(57)【要約】  本発明は癌を患っている個体の層別化の方法に関する。より詳細には、本発明は、ＰＴＡ断片が抗内分泌療法に感受性である癌細胞と前記療法には感受性がない癌細胞の区別を可能にすることの発見に関する。それ故、ＰＴＡ断片は、免疫組織学によるエストラジオールレセプター検出のための代替であることができ、抗エストラジオール療法に対する癌細胞の耐性をモニターするためのマーカーであることができ、再発をモニターするために使用することができ、及び脱分化の状態、例えば、癌細胞の状態を決定するために使用することができる。ＰＴＡ断片は、血清又は血漿のような容易に入手できる患者サンプルから決定されるという利点を有する。本発明はさらに、特異的ＰＴＡペプチド及び核酸、それらの抗体、試験キット及び診断及び治療法、及び組成物を包含する。
2008522601.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療のための個体の層別化についての方法であって、前記癌の癌細胞が抗内分泌療法に感受性であるかどうかを決定するため、
ａ）個体のサンプル中のプロチモシン−アルファ（ＰＴＡ）断片の量を決定すること；
ｂ）ａ）の結果と陰性対照サンプルを使用して決定された結果又はすでに既知の基準値を比較すること；及び
ｃ）抗内分泌療法に対する癌細胞の感受性を決定すること；
の工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
もし前記癌がエストラジオールレセプターを発現しているなら、前記陰性対照又は前記基準値と比較し、抗内分泌療法に感受性ではない前記癌細胞中で、前記ＰＴＡ断片の前記量が増加している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記陰性対照又は前記基準値と比較し、抗内分泌療法に感受性ではない前記癌細胞中で、前記ＰＴＡ断片の前記量が、
ａ）前記陰性対照中のレグマインの量と比較して、又はレグマイン基準値と比較して、もし、同時にタンパク質レグマインが正常又は増加した量で存在するならば、増加しており；又は
ｂ）前記陰性対照中のレグマインの量と比較して、又はレグマイン基準値と比較して、もし、同時にタンパク質レグマインが不存在であるか、又は減少した量で存在していれば、減少している；
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記個体が、疾患状態Ａ、疾患状態Ｂ、疾患状態Ｃ及び疾患状態Ｄと称される、異なった疾患状態に分類され、前記疾患が状態Ａから、状態Ｂへ、状態Ｃへ、状態Ｄへ悪化し、そして
ａ）疾患状態Ａが、前記サンプルがエストラジオールレセプター陽性であり、及び前記ＰＴＡ断片の量が前記ＰＴＡ断片についての基準値より下であることにより特徴付けられ；及び
ｂ）疾患状態Ｂが、前記サンプルがエストラジオールレセプター陽性であり、及び前記ＰＴＡ断片の量が前記ＰＴＡ断片についての基準値と等しいか又は上であることにより特徴付けられ；及び
ｃ）疾患状態Ｃが、前記サンプルがエストラジオールレセプター陰性であり、及び前記ＰＴＡ断片の量が前記ＰＴＡ断片についての基準値と等しいか又は上であることにより特徴付けられ；及び
ｄ）疾患状態Ｄが、前記サンプルがエストラジオールレセプター陰性であり、及び前記ＰＴＡ断片の量が前記ＰＴＡ断片についての基準値より下であることにより特徴付けられる；
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗内分泌療法を前記個体に適用すべきかを決定するための請求項４に記載の方法の使用であって、前記個体が疾患状態Ａに分類される場合にのみ抗内分泌療法が適用される、前記使用。
【請求項６】
攻撃的治療計画を必要としている、癌を患っている個体を決定する方法であって、前記個体のサンプル中のレグマインの発現を決定する工程を含んでなり、発現の消失又は陰性対照サンプルと比較して又は基準値と比較して減少した発現が、前記個体が攻撃的治療計画を必要としていることを示す、前記方法。
【請求項７】
抗内分泌療法に感受性ではない癌細胞が、損なわれたステロイドシグナリング経路を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＴＡ断片が、プロテアーゼレグマインの作用により発生することが可能なペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記癌細胞が、乳癌細胞、結腸癌細胞、中枢神経系癌細胞、前立腺癌細胞及び卵巣癌細胞から成る群より選択される癌細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルが、全血、血漿、血清、リンパ液、乳頭吸引液、乳汁、尿、組織、特別には腫瘍含有組織、及び大便から成る群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
抗内分泌療法が抗エストラジオール療法である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＴＡ断片が、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット、タンパク質チップアッセイ、質量分析法、免疫組織学、フローサイトメトリー又は分子生物学的方法から成る群より選択される方法により決定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
抗内分泌療法に対して減少した感受性又は耐性を獲得した癌細胞を有する個体を同定するため、抗内分泌療法で治療する個体の層別化のための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１４】
抗エストロゲン、エストロゲン変調物質、アロマターゼ阻害薬、エストラジオールレセプター下方調節剤、タモキシフェン、アリミデックス、ゴセレリン、ファスロデックス、フェメラ、レンタロン、アロマシン、ラロキシフェン、アタメスタン、ＴＡＳ−１０８、プロゲンタ、６−ＭＣＤＦ、ＰＳＫ３６６８及びトレミフェンから成る群より選択される物質で治療する個体の層別化のために、前記物質に対して減少した感受性又は耐性を獲得した癌細胞を有する個体を同定する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法の使用であって、
ａ）個体のサンプル中の内分泌レセプター；及び／又は
ｂ）個体のサンプル中のエストラジオールレセプター；及び／又は
ｃ）個体のサンプル中のプロゲステロンレセプター；及び／又は
ｄ）個体のサンプル中のレグマイン又はレグマイン活性
の決定が加わった、前記使用。
【請求項１６】
ペプチドであって、少なくとも８アミノ酸のＰＴＡ断片であり、抗内分泌療法に感受性である乳又は結腸癌細胞で罹患した個体と比較して、抗内分泌療法に対して減少した感受性又は耐性を有する乳又は結腸癌細胞で罹患した個体のサンプル中に増加した量で存在し、但し、前記ペプチドは配列番号１１、１２、１３及び１４からは選択されない、前記ペプチド。
【請求項１７】
配列番号１４の２〜４５位のアミノ酸配列の断片であり、配列番号１４の少なくとも８の連続的アミノ酸を含んでなり、但し、前記ペプチドが配列番号１１〜１４とは異なっている、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記ペプチドが配列番号１〜１０に従ったペプチドのいずれか一つである、請求項１６又は１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のペプチドの修飾形であって、アミノ酸位：
ａ）配列番号１４の２位に対応する；Ｎ−アセチルセリン残基又はホスホセリン残基、及び／又は
ｂ）配列番号１４の８位に対応する；ホスホスレオニン残基、及び／又は
ｃ）配列番号１４の１３位に対応する；ホスホスレオニン残基、及び／又は
ｄ）配列番号１４の１４位に対応する；ホスホスレオニン残基又はイソロイシン残基、及び／又は
ｅ）配列番号１４の４位に対応する；ホスホグルタミン酸残基、及び／又は
ｆ）配列番号１４の１５位に対応する；グルタミン酸残基、及び／又は
ｇ）配列番号１４の１８位に対応する；グルタミン又はアスパラギン残基、及び／又は
ｈ）配列番号１４の２１位に対応する；グルタミン酸残基、及び／又は
ｉ）配列番号１４の２９位に対応する；セリン残基、及び／又は
ｊ）配列番号１４の３６位に対応する；アスパラギン酸又はヒスチジン残基、及び／又は
ｋ）配列番号１４の３７位に対応する；アルギニン残基、及び／又は
ｌ）配列番号１４の４０位に対応する；グルタミン残基
を有する前記ペプチドの修飾形。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のＰＴＡ断片のネオエピトープに特異的に結合し、配列番号１１〜１４に記載のペプチドには結合しない抗体、又はそれらの結合特異性を保持している前記抗体の断片。
【請求項２１】
核酸であって：
ａ）請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸配列；
ｂ）ａ）の核酸配列に相補的である核酸配列；
ｃ）ストリンジェント条件下、ａ）及びｂ）の核酸にハイブリダイズし、最大で配列番号１４をコードする核酸配列よりも短い核酸配列、但し、前記核酸配列は配列番号１１、１２又は１３に記載のＴＡ１又はＴＡ１１をコードしていない；
ｄ）ａ）〜ｃ）のいずれか一つの前記核酸配列に関して縮重している核酸配列；
ｅ）ａ）〜ｄ）のいずれか一つの核酸配列の誘導体及び／又は断片、但し、前記核酸配列は配列番号１１、１２又は１３に記載のＴＡ１又はＴＡ１１をコードしていない；
ｆ）さらに少なくとも一つの非ＰＴＡ核酸配列を含んでなる、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）又はｅ）に記載の核酸配列；
ｇ）ｆ）に記載の核酸配列であって、前記少なくとも一つの非ＰＴＡ核酸配列は核酸配列のラベル化のための配列；
から成る群より選択される核酸。
【請求項２２】
さらにラベルを含んでなり、そのラベルは核酸配列ではない、請求項２１に記載の核酸。
【請求項２３】
試験キットであって、
ａ）請求項１６〜１９に記載のペプチド；及び／又は
ｂ）抗体又は請求項２０に記載の前記抗体の断片；及び／又は
ｃ）請求項２１〜２２に記載の核酸；及び
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法について前記試験キットをどのように使用するかの説明書、又は請求項１３〜１５に記載の使用について前記試験キットをどのように使用するかの説明書を含んでなる試験キット。
【請求項２４】
請求項２３に記載の試験キットの製造のための、
ａ）請求項１６〜１９に記載のペプチド；及び／又は
ｂ）抗体又は請求項２０に記載の前記抗体の断片；及び／又は
ｃ）請求項２１〜２２に記載の核酸；
の使用。
【請求項２５】
請求項２４に記載の使用であって、乳癌、結腸癌、中枢神経系癌、前立腺癌及び卵巣癌から成る群より選択される疾患の診断のための試験キットの製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は癌を患っている個体の層別化（stratification）の方法に関する。より詳細には、本発明は、ＰＴＡ断片が抗内分泌（anti-endocrine）療法に感受性である癌細胞と前記療法には感受性がない癌細胞の区別を可能にすることの発見に関する。それ故、ＰＴＡ断片は、免疫組織学によるエストラジオールレセプター検出のための代替であることができ、抗エストラジオール療法に対する癌細胞の耐性をモニターするためのマーカーであることができ、再発をモニターするために使用することができ、及び脱分化の状態、例えば、癌細胞の状態を決定するために使用することができる。ＰＴＡ断片は、血清又は血漿のような容易に入手できる患者サンプルから決定されるという利点を有する。本発明はさらに、特異的ＰＴＡペプチド及び核酸、それらの抗体、試験キット及び診断及び治療法、及び組成物を包含する。
【０００２】
背景技術 
癌の早期及び正確な診断は癌の有効な療法を成功させるために非常に重要である。加えて、例えば、癌の段階、癌のタイプなどに関する層別化を行うことを可能にする、癌細胞の正確な表現形を特徴付けることは極めて重要である。癌の特定のケースのすべてのこれらの特性は、その患者の療法についての最適な戦略を選択するために重要である。例えば、乳癌のケースにおいて、乳癌細胞がエストラジオールレセプターに陽性であるかどうかが通常決定される。このことは正しい療法を選択するためには、非常に重要である。エストラジオールは細胞増殖の重要なメディエーター であり、結果的にエストラジオールはエストラジオールレセプター陽性腫瘍細胞の増殖を促進する。それ故、エストラジオールレセプター陽性癌細胞は通常、いわゆる抗体液性又は抗内分泌又は抗エストラジオール療法で治療される。この療法は、例えばエストラジオールレセプターに結合するがそれを活性化しないエストラジオールの類似体でエストラジオールレセプターを阻止することにより、エストラジオールシグナリング経路を標的とする。この目的のために使用される最も普通の医薬品はタモキシフェンである。タモキシフェンはエストラジオールレセプター陽性癌細胞、特にエストラジオールレセプター陽性乳癌細胞の治療のみに有益であり、エストラジオールレセプター陰性癌細胞には有益ではない。
【０００３】
エストラジオールレセプターシグナリング経路は、中でも、ＰＴＡ、ＰＴアルファ, ＰＴα、ＰｒｏＴ、ＰｒｏＴアルファ、ＰｒｏＴα又はＰＴＭＡとして文献でも知られているプロチモシン−アルファと称されるタンパク質を含む。ＰＴＡは、１１０アミノ酸の配列長及び約１０〜１２ダルトンの分子量を有する細胞内タンパク質である。中でも、ＰＴＡはクロマチンリモデリングに関与しており、ＲＥＡ（エストラジオールレセプター活性化因子の抑制因子）に結合する。ＲＥＡへのＰＴＡの結合はエストラジオールレセプター仲介遺伝子転写を増強する(Mol Cell Biol. 2000, 17:6224-32) 。少数のＰＴＡ−断片、即ち、チモシン１（ＴＡ１、Ｔα１、ＴＨＮアルファｌ）と称されるＰＴＡ２−２９及びチモシン１１（ＴＡ１１、Ｔα１１）と称されるＰＴＡ２−３６が知られている。対応するＰＴＡ３０−１１０及びＰＴＡ３７−１１０断片はインビトロでのみ検出されているが、インビボでは検出されていない(J Bio Chem, 2003, 278:13286-93) 。この特許出願で述べられているすべてのアミノ酸番号は、ＰＴＡの成熟の間に除去されるＮ−末端メチオニンから始まっている。しばしば文献においてＰＴＡアミノ酸の計数はメチオニンから始まってはおらず、プロセスされたＰＴＡの最初のアミノ酸である二番目のアミノ酸から始まっている。ＴＡ１はGoldstein et al. (Proc Natl Acad Sci U.S.A., 1977, 74:725-729)により１９７７年にすでに同定されている。ＰＴＡのＮ末端セリンは、インビボでリン酸化されていてもよい(Biochemistry, 1993, 32:4587-96) 。ＰＴＡ又はＴＡ１は乳癌を含む多様なタイプの癌を患ったヒトにおいてその濃度が変化していることが示されている(Proc Natl Acad Sci U.S.A., 1993, 90:9504-7, Eur J Cardiothorac Surg, 1997, 12:885-91 , Br J Cancer , 1997, 76:1199-209) 。臨床的研究は、ＴＡ１がメラノーマ及び結腸直腸癌患者において特定の免疫細胞の抗腫瘍活性を増加できることを示している(Int J Immunopharmacol, 1997, 19:493-500) 。
【０００４】
レグマインは遺伝子発現プロフィリング及び腫瘍組織アレー分析から最近発見されたアスパラギニルエンドペプチダーゼである。Liu et al.は原発性ヒト固形腫瘍の種々のタイプを分析し、分析された乳癌腫、結腸癌腫、前立腺癌腫、卵巣癌腫及び中枢神経系腫瘍の７５〜１００％において、及び肺癌腫、リンパ腫及びメラノーマの少なくとも４０％においてレグマインを検出した(Cancer Res., 2003, 63:2957-2864) 。ＰＴＡはレグマインによりプロセスされ、ＴＡ１又はＴＡ１１を生じる(J Biol Chem, 2003, 278:13286-93) 。レグマインは特定のアスパラギニル結合に対して高い蛋白分解性特異性を有する。好ましくは、アラニン又はプロリンがアスパラギンに関してＰ３位に、グリシンがＰ１’位に存在する（Ｐ３＝Ｎ末端側に３アミノ酸、Ｐ１’＝Ｃ末端側に１アミノ酸、アスパラギンに対して）。レグマインの共通認識部位はＡｌａ／Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｓｎ−ＧＩｙ（配列番号１５）であり、切断がＡｓｎとＧＩｙの間で起こる 。Wang et al．はＬＯＨ１４ｑ３２．１と名付けた「ヘテロ接合性の喪失」（ＬＯＨ）を同定し、それは中でも乳癌サンプル中に検出された(Cancer Res, 2004, 64 :64-71 ) 。ＬＯＨ１４ｑ３２．１は染色体１４の３２．１領域中に位置している。中でもこの領域はレグマインをコードしている。それ故、ＬＯＨ１４ｑ３２．１はレグマインをコードしている遺伝子情報の欠失を表している。
【０００５】
技術分野
本発明は、個体における癌、特に、癌細胞、特に乳癌及び結腸癌細胞内に、損なわれたステロイド又はエストラジオールシグナリング経路を有するタイプの癌の層別化、診断及び療法の分野である。本発明はプロチモシンアルファ（ＰＴＡ）ペプチド（ＰＴＡ断片）及び核酸を提供する。さらに、本発明は、特定のタイプの癌細胞の存在又は不存在を決定するためのバイオマーカーとしてＰＴＡ、ＰＴＡ断片及びＰＴＡ核酸を使用する方法、最も成功すると思われる抗癌療法のタイプを決定するための方法、及び療法の成功をモニターする、ならびに抗内分泌療法、好ましくは抗エストラジオール療法に対する癌細胞の減少した感受性又は耐性を決定するための方法に関する。さらに、本発明は、癌マーカー又はバイオマーカーの検出のための試験キット、及びＰＴＡペプチド及び核酸を含んでなる医薬製剤に関する。
【０００６】
発明の概要
本発明の一つの側面は、癌の治療のために個体の層別化についての方法を提供し、前記癌の癌細胞が抗内分泌療法に感受性であるのかどうかを決定するため、前記方法は：
ａ）個体のサンプル中のプロチモシン−アルファ（ＰＴＡ）断片の量を決定すること；
ｂ）ａ）の結果と陰性対照サンプルを使用して決定された結果又はすでに既知の基準値を比較すること；及び
ｃ）抗内分泌療法に対する癌細胞の感受性を決定すること；
の工程を含んでなる。
【０００７】
本発明のさらなる側面において、好ましくは、損なわれた又は妨げられた、又は完全には機能的ではない又は機能的でないステロイドシグナリング経路の結果として、陰性対照と比較して又は基準値と比較して、抗内分泌療法に対して感受性ではない癌細胞ではＰＴＡ断片の量が変化している。さらに、抗内分泌療法に対して感受性ではない癌細胞において変化したＰＴＡ断片は、プロテアーゼレグマインの作用により発生されることが可能である。好ましくは、層別化に適した癌細胞は、乳癌細胞、結腸癌細胞、中枢神経系癌細胞、前立腺癌細胞及び卵巣癌細胞から成る群より選択される細胞であり、そして好ましくは、本発明に従って使用されるサンプルは、全血、血漿、リンパ液、乳頭吸引液、乳汁、尿及び大便から成る群より選択される。本発明の好ましい態様において、ＰＴＡ断片の量は、損なわれたエストラジオールシグナリング経路を有する癌細胞中で変化している。好ましくは、前記ＰＴＡ断片は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット、タンパク質チップアッセイ、質量分析法、免疫組織学、フローサイトメトリー又は生体分子測定法から成る群より選択される方法により決定される。
【０００８】
本発明の別の側面は、抗内分泌療法で治療する個体の層別化のために、前記療法への減少した感受性又は耐性を獲得した癌細胞を有する個体、好ましくは抗エストロゲン、エストロゲン変調物質、アロマターゼ阻害薬、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、エキセメスタン、レトロゾール及びアナストロゾールから成る群より選択される物質で治療する個体を同定する、本発明の方法の使用である。好ましくは、前記層別化は、内分泌レセプター、特にエストラジオールレセプター及び／又はプロゲステロンレセプターを決定することと組み合わせて、又は加えて行われる。
【０００９】
本発明の別の側面は、ＰＴＡ断片及び／又はそれらの多形形態であるペプチドであり、前記ペプチドは、損なわれたステロイドシグナリング経路を有しない癌細胞により罹患している個体と比較して、損なわれたステロイドシグナリング経路を有する癌細胞により罹患している個体のサンプル中では変化した量で存在し、但し、前記ペプチドはＴＡ１又はＴＡ１１（配列番号１１又は１２）ではない。さらに、配列番号１〜１０に従った配列を有するペプチド、ならびにそれらの多形形態は、本発明の別の側面である。
【００１０】
本発明のさらなる側面は、配列番号１〜１０のペプチドのネオエピトープ（neoepitope）へ特異的に結合するが、配列番号１１〜１４（ＴＡ１、ＴＡ１１、Ｎ−末端Ｍｅｔを有しないＰＴＡ、ＰＴＡ）のペプチドには結合しない結合剤、好ましくは、抗体又はそれらの誘導体である結合剤である。
【００１１】
本発明のさらに別の側面は、ペプチドをコードする核酸であり、前記ペプチドはＰＴＡ断片及び／又はそれらの多形形態であり、前記ペプチドは抗内分泌療法に感受性である癌細胞により罹患している個体と比較して、減少した内分泌療法に対する感受性又は耐性を有している癌細胞により罹患している個体のサンプル中に変化した量で存在し、但し、前記ペプチドは配列番号１１〜１３（ＴＡ１、ＴＡ１１、Ｎ−末端Ｍｅｔを有しないＰＴＡ）及びそれらの相補的核酸ではない。さらに本発明は、ストリンジェント条件下でこれらの核酸配列にハイブリダイズし、及び最大で配列番号１３をコードする核酸配列よりも短い核酸配列長を有する核酸配列を含み、但し、前記核酸配列はＴＡ１又はＴＡ１１（配列番号１１又は１２）をコードしていない。さらに本発明は前記核酸配列の縮重された核酸配列及び誘導体、及び／又は前記核酸配列の断片を含む。加えて、本発明に従った核酸配列は追加の核酸配列を含んでなることができ、前記追加の核酸配列は非ＰＴＡ核酸配列であり、ここで非ＰＴＡ核酸配列は好ましくは、前記核酸配列のラベル化のための配列である。
【００１２】
本発明のさらなる側面は、少なくとも一つのラベルを含んでなる、本発明に従った核酸であって、ここで前記ラベルは核酸配列ではない。
本発明のさらなる側面は、本発明の核酸配列を含んでなるベクターである。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明の核酸配列又はベクターを含んでなる宿主細胞を含んでなる。
本発明の別の態様は試験キットであって、
ａ）  ＰＴＡ断片及び／又はそれらの多形形態であるペプチドであり、前記ペプチドは、抗内分泌療法に感受性である癌細胞により罹患している個体と比較して、減少した内分泌療法に対する感受性又は耐性を有している癌細胞により罹患している個体のサンプル中に、変化した量で存在し、但し、前記ペプチドは配列番号１１〜１３（ＴＡ１、ＴＡ１１、Ｎ−末端Ｍｅｔを有しないＰＴＡ）ではなく、好ましくは、配列番号１〜１０に従った配列を有するペプチド及び／又は前記ペプチドの多形形態である；及び／又は
ｂ）  配列番号１〜１０に従ったペプチドのネオエピトープへ特異的に結合するが、配列番号１１〜１４（ＴＡ１、ＴＡ１１、Ｎ−末端Ｍｅｔを有しないＰＴＡ、ＰＴＡ）に従ったペプチドには結合しない結合剤、好ましくは、抗体又は断片、又は前記抗体の誘導体である結合剤；及び／又は
ｃ）  ａ）に従ったペプチドをコードする核酸配列、それらの相補的核酸配列、最大で配列番号１３をコードする核酸配列よりも短い核酸配列長を有するａ）に従った核酸にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列、但し、前記核酸配列は配列番号１１又は１２に従ったＴＡ１又はＴＡ１１をコードしていない；及び／又は
ｄ）  ｃ）の前記核酸配列及び誘導体及び／又はそれらの断片に関して縮重されている核酸配列、但し、前記核酸配列は配列番号１１又は１２に従ったＴＡ１又はＴＡ１１をコードしていない；及び／又は
ｅ）  さらに少なくとも一つの非ＰＴ核酸配列を含んでなるｃ）又はｄ）に従った核酸、ここで前記少なくとも一つの非ＰＴ核酸配列は、好ましくは、核酸配列の標識化のための配列である；及び／又は
ｆ）  さらにラベルを含んでなる、ｃ）、ｄ）又はｅ）に従った核酸配列、前記ラベルは核酸配列ではない；及び／又は
ｇ）  ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）に従った核酸配列を含んでなるベクター、及び／又は
ｈ）  ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）に従った核酸、又はｇ）に従ったベクターを含んでなる宿主細胞；及び
障害の存在、不存在、再発の予後を決定するために、どのように試験キットを使用するのかの説明書；
を含んでなる。
【００１４】
本発明のさらなる側面は、上記試験キットのａ）〜ｈ）に従ったペプチド、核酸、ベクター又は宿主細胞のいずれか一つを含んでなる医薬製剤、又は本発明に従った試験キット又は医薬製剤の製造のための上記試験キットのａ）〜ｈ）に従ったペプチド、核酸、ベクター又は宿主細胞のいずれか一つの使用である。
【００１５】
本発明の別の側面は、
ａ）上記試験キットのａ）〜ｈ）に従ったペプチド、核酸、ベクター又は宿主細胞のいずれか一つ；及び／又は
ｂ）ＰＴＡ又は断片及び／又はそれらの多形形態であるペプチド；及び／又は
ｃ）加えて、少なくとも一つの非ＰＴＡアミノ酸を含んでなる、ｂ）に従ったペプチド；及び／又は
ｄ）  ＰＴＡに特異的な、又は断片及び／又はそれらの多形形態に特異的な結合剤；及び／又は
ｅ）  ＰＴＡ及び／又は断片及び／又はそれらの多形形態をコードする核酸；及び／又は前記核酸に相補的であるか、又は前記核酸にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列；及び／又は
ｆ）  加えて、少なくとも一つの非ＰＴＡヌクレオチドを含んでなる、ｅ）に従った核酸；及び
本発明に従った方法又は使用のため、前記キットをどのように使用するのかの説明書；
を含んでなる、試験キットである。
【００１６】
本発明のさらなる側面は、前の章のａ）〜ｈ）に従ったペプチド、核酸、ベクター又は宿主細胞のいずれか一つを含んでなる、乳癌、結腸癌、中枢神経系癌、前立腺癌及び卵巣癌から成る群より選択される疾患の治療及び／又は予防及び／又は診断のための医薬組成物である。加えて、本発明は、乳癌、結腸癌、中枢神経系癌、前立腺癌及び卵巣癌から成る群より選択される疾患の治療及び／又は予防及び／又は診断のための試験キット及び／又は医薬組成物の製造のための、前の章のａ）〜ｈ）に従ったペプチド、核酸、ベクター又は宿主細胞のいずれか一つの使用を含んでなる。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、癌を有する個体の層別化のためのプロチモシンアルファ（ＰＴＡ）の特定の断片の使用、即ち、損なわれたステロイド、特にエストラジオール又はプロゲステロンシグナリング経路を有する患者癌細胞が存在するかどうかを決定することに関する。より特定的には、本発明は、癌細胞がＥＲ陽性であり及びＥＲシグナリングにおいて機能的であること（図１２、状態Ａ）、又は癌細胞がＥＲ陰性であること、又はＥＲ陽性であるが非機能的ＥＲシグナリングを有すること（図１２、状態Ｂ、Ｃ又はＤ）を決定することを可能にする。ＰＴＡ及びいくつかの特有のＰＴＡ断片（ＴＡ１、ＴＡ１１）は癌に関連して記載されているが、ＰＴＡ断片が、ステロイドシグナリング損傷癌細胞を、完全に機能的なステロイドシグナリング、特にエストラジオール又はプロゲステロンシグナリングを有する癌細胞から区別するための癌マーカーとして提案されたことはない。また、免疫組織学による、癌組織におけるステロイドレセプター、特にエストラジオールレセプター又はプロゲステロンレセプター検出を診断するための代替法としての又は診断することに加えて、ＰＴＡ断片を使用することが提案されたこともない。エストラジオールはＰＴＡの発現を刺激するので(Endocrinology, 2001 , 142:3493-501 )、エストラジオールは、機能的エストラジオールシグナリング経路を有する細胞において、ＰＴＡ断片の増加を生じることが期待できる。驚くことに、我々は、損なわれたエストラジオールシグナリングを有する癌細胞を含んでなる組織サンプル中、及び損なわれたエストラジオールシグナリングを有する癌細胞を含んでなる腫瘍を患った個体の血漿中に、ＰＴＡ断片が増加した量で存在する（図２）ことを発見した。
【００１８】
理論に縛られるわけではないが、もし特定の癌細胞中のステロイドシグナリング経路が損なわれ、不全であり、又は健康な細胞と同様に働いていなければ、変化した、特に増加した量のＰＴＡ断片がこれらの細胞中にのみ存在することが推定される（図１２、状態Ｂ及びＣ）。しかしながら、癌の後期段階において、又は高度に脱分化した癌細胞において（図１２、状態Ｄ）、癌細胞の脱分化の結果として（ＬＯＨ１４ｑ３２．１、例えば、レグマイン遺伝子の欠損 ）、多分プロテアーゼ活性（例えば、レグマイン活性）の減少又は欠乏により、ＰＴＡ断片は減少する、又は失われていてもよい。図１２は、ＥＲの発現についての発明者の理論、ＰＴＡ断片及びレグマイン、及びこれらのマーカーの相関を、癌の異なった状態又は段階及び適切な療法とともに図示している。
【００１９】
特に乳癌及び結腸直腸癌において、癌細胞が機能的又は損なわれていないステロイドシグナリング、特にエストラジオールシグナリング経路を有するかどうかを知ることは重要である。これらのタイプの癌において、少なくとも一部はステロイド又はエストラジオール仲介細胞増殖シグナルの結果として、非常にしばしば癌細胞が増殖する。もしこうした経路が治療されるべき癌細胞中で機能的であれば、これらの細胞増殖経路の一つを阻止することを試みる療法のみが成功することが可能である。結果的に、抗内分泌、抗ステロイド又は抗エストラジオールで治療されるべき腫瘍細胞中に、シグナリング経路が存在することを確かめることが非常に重要である。一般に、もし癌組織サンプルの免疫組織学的分析がエストラジオールレセプターの存在を明らかにしたら、例えば、機能的エストラジオール経路の存在が提案される。この手順は、本発明が克服したいくつかの欠点を有する。例えば、免疫組織学的検査は、試験者の主観的所見、ルーチン及び熟練に依存し、加えて、異なった試験者間及び異なった実験室間で直接比較できない。対照的に、ＰＴＡの断片のようなペプチドを測定することは、所見スコアに変換する必要がなく、それ故より客観的である特異的値を提供する。さらに免疫組織学は、サンプルが採られた正確及び正しい位置にある程度いつも依存し、加えて、視覚検査のために染色されたサンプルの非常に小さな切片に依存する。対照的に、組織抽出物からペプチドを測定することは、全組織サンプルを使用することができ、それ故、全サンプルを代表するある種の平均ペプチドシグナルを与える。特に、もし局所腫瘍組織ではなく、全血、血漿、血漿、リンパ液その他のようなより全身的サンプルがＰＴＡ断片を決定するために使用されるなら、結果は腫瘍の正確な位置にはさらに依存しない。加えて、手術後又は化学、放射線又は他の療法間又は後の、非常に小さな腫瘍、残存腫瘍又は転移は、場所を特定するのが困難であり、それ故、少しの腫瘍組織サンプルを得ることも困難であろう。
【００２０】
加えて、特許請求された方法は、抗内分泌療法の有効性を、例えば毎日モニタリングすることを可能にする。特に、本発明に従った方法は、血液サンプルのような容易に利用できるサンプルを使用して、有効性をモニターすることを可能にする。加えて、本発明に従った方法による層別化は、療法計画に対して減少した感受性又は耐性を発生する、抗内分泌療法をうけている個体の早期決定を可能にする。
【００２１】
本発明の方法は、癌疾患の状態に関して、例えば、どの程度癌細胞がすでに脱分化しているかについて患者を分類することも可能にする。状態（状態Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ、図１２）は、組み合わされたエストラジオールレセプターの存在又は不存在の決定により、及びＰＴＡ断片の決定により、及び場合によりレグマインの不存在又は存在を決定することにより、決定することができる；
状態Ａ：エストラジオールレセプターの存在、ＰＴＡ断片がないか又は減少したＰＴＡ断片量；
状態Ｂ：エストラジオールレセプターの存在、ＰＴＡ断片の存在又は増加したＰＴＡ断片量；
状態Ｃ：ないか又は減少したエストラジオールレセプター、ＰＴＡ断片の存在又は増加したＰＴＡ断片量；
状態Ｄ：ないか又は減少したエストラジオールレセプター、ＰＴＡ断片がないか又は減少したＰＴＡ断片量。
癌細胞の脱分化は通常、疾患の進行の間に起こり、癌細胞は、胚性又は幹細胞からそれらを分化させる特定の表現型を連続的に失うにつれて、胚性又は幹細胞の方向に連続的に発達する。胚性又は幹細胞は無限の様式で増殖する能力を有する。結果的に、より脱分化した癌細胞は、療法の間に根絶することがより困難になり、及び増殖に関して、転移に関してより活動的になり、化学療法又は放射線療法のような療法戦略に対する耐性をより容易に得、及び最初の療法が成功した後により再発しやすくなる。結果的に、患者の予後は、癌細胞の脱分化が増加するにつれて連続的に悪化し、それ故療法は、患者の治癒の可能性を保つためにより攻撃的であることを必要とする。しかしながら、このことは療法の有害な副作用を増加させる結果となる。これらの理由のため、患者の治癒の十分な可能性と療法に付随する有害な副作用の合理的程度間のバランスを有するように、療法がどの程度の攻撃性であるべきかを決定するため、癌細胞の状態を知ることが重要である。
【００２２】
本発明に従った方法の別の側面は、癌の再発をモニターすることに関する。それ故、容易に得ることが可能であるサンプルを使用し、初期の段階で個体中の癌細胞の再発を決定することが可能である。
【００２３】
さらに、例えば、血液、血漿、及び血漿又は尿サンプルを得ることは、医師の特別の技術を必要とせず、看護士のようなより専門的でない医療関係者により行うことが可能である。
【００２４】
本発明に従って使用されるサンプルは、組織又は体液のような、個体から誘導されるいずれのサンプルであってもよい。例えば、サンプルは全血、血液細胞（白血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、赤血球及び紡錘細胞のような）、血清、血漿、血液濾過液、乳頭吸引液、尿、リンパ液、リンパ節組織、大便、脳脊椎液、結腸又は直腸からの組織又は他の組織及び器官からの組織、腫瘍組織、ならびにそれらの組み合わせであることができる。
【００２５】
診断標準としてのペプチドの測定は、結果の分析にロボット及びコンピューターシステムを使用し、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡその他のような標準技術の使用により自動化することが可能であるので、免疫組織学検査と比較して通常より容易であり、安価で、誤差が少なく、及びより少ない操作者の処理しか必要としない。
【００２６】
免疫組織学による腫瘍組織サンプル中のエストラジオールレセプターの検出は、抗エストラジオール療法を使用すべきかどうかを決定するための現在の判断基準である。しかしながら、かなりの数のエストラジオールレセプター陽性腫瘍は抗エストラジオール療法に感受性ではない。このことについての一つのもっともらしい理由は、エストラジオールレセプターは存在するけれども、不全なエストラジオール経路又は不全なエストラジオールレセプターであるためであろう（図１２、状態Ｂ）。この場合、エストラジオールレセプターの存在は、エストラジオール仲介細胞増殖には十分ではなく、それ故、腫瘍増殖の理由ではありえない。結果として、状態Ｂ（そして状態Ｃ及びＤでも）の患者において抗エストラジオール療法はうまくいかない。本発明の新規方法は、タンパク質、即ち、プロチモシンアルファ（ＰＴＡ）に由来するペプチド断片を検出するので、この問題を回避する。ＰＴＡはエストラジオール経路、そして多分他のステロイドシグナリング経路にも関与する。特に、ＰＴＡは、エストラジオールレセプターそれ自身と比較して、エストラジオールのシグナル伝達カスケードのより後の工程で関与する。加えて、ＰＴＡは、細胞増殖の調節に関与する他のシグナリング経路にも関与することができ、単にエストラジオールレセプターの存在の代わりにＰＴＡ断片を決定することの別の利点であろう。
【００２７】
さらに、特定のＰＴＡ断片を発生するプロテアーゼ、レグマインは、それ自身、抗内分泌療法から恩恵を受けるであろう患者の及び抗内分泌療法から恩恵を受けないであろう患者の、患者のサブグループへの層別化のためのマーカーとして適している。同様のことが、レグマインの断片及び多形形態について当てはめることができる。特に癌の非常に後期の段階、例えば、図１２の状態Ｄは、レグマイン又はレグマイン活性の消失により又は減少した量により、又はＬＯＨ  １４ｑ３２．１(Cancer Res, 2004, 64:64-71 )のようなレグマインをコードする遺伝子情報の消失により決定することができる。レグマインはヒト染色体１４の３２．１位（１４ｑ３２．１）に位置している；Ensembl database, version 35, Nov. 2005, European Bioinformatics Institute (EBI), Heidelberg, Germany 及び the Sanger Institute, Hinxton, Great Britain; http://nov2005.archive.ensembl.org/Homo_sapiens/contigview?gene=ENSG00000100600 を参照されたい。
【００２８】
ＰＴＡ又はＰＴＡ断片の量、基準値及び陰性対照サンプル
本発明に従った用語「量」とは、物質の存在又は不存在、又は決定された物質の定量的又は半定量的濃度又は含量を意味する。物質の「不存在」は一般に、物質の量を決定するために使用された方法の感度に依存する。もし物質の量が基準値と、又は陰性対照サンプルを使用して決定された値と比較された場合、好ましくは、両方の値間の量における相違は、１．５倍以上、好ましくは２倍以上、好ましくは３倍以上、好ましくは５倍以上、好ましくは１０倍以上、好ましくは２０倍以上、好ましくは３０倍以上、好ましくは６０倍以上、好ましくは１００倍以上の、両方のデータ間の値における相違を表すことと定義される。
【００２９】
本発明に従った基準値、例えば、乳癌患者におけるＰＴＡ２−２９の濃度についての特定の基準値は経験的に決定することができる。この目的のためには、ＰＴＡ２−２９の濃度を、癌細胞中のエストラジオールレセプターの存在又は不存在が既知である乳癌患者からの一連のサンプル中で測定することが可能である。これらの経験的データを使用し、ＰＴＡ−２９の濃度についてのカットオフ値を決定することができ、それはエストラジオールレセプター陰性乳癌患者サンプルからエストラジオールレセプター陽性を区別することを可能にする。引き続いての未知の患者サンプルの測定において、これらの未知の患者がエストラジオールレセプター陽性又はエストラジオールレセプター陰性乳癌を患っているかどうかを決定するために、このカットオフ値を使用することが可能である。さらに、エストラジオールレセプターの存在又は不存在の決定及びＰＴＡ断片の決定の組み合わせを、図１２に示されているように、前記未知の患者サンプルに存在する癌細胞の異なった状態を決定するために使用することができる。  
【００３０】
基準値を作る別の手段は、ＰＴＡ、即ち、配列番号１３又は１４に従った完全ＰＴＡ分子の量であることができる。例えば、ＰＴＡに対するＰＴＡ断片の比が計算され、健康な個体に存在する比に対応する閾値より上では、比は本明細書で記載した癌細胞状態Ｂ及びＣの指標である。
【００３１】
例えば、もし乳癌サンプルに由来する未知の患者サンプルがエストラジオールレセプター陽性又は陰性であるかどうかを決定することが意図されたとすると、エストラジオールレセプター陽性乳癌サンプルに由来する別の患者サンプルを使用することが可能であり、ＰＴＡ２−２９について測定された両方の値を比較する。エストラジオールレセプター陰性サンプルと比較して、エストラジオールレセプター陽性乳癌サンプルがより少ないＰＴＡ２−２９しか含んでおらず、未知サンプル中のＰＴＡ２−２９について測定された値が、陰性対照サンプルとして使用されたエストラジオールレセプター陽性サンプル中の値よりも高いならば、未知のサンプルはエストラジオールレセプター陰性サンプルである。乳癌を有していない個体、又は一般にエストラジオールとは無関係に増殖する癌のタイプを患っている個体からのサンプル、又は非悪性疾患の患者からのサンプルなどを陰性対照として使用することも可能である。一般に、これらのサンプルが、改変されたエストラジオール経路を有する細胞を含有していない、又はそのような細胞を有する個体に由来しないことが明白である限り、多様な種類の陰性対照サンプルを使用することができる。
【００３２】
ペプチド、タンパク質及びＰＴＡ
用語「ペプチド」とは、２又はそれ以上、好ましくは、３又はそれ以上 、４又はそれ以上、６又はそれ以上、８又はそれ以上、１０又はそれ以上、１３又はそれ以上、１６又はそれ以上、好ましくは２１又はそれ以上のペプチド結合により共有結合で連結されたアミノ酸を含んでなる化合物を指す。大きなペプチドは普通、タンパク質と称されるが、一般にペプチドとタンパク質は同義語である。ＰＴＡの完全アミノ酸配列は、もしＰＴＡのようなタンパク質の名前が、例えば、ＰＴＡペプチドではなくＰＴＡ又はＰＴＡ断片ではなくＰＴＡのように、語ペプチド又は断片の付加なく本明細書で使用されるならば、天然に観察されるものを意味する。ＰＴＡ断片はＰＴＡペプチドの同義語である。ＰＴＡは、Ｎ末端メチオニンが除去される前の又は除去された後の完全アミノ酸配列を表す、例えば、配列番号１３及び１４。好ましくは、ペプチド及び／又はタンパク質及び／又はＰＴＡ−断片は、少なくとも３０％、好ましくは４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、好ましくは９７％、好ましくは９９％、好ましくは９９％以上の純度で精製されている。本発明のペプチド及び／又はタンパク質は、ペプチド及び／又はタンパク質の誘導体及び／又は多形形態、例えば、特定のペプチド又はタンパク質の非グリコシル化形態及び前記ペプチド又はタンパク質の一つ又はいくつかの異なってグリコシル化された形態のような類似のペプチド及び／又はタンパク質の混合物を含んでなることができる。グリコシル化、リン酸化などのような特定の修飾は、天然のように必ずしもすべての分子がこれらの修飾を受けず、又はいくつかの修飾は一部にのみ起こるように、又は可逆的であるか又は特定のペプチド又はタンパク質の異なった誘導体間に平衡が存在するように、そうでなければ均質なペプチド又はタンパク質サンプルのすべての分子中には存在しないことが普通である。
【００３３】
本発明に従った用語「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸のみを含んでなる化合物、ならびに炭水化物、脂質、リン基又は他の部分のような非アミノ酸構成物も含んでなる化合物を含み、及びペプチド結合のみを含んでなる化合物及び他の結合、例えば、エステル、チオエステル又はジスルフィド結合も含んでなる化合物を含む。例えば、ＰＴＡが最もＮ末端のセリンでリン酸化可能であること、及び前記Ｎ末端セリンがしばしば追加のアセチル基を含んでなることは、当該技術分野で公知である。それ故、天然に存在するＰＴＡのＮ末端は、セリン、ホスホセリン、アセチルセリン、アセチルホスホセリンであり得る。
【００３４】
用語「非ＰＴＡアミノ酸又は非ＰＴＡアミノ酸配列」は、天然に生じる多様なＰＴＡ配列のいずれにもそこには存在しない、ＰＴＡのＮ又はＣ末端に付加されたいずれかのアミノ酸を意味し、そのいくつかが図９に示されている。
【００３５】
ペプチドの修飾
本発明に従ったペプチド又はタンパク質の修飾は、翻訳後修飾、化学修飾、酵素的修飾による修飾及び他の機構による修飾を含んでなることができる。可能な修飾の例には、限定されるわけではないが：グリコシル化、リン酸化、スルファチル化、ピログルタミン酸修飾、システイン−ジスルフィド架橋、チオエステル架橋、メチル化、アセチル化、アシル化、ファメシル化、ホルミル化、ゲラニルゲラニル化、ビオチン化、ステアロイル化、パルミチル化、リポ化、Ｃ−マンノシル化、ミリストイル化、アミド化、脱アミド化、メチル化、脱メチル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、酸化、ペグ化、プレニル化、ＡＤＰ−リボシル化、脂質、ホスファチジルイノシトール、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカー、リン酸ピリドキサールの付加、カルボキシアミドメチルシステインを生じる、カルボキシメチルシステインを生じる、又はピリジルエチルシステインを生じるシステイン残基の修飾、リポン酸を生じるリジン残基の修飾、ピログルタミン酸を生じるグルタミン酸の修飾などが含まれる。
【００３６】
本発明に従ったペプチド又はタンパク質の修飾は、通常ではないアミノ酸、化学的又は酵素的に修飾されたアミノ酸などを含んでなることができ、限定されるわけではないが：アルファアミノ酪酸、ベータアミノ酪酸、ベータアミノイソ酪酸、ベータアラニン、ガンマ酪酸、アルファアミノアジピン酸、４−アミノ安息香酸、アミノエチルシステイン、アルファアミノペニシラン酸、アリシン、４―カルボキシグルタミン酸、シスタチオニン、カルボキシグルタミン酸、カルボキシアミドメチルシステイン、カルボキシメチルシステイン、システイン酸、シトルリン、デヒドロアラニン、ジアミノ酪酸、デヒドロアミノ−２−酪酸、エチオニン、グリシン−プロリンジペプチド、４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、ホモセリン、ホモシステイン、ヒスタミン、イソ−バリン、リジノアラニン、ランチオニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、２−ピピリジン−カルボン酸、ピログルタミン酸、ピロリジン、プロリン−ヒドロキシプロリンジペプチド、サルコシン、４−セレノシステイン、シンデシン、チオプロリンなどが含まれる。さらなる例は、ＡＢＲＦのウェブサイトで検索可能な「Ｄｅｌｔａ  Ｍａｓｓ」データベース、「Association of Biomolecular Resource Facilities」:http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home?AvgMass=all 、で見ることが可能である。さらに、ペプチドはペプチド模倣構造を含んでなる、又はペプチド模倣構造であることができる。
【００３７】
好ましくは、本発明に従ったＰＴＡ−断片は以下の修飾を含んでなることができる：
・ＰＴＡアミノ酸配列の２位に：セリンの代わりにＮ−アセチルセリン又はホスホセリン；
・ＰＴＡアミノ酸配列の８位に：スレオニンの代わりにホスホスレオニン；
・ＰＴＡアミノ酸配列の１３位に：スレオニンの代わりにホスホスレオニン；
・ＰＴＡアミノ酸配列の１４位に：スレオニンの代わりにホスホスレオニン。
【００３８】
ペプチドの断片及び多形形態
ペプチド又はタンパク質の多形形態はアミノ酸配列中の相違により特徴付けられる。
ペプチド及び／又はタンパク質の多形形態は、天然に存在する突然変異（図９参照）による、又は分子生物学、遺伝学又は化学（核酸又はペプチド合成）のような技術を使用した配列の実験的又はランダム操作により起こされた突然変異による、配列の変異を意味する。さらにペプチド及び／又はタンパク質の多形形態は、配列アラインメントにより決定された、好ましくは７０％配列同一性、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、好ましくは９７％、及び好ましくは９９％のお互いの配列同一性を有する。アミノ酸残基が、もし二つの配列の配列アラインメント内において、アミノ酸が同一位置に置かれていたら、このアミノ酸残基はこれら二つの配列内で同一と見なされる。例えば、もし第一の仮定配列「ＡＣＤＥＦＧＨＩＫＬ」及び欠失された「Ｇ」を有する第二の仮定配列「ＡＣＤＥＦＨＩＫＬ」がアラインされたとすると、第二の配列の「Ｆ」と「Ｈ」の間にギャップが挿入され、「ＡＣＤＥＦ−ＨＩＫＬ」を生じ、それにより第一の配列に対する第二の配列のより良いアラインメントを可能にする。生じたアラインメントにおいての結果として、１０位の内の新しい９位が同一のアミノ酸残基で占められ、９０％の第二の配列に対する第一の配列の配列同一性を生じる。どのようにして配列アラインメントを計算するかについての方法は以下に与えられている。
【００３９】
好ましくは、ペプチド又はタンパク質（特に、ペプチド又はタンパク質断片）、及び／又はそれらの多形形態は、少なくとも８アミノ酸残基、好ましくは１０、好ましくは１２、好ましくは１５、好ましくは２０、好ましくは５０、好ましくは少なくとも１００アミノ酸残基を含んでなり、それは両方のペプチド又はタンパク質のアラインメント内の同一位置に存在する。
【００４０】
本発明に従ったＰＴＡ断片であるペプチドは、ＰＴＡアミノ酸配列の少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５アミノ酸を含んでなることが可能である。核酸であるＰＴＡ断片は、ＰＴＡアミノ酸配列の一部をコードする少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００ヌクレオチドを含んでなることが可能である。最も好ましくは、ＰＴＡ断片の多形形態は、図９に示したＰＴＡ多形のような天然に存在するＰＴＡの配列の断片から成っており、ここで図９のＰＴＡ多形中に示された一つ又はそれより多くのアミノ酸残基は、ＰＴＡのアミノ酸配列（配列番号１４）内の特定の位置に通常存在するアミノ酸残基と交換することができる。
【００４１】
抗内分泌療法及び癌又は癌細胞の層別化
本発明に従った個体又は患者の層別化、又は癌又は癌細胞のタイプの層別化とは、前記個体又は患者、又は癌のタイプ又は癌細胞のタイプを、特定の特徴又は表現型に基づいてサブグループに分割することを意味する。それ故、例は、癌患者の二つのグループへの癌患者の層別化、抗内分泌癌療法から恩恵を受けるであろう一つのグループ（図１２の癌状態Ａ）及び抗内分泌癌療法から恩恵を受けないであろう別のグループ（図１２の癌状態Ｂ、Ｃ及びＤ）、又は抗内分泌治療に感受性である癌のタイプ（図の癌状態Ａ）及びこうした治療には感受性ではない癌のタイプ（癌状態Ｂ、Ｃ及びＤ）のグループへの癌のタイプの層別化、又は機能的エストラジオールシグナリング経路を有する癌細胞（図１２の癌状態Ａ）及び損なわれたステロイド又はエストラジオールシグナリング経路を有する癌細胞（癌状態Ｂ、Ｃ及びＤ）への癌細胞の層別化、である。層別化は、細胞の表現型、細胞の免疫学的特性、特定の医学治療に対する患者の提案された感受性などのような多様な判断基準に基づいて行うことができる。表現型的特徴、又は癌又は癌細胞のタイプの他の特徴付けに基づいた層別化は、それらがステロイド、好ましくはエストラジオール又はプロゲステロンに応答するかどうかを決定することを含む。エストラジオール及びプロゲステロンは、もしこれらの細胞がこれらの刺激に対する機能的シグナリング経路を所有していれば、細胞の成長及び増殖を促進するステロイドホルモンである。特に乳癌患者において、これらの刺激の阻止が療法において普通に使用される。しかしながら、エストラジオール刺激を阻止することから恩恵を受ける可能性のある癌患者の状態は、癌細胞の表面でのエストラジオールレセプターの存在又は不存在の免疫組織学的決定により、又はエストラジオールレセプターの定量的決定により、及び対応するステロイド又はエストラジオールシグナリング経路の機能性を決定することによらずに、主として決定される。この種の療法は抗内分泌療法と称されている。抗内分泌療法は一般に、エストラジオール又はプロゲステロンレセプターのようなステロイドレセプターへのリガンドの結合によるこうしたレセプターの阻止のような異なった機構（これらのレセプターのシグナリングカスケードを刺激しないが、天然のリガンドに対してこれらのレセプターを阻止する）を使用することができる。この種の物質はＳＥＲＭ（選択的エストラジオールレセプター変調剤）とも称される。抗内分泌療法に使用することが可能である別の機構は、エストラジオールレセプター（エストラジオールレセプター下方調節剤；ＥＲＤ）のようなステロイドレセプターの下方調節である。抗エストラジオール療法へのさらなるアプローチは、体により産生されているエストラジオールの量を低下させることである。例えば、閉経後の助成において、エストラジオールはもはや産生されないが、ホルモンアンドロゲンはエストラジオールに変換される。アロマターゼと称される特定の酵素がアンドロゲンからエストラジオールへの変換に関与しており、それ故、種々の機構によるアロマターゼの阻害を抗内分泌療法として使用することが可能である。一般に、すべての記載した及び可能なさらなる抗内分泌療法の機構を、エストラジオール、プロゲステロンその他のような、細胞増殖に関与する多様な種類のステロイドに対して使用することができる。これらの治療目的のために使用中の又は臨床試行中の物質は、中でも、タモキシフェン（商品名：ノルバデックス）、アリミデックス（商品名：アナストロゾール）、ゴセレリン（商品名：ゾラデックス）及びファスロデックス、すべてAstraZeneca, Sodertalje, Sweden, から、フェメラ (商品名：レトロゾール）及びレンタロン（商品名：フォルメスタン）、両方ともNovartis, Basel, Switzerland，から、アロマシン（商品名：エキセメスタン）Pfizer, New York, NY, USA, から、ラロキシフェン（商品名：エビスタ）、EIi Lilly, Indianapolis, IN, USA, から、アタメスタン、Biomedicines Inc., Alameda, CA, USA, から、ＴＡＳ−１０８、Taiho Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo, Japan, から、プロゲンタ、Zonagen Inc., The Woodlands, TX, USA,から、６−ＭＣＤＦ、AVAX Technologies, Kansas-City, USA, から、ＰＳＫ３６６８、ProSkelia SAS / Strakan Pharmaceuticals Ltd., Galashiels, Great Britain, から、トレミフェン（商品名：ファレストン）、GTx, Inc., Memphis, TN, USA から、である。
【００４２】
損なわれたステロイドシグナリング経路及び損なわれたステロイドシグナリング経路の決定
本発明に従った、損なわれたステロイドシグナリング経路とは、こうした損なわれたステロイドシグナリング経路により影響された細胞においては、ステロイドによる刺激による細胞性反応、特に細胞増殖が起こらないことを意味している。損なわれたステロイドシグナリング経路が部分的にのみ不全であることも可能であり、減少した細胞増殖のような、減少しているがしかし完全には失われていない細胞性反応を生じる。その結果、例えば、損なわれたステロイドシグナリング経路を有する細胞は、タモキシフェンのような抗エストラジオールでの治療のような抗内分泌治療に対して応答しないか又はより少ない程度で応答し、及び抗エストラジオールにより増殖が損なわれないか又は抗エストラジオールにより増殖が部分的にのみ損なわれる。当該技術分野で既知の多様な方法を、ステロイド経路、特にエストラジオール又はプロゲステロンシグナリング経路が細胞増殖において機能的であるかどうかを決定するために使用することができる。インビトロ培養細胞をエストラジオール又はプロゲステロンで刺激することができ、そして刺激した及び刺激しない増殖を、例えば、放射活性３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ、又はミトコンドリアの代謝活性を測定するＭＴＴ−（ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイのような代謝活性を測定するアッセイにより、又は当該技術分野で既知の他のアッセイにより決定することが可能である。もしくは又は加えて、機能的ステロイドシグナリングを示すマーカータンパク質又はペプチドの発現を、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティングなどのような標準免疫学的又は分子生物学的技術により、又は、シグナリングに関与するタンパク質の変化を、例えば、リン酸化タンパク質、プロセスされた又は分解されたタンパク質、又は増加した又は減少した量の発現の検出により測定することができる。
【００４３】
配列アラインメントの調製及び配列相同性の計算
配列の相同性を計算するため、ＧＡＰ(Nucleic Acids Res.12:387-95)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ (J MoI Biol. 215:403-10) 又は公知の Smith Watermann-algorithm を含む、ＧＣＧソフトウェア一式(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl, USA) のようなコンピュータープログラムを使用することができる。アミノ酸比較又はアラインメントに使用される好ましいパラメータは、Needleman and Wunsch (J MoI Biol. 48:443-53)のアルゴリズム、ＢＬＯＳＵＭ  ６２  マトリックス (Proc Natl Acad Sci U S A. 89:10915-9)、１２のギャップペナルティ、４のギャップ長ペナルティ及び０の同一性の閾値を含んでなる。ＧＡＰソフトウェアも、記載したパラメータで使用するのに適している。記述したパラメータはアミノ酸比較についてのデフォルトパラメータであり、配列末端のギャップは相同性値を減少させない。もし８〜２０アミノ酸長配列のような非常に短い配列を比較するならば、期待値を１０００００まで増加させ、及びワード長を２まで減少させる必要がある。さらに適したアルゴリズムは、ギャップ開始パラメータ、ギャップ伸長パラメータの使用、及びプログラムハンドブックWisconsin Package, バージョン９、１９９７年９月から、に見られるマトリックスの使用である。最も適したアルゴリズムの選択は、実施する比較の種類に依存する。もし二つの配列データベースを比較するならば、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムが好ましい。７０％の配列同一性は７０％の相同性とも称される。同一性とは、アラインメントの両方の配列内の同一位置に、同じアミノ酸が存在することを意味する。
【００４４】
ペプチド模倣体
本発明に従ったペプチドは、部分的に又は完全にペプチド模倣体を示すように製造又は合成することができる。このことはより明確な特性を有するペプチド及び／又はタンパク質を設計することを可能にする。例えば、Ｄ−アミノ酸をペプチド結合のタンパク分解を防止するために使用することができる。本発明に従った「ペプチド模倣体」は、アミノ酸又はアミノ酸配列の機能を模倣する構造である。「ペプチド模倣体」又は「ペプチドの模倣体」はしばしば、タンパク分解に対する増強された耐性のような追加の特性を有する。ペプチド模倣体は、アミノ酸を連結することができる別の種類の共有結合でいくつか又はすべてのペプチド結合を置き換えることが可能である。ペプチド模倣体は、中でも、（ｉ）アミノ酸修飾、（ｉｉ）ジペプチド類似体、（ｉｉｉ）生物学的半減期を増加させるペプチド主鎖修飾、及び（ｉｖ）二次構造模倣体、を含んでなることができる。いくつかのペプチド模倣体は、例えば、ペプチドに対する自由度の程度を制限している。アミノ酸修飾の例は、アルファ−Ｃアルキル化、アルファ−Ｎアルキル化など共有結合によりお互いに連結された二つのアミノ酸側鎖を有するペプチドであるジペプチド類似体、アミド結合アイソスターのようなペプチド主鎖の修飾、又はＬ−からＤ−アミノ酸へ及びインバースＮ−からＣ−配列へ変化させることにより得られるレトロ−インバーソ（retro-inverso）異性体などである。二次構造模倣体は、アルファ−へリックス（例えば、ベータ−アミノ酸による）、ベータ−シート、ベータ−ターン（例えば、輪止め（linchpin）構造による）及びガンマ−ターンのような構造の模倣体を含んでなる。ペプチド模倣体のさらなる例は、ペプチド及びタンパク質の溶解性又は免疫原性特性を修飾できる、スピーゲルマー（spiegelmers）（登録商標）（NOXXON Parma AG, Berlin, Germany）又はペグ化のような修飾である。
【００４５】
核酸、相補性及び縮重核酸及び誘導体
本発明に従った核酸又は核酸配列は、これらの核酸が一本鎖又は二本鎖、線状、環状又は分枝であるかどうかに関わらず、すべての種類のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）又はそれらの組み合わせを意味する。好ましくは、核酸分子は精製された核酸分子であり、それは調製物が５０％、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、好ましくは９９％以上の特定の核酸分子、又は一つ又はそれより多くの特定の核酸分子の特定の混合物を含有することを意味する。核酸分子の例は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、組換えで生成された核酸分子、化学的に合成された核酸分子又は酵素的に発生させた核酸分子（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により）、又は当該技術分野で既知の方法を使用し、原核又は真核細胞、ウイルス、組織、器官、又は細菌、酵素、昆虫、虫（ｗｏｒｍ）などの全生物体のような天然源から精製された核酸である。さらに本発明に従った核酸分子は、核酸の誘導体を部分的に又は完全に意味することができ、その誘導体は、ホスホロチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｎ３’，Ｐ５’−ホスホロアミデート、モルホリノホスホロアミデート、２’−Ｏ−メトキシエチル核酸、２’−フルオロ−核酸、アラビノ−核酸、ロックト核酸（ＬＮＡ、リボースの２’−酸素と４’−炭素を連結するメチレン架橋を含有するリボヌクレオチド）のような天然には観察することができないヌクレオチド又はヌクレオチド様分子を含んでなる。
【００４６】
本発明に従った核酸はさらに、アンチセンス核酸、リボザイム、三重鎖形成核酸、ＲＮＡｉ−核酸、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとして適した、インサイツハイブリダイゼーションに適した、ノーザン又はサザンブロットのようなハイブリダイゼーション実験に適した、又は核酸チップ実験に適した核酸、好ましくはＰＴＡ又はＰＴＡ断片の発現のための、又はＰＴＡ発現を抑制するように方向付けられたアンチセンス核酸の発現のためのベクター又はウイルスベクターとして適した核酸、を含んでなる。核酸は好ましくは、ＰＴＡをコードするｍＲＮＡの完全長の配列長、意図される使用に依存して、好ましくは６００未満、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、１００未満、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１５未満のヌクレオチドを有する。もし核酸が発現ベクターを表すとすれば、例えば、バキュロウイルスのような多くのウイルスは大きなゲノムを有し、非常に大きなベクターを生じるので、核酸分子の長さはより長く、数千のヌクレオチドまでであることが可能である。アンチセンス及び三重鎖形成核酸分子は、好ましくは、６〜５０、好ましくは１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０ヌクレオチドの配列長を有する。リボザイムは、好ましくは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列を有し、前記ハイブリダイズする配列は対応するアンチセンス核酸と同じ長さを有し、加えて、当該技術分野で公知の触媒リボザイム配列を含んでなる。ポリメラーゼ連鎖反応でプライマーとして使用するための核酸は、好ましくは、１０〜６０、好ましくは１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０ヌクレオチドの長さを有する。
【００４７】
相補核酸配列は、お互いにハイブリダイズして二重鎖又は三重鎖核酸分子を形成する核酸配列を意味する。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイブリダイゼーションが配列特異的であり、ランダムではないことを確実にするストリンジェント実験条件下で起こる。核酸についてのストリンジェントハイブリダイゼーション条件は当該技術分野で既知であり、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor, New York, 1998 又は Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Asibeo et al., John Wiley & Sons, Inc., New York. に公開されている。ハイブリダイゼーション条件についてのストリンジェント条件の例は、３．５ｘＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有する緩衝液中、６５℃でのハイブリダイゼーションである。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び０，１５Ｍクエン酸ナトリウムをｐＨ７で含有する緩衝液を表す。ハイブリダイゼーションに続いて、二重鎖核酸が付着している膜を、室温にて２ｘＳＳＣで、及び６８℃までの温度にて０．１％ＳＤＳ含有０．１〜０．５ｘＳＳＣで洗浄する。ストリンジェント実験ハイブリダイゼーション条件についての他のプロトコールは、当該技術分野で知られており、そして本発明の範囲内である。特異的ハイブリダイゼーションは、少なくとも４０％、好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％のお互いに相補的である核酸配列部分がお互いにハイブリダイズする。ストリンジェント実験条件下で二重鎖核酸構造が安定である限り、全核酸配列がお互いにハイブリダイズすることは必要ではない。
【００４８】
縮重核酸配列とは、ほとんどのアミノ酸は少なくとも二つの異なったコドンによりコードされているので、異なったアミノ酸配列が多種の核酸配列によりコードすることが可能であることを意味している。このため、同一のアミノ酸配列を非常に異なったヌクレオチドの配列でコードすることが可能である。
【００４９】
非ＰＴＡヌクレオチド又は非−ＰＴＡ核酸配列とは、ＰＴＡ核酸配列の５’又は３’末端のいずれかのヌクレオチドを意味し、それは天然に存在する多様なＰＴＡ核酸配列のいずれの一つにもこの位置には存在していない。
【００５０】
ラベル化核酸、ペプチド、タンパク質及び結合剤
本明細書において、用語「ラベル」とは：（ｉ）検出可能なシグナルを提供し；（ｉｉ）第一又は第二のラベルにより提供される検出可能なシグナルを修飾するために第二のラベルと相互作用し、例えば、ＦＲＥＴ；（ｉｉｉ）電荷、疎水性、形状又は他の物理学的パラメータにより、移動度、例えば、電気泳動移動度に影響し；又は（ｉｖ）捕捉部分を提供する、例えば、親和性、抗体／抗原、イオン複合体形成、縮重核酸配列を生じる；ように機能するいずれかの部分を指す。
【００５１】
本発明は、核酸、ペプチド、結合剤、抗体のような物質、ならびに前記物質の断片、誘導体及び多形形態を含んでなり、それらはラベル又は他の機能性基を含んでなることが可能である。蛍光分子、放射性分子、発光分子、酵素、毒素、染料、金属粒子、磁性粒子、ポリマー粒子、ビオチン又は他の有機分子のようなすべての種類のラベル及び機能性基が適している。特に、質量分析のためには同位元素ラベル又は等圧性（ｉｓｏｂａｒｉｃ）ラベルが適している。同位元素ラベルは、酸素−１８、窒素−１５、重水素、トリチウム、炭素−１４、硫黄−３５又はリン−３２などのような、それらの天然の分子量とは異なった分子量を有する同位元素の使用により得ることが可能である。等圧性ラベルは、これらのラベルがインタクトであり、そして質量分析計中でフラグメント化されていない限り、同一の分子量を有する。それ故、サンプルの分析に先立って限られた数の質量相違しか存在しないので、等圧ラベルは質量分析法を使用してより都合よく分析することが可能である。蛍光分子の例は、フルオレスセイン、テキサスレッド、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、サイバーグリーンなどのようなフルオロフォア、グリーン蛍光タンパク質、レッド蛍光タンパク質、ブルー蛍光タンパク質、ウミシイタケ蛍光タンパク質その他のような蛍光性タンパク質又はそれらの断片又は誘導体である。ラベル又は機能性基として適した放射性同位元素の例は、リン−３２又は−３３、硫黄−３５、ヨウ素−１２５、トリチウム、炭素−１４、カルシウム−４５、クロム−５１及び核酸及び／又はペプチド及び／又はタンパク質とカップリング可能であるすべての他の既知の放射性同位元素である。酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ガラクトシダーゼなどである。適した毒素は、微生物毒素、毒性ペプチド、毒性小有機分子、合成毒素、又は医学目的に使用される毒素のようなすべての種類の毒素である。適した色素の例はジゴキシゲニンである。粒子の例は、種々の粒子直径、好ましくは０．１〜１００μｍの間のものである。金属粒子は、種々の物質、好ましくは金、銀、白金のような重元素又は他の適した金属又は合金、又はそれらの混合物である。磁性粒子の例は、鉄、好ましくはＦｅ３Ｏ、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４などのような鉄酸化物を含む、すべての種類の磁性又は磁化可能な材料から作製される粒子である。ポリマー粒子の例は、ポリアクリルアミド、アガロース、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレンなどのようなポリマーから作製された粒子である。当該技術分野で知られているように、ビオチン、キチン、マルトース又はグルタチオンなどのような多様な他のラベルも使用することが可能である。
【００５２】
さらに、以後ラベル配列と称される、特定の追加の核酸又はアミノ酸配列を含んでなるラベル又は機能性基を使用することができる。例えば、核酸配列を含んでなるラベル配列は、例えば、ラベル配列に特異的なプローブでのハイブリダイゼーションにより、ポリメラーゼ連鎖反応などによるラベル配列の検出により、例えば、ラベル化物質の検出に使用することが可能である。アミノ酸配列を含んでなるラベル配列の例は、ｈｉｓ−タグ、ｆｌａｇ−タグ、ｍｙｃ−タグ又は抗体、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ストレプトアビジン、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、種々のレクチンなどのような全タンパク質又はそれらの断片である。これらのラベルは、抗体の使用により、又はプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＹ、プロテインＡ／Ｇ、グルタチオン、ビオチン、キチン、マルトース又は他の糖のようなこれらのラベルに結合するリガンドの使用により検出することが可能であり、又はこれらのラベル配列は、もしラベル配列が、例えば、ＨＩＶ−Ｔａｔペプチド、アンテナペディア（Antennapedia）ペプチド、ＶＰ２２ペプチドなどであれば、細胞内へのラベル化物質の輸送のような他の様式で機能することができる。ラベル配列は、特にラベル配列がアミノ酸配列を含んでなれば、前記ラベル配列に特異的な結合剤でラベル化物質を捕捉することにより、ラベル物質を精製するためにも一般に使用することができる。
【００５３】
ベクター
核酸配列はベクターの一部であることができる。本発明に従ったベクターは、環状又は線状又は分枝状、一本鎖又は二本鎖、リボ核酸、デオキシリボ核酸又はそれらの組み合わせであり得る。ベクターは裸の核酸、例えばタンパク質、脂質、リポソーム、リン酸カルシウム沈降物又は他の物質、又はそれらの組み合わせが付随した核酸であり得る。ベクターは、前記核酸又はベクターを含んでなるウイルス又は細胞でもあり得る。ベクターは、例えば、ＰＴＡ、ＰＴＡペプチド、ＰＴＡ核酸及び／又は断片、それらの誘導体又は多形形態の量を増強する又は減少させるために適していることができる。前記ＰＴＡ、ＰＴＡペプチド、ＰＴＡ核酸及び／又は断片、それらの誘導体又は多形形態の量を増加させるベクターは、例えば、過渡的又は安定発現ベクターである。前記ＰＴＡ、ＰＴＡペプチド、ＰＴＡ核酸及び／又は断片、それらの誘導体又は多形形態の量を減少させるベクターは、例えば、例えばＰＴＡ核酸配列特異的アンチセンス核酸、リボザイム、三重鎖形成核酸、ＲＮＡｉ分子などをコードする核酸配列を含んでなる。ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス、ファージ又は当該技術分野で既知の他のウイルスのようなウイルスの形態で存在することができる。ウイルスは、生きているウイルス又は増殖及び／又は感染のためにヘルパーウイルスを必要とするウイルスであることができる。ベクターは、ヒト、マウス、ラットなどのような特定の種、哺乳動物、齧歯動物などのような特定の種の群、又は筋肉組織，膵臓、肝臓、脂肪組織などのような特定の器官又は組織、脂肪細胞、筋肉細胞、膵臓の細胞、神経細胞、胃腸管からの細胞などのような特定のタイプの細胞に非特異的又は特異的で、又は細菌、酵母、昆虫細胞、ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞のような細胞株に特異的であることができる。ベクターの特異性は、特異的細胞タイプ又は種でのみ活性である特異的プロモーター核酸配列のためであることができ、又ベクターは、特異的細胞などへベクターを標的化する機構により特異的であり得る。
【００５４】
宿主細胞
宿主細胞とは、前の章に記載した核酸及び／又はベクターを含んでなる細胞を意味する。核酸又はベクターは、細胞中に過渡的に又は安定に存在することができ、前記核酸又はベクターはサイトゾル、又は核又はミトコンドリアのような細胞の特定の小器官に存在することができる。ベクター配列又はそれらの断片は、例えば、プラスミドの形態でサイトゾルに存在することが可能であり、又はベクター配列は、部位（配列）特異的、又はランダム又は他の機構により、細胞のゲノム又はミトコンドリアのゲノム内に、又は細胞に存在するプラスミド内に部分的に又は完全に組み込まれていることができる。
【００５５】
結合剤、抗体及び誘導体
本発明の別の態様は、本発明のＰＴＡペプチドに特異的な結合剤である。これらの結合剤は、例えば、ヒト、マウス、ラット及びウシＰＴＡは、特にＮ末端が非常に類似しているので、ヒトＰＴＡのみに特異的であることはできない。それ故、多くのＰＴＡ特異的結合剤はこれら及び他の種のＰＴＡへも結合するであろう。しかしながら、例えば、ヒトにおいての診断的又は治療的目的には、このことは問題にすべきものではない。本発明に従った結合剤は、中でも、これらのペプチドに特異的なレセプター、これらのペプチドを特異的に結合するファージ、これらのペプチドを特異的に結合するスピーゲルマー（登録商標）、これらのペプチドを特異的に結合する小有機分子、レセプター、ファージ、小有機分子、スピーゲルマー（登録商標）のような、これらのペプチドを特異的に結合する物質で表面被覆された粒子である。好ましくは、特異的結合剤は、前記ペプチドを結合する、又は前記ペプチドの断片、誘導体又は多形形態を結合する特異的抗体を含んでなる。ＰＴＡ断片にのみ存在し、ＰＴＡの完全配列には存在しないエピトープであるＰＴＡ断片のネオエピトープを認識する抗体も含まれる。また前記抗体の断片も、これらの断片が前記ペプチドに特異的に結合する限りは含まれる。好ましくは、前記ペプチドに特異的な結合剤は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＹ抗体のような抗体であり、前記抗体は、いずれの種から由来してもよく、精製された形態で、細胞培養上清、抗血清、腹水液として、又は卵内に含有されている形態で存在することができる。抗体は、好ましくは、ヒト、マウス、ラット又は他の哺乳動物、又は卵、好ましくは鶏卵に由来することができ、又は抗体を、当該技術分野で既知の組換え技術を使用して産生することができる。抗体はモノクローナル、オリゴクローナル又はポリクローナル抗体であることができる。
【００５６】
抗体は、好ましくは、精製された特異的抗体、非特異的抗体又はアルブミンのような他のタンパク質をさらに含んでなる精製された特異的抗体、全抗血清から調製された、細胞培養上清から調製された、卵から調製された、又は腹水液から調製された抗体、又は精製されていない抗体、好ましくは精製されていない抗血清、精製されていない細胞培養上清、精製されていない腹水液、又は精製されていない組換え抗体であることができる。好ましくは、本発明に従った精製された抗体又は抗体断片又は誘導体は、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％含んでなり、又は、好ましくは、少なくとも９８％の前記抗体及び／又は抗体断片及び／又はそれらの誘導体を含んでなる。
【００５７】
特異的結合剤とは、例えば抗体を意味し、それはＰＴＡ断片のようなペプチドリガンドに特異的に結合し、それは本発明の核酸に特異的に結合する。抗体又は核酸のような結合剤の結合の特異性は、例えば、標準ウェスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、又は当該技術分野で既知の他の方法により試験することができる。サンプルとして、例えば、試験されるべき抗体が恐らく特異的であるＰＴＡ断片をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞を使用することができる。陰性対照として、同一のしかしトランスフェクトされていない細胞株、又は非ＰＴＡ断片でトランスフェクトされた細胞株を使用することができる。抗体の特異性を決定するため、両方の細胞株からの溶解液を、ウェスタンブロットで試験することができる。抗体のような特異的結合剤は、ＰＴＡトランスフェクト細胞からの溶解物中でのみ正しい分子量のバンドを認識するが、陰性対照からの溶解物中では認識しない。核酸の特異性を決定するためには、ＲＮＡを両方の細胞株から精製し、例えば、ノーザンブロット又は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により試験することができる。ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＴＡトランスフェクト細胞株から単離されたＲＮＡを使用すると、正しいサイズのＰＣＲ産物のみを与える。ノーザンブロットにおいて、特異的結合核酸は、トランスフェクトされた細胞株のＲＮＡサンプル中にのみ正しい分子量のバンドを認識するが、陰性対照からのＲＮＡは認識しない。しかしながら、当該技術分野で知られているように、陰性対照にもシグナルがあり得るが、もし結合剤が細胞内にトランスフェクトされたリガンドに特異的であるならば、陰性対照中のシグナルは明らかにより低い。特異性はさらに、ノーザンブロットにおける洗浄工程のストリンジェンシーを増加させることにより試験することが可能であり、それは陰性対照中のシグナルを徐々に減少させ、一方、ＰＴＡトランスフェクト細胞のシグナルは依然として存在する。
【００５８】
本発明はさらに、異なった種に由来する抗体の一部を含んでなる抗体、例えば、マウス抗体の抗原結合ドメイン、及びヒト抗体由来の抗体又は抗体断片のもう一方の部分を含んでなる、例えば、ヒト化抗体のような抗体の誘導体を含んでなる。本発明は、抗体の断片がいまだにＰＴＡ断片又はそれらの多形形態に特異的に結合する限り、それらの抗体も含む。可能な抗体の例は、中でも、Ｆａｂ２又はＦａｂ抗体断片である。本発明に従った抗体のさらなる誘導体は、有機化合物、無機化合物、ペプチド又はタンパク質のような他の物質に共有結合又は非共有結合で結合された抗体又は抗体の断片である。抗体のこうした誘導体の例は、放射性核種、毒素、酵素、フルオロフォア、蛍光性タンパク質、染料又はラベル配列（前の章に記載したラベル配列）でラベルされた抗体である。
【００５９】
医薬組成物
本発明の別の態様は医薬組成物である。これらの医薬組成物は、ＰＴＡ断片又はそれらの多形形態、又は前記断片又は多形形態をコードする核酸、又は相補的又は縮重配列、前記核酸を含んでなるベクター、前記核酸又は前記ベクターを含んでなる宿主細胞、を含んでなる。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、癌、特に改変されたステロイドシグナリング経路、特に改変されたエストラジオールシグナリング経路を有する癌細胞、特に乳癌又は結腸癌の療法、予防、再発の治療のために使用することができる。
【００６１】
医薬組成物は、経口的、舌下的に投与され、静脈内に注射され、皮下に注射され、腫瘍内、筋肉、脂肪又は他の組織内へ注射され、皮膚上又は粘膜上へ局所投与され、肺内部へエアロゾールとして吸入され、直腸又は他の経路を介して投与されることができる。医薬組成物は、錠剤、ピル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、個体へ経皮的に物質を放出する絆創膏、チンキ剤、口蓋垂、懸濁剤、液剤、好ましくは注射又は連続的注入液としての使用のための滅菌生理学的塩化ナトリウム溶液、などとして供給することができる。医薬組成物は、充填添加剤、抗菌添加剤、保存添加剤、着色添加剤、フレーバー添加剤、芳香添加剤、保護又は安定化添加剤などのような添加剤を含んでなることができる。好ましい保護又は安定化添加剤は、ペプチド及びタンパク質の分解を抑制する物質であり、例えば、ペプチド及びタンパク質を分解、凝集から、又は活性の消失から保護するための、プロテアーゼ阻害剤又はアルブミン（好ましくはヒトアルブミン）のような担体タンパク質である。医薬組成物は、必要に応じて一度又は繰り返して個体に適用することができる。日、週、月に１回又はそれ以上、又はより長い時間間隔で適用することができる。医薬組成物は、単独で又は他の医薬組成物と併用して使用することができる。併用された医薬組成物は、治療されている又は試験されている個体に対して相加的未満、相加的及び相乗的効果を有することができる。医薬組成物は、３μｇまで、１０μｇまで、３０μｇまで、１００μｇまで、３００μｇまで、１ｍｇまで、３０ｍｇまで、３００ｍｇまで又は３００ｍｇ以上のＰＴＡ断片、前記断片をコードする核酸、前記断片に特異的に結合する結合剤、前記断片又は誘導体、又はそれらの多形形態又はそれらの組み合わせに特異的に結合する抗体を含んでなることができる。
【００６２】
もし医薬組成物が診断組成物として使用されるならば、それは単独で又は他の診断組成物又は診断法と併用して使用することができる。二つ又はそれより多くの医薬組成物及び／又は診断法の併用による診断の結果は、診断の信頼性が相加的未満でもあり得るが、相加的に改良することが可能であり、又は診断を相乗的に改良することができる。医薬組成物は、癌細胞、好ましくは損なわれたステロイドシグナリング経路、好ましくは損なわれたエストラジオールシグナリング経路を有する癌細胞、好ましくは乳癌又は結腸癌細胞の存在を証明するため、又は不存在を証明するために診断で使用することができる。
【００６３】
サンプルを分析するために適した方法
一般に、サンプル中に存在するペプチドを検出する、及び分析するために適したすべての方法を、本発明の方法において使用することが可能であり、本発明のペプチド、核酸及び断片、誘導体の存在、不存在又は量を決定するために使用することができる。好ましくは、質量分析、タンパク質チップアッセイ、免疫学及び分子生物学法を使用することができる。
【００６４】
適した質量分析法は、中でも、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、連続的又はパルスエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）及びイオンスプレー又は熱スプレー又はマッシブクラスター衝撃（ＭＣＩ）のような関連する方法である。イオン源は、リニア又はノンリニア反射飛行時間（ＴＯＦ）、単一又は多四重極、単一又は多磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、イオントラップ、及びそれらの組み合わせ（例えば、イオントラップ／飛行時間）を含む検出様式と一致させることができる。イオン化のためには、多数のマトリックス／波長組み合わせ（ＭＡＬＤＩ）又は溶媒組み合わせ（ＥＳＩ）を使用することができる。適した他の質量分析法は、例えば、高速原子衝突（ＦＡＢ）質量分析、表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析、同位元素コード化アフィニティータグ（ＩＣＡＴ）質量分析又はアフィニティー質量分析法である。
【００６５】
さらに、適した免疫学的方法は、中でも、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ、直接、間接又は競合ＥＬｌＳＡアッセイ、酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳ＝蛍光標識細胞分取）、免疫組織化学、ウェスタンブロット、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイ、例えば、本発明のペプチドに特異的な抗体、抗体断片、レセプター、リガンド又は他の結合剤を使用するタンパク質−チップアッセイである。
【００６６】
中でも、ノーザン又はサザンブロットハイブリダイゼーション、核酸ドット−又はスロット−ブロットハイブリダイゼーション、インサイツハイブリダイゼーション、核酸チップアッセイ（例えば、問題とする核酸を特異的に捕捉するＲＮＡ、ＤＮＡ又は他の核酸を使用する）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ｔａｑ−ｍａｎ  ＰＣＲ）を、本発明の核酸を検出するための分子生物学方法として使用することができる。
【００６７】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）、蛍光光度分析、比色分析、放射分析、発光分析又は他の分光分析法、高速液体クロマトグラフィー、キャピラリークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）、１次元又は２次元ゲル電気泳動などのようなさらなる方法を、本発明のペプチド又は核酸を検出するために使用することができる。
【００６８】
試験キット
本発明のさらなる側面は、本発明のペプチド又は核酸又は断片又は誘導体又はそれらの多形形態の絶対濃度又は相対濃度を決定するための、又は存在又は不存在を決定するための試験キットである。試験キットは、機能性ステロイドシグナリング経路、好ましくは機能性エストラジオールシグナリング経路を有する細胞の不存在又は存在を診断するために使用することができる。試験キットはさらに、癌の発生を予測するため又は癌の状態のグレードを予測するため、及び／又は前記癌についての療法の成功を予測する及び／又はモニターするため、及び／又は前記癌の再発を予測する及び／又はモニターするために使用することができる。好ましくは、当該技術分野で知られている他の診断試験により診断が可能になる前に、前記癌を早期に診断及び／又は予測するため、好ましくは、本試験キットを使用することができる。本試験キットは、限定されるわけではないが、全血、血液細胞（白血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、赤血球及び血小板のような）、血清、血漿、血液濾過物、乳頭吸引液、尿、リンパ液、リンパ節組織、大便、脳脊髄液、結腸又は直腸からの組織、又は他の組織及び器官（例えば、癌細胞含有組織）、ならびにそれらの組み合わせを含む個体からのいずれかのサンプルを分析するために使用することができる。試験は、一つ又は一つ以上の個体のプールされたサンプルで行うことができる。サンプルは、前処理されたサンプルであることができ、サンプルは、例えば、クロマトグラフィー、濾過、沈殿、液体抽出又は他の抽出法、免疫沈降などにより分画されている。続いて個々の又は、一つ又は一つより多くのサンプルに由来する二つ又はそれより多くの合わされた分画を分析することができる。試験は一回又は数回、好ましくは数回、ＰＴＡ、ＰＴＡペプチド、ＰＴＡ核酸又はＰＴＡ断片、又はそれらの多形形態の量変化についての時間経過を分析する期間にわたって行うことができる。試験は、限定されるわけではないが、本特許出願の別の所に記載されているサンプルの分析法を含む、当該技術分野で知られている多様なタイプの試験キットで行うことができる。試験キットは、ＰＴＡ、ＰＴＡ断片、ＰＴＡ核酸、ＰＴＡ結合剤、ＰＴＡ特異的抗体又は断片、それらの誘導体又は多形形態、又はそれらの組み合わせのような物質を含んでなることができる。前記物質は、ラベル化形態で、又はそれらのラベル化が可能な形態で、又はそれらの検出及び／又は定量を容易にする形態でキット中に存在することができる。
【００６９】
ＰＴＡ、ＰＴＡ断片、ＰＴＡ核酸及び／又は断片、それらの誘導体又は多形形態は、標品として、又は試験されるべきサンプル中に存在する抗体へ結合できる捕捉剤として使用することが可能であり、又は試験されるべきサンプル中に存在する同一の又は類似のリガンドと結合剤の結合に競合する結合剤のラベル化リガンドとして使用することができる。
【００７０】
キットは、前記ＰＴＡ、ＰＴＡ断片又はＰＴＡ核酸に特異的に結合する、又はハイブリダイズする剤を含んでなることができる。さらに、本発明の試験キットは、試験キットをどのように使用するか、サンプルをどのように調製するか、どのような種類のサンプルを使用するか、結果をどのように分析する及び説明するかなどについての説明書を含んでなることができる。特に、本試験キットは、損なわれたステロイドシグナリング、好ましくはエストラジオール又はプロゲストロンシグナリング経路を有する癌細胞、好ましくはそのような損なわれたシグナリング経路を有する乳癌又は結腸細胞の存在又は不存在を決定するために本キットをどのように使用するかどうかの説明書を含んでなることができる。試験キットのための説明書は、文書であることができ、図、フィルム、オーディオ、コンピューター−マルチメディア又はキットをどのように使用するかを説明するのに適したいずれかの他の様式として提供される。
【００７１】
同定されたマーカーの新規使用
同定されたペプチドのいくつかは、従来の技術で知られているＰＴＡ断片（ＴＡ１、ＴＡ１１）であったが、ＰＴＡ断片であるペプチド又はＮ末端メチオニン残基を有する又は有しない完全ＰＴＡは、癌細胞を有する個体の層別化、即ち、前記癌細胞が抗内分泌又は抗エストラジオール療法に対して感受性であるかどうかを決定するために適したマーカーとしては、これまで記述されていない。
【００７２】
図１２は、癌の層別化についてＰＴＡ断片を使用した本明細書で記載された研究の結果の表を示しており、基礎をなす理論及び前記ＰＴＡ断片の提案された使用を示している。本明細書で示された結果に基づくと、エストラジオールレセプター（ＥＲ）及びＰＴＡ断片（例えば、図に示されたＰＴＡ２−２８）の決定の組み合わせは、癌細胞を有している個体を４つの異なった疾患状態、状態Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに層別化することを可能にする。状態ＡはＥＲの存在（＋）及びＰＴＡ断片の不存在（−）により特徴付けられ、状態ＢはＥＲの存在（＋）及びＰＴＡ断片の存在（＋）により特徴付けられ、状態ＣはＥＲの不存在（−）及びＰＴＡ断片の存在（＋）により特徴付けられ、状態ＤはＥＲの不存在（−）及びＰＴＡ断片の不存在（−）により特徴付けられる。異なった疾患状態は癌細胞の分化特性の進行的消失を反映し、それは癌細胞の進行的脱分化を意味している。癌細胞の脱分化は、一般に、状態Ａでの０％から状態Ｄでの７５％へ増加している再発のパーセンテージで示されるように、より悪い予後を生じ、疾患の治癒の機会を得るためには結果的により攻撃的な癌治療を必要とする。疾患状態Ａの患者は、比較的温和な癌療法で治療することができるが、一方、疾患状態Ｄの患者はより低い治療の成功率を改善するために攻撃的な癌療法で治療しなければならず、より攻撃的な癌療法は同時により有害な副作用も有している。一方、攻撃的癌療法は疾患状態Ａの患者には適用されず、なぜならこれらの患者はとにかく癌療法について良好な成功率を有しており、それ故、このグループにおける攻撃的癌療法の増大した副作用は許容できないからである。我々は、エストラジオールレセプター（ＥＲ）の存在又は不存在及びＰＴＡ断片の存在又は不存在に関する患者のサンプルの異なった表現型を説明するであろう理論を有している。疾患状態Ａにおいては、エストラジオールレセプターは発現されており、そのシグナリング経路は完全に機能的である。中でも、このことは、サイトゾルから核への完全プロチモシンアルファ（ＰＴＡ）タンパク質の輸送を生じる。基質ＰＴＡを有するプロテアーゼレグマインはサイトゾルに位置しており、サイトゾルから核へのＰＴＡの輸送は、レグマイン仲介タンパク質分解からＰＴＡを保護し、ＰＴＡ断片がない又はより少ないことを生じている（状態Ａ）。状態ＡからＢへの癌細胞の転移は、機能的エストラジオールシグナリングの消失により起こされているであろうが、免疫組織学により我々が確認したように、細胞表面には未だにエストラジオールレセプターが存在している。このエストラジオールシグナリング不全の結果として、ＰＴＡはもはやサイトゾルから核へ輸送されず、それ故サイトゾルに残され、レグマインによるタンパク質分解を受ける。その結果、レグマインによりＰＴＡ断片が発生する。癌細胞の次の段階、段階Ｃは、エストラジオールレセプターの発現の消失により表現され及びその結果としてこの段階では、レグマイン活性によりＰＴＡ断片が発生する。最後の段階、段階Ｄにおいては、癌の特定のタイプについて文献に記載されているように（Wang et al., 2004, Cancer Res., 64:64-74）癌細胞は遺伝子情報の一片（例えば、ＬＯＨ１４ｑ３２．１）を消失す��。ＬＯＨ１４ｑ３２．１は、中でも、レグマインについての遺伝子をコードする。結果として、ＰＴＡはサイトゾルに残り、核へ輸送されないが、もはやレグマインは存在していないので、レグマイン仲介タンパク質分解を受けず、それ故、この非常に後期の癌状態の間はもはやＰＴＡ断片は発生しない。提案された機構は、なぜＰＴＡ断片が中間癌状態Ｂ及びＣの間にのみ存在し（又は増加した量で存在し）、初期状態Ａ又は最終状態Ｄでは存在しないかを説明している。
実施例
下記の実施例は、本発明を例示することを意図しているが、本発明の範囲をいかようにも限定することは意味していない。
【００７３】
実施例１：原発性ヒト乳癌組織サンプルの収集及びサンプル調製
原発性ヒト乳癌組織はバイオプシ又は腫瘍組織の手術的除去の間に集めた。この研究のための原発性ヒト組織の使用は、Medizinische Hochschule Hannover, Germany の倫理委員会により承認され、すべての患者から、この研究における彼らの組織の使用についての文書による承認を得た。エストラジオールレセプター存在又は不存在の免疫組織学決定後に残された腫瘍組織の２０μｍスライスを、さらに使用するまで−８０℃で保存した。秤量により組織サンプルの定量化後、組織サンプルを抽出緩衝液（６Ｍグアニジン−塩酸塩、５０ｍＭグリシン、ＨＣＩを使用してｐＨを２．６に調整）中で１０分、サーモミキサー中、９９℃及び１１００ｒｐｍでインキュベートした。抽出緩衝液中の組織の「濃度」は、２０ｍｇ／ｍＬであった。１８００Ｏｘｇで１５分、室温で遠心分離後、上清を採取し、限外濾過し、さらに加工するまで−８０℃で保存した。限外濾過カートリッジ(Microcon (登録商標)YM-50,cut-off50 000,order # 42416, Millipore GmbH, Schwalbach, Germany ）を４００μＬの水を用い、室温にて１２５００ｘｇで１分の遠心分離によりすすぎ、カートリッジ当たり４００μＬまでの組織を加えた。１２５００ｘｇで１時間、室温で遠心分離後、濾液を集め、さらに加工するまで−８０℃で保存した。保持物はさらなる分析には使用しなかった。
【００７４】
実施例２：原発性ヒト乳癌組織サンプルを使用するウェスタンブロッティング
−８０℃で保存した原発性ヒト乳癌組織サンプルを溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２０ｍＭ  ＫＣＩ、１ｍＭ  ジチオスレイトール）と混合し、超音波装置を使用してホモゲナイズした。遠心分離後、ペレットを廃棄し、上清を新しいチューブに集めた。組織細胞溶解物のタンパク質濃度を、当該技術分野で公知の通常のタンパク質決定アッセイ（ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ）を使用して決定した。組織細胞溶解物を濃縮サンプル緩衝液で希釈して１０μｌの総容量中、１５μｇタンパク質の最終濃度とした。サンプルを９５℃で５分加熱した後、サンプルをプレキャストＳＤＳ−ポリアクリルアミド勾配ゲル(Bio-Rad Laboratories GmbH,Munich, Germany, 注文番号161-1178) を使用して分離した。サンプル中に存在するタンパク質及びペプチドを２５ｍＡの電流で４５分分離した後、続いて当該技術分野で知られている標準セミドライブロット法を使用してNytran SuPerCharge膜( Schleicher und Schuell GmbH, Dassel, Germany )に移した。トリス／グリシン／メタノールを含有する移行緩衝液を使用し、製造元の指示に従い、移行を７５ｍＡ電流、１時間行った。使用されたタンパク質分子量マーカーはPageRuler（Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germany, 注文番号 #SMO671 ）であった。タンパク質移行後、５％（容量当たりの重量）脱脂紛乳含有リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を使用して、一夜膜をブロックした。膜を３回、１０分間洗浄し（各々ＰＢＳを使用して）、抗ＰＴＡ抗体（抗プロチモシンアルファ（ＮＴ）（２Ｆ１１）抗体（注文番号ALX804-486-C100 Alexis Deutschland GmbH, Grunberg, Germany）を使用して室温で１．５時間インキュベートし、３回、１０分間洗浄し（各々ＰＢＳを使用して）、１：５０００希釈二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼラベル化ヤギ抗マウス抗体）と室温で１．５時間インキュベートし、最後にＰＢＳで３回、１０分洗浄した。結合抗体の検出は、膜を検出溶液（トリス−ＨＣＩ、ルミノール、クマリン、Ｈ２Ｏ２）と１０分インキュベートし、続いてＣＣＤカメラを使用して写真に撮った。使用された抗体（製造元に従って）は、ヒトＰＴＡのアミノ酸１〜３１を含むエピトープを認識する。
【００７５】
実施例３：腫瘍細胞の増殖、マウス内への注射及びサンプル採取
ヒト結腸直腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６は、ATCC, Manassas, VA, USA, 注文番号CCL-247、から得た。腫瘍細胞を、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２、で培養した。すべての組織培養培地及び補充物はGibco BRL, Gaithersburg, MD, USA から得た。付着腫瘍細胞の細胞継代は、１週間に２回、１：１０の比で細胞培養物を分割することにより実施した。注射の日（０時点）、当該技術分野で知られているようにトリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用して細胞を培養フラスコから採取し、培養培地に移し、一度洗浄し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再懸濁した。ＰＢＳでの追加の洗浄工程の後、最終濃度をｍＬ当たり１５００００００生存細胞に調節した。腫瘍細胞懸濁液を、細胞凝集を避けるように注意深く混合し、氷上に保ち、針を付けずに１．０ｍＬシリンジ内に吸引した。２００μＬの細胞懸濁液（３，０００，０００細胞を含有）を、０．４５ｘ２５ｍｍのサイズの針を使用し、マウスの右横腹側面内の皮下に注射した。総計で６０匹のマウスに腫瘍細胞を注射した。４０匹の追加の動物は、対照として働き、ＰＢＳのみを注射した。腫瘍を有する動物を、腫瘍細胞注射後、第７、１３又は３４日目に殺した。各々２０匹の動物の対照群は７及び３４日目に殺した。示された時点で、心臓穿刺によりＥＤＴＡ−血液を得た。ＥＤＴＡ血漿は当該技術分野で知られているように調製し、個々の動物からのサンプルは、血液吸引３０分以内に−８０℃で保存した。移植された原発性ＨＣＴ−１１６−腫瘍の重量及び容積を切開時に決定した。腫瘍容積は、センチメーターで測定された長さ及び平均幅の二乗を掛けることにより計算し、腫瘍容積はミリリットル（ｍＬ）として得られた。個々の腫瘍を秤量し、そして容積を決定したらすぐに液体窒素中で凍結し、さらに加工するまで−８０℃で保存した。
【００７６】
実施例４：マウス血漿を使用するサンプル調製
分析に先立って、当該技術分野で知られているように、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿により、血漿サンプルのタンパク質ロードの減少を達成した。０．５ｍＬの血漿サンプルを１ｍＬの冷やした蒸留水に加えた。タンパク質沈澱のため、０．５ｍＬのＴＣＡ（２０％（ｖ／ｖ）ＴＣＡ濃度）を加え、チューブを３０秒激しく混合した。氷上で３０分インキュベートした後、サンプルを１８，０００ｇで３０分、４℃にて遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、さらに加工するまで−８０℃で保存した。３７５μＬ−等量の血漿を、クロマトグラフィー実施につき使用した。
【００７７】
実施例５：ＳＣＩＤマウスから単離されたＨＣＴ−１１６腫瘍を使用するサンプル調製
サンプル塊は秤量により決定した。４ｍｇの腫瘍組織サンプルの湿潤塊に、８０μＬの２００ｍＭ酢酸を加えた後、サンプルを１０分煮沸した。典型的には、２０〜５０ｍｇの腫瘍組織を出発物質として使用した。続いて、ＨＣｌの３０％保存溶液を使用してサンプルのｐＨをｐＨ２〜ｐＨ３に調整し、最後にＴＦＡの０．１％保存溶液を使用して１．５ｍＬにサンプルを希釈した。４℃にて、１８，０００ｘｇで１０分遠心分離後、上清を採取し、さらに加工するまで−８０℃で保存した。４ｍｇの腫瘍組織に相当する細胞抽出物を、クロマトグラフィー実施につき使用した。
【００７８】
実施例６：インビトロで培養した細胞を使用するサンプル調製
トリプシン／ＥＤＴＡ及びゴムポリスマンの使用により組織培養プレートから細胞を除去し、６００ｇで５分、室温で遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。ペプチド抽出のためには、５０，０００〜４００，０００細胞の湿潤塊標準化サンプルを使用した。２００μＬの２００ｍＭ酢酸を加えた後、サンプルを１０分煮沸した。続いて、ＨＣｌの３０％保存溶液を使用してサンプルのｐＨをｐＨ２〜ｐＨ３に調整し、最後にＴＦＡの０．１％保存溶液を使用して１．５ｍＬにサンプルを希釈した。４℃にて、１８，０００ｘｇで１０分遠心分離後、上清を採取し、さらに加工するまで−８０℃で保存した。５０，０００〜４００，０００細胞に相当する細胞抽出物を、クロマトグラフィー実施につき使用した。
【００７９】
実施例７：ヒト血漿の収集及び調製
６２歳の平均年齢を有し、種々の癌段階の１９人の男性結腸癌患者からの血漿サンプルを、抗凝固剤としてＥＤＴＡを使用し、当該技術分野で知られている標準法により集めた。収集チューブを２０００ｇ及び４℃で１０分遠心分離した。血漿サンプルは、さらに加工するまで−８０℃で保存した。クロマトグラフィーに先だって、これら１９血漿サンプルの４ｍＬのプールを、当該技術分野で知られているトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿にかけた。詳述すると、５００μＬの血漿を１ｍＬの冷やした蒸留水に加えた。タンパク質沈澱は、５００μＬの氷冷２０％ＴＣＡ（ｖ／ｖ）を加え、チューブを３０秒激しく混合することにより実施した。氷上で３０分インキュベートした後、チューブを１８，０００ｇで３０分、４℃にて遠心分離した。上清をさらなる分析に使用した。ＴＣＡ沈澱は、高分子量タンパク質を除去するため、及びペプチド及び低分子量タンパク質を濃縮するために行った。続いて、ＴＣＡ沈澱の上清を実施例６に記載したように９６分画に分離した。第一の分画化（実施例６に従って）の分画４２の３．６ｍＬ血漿等価物を使用した第二の分画化は、２ｘ２５０ｍｍのサイズのＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８逆相カラム(Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)を使用して行った。クロマトグラフィーは、マイクロフローセルを備えたＨＰ１１００ＨＰＬＣ（両方ともAgilent Technologies, Boblingen , Germany から供給された）を使用して３３℃で行った。緩衝液Ａは０．０６％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び９９．９４％（ｖ／ｖ）蒸留水であり及び緩衝液Ｂは０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル及び１９．９５％（ｖ／ｖ）蒸留水であった。クロマトグラフィー条件は以下のようである：
・最初の１分間は５％緩衝液Ｂ；
・次の２分間は５から１５％緩衝液Ｂへの直線濃度勾配；
・次の４２分間は１５から４０％緩衝液Ｂへの直線濃度勾配；
・次の４分間は４０から１００％緩衝液Ｂへの直線濃度勾配；
・次の４分間は１００％緩衝液Ｂ；
・次の１．５分間は１００から５０％緩衝液Ｂへの直線濃度勾配；
・次の３分間は５０から１００％緩衝液Ｂへの直線濃度勾配；
・及び最後に、最後の２．５分は１００から５０％緩衝液Ｂへの直線濃度勾配。
流速は１００μＬ／分であり、そして９６分画（各々μＬを含有する）を、５から１００％緩衝液Ｂへの間に集めた。
【００８０】
実施例８：サンプルの液体クロマトグラフィー
実施された分離法は逆相クロマトグラフィーであった。種々のＲＰクロマトグラフィー樹脂及び緩衝液は等しく適していた。約４ｍｍｘ２５０ｍｍのサイズを有するＣ１８逆相クロマトグラフィーカラムを使用したペプチド及び／又はタンパク質の分離は以下のように実施した。好ましくは、Ｓｏｕｒｃｅ  ＲＰＣ、４，６ｘ１５０ｍｍ（Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany) が使用された。緩衝液Ａは、０．０６％容量／容量（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び９９，９４％（ｖ／ｖ）蒸留水であり、及び緩衝液Ｂは、０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル   及び１９．９５％（ｖ／ｖ）蒸留水であった。クロマトグラフィーは、マイクロフローセルを備えたＨＰ１１００ＨＰＬＣ（両方ともAgilent Technologies, Boblingen , Germany から供給された）を使用して３３℃で行った。サンプルのｐＨは、３０％（ｖ／ｖ）ＨＣｌの保存溶液を使用してｐＨをｐＨ２〜ｐＨ３に調整し、続いてサンプルをトリフルオロ酢酸の０．０５％（ｖ／ｖ）保存溶液を使用して１．５ｍＬに希釈した。クロマトグラフィーに先だって、サンプルを４℃及び１８０００ｇで１０分遠心分離し、最後に、３７５μＬ血漿、５００００〜４０００００インビトロ培養細胞、腫瘍組織の４ｍｇ湿潤重量又は１．５ｍＬ細胞培養上清を表している、１．５ｍＬのサンプルをクロマトグラフィーカラムにロードした。緩衝液Ａ及びＢはクロマトグラフィーの間、種々の比で混合され、緩衝液Ｂのパーセンテージのみが述べられている。緩衝液Ａのパーセンテージは１００％引く％緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）である。クロマトグラフィー条件は以下のようである：
・最初の１分間は５％緩衝液Ｂ；
・次の４４分間は５から５０％緩衝液Ｂへの直線濃度勾配；
・次の４分間は５０から１００％緩衝液Ｂへの直線濃度勾配；
・次の４分間は１００％緩衝液Ｂ。
流速は５００μＬ／分であり、そして９６分画（各々０．５ｍＬを含有する）を、５から１００％緩衝液Ｂへの濃度勾配の間に集めた。
【００８１】
実施例９：サンプルの質量分析
質量分析のため、ペプチドの典型的陽性イオンスペクトルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間）質量分析計で生み出した。適したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計は、中でも、PerSeptive Biosystems, Framingham, USA(Voyager-DE, Voyager- DE PRO 又はVoyager-DE STR)又はBruker Daltonik, Bremen, Germany (BIFLEX) により製造されているものである。ペプチドに適した典型的マトリックス物質は、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸、アルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸及び２，５−ジヒドロキシ安息香酸のような有機酸を含んでなるマトリックス物質である。ＭＡＬＤＩサンプル調製のため、マトリックスとしてアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸及びコマトリックスとして０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルに溶解された、６−デスオキシ−ｌ−ガラクトースを使用した。質量分析キャリアプレート上にスポットされた、７．５μＬ血漿又は１０００〜５０００のインビトロ培養細胞又は８０μｇの腫瘍組織又は３０μＬの細胞培養上清に相当する、逆相クロマトグラフィーにより得られた凍結乾燥等価物を、ペプチド及び／又はタンパク質を測定するために使用した。分画化され、凍結乾燥されたサンプルを１５μＬのマトリックス溶液に溶解した。例えば、１０ｇ／Ｌのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸及び１０ｇ／ＬのＬ（−）フコースを含有するこのマトリックス溶液を、容量（ｖ／ｖ）で４９：４９：１：１の比のアセトニトリル、水、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びアセトンから成る溶媒混合物に溶解した。０．３μＬのこのサンプル溶液をＭＡＬＤＩキャリアプレートに移し、乾燥させたサンプルをPerSeptive Biosystems からのVoyager-DE STR MALDI 質量分析計で分析した。測定は、delayed extraction（商標）を伴うリニアモードで行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計は、ペプチドが質量分析計の動的測定範囲内である（それ故検出器飽和が避けられる）濃度で存在するとすれば、ペプチド、例えば、本発明のペプチドを定量することに用いることができる。個々のペプチド及び／又はタンパク質を定量するＭＡＬＤＩ質量分析計の能力は、５０〜８００ｐｍｏｌの既知の濃度の、ニューロテンシンのようなペプチドを、血漿サンプルのような複雑な生物学的サンプルへ添加することにより確認した。続いてこれらのサンプルを逆相クロマトグラフィーにより分離し、添加したペプチドを含有する分画を、実施例に記載したように質量分析計で分析した。例えば、ニューロテンシンペプチドのＭＡＬＤＩ質量分析シグナル強度と血漿サンプルに添加したニューロテンシンペプチドの量の間には直線的相関があり、ＭＡＬＤＩ質量分析は、血漿のような複雑なサンプル中のペプチドを定量的に決定するために適していることを示している（図１）。
【００８２】
実施例１０：ペプチド同定
異なって発現されたペプチドの検出は、減法ペプチドディスプレイマップ及び相関分析の計算により達成した。腫瘍を有しないマウスの血漿と比較して、腫瘍を有するマウスからの血漿のペプチドディスプレイマップで大量に現れる選択されたペプチド、又はマウスで増殖したＨＴＣ−１１６結腸癌腫瘍で現れる、又はインビトロ培養ＨＴＣ−１１６結腸癌細胞の細胞週出物で現れる、又はエストラジオール陽性乳癌サンプルと比較してエストラジオール陰性からの原発性乳癌試料で異なった量で存在するペプチドをＥＳＩ−ｑＴＯＦシークエンシング(PE Applied Biosystems, Framingham, USA) により分析した。当業者には既知の様式で、特異的ｍ／ｚ（質量／電荷）値に基づいて、質量分析計中でペプチドイオンを選択した。これらの選択されたイオンは次ぎに衝突ガス（例えば、ヘリウム又は窒素）で衝突エネルギー（２０−４０ｅＶ）を供給することにより断片化し、生じたペプチド又はタンパク質の断片を質量分析計中の積分分析ユニットで検出し、そして相当するｍ／ｚ値を決定した（タンデム質量分析計の原理）。ペプチドの断片化挙動は、ペプチドの明確な同定を可能にする。例えば、質量分析を四重極−ＴＯＦ（飛行時間）シークエンシング（ＱＳｔａｒ−Ｐｕｌｓａｒモデル）により、又はＥＳＩ−ｑＴＯＦシークエンシング（両方とも、PE Applied Biosystems, Framingham,USA より）により行うことができる。生じたペプチド断片スペクトルは、生成物イオンスキャンモードのｎａｎｏＳｐｒａｙを使用して検出した（スプレー電圧９５０Ｖ、衝突エネルギー２０〜４０ｅＶ）。サンプル当たり２００までのスキャンを蓄積した。電荷状態デコンボリューションはＢｉｏＡｎａｌｙｓｔプログラムパッケージ（PE Applied Biosystems)のＢａｙｅｓｉａｎ再構築ツールを使用して実行し、デアイソトーピング（ｄｅｉｓｏｔｏｐｉｎｇ）はＶｏｙａｇｅｒ  ５．１ソフトウェア（PE Applied Biosystems)により達成した。質量スペクトルはＭＡＳＣＯＴジェネリックファイルフォーマットで保存し、ＭＡＳＣＯＴ１９データベース検索エンジン(Matrix Science, London, UK)へ提出した。検索したデータベースはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ(Version 39.6, www.expasy.ch)及びＭＳＤＢ(Version 010721 , EBI, Europe)であった。加えて、このペプチドシークエンシング法は、タンパク質及びペプチドの生物学的活性の調節にしばしば関与するリン酸化又はアセチル化のようなアミノ酸修飾の同定も可能にする。
【００８３】
組織標本の単一ＨＰＬＡ分画のＭＡＬＤＩ−ＰＳＤ−ＭＳ測定も、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＴｏＦ質量分析計(Applied Biosystems, Framingham, MA, USA) を使用して実施した。
実施例１１：データ分析
実施例７又は８で記載したような分画化に続いて、各分画を実施例９に記載したようにＭＡＬＤＩ質量分析により個々に分析し、各サンプルについて９６の質量スペクトルを生じた。これら９６の質量スペクトルをいわゆるペプチドディスプレイに電子的に合併した。これらペプチドディスプレイのｘ軸は分子量を示し、ｙ軸は分画番号を示し、そしてグレースケール色強度は質量分析シグナル強度を表す。ペプチドディスプレイのデータはバックグラウンドノイズについて調整することにより再加工することができ、異常値は分析から除くことができる。ペプチドディスプレイ間の相違を、電子的にお互いに差し引くことにより、及び／又はシグナルの相関分析により計算した。相関分析については、特定の閾値より上のすべてのシグナルを、同一の特定のシグナル強度の閾値より上のいずれかの他のシグナルに対する相関について試験した。異なった（相対的）濃度のペプチド及び／又はタンパク質の検出は、比較すべきサンプルからの質量分析データ（シグナル強度）との比較、即ち、移植されたヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６を有する、又は移植された細胞株を有しないマウスからのＳＣＩＤマウス血漿、又はエストラジオールレセプター陽性乳癌細胞からの組織抽出物と比較されたエストラジオールレセプター陰性乳癌細胞から調製された原発性ヒト乳癌組織抽出物、により行われた。加えて、ペプチドディスプレイを、結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６のインビトロ培養細胞から、及びＳＣＩＤマウスから単離されたＨＣＴ−１１６腫瘍組織から発生させた。ペプチドディスプレイは約１０００〜２３００の非重複性ペプチド及び／又はタンパク質シグナルを与えた。異種移植片（移植されたヒトＨＣＴ−１１６結腸腫瘍細胞株）に明瞭に由来する多様なペプチド及び／又はタンパク質シグナルがＳＣＩＤマウスの血漿中で同定された。これらのペプチド及び／又はタンパク質は、異種移植片移植ＳＣＩＤマウスの血漿に検出されたが、腫瘍細胞の代わりにＰＢＳを注射した対称マウスでは検出されなかった。加えて、これら多様なペプチドのいくつかは、インビトロ培養ＨＣＴ−１１６細胞、及びＳＣＩＤマウスから単離されたＨＣＴ−１１６腫瘍組織においても同定された。エストラジオール陽性及び陰性原発性乳癌組織の比較もペプチドシグナルにいくらかの相違を与えた。両方の実験組み立てから、プロチモシンアルファ（ＰＴＡ）のＮ末端に由来する特定のペプチドの同定を生じ、これらＰＴＡペプチドのいくつかは両方のシステムで同定された。
【００８４】
実施例１２：ＰＴＡ−ＲＮＡの単離及びＲＴ−ＰＣＲ  ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲを使用する半定量的決定
原発性ヒト乳癌及び健康な近隣組織を、バイオプシ又は腫瘍組織の手術的除去の間に集めた。この研究における原発性ヒト組織の使用は、Medizinische Hochschule Hannover, Germany の倫理委員会により承認され、すべての患者から、この研究における彼らの組織の使用についての文書による承認を得た。
【００８５】
３から５の乳組織の１０μｍ切片をパラフィンブロックから切り出し、１．５ｍｌ反応チューブ内に移した。切片を、４ｍｏｌ／Ｌグアニジンイソチオシアネート、３０ｍｍｏｌ／ＬトリスＨＣＩ（ｐＨ７．６）、２％サルコシル、０．１ｍｏｌ／Ｌベータ−メルカブトエタノール及び５ｍｇプロテイナーゼＫを含有する溶液中、サーモシェーカー(Eppendorf, Germany)を激しく攪拌し、５５℃で一夜インキュベートした。消化されないパラフィンを分離後、遠心分離及び有機抽出（フェノール／クロロホルム）により、少なくとも−２０℃で２４時間、ＲＮＡ坦体としてイソプロパノール及びグルコーゲンで水性相から全ＲＮＡを沈殿させた。その後、ＲＮＡ濃度を分光光度的に測定した(Beckmann, USA)。ＤＮＡ夾雑を減じるためのＤＮＡｓｅ処理後、全ＲＮＡ（１μｇ）を、２０μｌの容量で製造元のプロトコルに従い、２５０ｎｇのランダムヘキサマー(Amersham Pharmacia)及び２００単位のSuperscript Il RNAse−逆転写酵素(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)を使用して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写した。リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）をABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)で実施した。ＰＴＡ及びハウスキーピング遺伝子ベータグルコロニダーゼ（ｂ−ＧＵＳ）についてのＰＣＲプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア  バージョン１．０（Applied Biosystems）を使用して設計した。ＰＴＡ  ｍＲＮＡ転写体レベルの定量は、蛍光ラベルとしてＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎを使用して実施した。ハウスキーピング遺伝子ベータグルコロニダーゼは、転写レベルを規格化するための基準として使用した。各ＰＣＲ反応の最終容量は２５μｌ、１ｘＰｌａｔｉｎｕｍ（商標）−Ｔａｑ反応緩衝液、１μｍｏｌ／ｌ  ＲＯＸ（インビトロゲン）、２００μｍｏｌ／ｌの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、０．６２５Ｕ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）−Ｔａｑ（インビトロゲン）、４００ｎｍｏｌ／ｌの各プライマーを含有、及び２μｌの１：１００００希釈ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ（Molecular Probes, Invitrogen）であり、ＭｇＣＩ２濃度はＰＴＡについて１，５ｍＭ及びｂ−ＧＵＳについて２，５ｍＭであった。反応混合物は９５℃で５分、前加熱し、９５℃で３０秒を４５サイクル、６０℃で３０秒及び７２℃で３０秒が続いた。測定されたデルタＣＴ値［ＣＴ（標的）−ＣＴ（参照）］をＥＲ＋及びＥＲ−サンプル間で比較した。使用されたプライマーは、ＰＴＡについて：
ＰＴＡフォワードプライマー GAGGCAGAAAATGGAAGAGACG 配列番号１６
ＰＴＡリバースプライマー  CTCATTGTCAGCCTCCTGC（配列番号１７）であり、
及びｂ−ＧＵＳについて：
ｂ−ＧＵＳフォワードプライマー CTCATTTGGAATTTTGCCGATT、（配列番号１８）
ｂ−ＧＵＳリバースプライマー CCGAGTGAAGATCCCCTTTTTA、（配列番号１９）
であった。
【００８６】
リアルタイムＲＴ−ＰＲは、ＰＴＡ  ｍＲＮＡのコード領域のヌクレオチド７６〜１５３を表しているＰＴＡ  ｍＲＮＡの内部断片の増幅を生じた。
この実験の結果は、ハウスキーピング遺伝子ｂ−ＧＵＳと比較して、エストラジオールレセプター陽性及び陰性癌細胞間でＰＴＡ  ｍＲＮＡには著しい相違がないことを示している（図１１を参照されたい）。
【００８７】
実施例１３：エストラジオールレセプター、プロゲステロンレセプター及びレグマインの組織切片の免疫組織学
腫瘍組織包埋パラフィンの２μｍ切片をキシレンで脱ワックスし、計量的アルコールで再水和し、エピトープ修復を電子レンジで実施した（２０分；１００℃、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）。切片をTecan Genesis Autostainer(ThermoShandon, Frankfurt a. M., Germany; Tecan, Deisenhofen, Germany) 中、Ｓｈａｎｄｏｎカバープレートを使用して染色した。組織ペルオキシダーゼ活性を、３％過酸化水素と８分のインキュベーションによりブロックした。エストラジオールレセプターのための一次抗体(抗体6F11, Novacastra Laboratories Ltd, Newcastle, Great Britain) を１：２０に希釈した：レグマイン抗体はR&D Systems, Minneapolis, MN, USA から購入し、１：２５に希釈した。検出のためには、触媒シグナル増幅技術(CSA, Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark) を使用した。新規フクシンが色素源として働き、ヘマラウンは対比染色として働いた。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】５０〜８００ｐｍｏｌのニューロテンシンを血漿サンプル内に導入し、続いて逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−クロマトグラフィー）により分離し、ニューロテンシンを含有する分画を実施例に記載したように質量分析法により分析した。ニューロテンシンのＭＡＬＤＩ質量分析シグナル強度（ｙ−軸）と、血漿サンプルに加えられたニューロテンシンペプチドの量（ｘ−軸）間に直線関係があり：ＭＡＬＤＩ質量分析は、血漿のような複雑なサンプル中のペプチドを定量的に決定するのに適していることを示している。
【図２】エストラジオールレセプター陽性（ＥＲ＋）及び陰性（ＥＲ−）乳癌腫瘍サンプル中で測定されたＰＴＡ２−２９（＝ＴＡ１）及びＰＴＡ２−３６（＝ＴＡ１１）のＭＡＬＤＩシグナル強度のＢｏｘ−ｗｈｉｓｋｅｒプロット。ｙ軸は、任意単位でのペプチドのＭＡＬＤＩシグナル強度を示している。
【００８９】
図中のボックス、即ち、カラムは、各々のＭＡＬＤＩシグナル強度の５０％が観察されるＭＡＬＤＩシグナル強度の範囲を含んでいる。ボックスから始まっている線及び上方及び下方の指示（ウィスカー）は、各々の場合において、最も高いシグナル強度（上部４分の１）を示す、２５％の測定が観察される範囲を示しており、最も低いシグナル強度（下部４分の１）を示す、２５％の測定が観察される範囲を示している。カラム中の実線は中央値を示し、カラム中の波線は平均値を示している。両方のペプチド、ＰＴＡ２−２９及びＰＴＡ２−３６とも、エストラジオールレセプター陰性乳癌腫瘍サンプルにおいて、増加した量で存在する。
【図３】図は、原発性ヒト乳癌腫瘍組織のＲＰ−クロマトグラフィーにより得られた個々の分画の質量スペクトルを「ゲル様」ビューで示している（ＭＡＬＤＩ−シグナル強度をグレースケールカラーに変換した）。ｙ軸はＭＡＬＤＩシグナル強度を表し、ｘ軸はダルトンでの分子量を表している。図下部の矢印及び上部の矢印はシークエンシング後、Ｎ末端アセチルセリン残基を有し、ヒトプロチモシンアルファ（ＰＴＡ）のアミノ酸残基２〜２９に対応する（＝ＴＡ１、図９を参照されたい、配列番号１１）、ＰＴＡの断片として同定された問題のペプチドを表しているピークを示している。Ｎ−末端アセチル修飾のないこのペプチドの理論的モノアイソトピック質量は、３０６５．５ダルトンであり、Ｎ末端修飾は４２ダルトンが加わり、３１０７．５ダルトンのＮ末端アセチル化ペプチドの理論的質量を生じ、それは実験的に決定された３１０８ダルトンの質量と完全に一致した。このシグナルはエストラジオールレセプター陰性（ＥＲ−）乳癌腫瘍のサンプル中に存在したが、エストラジオールレセプター陽性（ＥＲ＋）乳癌腫瘍では、不存在か又は非常に低かった。図中に示されているように、４つのデータセットを異なった数のＥＲ＋及びＥＲ−腫瘍サンプルで測定した。データセット１及び２：２８ＥＲ＋及び２８ＥＲ−、データセット３：８ＥＲ＋及び８ＥＲ−、データセット４：１８ＥＲ＋及び２０ＥＲ−。
【図４】図４は、エストラジオールレセプター陰性乳癌腫瘍（ＥＲ−）からの、及びエストラジオールレセプター陽性乳癌腫瘍（ＥＲ＋）からの組織サンプルのウェスタンブロットを示している。抗体はプロチモシンアルファ（ＰＴＡ）のＮ末端のエピトープを認識し、及び結果的に完全ＰＴＡ、ならびにＰＴＡ２−２９又はＰＴＡ２−３６のようなＰＴＡ断片を認識する。エストラジオール陰性癌サンプル（ＥＲ−）のみに、ＰＴＡ断片が検出され、一方、両方のサンプルで完全ＰＴＡ（約１０ｋＤａ）がほとんど等しい量で存在していた。
【図５】図はＳＣＩＤマウスにおける、ＨＣＴ−１１６腫瘍細胞の増殖時間（ｘ軸）の関数としての腫瘍重量（ｙ軸）を示している。ＨＣＴ１１６は、エストラジオール刺激では増殖しないヒト結腸癌細胞株である（Biochem Biophys Res Commun., 2000, 270:425-31）。腫瘍重量はグラムで示されており、腫瘍の増殖時間は日数で与えられている。腫瘍細胞注射後、第１４日目又は第３４日目に測定された個々の腫瘍の測定値は、黒丸で示されている。時間に対する腫瘍重量の相関ｒは０．９０であった。
【図６】この図は、ＰＴＡのアミノ酸残基２〜３７（図９、配列番号１を参照されたい）に相当するＰＴＡ断片のピークのＭＡＬＤＩシグナル強度に対する、個々のマウスの腫瘍の湿潤重量を示している。ｘ及びｙは対数フォーマットであり、ｙ軸は任意単位でのＭＡＬＤＩシグナル強度を表しており、一方、ｘ軸は腫瘍重量を表している。ＭＡＬＤＩシグナル強度対腫瘍重量の相関係数ｒは、ｒ＝０．９７であった。
【図７】ヒトＨＣＴ−１１６結腸癌細胞を注射して３４日後に得られたＳＣＩＤ−マウス血漿のＲＰ−クロマトグラフィーにより得られた個々の分画の質量スペクトルを「ゲル様」ビューで示している（ＭＡＬＤＩ−シグナル強度をグレースケールカラーに変換した）。ｙ軸はＭＡＬＤＩシグナル強度を表し、ｘ軸はダルトンでの分子量を表している。図下部の２つの矢印は問題とする２つのペプチドを表しているピークを示している（理論的モノアイソトピック質量は３７８８及び３８４５ダルトンであり；実験的質量は３７９０及び３８４６ダルトンであった）、それはシ−クエンシング後、ヒトプロチモシンアルファ（ＰＴＡ）のアミノ酸残基２〜３６及び２〜３７に対応する（配列については図９を参照されたい、配列番号１２及び１）、ＰＴＡの断片として同定されたペプチドを表しているピークを示している。これらのシグナルはＨＣＴ−１１６腫瘍を有するＳＣＩＤマウス及びインビトロ培養ＨＣＴ−１１６腫瘍細胞のサンプル中では存在したが、ＨＣＴ−１１６腫瘍を有しないＳＣＩＤマウスの血漿サンプル中では存在しないか又は非常に低くかった。以下のサンプルのＭＡＬＤＩシグナル強度が以下の順序で示されている：１４の個々に測定されたＨＣＴ−１１６腫瘍を有しないＳＣＩＤマウスの血漿サンプル；９の個々に測定されたＨＣＴ−１１６腫瘍を有するＳＣＩＤマウスの血漿サンプル；８の個々に測定されたＳＣＩＤマウスから単離された腫瘍組織から調製されたＨＣＴ−１１６細胞抽出物のサンプル及び１つのインビトロ培養ＨＣＴ−１１６細胞から調製されたＨＣＴ−１１６細胞抽出物のサンプル。
【図８】ＭＡＬＤＩシグナル強度と同定されたＰＴＡ断片を相関付けるさらなるペプチドの分析。乳腫瘍サンプルから得られたすべての測定されたＭＡＬＤＩ質量シグナル強度と同定されたＰＴＡ断片ＰＴＡ２−２９のＭＡＬＤＩシグナル強度との相関を分析した。ｒ＝０．９９７の相関係数（非常に高い相関）を有するペプチドをさらなる分析のために選択した。相関するペプチドの質量及び分画を、これらの相関するペプチドが他のＰＴＡ断片であるかどうかを予測するため、特殊化されたコンピューターソフトウェア及びアルゴリズムにより分析した（ＥＰ１５５３５１５Ａ１、出願番号：ＥＰ０４０００１７０．３、ＷＯ２００５／０６９１８７Ａ２）。この方法を使用して以下のＰＴＡ断片が同定された：ＰＴＡ２−３６、ＰＴＡ２−３７及びＰＴＡ４−３６。ＰＴＡ２−３６及び２−３７配列の質量及び分画番号は、それらの生物体で増殖するヒト結腸癌腫瘍（細胞株ＨＣＴ−１１６）を有するＳＣＩＤマウスからの血漿から同定されたように、ＰＴＡ２−３６及びＰＴＡ２−３７の対応するデータに一致した。
【図９】ヒトプロチモシンアルファ（ＰＴＡ＝配列番号１４）と種々のＰＴＡ断片のアミノ酸の配列アラインメント。左から右へ：配列、配列に関するコメント、及び配列に対応する配列番号、が示されている。配列番号１４はＰＴＡの完全アミノ酸に対応する。インビボＰＴＡは通常、そのＮ末端メチオニン残基なしで存在する、配列番号１３。完全ＰＴＡ配列の上にＰＴＡ配列の既知の多形が示されており、それらはヒト多形（括弧で囲まれている）又はマウス、ラット、ブタ、ウシのＰＴＡ配列と比較したヒトＰＴＡ配列の多形である。「−」は欠失した又は失われたアミノ酸残基である。もし一つ以上のアミノ酸又は「−」又はそれらの組み合わせがその間にスペースなしで書かれていたら、これらの多形は同時に一つ以上のアミノ酸残基に影響している単一多形である。一つより多くの多形の組み合わせが可能である。完全ＰＴＡ配列（配列番号１４）の直ぐ下に、プロテアーゼレグマインの３つの切断部位「Λ」が示されており、それはアミノ酸２９／３０間、３６／３７間（文献で既知である）及び本明細書で示されたデータに基づいて予測された４４／４５位の新規レグマイン部位でＰＴＡを切断する。完全ＰＴＡ配列の下に、すでに既知である（配列番号１１及び１２）、本明細書に示された研究で同定された（観察された）（配列番号１、２、３、４、１１、１２）、観察された配列及び他の情報に基づいて予測される（配列番号５〜７）及び仮定上のペプチド（配列番号８〜１０）を表す、ＰＴＡ断片も示されている。「＊」はＮ−末端セリンがアセチル化されていると同定／予測されたものを示しており、「観察された  ２ｘ」は、このペプチドが乳癌及び結腸癌サンプルで同定されていることを示している。プレースホルダーｒ１〜ｒ６は、ＰＴＡの配列の一部を表している。ｒ１はＰＴＡのアミノ酸１−８に対応する０〜８アミノ酸を表しており、ｒ２はＰＴＡのアミノ酸１７−２８に対応する０〜１２アミノ酸を表しており、ｒ３はＰＴＡのアミノ酸１−２２に対応する０〜２２アミノ酸を表しており、ｒ４はＰＴＡのアミノ酸３１−３５に対応する０〜４アミノ酸を表しており、ｒ５はＰＴＡのアミノ酸１−２９に対応する１〜２９アミノ酸を表しており、及びｒ６はＰＴＡのアミノ酸３８−５２に対応する０〜１５アミノ酸を表している。ｒ１〜ｒ６は、ｒ１〜ｒ６に対応するＰＴＡの配列を有する配列番号８〜１０で配列を伸長させる。
【図１０】安定性を証明するため、及びＰＴＡ断片が血漿中で定量的に測定可能であることを証明するため、以下の実験を実施した。血漿中、ＰＴＡ−２〜３７（ＰＴＡのアミノ酸残基２〜２７を表している）の１０及び８００ｐｍｏｌ／Ｌの最終濃度を生じるＰＴＡ−２〜３７の種々の希釈液を調製し、逆相クロマトグラフィー及び続いて質量分析にかけた。示されているのは、分画４４の２２００〜３６００ダルトンの範囲の分子量であり、３８４５ダルトンの分子量（ｍ／ｚ）（矢印参照）を有するＰＴＡ断片ＰＴＡ２−３７を含んでなる。質量分析シグナル強度は、濃度依存性様式で明白に上昇する。
【図１１】図１１はエストラジオールレセプター−陰性（ＥＲ−）及びエストラジオールレセプター−陽性（ＥＲ＋）ヒト乳癌組織サンプルから単離されたＰＴＡ  ｍＲＮＡの半定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を示している。ＲＴ−ＰＣＲシグナルの規格化のため、その発現が細胞のエストロゲンレセプター状態により通常影響されないベータ−グルコロニダーゼ （ｂ−ＧＵＳ）、ハウスキーピング遺伝子のシグナルを測定した。示されているのは、ＥＲ−及びＥＲ＋乳癌組織サンプルに由来するＲＮＡサンプルで測定された相対ＲＴ−ＰＣＲシグナル（ＰＴＡのＲＴ−ＰＣＲのシグナル／ｂ−ＧＵＳのＲＴ−ＰＣＲのシグナル）である。
【図１２】図１２は本発明の新規発見及びこれらの発見を説明している対応する理論をスキーム的に要約している。エストラジオールレセプター（ＥＲ）及びプロチモシンアルファ（ＰＴＡ）断片の存在又は不存在（又は量）に基づいて、癌サンプルを４つの異なった段階、段階Ａ〜Ｄに分類することが可能であり、その段階は連続的（段階Ａから段階Ｄへ）により悪い予後を有し、より攻撃的な癌治療療法を必要とする。前記ＰＴＡ断片の発生の原因となると提案されている、追加のメタデータ、プロテアーゼレグマインの発現データ、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）について陽性のサンプルのパーセンテージ、及び癌療法後に再発を患う癌患者のパーセンテージが示されている。表の一番上は、基礎となる理論に従った事象、一つの癌段階から次の段階転移仲介：段階ＡからＢへの転移はＥＲレセプターの機能の消失を示すことができ、ＥＲレセプターはまだ癌細胞で発現されている、ＢからＣへの転移は、ＥＲの発現の消失を示し、そしてＣからＤへの最終転移はＬＯＨ  １４ｑ３２．１の遺伝子消失を示し、その座位は、中でも、プロテアーゼ、レグマインをコードし、そのプロテアーゼは我々により、ＰＴＡ断片の発生及びＰＴＡ断片の原因であると考えられている。列「実施された抗ＥＲ療法」は、現在まで、癌細胞の表現型に基づいて、抗内分泌癌療法で治療される患者を示し、そして最後に、列「推奨される抗ＥＲ療法」は、本発明の新規発見に基づいている。
【００９０】
再発のパーセンテージは段階Ａについては最初の癌の診断後３．７年、段階Ｂについては３．０年、段階Ｃについては３．４年、及び段階Ｄについては最初の癌の診断後４．３年と計算された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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