(57)【要約】  本発明は、Ｐｄ耐性座に因り、真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｅｒｏｎｏｓｕｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）により生じるタマネギのべと病に対して耐性である、Ａｌｌｉｕｍ属の植物、特に、アリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）又はアリウム・フィツロサム（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）種の植物であって、Ｐｄ耐性座を含む染色体の断片が、致死を引き起こさずに子孫においてホモ接合で存在することができる前記植物に関する。本発明は、当該植物のゲノム内でホモ接合で存在するＰｄ耐性座に因り真菌Ｐｄにより生じるタマネギのべと病に対して耐性であるアリウム・セパ又はアリウム・フィツロサム種の植物をも包含する。本発明は、栽培タマネギ及びワケギを取得するために好適である、タマネギのべと病に対して耐性である上記植物を取得するための方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）又はアリウム・フィツロサム（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）種の植物であって、当該植物のゲノム内にホモ接合で存在する真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（Ｐｄ）耐性座に因り当該Ｐｄにより生じるタマネギのべと病（ｄｏｗｎｙ  ｍｉｌｄｅｗ）に対して耐性である前記植物。
【請求項２】
前記Ｐｄ耐性座が前記植物のゲノム内の第３染色体上にホモ接合で存在する、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
アリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）又はアリウム・フィツロサム（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）種の植物であって、真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（Ｐｄ）耐性座に因り当該Ｐｄにより当該Ｐｄにより生じるタマネギのべと病（ｄｏｗｎｙ  ｍｉｌｄｅｗ）に耐性であり、かつ、当該Ｐｄ耐性座が、致死を引き起こさずに子孫においてホモ接合で存在することができる前記植物。
【請求項４】
アリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）又はアリウム・フィツロサム（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）種の植物であって、真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（Ｐｄ）により生じるタマネギのべと病に耐性であり、ここで、第３染色体のホモログの内の少なくとも１つは、Ｐｄ耐性座を含み、そして当該Ｐｄ耐性座を含む上記染色体の断片は、致死を引き起こさずに子孫においてホモ接合で存在することができる前記植物。
【請求項５】
前記Ｐｄ耐性座はホモ接合で存在する、請求項３又は４に記載の植物。
【請求項６】
前記Ｐｄ耐性座は、遺伝子移入断片上に存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物。
【請求項７】
前記Ｐｄ耐性座は、アリウム・ロイレイ（Ａｌｌｉｕｍ  ｒｏｙｌｅｉ）からの遺伝子移入断片上に在る、請求項６に記載の植物。
【請求項８】
第３染色体のホモ接合体の内の１又は両者の長腕内を除き、アリウム・ロイレイ（Ａｌｌｉｕｍ  ｒｏｙｌｅｉ）からの遺伝子移入セグメントは存在しない、請求項７に記載の植物。
【請求項９】
前記Ｐｄ耐性座を含む断片が、第３染色体の長腕の長さの４４％未満である、請求項７又は８に記載の植物。
【請求項１０】
タマネギのべと病に耐性な野生型アリウム親（ｇｅｎｉｔｏｒ）と、アリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）の植物の数回の戻し交雑後のアリウム・セパとの間の種間交雑、及びその後の自家受粉から得られうる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物。
【請求項１１】
前記タマネギのべと病に耐性の野生型アリウム親がアリウム・ロイレイである、請求項１０に記載の植物。
【請求項１２】
前記Ｐｄ耐性座の存在が、以下のステップ：
ａ）制限酵素ＰｓｔＩ及びＭｓｅＩによる前記植物からのゲノムＤＮＡの制限酵素処理；
ｂ）以下のオリゴヌクレオチド・アダプター：
【化１】
2008522602.tif 000026
によるライゲーション；
ｃ）以下のプライマー：
【化２】
2008522602.tif 000027
による制限酵素処理断片のセットの選択的増幅；
を実行するとき、６１個のヌクレオチド増幅産物を特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の植物。
【請求項１３】
前記Ｐｄ耐性座の存在が、以下のステップ：
ａ）制限酵素ＰｓｔＩ及びＭｓｅＩによる前記植物からのゲノムＤＮＡの制限酵素処理；
ｂ）以下のオリゴヌクレオチド・アダプター：
【化３】
2008522602.tif 000028
によるライゲーション；
ｃ）以下のプライマー：
【化４】
2008522602.tif 000029
による制限酵素処理断片のセットの選択的増幅；
を実行するとき、１５１個のヌクレオチド増幅産物を特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の植物。
【請求項１４】
前記Ｐｄ耐性座の存在が、以下のステップ：
ａ）制限酵素ＰｓｔＩ及びＭｓｅＩによる前記植物からのゲノムＤＮＡの制限酵素処理；
ｂ）以下のオリゴヌクレオチド・アダプター：
【化５】
2008522602.tif 000030
によるライゲーション；
ｃ）以下のプライマー：
【化６】
2008522602.tif 000031
による制限酵素処理断片のセットの選択的増幅；
を実行するとき、３３０個のヌクレオチド増幅産物を特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の植物。
【請求項１５】
以下のステップ：
ａ）アリウム・ロイレイ（Ａｌｌｉｕｍ  ｒｏｙｌｅｉ）とアリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）の間の種間交雑；
ｂ）真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（Ｐｄ）により生じるタマネギのべと病に耐性な種間雑種の選択；
ｃ）上記雑種とアリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）の植物との戻し交雑；
ｄ）タマネギのべと病に耐性な植物の選択；
ｅ）得られた植物の自家受粉；
ｆ）タマネギのべと病に耐性なホモ接合な植物の選択；
により得られうる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）種の植物。
【請求項１６】
ステップｃ）とｄ）が少なくとも１回繰り返される、請求項１５に記載の植物。
【請求項１７】
ステップｅ）とｆ）が少なくとも１回繰り返される、請求項１５又は１６に記載の植物。
【請求項１８】
ステップｂ），ｄ）又はｆ）における選択が、請求項１３〜１５に記載のステップ及びプライマーによるＡＦＬＰTM技術を用いて実行される、請求項１５に記載の植物。
【請求項１９】
真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（Ｐｄ）により生じるタマネギのべと病に耐性なアリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）の植物の生産方法であって、以下の：
ａ）タマネギのべと病に耐性なアリウム・ロイレイ（Ａｌｌｉｕｍ  ｒｏｙｌｅｉ）の取得；
ｂ）上記アリウム・ロイレイとアリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）の間の種間交雑；
ｃ）タマネギのべと病に耐性な種間雑種の選択；
ｄ）上記雑種とアリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）の植物との戻し交雑；
ｅ）タマネギのべと病に耐性な植物の選択；
ｆ）ステップｅ）において得られた耐性植物の自家受粉；
ｇ）タマネギのべと病に耐性なホモ接合の植物の選択を含み、ここで、タマネギのべと病に耐性な植物の選択のためのステップｃ），ｅ）、及び／又はｇ）において分子マーカーが使用される、前記生産方法。
【請求項２０】
ステップｇ）において得られたホモ接合耐性植物とアリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）種のべと病感受性植物との交雑をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｃ），ｅ）、及び／又はｇ）における選択は、請求項１３〜１５のステップ及びアルファ及びベータ・アダプタマー並びに以下のプライマー対：
【化７】
2008522602.tif 000032
【化８】
2008522602.tif 000033
及び／又は
【化９】
2008522602.tif 000034
の内の少なくとも１つによるＡＦＬＰTM技術を用いて実行される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
ネガティブ・コントロールとして、増幅が、以下のプライマー対：
【化１０】
2008522602.tif 000035
【化１１】
2008522602.tif 000036
及び／又は
【化１２】
2008522602.tif 000037
の内の少なくとも１対を用いてさらに実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１９〜２２に記載の方法により得られうるアリウム（Ａｌｌｉｕｍ）植物。
【請求項２４】
べと病感受性アリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）親系と、請求項１又は５に記載の植物又は請求項１９に記載の方法により得られうる植物との交雑により得られうる雑種アリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）植物。
【請求項２５】
前記親系が、細胞質雄性不稔アリウム・セパ近交系である、請求項２４に記載の雑種アリウム・セパ植物。
【請求項２６】
前記植物が栽培されたタマネギ（ｏｎｉｏｎ）又はワケギ（ｓｈａｌｌｏｔ）である、請求項１〜１８、及び２３〜２５のいずれか１項に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（Ｐｄ）（Ｂｅｒｋ．）Ｃａｓ．により生じるタマネギのべと病に耐性なアリウム（Ａｌｌｉｕｍ）属の植物、特に、アリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）又はアリウム・フィツロサム（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）種の植物に関する。本発明に従って、上記植物のゲノム内にホモ接合又はヘテロ接合で存在することができ、かつ、その座を担持する植物に耐性を提供するために十分なものである耐性座により、耐性が提供される。本発明は、栽培タマネギ又はワケギを取得するために好適な、タマネギのべと病に耐性な上記植物を取得する方法をも提供する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（Ｐｄ）により生じるべと病は、事実上全世界に分布している。この病原体は、さまざまな種類のタマネギを攻撃するが、一般的なタマネギでありアリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）に対して特に破壊的である。この真菌により引き起こされる損害は、Ｍｕｋｅｒｊｉ（ｒｅｆ５）中に記載されている。条件がこの病気にとって好ましい場合、自然伝染が圃場において発生しうる。この兆候は、葉の黄色化、及び灰色の胞子形成である。経済的観点から、べと病は、世界のほぼ全てのタマネギ栽培地域において、タマネギ及びワケギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ  Ｌ．）の栽培を脅かす主要な真菌病の内の１つである。
【０００３】
べと病に対する完全な自然耐性は、アリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）及びアリウム・フィツロサム（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）において存在しないと推定される。しかしながら、べと病に対する完全な耐性が、野生型アリウム・ロイレイ・アテアン（Ａｌｌｉｕｍ  ｒｏｙｌｅｉ  Ｓｔｅａｒｎ）において発見された。Ａ．ｒｏｙｌｅｉとＡ．ｃｅｐａの間の一定の形態学的類似性により示唆されて、Ａ．ｃｅｐａのための遺伝子移入パートナーとしてＡ．ｒｏｙｌｅｉを使用することが提案された。ｖａｎｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓによる刊行物（ｒｅｆ１）中、Ａ．ｒｏｙｌｅｉとＡ．ｃｅｐａの間の雑種に関する予備的結果、並びにＡ．ｃｅｐａへの当該種間雑種の戻し交雑に関する結果が報告されている。上記種間雑種は、雄性及び雌性稔性であることが観察された（Ｋｏｆｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｒｅｆ２）。べと病耐性は、タマネギへの上記雑種のＢＣ１（第１戻し交雑）子孫に優性に遺伝されうることも報告されている。
【０００４】
上記耐性に責任を負う遺伝子移入された配列が存在するところのセパのゲノム内の遺伝子座は、「Ｐｄ耐性座」と呼ばれる。広義には、「Ｐｄ耐性座」は、それ自身の配列をも指す。
【０００５】
しかしながら、Ａ．ｒｏｙｌｅｉとＡ．ｃｅｐａの間のＦ１からのＢＣ１及びＦ２子孫の中でのべと菌耐性の分離が観察され（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｒｅｆ３）、そしてべと病に対する品種改良タマネギ変種は、最初の耐性雑種が得られて以後１０年以上の間、未だ得られていない。
【０００６】
したがって、べと病に耐性であり、かつ、自家受粉後未だ１００％耐性である、すなわち、耐性特性に分離がない、アリウム・セパ及びアリウム・フィツロサム種の植物に関して農業経済及び経済的観点からの興味が在る。これらの植物は特に価値が高い。なぜなら、それらは、感受性の系統と、実際に、交雑されて、タマネギのべと病に対して耐性である雑種を与えることができるからである。
【０００７】
本発明は、第１に、アリウム・セパ及びアリウム・フィツロサム種の入手しうる耐性材料の全てが、Ｐｄ耐性配列に関して実際ヘテロ接合であり、そしてホモ接合耐性植物は、今日まで再現性をもって得られておらず又は開示されていないという観察に在る。
【０００８】
本願発明者らは、ホモ接合耐性植物が得られない理由を明らかにし、そして１００％耐性である自家受粉後の子孫を生じさせるアリウム植物（すなわち、ホモ接合耐性植物）を取得することに成功した。
【０００９】
ホモ接合植物が入手可能ではないという驚ろくべき発見を、いくつかの仮定：トランスロケーション、組換え、雑種優先的選択、遺伝子サイレンシング、及び多面発現効果、連鎖障害（ｄｒａｇ）、その他は説明できたであろう。本発明は、セパ雑種内に存在し、べと病に対する耐性を付与するアリウム・ロイレイの遺伝子移入断片が、セパ内の染色体の両ホモログ上のその存在が当該植物にとって致死性であるところの「致死因子」と命名される配列をも含むことを決定した。それゆえ、耐性セパ植物が存在し、かつ、成長するためには、耐性を付与し、かつ、致死因子を含む遺伝子移入断片は、必ず、単一の染色体ホモログ上に存在し、これは、先駆者により得られたホモ接合耐性植物の不存在を説明する。致死性に責任を負う上記配列は、Ｐｄ耐性座の近傍に存在する。
【００１０】
耐性を付与する配列が致死性配列に連結されていることが同定されたため、本願発明者らは、最初に、両染色体上に存在するとき、致死性に責任を負う配列から、耐性を付与する配列を物理的に分離することに成功した。
【００１１】
組換え事件により引き起こされることができる上記分離ステップは、本発明の重要な点である。実際、耐性を付与する配列は、致死因子から分離されうることは予測されることができなかった。第１に、当該因子は、それ自体致死性である配列であるのか否か、又は内因性の不可欠な配列の、遺伝子移入断片上に存在する配列による、置換の結果として致死が生じるのか否かは、知られていなかった。事実、致死は、Ａ．ｒｏｙｌｅｉから導入された断片により補償されない、対応のセパ断片上の不可欠遺伝子のノック・アウトである。それゆえ、以下のさまざまなシナリオが致死を説明することができた：
−  耐性配列は、実際、致死因子を構成したかもしれない。なぜなら、それらは、内因性の決定的な配列を置換するからである。したがって、それらは、致死を生じさせずに、両染色体上に存在することは決してできなかったであろう。
−  耐性配列と致死配列は、染色体上、互いに極めて近接し、又は重複さえしたかもしれなかった。この状況においては、両者を分離する組換え事件を取得する可能性はほとんどない。
−  致死因子を構成する配列は、耐性の働きに必要であったかもしれない。この条件では、両者の分離は、耐性能力の喪失を導くであろう。
【００１２】
この点で、本発明者らは、両ホモログ上でのその存在が致死性であるところの配列から、耐性表現型を付与する配列を分離することに、予想外に、成功したのである。
【００１３】
本発明者らは、既に公表された耐性Ａ．ｃｅｐａが、同一の遺伝子移入断片上に、（優性である）Ｐｄ耐性座と、（劣性遺伝される）致死因子の両者を有するということも発見した。Ｐｄ耐性座は優性であるので、植物の表現型は「耐性」であり、そして劣性致死因子は観察されない。しかしながら、感受性植物と交雑されるとき、このような植物の子孫は、分離し、そしてそれゆえ、商業的に使用されることはできない。実際、商業的なタマネギ及びワケギは、一般に、変種であり、これゆえ、系統であるか雑種であるから問わず、均質でなければならない表現型を植物材料であり；着目の形質の分離は、商業的な植物と見ることはできない。
【発明の開示】
【００１４】
したがって、本発明は、Ｐｄ耐性座のそれらのゲノム内での存在に因りペロノスポラ・デストラクター（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（Ｐｄ）により生じるタマネギのべと病に対して耐性であるアリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）及びアリウム・フィツロサム（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）の植物を提供し、そして当該植物は、ホモ接合耐性植物、すなわち、自家受粉後も１００％耐性である子孫を与える植物である。
【００１５】
本発明は、アリウム・セパ又はアリウム・フィツロサム種の上述の耐性植物と、べと病に感受性であるアリウム・セパ又はアリウム・フィツロサム種の植物とを、交雑することにより得られうる耐性植物をも提供する。
【００１６】
本発明は、上記植物を取得する方法をも提供する。
【００１７】
定義
本願の文脈において、以下の用語を、以下のように定義する：
遺伝子移入：  種間交雑のプロセスを介しての１の種の遺伝子から他のものの中への自然導入、その後の、再出現植物への引き続き行われる戻し交雑。それにより、各種は、より変異性となり、そして他の種の一定の特徴を示しうる。
【００１８】
Ｐｄ耐性座：  植物に耐性を付与するために十分な、ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）に対する耐性に責任を負う配列により占有される染色体内の場所。Ｐｄ耐性座は、１の遺伝子又はおそらく、無関係の配列又は遺伝子により分離される数個の遺伝子を含みうる。広義には、本発明においては、その配列自体もＰｄ耐性座という。可能なＰｄ耐性座は、系統３５９１−１  ＮＣＩＭＢ寄託番号第４１２４９号の植物のゲノム内のＡ．ｒｏｙｌｅｉの遺伝子移入断片である。
【００１９】
感受性である／感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ／ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）：  “Definition of the Terms Describing the Reaction of Plants to Pests or Pathogens for the Vegetable Seed Industry”中２００４年５月のthe International Seed Federation, Section Vegetables, Position Paperに従えば、感受性とは、所定の害虫又は病原体の成長及び発達を制限する植物変種の不能力である。しかしながら、用語「感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）」が同一の特性を説明するために過去数十年間広く使用されてきたことに留意すべきである。これに反して、一定程度、及び類似の条件及び害虫又は病原体圧の下での感受性植物変種に対して比較されるとき、特定の害虫又は病原体の成長及び発達を制限することができる植物は、上記特定の害虫又は病原体に対して耐性（抵抗性）としての資格がある。耐性植物は、耐性である、すなわち、感染されているが生存している植物、及び完全に耐性である植物を含む。害虫又は病原体に対して耐性であるけれども、上記害虫又は病原体により攻撃された耐性植物は、感染、低下した成長、早い死、葉の損失等を特徴とする兆候を示すことができる。
【００２０】
近交系：  連続、同系交配及び選択により生産される（全ての特徴に関して）近いホモ接合系。
【００２１】
病原体に対するホモ接合耐性植物：  上記病原体に対してほぼ１００％耐性である（自家受粉）後の子孫を与える植物。耐性が植物の染色体内のＤＮＡ配列の存在に因る場合、当該配列は、当該染色体のホモログの全ての上に存在する。
【００２２】
致死因子：  その因子に晒された植物の生存を妨害する因子、例えば、遺伝的因子。致死因子の存在は、植物が最初から存在することを妨害し、又はその後の段階でその死を引き起こすことができる。
【００２３】
アリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）：  その丸い食用球根のために世界中で栽培される中空葉をもつ球根植物を含む、アリウム属の種。栽培変種タマネギ（ｏｎｉｏｎ）及びワケギ（ｓｈａｌｌｏｔｓ）はアリウム・セパ種である。
【００２４】
組換え：  細胞分裂の間に生じる交雑。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（Ｐｄ）により生じるタマネギのべと病に耐性なアリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）又はアリウム・フィツロサム（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）の植物である、最初の植物のタイプを提供する。本発明に従えば、べと病に対する耐性は、植物のゲノム内のＰｄ耐性座に因り、ここで、当該耐性座は、ゲノム内にホモ接合で存在し、当該耐性に責任を負う配列は、本発明に係る植物のゲノム内に２個のコピーで存在し、すなわち、両染色体ホモログ上に存在することを特徴とする。
【００２６】
実際、本発明は、両染色体ホモログ上に存在する場合、致死性であると本発明者らにより同定された、連結された致死性配列からべと病に対する耐性に責任を負う配列を分離することに成功した。これら２つのタイプの配列を分離することにより、本発明者らは、有害な配列（致死因子）に関してホモ接合であることを伴わずに、着目の配列（Ｐｄ耐性座）に関してホモ接合である植物を取得することに成功した。本発明は、耐性を付与する配列に関してホモ接合である上記生存可能な植物に関する。これらの植物は、存在しうるが単一コピーだけで存在しうる致死配列に関して必ずしもホモ接合ではない。
【００２７】
本発明に係る上記植物は、耐性を付与する着目の配列に関してホモ接合であるので、本発明に係る植物の子孫は、上記特徴を分離せずに、べと病に対して耐性な植物を導くであろう。実際、子孫の植物は、感受性表現型に対して優性であることが知られているＰｄ耐性座をそのゲノム内にもつであろう。
【００２８】
感染を妨害し又は感染後真菌の成長と闘うことにより、ペロノスポラ・デストラクターの成長及び発達を制限することができる場合、植物は耐性であると考えられる。これに反し、ペロノスポラ・デストラクターの成長及び発達を制限することができない植物は、ペロノスポラ・デストラクターに対して感受性であるといえる。本発明に係る上記耐性は、ペロノスポラ・デストラクターによる自然感染に対する耐性、そしてまた、ペロノスポラ・デストラクターによる人工接種に対する耐性を含む。人工試験は、十分に管理された環境下、温室又は空調室内で実施されうる。若い植物及び発芽している球根の両者が試験されうる。ペロノスポラ・デストラクターに対して植物が耐性であるか又は感受性であるかを試験するためのプロトコールは、ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｒｅｆ３）による文献中に報告されている。
【００２９】
耐性は、植物のゲノム内のＰｄ耐性座の存在をアッセイすることにより、分子マーカーにより遺伝子を試験されることもできる。使用しうる技術は、当業者に周知であり、そして一般に、遺伝子増幅に基づく。
【００３０】
分子タイピングのために使用されうる技術は、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、多座酵素電気泳動、及びランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）を含む。植物のゲノム内のＰｄ耐性座の存在を試験するために特に好適な他の技術は、ＡＦＬＰTM（増幅断片長多型）であり；このような技術は、例えば、Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｒｅｆ４）中に記載されている。この技術は、好適な制限酵素によるゲノムＤＮＡの消化の第１ステップ、それと同時の、特別にデザインされたオリゴヌクレオチド・アダプターとのライゲーションから成る。上記アダプターは、追加の定義された配列に連結された、制限酵素部位に対応する配列を有する。第２のステップにおいて、得られたタグ付制限酵素断片のＰＣＲ増幅が、その後、アダプターに相補的な配列と上記タグ付けされた制限酵素断片の間の区別を可能にする１，２又は３個の追加のヌクレオチドを含むプライマーを用いて実行される。
【００３１】
以下の実施例４に、Ｐｄ耐性座が存在するときにのみ、所定の長さの増幅された断片を与える４つの特異的プライマー対を与える。植物が、予想される増幅される断片の内の１以上を生成する場合、その植物は全Ｐｄ耐性座を有し、そしてそれゆえ、べと病に耐性であると演繹されうる。分子マーカーの使用は、本発明において特によく適合するものである。好ましくは、本発明に係る耐性植物は、ペロノスポラ・デストラクターによる感染に対して耐性である。
【００３２】
本発明に係る上記第１のタイプの植物は、例えば、寄託番号第４１２４９号の下、ＮＣＩＭＢに寄託されている系統３５９１−１からの植物である。本発明者らが上記植物を得たところの方法を、実施例１に報告する。本発明は、上記Ｐｄ耐性座をヘテロ接合で有する、すなわち、染色体ホモログの内の１つだけの上に有する植物である、第２のタイプの植物にも関する。本発明に従えば、上記植物は、上述のホモ接合植物を、アリウム・セパ又はアリウム・フィツロサムの第２の植物であって、タマネギのべと病に対して感受性であるものと、交雑することにより得られうる。
【００３３】
交雑させる植物の種に依存して、本発明は、アリウム・セパとアリウム・フィツロサムの間の雑種、並びにアリウム・フィツロサム種の植物、及びアリウム・セパ種の植物を包含する。
【００３４】
Ｐｄ耐性座が本発明の植物の第２のタイプにおいてヘテロ接合で存在するという事実に因り、自家受粉又はそれらを他の植物と交雑するとき、耐性形質は分離する。
【００３５】
本発明の上記態様に従う植物は、寄託番号第４１２４９号の下、ＮＣＩＭＢに寄託された系統３５９１−１からの植物を、べと病感受性アリウム・セパ親系統と、交雑することにより得られうる。この親系統は、好ましくは、細胞質雄性不稔のアリウム・セパ近交系である。
【００３６】
本発明に係る植物の第２のタイプは、もちろん、他の方法によっても得られうる。例えば、それらは、既にこのタイプである植物を自家受粉することによっても得られうる。但し、先に説明したように、このような自家受粉の子孫は、べと病に対して１００％耐性ではない。
【００３７】
本発明に従えば、Ｐｄ耐性座は、好ましくは、本発明の第１のタイプ又は第２のタイプに従う植物のゲノム内に、ホモ接合又はヘテロ接合で、第３染色体上に存在する。アリウム・セパ及びアリウム・フィツロサム種の植物は、実際、相同染色体であると考えられている２ｎ＝１６の染色体をもつ（特に、文献８を参照のこと）。
【００３８】
本発明の植物は、Ｐｄ耐性座に因り真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｄ）により生じるタマネギのべと病に対して耐性であるアリウム・セパ又はアリウム・フィツロサム種の植物であって、当該Ｐｄ耐性座を含む染色体の断片が、致死を引き起こさずに子孫においてホモ接合で存在することができる前記植物をも含む。
【００３９】
上述のように、Ｐｄ耐性配列又は座の近傍に、致死を引き起こす配列が一般に存在しうる。Ｐｄ耐性座及び上記致死配列を含む染色体の部分は、一般に、両染色体ホモログ上に存在し得ない。なぜなら、それは、植物が存在することを妨げるからである。当該致死配列からＰｄ耐性座を分離することにより、本発明者らは、Ｐｄ耐性座を含み、当該Ｐｄ耐性座を含む染色体の部分が両染色体ホモログ上に存在し又は存在することができる植物を取得することができた。なぜなら致死配列が存在しないからである。
【００４０】
本発明に係るアリウム・フィツロサム種の植物は、（寄託番号第４１２４９号の下、ＮＣＩＭＢに寄託された）系統３５９１−１の第１の植物と、アリウム・ロイレイ種の植物と交雑させ、そしてその後、得られた雑種を、１又は数回、すなわち、ブリッジング種としてアリウム・ロイレイを使用して、アリウム・フィツロサム種の植物を用いて、戻し交雑することにより、得られうる。
【００４１】
本発明は、真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｄ）により生じるタマネギのべと病に対して耐性であるアリウム・セパ又はアリウム・フィツロサム種の植物であって、第３染色体のホモログの内の少なくとも１つが、Ｐｄ耐性座を含み、そして当該Ｐｄ耐性座を含む当該染色体の断片が致死を引き起こさずに子孫においてホモ接合で存在することができる前記植物にも関する。
【００４２】
Ｐｄ耐性座に関してホモ接合であり、そして致死配列に関してヘテロ接合である植物、すなわち致死配列が第３染色体の１のホモログ上にのみ存在する植物も、本発明の一部であることに留意すべきである。実際、致死配列を伴わずにＰｄ耐性座を含む、第３染色体のホモログの内の少なくとも１つの断片は、致死を引き起こさずに子孫においてホモ接合で存在しうる。
【００４３】
このような植物は、例えば、本願の実験の節の実施例３において例示される植物３５９１−３，３５９１−４，３５９１−５，３５９１−６，又は３５９１−８である。
【００４４】
耐性植物を自家受粉することにより、子孫を分析することによって、当該植物が先に与えた定義に一致するか否かを、演繹することができる。実施例５は、このような決定のために実施される分析についての細目を与える。耐性植物は、子孫の少なくとも７５％（計測の変動性に因り＋／−５％）が耐性である場合、本発明に従う植物である。図１は、上記パーセンテージを導く、ゲノム・レベルでの異なる状況を例示する。
【００４５】
１の染色体ホモログ上にのみ致死配列に連結されたＰｄ耐性をもつ植物は、本発明の一部ではないということに留意すべきである。このような植物は、自家受粉後、遺伝法則に従って、６６．７％耐性である、すなわち、７５％未満耐性である子孫を与えるであろう。したがって、このような植物は本発明に従う植物から区別されることができる。
【００４６】
このような植物は、例えば、本発明の実験の節の実施例２において例示する系統２３４８の植物である。好ましくは、Ｐｄ耐性座は、本発明に従う植物内でホモ接合で存在する。
【００４７】
本発明の好ましい態様に従えば、ペロノスポラ・デストラクターによる感染に対する耐性を付与するＰｄ耐性座は、遺伝子移入断片上に存在する；それは、タマネギのべと病に対して天然で耐性である植物から、好ましくは、野生型親耐性から、最も好ましくはアリウム・ロイレイに起源をもつ。アリウム・セパ又はアリウム・フィツロサム種の植物のゲノム内の遺伝子移入断片の存在は、上記植物と、遺伝子移入パートナーを交雑し、それにより雑種を得ることにより得られうる。上記ハイブリッドは、遺伝子移入断片を最小化するために、アリウム・セパ又はアリウム・フィツロサム種の植物を用いて、好ましくは、戻し交雑され、そしてその後、べと病に対する耐性を示す能力に基づいて選択される。実際、本発明に従うアリウム・セパ又はアリウム・フィツロサム種の植物における遺伝子移入断片は、好ましくは、耐性形質を除く親植物の着目の特徴の全てを共有する植物をもつために、限定された。
【００４８】
好ましくは、本発明に係る植物のゲノム内の遺伝子移入断片は、第３染色体の１又は両ホモログ内に、そして好ましくは、第３染色体の長腕内にのみ存在する。Ｐｄ耐性座を含む遺伝子移入断片は、第３染色体の長腕の長さの５０％未満、好ましくは４４％未満、より好ましくは３５，３０，２５又は２０％未満である。上述のように、遺伝子移入断片は、好ましくは、アリウム・ロイレイのゲノムに起源をもつ。
【００４９】
上記のタイプに従う植物は、寄託番号４１２４９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された系統３５９１−１からの植物である。１，２又はそれ以上の遺伝子移入断片が、例えば、第３染色体の長腕内に存在することができるが、各断片は、互いに区別され、そして分離される。
【００５０】
最も好ましい状況に従えば、本発明に係る植物内に存在する遺伝子移入断片は、べと病に対する耐性のために不可欠な配列のみである。
【００５１】
本発明に係る植物は、Ｐｄ耐性を他の農業経済的に価値のある植物内に移入するために使用されうる。但し、当該植物は互いに交雑されることができる。これは、雑種を取得し、そしてその後に、当該雑種を、第２の植物と戻し交雑し、その後に、得られた植物を自家受粉することによりなされうる。ここで、各ステップにおいて、耐性の子孫が選択される。
【００５２】
好ましくは、本発明に係る植物は、着目の特徴、すなわち、タマネギのべと病に対する耐性のために好適であるが、他の形質のためには必ずしも好適でない。本発明に係る植物は、タマネギのべと病に対して耐性である野生型アリウム親（ｇｅｎｉｔｏｒ）とアリウム・セパの間の最初の種間交雑から得られうる。この状況に従えば、遺伝子移入断片は、野生型アリウム親に起源をもつ。
【００５３】
本発明に係る、すなわち、アリウム・セパ又はアリウム・フィツロサム種に属する植物を取得するためには、アリウム・セパ又はアリウム・フィツロサム種の親と最大の表現型類似性を共有するがべと病に対して耐性である交雑から得られた雑種植物を選択することが必要である。好ましくは、本発明に係る植物は、上述の最初の種間交雑、その後の、親種の植物との数回の戻し交雑、そして場合により１又は数回の自家受粉の後に、得られうる。
【００５４】
上記戻し交雑及び自家受粉のステップは、得られる植物内の遺伝子移入断片の割合を低下させる。推奨される戻し交雑の数は、少なくとも２回、好ましくは３，４，５又は６であり、７，８〜１０回の連続する戻し交雑も企図される。実施されるべき自家受粉の数は、１〜８の間、好ましくは２，３，４又は５である。
【００５５】
本発明の好ましい態様に従えば、上記最初の種間交雑は、タマネギのべと病に対して耐性な野生型親とアリウム・セパの間であり、そして上述の戻し交雑は、アリウム・セパ種の植物を用いて実施される。
【００５６】
野生型アリウム親は、ペロノスポラ・デストラクターにより生じるタマネギのべと病に対して耐性なアリウム属の植物、好ましくは、天然に耐性のものであり、そして好ましいアリウム親は、アリウム・ロイレイ種の植物である。
【００５７】
上述のように、Ｐｄ耐性座の存在は、ペロノスポラ・デストラクターによる感染に対する耐性を検出するために周知のプロトコールに従って試験されうる。しかしながら、これらのプロトコールは時間がかかる。したがって、Ｐｄ耐性座の存在は、当業者に周知である遺伝子増幅に基づく他の遺伝子技術によって試験されることもできる。
【００５８】
分子タイピングのために使用されうる技術は、制限酵素、断片長多型（ＲＦＬＰ）、多座酵素電気泳動、及びランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）を含む。植物のゲノム内Ｐｄ耐性座の存在を試験するために特に好適な他の技術は、ＡＦＬＰTM（増幅断片長多型）であり；このような技術は、例えば、文献４中に記載されている。この技術は、本発明のために、特に好適である。
【００５９】
本発明に従えば、ＡＦＬＰTMといわれる上記技術は、アリウム属の植物のゲノム内のＰｄ耐性座の存在をアッセイするために使用される。当該植物のゲノムＤＮＡの制限は、好ましくは、制限酵素ＰｓｔＩとＭｓｅＩを用いて実施され；そしてライゲーションは、以下のアダプター：
【化１】
2008522602.tif 000002
を用いて実行される。
【００６０】
次いで、以下のプライマー：
【化２】
2008522602.tif 000003
を用いて、上記アダプターにライゲートされた制限酵素処理断片に対してＰＣＲ増幅が実施される。
【００６１】
上記手順に従って、試験された植物内のＰｄ耐性座の存在は、６１個のヌクレオチドの増幅された断片の存在から演繹される。実際、かかる断片が先行するステップから得られる場合、それは、実施例４に報告する結果から演繹されることができるように、本発明に従うＰｄ耐性座の存在を指標する。
【００６２】
あるいは、上記方法は、以下の別プロトコールに従って実施されることもできる：
−  植物のゲノムＤＮＡの制限を、制限酵素ＰｓｔＩとＭｓｅＩを用いて実行する；そして
−  ライゲーションを、以下のアダプター：
【化３】
2008522602.tif 000004
を用いて実行する；
−  ＰＣＲ増幅を、その後、以下のプライマー：
【化４】
2008522602.tif 000005
を用いて上記アダプターにライゲートされた制限断片に対して実施する。
【００６３】
かかるプロトコールが実施されるとき、実施例４に報告する結果から演繹されることができるように、１５１個のヌクレオチドの特定断片が、試験された植物のゲノム内のＰｄ耐性座の存在を提示する。
【００６４】
第３の別法に従えば、上記方法は、以下のプロトコールに従って実施されうる：
−  上記植物のゲノムＤＮＡの制限を、制限酵素ＰｓｔＩとＭｓｅＩを用いて実行する；そして
−  ライゲーションを、以下のアダプター：
【化５】
2008522602.tif 000006
を用いて実行する；
−  以下のプライマー：
【化６】
2008522602.tif 000007
を用いて、上記アダプターにライゲートされた制限酵素断片に対してＰＣＲ増幅を、その後に、実施する。
【００６５】
かかるプロトコールを実施するとき、３３０個のヌクレオチドの特定の断片は、実施例４に報告する結果から演繹されることができる、試験された植物のゲノム内のＰｄ耐性座の存在を指標する。本願の実施例４は、上記方法の使用を説明する。
【００６６】
本発明は、タマネギのべと病に対して、ホモ接合で耐性なアリウム・セパ種の植物にも関し、すなわち、自家受粉後の当該植物の子孫は、べと病に対し１００％耐性であり、これは、以下のプロセスを実施することにより得られうる：
ａ）アリウム・ロイレイとアリウム・セパの間の種間交雑；
ｂ）真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｄ）により生じるタマネギのべと病に対して耐性である、種間雑種の選択；
ｃ）アリウム・セパの植物を用いた上記雑種の戻し交雑；
ｄ）タマネギのべと病に耐性な植物の選択；
ｅ）こうして得られた植物の自家受粉；
ｆ）タマネギのべと病にホモ接合で耐性な植物の選択。
【００６７】
上記ステップａ）は、雄性および雌性不稔である生存可能な種間雑種を与えることが証明されている。種間交雑は、雄としてのアリウム・ロイレイと雌親としてのアリウム・セパの間、又はその逆で、雌としてのアリウム・ロイレイと雄親としてのアリウム・セパの間で、実行されうる。
【００６８】
上記ステップｂ）は、真菌ペロノスポラ・デストラクターにより生じるタマネギのべと病に耐性な植物の選択のステップである。先の段落中に述べたように、耐性は、文献中又は本明細書の実験の節中に記載される知られたプロトコールを用いて天然又は人工接種により試験されうる。選択は、上記のＡＦＬＰTM法を利用することによっても達成されうる。有用な制限酵素、アダプター、及びＰＣＲプライマーは、Ｐｄ耐性座の存在を指標する予想される増幅断片の長さとともに、上記した。
【００６９】
本発明に従って、ステップｂ）において選択された植物は、タマネギのべと病に耐性であるだけでなく、それらは、有利にはできるだけ多くの形態学的特徴を、アリウム・セパ親と共有する。
【００７０】
ステップｃ）は、タマネギのべと病に対する耐性についてステップｂ）において選択された種間雑種とアリウム・セパ種の植物との戻し交雑に関する。この戻し交雑ステップのために使用される上記アリウム・セパ植物は、ステップａ）において使用した植物からよりも種間雑種のための親と同じ亜種、変種又は形態からのものであることができるが、必ずしもそうではない。
【００７１】
戻し交雑から生じた植物を得た後、タマネギのべと病に対して耐性な植物を選択する。ステップｂ）に関して述べたように、この選択は、ペロノスポラ・デストラクターによる感染に抵抗する能力を試験することにより、又は例えば、ＡＦＬＰTM技術による分子タイピングを達成することにより、達成されうる。
【００７２】
本発明の好ましい態様においては、ステップｃ）、その後のステップｄ）は、有利には少なくとも１回繰り返される。すなわち、少なくとも２回の連続した戻し交雑が存在する。戻し交雑の数は、２〜１０の間、好ましくは、３，４，５又は６回に変動しうる。
【００７３】
ステップｅ）は、当業者に周知である自家受粉（ｓｅｌｆ−ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｓｅｌｆｉｎｇ）のステップである。
この自家受粉ステップの後に、アリウム種の植物に特徴的な形質を全て共有する、タマネギのべと病に対して耐性な植物の選択が行われる。好ましくは、上記自家受粉と選択のステップは、少なくとも１回繰り返され、すなわち、自家受粉と選択の少なくとも２つのシリーズが達成される。これらのステップは、好ましくは、２，３，４，５又は８回行われ、すなわち、それらは１，２，３，４又は７回繰り返される。
【００７４】
上記プロセスの最後のステップは、ペロノスポラ・デストラクターにより生じるタマネギのべと病に対してホモ接合で耐性である植物の選択に関する。このホモ接合性は、ステップｅ）を達成し、そして子孫の１００％がべと病に耐性であることをチェックすることにより試験されうる。
【００７５】
本発明に従えば、選択の最後のステップは、好ましくは、先の節に記載した分子タイピング技術、例えば、ＡＦＬＰTM技術を用いることにより、そして好ましくは、先に述べた制限酵素、アダプター、及びプライマーを用いて達成されうる。
【００７６】
本発明は、以下のステップを含む真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｄ）により生じるタマネギのべと病に耐性なアリウム・セパ種の植物の生産方法にも関する：
ａ）タマネギのべと病に耐性なアリウム・ロイレイの取得；
ｂ）上記アリウム・ロイレイとアリウム・セパの間の種間交雑；
ｃ）タマネギのべと病に耐性な種間雑種の選択；
ｄ）上記雑種とアリウム・セパの植物との戻し交雑；
ｅ）タマネギのべと病に耐性な植物の選択；
ｆ）ステップｅ）において得られた耐性植物の自家受粉；
ｇ）タマネギのべと病にホモ接合で耐性な植物の選択。
【００７７】
本発明に従えば、タマネギのべと病に耐性な植物を選択するためにステップｃ），ｅ）、及び／又はｇ）において分子マーカーが使用される。
上記方法のさまざまなステップは、先の複数の段落中で説明したものと同じである。上記プロセスの好ましい態様も先に述べたものであり、特に、ステップｄ）とｅ）、及びステップｆ）とｇ）の繰り返しである。上記選択のステップは、先に説明したように達成されることもできる。それらは、好ましくは、分子マーカーを利用する分子タイピング法を用いて達成される。特に好ましい方法は、先の節において記載したＡＦＬＰTMである。本発明に従えば、分子マーカーは、選択ステップｃ）のみ、又はステップｅ）のみ、又はステップｇ）のみ、又はこれらステップの内のいずれか、又は３つの内の２つにおいて、使用されうる。
【００７８】
各選択ステップにおいて、選択された植物は、好ましくは、アリウム・セパに特徴的な形質の最大数を共有する植物である。
この手順に従えば、最初のアリウム・ロイレイ親に起源をもつ遺伝子移入断片は、各ステップにおいて最小化される。アリウム・セパに特徴的な形質は、ＵＰＯＶ条約に関連するthe Guidelines for the Conducts of Tests for Distinctness, Uniformity and Stability (reference TG/46/6）中に開示されたものと同じである。
【００７９】
本発明に従えば、上記方法は、ステップｇ）の終わりに得られた植物と、タマネギのべと病に感受性であるアリウム・セパ種の植物とを、交雑させる追加のステップを含んでもよい。得られる植物はべと病に耐性である。なぜなら、ステップｇ）の終わりに得られる植物は、べと病に対してホモ接合で耐性であるからである。
【００８０】
上述のように、選択ステップｃ），ｅ）、及び／又はｇ）は、ＡＦＬＰTM技術を用いて実施されうる。本発明において例示されるように、上記技術において使用される制限酵素は、好ましくは、ＰｓｔＩとＭｓｅＩである。前記ライゲーション・ステップのために好適なアダプター対は：
【化７】
2008522602.tif 000008
である。
【００８１】
ＰＣＲ増幅のための、使用されうる好適なプライマー対は：
【化８】
2008522602.tif 000009
【化９】
2008522602.tif 000010
及び
【化１０】
2008522602.tif 000011
である。
【００８２】
数個の断片が増幅され、そして当該ＰＣＲ増幅の後に、寒天ゲル上で検出されうる。しかしながら、プライマー対（Ａ）を使用するとき、６１個のヌクレオチドをもつ断片の存在は、試験された植物のゲノム内のＰｄ耐性座の存在を指標する。あるいは、プライマー対（Ｂ）を使用するとき、指標となる増幅された断片の長さは１５１個のヌクレオチドであり、そしてプライマー対（Ｃ）を使用するとき、ヌクレオチド長は３３０である。
【００８３】
本発明の好ましい態様においては、ＡＦＬＰTM技術を使用するとき、偽陽性を検出するために、追加のＰＣＲ増幅も実施されうる。この手順に従えば、以下のプライマー対：
【化１１】
2008522602.tif 000012
【化１２】
2008522602.tif 000013
及び
【化１３】
2008522602.tif 000014
の間から選ばれる少なくとも１つのプライマー対を用いて増幅が行われる。
【００８４】
上記追加の増幅から生じる増幅された断片は、ネガティブ・コントロールとして使用される。プライマー対（Ａ），（Ｂ）又は（Ｃ）を使用するときに予想される断片は、プライマー対（Ａ′），（Ｂ′）又は（Ｃ′）を使用するときに検出されてはならない。
【００８５】
本発明は、記載された方法、特に好ましい態様に従う方法により得られうるアリウム属の植物をも包含する。
【００８６】
本発明は、べと病に感受性であるアリウム・セパの親系統と、本発明に係るタマネギのべと病にホモ接合で耐性な植物とを交雑させることにより得られうる雑種アリウム・セパ植物にも関する。当該植物は、例えば、先に開示される本発明に係る方法を実施することにより得られうる。
【００８７】
アリウム・セパ親系は、アリウム・セパ種のいずれの系統であってもよく、それは、好ましくは、着目の特徴に関して十分に記載され、かつ、周知の系統である。例えば、それは、その味、速い成長、又は他の農業経済学的に重要な形質に関して知られた栽培変種である。
【００８８】
好ましい態様に従えば、上記親系統は、細胞質雄性不稔アリウム・セパ近交系である。
これまでに記載してきた本発明に係る植物は、本発明の好ましい態様に従えば、栽培されるタマネギ又はワケギである。
【実施例】
【００８９】
実施例：
実施例１：アリウム・セパのホモ接合耐性系統の取得
導入：
タマネギにおけるべと病を、真菌ペロノスポラ・デストラクター（Ｂｅｒｋ．）Ｃａｓｐ．（Ｍｕｋｅｒｊｉ，ｒｅｆ５）により引き起こされる。それは、植物組織上でのみ維持されインビトロにおいて寒天又は液体培地上では維持されることができない偏性の病原体である。
【００９０】
病気の耐性についての試験は、さまざまな方法で実施されることができ、例えば、ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ（ｒｅｆ３）を参照のこと。自然伝染は、当該病気にとって条件が好ましい場合、圃場において生じうる。人工試験は、より管理された環境下、温室又は空調室内で行われうる。幼岩植物と発芽球根の両者が試験されうる。兆候は、葉の黄変と灰色の胞子形成である。
【００９１】
本発明者らにより遂行された品種改良プログラムにおいては、ホモ接合系統を得るために、戻し交雑のプロセスの間、及び自家受粉のプロセスの間に、さまざまな方法が適用された。
【００９２】
本報告は、耐性は予想されたように簡単には遺伝しなかった、すなわち１遺伝子優性でなかったという結論をもたらし、そしてべと病に対して完全に耐性である本発明に係る系統３５９１の生産をもたらした試験について記載するものである。
【００９３】
材料及び方法
本試験の出発点は、ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ（ｒｅｆ３）中に開示されるＦ1ＢＣ2といわれる植物である。この植物は、アリウム・セパとアリウム・ロイレイの間の最初の種間交雑（Ｆ１）、その後のアリウム・セパへの２回連続した戻し交雑により得られたものであった。本発明者らは、上記植物材料をそれらの品種改良系統に戻し交雑を実施し続け、そしてホモ接合系を取得するためにＢＣ５世代の自家受粉を実施した。Ｓ１，Ｓ２及びＳ３は、それぞれ、１，２又は３回連続した自家受粉ステップが実施されたことを示す。
【００９４】
最初の圃場試験は、異なるＦ２集団の耐性植物（Ｆ1ＢＣ5Ｓ1）の自家受粉から得られたＦ３系統（Ｆ1ＢＣ5Ｓ2）を用いて実施した。
温室内で先に接種された散布用球根を、圃場内に植えた（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，ｒｅｆ７）。
【００９５】
接種物は、分生子柄をデミ水（ｄｅｍｉ−ｗａｔｅｒ）中に懸濁させることにより作製した。胞子をもつ葉を、２層のチーズクロスの上でデミ水で洗浄した。懸濁液を５×１０4胞子／mlに希釈した。胞子を、針つきシリングを用いて、球根の赤道から底板まで、球根内に接種した。球根を、１０℃２４時間いくつかの湿った紙を入れたプラスチック袋内に入れた。その後、菌糸体の成長を刺激するために温度を１５℃まで上昇させた。その後、球根を圃場に植え付けた。
【００９６】
伝染が始まり、そして８月の半ばに、感染された植物をカウントした。成長期の間、及び葉が落ち、球根が実るまで、非感染球根をカウントして、異なる系統の耐性格付け及び分離比を推定した。耐性植物は、兆候を全く示さない。いずれかの病変が認められる場合、その植物は感受性であると考えた。
【００９７】
第２の圃場試験において、４月の最初の週に、品種改良圃場に３５３個のプロットをドリルした。圃場は、べと病菌の伝染の発展を刺激するために、球根で取り囲んだ。感受性変種Ｓｔａｃｃａｔｏの対照プロットの１００％感染をもたらした重度の感染が始った。感染植物と非感染植物をカウントした。関連する系統の球根を収獲し、そしてさらなる研究及び翌年の種子生産のために使用した。
【００９８】
結果
上記最初の圃場試験は、タマネギ植物の重度の感染をもたらした。兆候が信頼性をもった格付けされることができる限り、感染性植物をカウントした。いくつかの初期の系統は、初期の段階で葉が落ち、そして葉の乾燥とべと病の兆候の間を区別することができなかった。これらの系統に関して、感受性植物だけを格付けし、そして耐性植物をカウントしなかった。なぜなら、耐性クラスは、それらの初期の系統において、多くの逸出を含むからである。合計で、２０系統が存在した。３４系統を、感受性植物と耐性植物の両者についてカウントし、そしてこれらの系統は、かなり遅れて葉が落ち、そして上記耐性についての格付けは、信頼性をもって行うことができなかった。データを表１に与える。
【００９９】
上記第２の圃場試験も、高いべと病菌感染を与えた。感受性変種Ｓｔａｃｃａｔｏの特別な対照プロットは、１００％感染された。３５３個の異なる品種改良系統の圃場試験において、感染植物を与えないたった１個が見つかった。プロット番号３５９１の下で播かれたこの品種改良系統第４０１８２８２号は、感染されていない１４０個の植物を与えた。同一Ｆ３系統、第３９９７２８４号からの自家受粉により得られた２１個の他のＦ４系統（Ｆ1ＢＣ5Ｓ3）は、耐性に関する分離を示した（表２）。
【０１００】
【表１】
2008522602.tif 000015
【０１０１】
【表２】
2008522602.tif 000016
【０１０２】
討議
圃場試験番号１は、べと病耐性タマネギの品種改良が先に予想された程簡単でなかったことを最初にはっきりと示した。単一遺伝子の優性に遺伝した耐性の場合、当業者は、通常、耐性Ｆ２植物の自家受粉後、完全に耐性である系統の少なくとも１／３が存在すると予想したであろう。ＲＲ植物だけが完全に耐性な子孫を与え、Ｒｒ植物は分離するであろうし、そして、耐性について選択した後のＦ２植物においては、ＲＲ植物は、当該集団の１／３を含む（ここで、「Ｒ」は、優性耐性遺伝子を担持する対立遺伝子を表し、「ｒ」は、劣性感受性遺伝子を表す）。
【０１０３】
５４個の系統を試験し、そして３４個は、耐性と感受性の両者について信頼性をもって格付けされることができたが、５４個の系統の全てが分離した。これは、１／３とは有意に異なる比を意味する。全系統に対する耐性植物の合計比は、予想されたものよりも低かった（６０．６５％）。ヘテロ接合植物が自家受粉される場合、単一優性遺伝子の場合には７５％の耐性比が予想された。
【０１０４】
個々の系統、例えば、第３９７７３０７号と第３９７７３５８号は、異なる比を与えた。これは、逸出により引き起こされることができる。第３９７７３０３号に由来する近交系は、試験され、そして５２％〜７３％の変動比をもって全て分離した（データは示さず）。感染されなかった植物を耐性として分類したが、兆候を示すように逸出した。これはおそらく、より湿度の低い微小環境あるいは他の病気を導き又は感染を失敗させる初期の葉の枯れ、低い植物数に因る。
【０１０５】
上記圃場試験番号２は、系統第４０１８２８２号を含む第３５９１プロットの発見をもたらした。この系統は、重度に感染した圃場において感受性の植物を示さなかった。この圃場は３５３個の系統を含み、これは、遺伝の複雑さを確認させるものであった。さらに、かなり高い頻度のホモ接合系統が見つかり、そして第４０１８２８２号／第３５９１号系統だけではなかった。
【０１０６】
Ａ．ｒｏｙｌｅｉ遺伝子移入断片についての試験を実施し（実施例３を参照のこと）、そして種子生産目的のために、プロット３５９１の中からの植物を温室内に移した。実施例３に提示する結果は、上記３５９１がより小さな遺伝子移入断片を含んでいたことを示した。上記植物の内のいくつかは、小さな遺伝子移入断片と大きな遺伝子移入断片に関してヘテロ接合であり、そして植物３５９１−１は、小さな遺伝子移入断片に関してホモ接合であった。
【０１０７】
上記系統のユニーク性を、表２に与える姉妹系統の結果により説明する。これらの系統は全て、自家受粉により同じＦ３系統から得られ、そしてそれらのいずれもホモ接合を示さなかった。
【０１０８】
実施例２：  品種改良系統第２３４８号、世代Ｆ1ＢＣ5Ｓ3によるゲノミック・イン・サイチュー・ハイブリダイゼーション（ＧＩＳＨ）（プロット２３４８のサンプル番号第４００８１９１号からの品種改良系統第２３４８号は圃場において６６％の耐性を与えた）。
ゲノミック・イン・サイチュー・ハイブリダイゼーション（ＧＩＳＨ）の技術は、Ｋｈｒｕｓｔａｌｅｖａ  ａｎｄ  Ｋｉｋ（ｒｅｆ９とｒｅｆ１０）によりタマネギにおいて開発されており、そしてアリウム・セパの染色体からゲノム・アリウム・ロイレイ挿入物／セグメントを識別するために本発明において使用された。したがって、この技術は、アリウム・セパ植物のゲノム内の、アリウム・ロイレイ由来の遺伝子移入断片を可視化することを可能にする。
【０１０９】
最初の実験セットは、耐性であるが分離性のタマネギ植物に対して、Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＢＶ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ（ＮＬ）により実施された。当該タマネギ植物は、１４個の植物Ｆ1ＢＣ5Ｓ3であり、ここで、Ｆ1は、アリウム・ロイレイとアリウム・セパの間の種間雑種であり、ＢＣ5は５回連続した戻し交雑を表し、そしてＳ3は３回連続した自家受粉を表す。
【０１１０】
導入：
ＧＩＳＨは、他の種上の１の種に由来するクロマチン材料の遺伝子移入を検出するための強力な技術である。ＧＩＳＨの利点は、遺伝子移入が、「遺伝子移入されたゲノムの絵」により可視化されることである。この技術により、ゲノムの特定の領域がホモ接合又はヘテロ接合であるか否かを確認することもできる。これは、同時優性である分子細胞遺伝マーカーの使用のおかげである。この技術により、どの染色体内に、着目の遺伝子移入された遺伝子が存在するかを決定することもできる。
【０１１１】
植物材料：
出発材料は、品種改良系統第２３４８号、世代Ｆ1ＢＣ5Ｓ3である。幼岩根の先端を集め、そして１００個までのスライドを、中期分配分析のために作製した（当該方法の説明については、Ｋｈｒｕｓｔａｌｅｖａ  ａｎｄ  Ｋｉｋ（ｒｅｆ９とｒｅｆ１０）を参照のこと）。十分に分配された中期をもち、そして染色体の全セット（２ｎ＝２×＝１６）を含むスライドを、ＧＩＳＨ実験のために選択する。
【０１１２】
方法：
ゲノムＤＮＡを、Ｒｏｇｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｅｎｄｉｃｈ（ｒｅｆ１３）のＣＴＡＢ法を用いて、Ａ．ｃｅｐａとＡ．ｒｏｙｌｅｉの若い葉から抽出する。
Ａ．ｒｏｙｌｅｉのゲノムＤＮＡを、標準的なニック−トランスレーション・プロトコール（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＤｉｇ−１１−ｄＵＴＰ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−２′−ｄｅｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎｅ−５′−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）で標識する。Ａ．ｃｅｐａのゲノムＤＮＡを、ブロックＤＮＡとして使用する。インサイチュー・ハイブリダイゼーション、免疫学的検出、及び顕微鏡手順は、Ｋｈｒｕｓｔａｌｅｖａ  ａｎｄ  Ｋｉｋ（ｒｅｆ９とｒｅｆ１０）により先に記載されたものと同じである。核型分析を、Ｋａｌｋｍａｎ（ｒｅｆ１２）により提案され、そしてＦｏｕｒｔｈ  Ｅｕｃａｒｐｉａ  Ａｌｌｉｕｍ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｂｙ  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ（ｒｅｆ１２）により確認された標準的なタマネギの命名システムに従って実施する。各寄託番号当り３〜５個の中期からの染色体計測を、Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｏｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／Ｄｅｐｔｓ／Ｍｉｃｒｏ  Ｍｅａｓｕｒｅ）からの、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用フリーのソフトウェア・プログラムを用いて実行した。
【０１１３】
結果：
品種改良系統第２３４８号、世代Ｆ1ＢＣ5Ｓ3からの１４個の耐性植物のＧＩＳＨ分析は、全ての植物が、べと病耐性の遺伝子を宿すＡ．ｒｏｙｌｅｉセグメントを有することを示した（図２Ａ，２Ｂ、及び２Ｃ）。核型分析は、Ｓ．ｒｏｙｌｅｉセグメントを担持する組換え染色体が第３染色体（動原体指数：４１．７；相対染色体長：１３．８）であることを現した。１３個の植物は、第３染色体上にたった１つのＡ．ｒｏｙｌｅｉセグメントを有しており、他の相同染色体は、Ａ．ｃｅｐａのクロマチンだけから構成されることが証明された。疑いもなく、これらの結果は、品種改良系統第２３４８号の１３個の植物の全てが、べと病耐性遺伝子を含むセグメントに関してヘテロ接合であることを証明した。寄託番号第２３４８−５号は、２つのＡ．ｒｏｙｌｅｉセグメント：べと病耐性遺伝子を担持する第３染色体の長腕上に存在するセグメント、と第４染色体の長腕上に存在する追加のセグメント（動原体指数：３９．３；相対染色体長：１２．６）を有している。両セグメントは、ゲノム内でヘテロ接合で存在する。
【０１１４】
ＧＩＳＨ分析は、Ａ．ｃｅｐａ染色体内へのＡ．ｒｏｙｌｅｉからの第３染色体の長腕上の遺伝子移入されたセグメントのサイズ決定をも可能にする。上記セグメントの平均は、染色体全長の２５．２％、及び長腕の長の４３．９％である。
【０１１５】
討議
上記の方法により、タマネギのゲノム内への、べと病耐性遺伝子を担持するＡ．ｒｏｙｌｅｉクロマチン材料の遺伝子移入が首尾良く検出された。本データは、品種改良系統第２３４８号、世代Ｆ1ＢＣ5Ｓ3におけるべと病耐性遺伝子のヘテロ接合の性質を証明するものである。圃場において耐性であるとして選択された１４個の植物の全てにおいて、第３染色体のたった１つのホモログ内にＡ．ｒｏｙｌｅｉセグメントが発見された。上述の結果は、Ａ．ｃｅｐａの発達のために、例えば、種子の発達のために必要であり、かつ、べと病耐性遺伝子の近くに位置する遺伝子（又は致死因子）がホモ接合植物の不存在の原因であるということを仮定することにより説明されうる。実際、遺伝子移入の間、対応のＡ．ｒｏｙｌｅｉ遺伝子により必須のＡ．ｃｅｐａ遺伝子を置換することにより、Ａ．ｃｅｐａ細胞質バックグラウンドに置かれるとき、植物の発達、例えば、種子の発達の重度の妨害が導かれることが想定されうる。生存可能なホモ接合耐性タマネギは、可能である場合には、べと病耐性遺伝子と致死因子の間に組換えが生じる場合にのみ得られうる。
【０１１６】
Ａ．ｃｅｐａへの戻し交雑及びべと病耐性についての選択の間、べと病耐性遺伝子を宿すＡ．ｒｏｙｌｅｉセグメントを含む植物だけが維持されるであろう。これは、Ａ．ｃｅｐａのクロマチンとＡ．ｒｏｙｌｅｉのセグメントだけから成る植物を、最終的に導く。しかしながら、上述の仮定に従えば、このセグメントは、発達のために必要なＡ．ｃｅｐａの遺伝子と入れ替わっている。ヘテロ接合条件下では、種子は発達し、そして植物は得られるであろうが、ホモ接合条件下では、植物は形成されない。
【０１１７】
実施例３：品種改良系統第３５９１号、世代Ｆ1ＢＣ5Ｓ3を用いたゲノミック・インサイチュー・ハイブリダイゼーション
導入：
品種改良系統第２３４８号、世代Ｆ1ＢＣ5Ｓ3からの１４個のべと病耐性植物を分析した後、全ての植物が、Ｐｄ耐性座に関してヘテロ接合であったことが示された。べと病耐性のための遺伝子を宿すＡ．ｏｙｌｅｉのセグメントは、第３染色体のホモログの１つの上にのみ検出され、他のホモログは、Ａ．ｃｅｐａのクロマチンだけから構成されていた。このさらなる分析は、圃場においてべと病耐性に関して分離が全く生じていない品種改良系統第３５９１号に関する。これを考えると、ＧＩＳＨを介して、この集団内に、べと病耐性座を宿す第３染色体の領域に関してホモ接合である植物が発見されることが予想される。
【０１１８】
植物材料：
６個の別個の植物、品種改良系統第３５９１号、世代Ｆ1ＢＣ5Ｓ3から、若い根の先端を集め、そして５０個までのスライドを、中期分配分析のために作製した（方法の説明に関しては、Ｋｈｒｕｓｔａｌｅｖａ  ａｎｄ  Ｋｉｋ，ｒｅｆ９を参照のこと）。よく分配された中期をもち、そして染色体の完全なセット（２ｎ＝２×＝１６）を含むスライドを、ＧＩＳＨ実験のために選択する。
【０１１９】
方法：
詳細は、先の実施例の「方法」の節の下で与える。
【０１２０】
結果：
Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＢＶ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，ＮＬは、品種改良系統第３５９１号、世Ｆ1ＢＣ5Ｓ3からの６個の耐性植物のＧＩＳＨ分析を実施し、これは、全ての植物が、べと病耐性座を宿す領域に関してホモ接合のＡ．ｒｏｙｌｅｉであることを示した（図３Ａ〜３Ｆを参照のこと）。核型分析は、第３染色体の両ホモログ上にＡ．ｒｏｙｌｅｉセグメントの存在を現す（動原体指数：４１．７；相対染色体長１３．８）。６個の分析された植物の中で、寄託番号第３５９１−１号は、第３染色体の両ホモログの上に２つの小さなセグメントを有している（図３Ａを参照のこと）。Ａ．ｒｏｙｌｅｉの遺伝子移入されたセグメントのサイズは、両ホモログ上で同じであり、そして平均、長腕の長さの１７．９±０．７８％である。５個の植物、すなわち、寄託番号第３５９１−３号、同第３５９１−４号、同第３５９１−５号、同第３５９１−６号、及び同第３５９１−８号は、サイズが異なる２つのＡ．ｒｏｙｌｅｉの遺伝子移入されたセグメントを有している（図３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ、及び３Ｆを参照のこと）。大きい方のセグメントのサイズの平均は、長腕の長さの４２．８±１．０９％であり、そして小さい方のサイズの平均は、１７．９±０．７８％である。
【０１２１】
討議：
本結果は、品種改良系統第２３４８号におけるべと病耐性座のヘテロ接合の性質を説明するために提案された仮説を確信させるものである。植物の発達のために有害であり、かつ、べと病耐性遺伝子の近くに位置する致死因子が、ホモ接合耐性植物の不存在の原因であるということ、又は植物の発達のために必要な必須Ａ．ｃｅｐａ遺伝子が、遺伝子移入によりノックアウトされ、そしてホモ接合耐性植物の不存在の原因であるということが、実際に仮定されることができた。
【０１２２】
Ａ．ｒｏｙｌｅｉ遺伝子移入セグメントが、Ａ．ｃｅｐａの細胞質だけでは機能しない（すなわち、核−細胞質相互作用）対応の遺伝子をも有することが提案される。ホモ接合Ａ．ｒｏｙｌｅｉ条件下では、上記必須Ａ．ｃｅｐａ遺伝子は対応のＡ．ｒｏｙｌｅｉ遺伝子により完全に置換され、その結果、生存可能な種子を全く与えないであろう。べと病耐性遺伝子と必須遺伝子（又は致死因子）の間に組換えが生じる場合にだけ、生存可能なホモ接合耐性植物が得られるであろう。品種改良系統第３５９１号のＧＩＳＨは、ホモ接合耐性植物（第３５９１−１号）が、耐性遺伝子と致死因子の間の組換え事件に因り得られうることを証明するものである。他の５個の寄託物は、Ａ．ｒｏｙｌｅｉ遺伝子移入セグメントの小さいものと大きなものを有しており、これは、これらの植物が、耐性遺伝子に関してホモ接合であり、そしてＡ．ｒｏｙｌｅｉの致死因子に関してヘテロ接合であることを意味する。
【０１２３】
上述の仮説から予想されるように、２つの大きなＡ．ｒｏｙｌｅｉ遺伝子移入セグメントを有する植物は発見されていないことに留意しなければならない。なぜなら、この遺伝子構成は、種子の発達をもたらさないからである。
【０１２４】
実施例４：（Ａ．ｒｏｙｌｅｉに由来する）ペロノスポラ・デストラクター（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）耐性座に結合されたマーカーの同定植物材料（個体の数）：
１×Ａｌｌｉｕｍ  ｒｏｙｌｅｉ（ホモ接合耐性）
４×（ＡｃＡ〜ＡｃＤと命名した）、及び２４×（Ａｃ０１〜Ａｃ２４と命名した）Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ（ホモ接合感受性）
１×第３５９１−１号（ホモ接合耐性、小さな遺伝子移入断片）
１×第３５９１−３号（ホモ接合耐性、小さな遺伝子移入断片と大きな遺伝子移入断片）
１４×第２３４８−*（ヘテロ接合耐性、大きな断片）。
【０１２５】
導入：
ＡＦＬＰTM技術についての補足情報に関しては、４番目の参考文献を参照のこと。
本実施例の目的は、タマネギにおけるペロノスポラ・デストラクターの耐性座に結合したＡＦＬＰTMマーカーを同定することである。この耐性座は、Ａｌｌｉｕｍ  ｒｏｙｌｅｉに由来する。実施例２に示したように、大きな遺伝子移入断片が、いくつかの個体において同定された（個体第２３４８−*）。これらの個体の他に、小さな遺伝子移入断片を有する２個の個体も得られた（第３５９１−１号、小さな断片、及び第３５９１−３、小さな断片と大きな断片）。耐性座に関連するマーカーを同定し、そして特に、小さな遺伝子移入断片上に位置するマーカーを得るために、改作されたＢｕｌｋｅｄ  Ｓｏｇｒｅｇａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＳＡ，Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ，ｒｅｆ１１を参照のこと）戦略を、４個の個体／プールに対して実行した：
Ｉ：個体第２３４８−６号；ヘテロ接合耐性；大きな遺伝子移入断片、
II：個体第３５９１−１号；ホモ接合耐性；小さな遺伝子移入断片、
III：個体Ａｌｌｉｕｍ  ｒｏｙｌｅｉ；ホモ接合耐性、
IV：４個のＡ．ｃｅｐａ個体（ＡｃＡ〜ＡｃＤ）のプール；ホモ接合感受性。
【０１２６】
上記４個の別個のＡｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ個体、１３個の残りの第２３４８号個体、及び個体第３５９１−３号を、結合されたマーカーの確認のために使用した。着目の形質に関連付けられることが分っているマーカーを、偽陽性マーカーを同定するために、２４個のＡｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａの個体のセット（Ａｃ０１〜Ａｃ２４）について最終的にチェックした。
【０１２７】
結果：
生物学的材料：ＤＮＡを、３１個体の葉材料（２８×Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ、並びに個体第３５９１−１号、同第３５９１−３号、及びＡｌｌｉｕｍ  ｒｏｙｌｅｉ）、及び１４×第２３４８号個体からのＤＮＡから抽出し、そして全ての個体に関して、ＰｓｔＩ／ＭｓｅＩテンプレートを作製した。個体第２３４８−４号、同第２３４８−５号、同第２３４８−１１号、及び同第３５９１−３号に関しては、信頼できるＡＦＬＰTMフィンガープリントは作製することができなかった。それゆえ、これらの個体は、さらなる分析から除外した。
【０１２８】
マーカーの同定及び確認：
先に記載したように、４つの個体又はプールＩ，II，III，IVに対して改作ＢＳＡアプローチを実施した。
ＢＳＡを、ＰｓｔＩ＋３／ＭｓｅＩ＋３マトリックス中９６個のプライマーの組合せを用いて実施し、使用したプライマーの組合せの概要を表３に与え、そして表６は、ＡＦＬＰTMプライマー酵素の組合せの命名法を与える。
【０１２９】
ＢＳＡは、３４個の候補マーカーの同定をもたらし、その内の８個の候補マーカーは、おそらく小さな遺伝子移入断片に連結されている。これらの３４個の候補マーカーから、おそらく小さな遺伝子移入マーカーに連結されている８個のマーカーを含む１３個のマーカーを選択した。この１３個のマーカーの選択を、より多くの個体についての確認のために使用した。確認のために、４個のＡｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ個体、１３個の残りの第２３４８号個体、及び個体第３５９１−３号を使用した。
【０１３０】
【表３】
2008522602.tif 000017
【０１３１】
上記の確認に基づき、３個の候補マーカー（その内の２個は、おそらく小さな遺伝子移入断片に連結されている）は、着目の形質との明らかな連鎖を示さなかった。しかしながら、全部で４個の、各々６個の候補マーカーは、大きな、個々小さな遺伝子移入断片と明らかな連鎖を示した。しかしながら、小さな遺伝子移入断片に連結された、上記候補マーカーの内の２つは、上記４個のＡｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ個体の内の１つにも存在する。それゆえ、これらのマーカーは、さらなる分析のために有用ではないことが分った。確認の結果を表４に示す。
【０１３２】
マーカーＰ３２／Ｍ６２−０６１，Ｐ３３／Ｍ３２−１５１，Ｐ３５／Ｍ５１−３３０、及びＰ４３／Ｍ３５−１９０は、小さな遺伝子移入断片に連結されていることが分った。
【０１３３】
２４個のＡｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ個体についてのさらなる確認：
偽陽性マーカーを克服するために、小さな遺伝子移入断片に連結された４つの候補マーカー（Ｐ３２／Ｍ６２−０６１，Ｐ３３／Ｍ３２−１５１，Ｐ３５／Ｍ５１−３３０、及びＰ４３／Ｍ３５−１９０）を、２４個のさらなるＡｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ個体（Ａｃ０１〜Ａｃ２４）に対してチェックした。得られたマーカーの格付けは、予想された格付けに従った（表５を参照のこと）。
【０１３４】
【表４】
2008522602.tif 000018
【０１３５】
討議及び結論：
タマネギにおけるペロノスポラ・デストラクター耐性座に関連するマーカーを同定し、そして特に、小さな遺伝子移入断片上に位置するマーカーを取得するために、４個の個体／プールに対して、改作Ｂｕｌｋｅｄ  Ｓｅｇｒｅｇａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＳＡ）戦略を実行した。（４個の個体／プールに対してスクリーニングされた）全部で９６個のＰｓｔＩ／ＭｓｅＩプライマー組合せ物を用いてＢＳＡを実施した。
【０１３６】
【表５】
2008522602.tif 000019
【０１３７】
ＢＳＡは、３４個の候補マーカーの同定をもたらし、その内８個の候補マーカーは、おそらく小さな遺伝子移入断片内に位置していた。確認後、（その上に、ペロノスポラ・デストラクターの耐性座が位置するところの）小さな遺伝子移入断片内に位置する全部で４個のマーカーが同定された。
偽陽性マーカーを克服するために、小さな遺伝子移入断片に連結された４つの候補マーカー（Ｐ３２／Ｍ６２−０６１，Ｐ３３／Ｍ３２−１５１，Ｐ３５／Ｍ５１−３３０、及びＰ４３／Ｍ３５−１９０）を、２４個のさらなるＡｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ個体に対してチェックした。得られたマーカーの格付けは、予想された格付けに従う。それゆえ、これらのマーカーは、着目の小さな遺伝子移入断片に連結していることが分かり、そしてさらなる選択手順のために使用されうる。
【０１３８】
【表６】
2008522602.tif 000020
【０１３９】
実施例５：致死を生じさせずにホモ接合で存在しうる、タマネギのべと病に対する耐性を付与するＡ．ｒｏｙｌｅｉの遺伝子移入断片の、Ａｌｌｉｕｍ属の植物における、存在の決定
第１のステップにおいて、タマネギのべと病に対するＰｄ耐性座の存在を、試験下の植物においてアッセイする。この座の存在は、先の実施例において例示したようなＡＦＬＰTMを使用して又はペロノスポラ・デストラクターによる天然又は人工接種に対する当該植物の耐性をアッセイすることにより、アッセイされることができる。
【０１４０】
上記植物が、そのゲノム内に、Ｐｄ耐性座を有する場合、当該植物の第３染色体のホモログは、（致死配列との連鎖を伴って又は伴わずに）図１に示す４つの可能性の内の１つに必ず対応する。
【０１４１】
本発明の一部である最初の３つのゲノムを、第４のものから区別するために、試験下の植物の自家受粉を実施する。次いで、自家受粉の子孫を、Ｐｄ耐性座の存在について試験する。図１から分るように、最初の３つのゲノムだけが、理論的に少なくとも７５％耐性である子孫を与え、一方、第４の図示するゲノム（本発明の一部ではない）は、タマネギのべと病に対して６７％未満の耐性である子孫を与える。
【０１４２】
自家受粉後の耐性子孫のパーセンテージを知ることによって、試験された植物が図示する最初の３つのカテゴリーの内の１つにあるのか又は第４のものにあるのかどうか、すなわち、それが本発明の範囲内にあるか否かを演繹することができる。
【０１４３】
実施例６：
それらが全てホモ接合耐性であり、そして耐性座を担持する２つの小さな遺伝子移入断片をもつ点で第３５９１−１号に類似する系統第３５９１号からの植物を、３方向品種改良スキームにおいて雑種と交雑させる（この３方向の交雑は、雌親として１つの雑種、及び雄親として第３５９１号からの植物を有する）。
【０１４４】
この交雑から得られた雑種、第３７−１００１号を圃場で試験した。この雑種は、中長期保存に好適な、初期中間の極長日タイプのタマネギである。それは、中強葉生長力、極均質落葉、均質丸平丸型球根（３．８ユニット／ｈｅ）、良好収量力、黄褐色の良好な皮、良好な堅さ（３．４mm）を示す。Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  Ｚｗａａｎからの商業化されたタマネギ雑種であるＴａｓｃｏとＤｒａｇｏと第３７−１００１号を比較する、表７に、圃場試験データを示す。この表から分かるように、農業経済的利益の特徴は、全ての植物において類似している。
【０１４５】
本発明にとって最も重要なことは、２連において２年連続して保持された病気圃場試験において、試験された植物第３７−１００１号の全ては、耐性であり、一方、感受性チェックとしての変種、Ｓｔａｃｃａｔｏ（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  Ｚｗａａｎ雑種）は、べと病に感染された植物を１００％有する。
【０１４６】
【表７】
2008522602.tif 000021
【０１４７】
実施例７：
以下、系統第３５９１号又は植物第３５９１号は、小さな遺伝子移入断片を担持するホモ接合耐性植物であし、それらは全て、第３５９１−１号に類似する植物である。なぜなら、それらは、ホモ接合条件下でも小さな遺伝子移入断片を含み、そして同一の品種改良系統に属するからである。
【０１４８】
第３５９１号植物は、タマネギのべと病に耐性である新たな商業的なタマネギ雑種の生産において有用である新たな親品種改良系統の開発のための出発材料として首尾よく使用された。第３５９１号植物は、まず近交系タマネギと交雑されてＦ１雑種が作られる。
【０１４９】
実際、他の花粉供給系統への戻し交雑を通じて、べと病耐性遺伝子は、多くの異なるタマネギのタイプの他の花粉供給系統内に導入されうる。
【０１５０】
最初の交雑は、耐性座を担持する２つの小さな遺伝子移入断片をもつ耐性植物と、感受性系統との間で行われる。この交雑は、ヘテロ接合で小さな遺伝子移入断片を含む雑種（Ｆｌｓ）を生じさせる。これらのヘテロ接合耐性Ｆ１植物は、感受性系統又は上記Ｆ１耐性植物を作製するために使用された感受性系統との、その後の戻し交雑のために使用される。このような戻し交雑ステップは、５０％耐性、及び５０％感受性植物をもつ集団を生じさせるであろう。この１：１の分離は、優性Ｐｄ耐性座の遺伝に因る各戻し交雑世代とともに生じるであろう。感受性植物は全て、べと病感受性として表現型分類され、そして除外されることができる。Ｆ１雑種を作製するための親材料として有用である新たなタマネギの近交系統は、数段階の戻し交雑、その後の当業者に知られているような自家受粉を通じて得られる。
【０１５１】
この遺伝は、圃場データにより確認され；交雑ｓｙ１０８ａ*３５９１により作製された９個の植物の内、９個の植物が耐性である。同様に、交雑ｆｒａ*３５９１により作製された４個の植物の内、４個全ての植物が耐性である。同様に、交雑ｓｙｔ*３５９１から作製された３個の植物も全て、タマネギのべと病に対して耐性である。次いで、これらの植物を、以下に述べるように戻し交雑させる。
【０１５２】
実施例８：
本発明に開示するマーカーにより、全ての植物の遺伝子型も分類されうる；耐性座を担持する２つの小さな遺伝子移入断片をもつ第３５９１号植物を、さまざまな他の近交親系統と交雑させるときに作製される１６個のＦ１雑種の内、全てが、プライマー対（Ａ）（小さな遺伝子移入断片に連結されたマーカーＰ３２／Ｍ６２−０６１が使用されたとき予想される６１ヌクレオチド断片を示したが、マーカーＰ３２／Ｍ６２−０７９（プライマー対（Ｂ′））が使用されるとき、大きな遺伝子移入断片の存在を通常強調する７９ヌクレオチド断片を示さなかった。
【０１５３】
【化１４】
2008522602.tif 000022
【０１５４】
【化１５】
2008522602.tif 000023
【０１５５】
【化１６】
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【０１５６】
【化１７】
2008522602.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１は、４つの異なる耐性Ａｌｌｉｕｍに関する自家受粉の子孫へのＰｄ耐性座と致死配列の可能な伝達方法の概要を図示する。右の欄は、子孫における耐性のパーセンテージを与え、そして親植物が、致死配列を伴わずに耐性座を担持する第３染色体のホモログを少なくとも有するか否かを示す。
【図２】図２は、実施例２に記載したプロトコールに従って分析された集団第２３４８号からの１４個のべと病耐性植物についてのＧＩＳＨ核型を示す。第２３４８−１号、第２３４８−３号、第２３４８−４号、第２３４８−５号、第２３４８−６号、第２３４８−７号、第２３４８−８号、第２３４８−１１号、第２３４８−１３号、第２３４８−１４号、第２３４８−１５号、第２３４８−１６号、第２３４８−１８号、及び第２３４８−１９号は、同一の親系統第２３４８号からの異なる植物である。
【図３】図３は、実施例２に記載したプロトコールに従って分析された集団第３５９１号からの６個のべと病耐性植物についてのＧＩＳＨ核型を示す。第３５９１−１号（図３Ａ）、第３５９１−３号（図３Ｂ）、第３５９１−４号（図３Ｃ）、図３５９１−５号（図３Ｄ）、図３５９１−６号（図３Ｅ）、及び図３５９１−８号（図３Ｆ）は、同一の親系統第３５９１号からの異なる植物である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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