(57)【要約】  本発明は、血管系を経由して個体に組成物を送達する方法を提供し、また、血管系を経由して個体に組成物を送達するために使用可能な装置を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテーテル本体および閉塞部材を含んでなる、血管内で血流を閉塞する装置であって、
前記カテーテル本体は近位部分および遠位部分を有し、近位および遠位部分が縦軸を規定し、カテーテル本体が内腔を有するものであり、
前記閉塞部材は孔を有し、この孔を通して前記カテーテル本体とかみ合っており、この閉塞部材が遠位端および近位端を有するものである、
上記装置。
【請求項２】
カテーテル本体の縦軸に沿ってスライドして移動することができる外部シースをさらに含んでなる、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
カテーテル本体の縦軸に沿ってスライドして移動可能で、カテーテル本体と外部シースの間に位置するカテーテル本体シースであって、カテーテル本体シースの遠位端が閉塞部材の近位端とかみ合っている、前記カテーテル本体シースをさらに含んでなる、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
カテーテル本体シースがカテーテル本体シースフランジをさらに含んでなり、このフランジが閉塞部材の近位端とかみ合っている、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
閉塞部材が円筒形もしくは円錐形である、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
閉塞部材がシリコーンもしくはフォームである、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
閉塞部材が生分解性である、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
閉塞部材に生理活性物質を含浸させた、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
生理活性物質が、１種以上の化学療法剤、１種以上の増殖因子、または増殖因子をコードする核酸からなる群から選択される、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
装置が使い捨てである、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
装置が滅菌可能である、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
カテーテル本体の内腔が、幹細胞、１種以上の増殖因子、１種以上の化学療法剤、増殖因子をコードする核酸、および抗炎症性化合物からなる群から選択される組成物を含んでなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
個体の生物学的標的に組成物を送達する方法であって、
請求項１に記載の装置のカテーテル本体の遠位部分を、個体の血管系における血管内に挿入して先へ進め、該装置の遠位部分が血管内の送達部位に留置されるようにすること；
外部シースを引き下げて、閉塞部材が血管を通る血流を実質的に塞ぐようにすること；
カテーテル本体の内腔を経由して送達部位に組成物を送達すること；ならびに、
血管から該装置を抜去すること、
を含んでなる前記方法。
【請求項１４】
抜去ステップの前に、カテーテル本体の遠位部分から閉塞部材を放出することをさらに含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
閉塞部材がフォーム、シリコーンもしくは生分解性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
閉塞部材が円筒形もしくは円錐形である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
血管が静脈である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
組成物が、幹細胞、１種以上の増殖因子、１種以上の化学療法剤、増殖因子をコードする核酸、および抗炎症性化合物からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
幹細胞がVEGFをコードする異種核酸を含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的標的が、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、脳、子宮、卵巣、前立腺、精巣、腸、眼、声帯、および固形癌からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
閉塞部材の放出後に閉塞部材の孔が閉じる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
血管内の送達部位が閉塞部材に対して遠位である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体の血管系への組成物のデリバリー装置、ならびに、血管系に組成物を送達するためにそうした装置を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
損傷した心臓のための細胞移植の研究は、典型的には、心筋内注入によって、血流の低下した部分に、もしくはその近傍に、細胞を送達するものである。こうした部分は、広範囲に壊死し、低酸素状態であり、マクロファージやその他の免疫応答細胞が浸潤している。このような条件下では、ほとんどすべての移植細胞は死滅し、生き残るのは0.02％未満にすぎない。イヌモデルにおいて冠動脈注入により送達する代替法は、細胞が接種された心筋部分に重大な微小梗塞を引き起こした。これに対して、心静脈系は、このような心筋損傷に対する抵抗性を与える、丈夫な側副血管を有する。
【発明の開示】
【０００３】
発明の概要
本発明は、血管系経由で個体に組成物を送達する方法を提供し、さらに、血管系を経由して個体に組成物を送達するために使用可能な装置を提供する。
【０００４】
ある態様において、本発明は、血管内で血流を遮断する装置を提供する。こうした装置は一般に、カテーテル本体と閉塞部材を包含する。カテーテル本体は典型的には、縦軸を規定する近位部分と遠位部分、および中空の内腔を有する。閉塞部材は孔があり（その孔を通してカテーテル本体とかみ合う）、遠位端および近位端を有する。
【０００５】
本発明の装置は、さらに、カテーテル本体の縦軸に沿ってスライドして移動可能な外部シース（被覆）を有することができる。本発明の装置はそれに加えて、カテーテル本体の縦軸に沿ってスライドして移動可能なカテーテル本体のシースを有することができる。一般に、カテーテル本体シースは、カテーテル本体と外部シースの間に位置する。ある実施形態において、カテーテル本体シースの遠位端は、閉塞部材の近位端とかみ合っている。カテーテル本体シースはさらに、閉塞部材の近位端とかみ合うカテーテル本体シースフランジを有することができる。
【０００６】
閉塞部材は、円筒形もしくは円錐形で、シリコーンもしくはフォームとすることができる。ある実施形態において、閉塞部材は生分解性である。閉塞部材に生理活性物質、たとえば、１種以上の増殖因子もしくは化学療法剤を含浸させることができる。本発明の装置は、使い捨て、もしくは滅菌可能（すなわち再使用可能）でありうる。本発明の装置（すなわち、カテーテル本体の内腔）は、幹細胞、１種以上の増殖因子、１種以上の化学療法剤、増殖因子をコードする核酸、および抗炎症性化合物からなる群から選択される組成物を含有することができる。
【０００７】
別の態様において、本発明は、個体において生物学的標的に組成物を送達する方法を提供するが、その方法は下記を包含する：請求項１に記載の装置の遠位部分を、個体の血管系の血管内に挿入して先へと進め、装置の遠位部分が送達部位に留置されるようにすること；外部シースを引き下げて、閉塞部材が血管を通る血流を実質的に塞ぐようにすること；カテーテル本体の内腔を経由して送達部位に組成物を送達すること；ならびに、血管から装置を抜去すること。一般に、送達部位は閉塞部材より遠位にある。
【０００８】
本方法はさらに、カテーテル本体の遠位部分から閉塞部材を放出することを含めることができる。典型的にはこの放出ステップは、抜去ステップの前である。これに加えて、最適な閉塞のために、カテーテル本体からの閉塞部材の放出直後に、閉塞部材の孔が閉じることが望ましい。
【０００９】
ある実施形態において、閉塞部材はフォーム、シリコーン、もしくは生分解性であって、円筒形もしくは円錐形の形態をとることができる。本発明の特徴は、前記血管が静脈であることである。生物学的標的に送達することができる代表的な組成物には、幹細胞、１種以上の増殖因子、１種以上の化学療法剤、増殖因子をコードする核酸、および１種以上の抗炎症性化合物がある。上記幹細胞は、さらに、VEGFをコードする異種核酸を含有することができる。代表的な生物学的標的としては、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、脳、子宮、卵巣、前立腺、精巣、腸、眼、声帯、および固形癌が挙げられる。
【００１０】
特に指示しない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似もしくは同等の方法および材料を、本発明の実施もしくは試験において使用することができるが、適切な方法および材料は以下に記載される。さらに、材料、方法、および実施例は一例にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書に記載のすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体を参考として本明細書に含めるものとする。抵触する場合には、本明細書が、定義を含めて支配する。
【００１１】
本発明の１つもしくは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および下記の説明に示される。本発明の他の目的、構成および効果は、図面および詳細な説明から、ならびに特許請求の範囲から、明らかとなるであろう。
【００１２】
詳細な説明
本発明は、血管系を経由して個体に組成物を送達する方法を与え、さらに、血管系を経て個体に組成物を送達するために使用することができる装置を提供する。
【００１３】
静脈閉塞装置
静脈閉塞装置1の具体例を図1に示す。図1に示す装置は、縮められた形をとっている。静脈閉塞装置1は、近位部分12および遠位部分14を有するカテーテル本体10を含む。近位部分12および遠位部分14はカテーテル本体の縦軸Lを規定する。静脈閉塞装置に使用するのに適したカテーテル本体10は、内腔16を有する。静脈閉塞装置1はまた、カテーテル本体10の縦軸Lに沿ってスライドして移動することができる、外部シース20を含めることができる。図2は、展開された形の図１の装置を示す。図1および図2に示す具体例によれば、展開は、外部シース20を、カテーテル本体10の近位部分12に向かって引っ込めることによって起こり、それによって、カテーテル本体10の遠位部分14にはめ込まれている閉塞部材18が露出される。その後、図1および図2に示す閉塞部材18は広がって、血流を遮断する。
【００１４】
カテーテル本体10の近位部分12および遠位部分14は、個体の血管系に本発明の静脈閉塞装置1を挿入して先へ進めるのに必要な強度および柔軟性を有する生体適合性材料から、一体的に形成することができる。近位部分12および遠位部分14は、使用中に装置の相互接合（articulation）を容易にするように柔軟なものとすることができる。適当な材料は当技術分野でよく知られており、一般にポリアミド類、たとえばDacronの商品名でDuPont社から市販されている織物素材を包含する。
【００１５】
図3は、閉塞部材の異なる具体例を示す。本発明の静脈閉塞装置1に使用するのに適した閉塞部材は孔Bを有するものとし、カテーテル本体10の遠位部分14がそれを通って延びている。一般に孔Bの大きさは、カテーテル本体10の遠位部分14の大きさに相関する。閉塞部材18は、遠位端30および近位端32を有する。ある実施形態において、遠位端30および／または近位端32は、孔Bに対してほぼ垂直でありうる。別の実施形態において、閉塞部材は中実であってもよく（すなわち孔がない）、静脈の完全な閉塞が生じるように、カテーテルの遠位端を用いて、閉塞部材を押し出すことができる。
【００１６】
遠位端の半径（r1）および近位端の半径（r2）は、互いに対して変化しうる。たとえば、遠位端の半径（r1）および近位端の半径（r2）が事実上等しいと、結果として円筒形の閉塞部材となり（r1＝r2）（図3A）、あるいは遠位端の半径（r1）および近位端の半径（r2）が異なると、結果として円錐形の閉塞部材となる（r1＞r2またはr1＜r2）（図3B）。展開された閉塞部材の最大円周は、閉塞部材が挿入されている血管の大きさに適合するはずである。本明細書で使用される場合、「〜と適合する」は、展開したとき、最適な閉塞のために血管壁に対してぴったりとはまっているが、血管を壊したり傷つけたりするほど大きくはない閉塞部材を指す。
【００１７】
閉塞部材は多くの材料から作ることができる。ある実施形態において、閉塞部材は、最初は圧縮されており、その後外部シースを引っ込めた直後に膨張する。圧縮可能および／または膨張可能な代表的な材料には、フォームおよびシリコーンが含まれるが、それらに限定されない。展開およびそれに続く血管の閉塞を可能にする他のいかなる材料も、そうした材料がそれを貫通する孔を有することに耐えられるならば、閉塞部材として使用するのに適している。それに加えて、閉塞部材は、生分解性材料から作られていてもよい。
【００１８】
多くの生分解性材料が、デンプン、セルロース、およびポリヒドロキシアルカノエートといった再生可能資源から、ならびに、ポリ乳酸およびポリカプロラクトンといった合成手段から誘導される。ポリヒドロキシアルカノエートは、多くの細菌によって炭素貯蔵顆粒の形で生成される天然ポリエステル類の一群である。市販製品の１つがBIOPOL（商標名）である。さらに、乳酸およびグリコール酸を基本とする製品、ならびにポリ（ジオキサノン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）コポリマー、およびポリ（ε-カプロラクトン）ホモポリマーおよびコポリマー、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、およびポリホスファゼンなどの他の材料が、現在医療器具において使用されているか、または医療器具に使用するために開発中である。本発明の方法もしくは装置に使用することができる、別の生分解性材料は米国特許出願第10/874,449号に記載のフィブリンバイオマトリックスである。
【００１９】
閉塞部材には、１種以上の生理活性物質を含浸させることができる。たとえば、閉塞部材に増殖因子（以下で説明）もしくは化学療法剤（以下で説明）を含浸させる。閉塞部材にはまた、生物学的標的に対して有益な臨床効果を及ぼす生理活性薬物もしくは分子を含浸させることができる。このような生理活性物質は、閉塞部材から長期間にわたってゆっくり放出されるように操作することができるが、生分解性閉塞部材に含まれる場合には、生理活性物質は、閉塞部材の生分解とほぼ同じ速度で放出される。
【００２０】
閉塞部材の展開後、閉塞部材がカテーテル本体から放出されて、数時間、数日、もしくは数週間にわたって血管内に留まり血流を閉塞させることができる。図1および図2は、放出メカニズムのある実施形態を示すが、閉塞部材を放出させるどのような手段も用いることができる。たとえば、図1および図2は、カテーテル本体シース22およびカテーテル本体シースフランジ24を含む静脈閉塞装置1を示す。カテーテル本体シース22およびカテーテル本体シースフランジ24を使用して、閉塞部材18を放出することができる。完全な、もしくはほぼ完全な閉塞を達成するために、孔Bは、カテーテル本体が抜去された後、孔が閉じるか、もしくは孔の中までつぶれることが望ましい。また、カテーテル本体シース22およびカテーテル本体シースフランジ24を用いて、外部シース20を引き下げている間カテーテル本体10上に閉塞部材18の位置を維持することができる
本発明の静脈閉塞装置1には、随意に、送達部位にてイメージングもしくはモニタリングするための装置を含めることができる。たとえば、心臓内心エコー（ICE）装置を用いて、血管を画像化し（たとえば、閉塞部材の適切な留置を目的として）、または血管の直径を測定することができる。超音波アセンブリー、もしくは電極のような検知部材といった、他のイメージングもしくはモニタリング装置または部材を使用することができる。イメージングおよび／またはモニタリング用装置は、カテーテル本体10の遠位部分14の位置で、静脈閉塞装置1に取り付けることができる。
【００２１】
静脈閉塞装置によるデリバリーのための組成物
確立された機能を有する細胞を、特定の生物学的標的に送達して、特定の組織（たとえば、心臓、肺、皮膚、骨、肝臓、腎臓、膵臓、精巣および卵巣）の修復を促進し、あるいはかかる組織の機能を改善することができる。たとえば、膵臓のβ細胞を膵臓に送達して、個体における膵臓機能を向上させることができる。他の種類の細胞としては、膵ランゲルハンス島細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、腎細胞、糸球体細胞、骨細胞（たとえば、骨芽細胞および破骨細胞）、リンパ球（たとえば、T細胞、B細胞、およびNK細胞）、顆粒球（たとえば、好中球、好塩基球、好酸球およびマスト細胞）、ならびに線維芽細胞があるが、それらに限定されない。それに加えて、特定の機能を果たすように操作された細胞型、たとえば遺伝子改変細胞を、生物学的標的に送達することができる。
【００２２】
さまざまな種類の細胞に分化する能力を有する細胞を生物学的標的に送達することもできる。こうした細胞には幹細胞および始原細胞が含まれるが、それに限定されない。幹細胞は、いくつかの細胞系統に分化することができる、大きな増殖能を備えた細胞である。たとえば、胚性幹（ES）細胞は、無限の自己複製能および多能性分化能を有する。ES細胞は、杯盤胞の内部細胞塊に由来するか、または着床後胚由来の始原生殖細胞から導くことができる（胚性生殖細胞、すなわちEG細胞）。幹細胞は多くの組織において存在が確認されている。典型的な幹細胞には、造血幹細胞、神経幹細胞、胃腸管幹細胞、表皮幹細胞、肝性幹細胞、間葉系幹細胞（MSC）、脱落した乳歯由来の幹細胞、および自己由来骨髄幹細胞（ABMSC）があるが、それらに限定されない。始原細胞は多能性分化能および多大な増殖能を有する。始原細胞はin vitroで、ほとんどの中胚葉細胞型に分化することができるが、この細胞型には、骨格筋芽細胞および心筋芽細胞の特性を有する細胞、ならびに内皮および平滑筋の特徴を有する細胞が含まれる。幹細胞、始原細胞、もしくは他の種類の細胞のどのような組み合わせでも、生物学的標的に送達することができる。
【００２３】
幹細胞もしくは始原細胞は、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒト以外の霊長類、およびヒトを含めて、さまざまな生物種から得ることができるが、これに限定されない。同種および異種細胞が本発明の範囲に含まれるが、典型的には、自己由来の幹細胞もしくは始原細胞が使用される。幹細胞もしくは始原細胞は、脳、脊髄、肺、皮膚、肝臓、血液および骨髄などの、個体のさまざまな組織から分離することができるが、これに限定されない。たとえば、幹細胞は、個体から吸引された骨髄から分離することができる。簡単に説明すると、麻酔した個体において、針を用いて、骨（たとえば腸骨稜）の外側のコアを貫通する。注射器を使用する場合には、注射器のプランジャーを力強く引くことによって陰圧をかけ、それによって注射筒の中に骨髄を採取することが可能となる。次に骨髄を、コニカルチューブ内の密度勾配基体（たとえば、Ficoll）の上に層状に重ねる。その後、骨髄を遠心して、既知の界面にある自己由来骨髄単核細胞を集める。続いて培養選択したのち、使用前にABMSCを操作することができる（たとえば、プラスミドを用いてトランスフェクトする、またはウイルスを用いて形質導入する）。あるいはまた、本発明で使用するのに適した幹細胞および始原細胞を分離し、精製して、特徴を明らかにするために、米国特許第5,486,359号および第6,261,549号に記載の技術を使用することもできる。
【００２４】
幹細胞および始原細胞をex vivoで巧みに処理して、治療的価値を高めることができる。たとえば、血管内皮増殖因子（VEGF）は、細胞増殖、遊走および生存を制御する多機能性増殖因子である。血管新生の部位において、VEGFは再血管新生プロセスを加速するさまざまな始原細胞の移動および動員を促進することがわかっている。
【００２５】
本発明の静脈閉塞装置を用いて、化学療法剤を生物学的標的に送達することもできる。限定はしないが、化学療法剤には、抗腫瘍性細胞毒性剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤、ならびに、癌の治療に使用することができる他の任意の薬物がある。ほとんどの化学療法剤、またはそれらの組み合わせは、癌細胞を殺す能力を有する。例としては、ブスルファン、シスプラチン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メルファラン、クラドリビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびクロラムブシルがある。化学療法剤は、一般に、数週間もしくは数ヶ月の期間にわたって特定の投与計画で、個体に投与される。
【００２６】
上記のVEGFに加えて、他の増殖因子も、本発明の静脈閉塞装置を用いて生物学的標的に送達することができる。増殖因子は一般に、細胞表面の受容体に結合するタンパク質であって、細胞の増殖および／または分化を活性化する。代表的な増殖因子には、たとえば、上皮成長因子（EGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ（TGF-αおよびTGF-β）、エリスロポエチン（Epo）、およびインスリン様成長因子IおよびII（IGF-IおよびIGF-II）が含まれる。あるいはまた、１種以上の増殖因子をコードする１つ以上の核酸を本発明の静脈閉塞装置によって生物学的標的に送達することができる。
【００２７】
本明細書に記載の方法および／または装置を用いて、生物学的標的に、抗炎症性化合物を送達することもできる。抗炎症性化合物は、炎症を止める、もしくは緩和する化合物である。もっとも一般的な抗炎症性化合物には、非ステロイド系抗炎症剤（NSAID）が含まれるが、数多くの他の抗炎症性化合物およびタンパク質（たとえば、ウイルスにコードされたタンパク質）が当技術分野において知られている。
【００２８】
本発明によれば、送達部位は血管系の内部であるが、生物学的標的は、血管系が通っているあらゆる臓器もしくは組織である。たとえば、生物学的標的には、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、脳、子宮、卵巣、前立腺、精巣、腸、眼、および声帯を含めることができるが限定はしない。さらに、生物学的標的は、個体において事実上あらゆる場所の固形腫瘍もしくは固形塊を包含することができる。
【００２９】
静脈閉塞装置の使用方法
本発明の静脈閉塞装置を使用して、組成物を生物学的標的に送達することができる。典型的には、カテーテル本体の遠位末端を、個体の血管系内に挿入して先に進め、送達部位に対して位置を合わせて、閉塞部材が広がったときに閉塞部材の遠位側（操作する人に対して）で血流を塞ぐようにする。上記の組成物はいずれも、送達部位に、そして最終的には生物学的標的に、カテーテルの内腔を経て送達することができる。
【００３０】
個体の血管系にカテーテルを挿入して前進させることは、当技術分野で使用されるルーチンな公知技術である。Seldinger法は、シースを挿入するために日常的に用いられるが、それによってカテーテルを、個体の適切な静脈系に進めることができる。しかしながら、他の方法も、本発明の静脈閉塞装置を血管内に挿入するために適しており、たとえば、逆行性アプローチもしくは静脈切開法が含まれる。
【００３１】
図１に示す静脈閉塞装置は、縮められた形となっている。装置が個体内に挿入されるのはこのような縮められた形である。カテーテル本体の遠位部分が送達部位の近位側に適切な距離で配置されたならば（装置の操作者に対して）、閉塞部材を広げることができる。閉塞部材を広げたとき、血流は実質的に塞がれる。「実質的に塞がれる」とは、少なくとも30％（たとえば、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、もしくは100％）血流が低下することを指す。
【００３２】
静脈血管系を経由して組成物を送達することの利点は数多くある。本発明の１つの利点は、血流が、通常は閉塞部材の、送達部位を含む側（装置の操作者に対して閉塞部材の遠位）でブロックされるので、送達された組成物を洗い流す血流が基本的に存在しないことである。静脈の閉塞は、数時間、数日、数週間、数ヶ月、もしくはもっと長期間であっても耐えることができるので、組成物は、血流によって洗い流されたり妨害されたりすることなく、生物学的標的に吸収される時間がある。本発明のこの態様は、動脈デリバリーについては高く評価することはできず、動脈デリバリーでは血流はわずか数分もしくは数秒しか止められない。
【００３３】
製品
本発明の静脈閉塞装置をさまざまな形で包装することができる。たとえば、本発明の静脈閉塞装置を１回使い切り（すなわち使い捨て）用に、製造および包装することができる。あるいはまた、本発明の静脈閉塞装置は、再使用可能かつ滅菌可能であるように製造することができる。装置が滅菌可能である実施形態において、追加の閉塞部材を装置とともに提供することができるが、あるいは別々に提供することもできる。さらに、さまざまな異なる閉塞部材（たとえば、異なる材料、いろいろな大きさ、および／または異なる形態）を包装してユーザーに供給することができる。
【００３４】
本発明は、生物学的標的に送達するための組成物（たとえば、１種以上の化学療法剤）を含有する製品（たとえば、キット）を包含することができる。製品はまた、このような組成物を使用するための、それに関する使用説明書を有する添付文書もしくはパッケージラベルを含むことができる。本発明の製品はまた、個体から幹細胞もしくは始原細胞を得るために必要な材料を含むことができ、さらに、個体から幹細胞もしくは始原細胞を収集するための使用説明書を有する添付文書もしくはパッケージラベルを、追加して含むことができる。幹細胞もしくは始原細胞を取得して調製する方法および材料は、本明細書において検討されている。
【００３５】
本発明にしたがって、従来の分子生物学、微生物学、生化学的および組換えDNA技術を、当技術分野の技術の範囲内で使用することができる。こうした技術は、文献で十分に説明されている。本発明は下記の実施例でさらに説明されることになるが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００３６】
実施例１：材料および方法
すべての手順およびプロトコルは、ミネソタ大学（University of Minnesota）の動物管理委員会によって承認された。本研究は、米国実験動物研究協会（Institute of Laboratory Animal Research）による実験動物の管理と使用に関する指針（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）に従った（Institute of Laboratory Animal Resources（実験動物資源協会）、1996, Guide for the care and use of laboratory animals（実験動物の管理と使用に関する指針）、第7版、Washington, D.C.、National Academy Press）。本研究において、7匹のブタが、心静脈注入によって、VEGF改変MSC（VEGF-MSC）の投与を受け、比較のために19匹の未処理LVH(左室肥大)ブタおよび8匹の正常ブタを用いた。核のβガラクトシダーゼレポーター遺伝子lacZを有する複製欠損組換えアデノウイルスは、アイオワ大学（University of Iowa）Gene Vector Core Labから購入した。ブタVEGF165発現ベクターは、バッファーロー大学(University of Buffalo)のJohn Canty博士より割譲された。
【００３７】
実施例２：ブタ間葉系幹細胞の培養
骨髄由来のMSCを密度勾配遠心によって分離した（Liuら、2004, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 287:H501-11; Pittengerら、1999, Science, 284:143-7）。骨髄を、健康なヨークシャー種ブタの胸骨から、6000 Uのヘパリンを入れた注射器内に吸引し、1対1の割合でダルベッコPBSにより希釈した。50 mlコニカルチューブ内のFicoll-Paque-1077 (Sigma)の上に骨髄サンプルを注意深く層状に重ね、室温にて400 xgで30分間、遠心分離した。単核細胞を界面から採取し、2〜3倍容量のダルベッコPBSで洗浄して、1000 rpmの遠心で集めた。細胞を再懸濁し、10 ng/mlフィブロネクチン（FN）でコーティングしたT-75フラスコ内に200,000細胞/cm2の密度で播種し、60％低グルコースDMEM（Gibco BRL）、40％ MCDB-201 (Sigma)、1×インスリン-トランスフェリン-セレン、1×リノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA)、0.05μMデキサメタゾン(Sigma)、0.1 mMアスコルビン酸2-リン酸、2％ FCS、10 ng/ml PDGF、10 ng/ml EGF、10 U/mlペニシリンおよび100 U/mlストレプトマイシンからなる培地中で培養した。3日後、非接着性細胞を、培地交換によって除去した。付着した細胞は増殖し、約5〜7日でコロニーを形成した。およそ10日後、MSCの初代培養物はほぼ90％のコンフルエンスに達した；細胞をトリプシンとともにインキュベーションすることによって継代培養した。最初の継代細胞を4000〜5000細胞／cm2の密度で培養皿にまき、さらにVEGFまたはAdRsvLacZを用いて形質導入するために2日間培養した。
【００３８】
実施例３：細胞表現型
CD44、CD45、CD90、MHC-クラスI、MHC-クラスII、SWC3AおよびSLA-DRをフローサイトメトリーによって検出した。0.5〜1×106個のMSCを、それぞれの表現型試験について100μl BSA/PBS溶液中に入れ、一次抗体としてブタCD44、CD45、CD90、MHC-クラスI、MHC-クラスII、SWC3AおよびSLA-DRに対するマウスモノクローナル抗体（mAb）とともに、4℃にて40分間インキュベートした。二次抗体としてFITCコンジュゲートされた、マウスに対するポリクローナル抗体IgG（1μg/チューブ）を加え、暗室内で4℃にてさらに30分間インキュベートした。陰性対照として一次mAbの代わりにマウスIgG 2μgを0.5〜1×106個の細胞に加えた。
【００３９】
実施例４：アデノウイルスによる形質導入
VEGFは、シャトルベクターpacAd5CMVK-Npにサブクローニングした。ウイルスを調製し、アイオワ大学の遺伝子ベクターCore Labによって用量設定した。アデノウイルス感染はプレーティングの24時間後に行った。細胞を、適当な濃度のウイルスを含有する無血清培地0.5 mlとともに、37℃にて3時間インキュベートした後、新鮮な2％血清培地を再供給した。核のβガラクトシダーゼレポーター遺伝子lacZの形質導入に使用されるウイルス濃度は、以前に記載された（Lieら、前掲）。
【００４０】
実施例５：左室肥大の誘発および細胞移植
重篤な求心性左室肥大（LVH）/鬱血性心不全（CHF）のブタモデルを、以前に記載されたように作製した（Mangiら、2003, Nat Med., 9:1195-1201; Yeら、2001, Circulation, 103:1570-1576; Zhangら、1993, J. Clin. Invest., 92:993-1003）。簡単に述べると、約45日齢のヨークシャー種ブタを、ペントバルビタールナトリウム（25〜30 mg/kg iv）で麻酔し、挿管して、人工呼吸器で換気した。第3肋間腔を貫いて右開胸術を実施し、上行大動脈のまわりを、大動脈弁より約1.5 cm上の位置で、幅2.5 mmのポリエチレンバンドで一周した。左心室内圧および遠位大動脈圧を同時に測定しながら、55〜60 mmHgのピーク収縮期血圧勾配が狭窄部を超えて達成されるまで、バンドを締めた。シリコーンエラストマーカテーテル（1.0 mm i.d.）を室間静脈（大心臓静脈）内に挿入した。静脈を近位で閉塞し、約3千万個のVEGF-MSCをゆっくりとカテーテルを通して注入した。その後、カテーテルを抜去し、注入部位に近い冠静脈を修復した。胸を層状に閉じ、動物を回復させた。正常な身体発育にもかかわらず大動脈の締め付け部分が固定されたままなので、LVHがしだいに発生した。バンド絞扼の25日後、動物を、MRIならびに分光学的および血行動態測定のために研究室に戻した。
【００４１】
実施例６：MRIならびに分光学的および血行動態測定のための動物の準備
分光学的測定および血行動態測定のための動物の準備は、以前に詳細に記述された（Yeら、前掲）。MRI研究はすべて、最後のMRSおよび生理学的研究の3日以内に、1.5テスラで作動するSiemens Medical VISION（登録商標）Systemで行った。動物をケタミン（20 mg/kg i.m.）で鎮静させ、ペントバルビタールナトリウム（30 mg/kg, i.v.）で麻酔し、挿管して人工呼吸器で換気した。動物を直径18 cmのヘルムホルツコイルの左側に置いた。イメージングシーケンスは心電図（ECG）と同期させ、呼吸ゲーティングは、データ収集の間の心周期に対して人工呼吸器をトリガーすることによって達成される。イメージングおよび分析法の詳細な説明は、左心室容積および駆出率の測定を含めて、すでに報告されている（Murakamiら、1999, Circulation, 99:942-8; ならびにZhangら、Circulation, 94:1089-1100）。下記の等式を用いて、左心室（LV）収縮期の壁肥厚率（ST％）を、前壁で測定した：ST％＝100％ X (ls-ld)/ld；ここでls＝LV収縮期厚さ(mm)、ld＝LV拡張期厚さ(mm)。
【００４２】
実施例７：心筋の血流
心筋の血流は、すでに報告されたようにγ線を放出する放射性核種（141Ce、51Cr、95Nb、85Srまたは46Sc）で標識された直径15μmのマイクロスフェアを用いて測定した（Domenechら、1969, Circ. Res., 25:581-596; Yeら、前掲; Zhangら、1996, Circulation, 94:1089-1100）。
【００４３】
実施例８：MRS研究のための実験準備
動物は、ペントバルビタールナトリウム（30 mg/kg iv.）で麻酔し、挿管して、酸素補給を伴う人工呼吸器で呼吸させた。人工呼吸器の設定および酸素流量を調整することによって、動脈血液ガスを生理的範囲内に維持した。ヘパリンを満たしたポリ塩化ビニルカテーテル（3.0 mm OD）を右大腿動脈内に挿入し、上行大動脈内に進めた。胸骨切開を行って、心臓を心臓周囲のクレードル内で吊り上げた。もう一つのヘパリン充填カテーテルを、先端のくぼみから左心室内に挿入し、巾着縫合で固定した。同様のカテーテルを心耳から左心房内に留置した。直径25 mmのNMR表面コイルを、左心室前壁上に縫合した。その後心臓周囲のクレードルをはずし、心臓を正常な位置に戻した。表面のコイルリードを、開胸切開の外側で、これと直角のバランス同調回路に接続した。次に動物をルーサイトクレードルに入れ、マグネットの範囲内に配置した。
【００４４】
実施例９：空間局所31P NMRスペクトロスコピー法
測定は、SISCO（Spectroscopy Imaging Systems Corporation, Fremont, CA）コンソールと適合させた内径40 cmの4.7 Tマグネット内で実施した。左心室圧信号を用いて、NMRデータ収集を心周期と同期させ、呼吸ゲーティングは、データ収集の間、心周期に対して人工呼吸器をトリガーすることによって達成された（LiuおよびZhang、1999, J. Magn. Reson. Imaging, 10:892-8; ならびにZhangら、1993, J. Clin. Invest., 92:993-1003）。31P および1H NMRの周波数は、それぞれ81および200.1 MHzとした。スペクトルは、パルス繰り返し時間6〜7秒で拡張期後期に記録した。この繰り返し時間は、ATPの完全な緩和、および無機リン酸（Pi）の共鳴を可能にし、さらにクレアチンリン酸(PCｒ)共鳴について約95％緩和を可能にした（LiuおよびZhang、前掲）。クレアチンリン酸（PCr）共鳴強度は、このマイナーな飽和に対して補正された；補正係数は、それぞれの心臓について、経壁的に区別することなく連続して記録された２つのスペクトルから決定されたが、一方は、完全な緩和を可能にする15秒の繰り返し時間であり、もう一方は、他のすべての測定で使用された6秒の繰り返し時間とした。
【００４５】
高周波透過およびシグナル検出を、直径25 mmの表面コイルを用いて実施した。コイルは、厚さ0.7 mmでコイル自体より直径が約20％大きいシリコーンゴムシートにセメントで固定した。3 M/Lホスホノ酢酸15μlを入れたキャピラリをコイルの中央に置き、対照として用いた。表面コイルで検出される水からのプロトンシグナルを用いて、磁場を均一化し、コイルが磁石および傾斜のアイソセンタもしくはその付近となるように磁石内の動物の位置を調整した。これは、スピンエコー実験および読み出し傾斜磁場を用いて達成された。またこの段階で集められた情報を利用して、スペクトロスコピックに位置決めするための空間座標を決定した(LiuおよびZhang、前掲)。化学シフトはPCrに対して測定されたが、これは0 ppmで85％リン酸に対して−2.55 ppmの化学シフトを割り当てられた（Zhangら、前掲）。
【００４６】
RAPP-ISIS/FSW法(LiuおよびZhang、前掲)を用いて、左心室壁の空間的位置確認を行った。ファントム実験およびin vivoで得られたボクセルプロフィール、ボクセル体積、および空間的位置確認の精度に関する詳細なデータは、他で公表されている（LiuおよびZhang、前掲）。簡単に述べると、信号源は、B0グラジエントおよび断熱的反転パルスを用いて、左心室壁に対して垂直な表面コイルと同軸方向の円柱状部に限定された。この円柱状部の大きさは17 mm x 17 mmであった。この円柱状部分内で、シグナルはさらに、B1グラジエントを用いて、約45°、60°、90°、120°、および135°スピン回転増加の集中した5ボクセルに局在した（LiuおよびZhang、前掲；ならびにZhangら、前掲）。FSW位置決定は、9項フーリエ級数展開を利用した。フーリエ係数、フーリエ展開において各項について得られる自由誘導減衰の数、およびボクセルを構築するために使用される増倍率は、すでに報告されている（LiuおよびZhang、前掲）。コイルに対するボクセルの位置は、コイル中心でのB1の大きさによって配置されるが、これはコイルの中心にあるホスホノ酢酸対照に対して90°パルス長を測定することによって、それぞれの場合において経験的に決定された。各組の空間局所経壁的スペクトルは、10分で得られた。全体で96スキャンが各10分ブロック内に蓄積された。
【００４７】
共鳴強度は、SISCOソフトウェアによって与えられた積分法を用いて数値化した。ATPγ共鳴は、ATP測定のために使用された。データは、ATPγおよびPCr共鳴の間にあるトランスミッター周波数で得られたので、これらのピークに対するオフレゾナンス効果は事実上存在しなかった。それぞれのボクセルにおけるPCrおよびATPに対する数値は、PCr/ATP比として表された。無機リン酸（Pi）レベルは、Pi共鳴を包含する領域で得られた積分を用いて、ベースライン値からの変化（ΔPi）として測定された。
【００４８】
実施例１０：実験プロトコル
最初に、血行動態測定および31P NMRスペクトルを基本条件下で得た。10分のNMRS収集時間の途中で、心筋の血流を測定するためにマイクロスフェア注入を行った。動脈血液ガスは、10分毎に測定し、人工呼吸器は、正常な生理的pO2、pCO2およびpHを維持するように調整した。基本データを取得した後、ドブタミンおよびドーパミンを同時に注入し（それぞれ20μg/kg/分i.v.）、心仕事量の高い状態（HCW）を誘導した。定常状態に達するまで約10分おいた後、すべての測定を繰り返した。
【００４９】
実施例１１：細胞生着率の測定
細胞移植の4週間後、すべての心臓を8から10個の輪切りにした。奇数番の切片を用いて細胞生着率を測定して組織学的分析を行い、偶数番の切片はQRT-PCR用に瞬間凍結した。組織学的分析のために、すべての輪切り切片を10から12片に分割した。X-gal染色後、組織をTissue-Tek OCTコンパウンド（Fisher Scientific）に包埋し、液体窒素-冷却イソペンタン中で凍結した。厚さ10μmの凍結組織切片をクリオスタットで薄片に切断した。すべての細胞核をDAPI（4', 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール；Sigma-Aldrich）で染色した。10枚毎の連続切片で、X-galおよびDAPIの二重陽性の核によって、生着細胞数を分析した。
【００５０】
実施例１２：RNA分離およびcDNA調製
瞬間凍結LV標本を液体窒素中で微粉砕した。RNaseフリーのDNase処理とともにRNeasyカラムを用いて、全RNAを分離した。1μgの全RNAを、プライマーとしてオリゴ(dT)18を用いた逆転写反応に使用した。
【００５１】
実施例１３：定量的リアルタイムRT-PCR
既報のように（Wangら、2002, Circ. Res., 90:340-347）、異なる実験条件下でのmRNAレベルの変化を、LightCycler（商標）サーモサイクラー (Roche Diagnostics Corp)を用いた定量的リアルタイムRT-PCR分析によって比較した。プライマー配列および反応パラメータを表１に示す。
【表１】
2008519659.tif 000003
【００５２】
実施例１４：BrdU分析
形質導入されたMSCによって分泌されるVEGFの機能を、VEGF-MSCによる馴化培地で培養された内皮細胞のBrdU取り込みアッセイ（Boehringer Mannheim, Tokyo）によって評価した。
【００５３】
実施例１５：免疫組織化学および免疫蛍光検査
組織サンプルを冷2-メチルブタンに入れて1時間凍結保護し、Tissue-Tek OCT (Fisher Scientific)に包埋して、クリオスタットを用いて10μmスライスに切断した。免疫組織化学法および免疫蛍光染色を、既述のように（Wangら、前掲）実施した。下記の一次抗体を使用した：マウス抗ヒトvWFおよびマウス抗マウス カベオリン-1抗体（BD Biosciences）、トロポニンT抗体（NeoMarkers）、マウス抗イヌ ホスホランバンおよびマウス抗ヒトαミオシン重鎖抗体（Abcam）、ならびに蛍光標識二次抗体（Molecular Probes）。
【００５４】
実施例１６：VEGF-MSC馴化培地および筋細胞アポトーシス
すでに報告されているように（Claycombら、1998, PNAS USA, 95:2979-84; ならびにWhiteら、2004, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 286:H823-9）、HL-1筋細胞（Claycomb Laboratory, University of Louisiana）を、フィブロネクチン-ゼラチンをコーティングしたプレートもしくはフラスコに入れ、10％ウシ胎仔血清、100単位/ml ペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、0.1 mMノルエピネフリン、および2 mM L-グルタミンを添加したClaycomb培地中で培養した。馴化培地実験のために、ブタMSCを、100 pfu/細胞のVEGFアデノウイルスおよび核LacZアデノウイルスでトランスフェクトした。感染の6時間後、細胞を3回洗浄し、既述のように（Lieら、前掲）MSC培地中に入れた。培養して48時間後に馴化培地を集めた。対照として、馴化培地の一部をMSCなしで48時間インキュベートした。馴化培地においてHL-1細胞を培養し、2％酸素（低酸素）に24時間曝露して、アポトーシスを誘導した。
【００５５】
共培養実験のために、HL-1細胞を12ウェルプレートに、全体としての密度5×105で（MSC:HL-1細胞；1:30）、MSC培地とClaycomb培地半々の培地中にまいた。共培養に先だって、Vybrant CFDA SE細胞トレーサーキット（Molecular Probes）を用いて細胞を標識した。標識したHL-1細胞は十分に洗浄して、MSCもしくはVEGF改変MSCとともに共培養した。その後、細胞を2％酸素（低酸素）もしくは21％酸素（正常酸素）で24時間インキュベートした。アポトーシスは、Hoechst 33342 (H33342)色素で染色し、次いで、細胞識別によりCFDA標識サブセット中のアポトーシス核のパーセンテージを数量化する（300細胞カウント／サンプル）ことによって評価した（Wangら、2004, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 287:H2376-83; ならびにWangら、2002, Circ. Res., 90:340-7）。
【００５６】
実施例１７：データ解析
一元配置分散分析は、群平均に差のあることを認めた。シェフェの多重比較検定は、２つの群平均間の差の有意性を評価した。差は、p＜0.05の値で、統計学的に有意であるとみなされた。
【００５７】
実施例１８：遺伝子操作で作製された自己由来VEGF過剰発現MSC
ブタ成体の骨髄から分離されたMSCは、CD90、CD44、SWC3AおよびHLA-クラスIが陽性であり、CD34、CD45およびHLA-クラスIIが陰性であった。ブタVEGF165 DNAおよびlacZ対照の両方を用いた、MSCのアデノウイルス形質導入は、90％の効率であった。リアルタイム定量的RT-PCRは、設計された特異的プローブを用いて、内因性および外因性ブタVEGFをいずれも検出した。10 pfu/細胞および100 pfu/細胞で形質導入されたVEGF-MSCは、それぞれ、lacZ-MSCの内因性レベルより10および30倍高レベルのVEGF mRNAを発現した。これらの結果は、ブタMSCのゲノムに外因性VEGF遺伝子がうまく組み込まれたことを示す。さらに、免疫組織化学法によって、形質導入MSCにおけるVEGF発現の顕著な増加が示された。
【００５８】
VEGF-MSCが分泌するVEGFの機能を評価するために、VEGF-MSCによって馴化された培地で培養したヒト臍帯内皮細胞（HUVEC）を用いて、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）取り込みアッセイを行った。簡単に説明すると、HUVECを通常のMSC培地で24時間培養した後、無血清培地で24時間培養した。別のHUVECフラスコには、VEGFのみ、またはlacZのみで形質導入されたMSCから得られた馴化培地を入れ、BrdU溶液（1 mM BrdU、ダルベッコリン酸緩衝食塩水に溶解）10μlを用いて6また12時間標識した。陰性対照は、PBSのみ10μl使用して作製した。BrdU標識化は、VEGF-MSC馴化培地で培養したHUVECの35 ± 4％において陽性であったが、lacZ-MSC馴化培地で培養したHUVECでは基本的に存在しなかった。これは、形質導入されたMSCによって発現されたVEGFが機能することを示した。
【００５９】
実施例１９：VEGF-MSCおよびVEGF-MSC馴化培地は培養HL-1筋細胞のアポトーシスを減少させる
VEGF-MSC馴化培地は、HL-1筋細胞のアポトーシスを顕著に減少させた。同様に、VEGF-MSCとHL-1筋細胞との共培養は、実質的に、HL-1筋細胞のアポトーシスを減少させた。VEGF-MSC馴化培地の抗アポトーシス効果は、VEGF抗体を培地に添加することによって阻止された。こうしたデータは、VEGF-MSCが、VEGFであると思われる抗アポトーシス性物質を分泌することを示す。
【００６０】
実施例２０：VEGF-MSCの移植が心機能を改善する
VEGFを過剰発現するように操作した自己由来の間葉系幹細胞を、重い求心性LVHのある心臓に移植することは、心筋における修復反応を推進し、それに続いて、収縮能力を改善し、心筋の生体エネルギー特性の異常に対する抵抗性を賦与し、さらに心不全への移行を防止すると仮定した。
【００６１】
未治療LVH群の19被験体のうち9個体は、腹水（100〜1000 ml）を発生し、両心室代償不全の存在が示唆された。したがって、未治療LVH群は、それぞれ、腹水の有無に基づいてCHFおよびLVHの２亜群に分けられた。LV重量と体重の比（LVW/BW; g/kg）は、腹水のない未治療LVH群において、ならびにMSC移植群（この群は一つも腹水を発生しなかった；p＜0.05、表２）においても、約50％増加した。これに対して、LVW/BWは、CHF心臓では118％増加した（LVHおよびNに対してp＜0.01、表２）。一致して、RVW/BWもLVH群で有意に増加し、CHF心臓でもっとも重大であった（p＜0.05、表２）。したがって、MSCおよびVEGF-MSCの移植はいずれも、LVHの進行を弱め、圧負荷のかかった未治療の心臓の49％に存在したLV代償不全の発生を防止した。
【表２】
2008519659.tif 000004
【００６２】
血行動態データを表３に要約する。心拍数および遠位平均大動脈圧は、群の間で有意差はなかった（表３）。LVH群は、予想どおり基底状態では、LV収縮期圧が有意に上昇していた（表３）。CHF群のみがLV拡張末期圧の有意な増加を示した（p＜0.01、表３）。ドブタミンおよびドーパミンの併用注入によって誘導されたHCWの期間に、すべての群は、心拍数およびLV収縮期圧が増加した（表３）。HCWの時、LV収縮期圧およびRPPは、LVH+VEGF-MSCの心臓が、他のLVH群および正常対照群より著しく高かった（P＜0.01、表３）。心拍数と収縮期圧の積（RPP）の、ベースラインとHCWとの間での増加パーセントによって示される収縮予備能[収縮予備能（CR％）＝100％×(RPPhw - RPPbaseline)/RPPbaseline)]は、移植を受けないLVH心臓において有意に低下し、その低下はCHF群でもっとも重大であった。しかしながら、CRの低下は、LVH+MSCの心臓においてある程度弱まり、LVH+VEGF-MSCの心臓では完全に排除された（p＜0.05）。MRIによって測定されたLV収縮期壁厚増加率は、基底状態では4群の間に有意な差異はなかったが、LVH-CHF群ではそれより低い傾向があった（表３）。高用量のカテコールアミン刺激に応答して、収縮期壁厚増加率は、すべての群で増加し、その応答は、MSCを与えられた心臓でより大きく、VEGF-MSCの投与を受けた心臓においてもっとも顕著であった（p＜0.05、表３）。
【表３】
2008519659.tif 000005
【００６３】
局所的心筋血流データを表４にまとめた。前壁および後壁のいずれにおいても、基底状態の血流は、LVH+VEGF-MSC群の方が、他の群よりもほどほどに（ではあるが、有意に；p＜0.05）高かった（表４）。HCWでは、心筋血流（MBF）はすべての群でかなり増大した（p＜0.05、表４）。こうしたMBFの増加は、LVH+VEGF-MSC群のほうが有意に高かった（p＜0.05、表４）。
【表４】
2008519659.tif 000006
【００６４】
各群の全LV壁スペクトルから得られたすべてのHEPデータを表５に要約する。すべてのLVH群の基底状態のPCr/ATP比は、正常群より有意に低く、この低下は、LVH-CHFの心臓においてもっとも激しかった。HCWの状態で、PCr/ATPは、VEGF-MSC移植を受けた動物以外の全群で、さらに有意に減少した。驚くべきことに、上記移植群は、（表４に示すRPPデータに表されるように）二番目に高いRPPを有する群よりも約40％多いエネルギーを消費したという事実にもかかわらず、HCW時にベースラインPCr/ATP値を維持した（表５）。ベースラインおよびHCW時に得られた、経壁的に区別されたスペクトルによって、すべての群の心内膜下層において、この減少がもっとも顕著であることが示された。HCWの期間に、心筋の無機リン酸レベル（ΔPi/PCr）は上昇した（表５）。この増加度は、VEGF-MSC移植を受けたLVH群では著しく弱まり、MSC群ではやや減少した（表５）。これらのデータは、MSC移植が、血圧過負荷の心筋において、HCWに対する生体エネルギー応答を改善することを示す（表５）。
【表５】
2008519659.tif 000007
【００６５】
生着した細胞数を、10枚毎の連続切片で、X-galおよびDAPI二重陽性核によって分析した。4週までに、MSCのみ、およびVEGF-MSCを移植した心臓において、細胞生着率に有意差は存在しない(MSCのみ、1.81 ± 0.43％; VEGF-MSC、2.06 ± 0.27％; n=4, p＞0.05)。
【００６６】
総合すると、これらの実験に基づく知見は、重症のLVHにおいてVEGF過剰発現MSCの移植が、収縮能力および生体エネルギー特性を改善し、心臓肥大を低減し、心不全への移行を防止することを示す。
【００６７】
実施例２１：移植されたMSCは心筋様細胞へと成長しかつ血管新生を促進した
免疫組織学は、宿主の心筋における、移植されたVEGF-MSCの寄与を評価し、また、機能的な改善を説明するための細胞学的根拠を提供した。細胞治療されたLVH心臓のH&EおよびX-gal染色は、心筋に場所を占めるβガラクトシダーゼ発現細胞を示したが、細胞の大部分は、左心室前壁に生着し、宿主心筋細胞に平行して並んでいると思われた。興味深いことに、明確な横紋を、βガラクトシダーゼ発現細胞においてはっきりと見ることができ、これらの細胞はまた、筋節αミオシン重鎖抗体で共染色された。βガラクトシダーゼおよび心臓特異的タンパク質に対する二重染色は、βガラクトシダーゼが、心筋トロポニンTおよびホスホランバン陽性心筋細胞において発現されることを示した。これらの所見は、移植されたVEGF-MSCが心筋様細胞に分化転換したことを示唆する。
【００６８】
移植されたVEGF-MSCを調べ、それが血管新生、ならびに血管細胞への分化転換を誘導することができるかどうかを決定した。von Willebrand因子（vWF）に対する免疫蛍光染色は、VEGF-MSCで治療された心臓において相当な血管新生を示したが、対照より多くのvWF発現毛細血管が細胞治療したLVH心臓に存在した。VEGF-MSC治療LVH群は、高倍率視野あたりの平均vWF+毛細血管数が42±5であったが、これに対して正常群は32±2、ならびに未治療LVH群は27±3であった（n=6, P＜0.01）。リアルタイム定量的RT-PCRによって、正常、および未治療LVH心臓と比較して、細胞治療したLVH心臓ではvWF mRNA発現の相当な増加が明らかになった（正常心臓 1.90±0.19; 未治療LVH心臓 1.39±0.33; 細胞治療した心臓 4.49±0.76; n=5, P＜0.01）。未治療LVHおよび正常心臓の間で、毛細血管数およびvWF mRNA発現に有意差はなかった。細胞治療した心臓のVEGF mRNA発現は、未治療LVHおよび正常心臓のどちらよりも高かった（正常心臓 1.20±0.12; 未治療LVH心臓 1.39±0.33; 細胞治療した心臓3.98±0.38; n=5, P＜0.001）。興味深いことに、二重染色は、βガラクトシダーゼ陽性核が、内皮細胞マーカー、カベオリン-1とともに局在することを明確に示した。これらの結果は、重症のLVHへのVEGF-MSCの移植が、内因性血管細胞もしくは血管前駆細胞を刺激することによって、血管新生および新生血管形成を誘導することを示す。その上、移植されたMSCの血管細胞への分化転換も、血管新生および新生血管形成の増加に関与すると考えられる。総合すると、上記の所見は、細胞治療に応じて増加した新生血管形成が、移植されたVEGF-MSC、および余力を残した宿主心筋細胞のいずれに向けても心筋血流を改善し、それによってLV収縮能力を向上させることを示唆する。
【００６９】
他の実施形態
当然のことながら、本発明は、その詳細な説明と併せて説明されたが、前記の説明は、本発明を説明することを目的とするものであって、本発明の範囲を制限する意図はなく、その範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められる。他の態様、利点、および改変は、特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】縮められた位置にある静脈閉塞装置の一具体例の図である。
【図２】広げられた位置にある静脈閉塞装置の一具体例の図である。
【図３】Aは、円筒形の閉塞部材である。Bは、円錐形の閉塞部材である。各図面における同様の参照記号は、同様の部材を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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