(57)【要約】  本発明は一般に、医薬品組成物と、多発性骨髄腫（ＭＭ）を予防し緩和し治療する必要のある個体に線維芽増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）の少なくとも１種の抗体を投与するための、多発性骨髄腫を予防し、緩和し、治療するための改善された方法とに関する。詳細には、少なくとも１種のＦＧＲ３抗体は、野生型ＦＧＦＲ３を発現する骨髄腫細胞のアポトーシスを誘発する。
2008519028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦＲ３に対して特異性及び親和性を有する単離された抗体の抗原結合部分を含み、骨髄腫細胞のアポトーシスを誘発する治療上有効な量の分子と、医薬品として許容される担体とを含んだ医薬組成物を、その必要のある対象に投与するステップを含む、Ｂ細胞悪性腫瘍を予防し、緩和し、又は治療する方法。
【請求項２】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍が多発性骨髄腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記骨髄腫細胞が野生型ＦＧＦＲ３を発現している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、ＦＧＦＲ３の細胞外ドメインに対して特異性及び親和性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記単離された抗体の抗原結合部分を含む分子が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、組換え抗体、及びこれらの断片から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子が、モノクローナル抗体又はそのタンパク質分解断片である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体又はそのタンパク質分解断片がＦａｂ断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記単離された抗体の抗原結合部分を含む分子が組換え抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記単離された抗体の抗原結合部分を含む分子が、組換えＦａｂ抗体断片である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記単離された抗体の抗原結合部分を含む分子が、組換え単鎖抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号１〜９のいずれかに示されるポリペプチドからなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ３領域と、配列番号１０〜１８のいずれかに示されるポリペプチドからなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ３領域とを含む、請求項６又は８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号１で示されるＶＨ−ＣＤＲ３領域と、配列番号１０で示されるＶＬ−ＣＤＲ３領域とを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号１９〜２７のいずれかに示されるポリペプチドの群から選択されるＶＨ領域と、配列番号２８〜３６のいずれかに示されるポリペプチドの群から選択されるＶＬ領域とを含む、請求項６又は８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号１９で示されるＶＨ領域と、配列番号２８で示されるＶＬ領域とを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子がＰＥＧ化されている、請求項１１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号３７で示される単鎖Ｆｖである、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子がＰＥＧ化されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号３９〜４７のいずれかに示されるポリヌクレオチド配列によってコード化されたＶＨ−ＣＤＲ３領域と、配列番号４８〜５６のいずれかに示されるポリペプチドからなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ３領域とを含む、請求項６又は８に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号３９で示されるポリヌクレオチド配列によってコード化されたＶＨ−ＣＤＲ３領域と、配列番号４８で示されるＶＬ−ＣＤＲ３領域とを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号５７〜６５のいずれかに示されるポリヌクレオチドの群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコード化されたＶＨ領域と、配列番号６６〜７４のいずれかに示されるポリヌクレオチドの群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコード化されたＶＬ領域とを含む、請求項６又は８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号５７で示されるポリヌクレオチドによってコード化されたＶＨ領域と、配列番号６６で示されるポリヌクレオチドによってコード化されたＶＬ領域とを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号３７で示される配列を有する単鎖Ｆｖである、請求項５に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体の抗原結合部分を含む記分子が、配列番号３７で示される配列を有するポリヌクレオチドによってコード化された単鎖Ｆｖである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＦＧＦＲ３に対して特異性及び親和性を有する単離された抗体の抗原結合部分を含み、ＦＧＦＲ３を発現する悪性Ｂ細胞のアポトーシスを誘発する、治療上有効な量の分子の、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療する医薬を調製するための使用。
【請求項２５】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍が多発性骨髄腫である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ＦＧＦＲ３に対して特異性及び親和性を有する単離された抗体の抗原結合部分を含み、骨髄腫細胞のアポトーシスを誘発する、治療上有効な量の活性成分としての分子と、医薬品として許容される担体とを含む、Ｂ細胞悪性腫瘍を予防し、緩和し、又は治療するための医薬組成物。
【請求項２７】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍が多発性骨髄腫である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、ＦＧＦＲ３の細胞外ドメインに対して特異性及び親和性を有する分子である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記単離された抗体の抗原結合部分を含む分子が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、組換え抗体、及びこれらの断片から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子が、モノクローナル抗体又はそのタンパク質分解断片である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記モノクローナル抗体又はそのタンパク質分解断片がＦａｂ断片である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記単離された抗体の抗原結合部分を含む分子が組換え抗体である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記単離された抗体の抗原結合部分を含む分子が組換えＦａｂ抗体断片である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記単離された抗体の抗原結合部分を含む分子が組換え単鎖抗体である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号１〜９のいずれかに示されるポリペプチドからなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ３領域と、配列番号１０〜１８のいずれかに示されるポリペプチドからなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ３領域とを含む、請求項３０又は３２に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号１で示されるＶＨ−ＣＤＲ３領域と、配列番号１０で示されるＶＬ−ＣＤＲ３領域とを含む、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号１９〜２７のいずれかに示されるポリペプチドの群から選択されるＶＨ領域と、配列番号２８〜３６のいずれかに示されるポリペプチドの群から選択されるＶＬ領域とを含む、請求項３０又は３２に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号１９で示されるＶＨ領域と、配列番号２８で示されるＶＬ領域とを含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子がＰＥＧ化されている、請求項３５から３８までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号３７で示される単鎖Ｆｖである、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子がＰＥＧ化されている、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号３９〜４７のいずれかに示されるポリヌクレオチド配列によってコード化されたＶＨ−ＣＤＲ３領域と、配列番号４８〜５６のいずれかに示されるポリペプチドからなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ３領域とを含む、請求項３０又は３２に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号３９で示されるポリヌクレオチド配列によってコード化されたＶＨ−ＣＤＲ３領域と、配列番号４８で示されるＶＬ−ＣＤＲ３領域とを含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号５７〜６５のいずれかに示されるポリヌクレオチドの群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコード化されたＶＨ領域と、配列番号６６〜７４のいずれかに示されるポリヌクレオチドの群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコード化されたＶＬ領域とを含む、請求項３０又は３２に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記ＦＧＦＲ３に対して特異的親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号５７で示されるポリヌクレオチドによってコード化されたＶＨ領域と、配列番号６６で示されるポリヌクレオチドによってコード化されたＶＬ領域とを含む、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記抗体の抗原結合部分を含む分子が、配列番号３８で示される配列を有するポリヌクレオチドによってコード化された単鎖Ｆｖである、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
抗体又は化学療法薬である少なくとも１種のその他の活性成分と組み合わせた使用に用いられる、請求項２９から４１までのいずれか一項に記載の抗体を活性成分として含む、Ｂ細胞悪性腫瘍を予防し、緩和し、又は治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その必要のある個体に、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）に対する少なくとも１種の抗体を投与することによって、Ｂ細胞悪性腫瘍、特に多発性骨髄腫（ＭＭ）を、予防し、緩和し、治療する、医薬組成物及び方法に関する。具体的には、上記少なくとも１種のＦＧＦＲ３抗体は、野生型ＦＧＦＲ３を発現する骨髄腫細胞のアポトーシスを誘発する。
【背景技術】
【０００２】
（線維芽細胞増殖因子）
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、発達過程で調節され且つ広く様々な組織内に発現する、２０種を超える構造的に関連のあるポリペプチドのファミリーを構成する。ＦＧＦは、増殖、細胞移動、及び分化を刺激し、骨格及び四肢の発達、創傷治癒、組織修復、血液新生、血管形成、及び腫瘍形成で主要な役割を演ずる（Ｏｒａｉｔｚ及びＩｔｏｈ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００１，２（３）：ｒｅｖｉｅｗｓ  ３００５．１〜３００５．１２に概説されている）。
【０００３】
ＦＧＦの生物学的作用は、タンパク質キナーゼである受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）ファミリーに属する特定の細胞表面受容体によって媒介される。これらのタンパク質は、細胞外リガンド結合ドメイン、１回膜貫通ドメイン、及びＦＧＦとの結合によりリン酸化に付される細胞内チロシンキナーゼドメインからなる。ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）細胞外領域は、３つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ループ又はドメイン（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）、酸性ボックス、及びヘパリン結合ドメインを含有する。多数の受容体変種をコード化する４つのＦＧＦＲ遺伝子が、今日までに明らかにされている。
【０００４】
（Ｂ細胞関連の悪性腫瘍）
Ｂ細胞腫瘍物には、前駆Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫（前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病）、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、形質異細胞骨髄腫／形質細胞腫、ＭＡＬＴタイプの結節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、外套細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、及び多発性骨髄腫が含まれる。
【０００５】
（多発性骨髄腫）
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、形質細胞の致命的な造血器悪性腫瘍である。ＩｇＨスイッチ組換えを受ける形質細胞は、典型的には骨髄に戻り、そこで存在する。骨髄間質との相互作用が、悪性形質細胞の増殖及び腫瘍形成をもたらす。髄内骨髄腫の進行は、溶解性骨疾患及び骨粗しょう症、高カルシウム血症、貧血、免疫不全、及び腎不全を含めた益々重篤な２次的特徴に関連する。
【０００６】
多発性骨髄腫は、非ホジキンリンパ腫の次に広く蔓延している血液癌である。これは、全ての癌の約１％を占め、全ての癌死亡の２％を示す。多発性骨髄腫が発症するピーク年齢は６５から７０才であるが、最近の統計では、罹患率が上昇し且つ発症年齢がより早くなったことが示されている。
【０００７】
何十年もの間、ＭＭの治療は、細胞毒性化学療法、主に標準用量経口投与でのメルファランとプレドニゾンとの併用を基礎にしてきた。骨髄毒性を低下させるための、高用量メルファラン療法と自家骨髄移植との併用（Ｃｈｉｌｄ他（２００３）ＮＥＪＭ  ３４８；１９  １８７５〜１８８３）も評価されており、全体の生存期間を、標準用量化学療法よりもやや上昇させている。
【０００８】
いくつかの遺伝的決定因子は、ＭＭの発症及び進行の原因であることが示されている。ＭＭの症例の約１５％〜２０％は、染色体転座、ｔ（４；１４）（ｐ１６．３；ｑ３２）を伴っており、ｄｅｒ（４）からのＭＭＳＥＴ及びｄｅｒ（１４）からのＦＧＦＲ３の発現を調節解除している。特に野生型ＦＧＦＲ３は、非常に高いレベルで異所的に発現するようになり、骨髄腫細胞内で増殖性シグナルを誘発する。この転座は、ＭＭでの主な現象であることが示されており、場合によってはＦＧＦＲ３の変異の活性化を疾患の進行につれて獲得する。最近の研究では、ｔ（４；１４）を有する患者が特に悪い予後になることを実証している。
【０００９】
ＦＧＦＲ３は、ＭＭの治療標的であることが、生体外及び生体内での動物研究によって確認されている。原則として、ＭＭの治療に有用な理想的なＦＧＦＲ３阻害剤は、下記の性質、即ち
ＦＧＦＲ３を認識し、野生型及び変異型のＦＧＦＲ３の活性化形態を阻害することができ、
ＦＧＦＲ３に特異的であり、即ちその他のＦＧＦＲ又はチロシンキナーゼタンパク質を阻害せず、
生体適合性があり、即ち患者に対して非免疫原性であり無毒性であり、
血流中での半減期が長い
という性質を示す。
【００１０】
本発明の譲受人の一部に同時譲渡された国際特許出願公開ＷＯ  ０２／１０２９７３は、受容体チロシンキナーゼに対する抗体、特に抗線維芽増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）抗体を開示している。ＦＧＦＲ３に特異的であることが示されたある抗体は、ＦＧＦＲ３活性を中和し、軟骨形成不全などの骨格形成異常及び膀胱癌などの増殖性疾患の治療に有用である。この開示は、とりわけ多発性骨髄腫も含め、ＦＧＦ受容体が関与していることが分かっている増殖性疾患の一覧を示している。
【００１１】
国際特許出願公開ＷＯ  ０３／００４０５６は、骨髄腫細胞にアポトーシスを誘発させるＫｌ２１様抗体を使用して、多発性骨髄腫を治療する方法について教示している。
【００１２】
ＰＥＧ化は、生体内でのより高い溶解性とより長い循環寿命を実現するために、単鎖とモノクローナルの両方の抗体を修飾するのに用いられている。ＰＥＧ（４００００）は、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）腫瘍性タンパク質に特異的なｍａｂ、Ｎ１２及びＬ２６に結合する（Ｈｕｒｗｉｔｚ他（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４９  ２２６〜２３４）。Ｋｏｕｍｅｎｉｓ他（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．１９８  ８３〜９５（２０００））も、ＰＥＧ結合によって、ヒト化抗ＩＬ−８のＦ（ａｂ’）２形態の循環半減期の延長を実現した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
化学療法及び放射線両方を含めたＢ細胞悪性腫瘍を治療する伝統的な方法は、毒性ある副作用が原因でその有用性に限度があった。モノクローナル抗体の使用は、標的抗原を発現する細胞に対するその毒性を制限する。当技術分野では、多発性骨髄腫の予防又は治療に有効な抗ＦＧＦＲ３抗体が、まだ明らかにされていない。
【００１４】
本明細書におけるどの文献の引用も、そのような文献が適切な従来技術であり又は本出願の任意の請求項の特許性に対して重要と考えられることを認めるものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、初めて、多発性骨髄腫を含めたＢ細胞悪性腫瘍の治療に非常に有効な治療薬を提供する。多発性骨髄腫は難病であり、従来の療法は、患者の５％にしか完全な寛解がもたらされず、全体の平均生存期間はわずかに約３６カ月である。今回、２量体ＦＧＦＲ３細胞外ドメインに特異的なヒト組換え抗体が、多発性骨髄腫のあるサブタイプを予防し、緩和し、又は治療するのに非常に有効であることを開示する。
【００１６】
一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３に対して特異性及び親和性を有する単離された抗体の抗原結合部分を含んだ治療上有効な量の分子であって、ＦＧＦＲ３を発現する骨髄腫細胞のアポトーシスを誘発する分子と、医薬品として許容される担体とを、その必要のある対象に投与するステップを含む、多発性骨髄腫を予防し、緩和し、又は治療する方法に関する。
【００１７】
別の態様は、ＦＧＦＲ３に対して特異性及び親和性を有する単離された抗体の抗原結合部分を含む分子であって、ＦＧＦＲ３を発現する骨髄腫細胞のアポトーシスを誘発する分子の、多発性骨髄腫を治療する薬剤を製造するための使用に関する。
【００１８】
本発明の別の態様は、ＦＧＦＲ３に対して特異性及び親和性を有する単離された抗体の抗原結合部分を含んだ治療上有効な量の分子を、活性成分として含む、Ｂ細胞悪性腫瘍を予防し、緩和し、又は治療するための医薬組成物に関する。
【００１９】
本明細書に記述される分子及びその組成物のいくつかは、国際特許出願ＷＯ  ０２／１０２９７２に開示されており、その教示を、本発明の出願人の一部に同時譲渡された本明細書で完全に述べるかのように、参照により本明細書に組み込む。これらの組成物は、骨格形成異常及び増殖性疾患の治療に有用であることが既に開示された。この分子は、野生型と恒常的に活性な型の両方のＦＧＦＲ３を阻害するのに有効であることが示された。ＷＯ  ０２／１０２９７２は、特定の徴候の治療に有用な特定の化合物に関する本発明の特許請求の範囲を、予測していない開示である。ここでは、前記知られている組成物のいくつかが、多発性骨髄腫の治療及び緩和に特に有効であることを開示する。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）に対して特異性及び親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、組換え抗体、及びこれらの断片から選択される。好ましい抗体種は組換え抗体である。より好ましい抗体種は、組換え単鎖抗体及び組換えＦａｂ抗体から選択される。単鎖抗体は、抗原結合能力を有し且つ免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変領域に対して相同な又は類似するアミノ酸配列を含んだ単鎖複合体ポリペプチド、即ち連鎖型ＶＨ−ＶＬ又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）にすることができる。
【００２１】
ある実施形態では、本発明は、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）に対して特異性及び親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子であって、配列番号１〜９のいずれかに記載されるポリペプチド配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３領域、及び配列番号１０〜１８のいずれかに記載されるポリペプチド配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３領域を含む分子と、医薬品として許容される担体とを含んだ医薬組成物を投与することを含む、多発性骨髄腫を予防し、緩和し、又は治療する方法を提供する。対応するＶＨ−ＣＤＲ３領域及びＶＬ−ＣＤＲ３領域のポリヌクレオチド配列を、配列番号３９〜４７及び配列番号４８〜５６にそれぞれ示す。これらの配列は、本発明の譲受人の一部に譲渡されたＷＯ  ０２／１０２９７２に開示されている。
【００２２】
１つの好ましい実施形態によれば、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）に対して特異性及び親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子は、配列番号１で示されるポリペプチド配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３領域、及び配列番号１０で示されるポリペプチド配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３領域と、医薬品として許容される担体とを含む。ＶＨ−ＣＤＲ３領域及びＶＬ−ＣＤＲ３領域の対応するポリヌクレオチド配列を、配列番号３９及び配列番号４８にそれぞれ示す。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号１で示されるポリペプチド配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３領域、及び配列番号１０で示されるポリペプチド配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３領域を含む、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）に対して特異性及び親和性を有する抗体の抗原結合部分と、医薬品として許容される担体（ＰＲＯ−ＯＯ１と示す）とを含む、多発性骨髄腫を予防し、緩和し、又は治療するための医薬組成物である。
【００２４】
様々な追加の実施形態によれば、本発明は、線維芽細胞増殖因子受容体３に対して特異性及び親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む治療上有効な分子であって、配列番号１９〜２７のいずれかに示されるポリペプチド配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号２８〜３６のいずれかに示されるポリペプチド配列を有するＶＬドメインを含む分子と、医薬品として許容される担体とを含んだ組成物を投与するステップを含む、多発性骨髄腫を予防し、緩和し、又は治療する方法を提供する。ＶＨ及びＶＬドメインの、対応するポリヌクレオチド配列を、配列番号５７〜６５及び配列番号６６〜７４にそれぞれ示す。
【００２５】
ある好ましい実施形態によれば、線維芽細胞増殖因子受容体３に対して特異性及び親和性を有する抗体の抗原結合部分を含む分子は、配列番号１９で示されるポリペプチド配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号２８で示されるポリペプチド配列を有するＶＬドメインと、医薬品として許容される担体とを含む。ＶＨ及びＶＬドメインの、対応するポリヌクレオチド配列を、配列番号５７及び配列番号６６にそれぞれ示す。
【００２６】
さらに別の好ましい実施形態では、医薬組成物は、配列番号３８の対応するポリヌクレオチド配列を有する、配列番号３７で示されるポリペプチド配列を有する単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）と、医薬品として許容される担体とを含む。
【００２７】
また本発明は、ＦＧＦＲ３に免疫特異的に結合する１個又は複数のＰＥＧ化抗体及びその断片を含んだ医薬組成物も提供する。この場合、ＰＥＧ化抗体及びその断片は、ＦＧＦＲ３に結合し中和する能力によって決定される際、天然の分子の生物活性を保持している。
【００２８】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、配列番号３７で示されるポリペプチド配列を有するＰＥＧ化単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）を含み、ロイシン、即ちＮ末端の当初のアミノ酸をセリンに代えて、目標とされるＰＥＧ化を可能としている。
【００２９】
ある実施形態では、抗体の抗原結合ドメインを含む分子の親和性は、結合アッセイ及びＢＩＡｃｏｒｅ（生体分子相互作用分析システム）を含めた当技術分野で知られている方法によって測定される。ある実施形態によれば、抗体の抗原結合ドメインの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ反応器で測定したときに約３０ｎＭ未満であり、好ましくは約１５ｎｍ未満であり、より好ましくは約５ｎｍ未満である。
【００３０】
別の実施形態では、本発明の医薬組成物を、別の治療薬と組み合わせて患者に投与する。そのようなその他の治療薬は、抗体又は化学療法薬でよい。化学療法薬は、多発性骨髄腫の治療で一般に使用され、メルファラン、ドキソルビシン、カルムスチン、シクロホスファミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、及びレナリドマイドを含めることができる（しかしこれらに限定するものではない）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）に対して特異性及び親和性を有する抗体が、生体外及び生体内で骨髄腫細胞のアポトーシスを誘発させるという発見に基づく。
【００３２】
本発明は、ＦＧＦＲ３に対して特異性及び親和性を有する単離された抗体の抗原結合部分を含んだ治療上有効な量の分子であって、骨髄腫細胞のアポトーシスを誘発させる分子と、医薬品として許容される担体とを含んだ医薬組成物を、その必要のある対象に投与するステップを含む、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療する方法に関する。１つの好ましい実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は多発性骨髄腫である。
【００３３】
本発明はさらに、Ｂ細胞悪性腫瘍、好ましくは多発性骨髄腫を予防し、緩和し、又は治療する薬剤を製造するための、少なくとも１個の抗ＦＧＦＲ３抗体の使用に関する。
【００３４】
いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、抗ＦＧＦＲ３抗体は、間質と骨髄腫細胞との間の接着を妨げる可能性がある。この相互作用は、骨髄腫形質細胞の増殖及び疾患の進行に極めて重要であり、溶解性骨疾患などの局所的徴候、及び免疫無防備状態や貧血などの全身性徴候をもたらす。
【００３５】
本発明の譲受人の一部に同時譲渡された国際特許出願ＷＯ  ０２／１０２９７２は、特異的な抗線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）抗体を含む、受容体タンパク質チロシンキナーゼに対するモノクローナル抗体を開示する。ファージディスプレー抗体ライブラリーから抗体（例えばＦａｂ）をスクリーニングするための、ＦＧＦＲ３受容体の細胞外ドメインの可溶性２量体形態の利用は、ＦＧＦＲ３に結合し且つリガンド結合を妨げる、非常に数多くの高親和性（ＫＤ＜５０ｎＭ）抗体（Ｆａｂ）をもたらし、それによってＦＧＦＲ３のリガンド依存的活性が阻止される。ある抗体は、ＦＧＦＲ３に対して特異的であり、ＦＧＦＲ３活性を中和するのに、また軟骨形成不全などの骨格形成異常及び膀胱癌などの増殖性疾患の治療に有用であることが示された。リガンド依存的な、又は恒常的な活性を阻止するのに有用な追加の抗体も、特定され単離された。
【００３６】
本発明者等はこの度、その出願に開示された一定の分子が、ＦＧＦＲ３発現骨髄腫細胞、特に多発性骨髄腫患者の骨髄間質中に位置する骨髄腫細胞で、アポトーシスを誘発させるのに非常に有効であることを発見した。ここでは、これらの分子を、多発性骨髄腫の予防、緩和、及び治療について開示する。
【００３７】
便宜のため、本明細書、実施例、及び特許請求の範囲で用いられるある用語について、以下に述べる。
【００３８】
「線維芽細胞増殖因子受容体」又は「ＦＧＦＲ」という用語は、典型的には細胞外リガンド結合ドメイン、１回膜貫通ヘリックス、及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインを含む、ＦＧＦによって生じたシグナルを細胞内部に伝達するのに必要な、ＦＧＦに特異的な受容体を示す。ＦＧＦＲ細胞外ドメインは、３つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）、ヘパリン結合ドメイン、及び酸性ボックスからなる。多数の受容体タンパク質変種をコード化する４個のＦＧＦＲ遺伝子が分かっている。ＦＧＦＲ３  ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、この受容体の少なくとも２個の既知のアイソフォーム、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ及びＦＧＦＲ３ＩＩＩｂを生成する。
【００３９】
本明細書及び以下の特許請求の範囲全体を通して、「ＦＧＦＲ３特異的」という用語は、ＦＧＦＲ３ポリペプチドに対して又はこれをコード化するポリヌクレオチドに対して、別のＦＧＦ受容体タンパク質又はポリヌクレオチドよりも高い親和性又は活性又は結合性を有する任意のエフェクターを指す。エフェクターは、リガンド、阻害剤、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は小有機分子、例えばチロシンキナーゼ阻害剤などを含めた任意の分子にすることができる。「ＦＧＦＲ３特異的」という用語は、エフェクターが別のＦＧＦ受容体サブタイプに対して若干の活性を有する状況を、排除又は除外しないことを明白に理解すべきである。さらに、別の受容体サブタイプを介して媒介された活性が、観察される治療上の有用性に臨床上重要である場合、これは明らかに、特許請求の範囲で請求される本発明の範囲に包含されることを理解すべきである。
【００４０】
本明細書で使用される「親和性」は、単一の抗原連結部位と１価の抗原決定基との反応の強度を指す。親和性は、結合定数として測定される。
【００４１】
抗体の特異性は、いくつかの抗原決定基との反応を可能にし、且つその他とは反応させない抗体の性質である。特異性は、結合部位の化学組成、物理力、及び分子構造に依存する。
【００４２】
本明細書で使用される、形質細胞骨髄腫としても知られる「多発性骨髄腫」は、形質細胞の増殖性血液疾患を指す。多発性骨髄腫は、骨髄内の過剰な数の異常形質細胞と、無傷のモノクローナル免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ）又はベンス−ジョーンズタンパク質の過剰産生によって特徴付けられる。高カルシウム血症、貧血、腎障害、細菌感染に対する高罹患率、及び正常免疫グロブリンの不十分な産生は、多発性骨髄腫の一般的な臨床徴候である。また、びまん性骨粗しょう症及び軸骨格で主に観察される溶解性骨病変によっても、しばしば特徴付けられる。
【００４３】
本明細書で使用する「間質」は、骨髄内の細胞、及び骨髄腫細胞の周囲の支持組織を指す。骨髄腫細胞と骨髄との接着は、骨髄腫の増殖を強化する。
【００４４】
本発明の一態様は、ＦＧＦＲ３の活性を減少させ又は阻害する抗体の抗原結合部分を含む分子と、医薬品として許容される担体とを投与することによって、多発性骨髄腫を予防し、緩和し、又は治療する方法を対象とする。本発明の一実施形態によれば、抗体の抗原結合部分は、ＦＧＦＲ３の細胞外ドメインに向けられる。
【００４５】
本発明の一実施形態は、ＦＧＦＲ３のリガンド依存的活性化を阻止する抗原結合ドメインを含む分子を対象とする。
【００４６】
本発明による、抗体の抗原結合部分を有する分子は、ＦＧＦＲ３のリガンド依存的活性化及び／又はリガンド非依存的（恒常的）活性化を阻止するのに有用である。ＨｕＣＡＬ（登録商標）（Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ）クローンと呼ばれる抗体ライブラリーから得られたそのような抗体／分子の好ましい実施形態を、表１に示し、独自のＶＨ−ＣＤＲ３及びＶＬ−ＣＤＲ３配列を表２に示す。
【００４７】
表１：多発性骨髄腫の阻害、治療、又は緩和に有用な抗体の性質
【表１】
2008519028.tif 000003
キーポイント：ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ１に対するそれぞれの分子の親和性（ｎＭ）は、ＢＩＡｃｏｒｅ及び／又はＦＡＣＳにより測定した。ＩＣ５０は、ＦＧＦ９で行ったＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ３増殖アッセイにおいて、抗原結合部位を有するある分子の２量体ｄＨＬＸフォーマットに関して決定した。Ｆａｂ−ｄＨＬＸは、Ｆａｂモノマーの２量体が、発現ベクターの挿入後に融合タンパク質として生成される、Ｆａｂミニ抗体フォーマットを指す。ＢＩＡｃｏｒｅによって得られた値は、抗体と受容体との間の相互作用が特異的であることを実証した。
【００４８】
表２：ＶＨ−ＣＤＲ３及び対応するＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列
【表２】
2008519028.tif 000004
【００４９】
ＶＨは可変重鎖を指し、ＶＬは可変軽鎖を指し、ＣＤＧ３は相補性決定領域３を指す。ある好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１〜９のいずれかに示されるポリペプチド配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３領域、及び配列番号１０〜１８のいずれかに示されるポリペプチド配列を有する対応するＶＬ−ＣＤＲ３領域を含む治療上有効な分子と、医薬品として許容される担体とを含んだ組成物を投与することを含む、多発性骨髄腫を治療し又は予防する方法を提供する。ＶＨ−ＣＤＲ３及びＶＬ−ＣＤＲ３領域の、対応するポリヌクレオチド配列は、配列番号３９〜４７及び配列番号４８〜５６のいずれか１つにそれぞれ示される。ポリヌクレオチド配列を表３に示す。
【００５０】
ある実施形態によれば、本発明は、配列番号１９〜２７のいずれか１つに示されるポリペプチド配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号２８〜３６のいずれか１つに示されるポリペプチド配列を有する対応するＶＬドメインを含む、治療上有効な分子と、医薬品として許容される担体とを含んだ組成物を投与することを含む、多発性骨髄腫を治療し又は予防する方法を提供する。好ましいＶＨ及びＶＬ配列を本明細書に示す。
【００５１】
【化１】
2008519028.tif 000005
【００５２】
【化２】
2008519028.tif 000006
【００５３】
【化３】
2008519028.tif 000007
【００５４】
【化４】
2008519028.tif 000008
【００５５】
【化５】
2008519028.tif 000009
【００５６】
【化６】
2008519028.tif 000010
【００５７】
【化７】
2008519028.tif 000011
【００５８】
【化８】
2008519028.tif 000012
【００５９】
【化９】
2008519028.tif 000013
【００６０】
【化１０】
2008519028.tif 000014
【００６１】
【化１１】
2008519028.tif 000015
【００６２】
【化１２】
2008519028.tif 000016
【００６３】
【化１３】
2008519028.tif 000017
【００６４】
【化１４】
2008519028.tif 000018
【００６５】
【化１５】
2008519028.tif 000019
【００６６】
【化１６】
2008519028.tif 000020
【００６７】
【化１７】
2008519028.tif 000021
【００６８】
【化１８】
2008519028.tif 000022
【００６９】
ＶＨ及びＶＬドメインの、対応するポリヌクレオチド配列は、配列番号５７〜６５及び配列番号６６〜７４をそれぞれ有する。
【００７０】
【化１９】
2008519028.tif 000023
【００７１】
【化２０】
2008519028.tif 000024
【００７２】
【化２１】
2008519028.tif 000025
【００７３】
【化２２】
2008519028.tif 000026
【００７４】
【化２３】
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【００７５】
【化２４】
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【００７６】
【化２５】
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【００７７】
【化２６】
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【００７８】
【化２７】
2008519028.tif 000031
【００７９】
【化２８】
2008519028.tif 000032
【００８０】
【化２９】
2008519028.tif 000033
【００８１】
【化３０】
2008519028.tif 000034
【００８２】
【化３１】
2008519028.tif 000035
【００８３】
【化３２】
2008519028.tif 000036
【００８４】
【化３３】
2008519028.tif 000037
【００８５】
【化３４】
2008519028.tif 000038
【００８６】
【化３５】
2008519028.tif 000039
【００８７】
【化３６】
2008519028.tif 000040
【００８８】
さらに別の好ましい実施形態では、医薬組成物は、対応するポリヌクレオチド配列、配列番号３８を有する、配列番号３７で示される単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）と、医薬品として許容される担体とを含む。ポリペプチド配列及びポリヌクレオチド配列のそれぞれを、ここに示す。
【００８９】
ＰＲＯ−００１  ｓｃＦｖポリペプチド  ｆ配列番号３７）
【化３７】
2008519028.tif 000041
【００９０】
ＰＲＯ−００１  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ  ｆ配列番号３８）
【化３８】
2008519028.tif 000042
【００９１】
表３：ＶＨ−ＣＤＲ３及び対応するＶＬ−ＣＤＲ３ポリヌクレオチド配列
【表３】
2008519028.tif 000043
【００９２】
（抗体）
自然抗体又は免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって共に結び付けられた２つの重鎖と２つの軽鎖とを有し、各軽鎖はジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖に「Ｙ」字形構造に結び付けられている。抗体のタンパク質分解性消化は、Ｆｖ（可変断片）ドメイン及びＦｃ（結晶性断片）ドメインをもたらす。抗原結合ドメインＦａｂは、ポリペプチド配列が様々に異なる領域を含む。Ｆ（ａｂ’）２という用語は、ジスルフィド結合によって共に結び付けられた２つのＦａｂ’アームを表す。抗体の中心軸を、Ｆｃ断片と呼ぶ。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後にいくつかの定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有し、この軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと位置合わせされており、軽鎖定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と位置合わせされている。
【００９３】
軽鎖及び重鎖の各対の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖及び重鎖上のドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、４つのフレームワーク領域を含み、その配列は比較的保存され、相補性決定領域として知られる３つの超可変領域（ＣＤＲ１〜３）により接合される。これらのドメインは、抗原結合部位の特異性及び親和性に寄与する。
【００９４】
重鎖のアイソタイプ（γ、α、δ、ε、又はμ）は、免疫グロブリンの種類（それぞれＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ）を決定する。軽鎖は、全ての抗体の種類で見出される２つのアイソタイプ（カッパ、Κ、又はラムダ、λ）のいずれかである。
【００９５】
「抗体」又は「抗体の抗原結合部分を有する分子」という用語は、抗原上の特異的エピトープに結合することが可能であり、且つポリクローナル混合物からなるものでも又は本質的にモノクローナルからなるものでよい免疫グロブリン分子を指す。抗体は、自然源から又は組換え源から得られた免疫グロブリン全体又はその断片でよい。本発明による抗体は、例えば全抗体、抗体断片、又は別の免疫学的活性なその断片、例えば相補性決定領域などを含めた様々な形で存在することができる。同様に抗体は、機能的抗原結合ドメイン、即ち重鎖及び軽鎖可変ドメインを有する抗体断片でよい。抗体断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ  Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、２重特異性抗体、ダイアボディ、及びトリアボディからなる群から選択される形態で存在してもよい。
【００９６】
本発明の範囲内には、キメラ抗体；ヒト及びヒト化抗体；単一ドメイン抗体；組換え及び設計製作された抗体と、その断片が含まれる。さらに、抗体の可変領域をコード化するＤＮＡを、その他の抗体をコード化するＤＮＡに挿入して、キメラ抗体を生成することができる（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）。単鎖抗体は、本発明の範囲内に包含される。単鎖抗体は、抗原結合能力を有し且つ免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変領域（結び付けられたＶＨ−ＶＬ又は単鎖ＦＶ（ｓｃＦｖ））に対して相同性又は類似性があるアミノ酸配列を含む、単鎖複合体ポリペプチドにすることができる。ＶＨ及びＶＬの両方は、自然モノクローナル抗体配列をコピーすることができ、或いはこの鎖の一方又は両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５０９１５１３号に記載されるタイプのＣＤＲ−ＦＩＬ構造を含むことができる。軽鎖及び重鎖の可変領域から切り離されたポリペプチド類似体は、ポリペプチドリンカーによって一緒に保持される。そのような単鎖抗体を生成する方法、特に、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のポリペプチド構造をコード化するＤＮＡが知られている方法は、例えば、そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４９４６７７８号、第５０９１５１３号、及び第５０９６８１５号に記載されている方法に従って実現することができる。
【００９７】
さらに、ＣＤＲ移植を行って、親和性又は特異性を含めた抗体分子のある性質を変化させることができる。ＣＤＲ移植の非限定的な例は、米国特許第５２２５５３９号に開示されている。
【００９８】
本明細書で使用する「抗体の抗原結合部分を有する分子」は、任意のアイソタイプ及び任意の動物細胞系又は微生物により生成された無傷の免疫グロブリン分子だけではなく、その抗原結合反応性部分も含むものとし、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ１断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、その重鎖及び／又は軽鎖の可変部分、Ｆａｂミニ抗体（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９３／１５２１０；米国特許第５９１０５７３号；ＷＯ９６／１３５８３；ＷＯ９６／３７６２１参照）、２量体２重特異性ミニ抗体（Ｍｕｌｌｅｒ他，１９９８  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４３２：４５〜４９参照）及びそのような反応性部分を組み込んだキメラ又は単鎖抗体、並びにそのような抗体反応性部分が物理的に挿入されている任意のその他のタイプの分子又は細胞であって、例えばキメラＴ細胞受容体やそのような受容体を有するＴ細胞など、又はそのような反応性部分を含有する分子の一部を用いて治療用部分を送達するように開発された分子が含まれるが、これらに限定するものではない。そのような分子は、酵素切断、ペプチド合成、又は組換え技法を含むがこれらに限定することのない、任意の知られている技法によって提供することができる。
【００９９】
本明細書で使用する「Ｆｃ」という用語は、食作用を媒介し、炎症を引き起こし、Ｉｇを特定の組織に向ける免疫グロブリン分子の部分（結晶化可能な断片）を意味し、Ｆｃ部分は補体活性化にも重要である。
【０１００】
本発明の一実施形態では、ＲＰＴＫの細胞外ドメインと免疫グロブリン定常ドメインとの融合を含むキメラを、受容体に対するリガンドのアッセイを行うのに、また抗体及びその断片をスクリーニングするのに役立つように構成することができる。
【０１０１】
「細胞外ドメイン」は、本明細書で使用する場合、通常その細胞の外側に位置する本明細書に開示されるＦＧＦＲ３のポリペプチド配列を指す。細胞外ドメインは、成熟ＦＧＦＲ３の、隣接する（Ｃ末端）疎水性膜貫通及び細胞内配列の一部又は全てが欠失しているポリペプチド配列を包含する。したがって、細胞外ドメイン含有ポリペプチドは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの一部とを含むことができる。或いは、好ましい実施形態では、ポリペプチドがＦＧＦＲ３の細胞外ドメインのみ含む。切断型細胞外ドメインは、一般に可溶性である。熟練した専門家なら、ＦＧＦＲ３の細胞外及び膜貫通ドメインを、これらのドメインが描写されている既知のＲＰＴＫ（受容体タンパク質チロシンキナーゼ）アミノ酸配列とアライメントを行うことによって、容易に決定することができる。或いは、疎水性膜貫通ドメインは、ポリペプチド配列の疎水性プロットに基づいて容易に描写することができる。細胞外ドメインは、膜貫通ドメインのＮ末端側にある。
【０１０２】
「エピトープ」という用語は、抗体又はその断片によって結合することが可能な任意の分子の部分であって、その抗体により認識することもできる部分を指すものとする。エピトープ又は抗原決定基は、通常、アミノ酸や糖側鎖など、分子の化学的に活性な表面の群からなり、特異的３次元構造特性並びに特異的電荷特性を有する。
【０１０３】
「抗原」は、抗体によって結合することが可能な分子又は分子の一部であって、さらに動物に、この抗原のエピトープに結合することが可能な抗体を生成させることが可能な分子又は分子の一部である。抗原は、１つ又は複数のエピトープを有することができる。上述の特異的反応は、抗原が、高度に選択的な手法によってこの抗原に対応する抗体と反応し、且つその他の抗原によって引き起こされる可能性のある多数のその他の抗体とは反応しないことを示すものとする。
【０１０４】
本明細書で使用する「中和抗体」は、明細書の通りに生体内又は生体外アッセイによって決定される際、受容体を介する活性又はシグナル伝達を低下させ又は阻害（阻止）することが可能な、特定の受容体に対する抗原結合部位を有する分子を指す。
【０１０５】
「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」は、特定の抗原に対して実質的に同種の抗体集団である。ｍＡｂは、当業者に知られている方法により得ることができる。例えば、これら文献の内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６（５５  １７）：４９５〜４９７（１９７５）；米国特許第４３７６１１０号；Ａｕｓｕｂｅｌ他（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８７〜１９９９）；Ｈａｒｌｏｗ他，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８８）；及びＣｏｌｌｉｇａｎ他（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９２〜２０００）を参照されたい。本発明のｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びこれらの任意のサブクラスを含めた任意の免疫グロブリンの種類でよい。ｍＡｂを生成するハイブリドーマは、生体外又は生体内で培養することができる。ｍＡｂの高い力価は、生体内での生成によって得ることができ、個々のハイブリドーマからの細胞を、初期プライム化Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射することにより、高濃度の所望のｍＡｂを含有する腹水を生成する。アイソタイプＩｇＭ又はＩｇＧのｍＡｂは、そのような腹水から、又は培養上澄みから、当業者に周知のカラムクロマトグラフィ法を使用して精製することができる。
【０１０６】
キメラ抗体は、その分子の異なる部分が異なる動物種から得られる分子であって、例えば、マウスｍＡｂから得られる可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有するような分子である。実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と呼ぶ）から得られる可変領域フレームワーク残基、及び実質的にマウス抗体（ドナー抗体と呼ぶ）から得られる相補性決定領域を有する抗体を、ヒト化抗体とも呼ぶ。キメラ抗体は、例えばマウスｍＡｂが、ハイブリドーマからのより高い収量を有するがヒトにおける免疫原性がより高い場合、主に、適用の際に免疫原性を低下させ且つ生成の際に収量を増加させるために使用し、したがってヒト／マウスキメラｍＡｂが使用されるようになる。キメラ抗体及びその生成方法は、当技術分野で知られている（Ｂｅｔｔｅｒ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４Ｏｄ（４８５５）：１０４１〜１０４３（１９８８）；Ｃａｂｉｌｌｙ他，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１（１１）３２７３〜７（１９８４）；Ｌｉｕ他，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８４（１０）：３４３９〜３４４３（１９８７）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１（２１）：６８５１〜６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２（５９９５）：６４３〜６４６（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（６００８）：２６８〜２７０（１９８５）；Ｃａｂｉｌｌｙ他，欧州特許出願第１２５０２３号、第１７１４９６号、第１７３４９４号、第１８４１８７号、第１７３４９４号、国際特許出願ＷＯ  ８６／０１５３３、ＷＯ  ９７／０２６７１、ＷＯ  ９０／０７８６１、ＷＯ  ９２／２２６５３、及び米国特許第５６９３７６２号、第５６９３７６１号、第５５８５０８９号、第５５３０１０１号、及び第５２２５５３９号）。これらの参考文献を、参照により本明細書に組み込む。
【０１０７】
生体内で抗体を産生する従来の方法の他に、抗体は、ファージディスプレー技術を使用して生体外で生成することができる。そのような組換え抗体の生成は、従来の抗体生成に比べてさらに速く、膨大な数の抗原に対して生成することができる。これとは対照的に、従来の方法では、多くの抗原が非免疫原性であり又は極めて毒性が高いことが判明し、したがって動物で抗体を生成するのに使用することができない。さらに、組換え抗体の親和性成熟（即ち、親和性及び特異性の増大）は、非常に単純であり且つ比較的速い。最後に、特定の抗原に対する多数の種々の抗体を、１つの選択手順で生成することができる。組換えモノクローナル抗体を生成するには、全てがファージディスプレーライブラリーを基にした様々な方法を使用することができ、それによって、異なる抗原認識部位を有する抗体の大きなプールが生成される。そのようなライブラリーは、いくつかの方法で作製することができる。１つは、重鎖生殖系列遺伝子のプール内で合成ＣＤＲ３領域をクローニングすることによって、合成レパートリーを生成することができ、したがって、そこから様々な特異性を有する組換え抗体断片を選択することができる、大きな抗体レパートリーが生成される。１つは、抗体ライブラリーを構成するための出発材料として、ヒトのリンパ球プールを使用することができる。ヒトＩｇＭ抗体の未処置のレパートリーを構成することが可能であり、したがって、極めて多様なヒトライブラリーを生成することが可能である。この方法は、種々の抗原に対して多数の抗体を選択するために、首尾良く広範にわたって使用されている。バクテリオファージライブラリーの構成及び組換え抗体の選択に関するプロトコルは、周知の参考テキスト、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｉｇａｎ他（編），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２〜２０００），Ｃｈａｐｔｅｒ  １７，Ｓｅｃｔｉｏｎ  １７．１に示されている。
【０１０８】
（薬理）
本発明は、ＦＧＦＲ３に対して特異性及び親和性を有する分子であって骨髄腫細胞のアポトーシスを誘発する分子の１種又は複数を活性剤として含む、本明細書に様々に記述される状態を治療し又は予防するための医薬品を製造するための、獣医学用及びヒト医療用の両方に向けた医薬品製剤も企図するものである。
【０１０９】
そのような医薬及び薬物製剤では、活性剤は、この活性剤のための１種又は複数の医薬品として許容される担体、及び任意選択で、任意のその他の治療成分と共に利用することが好ましい。担体は、製剤のその他の成分と適合するがそのレシピエントに対して過度に有害ではないという意味で、医薬品として許容されなければならない。活性剤は、上述のように、所望の薬理効果を実現するのに有効な量で、且つ所望の日用量を実現するのに適切な量で提供される。
【０１１０】
典型的な場合、抗体の抗原結合部分を含み、或いはペプチド擬態の拮抗リガンド若しくは可溶性受容体又は有機分子若しくはポリヌクレオチドを含んだ別のポリペプチドを含む本発明の分子は、治療目的のために滅菌生理食塩液中に懸濁されることになる。或いは医薬組成物は、活性成分（抗体の抗原結合部分を含む分子）の放出が制御されるように、又はその患者の系内での存在が延長されるように処方することができる。非常に数多くの適切な薬物送達システムが知られており、例えば移植可能な薬物放出システム、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、及び小球体などが含まれる。制御放出調合剤は、本発明による分子と複合体を形成し又は本発明による分子を吸着するためにポリマーを使用することによって調製することができる。例えば生体適合性ポリマーは、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のマトリックスと、ステアリン酸ダイマー及びセバリン酸のポリ無水物コポリマーのマトリックスを含む。そのようなマトリックスからの、本発明による分子の放出速度、即ち抗体又は抗体断片の放出速度は、分子の分子量、マトリックス内の分子の量、及び分散した粒子のサイズに依存する（Ｓａｌｔｚｍａｎ他，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ，５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ他，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０（１１）：１４４６〜９（１９９２））。その他の固体剤形は、Ａｎｓｅｌ他，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，第５版（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）及びＧｅｎｎａｒｏ（編），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９０）に記載されている。
【０１１１】
本発明の医薬組成物は、経口、局所、鼻内、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、関節内、病変内、又は非経口など、任意の適切な手段によって投与することができる。通常、静脈内（ｉ．ｖ．）、関節内、局所、又は非経口投与が好ましい。
【０１１２】
本発明による分子の治療上有効な量は、とりわけ投与スケジュール、投与される分子の単位用量、分子をその他の治療薬と組み合わせて投与するか否か、患者の免疫状態及び健康、投与される分子の治療活性、及び治療を行う医師の判断に依存することが、当業者に明らかであろう。本明細書で使用する「治療上有効な量」は、経時的に、治療される障害に関連した１つ又は複数の症状を軽減させるのに必要とされる、分子の量を指す。
【０１１３】
本発明の分子の適切な投与量は、投与経路、分子のタイプ（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機分子など）、年齢、体重、性別、又は患者の状態に応じて様々に変化し、最終的には医師が決定すべきであるが、経口投与の場合、１日の投与量は、一般に体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから約５００ｍｇの間、好ましくは約０．０１ｍｇから約５０ｍｇの間、より好ましくは約０．１ｍｇから約１０ｍｇの間にすることができる。非経口投与の場合、１日の投与量は、一般に体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇから約１００ｍｇの間、好ましくは約０．００１ｍｇから約１０ｍｇの間、より好ましくは約０．０１ｍｇから約１ｍｇの間にすることができる。１日の投与量は、例えば毎日１〜４回に分けて投与する典型的な投薬計画で、投与することができる。その他の好ましい投与方法には、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから約１００ｍｇを関節内投与することが含まれる。有効量に到達するための様々な問題が、例えばＧｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０に記載されている。
【０１１４】
活性成分としての本発明の分子は、医薬品として許容され且つ周知の活性成分に対して適合性ある賦形剤に、溶解し、分散され、又は混合される。適切な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセロール、又はエタノールなど、及びこれらの組合せである。その他の適切な担体は、当業者に周知である。さらに望むなら、組成物は、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの、少量の補助物質を含有することができる。
【０１１５】
本発明の分子の１種又は複数と、メトトレキセートやグルココルチコイドなどの抗炎症薬とを組み合わせた治療は、ＦＧＦＲ３活性を阻害するためのより効率的な治療を提供することができる。一実施形態では、医薬組成物は、抗体、抗炎症薬、及び医薬品として許容される担体を含む。
【０１１６】
（ポリヌクレオチド）
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などの分子を指し、適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。この用語は、均等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたＲＮＡ又はＤＮＡの類似体を、また記述される実施形態に適用されるように、１本鎖（センス又はアンチセンス）及び２本鎖ポリヌクレオチドも含むと理解すべきである。
【０１１７】
本発明の範囲内には、多発性骨髄腫を治療するための医薬品の調製に有用な、抗ＦＧＦＲ３抗体をコード化する核酸分子が含まれる。核酸分子は、当業者に十分理解されるように、配列番号５７〜７４のいずれか１つに示される上記コード化ヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％の配列同一性、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。重鎖及び軽鎖の超可変領域では、核酸分子が、配列番号３９〜５６のいずれか１つに示される分子に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは約７０％、より好ましくは約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１１８】
また本発明は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号５７〜７４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド又はその相補体とハイブリダイズする核酸も提供する。本明細書で使用する高ストリンジェント条件は、約５％〜２５％までの配列多様性、好ましくは約５％〜１５％の配列多様性に寛容なものである。限定することなく、高ストリンジェント（ハイブリッドの計算されたＴｍよりも１０℃低い）条件の例としては、０．１×ＳＳＣ（標準食塩クエン酸緩衝液）及び０．５％ＳＤＳの洗浄溶液を、ハイブリッドの計算されたＴｍよりも低い適切なＴｉで使用する。この条件の最終的なストリンジェンシーは、特に、使用されるハイブリダイゼーション条件によって安定性の低いハイブリッドが安定なハイブリッドと共に形成される場合、主に洗浄条件に起因する。したがって、より高いストリンジェンシーでの洗浄条件は、安定性の低いハイブリッドを除去する。上述の、高度にストリンジェントな条件から中程度にストリンジェントな条件で使用することができる一般的なハイブリダゼーション条件は、６×ＳＳＣ（又は６×ＳＳＰＥ）、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性、断片化サケ精子ＤＮＡの溶液での、適切なインキュベーション温度Ｔｉでのハイブリダイゼーションである。適切な高ストリンジェンシー条件に関しては、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。
【０１１９】
ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーション実験及び洗浄で使用される温度、ハイブリダイゼーション溶液中及び洗浄溶液中の１価の陽イオンのモル濃度、及びハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージの関数である。一般に、プローブでのハイブリダイゼーションによる感度は、プローブの量及び特異的活性、標的核酸の量、標識の検出可能性、ハイブリダイゼーション速度、及びハイブリダイゼーションの持続時間の影響を受ける。ハイブリダイゼーション速度は、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関するＴｍよりも２０〜２５℃低いＴｉ（インキュベーション温度）、及びＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに関するＴｍよりも１０〜１５℃低いＴｉで最大になる。約１．５ＭのＮａ＋のイオン強度によっても最大になる。この速度は、２重鎖の長さに正比例し、ミスマッチの程度に逆比例する。
【０１２０】
しかし、ハイブリダイゼーションにおける特異性は、所望のハイブリッドと「バックグラウンド」のハイブリッドとの間での、安定性の差の関数である。ハイブリッドの安定性は、２重鎖の長さ、塩基組成、イオン強度、ミスマッチ、及び不安定化剤（少しでも存在する場合）の関数である。
【０１２１】
完全ハイブリッドのＴｍは、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関して
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ
のように、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ及びＷａｈｌの方程式を使用して（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８（２）：２６７〜８４（１９８４））推定することができ、またＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに関しては、
Ｔｍ＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．５８（％ＧＣ）−１１．８（％ＧＣ）２−０．５６（％ｆｏｒｍ）−８２０／Ｌ
のように推定することができ、
但しＭは、１価の陽イオンのモル濃度、０．０１〜０．４Ｍ  ＮａＣｌであり、
％ＧＣは、ＤＮＡ中のＧ及びＣヌクレオチドのパーセンテージ、３０％〜７５％であり、
％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、
Ｌは、塩基対におけるハイブリッドの長さである。
【０１２２】
Ｔｍは、それぞれ１％のミスマッチごとに、０．５〜１．５℃だけ低下する（計算のそれぞれに関して、Ｉ℃の平均を使用することができる）。Ｔｍは、実験的により決定してもよい。上記法的式でハイブリッドの長さ（Ｌ）が増加するにつれ、Ｔｍが上昇し且つ安定性が増大し、完全長ラット遺伝子配列をプローブとして使用することができる。
【０１２３】
フィルターハイブリダイゼーションは、典型的には６８℃で且つ高イオン強度（例えば５〜６×ＳＳＣ）で実施されるが、これはストリンジェントなものでなく、その後、１回又は複数の洗浄を行ってストリンジェンシーを高め、最後の１回が、最終的に望まれる高ストリンジェンシーになる。Ｔｍに関する方程式は、最終洗浄に関して適切なＴｉを推定するのに使用することができ、又は完全２重鎖のＴｍを実験により決定し、次いでＴｉをそれに応じて調節することができる。
【０１２４】
また本発明は、分子の保存的アミノ酸変種も提供する。本発明による変種は、コード化されたタンパク質の分子構造全体を保存するものを作製することもできる。開示されたタンパク質生成物を含む個々のアミノ酸の性質が与えられると、いくつかの合理的な置換が当業者によって認識されることになる。アミノ酸置換、即ち「保存的置換」は、例えば関係する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
【０１２５】
多くの治療用ヒトタンパク質は、循環内でのその半減期が短く且つ安定性が低くなっており、したがって治療効果を維持するには、高用量の使用が必要である。ＰＥＧ化は、ＰＥＧをタンパク質に共有結合させる方法である（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ他（２００３）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５５  ２１７〜２５０に概説されている）。ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）は、有機溶媒並びに水に溶解する独特のポリマーであり、無毒性で、腎臓経路及び肝臓経路の組合せによって排除され、したがって、医薬品としての用途で使用するのに理想的なものになる。ＰＥＧ化タンパク質は、通常、血液循環内で著しく延長された半減期を有し、免疫原性及び抗原性が低下する一方でその生物活性が維持される。
【０１２６】
タンパク質に関する初期の研究では、Ｍｗ  ５０００のＰＥＧをしばしば利用した。しかし、より高いＭｗの、より少ないストランドのＰＥＧ、例えばＭｗが２００００又は４００００であるＰＥＧも用いられる。
【０１２７】
したがって本発明は、本発明の分子がＰＥＧ化したものも提供する。具体的には本発明は、生体内での半減期が延びたために、対象に対する前記抗体又はその断片の投与量及び／又は投与頻度を減少させることが可能な、ＦＧＦＲ３に対して特異性及び親和性を有するＰＥＧ化モノクローナル抗体又はその断片を包含する。
【０１２８】
この分子は、Ｍｗ  ５０００からＭｗ  ４００００に及ぶ異なる分子量のＰＥＧ分子を使用するが好ましくはＭｗ  ５０００から２００００のＰＥＧ分子を使用する、当技術分野で周知のＰＥＧ化法のいずれかによって（Ｌｅｅ他（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０  ９７３〜９８１）ＰＥＧ化することができる。
【０１２９】
分子の生物活性に対して最小限の障害を有するＰＲＧ化を可能にするために、ＰＥＧ部分を、分子のＮ末端に付加することができる。このため、Ｎ末端のアミノ酸（位置２）がロイシンではなくセリンである本発明のｓｃＦｖ分子（配列番号３７）が生成され、これで、目標とするＰＥＧ化か可能になった。
【０１３０】
これまで本発明について十分に述べてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく且つ過度な実験を行うことなく、広範にわたる同等のパラメータ、濃度、及び条件内で同じことを実施できることが、当業者に理解されよう。
【０１３１】
本発明について、その特定の実施形態に関連して述べてきたが、さらなる修正が可能であることが理解されよう。本出願は、一般に、本発明の原理に従って、且つ本発明が関係する技術分野の範囲で知られており又は慣行に含まれるような、また添付される特許請求の範囲の通りに上記にて述べた本質的な特徴に適用することができるような、本発明の開示からの逸脱も含めて、本発明の任意の変形例、使用例、適用例、包含するものとする。
【０１３２】
学術雑誌論文又は要約、公開され又は対応する米国の又は外国の特許出願、発行された米国の又は外国の特許、或いは任意のその他の参考文献を含めた、本明細書で引用される全ての参考文献は、そこに引用された参考文献に示される全てのデータ、表、図、及び文も含めて、参照によりその全体を本明細書に組み込む。さらに、本明細書で引用される参考文献の中で引用された参考文献の内容全体も、参照によりその全体を組み込む。
【０１３３】
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な本質を完全に明らかにし、他の者は、当業者の範囲内の知識を利用することによって（本明細書で引用される参考文献の内容を含む）、必要以上の実験をすることなく、また本発明の一般的概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を容易に修正し且つ／又は様々な適用例に適合させることができる。したがって、そのような適合例及び修正例は、本明細書に提示される教示及び指針に基づいて、開示される実施形態の均等物の意味及び範囲内にあるものとする。本発明の語法又は用語は説明を目的とするものであって限定を目的するものではなく、したがって本明細書の用語又は語法は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書に提示される教示及び指針に照らすことにより、当業者によって解釈されることを理解すべきである。
【実施例】
【０１３４】
（方法）
（細胞系及び組織培養）
誘導的な手法でＦＧＦＲ３を発現する、非形質転換ラット軟骨細胞系（ＲＣＪ−ＦＧＦＲ３）については、既に記述されている（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｒ．他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３；２７８：３８１９４〜２０５）。細胞を、１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｏｎｔａｒｉｏ，カナダ）、２μｇ／ｍｌテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，カナダ）、及び５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）が補われたα−最小必須培地で維持した。ＦＧＦＲ３発現は、テトラサイクリンの除去及び血清飢餓によって誘発させた。マウス骨髄前駆細胞系（ＦＤＣＰ−１）に、完全長ＦＧＦＲ１（ＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ１）、ＦＧＦＲ２（ＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ２）、ＦＧＦＲ３（ＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ３）、又はＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ突然変異ｃＤＮＡをトランスフェクトし、１０％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ、及び５μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ）と共にＩｓｃｏｖｅ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で培養した。ヒト骨髄細胞系（ＵＴＭＣ２、Ｈ９２９、ＫＭＳＩｌ、ＫＭＳ１８、８２２６）は、２．５％ＦＣＳ及びペニシリン−ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）が補われたＩｓｃｏｖｅ修飾Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）で維持した。ＷＴ  ＦＧＦＲ３を発現するＢ９細胞（Ｂ９−ＦＧＦＲ３ＷＴ）、ＦＧＦＲ３−Ｆ３８４Ｌを発現するＢ９細胞（Ｂ９−ＦＧＦＲ３Ｆ３８４Ｌ）、ＦＧＦＲ３−Ｙ３７３Ｃを発現するＢ９細胞（Ｂ９−ＦＧＦＲ３Ｙ３７３Ｃ）、ＦＧＦＲ３−Ｇ３９４Ｄを発現するＢ９細胞（Ｂ９−ＦＧＦＲ３Ｇ３９４Ｄ）については、既に記述されている（Ｐｌｏｗｒｉｇｈｔ  ＥＥ他，Ｂｌｏｏｄ．２０００；９５：９９２〜９９８；Ｔｒｕｄｅｌ  Ｓ他，Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５：２９４１〜８）。これらを、５％ＦＣＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、及び１％ＩＬ−６調整培地が補われたＩＭＤＭで維持した。骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）を、ＭＭ患者から得られた骨髄（ＢＭ）標本から得て、前述のように調製した（Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ  Ｔ他，Ｂｌｏｏｄ  ２０００；９６：２９４３〜２９５０）。ＢＭＳＣを、集密になるまで６ウェルプレート上で増殖させ、次いで以下に示すアポトーシス研究のために２０Ｇｙを照射した。
【０１３５】
（免疫沈降及び免疫ブロット）
細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｎｐ−４０、１ｍｇ／ｍｌ完全プロテアーゼ阻害剤ミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ））に溶解し、１２０００×ｇで１５分間の遠心分離によって清澄化した。溶解産物を、抗ＦＧＦＲ３（Ｃ１５）と共に４℃で１６時間免疫沈降にかけ、７．５％ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び抗ホスホチロシン（Ｒ＆Ｄからの４Ｇ１０）によるウェスタンブロットによって分析した。タンパク質バンドを、ホースラディッシュペルオキシダーゼに連結された２次抗体及びＰｉｅｒｃｅからのＥＣＬキットを使用して、製造業者の取扱い説明書に従って視覚化した。
【０１３６】
（生存度アッセイ）
細胞生存度を、３−（４，５−ジメチルチアゾール）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）又は指示される場合には（２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリイウム水酸化物（ＸＴＴ）の染料吸光度によって評価した。細胞を、培養培地中で９６ウェルプレートに、ウェル当たり２００００個（ＦＤＣＰ−Ｉ細胞）、５０００個（Ｂ９細胞）、又は２５０００個（ＭＭ細胞系）の密度で播いた。細胞を、下記のサイトカインの１種、即ち１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ９及び５μｇ／ｍｌヘパリン、１％マウスＩＬ−６、５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−Ｉ、又は指示される場合には５０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６の１種が存在しない状態で又は存在下でインキュベートし、ＰＲＯ−００１、対照抗体（精製されたヒトＦａｂ）、又は１００ｎＭ  ＰＤ１７３０７４の濃度を増加させた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間又は７２時間インキュベートした。ＭＴＴ及びＸＴＴアッセイを、製造業者の取扱い説明書に従って実施した（それぞれＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ及びＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，イスラエル）。各実験条件は、２重に又は３重に実施した。
【０１３７】
（増殖アッセイ）
細胞増殖を、［３Ｈ］−チミジン組込みアッセイによって決定した。ＵＴＭＣ２細胞（２００００細胞／ウェル）を、ビヒクル対照又は５μｇ／ｍｌ  ＰＲＯ−００１の存在下、９６ウェルプレートで３７℃でインキュベートした。［３Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ）を、各ウェルに８時間添加した。細胞を、自動細胞収集器でガラスフィルタ上に収集し、ＰＡＣＫＡＲＤ  ＴＯＰ計数器（ＣＡＮＢＥＲＰＡ  ＰＡＣＫＡＲＤ，カナダ）で計数した。
【０１３８】
（フローサイトメトリー分析）
細胞（５×１０５）を、冷リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで下記の１種、即ちＰＲＯ−００１  Ｆａｂ又はヒトＦａｂ対照抗体、ウサギ抗ＦＧＦＲ３（１００）、又はウサギ免疫前血清の１種と共にＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。次いで細胞を、ＰＥ共役ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２２次抗体又はヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＰＥで、氷上で３０分間染色した。フローサイトメトリーをＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で実施し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。ＦＧＦリガンドが結合を競い合う能力を評価するために、細胞を、３０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ及び５μｇ／ｍｌヘパリンの存在下又は存在しない状態で、３０分間インキュベートし、次いで上述のＰＲＯ−００１  Ｆａｂで染色した。
【０１３９】
（細胞内リンタンパク質染色）
フローサイトメトリーによるＥＲＫ  １／２リン酸化の決定については、既に記述されている（Ｃｈｏｗ  Ｓ．他，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２００１；４６：７２〜７８）。細胞に、血清飢餓処理を一晩行い、次いで３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ及び１０μｇ／ｍｌのヘパリンで、３７℃で１０分間刺激を与えた。最終濃度２％が得られるように、１０％ホルムアルデヒドを培地に直接添加することによって、細胞を固定した。細胞を、３７℃の固定液中で１０分間インキュベートし、次いで氷上でさらに２分間インキュベートした。氷冷メタノールを撹拌しながら添加することによって（最終濃度９０％に）、細胞の透過化処理を行い、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳに４％ＦＣＳを加えたもので洗浄し、抗ＥＲＫＩ１／２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＴＥｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で１５分間染色し、次いで指示される場合には、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）共役ヤギ抗ウサギ及び抗ＣＤ  １３８−ＰＥ（ＰｈａｒＭｉｎｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識した。悪性腫瘍細胞は、高レベルのＣＤ１３８を発現する細胞であることが確認された。フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（登録商標）フローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で実施し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。
【０１４０】
（アポトーシス分析）
アポトーシスの研究のため、細胞を、ＢＭＳＣで被覆され且つ対照（ビヒクル又は抗体）又は５μｇ／ｍｌ  ＰＲＯ−００１が補充された６ウェルプレートに初期密度２．５×１０５／ｍＬで播き、４８時間培養した。アポトーシスを、アネキシンＶ染色により決定し（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶは、細胞膜中でホスホジチル−セリンに特異的に結合するタンパク質である。結合は、膜が破壊され始めると生じ、リン脂質が細胞外媒体中に放出される。
【０１４１】
（１次患者サンプル）
研究用に特定された患者は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって、ｔ（４；１４）転座を有することが決定された。ＦＧＦＲ３の発現を、前述のフローサイトメトリーにより確認した（Ｃｈｅｓｉ  Ｍ．他，Ｂｌｏｏｄ．２００１；９７：７２９〜７３６）。簡単に言うと、赤血球を溶解し、骨髄単核細胞を氷上で３０分間、ウサギ抗ＦＧＦＲ３（Ｈ１００）又はウサギ免疫前血清と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ及びマウス抗ＣＤ１３８−ＰＥで染色して、ＭＭ細胞を特定した。次いでサンプルを、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１４２】
全てのｔ（４；１４）陽性サンプルを、ＦＧＦＲ３突然変異の存在に関してさらに分析した。４対のプライマーを、突然変異を活性化させるための既知のホットスポットである、細胞外（ＥＣ）ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、チロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインのコドン、及び終止コドン（ＳＣ）を含有するＦＧＦＲ３の領域が増幅されるように設計した。最初のＰＣＲ反応は、ＣＤ１３８精製骨髄腫細胞から抽出されたゲノムＤＮＡで実施され、単位複製配列をＤＨＰＬＣ分析のために使用した。結果は、ＰＤＲ産物の配列分析によって確認された。
【０１４３】
細胞死分析では、骨髄吸引液から新たに単離された単核細胞を、フィコール−ハイパック比重沈降によって分離し、２０％ＦＣＳ、１％グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン、及び３０ｎｇ／ｍｌ  ａＦＧＦ、及び１０μｇ／ｍｌヘパリンが補われたＩＭＤＭ中、５×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で播いた。細胞を、対照又は５μｇ／ｍｌ  ＰＲＯ−００１の存在下で、最長１２日間培養した。培地、ａＦＧＦ／ヘパリン、及び薬物を、３日ごとに補充した。３、７、及び１２日後、細胞を、抗ＣＤ３８−ＰＥ、抗ＣＤ４５−サイクローム（ＰｈａｒＭｉｎｏｇｅｎ）、及びＦＩＴＣ結合アネキシンＶで３回染色し、又は抗ＣＤ１３８−ＰＥ及びＦＩＴＣ結合アネキシンＶで標識した。対照は、非染色細胞、アイソタイプ対照染色細胞、及び１回染色細胞を含んでいた。悪性腫瘍形質細胞は、ＣＤ１３８又は高レベルのＣＤ３８を発現し、ＣＤ４５（ＣＤ３８＋＋／ＣＤ４５−）を全く発現しないか若しくは低レベルで発現する細胞と定義した。サンプルを、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用したＦＡＣＳｃａｎによって分析した。骨髄吸引液は、ＩＲＢ承認プロトコル下での同意により得られた。
【０１４４】
（異種移植マウスモデル）
ＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで２×１０６細胞／２００μｌ  ＰＢＳで再懸濁した。細胞を、ＣＤ１ヌード成体メス（Ｈａｒｌａｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，イスラエル）に対してそのマウスの側腹部の片側又は両方に、２５Ｇ針を用いて皮下注射（Ｓ．Ｃ．）した。処理は、細胞接種後１週間で開始したが、このときマウスを無作為化して、ＰＲＯ−００１又は等体積のＰＢＳのみ与えた。投薬は、３週間にわたり、腹腔内（ＬＰ．）注射によって毎週２回実施した。マウスを２〜４日ごとに追跡し、発症した腫瘍について、カリパを使用して３次元で寸法を測定した。腫瘍体積は、これら３つの値を掛けることによって推定した。
【０１４５】
（ＰＥＧ化）
ＰＲＯ−００１  Ｓｅｒ  ｓｃＦｖを、ＰＢＳ中で５倍に希釈して１ｍｇ／ｍｌにし、１０倍過剰な過ヨウ素酸塩を用いて室温で１０分間酸化させた。この反応を、さらに１５分間、酸化剤よりも１０倍過剰なジアミノプロパノールを添加することによって終了させた。酸化した材料を、ＰＢＳに対して室温で２時間透析し、次いで５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．３）に対して室温でさらに透析することによって、ｐＨを低下させた。ｍＰＥＧ−ＨＺ−５Ｋ及びｍＰＥＧ−ＨＺ−２０Ｋ（ＩＤＢから購入）を酢酸（ｐＨ５．３）に溶解し、それぞれ１０倍及び２．５倍過剰なモル数で、酸化したＰＲＯ５９ｓｃＳｅｒに添加した。水に溶解したｍＰＥＧ−ＨＺ−４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒから購入）を、酸化した単鎖に１．３当量添加した。反応生成物を、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって２４時間後に分析した。
【０１４６】
（実施例１：ＰＲＯ−００１の遮断活性及びＦＧＦＲ３に対する選択性）
ヒト抗ＦＧＦＲ３  Ｆａｂ  ＰＲＯ−００１を、示差的全細胞パニング法を使用して（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｒ．他，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３；２７８：３８  １９４〜２０５）、Ｈｕ−ＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ−１ヒトコンビナトリアルライブラリーから単離した。ＦＡＣＳ分析は、ＰＲＯ−００１  ＦａｂがＷＴ  ＦＧＦＲ３に結合すること、及びＢ９−ＦＧＦＲ３ＷＴ細胞との結合を、ＦＧＦを添加することによって減少できることを明らかにし、ＰＲＯ−００１及びＦＧＦは共通のエピトープを共有するという考えを裏付けている（図１Ａ）。図１Ｂは、ＰＲＯ−００１が、ＦＧＦ刺激Ｂ９−ＦＧＦＲ３ＷＴ細胞の増殖を阻害することを示す。この増殖阻害は、用量依存的である。ミリリットル当たり１マイクログラムの抗体（１μｇ／ｍｌ）は、約２５％だけ増殖を阻害するが、５μｇ／ｍｌの抗体は、６０％よりも多く増殖を阻害する。さらに、ＰＲＯ−００１は、ＦＧＦＲ３突然変異Ｆ３８４Ｌを発現するＢ９細胞のＦＧＦ刺激増殖（ＦＧＦＲ３の非形質転換多形）並びにＧ３９４Ｄ及びＹ３７３Ｃ−ＦＧＦＲ３を発現する細胞のＦＧＦ刺激増殖（ＭＭ患者で特定された恒常的に活性化したＦＧＦＲ３突然変異）も、用量依存的な手法で阻害し、このときＩＣ５０は、ＦＧＦ結合を阻害する能力と一致した約３μｇ／ｍｌである。
【０１４７】
ＰＲＯ−００１がＦＧＦＲ３のキナーゼ活性を阻害することを確認するために、本発明者等は、ＰＲＯ−００１が、ＷＴ  ＦＧＦＲ３をトランスフェクトしたＲＣＪ細胞（ＲＣＪ−ＦＧＦＲ３）においてリガンド刺激受容体リン酸化に及ぼす影響について試験をした。抗ホスホチロシン免疫ブロットでは、ＰＲＯ−００１によって阻害されるが対照Ｆａｂによっては阻害されないリガンド刺激によるＦＧＦＲ３の自己リン酸化が高まることが明らかにされた（図１Ｃ）。ＦＧＦＲ３活性化の阻害は、下流のＪＮＫリン酸化の低減に関連していた。細胞ベースアッセイでのＰＲＯ−００１の特異性及び遮断活性を確認するために、本発明者等は、ＦＤＣＰ−１細胞系を発現するＦＧＦＲ１〜３に対するＰＲＯ−００１の活性について試験をした。ＦＤＣＰ−１の細胞増殖は、通常、ＩＬ−３の存在に依存する。しかしＩＬ−３は、同族ＲＴＫを発現する細胞内で、ＦＧＦリガンドにより置換することができる。ＤＦＣＰ−ＦＧＦＲ３細胞のＦＧＦ刺激増殖は、ＰＲＯ−００１によって強力に阻害され、このときのＩＣ５０（細胞の５０％を阻害する濃度）は０．５μｇ／ｍｌであった（図１Ｄ）。これとは対照的に、ＦＧＦＲ１又はＦＧＦＲ２を発現するＦＤＣＰ−１細胞の増殖は、１０倍高い濃度まで影響を受けなかった。したがってＰＲＯ−００１は、ＦＧＦＲ３の非常に特異的で強力な阻害剤である。
【０１４８】
（実施例２：抗ＦＧＦＲ３は、ＦＧＦ刺激ＵＴＭＣ２ヒト骨髄腫細胞の生存能力を阻害する）
ＰＲＯ−００１を、ＦＧＦＲ３を発現するｔ（４；１４）骨髄腫細胞系：ＷＴ  ＦＧＦＲ３を発現するＵＴＭＣ２細胞、及びＷＴ  ＦＧＦＲ３を発現するＨ９２９細胞であって、下流のＮ−Ｒａｓの活性化突然変異を含む細胞について試験をした。ＦＧＦ及びＰＲＯ−００１（５μｇ／ｍｌ）、対照抗体（アイソタイプ）、又は１００ｎＭ  ＰＤ  １７３０７４の存在下での細胞増殖を、ＭＴＴアッセイにより決定した。ＦＧＦ刺激ＵＴＭＣ２細胞の増殖は、ＰＲＯ−００１によって著しく阻害された（図２）。ＰＲＯ−００１によるＵＴ１ＶＥＣ２のＦＧＦ刺激増殖の阻害は、ＰＤ  １７３０７４によって誘発されたものと同等であった（キナーゼドメインに結合し阻害するＡＴＰ類似体）。ＦＧＦＲ３発現が不十分な８２２６細胞、及びＨ９２９細胞は、ＰＲＯ−００１及びＰＤ  １７３０７４の両方に耐性があり、どちらの試薬もＲａｓの上流で作用し且つＦＧＦＲ３を選択的に標的とすることを示している。
【０１４９】
ＰＲＯ−００１は、ＫＭＳｌ  １（ＦＧＦＲ３−Ｙ３７３Ｃ）及びＫＭＳ１８（ＦＧＦＲ３−Ｇ３８４Ｄ）、突然変異ＦＧＦＲ３を発現しＦＧＦとは無関係に増殖する細胞の生存能力を阻害できなかった。
【０１５０】
（実施例３：抗ＦＧＦＲ３は、ＦＧＦ刺激ＵＴＭＣ２ヒト骨髄腫細胞の下流ＥＲＫ１／２リン酸化を阻害する）
図３は、フローサイトメトリーにより検出したときの、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体と共にＦＧＦ刺激ＵＴＭＣ２細胞をインキュベーションした後の細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）１／２リン酸化の阻害を示す。リン酸化ＥＲＫのレベルは、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体と共にインキュベーションした後の非刺激細胞の場合に戻っている。
【０１５１】
（実施例４：ＩＬ−６及びＩＧＦ−Ｉは、抗ＦＧＦＲ３に対する耐性を与えない）
図４は、ＦＧＦ９（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）、又はＩＧＦ−Ｉ（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激を与え、抗ＦＧＦＲ３抗体で処理した細胞の、生存度を示す。ＩＬ６及びＩＧＦ−Ｉは骨髄腫細胞を刺激し、そのため抗ＦＧＦＲ３抗体による処理に対して感受性を有したままである。これらの結果は、薬物耐性を与えることが分かっているパラクリン因子が、ＦＧＦＲ阻害の潜在的な抗腫瘍作用を克服できないことを実証している。細胞は、ＦＧＦＲ阻害剤、対照としてＰＤ１７３０７４で処理した。
【０１５２】
（実施例５：抗ＦＧＦＲ３は、骨髄間質細胞と共に同時培養したＵＴＭＣ２細胞のアポトーシスを誘発する）
抗ＦＧＦＲ３は、骨髄間質細胞、ＢＭＳＣと同時培養したときに、ＵＴＭＣ２細胞のアポトーシスを高レベルで誘発し、したがって骨髄腫細胞の環境を模倣する（図５）。抗体は、ＢＭＳＣに対する直接的な毒性がない。これらのデータは、ＦＧＦＲ３小分子キナーゼ阻害剤を使用した先の研究と一致している。
【０１５３】
（実施例６：抗ＦＧＦＲ３は、原発性骨髄腫細胞を発現するＦＧＦＲ３のアポトーシスを誘発する）
次の実験は、ＰＲＯ−００１が原発性ヒトＭＭ細胞に及ぼす影響を試験するために設計された。骨髄サンプルを、１０名の患者から得たが、そのうち５つは、ＦＩＳＨによってｔ（４；１４）陽性であることが既に明らかにされている。フローサイトメトリーによるＦＧＦＲ３発現の測定及びＦＧＦＲ３遺伝子型を含めたサンプルの特徴を、表Ｉにまとめる。試験をしたｔ（４；１４）陽性サンプルの中で、ＣＤ１３８骨髄腫細胞は、ＦＦＲ３の表面発現を示し、ＦＧＦＲ３の突然変異は確認されなかった。図６Ａは、ＦＧＦＲ３を発現する細胞が、抗ＦＧＦＲ３抗体によって明らかにされ（黒色の線）、アイソタイプ対照によっては明らかにされなかった（灰色の線）ことを示す。図６Ｂは、ＦＧＦに曝された細胞（薄い灰色）と比較した場合、ＰＲＯ−００１が、骨髄腫細胞でのＦＧＦ誘導ＥＲＫリン酸化を阻止したことを示す（濃い灰色）。非刺激細胞を、比較のため示す（濃い領域）。
【０１５４】
最後に、新たな骨髄サンプルから単離された単核細胞画分を、５μｇ／ｍｌ  ＰＲＯ−００１又はアイソタイプ対照と共にインキュベートし、ＣＤ３８＋＋／ＣＤ４５−細胞のアネキシンＶ染色及び表面ＣＤ１３８発現の減少によって、アポトーシスを決定した。全てのＦＧＦＲ３発現骨髄腫サンプルは、対照抗体と比較した場合、ＰＲＯ−００１に対して強力なアポトーシス応答を示した（図７は、代表的な実験を示す）。さらに細胞傷害効果は、ｔ（４；１４）陰性サンプルがＰＲＯ−００１に対する応答で高いアポトーシスを示さなかった点で、選択的であった。
【０１５５】
【表４】
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キーポイント：ＣＤ１３８原発性ＭＭ細胞でのＦＧＦＲ３発現は、フローサイトメトリーによって分析し、蛍光は、下記の通りに示した：＋、弱い；−Ｈ−  中間；＋＋＋  強い；−  無し。ＣＤ１３８選択細胞を、ＦＧＦＲ３突然変異に関してスクリーニングした。ＷＴは野生型状態を示し、Ｎ／Ｄは、決定されなかったことを示す。
【０１５６】
（実施例７：ＳＣＩＤマウス腫瘍モデル）
生体内での抗ＦＧＦＲ３の潜在的な抗腫瘍作用を評価するために、本発明者等は、構成性突然変異体ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃを発現するＦＤＣＰ細胞（ＦＤＣＰ−ＦＧＦＲＳ８２４９０）を注射したヌードマウスを含む動物モデルを使用した。ＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃは、ＩＬ−３及びＦＧＦが存在しない状態で増殖し、ヌードマウスに注射すると素早く（２〜３週間以内で）腫瘍を形成する。ＰＲＯ−００１は、生体外で、ＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ３Ｓ２４９ＣのＦＧＦ非依存型増殖を効率的に阻止した（図８Ａ）。
【０１５７】
ヌードマウスの２箇所の部位、即ち側腹部のそれぞれに１回ずつ、２×１０６  ＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ細胞をそれぞれ皮下注射した。細胞注射から１週間後、マウスをＰＲＯ−００１  Ｆａｂで処置した。処置の最初の１週間の間に、ＦＧＦＲを飽和させるため、マウスには１匹当たり約１ｍｇという比較的高い用量を与えた。この後、続けて行われるＦａｂ送達の１２日間の間に、わずかに減少させた用量を与えた（表ＩＩ）。本発明者等は、毎日注射した場合（図示せず）と比較して、このスケジュールの効力に著しい差が無いことを見出したので、平均して３日ごとにマウスを処置した。細胞注射から４週間後、ＰＲＯ−００１は、腫瘍増殖を、平均して対照マウスの場合の１０％まで劇的に低下させた（図８Ｂ）。高い毒性又は著しい体重減少は、処理期間全体を通して観察されなかった。
【表５】
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【０１５８】
本発明は、ある動物疾患モデルによって例示される。これらのモデルは、本発明の原理の例示的な目的で使用される非限定的な例とされる。
【０１５９】
（実施例８：ＰＲＯ−００１  ｓｃＦｖのＰＥＧ化）
ＰＥＧ部分を、本発明の単鎖抗体（ＰＲＯ−００１  ｓｃＦｖ）のアミノ末端に、セリン残基を通じて付加した。ＰＥＧ化させるため、２位にアミノ酸であるセリンを有するｓｃＦｖ（配列番号３７）を生成した。Ｎ末端にセリンを有するＰＲＯ−００１  ｓｃＦｖは、ＰＣＲによって生成し、前述のように（ＷＯ  ０２／１０２９７２）配列決定によって確認した。簡単に言うと、封入体を、ＰＢＳ、ＰＢＳ＋０．１％トリトン、及び３Ｍ尿素中で洗浄した。洗浄したペレットをＰＢＳ＋５Ｍ尿素に溶解し、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ（それぞれ０．５ｍＭ）酸化還元電位を加え、次いで尿素ステップ勾配に対して徐々に透析した。再び折り畳まれたＰＲＯ−００１ｓｅｒ  ｓｃＦｖとＦＧＦＲ３との結合活性を、ＥＬＩＳＡによって比較し、親単鎖に類似した活性が示された（図９）。
【０１６０】
ＰＥＧ化は、方法のセクションで述べたように実施した。クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる反応生成物の分析では、単鎖の約５０％が、ｍＰＥＧ−ＨＺ−５Ｋ、ｍＰＥＧ−ＨＺ−２０Ｋ、又はｍＰＥＧ−ＨＺ−４０Ｋのいずれかとコンジュゲートすることが明らかにされた（図１０）。次に本発明者等は、ＦＧＦＲ３ｅｘ／Ｆｃ−タンパク質Ａセファロース上で反応ミックスをインキュベートすることによって、ＰＥＧ化単鎖の活性について試験をした。非結合画分を収集し、ＦＧＦＲ３ｅｘ／Ｆｃ−タンパク質Ａセファロースと共にさらに２サイクル実施した。各サイクルの結合材料と、最後の１サイクルの非結合画分とをクーマシー染色によって分析したが、非修飾の並びにＰＥＧ化された単鎖の両方は、どちらのタイプも結合した画分のみに存在して非結合画分には存在しないので、ＦＧＦＲ３に結合したことが実証された。相互分布が、ＦＧＦＲ１  ｅｘ／Ｆｃ−タンパク質Ａセファロースと共に分画した後に得られ、ＰＥＧ化したＰＲＯ−００１Ｓｅｒ  ｓｃＦｖによる特異的認識が実証された。ＰＥＧ化ＰＲＯ−００１Ｓｅｒ  ｓｃＦｖの相対的活性を決定するために、ＰＥＧ化反応生成物をＱセファロース陰イオン交換器に添加し、大量のＰＥＧ化単鎖を含有する画分が得られた。ＰＥＧ化ＰＲＯ−００１を、高レベルでＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ３又はＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ１細胞に添加し、細胞増殖を測定した。ｍＰＥＧ−ＨＺ−５ＫによりＰＥＧ化されたＰＲＯ−００１は、十分なＦＧＦＲ３中和活性を保持していた（図１１）。ｍＰＥＧ−ＨＺ−２０Ｋへのコンジュゲートは、抗体活性を５分の１に低下させ、ｍＰＥＧ−ＨＺ−４０Ｋへのコンジュゲートは約４０分の１に低下させた。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１Ａ】ＰＲＯ  ００１で蛍光標識され、その後、ＰＥ共役抗ヒト２次抗体で標識された、Ｂ９−ＦＧＦＲ  ＷＴ（野生型）細胞を示すフローサイトメトリーチャートである。塗りつぶされたヒストグラムは、親Ｂ９細胞（ＦＧＦＲ３発現が不十分）を示し；薄い破線は、ＦＧＦを含まないＢ９−ＦＧＦＲ  ＷＴを示し；濃い実線は、ＦＧＦの存在下でのＢ９−ＷＴを示す。Ｙ軸は、細胞の量を示す計数値を表す。Ｘ軸は、蛍光強度を表す。
【図１Ｂ】種々の濃度のＰＲＯ−００１で処理したＢ９−ＦＧＦＲ  ＷＴ細胞の生存度を示すグラフである。塗りつぶした棒は対照（ＰＲＯ−００１を含まない）を表す。点が付された棒は、ＰＲＯ−００１で処理した細胞を表す。
【図１Ｃ】ＲＣＪ−ＦＧＦＲ３細胞溶解産物の免疫染色を示すウェスタンブロットの写真である。ＲＣＪ細胞を、Ｆａｂと共にプレインキュベーションを行って、又はそのようなプレインキュベーション無しで、ＦＧＦ（＋）で刺激した。レーン１−ＦＧＦ刺激無し、及びＦａｂとのプレインキュベーション無し。レーン２−ＦＧＦ刺激有り、Ｆａｂとのプレインキュベーション無し。レーン３−ＦＧＦ刺激有り、対照（Ｃ）抗体とのプレインキュベーション有り。レーン４−ＦＧＦ刺激有り、及び抗ＦＧＦＲ３（００１）Ｆａｂとのプレインキュベーション有り。中間パネル（ホスホ−ＪＮＫ）は、抗ホスホ−ＪＮＫ抗体でプローブされた全細胞溶解産物を示す。上部パネル（ホスホ−ＦＧＦＲ３）は、抗ＦＧＦＲ３抗体による免疫沈降（ＩＰ）がなされ、次いで抗ホスホチロシン（４Ｇ１０）を用いたウェスタンブロットにより分析された、細胞溶解産物を示す。下部パネル（ＦＧＦＲ３）は、抗ＦＧＦＲ３抗体による免疫沈降（ＩＰ）がなされ、次いで抗ＦＧＦＲ３を用いたウェスタンブロットにより分析された、細胞溶解産物を示す。
【図１Ｄ】ＸＴＴ分析により決定したときの、高濃度のＰＲＯ−００１の存在下での、ＦＧＦＲ発現ＦＤＣＰ細胞の増殖を示すグラフである。データは、２連で行った培養の結果の平均である。Ｘ軸は、ＰＲＯ−００１  Ｆａｂの濃度を表す。Ｙ軸は、％阻害を表す。
【図２】ＰＲＯ−００１の存在下での、ヒト骨髄腫細胞系の生存度を示すグラフである。生存度は、ＦＧＦ±阻害剤の存在下での光学密度（ＯＤ）と、ＦＧＦが存在しない状態でのＯＤとの比として報告される。
【図３】ＵＴＭＣ２細胞におけるＥＲＫ（細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ）のリン酸化を示す、フローサイトメトリーチャートである。塗つぶされたヒストグラムは、ＦＧＦ刺激の無いＵＴＭＣ２を表し（非刺激）；薄い線は、ＦＧＦで刺激され、対照抗体で処理された細胞を表し（ＦＧＦ／ビヒクル）；濃い線は、ＦＧＦで刺激され、ＰＲＯ−００１で処理された細胞を表す（ＦＧＦ／ＰＲＯ−００１）。
【図４】ＦＧＦ、ＩＬ６、又はＩＧＦ−Ｉで処理されたＵＴＭＣ２細胞の生存度を示すグラフである。濃い棒は、対照抗体で処理された、刺激を受けた細胞を表し；点が付された棒は、５μｇ／ｍｌのＰＲＯ−００１で処理された、刺激を受けた細胞を表し；四角で埋め尽くされた棒は、１００ｎＭのＰＤ１７３０７４で処理された、刺激を受けた細胞を表す。
【図５】ＢＭＳＣの存在下、ＰＲＯ−００１での処理に応答したＵＴＭＣ２細胞のアポトーシスを示すグラフである（間質）。ＢＭＳＣ単独（間質）、又はＵＴＭ２細胞と一緒のＢＭＳＣ（間質／ＵＴＭＳ２）を、対照抗体又は５μｇ／ｍｌのＰＲＯ−００１と共に７２時間培養し、アネキシンＶ結合及びヨウ化プロピジウム排除のフローサイトメトリーアッセイによって、アポトーシスを評価した。値は、４回の培養の平均±ＳＤを表す。
【図６Ａ】抗ＦＧＦＲ抗体ＰＲＯ−００１で処理された、ヒト原発性骨髄腫細胞のフローサイトメトリーチャートである。新たに単離したＢＭＳＣを、ＰＲＯ−００１（黒色の線）又は対照抗体（灰色の線）で染色し、次いでＰＥ共役抗ヒト２次抗体で染色した。
【図６Ｂ】抗ＦＧＦＲ抗体ＰＲＯ−００１で処理された、ヒト原発性骨髄腫細胞のフローサイトメトリーチャートである。原発性骨髄腫細胞を、２時間、ＦＧＦが存在しない状態で（塗りつぶされている）又はＦＧＦの存在下で（薄い線）インキュベートし、又は５μｇ／ｍｌのＰＲＯ−００１と共に（濃い線）プレインキュベートし、次いでＦＧＦで刺激を与えた。ＥＫＲ１／２リン酸化を、フローサイトメトリー分析によって評価した。
【図７】アネキシンＶで染色されたＣＤ１３８陽性原発性ＭＭ細胞を示すフローサイトメトリーチャートである。原発性骨髄腫細胞を、対照Ｆａｂ（下部パネル）又は５μｇ／ｍｌのＰＲＯ−００１（上部パネル）の存在下で培養した。細胞を７日後に収集し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。骨髄腫細胞は、ＣＤ１３８＋＋であることが確認された。ＣＤ１３８＋＋細胞の全パーセンテージを、左上の象限に示す。示されているのは、代表的な実験である。
【図８Ａ】ＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃの生存度を示すグラフである。細胞を、多量のＰＲＯ−００１又は対照抗体（Ｃ）の存在下で２日間培養した。細胞増殖を、ＸＴＴ分析によって決定した。データは、２回の培養の平均である。
【図８Ｂ】ＰＲＯ−００１がＦＧＦＲ３促進型異種移植腫瘍モデルに及ぼす影響を示すグラフである。ヌードマウス（各グループに３匹）に対し、その２カ所に、即ち各側腹部に１回ずつ（α−右側腹部、ｂ−左側腹部）、それぞれ２×１０６ＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ細胞をＳ．Ｃ．注射した。１週間後、マウスを無作為化して、表Ｉに記載されたスケジュールに従ってＬＰ注射によりＰＲＯ−００１を与え、又は対照としてＰＢＳを与えた。腫瘍体積を、細胞注射後２２又は２９日で３つの寸法の測定値から推定した。
【図９】ＰＲＯ−００１Ｓｅｒ  ｓｃＦｖのＦＧＦＲ３結合活性を示すグラフである。ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、指示量の単鎖で被覆した。可溶性ＦＧＦＲ３／Ｆｃを添加し、結合した受容体をＨＲＰ抗Ｆｃで測定した。
【図１０】ｍＰＥＧ−ＨＺ５Ｋ、ｍＰＥＧ−ＨＺ２０Ｋ、及びｍＰＥＧ−ＨＺ４０Ｋ共役ＰＲＯ−００１Ｓｅｒの特異的ＦＧＦＲ３結合を示す、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。ＰＥＧ化反応ミックス（Ｐ）を、ＦＧＦＲ３／Ｆｃ又はＦＧＦＲ１／Ｆｃタンパク質Ａセファロースビーズと共にインキュベートした。非結合材料を収集し、さらに２回続けて新たなビーズと共にインキュベートした。最後の結合サイクルから得た、結合した画分（Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３）並びに非結合材料（Ｕ２）を、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。Ｕ−非修飾単鎖。
【図１１】ＰＲＯ−００１−ＰＥＧ接合体のＦＧＦＲ３中和活性を示すグラフである。ｍＰＥＧ−ＨＺ−５Ｋ、ｍＰＥＧ−ＨＺ−２０Ｋ、又はｍＰＥＧ−ＨＺ−４０ＫによりＰＥＧ化されたＰＲＯ−００１  Ｓｅｒを、ＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ３細胞又はＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ１細胞を対照として使用したＸＴＴによって分析した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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