(57)【要約】  本発明は第二世代免疫調節性オリゴヌクレオチドのHIV-1抗原または免疫原と組み合わせた治療的な使用によって、そのHIV感染の危険を下げる能力を増大し、またHIV感染のエイズ関連症候群（ARC）とエイズへの進行をコントロールすることに関する。
2008500963.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）単独のまたはHIV免疫原を産出するためにIFAと混合されたHIV-1抗原；および
ｂ）5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであり、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである、免疫調節性のオリゴヌクレオチド、
を含む、HIV-1特異的な免疫原性組成物。
【請求項２】
ａ）単独のまたはHIV免疫原を産出するためにIFAと混合されたgp120劣化HIV-1抗原；および
ｂ）5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであり、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである、免疫調節性のオリゴヌクレオチド
を含む、HIV-1特異的な免疫原性組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の免疫原性組成物を哺乳動物へ投与することを含む、HIV特異的免疫を高める方法。
【請求項４】
HIV-1抗原またはHIV免疫原および免疫調節性のオリゴヌクレオチドを同時に投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
HIV-1抗原またはHIV免疫原および免疫調節性のオリゴヌクレオチドを順次投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
HIV-1抗原またはHIV免疫原が、免疫調節性のオリゴヌクレオチドと処方または混合される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物においてHIV感染を防ぐための方法であって、
ａ）単独のまたはIFAと混合されたHIV-1抗原；および
ｂ）5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであり、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである、免疫調節性のオリゴヌクレオチド
を含む免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
HIV-1抗原またはHIV免疫原および免疫調節性のオリゴヌクレオチドを同時に投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
HIV-1抗原またはHIV免疫原および免疫調節性のオリゴヌクレオチドを順次投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
HIV-1抗原またはHIV免疫原が、免疫調節性のオリゴヌクレオチドと処方または混合される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
HIV感染の進行を阻害するための方法であって、
ａ）単独のまたはアジュバントと混合された、HIV-1抗原またはHIV免疫原、および
ｂ）5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであり、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである、免疫調節性のオリゴヌクレオチド
を含む免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
HIV-1抗原または免疫原および免疫調節性のオリゴヌクレオチドを同時に投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
HIV-1抗原または免疫原および免疫調節性のオリゴヌクレオチドを順次投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
HIV-1抗原または免疫原が、免疫調節性のオリゴヌクレオチドと処方または混合される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物においてエイズを治療するための方法であって、
ａ）単独のまたはアジュバントと混合されたHIV-1抗原、および
ｂ）5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであり、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである、免疫調節性のオリゴヌクレオチド
を含む免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
HIV-1抗原または免疫原および免疫調節性のオリゴヌクレオチドを同時に投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
HIV-1抗原および免疫調節性のオリゴヌクレオチドを順次投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
HIV-1抗原が免疫調節性のオリゴヌクレオチドと処方または混合される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）単独のまたはIFAと混合されたHIV-1抗原、
ｂ）5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’の構造を有する免疫調節性のオリゴヌクレオチド；および
ｃ）生理学的に許容し得る担体、
ここでXがグリセロールリンカーであり、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである、
を含む医薬組成物。
【請求項２０】
ａ）単独のまたはIFAと混合されたHIV-1抗原；および
ｂ）5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’の構造を有する免疫調節性のオリゴヌクレオチド、
の構成要素からなるキットであって、ここでXがグリセロールリンカーであり、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンであり、前記キットの構成要素が組み合わされた場合、免疫原性組成物を生成する、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は第二世代免疫調節性オリゴヌクレオチドを用いた、HIV抗原および／または免疫原との組み合わせにおける、抗HIVへの適用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、何人かの研究者によってオリゴヌクレオチドの免疫刺激剤としての様々な使用法が免疫療法の適用において示されている。ホスホジエステル結合、またはホスホロチオエート結合のオリゴヌクレオチドが免疫刺激を誘発できるという現象が見つかったため、治療ツールとしてこれらの化合物の開発に関心が寄せられた。こうした試みの対象はホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドの中に天然のジヌクレオチドCpGが含まれている化合物に集中されてきている。
【０００３】
Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131 (1992)によると、ホスホジエステル結合のオリゴヌクレオチド内にジヌクレオチドCpGを含むパリンドローム配列があると、そのオリオヌクレオチドはインターフェロンアルファおよびガンマの合成を誘発でき、ナチュラルキラー細胞の活動を増大させることが知られている。また、Krieg et al., Nature 371:546-549 (1995)はCpGを含むホスホロチオエート結合のオリゴヌクレオチドが免疫誘発性をもつことを明らかにした。さらに、Liang et al., J. Clin. Invest. 98:1119-1129 (1996)はこのようなオリゴヌクレオチドがヒトB細胞を活性化することを明らかにした。
【０００４】
Moldoveanu et al., Vaccine 16:1216-124 (1998)によると、CpGを含むホスホロチオエート結合のオリゴヌクレオチドはインフルエンザウイルスに対する免疫応答を増大させる。McCluskie and Davis, J. Immunol. 161:4463-4466 (1998)によるとCpGを含むオリゴヌクレオチドは有効なアジュバントとして機能し、B型肝炎表面抗原に対する免疫応答を促進させる。MossらはJournal of Interferon and Cytokine Research, 20:131-1137(2000)などでCpGに促進されたHIVに対する応答を発表した。
【０００５】
HIVはエイズ（AIDS）として知られる後天性免疫不全症候群をひきおこす病原となるウイルスである。エイズはその流行が始まってから６千万人に感染した。現在４千万人がHIV／エイズに感染しており、うち２５０万人は子供である。
1981年にエイズが初めて報告されてから２千万人がこの病気によって死亡しており、世界で４番目の死因となっていて、一日あたり８千人の死亡を引き起こしている。治療や予防のためのワクチンを開発する試みは困難であり、いずれの試みも現在までのところ臨床治療で有効な効果を得られてはいない。
【０００６】
治療ワクチンの候補の一つ、HIV-1免疫原である、フロイント不完全アジュバンドと共に乳化したgp120劣化(depleted)ウイルスの不活化全ウイルスワクチン候補は、被験者にHIV-1特異的な、細胞性・液性両方の免疫応答を誘発することが報告されている。この方法はHIV感染患者において有意な数の免疫応答を起こしはするが、それでも免疫調節性のオリゴヌクレオチドを使ってその活性を増強する要求がある。これはこれまですべてのHIVワクチン候補について共通に存在する要求である。
【発明の開示】
【０００７】
発明の簡単な概要
第一の態様において、本発明は、単独のまたはIFAで乳化したgp120劣化HIV-1抗原および5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであり、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシン(2’-deoxy-7-deazaguanosine)である、IMO1などの第二世代免疫調節性オリゴヌクレオチドを含む、免疫原性組成物を提供する。
【０００８】
第二の態様において、本発明は、免疫調節性オリゴヌクレオチドとHIV抗原を組み合わせて使用することを介して、HIV特異的なHIVに対する免疫を増強する方法であって、IFAまたは他のアジュバントを加えるか加えないgp120劣化HIV-1抗原など、および5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’（IMO1）の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであり、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである免疫調節性オリゴヌクレオチドの前記免疫原性組成物を単独もしくはIFAと乳化して哺乳動物への投与することを含む、前記方法を提供する。この態様において、IFAを加えるか加えない、免疫調節性オリゴヌクレオチドおよびHIV-1抗原は、同時または順次に投与され得る。この態様において、HIV-1抗原は免疫調節性オリゴヌクレオチドと処方または混合されてもよい。
【０００９】
第三の態様において、本発明は、第二の態様と同様で、IFAを加えるか加えないHIV抗原を組み合わせた免疫調節性オリゴヌクレオチドの使用が、HIV感染のエイズへの進行時間を遅延させ、または感染を起きることを予防する方法を提供する。
【００１０】
第四の態様において、本発明は、IMO1などの、5'-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5'の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであり、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである免疫調節性オリゴヌクレオチドと組み合わせてHIV-1抗原を投与することを含む、患者においてエイズを処置する方法を提供する。
【００１１】
第五の態様において、本発明は、IFAを加えるか加えないHIV-1抗原、5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’（IMO1）の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであり、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである免疫調節性オリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体を含む医薬製剤を提供する。
【００１２】
第六の態様において、本発明は、IFAを加えるか加えないHIV-1抗原および5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’（IMO1）の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであって、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである免疫調節性オリゴヌクレオチドを含むキットであって、該キットの構成要素が組み合わされた場合、免疫原性組成物を生成する、前記キットを提供する。
【００１３】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、予防的または治療的なHIV特異的な免疫応答を増強し、HIV感染およびそれに続くエイズ関連性症候群（ARC）およびエイズへの進行を遅らせまたは阻害するためのgp120劣化HIV抗原または免疫原と組み合わせた第二世代免疫調節性オリゴヌクレオチドの使用に関する。本明細書中に引用された刊行された特許、特許出願および文献は、それぞれが引用文献として組み込まれるべきと特別におよび個別に示されたようであるのと同じ範囲で参照によって、本明細書中に組み込まれる。本明細書中に引用されたいかなる文献の内容と本明細書の示すところが矛盾する場合、後者が本発明の目的のためには優先されるべきである。
【００１４】
本発明は、HIV感染の処置または予防のための免疫療法の適用のために用いられる、gp120劣化HIV-1抗原または免疫原によって誘発される免疫応答を増大するための組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法において、免疫調節性のオリゴヌクレオチドが、HIV-1抗原またはHIV-1免疫原を組み合わせて用いた場合、増大された免疫原性の効果を生みだす。HIV-1抗原の産生に用いられたウイルスは、ザイールにて１９７６年に感染された個体（HZ321）から早期に単離されたもので、塩基配列決定され、クレード（clade）Aのエンベロープ（envelope）とクレードGのgagを有している。この不活化されたgp120劣化HIV-1抗原は、フロイント不完全アジュバンド（IFA）と処方されるとHIV-1免疫原とよばれる。
【００１５】
第一の態様において、本発明は、単独またはgp120劣化免疫原を得るためIFAと共に乳化したgp120劣化HIV-1抗原および、5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであり、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンであるIMOなどの第二世代免疫調節性オリゴヌクレオチドを含む、免疫原性組成物を提供する。免疫調節性オリゴヌクレオチドは脊椎動物に投与した場合免疫応答を誘導する。gp120劣化HIV-1抗原または免疫原を組み合わせて用いた場合、増大された治療効果が得られる。この態様において、gp120劣化HIV-1抗原や免疫原は、免疫調節性オリゴヌクレオチドと処方、または混合されてもよい。
【００１６】
本発明のこの側面による方法において、免疫調節性オリゴヌクレオチドのHIV抗原または免疫原との投与は任意の好適な経路によってもよく、この経路は非経口、経口、舌下、粘膜、経皮、局部、鼻腔内、エアゾール(aerosol)、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃によるもの、ダーマルパッチ（dermal patch）、点眼、口内洗浄液を含むがこれに限定されない。HIV抗原または免疫原を伴なう免疫調節性オリゴヌクレオチドの治療用組成物の投与は、該当する疾患の症状や代用マーカーを改善するために有効と知られている投与量と期間で行うことができる。全身投与する場合、治療用組成物は、免疫調節性のオリゴヌクレオチドの血中濃度が約1pg/mLから約10ug/mLまでにいたるのに十分な量で投与されるのが好ましい。局部投与にはこれよりずっと低い濃度が有効であり得、ずっと高い濃度が許容し得る可能性もある。
【００１７】
免疫調節性オリゴヌクレオチドの全投与量は一患者一投与あたり0.05mgから100mgであるのが好ましく、一方HIV抗原および／または免疫原の投与量はgp120劣化抗原および／または免疫原にして一患者／一投与あたり0.05から0.5mgであってもよい。そのほかの態様において、投与量の範囲はIMO1については患者毎に0.1mgから5mg、p24抗原については患者毎に10〜200μgが好ましい。（註：p24の10μgはgp120劣化HIV-1抗原の100μgに相当する。）場合によっては投与量を患者の体重kgあたりの投与量mgの基準で計算するのが望ましいこともある。治療に効果的な量の本発明の１またはそれ以上組成物を、患者に対しての一つの治療エピソード(episode)として、同時に、あるいは順次に投与するのが好ましいこともありうる。
【００１８】
本発明のこの側面の目的において、「組み合わせて」という述語は同一の患者の同一の疾患における治療の過程で、ということを意味し、免疫調節性オリゴヌクレオチドとHIV-1抗原をいかなる順序で投与し、あるいは同時に投与することを含み、またいかなる時間的間隔をおいた順序をも含み、例えば一つの投与のあと、直後にもう一つを投与したり、最大数日の間隔をおいて投与したりできる。こうした複合治療には、免疫調節性オリゴヌクレオチドと、それとは別にHIV-1抗原および／または免疫原の一度以上の回数の投与を含んでもよい。免疫調節性オリゴヌクレオチドとHIV-1抗原または免疫原の投与は同一経路でも別の経路でもよい。
【００１９】
免疫調節性オリゴヌクレオチドは、式CpGで示される免疫刺激性(immunostimulatory)のジヌクレオチドであって、式中Cはシチジン、Gは2’-デオキシ-7-デアザグアノシン、pはホスホチオエートヌクレオシド間結合(internucleoside linkage)である、ジヌクレオチドを含む。
【００２０】
本発明による方法で用いられる免疫調節性オリゴヌクレオチドは、自動合成機を使用してホスホラミダイト法で合成するのが簡便である。態様によっては免疫調節性オリゴヌクレオチドはリニア合成法で合成される。本明細書において、用語「リニア合成法」は免疫調節性オリゴヌクレオチドの一端から合成を始めて線状に他端にむかって進行する合成法を指す。
【００２１】
免疫調節性オリゴヌクレオチドの別の合成方法として「パラレル合成法」があり、この方法では合成は中央のリンカー部分から外に向かって進行する。合衆国特許番号5,912,332に記載のとおり、固体担体に結合されたリンカーがパラレル合成法に使用できる。あるいは孔径制御した多孔質ガラス支持体に結合されたリン酸など、汎用の固体支持体も使用できる。
【００２２】
リニア合成法あるいはパラレル合成法いずれを用いる場合も、本発明による方法に用いられる免疫調節性オリゴヌクレオチドは、合成後には、高濃度のアンモニア溶液を用いて、またはホスホラミダイトの供給者の推薦する方法に従って脱保護するのが簡便である。産物である免疫調節性オリゴヌクレオチドは逆相HPLCで精製され、脱トリチル化され、脱塩され、透析されることが好ましい。
【００２３】
第二の態様では本発明はHIV特異的免疫を増大する方法を提供し、その方法はこれよって前出ウイルスに感染した患者のエイズへの進行を遅らせること、あるいは未感染の個人への感染を予防することを目的とし、その方法は哺乳動物にgp120劣化HIV-1抗原または免疫原と5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’（IMO1）の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであって、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである免疫調節性オリゴヌクレオチドとを含む組成物を哺乳動物に投与することを含む。この態様では免疫調節性オリゴヌクレオチドとHIV-1抗原または免疫原は、同時に、あるいは順次投与することができる。この態様ではHIV-1抗体は免疫調節性オリゴヌクレオチドと処方され、または混合されてもよい。
【００２４】
第三の態様では本発明は哺乳動物においてHIV特異的応答を誘導する方法を提供し、その方法はHIV-1抗原または免疫原と5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’（IMO1）の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであって、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである免疫調節性オリゴヌクレオチドを含む免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む。この態様ではHIV-1抗体は免疫調節性オリゴヌクレオチドと処方または混合されてもよい。
【００２５】
第四の態様では本発明はエイズ患者を治療する方法であって、HIV-1抗原または免疫原と5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’（IMO1）の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであって、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである免疫調節性オリゴヌクレオチドを組み合わせて投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
第五の態様において、本発明は、HIV-1抗原または免疫原と、5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’（IMO1）の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであって、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである免疫調節性オリゴヌクレオチドと、生理学的に許容し得る担体を含む医薬製剤を提供する。本明細書では、「生理的に許容し得る」という用語は免疫調節性オリゴヌクレオチドとHIV-1抗原または免疫原の効果と干渉せず、細胞、組織、臓器などの生体器官（biological system）中で適合性である材料を意味する。生体器官は脊椎動物など、生存している生物体であることが好ましい。
【００２７】
本明細書では「担体（carrier）」という用語はあらゆる賦形剤、希釈剤、注入剤(filler)、塩、緩衝液、安定剤、液化剤、脂質あるいはその他の、医薬製剤で使用される技術中でよく知られてる材料を含む。担体、賦形剤または希釈剤の性質は特定の適用における投与の経路によって異なるものであると理解されるべきである。
これらの材料を含め、薬剤的に許容し得る製剤の調製法については、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990などに記載されている。
【００２８】
第六の態様において、本発明はHIV抗原または免疫原と、5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’（IMO1）の構造を有し、ここでXがグリセロールリンカーであって、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである免疫調節性オリゴヌクレオチドを含むキットを提供し、前記キットの構成要素が混合されると免疫原性組成物を生成する。
【００２９】
以下の例は本発明の好ましい態様を更に説明するのが目的であって発明の範囲を限定するものではない。
例
例１：動物
生後６−８週の近交系C57BL/6のメスマウス（Charles River Laboratoriesより入手、カルコ、イタリア）が使用された。マウスコロニーは12時間の明暗サイクルのケージでグループあたり8から10個体で維持され、不断に給餌および給水された。
【００３０】
例２：動物実験に向けた製剤
この実験に用いられるIMOはHybridon Inc.により供給された。5’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’の配列を有し、ここでXがグリセロールリンカーであって、Rが2’-デオキシ-7-デアザグアノシンである免疫調節性オリゴヌクレオチド、IMO1が実験に用いられた。
【００３１】
HIV-1抗原はgp120劣化HIV-1（HZ321、The Immune Response Corporation）を含む。gp120劣化HIV-1（HZ321）抗原はHIV-1 HZ321 Hut-78細胞の細胞外上清から超遠心とイオン交換クロマトグラフィによって高純度に精製された。アウターエンベロープ(outer envelope)のgp120は超遠心の段階で劣化させられた。調製された抗原はベータプロピラクトンと60Coガンマ線照射で順に処理されて不活化された。
【００３２】
例３：プロトコールIスキーム
生後6-8週のメスC57/BL6マウス（グループ毎にN=10）は、gp120劣化した全ウイルス不活化HIV-1抗原（10μg）を単独で用いて、または10、30、90μgのIMO１と合わせて、または30μgのマウスオリゴヌクレオチドIMO2および／またはgp120劣化した全ウイルス不活化HIV-1抗原（10μg）を用いて皮下免疫化された。第一(primary)免疫化のあと、マウスは同様の投与で２週間後に追加免疫された。実験28日目に（追加免疫後2週間後）、培地のみ、または未変性の(native)p24抗原で、またはHIV-1抗原で試験管内で4日間にわたって刺激した新鮮な脾臓単核細胞に対して免疫学的検査が行われた。
IFN-ガンマ、IL-12、IL-5、IL-10、MIP1アルファ、MIP1ベータ、RANTESの生成量が市販のキット（kit）を用いてELISA法で計測された。P24抗原とHIV-1免疫原特異的なIFN-γを生産するリンパ球量もELISPOTアッセイによって測定された。P24抗原、HIV抗原、およびLPS特異的リンパ球の増殖は標準的な増殖アッセイによって定量された。
【００３３】
例４：免疫学的解析
マウス血液が採集され、得られた血清は抗体評価のため冷凍保存された。脾臓は層流フード（laminar flow hood）内の無菌条件下で切除され、最適な細胞回収を得るために加圧型細胞粉砕装置（Dounce homogenizer）とB内筒（pestle）でホモジナイズされた。脾臓細胞は細胞培養液（RPMI 1640）に適切な濃度で再懸濁され、培養アッセイに用いられた。
【００３４】
IFN-γ, IL5, IL-10, M1P1α, M1P1s, RANTES生産量のELISA法による評価
ケモカイン測定（M1P1α, M1P1s, RANTES）のため、新鮮な脾臓単核細胞が単離され、HIV-1抗原（10μg/mL）または未変性のp24（np24）抗原(Ag) （10μg/mL）による刺激を行ったもの、行わないものについて４日間にわたって96穴プレート中で最終量200μLのRPMI1640倍地で培養された。上清が採集され、IFNガンマ、マクロファージ炎症淡白MIP-1アルファ、ベータ、またはRANTESケモカインについてELISA法で製造元の指示に従った方法で解析された（R&D Systems）。それぞれの処置後のこれらサイトカインとケモカインのレベルを示す結果と、その結果に与えるIMO1の影響が図1Aから1Fに示されている。図５はIFN-γ／IL-10比がIMO1によって有意に増加したことを示し、この結果は優位なIFN-γ誘導と、細胞性免疫応答が強く刺激されたことを示唆する。
【００３５】
ELISPOTアッセイによって定量されたP24抗原およびHIV-1抗原特異的IFN-γを生産するリンパ球
脾臓からの単細胞懸濁液がPBS中で作成され、10μg/mLのPBS中の抗IFNガンマ(PharMingen)抗体でコートされた96穴ニトロセルロースプレートに分注され、一晩４℃で保温された。プレートは10mg/mLのPBS中のBSA(pH7.4)でブロックされた。連続希釈（２倍間隔）された単細胞懸濁液と、補充されたRPMI1640培地（10％牛胎児血清）が３通り、37℃のプレートに分注された。細胞は無処理で、あるいは５μg/mLの高純度p24(Immune Response社製)または5μgの高純度HIV-1抗体(Immune Response社製)で刺激された。24時間後、ウェルがPBS-Tween20(0.05%)で洗浄され、ビオチン化された抗IFN-γ（PharMingen）が加えられ、２時間室温に保温された。西洋わさびペルオキシターゼ・ストレプトアビディン接合体（Sigma）が加えられ、室温で1時間保温され、プレートは過酸化水素と酢酸バッファ中の3-アミノ-9-エチルカルボアゾール（ethylcarboazole）を含むアビジン-ペルオキシターゼ其質で最現像された。プレートは再乾燥され、自動ELIspot判読機で計数された。結果は図２に示されており、IMP1によるIFN-γ生産細胞の増加が示されている。
【００３６】
標準増殖アッセイで測定されたP24抗原；HIV-1抗原；および分裂促進因子特異的リンパ球の増殖
リンパ球増殖を測定するため、免疫化されたマウスの新鮮な脾臓単核細胞が精製され、培地のみ、PMA／イオノマイシン (5 ug/mLと1 uM) 、あるいは不活化されたgp120劣化HIV-1抗原（10μg/mL）と培養された。脾細胞は丸底96穴プレートに10%FBSと1%抗生物質を加えた完全ROMI1640培地に2x105細胞／毎ウェルで植菌された。全てのアッセイは、三回の繰り返しを行った。５日間の保温のあと、細胞はFBSなしの完全RPMIで18時間、１マイクロキュリーの重水素チミジンで標識された。第6日目に細胞は採集され、取り込まれたラベルがシンチレーションカウンターで測定された。分毎の幾何学的平均カウント数が３回繰り返された。ウェルのHIV-1抗原による刺激のあと、または刺激なしで（with and without）計数された。図４に示された結果は、リンパ球刺激指標として計算され、その結果は抗原誘導を受けた細胞の幾何学平均cpmを培地のみで刺激された細胞幾何学平均cpmで割ったものとして示した。データの統計的解析はSPSS-PC統計解析パッケージ（SPSS社、イリノイ州シカゴ）によって行った。異なるグループの動物の比較は両端T検定で行われた。
【００３７】
例５：実験手順II詳細(Protocol II Schema)
第二のマウス実験手順の設計目標は以下の通りであった：（１）投与薬に免疫調節性オリゴヌクレオチドIMO1が存在するとき、IFAがまだ必要かどうかを決定する、（２）皮下と筋肉内の注射経路を比較する、および（３）IMO1がIFAの乳化前か乳化後に加えられるかの違いがそのHIV-1抗原効力を増強する性能に影響するかどうか。
生後6-8週間のメスC57/BL6マウス（グループごとに8固体）は皮下、あるいは筋肉内で10μgのgp120劣化した全ウイルス不活化HIV-1抗原および／または90μgのIMO1で免疫化された。第一(primary)免疫のあと、マウスは２週間後に追加免疫された。第28日目に（追加免疫の２週間後）、免疫化された秘蔵細胞によるHIV特異的応答が上記のとおり、HIV-1抗原または未変性p24による試験管内刺激のあと評価された。ケモカイン生産、リンパ球増殖と、ELIspot法によるIFN-ガンマ生産を含む測定が行われた。血清内のp24特異的抗体量の測定にはELISA法に基づくアッセイが用いられた。
【００３８】
例６：免疫学的解析
免疫学的解析は上記の通り行われた。結果は図６から１０に示される。これらの結果は
IMO1が皮下、あるいは筋肉内への投与後に、有意にHIV抗原の免疫原性を増大させること、増大の程度はIMO1がIFAの乳化前または後で加えられた組成のいずれでも同様であること、およびIMO1がIFAなしでもHIV抗原の免疫原性を増大させられることを示している。
【００３９】
例７：あらかじめHIV-1抗原で免疫化されたHIV感染した患者からのPBMCによって起こされるHIV特異的免疫応答に対するIMO1の試験管内での効果
抗レトロウイルス治療を施されたHIV患者であって、HIV免疫原で免疫化（３ヶ月毎の6から24回の注射）されている場合とされていない患者について、その抹消血単核細胞（PBMC）の培養内でIMO1がHIV特異的免疫応答を増大させられるかどうかを決定する目的で評価実験が行われた。CD4カウント、HIVウイルス血漿、感染の期間と抗レトロウイルス治療法については両グループの患者で対等だった。
【００４０】
高活性の抗レトロウイルス治療法（HAART）とREMUNE（IFAと乳化された不活化されたgp120劣化HIV抗原）処置されたHIV感染患者（Dr. Fernandez-Cruz博士のコホートから）と、HAART処置されたHIV感染患者（ミラノ大学のコホートから）は、その治療計画での感染の期間、CD4カウント、HIVウイルス血漿とプロテアーゼ阻害剤の有無に関して、対等だった。50mlの全血が静脈穿刺によってEDTAを含む試験管へ採血された。未変性p24あるいはgegのHIV抗原を用いて、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/mlの濃度のIMO1存在下で、または培地のみで、PBMCの試験管内の刺激が行われた。
【００４１】
免疫学的解析：
P24抗原、HIV-1抗原、envペプチド、gagペプチド、インフルエンザ特異的IFNγを生産するCD8リンパ球がELISPOTアッセイで評価された（表３）。
【表１】
2008500963.tif 000003
【００４２】
アルファ-ディフェンシンの生産量はCD8ポジティブなT細胞のFACS法による細胞内染色で評価された。アルファ-ディフェンシン結果はPBMCがアロ抗原（allo-antigen）（３人の異なる検体から採取され貯蔵されたガンマ線照射された抹消血単核細胞）で刺激された場合と比較して有意差に達した（表４参照）。
【表２】
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【００４３】
均等物
本発明の記載が明快さを増し、理解を助ける目的である程度の詳細さを持って行われているが、これは本明細書を読むことによって本技術分野の当業者への利便となる目的のものであって、本発明の本来の目的および添付されたクレームから乖離することなく、本発明のあらゆる形態と詳細の変形が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａから１Ｆは、生理食塩水またはHIV免疫原とIMO1の異なる組み合わせで皮下免疫化(immunized subcutaneously)したマウスの脾臓単核細胞におけるIFN-γ、IL-10、RNATES、MIP-1α、MIP-1βとIP-5の誘導を図示する。
【図１Ｃ−１Ｅ】図１Ａから１Ｆは、生理食塩水またはHIV免疫原とIMO1の異なる組み合わせで皮下免疫化(immunized subcutaneously)したマウスの脾臓単核細胞におけるIFN-γ、IL-10、RNATES、MIP-1α、MIP-1βとIP-5の誘導を図示する。
【００４５】
【図２】図２は、生理食塩水またはHIV免疫原とIMO1の異なる組み合わせで皮下免疫化したマウスの試験管内で刺激されたp24とHIV-1抗原に特異的なIFN-γ生成リンパ球のELISPOTアッセイによる計測結果を図示する。
【図３】図３は、生理食塩水またはHIV免疫原とIMO1の異なる組み合わせで皮下免疫化したマウスのp-24特異的抗体タイターを図示する。
【図４】図４は、生理食塩水またはHIV免疫原とIMO1の異なる組み合わせで皮下免疫化したマウスのリンパ球増殖応答を図示する。
【図５】図５は、生理食塩水またはHIV免疫原とIMO1の異なる組み合わせで皮下免疫化したマウスのIFN-γ／IL-10比を図示する。平均値と標準偏差が示されている。*はHIV-1免疫原単独の場合と比較した有意差。
【００４６】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａから６Ｃは、生理食塩水またはHIV免疫原とIMO1の異なる組み合わせで示されたとおりに皮下、または筋肉内に免疫化したマウスの脾臓単核細胞における、IFN-γ、IL-10、RNATESの誘導を図示する。
【図６Ｃ】図６Ａから６Ｃは、生理食塩水またはHIV免疫原とIMO1の異なる組み合わせで示されたとおりに皮下、または筋肉内に免疫化したマウスの脾臓単核細胞における、IFN-γ、IL-10、RNATESの誘導を図示する。
【００４７】
【図７Ａ−７Ｂ】図７は、生理食塩水またはHIV抗原／免疫原とIMO1の異なる組み合わせで示されたとおりに皮下、または筋肉内に免疫化したマウスの脾細胞による、リンパ球増殖応答を図示する。パネルA：比刺激、HIV-1 Agと未変性p24で刺激した細胞；パネルB：PMA+IONOで刺激した細胞。平均値と標準偏差が示されている。*はHIV-1免疫原と比較した有意差。
【００４８】
【図８Ａ−８Ｂ】図８は、脾細胞のIFN-γ ELISPOT結果を図示する：全PBMC（パネルA）、CD8+T細胞（パネルB）とCD4+T細胞（パネルC）は生理食塩水またはHIV抗原／免疫原とIMO1の異なる組み合わせで示されたとおりに皮下、または筋肉内に免疫化したマウスから採取された。
【図８Ｃ】図８は、脾細胞のIFN-γ ELISPOT結果を図示する：全PBMC（パネルA）、CD8+T細胞（パネルB）とCD4+T細胞（パネルC）は生理食塩水またはHIV抗原／免疫原とIMO1の異なる組み合わせで示されたとおりに皮下、または筋肉内に免疫化したマウスから採取された。
【００４９】
【図９Ａ−９Ｂ】図９は、示されたとおりに皮下、または筋肉内に免疫化したマウスの脾細胞のサイトカイン生成量を図示する；パネルA：IFN-γ、パネルB:IL-10、パネルC：RANTES。平均値と標準偏差が示されている。*はHIV-1免疫原と比較した有意差。
【図９Ｃ】図９は、示されたとおりに皮下、または筋肉内に免疫化したマウスの脾細胞のサイトカイン生成量を図示する；パネルA：IFN-γ、パネルB:IL-10、パネルC：RANTES。平均値と標準偏差が示されている。*はHIV-1免疫原と比較した有意差。
【００５０】
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０は、HIV免疫原に乳化前、あるいは乳化後にIMO1を加えて免疫化したマウスの脾細胞によるサイトカイン生成量を図示している。パネルA：IFN-γ、パネルB:IL-10、パネルC：RANTES。平均値と標準偏差が示されている。*は乳化後と比較した有意差。
【図１０Ｃ】図１０は、HIV免疫原に乳化前、あるいは乳化後にIMO1を加えて免疫化したマウスの脾細胞によるサイトカイン生成量を図示している。パネルA：IFN-γ、パネルB:IL-10、パネルC：RANTES。平均値と標準偏差が示されている。*は乳化後と比較した有意差。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図１Ｃ−１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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