(57)【要約】  本発明は、膵島β細胞活性を刺激する能力を有するが、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４受容体に結合することも、またはこの受容体を活性化させることもないポリペプチドを投与するステップを含む、糖尿病状態を治療しまたは予防する方法を提供する。前記ポリペプチドの使用および前記ポリペプチドを含む組成物と同様に、糖尿病状態を診断する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病状態に罹患しているかまたは罹患する危険性がある被験体において糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させる方法であって、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有し、かつその細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減しているポリペプチドを、被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項２】
糖尿病状態に罹患しているかまたは罹患する危険性がある被験体において糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させる方法であって、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドをコードする核酸を被験体に投与するステップを含み、その際、該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している方法。
【請求項３】
糖尿病状態に罹患している被験体において糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させるための、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドの使用であって、その際、該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣと比較して低減している、使用。
【請求項４】
糖尿病状態に罹患しているかまたは罹患する危険性がある被験体において糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させるための、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドをコードする核酸の使用であって、その際、該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している、使用。
【請求項５】
糖尿病状態に罹患しているかまたは罹患する危険性がある被験体において糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させるための医薬を製造するための、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドの使用であって、その際、該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している、使用。
【請求項６】
糖尿病状態に罹患しているかまたは罹患する危険性がある被験体において糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させるための医薬を製造するための、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドをコードする核酸の使用であって、その際、該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している、使用。
【請求項７】
被験体においてＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４受容体を活性化する前記ポリペプチドの能力が、真正ＢＴＣのその能力と比較して大幅に低減している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項８】
膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化が、他の細胞型の増殖を刺激することなく刺激される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項９】
前記糖尿病状態が２型糖尿病である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１０】
前記糖尿病状態が１型糖尿病である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１１】
糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させるための組成物であって、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドを、薬学的に許容される担体と共に含み、かつ該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している、組成物。
【請求項１２】
糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させるための組成物であって、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドをコードする核酸を、薬学的に許容される担体と共に含み、かつ該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している、組成物。
【請求項１３】
前記ポリペプチドの細胞型の増殖を刺激する能力が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその能力と比較して低減している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドのＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４受容体を活性化する能力が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその能力と比較して低減している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドのＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ３ホモ二量体を活性化する能力が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその能力と比較して低減している、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項１６】
治療の副作用として被験体において癌が生じる危険性が、真正ＢＴＣでの治療から生じる危険性と比較して低減されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、ＥＧＦファミリーのメンバーと実質的に相同である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、上皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子、エピレグリン、アンフィレグリン、ＥｒｂＢキナーゼに対する神経由来および胸腺由来アクチベーター（ＮＴＡＫ）、ニューレグリン・サブファミリーのメンバー（ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４）、またはベータセルリン（ＢＴＣ）と実質的に相同である、請求項１７に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、ＢＴＣ−δ４と実質的に相同である、請求項１８に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項２０】
前記ポリペプチドがＢＴＣ−δ４である、請求項１９に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項２１】
前記ＢＴＣ−δ４ポリペプチドが、図４に示すアミノ酸配列（配列番号１１）を有する、請求項２０に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、
（ａ）真正ＢＴＣをコードする遺伝子中に通常存在するＣ５−Ｃ６ジスルフィドループを欠如している、ＢＴＣのスプライス変異体、または
（ｂ）分子（ａ）の配列と実質的に相同な配列を有するポリペプチド、または
（ｃ）分子（ａ）の類似体、断片、突然変異体、誘導体、もしくはアレル変異体、
である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、
（ａ）真正ＢＴＣをコードする遺伝子中に通常存在するＣ５−Ｃ６ジスルフィドループを欠如し、かつループＡおよびＢならびにその「ヒンジ」であるバリンを含むその成熟分子の残部が末端切断されたＣ末端細胞質尾部にインフレームで融合している、ＢＴＣのスプライス変異体、
（ｂ）分子（ａ）と実質的に相同な配列を有するポリペプチド、または
（ｃ）（ａ）の断片、類似体、変異体、または誘導体、
である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、β細胞の分化因子として作用すること、β細胞量を増大させること、β細胞の機能低下を減少させること、および／またはβ細胞によるインスリン分泌を増加させることができる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項２５】
治療の副作用として被験体において癌が生じる危険性が、ＢＴＣでの治療に伴うその危険性と比較して低減される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法、使用、または組成物。
【請求項２６】
被験体が、以下の糖尿病危険因子：耐糖能障害、メタボリック症候群、１型または２型糖尿病の家族歴、肥満、多嚢胞性卵巣症候群、高血圧症、または高コレステロールレベルのうち一つまたはそれ以上を有する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法、使用、または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病状態の治療または予防に関し、特に、１型または２型糖尿病の治療または予防、あるいはその発症の遅延にポリペプチドまたは対応する核酸分子を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書に引用した全ての参照文献は、いかなる特許または特許出願を含め、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる参照文献も従来技術を構成することを自認するものではない。これらの参照文献についての記述は、その著者が主張していることを述べるものであり、本出願人は、引用文献の正確さおよび関連性に対して異議申し立てをする権利を留保する。多数の先行文献について本明細書で言及しているが、オーストラリアまたは他のどの国でも、これらの文献のいずれについても当技術分野での技術常識の一部を形成することの自認を構成するものではないことは明瞭に理解されるであろう。
【０００３】
糖尿病は、ヒトを苦しめる深刻な代謝性疾患の最も一般的なものである。糖尿病は、インスリン作用が相対的にまたは絶対的に欠如している結果として生じる慢性高血糖、すなわち、血液中の糖が過剰な状態として定義されうる。
【０００４】
糖尿病は、２つの主要な形態、１型および２型糖尿病に分類される。インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも言う１型糖尿病は、インスリン産生膵β細胞のほぼ完全な消失に関連付けられる自己免疫疾患である。このβ細胞の消失により生涯にわたってインスリンに依存することになる。１型糖尿病は、どの年齢でも生じる可能性があり、一生の間には、全新生児の約１％がこの疾患を発症すると推定される。２型糖尿病、すなわち、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、高グルコース血中濃度（高血糖）およびインスリン抵抗性によって特徴付けられる一群の疾患をさし、膵β細胞の機能が損なわれている患者で生じる。１型患者でのインスリンの欠如および２型糖尿病でのインスリン抵抗性によって、血流から糖の吸収は減少し、従って血液中に糖が過剰に蓄積される。両型の糖尿病には、推定寿命の短縮、ならびに血管疾患、失明、およびアテローム性動脈硬化症など、顕著な罹病率が伴う。ＬＡＤＡ（成人潜在性自己免疫性糖尿病）と表される新型の糖尿病は、抗Ｇａｄ抗体陽性であるという点で、１型糖尿病の免疫学的形質をも示す２型糖尿病と診断された成人について記載することが提案されている。
【０００５】
糖尿病は先進諸国で最も流行している慢性疾患の一つであり主要な死亡原因である。臨床的罹患率および死亡率に加えて、糖尿病の経済的コストは莫大であり、米国だけでも年間９００億ドルを超え、糖尿病有病率は、大部分、肥満に伴う２型糖尿病の結果として、２０１０年までに２倍を超えて増大すると推定される。
【０００６】
欧州を起源としない人々は、糖尿病にかかる危険性が著しく上昇している。南アジア人を含むアジア人は、近未来には糖尿病の大流行を経験するであろう。こうした個人は、重篤な肥満ではないのに糖尿病にかかり、従ってその病的状態の主要素としてインシュリン欠乏症を有しうる。さらに、栄養不良・線維結石性膵性糖尿病、および蛋白欠乏性膵性糖尿病に関連する、低インスリン濃度に関連付けられる２つの型の糖尿病がインドで記載されている。
【０００７】
インスリンは、膵臓のランゲルハンス島のβ細胞によって産生される。膵臓の発生の際、膵島前駆細胞は増殖し、最終的に４つの主要な膵島細胞型の一つに分化する。β細胞の形成は、特に様々な増殖因子、サイトカイン、およびホルモンの作用によって調節されると考えられる。
【０００８】
β細胞の数および機能は、グルコース代謝を維持するのに重要であり、β細胞の数および／または機能の著しい減退は糖尿病を発症させる。今回、β細胞量は、前駆細胞の消失と新生の間のバランスによって維持されることを実証する。インスリン要求量が、例えば、肥満によるインスリン抵抗性によって著しく上昇した場合、β細胞の新生が刺激される。これによりβ細胞量が増大し、グルコース代謝が維持される。この代償機序が損なわれている場合、例えば、２型糖尿病では、グルコース代謝に支障をきたす。２型糖尿病の動物モデルではβ細胞の新生が損なわれていることが、近年の研究によって示されている。従って、β細胞の新生を刺激する因子が糖尿病発症の予防に有効であり、すなわち潜在的に有用な治療的手法を示している。
【０００９】
あらゆる形態の糖尿病の治療における第一の目的は同じであり、すなわち、血糖値を可能な限り正常値付近に下げることであり、それによってこの疾患の短期的および長期的合併症を最小限に抑えることである。
【００１０】
糖尿病の長期管理は、患者が１型または２型のどちらに分類されるかに関わらず、インスリン療法を含むことが多い。健康な個体では、インスリンは、骨格筋によるグルコースの取込みを増大させ、肝臓でのグルコースの産生を減少させるが、２型糖尿病個体では、インスリンはそのように働かない傾向がある。従って、多くの２型糖尿病患者は、たとえ高用量でインスリンを投与してもインスリン療法に十分に応答しない。
【００１１】
１型糖尿病の治療は、代替用量のインスリンの投与を必須として伴い、そのインスリンは従来は非経口経路により投与されている。食事対策と血糖値の自己モニタリングを組み合せて、大多数の１型患者は血中グルコースを適切に制御することができる。２型糖尿病では、初期療法は最適の食事、減量、および運動の治療計画である。薬物療法は、これらの手段によっても、もはや適切に代謝が制御されない場合、そして制御されないときに開始される。一般的に、インスリン分泌を促進し、または他の手段によってグルコース値を下げる薬物が処方される。血糖降下薬、例えば、スルホニルウレア系またはビグアニド系が、そのような患者に処方される主な薬物である。それらの薬物は、β細胞を直接刺激することによってインスリンの産生を刺激し、従ってそのような薬物の有効性は膵臓中に残存する機能性β細胞数（β細胞量）に依存する。
【００１２】
スルホニルウレア系は、２型糖尿病患者のうち高割合でその有効性を失っている。ある研究では、スルホニルウレア系で治療した、新たに診断された糖尿病患者の３０％が、療法の初めの６年以内にインスリンを必要とした。近年、２型糖尿病者の最大１２％が遺伝子変異、すなわちインスリン受容体基質１におけるＡｒｇ９７２変異を有し、この変異によって彼らはこれらの薬物で失敗する傾向を示すのかもしれず、その結果彼らはインスリンによって治療しなければならないことが報告されている。
【００１３】
ペプチド増殖因子は、シグナル伝達、細胞生存、分化、細胞接着、細胞移動、免疫応答、造血、炎症、組織修復、アテローム性動脈硬化症、および癌を含む広範な生理学的および病理学的過程に関与する。これらの過程のほぼ全てで、ペプチド増殖因子は、膜貫通型受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の細胞外ドメインと相互作用することによって、その生物学的作用を発揮する。ほとんどのＲＴＫは、類似するリガンドを結合し、リガンドが誘導したホモおよびヘテロ二量体形成によって受容体間相互作用を維持する、高度に相同な受容体の小さなグループに属する。リガンドが誘導した二量体化によって、細胞質ドメイン中のこれらの受容体に特異的なチロシン残基が自己リン酸化される。リン酸化したチロシン残基は、ＳＨ２あるいはホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン、例えば、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、およびホスホイノシチド３’キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）のｐ８５サブユニットを保持する蛋白質の高親和性連結部位として機能する。これにより、シグナル伝達経路、例えば、分裂促進因子活性化蛋白質キナーゼ経路が活性化され、その結果細胞内シグナルの複雑なカスケードがもたらされ、最終的に標的細胞に対して特異的事象がもたらされる。
【００１４】
最も全体的に調べられたＲＴＫサブファミリーの一つは、４つの既知の受容体：ＥｒｂＢ−１（上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）とも言われる）、ＥｒｂＢ−２（ＨＥＲ２またはＮｅｕとも言われる）、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４を包含するＥｒｂＢファミリーである。これらの受容体は、異なる組織全体にわたって広く分布し、細胞型および生理学的状態に応じて細胞増殖および分化の増殖阻害または誘導を媒介する働きをする。
【００１５】
多くのペプチド増殖因子は、ＥｒｂＢ受容体ファミリーに対するリガンドである。この因子群は、特に、共通の６−システイン３６〜４０アミノ酸残基上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）モチーフに関して高度の配列類似性を有する。このモチーフは、ＣＸ７ＣＸ４ＣＸ１０ＣＸ１ＣＸ８Ｃのスペーシングを有し、３個の分子内ジスルフィド結合（Ｃ１−Ｃ３、Ｃ２−Ｃ４、Ｃ５−Ｃ６）および特徴的な３ループ構造を形成し、このループ構造にはＣ１−Ｃ３ジスルフィドループ、Ｃ２−Ｃ４ジスルフィドループ、およびＣ５−Ｃ６ジスルフィドループが含まれる。
【００１６】
このファミリーに属する増殖因子ペプチドＥＧＦモチーフは全て、最初の２個のジスルフィドループ（Ａループ：Ｃ１−Ｃ３、Ｂループ：Ｃ２−Ｃ４）と第３のループ（Ｃループ：Ｃ５−Ｃ６）を分離する境界に相当する、正確に位置付けられた介在イントロンと２個のエクソンによってコードされていると思われる。これらの分子に共通する特徴は、大型の膜貫通型前駆体として合成されることであり、この前駆体はタンパク分解で切断されて増殖因子の可溶性生物活性形態を遊離する。
【００１７】
コンセンサスＥＧＦモチーフは、ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーに結合し、それを活性化するのに重要である。ＥｒｂＢ受容体へのリガンド結合は、受容体ホモまたはヘテロ二量体化、自己リン酸化、続いて下流のシグナル伝達経路の活性化を誘導し、細胞の増殖、分化、遊走、および生存を含む多様な生理学的過程をもたらす。哺乳動物のＥｒｂＢファミリーに対するリガンドには、ＥＧＦ、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、エピレグリン、アンフィレグリン、ＥｒｂＢキナーゼに対する神経および胸腺由来アクチベーター（ＮＴＡＫ）、４つの遺伝子（ＮＲＧ１）、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４の産物を含むニューレグリン（ＮＲＧ）サブファミリー、ならびにベータセルリン（ＢＴＣ）が含まれる。
【００１８】
ＢＴＣは、元々、線維芽細胞、レチナール色素上皮細胞、および平滑筋細胞に対して分裂促進活性を有する３２ｋＤａの糖蛋白として、マウス膵β細胞癌（膵島細胞腺腫）細胞系の馴化培地から精製された。ヒトＢＴＣがヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７からクローン化され、ウシＢＴＣがウシ腎細胞系からクローン化されている。
【００１９】
ＢＴＣは、タンパク分解で切断されて可溶性成熟増殖因子を遊離することができる、膜固定前駆体蛋白質として合成される。成熟ＢＴＣは、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ−４ホモ二量体に結合しこれを活性化し、さらに高発癌性ヘテロ二量体ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３受容体複合体を含む、全ての可能性のあるＥｒｂＢヘテロ二量体に結合しこれを活性化する。
【００２０】
多数の研究が、特に膵臓の発生および機能における、ＥｒｂＢ１受容体、ならびにリガンドＴＧＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、およびＢＴＣの潜在的な重要性を強調している。ＥｒｂＢリガンドは、発生中の膵臓全体にわたって豊富に発現される。出生後第一週に死ぬことが多いＥｒｂＢ１−／−マウスは、膵臓上皮の全般的な増殖欠陥を示し、この欠陥は膵島細胞のインスリン産生β細胞への分化の遅延を伴い、発生中の膵島内分泌細胞の遊走および構造形成を妨害する。これらの欠陥は、ＥｒｂＢ−１が媒介するシグナル伝達が正常なβ細胞の発生にとって重大であることを示唆する。ＥｒｂＢ−３−／−マウスでの膵臓の発生もまた、深刻な欠陥を示す。
【００２１】
ＥＧＦでもＴＧＦαでもないＢＴＣが、膵臓の発生および機能において、特有であり重複しない役割を有しうることは多くの研究から示されている。ＢＴＣは、膵臓、特にランゲルハンス島で強く発現し、インビトロおよびインビボで様々な膵臓細胞の増殖および分化を刺激する。ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−４は膵臓の腺管（duct）細胞によって発現されるので、ＢＴＣは、これらの受容体に結合し活性化してβ細胞の新生を刺激しうると考えられる。
【００２２】
驚くほど多数の膜蛋白質が、膜貫通型ドメインをコードするエクソン配列を除去する選択的スプライシングを受け、膜結合形態とは異なる機能を示す可溶性形態を生成する。選択的スプライシングの結果としてのｍＲＮＡ構造の変化は、細胞活性化の異なる発生段階中および／または異なる状態中に、特定の組織で示差的に発現されうる蛋白質変異体を産生する可能性がある。選択的スプライシングされたエクソンが、触媒活性または結合相互作用にとって機能的に重要な蛋白質ドメインをコードする場合、得られる蛋白質は、しばしば、異なる活性、またはアンタゴニスト活性さえも示す可能性がある。
【００２３】
近年、本発明者らは、新規なヒトＢＴＣアイソフォームをコードする、選択的にスプライスされたｍＲＮＡ転写物を同定した（GroPep Limited、Dunbarらによる国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ０１／０００１０号、２０００年）。ＢＴＣ−δ４と称するこのアイソフォームは、ＢＴＣ遺伝子のエクソン４をコードする１４７ｂｐが欠けており、ＥＧＦドメインのＣループおよび膜貫通型ドメインが欠失する一方で、ループＡとＢおよびその「ヒンジ」であるバリンを含むその成熟分子の残部は、末端が切断されたＣ末端細胞質尾部にインフレームで融合している、通常と異なるＢＴＣ前駆体をコードするｍＲＮＡを生じる。疎水性シグナル配列が保持されていること、および膜貫通型ドメインが存在しないことは、ＢＴＣ−δ４が分泌蛋白質でありうることを示唆している。このＢＴＣスプライス変異体が、ＥｒｂＢ受容体によって媒介される活性の調節に有用であり、従ってＥｒｂＢ発癌遺伝子の過剰発現に伴う癌などの状態の治療に有用であろうということがＰＣＴ／ＡＵ０１／０００１０に提唱された。
【００２４】
続いて、本発明者らは、このスプライス変異体が分泌蛋白質であることを確認した。しかし、本発明者らは、ＢＴＣ−δ４がＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４受容体に結合することも、これを活性化することもなく、ＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ３ホモ二量体にも結合しないことを見出した。従って本発明者らは、ＢＴＣ−δ４は、少なくともＥｒｂＢ１とＥｒｂＢ４受容体およびＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３ホモ二量体に関して機能活性を持たず、ＢＴＣ−δ４から欠損しているコアＥＧＦモチーフが活性に不可欠であるように思われると結論付けた（Dunbarら、２０００）。
【００２５】
そのＥＧＦドメインの第３ジスルフィドループを欠くアイソフォームがＨＢ−ＥＧＦについて報告されている（Loukianovら、１９９７）。この場合は、エクソンＩＩＩとＩＶの間の９４ｂｐの挿入が、フレームシフトおよび成熟前終結を引き起こし、それにより、シグナルペプチド、プロ領域、ヘパリン結合ドメイン、およびＥＧＦモチーフの最初の２個の保存されたジスルフィドループを保持する一方で、短い９アミノ酸の尾部が第３ジスルフィドループ、膜貫通型ドメイン、および細胞質ドメインに取って代わった蛋白質を生じる。
【００２６】
米国特許第６，８２５，１５９号は、配列番号３８として同定されたベータセルリン変異体を開示し、この変異体が無傷のベータセルリン活性および低下したＥＧＦ活性を有することを示唆している。配列番号３８は、６個全てのシステインを含み、Ｃ５−Ｃ６ループが欠けている点で、本発明のポリペプチドとは異なる。
【特許文献１】米国特許第４，２５６，１０８号明細書
【特許文献２】米国特許第４，１６０，４５２号明細書
【特許文献３】米国特許第４，２６５，８７４号明細書
【特許文献４】米国特許第６，８２５，１５９号明細書
【非特許文献１】Remington's Pharmaceutical Sciences, 第２０版, Williams & Wilkins, Pennsylvania, USA
【非特許文献２】Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher,およびWingfield: “Current protocols in Protein Science” (1999) Volumes IおよびII (John Wiley & Sons Inc.)
【非特許文献３】Sambrook, Fritsch,およびManiatis: “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2001)
【非特許文献４】Shuler, M.L. :Bioprocess Engineering: Basic Concepts (第２版、Prentice-Hall International, 1991)
【非特許文献５】Glazer, A.N., DeLange, R.J.,およびSigman, D.S.: Chemical Modification of Proteins (North Holland Publishing Company, Amsterdam, 1975)
【非特許文献６】Graves, D.J., Martin, B.L.,およびWang, J.H.: Co- and post-translational modification of proteins: chemical principles and biological effects (Oxford University Press, 1994)
【非特許文献７】Lundblad, R.L. (1995) Techniques in protein modification.  CRC Press, Inc. Boca Raton, Fl. USA
【非特許文献８】Goding, J.W Monoclonal Antibodies: principles and practice (Academic Press, New York: 第３版1996)
【非特許文献９】Guo et al, 2004; Bohren et al, 2004
【非特許文献１０】Remington's Pharmaceutical Sciences, 第２０版 Williams & Wilkins (2000)
【非特許文献１１】The British National Formulary 第４３版 (British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 2002; http://bnf.rhn.net)
【非特許文献１２】Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (第７版、１９８５)
【非特許文献１３】Langer, Science, 249: 1527, (1990)
【非特許文献１４】Endocrinology 142: 5379-5385, 2001
【非特許文献１５】Am J Physiol 285: E577-E583, 2003
【発明の開示】
【００２７】
要旨
今回、本発明者らは、ＢＴＣ−δ４とＥｒｂＢ受容体の結合が明らかに欠如しているにもかかわらず、ＢＴＣ−δ４が、β細胞の分化を刺激し、β細胞量を増大し、β細胞の機能低下を減少させ、そしてβ細胞によるインスリン分泌を増大させることを見出した。ＢＴＣ−δ４は、β細胞分化の刺激因子として真正ＢＴＣより高い有効性を有する。しかしＢＴＣ−δ４の細胞増殖促進活性は、欠如しているか、または真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している。
【００２８】
第１態様では、本発明は、糖尿病状態に罹患しているかまたは罹患する危険性がある被験体において、糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させる方法であって、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有し、かつその細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減しているポリペプチドを、被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２９】
第２態様では、本発明は、糖尿病状態に罹患しているかまたはその危険性がある被験体において、糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させる方法であって、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドをコードする核酸を被験体に投与するステップを含み、その際、該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している方法を提供する。
【００３０】
第３態様では、本発明は、糖尿病状態に罹患している被験体において、糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させるための膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドの使用であって、その際、該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している使用を提供する。
【００３１】
第４態様では、本発明は、糖尿病状態に罹患しているかまたは罹患する危険性がある被験体において、糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させるための、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドをコードする核酸の使用であって、その際、該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している使用を提供する。
【００３２】
第５態様では、本発明は、糖尿病状態に罹患しているかまたは罹患する危険性がある被験体において、糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させる医薬を製造するための、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドの使用であって、その際、該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している使用を提供する。
【００３３】
第６態様では、本発明は、糖尿病状態に罹患しているかまたは罹患する危険性がある被験体において、糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させる医薬を製造するための、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドをコードする核酸の使用であって、その際、該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している使用を提供する。
【００３４】
好ましくは、被験体においてＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４受容体を活性化する前記ポリペプチドの能力は、真正ＢＴＣと比較して大幅に低減しており、また、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化は、他の細胞型の増殖を刺激することなく刺激される。好ましくは、その線維芽細胞細胞増殖促進活性は欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している。好ましくは、上皮細胞増殖促進活性は欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している。
【００３５】
糖尿病状態は、２型糖尿病または１型糖尿病であることが好ましい。
【００３６】
第７態様では、本発明は、糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させるための組成物であって、膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有するポリペプチドを、薬学的に許容される担体と共に含み、かつ、該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している組成物を提供する。
【００３７】
第８態様では、本発明は、糖尿病状態を治療し、予防し、またはその発症を遅延させるための組成物であって、膵島細胞前駆細胞を膵β細胞へ分化させる刺激能を有するポリペプチドをコードする核酸を、薬学的に許容される担体と共に含み、かつ該ポリペプチドの細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減している組成物を提供する。
【００３８】
好ましくは、本ポリペプチドの細胞型の増殖を刺激する能力は欠如しているかまたは真正ＢＴＣと比較して低減しており、また、本ポリペプチドのＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４受容体を活性化する能力は欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその能力と比較して低減している。その線維芽細胞細胞増殖促進活性は欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減しているのが好ましい。その上皮細胞増殖促進活性は、欠如しているかまたは真正ＢＴＣのそれと比較して低減しているのが好ましい。
【００３９】
好ましくは、本ポリペプチドのＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ３ホモ二量体を活性化する能力は欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその能力と比較して低減している。
【００４０】
治療の副作用として、被験体において癌が生じる危険性は、真正ＢＴＣでの治療から生じる危険性と比較して低減されうる。
【００４１】
本ポリペプチドは、ＥＧＦファミリーのメンバーと実質的に相同であるのが好ましい。より好ましくは、本ポリペプチドは、上皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子、エピレグリン、アンフィレグリン、ＥｒｂＢキナーゼに対する神経由来および胸腺由来アクチベーター（ＮＴＡＫ）、ニューレグリン・サブファミリーのメンバー（ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４）、あるいはベータセルリン（ＢＴＣ）と実質的に相同である。本ポリペプチドは、ＢＴＣ−δ４と実質的に相同であることがさらにいっそう好ましい。本ポリペプチドはＢＴＣ−δ４であることが最も好ましい。ＢＴＣ−δ４ポリペプチドは、図４に示すアミノ酸配列を有する（配列番号：１１〜１５）。
【００４２】
本ポリペプチドは、
（ａ）真正ＢＴＣをコードする遺伝子中に通常存在するＣ５−Ｃ６ジスルフィドループが欠如しているＢＴＣのスプライス変異体、または
（ｂ）分子（ａ）の配列と実質的に相同な配列を有するポリペプチド、または
（ｃ）分子（ａ）の類似体、断片、突然変異体、誘導体、もしくはアレル変異体
でありうる。
【００４３】
本ポリペプチドは、
（ａ）真正ＢＴＣをコードする遺伝子中に通常存在する核酸配列によってコードされるＣ５−Ｃ６ジスルフィドループが欠如し、かつループＡとＢおよびその「ヒンジ」であるバリンを含む真正ＢＴＣポリペプチド分子をコードする核酸配列の残部が、末端切断されたＣ末端細胞質尾部をコードする核酸配列にインフレームで融合している、ＢＴＣのスプライス変異体、
（ｂ）分子（ａ）と実質的に相同な配列を有するポリペプチド、または
（ｃ）（ａ）の断片、類似体、変異体、または誘導体
でありうる。
【００４４】
本ポリペプチドは、β細胞の分化因子として作用すること、β細胞量を増大させること、β細胞の機能低下を減少させること、および／またはβ細胞によるインスリン分泌を増加させることができるのが好ましい。
【００４５】
その断片、類似体、変異体、または誘導体は以下のものである。
【００４６】
（ａ）そのアミノ酸残基の一つまたはそれ以上が、保存された、または保存されていないアミノ酸残基によって置換され、好ましくは保存されたアミノ酸残基によって置換されており、そのような置換されたアミノ酸残基が、その遺伝暗号によってコードされていても、いなくてもよいもの。
【００４７】
（ｂ）アミノ酸残基の一つまたはそれ以上が置換基を含むもの。
【００４８】
（ｃ）その成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させるために、別の化合物と融合されているもの、または
（ｄ）追加のアミノ酸がその成熟ポリペプチドに融合されているもの。
【００４９】
治療の副作用として、被験体において癌が生じる危険性は、ＢＴＣでの治療に伴う危険性と比較して低減されうる。
【００５０】
好ましくは、被験体は、以下の糖尿病危険因子：耐糖能障害、メタボリック症候群、１型または２型糖尿病の家族歴、肥満、多嚢胞性卵巣症候群、高血圧症、または高コレステロールレベルのうち一つまたはそれ以上を有する。
【００５１】
本発明が、本発明のその範囲内に、インビトロおよび／またはインビボでβ細胞の分化因子として作用し、インビトロおよび／またはインビボでβ細胞量を増大させ、インビトロおよび／またはインビボでβ細胞の機能低下を減少させ、および／またはインビトロおよび／またはインビボでβ細胞によるインスリン分泌を増加させることができる、本明細書で「類似の増殖因子変異体」として定義したペプチド増殖因子のＥＧＦファミリーの他のメンバーの変異形態の使用が含まれることは明瞭に理解されるであろう。これらの変異形態では、その真正ポリペプチド中に通常存在するアミノ酸残基は、それがＢＴＣ−δ４に存在しないのと同様に欠如している。その真正分子中に通常存在するＣ５−Ｃ６ジスルフィドループがＢＴＣ−δ４と同様に欠如しているのが好ましい。ＥＧＦファミリーから選択される適当な真正ポリペプチドには、上皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子、エピレグリン、アンフィレグリン、ＥｒｂＢキナーゼに対する神経由来および胸腺由来アクチベーター（ＮＴＡＫ）、ならびにニューレグリン・サブファミリーのメンバー（ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４）が含まれる。そのような変異形態は、本発明のＢＴＣ−δ４ポリペプチドに見出される変異形態と類似する形で機能すると推定されるが、ただしそれらの変異形態は先に定義した機能特性を有する。
【００５２】
本明細書に開示したポリペプチドのアミノ酸配列が一旦判明すれば、ＢＴＣ−δ４も他の増殖因子の類似変異体も、固相ポリペプチド合成などの化学的手段または組換え法によって合成できることは理解されよう。それらの方法の全ては、当技術分野で周知である。
【００５３】
本ポリペプチド分子はヒト起源のアミノ酸配列を有するのが好ましい。しかし、本発明は、非ヒト哺乳動物由来ＢＴＣ−δ４の使用も包含し、本発明のＢＴＣ−δ４ポリヌクレオチドは、当技術分野で慣用の方法を使用して他の哺乳動物細胞から対応するポリヌクレオチドを単離するためのプローブとして容易に使用することができる。
【００５４】
すなわち、本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、単離した天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであってよく、組換えポリペプチドであることが好ましい。
【００５５】
本発明の方法は、２型糖尿病状態の治療および２型糖尿病状態の予防もしくはその発症の遅延に有用である。さらに、１型糖尿病は、β細胞の消失およびβ細胞の機能の完全消失によって特徴付けられるので、本発明はまた、１型糖尿病状態の治療または１型糖尿病状態の予防もしくはその発症の遅延に有用である。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、任意に免疫抑制剤と共に投与することができる。適当な免疫抑制剤には、コルチコステロイド；レミケードなどのＴＮＦ−α抗体；およびエンブレルなどの可溶性ＴＮＦ−α受容体が含まれる。１型糖尿病またはＬＡＤＡの治療にはそのような併用治療が好ましいと思われ、その際、免疫攻撃を抑制しないと、いずれの新規なβ細胞も依然として免疫攻撃にさらされるであろう。
【００５７】
本発明の方法によって、真正ＢＴＣの使用と比較して発癌の危険性が低下すると思われる。本発明者は、ＢＴＣ−δ４が、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４受容体を活性化することができず、そのためＥｒｂＢによって刺激される細胞増殖が阻止され、それによって治療の副作用としての癌の危険性が減少し、または回避されることを見出した。
【００５８】
本発明の方法および組成物は、特に、ヒトの糖尿病状態を医学的に治療する際の使用に適切であることを企図しているが、それらはまた、イヌやネコなどのコンパニオンアニマル、ならびにウマ、ウシ、およびヒツジなどの家畜、あるいは非ヒト霊長類、ネコ科、イヌ科、ウシ科、および有蹄動物などの動物園の動物の治療を含む動物治療に利用することもできる。
【００５９】
本発明のポリペプチドは、一般的に、医薬組成物の形で投与される。医薬組成物を製造するための方法および医薬用担体は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第２０版, Williams & Wilkins, Pennsylvania, USAなどの教本に記載されているように当技術分野で周知である。
【００６０】
担体もしくは希釈剤、および他の賦形剤は投与経路に依存し、また当業者が、それぞれの特定な事例に合わせて最も適当な処方を容易に決定することもできる。
【００６１】
本発明の化合物および組成物は、任意の適当な経路により投与することができ、当業者は、治療しようとする状態に対して最も適当な経路および用量を容易に決定することができる。投薬量は、担当内科医または獣医の裁量に任せられ、治療しようとする状態の性質および状況、治療しようとする被験体の年齢および全身的な健康状態、投与経路、ならびに既に投与されている可能性があるあらゆる前治療に依存する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
詳細な説明
特に明記しない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似の、または同等のいかなる物質および方法も、本発明を実施しまたは試験するために使用することができるが、好ましい物質および方法を記載する。
【００６３】
定義
本明細書で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から明瞭にそうではないことが示されない限り、その対応する複数の意味を包含する。従って、例えば、「ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ」というときには複数個のそのような酵素が含まれ、「ａｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ」というときは一個または複数個のアミノ酸が含まれる。
【００６４】
本発明の説明および続く特許請求の範囲では、言語的意味または必要な意味を表現するためにそうではないことが要求される場合を除き、「含む（comprise）」という単語、または「comprises」もしくは「comprising」などの変化形は、包含的意味で使用され、すなわち、様々な本発明の実施形態で述べた特徴を特定するために使用されるが、さらなる特徴の存在または追加を排除するものではない。
【００６５】
本明細書で使用する「被験体」という用語は、薬学的に活性な薬剤での治療を必要とする糖尿病状態を示す任意の動物をさす。被験体は、ヒトであってよく、または家畜もしくはコンパニオンアニマルであってもよい。本発明の化合物は、ヒトの医学的治療における使用に適当であることを特に企図しているが、これらはまた、イヌやネコなどのコンパニオンアニマル、ならびにウマ、ウシおよびヒツジなどの家畜、あるいは非ヒト霊長類、ネコ科、イヌ科、ウシ科、および有蹄動物など、動物園の動物の治療を含む動物の治療に適用することができる。
【００６６】
本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、所望の治療応答を得るのに有効な、例えば、薬学的に活性な薬剤の投与による治療に感受性の高い疾患を予防し、または治療するのに有効な本発明の化合物の量を意味する。
【００６７】
特定の「治療有効量」は、もちろん、治療する個々の病的状態、被験体の身体状態および病歴、治療する動物の種類、治療期間、（もしもあれば）併用療法の性質、ならびに使用する特定の製剤およびその化合物もしくはその誘導体の構造などの要因によって異なるであろう。
【００６８】
治療組成物中のポリペプチド濃度は決定的なものではないが、糖尿病状態を治療し、または糖尿病状態の発症を予防し、もしくは遅らせるのに有効な量であるべきである。本明細書においてＢＴＣ−δ４ポリペプチドを使用する全ての方法で使用される「有効量」という用語は、９５％信頼水準（すなわち、その効果が偶然のみによるものであればｐ＜０．０５）で統計上有意な応答を引き出すのに十分な量を意味する。使用するポリペプチドの量は、そのポリペプチドまたはそのポリペプチドを含む製剤に対する、インビトロでの細胞の応答および実験動物の応答に基づいて経験的に決定することができる。使用するポリペプチドの量は、インビボでのβ細胞の分化、インビボでのβ細胞量の増大、インビボでのβ細胞の機能低下の減少、および／またはインビボでのβ細胞によるインスリン分泌の増大を引き出すのに十分であるべきである。平均して、体重約７５ｋｇの患者の一日量は少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、１ｍｇ／ｋｇ体重が好ましい。
【００６９】
本明細書で使用する「医薬用担体」は、ＢＴＣ−δ４および／または他の薬学的に活性な薬剤を被験体に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤、賦形剤、またはビヒクルである。担体は、液体でも固体でもよく、念頭に置いている計画した投与法と共に選択する。
【００７０】
本明細書で使用する「糖尿病状態」という用語は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＭＭ）としても知られている１型糖尿病、および非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても知られている２型糖尿病の両方を含む。
【００７１】
本発明のスプライス変異体は、ＢＴＣ−δ４と呼ばれ、本明細書ではＢＴＣ−δ４をコードするポリヌクレオチドをＢＴＣ−δ４ポリヌクレオチドと称する。ＢＴＣに関して使用する場合、「真正」という用語は１７８アミノ酸の完全長または成熟可溶性の成熟ＢＴＣ蛋白質を意味する。
【００７２】
「実質的に相同な配列」という用語は、本明細書に開示した特定のＢＴＣ−δ４配列に機能的に同等であり、具体的に開示したポリペプチド配列中に置換、欠失および挿入を含むポリペプチドをさす。
【００７３】
本発明のポリペプチドに関する場合、「断片」、「類似体」、「変異体」、および「誘導体」という用語は、このポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持する分子を意味する。すなわち、類似体はプロタンパク質部分を切断することによって、活性化されて活性成熟ポリペプチドを生成できるプロタンパク質を含む。
【００７４】
「断片」という用語は、その断片が機能的に活性である場合に限るが、完全長配列の任意のサイズの一部またはドメインを含むことは明瞭に理解されよう。「配列の断片」または「配列の一部」という用語は、言及する元の配列の末端切断された配列を意味する。末端切断された配列（核酸またはポリペプチド配列）は、長さが広く様々なものであってよく、下限サイズは、言及する元の配列に少なくとも匹敵する機能および／または活性を備えた配列を提供するのに十分なサイズの配列でありうるが、最大サイズは重要ではない。いくつかの実施形態では、通常、最大サイズは、元の配列の所望する活性および／または機能を提供するために必要なサイズを実質的に超えない。典型的には、末端切断されたアミノ酸配列は少なくとも約５アミノ酸長である。しかし、より典型的には、その配列は少なくとも約５０アミノ酸長であり、好ましくは少なくとも約６０、８０、１００、１２０、１５０、２００、または２２０アミノ酸である。断片配列には、さらにアミノ酸が隣接していてもよく、または当業者に公知の方法によって改変されていてもよい。改変された蛋白質は、その天然蛋白質の少なくとも一つの生物活性を維持していなければならない。断片は、酸化形態または還元形態で、またはコンジュゲートした基もしくは保護基と連結して使用しうる。例えば、断片は担体分子にコンジュゲートしてもよい。
【００７５】
蛋白質の「変異体」は、図４に示す蛋白質の相同物、および蛋白質の二次構造が変化しないまま残るような保存的置換を有する蛋白質を含む。そのような保存的置換の例には、元のアミノ酸残基と実質的に同じ疎水性、サイズ、および電荷を有するアミノ酸残基が含まれる。そのような置換は、一般的に、蛋白質化学の当業者にはよく知られている。例えば、保存的置換には、グリシンの代わりにプロリンそしてその逆、グリシンの代わりにアラニンもしくはバリンそしてその逆、ロイシンの代わりにイソロイシンそしてその逆、リジンの代わりにヒスチジンそしてその逆、アスパラギンの代わりにセリンそしてその逆、システインの代わりにトレオニンそしてその逆、トレオニンの代わりにセリンもしくはアラニンそしてその逆、アスパラギンの代わりにグルタミンそしてその逆、チロシンの代わりにトリプトファンそしてその逆、およびグルタミン酸の代わりにアルギニンそしてその逆も含まれる。
【００７６】
蛋白質「誘導体」という用語は、一個または数個のアミノ酸残基が、２０種の天然アミノ酸の、天然アミノ酸相同物もしくは合成アミノ酸相同物によって置換されている蛋白質を含む。そのような相同物の例は、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、ホモセリン、β−アラニン、４−アミノブタン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンなどである。
【００７７】
本明細書で使用する天然アミノ酸残基は、一般に蛋白質で見出される２０種のアミノ酸残基（すなわち、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン、およびバリン）であり、そのようなアミノ酸のＤ体およびＬ体も含まれる。
【００７８】
本明細書で使用する合成アミノ酸残基は、タンパク質中に見出されるものであれ、天然に見出されるものであれ、または合成により生成されたものであれ、他のいかなるアミノ酸残基のＤ体およびＬ体をも含む。合成アミノ酸残基には、それだけには限らないが、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γアミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンなどが含まれる。
【００７９】
値の範囲が示されている場合、この範囲が、範囲の上限および下限、およびこれらの境界値の間にある全ての値を包含することは明瞭に理解されよう。
【００８０】
本発明は、本明細書に記載した特定の物質および方法だけには限られない（それらは変動しうるので）ことは明瞭に理解されよう。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみについて記述することを目的とし、本発明の範囲を制限する意図はなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによってに制限されることはさらに理解されよう。
【００８１】
別段の指示が無い限り、本発明は、当業者の能力の範囲内にある従来の化学、蛋白質化学、分子生物学的および酵素学的技術を使用する。そのような技術は、当業者に公知であり、文献に十分に説明されている。例えば以下を参照のこと。Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher,およびWingfield: “Current protocols in Protein Science” (1999) Volumes IおよびII (John Wiley & Sons Inc.)；Sambrook, Fritsch,およびManiatis: “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2001)；Shuler, M.L. :Bioprocess Engineering: Basic Concepts (第２版、Prentice-Hall International, 1991)；Glazer, A.N., DeLange, R.J.,およびSigman, D.S.: Chemical Modification of Proteins (North Holland Publishing Company, Amsterdam, 1975)； Graves, D.J., Martin, B.L.,およびWang, J.H.: Co- and post-translational modification of proteins: chemical principles and biological effects (Oxford University Press, 1994)；Lundblad, R.L. (1995) Techniques in protein modification.  CRC Press, Inc. Boca Raton, Fl. USA；およびGoding, J.W Monoclonal Antibodies: principles and practice (Academic Press, New York: 第３版. 1996)。
【００８２】
本発明の方法は、
（ａ）糖尿病を治療するための第２の薬学的に活性な薬剤を投与する前の、その投与と一緒の、またはその投与後のＢＴＣ−δ４の投与、または
（ｂ）ＢＴＣ−δ４と糖尿病を治療するための第２の薬学的に活性な薬剤の組み合せの投与
を含みうる。
【００８３】
本明細書で使用する略語は以下の通りである。
【００８４】
ｂｐ              塩基対
ＢＴＣ            ベータセルリン
ＣＭ              培養培地
ＤＭＥＭ          ダルベッコ最小必須培地
ＥＧＦ            上皮細胞増殖因子
ＥＩＡ            酵素イムノアッセイ
ＥＬＩＳＡ        酵素結合免疫吸着アッセイ
ＩＤＭＭ          インスリン依存性糖尿病
ＩＧＴ            耐糖能障害
ＬＡＤＡ          成人潜在性自己免疫性糖尿病
ＮＩＤＭＭ        非インスリン依存性糖尿病
ＰＣＲ            ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＰ              膵臓ポリペプチド
ＰＢＳ            リン酸緩衝生理食塩水
ＲＴ−ＰＣＲ      逆転写酵素ＰＣＲ
ＳＤ              標準偏差
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＴＺ            ストレプトゾトシン
耐糖能障害（ＩＧＴ）としても知られる前糖尿病は、約４１００万人の米国人が患い、２型糖尿病および心血管疾患の前兆である。米国糖尿病学会（ＡＤＡ）は、血糖値は正常より高いが、２型糖尿病と診断されるほど十分に高くない状態として前糖尿病を定義する。体重減少および身体的活動の増加に加えて、臨床試験では、前糖尿病が慢性疾患状態に進行する前のピコリン酸クロムによる栄養補充の有効性を試験している。
【００８５】
糖尿病状態を引き起こす恐れがあり、または糖尿病症状に関連付けられる、可能性のある根本にある状態には、以下のものが含まれる。メタボリック症候群（高血圧症、肥満／過体重、および高コレステロール）、血色素症、慢性膵炎、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、カルチノイド症候群、膵臓への手術または外傷、下垂体機能亢進、副腎機能亢進、膵臓機能不全、末端肥大症、クラッシュ症候群、嚢胞性線維症、腺癌、ソマトスタチン産生腫瘍、アルドステロノーマ誘導低カリウム血症、クロム親和細胞腫、原発性アルドステロン症、Wolfram症候群、妖精症、Rabson-Mendenhall症候群、stiff man症候群、自己免疫リンパ球増殖症候群；高プロラクチン血症、甲状腺機能亢進症、ＰＯＥＭＳまたはCrow-Fukase症候群（多発ニューロパシー、臓器巨大症、内分泌疾患、Ｍ蛋白質、および皮膚変化）；プロラクチン産生腺腫；Kearns-Sayre症候群；ナイアシン過剰摂取、並びに２型多腺性内分泌欠乏症候群。
【００８６】
特に、２型糖尿病の危険因子には、ＩＧＴ、２型糖尿病家族歴、肥満、高血圧症、高コレステロールレベル、および坐位生活様式のうち一つまたはそれ以上が含まれる。特定の民族、特にアフリカ系、ヒスパニック系、およびメキシコ系アメリカ人、オーストラリア先住民、および太平洋諸島民は２型糖尿病の発症が多いことが知られている。妊娠に伴う要因もまた含まれる。妊娠性糖尿病歴、流産、死産、または巨大児もしくは先天異常がある児の出産は全て、２型糖尿病の発症の増加に関連するからである。
【００８７】
近年、低分子ユビキチン様修飾因子として知られている遺伝子（ＳＵＭＯ−４）の変異が、１型糖尿病ではない個人よりも１型糖尿病の個人に多く見受けられ、この遺伝子が、一部の家族では１型糖尿病に関連付けられることが報告されている（Guoら, 2004; Bohrenら, 2004）。
【００８８】
糖尿病状態の診断方法は当業者に公知である。典型的には、ヒトの糖尿病状態を診断するために次の２種類の検査が使用されている。  
（１）空腹時血中グルコースレベル：糖尿病を診断するための「判断基準」は、終夜絶食（真夜中以後食餌摂取をしない）後の高血糖レベルである。少なくとも２回の検査で１４０ｍｇ／ｄｌを超える値によって、糖尿病であると診断される。正常な被験体の空腹時血糖値は７０〜１１０ｍｇ／ｄｌである。
【００８９】
経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）：経口グルコース耐性試験は、診察室または研究室で実施することができる。グルコースチャレンジ後３時間にわたって５回、血中グルコースレベルを測定する。被験体は空腹状態（少なくとも１０時間であるが多くても１６時間未満の間は水以外は食物や飲物を摂らない）で検査を開始する。最初の血液試料を採取し、次いで被験体に高グルコース飲料（７５ｇのグルコース；妊娠中の女性には１００ｇ）を与える。高グルコース飲料の摂取から３０分、１時間、２時間、および３時間後にさらに血液試料を採取する。非糖尿病者では、血液中のグルコースレベルはグルコースチャレンジ後に上昇するが、次いで急速に正常に戻る。糖尿病被験体では、グルコースチャレンジ後、正常レベルを超えてグルコースレベルは上昇し、非常にゆっくりと正常レベルに戻る。
【００９０】
ＥｒｂＢファミリーに対する哺乳動物リガンドには、ＥＧＦ（Savageら、１９７２）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）（Marquardtら、１９８４）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Higashiyamaら、１９９１）、エピレグリン（Toyodaら、１９９５）、アンフィレグリン（Shoyabら、１９８９）、ＥｒｂＢキナーゼに対する神経および胸腺由来アクチベーター（ＮＴＡＫ）（Higashiyamaら、１９９７）、ニューレグリン（ＮＲＧ）・サブファミリー（４つの遺伝子の産物である（ＮＲＧ１）（Marchionniら、１９９３）、ＮＲＧ２（Changら、１９９７；Carrawayら、１９９７）、ＮＲＧ３（Zhangら、１９９７）およびＮＲＧ４（Harariら、１９９９）を含む）、およびベータセルリン（ＢＴＣ）（Shingら、１９９３）が含まれる。
【００９１】
ＢＴＣ−δ４ポリペプチドおよびその変異体は、概括的にＰＣＴ／ＡＵ０１／０００１０（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本ポリペプチドを産生するのに適当な方法は、当技術分野で広く利用することができる。組換えＤＮＡ技術を使用するのが好ましい。
【００９２】
例えば、ＢＴＣ−δ４ポリヌクレオチド配列をＭＣＦ−７細胞から単離する。その配列には、１２９アミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームが含まれる。そのポリヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレーム内の１４７ｂｐ（４９アミノ酸をコードする）が欠失し、その結果、ＥＧＦドメイン中に通常存在するＣ５−Ｃ６ジスルフィドループが欠如していること以外は、ヒトＢＴＣの配列と同一である（図２Ｂおよび３参照）。これは、ヒトＢＴＣ遺伝子のエクソンの一つの選択的ｍＲＮＡスプライシング（エクソンスキッピング）の結果として生じた。
【００９３】
ＢＴＣ−δ４ポリヌクレオチドは、ＢＴＣ−δ４をコードするｍＲＮＡを発現する様々な細胞源から得ることができる。本発明者らは、ＢＴＣ−δ４ポリヌクレオチドにとって適当な多数のヒト細胞源を同定したが、それには腎臓、肝臓、膵臓、およびＭＣＦ−７などの様々な乳癌細胞系が含まれるが、それだけには限られない。
【００９４】
例えば、ＢＴＣ−δ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞源から単離精製したＲＮＡからｃＤＮＡクローニングすることによって得ることができる。クローンのｃＤＮＡライブラリーは、当業者に周知の技術を使用し調製することができ、そしてそのＢＴＣ遺伝子の任意の部分に実質的に相補的なヌクレオチドプローブを用いて、ＢＴＣ−δ４をコードするＤＮＡについてスクリーニングすることができる。本発明のＢＴＣ−δ４ポリヌクレオチドを得るために、様々なＰＣＲクローニング技術を使用することもできる。
【００９５】
従って、本発明のＢＴＣ−δ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＢＴＣ遺伝子の一部分をコードするポリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、ＰＣＲによって得ることができる。プライマーは、最も５’および３’側のコード領域を含むのが好ましい。オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列、またはそれと実質的に相同な配列を有するのがより好ましい：
５’ＧＡＧＣＧＧＧＧＴＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧ  ３’（配列番号１）
５’ＴＴＡＡＧＣＡＡＴＡＴＴＴＧＴＣＴＣＴＴＣ  ３’（配列番号２）。
【００９６】
宿主細胞を本発明のベクター、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターで形質転換し、またはトランスフェクトする。当業者は、ＢＴＣ−δ４ポリペプチドを組換え発現させるために、様々な発現ベクター／宿主系は、等しく首尾よく使用することができる。そのような系には、それだけには限らないが、所望のＢＴＣ−δ４ポリヌクレオチドコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物；所望のＢＴＣ−δ４ポリヌクレオチドコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母；所望のＢＴＣ−δ４ポリヌクレオチドコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；あるいは所望のＢＴＣ−δ４ポリヌクレオチドコード配列を含む適当な哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトした動物細胞系が含まれる。
【００９７】
適当なＤＮＡ配列は、様々な手順によりベクター中に挿入することができる。一般に、ＤＮＡ配列は、当業者に周知の手順により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。
【００９８】
発現ベクターに挿入したＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を目的として発現制御配列（プロモーター）に作動的に結合させる。使用する宿主／ベクター系に応じて、任意の適当な転写／翻訳エレメントを使用することができる。例えば、大腸菌などの原核生物細胞中にクローニングする場合は、ｔｒｃまたはＴ７プロモーターを使用でき、哺乳動物発現系にクローニングする場合は、哺乳動物細胞のゲノムから単離したプロモーター（例えば、マウスメタロチオネインプロモーター）、またはこれらの細胞中で増殖するウイルスから単離したプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ）プロモーター）を使用することができる。組換えＤＮＡ技術または合成技術によって作製したプロモーターは、挿入した配列を転写するために使用することもできる。発現ベクターは、翻訳開始用のリボソーム結合部位および転写ターミネーターをも含有する。挿入したコード配列を効率的に翻訳させるために、特異的開始シグナルもまた必要である。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。その自身の開始コドンおよび隣接配列を含むＢＴＣ−δ４コード配列全体を適当な発現ベクターに挿入する場合には、別の翻訳制御シグナルは必要ないであろう。しかし、ＢＴＣ−δ４コード配列の一部のみを挿入する場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを提供する必要がある。
【００９９】
さらに、開始コドンは、インサート全体を確実に翻訳させるために、ＢＴＣ−δ４コード配列の読み枠と一致していなければならない。これらの外来の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然でも合成でも様々な起源のものであってよい。発現効率は、転写減衰配列、エンハンサーエレメントなどを含めることによって促進できる。
【０１００】
さらに、発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を選択するための表現型形質、例えば、真核細胞用のネオマイシン（Ｇ４１８）耐性、または大腸菌などの原核生物細胞用のアンピシリン耐性を提供するための、一個またはそれ以上の選択マーカー遺伝子を含むのが好ましい。
【０１０１】
本発明のＤＮＡ分子および適当なプロモーターもしくは制御配列を含むベクターを使用して、適当な宿主を形質転換し、またはそれにトランスフェクトして、その宿主にその蛋白質を発現させることができる。
【０１０２】
適当な宿主の代表的な例には、それだけには限らないが、大腸菌などの細菌細胞、ショウジョウバエおよびＳｆ９などの昆虫細胞、ならびにＣＨＯ、ＣＯＳ、または２９３細胞などの動物細胞が含まれる。
【０１０３】
宿主細胞中の構築物は、その組換え配列がコードする遺伝子産物を産生するように、従来の方法で使用することができる。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置によって合成により製造することができる。
【０１０４】
上記のように様々な異なるベクター／宿主発現系で産生された本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む多彩な方法によって、組換え細胞培養物から回収し精製することができる。蛋白質の再折りたたみステップを、必要に応じて所望のポリペプチドの立体形成が完成する上で使用することができる。
【０１０５】
本ポリペプチドは、組織または細胞源から単離し精製した生成物、化学合成手順の産生物、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主を使用し組換え技術によって産生した産生物であってよい。組換え産生手順で使用した宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、グリコシル化または非グリコシル化しうる。
【０１０６】
例えば、ポリペプチドがインビトロで膵臓細胞系の分化を誘導する能力を評価するか、または糖尿病動物モデルで糖尿病症状の重症度を減少させる能力を評価することによる方法は、本発明に従って使用するための、ＢＴＣ−δ４に実質的に相同な配列を有するポリペプチド、またはＢＴＣ−δ４の類似体、断片、突然変異体、誘導体、もしくはアレル変異体を当業者が同定することを可能にするのに利用できる。
【０１０７】
好ましくは、本発明に従って使用するためのＢＴＣ−δ４の類似体、断片、突然変異体、誘導体、またはアレル変異体は、インビトロで以下の生物学的特性を有する。  
（１）そのポリペプチドは、実施例５に記載した方法を使用した場合、ヒト肺線維芽細胞（ＡＧ２８０４）上のＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４受容体から、放射標識した成熟ＢＴＣを除去し取って代わることはない。  
（２）そのポリペプチドは、実施例５に記載した方法を使用した場合、ヒト肺線維芽細胞（ＡＧ２８０４）上のＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４受容体のチロシンリン酸化を誘導しない。  
（３）そのポリペプチドは、実施例６に記載した方法を使用した場合、真正ＢＴＣと同様に、アクチビンＡと一緒になってＡＲ４２Ｊ−Ｂ２０細胞の分化を刺激するが、真正成熟ＢＴＣと比較して細胞生存の促進にはほとんど有効ではない。
【０１０８】
本発明の化合物は、慣用される無毒の薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルを含む単位用量製剤で、経口、経直腸、非経口、または吸入によって投与しうる。本明細書で使用する非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、頭蓋内の注射または輸液技術を含む。
【０１０９】
本発明は、本発明の新規治療法で使用するための適当な局所、経口、エアロゾル、および非経口医薬製剤も提供する。本発明の化合物は、錠剤、水性もしくは油性懸濁剤、ロゼンジ錠、トローチ剤、粉剤、顆粒剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤、またはエリキシル剤として経口投与しうる。経口使用のための組成物は、薬学的に洗練され口当たりのよい調製物を生成するために甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤の群から選択される一種またはそれ以上の物質を含みうる。錠剤は、錠剤の製造に適している無毒の薬学的に許容される賦形剤と混合して活性成分を含む。
【０１１０】
これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、乳糖、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；コーンスターチまたはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤；澱粉、ゼラチン、またはアラビアゴムなどの結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどの滑沢剤であってよい。錠剤は素錠であっても、または消化管での崩壊および吸収を遅らせるための公知の技術によってコーティングしてもよく、それによって長期に渡って持続作用が提供される。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの遅延物質を使用することができる。コーティングは、米国特許第４，２５６，１０８号；同第４，１６０，４５２号；および同第４，２６５，８７４号に記載されている技術を使用し、制御放出用の浸透圧性治療錠剤を形成してもよい。
【０１１１】
ＢＴＣ−δ４および本発明の方法に有用な薬学的に活性な薬剤は、注射によって、あるいは時間とは無関係に、または時間と共に徐々に灌流することによって非経口投与することができる。投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮でありうる。インビトロ研究には、適切な生物学的に許容される緩衝液に薬剤を加え、または溶解して、細胞または組織に加えてよい。
【０１１２】
非経口投与用調製物は、滅菌水溶液または滅菌非水性溶液、懸濁液、および乳濁液を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝化培地を含め、水、アルコール／水溶液、乳濁液、または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液が含まれ、静脈内ビヒクルには、液体補液および栄養補液、リンゲルデキストロースに基づくものなどの電解質補液などが含まれる。保存剤および他の添加物、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、増殖因子、および不活性ガスなども存在しうる。
【０１１３】
一般的に、「治療する（treating）」、「治療（treatment）」などの用語は、本明細書で、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得られるように被験体、組織、または細胞に作用を及ぼすことを意味するために使用される。その効果は、疾患またはその徴候もしくは症状を完全にまたは部分的に防ぐという点で予防的であり、かつ／または疾患の部分的または完全な治癒の点から治療的でありうる。本明細書で使用する「治療する（Treating）」とは、脊椎動物、哺乳動物、特にヒトの疾患のいかなる治療または予防も包含し、その疾患にかかり易い可能性があるが、それにかかっていると診断されていない被験体においてその疾患が発生するのを予防すること；その疾患を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること、あるいは疾患の影響を軽減しまたは改善すること、すなわち、疾患の影響の後退を引き起こすことを含む。
【０１１４】
本発明は、疾患を改善するのに有用な様々な医薬組成物の使用も含む。本発明の一実施形態による医薬組成物は、担体、賦形剤、および添加物もしくは助剤を使用し、ＢＴＣ−δ４、その類似体、誘導体、またはその塩、およびＢＴＣ−δ４の一種もしくはそれ以上の薬学的に活性な薬剤もしくは組合せ、および一種もしくは複数の薬学的に活性な薬剤を、被験体への投与に適した形態にすることによって、調製される。
【０１１５】
よく使用される担体または助剤には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、乳糖、マンニトール、および他の糖類、タルク、乳蛋白質、ゼラチン、澱粉、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物油および植物油、ポリエチレングリコール、ならびに溶媒、例えば、滅菌水、アルコール、グリセロール、および多価アルコールが含まれる。静脈内ビヒクルには、液体補液および栄養補液が含まれる。保存剤には、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスが含まれる。他の薬学的に許容される担体には、塩、保存剤、緩衝液などを含む、水溶液、非毒性賦形剤が含まれ、これらは例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第２０版, Williams & Wilkins (2000)およびThe British National Formulary 第４３版 (British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 2002; http://bnf.rhn.net)に記載されている通りであり、それら文献の内容は参照により本明細書に組み込まれるものとする。本医薬組成物の様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は、当技術分野での慣用の技術に従って調整する。Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (第７版、１９８５)を参照。
【０１１６】
本医薬組成物は、用量単位で調製し投与することが好ましい。固形用量単位には、錠剤、カプセル剤、および座薬が含まれる。被験体の治療には、化合物の活性、投与方法、疾患の性質および重症度、被験体の年齢および体重に応じて、異なる一日量を使用することができる。しかし、一定の状況下では、より多いまたは少ない一日量も適当でありうる。一日量の投与は、個々の用量単位または別の数個のより小さな用量単位の形態での単一投与によって、また細分化した用量を特定の間隔で多数回投与することによっても、行うことができる。
【０１１７】
本発明による医薬組成物は、治療上有効な用量で局所にまたは全身に投与しうる。もちろん、この使用に有効な量は、疾患の重症度並びに被験体の体重および全身状態に依存する。通常は、インビトロで使用した投薬量は、医薬組成物をインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で投与するのに有用な量の役立つ指針を提供し、動物モデルは、細胞傷害性副作用の治療に有効な投薬量を判定するために使用することができる。例えば、Langer, Science, 249: 1527, (1990)には様々な考察が記載されている。経口使用のための製剤は、硬ゼラチンカプセルの形態であってよく、その場合、活性成分は不活性固形希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンと混合される。経口使用製剤は、ソフトゼラチンカプセルの形態であってもよく、その場合、活性成分は水、またはピーナッツ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油などの油性媒体と混合される。
【０１１８】
通常、水性懸濁剤は、活性物質を、水性懸濁液の製造に適当な賦形剤と混合された状態で含む。そのような賦形剤は、懸濁化剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムであってよく、また以下の分散剤もしくは湿潤剤であってもよい：（ａ）レシチンなど、天然のリン脂質、（ｂ）脂肪酸と酸化アルキレンの縮合生成物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、（ｃ）酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレノキシセタノール、（ｄ）酸化エチレンと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルの縮合生成物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、または（ｅ）酸化エチレンと脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルの縮合生成物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンでありうる。
【０１１９】
本医薬組成物は、注射可能な滅菌水性または油性懸濁液の形態でありうる。この懸濁液は、上記したものなどの、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用し公知の方法により製剤化することができる。滅菌注射用調製物は、非毒性かつ非経口で許容される希釈剤または溶媒、例えば、１，３−ブタンジオール溶液中の滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用しうる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来より使用されている。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを始めとする、任意の無刺激性の不揮発性油が使用されるであろう。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射液の調製に使用することができる。
【０１２０】
本発明の化合物は、小型単層膜小胞、大型単層膜小胞、および多層膜小胞などのリポソーム送達系の形態で投与しうる。リポソームは、様々なリン脂質、例えば、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンから形成されうる。
【０１２１】
ＢＴＣ−δ４の投薬量レベルは、通常、１日につき体重１ｋｇ当たり約０．５ｍｇ〜約２０ｍｇであり、好ましい投薬量範囲は体重１ｋｇ当たり約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ（１日につき患者１人当たり約０．５ｇ〜約３ｇ）のオーダーである。担体物質と組み合わせて単回投薬物を生成しうる活性成分の量は、治療しようとする宿主および特定の投与方法に応じて異なる。例えば、ヒトに経口投与することを意図した製剤は、約５ｍｇ〜１ｇの活性化合物を、適当かつ好都合な量の担体物質を含んでよく、この担体物質の量は総組成物の約５〜９５％で変化しうる。一般に、単位剤形には約５ｍｇ〜５００ｍｇの活性成分が含まれる。
【０１２２】
しかし、任意の個々の患者に向けた特定の用量レベルは、使用した特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬物の組合せおよび治療を受ける個々の疾患の重症度を含む様々な要因によって決まることは理解されよう。
【０１２３】
本発明のポリペプチドは、さらに他の化合物に追加混合して効力のある組合せを提供しうる。その組合せがＢＴＣ−δ４の活性を除去しない限り、それは薬学的に活性な薬剤の、任意の化学的に適合する組合せを包含することが意図される。
【０１２４】
ＢＴＣ−δ４の効力を試験するためのインビトロモデル
ＡＲ４２Ｊ−Ｂ２０細胞の分化
膵臓ＡＲ４２Ｊ細胞は、化学的に誘導した膵臓腫瘍に由来し、外分泌特性および神経内分泌特性を示す（Rosewiczら、１９９２）。アクチビンＡで治療すると、ＡＲ４２Ｊ−Ｂ２０細胞は増殖を停止し、その形態は神経突起を伸長させることによって著しく変化する。さらに、アクチビン処理細胞は、ＧＬＵＴ２、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル、および膵臓ポリペプチド（ＰＰ）をコードするｍＲＮＡを発現する。すなわち、アクチビンＡは、ＡＲ４２Ｊ細胞を内分泌細胞へと変換する。
【０１２５】
これらの細胞をＢＴＣ−δ４およびアクチビンＡで処理すると、それらはさらにインスリン産生細胞に変換される。ＢＴＣ−δ４に応答したインスリンの産生は、細胞を抗インスリン抗体で染色後、免疫蛍光法によって検出することができる。あるいは、ＡＲ４２ＪクローンのＡＲ１８９８−０１９２は、ＡＲ４２Ｊ細胞のインスリン分泌細胞へ分化を定量的に測定するために使用できる。このクローンは、ラットインスリンＩＩ遺伝子プロモーター下流に、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を含む。これらの細胞をＢＴＣ−δ４で刺激すると、酵素的に測定することができるアルカリホスファターゼが培地中に合成および分泌される。
【０１２６】
不死化された上皮細胞系
膵臓前駆細胞細胞系が、温度感受性ＳＶ４０  Ｔ抗原を保持するトランスジェニックマウス（Immortomouse）の膵管から単離された（Sharmaetal、２００１）。これらのマウスから得た細胞を３３℃で培養すると、ＳＶ４０  Ｔ抗原が発現され、細胞は条件的に不死化されるが、３７℃では、Ｔ抗原の発現は中断され、細胞は適切に分化する。すなわち、３３℃で増殖させた場合のこれらの細胞は膵島／神経内分泌顆粒を示さず、膵島マーカーを発現できない。しかし、３７℃で約２週間培養した後は、約５０％の細胞が死ぬが、残りの細胞は原始的膵島様インスリンおよびグルカゴン顆粒を示す細胞に分化し始める。ヌードマウスの腎臓被膜（kidney capsule）下に移植した場合、いずれの温度で増殖させた細胞も、細胞は腺管様および膵島様表現型を発達させる。
【０１２７】
この細胞系は、インスリン発現およびβ細胞分化を測定するための、上記のものと類似した迅速かつ高感度なアッセイで使用される。この場合は、ラットインスリン１プロモーターを使用して、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）レポーターの発現を駆動する。この細胞系は、生細胞中でＧＦＰ蛍光によってアッセイするような、インスリンなどのβ細胞特異的遺伝子の発現を刺激するＢＴＣ−δ４などのβ細胞分化因子を同定するための非常に高感度な方法を提供する。
【０１２８】
２型糖尿病インビボモデル
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）モデル（実施例７を参照）に加えて、ＢＴＣ−δ４のインビボ活性を試験する上で使用するために、多数の他の２型糖尿病の動物モデルを利用することができる。これらのモデルには、例えばラットでの膵切除による、２型糖尿病の外科的作製（Bonner-Weirら、１９８３）、および選抜育種に基づく遺伝的モデルが含まれる。遺伝的モデルには、Goto-Kakizaki（ＧＫ）ラット、自然発症糖尿病Torii（ＳＤＴ）ラット、Otsuka-Long-EVANS-Tokushima脂肪（ＯＬＥＴＦ）ラット、ｄｂ／ｄｂマウス、およびＮＯＤ／Ｌｔｊマウスが含まれる。
【０１２９】
Goto-Kakizaki（ＧＫ）ラットは、ヒト糖尿病疾患で見られるものと同様の代謝疾患、ホルモン疾患および血管疾患を示す。他の多くの２型糖尿病げっ歯類モデルとは異なり、ＧＫラットは肥満ではない。Goto-Kakizakiラットの特性には、空腹時高血糖、インビボおよび単離した膵臓細胞の両方でのグルコースに応答したインスリンの分泌障害、ならびに肝臓および末梢インスリン抵抗性が含まれる。文献には網膜症、微小血管障害、ニューロパシー、および腎症などの後期合併症が記載されている。
【０１３０】
自然発症糖尿病Torii（ＳＤＴ）ラットモデルでは、１４週間後に雄ラットが、インスリン分泌障害を伴う耐糖能障害を自然発症し、２０週間後に著しい高血糖および顕著な低インスリン血症を伴う糖尿病を発症する。糖尿病Long-Evansラットは、軽度肥満および１８週齢後の遅発性高血糖症、それに慢性糖尿病に関する合併症によって特徴付けられる。遺伝的解析によって多数の座位が同定されているが、これらのラットにおける糖尿病の原因は、ヒト２型糖尿病と同様に、インスリン抵抗性およびインスリン分泌障害の組合せであると思われる。Otsuka-Long-EVANS-Tokushima脂肪（ＯＬＥＴＦ）ラットは、ヒト２型糖尿病と同様に、インスリン抵抗性およびインスリン分泌障害の自然発生的組合せかに由来している。これらのラットでは、インスリン感受性は加齢と共に減少し、すなわち、同年齢の対照Long-EVANSラット、Tokushima  Otsuka（ＬＥＴＯ）ラットと比較して、６週間で正常に、１２週間で４０％低下し、１８週間後には８０％低下する。インスリン分泌は４０週間で損なわれており（１４）、膵島β細胞への脂肪毒性は、高トリグリセリド血症ＯＬＥＴＦラットでは膵島機能不全の病因に関与している可能性がある。さらに、ＯＬＥＴＦラットは、ＬＥＴＯラットと比較して膵β細胞の再生能力が低い（１７）。慢性進行型の糖尿病であるために、ＯＬＥＴＦラットは、前糖尿病段階における病態生理学的変化の研究に適している。
【０１３１】
ｄｂ／ｄｂマウスは、レプチン受容体遺伝子中に点突然変異を有し、出生後８〜１０週間までに血中グルコースレベルの上昇と膵β細胞の枯渇を自然発症する。これらのマウスも、約４週齢までに明らかに肥満になる。
【０１３２】
ＮＯＤ／Ｌｔｊマウスは、膵島炎、膵島の白血球浸潤によって特徴付けられる。膵臓インスリン含量の顕著な減少が、メスでは約１２週齢で、オスではその数週間後に生じる。糖尿病の発症は、中程度の糖尿、および２５０ｍｇ／ｄｌより高い非空腹時血漿グルコースによって特徴付けられる。糖尿病ＮＯＤ／Ｌｔｊマウスは、低インスリン血症および高グルカゴン血症であり、これは膵島β細胞の選択的破壊を示す。ＮＯＤ／ＬｔＪマウスのＩＤＤＭへの感受性は多遺伝子性であり、住居状態、健康状態、および食事を含む環境が浸透度に対して強力に影響する。ＮＯＤ／ＬｔＪのメスはオスよりも広く使用されている。というのは、ＩＤＤＭ症状の発症がより早期であり高い罹患率（３０週齢までに９０〜１００％）を示すからである。ＮＯＤ／ＬｔＪのオスは、３０〜４０週齢までに４０〜６０％の頻度でＩＤＤＭを発症する。雄マウスは、医薬研究、ＩＤＤＭの「加速送達」、および幾つかのインビトロ研究を含め、特定の適用で有用である。ＮＯＤマウスにおける糖尿病への罹り易さの主要因は、特有のＭＨＣハプロタイプ（Ｈ２ｇ７＝Ｋｄ、Ａａｄ、Ａｂｇ７、Ｅｎｕｌｌ、Ｄｂ）である。ＮＯＤマウスは、抗原掲示細胞の免疫調節機能の不全、Ｔリンパ球レパートリーの調節不全、ＮＫ細胞機能不全、マクロファージからのサイトカイン産生障害（Fanら、２００４）、および創傷治癒不全を含む複数の異常な免疫表現型も示す。これらは、α溶血性補体成分Ｃ５も欠損している。ＮＯＤ／ＬｔＪマウスは、重度の聴覚障害も有する。免疫不全を引き起こす様々な突然変異、免疫機能に影響を及ぼすサイトカイン遺伝子および導入遺伝子中の標的化変異が、ＮＯＤ／Ｌｔ近交系バックグラウンドに戻し交配されている。
【０１３３】
本発明に従って使用するための本発明の推定ポリペプチドを試験するために当業者が利用可能な他の適当な方法には、上述した２型糖尿病のインビボモデルの使用；β細胞の再生、耐糖能障害の改善、および改善した血糖のコントロール（空腹時血清グルコース）の試験；血中グルコースレベルが上昇している場合のインスリン分泌刺激およびグルカゴン分泌の抑制；低血糖；および静脈糖耐性試験などのβ細胞機能マーカーの改善を測定すること、アルギニン刺激、ならびに高血糖クランプが含まれる。これらのアッセイは、ヒト臨床試験にも利用することができる。
【０１３４】
次に、本発明を以下の非限定的な実施例および図を参照のためにのみ用いて詳細に説明する。
【実施例１】
【０１３５】
ＲＴ−ＰＣＲによるＢＴＣ−δ４の検出、およびpBluescript II SK中へのクローニング
RNeasy Mini Kit（Qiagen, Clifton Hill, Vic., オーストラリア）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、全ＲＮＡを７０〜８０％集密の、ＭＣＦ−７細胞およびヒト乳房皮膚線維芽細胞から単離した。乳房縮小術手術の際に得た一片の皮膚から、正常なヒト乳房皮膚線維芽細胞を調製した。１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン−硫酸ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で、線維芽細胞が単層に増殖するまで、皮膚を外植片として５日間培養した。続いて、オリゴ（ｄＴ）プライマー（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、Superscript II酵素を用いて全ＲＮＡ（２μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。ヒトＢＴＣ−βに対応するｃＤＮＡをセンスプライマー：
（５’−ＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＧＴＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧ−３’）（配列番号３）
およびアンチセンスプライマー：
（５’−ＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧＣＡＡＴＡＴＴＴＧＴＣＴＣＴＴＣ−３’）（配列番号４）
を用いてＰＣＲにより増幅した。
【０１３６】
下線部のヌクレオチドは、ＳａｌＩ（センスプライマー）およびＰｓｔＩ（アンチセンスプライマー）制限部位に相当する。５０μｌの６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、１８ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４（ｐＨ９．１）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２００ｎｇの各プライマー、１U eLONGase（Gibco BRL、Gaithersburg、MD）、および１μｌのｃＤＮＡでＰＣＲを実施した。９４℃で３分間の初期インキュベーション後、３５サイクルの増幅を以下のように実施した：９４℃で１分間、５０℃で１分間、および６８℃で１分間の後、最後に６８℃で４分間の伸長。４１６ｂｐのＢＴＣ−δ４のＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムによる染色後、紫外線下で可視化した。ＰＣＲマーカー（Promega、Madison、WI）をサイズ標準品として使用し、その結果を図１Ａに示す。電気泳動後、０．４Ｍ  ＮａＯＨ中の正荷電ナイロン膜（Roche, Castle Hill, NSW, オーストラリア）にゲルをサザントランスファーした。プレハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中でブロットを５５℃で２時間インキュベートし、Gigaprimeキット（Geneworks,オーストラリア国アデレード）を使用し、ランダムプライミング法によって作製した３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識したヒトＢＴＣ ｃＤＮＡプローブ（Ｄ３２−Ｙ１１１）を含む同じ緩衝液中で、１６時間ハイブリダイズさせた。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で室温で５分間にわたる洗浄を２回行い、続いて０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５５℃、１５分間の洗浄をさらに２回行った。次いで、ブロットをKodak XARのＸ線フィルムに−８０℃で曝露し、その結果を図１Ｂに示す。
【０１３７】
ＢＴＣおよびＢＴＣ−δ４のＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定した。それはアガロースゲル電気泳動によりその産物を分離し、Concertキット（Gibco BRL、Gaithersburg、MD）を用いてゲル抽出後、断片を回収することで行った。次いで、精製したＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＰｓｔＩで消化し、ＳａｌＩ／ＰｓｔＩで消化したpBluescript II SK（Strategene, La Jolla, CA）中にサブクローン化してｐＢｌｕｅ−ＢＴＣおよびｐＢｌｕｅ−ＢＴＣ−δ４を作製し、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。その組換えプラスミドを増殖し、Ｍ１３  Ｔ７およびＴ３プロモータープライマーを用いて、Thermosequenaseサイクルシーケンシングキット（Amersham-Pharmacia Biotech、オーストラリア国シドニー）を使用してジデオキシヌクレオチド鎖終結法により配列決定した。両方向からＰＣＲ産物を配列決定して配列を確認した。これを２個の別個のクローンから２度行った。結果を図２ＡおよびＢに示す。
【実施例２】
【０１３８】
組換えＢＴＣおよびＢＴＣ−δ４の大腸菌発現および精製
ＢＴＣ−δ４の生物活性を特徴付けるために、本発明者らは、その対応するｃＤＮＡ（シグナルペプチドを含まないＡｓｐ３２〜Ａｌａ１２９）をｐＥＴ−３２ａ発現ベクター中にクローン化し、大腸菌ＢＬ２１ ｔｒｘＢ（ＤＥ３）中のチオレドキシン融合体としてその蛋白質を発現させた。この株は、チオレドキシン還元酵素を欠損しており、それにより細胞質でのジスルフィド結合が可能になっている。使用した構築物を図５Ａに概略的に示す。ＢＴＣの成熟形態（Ａｓｐ３２〜Ｔｙｒ１１１）、または完全長ＢＴＣ−δ４（Ａｓｐ３２〜Ａｌａ１２９。疎水性シグナルペプチドＭｅｔ１〜Ａｌａ３１を欠いたもの）を、細菌発現ベクターｐＥＴ３．２ａでチオレドキシン融合蛋白質として発現させた。ｐＥＴ３．２ａ−ＢＴＣおよびｐＥＴ３．２ａ−ＢＴＣ−δ４構築物を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換し、ＩＰＴＧで誘導後に蛋白質が発現された。誘導後、細胞を収集し、溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、ＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４を精製した。発現後、細胞を溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを使用して融合蛋白質を精製した。精製したチオレドキシン融合蛋白質をエンテロキナーゼによって切断してＢＴＣ−δ４を遊離し、このＢＴＣ−δ４を逆相ＨＰＬＣにより精製して均質にした。
【０１３９】
ＢＴＣ−δ４３２−１２９のオープンリーディングフレーム配列を、プライマーセット：
５’−ＣＧＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＴ−３’（配列番号５）（センス）および
５’−ＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＡＡＧＣＡＡＴＡＴＴＴＧＴＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号６）（アンチセンス）、
ならびに鋳型としてｐＢｌｕｅ−ＢＴＣ−δ４（Dunbarら、2000）を使用し、ＰＣＲによって増幅した。ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ認識部位を、それぞれ、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーに結合させた（下線）。既に記載されているように（Senoら、1996）、アミノ酸３２〜１１１（ＢＴＣ３２−１１１）から構成されるＢＴＣも陽性対照としてｐＥＴ系を使用して発現させ、精製し、またはプラスミドｐＥＴ３２ａによりチオレドキシン融合蛋白質として産生させた。この構築物としては、ＢＴＣ３２−１１１のＯＲＦ配列をプライマーセット：
５’−ＣＧＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＴ−３’（配列番号７）（センス）および
５’ＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＡＣＴＧＴ−３’（配列番号８）（アンチセンス）、
ならびに鋳型としてｐＢｌｕｅ−ＢＴＣ−δ４（DunbarおよびGoddard、2000）を使用し、ＰＣＲによって増幅した。ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ認識部位（下線部）を、それぞれ、センスおよびアンチセンスプライマーにも結合させた。増幅後、上記のようにＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＥＴ３２ａベクター中にクローン化した。得られたプラスミド、すなわちｐＥＴＢＴＣ−δ４３２−１２９およびｐＥＴＢＴＣ３２−１１１は、大腸菌ＪＭ１０９中で維持し、発現のために大腸菌ＢＬ２１ ｔｒｘＢ（ＤＥ３）細胞中に形質転換させた。ＢＬ２１ ｔｒｘＢ（ＤＥ３）細胞中でＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４を発現させるために、単一コロニーを５０ｍｌに接種し、ＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１５μｇ／ｍｌカナマイシンを補充）中、３７℃で、終夜培養物を一定して振盪しながら増殖させた。次いで、この終夜培養物の１０ｍｌを使用して、２００ｍｌの新鮮ＬＢ培地に接種した。その細胞を、ＯＤ６００ｎｍが０．４〜０．５になるまで３７℃で増殖し、その後ＩＰＴＧ（１ｍｍｏｌ／ｌ）で誘導し、次いでさらに３時間増殖させた後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分、４℃）によってペレット化し、精製する前は−８０℃で保存した。
【０１４０】
融合蛋白質として発現させたＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４を精製するために、凍結細胞ペレットを氷上で解凍し、それをリゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）を含むBugBuster蛋白質抽出試薬１８ｍｌに再懸濁し、穏やかに振盪しながら室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞ライセートを超音波処理（３×５秒バースト）して粘度を減少させ、遠心分離（２０分間、１６０００ｒｐｍ、１０分間）によって清澄にした。遠心分離後、清澄化した細胞ライセートを１０ｍｍｏｌ／ｌ  イミダゾールで調整し、６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースと共にインキュベートし、５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．３ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  イミダゾール（ｐＨ８．０）中で穏やかに振盪しながら４℃で１時間、予備平衡化した。インキュベーションに続いて、樹脂を遠心分離（５分間、１５０００ｒｐｍ、４℃）し、上清を取り出し、樹脂を５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．３ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、４０ｍｍｏｌ／ｌ  イミダゾール（ｐＨ８．０）中に再懸濁することによって洗浄した。上記のように３回連続洗浄した後、樹脂を１２ｍｌの５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．３ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、２５０ｍｍｏｌ／ｌ  イミダゾール（ｐＨ８．０）中で１５分間インキュベートすることによって蛋白質を溶出させた。続いて、ＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４を含む得られた上清を、いくつかの改変を含むエンテロキナーゼ切断緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＣａＣｌ２、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）に対して、連続的に終夜にわたり透析した（Spectra/Por，3.5kDa MWCO，Spectrum Laboratories）。ＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４由来のチオレドキシン融合パートナーを除去するために、エンテロキナーゼを、終濃度が０．１単位／２０μｇ蛋白質になるように加え、３７℃で穏やかに攪拌しながら終夜インキュベートした。さらに上記のようなＮｉ−ＮＴＡアガロースアフィニティクロマトグラフィーにかけることによって、ＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４をチオレドキシン融合パートナーから分離した。この場合は、切断されたチオレドキシン融合パートナーを樹脂上に捕捉し、ＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４を流出画分中に回収した。流出画分中に存在するＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４を逆相ＨＰＬＣによってさらに精製した。手短に言えば、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース流出画分を０．１％ＴＦＡで１：４（ｖ／ｖ）希釈し、流速１０ｍｌ／分でC4 Prep-Pak逆相ＨＰＬＣカラム（２５ｍｍ×１００ｍｍ；３００Å、１５μｍ；Millipore-Waters）にかけた。そのカラムはＯＤ２１４ｎｍがベースラインに戻るまで０．１％ＴＦＡで洗浄し、次いでそのカラムを８〜８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの勾配を用いて、１５０分にわたり、０．０８％ＴＦＡの存在下、流速１０ｍｌ／分で溶出した。画分２０ｍｌを回収し、それぞれのアリコート（５０μｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびヤギ抗ヒトＢＴＣ外部ドメイン（Ａｓｐ３２〜Ｔｙｒ１１１）抗体を使用するウェスタンブロッティングにより分析して、純粋なＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４を含む画分を同定した。ＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４を含む画分をプールし、分析ＲＰ−ＨＰＬＣ、エレクトロスプレーイオン化質量分析法、およびＳ���Ｓ−ＰＡＧＥによってその純度を分析した。分析ＲＰ−ＨＰＬＣは、線形勾配の８〜８０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルおよび０．０８％ＴＦＡを用いるBrownlee aquapore C4 RP-HPLCカラム（２．１×１００ｍｍ）（Alltech）を使用し、４０分間にわたって流速０．５ｍｌ／分で実施した。結果を図５Ｂに示す。
【０１４１】
エレクトロスプレーイオン化質量分析によって決定した組換えＢＴＣおよびＢＴＣ−δ４の分子量は、それぞれ、９２１１．３５±０．２９  Ｄａおよび１１４５０．２６±０．２３  Ｄａであり、この分子量は算出した理論上の質量の９２４９および１１４５２  Ｄａに一致する（データ非表示）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色後、ＢＴＣおよびＢＴＣ−δ４について約９ｋＤａおよび１１．５ｋＤａの単一バンドが得られ、還元条件または非還元条件下で検出された。ＢＴＣおよびＢＴＣ−δ４両方の純度をＮ末端配列分析（５サイクル）によってさらに確認したが、この分析により、予測されるＮ末端配列が＞９５％の概算純度でもたらされた。
【０１４２】
あるいは、先に述べた通り（Maedaら、2002）、ＢＴＣ−δ４３２−１２９（開始メチオニン残基を含む）を発現ベクターｐＥＴ３ｂおよび組換え蛋白質中にクローン化し、可溶化し、封入体から再び折畳み、カチオン交換カラムおよびゲル濾過カラムクロマトグラフィーによって精製した。この研究で調製した組換え蛋白質全てを凍結乾燥し、使用前まで−８０℃で貯蔵した。
【実施例３】
【０１４３】
哺乳動物発現用ＢＴＣ−δ４発現プラスミドの構築
以下のように、完全長ＢＴＣ−δ４（１−１２９）をベクターｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）中にクローン化して、ＢＴＣ−βを哺乳動物で産生するための発現ベクターを作製した。手短に言えば、実施例１からのｐＢｌｕｅ−ＢＴＣ−δ４をＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、遊離したインサートをアガロースゲル電気泳動に続いて精製した。次いで、消化し精製されたインサートをＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐｃＤＮＡ３．１中にクローン化し、大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Invitrogen）中に形質転換した後、組換えクローンを同定した。ＦｌａｇエピトープＤＹＫＤＤＤＤＫがアミノ酸Ｓ３５〜Ｔ３６間に挿入されている「Ｆｌａｇタグ付き」ｐｃＤＮＡ３．１−ＢＴＣ−δ４構築物を作製するために、図３に例示したように、ｐＢｌｕｅ−ＢＴＣ−δ４をＰＣＲの鋳型として使用し、そのＰＣＲにプライマー：
2008509093.tif 000002
（配列番号９）（センス：下線部のヌクレオチドはＥｃｏＲＩ制限部位に相当し、二重下線部ヌクレオチドは、ＦＬＡＧエピトープタグをコードする）、および
５’−ＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧＣＡＡＴＡＴＴＴＧＴＣＴＣＴＴＣ−３’
（配列番号１０）（アンチセンス：下線部ヌクレオチドはＰｓｔＩ制限部位に相当する）
を使用した。得られたＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ１で消化したｐＢｌｕｅ−ＢＴＣ−δ４中にクローン化した。続いて、得られたＦｌａｇタグ付きｐＢｌｕｅ−ＢＴＣ−δ４構築物をＡｐａＩ／ＢａｍＨ１で消化し、ＡｐａＩ／ＢａｍＨ１で消化したｐｃＤＮＡ３．１中にクローン化してｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＢＴＣ−δ４を作製した。
【実施例４】
【０１４４】
ＣＯＳ−７細胞におけるＢＴＣおよびＢＴＣ−δ４ ＦＬＡＧタグ付き構築物の発現および分析
ＥＧＦファミリーの他のメンバーと同様に、ＢＴＣを膜貫通型アンカー付き前駆体蛋白質（ｐｒｏ−ＢＴＣ）として合成するが、この蛋白質は、タンパク分解により切断されてＥＧＦモチーフ（Ａｓｐ３２−Ｔｙｒ１１１）を含む可溶性ＢＴＣを産生することができる。疎水性シグナルペプチドの保持、および膜貫通型ドメインの欠如は、ＢＴＣ−δ４が分泌蛋白質でありうることを示している。これを調べるために、実施例３に記載したように、その後の検出用に、ＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４の完全なオープンリーディングフレームのアミノ酸Ｓｅｒ３５とＴｈｒ３６の間にＦＬＡＧエピトープを組み込むようにさらに遺伝子操作したものを、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１中にクローン化し、ＣＯＳ−７細胞に一時的トランスフェクションをした後、分泌をモニターした。トランスフェクションから７２時間後、培養上清および細胞ライセートを回収し、分泌されたり細胞に結合したりしたＢＴＣ−ＦＬＡＧおよびＢＴＣ−δ４−ＦＬＡＧの存在について、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを使用して分析した。
【０１４５】
ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＢＴＣ−δ４およびｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＢＴＣを一時的に発現させるために、ＣＯＳ−７細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中２×１０５細胞／ウェルで１２ウェルプレートに播種した。終夜インキュベーション後、Lipofectamine 2000およびOptimem-1培地（共にInvitrogenより）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、細胞に２μｇの構築物ＤＮＡをトランスフェクトした。１２時間後、細胞を２回洗浄し、新鮮Optimem-1培地を継ぎ足した。トランスフェクトから７２時間後、培地（ＣＭ）を回収し、細胞ライセートを調製した。ＣＭを遠心分離によって清澄にし、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体（Sigma）を使用するＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングによって培地中のＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４の存在を分析した。細胞ライセート中に存在するＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４は、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。ＣＭを取り除いた後、細胞を２回ＰＢＳで洗浄し、次いで細胞を直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で溶解させ、９５℃で５分間加熱することによって、細胞ライセートを調製した。
【０１４６】
ＣＭをＥＬＩＳＡ分析するために、９０μｌのＣＭを１０×コーティング緩衝液（０．１５ｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＣＯ３、０．３５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．３）の１０μｌと混合し、９６ウェル免疫吸着プレート中にロードした。次いで、プレートを終夜４℃でコートし、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）中でブロッキングした。プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｔに希釈した抗ＦＬＡＧ抗体（２．５μｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、上記のようにプレートを洗浄し、それを、ＰＢＳ−Ｔ中に希釈したＨＲＰコンジュゲートヒツジ抗マウス抗体（１：２０００）（ＨＲＰコンジュゲートヒツジ抗マウス抗体はSilenus Laboratoriesから入手した）と共にインキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ｏ−フェニルアミンジアミン（ＯＰＤ）基質で発色させ、２ｍｏｌ／ｌ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度を４９０ｎｍで読み取った。３つ重複した測定値の平均±標準偏差（ＳＤ）として結果を表示する。ＥＬＩＳＡにより細胞表面のＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４の存在を分析するために、ＣＭを除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、上記のように、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体で染色した。
【０１４７】
抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体によりウエスタンブロット分析するために、ＣＭまたは細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜２０％Ｔｒｉｓ−トリシンゲル）により分離した。次いで、蛋白質をニトロセルロース（Hybond-C extra、Amersham）に転写し、膜をマウス抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体（２．５μｇ／ｍｌ）で、次いでＨＲＰコンジュゲートヒツジ抗マウス抗体（１：１００００）を用いてプローブした。ＨＲＰ標識蛋白質は、Supersignal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce)を使用して可視化した。
【０１４８】
結果を図６にまとめる。図６ＡおよびＢに示すように、ＢＴＣ−δ４−ＦＬＡＧは、ウエスタンブロット（約１４ｋＤａ）または酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）によって培養上清中に明瞭に検出されるが、細胞ライセート中または細胞表面上には極微量しか存在しなかった（図６ＡおよびＢ）。対照的に、ＢＴＣ−ＦＬＡＧは、大部分は細胞ライセート中（約２０ｋＤａ）および細胞表面上に存在した（図６ＡおよびＢ）。従って、細胞表面外部ドメインの切断後に分泌される膜に結合されたｐｒｏ−ＢＴＣとは異なって、膜貫通型ドメインが欠如しているＢＴＣ−δ４は、発現後、直接分泌されるものと思われる。
【実施例５】
【０１４９】
ＢＴＣ−δ４のＥｒｂＢ受容体結合活性および分裂促進活性
ＢＴＣ−δ４の生物活性を調べるために、本発明者らは、最初に、ＥｒｂＢ１を発現するＢａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞の増殖を刺激するその能力を試験した。既に記載されている通りに（Dunbarら、１９９９）、Ｂａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３線維芽細胞に対するＢＴＣおよびＢＴＣ−δ４の分裂促進活性を決定した。Ｂａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３細胞をアメリカン・ティッシュ・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。
【０１５０】
結果を図７Ａおよび７Ｂに示す。予測される通り、ＢＴＣは用量依存的にＢａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３の増殖を刺激した。それとは対照的に、ＢＴＣ−δ４は１００ｎｍｏｌ／ｌという高い濃度でさえ細胞増殖を刺激しなかった。さらに、この細胞系では、ＢＴＣ−δ４はＢＴＣの効果に対し拮抗作用を示さなかった。
【０１５１】
ＢＴＣおよびＢＴＣ−δ４のＥｒｂＢ受容体に対する結合親和性は、ＥｒｂＢ４を安定的にトランスフェクトしたＡＧ２８０４線維芽細胞（Dunbarら、１９９９）またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ−ＥｒｂＢ４細胞、（Tzaharら、１９９６）、イスラエル国Weizmann Institute, Yosef Yarden教授からの供与）にそれぞれ存在するＥｒｂＢ１受容体またはＥｒｂＢ４受容体から、［１２５Ｉ］標識組換えヒトＢＴＣを競合的に除去し取って代わるＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４の能力を測定することによって測定した。これを行うために、２４ウェルプレートにおいてＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中でＡＧ２８０４またはＣＨＯ−ＥｒｂＢ４細胞を７０〜８０％集密になるまで増殖させた。（ヒト肺線維芽細胞。次いで、その細胞を結合緩衝液（１００ｍｍｏｌ／１  Ｈｅｐｅｓ、（ｐＨ７．６）、１２０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、１．２ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＳ０４、８ｍｍｏｌ／ｌ  グルコース、０．１％ＢＳＡ）で２回洗浄し、次いで結合緩衝液中で［１２５Ｉ］−ｒｈＢＴＣ（１００００〜１５０００ｃｐｍ、クロラミン−Ｔを使用し比活性が約２０μＣｉ／μｇになるようにＮａ［１２５Ｉ］で標識したもの）、および漸増濃度の非標識ＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４（ＡＧ２８０４細胞については０〜１００ｎｍｏｌ／ｌおよびＣＨＯ−ＥｒｂＢ４細胞については０〜１０ｎｍｏｌ／ｌ））と共に、４℃で１８時間インキュベートした。次いで、標識した細胞を氷冷ハンクス緩衝化塩溶液で３回洗浄し、１ｍｌの０．５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨ／０．１％（ｖ／ｖ）Triton X-100を用いて３０分間にわたり溶解させた。次いで、細胞ライセートの放射活性をγ−カウンター（Wallac 1470）で測定した。非特異的結合は、１００倍過剰の未標識リガンドの存在下でバイオアッセイを実施することによって測定した。通常、非特異的結合は全結合の約５％であった。
【０１５２】
本発明者らは、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４の一方のチロシンリン酸化を刺激するＢＴＣおよびＢＴＣ−δ４の能力も比較した。ＥｒｂＢ１受容体を過剰発現する細胞系であるＡＧ２８０４、またはＥｒｂＢ４受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＥｒｂＢ４細胞、イスラエル国Weizmann Institute, Yosef Yarden教授からの供与）を１０ｃｍディッシュに集密になるまで増殖させ、続いて無血清培地中で１２〜１４時間インキュベートし、次いで細胞を１０ｎｍｏｌ／ｌ  ＢＴＣ、ＢＴＣ−δ４、または両者の組合せを用いて室温で１０分間刺激した。刺激した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで溶解緩衝液（０．５ｍｌ）（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、１％デオキシコラート、１％Triton X-100、０．１％ＳＤＳ、５ｍｍｏｌ／ｌ  オルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ  フッ化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＧＴＡ、および完全プロテアーゼ阻害薬（商標））に溶解させた。細胞ライセートを遠心分離（１５０００ｇ、４℃で２０分間）によって清澄にし、そのライセートを、それぞれ、ウサギポリクローナル抗ＥｒｂＢ１抗体（１００５）（Santa Cruz）またはウサギポリクローナル抗ＥｒｂＢ４抗体１μｇと共に、４℃で２時間穏やかに振盪しながらインキュベートすることにより、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４を免疫沈降させた。
【０１５３】
インキュベーション後、プロテインＧセファロースを加え、混合物を４℃でさらに１時間インキュベートした。免疫複合体を遠心分離によって集め、溶解緩衝液で３回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で加熱（３分間、９５℃）した。蛋白質をＳＤＳ  ＰＡＧＥまたは１０〜２０％トリシンゲルによって分離し、ニトロセルロースフィルタ（Hybond C, Amersham）に転写した。膜を最初に抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（ＰＹ２０）で、次いでＨＲＰコンジュゲートヒツジ抗マウス抗体でプローブした。ＨＲＰ標識蛋白質は、酵素結合化学発光（ＥＣＬ）（Amersham）を使用して可視化した。ローディングの等量性を確認するために、ブロットを剥離し、ウサギポリクローナル抗ＥｒｂＢ１もしくはウサギポリクローナル抗ＥｒｂＢ４抗体、およびＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ヒツジ抗体で再プローブした。抗ＥｒｂＢ１（１００５）、抗ＥｒｂＢ４（Ｃ−１８）、および抗ホスホチロシン（ＰＹ２０）抗体はSanta Cruzから購入し、ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ヒツジ抗体はZymed Laboratoriesから購入した。
【０１５４】
結果を図７Ｃ〜７Ｆおよび図８にまとめて示す。本発明者らは、ＢＴＣ−δ４ではなくＢＴＣが、ヒト肺線維芽細胞（ＡＧ２８０４）上に存在するＥｒｂＢ１受容体から［１２５Ｉ］−ＢＴＣに取って代わり（図７ＣおよびＤ）、ＥｒｂＢ１受容体の自己リン酸化を誘発できること（図８）を見出した。同様に、ＢＴＣ−δ４ではなくＢＴＣが、ＥｒｂＢ４受容体結合について競合し（図７ＥおよびＦ）、ＥｒｂＢ４受容体チロシンリン酸化（図８）を誘導した。これらの結果は、ＢＴＣとは対照的に、ＢＴＣ−δ４が、ＥｒｂＢ１とＥｒｂＢ４のいずれに対しても親和性を全く示さないことを示している。さらに、ＢＴＣ−δ４はＥｒｂＢ１やＥｒｂＢ４を活性化しない。
【０１５５】
これらの結果は、完全に予想外であった。このことは、ＢＴＣ−δ４が細胞増殖を刺激しないことを意味するため、本発明者らの知見は、真正ＢＴＣよりもＢＴＣ−δ４が癌を誘発する危険性が低いであろうことを示している。さらに、ＢＴＣ−δ４は、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４受容体によってというよりは、まだ同定されていない受容体によりその効果を発揮すると思われる。本明細書に記載した方法を使用し、またはBIAcoreアッセイを使用し、さらに研究を進めることができる。
【実施例６】
【０１５６】
ＡＲ４２Ｊ細胞の分化およびアポトーシスの測定
天然のＢＴＣは、膵β細胞の分化を刺激することが知られており（Mashimaら、１９９６；Watadaら、１９９６；Yamamotoら、２０００；Liら、２００１；LiLら、２００３；Liら、２００４）、これが特有の非ＥｒｂＢ細胞表面受容体を通じて生じうることを示唆する幾つかの証拠がある（Ishiyamaら、１９９８）。
【０１５７】
インスリン発現の誘導によって評価される、ＢＴＣ−δ４が膵β細胞の分化に及ぼす作用を調べるために、本発明者らは、モデル細胞系ＡＲ４２Ｊ−Ｂ２０（アミラーゼ分泌膵臓腫瘍細胞系のＡＲ４２Ｊのサブクローン）を使用した。これらの細胞では、ＢＴＣはアクチビンＡと協調的に働き、それらをインスリン分泌細胞に変換する（Mashimaら、１９９６）。それによって、アクチビンＡは、アミラーゼ分泌ＡＲ４２Ｊ−Ｂ２０を膵臓ポリペプチド（ＰＰ）産生内分泌細胞に変換する。アクチビンＡはまた、生存因子の不在下、これらの細胞でアポトーシスを誘導し、アクチビン処理細胞の多くは、ＰＰ産生細胞へ変換された後、アポトーシスによって死ぬ（Furukawaら、１９９９）。
【０１５８】
ＢＴＣは、ＡＲ４２Ｊ−Ｂ２０細胞で２つの作用を発揮する：第一に、ＢＴＣはアクチビンＡにより誘導されたアポトーシスを阻止し、第二に、ＢＴＣはそれらの細胞をインスリン産生細胞に変換する（Mashimaら、１９９６；Furukawaら、１９９９）。既に記載されているように（Mashimaら、１９９６）、ＡＲ４２Ｊ−Ｂ２０細胞は１０％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地で培養した。
【０１５９】
インスリン産生細胞への分化を評価するために、細胞を２ｎｍｏｌのアクチビンＡ、および１ｎｍｏｌのＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４と共に４８時間インキュベートした。次いで、既に記載されているようにして（Mashimaら、１９９６）、細胞を固定し、抗インスリン抗体で染色し、インスリン陽性細胞数をカウントした。核をＤＡＰＩで染色した。
【０１６０】
アポトーシスは、末端ヌクレオチド付加酵素（ＴＵＮＥＬ）法（和光純薬工業株式会社、日本国大阪）の使用によって評価した。生細胞数の変化を３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５，−ジフェニルテトラゾリウム）ブロミド（ＭＴＴ）の使用によって評価した（Carmichaelら、１９８７）。
【０１６１】
カラー印刷した場合に図９Ａに示されるように、ＡＲ４２Ｊ−Ｂ２０細胞は、アクチビンＡおよびＢＴＣの組合せに応答してインスリン産生細胞に分化した。定量的には、４８時間後に細胞の７８±６．５％（平均±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝４）がインスリン陽性になった。アクチビンＡおよびＢＴＣで処理した細胞は、カラー印刷した場合の図９Ｃに示されるように、長くなった突起、および発現された免疫反応性インスリンを示した。アクチビンＡおよびＢＴＣ−δ４の組合せで処理した細胞もまた、カラー印刷した場合の図９Ｂに例示されるように、インスリン陽性になり、４８時間後に細胞の７２±４．５％（ｎ＝４）がインスリン陽性になる。
【０１６２】
アクチビンＡおよびＢＴＣで処理した細胞とは対照的に、アクチビンＡおよびＢＴＣ−δ４で処理した細胞の形態は全く異なる。インスリン陽性細胞の一部は、長くなった突起を示したが、それらの大部分は依然として外観は円形のままであった。カラー印刷した場合の図９ＢおよびＤに示したように、これらの細胞の核は凝縮し、時には断片化するかまたは欠如していたが、それはアポトーシスによる細胞死に特徴的である。図１０に示すように、アポトーシス現象と一致するように、アクチビンＡおよびＢＴＣ−δ４で処理した細胞の多くはＴＵＮＥＬ陽性であり、それに対してアクチビンＡおよびＢＴＣで処理した細胞のごく一部しかＴＵＮＥＬ陽性にならなかった。
【０１６３】
ＢＴＣ−δ４がＡＲ４２Ｊ−Ｂ２０細胞の生存に及ぼす効果をさらに確認するために、本発明者らは、アクチビンＡとＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４とで処理後の生細胞数の変化を測定した。４８時間後、アクチビンＡおよびＢＴＣで処理した培養中の生細胞数は播種した細胞数の７８．８±４．２％であった。それとは対照的に、アクチビンＡおよびＢＴＣ−δ４で処理した培養中の生細胞数は著しく少なかった（２１．８±３．２％）（Ｐ＜０．００５）。総合すると、ＢＴＣ−δ４はＡＲ４２Ｊ−Ｂ２０細胞の分化の刺激においてはＢＴＣと同程度に有効であったが、これらの細胞の生存の促進においてはＢＴＣ−δ４はほとんど有効ではなかった。
【実施例７】
【０１６４】
ＳＴＺ処置ラットへのＢＴＣ−δ４の投与は、血漿グルコース濃度を低下させ、糖耐性を改善する
ＢＴＣ−δ４のインビボでのβ細胞分化活性を調べるために、本発明者らは、ＳＴＺ処置新生仔ラットにＢＴＣ−δ４を投与した。実験プロトコルは群馬大学動物管理委員会により認可を受けた。１日齢のSprague-Dawley（ＳＤ）ラットに、０．０５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に新たに溶解させた８５μｇ／ｇストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を腹腔内注射（ｉｐ）した。仔ラットは、４週齡までその母ラットと共に置いた。新生仔は全て、ＳＴＺ注射から１日後（第１日）に、Accu-Chek Active (Roche Diagnostics, Germany)を使用し血中グルコース（血糖）を検査した。第１日の血中グルコース濃度が２００〜３５０ｍｇ／ｄｌであった場合に限り、動物を研究に加えた。第１日の血中グルコースが３５０ｍｇ／ｄｌを超えていた動物は重篤な糖尿病を発症し、これらの動物の血中グルコース濃度は第２日または第３日に６００ｍｇ／ｄｌを超えていた。ＳＴＺ処置新生仔ラットに、第０日から始めて５日間の毎日、３ｐｍｏｌ／ｇのＢＴＣ−δ４、ＢＴＣ、または生理食塩水を注射した。第１週目は毎日、次いで８週間までは週一度、空腹時血中グルコース濃度および体重を測定した。ＳＴＺ処置から２ヵ月後、絶食から１４時間後に腹腔内（ｉｐ）糖耐性検査（２ｇ／ｋｇ体重）を実施した。
【０１６５】
第４日および第８週に、動物に体重１００ｇ当たりブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識試薬１ｍｌを腹腔内（ｉｐ）注射し（細胞増殖キット、Amersham Pharmacia Biotech, U.K.）、３時間後に断頭した。膵臓を切り取り、秤量し、２つの部分に分割した。脾臓セグメントの一方の部分を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳによって４℃で終夜固定し、パラフィン包埋用に加工した。免疫染色および組織化学用に、各膵臓から新生仔では１００μｍ、成体では３００μｍの間隔を空けて一連の切片を４セット切り出した。２つ目の部分を冷酸−エタノール中でホモジナイズし、７０℃のウォーターバス中で５分間加熱し、遠心分離し、インスリンアッセイ前に上清を−２０℃で貯蔵した。既に記載されているように（Mashimaら、１９９６）、インスリンを時間分解免疫蛍光アッセイによって測定した。
【０１６６】
既に記載されているようにして（Liら、２００１；Liら、２００３）、免疫組織化学を実施した。一次抗体源および希釈度は、以下の通りであった。モルモット抗ブタインスリン、１：１０００（群馬大学的崎博士提供）；ウサギ抗ＰＤＸ−１、１：３０００；モノクローナルマウス抗ＢｒｄＵ、１：１００（Amersham）；広範囲スクリーニング用ウサギ抗ウシサイトケラチン（Ckwss）、１：１０００（DAKO）。二次抗体源および希釈度は、以下の通りであった。ヤギAlexa Flour ５６８コンジュゲート抗モルモットＩｇＧ、１：１０００；ヤギAlexa Flour ４８８コンジュゲート抗モルモットＩｇＧ、１：５００；ヤギAlexa Flour ５６８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ、１：１０００；ヤギAlexa Flour ４８８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ、１：５００；ヤギAlexa Flour ５６８コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ、１：１０００；ヤギAlexa Flour ４８８コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ、１：５００（Molecular Probes Inc., Eugene, OR）。
【０１６７】
IP Lab Spectrumソフトウェア（Signal Analysis, Vienna, VA）によって作動するPXL 1400冷却電荷結合素子カメラシステム（Photometrics, Tucson, AZ）を備えた、AX70 Epifluorescence顕微鏡（オリンパス株式会社、日本国東京）により、画像解析ソフトウェア（NIH image）を使用して、インスリン染色切片についてβ細胞量の定量を実施した。インスリン陽性細胞領域について、一切片から少なくともランダムに４０視野（倍率×２００）（一ブロック毎に異なるセットに由来する３つの切片）を測定した。他に記載されている通りにして（Li L, Seno M, Yamada H, Kojima I、「９０％膵切除したラットにおけるベータセルリンによるβ細胞再生の促進」Endocrinology 142: 5379-5385, 2001；Li L, Seno M, Yamada H, Kojima I「ストレプトゾトシンで処置したマウスでは、ベータセルリンが膵島内前駆細胞のβ細胞への転化を促進することによってグルコース代謝を改善する」Am J Physiol 285: E577-E583, 2003）、β細胞量を算出した)。β細胞の新生を定量化するために、本発明者らは、膵島様細胞クラスタ（ＩＣＣ）（直径で５細胞未満）の数を定量化した。切片中のＩＣＣ数および島数をカウントし、抗インスリン抗体で染色し、これらの切片中の領域を測定した。動物１頭につき少なくとも５切片を分析した。結果を平均±ＳＥとして表し、表１ならびに図１１および１２に示す（図１２がカラー印刷される場合）。２群間を比較するために、対応のないｔ検定を使用した。
【表１】
2008509093.tif 000003
【０１６８】
ＳＴＺ処置新生仔ラットでは、血漿グルコース濃度は顕著に増加し、第２日にピークに達し（＞４００ｍｇ／ｄｌ）（図１１Ａ）、その後徐々に減少したが、２ヵ月後でも依然として対照ラットと比較して有意に高かった（表１）。それとは対照的に、ＢＴＣ−δ４を投与したＳＴＺ処置ラットでは、血漿グルコース濃度は第１日に著しく低く、ピーク値は顕著に減少した（図１１Ａ）。血漿グルコース濃度もその後２ヵ月までに減少した（表１）。ＢＴＣ−δ４の効果と比較して、ＢＴＣは高血糖の改善にそれほど有効ではなかった（図１１Ａ、表１）。２ヵ月齢で、腹腔内（ｉｐ）糖耐性検査を実施した。ＳＴＺ処置ラットでは、ｉｐグルコース負荷に対するグルコース応答は顕著に損なわれたが、それに対してＢＴＣ−δ４を投与したＳＴＺ処置ラットでは、グルコース応答は著しく改善された（図１１Ｂ）。ＢＴＣ−δ４も正常ラットと比較してインスリン応答を上昇させたが、ｉｐグルコース負荷に対するインスリン応答は依然として遅れた。ＢＴＣで処置したラットでは、糖耐性は改善したが、ＢＴＣの効果はＢＴＣ−δ４の効果より低かった（図１１Ｂ）。さらに、ＢＴＣ−δ４で処置したラットではインスリン含量およびβ細胞量が有意に増加し（表１）、第４日の膵臓組織の組織分析ではＢＴＣ−δ４がＰＤＸ−１陽性腺管細胞（ductal cell）数およびＩＣＣ数を著しく増加させたことが示された（図１２、カラー印刷した場合）。
【０１６９】
本発明は、明解さと理解を求めて一部詳細に記載されているが、本明細書に開示した本発明の概念である本発明の範囲から逸脱することなしに、本明細書に記載した実施形態および方法には様々な改変および変更を加えうることは当業者に明らかである。
【０１７０】
本明細書に引用した参照文献を以下のページを収載し、これを参照することにより本明細書に組み込む。
【０１７１】
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【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによるＭＣＦ−７細胞（レーン１）、およびヒト乳房皮膚線維芽細胞（レーン２）における真正ヒトＢＴＣおよびスプライス変異体ヒトＢＴＣ−δ４の検出を示す。レーン３はｃＤＮＡ鋳型を含まない対照である。図１Ｂは、ヒトＢＴＣのアミノ酸Ｄ３２−Ｙ１１１をコードするポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡプローブを使用した、その対応するサザンブロットを示す。
【図２】図２Ａは、真正ヒトＢＴＣの部分ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（一文字アミノ酸コードで示す）と、スプライス変異体であるヒトＢＴＣ−δ４のそれらとを比較している。図１ＡでＭＣＦ−７のｃＤＮＡから得られたＲＴ−ＰＣＲ産物をpBluescript II SK中にクローン化し、インサートを配列決定した。１４７ｂｐ欠失の部位（下向き矢印により示す）の周辺配列を示す。図２Ｂは、ＢＴＣ−δ４  ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図３】真正ヒトＢＴＣおよびスプライス変異体であるヒトＢＴＣ−δ４の完全なアミノ酸配列を仮想アラインメントにおいて比較する。ＢＴＣ−δ４配列中の水平破線は、真正ｈＢＴＣ配列と比較した場合の欠損しているアミノ酸部位を示す。下の略図は、ＢＴＣ−δ４と比較した真正ヒトＢＴＣの全体的構造を示す。
【図４】ＢＴＣ−δ４ポリペプチド（ＢＴＣ−δ４１−１２９、ＢＴＣ−δ４１−９４、ＢＴＣ−δ４３２−９４、ＢＴＣ−δ４３２−１２９、ＢＴＣ−δ４３２−１１１およびＢＴＣ−δ４９９５−１２９）のアミノ酸配列を示す。
【図５】ＢＴＣおよびＢＴＣ−δ４の組換え発現および精製に使用した構築物を示す。図５Ａは、ＢＴＣおよびＢＴＣ−δ４それぞれに使用した構築物の模式図である。図５Ｂは、Ｃ４カラムでの分析ＲＰ−ＨＰＬＣによりＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４それぞれの調製物の純度を評価した結果を示す。
【図６Ａ】ＢＴＣ−δ４が分泌蛋白質であることを示す。Ａ：ＣＯＳ−７細胞にＢＴＣ−ＦＬＡＧ、ＢＴＣ−δ４−ＦＬＡＧ、または空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）のいずれかを一過性トランスフェクトした。トランスフェクトの７２時間後、培地を回収し、細胞ライセートを調製した。培地および細胞ライセートは、ウエスタンブロットにより抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いて分析した。抗ＢＴＣ外部ドメイン抗体（R&D Systems）を用いて、ウエスタンブロットで同様の結果を得たことも留意されたい（データ非表示）。
【図６Ｂ】ＢＴＣ−δ４が分泌蛋白質であることを示す。Ｂ：ＣＯＳ−７細胞を上記のようにトランスフェクトし、培地または非浸透化固定細胞は、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いてＥＬＩＳＡにより分析した。抗ＢＴＣ外部ドメイン抗体（R&D Systems）を用いて、ＥＬＩＳＡで同様の結果を得たことも留意されたい（データ非表示）。
【図７】ＢＴＣ−δ４ではなくＢＴＣがＢａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３線維芽細胞の増殖を刺激し、またＢＴＣ−δ４ではなくＢＴＣがＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４に結合することをラジオレセプターアッセイで示す。Ｂａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３線維芽細胞を漸増濃度のＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４単独と共に（Ａ）、または固定濃度のＢＴＣの存在下の漸増濃度のＢＴＣ−δ４と共に（Ｂ）、インキュベートした。漸増濃度のＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４の存在下における、ＥｒｂＢ１を発現しているＡＧ２８０４細胞（Ｃ、Ｄ）、またはＥｒｂＢ４をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（Ｅ、Ｆ）への、［１２５Ｉ］標識ＢＴＣの競合的結合。
【図８】ＢＴＣ−δ４ではなくＢＴＣが、ＡＧ２８０４細胞およびＣＨＯ−ＥｒｂＢ４細胞において、それぞれＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４受容体のチロシンリン酸化を誘導することを示す。未処理（−）または処理（１０ｎｍｏｌ／ｌ  ＢＴＣ、１０ｎｍｏｌ／ｌ  ＢＴＣ−δ４、または１０ｎｍｏｌ／ｌ  ＢＴＣ＋１０ｎｍｏｌ／ｌ  ＢＴＣ−δ４）由来のライセート。抗ＥｒｂＢ１（ＡＧ２８０４）抗体または抗ＥｒｂＢ４（ＣＨＯ−ＥｒｂＢ４）抗体で細胞を免疫沈降（ＩＰ）させ、次いでブロットし、抗ホスホチロシン抗体（αＰＹ）でプローブした。さらにブロットを剥がし、抗ＥｒｂＢ１抗体または抗ＥｒｂＢ４抗体で再プローブした。
【図９】ＢＴＣおよびＢＴＣ−δ４が、ＡＲ４２Ｊ細胞の分化を誘導することを示す。２ｎＭのアクチビンＡと、１ｎＭのＢＴＣ（パネルＡおよびＣ）またはＢＴＣ−δ４（パネルＢおよびＤ）と共に、ＡＲ４２Ｊ−Ｂ２０細胞を４８時間インキュベートし、次いで固定し、抗インスリン抗体（矢印「１」）および核を染色するためのＤＡＰＩ（矢印「２」）で染色した。アクチビンＡおよびＢＴＣ−δ４で処理した細胞では、多くの細胞がインスリンを発現したが、核が断片化され（矢印「３」）または消失した。倍率：パネルＡおよびＢは×１００、パネルＣおよびＤは×４００。
【図１０】ＢＴＣ−δ４ではなくＢＴＣが、ＡＲ４２Ｊ細胞のアクチビン誘導アポトーシスを改善することを示す。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ２０細胞を２ｎＭ  アクチビンＡと、１ｎＭ  ＢＴＣ（Ａ）またはＢＴＣ−δ４（Ｂ）で４８時間処理した。矢印はＴＵＮＥＬ陽性細胞を示す。
【図１１】ＳＴＺ処置ラットへのＢＴＣ−δ４の投与が、血漿グルコース濃度を低下させ、糖耐性を改善させることを示す。Ａ：ＳＴＺ（８５μｇ／ｇ）を第０日（１日齢の新生仔）に注射し、第０日から開始して５日間、ＢＴＣまたはＢＴＣ−δ４（３ｐｍｏｌ／ｇ）の毎日の注射を行い、血漿グルコース濃度を測定した。値は平均±Ｓ．Ｅ．である。○はＳＴＺ群（ｎ＝５）、●はＳＴＺ／ＢＴＣ−δ４群（ｎ＝５）、△はＳＴＺ／ＢＴＣ群（ｎ＝５）である。＊Ｐ＜０．０５はＳＴＺ群に対するもの。Ｂ：２月齢ラットで糖耐性検査を実施した。左パネル、血漿グルコース濃度の変化。右パネル、血漿インスリン濃度の変化。値は平均±ＳＥである。○はＳＴＺ群（ｎ＝５）、●はＳＴＺ／ＢＴＣ−δ４群（ｎ＝５）、△はＳＴＺ／ＢＴＣ群（ｎ＝５）、（−−−）は正常なＳＤラット（ｎ＝３）である。＊ＳＴＺ群に対してＰ＜０．０５、＊＊ＳＴＺ群に対してＰ＜０．０１。
【図１２】図１１に記載した研究の第４日に測定した、ＰＤＸ−１陽性腺管細胞の数（Ａ）および膵島様細胞クラスタ（ＩＣＣ）の数（Ｂ）を示す。（Ａ）：ＰＤＸ−１陽性腺管細胞（矢印「１」）：ＰＤＸ−１（矢印「２」）：サイトケラチン。（Ｂ）：ＩＣＣ（矢印「３」）：サイトケラチン（矢印「４」）：インスリン（矢印５」）：ＤＡＰＩ。ＳＴＺ：生理食塩水で処置したＳＴＺ注射ラット。＊ＳＴＺに対してｐ＜０．０５。＊＊ＳＴＺに対してｐ＜０．０１。倍率は、Ａ：×４００、Ｂ：×１００。
【図１】
2008509093.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月9日(2007.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記：
ａ）膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有し、かつその細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減しているポリペプチド、または
ｂ）前記ポリペプチドをコードする核酸、
の、２型糖尿病の治療を必要としている被験体の２型糖尿病の治療のための医薬の製造における使用。
【請求項２】
被験体においてＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４受容体を活性化する前記ポリペプチドの能力が、真正ＢＴＣのその能力と比較して大幅に低減されている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化が、他の細胞型の増殖を刺激することなく刺激される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記ポリペプチドの細胞型の増殖を刺激する能力が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその能力と比較して低減している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記ポリペプチドのＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４受容体を活性化する能力が、欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその能力と比較して低減している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記ポリペプチドのＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ３ホモ二量体を活性化する能力が、欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその能力と比較して低減している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
治療の副作用として被験体において癌が生じる危険性が、真正ＢＴＣでの治療から生じる危険性と比較して低減されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、ＥＧＦファミリーのメンバーと実質的に相同である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、上皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子、エピレグリン、アンフィレグリン、ＥｒｂＢキナーゼに対する神経由来および胸腺由来アクチベーター（ＮＴＡＫ）、ニューレグリン・サブファミリーのメンバー（ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４）、またはベータセルリン（ＢＴＣ）と実質的に相同である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＢＴＣ−δ４と実質的に相同である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがＢＴＣ−δ４である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＢＴＣ−δ４ポリペプチドが、図４に示すアミノ酸配列（配列番号１１）を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、
（ａ）真正ＢＴＣをコードする遺伝子中に通常存在するＣ５−Ｃ６ジスルフィドループを欠如している、ＢＴＣのスプライス変異体、または
（ｂ）分子（ａ）の配列と実質的に相同な配列を有するポリペプチド、または
（ｃ）分子（ａ）の類似体、断片、突然変異体、誘導体、もしくはアレル変異体、
である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、
（ａ）真正ＢＴＣをコードする遺伝子中に通常存在するＣ５−Ｃ６ジスルフィドループを欠如し、かつループＡおよびＢならびにその「ヒンジ」であるバリンを含むその成熟分子の残部が末端切断されたＣ末端細胞質尾部にインフレームで融合している、ＢＴＣのスプライス変異体、
（ｂ）分子（ａ）と実質的に相同な配列を有するポリペプチド、または
（ｃ）（ａ）の断片、類似体、変異体、または誘導体、
である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、β細胞の分化因子として作用すること、β細胞量を増大させること、β細胞の機能低下を減少させること、および／またはβ細胞によるインスリン分泌を増加させることができる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
被験体が、以下の糖尿病危険因子：耐糖能障害、メタボリック症候群、１型または２型糖尿病の家族歴、肥満、多嚢胞性卵巣症候群、高血圧症、または高コレステロールレベルのうち一つまたはそれ以上を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
被験体がＬＡＤＡにも罹患している、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
下記：
ａ）膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有し、かつその細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減しているポリペプチド、または
ｂ）前記ポリペプチドをコードする核酸、
の、糖尿病状態に罹患しているかまたは罹患する危険性がある被験体において糖尿病状態を予防し、またはその発症を遅延させるための医薬の製造における使用。
【請求項１９】
前記糖尿病状態が２型糖尿病である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記糖尿病状態が１型糖尿病である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
被験体がＬＡＤＡにも罹患している、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
下記：
ａ）膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有し、かつその細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減しているポリペプチド、または
ｂ）前記ポリペプチドをコードする核酸、
の、糖尿病状態の治療を必要としている被験体の糖尿病状態の治療のための医薬の製造における使用であって、
治療の副作用として被験体において癌が生じる危険性が、ＢＴＣでの治療に伴う危険性と比較して低減されている、前記使用。
【請求項２３】
前記糖尿病状態が２型糖尿病である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記糖尿病状態が１型糖尿病である、請求項２２に記載の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月4日(2007.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記：
ａ）膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有し、かつその細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減しているポリペプチド、または
ｂ）前記ポリペプチドをコードする核酸、
の、２型糖尿病の治療を必要としている被験体の２型糖尿病の治療のための医薬の製造における使用。
【請求項２】
被験体においてＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４受容体を活性化する前記ポリペプチドの能力が、真正ＢＴＣのその能力と比較して大幅に低減されている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化が、他の細胞型の増殖を刺激することなく刺激される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記ポリペプチドの細胞型の増殖を刺激する能力が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその能力と比較して低減している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記ポリペプチドのＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４受容体を活性化する能力が、欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその能力と比較して低減している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記ポリペプチドのＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ３ホモ二量体を活性化する能力が、欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその能力と比較して低減している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
治療の副作用として被験体において癌が生じる危険性が、真正ＢＴＣでの治療から生じる危険性と比較して低減されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、ＥＧＦファミリーのメンバーと実質的に相同である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、上皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子、エピレグリン、アンフィレグリン、ＥｒｂＢキナーゼに対する神経由来および胸腺由来アクチベーター（ＮＴＡＫ）、ニューレグリン・サブファミリーのメンバー（ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４）、またはベータセルリン（ＢＴＣ）と実質的に相同である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＢＴＣ−δ４と実質的に相同である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがＢＴＣ−δ４である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＢＴＣ−δ４ポリペプチドが発現ベクターｐＥＴ３ｂを用いて組換え合成されたものであり、該ポリペプチドは可溶化され、封入体から再び折り畳まれ、そしてカチオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記ＢＴＣ−δ４ポリペプチドが、図４に示すアミノ酸配列（配列番号１１）を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、
（ａ）真正ＢＴＣをコードする遺伝子中に通常存在するＣ５−Ｃ６ジスルフィドループを欠如している、ＢＴＣのスプライス変異体、または
（ｂ）分子（ａ）の配列と実質的に相同な配列を有するポリペプチド、または
（ｃ）分子（ａ）の類似体、断片、突然変異体、誘導体、もしくはアレル変異体、
である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、
（ａ）真正ＢＴＣをコードする遺伝子中に通常存在するＣ５−Ｃ６ジスルフィドループを欠如し、かつループＡおよびＢならびにその「ヒンジ」であるバリンを含むその成熟分子の残部が末端切断されたＣ末端細胞質尾部にインフレームで融合している、ＢＴＣのスプライス変異体、
（ｂ）分子（ａ）と実質的に相同な配列を有するポリペプチド、または
（ｃ）（ａ）の断片、類似体、変異体、または誘導体、
である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、β細胞の分化因子として作用すること、β細胞量を増大させること、β細胞の機能低下を減少させること、および／またはβ細胞によるインスリン分泌を増加させることができる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
被験体が、以下の糖尿病危険因子：耐糖能障害、メタボリック症候群、１型または２型糖尿病の家族歴、肥満、多嚢胞性卵巣症候群、高血圧症、または高コレステロールレベルのうち一つまたはそれ以上を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
被験体がＬＡＤＡにも罹患している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
下記：
ａ）膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有し、かつその細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減しているポリペプチド、または
ｂ）前記ポリペプチドをコードする核酸、
の、糖尿病状態に罹患しているかまたは罹患する危険性がある被験体において糖尿病状態を予防し、またはその発症を遅延させるための医薬の製造における使用。
【請求項２０】
前記糖尿病状態が２型糖尿病である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記糖尿病状態が１型糖尿病である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
被験体がＬＡＤＡにも罹患している、請求項１９に記載の使用。
【請求項２３】
下記：
ａ）膵島細胞前駆細胞の膵β細胞への分化を刺激する能力を有し、かつその細胞増殖促進活性が欠如しているかまたは真正ＢＴＣのその活性と比較して低減しているポリペプチド、または
ｂ）前記ポリペプチドをコードする核酸、
の、糖尿病状態の治療を必要としている被験体の糖尿病状態の治療のための医薬の製造における使用であって、
治療の副作用として被験体において癌が生じる危険性が、ＢＴＣでの治療に伴う危険性と比較して低減されている、前記使用。
【請求項２４】
前記糖尿病状態が２型糖尿病である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記糖尿病状態が１型糖尿病である、請求項２３に記載の使用。
【国際調査報告】
2008509093.tif 000022
2008509093.tif 000023
2008509093.tif 000024