【事件の表示】
　特許第２７８１３９１号「組織因子インヒビター」の請求項１ないし６に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７８１３９１号の請求項１ないし３に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第２７８１３９１号に係る出願は、昭和63年7月22日（パリ条約による優先権主張1987年7月23日、米国）に特願昭63−183424号として出願され、平成10年5月15日にその特許の設定登録がなされ、その後、沢村嘉朗より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、訂正請求（後日取下げ）がなされた後、再度の取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１３年８月１日に訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正請求
１．訂正の内容
(1)特許請求の範囲の請求項１に係る記載「(C)Ｘａ因子に対して阻害活性を示すことを特徴とする組織因子インヒビター」を、「(C)Ｘａ因子に対して阻害活性を示すことを特徴とする組織因子インヒビター（TFI）であって、培養生育させたチャン肝細胞またはSK-HEP-1細胞の調整メジウムから単離される組織因子インヒビター」と訂正する。
(2)特許請求の範囲の請求項２乃至４を削除する。
　
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項(1)は、「(C)Ｘａ因子に対して阻害活性を示すことを特徴とする組織因子インヒビター」を「(C)Ｘａ因子に対して阻害活性を示すことを特徴とする組織因子インヒビター（TFI）であって、培養生育させたチャン肝細胞またはSK-HEP-1細胞の調整メジウムから単離される組織因子インヒビター」に訂正するものであるから特許請求の範囲の減縮に該当し、訂正事項(2)は、請求項を削除するものであるから特許請求の範囲の減縮に該当する。
　そして、上記いずれの訂正も新規事項に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　
３．独立特許要件
　訂正された請求項１乃至３に係る発明（以下、「本件発明１乃至３」という。）は、後述の「III.３．判断」の項に記載のように、特許法２９条１項３号の規定に該当せず、或いは同条２項の規定に違反するものではないから、本件発明１乃至３は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４,２項、及び同条３項で準用する１２６条２項から４項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要
　訂正前の本件請求項１、２及び４に係る発明は、甲第１又は２号証に記載された発明である、或いは、同請求項１乃至６に係る発明は、甲第１乃至３号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条１項３号或いは同条２項の規定により特許を受けることができない。
　　　　　　　　　記
甲第１号証：Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.84,pp1866-1890,April 1987
甲第２号証：Clinical Research,Vol.35,Number3,April 1987
　
２．甲各号証の記載内容
　甲第１号証には、
「組織因子をヒト血漿(血清)に添加すると組織因子活性の阻害が進行する。この反応は、血漿中において、VIIa因子、Ｘa因子、Ca2+及び組織因子インヒビター(TFI)と呼ばれるもう一つの成分の存在下、進行する。HepG2細胞(ヒトヘパト−マセルライン)により分泌されるTFIは、CdCl2沈殿、ジイソプロピルホスホリル−Ｘa因子アフィニティ−クロマトグラフィー、セファデックスG-75ゲル濾過剤、及びモノＱイオン交換クロマトグラフィーの４つの行程を経て、無血清培地から単離された。精製されたTFIは、NaDodSO4（ドデシル硫酸ナトリウム）／ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、38,000の位置に、阻害活性を有したまま移動するバンドを有していた。血漿中における活性物質と同様に、このTFIが阻害活性を示すためには、VIIa因子、Ｘa因子及びCa2+を必要とする。その特異的な活性（光路長１cm、１％溶液に対して280nmにおける吸光計数を１０と仮定する）は9,800比活性単位/mgであった。ここで、TFI活性の１単位は通常プール血清の１ml中における活性で定義された。」（要約の項）との記載が、
　甲第２号証には、
　
３．判断
Ａ．特許法２９条１項３号について
　本願発明１は、「培養生育させたチャン肝細胞またはSK-HEP-1細胞の調整メジウムから単離される組織因子インヒビター」であるところ、甲第１号証或いは甲第２号証に係る組織因子インヒビター（TFI）は、いずれも「チャン肝細胞」又は「SK-HEP-1細胞」とは異なる「HepG2細胞」に由来するものであるから、本願発明１は、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明であるとはいえない。
　
Ｂ．特許法２９条２項について
　特許権者が提出した参考資料１及び２によると、本願発明１に係る「チャン肝細胞」又は「SK-HEP-1細胞」は、HepG2細胞由来のTFIより、それぞれ１．４倍又は５．８倍活性が強いことが記載されている。
　そうすると、HepG2細胞由来のTFIについて開示されている甲第１号証及び甲第２号証に記載された事項に基づき、本願発明１を当業者が容易に想到し得るとは到底いうことができない。
　また、本願発明２及び本願発明３は、本願発明１を引用するものであるから、本願発明１についての判断と同様の理由により甲第１号証及び甲第２号証に記載された事項に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
（なお、特許異議申立人は、甲第３号証を証拠として提出しているが、甲第３号証は、本件特許の特許公報であるから、これを根拠に本願発明１乃至３が当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。）
　
III．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１乃至３についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明１乃至３についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年８月２日（２００１．８．２）
【訂正の要旨】
（訂正の要旨）
（１）特許請求の範囲の請求項１に係る記載「（Ｃ）Ｘａ因子に対して阻害活性を示すことを特徴とする組織因子インヒビター」を、特許請求の範囲の減縮を目的として「（Ｃ）Ｘａ因子に対して阻害活性を示すことを特徴とする組織因子インヒビター（ＴＦＩ）であって、培養生育させたチャン肝細胞またはＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の調整メジウムから単離される組織因子インヒビター」と訂正する。
（２）特許請求の範囲の請求項２乃至４を特許請求の範囲の減縮を目的として削除する。
（５４）【発明の名称】
組織因子インヒビター
（５７）【特許請求の範囲】
（１）（Ａ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により、約３７，０００〜４０，０００ダルトンの位置に移動するＴＦＩ１と約２５，０００〜２６，０００ダルトンの位置に移動するＴＦＩ２の２つの形で存在し、
（Ｂ）式
（式中、Ｘ−Ｘは未決定である）で示される部分Ｎ末端アミノ酸配列を有し、
（Ｃ）Ｘａ因子に対して阻害活性を示すことを特徴とする組織因子インヒビター
（ＴＦＩ）であって、
培養生育させたチャン肝細胞またはＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の調整メジウムから単離される組織因子インヒビター。
（２）
（３）
【発明の詳細な説明】
　本発明は、組織因子インヒビター（ＴＦＩ）として知られている血液凝固インヒビターに関する。
　哺乳動物の血液で起こる血液凝固過程には２種の別個のシステム、すなわちいわゆる内因系および外因系血液凝固がある。後者の外因系血液凝固システムは、血液が組織トロンボプラスチン（ＩＩＩ因子、以下、組織因子−ＴＦ−と呼ぶ）に接触すると活性化される。組織因子は、多くの細胞種の形質膜に生じるリポ蛋白質であつて、とくに脳および肺に多量に存在する。ＴＦと接触すると、血漿ＶＩＩ因子またはその活性型、ＶＩＩａ因子がＴＦとカルシウム依存性複合体を形成し、ついで蛋白分解的にＸ因子Ｘａ因子に、ＩＸ因子をＩＸａ因子に活性化する。
　ＴＦ開始血液凝固の調節に関する初期の研究では、血清でＴＦ（粗組織卜ロンボプラスチンプレパレーシヨン中）をインキユベーシヨンするとその
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
９
６９
６６
　
発明の簡単な記述
　本発明は、以下の特徴、すなわち、（Ａ）　ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ　ＰＡＧＥ）により、約３７，０００〜４０，０００ダルトンの位置に移動するＴＦＩ１と約２５，０００〜２６，０００ダルトンの位置に移動するＴＦＩ２の２つの形で存在し、
（Ｂ）　式
（式中、Ｘ−Ｘは未決定である）で示される部分Ｎ末端アミノ酸配列を有し、（Ｃ）　Ｘａ因子に対して阻害活性を示す、新規な組織因子インヒビター（ＴＦＩ）を提供する。
　本発明の新規なＴＦＩは、その原料とした細胞および組織源中では存在しない高度に精製された形で単離された。すなわち、本発明のＴＦＩは他の蛋白質、他の細胞成分および組織内物質を含まない、精製された形で精製された。
　新規なＴＦＩは、血液凝固過程の研究において医学的に重要であることを示唆する生物学的活性を示す。とくに、本発明の新規なＴＦＩは血液凝固インヒビターおよび抗血栓剤として治療的に有用であることが示された。
　好ましい態様においては、本発明の新規なＴＦＩは、栄養培養メジウム中で生育されたＨｅｐＧ２細胞によつて分泌され、その調整培地から単離された。この単離は、以下の３工程からなる。すなわち、（Ａ）　ＣｄＣｌ２沈殿、（Ｂ）　再溶解した沈殿のＸａ因子アフイーゲル１５アフイニテイークロマトグラフイー、および（Ｃ）　上記アフイニテイークロマトグラフイーにおけるＴＦＩ活性含有分画のスーパーロース１２ゲル濾過である。
　単離の別法では、工程（Ｂ）におけるＸａ因子はジイソプロピルホスフエート（ｉＰｒ２Ｐ）への結合によって不活性化し、工程（Ｃ）のゲル濾過材としてセフアデツクスＧ−７５を使用し、さらに次の（Ｄ）　工程、すなわちゲル濾過におけるＴＦＩ活性含有分画のモノＱイオン交換クロマトグラフイーを行う。
　上述の方法において、ＨｅｐＧ２はよく知られていて、広く利用されているヒトヘパトーマ細胞系であり、その樹立および特性は米国特許第４，３９３，１３３号に記載されている。この細胞系のサンプルはＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）の永久収集細胞から入手することもできる。受入番号はＡＴＣＣ　ＨＢ８０６５である。
　ＴＦＩの他の適当な細胞系には、たとえばＳＫ−ＨＥＰ−１細胞（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ　５２）、チヤンの肝細胞（ＡＴＴ　ＣＣＬ　１３）、内皮細胞および哺乳動物血清がある。
　ＨｅｐＧ２細胞は、慣用の栄養培養メジウム中、約３７℃で生育させて、ＴＦＩを発現させることができる。好ましいメジウムはイーグルの改良必須培地（ＥＭＥＭ）で、市販されている。その他の適当な市販メジウムは、たとえばＨｅｌｅｎ　Ｊ．ＭｏｒｔｏｎによりＩｎ　Ｖｉｔｒｏ，
６
　上記工程Ａで生成したＣｄＣｌ２沈殿は、工程Ｂにおけるアフイニテイークロマトグラフイーカラムに適用する前に、等容量の緩衝溶液で希釈するのが好ましい。緩衝溶液は、生物学的に許容される緩衝物質の水溶液でなけれはならず、ｐＨは約７．５に調整する。たとえば０．０５Ｍトリス塩酸塩を使用する。ついでほぼ同様の緩衝液をアフイニテイークロマトグラフイーカラムの平衡化に使用できる。
橋アガロースゲル誘導体のＮ−ヒドロキシスクシンイミドとして調製された市販の、活性化アフイニテイー支持体である。
キストランとエピクロルヒドリンで調製された市販の、ビーズ状ゲルである。好ましい特級品の径は約２０〜５０μＭのオーダーである。
　ゲル濾過カラムに適用する前に、ＴＦＩ活性を含む工程Ｂにおけるアフイニテイークロマトグラフイーカラムからの分画は、たとえば限外濾過によって濃縮し、処理溶液を減らすことが好ましく、カラムはｐＨ約７．５に緩衝された１ＭＮａＳＣＮで平衡化できる。
　単離の別法においては、ゲル濾過工程Ｃに続いて、ＴＦＩ活性を含む分画を好ましくはアセトンで沈殿させ、ついで沈殿を再溶解してモノＱカラムに適用する。このカラムはｐＨ約８．３に緩衝化された６Ｍ尿素で平衡化することができる。
　工程Ｄにおいて使用するモノＱは、径約１０μＭのビーズ状の親水性ポリマーを基材とし、四級アミノ荷電基を有する強陰イオン交換樹脂であって、市販品を入手できる。
　本明細書にはＴＦＩの特定の単離方法について述べたが、本発明の新規なＴＦＩは特定の製造方法によって限定されるものではない。たとえばＴＦＩ蛋白質は慣用の組換えＤＮＡ技術によつて製造できる。生化学および組換えＤＮＡ技術における最近の進歩は、特定の蛋白質たとえば酵素を、それが通常単離される生物とは無関係に制御された条件で合成することを可能にした。これらの生化学的合成方法は、生存細胞の蛋白質合成系の酵素および細胞下成分を、細胞を用いない
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
ｉｎ　ｖｉｖｏ
　クローン化された遺伝子は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏシステムで合成される蛋白質のアミノ酸配列を特定するために使用できる。ＲＮＡ指示蛋白質合成系は本技術分野においては確立している。二本鎖ＤＮＡを誘導し、
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
　現在では、高級動物たとえばヒトおよび動物から特定の遺伝子またはその蛋白質を単離し、遺伝子またはフラグメントを微生物たとえば細菌または酵母に移入することができる。移入された遺伝子は、形質転換された微生物の複製に応じて、複製され、増殖される。すなわち、形質転換された微生物は、所望の蛋白質たとえば酵素またはそれをコードする遺伝子を作る能力を付与され、この能力はその子孫に受け継がれる（たとえば、Ｃｏｈｅｎ＆Ｂｏｙｅｒ：米国特許第４，２３７，２２４号および第４，４６８，４６４号参照）。
　
発明の詳細な記述
　本発明は、本発明の構成に欠くことができない事項を特定し、請求する特許請求の範囲に示すとおりの発明であるが、以下に、図面を参照しながら説明する本発明の好ましい態様の記載により、本発明をさらに明瞭に理解できるものと信じる。図面を簡単に説明すると次のとおりである。
　第１図は、本発明の一態様において、ＨｅｐＧ２細胞から単離された濃縮ＴＦＩプレパレーシヨンをｉＰｒ２Ｐ−ヒトＸａ因子アフイーゲルアフイニテイークロマトグラフイーに付した場合の溶出像を示すグラフである。
　第２図は、第１図のＴＦＩ活性分画の濃縮サンプルをセフアデツクスＧ−２５ゲル濾過に付した場合の溶出像を示すグラフである。
　第３図は、第２図のＴＦＩ活性分画の濃縮サンプルをモノＱイオン交換クロマトグラフイーに付した場合の溶出像を示すグラフである。
　第４図は、第３図における精製ＴＦＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
　第５図は、第３図における精製ＴＦＩと正常ヒト血清をＴＦＩアツセイによつて比較したグラフである。
　第６図は、第３図における精製ＴＦＩのＸａ因子に対する阻害作用と、それがトロンビンに対しては作用しないことを示すグラフである。
　第７図は、第３図における精製ＴＦＩがＶＩＩａ因子、Ｘａ因子およびＣａ２＋の存在において急速にＴＦ活性を阻害することを示すグラフである。
　第８図は、本発明の他の態様においてＨｅｐＧ２細胞から単離された濃縮ＴＦＩプレパレーシヨンをウシＸａ因子アフイーゲルアフイニテイークロマトグラフイーに付した場合の溶出像を示すグラフである。
　第９図は、第８図におけるＴＦＩ活性分画からの濃縮サンプルをスーパーロース１２ゲル濾過に付した場合の溶出像を示すグラフである。
　第１０図は、第９図からの還元、精製ＴＦＩサンプルのＳＤＳ　ＰＡＧＥを示す。
　第１１図は、第９図からの非還元、精製ＴＦＩサンプルのＳＤＳ　ＰＡＧＥを示す。
　第１２図は、種々の細胞から単離されたＴＦＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。（Ａ）は、本発明のさらに別の態様において、免疫アフイニテイークロマトグラフイーによりチャン肝細胞（レーン２）、ＳＫ−ＨＥＰ−１（レーン３および４）、ならびにＨｅｐＧ２細胞（レーン５および６）から単離されたＴＦＩのＳＤＳ　ＰＡＧＥを示す。標準分子量マーカーはレーン１に示す。（Ｂ）図は、第１２Ａ図のレーン２，３，４および６から電気泳動によって分離された蛋白質を、ニトロセルロース濾紙上ウエスタンブロツト（電気泳動移動）および１２５Ｉ−Ｘａによる染色に付し、ついでオートラジオグラフイを行つた結果をそれぞれレーン１，２，３および４に示す。
　本発明の特定の好ましい態様をさらに詳細に例示するために、以下の例示的な実験室的製造実験を実施した。ＴＦＩは、前述のようにＨｅｐＧ２細胞の調整メジウムから、例１では４工程法により、例２では３工程法により、単離されたものである。例３では、ＴＦＩは数種の細胞源から免疫アフイニテイークロマトグラフイーで単離される。
　
例１
　
材料
　
蛋白質
２６０
２６０
８０
１１
　
アツセイ
　サンプルの代わりにＴＢＳＡを加えた混合物を第１段階でインキユベーシヨンし、対照とした。アツセイ中の粗ＴＦ濃度は、対照凝血時間３５〜４０秒を生じるように選んだ。抗トロンビンＩＩＩαは、第１段階のインキユベーシヨン時に生じるＸａ因子がアツセイの第３段階に引き出す凝血時間への影響を低下させるためにアツセイ中に加えた。ＴＦＩの相対活性は、第１段階のアツセイにおける凝血時間の正常値に対する延長（秒）を５０例の供給者からの正常保存血清の最終濃度に対してプロツトし（対数−対数方眼紙）て作成した標準曲線から計算した。この標準曲線は血清濃度１〜１０％（ｖ／ｖ）で直線性を示した。ＴＨＦ活性１単位は、正常保存血清１ｍｌ中に含まれる量と定義した。クロマトグラフィー分画のアツセイの結果は凝血時間で示し、単位／ｍｌには変換しなかつた。
　ＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０〜６８５、１９７０）により、１５％ゲル（堆積ゲルの４％）において実施する。還元サンプルは、電気泳動前に、１０％２−メルカプトエタノールの存在下、１００℃に５分間加熱した。ＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥについでゲルからレーンを切り取り、０．１Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に３０分間浸漬し、２ｍｍの切片に切断し、各切片をウシ血清アルブミン０．５ｍｇ／ｍｌを含有する１Ｍ　ＮａＳＣＮ／０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／０．０２５％ルブロールＰＸ（ＬｕｂｒｏｌＰＸ；脂肪酸のエチレンオキサイド縮合物からなる生物用非イオン界面活性剤）中で一夜インキユベーシヨンしてＴＦＩを抽出した。抽出物質のＴＢＳＡ中１：５０希釈液について上述のようにしてＴＦ阻害のアツセイを行つた。ウエスターンブロツトを１２５Ｉ−標識Ｘａ因子をプローブとして用い、Ｂｒｏｚｅ，Ｈｉｃｋｍａｎ＆Ｍｉｌｅｔｉｃｈの記載（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、
７６
　
細胞培養
　
Ｎ末端アミノ酸配列の決定
　精製ＴＦＩのＮＨ２末端蛋白質配列の決定には、自動化されたエドマン分解法を用いた。分解はＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．、
９１
　ＴＦＩの精製：とくに指示のない限り精製操作は室温で実施した。精製方法は、以下の第１表に示すように、主たる４工程に要約される。
　精製操作の詳細は次のとおりであった。
　
Ａ．　塩化カドミウム沈殿
　ＨｅｐＧ２細胞の血清を含まない調整メジウム（４ｌ）、にフエニルメチルスルホニルフルオライド（最終濃度０．１ｍＭ）およびＮａＮ３（最終濃度０．０５ｗ／ｖ％）を加えたのち、２５００×ｇで３０分間遠心分離して細胞屑粒子を除去した。ついで、ＣｄＣｌ２（１．０Ｍ）を最終濃度が５ｍＭになるように加え、混合物を１５分間撹拌した。ＴＦＩ活性を含有する沈殿を遠心分離（２５００×ｇ、３０分間）で集め、上澄液を傾瀉した。ペレツトを０．５Ｍ　ＥＤＴＡ／５ｍＭｉＰｒ２Ｐ−Ｆ、ｐＨ９．５、４０ｍｌに溶解し、ＴＳ緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ／０．１ｍＭフエニルスルホニルフルオライド／０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ／０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ７．５）の大容量に対して透析した。
　
Ｂ．　ｉＰｒ２−Ｘａ因子アフイーゲル１５クロマトグラフィー
　透析したプレパレーシヨンを遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間）して澄明化し、ＴＳ緩衝液に平衡化したｉＰｒ２Ｐ−Ｘａ因子−アフイーゲル１５のカラムに適用した。ゲルを最初の緩衝液で洗浄し、結合した物質を２Ｍ　ＮａＳＣＮ／０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／０．０５％ルブロ−ルＰＸ／０．２％　　ＮａＮ３／０．１ｍＭフエニルメチルスルホニルフルオライドで溶出した（第１図）。ＴＦＩ活性を含有する分画を集め、ＹＭ５親水性限外濾過膜（アミコン）を用いて約１ｍｌに濃縮した。
　
Ｃ．　ゲル濾過およびアセトン脱脂
　濃縮したサンプルを、１Ｍ　ＮａＳＣＮ／０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／０．０５％ルブロール　ＰＸ／０．０２％ＮａＮ３／０．１ｍＭフエニルメチルスルホニルフルオロイドで平衡化したセフアデツクスＧ−７５（特級）のカラムに適用した（第２図）。ＴＦＩ活性を含む分画を集め、８容量のアセトンと混合した。３０分後に沈殿を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分、１０℃）によつて集めた。
　
Ｄ．　モノＱイオン交換クロマトグラフイー
　アセトンによる沈殿を１．０ｍｌの６Ｍ尿素／０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ／０．０５％ルブロールＰＸ、ｐＨ８．３に溶解し、同じ緩衝液で平衡化したモノＱカラムに適用した。カラムを、開始緩衝液から６Ｍ尿素／０．５Ｍトリス−ＨＣｌ／０．０５％ルブロールＰＸ、ｐＨ８．３への３０ｍｌ直線勾配で展開した（第３図）。ＴＦＩ活性を含有する分画を第３図に示したようにして集め、約１ｍｌに濃縮し（ＹＭ５、アミコン）、１ＭＮａＳＣＮ／０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ／０．０５％ルブロールＰＸ、ｐＨ７．５に対して透析し、４℃に保存した。
　
ＴＦＩの性質
　精製ＴＦＩのＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥでは、著名なバンドがＭｒ３８，０００（非還元）および３９，０００（還元）に認められた（第４図）。精製プレパレーシヨンの非還元サンプルのＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥに続きゲル切片を抽出すると、インヒビター活性はクーマツシー染色バンドと一緒に移動した。期待されたようにこの同じバンドは免疫ブロツテイングで１２５Ｉ−標識Ｘａ因子によって認識された（データは示していない）。精製ＴＦＩのアミノ酸組成は以下の第２表に示す。精製ＴＦＩは、活性の発現にＶＩＩａ因子、Ｘ因子およびＣａ２＋を必要とする点で血清中に存在するインヒビターに類似し（Ｂｒｏｚｅ＆Ｍｉｌｅｔｉｃｈ：前出）（以下の第３表参照）、精製ＴＦＩの希釈で正常ヒト血清標準曲線と平行な線が得られた（第５図）。
　精製ＴＦＩ（２５０ｎｇ／ｍｌ）をＸａ因子（２５ｎｇ／ｍｌ）とインキユベーシヨンすると、機能的バイオアツセイにおけるＸａ血液擬固活性が失われる（第６図）。ＴＦＩのこの阻害作用は、トロンビンがＴＦＩとのインキユベーシヨンで全く影響されないことから、すべてのセリンプロテアーゼに対する一般的な性質ではなかつた（第６図）。
　ＶＩＩａ因子、Ｘａ因子およびＣａ２＋の存在下にＴＦＩは見掛けのｔ１／２２０秒というきわめて急速なＴＦ活性阻害を生じた（第７図）。混合物中にヘパリン（０．５単位／ｍｌ）を加えると、最初の阻害速度は３倍（ｔ１／２＝６秒）に加速された。ＴＦＩによる見掛けのＴＦ活性の阻害は反応混合物中への抗トロンビンＩＩＩα（６５μｇ／ｍｌ）の添加では影響されなかつた。
　ＮＤ、測定せず
　＊２４時間加水分解後のシステイン値、過ギ酸酸化は行わなかつた
　＋メチオニンは加水分解中に巌化され、検出されなかつた
　＊上述のＴＦＩアツセイの記載参照
　＋結果は２回のアツセイの平均である。ＴＦＩの最終濃度は、アツセイの第１段階における１０ｎｇ／ｍｌであつた
　ＨｅｐＧ２調整メジウムから上述のように単離されたＴＦＩの機能的性質を以下に例示する。
　
血液凝固アツセイ
　精製ＴＦＩ（２５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｘａ因子（２５ｎｇ／ｍｌ）およびＥＤＴＡ（１ｍＭ）またはＣａＣｌ２（５ｍＭ）ならびにウサギ脳セフアリンの１：４０希釈液（Ｓｉｇｍａの指示文書に従つて調製）をＴＢＳＡ（０．１Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）中に含有する反応混合物を室温でインキユベーシヨンした。様々の時点で、サンプルの一部１００μｌを、すでにＣａＣｌ２（２５ｍＭ）５０μｌとウサギ脳セフアリン（保存液の１〜１０倍希釈液）５０μｌを３７℃で含有するフアイブロメーターのカツプに加えた。ついでＸ因子欠乏血漿５０μｌを直ちに加え、凝血形成時間を、フイブロメーター（ＢＢＬ，Ｃｏｃｋｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で測定した。Ｘａ因子活性はＴＦＩを欠く同じインキユベーシヨン混合物にＸａの希釈系列を用い作成した標準曲線と凝血時間を比較して求めた。
　
ＴＦＩによるトロンビン阻害
　ＴＦＩ（４００ｎｇ／ｍｌ）とトロンビン（０．５単位／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ）を含有する反応混合物をＴＢＳＡ中室温でインキユベーシヨンした。様様な時点で、サンプルの一部１００μｌを、３７℃に加温した１００μｌの０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、６．６ｇ／ｌ　ＰＥＧ−６０００、１０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ　ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４に加えた。ついでフイブリノーゲン（２ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを加えて直ちに、フイブロメーターで凝血形成時間を測定した。トロンビンの相対活性は、トロンビンの希釈系列を用いて作成した標準曲線によつて求めた。
　
ＴＦＩによるＴＦの阻害
　ＶＩＩａ因子（２００ｎｇ／ｍｌ）、Ｘａ因子（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ２（８ｍＭ）およびＴＦ（２％ｖ／ｖ）を含有する混合物１００μｌを室温で１分間インキユベーシヨンしたのち、ＴＦＩ（６００ｎｇ／ｍｌ）を含有し、抗トロンビンＩＩＩα（１３０μｇ／ｍｌ）とヘパリン（１単位／ｍｌ）を添加したまたは添加されていないＴＢＳＡ１００μｌに加えた。特定時間後にサンプル１０μｌを取り、５ｍＭ　ＣａＣｌ２を含むＴＢＳＡ中に１００倍希釈した。実際には便宜上、早い時点で作成された希釈サンプルも最後の１分後サンプルが得られるまで待つて、ついで全希釈液について２段階アツセイを用いて残つたＴＦ活性を測定した。ＶＩＩａ因子（１μｇ／ｍｌ）５０μｌ、ＣａＣｌ２（２５ｍＭ）５０μｌ、希釈サンプル５０μｌ、およびＸ因子（１０μｇ／ｍｌ）を３７℃でインキユベーシヨンした。１分後に、Ｘ因子欠乏血漿１０部とウサギ脳セフアリン保存試薬（Ｓｉｇｍａの指示文書に従って調製）１部を含有する混合物５０μｌを加え、凝血形成時間をフイブロメーターで測定した。このＴＦアツセイには最初のインキユベーシヨン混合物からのサンプルの希釈およびさらに１〜２分のインキユベーシヨン工程を含むので、得られた阻害速度は見掛けの速度とする。
　上述の実験室的製造実験による精製ＴＦＩの単離およびその機能的試験の結果を、以下の第１図〜第７図についての詳細な説明によつてさらに例示する。
　第１図：この図はｉＰｒ２Ｐ−Ｘａ因子−アフイーゲルアフイニテイークロマトグラフイーを示す。ＣａＣｌ２沈殿および抽出後に透析されたＴＦＩプレパレーシヨン（約１００ｍｌ）を、０．１Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ／０．０２％ＮａＮ３／０．１ｍＭフエニルメチルスルホニルフルオライドで平衡化したｉＰｒ２Ｐ−Ｘａ因子−アフイーゲル１５カラム（１．５×４０ｃｍ）に適用した。開始緩衝液で洗浄したのち、ＴＦＩを２Ｎ　ＮａＳＣＮ／０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／０．０５％ルブロールＰＸ／０．１ｍＭフエニルメチルスルホニルフルオライドで溶出した。流速は３ｍｌ／時、分画サイズは４ｍｌとした。ＴＦＩアツセイにはサンプルを５００倍に希釈した。分画６６〜７０を集めた。
　第２図：この図はセフアデツクスＧ−７５（特級）ゲル濾過を示す。ｉＰｒ２Ｐ−Ｘａ因子−アフイーゲルクロマトグラフイーからの濃縮サンプル（約１ｍｌ）をセフアデツクスＧ−７５（特級）の１×１２０−ｃｍカラムに適用した。流速は１．５ｍｌ／時、分画サイズは１ｍｌとした。ＴＦＩアツセイにはサンプルを２０００倍に希釈した。分画３４〜４１を集めた。
　第３図：この図はモノＱイオン交換クロマトグラフイーを示す。アセトン沈殿後、ＴＦＩを６Ｍ尿素／０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３／０．０５％ルブロールＰＸに溶解し、同じ緩衝液で平衡化した１−ｍｌのモノＱカラムに適用した。閥始緩衝液で洗浄したのち、カラムを開始緩衝液から最終緩衝液（６Ｍ尿素／０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３／０．０５％ルブロールＰＸ）まで３０ｍｌ勾配で展開した。流速は２０ｍｌ／時、分画サイズは１ｍｌとした。ＴＦＩアツセイにはサンプルを２０００倍に希釈した。縦の線は収集した分画を示している。
　第４図：この図は精製ＴＦＩのＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥである。精製ＴＦＩ（３．７５μｇ／レーン）を、還元しないまま（２レーン）または１０％２−メルカプトエタノールで還元後（１レーン）ＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥに付した。（上図）非還元ＴＦＩを含むレーンの１つをゲルから切断してスライスとし、ＴＦＩ活性をアツセイのために抽出した。（下図）還元（Ｒ）および非還元（Ｕ）ＴＦＩのクーマツシーブル染色。原点は左である。
　第５図：この図は、精製ＴＦＩと正常ヒト血清のＴＦＩアツセイにおける比較を示す。精製ＴＦＩの希釈系列をＴＦＩ機能アツセイにより定量し、正常ヒト血清を用いて作成した標準曲線と比較した。ｙ軸は凝血の対照値（３９秒）に対する延長をｘ軸はアツセイの第１段階における
の最終濃度（○，ｖ／ｖ％）である。
　第６図：この図はＸａ因子およびトロンビンに対するＴＦＩの作用を示す。精製ＴＦＩとＸａまたはトロンビンのいすれかを含有する反応混合物を上述のようにして構築した。特定の時間にサンプルを採取し、バイオアツセイによつて残つた酵素活性を定量した。
○−−○、ホスホリヒトおよびＣａ２＋とＸａ
　ＴＦＩを欠く対照混合物ではＸａまたはトロンビン活性の消失は認められなかつた（データは示していない）。
　第７図：この図はＴＦＩによる組織因子（ＴＦ）の阻害を示す。ＶＩＩａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｘａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｃａ２＋（４ｍＭ）、ＴＦ（１％ｖ／ｖ）、ＴＦＩ（３００ｎｇ／ｍｌ）を含み、抗トロンビンＩＩＩα（６５μｇ／ｍｌ）とヘパリン（０．５単位／ｍｌ）を含有するかまたは含有しない混合物を室温でインキユベーシヨンした。特定の時間にサンプルを採取し、希釈し、残つているＴＦ活性を定量した。
　○−○、抗トロンビンＩＩＩα、ヘパリン添加せず；▽−−▽、ヘパリン添加、抗トロンビンＩＩＩα添加せず、□−−□、抗トロンビンＩＩＩα添加、ヘパリン添加せす、△−−△、抗トロンビンＩＩＩαおよびヘパリン添加
　最上部の水平線（活性１００％）上の白ぬきの記号は、ＴＦＩを添加しない場合の各インキユべーシヨン混合物を示す。
　
例２
　ＨｅｐＧ２細胞の調整メジウムからのＴＦＩの単離を、以下の操作を変えたほかは例１の場合と同様にして実施した。
　１）　上述の４工程でなく、３工程で単離を実施した。
　２）　工程ＡのＣｄＣｌ２沈殿には異なる緩衝系を用い（下記参照）、透析は省略した。
　３）　工程ＢのＸａ因子−アフイーゲル１５アフイニテイークロマトグラフイーには、ｉＰｒ２Ｐに結合させたヒトＸａ因子の代わりにｉＰｒ２Ｐに結合していないウシＸａ因子を用いた。
　４）　工程Ｃのゲル濾過にはセフアデツクスＧ−７５ゲルの代わりにスーパーロース１２ゲルを使用した。
　これらの相違点の詳細な条件は次のとおりである。
　ＣｄＣｌ２沈殿　
　ＨｅｐＧ２細胞の血清を含まない調整メジウム（４ｌ）を２，５００×ｇで３０分間遠心分離して粒状の細胞屑を除去した。ついで、ＣｄＣｌ２（１．０Ｍ）を最終濃度１０ｍＭになるように加え、混合物を３０分間撹拌した。ＴＦＩ活性を含有する沈殿を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分）によつて集め、上澄液を傾斜した。ペレツトを８０ｍｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡ、１００ＫＩ単位／ｍｌアプロトニン（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ９．５に溶解し、不溶の物質を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分）で除去した。
　
ウシＸ因子精製
　ウシＸ因子は、ウシ血漿（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ．，Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ）の硫酸バリウム溶出液から精製した。溶出液４０単位（それぞれ血漿１ｌから）を水１．６ｌに懸濁し、ｐＨをＨＣｌで６．０に調整した。乾燥ベンズアミジンを最終濃度が１ｍＭになるように加え、混合物を１０，０００×ｇ、４℃で遠心分離して、不溶の物質を除去した。ついで、サンプルを、予め０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、１ｍＭベンズアミジン、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ６．０に４℃で平衡化したＤＥＡＥセフアロースの５×９５ｃｍカラムに適用した（１００ｍｌ／時）。カラムを開始緩衝液２ｌで洗浄したのち、開始緩衝液から０．８Ｍ　ＮａＣｌ、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、１ｍＭベンズアミジン、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ６．０まで１５ｌの勾配で展開した。プロテインＣの後、プロテインＺの前に溶出したウシＸ１、因子およびＸ２因子を含む分画を集め、約４０ｍｌに濃縮し（ＰＭ１０、Ａｍｉｃｏｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、０．１Ｍ　ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５中に透析した。精製Ｘ因子の収量は６８ｍｇであつた。Ｘａ因子は、Ｘ因子を不溶化ＸＣＰ（ルセルの蛇毒からのＸ因子凝析蛋白質）で活性することにより製造した。
　
ウシＸａ因子アフイーゲルアフイニテイークロマトグラフイー
　サンプルを等容量の０．１Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２％ルブロールＰＸで希釈し、予め０．１ＭＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％　ルブロールＰＸで平衡化したウシＸａ因子−アフイーゲルの３ｍｌカラムに連結したセフアロース４Ｂアガロースの２ｍｌカラムに４ｍｌ／時間の流速で適用した。カラムを０．１ＭＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％ルブロール（２０ｍｌ）、ついで０．１ＭＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２％ルブロールＰＸ（２０ｍｌ）で洗浄した。セフアロース４Ｂプレカラムを回路からはずし、ウシＸａ因子アフイーゲルカラムをさらに、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス−ＮＣｌ、ｐＨ７．５、２％β−オクチルグルコシド（２０ｍｌ）で洗浄し、０．５ベンズアミジン、０．０５トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２％β−オクチルグコシドで溶出した。ＴＦＩアツセイによつて決定されたＴＦＩ含有分画を集め（第８図、分画６２〜６６）、ＹＭ５膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，Ｍａｓｓ．）を用いて約０．４に濃縮した。溶出分画中の大量のＡ２８０はベンズアミジンによるものである。
　
スーパーロース１２ゲル濾過
　濃縮サンプル（約０．４ｍｌ）を１Ｍ　ＮａＳＣＮ、２％β−オクチルグルコシド、０．０２Ｍ　ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０で平衡化し、連結した２個の２５ｍｌスーパーロース１２カラムに適用した。カラムを開始緩衝液により０．３ｍｌ／分の流速で展開した。ＴＦＩ活性を含有する分画２７〜３１を確認し、収集した（第９図）。
　
ＴＦＩの性質
　還元した精製ＴＦＩ物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、硝酸銀で染色すると、見掛けの分子量３９，０００ダルトンの拡散したバンドが認められた。ゲル切片の溶出により、機能的ＴＦＩ活性はその蛋白質バンドと一緒に移動することが明らかにされた（第１０図）。
　ウエスタンブロツトおよび１２５Ｉ−Ｘａ染色　
　精製された物質はＸａ因子に結合する。スーパーロース１２クロマトグラフイーからのＴＦＩプールをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、電気泳動によってニトロセルロースに移動させた。ついで、このートロセルロースを１２５Ｉ−Ｘａとインキユベーシヨンすると、精製蛋白質はＸａ因子に結合することが明らかにされた。
　上述の例２における実験室的製造実験による精製ＴＦＩの単離結果を、さらに以下の第８図〜第１１図についてさらに詳細に説明、例示する。
　第８図：この図は、ウシＸａ因子アフイーゲルアフイニテイークロマトグラフイーを示す。分画１〜６０の容量は４ｍｌ、分画６０〜７０の容量は
０００倍希釈サンプルのＴＦＩ活性は○−−○で示す。
　第９図：この図はスーパーロース１２ゲル濾過を示す。ＴＦＩ活性を含有する分画２７〜３１を集め、−４℃に保存した。吸収（Ａ２８０）は実線―で、１０００倍希釈サンプルのＴＦＩ活性は○−−○で示す。
　第１０図は、還元した精製ＴＦＩのＳＤＳ　ＰＡＧＥを示す。精製ＴＦＩ（２μｇ）を１０％２−メルカプトエタノールで還元したのちＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥに付し、銀染色した。分子量マーカーは左側のレーンにキロダルトンで示す。右側のレーンには、見掛けの分子量３９，０００ダルトンの還元ＴＦＩの拡散したバンドが認められる。
　第１１図は、還元されていない精製ＴＦＩのＳＤＳ　ＰＡＧＥであり、上方のブロツトがＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥに付し、銀染色した精製ＴＦＩ（２μｇ）である。下方の１２５Ｉ−Ｘａブロツトは、非還元ＴＦＩ（１μｇ）を電気泳動によつてニトロセルロースに移し、１２５Ｉ−Ｘａで染色し、オートラジオグラフイーに付した結果である。上方のパネルは１μｇのＴＦＩをＳＤＳ　ＰＡＧＥに付し、ついで抽出したゲル切片におけるＴＦＩ活性を示している。
　
例３
　数種の細胞源、すなわちチヤン肝細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞およびＨｅｐＧ２細胞からのＴＦＩの単離を、上述の成熟ＴＦＩのアミノ酸配列３〜２５を有する合成ペプチドを免疫原として用いた免疫アフイニテイークロマトグラフイーによつて行つた。操作は次のとおりである。
　
免疫感作
　成熟ＴＦＩのアミノ酸配列３〜２５に相当する配列を含むＴＦＩ−ペプチドを、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの固相ペプチド合成装置を用いて合成した。ＴＦＩ−ペプチド（５ｍｇ）を、キーホールリンペツトのヘモシアニン（１０ｍｇ）にグルタルアルデヒドによって抱合させた。ニユージーランド白色ウサギ２羽にそれぞれ、フロインドの完全アジユバント１ｍｌおよび抱合体１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド２００μｇ）を含有するホモジネートを皮内注射して、免疫感作した。１カ月後、各ウサギに、フロインドの不完全アジユバント１ｍｌおよび抱合体１ｍｌ（ＴＦＩ−ペプチド１００μｇ）を含有するホモジネートをブースター投与した。以後各週に抗血清を採取した。ブースター投与は１月ごとに行い、３カ月後にウサギを放血させた。
　
抗−ＴＦＩ−ペプチド−Ｉｇの単離
　合成ＴＦＩ−ペプチド（３ｍｇ）を０．８ｇの
指示文書（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に従つてカツプリングさせた。特異的抗体の単離には、プールした抗血清（１５ｍｌ）を、ＰＢＳ、０．４Ｍ　ＮａＣｌ、
Ｘ−１００を含有する溶液（ＰＮＢＴ）の等容量と混合し、ＴＦＩ−ペプチドセフアロース４Ｂカラム上、室温でクロマトグラフイーに付した。カラムをＰＮＢＴ溶液３０ｍｌで洗浄し、ついでトリトンＸ−１００を含まない同じ溶液で洗浄した。結合した抗体は０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２で溶出し、直ちに１Ｍトリス−ＯＨ１／１０容量を加えて中和し、大量の食塩溶液に対して透析した。抗血清１５ｍｌから約６．５ｍｇの抗−ＴＦＩ−ペブチドＩｇが単離された。
　
細胞培養
　チヤン肝細胞、ＳＫヘパトーマ細胞およびＨｅｐＧ２細胞は、１７５−ｃｍ２のフラスコ中、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン５０単位／ｍｌおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを補充したダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、集密状態に生育させた。各細胞５フラスコ分をトリプシン処理して、１個の１０室細胞フアクトリー（Ｎｕｎｃ）の接種に使用した。集密的に生育したのち（約１週間）、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、血清を含まないメジウム中でインキユベーシヨンした。血清を含まないメジウムは、０．５％ラクトアルブミン加水分解物、アプロチニン５０単位／ｍｌ、ＩＴＳプレミツクス（インスリン−トランスフエリン−セレン、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈの製品）、肝細胞成長因子（グリシル−ヒスチジル−リジン）２０ｎｇ／ｍｌおよびフオルボール　１２−ミリステート　１３−アセテートを補充したＤＭＥＭである。血清を含まないメジウムは３日毎に新しいメジウムと交換した。細胞はこの状態で２カ月以上維持できる。収集した調整メジウムを０．０２％ＮａＮ３および０．０１％トリトンＸ−１００として、４℃で保存した。メジウムの一部はアミコンのＹＭ３０螺旋膜システムを用いた限外濾過によつて２０〜１００倍に濃縮した。
　
ＴＦＩの免疫アフイニテイーによる精製
　単離した抗−ＴＦＩ−ペプチド−Ｉｇ（２０ｍｇ）をＣＮＢｒ活性化セフアロース４Ｂ　２ｇに製造業者の指示操作に従つてカツプリングした。ゲル床の容量は７ｍｌとした。ＴＦＩの単離には、チヤン肝細胞、ＳＫヘパトーマ細胞またはＨｅｐＧ２細胞からの調整メジウム（非濃縮または濃縮）を、冷室内において抗−ＴＦＩ−ペプチド−Ｉｇセフアロース４Ｂカラム上、２ｍｌ／分の速度で、有意なＴＦＩ活性が流出してくるまでクロマトグラフイーを行つた。ついでカラムをＰＮＢＴ　７０ｍｌおよびトリトンＸ−１００を含まない同溶液７０ｍｌで洗浄した。結合したＴＦＩを０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２で溶出し、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２に対して真空透析して約０．６ｍｌに濃縮した。
　
結果
　抗−ＴＦＩ−ペプチド−Ｉｇセフアロース４Ｂカラム上での免疫アフイニテイークロマトグラフイーにより、多数の肝誘導細胞系、チヤン肝細胞、ＳＫヘパトーマ細胞およびＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞からＴＦＩが単離された。第１２Ａ図には、抗−ＴＦＩ−ペプチド−Ｉｇセフアロースカラムから溶出した蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。プレパレーシヨンが異なると蛋白質像がやや異なることがある。あるプレパレーシヨンでは、４０ｋＤａの蛋白質が唯一の主蛋白質であり（レーン４および５）、またある場合には多数の蛋白質バンドが共存し、４０ｋＤａ蛋白質に代わつて３８ｋＤａ蛋白質のバンドが著名になる。いずれの蛋白質がＴＦＩに関係があるのかを確立するために、１２５Ｉ−Ｘａ結合研究を実施した。単離されたＴＦＩサンプルを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動に付し、ついで蛋白質を電気泳動的にニ卜ロセルロース濾紙上に移動させ、１２５Ｉ−Ｘａ結合活性をスクリーニングした。その結果、見掛けの分子量４０、３８および２５ｋＤａの３つの主要バンドが１２５Ｉ−Ｘａ結合活性を示し、他のバンドは活性を示さないことが明らかにされた（第１２図（Ｂ））。ＳＫヘパトーマ細胞からの３８ｋＤａバンドの配列解析を行ったところ、上記例１においてＨｅｐＧ２細胞から単離された４０ｋＤａ　ＴＦＩと同じアミノ末端配列をもつことが明らかになつた。免疫アフイニテイー、アミノ酸配列解析および１２５Ｉ−Ｘａ結合実験から、４０、３８および２５ｋＤａのインヒビターは同一分子から誘導されているものと考えられる。
　上述の実験室的製造実験における、数種の細胞源からの免疫アフイニテイークロマトグラフイーによるＴＦＩの単離の結果を、以下の第１２図（Ａ）および（Ｂ）の詳細な記述により、さらに説明する。
　第１２図：この図は、免疫アフイニテイーによつて単離されたＴＦＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその１２５Ｉ−Ｘａ結合のスクリーニングを示す図である。（Ａ）　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：電気泳動は１２％ポリアクリルアミドゲル上で行われた。レーン１は分子量マーカー；レーン２はチヤン肝細胞ＴＦＩ；レーン３はＳＫヘパトーマＴＦＩ（プレパレーシヨン１）；レーン４はＳＫヘパトーマＴＦＩ（プレパレーシヨン２）；レーン５はＨｅｐＧ２　ＴＦＩ（プレパレーシヨン１）；レーン６はＨｅＰＧ２　ＴＦＩ（ブレパレーシヨン２）である。（Ｂ）　１２５Ｉ−Ｘａ結合活性のスクリーニング：サンプルは１２％ポリアクリルアミドゲル上電気泳動に付した。蛋白質は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ
ルロース濾紙上に電気泳動により移動させた。移動後、ニ卜ロセルロース濾紙をまずＰＢＢ溶液（５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡおよび２．５ｍｇ／ｍｌ　ウシγ−グロブリン含有のＰＢＳ）中、ついで４００ｎｇ／ｍｌの１２５Ｉ−Ｘａを含むＰＢＢ溶液中、室温において各１時間、穏やかに振盪した。次に、ニ卜ロセルロース濾紙を乾燥し、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フイルムを用い３日間オートラジオグラフイーを行つた。レーン１、チャン肝細胞ＴＦＩ；レーン２、ＳＫヘパトーマＴＦＩ（プレパレーシヨン１）；レーン３、ＳＫヘパトーマＴＦＩ（プレパレーシヨン２）；およびレーン４、ＨｅｐＧ２ＴＦＩ（プレパレーシヨン）２である。
　本明細書の開示から、本技術分野の熟練者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様様な他の実施例が自明であろう。このような例はすべて、本発明の範囲に包含されるものであることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
　第１図は、ＨｅｐＧ２細胞から単離された濃縮ＴＦＩプレパレーシヨンを本発明の一態様により、ｉＰｒ２Ｐ−ヒトＸａ因子−アフイゲルアフイニテイークロマトグラフイーに付した場合の溶出像を示す。
　第２図は、第１図のＴＦＩ活性分画からの濃縮サンプルをセフアデツクスＧ−２５ゲル濾過に付した場合の溶出像である。
　第３図は、第２図のＴＦＩ活性分画の濃縮サンプルをモノＱイオン交換クロマトグラフイーに付した場合の溶出像である。
　第４図は、第３図からの精製ＴＦＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
　第５図は、第３図からの精製ＴＦＩと正常ヒト血清とのＴＦＩアツセイによる比較を示すグラフである。
　第６図は、第３図からの精製ＴＦＩのＸａ因子に対する阻害作用と、それがトロンビンに対して作用しないことを示すグラフである。
　第７図は、第３図からの精製ＴＦＩがＶＩＩａ因子、Ｘａ因子およびＣａ２＋の存在下において急速にＴＦ活性を阻害することを示すグラフである。
　第８図は、ＨｅｐＧ２細胞から単離された濃縮ＴＦＩプレパレーシヨンを、本発明の別の態様により、ウシＸａ因子アフイゲルアフイニテイークロマトグラフイーに付した場合の溶出像を示す。
　第９図は、第８図からのＴＦＩ活性分画の濃縮サンプルをスーパーロース１２ゲル濾過に付した場合の溶出像を示す。
　第１０図は、第９図からの還元、精製ＴＦＩサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
　第１１図は、第９図からの非還元、精製ＴＦＩサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
　第１２図は、種々の細胞から単離されたＴＦＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、（Ａ）は、本発明のさらに別の態様により、免疫アフイニテイークロマトグラフイーを用いて種々の細胞から単離されたＴＦＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。（Ｂ）は（Ａ）で分離された蛋白質のニ卜ロセルロース濾紙上ウエスタンプロツトおよびオートラジオグラフイーである。