(57)【要約】テスト化合物溶液が細胞活性を誘導しているかどうかを決定する装置および方法であって、本発明の方法の１つの実施形態が、細胞を含有する細胞懸濁媒体に接触させて、テスト化合物溶液を配置するステップと、点源から細胞懸濁液内にテスト化合物溶液を拡散するステップと、点源からの距離に対して細胞の活性を検出するステップとを含む。細胞における活性を検出するステップは、点源に最も近い第１の群の細胞の活性を検出するステップと、点源から第１の群より遠くにある第２の群の細胞の活性を検出するステップとを含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
テスト化合物溶液が細胞活性を誘導しているかどうかを決定する方法であって、
前記テスト化合物溶液を、細胞を含有する細胞懸濁媒体に接触させるようにしながら配するステップと、
前記テスト化合物溶液を、前記細胞懸濁媒体内に点源から拡散するステップと、
前記点源からの距離に関連させて前記細胞の活性を検出するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞の活性を検出するステップが、
前記点源に最も近い第１の群の細胞の活性を検出するステップと、
前記点源から前記第１の群より遠くにある第２の群の細胞の活性を検出するステップとを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の群の活性の検出を、前記第１の群の活性の検出の後に行う、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞懸濁媒体へ前記テスト化合物溶液の拡散速度を制御するステップをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞懸濁媒体への前記テスト化合物溶液の拡散速度を制御するステップは、前記細胞懸濁媒体および前記テスト化合物溶液がそれを通して互いに接触する位置にあるフィルムに設けられた開口のサイズを制限するステップを含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞懸濁媒体への前記テスト化合物溶液の拡散速度を制御するステップは、前記テスト化合物溶液と前記細胞懸濁媒体との間にゲルを配することにより、前記細胞懸濁媒体内への前記テスト化合物溶液の流れを制限するステップを含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞懸濁媒体への前記テスト化合物溶液の拡散速度を制御するステップは、ゲル又は焼結材料内に前記テスト化合物を配するステップを含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞懸濁媒体への前記テスト化合物溶液の拡散速度を制御するステップは、前記テスト化合物溶液を凍結した状態で配するステップを含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞懸濁媒体への前記テスト化合物溶液の拡散速度を制御するステップは、前記テスト化合物溶液を、乾燥化合物又は凍結乾燥化合物として配するステップと、乾燥化合物又は凍結乾燥化合物を溶解するための溶液を配するステップとを含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記テスト化合物溶液を、細胞を含有する細胞懸濁媒体に接触させるようにしながら配置するステップは、
前期細胞懸濁液を、フィルムの第１の側の上に、前記フィルムによって規定された開口を覆うようにして配するステップと、
細胞が前記細胞懸濁媒体によって取り囲まれた状態にしたまま、前記細胞懸濁液からの細胞を、前記細胞懸濁液から前記開口の周りのフィルムへ沈降させるステップと、
前記テスト化合物溶液を、前記第１の側とは反対の前記フィルムの第２の側の上にへ、前記開口を覆うようにして配するステップとを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記開口が、前記点源を備える、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞懸濁媒体および前記テスト化合物溶液を前記開口を覆うようにして、疎水性バリアを使用して保持するステップをさらに含む、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記フィルムとの間に前記細胞懸濁媒体を挟めるように、前記細胞懸濁媒体上に蓋を配置するステップをさらに含む、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞懸濁媒体が、第１の細胞懸濁媒体であり、且つ前記蓋が、液体透過性のものとされるとともに、前記第１の細胞懸濁媒体と反対の前記蓋の上に第２の細部緒懸濁媒体を配することで、前記第２の細胞懸濁液が、前記蓋を通って前記第１の細胞懸濁媒体内に流れて、前記細胞をさらに持続させるようにするステップをさらに含む、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記テスト化合物溶液を配して拡散させるステップは、
前記細胞懸濁液を、フィルムの第１の側の上に、前記フィルムのスリットを覆うようにして配するステップと、
細胞が前記細胞懸濁媒体によって取り囲まれた状態にしたまま、前記細胞懸濁液からの細胞を、前記細胞懸濁液から前記スリットの周りのフィルムの上へ沈降させるステップと、
前記第１の側とは反対の前記フィルムの第２の側の上に前記スリットを覆うようにして前記テスト化合物溶液を配するステップと、
前記スリットを開口させる圧力差を前記フィルムに与えるステップとを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞懸濁媒体に接触させて前記テスト化合物溶液を配するステップは、
細胞懸濁液を第１のフィルムに配するステップと、
細胞が前記細胞懸濁媒体によって取り囲まれた状態にしたまま、前記細胞懸濁液からの細胞を、前記細胞懸濁液から前記第１のフィルムへ沈降させるステップと、
前記細胞懸濁媒体上に位置するようにして設けられた開口を規定する第２のフィルムを、前記第１のフィルムと前記第２のフィルムとの間に前記細胞懸濁媒体を挟むようにして前記細胞懸濁媒体の上に位置するようにして配するステップと、
テスト化合物溶液を、前記細胞懸濁媒体とは反対の側の第２のフィルムの上へ、前記開口を覆うようにして配するステップとを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記テスト化合物溶液が通過する開口を覆うようにして細胞層を堆積するステップをさらに含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のフィルムおよび前記第２のフィルムに接触させるようにしながら前記細胞を配するステップをさらに含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ゲル内に前記テスト化合物溶液を配するステップをさらに含む、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
赤外線検出システムを使用して、前記第１のフィルムおよび第２のフィルムに接触させた前記細胞の活性を検出するステップをさらに含む、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞懸濁媒体に接触させるようにしながら前記テスト化合物溶液を配置するステップは、
細胞懸濁液を第１のフィルムの上に配するステップと、
細胞が前記細胞懸濁媒体によって取り囲まれた状態にしたまま、前記細胞懸濁液からの細胞を、前記細胞懸濁液から前記第１のフィルムへ沈降させるステップと、
第２のフィルムの上にテスト化合物溶液ゲルを配するステップと、
前記テスト化合物溶液ゲルが、前記細胞懸濁媒体と接触するようにしながら、前記第１のフィルム上に前記第２のフィルムを配するステップとを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の細胞群より前記点源から離れた場所に、前記細胞懸濁媒体に接触させるようにしながらテスト化合物溶液抑制剤を配するステップと、
前記第２の細胞群の低減した活性を検出するステップとをさらに含む、
請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記テスト化合物溶液と前記テスト化合物溶液抑制剤から得られた重なり合う拡散勾配を検出する、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞懸濁媒体に接触させるようにしながら前記テスト化合物溶液を配するステップは、
乾燥状態又は凍結状態であるテスト化合物を第１のフィルムの上に配するステップと、
細胞懸濁液を第２のフィルムの上に配するステップと、
細胞が前記細胞懸濁媒体によって取り囲まれた状態にしたまま、前記細胞懸濁液からの細胞を、前記細胞懸濁液から前記第２のフィルムへ沈降させるステップと、
前記細胞懸濁媒体上に位置するようにして設けられた開口を規定する第３のフィルムを、前記第３のフィルムと前記第２のフィルムとの間に前記細胞懸濁媒体を挟むようにして前記細胞懸濁媒体の上に位置するようにして配するステップと、
前記第３のフィルムの前記開口を前記テスト化合物溶液がほぼ覆うようにしながら、前記第３のフィルム上に前記第１のフィルムを配することにより、前記細胞懸濁媒体が、前記開口を通って、前記第３のフィルムと前記第１のフィルムとの間に運ばれ、前記テスト化合物と接触するようにするステップとを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞懸濁媒体に接触させるようにしながら前記テスト化合物溶液を配置するステップは、
フィルムによって規定され、前記フィルムと基板との間に規定された通路に続く開口を覆うようにして細胞懸濁液を配するステップと、
前記細胞懸濁液が、前記開口を通って、前記フィルムと前記基板との間、および前記フィルムと前記基板との間に設けられた疎水性バリアまで流れるようにするステップと、
細胞が前記細胞懸濁媒体によって取り囲まれた状態にしたまま、前記細胞懸濁液からの細胞を、前記細胞懸濁液から前記基板へ沈降させるステップと、
前記開口および前記細胞懸濁媒体上に位置するようにして前記テスト化合物溶液を配するステップとを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記基板が、ガラスを含む、
請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞懸濁液によって押される空気を前記疎水性バリアを通して排気するステップをさらに含む、
請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞懸濁液およびテスト化合物溶液を前記開口上を覆うようにして、前記開口の周囲の前記フィルム上に設けられた疎水性バリアを使用して保持するステップをさらに含む、
請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記開口が、点源を含む、
請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞懸濁媒体に接触させるようにしながら前記テスト化合物溶液を配するステップは、
プレートと基板との間に規定され、前記プレートの第２の貫通孔と流通状態にある通路に続くプレートの第１の貫通孔内に細胞懸濁液を配するステップと、
前記細胞懸濁液が、前記プレートと前記基板との間、前記第２の貫通孔、および前記プレートと前記基板との間に設けられた疎水性バリアに流れるようにするステップと、
細胞が前記細胞懸濁媒体によって取り囲まれた状態にしたまま、前記細胞懸濁液からの細胞を、前記細胞懸濁液から前記基板へ沈降させるステップと、
前記第２の貫通孔内に、前記細胞懸濁媒体に接触させるようにしながら前記テスト化合物溶液を配するステップとを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記基板が、ガラスを含む、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記プレートの前記第２の貫通孔と整列した開口を規定し、前記プレートの前記第１の貫通孔を密封するフィルムを、前記基板と反対の前記プレートの側に配するステップと、
前記フィルムにある前記開口を通して前記テスト化合物溶液を配するステップとをさらに含む、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の貫通孔が、前記フィルムによって空気圧で密封され、前記第２の貫通孔が、前記細胞懸濁媒体の流れを制限するために、大気に開口されている、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記フィルム上に蓋を配置するステップをさらに含む、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
通路を規定するために、前記プレートおよび前記基板が、間隔を空けて接着剤によって固定されている、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞懸濁液によって押される空気を前記疎水性バリアを通して排気させるステップをさらに含む、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の貫通孔が、前記点源を含む、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞懸濁媒体に接触させるようにしながら前記テスト化合物溶液を配置するステップは、
フィルムと基板との間に規定され、前記フィルムによって規定された第２の開口と流通状態にある通路に続くフィルムによって規定された第１の開口を覆うようにして前記細胞懸濁液を配するステップと、
前記細胞懸濁液が、前記第１の開口を通って、前記フィルムと前記基板との間、前記第２の開口、および前記フィルムと前記基板との間に設けられた疎水性バリアまで流れるようにするステップと、
細胞が前記細胞懸濁媒体によって取り囲まれた状態にしたまま、前記細胞懸濁液からの細胞を、前記細胞懸濁液から前記基板へ沈降させるステップと、
前記細胞懸濁媒体に接触させるようにしながら、前記第２の開口を覆うようにして前記テスト化合物溶液を配するステップとを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記フィルム上に蓋を配置するステップをさらに含む、
請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
通路を規定するために、前記フィルムおよび前記基板が、間隔を空けて接着剤によって固定されている、
請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞懸濁液によって押される空気を前記疎水性バリアを通して排気するステップをさらに含む、
請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記テスト化合物溶液の流れおよび拡散を制御するために、前記第２の開口内にゲルを配するステップをさらに含む、
請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の開口が、前記点源を含む、
請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
細胞活性の分析装置であって、
基板と、
通路がフィルムと前記基板との間に規定されるように前記基板上に配され、前記通路と連通状態にある開口を規定するフィルムと、
前記通路内に設けられ、テストサイトを規定し、前記テストサイトの外側への液体の通過を制限し、前記テストサイトの外側へのガスの通過を許容する疎水性バリアとを備える、装置。
【請求項４５】
前記フィルムが、前記テストサイトの外側に設けられた通気孔を規定するようになっている、
請求項４４に記載の装置。
【請求項４６】
前記フィルムと前記基板とを接合し、前記通路の寸法を規定する接着剤をさらに含む、
請求項４４に記載の装置。
【請求項４７】
前記基板が、ガラスを含む、
請求項４４に記載の装置。
【請求項４８】
細胞活性の分析装置であって、
基板と、
前記プレートと前記基板との間に通路が規定されるように前記基板に取り付けられ、前記通路と連通状態にある第１の貫通孔および第２の貫通孔を規定するプレートと、
前記通路内に設けられ、テストサイトを規定し、前記テストサイトの外側への液体の通過を制限し、前記テストサイトの外側へのガスの通過を許容する疎水性バリアと、
前記基板とは反対の前記プレートの側の前記プレートに付着され、前記第１の貫通孔を空気圧で密封し、前記第２の貫通孔と整列した開口を規定するフィルムとを備える、装置。
【請求項４９】
前記プレートと前記基板とを接合し、前記通路の寸法を規定する接着剤をさらに含む、
請求項４８に記載の装置。
【請求項５０】
前記基板が、ガラスを含む、
請求項４８に記載の装置。
【請求項５１】
前記第２の貫通孔が、前記細胞懸濁媒体を前記第２の貫通孔内に引き込む寸法を有する、
請求項４８に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の表示】
【０００１】
本願は、２００４年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／６００，７８３号の利益を享受し、同出願の内容全体は、本願明細書に援用されたものとする。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ハイコンテントスクリーニング（high content screening:ＨＣＳ）およびハイスループットスクリーニング（high throughput screening:ＨＴＳ）の方法および装置に関する。特に、本発明は、例えば、細胞の形態、形状、および運動に基づいて、走化性、移動、脈管形成、成長、増殖、および他の細胞活性に関わる細胞活性分析（cell activity assays:ＣＡＡ）に関する。本発明はまた、細胞膜の受容体の活性によって起きる細胞内の分化、代謝率の変化、および分子運動などの細胞内部の変化に関わる細胞活性分析に関する。本発明はまた、さまざまな化学的環境に応答した細胞の相互作用と、互いに異なる細胞タイプの相互作用に関わる細胞活性分析に関する。本発明はまた、化学化合物または他の存在物による細胞層の浸透に関わる分析、およびさまざまな融合性細胞層、例えば、内皮または上皮細胞層を通って化合物ライブラリの要素の拡散速度を確認するための分析に関する。
【背景技術】
【０００３】
製薬会社が薬物療法の研究開発に投じている資金は膨大である。構想の段階から食品医薬品局（ＦＤＡ）による最終的な承認の段階に至るまでの研究開発プロセスは、数年に及ぶこともある。したがって、初期の段階で、使用不能な化学物質を即座に除外し、効き目のある物質に傾注することが非常に望ましい。
【０００４】
通常、薬物療法の開発に際し、製薬会社が最初に着手するのは、膨大な量の化学物質ライブラリ作成である。このライブラリの中の多数の化学物質は、開発中の薬物の対象である病気や疾患に関連する細胞に治療的に作用する可能性を有する場合がある。したがって、どの化学物質が細胞に影響を及ぼすかということを決定することが、薬物開発における１つの重要なステップとなる。
【０００５】
走化性とは、化学物質の濃度勾配に応答した生体細胞または有機体の指向性運動（移動）である。浸(invasion)とは、細胞がバリア内へ入るまたはバリアを通過する運動（移動）である。腫瘍浸襲とは、癌細胞が、生体内の生物組織内へ入るまたはそれを通過することにより、或いは、(collagen)コラーゲンやマトリゲルなどの細胞外基質タンパク質の中へ入るまたはそれを通過することにより、或いは、他の物質で作られた生体外のバリア内へ入るまたはそれを通過することによって起きる活動である。脈管形成(angiogenesis)とは、内皮細胞(endothelial cells)による毛細血管の移動および形成である。成長とは、細胞のサイズ、形、または複雑性の増大である。増殖とは、細胞分裂による細胞の成長である。分化とは、細胞が、異なる機能的役割と新しく異なる形質の発現とに一般的に関連する特異性がより高い状態に変化するプロセスである。細胞の相互作用とは、同一または異なるタイプの近傍の細胞の存在および活動に応答した運動、浸襲、脈管形成、成長、増殖、または分化などの細胞行動の変化である。
【０００６】
細胞内での化合物および構造の動きは、創薬において着目し得る別の種類の細胞活性である。例えば、新しい高性能の光学検出システムは、細胞内の蛍光化合物（例えば、タンパク質）の動きを追跡することができる。これらの新しい検出システムを用いると、ライブラリからの化合物が、細胞の膜および／または受容体に接触したことに応答して生じる細胞内活性の多くの異なる変化を観察できる。本願明細書において、これらの活性および同様の活性を、総称的に「細胞活性」と呼び、本願明細書において、分析を実行するために用いる装置を、「細胞活性分析装置」と呼ぶ。
【０００７】
「走化性チャンバー」、「ボイデンチャンバー」、「ボイデン走化性チャンバー」、「ブラインドウェルチャンバー」、または「マイクロ走化性チャンバー」とさまざまな表現で呼ばれるある種のシングルサイト(single-site)の従来の細胞活性分析装置は、膜によって分けられた２つの区画を含み、区画の一方または両方が、空気に開口した状態とされている。「マルチウェル走化性チャンバー」、または「マルチウェルボイデンチャンバー」と呼ばれるマルチサイト(multi-site)装置は、基本的なサイト構造は同じであるが、サイトが複数ある。（例えば、米国特許第５，２１０，０２１号明細書および同第５，３０２，５１５号明細書を参照されたい。）
【０００８】
この種の装置を用いて分析を行う場合、媒体に懸濁した細胞を上側の区画内にピペットで滴下し、走化性因子および抑制因子を下側の区画にピペットで滴下する。走化性因子は、線量反応曲線(dose-response curve)を得るために、さまざまな希釈液中で使用できる。抑制因子は、一般に、以下の３つの種類、すなわち、（ａ）負(negative)：細胞を懸濁するために使用される同一の媒体が膜の下方でも使用される場合、（ｂ）化学運動性(chemokinetic)：細胞を含んだ媒体と同じ濃度で走化性因子を含んだ媒体を膜の反対側のウェルに配置する場合、および（ｃ）正(positive)：底部ウェルに既知の化学誘引物質(chemoattractant)を配置する場合、の３つの種類からなる。化学運動性を抑制する抑制因子により、ユーザーは、走化性因子との接触によって増強された細胞のランダム活性と、その走化性因子の濃度勾配によって生じた細胞の指向性応答とを区別することができる。
【０００９】
細胞活性分析装置は、また、既知の走化性活性の走化性因子に対する、異なる起源の細胞の応答性、例えば、病気を患っている患者から得た免疫細胞の応答性を測定するために使用することもできる。この場合、問題となっている細胞は、反応差(differential response)が低下しているか、または正常であるかを確認するために、負の抑制因子および既知の走化性因子の両方を用いて試験される。
【００１０】
これまで、走化性活性は、細胞活性分析装置において安定した濃度勾配を確立し、所定の時間インキュベートした後、膜を通って（または膜内に）移動した細胞を計数することによって測定されてきた。次いで、テスト中の走化性因子に濃度勾配がある細胞の活性と、濃度勾配がない場合の細胞の活性との比較がなされる。
【００１１】
従来の細胞活性分析装置および方法の１つのタイプにおいて、化学剤を含有するチャンバーに最も近い膜表面上の細胞数を物理的に計数することによって、走化性の応答性が測定される。米国特許第５，２１０，０２１号明細書（Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｊｒ）に、このタイプの細胞活性分析装置の１つの例が記載されており、この内容全体は、本願明細書に参照により援用されたものとする。定量的データを獲得する従来方法の一つは、細胞活性分析装置から膜を除去し、元の細胞懸濁液を含有するチャンバーに最も近い膜表面から細胞を除去し、残りの細胞を固定および着色し、次いで、顕微鏡下で着色細胞を観察および計数することである。膜全体の検査に関連する時間と費用により、膜の代表的なエリアのみが計数されることで、膜全体が検査および計数された場合より結果の正確性が低下してしまう。
【００１２】
使い捨ての９６ウェルマイクロプレートフォーマット、例えば、（メリーランド州ゲーサーズバーグのＮｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．から市販されている）ＣｈｅｍｏＴｘＴＭシステムを使用する細胞活性分析は、結果を定量化する別の方法に適している。上述した手動の着色計数方法は、使用可能であるが、必要となる時間が長いため推奨できない。１つの好ましい方法は、フィルタを通って移動した細胞が、下側ウェルの底部に堆積するようにフィルタを取り付けたマイクロプレートを遠心分離機にかけることである。次いで、細胞は、ＭＴＴ、ＭＴＳ（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａから市販されている）、または同様の色素で着色され、次いで、標準的な自動化された実験用濃度計リーダー（Ｅｌｉｓａプレートリーダーと呼ぶこともある）で読み取られる。
【００１３】
この装置を用いて定量的データを獲得する別の方法は、蛍光物質、例えば、（オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから市販されている）カルセインＡＭで細胞を染色し、マイクロプレート内への移動細胞を遠心分離機にかけ、自動蛍光プレートリーダーで細胞を計数することである（例えば、カリフォルニア州フォスターシティのＰＢ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているＣｙｔｏｆｌｕｏｒ、メリーランド州ゲーサーズバーグのＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃから市販されているＶｉｃｔｏｒ２、カリフォルニア州サニーヴェールのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓから市販されているｆｍａｘ）。自動プレートリーダーは、第１の光の波長で移動細胞にある蛍光色素を励起し、第２の波長で放出された光を読み取る。他の形態において、移動していない細胞は、各サイトの上部から除去され、枠付き膜が取り付けられたプレートは、プレート内に細胞をスピンさせることなく、自動蛍光プレートリーダーで読み取られることによって、下側ウェル内にフィルタから離れ落ちた細胞とともに、膜の底部および膜の孔内の細胞を計数する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したように、走化性活性を測定するためにこれまで行われてきた試みでは、長い経路、フィルタや厚い膜などのまわりくどい(tortuous)経路を通過した細胞を測定または計数することに焦点をあててきた。これらの技術には、細胞の移動に依存しているということから、少なくとも３つの重大な欠点がある。第１に、細胞は、媒体を通って走化性因子までかなりの距離を移動しなければならず、これによって、分析に必要な実質的な時間が追加されかねない。第２に、所望の（低い）変動係数を実現するために、移動パーセンテージを計算する際に比較的多数の細胞が必要とされる。結果的に、これらの分析では、常にすぐに利用できるわけではない化合物ライブラリからの大量の化合物を必要とする。第３に、フィルタを通過した細胞の数またはパーセンテージを計数する移動分析において、これらの結果は、定量的データを提供するが、動的データを提供しない。さらに、これらの結果は、フィルタを通過しなかった細胞についての情報を提供しない。
［略語および定義］
【００１５】
１．本願明細書において、「ハイスループットスクリーニング」は、「ＨＴＳ」と省略する。
２．本願明細書において、「細胞ベースのハイスループットスクリーニング」は、「ＣＢＨＴＳ」と省略する。
３．本願明細書において、「ハイコンテントスクリーニング」は、「ＨＣＳ」と省略する。
４．本願明細書において、「ナノメートル」は、「ｎｍ」と省略する。
５．本願明細書において、「マイクロリットル」は、「μｌ」と省略する。
６．本願明細書において、「マイクログラム」は、「μｇ」と省略する。
７．本願明細書において、「細胞活性分析装置」は、「ＣＡＡＡ」と省略する。
８．本願明細書において、「テスト化合物溶液」は、「ＴＣＳ」と省略し、これは、水、細胞培地、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、他の適切な媒体、またはそれらとそれらの組み合わせに溶解した化合物ライブラリからの化合物からなる溶液をさす。
９．本願明細書において、「細胞懸濁媒体」は、「ＣＳＭ」と省略し、細胞を懸濁可能な媒体または流体をさす。
１０．本願明細書において、「細胞懸濁液」は、「ＣＳ」と省略し、細胞懸濁媒体に懸濁された細胞を含有する溶液をさす。
１１．本願明細書において、「点源」は、「ＰＳ」と省略し、化学化合物が同心円状に拡散する中心エリアをさす。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、細胞膜と接触する化合物によって細胞活性が影響されているのか、またはどの程度影響されているのかということを迅速かつ正確に評価するための装置および方法を提供する。本発明は、細胞、試薬、分析プラットフォーム、および他の使い捨てのものにかかるコストを最小限にして、且つ非常に低い変動係数で、上述の評価を実行することができ、また、各化合物に対して二重または三重のサイトを使用することなく、大量の化合物ライブラリを一次スクリーニングすることができる。
【００１７】
本発明は、ＨＣＳ、ＨＴＳ、ＣＢＨＴＳ、細胞ベースのスクリーニングとともに、細胞活性の基礎研究用の分析装置を提供する。本発明の装置および方法により、細胞活性分析が促進される。特に、本発明は、化合物ライブラリからの化合物が、細胞活性、例えば、走化性を誘導できるかどうかを評価する手段を提供する。従来技術とは対照的に、本発明では、細胞が膜を通って移動するよりもかなり前に生じた細胞の変化を検出することによって、細胞活性を決定することができる。この変化は、例えば、細胞配向、内部形態変化、温度変化、細胞内の分子運動、および電磁変化、すなわち、簡単に言えば、検出可能である細胞のあらゆる変化を含む。
【００１８】
本発明により、テスト化合物溶液が、細胞懸濁媒体内にそこから拡散し細胞と接触していく点源が提供される。本願明細書で使用する場合、「点源」という表現における「点」という用語は、幾何学的な用語ではなく、化合物が同心円状に拡散していく場合の中心の範囲を指す相対的な用語である。この用法での点源の範囲は、サイト全体の範囲に対して比較的狭いため（例えば、サイト全体の範囲のおよそ１０％）、中心の範囲からサイトの残りの部分への拡散は、点からの拡散と実験的に同等である。一例として、同心の拡散は、サイトの上方視点から容易に観察でき、点源のサイトおよび場所の構成に応じて、漸進的なリングが、円または円の一部（例えば、半円または四半円）の形状でに点源から外向きに延びていく。
【００１９】
本発明は、細胞活性を経時的にモニタできるように、この拡散速度を制御する。本発明の１つの態様では、拡散は逐次生じるものなので、テスト化合物溶液が点源から離れて拡散するにしたがってテスト化合物溶液によって生じる細胞活性が徐々に生じ、また、サイトを周期的に読み取ることでその経時的変化を検出できる。本発明の一態様では、例えば、フィルムを貫通する開口、フィルムを貫通する開口を塞ぐゲル、テスト化合物溶液を含有するゲル、テスト化合物溶液を含有する焼結材料、凍結したテスト化合物溶液、乾燥または凍結乾燥したテスト化合物溶液、或いはこれらの組み合わせを使用することにより、拡散速度を制御する。
【００２０】
本発明の１つ態様は、前記テスト化合物溶液を、細胞を含有する細胞懸濁媒体に接触させるようにしながら配置するステップと、前記テスト化合物溶液を、前記細胞懸濁媒体内に点源から拡散するステップと、前記点源からの距離に関連させて前記細胞の活性を検出するステップとを含む、、テスト化合物溶液が細胞活性を誘導しているかどうかを決定する方法を提供する。細胞における活性を検出するステップは、点源に最も近い第１の群の細胞の活性を検出するステップと、点源から第１の群より遠くにある第２の群の細胞の活性を検出するステップとを含み得る。
【００２１】
本発明の別の態様は、２つの側を有するフィルムと、フィルムを貫通する開口と、開口を覆うようにしてフィルムの第１の側に設けられた細胞懸濁媒体と、フィルムの第１の側に沈降した(settled on)細胞と、開口を覆うようにしてフィルムの第２の側に設けられたテスト化合物溶液と、を含む細胞活性分析装置を提供する。この構成では、テスト化合物溶液は、開口内のまたは開口に最も近い細胞懸濁媒体と接触し、細胞懸濁媒体内に拡散することで、開口からフィルムの第１の側の細胞懸濁媒体内に向かう濃度勾配を生成する。１つの態様にでは、開口は、穴であり、濃度勾配は、開口から同心円状に延在する。このようにして、開口に最も近い細胞が、まず、テスト化合物溶液と接触する。続いて、テスト化合物溶液が開口から離れながら拡散していくため、他の細胞は、放射状外向きに徐々にそれに接触する。細胞が、テスト化合物溶液に反応を示せば、テスト化合物の経時的拡散は、細胞活性化を徐々にもたらし、適切な検出手段を用いてそれをモニタすると、細胞活性に関する定量的および動的（例えば、時間に応じた細胞の変化）データを生じる。
【００２２】
本発明の１態様では、上述した装置を使用して、細胞活性分析を実行する方法が提供される。この方法によれば、開口を覆うようにしながらフィルムの第１の側に、細胞懸濁液が配される。次いで、細胞が細胞懸濁液から沈降し、フィルムの第１の側に付着できるようにフィルムをインキュベートすることで、細胞がフィルムの第１の側に付着し、細胞懸濁媒体が細胞を覆う。フィルムは、細胞の基本読み取り値を与えるように読み取られてもよい。次いで、テスト化合物溶液は、開口を覆うようにしながらフィルムの第２の側上に配される。テスト化合物溶液は、例えば、反転させたフィルムの第２の側にピペットで滴下することによって、ピンアプリケータを反転させフィルムの第２の側にテスト化合物溶液を配することによって、テスト化合物溶液を上向きに射出することによって、または他の適切な手段によって、フィルムの第２の側に配すことができる。好ましくは、細胞懸濁液およびテスト化合物溶液を配す場合、これらの溶液は、開口を中心とする。
【００２３】
膜の第２の側にテスト化合物溶液を配すると、テスト化合物溶液は、フィルムの開口で細胞懸濁媒体と接触した状態になる。このように細胞懸濁媒体と接触すると、テスト化合物溶液は、細胞懸濁媒体内への拡散を開始する。次いで、この拡散が進行するにつれ、細胞へのテスト化合物溶液の影響を観察するために、サイトを周期的に読み取る。これらの読み取り値は、例えば、細胞の延長(elongation)と配向、他の形態変化、温度変化、細胞内の分子運動および構造の動き、および電磁変化として検出される。例えば、形態変化を検出するには、細胞のアスペクト比（長さと幅の比）を調べればよい。例えば、細胞配向を検出するには、テスト化合物溶液が拡散している開口に関連してアスペクト比の配向を調べればよい。
【００２４】
他の態様では、上述した装置は、まず、単一の検出ステップを実行するのに最適な時間を決定するための分析開発においても、次に、単一の検出ステップを用いるスクリーニング段階（通常、貴重な時間と材料を投じる段階）においても使用することができる。分析開発段階は、複数回の検出ステップを行うことにより、時間の経過とともに応答する細胞の「動画」を作り出し、それによりプロセスの動態を示し記録することができる。このデータから、実際のスクリーンにおいて単一の検出ステップを実行するための最適な時間が導き出される。単一の検出ステップは、テスト化合物がサイトを横切って部分的に拡散した時点で行われる。このように、その時点でのサイトには２つの幾何学的に別個の細胞の部分集団、すなわち、テスト化合物にさらされたものと、さらされていないものとが存在することになる。さらに、テスト化合物にさらされた部分集団は、テスト化合物に漸進的にさらされる、すなわち、点源により近いものの方が、遠くに離れたものより長くさらされることになる。このように、単一の検出ステップであっても、細胞の活性、非活性、および活性の程度は、状況の動態を表すであろう。このように、本発明は、点源からの距離を基準にして細胞の活性を検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
図１は、本発明の１つの実施形態によるマルチサイト分析装置１００の１つのサイトを示す。図示するように、分析装置１００は、フィルム１０２と、フィルム１０２を貫通する開口１１０と、開口１１０を覆うようにしてフィルム１０２の第１の側の上に配された細胞懸濁媒体１０４と、フィルム１０２の第１の側上に沈降した細胞懸濁液の細胞１０８と、開口１１０を覆うようにしてフィルム１０２の第２の側の上に配されたテスト化合物溶液１０６とを含む。テスト化合物溶液１０６は、最初、フィルム１０２の第２の側の上の開口１１０を覆うようにされた細胞懸濁媒体１０４のメニスカス(meniscus:液体架橋)１１４により細胞懸濁媒体１０４と接触している。必ずしも必要ではないが、図１に示すように、フィルム１０２は、細胞懸濁媒体１０４およびテスト化合物溶液１０６を適所に保ちやすくするために、疎水性コーティング１１６を有してもよい。
【００２６】
細胞懸濁媒体１０４とテスト化合物溶液１０６とが最初に接触した状態から、テスト化合物溶液１０６は、開口１１０を通ってフィルム１０２の第１の側へ向かい、細胞懸濁媒体１０４内に拡散する。テスト化合物溶液１０６は、開口１１０から細胞懸濁液１０４内に拡散することで、開口１１０を中心とする同心円状に広がる濃度勾配を生じる。この拡散が生じるにつれ、テスト化合物溶液１０６は、最初に、開口１１０の最も近くにある細胞１０８に到達し、次いで、時間の経過とともに、最終的には、開口１１０から遠く離れた細胞１０８に達する。この拡散が生じている間に、装置１００では、細胞１０８がテスト化合物溶液１０６に反応を示すかどうかと、反応をいつ示したかを測定するために、周期的に読み取りが行われる。細胞１０８が反応を示す場合には、テスト化合物溶液１０６が開口１１０から放射状に拡散するにつれ、効果を徐々に認知できるようになる。このように、細胞１０８の経時的な反応により、定量的データおよび動的データの両方が生じ得る。
【００２７】
本発明の１つの実施形態により提供される、図１に示す例示的な装置１００を使用して細胞活性分析を実行する方法は以下のようなものである。この方法によれば、開口１１０を覆うようにして、フィルム１０２の第１の側に、細胞懸濁液（細胞懸濁媒体に懸濁した細胞を含有する）が配される。次いで、装置がインキュベートされることで、細胞１０８をフィルム１０２の第１の側に沈降させ付着させることができる。その後、サイトは、細胞１０８の基本読み取り値を与えるように読み取られ記録されてもよいが、もっともこのステップは、テスト溶液の導入直後に実行されてもよい。
【００２８】
次いで、テスト化合物溶液１０６が、開口１１０を覆うようにしてフィルム１０２の第２の側に配される。例えば、テスト化合物溶液１０６は、フィルム１０２を反転させフィルム１０２の第２の側にピペットを用いて滴下することによって、ピンアプリケータを反転させフィルム１０２の第２の側にテスト化合物溶液１０６を配することによって、テスト化合物を上向きに射出することによって、または他の適切な手段によって、フィルム１０２の第２の側に配することができる。好ましくは、細胞懸濁液およびテスト化合物溶液１０６を設ける場合、これらの溶液は、開口１１０を中心とするようにする。
【００２９】
テスト化合物溶液１０６がフィルム１０２の第２の側に配されると、テスト化合物溶液１０６は、開口１１０を介して細胞懸濁媒体１０４と接触した状態になる。このように接触すると、テスト化合物溶液１０６は、細胞懸濁媒体１０４内への拡散を開始する。次いで、この拡散の進行する間に、細胞１０８へのテスト化合物溶液１０６の影響を観察するために、サイトが周期的に読み取られる。これらの読み取り値は、例えば、細胞の延長と配向、他の形態変化、温度変化、細胞内の分子運動および構造の動き、および電磁変化として検出される。例えば、形態変化を検出するには、細胞のアスペクト比（長さと幅の比）を調べればよい。例えば、細胞配向を検出するには、テスト化合物溶液が拡散している開口に対するアスペクト比の配向を調べる。
【００３０】
図１に示す例示的な装置１００では、細胞懸濁媒体１０４は、開口１１０に充填され、フィルム１１０の第２の側にある開口１１０の端部上に、メニスカス１１４を形成する。このようにして、（メニスカス１１４により）溶液間の初期の境界が形成される。この例において、細胞懸濁媒体１０４は、開口１１０を覆うように最初に細胞懸濁液が配されるため開口１１０を占め、開口１１０を充填し、フィルム１０２の第２の側の開口１１０の部分にメニスカス１１４を形成する。記号１１２で示すように、フィルム１０２の第２の側における開口１１０の縁部が直角になるように、フィルム１０２をきれいに切り取って開口１１０を設け、開口１１０を疎水性バリアとして機能させることで、メニスカス１１４を形成しやすくのが好ましい。開口１１０は、例えば、フィルム１０２の第１または第２の側のいずれかの幅を狭くして、非直角となるようにフィルム１０２を切り取って作られていてもよい。別の選択肢として、図１に示すように、フィルム１０２に実質的に垂直に開口１１０を形成する代わりに、フィルム１０２に対して適当な角度で開口１１０が形成されてもよい。
【００３１】
本発明の１つの実施形態において、開口１０２は、実質的に円形の開口とされる。例えば、フィルム１０２の厚みがおよそ２５ミクロンの場合、開口１１０は、およそ２５ミクロンのレーザアブレーションにより形成された穴であってもよい。細胞１０８は、通常、最大径が２５ミクロン未満であろう。この場合、単一の細胞１０８が開口１１０に入り込まず、開口１１０を完全に塞ぐ状態となる。開口１１０の閉塞さらに回避するために、細胞懸濁媒体１０４にある細胞１０８は、開口１１０を閉塞する機会を少なくするために、比較的散在するような状態とすることが好ましい。別の実施形態となるが、タンパク質ゲル（例えば、細胞外ゲルマトリックを形成する、コラーゲンやケラチンなどのタンパク質）で開口１１０を充填することで、フィルム１０２の一方側から他方側への細胞１０８の通過を阻止できるが、他方、テスト化合物溶液１０６の開口１１０の通過は許容され、細胞懸濁媒体１０４内への拡散が制御される。また、このようなタンパク質ゲルは、細胞１０８がゲル層上に沈降し付着するように、フィルム１０２の表面に配置されてもよい。
【００３２】
開口１１０が実質的に円形の場合、テスト化合物溶液１０６は、開口１１０から同心円状に細胞懸濁媒体１０４内に拡散する。このように放射状に拡散することで、フィルム１０２の第１の側で細胞懸濁媒体１０４内に開口１１０を中心とする濃度勾配が生じる。図２は、この濃度勾配を示すものであり、フィルム１０２上に沈降した細胞１０８を下方に見た場合の装置１００の典型的な平面図を示す。開口１１０は、細胞懸濁媒体１０４内へのテスト化合物溶液１０６の拡散の開始点となる。したがって、テスト化合物溶液１０６は、最初、第１の勾配ライン２０２内の細胞である、開口１１０に最も近い細胞１０８に達する。細胞１０８が、テスト化合物溶液１０６に反応を示す場合、そのような反応は、第１の勾配ライン２０２内の細胞においてのみ検出され、残りの細胞１０８は反応を示さない。
【００３３】
拡散が続き、装置１００での読み取りが周期的に行われると、テスト化合物溶液１０６は、第２の勾配ライン２０４および第３の勾配ライン２０６によって示されたような、開口１１０から離れた距離にまで到達する。装置１００が、このように段階的に増大する拡散場所で読み取られると、それぞれの勾配ライン内の細胞は、ある反応を示す（細胞がテスト化合物溶液に反応を示すものと仮定した場合）。さらに、テスト化合物溶液１０６が到達した最も外側の勾配ラインよりも内側に位置する細胞１０８のすべては、異なる程度の反応を示すこともある。例えば、テスト化合物溶液１０６が、第３の勾配ライン２０６に到達した場合、第１の勾配ライン２０２内の細胞１０８が最大の反応を示し、第２の勾配ライン２０４と第３の勾配ライン２０６との間の細胞が最小の反応を示し、第１の勾配ライン２０２と第２の勾配ライン２０４との間の細胞１０８がそれらの中間の反応を示す場合がある。このように、本発明は、定量的データ（例えば、影響を受けた細胞数）だけでなく、動的データ（例えば、経時的な細胞のパターン化反応）と、拡散の起点から離れた細胞に接触するテスト化合物の量が減少するときの用量反応データも提供可能である。また、「リング」に外向きに生じる反応を観察する際、本発明では、この「リング効果」において反応が経時的に検出できるため、反応（または「ヒット」）が検出されるかどうかという疑問がなくなる。このように、本発明は、従来技術よりも著しく変動係数低減できる。
【００３４】
図３は、本発明の別の実施形態によるマルチサイト分析装置３００の１つのサイトを示す。装置３００は、細胞懸濁媒体３０６を覆う第２のフィルム３０４を有する点以外は、図１の装置１００とほとんどの点で類似している。図示するように、装置３００は、第１のフィルム３０２と、第１のフィルム３０２を貫通する開口３１４と、開口３１４を覆うようにして第１のフィルム３０２の第１の側上に配された細胞懸濁媒体３０６と、第１のフィルム３０２の第１の側上に沈降した細胞３０８と、開口３１４を覆うようにしてフィルム３０２の第２の側上に配されたテスト化合物溶液３０６と、細胞懸濁媒体３０６を覆う第２のフィルム３０４とを含む。第２のフィルム３０４は、プレート３１２に接合されることが好ましい。このプレート３１２は、第２のフィルム３０４を支持し、第１のフィルム３０２と第２のフィルム３０４との間に分離を与える。
【００３５】
テスト化合物溶液３１０は、最初に、第１のフィルム３０２の第２の側上に、開口３１４を覆うようにされた細胞懸濁媒体３０６のメニスカス３１６を介して、細胞懸濁媒体３０６と接触する。必ずしもこの限りではないが、図３には示していないが、第１のフィルム３０２は、細胞懸濁媒体３０６およびテスト化合物溶液３１０を適所に保ちやすくするために、図１に示すものと類似した疎水性コーティングを有してもよい。
【００３６】
図３は、第１のフィルム３０２に重ねて第２のフィルム３０４が配置される前または配置された後の細胞懸濁媒体３０６の代表的な形状および位置を示す。第１のフィルム３０４に重ねて第２のフィルム３０４が設けられる前、細胞懸濁媒体３０６は、ライン３０６ａによって示すような液滴を形成する。第１のフィルム３０２に重ねて第２のフィルム３０４が適切な位置に設けられると、第２のフィルム３０４は、ライン３０６ｂによって示すように、細胞懸濁媒体３０６を適所に挟む。細胞懸濁媒体３０６を挟むことで、液滴は、蒸発効果を受けず、より安定した状態で維持される。さらに、第２のフィルム３０４の平坦な表面との間で細胞懸濁媒体３０６を挟むことにより、装置３００の第２のフィルム３０４の上方から、またはその下方から読み取りを行うための光学的に透明な表面が得られる。蛍光リーダーを使用する場合、励起ビームは、発光検出器と同軸であってもよい。
【００３７】
本発明の１つの実施形態では、図３に示す例示的な装置３００を使用して、細胞活性分析を実行するための以下の方法が提供される。この方法では、開口３１４を覆うようにして第１のフィルム３０２の第１の側に、細胞懸濁液（細胞懸濁媒体に懸濁した細胞を含有する）が配される。次いで、第２のフィルム３０４が、細胞懸濁液を適所に挟むために、第１のフィルム３０２に重ねて配置される。細胞３０８が細胞懸濁液から沈降し、第１のフィルム３０２の第１の側に付着させられるように、第２のフィルム３０４を配置する前、または配置した後のいずれかに、装置３００をインキュベートすることができる。これにより、細胞３０８が第１の側に付着され、細胞懸濁媒体３０６が細胞３０８を覆う。細胞３０８が沈降すると、必ずしも必要ではないが、装置３００は、細胞３０８の基本読み取り値を与えるように読み取られ得る。
【００３８】
細胞懸濁媒体３０６を適所に配すると、テスト化合物溶液３１０は、開口３１４上を覆うようにして第１のフィルム３０２の第２の側に配される。例えば、テスト化合物溶液３１０は、装置３００を反転させ第１のフィルム３０２の第２の側にピペットで滴下することによって、ピンアプリケータを反転させ第１のフィルム３０２の第２の側までテスト化合物溶液３１０を配することによって、テスト化合物溶液を上向きに射出することによって、または他の適切な手段によって、配することができる。好ましくは、細胞懸濁液およびテスト化合物溶液３１０を設ける際、これらの溶液は、開口３１４を中心とする。
【００３９】
テスト化合物溶液３１０が、第１のフィルム３０２の第２の側に配されると、テスト化合物溶液３１０は、細胞懸濁媒体３０６と接触し、細胞懸濁媒体３０６内への拡散を開始する。次いで、この拡散が同心円状に外向きに進行するにつれ、細胞３０８へのテスト化合物溶液３１０の影響を観察するために、好ましくは、第２のフィルム３０４を通して、装置３００を周期的に読み取る。第２のフィルム３０４および挟まれた細胞懸濁媒体３０６により、細胞３０８の変化をより正確かつ便利にモニタできる平坦な表面が得られる。
【００４０】
図４は、細胞懸濁媒体とテスト化合物溶液の両方を挟むため、３つのフィルムを使用した、本発明の別の実施形態によるマルチサイト分析装置４００の１つのサイトを示す。図示するように、装置４００は、第１のプレート４１３に接合された第１のフィルム４０２と、第２のプレート４１２に接合された第２のフィルム４０４と、第３のフィルム４２２とを含む。第３のフィルム４２２は、第１のプレート４１３および／またはその下の別のプレート（図示せず）に接合され得る。第１のフィルム４０２は、開口４１４を有する。第１のフィルム４０２と第２のフィルム４０４との間、好ましくは、開口４１４上を中心にして、細胞懸濁媒体４０６が配される。第１のフィルム４０２の第１の側に、細胞４０８が沈降する。第１のフィルム４０２と第３のフィルム４２２との間、好ましくは、開口４１４上を覆うようにして且つ開口４１４を中心として、フィルム４０２の第２の側に、テスト化合物溶液４１０が配される。細胞懸濁媒体４０６はまた、毛管作用によって第１のフィルム４０２の第２の側にメニスカス４１６を形成することが好ましい。
【００４１】
第３のフィルム４２２を設けると、分析を組み立てるためのオプションをさらに得ることができる。詳しく言えば、第３のフィルム４２２は、テスト化合物溶液４１０を配することができる表面を与える。このように、細胞懸濁液（細胞懸濁媒体４０６の一部）は、最初に、第１のフィルム４０２上に設けられ、第２のフィルム４０４によって挟むことができる。次いで、組み立てたフィルム４０２および４０４を反転し、第１のフィルム４０２の第２の側にテスト化合物溶液４１０を配し、または反転させたピンアプリケータを使用してテスト化合物溶液４１０を配す代わりに、テスト化合物溶液４１０は、分離動作で第３のフィルム４２２に配すこともできる。次いで、上部にテスト化合物溶液４１０の液滴が形成された第３のフィルム４２２は、テスト化合物溶液４１０が第１のフィルム４０２の第２の側に接触した状態で挟まれるように、第１のプレート４１３に接触させた状態にされる。応用例によっては、このようにテスト化合物溶液４１０を挟みつけることで、望むとおりに拡散を行いやすくするために、テスト化合物溶液４１０を、開口４１４を通して細胞懸濁媒体４０６内へ押し入れることが有益なこともある。さらに、細胞懸濁媒体４０６とテスト化合物溶液４１０の両方を挟むと、蒸発が分析に及ぼしかねない影響を低減させられる。さらに、装置を反転させることもできる。
【００４２】
他の形態において、（図４の装置に対して反転され、以下により詳細に記載される）図１０の装置に示すように、第３のフィルム１００４の底部側に先行してテスト化合物溶液１００２配される場合がある。装置において、中間フィルム１００６に重ねて第３のフィルム１００４が適用されると、細胞懸濁液からの媒体は、中間フィルム１００６と第３のフィルム１００４との間を移動し、テスト化合物１００２を溶解させ（または凍結していれば溶融し）、フィルム１００６および１００８間の流体内へ同心円状に広がっていくテスト化合物１００２の拡散を開始させる。
【００４３】
図４の別の実施形態において、第２のフィルム４０４は、非透過性フィルムではなく、半透過性または多孔性フィルタ膜である。例えば、フィルタ膜は、孔を有するフィルムから作製されてもよい。このフィルムは、プラスチック、金属、ガラス、セラミック、有機材料、またはそれらの組み合わせを含む種々の材料から作ることができる。図４の代表的な点線によって示すように、第２のフィルム４０４は、液体が通過できる孔４２４を有していてもよい。細胞懸濁媒体４０６が設けられた側とは反対の第２のフィルム４０４の側に、第２の媒体４２０が配される。第２の媒体４２０は、細胞懸濁媒体４０６だけしかない場合よりもより長い時間、細胞４０８を持続させるように孔４２４を通過していく。例えば、この第２の媒体４２０により、テスト化合物との接触開始前に、長期の細胞成長、増殖、融合性細胞層の形成、および分化が可能となる。
【００４４】
図１〜図４は、単一の分析またはテストサイトを示しているが、当業者であれば、例えば、９６サイト、３８４サイト、または１５３６サイトを有する複数サイト装置や、連続したフィルムストリップに対して、例示した構造を適用する方法を想到できるであろう。このような場合、フィルムを支持する構造またはプレート（図３のプレート３１２など）は、各サイトに対して連通する孔を有する格子であってもよい。この格子プレートまたはストリップは、例えば、鋼、プラスチック、またはセラミックで作られてもよい。
【００４５】
本発明の１つの実施形態において、図１〜図４に示すフィルムは、透明なＴｅｆｌｏｎＴＭ、例えば、０．００１インチ厚のＴｅｆｌｏｎＴＭである。フィルムに開口を形成するために使用する方法および細胞の反応を検出するために使用する方法に応じて、フィルムに他の材料が使用されてもよいことは言うまでもない。
【００４６】
図１〜図４の実施形態は、テスト化合物溶液が細胞懸濁媒体内に拡散できる単一の開口を有する第１のフィルムを示す。単一の開口を有するということは、拡散点と細胞との間の距離および配向に依存する検出のに好ましく、例えば、細胞の延長、配向、および他の形態変化を検出する場合などに好ましい。例えば、図２の開口１１０のように単一の拡散源を有すると、細胞１０８が形状を変化させたり、単一の開口１１０の方へ細胞が向きを変える様子を調べることを目的とした分析が単純になる。２つ以上開口がある場合、不可能ではないが、ある特定の細胞に複数の拡散源のそれぞれが及ぼす影響を決定することが難しくなることがある。それにもかかわらず、本発明は、第１のフィルムに２つ以上の開口がある場合をも包含する。密集度を検証するために細胞層に生じる電気抵抗をチェックする能力を与えるために、導電エリアまたはラインなどの他の機能を追加することもできる。
【００４７】
上述したように、本発明により、テスト化合物溶液に対して反応を示し、細胞が膜を通って移動するよりかなり前に生じる細胞の変化を検出することによって、細胞活性を検出することができる。これらの変化は、例えば、細胞配向、内部形態変化、温度変化、細胞内の分子運動、電磁変化を含む。これらの変化を検出する最も適切な方法は、検査下にある化合物および細胞のタイプに応じる。これらの方法の任意のものを用いて、本発明により、同心円状に進むテスト化合物濃度勾配と、開口から細胞懸濁媒体内へ同心円状に進行する細胞活性とに基づいて、動力学的に不明瞭さなしに細胞の変化を検出する能力が得られる。
【００４８】
細胞変化を検出する１つの例として、細胞の温度変化をモニタするための赤外線リーダーを使用する場合を挙げる。例えば、免疫細胞に代謝反応を引き起こすようなテスト化合物溶液の化合物にさらす場合には、細胞を免疫細胞とすることができる。この場合の代謝反応は、細胞の温度を上昇させる。赤外線リーダーによる反復スキャンで、この温度上昇を検出することができる。さらに、点拡散源を使用する場合、テスト化合物溶液の拡散源により近い細胞が最初に反応するため、濃度勾配によって生じるリング効果を赤外線リーダによって観察できる。温度上昇も同様に時間の経過とともに、細胞のリングの間に温度勾配を生じるため、別の動的データ源となり得る。
【００４９】
温度変化による細胞の反応を検出する際、本発明の別の実施形態では、図５に示すようなヒートシンク５２０を使用する。このヒートシンク５２０は、一定の背景温度を確立することで、温度の読み取り値を安定した値にさせやすくなる。図５に示すように、この実施形態による例示的な装置５００は、第１のフィルム５０２と第２のフィルム５０４との間に挟まれた細胞懸濁媒体５０６と、第１のフィルム５０２とヒートシンク５２０との間に挟まれたテスト化合物溶液５１０とを含む。第１および第２のフィルムは、ＴｅｆｌｏｎＴＭフィルムであることが好ましい。第１のフィルム５０２は、テスト化合物溶液５１０を細胞懸濁媒体５０６内に拡散させる開口５１４を有する。ヒートシンク５２０は、必ずしもその限りではないが、テスト化合物溶液５１０を適所に保つため、疎水性コーティング５１８を有する。ヒートシンク５２０は、例えば、ガラスまたは陽極酸化アルミニウムで作られてもよい。ヒートシンク５２０により、細胞５０８の赤外線読み取り値をとることに対して、一定の背景温度が確保される。装置は、細胞懸濁液を挟むフィルムが、細胞の上部と底部と接触した状態にあり、絶縁性を有するように構成されてもよい。このようにすることで、代謝活性による温度上昇が生じた場合における熱損失の速度を低速化することができるため、検出システムが、生じた熱のばらつきを記録するための時間を確保できる。
【００５０】
細胞の変化を検出する別の例として、蛍光ラベル化された細胞内の動きをモニタするための可視光リーダーが使用される場合を挙げる。細胞は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＰＲ）を用いてタグ付けされてもよい。このようにすると、細胞が配勾し、その形状を変化させ、またはテスト化合物溶液源の方へ移動するよりもかなり前に、可視光リーダーにより細胞内部の動きを検出できる。
【００５１】
細胞の変化を検出する別の例として、細胞の形状および配向の変化を検出するための顕微鏡検出システムが使用される場合を挙げる。細胞は、移動に先行として、典型的には、形態変化（例えば、アスペクト比の変化）を生じ、テスト化合物溶液の拡散源の方へ向く。これらの変化は、細胞が移動するかなり前に観察することができる。適切な顕微鏡検出システムの例は、メリーランド州ロックヴィルのＡｔｔｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の共焦顕微鏡検出システムおよびイメージングシステムである。
【００５２】
細胞の変化を検出する別の例として、細胞の形状および配向の変化を検出するための超音波検出システムが使用される場合を挙げる。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、テスト化合物溶液を細胞懸濁媒体内に拡散させるための穴を第１のフィルムに設ける代わりに、テスト化合物溶液の通過および拡散を制御するために開閉できる弁をフィルムにに形成することができる。一例として、弁は、例えば、鋭いくさび形の先端部でフィルムに穴をあけることによってフィルム内に切り出されたスリットとすることができる。くさび形の先端部の幅は、弁の所望の長さに等しいことが好ましい。弁は、フィルムに圧力差がない場合、常時閉まっている。フィルムに圧力差が加えられると、フィルムは起き上がる。この起きあがりによってスリットは開き、それによって、テスト化合物溶液は、スリットを通過することができるようになる。
【００５４】
本発明の別の実施形態を示す図６には、第１のフィルム６０２と第２のフィルム６０４との間に挟まれた細胞懸濁媒体６０６と、第１のフィルム６０２と第３のフィルム６２０との間に挟まれたテスト化合物溶液６１０とを有する装置６００が示される。図示していないが、フィルム６０２、６０４、および６２０を支持するためのプレートが設けられていてもよい。第１のフィルムは、テスト化合物溶液６１０を細胞懸濁媒体６０６内に通過させない通常時は閉まっているスリット６５０を含む。しかしながら、第１のフィルム６０２に圧力差が加えられると、スリットは、図示するように、第１のフィルム６０２ａおよび開いたスリット６５０ａを起きあがらせることによって開く。この圧力差は、例えば、第１のフィルム６０２と第３のフィルム６２０との間のエリアの圧力を増大させることによって、第１のフィルム６０２と第２のフィルム６０４との間のエリアの圧力を低下させることによって、または、装置６００の外側の周囲圧力を低下させることによって生じさせることができる。相対的な圧力を制御し、スリット６５０を開閉することによって、ユーザーは、弁を通して細胞懸濁媒体内に導入されるテスト化合物溶液の量を制御できる。このプロセスは、サイクル間にまたは継続的に細胞活性を検出する場合に１回以上の回数で繰り返してもよい。この装置および方法により、化合物に対する用量反応に関するデータを収集できる。
【００５５】
図７は、（図１〜図６のように、同じフィルムの両側上に細胞およびテスト化合物溶液を配することとは対照的に）２つの異なるフィルム上に細胞およびテスト化合物溶液を配するものとされた、本発明の別の実施形態を示すものである。図示するように、この実施形態による装置７００は、第１のフィルム７０２と、第１のフィルム７０２上に沈降した細胞７０８と、細胞７０８を取り囲み第１のフィルム７０２と第２のフィルム７０４との間に挟まれた細胞懸濁媒体７０６と、第２のフィルム７０４にある開口７１４を覆うようにして第２のフィルム７０４に配されたテスト化合物溶液７１０とを含む。テスト化合物溶液７１０は、最初、開口７１４に、または開口７１４を覆うように形成された細胞懸濁媒体７０６が形成したメニスカス７１６を介して細胞懸濁媒体７０６と接触する。
【００５６】
本発明の１つの実施形態は、図７に示す例示的な装置７００を使用して、細胞活性分析を実行するための方法を提供する。この方法では、フィルム７０２に、細胞懸濁液（細胞懸濁媒体に懸濁した細胞を含有する）を配する。次いで、細胞７０８がフィルム７０２に沈降および付着できるように、フィルム７０２をインキュベートすることで、細胞７０８をフィルム７０２に付着させ、細胞懸濁媒体７０６が細胞７０８を覆うようにする。次いで、必ずしも必要ではないが、フィルム７０２上の細胞７０８を、基本読み取り値を与えるように読み取る。
【００５７】
次いで、細胞懸濁媒体７０６の上に開口７１４を設けて（好ましくは、開口７１４を中心に位置させて）、細胞懸濁媒体７０６を覆うようにして第２のフィルム７０４を配置する。フィルム７０２および７０４の間の適所に細胞懸濁媒体７０６を挟むと、毛管作用によって開口７１４内に細胞懸濁媒体７０６の一部分が引き込まれ、メニスカス７１６が形成される。
【００５８】
次いで、フィルム７０４の細胞懸濁媒体７０６が配される側とは反対の側に、テスト化合物溶液７１０を配する。テスト化合物溶液７１０は、開口７１４を覆うようにされ、且つ開口７１４を中心とすることが好ましい。
【００５９】
フィルム７０４上にテスト化合物溶液７１０を設けると、テスト化合物溶液７１０は、開口７１４で細胞懸濁媒体７０６と接触した状態になる。このように接触すると、テスト化合物溶液７１０は、細胞懸濁媒体７０６内への拡散を開始する。次いで、この拡散が進行するにつれ、細胞７０８へのテスト化合物溶液７１０の影響を観察するために、サイトが周期的に読み取られる。これらの読み取り値は、例えば、細胞の延長と配向、他の形態変化、温度変化、細胞内の分子運動および構造の動き、および電磁変化として検出される。
【００６０】
図７の別の実施形態において、図７のテスト化合物溶液７１０は、タンパク質ゲルなどのゲルにされる。それらをゲルにすることより、テスト化合物溶液の放出速度と、細胞懸濁媒体７０６内へのテスト化合物溶液の拡散とが制御しやすくなる。このようにして、特定の研究や、細胞活性を検出するのに使用する手段に適切なものになるように、研究者は、細胞懸濁媒体７０６内へのテスト化合物溶液７１０の拡散を低速化できる。
【００６１】
図７の別の実施形態において、テスト化合物溶液７１０は、テスト化合物溶液７１０を保持するものであり、ゲルによって与えられた拡散速度の制御に類似した制御方法の下でテスト化合物溶液７１０を放出する焼結材料に含められていてもよい。
【００６２】
図７の別の実施形態において、テスト化合物溶液７１０は溶液であり、フィルム７０４の開口は、タンパク質ゲルなどのゲルで閉塞される。この実施形態において、テスト化合物溶液７１０は、細胞懸濁媒体７０６に到達してその中に拡散するには、ゲルを通過しなければならない。開口７１４にゲルがあることで、テスト化合物溶液が細胞懸濁媒体内へすぐに流れることができなくなり、拡散速度を制御しやすくなる。
【００６３】
図７の別の実施形態では、テスト化合物溶液７１０は、最初にフィルム７０４上に配される際に凍結されている。次いで、凍結された化合物溶液７１０は、溶融するにしたがって、次第に開口７１４に入っていき、やがて細胞懸濁媒体７０６内に拡散する。したがって、凍結したテスト化合物溶液７１０を使用することで、細胞懸濁媒体７０６内への流れを防止し、その中への拡散が制御しやすくなる。
【００６４】
図７の別の実施形態では、テスト化合物溶液７１０は、２つのステップで適用される。第１に、フィルム７０４上に、乾燥または凍結乾燥した化合物が設けられる。第２に、乾燥または凍結乾燥した化合物に、溶液が添加される。次いで、化合物が次第に溶解して、テスト化合物溶液７１０になる。このように次第に溶解するにしたがって、テスト化合物溶液７１０は、細胞懸濁媒体７０６内に次第に拡散する。細胞懸濁媒体７０６は、化合物と細胞懸濁媒体７０６との混合を促進するために溶解させられるが、他の実施形態においては、乾燥または凍結乾燥化合物に溶液を添加する代わりに、場合によっては、フィルム７０４を動かす方法を用いて（例えば、図６を参照して上述したものと同様の方法で）もよいし、或いはそれ以外の適切な方法を用いてもよい。
【００６５】
当業者であれば、テスト化合物溶液の放出速度および細胞懸濁媒体内へのテスト化合物溶液の拡散を制御しやすくする図７の上述した別の実施形態は、図７に示したもの以外の本発明の他の実施形態に適用されてもよいことを容易に認識するであろう。
【００６６】
図７の別の実施形態においては、さまざまな融合性細胞層、例えば、内皮または上皮細胞層を通って化合物ライブラリの要素の拡散速度を研究する分析に、装置７００が応用される。この実施形態において、点線で表される細胞層７２０が、テスト化合物溶液７１０が設けられた側とは反対のフィルム７０４の側に設けられる。また、細胞層７２０は、開口７１４を覆う。テスト化合物溶液７１０は、細胞層７２０と接触し（場合によっては、細胞層７２０に変化を生じさせ）、細胞懸濁媒体７０６内に拡散して、細胞７０８に到達し、細胞７０８に変化を生じさせる。
【００６７】
図８は、テスト化合物溶液が、テスト化合物溶液をゆっくりと放出する材料（例えば、ゲルまたは焼結材料）にされ、材料およびテスト化合物溶液が、細胞懸濁媒体によって取り囲まれている、本発明の別の実施形態を示す。図示するように、この実施形態による装置８００は、第１のフィルム８０２と、第１のフィルム８０２上に沈降した細胞８０８と、細胞８０８を取り囲み第１のフィルム８０２と第２のフィルム８０４との間に挟まれた細胞懸濁媒体８０６と、細胞懸濁媒体８０６内および第１のフィルム８０２と第２のフィルム８０４との間に配されたテスト化合物溶液ゲル８１０とを含む。ゲル８１０は、テスト化合物溶液をゆっくり放出し、テスト化合物溶液は、細胞懸濁媒体８０６と接触し、その中へ拡散する。
【００６８】
図８に示すように、第１のフィルム８０２と第２のフィルム８０４とを所望の距離に分離させるために、支持構造体８２０が提供され得る。他の形態では、構造体８２０を使用する代わりに、テスト化合物溶液ゲル８１０自体がその役目を果たしてもよいし、場合によっては、さらなる支持用に疎水性コーティング８２２を用いてもよい。それらによっても、適切なサイズと一貫性を有するのであれば、第１のフィルム８０２と第２のフィルム８０４とを分離できる。別の形態として、細胞懸濁媒体８０６の表面張力で、第１のフィルム８０２と第２のフィルム８０４とを所望の距離に分離してもよい。
【００６９】
本発明の１つの実施形態では、図８に示す例示的な装置８００を使用して細胞活性分析を実行する方法を提供する。この方法によれば、第１のフィルム８０２に、細胞懸濁液（細胞懸濁媒体に懸濁した細胞を含有する）が配される。次いで、細胞８０８が第１のフィルム８０２に沈降および付着できるように、第１のフィルム８０２をインキュベートし、それにより、細胞８０８を第１のフィルム８０２に付着させ、細胞懸濁媒体８０６が細胞８０８を覆う状態とする。これには限られないが、細胞８０８または第１のフィルム８０２は、基本読み取り値を与えるように読み取られる。
【００７０】
次いで、テスト化合物溶液ゲル８１０は、第２のフィルム８０４上に配される。例えば、最初に、第２のフィルム８０４上にゲルが配されれ、次いで、ゲル上にテスト化合物溶液が配される。他の形態において、テスト化合物溶液は、ゲルと予め混合され、次いで、第２のフィルム８０４上に配されて、ゲル（または乾燥）状態にされてもよい。
【００７１】
第２のフィルム８０４上にテスト化合物溶液ゲル８１０を配すると、第２のフィルム８０４は、反転され、第１のフィルム８０２に重ねられる。テスト化合物溶液ゲル８１０が、細胞懸濁媒体８０６の中心に位置することが好ましい。任意であるが、第１のフィルム８０２上にわたって第２のフィルム８０４を配置する前に細胞懸濁媒体８０６が多過ぎるときには、細胞懸濁媒体８０６から流体の一部分が除去される。細胞懸濁媒体８０６の表面張力、ゲル８１０の厚み、および／またはフィルム８０２および８０４を支持する構造体８２０は、フィルムの表面間の距離、ひいては、細胞懸濁媒体８０６の厚みを決定する。
【００７２】
第１のフィルム８０２と第２のフィルム８０４とを重ね合わせると、テスト化合物溶液ゲル８１０は、細胞懸濁媒体８０６によって取り囲まれる。したがって、テスト化合物溶液は、テスト化合物溶液ゲル８１０から次第に放出され、細胞懸濁媒体８０６内に拡散する。次いで、この拡散が進行するのにあわせて、細胞８０８へのテスト化合物溶液の影響を観察するために、サイトが周期的に読み取られる。
【００７３】
図８の別の実施形態では、テスト化合物溶液が、最初に、第２のフィルム８０４上に設けられ、細胞懸濁媒体８０６と接触した状態とされるときに、凍結された状態とされる。次いで、凍結した化合物溶液が溶融すると、それは、細胞懸濁媒体８０６内に次第に拡散していく。したがって、凍結したテスト化合物溶液を使用すると、細胞懸濁媒体８０６内への拡散を制御しやすくなる。
【００７４】
図８の別の実施形態では、テスト化合物溶液が、２つのステップで第２のフィルム８０４へ適用される。第１に、第２のフィルム８０４上に、乾燥または凍結乾燥した化合物が配される。第２に、乾燥または凍結乾燥した化合物に、溶液が添加される。次いで、溶液および溶解化合物は、細胞懸濁媒体８０６と接触した状態にされる。化合物が溶解し続けると、テスト化合物溶液は、細胞懸濁媒体８０６内に次第に拡散する。細胞懸濁媒体８０６は、化合物と細胞懸濁媒体８０６との混合を促進するために溶解させられるが、他の実施形態においては、乾燥または凍結乾燥化合物に溶液を添加する代わりに、場合によっては、フィルム８０４を動かす方法を用いて（例えば、図６を参照して上述したものと同様の方法で）もよいし、或いはそれ以外の適切な方法を用いてもよい。
【００７５】
図８の別の実施形態では、既知の細胞活性発生剤に及ぼすテスト化合物溶液抑制剤の影響を研究する分析に、装置８００を応用できる。この実施形態では、点線で表される抑制剤テスト化合物溶液８３０が、細胞懸濁媒体８０６およびテスト化合打つ溶液ゲル８１０が設けられる側とは反対の第１のフィルム８０２の側に配される。点線で表される開口８３２が、抑制剤テスト化合物溶液８３０が設けられる第１のフィルム８０２に配される。（任意ではあるが、開口８３２および抑制剤テスト化合物溶液８３０が、第１のフィルム８０２ではなく、第２のフィルム８０４に設けられてもよい。）
【００７６】
テスト化合物溶液ゲル８１０は、既知の細胞活性発生剤でありうる。したがって、研究者が、ゲルからテスト化合物溶液の放出、細胞懸濁媒体８０６内へのテスト化合物溶液の拡散、およびテスト化合物溶液に対する細胞８０８の反応を予想できる。この反応を生じさせるようにして、抑制剤テスト化合物溶液８３０は、開口８３２内またはその周囲で細胞懸濁媒体８０６に接触し、細胞懸濁媒体８０６内に拡散していく。抑制剤テスト化合物溶液８３０が、開口８３２に最も近い細胞８０８に達すると、細胞８０８が抑制剤テスト化合物溶液８３０に反応を示せば、これらの細胞８０８は、既知の細胞活性発生剤（テスト化合物溶液ゲル８１０）に対する反応を停止する。したがって、（既知の細胞活性発生剤および抑制剤の）２つの拡散勾配が重なり合うため、研究者は、抑制剤テスト化合物溶液８３０の影響を観察できる。
【００７７】
当業者であれば、図８のこの別の実施形態は、抑制剤テスト化合物溶液を使用して、図７などを用いてこれまでに述べた他の実施形態に適用されてもよいことを認識するであろう。例えば、図７に示した例では、細胞懸濁媒体７０６が設けられる側とは反対の側のフィルム７０２上に、抑制剤テスト化合物溶液が設けられてもよい。フィルム７０２に開口が設けられてもよく、この開口を通って、抑制剤テスト化合物溶液が細胞懸濁媒体７０６内に拡散するようにしてもよい。テスト化合物溶液ゲル７１０は、既知の細胞活性発生剤であってもよい。別の例として、図８に示した例の場合であれば、抑制剤テスト化合物溶液と既知の細胞活性発生剤化合物溶液との両方が、ゲルに含められ、互いに離して細胞懸濁媒体８０６内に配されてもよい。抑制剤および発生剤溶液は、上述した重なり合う拡散勾配を生じながら、細胞懸濁媒体８０６内に拡散することもある。
【００７８】
図９は、２つのフィルム間に研究中の細胞を挟む、本発明の１つの実施形態を示す。図示するように、この実施形態による装置９００は、第１のフィルム９０２と、第２のフィルム９０４と、第１のフィルム９０２と第２のフィルム９０４との間に挟まれた細胞９０８と、細胞９０８を取り囲む細胞懸濁媒体９０６と、第１のフィルム９０４にある開口９１４上にわたって第２のフィルム９０４上に配されたテスト化合物溶液ゲル９１０とを含む。本発明の実施形態の特定の実施例において、第１のフィルム９０２の厚みは、約０．００１０インチであり、第２のフィルム９０４の厚みは、約０．００１０インチであり、フィルム９０２および９０４間の距離（または細胞９０８の高さ）は、約０．０００３インチである。
【００７９】
本発明の１つの実施形態では、図９に示す例示的な装置９００を使用して細胞活性分析を実行する方法を提供する。この方法では、フィルム９０２に、細胞懸濁液（細胞懸濁媒体に懸濁した細胞を含有する）が配される。次いで、細胞９０８が第１のフィルム９０２に沈降および付着できるように、フィルム９０２がインキュベートされる。これにより、細胞９０８がフィルム９０２に付着し、細胞懸濁媒体９０６が細胞９０８を覆う状態となる。次いで、任意であるが、フィルム９０２上の細胞９０８は、基本読み取り値を与えるように読み取られる。
【００８０】
次いで、細胞懸濁媒体９０６上に位置するようにして開口９１４を設けて（好ましくは、開口９１４を細胞懸濁媒体９０６の中心に位置させて）、細胞懸濁媒体９０６に第２のフィルム９０４が重ねられる。第２のフィルム９０４は、細胞９０８の上部に接触した状態となるように吸引され、または強制的に圧力を与えられて接触状態にされる。この接触により、細胞９０８は細胞懸濁媒体９０６から隔離され、いずれかの側（すなわち、第１のフィルム９０２または第２のフィルム９０４に対面する側）からのイメージングが可能になる。かかる細胞９０８の隔離は、代謝変化による細胞の温度変化を検出するのに有用である。細胞９０８を隔離し、細胞懸濁媒体９０６にさらされた細胞９０８の表面積を縮小することによって、細胞９０８の代謝熱利得を持続させることが可能となり、その検出に有利となる。
【００８１】
次いで、開口９１４上を覆うようにして（好ましくは、その中心に位置させて）、第２のフィルム９０４上に、テスト化合物溶液ゲル９１０が設けられる。テスト化合物溶液ゲル９１０は、開口９１４で細胞懸濁媒体９０６と接触した状態になる。このように接触した状態となると、テスト化合物溶液は、細胞懸濁媒体９０６内への拡散を開始する。次いで、この拡散が進行するにつれ、細胞９０８へのテスト化合物溶液の影響を観察するために、サイトが周期的に読み取られる。これらの読み取り値は、例えば、細胞の延長と配向、他の形態変化、温度変化、細胞内の分子運動および構造の動き、および電磁変化として検出される。
【００８２】
細胞９０８を挟この構成は、赤外線検出システムに特に適している。実際、赤外線検出により、挟められた細胞９０８の三次元画像が得られ、任意の細胞活性を検出する場合における感度をさらに高くすることができる。任意ではあるが、赤外線検出が通過するフィルムとは反対のフィルムには、赤外線光を反射しイメージングをさらに高めるために、反射面（例えば、アルミニウム）がコーティングされる。このように、例えば、図９において、赤外線検出器が、第１のフィルム９０２の下方に設けられれば、第２のフィルム９０４の上側に、反射材料がコーティングされてもよい。
【００８３】
図９の別の実施形態においては、テスト化合物溶液を保持し、細胞懸濁媒体９０６内に拡散するように制御して放出するために、ゲルではなく、他の手段が使用される。例えば、上述したように、これらの他の手段は、テスト化合物溶液を焼結材料に固化する手段、ゲルで開口９１４を閉塞する手段、テスト化合物溶液を凍結した状態で設ける手段、またはテスト化合物を乾燥または凍結乾燥した状態で設ける手段を含んでいてもよい。
【００８４】
図１０に示す本発明の別の実施形態において、テスト化合物は、非常に小さな液滴（ピコリットル〜ナノリットル量）でフィルムに配されれ、また、乾燥または凍結されてもよい。細胞懸濁液が、底部フィルム１００８に配され、底部フィルム１００８と中間フィルム１００６との間に挟まれた状態とされ、細胞１０１０が付着する時間が与えられる（細胞に付着性がある場合）。次いで、テスト化合物１００２を中間フィルム１００６にある穴１０１６にわたってほぼ近づけた状態にして、第２のフィルム１００６に、第３のフィルム１００４を重ね合わせ、または貼り合わせる。細胞懸濁媒体１０１２は、中間フィルム１００６の上面と上部フィルム１００４の底面との間を毛管作用で運ばれ、テスト化合物１００２を溶解または溶融する。次いで、テスト化合物１００２は、中間フィルム１００６にある穴１０１６を通り抜け、底部フィルム１００８と中間フィルム１００６との間で同心円状に拡散する。相乗効果または抑制効果を検出するため、中間フィルムにある複数の穴に対応する複数の化合物を、１つのサイトにおいて使用することもできる。
【００８５】
図１１Ａは、フィルムにある開口上にわたってフィルムの同じ側に、細胞懸濁液およびテスト化合物溶液を連続して設ける、本発明の別の実施形態を示す。図示するように、この実施形態による装置１１００は、透明な基板１１０２と、フィルム１１０４とを含む。基板１１０２およびフィルム１１０４は、例えば、支持構造体によって、または、図１１Ａに示すように、接着剤１１２４によって、互いに間隔を空けた状態で接続され保持される。基板１１０２は、検出手段に対して透明（例えば、電磁放射に対して透明）であるガラスその他の任意の材料で作られることが好ましく、溶液を容易に運んだり流したりできる表面特性を備える。また、基板１１０２は、適切な表面特性を有するフィルムであってもよい。フィルム１１０４は、開口１１１４を規定する。基板１１０２上に細胞１１０８が沈降し、細胞懸濁媒体１１０６が、細胞１１０８を取り囲んだ状態で基板１１０２とフィルム１１０４との間に挟まれる。テスト化合物溶液１１１０は、フィルム１１０４上にある細胞懸濁媒体１１０６および開口１１１４上を覆うようにしてフィルム１１０４上に配される。テスト化合物溶液１１１０は、最初に、開口１１１４に形成された、または開口１１１４を覆うようにして形成された細胞懸濁媒体１１０６のメニスカス１１１６を介して、細胞懸濁媒体１１０６と接触する。
【００８６】
また、装置１１００は、細胞１１０８、細胞懸濁媒体１１０６、およびテスト化合物溶液１１１０を、静止状態で、或いは適当な所に保持しやすいように、疎水性コーティング１１２２を有していてもよい。例えば、図１１Ａに示すように、フィルム１１０４の上面は、開口１１１４上を覆うように溶液を適所に保持する疎水性コーティング１１２２を有してもよい。同様に、サイト内のフィルム１１０４の底面および基板１１０２の上面には、溶液を通さないが、空気を通過させることができる適当に選択された疎水性コーティング１１２３が設けられていてもよい。
【００８７】
本発明の１つの実施形態では、図１１Ａに示す例示的な装置１１００を使用して、細胞活性分析を実行する方法を提供する。この例示的な方法は、基板１１０２およびフィルム１１０４を図１１Ａに示すように予め組み立てた装置１１００により実行される。この方法では、フィルム１１０４の上面に、好ましくは、開口１１１４上を覆うようにして、且つ開口１１４を中心として、細胞懸濁液（細胞懸濁媒体に懸濁させた細胞を含有する）が配される。疎水性コーティング１１２２は、細胞懸濁液を適所に保持し、開口１１１４上にわたってその中心に位置させやすくする。図１１Ａに、細胞懸濁液の初期配置を点線１１０６ａで表す。
【００８８】
この初期配置が行われた後、細胞懸濁液は、開口１１１４を通って、基板１１０２とフィルム１１０４との間の空間内に入り、疎水性バリア１１２３まで流れる。この空間の寸法は、細胞懸濁液を、サイト内および疎水性バリア１１２３まで引き寄せるウィッキング作用を生じさせ得る。さらに、その空間内への細胞懸濁液の流れをさらに促すために、細胞懸濁液によって押された空気が、疎水性バリア１１２３を通って、フィルム１１０４によって規定された通気孔１１２６などの１つ以上の通気孔を通ってサイトから放出されるようにしてもよい。細胞懸濁液が疎水性バリア１１２３に到達した後、その流れが止まるが、そのときの細胞懸濁液は、メニスカスライン１１１６によって表されるような静止位置にあるとする。細胞懸濁液の流れを制限することで、細胞の沈降が促され、均一の拡散が生じ得る媒体の静止性が確立される。この時点で、必要に応じて、細胞１１０８を細胞懸濁液から沈降させて基板１１０２に付着させるように、装置１１００をインキュベートし、それにより、静止した細胞懸濁媒体１１０６が付着細胞１１０８を取り囲んだ状態とする。次いで、任意であるが、基板１１０２上の細胞１１０８は、基本読み取り値を与えるように読み取られる。
【００８９】
次いで、フィルム１１０４の上面に、好ましくは、開口１１１４を覆うように且つ開口１１１４が中心になるようにしながら、細胞懸濁媒体１１０６内またはその上に、テスト化合物溶液１１１０を配する。テスト化合物溶液１１１０は、細胞活性のスクリーニング対象の化合物を含有する。疎水性コーティング１１２２は、テスト化合物溶液１１１０を適当な所に保持し、開口１１１４をその中心に位置させやすくする。図１１Ａには図示していないが、この時点で、細胞懸濁液およびテスト化合物溶液１１１０を配した後、サイトを密封し、溶液の蒸発を制限するために、フィルム１１０４上に蓋を配置してもよい。
【００９０】
細胞懸濁媒体１１０６内またはその上部となるフィルム１１０４上にテスト化合物溶液１１１０を配すると、テスト化合物溶液１１１０は、メニスカス１１１６で細胞懸濁媒体１１０６と接触した状態になる。このような接触が生じると、テスト化合物溶液１１１０は、細胞懸濁媒体１１０６内への拡散を開始する。溶液の位置安定性は、疎水性バリアによって与えられ、サイト全体にわたって一様で測定可能な同心拡散を促す。次いで、この拡散が進行するのに応じて、細胞１１０８へのテスト化合物溶液１１１０の影響を観察するため、サイトを周期的に読み取る。これらの読み取り値は、例えば、細胞の伸びと配向、他の形態変化、温度変化、細胞内の分子運動および構造の動き、および電磁変化として検出される。
【００９１】
図１１Ａの実施形態の例示的な実施例では、図１１Ａの単一のサイトは、９６サイト装置の一部である。この装置において、各サイトは、およそ９×９ｍｍ平方であり、疎水性バリア１１２３によって規定された各サイト内の面積は、およそ７×７ｍｍ平方である。基板１１０２とフィルム１１０４との間の距離は、およそ１０〜２００μである。疎水性バリア１１２３によって規定されたサイトの容量は、およそ１〜５μｌである。この構成を用いると、およそ１μｌから５μｌの間の細胞懸濁液をサイトに配すことができ、既知の細胞活性誘導性質を有する化合物溶液をサイトに配した後約１５〜４０分以内に、疎水性バリア１１２３に最も近い細胞１１０８に変化した細胞活性を観察できることが実験により示された。
【００９２】
図１１Ｂは、図１１Ａに示す装置１１００の例示的なサイト１１５０の平面図を示す。（図１１Ａに示す断面図は、例えば、図１１Ｂの線Ａ−Ａに沿って切り取られたものであってもよい。）図１１Ｂの平面図は、フィルム１１０４を下方に見たものであり、フィルム１１０４によって規定された開口１１１４を示す。接着剤１１２４によって下方の基板１１０２にフィルム１１０４が付着され、この接着剤により、この実施形態では、フィルム１１０４と基板１１０２との間に間隔が設けられる。接着剤１１２４の周囲において、サイト１１５０は、疎水性バリア１１２３によって規定される。サイト１１５０から空気を逃すことができる通気孔１１２６が、フィルム１１０４に設けられている。通気孔１１２６は、接着剤１１２４とバリア１１２３との間の位置に示しているが、その位置は、細胞懸濁液が到達し得る点を越えた場所であればどの位置でもよく、例えば、バリア１１２３上にわたって、または、接着剤が通気孔を閉塞することがないのであれば、接着剤１１２４に近接した場所でもよい。製造を容易にするために、接着剤が通気孔を閉塞しないように接着剤１１２４に近接する位置に、さらなる疎水性バリアを設けることもできる。通気孔１１２６の位置もそうであるが、通気孔１１２６の数も変動し得る。図では、２つの通気孔１１２６を図示しているが、所望の用途に適した任意の数の通気孔を設ければよい。
【００９３】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、上側フィルムおよび下側基板（例えば、ガラス基板）を有し、開口および通気孔がフィルムによって規定された１つの例示的な装置１１００を示すが、当業者であれば、この構成は、逆であっても、または特定の実施例の需要に満たすように変更されてもよいことを認識するであろう。例えば、別の例示的な装置は、下側フィルムおよび上側ガラスまたはプラスチックカバーを有し、開口および通気孔が上側カバーに設けられていてもよい。
【００９４】
図１２Ａは、通路によって接続された別々のウェルに、細胞懸濁液およびテスト化合物溶液を配する、本発明の別の実施形態を示す。図示するように、この実施形態による装置１２００は、透明基板１２０２と、貫通孔構造体１２２８と、フィルム１２０４とを含む。基板１２０２は、例えば、検出手段に対して透明であり、溶液を容易に運んだり流したりできる表面特性を備えるガラスその他の材料により形成される。構造体１２２８は、穴１２３０および１２３２などの貫通孔を有数る。構造体１２２８は、例えば、アクリル板であり得る。接着剤１２２４によって接合可能な基板１２０２および構造体１２２８は共に、通路によって接続されたウェルを形成する。接着剤１２２４の厚みは、通路の高さを規定し得る。感圧接着剤によって、構造体１２２８にフィルム１２０４が接続され得る。フィルム１２０４は、構造体１２２８の貫通孔１２３０と整列した開口１２１４を規定する。
【００９５】
図１２Ｂは、図１２Ａに示す装置１２００の１つの例示的なサイト１２５０の平面図を示す。（図１２Ａに示す断面図は、例えば、図１２Ｂの線Ａ−Ａに沿って切り取られたものであってもよい。）図１２Ｂの平面図は、フィルム１２０４を下方に見たものであり、フィルム１２０４によって規定される開口１２１４を示す。基板１２０２は、接着剤１２２４によって構造体１２２８に接続される。この接着剤により、この実施形態においても、基板１２０２と構造体１２２８との間に間隔が設けられる。接着剤１２２４の周囲において、サイト１２５０は、疎水性バリア１２２３を有し、その上部セクションは、構造体１２２８に接続され、底部セクションは、基板１２０２に接続される。任意ではあるが、図１２Ｂに示すように、フィルム１２０４が配される前にサイト１２５０から空気を逃がすことができるように、基板１２０２、または構造体１２２８に通気孔１２２６が設けられていてもよい。通気孔１２２６は、接着剤１２２４とバリア１２２３との間の位置に示されているが、細胞懸濁液が到達し得る点を越えた場所であればどの位置であってもよい。製造を容易にするために、接着剤が通気孔を閉塞しないのであれば、接着剤１２２４に近接して通気孔を設けてもよいし、製造を簡単にするべく接着剤１２２４と通気孔の間に疎水性バリアを設けることもできる。通気孔１２２６の位置決めもそうであるが、通気孔１２２６の数も変えられる。この図では、２つの通気孔１２２６を示しているが、通気孔の数は所望の用途に適した任意の数にでき、また貫通孔１２３０を単独の通気孔として機能させることもできる。
【００９６】
本発明の１つの実施形態では、図１２Ａに示す例示的な装置１２００を使用して、細胞活性分析を実行する方法を提供する。この例示的な方法は、基板１２０２および構造１２２８をすでに組み立てた装置１２００にて実行される。この方法では、穴１２３２内に、ある量の細胞懸濁液（細胞懸濁媒体に懸濁した細胞を含有する）が配される。細胞懸濁液のこのような初期配置は、第１の量（例えば、３μｌ）を設けた場合を点線１２０６ａで、第２の量（例えば、７μｌ）を線１２０６ｂで図１２Ａに表すように、１回分の量（例えば、１０μｌ）で、または２回（以上）分の量ですべて配すことができる。
【００９７】
初期配置後、細胞懸濁液は、穴１２３２を通って、基板１２０２と構造体１２２８との間の通路内に入り、疎水性バリア１２２３まで、また、線１２０６ｃによって表される穴１２３０の上方まで部分的に流れる。通路の寸法および穴１２３０の内部寸法は、細胞懸濁液を、サイト内および疎水性バリア１２２３まで、および穴１２３０内に引き寄せるウィッキング作用を生じさせ得るようなものとされる。さらに、空間内への細胞懸濁液の流れをさらに促すため、細胞懸濁液によって押される空気が、疎水性バリア１２２３を介し、通気孔１２２６などの１つ以上の通気孔を通して、サイトから放出されるようにすることができる。細胞懸濁液が、疎水性バリア１２２３に到達した後、流れが止まる。この場合における細胞懸濁液は、ライン１２０６ａ、１２０６ｂ、および１２０６ｃによって表されるような静止位置にあるとする。サイトの構造は、細胞懸濁液の流れを制限し、細胞１２０８の沈降および基板１２０２への付着を促し、均一の拡散が生じ得るように媒体を静止させる状態を確立する。この時点で、必要に応じて、細胞１２０８を細胞懸濁液から沈降させ、基板１２０２に付着させるように、装置１２００をインキュベートする。それにより、静止した細胞懸濁媒体１２０６が付着細胞１２０８を取り囲んだ状態となる。次いで、任意であるが、テスト化合物溶液１２１０を穴１２３０内に投入した後、さらなる読み取り値と比較するための基本読み取り値を得るために、基板１２０２上の細胞１２０８が読み取られる。
【００９８】
次いで、フィルム１２０４を、構造体１２２８上に配置し、感圧接着剤などの接着剤によって、構造体１２２８に接合する。フィルム１２０４にある開口１２１４が、構造体１２２８の穴１２３０に対応して整列される。フィルム１２０４は、例えば、穴１２３２の周囲の周りに塗布された接着剤によって付着させることにより、穴１２３２を密封することが好ましい。このようにすると、フィルム１２０４は穴１２３２に空気を閉じ込めるようになり、細胞懸濁媒体および沈降細胞の流れをさらに制限しやすくなる。このようにして、穴１２３２は、フィルム１２０４によって空気圧および液圧的に密封され（穴１２３０は大気に開放されているが）、通路は、疎水性バリア１２２３によって液圧密封される。それにより、細胞懸濁媒体のさらなる流れが防止される。
【００９９】
次いで、細胞懸濁媒体１２０６が静止状態に保持され、細胞１２０８が沈降すると、テスト化合物溶液１２１０が、開口１２１４に、細胞懸濁媒体１２０６と接触した状態で排される。テスト化合物溶液１２１０は、細胞活性のスクリーニング対象の化合物を含有する。図１２Ａに図示していないが、この時点で、細胞懸濁液およびテスト化合物溶液１２１０が配した後、サイトを外部環境から密封し、溶液の蒸発を制限するためフィルム１２０４上に蓋を配置してもよい。
【０１００】
細胞懸濁媒体１２０６上にテスト化合物溶液１２１０を配すると、テスト化合物溶液１２１０は、ライン１２０６ｃで細胞懸濁媒体１２０６と接触した状態になる。このように接触すると、テスト化合物溶液１２１０は、細胞懸濁媒体１２０６内への拡散を開始する。溶液の空間安定性は、疎水性バリアおよび穴１２３２を密封するフィルム１２０４によって与えられ、サイト全体にわたって一様で測定可能な拡散速度を促す。次いで、穴１２３０から穴１２３２の方へこの拡散が進行するのに応じて、細胞１２０８へのテスト化合物溶液１２１０の影響を観察するために、サイトが周期的に読み取られる。これらの読み取り値は、例えば、細胞の伸びと配向、他の形態変化、温度変化、細胞内の分子運動および構造の動き、および電磁変化として検出される。
【０１０１】
図１２Ａの実施形態の例示的な実施例においては、図１２Ａの単一のサイトは、９６サイト装置の一部である。この装置において、各サイトは、およそ９×９ｍｍ平方であり、疎水性バリア１２２３によって規定された各サイト内の面積は、およそ７×７ｍｍ平方である。基板１２０２は、例えば、ガラスまたはプラスチックであってもよく、フィルム１２０４は、Ｔｅｆｌｏｎであってもよい。
【０１０２】
本発明の方法の別の実施形態では、拡散を意図したように促すために、図１２Ａの装置１２００に圧力差を加える。例えば、細胞懸濁媒体１２０６およびテスト化合物溶液１２１０を配した後、それを位置的に静止させたときに、溶液間の制御された動きを促し、必要に応じて、望ましいように溶液間の拡散速度に影響を与えるように、圧力差を加えることができる。
【０１０３】
図１３は、通路によって接続された、フィルムにある別々の開口を覆うようにして細胞懸濁液およびテスト化合物溶液を設けた、本発明の別の実施形態を示す。この実施形態において、細胞懸濁液とテスト化合物溶液との量の差により、所望の流れ、および拡散特性が得られる。図示するように、この実施形態による装置１３００は、基板１３０２と、フィルム１３０４とを含む。基板１３０２は、例えば、検出手段に対して透明であり、溶液を容易に運んだり流したりできる表面特性を備えるガラスその他の任意の材料を含む。フィルム１３０４は、開口１３３０および１３３２を規定する。接着剤１３２４によって接合可能な基板１３０２およびフィルム１３０４は共に、開口１３３０および１３３２を接続する通路を形成する。接着剤１３２４の厚みは、通路の高さを規定する。装置１３００の構造は単純であるため、この実施形態は、１５３６フォーマットなどのより稠密なフォーマットに特に適したものになる。
【０１０４】
装置１３００は、細胞懸濁液、細胞懸濁媒体、およびテスト化合物溶液を適当な所に保持しやすいように疎水性コーティングを有していてもよい。例えば、図１３に示すように、フィルム１３０４の上面は、開口１３３０および１３３２上にわたって溶液を適当な所に保持する疎水性コーティング１３２２を有していてもよい。同様に、フィルム１３０４の底面および基板１３０２の上面は、サイト内に溶液を止めるが、空気を通すこともできる疎水性コーティング１３２３を有していてもよい。
【０１０５】
本発明の１つの実施形態により、図１３に示す例示的な装置１３００を使用して細胞活性分析を実行する方法を提供する。この例示的な方法は、基板１３０２およびフィルム１３０４を図１３に示すようにすでに組み立てた装置１３００にて実行される。この方法によれば、開口１３３０を覆うようにしてフィルム１３０４の上面に、細胞懸濁液（細胞懸濁媒体に懸濁させた細胞を含有する）が配される。疎水性コーティング１３２２は、細胞懸濁液を適当な所に保持し、開口１３３０を覆い且つ開口１３３０の中心に細胞懸濁液を位置させやすくする。図１３に、細胞懸濁液の初期配置を点線１３０６ａで表す。
【０１０６】
この初期配置の後、細胞懸濁液は、開口１３３０を通って、基板１３０２とフィルム１３０４との間の空間内に入り、疎水性バリア１３２３まで流れる。この空間の寸法は、細胞懸濁液を、サイト内および疎水性バリア１３２３まで引き寄せるウィッキング作用を生じさせるものとされていてもよい。さらに、空間内への細胞懸濁液の流れをさらに促すために、細胞懸濁液によって押される空気が、疎水性バリア１３２３を通って、フィルム１３０４に設けられた通気孔１３２６などの１つ以上の通気孔を通ってサイトから放出されるようになっていてもよい。細胞懸濁液が、疎水性バリア１３２３に達した後、流れが止まる。このときの、細胞懸濁液は、ライン１３０６ａおよび１３０６ｂによって表されるような静止位置にあるとする。細胞懸濁液の流れを制限することで、細胞の沈降が促され、均一の拡散が生じ得るような媒体の静止状態が確立される。この時点で、必要に応じて、細胞１３０８を細胞懸濁液から沈降させ、基板１３０２に付着させるように、装置１３００をインキュベートする。それにより、細胞懸濁媒体１３０６が付着細胞１３０８を取り囲んだ状態にする。次いで、任意であるが、基板１３０２上の細胞１３０８は、基本読み取り値を与えるように読み取られる。
【０１０７】
次いで、開口１３３２上にわたってフィルム１３０４の上面に、テスト化合物溶液１３１０を配する。テスト化合物溶液１３１０は、細胞活性のスクリーニング対象の化合物を含有する。疎水性コーティング１３２２は、開口１３３２を覆うような状態で、テスト化合物溶液１３１０を適当な所に保持しやすくする。図１３に図示していないが、この時点で、つまり、細胞懸濁液およびテスト化合物溶液１３１０を配した状態で、サイトを外部環境から密封し、溶液の蒸発を制限するとともに、溶液の流れを制限するように安定させるために、フィルム１３０４上にわたって蓋を配置してもよい。他の形態において、穴１３３０に対応する蓋の底面上の点に、テスト化合物溶液１３１０を配することで、蓋でサイトを密封すると同時に、細胞懸濁媒体１３０６内へのテスト化合物溶液の拡散を開始することができる。  
【０１０８】
開口１３３２上を覆うようにしてフィルム１３０４上にテスト化合物溶液１３１０を配すると、テスト化合物溶液１３１０は、ライン１３０６ｂで細胞懸濁媒体１３０６と接触した状態になる。このように接触すると、テスト化合物溶液１３１０は、細胞懸濁媒体１３０６内への拡散を開始する。溶液の空間安定性は、疎水性バリアによって与えられ、サイト全体にわたって一様で測定可能な拡散速度を促す。溶液の流れおよび拡散特性は、細胞懸濁媒体１３０６およびテスト化合物溶液１３１０の相対容量を調整することによって、意図的にさらに制御し得る。これらの容量によって加えられる力は、液滴の半径および溶液の表面張力に比例する。このようにして、例えば、さらなる細胞懸濁媒体１３０６ｃで表されるように、所望の結果（例えば、細胞懸濁媒体からテスト化合物溶液への流れ）を達成するために、より多くの細胞懸濁媒体を配しうる。開口１３３０に設けられた細胞懸濁媒体の量が、開口１３３２に設けられたテスト化合物溶液１３１０の量より多ければ、細胞懸濁媒体は、均衡が確立されるまで、開口１３３２の方向に開口１３３０から流れる。
【０１０９】
適切な量の溶液が設けられた後、拡散が進行するのに応じて、細胞１３０８へのテスト化合物溶液１３１０の影響を観察するために、サイトを周期的に読み取る。これらの読み取り値は、例えば、細胞の伸びと配向、他の形態変化、温度変化、細胞内の分子運動および構造の動き、および電磁変化として検出される。
【０１１０】
図１３の装置１３００の別の実施形態では、流れおよび拡散を制御するために、ある量の溶液を使用する代わりに、ゲルを使用し、それにより流れおよび拡散を制御する。ゲルが溶液の流れを制限するので、細胞懸濁媒体内に拡散するテスト化合物溶液の量を制御できる。この別の実施形態によれば、フィルム１３０４は、開口１３２６、１３３０、および１３３２以外の部分で閉塞されるフィルタを備えてもよい。開口１３３２では、フィルタ１３０４が、閉塞されない。また、開口１３３２は、ゲルを有し得る。通気孔１３２６および開口１３３０の部分では、フィルタは閉塞されず、また、ゲルがないので、開いた開口となる（例えば、フィルタ１３０４に開けた穴）。
【０１１１】
開口１３３２のゲルは、テスト化合物溶液１３１０と細胞懸濁媒体１３０６との間の流れを制限し、細胞懸濁媒体１３０６内へのテスト化合物溶液１３１０の拡散を制御する。溶液の相対容量は、流れまたは拡散に影響を与えない。細胞懸濁媒体は、開口１３３０を通って特定の量で配することができ、疎水性バリア１３２４および開口１３３２に配したゲルへ流れるようにすることができる。細胞１３０８が、細胞懸濁媒体から沈降したあと、テスト化合物溶液１３１０は、溶液の相対容量に関係なく、開口１３３２に配されうる。したがって、この別の実施形態は、ピペットで滴下するさいの不正確さを補償できる。
【０１１２】
上述した実施形態では、細胞が沈降しフィルムに付着できるように細胞懸濁液をインキュベートすることを伴うが、本発明の別の実施形態は、フィルムに付着させない代わりに、細胞懸濁液に懸濁したまま留まる細胞の分析に適応することができる。これらの非付着性細胞は、例えば、精子や細菌を含んでもよい。これらの場合、拡散勾配の効果も観察することができる。言い換えれば、細胞が移動していても、テスト化合物溶液が、点源より遠くに拡散し、さらなる細胞に達してそれを活性化させるのに応じて、研究者が、経時的に生じるリング効果を観察できる。
【０１１３】
本発明の別の実施形態によれば、化合物ライブラリからのテスト化合物が、粒子またはビードに液体状で与えられる。次いで、液体テスト化合物は、粒子またはビードでゲル化または乾燥される。次いで、粒子またはビードは、（表面に沈降し付着したものか、または非付着性のいずれかの）細胞を有する細胞懸濁媒体に浸され、その後、細胞懸濁媒体内に拡散させられ、そして、細胞への効果を周期的に読み取られる。粒子またはビードは、粒子またはビードにどのテスト化合物溶液が適用されたかを示すために識別されることが好ましい（例えば、色帯を有する色分けしたビードとする。）。
【０１１４】
粒子またはビードは、媒体可溶性（水溶性）コーティングでコーティングされていてもよい。粒子またはビードは、小さな管であってもよく、例えば、表面に小さな穴を有する毛管の部分または中空ボールであってもよい。中空ボールの場合、ボールは、テスト化合物溶液にあるまま、真空を適用することによって充填されてもよい。真空が解放されると、溶液はボールを充填する。
【０１１５】
また、粒子やビードは、焼結材料であってもよく、例えば、色、形状、またはそれらの組み合わせで識別された金属、プラスチック、ガラス、またはセラミック粒子であってもよい。これらの粒子は、中空ボールと同様の方法で真空を用いてテスト化合物溶液で充填されてもよい。
【０１１６】
粒子やビードは、上部および底部にスキンを適用したセルロースフィルタの一部であってもよい。この実施例によれば、例えば、シルクスクリーンを用いて、フィルタのシートの上部側および底部側にスキンが適用される。まず、フィルタシートの上部側のスキンに、小さな穴が形成される。各穴を覆うようにして、テスト化合物溶液の液滴が配される。上部スキンと底部スキンとの間のフィルタシート内にテスト化合物溶液を引き込むために、真空が適用され、または解放される（必要に応じて、数回これが行われる）。必要に応じて、上部スキンの上部から、余分なテスト化合物溶液が除去される。次いで、上部スキンにある各穴上にわたって、細胞懸濁液の液滴が配される。次いで、細胞懸濁液の液滴は、フィルムで覆われる。任意であるが、細胞懸濁液は、まずフィルムに配されてもよい（望ましければ、細胞を沈降させ）。フィルムは、テスト化合物溶液を保持するフィルタの上部スキン上にわたって反転されてもよい。
【０１１７】
本発明は、種々の分析フォーマットに適応可能である。１つの例において、本発明は、生物分子スクリーニング学会（ＳＢＳ：Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）マイクロプレートフォーマットに準拠した分析装置に適用されてもよい。このような装置は、大量の化合物を化学分析する自動システムで典型的に使用されている、９６、３８４、または１５３６サイトを有する個々のマイクロプレートを含んでもよい。上述した個々のサイト構造のさまざまな実施形態は、ＳＢＳプレートの複数サイトで再現されてもよい。しかしながら、当業者であれば、これらの個々のサイト構造の使用は、ＳＢＳフォーマットに限定されるものではなく、他の標準的および非標準的フォーマットに適用されてもよいことを認識するであろう。
【０１１８】
別のフォーマットの一例として、本発明は、連続的なフィルムを使用する分析装置に適用されてもよい。フィルムは、例えば、リールのスプロケットとフィルムにある対応するスプロケット穴とを用いて、リール上で搬送されてもよい。リールは、１つのステーションから次へとフィルムを搬送し、その場所で、上述した方法の各ステップが生じることになる。
【０１１９】
例えば、図１の実施形態を参照すると、第１のステーションが、図１に示す開口１１０などのフィルム１０２にある開口の群（例えば、列）上にわたって、フィルム１０２の第１の側に細胞懸濁液を配する液体分配ステーションであってもよい。次いで、このサイト群は、フィルムとともにインキュベーションステーションに搬送されてもよく、このステーションで、細胞１０８がフィルム１０２に沈降し付着するようになっていてもよい。インキュベーション後、サイト群は、細胞１０８の基本読み取り値を与える第１の検出器に移動する。次いで、サイト群は、例えば、反転させたピンアプリケータシステムを使用して、フィルム１０２の第２の側にテスト化合物溶液１０６を設ける第２の液体分配ステーションに移動する。次いで、サイト群は、分析を完了するために、必要に応じて、１つ以上のインキュベーションステーションおよび／または１つ以上の検出器に搬送される。
【０１２０】
連続フィルムの実施形態は、複数フィルムおよび支持構造体を含み得る。フィルムまたは支持構造体を有するフィルム（例えば、より厚みのあるフィルム）は、細胞およびテスト化合物を挟める分析プロセス中に貼り合わされることによって、蒸発効果がなくなる。
【０１２１】
本発明とともに連続フィルムを使用することで、安価で効率的な分析方法が実現できる。また、フィルムは、搬送の利便性がよいため、単純で正確な自動的手段が得られる。また、連続フィルムにより、テストサイトが、アセンブリンラインの最初から最後まで進行するのに応じて、複数の連続した検出ステップを実行できるようになる。
【０１２２】
別の形態の別の例として、本発明は、コンパクトディスクなどの回転式の複数サイトプラットフォームを使用する分析装置に応用可能である。この場合、サイト群は、プラットフォームの中心から放射状に延在する列状のものであってもよい。プラットフォームは、各サイト群にさまざまなステーションを通らせるように回転する。この形態は、細胞の変化を検出できる１つの例示的なフラットで光学的に良好な表面を与え得る。
【０１２３】
本発明により、以下の１つ以上の利益を含むが、これらに限定されるものではない多数の利益が得られる。
１）少数の細胞を使用。
２）少量のテスト化合物を使用。
３）従来の細胞移動分析より最大１０〜１０００倍速く分析を完了。
４）高密度の研究を可能にすることにる低コスト化（すなわち、化合物当たりテスト当たりのコストが低い）。
５）ピペット操作エラーによる変動係数が、分析の変動係数へ及ばないようにすることを含む変動係数の低下と、その結果として、細胞ベースＨＣＳおよびＨＴＳを実現。
６）例えば、フィルタを通過した細胞の数またはパーセンテージを計数するが、フィルタを通過していない細胞に関するデータを生じない移動分析とは対照的に、動的データおよび定量的データを獲得。
７）少数の細胞および少量の化合物しか必要でないため、試薬コストが低下。
８）高解像度光学検出システムによって比較的ひずみのない視野を可能にする光学的に有益な分析装置を提供。
９）永久細胞系とは対照的に、一次細胞、すなわち、患者からの直接の細胞の使用を可能にする。
１０）平坦で透明な上部および底部と、比較的薄い層（０．１〜２．０ｍｍの厚み）を必要とする、高解像度光学検出システムに幾何学的に適合可能である。
１１）密封環境で細胞懸濁液およびテスト化合物を挟めることによって、蒸発問題を回避しやすくする。
【０１２４】
本発明により、研究者らは、例えば、細胞の配向、形状、および形態に関する細胞データを収集できる。脈管形成などの複雑な分析において、本発明により、脈管形成の発生が観察されたか否かに関するデータが得られる。さらに、例えば、脈管形成が逆転または抑制可能であるかを決定するために、脈管形成を受ける細胞に異なる化合物を追加することによって、さらなるデータを収集できる。
【０１２５】
動的データを得ると、研究の変動係数を著しく低下させることもできる。従来の細胞活性分析の場合、テストサイトと、陽性および陰性の制御サイトの大きな変動により、変動係数が許容不能な大きさになる。実際、研究者らは、通常、各テスト化合物に対して二重または三重のサイトを使用し、結果を確認するために、従来の細胞活性分析を２回および３回繰り返す。対照的に、本発明により、変動係数を著しく低下する動的研究が可能になる。これらの動的研究は、細胞および細胞集団の変化を漸進的に識別する。研究者（または検出システム）が、テスト化合物の拡散が、細胞の集団を通って移動するとき、細胞の集団を幾何学的に通る細胞活性進行のパターンを観察でき、または漸進的パターンを観察しない。横並びに（同心円状パターンで）幾何学的に進行する細胞活性の変化は、同じ同心円状パターンでのテスト化合物の拡散とともに、動的パターンを使用できない分析とは質的に異なる。これらのパターンを検出すると、因果関係が確立される。したがって、このアプローチは、現行の細胞ベース分析に一般的な偽陽性および不規則性が事実上なくなる。
【０１２６】
本発明を使用する研究者はまた、テスト化合物溶液に反応を示す細胞が、隣接する細胞に影響を及ぼしているときを決定できる。例えば、テスト化合物溶液の拡散速度をモニタすることによって、研究者が、点源からの距離に基づいて細胞が反応すべきときを決定できる。これらの細胞が、その時より前に変化を示せば、研究者は、すでに反応を示している細胞が、隣接する細胞によって影響を受けた後に、テスト化合物溶液がそれらの細胞に達しているということを導き出せる。このような情報は、二次および三次スクリーンにとって特に有益である。
【０１２７】
図面および記載は、点源拡散を参照しているが、装置のサイトにある点源は２つ以上であってもよいことは明らかである。点源の数に対して関連することは、点源が、研究されている現象の動態が明確になるように十分に離されることである。例えば、分析サイトに点源のパターンがあれば、点源は、分析の過程で互いに干渉しないように十分に離れていなければならない。さらに、いくつかの点源が使用可能であり、１つの点源は、細胞活性の既知の抑制剤とともに、別の点源は、ライブラリからの化合物とともに使用可能である。抑制剤の拡散前面が、テスト化合物の拡散前面と交差すると、細胞活性のパターンは、特性パターンを示す。
【０１２８】
本発明の代表的な実施形態を記載するにあたって、本願明細書では、特定のステップシーケンスとして本発明の方法および／またはプロセスを提示してきた。しかしながら、この方法またはプロセスが、本願明細書に示す特定のステップ順序に依存しないという点で、この方法またはプロセスは、記載した特定のステップシーケンスに限定されるべきではない。当業者であれば、他のステップシーケンスも可能な場合があることを認識するであろう。したがって、本願明細書に示すステップの特定の順序は、特許請求の範囲に制限を課すものとして解釈されるべきではない。さらに、本発明の方法および／またはプロセスに関する特許請求の範囲は、本願明細書におけるプロセスの記載によって必要に応じて、順序に関する特段の記載がない限り、記載した順序でステップを実行することに限定されるべきではない。当業者であれば、シーケンスが変更されてもよく、本発明の趣旨および範囲内のものであることは容易に認識するであろう。
【０１２９】
本発明の実施形態の前述の開示は、説明および記述を目的として与えられたものである。この開示は、完全なものであることを意図したものでも、本発明を開示された正確な形態に限定するように意図したものでもない。本願明細書に記載した実施形態の多数の変更および修正は、上記開示を考慮して当業者に明らかであろう。本発明の範囲は、特許請求の範囲およびそれらと同等のものによってのみ定義されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】本発明の１つの実施形態による、単一のフィルムを有するマルチサイト分析装置の１つのサイトの略図的断面図である。
【図２】本発明の１つの実施形態による、濃度勾配を示す、図１の分析装置の略図的平面図である。
【図３】本発明の１つの実施形態による、２つのフィルムを有するマルチサイト分析装置の１つのサイトの略図的断面図である。
【図４】本発明の１つの実施形態による、３つのフィルムを有するマルチサイト分析装置の１つのサイトの略図的断面図である。
【図５】本発明の１つの実施形態による、ヒートシンクを有するマルチサイト分析装置の１つのサイトの略図的断面図である。
【図６】本発明の１つの実施形態による、細胞懸濁媒体とテスト化合物溶液との間のフィルムに弁開口を有するマルチサイト分析装置の１つのサイトの略図的断面図である。
【図７】本発明の別の実施形態による、２つの異なるフィルム上に細胞およびテスト化合物溶液が設けられた、マルチサイト分析装置の１つのサイトの略図的断面図である。
【図８】本発明の別の実施形態による、テスト化合物溶液が、テスト化合物溶液をゆっくり放出材料に設定され、材料およびテスト化合物溶液が、細胞懸濁媒体によって取り囲まれた、マルチサイト分析装置の１つのサイトの略図的断面図である。
【図９】本発明の１つの実施形態による、２つのフィルム間に細胞が挟められた、マルチサイト分析装置の１つのサイトの略図的断面図である。
【図１０】本発明の１つの実施形態による、テスト化合物が非常に小さな液滴でフィルムに適用されて乾燥させるか、または凍結される、マルチサイト分析装置の１つのサイトの略図的断面図である。
【図１１Ａ】本発明の１つの実施形態による、フィルムの開口上のフィルムの同じ側に、細胞懸濁液およびテスト化合物溶液が連続して設けられる、マルチサイト分析装置の１つのサイトの略図的断面図である。
【図１１Ｂ】本発明の１つの実施形態による、図１１Ａに示す装置の例示的なサイトの略図的平面図である。
【図１２Ａ】本発明の１つの実施形態による、細胞懸濁液およびテスト化合物溶液を別々に設けるための通路によって接続された２つのウェルがサイトにある、マルチサイト分析装置の１つのサイトの略図的断面図である。
【図１２Ｂ】本発明の１つの実施形態による、図１２Ｂに示す装置の例示的なサイトの略図的平面図である。
【図１３】本発明の１つの実施形態による、通路によって接続されたフィルムにある別々の開口上に細胞懸濁液およびテスト化合物溶液が設けられる、マルチサイト分析装置の１つのサイトの略図的断面図である。
【図１】
2008509669.tif 000002
【図２】
2008509669.tif 000003
【図３】
2008509669.tif 000004
【図４】
2008509669.tif 000005
【図５】
2008509669.tif 000006
【図６】
2008509669.tif 000007
【図７】
2008509669.tif 000008
【図８】
2008509669.tif 000009
【図９】
2008509669.tif 000010
【図１０】
2008509669.tif 000011
【図１１Ａ】
2008509669.tif 000012
【図１１Ｂ】
2008509669.tif 000013
【図１２Ａ】
2008509669.tif 000014
【図１２Ｂ】
2008509669.tif 000015
【図１３】
2008509669.tif 000016
【国際調査報告】
2008509669.tif 000017
2008509669.tif 000018