【事件の表示】
　特許第２５２７８７２号「糖タンパク質、ｇＤ、ｇＩおよびｇＥをコ―ドするマレック病ヘルペスウイルスＤＮＡセグメント」の請求項１ないし１４に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２５２７８７２号の請求項１ないし１４に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第２５２７８７２号に係る発明についての出願は、平成３年８月１９日（パリ条約による優先権主張　１９９０年８月２４日、米国，１９９１年７月２５日、米国）に出願され、平成８年６月１４日にその特許の設定登録がなされ、その後、異議申立人　財団法人　化学及血清療法研究所により特許異議の申立てがなされ、取消理由が通知され、その指定期間内である平成１０年１月５日に訂正請求がなされたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
ア．訂正の内容
　特許請求の範囲の請求項１に記載の「１〜８７９９ヌクレオチド配列の多重糖タンパク質をコードする遺伝子」を「１〜８７９９ヌクレオチド配列の、複数の糖タンパク質前駆体をコードする遺伝子」と訂正する。
　
イ．訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び拡張・変更の存否
　上記訂正は、「多重糖タンパク質」の技術的に意味するところをより明確にしたものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とするものである。
　そして、複数の糖タンパク質前駆体については、願書に添付した明細書の発明の詳細な説明に「マレック病ヘルペスウイルスＤＮＡの５９６４および７１７２ヌクレオチドの間の糖タンパク質ｇＤプレカーサーをコードし、……………マレック病ヘルペスウイルスＤＮＡの７２８２および８３４６ヌクレオチドの間の糖タンパク質ｇＩプレカーサーをコードし、……………マレック病ヘルペスウイルスＤＮＡの８４８８および９９７８ヌクレオチドの間の糖タンパク質ｇＥプレカーサーをコードし、」（明細書１４頁８行〜２５行）と記載されていることから、上記訂正は、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内においてなされたものである。
  また、上記訂正は、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　
ウ．独立特許要件
　「３．特許異議申立てについて」の「ウ．判断」の項に示すとおり、訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし１４に記載の発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　
エ．むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する同法第１２６条第２ー４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議申立てについて
ア．本件請求項１ないし１４に係る発明
　上記「２．訂正の適否についての判断」で示したように訂正請求が認められるから、本件請求項１ないし１４に係る発明は、訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし１４に記載された事項により特定されるとおりのものと認められるところ、請求項１に係る発明は、次のとおりのものである。
「１．マレック病ヘルペスウイルス（ＭＤＶ）ゲノムのＵｓ領域に存在する遺伝子であって、
　配列番号１により表される８４８８〜９９７８ｂｐ配列の間の、ＭＤＶ糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）前駆体をコードする遺伝子（以下遺伝子１という）、
　配列番号１により表される、１〜８７９９ヌクレオチド配列の、複数の糖タンパク質前駆体をコードする遺伝子（以下遺伝子２という）、
　配列番号１により表される５９６４〜７１７５ｂｐ配列の間の、ＭＤＶ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）前駆体をコードする遺伝子（以下遺伝子３という）、　配列番号１により表される７２８２〜８３４９ｂｐ配列の間の、ＭＤＶ糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）前駆体をコードする遺伝子（以下遺伝子４という）、及び配列番号１により表される８４８８〜８７９９ｂｐ配列の間の、ＭＤＶ糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）前駆体の一部をコードする遺伝子（以下遺伝子５という）
　からなる群より選ばれる上記遺伝子を有することを特徴とする、ＭＤＶゲノムのＤＮＡセグメント。」
（なお、配列番号１に示される塩基配列及びアミノ酸配列は省略する。）
イ．異議申立ての理由の概要
　異議申立人　財団法人　化学及血清療法研究所は、下記の甲第１〜５号証を提出して、
（１）本件請求項１ないし１４に係る発明は、甲第１〜３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである、
（２）本件明細書の発明の詳細な説明の記載に不備があり、本件特許は、同法第３６条第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものである、
旨主張している。
　　　　　　　　　　　　　　　　記
　甲第１号証　Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９，２０３３ー２０４２，１９　　　　　　　８８
　甲第２号証　ＡＤＶＡＮＣＥＳ　ＩＮ　ＭＡＲＥＫ’Ｓ　ＤＩＳＥＡＳＥ　　　　　　　ＲＥＳＥＲＣＨ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
　　　　　　　３ｒｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　　　　　　　ｏｎ　Ｍａｒｅｋ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅ　　　　　　　ｒ　１２ー１６，１９８８，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ：Ａｂ　　　　　　　ｓｔ．３ｒｄ　Ｉｎｔｌ．Ｓｙｍ．Ｍａｒｅｋ’ｓ　Ｄｉｓ　　　　　　　．２１−４２，１９８８
　甲第３号証　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８１，１ー１３，１９８５
　甲第４号証　細胞工学　Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．６，７２６−７３４，
　　　　　　　１９９６
　甲第５号証　「糖鎖工学」株式会社　産業調査会　バイオテクノロジー情　　　　　　　報センター　１９９２年８月１日、１８−１９
　
ウ．判断
　＜２９条２項違反について＞
（請求項１に係る発明）
　甲第１号証は、マレック病ヘルペスウイルス（ＭＤＶ）と七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）のＤＮＡ断片をＭ１３バクテリオファージにクローニングし、塩基配列を決定し、得られた塩基配列から推定されるアミノ酸配列と他のヘルペスウイルスの既知の配列をコンピューター分析法により比較したものであって、そこには、ＭＤＶ及びＨＶＴのゲノム構造は、αあるいはβヘルペスウイルスのそれに類似し、それぞれ倒置末端反復配列に挟まれた長いユニーク領域（ＵＬ）及び短いユニーク領域（Ｕｓ）とによって構成されていること、ＭＤＶとＨＶＴのＵｓ領域に位置する遺伝子は、ＶＺＶおよびＨＳＶのＵｓ領域にも存在していること、ＭＤＶ及びＨＶＴのＵｓ領域にある遺伝子の相対的な位置については未だ同定されていないこと、ＶＺＶおよびＨＳＶは、その他にも多くの糖タンパク質をＵｓ領域にコードしていること、及びＭＤＶとＨＶＴのＵｓ領域には、さらなる糖タンパク質がコードされている可能性が高いことが記載されている。
　また、甲第１号証の図３には、ＨＳＶのＩＥ６８及びプロテイン　キナーゼに相同なＤＮＡ配列が、ＭＤＶのＵｓ領域において同定されたことが示されている。
　しかしながら、甲第１号証には、ＭＤＶのＵｓ領域に特定の遺伝子、即ち糖タンパク質ｇＤ、ｇＩ及びｇＥの前駆体をコードする遺伝子が存在することを教示する記載はない。
　甲第２号証の図１には、ＭＤＶ１及びＨＶＴゲノム上の遺伝子配置の相対的関係を示すマップが記載され、そこには、ＭＤＶ１のＵＬ領域において糖タンパク質ｇＡ及びｇＢをコードする遺伝子が同定されたこと、ＥＸＯ（エキソヌクレアーゼ）、ＭＣＰ（主要カプシドタンパク質）、ｇｐＩＩ（ＶＺＶ‐ｇｐＩＩのホモロジー）、ｇｐＩＩＩ（ＶＺＶ‐ｇｐＩＩＩのホモロジー）、ｐｏｌ（ＤＮＡポリメラーゼ）、及びＲＤ（リボヌクレオチドリダクターゼの大及び小サブユニット）をコードする遺伝子がＭＤＶ１のＵＬ領域に存在することが推定されたこと、ＰＫ（プロテインキナーゼ）をコードする遺伝子がＭＤＶ１のＵｓ領域に存在することが推定されたことが記載されている。
　さらに、甲第２号証の図１には、ＨＶＴのＵｓ領域に対応するＨＳＶゲノム上に糖タンパク質ｇＤ、ｇＥ及びｇＩをコードする遺伝子が存在することが示されている。
　しかしながら、甲第２号証の別の箇所に「ＭＤＶ１及びＨＶＴの遺伝子の順序は、少なくともＵＬ領域においてはＶＺＶ及びＨＳＶ１のそれと本質的に同じである。ＭＤＶ１のＵｓ領域は、ＨＶＴのそれと相同性はないので、これらウイルス間で相同性を示す遺伝子は、Ｕｓ領域においてマップできない。」（３４頁２９行〜３３行）と記載されており、ＭＤＶとＨＶＴのＵｓ領域は相同性がないことが明記されている。
　そうだとすると、甲第２号証に記載の「ＨＶＴのＵｓ領域に対応するＨＳＶゲノム上に糖タンパク質ｇＤ、ｇＥ及びｇＩをコードする遺伝子が存在する」という技術的事項から、直ちに「ＭＤＶ１のＵｓ領域に糖タンパク質ｇＤ、ｇＩ及びｇＥの前駆体をコードする遺伝子が存在する」ということが導き出せないことは明らかであり、甲第２号証は、糖タンパク質ｇＤ、ｇＩ及びｇＥの前駆体をコードする遺伝子がＭＤＶのＵｓ領域に存在することを教示するものではない。
　甲第３号証には、ＨＳＶのＵｓ領域の全ＤＮＡ配列が記載され、さらに糖タンパク質ｇＤ（ＵＳ６）遺伝子が塩基配列番号の第５８１５〜６９９６番目にコードされること、糖タンパク質ｇＥ（ＵＳ８）遺伝子が塩基配列番号の第８６３９〜１０２８８番目にコードされることが記載されているが、ＭＤＶのＵｓ領域に糖タンパク質ｇＤ、ｇＩ及びｇＥの前駆体をコードする遺伝子が存在することを教示する記載は何もない。
　加えて、甲第３号証に記載されているＨＳＶのｇＤ（配列番号第５８１５〜６９９６番）のヌクレオチヂ配列及びｇＥ（配列番号第８６３９〜１０２８８番）のヌクレオチヂ配列は、本件請求項１に係る発明において特定する
ＭＤＶのｇＤ及びｇＥの前駆体とは全く異なるものである。
　
　確かに、異議申立人が指摘するとおり、ＭＤＶのＤＮＡ断片をＭ１３バクテリオファージにクローニングし、塩基配列を決定し、得られた塩基配列から推定されるアミノ酸配列と他のヘルペスウイルスの既知の配列をコンピューター分析法により比較することで、ＭＤＶゲノム上の遺伝子を同定するという実験手法が甲第１号証に記載されているとしても、上述のとおり、甲第１〜３号証には、糖タンパク質ｇＤ、ｇＩ及びｇＥの前駆体をコードする遺伝子がＭＤＶのＵｓ領域に存在することを教示する記載は何もなく、異議申立人の予測とは逆に、甲第２号証に「ＭＤＶ１のＵｓ領域は、ＨＶＴのそれと相同性はない」と明記されており、しかも甲第３号証に記載のＨＳＶのｇＤ及びｇＥのヌクレオチド配列は、本件請求項１に係る発明において特定するＭＤＶのｇＤ及びｇＥの前駆体のそれとは全く異なることを考えると、甲第１〜３号証の記載に基づいて、ＭＤＶのＵｓ領域に存在する糖タンパク質ｇＤ、ｇＩ及びｇＥの前駆体をコードする遺伝子を同定し、これら遺伝子の塩基配列を決定することは当業者において困難である。
　そして、本件請求項１に係る発明は、特許明細書に記載されたとおりの「これらのセグメントは、マレック病ヘルペスウイルスのプロービングに、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）プロモーターの可能性のあるソースとして、ついでこの３種の糖タンパク質抗原を認識する抗体の製造に使用できる糖タンパク質を産生させるための遺伝子発現に、ならびに後二者の遺伝子の場合には、ワクチン製造の目的での、外来遺伝子の挿入可能な部位としてまたＭＤＶフイールド単離体の弱毒化のための遺伝子不活化の可能な部位として有用である。」という効果を奏するものである。
　したがって、本件請求項１に係る発明は、甲第１〜３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるとすることはできない。
　
（請求項２ないし７、及び１０ないし１３に係る発明）
　本件請求項２ないし７、及び１０ないし１３に係る発明は、いずれも請求項１を引用する発明であるから、当該発明は、請求項１に関し記載した上記理由により、甲第１〜３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　
（請求項８、９及び１４に係る発明）
　本件請求項８及び９に係る発明は、請求項１において特定する糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）前駆体をコードする、ＭＤＶゲノムのＵｓ領域に存在する遺伝子を必須の構成要件とする発明であり、また本件請求項１４に係る発明は、請求項１において特定する糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）、Ｉ（ｇＩ）、及びＤ（ｇＤ）前駆体、又は前記Ｄ（ｇＤ）前駆体の一部をコードする、ＭＤＶゲノムのＵｓ領域に存在する遺伝子を必須の構成要件とする発明であるから、当該発明は、請求項１に関し記載した上記理由により、甲第１〜３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　
  ＜３６条４項違反について＞
　異議申立人は、「コンピューター分析法により、ＨＳＶの糖タンパク質ｇＤ、ｇＥ及びｇＩに相当するタンパク質の存在及び糖鎖の付加を推定することはできるが、これらのタンパク質に糖鎖が付加していることを実証するものではない。甲第４号証及び甲第５号証に開示されているように、一般に、糖タンパク質の糖鎖はＡｓｎーＸーＴｈｒ／Ｓｅｒなるアミノ酸配列のＡｓｎに付加していることが知られている。しかしながら、逆に、ＡｓｎーＸーＴｈｒ／Ｓｅｒ」なる配列が存在するからと言って、該配列は、そのＡｓｎ
に必ず糖鎖が付加していることを教示するものではない。」との理由を挙げて、本件請求項１ないし１４に係る発明は、発明の詳細な説明に具体的に
十分に開示されているとはいえない、
旨主張している。
　上記主張について検討すると、本件明細書の発明の詳細な説明には、ＵＳ６（ｇＤ）、ＵＳ７（ｇＩ）及びＵＳ８（ｇＥ）遺伝子について、それぞれのＮ−グリコシレーション部位の位置が具体的に予測されている。（明細書の表３参照）
　一方、本件特許の出願時、ＭＤＶ、ＨＳＶ等のヘルペスウイルスゲノム上に存在する糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードする遺伝子を発現させて、糖タンパック質を得る方法は当業者において周知であった。（必要なら、例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　Ｖｏｌ．８４、ｐｐ．５９０８ー５９１２、Ａｕｇｕｓｔ　１９８７　及びＪ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）、７０、１７８９ー１８０４を参照されたい。）
　このような本件出願時の技術水準を考慮すれば、本件請求項１において特定する糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）、Ｉ（ｇＩ）、及びＤ（ｇＤ）前駆体をコードする遺伝子を発現させ、糖タンパク質であることを確認することは、当業者なら容易に実施できることである。
　そして、このような発現、確認の実験をすれば、本件請求項１に係る上記タンパク質は、本件特許明細書で予測したとおり、糖タンパク質である蓋然性は高いものと認められる。
　したがって、甲第４号証及び甲第５号証の記載内容を参考にするも、異議申立人の上記主張は採用しない。
　
エ．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立ての理由及び提出した証拠方法によっては、本件請求項１ないし１４に係る特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１ないし１４に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年６月１９日（２００１．６．１９）
【訂正の要旨】
　＜訂正の要旨＞
　特許請求の範囲の請求項１に記載の「１〜８７９９ヌクレオチド配列の多重糖タンパク質をコードする遺伝子」を「１〜８７９９ヌクレオチド配列の、複数の糖タンパク質前駆体をコードする遺伝子」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
糖タンパク質、ｇＤ、ｇＩおよびｇＥをコードするマレック病ヘルペスウイルスＤＮＡセグメント
【発明の詳細な説明】
　
関連出願の引照
　この出願は、１９９０年８月２４日出願の米国特許出願連続番号第０７／５７２，７１１号の一部継続出願である。
　
発明の背景
　（１）
発明の分野
　本発明は、マレック病ヘルペスウイルスゲノムの、糖タンパク質ｇＤ、ｇＩおよびｇＥをコードするその短いユニーク（ＵＳ）領域からのセグメントならびにそれらから産生される新規な糖タンパク質に関する。とくに本発明は、これらの糖タンパク質抗原をコードする遺伝子、および各遺伝子の４００ヌクレオチド５′までのプロモーターの可能性がある配列を含有するＤＮＡセグメントに関し、これらのセグメントは、マレック病ヘルペスウイルスのプロービングに、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）プロモーターの可能性のあるソースとして、ついでこの３種の糖タンパク質抗原を認識する抗体の製造に使用できる糖タンパク質を産生させるための遺伝子発現に、ならびに後二者の遺伝子の場合には、ワクチン製造の目的での、外来遺伝子の挿入可能な部位としてまたＭＤＶフィールド単離体の弱毒化のための遺伝子不活化の可能な部位として有用である。
　（２）
先行技術
　ＭＤＶは、Ｔ細胞リンパ種および末梢神経脱髄を生じることが知られているニワトリの腫瘍ヘルペスウイルスである。発症する疾患、マレック病（ＭＤ）は、抗原的には類似するが非病原性の七面鳥のヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、またはＭＤＶの弱毒化フィールド単離体を用いたワクチン接種によって効果的に制御された最初の自然発症リンパ腫疾患であった。
　類似の生物学的性質、とくにそのリンパ球向性により、ＭＤＶはガンマヘルペスウイルス亜科の一員として分類されてきた（Ｒｏｉｚｍａｎ，Ｂ　ら，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６：２０１−２１７，１９８１）。３つのヘルペスウイルス亜科の中で、ガンマヘルペスウイルスは、ゲノムの組成および編成に関してとくに著しい差を示す。たとえば、ヒトのＢリンパ球向性エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）は、Ｇ＋Ｃ含量６０％の１７２．３ｋｂｐ　ゲノムを有し、末端０．５ｋｂｐ　直接反復配列に結合し、特徴的な一群の内部３．０７ｋｂｐ　縦列反復配列を含有する〔Ｂａｅｒ，Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１０：２０７−２１１，１９８４〕。ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＶＳ）、すなわちニューワールドモンキーおよびより低級な脊椎動物のＴリンパ球向性ヘルペスウイルスは大規模な内部重剰性はない、Ａ＋Ｔに富んだコード配列（１１２ｋｂｐ　；３６％Ｇ＋Ｃ；すなわちＬ−ＤＮＡ）をもつが、その代わりゲノムの末端に７１％Ｇ＋Ｃの１．４４ｋｂｐ　配列の３０を越える反復（Ｈ−ＤＮＡ）を含有する（Ｂａｎｋｅｒ，Ａ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５５：１３３−１３９，１９８５）。ＥＢＶとＨＶＳの間の構造的な差にもかかわらず、これらの２つのウイルスのゲノムは血清学的に類似のタンパク質をコードし、たとえば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）および帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）のような神経向性アルファヘルペスウイルスの場合とは異なる共通のコード配列編成を有する
（Ｃａｍｅｒｉｏｎ，Ｋ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：２０６３−２０７０，１９８７；
Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１０６７−１０７９，１９８７；
Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９７−６１１，１９８６；
Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１７５９−１８１６，１９８６；
Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１９２７−１９４２，１９８３；
Ｇｏｍｐｅｌｓ，Ｕ．Ａ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：７５７−７６７，１９８８；およびＮｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３２５０−３２５７，１９８８）。
　他のガンマヘルペスウイルスとは異なり、ＭＤＶはアルファヘルペスウイルスの場合に極めて類似したゲノム構造を有する（Ｃｅｂｒｉａｎ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：５５５−５５８，１９８２；および　Ｆｕｋｕｃｈｉ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：１０２−１０９，１９８４）。後者の亜科のメンバーは、共有結合で連結した長い（Ｌ）セグメントと短い（Ｓ）セグメントから構成される類似のゲノム構造を有する。各セグメントは、ユニークな（Ｕ）セグメント〔ＵＬ，ＵＳ）からなり、これらは一対の（末端および内部）逆方向反復領域（それぞれＴＲＬ，ＩＲＬ；ＴＲＳ）に隣接している。アルファヘルペスウイルスには、ヒトＨＳＶおよびＶＺＶ、ブタ仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、ならびにウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）が包含される。ＭＤＶはそのＵＬ領域に隣接した広範囲の反復配列を含有するので、そのゲノム構造はＨＳＶのそれにとくによく似ている（Ｃｅｂｒｉａｎ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：５５５−５５８，１９８２；およびＦｕｋｕｃｈｉ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：１０２−１０９，１９８４）。
　最近の研究（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒ，Ａ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２０３３−２０４２，１９８８）では、この２種のガンマヘルペスウイルスＭＤＶおよびＨＶＴは、ガンマヘルペスウイルスのＥＢＶよりも、アルファヘルペスウイルスＶＺＶおよびＨＳＶに高い類似性をもつと思われることが示されている。これは、無作為に単離された多数のＭＤＶとＨＶＴクローンについての予測されるアミノ酸レベルでの比較に基づいたものであるが、単に個別の配列がガンマヘルペスウイルス遺伝子よりもアルファヘルペスウイルス遺伝子に対して高い関連性を示したというのみではなく、この２種のウイルスゲノムは少なくともその長いユニーク（ＵＬ）領域に関して、ＶＺＶと一般的に共直線性であることが見出された。ＵＬ遺伝子のこのような共直線性は、他のアルファヘルペスウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＥＨＶ−１、およびＰＲＶにも及ぶことが、配列分析（ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１−１５７４，１９８８）およびＤＮＡハイブリダイゼーション実験（Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１９２７−１９４２，１９８３）の両者によって証明された。これらのＵＬ遺伝子の多くは、ベータおよびガンマヘルペスウイルスを含む他のヘルペスウイルスにも共通している（Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１０６７−１０７９，１９８７）。このような遺伝子の編成と類似から、共通の祖先からのヘルペスウイルスの分岐進化を説明する大規模な再配列が過去に起こったことが示唆される。しかし残念ながらこのような仮説では、アルファヘルペスウイルス亜科のメンバーに特有に認められるアルファヘルペスウイルスのＳ成分（短いユニーク領域、ＵＳ、および関連の短い逆方向／末端反復領域、ＩＲＳ、ＴＲＳ）遺伝子の存在を説明することはできない（Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１０６７−１０７９，１９８７；Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９７−６１１，１９８６；およびＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｉｏｌ．１８１：１−１３，１９８５）。
　ＭＤＶ株ＲＢＩＢのＵＳ領域に存在する５．５ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩフラグメントにおけるの遺伝子のＤＮＡ配列および編成が、Ｒｏｓｓ，Ｂｉｎｎｓ　およびＰａｓｔｏｒｅｃｋ（Ｒｏｓｓ，Ｌ．Ｊ．Ｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４９−９５４，１９９１）によって報告された。予測された４つのポリペプチドの性質および進化的関係についても記載されている（Ｒｏｓｓ，Ｌ．Ｊ．Ｎ．＆　Ｂｉｎｎｓ，Ｍ．Ｍ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９３９−９４７，１９９１）。そのフラグメント中に、彼らは、ＨＳＶのＵＳ２，ＵＳ３，ＵＳ６（ｇＤ）およびＵＳ７（ｇＩ）のホモローダ、ならびにＭＤＶ特異的遺伝子を見出した。後者については、遺伝子の部分しか存在しなかった。これらの報告は、ＭＤＶにおける４つのＵＳ遺伝子の存在と、上述の進化的関係を確認するものである。ＵＳ８（ｇＥ）、またはＵＳ２の左側の遺伝子についての証明は記載されていないことに注目することが重要である。
　ベータおよびガンマヘルペスウイルスと比較したその独特性に加えて、アルファヘルペスウイルスＵＳ領域は、その亜科内でのその含量および遺伝子編成における著しい差異により、とくに興味がある（たとえば、ＨＳＶ−１のＵＳ＝１３．０ｋｂｐ　、１２遺伝子、ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８１：１−１３，１９８５；ＶＺＶのＵＳ＝５．２ｋｂｐ　、４遺伝子、Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１７５９−１８１６，１９８６）。ＨＳＶ−１の場合、１２のＵＳ遺伝子中１１が、細胞培養において複製にはなくてもよいことが明らかにされている（Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒ，Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４３０３−４３０７，１９８７）。これはこれらの遺伝子の病原性および／または潜伏性における関与の可能性を示唆している（Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒ，Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：４３０３−４３０７，１９８７；Ｍｅｉｇｎｉｅｒ，Ｂ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６２：２５１−２５４，１９８８；およびＷｅｂｅｒ，Ｐ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３６：５７６−５７９，１９８７）。Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒらの報告（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒ，Ａ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：　２０３３−２０４２，１９８８）では、ＨＳＶの即時初期タンパク質α２２（ＵＳ１）およびセリン−スレオニンプロテインキナーゼ（ＵＳ３）に相同の部分ＭＤＶ配列の同定を除いて、ＭＤＶのＳ成分のホモローグの含量、局在および編成については決定されていない。しかも、少なくとも４つのＨＳＶのＵＳ糖タンパク質遺伝子の存在にもかかわらず（ＶＺＶでは２つ）、このようなホモローグは同定されなかった。
　本発明者らの一人、Ｌｅｌａｎｄ　Ｆ．Ｖｅｌｉｃｅｒが関与した　１９８８年８月５日出願の出願連続番号０７／２２９，０１１号では、糖タンパク質Ｂ抗原複合体（ｇｐ１００，ｇｐ６０，ｇｐ４９）をコードする遺伝子を含有すると考えられるマレック病ヘルペスウイルスＤＮＡセグメントが同定されているが、配列は決定されていない。抗原Ｂは、少なくとも部分保護免疫を誘発できるので重要な糖タンパク質複合体であり、したがってＭＤＶのＤＮＡセグメントは、プローブに、その遺伝子の５′調整領域におけるプロモーターの可能性あるソースとして、ついで糖タンパク質抗原を認識する抗体の製造に使用できる糖タンパク質を産生させるための遺伝子の発現に使用できる。しかしながら、本発明の糖タンパク質については何の考察もなかった。これらのＢ抗原糖タンパク質はＵＳ領域によってはコードされていない。すなわちＭＤＶゲノムの異なる領域からのものである。
　Ｌｅｌａｎｄ　Ｆ．Ｖｅｌｉｃｅｒによる１９８７年５月１７日出願の出願連続番号０７／５２６，７９０号には、糖タンパク質Ａ抗原（ｇｐ５７〜６５）をコードする遺伝子を含有するＭＤＶヘルペスウイルスＤＮＡセグメントが記載されているが、配列は決定されていない。このＭＤＶのＤＮＡセグメントは、プローブとして、その遺伝子の５′調整領域におけるプロモーターの可能性あるソースとして、また上述の場合の配列による抗体の製造に有用である。このＤＮＡはまた、抗原Ａが現在は、細胞培養における複製に必須ではない遺伝子、ＨＳＶｇＣのホモローグであることが知られているので、重要である。その性質がＭＤＶホモローグにも適用される可能性が極めて高いので、それは外来遺伝子の挿入の部位として有用と考えられる。しかしながら、本発明の糖タンパク質については何の考察もなかった。この糖タンパク質もＵＳ領域によってはコードされていない。すなわちＭＤＶゲノムの異なる領域からのものである。
　他の糖タンパク質はマレック病ヘルペスウイルスゲノムによってコードされる。Ｌｅｌａｎｄ　Ｆ．Ｖｅｌｉｃｅｒ　らによる１９９０年８月２４日出願の出願連続番号０７／５７２，７１１号には、ＭＤＶのｇＤ、ｇＩおよび部分ｇＥの糖タンパク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡが、ＭＤＶの完全ｇＤおよびｇＩ遺伝子ならびに部分ｇＥ（それぞれ、ＨＳＶ遺伝子のＵＳ６，ＵＳ７，ＵＳ８のＭＤＶホモローグ）のヌクレオチド配列とともに記載されている。このＭＤＶのＤＮＡセグメントは、プローブとして、その遺伝子の５′調整領域におけるプロモーターの可能性あるソースとして、また上述の場合の配列による抗体の製造に有用である。本発明はとくに、糖タンパク質ｇＥをコードする完全遺伝子（ＵＳ８）を目指すものである。
　
目的
　本発明の目的は、糖タンパク質ｇＤ、ｇＩおよびｇＥを一緒にまたは個別にコードする配列決定ＤＮＡを提供することにある。さらに、本発明の目的は、これらの糖タンパク質抗原をコードし、各遺伝子の４００ヌクレオチド５′までのプロモーターの可能性がある配列を含むＤＮＡセグメントを提供することにある。これらのセグメントは、ＤＮＡプローブとして、ＭＤＶプロモーターの可能性あるソースとして、これらの抗原を認識する抗体の製造に、ならびに後二者の糖タンパク質の場合には、ワクチン製造の目的でのＭＤＶフィールド単離体の弱毒化のための、外来遺伝子の挿入部位としてまた遺伝子不活化の可能な部位として、有用である。これらの目的および他の目的は、以下の説明および図面を参照すれば、さらに明白になろう。
　
図面の説明
　図１Ａ〜Ｃは、遺伝子地図ロケーション、配列決定方法およびＭＤＶオープンリーディングフレーム読取り枠（ＯＲＦ）の編成を示す。
　図１Ａは、配列が決定された領域の概略を示すＭＤＶゲノム構造および制限酵素地図を包含する。
　図１Ｂは、遺伝子地図ロケーションと配列決定方法を包含する。ボックスは、ＤＮＡ配列決定のＭ１３ｍｐ１８および１９鋳型を発生させるために用いられたＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩまたはＳａｌＩ結合挿入体でのプラスミドクローンを示す。右方向および左方向の矢印は、それぞれ上部および下部の鎖から誘導される配列を示す。制限酵素部位は、Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、Ｎｃ＝ＮｃｏＩ、Ｎｓ＝ＮｓｉＩ、Ｓ＝ＳａｌＩ、およびＰ＝ＰｓｔＩで示す。ランダムライブラリー（Ｓａｕ３Ａ、ＴａｑＩ、ＲｓａＩ）、特異的クローン化制限フラグメント、Ｂａｌ　３１−消化ライブラリーからまたは合成的に誘導されたヌクレオチドを用いて誘導された配列は、それぞれａ、ｂ、ｃ、およびｄで示す。
　図１Ｃには、ＭＤＶのＵＳのＯＲＦの編成を包含する。番号はＨＳＶ−１ＵＳのＯＲＦの命名（ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８１：１−１３，１９８５）との関連に基づくホモローグを指示する。ボックスは、ＭＤＶのＯＲＦのロケーションを示す。矢印は転写／翻訳の方向を示す。ＯＲＦの名称は上記ボックスの上に表示する。上部および下部鎖上のポリアデニル化シグナルの可能性はそれぞれＡＡＴＡＡＡおよびＡＡＡＴＡＡで強調する。ＳＯＲＦ１およびＳＯＲＦ２はＭＤＶ特異的Ｓ成分ＯＲＦに任意の名称を付したものである。
　図２には、ヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を示す。ヌクレオチド配列は右方向に５′から３′への鎖としてのみ示す（番号１〜１０３５０）。右および左方向への予測されるアミノ酸配列は、それぞれ相当するヌクレオチド配列の上部および下部に一文字コードで示す。各ＯＲＦの名称は、そのアミノ酸配列の第１行の左側に示す。アミノ酸配列には、Ｎ末端の最初のＭ（三文字コード）（ＤＮＡではＡＴＧ）から、終結コドン（＊で表示）に先立つＣ末端の最後のアミノ酸まで番号を示す。ＡＴＧの４００ヌクレオチド内に位置する、可能性のあるＴＡＴＡコンセンサス部位には下線を付し、Ｃｏｒｄｅｎら（Ｃｏｒｄｅｎ，Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０９：１４０６−１４１４，１９８０）によって定義されたＴＡＴＡ（ＡＴ）Ａ（ＡＴ）コンセンサス配列に７個中少なくとも６個のマッチを含有する部位と定義される。７ヌクレオチドを越える下線は、重複ＴＡＴＡコンセンサス部位を含む領域を示す。
　図３Ａは、最大のアミノ酸保存性を示す選ばれた領域についてのＳ成分ホモローグのアラインメントを示す。ギャップは方法の項に記載するように、同一のアミノ酸のアラインメントが最大になるように導入した。コンセンサス配列（ｃｏｎｓ）は、１種を除くすべてのウイルスで少なくとも共有される残基を指し、大文字で示される。３以上の配列間のアラインメントにおいては、星印（＊）はすべてのウイルスで保存されている残基を指す。相当するアラインメント領域のアミノ酸番号（５′−ＡＴＧに関して）は各配列の前後に掲げる。
　図３Ｂは、選ばれたＭＤＶ−アルファヘルペスウイルスＳセグメント類似体間の全体的ホモロジーを指示するドットマトリックス分析を示す。スライドさせる窓の長さ３０の中で少なくとも１５のアミノ酸が同一または類似の場合に点を発生させた。生じた斜線は保存性の大きい領域を例示する。相当する配列のアミノ酸番号（５′−ＡＴＧに関して）は各プロットの上部および右部に表示する。
　図４は、得られたＳ成分ＯＲＦの全ゲノム編成の比較である（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，Ｊ．−Ｃ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２９６９−２９７８，１９９０；ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１９−３８，１９８７；Ｔｉｋｏｏ，Ｓ．Ｋ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５１３２−５１４２，１９９０；Ｖａｎ　Ｚｉｊｉ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１７４７−１７５５，１９９０；Ｚｈａｎｇ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２４３３−２４４１，１９９０；Ｃｕｌｌｉ−ｎａｎｅ，Ａ．Ａ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５７５−１５９０，１９８８；Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１７５９−１８１６，１９８６；ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８１：１−１３，１９８５；Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ，Ｅ．Ａ．ら，Ｖｉｒｉｌｏｇｙ１５９：１９３−１９５，１９８７；Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ，Ｅ．Ａ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０：１８５−１９３，１９８６；および　Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ，Ｅ．Ａ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５９：２１６−２２３，１９８６参照）。各ＯＲＦ上の番号はＨＳＶ−１ＵＳのＯＲＦの命名（ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８１：１−１３，１９８５）との関連に基づくホモローグを指示する。各システムに共通な別のポリペプチドの名称を、該当する場合は、ＯＲＦの下部に掲げる。大なりおよび小なりの記号はそれぞれ、右方向および左方向のＯＲＦを示す。矢印は、同定されたＩＲＳ−ＵＳおよび／またはＵＳ−ＴＲＳ接合部位を示す。
　図５は、１９９０年８月２４日提出の出願に包含される、糖タンパク質ｇＩ、およびｇＥの部分をコードするマレック病ヘルペスウイルスＤＮＡの完全なセグメントの製造に必要な工程の順序を示す。
　
一般的説明
　本発明は、多重糖タンパク質をコードし、各遺伝子の４００ヌクレオチド５′までのプロモーターの可能性がある、図２に示す１〜１０３５０の間の配列（ＳＥＱ　ＮＯ．：１の部分として同定）を含有する、マレック病ヘルペスウイルスゲノムのＤＮＡのセグメントに関する。
　さらに、本発明は、糖タンパク質Ｄプレカーサーをコードするマレック病ヘルペスウイルスゲノムのＥｃｏＲＩセグメント、およびそのＤＮＡを認識するサブセグメントに関する。
　さらにまた本発明は、マレック病ヘルペスウイルスＤＮＡの５９６４および７１７２ヌクレオチドの間の糖タンパク質ｇＤプレカーサーをコードし、各遺伝子の４００ヌクレオチド５′までのプロモーターの可能性がある、図２に示す配列（ＳＥＱ　ＮＯ．：１の部分として同定）を含有するＤＮＡのセグメント、およびそのＤＮＡを認識するＤＮＡのセグメントのサブセグメントに関する。
　本発明はまた、マレック病ヘルペスウイルスＤＮＡの７２８２および８３４６ヌクレオチドの間の糖タンパク質ｇＩプレカーサーをコードし、各遺伝子の４００ヌクレオチド５′までのプロモーターの可能性がある、図２に示す配列（ＳＥＱ　ＮＯ．：１の部分として同定）を含有するＤＮＡのセグメント、およびそのＤＮＡを認識するセグメントのサブセグメントに関する。
　本発明はまた、マレック病ヘルペスウイルスＤＮＡの８４８８および９９７８ヌクレオチドの間の糖タンパク質ｇＥプレカーサーをコードし、各遺伝子の４００ヌクレオチド５′までのプロモーターの可能性がある、図２に示す配列（ＳＥＱ　ＮＯ．：１の部分として同定）を含有するＤＮＡのセグメント、ならびにそのＤＮＡを認識するＤＮＡのサブセグメントに関する。
　さらに本発明は、それらのＭＤＶセグメントにおける遺伝子の発現によって産生される新規な糖タンパク質のプレカーサーに関する。
　さらに本発明は、ＭＤＶ遺伝子の各コード配列の４００ヌクレオチド５′までに位置する、ＭＤＶ遺伝子の可能性あるプロモーターに関する。
　
特定の説明
　本発明は、ＭＤＶのＵＳ領域の大部分を包含する１０．３５ｋｂｐ　範囲の配列分析を示すものである。３つの糖タンパク質遺伝子およびさらに２つのＭＤＶ特異的オープンリーディングフレームを含む全部で７つのＭＤＶのＵＳホモローグが同定された。
　例１
　
材料および方法
　
組換えプラスミド、Ｍ１３のサブクローニングおよびＤＮＡ配列決定
　病原性ＧＡ株の、ＭＤＶのＥｃｏＲ１−ＯおよびＥｃｏＲ１−Ｉは以前にｐＢＲ　３２８にクローン化され（Ｇｉｂｂｓ，Ｃ．Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：３３６５−３３６９，１９８４；Ｓｉｌｖａ，Ｒ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５４：６９０−６９６，１９８５）、これらのクローンが維持されているＵＳＤＡ　Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｌａｂ，Ｅａｓｔ　Ｌａｎｓｉｎｇ，ＭＩのＲ．Ｆ．Ｓｉｌｖａ　から入手した。ＧＡ株　ＢａｍＨＩ−ＡおよびＢａｍＨＩ−Ｐ１は以前にそれぞれ　ｐＡＣＹＣ　１８４およびｐＢＲ　３２２にクローン化され（Ｆｕｋｕｃｈｉ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：１０２−１０９，１９８４），Ｓｈｏｗａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ．ＦＬ　のＭ．Ｎｏｎｏｙａｍａ　によって恵与された。上記ＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１フラグメントの右方に分析を広げるためには、ＢａｍＨＩ−Ａ、−Ｐ１、ならびにさらに５′および３′隣接配列を含む、ＧＡ株クローンＧＡ−０２、部分消化ＭＤＶのＳａｌＩ挿入体含有ＥＭＢＬ−３クローン（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ　Ｉｎｔｌ．Ｂ．Ｖ．，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ　のＰ．Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｅｒ　により恵与された）を使用した。このファージクローンを用いて、３′ＢａｍＨＩ−Ｐ１隣接領域を含む小さなＳａｌＩ−結合挿入体（ｐＳＰ　１８−Ａ，ｐＳＰ　１８−Ｂ，およびｐＳＰ　１８−Ｃ）をもつｐＵＣ　１８サブクローンを発生させた。これらのクローン（図１Ｂ）を用いて、ヌクレオチド配列決定のための鋳型として使用するＭ１３ｍｐ１８および−１９を発生させた。小規模および大規模なプラスミドの製造はアルカリ分解法を用いて行った（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８２）。
　配列決定のための鋳型として使用するＭ１３ｍＰ１８およびＭ１３ｍＰ１９ファージサブクローンは、制限酵素地図作成によって決定された特異的制限サブフラグメントの使用により、またはＭ１３ＲＦのＤＮＡの唯一のＢａｍＨＩ、ＡｃｃＩまたはＳｍａＩ部位にそれぞれリゲートしたＳＡＵ３Ａ、ＴａｑＩまたはＲｓａＩ消化ウイルスＤＮＡプールの使用により発生させた。場合によっては、ＥｃｏＲｌ−Ｏ中ＡｃｃＩ、ＮａｅＩまたはＮｓｉＩ制限部位から、段階的Ｂａｌ３１消化により、重複Ｍ１３欠失クローンが　Ｐｏｎｃｚ　らの方法（Ｐｏｎｃｚ，Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：４２９８−４３０２，１９８２）で得られた。制限酵素消化、ゲル電気泳動、アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの精製、リゲーション、およびクレノーフラグメントによる５′オーバーハングの充嗔には、標準方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８２）を使用した。
　リゲートしたＭ１３生成物をＣａＣｌ２コンピーテントＪＭ１０７宿主細胞にトランスホームし、１０リットルの　１００ｍＭ　ＩＰＴＧ，５０リットルの２％Ｘ　−ｇａｌおよび２００リットルの新鮮な一夜ＪＭ１０１培養体を含む溶融Ｂトップアガールに加えた。これらの内容物をついで、Ｂアガールプレート上にプレーティングし、３７℃で一夜インキュベートした。ついで、組換え（透明）プラークを用いて、一夜ＪＭ１０１培養体で１：５０に希釈したＹＴメジウム５ｍｌに感染させ、３７℃で６時間回転培養した。生成した細胞を室温で５時間遠心分離してペレット化し、上澄液を除去し、４℃で保存して、各組換えクローンのウイルス株が維持された。
　回収された上澄液を使用して、ジデオキシ−連鎖伸長停止法によるＤＮＡ配列決定用の鋳型として使用する一本鎖Ｍ１３ファージＤＮＡを、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　によって提供されたＭ１３クローニング／ジデオキシ配列決定指導マニュアルの指示に従って単離した。組換えＭ１３ファージはさらに、電気泳動精製一本鎖ウイルスＤＮＡにより、１％アガロースミニゲル上でスクリーニングし、一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８対照ＤＮＡと比較して移動性の低下を示す鋳型を選択した。
　一本鎖Ｍ１３鋳型でのＤＮＡ配列決定は、ジデオキシ−連鎖伸長停止法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４：５４６３−５４６７，１９７７）により、改良Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を用いて実施された。配列決定方法の要約は図１Ｂに包含されている。ＤＮＡ配列決定反応には、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ配列決定キットに示された特定の逐次指示方法が使用された。略述すれば、一本鎖Ｍ１３鋳型をまず万能Ｍ１３合成オリゴヌクレオチドプライマーと６５℃で２分間インキュベートし、ついでインキュベーション温度が３０℃以下になるまで徐々に冷却して、アニーリングした。デオキシおよびジデオキシヌクレオチド三リン酸（それぞれ　ｄＮＴＰ　および　ｄｄＮＴＰ）の適当な混合物、放射標識デオキシアデノシン５′−（α−チオ）三リン酸（３５Ｓ−　ｄＡＴＰ，１０００〜１５００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＮＥＮ−ＤｕＰｏｎｔ）およびＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ酵素の添加後、アニーリングされたプライマーから放射標識相補性鎖の合成を開始させた。４つの別個の合成反応は、それぞれ各試験管ごとに使用した特定のｄｄＮＴＰ（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ）の導入によって停止させた。反応生成物を、７％ポリアクリルアミドゲル／５０％尿素／トリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡゲルに通して電気泳動に付し、標識鎖をオートラジオグラフィーによって可視化した。両鎖について少なくとも１回の配列決定を行った。これは、以前に決定した配列に基づき万能プライマーに置換して発生させた１６の合成１７−マーオリゴヌクレオチドを上記と同じ反応条件下、Ｓｔｒａｕｓｓ　によって記載された一般的アプローチ（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｅ．Ｃ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５４：３５３−３６０，１９８６）に従って使用することで促進された。
　
配列データの解析
　配列は、ＩＢＩ　／Ｐｕｓｔｅｌｌ（Ｐｕｓｔｅｌｌ　，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：４７９−４８８，１９８６）および　Ｇｅｎｅｐｒｏ（バージョン４．１０；Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）配列解析ソフトウエアパッケージを用いてＩＢＭ　パーソナルシステム２／モデル５０マイクロコンピューターで、またはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ　大学遺伝学コンピューターグループから入手したプログラム（ＧＣＧ　；Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５，１９８４）をＶＡＸ　８６５０ミニコンピューターで走らせて、集合させ解析した。Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＢＲＦ−Ｐｒｏｔｅｉｎ，公開２１．０，６／８９のデータベースの検索はＧＣＧ　プログラムＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４−２４４８；１９８３）によって行った。これは、アラインメントと、その結果得られる至適化スコアを導くために、（１）類似性の領域を捜し出すための、ＷｉｌｂｕｒとＬｉｐｍａｎのアルゴリズムの改変（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：７２６−７３０，１９８３）、（２）ＰＡＭ　２５０べ一ススコアリングシステム（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら，３４５−３５２頁，Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃ−ｔｕｒｅ，第５巻，補遺３，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．編，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９７８）および（３）Ｓｍｉｔｈ　とＷａｔｅｒｍａｎのアラインメント操作（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．ら，Ａｄｖ．ＡＰＰｌ．Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ　２：４８２−４８９，１９８１）を、可能な場合には結合して、使用するものである。ドットマトリックスホモロジープロットは、ＧＣＧ　プログラムＤＯＴＰＬＯＴ　とＧＣＧ　のＣＯＭＰＡ−ＲＥからの出力ファイルを用いて発生させた。後者は、窓長３０、基準１５（この場合、保存アミノ酸置換はプラスに評価した）で、２つの予測アミノ酸配列の類似性の点数のファイルを作成する。ＧＣＧ　プログラムＧＡＰ　により、特定のアミノ酸配列のアラインメントを、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　とＷｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：　４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムを用いて行い、マッチ数を最大にするようにギャップを挿入したのちに、同一および類似アミノ酸残基のパーセントを求めた。ＧＡＰ　を用いて多数のアラインメントを作成するためには、ギャップを設けたＭＤＶ配列の出力ファイルを、ＭＤＶ配列とその相同性配列の間の連続的なＧＡＰ　比較後に作成した（ホモロジーの高い順に）。これらの出力ファイルを、次のＧＡＰ　試行の入力配列とし、これらのギャップを挿入した配列のアラインメントが新しいギャップの添加によってもはや拡大しなくなるまで、使用した。アラインメント後に、ギャップを加えた出力ファイルを表示させ、ＧＣＧ　プログラムＰＲＥＴＴＹを用いてコンセンサス配列を計算した。至適な結果を達成するためには、場合によっては、マニュアル編集を使用した（ＧＣＧ　　のＬＩＮＥＵＰを使用）。
　
結果
　呈示した１０，３５０ヌクレオチドＤＮＡ配列（図２）は、ＭＤＶ（ＧＡ）ゲノムの短いユニーク（ＵＳ）領域の大部分を包含するものと思われる。配列決定方法の要約は、材料および方法の項に包含させ、図１Ｂに描写されている。この配列は、ＵＳフラグメント、ＥｃｏＲ１−Ｏ、ＥｃｏＲ１−Ｉにまたがり、ＢａｍＨＩ−Ｐ１の３′末端の１．５５ｋｂｐ　下流のＳａｌＩ部位にまで及んでいる（図１Ａおよび１Ｂ）。Ｆｕｋｕｃｈｉ　ら（Ｆｕｋｕｃｈｉ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：１０２−１０９，１９８４）は以前に、ＢａｍＨＩ−Ａの５つのＥｃｏＲ１サブフラグメントの第二番目に位置する１．４ｋｂ　ＢｇｌＩフラグメントにＩＲＳ−ＵＳ接合部を認めた（図１Ｂ）。したがって、上記ＩＲＳ−ＵＳ接合部の局在が独立に確認できるとすれば、ここに呈示された配列は、５′近位ＵＳ領域の２．６〜　４．０ｋｂの間を欠いているはずである。配列決定された領域は、ＢａｍＨＩ−Ｐｌの下流に十分な距離及んでいないので、ＭＤＶのＵＳ−ＴＲＳ接合部はまだ正確に決定されていない（Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１７５９−１８１６，１９８６）。ＶＺＶ、ＥＨＶ−４およびＨＳＶ−１については、この境界はそれぞれ各ＵＳ８ホモローグの終結コドンの約１００ｂｐ上流、または１．１および２．７ｋｂ下流に位置する（Ｃｕｌｌｉｎａｎｅ，Ａ．Ａ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５７５−１５９０，１９８８；Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１７５９−１８１６，１９８６およびＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１−１５７４，１９８８）。配列決定された領域の総Ｇ＋Ｃ含量は４１％であることが明らかにされ、ゲノムＭＤＶのＧ＋Ｃ値の４６％よりも幾分低値であった（Ｌｅｅ，Ｌ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７：２８９，１９７１）。全配列、またはコード領域のみにおける、ＣｐＧ　ジヌクレオチドの観察される頻度は、それらのモノヌクレオチド組成から期待される頻度と有為な差は示さなかった（データは示していない）。この結果は、アルファヘルペスウイルスから得られた結果に一致するが、Ａ＋Ｔに富んだＨＶＳおよびＧ＋Ｃに富んだＥＢＶのような、いずれもＣｐＧ　ジヌクレオチド欠損ガンマヘルペスウイルスとは異なっている（Ｈｏｎｅｓｓ，Ｒ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８３７−８５５，１９８９）。
　配列決定された領域は、タンパク質をコードしていると思われる９つの完全なＯＲＦを含有する（図１Ｃ、名称の基礎は以下に示す）。この予測は、（１）他のアルファヘルペスウイルス遺伝子とのホモロジーおよび配置編成の比較、（２）可能性のあるＴＡＴＡおよびポリアデニル化コンセンサス配列の存在（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ，Ｍ．Ｌ．ら，Ｃｅｌｌ　４１：３４９−３５９，１９８５；およびＣｏｄｅｎ，Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０９：１４０６−１４１４，１９８７）ならびに（３）翻訳開始に好ましい状況の所持（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０８：２２９−２４１，１９８９）を基盤とした。この同定にはさらに、ＨＳＶおよびＶＺＶのようなアルファヘルペスウイルスが比較的密に充填され、継ぎ目のない、一般に重複のないコード領域を含む傾向をもつとの観察を基準にした（Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１７５９−１８１６，１９８６；Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１７５９−１８１６，１９８６；ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１−１５７４，１９８８；ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８１：１−１３，１９８５；およびＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１９−３８，１９８７）。このような遺伝子とくにＵＳ領域の遺伝子は、ポリアデニル化シグナルを共有することが多く、そのため３′−共終結　ｍＲＮＡファミリーを生じる（Ｒｉｘｏｎ，Ｆ．Ｊ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１３：９５３−９７３，１９８５）。ＭＤＶ由来のコドン頻度表の使用（これらのおよび以前に公表されたＭＤＶ配列を使用、Ｂｉｎｎｓ，Ｍ．Ｍ．ら，Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．１２：３７１−３８２，１９８９；（Ｒｏｓｓ，Ｌ．Ｊ．Ｎ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１７８９−１８０４，１９８９；およびＳｃｏｔｔ，Ｓ．Ｄ．ら，Ｊ．Ｇｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３０５５−３０６５，１９８９）または構成の偏りの解析の使用（ＧＣＧ　プログラムＣＯＤＯＮ−ＰＲＥＦＥＲＥＮＣＥおよびＴＥＳＴＣＯＤＥを使用）に基づくタンパク質コード領域の検出方法は大部分決定的ではなく、ＭＤＶは、そのモノヌクレオチド組成に基づく予測に比較して、比較的に低いコドンおよび組成の偏りしかもたないことが示唆された。しかしながら、ＧＣＧ　プログラムＦＲＡＭＥＳを上記ＭＤＶ由来のコドン頻度表とともに使用すると、９つの同定されたＯＲＦは明らかに、希なコドン利用の有意に低いパターンを示し、これは他のすべての可能性ある翻訳可能領域に認められるパターンと著しく対照的である（データは示していない）。
　予測されたＯＲＦの予測されるアミノ酸配列（最初のＡＴＧコドンに始まる）をそのヌクレオチドと対比して図２に示す。開始コドンから４００ヌクレオチドの範囲内の、可能性あるＴＡＴＡ部位には下線を付してある。提案されたＯＲＦおよび可能性のあるポリアデニル化シグナル位置、−３、＋４ＡＴＧ関連ヌクレオチド（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０８：２２９−２４１，１９８９）、ならびに予測される生成物の長さ、相対分子量および予測される等電点を表１に示す。
　ＭＤＶデータの要約を、ＯＲＦの配置、予測される使用ポリアデニル化シグナル、翻訳関連ヌクレオチド、予測される翻訳生成物の長さ、相対分子量および予測される等電点とともに表１に示す。
　これらのＭＤＶのＯＲＦに関する前の情報がない状況で、確認を簡単にするために、それらはＵＳＯＲＦをコードするＨＳＶ−１に対する相同性の関係に基づいて命名された（図１Ｃ，表１）（ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８１：１−１３，１９８５）。必要な場合は、ＭＤＶの語をホモローグの名称の前につけてＯＲＦのオリジンを示すことにする。２つのＭＤＶ特異的ＯＲＦは、そのＳ成分の位置に基づいて、ＳＯＲＦ１およびＳＯＲＦ２と命名した。
　転写の走査モデルによれば、４０Ｓリボソームサブユニットは、最初　ｍＲＮＡの５′末端に結合し、ついで移動して転写開始に好都合な関係でのＡＵＧ（ＡＴＧ）コドンで停止する（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０８：２２９−２４１，１９８９）。しかしながら、Ｓ１ヌクレアーゼの不存在下および／またはプライマー伸長分析においては、転写の明確な開始部位を正確に予測することはできない。それでも、開始部位と思われる部位を表１に掲げる。これらは主要オープンリーディングフレームに認められる最初のインフレームＡＴＧコドンの位置を示す。Ｋｏｚａｋ　によれば（Ｋｏｚａｋ，Ｍ，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０８：２２９−２４１，１９８９）、−３の位置にプリンが存在する限り、そのコンセンサスの残部からの逸脱は開始をわずかしか障害しない。このようなプリンの不存在下には、しかしながら、効率的な翻訳のためには、位置＋４のグアニンが必須である。表１は、ＳＯＲＦ２を除き、すべてのＯＲＦが−３の位置に重要なプリン残基を含むことを示している。しかし一方、ＳＯＲＦ２の場合には位置＋４に補償的なグアニンが存在する。
　ＭＤＶのＵＳ１の場合、２つの転写ｃａｐ　部位が５′Ｓ１ヌクレアーゼ保護分析によって仮に同定されている（データは示されていない）。これらの部位は、それぞれ、位置２００〜２０７におけるＴＡＴＡＴＡＡ配列の１８および２５ヌクレオチド下流に存在するものと思われる（図２）。３′Ｓ１データに基づき、この転写はＵＳ１０コード領域のすぐ下流に存在するポリアデニル化シグナルを利用する（表１、データは示されていない）。ＵＳ領域の比較ノーザンブロット解析により、ＭＤＶのＵＳ１の転写体は、広範囲の細胞変性効果が観察される、感染後の遅い時期（７２時間）に発現されるもっとも顕著な転写体である（データは示されていない）。ホスホノ酢酸阻害実験により、ＭＤＶのＵＳ１は、その即時ＨＳＶ１のＵＳ１の同等体と異なり、遅発クラスの遺伝子として調節される（データは示されていない）。
　コンピュータープログラムＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４−２４４８，１９８８）と１のＫ−集合値を用い、９つの予測されたアミノ酸配列のそれぞれをＮＢＲＦ−タンパク質データベース（公開２１．０，６／８９）、および最近公表されたＥＨＶ−４Ｓセグメント遺伝子配列（１１）に対してスクリーニングした。至適化ＦＡＳＴＡ　スコアが１００を越えた場合、一般に有意なアミノ酸類似性を指示するものと判定した。この分析の結果は表２に示す。
　ＳＯＲＦｌとＳＯＲＦ２は、データベース中のいずれの配列とも有意なホモロジーを示さないようであるが（データは示していない）、ＭＤＶのなとＵＳ３は別として他の６つのＯＲＦ（ＭＤＶのＵＳ１，１０，２，６，７および８；表１，２）にはもっぱらアルファヘルペスウイルスＳセグメン遺伝子に相同性が認められた（表２）。ＵＳ３のＯＲＦはセリン−スレオニンタンパク質キナーゼスーパーファミリーの一員であるので（Ｈａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：４２，１９８８），１５０を越える比較的大きい数のスコアが得られた。しかしながら、これらのスコアはＨＳＶ、ＰＲＶおよびＶＺＶのＵＳ３ホモローグと比較して得られたスコアの３〜４分の１と低かった。以前に確立されたアルファヘルペスウイルスＳセグメントのホモロジーとの比較には、７群のアルファヘルペスウイルス関連配列との間のすべての可能なＦＡＳＴＡ　比較が包含される。２つの配列が共有する同一および類似アミノ酸の総百分率を決定するための至適アラインメントの発生には、類似ペア間の比較にプログラムＧＡＰ　を使用した。表２に示すようにＭＤＶのＳセグメントＯＲＦとそれらのアルファヘルペスウイルス対応部の間のホモロジーは、他のアルファヘルペスウイルスＳセグメントホモローグ自体の間に以前観察されたホモロジーに匹敵するものであった。場合によっては、ＭＤＶのＯＲＦはアルファヘルペスウイルスホモローグに、それらの同じホモローグが他のアルファヘルペスウイルス対応部に対するよりもよく相関していた（ＭＤＶ／ＥＨＶ−４対ＨＳＶ−１／ＥＨＶ−４ＵＳ１およびＭＤＶ／ＥＨＶ−４対ＨＳＶ−１／ＥＨＶ−４ＵＳ１０ホモローグの比較）。さらに、ＶＺＶはＵＳ２およびＵＳ６ホモローグを欠くにもかかわらず、形式的にはガンマヘルペスウイルスと考えられているＭＤＶは、明らかに、ＵＳ２およびＵＳ６ホモローグをもっている。７つの各ホモローグの限られた多重アラインメントで、最高の保存性を示した領域における結果を図３Ａに示す。
　選ばれたＭＤＶ−アルファヘルペスウイルスＳセグメントホモローグ間の総ホモロジー比較を示すドットマトリックスホモロジープロットは図３Ｂに包含される（長さ３０アミノ酸の窓をスライドさせ、少なくとも１５のアミノ酸が同一または類似の場合に点を与える）。生じた斜線は大きな保存性を示す領域を例示するものである。この領域は図３Ａに描かれた領域に重なり、ある場合にはそれらの領域を越えるものであった。
　ＦＡＳＴＡ　では検出されない他の類似タンパク質を同定するさらに高感度な方法として、ＧＣＧ　プログラムＰＲＯＦＩＬＥ　およびＰＲＯＦＩＬＥＳＥＡＲＣＨ　を使用した。これらのプログラムの使用は、構造研究から得られた情報、この場合は関連Ｓ成分ＯＲＦのアラインメントに含まれる情報（ＧＡＰ　を用いるＭＤＶ配列を含む）によるデータベース比較を可能にする（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：４３５５−４３５８，１９８７）。しかしながら、このような解析でも、ここに記載された関連タンパク質群は拡大されなかった。
　ヘルペスウイルス糖タンパク質ホモローグは、一般に、類似パターンの保存的システイン残基を含有することが見出された。アルファ、ベータおよびガンマヘルペスウイルスサブクラスに包含される７つの異なるヘルペスウイルスのｇＢホモローグの比較では、１０個のシステイン残基の完全な保存がある（Ｒｏｓｓ，Ｌ．Ｊ．Ｎ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１７８９−１８０４，１９８９）。ＨＳＶ−１のＵＳ６は７個のシステイン残基を含有し、６個は、正しいフォールディング、抗原性構造およびオリゴ糖プロセッシングの程度に必須と思われる（Ｗｉｌｃｏｘ，Ｗ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９４１−１９４７，１９８８）。システインのこの同じ一般的パターンはＨＳＶ−２の　ｇＤホモローグ（ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１９−３８，１９８７）やＰＲＶ（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ，Ｅ．Ａ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５９：２１６−２２３，１９８６）に保存されているのみでなく、ＭＤＶのｇＤホモローグにも同様に保存されている（全アラインメントは示されていない）。図３Ａには、ＵＳ６（ｇＤ）、ＵＳ７（ｇＩ）およびＵＳ８（ｇＥ）間に観察されたシステイン保存パターンの一部が示されている（この場合、それぞれ４、３および６個の保存システイン残基が示されている）。ＭＤＶ、ＶＺＶ、ＰＲＥＶおよびＥＨＶ−１のＵＳ８ホモローグはすべてそれらのアミノ末端付近に４個の保存システイン残基の類似パターンをもつが（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，Ｊ．−Ｃ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２９６９−２９７８，１９９０；Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１７５９−１８１６，１９８６およびＰｅｔｒｏｖｓｋｉｓ，Ｅ．Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０：１８５−１９３，１９８６）、ＨＳＶ−１および−２の対応部はこれらの２個しかもっていない（ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２３６１−２３６７，１９９０；データは示していない）。４個の保存システインのユニークなパターンが重要な機能的結果を付与すると思われる異なる二次および三次構造の形成を容易にすることであろうことは十分に考えられる。ＨＳＶ−１ｇＥがＦｃ受容体活性を有し（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１３４７−１３５４，１９８８）、一方そのＰＲＶおよびＶＺＶ対応部がその活性をもたないこと（Ｅｄｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６１：５９９−６０２，１９８７；およびＺｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｆ．Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：４６２２−４６２６，１９８８）を示す所見はこれらを反映するものと思われる。
　ＭＤＶのｇＤ、ｇＩおよびｇＥホモローグのＮ末端領域を注意深く検討した結果、それらはシグナルペプチド配列の３つの基礎的な構成ブロック、すなわち、塩基性の陽性に荷電したＮ−末端領域（ｎ−領域）、中央の疎水性領域（ｈ−領域）、および、切断部位を決定すると思われるさらに極性の末端領域（ｃ−領域）を含有することが明らかにされた（ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５，１６８５）。シグナル配列切断部位を予測するための最近改良された方法（ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０，１９８６）を用いて、これらの部位と思われる位置、Ｃ−末端付近の疎水性膜透過および荷電細胞質ドメインの局在、ならびに可能性のあるＮ−グリコシレーション部位の局在を表３に示す。
　表３は、ＭＤＶのＵｓ糖タンパク質の、予測されたシグナルペプチド切断部位ならびに膜透過および荷電細胞質ドメインと可能性のあるＮ−グリコシレーション部位の局在を示す（ＡＴＧ開始コドンに関して）。
　他のｇＩホモローグと同様に、ＭＤＶの対応部は比較的長い細胞質ドメインを含有する。しかしながら、他のｇＤホモローグとは対照的に、ＭＤＶのｇＤのシグナルペプチドは、一般的に長さによって変動せず、真核生物間では全体的平均値が＋１．７であることを考慮すれば、異常に高い電荷（＋４、図２）を有する比較的長いｎ−領域（１８残基）を含有する（Ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５，１９８５）。開始コドンの直接前にさらに遠位メチオニンコドンが存在するにもかかわらず（ＰＲＶのｇＤホモローグの場合と同様、Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ，Ｅ．Ａ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５９：２１６−２２３，１９８６）、翻訳の走査モデルではより５′近位の開始コドン（位置５９６４、図２）の利用が好まれる。さらにこれを支持としては、全体的翻訳状況が、下流ＡＴＧに相当する場合に比べて、より良好ではないにしても、少なくとも同等であると思われることに基づくものがある。このような予測にもかかわらず、２つのＡＴＧ部位の間にこの予測を排除することになる　ｍＲＮＡｃａｐ　部位の局在の可能性も、現時点では除外できない。
　ＭＤＶｇＤに関しては、最後に触れなければならない点がある。１０，３５０ヌクレオチドＤＮＡ配列をプローブとして用い、コンピュータープログラムＦＡＳＴＡ（Ｋ−Ｓ集合＝６）で、ＧｅｎＢａｎｋ（６２．０，１２／８９）およびＥＭＢＬ（１９．０，５／８９）核酸データベースをスクリーニングしたところ、ＭＤＶｇＤコード配列（６４７９〜６８１４；ａａ＃１７３〜ａａ＃２８４；図２）と以前報告された４６７ｂｐＭＤＶのＤＮＡセグメント（Ｗｅｎ，Ｌ．−Ｔ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３７６４−３７７１，１９８８）の間には３４２ｂｐのオーバーラップ中９１．５％ヌクレオチド同一性に相当する、至適化スコア１０２７が得られた。後者の配列は、潜伏感染ＭＤＶ−トランスフォームリンパ芽球細胞にのみ発現される２８　ｋＤ　ＭＤＶ核抗原（ＭＤＮＡ）の結合によってＤＮアーゼの消化から保護される６０　ｂｐ　セグメントを含むことが報告されている。ＭＤＶとＶＺＶの間の類似性に照らして、これらの研究者は、ＭＤＮＡは不死化霊長類細胞におけるＥＢＮＡ−１の場合と類似の様式で機能する可能性を示唆した。Ｗｅｎ　ら（Ｗｅｎ，Ｌ．−Ｔ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３７６４−３７７１，１９８８）は彼らの報告中では、ＭＤＶｇＤが位置するＢａｍＨＩ−Ａの同じＥｃｏＲＩサブフラグメント（ＥｃｏＲＩ−Ｉ、図１）にＭＤＮＡの結合部位を認めた。この領域をカバーするわれわれの配列は、糖タンパク質のすべての特徴的性質を含む完全な、連続したＯＲＦに一致して、ＨＳＶｇＤと有意なホモロジーを示すが、彼らの配列は、われわれの５．３ｋｂｐ　ＥｃｏＲ１−Ｉフラグメント、またはその隣接３．５ｋｂ配列から決定されるいずれの配列とも無関係な約１４０塩基の５′近位配列を含有する。残りの３２７ｂｐ配列（核抗原結合部位候補を含む）は、明らかにわれわれのｇＤコード配列と類似しているが、コンピューター翻訳では３０ａａを越えるＯＲＦを発生させることはできない。
　
考察
　ＭＤＶのガンマヘルペスウイルスとしての分類はこの亜科のメンバーと共通のリンパ向性に基づくものであるが、最近のデータは、そのゲノム構造（Ｃｅｂｒｉａｎ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：５５５−５５８，１９８２；およびＦｕｋｕｃｈｉ，Ｋ．ら．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：１０２−ｔ０９，１９８４）、および主としてそのＵＬ領域の遺伝子編成（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒ，Ａ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２０３３−２０４２，１９８８）は、神経向性のアルファヘルペスウイルスにより密接に類似することを示している。しかも、３種のヘルペスウイルス亜科内でポリペプチド配列が保存されていることが見出された場合には（たとえば、ＵＬ遺伝子）、ベータおよびガンマヘルペスウイルスの対応部よりも、各アルファ対応部に対して常に有意に高いホモロジースコアが認められた（Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９７−６１１，１９８６；Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒ，Ａ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２０３３−２０４２，１９８８；Ｒｏｓｓ，Ｌ．Ｊ．Ｎ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１７８９−１８０４，１９８９；およびＳｃｏｔｔ，Ｓ．Ｄ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３０５５−３０６５，１９８９）。アルファヘルペスウイルスＳセグメント遺伝子は以前に、この分類学的亜科のメンバーに独特であることが見出されたものである（Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１０６７−１０７９，１９８７；およびＤａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９７−６１１，１９８６）。この研究におけるアルファヘルペスウイルスＳセグメント遺伝子の７つのＭＤＶホモローグの同定は、ＭＤＶがガンマヘルペスウイルスよりもアルファヘルペスウイルスと密接な進化的関係を共有するとの考え方に一致する。これはさらに、ジヌクレオチド頻度解析によっても支持されている。これまでに研究されたすべてのガンマヘルペスウイルス中で観察されているＣｐＧ　抑制の欠如（Ｅｆｓｔａｔｈｉｏｕ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１３６５−１３７２，１９９０；および　Ｈｏｎｅｓｓ，Ｒ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８３７−８５５，１９８９）を示すことはできていない。上述の状況は、そのリンパ向性からガンマヘルペスウイルスとしての仮の分類が示唆されたヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ−６）の場合に類似している（Ｌｏｐｅｚ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．ＤｉＳ．１５７：１２７１−１２７３，１９８８）。しかしながら、その後の遺伝子解析により、ＨＨＶ−６とベータヘルペスウイルス、ヒトメガロウイルスの間により大きな類似性が示された（ＨＣＭＶ；Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｇ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：２８７−２９９，１９９０）。
　アルファヘルペスウイルスＳセグメント遺伝子の遺伝子編成の比較は図４に掲げる。これらの遺伝子の編成は、場合により、全体の長さ、編成およびホモロジーの程度に著しい変動を示す。しかしながら、提示された全遺伝子のレイアウトに、逆行反復配列の拡大または収縮およびＵＳ遺伝子の同時喪失または獲得を生じる多数の相同性組換え事象を経て、共通の祖先からのアルファヘルペスウイルスの分化を説明する、モデルと一致する。ＶＺＶの場合は、ＨＳＶ−１に比較して６個のセグメントを欠いている（ＵＳ２、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ１１、ＵＳ１２）。一部の遺伝子、たとえばＵＳ１ホモローグは、特別の配列と長さの分化を示している。ＨＳＶ−１に比べてＭＤＶ、ＶＺＶおよびＥＨＶ−４のＵＳ１は、ＨＳＶ−１のＵＳ１の５′近位部分に相当する約１２０ａａの配列（アルファ２２）を欠く。ノーザンブロット解析、Ｓ１ヌクレアーゼ解析およびホスホノ酢酸阻害試験に基づいて、その比較的特徴のない即時初期ＨＳＶ−１対応部とは異なり、ＭＤＶのＵＳ１遺伝子は豊富に発現される遅いクラスの遺伝子として調節されているように思われる（データは示していない）。他のアルファヘルペスウイルスとは異なり、ＭＤＶは２つの明らかにＭＤＶ特異的なＯＲＦを有する。しかも、ＭＤＶのＵＳ領域は、さらに約２．６〜４．０ｋｂの５′近位配列を含有する。図４の比較および拡大−収縮組換えスキームを考慮すると、さらにＭＤＶ特異的なＵＳ領域の存在が考えられる。
　ＭＤＶは長い間ガンマヘルペスウイルスと見做されてきたので、その性質を解明するための以前の研究は、ＥＢＶとＢ細胞と間の関連と同様に進められてきた（Ｎｏｎｏｙａｍａ，Ｍ．Ｐ．，３３３−３４１，Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ編，Ｔｈｅ　ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ，１巻，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，１９８２；および　Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：７２６−７３０，１９８３）。アルファヘルペスウイルスとの密接な遺伝学的関係から、また上述のＨＨＶ−６の解析を念頭に置いて、われわれは、ＭＤＶとＨＶＴのリンパ向性をもってＥＢＶに対して相同な分子とするには適当ではなく、ＭＤＶと神経向性アルファヘルペスウイルスの間の分子的差異の記述は、ＥＢＶおよびＨＶＳのようなガンマヘルペスウイルスの性質に基づく類比を採用するよりも、観察された生物学的差異を説明する方か実りを期待できるとする　Ｌａｗｒｅｎｃｅ　ら（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｇ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：２８７−２９９，１９９０）に同意する。
　このような差異を説明するには、ＭＤＶのＵＳ領域がとくに重要である。わずかな例外を除いて、各ＨＳＶ−１のＬ成分遺伝子はＶＺＶ中に均等部をもっていて（ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１−１５７４，１９８８）、これらのかなりの数はベータおよびガンマヘルペスウイルスにも同様に類似している（ＶＺＶのＵＬ遺伝子に対するＥＢＶ対応部６７中２９；Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１０６７−１０７９，１９８７）。これに対し、ＨＳＶ−１とＶＺＶのＳセグメントはサイズが有意に異なり、２つのゲノムの間で最も関連のない部分の一つと思われる（Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９７−６１１，１９８６；Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１９２７−１９４２，１９８３）。最近の研究により、ＨＳＶ−１のＳ成分に含まれる１２のオープンリーディングフレーム中１１が細胞培養液中での成育には必須ではないことが明らかにされている（Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒ，Ｒ　ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：４３０３−４３０７，１９８７；およびＷｅｂｅｒ，Ｐ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３６：５７６−５７９，１９８７）。このような必須でない遺伝子の維持および進化は、複製に必要な機能の存在よりもむしろ、天然または実験宿主動物におけるその特異的な生態的地位でのウイルスの生存に関連する機能の存在を示唆する（Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒ，Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４３０３−４３０７，１９８７；および　Ｗｅｂｅｒ，Ｐ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：５７６−５７９，１９８７）。Ｓ成分遺伝子特異的な欠失をもつＨＳＶ変異体の病原性が有意に弱く、マウスにおいて潜伏性確立の能力に低下がみられるとの所見（Ｍｅｉｇｎｉｅｒ，Ｂ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６２：２５１−２５４，１９８８）は、上述の仮説を支持するものである。後者に関しては、ヒト胎児肺線維芽細胞を用いてＨＳＶのＵＳ領域から転写されたＲＮＡが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ潜伏系の確立および維持に関与することを示唆した証拠がある（Ｓｃｈｅｃｋ，Ａ．Ｃ．ら，ｌｎｔｅｒｉｒｏｌｏｇｙ３０：１２１−１３６，１９８９）。これらを考え合わせると、上述の証拠は、組織向性、潜伏および／または細胞形質転換におけるＭＤＶのＵＳ遺伝子の重要な役割を示唆する可能性がある。
　本発明で同定された３つのｇＤ、ｇＩおよびｇＥホモローグを考慮すると、将来のワクチンの開発に関連して他の２つの疑問がある。上述の、組織培養における成育に必須でない１１のＨＳＶ−１のＵＳ領域遺伝子には、ＨＳＶ−１のＵＳ７（ｇＩ）およびＵＳ８（ｇＥ）が包含される（Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒ，Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ８４：４３０３−４３０７，１９８７；およびＷｅｂｅｒ，Ｐ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３６：５７６−５７９，１９８７）。ＭＤＶのホモローグが同じ性質をもつと仮定すると、これらの遺伝子は外来遺伝子の挿入部位として有用な可能性がある。さらに、同じ２つのＭＤＶホモローグ、とくにＵＳ８（ｇＥ）は、上に紹介した病原性に関連する性質の発現に関与する可能性が極めて高い。とくに、ＨＳＶのｇＥは、マウスにおいて致死的感染および潜伏を確立するＨＳＶ−１の能力に役割を果たすものと思われる（Ｍｅｉｇｎｉｅｒ，Ｂ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６２：２５１−２５４，１９８８）。さらに、ブタのＰＲＶのｇＩおよびｇＥホモローグは、１日齢のヒナおよび幼若ブタに対するＰＲＶの毒性に明らかな役割を果たしている（Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｃ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐ　４０３０−４０３２，Ｄｅｃ．１９８７）。同じことがＭＤＶのＵＳ７（ｇＩ）およびＵＳ８（ｇＥ）ホモローグについても真実であるとすると、現在のワクチンでは防止できない爆発を生じる極めて毒性の強いＭＤＶ単離体からのこれらの遺伝子の一方または両者を不活性化し、疾患の流行を起こすフィールドウイルスにより密接に関連する弱毒化ウイルスを作成できる可能性がある。
　本発明で同定された３つの（ｇＤ、ｇＩおよびｇＥ）ホモローグについてさらに考慮すると、他の興味ある問題が提起される。完全なエンベロープを有する感染性　ＭＤＶウイルス粒子は羽毛嚢上皮細胞中で産生されることしか知られていない（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．ｐ３４７−４３１，Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ　編，Ｔｈｅ　ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ，１巻，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，１９８２）。このため、ＭＤＶの研究は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの細胞関連感染の蔓延の促進するだけの限られた線維芽細胞培養に頼らざるを得なかった。過去２０年間にわたり、免疫原性表面抗原の同定を目的とした研究は、この　ｉｎ　ｖｉｔｒｖｏ培養系に依存し、総じて２種の糖タンパク質抗原（Ａ抗原／ｇＣホモローグ；Ｂ抗原）のみが定常的に同定され、特性づけられてきた（Ｂｉｎｎｓ，Ｍ．Ｍ．ら，Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．１２：３７１−３８２，１９８９；Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，Ｐ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２３７３−２３７９，１９８８；Ｉｓｆｏｒｔ，Ｒ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５９：４１−４１９，１９８６；Ｉｓｆｏｒｔ，Ｒ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：４６４−４７４，１９８６；およびＳｉｔｈｏｌｅ，Ｉ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：４２７０−４２７９，１９８８）。それにもかかわらず、これは本発明の３つのＭＤＶｇＤ、ｇＩおよびｇＥホモローグ、およびさらに２つの糖タンパク質ホモローグ（ｇＢおよびｇＨ、Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒ，Ａ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２０３３−２０４２，１９８８；および　Ｒｏｓｓ，Ｌ．Ｊ．Ｎ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１７８９−１８０４，１９８９）の所見である。自然感染トリからの免疫ヒナ血清（ＩＣＳ）は、すべてではないにしても、多くＭＤＶにコードされた表面抗原と反応するらしいが、この複雑なポリクローナル血清は、半増殖性細胞培養における抗原の発現／プロセッシングが羽毛嚢上皮細胞中でのそれに類似するという限りにおいてのみ有用であろう。ＭＤＶｇＤ特異的プローブを用いたノーザンブロット解析により、ＭＤＶｇＤの　ｍＲＮＡは、広範な細胞変性効果が認められている時点ではＤＥＦ細胞中で全くまたはわずかしか発現しないことが示唆される（データは示していない）。ＶＺＶがｇＤホモローグを欠き、強度に細胞関連性であることを考慮すると、一次トリ線繊芽細胞におけるＭＤＶウイルス粒子の形成の遮断が、糖タンパク質たとえばｇＤ、および／またはある種の他のＳ成分遺伝子の発現（この細胞内での）の欠如と相関するかをみることは興味がもたれる。
　弱毒化ＭＤＶ株（血清型２）、またはＨＶＴ（血清型３）によって付与されるＭＤに対する保護は免疫学的基盤をもつと思われるので、共通の抗原を確認することにはかなりの興味がある。ＨＳＶのＵＳ遺伝子（これは明らかにＨＶＴよりもＭＤＶに対する類似性が低い）に対する７つのＭＤＶのＵＳホモローグを同定した本発明を見れば、ＭＤＶ−ＨＶＴのＵＳ領域間でのホモロジーの欠如を示した以前の報告（Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｔ．ら，Ｖｉｏｌｏｇｙ　１５７：３５１−３５８，１９８７）が正しいとしたら驚くべきであろう。このような否定的な結果は、配列解析研究ではなく、ハイブリダイゼーションに基づくホモロジー評価の限界を反映するものかもしれない。
　例２は、完全なＭＤＶのＵＳ７（ｇＩ）遺伝子およびＭＤＶのＵＳ８（ｇＥ）遺伝子の部分をコードするＤＮＡを含む構築体の分子クローニングを示す。明らかなように、これはｇＩ、およびｇＥの部分をコードする領域にまたがるＤＮＡのセグメントを用いて達成される。
　例２
　ＭＤＶの完全ＵＳ７（ｇＩ）およびＭＩ）ＶのＵＳ８（ｇＥ）の部分をコードするＤＮＡを構築体の部分クローニング
　ＭＤＶの完全ＵＳ７（ｇＩ）のコード配列およびＭＤＶのＵＳ８（ｇＥ）の部分のコード配列を含む組換えクローン（ｐＫＳ−ＭＤｇＩ　ｌ．５９）構築には、２つの既存のＭＤＶクローン、ｐＫＳ−ＭＤｇＤ　１．７５とｐ　１９Ｐｌが必要である（図５）。ｐＫＳ−ＭＤｇＤ　１．７５はクローニングベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ−　のＳｍａ　Ｉ−Ｓｓｔ　ＩＩ部位にリゲートされたＭＤＶのＥｃｏＲ１−Ｉの１．７５ｋｂｐ　ＮｃｏＩ−Ｓｓｔ　ＩＩサブフラグメントを含有する組換えプラスミドである。このクローンは、ＭＤＶの完全なＵＳ６（ｇＤ）コード配列とさらにＭＤＶのｇＩの最初の３９のアミノ酸（ａａ）をコードする３′末端における配列を含有する。ｐ　１９Ｐｌは、ｐＵＣ　１９の唯一のＢａｍＨＩ部位にクローン化されたＭＤＶの１．５Ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ−Ｐｌサブフラグメントを含有する組換えプラスミドである。このクローンは、そのシグナル配列の最初の９ａａを除く、全ＭＤＶｇｌのコード配列を含有する。さらにｐ　１９Ｐ１は３′末端にＭＤＶのＵＳ８（ｇＥ）コード領域の最初の１０４ａａを含有する。
　ｐＫＳ−ＭＤｇ１１．５９を発生させるためには、ｐＫＳ−ＭＤｇＤ１．７５をまずＨｉｎｃ　ＩＩで切断する。これは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ベクターの多重クローニング部位を１カ所および挿入体のＳｓｔ　ＩＩ末端の約１８ｂｐ上流を一カ所切断する。これにより、２つのフラグメント１つは主としてＭＤＶのＵＳ６（ｇＤ）をコードする挿入配列からなるフラグメント（１．６ｋｂｐ）、ｐＢｉｕｅｓｃｒｉｐｔ　ベクター配列からなる大フラグメント（３．ｌｋｂｐ）と、さらにＭＤＶｇＩのＮ−末端をコードする約１８０ｂｐフラグメントを生じる。３．１ｋｂｐ　フラグメントをゲル精製し、２つのＨｉｎｃ　ＩＩ末端で自己リゲートさせる。得られた組換えプラスミド、ｐＫＳ−ＮＤｇＩ０．１８を次に、Ｓｓｔ　Ｉ切断する（Ｓｓｔ　ＩＩ部位のすぐ下流の多重クローニング部位で）。粘着ＳｓｔＩ端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼでブラント端としたのち、続いてＳｓｔ　ＩＩで消化する。得られたｐＫＳ−ＮＤｇＩ　０．１８の３．１Ｋｂｐ　Ｓｓｔ　ＩＩ−Ｓｓｔ　Ｉ（ブラント）フラグメントをゲル精製し、これを最終リゲーション工程に使用して、ｐＫＳ−ＭＤｇ　Ｉ　ｌ．５９を生成させる。ｐＫＳ−ＭＤｇＤ　１．７５およびｐＫＳ−ＮＤｇ　Ｉ　０．１８の酵素操作を行う間に　ｐ　１９ＰｌはＨｉｎｄ　ＩＩＩ　で切断する。これは、部分ＭＤＶＵＳ８（ｇＥ）コード配列のすぐ下流をｐ１９Ｐ１の多重クローニング部位で切断する。粘着Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ端をクレノーフラグメントでブラント端としたのち、続いてＳｓｔ　ＩＩ　ｄ　で消化する。小さなＳｓｔ　ＩＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　（ブラント）フラグメント（１．４ｋｂｐ）はＭＤＶＵＳ７（ｇＩ）コード配列の大部分と、さらにＭＤＶｇＥの５′末端をコードする３１２ヌクレオチドをその３′末端に含有する。この１．４ｋｂｐ　Ｓｓｔ　ＩＩ　−　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ（ブラント）フラグメントをゲル精製し、ｐＫＳ−ＮＤｇＩ　０．１８の３．１ｋｂｐ　Ｓｓｔ　ＩＩ　−Ｓｓｔ　Ｉ（ブラント）フラグメントにリゲートする。得られた組換え体、ｐＫＳ−ＭＤｇＩ１．５９は、ＭＤＶのｇＩの完全なコード配列と、Ｎ末端ｇＥコード配列の部分を含有する。ｐＫＳ−ＭＤｇＩ　１．５９をＫｐｎＩで消化すると、２つのフラグメントが得られ、小さな１．１５ｋｂｐ　フラグメントはＭＤＶのｇＩの完全なコード配列を含有する。
　例３は、ＭＤＶの完全なＵＳ８（ｇＥ）遺伝子を含有する構築体の分子サブクローニングを示す。
　例３
　ＭＤＶの完全なＵＳ８（ｇＥ）をコードする構築体の分子クローニング
　ＭＤＶの完全なＵＳ８（ｇＥ）コード配列を含有する組換えクローン（ｐ１８−ＭＤ−ｇＥ２．５　３）の構築には、前に使用したＢａｍＨ　ＩまたはＥｃｏＲ１以外のクローンが必要である。ＧＡ株クローンＧＡ−０２、ＥａｍＨ　Ｉ−Ａ、−Ｐ１ならびにさらに５′および３′隣接配列を含む部分消化ＭＤＶのＳａｌＩ挿入体を含有するＥＭＢＬ−３クローン（ｌｎｔｅｒｖｅｔ　ｌｎｔｌ．Ｂ．Ｖ．，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ　ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓのＰ．Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｅｒ　によって恵与された）をＥｃｏＲ１−ＩおよびＢａｍＨＩ−Ｐ１フラグメントの３′分析の拡張に使用した。これらのファージクローンＭＤＶ挿入体の３′末端に位置する小さなＳａｌＩサブフラグメントをゲル精製し、ＳａｌＩで線状化したｐＵＣ　１８にリゲートした（ｐＳＰ１８−Ａ，　ｐＳＰ１８−Ｂ，　ｐＳＰ１８−Ｃ，図１Ｂ）。ｐＵＣ１８サブクローン、ｐＳＰ１８−Ａは、全ＭＤＶＵＳ８（ｇＥ）コード配列を含有し、ＡＴＣＣ寄託のために、ｐ１８−ＭＤｇＥ　２．５３と命名する。
　図２中の記号の定義
　表４には、アミノ酸の１文字および３文字記号の両者を示す。
　糖タンパク質ｇＩおよびｇＥをコードするＤＮＡセグメントが、挿入、部位特定または欠失突然変異によって改変される場合には、ＭＤＶの病原性は低下する可能性がある、また、非必須ｇＩおよびｇＥをコードするＤＮＡセグメントは、組換えワクチンの製造の目的で、抗原的に活性なタンパク質をコードする外来性ＤＮＡのセグメントの挿入部位として使用できる。
　
ＡＴＣＣ寄託
　ＭＤＶのＵＳ６（ＭＤＶｇＤ）の遺伝子は、プラスミド（ファージミド）ｐＫＳ−ＭＤｇＤ１．７５中、Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ　２０８５２，　ＵＳＡ　にＡＴＣＣ４０８５５として寄託された。
　ＭＤＶのＵＳ７（ＭＤＶｇＩ）の遺伝子は、プラスミド（ファージミド）ｐＫＳ−ＭＤｇＤ　１．５９中、Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ　２０８５２，　ＵＳＡ　にＡＴＣＣ７５０４０として寄託された。
　ＭＤＶのＵＳ８（ＭＤＶｇＥ）の遺伝子は、プラスミド（ファージミド）ｐＫＳ−ＭＤｇ　２．５３中、Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　ＭＤ　２０８５２，　ＵＳＡ　にＡＴＣＣ７５０３９として寄託された。
　出願中に前述した配列番号１、２および３　についての配列表を添付する。
　付　録　１
（１）一般的情報
（ｉ）　出願人：レランドエフ．ベリサー、ピータ−ブルノブスキスおよびポールコウセンズ
（ｉｉ）発明の名称：糖タンパク質、ｇＤ、ｇＩおよびｇＥをコードするマレック病ヘルペスウイルスＤＮＡセグメント
（ｉｉｉ）配列の数：３
（ｉｖ）連絡住所：
　（Ａ）受信人：イアン　シー．マクレオド
　（Ｂ）街：２１９０　コモンズ　パークウエイ
　（Ｃ）市：オケモス
　（Ｄ）州：ミシガン
　（Ｅ）国：Ｉｎｇｈａｍ
　（Ｆ）郵便番号：４８８６４
　（ｖ）コンピューター読出し形式：
　（Ａ）媒体：１．４４Ｍｂ３　１／２″フロッピーディスク
　（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ　ＰＳ２、Ｍｏｄｅ５０
　（Ｃ）オペレーションシステム：ＭＳ−ＤＯＳ　５．０
　（Ｄ）ソフトウエア：ＰＣ−Ｗｒｉｔｅ　３．０２
（ｖｉｉｉ）弁護士／代理人　情報：
　（Ａ）名前：イアン　シー．マクレオド
　（Ｂ）登録番号：２０，９３１
　（Ｃ）参照／摘要番号：ＭＳＵ４．１−１３２
（ｉｘ）電話回線情報
　（Ａ）電話：（５１７）３４７−４１００
　（Ｂ）テレファクス：（５１７）３４７−４１０３
　配列ＩＤ番号：１の情報
（ｉ）　配列の特徴
　（Ａ）長さ：１０，３５０塩基対
　（Ｂ）型：核酸
　（Ｃ）鎖の数：二本鎖
　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｙｅｓ
（ｖ）　アンチセンス：Ｎｏ
（ｖｉ）起源：
　（Ａ）生物名：ＭＤＡ、ＧＡ株
（ｖｉｉ）直接の起源：
　（Ａ）ライブラリー：Ｇｅｎｏｍｉｃ
配列ＩＤ番号：２の情報
（ｉ）　配列の特徴：
　（Ａ）長さ：１０，３５０塩基対
　（Ｂ）型：核酸
　（Ｃ）鎖の数：二本鎖
　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：
　（Ａ）配列：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｙｅｓ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｙｅｓ
（ｖｉ）起源：
　（Ａ）生物名：ＭＤＡ，ＧＡ株
（ｖｉｉ）直接の起源：
　（Ａ）ライブラリー：Ｇｅｎｏｍｉｃ
配列ＩＤ番号：３の情報
（ｉ）　配列の特徴：
　（Ａ）長さ：４９７
　（Ｂ）型：アミノ酸ペプチド
　（Ｃ）鎖の数：一本鎖
　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：
　（Ａ）配列：ポリペプチド
（ｖｉ）起源：
　（Ａ）生物名：ＭＤＡ，ＧＡ株
（ｖｉｉ）直接の起源：
　（Ａ）ライブラリー：Ｇｅｎｏｍｉｃ
（５７）【特許請求の範囲】
　１．マレック病ヘルペスウイルス（ＭＤＶ）ゲノムのＵｓ領域に存在する遺伝子であって、
　配列番号１により表される８４８８〜９９７８ｂｐ配列の間の、ＭＤＶ糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）前駆体をコードする遺伝子（以下遺伝子１という）、
　配列番号１により表される、１〜８７９９ヌクレオチド配列の、複数の糖タンパク質前駆体をコードする遺伝子（以下遺伝子２という）、
　配列番号１により表される５９６４〜７１７５ｂｐ配列の間の、ＭＤＶ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）前駆体をコードする遺伝子（以下遺伝子３という）、
　配列番号１により表される７２８２〜３３４９ｂｐ配列の間の、ＭＤＶ糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）前駆体をコードする遺伝子（以下遺伝子４という）、
及び
　配列番号１により表される８４８８〜８７９９ｂｐ配列の間の、ＭＤＶ糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）前駆体の一部をコードする遺伝子（以下遺伝子５という）
　からなる群より選ばれる上記遺伝子を有することを特徴とする、ＭＤＶゲノムのＤＮＡセグメント。
　２．該遺伝子が前記遺伝子１であり、さらに該遺伝子の５′端側に４００ヌクレオチド以下のプロモーター活性を有する遺伝子を含む、請求項１記載のＤＮＡセグメント。
　３．２．５３ｋｂの大きさを有する請求項２記載のＤＮＡセグメント。
　４．コードされる糖タンパク質前駆体は４９７のアミノ酸を含有する請求項３記載のＤＮＡセグメント。
　５．該遺伝子が前記遺伝子２であり、さらに遺伝子の５′端側に４００ヌクレオチド以下のプロモーター活性を有する遺伝子を含む、請求項１記載のＤＮＡセグメント。
　６．該遺伝子が前記遺伝子３であり、さらに遺伝子の５′端側に４００ヌクレオチド以下のプロモーター活性を有する遺伝子を含む、請求項１記載のＤＮＡセグメント。
　７．該遺伝子が前記遺伝子３であり、コードされる糖タンパク質前駆体は４０３のアミノ酸を含有する、請求項１又は６記載のＤＮＡセグメント。
　８，以下の配列
　からなる糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）前駆体をコードする、ＭＤＶゲノムのＵｓ領域に存在する遺伝子及びプロモーター活性を有する遺伝子を含む、ＧＡ株由来のＭＤＶゲノムの５．３ｋｂｐＥｃｏＲ１−ＥｃｏＲＩセグメント。
　９．以下の配列
　からなる糖タンパク質Ｄ前駆体をコードする、ＭＤＶゲノムのＵｓ領域に存在する遺伝子、及び該遺伝子の５′端側にプロモーター活性を有する遺伝子を含む、ＧＡ株由来のＭＤＶゲノムの１．７５ｋｂｐＮｃｏＩ−ＳｓｔＩＩセグメント。
　１０．該遺伝子が前記遺伝子４であり、さらに遺伝子の５′端側に４００ヌクレオチド以下のプロモーター活性を有する遺伝子を含む、請求項１記載のＤＮＡセグメント。
　１１．該遺伝子が前記遺伝子４であり、コードされる糖タンパク質前駆体は３５５のアミノ酸を含有する請求項１又は１０記載のＤＮＡセグメント。
　１２．該遺伝子が前記遺伝子５であり、さらに遺伝子の５′端側に４００ヌクレオチド以下のプロモーター活性を有する遺伝子を含む、請求項１記載のＤＮＡセグメント。
　１３．該遺伝子が前記遺伝子５であり、コードされる糖タンパク質前駆体は１０４のアミノ酸を含有する請求項１又は１２記載のＤＮＡセグメント。
　１４．ＭＤＶゲノムのＵｓ領域にコードされている糖タンパク質前駆体であって、
　以下の配列
　からなる糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）前駆体，
　以下の配列
　からなる糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）前駆体，
　以下の配列
　からなる糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）前駆体，及び
　以下の配列
　からなる糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）前駆体
　からなる群より選ばれる上記糖タンパク質前駆体。