【事件の表示】
　特許第２７３６１４３号「カルボキシル基含有重合体を含む免疫化学試験用剤」の請求項１ないし２に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２７３６１４３号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理由】
Ｉ　手続の経緯
　本件特許第２，７３６，１４３号の発明は、平成１年１２月１日（パリ条約による優先権主張、１９８８年１２月２日、ドイツ）に出願されたものであり、平成１０年１月９日に設定登録されたものである。
　本件特許について、申立人富士レビオ株式会社より特許異議の申立があった。取消理由が通知され、それに対して平成１１年８月２日付で意見書および訂正請求書が提出された。
ＩＩ　訂正の適否の検討
　前記平成１１年８月２日付け訂正請求書による訂正の適否について以下検討する。
１．　訂正事項
　登録時の特許請求の範囲の「カルボキシル基含有水溶性重合体」を「ポリアクリル酸；ポリマレイン酸；無水マレイン酸とメチルビニルエーテル、エチレン、プロピレンもしくはオクタデセンとのポリマーまたはテロマーであってその無水物環を加水分解によって開裂した重合体；ポリアスパラギン酸；ポリグルタミン酸；およびポリガラクツロン酸から選択されるカルボキシル基含有水溶性重合体」にする訂正。
２．　訂正の目的
　上記訂正事項は、特許請求の範囲の「カルボキシル基含有水溶性重合体」を限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的にしているものといえる。
３．　明細書の記載事項の範囲内
　訂正されたカルボキシル基含有重合体は、本件特許明細書に好ましいものとして例示されているものであるから（明細書９頁　１０行〜１６行、特許公報４欄１６行〜２１行参照）、この訂正事項は明細書の記載事項の範囲内であることは明らかである。
４．　拡張・変更
　上記訂正事項は、実質上特許請求の範囲を拡張するものでなく、また、変更するものでもない。
５．　独立特許要件
　上記訂正事項は、特許請求の範囲を減縮することを目的とするものであるので、訂正後の発明が独立して特許を受けることができるものであるかどうかについて以下検討する。
５．１　本件訂正後の発明
　本件訂正による訂正請求項１〜訂正請求項２の発明は、本件訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１、請求項２の記載事項により構成される。
　本件訂正明細書の特許請求の範囲は次のとおりである。
　【請求項１】
　免疫化学反応体を含有する生物学的材料中の分析物質の検出または定量用の試剤であって、少なくとも１種の免疫化学反応体が分析物質と反応するものである試剤がさらにポリアクリル酸；ポリマレイン酸；無水マレイン酸とメチルビニルエーテル、エチレン、プロピレンもしくはオクタデセンとのポリマーまたはテロマーであってその無水物環を加水分解によって開裂した重合体；ポリアスパラギン酸：ポリグルタミン酸；およびポリガラクツロン酸から選択されるカルボキシル基含有水溶性重合体を含有する免疫化学試験用剤。
　【請求項２】
　生物学的材料中に含まれる分析物質を免疫化学的に定量する方法において、分析物質を請求項１記載のカルボキシル基含有重合体と混合し、必要な場合にはこの混合物を水性溶液中でインキュベートし、こうして得られた混合物について免疫化学的定量を実施する方法。
５．２　本件発明の概要
（１）　本件発明の技術分野（特許公報１欄１４行〜参照）
　本発明は、生物学的材料中の分析物質の免疫化学検出および定量用の試剤に関し、この試剤はカルボキシル基含有水溶性重合体である。
（２）　非特異的結合の防止の従来技術（特許公報２欄２行〜参照）
　公知の免疫化学試験系では、タンパク質、多糖および／または界面活性剤の添加物が使用される。これらは免疫化学反応にはあずからないが、このような反応の結果に有利な影響を与えるのに適している。
　イムノアツセイたとえばＥＬＩＳＡでは、使用されるインキュベーション培地（緩衝溶液、インキュベーション培地、接合緩衝液）の組成は、サンプル中の交雑物質の非特異的結合および／または固相への接合を防止するものでなければならない。タンパク質たとえばアルブミン、ＩｇＧ、カゼイン、加水分解ゼラチンおよびそれらの誘導体、タンパク質混合物、またはヒトもしくは動物血清、ならびに界面活性剤のような既知の添加物は、このようなわけでインキュベーション培地中に用いられる。
　ラクトフエリン、ウシ胎仔血清、ポリオキシエチレン２０−ソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）２０）および緩衝塩類を含有する、固相免疫化学試験用のインキュベーション培地がドイツ特許第３，６３８，７６７号に記載されている。
　ポロキサマー類からの界面活性剤たとえばｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｒ）Ｆ６８、ならびにポロキサミン類からの界面活性剤たとえばＴｅｔｒｏｎｉｃ（Ｒ）７０７および１１０７がまたヨーロッパ特許Ａ−２１５，４５７号に記載されている。上述の３種の化合物はＴｗｅｅｎ（Ｒ）２０に比べて有利であることが明らかにされている。
（３）　従来技術の問題点（特許公報３欄１０行〜参照）
　しかしながら、これらの添加物を加えたインキュベーション培地では、たとえば、至適感度を得るために大サンプル容量を高い接合体濃度で、しかし低い接合体容量で使用する一工程サンドイッチ法で生じる誤まった測定値を防止することはできない。
　したがって、サンプルとのインキュベーションによって誤まった測定値を防止できる試剤の発見は重要な課題であった。
（４）　カルボキシル基含有水溶性重合体（特許公報３欄１８行〜参照）
　驚くべきことに、カルボキシル基含有水溶性重合体は、誤まった測定値を防止し、生物学的材料（サンプルとも呼ぶ）中に含まれる分析物質の検出および定量に高感度の効果を示す免疫化学反応に有利に影響する添加剤として、従来の添加剤よりもさらに適していることが明らかにされた。
　このような試剤の成分としてのこれらの重合体は、試験用サンプルの調製時にすでに添加することができる。
（５）　本件発明（特許公報３欄２６行〜参照）
　したがって、本発明は、免疫化学反応体を含有する生物学的材料中の分析物質の検出または定量用の試料であって少なくとも１種の免疫化学反応体が分析物質と反応するものである試剤がさらにカルボキシル基含有水溶性重合体を含有する免疫化学試験用剤に関する。
５．３　取消理由通知に引用の刊行物
　刊行物１：
　　　特開昭５６−４２１４２号公報
　刊行物２：
　　　化学大辞典３、４００頁「ケラチン」、
　（共立出版株式会社昭和５４年１１月１０日縮刷版第２３刷発行）
　刊行物３：
　　　化学大辞典５、３８３頁〜３８４頁「ゼラチン」、
　　（共立出版株式会社昭和５４年１１月１０日縮刷版第２３刷発行）
５．４　引用刊行物の記載事項
（１）刊行物１の記載事項
　（１ａ）非特異的阻害作用の除去法（１頁左下欄１１行〜右下欄１行）
「　本発明（刊行物１発明）は免疫測定法における非特異的阻害作用の除去法に関するものである。更に詳しくはラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、レーザーネフエロメトリー等の測定法による生体中の微量物質量の決定の際、ゼラチン分解物又はケラチン分解物と塩類とを共存させて、生体試料中に含まれる干渉物質の影響を抑え、生体中に存在する、目的とする物質量の含量を正確に測定することを可能ならしめるところの免疫測定法における非特異的阻害作用の除去法に関するものである。」
　（１ｂ）実施例１（３頁右下欄下から２行〜４頁左上欄２行）
「　インシュリン測定系−Ｋ：緩衝液Ｋ〔緩衝液Ａにケラチン分解物０．５％とＮａＣＩ　０．２Ｍを加えたもの〕０．４５ｍｌに適当に希釈したインシュリン含有液３０μ１を加え、以下測定系Ａと同様の操作をする。但し３０℃、２時間振盪後のシリコンゴム固相の洗浄は、はじめ緩衝液Ｋで行ない、ついで緩衝液Ａでする。」
　（１ｃ）『測定系Ａの操作』（３頁右下欄１２行〜１８行）
「　３０℃で２時間振盪する。振盪終了後、緩衝液Ａにてシリコンゴムをよく洗浄し、緩衝液Ａで希釈した抗インシュリン抗体−β−ガラクトシダーゼ複合体０．２ｍｌを加えて、４℃にて一夜反応させる。反応終了物を再び緩衝液Ａにてよく洗浄し、シリコンゴムに結合しているβ−ガラクトシダーゼ活性を測定する。」
　（１ｄ）実施例１の免疫化学反応体（３頁右下欄１０行〜１１行）
「シリコンゴム−抗インシュリン抗体結合物」
　（１ｅ）測定系への阻害作用を消失（２頁左下欄２行〜４行）
「ゼラチン分解物を用いたところ、・・・測定系への阻害作用を消失させることができたものである。」
（２）刊行物２の記載事項
　刊行物２には、ケラチンについての説明がある。
　「普通の溶媒には不溶」と記載されている（右欄６行参照）。
　ケラチンの一例として羊毛ケラチンの組成が記載されていて（左欄下から１３行〜参照）、羊毛ケラチン１０５ｇのアミノ酸計８８８個中には、ジカルボン酸であるアスパラギン酸が５４個、グルタミン酸が９６個含まれている。
（３）刊行物３
　刊行物３には、ゼラチンについての説明が記載されている。
　「温水に溶ける」ことが記載されている。
　ゼラチンの組成が記載されていて（３８３頁右欄下から９行〜参照）、ゼラチン１０５ｇのアミノ酸計１０６９個中には、ジカルボン酸であるアスパラギン酸が５１個、グルタミン酸が７６個含まれている。
５．５　訂正請求項１発明と刊行物１発明との対比
　ここで、訂正請求項１発明と刊行物１発明とを対比する。
　訂正請求項１発明と刊行物１発明とは、次の点で一致する。
（一致点）
「　免疫化学反応体を含有する生物学的材料中の分析物質の検出または定量用の試剤であって、少なくとも１種の免疫化学反応体が分析物質と反応するものである試剤がさらにカルボキシル基含有重合体を含有する免疫化学試験用剤。」
　そして、訂正請求項１発明と刊行物１発明とは、次の点で一応相違する。
（相違点）
　訂正請求項１発明は、「カルボキシル基含有重合体」が「ポリアクリル酸；ポリマレイン酸；無水マレイン酸とメチルビニルエーテル、エチレン、プロピレンもしくはオクタデセンとのポリマーまたはテロマーであってその無水物環を加水分解によって開裂した重合体；ポリアスパラギン酸；ポリグルタミン酸；およびポリガラクツロン酸から選択されるカルボキシル基含有水溶性重合体」であるのに対し、刊行物１発明では、「カルボキシル基含有重合体」が「ゼラチン分解物又はケラチン分解物」である点。
５．６　相違点についての検討
　そこで、この相違点について以下検討する。
　本件訂正請求項１発明は、この特定のカルボキシル基含有水溶性重合体を使用することにより、明細書の表（特許公報８欄参照）に示されるように、従来の一工程法に比較して、高感度で信頼できる測定結果を与えるという、顕著な効果を奏する。
　これに対して、従来技術の「加水分解ゼラチン」等のタンパク質からなる非特異的結合防止材では、本件明細書によれば、一工程サンドイッチ法で生じる誤った測定値を防止することはできないものである（前記５．２（２）参照）。
　そして、刊行物２〜刊行物３にも、本件訂正請求項１発明の「ポリアクリル酸；ポリマレイン酸；無水マレイン酸とメチルビニルエーテル、エチレン、プロピレンもしくはオクタデセンとのポリマーまたはテロマーであってその無水物環を加水分解によって開裂した重合体；ポリアスパラギン酸；ポリグルタミン酸；およびポリガラクツロン酸から選択されるカルボキシル基含有水溶性重合体」を非特異的結合防止に使用することは示唆されていない。
　そうすると、訂正請求項１発明は、刊行物１〜刊行物３に記載の発明と同一であるということはできない。そして、刊行物１〜刊行物３に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものといこともできない。
５．７　訂正請求項２発明について
　訂正請求項２発明は、訂正請求項１発明の「カルボキシル基含有水溶性重合体」を使用するものである。
　そうすると、訂正請求項１発明について述べたのと同様の理由により、本件訂正請求項２発明は、刊行物１〜刊行物３に記載の発明と同一であるということはできない。そして、刊行物１〜刊行物３に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものといこともできない。
５．８　独立特許要件についての検討結果
　以上検討したところによれば、訂正請求項１発明および訂正請求項２発明は、いずれも、本件特許出願の際、独立して特許が得られるものといえる。
６．　訂正適否の検討結果
　以上の検討によれば、本件訂正は、特許法１２０条の４、２項および３項の規定に適合する。
ＩＩＩ　特許異議の申立
１．　本件発明
　本件請求項１〜請求項２の各発明は、本件訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１、請求項２の記載事項により構成される。
　その特許請求の範囲は前述のとおりである（前記ＩＩ５．２参照）。
２．　申立の概要
　申立人富士レビオ株式会社の申立の概要は、以下のとおりである。
　本件請求項１〜請求項２の各発明は、前記刊行物１〜刊行物３に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。したがって、本件請求項１〜請求項２の各発明に係る特許は、特許法２９条２項の規定に違反してされたものである。
３．申立についての検討
　本件請求項１〜請求項２の各発明は、前述のとおり（前記ＩＩ５．６〜５．７参照）、刊行物１〜刊行物３に記載の発明と同一であるということはできず、そして、刊行物１〜刊行物３に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものといこともできない。
　したがって、異議申立人の申立は、理由がない。
ＩＶ　むすび
　前記ＩＩで検討したように、本件訂正は、特許法１２０条の４、２項および３項の規定に適合する。
　前記ＩＩＩで検討したように、本件特許異議申立の
理由によっては、本件請求項１〜請求項２の各発明に係る特許を取り消すことができない。
　また、他に本件請求項１〜請求項２の各発明に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年９月２７日（１９９９．９．２７）
【訂正の要旨】
　　　　　　　　　　　　訂正の要旨
　特許請求の範囲の減縮を目的にして、
特許請求の範囲の「カルボキシル基含有水溶性重合体」を、「ポリアクリル酸；ポリマレイン酸；無水マレイン酸とメチルビニルエーテル、エチレン、プロピレンもしくはオクタデセンとのポリマーまたはテロマーであってその無水物環を加水分解によって開裂した重合体；ポリアスパラギン酸；ポリグルタミン酸；およびポリガラクツロン酸から選択されるカルボキシル基含有水溶性重合体」に訂正。
（５４）【発明の名称】
カルボキシル基含有重合体を含む免疫化学試験用剤
（５７）【特許請求の範囲】
　１）免疫化学反応体を含有する生物学的材料中の分析物質の検出または定量用の試剤であって、少なくとも１種の免疫化学反応体が分析物質と反応するものである試剤がさらにポリアクリル酸；ポリマレイン酸；無水マレイン酸とメチルビニルエーテル、エチレン、プロピレンもしくはオクタデセンとのポリマーまたはテロマーであってその無水物環を加水分解によって開裂した重合体；ポリアスパラギン酸；ポリグルタミン酸；およびポリガラクツロン酸から選択されるカルボキシル基含有水溶性重合体を含有する免疫化学試験用剤。
　２）生物学的材料中に含まれる分析物質を免疫化学的に定量する方法において、分析物質を請求項１記載のカルボキシル基含有重合体と混合し、必要な場合にはこの混合物を水性溶液中でインキュベートし、こうして得られた混合物について免疫化学的定量を実施する方法。
【発明の詳細な説明】
　本発明は、生物学的材料中の分析物質の免疫化学検出および定量用の試剤に関し、この試剤はカルボキシル基含有水溶性重合体である。
　公知の免疫化学試験系では、タンパク質、多糖および／または界面活性剤の添加物が使用される。これらは免疫化学反応にはあずからないが、このような反応の結果に有利な影響を与えるのに適している。
　　イムノアッセイたとえばＥＬＩＳＡでは、使用されるインキュベーション培地（緩衝溶液、インキュベーション培地、接合緩衝液）の組成は、サンプル中の夾雑物質の非特異的結合および／または固相への接合を防止するものでなければならない。タンパク質たとえばアルブミン、ＩｇＧ、カゼイン、加水分解ゼラチンおよびそれらの誘導体、タンパク質混合物、またはヒトもしくは動物血清、ならびに界面活性剤のような既知の添加物は、このようなわけでインキュベーション培地中に用いられる。
　ラクトフェリン、ウシ胎仔血清、ポリオキシエチレン２０−ソルビタンモ
験用のインキュベーション培地がドイツ特許第３，６３８，７６７号に記載されている。
　しかしながら、これらの添加物を加えたインキュベーション培地では、たとえば、至適感度を得るために大サンプル容量を高い接合体濃度で、しかし低い接合体容量で使用する一工程サンドイッチ法で生じる誤まった測定値を防止することはできない。
　したがって、サンプルとのインキュベーションによって誤まった測定値を防止できる試剤の発見は重要な課題であった。
　驚くべきことに、カルボキシル基含有水溶性重合体は、誤まった測定値を防止し、生物学的材料（サンプルとも呼ぶ）中に含まれる分析物質の検出および定量に高感度の効果を示す免疫化学反応に有利に影響する添加剤として、従来の添加剤よりもさらに適していることが明らかにされた。
　このような試剤の成分としてのこれらの重合体は、試験用サンプルの調製時にすでに添加することができる。
　したがって、本発明は、免疫化学反応体を含有する生物学的材料中の分析物質の検出または定量用の試料であって少なくとも１種の免疫化学反応体が分析物質と反応するものである試剤がさらにカルボキシル基含有水溶性重合体を含有する免疫化学試験用剤に関する。
　適当なカルボキシル基含有水溶性重合体は、エステルまたは無水物質をもつ水不溶性合成重合体からアルカリ加水分解によって製造することができる。これらの例には、モノマーとして、アクリル酸およびアルキルアクリル酸のエステルもしくは無水マレイン酸のみを単独で、またはカルボキシル基を含まないモノマー（たとえばメチルビニルエーテル、スチレン、エチレン、プロピレンまたはオクタデセン）と混合して用いて製造される重合体がある。ホモポリマーまたはヘテロポリマーと呼ばれるこれらの重合体は一般的に遊離ラジカル重合によって得られる。すなわち、遊離基重合開始剤の添加、たとえばクマリルヒドロペルオキシドまたはジベンゾイルペルオキシドによって行われ、重合体の鎖長はペルオキシドの添加量、または温度、テロゲンたとえば四塩化炭素もしくは遊離ラジカルを捕集する試剤たとえばアセチルシステインや他のチオールの添加によって調節される。
　分子量が２，０００を越える反応生成物は一般に重合体（ポリマー）と呼ばれ、分子量２，０００未満の反応生成物はスリゴマ一またはテロマーと呼ばれる。
　カルボキシル基を含有する水溶性合成ヘテロポリマーは、カルボキシル基をもつモノマーとカルボキシル基を含まないモノマーの割合を、生成したポリマー、オリゴマーまたはテロマーがアルカリ加水分解後に水溶性になるように選択するだけで、有利に製造される。この比は各ヘテロポリマーについて経験的に決定できる。たとえば、スチレンと無水マレイン酸のモノマーから製造されるヘテロポリマーではモル比２〜２．５：１ではアルカリ加水分解後にまだ水溶性を示すが、比が３：１以上になるとアルカリ加水分解後も水不溶性のままである。カルボキシル基を含む水溶性ポリペプチド、たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸、また必要に応じて中性アミノ酸も含有し、市販されているかまたは既知のペプチド合成法で製造できるポリペプチドもまた適当である。
　天然生成物から得られ、糖酸たとえばペクチン酸およびガラクツロン酸を含有する多糖はさらに適当である。
　以下に挙げる重合体：ポリアクリル酸、ポリマレイン酸、無水マレイン酸とメチルビニルエーテル、エチレン、プロピレンまたはオクタデセンとのポリマーまたはテロマーであってその無水物環を加水分解によって開裂した重合体、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸およびポリガラクツロン酸が好ましい。
　無水マレイン酸とメチルビニルエーテルまたはプロピレンのテロマーを水酸化ナトリウム溶液で処理して水溶性のカルボキシル基含有重合体に変換した重合体がとくに好ましい。
　免疫化学反応体および／または生物学的親和性を有する結合パートナーを含む試剤については多くのものが知られている。
　これらの試剤は一般に、それらが使用される免疫化学過程によって命名される。
　本発明における試剤とは、それによって分散系としてもしくはゲルの沈殿または粒子の凝集を生じるかあるいはそれらの不存在がわかる試剤、または免疫化学反応によって発色シグナルもしくは放射線の生成もしくは妨害を生じる試剤である。
　最後に挙げた種類の好ましい試剤は、発色もしくは放射線が酵素基質から生じる場合はＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着検定）もしくはシンチレーション検定、放射能で標識された同位元素によって放射線を生じる場合は固相放射免疫検定、蛍光原によって蛍光を生じる場合は固相蛍光検定と呼ばれる固相免疫化学試験に用いられる試剤である。
　診断用試剤は、反応体として抗原、抗体または同時にその両者、および反応体に対するまたは分析物質に生物学的親和性を有する他の結合パートナー例えばレクチン、補体、プロテインＡもしくはＧならびにビオチンおよびアビジンの誘導体を含有し、反応体の少なくとも１種を標識することができる。さらに必要に応じて標識の検出用試薬を含有する。またさらに、反応体の１種は固相として存在させることもできる。
　本発明において固相とは、１種または２種以上の反応体が結合した水不溶性担体である。
　担体の例としては、ラテックス粒子、顆粒状の膨潤性または非膨潤性材料、ビーズ、試験管の内壁、試験管構造の特殊な態様としてのマイクロテストプレート、ならびに吸着マトリックスとして記載されている多孔性材料を挙げることができる。
　本発明の試剤は一構成態様として、サンプルを収容するデバイス、たとえばサンプルを収容する容器または、いわゆる「乾燥試薬」試験システムのサンプル吸収域たとえば吸着マトリックスとすることができる。また構成態様を水溶液とすることもできる。この溶液にはまた緩衝剤および必要に応じ安定化添加剤たとえば、分析物質も同様に安定化する物質としてタンパク質または多糖を含有させる。重合体は０．０１〜５０ｇ／ｌ、好ましくは０．１〜２０ｇ／ｌ、とくに好ましくは０．２〜２ｇ／ｌの濃度で存在させる。
　重合体はまたその中で免疫化学反応が起こる診断用試剤の構成成分としてデバイス中に含有させることもできる。
　分析物質を含有し、サンプルとも呼ばれる生物学的材料は、たとえば生検もしくは剖検で得られた組織、血液、血球、血清もしくは血漿、分泌物炎症もしくは非炎症組織からの液体、組織の崩壊生成物および代謝排泄物である。
　本発明はまた、生物学的材料中に含まれる分析物質を免疫化学的に定量する方法において、分析物質を重合体と混合し、混合物を必要に応じて水溶液中でインキュベートし、こうして得られた混合物について免疫化学的定量を実施する方法に関する。
　本発明はまたさらに、このような重合体の免疫化学試験における使用に関する。
　生物学的材料を重合体と混合すると長期間にわたって保存することが可能で、その中に含まれる分析物質の免疫化学的性質は変化することがない。
　反応体の１種が固相中に存在する免疫化学的方法では、上述の処理材料を固相と混合し、また必要に応じて固相の反応体および分析物質の検出試薬のほかに他の免疫化学反応体を混合し、ついで固相を液相から分離し、分析物質を固相または液相のいずれかについて定量するのが好ましい。
実施例
１．水溶性カルボキシル基含有重合体の製造
１．１．無水マレイン酸−プロピレンテロマーのカルボキシレート（ＭＰＴカルボキシレート）　Ｓｔｉｃｋｓｔｏｆｆｗｅｒｋｅ　Ｌｉｎｚの市販製品であるＭＰＴ　１５５（５ｇ）を脱イオン水５００ｍｌに懸濁した。５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を、ついで、撹拌下に１時間かけて滴下した。この混合物をさらに３時間、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを８に維持しながら撹拌した。こうして得られた溶液を２０〜２５℃にさらに１５時間放置してから使用した。
１．２．無水マレイン酸−メチルビニルエーテルテロマーのカルボキシレート（ＭＭＶＴカルボキシレート）
　Ｓｅｒｖａ　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇから入手できるＧａｎｔｒｅｚ　ＡＮ　１７９の商品名の無水マレイン酸−メチルビニルエーテルテロマー５ｇを例１．１に記載したと同様に処理した。
２．固相二側免疫化学法（サンドイッチＥＬＩＳＡ）によるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）定量用試験キットの構成成分の製造
２．１．ＨＢｓに体する抗体で被覆したマイクロテストプレート
　マイクロプレート、すなわち丸型のイムノプレートＩＩ９６Ｆ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ，商品番号２６２１６２）をマウスからのモノクローナル抗−ＨＢｓ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）で被覆した。このためには、ＩｇＧをｐＨ９．６の１００ｍｍｏｌ／ｌ炭酸水素ナトリウムで２ｍｇ／ｌに希釈した。
　マイクロテストプレートの各凹部（ウエル）にこの希釈液１００μｌを加えた。このように充填したテストプレートを２０℃で１８時間放置し、つい
　３〜４回充填、吸引して洗浄し、次にシリカゲル上２０℃でテストプレートを乾燥した。
２．２．抗−ＨＢｓ　ＩｇＧペルオキシダーゼ接合体
　ＨＢｓに対するモノクローナルマウスＩｇＧをＴａｎａｍｏｒｉら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，６２：１２３〜１３１（１９８３）に記載されているようにしてＮ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド（ＧＭＢＳ）と反応させた。２−イミノチオラン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｉ６２５６）をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍから入手した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ，カタログ番号４１３４７０）と、Ｋｉｎｇら：Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７：１４９９〜１５０６（１９７８）に記載されているようにして反応させた。ＩｇＧ−ＰＯＤ接合体はＧＭＢＳ−ＩｇＧ接合体とイムノチオラン−ＰＯＤ接合体から、Ｔａｎａｍｏｒｉの記載に従って調製した。得られたＩｇＧ−ＰＯＤ接合体の溶液のタンパク含量は１．２ｍｇ／ｍｌであった。ＰＯＤとＩｇＧの比率は２．５と測定された。次にこの溶液を、加熱により脱繊
　ｔｒｉｓ５０ｍｍｏｌ／ｌ、クエン酸三ナトリウム１５０ｍｍｏｌ／ｌおよびＮａＣｌ０．５ｍｏｌ／ｌを含有しＨＣｌでｐＨ７．４に調整した溶液でＩｇＧ−ＰＯＤ２４および６μｇ／ｍｌに希釈し、得られた溶液を２４μｌ／ｍ　および６μｇ／ｍｌ抗−ＨＢｓ−ＰＯＤと呼称した。
２．３．ＴＭＢ基質プレパレーション
　抗−ＨＢｓ−ＰＯＤの検出には、２種の保存溶液から調製した過酸化水素およびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）含有基質系または基質プレパレーションを使用した。
　保存溶液１：ＴＭＢ二塩酸塩を二回蒸留精製水に撹拌しながら、濃度５ｇ／ｌすなわち１６ｍｍｏｌ／ｌになるように溶解し、この溶液のｐＨを５Ｎ塩酸で１．５にした。この溶液にペニシリンＧを、撹拌しながら、最終濃度が２００ｍｇ／ｌすなわち０．５６ｍｍｏｌ／ｌになるように加えた。
　保存溶液２：氷酢酸１．４ｍｌ、１Ｎ　ＮａＯＨ　１．５ｍｌ、およびＨ２Ｏ２　２５０ｍｇすなわち３ｍｍｏｌを尿素−過酸化水素付加物として９００ｍｌの二回蒸留精製水に加えた。全成分が完全に溶解したのち、溶液を二回蒸留精製水で全容１ｌとした。
　ＴＭＢ基質プレパレーション：１容量部の保存溶液１と１０容量部の保存溶液を互いに混合した。
３．比較定量および結果
３．１．一工程サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨＢｓの定量
　従来技術の方法、すなわち二工程サンドイッチＥＬＩＳＡによってＨＢｓ陰性と定量されたが、カルボキシル基含有重合体を使用しない一工程サンドイッチＥＬＩＳＡでは０．０４を越える吸光を生じたため確定とは評価されなかった血清も定量に加えた。ＨＢｓ陰性として分類された参考パネルの全サンプルが二工程サンドイッチＥＬＩＳＡで０．０４０未満の吸光しか生じなかったので、このＥＬＩＳＡは偽陽性結果の回避に関しては信頼できるものとして評価された。陰性および陽性対照も同時に定量に加えた。２．１に記載したようにしてＨＢｓに対する抗体で予め被覆したマイクロテストプレートの２個の凹部を各対照および各サンプル毎に使用した。２個の凹部の群に、抗−ＨＢｓ−ＰＯＤ　２４μｇ／ｍｌの溶液２５μｌとこの溶液に１ｇ／ｌのＭＭＶＴカルボキシレートを添加した溶液２５μｌを使用した。各群の各凹部に陰性対照１００μｌもしくは陽性対照１００μｌまたはサンプル１００μｌを導入した。
　このように処理したマイクロテストプレートを３７℃で１時間放置した。次に凹部の内容物を吸引によって除去し、リン酸緩衝生理食塩溶液ｐＨ
を４回反復して凹部を洗浄した。各凹部にＴＭＢ基質プレパレーション１００μｌを導入し、２０〜２２℃で３０分間放置し、ついで１Ｎ硫酸１００μｌを添加した。凹部内の溶液の吸光度を４５０ｎｍにおいて、別の凹部のリン酸緩衝食塩溶液２００μｌのブランク値に対して測定した。
３．２．従来技術の方法、二工程サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨＢｓの定量
　一工程サンドイッチによっても試験した陰性対照１００μｇ、陽性対照１００μｇおよびサンプル１００μｇを、実施例２．１に従ってＨＢｓに対する抗体で被覆したマイクロテストプレートの凹部に導入した。プレートを３７℃で１時間放置した。ついで凹部の内容物を実施例３．１に記載したと同様にして４回洗浄した。抗−ＨＢｓ−ＰＯＢの６μｇ／ｍｌ溶液１００μｌを次に加え、プレートを３７℃で１時間放置した。凹部の内容物を除去し、上述のようにして凹部を洗浄した。ＴＢＳ基質プレパレーションおよび硫酸の添加ならびに溶液の吸収度の測定は実施例３．１に記載したと同様に実施した。
３．３．実施例３．１および３．２によるＨＢｓ定量の測定結果
　陰性対照および陽性対照ならびに１０個の血清サンプルについて、一工程および二工程サンドイッチＥＬＩＳＡにより得られた吸光度を表に示す。サンプルの吸光度のカットオフと呼ばれる、ＨＢｓ陰性と分類される上限値も示す。カットオフ値は陰性対照の吸光度プラス吸光度０．０２５と特定した。
　表から明らかなように、一工程サンドイッチ検定は陽性対照については二工程サンドイッチＥＬＩＳＡよりも高い吸光度を与えたが、二工程検定で陰性と判定されたサンプルが、ＨＢｓ−ＰＯＤ接合体を含む溶液にＭＭＶＴカルボキシレートが添加されていない一工程検定において陽性となっている。
　ＭＭＶＴカルボキシレートを含有する上述の一工程サンドイッチＥＬＩＳＡは、サンプルがＨＢｓ陰性として分類されるべきかの決定に関しては、高感度で、信頼できるものである。測定された吸光度はすべて０．０４０のカットオフ値未満であり、０．０４０の付近の値も示さないからである。
　さらに別の実験において、ＭＰＴカルボキシレート、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸および／またはポリガラクツロン酸を含有する一工程サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたＨＢｓの検定でも同等の結果が得られた。