(57)【要約】  本発明は、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合できる、ペルオキシソームを含む真核細胞に関する。このようにして、真核細胞は、ペルオキシソーム内容物を細胞外に放出できる。本発明はまた、前記真核細胞における目的の化合物の生成方法に関し、ここで前記目的の化合物は細胞のペルオキシソーム中に存在する。前記目的の化合物は、ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルによってペルオキシソーム中に蓄積する。好ましい宿主細胞は、糸状菌細胞である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合することのできるペルオキシソームを含む、真核細胞。
【請求項２】
細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造が、細胞膜、ゴルジ複合体および小胞体からなる群より選択される、請求項１に記載の真核細胞。
【請求項３】
融合ポリペプチドまたはその一部がペルオキシソームの表面で露出している、請求項１または２に記載の真核細胞。
【請求項４】
通常供与膜構造の表面で露出している融合ポリペプチドの一部が露出している、請求項３に記載の真核細胞。
【請求項５】
融合ポリペプチドまたはその一部がペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部に融合、または操作可能に結合している、請求項３または４に記載の真核細胞。
【請求項６】
ペルオキシソーム膜ポリペプチドの一部が少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む、請求項５に記載の真核細胞。
【請求項７】
融合ポリペプチドがｖ−ＳＮＡＲＥである、請求項３〜７のいずれかに記載の真核細胞。
【請求項８】
ｖ−ＳＮＡＲＥがＳｎｃ１、Ｓｎｃ２またはそれらのホモログ、好ましくはＳｎｃＡである、請求項７に記載の真核細胞。
【請求項９】
ペルオキシソーム膜ポリペプチドがＰｍｐ２２またはそのホモログである、請求項５または６に記載の真核細胞。
【請求項１０】
補完融合ポリペプチドまたはその一部が受容膜構造で過剰発現されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項１１】
受容膜構造が細胞膜である、請求項１０に記載の真核細胞。
【請求項１２】
補完融合ポリペプチドがｔ−ＳＮＡＲＥである、請求項１０または１１に記載の真核細胞。
【請求項１３】
細胞が、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部と操作可能に結合した融合ポリペプチドまたはその一部をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを含む、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項１４】
核酸コンストラクトが、配列番号２４のアミノ酸配列とのキメラポリペプチドをコードする核酸配列を含み、好ましくは配列番号２３の核酸配列である、請求項１３に記載の真核細胞。
【請求項１５】
細胞が、目的のポリペプチドのペルオキシソーム局在化を促進するＤＮＡ配列に操作可能に結合された、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む核酸コンストラクトまたは発現ベクターをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項１６】
ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルが、（ａ）ＮからＣ末端方向の第一のアミノ酸がＡ、Ｃ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、ＳまたはＴであり、ＮからＣ末端方向の第二のアミノ酸がＨ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＲまたはＳであり、ＮからＣ末端方向の第三のアミノ酸がＡ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＶであるトリペプチド配列、および（ｂ）（Ｒ／Ｋ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｑ）ＸＸ（Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｈ／Ｑ）（Ｌ／Ｓ／Ｇ／Ａ／Ｋ）Ｘ（Ｈ／Ｑ）（Ｌ／Ａ／Ｆ）として定義され、ここでＸが任意のアミノ酸であり得るペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列である、請求項１５に記載の真核細胞。
【請求項１７】
真核細胞が哺乳動物、昆虫、植物、菌類または藻類細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項１８】
菌類細胞が酵母細胞、好ましくはＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）またはＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１７に記載の真核細胞。
【請求項１９】
菌類細胞が糸状菌細胞、好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の種に属する細胞である、請求項１７に記載の真核細胞。
【請求項２０】
糸状菌細胞がアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｉｚａｅ）、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に属する、請求項１９に記載の真核細胞。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の真核細胞における、目的のポリペプチドの生成方法であって、前記目的のポリペプチドが細胞のペルオキシソーム中に存在し、前記方法が所定の培地中で真核細胞を培養する工程、および任意にポリペプチドを精製する工程を含む、方法。
【請求項２２】
培地がＣＡＰＰの活性化因子、好ましくはセラミドおよび／またはペルオキシソーム増殖を誘導する物質、好ましくはオレイン酸塩を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも０．０１ｇ／ｌの目的のポリペプチドが生成される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の真核細胞における、代謝産物の生成方法であって、前記代謝産物が細胞のペルオキシソーム中に存在し、前記方法が所定の培地中で真核細胞を培養する工程、および任意に代謝産物を精製する工程を含む、方法。
【請求項２５】
真核が、酵素のペルオキシソーム局在化を促進するＤＮＡ配列に操作可能に結合された代謝産物合成に関係する酵素をコードするＤＮＡ配列を含む核酸コンストラクトまたは発現ベクターをさらに含む、請求項２４に記載の代謝産物の生成方法。
【請求項２６】
真核細胞が培養され、適量の酸素が培養物に供給されて培養物が酸素制限の条件下に維持される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項２７】
培地のｐＨが培養プロセスの間に変えられる、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項２８】
培養プロセスの全保持時間が、１９２時間であり、
・培地のｐＨが６．０である７２時間の第一段階、
・培地のｐＨが線形の過程で６．０から６．７に変えられる、２４時間の遷移段階、および
・培地のｐＨが６．７である、９６時間の第二段階
からなる、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項２９】
培地の温度が培養プロセスの間に変えられる、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項３０】
培養プロセスの間に培地の温度が３０℃から３６℃に変えられる、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項３１】
真核細胞が糸状菌、好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、より好ましくはアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株である、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項３２】
（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列に少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９５％さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義されるポリペプチドの機能的断片からなる群より選択される、ｖ−ＳＮＡＲＥ機能を示すポリペプチド。
【請求項３３】
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列に少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９５％さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義されるポリペプチドの機能的断片からなる群より選択される、ペルオキシソーム膜ポリペプチド。
【請求項３４】
キメラポリペプチドが、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部に操作可能に結合した融合ポリペプチドまたはその一部を含む、供与膜構造の表面で露出している融合ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列の、ペルオキシソームの表面での露出を得るのに適したキメラポリペプチド。
【請求項３５】
（ａ）分泌経路の供与膜の細胞質側表面に露出した融合ポリペプチドのドメイン、および
（ｂ）ペルオキシソーム膜に標的化および結合したドメイン
を含み、ドメイン（ａ）および（ｂ）が操作可能に結合し、ペルオキシソームを含む宿主細胞におけるキメラポリペプチドの発現によってペルオキシソームに宿主細胞の分泌経路の受容膜と融合する能力が与えられる、キメラポリペプチド。
【請求項３６】
ドメイン（ａ）および（ｂ）が単一のオープンリーディングフレーム中に存在し、ドメイン（ａ）がドメイン（ｂ）よりもポリペプチドのＮ末端に近い、請求項３５に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３７】
ドメイン（ａ）がｖ−ＳＮＡＲＥ由来である、請求項３５または３６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３８】
ドメイン（ａ）が、ｖ−ＳＮＡＲＥのＮ末端から、第一の膜貫通ドメインまで、または第一の膜貫通ドメインを含む範囲にわたる、ｖ−ＳＮＡＲＥ由来の断片を含む、請求項３７に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３９】
ドメイン（ａ）の断片が、配列番号１３の１〜９５位、または配列番号１３に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性の程度を示す相同な配列に対応する配列を含む、請求項３８に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４０】
断片がｖ−ＳＮＡＲＥのＮ末端から第一の膜貫通ドメインまでのアミノ酸の少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％にわたる、請求項３８または３９に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４１】
ドメイン（ｂ）が、膜貫通ドメイン、およびドメインをペルオキシソーム膜に標的化させる配列を含む、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４２】
ドメイン（ａ）に最も近位の膜貫通ドメインのＮ末端が細胞質側向きに方向付けられている、請求項４１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４３】
ドメイン（ｂ）がペルオキシソーム膜タンパク質由来の配列を含む、請求項４２または４３に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４４】
ドメイン（ｂ）が、Ｎ末端が元々ペルオキシソームの細胞質側に露出したペルオキシソーム膜ポリペプチド由来であるか、またはＮ末端が細胞質側向きに方向付けられた少なくとも１つの膜貫通ドメインを有するペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である、請求項４３に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４５】
ドメイン（ｂ）が、Ｎ末端が細胞質側向きに方向付けられた最もＮ末端側の膜貫通ドメインから少なくとも１０アミノ酸までＮ末端アミノ酸が除かれたペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である、請求項４４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４６】
ドメイン（ｂ）が、Ｐｍｐ２２、Ｐｍｐ３４、Ｐｍｐ４７、Ｐｍｐ７０、Ｐｅｘ３、Ｐｅｘ１１、Ｐｅｘ１４およびＰｅｘ２２から選択されるペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である、請求項４５に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４７】
ドメイン（ｂ）が、配列番号１６の２〜２２４位に対応する配列、好ましくは３もしくは４もしくは５もしくは６もしくは７もしくは８もしくは９もしくは１０もしくは１１もしくは１２もしくは１３もしくは１４もしくは１５もしくは１６もしくは１７もしくは１８もしくは１９もしくは２０もしくは２１もしくは２２もしくは２３もしくは２４もしくは２５もしくは２６もしくは２７もしくは２８もしくは２９もしくは３０もしくは３１もしくは３２もしくは３３もしくは３４もしくは３５もしくは３６もしくは３７もしくは３８もしくは３９もしくは４０〜２２４位または配列番号１６に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性の程度を示す相同な配列に対応する配列である、請求項４６に記載のキメラタンパク質。
【請求項４８】
配列番号２４のアミノ酸配列を有する、請求項４７に記載のキメラタンパク質。
【請求項４９】
請求項３５〜４８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質をコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項５０】
プロモーターに動作可能に連結された請求項４９に記載のヌクレオチド配列を含む、発現コンストラクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換えＤＮＡ技術に関する。特に、本発明は、真核細胞における化合物の生成方法に関し、ここで化合物は細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合することができるペルオキシソーム中に存在し、細胞外への化合物の放出を引き起こす。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞による培地へのタンパク質の分泌は、分泌経路を構成する種々の膜で包まれた区画を介したタンパク質の運搬を含む。まず、タンパク質は、小胞体（ＥＲ）の内腔に輸送される。そこから、タンパク質は膜小胞中でゴルジ複合体へ、およびゴルジ複合体から細胞膜へと輸送される。分泌経路は、分泌タンパク質を含む小胞が供与膜からくびれ切れ、受容膜に標的化および融合する、いくつかのステップを含む。これらのステップのそれぞれで、糖鎖付加およびジスルフィド架橋形成を含むタンパク質の十分な成熟が行われるために、シャペロンまたは折りたたみ酵素等のいくつかのタンパク質の機能が必要である。細胞外タンパク質は、ＥＲの酸化環境で成熟し、コア糖鎖付加されるようになり、この糖鎖付加プロセスは、続いてゴルジ複合体中で完了する。
【０００３】
真核生物におけるタンパク質分泌を増大させるために、いくつかの試みがなされている。異種タンパク質の分泌を増大させる一般的なアプローチは、シグナル配列を使用することである（例えばＥＰ０２１５５９４号明細書参照）。真核細胞における従来の分泌経路は、上記で概説したように、定義により、細胞外タンパク質の成熟に適合している。細胞内タンパク質の成熟は、特定のシャペロンおよび折りたたみタンパク質を有する細胞質の還元環境で実現される。産業環境における、タンパク質、特に細胞内タンパク質の生成は、分泌および下流のプロセシングの両方が不十分なことによってタンパク質の収率が低いために、依然として困難な課題である（ホプキンズ（Ｈｐｋｉｎｓ）ＴＲ．細胞内タンパク質の回収のための物理的および化学的細胞崩壊（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）バイオプロセス・テクノロジー（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．）１９９１年、１２：５７−８３頁）。
【０００４】
タンパク質を生成する産業上の重要性が高まっているため、ならびに分泌および下流のプロセシング経路の効率が不十分であるため、依然として、真核細胞におけるタンパク質の生成の、向上したプロセスを得る必要がある。本発明は、高い効率でタンパク質を生成する、新規の方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【０００５】
第一の態様において、本発明は、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合することができる、ペルオキシソームを含む真核細胞に関する。このようにして、本発明は、ペルオキシソームの内容物を細胞外に放出することができるという点で、真核細胞の新規の能力を提供する。このようにして、真核細胞によって他の状態では分泌されないであろう化合物が、今やペルオキシソーム経路を介して有利に放出され得る。
【０００６】
本発明によると、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合は、ペルオキシソーム膜の、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合と同等である。融合は、一体化された全体を形成する、多様な要素の溶け込みを意味する。ある要素が、ここではペルオキシソーム膜であり、他の要素は細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造由来の膜である。ペルオキシソーム脂質二重層膜の、分泌経路の膜構造の脂質二重層膜との融合は、本明細書中では、２つの脂質二重層膜が、ペルオキシソームおよび分泌経路の膜構造の両方の内容物を囲む１つの単一の連続した脂質二重層膜を形成することを意味すると理解される。ペルオキシソーム脂質二重層膜が細胞膜と融合して１つの単一の連続した脂質二重層膜を形成する場合、新しく形成された単一の膜はペルオキシソーム内容物を囲まず、むしろペルオキシソーム内容物が細胞外環境へ放出されると理解される。例えば、ペルオキシソームの、細胞膜との融合が起こる場合、ペルオキシソーム内容物は、細胞外に直接輸送される。別の例において、ペルオキシソームの、ゴルジ複合体および／またはＥＲとの融合が起こる場合、ペルオキシソーム内容物はゴルジ複合体および／またはＥＲに輸送され、それによって、細胞の内在性分泌経路を介して間接的に細胞外へ輸送される。
【０００７】
ペルオキシソーム（マイクロボディとも呼ばれる）は、真核細胞に遍在して見られる種々の代謝プロセスに関係する単一の膜で包まれた細胞器官として定義される（阪井（Ｓａｋａｉ）ら、イースト（Ｙｅａｓｔ）１４、１１７５−１１８７頁、１９９８年）。真核細胞において、ペルオキシソームは、通常は、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合しないが、単一の膜に包まれた細胞器官として細胞質内に維持されている。
【０００８】
本発明の関係において、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造は、細胞によるポリペプチドの分泌に関係する任意の膜構造であり得る。本発明全体で、用語「細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造」および用語「膜構造」は、同義的に使用される。好ましくは、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造は、細胞膜、ゴルジ複合体および小胞体（ＥＲ）からなる群より選択される。ゴルジ複合体は、互いに結合して層板を形成する、最低３つ（シス、中間およびトランスゴルジ）の別個の扁平な、膜に包まれた区画（槽）を含むと定義される（プファイファー（Ｐｆｅｆｆｅｒ）ＳＲ、ゴルジ複合体の構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａ  Ｇｏｌｇｉ  ｃｏｍｐｌｅｘ）。ジャーナル・オブ・セルバイオロジー（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）２００１年１２月１０日、１５５（６）：８７３−５頁）。
【０００９】
分泌経路内の膜融合のプロセスは、全ての真核種において高度に保存されている。当該分野の現状によると、膜融合を推進する中心的構成要素は、ＳＮＡＲＥ（可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体）と呼ばれるポリペプチドである。相補的ＳＮＡＲＥが供与（ｖ−ＳＮＡＲＥ）および受容膜（ｔ−ＳＮＡＲＥ）上に存在し、保存配列モチーフ（ＳＮＡＲＥモチーフ）によって区別される。膜融合を媒介するために、４つのＳＮＡＲＥモチーフが束になって、ＳＮＡＲＥｐｉｎと呼ばれる平行なコイルドコイル構造を形成する。ＳＮＡＲＥｐｉｎは、受容膜構造上の少なくとも１つの膜アンカー型ＳＮＡＲＥおよび供与膜構造上の少なくとも１つの膜アンカー型ＳＮＡＲＥで構成される。１つまたは２つのＳＮＡＲＥモチーフ（例えばＳｅｃ９）を含む、可溶性、またはあるいは膜結合型ＳＮＡＲＥは、ＳＮＡＲＥｐｉｎ形成を補完し得る。供与：受容膜構造におけるＳＮＡＲＥｐｉｎ構成要素の組み合わせ方は１：３であり得るが、２：２でもあり得る（ブーリ（Ｂｕｒｒｉ）Ｌ、リスゴウ（Ｌｉｔｈｇｏｗ）Ｔ．酵母におけるＳＮＡＲＥの完全な組（Ａ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ＳＮＡＲＥｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．）トラフィック（Ｔｒａｆｆｉｃ．）２００４年１月、５（１）：４５−５２頁）。
【００１０】
本発明によると、ペルオキシソーム膜の、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合は、単独または組み合わせで用いられ得る、いくつかの様式で実現され得る。
【００１１】
本発明は、ペルオキシソームの、真核細胞の細胞膜（または分泌経路の別の膜）との融合を得るために、ある好ましい選択肢は、ペルオキシソームの表面で融合ポリペプチドまたはその一部を露出させることであることを開示する。本発明によると、融合ポリペプチドは、供与膜構造の、受容膜構造との融合に関係するポリペプチドであり、通常は供与膜構造の表面で露出している。表面で露出するとは、本明細書中では、内腔側の反対の、供与膜の細胞質側で露出していることを意味すると理解される。供与膜構造は、受容膜構造と融合することができる小胞を生じることができる膜構造として定義される。好ましくは、供与および受容膜構造は、分泌経路の膜である。より好ましくは、供与膜構造は、ゴルジ複合体およびＥＲからなる群より選択される。
【００１２】
融合ポリペプチドは、典型的には、供与膜構造、例えばゴルジ複合体またはＥＲの表面で露出した部分、および膜貫通ドメインを含む。好ましい実施形態において、通常供与膜構造の表面で露出している融合ポリペプチドのその部分、すなわち表面露出ドメインは、ペルオキシソームの表面での露出に用いられる。
【００１３】
好ましい実施形態において、供与膜構造はゴルジ複合体であり、すなわち、融合ポリペプチドは、通常ゴルジ複合体の小胞の表面で露出しているポリペプチドであり、ゴルジ小胞の、細胞膜との融合に関係することが公知である。
【００１４】
好ましい融合ポリペプチドは、ｖ−ＳＮＡＲＥポリペプチドのファミリー、またはベシクル−ＳＮＡＲＥ（ｖｅｓｉｃｌｅ−ＳＮＡＲＥｓ）、ヤーン（Ｊａｈｎ）ら、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）（１９９９年）８６３−９１１頁、ブーリ（Ｂｕｒｒｉ）ら、上掲に記載されているｖ−ＳＮＡＲＥのポリペプチドである。好ましいＳＮＡＲＥは、配列番号１３への配列同一性によって、本明細書中で下記にさらに定義される。
【００１５】
ゴルジ複合体の小胞の表面で発現されるいくつかのｖ−ＳＮＡＲＥは、すでに記載されており、例えばＳｎｃ１およびＳｎｃ２である（ブーリ（Ｂｕｒｒｉ）ら、上掲）。ＥＲの表面で発現されるｖ−ＳＮＡＲＥの例は、Ｓｅｃ２２およびＹｋｔ６である（ブーリ（Ｂｕｒｒｉ）ら、上掲）。本発明の好ましい実施形態において、ｖ−ＳＮＡＲＥ  Ｓｎｃ１もしくはＳｎｃ２、またはそれらのホモログの少なくとも１つが用いられる。Ｓｎｃ１／Ｓｎｃ２ホモログの例は、本発明によって提供されるような、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＳｎｃＡポリペプチドである。
【００１６】
本発明は、特定の参照種、通常酵母（Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来の起源を参照しながら本発明に記載される任意のポリペプチド（またはそのコード遺伝子）のホモログの使用を包含する。したがって、ホモログは参照種で用いられる名前と異なる名前を有し得るが、ホモログ（またはホモログ配列）は、参照種のポリペプチドと実質的に同じ機能を発揮する、参照種とは別の種由来のポリペプチドとして定義される。典型的には、かかるホモログは、少なくとも５０％の、参照種のポリペプチドとの同一性の程度を有し得る。かかるホモログは、好ましくは、本発明に従って修飾された真核細胞と同じ真核生物種から生じる。
【００１７】
ペルオキシソーム表面でのｖ−ＳＮＡＲＥ等の融合ポリペプチドの露出を得るために、受容膜上の相補的ＳＮＡＲＥとの機能相互作用が可能である、融合ポリペプチドまたは少なくともその一部がペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部に、操作可能に結合、好ましくは融合する。このようにして、融合ポリペプチド部分または構成要素およびペルオキシソーム膜ポリペプチド部分または構成要素を含んで、キメラポリペプチドが得られる。
【００１８】
ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部は、キメラポリペプチドの構成要素として、好ましくは、ペルオキシソーム膜へのキメラポリペプチドの標的化を媒介することができ、より好ましくは、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部は、キメラポリペプチドをペルオキシソーム膜へアンカーすることができる。最も好ましくは、キメラポリペプチドをペルオキシソーム膜にアンカーすることは、膜貫通セグメントにわたる少なくとも１つの膜の、ペルオキシソーム膜への統合によって、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部によって遂げられる。好ましくは、ペルオキシソーム膜中のキメラポリペプチド全体の局在化は、膜アンカーとして機能し、同時にペルオキシソームの（細胞質側）表面上のキメラポリペプチドの融合ポリペプチド部分を露出させるものである。好ましくは、ペルオキシソーム膜ポリペプチドは、Ｎ末端部分でトリミングされて、結果として、キメラ融合ポリペプチドのペルオキシソーム標的化を排除することなく、ペルオキシソーム膜に可能な限り近い融合ポリペプチドの露出を生じる。
【００１９】
好ましくは、ｖ−ＳＮＡＲＥ等の、融合ポリペプチドのその部分は、少なくとも、通常はゴルジ小胞等の供与膜構造の表面で露出している融合ポリペプチドのドメインを含む、キメラポリペプチドの構成要素として用いられる。融合ポリペプチドの膜貫通ドメインは、部分的または完全にのいずれかで、キメラポリペプチドに存在しなくてもよい。
【００２０】
ペルオキシソーム膜アンカーとして機能するのに適した任意のペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部は、（細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と相互作用できるように）ペルオキシソームの細胞質側（または表面）に位置する融合ポリペプチド部分を含むキメラポリペプチドが結果として生じる限りは、少なくとも融合ポリペプチドの表面露出ドメインとの、操作可能な結合、好ましくは融合に用いられるのに適している。好ましくは、融合ポリペプチド部分は、キメラポリペプチドのＮ末端部分に位置し、そのため、好ましくは、ペルオキシソーム膜ポリペプチドは、Ｎ末端が天然にペルオキシソームの細胞質側に露出した、または天然の配向がセグメントのＮ末端が細胞質の方に向くように方向付けられたものである少なくとも１つの膜貫通セグメントを有するポリペプチドである。
【００２１】
好ましいペルオキシソーム膜ポリペプチドの例は、ペルオキシソーム膜ポリペプチド２２（Ｐｍｐ２２）またはそのホモログである（ブロシアス（Ｂｒｏｓｉｕｓ）Ｕ、デーメル（Ｄｅｈｍｅｌ）Ｔ、ガートナー（Ｇａｒｔｎｅｒ）Ｊ．２つの異なる標的化シグナルがヒトペルオキシソーム膜タンパク質２２をペルオキシソームに方向付ける（Ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２２  ｔｏ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｓ．）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．）２００２年１月４日、２７７（１）：７７４−８４頁）。Ｐｍｐ２２ホモログの例は、本発明によって提供されるようなアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）Ｐｍｐ２２である。ブロシアス（Ｂｒｏｓｉｕｓ）ら（２００２年、上掲）は、ヒトおよびラットＰｍｐ２２タンパク質は４つの膜貫通ドメイン（１つはＮからＣ末端の方向で通る）ならびに第一および第二の膜貫通ドメインのＮ末端に位置する２つの独立したペルオキシソーム標的化シグナルを有することを示した。好ましい実施形態によると、キメラポリペプチドの構成要素として用いられる、Ｐｍｐ２２ポリペプチドの一部は、そのため、少なくとも、Ｐｍｐ２２のペルオキシソーム膜貫通ドメイン３および４、より好ましくはＰｍｐ２２の４つ全てのペルオキシソーム膜貫通ドメインを含む。好ましくは、Ｐｍｐ２２のペルオキシソーム膜貫通ドメイン３および４のみを含むキメラポリペプチドの構成要素として用いられるＰｍｐ２２ポリペプチドの一部は、さらに、膜貫通ドメイン３のＮ末端側の、機能的ペルオキシソーム標的化シグナルを含むのに十分なアミノ酸を含む。好ましくは、ブロシアス（Ｂｒｏｓｉｕｓ）ら（２００２年、上掲）によって定義されるような膜貫通ドメイン３のＮ末端側の少なくとも１５、１２、１０、８または７アミノ酸が含まれる。
【００２２】
少なくとも融合ポリペプチドの表面露出ドメインへの、操作可能な結合、好ましくは融合に用いられるのに適した、他の適したペルオキシソーム膜タンパク質（またはペルオキシソーム膜アンカーとして機能するのに適したその一部）としては、例えばＰＭＰ３４、ＰＭＰ４７、ＰＭＰ７０、ＰＥＸ３、ＰＥＸ１１、ＰＥＸ１４およびＰＥＸ２２が挙げられるが、これらに限定されない（エッカート（Ｅｃｋｅｒｔ）ＪＨおよびアードマン（Ｅｒｄｍａｎｎ）Ｒ．、ペルオキシソームバイオジェネシス（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．）レビュース・オブ・フィジオロジー、バイオケミストリー・アンド・ファーマコロジー（Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）２００３年、１４７：７５−１２１頁において総説されている）。
【００２３】
好ましくは、Ｐｍｐ２２または別のペルオキシソーム膜タンパク質は、上述のように、Ｎ末端部分でトリミングされる。前記トリミングは、少なくとも第一のメチオニンの消失を含む。Ｎ末端部分でのトリミングは、さらにＮ末端の１〜５０、例えば４８アミノ酸、好ましくはＮ末端の１〜３５、例えば３３アミノ酸、より好ましくはＮ末端の１〜２０、例えば１８アミノ酸の消失を含み得る。好ましくは、ペルオキシソーム膜タンパク質のＮ末端は、天然の配向がセグメントのＮ末端が細胞質側向きに方向付けられたものである（ＮからＣ末端の方向で）第一の膜貫通ドメインのＮ末端側である少なくとも１５、１２、１０、８、７、５または３アミノ酸が残るようにトリミングされる。好ましくは、ペルオキシソーム膜タンパク質のＮ末端のトリミングは、ペルオキシソーム標的化に必要なアミノ酸配列を消失または崩壊させない。
【００２４】
好ましい実施形態によると、通常供与膜構造の表面で露出しているｖ−ＳＮＡＲＥのドメイン（例えばＳｎｃ１、Ｓｎｃ２またはＳｎｃＡ）は、ペルオキシソーム膜ポリペプチドＰｍｐ２２に操作可能に結合（融合）して、ｖ−ＳＮＡＲＥの対応する部分、例えばＳｎｃ１、Ｓｎｃ２またはＳｎｃＡで、ペルオキシソームを装飾している。より好ましくは、ＳｎｃＡの表面露出ドメインが用いられる。さらにより好ましくは、キメラポリペプチドは配列番号２４のアミノ酸配列を有する。当業者は、配列番号２４に関して記載されるのと同じ原理に従って、どのようにして他の生物由来のＰｍｐ２２ポリペプチドオルソログおよびｖ−ＳＮＡＲＥオルソログからキメラポリペプチドを構築するかを知るであろう。
【００２５】
本発明のある実施形態において、ペルオキシソームの表面での融合ポリペプチドの露出は、細胞の受容膜構造、例えば細胞膜またはゴルジ複合体での、補完融合ポリペプチドの過剰発現を伴う。「補完融合ポリペプチド」は、本発明によると、供与膜構造、例えばゴルジ複合体の小胞またはＥＲと、受容膜構造、例えば細胞膜またはゴルジ複合体との、融合の促進に関係するポリペプチドである。
【００２６】
補完融合ポリペプチドは、好ましくは、標的ＳＮＡＲＥまたはｔ−ＳＮＡＲＥである（ヤーン（Ｊａｈｎ）ら、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）８６３−９１１頁（１９９９年））。好ましいｔ−ＳＮＡＲＥポリペプチドは、例えば、細胞膜に位置するＳｓｏ１もしくはＳｓｏ２、またはそれらのホモログ、またはゴルジ複合体に位置するＳｅｄ５またはそのホモログである（ブーリ（Ｂｕｒｒｉ）ら、上掲）。他の好ましい補完融合ポリペプチドは、細胞膜での融合に関係するＳｅｃ９、またはゴルジ複合体での融合に関係するＢｏｓ１、Ｇｏｓ１、Ｂｅｔ１もしくはそれらのホモログである（ブーリ（Ｂｕｒｒｉ）ら、上掲）。
【００２７】
好ましい実施形態によると、融合および補完融合ポリペプチドは、化学量論的量で露出または過剰発現され、融合および補完融合ポリペプチドの間のポリペプチド相互作用が可能な限り生理学的速度または天然の化学量論に近いことを意味する（ブーリ（Ｂｕｒｒｉ）Ｌら、上掲）。化学量論的同時露出は、ペルオキシソームの、受容膜構造、例えば細胞膜との融合を、さらに促進すると期待される。この化学量論的同時露出は、好ましくは、実質的に同じコピー数で同一な発現カセットを用いることによって達成される。好ましくは、ｔ−ＳＮＡＲＥ遺伝子の内在性コピーは、内在性コピーに由来するｔ−ＳＮＡＲＥの量が分泌経路の天然の小胞との融合に利用できるように、変化しないままである。
【００２８】
本発明のある実施形態によると、真核細胞は、細胞膜ならびに細胞のゴルジ複合体と融合することができるペルオキシソームを含む。
【００２９】
好ましい実施形態によると、全ての選択された融合および任意の補完融合ポリペプチド、ならびに発現されるペルオキシソーム膜ポリペプチドは、適した真核宿主細胞にとって天然である。
【００３０】
本発明はさらに、真核細胞が本発明の活性を、増大した効率で達成することができるような、本発明の真核細胞の改良を構想する。
【００３１】
例えば、細胞膜へのペルオキシソームの標的化およびそれに続く膜融合が、ゴルジ由来小胞の標的化機構を用いることによって、促進され得る。改変によって、この機構がペルオキシソームに対して効果的になることが可能になり得る。
【００３２】
この機構をペルオキシソームに対して効果的に改変する例は、Ｓｅｃ４またはそのホモログを、操作可能にペルオキシソームと結合するように、操作することである。これにより、結果として細胞膜中の分泌複合体へのペルオキシソームの標的化が生じ（エキソシスト（ｅｘｏｃｙｓｔ））、さらに、ＳＮＡＲＥｐｉｎ形成を増大させて、細胞膜とのペルオキシソーム融合の効率を促進させる。通常Ｓｅｃ４は、ＧＤＰ可溶性状態、およびＧＴＰ結合型分泌小胞膜付着状態の間で循環する。永続的に付着したＳｅｃ４は生物学的に活性があることが示されている（オシッヒ（Ｏｓｓｉｇ）ら１９９５年、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）３６４５−３６５３頁）。Ｓｅｃ４の膜付着は、通常は、２つのＣ末端システイン残基のゲラニルゲラニル化によって達成される。ペルオキシソーム膜へのＳｅｃ４の永続的な付着を可能にするために、Ｓｅｃ４の２つのＣ末端システイン残基は消失、または異なるアミノ酸と置換され得、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部を含むキメラポリペプチドが、すでに記載した融合ポリペプチドおよびペルオキシソーム膜ポリペプチドを含むキメラポリペプチドに類似するように操作され得る。
【００３３】
また、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造とのペルオキシソームの融合は、融合ポリペプチドとの相互作用に対する補完融合ポリペプチドの感受性をより高くすることによって、改良され得る。これは、後述されるように、種々の方法で行われ得る。
【００３４】
融合ポリペプチドの構成的に活性のある変異体、および任意に補完融合ポリペプチドは、ペルオキシソーム、および任意に受容膜構造、例えば細胞膜の表面で、調製および（過剰）露出され得る。構成的に活性のある変異体の例は、補完融合ポリペプチド、好ましくはｔ−ＳＮＡＲＥ、より好ましくはＳｓｏ１またはそのホモログの、脱リン酸化変異体である（マラシュ（Ｍａｒａｓｈ）Ｍ、ガースト（Ｇｅｒｓｔ）ＪＥ、ｔ−ＳＮＡＲＥ脱リン酸化は酵母におけるＳＮＡＲＥ集合およびエキソサイトーシスを促進する（ｔ-ＳＮＡＲＥ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＳＮＡＲＥ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．）ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）２００１年２月１日、２０（３）：４１１−２１頁）。
【００３５】
当業者に公知の技術によって、ＳＮＡＲＥの調節遺伝子を不活性化することも可能である。かかる調節因子は、例えば、リン酸化Ｓｓｏ１に結合して、Ｓｓｏ１の閉鎖した不活性なコンフォメーションを安定化させる、ｖ−ＳＮＡＲＥマスター（ＶＳＭ−１またはそのホモログ）である（マラシュ（Ｍａｒａｓｈ）Ｍ、ガースト（Ｇｅｒｓｔ）ＪＥ．モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．）２００３年８月、１４（８）：３１１４−２５頁）。
【００３６】
ＳＮＡＲＥ相互作用を活性化することが公知である酵素を過剰発現することも可能である。好ましくは、セラミド活性化ホスファターゼタンパク質（ＣＡＰＰ）またはそのホモログが過剰発現される（フィッシュバイン（Ｆｉｓｈｂｅｉｎ）ＪＤ、ドブロフスキー（Ｄｏｂｒｏｗｓｋｙ）ＲＴ、ビエラウスカ（Ｂｉｅｌａｗｓｋａ）Ａ、ガレット（Ｇａｒｒｅｔｔ）Ｓ、ハヌン（Ｈｕｎｎｕｎ）ＹＡ．セラミド媒介増殖阻害およびＣＡＰＰはサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で保存されている（Ｃｅｒａｍｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＣＡＰＰ  ａｒｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．）１９９３年５月５日、２６８（１３）：９２５５−６１頁）。
【００３７】
ペルオキシソームの恒常性が影響を受けるように真核細胞を改変することも可能である。かかる改変は、本発明の真核細胞を生じる親細胞のペルオキシソームバイオジェネシスおよび／または分解と比較して、ペルオキシソームバイオジェネシスの速度を向上させることおよび／またはペルオキシソーム分解の速度を減少させることを含み得る。
【００３８】
より好ましい実施形態によると、真核細胞は、
（ａ）ペルオキシソームバイオジェネシスに関係する遺伝子、例えばｐｅｘ１１および／もしくはｐｅｘ３またはそれらのホモログを過剰発現させること、ならびに／または
（ｂ）ペルオキシソーム分解に関係する遺伝子、例えばｖｐｓ１５および／もしくはｐｄｄ１および／もしくはＡＰＧまたはそれらのホモログの発現を下方制御すること
によって、遺伝学的に改変されている（国際公開第００／７１５７９号パンフレットに記載されている）。
【００３９】
ペルオキシソームバイオジェネシスにおけるｐｅｘ３およびｐｅｘ１１ポリペプチドの役割は、すでに記載されている（ベーレンツ（Ｂａｅｒｅｎｄｓ）ＲＪら、イースト（Ｙｅａｓｔ．）１９９７年１２月、１３（１５）：１４４９−６３頁および国際公開第００／７１５７９号パンフレット）。ペルオキシソームの分解におけるＡｐｇおよびＶｐｓ１５ポリペプチドの役割もまた、記載されている（ワン（Ｗａｎｇ）ＣＷら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．）２００１年８月１０日、２７６（３２）：３０４４２−５１頁およびハッチンス（Ｈｕｔｃｈｉｎｓ）ＭＵら、ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．）１９９９年１１月、１１２（２２号）：４０７９−８７頁）。
【００４０】
上述の方法の代わりに、または上述の方法と組み合わせて、適切なスクリーニング方法を用いた典型的な菌株改良によって、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合することができるペルオキシソームを含む真核細胞を得ることができる。好ましいスクリーニング方法は、後で記載するように、好ましくは、モデルタンパク質のペルオキシソーム局在化を促進するシグナルを用い、細胞外のモデルポリペプチドの存在を測定して、細胞のペルオキシソームにおいてＧＦＰのようなモデルポリペプチドの発現を用いる。細胞外のＧＦＰの存在は、蛍光および／またはウェスタンブロッティングによって測定され得るが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明の真核細胞は、遺伝学的に改変されて、野生型細胞と比較してより低いプロテアーゼ発現および／または分泌を示す表現型を得ることができる。かかる表現型は、プロテアーゼの発現の転写調節因子の欠失および／または修飾および／または不活性化によって得ることができる。かかる転写調節因子は、例えばｐｒｔＴである。ｐｒｔＴを調節することによってプロテアーゼの発現を低下させる技術は、米国特許出願公開第２００４／０１９１８６４Ａ１号明細書に記載されている。
【００４２】
本発明に従って改変される宿主細胞の選択は、大部分は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の供給源、または生成される代謝産物の同一性に依存する。好ましくは、真核細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、菌類または藻類細胞である。好ましい哺乳動物細胞としては、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞およびハイブリドーマが挙げられる。好ましい昆虫細胞としては、例えばＳｆ９およびＳｆ２１細胞およびそれらの派生物が挙げられる。より好ましくは、真核細胞は菌類細胞、すなわちＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）もしくはＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母細胞、または糸状菌細胞である。最も好ましい実施形態によると、真核細胞は糸状菌細胞である。
【００４３】
「糸状菌」としては、亜門、真菌（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の全ての糸状形態が挙げられる（ホークスワーク（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ）ら、１９９５年、上掲に定義されるように）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複合多糖類で構成される菌糸壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸の伸長により、炭素異化は絶対的に好気性である。糸状菌株としては、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ヒュミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
好ましい糸状菌細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の種、最も好ましくはアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の種に属する。
【００４５】
いくつかの菌株の糸状菌が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、ドイッチュ・ザンムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥレンＧｍｂＨ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｕｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）、菌株保存機関（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）およびアグリカルチュラル・リサーチ・サービス・パテント・カルチャー・コレクション、ノーザン・リージョナル・リサーチ・センター（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＮＲＲＬ）等の多くのカルチャーコレクションにおいてすでに公に容易に入手可能であり、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ２０４２３、ＩＦＯ４１７７、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ９５７６、ＡＴＣＣ１４４８８〜１４４９１、ＡＴＣＣ１１６０１、ＡＴＣＣ１２８９２、Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＣＢＳ４５５．９５、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｐ２、アクレモニウム  クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ３６２２５またはＡＴＣＣ４８２７２、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ２６９２１またはＡＴＣＣ５６７６５またはＡＴＣＣ２６９２１、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）ＡＴＣＣ１１９０６、クリソスポリウム・ルクノウエンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ４４００６およびそれらの派生物である。
【００４６】
ポリペプチド
第二の態様において、本発明は、第一の態様の真核細胞の調製に用いられる新規のポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、本明細書中上記で定義するような、融合ポリペプチド、融合ポリペプチドがペルオキシソーム膜ポリペプチドに操作可能に結合しているキメラポリペプチド、ペルオキシソーム膜ポリペプチドおよび補完融合ポリペプチドを提供する。
【００４７】
ある実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列に少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９５％さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義されるポリペプチドの機能的断片からなる群より選択される、ｖ−ＳＮＡＲＥ機能を示すポリペプチドを提供する。
【００４８】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列に少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９５％さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義されるポリペプチドの機能的断片からなる群より選択される、ペルオキシソーム膜ポリペプチドを提供する。
【００４９】
さらに別の実施形態において、本発明は、キメラポリペプチドが、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部に操作可能に結合した融合ポリペプチドまたはその一部を含む、供与膜構造の表面で露出した融合ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列のペルオキシソームの表面での露出を得るのに適したキメラポリペプチドを提供する。
【００５０】
好ましくは、キメラポリペプチドの融合ポリペプチド構成要素は、Ｎ末端から第一の（最もＮ末端側）膜貫通ドメインまでの、ｖ−ＳＮＡＲＥポリペプチドのアミノ酸を含む。より好ましくは、融合ポリペプチド構成要素は、（ａ）配列番号１３の１〜９５位に対応する配列、および（ｂ）（ａ）で定義される配列に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性の程度を示す相同な配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５１】
同様に好ましくは、キメラポリペプチドのペルオキシソーム膜タンパク質構成要素は、（ａ）配列番号１６の２〜２２４位に対応する配列、好ましくは３または４または５または６または７または８または９または１０または１１または１２または１３または１４または１５または１６または１７または１８または１９または２０または２１または２２または２３または２４または２５または２６または２７または２８または２９または３０または３１または３２または３３または３４または３５または３６または３７または３８または３９または４０〜２２４位に対応する配列、および（ｂ）（ａ）で定義される配列に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性の程度を示す相同な配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５２】
より好ましくは、キメラポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
【００５３】
したがって、本発明の好ましいキメラポリペプチドは、（ａ）分泌経路の供与膜の細胞質側表面で露出した融合ポリペプチドのドメイン、および（ｂ）ペルオキシソーム膜に標的化され、結合するドメインを含み、ここでドメイン（ａ）および（ｂ）は操作可能に結合されており、ペルオキシソームを含む宿主細胞におけるキメラポリペプチドの発現によって、ペルオキシソームに、宿主細胞の分泌経路の受容膜と融合する能力が与えられる。好ましくは、ドメイン（ａ）および（ｂ）は、単一のオープンリーディングフレーム中に存在し、ドメイン（ａ）は、ドメイン（ｂ）よりもポリペプチドのＮ末端に近い。好ましくは、ドメイン（ａ）はｖ−ＳＮＡＲＥ由来である。より好ましくは、ドメイン（ａ）は、ｖ−ＳＮＡＲＥの、Ｎ末端から、第一の膜貫通ドメインまで、または第一の膜貫通ドメインを含む範囲にわたる、ｖ−ＳＮＡＲＥ由来の断片を含む。本発明の好ましいキメラポリペプチドにおいて、ドメイン（ａ）における断片は、配列番号１３、または配列番号１３に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性の程度を示す相同な配列の、１〜９５位に対応する配列を含む。断片は、ｖ−ＳＮＡＲＥのＮ末端から第一の膜貫通ドメインまでのアミノ酸の、少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％にわたり得る。
【００５４】
本発明の好ましいキメラポリペプチドにおいて、ドメイン（ｂ）は、膜貫通ドメイン、およびドメインをペルオキシソーム膜に標的化する配列を含む。好ましくは、ドメイン（ａ）に最も近位の膜貫通ドメインのＮ末端は、細胞質側向きに方向付けられている。好ましくは、ドメイン（ｂ）は、ペルオキシソーム膜タンパク質由来の配列を含む。より好ましくは、ドメイン（ｂ）は、Ｎ末端が天然にペルオキシソームの細胞質側に露出しているペルオキシソーム膜ポリペプチド由来、または細胞質側向きに方向付けられたＮ末端を有する少なくとも１つの膜貫通ドメインを有するペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である。最も好ましくは、ドメイン（ｂ）は、Ｎ末端が細胞質側向きに方向付けられた最もＮ末端側の膜貫通ドメインから少なくとも１０アミノ酸までＮ末端アミノ酸が除かれている、ペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である。ドメイン（ｂ）は、Ｐｍｐ２２、Ｐｍｐ３４、Ｐｍｐ４７、Ｐｍｐ７０、Ｐｅｘ３、Ｐｅｘ１１、Ｐｅｘ１４およびＰｅｘ２２から選択されるペルオキシソーム膜ポリペプチドから得ることができる。好ましい実施形態において、本発明のキメラタンパク質ドメイン（ｂ）は、配列番号１６の２〜２２４位に対応する配列、好ましくは３もしくは４もしくは５もしくは６もしくは７もしくは８もしくは９もしくは１０もしくは１１もしくは１２もしくは１３もしくは１４もしくは１５もしくは１６もしくは１７もしくは１８もしくは１９もしくは２０もしくは２１もしくは２２もしくは２３もしくは２４もしくは２５もしくは２６もしくは２７もしくは２８もしくは２９もしくは３０もしくは３１もしくは３２もしくは３３もしくは３４もしくは３５もしくは３６もしくは３７もしくは３８もしくは３９もしくは４０〜２２４位に対応する配列、または配列番号１６に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性の程度を示す相同な配列である。最も好ましくは、キメラタンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
【００５５】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の間の相同性の程度は、２つの配列の間で同一であるアミノ酸のパーセンテージをいう。まず、相同なポリペプチド配列は、ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを用いて検索され、これはアルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２１５：４０３−４１０頁（１９９０年）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＢおよびＥは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして３の文字列長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８９：１０９１５頁（１９８９年）参照）５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を使用する。
【００５６】
次に、相同な配列の（上記で定義したような）同一性の程度を、以下のパラメータ、ギャップサイズ：５、ギャップオープン：１１、ギャップ延長：１、ミスマッチ：−１５、文字列サイズ：３を用いたＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントアルゴリズム（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）Ｄら（１９９４年）ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）２２：４６７３−４６８０頁）を用いて決定する。
【００５７】
ポリヌクレオチド
第三の態様において、本発明は、第二の態様のポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００５８】
本発明は、本明細書中で定義されるような、融合ポリペプチド、融合ポリペプチドがペルオキシソーム膜ポリペプチドに操作可能に結合したキメラポリペプチド、ペルオキシソーム膜ポリペプチドおよび補完融合ポリペプチドをコードする核酸配列を包含する。
【００５９】
本発明に従って改変される真核細胞を選択した後、融合ポリペプチドの本体（供給源）、ペルオキシソーム膜アンカーとして機能するポリペプチド、および任意に補完融合ポリペプチドが樹立され得る。例えば、第二の態様のポリペプチドをコードする核酸配列の供給源は、適した真核細胞の本体に依存し得る。好ましくは、第二の態様のポリペプチドをコードする核酸配列は、本発明に従って改変される真核細胞にとって内在性である。
【００６０】
本発明はさらに、適した宿主におけるポリペプチドの発現を指示する１つ以上の制御配列に操作可能に結合された、上記で定義されるようなポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを提供する。
【００６１】
発現は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの生成に関係する任意のステップを含むと理解されよう。
【００６２】
「核酸コンストラクト」は、本明細書中では、天然に存在する遺伝子から単離された、または天然に他に存在しないように組み合わせおよび並置された核酸のセグメントを含むよう修飾された、単鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子として定義される。用語核酸コンストラクトは、核酸コンストラクトがコード配列の発現に必要な制御配列全てを含む場合、用語発現カセットまたはベクターと同義である。
【００６３】
用語「制御配列」は、本明細書中では、一般にポリペプチドの発現に必要または有利である全ての構成要素を含むよう定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然または外来であり得る。かかる制御配列としては、プロモーター、リーダー、最適な翻訳開始配列（コザック（Ｋｏｚａｋ）、１９９１年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６６：１９８６７−１９８７０頁に記載されるような）、ポリアデニル化配列、転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最低限、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。
【００６４】
用語「操作可能に結合された」は、本明細書中では、制御配列がＤＮＡ配列のコード配列に関する位置に、制御配列がポリペプチドの発現を指示するように適切に配置された配置として定義される。
【００６５】
制御配列は、変異、トランケートおよびハイブリッドプロモーターを含む、細胞において転写活性を示す、任意の適切なプロモーター配列であり得、細胞にとって相同（天然）または異種（外来性）のいずれかの、細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【００６６】
プロモーターは、発現されるコード配列と天然に結合しているプロモーターであり得る。プロモーターはまた、発現されるコード配列にとって外来性の、構成的または誘導性プロモーターであり得る。哺乳動物細胞における使用に適したプロモーターの例は、例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）（２００１年）「モレキュラークローニング：ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版）」ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。酵母における使用に適したプロモーターの例としては、例えば、解糖プロモーターが挙げられる。
【００６７】
使用され得る好ましい誘導性プロモーターの例は、デンプン、銅、オレイン酸誘導性プロモーターである。
【００６８】
別の好ましい実施形態によると、本発明の宿主細胞において、ＣＡＰＰ等の遺伝子が過剰発現されなければならない場合、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼプロモーターまたはＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼプロモーター等の強力な誘導性プロモーターが用いられる。
【００６９】
制御配列はまた、転写を終了するよう細胞によって認識される配列である、適した転写ターミネーター配列であり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に、動作可能に連結される。細胞において機能的である、任意のターミネーターが、本発明において用いられ得る。
【００７０】
糸状菌細胞のための好ましいターミネーターは、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ遺伝子およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００７１】
制御配列はまた、糸状菌細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である、適したリーダー配列であり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に、動作可能に連結される。細胞において機能的である任意のリーダー配列が、本発明において用いられ得る。
【００７２】
糸状菌細胞のための好ましいリーダーは、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースホスフェートイソメラーゼおよびＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００７３】
制御配列はまた、核酸配列の３’末端に動作可能に連結された、転写された場合に糸状菌細胞によって、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される配列である、ポリアデニル化配列であり得る。細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列が、本発明において用いられ得る。
【００７４】
糸状菌細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼおよびＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００７５】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードする、プロペプチドコード領域であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（またはいくつかの場合においてはチモーゲン）として公知である。
【００７６】
核酸コンストラクトは、ベクターもしくは発現ベクターと同一、またはベクターもしくは発現ベクター中でクローニングされ得る。
【００７７】
組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ手順に簡便に供され得、融合ポリペプチド（または補完融合ポリペプチド）をコードする核酸配列の発現引き起こし得る、任意のベクター（例えばプラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される真核細胞との、ベクターの適合性に依存する。ベクターは、直鎖状または閉環プラスミドであり得る。ベクターは、自律増殖ベクター、すなわち複製が染色体複製から独立した染色体外の実体として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム、または人工染色体であり得る。糸状菌細胞中で用いられ得る自律維持クローニングベクターは、ＡＭＡ１−配列を含む（例えばアレクセンコ（Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ）およびクラッターバック（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ）（１９９７年）フンガル・ジェネティクス・アンド・バイオロジー（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．）２１：３７３−３９７頁参照）。
【００７８】
あるいは、ベクターは、細胞に導入された場合にゲノムに統合され、統合された染色体とともに複製されるものであり得る。組み込みベクターは、宿主細胞の染色体中、ランダムに、または予め決定された標的遺伝子座で統合し得る。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態において、組み込みベクターは、予め決定された遺伝子座に、ベクターを標的化するために宿主細胞のゲノム中の予め決定された標的遺伝子座におけるＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ断片を含む。標的化された統合を促進するために、ベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、クローニングベクターの少なくとも一方、好ましくは両端で、標的遺伝子座に相同な配列が側面に並ぶように行われる。標的遺伝子座が側面に並ぶ相同な配列の長さは、宿主細胞の本体に依存している。菌類に関して、長さは、好ましくは少なくとも３０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、さらに好ましくは少なくとも０．１ｋｂ、さらに好ましくは少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは少なくとも０．５ｋｂ、さらにより好ましくは少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。好ましくは、標的遺伝子座に相同な、ベクター中のＤＮＡ配列は、高度に発現される遺伝子座に由来し、宿主細胞において高い発現レベルが可能な遺伝子に由来することを意味する。高い発現レベルが可能な遺伝子、すなわち高度に発現される遺伝子は、本明細書中では、例えば誘導条件下でｍＲＮＡが全細胞ｍＲＮＡの少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）を占め得る遺伝子、または、あるいは遺伝子産物が全細胞タンパク質の少なくとも１％（ｗ／ｗ）を占め得る遺伝子（ＥＰ３５７１２７号明細書に記載されるように）として定義される。多くの好ましい高度に発現される菌類遺伝子が、例によって示される。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来のアミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼまたはセロビオヒロドロラーゼ遺伝子。これらの目的のための、最も好ましい、高度に発現される遺伝子は、グルコアミラーゼ遺伝子、好ましくはＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子、Ａ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子またはトリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼ遺伝子である。この型の発現ベクターは、ＣＡＰＰまたは融合ポリペプチドもしくは補完融合ポリペプチドの野生型もしくは構成的に活性のある変異体（ｓｓｏ１）等の所定の遺伝子を本発明真核細胞中で過剰発現するのに高度に適している。
【００８０】
あるいは、遺伝子の修飾または不活性化は、遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を用いる確立されたアンチセンス技術によって行われ得る。より具体的には、糸状菌細胞による遺伝子の発現は、細胞中で転写され得、細胞中で生成されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる、核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することによって、減少または排除され得る。ｍＲＮＡへの相補的アンチセンスヌクレオチド配列のハイブリダイズが可能な条件下で、翻訳されるタンパク質の量は、したがって、減少または排除される。アンチセンスＲＮＡを発現することの例は、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）２０００年２月、６６（２）：７７５−８２頁に示されている。（アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のタンパク質分泌経路における、フォルダーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｏｌｄａｓｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ａ，ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ニャム（Ｎｇｉａｍ）Ｃ、ジェーネス（Ｊｅｅｎｅｓ）ＤＪ、プント（Ｐｕｎｔ）ＰＪ、ヴァンデンホンデル（Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ）ＣＡ、アーチャー（Ａｒｃｈｅｒ）ＤＢ）または（ズレンナー（Ｚｒｅｎｎｅｒ）Ｒ、ウィルミツアー（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ）Ｌ、ゾンネンワルド（Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ）Ｕ、ジャガイモウリジン二リン酸−グルコースピロホスホリラーゼの発現およびアンチセンスＲＮＡによるその阻害の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔａｔｏ  ｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ）プランタ（Ｐｌａｎｔａ．）（１９９３年）、１９０（２）：２４７−５２頁）。
【００８１】
さらに、遺伝子の修飾、下方制御または不活性化は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術を介して得ることができる（ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｌｅｔｔ．）２３７（２００４年）：３１７−３２４頁）。この方法において、発現が影響を受けるヌクレオチド配列の同一のセンスおよびアンチセンス部分が、間のヌクレオチドスペーサーとともに互いの後ろにクローニングされ、発現ベクターに挿入される。その後、分子が転写され、小さい（２１〜２３）ヌクレオチド断片の形成によって、影響を受けるｍＲＮＡの、標的化された分解につながる。特定のｍＲＮＡの排除は、種々の程度であり得る。国際公開第２００５／０５６７２Ａ１号パンフレットおよび／または国際公開第２００５／０２６３５６Ａ１号パンフレットに記載されているＲＮＡ干渉技術を、遺伝子の下方制御、修飾または不活性化に用い得る。
【００８２】
ＶＳＭ１等の宿主の遺伝子が不活性化されなければならない場合、これは、好ましくは、ＥＰ６３５５７４号明細書に記載される技術に従って不活性化ベクターを設計することおよびベクターを不活性化される遺伝子の遺伝子座で標的化することによって行われる。
【００８３】
１つより多いコピーの、融合（任意に補完融合）ポリペプチドをコードする核酸配列を宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の生成を増大させ得る。これは、好ましくは、ＤＮＡ配列をそのゲノムコピーに組み込むこと、より好ましくはＤＮＡ配列の組み込みを高度に発現される遺伝子座、好ましくはグルコアミラーゼまたはアミラーゼ遺伝子座で標的化することによって、行われ得る。あるいは、これは、選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、それによってさらなるコピーの核酸配列を含む細胞が適切な選択可能因子の存在下で細胞を培養することによって選択され得る核酸配列を有する、増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を含むことによって行われ得る。過剰発現されるＤＮＡ配列のコピーの数をさらに多く増大させるために、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載されるような遺伝子変換の技術が用いられ得る。この型の発現ベクターはまた、本発明の宿主細胞中でＣＡＰＰ等の所定の遺伝子を過剰発現するのに高度に適している。
【００８４】
糸状菌細胞における使用のための選択可能マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノ−スリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびに他の種由来の同等物を含むがこれらに限定されない群より選択され得る。Ａ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳ（欧州特許第６３５５７４Ｂ１号明細書、国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）およびｐｙｒＧ遺伝子ならびにストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞における使用に好ましい。より好ましくは、ａｍｄＳ遺伝子が用いられ、さらにより好ましくは、Ａ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のａｍｄＳ遺伝子が用いられる。最も好ましい選択マーカー遺伝子は、Ａ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡプロモーターに融合したＡ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳコード配列である（欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書に開示されるように）。他の糸状菌由来のａｍｄＳ遺伝子もまた、用いられ得る（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。ストレプトアロテイチャス・ヒンドゥスタナス（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ）由来のブレオマイシン遺伝子もまた、フレオマイシン耐性への下等および高等真核生物の形質転換のためのストレプトアロテイチャス・ヒンドゥスタナス（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ）ｂｌｅ遺伝子のカセット（Ｃａｓｓｅｔｅｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ  ｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗｅｒ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｅｒ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ  ｔｏ  ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）。ドロコート（Ｄｒｏｃｏｕｒｔ）Ｄ、カルメル（Ｃａｌｍｅｌｓ）Ｔ、レイネス（Ｒｅｙｎｅｓ）ＪＰ、バロン（Ｂａｒｏｎ）Ｍ、ティラビ（Ｔｉｒａｂｙ）Ｇ．ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１９９０年７月１１日、１８（１３）：４００９頁に記載されているように、用いられ得る。
【００８５】
本発明の組み換え発現ベクターを構築するための、上述の要素をライゲートするために用いられる手順は、当業者に周知である（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、上掲参照）。
【００８６】
ベクター系は、ともに細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含む、単一のベクターまたは２つ以上のベクターであり得る。ベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする、１つ以上の選択可能マーカーを含む。選択可能マーカーは、生成物が生命崩壊剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株への原栄養性等を提供する、遺伝子である。
【００８７】
細胞への発現ベクターまたは核酸コンストラクトの導入は、一般に公知の技術を用いて行われる。これは、それ自体公知の様式で、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換および細胞壁の再生からなるプロセスを含み得る。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞の形質転換に適した手順は、ＥＰ２３８０２３号明細書およびエルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）ら、１９８４年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ）８１：１４７０−１４７４頁に記載されている。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換する、適した方法は、マラーディーら、１９８９年、ジーン（Ｇｅｎｅ）７８：１４７１５６頁または国際公開第９６／００７８７号パンフレットによって記載されている。真正植物病原菌エリシフェ・グラミニスホルデイ亜種の微粒子銃形質転換（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｇｕｓ，Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｆ．ｓｐ．ｈｏｒｄｅｉ．）クリスチャンセン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ）ＳＫ、クヌートセン（Ｋｎｕｄｓｅｎ）Ｓ、ギーゼ（Ｇｉｅｓｅ）Ｈ．カレント・ジェネティクス（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．）１９９５年１２月、２９（１）：１００−２頁に記載されるような微粒子銃形質転換を用いる方法等の他の方法が適用され得る。選択された形質転換細胞は、次いでペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する膜構造、例えば細胞膜に融合する能力について、解析される。
【００８８】
細胞が、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合の能力を得たかどうかを解析する、いくつかの方法が利用可能である。
【００８９】
ある実施形態によると、細胞の形態が、ペルオキシソーム特異的標識を用いて、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合を可視化する、電子または蛍光顕微鏡下で研究される。ペルオキシソーム特異的標識の例は、
・サイモン（Ｓｉｍｏｎ）Ｍ、ビンダー（Ｂｉｎｄｅｒ）Ｍ、アダム（Ａｄａｍ）Ｇ、ハルティヒ（Ｈｅｒｔｉｇ）Ａ、ルイス（Ｒｕｉｓ）Ｈ  ＡＤＲ１、ＳＮＦ１（ＣＡＴ１、ＣＣＲ１）およびＳＮＦ４（ＣＡＴ３）によるサッカロミセス・セレヴィシエにおけるペルオキシソーム増殖の制御（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂｙ  ＡＤＲ１，ＳＮＦ１（ＣＡＴ１，ＣＣＲ１）ａｎｄ  ＳＮＦ４（ＣＡＴ３）．）イースト（Ｙｅａｓｔ）１９９２年４月、８（４）：３０３−９頁によって記載されているようなチオール酸標識、または
・モノソフ（Ｍｏｎｏｓｏｖ）ＥＺ、ワンツェル（Ｗｅｎｚｅｌ）ＴＪ、ルアーズ（Ｌｕｅｒｓ）ＧＨ、ハイマン（Ｈｅｙｍａｎ）ＪＡ、サブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）Ｓ  生きたＰ．パストリス細胞における緑色蛍光タンパク質でのペルオキシソームの標識（Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｃｅｌｌｓ．）ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．）１９９６年６月、４４（６）：５８１−９頁によって記載されているようなＧＦＰ標識、または
・クンシュ（Ｋｕｎｃｅ）ＣＭ、トレリース（Ｔｒｅｌｅａｓｅ）ＲＮ、ターリー（Ｔｕｒｌｅｙ）ＲＢ．綿実（ゴシピウム・ヒルスツム・Ｌ．）カタラーゼの精製および生合成（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  Ｌ．）ｃａｔａｌａｓｅ．）バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．）１９８８年４月１日、２５１（１）：１４７−５５頁に記載されているようなカタラーゼ標識
である。
【００９０】
別の実施形態によると、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合は、好ましくはモデルポリペプチドのペルオキシソーム局在化を促進するシグナルを用い、培地中のモデルポリペプチドの存在を測定して、細胞のペルオキシソームにおいてモデルポリペプチドを発現することによってモニタリングされる。好ましいモデルポリペプチドは、発酵培地中の存在が蛍光によって可視化され得、ウェスタンブロットによってモニタリングされ得るために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。他のモデルポリペプチドは、アセトアミダーゼ等のペルオキシソーム局在化シグナルまたはカタラーゼ、アマドリアーゼもしくはチオラーゼ等の天然にペルオキシソームに局在するタンパク質と、操作可能に結合された、酵素活性のある細胞内タンパク質であり得る。
【００９１】
好ましくは、第一の態様の真核細胞は、生成されたポリペプチドの合計量の少なくとも１０％が培養中の所定の時点で培地中に分泌される程度まで、より好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも４０％が分泌される程度まで、さらにより好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも６０％が分泌される程度まで、さらにより好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも７０％が分泌される程度まで、さらにより好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも８０％が分泌される程度まで、最も好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも９０％が分泌される程度まで、ペルオキシソーム融合効率を示す。生成されたポリペプチドの合計量は、培地がバイオマス画分および培地画分からなると定義される場合、培地中に存在するポリペプチドの量として定義される。分泌されたポリペプチドの量は、モデルポリペプチドを用いて推定され得る。このモデルポリペプチドは、後に定義されるように、ＰＴＳ−１等の操作された、ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルを有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（例えばＧＦＰ−ＳＫＬ）であり得る。培地画分内のＧＦＰ−ＳＫＬの濃度は、当業者に公知の技術（例えば蛍光測定、吸光度測定、ウェスタンブロット）を用いて決定され得る。決定された、モデルポリペプチドの濃度を用いて、分泌されたモデルポリペプチドの画分を、生成されたモデルポリペプチドの合計量のパーセンテージとして計算し得る。
【００９２】
目的の化合物の生成
本発明はさらに、目的の化合物が細胞のペルオキシソーム中に存在する、第一の態様の真核細胞における目的の化合物の生成の方法に関する。この方法は、
（ａ）目的の化合物の発現に伝導性のある条件下、所定の培地中で第一の態様の真核細胞を培養する工程および
（ｂ）任意に、目的の化合物を精製する工程
を含む。
【００９３】
好ましい実施形態によると、目的の化合物は、培地から回収され、任意に精製される。
【００９４】
別の好ましい実施形態によると、目的の化合物はポリペプチドである。
【００９５】
より好ましくは、第一の態様の真核細胞は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、目的のポリペプチドのペルオキシソーム局在化を促進するシグナルをコードする核酸配列と操作可能に結合された核酸コンストラクトまたは発現ベクターをさらに含む。
【００９６】
ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルは、ペルオキシソームの内側の結合したポリペプチドの局在化および／または蓄積を可能にする限りは、任意のシグナルであり得る。
【００９７】
好ましくは、ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルは、
（ａ）ＮからＣ末端方向の第一のアミノ酸がＡ、Ｃ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、ＳまたはＴであり、ＮからＣ末端方向の第二のアミノ酸がＨ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＲまたはＳであり、ＮからＣ末端方向の第三のアミノ酸がＡ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、ＭまたはＶであるトリペプチド、および
（ｂ）（Ｒ／Ｋ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｑ）ＸＸ（Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｈ／Ｑ）（Ｌ／Ｓ／Ｇ／Ａ／Ｋ）Ｘ（Ｈ／Ｑ）（Ｌ／Ａ／Ｆ）として定義され、Ｘが任意のアミノ酸であり得るペプチド
からなる群より選択される。
【００９８】
より好ましくは、ＰＴＳ−１とも呼ばれる、（ａ）で定義されるトリペプチドは、ペルオキシソームにおいて生成されるポリペプチドのＣ末端延長部分として存在する。したがって、ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルをコードするＤＮＡ配列は、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の下流でクローニングされ、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、操作可能に結合される。
【００９９】
好ましい実施形態によると、（ａ）で定義されるトリペプチドは、菌類、植物および動物におけるペルオキシソームプロテオームのコンピュータでの予測（Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｉｎ  ｆｕｎｇｉ，ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌｓ．）オロフ・エマニュエルソン（Ｏｌｏｆ  Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ）、アルネ・エロフソン（Ａｒｎｅ  Ｅｌｏｆｓｓｏｎ）、グンナー・フォン・エジュン（Ｇｕｎｎｅｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ）およびスサーナ・クリストーバル（Ｓｕｓａｎａ  Ｃｒｉｓｔｏｂａｌ）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）（２００３年）３３０、４４３−４５６頁に記載されるような、［ＰＡＳ］−［ＨＫＲ］−［Ｌ］のバリアントである。より好ましい実施形態によると、（ａ）で定義されるトリペプチドは、ＳＫＬまたはＰＲＬである。
【０１００】
別の好ましい実施形態によると、（ａ）で定義されるトリペプチドＰＴＳ−１）は、一旦細胞外にポリペプチドが分泌されると、目的のポリペプチドのＣ末端から、トリペプチド配列の除去を可能にする配列、またはトリペプチド配列の前の配列とともにトリペプチド配列の除去を可能にする配列に、先行される。かかる配列は、例えば、適した配列特異的プロテアーゼまたはペプチダーゼの、認識配列であり得る。
【０１０１】
（ｂ）で定義されるペプチドはまた、ＰＴＳ２シグナルと呼ばれる（スウィンケルス（Ｓｗｉｎｋｅｌｓ）Ｂら、１９９１年ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）３２５５−３２６２頁、ペトリフ（Ｐｅｔｒｉｖ）Ｏ．Ｉ．ら、２００４年ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）１１９−１３４頁）。好ましくは、これらはポリペプチドのＮ末端部分に存在する。
【０１０２】
目的のポリペプチドがすでにペルオキシソーム局在化を促進するシグナルを含む場合、好ましくは、この天然のシグナルを用いて、ペルオキシソーム局在化が促進される。あるいは、ペルオキシソーム局在化を促進する天然のシグナルを異なるものによって置換することを選択し得る。あるいは、ペルオキシソーム局在化を促進する天然のＤＮＡ配列を、上記で定義されたペルオキシソーム局在化を促進する配列をコードするＤＮＡ配列の１つによって置換することを選択し得る。
【０１０３】
ある実施形態において、本発明は、ペルオキシソームにおける目的のポリペプチドの段階的細胞外生成を構想する。第一段階において、目的のポリペプチドがペルオキシソーム中に蓄積し、第二段階において、本発明のキメラポリペプチド（任意に補完融合ポリペプチド）の発現を推進する誘導性プロモーターが、特異的誘導因子を培地に加えることによって誘導され、これは次にペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の受容膜構造との融合につながる。これにより、結果として目的のポリペプチドの細胞外生成が生じる。
【０１０４】
あるいは、他の型の段階的生成が可能である。第一に、目的のポリペプチドの生成、次いでペルオキシソーム増殖の誘導、および最後のステップとして、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の受容膜構造との融合。
【０１０５】
ポリペプチドは、宿主細胞にとって天然または外来性の任意のポリペプチドであり得る。用語「外来性ポリペプチド」は、本明細書中では、所定の細胞によって天然に生成されないポリペプチドとして定義される。用語「ポリペプチド」は、本明細書中では、特定の長さの、生成される、コードされるポリペプチドをいうよう意図されず、そのため、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を包含する。
【０１０６】
第一の態様の真核細胞は、成熟に還元環境を必要とするポリペプチド、例えば細胞内ポリペプチドの生成に高度に適している。したがって、好ましい実施形態によると、目的のポリペプチドは、細胞内ポリペプチドである。したがって、第一の態様の真核細胞を用いる本発明の方法は、産業規模で培地中で細胞内ポリペプチドを生成することができる最初のものである。
【０１０７】
好ましいポリペプチドは、アマドリアーゼ、カタラーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、リノール酸イソメラーゼ、トランス−２−エノイル−ＡＣＰレダクターゼ、トリコテセン、３−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、カルニチンラセマーゼ、Ｄ−マンデル酸デヒドロゲナーゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、フルクトシルアミン酸素オキシドレダクターゼ、２−ヒドロキシヘプタ−２，４−ジエン−１，７−ジオエートイソメラーゼ、ＮＡＤＰ依存性マレイン酸デヒドロゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、キノンレダクターゼ等のペルオキシソーム中で天然に生成される酵素である。これらの酵素は全てＣ末端のＳＫＬ配列を含む。
【０１０８】
他の細胞内酵素は、セラミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼアミノペプチダーゼ、アシラーゼ、アルドラーゼ、ヒドロキシラーゼ、アミノペプチダーゼである。
【０１０９】
別の実施形態において、ポリペプチドは、抗体もしくはその一部、抗原、凝固因子、細胞外酵素、ホルモンもしくはホルモンバリアント、受容体もしくはその一部、調節タンパク質、構造タンパク質、レポーターまたは輸送タンパク質である。
【０１１０】
別の実施形態によると、生成されるポリペプチドは、組み換え体である。第一の態様の真核細胞が、ペルオキシソーム局在化を促進するＤＮＡ配列を含む、生成されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に操作可能に結合された核酸コンストラクトまたは発現コンストラクトで形質転換されている。
【０１１１】
それによって、本発明は、細胞の通常の分泌経路において困難に遭遇するポリペプチドの細胞外生成を、有利に可能にする。一例として、生成される目的のポリペプチドは細胞外ポリペプチドであり、２０個より多いシステイン、１０個以下のシステイン、６個以下のシステインまたは２個以下のシステインを含んではならない。かかるポリペプチドは、宿主細胞にとって天然または異種であり得る。これらのポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞にとって組み換え体である。かかるポリペプチドの例は、以下の通りである。システインを含まない、アスペルギルス・フォエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）由来のシュウ酸デカルボキシラーゼ（ＡＰＯＸＤ、特許出願国際公開第９８４２８２７−Ａ２号パンフレットに記載されている）、システインを含まない、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のアスペルギロペプシンＩＩ（アスペルギルス・ニゲル酸性プロテイナーゼＡのチモーゲンの遺伝子および推論されるタンパク質配列（Ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ｐｔｏｒｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｚｙｍｏｇｅｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ａ）、イノウエ（Ｉｎｏｕｅ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．）１９９１年１０月１５日、２６６（２９）：１９４８４−１９４８９頁）、システインを含まない、リーシュマニア・メキシカナ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）由来の分泌された酸性ホスファターゼ２（リーシュマニア・メキシカナ分泌酸性ホスファターゼにおけるホスホグリカン修飾の標的としてのＳｅｒ／Ｔｈｒに富んだ反復モチーフ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃａｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）ヴィーゼ（Ｗｉｅｓｅ）ら、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）１９９５年３月１５日、１４（６）：１０６７−１０７４頁）、システインを含まない、スクレロティニア・スクレロティオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）由来の非アスパルチル酸性プロテアーゼ（スクレロティニア・スクレロティオラムの病因の間に発現される非アスパルチル酸性プロテアーゼをコードするａｃｐ１の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｐ１，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｎ−ａｓｐａｒｔｙｌ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、プスロー（Ｐｏｕｓｓｅｒｅａｕ）ら、マイクロバイオロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）２００１年３月、１４７（３号）：７１７−７２６頁）、１個のシステインを含む、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のキシラナーゼＡ（特許出願国際公開第２０００６８３９６−Ａ２号パンフレットに記載されるｘｙｎＡ）、２個のシステインを含む、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のスルファミダーゼ（マウススルファミダーゼをコードする遺伝子：ｃＤＮＡクローニング、構造および染色体マッピング（Ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｓｕｌｐｈａｍｉｄａｓｅ：ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ）、コンスタンツィ（Ｃｏｎｓｔａｎｚｉ）ら、マンマリアン・ゲノム（Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ）２０００年６月、１１（６）：４３６−４３９頁）。目的のポリペプチドはさらに、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、オキシドレダクターゼペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼであり得る。目的のポリペプチドをコードする核酸配列は、任意の原核、真核、または他の供給源から得ることができる。本発明の目的のために、用語「から得る」は、所定の供給源と関連して本明細書中で使用される場合、ポリペプチドが供給源によって、または供給源由来の遺伝子が挿入された細胞によって生成されることを意味するものとする。
【０１１２】
本発明の方法は、培養プロセスの最後に少なくとも０．０１ｇ／ｌの目的のポリペプチドの生成を、有利に可能にする。好ましくは少なくとも０．０５ｇ／ｌのポリペプチドが生成され、より好ましくは少なくとも０．１ｇ／ｌ、さらにより好ましくは少なくとも０．５ｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｇ／ｌのポリペプチドが生成される。
【０１１３】
別の好ましい実施形態によると、目的の化合物は代謝産物である。好ましい代謝産物は、タキソール、カロチノイドを含むイソプレノイド、アルカロイドを含むペニシリン、セファロスポリン、ロバスタチンを含むスタチン、および抗酸化物質である。第一の好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞は、内在性ペルオキシソーム代謝産物の生成に用いられている。内在性ペルオキシソーム代謝産物の例は、イソ酪酸、イソ吉草酸およびａ−メチル酪酸である。第二の好ましい実施形態によると、代謝産物は、第一の態様の真核細胞を宿主細胞として用いて生成され、ここで真核細胞はさらに、代謝産物合成に関係する酵素をコードする核酸配列を含む、代謝産物合成に関係する酵素のペルオキシソーム局在化を促進するシグナルをコードする核酸配列と操作可能に結合された、核酸コンストラクトまたは発現ベクターを含む。ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルは、すでに前述したようにペルオキシソームの内側の結合したポリペプチドの局在化および／または蓄積を可能にする限りは、任意のシグナルであり得る。代謝産物合成に関係する酵素の例は、以下の通りである。
−カロチノイド合成：フィトエン−βカロチンシンターゼｃｒｔＹＢおよびｃｒｔＥ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＺ。
−タキソール生合成：タキサン１３α−ヒドロキシラーゼおよびタキサジエンシンターゼ。
−ペニシリン合成：アシルトランスフェラーゼ。
−セファロスポリン合成：エクスパンダーゼ。
−アルカロイド合成：Ｓ）−ノルコクラウリンシンターゼ（ＮＣＳ）。
−スタチンポリケチドシンターゼ：ゲラニオール１０−ヒドロキシラーゼ。
【０１１４】
さらに別の実施形態によると、本発明は、ペルオキシソーム中に存在する代謝産物の段階的細胞外生成を構想する。第一段階において、ペルオキシソーム中に代謝産物が蓄積し、第二段階において、融合ポリペプチド（任意に補完融合ポリペプチド）の発現を推進する誘導性プロモーターが、培地に特異的誘導因子を加えることによって誘導され、これは次に、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の受容膜構造との融合につながる。これにより、結果として、代謝産物の細胞外生成が生じる。
【０１１５】
あるいは、他の型の段階的生成が可能である。まず、代謝産物の生成、次いでペルオキシソーム増殖の誘導、および最後のステップとして、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の受容膜構造との融合の誘導。
【０１１６】
培養条件
第一の態様の宿主細胞は、当業者に公知の方法を用いて、目的の化合物の生成に適した栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、適した培地中および目的の化合物の発現および／または単離を可能にする条件下で行われる実験室または産業的発酵槽における、振とうフラスコ培養、小規模または大規模培養（連続、回分、流加または固体培養を含む）によって、培養され得る。培養は、当該分野で公知の手順を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む、適した栄養培地中で行われる（例えば、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）Ｊ．Ｗ．およびラシュール（ＬａＳｕｒｅ）Ｌ．編、カリフォルニア州アカデミック・プレスのモア・ジーン・マニピュレーションズ・イン・フンギ（Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＣＡ）１９９１年参照）。適した培地は、商業的供給業者から入手可能であるか、または公開された組成物を用いて調製され得る（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログにおいて）。
【０１１７】
本発明はさらに、目的の化合物の生成のための、向上した生成方法を提供する。第一の好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞は、培養物が酸素制限の条件下で維持されるように適した量の酸素が供給される培地中で培養される。より好ましくは、酸素制限の培養条件は、少なくとも培養期間の一部にわたって全ての栄養素が過剰に提供される培地中で行われる。さらにより好ましくは、培養期間の少なくとも一部は、培養期間の半分、より好ましくは培養期間の２／３、さらにより好ましくは培養期間の４／５、さらにより好ましくは培養期間の５／６、最も好ましくは培養期間全体を意味する。
【０１１８】
特徴によって、「過剰に提供される」は、全ての栄養素が、培養の間の本発明の宿主細胞の増殖の制限を確立を避けるのに十分な量供給されることを意味する。明らかに、栄養素は、阻害または毒性の効果を引き起こすような量で供給されるべきではない。
【０１１９】
適した量の酸素が培養物に供給され、培養物が酸素制限の条件下で維持される。したがって、本発明の関係において、適した量の酸素は、培養の間の酸素制限の条件を実現する量の酸素として定義される。酸素制限下で培地を維持するために、培地に供給される酸素の量は、宿主細胞によって消費される酸素の量を超えるべきではない。言い換えれば、ＯＴＲは、ＯＵＲに実質的に同一であるべきである。ＯＴＲ（酸素消費速度）は、酸素が培地の気相から液相に輸送される速度として定義される。ＯＴＲは、時間の単位あたりの酸素量として表される（例えばモル／時間）。ＯＴＲは、培養装置に入る酸素の量と気体出口で測定される酸素の量との間の差から簡便に測定される。ＯＵＲ（酸素摂取速度）は、宿主細胞が、培地に供給される酸素を消費する速度として定義される。「実質的に同一」は、ＯＴＲが、＋または−５％の偏差でＯＵＲに同一であることを意味する。好ましくは、ＯＴＲは、宿主細胞が酸素を直ちに消費することができるとすると、可能な限り、すなわち、例えば培養装置の配置および／または気体供給における酸素濃度によって可能な限り高い。しかしながら、到達し得る最大ＯＴＲよりも低いＯＴＲ、例えば最大ＯＴＲ値の８０または９０％で酸素制限の条件下で培養プロセスを行うことも可能であることは、当業者に明らかになろう。
【０１２０】
ＯＴＲがＯＵＲに実質的に同一である状況において、培地中の溶存酸素濃度は、典型的には一定であり、酸素制限が培養を制御する場合、溶存酸素はゼロ、またはゼロに近くなる。培養プロセス中に酸素制限が存在するか否かを決定する簡便な方法は、ＯＴＲに対する、撹拌速度のわずかな増大（例えば５％）の効果を試験することである。ＯＴＲもまた減少する場合、酸素制限が実際に存在する。ＯＴＲが減少しないおよび／または溶存酸素濃度のみが減少する場合、酸素制限が存在する。代替的方法は、ＯＴＲに対する、栄養素供給の増大の効果を測定することである。栄養素供給の増大がＯＴＲの増大を伴わない場合、酸素制限が存在する。
【０１２１】
第二の好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞を培養することは、培養プロセスの間に培地のｐＨを変化させて目的の化合物の段階的細胞外生成を実現することを含む。第一の態様の宿主細胞の培養は、典型的には、宿主細胞および目的の化合物の両方に伝導性のある任意のｐＨで行われ得る。段階的細胞外生成は、プロセスの全体的収量を増大させ得る。第一段階において、第一の態様の宿主細胞に最も伝導性のあるｐＨで、目的の化合物がペルオキシソーム中に蓄積する。第二段階において、培地のｐＨが変えられる。より好ましくは、ｐＨは、第一の態様の宿主細胞の培養の段階１と２の間の遷移段階の間に線形の過程で変えられる。第一の態様の宿主細胞の培養プロセスの全持続時間は、等式Ｔｃ＝ａ＋ｔ＋ｂによって定義され、式中
Ｔｃ＝時間で表した培養プロセスの合計時間、
ａ＝時間で表した培養の第一段階の持続時間、
ｔ＝時間で表した遷移段階の持続時間、
ｂ＝時間で表した培養の第二段階の持続時間。
【０１２２】
さらにより好ましい実施形態によると、等式は、以下の基準を満たす。
９７≦Ｔｃ＝ａ＋ｔ＋ｂ≦２４０、式中、
７２≦ａ≦１２０、
１≦ｔ≦２４、
２４≦ｂ≦９６
【０１２３】
さらにより好ましくは、等式は、以下の基準を満たす。
１２８≦Ｔｃ＝ａ＋ｔ＋ｂ≦２１６、式中、
７２≦ａ≦９６、
８≦ｔ≦２４、
４８≦ｂ≦９６
【０１２４】
なおさらにより好ましくは、等式は、以下の基準を満たす。
１６０≦Ｔｃ＝ａ＋ｔ＋ｂ≦２１６、式中、
７２≦ａ≦９６、
１６≦ｔ≦２４、
７２≦ｂ≦９６
【０１２５】
最も好ましくは、等式は以下の基準を満たす。
Ｔｃ＝ａ＋ｔ＋ｂ≦１９２、式中、
ａ≦７２、
ｔ≦２４、
ｂ≦９６
【０１２６】
好ましくは、宿主細胞は、第一の段階において４．５〜６．０の間の範囲のｐＨで、および第二段階において５．５〜７．０の間の範囲のｐＨで培養される。最も好ましくは、宿主細胞は、第一段階において（ａ）ｐＨ６．０、および第二段階において（ｂ）ｐＨ６．７で培養される。
【０１２７】
第三の好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞の培養は、培養プロセスに間に培地の温度を変化させて目的の化合物の段階的細胞外生成を実現することを含む。第一の態様の宿主細胞の培養は、典型的には、宿主細胞および目的の化合物の両方に伝導性のある任意の温度で行われ得る。段階的細胞外生成は、プロセスの全体的収量を増大させ得る。第一段階において、第一の態様の宿主細胞に最も伝導性のある温度で、目的の化合物がペルオキシソーム中に蓄積する。第二段階において、培地の温度が変えられる。好ましくは、宿主細胞は、第一段階において３０℃〜３７°の間の範囲の温度で、および第二段階において３４℃〜３８℃の間の範囲の温度で培養される。最も好ましくは、宿主細胞は、第一段階において３０℃で、および第二段階において３６℃で培養される。
【０１２８】
あるいは、およびさらにより好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞の培養が行われ、ここで
・培養プロセスの少なくとも一部の間、適した量の酸素が培養物に供給されて培養物が酸素制限の条件下で維持される、および／または
・培地のｐＨが培養プロセスの間に変えられて、目的の化合物の段階的細胞外生成が実現される、および／または
・培養プロセスの間に培地の温度が変えられて、目的の化合物の段階的細胞外生成が実現される、および／または
・第一の態様の宿主細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、最も好ましくはアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の菌株である。
【０１２９】
最も好ましくは、第一の態様の宿主細胞の培養が行なわれ、ここで
・培養プロセスの少なくとも一部の間、適した量の酸素が培養物に供給されて培養物が酸素制限の条件下で維持される、および／または
・培地のｐＨが培養プロセスの間に変えられて、目的の化合物の段階的細胞外生成が実現され、上述したような全培養時間の等式が以下の基準、Ｔｃ＝ａ＋ｔ＋ｂ≦１６８（式中ａ≦７２、ｔ≦２４、ｂ≦９６）を満たし、第一段階のｐＨが６．０で第二段階のｐＨが６．７である、および／または
・培養プロセスの間に培地の温度が変えられて、目的の化合物の段階的細胞外生成が実現され、第一段階の温度が３０℃であり、第二段階の温度が３６℃である、および／または
・第一の態様の宿主細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、最も好ましくはアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の菌株である。
【０１３０】
培地は、生成される目的の化合物および選択された真核細胞に適合され得る。
【０１３１】
好ましい実施形態によると、培地は、セラミド活性化ホスファターゼタンパク質（ＣＡＰＰ）の活性化因子を含む。このホスファターゼは、ｔ−ＳＮＡＲＥを脱リン酸化することによってＳＮＡＲＥ相互作用を活性化することが公知である（マラシュ（Ｍａｒａｓｈ）Ｍ、ゲルスト（Ｇｅｒｓｔ）ＪＥ、ｔ−ＳＮＡＲＥ脱リン酸化によって酵母におけるＳＮＡＲＥ集合およびエキソサイトーシスが促進される（ｔ−ＳＮＡＲＥ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＳＮＡＲＥ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．）ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）２００１年２月１日、２０（３）：４１１−２１頁）。ＣＡＰＰの活性化因子の例は、セラミド、例えばジヒドロ−Ｃ２セラミドまたは別のＣ２−セラミドである（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、シグマ（ＳＩＧＭＡ））。好ましくは、培養の初めに、培地中に１〜１００μＭセラミドが存在する。より好ましくは、培養の初めに、培地中に５〜５０μＭセラミドが存在する。さらにより好ましくは、培養の初めに培地中に約１０μＭセラミドが存在する。最も好ましい実施形態によると、セラミドの濃度は、培養プロセス全体の間中、かかる値に維持されるようモニタリングされる。必要に応じて、培養プロセスの間に新鮮なセラミドが継続的に加えられ得る。
【０１３２】
別の好ましい実施形態によると、培地は、これまでに記載されているような、通常ペルオキシソーム中に位置する少なくとも１つの酵素を介して代謝される物質、好ましくは脂肪酸、より好ましくはオレイン酸等の、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質を含む（阪井康能ら、メチルトローフ酵母カンジダ・ボイジニにおける複数の炭素源によるペルオキシソームタンパク質および細胞器官増殖の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｙｅａｓｔ，Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、イースト（Ｙｅａｓｔ）１４、１１７５−１１８７頁（１９９８年））。脂肪酸を用いて、これまでに記載されているようにペルオキシソーム増殖を得ることもできる（イントラスクスリ（Ｉｎｔｒａｓｕｋｓｒｉ）Ｕら、ペルフルオロオクタン酸および内在性脂肪酸によるペルオキシソーム増殖の機構（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ．）ジェネラル・ファーマコロジー（Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）１９９８年８月、３１（２）：１８７−９７頁）。ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地中で利用可能な炭素のパーセンテージとして定義される（例えば、培地の炭素源は１０％ペルオキシソーム増殖誘導物質＋９０％グルコースで構成される）。好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の０．１％〜１００％の間の範囲である。より好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の１％〜５０％の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の２％〜４０％の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の３％〜３０％の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の４％〜２５％の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の５％〜２０％の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の６％〜１８％の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の７％〜１５％の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の８％〜１３％の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の９％〜１２％の間の範囲である。最も好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の１０％に等しい。最も好ましい実施形態によると、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質は、オレイン酸Ｎａおよび／またはオレイン酸であり、培地中に存在するオレイン酸Ｎａおよび／またはオレイン酸の量は、培地の炭素源の１０％に等��い。
【０１３３】
より好ましい実施形態によると、培地は、ＣＡＰＰの活性化因子およびペルオキシソーム誘導物質の両方を、両方ともこれまでの段落に記載されているような好ましい量で、含む。
【０１３４】
得られる目的の化合物は、当該分野で公知の方法によって培地から単離され得る。例えば、目的の化合物は、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含むがこれらに限定されない従来の手順によって、培地から単離され得る。単離されたポリペプチドは、次いで、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、調製的等電点電気泳動）、異なる溶解度（例えば、硫安塩析）、または抽出（例えば、プロウティーン・ピューリフィケーション（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｊ．−Ｃ．ジャンソン（Ｊａｎｓｏｎ）およびラーズ・ライデン（Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ）編者、ニューヨークのＶＣＨパブリッシャーズ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８９年参照）を含むがこれらに限定されない当該分野で公知の種々の手順によって、さらに精製され得る。
【０１３５】
ペルオキシソーム中の目的の化合物の蓄積
さらなる態様において、本発明は、宿主細胞が核酸コンストラクトまたは発現コンストラクトを含み、前記コンストラクトがペルオキシソーム局在化を促進するＤＮＡ配列を含み、生成されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に操作可能に結合されている、宿主細胞、好ましくは糸状菌細胞における、目的のポリペプチドの、生成および任意に精製の方法を提供する。別の態様において、本発明は、宿主細胞が核酸コンストラクトまたは発現コンストラクトを含み、前記コンストラクトがペルオキシソーム局在化を促進するＤＮＡ配列を含み、代謝産物合成に関係する酵素をコードするＤＮＡ配列に操作可能に結合されている、宿主細胞、好ましくは糸状菌細胞における、代謝産物の、生成および任意に精製の方法を提供する。これらの要素の全ては、これまでに定義されている。これらの最後の２つの態様において、前記宿主細胞のペルオキシソームの恒常性は、好ましくは、上記で定義したように影響を受ける。これらの最後の２つの態様において、培地は、好ましくは、上記で定義されたようなペルオキシソーム誘導物質を含む。これらの最後の２つの態様において、目的の化合物は、続いて、細胞溶解物のペルオキシソームから回収され得る。目的の化合物の回収は、好ましくは、すでに記載されているように行われる（酵母ペルオキシソームの可視化および精製（Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｓ．）アードマン（Ｅｒｄｍａｎｎ）Ｒ、グールド（Ｇｏｕｌｄ）ＳＪ、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）２００２年、３５１：３６５−８１頁）。これらの最後の２つの態様において、前記宿主細胞の培養条件（酸素制限および／または培地のｐＨ値および／または培地の温度）は、好ましくは、明細書において上記で定義された通りである。
【０１３６】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１３７】
実施例１
実施例１：Ｃ末端ＳＫＬタグを用いた、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）およびクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）におけるペルオキシソーム中のアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）タンパク質の標的化
用いたアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株（ＣＢＳ５１３．８８）およびＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）株（ＣＢＳ６８５．９７）は、すでに寄託されている。これらの菌株において、モレキュラークローニング：ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて、以下に記載するように、いくつかの遺伝子を過剰発現し、コードされるタンパク質の活性を測定した。
【０１３８】
１．１．Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アセトアミダーゼ遺伝子の、ＳＫＬタグありおよびなしでのクローニング、ならびにＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）における発現
配列番号１および配列番号２を用いたＰＣＲ反応において、ＣＢＳ５１３．８８由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、結果として、配列番号４として示されるコード配列を生じた。また、配列番号１および配列番号３を用いたＰＣＲ反応において、ＣＢＳ５１３．８８由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、結果として、配列番号５として示されるコード配列を生じた。全てのＰＣＲ反応、ｃＤＮＡ合成、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）で上述したように行った。製造業者の使用説明書に従って、得られたＰＣＲ断片（配列番号４および配列番号５）をＰａｃＩおよびＡｓｃＩで切断し、図１に表されるＰａｃＩ、ＡｓｃＩ線状化Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターにおいて個々にライゲートし、結果として、各アセトアミダーゼ遺伝子（ＳＫＬありおよびなし）がｇｌａＡプロモーターの制御下に置かれた２つのコンストラクトを生じた。発現ベクターを用いて、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）を形質転換した。
【０１３９】
また、配列番号６および配列番号７を用いたＰＣＲ反応において、ＣＢＳ５１３．８８由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、結果として、配列番号９として示されるコード配列を生じた。さらに、配列番号６および配列番号８を用いたＰＣＲ反応において、ＣＢＳ５１３．８８由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、結果として、配列番号１０として示されるコード配列を生じた。製造業者の使用説明書に従って、得られたＰＣＲ断片（配列番号９および配列番号１０）をＰａｃＩおよびＡｓｃＩで切断し、図２に表されるＰａｃＩ、ＡｓｃＩ線状化Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）発現ベクターにおいて個々にライゲートし、結果として、各Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アセトアミダーゼ遺伝子（−ＳＫＬありおよびなし、それぞれ配列番号９および配列番号１０）がｌａｃ４プロモーターの制御下に置かれた２つのコンストラクトを生じた。発現ベクターを用いて、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）を形質転換した。
【０１４０】
得られたプラスミドを、それぞれＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８またはＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＣＢＳ６８５．９７に形質転換した。Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の形質転換を（ケリー（Ｋｅｌｌｙ）ＪＭ、ハインス（Ｈｙｎｅｓ）ＭＪ、アスペルギルス・ニードランスのａｍｄＳ遺伝子によるアスペルギルス・ニゲルの形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｍｄＳ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）１９８５年２月、４（２）：４７５−９頁）に従って行い、Ｋ  ラクティス（Ｋ  ｌａｃｔｉｓ）の形質転換を（シュリークリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）Ｋ、ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）ＴＤ、ディクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ）ＲＣ、Ｔｎ９０３のカナマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子でのクルイベロマイセス・ラクティスの形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ（Ｇ４１８）ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｔｎ９０３）ジーン（Ｇｅｎｅ）１９８４年４月、２８（１）：７３−８１頁）に従って行った。
【０１４１】
１．２．Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）形質転換体の培養ならびに細胞内アセトアミダーゼ活性の測定
Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換体の発現カセットの存在を、ＰＣＲによって調査した。選択した形質転換体を、５日間、３０℃、２５０ｒｐｍで、バッフルを有する５００ｍｌ三角振とうフラスコ中、１００ｍｌの以下の培地中で培養した。１５０ｇ／ｌマルトース、６０ｇ／ｌバクトソイトン、１ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、１５ｇ／ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．０８ｇ／ｌ  ｔｗｅｅｎ−８０、０．０２ｇ／ｌバシルドン、２０ｇ／ｌモルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１ｇ／ｌ  Ｌ−アルギニン。細胞を採取し、液体窒素下、粉砕によって破砕した。２５ｍｇの粉砕したバイオマスを０．５ｍｌリン酸緩衝Ｄ２Ｏ（重水素Ｈ２Ｏ、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、重水素ｐＤ７．０）に再懸濁することによって、細胞溶解物を得た。続いて、０．５ｍｌのＤ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍｌ基質（プロピオンアミド）を加え、３７℃で４日間インキュベートし、遠心分離した（最終濃度５ｍｇ／ｍＬ基質および２５ｍｇ／ｍＬ抽出物）。対照細胞ＣＢＳ５１３．８８中および形質転換細胞中のアセトアミダーゼ活性の測定を、製造業者の使用説明書に記載されるように、核磁気共鳴によって行った（図３）。６００ＭＨｚのプロトン周波数で稼動するブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）ＤＲＸ−６００で、３００Ｋのプローブ温度で１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録した。セルフシールドグラジエントを有する５ｍｍ三重共鳴プローブを用いた。関係する全ての化合物が、それらが同定および定量され得る独特のＮＭＲシグナルを有することを示すために、全ての参照化合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを獲得した（データ示さず）。全ての関連する化合物の完全な参照スペクトルを作成するために、Ｄ２Ｏ中で、各化合物のストック溶液を調製した。基質または参照化合物を計量することおよびＤ２Ｏを添加することによって、１０ｍｇ／ｍＬの濃度でストック溶液を調製した。これらのストック溶液から、５００μＬを、５００μＬの０．５Ｍリン酸バッファーｐＨ６．９６（ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４）と混合した。各化合物、すなわちアクリルアミド、アクリル酸、アセトアミド、酢酸、プロピオンアミドおよびプロピオン酸の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、続いて、６００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ中２７℃で収集した（Ｄ２Ｏ中最終濃度５ｍｇ／ｍＬ基質または参照化合物）。他の化合物によって引き起こされるシグナルと重複しなかった独特の化学シフトを、各化合物に関して同定した。また、各参照の純度を調査し、可能性のある混入物の非存在を確認した。
【０１４２】
化合物は、以下の特徴的なシグナルを有していた。
・アクリルアミド（カタログ番号８．００８３０、ロット４２０２０５６、アメリカ合衆国ニュージャージー州のメルク（Ｍｅｒｃｋ  ＮＪ  ＵＳＡ））：５．８２（ｄｄ、Ｈｂ、Ｊ＝１０．３Ｈｚ、１．２Ｈｚ）、６．２２（ｄｄ、Ｈｃ、Ｊ＝１７．２Ｈｚ、１．２Ｈｚ）、６．２８（ｄ、Ｈａ、Ｊ＝１０．３Ｈｚ）、６．３１（ｄ、Ｈａ、Ｊ＝１０．３Ｈｚ）ｐｐｍ。
・アクリル酸（カタログ番号１４，７２３−０、ロットＳ１７１６３−０３４、アメリカ合衆国ウィスコンシン州のオールドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＷＩ、ＵＳＡ））：５．６５（ｄｄ、Ｈｂ、Ｊ＝１０．４Ｈｚ、１．６Ｈｚ）、６．０１（ｄｄ、Ｈｃ、Ｊ＝１７．４Ｈｚ、１．６Ｈｚ）、６．１１（ｄ、ＣＨ２＝ＣＨ、３Ｊ＝１０．３Ｈｚ）、６．１４（ｄ、ＣＨ２＝ＣＨ、３Ｊ＝１０．３Ｈｚ）。
・アセトアミダーゼ（カタログ番号１２，２６３−７、ロット１６８１３ＢＡ−４５３、アメリカ合衆国ウィスコンシン州のオールドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＷＩ  ＵＳＡ））：１．９９（ｓ、ＣＨ３）ｐｐｍ。
・酢酸（カタログ番号１．０００６３、ロットＫ３１６６８３６３、アメリカ合衆国ニュージャージー州のメルク（Ｍｅｒｃｋ  ＮＪ  ＵＳＡ））：１．９０（ｓ、ＣＨ３）ｐｐｍ。
・プロピオンアミド（カタログ番号１４，３９３−６、ロット２５００９ＪＢ−４１３、アメリカ合衆国ウィスコンシン州のオールドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＷＩ  ＵＳＡ））：１．１０（ｔ、ＣＨ３）、２．２７（ｑ、ＣＨ２）ｐｐｍ。
・プロピオン酸（カタログ番号Ｐ−１３８６、ロット０８３  Ｋ３４０４、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ  ＵＳＡ））：１．０９（ｔ、ＣＨ３）、２．３７（ｑ、ＣＨ２）ｐｐｍ。
【０１４３】
得られたＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）形質転換体（ＰＣＲによって調査した）を、３日間、１００ｍｌ  ＹＥＰＤ（イーストエクストラクト１０ｇ／ｌ、ペプトン２０ｇ／ｌ、右旋糖２０ｇ／ｌ）中、３０℃、２５０ｒｐｍで、バッフルを有する５００ｍｌ三角振とうフラスコ中で培養した。細胞を採取し、窒素下で粉砕することによって破砕した。粉砕したバイオマスを、プロテアーゼ阻害剤（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）のコンプリート、カタログ番号１８７３５８０）を含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ中に再懸濁することによって、細胞溶解物を得た。スクルブリ（Ｓｋｏｕｌｏｕｂｒｉｓ）ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）（２００１年）４０（３）、５９６−６０９頁に従って、対照Ｋ  ラクティス（Ｋ  ｌａｃｔｉｓ）細胞中および形質転換細胞中で、アセトアミダーゼ活性を測定した（図４）。
【０１４４】
図３および４に明らかに示されるように、アセトアミダーゼタンパク質のペルオキシソーム局在化を促進するＣ末端ＳＫＬタグの付加によって、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）における細胞内アセトアミダーゼ酵素活性が増大する。
【０１４５】
実施例２：ペルオキシソーム増幅を増大させるための、発酵培地へのオレイン酸の添加
Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における、細胞あたりのペルオキシソームの数の増大、したがってペルオキシソーム貯蔵体積の増大は、培地にオレイン酸Ｎａ（カタログ番号２６１２５、ドイツ、ハノーファーのリーデル・デ・ハエン（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ、Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ））およびＴｗｅｅｎ−４０（カタログ番号９３７７５、スイス、ブーフスのフルカ（Ｆｌｕｋａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））を補充することによって媒介された。ペルオキシソームの数の増大を、操作されたＣ末端ＳＫＬタグを有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いた蛍光顕微鏡法によって示した（チャルフィ（Ｃｈａｌｆｉｅ），Ｍら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）（１９９４年）２６３（５１４８）：８０２−８０５頁）。Ｃ末端−ＳＫＬタグを、実施例１に記載されているようなＰＣＲ法を用いて、広く使用されていて十分特徴付けられているＧＦＰ遺伝子に操作した。実施例１に記載されているような方法論を用いて、得られたＧＦＰ−ＳＫＬ遺伝子を、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターにクローニングし、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８に形質転換した。
【０１４６】
得られた、Ｃ末端連結−ＳＫＬペプチドを有するＧＦＰを過剰発現するＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を、３０℃、２５０ＲＰＭで、最小強化アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）培地（ＭＥＡＭ、特許出願国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載されている）中でオービタルシェイカーを用いて、振とうフラスコ中で培養した。４８時間の前培養後、菌糸を採取し、洗浄し、続いて、０．１８％（ｗ／ｖ）オレイン酸Ｎａおよび０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−４０を補充した新鮮な培地（ＭＥＡＭ）に移した。オレイン酸ＮａおよびＴｗｅｅｎ−４０の補充なしで、対照培養物をＭＥＡＭ中で培養した。２６時間の培養後、青色光励起（４９０ｎｍ）を用いたツァイス（Ｚｅｉｓｓ）蛍光顕微鏡を用いて試料を解析した。代表的な試料を、フジカラー（Ｆｕｊｉｃｏｌｏｒ）８００ＡＳＡカラーフィルムを用いた蛍光写真撮影に用いた。
【０１４７】
図５で見ることができるように、オレイン酸ＮａおよびＴｗｅｅｎ−４０を含まない培地中でのＧＦＰ−ＳＫＬ過剰発現株の培養は、結果として、細胞あたりの少ないペルオキシソームを生じた。図６で明らかに示されるように、オレイン酸ＮａおよびＴｗｅｅｎ−４０を補充した発酵培地中で同じ細胞を培養することは、ペルオキシソーム増殖を誘導し、結果として、細胞あたりの増大した数のペルオキシソームを生じた。
【０１４８】
実施例３：ペルオキシソームの、細胞膜との融合による、細胞外のペルオキシソーム内容物（ＧＦＰ−ＳＫＬ）の放出
３．１  ペルオキシソームの表面での融合ポリペプチドのクローニングおよび発現
膜貫通ドメインなしの、それぞれゲノム、ｃＤＮＡおよびタンパク質配列である配列番号１１、１２および１３として示されるＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｖ−ＳＮＡＲＥ  ＳｎｃＡを、それぞれゲノム、ｃＤＮＡおよびタンパク質配列である配列番号１４、１５および１６として示されるペルオキシソーム膜タンパク質２２（Ｐｍｐ２２）に融合させた。配列番号１７および配列番号１８を用いたＰＣＲ反応において、ＣＢＳ５１３．８８由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、結果として、コード配列番号１９を生じた。また、配列番号２０および配列番号２１を用いたＰＣＲ反応において、ＣＢＳ５１３．８８由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、結果として、コード配列番号２２を生じた。続いて、配列番号１７および配列番号２１を用いたＰＣＲ反応において、配列番号１９および配列番号２２を鋳型として用い、結果として、配列番号２３を生じた。得られたＰＣＲ断片（配列番号２３）を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素ＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化し、図１に表されるように、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ線状化Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、ペルオキシソーム膜アンカーを有する融合ポリペプチドをコードする遺伝子（ＳｎｃＡ／Ｐｍｐ−２２）がｇｌａＡプロモーター制御下に置かれたコンストラクトを生じた。遺伝子の発現により、結果として、配列番号２４に示されるような、ペルオキシソーム膜アンカーを含むキメラタンパク質を生じた。ＳｎｃＡ／Ｐｍｐ−２２発現ベクターとＧＦＰ−ＳＫＬ発現ベクターをともに用いて、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）を同時形質転換した。全てのＰＣＲ反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング：ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。
【０１４９】
３．２  ペルオキシソーム内容物の放出の解析のための同時形質転換体の培養
前の段落で得られたＧＦＰ−ＳＫＬおよびＳｎｃＡ／Ｐｍｐ−２２を過剰発現しているＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株のいくつかのクローンの間で、各遺伝子の単一コピーを含むクローンに関して、ＰＣＲを用いて選択を行った。選択したクローンを、１０μＭ  Ｃ２−セラミド（Ｎ−アセチル−Ｄ−スフィンゴシン：カタログ番号Ａ７１９１、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  ＵＳＡ））ありまたはなしで、オービタルシェイカー中の振とうフラスコ中、３０℃、２５０ＲＰＭ、ＭＥＡＭバッファー（特許出願国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに広範に記載されている）中で培養した。単一遺伝子コピーを含むＧＦＰ−ＳＫＬ過剰発現株（実施例２に記載されている構成）および空の宿主株（ＣＢＳ５１３．８８）を対照として用いた。試料を２４時間および４８時間の時点で採取した。上清試料を遠心分離によって澄ませ、０．４５μｍフィルター（カタログ番号４６１４、アメリカ合衆国ミズーリ州アナーバーのポール（Ｐａｌｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｏ  ＵＳＡ））を通した限外ろ過によって残りの細胞残屑から分離した。
【０１５０】
３．３  細胞外のペルオキシソーム内容物の放出のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析、放出促進因子としてのＣ２−セラミドの解析
３．２の上清試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。製造業者の使用説明書に従って、ヌーページ・ノベックス（ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ）高性能プレキャストゲル（４〜１２％ビス−トリスグラジエントゲル、イギリス、ペーズリーのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ））を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。製造業者の使用説明書に従って、試料（２０μｌ）を、２．０μｌ還元剤および６．０μｌ試料バッファーと混合し、続いて、ゲルにロードする前に１０分間７０℃で加熱した。電気泳動後、製造業者の使用説明書に従って、シンプリー・ブルー・セーフ（Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ）ステイン（イギリス、ペーズリーのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ））を用いてゲルを染色した。
【０１５１】
図７において、細胞外のＧＦＰ−ＳＫＬの放出が、明らかに観察され得る。全ての試料は、５４ｋＤの内在性バンドによって見られるように、等量の内在性タンパク質を含む。対照的に、レーン４、５、６および７は、対照レーン１、２および３と比較して、有意により多いＧＦＰ−ＳＫＬを含む。さらに、Ｃ２−セラミドが、細胞外の、ペルオキシソーム内容物、すなわちＧＦＰ−ＳＫＬの放出をさらに誘導することが示される。レーン５および７（ＭＥＡＭ＋Ｃ２−セラミド）は、それぞれレーン４および６と比較して、より多くのＧＦＰ−ＳＫＬを含む。
【０１５２】
３．４  細胞外のペルオキシソーム内容物の放出のウェスタンブロット解析、放出促進因子としてのＣ２−セラミドの解析
３．２の上清試料を、ウェスタンブロットによって解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを３．３のように行い、製造業者の使用説明書（イギリス、ペーズリーのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ））に従って、エクセルＩＩブロットモジュール（ＸＣｅｌｌ  ＩＩ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ）を用いてウェスタンブロットを行った。電気泳動後、ヌーページ（ＮｕＰａｇｅ）ゲルを１時間、３０ボルトで、プレカットニトロセルロースメンブレン（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））上でブロットした。室温（ｒＴ）で１時間、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．９％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ、カタログ番号Ｔ５９１２、シグマ（Ｓｉｇｍａ））＋２％スキムミルク中でブロットをブロックした。市販の抗ＧＦＰ抗体（抗ＧＦＰ、ベルギーのユーロジェンテック（Ｅｎｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）カタログ番号ＭＭＳ−１１８Ｐ）を１／１０．０００に希釈し、ブロットを１時間、この抗体とともにインキュベートした。続いて、ブロットを３回、ミリＱ（ＭｉｌｌｉＱ）水およびＴＢＳ＋０．２％スキムミルクで５分間洗浄した。洗浄後、ブロットを１時間室温で、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ（カタログ番号３１４６０、アメリカ合衆国イリノイ州ロックフォードのピアス（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋ  Ｆｏｒｄ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ＵＳＡ））の１／５０００希釈物とともにインキュベートした。ブロットを再び洗浄し、検出液（ＥＣＬ直接核酸標識検出システム、イギリス、バッキンガムシアのアマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ））に浸漬した。最後に、ブロットをアグフア・キュリックス・ブルー（ＡＧＦＡ  Ｃｕｒｉｘ  Ｂｌｕｅ）ＨＣ−Ｓプラスフィルム（ベルギー、モルトセルのアグフア（ＡＧＦＡ、Ｍｏｒｔｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ））に曝露した。
【０１５３】
図８において、細胞外のＧＦＰ−ＳＫＬの放出が、明らかに観察され得る。レーン５、６、７および８において、ＧＦＰ−ＳＫＬが存在する。対照的に、レーン３、４および９、１０においては、細胞外ＧＦＰ−ＳＫＬが存在しない。
【０１５４】
３．５  Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）培養物の非特異的溶解の解析
３．１〜３．４に記載されるような観察されたペルオキシソーム内容物の放出が非特異的溶解に媒介されていないことを示すために、培養上清中の細胞内酵素アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）の活性の測定によって、培養物の溶解の程度を決定した。スクルブリ（Ｓｋｏｕｌｏｕｂｒｉｓ）ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）（２００１年）４０（３）、５９６−６０９頁に従って、アセトアミダーゼ測定を行った。培養物由来の１０μｌの上清を、リン酸ＥＤＴＡバッファー（ＰＥＢ、１００ｍＭ  リン酸Ｎａ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中１００ｍＭアセトアミダーゼ（カタログ番号Ａ０５００、アメリカ合衆国ミズーリ州のシグマ（Ｓｉｇｍａ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  ＵＳＡ））に加えた。９０分間３７℃でのインキュベーション後、４００μｌフェノールニトロプルシド（カタログ番号Ｐ６９９４、アメリカ合衆国ミズーリ州のシグマ（Ｓｉｇｍａ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  ＵＳＡ））および４００μｌアルカリ性次亜塩素酸溶液（０．２％、カタログ番号Ａ１７２７、アメリカ合衆国ミズーリ州のシグマ（Ｓｉｇｍａ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  ＵＳＡ））を加え、混合した。混合物を、５５℃で６分間インキュベートした。続いて、製造業者の使用説明書に従って、ウルトラスペック（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ）２０００ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計（スウェーデンのファルマシア・バイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｗｅｄｅｎ））中で、吸光度を６３５ｎｍで測定した。試料中のａｍｄＳの量を、標準曲線から計算し、相対的単位／ｍｌ培養上清と呼んだ。
【０１５５】
結果を図１０に示し、２４時間の培養後培養上清中にａｍｄＳ活性が存在しないことが明らかに観察され、溶解が起こっていないことが示される。４８時間の培養後、全ての試料は等量のａｍｄＳ活性を含み、全ての培養物における溶解の程度が同じであることを示す。これらの結果は、３．１〜３．４の、培養上清中の観察されたＧＦＰ−ＳＫＬの存在が、細胞外のペルオキシソーム内容物の活発な放出によって媒介されており、細胞の非特異的溶解によって媒介されていないことを明らかに示す。
【０１５６】
実施例４．Ｐｍｐ２２を利用して組み換え（ポリ）ペプチドでペルオキシソームを装飾し得る
Ｐｍｐ２２をペルオキシソーム膜アンカーとして利用し得ることを示すために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がＰｍｐ２２のＮ末端に融合したキメラ遺伝子を構築し、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中で発現させた。蛍光顕微鏡観察から、強い緑色の球状の形状の細胞内マイクロボディが明らかになった。
【０１５７】
４．１  ＧＦＰ／Ｐｍｐ２２キメラコンストラクトのクローニングおよび発現
配列番号２５および２６として示されるＧＦＰを、配列番号１４、１５および１６として示されるペルオキシソーム膜タンパク質２２（Ｐｍｐ２２）に融合させた。
【０１５８】
配列番号２７および配列番号２８を用いたＰＣＲ反応において、ＧＦＰ  ＤＮＡ（配列番号２５）を鋳型として用い、結果として、配列番号２９を生じた。また、配列番号３０および配列番号３１を用いたＰＣＲ反応において、ＣＢＳ５１３．８８由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、結果として、配列番号３２を生じた。続いて、配列番号２７および配列番号３１を用いたＰＣＲ反応において、配列番号２９および配列番号３２を鋳型として用い、結果として、配列番号３３を生じた。得られたＰＣＲ断片（配列番号３３）を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素ＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化し、図１に表されるように、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ線状化Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、ペルオキシソーム膜アンカーを有するＧＦＰをコードする遺伝子（ＧＦＰ／Ｐｍｐ−２２）がｇｌａＡプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。遺伝子の発現により、結果として、配列番号３４として示される、ペルオキシソーム膜アンカーを有するＧＦＰを生じた。ＧＦＰ／Ｐｍｐ−２２発現ベクターを用いて、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）を形質転換した。全てのＰＣＲ反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング：ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。
【０１５９】
得られた、ＧＦＰ／Ｐｍｐ−２２を過剰発現しているＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株のクローンを、オービタルシェイカーを用いた振とうフラスコ中、３０℃、２５０ＲＰＭで、最小強化アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）培地（ＭＥＡＭ、特許出願国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに広範に記載されている）中で培養した。Ｃ末端連結−ＳＫＬありまたはなしで（実施例２に記載されているように）ＧＦＰを過剰発現している対照培養物を、同一の培養条件を用いて培養した。１８時間の培養後、青色光励起（４９０ｎｍ）を用いたツァイス（Ｚｅｉｓｓ）蛍光顕微鏡を用いて試料を解析した。代表的な試料を、フジカラー（Ｆｕｊｉｃｏｌｏｒ）８００ＡＳＡカラーフィルムを用いた蛍光写真撮影のために用いた。
【０１６０】
図９Ａで観察され得るように、ＧＦＰ／Ｐｍｐ２２キメラタンパク質を過剰発現しているＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）は、ＧＦＰ−ＳＫＬがＣ末端ＳＫＬによってペルオキシソームに標的化されているＧＦＰ−ＳＫＬ（図９Ｂ）を過剰発現しているＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）と同じ、強い緑色の球状の形状の細胞内マイクロボディの断続パターンを示す。対照的に、野生型ＧＦＰを過剰発現している（すなわち、Ｃ末端ＳＫＬがない）Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）は、細胞の細胞質全体で、一般的な緑色蛍光を示す（図９Ｃ）。
【０１６１】
組み合わせた結果から、Ｐｍｐ−２２をペルオキシソーム膜アンカーとして利用して、ＧＦＰまたは本発明において記載されるような融合ペプチドのような組み換え（ポリ）ペプチドでペルオキシソームを装飾し得ることが、明らかに示される。
【０１６２】
実施例５．融合ポリペプチドで装飾されたペルオキシソームを用いることによって細胞内化合物を分泌することができるＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主細胞の構築
５．１  Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主細胞のペルオキシソームの表面での融合ポリペプチドのクローニングおよび発現
膜貫通ドメインなしの、それぞれゲノム、ｃＤＮＡおよびタンパク質配列である配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３として示されるＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｖ−ＳＮＡＲＥ  ＳｎｃＡを、それぞれゲノム、ｃＤＮＡおよびタンパク質配列である配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６として示されるペルオキシソーム膜タンパク質２２（Ｐｍｐ２２）に融合させた。配列番号１８および配列番号３５を用いたＰＣＲ反応において、ＣＢＳ５１３．８８由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、結果として、コード配列番号３６を生じた。また、配列番号２０および配列番号３７を用いたＰＣＲ反応において、ＣＢＳ５１３．８８由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、結果として、コード配列番号３８を生じた。続いて、配列番号３５および配列番号３７を用いたＰＣＲ反応において、配列番号３６および配列番号３８を鋳型として用い、結果として、配列番号３９を生じた。得られたＰＣＲ断片（配列番号３９）を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素ＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化し、図１１に示されるように、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ線状化Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターにライゲートした（ｐＧＢＦＩＮ−５）。これにより、結果として、ペルオキシソーム膜アンカーを有する融合ポリペプチドをコードする遺伝子（ＳｎｃＡ／Ｐｍｐ−２２）がｇｌａＡプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。遺伝子の発現により、結果として、配列番号４０に示されるような、ペルオキシソーム膜アンカーを含むキメラタンパク質を生じた（ＳｎｃＡ／Ｐｍｐ２２タンパク質）。実施例２に記載されているように、ＳｎｃＡ／Ｐｍｐ−２２発現ベクターを用いて、ＧＦＰ−ＳＫＬを過剰発現しているＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８を形質転換した。得られたＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換体を、発現コンストラクトＳｎｃＡ／Ｐｍｐ２２およびＧＦＰ−ＳＫＬの両方の存在に関して、ＰＣＲによって解析した。実施例３．２および３．３に記載されているように、培養およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、両方の発現コンストラクトを含むいくつかのクローンを、ペルオキシソーム内容物の放出に関して解析した。最も機能したクローンを、実施例６および７においてさらに解析した。全てのＰＣＲ反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング：ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。
【０１６３】
５．２  細胞内化合物を分泌することができるＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主細胞の矯正
前の段落で得られた、実施例６および７においてさらに解析される最も機能したクローンを選択し、ＧＦＰ−ＳＫＬ発現を矯正した。得られた、細胞内化合物を分泌することができるＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主細胞を、実施例８および９において、細胞内化合物を分泌することができる包括的なＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主として用いた。
【０１６４】
選択したクローンを、オービタルシェイカー中の振とうフラスコ中、３０℃、２５０ＲＰＭで、ＭＥＡＭ緩衝培地（特許出願国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに広範に記載されている）中で培養した。自発的組み換え事象におけるＧＦＰ−ＳＫＬ発現ベクターを失うために、このクローンの培養物を、ＰＤＡ培地（フランスのディフコ（Ｄｉｆｃｏ、Ｆｒａｎｃｅ））を含むプレートにプレーティングした。ゲルドック（Ｇｅｌｄｏｃ）２０００システム（イタリアのバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｉｔａｌｙ））で３１５ｎｍのＵＶ照明を用いて、合計１００．０００個のコロニーを、ＧＦＰ−ＳＫＬの発現に関して解析した。最小のＧＦＰ発現を示すコロニーを、もう一度培養およびプレーティングに供した。２回の選択後、最小のＧＦＰ−ＳＫＬ発現を有するクローンを選択した。ＰＣＲから、菌株が、少なくとも１コピーのＧＦＰ−ＳＫＬ発現カセットを保持しながら依然としてＳｎｃＡ／Ｐｍｐ２２発現ベクターを含んでいたことが示された。得られた、細胞内化合物を分泌することができるＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主細胞を、実施例８および９において、細胞内化合物を分泌することができる包括的なＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主として用いた。
【０１６５】
実施例６．１０Ｌスケール発酵槽における細胞外ＧＦＰ−ＳＫＬ生成
菌株：
ＧＦＰ−ＳＫＬおよびＳｎｃＡ／Ｐｍｐ２２を過剰発現するＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８株の構築は、実施例５．１に記載した。菌株の胞子を−８０℃で保存した（５×１０７個の生存可能な胞子／バイアル）。
【０１６６】
接種手順：
１つの胞子−バイアルの内容物を、バッフル２Ｌ振とうフラスコ中の前培養培地（２０ｇ／Ｌイーストエクストラクト、２０ｇ／Ｌグルコース、ｐＨ６．８（ＫＯＨで）、３００ｍＬ培地、２０分１２１℃で蒸気滅菌）に加えた。この前培養物を、３０℃、２２０ｒｐｍで４０時間培養した。
【０１６７】
流加発酵：
当該分野で公知の手順（国際公開第９３／３７１７９号パンフレットに記載されている）を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む適した栄養培地中で培養を行った。適用した増殖条件は、以下の通りであった。プロセスｐＨを、増殖の最初の７２時間は６．０で制御し、次いで２４時間以内に徐々に６．７まで上げ、この値で維持した。温度を３０℃で制御した。作業体積は１０Ｌであり、総発酵時間は１９２時間であった。培地の供給の制御によって、酸素制限を課した。酸素摂取速度を、０．０２５時間−１の速度増加の指数関数的プロフィールに従った撹拌によって制御した。グルコースを含有した供給を調節して、培地中のグルコース濃度を１０ｇ／Ｌより多く維持した。必要な場合、停止を行った。分光学的解析を用いて、ＧＦＰ−ＳＫＬに関して上清試料を解析した。２００μｌの試料を用い、室温で、４９０ｎｍの励起、５１０ｎｍの発光、４９５ｎｍのカットオフ、自動増幅率、および４８８ｎｍで６１０００Ｍ−１ｃｍ−１のｅＦＧＰのモル吸光係数で相対的蛍光を測定した。蛍光測定のための試料を、５ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０を含む５ｍＭトリスＨＣｌバッファー中で希釈した。期待されるｅＧＦＰ濃度に依存して、ろ液を２〜６４０倍に希釈した。
【０１６８】
図１２に表されるように、継続的な培地の供給によって生じた希釈効果のために、培養の最初の７２時間の間（ｐＨ６．０）、バイオマス濃度は急速に増大し、次いで発酵の最後まで、殆ど一定に保たれた。この時間において、（最初の７２時間）、非常に低いレベルのＧＦＰ−ＳＫＬが細胞外で見られた（およそ０．２５ｇ／Ｌ）。６．０から６．７へのｐＨ変化（７２〜９６時間の間に実現される）の後、細胞外ＧＦＰ−ＳＫＬ濃度は、発行の最後まで継続的に増大し、１９２時間目に３．３ｇ／Ｌの値に達した。これにより、記載されたプロセス条件を用いて、１０Ｌスケール流加培養プロセスにおいて、３．０ｇ／Ｌより多い収量でＧＦＰ−ＳＫＬが生成および分泌されたこと明らかに示された。
【０１６９】
実施例７．同じ増殖プロフィールを有するグルコースおよび酸素制限条件下での細胞内ＧＦＰ−ＳＫＬ生成
菌株：
ＧＦＰ−ＳＫＬおよびＳｎｃＡ／Ｐｍｐ２２を過剰発現するＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８株の構築は、実施例５．１に記載した。菌株の胞子を−８０℃で保存した（５×１０７個の生存可能な胞子／バイアル）。
【０１７０】
接種手順：
１つの胞子−バイアルの内容物を、バッフル２Ｌ振とうフラスコ中の前培養培地（２０ｇ／Ｌイーストエクストラクト、２０ｇ／Ｌグルコース、ｐＨ６．８（ＫＯＨで）、３００ｍＬ培地、２０分１２１℃で蒸気滅菌）に加えた。この前培養物を、３０℃、２２０ｒｐｍで４０時間培養した。
【０１７１】
流加発酵：
当該分野で公知の手順（国際公開第９３／３７１７９号パンフレットに記載されている）を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む適した培地中で培養を行った。
【０１７２】
適用した増殖条件は、以下の通りであった。プロセスｐＨを５．５で、温度を３０℃で制御した。作業体積は１０Ｌであり、総発酵時間は１４４時間であった。空気流は１ｖｖｍ（１分あたりの培地体積あたりの空気体積）であった。グルコース制限培養のために、速度増加が０．０２５時間−１の指数関数的供給プロフィールを適用した。酸素制限発酵のために、酸素摂取速度を、速度増加が０．０２５時間−１の指数関数的プロフィールに従った撹拌によって制御した。グルコースを含有した供給を調節して、培地中のグルコース濃度を１０ｇ／Ｌより多く維持した。
【０１７３】
必要な場合、停止を行った。試料を採取し、細胞を含まない抽出物を調製した。実施例６に記載される方法に従って、ＧＦＰ−ＳＫＬに関して試料を解析した。
【０１７４】
図１３に表されるように、細胞内ＧＦＰ−ＳＫＬ生成は、グルコース制限条件下よりも酸素制限条件下の方が、かなり高かった。発酵の最後（１４４時間）に、細胞内ＧＦＰ−ＳＫＬ生成は、酸素制限条件が用いられた場合に、グルコース制限条件と比較して、およそ２０倍高かった。この特定の実施例は、酸素制限条件が１０Ｌスケール流加培養プロセスにおけるＧＦＰ−ＳＫＬのペルオキシソーム／細胞内蓄積に望ましいことを明らかに示す。
【０１７５】
実施例８．ペルオキシソームの、細胞膜との融合による、細胞外のペルオキシソーム内容物（アセトアミダーゼ）の放出
８．１  Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アセトアミダーゼのクローニングおよび発現
それぞれゲノム、ｃＤＮＡおよびタンパク質配列である配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３として示されるＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アセトアミダーゼＡｍｄＳを用いた。配列番号４４および配列番号４５を用いたＰＣＲ反応において、ＣＢＳ５１３．８８由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、結果として、コード配列番号４６を生じた。得られたＰＣＲ断片（配列番号４６）を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素ＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化し、図１に示されるように、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ線状化Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターにライゲートした。これにより、結果としてＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アセトアミダーゼをコードする遺伝子がｇｌａＡプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。
【０１７６】
また、配列番号４４および配列番号４７を用いたＰＣＲ反応において、ＣＢＳ５１３．８８由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、結果として、コード配列番号４８を生じた。得られたＰＣＲ断片（配列番号４８）を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素ＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化し、図１に示されるように、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ線状化Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、操作されたＣ末端ＳＫＬ尾部を有するＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アセトアミダーゼをコードする遺伝子がｇｌａＡプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。このコンストラクトの発現により、結果として、配列番号４９に表されるようなポリペプチドを生じた。全てのＰＣＲ反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング：ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。得られた、Ｃ末端−ＳＫＬありまたはなしのＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アセトアミダーゼをコードする発現コンストラクトを用いて、実施例５．２の細胞内化合物を分泌することができる包括的なＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主およびＣＢＳ５１３．８８を形質転換した。形質転換体を、ＳｎｃＡ／Ｐｍｐ２２発現コンストラクトならびにアセトアミダーゼコンストラクトの両方の存在、それぞれＳｎｃＡ／Ｐｍｐ２２発現コンストラクトならびにアセトアミダーゼ−ＳＫＬコンストラクトの両方に関して、ＰＣＲによって解析した。選択したクローンを、実施例８．３においてさらに解析した。
【０１７７】
実施例８．２  Ａ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼのクローニングおよび発現
この実験のために、それぞれゲノム、ｃＤＮＡおよびタンパク質配列である配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２として示される周知のＡ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ遺伝子を用いた（ティルバーン（Ｔｉｌｂｕｒｎ）ら、１９８３年、ジーン（Ｇｅｎｅ）２６：２０５−２２１頁）。配列番号５３および配列番号５４を用いたＰＣＲ反応において、Ａ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＡｍｄＳ（ＥＰ１３２１１５２３号明細書に記載されている）を含む発現ベクター由来のプラスミドＤＮＡを鋳型として用い、結果として、コード配列番号５５を生じた。得られたＰＣＲ断片（配列番号５５）を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素ＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化し、図１に示されるように、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ線状化Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、Ａ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼをコードする遺伝子がｇｌａＡプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。
【０１７８】
また、配列番号５３および配列番号５６を用いたＰＣＲ反応において、Ａ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＡｍｄＳ（ＥＰ１３２１１５２３号明細書に記載されている）を含む発現ベクター由来のプラスミドＤＮＡを鋳型として用い、結果として、コード配列番号５７を生じた。得られたＰＣＲ断片（配列番号５７）を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素ＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化し、図１に示されるように、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ線状化Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、操作されたＳＫＬ尾部を有するＡ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼをコードする遺伝子がｇｌａＡプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。このコンストラクトの発現により、結果として、配列番号５８で表されるポリペプチドを生じた。全てのＰＣＲ反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング：ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。得られた、Ｃ末端−ＳＫＬありまたはなしのＡ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼをコードする発現コンストラクトを用いて、実施例５．２の細胞内化合物を分泌することができる包括的なＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主およびＣＢＳ５１３．８８を形質転換した。形質転換体を、ＳｎｃＡ／Ｐｍｐ２２発現コンストラクトならびにアセトアミダーゼコンストラクトの両方の存在、それぞれＳｎｃＡ／Ｐｍｐ２２発現コンストラクトならびにアセトアミダーゼＳＫＬコンストラクトの両方に関して、ＰＣＲによって解析した。選択したクローンを、実施例８．３においてさらに解析した。
【０１７９】
８．３  細胞内アセトアミダーゼの放出の解析のための実施例８．１および８．２の形質転換体の培養
−ＳＫＬありもしくはなしのＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＡｍｄＳまたは−ＳＫＬありもしくはなしのＡ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）Ａｍｄｓを、細胞内化合物を分泌することができる包括的なＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主（実施例５．２で構築した）および陰性対照としてのＣＢＳ５１３．８８の両方に形質転換した。ＰＣＲを用いて、単一コピーのアセトアミダーゼ発現カセットを含む形質転換体を選択した。８つの型のクローンを、オービタルシェイカー中の振とうフラスコ中、３０℃、２５０ＲＰＭで、ＭＥＡＭ緩衝培地（特許出願国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに広範に記載されている）中で培養した。培養の開始後１２０および１４４時間の時点で上清試料を採取した。上清試料を遠心分離によって澄ませ、０．４５μｍフィルター（カタログ番号４６１４、アメリカ合衆国ミズーリ州アナーバーのポール（Ｐａｌｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｏ  ＵＳＡ））を通した限外ろ過によって残りの細胞残屑から分離した。実施例８．４において、アセトアミダーゼ活性に関して上清試料を解析した。
【０１８０】
８．４  アセトアミダーゼ酵素アッセイ
試料中の遊離アンモニアを測定することによって、アセトアミダーゼ活性に関して８．３の上清試料を解析した。遊離アンモニアは、アセトアミダーゼ活性の指標である（スクルブリ（Ｓｋｏｕｌｏｕｂｒｉｓ）ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）（２００１年）４０（３）、５９６−６０９頁によって記載されているように）。ＣＢＳ５１３．８８の、全ての選択および解析された形質転換クローンは、検出可能な遊離アンモニアを生じなかった（データ示さず）。図１４において、実施例５．２の菌株の４つの型の形質転換体によって生じた遊離アンモニアを表す。図１４で明らかに示されるように、Ｃ末端ＳＫＬ延長部分を含むコンストラクト（すなわち、ペルオキシソームに標的化されている）は、結果として、Ｃ末端ＳＫＬ延長部分を含まないコンストラクトと比較して、より高い細胞内アセトアミダーゼ活性を生じた。この、より高いアセトアミダーゼ活性は、ペルオキシソーム内容物の放出によって引き起こされた。図１４において、ブロック２（ＳＫＬありのＡニゲル（Ａ  ｎｉｇｅｒ）アセトアミダーゼ）および４（ＳＫＬありのＡニードランス（Ａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ）をブロック１（ＳＫＬなしのＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アセトアミダーゼ）および３（ＳＫＬなしのＡ．ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ）と比較すると、細胞外にＳＫＬありまたはなしの分泌されたアセトアミダーゼの間の差が明らかに観察され、ＳＫＬを有する上清アセトアミダーゼにおいて、かなりより多くのアセトアミダーゼ活性が存在した。
【０１８１】
実施例９．ペルオキシソームの、細胞膜との融合による、細胞外のペルオキシソーム内容物（アマドリアーゼ）の放出
９．１  Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アマドリアーゼ−ＳＲＬのクローニングおよび発現
それぞれゲノム、ｃＤＮＡおよびタンパク質配列である配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１として示されるＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アマドリアーゼ−ＳＲＬを用いた。配列番号６２および配列番号６３を用いたＰＣＲ反応において、ＣＢＳ５１３．８８由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、結果として、コード配列番号６４を生じた。得られたＰＣＲ断片（配列番号６４）を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素ＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化し、図１１に示されるように、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ線状化Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、アマドリアーゼをコードする遺伝子がｇｌａＡプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。得られたプラスミドＤＮＡを、製造業者の使用説明書に従って制限酵素ＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化し、図１に示されるように、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ線状化Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターにライゲートした。全てのＰＣＲ反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング：ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。得られたＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アマドリアーゼ−ＳＲＬをコードする発現コンストラクトを用いて、実施例５．２の細胞内化合物を分泌することができる包括的なＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主およびＣＢＳ５１３．８８（陰性対照として）を形質転換した。形質転換体を、ＳｎｃＡ／Ｐｍｐ２２発現コンストラクトならびにアマドリアーゼ−ＳＲＬコンストラクトの存在に関して、ＰＣＲによって解析した。選択したクローンを、実施例９．２においてさらに解析した。
【０１８２】
９．２  細胞内アマドリアーゼの放出の解析のための実施例９．１の形質転換体の培養
Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アマドリアーゼ−ＳＲＬを、実施例５．２の細胞内化合物を分泌することができる包括的なＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主およびＣＢＳ５１３．８８（陰性対照として）に形質転換した。ＰＣＲを用いて、単一コピーのアマドリアーゼ発現カセットを含むクローンに関して選択を行った。２つの型の形質転換体（それぞれアマドリアーゼ−ＳＲＬを含む、実施例５．２のＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＣＢＳ５１３．８８）の代表的なクローンを選択し、オービタルシェイカー中の振とうフラスコ中、３０℃、２５０ＲＰＭで、ＭＥＡＭ緩衝培地（特許出願国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに広範に記載されている）中で培養した。培養の開始後９６時間の時点で上清試料を採取した。上清試料を遠心分離によって澄ませ、０．４５μｍフィルター（カタログ番号４６１４、アメリカ合衆国ミズーリ州アナーバーのポール（Ｐａｌｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｏ  ＵＳＡ））を通した限外ろ過によって残りの細胞残屑から分離した。実施例９．３において、アマドリアーゼ活性に関して上清試料を解析した。
【０１８３】
９．３  アマドリアーゼ酵素アッセイ
９．２の上清試料を、酵素アッセイによって解析した。アマドリアーゼ活性アッセイは、モニエ（Ｍｏｎｎｉｅｒ）ＶＭら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．）１９９７年２月７日、２７２（６）：３４３７−４３頁によって記載されている。フルクトシルプロピルアミン（モニエ（Ｍｏｎｎｉｅｒ）教授の厚意より提供された）を基質として用いてオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）との比色反応によって測定されるグルコソンの放出によって、酵素活性をモニタリングした。このアッセイは、１２０分の反応時間の後に形成されたグルコソンの終点測定に基づく。反応混合物は、１ｍｌの最終体積中、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１０ｍＭＯＰＤ、１０ｍＭフルクトシルプロピルアミン、および実施例９．３の上清試料を含んだ。３７℃で２時間のインキュベーション後、３２０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を図１５に表す。結果から、実施例５．２の細胞内化合物を分泌することができる包括的なＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主が、アマドリアーゼ−ＳＲＬ遺伝子で形質転換した対照株ＣＢＳ５１３．８８よりも、少なくとも３倍多くアマドリアーゼ−ＳＲＬを培地中で生成することができることが、明らかに示される。
【０１８４】
実施例１０．ペルオキシソーム代謝産物の排出の増大
実施例５．２の細胞内化合物を分泌することができる包括的なＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主が陰性対照株ＣＢＳ５１３．８８と比較して増大したペルオキシソーム代謝産物の分泌を示すことを示すために、実験を行った。
【０１８５】
実施例６に従って、実施例５．２の細胞内化合物を分泌することができる包括的なＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主およびＣＢＳ５１３．８８を培養した。培養の開始後１３８時間目に上清試料を採取した。上清試料を遠心分離によって澄ませ、０．４５μｍフィルター（カタログ番号４６１４、アメリカ合衆国ミズーリ州アナーバーのポール（Ｐａｌｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｏ  ＵＳＡ））を通した限外ろ過によって残りの細胞残屑から分離した。続いて、１Ｈ  ＮＭＲによって、ペルオキシソームβ−酸化代謝産物（デービッド・Ｅ・ミッツラー（Ｄａｖｉｄ  Ｅ  Ｍｅｔｚｌｅｒ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２版、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）２００１年）に関して試料を解析した。
【０１８６】
２ｍｌの上清を、４Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２に酸性化し、４ｍｌクロロホルムで抽出した。澄んだクロロホルム層（遠心分離後）から、３ｍｌを２ｍｌ水にｐＨ７．５（０．０１Ｎ  ＮａＯＨで調節）で逆抽出した。遠心分離後の１．５ｍｌの水層を凍結乾燥し、０．５ｍｌ  Ｄ２Ｏ（重水素Ｈ２Ｏ、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））に再懸濁した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、ブルカー・アバンス（Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ）６００分光光度計で、６００ＭＨＺで測定した。２倍の濃度の増大を示す化合物を、二次元ＮＭＲ分光学によって、分枝脂肪酸、イソ酪酸（ａ）、イソ吉草酸（ｂ）およびａ−メチル酪酸（ｃ）であると同定した。これらは、それぞれａ＋ｂおよびｃに関する分枝イソ−およびアンテイソ脂肪酸のβ−酸化から生じることが公知である（デービッド・Ｅ・ミッツラー（Ｄａｖｉｄ  Ｅ  Ｍｅｔｚｌｅｒ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２版、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）２００１年）。
【０１８７】
これらの酸の間の量的比較を、ＮＭＲスペクトルにおけるこれらの特徴的なメチル共鳴の統合によって行った（ａは１．１１４ｐｐｍ、ｂは０．９２８、ならびにｃは０．８８５および１．０８９ｐｐｍ）。３つ全ての代謝産物に関して、２倍の増大が、陰性対照株ＣＢＳ５１３．８８と比較して、実施例５．２の細胞内化合物を分泌することができる包括的なＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主に関して測定された。結果から、実施例５．２の細胞内化合物を分泌することができる包括的なＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主を目的のペルオキシソーム代謝産物の細胞外生成の宿主株として用い得ることが、明らかに示された。
【０１８８】
本明細書中に記載および特許請求される発明は、実施形態が本発明のいくつかの態様の例示として意図されているために、本明細書中に開示される特定の実施形態によって範囲に限定されるものではない。任意の同等な実施形態が、本発明の範囲内にあると意図される。実際、本発明に示され、記載されたもの以外の本発明の種々の変更は、上記の記載から、当業者に明らかになろう。かかる変更はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されると意図される。争議の場合には、定義を含む本開示が制御する。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターｐＧＢＦＩＮ−３２を表す。
【図２】Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）発現ベクターｐＧＢＫ−２０を表す。
【図３】アセトアミダーゼ遺伝子で形質転換された対照Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）細胞またはＳＫＬ配列に融合したアセトアミダーゼ遺伝子で形質転換されたＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）細胞で測定されたアセトアミダーゼ活性を表す。
【図４】アセトアミダーゼ遺伝子で形質転換された対照Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）細胞またはＳＫＬ配列に融合したアセトアミダーゼ遺伝子で形質転換されたＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）細胞で測定されたアセトアミダーゼ活性を表す。
【図５】ＧＦＰ−ＳＫＬで形質転換されたＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のペルオキシソームを示す。
【図６】ＧＦＰ−ＳＫＬで形質転換され、ペルオキシソーム増殖の媒介物質であるオレイン酸Ｎａとともに培養された、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のペルオキシソームを示す。
【図７】上清中のＧＦＰ−ＳＫＬの放出を示すいくつかの形質転換Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養上清を含む、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図８】上清中のＧＦＰ−ＳＫＬの放出を示すいくつかの形質転換Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養上清を含む、ウェスタンブロットを示す。
【図９】ＧＦＰ（パネルＣ）、ＧＦＰ−ＳＫＬ（パネルＢ）またはＧＦＰ／Ｐｍｐ２２（パネルＡ）を発現しているＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を示す。
【図１０】アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）／ｍｌ培養上清の相対的な量として表された、細胞の非特異的溶解の程度を示す。
【図１１】Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターｐＧＢＦＩＮ−５を表す。
【図１２】１０Ｌスケール発酵におけるＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中のバイオマス濃度および細胞外ＧＦＰ−ＳＫＬ生成を示す。
【図１３】Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における細胞内ＧＦＰ−ＳＫＬ生成に関するグルコースおよび酸素制限条件発酵条件の間の差を示す。
【図１４】培養上清中の、Ｃ末端ＳＫＬのある分泌されたアセトアミダーゼの存在を示す。ブロック２および４は、細胞内化合物を分泌することができるＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主細胞における、ＳＫＬのあるアセトアミダーゼを表す。ブロック１および３は、細胞内化合物を分泌することができるＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主細胞における、ＳＫＬがないアセトアミダーゼを表す。
【図１５】培養物上清中の、Ｃ末端ＳＲＬのある分泌されたアセトアミダーゼの存在を示す。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１１】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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