(57)【要約】本発明は、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与するペプチドをコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成されたジーンサイレンシング分子を提供する。ジーンサイレンシング分子は、中枢神経系（ＣＮＳ）においてニューロン生存および軸索再生を促進するために用いられる。本発明はまた、神経生存を改善して軸索成長を促進するための組成物、およびその組成物の使用方法を提供する。
2008516628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与するペプチドをコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成されたジーンサイレンシング分子。
【請求項２】
ジーンサイレンシング分子はアンチセンス分子、リボザイム分子または低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）であることを特徴とする、請求項１に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項３】
ｓｉＮＡ分子はｓｉＲＮＡ分子を含むことを特徴とする、請求項２に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項４】
ｓｉＮＡ分子はおよそ５ｂｐ〜５０ｂｐを含むことを特徴とする、請求項２または３に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項５】
ｓｉＮＡ分子は５０％未満のＧＣ含量を含むことを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項６】
ｓｉＮＡ分子はｐ７５ＮＴＲ受容体をコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成された配列を含むことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項７】
ｓｉＮＡ分子は：
５'−ＡＡＣＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＣＴＡＴＴＧＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１）；
５'−ＡＡＣＧＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＴＴＡＧＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２）；
５'−ＡＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＴＴＧＴＡＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３）；
５'−ＡＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４）；または
５'−ＡＡＧＣＧＧＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＧＧＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５）、
を含むことを特徴とする、請求項６に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項８】
ｓｉＮＡ分子は、ＮｇＲをコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成された配列を含むことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項９】
ｓｉＮＡ分子は：
５'−ＡＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６）；
５'−ＡＡＣＣＴＣＡＣＧＣＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.７）；
５'−ＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８）；
５'−ＡＡＡＴＧＣＡＣＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＴＧＴ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９）；または
５'−ＡＡＴＧＡＣＴＣＴＣＣＡＴＴＴＧＧＧＡＣＴ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０）、
を含むことを特徴とする、請求項８に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項１０】
ｓｉＮＡ分子は、Ｒｈｏ-Ａ分子をコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成された配列を含むことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項１１】
ｓｉＮＡ分子は：
５'−ＡＡＧＡＴＴＡＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＡＧＧＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１１）；
５'−ＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＧＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２）；
５'−ＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＡＡＡＡＴ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１３）；
５'−ＡＡＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＧＧＴＡＡＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１４）；または
５'−ＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＧＧＡＧＴＧＡＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１５）、
を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項１２】
ジーンサイレンシング分子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２として識別される配列を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項１３】
ジーンサイレンシング分子は、神経突起成長を活性化する分子と組合わせて用いられることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項１４】
神経突起成長を活性化する分子は神経栄養因子（ＮＴＦ）を含むことを特徴とする、請求項１３に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項１５】
ＮＴＦは、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＮＧＦ、ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＦＧＦ-１、ＦＧＦ-５、ＣＴ-１、ＣＤＦ、インシュリン、ＩＧＦ-１、ＩＧＦ-２、ＩＬ-６、ＬＩＦ、ＮＰＦ、ＰＤＧＦ、ＰＮ-１、Ｓ-１００、ＴＧＦ-βおよびＶＩＰなどから成る群から独立に選択されることを特徴とする、請求項１４に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項１６】
ＮＴＦは毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）または線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）であることを特徴とする、請求項１５に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項１７】
薬剤としての利用のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項１８】
ニューロン生存および軸索成長を促進する薬剤の製造のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のジーンサイレンシング分子の使用。
【請求項１９】
細胞のアポトーシスを阻害する薬剤の製造のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のジーンサイレンシング分子の使用。
【請求項２０】
分子は、神経突起成長阻害性分子の不在下よりも阻害性分子の存在下でニューロン生存および軸索成長を誘導するように構成されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のジーンサイレンシング分子。
【請求項２１】
治療に効果的な量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載のジーンサイレンシング分子と、薬学的仕様に合った媒体とを含む組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のジーンサイレンシング分子と、神経栄養成長因子とを含むことを特徴とする、ニューロン生存および軸索成長を促進する組成物。
【請求項２３】
ＮＴＦは、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＮＧＦ、ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＦＧＦ-１、ＦＧＦ-５、ＣＴ-１、ＣＤＦ、インシュリン、ＩＧＦ-１、ＩＧＦ-２、ＩＬ-６、ＬＩＦ、ＮＰＦ、ＰＤＧＦ、ＰＮ-１、Ｓ-１００、ＴＧＦ-βおよびＶＩＰなどから成る群から独立に選択されることを特徴とする、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の組成物を、そのような治療の必要な対象へ投与することを含むことを特徴とする、対象のニューロン生存および軸索成長を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ニューロン生存および軸索再生、特に、中枢神経系（ＣＮＳ）における神経成長の調節に関する。本発明はまた、神経生存を改善して軸索成長を促進するための組成物、およびその組成物の使用方法を提供する。
【０００２】
全動物種のＣＮＳおよび末梢神経系（ＰＮＳ）の両方において、軸索および樹状突起は発育中に盛んに伸長する。しかし、成体において、ＣＮＳの軸索および樹状突起の再成長は、進化の経過とともに急速に失われている。ＰＮＳにおいて、全脊椎動物種の軸索は、損傷を受けた後に、少なくともある程度再成長することができる。しかし、哺乳類のＣＮＳにおいて、損傷後の軸索再成長は、軸索発芽に限定される。ただし、ニューロン突起の再成長は、下位の脊椎動物種のＣＮＳにおいては可能である。
【０００３】
グリアは軸索再成長を制御する重要な決定因子である。一般に、哺乳類のグリアは、発育中のＣＮＳおよび成体のＰＮＳにおいて、軸索伸長を許容する。したがって、損傷を受けたとき、成体哺乳類のＰＮＳのグリアは、その初期軸索伸長促進能およびフォスター（foster）再生を再発現することができる。下位の脊椎動物数種のＣＮＳグリアは成体期の軸索再成長を許容している。反対に、成体哺乳類のＣＮＳグリアは損傷後にその発育成長能を再発現しない。
【０００４】
神経栄養因子（ＮＴＦ）が神経系の正常な発育中に存在する。そのような発育中に、ニューロンのターゲット構造は、ターゲット構造内に突出するニューロンの生存、分化および成長に不可欠な限られた量の特定のＮＴＦを産生する。ＮＴＦは、成熟ニューロンの生存および／または維持を促進し、ＣＮＳ損傷後のニューロン再生の主な決定因子である。さらに、末梢神経グリア（シュワン細胞）は、成体ＰＮＳにおける損傷後の軸索再生に関与するとされる神経栄養因子（ＮＴＦ）を産生する。しかし、長期間の実験により、ＣＮＳに移植された末梢神経移植片は３０日損傷後日数（ｄｐｉ）を超過するとＣＮＳ軸索再生を維持せず、１００ｄｐｉまでにほとんどの軸索が退化することが実証されており、これはおそらく、末梢神経移植片のシュワン細胞が、おそらく軸索の接触が欠如するため、移植後約２０日でＮＴＦの産生を止めるためである。
【０００５】
ＣＮＳミエリンは軸索成長阻害物質の豊富な源であり、ミエリン関連糖たんぱく（ＭＡＧ）、オリゴデンドロサイトミエリン糖たんぱく（ＯＭｇｐ）、ノゴおよびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）を含み、それらがノゴ受容体（ＮｇＲ）に結合することで軸索の成長を阻む。ノゴ受容体は、ＬＩＮＧＯ-Ｉ（ＬＲＲおよびＩｇドメイン含有ノゴ受容体結合たんぱく）および腫瘍壊死因子受容体ファミリーの一員であるｐ７５神経栄養因子受容体（ｐ７５ＮＴＲ）と関係している。後者は、下流のＲｈｏ-Ａを活性化することで阻害性シグナルを変換し、逐次ＲＯＣＫ／ＬＩＭキナーゼ／コフィリン介在性アクチンフィラメント脱重合および成長円錐崩壊を導く。したがって、ＮｇＲ、ｐ７５ＮＴＲおよびＲｈｏＡ阻害分子は、軸索成長阻害経路の重要な要素を共同で形成する。当然のことながら、ＲＯＣＫ／ＬＩＭ、コフィリンおよびＬＩＮＧＯ-Ｉなどの他の多数の分子もまた、この経路に含まれる。
【０００６】
長年にわたる幾多の努力にもかかわらず、ＣＮＳの神経再生は治療上達成されていない。たとえば、Loganら（Eur. J. Neurosci.、１９９４年、第１巻、第６号（３）、３５５−３６３頁）は、ニューロン再生が誘導されるかどうかを確かめるために、損傷ＣＮＳの形質転換成長因子β１（ＴＧＦβ１）の調節レベルの効果を調査した。ＴＧＦβ１は状況次第で神経栄養因子であり、また、強力な線維形成因子であり、ＣＳＰＧ（軸索成長阻害性リガンド）を含むマトリックス分子の産生を活性化し、それによって軸索成長阻害経路を調節する可能性を有する。Loganらは、ＴＧＦβ１が瘢痕形成に加わり、次いで瘢痕形成が瘢痕領域周辺の損傷ＣＮＳにおいて、おそらく、そこに含まれるＧＳＰＧのような阻害性リガンドを経た活性軸索成長阻害によって、軸索投射成長を制限することを実証した。Loganらは、ＴＧＦβ１作用の遮断は瘢痕化を抑制するものの、関連する軸索成長はほとんど、または全く存在しないことを示し、瘢痕形成遮断および何種類かの阻害分子の産生が軸索再生の増進を引き起こさないことを示唆している。
【０００７】
したがって、ＣＮＳにおける神経成長を促進し得る再生治療を提供する明確な必要がある。そのような治療は、損傷または罹患神経が損傷後に生存、再成長、および再び機能することを可能にするために用いられ得る。したがって、本発明者らは、ニューロン阻害経路の調節がＮＴＦ活性化ニューロン生存および軸索伸長を増進するかどうかを確かめるために、ニューロン阻害経路に研究の焦点を当てることにした。
【０００８】
本発明の第１の側面によれば、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与するペプチドをコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成されたジーンサイレンシング分子が提供される。
【０００９】
本発明の第２の側面によれば、薬剤としての利用のために、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与するペプチドをコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成されたジーンサイレンシング分子が提供される。
【００１０】
本発明の第３の側面によれば、ニューロン生存および軸索成長を促進する薬剤の製造ための使用であって、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与するたんぱくをコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成されたジーンサイレンシング分子の使用が提供される。
【００１１】
本発明者らは、様々な生化学的経路について、それらが調節されてニューロン成長に影響を与えるか否かを評価するための調査を行った。我々の調査によって、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路は、調節に関して驚くほど良いターゲットであることが立証された。「Ｒｈｏ-Ａ阻害経路」という表現によって、我々は、とりわけＮｇＲ、ｐ７５ＮＴＲおよびＲｈｏＡ阻害分子を含む軸索成長阻害経路を意味する。
【００１２】
軸索成長が促進されるかをみるために、本発明者らはＲｈｏ-Ａ経路の様々な調節因子を試験し続けたが、成功しなかった（たとえば、上述の説明参照）。しかし、驚いたことに、本発明の第１の側面に従ったジーンサイレンシング分子（たとえばｓｉＮＡ）の使用は効果的であることが証明され、神経成長を活性化した。さらに、驚いたことに、本発明者らは、本発明に従うジーンサイレンシング分子がニューロン生存の促進にも有用であることを立証した（つまり、それらはアポトーシスによるニューロンの除去を減らす）。したがって、第１の側面の分子は第２の側面に従う医学的用途を有し、より具体的には、第３の側面に従ってニューロン生存および軸索成長を活性化することを示した。
【００１３】
この薬剤はＣＮＳにおけるニューロン生存および軸索再生を促進するのに用いられるのが好ましい。ＣＮＳ損傷は、外科手術、精神的外傷、圧迫、挫傷、切断、神経毒性もしくは他の肉体的損傷に、出血性もしくは虚血性損傷を含む血管系薬理もしくは他の損傷に、または神経変性もしくは他の神経系疾患に起因し得る。軸索成長の障害または不全を特徴とする、この薬剤によって治療され得る病気は、好ましくはニューロン損傷を特徴とする。たとえば、その病気は、慢性または急性脳外傷、脊髄損傷、神経毒性、脳梗塞、緑内障、視神経損傷、ＣＮＳ出血、顔面神経損傷、待機手術によって起こされたもの、神経圧迫、脳震盪、虚血、火傷などである。
【００１４】
本発明者らは、本発明に従う分子が、細胞死の増加を特徴とする治療条件に用いられ得ることが立証されたことに最も驚いた。したがって我々は、ニューロン生存が重要な課題である治療条件にも、これらの薬剤を用い得ることを立証した。たとえば薬剤を、認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、ＣＪＤなどのニューロン変性疾患を治療するために用いることができる。
【００１５】
本発明の第４の側面によれば、細胞のアポトーシスを阻害する薬剤の製造のための使用であって、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与するたんぱくをコードする遺伝子の発現を下方制御させるように構成されたジーンサイレンシング分子の使用が提供される。
【００１６】
「ジーンサイレンシング分子」という用語によって、我々は、問題になっている遺伝子の発現を妨げる分子すべてを意味する。そのような分子は、アンチセンス分子（アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）またはリボザイム分子である。リボザイムおよびアンチセンス分子は、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与するペプチドをコードする遺伝子の転写、またはその遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を阻害するために用いられ得る。アンチセンス分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に配列特異的に結合するオリゴヌクレオチドである。相補配列を有するｍＲＮＡに結合したとき、アンチセンスＲＮＡはｍＲＮＡの翻訳を妨げる。三本鎖分子は、二本鎖ＤＮＡに結合して共直線性三本鎖分子を形成する一本鎖アンチセンスＤＮＡ鎖によるもので、それによって転写を妨げる。特に有用なアンチセンスヌクレオチドおよび三本鎖分子は、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与するペプチドをコードするＤＮＡ（またはｍＲＮＡ）のセンス鎖に相補的であるか、またはそのセンス鎖に結合するものである。
【００１７】
ＲＮＡサブ状態の特異的切断を触媒し得る酵素的ＲＮＡ分子であるリボザイムの発現もまた、たんぱく翻訳の遮断に用いられる。リボザイムの活性化の機構は、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションを含み、その後、たとえばハンマーヘッドモチーフリボザイムなどのエンドヌクレアーゼ的切断が続く。
【００１８】
ジーンサイレンシング分子は低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）であるのが好ましい。
本発明に従う分子は、ＮｇＲ、ｐ７５ＮＴＲおよび／またはＲｈｏＡ阻害分子に関する遺伝子をサイレンシングするのが好ましい。
【００１９】
分子がｓｉＮＡ分子であるとき、それは二本鎖構造であってよく、従ってセンス鎖およびアンチセンス鎖から成る。ｓｉＮＡ分子はｓｉＤＮＡ分子から成ってもよく、またはｓｉＲＮＡ分子から成ってもよい。しかし、ｓｉＮＡ分子はｓｉＲＮＡ分子から成るのが好ましい。したがって、本発明に従うｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって遺伝子発現を下方制御するのが好ましい。
【００２０】
ＲＮＡｉは、動物および植物における配列特異的転写後ジーンサイレンシングの過程である。これには、二本鎖であり、サイレンシングされる（ターゲット）遺伝子配列に相同である低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）が用いられる。したがって、ターゲット遺伝子の転写によって産生されるｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ分子の配列特異的結合によって、遺伝子発現の顕著に特異的なターゲット「ノックダウン」が可能になる。
【００２１】
１つの実験的アプローチとして、本発明者らは、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路の調節に対するｓｉＲＮＡ分子の効果を試験する目的で、多数のｓｉＲＮＡ分子を設計し産生した。驚いたことに、本発明者らは、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与する様々なたんぱくに配列特異性を示す様々なｓｉＲＮＡ分子を使用することが、その経路の脱阻害、ならびに軸索成長の改善およびニューロン生存の改善をももたらすことを発見した。これによって我々は、本発明に従う分子の使用が、軸索伸長の脱阻害の内生機構およびニューロン生存の改善をも増進するための有用な技術であると考えるに至った。
【００２２】
Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与するペプチドをコードする遺伝子を、ターゲット遺伝子とみなすことができる。ｓｉＮＡ分子は、ターゲット遺伝子の下方制御を可能とするターゲット遺伝子のコード配列の少なくとも１領域と実質的に一致するのが好ましい。好ましくは、ｓｉＮＡ分子の配列とターゲット遺伝子の領域との相同性は少なくとも６０％の配列相同性であり、好ましくは少なくとも７５％の配列相同性、好ましくは少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９７％の相同性、最も好ましくは少なくとも９９％の相同性である。
【００２３】
異なるアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列間の相同性割合の算出は、以下のように行うことができる。初めに、多重アラインメントをＣｌｕｓｔａｌＸプログラムによって作成する（ペアワイズパラメータ：ギャップオープニング １０．０、ギャップエクステンション ０．１、たんぱくマトリックス ゴネット２５０、ＤＮＡマトリックス ＩＵＢ；多重パラメータ：ギャップオープニング １０．０、ギャップエクステンション ０．２、ディレイ発散配列 ３０％、ＤＮＡ転位重 ０．５、ネガティブマトリックス オフ、たんぱくマトリックス ゴネットシリーズ、ＤＮＡ重 ＩＵＢ；たんぱくギャップパラメータ：残基特異的ペナルティ オン、親水性ペナルティ オン、親水性残基 ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ、ギャップセパレ−ションディスタンス ４、エンドギャップセパレ−ション オフ）。その後、多重アラインメントから相同性割合を（Ｎ／Ｔ）×１００として算出する。ここで、Ｎは２配列が相同残基を共有する位置の数で、Ｔは比較した位置の総数である。また、相同性割合を（Ｎ／Ｓ）×１００として算出することも可能である。ここで、Ｓは比較したうちの短い方の配列の長さである。アミノ酸／ポリペプチド／核酸配列は新たに合成されてもよく、天然アミノ酸／ポリペプチド／核酸配列またはその誘導体であってもよい。
【００２４】
充分に類似するヌクレオチド配列は、厳しい条件の下、ここで言及した核酸配列またはそれらの相補体のいずれかとハイブリダイズする配列によってコードされるであろう。厳しい条件について、我々は、ヌクレオチドが、およそ４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で、その後のおよそ５〜６５℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での少なくとも１回の洗浄によって、フィルタ結合ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズすることを意味する。あるいは、充分に類似するポリペプチドは、少なくとも１つ、かつ、５，１０，２０，５０または１００未満のアミノ酸において、本発明に従うペプチド配列と異なってもよい。
【００２５】
遺伝コードの縮重に起因して、どんな核酸配列も、それがコードするたんぱくの配列に実質的に影響を及ぼすことなく変異または変化されて、その機能変異体を与え得ることは明らかである。適したヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化した配列を有し、したがってサイレント変化を起こすものである。他の適した変異体は、相同ヌクレオチド配列を有するが、置換するアミノ酸と類似する生物物理的性質の側鎖を持つアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化したすべてのまたは一部の配列を含み、保存性変化を起こすものである。たとえば、小型で非極性の疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリンおよびメチオニンが含まれ、大型で非極性の疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれ、極性の中性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ、正荷電（塩基性）アミノ酸には、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれ、負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００２６】
たんぱくまたはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは複雑な過程であり、多くの研究者によって詳細に調査されてきた。配列の最適な適合とそのような適合を得るためのギャップの導入との間のトレードオフが特に重要である。たんぱくの場合、適合を評点する手段もまた重要である。他の、同等に適用できるマトリックスが当該技術の熟練者に良く知られているであろうが、ＰＡＭマトリックス（たとえば、Dayhoff, M.ら、１９７８年、
Atlas of protein sequence and structure、Natl. Biomed. Res. Found.）およびＢＬＯＳＵＭマトリックスのファミリーが、保存性置換の性質および可能性を定量化し、多重アラインメントアルゴリズムにおいて用いられる。一般的な多重アラインメントプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷおよびそのウィンドウズ（登録商標）バージョンＣｌｕｓｔａｌＸ（Thompsonら、１９９４年、Nucleic Acids Research、第２２巻、４６７３−４６８０頁；Thompsonら、１９９７年、Nucleic Acids Research、第２４巻、４８７６−４８８２頁）は、たんぱくおよびＤＮＡの多重アラインメントを作成するのに効果的な方法である。
【００２７】
しばしば、自動的に作成されるアラインメントは、たとえば重要な保存サイトの生物学的知識といった、研究されるたんぱくファミリーについての熟練したユーザの知識を活用する手動のアラインメントを必要とする。そのようなアラインメントエディタプログラムの１つにＡｌｉｇｎ（http://www.gwdg.de/~dhepper/download/、Hepperle, D.、２００１年、Multicolor Sequence Alignment Editor、Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries、１６７７５ シュテッヒリン、ドイツ）があるが、ＪａｌＶｉｅｗ、Ｃｉｎｅｍａなど他のものも適している。
【００２８】
たんぱく間の相同性割合の算出は、Ｃｌｕｓｔａｌによる多重アラインメントの作成中に行われる。しかし、アラインメントを手動で改良する場合には、または２つの配列を入念に比較するために、これらの値を再算出する必要がある。アラインメント内のたんぱく配列のペアに関してこの値を算出するプログラムは、ＰＨＹＬＩＰ系統学パッケージソフトウェア（Felsenstein、http://evolution.gs.washington.edu/phylip.html）内のＰＲＯＴＤＩＳＴを含み、アミノ酸置換（Ｐ）のモデルとして「Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｔａｂｌｅ」オプションを用いる。ＤＮＡ／ＲＮＡについて、同一のオプションがＰＨＹＬＩＰのＤＮＡＤＩＳＴプログラム内に存在する。
【００２９】
好ましい実施形態において、分子はｓｉＮＡ分子であり、およそ５ｂｐ〜５０ｂｐ、より好ましくは１０ｂｐ〜３５ｂｐ、さらに好ましくは１５ｂｐ〜３０ｂｐ、さらに好ましくは１８ｂｐ〜２５ｂｐの間で構成される。ｓｉＮＡ分子は２０ｂｐ〜２３ｂｐの間であるのが好ましく、より好ましくはｓｉＮＡ分子は２１ｂｐまたは２２ｂｐで構成される。最も好ましくは、ｓｉＮＡ分子は２２ｂｐ未満で構成される。
【００３０】
適したｓｉＮＡ分子の設計は複雑な過程であり、ターゲットｍＲＮＡ分子の配列のかなり注意深い分析を含む。その後、かなりの発明努力をして、本発明者らは、ＲＮＡ干渉を誘導するのに必要とされる類似性および安定性を有するであろう、あるヌクレオチド塩基組成を有するｓｉＲＮＡの確定した配列を選択しなければならない。
【００３１】
したがって、適するｓｉＮＡ配列が決定され得るようにするために、ターゲットｍＲＮＡをコードするであろうターゲット遺伝子のターゲット領域を決定すべく、初めにそのコード配列を発明者らはスキャンした。ターゲット配列のターゲット領域はジアデニン開始配列および最大６０％のＧＣ含量を含むのが好ましい。分子は５０％未満のＧＣ含量を含むのが好ましい。ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、５'末端で選択されたターゲット遺伝子のｍＲＮＡ配列の対応ＤＮＡによって設計された。
【００３２】
ｓｉＮＡ分子は新たに合成されるか、微生物によって産生されてもよい。たとえばｓｉＮＡ分子は、たとえばＥ． ｃｏｌｉといった細菌によって産生されてもよく、その場合、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の３'末端は、５'−ＣＣＴＧＴＣＴＣ−３'の８ヌクレオチド配列を含むのが好ましい。これは、ｓｉＮＡ分子の効率的な転写に必要とされる、Ｔ７プロモータプライマーの相補配列に一致する。この８ヌクレオチド配列は、ターゲット遺伝子を下方制御するｓｉＮＡ分子の使用前に除去されることが好ましい。
【００３３】
特に好ましいｓｉＮＡ分子配列は、ｐ７５ＮＴＲ受容体をコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成されており、以下の配列を含む。
【００３４】
ｐ７５ＮＴＲ配列
配列１、  ５'−ＡＡＣＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＣＴＡＴＴＧＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１）；
配列２、  ５'−ＡＡＣＧＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＴＴＡＧＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２）；
配列３、  ５'−ＡＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＴＴＧＴＡＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３）；
配列４、  ５'−ＡＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４）；および
配列５、  ５'−ＡＡＧＣＧＧＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＧＧＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５）。
【００３５】
当然のことながら、そのようなｓｉＮＡはウラシル（ｓｉＲＮＡ）またはチミン（ｓｉＤＮＡ）を含む。
【００３６】
本発明者らは、実施例１および実施例２に記載される方法によって、これら５つのｓｉＮＡ分子をそれぞれ試験した。
【００３７】
本発明の重要な特徴は、本発明に従うジーンサイレンシング分子を他の分子と組合わせて用いてもよいことで、軸索成長およびニューロン生存に驚くべき相乗効果を及ぼす神経突起成長を想定している。これら試薬は単独で使用されると中程度かわずかな効果を及ぼすが、試薬を組合わせると劇的に神経再生を改善することができる。適した成長活性剤の例にはあらゆるＮＴＦ（ＴＲＫ依存またはＴＲＫ非依存性）が含まれ、たとえば毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）または線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）がある。当然のことながら、ＣＮＴＦは網膜神経節細胞（ＲＧＣ）における神経突起の効果的な成長活性剤であり、ＦＧＦ２は後根神経節神経（ＤＲＧＮ）における神経突起の効果的な成長活性剤である。分子と組合わせて用いられ得る他のＮＴＦには、ＮＧＦ、ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＦＧＦ-１、ＦＧＦ-５、ＣＴ-１、ＣＤＦ、インシュリン、ＩＧＦ-１、ＩＧＦ-２、ＥＬ-６、ＬＩＦ、ＮＰＦ、ＰＤＧＦ、ＰＮ-１、Ｓ-１００、ＴＧＦ-βおよびＶＩＰが含まれる（Oppenheim、１９９６年、Neuron、第１７巻、１９５−１９７頁）。
【００３８】
実施例１は、阻害性ＣＮＳミエリン存在下でＣＮＴＦによって処理された培養網膜神経節細胞（ＲＧＣ）におけるｐ７５ＮＴＲｍＲＮＡに対して、ｓｉＮＡ分子を供給する試験パラダイムを記載している。本発明者らは、図１に示されるように、ＣＮＴＦとの組合わせにおいて、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１〜５で識別される上記ｓｉＮＡ分子のそれぞれが、阻害性ＣＮＳミエリン存在下でのＲＧＣにおけるニューロン生存および神経突起生成を誘導するということを発見して驚いた。５つのｓｉＮＡ分子のうち４つ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２以外のすべて）によって誘導される神経突起生成の範囲は、ミエリン不在下およびＣＮＴＦ存在下で誘導されるそれに匹敵した。各配列は、ｐ７５ＮＴＲをコードする遺伝子の発現を下方制御（ノックダウンとしても知られる）し、それによって下流のシグナル応答要素を下方制御することによって神経突起伸長経路の脱阻害を示した（つまり、阻害性ミエリンの効果を妨げた）。
【００３９】
さらに驚くべきことは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２を有するｓｉＮＡ分子がｐ７５ＮＴＲを下方制御し、（ａ）神経突起を有するＲＧＣ数、（ｂ）平均神経突起長、および有意に促進された（ｃ）ＲＧＣ生存、において有意な増加を誘導することであった。したがって、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２は、他の４つのｓｉＮＡが誘導したように経路の脱阻害を誘導するだけではなく、ミエリン不在下で活性化されるよりも大きな神経成長を誘導することも可能であった。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２が、知られていない何らかの機構によって、ミエリン不在下でみられる以上の成長を活性化することができたのであるから、これは特に驚くべきことである。これは、分子がミエリン以外の阻害剤を脱阻害したためであるかも知れない。
【００４０】
したがって、ｓｉＮＡ分子はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２を含むのが特に好ましく、この分子を臨床用途のためにＮＴＦと組合わせることが特に好ましい。
【００４１】
当然のことながら、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２は４つの連続チミン塩基を含む。本発明者らは当初、これはＲＮＡｉ計画において問題になり得ると考えた。これは、ｓｉＮＡ分子における４つの連続チミン塩基が転写終結配列によく似ており、それによってｓｉＮＡ鋳型からＲＮＡポリメラーゼが分離し、ｓｉＮＡの転写を終結させると我々が考えたからである。幸運なことに、そのようなことはなく、好ましいｓｉＮＡは、細菌内で効率的に合成されるだけでなく、ｐ７５ＮＴＲの下方制御において非常に効果的である。
【００４２】
したがって本発明者らは、ｐ７５ＮＴＲのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンが、ＲＧＣにおけるＣＮＴＦ活性化神経突起伸長の脱阻害をもたらすことを示した。
【００４３】
本発明者らは同じ５つのｓｉＮＡ分子についてさらに試験を行った。実施例２は、阻害性ＣＮＳミエリン存在下でＦＧＦ２によって処理された培養後根神経節神経（ＤＲＧＮ）におけるｐ７５ＮＴＲｍＲＮＡに対して、同じ５つのｓｉＮＡ分子を供給することを記載している。当然のことながら、ＦＧＦ２はＤＲＧＮにおいて神経突起生成を促進し、したがってＤＲＧＮにおける神経突起の陽性成長活性剤として機能する。上記のように、ＣＮＳミエリンは神経突起生成を阻害するように作用した。また本発明者らは、各ｓｉＮＡ分子がＤＲＧＮの細胞生存を増大させ、軸索成長を促進することも発見して驚き、最も効果的なｓｉＮＡ分子はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２を有していた。しかし、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２は、他の４つのｓｉＮＡが誘導したように経路の脱阻害を誘導するだけではなく、ミエリン不在下で活性化されるよりも大きな神経成長を誘導することも可能であった。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２が、知られていない何らかの機構によって、ミエリン不在下でみられる以上の成長を活性化することができたのであるから、これは特に驚くべきことである。これは、分子がミエリン関連分子以外の阻害剤を脱阻害したためであるかも知れない。
【００４４】
したがって本発明者らはまた、ｐ７５ＮＴＲのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンがＤＲＧＮにおけるＦＧＦ２活性化神経突起伸長の脱阻害をもたらすことを実証した。
【００４５】
特に好ましいｓｉＮＡ分子配列は、ＮｇＲをコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成され、以下の配列を含む。
【００４６】
ＮｇＲ配列
配列１、  ５'−ＡＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６）；
配列２、  ５'−ＡＡＣＣＴＣＡＣＧＣＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.７）；
配列３、  ５'−ＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８）；
配列４、  ５'−ＡＡＡＴＧＣＡＣＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＴＧＴ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９）；および
配列５、  ５'−ＡＡＴＧＡＣＴＣＴＣＣＡＴＴＴＧＧＧＡＣＴ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０）。
【００４７】
本発明者らは、実施例２に記載される方法によって、上記ｓｉＮＡ分子をそれぞれ試験した。実施例２は、阻害性ＣＮＳミエリン（成長阻害剤）存在下で線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）と呼ばれるＮＧＦによって処理された培養ＤＲＧＮにおけるＮｇＲ ｍＲＮＡに対して、上記５つのｓｉＮＡ分子を供給することを記載している。本発明者らは、各ｓｉＮＡ分子がＤＲＧＮの神経突起生成を増大させることを発見し、最も効果的なｓｉＮＡ分子はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６を有していた。驚いたことに、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６は、阻害性ミエリン不在下よりもミエリン存在下で軸索成長をより活性化した。
【００４８】
したがって、ｓｉＮＡ分子はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６を含むのが特に好ましい。
したがって本発明者らはまた、ＮｇＲのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンが、ＤＲＧＮにおけるＦＧＦ２活性化神経突起伸長の脱阻害をもたらすことを実証した。
【００４９】
特に好ましいｓｉＮＡ分子配列は、Ｒｈｏ-Ａ分子をコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成され、以下の配列を含む。
【００５０】
Ｒｈｏ-Ａ配列
配列１、  ５'−ＡＡＧＡＴＴＡＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＡＧＧＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１１）；
配列２、  ５'−ＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＧＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２）；
配列３、  ５'−ＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＡＡＡＡＴ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１３）；
配列４、  ５'−ＡＡＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＧＧＴＡＡＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１４）；および
配列５、  ５'−ＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＧＧＡＧＴＧＡＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１５）。
【００５１】
本発明者らは実施例２に記載される方法によって、上記ｓｉＮＡ分子をそれぞれ試験した。上述したように、本発明者らは各ｓｉＮＡ分子がＤＲＧＮの神経突起生成を増大させることを発見し、最も効果的なｓｉＮＡ分子はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２を有していた。本発明者らは、各ｓｉＮＡ分子がＤＲＧＮの細胞生存を増大させ、軸索成長を促進することを発見して驚き、最も効果的なｓｉＮＡ分子はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２を有していた。しかし、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２は、（他のｓｉＮＡが誘導したように）経路の脱阻害を誘導するだけではなく、ミエリン不在下で活性化されるよりも大きな神経成長を誘導することも可能であった。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２が、知られていない何らかの機構によって、ミエリン不在下でみられる以上の成長活性化もできるようなので、これは特に驚くべきことである。これは、分子がミエリン関連分子以外の阻害剤を脱阻害したためであるかも知れない。
【００５２】
したがって、ｓｉＮＡ分子はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２を含むのが特に好ましい。
したがって本発明者らは、本発明に従う分子によるジーンサイレンシングがニューロン生存および軸索成長を改善するのに用いられ得ることを示した。分子は、ＮｇＲ、ｐ７５ＮＴＲおよび／またはＲｈｏ-Ａのいずれかのノックダウンを仲介するｓｉＲＮＡ分子であることが望ましい。本発明に従う分子はＮＴＦ（たとえばＦＧＦ２）と組合わせて用いられるのが最も好ましい。この場合、本発明に従う分子はＮＴＦ活性化軸索成長と、驚いたことにニューロン生存とを脱阻害するのに顕著に効果的である。本発明者らは、ＦＧＦ２活性化ＤＲＧＮにおいて、ｐ７５ＮＴＲ、ＮｇＲおよびＲｈｏ-Ａのノックダウンが、ＣＮＳミエリン存在下で神経突起伸長をそれぞれ５倍，３．５倍および６．５倍促進することを発見した。ｐ７５ＮＴＲおよびＮｇＲのｓｉＮＡ介在性ノックダウン後よりも、Ｒｈｏ-ＡのｓｉＮＡ介在性ノックダウン後の方が、神経突起は長く成長した。これは、Ｒｈｏ-Ａサイレンシングが生体内でＣＮＳ軸索再生を促進するのに特に効果的な脱阻害戦略であり得ることを示唆している。したがって、本発明に従うｓｉＮＡ分子はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２であることが特に好ましい。本発明者らは、いかなる仮説によって制約されることなく、ＲｈｏＡのサイレンシングが、−おそらく、未だ明確にされていないフィードバックループによって−シグナル伝達経路の上流成分の驚くべきサイレンシングを導いていると考えている。
【００５３】
本発明の第５の側面によれば、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与するペプチドをコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成されたジーンサイレンシング分子が提供され、分子は、神経突起成長阻害分子の不在下よりも阻害分子の存在下においてより多くのニューロン生存および軸索成長を誘導するように構成されることを特徴とする。
【００５４】
「より多くのニューロン生存および軸索成長」という表現によって、我々は、神経突起成長阻害分子が存在しないときと比較して、同分子が存在するときにより誘導レベルが高く達成されることを意味する。
【００５５】
好ましくは、第５の側面に従う分子は、以前名づけられたミエリン関連分子などの神経突起成長阻害分子の存在下で活性が阻害されるＮＴＦ（たとえばＦＧＦ２またはＣＮＴＦ）と組合わせて用いられてもよい。本発明の第５の側面に従う分子は、指摘されたミエリン関連分子などの神経突起成長阻害分子によって誘導されるＮＴＦ活性化軸索成長の阻害を無効にするだけでなく、阻害分子の不在下でみられるよりもニューロン生存および軸索成長を驚くほど大きく活性化するであろう。たとえば、その効果は、神経突起が神経突起成長阻害分子不在下（たとえばミエリン剥離ＣＮＳニューロン）でＮＴＦによって活性化される対照実験でみられるよりも大きい。
【００５６】
第５の側面に従う分子はｓｉＮＡ分子を含み、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２として識別される配列のｓｉＲＮＡ分子群から選択されるのが好ましい。
【００５７】
本発明のあらゆる側面に従って用いられるジーンサイレンシング分子は核酸であることが好ましい（たとえばｓｉＲＮＡまたはアンチセンスまたはリボザイム）。そのような分子は（必ずではないが）治療対象の細胞のＤＮＡに組込まれ得る。未分化細胞はジーンサイレンシング分子によって安定的に形質転換され、遺伝子組換え娘細胞の産生を導くであろう（その場合、たとえば特定の転写因子または遺伝子活性剤による対象内の発現調節が必要となるであろう）。
【００５８】
ジーンサイレンシング分子は、新たに合成されて、（たとえばＲＮＡ干渉によって）ジーンサイレンシングを誘導するのに充分な量でターゲット細胞に導入されてもよい。あるいは、分子はたとえばＥ． ｃｏｌｉといった微生物によって産生されて、その後ジーンサイレンシングを誘導するのに充分な量でターゲット細胞に導入されてもよい。
【００５９】
分子は、ジーンサイレンシング配列をコードする核酸を含むベクターによって産生されてもよい。ベクターは、核酸の発現を制御および／または増大させることのできる要素を含んでもよい。ベクターは組換えベクターであってもよい。ベクターは、たとえばプラスミド、コスミド、ファージまたはウイルスＤＮＡを含んでもよい。ジーンサイレンシング分子を合成するのにベクターを用いることに加えて、またはその代わりに、ターゲット細胞をジーンサイレンシング配列によって形質転換する運搬システムとして、ベクターを用いてもよい。
【００６０】
また、組換えベクターは他の機能要素を含んでもよい。たとえば、組換えベクターを、ベクターがターゲット細胞において自己複製するように設計することができる。この場合、核酸複製を誘導する要素が組換えベクター中に必要とされるかもしれない。あるいは、組換えベクターを、ベクターと組換え核酸分子とが一体化してターゲット細胞のゲノムになるように設計してもよい。この場合、（たとえば相同組換えによって）目的とする一体化に有利にはたらく核酸配列が望ましい。また、組換えベクターは、クローニング工程における選択マーカーとして用い得る遺伝子をコードするＤＮＡを有してもよい。
【００６１】
また、組換えベクターは、必要に応じて、核酸の発現を制御するプロモータまたはレギュレータまたはエンハンサを含んでもよい。組織特異的プロモータ／エンハンサ要素を、たとえばＣＮＳニューロンといった特定の細胞型における核酸の発現を調節するのに用いてもよい。プロモータは構成性でも誘導性でもよい。
【００６２】
あるいは、ジーンサイレンシング分子を、ベクターに組込んで、または組込まずに、ターゲット細胞または対象に投与することができる。たとえば、分子はリポソームまたはウイルス粒子（たとえば、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ワクチンウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスなど）に組込まれてもよい。あるいは、「裸の」ｓｉＮＡまたはアンチセンス分子を、たとえば直接のエンドサイトーシス摂取といった適当な手段によって対象の細胞に挿入してもよい。
【００６３】
ジーンサイレンシング分子を、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合またはバリスティックボンバードメント（ballistic bombardment）のいずれかによって治療対象の細胞に運搬してもよい。たとえば、運搬は、被覆金粒子によるバリスティックトランスフェクション、ｓｉＮＡ分子を含むリポソーム、ジーンサイレンシング配列を含むウイルスベクター（たとえばＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２，６または１２を含むアデノウイルス）、または直接ジーンサイレンシング分子を適用して直接の核酸摂取（たとえばエンドサイトーシス）を与える手段によってなされてもよい。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態において、ｓｉＮＡ分子は（ベクターに入れられて、または「裸」で）ターゲット細胞に供給され、その後、複製を宿主細胞に頼り、それによって治療に効果的なレベルに達する。この場合、ｓｉＮＡ（たとえばＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２，６または１２）が細胞中で転写され、その後Ｒｈｏ-Ａ経路に含まれるたんぱくをコードする内生ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる発現カセットにｓｉＮＡを組込むのが好ましい。
【００６５】
当然のことながら、本発明に従うジーンサイレンシング分子を単剤治療（たとえば、本発明に従うｓｉＮＡの使用によるニューロン生存および軸索成長の活性化）に用いてもよい。しかし、本発明に従う分子を、軸索成長の活性化に用いられる公知の治療の補助として、公知の治療と併用して用いてもよい。併用治療はジーンサイレンシング分子およびＮＴＦ（たとえばＦＧＦ２またはＣＮＧＦ）を含むことが特に好ましい。
【００６６】
本発明に従うジーンサイレンシング分子を、多くの異なる型を有する組成に、特にその組成が用いられる様式に依存して、組込んでもよい。したがって、たとえば組成物は、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル、経皮貼布、リポソームの性状で、または軸索成長の障害を特徴とする病状を患っているヒトまたは動物に投与される他の適当な性状であればよい。当然のことながら、本発明の組成物の媒体は、それを与える対象がよく耐え得るべきで、軸索成長および／または改善したニューロン生存を必要とするターゲットサイトに分子を送達することができるのが好ましい。
【００６７】
本発明に従うｓｉＮＡを含む組成物は、様々な方法で用いることができる。たとえば、全身投与が必要になるかもしれず、その場合、化合物はたとえば血流に注射されることで投与される組成物に含まれる。注射は静脈内（ボーラスまたは注入）、皮下（ボーラスまたは注入）、脳室内またはくも膜下でよい。
【００６８】
化合物は（たとえば鼻腔内）吸入によって投与されてもよい。
また、ジーンサイレンシング分子は、緩やかな、または遅延型の放出装置内に組込まれてもよい。そのような装置は、たとえば、ＣＮＳ損傷サイトに挿入されてもよく、分子は数週間または数カ月にわたって放出されてもよい。そのような装置は、本発明に従うジーンサイレンシング分子による長期間の治療が必要とされ、本来なら頻繁な投与（たとえば少なくとも連日注射）が必要になる場合に、特に有利である。
【００６９】
当然のことながら、必要とされるジーンサイレンシング分子の量は、その生物活性および生体利用率によって決定され、生体利用率は投与様式、用いられる分子の物理化学特性、および単剤治療としてかＮＴＦとの併用治療において用いられるかに依存する。また、投与頻度は、上述の因子と、特に治療対象内における分子の半減期とに影響されるであろう。
【００７０】
最適な投与用量は当該技術における熟練者によって決定されればよく、使用時の特定のジーンサイレンシング分子、製剤の力価、投与様式および病状の進行度または重症度、ならびに軸索成長に必要とされる緊急性によって変動するであろう。対象の年齢、体重、性別、食習慣および投与時期を含む特定の治療対象に依存するさらなる因子が、用量を調整する必要をもたらすであろう。
【００７１】
製薬業界で従来用いられたような公知のやり方（たとえば生体内実験、臨床試験など）が、本発明に従う使用および（ジーンサイレンシング分子の日用量、投与頻度などの）正確な治療計画のための特定の調合を確立するのに用いられ得る。
【００７２】
一般に、本発明に従うジーンサイレンシング分子の、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜０．５ｇの日用量が、軸索成長の活性化（およびニューロン生存の促進）に用いられ得、用いられる特定のジーンサイレンシング分子に依存する。より好ましくは、日用量は、体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜２００ｍｇ、より好ましくはおよそ０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、さらに好ましくは約１ｍｇ〜１０ｍｇである。
【００７３】
分子（たとえばｓｉＮＡまたはアンチセンス）が細胞に送達されるとき（そしてターゲット細胞における新たな合成は必要とされない）、日用量は単独投与（たとえば１日１回の注射）として与えられてもよい。概して、治療に効果的な用量として、単回投与あたりジーンサイレンシング分子の約１ｎｇ〜１００μｇ／ｋｇを、好ましくは投与あたり２ｎｇ〜５０ｎｇを規定すべきである。
【００７４】
あるいは、分子は１日で２回以上の投与を必要とするかもしれない。例として、本発明に従うｓｉＮＡは、（体重を７０ｋｇと想定して）０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの２回（または症状の程度に依存してそれ以上）の日用量として投与されてもよい。治療を受ける患者は、１回目の用量を起床時に、（もし２回の用量計画なら）その後２回目の用量を夕刻に、またはその後３または４時間の間隔で摂取してもよい。あるいは、反復投与する必要なしに患者に最適な用量を与えるために、徐放装置を用いてもよい。
【００７５】
第６の側面によれば、治療に効果的な量の本発明の第１の側面に従うジーンサイレンシング分子と、薬学的仕様に合った媒体とを含む組成物が提供される。
【００７６】
１つの実施形態においては、本発明の第６の側面に従う組成物は約０．０１μｇ〜０．５ｇのジーンサイレンシング分子を含むのがよい。より好ましくは、組成量は、０．０１ｍｇ〜２００ｍｇ、より好ましくはおよそ０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、さらに好ましくは約１ｍｇ〜１０ｍｇのジーンサイレンシング分子である。最も好ましくは、組成物はおよそ２ｍｇ〜５ｍｇのジーンサイレンシング分子を含む。
【００７７】
好ましくは、組成物はおよそ０．１％（ｗ／ｗ）〜９０％（ｗ／ｗ）のジーンサイレンシング分子、より好ましくは、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のジーンサイレンシング分子を含む。組成物の残りは媒体を含むのがよい。
【００７８】
本発明は、治療に効果的な量の本発明に従うジーンサイレンシング分子と、薬学的仕様に合った媒体とを組合わせることを含む薬剤組成物の調製プロセスを提供する。
【００７９】
「治療に効果的な量」とは、対象に投与されたとき、軸索成長およびニューロン生存を活性化する本発明の第１または第４の側面に従う分子の量である。
【００８０】
「対象」は脊椎動物、哺乳類、家畜またはヒトであるのがよい。
ここで言う「薬学的仕様に合った媒体」は、薬剤組成物を調合するのに有用な当該技術における熟練者に公知の生理学的媒体すべてである。
【００８１】
好ましい実施形態において、薬剤媒体は液体であり、薬剤組成物は溶液の性状をしている。別の実施形態において、薬剤媒体はゲルであり、組成物はクリームなどの性状をしている。
【００８２】
滅菌溶液または懸濁液である液体の薬剤組成物は、たとえば筋肉内、くも膜下、硬膜外、腹腔内、静脈内、特に皮下、大脳内または脳室内注射によって利用され得る。ｓｉＮＡは、滅菌水、生理食塩水または他の適した滅菌注射媒体を用いて投与時に溶解または懸濁される滅菌固体組成物として調製されてもよい。媒体は、必要で不活性な結合剤、懸濁化剤、滑剤、香味料、甘味料、防腐剤、着色剤および被覆剤を含むことが意図されている。
【００８３】
ジーンサイレンシング分子とＮＴＦとの組合せは本発明の重要な特徴を表わす。したがって本発明者らは、これら２つの有効成分の組合せが損傷組織におけるニューロン成長の誘導および細胞生存の促進に特に有益であることを発見したことになる。
【００８４】
したがって、本発明の第７の側面によれば、ニューロン生存および軸索成長を促進するための組成物であって、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与するペプチドをコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成されたジーンサイレンシング分子と、神経栄養成長因子とを含む組成物が提供される。
【００８５】
第７の側面に従う組成物はＣＮＳ損傷を患っている個体を治療するのに用いられる。
第８の側面によれば、対象のニューロン生存および軸索成長を促進する方法であって、Ｒｈｏ-Ａ阻害経路に関与するペプチドをコードする遺伝子の発現を下方制御するように構成されたジーンサイレンシング分子と、ＮＴＦとを含む組成物を、そのような治療の必要な対象へ投与することを含む方法が提供される。
【００８６】
適当な神経栄養成長因子の例には、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＮＧＦ、ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＦＧＦ-１、ＦＧＦ-５、ＣＴ-１、ＣＤＦ、インシュリン、ＩＧＦ-１、ＩＧＦ-２、ＩＬ-６、ＬＩＦ、ＮＰＦ、ＰＤＧＦ、ＰＮ-１、Ｓ-１００、ＴＧＦ-βおよびＶＩＰなどがある（Oppenheim、１９９６年、Neuron、第１７巻、１９５−１９７頁）。
【００８７】
ＮＴＦの量は、体重１ｋｇあたりおよそ０．０１μｇ〜０．５ｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ〜１０ｍｇであるのがよい。
【００８８】
ジーンサイレンシング分子はアンチセンス分子または低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を含んでもよい。
【００８９】
ここで記述した特徴のすべて（付随する請求項、要約および図面を含む）および／または開示した方法またはプロセスのすべての工程は、上記側面のいずれかとあらゆる組合せで組合わされてもよいが、それらの特徴および／または工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組合せは除かれる。
【００９０】
本発明のより詳しい理解のために、そして本発明の実施形態がどのようにして機能するのかを示すために、添付図面を参照して説明する。
【００９１】
実施例１
材料および方法
成体網膜の培養
成体ラット（６〜８週齢）の頸椎脱臼による殺後、網膜を切開によって取出し、パパインシステム（Worthington Biochem社、ニュージャージー州、米国）を用いてメーカのプロトコルに従って分離した。ＲＧＣを含む２×１０６個の分離網膜細胞を、補足ニューロベイサル-Ａ（Invitrogen社）培地中で、４ウェル組織培養プレート（Nunc社、英国）の、１００μｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リジン（Sigma社、ドーセット州、英国）および２０μｇ／ｍｌメロシン（Chemicon社、ハロー、英国）でプレコートされたガラスカバースリップ上で、４日間、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤環境で培養した。
【００９２】
ｓｉＲＮＡ調製とトランスフェクション
ターゲット特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖を設計するために、ＮＣＢＩ系統番号ＮＭ０１２６１０であるラットｐ７５ＮＴＲｍＲＮＡのオープンリーディングフレームから、Elbashirおよび共同研究者によって設定された基準（Nature、第４１１巻、４９４−４９８頁）を用いて、ｐ７５ＮＴＲに対する５つのｓｉＲＮＡ配列を選択した。オリゴヌクレオチドの鋳型および対照のスクランブル配列を化学的に合成し（Alta Biosciences社、Birmingham大学、英国）、ｓｉＲＮＡ配列をサイレンサーｓｉＲＮＡコンストラクションキット（
Ambion社、テキサス州、米国）を用いて構築した。
使用したｓｉＲＮＡ配列は以下のとおりであった：
【００９３】
ｐ７５ＮＴＲ配列：
配列１、  ５'−ＡＡＣＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＣＴＡＴＴＧＣ−３'；
配列２、  ５'−ＡＡＣＧＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＴＴＡＧＣ−３'；
配列３、  ５'−ＡＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＴＴＧＴＡＣ−３'；
配列４、  ５'−ＡＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＣ−３'；および
配列５、  ５'−ＡＡＧＣＧＧＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＧＧＡ−３'。
【００９４】
スクランブル配列は以下のとおりであった：
アンチセンス  ５'−ＡＡＴＣＧＣＡＴＧＣＧＴＴＣＣＡＴＴＴＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣ−３'；
センス  ５'−ＡＡＣＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＣＡＴＧＣＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣ−３'。
【００９５】
ＲＧＣを、４ウェル組織培養プレート（Nunc社）において、オリゴフェクタミン試薬（Invitrogen社）を用いてメーカ（Invitrogen社）の取扱説明書に従い、ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトした。トランスフェクションの５時間後、細胞の溶解および免疫組織化学の前に、補足ニューロベイサル−Ａを加え、ＣＮＳミエリン（N. Gregson氏、London大学Kings College、英国からの寄贈）の存在／不在下で、さらに７２時間インキュベートした。
【００９６】
抗体
モノクローナルβ-ＩＩＩチューブリン（１：１００）およびポリクローナル抗ｐ７５ＮＴＲ（１：５００）は両方ともSigma社、プール、英国由来のもので、モノクローナル１９２-Ｉｇ（免疫組織化学で１：１００、ウェスタンブロットで１：５００）を
Oncogene Research Products社、サンディエゴ、米国から購入した。免疫組織化学（１：２００）およびウェスタンブロット（１：２００）によってＲｈｏ-Ａの局在を突止めるために、ヤギ抗ヒトＮｇＲ（ウェスタンブロットで１：１００）およびモノクローナル抗ヒトＲｈｏ-Ａ（２６Ｃ４）を使用した（Santa Cruz社、カリフォルニア州、米国）。
【００９７】
組織標本および免疫組織化学
少なくとも３体のラット群について、麻酔の過剰摂取による殺後、それらの網膜および視神経（ＯＮ）を摘出し、ＯＣＴ（Miles Inc社、カリフォルニア州、米国）に埋込み、液体窒素中で凍結した。厚さ１０μｍの長手の低温槽切片は、−２０℃で、ＯＮおよび網膜を切出し（Bright Instrument社、ケンブリッジシャー州、英国）、ベクタボンド（
Vectabond）被覆スライド（Vector Laboratories社、ケンブリッジシャー州、英国）に集めて、風乾し、先に記載された免疫組織化学（MoI. Cell Neurosci.、第２１巻、３０１−３１１頁）用に処理された。培養網膜細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、また、先に記載されたように処理した（Lorberら、２００２年、MoI. Cell Neurosci.、第２１巻、３０１-３１１頁）。
【００９８】
神経突起伸長測定
アクシオビジョン（Axiovision）ソフトウェア（Zeiss社、ハートフォードシャー州、英国）を用いて各神経突起をトレースし、各カバースリップの５０個のＲＧＣについて最長の神経突起を測定することで、βＩＩＩ-チューブリン免疫染色されたＲＧＣの取込み画像から神経突起伸長を測定した（ｎ＝３，３回の独立実験）。その後、平均神経突起長を算出した。
【００９９】
たんぱく抽出およびウェスタンブロッティング
ＯＮ粉砕後０，６，８および２０日目に、各処理群のラットの殺後、６つのプールしたＯＮからたんぱくを抽出し、先に記載されたウェスタンブロッティング用に処理した（J. Biol. Chem.、第２７７巻、３２８２０−３２８２９頁）。ｓｉＲＮＡ処理されたＲＧＣ培養物におけるｐ７５ＮＴＲレベルをウェスタンブロッティングによって決定するために、先に記載されたように（Wintonら、２００２年、J. Biol. Chem.、第１５７巻、５６５−５７０頁）、６×１０６細胞／ｓｉＲＮＡを溶解し、ブロットした。
【０１００】
統計分析
グラフパッドプリズム（GraphPad Prism）（GraphPad Software社、バージョン４．０、サンディエゴ、米国）を用いて、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続くダネットの方法による事後検定によって、有意性について標本平均を算出し、分析した。
【０１０１】
結果
ｐ７５ＮＴＲのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンは、阻害性ＣＮＳミエリン存在下でＲｈｏ-Ａを下方制御し、ＣＮＴＦ活性化神経突起伸長を増進する
本発明者らはＣＮＳ損傷の生体外モデルを提起するために、分離ＲＧＣの初代培養物を用い、１００ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦ、つまり非Ｔｒｋ依存神経栄養因子が最適なＲＧＣ神経突起伸長を促進すること、および、このＣＮＴＦ介在性伸長は１０μｇ／ｍｌのラットＣＮＳミエリンによって阻害されることを発見した（不図示）。ｐ７５ＮＴＲのノックダウンは、ミエリン存在下で成長するＣＮＴＦ活性化ＲＧＣにおいてｓｉＲＮＡ ｐ７５ＮＴＲによって達成された。結果を図１に示す。
【０１０２】
（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２として識別されるｐ７５ＮＴＲｓｉＲＮＡによる完全ノックダウン、およびｐ７５ＮＴＲの他のｓｉＲＮＡ配列による「部分」ノックダウン、ならびに、ＲＧＣがミエリン存在下でＣＮＴＦによって活性化されるときのＲｈｏ-Ａ活性の同時抑制を示す。したがって、すべてのｓｉＲＮＡ配列が効果を示す。（ｂ）網膜細胞培養物からの二次ウェスタンブロットによって、スクランブル配列はｐ７５ＮＴＲおよびＲｈｏ-Ａに効果がないことが示され、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２の効果の特異性が実証される。（ｃ）特にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２による生体外ノックダウンは、神経突起伸長レベルをミエリン不在下でみられるレベルに回復し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２はミエリン不在下でみられるレベル以上に神経突起伸長を有意に活性化した。また、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２はＲＧＣ生存を有意に促進した（ミエリン存在下での配列２対ＣＮＴＦについて、ＡＮＯＶＡにおいて＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。なお、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１〜５はすべてミエリンの阻害効果を遮断する。（ｄ）二重免疫組織化学によると、ＣＮＴＦ存在下で成長したβＩＩＩ-チューブリン＋ＲＧＣは、体細胞および神経突起の両方において、ｐ７５ＮＴＲ免疫染色を示した。しかし、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２介在性ｐ７５ＮＴＲｓｉＲＮＡ実験において、βＩＩＩ-チューブリン＋ＲＧＣはｐ７５ＮＴＲの完全（体細胞および神経突起）または部分（神経突起のみ）ノックダウンのいずれかを示した。スケールバーは５０μｍである。
【０１０３】
全対照培養物（無処理ＲＧＣ、ＣＮＴＦ処理ＲＧＣならびにＣＮＴＦおよびＣＮＳミエリン処理ＲＧＣ）において、ｐ７５ＮＴＲおよびＲｈｏ-Ａの高いレベルが検出された（図１ａ）。５つのｐ７５ＮＴＲｓｉＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１〜５）の導入後、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１および３はｐ７５ＮＴＲの有意なノックダウンを誘導し（７０〜８０％、ウェスタンブロット濃度測定によって定量した（不図示））、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２はｐ７５ＮＴＲおよびその加工型（細胞外ドメイン（ＥＣＤ）：ｐ５５フラグメントおよび細胞内ドメイン（ＩＣＤ）：ｐ２５フラグメント）の１００％ノックダウンを誘導した（図１ａ）。また、試験した５つのｐ７５ＮＴＲｓｉＲＮＡ配列はすべてＲｈｏ-Ａ-ＧＴＰレベルを顕著に抑制し、活性は配列１〜３を用いて完全に遮断された（図１ａ）。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２の対照のスクランブル配列は、別のウェスタンブロットで実証されたように、ｐ７５ＮＴＲまたはＲｈｏ-Ａ活性のどちらのレベルにおいても変化を起こさなかった（図１ｂ）。
【０１０４】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２による培養ＲＧＣにおけるｐ７５ＮＴＲ／ｐ５５／ｐ２５のノックダウンおよび結果として生じるＲｈｏ-Ａ活性の抑制後、ミエリン存在下でＣＮＴＦによって神経突起を成長させるために活性化されたＲＧＣの数は、ミエリン存在下のＣＮＴＦのみによる神経突起にみられるよりも５倍増加しており（図１ｃ）、それにともないＲＧＣ神経突起長は５倍の促進があった（図１ｃ）。さらに、ｐ７５ＮＴＲ／ｐ５５／ｐ２５の下方制御およびＲｈｏ-Ａ活性抑制は、培養４日後に有意に増加したＲＧＣ生存と関連していた（図１ｃ）。興味深いことに、５つのｓｉＲＮＡ配列すべてが、阻害性ＣＮＳミエリン存在下のＣＮＴＦ活性化ＲＧＣ神経突起伸長を、ミエリン不在下のＣＮＴＦによってみられるレベルに回復した。しかし、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２は、ＣＮＳミエリン不在でＣＮＴＦによって活性化されたときに観察されるレベル以上に、ＲＧＣ神経突起伸長を驚くほど増進させた。ＣＮＴＦおよびスクランブル配列２の存在下で成長したＲＧＣは、ＣＮＴＦのみの対照と比較して、神経突起伸長において差異を示さなかった（図１ｄ）。
【０１０５】
本発明者らは、いかなる仮説によって制約されることも望まないが、これら結果は、ｓｉＲＮＡ介在性ｐ７５ＮＴＲｍＲＮＡ翻訳サイレンシングによるｐ７５ＮＴＲノックダウンが、Ｒｈｏ-Ａ ＧＤＰのＲｈｏ-Ａ ＧＴＰへの変換を遮断し、これによって、成長円錐の完全性を保存することで、阻害環境を通じてＣＮＴＦ誘導ＲＧＣ神経突起伸長を増進させ、場合によっては、アクチン重合の増大を介して進展させることを示唆していると考える。
【０１０６】
考察
試験した５つのｓｉＲＮＡ分子のそれぞれが、ＲｈｏＡ阻害経路の脱阻害を示した。特に、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２は、阻害剤の不在下よりも阻害性ミエリン存在下でより成長を活性化するという驚くべき効果があった。生体外では、ｐ７５ＮＴＲのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンは、下流の阻害性シグナル伝達分子Ｒｈｏ-Ａ活性の完全な遮断を導き、ＣＮＴＦ活性化ＲＧＣ生存およびＣＮＳミエリン存在下の神経突起伸長が顕著に増進する。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２以外のｐ７５ＮＴＲのｓｉＲＮＡ配列もまた、ｐ７５ＮＴＲを部分に除去すると同時に、Ｒｈｏ-Ａ活性の有意な抑制を導き、ＣＮＳミエリン存在下でのＣＮＴＦによるＲＧＣ神経突起伸長を回復した。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２は、ＣＮＳミエリン存在下において、ｐ７５ＮＴＲ型すべてと、Ｒｈｏ-Ａとの完全ノックダウンを誘導し、ミエリン不在下でみられるより神経突起伸長を２倍以上増進させた。これは、ＣＮＴＦの神経栄養因子効力が、ミエリン不在下でさえ阻害性分子によって抑制されていることを示唆している。我々は、いかなる仮説によって制約されることも望まないが、本発明者らは、これらはＣＳＰＧ、エフリン、セマフォリンなどを含むと考えている。
【０１０７】
結論として、本発明者らの結果は、ＮＴＦ活性化再生ＲＧＣにおいては、ｐ７５ＮＴＲ介在性成長円錐崩壊の下方制御に関する内生機構が存在し、これには下流Ｒｈｏ-Ａ介在性阻害性シグナル伝達の抑制が含まれることを示唆している。このｐ７５ＮＴＲの内生下方制御は、ｐ７５ＮＴＲターゲットｓｉＲＮＡの適用によって効果的に増補されるのがよい。したがって、ｓｉＲＮＡ技術は、軸索がＣＮＳの阻害環境を克服して再生するのに役立つ付加的な治療戦略を提供する。ニューロン死は、最初の考えより、良好なＣＮＳ修復の大きな障壁であるらしく、適切なＮＴＦを用いてニューロン生存および軸索再生を増大させる治療戦略と、本発明に従う分子との併用は、ＣＮＳ軸索再生および細胞生存を促進し、損傷後の機能を回復する好ましい方法である。
【０１０８】
実施例２
材料および方法
成体ＤＲＧＮ培養
Ｌ４〜Ｌ７のＤＲＧ対を成体ラット（６〜８週齢）から取出し、０．１％コラゲナーゼ（Sigma社、プール、英国）および２００Ｕ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ（Worthington Biochem社、ニュージャージー州、米国）を含むニューロベイサル-Ａ（Invitrogen社、ペーズリー、英国）の溶液を用いて、２時間、３７℃、５％ＣＯ２を含む湿潤環境で単細胞に分離し、何度も粉砕し、残渣を除去するために１５％ウシ血清アルブミン勾配によって遠心分離にかけた。分離細胞をペレットにして、その後、Ｂ２７サプリメント、Ｌ−グルタミンおよびゲンチミシンを含むニューロベイサル-Ａ（補足ニューロベイサル-Ａ、すべてInvitrogen社より）に再懸濁し、１，５００個のＤＲＧＮ／ウェルを、４ウェル組織培養プレート（Nunc社、英国）の、１００μｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リジンに続き２０μｇ／ｍｌラミニン-Ｉ（Sigma社、ドーセット州、英国）でプレコートされた滅菌カバースリップ上で、補足ニューロベイサル-Ａ培地中において、ラットＣＮＳミエリン（Norman Gregson博士、London大学King's College、英国より）の存在下と不在下との両方において、７２時間、３７℃、５％ＣＯ２を含む湿潤環境で培養した。
【０１０９】
ｓｉＲＮＡ調製とトランスフェクション
実施例１のように、Elbashirおよび共同研究者によって設定された基準（Elbashirら、２００１年、上記を参照）を用いて、ｐ７５ＮＴＲ、ＮｇＲおよびＲｈｏ-Ａに対するｓｉＲＮＡを設計した。ジアデニン開始配列を有して５０％未満のＧＣ含量から成る可能領域を同定するために、ラットｐ７５ＮＴＲ、ＮｇＲおよびＲｈｏ-Ａのコード配列をスキャンした。使用したｓｉＲＮＡ配列は以下のとおりである：
ｐ７５ＮＴＲ配列
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１、  ５'−ＡＡＣＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＣＴＡＴＴＧＣ−３'；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２、  ５'−ＡＡＣＧＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＴＴＡＧＣ−３'；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３、  ５'−ＡＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＴＴＧＴＡＣ−３'；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４、  ５'−ＡＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＣ−３'；および
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５、  ５'−ＡＡＧＣＧＧＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＧＧＡ−３'。
【０１１０】
ＮｇＲ配列
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６、  ５'−ＡＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧ−３'；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.７、  ５'−ＡＡＣＣＴＣＡＣＧＣＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧ−３'；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８、  ５'−ＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧ−３'；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９、  ５'−ＡＡＡＴＧＣＡＣＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＴＧＴ−３'；および
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０、  ５'−ＡＡＴＧＡＣＴＣＴＣＣＡＴＴＴＧＧＧＡＣＴ−３'。
【０１１１】
Ｒｈｏ-Ａ配列
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１１、  ５'−ＡＡＧＡＴＴＡＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＡＧＧＣ−３'；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２、  ５'−ＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＧＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧ−３'；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１３、  ５'−ＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＡＡＡＡＴ−３'；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１４、  ５'−ＡＡＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＧＧＴＡＡＡ−３'；および
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１５、  ５'−ＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＧＧＡＧＴＧＡＧ−３'。
【０１１２】
他の遺伝子と高い相同性を持たないことを確実にするために、選択した配列をＢＬＡＳＴ検索にかけた（www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed）。センスｓｉＲＮＡ鋳型は、５'末端がＡＡダイマで開始し、ターゲット配列に相補的な１９ヌクレオチドが続いた。センス鋳型およびアンチセンス鋳型の両方の３'末端は、ｓｉＲＮＡの効率的な転写に必要なＴ７プロモータプライマーの相補配列に一致する５'−ＣＣＴＧＴＣＴＣ−３'の８ヌクレオチド配列を含む。脱保護および脱塩オリゴヌクレオチド鋳型および対照のスクランブル配列を化学的に合成した（Alta Biosciences社、バーミンガム大学、英国）。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１６：スクランブルｐ７５ＮＴＲ Ｓｅｑ２：  ５'−ＡＡＴＣＧＣＡＴＧＣＧＴＴＣＣＡＴＴＴＣＧ−３'；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１７：スクランブルＮｇＲ１：  ５'−ＡＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＴＴＧＧＣＧＧＴＣ−３'；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１８：スクランブルＲｈｏ-Ａ Ｓｅｑ２：  ５'−ＡＡＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＧ−３'
【０１１３】
ｓｉＲＮＡトランスフェクションのため、オリゴフェクタミン試薬（Invitrogen社）を４ウェル組織培養プレート（Nunc社）において用いた。１本のチューブで、０．８４μｇのｓｉＲＮＡ／ウェルを５０μｌのＯｐｔｉ-ＭＥＭ（Invitrogen社）に混合し、２番目のチューブに３μｌのオリゴフェクタミン（Invitrogen社）および１２μｌのＯｐｔｉ-ＭＥＭ（I nvitrogen社）を入れた。これらチューブを、２溶液を混合する前に室温で５分インキュベートし、複合体形成のため、さらに２５分室温でインキュベートした。その後、ＤＲＧＮの各ウェルについて、１５０μｌのトランスフェクション培地を加えることのできる必要量にまで、全混合物にＯｐｔｉ-ＭＥＭ（Invitrogen社）を補足した。トランスフェクション５時間後、補足ニューロベイサル-Ａを、最終量が５００μｌ／ウェルになるまでトランスフェクション培地に加え、ＤＲＧＮを、細胞溶解（ウェスタンブロット分析用）または免疫組織化学のいずれかに付す前に、さらに４８時間インキュベートした。
【０１１４】
抗体
ＤＲＧＮ神経突起を標識するために、モノクローナルβ-ＩＩＩチューブリン抗体（
Sigma社）を、免疫組織化学（ＩＣＣ）では１：１００で、ウェスタンブロットでは１：５００で用いた。ｐ７５ＮＴＲを同定して局在を突止めるために、ポリクローナル抗ｐ７５ＮＴＲＡｂを用いた（Sigma社、ウェスタンブロットおよびＩＣＣの両方で１：５００希釈）。ｐ７５ＮＴＲの２５ｋＤａ加工細胞質フラグメントを同定して局在を突止めるために、モノクローナル１９２-Ｉｇを用いた（Oncogene Research Products社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国；ウェスタンブロッティングで１：２００希釈）。Ｒｈｏ-Ａ（モノクローナルおよびポリクローナルＡｂ、ウェスタンブロッティングおよびＩＣＣの両方で１：２００希釈）およびポリクローナル抗ＮｇＲ Ａｂ（ウェスタンブロッティングおよびＩＣＣの両方で１：１００希釈）を、Santa Cruz Biotechnology社、カリフォルニア州、米国から購入した。
【０１１５】
免疫細胞化学
ＤＲＧ培養物を、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し（TAAB Laboratories社、バークシャー州、英国）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma社）および１％トリトンＸ-１００（Sigma社）を含むＰＢＳ中でブロッキングし、０．５％ ＢＳＡおよび０．５％ Ｔｗｅｅｎ-２０（Sigma社）を含むＰＢＳ中で１：１００に希釈された関連一次抗体とともに、加湿チャンバ内において１時間室温でインキュベートした。その後細胞を、ＰＢＳ中で３回洗浄し、ＰＢＳ-Ｔ-ＢＳＡにおいて１：１００に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Green社）またはテキサスレッド（Red社）のいずれか一方とともに、１時間室温でインキュベートした。ＰＢＳ中でのさらなる洗浄に続いて、カバースリップをＦｌｕｏｒＳａｖｅ（
Calbiochem社、サンディエゴ、米国）に載せ、蛍光顕微鏡（Carl Zeiss社、ウェリン-ガーデンシティー、英国）で観察した。
【０１１６】
神経突起伸長の測定
アクシオビジョンの測定機能を用いてランダムに選択した３０のＤＲＧＮ／カバースリップから、βＩＩＩ-チューブリン＋免疫染色ＤＲＧＮ神経突起の顕微鏡写真を、アクシオビジョンソフトウェア（Carl Zeiss社）を用いて記録した。神経突起長を平均±ＳＤで表わした。神経突起伸長は広範囲に及ぶため、ｓｉＲＮＡノックダウン実験由来の神経突起を測定するのにソフトウェアを用いることはできなかった。そのような場合、神経突起伸長の測定として、ＤＲＧＮ細胞溶解物をβＩＩＩ-チューブリン用ウェスタンブロットに用いた。
【０１１７】
たんぱく抽出およびウェスタンブロッティング
ｓｉＲＮＡ処理ＤＲＧ培養物におけるｐ７５ＮＴＲ、ＮｇＲおよびＲｈｏ-Ａのレベルを決定するため、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（
Invitrogen社）と１５分３７℃でインキュベートし、その後粉砕し１３００ｒｐｍで５分間遠心した。ＤＲＧ細胞ペレットを、２０ｍＭトリス-塩酸（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ-４０（Sigma社）およびプロテアーゼインヒビタカクテル（Sigma社）を含む氷冷溶解バッファに再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。１３，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心した後、比色分析ＤＣプロテインアッセイ（Bi o-Rad社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を用いて、たんぱく濃度について溶解物を標準化した。ウェスタンブロット分析に用いるまで、ホモジネートおよび細胞溶解物を−７０℃で保存した。
【０１１８】
各標本（総たんぱく量４０μｇ）をレメリ（Laemmeli）ローディングバッファとともに９０℃４分間で２回インキュベートし、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（
Invitrogen社）で分離した。たんぱくをＰＶＤＦメンブレン（Millipore UK社、グロスターシャー州、英国）に転写し、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０および５％脱脂乳を含むトリス緩衝生理食塩水中において１時間室温でブロッキングした。メンブレンを関連抗体に対して一夜ブロットした。検出のために、増進化学発光（ＥＣＬ）システム（Amersham社、バッキンガムシャー州、英国）およびＨＲＰ-共役二次抗体（１：１，０００、Amersham社）を用いた。各ブロットをはがし、その後関連抗体と再プロービングした。
【０１１９】
ＤＲＧＮ生存
ｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンに続いて、１ｓｉＲＮＡあたり９のカバースリップの全面積をスキャンすることによって蛍光顕微鏡下において、βＩＩＩ-チューブリン＋ＤＲＧＮの数をカウントした。ＤＲＧＮ／カバースリップの平均数を、以下に記載するように統計的に算出し、分析した。
【０１２０】
濃度測定
各ｓｉＲＮＡについて、ウェスタンブロットおよび抗体の評価を３つの別々の実験で３回実行し、関連する場合は、サイオンイメージソフトウェア（Scion Corporation社／NIH Image、米国）を用いて濃度測定によってブロットを定量した。
【０１２１】
統計分析
標本平均を算出し、グラフパッドプリズム（GraphPad Software社、バージョン４.０、サンディエゴ、米国）を用いて、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって有意性について分析し、続いて、統計的に有意な群を同定するためにダネットの方法による事後検定を行った。
【０１２２】
結果
ＦＧＦ２はＤＲＧＮ神経突起伸長を促進する
選択したｓｉＲＮＡ配列の効力を試験するために、本発明者らは初めに生体外モデルを提起し、その中で非Ｔｒｋ依存神経栄養因子であるＦＧＦ２を、ＤＲＧＮの神経突起伸長を活性化するために用いた。その結果を図２に示す。
【０１２３】
Ａ，ＦＧＦ２なし；Ｂ，１ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２；Ｃ，１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２；Ｄ，１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２；Ｅ，２００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２は、ＤＲＧＮ神経突起長において用量依存的な増加を誘導し；Ｆ，画像分析によるβＩＩＩ-チューブリン＋の平均±ＳＤ神経突起長の定量化であって、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２で最適な神経突起伸長を示し、その後平均神経突起伸長は低下した（１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２対０ｎｇ／ｍｌについて、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
【０１２４】
この結果は、βＩＩＩ-チューブリンポジティブＤＲＧＮ神経突起がニューロベイサル-Ａのみでも成長して、平均長３５０±３５μｍに到達することを示す（図２Ａおよび図２Ｆ）。しかし、ＦＧＦ２の濃度が高まるにつれ、１０ｎｇ／ｍｌまでは、神経突起伸長は増大した（図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｆ）。この最適濃度を越えると、ＤＲＧＮ神経突起伸長は減少した（図２Ｄ〜図２Ｆ）。これらの結果は、ＦＧＦ２が濃度依存的に、ＤＲＧＮの神経突起伸長を効果的に促進できることを実証している。
【０１２５】
ＣＮＳミエリンにおけるＦＧＦ２活性化ＤＲＧＮ神経突起伸長の阻害
ＣＮＳミエリンによるＦＧＦ２活性化ＤＲＧＮ神経突起伸長の阻害を、ＣＮＳミエリンに濃度幅を持たせてＤＲＧＮを培養することによって決定した。その結果を図３に示す。
【０１２６】
Ａ，ＣＮＳミエリンなし；Ｂ，１００μｇ／ｍｌ ＣＮＳミエリン；Ｃ，１０μｇ／ｍｌ ＣＮＳミエリン；Ｄ，１００μｇ／ｍｌ ＣＮＳミエリン；Ｅ，２００μｇ／ｍｌ ＣＮＳミエリンは、ＤＲＧＮ神経突起長において用量依存的な減少を誘導し；Ｆ，画像分析による平均±ＳＤ神経突起長の定量化であって、ＤＲＧＮ神経突起伸長阻害に関して２００μｇ／ｍｌ ＣＮＳミエリンが最適濃度であることを示し、より高濃度のＣＮＳミエリン（５００μｇ／ｍｌ）はＤＲＧＮに有毒である（２００μｇ／ｍｌ対０μｇ／ｍｌミエリンについて、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
【０１２７】
１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２によって活性化されたＤＲＧＮ神経突起伸長（図３Ａに示す）は、１００μｇ／ｍｌ ＣＮＳミエリンの存在下でＤＲＧＮを成長させることによって有意に減少させられ（図３Ｂ）、２００μｇ／ｍｌ ＣＮＳミエリンは、ほぼ完全にＦＧＦ２介在性ＤＲＧＮ神経突起伸長を阻害した（図３Ｃ）。ＣＮＳミエリン濃度を２５０μｇ／ｍｌ（図３Ｄ）および５００μｇ／ｍｌ（図３Ｅ）に高めると、神経突起伸長を完全に阻害した。しかし、用いたＣＮＳミエリンの最高濃度によって細胞死の増大およびＤＲＧＮ形態変化が導かれたため、以降のｓｉＲＮＡ実験については最適な阻害を与えるのに２００μｇ／ｍｌのミエリンを選択した。神経突起長測定による神経突起伸長の定量化によってこれらの観察は確かめられ（図３Ｆ）、ＦＧＦ２活性化神経突起伸長はＣＮＳミエリンによって効果的に遮断されることが実証された。
【０１２８】
ｐ７５ＮＴＲｓｉＲＮＡは、ＤＲＧＮにおいてｐ７５ＮＴＲおよびそのフラグメントをノックダウンし、Ｒｈｏ-Ａをも下方制御する
本発明者らは実施例１において、ｐ７５ＮＴＲｍＲＮＡに対する５つの選択したｓｉＲＮＡ配列のうち、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２が、ＲＧＣのｐ７５ＮＴＲおよびその加工フラグメントと下流Ｒｈｏ-Ａとを完全にノックダウンすることを実証した（実施例１参照）。ＦＧＦ２のみの存在下で成長したＤＲＧ培養物由来の細胞溶解物のウェスタンブロット分析は、ｐ７５ＮＴＲおよびＲｈｏ-Ａたんぱくレベルのいかなる変化も示さなかった。しかし、ＦＧＦ２およびＣＮＳミエリンの存在下で成長した細胞溶解物において、ｐ７５ＮＴＲたんぱくレベルは影響を受けないままであったが、Ｒｈｏ-Ａレベルは増進されており、阻害経路の誘導を示している（図４Ａに示す）。
【０１２９】
図４において：Ａ，ｓｉＲＮＡ介在性ジーンサイレンシング後の細胞溶解物のウェスタンブロッティングは、ｐ７５ＮＴＲたんぱくの７０％ノックダウンおよびｐ７５ＮＴＲの全フラグメントの下方制御ならびにその後のＲｈｏ-Ａ活性抑制を示す；Ｂ，βＩＩＩ-チューブリンおよびｐ７５ＮＴＲ抗体による二重免疫組織化学によって、ＣＮＳミエリン不在下におけるＦＧＦ２による神経突起伸長を示し、ｐ７５ＮＴＲ免疫染色はＤＲＧＮ体細胞およびその神経突起に局在している；Ｃ，ＣＮＳミエリンは神経突起伸長を阻害するが、ｐ７５ＮＴＲ免疫活性に影響はない；Ｄ，ｐ７５ＮＴＲ配列２によるＤＲＧＮのトランスフェクションは、神経突起伸長と有意（対ｐ７５ＮＴＲスクランブル配列２について、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）に関連するｐ７５ＮＴＲに対する免疫活性の顕著な減少を誘導した；Ｅ，ｐ７５ＮＴＲ配列２に対するスクランブル配列の存在下で、明らかな神経突起伸長は少しもなく、ｐ７５ＮＴＲへの免疫活性が維持される。
【０１３０】
ＲＧＣで用いたｐ７５ＮＴＲｍＲＮＡに対する同じ５つのｓｉＲＮＡ配列（実施例１参照）でＤＲＧＮをトランスフェクトすると、配列２は再びｐ７５ＮＴＲならびにその加工フラグメントｐ５５およびｐ２５の最大ノックダウンを誘導し、７０％の効果があった（対スクランブル２について、Ｐ＜０．０００１）（図４Ａ）。配列２のスクランブルバージョンはｐ７５ＮＴＲノックダウンに効果がなかったことから、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２で観察されたノックダウンは特異的であった。ブロットをはがし、Ｒｈｏ-Ａと再プロービングしたとき、ｐ７５ＮＴＲｓｉＲＮＡ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２によってＲｈｏ-Ａのほぼ完全なノックダウンもまた達成された。ｐ７５ＮＴＲ免疫活性は、ＣＮＳミエリンのないＦＧＦ２の存在下で中程度の神経突起伸長があった、βＩＩＩ-チューブリン＋ＤＲＧＮに存在した（図４Ｂ）。ＤＲＧＮ体細胞および神経突起のｐ７５ＮＴＲ免疫活性は、ＣＮＳミエリンおよびＦＧＦ２を組合せて存在させても影響されなかったが、神経突起伸長は有意に減少した（図４Ｃ）。
【０１３１】
しかし、ＣＮＳミエリンおよびＦＧＦ２と共にｐ７５ＮＴＲｓｉＲＮＡ配列２の存在下で成長したＤＲＧＮのｐ７５ＮＴＲ免疫活性には著しい減少があり、神経突起伸長は増進された（図４Ｄ）。スクランブル対照配列２は、ＦＧＦ２およびＣＮＳミエリンの存在下においてｐ７５ＮＴＲ免疫活性の変化および神経突起伸長を示さず（図４Ｅ）、ｐ７５ＮＴＲｓｉＲＮＡ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２介在性ノックダウンの生物学的反応は、下流の阻害性シグナル伝達分子であるＲｈｏ-Ａの効果的ノックダウンをも誘導するｓｉＲＮＡの特異的反応であることが確かめられた。
【０１３２】
ＮｇＲ  ｓｉＲＮＡはＤＲＧＮにおいてＮｇＲを有意にノックダウンする
本発明者らは、ＤＲＧＮにおけるＮｇＲのノックダウンに関して、ＮｇＲ ｍＲＮＡに対する５つのｓｉＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６〜１０）を試験した。その結果を図５に示す。
【０１３３】
Ａ，ｓｉＲＮＡ介在性ジーンサイレンシング後の細胞溶解物のウェスタンブロッティングは、ｓｉＲＮＡ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６，７および１０を用いたときのＮｇＲたんぱくのノックダウンが、それぞれ１００％，５５％および１８％であることを示した；Ｂ，ＮｇＲ ｓｉＲＮＡ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６によるＤＲＧＮトランスフェクションは、有意な神経突起伸長を促進するものの、免疫活性の有意な減少を誘導する；Ｃ，しかし、スクランブル配列１でトランスフェクトされたＤＲＧＮ中のβＩＩＩ-チューブリンおよびＮｇＲ抗体による二重免疫組織化学は、神経突起伸長およびＮｇＲ免疫活性変化を明らかにしなかった。
【０１３４】
本発明者らは、図５Ａに示されるように、ＦＧＦ２およびＣＮＳミエリン存在下で、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６がＮｇＲを完全にノックダウンする（１００％ノックダウンで、対スクランブル１について、Ｐ＜０．０００１）ことを示した。ｓｉＲＮＡ ＮｇＲ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６のスクランブルバージョンは、ＮｇＲレベルに効果がなく、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６ ｓｉＲＮＡの特異性を実証した。ＮｇＲノックダウン後、ｐ７５ＮＴＲおよびそのフラグメントの調節はなかったが、有意なノックダウンが達成されたサンプル中では活性Ｒｈｏ-Ａレベルが減少した（図５Ａ）。ＮｇＲ免疫活性は、ＮｇＲ ｓｉＲＮＡ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６でトランスフェクトされたＤＲＧＮにおいて著しく減少したが、βＩＩＩ-チューブリン＋神経突起の成長は、ＣＮＳミエリン存在下のＦＧＦ２による活性化後に増進した（図５Ｂ）。スクランブルＮｇＲ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６は、ＦＧＦ２およびＣＮＳミエリン存在下のＤＲＧＮのＮｇＲ免疫活性および神経突起伸長に効果がなかった（図５Ｃ）。
【０１３５】
Ｒｈｏ-Ａ  ｓｉＲＮＡはＤＲＧＮにおいてＲｈｏ-Ａを有意にノックダウンする
次に、本発明者らは、下流の阻害性シグナル伝達分子Ｒｈｏ-Ａに対する５つのｓｉＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１１〜１５）を構築し、ＤＲＧＮにおけるＲｈｏ-Ａのノックダウン能を試験した。その結果を図６に示す。
【０１３６】
Ａ，ｓｉＲＮＡ介在性ジーンサイレンシング後の細胞溶解物のウェスタンブロッティングは、Ｒｈｏ-Ａ ｓｉＲＮＡ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１１，１２，１３および１５を用いたときのＲｈｏ-Ａたんぱくのノックダウンが、それぞれ８０％，１００％，１０％および７０％であることを示す。また、ｐ７５ＮＴＲの全長および加工型における同時減少が明らかである；Ｂ，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２でトランスフェクトしたＤＲＧＮは、減少したＲｈｏ-Ａ免疫活性と、堅固な神経突起伸長とを有した；Ｃ，しかし、スクランブルＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２でトランスフェクトしたＤＲＧＮ中のβＩＩＩ-チューブリンおよびＮｇＲ抗体による二重免疫組織化学は、神経突起伸長およびＲｈｏ-Ａ免疫活性の変化を示していない。
【０１３７】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２は、ＣＮＳミエリン存在下において、ＦＧＦ２によって活性化されるＤＲＧＮ中のＲｈｏ-Ａたんぱくを完全にノックダウンし（１００％ノックダウンで、対スクランブル配列１２について、Ｐ＜０．０００１）、一方でスクランブルバージョンは効果がなかった（図６Ａ）。Ｒｈｏ-ＡのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンは、ｐ７５ＮＴＲならびにそのフラグメントｐ５５およびｐ２５の著しいノックダウンと相間があった（図６Ａ）。Ｒｈｏ-Ａ ｓｉＲＮＡ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２は、βＩＩＩ-チューブリン＋ＤＲＧＮにおけるＲｈｏ-Ａ免疫活性をほぼ完全に止め、ＣＮＳミエリンの存在下において、試験した他のｓｉＲＮＡ配列のどれよりも大きいＦＧＦ２活性化神経突起伸長を導いた（図６Ｂ）。スクランブルＲｈｏ-Ａ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２は、ＤＲＧＮのＲｈｏ-Ａ免疫細胞化学または神経突起伸長のどちらにも効果がなかった。
【０１３８】
βＩＩＩ-チューブリンのウェスタンブロットからのＤＲＧＮ神経突起伸長の定量
多くのＤＲＧＮは２つ以上の神経突起を成長させ、これらが周辺のＤＲＧＮの神経突起と混在していたため、ｐ７５ＮＴＲ、ＮｇＲおよびＲｈｏ-ＡのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンで観察される神経突起長を測定するのに、アクシオビジョンソフトウェアを用いるのは困難であった。したがって、βＩＩＩ-チューブリンのウェスタンブロットの濃度測定分析を神経突起伸長の推定に用いた。その結果を図７に示す。
【０１３９】
ＡおよびＢ，スクランブル、または他のｓｉＲＮＡ配列のどれよりも有意に多い量のβＩＩＩ-チューブリンたんぱくが、ｐ７５ＮＴＲｓｉＲＮＡ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２によってトランスフェクトされたＤＲＧＮにおいて検出されており（ＡＮＯＶＡにおいてＰ＜０．０００１）、ＦＧＦ２およびＣＮＳミエリンのみの存在下で成長したＤＲＧＮと比較して５倍の増加を示す；ＣおよびＤ，ＮｇＲに対するｓｉＲＮＡを用いて、スクランブル、または他のｓｉＲＮＡ配列のどれよりも有意に多い量のβＩＩＩ-チューブリンたんぱくを、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６によってトランスフェクトされたＤＲＧＮにおいて検出しており（ＡＮＯＶＡにおいてＰ＜０．０００１）、ＦＧＦ２およびミエリンのみの存在下で成長したＤＲＧＮと比較して３倍の増加を示す；ＥおよびＦ，Ｒｈｏ-Ａに対するｓｉＲＮＡを用いて、スクランブル、または他のｓｉＲＮＡ配列のどれよりも有意に多い量のβＩＩＩ-チューブリンたんぱくを、Ｒｈｏ-Ａ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２によってトランスフェクトされたＤＲＧＮにおいて検出しており（ＡＮＯＶＡにおいてＰ＜０．０００１）、ＦＧＦ２およびミエリンのみの存在下で成長したＤＲＧＮと比較して６．５倍の増加を示す。βＩＩＩ-チューブリンたんぱくの最大量（最も堅固な神経突起伸長を反映している）は、Ｒｈｏ-Ａ ｓｉＲＮＡ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２によってトランスフェクトされたＤＲＧＮにおいて検出されている；Ｇ，細胞生存の測定としてβＩＩＩ-チューブリン＋ＤＲＧＮ数を数え、ｐ７５ＮＴＲ、ＮｇＲまたはＲｈｏ-ＡのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウン後に有意な変化は示されていない（ＦＧＦ２およびミエリンを伴う対照ＤＲＧＮに対し、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
【０１４０】
ＣＮＳミエリン存在下のＦＧＦ２活性化神経突起伸長は、ｓｉＲＮＡ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２をｐ７５ＮＴＲノックダウンに用いたときに５倍に増進され（図７Ａおよび図７Ｂ）、ｓｉＲＮＡ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６をＮｇＲノックダウンに用いたときに３．５倍に増進され（図７Ｃおよび図７Ｄ）、ｓｉＲＮＡ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２をＲｈｏＡノックダウンに用いたときに６．５倍に増進された（図６Ｅおよび図６Ｆ）。ＦＧＦ２活性化βＩＩＩ-チューブリンレベルは、ｐ７５ＮＴＲノックダウン後にみられるレベルよりも、Ｒｈｏ-Ａノックダウン後でさらに増大された。これらの結果は、Ｒｈｏ-Ａを遮断することで、ＣＮＳミエリン存在下のＦＧＦ２活性化ＤＲＧＮ神経突起伸長が最適に脱阻害されることを示している。
【０１４１】
ｐ７５ＮＴＲ、ＮｇＲおよびＲｈｏ-Ａのノックダウン後のＤＲＧＮ生存
ミエリン存在下でＦＧＦ２によって活性化した、ｐ７５ＮＴＲ、ＮｇＲおよびＲｈｏ-Ａのノックダウン後の培養物に存在するβＩＩＩ-チューブリン＋ＤＲＧＮの数は、影響されないままであった（図７Ｇ）。これは、ｐ７５ＮＴＲ、ＮｇＲまたはＲｈｏ-Ａのいずれかのノックダウンが、ＣＮＳミエリン存在下のＦＧＦ２活性化ＤＲＧＮ神経突起伸長に悪影響しないことを示唆している。
【０１４２】
考察
本発明者の軸索成長脱阻害戦略は、阻害性リガンドではなく、阻害性シグナル伝達カスケードをターゲットにするｓｉＲＮＡを用いる。ＦＧＦ２活性化ＤＲＧＮにおけるｐ７５ＮＴＲ、ＮｇＲおよびＲｈｏ-Ａのノックダウンはすべて、ＣＮＳ阻害性ミエリンの存在下において神経突起伸長の脱阻害を導き、Ｒｈｏ-Ａのノックダウンが最も顕著な効果を誘導した。最も効果的なｓｉＲＮＡであるＲｈｏ-Ａ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２は、ＣＮＳミエリン存在下のＦＧＦ２によって観察されるときの６．５倍以上の、および、ｓｉＲＮＡ ｐ７５ＮＴＲ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２によって観察されるときの１．５倍以上のＦＧＦ２活性化神経突起伸長を促進した。興味深いことに、ｐ７５ＮＴＲのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンもまたＲｈｏ-Ａの完全ノックダウンを誘導し、一方で総Ｒｈｏ-ＡのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンは、ＤＲＧＮにおけるｐ７５ＮＴＲの中程度の、しかし有意なノックダウンを逆に誘導した。ＮｇＲのノックダウンによる神経突起伸長の増進は最小で、ＣＮＳミエリンの存在下で成長したＤＲＧＮと比較して、ＦＧＦ２活性化神経突起伸長を３．５倍増大させた。
【０１４３】
ｐ７５ＮＴＲのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウン
本発明者らは、ｐ７５ＮＴＲのｓｉＲＮＡ介在性ジーンサイレンシングが、ＣＮＳミエリン存在下のＲＧＣにおいて神経突起伸長を脱阻害することを実証した（実施例１）。また本発明者らは、ｐ７５ＮＴＲノックダウンがＲｈｏ-Ａ活性の抑制を導くことを示し、それによって阻害性シグナル伝達の抑制を示唆した（実施例２）。ここで、生体外のＤＲＧＮにおけるｐ７５ＮＴＲジーンサイレンシングの効果を研究するために、本発明者らは同じｓｉＲＮＡ配列を用いた。ｐ７５ＮＴＲおよびそのフラグメントのノックダウン、ならびに、それに続くＲｈｏ-Ａ活性の抑制によって、ミエリン存在下でＦＧＦ２活性化ＤＲＧＮ神経突起伸長が増進されたという観察から、多様なニューロン細胞型においてシグナルを変換するために、阻害性リガンド結合分子ＮｇＲによってｐ７５ＮＴＲが必要とされるという仮説が支持される。
【０１４４】
結論として、これらの結果は、ｐ７５ＮＴＲのノックダウンが推定上の阻害性環境（ミエリン）の存在下においてＲＧＣの神経栄養因子活性化（ＣＮＴＦ）神経突起伸長に有意に有益な影響を及ぼすことを実証している。さらに、ＮｇＲ、ｐ７５ＮＴＲおよびＲｈｏ-Ａのノックダウンは、推定上の阻害性環境の存在下においてＤＲＧＮの神経栄養因子活性化（ＦＧＦ２）神経突起伸長に有意に有益な影響を及ぼす。これは、神経栄養因子活性化機構による神経突起伸長の脱阻害が普遍的現象であるということと、ｓｉＲＮＡがこの過程を増補できるということとを暗示している。これら結果は脱阻害戦略に有望であり、下流のシグナル伝達分子に対するＲＮＡｉが、最適なＣＮＳ軸索再生を促進するのに最も有益であることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】ｓｉＲＮＡ処理後の分離網膜培養物におけるｐ７５ＮＴＲおよびＲｈｏ-Ａのノックダウンを示す。
【図２】ＤＲＧＮ培養物においてＦＧＦ２が神経突起伸長を促進することを示す。
【図３】ＣＮＳミエリンがＦＧＦ２促進ＤＲＧＮ神経突起伸長を遮断することを示す。
【図４】ＣＮＳミエリン存在下のＦＧＦ２活性化ＤＲＧＮのｐ７５ＮＴＲによるｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンを示す。
【図５】ミエリン存在下のＦＧＦ２活性化ＤＲＧＮにおけるＮｇＲのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンを示す。
【図６】ミエリン存在下のＦＧＦ２活性化ＤＲＧＮにおけるＲｈｏ-ＡのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンを示す。
【図７】ｐ７５ＮＴＲ、ＮｇＲおよびＲｈｏ-ＡのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウン後の、ＣＮＳミエリン存在下のＦＧＦ２活性化ＤＲＧＮ神経突起伸長の相関として、ＤＲＧ培養物におけるβＩＩＩ-チューブリンのウェスタンブロットおよび濃度測定定量化を示す。
【図１】
2008516628.tif 000003
【図２】
2008516628.tif 000004
【図３】
2008516628.tif 000005
【図４】
2008516628.tif 000006
【図５】
2008516628.tif 000007
【図６】
2008516628.tif 000008
【図７】
2008516628.tif 000009
【国際調査報告】
2008516628.tif 000010
2008516628.tif 000011
2008516628.tif 000012
2008516628.tif 000013
2008516628.tif 000014
2008516628.tif 000015