計算上の平衡時間スケールとを比較することが興味深い。１Ｍ  Ｎａ＋でｍｆｏｌｄサーバを使用して、ＨＰｌについてΔＧ０＝−１６．４ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ、そしてＨＰ２についてΔＧ０＝−１２．２  ｋｃａｌ／ｍｏｌｅを得、数時間のおよその（閉鎖から開口までを完了する）時間スケールを得た。対照的に、推定により、τＵ（０）〜１ｓを得、これは数桁の強度でより短い。時間スケールのこの相違は、先に示される「歯止め」の考えに合致する。特に、１つではなく２つの熱的に活性化された工程によりナノ細孔解離が生じる場合（各々、約５塩基）、これらの時間全体は、数秒のオーダーまで低減される。
【０１２６】
１．５ｎｍのα−ＨＬチャネル内のｓｓＤＮＡ上の有効電荷を、２つの独立したアプローチ（一定の力または固定の負荷速度）により推定した。両方の方法は、細孔内の鎖について１．１３ｅの有効電荷または１ヌクレオチドあたり０．０９４ｅの有効電荷を得、このことは、チャネル内のＤＮＡの負電荷が、正に荷電したカリウムイオンの「濃縮（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）」およびα−ＨＬチャネルの内壁上の極性基の存在により効果的に釣り合うことを示し、また先の結果と合致する。この有効電荷を使用して、任意の所定のＶでの力を計算することができる。
【０１２７】
動態作用の測定は、上記の図と合致する。高い負荷速度（ランプ＞２Ｖ／ｓ）において、解離時間（それゆえＶｃ）を、力による電位障壁の高さの急速な変化により決定する。この制限において、システムは、開口閉鎖移行を多数回は起こさず、Ｖｃは
【０１２８】
【化１５】
2008509671.tif 000017
に直接比例する。
【０１２９】
【化１６】
2008509671.tif 000018
の小さな値に対して、負荷速度に対する臨界電圧の弱い依存性により特徴付けられる、別の方式への柔軟な重複（ｓｏｆｔ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）が存在する。この方式において、電圧は、十分低いまま維持され、このことは、システムが、最終的な解離の前に、閉鎖状態と開口状態との間で変動することを可能にするのに十分長い時間を提供する。
【０１３０】
図１７の対数曲線の傾きは、式２により定義されるＶβを与える。フィットパラメータは、一定の力による方法を使用して得た値と極めて良好に合致する。さらに、
【０１３１】
【化１７】
2008509671.tif 000019
へのフィットの外挿を使用して、２つのヘアピンについてのτＵ（Ｏ）を推定することができる。動的測定から取得した値は、一定の力で得た外挿値よりも一貫して小さい（約２分の１）。ＨＰｌおよびＨＰ２に対応する曲線は、大体２０ｍＶで置き換えることに留意すること。ＤＮＡ上の測定された有効電荷を使用して、この変化を、約１ｋＢＴ（約０．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）のエネルギーの相違に解釈することができる。
【０１３２】
本発明は、種々の実施形態に関して記載されたが、本発明が、添付の特許請求の範囲の意図および範囲内の、広範な種類のさらなる実施形態および他の実施形態も可能であることも認識されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１は、設計ポリマーへの標的ポリヌクレオチドの変換の概略図である。ここで、（ａ）は標的ポリヌクレオチドであり、（ｂ）は標的の単離された部分であり、（ｃ）は生じる設計ポリマーである。
【図２】図２は、標的ポリヌクレオチドの設計ポリマーへの変換に関するサイクルの概略図である。ここで、（ａ）は２つの設計モノマーであり、（ｂ）は設計ポリマーであり、そして（ｃ）は、その標的の変換に関するサイクルを図示する。
【図３】図３は、分子ビーコンの概略図である。ここで、（ａ）はそのビーコンの直線にされた図であり、そして（ｂ）は自己ハイブリダイズしたビーコンを示す。
【図４】図４は、ビーコン−設計ポリマー複合体の概略図である。
【図５】図５は、ナノ細孔によるビーコン−設計ポリマーのトランスロケーションプロセスの概略図である。ここで、（ａ）は、このトランスロケーションプロセスに関する最初の工程を示し、そして（ｂ）は、そのプロセスのより後の段階を図示する。
【図６】図６は、能動的な制御を使用する、１０ｂｐヘアピンＤＮＡの解離による結果を示すグラフである。ここで、（ａ）は、印加された電圧対時間（ミリ秒）を表し、そして（ｂ）は、細孔を通る測定されたイオン電流を表す。
【図７】図７は、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）によって示される４つの異なる工程を示し、サンプルポリヌクレオチドの代表的な分析において起こる工程が示されている。ここで、上部のパネルは、ナノ細孔システム内へ、およびナノ細孔システムを通る、設計ポリマーのトランスロケーションの概略図を示し、中央のパネルは、光子カウント／ｍｓ対時間を示し、そして下部のパネルは、記録した電圧を示す。
【図８】図８は、ナノ細孔システムと組み合わせて使用される光学系の概略図である。
【図９】図９は、図８において示された光学系の拡大部分である。
【図１０】図１０は、薄いＴｅｆｌｏｎフィルムに製作された約３０μｍの孔のＳＥＭ像である。
【図１１】図１１は、一定の力で実施された代表的な解離事象の最初の数ミリ秒（ｍｓ）を示すグラフである。ここで、上部のパネルは、細孔を横切って印加される制御された電圧を示し、一方、下部のパネルは、その印加された電圧から生じる細孔電流を示す。ｔ＝０において、ＤＮＡはその細孔の中に入る。
【図１２】図１２は、Ｖ＝１２０ｍＶかつ１５℃において測定された一本鎖ＤＮＡ（ポリ（ＤＡ）９０）のトランスロケーション時間の分布を示すヒストグラムである。このヒストグラムは、約１，５００回の個別の事象から構築した。ｔＴ＞ｔＰ＝０．５ｍｓ（最も好ましいトランスロケーション時間）の後、この分布を、０．３２ｍｓの時間定数の単一指数関数によってフィッティングする。
【図１３】図１３は、定常電圧実験についての代表的な解離事象を示すグラフである。上部のパネルは、印加した電圧パターンを示し、下部のパネルは、生じる細孔電流であり、挿入図は、約１０００回の別個の解離事象からｔ＝５ｍｓにおいて測定された細孔電流の代表的な分布を示す。
【図１４】図１４は、ＨＰ１に対する異なる解離電圧レベルに対するｔの関数として、解離の可能性Ｐｕｎｚｉｐを示すグラフである。使用した電圧レベルは：（円形）３０ｍＶ、（正方形）６０ｍＶ、（三角形）９０ｍＶ、（逆三角形）１２０ｍＶおよび（菱形）１５０ｍＶである。
【図１５】図１５は、解離電圧ＶＵについてのτＵの依存性をプロットしたグラフである。解離電圧ＶＵは、ＨＰｌ（完全な円）、ＨＰ２（三角形）およびＨＰ３（正方形）について、図５においてプロットされる。特徴的な時間スケールが、ＶＵの関数としてＰＵＮＺＩＰ（図４）の指数関数によるフィッティングから得られる。
【図１６】図１６は、４．５Ｖ／ｓの一定の負荷速度において実施された、一定の負荷速度の下での代表的な解離事象を示すグラフである。ここで、上部のパネルは、時間ｔ＝０において印加された電圧を示す。この時間は、細孔へのＤＮＡ進入の開始を表す。一方、下部のパネルは、制御された電圧ランプの間の細孔電流を示す。
【図１７】図１７は、約１５００の解離事象（図６のように）の集合を示すグラフである。これらの解離事象は、ＶＵおよび最も好ましい解離電圧ＶＣの分布を得るために使用され得る。メインの図：ＨＰ１（黒丸）、ＨＰ２（三角形）およびＨＰ３（正方形）に対する、ランプＶ＆の関数としてのＶＣの片対数プロット。
【図１】
2008509671.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2008509671.tif 000034
【図１６】
2008509671.tif 000035
【図１７】
2008509671.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月16日(2007.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
図１に示される例において、「０」に対する設計モノマー１２’（配列番号４〜５）と「１」に対する設計モノマー１２’’（配列番号６〜７）とが存在する。もし各々のヌクレオチドが二進コードにより表されるとするならば、各々のヌクレオチドが２つの設計モノマーに表されることを必要とする。例えば、グアニンは、二進コード「１＋０」により表されると、グアニンは、設計モノマー１２’’により「１」と表され、設計モノマー１２’により「０」と表される。しかしながら、設計モノマーは、それらが表している特定のヌクレオチドを反映するように適切な配列でなければならない。したがって、グアニンに対して、設計モノマー１２’’「１」の次に設計モノマー１２’「０」が続かなければならない（５’→３’の従来のマップ割り当て（ｍａｐ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）を使用して）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
図２ｃは、設計ポリマーへの標的の変換サイクルを示す。標的ポリヌクレオチド１６（配列番号８および配列番号９）は、３つの酵素的な工程（Ａ、ＢおよびＣ）により循環され得る。この図において、１サイクルあたり、３つの標的塩基が変換される。この図中の標的ポリヌクレオチド１６は２１塩基対から構成され、したがって、標的を完全に変換するのに全部で７回のサイクルが必要とされる。図２ｃにおいて、上側の鎖（太字）がこの図中で変換される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
【図１】図１は、設計ポリマーへの標的ポリヌクレオチドの変換の概略図である。ここで、（ａ）は標的ポリヌクレオチドであり、（ｂ）は標的の単離された部分（配列番号４〜７）であり、（ｃ）は生じる設計ポリマーである。
【図２】図２は、標的ポリヌクレオチドの設計ポリマーへの変換に関するサイクルの概略図である。ここで、（ａ）は２つの設計モノマー（配列番号４〜７）であり、（ｂ）は設計ポリマーであり、そして（ｃ）は、その標的の変換（配列番号８〜１７）に関するサイクルを図示する。
【図３】図３は、分子ビーコンの概略図である。ここで、（ａ）はそのビーコンの直線にされた図であり、そして（ｂ）は自己ハイブリダイズしたビーコンを示す。
【図４】図４は、ビーコン−設計ポリマー複合体の概略図である。
【図５】図５は、ナノ細孔によるビーコン−設計ポリマーのトランスロケーションプロセスの概略図である。ここで、（ａ）は、このトランスロケーションプロセスに関する最初の工程を示し、そして（ｂ）は、そのプロセスのより後の段階を図示する。
【図６】図６は、能動的な制御を使用する、１０ｂｐヘアピンＤＮＡの解離による結果を示すグラフである。ここで、（ａ）は、印加された電圧対時間（ミリ秒）を表し、そして（ｂ）は、細孔を通る測定されたイオン電流を表す。
【図７】図７は、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）によって示される４つの異なる工程を示し、サンプルポリヌクレオチドの代表的な分析において起こる工程が示されている。ここで、上部のパネルは、ナノ細孔システム内へ、およびナノ細孔システムを通る、設計ポリマーのトランスロケーションの概略図を示し、中央のパネルは、光子カウント／ｍｓ対時間を示し、そして下部のパネルは、記録した電圧を示す。
【図８】図８は、ナノ細孔システムと組み合わせて使用される光学系の概略図である。
【図９】図９は、図８において示された光学系の拡大部分である。
【図１０】図１０は、薄いＴｅｆｌｏｎフィルムに製作された約３０μｍの孔のＳＥＭ像である。
【図１１】図１１は、一定の力で実施された代表的な解離事象の最初の数ミリ秒（ｍｓ）を示すグラフである。ここで、上部のパネルは、細孔を横切って印加される制御された電圧を示し、一方、下部のパネルは、その印加された電圧から生じる細孔電流を示す。ｔ＝０において、ＤＮＡはその細孔の中に入る。
【図１２】図１２は、Ｖ＝１２０ｍＶかつ１５℃において測定された一本鎖ＤＮＡ（ポリ（ＤＡ）９０）のトランスロケーション時間の分布を示すヒストグラムである。このヒストグラムは、約１，５００回の個別の事象から構築した。ｔＴ＞ｔＰ＝０．５ｍｓ（最も好ましいトランスロケーション時間）の後、この分布を、０．３２ｍｓの時間定数の単一指数関数によってフィッティングする。
【図１３】図１３は、定常電圧実験についての代表的な解離事象を示すグラフである。上部のパネルは、印加した電圧パターンを示し、下部のパネルは、生じる細孔電流であり、挿入図は、約１０００回の別個の解離事象からｔ＝５ｍｓにおいて測定された細孔電流の代表的な分布を示す。
【図１４】図１４は、ＨＰ１に対する異なる解離電圧レベルに対するｔの関数として、解離の可能性Ｐｕｎｚｉｐを示すグラフである。使用した電圧レベルは：（円形）３０ｍＶ、（正方形）６０ｍＶ、（三角形）９０ｍＶ、（逆三角形）１２０ｍＶおよび（菱形）１５０ｍＶである。
【図１５】図１５は、解離電圧ＶＵについてのτＵの依存性をプロットしたグラフである。解離電圧ＶＵは、ＨＰｌ（完全な円）、ＨＰ２（三角形）およびＨＰ３（正方形）について、図５においてプロットされる。特徴的な時間スケールが、ＶＵの関数としてＰＵＮＺＩＰ（図４）の指数関数によるフィッティングから得られる。
【図１６】図１６は、４．５Ｖ／ｓの一定の負荷速度において実施された、一定の負荷速度の下での代表的な解離事象を示すグラフである。ここで、上部のパネルは、時間ｔ＝０において印加された電圧を示す。この時間は、細孔へのＤＮＡ進入の開始を表す。一方、下部のパネルは、制御された電圧ランプの間の細孔電流を示す。
【図１７】図１７は、約１５００の解離事象（図６のように）の集合を示すグラフである。これらの解離事象は、ＶＵおよび最も好ましい解離電圧ＶＣの分布を得るために使用され得る。メインの図：ＨＰ１（黒丸）、ＨＰ２（三角形）およびＨＰ３（正方形）に対する、ランプＶ＆の関数としてのＶＣの片対数プロット。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008509671000001.app
【国際調査報告】
2008509671.tif 000037