(57)【要約】癌幹細胞の新しい概念は、形質転換細胞における「幹性」遺伝的経路（例えば、正常幹細胞の自己複製経路）の活性化が、癌幹細胞の生存ライフサイクルおよび悪性腫瘍の腫瘍進行および転移に寄与し得ることを示唆する。従って、癌細胞における「幹性」遺伝子の活性化は、攻撃的な臨床的挙動に関連し得、そして治療失敗の可能性を増大させ得る。遺伝子発現解析に基づく被験体の疾患状態についての臨床結果の予測に関連する全般的な方法およびキットが記載されている。本発明は、ＧＢＸ２、ＭＫＩ６７、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２、ＵＳＰ２２、ＨＣＦＣ１、ＲＮＦ２、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１ならびにそれらのマウスホモログからなる群から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現を測定することを含む。
2008536488.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＢＸ２、ＭＫＩ６７、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２、ＵＳＰ２２、ＨＣＦＣ１、ＲＮＦ２、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１ならびにそれらのマウスホモログからなる群から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現を判定するためのキットであって、該少なくとも３つの遺伝子の発現を特異的に検出し、かつ他の遺伝子の発現を特異的に検出しないプローブセットを備え、該プローブセットは、核酸または抗体を含む、キット。
【請求項２】
前記プローブセットが、前記少なくとも３つの遺伝子から転写されたＲＮＡ種または該ＲＮＡ種に由来するｃＤＮＡ種に通常のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記プローブセットが、ＰＣＲプライマーである、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記ＰＣＲプライマーが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１３、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択される少なくとも３対のプライマーである、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記キットが、固相を備える、請求項２に記載のキット。
【請求項６】
前記プローブセットが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３３６８８＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット４１８＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３４７３６＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット４１０８１＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット４００４１＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３９８６６＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３７９１０＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３３４８４＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３６９６７＿ｇ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット１１４３＿ｓ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３７２０３＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２１０５６０＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２１２０２２＿ｓ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２１４７１０＿ｓ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２１６２７７＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２０４１６２＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２１６９６４＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２０２４７３＿ｘ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２０５２１５＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２０９４４２＿ｘ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２０８２２８＿ｓ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２０９６１６＿ｓ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９４２００＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９９４５７＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット１６０１５９＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット１０４０９７＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９３４４１＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９７９６０＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット１００９０１＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９３１６４＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９８４７７＿ｓ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９３０９０＿ａｔおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット１０１５３８＿ｉ＿ａｔからなる群から選択される少なくとも３つのプローブセットからなる、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記少なくとも３つの遺伝子が、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２またはそれらのマウスホモログである、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
前記キットが、ＭＫＩ６７、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログの発現を判定するためのキットであり、そして前記プローブセットが、ＭＫＩ６７、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログの発現を特異的に検出する、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
前記キットが、ＧＢＸ２、ＭＫＩ６７、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２、ＵＳＰ２２、ＨＣＦＣ１、ＲＮＦ２、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログの発現を判定するためのキットであり、そして前記プローブセットが、ＧＢＸ２、ＭＫＩ６７、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２、ＵＳＰ２２、ＨＣＦＣ１、ＲＮＦ２、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログの発現を特異的に検出する、請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
被験体における疾患状態についての臨床結果を予測するための方法であって、
該被験体からサンプルを得る工程；
該サンプルから、ＧＢＸ２、ＭＫＩ６７、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２、ＵＳＰ２２、ＨＣＦＣ１、ＲＮＦ２、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログからなる群から選択される少なくとも３つの遺伝子についての遺伝子発現測定値のセットを測定する工程；および
該遺伝子発現測定値のセットと、該遺伝子のセットについての幹細胞および腫瘍細胞からの発現値を比較することによって得られた遺伝子発現測定値の対照基準セットとの間の相関係数を決定する工程であって、ここで、該相関係数のサインは、該疾患状態についての該臨床結果を予測する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
前記幹細胞が、末梢神経系ニューロスフェアである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍細胞が、転移性の前立腺腫瘍細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患状態が、癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、中皮腫、髄芽腫、神経膠腫および急性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも３つの遺伝子が、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２またはそれらのマウスホモログである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子発現測定値のセットが、ＭＫＩ６７、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログの発現測定値である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子発現測定値のセットが、ＧＢＸ２、ＭＫＩ６７、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２、ＵＳＰ２２、ＨＣＦＣ１、ＲＮＦ２、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログの発現測定値である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記臨床結果が、再発、治療失敗、転移の可能性、遠隔転移の可能性、無病生存率、侵襲性および所定期間における生存の可能性からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が、前立腺癌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前立腺全摘除術前グリーソンスコア、切除断端評価、精嚢浸潤、年齢および被膜外進展からなる群から選択される、臨床病理学的特徴を解析する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年３月１６日に出願された、米国仮特許出願第６０／６６３，０１４号に対する利益を主張する。米国仮特許出願第６０／６６３，０１４号は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府の支援による研究または開発に関する陳述）
米国合衆国政府は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって与えられたグラント番号５ＲＯ１  ＣＡ８９８２７に従って、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、分子署名（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）に関する遺伝子発現パターンを検出することによって患者の臨床結果を予測することに関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒトの癌の進行の遺伝的な根拠に関する研究によって、この疾患の有効な処置法の探索が大きく前進してきた。遺伝的解析は、癌の有効な処置法を提供することだけでなく、この疾患の進行に関する他の重要な情報を提供することができる。この疾患の初期の癌患者は、例えば、代表的には、その患者の癌が示し得る攻撃性について、その癌がどのように進行し得るか、転移する可能性があるか否か、治療後に再発可能性があるか否か（およびどれくらい速く再発し得るか）などをより簡単に知るということから多大な恩恵を受ける。手にしたこの種の知識をもとに、医師は、特に攻撃的な悪性挙動を示し得る癌に罹患している患者に対してより積極的な治療を適用することによって応えることができるであろう。処置は、その患者の特定の疾患状態に対する予後に基づいて、患者に対して適切に調整することができるだろう。
【０００５】
最近の研究では、より攻撃性の高い癌が、より攻撃性の低いタイプと区別するいくつかの認識可能かつ測定可能な特徴を有し得ることが示唆されている。いくつかのタイプの癌は、腫瘍内に幹細胞との重要な生物学的類似点を有する少数の細胞を含むことが研究によって示唆されている。その細胞とは、分化していない前駆細胞であり、急速に分裂し、分化して、特定の特殊化した細胞を生じる（Ａｌ−Ｈａｊｊ，Ｍ．，Ｗｉｃｈａ，Ｍ．Ｓ．，ら、Ｍ．Ｆ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００３，１００：３９８３−３９８８；Ｐａｒｄａｌ，Ｒ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｍ．Ｆ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ａｐｐｌｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３，３：８９５−９０２；Ｓｍａｌｌｅｙ，Ｍ．ａｎｄ  Ａｓｈｗｏｒｔｈ，Ａ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｆｉｅｌｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｉｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３，３：８３２−８４４（各々は、本明細書中で参考として援用される））。多能性の幹細胞様表現型について、自己複製能は、幹細胞と他の細胞タイプとを区別する決定的な必須の特性である（Ｄｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．Ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｗｒｉｔ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２３：２３１−２３３、本明細書中で参考として援用される）。同様に、癌幹細胞において、この自己複製能は、特により攻撃的な癌において、腫瘍の発生に重要な役割を果たし得る。腫瘍内の癌幹細胞のこの小集団は、さらなる癌細胞の増殖のもととなる複製を可能にさせ得る。腫瘍を含む細胞の不均一な混合物の中に癌細胞の集団に類似する珍しい幹細胞が存在することは、持続性の腫瘍増殖に必須であるようであり、そして腫瘍進行の間の転移性の癌細胞の出現に寄与し得る（Ｐａｒｄａｌ，Ｒ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｍ．Ｆ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ａｐｐｌｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３，３：８９５−９０２；Ａｌ−Ｈａｊｊ，Ｍ．，ら、Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００３，１００：３９８３−３９８８；Ｓｍａｌｌｅｙ，Ｍ．ａｎｄ  Ａｓｈｗｏｒｔｈ，Ａ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｆｉｅｌｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｉｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３，３：８３２−８４４、本明細書中で参考として援用される）。
【０００６】
癌幹細胞のこの概念は、通常の遺伝的経路が、腫瘍性の幹細胞ならびに正常な幹細胞において、重大な幹細胞様機能を規定し得ることをさらに意味する（Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓａｕｖａｇｅａｕ，Ｇ．ＢＭＩ−１  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２３：２５５−２６０；Ｐａｒｄａｌ，Ｒ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｍ．Ｆ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＳＪ．Ａｐｐｌｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３，３：８９５−９０２、本明細書中で参考として援用される）。例えば、直腸結腸癌において、β−カテニン／ＴＣＦ−４経路の恒常的な活性化によって、直腸結腸癌細胞上に陰窩前駆体表現型を示すようになる。このことから、正常な幹細胞および癌細胞の解析によって、悪性の細胞に関与している通常の幹細胞様経路が明らかになり得ることが示唆される（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．，Ｓａｎｃｈｏ，Ｅ．，Ｖｅｒｗｅｉｊ，Ｃ，ら、Ｔｈｅ  β−ｃａｔｅｎｉｎ／ＴＣＦ−４  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｍｐｏｓｅｓ  ａ  ｃｒｙｐｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  ２００２，１１１：２４１−２５０、本明細書中で参考として援用される）。
【０００７】
具体的には、幹細胞の増殖能に関連する遺伝子は、癌研究において特に注目されている可能性がある。１つの例として、ポリコーム群（ＰｃＧ）遺伝子のＢＭＩ−１が、正常な幹細胞および白血病性の幹細胞の増殖能を決定し、そして造血性幹細胞および神経性幹細胞の自己複製に必要であることが最近の研究で示唆されている（Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓａｕｖａｇｅａｕ，Ｇ．ＢＭＩ−１  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２３：２５５−２６０；Ｐａｒｋ，Ｌ−Ｉ．，ら、ＢＭＩ−１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２３：３０２−３０５；Ｍｏｌｏｆｓｋｙ，Ａ．Ｖ．，ら、ＢＭＩ−１  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２５：９６２−９６７、各々が本明細書中で参考として援用される）。ＢＭＩ−１癌遺伝子は、すべての原発性骨髄性白血病およびこれまでの種々の研究において解析されてきた白血病性細胞株において発現しており、ＢＭＩ−１の過剰発現によって、リンパ球の腫瘍性の形質転換が引き起こされる（Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓａｕｖａｇｅａｕ，Ｇ．ＢＭＩ−１  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２３：２５５−２６０；Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．，ら、Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ｇｒｏｕｐ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １９９８，９１：１２１６−１２２４；Ｈａｕｐｔ，Ｙ．，ら、Ｊ．Ｍ．ＢＭＩ−１  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｙｃ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９３，８：３１６１−３１６４；Ａｌｋｅｍａ，Ｍ．Ｊ．，ら、Ａ．Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｌｙｍｐｈｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅμ−ＢＭＩ−１  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ｔｈｅ  ＢＭＩ−１  ＲＩＮＧ  ｆｉｎｇｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９７，１５：８９９−９１０、各々が本明細書中で参考として援用される）。最近、ＢＭＩ−１発現が、ヒト非小細胞肺癌および乳癌細胞株において報告されたことから、上皮の悪性腫瘍におけるＢＭＩ−１活性化の腫瘍形成の役割が示唆される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３、各々が本明細書中で参考として援用される）。
【０００８】
腫瘍性の幹細胞および正常な幹細胞と、癌細胞における重大な幹細胞様機能を規定する通常の遺伝的経路との間にこれらの強力な結びつきが存在するために、さらなる解析の有用な機会が提供される。オリゴヌクレオチドマイクロアレイ技術またはｃＤＮＡマイクロアレイ技術を使用した腫瘍サンプルの発現プロファイリングは、様々な癌に関連する複数の遺伝子発現署名（ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を明らかにする強力なツールである。例えば、正常な幹細胞と癌細胞との比較による遺伝子発現プロファイリング解析は、悪性の細胞に関与する「幹性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）」経路の遺伝子発現署名を明らかにし得る。特定の癌に関連すると同定され、また、幹細胞様特性との関連を有すると同定されたこれらの遺伝子署名（ｇｅｎｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）は、特定の患者に対する臨床結果を予後的に予測するために使用され得る。癌患者に対する臨床結果におそらく関与する情報を提供する際に、その癌が初期の癌であっても非常に有効である小さな署名（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の同定を通じて、診断および予後を提供するための発現プロファイリングを使用した様々な技術の正確度が高まるだろう。これらの遺伝子署名は、癌患者における遠隔転移、短い間隔での疾患再発、治療後の死などを予測する強力な判断材料として作用し得るので、癌が進行する機会を有する前の不可欠な情報を癌患者に提供する。
【０００９】
従って、腫瘍および正常細胞サンプルなどの生物学的サンプルにおいて差次的に発現しているか、または制御されている遺伝子に関連する遺伝子署名を使用することによる、癌などの疾患状態の臨床結果を予測する改善された方法が当該分野で必要とされている。本発明は、当該分野のこれらの不十分な点および他の不十分な点を扱っている。
【非特許文献１】Ｖｏｎｌａｎｔｈｅｎ，Ｓ．ら、「Ｔｈｅ  ＢＭＩ−１  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ＩＮＫ４Ａ−ＡＲＦ  ｌｏｃｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００１，８４：１３７２−１３７６
【非特許文献２】Ｄｉｍｒｉ，Ｇ．Ｐ．ら、「Ｔｈｅ  ＢＭＩ−１  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２，６２：４７３６−４７４５
【非特許文献３】ＬａＴｕｌｉｐｐｅ，Ｅ．ら、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２，６２：４４９９−４５０６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
被験体における疾患状態についての臨床結果を予測するためのキットおよび方法が本明細書中で開示される。従って、本発明の１つの態様は、複数の遺伝子の発現レベルを決定するための核酸プローブセットおよび使用のための指示書を備える、被験体における疾患状態についての臨床結果を予測するためのキットである。複数の遺伝子は、表２（以下に記載）において同定される遺伝子セットの遺伝子からなる群から選択される。核酸プローブセットは、複数の遺伝子由来のＲＮＡ種またはｃＤＮＡ種にハイブリダイズすることができ、そのプローブは、発現レベルの定量化および前記定量化に基づいた臨床結果の予測を可能にする。
【００１１】
別の態様は、被験体における疾患状態についての臨床結果を予測するための方法であり、その方法は、前記被験体における複数の遺伝子の発現レベルを検出する工程を含む。複数の遺伝子は、表２において同定される遺伝子セットの遺伝子からなる群から選択される。複数の遺伝子由来のＲＮＡ種またはｃＤＮＡ種にハイブリダイズすることができる核酸プローブセットは、発現レベルの定量化および前記定量化に基づいた臨床結果の予測を可能にする。
【００１２】
キットおよび方法のいくつかの実施形態において、その複数の遺伝子は、表２において同定される遺伝子セットの遺伝子のすべてを含む。１つの実施形態において、その複数の遺伝子は、遺伝子ＭＫＩ６７およびＣＣＮＢ１を含む。疾患状態が前立腺癌である実施形態において、その複数の遺伝子は、ＭＫＩ６７、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１からなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子を含む。疾患状態が乳癌である実施形態において、その複数の遺伝子は、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１およびＫＮＴＣ２からなる群から選択される。なおも他の実施形態において、その複数の遺伝子は、表２において同定される遺伝子の５つまたは６つを含む。いくつかの実施形態において、本発明は、ＲＰ前グリーソンスコア（Ｇｌｅａｓｏｎ  ｓｕｍ）、切除断端、精嚢浸潤、年齢および被膜外進展からなる群から選択される臨床病理学的特徴を解析する工程をさらに含む。
【００１３】
本発明のなお別の態様において、被験体における疾患状態についての臨床結果を予測するためのキットが開示され、このキットは、複数の遺伝子の発現レベルを測定するための核酸プローブセットおよび使用のための指示書を備える。複数の遺伝子は、表９ａにおいて同定される遺伝子セットＡ、表９ｂにおいて同定される遺伝子セットＢ、表９ｃにおいて同定される遺伝子セットＣおよび表９ｄにおいて同定される遺伝子セットＤ（表は以下に記載）からの遺伝子からなる群から選択される。核酸プローブセットは、複数の遺伝子由来のＲＮＡ種またはｃＤＮＡ種にハイブリダイズすることができ、そのプローブは、発現レベルの定量化および前記定量化に基づいた臨床結果の予測を可能にする。特定の実施形態において、プローブは、同定された遺伝子セットからのすべての遺伝子を対象としている。他の実施形態において、プローブは、同定された遺伝子セットからの遺伝子のサブセットを対象としている。
【００１４】
別の態様は、被験体における疾患状態についての臨床結果を予測するための方法であり、この方法は、前記被験体における複数の遺伝子の発現レベルを検出する工程を含む。複数の遺伝子は、表９ａにおいて同定される遺伝子セットＡ、表９ｂにおいて同定される遺伝子セットＢ、表９ｃにおいて同定される遺伝子セットＣおよび表９ｄにおいて同定される遺伝子セットＤからの遺伝子からなる群から選択される。複数の遺伝子由来のＲＮＡ種またはｃＤＮＡ種にハイブリダイズすることができる核酸プローブセットは、発現レベルの定量化および前記定量化に基づいた臨床結果の予測を可能にする。特定の実施形態において、プローブは、同定された遺伝子セットからのすべての遺伝子を対象としている。他の実施形態において、プローブは、同定された遺伝子セットからの遺伝子のサブセットを対象としている。
【００１５】
それらの方法のいくつかの実施形態において、遺伝子は、前記被験体から回収した腫瘍細胞から抽出される。その腫瘍細胞は、前立腺、乳房、結腸、肺、膀胱および卵巣からなる群から選択される器官から回収され得る。
【００１６】
いくつかの実施形態において、それらの方法は、被験体が治療後のある期間に亘って無病状態のままである確率を決定するカプランマイヤー生存解析を行う工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、それらの方法は、被験体から採取された腫瘍サンプルについての発現プロファイルと幹細胞関連発現プロファイルとを比較することによってピアソン相関係数を計算する工程をさらに含む。
【００１７】
上記の実施形態のいずれか１つにおいて、核酸プローブは、固体支持体に付着され得るか、またはそのプローブは、遺伝子のサブセットの核酸増幅のためのプライマーを含み得る。そのプライマーは、表５および表６（以下に記載）において同定されるプライマーからなる群から選択され得る。さらに、上記の実施形態のいずれかにおいて、疾患状態は、好ましくは、前立腺癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、中皮腫、髄芽腫、神経膠腫または急性骨髄性白血病である。さらに、その予後は、治療後の疾患状態の再発、治療後の疾患状態が再発しないこと、治療失敗、疾患再発までの期間が短いこと（例えば、２年未満または１年未満または６ヶ月未満）、転移までの期間が短いこと（例えば、２年未満または１年未満または６ヶ月未満）、侵襲性、非侵襲性、転移の可能性、遠隔転移の可能性、治療後の生存率が悪いこと、治療後の死および無病生存率からなる群から選択され得る。
【００１８】
本発明の別の態様は、ＧＢＸ２、ＭＫＩ６７、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２、ＵＳＰ２２、ＨＣＦＣ１、ＲＮＦ２、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１ならびにそれらのマウスホモログからなる群から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現を測定するためのキットである。このキットは、少なくとも３つの遺伝子の発現を特異的に検出し、かつ他の遺伝子の発現を特異的に検出しないプローブセットを備える。このプローブセットは、核酸または抗体である（用語「抗体」は、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖなどを含み得る）。
【００１９】
いくつかの実施形態において、プローブセットは、通常のストリンジェントな条件（例えば、Ｋｏｒｋｏｌａ，ら、Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２００３，３５：８２８−８３５および２００１年１１月１４日出願の米国特許第７，００５，５００号（これらは参考として援用される）に記載されているように、本発明の化合物がその標的配列にハイブリダイズし得るが、最小数の他の配列にハイブリダイズし得る条件）下で少なくとも３つの遺伝子から転写されたＲＮＡ種またはそのＲＮＡ種由来のｃＤＮＡ種にハイブリダイズすることができる核酸である。いくつかの実施形態において、プローブセットは、ＰＣＲプライマーである。さらに、ＰＣＲプライマーは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１３、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるプライマーの少なくとも３対であり得る。
【００２０】
いくつかの実施形態において、キットは、固相を備える。さらに、いくつかの実施形態において、プローブセットは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３３６８８＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット４１８＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３４７３６＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット４１０８１＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット４００４１＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３９８６６＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３７９１０＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３３４８４＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３６９６７＿ｇ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット１１４３＿ｓ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２プローブセット３７２０３＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２１０５６０＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２１２０２２＿ｓ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２１４７１０＿ｓ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２１６２７７＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２０４１６２＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２１６９６４＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２０２４７３＿ｘ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２０５２１５＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２０９４４２＿ｘ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２０８２２８＿ｓ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプローブセット２０９６１６＿ｓ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９４２００＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９９４５７＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット１６０１５９＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット１０４０９７＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９３４４１＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９７９６０＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット１００９０１＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９３１６４＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９８４７７＿ｓ＿ａｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット９３０９０＿ａｔおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＧ−Ｕ７４Ａプローブセット１０１５３８＿ｉ＿ａｔからなる群から選択される少なくとも３つのプローブセットからなる。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも３つの遺伝子は、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２またはそれらのマウスホモログである。他の実施形態においては、キットは、ＭＫＩ６７、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログの発現を測定するためのキットであり、そしてプローブセットは、ＭＫＩ６７、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログの発現を特異的に検出する。なおも他の実施形態において、キットは、ＧＢＸ２、ＭＫＩ６７、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２、ＵＳＰ２２、ＨＣＦＣ１、ＲＮＦ２、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログの発現を測定するためのキットであり、そしてプローブセットは、ＧＢＸ２、ＭＫＩ６７、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２、ＵＳＰ２２、ＨＣＦＣ１、ＲＮＦ２、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログの発現を特異的に検出する。
【００２２】
本発明の別の態様は、被験体における疾患状態についての臨床結果を予測するための方法である。その方法は、前記被験体からサンプルを得る工程ならびにＧＢＸ２、ＭＫＩ６７、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２、ＵＳＰ２２、ＨＣＦＣ１、ＲＮＦ２、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログからなる群から選択される少なくとも３つの遺伝子について遺伝子発現測定値のセットをそのサンプルから測定する工程を含む。その方法は、遺伝子発現測定値セットと、遺伝子セットについて幹細胞および腫瘍細胞からの発現値を比較することによって得られる遺伝子発現測定値の対照基準セットとの間の相関係数を決定する工程をさらに含む。相関係数のサインは、疾患状態についての臨床結果を予測している。
【００２３】
いくつかの実施形態において、幹細胞は、末梢神経系ニューロスフェアである。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、転移性の前立腺腫瘍細胞である。さらに、いくつかの実施形態において、疾患状態は、癌であり、そしていくつかの実施形態において、癌は、前立腺癌である。癌はまた、前立腺癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、中皮腫、髄芽腫、神経膠腫および急性骨髄性白血病からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、臨床結果は、再発、治療失敗、転移の可能性、遠隔転移の可能性、無病生存率、侵襲性および所定期間における生存の可能性からなる群から選択される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも３つの遺伝子は、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２またはそれらのマウスホモログである。他の実施形態において、遺伝子発現測定値セットは、ＭＫＩ６７、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログの発現測定値である。なお他の実施形態において、遺伝子発現測定値セットは、ＧＢＸ２、ＭＫＩ６７、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２、ＵＳＰ２２、ＨＣＦＣ１、ＲＮＦ２、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２およびＣＥＳ１またはそれらのマウスホモログの発現測定値である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、方法は、前立腺全摘除術前グリーソンスコア、切除断端評価、精嚢浸潤、年齢および被膜外進展からなる群から選択される臨床病理学的特徴を解析する工程をさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
定義
すべての用語は、以下で特に定義されない限り、当業者によって理解されるような通常の意味を有すると意図される。特許請求される質量および容積は、本発明の実施に適合し得る、述べた量での変更を包含すると意図される。このような変更は、例えば、述べた量の約±１０〜２０パーセントの範囲内であると企図される。本項に含まれる特定の定義と当業者によって理解されているような通常の意味との間に矛盾がある場合、以下に提供される定義が支配する。
【００２７】
「差次的に発現された」とは、２つのサンプルクラス間で比較されるとき、ある遺伝子の発現レベルに差があることをいう。「差次的に発現された」遺伝子の発現レベルの差は、好ましくは統計的に有意である。
【００２８】
「腫瘍」とは、固形およびびまん性の悪性新形成の任意のタイプおよびすべてのタイプのことをいうと広く解釈されるべきであり、肉腫、癌腫、白血病、リンパ腫などが挙げられるがこれらに限定されず、そして、例としては、前立腺、乳房、結腸、肺および卵巣組織内に見られる腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
「腫瘍細胞株」とは、腫瘍サンプルから得られた形質転換された細胞株のことをいう。通常、「腫瘍細胞株」は、適切な宿主に対する外植片に腫瘍を作ることができる。「腫瘍細胞株」系統は、通常、例えば、分化の喪失、接触阻止の喪失を含む、その「腫瘍細胞株」系統が得られた腫瘍に共通の特性をインビトロにおいて保持し、そしてインビトロにおいて本質的に無制限の細胞分裂を生じる。
【００３０】
「コントロール細胞株」とは、形質転換していない、正常に分化した細胞タイプの通常の初代培養物のことをいう。本発明の実施において、観察された遺伝子発現の差がコントロール細胞から腫瘍への形質転換の根底にある遺伝子発現の変化に関連する確率を改善する起源の組織に関する、「コントロール細胞株」および「腫瘍細胞株」を使用することが好ましい。
【００３１】
「同所性」とは、起源の器官または組織における細胞の留置のことをいい、細胞が本来得られた、同種または異種内における留置を包含すると意図される。
【００３２】
用語「インビボ」とは、生存生物体において起きるプロセスのことをいう。
【００３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別途明示的に規定されない限り、複数形の指示物を含むことに注意しなければならない。
【００３４】
緒言
近年、包括的な遺伝子発現プロファイリングのアプローチをうまく利用して、腫瘍形成経路の活性化、標的化された遺伝的操作または生理学的刺激に対する細胞の応答に関連した分子署名を同定し、そして実験サンプルおよび臨床サンプルにおける遺伝子発現の高度な複雑性パターン内の対応する経路の関与を確実に認識する頑強な転写同定物が構築された（Ｌａｍｂ，Ｊ．，Ｒａｍａｓｗａｍｙ，Ｓ．，ら、Ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ａｃｔｉｏｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ  ２００３，１１４：３２３−３３４；Ｃｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．，ら、Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ：Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｗｏｕｎｄｓ．ＰＬＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００４，２：１−９；Ｒａａｐｈｏｒｓｔ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｐｏｏｒｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ｇｒｏｕｐ  ＥＺＨ２  ｇｅｎｅ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ２００３，５：４８１−４８８、これらの各々が本明細書中で参考として援用される）。本発明は、マイクロアレイ遺伝子発現解析などの技術を使用して、浸潤性の腫瘍が、転移性の癌細胞ならびに確立された遠隔転移性の病変を活発に播種性転移している間、幹細胞の転写プログラムと類似の遺伝子発現プロファイルを有するか否かを判定する。この遺伝子発現プロファイリングアプローチをうまく利用して、腫瘍形成経路の活性化に関与する分子署名を同定し、そしてそれは、幹細胞に似たプロファイルを遠隔転移性の病変において一貫して示した。前立腺癌のトランスジェニックマウスモデルおよびヒト癌患者からの転移および原発腫瘍の解析を行った。そして、本発明の方法を使用して、癌患者についての臨床結果を予測する際に、同定された「幹性」署名の予後診断能力を評価した。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態において、臨床結果を予測する際に使用することができる幹細胞様署名を同定するとき（腫瘍サンプルの解析に適用されるとき）、原発腫瘍および転移においてアップレギュレートされたか、またはダウンレギュレートされた遺伝子を示す遺伝子発現データを、ある幹細胞において（例えば、神経性幹細胞、造血性（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｉｔｉｃ）幹細胞、胚性幹細胞などにおいて）、アップレギュレートされたか、またはダウンレギュレートされた遺伝子を示すデータと比較する。差次的に制御された転写物のセットは、遠隔転移性の病変および原発腫瘍対幹細胞サンプルについて同定され得る。遺伝子が腫瘍とコントロール細胞株との間または腫瘍と正常な臨床サンプルとの間において差次的に発現されることを必要とするスクリーニング基準を満たす、１つ以上の遺伝子を選択する。そして分子署名は、転移性の腫瘍と幹細胞サンプルとの間で一致した発現変化を示す転写物のこれらのセットから同定され得る。これらの署名の結果予測能力を同定および確証するために使用され得る方法のより詳細な説明は、Ｇｌｉｎｓｋｙ，Ｇｅｎｎａｄｉ  Ｖ．ら、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｄｅａｔｈ−ｆｒｏｍ−ｃａｎｃｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００５，１：１１５（６）：１５０３−１５２１（参考として援用）ならびに２００４年６月３日に出願された係属中の米国特許出願公開第１０／８６１，００３号および２００３年９月１０日に出願された係属中の米国特許出願公開第１０／６６０，４３４号（これらの各々は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される）に提供されている。
【００３６】
分子署名を使用して、患者についての疾患状態（癌など）の臨床結果を予測することができる。本明細書中に含まれる記載のほとんどが、主に癌に関連する臨床結果の予測に注目しているが、本発明は、他の疾患状態（例えば、アテローム性動脈硬化症、関節炎など）に関連する臨床結果を予測するために使用することもできる。
【００３７】
広範かつ通常の意味において、本発明の方法は、腫瘍サンプルの解析に適用するとき、患者における複数の遺伝子の発現レベルを特異的に検出する工程を含む。ここで、それらの遺伝子は、上記の手順を使用して同定される１つ以上の遺伝子署名に対応する。同定された特定の署名の例としては、以降の項で記載する表２、９ａ、９ｂ、９ｃおよび９ｄに示されるものが挙げられる。同定された分子署名は、調べられた遺伝子の数だけ異なり得る。いくつかの実施形態において、使用された分子署名としては、少なくとも５、１１、１４、１６、２３の遺伝子または臨床結果を予測する際のセットとして有効であると見出されている他の数の遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態において、各分子署名についての遺伝子セットに含まれる遺伝子の１つ以上は、患者についての臨床結果を予測するために使用される。いくつかの実施形態において、表２、９ａ、９ｂ、９ｃまたは９ｄにおいて同定された署名の少なくとも２つ以上が、患者についての臨床結果を予測するために本発明の方法またはキットにおいて使用される。
【００３８】
発現を特異的に検出することは、核酸プローブの場合、そのプローブが、意図された種と結合して識別可能なシグナルを提供する場合に、プローブが結合するように操作されているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのレベルを測定することを含むことを当業者は理解するだろう。ＰＣＲプライマーおよび／またはハイブリダイゼーションプローブを選択するための例示的な方法は、Ｉｎｎｉｓら、ｅｄｓ．，１９９０，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、１９８６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４０７；ＭｃＢｒｉｄｅら、１９８３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４：２４６−２４８、２０００年４月２８日に出願された米国特許第７，０１３２２１号（参考として援用される）に含まれている。好ましくは、プローブは、発現を検出するために必要な特異性を提供する少なくとも２０ヌクレオチド長を有するが、サンプル中に見られると考えられる他の種によっては、それよりも短くてよい。測定のために発現を特異的に検出することまたはタンパク質発現レベルを測定することは、以下により詳細に記載されるような抗体などの特異的に結合する試薬を使用することによって達成することもできる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明のキットおよび方法を使用して、種々のタイプの臨床結果を予測することができる。例えば、本発明を使用して、治療後の疾患状態の再発、治療後に疾患状態が再発しないこと、治療失敗、疾患再発までの期間が短いこと、癌において転移までの期間が短いこと、侵襲性、非侵襲性、癌における転移の可能性、癌における遠隔転移の可能性、治療後の生存率が悪いこと、治療後の死、無病生存率などを予測することができる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、分子署名を構成している複数の遺伝子から得られたＲＮＡ種またはｃＤＮＡ種にハイブリダイズすることができる核酸プローブセットによって、発現レベルの定量化およびこの定量化に基づいた臨床結果の予測が可能となる。いくつかの実施形態において、それらのプローブは、マイクロアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍによって提供されているもの）などの固体支持体に付着している。マイクロアレイを作製するための方法および本発明において使用されるマイクロアレイの例は、以下により詳細に記載する。他の実施形態において、それらのプローブは、遺伝子セットの核酸増幅用のプライマーである。本発明とともに使用されるＱ−ＲＴ−ＰＣＲ法は、以下でより詳細に記載する。一般に、分子署名の遺伝子セット内の遺伝子の発現は、現在公知であるか、または後に遺伝子発現を評価するために開発される任意の方法によって解析することができる。それらの方法としては、核酸増幅、転写、ＲＮＡスプライシングおよび翻訳の生物学的プロセスに関連する測定が挙げられるがこれらに限定されない。従って、遺伝子コピー数（例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションもしくは他のタイプの定量的ハイブリダイゼーション測定または定量的ＰＣＲなどによって）、転写物の濃度（例えば、ノーザンブロッティング、発現アレイ測定、定量的ＲＴ−ＰＣＲまたは、例えば、米国特許第６，３３５，１６７号（本明細書中で参考として援用される）に記載されているような比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＣＧＨなどによって）およびタンパク質濃度（例えば、定量的２−Ｄゲル電気泳動、質量分析、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはタンパク質濃度を測定するための他の方法によって）の直接的な測定および間接的な測定。
【００４１】
１つ以上の抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）などの様々な親和性試薬を本発明とともに使用することができ、そして本発明が、解析のためにＥＬＩＳＡなどの技術を使用することを含み得ることを当業者は認識するだろう。従って、特定の抗体（例えば、対象の分子署名によってコードされるタンパク質の遺伝子に特異的な抗体）は、上記のキットおよび方法に類似した様式で発現解析に基づく臨床結果を予測するために本発明のキットおよび方法において使用することができる。抗体および関連の親和性試薬（例えば、抗体フラグメントおよび一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの操作された配列など）の場合、これらの試薬は、それらが意図する標的、すなわち、目的の分子署名に含まれる遺伝子によってコードされるタンパク質と特異的に結合するはずである。特異的結合は、意図される標的に主に結合することか、または意図される標的に排他的に結合することを含む。その試薬が、ゲル上に現れ得る他のバンドよりも少なくとも２倍または少なくとも１０倍以上の強さであるバンドを予測される分子量において生じる場合に、特異的結合は、例えば、ウエスタンブロットを使用して容易に評価される。例えば、この実施形態のキットにおいて、このキットは、試薬および使用のための指示書を備え得る。ここで、その試薬は、抗体であり、その抗体は、表３において同定される遺伝子からなる遺伝子セットの複数の発現産物にハイブリダイズするか、またはその抗体は、表９ａにおいて同定される遺伝子セットＡ、表９ｂにおいて同定される遺伝子セットＢ、表９ｃにおいて同定される遺伝子セットＣおよび表９ｄにおいて同定される遺伝子セットＤからの遺伝子からなる群から選択される複数の発現産物にハイブリダイズする。抗体は、同定され得、ＭＳＲＳカタログの抗体（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ）などの種々の供給元から入手可能であるか、または従来の抗体作製方法を介して調製され得る様式は、当該分野で周知である。ポリクローナル抗血清を調製するための方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，１９９７，ｐｐ．１１．１２．１−１１．１２．９（参考として援用）に教示されている。モノクローナル抗体の調製については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，１９９７，ｐｐ．１１．４．１−１１．１１．５（参考として援用）に教示されている。ｓｃＦｖの調製については、例えば、米国特許第５，５１６，６３７号および同第５，８７２，２１５号（この両方を参考として援用する）に教示されている。
【００４２】
同定された署名（幹細胞および癌転移において発現プロファイルの最も有意な相関を示すものなど）は、患者における転移性前立腺腫瘍と原発性前立腺腫瘍とを識別するために使用することができるので、患者についての臨床結果を予測する際に使用することができる。いくつかの実施形態において、署名に基づいた生存予測モデルは、疾患状態（例えば、上皮癌および非上皮性癌）を示す複数の独立した治療結果のデータセットにおけるモデルの予後成績を検定することによって確認される。署名に対する予後識別カットオフ値は、ログランク検定（最低のＰ値および最大の危険率）によって判定されるように、予後が不良な群および予後が良好な群への患者の層別化における統計的有意性の最も高いレベルに基づいて選択され得る。
【００４３】
いくつかの実施形態において、署名の潜在的な診断と予後との関係性を評価するために、個別のサンプルの発現プロファイルと、幹細胞における参照発現プロファイルとを比較することによって、個別の腫瘍サンプルについて（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン４．００ソフトウェアを使用して）ピアソン相関係数を計算する。ピアソン相関係数は、表現型関連指標（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ；ＰＡＩ）と命名され得る、サンプルと対照基準との間の遺伝子クラスター内の転写物量の順番の類似の程度を判定するために使用され得る。幹細胞と類似の発現プロファイル（幹細胞様ＰＡＩまたはＳＰＡＩ）を有するサンプルは、ピアソン相関係数の正の値を有すると考えられる。カットオフ値以上のピアソン相関係数を有する臨床サンプルは、予後が不良な署名を有すると同定され得る。カットオフ値未満の係数を有する臨床サンプルは、予後が良好な署名を有すると同定された。いくつかの実施形態において、生存予測モデルの成績は、サンプル層別化アプローチ（例えば、ｔｅｒｒａｉｎクラスタリング、サポートベクターマシン分類および重み付け生存スコアアルゴリズム（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｓｃｏｒｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ））を使用して確認される。
【００４４】
いくつかの実施形態において、署名の潜在的な臨床有用性は、治療後に再発した癌患者から得られたサンプルおよび無病状態のままである他の患者に適用される署名の予後診断能力を評価することによってさらに確かめることができる。カプランマイヤー生存解析を使用して、署名によって規定される正および負のＳＰＡＩを有する群間で癌患者が治療後に無病状態のままでいる確率に非常に有意な差が存在するか否かを判定することができる。治療後の疾患再発についての推定危険率は、署名によって規定された正のＳＰＡＩ対負のＳＰＡＩを有する患者について判定され得る。
【００４５】
いくつかの実施形態において、治療結果および好ましくない予後の予測材料として個別の共変量の増加性の統計的検出力を確かめるために、１変量および多変量のコックス比例ハザード生存解析を行う。これらの解析によって、幹性署名全体および署名または遺伝子のサブセットを構成する個別の遺伝子の予後成績の比較が可能になる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、重み付け生存スコア解析は、多成分の予後モデルに基づく治療結果の予測材料として個別の共変量の増加性の統計的検出力を反映すると企図される。最終的な生存予測スコアは、署名の個別の遺伝子についてのスコアの合計を含み得、そして多変量の解析における各遺伝子の相対的な寄与を反映し得る。負の重み値（ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ  ｖａｌｕｅ）は、より高い発現が、より長い生存期間および好ましい予後と相関することを示唆する一方で、正のスコアは、より高い発現が、不良な結果およびより短い生存期間と相関することを示唆する。署名を構成する遺伝子の重み付け発現値の累積スコアに基づくこの重み付け生存予測モデルの適用を使用することにより、治療後に再発せずに生存する期間の確率が統計的に異なるサブグループに癌患者を層別化する際の、同定された署名の予後診断能力を確かめることができる。
【００４７】
同様のタイプの方法（例えば、カプランマイヤー法）を使用することにより、初期の疾患を有する患者における治療後の短い再発生存期間、転移性再発および治療後の生存率が悪いことについて、署名の予測可能性を判定することもできる。さらに、カプランマイヤー解析を使用して、治療後に遠隔転移を起こす確率およびより高い治療後の死の危険性を判定することができる。これらの解析を使用して、数多くのタイプの癌（上皮癌および非上皮性癌の両方）に関する署名の予測可能性を検討することができる。カプランマイヤー解析および他の方法に関する詳細は、Ｇｌｉｎｓｋｙ，Ｇｅｎｎａｄｉ  Ｖ．ら、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｄｅａｔｈ−ｆｒｏｍ−ｃａｎｃｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００５，１：１１５（６）：１５０３−１５２１（参考として援用）に提供されている。
【００４８】
第１の実施例における１１−遺伝子署名を関する方法およびキットならびに第２の実施例における４つの他の幹性署名を含む、本発明の方法／キットに関するより詳細な情報およびこれらの方法がどのようにして発現を検出するために適用されるかについてが以下に含まれる。
【実施例】
【００４９】
本発明を実施するための特定の実施形態の実施例が以下である。この実施例は、例示の目的だけのために提供され、決して本発明の範囲を限定すると意図されない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証する努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差は、当然のことながら許容されるべきである。
【００５０】
本発明の実施は、別途示さない限り、当該分野の技術の範囲内であるタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照のこと。
【００５１】
材料および方法
本発明に関して使用される材料および方法は、Ｇｌｉｎｓｋｙ，Ｇｅｎｎａｄｉ  Ｖ．ら、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｄｅａｔｈ−ｆｒｏｍ−ｃａｎｃｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００５，１：１１５（６）：１５０３−１５２１（参考として援用）に詳細に記載されており、それらの方法のいくつかは、２００４年６月３日に出願された係属中の米国特許出願公開第１０／８６１，００３号および２００３年９月１０日に出願された係属中の米国特許出願公開第１０／６６０，４３４号にも記載されている。これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される。具体的には、援用される参考文献には、臨床サンプルの使用および細胞培養に関する材料および方法、アノイキスアッセイ、アポトーシス細胞を同定し、定量するためのアポトーシスアッセイ、フローサイトメトリーの使用、ヒト前立腺ＰＣ−３細胞および亜系統の同所性異種移植片の発達、前立腺癌のトランスジェニックマウスモデルの作製、ｍＲＮＡおよびＲＮＡ単離のための組織の処理、ＲＮＡおよびｍＲＮＡ抽出、ｍＲＮＡ品質管理および遺伝子発現解析のためのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイの用法ならびにデータ解析について記載されている。
【００５２】
ＴＲＡＭＰマウスモデル、ＰＮＳ（末梢神経系）ニューロスフェアおよびＣＮＳ（中枢神経系）ニューロスフェアにおける差次的に制御された転写物の同定、発現の変化が一致していると示す転写物のサブセットの同定、それらのサブセットからの小さな遺伝子クラスターの選択（例えば、１１−遺伝子ＭＴＴＳ（転移性のＴＲＡＭＰ腫瘍サンプル）／ＰＮＳ署名、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＣＮＳ署名および１４−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ／ＣＮＳ署名を得るために）、さらなる検証解析のために、最良の成績を示す１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名（１１−遺伝子署名または１１−遺伝子ＢＭＩ−１経路署名とも呼ばれる）の選択をもたらす転移性の表現型の判別能力について３つの署名を検定することについての工程を含む、幹細胞におけるＢＭＩ−１経路に関連する１１−遺伝子署名の発見の詳細なプロトコールは、Ｇｌｉｎｓｋｙ，Ｇｅｎｎａｄｉ  Ｖ．ら、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｄｅａｔｈ−ｆｒｏｍ−ｃａｎｃｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＰＡＩ  Ｉｎｄｅｘ，Ｃｏｘ  ａｎａｌｙｓｉｓ，ｒａｎｄｏｍ  ｃｏ−ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｔｅｓｔ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００５，１：１１５（６）：１５０３−１５２１（参考として援用）中に詳細に記載されている。さらに、これらの方法を、以下の実施例に関して記載する。
【００５３】
１１−遺伝子署名の検証
ＳＰＡＩ指標
表現型関連指標［幹細胞に類似の表現型関連指標（ＳＰＡＩ）］としてのピアソン相関係数の定義は、ＰＮＳニューロスフェアの状態における神経性幹細胞と前立腺癌転移との間の１１−遺伝子署名の高度に一致した挙動に基づく（ｒ＝０．９８９７；Ｐ＜０．０００１）。標準的なＰＮＳニューロスフェアおよびＴＲＡＭＰ転移の値を、署名発見プロトコールにおいて記載されているように確立した。それらの値を、一貫して本研究を通じて臨床サンプルについてのピアソン相関係数の測定値に対する一定の対照基準として使用した。
【００５４】
試験サンプルと対照基準との間の遺伝子クラスター内の転写物量の順番の類似の程度を、ピアソン相関係数よって測定し、表現型関連指標（ＰＡＩ）と命名する。幹細胞に類似の発現プロファイル（幹細胞様ＰＡＩまたはＳＰＡＩ）を有するサンプルは、ピアソン相関係数の正の値を有すると考えられる。
【００５５】
ランダム共起検定（Ｒａｎｄｏｍ  ｃｏ−ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｔｅｓｔ）
本発明者らは、１０，０００回の並べ替え検定を行うことにより、大きなＭＴＴＳ署名に由来する小さい１１−遺伝子署名が０．１％レベルの有意性を評価するという高い識別能力をどの程度確実に示し得るかを調べた。本発明者らは、大きい１３４５−遺伝子ＭＴＴＳ署名に由来する小さい１１−遺伝子署名の１０，０００回の並べ替えを行い、それらのサンプル層別化能力を１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名と比較した。分類成績のカットオフｐ値を、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名に両側Ｔ検定を適用することによって確立した（転移性前立腺癌データセット対原発性前立腺癌データセットについてｐ＝０．０００５および再発性前立腺癌データセット対非再発性前立腺癌データセットについてｐ＝０．０２６）。約２００の転写物を含むランダムな一致した遺伝子セットを、４５の正常組織にわたる約１２，０００の転写物の発現プロファイリングデータを示すマウストランスクリプトームデータセットを使用して生成した（５５）。種間アレイおよび種内アレイとアレイプローブセットとの一致を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータベース（ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ）を使用して、９５％またはそれ以上の同一性レベルで行った。
【００５６】
１３４５−遺伝子ＭＴＴＳ署名から得られるランダムな１１−遺伝子署名の識別を評価するために、転移性前立腺癌データセット対原発性前立腺癌データセット（３２サンプル）および再発性前立腺癌データセット対非再発性前立腺癌データセット（２１サンプル）について両側Ｔ検定を行った。署名を、ｐ値に基づいて順位をつけ、そしてランダムな１１−遺伝子署名の各々の順位の評価基準を、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名のｐ値と比較した。本発明者らは、１０，０００回の並べ替えにより、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名のサンプル分類レベルで行う７つのランダムな１１−遺伝子署名が生成されたことを見出した。
【００５７】
重み付け生存予測スコアアルゴリズム
本発明者らは、多成分予後モデルに基づいた治療結果の予測材料として個別の共変量の増加性の統計的検出力を反映する重み付け生存スコア解析を企図した。マイクロアレイベースの遺伝子発現値またはＱ−ＲＴ−ＰＣＲから得られる遺伝子発現値を、標準化し、そして対数変換した。各データセットについて対数変換して標準化された発現値を、従属変数として全体的な生存率または無再発生存率を含む多変量のコックス比例ハザード回帰モデルにおいて解析した。
【００５８】
各患者について生存／予後予測スコアを計算するために、本発明者らは、各遺伝子について測定して、対数変換し標準化された遺伝子発現値に多変量のコックス比例ハザード回帰解析から得られた係数を掛けた。最終的な生存予測スコアは、個別の遺伝子についてのスコアの合計を含み、多変量解析における１１の遺伝子の各々の相対的寄与を反映する。負の重み値は、より高い発現が、より長い生存期間および好ましい予後と相関することを示唆する一方で、正の重み値は、より高い発現が、不良な結果およびより短い生存期間と相関することを示唆する。従って、重み付け生存予測モデルは、１１の遺伝子の重み付けられた発現値の累積スコアに基づく。ＢＭＩ−１およびコントロールルシフェラーゼのｓｉＲＮＡについての標的ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＲＴプールを、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃから購入した。それらを、製造者のプロトコールに従って、ＰＣ−３−３２ヒト前立腺癌細胞にトランスフェクトした。細胞培養物を増殖および生存率について連続してモニターし、そしてＲＴ−ＰＣＲ法およびＱ−ＲＴ−ＰＣＲ法を使用してＢＭＩ−１および選択された遺伝子セットのｍＲＮＡ発現レベルについて調べた。
【００５９】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析
リアルタイムＰＣＲ法では、蛍光検出器システムによってＰＣＲ産物の蓄積を測定し、反応の対数期における増幅されたＰＣＲ産物の量の定量化が可能になる。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して製造者の指示書に従って抽出した。全ＲＮＡの１μｇ（腫瘍サンプル）または２μｇおよび４μｇ（参照ｃＤＮＡサンプルの独立した調製物）の測定を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いたｃＤＮＡ合成用の鋳型として使用した。ＱＰＣＲプライマー配列は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を活用して各ｃＤＮＡについて選択した。ＰＣＲ増幅は、表５および６（以下に詳細を記載）に列挙された遺伝子特異的プライマーを用いて実施した。
【００６０】
Ｑ−ＰＣＲ反応および測定は、ＡＢＩ  ７９００  ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＳＹＢＲ−ＧｒｅｅｎおよびパッシブリファレンスとしてＲＯＸを用いて実施した。ＰＣＲのための条件は次のとおりとした：９５℃で１０分を１サイクル；９４℃で０．２０分；６０℃で０．２０分および７２℃で０．３０分を４０サイクル。結果を、内在性コントロール遺伝子ＧＡＰＤＨの発現の相対量に対して標準化した。
【００６１】
１１の遺伝子および内在性コントロール遺伝子（ＧＡＰＤＨ）についてのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現を、ＲＰ（前立腺全摘除術（ｒａｄｉａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ））後、５年以内にＰＳＡ再発を示した患者およびＲＰ後、少なくとも５年間無病状態のままであった患者（各群患者１０人ずつ）から得られた原発性前立腺癌の２０検体について、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００  ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）におけるリアルタイムＰＣＲ法によって測定した。各遺伝子について少なくとも２セットのプライマーを試験し、最も高い増幅効率であったものをこの研究において使用されるアッセイのために選択した。ｍＲＮＡ測定のアッセイの特異性を、ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した場合に、予想されるＰＣＲ産物が存在しないことによって確かめた。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ：５’−ＣＣＣＴＣＡＡＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡ−３’（配列番号１）および５’−ＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号２））を内在性ＲＮＡおよびｃＤＮＡの定量の標準化コントロールとして使用した。検量線の較正および作成のために、本発明者らは、いくつかの参照ｃＤＮＡを使用した：正常ヒト前立腺上皮細胞（ＮＰＥＣ）の初代インビトロ培養物から調製されたｃＤＮＡ、ＰＣ−３Ｍヒト前立腺癌細胞株から得られたｃＤＮＡおよび正常ヒト前立腺（ＮＨＰ）から調製されたｃＤＮＡ（Ｇｌｉｎｓｋｙ，Ｇ．Ｖ．，ら、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００３３７：２０９−２２１（Ｍａｇｅｅ，Ｊ．Ａ．，ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｈｅｐｓｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１，６１：５６９２−５６９６，参考として援用）。
【００６２】
すべての遺伝子の発現解析を、異なるＱ−ＲＴ−ＰＣＲ実験間の変動のためのコントロールに参照ｃＤＮＡを使用して２回の独立した実験において評価した。統計解析の前に、標準化した遺伝子発現値を、アレイベースの遺伝子発現データの変換と同様に対数変換した。
【００６３】
生存解析
カプランマイヤー生存解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン４．００ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を使用して行った。前立腺癌における生存解析についてのエンドポイントは、治療後の血清ＰＳＡの上昇によって規定される生化学的な再発とした。無病状態間隔（ＤＦＩ）を、前立腺全摘除術（ＲＰ）の日付とＰＳＡ再発の日付（再発群）または経過観察の最後の日付（非再発群）との間の期間として定義した。異なる群の患者についての生存曲線間の差の統計的有意性を、カイ二乗検定およびログランク検定を使用して評価した。治療結果および好ましくない予後の予測材料として個別の共変量の増加性の統計的検出力を評価するために、本発明者らは、一変量および多変量のコックス比例ハザード生存解析の両方を実施した。
【００６４】
臨床結果の予測における幹性署名の検証
臨床サンプル
本発明者らは、本発明者らの実験に、ヒト原発性前立腺腫瘍および１３２の組織サンプルを含む遠隔転移の３つの独立したセットを利用した。３２の臨床サンプル（２３の原発性前立腺腫瘍および９つの遠隔転移性病変）についてのマイクロアレイ解析および関連の臨床上の情報を利用して、以前に報告された（１１）ヒト前立腺癌転移の発現プロファイルを詳細に記載した。２１（結果セット１）および７９（結果セット２）のサンプルを含む２つの臨床結果セットを遺伝子発現ベースの再発予測アルゴリズムの発見および検証に利用した。本研究において解析される２１の臨床サンプル（結果セット１）のもとの遺伝子発現プロファイルは、他で（Ｇｌｉｎｓｋｙ，Ｇ．Ｖ．，ら、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００３，３７：２０９−２２１、本明細書中で参考として援用される）報告された。臨床サンプルの主な遺伝子発現データファイルならびに関連の臨床上の情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃａｎｃｅｒ／で見ることができる。使用する臨床サンプルおよび細胞培養に関するさらなる詳細は、Ｇｌｉｎｓｋｙ，Ｇｅｎｎａｄｉ  Ｖ．ら、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｄｅａｔｈ−ｆｒｏｍ−ｃａｎｃｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００５，１：１１５（６）：１５０３−１５２１（参考として援用）内で見ることができる。
【００６５】
同所性異種移植片
本研究において使用されるヒト前立腺ＰＣ−３細胞および亜系統の同所性異種移植片を、以前に報告されているように（１３）、外科的な同所性移植によって発達させた。簡潔には、２×１０６個の培養ＰＣ３細胞、ＰＣ３ＭまたはＰＣ３ＭＬＮ４亜系統をオス胸腺欠損マウスの皮下に注入して、２〜４週間に亘って堅く触診可能で、目に見える腫瘍に発達させることができた。無傷の組織を単一の皮下腫瘍から回収し、１細胞株サブタイプあたり６匹の胸腺欠損マウスの前立腺の腹側葉に外科的に移植した。そのマウスの恥骨上の集団について定期的に検査したところ、その集団は、すべての亜系統細胞タイプについて、ＰＣ３ＭＬＮ４＞ＰＣ３Ｍ＞＞ＰＣ３の順で出現した。腫瘍を有するマウスを、ドライアイスを用いたＣＯ２吸入によって屠殺し、ネクロプシーを２〜４℃の低温室にて行った。代表的には、両側的に対称な前立腺腫瘍は、非常に肥大した前立腺の形態で出現した。前立腺腫瘍組織を切り取り、液体窒素中で急凍した。屠殺から急凍までの経過時間は、５分未満であった。死後の系統的な肉眼的および顕微鏡的検査を行った。前立腺癌のトランスジェニックマウスモデルの作製、ｍＲＮＡおよびＲＮＡの単離のための組織の処理、ＲＮＡおよびｍＲＮＡの抽出、ｍＲＮＡ品質管理および遺伝子発現のためのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイの用法、データ解析および生存解析に関するさらなる詳細は、Ｇｌｉｎｓｋｙ，Ｇｅｎｎａｄｉ  Ｖ．ら、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｄｅａｔｈ−ｆｒｏｍ−ｃａｎｃｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００５，１：１１５（６）：１５０３−１５２１（参考として援用）に見ることができる。
【００６６】
データ解析
データ解析についての詳細なプロトコールならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術を使用した定量的統計的マイクロアレイ解析の感度、再現性および他の態様の記述が報告されている（Ｂａｒｏｎ，Ｖ．，ら、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｇｒ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００３，２２：４１９４−４２０４，参考として援用）。調査される遺伝子の４０〜５０％は、これらの実験においてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ５．０ソフトウェアによって存在するとみなした。データセットにわたる差次的遺伝子発現の一致解析は、以前に記載されているように（１１，１３）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭｉｃｒｏＤＢ  ｖ．３．０およびＤＭＴ  ｖ．３．０ソフトウェアを使用して行った。本発明者らは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ｖ．５．０ソフトウェアを使用してマイクロアレイデータを処理し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭｉｃｒｏＤＢおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＤＭＴソフトウェアを使用して発現データセットの統計解析を行った。この解析から、Ｔ検定およびマン・ホイットニー検定の両方によって定義された統計的有意水準（ｐ＜０．０５）で、再発性対非再発性の前立腺癌を有する患者からの腫瘍において差次的に制御された２１８の遺伝子（９１のアップレギュレートされた転写物および１２７のダウンレギュレートされた転写物）のセットを同定した。臨床上および実験上のデータセットにわたる差次的遺伝子発現の一致解析を、以前に記載されているようにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭｉｃｒｏＤＢ  ｖ．３．０およびＤＭＴ  ｖ．３．０ソフトウェアを使用して行った。同文献を参照のこと。個別の試験サンプルおよび適切な対照基準についてのピアソン相関係数を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン４．００ソフトウェアを使用して決定した。本発明者らは、超幾何分布テストを使用することによって「幹性」遺伝子のリストと前立腺癌関連遺伝子のリストとの間の重複の有意性を計算した。
【００６７】
実施例１：患者における臨床結果を予測するための１１−遺伝子署名
ＢＭＩ−１癌遺伝子発現は前立腺癌において上昇する
近年の実験観察によって、ヒト非小細胞肺癌、ヒト乳癌および樹立された乳癌細胞株においてＢＭＩ−１発現の増加が証明されたことから、ＢＭＩ−１活性化の腫瘍形成の役割が、白血病を超えて広がる可能性があり、おそらく同様に上皮の悪性腫瘍の進行に影響し得ることが示唆されている（Ｖｏｎｌａｎｔｈｅｎ，Ｓ．，ら、Ｔｈｅ  ＢＭＩ−１  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ＩＮＫ４Ａ−ＡＲＦ  ｌｏｃｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００１，８４：１３７２−１３７６；Ｄｉｍｒｉ，Ｇ．Ｐ．，ら、Ｔｈｅ  ＢＭＩ−１  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２，６２：４７３６−４７４５；ＬａＴｕｌｉｐｐｅ，Ｅ．，ら、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２，６２：４４９９−４５０６；Ｇｉｎｇｒｉｃｈ，Ｊ．Ｒ．，ら、Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９６，５６：４０９６−４１０２）。ヒト前立腺癌の複数の実験モデルを示す樹立された癌細胞株のマイクロアレイ遺伝子発現解析から、ＢＭＩ−１発現が、図１に示されているように、ヒト正常前立腺上皮細胞（ＮＰＥＣ）の初代培養物と比較して転移性腫瘍（本実施例で使用した癌細胞株は、ＰＣ−３、ＤｕＣａｐＬ、ＤｕＣａｐＲ、Ｖｃａｐ、ＬＮＣａｐ、ＰＲＯ５およびＬＮ３であった）から樹立されたヒト前立腺癌細胞株において一貫して上昇するようであることが明らかになった（Ｍａｇｅｅ，Ｊ．Ａ．，ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｈｅｐｓｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１，６１：５６９２−５６９６，参考として援用）。マイクロアレイ実験の結果を検証するために、下記の表１（発現が解析された癌細胞株ならびに各々に対する平均発現値、標準偏差およびＰ値を示す）に示されるようにＢＭＩ−１のｍＲＮＡ発現の定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）解析を使用した。
【００６８】
【表１−１】
2008536488.tif 000003
【００６９】
【表１−２】
2008536488.tif 000004
１４つの測定値についての標準化された平均発現値  ２ＮＰＥＣと比較した両側Ｔ検定
このように、発現プロファイリング実験の結果は、ＢＭＩ−１遺伝子の転写活性化が、頻繁にヒト前立腺癌に関連するという考えを支持するようである。
【００７０】
興味深いことに、マイクロアレイ解析から、リンパ節転移においてＢＭＩ−１発現レベルが著しく高いこと、およびより少ない転移性の対応物と比較してヌードマウスにおけるヒト前立腺癌腫の同所性異種移植片の転移性が高いことが示される。このことから、ＢＭＩ−１の活性化が、前立腺癌細胞の攻撃的な悪性の挙動と関連し得ることが示唆される。この仮説を検定するために、転移性の前立腺癌のトランスジェニックマウスモデルにおける約１２，０００の転写物の発現プロファイリング解析を行った。マイクロアレイ実験から、前立腺癌のＴＲＡＭＰトランスジェニックマウスモデルの後期の浸潤性の原発腫瘍および複数の遠隔転移性の病変において高いＢＭＩ−１のｍＲＮＡ発現のレベルが検出されたことから、ＢＭＩ−１関連経路の活性化と前立腺癌転移とを結びつける考えに対する信用がさらに上がる。
【００７１】
正常幹細胞と前立腺癌のトランスジェニックマウスモデルにおける遠隔転移性の病変とで一致した発現プロファイルを有するＢＭＩ−１経路署名の同定
最近の実験において、ＢＭＩ−１遺伝子が造血性幹細胞および神経性幹細胞の自己複製に必要であることが証明され、そして中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロスフェアと末梢神経系（ＰＮＳ）ニューロスフェアとの両方の状態においておそらく自己複製プログラムの実行に関与する、ＢＭＩ−１を制御する遺伝子が神経性幹細胞において同定された（Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓａｕｖａｇｅａｕ，Ｇ．ＢＭＩ−１  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２３：２５５−２６０；Ｐａｒｋ，Ｉ−Ｋ．，ら、ＢＭＩ−１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２３：３０２−３０５；Ｍｏｌｏｆｓｋｙ，Ａ．Ｖ．，ら、ＢＭＩ−１  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２５：９６２−９６７、これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。転移性の癌細胞において正常幹細胞の自己複製プログラムの活性化に関連する分子署名が、ＢＭＩ−１＋／＋遺伝的バックグラウンド対ＢＭＩ−１−／−遺伝的バックグラウンドにおける転移と正常幹細胞とで一致した制御パターンを証明する遺伝子を探索することによって検出される可能性があり得ると仮定した。従って、前立腺癌転移において活性化された転写物および抑制された転写物の発現プロファイルが、アップレギュレートされた転写物とダウンレギュレートされた転写物との両方に対するリストの一致／交差についての検索において差次的に制御された遺伝子のセットを比較することによって正常幹細胞においてＢＭＩ−１を制御する遺伝子の発現プロファイルを反復し得るか否かに関する決定がなされた。この解析から、前立腺癌転移における転写物量の挙動およびＢＭＩ−１＋／＋対ＢＭＩ−１−／−ＰＮＳニューロスフェアの高度に一致したプロファイルを示す遺伝子を同定した。このことから正常幹細胞と前立腺癌腫の遠隔転移性の病変との両方に同様に関与する保存されたＢＭＩ−１を制御する経路の存在が示唆される。
【００７２】
１）親署名の同定
前立腺癌のトランスジェニックマウスモデル（ＴＲＡＭＰ）をこれらの実験において使用した。転移性のＴＲＡＭＰ腫瘍サンプル（ＭＴＴＳ）署名は、転移性の表現型について判別可能である遺伝子が豊富である可能性がある。ＭＴＴＳ署名に結び付けられる遺伝子発現パターンの多くが、転移性の表現型の判別能力を証明し得、そして正常幹細胞の転写プログラムとは関連性を有しないと考えることは合理的である。ＭＴＴＳ署名のこれらの特徴は、転移性の癌細胞において協調的に発現される幹細胞トランスクリプトームの遺伝子発現成分の同定に使用され、そして悪性の表現型についての判別可能な診断能力を証明し得る。差次的に制御された転写物のセットを、ＢＭＩ−１＋／＋バックグラウンド対ＢＭＩ−１−／−バックグラウンドにおける、遠隔転移性の病変および原発性の前立腺腫瘍対転移性前立腺癌のトランスジェニックＴＲＡＭＰマウスモデルにおける同齢コントロールサンプル（ＭＴＴＳ署名）ならびにＰＮＳニューロスフェアにおける同齢コントロールサンプル（ＰＮＳ署名）およびＣＮＳニューロスフェアにおける同齢コントロールサンプル（ＣＮＳ署名）について独立して同定した。この解析工程によって、３つの大きな親署名：８６８のアップレギュレートされた転写物および４７７のダウンレギュレートされた転写物を含むＭＴＴＳ署名；８８５のアップレギュレートされた転写物および１０８８のダウンレギュレートされた転写物を含むＰＮＳ署名；ならびに７６９のアップレギュレートされた転写物および７７８のダウンレギュレートされた転写物を含むＣＮＳ署名が定義された。
【００７３】
２）遺伝子の一致したサブセット（子署名）の同定
ＭＴＴＳ署名が、ＰＮＳニューロスフェアおよびＣＮＳニューロスフェアの状態の幹細胞署名と交差していたことから、一致した遺伝子セットを同定し、そしてＭＴＳＳ署名にはまり込む幹細胞署名を定義した。転移性のＴＲＡＭＰ腫瘍サンプル（ＭＴＴＳ署名）ならびにＢＭＩ−１＋／＋バックグラウンド対ＢＭＩ−１−／−バックグラウンドにおけるＰＮＳ（ＰＮＳ署名）ニューロスフェアおよびＣＮＳ（ＣＮＳ署名）ニューロスフェアにおける一致した発現の変化を示す転写物のサブセットが同定された。従って、ＰＮＳニューロスフェアおよびＣＮＳニューロスフェアの状態の転移性のＴＲＡＭＰ腫瘍および神経性幹細胞サンプルの各２成分比較に対応する転写物の２つの一致したサブセットが同定された［ＰＮＳニューロスフェアについて、１４１のアップレギュレートされた転写物および５８のダウンレギュレートされた転写物（ｒ＝０．７５９３；Ｐ＜０．０００１）ならびにＣＮＳニューロスフェアについて４０のアップレギュレートされた転写物および２４のダウンレギュレートされた転写物（ｒ＝０．７６７９；Ｐ＜０．０００１）］。１５のアップレギュレートされた転写物および１２のダウンレギュレートされた転写物を含む２７の遺伝子の第３の一致したサブセットを、３つすべての署名に対して共通する交差について選択した（ｒ＝０．８００２；Ｐ＜０．０００１）。このようにして、３つの一致した遺伝子サブセットを同定した。
【００７４】
この解析はまた、一貫した対照基準として使用することにより、幹細胞様発現署名の存在可能性について独立したデータセットを調査することができる、転移性の癌細胞および正常幹細胞において協調的に発現される転写物についての幹細胞様発現プロファイルを同定した。これらの一致した遺伝子セットから、本発明者らは、転移性の癌細胞および幹細胞において高レベルな発現相関を有する転写物を含む、より小さい遺伝子発現署名（例えば、１１または１４の遺伝子セット）を選択した（より小さい署名用の選択閾値は、ピアソン相関係数＞０．９５で任意に設定した）。ある転写物のさらなる排除がピアソン相関係数の値を増大させなかったとき、署名転写物数の減少は、終止した。このアプローチを使用して、単一の予後遺伝子発現署名の候補を、ＭＴＴＳ署名および親幹細胞署名の各２成分の交差について選択した。より小さい子署名（ＰＮＳセットについて１つの１１−遺伝子署名、ＣＮＳセットについて１つの１１−遺伝子署名および共通ＰＮＳ／ＣＮＳセットについて１つの１４−遺伝子署名）を、転移性の表現型判別能力および治療結果分類成績について試験した。１つの実施例として、ＰＮＳセットについての１１−遺伝子署名に対する遺伝子セット（１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名）を下記の表２に示す。
【００７５】
【表２−１】
2008536488.tif 000005
【００７６】
【表２−２】
2008536488.tif 000006
診断的および予後的な分類成績に基づいて、単一の最も成績の良い１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名を、さらなる検証解析のために選択した。上記の表２に提供される情報に基づいて、これらの遺伝子についてのさらなる情報が、数多くの供給源、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／におけるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから（例えば、検索するデータベースの検索のために検索ウインドウのドロップダウンメニューから「Ｇｅｎｅ」を選択することおよび遺伝子名（例えば、ＧＢＸ２）についての検索を実施することによって）入手可能であることを当業者は理解するだろう。表２に示される遺伝子についての代表的なｃＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、本明細書に添付の配列表に含めた。いくつかの実施形態において、本発明の方法およびキットにおいて使用される配列は、配列表に含まれる例示された配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
【００７７】
用語パーセント「同一性」は、以下に記載する配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮまたは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用してか、または目視検査によって測定されるように比較されて、最大の対応についてアラインメントされるとき、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の場合において、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列または部分配列のことをいう。用途に依存して、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在し得るか、または、比較される２つの配列の完全長に亘って存在し得る。
【００７８】
配列比較について、典型的には、試験配列が比較される参照配列として１つの配列が作用する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列がコンピュータに入力されるとき、対等な部分配列が指定され、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００７９】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的な相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似の方法についての検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または目視検査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら、下記を参照のこと）によって実施され得る。
【００８０】
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適したアルゴリズムの１つの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に入手可能である。
【００８１】
３）悪性の表現型分類成績試験
悪性の表現型分類成績試験の間、本発明者らは、個別の転移性の病変および原発性前立腺腫瘍が、予後の署名候補の幹細胞様発現プロファイルを示し得るか否かを求めた。本発明者らは、この解析に対して、幹細胞および前立腺癌転移における発現プロファイルの最も有意な相関を示す３つの小さい署名を選択した。個別の腫瘍サンプルおよび正常幹細胞における署名発現プロファイルの類似の程度を評価するために、本発明者らは、個別のサンプルにおける署名発現プロファイルと対応する小さい署名の幹細胞関連発現プロファイルとを比較することによって、各サンプルについてピアソン相関係数を計算した。幹細胞および前立腺癌転移における予後の署名の考えられる類似性に基づいて、本発明者らは、個別のサンプルについて測定された対応するピアソン相関係数を幹細胞様表現型関連指標（ＳＰＡＩ）と名付けた。署名の１つについての発現プロファイルを示す図２に示されるように、３つの後期浸潤性原発腫瘍のうちの２つおよび前立腺癌のＴＲＡＭＰトランスジェニックマウスモデルにおけるすべての遠隔転移性の病変が、正のＳＰＡＩを有することから、小さい署名の幹細胞様発現プロファイルが証明される。
【００８２】
治療結果が異なる癌患者由来の遠隔転移性病変および原発性前立腺腫瘍は１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の異なる発現プロファイルを示す
ヒト腫瘍について同様の解析を行うために、本発明者らは、Ｌｏｃｕｓｌｉｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用してマウスの小さい署名をヒトホモログのリストに変換し、対応するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットについての発現データを取得した。本発明者らは、９つの転移性の腫瘍および２３の原発性前立腺癌の各々についてＳＰＡＩを計算し、そして図３に示されるように前立腺癌患者からの遠隔転移性の病変の９つのサンプルのうち７つが、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の幹細胞様発現プロファイルを示すと判定した。対照的に、原発性前立腺腫瘍の大部分は、ＳＰＡＩが負の値で表されるように１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名について異なる発現プロファイルを示すようである。興味深いことに、原発性前立腺癌のサンプルのサブセットは、正の相関係数（図３における正のＳＰＡＩ値）において反映されるような転移性の腫瘍に類似した１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現プロファイルを明らかにする。このことから、ＰＮＳニューロスフェア由来の１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の異なる発現プロファイル（例えば、ＳＰＡＩの正および負の値）を有する原発性前立腺腫瘍が、異なる生物学的特徴および疾患進行の異なる臨床経過を有し得ることが示唆される。ＣＮＳニューロスフェア由来のＭＴＴＳ／ＣＮＳ１１−遺伝子署名およびＭＴＴＳ／ＰＮＳ／ＣＮＳ１４−遺伝子署名を使用した検証解析から、これらの署名の適用が、ＭＴＴＳ／ＰＮＳ１１−遺伝子署名と比較して転移性のヒト前立腺腫瘍と原発性のヒト前立腺腫瘍とを識別する際にそれほど情報価値がないことが示唆される。従って、本発明者らは、ＭＴＴＳ／ＰＮＳ１１−遺伝子署名を用いて本発明者らの解析を進めた。
【００８３】
１）１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の臨床上の有用性の評価
ヒト前立腺癌における１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名発現の潜在的な生物学的有意性および臨床上の有用性を評価するために、本発明者らは、個別の癌患者の原発性前立腺腫瘍における幹細胞様発現プロファイルの検出が、前立腺全摘除術後の治療結果が異なることに基づいて、診断時に患者を疾患進行の異なる経過を有するサブグループに層別化する際に役立ち得るか否かを調べ始めた。本発明者らは、前立腺全摘除術後の疾患進行の再発性および非再発性の経過を有する患者を異なるサブグループに分ける能力に基づいて１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の予後診断能力を評価した。本発明者らは、個別のサンプルの１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名発現プロファイルを、ＰＮＳニューロスフェアにおける１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の幹細胞様発現プロファイルと比較することによって、結果セット１の２１の腫瘍サンプルの各々についてピアソン相関係数を計算した。１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の予後診断能力を判定するために、本発明者らは、正および負のＳＰＡＩを有する前立腺癌患者における治療後のクリニカルエンドポイント無病状態間隔（ＤＦＩ）として使用するカプランマイヤー生存解析を行った。
【００８４】
カプランマイヤー生存曲線は、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名によって定義される正のＳＰＡＩと負のＳＰＡＩを有する群間で治療後に前立腺癌患者が無病状態のままでいる確率において大きな有意差を示した。このことから、正のＳＰＡＩを有する患者が不良な結果の署名を示す一方で、負のＳＰＡＩを有する患者が良好な結果の署名を示すことが示唆される。図４に示されるように、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名によって定義される負のＳＰＡＩを有する患者の群と比較して、正のＳＰＡＩを有する患者の群において治療後の疾患再発についての推定危険率は、９．２５９であった（９５％信頼区間、１．５４５〜２６．０７；Ｐ＝０．０１０４）。正のＳＰＡＩを有する患者の５８％は、治療後の３年以内に疾患を再発した一方で、負のＳＰＡＩを有する患者の９０％が、再発しないままであった。治療の５年後、正のＳＰＡＩを有する患者の６９％が、疾患再発を起こした一方で、負のＳＰＡＩを有する患者の９０％が再発しないままであった。この解析に基づいて、本発明者らは、ＰＮＳニューロスフェア由来の１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の正の値を有する前立腺癌患者の群を予後が不良な群として同定し、そして１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の負の値を有する前立腺癌患者の群を予後が良好な群として同定することを提案した。
【００８５】
２）１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名のさらなる解析
同定された署名遺伝子を、２つの種（マウスおよびヒト）から得られた実験サンプルおよび臨床サンプルの複数の独立したセットにおける強い相関性挙動に基づいて定義した。ＢＭＩ−１経路標的遺伝子の発現とヒト癌細胞に関するＢＭＩ−１遺伝子産物の発現との疑われる関連を独立した方法によって検定するために、本発明者らは、ヒト前立腺癌細胞を内在性ＢＭＩ−１遺伝子の発現のｓｉＲＮＡ媒介性サイレンシングに供した。ＰＣ−３−３２ヒト前立腺癌細胞を、ＢＭＩ−１またはコントロールのｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、そしてＲＴ−ＰＣＲ法およびＱ−ＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、ＢＭＩ−１および選択された遺伝子セットのｍＲＮＡ発現レベルを連続的にモニターした（データ示さず）。ＲＴ−ＰＣＲ解析およびＱ−ＲＴ−ＰＣＲ解析から、使用したｓｉＲＮＡ媒介性ＢＭＩ−１サイレンシングプロトコールによって内在性ＢＭＩ−１  ｍＲＮＡ発現を約９０％阻害したことが示された。本発明者らは、免疫蛍光解析を使用してＢＭＩ−１タンパク質発現レベルでｓｉＲＮＡ媒介性ＢＭＩ−１サイレンシングの効果を検証した。９つの無関係な転写物（例えば、ＧＡＰＤＨ、ＥＺＨ２およびいくつかの他の遺伝子）の発現レベルが変化していなかったので（データ示さず）、ＢＭＩ−１サイレンシングは特異的であった。１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名を含む遺伝子の発現がＢＭＩ−１遺伝子産物の発現に関連するという仮説に一致して、調べられた１１のＢＭＩ−１経路標的遺伝子のうち８つのｍＲＮＡ量のレベルが、ヒト前立腺癌細胞においてＢＭＩ−１遺伝子の約９０％サイレンシングを受けていたという変化が見られた。
【００８６】
ヒト前立腺癌腫転移前駆体細胞におけるＢＭＩ−１  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現の減少は、最適培養条件および血清飢餓実験において生育された接着培養物の生存率は有意に変化せず（データ示さず）、そして増殖に対して中程度の阻害性の影響を示しただけであった（３日間のサイレンシングプロトコールにおいて細胞数が約２５〜３０％減少した）。しかしながら、ヒト前立腺癌細胞の非接着状態における生存能力は、ＢＭＩ−１発現のｓｉＲＮＡ媒介性減少後に大幅に影響を受けた。蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）解析によって、非接着状態で培養されたＢＭＩ−１ｓｉＲＮＡ処置されたヒト前立腺癌細胞においてアポトーシスが約３倍増加したことが明らかになった。これらのデータから、高レベルのＢＭＩ−１タンパク質を発現しているヒト前立腺癌細胞が、接着剥奪（アノイキス）に応答して上皮起源の細胞において誘導されるアポトーシスに対してより抵抗性であり、そしておそらく転移性播種の間、血液中でより生存し得ることから、循環性ストレス生存転移前駆体細胞のプールを形成することが示唆される。分子署名の同定、ピアソン係数の使用、カプランマイヤー生存解析および上記の他の方法に関するさらなる詳細は、２００４年６月３日に出願された係属中の米国特許出願公開第１０／８６１，００３号および２００３年９月１０日に出願された係属中の米国特許出願公開第１０／６６０，４３４号に提供されている。これらの両方は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００８７】
原発性前立腺腫瘍における１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現は、前立腺癌患者における治療失敗についての予測材料である
１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名に基づいて生存予測モデルを検証するために、本発明者らは、５つの上皮癌および５つの非上皮性癌を示す複数の独立した治療結果のデータセットにおけるモデルの予後成績を試験した。本発明者らは、個別のコホート内の患者を、カットオフ閾値選択のためおよびモデルを検定するために使用した学習用セットと、分類成績の再現性を評価するために使用した試験セットとに分けた。サンプルの学習用セットを使用して、本発明者らは、ログランク検定（学習用セットにおいて最低のＰ値および最高の危険率）によって決定されるとき、予後が不良な群および予後が良好な群への患者の層別化において最高レベルの統計的有意性に基づいて署名についての予後判別カットオフ値を選択した。カットオフ値以上のピアソン相関係数を有する臨床サンプルを、予後が不良な署名を有すると同定した。カットオフ値より低いピアソン相関係数を有する臨床サンプルを、予後が良好な署名を有すると同定した。次に同じ判別カットオフ値を適用して、患者の試験セットにおける予後成績の再現性を評価した。最後に、本発明者らは、分類成績を確かめるために同じカットオフ閾値を使用してそのモデルを結果セット全体に適用した。学習用セットおよび試験セットを、患者の総数、負の治療結果および正の治療結果ならびに生存期間の長さに関して比較した。この段階の解析において本発明者らが、学習用セットを使用して予後のカットオフ閾値を選択すること以外は、追加モデルの学習、開発または最適化の工程を実施しなかったことを指摘したい。本発明者らは、本研究を通じて一貫して、対照基準として同じＭＴＴＳ／ＰＮＳ発現プロファイルを使用して、個別のサンプルのピアソン相関係数を定量化した。
【００８８】
この解析に加えて、本発明者らは、様々なサンプル層別化アプローチ（例えば、ｔｅｒｒａｉｎ（ＴＲＮ）クラスタリング、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）分類および重み付け生存スコアアルゴリズム）を使用してモデル成績を確認した。最後に、本発明者らは、遺伝子発現解析の独立した方法、すなわち、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）法に基づいた予後検査を使用して前立腺癌設定における１１−遺伝子モデルの治療結果予測能力を評価した。
【００８９】
１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の潜在的な臨床上の有効性をさらに検証するために、本発明者らは、治療後に再発した３７人の前立腺癌患者および無病状態のままであった４２人の患者から得られた７９の臨床サンプル（前立腺癌結果セット２）の独立したセットに適用された１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の予後診断能力を評価した。患者のこのコホートにおいて、カプランマイヤー生存解析から、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名によって定義された正のＳＰＡＩおよび負のＳＰＡＩを有する群間で、前立腺癌患者が治療後に無病状態のままでいる確率において高度な有意差が証明された。図５に示されるように、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名によって定義される負のＳＰＡＩを有する患者の群と比較して、正のＳＰＡＩを有する患者の群における治療後の疾患再発についての推定危険率は、３．７４であった（９５％信頼区間、３．０１０〜２５．８３；Ｐ＜０．０００１）。正のＳＰＡＩを有する患者の６７％は、治療後３年以内に疾患が再発した一方で、負のＳＰＡＩを有する患者の７０％は、再発しないままであった。治療の５年後に、正のＳＰＡＩを有する患者の８３％が疾患を再発した一方で、負のＳＰＡＩを有する患者の６４％が、再発しないままであった。
【００９０】
標準的なカプランマイヤーログランク統計値は、生存曲線における差を評価するが、しかしながら、複数の仮説試験および遺伝子発現プロファイリング実験の固有の問題を示すランダムな共起を説明しない。部分的に、本発明者らは、署名選択プロセスの間に患者の生存率に対する代替の生物学的エンドポイントを使用することおよび生存解析を単一の署名に適用して、生存モデル構築プロトコールから複数の比較を排除することによって、この問題を軽減するように試みた。ＭＴＴＳ署名は、正常幹細胞の転写プログラムに関係のない、転移性の表現型判別能力を示す多くの遺伝子発現パターンを保持する可能性がある。本発明者らの目標の１つは、多能性自己複製表現型に関連し、そしてＭＴＴＳ署名に埋め込まれている幹細胞署名を同定することであった。このアプローチから、候補マーカー署名が、臨床サンプルにおける幹細胞様署名の発現を検索するための対照基準として次に続く経過観察検証解析において使用され得る定義された幹細胞様発現プロファイルを有し得ることが示唆される。
【００９１】
１１−遺伝子幹細胞様プロファイルの統計的有効性をさらに評価するために、本発明者は、１９７３−遺伝子ＰＮＳ署名からランダムに選択される１１−遺伝子幹細胞プロファイルの１０００回のランダムな並べ替えを行った。各ランダム１１−遺伝子幹細胞プロファイルについて、本発明者らは、１１−遺伝子ＢＭＩ−１経路ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の判別可能な信頼水準でＴＲＡＭＰトランスジェニックマウスモデルにおいてその転移性の表現型の判別可能な成績を評価した。１０００の順列のうち１つのランダムな１１−遺伝子幹細胞プロファイルだけが、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の転移性の表現型判別可能な成績と一致する分類能力を示した。本発明者らは、１０，０００回の並べ替え検定を行うことにより、大きなＭＴＴＳ署名に由来する１１−遺伝子署名が０．１％水準で有意性を評価するという高い識別能力をどの程度確実に示し得るかを調べた。本発明者らは、大きい１３４５−遺伝子ＭＴＴＳ署名に由来する小さい１１−遺伝子署名の１０，０００回の並べ替えを行い、そしてそれらのサンプルの層別化能力を１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名と比較した。両側Ｔ検定を１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名に適用することによって分類成績カットオフｐ値を確立した（転移性前立腺癌データセット対原発性前立腺癌データセットについてｐ＝０．０００５および再発性前立腺癌データセット対非再発性前立腺癌データセットについてｐ＝０．０２６）。本発明者らは、１０，０００回の並べ替えから、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名のサンプル分類レベルで示す７つのランダムな１１−遺伝子署名が生成されたことを見出した。
【００９２】
コックス比例ハザード生存回帰解析
治療結果および好ましくない予後の予測材料としての個別の共変量の増加性の統計的検出力を確かめるために、本発明者らは、１変量のコックス比例ハザード生存解析と多変量のコックス比例ハザード生存解析との両方を行った。１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名のいくつかの個別の遺伝子メンバー（例えば、ＭＫＩ６７およびＣＣＮＢ１）は、予後の重要な予測材料として以前に報告があり、リンパ腫の生存予測材料署名について最近示されているとき、増殖性の割合と不良な治療結果との間の相関を反映し得る。しかしながら、本発明者らの解析から、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名が、個別の遺伝子（以下を参照のこと）と比較される複数のデータセットにわたってより均一な治療結果の予測材料であり、そしておそらく、一連のヒト癌にわたる生物学的多様性のよりよい「インテグレーター」および「センサー」であることが示唆されるようである。本発明者らは、１変量のコックス比例ハザード生存解析と多変量のコックス比例ハザード生存解析との両方を行うことにより、幹性署名全体および個別の遺伝子の予後成績を比較した。これらの解析の結果を下記の表３および４に示す。
【００９３】
【表３−１】
2008536488.tif 000007
【００９４】
【表３−２】
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【００９５】
【表４】
2008536488.tif 000009
９  ＲＰ、前立腺全摘除術；ＰＳＡ、前立腺特異的抗原；ＳＭ、切除断端；ＧＬＳＮ  ＳＵＭ、グリーソンスコア；Ｓｅｍ  Ｖｅｓ  Ｉｎｖ、精嚢浸潤；ＥＣＥ、被膜外進展。
【００９６】
１変量の解析において、治療結果の予測材料としてのＭＫＩ６７発現の予後成績は、様々な結果データセットにおいて変化した。ＭＫＩ６７発現の予後成績は、前立腺癌治療結果セット２（ＭＳＫＣＣデータセット）において有意性が高かった；しかしながら、前立腺癌結果セット１（Ｐ＝０．１；ＭＩＴデータセット）および乳癌結果データセット（Ｐ＝０．０５３３）において統計的有意性に対して傾向性のみを示した。前立腺癌において、１変量のコックス回帰解析における有意な予後予測材料は、ＭＫＩ６７、ＡＮＫ３、ＦＧＦＲ２、ＣＥＳ１および１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名であった。乳癌においては、１変量解析における有意な予後予測材料は、ＣＣＮＢ１、ＢＵＢ１、ＫＮＴＣ２および１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名であった。従って、本発明者らの解析により、個別の遺伝子が複数の結果データセットにわたる可変成績を示し、本発明者らが、不良な治療結果を均一に予測する単一の遺伝子を同定することができなかったことが示唆されるようである。
【００９７】
多変量の解析において、ほとんどの有意な前立腺癌再発予測材料は、１１の共変量［１１−遺伝子署名、４つの個別の遺伝子（ＭＫＩ６７；ＡＮＫ３；ＦＧＦＲ２；ＣＥＳ１）；および６つの臨床病理学的特徴（ＲＰ前グリーソンスコア；切除断端；精嚢浸潤；年齢；および被膜外進展）］を含んだモデルであった。興味深いことに、いくつかの共変量（例えば、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名、ＭＫＩ６７、ＣＥＳ１、ＲＰ前ＰＳＡレベル、切除断端および被膜外進展）が多変量解析において統計的に有意な予後マーカーのままであった。従って、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の個別の遺伝子メンバーの予後成績が、異なる結果データセットにおいて大きく変化していたが、同定された１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名は、１，０００の臨床サンプルにわたって含まれ、そして１０の異なるタイプのヒト癌（以下を参照のこと）を示す複数の独立した結果データセットにわたって不良な治療結果の最も矛盾のない予測材料として行うようである。しかし、統計的に最も成績の良い多変量の癌タイプ特異的モデルは、個別の遺伝子の発現レベル、遺伝子発現署名および臨床病理学的共変量に基づく要求の組み合わせを必要とするようである。
【００９８】
本発明者らは、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名を含む遺伝子の予後診断能力をさらに評価するために、代替の統計計量を使用しようとした。本発明者らは、図６に示されるように、多成分予後モデルに基づいた治療結果の予測材料として個別の共変量の増加性の統計的検出力を反映する重み付け生存スコア解析を企図した。最終的な生存予測材料スコアは、個別の遺伝子についてのスコアの合計を含み、多変量解析における１１の遺伝子の各々の相対的な寄与を反映する。負の重み付け値が、より高い発現がより長い生存期間および好ましい予後と相関することを示唆する一方で、正のスコア値は、より高い発現が不良な結果およびより短い生存期間と相関することを示唆する。１１の遺伝子の重み付けされた発現値の累積スコアに基づく重み付け生存予測モデルの適用により、前立腺癌患者を前立腺全摘除術後に再発せずに生存している統計的に異なる確率を有するサブグループに層別化する際に、同定された１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の予後診断能力が確かめられた。
【００９９】
１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現は、初期の疾患を有する前立腺癌患者において治療後に再発なしでの生存期間が短い予測材料である
治療後の結果が不良である確率が高い患者の同定は、一見したところ局在化した初期の前立腺癌と診断された患者のコホートにおいて特に望ましいだろう。次に、本発明者らは、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名が、初期の前立腺癌と診断され、治療後の疾患再発の確率において統計的有意差を有する患者のサブグループを定義する際に有用であり得るか否かを判定した。ステージ１Ｃまたは２Ａの前立腺癌と診断された患者の群において、図７に示されるように、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名によって定義された予後が不良であるサブグループにおいて治療後に再発なしでの生存期間の中央値は、２７ヶ月であった。対照的に、予後が良好な群において治療後に再発なしでの生存期間の中央値は、８２．４ヶ月であった。予後が不良なサブグループにおける患者の８８％は、治療の５年後に疾患を再発した。逆に、予後が良好なサブグループにおける患者の６４％は、再発しないままであった（図７）。１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名によって定義された患者の予後が良好なサブグループと比較して、予後が不良なサブグループにおける治療後の疾患再発についての推定危険率は、３．９０７であった（９５％信頼区間、２．６８７〜３４．８４；Ｐ＝０．０００５）。
【０１００】
定量的ＲＴ−ＰＣＲベースのアッセイを使用した１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の予後成績の検証
マイクロアレイ由来の遺伝子発現署名に基づいた予後試験の日常的な臨床上の使用は、最先端の臨床検査の実施に高度に適合し得る実験的な設定における同定されたマーカーの有用性の予測的バリデーション研究を必要とし得る。マイクロアレイベースのアッセイ形式が、臨床検査における用途に容易に利用可能とならないので、本発明者らは、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲベースの検定を、マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの測定に適した、臨床的に適合可能な代替の解析プラットフォームとして考えた。下記の表５および６において同定されるプライマーセットを使用した１１の遺伝子および内在性コントロール遺伝子（ＧＡＰＤＨ）についてのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現を、リアルタイムＰＣＲ法によって、ＲＰ後の５年以内にＰＳＡが再発した患者およびＲＰ後の少なくとも５年間、無病状態のままであった患者から得られた原発性前立腺癌の２０検体（各群１０人の患者）において測定した。図８に示されるように、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ法を使用して１１の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの測定に基づいた前立腺癌治療結果検定は、前立腺全摘除術後に再発なしで生存する確率が統計的に異なるサブグループに前立腺癌患者を判別する。
【０１０１】
【表５−１】
2008536488.tif 000010
【０１０２】
【表５−２】
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【０１０３】
【表６】
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１参考文献：Ｐａｒｋ，Ｉ−Ｋ．，Ｑｉａｎ，Ｄ．，Ｋｉｅｌ，Ｍ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｐｉｈａｌｊａ，Ｍ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ
上記の表は、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名を含む遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルのＱ−ＲＴ−ＰＣＲ解析用のプライマー配列の例を提供するが、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルのこのＰＣＲ解析用の他のプライマー配列が、多くの供給源（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／におけるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙなど）（例えば、検索するデータベースの選択のために検索ウインドウのドロップダウンメニューから「ＵｎｉＳＴＳ」を選択することおよび遺伝子名（例えば、ＧＢＸ２）についての検索を実施することによって）およびｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ．におけるＷｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＲｅｓｅａｒｃｈについてのＰｒｉｍｅｒ３で入手可能であることを当業者は理解するだろう。
【０１０４】
カプランマイヤー生存解析から、１１遺伝子Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲベースの前立腺癌治療結果検定を適用することにより、前立腺癌患者を、治療後に再発しないままである確率において統計的有意差を有するサブグループに分離されることが証明された（図８）。検定によって定義された予後が良好な群と比較して、患者の予後が不良な群における治療後の疾患再発についての推定危険率は、２１．３であった（９５％信頼区間、５．７４１〜９８．３９；Ｐ＜０．０００１）。予後が不良な群における患者の１００％が、ＲＰ後の４年以内に疾患を再発した一方で、予後が良好な群の患者の９１％は、再発しないままであった（図８）。
【０１０５】
１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現は、初期の疾患と診断された乳癌および肺癌の患者における治療後の転移性の再発および不良な生存期間を予測する
乳癌
本発明者らはまた、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現の測定が、散発性のリンパ節無症状の初期乳癌と診断された９７人の若年女性の群における患者の予後の予測において情報価値があるか否かを調べようとした（この群は、治療後５年以内に遠隔転移した４６人の患者および治療後少なくとも５年間、無病状態であり続けた５１人の患者から構成される；彼女らは、同様に臨床上定義された、予後が不良な群および予後が良好な群を構成する）。カプランマイヤー解析から、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の幹細胞様発現プロファイルを示す腫瘍を有する乳癌患者が治療後５年以内に遠隔転移する有意に高い確率を有するがゆえに予後が不良なサブグループとして同定され得ることが示唆される。１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名によって定義された乳癌患者の予後が不良なサブグループにおいて治療後に転移なしでの生存期間の中央値は、２６ヶ月であった。予後が不良なサブグループにおける患者の８４％は、治療後５年以内に遠隔転移と診断された。対照的に、予後が良好なサブグループにおける患者の６２％は、転移しないままであった。図９に示されるように、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名によって定義される患者の予後が良好なサブグループと比較して、予後が不良なサブグループにおける治療後の転移なしでの生存についての推定危険率は、３．７６２であった（９５％信頼区間、３．４２１〜２０．２７；Ｐ＜０．０００１）。従って、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現パターンは、初期乳癌患者において診断から遠隔転移までの間隔および処置から遠隔転移までの間隔が短いことを強く予測している。
【０１０６】
肺腺癌
次に本発明者らは、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現解析が、肺腺癌と診断された１２５人の患者の群において治療後の異なる生存確率を有するサブグループへの患者の層別化に対して情報価値があるか否かを求めた（３４）。前立腺および乳癌の患者と同様に、カプランマイヤー解析は、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の幹細胞様発現プロファイルを示す腫瘍を有する患者が、治療後の死の危険性が有意に高いがゆえに予後が不良なサブグループとして定義され得ることを示す。１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名によって定義された肺腺癌患者の予後が不良なサブグループにおける治療後の生存期間の中央値は、１５．２ヶ月であった。対照的に、予後が良好なサブグループにおける治療後の生存期間の中央値は、４８．８ヶ月であった。予後が不良なサブグループにおける患者の１００％が、治療後の３年以内に死亡した。逆に、予後が良好なサブグループにおける患者の５８％が生存したままであった。図１０に示されるように、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名によって定義された患者の予後が良好なサブグループと比較して、予後が不良なサブグループにおける治療後の死についての推定危険率は、３．５８９であった（９５％信頼区間、２．９１０〜４６．６７；Ｐ＝０．０００５）。
【０１０７】
次に本発明者らは、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名が、初期の肺腺癌と診断され、そして治療後の生存確率に統計的有意差を有する患者のサブグループを定義する際に有用であり得るか否かを調べた。ステージ１Ａの肺腺癌と診断された患者の群において、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名によって定義される予後が不良なサブグループにおける治療後の生存期間の中央値は、４９．６ヶ月であった。予後が不良なサブグループにおける患者の５３％は、治療後５年以内に死亡した。対照的に、予後が良好なサブグループにおける患者の９２％は生存したままであった。１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名によって定義される患者の予後が良好なサブグループと比較して、予後が不良なサブグループにおける治療後の死についての推定危険率は、８．９０９であった（９５％信頼区間、１．４１８〜１３．１２；Ｐ＝０．０１）。
【０１０８】
この解析に基づいて、本発明者らは、初期の前立腺癌、乳癌および肺癌と診断された患者からの原発腫瘍における１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の幹細胞様発現プロファイルの検出は、転移性播種に対する高い傾向および不良な治療結果の有意に高い危険性に関連すると結論付けた。興味深いことに、他のタイプの上皮癌（例えば、卵巣癌および膀胱癌）と診断された癌患者における治療結果は、図１１および１２に示されるように１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現の異なるパターンと類似の関連を示すようである。
【０１０９】
１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現は非上皮性の悪性腫瘍と診断された患者において治療結果を予測する
本発明者らは、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名が、非上皮性癌と診断され、治療後の生存確率に統計的有意差を有する患者のサブグループを定義する際に有用であり得るか否かをさらに解析しようとした。カプランマイヤー法を使用して、本発明者らは、びまん性の大きなＢ細胞型リンパ腫；マントル細胞リンパ腫；急性骨髄性白血病；中皮腫；髄芽腫；および神経膠腫と診断された患者において１１−遺伝子署名の予後診断能力を解析した（リンパ腫患者の生存率を示す１つの実施例として図１３を参照のこと）。カプランマイヤー解析は、原発腫瘍における１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の幹細胞様発現プロファイルが、治療失敗であることおよび５つの異なるタイプの非上皮性癌と診断された癌患者の生存期間が短いことについての一貫して強力な予測材料であることを証明する。本発明者らの知見と一致して、ヒト髄芽腫におけるＢＭＩ−１発現の増加は、最近の研究において証明された（ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ，Ｍ．Ｊ．，ら、Ａ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ，２００２，３４７：１９９９−２００９）。まとめると、これらのデータは、神経性幹細胞と幅広い器官において診断されたヒト癌の高度に悪性のサブセットとの両方に同様に関与し、そして転移性播種ならびに好ましくない治療結果の高確率に対して著明な傾向を一様に示す、保存されたＢＭＩ−１関連経路の存在を示唆するようである。
【０１１０】
実施例２：患者における臨床結果を予測するための幹性発現署名
前立腺癌のトランスジェニックマウスモデルにおける浸潤性の原発腫瘍および遠隔転移性の病変の発現プロファイルは正常幹細胞に対して著明な類似性を示す
上で記載したように、癌幹細胞の新しい概念は、形質転換した細胞における「幹性」遺伝的経路の関与が、腫瘍進行および上皮の悪性腫瘍の転移に寄与し得ることを示唆する。従って、癌細胞における「幹性」遺伝子の不適当な活性化は、攻撃的な臨床的挙動および治療失敗の確率の上昇に関連し得る。本発明者らは、６月齢のＴＲＡＭＰマウスの様々な解剖学的部位の原発性前立腺腫瘍および遠隔転移性の病変における約１２，０００の遺伝子の発現レベルを測定し、そして前立腺における悪性のプロセスの証拠がなく年齢が一致する野生型コントロールマウスの遺伝子発現プロファイルと比較することによって、差次的に制御された転写物を定義した。この解析から、それぞれ浸潤性の原発性前立腺腫瘍および遠隔転移性の病変における転写物量レベルが増加した２７６および８６８の遺伝子が同定された。
【０１１１】
原発性および転移性の前立腺腫瘍の発現プロファイルが幹細胞の転写プログラムと似ているか否かを検定するために、本発明者らは、原発腫瘍および転移においてアップレギュレートされた遺伝子と、３つの異なる幹細胞タイプ、すなわち神経性幹細胞、造血性幹細胞および胚性幹細胞において豊富な遺伝子のリストとを比較した（Ｉｖａｎｏｖａ，Ｎ．Ｂ．，ら、Ａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９８：６０１−６０４、本明細書中で参考として援用される）。驚くべきことに、リストの一致／交差について検索したところ、以下の表７に示される各２成分の比較において多数の共通の遺伝子が同定された。最も有意な類似度は、進行期の原発性前立腺腫瘍と遠隔転移との両方の発現プロファイルおよび神経性幹細胞中に豊富な転写物について観察された。これらのデータは、前立腺癌のトランスジェニックマウスモデルにおける転移性の疾患への腫瘍進行が、「幹性」遺伝子発現プログラムによって定義される転写場所（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｐａｃｅ）内に有意な程度で生じるという仮説と一致する。
表７．前立腺癌のＴＲＡＭＰトランスジェニックマウスモデルの原発性および転移性の腫瘍においてアップレギュレートされる転写物の「幹性」発現プロファイル
原発性前立腺腫瘍においてアップレギュレートされた２７６の転写物
【０１１２】
【表７】
2008536488.tif 000013
表は、リストの一致／交差について検索する際に、６月齢のＴＲＡＭＰマウスの原発性前立腺腫瘍および遠隔転移性の病変においてアップレギュレートされたそれぞれ２７６および８６８の転写物が、神経幹細胞、胚性幹細胞および造血性幹細胞において豊富な遺伝子と比較したことを示す。
ヒト前立腺癌における「幹性」遺伝子の発現の変化
次に、本発明者らは、「幹性」発現プロファイルの類似の現象が、ヒト前立腺癌に関連するか否かを判定しようと試みた。本発明者らは、発現配列タグアセンブリの直接的な配列比較によって、マウスとヒトとで相同な対の検索を通じて定義されるマウスのＨＳＣ関連遺伝子についてのヒトホモログのリストを使用することにより、ヒト前立腺癌に関係がある複数の臨床上および実験上の設定における「幹性」遺伝子サブセットを同定した。この解析の結果から、幹細胞において豊富な遺伝子の実質的な割合の発現が、ヒト前立腺癌に病態生理学的に関する様々な臨床上および実験上の設定において変化するようであると示唆され得る。全体としては、調べられた４６０のヒト「幹性」遺伝子のうち３３４（７３％）を、表８に列挙された調査された臨床上または実験上の設定の少なくとも１つにおいて差次的に制御した。
【０１１３】
【表８−１】
2008536488.tif 000014
【０１１４】
【表８−２】
2008536488.tif 000015
ヒト前立腺癌に関係する複数の臨床上および実験上の設定における「幹性」遺伝子サブセットを同定するために、ヒト「幹性」遺伝子セットを、転移性ヒト前立腺腫瘍対原発性ヒト前立腺腫瘍、原発性前立腺腫瘍対隣接の正常前立腺組織および各設定についてのリストの一致／交差について検索する際のヒト前立腺癌の複数の実験モデルにおいて豊富な遺伝子と比較した。ヒト「幹性」遺伝子セットを、発現配列タグアセンブリの直接的な配列比較によって、マウスとヒトとで相同な対の検索を通じて定義されるマウスのＨＳＣ関連遺伝子についてのヒトホモログのリストから定義した。この実施例において、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ９５Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐを使用したマイクロアレイ解析から得られた遺伝子発現プロファイリングデータをこの解析において利用した（８２２のマウスとヒトとで相同な対のうち４６０）。
【０１１５】
本発明者らのデータから、「幹性」トランスクリプトームの構成要素が、樹立されたヒト前立腺癌細胞株、異種移植片、原発性前立腺腫瘍ならびに遠隔転移の臨床サンプルにおいて転写物量レベルで頻繁に変化していることが示唆され得る。このことから、「幹性」遺伝子の発現における差がヒト前立腺癌細胞の悪性の表現型の異なる特徴に関連し得ると示唆される。前立腺腫瘍において「幹性」遺伝子の変化した発現の潜在的な臨床的関連を評価するために、本発明者らは、治療後の異なる臨床結果を示す原発性前立腺腫瘍が、「幹性」遺伝子の異なる発現プロファイルを示し得るか否かを解析しようと考えた。本発明者らは、表９ａ、９ｂ、９ｃおよび９ｄに示される２３、１４、５および１６の「幹性」遺伝子を含む４つの分子署名（それぞれ遺伝子セットＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）を同定した。それらは、再発性および非再発性の疾患を有する患者からの前立腺腫瘍において異なる発現プロファイルを示すようである（図１４、１５、１６および１７を参照のこと）。このことから、疾患の無痛の臨床経過および正の治療結果を示す前立腺腫瘍と比較して、攻撃的な臨床的挙動および治療後の有害な結果を示す前立腺癌腫が活性化され得、そして反対の領域の「幹性」遺伝子を抑制し得ることが示唆される。
【０１１６】
【表９−１】
2008536488.tif 000016
【０１１７】
【表９−２】
2008536488.tif 000017
【０１１８】
【表９−３】
2008536488.tif 000018
表９ａ、９ｂ、９ｃおよび９ｄに示される遺伝子の各々に対応するプローブおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットＵ９５Ａｖ２からのプローブについてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブＩＤ番号は、「アレイファインダー（Ａｒｒａｙ  Ｆｉｎｄｅｒ）」および検索を実行するための識別子としてＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤまたはＵｎｉｇｅｎｅ  ＩＤのいずれかを使用して、ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５セットについてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｒｒａｙｓ／ｓｐｅｃｉｆｉｃ／ｈｇｕ９５．ａｆｆｘにおいて検索することができる。さらに、Ｕ９５プローブセット内のすべてのプローブを示す表（各プローブＩＤおよび対応する遺伝子ならびに他の詳細を含む）は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｎｅｔａｆｆｘ／ｓｈｏｗｒｅｓｕｌｔｓ．ａｆｆｘ．で見ることができる。
【０１１９】
「幹性」遺伝子発現署名の予後の値
ヒト前立腺癌において「幹性」遺伝子の変化した発現の潜在的な臨床上の有用性をさらに調べるために、本発明者らは、個別の前立腺腫瘍における「幹性」署名の発現プロファイルの評価が、前立腺癌患者を、診断時に前立腺全摘除術後に疾患が再発する可能性が統計的に異なるサブグループに層別化する際に役立ち得るか否かを調べた。本発明者らは、再発性および非再発性の前立腺腫瘍を有する患者を異なるサブグループに分離する能力に基づいて、同定された「幹性」署名の各々の予後診断能力を評価した。個別の「幹性」署名の潜在的な予後関連性を評価するために、本発明者らは、結果セット１の２１の腫瘍サンプルの各々について、個別のサンプルの発現プロファイルと、再発性対非再発性の腫瘍の「平均」発現プロファイル（１４−遺伝子署名または遺伝子セットＢ）または関連する実験上または臨床上のサンプルの「幹性」発現プロファイルとを比較することによってピアソン相関係数を計算した（図１４、１５、１６、１７および表９ｂ）。前立腺癌の再発性臨床的挙動を有する同定された「幹性」署名の発現プロファイルの予想される相関に基づいて、本発明者らは、個別のサンプルについて計算された対応する相関係数を「幹性」表現型関連指標（ＳＰＡＩ）と名づけた。
【０１２０】
同定された「幹性」遺伝子発現署名の予後診断能力を評価するために、本発明者らは、正および負のＳＰＡＩを有する前立腺癌患者における治療後のクリニカルエンドポイント無病状態間隔（ＤＦＩ）を使用してカプランマイヤー生存解析を行った。カプランマイヤー生存曲線は、「幹性」署名によって定義される正および負のＳＰＡＩを有する群間で前立腺癌患者が治療後に無病状態のままでいる確率において高い有意差を示した（図１８、１９、２０および２１）。このことから、正のＳＰＡＩを有する患者が、不良な結果の署名を示す一方で、負のＳＰＡＩを有する患者は、良好な結果署名を示すことが示唆される。２３−遺伝子「幹性」署名または遺伝子セットＡ（表９ａおよび図１８）によって定義された負のＳＰＡＩを有する患者の群と比較して、正のＳＰＡＩを有する患者の群における治療後の疾患再発についての推定危険率は、３０．０６であった（９５％信頼区間、２０．１４〜８００．４；Ｐ＜０．０００１）。正のＳＰＡＩを有する患者の１００％が、治療後３年以内に疾患を再発した一方で、負のＳＰＡＩを有する患者の１００％は、少なくとも３年間は再発しないままであった（図１８）。治療の５年後、正のＳＰＡＩを有する患者の１００％が疾患を再発した一方で、負のＳＰＡＩを有する患者の９２％は、再発しないままであった（図１８）。この解析に基づいて、本発明者らは、正の「幹性」署名を有する前立腺癌患者の群を予後が不良な群として、そして負の「幹性」署名を有する前立腺癌患者の群を予後が良好な群として同定することを提案する。
【０１２１】
理論的に、署名の組み合わせに基づいた再発予測アルゴリズムは、特に患者の独立した試験コホートを使用した検証解析の間、単一の予測署名よりも頑強であるはずである。それゆえ本発明者らは、４つの「幹性」署名の組み合わせが、患者の分類試験において個別の署名と同様の正確性で行われるか否かを解析した。カプランマイヤー生存解析（図２２）は、予後が不良な群（２つ以上の正の「幹性」署名を有すると定義された群）の患者が治療後に再発なしで生存する期間の中央値が２６ヶ月であることを示した。予後が不良な群の患者の８９％が、治療後５年以内に疾患を再発した一方で、予後が良好な群（３または４つの負の「幹性」署名を有すると定義された群）の患者の１００％は、再発しないままであった（図２２；Ｐ＜０．０００１）。「幹性」署名アルゴリズムを使用したところ、治療後に疾患を再発した８人すべての患者は、予後が不良な群に正しく分類された。
【０１２２】
同定された「幹性」署名の潜在的な臨床上の有用性をさらに確かめるために、本発明者らは、治療後に再発した３７人の前立腺癌患者および無病状態のままであった４２人の患者から得られた７９の臨床サンプル（結果セット２）の独立したセットに適用される署名の予後診断能力を評価した。カプランマイヤー生存解析により、４つすべての個別の「幹性」署名が、前立腺癌患者を、治療後に再発しないままである確率において統計的に有意な差で、予後が不良なサブグループおよび予後が良好なサブグループに分離することが証明された。
【０１２３】
次に、本発明者らは、４つの「幹性」署名の組み合わせが、患者の分類試験において個別の署名と同様に正確に行われるか否かを判定した。カプランマイヤー生存解析から、予後が不良な群（４つの正の「幹性」署名を有すると定義された群）の患者が治療後に再発せずに生存する期間の中央値が６ヶ月であることが示された（図２３および２４を参照のこと）。予後が不良な群の患者の８０％が、治療後１年以内に疾患を再発した一方で、予後が良好な群（３または４つの負の「幹性」署名を有すると定義された群）の患者の９２％は、再発しないままであった。予後が不良な群のすべての患者は、治療後３年以内に疾患を再発した一方で、予後が良好な群の患者の８０％は、少なくとも３年間は再発しないままであった。予後が不良な群の患者の治療後の疾患再発についての推定危険率（ｒａｔｉｏｎ）は、再発予測アルゴリズムによって定義される患者の予後が良好な群と比較して、９．１７２であった（９５％信頼区間、４７．７９〜５４８４；Ｐ＜０．０００１）。
【０１２４】
カプランマイヤー生存解析から、患者のこのコホートにおいて中間の予後を示す群が同定された。「幹性」アルゴリズムによって２または３つの正の署名を有すると定義された予後が中間である群の患者が治療後に再発せずに生存した期間の中央値は、４９．４ヶ月であった（図２３および２４を参照のこと）。予後が中間である群の患者の５８％が、治療後３年以内に疾患を再発した一方で、予後が良好な群の患者の８０％は、再発しないままであった。予後が中間である群の患者の４５％が、治療後５年以内に疾患を再発した一方で、予後が良好な群の患者の７８％は、再発しないままであった。予後が不良な群の治療後の疾患再発についての推定危険率は、再発予測アルゴリズムによって定義された予後が良好な群の患者と比較して、２．８３２であった（９５％信頼区間、１．４７５〜６．２８１；Ｐ＝０．００２６）。全体としては、「幹性」再発予測アルゴリズムを適用することにより、前立腺摘除術後１年以内に治療が不十分であった患者の８２％を予後が不良である群および予後が中間である群に正しく層別化することができた。
【０１２５】
ヒト前立腺癌における「幹性」遺伝子の異常な発現の潜在的な有意性をさらに確かめるために、本発明者らは、異なる「幹性」遺伝子発現プロファイルを有する前立腺癌患者における実際の疾患再発の頻度を解析した。この解析から、４および３つの正の「幹性」署名を有する患者のサブグループが進行の初期においてでも非常に攻撃的な悪性の疾患を有したこと：このサブグループのステージ１Ｃ患者の１００％が前立腺全摘除術後に疾患が再発したと診断されたことがはっきりと示された。全体として、このサブグループの患者の７６％が、疾患を再発し、患者の４８％は、前立腺摘除術後１年以内に再発と診断された。対照的に、４つの負の「幹性」署名を有する患者の７９％は、無病状態のままであり、５％だけが手術後１年以内に再発した。
【０１２６】
要約すれば、本発明者らの解析から、「幹性」トランスクリプトームの構成要素として同定された遺伝子の発現が、前立腺癌において頻繁に変化していることが示唆されるようであり、このことから、前立腺癌進行が、少なくとも部分的に正常幹細胞において活性化された転写場所内で生じると示唆される。正常幹細胞の生物学的特徴の１つは、自発的にインビトロおよびインビボにおいて再プログラムされた生存可能な体細胞性の細胞ハイブリッドの形成をもたらす他の細胞タイプと融合する能力である（Ｖａｓｓｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｐ．−Ｒ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｌｉｖｅｒ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２２：９０１−９０４；Ａｌｖａｒｅｚ−Ｄｏｌａｄｏ，Ｍ．，ら、Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ−ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ，ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２５：９６８−９７３；Ｗｅｉｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．，ら、Ｓｔａｂｌｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎｓ  ｆｏｒｍ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｉｎ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３，５：９５９−９６６；ＬａＴｕｌｉｐｐｅ，Ｅ．，ら、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２，６２：４４９９−４５０６、本明細書中で参考として援用される）。どのようにして癌細胞が「幹性」トランスクリプトームを進行経路に取り込むのかということ、およびいくつかのヒト癌腫が幹細胞「ニッチ」微小環境を模倣することによって幹細胞を引きつけることにより、正常幹細胞を悪性のプロセスに直接関与させ得るか否かということを研究することが興味深いだろう。
【０１２７】
本発明は、好ましい実施形態および様々な代替の実施形態を参照して特に示され、記載されてきたが、形態および詳細における様々な変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが当業者に理解されるだろう。本明細書の本体内で引用されたすべての参考文献、発行された特許および特許出願は、すべての目的のために本明細書によってそれらの全体が参考として援用される。
【０１２８】
【数１】
2008536488.tif 000019
【０１２９】
【数２】
2008536488.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様および利点は、以下の記載および添付の図面に関してより理解されるようになる：
【図１】図１は、転移性の腫瘍から樹立された複数のヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ−３、ＬＮＣａｐ、ＤｕＣａｐ、ＶＣａｐなど）および正常ヒト前立腺上皮細胞、ＮＰＥＣ（ＮＰＥＣ、正常前立腺上皮細胞）におけるＢＭＩ−１のｍＲＮＡのマイクロアレイデータから得られた発現値を示すグラフである。
【図２】図２は、前立腺癌のＴＲＡＭＰトランスジェニックマウスモデルにおける複数の遠位の標的器官における転移性の病変および原発性前立腺癌腫中の１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の（表現型関連指標として示された）発現プロファイルを示すグラフである。
【図３】図３は、ヒト前立腺癌患者の複数の遠位の標的器官における転移性の病変および原発性前立腺癌腫中の１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の（表現型関連指標として示された）発現プロファイルを示すグラフである。
【図４】図４は、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の異なる発現プロファイルを有する前立腺癌患者のカプランマイヤー生存曲線を示すグラフである。
【図５】図５は、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の異なる発現プロファイルを有する前立腺癌患者のカプランマイヤー無再発生存曲線を示すグラフである。ＲＰ，前立腺全摘除術。
【図６】図６は、重み付け生存予測スコアアルゴリズムを使用して異なるサブグループに層別化された７９人の前立腺癌患者についてのカプランマイヤー生存曲線を示すグラフである。
【図７】図７は、初期の疾患（ステージ１Ｃおよび２Ａ）と診断された前立腺癌患者の異なるサブグループについてのカプランマイヤー生存曲線を示すグラフである。
【図８】図８は、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して１１−遺伝子署名の異なるサブグループに層別化された２０人の前立腺癌患者についてのカプランマイヤー生存曲線を示すグラフである。
【図９】図９は、９７人の初期乳癌患者のうち、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現プロファイルによって定義される予後が良好な署名または予後が不良な署名を有するか否かににしたがって患者が治療後に転移しないままであるか、または生存する確率のカプランマイヤー解析を示すグラフである。
【図１０】図１０は、すべてのステージの１２５人の肺腺癌患者のうち、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現プロファイルによって定義される予後が良好な署名または予後が不良な署名を有するか否かに従って、患者が治療後に転移しないままであるか、または生存する確率のカプランマイヤー解析を示すグラフである。
【図１１】図１１は、すべてのステージの３７人の卵巣癌患者のうち、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現プロファイルによって定義される予後が良好な署名または予後が不良な署名を有するか否かに従って、患者が、治療後に転移しないままであるか、または生存する確率のカプランマイヤー解析を示すグラフである。
【図１２】図１２は、３１人の膀胱癌患者のうち、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の発現プロファイルによって定義される予後が良好な署名または予後が不良な署名を有するか否かに従って、患者が、治療後に転移しないままであるか、または生存する確率のカプランマイヤー解析を示すグラフである。
【図１３】図１３は、非上皮性癌であるリンパ腫と診断され、１１−遺伝子ＭＴＴＳ／ＰＮＳ署名の異なる発現プロファイルを有する癌患者における治療失敗の確率についてのカプランマイヤー生存解析を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ヌードマウスにおける高度に転移性のＰＣ３ＭＬＮ４同所性異種移植片中の「幹性」転写物量パターンに似た再発性疾患を有する患者からの原発性前立腺腫瘍における２３−遺伝子「幹性」署名の発現プロファイルを示すグラフである。
【図１５】図１５は、遠隔前立腺癌転移における「幹性」転写物量パターンに似た再発性疾患を有する患者からの原発性前立腺腫瘍における１６−遺伝子「幹性」署名の発現プロファイルを示すグラフである。
【図１６】図１６は、８の再発性ヒト前立腺癌腫対１３の非再発性ヒト前立腺癌腫における１４−遺伝子「幹性」署名の発現プロファイルを示すグラフである。
【図１７】図１７は、ヌードマウスにおける高度に転移性のＰＣ３ＭＬＮ４同所性異種移植片中の「幹性」転写物量パターンに似た再発性疾患を有する患者からの原発性前立腺腫瘍における５−遺伝子「幹性」署名の発現プロファイルを示すグラフである。
【図１８】図１８は、２３−遺伝子「幹性」署名の発現プロファイルによって定義される予後が良好な署名または予後が不良な署名を有するか否かに従って、臨床結果群１を含む２１人の前立腺癌患者のうち、患者が無病状態のままである確率のカプランマイヤー解析を示すグラフである。
【図１９】図１９は、１４−遺伝子「幹性」署名の発現プロファイルによって定義される予後が良好な署名または予後が不良な署名を有するか否かに従って、臨床結果群１を含む２１人の前立腺癌患者のうち、患者が無病状態のままである確率のカプランマイヤー解析を示すグラフである。
【図２０】図２０は、５−遺伝子「幹性」署名の発現プロファイルによって定義される予後が良好な署名または予後が不良な署名を有するか否かに従って、臨床結果群１を含む２１人の前立腺癌患者のうち、患者が無病状態のままである確率のカプランマイヤー解析を示すグラフである。
【図２１】図２１は、１６−遺伝子「幹性」署名の発現プロファイルによって定義される予後が良好な署名または予後が不良な署名を有するか否かに従って、臨床結果群１を含む２１人の前立腺癌患者のうち、患者が無病状態のままである確率のカプランマイヤー解析を示すグラフである。
【図２２】図２２は、患者が少なくとも２つの正の署名または少なくとも３つの負の署名を有する場合に、患者が無病状態のままでいる確率のカプランマイヤー解析を示すグラフである。
【図２３】図２３は、患者が４つの正の署名または２つもしくは３つの正の署名あるいは３つもしくは４つの負の署名を有する場合に、患者が無病状態のままでいる確率のカプランマイヤー解析を示すグラフである。
【図２４】図２４は、４つの「幹性」署名アルゴリズムによって定義された、異なる「幹性」遺伝子発現プロファイルを有する前立腺癌患者における前立腺全摘除術後の疾患再発の実際の頻度を示すグラフである。
【０１３１】
（配列表）
【０１３２】
【化１】
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【０１３３】
【化２】
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【０１３４】
【化３】
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【０１３５】
【化４】
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【０１３６】
【化５】
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【０１３７】
【化６】
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【０１３８】
【化７】
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【０１３９】
【化８】
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【０１４０】
【化９】
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【０１４１】
【化１０】
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【０１４２】
【化１１】
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【０１４３】
【化１２】
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【０１４４】
【化１３】
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【０１４５】
【化１４】
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【０１４６】
【化１５】
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【０１４７】
【化１６】
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【０１４８】
【化１７】
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【０１４９】
【化１８】
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【０１５０】
【化１９】
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【０１５１】
【化２０】
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【０１５２】
【化２１】
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【０１５３】
【化２２】
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【０１５４】
【化２３】
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【０１５５】
【化２４】
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【０１５６】
【化２５】
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【０１５７】
【化２６】
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【０１５８】
【化２７】
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【０１５９】
【化２８】
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【０１６０】
【化２９】
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【０１６１】
【化３０】
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【０１６２】
【化３１】
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【０１６３】
【化３２】
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【０１６４】
【化３３】
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【０１６５】
【化３４】
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【０１６６】
【化３５】
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【０１６７】
【化３６】
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【０１６８】
【化３７】
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【０１６９】
【化３８】
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【０１７０】
【化３９】
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【０１７１】
【化４０】
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【０１７２】
【化４１】
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【０１７３】
【化４２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月11日(2008.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008536488000001.app
【国際調査報告】
2008536488.tif 000129
2008536488.tif 000130
2008536488.tif 000131