【事件の表示】
　特許第２９１６６８４号「リポソーム製剤の精製法」の特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２９１６６８４号の請求項１ないし３に係る特許を維持する。
【理　由】
 （１）手続の経緯
　本件特許第２９１６６８４号発明は、平成１年３月１日に特許出願され、平成１１年４月２３日にその特許の設定登録がなされ、その後、テルモ株式会社より特許異議の申し立てがなされ、当審により取り消し理由通知がなされ、その指定期間内である平成１２年７月１０日に、訂正明細書のとおり、すなわち、下記のとおり訂正することを内容とする訂正請求がなされたものである。
（２）訂正の内容
ア．特許請求の範囲の請求項１において、「未封入薬物」とあるのを、「未封入の当該薬物」と訂正する（二カ所）。
イ．本件特許明細書第４頁第１７行並びに第１９行、同書第５頁第２行および同書第３１頁第１５行並びに第１６行（特許第２９１６６８４号公報第３欄、第３７行、第３９行並びに第４１行〜４２行および同公報第１３欄第４４行〜第１４欄第１行）の「未封入薬物」を「未封入の当該薬物」と訂正する。
（３）訂正の適否についての判断
　そこで、これらの訂正事項について検討すると、上記の訂正事項アは、特許請求の範囲の明りょうでない記載の釈明を目的とするものであり、訂正事項イは訂正事項アによる特許請求の範囲の訂正にともなって、記載内容を整合させるものであるから、同じく不明りょうな記載の釈明を目的とするものである。
　そして、上記の各訂正事項は、特許明細書に記載された事項の範囲内のものであって、かつ、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものではない。
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する第１２６条第２及び３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
（４）特許異議の申立てについての判断　
ア．本件発明
　訂正後の特許請求の範囲の請求項１〜３に係る発明は以下のとおりのものである。
「（１）薬物を封入してなるリポソームと未封入の当該薬物とを含有してなる水性液を、薬物を透過しリポソームを透過しないホローファイバーによる透析に付し、該ファイバーの外液中に未封入の当該薬物を分離除去することを特徴とするリポソーム製剤の精製法。
（２）ホローファイバー中の水性液圧を外液圧よりも高くなるように制御する請求項（１）記載の方法。
（３）差圧が３００ｍｍＨｇ以下である請求項（２）記載の方法。」
イ．申立ての理由の概要
　特許異議申立人テルモ株式会社は、甲第１号証（CANCER　DRUG　DELIVERY，Volume　３，Number　２，１９８６，Ｐ１２３−１２９　「毛細管ダイアライザーの使用による、多種類の脂質細胞増殖抑制薬物を含む、均質な無菌のリポソームの大容量の製造」及び甲第２号証（特開昭６１−３７７３５号公報）を提出し、訂正前の特許請求の範囲の請求項１〜３に係る発明は、上記甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に該当し、特許を受けることができず、また同請求項１〜３に係る発明は甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、したがって、本件請求項１〜３に係る発明の特許は、特許法第１１３条第１項第２号の規定に該当し、取り消されるべきものであると主張する。
ウ．甲号各証の発明
　甲第１号証には、「無菌状態での安定で均質な２層リポソームの、大容量の製造を開発した」ことが記載（英文第１２３頁「要約」の項）され、また、「細胞増殖抑制医薬１−β−Ｄ−アラビノフラノシル　シトシン（ａｒａ−Ｃ）および５’−フルオロ−２’デオキシ　ウリジン（ＦＵｄＲ）の親油性誘導体の挿入率はほぼ定量的であり、約１００ｎｍの径の均質な２層リポソームが得られた。ｍｌあたり２−１０ｍｇのプロドラッグ濃度のリポソームが、用いられた脂質量に依存して製造できた。しかし、遊離のａｒａ−Ｃや一般的に小さくて水溶性の分子は透析中の定量的損失によりリポソームに挿入されることはできなかった。」（英文１２３頁要約の下から９行〜最下行）と記載され、さらに、［ＦＵｄＲやａｒａ−Ｃプロドラッグについては、安定で均質なリポソームの製造では最大挿入量はモルリポソームあたり０．１〜０．４モルプロドラッグの間にある。ＦＵｄＲやａｒａ−Ｃ等の細胞増殖抑制薬剤のような小さくて水溶性の化合物は、この方法又は他の確立された透析方法によっても捕獲されたリポソーム体積の中に無理のない量で封入されることは出来ない。これに対し、蛋白やペプチド、核酸のような大きな透析されない親水性の分子はリポソーム形成工程が非常に早いので速い速度で封入される。」と記載（英文１２８頁（ＤＩＳＣＵＳＳＩＯＮの欄の下から１４行〜下から５行）され、甲第２号証には、「大量生産に適した製法である透析法によりヘモグロビン含有リポソームを製造する」ことが記載（第２頁左上欄第６ないし８行）されている。
エ．判断
（特許法第２９条第１項第３号について）
　本件請求項１に係る発明（以下、「前者」ともいう。）と、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明（以下、併せて後者ともいう。）とを対比すると、両者はリポソーム製剤に関するものである点で一致するが、両者は、方法の種類、出発原料、透析膜及び透析除去される主な物質のいずれにおいても相違するものである。　以下、順に説明する。
　まず、方法の種類についてみると、前者が、すでに形成されたリポソームを含む系から、リポソームに封入されなかった未封入薬剤を除去する精製方法に関するものである（本件請求項１）のに対し、後者はリポソームを形成する方法に関する（上記ウ）ものであるから、本件請求項１に係る精製法は、後者の製造法に引き続いて行うことは可能であっても、後者の一部として含まれるものではなく、両者は方法の種類において相違する。
　つぎに、出発原料についてみると、前者は薬物を封入したリポソーム及び未封入の当該薬物が存在する系であるのに対し、後者においては、薬物（甲第１号証においてはａｒａ−Ｃ及びＦＵｄＲの親油性誘導体であり、甲第２号証においてはヘモグロビン、メトヘモグロビン化防止剤である）、脂質及び界面活性剤が存在する系であって、両者は、出発原料においても相違する。
　つぎに、使用する透析膜についてみると、前者において使用するホローファイバーを構成する透析膜の膜透過性は、不純物としての「薬物を透過しリポソームを透過しない」（本件請求項１）もの、例えば「薬物を透過しリポソームを透過しないような孔径を有するもの」を選択する（本件公報第５欄第３〜４行）必要があるのに対し、後者においては、ホローファイバー中でリポソームを形成し、同時にその中に薬剤を封入させるものであるから、そこで使用されるホローファイバーの膜透過性は当然未封入の薬物を透過せず、かつ当該薬物を封入したリポソームを通過させずに、界面活性剤等の成分を透過させる（甲第１号証英文第１２４頁第２１〜２３行及び甲第２号証第２頁左上欄第６〜８行））ものであり、薬物の透過性に関して、前者は、１００％透過させようとするものであるのに対して、後者は１００％透過を防止しようとするものであるから、ある薬物に対して選択される膜透過性が正反対のものであるから、ある同一の薬物に対してそのような正反対の膜透過性を有する透析膜が同一であるはずがない。
　さらに、透析除去される主な物質についてみると、上記したような膜透過性の相違からも知られるように、前者においては未封入の当該薬物が透析除去される主な物質であるのに対して、後者においては、当該薬物以外の界面活性剤などであるから、この点においても両者は相違するものである。
　なお、特許異議申立人は、甲第１号証に「ＦＵｄＲやａｒａ−Ｃプロドラッグについては、安定で均質なリポソームの製造では最大挿入量はモルリポソームあたり０．１〜０．４モルプロドラッグの間にある。ＦＵｄＲやａｒａ−Ｃ等の細胞増殖抑制薬剤のような小さくて水溶性の化合物は、この方法又は他の確立された透析方法によっても捕獲されたリポソーム体積の中に無理のない量で封入されることは出来ない。」（上記ウ）と記載されていることを根拠に「界面活性剤の除去中に、リポソームに封入された大きな親油性誘導体分子が、リポソーム内に封入され、小さな分子である遊離ａｒａ−Ｃ等が透析中に透析外液中に出て定量的に除去されることが記載されている。この記載は、薬物を透過しリポソームを透過しないホローファイバーによる透析によりリポソームが精製されていることに他ならない。」と主張する（特許異議申立書第７頁）が、訂正請求により訂正された結果、本件請求項１に係る発明においては、封入される薬物と透析除去される薬物とが同一のものであることが明りょうになったので、特許異議申立人の上記主張は妥当でない。
　訂正後の本件請求項２及び３に係る発明は、同請求項１に係る発明をさらに技術的に限定するものであるから、上記と同様の理由により、いずれも甲第１及び２号証に記載された発明とはいえない。
　したがって、訂正後の請求項１〜３に係る発明が甲第１及び２号証に記載された発明であるという特許異議申立人の主張は妥当でない。
（特許法第２９条第２項について）
　また、上記のとおり、甲第１及び２号証には、薬物及びリポソームを透過せず、界面活性剤などを透過するホローファイバーを用いてリポソームを形成することが記載されているに過ぎず、これら記載された発明に基づいて、薬物を透過しリポソームを透過しないホローファイバーによる透析により、薬剤を封入したリポソーム及び未封入の当該薬物を含有する系から、未封入薬物を透過させることにより、リポソーム製剤を精製する方法を想到することは、当業者が容易になし得ないものである。
　そして、訂正された本件請求項１に係る発明は、このような構成を採用することにより、このような精製を目的とした従来の透析袋膜法、遠心分離法、ゲル濾過法に比較して、短時間に大量処理が可能であることなど、明細書記載のとおりの顕著な効果を奏するものである。
　したがって、訂正された本件請求項１に係る発明は、当業者が甲第１及び２号証に記載された発明から容易に発明をすることが出来たものとはいえない。
　また、訂正後の本件請求項２及び３に係る発明は、同請求項１に係る発明をさらに技術的に限定するものであるから、上記と同様の理由により、いずれも甲第１及び２号証に記載された発明から当業者が容易に発明し得たものではない。
　したがって、いずれの特許異議申立人の主張も妥当でない。
エ.むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立ての理由及び提出した証拠によっては、本件請求項１〜３に係る発明についての特許を取り消すことはできない。
  また、他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
  よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年９月１２日（２０００．９．１２）
【訂正の要旨】
　　　　　　　　　　　訂正の要旨
ア．特許請求の範囲の請求項１において、「未封入薬物」とあるのを、「未封入の当該薬物」と訂正する（二カ所）。
イ．本件特許明細書第４頁第１７行並びに第１９行、同書第５頁第２行および同書第３１頁第１５行並びに第１６行（特許第２９１６６８４号公報第３欄、第３７行、第３９行並びに第４１行〜４２行および同公報第１３欄第４４行〜第１４欄第１行）の「未封入薬物」を「未封入の当該薬物」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
リポソーム製剤の精製法
（５７）【特許請求の範囲】
（１）薬物を封入してなるリポソームと未封入
の当該
の当該
（２）ホローファイバー中の水性液圧を外液圧よりも高くなるように制御する請求項（１）記載の方法。
（３）差圧が３００ｍｍＨｇ以下である請求項（２）記載の方法。
【発明の詳細な説明】
　　産業上の利用分野
　本発明は薬物を封入したリポソーム製剤の精製法に関する。
　従来の技術
　リン脂質と薬物液とから薬物を封入したリポソームを形成後は、一般に薬物封入リポソームと未封入の遊離薬物とを分離する工程が必要である。その分離技術としては、従来、セロファン袋膜による透析法〔細胞工学、
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　上記のように、リポソームに未封入の遊離薬物を分離除去する方法は、従来、いくつか見られるものの、いずれの方法も工業的スケールで実施するには不適当である。例えば、セロファン袋膜を用いる方法は、処理対象液であるリポソーム懸濁液を袋膜に小分する作業が煩雑なこと、長時間の処理時間を要すること、品質が一定しないこと、無菌化製造することが容易でないことなどの欠点がある。超遠心分離法の場合、超遠心受器にリポソーム懸濁液を小分け分注し、遠心分離した後、上清を廃液して沈降物を回収するという操作を数回くり返して遊離薬物を除去する方法であり、やはり操作が煩雑となり、無菌化処理も困難なことが予想される。さらに、リポソームの種類（例えば、ＳＵＶ，ＲＥＶ）によっては、リポソームが完全に沈降せず、上清の廃液時に流出し、完全な回収が困難であることから、比較的粒径の大きいリポソームに限られること、また、遠心沈降によるリポソームの凝集が起こり、再分散後、凝集体を形成することが懸念される。
　一方、ゲルろ過法は、薬物を吸着するための吸着剤を充填したカラムにリポソーム懸濁液を流通させ、未封入薬物を吸着分離する方法であるが、カラム流通速度が比較的遅いため、処理時間に長時間を要すること、カラム溶離液により希釈されるので、後に濃縮工程が必要であること、吸着剤にリン脂質が吸着することも起こりうるので、空リポソーム等での前処理が必要であること、ときには試料注入部位への物理的なブロッキングが認められること、また、再使用するには吸着剤の再生処理（吸着した薬物の再遊離除去処理）が必要であること、無菌化処理（使用前の吸着剤の滅菌処理）が困難であることなどの欠点がある。
発明が解決しようとする課題
　上記のように薬物封入リポソーム製剤の製造法において、未封入の遊離薬物を効率的に分離除去する方法はまだ完成されていない。この工業的実施のためには、大量処理が短時間で実施できること、無菌化処理が簡単にできること、リポソーム製剤の製造と連結することができ一貫した操作で、一日内に製品化できること、などの条件をできるだけ満足する必要がある。
課題を解決するための手段
　以上の点に鑑み、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、リポソーム製剤の製造における未封入薬物の分離除去にはホローファイバー型透析器が工業的有利に利用できることを知り、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は薬物を封入してなるリポソームと未封入
の当該
の当該
　本発明でいう「薬物を封入してなるリポソームと未封入の当該薬物とを含有してなる水性液」は、水に薬物を封入してなるリポソームが懸濁しており、同時にその水に薬物が含有されている系であれば特に限定されない。一般にはリン脂質と薬物液を用いて自体公知の方法によって薬物を封入するリポソームを調製した後に得られる液であって、該リポソームを懸濁し、かつ未封入の薬物を含有している水性液が主対象となる。以下、本明細書では上記の水性液を単に「リポソーム懸濁液」と称することもある。薬物を封入するリポソーム製剤の調製において、現在まで知られているリポソームの形成法では、未封入薬物の発生は避け難い。そして、リポソーム製剤をＤＤＳ（ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ）等の目的で使用する場合、未封入薬物は予め除去しておくことが一般に望ましいことが多い。本発明の適用対象となりうるリポソームの種類は、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ），ＭＬＶ（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ），ＬＵＶ（ｌａｒｇｅｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ），ＲＥＶ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ　ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎｖｅｓｉｃｌｅ）あるいはＳＰＬＶ（ｓｔａｂｌｅ　ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）のいずれであってもよい。
　次に、本発明に用いるホローファイバー型透析器は、半透膜の材質からなり中空を有する繊維を一般に数千本を束ねて形成し、かつ該繊維の外側に透析液を流通するように構成された装置をいう。この例としては、公知のホローファイバー型人工腎臓と同様に構成された透析装置があげられる。ホローファイバーの材質は、リポソーム形成材料であるリン脂質と反応もしくは吸着を起こさないことを基準に天然高分子膜またはその加工処理膜、再生高分子膜あるいは合成高分子膜のなかから選択すればよい。
　具体的には、天然高分子膜またはその加工処理膜としてはセロファン，架橋コラーゲンが、再生高分子膜としては各種のセルロース系膜、たとえば、酢酸セルロース（例、酢化５０％以上），三酢酸セルロース，酢酸・酪酸セルロース，ニトロセルロース，キュプロ・アンモニウム・レーヨン膜等があげられる。
　また合成高分子膜としては、ポリビニールアルコール，ポリビニールピロリドン・メチレンビス・４・フェニルイソシアネート（ＭＤＩ），ポリエチレングリコールＭＤＩ，ポリビスフェノール・カーボネイト−ポリエチレンオキシド共重合体，ポリイオンコンプレックス，ポリプロピレン，ポリビニルアセテート，ポリスルフォンカーボネイト，ポリエチレン，ポリアクリロニトリル，ポリメチルメタクリレート膜等が検討されており、これらの中でもポリビニルアルコールＭＤＩ，架橋コラーゲン，ポリビスフェノール・カーボネイト・ポリエチレンオキシド，ポリビニルアセテート，ポリスルフォンカーボネイト，ポリアクリルニトリル，ポリメチルメタアクリレート膜が本発明では好ましく用いられる。
　ホローファイバー膜の透過性は尿素透析速度で表わしたときの半減期が、セロファンと同等もしくは小であることが一般に好ましく、たとえばセロファンの半減期を１とした場合、約０．２〜１の透過性を有するものが有利に使用できる。
　本発明において、ホローファイバーの透過性を選択する基準は、使用する薬物の分子の大きさ等とも関係するのでこの点について説明する。
　まず、本リポソーム製剤の製造に用いられる薬物の種類は、水溶性薬物であってマイクロカプセル化して使用する可能性を有するものが対象となり得る。水溶性の程度は、たとえば、オクタノール／水で示される分配率の対数値が１０以下であるものをいう。ホローファイバーは、薬物を透過しリポソームを透過しないような孔径を有するものを選択するが、薬物の透過性はファイバーの孔径と薬物の分子の大きさに関係する。例えば、孔径６Åではクレアチニン（分子量１１３），１５ÅでビタミンＢ１２（分子量１，３５０），２４Åでイヌリン（分子量５，２００），３２ÅでチトクロームＣ（分子量２４，０００），４６Åでβ−イミノグロブリン（分子量３８，０００），５５Åでアルブミン（分子量６０，０００）等に相当し、透析性の目安になる。ホローファイバー型透析器の中空繊維膜として一般によく使用されるキュプロ・アンモニウム・レーヨンの場合、孔径が約２０Åである。分子量３，０００以下の薬物であれば約２０Åの孔径を有するホローファイバー膜で有効に透析される。
　本発明においては、分子量が約１００〜約６万の薬物が好ましい適用対象である。以下に、本発明方法において適用可能な薬物の例を分子量の範囲別に示す。
（１）分子量１００以上１０００以下
　（例）　シスプラチン（ＣＤＤＰ），カルボプラチン，イプロプラチン，テトラプラチン等の金属錯体，マイトマイシン，アドリアマイシン，アンサマイトシン，アクチノマイシンあるいはその誘導体（例、９−チオメイタンシン），ブレオマイシン，Ａｒａ−Ｃ，ダウノマイシン等の制癌抗生物質，５−ＦＵ，メトトレキセート，ＴＡＣ−７８８〔イソブチル５−フルオロ−６−（Ｅ）−フルフリリデンアミノオキシ−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロ−２，４−ジオキソピリミジン−５−カルボキシレート，特開昭５９−１３７８０号〕等の代謝拮抗剤，ＢＣＮＵ，ＣＣＮＵ等のアルキル化剤；メルファラン，ミトキサントロン等の抗腫瘍剤，ゲンタマイシン，ストレプトマイシン，カナマイシン，ジベカシン，パロモマイシン，カネンドマイシン，リピドマイシン，トブラマイシン，アミカシン，フラジオマイシン，シソマイシン等のアミノ配糖系抗生物質，スルベニシリン，メシリナム，カルベニシリン，ピペラシリン，チカルシリン等のペニシリン類；チェナマイシン類；セフォチアム，セフスロジン，セフメノキシム，セフメタゾール，セファゾリン，セフォタキシム，セフォペラゾン，セフチゾキシム，モキソラクタム等のセファロスポリン類等のβ−ラクタム系抗生物質，ＴＲＨ類〔ＴＲＨ，ＴＲＨアナログ（例、Ｌ−Ｎ−（２−オキソピペラジン−６−カルボニル）−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボキサミド，Ｌ−２−オキソオキサゾリン−４−カルボニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−プロリンアミド，Ｌ−トランス−５−メチル−２−オキソオキサゾリジン−４−カルボニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−プロリンアミド，Ｌ−２−オキソチアゾリジン−４−カルボニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−プロリンアミド，γ−ブチロラクトン−γ−カルボニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−プロリンアミド，２−ケトピペリジン−６−カルボニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−プロリンアミド，３−オキソバ−ハイドロ−１，４−チアジン−５−カルボニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−プロリンアミド）これらＴＲＨ，ＴＲＨアナログのアミド基における水素原子がメチル基，エチル基，ｎ−プロピル基，ｎ−ブチル基，ｎ−ヘキシル基，ｎ−アミル基，β−フェネチル基で置換された化合物，ならびにこれら化合物の酢酸塩，酒石酸塩など〕，エンケファリン等のペプチド系薬物，アスピリン，ジフルニサール，インドメタシン，ジクロフェナック，フェンブフェン，スハンダク，アセメタシン，イブプロフェン，ナプキセン，ケトプロフェン，フラパイプロフェン，フェノプロフェン，チアプロフェン，プラノプロフェン，メフェナム酸，トルフェナム酸，フルフェナム酸，フェニルブタゾン，オキシフェン，ブタゾン，ピロキシカム，メピルゾーム，エモルファゾン等抗炎症剤，鎮痛剤，解熱剤そして各種プロスタグランジン及びその誘導体。
（２）分子量１０００以上２０００以下
　（例）　グラミシジンＤ，バシトラシン等のペプチド系抗生物質
（３）分子量２０００以上５０００以下
　（例）　ＡＣＴＨ，ポリミキシンＢ，コリスチン等ペプチド系物質
（４）分子量５０００以上１００００以下
　（例）　ヘパリン，レンチナン，ザイモサン，ＰＳ−Ｋ等の多糖類，インスリン，成長ホルモン等のペプチドホルモン
（５）分子量１００００以上２００００以下
　（例）　インターフェロン（α，β，γ），インターロイキン２，ＴＮＦ等のリンホカイン類
（６）分子量２００００以上６００００以下
　（例）　ＳＯＤ
　次に、ホローファイバーは、通常、その中空内径が約１５０〜２５０μｍ，膜厚さは約１０〜２０μｍの形状を有するものが好ましく用いられる。
ホローファイバー型の透析器として用いる場合、表面積の大きな一本のファイバーを使用してもよいが、大量処理の目的をより容易に達成するためには、小膜面積のホローファイバーを複数個並列または直列に連結して用いるのが有利である。さらに、ホローファイバーを多数集束して用いるのが好ましく、例えば、内径２００μｍで有効長２３．５ｃｍホローファイバーを９９００本集束させることによって、透析面積１．５ｍ２の透析器が得られ、この程度の表面積を有するものが実用的に利用しうる。集束させたホローファイバーをさらに直列または並列に連結させることにより、透析面積の拡大をはかってもよい。
　次に、本発明の透析処理法においては、ホローファイバーの外側に液を流通させて、透過してきた薬物を系外に除去させるが、この透析外液として単に水を用いてもよいが、そのリポソーム製剤の投与形態に合うような液を用いるのが実用上、好都合である。すなわち、温血動物が生理的に許容しうるような各種物質の水溶液、具体的には、塩類（例、食塩），糖類（例、ぶどう糖，マンニット，ソルビット），アミノ酸類（例、グリシン，アスパラギン酸，グルタミン酸）などの水溶液あるいはこれらの２種またはそれ以上の混合溶液があげられる。これらの中でも、生理食塩水は各種薬剤の静脈投与の際に最も広く用いられている分散媒であり、本発明においても有利に用いることができる。
　本発明方法は、たとえば第１図（ａ）（ｂ）に示す装置を用いて、次のような順序で実施できる。
　第１図（ａ）に示す装置において、貯留容器▲１▼にリポソーム懸濁液を仕込み、送液ポンプ▲２▼によって、送液パイプ▲３▼を介して連結されているホローファイバー型透析器▲４▼に液送される。該透析器▲４▼は第１図（ｂ）に示される構造を有し、ホローファイバー▲１１▼は接着固定部▲１２▼によって集束された
貯留容器▲１▼に戻る。一方、第１図（ａ）の貯留容器▲６▼に仕込まれた透析外液は送液ポンプ▲７▼によって送液パイプ▲８▼を通して、前記のホローファイバ
透析器外に流出させる。この透析外液は、必要に応じて活性炭，イオン交換樹脂により薬物を吸着・除去したのち、循環使用し得る。かくして、リポソーム懸濁液中の遊離薬物はホローファイバーの膜を通過して、透析外液中に溶解して、次第に系外に分離されていき、精製されたリポソーム製剤を貯留容器▲１▼に回収することができる。
　本発明において、ホローファイバー内液の圧力を透析外液のそれよりも高くなるように制御しながら透析を続けると、遊離薬物の除去効率を高めることができる。この差圧は一般に３００ｍｍＨｇまでに制御されるが、好ましくは約５０ｍｍＨｇ以下さらに好ましくは１０〜５０ｍｍＨｇとなるように制御される。差圧を５０ｍｍＨｇ以上にすると、水の透過も大きくなり、リポソーム分散液が濃縮されてくるので、未封入の遊離薬物の分散除去と同時に濃縮を行なうことも可能である。ただ、過剰の差圧下で濃縮を行なわせると、リポソーム内に封入されている薬物が漏出してくることがあり好ましくない場合がある。この差圧の制御方法は、たとえば第１図（ａ）に示される装置において、リポソーム懸濁液送液パイプ▲５▼および透析外液送液パイプ▲９▼にそれぞれ設置された差圧調整バルブ▲１０▼によって調整される。特に、高分子量薬物（例、分子量１〜６万）の場合には、拡散透析速度が遅いため、より効率を上げるためにホローファイバー膜内液を加圧して行なう中空繊維膜透析が有効であり、この場合、耐圧強度をもたせるために膜はやや厚い方がよい。
　リポソーム懸濁液と透析外液は、第１図（ａ）のように、向流方式で流通させるのが一般的であるが、並流方式も場合によっては採用できる。ホローファイバー透析器は▲４▼に示すような装置を、さらに直列または並列で複数個連結させることにより、さらに大量処理に適した装置を用いてもよい。
　一方、より実用的には第２図に示されるように、リポソーム製造装置と、たとえば第１図（ｂ）に示されるホローファイバー透析装置とを直結させることによりクローズドシステムで、リポソーム懸濁液の製造と未封入薬物の分離除去を一貫処理でき、作業性を一段と向上させ得る。この場合、ホローファイバー透析装置は、予め高圧蒸気滅菌などの処理を施しておくことにより、精製されたリポソーム製剤を無菌的に製造することができる。
実施例
　以下に実験例及び実施例を示し、本発明を更に詳しく説明するが、これらは何ら本発明を限定するものではない。
実験例１
（１）　ＲＥＶリポソームの製法
　１ｌ丸底フラスコ中に、０．５ｍＭ　６−ＣＦ（６−カルボキシフルオレセイン）の生理食塩水溶液３００ｍｌとリン脂質（ジパルミトイルフォスファチジルコリン：　ジステアリルフォスファチジルコリン＝９：１）６ｇをクロロホルム：　ジイソプロピルエーテル（１：１）の混合溶媒３００ｍｌに溶解した液を入れて混合し、次に浴槽型超音波発生機（６０Ｗ）で２０分間超音波照射して乳化した。これを、５５℃の水浴加温下で真空ロータリーエバポレーターによって有機溶媒を徐々に留去して、６−ＣＦを封入するＲＥＶリポソームの懸濁液を調製した。本懸濁液にはリポソームに未封入の６−ＣＦが溶解されている。
（２）　透析法
　対照透析法：　セロファン袋膜（内径２ｃｍ，長さ１ｍ，０．０８ｍ２、スペクトラポア、ＳＰＥＣＴＲＵＭ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ，ＩＮＣ．製）にリポソーム懸濁液３００ｍｌを充填し、これを生理食塩水溶液１０ｌ中に浸漬し、室温下で撹拌しながら透析した。
　本発明透析法：　キュプラ・アンモニウム・レーヨン使用のホローファイバー型透析器（中空の平均内径２００μｍ、有効表面積０．８ｍ２、ＴＡＦ０８Ｗ型，テルモ製）を用いて、リポソーム懸濁液循環流量１５０ｍｌ／分、透析外液（生理食塩水）の流量５００ｍｌ／分で懸濁液と透析外液との差圧が１０ｍｍＨｇの条件でリポソーム懸濁液３００ｍｌを処理した。
（３）　透析分離除去の効果の測定
　未封入の遊離６−ＣＦの分離除去の効果は、分離除去前のリポソーム懸濁液中の遊離６−ＣＦの含量に対する分離除去後の同含量の百分率（残存率）で表わした。
（４）　遊離６−ＣＦの測定法
　リポソーム懸濁液の０．１ｍｌを採取し、セントリザルト（Ｃｅｎｔｒｉｓａｒｔ　ｌ，ＳＭ１３２４９，西独製）に入れ、生理食塩水１ｍｌを加えて遠心分離（２０００ｒｐｍ，５分間）して、遊離６−ＣＦのみを含有する上清の一定量を蒸留水で１００倍に希釈したのち、光路長１ｃｍの石英セルに入れ、蛍光分光器によって蛍光強度（励起波長４９４ｍｍ、蛍光波長５１５ｎｍ）を測定し、検量線から遊離６−ＣＦを定量した。検量線は、別に６−ＣＦの標準液の蛍光強度を測定し作成した。
（５）　結　果
　対照透析法と本発明透析法をそれぞれ適用したときの、処理時間と６−ＣＦ残存率との関係を表１に示す。
　表１の結果から明らかなように、セロファン袋膜透析法が、リポソーム中へ未封入の遊離６−ＣＦの残存率が７２時間（３日）後に漸く０．８％以下になるのに対し、本発明方法によると遊離６−ＣＦの残存率は４０分間で０．１％以下にすることができ、きわめて短時間で効率的に分離除去できる。
　さらに、前記の本発明の透析法において、有効表面積を１．５ｍ２に増大したホローファイバーを使用した場合は、処理時間２０分でも６−ＣＦ残存率を０．１％以下にすることができ、さらに処理時間を短縮することができた。
実験例２
　実験例１と同様の方法で調製した６−ＣＦ封入リポソーム懸濁液を用いて、超遠心分離（１２０００×ｇ，３０分間）法と本発明法とによる未封入６−ＣＦ液の分離効果について比較した。
　その結果、超遠心分離法では、粒径の小さいリポソームが完全に沈降せずに上清中に浮遊し、傾斜分離操作中にリポソームが流出し、損失量が大であった。また、分離除去率は１回だけの超遠心分離処理では、６−ＣＦ残存率が６．３％と大きく、洗浄と遠心分離の操作を３回繰り返した後にはじめて１％以下となり、従って約９０分もの処理時間を要し、大量処理が困難であった。これに対し、本発明法は全ての種類のリポソームに適用でき、リポソームをほとんど損失することなく、きわめて短時間に大量処理できた。
実験例３
（１）　シスプラチン（ＣＤＤＰ）封入のＲＥＶの調製
　実験例１のＲＥＶ調製法において、６−ＣＦの代わりにＣＤＤＰ（３００ｍｇ）を用いて同様の方法によりＣＤＤＰを封入するリポソームを懸濁し、未封入のＣＤＤＰを溶解する液を得た。
（２）　透析法
　対照透析法：　実験例１と同様に、セロファン袋膜にＣＤＤＰ封入リポソーム懸濁液３００ｍｌを充填し、同様の処理をした。
　本発明透析法：　実験例１と同様の条件で、ＣＤＤＰ封入リポソーム懸濁液の３００ｍｌを処理した。
（３）　透析分離除去の効果の測定
　前記リポソーム懸濁液中の未封入の遊離ＣＤＤＰ含量を、実験例１の第（３）項に示したと同様の操作で、分離除去前及び分離除去後において定量し、残存率を測定した。
（４）　遊離ＣＤＤＰの測定法
　遊離ＣＤＤＰの測定は実験例１の第（４）項に示したと同様の操作で、ＣＤＤＰ封入リポソームと遊離ＣＤＤＰをセントリザルト（Ｃｅｎｔｒｉｓａｒｔ　ｌ，ＳＭ１３２４９，西独製）で分離し、遊離ＣＤＤＰのみ含有する上清の０．１ｍｌを採取し、内部標準液０．１ｍｌを加えて、その一定量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によって定量した。ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
　カラム：日立ゲル３０１３Ｎ　４ｍｍφ×１５ｃｍ
　カラム温度：５０℃
　分離液：０．０２Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）
　流速：０．９ｍｌ／分，検出：ＵＶ２１０ｎｍ
　内部標準液：ヒポキサンチン（４μｇ／ｍｌ）水溶液表２にその結果を示す。
　この結果、セロファン袋膜透析法の場合、未封入の遊離ＣＤＤＰの分離除去残存率が、７２時間後（３日）後にようやく０．８％になるのに対し、本発明法によると３０分後に０．２％にすることができ、きわめて短時間に分離除去できる。
実施例１
　シスプラチン（ＣＤＤＰ）の１ｍｇ／ｍｌ生理食塩水溶液５００ｍｌとリン脂質（ジパルミトイルフォスファチジルコリン：　ジステアリルフォスファチジルコリン＝９：１）１０ｇをクロロホルム：　ジイソプロピルエーテル（１：１）の混合溶媒に溶解した溶液５００ｍｌとから、ＣＤＤＰ封入ＲＥＶリポソームを実験例１の方法に準じて製造した。このリポソーム懸濁液をホローファイバー型透析器（有効表面積１．５ｍ２、キュプラ・アンモニウム・レーヨン、テルモ製ＴＡＦ−１５Ｗ型）を用い、リポソーム懸濁液のホローファイバー内循環流量１５０ｍｌ／分、透析外液（生理食塩水）流量５００ｍｌ／分リポソーム懸濁液の循環液流出側系路と透析外液側との差圧を１０ｍｍＨｇに調整した。この条件下で０．５時間処理することにより、未封入の遊離ＣＤＤＰを分離除去できた。その結果、遊離のＣＤＤＰを含有せず、ＣＤＤＰの封入率２０％のリポソーム製剤を得た。
実施例２
　実施例１と同様の方法で製造した、ＣＤＤＰ封入ＲＥＶリポソーム懸濁液５００ｍｌを、ホローファイバー型透析器（有効表面積１．５ｍ２，キュプラ・アンモニウム・レーヨン、テルモ製ＴＡＦ−１５Ｗ型）を用い、リポソーム懸濁液の循環流出側系路の差圧調整バルブを絞って圧力を高めて、透析外液側との差圧を７０ｍｍＨｇにした。この条件下で０．３時間処理し、未封入の遊離ＣＤＤＰの残存率が０．５％以下で、リポソームを分散する液量が初期量の８０％に濃縮されており、ＣＤＤＰの封入率２０％のリポソーム製剤を得た。
実施例３
　前記実施例１と同様の方法で製造した、ＣＤＤＰ封入リポソーム懸濁液１０００ｍｌを調製した。この懸濁液をホローファイバー型透析器（有効表面積１．５ｍ２、キュプラ・アンモニウム・レーヨン、テルモ製ＴＡＦ−１５Ｗ型）を２本並列に連結した透析器を用いて、リポソーム懸濁液側と透析外液側の差圧を１０ｍｍＨｇに調整した条件下で、未封入ＣＤＤＰの分離除去を行い、処理時間０．５時間で遊離ＣＤＤＰを実質的に含まず、ＣＤＤＰ封入率２０％のリポソーム製剤を得た。
実施例４
　ＣＤＤＰ　０．６ｇを溶解した生理食塩水溶液　６００ｍｌとリン脂質（ジパルミトイルフォスファチジルコリン：　ジステアリルフォスファチジルコリン＝９：１）１２ｇを溶解した有機溶媒溶液〔クロロホルム：　ジイソプロピルエーテル（１：１）〕６００ｍｌとを真空乳化機（アジホモミキサーＭ型、特殊機化工業製）に入れホモミキサー（回転数１５０００ｒｐｍ，３０分間）で乳化し、６０℃の加温及び減圧下でパドルミキサーによって撹拌（８０回転／分）しながら、徐々に有機溶媒を留去してＣＤＤＰを封入するＲＥＶリポソームを製造した。このリポソーム懸濁液１１５０ｍｌをホローファイバー型透析器（有効表面積１．５ｍ２、キュプラ・アンモニウム・レーヨン、テルモ製ＴＡＦ−１５Ｗ型）を用い、リポソーム懸濁液循環流出量１５０ｍｌ／分，透析外液に生理食塩水を用い流量５００ｍｌ／分で前者と後者の差圧を１０ｍｍＨｇに調整した条件によって分離除去し、１．２時間でＣＤＤＰ封入率２０％のリポソーム製剤（１１５０ｍｌ）を得た。
実施例５
　実施例４と同様のホローファイバー型透析器（透析表面積１．５ｍ２、キュプラ・アンモニウム・レーヨン，テルモ製ＴＡＦ−１５Ｗ型）を予め高圧蒸気滅菌した。この透析器にリポソーム製造装置である真空乳化機（アジホモミキサーＭ型，特殊機化工業製）を直結し、実施例４と同様の方法でリポソーム製造後直ちにクローズドシステム（第２図）で、リポソーム懸濁液をホローファイバー内に循環させて透析外液に生理食塩水を用い、流量５００ｍｌ／分で、リポソーム分散液と透析外液との差圧を１０ｍｍＨｇに調整した。この条件で未封入の遊離ＣＤＤＰを分離除去し、無菌化リポソームを一貫処理で製造した。このとき、透析時間は１時間で、ＣＤＤＰ封入率２０％のリポソーム分散液（１０００ｍｌ）を得た。
実施例６
　卵黄レシチン１ｇを含有するクロロホルム溶液１００ｍｌを５００ｍｌ用ナス型コルベンに入れ、真空ロー夕リーエバポレーターでクロロホルムを徐々に留去して、ガラス壁にリン脂質の薄膜を形成させ、これに生理食塩水に溶解した１ｍｇ／ｍｌのＣＤＤＰ６０ｍｌを加え、よく撹拌しながらＣＤＤＰを封入し、ＣＤＤＰ液に分散されたＭＬＶを製造した。この方法でＭＬＶを５バッチ製造し、これらを合わせ得た３００ｍｌをホローファイバー型透析器（キュプラ・アンモニウム・レーヨン、有効表面積０．８ｍ２、ＴＡＦ０８型，テルモ製）を用い、リポソーム循環流量１５０ｍｌ／分、透析外液流量（生理食塩水）５００ｍｌ／分で処理し、未封入の遊離ＣＤＤＰを分離除去して、０．３時間で封入率３％のリポソーム分散液（３００ｍｌ）を得た。
実施例７
　実施例１で用いられる１ｍｇ／ｍｌＣＤＤＰの代わりに２００μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を用いて、それ以外は実施例１と同じ方法で、５−ＦＵを封入するリポソーム懸濁液を得て、同じ透析条件で未封入の遊離５−ＦＵを分離除去して、０．５時間処理で封入率２２％のリポソーム分散液（３００ｍｌ）を得た。
実施例８
　実施例１で用いられる１ｍｇ／ｍｌＣＤＤＰの代わりに、２００μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を用いて、それ以外は実施例１と同じ方法で、ＭＭＣを封入するリポソーム製剤を得て、同じ透析条件で未封入の遊離ＭＭＣを分離除去して、０．５時間処理で封入率２４％のリポソーム分散液（３００ｍｌ）を得た。
実施例９
　実施例１で用いられる１ｍｇ／ｍｌＣＤＤＰの代わりに、５００μｇ／ｍｌのアクラルビシン（Ａｒａ−Ｃ）を用いて、それ以外は実施例１と同じ方法で、Ａｒａ−Ｃを封入するリポソーム製剤を得て、同じ透析条件で未封入の遊離Ａｒａ−Ｃを分離除去して、０．５時間処理で封入率２０％のリポソーム分散液（３００ｍｌ）を得た。
実施例１０
　実施例１で用いられる１ｍｇ／ｍｌＣＤＤＰの代わりに、２００μｇ／ｍｌのビスクロルエチルニトロソウレア（ＢＣＮＵ）を用いて、それ以外は実施例１と同じ方法で、ＢＣＮＵを封入するリポソーム製剤を得て、同じ透析条件で未封入の遊離ＢＣＮＵを分離除去して、０．５時間処理で封入率２０％のリポソーム分散液（３００ｍｌ）を得た。
実施例１１
　１８ｇのＤＰＰＣと２ｇのＤＳＰＣを２１のビーカー内でクロロホルムとイソプロピルエーテルの１：１の混合溶液１０００ｍｌに溶解した。この溶液に浸透圧が生理食塩水の浸透圧の１．９倍となるようにあらかじめ調製しておいた５００μｇ／ｍｌのＣＤＤＰ食塩水溶液を１０００ｍｌ加え軽く混合した後、乳化機（３ｌ用ホモミキサー、特殊機化工業製）で６０分間乳化しＷ／Ｏエマルジョンを作製した。このようにして得たエマルジョンを同じホモミキサーを用いて、６０℃減圧下で有機溶媒を留去することによりＬＵＶを得た。さらに得られたＬＵＶの一部５００ｍｌをホローファイバー型透析器［ＡＭ−Ｎｅｏ−２００１型，旭化成製，ファイバー長約２５ｃｍ，有効膜面積１．５ｍ２］中に、約１５０ｍｌ／分の速度で注入し、透析外液として生理食塩水をホローファイバーにかかる膜圧が０となるように、約５００ｍｌ／分の速度で流すことにより、遊離のＣＤＤＰを透析除去し、ＣＤＤＰが上記高張溶液と共に封入されたリポソーム製剤を得た。
発明の効果
　本発明によると、薬物を封入してなるリポソームと未封入
の当該
の当該
【図面の簡単な説明】
　　第１図（ａ）は、本発明に用いる装置の１例を示す。図中、▲１▼はリポソーム懸濁液貯留容器、▲２▼はリポソーム懸濁液送液ポンプ，▲３▼および▲５▼はリポソーム懸濁液の送液パイプ，▲４▼はホローファイバー型透析器，▲６▼は透析外液貯留容器，▲７▼透析外液送液ポンプ，▲８▼および▲９▼は透析外液送液パイプ，▲１０▼は差圧調整バルブをそれぞれ示す。
　第１図（ｂ）は、第１図（ａ）中の▲４▼ホローファイバー型透析器の拡大図を示す。▲１１▼中空繊維膜（ホローファイバー），▲１２▼中空繊維集束接着固定部，▲１３▼
　第２図は、リポソーム製造装置にホローファイバー型透析器を直結させ、薬物を封入するリポソームの調製と未封入の薬物の分離を無菌的に一貫して実施できる装置の一例を示す。図中、▲１▼リポソーム製造装置（真空乳化機），▲２▼リポソーム懸濁液，▲３▼ホローファイバー型透析器，▲４▼リポソーム懸濁液循環送液ポンプ，▲５▼透析外液送液ポンプ，▲６▼リポソーム懸濁液送液パイプ，▲７▼透析外液送液パイプ，▲８▼中空繊維内側圧調整バルブ，▲９▼透析外液側圧調整バルブ，▲１０▼透析外液貯留タンクをそれぞれ示す。