(57)【要約】  本発明は、トランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞、及びその作出方法に関する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物、或いは該動物由来の組織又は細胞により、相同内在性非ヒト動物タンパク質に代わって薬物代謝に関与すると共に、該動物に導入されたヒト遺伝子の発現の調節がヒトにおいてインビボで見られるものと一層同様になされるように該遺伝子を制御することに関与するヒトタンパク質を発現することが可能な系が得られる。【選択図】なし
2008522605.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写因子プロモーターの制御下で少なくとも１個の転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、次のヒトＤＮＡ配列、即ち、
（ｉ）第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、
（ｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列から成る群から選択されるヒトＤＮＡ配列の少なくとも一以上を更に含み、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項２】
転写因子をコードするヒトＤＮＡは、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ／ＳＸＲ）、構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）及びその組合せから成る群から選択される、請求項１に記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項３】
転写因子をコードするヒトＤＮＡはプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）及び構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）の両方を含む、先の請求項のいずれかに記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項４】
第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡはシトクロムＰ４５０から成る群から選択される、先の請求項のいずれかに記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項５】
Ｐ４５０は、次のアイソフォーム、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ８及びＣＹＰ２Ｂ６のいずれか一以上を含む、請求項４に記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項６】
第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡはＣＹＰ３Ａ及び／又はＣＹＰ２Ｃ遺伝子クラスターを含む、請求項４又は５に記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項７】
第２相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡは、グルクロニルトランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、スルホニルトランスフェラーゼ及びアセチルトランスフェラーゼから成る群から選択されるトランスフェラーゼのいずれか一以上を含む、先の請求項のいずれかに記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項８】
第２相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡはＵＧＴ１Ａ遺伝子クラスターを含む、請求項７に記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項９】
薬物輸送タンパク質をコードするヒトＤＮＡは、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、多剤耐性タンパク質、多剤耐性関連タンパク質及び有機アニオン輸送ポリペプチドから成る群から選択される、先の請求項のいずれかに記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１０】
薬物輸送タンパク質をコードするヒトＤＮＡはＭＤＲ１又はＭＲＰ２をコードする、請求項９に記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１１】
ヒトＤＮＡ配列はヒト調節ＤＮＡ配列と作用的に連結しているコード配列を含む、先の請求項のいずれかに記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１２】
マウスに由来する、先の請求項のいずれかに記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１３】
（ｉ）転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）第１相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｖ）薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列とを含み、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１２の特徴のいずれか一以上を更に含む、請求項１３に記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１５】
ＰＸＲ及びＣＡＲ転写因子をコードするヒトＤＮＡ配列と、第１相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、第２相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列とを含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１２の特徴のいずれか一以上を更に含む、請求項１５に記載の非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１７】
（ｉ）ＰＸＲ及び／又はＣＡＲ転写因子をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）ＣＹＰ３Ａ４酵素をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）ＭＤＲ１タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列とを含む、非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞。
【請求項１８】
少なくとも１個の機能性ヒト転写因子、少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素、少なくとも１個の第２相薬物代謝酵素及び／又は少なくとも１個の薬物輸送タンパク質を、前記タンパク質を発現する内在性等価遺伝子が不活性化された非ヒト動物細胞に導入する方法であって、非ヒト動物細胞の内在性等価遺伝子が不活性であるのに対し前記ヒト発現産物が機能性を保持するように前記ヒト転写因子と、第１相及び第２相薬物代謝酵素と、薬物輸送タンパク質とをコードするＤＮＡを導入することを含む方法。
【請求項１９】
導入されるヒトＤＮＡ配列のタンパク質産物と類似するタンパク質産物を発現する非ヒト遺伝子の欠失を、この遺伝子のヒトカウンターパートで直接ターゲティングするか、又はこの遺伝子又は遺伝子クラスターを認識部位に隣接させた後、リコンビナーゼ介在欠失によって行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
非ヒトトランスジェニック細胞／動物は、ＰＸＲ若しくはＣＡＲ単独又はこの両方の組合せがヒト化される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト遺伝子は構築物内に少なくとも一部保存されている、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＸＲ構築物はエクソン４と６との間にイントロン−エクソン構造を保持する、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＡＲ構築物はエクソン２と９との間にイントロン−エクソン構造を保持する、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
トランスジェニック非ヒト細胞／動物又は組織又はそれに由来する細胞は、Ｐ４５０レダクターゼヌル細胞／動物をＰＸＲ及び／又はＣＡＲをヒト化した細胞／動物と交雑させることによって作出し、非ヒト細胞／動物のいずれかのトランスジェニック系における第２相薬物代謝酵素及び薬物輸送タンパク質に対する更なる改変を含む、請求項１８〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
トランスジェニック非ヒト細胞／動物を新たに作出する、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ＤＮＡ配列の欠失を、そのヒトカウンターパートで直接ターゲティングするか、又はこの遺伝子又は遺伝子クラスターを認識部位に隣接させた後、リコンビナーゼ介在欠失によって行う、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
発現産物が転写産物又は翻訳産物のアッセイによって測定できるようにレポーター遺伝子ＤＮＡ配列を更に含む、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
転写因子プロモーターの制御下で少なくとも１個の転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、
（ｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列
をコードするヒトＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを更に含む、非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項２９】
薬物輸送体プロモーターの制御下で少なくとも１個の薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）転写因子をコードするＤＮＡ配列、
（ｉｉ）第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列
をコードするヒトＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを更に含む、非ヒト動物、組織又は細胞。
【請求項３０】
実質的に図２、図３、図１２、図１３及び／又は図１４に示すようなターゲティングベクターを含む核酸構築物。
【請求項３１】
少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素及び／又は少なくとも１個の第２相薬物代謝酵素及び／又は少なくとも１個の薬物輸送タンパク質のヒト化及びノックアウトを同一の構築物又は更に独立した構築物において更に含む、請求項２８又は請求項２９に記載の核酸構築物。
【請求項３２】
請求項３０又は３１に記載の核酸構築物をトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項３３】
該細胞又は非ヒト動物を更なる遺伝子組換え、即ち、遺伝子又はタンパク質をコードする核酸配列を更に導入する遺伝子組換えに付す、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
前記遺伝子組換えは、細胞や細胞株の一過性の又は安定なトランスフェクション、細胞や細胞株のエピソーム発現系、又は、前核マイクロインジェクション、胚性幹（ＥＳ）細胞における組換えイベント又はその核を核移植クローニング法でドナー核として用いる細胞のトランスフェクションによるトランスジェニック非ヒト動物の作出である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
その細胞が請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の核酸構築物によってコードされるタンパク質を発現する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３６】
少なくとも１個の機能性ヒト転写因子、及び／又は少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素、及び／又は少なくとも１個の第２相薬物代謝酵素及び／又は少なくとも１個の薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡを含み且つ発現するように改変され、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒトトランスジェニック細胞、又はトランスジェニック動物、該動物由来の組織及び／又は細胞の使用であって、前記トランスジェニック動物、該動物由来の組織及び／又は細胞における生体異物の代謝や毒性、又は内因性化合物の代謝及び／又は生合成を調べるための使用。
【請求項３７】
少なくとも１個の機能性ヒト転写因子、及び／又は少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素、及び／又は少なくとも１個の第２相薬物代謝酵素及び／又は少なくとも１個の薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡを含み且つ発現するように改変され、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒトトランスジェニック細胞、又はトランスジェニック動物、該動物由来の組織及び／又は細胞の使用であって、生体異物の代謝や体内動態、毒性についてのヒトメカニズムの機能や調節を、単一動物の消化管や血液脳関門、肝臓、腎臓、該動物由来の組織や細胞において調べるための使用。
【請求項３８】
少なくとも１個の機能性ヒト転写因子、及び／又は少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素、及び／又は少なくとも１個の第２相薬物代謝酵素及び／又は少なくとも１個の薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡを含み且つ発現させるように改変され、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒトトランスジェニック細胞、又はトランスジェニック動物、該動物由来の組織及び／又は細胞の使用であって、非ヒト移植腫瘍細胞株及び／又は宿主動物でヒト化代謝経路を発現することにより、動物異種移植実験において薬物の抗腫瘍作用に対するヒト代謝、体内動態又は毒性の影響を調べるための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞、及びその作出方法に関する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物、或いは該動物由来の組織又は細胞により、相同内在性（homologous endogenous）非ヒト動物タンパク質に代わって薬物代謝に関与すると共に、該動物に導入されたヒト遺伝子の発現の調節をヒト生体内で見られるものにより近づけるように発現制御することに関与するヒトタンパク質を発現することが可能な系が得られる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物、或いは該動物由来の組織又は細胞は特に、導入されたヒトタンパク質の生体異物代謝や薬物代謝、毒性、その他の特性や機能（例えば内因性化合物の代謝及び／又は生合成）の評価に用いられるが、これらに限定されない。
【背景技術】
【０００２】
治療薬候補はそのかなりの割合が、治験時に見出された有害な代謝や毒性のために市場向けの薬物とはなり得ない。このような状況は、多額の開発費が無駄になっていることを示しており、よって、候補薬のヒトにおける代謝特性や毒物学的特性を前臨床開発段階で、より確実に、迅速に且つ経済的に予測できる新しい技術が必要である。現在、候補薬の前臨床代謝試験や毒性試験の多くは、実験動物やヒト及び／又は哺乳動物の培養細胞株及び／又は組織を利用している。しかし、これらの方法はいずれも、被験者における代謝や毒性を予測する上で完全に信頼できるものではない。動物から得た代謝データや毒物学的データは、生化学的機序に関する種差のため、被験者から得たものとは大きく異なる。また、インビトロでのヒト細胞培養物や単離ヒト組織の研究から得たデータの解釈は、このような系が全ての器官や組織について利用できるとは限らず、また、インビボで有するのと同じ代謝特性を保持できないため問題となり得る。
先行技術においては、多くの薬剤の代謝、分布及び毒性は、互いに明瞭に区別される次の４種類の主要タンパク質クラスと該薬剤との相互作用に依存することが知られている。
ａ）第１相薬物代謝酵素（通常、生体異物分子上に極性基を付加したり或いは露出させるシトクロムＰ４５０等）；
ｂ）第２相薬物代謝酵素（例えば、トランスフェラーゼ、特に、極性化した生体異物分子に親水基を抱合させ、それに続く排泄を促進する、グルクロニルトランスフェラーゼやグルタチオントランスフェラーゼ、スルホニルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ）；
ｃ）薬物輸送タンパク質（例えば、薬物や他の生体異物分子の形質膜経由の輸送を促進する、多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ）や多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）等のＡＴＰ結合カセットタンパク質や有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ））；
ｄ）転写因子（例えば、先のクラスのタンパク質（特に、シトクロムＰ４５０）をコードする遺伝子の転写を調節する、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）や構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ））。
これらのタンパク質クラスの各々においては、各クラス内のタンパク質の多様性やタンパク質自身の機能についての、また、その発現の遺伝的調節についての種間での差異が知られている。
【０００３】
ＷＯ２００４／００７７０８からは、個々のＰ４５０遺伝子の欠失、或いはシトクロムＰ４５０全ての機能を左右する酵素をコードするシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子の欠失によって内在性シトクロムＰ４５０の機能が無効になった機能性ヒトＰ４５０を発現する非ヒトトランスジェニック動物を作出する方法が知られる。しかし、ここに記載された動物モデルは、導入Ｐ４５０が非ヒト動物の特定の器官や組織に限定されるだけでなく、ヒトにおいて見られるのと同様にはヒトＰ４５０の発現が調節されないという点で制約を受ける。また、先行技術モデルの或るものでは、内在性非ヒトＰ４５０を再活性化せずに導入ヒトＰ４５０にシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を付与するためには更なる改変が必要であるという点でも制約を受ける。更に不都合な点は、ヒト第２相代謝が再現性を欠くため、この系によって全代謝プロファイルを得ることができないことである。
また、先行技術によると、マウスＰＸＲ遺伝子及び／又はマウスＣＡＲ遺伝子がそれぞれ欠失したマウスにおいて、ヒトＰＸＲ（シエ（Xie）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．４０６、４３５〜９、２０００）又はヒトＣＡＲ（ジャン（Zhang）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２９８、４２２〜４、２００２）を発現させることによりマウスにおけるシトクロムＰ４５０の誘導特性をヒト化することも知られている。このような動物は、ヒトにおいて見られる内在性Ｐ４５０誘導パターンを再現する内在性Ｐ４５０誘導パターンを示す一方、シトクロムＰ４５０の発現がヒトと同様に調節されるとはいえ依然として非ヒトシトクロムＰ４５０であるため、望ましくない特性を有する。更に不都合な点は、異種組織特異的プロモーター（アルブミンプロモーター）により駆動される導入遺伝子によって、ＰＸＲ遺伝子又はＣＡＲ遺伝子自身がヒトの場合と同様には調節されないため、異種遺伝子の過剰発現が生じ、その結果、通常の代謝経路が迂回されるおそれがあることである。また、ＰＸＲ及びＣＡＲ導入遺伝子は、ゲノムクローンではなくｃＤＮＡに由来しているため、トランスジェニック非ヒト動物には、ＰＸＲ発現又はＣＡＲ発現の転写調節及び転写後調節全てを正確に再現するのに必要な配列が欠如しており、従って、その発現は肝臓に限定され、生理学的レベルにはなり得ない。更に、これらのモデルは、ヒト遺伝子のスプライスバリアントをコードしない。ＰＸＲ／ＣＡＲモデルの他の欠点は、各遺伝子のヒト化が２種の独立したゲノム変化、即ち、（ｉ）内在性遺伝子のノックアウト及び（ｉｉ）異なるゲノム位置におけるアルブミンプロモーター制御下でのヒトオルソログとの遺伝子組換え、によってなされるため、ＰＸＲ／ＣＡＲモデルが一動物内において他の遺伝子の改変と組合せるのに適していないことである。
従って、導入されたヒト遺伝子の発現を制御することが可能なヒト代謝動物モデルを改良し、その発現がヒトにおいて見られるものと一層同様に調節されるようにする必要がある。また、ヒトの代謝経路をより多くの様相（more aspects）で再現できるようにすることも必要である。有効なヒト代謝動物モデルでは、関連するヒトタンパク質の発現だけでなく、相同内在性タンパク質の機能の無効化（annulment）も必要である。
【０００４】
本発明が先行技術を超える驚くべき先進性を具現化している一理由としては、先行技術の研究者の多くが、薬物代謝モデルが必要とされることに伴う問題は既に解決済みであると考えているように思われる点が挙げられる。例えば、シエ（Xie）及びエヴァンズ（Evans）（２００２、ＤＤＴ７、ｐ５０９）は、ＰＸＲをヒト化することは「単一の転写調節因子を置換することによって種特異的な遺伝子調節の転換が可能となる稀な一例である」と述べている。また、研究者らがトランスジェニック動物系を利用する技術とは著しく異なる技術に注目を向けているのは明らかである。例えば、ヒト肝細胞を用い、臓器としてのマウス肝臓をヒト化する試みが行われているが、この目的は、ヒトにおける薬物代謝のマウスモデルを得ることである。しかしながらこの作業は労働集約的であり、本発明者らの考えでは、実際の状況に即したものであるかどうかは疑わしい。
【特許文献１】ＷＯ２００４／００７７０８
【非特許文献１】ヒトＰＸＲ(シエ(Xie)ら、Nature Vol. 406、435〜9、2000)
【非特許文献２】ヒトＣＡＲ(ジャン(Zhang)ら、Science Vol．298、422〜4、2002)
【非特許文献３】シエ(Xie)及びエヴァンズ(Evans)(2002、DDT7、p509)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、先行技術の系が悩んでいる問題の全てを考慮し、このような問題を実際的に解決しようとする最初の方法である。本発明者らは、先行技術に記載された動物モデルの望ましくない特徴を克服するヒト化薬物代謝経路を有するトランスジェニック非ヒト動物モデルを得るためには、幾つかの基準、即ち、
ａ）ヒトにおける発現パターンが再現されるように、導入されたヒトタンパク質の発現を調節すること、
ｂ）ヒト代謝の複数の様相（aspects）が再現されるように複数のヒトタンパク質を発現させること、及び
ｃ）導入されたヒトタンパク質の機能に対する非ヒト代謝経路からの干渉が大幅に低減するように複数の内在性遺伝子の発現又は機能を無効化することが理想的に満たされる必要があること、を認識した。
本発明において、本発明者らは、このような望ましい特性の全てではないにせよ少なくともそのいくらかを有する非ヒト動物細胞及び非ヒトトランスジェニック動物を作出する方法を提供する。このような非ヒト動物細胞及び非ヒトトランスジェニック動物は、単に個々の経路要素ではなくヒトの生体異物代謝経路全体をモデル化できると共に、このようなモデルが全ての組織及び器官に提供される点において、先行技術では得られなかった望ましい特性を有する。これは、広範囲の調節ＤＮＡ配列を用いてヒト細胞において見られるのと同様に導入遺伝子の発現を調節することや、欠失又は遺伝子交換によって内在性代謝経路を無効化することに関し、先行技術において従来得られなかった技術的アプローチの応用によってなされたものである。多数の関連するヒトタンパク質が単一の動物において発現される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の様相においては、転写因子プロモーターの制御下で少なくとも１個の転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子（endogenous equivalent genes）が無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、次のヒトＤＮＡ配列、即ち、
（ｉ）第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、
（ｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列、から成る群から選択されるヒトＤＮＡ配列の少なくとも一以上を更に含み、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲においては、特に明記しない限り、「含む（comprise）」或いはその変形である「含む（comprises）」や「含んでいる（comprising）」は、述べられたとおりのインテジャ（自体完全であるもの）やインテジャの群（stated integer or group of integers）を包含するが、他のインテジャやインテジャの群を除外しないことを暗示すると理解されたい。
本明細書に記載の非ヒト動物の「内在性等価遺伝子」とは、一又は複数の遺伝子であって、その発現産物がヒトカウンターパート遺伝子と同様、類似或いは同一の機能を保持する遺伝子をいう。例えば、ＰＸＲ（ＮＲ１Ｉ２核内受容体サブファミリー１、グループＩ、メンバー２）として知られているヒト転写因子遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ：８８５６）は、名称が同じでそのＥｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤが１８１７１であるマウスカウンターパートを有する。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は、その由来源の生物内において等価な機能を有する。
【０００８】
一般に、導入された転写因子遺伝子、第１相薬物代謝酵素遺伝子、第２相薬物代謝酵素遺伝子及び／又は薬物輸送タンパク質遺伝子は、それと等価の内在性遺伝子とある程度の相同性を有する。好ましくは、その相同度（the degree of homology）は３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超又は９５％超である。
薬物代謝酵素遺伝子の場合、遺伝子間の等価性（equivalence）は、基質特異性、調節様式（例えば、転写因子や外因性薬物による）、配列相同性及び組織分布の組合せによって評価することができる。正確に等価な遺伝子もあり、そのような遺伝子の例としては、ＣＹＰ２Ｅ１やＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２が挙げられる。ＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｄは、ヒトには１個の遺伝子しか存在しないが、マウスには多数の等価な遺伝子が存在する例である。ヒトには４種類のＣＹＰ２Ｃ遺伝子が存在し、マウスには多数の等価な遺伝子が存在する。このような状況で、等価なマウス遺伝子の少なくとも１個、好ましくは２個、３個、４個、５個以上、或いはその全てを無効化する。ＣＹＰ３Ａ４はマウスにおいて明らかなオルソログが存在しない例であるが、ＣＹＰ３Ａ１１は、その肝発現、調節様式及び配列相同性から、少なくとも１個の等価なマウス遺伝子と考えることができる。
【０００９】
本明細書に記載の「無効化」とは、非ヒト動物の内在性等価遺伝子が遺伝子産物を発現できないように、少なくとも薬物代謝プロセスに重要なレベルまで発現しないようにサイレント化、欠失又は不活性化することを包含するものとする。例えば、無効化遺伝子の発現レベルは、野生型発現レベルの２０％未満でもよいが、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満、更に好ましくは１％以下である。無効化遺伝子の発現は、それが検出できない程度まで低下させるのが好ましい。
部分ゲノム配列
これまでに開示された先行技術において、研究者らは、非ヒト系（特にマウス）にヒト遺伝子を組み込んだトランスジェニックモデルを作出している。
しかし、このような系を考案するに当り、ヒト遺伝子のコンテクストを保持することに対しては、それが自然の状態で存在するため、殆ど注意が払われていなかった。
【００１０】
一般に、先行技術においては、ヒト遺伝子のイントロン／エクソン構造を考慮したり、イントロン配列及びエクソン配列の両方を含むヒト遺伝子全体を組み込んだりするのではなく、ｃＤＮＡ配列が用いられている。これは、自然に産生し得るスプライスバリアントが生成できないことを意味する。スプライスバリアントは幾つかの理由により重要である。第１には、ある機能を有し得ること。第２には、例えば、その通常のタンパク質パートナーに結合し、該タンパク質の生物学的作用を変えることによってドミナントネガティブ作用を有する。第３には、リガンドを隔離し得る。従って、インビボでの状態を正確に反映する系は、生体系において存在するスプライスバリアントのバランスを反映するのが好ましい。
また、ｃＤＮＡを用いることは、ｍＲＮＡレベルが人工的に生成され、自然の生理学的状態の現実が反映されない場合があることも意味する。
【００１１】
これに対し、本発明では、可能な場合には遺伝子全長を提供することによってインビボでの状態を反映することを試みる。これは、スプライシング現象が自然の状態と全く同様に起こり得るように、イントロン−エクソン接合を自然系同様に保持することを意味する。遺伝子の長さによって、その遺伝子全体をトランスジェニック系に組み込むことが容易でない場合には、本発明は、スプライシング現象の大部分が生じる重要なイントロン−エクソン境界が保持されるようにｃＤＮＡとゲノムＤＮＡとの組合せをその構築物として用いようとするものである。
【００１２】
従って、本発明においては、ある特定のイントロン内でのスプライシング変異によってスプライスバリアントの大部分が生じることが分かれば、このイントロンを構築物内にゲノムＤＮＡとして組み込むことが好ましい一方で、影響力の小さいイントロン配列は保持しない。この結果、機能性ｍＲＮＡ及び機能性タンパク質のレベルが、特定の薬物又は薬物カクテルへの曝露に反応してインビボで見出されるレベルを反映する。これが、生理学的関連モデルにとって理想的に必要なものである。
従って、ｃＤＮＡ配列を用いてもよいが、この配列よりも好ましいものとして、本発明ではヒト化される遺伝子由来のｃＤＮＡとゲノム配列との組合せを用いることができる。例えば、ヒトＰＸＲ遺伝子を発現するトランスジェニック動物の場合、ヒトＰＸＲ遺伝子のサイズが３５ｋｂ超と大きいため、エクソン４とエクソン６との間のイントロン−エクソン構造を保持するのが好ましいが、これは、このゲノム領域がリガンド結合ドメイン内に位置するために、このゲノム領域で多くのスプライスバリアントが見られるからである。これによって、多くのスプライスバリアントが見られ、都合よくリガンド結合ドメイン内に位置する配列が有利に保持される。
【００１３】
他の例としてはＣＹＰ３Ａ４に好ましく用いられるヒト化カセットの場合が挙げられるが、これは、１３ｋｂのヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターと、通常のゲノム構成同様にエクソン１及びイントロン１と、エクソン２〜１３から成るヒトｃＤＮＡとを含むことができる。
他の例としてはＣＹＰ２Ｃ９に好ましく用いられるヒト化カセットの場合が挙げられるが、これは、１２ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｃ９プロモーターと、エクソン１〜４から成るヒトｃＤＮＡと、イントロン４と、エクソン５〜９から成るｃＤＮＡとを含むことができる。
【００１４】
全ゲノム配列
全ゲノムＤＮＡ配列を用いることもできる。例えば、ヒトＣＡＲ遺伝子を発現するトランスジェニック動物の場合、ヒトＣＡＲのサイズは比較的小さい（エクソン２〜９由来の約７ｋｂ）ため、ターゲティングベクター内で全ゲノム構造を保持することが容易となる。構築物は、エクソン２とエクソン９との間のイントロン−エクソン構造を保持するのが好ましい。これによって、ターゲティングベクター内で全ゲノム構造が有利に保持され、ヒトＣＡＲの全てのスプライスバリアントをカバーすることができる。ゲノムヒトＣＡＲ配列はマウスＣＡＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合するのが好ましい。その際、ヒトＣＡＲ配列はエクソン１〜９の全てのゲノム配列を含む。５’及び３’ＵＴＲはヒトであってもよく、マウスゲノムから保持されていてもよい。マウスＣＡＲ遺伝子のコード配列の他の全ての部分を欠失させることができる。
【００１５】
転写因子
転写因子をコードするヒトＤＮＡは、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ、ステロイド生体異物受容体（ＳＸＲ）としても知られている）、構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）、それらの複数での存在（multiples thereof）及びそれらの組合せから成る群から選択されるのが好ましい。本発明のこの様相における動物及び細胞は、上で詳述した理由によって有利である。例えば、最近のエビデンスによって、マウス及びヒトＣＡＲタンパク質のリガンド結合ドメインは他の核内ホルモン受容体に比べて分岐しており、これによって生体異物反応における種特異的差異がもたらされるという主張が更に支持されている（フアン（Huang）ら、２００４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １８（１０）：２４０２〜２４０８）。この論文で報告された結果から、げっ歯類及びヒトにおけるオルソロガスな受容体経由の相対する生体異物反応が単一の化合物によって誘導され得ることが分かる。
【００１６】
ヒトＰＸＲのトランスジェニックマウスを作出したが、その説明は本明細書中、実施例にて行う。ヒトＰＸＲは、予想されたように、内在性マウス遺伝子と等価なレベルでマウスの肝臓及び消化管の両方で発現することが分かる。こうして、この種の従来技術が直面する典型的な問題（過剰発現や低発現等）が回避される。また、現在入手可能なヒト化ＰＸＲモデルでは、アルブミンプロモーターを用いて、ＰＸＲヌルバックグラウンドにクロスしたヒトＰＸＲを作動させている。従って、ＰＸＲはこのようなモデルでは非常に高いレベルで発現するが、肝臓以外のいずれの組織にもＰＸＲは存在しない。このことは、消化管や血液脳関門、或いは実際に他の組織で遺伝子発現を制御するｈＰＸＲの役割を把握するためにこのようなモデルを使用する上で大幅に妥協することになる。
【００１７】
このようなモデルにおいては、この経路による遺伝子発現を誘導することが知られている化合物（リファンピシンやＴＣＰＯＢＯＰ等）にマウスが反応するため、ＰＸＲタンパク質が機能的であることも示されている。野生型とヒト化マウスとの系統差が示された。例えば、ヒト化マウスは、ｈＰＸＲに対する活性が高いことが知られている化合物（リファンピシン等）に対して高い反応性を示す。このように、ヒト化ＰＸＲマウスにおいては、野生型に比べてリファンピシンに対する感受性が変化したことが分かる。
また、野生型マウスとヒト化ＰＸＲマウスとの間には、テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化及び７−ベンジルオキシキノリンの脱メチル化から得られたバックグラウンドＰ４５０酵素活性について、一方が他方より明らかに高い活性が見られた。
【００１８】
誘導剤ＴＣＰＯＢＯＰを用いた実験においては、テストステロンの肝ミクロソーム代謝を測定した。ここでも野生型とヒト化ＰＸＲマウスとの間には明らかな差が見られた。特に、テストステロンの７−α−ヒドロキシル化は、野生型と比べてｈｕＰＸＲマウスでは構成的に高かった。
【００１９】
野生型とヒトＰＸＲとの系統差に呼応して、ＴＣＰＯＢＯＰによる誘導に対するマウス系の感受性には顕著な差があった。テストステロンの１６−α−ヒドロキシル化の場合、この活性は野生型マウスでは大幅に誘導されたが、ヒト化ＰＸＲマウスでは誘導されなかった。特に興味深いのは、テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化の誘導が、ｈｕＰＸＲマウスよりも野生型においてかなり顕著に見られたことである。実際に１ｍｇ／ｋｇの用量で、テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化の誘導が野生型では約６倍であったが、ｈｕＰＸＲマウスでは１．７倍にすぎなかった。これからも、対照に比べてヒト化マウスの感受性が低下したことが分かる。
【００２０】
本発明のこの様相におけるトランスジェニック動物（マウス等）及び細胞は、上述の機能特性を示すのが好ましい。例えば、この細胞及び動物は、リファンピシンに応じたＣｙｐ２ｂ１０活性の誘導を示さないのが好ましい。しかし、この細胞及び動物は、リファンピシンだけでなくＴＣＰＯＢＯＰにも応じてＣＹＰ３Ａ１１に対する誘導作用を示す。
当然のことながら、転写因子をコードする他のヒトＤＮＡも、第１相薬物代謝酵素、第２相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送タンパク質を調節できるのであれば本発明で用いることができる。その例としては、ＰＰＡＲ（α、δ及びγ）やＮＲＦ２、Ａｈ受容体、ＨＮＦｌ、ＨＮＦ４が挙げられる。
【００２１】
転写因子をコードするヒトＤＮＡは、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）及び構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）の両方を含むのが好ましい。本発明のこの実施形態においては、トランスジェニック動物、該動物由来の組織又は細胞は、これらの転写因子遺伝子について「二重ヒト化（double-humanised）である」と考えることができる。多くの薬物代謝酵素や薬物輸送体はＣＡＲ及びＰＸＲ両方の結合に反応する要素を有しているため、このような二重ヒト化モデルは、単一遺伝子（ＰＸＲ又はＣＡＲの一方）のみを組み込んでいるモデルよりも有利である。また、ＰＸＲ反応性要素の数はＣＡＲ反応性要素の数と異なることが多いため、両方の転写因子による調節が一般に重要である。従って、両方の因子の作用を考慮したモデルは好ましく、インビボでの生理学的状態をより詳細に反映する。
【００２２】
ヒトＰＸＲ及びヒトＣＡＲ両方のトランスジェニックマウスを作出したが、その説明は本明細書の実施例にて行う。これらの転写因子の組合せの活性について予備研究を行ったが、この活性はバルビツール酸塩誘導睡眠時間を測定することによって求めた。長年、睡眠時間は肝シトクロムＰ４５０活性に正比例することが知られており、この活性は、ＣＡＲ及びＰＸＲの機能によって決まる肝臓内のＰ４５０レベルに少なくとも一部起因し得る。麻酔量のペントバルビトン（pentobarbitone）を投与した野生型マウスの睡眠時間は２１分間であったが、ＣＡＲ及びＰＸＲの二重ヒト化マウスの睡眠時間は３４分間であった。従って、二重ヒト化マウスは野生型対照に対して有意差を示したが、この結果から、二重ヒト化マウスは野生型マウスに比べて薬物に対する反応が顕著に異なることが分かる。
【００２３】
本発明のこの様相におけるトランスジェニック動物（マウス等）及び細胞は、上述の機能特性を示すのが好ましい。例えば、ヒトＰＸＲのトランスジェニック動物及び細胞は、リファンピシンに応じたＣｙｐ２ｂ１０活性の誘導を示さないのが好ましいが、リファンピシンだけでなくＴＣＰＯＢＯＰにも応じてＣＹＰ３Ａ１１に対する誘導作用を示す。
【００２４】
また、本発明者らは、プロモーターが酵素発現を誘導する能力は各組織によってそれぞれ異なることも見出した。従って、ヒト以外の動物由来の内在性転写因子ではなく、ヒト転写因子を用いることが非常に重要である。また、転写因子の調節配列及びそれが調節する遺伝子は、できるだけ詳細に自然の生理学的状態を反映する必要がある。これを確実に生じさせるためには、できるだけ多くのヒト転写因子、ヒト薬物代謝酵素及びヒト薬物輸送体を用いることが重要である。
また、特定の薬物によって生じるタンパク質レベルの割合（ratio of protein levels）も非常に重要である。例えば、マウスＰＸＲの作用によって、ヒトＰＸＲの作用に比べて様々なタンパク質の発現が様々なレベルで刺激される。特定の薬物やその代謝物のレベルは、どのような薬物代謝酵素や輸送体が発現しているかに大きく依存するが、このことからも、ヒト以外の動物由来の内在性転写因子ではなく、ヒト転写因子を用いることが非常に重要である。
【００２５】
毒物学的観点からもヒト転写因子を用いることが重要である。例えば、ＰＸＲは胆汁酸や他の生理学的化合物によって自然に調節され、胆管壊死や胆汁うっ帯等の中毒症状は特定の薬物への曝露によって生じ得る。従って、ヒトと試験動物との薬物代謝の差によって、ヒトの場合には明らかでなかった毒性作用が試験動物では顕著に見られることがあり得る。
転写因子の発現を左右する調節配列は、ヒト由来であるか、或いは標的動物種（例えば、マウス）由来であることが好ましい。
【００２６】
第１相薬物代謝酵素
第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡは、シトクロムＰ４５０（例えば、ＣＹＰ３Ａ４やＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｂ６が挙げられるが、これらに限定されない）から成る群から選択されるのが好ましい。当然のことながら、第１相薬物代謝酵素をコードする他のＤＮＡも、生体異物分子上に極性基を付加又は露出させることによって生体異物を改変することができるのであれば本発明に含めることができる。
【００２７】
Ｐ４５０ヒト化非ヒト動物に導入するヒトＰ４５０アイソフォームの選択は主に、関連組織での代謝における各種Ｐ４５０アイソフォームについて知られている相対的な重要度によって行う。例えば、これまでにヒト肝臓内で認識された最重要Ｐ４５０アイソフォームはＣＹＰ３Ａ４であるため、恐らく、ＣＹＰ３Ａ４が肝臓のＰ４５０ヒト化に際し第１に選択されるヒトＰ４５０アイソフォームとなる。本発明の多重Ｐ４５０ヒト化マウス用のヒトＰ４５０の選択は、ユーザーの必要性によって決まる。この点で、次のヒトアイソフォーム、即ち、３Ａ４、２Ｄ６、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｃ１９、１Ａ２及び２Ｃ８のいずれか一以上が好ましいことが予想される。しかし、当然のことながら、動物細胞に組み込まれるアイソフォームはユーザーの要求によって決まる。このように、ヒト化トランスジェニック動物を「デザイン」して代謝プロセスにおける特定のアイソフォームの役割を調べることができる。
【００２８】
本発明の教示によれば、単一遺伝子、遺伝子クラスター、又は単一遺伝子や遺伝子クラスターの組合せを交換することができる。可能であれば、個々の遺伝子を単に交換するのではなく、遺伝子クラスター全体を交換するのが好ましい。これによって、いずれの遺伝子クラスターにおいても遺伝子の発現レベルの割合（ratios）がこの遺伝子のインビボでの発現割合と同じであるという状態が生み出される。これは、先行技術では注目されなかった現象である。本発明においては、置換用の第１相薬物代謝酵素の好ましいクラスターはＣＹＰ３Ａクラスター及びＣＹＰ２Ｃクラスターである。本発明においては、これらの遺伝子クラスターのいずれか一方又はその両方を置換することができる。
【００２９】
従って、本発明においては、特定の経路に関与する遺伝子のカスケードの一部（好ましくは全体）を置換するのが好ましい。これによって遺伝子機能の部分的冗長性が確実に保持されるため、実際の生理学的状態が反映される。一例としてＣＹＰ３Ａ  Ｐ４５０クラスター（群）を挙げることができる。ヒトの場合、このクラスターには４種類の機能性遺伝子が存在し、これらは基質特異性が重複している。例えば、ＣＹＰ３Ａ５タンパク質はＣＹＰ３Ａ４基質を代謝する。従って、薬物代謝モデルを作出しようとする場合、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子をその遺伝子クラスター全体の一部として以外の状態で組み込むと、作出したモデルは実際とはかけ離れたものになる。
【００３０】
これに対して、先行技術の教示によると、ある研究者がＣＹＰ３Ａ５遺伝子のトランスジェニック動物を作出するのが得策であると考えた場合、その研究者は該遺伝子を組み込むことしか知らず、該遺伝子が一部を成す遺伝子クラスター全体を組み込もうとは思わないであろう。また、先行技術を用いた場合、ゲノムにおいて該遺伝子をその自然構造位置（natural contextual position）ではなく任意の部位に挿入するであろう。更に悪いことに、該遺伝子の発現は、肝臓に対して特異的な強力なプロモーターの指示の下で生じるであろう。この戦略では多量のＣＹＰ３Ａ５タンパク質が肝臓で産生する可能性が非常に高く、こうして多量のタンパク質が得られるため、このタンパク質はインビボで作用するのに比べて高い割合で基質を代謝するであろう。これら全ての理由から、本発明の方法は上述の系に比べて有利である。
【００３１】
ヒト化に用いる第１相薬物代謝酵素のクラスターは、ＣＹＰ３Ａクラスター及びＣＹＰ２Ｃクラスターであるのが好ましい。
ヒトと一般に用いる標的トランスジェニック動物（例えば、マウス）との間のタンパク質機能の冗長性を考慮すると、第１相薬物代謝酵素のヒト化は、標的動物の第１相薬物代謝酵素のごく一部（例えば、１、２、３、４又は５個）がかなりのレベルで発現している（好ましくは、該酵素のいずれも発現していない）欠失バックグラウンドに対して行うのが好ましい。
【００３２】
第２相薬物代謝酵素
第２相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡは、グルクロニルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＧＴ１Ａ遺伝子や遺伝子クラスター）、グルタチオントランスフェラーゼ（例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ））、スルホニルトランスフェラーゼ及びアセチルトランスフェラーゼから成る群から選択するのが好ましい。当然のことながら、第２相薬物代謝酵素をコードする他のＤＮＡも、第１相代謝産物を抱合することができるのであれば本発明に含めることができる。
ヒト化に用いる第２相薬物代謝酵素のクラスターは、ＵＧＴ１Ａ遺伝子クラスターであるのが好ましい。
【００３３】
薬物輸送体
薬物輸送タンパク質をコードするヒトＤＮＡは、ＡＴＰ結合カセットタンパク質（多剤耐性タンパク質（例えば、ＭＤＲ−１）や多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）（例えば、ＭＲＰ１及び／又はＭＲＰ２）等が挙げられるがこれらに限定されない）から成る群から選択されるか、或いは有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）から選択されるのが好ましい。当然のことながら、薬物輸送タンパク質をコードする他のＤＮＡも、薬物や他の生体異物分子の形質膜経由の輸送を促進することができるのであれば本発明に含めることができる。
多剤耐性タンパク質はＭＤＲ１であるのが好ましい。
多剤耐性関連タンパク質はＭＲＰ２であるのが好ましい。
【００３４】
調節配列
本発明は、トランスジェニック非ヒト動物細胞、組織又は動物について特に転写因子をヒト化することにもあるが、転写因子導入遺伝子は転写因子プロモーターによって駆動される（即ち、該遺伝子は異種アルブミン／組織特異的プロモーターを利用するのではなく「ノックイン」される）。従って、本発明の動物はヒトタンパク質を適切な生理学的レベルで発現させることができるだけでなく、先行技術によって知られているものとは異なり肝臓だけでなく全ての組織で発現させることができる。
当然のことながら、ヒトＤＮＡ配列はいずれも、ヒト第１相代謝酵素、ヒト第２相代謝酵素、ヒト薬物輸送体及びヒト転写因子のクラスから成る群から選択されるタンパク質のコード配列を含んでおり、理想的にはヒト調節ＤＮＡ配列と作用的に連結(operatively linked)していてもよい。
【００３５】
上述の転写因子及び他のタンパク質のヒトＤＮＡ配列は全遺伝子であるか、或いはヒト又は動物由来の調節遺伝子を含むＤＮＡ構築物であるのが好ましい。調節遺伝子がヒトに由来しない場合、この調節遺伝子は標的動物（例えば、マウス）に由来していてもよい。調節遺伝子とは、対象遺伝子の転写に必要な、プロモーター配列やエンハンサー配列、５’ＵＴＲや３’ＵＴＲ、ポリＡ終結配列、又は他のＤＮＡ配列を含むことを意味する。ヒト配列の挿入に用いる転写物はポリＡモチーフによって終結するのが好ましい。
【００３６】
先行技術では異種プロモーターが一般に用いられているが、このように用いられているプロモーター（例えば、アルブミンプロモーター）は、通常強力なプロモーターであり、リガンド非依存的に作用し、構造的にスイッチオンされる。通常の発達においては、アルブミンは新生児期に発現されるのみである。このことから、遺伝子の転写及びそれに続くｍＲＮＡ産物の翻訳を指示する調節シグナルがトランスジェニック系で保持されないという点で、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が実際の自然状態から切り離される。先行技術における研究者らは、様々な理由からこのようなプロモーターを用いることになった。そうする必要があると感じた一理由は、内在性プロモーターによってもたらされる転写シグナルが十分に強力ではないと考えたことである。また、マウスにおいて有効であることが示されたプロモーターを用いる必要があると考えられた。
【００３７】
これに対して、本発明では、発生的に（developmentally）、時間的に且つ組織特異的に野生型ヒト発現の忠実度が保持されるように内在性プロモーターをヒト遺伝子と組合せるのが好ましい。
「内在性プロモーター」とは、対象遺伝子の発現を自然に指示するプロモーターを意味する。従って、内在性プロモーターは内在性ヒトプロモーターであってもよく、或いはトランスジェニック被験動物に導入された遺伝子に対して内在的なプロモーターであってもよい。例えば、トランスジェニックマウスの場合、ヒト遺伝子の発現は、該遺伝子の内在性マウスプロモーターによって指示されることがある。プロモーター活性に必要な５’上流配列の全て（好ましくはいずれのエンハンサーをも含む）を組み込むことによって、自然状態と同様に内在性プロモーターの全体が関連タンパク質の発現を生理学的に関連するように完全に指示することができるため、強力な構成的プロモーターを実際に用いる必要がないことを見出した。一例としてはＣＹＰ３Ａ４遺伝子が挙げられるが、これは、転写開始点の最大１３ｋｂ上流に強力なエンハンサー要素を有する。この配列全てを組み込むことによって適切な転写機序を生じさせることができるが、このような上流配列の脱落によってもたらされる系においては、遺伝子発現の忠実度を保持させることが可能な調節配列の存在が不完全又は不十分になる。
【００３８】
先行技術で専ら用いられているプロモーター（例えば、アルブミンプロモーター）を用いた場合、遺伝子の発現の作用は特定の組織（アルブミンプロモーターの場合には肝臓）でしかモニターすることができない。先行技術の研究者はこのような制限に落胆することはなかったが、それは、肝臓が薬物代謝を研究する上で唯一の重要な組織であると一般に考えられており、よって肝臓における発現しか望まれなかったからである。肝臓以外の組織での発現は人為的であると見なされたため、有効なモデルに対しても、多少なりとも有利であるとは見られず、何らかの妨げがあった。卵白（albumen）プロモーターの使用に基づく先行技術系の他の欠点は、その系を作動させる際にマウスＰＸＲヌルバックグラウンドが必要であることである。このことは、ＰＸＲが、薬物代謝に対して広範な作用を有する肝臓内の導入遺伝子以外の如何なる場所でも発現されないことを意味し、即ち、このようなマウスは、もはや天然マウスの自然な組織分布を反映しない。
【００３９】
本発明者らは、薬物代謝に重要な組織は肝臓だけではないと考えている。従って、先行技術研究者が利点として考えていること（即ち、肝臓特異的発現のみによって実際の生理学的状態の正確な評価が可能になるということ）については、本発明者らは、他の潜在的に重要な組織が無視されている点で明らかに不都合であると見なしている。本発明によって、薬物代謝プロセスの包括的で全体論的なスナップショットを得ることができる。
また、内在性プロモーターを用いることによって他の利点ももたらされる。特に、発生過程での発現（developmental expression）の忠実度が保持される。先行技術の系では肝臓発現のみを保障する肝臓特異的プロモーターを用いたが、天然内在性プロモーターを用いることによって、タンパク質をそれが自然発生する組織内で確実に発現させ、しかも成体動物だけでなく各発達段階においても発現させる。これによって、トランスジェニック動物を生育できる可能性が高くなるため、該動物が薬物のスクリーニングや下流交雑種（downstream crosses）の開発において有用であるという利点ももたらされる。また、転写因子や薬物代謝酵素の胎盤発現が保持されるため、該動物を用いて試験化合物を催奇形作用についてスクリーニングすることもできる。
【００４０】
また、本発明者らは、潜在的な「抑制」作用の存在によって、特定の薬物化合物が特定の薬物輸送体や代謝酵素のレベルを低下させて体内動態（disposition）の速度や経路を変えることも見出した。例えば、従来のヒト転写因子パートナーではなくマウスＰＸＲが抑制されてヒトＣＹＰ３Ａ４のレベルが低下した場合、別の体内動態経路が誇張（exaggerated）され得る。これにより、生物内で特定の薬物によって誘導される酵素レベルについて紛らわしい結果となるであろう。また、この特定の薬物への曝露によってヒト内で進行する代謝の速度や種類についても紛らわしい結果となるであろう。
【００４１】
また、本発明者らは、特定の薬物によって誘導される発現の持続期間が非常に重要であることも見出した。例えば、ヒトに用いる候補薬の一部はマウスにおいて効率的に代謝されないことがある。これは、このような薬物がかなりの期間、全身的に高濃度で残存していることを意味する。このことは、ＰＸＲ等の転写因子がこの期間活性状態であり、この期間常に活性化されることを意味する。その結果、これに伴うレベルの薬物代謝酵素や薬物輸送体、他のこのような酵素も、該薬物が動物内で残存している期間中ずっと高度に発現される。これは明らかに誤解を招く恐れがあり、該薬物の代謝がかなり効率的になり得るヒトにおける等価状態（equivalent situation）とは対照的である。
【００４２】
ヒトプロモーターによってヒト発現系の特異性を保持することができるため、マウスプロモーターではなくヒトプロモーターを用いることは、転写因子、第１相薬物代謝酵素、第２相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送体の発現を作動させる上で好ましい場合もある。再びマウスＣＹＰ３Ａ遺伝子を例にとると、この遺伝子が有するＰＸＲ及びＣＡＲ反応要素の数はヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子に存在する数とは異なる。等価なマウスプロモーターを用いる場合、マウスを薬物へ曝露することによるＰＸＲ転写活性化に対する反応は、ヒト系において明らかな反応とは異なる。多くの場合、真のマウスオルソログが存在しないことがヒトプロモーターを用いる利点であるというのも真実である。これにより、特定の薬物に反応して薬物代謝タンパク質が多少は産生され、該薬物の代謝における該タンパク質の役割が潜在的に肥大又は減少する。例えば、先行技術で知られている特定のマウス系においては、不適切なプロモーターによって作動される不適切に高いレベルのＣＹＰ３Ａ４発現のため、試験薬物があまりにも速く代謝され、潜在的に有益な作用が明らかにならない場合がある。これは当然ながら誤解を招く恐れがある。
【００４３】
対照的に、天然ヒトプロモーターを用いることは、この例によると、適当量のＣＹＰ３Ａ４が薬物の活性化に反応して産生され、尚且つ正しい組織で産生されることを意味する。その際、特定の薬物に対する自然生理学的反応は、肝臓だけでなく、例えば消化管でも産生されるＣＹＰ３Ａ４の量について模倣される（mimicked）。該薬物が実際にＣＹＰ３Ａ４の基質である場合には、ヒトにおける状態を反映する速度及び方法で代謝される。これに対し、アルブミンプロモーターを用いて不適切に多量のＣＹＰ３Ａ４の発現を指示する先行技術方法では、このタンパク質の役割が曲解され、誤解を招くような結果がもたらされる。例えば、薬物が実際にはＣＹＰ３Ａ４の弱い基質にすぎなくても、このタンパク質が多量に存在すればこの薬物は積極的に代謝される。
その結果、ヒトタンパク質は正しい場所で正しい時間産生される。これにより、先行技術の系ではどうしても得られなかったモデルへのリアリズムが付与される。
【００４４】
好ましい構築物
ある状況下においては、標的遺伝子と組み込まれたヒト遺伝子とがリーダー配列を共有することがある。これは、前記構築物において少なくとも１個のイントロンを保持することによってなされ得るが、通常良好な発現がもたらされる。また、この戦略によって、遺伝子産物が正しい細胞内位置に確実に導かれるようにもなる。ヒトリーダー配列がその機能をも果たすことができるかもしれないが、代わりにマウスリーダーを用いる方が安全であることが多い。例えば、ＭＲＰ２の場合、エクソン１によってコードされるマウスタンパク質の「リーダー配列」を保持することができる。そして、エクソン１由来の配列を持たないヒトｃＤＮＡをマウスゲノム配列のエクソン２に導入する。マウスイントロン１の元のスプライス部位が保持されるため、この構築物は、マウスエクソン１及びヒトエクソン２〜３２に由来するアミノ酸の融合タンパク質をコードする。この構築物によって高レベルの発現が確実になると共に、ＭＲＰ２がその正しい位置（即ち、形質膜）に確実に導かれる。
他の場合においては、組み込まれたヒト遺伝子を適切な標的動物遺伝子のプロモーターの制御下に置くことができる。例えば、ＭＤＲ１の場合、ヒトＭＤＲ１のｃＤＮＡを対応するマウス遺伝子（Ｍｄｒ１ａ又はＭｄｒ１ｂ）の翻訳開始部位に融合することができる。ＰＸＲを例にとると、ヒトＰＸＲｃＤＮＡとゲノム配列のハイブリッドをマウスＰＸＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合することができ、これによってマウスの開始ＡＴＧが保持される。ＣＡＲの場合には、ヒト配列をマウスＣＡＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合することができる。
【００４５】
トランスジェニック動物
上述及び後述の本発明の好ましい実施形態においては、トランスジェニック非ヒト動物及び該動物由来の組織又は細胞はマウスであるのが好ましいが、他の哺乳類、例えば、ラットやハムスター、モルモット等の他のげっ歯動物や、サルやブタ、ウサギ、イヌ、ネコ等の他種、或いはヒツジやヤギ、ウマ、ウシ等の有蹄類であってもよく、非哺乳動物種であってもよい。より好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物（哺乳動物）及び組織又は細胞はげっ歯動物（より好ましくはマウス）に由来する。
【００４６】
トランスジェニック動物の使用は倫理的性質の問題を呈するが、本明細書に記載した種類の研究から得られるヒトにとっての利益は、トランスジェニック動物の産生や試験に課せられるであろう如何なる苦労をも大きく上回ると考えられる。当業者には明らかなように、薬物療法の場合、ヒトにおいて治験を始める前に、現在の規制の下、現在入手可能なモデル系を用いて動物実験を行う必要があり、動物実験なしで済ますことはできない。いずれの新薬も少なくとも２種類の生きた哺乳動物に対して試験を行う必要があり、その内の１種類は大型の非げっ歯動物でなければならない。体内で非常に特異的に作用する現在開発中の新しいクラスの薬物の場合、今後においてより多くの動物を用い、また、より多くの霊長類を用いることになるであろうと専門家は考えている。例えば、「高齢者（greying population）」を悩ます神経疾患に科学が取り組もうとするに従って、次世代薬剤の安全性や有効性を試験するためのサルを安定供給する必要があると考えられる。即ち、本明細書に記載のようなトランスジェニックモデルから得られるヒトにとっての利益は、一般には決してマウスやげっ歯動物に限られるものではなく、霊長類を含む他の哺乳動物をも網羅する。このような新規な薬物が特異的に作用するということは、脳構造が我々と非常に類似している点から霊長類のみが実験に適した動物となり得ることを意味する。
【００４７】
本発明は、創薬における消耗（attrition）の程度を減少させることを目的としている。薬物が試験後期で失敗に終わる場合には、動物実験全てがある意味で無駄になる。よって、薬物の失敗を阻止することは実験動物の命を救うことになる。従って、本発明はトランスジェニック動物に関するものであるが、このような動物を用いれば、薬物試験プログラムで用いるのに必要な動物の数を減らすことになるであろう。
【００４８】
本発明の利点は、ヒトと従来試験モデルとして用いられている他の哺乳動物との種の相違に関する問題を回避することにある。一例としてペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）のファミリーが挙げると、これに対しては過去、各種薬物が低脂血症剤として開発された。それら薬物はマウスモデルにおいて後成的な発癌物質であることが確認されたため、その開発は中止された。結局、種間の毒性の差は、肝臓内のＰＰＡＲαレベルの差に起因し得ることが分かった。マウスでは明らかな現象が、ヒトにおいては肝臓に存在するＰＰＡＲαタンパク質のレベルが低いために生じない。人体に存在するタンパク質を反映する真のタンパク質発現レベルを示すモデルにとっては非常に明白な利点である。
ヒトＤＮＡ配列は各々、ヒト又は非ヒト動物調節ＤＮＡ配列（例えば、内在性ヒト又は非ヒトプロモーター）に対して非依存的に連結していることが好ましい。この連結が先行技術との明確な相違点であり、インビボでのヒトの状態の反映が更に向上するため、先行技術モデルに対する改良の利点が得られる。
特に、本発明のヒト化トランスジェニック動物、細胞及び組織の利点は、これらによって、単一の系において通常の実験動物モデルの利益とヒト細胞又は組織培養物の利益とが組合わせられることにある。この系或いはヒト化トランスジェニック動物によって、全ての前臨床における代謝、毒性及び薬物動態研究で利用可能な改善された選択肢が製薬業界にもたらされる。
【００４９】
細胞
本発明の他の様相は、本発明の上述のいずれか一様相における特性を有するように改変された細胞に関する。本発明に係る好ましい細胞型は肝細胞及び神経細胞である。該細胞は、哺乳動物細胞（例えば、非ヒト細胞やげっ歯類細胞）等の動物細胞であることができ、より好ましくはマウス細胞である。
本発明のこの様相における細胞は、本発明の知見を十分体得した当業者には明らかなように、本発明に係るトランスジェニック動物から標準的な技法を用いて産生することができる。好適な方法は多くの標準的な実験マニュアル、例えば、デイヴィス（Davis）ら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）やＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第３版（２０００）、アウスベル（Ausubel）ら、１９９１（上掲）、Ｓｐｅｃｔｏｒ、Ｇｏｌｄｍａｎ＆Ｌｅｉｎｗａｌｄ、１９９８）に記載されている。
【００５０】
一様相において、このような細胞は、本発明の上述のいずれか一様相において産生される非ヒト動物細胞（例えば、マウス細胞）であることができる。このような細胞を作出する好ましい一方法は、上述のようにヒト化マウスをＳＶ４０不死化マウス（例えば、不死マウス（タコニクス（Taconix）））と交雑させることである。次に、当該技術分野で周知の技法によってこのような動物から細胞を単離することができる。肝臓でのみ活性であるため肝細胞しか産生することができないアルブミンプロモーターを用いる先行技術のトランスジェニック系とは対照的に、本発明において作出されるトランスジェニック動物由来の細胞は、薬物動態解析にかなり重要な細胞（例えば、肝細胞や神経細胞）等の様々な細胞型から選択することができる。
上述の特性を有する、本発明に係るトランスジェニック動物から単離された幹細胞も本発明の有用な様相である。このような細胞は多能性であってもよく、部分的に分化していてもよい。幹細胞は成体幹細胞であってもよく、胚性幹細胞であってもよい。より一般には、用いる幹細胞は後胚発達段階（例えば、胎生期や新生期、幼若期、成体期）で得られることができる。このように単離された幹細胞を用いて特定の細胞型（例えば、肝細胞や神経細胞）を作出することができる。このような細胞も本発明の一様相を構成する。
【００５１】
置換遺伝子（replaced genes）の好ましい選択
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列とを含み、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
本発明者らは、薬物代謝モデルの場合には、特定の薬物代謝酵素についてトランスジェニックである動物を作出するだけでなく、薬物輸送体であるタンパク質（即ち、薬物輸送タンパク質）をこのようなモデルに組み込むことも重要であると考えている。例えば、ＰＸＲ（核内転写因子）を活性化する多くの化合物はＭＤＲ１の基質でもあるため、このタンパク質によって細胞の外へ輸送される。従って、インビボでの状態を忠実に反映するモデルを作出するためには、薬物輸送タンパク質のトランスジェニック動物であることが好ましい。さもなければ、特定濃度の薬物の細胞内作用について、その濃度が如何なる場合であっても紛らわしい結果が得られる。薬物輸送タンパク質の中ではＭＤＲ１が好ましい。先行技術のトランスジェニックマウスモデルの場合には、当然のことながら、ｍｄｒ１ａ及びｍｄｒ１ｂ両方の存在によって産生される薬物輸送体の冗長性によって紛らわしい結果がもたらされ得るため、これらのマウス遺伝子両方をノックアウトし、ヒトｍｄｒ１遺伝子で置換することが好ましい。
【００５２】
薬物輸送タンパク質（例えば、ＭＤＲ１）をコードする遺伝子の発現は、ＰＸＲベースの情報伝達系によっても活性化される。従って、第Ｉ相、第ＩＩ相及び薬物輸送体遺伝子の発現はＰＸＲとリンクしているため、これらの遺伝子の産物が薬物やその代謝物のレベルや代謝に対して異なる作用を及ぼすという事実に加え、本発明によって保持される協調的調節（co-ordinated regulation）の完全性は、特に先行技術の系に比べると著しく有利である。
また、ＭＤＲは消化管及び血液脳関門の環境にてかなりの程度発現される。消化管及び血液脳関門はいずれも血流への重要な薬物輸送源であるため、生理学的に関連するＭＤＲの発現レベルが存在すると、薬物モデルに対し薬理活性を示す上で薬物代謝プロセスの重要な様相が付与される。例えば、消化管にＭＤＲが存在すると、経口送達された薬物が体内で利用されなくなる場合がある。ＭＤＲは脳の内外で薬物輸送に対し非常に重要である。また、ＭＤＲは肝臓内の体細胞から胆汁への薬物輸送も行う。
【００５３】
薬物代謝遺伝子の他の好ましい組合せは次の通りである。
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列、及び
（ｉｉ）第１相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列、及び
（ｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）第１相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｖ）薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列とを含み、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
この様相は上述の特徴のいずれか一以上を含むのが好ましい。
【００５４】
本発明はその更なる様相において、ＰＸＲ及びＣＡＲ転写因子をコードするヒトＤＮＡ配列と、第１相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、第２相薬物代謝酵素をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列と、薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列とを含む非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒト動物、組織又は細胞を提供する。
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）ＰＸＲ及び／又はＣＡＲ転写因子をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）ＣＹＰ３Ａ４酵素をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）ＭＤＲ１タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列とを含む、非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
本発明のこの様相は、ＣＹＰ３Ａ４酵素が消化管において特に重要であるため、このアイソフォームについてヒト化した動物が腸内での薬物のバイオアベイラビリティにおける薬物代謝の役割を調べる上で重要であるという点で特に有用である。また、上述のように、ＭＤＲ１タンパク質は血液脳関門にて発現することが知られており、上述のヒト化マウスに組み込むと、ヒトの脳内への薬物／生体異物の摂取や脳外への排出に関する真の典型的なシナリオが得られる。
【００５５】
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）ＰＸＲ及び／又はＣＡＲ転写因子をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉ）ＣＹＰ３Ａ４酵素をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｉｉ）ＵＧＴ１Ａ酵素をコードするヒトＤＮＡ配列と、
（ｉｖ）ＭＤＲ１タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列とを含む、非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
他の好ましい組合せとしては、ＰＸＲ及び／又はＣＡＲ転写因子と、ＭＤＲ１タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列と、ＣＹＰ２Ａ９、ＣＹＰ３Ａクラスター、ＣＹＰ２Ｃクラスター及びＵＧＴ又はＵＧＴ０クラスターの一以上との組合せが挙げられる。
置換遺伝子（replacement genes）を導入するための方法
【００５６】
本発明はその更なる様相において、少なくとも１個の機能性ヒト転写因子と、少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素と、少なくとも１個の第２相薬物代謝酵素と、少なくとも１個の薬物輸送タンパク質とを、前記タンパク質を発現する内在性等価遺伝子が不活性化された非ヒト細胞に導入する方法であって、該細胞の内在性等価遺伝子が不活性であるのに対し前記ヒト発現産物が機能性を保持するように前記ヒト転写因子と、第１相及び第２相薬物代謝酵素と、薬物輸送タンパク質とをコードするＤＮＡを導入することを含む方法を提供する。本発明の上述のいずれか一様相の構築物を用いることができる。
導入されるヒトＤＮＡ配列のタンパク質産物と類似するタンパク質産物を発現する内在性非ヒト遺伝子を欠失させることが好ましい。これは好ましくは、この遺伝子のヒトカウンターパートで直接ターゲティングするか、又はこの遺伝子又は遺伝子クラスターを認識部位に隣接させた後、リコンビナーゼ介在欠失によって行うことができる。
【００５７】
本発明においては、トランスジェニックモデルに挿入される遺伝子は、内在性等価遺伝子又は遺伝子クラスターが自然に生じるゲノム内の部位に挿入するのが好ましい。これは、遺伝子座のコンテクストが保持される、即ち、この部位からの転写の忠実度が野生型の系で生じる転写レベルにできるだけ近くなるという点で有利である。
また、本発明においては、トランスジェニック系に挿入される遺伝子の内在性等価遺伝子が無効化される。「無効化」とは、非ヒト動物の内在性等価遺伝子が遺伝子産物を発現できないように、サイレント化、欠失或いは不活性化すること等を意味する。内在性等価遺伝子の発現を無効化すると同時に置換遺伝子をそれが自然に生じる部位に挿入する方法としては、上述の相同的組換えプロセスによるものが好ましい。この方法においては、標的ゲノム内の部位に相補的な配列の相同アームが挿入配列に隣接しており、これらを用いて所望のヒト遺伝子を直接挿入する。
【００５８】
例えば、ＭＤＲ１（薬物輸送タンパク質）の場合、様々な動物種はそれぞれ異なるＭＤＲ１アイソタイプや発現プロファイルを有する。マウスの場合、活性薬物輸送体（ＭＤＲ１ａ及びＭＤＲ１ｂ）をコードする２種類の遺伝子を有し、これらの組織発現は相互排他的である。これに対し、ヒトに存在する２種類のＭＤＲ遺伝子（ＭＤＲ１及びＭＤＲ３）の内、ＭＤＲ１のみが機能性薬物輸送体である。従って、ＭＤＲのトランスジェニックマウスを作出する場合には、内在性ＭＤＲ遺伝子の両方（即ち、ＭＤＲ１ａ及びＭＤＲ１ｂ）をＭＤＲ１で置換するのが好ましい。
他の例としてはＣＹＰ２Ｄ６を挙げることができるが、この場合、マウスには９種類の遺伝子が存在するが、これに対し、ヒトにおいては１種類の機能性遺伝子しか存在しない。ヒト遺伝子のスパンは約４０ｋｂ未満のゲノム配列であるため、マウス遺伝子クラスターをヒト遺伝子で置換するのは比較的容易である。
【００５９】
ＤＮＡ配列は、例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘ介在欠失によって欠失させることができる。この種の欠失は、大きなＤＮＡ断片（２００ｋｂ〜数メガ塩基対）を欠失させるのに適している。この方法は次の論文に記載されている（リー（Li）ＺＷ、スターク（Stark）Ｇ、ゴッツ（Gotz）Ｊ、ルリッケ（Rulicke）Ｔ、グシュウィンド（Gschwind）Ｍ、フーバー（Huber）Ｇ、ミューラー（Muller）Ｕ、ワイスマン（Weissmann）Ｃ、胚性幹細胞におけるＣｒｅリコンビナーゼ介在の部位特異的組換えによる２００ｋｂアミロイド前駆体タンパク質遺伝子が欠失したマウスの作出、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９６年６月  １１；９３（１２）：６１５８〜６２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９６年１０月、１５；９３（２１）：１２０５２の正誤表（Erratum）、及びスー（Su）Ｈ、ワン（Wang）Ｘ、ブラッドリー（Bradley）Ａ、マウスにおいてレトロウイルスベクターで誘導される入れ子（Nested）染色体欠失、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２０００年１月；２４（１）：９２〜５）。
また、Ｃｒｅ／ｌｏｘ介在で大きな断片の挿入を用い、コール（Call）ＬＭ、ムーア（Moore）ＣＳ、ステッテン（Stetten）Ｇ、ギアハート（Gearhart）ＪＤ記載の方法（胚性幹細胞へ環状酵母人工染色体を標的組込みするためのｃｒｅ−ｌｏｘ組換え系、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２０００年７月、２２；９（１２）：１７４５〜５１）によってヒトＤＮＡ配列を挿入することもできる。
非ヒトトランスジェニック動物は、添付した図１、２及び３の概略図に示すように、従来開示されていない「ノックイン」アプローチによって薬物輸送タンパク質をヒト化するのが好ましい。
【００６０】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、ＰＸＲ又はＣＡＲのみ或いはこの両方の組合せをヒト化するのが好ましく、この両方の組合せをヒト化するのがより好ましい。
ヒト遺伝子は、構築物内に少なくとも一部保存されているのが好ましい。
ヒトＰＸＲ遺伝子を発現するトランスジェニック動物の場合、ＰＸＲ構築物はエクソン４と６との間にイントロン−エクソン構造を保持するのが好ましい。これによって、多くのスプライスバリアントが見られ、都合よくリガンド結合ドメイン内に位置する配列が有利に保持される。従って、好ましいヒトＰＸＲ配列は、エクソン１〜４から成るｃＤＮＡと、イントロン４、エクソン５及びイントロン５から成るゲノム配列と、エクソン６〜９から成るｃＤＮＡとを含む。
当然のことながら、リガンド結合能が異なるタンパク質を占める、これらのエクソン間の他のスプライス産物は本発明の構築物によってカバーされている。
ＣＡＲ構築物はエクソン２と９との間にイントロン−エクソン構造を保持するのが好ましい。これによって、ターゲティングベクター内で全ゲノム構造が有利に保持され、ヒトＣＡＲの全てのスプライスバリアントをカバーすることができる。
他の好ましい構築物については上述の通りである。
【００６１】
本発明の一実施形態においては、トランスジェニック動物を上述の特徴を全て含むよう新たに作出するが、その際、次の方法を用いる（例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘ介在によって大きなＤＮＡ断片（２００ｋｂ〜数メガ塩基対）を欠失させる方法（リー（Li）ＺＷら、胚性幹細胞におけるＣｒｅリコンビナーゼ介在の部位特異的組換えによる２００ｋｂアミロイド前駆体タンパク質遺伝子が欠失したマウスの作出、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９６年６月  １１；９３（１２）：６１５８〜６２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９６年１０月、１５；９３（２１）：１２０５２の正誤表（Erratum）、及びスー（Su）Ｈら、マウスにおいてレトロウイルスベクターで誘導される入れ子（Nested）染色体欠失、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２０００年１月；２４（１）：９２〜５）や、コール（Call）らの記載によるｃｒｅ／ｌｏｘ媒介によって大きな断片を挿入する方法（胚性幹細胞へ環状酵母人工染色体を標的組込みするためのｃｒｅ−ｌｏｘ組換え系、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２０００年７月、２２；９（１２）：１７４５〜５１））。
【００６２】
本発明の他の実施形態においては、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を交雑によって作出する。例えば、ＷＯ２００４／００７７０８に記載の動物をＰＸＲ及び／又はＣＡＲをヒト化したトランスジェニック動物と交雑することができ、また、非ヒト動物のいずれかのトランスジェニック系における第２相薬物代謝酵素や薬物輸送タンパク質に対する更なる改変を含むことができる。
本発明の更なる実施形態においては、後に開示する方法によってトランスジェニック非ヒト動物を上述の特徴を全て含むよう新たに作出する。
当然のことながら、導入されたヒトＤＮＡ全てが実質的にヒトプロモーターの制御下にあることが理想的である。
【００６３】
モデル系
有利なことに、本発明は、薬物や他の生体異物化合物のヒト代謝や体内動態（disposition）、毒性に関与する一以上のタンパク質の調節や機能を再現するのに必要なコード配列及び調節配列を含む一以上のヒトＤＮＡ配列を非ヒト動物細胞に導入することによって、非ヒト動物細胞上で薬物や他の生体異物化合物の代謝や体内動態、毒性のヒトメカニズムを模倣する非ヒトトランスジェニック動物であって、前記非ヒト動物細胞においては、導入されたヒトＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を有するタンパク質をコードする内在性遺伝子が欠失しており、該非ヒト動物細胞をモデル系として用いて相同的ヒト細胞における薬物や他の生体異物化合物の代謝や体内動態、毒性を確認できるようになっている、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
【００６４】
本発明においては、特定のトランスジェニック系を「パーソナル化」して検討に値する現象に合わせることが可能である。例えば、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現レベルは個体間で６０倍も変わる場合があり、また、各個体においても経時的に変わり得る。この一因として固有の遺伝的差異が挙げられるが、より重要なのは薬物や毒物、食品その他の環境的変動要因に曝露した際の変動性（variability）に起因することである。この系は、必要なだけ長く高い酵素レベルを維持するのみの適応反応系である。よって、他に何を行っても無駄になるであろう。これは、ＣＹＰ３Ａ４の一レベルで特定薬物濃度の作用を試験するだけでは、一般にいずれの試験系においても適切ではないことを意味する。高Ｐ４５０環境及び低Ｐ４５０環境の両方で反応が試験されるように、薬物の作用の評価は高ＣＹＰ３Ａ４レベル及び低ＣＹＰ３Ａ４レベルの両方で行うのが理想的である。当然のことながら、アルブミンプロモーターを用いた先行技術による系は、インビボで見出される真の状態を全く反映することができない。
【００６５】
他の例としてＣＹＰ２Ｄ６タンパク質が挙げられるが、このタンパク質は神経遮断薬（例えば、抗うつ薬や統合失調症治療用薬物）の代謝における主要な役割を果たすため、かなり重要である。製薬会社はＣＹＰ２Ｄ６によって代謝される薬物を撤退（back）させたがらないため、薬物を開発している間にその薬物のＣＹＰ２Ｄ６ライアビリティーの有無をできるだけ早く知る必要がある。この遺伝子は個体間でばらつきを示し、実際にコーカソイドの約６％ではその発現が見られない。高ＣＹＰ２Ｄ６レベル及び低ＣＹＰ２Ｄ６レベル両方の環境で薬物（特に抗うつ薬）の代謝について研究できることは大きな利益となるであろう。
このような利点によって、発癌性試験を行うことができると共に、上述の急性薬理学的試験を行うことができる。例えば、本発明においては、Ｐ４５０レベル（単一遺伝子又は同義遺伝子、好ましくは遺伝子クラスターとして）を代謝産物の潜在的な発癌作用について試験するために人為的に高レベルへ上げることができる。生理学的に正常なレベルでは、このような代謝産物の作用は明らかではないであろう。げっ歯動物とヒトとの間での化合物の発癌性の顕著な種差は、他の薬物動態や分布の差と共に、毒性代謝産物や変異原性代謝産物が異なる速度で産生される要点となる。クラスター全体で遺伝子レベルを上昇させる能力は、それによって該クラスターの遺伝子により発現されるタンパク質間の基質クロストークが保持されるため重要である。
【００６６】
また、この種のオーダーメードの系（Bespoke systems）を利用して疾患を研究することもできる。一例としてはジルベール症候群が挙げられるが、これは、薬物代謝に関与するＵＧＴ１Ａ１遺伝子の多型によって生じる現象である。本発明においては、この症候群を評価できるようにするため、トランスジェニックモデル動物に多型含有遺伝子を組み込むことができる。
【００６７】
本発明はその更なる様相において、本発明の上述のいずれか一様相における核酸構築物をトランスフェクトした宿主細胞を提供する。細胞型はヒト又は非ヒト哺乳動物に由来するのが好ましいが、他の動物や植物、酵母、細菌に由来してもよい。
【００６８】
本発明はその更なる様相において、その細胞が本発明の上述のいずれか一様相における核酸構築物によってコードされるタンパク質を発現する、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。該トランスジェニック動物は、現在入手可能な技術という理由からマウスであるのが好ましいが、他の哺乳類、例えば、ラットやモルモット等の他のげっ歯動物や、ウサギやブタ、イヌ、ネコ等の他種、或いはヒツジやウマ、ウシ等の有蹄類であってもよく、非哺乳動物種であってもよい。
【００６９】
上述の核酸構築物の使用を含む、トランスジェニック宿主細胞又はトランスジェニック非ヒト動物の作出に関する本発明の実施形態においては、該細胞又は非ヒト動物を更なる遺伝子組換え、即ち、遺伝子又はタンパク質をコードする核酸配列を更に導入する遺伝子組換えに付すことができる。この遺伝子組換えは、細胞や細胞株の一過性の又は安定なトランスフェクションや、細胞や細胞株のエピソーム発現系、又は前核マイクロインジェクションや、非胚性幹（ＥＳ）細胞における組換えイベント、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞におけるランダム遺伝子組換え、その核を核移植クローニング法でドナー核として用いる細胞のトランスフェクションによるトランスジェニック非ヒト動物の作出であることができる。
【００７０】
細胞や細胞株の一過性の又は安定なトランスフェクションや、細胞や細胞株のエピソーム発現系の発現、前核マイクロインジェクション、ＥＳ細胞や他の細胞株における組換えイベント、或いは、様々な発達経路で分化し得る細胞株であって、その核を核移植のドナーとして用いる細胞株のトランスフェクションを含む、トランスジェニック細胞や細胞株、又はトランスジェニック非ヒト動物を作出する方法においては、更なる核酸配列や構築物の発現を用いて本発明の上述の様相におけるトランスフェクションや遺伝子組換えをスクリーニングする。その例としては、細胞の成長培地に添加された抗生物質に対して耐性を付与する選択可能マーカー（例えば、Ｇ４１８に耐性を付与するネオマイシン耐性マーカー）の使用が挙げられる。他の例としては、本発明の上述の様相における核酸配列又はその一部に相補的であり、それに対してハイブリダイズする核酸配列を用いた検出が挙げられる。例えば、サザンブロット解析やノーザンブロット解析、ＰＣＲが挙げられる。
本発明の方法によって作出される非ヒト動物細胞又はトランスジェニック非ヒト動物をモデル系として用いて、ヒトにおける薬物や他の生体異物化合物の代謝を確認することができる。
【００７１】
本発明はその更なる様相において、少なくとも１個の機能性ヒト転写因子、少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素、少なくとも１個の第２相薬物代謝酵素及び少なくとも１個の薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡを含み且つ発現するように改変された上述のトランスジェニック動物、該動物由来の組織及び／又は細胞の使用であって、前記トランスジェニック動物、該動物由来の組織及び／又は細胞における生体異物の代謝や毒性、又は内因性化合物の代謝及び／又は生合成等の導入ヒトタンパク質の他の特性や機能を調べるための使用を提供する。
本発明の系によって、生体異物の代謝や体内動態、毒性についてのヒトメカニズムの機能や調節を、いずれの組織や細胞型（例えば、単一動物の消化管や血液脳関門、肝臓、腎臓、該動物由来の組織や細胞）においても検討することができる。
非ヒト移植腫瘍細胞株及び／又は宿主動物でヒト化代謝経路を発現することにより、動物異種移植実験において薬物の抗腫瘍作用に対するヒト代謝、体内動態又は毒性の影響を検討するために本発明の系を適用することができる。
【００７２】
レポーター
有利なことに、本発明は、レポーター遺伝子の発現産物の簡便なアッセイによりヒト細胞において薬物や他の生体異物化合物の代謝経路を把握するために用いることができるようにレポーター遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞及びトランスジェニック非ヒト動物も提供する。
本発明の方法によって作出された非ヒト動物細胞又はトランスジェニック非ヒト動物にレポーター遺伝子を組み込んだ場合（後述参照）、該細胞又は動物を用いれば、レポーター遺伝子ＤＮＡ配列の発現をアッセイすることによって遺伝子の調節を確認することができると共に、相同的ヒト細胞において生じ得る薬物や他の生体異物化合物の機序や代謝を把握することができる。また、該細胞又は動物を用いて、薬物や他の生体異物化合物の代謝の程度を把握することもできる。例えば、特定の組織内でのレポーター遺伝子発現の分布を解析することによって、特定の薬物化合物に応じた遺伝子発現の誘導の程度をモニターすることができる。
【００７３】
本発明はその更なる様相において、
（ｉ）転写因子、及び
（ｉｉ）第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｖ）薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列
をコードするヒトＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含む、非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞を提供する。
【００７４】
転写因子及び／又は第１相及び／又は第２相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送タンパク質のプロモーターは、薬物／生体異物の体内動態に関与する少なくとも１個の酵素の相対的調節のモニタリングを可能とするレポーターと連結させることができる。有利なことには、このような実施形態によって、酵素の相対的調節が可能になるだけでなく、トランスジェニック動物又は全動物自体（the whole animal itself）において組織特異的且つ非侵襲的に遺伝子誘導の程度や効力を調節することが可能になる。上述の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の二以上のプロモーターにレポーターを連結させることができる。
【００７５】
レポーター遺伝子は、直接的又は間接的にアッセイ可能なタンパク質をコードする核酸配列である。これらを用いて、予想されるアッセイが不適切であるか或いは容易に行えないタンパク質産物に対応する他のコード領域を置換する。当該技術分野で知られていて本発明で用いることのできる好適なレポーター遺伝子は次のタンパク質（例えば、クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼやβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）等が挙げられるが、これらに限定されない）をコードする遺伝子から選択される。当然のことながら、上述の好適なレポーター遺伝子は網羅的でも排他的でもなく、適用の範囲を制限するものではない。当業者ならば、本発明に同様に適用し得る他のレポーター系を選択することができるであろう。
本発明においては、レポーター遺伝子に連結させる好ましい標的であるプロモーターはＰＸＲ、ＣＡＲ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＵＧＴ１Ａ、ＭＲＰ２及びＭＤＲ１である。
【００７６】
本発明のこれらの様相における動物、組織及び細胞によって、薬物代謝における遺伝子調節プロセスの非常に有用な要素を解明することができる。例えば、ＰＸＲはＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写制御において非常に重要であることが知られているが、他の重要な活性機序が存在する可能性が高い。ヒト化ＰＸＲ又はＰＸＲヌルバックグラウンドにおいてＣＹＰ３Ａ４レポーター動物又は細胞を薬物化合物に曝露することは、ＰＸＲ経由以外にＣＹＰ３Ａ４を調節する方法を検討する上で有用となるであろう。他に注目される例は、ヒト化ＰＸＲ及びＰＸＲヌルバックグラウンドの両方においてｍｄｒ１レポーター動物又は細胞を薬物化合物に曝露して、ＰＸＲ調節から独立したｍｄｒ１発現の様相を検出することであろう。
【００７７】
従って、本発明のこの様相における動物、組織及び細胞は、ＰＸＲ、ＣＡＲ又は他の転写因子のヌルバックグラウンドにおいて第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡ配列、第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。「ヌルバックグラウンド」とは、上述の定義に従い、遺伝子が無効化されたことを意味する。このような動物、細胞又は組織は、ヒト化ＰＸＲ又はＣＡＲバックグラウンドと同様の条件下（例えば、薬物の存在下及び非存在下）で比較されるであろう。従って、本発明のこの様相における動物、組織及び細胞は、転写因子のヒト化バックグラウンドにおいて第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡ配列、第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。このような転写因子は、ＰＸＲ単独、ＣＡＲ単独、ＰＸＲ及びＣＡＲ、又は他の単一転写因子であってもよく、本明細書に記載の転写因子の組合せであってもよい。
【００７８】
「転写的に連結している」とは、プロモーターの活性がレポータータンパク質の発現レベルを決定することを意味する。レポーター遺伝子は、調査対象のプロモーターを有する対応ヒト遺伝子の翻訳開始部位に融合するのが好ましい。ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９プロモーターの場合、レポーター遺伝子の転写物はポリＡモチーフによって終結されないこともあるが、構築物は内在性ポリＡモチーフが潜在的に用いられるようにデザインされている。従って、このような構築物は、レポーターへのエクソン３’の正しいスプライシングに依存している（図１２参照）。ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｂ６の場合、レポーター遺伝子の転写物は、合成イントロンを有するレポーター遺伝子に連結しているポリＡモチーフによって終結するのが好ましい（図１３参照）。ＭＤＲ１の場合、レポーター遺伝子の転写物は、付加的イントロンを有しないポリＡモチーフによって終結するのが好ましい（図１４参照）。
【００７９】
本発明はその更なる様相において、転写因子プロモーターの制御下で少なくとも１個の転写因子をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子が必要に応じて無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列
をコードするヒトＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを更に含む、非ヒト動物、組織又は細胞を提供する。
【００８０】
本発明のこの様相の非ヒト動物及び組織又は細胞は、第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列及び第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。前記非ヒト動物及び組織又は細胞は、第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列及び薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。前記非ヒト動物及び組織又は細胞は、第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列及び薬物輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。好適な第１相薬物代謝酵素、第２相薬物代謝酵素及び薬物輸送タンパク質の例としては本明細書に記載のものが挙げられる。
他の様相においては、例えば、ｍｄｒ１遺伝子のプロモーター活性を調べることができる。このシナリオでは、動物、組織及び細胞は、ｍｄｒ１のヒト化バックグラウンド又はヌルバックグラウンドにおいて、転写因子をコードするヒトＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーター、第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーター、及び／又は第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。
【００８１】
本発明のこの様相においては、薬物輸送体プロモーターの制御下で少なくとも１個の薬物輸送タンパク質をコードする少なくとも１個のヒトＤＮＡ配列を含み、その内在性等価遺伝子が無効化された非ヒト動物、該動物由来の組織又は細胞であって、
（ｉ）転写因子をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉ）第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列、及び／又は
（ｉｉｉ）第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列
をコードするヒトＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを更に含む、非ヒト動物、組織又は細胞を提供する。
【００８２】
本発明のこの様相の非ヒト動物及び組織又は細胞は、第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列及び第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。前記非ヒト動物及び組織又は細胞は、第１相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列及び転写因子をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。前記非ヒト動物及び組織又は細胞は、第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列及び転写因子をコードするＤＮＡ配列と転写的に連結しているプロモーターを含むことができる。好適な第１相薬物代謝酵素、第２相薬物代謝酵素及び転写因子タンパク質の例としては本明細書に記載のものが挙げられる。
【００８３】
本発明はその更なる様相において、実質的に図２、図３、図１２、図１３及び／又は図１４に示すターゲティングベクターを含む核酸構築物を提供する。
該構築物は、少なくとも１個の第１相薬物代謝酵素、少なくとも１個の第２相薬物代謝酵素及び少なくとも１個の薬物輸送タンパク質を、ヒト化及び対応するノックアウトのために、同一の構築物内に又は更に独立した構築物内に更に含むのが好ましい。
【００８４】
細胞
本発明の他の様相においては、本発明の上述のいずれか一様相によって動物細胞を産生する。好ましい様相においては、薬物や他の生体異物化合物のヒト代謝や体内動態、分布、毒性の決定に関与するタンパク質をコードする遺伝子に関する少なくとも１個のヒト調節ＤＮＡ配列を、転写産物や翻訳産物のアッセイによってその発現が簡便に測定可能なＤＮＡ配列と作用的に連結させて、非ヒト動物細胞に導入するレポーター遺伝子ＤＮＡ配列を産生する。この実施形態においては、一以上のレポーター配列（例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ））と連結される。
【００８５】
アッセイ
本発明の動物、組織及び細胞を用いて、薬物化合物がヒトによってどのように代謝されるか確認することができる。特に、薬物化合物が転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の活性や発現レベルを調節するかどうか調べることができる。また、薬物化合物によって誘導される転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の活性化や発現のレベルの割合を調べることができる。また、体組織内での転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の体内動態や分布に薬物化合物が影響を及ぼすかどうか調べることができる。また、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現の持続期間に薬物化合物が影響を及ぼすかどうか調べることができる。
動物における表現型の変化（例えば、生理学的作用）を測定することができる。このような生理学的作用としては、例えば、病態（胆管壊死等）や中毒性副作用を挙げることができる。
【００８６】
薬物化合物の代謝速度を調べることができる。この代謝速度は、該化合物の投与によってもたらされる毒性や活性を測定するか、該化合物の半減期を測定するか、又は薬物代謝酵素のレベルを測定することによって求めることができる。例えば、該化合物の代謝速度は、酸化生成物の生成速度や酸化中間体から次に産生される生成物の生成速度として測定することができる。或いは、この代謝速度は、最初の化合物（initial compound）の半減期や消失速度として、又は最初の化合物や最初の化合物から産生される代謝物の毒性や活性の変化として表わすことができる。半減期は、様々な時点で採取したサンプルに存在する薬物化合物の量を求めることによって測定することができる。薬物化合物の量は、標準的な方法（例えば、高速液体クロマトグラフィーや質量分析、化合物特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析、他の適切な方法）によって測定することができる。
また、薬物化合物が毒性代謝物や発癌性代謝物に代謝されるかどうかを、例えば、該化合物の組織やタンパク質、ＤＮＡへの共有結合を測定するか、又はグルタチオンの欠乏を測定することによって調べることもできる。
上述の種の測定は、薬物化合物投与後、２以上の時点、３時点、５時点又は１０以上の時点で行うのが好ましい。
従って、本発明の更なる様相は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の活性や発現レベルに対する薬物化合物の作用を確認するために提供されるスクリーニング方法に関する。このような方法は、本発明の上述のいずれか一様相におけるトランスジェニック動物、又は該動物由来の組織又は細胞に薬物化合物を投与することを含む。
【００８７】
スクリーニング工程は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質をコードする遺伝子の誘導を測定することを含むことができる。また、スクリーニング工程は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現のレベル、又はこのような発現の持続期間を測定することを含むことができる。また、スクリーニング工程は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現の分布を測定することを含むことができる。
薬物化合物の存在下及び非存在下でアッセイを行って、分布や代謝、毒性の差を確認することができる。様々なトランスジェニック動物や細胞、組織に対する薬物化合物の作用を評価することによって、特定の遺伝子の存在下及び非存在下における薬物化合物の作用を確認することができる。例えば、ヌルバックグラウンドを有する動物と対象遺伝子（例えば、ＰＸＲやＣＡＲ、ＭＤＲ１、第１相代謝酵素、第２相代謝酵素）をヒト化した動物との間で薬物化合物の作用を評価することも可能である。
複数の薬物化合物を投与することができる。例えば、ある薬物化合物がＣＡＲ遺伝子の誘導をもたらす場合、該化合物はＣＡＲ転写因子を活性化することが確認される。また、対照としてのヒトＣＡＲ受容体を発現する動物にＣＡＲ受容体インバースアゴニスト（例えば、クロトリマゾール）を投与することもできる。
【００８８】
本発明の更なる様相におけるアッセイによって、第１の薬物化合物の代謝が第２の薬物化合物で調節されるかどうか確認するためのスクリーニング方法を提供することができる。この方法は、第２の化合物の存在下及び非存在下で第１の化合物を本発明の上述のいずれか一様相におけるトランスジェニック動物、又は該動物由来の組織又は細胞に投与することと、表現型効果をモニタリングすることとを含む。或いは、上述のように、スクリーニング工程は、遺伝子の誘導、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現のレベルや持続期間、分布を測定することを含むことができる。第２の化合物がこれらの試験因子のいずれか一因子の変化をもたらす場合、第２の化合物は第１の化合物の代謝を調節することが確認される。例えば、第１の化合物の投与によってもたらされる毒性や活性を測定するか、又は第１の薬物化合物の半減期を測定することによって生理学的作用をアッセイすることができる。
このように、アッセイを用いて、特定のタンパク質の発現を活性化又は誘導する能力が低いか又は検出できないために、副作用が少ないか又はインビボでの半減期が長いことが期待される薬物化合物の類似体を容易に同定することができる。
以下、次の図面を参照しつつ本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００８９】
実施例１：ヒト化ＰＸＲ／ＣＡＲマウス
この方法によって、ＰＸＲやＣＡＲのみをヒト化したマウス、又は各遺伝子を二重ヒト化したマウスが得られる（図１参照）。本発明者らは、従来の繁殖によるものではなく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の段階的形質転換による様々なヒト化を組合せたため、ＰＸＲ／ＣＡＲ二重ヒト化ＥＳ細胞を産生することができる。この細胞は、引き続き行う第１相又は第２相薬物代謝酵素をコードするＤＮＡ配列や薬物輸送タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列による改変に用いることができる。
ＰｈｉＣ３１組換え部位の適用により、ヒト化マウスをＰｈｉ３１欠失株と交雑させることによって両方の遺伝子をノックアウトすることができる。
既存のモデルとは対照的に、本発明者らは「ノックイン」アプローチを用いて内在性遺伝子をそのヒトオルソログで置換する（図２及び３）。従って、ＰＸＲ及びＣＡＲ遺伝子はその正常なゲノムコンテクスト及び発現レベルの下で維持され、転写物の分布は有利に生理学的に調節又は制御される。この結果、本発明のモデルは、先行技術の試みに比べてヒトの状態に酷似するようになる。
更に、本発明の構築物内ではヒト遺伝子のゲノム構造が少なくとも部分的に保存されている。ＰＸＲの場合、本発明者らはｃＤＮＡとゲノム配列との複合構築物を用いた（図２参照）。ヒトＰＸＲ遺伝子のサイズは３５ｋｂ超と大きいため、４と６との間のイントロン−エクソン構造のみを保持したが、これは、このゲノム領域がリガンド結合ドメイン内に位置するために、このゲノム領域で多くのスプライスバリアントが見られるからである。ヒトＣＡＲのサイズは比較的小さい（エクソン２〜９由来の約７ｋｂ）ため、ターゲティングベクター内で全ゲノム構造を保持することができた（図３）。
薬物代謝酵素（第１相及び第２相）及び／又は薬物輸送タンパク質を調節するヒト遺伝子を用いて、ヒト化ＰＸＲ及び／又はＣＡＲを含むＥＳ細胞を更に改変することができる。ヒト化ＰＸＲ／ＣＡＲを有するマウス細胞を後述のＨＲＮマウスと交雑したり、上述の基準全てを満たす新しい非ヒトトランスジェニック動物を産生することができる。
【００９０】
実施例２：ＨＲＮTMマウス
全てのＰ４５０は、酵素シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）による供給電子の減少を必要とする。従って、ＣＰＲが欠失すると、同時にＰ４５０全てが不活性化される。ＣＰＲの欠失は胚において致命的であるが、ＨＲＮTMマウスは、出生後肝細胞を標的とした発達的に調節される条件的ＣＰＲ欠失を用いる。従って、ＨＲＮTMマウスは成体期まで生存し、肝Ｐ４５０による代謝が完全に不足しているにも関わらず繁殖することができる（ヘンダーソン（Henderson）ＣＪら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８：１３４８０〜６、２００３）。従って、ＨＲＮTMマウスによって、Ｐ４５０をヒト化するためにヒトＰ４５０活性を発現させる好適なバックグラウンドが得られる。
トランスジェニックマウスの作出
アデノウイルスベクターを用いてヒトＰ４５０／ＣＰＲの組合せをＨＲＮTM細胞に導入することができる。或いは、同じ導入遺伝子を組み込んだ生殖系列トランスジェニックマウスを作出することができる。これは先ず、選択されたＣＹＰ３Ａ４／ＣＰＲヒト化導入遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを作出し、次にこのマウスをＨＲＮTMマウスと交雑してＣＹＰ３Ａ４ヒト化マウスを産生することによってなされる。ＣＹＰ３Ａ４／ＣＰＲトランスジェニックマウスの作出は、胚性幹細胞の標的トランスフェクションとそれに続く胚盤胞注入によってなされる。ＣＹＰ３Ａ４／ＣＰＲトランスジェニックマウスをＨＲＮTMマウスと交雑してＰ４５０ヒト化マウスを産生することによって多重Ｐ４５０ヒト化マウスを作出することができる。或いは、ＣＰＲ遺伝子にｌｏｘＰ部位が隣接し、標的ヒトＰ４５０及びＣＰＲの発現配列又はヒトＰ４５０−ＣＰＲ融合タンパク質の発現配列が導入された胚性幹細胞を作出することができる。次に、このような胚性幹細胞に由来するマウスを、様々なプロモーターの制御下でｃｒｅリコンビナーゼを発現する各種マウス株と交雑し、ｃｒｅリコンビナーゼ発現を制御するプロモーターの組織特異性や誘導能に応じて様々な組織又は様々な誘導条件下でヒト化Ｐ４５０を有する子孫を産生することができる。
ヒト化戦略
ＨＲＮTM細胞で機能性ヒトＰ４５０活性を発現させる最適な方法を確立するため、別々の細胞質Ｐ４５０を有する標的ＣＰＲや標的融合タンパク質、細胞質融合タンパク質をコードする実験導入遺伝子を比較し、評価する。いずれの場合にも、これらの選択肢を適切な細胞培養系で発現させた後、ＨＲＮTMマウスのアデノウイルストランスフェクションによりインビボで試験することによってＰ４５０がＣＰＲ成分と相互作用する能力を確認する。
【００９１】
実施例３：ヒト化計画
タイプ１：ヒトｃＤＮＡの対応するマウスプロモーターからの発現
計画：ＭＤＲ１のヒト化
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。このベクターは、ヒトＭＤＲ１のｃＤＮＡが対応するマウス遺伝子（Ｍｄｒ１ａ及びＭｄｒ１ｂ）の翻訳開始部位に融合されるようにデザインする。Ｍｄｒ１ａターゲティングベクターはＦＲＴ隣接ハイグロマイシン耐性カセットを有し、Ｍｄｒ１ｂターゲティングベクターはＦ３隣接ネオマイシン耐性カセットを有する。両方の場合において、転写物はポリＡモチーフによって終結する。Ｍｄｒ１ａの場合、ターゲティングイベントによってエクソン２の３’部分が除去され、Ｍｄｒ１ｂの場合、エクソン２〜エクソン４の３’部分が欠失する。図４及び５を参照。
Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞での標準的なエレクトロポレーションの連続する２ラウンドにおいて、両方のマウス遺伝子を相同的組換えによって改変する。トランスフェクションの各ラウンドに由来するクローンをＧ４１８及びハイグロマイシンでそれぞれ選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザー（foster mothers）に導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってインビボで除去する。
【００９２】
タイプ２：マウス遺伝子とヒトｃＤＮＡとの融合物の対応するマウスプロモーターからの発現
計画：ＭＲＰ２のヒト化
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。このベクターは、エクソン１によってコードされるマウスタンパク質の「リーダー配列」が保持されるようにデザインする。エクソン１に由来する配列を有しないヒトｃＤＮＡをエクソン２に導入する。マウスイントロン１の本来のスプライス部位を保持し、この構築物がマウスエクソン１及びヒトエクソン２〜３２に由来するアミノ酸の融合タンパク質を潜在的にコードするようにする。転写物はポリＡモチーフによって終結する。ターゲティングベクターはＦＲＴ隣接ネオマイシン耐性カセットを有する（図６参照）。
ターゲティングベクターを標準的なエレクトロポレーションによってＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。クローンをＧ４１８で選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってインビボで除去する。
【００９３】
タイプ３：ヒトｃＤＮＡとゲノム配列とのハイブリッドの対応するマウスプロモーターからの発現
計画：ＰＸＲのヒト化
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。このベクターは、ヒトＰＸＲｃＤＮＡとゲノム配列とのハイブリッドがマウスＰＸＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合されてマウスの開始ＡＴＧが保持されるようにデザインする。ヒトＰＸＲ配列は、エクソン１〜４のｃＤＮＡと、イントロン４、エクソン５及びイントロン５のゲノム配列と、エクソン６〜９のｃＤＮＡとを含む。転写物はポリＡモチーフによって終結する。ターゲティングベクターはＦＲＴ隣接ハイグロマイシン耐性カセットと、選択カセットに対するスプライス受容体ポリＡモチーフ３’とを有する。更に、スプライス受容体ポリＡモチーフに対するマウスイントロン１及び３’にａｔｔ部位を挿入したが、これによって、部位特異的Ｐｈｉ−Ｃ３１リコンビナーゼを用いた中間配列の除去によるＰＸＲノックアウトの作出が可能となる（図７参照）。
ターゲティングベクターを標準的なエレクトロポレーションによってＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。クローンをハイグロマイシンで選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってインビボで除去する。
【００９４】
マウスＰＸＲ遺伝子がヒトカウンターパートと交換されたことの確認
ＰＸＲヒト化マウスを上述の戦略を用いて作出したが、該マウスは目視検査の結果、表現型が正常である。ＰＣＲを用いて該マウスをタイピングした（図１５参照）。該マウスは少なくとも３月齢まで生存する。その例としては、雄「３０６４３」（出生日２００４年１２月１２日、２００５年４月１９日時点で生存中）、及び雌「３０７９２」（出生日２００４年１２月１９日、２００５年４月１９日時点で生存中）が挙げられる。これらのマウスをうまく交配することができる。
□  ２００４年２月１日、３０６４３×３０７９２セットアップ
□  ２００５年２月２２日同腹仔出生−６匹−２００５年３月３０日離乳
□  ２００５年４月６日同腹仔出生−７匹−離乳未定
更なるタイピングはＴａｑｍａｎ(解析を用いて行った（図１６参照）。この解析から、野生型マウスのみにマウスＰＸＲ転写物が存在し、トランスジェニックマウス系列（lines）のみにヒト転写物が存在することが明示されたが、これによって、遺伝子交換が生じ、遺伝子構築物が正しい組織で活発に転写されたことが分かった。
次に、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒト化マウスに全長ヒトＰＸＲ転写物が存在することを確認した（図１７参照）。この解析から、サイズが１．３キロ塩基対及び１．１キロ塩基対の２種類の転写物の存在が示されたが、これによって、ヒト化ＰＸＲ遺伝子全体が転写されたことが分かる。得られた断片のサイズから、正しい（correct）スプライスバリアントと共に選択的スプライスバリアントが存在することが分かった。
全長転写物の配列解析によって、ＰＸＲｍＲＮＡ全体のオープンリーディングフレームが産生されたことを確認した。次に、マウスＰＸＲに対して産生された抗体を用いたウェスタンブロット解析によってＰＸＲの存在を確認した。
【００９５】
ヒトＰＸＲが機能的であることの証明
ヒトＰＸＲタンパク質が機能的であることを実証するため、プレグネノロン−１６αカルボニトリル（ＰＣＮ）やリファンピシン（Ｒｉｆ）等のＰＸＲ活性化化合物をマウスに投与した。
投与溶液の調製は投与日に行い、必要量の試験物質にコーン油を添加し撹拌して溶液又は微細懸濁液（fine suspension）を得た。供給物質中のＰＣＮ濃度は１０ｍｇ／ｍＬ、Ｒｉｆ濃度は２．５ｍｇ／ｍＬで、純度の補正は行わなかった。調製の記録を残した。
対照マウスに対しては媒体（コーン油）を毎日腹腔内投与した。投与した媒体及び誘導剤溶液の量は１０ｍＬ／ｋｇ体重であった。この投与経路は、先に公表された研究との一貫性を保つように選択した。
マウスに４日間投与し、最終投与から約２４時間後に殺した。
マウスサンプル全ての肝ミクロソーム中のＣｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ２ｂ１０及びＰＸＲタンパク質の定量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによって行った。マウス及びヒトＰＸＲタンパク質を検出するため、抗体（ＲＦ８）を用いた。Ｃｙｐ３ａ及びＣｙｐ２ｂを同定するため、抗ｃｙｐ２ｂ抗体（ＣＨ３２及びＣＨ４）をぞれぞれ用いた。結果を図１８に示す。
このデータから、野生型マウス及びヒト化ＰＸＲマウスの両方で正しい分子量のタンパク質が同定されたことが分かった。この２種類のタンパク質の分子量は同じであることが示されたが、これは、予測されるアミノ酸配列から計算した分子量と一致する。また、興味深いことには、野生型マウス（the murine）とヒト化マウスのＰＸＲの発現レベルが酷似しており、これは、同じプロモーターによって発現が開始する（driven off）という事実と一致する。
シトクロムＰ４５０  Ｃｙｐ３ａ遺伝子ファミリー内のＰＸＲ誘導性タンパク質の解析によって、ヒト化ＰＸＲマウスにおける顕著な誘導が示された（図１９参照）。興味深いことに、シトクロムＰ４５０  Ｃｙｐ２ｂ１０はこの処理では顕著に誘導されなかったが、このことから、この誘導がＰＸＲタンパク質を経由するものであって他の転写因子、即ち、構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）によるものではないことが分かる。この実験において、野生型マウスではＣｙｐ３ａ１１もリファンピシンによって誘導された。リファンピシンはＰＸＲと相互作用する能力において種差を示すことが報告されているが、ここで差が見られなかったという事実は高用量の化合物を用いたことで説明されるであろう。
【００９６】
酵素活性アッセイ
肝ミクロソームに対する酵素活性アッセイによって、ウェスタンブロット結果を確認することができた。ペントキシレゾルフィン−Ｏ−脱エチル化（ＰＲＯＤ）における活性はＣｙｐ２ｂ１０の発現レベルに起因し、７−ベンジルオキシキノリン（ＢＱ）の活性はＣｙｐ３ａの発現レベルに起因する。リファンピシンによるＣｙｐ３ａ及びＣｙｐ２ｂ誘導についての酵素活性データは図２０に示す。
【００９７】
低用量のリファンピシン及びＴＣＰＯＢＯＰを用いたｈｕＰＸＲマウスにおける誘導研究
野生型マウスとｈｕＰＸＲマウスとの系統差を実証するため、マウスに対して低用量のリファンピシン又はＴＣＰＯＢＯＰを投与した。このような化合物を選択した理由としては、リファンピシンの場合、マウス転写因子に比べてより効率的なヒトＰＸＲの誘導剤であることが報告されているからであり、また、ＴＣＰＯＢＯＰの場合、シトクロムＰ４５０遺伝子発現の誘導剤としてヒト系よりもマウスにおいてより効率的であることが報告されているからである。
研究は各群３匹のマウスで行った。対照群はコーン油で毎日４日間処理したマウス又はコーン油を単回投与したマウスで構成した。処理群のマウスに対しては、表１に詳述するように誘導剤を投与した。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
ＰＸＲ活性は、様々なシトクロムＰ４５０酵素により様々な程度代謝される複数のシトクロムＰ４５０基質の代謝を測定することによって求めた。次のアッセイを行った。
・肝ミクロソーム内で７−ベンジルオキシキノリン（ＢＱ）活性を求めた。
・肝ミクロソーム内でテストステロンヒドロキシラーゼ活性を求めた（ＬＭＳ  ＨＰＬＣ−００６）。
・これらの反応の比活性は、ローリー法によって求めたｍｇタンパク質当りの値で表わした（ＬＭＳ  Ｓｐｅｃ−０００１）。
第１の実験では７−ベンジルオキシキノリンを基質として用いた。リファンピシン処理マウスにおいて、第１の例では、野生型とヒト化ＰＸＲマウスとの間でバックグラウンドＣＹＰ３Ａ酵素活性に明らかな差があった（図２１）。また、この酵素活性はリファンピシンによって誘導可能ではなかったが、用量３ｍｇ／ｋｇにおいて野生型とヒト化ＰＸＲマウスとの間で酵素活性に顕著な差があった。
【０１００】
次の実験においては、野生型及びｈｕＰＸＲマウス由来の肝ミクロソーム画分内でテストステロンヒドロキシル化を測定した。興味深いことに、用量１０ｍｇ／ｋｇの場合、野生型マウスにおいてはテストステロンの６−β−ヒドロキシル化の誘導がない一方で、ヒトＰＸＲマウスにおいてはかなりの誘導があったが、このことから、野生型と比べてヒトＰＸＲマウスのリファンピシンに対する感受性が変化したことが分かる（図２２）。
７−ベンジルオキシキノリン脱メチル化の場合と同様に対照において高い活性を示したテストステロンの１６−β−ヒドロキシル化の測定についても同様の知見が得られた（図２３）。この活性についても、ｈｕＰＸＲマウスでは誘導されたが野生型では誘導されなかった。実際に、ｈｕＰＸＲマウスでは活性が約３倍であった。
テストステロンの２−α−ヒドロキシル化においても同様の知見が得られた。また、リファンピシンによるＣｙｐ３ａ１１の誘導から、ｈｕＰＸＲがｈｕＰＸＲマウスにおいて機能的に活性であることが分かる。
誘導剤ＴＣＰＯＢＯＰを用いた実験においても、テストステロンの肝ミクロソーム代謝を測定した。この場合にも、野生型とｈｕＰＸＲマウスとの間には明らかな差が見られた。特に、テストステロンの７−α−ヒドロキシル化については、野生型と比べてｈｕＰＸＲマウスでは構成的に高かった（図２４）。
テストステロンの６−β−ヒドロキシル化については両方のマウス系で誘導可能であった。野生型とｈｕＰＸＲマウスとの間で有意差はなかったが、ここでもヒトＰＸＲが活性であることが分かる（図２５）。
野生型とヒトＰＸＲとの系統差に合致して、ＴＣＰＯＢＯＰによる誘導に対するマウス系の感受性においては顕著な差があった。
【０１０１】
テストステロンの１６−α−ヒドロキシル化の場合、この活性は野生型マウスでは有意に誘導されたが、ｈｕＰＸＲマウスでは誘導されなかった。特に興味深いのは、テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化の誘導が、ｈｕＰＸＲマウスに比べて野生型で遥かに顕著に見られたことである（図２６及び図２７をそれぞれ参照のこと）。実際に用量１ｍｇ／ｋｇの場合、テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化の誘導は野生型マウスでは約６倍であったが、ｈｕＰＸＲマウスでは１．７倍にすぎなかった。ここでも、対照に比べてヒト化マウスの感受性が低下したことが分かる。
これは、ヒトＰＸＲ遺伝子と内在性マウスタンパク質を交換したマウスモデルの最初の報告である。他のＰＸＲヒト化マウスと比べてこのようなモデルの利点は次の事実にある。
・構築物を用いて検討を行い、ＰＸＲ発現レベルを制御する上でのＰＸＲの選択的スプライシングの役割を把握することができる。
・内在性遺伝子と同様に全ての組織で内在性マウスプロモーターＰＸＲの使用が発現する。
・ＰＸＲ発現のレベルが内在性遺伝子と酷似するようであり、従って、潜在的な過剰発現／低発現に伴う問題が減少する。
・現在入手可能なヒト化ＰＸＲモデルでは、アルブミンプロモーターを用いて、ＰＸＲヌルバックグラウンドにクロスしたヒトＰＸＲを作動させている。従って、ＰＸＲはこのようなモデルでは非常に高いレベルで発現するが、肝臓以外のいずれの組織にもＰＸＲは存在しない。このことは、消化管や血液脳関門、或いは実際に他の組織で遺伝子発現を制御するｈＰＸＲの役割を把握するためにこのようなモデルを使用する上で大幅に妥協することになる。
【０１０２】
ヒト化ＰＸＲマウスは多くの有用性を有する。例えば、このようなマウスを用いて、マウス組織における遺伝子発現の制御に関するヒトＰＸＲの役割を把握することができる。また、ヒト化ＰＸＲマウスを用いて、開発中の薬物や環境化学物質が有益又は有害となり得るようにヒトＰＸＲ機能を調節する能力を有するかどうか評価することもできる。また、このモデルによって、例えば、胆汁酸ホメオスタシスの撹乱によって生じ得る薬物や化学物質の潜在的毒性作用、ひいてはそのヒトとの関係を仲介する上でのヒトＰＸＲの役割を把握するための検討を行うこともできる。また、このモデルを用いて、この情報伝達経路に拮抗的又は作用的となり得る化学物質を評価することもできる。
【０１０３】
タイプ４：ヒトゲノム配列の対応するマウスプロモーターからの発現
計画：ＣＡＲのヒト化
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。このベクターは、ゲノムヒトＣＡＲ配列がマウスＣＡＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合されるようにデザインする。ヒトＣＡＲ配列は、５’及び３’ＵＴＲ（これらはマウスゲノムから保持されている）を除く、エクソン１〜９から成るゲノム配列全てを含む。マウスＣＡＲ遺伝子のコード配列の他の部分は全て欠失させる。転写物はポリＡモチーフによって終結する。ターゲティングベクターはＦＲＴ隣接ネオマイシン耐性カセットを有する。更に、選択マーカーに対するヒトイントロン２及び３’にａｔｔ部位を挿入したが、これによって、部位特異的Ｐｈｉ−Ｃ３１リコンビナーゼを用いた中間配列の除去によるＣＡＲノックアウトの産生が可能となる（図８参照）。
ターゲティングベクターを標準的なエレクトロポレーションによってＰＸＲヒト化Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。クローンをハイグロマイシンで選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってインビボで除去する。
ターゲティングベクターを標準的なエレクトロポレーションによってＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。クローンをハイグロマイシンで選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってインビボで除去する。
【０１０４】
２種類の二重ホモ接合ＰＸＲ／ＣＡＲヒト化マウスにおいてマウスＰＸＲ遺伝子がヒトカウンターパートと交換されたことのＰＣＲ確認
ＰＸＲ及びＣＡＲをヒト化したマウスの作出の際には、ヒト化ＰＸＲを含むマウスを用い、このマウスをヒト化ＣＡＲを含むマウスと交雑し、ヒト化ＰＸＲ及びヒト化ＣＡＲの両方を含むマウスを作出した。該マウスは目視検査の結果、表現型が正常である。ＰＣＲを用いて該マウスをタイピングした（図２８参照）が、ＰＸＲ及びＣＡＲがホモ接合的にヒト化されている。その例としては、「４２７４９」及び「４２７５２」と称されるマウスが挙げられる。
【０１０５】
ペントバルビトン睡眠試験
この実験においては、バルビツール酸塩誘導睡眠時間を測定することによってこれらの転写因子の組合せの活性を求めた。長年、睡眠時間は肝シトクロムＰ４５０活性に正比例することが知られており、この活性は、ＣＡＲ及びＰＸＲの機能によって決まる肝臓内のＰ４５０レベルに少なくとも一部起因し得る。
マウスに対して、Ｎａｒｃｏｒｅｎ（ペントバルビトンナトリウム；ドイツ、メリアル社で販売、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔ経由で購入）を腹腔内単回投与した（２５ｍｇ／ｋｇ体重）。マウスが正向反射を消失した後、回復するまでの時間を測定した。結果は下表２に示す。
【０１０６】
【表２】
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麻酔量のペントバルビトンを投与した野生型マウスの睡眠時間は２１分間であったが、ＣＡＲ及びＰＸＲの二重ヒト化マウスの睡眠時間は３４分間であった。従って、二重ヒト化マウスは野生型対照に対して有意差を示したが、この結果から、二重ヒト化マウスは野生型マウスに比べて薬物に対する反応が顕著に異なることが分かる。
【０１０７】
上述のタイプ３及び４に関する研究の概要
ヒトＰＸＲを内在性遺伝子と等価なレベルで予測されたようにマウスの肝臓及び消化管の両方において発現するモデルを開発した。この経路によって遺伝子発現を誘導することが知られている化合物にマウスが反応するため、ＰＸＲタンパク質は機能的であることが示された。野生型マウスとヒト化マウスとの系統差が示され、ヒト化マウスは、ｈＰＸＲに対して高い活性を有することが知られている化合物に対する反応性が高いことが示された。ヒト化ＰＸＲマウスを用いて行った動物実験に加え、ヒト化ＰＸＲを含んだマウスをヒト化ＣＡＲを含んだマウスと交雑し、ヒト化ＰＸＲ及びヒト化ＣＡＲの両方を含むマウスを作出した。
【０１０８】
タイプ５：ＲＯＳＡ２６遺伝子座への挿入によるヒトｃＤＮＡとゲノム配列とのハイブリッドの対応するヒトプロモーターからの発現
計画：ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ｃ９のヒト化
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。基本ＲＯＳＡ２６ターゲティングベクターは、ネオマイシン遺伝子が正しい標的ＥＳクローンにおいて内在性ＲＯＳＡ２６プロモーターから発現されるようにデザインする。Ｎｅｏ転写物はポリＡモチーフによって終結する。
ＣＹＰ３Ａ４の場合、ヒト化カセット（３’〜選択マーカー）は、１３ｋｂのヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターと、通常のゲノム構成同様にエクソン１及びイントロン１と、エクソン２〜１３から成るヒトｃＤＮＡとを含む。転写物はポリＡモチーフによって終結する（図９参照）。
ＣＹＰ２Ｃ９の場合、ヒト化カセット（３’〜選択マーカー）は、１２ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｃ９プロモーターと、エクソン１〜４から成るヒトｃＤＮＡと、イントロン４と、エクソン５〜９から成るｃＤＮＡとを含む。転写物はポリＡモチーフによって終結する（図１０参照）。
ターゲティングベクターを標準的なエレクトロポレーションによってＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。クローンをＧ４１８で選択し、陽性クローンをサザンブロット解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。
【０１０９】
タイプ６：大規模ゲノム領域の置換（クラスター交換）
計画：ＣＹＰ３Ａクラスターの交換、ＣＹＰ２Ｃクラスターの交換、及びＵＧＴのヒト化
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。原則としては、２種類のターゲティングベクターを構築し、標準的なエレクトロポレーションによるＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞へのトランスフェクションの連続する２ラウンドに用いる。第１のベクターは、機能性ＴＫカセットと、ｗｔ−ｌｏｘＰ部位によってその翻訳開始ＡＴＧ及びプロモーターから中断された５’欠失Ｎｅｏ遺伝子とを含む。第２のベクターは、機能性ＴＫカセット及びハイグロマイシンカセットと、ｗｔ−ｌｏｘＰと、ｌｏｘ５１１部位とを有する。各クラスター交換のための最終ターゲティングベクターは、正しい標的ＥＳクローンにおいてｗｔ−ｌｏｘＰ部位間のゲノム配列がＣｒｅ介在欠失によって除去できるようにデザインする。これによって、ｌｏｘＰに隣接する遺伝子クラスターがノックアウトされる。改変細菌人工染色体（ＢＡＣ）を用いて、Ｃｒｅ介在挿入によりヒト配列を再誘導（re-derived）ＥＳ細胞に導入する。ヒト化クラスターに隣接する選択カセットは、ＦＬＰ介在欠失によって除去することができる（図１１参照）。
【０１１０】
実施例４：レポーター計画
計画：ＣＹＰ３Ａ４レポーター、ＣＹＰ２Ｃ９レポーター、ＣＹＰ２Ｃ１９レポーター、ＣＹＰ２Ｂ６レポーター、ＣＹＰ２Ｄ６レポーター及びＭＤＲ１レポーター
方法：標準的な分子クローニング手順によってターゲティングベクターを構築する。全てのレポーターにおいて、レポーター遺伝子が対応するヒト遺伝子の翻訳開始部位に融合されるようにヒトＢＡＣを改変する。改変ＢＡＣはＦＲＴ隣接Ｋｅｏカセットを有しており、細菌コロニーをカナマイシンで選択し、マウスＥＳ細胞クローンをＧ４１８で選択することができる。ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９の場合、レポーター遺伝子の転写物はポリＡモチーフによって終結せず、内在性ポリＡモチーフが潜在的に用いられるように構築物をデザインする。従って、このような構築物は、エクソン３’のレポーターへの正しいスプライシングに依存している（図１２参照）。
ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｂ６の場合、レポーター遺伝子の転写物は、合成イントロンを有するレポーター遺伝子に連結しているポリＡモチーフによって終結する（図１３参照）。
ＭＤＲ１の場合、レポーター遺伝子の転写物は、付加的イントロンを有しないポリＡモチーフによって終結する（図１４参照）。
改変ＢＡＣをＮｏｔＩで直線化し、標準的なエレクトロポレーション又はリポフェクタミン２０００を用いたリポフェクションによってＣ５７ＢＬ／６ＮマウスＥＳ細胞にトランスフェクトする。クローンをＧ４１８で選択し、ＤＮＡをランダムに組み込んだ陽性クローンをＰＣＲ解析によって同定する。標準的な操作手順に従って、選択したクローンを拡大し、ＢＡＬＢｃ胚盤胞に注入し、フォスターマザーに導入する。このフォスターマザーの同腹仔を目視検査し、体毛色によってキメリズムを確認する。高キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的バックグラウンドにおいて更なる繁殖に用いる。選択マーカーは、ＦＬＰ欠失株との交雑によってインビボで除去する。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＰＸＲ／ＣＡＲのヒト化及びノックアウトの概略図を示す。
【図２】ＰＸＲヒト化戦略のためのゲノム配列を有する複合ｃＤＮＡの概略図を示す。
【図３】ＣＡＲヒト化戦略のためのゲノム配列を有する複合ｃＤＮＡの概略図を示す。
【図４】マウスｍｄｒ１ａターゲティングベクターを示す。
【図５】マウスｍｄｒ１ｂターゲティングベクターを示す。
【図６】ＭＲＰ２ヒト化のための構築物を示す。
【図７】ＰＸＲヒト化のためのターゲティング戦略を示す。
【図８】ＣＡＲヒト化のためのターゲティング戦略を示す。
【図９】ＣＹＰ３Ａ４ヒト化のための戦略を示す。
【図１０】ＣＹＰ２Ｃ９ヒト化のための戦略を示す。
【図１１】クラスター交換のための全体的戦略を示す。
【図１２】レポーター構築物のための全体的戦略を示す。
【図１３】は、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｂ６のためのレポーター計画戦略（reporter project strategy）を示す。
【図１４】ＭＤＲ１のためのレポーター計画戦略を示す。
【図１５】ＰＸＲタイピング用ＰＣＲの例を示す。
【図１６】野生型及びトランスジェニックマウスのＴａｑｍａｎタイピングを示す。用いた全てのプローブ及びプライマーは、予め最適化されたＴａｑＭａｎ(ゲノムアッセイキットであり、アプライド・バイオシステムズから購入した。用いたアッセイは全てアプライド・バイオシステムズのものである。マウスＰＸＲｍＲＮＡ転写物（Ａ、Ｃ）又はヒトＰＸＲｍＲＮＡ転写物（Ｂ、Ｄ）に特異的なアッセイを用いて９匹の野生型マウス及び４匹のｈＰＸＲマウスの肝臓（Ａ、Ｂ）及び小腸（Ｃ、Ｄ）のＴａｑＭａｎ解析によって得られた結果を示す。
【図１７】トランスジェニックマウスにおけるｈｕＰＸＲ転写物のＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図１８】野生型及びｈＰＸＲマウス由来のＰＸＲタンパク質のウェスタンブロッティングを示す。処理した野生型マウス及びｈｕＰＸＲマウスの肝臓由来のタンパク質をＰＸＲタンパク質に特異的な抗体でプローブした。標準（＋ｖｅ）はｈｉｓタグマウスＰＸＲである。
【図１９】リファンピシンによるＣｙｐ３ａ及びＣｙｐ２ｂの誘導のウェスタンブロッティングを示す。リファンピシンで処理した野生型マウス及びｈｕＰＸＲマウスの肝臓由来のミクロソームタンパク質をＣｙｐ３ａ１１タンパク質（上部パネル）及びＣｙｐ２ｂ１０（下部パネル）の抗体でプローブした。
【図２０】リファンピシン（１００ｍｇ／ｋｇ）によるＣｙｐ３ａ及びＣｙｐ２ｂ１０誘導の酵素活性アッセイを示す。Ｃｙｐ２ｂ１０の発現レベルによるペントキシレゾルフィン−Ｏ−脱エチル化（ＰＲＯＤ）の活性と、Ｃｙｐ３ａの発現レベルによる７−ベンジルオキシキノリン（ＢＱ）の活性とを用いた肝臓ミクロソームに対する酵素活性アッセイから得た結果を示す。
【図２１】リファンピシン（３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（７−ベンジルオキシキノリン）。７−ベンジルオキシキノリンの活性を用いた肝臓ミクロソームに対する酵素活性アッセイから得た結果を示す。
【図２２】リファンピシン（３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（テストステロンの６−β−ヒドロキシル化）（ｐ＜０．０１）。
【図２３】リファンピシン（３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化）（ｐ＜０．０５）。
【図２４】ＴＣＰＯＢＯＢ（０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（テストステロンの７−α−ヒドロキシル化）。これは、野生型に比べてｈｕＰＸＲマウスで構成的に高かった。
【図２５】ＴＣＰＯＢＯＢ（０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（テストステロンの６−β−ヒドロキシル化）。
【図２６】ＴＣＰＯＢＯＢ（０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（テストステロンの１６−α−ヒドロキシル化）。この活性は野生型マウスでは有意に誘導された（ｐ＜０．０５）が、ｈｕＰＸＲマウスでは誘導されなかったことが分かる。
【図２７】ＴＣＰＯＢＯＢ（０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇ）による誘導後の肝臓ミクロソームにおける酵素活性アッセイを示す（テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化）。この活性はｈｕＰＸＲマウスと比べて野生型マウスで遥かに顕著であったことが分かる。
【図２８】２種類の二重ホモ接合ＰＸＲ／ＣＡＲヒト化マウスにおいてマウスＰＸＲ遺伝子がヒトカウンターパートと交換されたことのＰＣＲ確認を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2008522605.tif 000025
【図２２】
2008522605.tif 000026
【図２３】
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【図２４】
2008522605.tif 000028
【図２５】
2008522605.tif 000029
【図２６】
2008522605.tif 000030
【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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