(57)【要約】  多成分、典型的には生体サンプルから化合物を単離するための方法。この方法は、化合物を反対の電荷に結合して粒子／化合物錯体が形成されるように、結合電荷を有する少なくとも１つの常磁性粒子を使用する。あるいは常磁性粒子は、粒子／化合物錯体を形成するために目標化合物に対してアフィニティーを有するリガンドまたは官能基を有する。錯体は、粒子／タンパク質錯体に磁場を印加することによって固定化することができる。サンプルは、より純粋な形のタンパク質サンプル、または選択された化合物が減少したサンプルが得られるように、さらに処理することができる。
2008509393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）鉄、コバルト、およびニッケルからなる群から選択された金属；酸化鉄、硫化鉄、塩化鉄、水酸化第二鉄、および酸化第一第二鉄からなる群から選択された金属化合物；および有機金属化合物を含む少なくとも１つの常磁性粒子を、１種または複数の目標化合物を含むサンプルに添加するステップであって、少なくとも１つの常磁性粒子が１つまたは複数の目標化合物を有し、少なくとも１つの常磁性粒子が、サンプル中の目標化合物の１種または複数に対してアフィニティーを有する１つまたは複数のリガンドまたは官能基を有するものであるステップと、
ｂ）１つまたは複数のリガンドまたは官能基を、１種または複数の目標化合物に接触させて、錯体を形成するステップと、
ｃ）磁場を印加することによって錯体を固定化するステップと、
ｄ）磁場によって固定化されていないサンプルの部分を除去するステップと、
ｅ）磁場を除去して前記錯体を解放するステップと、
ｆ）前記錯体から目標化合物を溶出するステップと、
ｇ）常磁性粒子を固定化するステップと、
ｈ）目標化合物を回収するステップと
を含むことを特徴とするサンプルから目標化合物を単離するための方法。
【請求項２】
１つまたは複数のリガンドまたは官能基は、少なくとも１つの常磁性粒子と共有結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つまたは複数のリガンドまたは官能基は、抗体、抗原、ハプテン、受容体、酵素、ポリペプチド、タンパク質、およびポリヌクレオチドからなる群から選択された目標化合物に特異的であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つまたは複数のリガンドまたは官能基は、生物学的結合によって結合されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生物学的結合は、ストレプトアビジン−ビオチン、アビジン−ビオチン、炭水化物−レクチン、および酵素−酵素阻害剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ａ）少なくとも１つの常磁性粒子を、１種または複数の目標化合物を含むサンプルに添加するステップであって、少なくとも１つの常磁性粒子が、そこに結合している１つまたは複数のリガンドまたは官能基を有し、１つまたは複数のリガンドまたは官能基が、前記サンプル中の問題になっていない目標化合物の１種または複数に対してアフィニティーを有するものであるステップと、
ｂ）リガンドまたは官能基を、問題となっていない化合物に接触させて、錯体を形成するステップと、
ｃ）磁場を印加することによって錯体を固定化するステップと、
ｄ）磁場によって固定化されていないサンプルの部分を除去するステップであって、このように除去された前記サンプルが、１種または複数の目標化合物を含有するものであるステップと
を含むことを特徴とする１種または複数の目標化合物および問題となっていない化合物を含むサンプルから目標化合物を単離するための方法。
【請求項７】
１つまたは複数のリガンドまたは官能基は、常磁性粒子と共有結合することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１つまたは複数のリガンドまたは官能基は、抗体、抗原、ハプテン、受容体、酵素、ポリペプチド、タンパク質、およびポリヌクレオチドからなる群から選択された化合物に特異的であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの常磁性粒子は、鉄、コバルト、およびニッケルからなる群から選択された金属であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの常磁性粒子は、酸化鉄、硫化鉄、塩化鉄、水酸化第二鉄、および酸化第一第二鉄からなる群から選択された鉄化合物であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
１つまたは複数のリガンドまたは官能基は、生物学的結合により結合されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
生物学的結合は、ストレプトアビジン−ビオチン、アビジン−ビオチン、炭水化物−レクチン、および酵素−酵素阻害剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）少なくとも１つの常磁性粒子を、１種または複数の目標化合物を含むサンプルに添加するステップであって、少なくとも１つの常磁性粒子および１種または複数の目標化合物は、電荷の差を有するものであるステップと、
ｂ）１種または複数の目標化合物と少なくとも１つの常磁性粒子との間に錯体を生成するステップと、
ｃ）磁場を印加することによって錯体を固定化するステップと、
ｄ）サンプルから、磁場によって固定化された錯体を分離するステップと、
ｅ）磁場を除去することによって錯体を解放するステップと、
ｆ）前記目標化合物を錯体から溶出するステップと、
ｇ）前記常磁性粒子を固定化するステップと、
ｈ）前記目標化合物を回収するステップと
を含むことを特徴とするサンプルから化合物を単離するための方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの常磁性粒子は、そこに結合している１つまたは複数の荷電官能基を有し、それによって少なくとも１つの常磁性粒子に全電荷がもたらされるようになされていることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
遠心分離し、濾過し、アフィニティークロマトグラフィーを介して精製し、錯体を分解した後に磁場を印加するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
サンプルは、サンプルのｐＨを変化させることによって改変することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルは、イオン強度を変化させることによって改変することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの常磁性粒子は、鉄、コバルト、およびニッケルからなる群から選択された金属であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの常磁性粒子は、酸化鉄、硫化鉄、塩化鉄、水酸化第二鉄、および酸化第一第二鉄からなる群から選択された鉄化合物であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年８月３日に出願した米国特許出願第６０／５９８，１１８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、一般に、多成分サンプルから化合物を選択的に精製するのに有用な、組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、アフィニティーまたはイオン交換クロマトグラフィー法による直接的な手法で化合物を抽出するための、常磁性化合物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
以下の考察では、背景および序文として、ある物品および方法について述べる。従来技術と「認められるもの」は本明細書には含まれない。本出願人は特に、適切な場合には、本明細書に引用される物品および方法が、適用可能な法規定の下で従来技術を構成しないことを実証する権利を保有する。
【０００４】
従来、精製スキームは、精製される化合物とそこに含有される望ましくない汚染物質との間での、サイズ、電荷、および可溶性という分子特性の相違に基づいている。これらのパラメータに基づくプロトコルには、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、差次的沈殿（differential precipitation）などが含まれる。
【０００５】
通常はゲル濾過またはゲル透過クロマトグラフィーと呼ばれるサイズ排除クロマトグラフィーは、固定相粒子の孔内への、移動相の分子の浸透に依存する。差次的浸透(differential penetration)は、粒子の流体力学的体積の関数である。したがって理想的な条件下では、より大きい分子が粒子内部から除外され、一方、より小さい分子はこの体積に接近可能であり、その溶出順序は、溶出体積と分子量の対数との間に線形関係が存在することから、化合物のサイズによって予測することができる。
【０００６】
イオン交換クロマトグラフィーでは、サンプルの荷電官能基と、吸着剤表面の反対の電荷を有するイオン官能基とが相互に作用する。２つの一般的なタイプの相互作用が知られている。第１は、正に帯電した表面と相互に作用する負に帯電した官能基によって媒介される、陰イオン交換クロマトグラフィーである。第２は、負に帯電した表面と相互に作用する正に帯電した官能基によって媒介される、陽イオン交換クロマトグラフィーである。
【０００７】
つい最近、アフィニティークロマトグラフィーおよび疎水的相互作用クロマトグラフィー技法は、より伝統的なサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィープロトコルを補うように開発された。アフィニティークロマトグラフィーは、化合物と固体化されたリガンドとの相互作用に依存する。リガンドは、問題とされる特定の化合物に特異的になることができ、その場合のリガンドは、基質(substrate)、基質類似体、阻害剤、または抗体である。あるいはリガンドは、いくつかの化合物と反応することができる。アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、ニコチンアデニンジヌクオチド、またはある色素などの一般的リガンドを、特定の種類のタンパク質を回収するのに用いることができる。
【０００８】
金属アフィニティー分配は、一部のタンパク質の表面に接近可能な、ヒスチジンおよびシステインなどの電子リッチなアミノ酸残基に対する遷移金属イオンのアフィニティーを活用する。金属イオンが部分的にキレート化し、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）などの線状ポリマーに結合する場合、得られるポリマー結合金属キレートを使用して、ＰＥＧ塩またはＰＥＧデキストラン水性２相系のポリマーリッチ相に対する金属結合タンパク質の分配を高めることができる。
【０００９】
タンパク質の単離のために、金属アフィニティーリガンドを利用することが知られている。ヒスチジンおよびシステイン含有タンパク質は、ポリマースペーサに結合しかつ銅、亜鉛またはニッケルなどの金属に結合するイミノ二酢酸（「ＩＤＡ」）などのキレート剤で官能化した支持体を使用して、互いにクロマトグラフィーにより分離できることが実証されている。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（「ＩＭＡＣ」）は、タンパク質クロマトグラフィーに有用なツールとなり、いくつかのＩＤＡベースのＩＭＡＣ樹脂が、現在市販されている。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，９０７，０３５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
組成製剤から目標タンパク質を精製するために金属キレートを使用する場合、多くの問題が生ずる。１つの問題は、特に、目標タンパク質に対するリガンドの選択性に集中しており、すなわちリガンドは、目標タンパク質の結合において選択性が不十分でありまたは過剰になる可能性がある。また、目標タンパク質とのリガンドの結合を阻害する粗製系での窒素含有化合物の問題もある。最後に、水性２相分配系で使用される塩による、タンパク質の溶解度および可能性あるタンパク質の沈殿に関する問題がある。これらの問題のすべては、目標タンパク質の収量に劇的な影響を及ぼす可能性がある。
【００１２】
特許文献１（Ｇｕｉｎｎ）は、粗製タンパク質溶液から目標タンパク質を精製するために水性２相金属アフィニティー分配系を使用することによる、金属キレート化に関連した問題の対処を試みている。この方法は、水性２相系を生成するための、塩およびポリマーなどの不活性な疎水性分子の使用と、この錯体に目標タンパク質を選択的に結合することによってこの目標タンパク質を精製するための、ポリマー−キレート剤−金属錯体の使用を含む。
【００１３】
粗製サンプルから小分子化合物、高分子、またはタンパク質を迅速に単離する、効果的かつ自動化された方法は、得られていない。沈殿技法は、依然として粗雑であり、自動化するのが難しい。クロマトグラフィーは、費用がかかり時間もかかる。したがって、粗製の化学的に多様なサンプル中の化合物を、迅速に分別しかつ単離する技法が、依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的は、イオン交換またはアフィニティーをベースにした方法の両方で利用することができる捕捉技術を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、化合物の混合物を含有する有機または生体サンプルを分別するための、堅牢で安価な手段を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、目標化合物に特異的なアフィニティーを有するリガンドまたは官能基を使用することによって、サンプルから化合物を分離するための方法を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、化合物を分離し単離するために、化合物と、常磁性粒子に結合している荷電官能基またはリガンドとの間の電荷の差を使用することである。
【００１８】
化合物の精製および取扱いのためにより効果的で効率的な技法を提供するために、本発明は、目標化合物を結合するのに有用な組成物に関する。目標化合物は、小分子化合物、タンパク質、ペプチド、またはポリヌクレオチドでよい。組成物は、目標化合物に対するリガンドまたは官能基の親和性に基づいて目標化合物を結合することが可能な、リガンドまたは官能基が結合している常磁性粒子を含む。また本発明は、キットのように包装された組成物、ならびにそのような組成物を利用する方法も含む。
【００１９】
本発明は、多成分サンプルから１種または複数の化合物を単離する方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの常磁性粒子を、１種または複数の目標化合物を含むサンプルに添加することによって開始することができる。少なくとも１つの常磁性粒子は、そこに１つまたは複数の官能基またはリガンドが結合しており、その各官能基またはリガンドは、サンプル中の目標化合物の１種または複数に対してアフィニティーを有している。この方法は、錯体を形成するために、官能基またはリガンドを目標化合物に接触させることによって継続する。錯体は、外部磁場によって固定化する。固定化されないサンプルの残りの部分を除去し、さらに処理するために目標化合物を残す。錯体は、追加の化学作用または精製方法をこの錯体に実施することができるように、磁場を除去しそれによって錯体を解放することにより、さらに処理することができる。あるいは、問題となっている化合物以外の化合物を、錯体に結合し、残りの溶液から分離することができる。固定化されない溶液は、結合材料から分離し、このより濃縮された状態において必要に応じて処理することができる。
【００２０】
サンプルから目標化合物を単離するための本発明の方法は、ａ）酸化鉄、硫化鉄、塩化鉄、水酸化第二鉄、および酸化第一第二鉄(ferrosoferric oxide)からなる群から選択された少なくとも１つの常磁性粒子を、１種または複数の目標化合物を含むサンプルに添加するステップであって、前記少なくとも１つの常磁性粒子が、そこに結合している１つまたは複数のリガンドまたは官能基を有し、前記リガンドまたは官能基が、前記サンプル中の目標化合物の１種または複数に対してアフィニティーを有するものであるステップと、ｂ）１つまたは複数のリガンドまたは官能基を、１種または複数の目標化合物に接触させて錯体を形成するステップと、ｃ）磁場を印加することによって錯体を固定化するステップと、ｄ）磁場によって固定化されていないサンプルの部分を除去するステップと、ｅ）磁場を除去して錯体を解放するステップと、ｆ）前記錯体から前記目標化合物を溶出するステップと、ｇ）前記常磁性粒子を固定化するステップと、ｈ）前記目標化合物を回収するステップとを含む。
【００２１】
本発明の方法は、前記１つまたは複数のリガンドまたは官能基が少なくとも１つの常磁性粒子に共有結合しているものである方法を、上述のように実施することができる。
【００２２】
本発明の方法は、前記１つまたは複数のリガンドまたは官能基が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、酵素、ポリペプチド、タンパク質、およびポリヌクレオチドからなる群から選択された目標化合物に特異的なものである方法を、上述のように実施することができる。
【００２３】
本発明の方法は、少なくとも１つの常磁性粒子が、鉄、コバルト、およびニッケルからなる群から選択された金属である方法を、上述のように実施することができる。
【００２４】
本発明の方法は、前記１つまたは複数のリガンドまたは官能基が生物学的結合によって結合しているものである方法を、上述のように実施することができる。
【００２５】
本発明の方法は、前記生物学的結合が、ストレプトアビジン−ビオチン、アビジン−ビオチン、炭水化物−レクチン、および酵素−酵素阻害剤からなる群から選択されたものである方法を、上述のように実施することができる。
【００２６】
１種または複数の目標化合物および問題となっていない化合物を含むサンプルから目標化合物を単離するための代替方法は、ａ）少なくとも１つの常磁性粒子を、１種または複数の目標化合物を含むサンプルに添加するステップであって、前記少なくとも１つの常磁性粒子が、そこに結合している１つまたは複数のリガンドまたは官能基を有し、前記１つまたは複数のリガンドまたは官能基が、前記サンプル中の問題になっていない目標化合物の１種または複数に対してアフィニティーを有するものであるステップと、ｂ）リガンドまたは官能基を、問題となっていない化合物に接触させて、錯体を形成するステップと、ｃ）磁場を印加することによって錯体を固定化するステップと、ｄ）磁場によって固定化されていないサンプルの部分を除去するステップであって、このように除去された前記サンプルは、１種または複数の目標化合物を含有するものであるステップとを含む。
【００２７】
本発明の方法は、前記１つまたは複数のリガンドまたは官能基が常磁性粒子に共有結合しているものである方法を、上述のように実施することができる。
【００２８】
本発明の方法は、前記１つまたは複数のリガンドまたは官能基が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、酵素、ポリペプチド、タンパク質、およびポリヌクレオチドからなる群から選択された化合物に対して特異的なものである方法を、上述のように実施することができる。
【００２９】
本発明の方法は、少なくとも１つの常磁性粒子が、鉄、コバルト、およびニッケルからなる群から選択される金属である方法を、上述のように実施することができる。
【００３０】
本発明の方法は、少なくとも１つの常磁性粒子が、酸化鉄、硫化鉄、塩化鉄、水酸化第二鉄、および酸化第一第二鉄からなる群から選択された鉄化合物である方法を、上述のように実施することができる。
【００３１】
本発明の方法は、前記１つまたは複数のリガンドまたは官能基が、生物学的結合によって結合している方法を、上述のように実施することができる。
【００３２】
本発明の方法は、前記生物学的結合が、ストレプトアビジン−ビオチン、アビジン−ビオチン、炭水化物−レクチン、および酵素−酵素阻害剤からなる群から選択されるものである方法を、上述のように実施することができる。
【００３３】
サンプルから化合物を単離するための別の代替方法は、ａ）少なくとも１つの常磁性粒子を、１種または複数の目標化合物を含むサンプルに添加するステップであって、前記少なくとも１つの常磁性粒子および前記１種または複数の目標化合物は、電荷の差を有するものであるステップと、ｂ）前記１種または複数の目標化合物と前記少なくとも１つの常磁性粒子との間に錯体を生成するステップと、ｃ）磁場を印加することによって錯体を固定化するステップと、ｄ）サンプルから、磁場によって固定化された錯体を分離するステップと、ｅ）磁場を除去することによって錯体を解放するステップと、ｆ）前記目標化合物を前記錯体から溶出するステップと、ｇ）前記常磁性粒子を固定化するステップと、ｈ）前記目標化合物を回収するステップとを含む。
【００３４】
本発明の方法は、少なくとも１つの常磁性粒子に全電荷が提供されるように、少なくとも１つの常磁性粒子が、そこに結合している１つまたは複数の荷電官能基を有する方法を、上述のように実施することができる。
【００３５】
本発明の方法は、磁場を印加する前に、錯体を遠心分離し、濾過し、アフィニティークロマトグラフィーを介して精製し、分解するステップをさらに含む方法を、上述のように実施することができる。
【００３６】
本発明の方法は、サンプルのｐＨを変化させることによってサンプルを改変させる方法を、上述のように実施することができる。
【００３７】
本発明の方法は、イオン強度を変化させることによってサンプルを改変させる方法を、上述のように実施することができる。
【００３８】
本発明の方法は、少なくとも１つの常磁性粒子が、鉄、コバルト、およびニッケルからなる群から選択される金属である方法を、上述のように実施することができる。
【００３９】
また本発明は、上述の構成要素の一部またはすべての組合せを含む、サンプルからタンパク質を単離するためのキットにも関する。
【００４０】
本発明のその他の対象、目的、および利点は、本発明の以下の記述により明らかにされよう。
【００４１】
本発明の前述およびその他の特徴、態様、および利点は、以下の記述、添付の特許請求の範囲、および以下に簡単に説明がなされる図面に示す例示的な実施形態から明らかにされよう。他に特に指示しない限り、同様の要素には同じ参照番号が付されることに留意されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
次に本発明の原理について、このある例示的な実施形態の以下の考察により、また添付の図面に描かれた図を参照することにより、さらに説明する。
【００４３】
本発明は、粗製の有機または生体サンプルから目標化合物を抽出するための、物質の独自の組成物とその使用方法に関する。
【００４４】
本発明は、多成分サンプルから１種または複数の化合物を単離するための方法を提供する。この方法は、少なくとも１つ常磁性粒子を、１種または複数の目標化合物を含むサンプルに添加することによって開始することができる。少なくとも１つの常磁性粒子は、そこに結合している１つまたは複数のリガンドまたは官能基を有し、その各リガンドまたは官能基は、サンプル中の目標化合物の１種または複数に対してアフィニティーを有している。この方法は、錯体を形成するために、リガンドまたは官能基を目標化合物に接触させることにより継続する。錯体は、外部磁場によって固定化される。固定化されていないサンプルは除去され、さらなる処理に向けて目標化合物が残される。錯体は、この錯体に追加の化学作用または精製方法を実施することができるように、磁場を除去し、それによって錯体を解放することにより、さらに処理することができる。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの常磁性粒子とは反対の電荷を有する目標化合物を、差別的に結合し分離するために、少なくとも１つの帯電常磁性粒子を使用する。電荷の差は、サンプルを改変させることによって、少なくとも１つの常磁性粒子と、目標化合物の１種または複数との間で生成することができる。
【００４６】
本明細書で使用する「常磁性粒子」という用語は、磁場に置いたときにそれらに与えられた磁気モーメントを有することが可能な粒子を意味する。典型的な場合、常磁性粒子は、金属である鉄、コバルト、またはニッケルからなる。これらの元素は、その基底状態またはゼロ酸化状態にありながら常磁性状態で存在することしか知られていない。これら３種の金属に加え、有機および有機金属化合物も常磁性を有し、同様に使用してもよい。
【００４７】
本明細書で使用する「サンプル」という用語は、サンプル溶媒と、このサンプル溶媒に含有される無機および有機溶質とを指す。サンプルは、典型的には溶液相にあるが、ゲル、気相、ペーストなどを含めた物質のその他の相で存在してもよい。サンプルは、溶媒状態を変化させることによって、あるいはサンプル中の有機物質の１種または複数を直接変化させることによって改変することができる。サンプルは、サンプル要素のいずれか１つまたはその組合せを変化させることによって、常磁性粒子と目標化合物との間に十分な電荷の差がもたらされるように改変することができる。
【００４８】
例えば、サンプルのｐＨまたはイオン強度に対する変化は、常磁性粒子および目標化合物上の異なる電荷を結び付けることができるが、これに限定するものではない。イオン強度およびｐＨは、この目標化合物とそれほど区別しやすくはないその他の物理的性質を共有する化合物の群と混合された目標化合物を、差別的に結合する結合状態をもたらすように最適化することができる。あるいは、常磁性粒子と目標化合物との間で電荷の差が促進されるように、化学作用を、サンプル溶媒中に含有される化合物に実施することができる。目標化合物に対して実施することができる特定の化学作用には、カルボキシル基のエステル化、保護基の付加、あるいはシトラコニル化、マレイル化、トリフルオロアセチル化、スクシニル化、テトラフルオロスクシニル化などを含めたタンパク質／ペプチド変性技法によるものが含まれるが、これらに限定するものではない。
【００４９】
イオン交換による非特異的分別が、特定の適用例に適している場合、非リガンド付きの常磁性粒子、あるいはカルボキシルまたはアミン官能基のみ含有する常磁性粒子を利用することができる。
【００５０】
本発明は、宿主細胞または感染生物から核酸を放出する前に、サンプルからタンパク質を減少させるのに使用することができる。これは、核酸結合動態を改善するのに役立てることができる。この技法は、タンパク質を含まない核酸製剤が必要とされる場合に有用である。さらに本発明は、タンパク質結合状態を処理することによって、総タンパク質サンプル集団のサブセットを抽出するのに使用することができる。これらの目的で本発明を使用することにより、２つのまったく異なる用途が生じ、すなわち（１）問題となっているタンパク質を選択的に結合し、問題にされていない未結合のサンプルまたはタンパク質を廃棄し、結合したタンパク質を溶出してさらなる分析にかけること、および（２）結合したタンパク質が、問題となっているタンパク質を含有しない場合、この結合タンパク質または問題にされていないタンパク質を廃棄し、問題となっているタンパク質を含有する未結合のサンプルを収集して、さらなる分析にかけることである。どちらのシナリオの下でも、類似する電荷特性を共有するその他の化合物から問題となっている特定の化合物をさらに単離するために、追加のクロマトグラフィー技法を使用して、問題となっている化合物を分割することができる。
【００５１】
本発明によれば、常磁性粒子が電荷を保持する場合、この常磁性粒子は、常磁性粒子とは反対の全電荷を有する目標分子に可逆的に結合することになる。したがって、常磁性粒子および目標分子が結合して、目標分子／粒子錯体を形成する。
【００５２】
電荷は、いくつもの方法で常磁性粒子に結合することができる。一実施形態では、電荷は、荷電リガンドまたは官能基を常磁性粒子に結合することによって、結び付けることができる。別の実施形態では、電荷は、粒子を取り囲むサンプル溶液のｐＨを単に増減させることによって、常磁性粒子に結合することができる。どちらの実施形態においても、常磁性粒子上の全電荷は、リガンドまたは官能基（陰イオン性または陽イオン性）、サンプルのｐＨまたはイオン強度に応じて、正または負にすることができる。
【００５３】
特定の理論に拘泥することを望むものではないが、電荷を結合するのに酸を使用した場合、その酸性環境によって、常磁性粒子の金属部分の正に帯電した性質が増大すると考えられる。また、低ｐＨ状態によって、例えばタンパク質またはペプチド中の目標化合物の負荷電部あるいはグルタミン酸およびアスパラギン酸の高含量領域に対する粒子の結合性が増大すると考えられる。
【００５４】
常磁性粒子は、磁場に置かれたときに、この磁場の作用の下で移動可能である。そのような動きは、サンプル処理プロトコルにおいてまたはその他の操作のために、結合した目標化合物を移動させるのに有用である。したがって、常磁性粒子に結合した目標化合物は、サンプルを保持するレセプタクル内部に固定化することができ、あるいは、磁力の印加による最小限の直接接触によって、異なる試薬および／または状態に曝露するための異なる領域に移動することができる。
【００５５】
本発明で有用な常磁性粒子は、複雑な構造である必要はない。適切な常磁性粒子には鉄粒子が含まれ、鉄は、水性環境での溶解度が低い水酸化第二鉄および酸化第一第二鉄などの形の酸化鉄でよい。硫化鉄おおよび塩化鉄などのその他の鉄粒子は、本明細書に記述される条件を使用して目標化合物を結合し抽出するのに適切である可能性もある。
【００５６】
同様に、常磁性粒子の形状は、本発明にそれほど重要ではない。常磁性粒子は、例えば、球状、立方体、卵形、カプセル形、錠剤形、特徴のないランダムな形などを含めた様々な形状のものでよく、均一な形状または不均一な形状のものでよい。常磁性粒子の形がどのようであろうと、最も幅が広い点での直径は、一般に約０．０５μｍから約５０μｍの範囲内であり、特に約０．１から約０．３μｍの範囲内である。
【００５７】
電荷を常磁性粒子または目標化合物に結合するのに酸またはイオン強度を使用する場合、ｐＨまたはイオン強度は、様々な手段を通して提供することができる。例えば、常磁性粒子を酸性溶液に添加することができ、または酸性溶液を粒子に添加することができる。あるいは、常磁性粒子が位置付けられている溶液または環境は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸などの酸性化剤を添加することによって酸性化することができる。
【００５８】
常磁性粒子が位置付けられている環境のｐＨが約７．０未満であるならば、この粒子は、全負電荷を有する目標分子に可逆的に結合することになる。さらに、常磁性粒子（結合されるリガンドまたは官能基はない）のタンパク質結合能力は、ｐＨの低下と共に増大する。あるいは、溶液が中性またはそれよりも高いｐＨに近付き、かつ常磁性粒子上の全電荷が負になるにつれ、正に帯電したタンパク質が結合することができる。以下の実施例１に示すように、常磁性粒子、酸化第一第二鉄の最適な抽出は、３〜４および９〜１０の間のｐＨ範囲で生ずる。
【００５９】
特定の理論に拘泥することを望むものではないが、本発明は、水溶性有機塩およびその他の有機試薬などのサンプル中のその他の物質に比べ、本発明の酸性溶液が、正に帯電した常磁性粒子と負に帯電したタンパク質分子との結合を促進させるので、その他の粗製タンパク質分別技法に取って代わることができると考えられる。
【００６０】
上述のように、酸性環境では、酸化第二鉄粒子などの正に帯電した常磁性粒子が、負に帯電したタンパク質分子に結合することになる。したがって本発明は、電荷に基づいてサンプルのタンパク質を分別するのに使用することができる。本発明のプロトコルを使用することにより、正に帯電したタンパク質だけが抽出されると予想される。試薬は、サンプルのタンパク質に全負電荷が与えられるように、サンプルに添加することができる。例えば、リジン残基を、シトラコニル化によって可逆的に変性させることができる。同様に、アルギニン残基を、１，２−シクロヘキサンジオンにより変性させることができる。タンパク質に負電荷を導入するその他の手段には、マレイル化、トリフルオロアセチル化、スクシニル化、およびテトラフルオロスクシニル化が含まれる。例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの様々な界面活性剤を使用することもできる。
【００６１】
タンパク質変性と同様の手法を使用して、タンパク質上に全正電荷を与え、それによって結合を防止することもできる。これは、タンパク質サンプルが分別されるように別の手段を付加することによって、抽出効率および生成物純度を改善するのに行うことができる。したがって、結合されるタンパク質以外の材料は、負に帯電した常磁性粒子に引き付けられないように、正に帯電させることができる。正に帯電した材料は、溶液中に残され、その結果、常磁性粒子によって保持された結合タンパク質から抽出されるようになる。そのような分離は、遠心分離、濾過、磁力の印加など、当業者に知られている手段によって実現することができる。
【００６２】
次いで結合タンパク質分子を、様々な分析技法によりさらに処理しまたは特徴付けをするために、適切な緩衝液中に溶出することができる。溶出は、結合されたタンパク質を有する粒子の環境を加熱することによって、かつ／または環境のｐＨを上昇させることによって実現することができる。常磁性粒子からのタンパク質の溶出を助けるのに使用できる物質には、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、または負に帯電したタンパク質を粒子から外すのに十分な程度にまで環境のｐＨを上昇させる任意の化合物などの塩基性溶液が含まれる。
【００６３】
本発明は、アフィニティーベースのクロマトグラフィーを使用して化合物を単離するために、常磁性粒子を使用することが可能な方法も提供する。これらの方法によれば、少なくとも１つの常磁性粒子を、１種または複数の有機または生物学的目標化合物を含有するサンプルのレセプタクルに添加する。常磁性粒子は、そこに共有結合されかつ目標化合物の１種または複数に対してアフィニティーを有する１つまたは複数のリガンドまたは官能基を有する。リガンドまたは官能基は、目標化合物と相互に作用しかつ接触することが可能になり、それによって粒子−化合物錯体が形成される。次いで錯体を、外部磁場を印加することによって固定化する。次いで未結合サンプルまたは固定化錯体をサンプルレセプタクルから除去することができる。固定化された錯体をサンプルから除去する場合、追加の化学作用またはクロマトグラフィーを、サンプルに適用することができる。本発明のこの態様の特定の実施例は、質量分析計などの分析機器によってサンプルを評価する前に、血清から非常に豊富なタンパク質を減少させることと考えられる。血清アルブミン、免疫グロブリン、およびトランスフェリンの濃度はその他の血清タンパク質よりも高いので、質量分析によるサンプル分析の前にこれらタンパク質を除去することによって、その他のタンパク質または化合物の分解能が大幅に増強される。特に、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇは、免疫グロブリンを結合するリガンドまたは官能基として利用することができる。天然のタンパク質Ｇも、アルブミン用の結合部位を有している。この結合部位は、通常、タンパク質Ｇが免疫グロブリンに対してより特異的であるように設計製作される。しかし、そのヒトアルブミン結合部位を有する天然のタンパク質Ｇは、質量分析サンプル調製のための高速大量処理量のアルブミン減少が可能なアフィニティークロマトグラフィーシステムを実証するために、常磁性粒子を有するリガンドまたは官能基として利用することができる。
【００６４】
同様に本発明は、化合物と１つまたは複数の固相常磁性粒子とを結合し、その後サンプルから望ましくない化合物を除去することによって、サンプルから、問題にはなっていない選択された化合物を減少させるのに使用することができる。例えば、血清と、タンパク質アルブミンに対して特定のアフィニティーを有するリガンドまたは官能基を含有する常磁性粒子とを結合する場合、好ましいアルブミンの結合が生じて、疾患マーカーなどの問題となっているタンパク質が残される。この手法を、磁気抽出ブロックを備えた自動化装置（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（「ＢＤ」）Ｖｉｐｅｒプラットホームなど）と併せて使用することにより、分別／単離プロトコルの容易な自動化が可能になる。
【００６５】
アフィニティークロマトグラフィー法は、サンプルレセプタクルから未結合サンプルを除去し、固定化された錯体を残すこともできる。磁場を除去し、錯体をレセプタクルに解放し、それによって、常磁性粒子からの目標化合物の解放を含むがこれに限定することのない追加の化学作用を、錯体に対して実施することができる。上述のシナリオのいずれにおいても、すなわち錯体の除去またはレセプタクル内での錯体の保持のいずれにおいても、この方法は、自動化高速大量処理によるサンプル分別および化合物単離を可能にするために、外部磁石（ＢＤ  Ｖｉｐｅｒプラットホームなど）を組み込んだハードウェアと併せて使用することができる。
【００６６】
追加のリガンド／受容体系は、その他のアフィニティークロマトグラフィーシステムを生成するために、常磁性粒子と共に使用することができる。タンパク質Ａおよびタンパク質Ｇの他に、抗体、抗原、ハプテン、受容体、酵素、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列をすべて、良好な効果を発揮するリガンドまたは官能基として使用することができる。さらに、常磁性粒子は、ストレプトアビジン−ビオチン、アビジン−ビオチン、炭水化物−レクチン、および酵素−酵素阻害剤系を含めた生物学的結合と組み合わせることができる。
【００６７】
本発明は、サンプルからタンパク質を単離するためのキットであって、少なくとも１つの常磁性粒子を含むキットにも関する。このキットは、酸などの、常磁性粒子の電荷を付与しまたは変更するための供給源を含んでもよい。キットは、本明細書で述べる方法で使用される磁場を生成するための、磁石または別の手段を含んでもよい。本発明のキットは、試験管、注射器、濾紙などの、本発明の方法を実施する際に使用することができる標準的な実験器具を含んでも含まなくてもよい。
【００６８】
以下の実施例は、この文書に記述される本発明の特定の実施形態を示す。当業者に明らかにされるように、様々な変更および修正が可能であり、これらは記述される本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００６９】
（実施例）
【実施例１】
【００７０】
質量分光分析を強化するための磁性粒子ベースのアフィニティークロマトグラフィー
この実験は、血漿アルブミンおよびＩｇＧ含量を低下させ、それによって問題となっているその他のサンプルタンパク質の質量分光分析を強化するための手段として、磁性粒子ベースのアフィニティークロマトグラフィーを評価するために行った。この手順の概要を、以下の表Ｉにまとめる。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
表Ｉにまとめた実験を実施するのに使用される手順は、ストレプトアビジンで被覆された磁性粒子を１×リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄することによって開始される。ＰＢＳ溶液を吸引によって除去し、磁石を収集容器の隣りに置くことによって粒子を固定化する。第２のステップでは、磁性粒子を１×ＰＢＳで再懸濁させて、濃度を６ｍｇ／ｍＬにする。ステップ３では、４ｍｇ／ｍＬのビオチニル化ウサギ抗ヒト血清アルブミン２５μＬを、６ｍｇ／ｍＬの洗浄済みストレプトアビジン磁性粒子２００μＬが入っている収集容器（試験管１）に添加する。ステップ４では、２．９ｍｇ／ｍＬのビオチニル化モノクローナル抗ヒトＩｇＧ１  ２５μＬを、６ｍｇ／ｍＬの洗浄済みストレプトアビジン磁性粒子２００μＬが入っている試験管に添加することによって、第２の収集容器（試験管２）を作成する。ステップ５では、両方の収集容器（試験管１および試験管２）を、穏かに混合しながら３０分間インキュベートする。試験管１および２をステップ６で混合して、第３の収集容器（試験管３）を作成する。試験管３は、試験管１および試験管２の均等混合である。ステップ７では、３つの収集容器を１×ＰＢＳで洗浄する。外部磁石によって粒子を固定化した後、吸引によって再びＰＢＳを除去する。ステップ８では、ヒト血漿サンプル２０μＬを、１×ＰＢＳ  １８０μＬを添加することによって１：１０に希釈する。希釈ヒト血漿サンプル（ステップ８）の一定分量２０μＬを、試験管１、２、および３のそれぞれに添加する。この試験管を１０分間インキュベートして、ステップ９を終了する。外部磁石によってストレプトアビジン磁性粒子を固定化した後、ステップ１０で試験管１、２、および３のそれぞれの上澄みを除去する。ステップ１１では、各試験管からの粒子を、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＷＣＸ２チップを使用する質量分析によって分析する。１×ＰＢＳで１：３０に希釈した未処理の血漿も、質量分析（ＷＣＸ２チップ）によって分析する。このサンプルは、試験管１、２、および３から分析された粒子の対照としての役割をする。対照およびすべてのサンプルに関して使用された質量分析マトリックスは、０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリルである。
【００７３】
実施例２の実験結果を、図１にグラフで示す。図１は、対照としての役割をする１×ＰＢＳで１：３０に希釈した未処理のヒト血漿サンプルに対して、試験管１、２、および３の質量分析クロマトグラムを比較する。試験管１（磁性粒子＋抗ヒトアルブミン）および試験管２（磁性粒子＋抗ヒトＩｇＧ１）の両方において、少なくとも６個の明確なピークが分解されたが、これは対照サンプルでは検出できなかったものであり、またはクロマトグラムのベースラインに関連したノイズを辛うじて超えたものである。６個のピークは、２つの比較的小さい分子量タンパク質（１）、（２）の形が５から１０，０００Ｄａの間に現れ、また４種のより大きいタンパク質（３）、（４）、（５）、および（６）が、約１５，０００（ピーク（３）および（４））、２０，０００、および２６，０００Ｄａで現れる。このパターンは、試験管３（磁性粒子＋抗ヒトアルブミン＋抗ヒトＩｇＧ１）のクロマトグラムで一貫したままであり、やはり６個の追加の十分に分解されたピークを示している。
【００７４】
追加のタンパク質のピークの分解は、質量分析前に、抗アルブミンおよび／または抗ＩｇＧを含有する磁性粒子でヒト血漿サンプルを処理することによって、問題となる可能性のあるその他のタンパク質の検出を強化できることを示している。磁性粒子および流体を効果的に処理することが判明した自動化システムでのこれら粒子の使用により、質量分析に向けた高速大量の自動サンプル調製が可能になる。
【００７５】
記述された実施形態の前述の説明は、当業者が本発明を作りかつ使用することができるように提示される。これらの実施形態に対する様々な修正が可能であり、本明細書に示される総体的な原理をその他の実施形態にも適用することができる。要約は、その目的が、適切な権威者ならびに一般の人々が本発明の全体的な性質を迅速に決定することができるようにすることにあるので、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】結合された１つまたは複数のタンパク質アフィニティーリガンドまたは官能基を有する磁性粒子で血漿サンプルを前処理することによって得られた、強調された分解能を示すヒト血漿サンプルに関する質量分析クロマトグラフの並列比較を示す図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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