(57)【要約】超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護する方法が、本明細書中に開示される。本発明のこの方法は、界面活性剤を細胞に送達することを含む。本発明の一態様では、この界面活性剤は、５，０００Ｄａ未満の分子量を有する。本発明の一態様では、この界面活性剤は、キャビテーション気泡の気液界面に蓄積し、該界面活性剤がラジカルをクエンチする。本発明のまた別の態様では、この界面活性剤は、少なくとも１つの疎水性基を含む炭水化物を含む。
2008516635.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に界面活性剤を送達することを含む、超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護する方法であって、該界面活性剤は、以下の式Ｉ：
【化１】
2008516635.tif 000011
を有する少なくとも１つの単位あるいはその薬学的に受容可能な塩またはエステルを含み、
この式において、Ｘは酸素、硫黄またはＮＲ５であり、
Ｙは酸素、硫黄またはＮＲ６であり、
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立して、水素、分岐鎖もしくは直鎖アルキル基、置換もしくは非置換アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、エステル基、アルデヒド基、ケト基、アミド基、糖類の残基、またはこれらの組み合わせであり、
ここで、Ｒ１〜Ｒ７の少なくとも１つが疎水性基であり、
該界面活性剤は、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせではない、方法。
【請求項２】
細胞に界面活性剤を送達することを含む、超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護する方法であって、該界面活性剤が以下の式Ｉ
【化２】
2008516635.tif 000012
を有する少なくとも１つの単位またはその薬学的に受容可能な塩またはエステルを含み、
この式において、Ｘは酸素、硫黄またはＮＲ５であり、
Ｙは酸素、硫黄またはＮＲ６であり、
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立して、水素、分岐鎖もしくは直鎖アルキル基、置換もしくは非置換アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、エステル基、アルデヒド基、ケト基、アミド基、糖類の残基、またはこれらの組み合わせであり、
Ｒ１〜Ｒ７の少なくとも１つが疎水性基であり、
該界面活性剤は、５，０００Ｄａ未満の分子量を有する、方法。
【請求項３】
前記界面活性剤が１，０００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記界面活性剤が式Ｉを有する単位の１０個未満を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ４が疎水性基であり、Ｒ１〜Ｒ３およびＲ７が独立して水素または糖類の残基である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ７が疎水性基であり、Ｒ１〜Ｒ４が独立して水素または糖類の残基である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ１〜Ｒ４およびＲ７の少なくとも１つが水素である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
ＸおよびＹが酸素である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
Ｒ１〜Ｒ３が水素である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ７が水素である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ７が糖類の残基である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記糖類の残基が単糖類である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単糖類が、２−デオキシリボース、フルクトース、イドース、グロース、タロース、ガラクトース、マンノース、アルトロース、アロース、キシロース、リキソース、アラビノース、リボース、トレオース、グルコサミン、エリトロースまたはこれらのピラノシドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記単糖類がグルコピラノシドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ４が分岐鎖または直鎖Ｃ１〜Ｃ２５アルキル基である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ４が分岐鎖または直鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ４が分岐鎖または直鎖Ｃ２〜Ｃ９アルキル基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ４が分岐鎖または直鎖Ｃ４〜Ｃ９アルキル基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ４がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルまたはオクチルである、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ１がＣ（Ｏ）Ｒ８であり、Ｒ８が分岐鎖または直鎖Ｃ１〜Ｃ２５アルキル基である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ１がＣ（Ｏ）ＮＨＲ９であり、Ｒ９が分岐鎖または直鎖Ｃ１〜Ｃ２５アルキル基である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ２、Ｒ３およびＲ７が水素である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ４が分岐鎖または直鎖Ｃ１〜Ｃ２５アルキル基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ４がメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシルである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記界面活性剤がα−アノマーである、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記界面活性剤がβ−アノマーである、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記界面活性剤がアルキル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、アルキル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、アルキル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、アルキル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、またはアルキル−β−Ｄ−マルトリオシドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２８】
前記界面活性剤がヘキシル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ノニル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、デシル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ウンデシル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ドデシル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、デシル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、ウンデシル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、またはドデシル−β−Ｄ−チオマルトピラノシドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２９】
前記界面活性剤がアルキル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３０】
前記界面活性剤が、ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ウンデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、トリデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、テトラデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ペンタデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘキサデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、メチル−６−Ｏ（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド、６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、または３−シクロヘキシル−１−プロピル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３１】
前記界面活性剤がアルキル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３２】
前記界面活性剤が２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ノニル−β−Ｄ−マルトピラノシド、デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、トリデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、テトラデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ペンタデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、またはヘキサデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３３】
前記界面活性剤が、レアトリル、アルブチン、サリシン、ジギトキシン、ｎ−ラウリル−β−Ｄ−マルトピラノシド、グリシリチン、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシド、またはｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３４】
前記界面活性剤が天然に存在するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３５】
前記界面活性剤が、（Ｚ）−５′−ヒドロキシジャスモン５′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、３′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−カタルポール、プリンセピオール−４−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フラキシレシノール−４′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、クエルセチン３−Ｏ−α−Ｌ−アラビノピラノシル−（１−−＞２）−β−Ｄ−グルコピラノシド、ケンフェロール３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、クエルセチン３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、カテキン（４−α−−＞８）ペラルゴニジン３−Ｏ−β−グルコピラノシド、エピカテキン（４−α−−＞８）ペラルゴニジン３−Ｏ−β−グルコピラノシド、アフゼレキン（４−α−−＞８）ペラルゴニジン３−Ｏ−β−グルコピラノシド、エピアフゼレキン（４−α−−＞８）ペラルゴニジン３−Ｏ−β−グルコピラノシド、クエルセチン３，７−Ｏ−β−Ｄ−ジグルコピラノシド、クエルセチン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノソール−（１−−＞６）−β−Ｄ−グルコピラノソール−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、イソラムネチン−３−Ｏ−β−Ｄ−６′−アセチルグルコピラノシドまたはイソラムネチン−３−Ｏ−β−Ｄ−６′−アセチルガラクトピラノシドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が化合物送達のためにソノポレーションを受ける、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）を受ける、腫瘍細胞または腫瘍細胞に近接する健常な細胞である、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）を受ける、腫瘍細胞に近接する健常な細胞である、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、超音波が適用されるバイオリアクター内の植物、動物または微生物の細胞である、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、焦点式超音波を使用した経頭蓋血栓崩壊のときの脳細胞である、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が、水晶体超音波吸引のときの角膜内皮細胞である、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
細胞に界面活性剤を投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から該細胞を保護する方法であって、該界面活性剤がキャビテーション気泡の気液界面に蓄積し、該界面活性剤がラジカルをクエンチする、方法。
【請求項４３】
前記界面活性剤が少なくとも１つの疎水性基を含む炭水化物を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記炭水化物が単糖類である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記単糖類が、２−デオキシリボース、フルクトース、イドース、グロース、タロース、ガラクトース、マンノース、アルトロース、アロース、キシロース、リキソース、アラビノース、リボース、トレオース、グルコサミン、エリトロースまたはこれらのピラノシドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記単糖類がグルコピラノシドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記炭水化物が二糖類である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記二糖類がラクトース、セロビオースまたはスクロースである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記二糖類がマルトセピラノシドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記炭水化物が多糖類である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記多糖類が、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、ヘパラン、ヘパリン、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸、アルギン酸、ペクチン、またはカルボキシメチルセルロースである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
前記疎水性基が分岐鎖または直鎖Ｃ１〜Ｃ２５アルキル基を含む、請求項４２〜５１のいずれかに記載の方法
【請求項５３】
前記疎水性基が分岐鎖または直鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基を含む、請求項４２〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記疎水性基が分岐鎖または直鎖Ｃ２〜Ｃ９アルキル基を含む、請求項４２〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
細胞に界面活性剤を投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から該細胞を保護する方法であって、該界面活性剤がヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、方法。
【請求項５６】
細胞に界面活性剤を投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から該細胞を保護する方法であって、該界面活性剤がヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、方法。
【請求項５７】
細胞に界面活性剤を投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から該細胞を保護する方法であって、該界面活性剤がオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、方法。
【請求項５８】
細胞に界面活性剤を投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から該細胞を保護する方法であって、該界面活性剤がノニル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、方法。
【請求項５９】
細胞に界面活性剤を投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から該細胞を保護する方法であって、該界面活性剤がヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、方法。
【請求項６０】
細胞に界面活性剤を投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から該細胞を保護する方法であって、該界面活性剤がｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、方法。
【請求項６１】
細胞に界面活性剤を投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から該細胞を保護する方法であって、該界面活性剤がｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドである、方法。
【請求項６２】
細胞に界面活性剤を投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から該細胞を保護する方法であって、該界面活性剤が２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、方法。
【請求項６３】
細胞に界面活性剤を投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から該細胞を保護する方法であって、該界面活性剤がメチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドである、方法。
【請求項６４】
細胞に界面活性剤を投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から該細胞を保護する方法であって、該界面活性剤が３−シクロヘキシル−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシドである、方法。
【請求項６５】
細胞に界面活性剤を投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から該細胞を保護する方法であって、該界面活性剤が６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボキシル−α−Ｄ−グルコピラノシドである、方法。
【請求項６６】
腫瘍の治療が必要な被験体において、腫瘍を治療する方法であって、
ａ．有効量の界面活性剤を該腫瘍の領域に投与する工程であって、該界面活性剤はキャビテーション気泡の気液界面に蓄積し、該界面活性剤がラジカルをクエンチする、工程；および
ｂ該腫瘍を高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）に供し、それによって該腫瘍が治療される工程、
を包含する、方法。
【請求項６７】
化合物を細胞に送達する方法であって、
ａ．界面活性剤を含む組成物を該細胞に投与する工程であって、該界面活性剤はキャビテーション気泡の気液界面に蓄積し、該界面活性剤はラジカルをクエンチする、工程；および
ｂ．該化合物の存在下で、該細胞をソノポレーションする上で十分な超音波周波数に該細胞を供し、それによって該細胞に該化合物を送達する工程、
を包含する、方法。
【請求項６８】
前記界面活性剤がヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項６６〜６７いずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記界面活性剤がヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項６６〜６７いずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記界面活性剤がオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項６６〜６７いずれかに記載の方法。
【請求項７１】
前記界面活性剤がノニル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項６６〜６７いずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記界面活性剤がヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、請求項６６〜６７いずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記界面活性剤がｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、請求項６６〜６７いずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記界面活性剤がｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドである、請求項６６〜６７いずれかに記載の方法。
【請求項７５】
前記界面活性剤が２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシドある、請求項６６〜６７いずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記界面活性剤がメチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項６６〜６７いずれかに記載の方法。
【請求項７７】
前記界面活性剤が３−シクロヘキシル−１−プロピル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項６６〜６７いずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記界面活性剤が６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボキシル−α−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項６６〜６７いずれかに記載の方法。
【請求項７９】
界面活性剤を適切な薬学的キャリア中に含む組成物であって、該界面活性剤はキャビテーション気泡の気液界面に蓄積することができ、該界面活性剤はラジカルをクエンチすることができる、組成物。
【請求項８０】
適切な薬学的キャリア内に、請求項１に記載の化合物および少なくとも１つの界面活性剤を含む組成物であって、該化合物は、ソノポレーションによって被験体における細胞に送達される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、Ｓｏｓｔａｒｉｃらによって２００４年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／６２０２５８号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／６２０２５８号は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書に開示されているのは、超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護することができる、界面活性剤およびその組成物である。また、超音波を施す前または超音波を施すのと同時に、開示されている界面活性剤およびその組成物を細胞または被験体内の細胞に送達する方法も開示されている。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
診療用途での超音波の使用は、周知である。例えば理学療法における超音波の治療的な使用は、かねてから行われてきた。超音波の他の治療的な使用は、例えば高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）として現れており、これは腫瘍を切断するために患者で使用されている。加えて、超音波エネルギーは、遺伝子治療、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、経皮薬剤送達、音波力学療法（ｓｏｎｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）、心血管用途などにおいて、使用されているか、または使用が検討されている。これらの超音波の治療的な使用は、熱的影響（例えば、温熱療法）、機械的影響（例えば、音響キャビテーション、または放射線力、アコースティックストリーミングおよび他の超音波誘導性の力）、ならびに化学的影響（音化学を介した、または音ルミネセンスによる溶質の活性化による）により、細胞崩壊を含む組織状態の変化を誘導する。
【０００４】
音響キャビテーションは、液体媒質における微小気泡の形成、成長、および特定の状況下におけるほぼ断熱的な崩壊を伴う（Ｎｅｐｐｉｒａｓ，Ｅ．Ａ．１９８０；Ａｐｆｅｌ，Ｒ．Ｅ．Ｊ．１９８１；Ｌｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｇ．１９９４）。医学および生物学における音響キャビテーションの影響の研究において、気泡は、不活性気泡または気体活性（安定キャビテーション）気泡のいずれかに分類される（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．１９９６）。不活性気泡が高温および高圧で崩壊すると、高温スポットが形成される（Ｎｏｌｔｉｎｇｋ，Ｂ．Ｅ．およびＮｅｐｐｉｒａｓ，Ｅ．Ａ．１９５０；Ｎｅｐｐｉｒａｓ，Ｅ．Ａ．およびＮｏｌｔｉｎｇｋ，Ｂ．Ｅ．１９５１；Ｓｕｓｌｉｃｋ，Ｋ．Ｓ．ら、１９８６；Ｓｕｓｌｉｃｋ，Ｋ．Ｓ．１９９０；Ｄｉｄｅｎｋｏ，Ｙ．Ｔ．ら、１９９９ａ）。これが、音ルミネセンスの供給源（Ｈａｒｖｅｙ，Ｅ．Ｎ．１９３９：Ｄｉｄｅｎｋｏ，Ｙ．Ｔ．ら、１９９６；Ｄｉｄｅｎｋｏ，Ｙ．Ｔ．ら、１９９９ｂ；ＭｃＮａｍａｒａ，Ｗ．Ｂ．ら、１９９９）、および音化学の供給源である（Ｓｕｓｌｉｃｋ，Ｋ．Ｓ．１９８８；Ｍａｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．およびＬｏｒｉｍｅｒ，Ｊ．Ｐ．１９８８；Ｍａｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．１９９０）。安定した気泡は数百の音響周期に対して平衡半径の周りで振動し、この間に周囲の環境に剪断応力の領域を作り出す。安定なキャビテーション気泡が、整流拡散プロセスを介して、不活性駆動崩壊を受けることができる大きさに成長することもあるためである点において、この気泡の定義はやや不明瞭である（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ，ＴＧ，Ｔｈｅ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｂｕｂｂｌｅ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４，ｐ３３５およびｐ４２７；音波崩壊（ｓｏｎｏｌｙｓｉｓ）のときに見出すことができる気泡の種類の教示について、参考として本明細書に盛り込まれる）。
【０００５】
生物系における不活性キャビテーションの主要な化学的生成物はまとめられている（Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．２００３を参照）。これは、それらの生成物の教示について、参考として本明細書に盛り込まれている。要約すると、水を有する環境での不活性キャビテーション気泡の激しい崩壊は、気泡中に水蒸気のホモリシスをもたらして、音崩壊の一次ラジカルとして公知のＨ・原子または・ＯＨラジカルを作り出す。これらの一次ラジカルが再度組み合わさって、Ｈ２Ｏ、Ｈ２およびＨ２Ｏ２を生成することができる。空気の存在下で、Ｈ・原子は酸素と反応してヒドロペルオキシラジカル（ＨＯ２・）を形成することもでき、これらはほとんどの場合、自然のｐＨで超酸化物ラジカルアニオン（Ｏ２・−）に分離する。更に、一次ラジカルは極めて反応性が高く、非揮発性有機溶質（ＲＨ）、特に不活性キャビテーション気泡の気液界面における濃度が比較的高い溶質から、水素原子を抽出する。これにより炭素中心ラジカル（Ｒ・）が作り出され、これらが酸素と反応して、有機溶質から誘導される、比較的寿命が長い有機ペルオキシルラジカル（ＲＯ２・）などの反応性酸素ラジカルも生成する。キャビテーション誘導細胞崩壊の機序は完全には解明されていないものの、キャビテーション気泡は、Ｈ２Ｏ２のような細胞毒性種（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａ．１９８７）およびフリーラジカル中間体（Ｌｉｐｐｉｔｔ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．１９７２；Ｍｉｓｉｋ，Ｖ．およびＲｉｅｓｚ，Ｐ．１９９９）（不活性気泡）および／またはキャビテーション気泡の周囲のアコースティックストリーミングの流れにより誘導される剪断応力のような、細胞膜に対する物理的な力（Ｎｅｐｐｉｒａｓ，  Ｅ．Ａ．  １９８０；  Ｌｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｔ．Ｇ．  １９９４；  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｍ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９６；  Ｙｏｕｎｇ，  Ｆ．Ｒ．  １９８９；  Ｋｏｎｄｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９８９）（不活性および安定気泡）の形成により、細胞崩壊を誘導する可能性がある。近年、直線的に振動する単一の微小気泡により生成される剪断応力でさえも、脂質小胞の穿孔および崩壊を引き起こす上で十分な大きさであることが示されている（Ｍａｒｍｏｔｔａｎｔ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｇｅｎｆｅｌｄｔ，  Ｓ．  ２００３）。
【０００６】
例えばチオールを基にした分子（Ｆａｈｅｙ，  Ｒ．Ｃ．  １９８８；  Ｚｈｅｎｇ，  Ｓ．Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９８８；  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｊ．Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９１；  Ａｇｕｉｌｅｒａ，  Ｊ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９２）およびニトロキシド（Ｈａｈｎ，  Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９２ａ；  Ｈａｈｎ，  Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９２ｂ；  Ｎｅｗｔｏｎ，  Ｇ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９６）のような特定の分子は、細胞の核に近接したラジカルを捕捉して、哺乳類の細胞に対する電離放射線の損傷作用から保護することが可能である。しかし、脂質膜およびその構成成分に対する損傷（Ｅｌｌｗａｒｔ，  Ｊ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９８；  Ｈｒｉｓｔｏｖ，  Ｐ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９７；  Ｋａｗａｉ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）、ＤＮＡ損傷（Ｄｏｏｌｅｙ，  Ｄ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９８４；  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｄ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９１）、生殖生存能の欠損（Ｆｕ，  Ｙ．−Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９７９；  Ｋｏｎｄｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９８８；  Ｉｎｏｕｅ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９８９）、アポトーシス（Ｌａｇｎｅａｕｘ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）および即時細胞溶解（Ｍｉｙｏｓｈｉ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３；  Ｓａｃｋｓ，  Ｐ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９８２；  Ｃｈｕｒｃｈ，  Ｃ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９８２）を含めたキャビテーション誘導損傷から保護することができる分子を予測することは困難であると思われる。これらの保護分子は、キャビテーションの化学的および物理的影響の両方から細胞を保護する能力を有すると思われる。
【０００７】
生物系および医学における超音波の有益な効果は、一般的に、超音波の悪影響、例えば健常な組織の損傷または健常な組織の細胞崩壊と相等しく、従ってそれにより制限されている。そのため、多くの用途では、超音波媒介細胞崩壊を低減または防止できる化合物を投与することが有益である。例えば、グリコサミノグリカンのヒアルロン酸ナトリウムおよびコンドロイチン硫酸ナトリウムは、水晶体超音波吸引術、即ち白内障を非常に微細な断片に破壊する超音波の使用時において、角膜内皮細胞を保護するために、眼科粘弾性手術装置（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｖｉｓｃｏｓｕｒｇｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅ）（ＯＶＤ）の主要成分として使用されてきた（非特許文献１）。これらのＯＶＤは、部分的には、水晶体超音波吸引術時に角膜内皮細胞に付着するメッシュ構造を形成することによって機能する。保護の機序は未知であるものの、このＯＶＤメッシュは、酸化防止特性により、超音波誘導ラジカルの悪影響から内皮細胞を保護することが示唆されている（非特許文献２）。
【０００８】
しかし、長鎖グリコサミノグリカンの高粘性は系の粘性も変え、それが音響キャビテーション気泡の形成および力学、従って超音波の潜在的なポジティブな効果を妨げる。他の系、例えばインビトロでの細胞の懸濁またはヒトの体内深くの組織においては、細胞または組織それぞれに当該粘性構造を作り出すことは、不可能でないにしろ、現実的ではない。粘性メッシュ様構造を細胞の表面に適用する代わりに、超音波により誘導される物理的特性に対する影響を最小限にするかまたは影響を与えない、超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護する分子を提供することが有益である。更に、音響キャビテーション気泡の気液界面に蓄積し、ラジカル形成部位で細胞を超音波媒介損傷から保護することができる、比較的小さな溶質分子を使用することも有益である。本明細書に記載される化合物、組成物および方法は、広範囲の超音波周波数および強度条件でこの目的を達成し、現在は利用できない、診療、治療およびバイオテクノロジー用途における超音波の使用に新たな可能性ももたらす。
【非特許文献１】Ｍｉｙａｔａ  Ｋ．ら、２００２．Ｊ  Ｃａｔａｒａｃｔ  Ｒｅｆｒａｃｔ  Ｓｕｒｇ．２８（９）：ｐ．１５５７−６０
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｈ．ら、２００２，Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１２０（１０）：ｐ．１３４８−５２
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載されているのは、細胞を超音波媒介損傷から保護する方法である。本発明のさらなる利点は、以下の説明において部分的に記載され、当該説明から部分的に明らかになり、または本発明の実施により教示され得る。本発明の利点は、添付の請求項にて具体的に指摘されている要素および組み合わせにより理解され、実現される。前述の概説および後述の詳細な説明は、いずれも例示および説明のみのためのものであり、特許請求される本発明の範囲を制限するものではないことを理解しなければならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、以下の本発明の好ましい実施態様および本明細書に含まれる実施例の詳細な説明、ならびに図面およびその前後の説明を参照することで、より容易に理解することができる。
【００１１】
本発明の化合物、組成物、物品および／または方法が開示および記載される前に、これらが、特に指摘されない限り特定の合成方法もしくは特定の組換えバイオテクノロジー法、または特に指摘されない限り特定の試薬に限定されず、そのようなものは当然のことながら変更できることを理解しなければならない。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施態様を説明することのみを目的としており、制限することを意図しないことも理解しなければならない。
【００１２】
本明細書および添付の請求書において使用される際、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に状況を明確に指示していない限り複数の言及を含む。従って、例えば、「ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ（薬学的キャリア）」という記載には、２つ以上のそのようなキャリアの混合物が含まれる。
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲には、以下の意味を有するように定義された用語がいくつか記載される。
【００１４】
「任意の」または「任意に」という用語は、続いて記載される事象または状況が生じることも、または生じないこともあり、その説明には、前記事象または状況が生じた場合と生じない場合が含まれることを意味する。
【００１５】
範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして本明細書で表されることがある。当該範囲が表される場合、別の態様は、１つの特定の値から、かつ／または別の特定の値までを含むことになる。同様に、先行する「約」の使用により値が近似値として表される場合、特定の値は別の態様を形成することものと理解される。更に、それぞれの範囲の終点は、他の終点との関係性および他の終点からの独立性の両方において重要であることが理解される。本明細書において開示される値はいくつかあり、それぞれの値は、また、その値自体に加えて「約」という特定の値として本明細書に開示されていることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合は、「約１０」も開示される。また、値がある値「以下」を開示する時には、「その値以上」およびその値の間の可能な範囲も開示されることも理解され、このことは当業者に適切に理解される。例えば、値「１０」が開示される場合は、「１０以下」ならびに「１０以上」も開示される。そして、本出願全体を通して、データはいくつかの異なる形式で提示され、このデータは終点および始点、ならびにこれらのデータ点のあらゆる組み合わせの範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点１５が開示される場合、１０および１５を超える、１０および１５以上、未満および以下、１０および１５に等しい、ならびに１０と１５の間の値が開示されているものと理解される。
【００１６】
特に指示がない限り、成分の重量％は、成分が含まれる製剤または組成物の総重量に基づく。
【００１７】
本出願全体を通して使用されるＲ１〜Ｒ９、ＸおよびＹのような変数は、特に指示がない限り、前に定義された変数と同じである。
【００１８】
本明細書で使用される「アルキル基」という用語は、炭素原子１〜２５個の分岐鎖または非分岐鎖の飽和炭化水素基であり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル等である。
【００１９】
本明細書で使用される「アルケニル基」という用語は、炭素原子２〜２４個および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む構造式の炭化水素基である。（ＡＢ）Ｃ＝Ｃ（ＣＤ）のような非対称構造は、ＥおよびＺ異性体の両方を含むことを意図する。これは、非対称アルケンが存在する本明細書の構造式から推測されることもあれば、結合符号Ｃにより明示的に示されることもある。
【００２０】
本明細書で使用される「アルキニル基」という用語は、炭素原子２〜２４個および少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む構造式の炭化水素基である。
【００２１】
本明細書で使用される「アリール基」という用語は、ベンゼン、ナフタレン等を含むが、これらに限定されない、任意の炭素系芳香族基である。また、「芳香族」という用語には「ヘテロアリール基」が含まれ、これは、芳香族基の環内に組みこまれた少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基として定義される。ヘテロ原子の例には、窒素、酸素、硫黄およびリンが含まれるが、これらに限定されない。アリール基は、置換されていても、置換されていなくてもよい。アリール基は、アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、ハロゲン化物、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸またはアルコキシを含むが、これらに限定されない、１つ以上の基により置換され得る。
【００２２】
本明細書で使用される「シクロアルキル基」という用語は、少なくとも３個の炭素原子から構成される、非芳香族炭素系環である。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が含まれるが、これらに限定されない。また、「ヘテロシクロアルキル基」という用語は、環の炭素原子のうち少なくとも１個が、ヘテロ原子（窒素、酸素、硫黄またはリンを含むが、これらに限定されない）により置換されている、上で定義されたシクロアルキル基である。
【００２３】
本明細書で使用される「アラルキル」という用語は、芳香族基に結合されている上で定義されたアルキル、アルキニルまたはアルケニル基を有するアリール基である。アラルキル基の例には、ベンジル基がある。
【００２４】
本明細書で使用される「エステル」という用語は、式：−Ｃ（Ｏ）ＯＲにより表され、この式において、Ｒは、前述のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００２５】
本明細書で使用される「アルデヒド」という用語は、式：−Ｃ（Ｏ）Ｈにより表される。
【００２６】
本明細書で使用される「ケト基」という用語は、式：−Ｃ（Ｏ）Ｒにより表され、この式において、Ｒは前述のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基であり得る。
【００２７】
本明細書で使用される「アミド」という用語は、式：−Ｃ（Ｏ）ＮＲにより表され、この式において、Ｒは前述のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００２８】
本明細書で言及されるＲ１〜Ｒ７に関する「またはその組み合わせ」という語句は、Ｒ１〜Ｒ７のそれぞれが、上で列挙した２つ以上の基を任意に有することができることを意味する。例えば、Ｒ１が直鎖アルキル基である場合、アルキル基の水素原子のうちの１個は、例えばアリール基またはシクロアルキル基のような別の基により置換することができる。ここでＲ１は、アルキル基とアリール基の組み合わせである。
【００２９】
本明細書で使用される「単糖類」という用語は、加水分解によってより単一の単位に分解できない任意の炭水化物である。
【００３０】
本明細書で使用される「二糖類」という用語は、２つの単糖類単位から生成される任意の炭水化物である。
【００３１】
本明細書で使用される「多糖類」という用語は、２つより多い単糖類単位から生成される任意の炭水化物である。
【００３２】
本明細書で使用される「残基」という用語は、特定の反応スキームにおいて得られた化学種の生成物、またはその後の製剤もしくは化学生成物を成す一部分を意味し、その部分が化学種から実際に得られたかどうかは問題ではない。例えば、少なくとも１つの−ＣＯＯＨ基を含有する多糖類は、式：Ｙ−ＣＯＯＨで表すことができ、この式において、Ｙは多糖類部分の残りの部分（即ち、残基）である。
【００３３】
開示されている方法および組成物に使用できる、それらと併せて使用できる、またはそれらの調製に使用できる化合物、組成物および成分、またはそれらの生成物が、本明細書中で開示される。これらおよびその他の材料が本明細書には開示されており、また、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、基等が開示されるときには、これらの化合物のそれぞれ多様な個別のおよび総合的な組み合わせおよび交換に関する特定の言及が明確に開示されなくてもよいが、それぞれは具体的に企図され、本明細書に記載されることが理解される。従って、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスが開示され、同じく分子Ｄ、ＥおよびＦのクラス、ならびに組み合わせ分子Ａ−Ｄの例が開示され、それぞれが個別に記載されていない場合でさえも、それぞれが個別におよび総合的に考慮される。従って、この例では、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆのそれぞれが具体的に企図され、そしてそれぞれの組み合わせが、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；ならびに組み合わせＡ−Ｄの例の開示内容から開示されるとみなされるべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に考察され、開示される。従って、例えばＡ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループが具体的に企図され、そしてそれぞれの組み合わせが、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；ならびに組み合わせＡ〜Ｄの例の開示内容から開示されると考えるべきである。この概念は、開示される組成物を作製および使用する方法の工程を含むが、これらに限定されない、本開示の全ての態様に当てはまる。従って、実施できる多様な追加の工程がある場合、これらの追加の工程のそれぞれは、開示された方法の特定の実施態様または実施態様の組み合わせにより実施することができ、当該組み合わせはそれぞれ具体的に考察され、開示されると考えるべきである。
【００３４】
本明細書に提示されているのは、超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護する組成物および方法である。一つの態様では、その組成物は、音波保護剤（ｓｏｎｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）（本明細書では音波保護物質（ｓｏｎｏｐｒｏｔｅｃｔｏｒ）とも呼ぶ）を含む。別の態様では、その音波保護剤は界面活性剤を含む。更に別の態様では、音波保護剤は２つ以上の界面活性剤を含む。本明細書で使用される「界面活性剤」という用語は、液−液界面または気−液界面の間にいくらかの表面または界面活性を示す物質のことを指す。界面活性剤は、選択される界面活性剤、投与方法、および処置される細胞に応じて、アニオン性、カチオン性または中性であり得る。両性または双性イオン性界面活性剤（即ち、アニオン性とカチオン性の両方の特性を示す界面活性剤分子）の使用も考慮される。
【００３５】
一つの態様では、上記方法は界面活性剤を細胞に投与することからなり、前記界面活性剤は少なくとも１つの疎水性基を含む炭水化物を含む。「炭水化物」という用語は、ポリヒドロキシアルデヒドまたはケトンとしてもまた、本明細書に定義される。炭水化物は、上で定義された単糖類、二糖類または多糖類であり得る。前記炭水化物は環状でも、非環状でもよいことが企図される。本明細書で有用な環状炭水化物の場合、本明細書で使用される「ピラノシド」という用語は、非環状炭水化物の環状形態である。炭水化物は、当該技術分野で公知の技術を使用して環状形態および非環状形態に容易に変換することができる。単糖類の例には、２−デオキシリボース、フルクトース、イドース、グロース、タロース、ガラクトース、マンノース、アルトロース、アロース、キシロース、リキソース、アラビノース、リボース、トレオース、グルコサミン、エリトロースまたはこれらのピラノシドが含まれるが、これらに限定されない。一つの態様では、単糖類はグルコピラノシドである。二糖類の例には、ラクトース、セロビオース、またはスクロースが含まれるが、これらに限定されない。一つの態様では、二糖類はマルトセピラノシドである。多糖類の例には、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、ヘパラン、ヘパリン、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸、アルギン酸、ペクチン、またはカルボキシメチルセルロースが含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
上述の態様では、界面活性剤は、少なくとも１つの疎水性基を有する炭水化物である。「疎水性基」という用語は、水に対する親和性がほとんどまたは全くない任意の基として、本明細書で定義される。この疎水性基は、一般的に炭水化物基に共有結合されている。２つ以上の疎水性基が炭水化物に結合できることが企図される。一つの態様では、疎水性基は、炭素原子１〜２５個を有する分岐鎖または直鎖アルキル基である。別の態様では、疎水性基は、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１５、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ２〜Ｃ１５、Ｃ３〜Ｃ１５、Ｃ４〜Ｃ１５、Ｃ５〜Ｃ１５、Ｃ５〜Ｃ１０、Ｃ２〜Ｃ９またはＣ４〜Ｃ９の分岐鎖または直鎖アルキル基である。
【００３７】
一つの態様では、本明細書に記載されているのが、細胞に界面活性剤を送達することを含む、超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護する方法であって、前記界面活性剤が以下
【００３８】
【化３】
2008516635.tif 000003
の式Ｉを有する少なくとも１つの単位、またはこれらの薬学的に受容可能な塩またはエステルを含み、
この式において、Ｘは酸素、硫黄またはＮＲ５であり、
Ｙは酸素、硫黄またはＮＲ６であり、
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立して、水素、分岐鎖もしくは直鎖アルキル基、置換もしくは非置換アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、エステル基、アルデヒド基、ケト基、アミド基、糖類の残基、またはこれらの組み合わせであり、
Ｒ１〜Ｒ７の少なくとも１つが疎水性基であり、
前記界面活性剤は、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせではない方法である。
【００３９】
別の態様では、細胞に界面活性剤を送達することを含む、超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護する方法が本明細書中に記載される。ここで、この界面活性剤は以下
【００４０】
【化４】
2008516635.tif 000004
の式Ｉを有する少なくとも１つの単位、あるいはその薬学的に受容可能な塩またはエステルを含み、
この式において、Ｘは酸素、硫黄またはＮＲ５であり、
Ｙは酸素、硫黄またはＮＲ６であり、
Ｒ１〜Ｒ７が、それぞれ独立して、水素、分岐鎖もしくは直鎖アルキル基、置換もしくは非置換アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、エステル基、アルデヒド基、ケト基、アミド基、糖類の残基、またはこれらの組み合わせであり、
Ｒ１〜Ｒ７の少なくとも１つが疎水性基であり、
前記界面活性剤は、５，０００Ｄａ未満の分子量を有する方法である。
【００４１】
これらの態様において、界面活性剤に関する「単位」という用語は、界面活性剤に組み込まれた、式Ｉを有する少なくとも１つのフラグメントを有する化合物である。例えば、界面活性剤が多糖類である場合、式Ｉを有する単位は、多糖類鎖内にまたは多糖類鎖の末端部に組み込まれることが可能である。式Ｉを参照すると、Ｒ４およびＲ７が糖類の残基である場合、式Ｉを有する単位が多糖類鎖に組み込まれる。あるいは、Ｒ４が水素であり、Ｒ７が糖類の残基である場合、界面活性剤では、式Ｉを有する単位が末端となる。ここで「糖類」という用語は、上で定義された任意の単糖類、二糖類または多糖類として本明細書に定義される。一つの態様では、この界面活性剤は、式Ｉの単位（例えば、Ｒ７は単糖類である）を有する二糖類であり得る。別の態様では、界面活性剤は単位Ｉの単糖類でくぁり、ここで、Ｒ１〜Ｒ７は糖類の残基ではない。
【００４２】
上記界面活性剤が炭水化物（例えば、少なくとも１つの式Ｉの単位を有する炭水化物）である場合は、炭水化物はいくつかの異なる形状をとり得ることが企図される。一つの態様では、炭水化物は、アセタールまたはヘミアセタールとして存在し得る。更に、界面活性剤が炭水化物である場合は、異なるアノマーおよびエピマーも企図される。
【００４３】
一つの態様では、上記界面活性剤の分子量は、５，０００Ｄａ未満、４，５００Ｄａ未満、４，０００Ｄａ未満、３，５００Ｄａ未満、３，０００Ｄａ未満、２，５００Ｄａ未満、２，０００Ｄａ未満、１，５００Ｄａ未満、１，０００Ｄａ未満、５００Ｄａ未満、４００Ｄａ未満、または３００Ｄａ未満である。別の態様では、上記界面活性剤は、式Ｉを有する単位を１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個有する。理論に束縛されることは望まないが、この界面活性剤は、標的（すなわち、媒質、血漿、または細胞の細胞間液；細胞の表面または組織の表面；超音波で処置される被験体の細胞または被験体内の領域）の粘性を、必ずしも変える必要のない化合物である。粘性のいかなる変化も、偶発的なものであり、音波保護の要件ではない。従って、一つの態様では、上記界面活性剤は、標的の粘性を有意には変えない化合物である。別の態様では、上記界面活性剤は、商標名ＨＥＡＬＯＮ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）またはＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から販売されている高分子量のヒアルロン酸ナトリウムまたはコンドロイチン硫酸ナトリウムではない。
【００４４】
一つの態様では、Ｒ４は疎水性基であり、Ｒ１〜Ｒ３およびＲ７は、独立して、水素または糖類の残基である。別の態様では、Ｒ４は疎水性基、Ｒ１〜Ｒ３は水素、Ｒ７は水素または糖類の残基である。更に別の態様では、Ｒ７は疎水性基であり、Ｒ１〜Ｒ４は、独立して、水素または糖類の残基である。別の態様では、Ｒ７は疎水性基、Ｒ１〜Ｒ３は水素、Ｒ７は水素または糖類の残基である。
【００４５】
別の態様では、界面活性剤が式Ｉを有する少なくとも１つの単位を有する場合、Ｒ１〜Ｒ４およびＲ７のうちの少なくとも１つが水素である。別の態様では、ＸおよびＹが酸素である。前述の態様のいずれかでは、Ｒ１〜Ｒ３は水素であり、また、前述の態様のいずれかでは、Ｒ７が水素である。
【００４６】
別の態様では、単位ＩのＲ７が糖類の残基である。一つの態様では、糖類が、例えば２−デオキシリボース、フルクトース、イドース、グロース、タロース、ガラクトース、マンノース、アルトロース、アロース、キシロース、リキソース、アラビノース、リボース、トレオース、グルコサミン、エリトロースまたはこれらのピラノシドのような糖類である。別の態様では、単位ＩのＲ７がグルコピラノシドである。
【００４７】
別の態様では、単位ＩのＲ４が疎水性基である。一つの態様では、Ｒ４が分岐鎖または直鎖Ｃ１〜Ｃ２５、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１５、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ２〜Ｃ１５、Ｃ３〜Ｃ１５、Ｃ４〜Ｃ１５、Ｃ５〜Ｃ１５、Ｃ５〜Ｃ１０、Ｃ２〜Ｃ９またはＣ４〜Ｃ９アルキル基である。別の態様では、Ｒ４がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルまたはデシルである。
【００４８】
別の態様では、単位ＩのＲ１が疎水性基である。一つの態様では、単位ＩのＲ１がＣ（Ｏ）Ｒ８となっており、ここでＲ８は分岐鎖または直鎖Ｃ１〜Ｃ２５、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１５、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ２〜Ｃ１５、Ｃ３〜Ｃ１５、Ｃ４〜Ｃ１５、Ｃ５〜Ｃ１５、Ｃ５〜Ｃ１０、Ｃ２〜Ｃ９またはＣ４〜Ｃ９アルキル基である。別の態様では、Ｒ１がＣ（Ｏ）ＮＨＲ９となっており、ここでＲ９は分岐鎖または直鎖Ｃ１〜Ｃ２５、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１５、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ２〜Ｃ１５、Ｃ３〜Ｃ１５、Ｃ４〜Ｃ１５、Ｃ５〜Ｃ１５、Ｃ５〜Ｃ１０、Ｃ２〜Ｃ９またはＣ４〜Ｃ９アルキル基である。これらの態様のいずれかでは、Ｒ２、Ｒ３およびＲ７が水素である。前述の態様のいずれかでは、Ｒ４が、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシルのような、分岐鎖または直鎖Ｃ１〜Ｃ２５アルキル基である。
【００４９】
一つの態様では、単位Ｉを有する界面活性剤は、α−アノマーである。別の態様では、単位Ｉを有する界面活性剤は、β−アノマーである。
【００５０】
本明細書で有用な界面活性剤は、当該技術分野で既知の技術を使用して調製することができる。あるいは、市販の界面活性剤を本明細書に記載された方法にて使用することもできる。例えば、Ａｎａｔｒａｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｍａｕｍｅｅ，ＯＨ，ＵＳＡ）から販売されているアルキル化炭水化物を、本明細書で使用することができる。
【００５１】
一つの態様では、上記界面活性剤は、ルキル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、アルキル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、アルキル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、アルキル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、またはアルキル−β−Ｄ−マルトリオシドである。
【００５２】
アルキル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドの例には、ヘキシル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ノニル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、デシル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ウンデシル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、またはドデシル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドが含まれるが、これらに限定されない。アルキル−β−Ｄ−チオマルトピラノシドの例には、オクチル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、デシル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、ウンデシル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、またはドデシル−β−Ｄ−チオマルトピラノシドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
別の態様では、上記界面活性剤は、アルキル−β−Ｄ−グルコピラノシドである。アルキル−β−Ｄ−グルコピラノシドの例には、ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ウンデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、トリデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、テトラデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ペンタデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘキサデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、メチル−６−Ｏ（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド、６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボキシル−α−Ｄ−グルコピラノシド、または３−シクロヘキシル−１−プロピル−β−Ｄ−グルコピラノシドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
別の態様では、界面活性剤は、アルキル−β−Ｄ−マルトピラノシドである。アルキル−β−Ｄ−マルトピラノシドの例には、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ノニル−β−Ｄ−マルトピラノシド、デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、トリデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、テトラデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ペンタデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、またはヘキサデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
別の態様では、上記界面活性剤は、レアトリル、アルブチン、サリシン、ジギトキシン、ｎ−ラウリル−β−Ｄ−マルトピラノシド、グリシリチン、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシド、またはｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトピラノシドである。
【００５６】
別の態様では、上記界面活性剤は、天然生成物から誘導される。一つの態様では、上記界面活性剤は、Ａｓｙｓｔａｓｉａ  ｉｎｔｒｕｓａの気生部分から単離された（Ｚ）−５′−ヒドロキシジャスモン５′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドまたは３′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−カタルポール；Ｖａｌｅｒｉａｎａ  ｐｒｉｏｎｏｐｈｙｌｌａの根から単離されたプリンセピオール−４−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドおよびフラキシレシノール−４′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド；Ｅｕｃｏｍｍｉａ  ｕｌｍｏｉｄｅｓの葉から単離されたクエルセチン３−Ｏ−α−Ｌ−アラビノピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−グルコピラノシド、ケンフェロール３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、およびクエルセチン３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド；ストロベリーから単離されたカテキン（４−α→８）ペラルゴニジン３−Ｏ−β−グルコピラノシド、エピカテキン（４−α→８）ペラルゴニジン３−Ｏ−β−グルコピラノシド、アフゼレキン（４−α→８）ペラルゴニジン３−Ｏ−β−グルコピラノシド、およびエピアフゼレキン（４−α→８）ペラルゴニジン３−Ｏ−β−グルコピラノシド；ならびにＨｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓの葉から抽出されたクエルセチン３，７−Ｏ−β−Ｄ−ジグルコピラノシド、クエルセチン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノソール−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノソール−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、イソラムネチン−３−Ｏ−β−Ｄ−６′−アセチルグルコピラノシド、およびイソラムネチン−３−Ｏ−β−Ｄ−６′−アセチルガラクトピラノシドである。
【００５７】
本明細書に記載される界面活性剤のいずれも、その薬学的に受容可能な塩またはエステルであり得る。薬学的に受容可能な塩は、遊離酸またはアルコールを、適切な量の薬学的に受容可能な塩基で処理することによって調製される。薬学的に受容可能な一般的な塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロポリアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リシン、アルギニン、ヒスチジン等である。
【００５８】
別の態様では、上記界面活性剤が塩基性基を有する場合、例えばＨＣｌまたはＨ２ＳＯ４のような酸によりプトロン化して、カチオン性塩を生成することができる。一つの態様では、界面活性剤と酸または塩基との反応が、水単独で、または不活性な水混和性有機溶媒と組み合わせて、約０℃〜１００℃の温度、例えば室温にて実施される。適用可能な特定の態様では、本明細書に記載される界面活性剤と使用される塩基のモル比が、任意の特定の塩に望ましい比率をもたらすように選択される。例えば、遊離酸出発材料のアンモニウム塩を調製するには、出発材料を、ほぼ１当量の薬学的に受容可能な塩基で処理して、中性の塩を生じることができる。
【００５９】
エステル誘導体は、一般的には界面活性剤の酸形態の前駆体として調製され、従って、プロドラッグとしての機能を果たすことができる。一般的にこれらの誘導体は、メチル、エチル等のような低級アルキルエステルである。アミド誘導体−（ＣＯ）ＮＨ２、−（ＣＯ）ＮＨＲおよび（ＣＯ）ＮＲ２（ここでＲは上で定義されたアルキル基である）は、カルボン酸含有化合物とアンモニアまたは置換アミンとの反応により調製することができる。
【００６０】
本明細書に記載される界面活性剤の薬学的に受容可能な塩またはエステルは、投与の前に、活性化合物のプロドラッグまたは前駆体として使用できることが企図される。例えば、活性界面活性剤が不安定である場合、安定性を高めるために塩形態として調製することができる。
【００６１】
本明細書に記載される界面活性剤のいずれも、薬学的に受容可能なキャリアと配合して薬学的組成物を製造することができる。この「薬学的に受容可能な」とは、生物学的にも、それ以外の面においても望ましくないものではない物質を意味しする。即ち、その物質は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、または薬学的組成物に含有されているその他のあらゆる成分と有害な様式で相互作用することなく、組成物と共に、被験体に投与することができる。キャリアは、当然のことながら、当業者に周知なように、活性成分のあらゆる劣化を最小限にするように、かつ被験体に対してあらゆる副作用を最小限にするように選択される。
【００６２】
全体を通して使用されるとき、本明細書に記載される任意の界面活性剤および組成物の投与は、他の処置剤と併せて実施することができる。従って、界面活性剤は、単独で、または１つ以上の処置剤と組み合わせて投与することができる。例えば、被験体を、界面活性剤単独で、または核酸、化学療法剤、抗体、抗ウイルス剤、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、従来の免疫療法剤、サイトカイン、ケモカイン、および／または増殖因子と組み合わせて処置することができる。組み合わせは、併用（例えば、混合物として）、個別ではあるが同時（例えば、同じ被験体への別個の静脈管を介して）、または連続的（例えば、化合物または薬剤の内の１つを最初に与え、続いて二番目を与える）のいずれかで投与され得る。従って、「組み合わせ」または「組み合わせた」という用語は、２つ以上の薬剤の併用、同時または連続いずれかの投与に言及するために使用される。
【００６３】
適切なキャリアおよびそれらの配合は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。一般的に、適切な量の薬学的に受容可能な塩が、製剤を等張性にするために配合に使用される。薬学的に受容可能なキャリアの例には、生理食塩水、リンゲル溶液、およびブドウ糖液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、約５〜約８が好ましく、約７〜約７．５がより好ましい。更にキャリアには、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような持続放出性調製物が含まれ、そのマトリックスは、造形品、例えばフィルム、リポソームまたは微小粒子の形態である。例えば投与経路および投与される組成物の濃度により、特定のキャリアがより好ましい場合があることは、当業者には明らかとなる。
【００６４】
薬学的キャリアは当業者に公知である。これらの最も一般的なものは、滅菌水、生理食塩水および生理的ｐＨの緩衝溶液のような溶液を含む、ヒトへの薬剤投与に使用される標準的なキャリアであると思われる。組成物は、筋肉内または皮下投与することができる。その他の化合物は、当業者に使用される標準的な手順に従って投与される。
【００６５】
薬学的組成物には、選択した分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤等が含まれ得る。また、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤等のような１つ以上の活性成分が含まれてもよい。
【００６６】
組成物の投与は、局所的または全身的のいずれかであり得る。薬学的組成物は、局所的処置または全身処置が望ましいかどうかに応じて、および処置される領域に応じて、多数の方法で投与することができる。投与は、局所投与（眼内投与、膣内投与、直腸内投与、鼻腔内投与）、経口投与、吸入投与、頭蓋内投与、または非経口投与（例えば、静脈持続点滴、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内注入）であり得る。開示される組成物は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、腔内投与、または経皮投与さ得る。
【００６７】
組成物の非経口投与は、使用される場合、一般的に注入により特徴付けられる。注射液は、溶液または懸濁液として、注入の前の液体中の懸濁液の溶液に適切な固体形態、または乳濁液として、従来の形態で調製することができる。最近改訂された非経口投与手法は、一定の投与が維持される徐放系または持続放出性系の使用を伴う。米国特許第３，６１０，７９５号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００６８】
非経口投与のための調製物には、滅菌水性または非水性液剤、懸濁剤、および乳濁液が含まれる。非水性液剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射用有機エステルである。水性キャリアには、生理食塩水および緩衝媒質を含む、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈用ビヒクルには、流体および栄養補液、電解質補液（例えばリンゲルブドウ糖に基づくもの）等が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等のような、防腐剤およびその他の添加剤も存在することがある。
【００６９】
局所投与用の製剤には、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴、坐剤、噴霧剤、液剤および粉末剤が含まれ得る。従来の薬学的キャリア、水性、粉末または油性基剤、増粘剤等が、必要または望ましくあり得る。
【００７０】
経口投与用の組成物には、粉末または顆粒剤、水または非水性媒質中の懸濁または液剤、カプセル剤、サッシュ剤または錠剤が含まれる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましい場合もある。
【００７１】
従って、音波保護剤および／またはその他の化合物の薬学的キャリアには、ポリマーマトリックスであり得る。米国特許第４，６５７，５４３号（本明細書中に参考として援用される）は、組成物を含有するポリマーマトリックスを超音波エネルギーに曝露することによって、ポリマーマトリックスから組成物を送達する方法を提示している。放出される組成物または分子を含有するポリマーマトリックスを、インビボのような液体環境において所望の場所に移植した後、超音波エネルギーに供して、ポリマーを部分的に分解し、それによりポリマーに封入された組成物または分子を放出させる。生分解性ポリマーの場合、ポリマー主鎖の破断は、キャビテーションによって作り出された衝撃波により誘導されたと考えられ、急激な圧縮、続いて周囲の液体または固体の急激な拡大を引き起こすと推測される。衝撃波の作用とは別に、キャビテーション気泡の崩壊は、周囲の液体に顕著な摂動を作り出し、これはおそらくその他の化学的な効果も誘導し得る。撹拌は、液体分子、例えば水によるポリマーの利用可能性を高めることができる。非分解性ポリマーの場合、キャビテーションは、これらのポリマーから出る分子の拡散プロセスを増強することができる。
【００７２】
音響エネルギーおよび変調の程度は、広範囲の周波数および強度にわたって容易に監視することができる。パラメーターの選択は、ポリマーマトリックスにより封入されている組成物で利用される、特定のポリマーマトリックスにより異なる。使用される超音波の周波数または強度範囲は、キャビテーションおよび／または超音波の物理的効果をもたらすのに必要な曝露に基づき、標準的な技術を使用して経験的に決定することができる。一般的に適切な超音波周波数は、約２０ＫＨｚ〜約１０００ＫＨｚ、通常は約５０ＫＨｚ〜約２００ＫＨｚであり、一方、強度は、約１ワット〜約３０ワット、通常は約５ｗ〜約２０ｗの範囲が可能である。ポリマーマトリックス組成物系が超音波エネルギーに曝露される時間は、当然のことながら、使用環境に応じて広範囲にわたって変化する可能性がある。一般的に適切とされる時間は、約１分間〜約２時間である。
【００７３】
一つの態様では、音波保護剤および／またはその他の化合物の薬学的キャリアは、マイクロカプセルであり得る。この「マイクロカプセル」という用語は、圧力により破壊されるか、または溶解もしくは溶融したときに、その内容物を放出するように設計され、通常、徐放性薬剤送達のために使用されるか、または消化管における破壊から経口投与剤を保護するために使用される、有機ポリマーまたはその他の材料の、小型の、時には微視的なカプセルまたは球体を意味する。一つの態様では、これらのマイクロカプセルは、リポソーム、微小粒子、ミセル、ミクロスフィアまたは微小気泡であり得る。本明細書で開示された音波保護剤で使用され得る、以前に記載されたマイクロカプセルが、非限定的な例として提示される。
【００７４】
音波保護剤および／またはその他の化合物の薬学的キャリアは、リポソームであり得る。ＰＣＴ国際公開公報第９２／２２２９８号は、超音波の照射により破壊できる薬剤送達用リポソームの使用方法の教示について、本明細書中に参考として援用される。提示されているのは、患者の領域への薬剤の制御送達であり、ここで患者には薬物を含有するリポソームが投与される。超音波は、その領域におけるリポソームの存在を決定し、次にリポソームを破裂させてその領域に薬物を放出するために使用される。超音波が、薬物を含有するガス充填リポソームのピーク共鳴振動数に相当する周波数で適用される場合、リポソームは破裂し、内容物を放出する。ピーク共鳴振動数は、従来の方法を使用してリポソームを超音波に曝露し、反射した共鳴振動信号を受信し、受信した信号のスペクトルを分析してピークを決定することによって、インビボまたはインビトロのいずれかで、当業者によって決定することができる。このようにして決定されたピークは、ピーク共鳴振動数（または時に、第二調波と呼ばれることもある）に相当する。
【００７５】
超音波は、一般的により低い強度および持続時間（好ましくは、ピーク共鳴振動数）で開始し、次に強度、時間および／または共鳴振動数をリポソームの破裂が生じるまで増加する。本発明の開示に基づいて種々の原則の適用が当業者には明らかであるが、直径約１．５〜２．０ミクロンのガス充填リポソームでの一般的な目安としては、共鳴振動数が約７５０ＫＨｚというのが一般的である。
【００７６】
本明細書に記載されるリポソームは、多様な大きさであってもよいが、約３０ナノメーターから約１０ミクロンの平均外径を有する大きさの範囲が好ましく、更に平均外径約２ミクロンが好ましい。当業者には公知なように、リポソームの大きさは体内分布に影響を与えるため、異なる大きさのリポソームを種々の目的のために選択してもよい。例えば静脈内適用では、リポソームの大きさが平均外径約５ミクロン以下というのが一般的であり、約３０ナノメーター以上であるというのが一般的である。肝臓のような臓器へ薬剤送達を行い、正常な組織から腫瘍を識別できるようにするには、平均外径が約３０ナノメーターから約１００ナノメーターの範囲でより小さなリポソームが有用である。一般的に、リポソームが小さいほど、大きなリポソームよりも超音波共鳴振動数が高くなる。
【００７７】
音波保護剤および／またはその他の化合物の薬学的キャリアは、微小粒子であり得る。米国特許第６，０６８，８５７号（本明細書中に参考として援用される）は、活性成分に加えて、少なくとも１種類のガスまたはガス状相を含有する活性成分を含有する微小粒子、ならびに活性成分の超音波制御されたインビボ放出の方法を提示している。この粒子は、０．８ｇ／ｃｍ３未満、好ましくは０．６ｇ／ｃｍ３未満の密度を示し、０．１〜８μｍ、好ましくは０．３〜７μｍの範囲の大きさを有する。封入セルの場合、好ましい粒径は５〜１０μｍである。大きさが小さいため、静脈内注入等の後に、これらは血管系の全体にわたって分散する。超音波診断装置の監視で可視的に観察している間、ユーザーにより制御される含有物質の放出は、音響信号を増大することによって起こすことができ、それによって放出に必要な周波数は微小粒子の共鳴振動数よりも低くなる。適切な周波数は１〜６ＭＨｚ、好ましくは１．５〜５ＭＨｚの範囲である。
【００７８】
ガス／活性成分を含有する微小粒子のシェル材料として、例えばアルブミン、ゼラチン、フィブリノーゲン、コラーゲンのようなタンパク質、ならびに例えばスクシニル化ゼラチン、架橋ポリペプチド、タンパク質とポリエチレングリコールとの反応生成物（例えば、アルブミン共役ポリエチレングリコール）のようなそれらの誘導体、デンプンまたはデンプン誘導体、キチン、キトサン、ペクチン、ポリ乳酸のような生分解性合成ポリマー、乳酸とグリコール酸とを含むコポリマー、ポリシアノアクリレート、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリ−ε−カプロラクトン、ならびに乳酸とポリ−ε−カプロラクトンを含むコポリマー、ならびにこれらの混合物のような、生分解性および生理学的適合性の全ての材料が基本的に適している。特に適しているのが、アルブミン、ポリ乳酸、乳酸とグリコール酸を含むコポリマー、ポリシアノアクリレート、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミノ酸、ポリ−ε−カプロラクトン、ならびに乳酸とポリ−ε−カプロラクトンとを含むコポリマーである。
【００７９】
封入されるガスは自由に選択することができるが、空気、窒素、酸素、希ガス、ハロゲン化炭化水素、ＳＦ６またはこれらの混合物のような生理学的に無害なガスが好ましい。また、アンモニア、二酸化炭素、ならびに水蒸気または低沸点液（沸点３７℃未満）のような液体蒸気も適している。
【００８０】
音波保護剤および／またはその他の化合物の薬学的キャリアは、ポリマーミクロスフィア／微小気泡であり得る。米国特許第５，４９８，４２１号、同第５，６３５，２０７号、並びに第５，６３９，４７３号、並びに第５，６５０，１５６号、および並びに第５，６６５，３８２号は、強力超音波を使用する生物工学製品を含有するポリマーシェルの合成の教示について、本明細書中に参考として援用される。ポリマーミクロスフィアは、使用される音波保護物質に応じて１〜１００ｍＭの濃度で音波保護剤を有する、薬学的に生存可能な溶液を有する。超音波ビームの焦点領域に入るミクロスフィアは、ミクロスフィアに対する超音波の物理的作用により破裂する。これにより、焦点および焦点領域における音波保護物質の突然の放出がもたらされる。ミクロスフィア内に封入された、初期の比較的高濃度の音波保護物質は、音波保護物質が依然として音波保護能力を保持している処置領域で、非毒性レベルに急速に希釈される。例えば、処置される領域の音波保護物質の最終濃度は、使用される音波保護剤に応じて、瞬時に約０．１〜３０ｍＭになる必要があると予測される。
【００８１】
気泡が音波の影響下で圧縮され、破裂し、音波保護剤を放出するように、ガス用の空間が存在することが必要である。従って、微小気泡は、音波保護物質を有する溶液により完全に充填されることができない。しかし別の方法としては、種々の量の音波保護溶液により充填される微小気泡の不均質な混合物（空の気泡から完全に充填された気泡まで）を有する方法がある。この方法では、少ない音波保護物質溶液を有する気泡が激しく振動して破裂し、部分的および完全に充填された微小気泡の近くで物理的な力を作り出し、それらを破裂させる。
【００８２】
音波保護剤および／またはその他の化合物の薬学的キャリアは、ポリマーミセルであり得る。ＰＣＴ特許出願第９９／１５１５１号は、ポリマーミセルを使用して患者の選択された部位に薬剤を送達する方法の教示について、本明細書中に参考として援用される。ポリマーミセルは、疎水性コアおよび疎水性コアに配置された封入薬剤の有効量を有することが可能である。選択部位への超音波エネルギーの適用によって、疎水性コアから薬剤を選択部位へ放出することが可能となる。疎水性−親水性ブロックコポリマーにより形成され、親水性ブロックがＰＥＯ鎖から構成されるポリマーミセルは、非常に魅力的な薬剤キャリアである。これらのミセルは球形のコア−シェル構造を有しており、疎水性ブロックがミセルのコアを形成し、１つまたは複数の親水性ブロックがシェルを形成している。ブロックコポリマーミセルは、その大きさおよび構造の点から薬剤キャリアとして有望な特性を有する。
【００８３】
マイクロカプセル、即ち、リポソーム、微小粒子、微小気泡、ミクロスフィア、またはミセルを使用することにより、全身において、ユーザーによる活性成分の放出速度および部位を組み合わせて制御することが可能となる。マイクロカプセルの破壊によるこの放出は、組織を加熱することなく、内科的診断で慣用的に生じる音波圧力によるマイクロカプセルの共鳴振動よりもかなり低い超音波周波数で、達成することができる。
【００８４】
マイクロカプセルを破裂させる上で必要な超音波の周波数が超音波処置に望ましい周波数よりも高い場合、代替的な手法としては、マイクロカプセルを破裂させる別の形態のエネルギーを使用する手法がある。例えば、電気（Ｋｗｏｎ，Ｉ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：２９１−２９３，１９９１）、磁場（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｅ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９：６７−８３，１９８５）、光（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ，Ｅ．およびＣｏｈｅｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．４０：６７−８６，１９８９）、酵素（Ｆｉｓｃｈｅｌ−Ｇｈｏｄｓｉａｎ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４０３−２４０６，１９８８）、温度変動（Ｂａｅ，Ｙ．Ｈ．ら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．８：４８１−４８５，１９８７）、またはｐＨ変化（Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ８：１７９−１８２，１９８８）を、超音波の代わりに使用して（Ｋｏｓｔ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７６６３−７６６６，１９８９）、音波保護剤を含むマイクロカプセルを破裂させることがでる。全ての参考文献は、エネルギーの外部供給源によるマイクロカプセル破裂の教示について、本明細書に開示されている。
【００８５】
本明細書で提示される全ての組成物および薬学的キャリアでは、有効な用量および投与スケジュールは経験的に決定することができ、当該決定を行うことは当該技術の範囲内である。組成物の投与のための用量範囲は、障害の症状に影響を与える所望の効果を生み出すほどの大きさのものである。用量は、不要な交差反応、アナフィラキシー反応等の有害な副作用を引き起こすほどの大きさであってはならない。一般的に用量は、年齢、症状、性別、患者の疾患の程度、投与経路、またはレジメンに他の薬剤が含まれているか否かによって変わり、当業者により決定することができる。用量は、使用禁忌の場合には、個々の医師により調整することができる。用量は変えることができ、毎日１回以上の用量投与回数にて１日から数日間投与することができる。目安は、所定の部類の医薬品に適切な用量に関する文献で見出すことができる。処置される領域の音波保護物質の最終濃度は、使用される音波保護剤に応じて約０．１〜３０ｍＭであると予測される。
【００８６】
超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護する方法が、本明細書中で開示される。本明細書で使用される「超音波」という用語は、音と同じ物理的性質の振動ではあるが、ヒトの聴覚の範囲を超える周波数の振動、即ち、およそ２０，０００サイクル／秒（Ｈｚ）を超える周波数の振動を意味する。本明細書で使用される「音波崩壊」という用語は、超音波により誘導される、液体中のキャビテーション気泡の形成、成長、振動または内破により開始される物理的／化学的反応を意味する。本明細書で使用される「細胞崩壊」という用語は、細胞死の誘導形態を意味し、外膜の破壊による細胞の病理的分解、ならびに超音波および音波崩壊により引き起こされるアポトーシスおよびネクローシスを含むが、これらに限定されない。医学における超音波の使用には、診療的用途および処置的用途がある。本明細書で使用される「保護する」という用語は、超音波媒介細胞崩壊の防止のために超音波媒介細胞崩壊を低減することとして定義される。
【００８７】
例えば、超音波医学診断画像は、胎児検査に音波検査図が一般的に使用されていることからも周知である。超音波は、バイオリアクターの性能を向上させるためにも使用することができる。処置用超音波は、熱効果（例えば、誘導された温熱療法）と機械的効果（例えば、細胞および組織に対する超音波の直接的な効果、またはキャビテーションおよびアコースティックストリーミングのような間接的な効果）の両方によって組織の状態に変化を誘導するための、強力な超音波の使用を意味する。高周波数超音波が温熱療法およびキャビテーションの両方の医学的用途に使用されるのに対して、低周波数超音波は主にキャビテーション効果のために使用されてきた。超音波の処置的な使用の例には、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）、集束超音波手術（ＦＵＳ）、水晶体超音波吸引術、音波泳動（音泳動）、血栓崩壊、およびソノポレーションが含まれる。
【００８８】
診断および処置用超音波の方法および装置の種々の態様は、Ｇ．ｔｅｒ  Ｈａｒｒによる論文Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｆｏｃａｌ  Ｂｅａｍ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｍｅｄ．＆  Ｂｉｏ．，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．９，ｐｐ．１０８９−１１００，１９９５、およびＴｈｅ  ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｆｅｒｒｏｅｌｅｃｔｒｉｃｓ，ａｎｄ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９６，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．６（ＩＳＳＮ  ０８８５−３０１０）により詳細に考察されており、これらはいずれも超音波の医学的用途を教示について、本明細書中に参考として援用される。ＩＥＥＥジャーナルには、「熱効果の基本原理はよく理解されているが、損傷、用量効果、および変換器特性の閾値を確立するためには、依然として研究が必要である・・・」（同上，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，p．９９０）ということが、簡潔に指摘されている。
【００８９】
開示されている超音波および音波保護の方法において、細胞は、インビトロで培養される任意の細胞であり得る。一つの態様では、開示されている細胞は、原核細胞であり得る。一つの態様では、開示されている細胞は、真核細胞であり得る。別の態様では、細胞は、被験体内の任意の細胞であり得る。一つの態様では、被験体にヒトであり得る。別の態様では、細胞は、腫瘍または血栓の近くに存在する任意の健常な細胞であり得る。別の態様では、細胞は、ソノポレーションにより遺伝子のトランスフェクションのために処置される任意の細胞であり得る。別の態様では、細胞が、超音波媒介細胞崩壊から保護されなければならない、神経および筋肉細胞のような非増殖性細胞である。別の態様では、細胞は、バイオリアクターで使用される種々の形態の植物、動物または微生物の細胞であり得る。
【００９０】
本明細書に記載されているのが、本明細書に記載された界面活性剤のいずれかを、細胞にまたは被験体の細胞に単独で、または薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、超音波の投与と併用して送達することを含む、改善された超音波の利用方法である。本明細書で使用される「送達する」とは、提示される組成物を、標的に、標的内にまたは標的の近くに投与することを意味する。従って、細胞へ送達することには、細胞に接触させること、トランスフェクトすること、または細胞を囲むことが含まれる。従って、提示される界面活性剤は、処置される領域に存在するか、または領域の近くに存在する健常な細胞を保護するように、超音波で処置される被験体内の領域に送達することができる。本明細書で使用される「併用する」とは、２つ以上の組成物または方法の、同時または連続のいずれかによる組み合わせを意味する。従って、一つの態様では、提示される方法が、細胞にまたは被験体の細胞に、超音波を投与する前に界面活性剤を送達することを含む。別の態様では、提示される方法が、細胞にまたは被験体の細胞に、超音波の投与と同時に界面活性剤を送達することを含む。送達工程は、更にインビトロ、インビボまたはエキソビボで実施することができる。
【００９１】
提示される音波保護方法は、あらゆる特定の方法または超音波の種類に限定されない。例えば、開示される音波保護方法および組成物は、処置用超音波を受けている被験体の細胞を保護する。処置用超音波は、肺毛細血管出血および腸出血を引き起こす可能性があり、これは、周波数、強度および超音波曝露の持続時間により異なる〔Ｒｏｔｔ，Ｈ．Ｄ．ら、Ｕｌｔｒａｓｃｈａｌｌ  Ｍｅｄ．１８，２２６−２２８（１９９７）〕。診断目的の超音波の適用パラメーターのための厳格な目安〔Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６，３５５−３６６（２０００）〕に従わない限り、特に造影剤の存在下で、不要な生物学的効果を生じる危険性がある〔Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２３，８０５−８１２（１９９７）〕。
【００９２】
開示される音波保護方法および組成物は、バイオリアクターの中にある細胞を保護する。超音波は、いくつかの機構によってバイオリアクターの性能を増強することが示されいる。音波処置は、一般的に細胞の破損に関連するが、超音波パラメーターを注意深く制御することによって有益な効果を生じ、同時に、超音波の有害な効果を最小限にする〔Ｓｉｎｉｓｔｅｒｒａ，Ｊ．Ｖ．Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ３０，１８０−１８５（１９９２）〕。生物学的効果による汚染物質破壊の有益な効果を得るために使用できる、非常に狭い領域の超音波パラメーターが存在する〔Ｓｃｈｌａｆｅｒ，Ｏ．ら、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ４０，２５−２９（２００２）〕。食品産業における用途のため、排水の超音波支援生物学的処理のヨーロッパでの研究において、超音波は、実験室規模の反応器で生物学的活性を改善したことを示した〔Ｓｃｈｌａｆｅｒ，Ｏ．ら、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ３８，７１１−７１６（２０００）〕。しかし、一定の閾値強度を超えた超音波の適用は、キャビテーションをもたらし、生物学的活性を、超音波の非存在下で観察されるよりも遥かに下回って減少させた〔Ｓｃｈｌａｆｅｒ，Ｏ．ら、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ４０，２５−２９（２００２）〕。
【００９３】
別の態様では、開示された音波保護方法および組成物は、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）を受ける腫瘍細胞に隣接する細胞を保護する。ＨＩＦＵの使用方法の例は、米国特許第６，３１５，７４１号に記載されており、これは、ＨＩＦＵのインビボでの使用方法の教示について、本明細書中に参考として援用される。腫瘍を切断するＨＩＦＵの使用時に被験体の細胞を付随する損害から保護するための、本明細書で開示されている界面活性剤の使用によるこれらの方法の改善が、本明細書中に開示される。
【００９４】
組織を切断する超音波の別の使用は、水晶体超音波吸引術の間である。水晶体超音波吸引技術は、小さな切開を利用し、器具の先端がこの小さい切開を通って眼の中に導入される。局所的な高周波がこの先端から発生して、白内障を非常に微細な断片に破壊し、次に同じ先端を通して、制御された方法で吸引する。超音波エネルギーは、２つの主要な成分（白内障を破壊できる機械的な成分および重度な不利益を引き起こし得るキャビテーション成分）を有する（Ｐａｃｉｆｉｃｏ，Ｒ．Ｌ．１９９４．Ｊ．Ｃａｔａｒａｃｔ．Ｒｅｆｒａｃｔ．Ｓｕｒｇ．２０，３３８−３４１）。水晶体超音波吸引術のときに形成されるキャビテーション気泡は、フリーラジカルの形成をもたらし（Ｔｏｐａｚ，Ｍ．ら、２００２．Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２８，７７５−７８４）、これは角膜内皮の損傷の供給源であると考えられる（Ｈｏｌｓｔ，Ａ．，Ｒｏｌｆｓｅｎ，Ｗ．，Ｓｅｖｅｎｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．  ＆  Ｌｕｎｄｇｒｅｎ，Ｂ．１９９３．Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１２，３５９−３６５；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ら、２００２．Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１２０，１３４８−１３５２）。角膜内皮細胞の損失の防止に役立てるために、粘弾性物質を白内障手術で使用する（Ｈｅｓｓｅｍｅｒ，Ｖ．  ＆  Ｄｉｃｋ，Ｂ．１９９６．Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ  Ｍｏｎａｔｓｂｌａｔ．Ａｕｇｅｎｈｅｉｌｋｕｎｄｅ  ２０９，５５−６１）。従って、音波保護剤は、水晶体超音波吸引術のときに、現行の粘弾性物質との組み合わせるか、または全く新しい分野の保護液混合物中の成分としてのいずれかで使用することができる。このことの一つの利点は、角膜内皮細胞の保護に必要な添加剤の粘度の低減であり、それによって、より容易な吸引を可能にするが、同時に、超音波の有害な効果からの優れた保護を可能にする。優れた保護特性は、また、より高い強度の超音波の使用を可能にすることができ、それによって、処置時間を低減することを可能にできる。
【００９５】
高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）温熱処置において、高集束変換器により発生される超音波の強度は、供給源から焦点領域で増加し、そこで非常に高温（例えば、９８℃）を達成することができる。焦点での超音波エネルギーの吸収は、組織の突然の温度上昇−１〜２００度ケルビン／秒と同じ高さ−を誘導し、焦点領域の細胞の標的容量の不可逆的消失を引き起こす。従って、例えばＨＩＦＵ温熱処置は、中間組織を損傷することなく、内部損傷の壊死を引き起こすことができる。焦点領域の寸法は、被写体深度と呼ばれ、変換器から焦点領域の中心点までの距離は、焦点深度と呼ばれる。概して、超音波は有望な非侵襲性の手術技術であり、それは、超音波が介在組織への非効果的貫通を提供し、更に、小さい焦点標的へエネルギーを送達するために十分に低い減衰を有するからである。現在、非侵襲性の深い局所的な焦点を持つ処置目的の非電離放射線を提供する、他の既知の物理療法手段はない。従って、超音波処置は、マイクロ波および放射線処置処置技術よりも大きな利点を有する。
【００９６】
組織を切除するためのＨＩＦＵの使用に加えて、血液脳関門（ＢＢＢ）の可逆的で非破壊的な破壊における、超音波適用のより制御された条件下におけるＨＩＦＵの有益な使用もまた考慮される〔Ｍｅｓｉｗａｌａ，Ａ．Ｈ．ら、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２８，３８９−４００（２００２）〕（ＢＢＢを破壊するためのＨＩＦＵの使用について、本明細書中に参考として援用される）。この技術の大きな問題は、脳組織への回復不能な損傷が生じる可能性があることである。音波保護物質は、当該損傷から保護することができ、同時にＢＢＢの可逆的な破壊を可能にする。
【００９７】
ＨＩＦＵ技術の使用に直面する主な問題は、キャビテーション効果である。キャビテーションは、医学的手法のために超音波の使用を考慮する時に重要な、少なくとも３つの様式で起こり得る。第１は、ガスキャビテーションであり、溶解したガスが、音波の負圧相時にキャビテーション気泡の中に拡散する。第２は、蒸気キャビテーションであり、波の負圧振幅が、流体にとって組織液の周囲温度で蒸気形態に変換するために十分に低くなることに起因する。第３は、超音波エネルギーが、雰囲気圧で、沸騰よりも高い温度に上昇する程度で吸収されることである。より低い周波数では、波が必然的に負圧相にいる時間は、より高い周波数よりも長く、ガスまたは蒸気含有キャビテーション気泡が形成されるためにより長い時間が提供される。全ての要素が等しいとすると、低周波数での曝露は、超音波のより高い周波数と比較して、キャビテーション気泡を形成するためにより低い圧振幅が必要である。より高い周波数はより急速に吸収され、従って、より低い周波数よりも、同じ適用強度でより急速に温度を上昇させる。従って、ガスおよび蒸気キャビテーションは、低周波数により促進され、沸騰キャビテーションは、高周波数により促進される。しかし両方のタイプのキャビテーションは、照射方法に応じて、例えば超音波曝露の時間、脈動または連続的曝露レジメン等に応じて全ての周波数で生じることができる。
【００９８】
ＨＩＦＵ用途では、強度閾値を超え、それによって音響希薄化により生じる引っ張り応力が組織それ自体内に蒸気キャビテーションを発生する時、超音波誘導キャビテーションが生じる。続いて音響周期が、気泡を平均位置の周りで振動させ、気泡を、不活性駆動崩壊を受けることができる大きさに成長させることがあり、非縮合ガスが作り出されるため、高剪断応力を働かせる強力な放射圧力が存在する。従って、組織は細かく裂かれ、ピューレ状になって、実質的に液体の状態になり得る。当該効果を制御することは、実用的な目的では未だに実現しておらず、従って、意図される処置の一部でない場合はいつでも、組織を損傷するキャビテーションを避けることが一般的に望ましい。
【００９９】
ＨＩＦＵでは、集束超音波は、任意の方法によって生成することができる。超音波変換器は、好ましくは、周波数、出力、切除時間、および／または組織に対する焦点軸の位置のような切除技術の１つ以上の特性を変えながら、操作する。例えば変換器は、周波数２〜７ＭＨｚおよび出力８０〜１４０ワットで０．０１〜１．０秒間操作することができる。変換器は、周波数２〜１４ＭＨｚ、出力２０〜６０ワットで０．７〜４秒間操作することができる。超音波変換器は、周波数６〜１６ＭＨｚ、２〜１０ワットで、表面に近いＮＳ温度が７０〜８５℃に達するまで稼働することもできる。
【０１００】
ＨＩＦＵ使用の別の分野は、非侵襲性手術手法、即ち集束超音波手術（ＦＵＳ）のための直接的な手術用具としてである。超音波は、切断用具手段のための電気機械駆動体として使用することができる（例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらの米国特許第５，３２４，２９９号であり、時々、「調和振動メス」と呼ばれる超音波メス刃およびその使用の教示について、本明細書中に参考として援用される）。
【０１０１】
本明細書に記載される界面活性剤のいずれも、単独で、または他の界面活性竿と組み合わせて使用して、例えばＨＩＦＵのときに生じる超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護することができる。一つの態様では、超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護するために使用される界面活性剤は、少なくとも１つの疎水性基を有する炭水化物を含む。別の態様では、上記界面活性剤は、前述の式Ｉを有する少なくとも１つの単位を有している。更なる態様では、界面活性剤が、ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、メチル−６−Ｏ（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド、３−シクロヘキシル−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシド、または６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボキシル−α−Ｄ−グルコピラノシドである。
【０１０２】
別の態様では、化合物を細胞に送達する方法が本明細書において開示される。一つの態様では、この方法は、
ａ．本明細書に記載されている任意の界面活性剤を含む組成物を細胞に投与する工程であって、この界面活性剤は、キャビテーション気泡の気液界面に蓄積し、ラジカルをクエンチする、工程、および
ｂ．化合物の存在下で細胞をソノポレーションする上で十分な超音波周波数に細胞を供し、それによって細胞に化合物を送達する工程、
を包含する。
【０１０３】
本明細書に記載されている界面活性剤は、化合物の細胞への送達を促進することができる。提示される方法は、特定の細胞型または場所に限定されない。「化合物」という用語は、例えば核酸、タンパク質、または低分子（例えば、医薬品）のようなあらゆる生物活性物質を含むことが本明細書で定義される。従って、ソノポレーションは、裸のＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトする遺伝子処置に使用することができる〔Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，８４６２−８４６７（１９８７）〕。ソノポレーションは、比較的大型の薬剤分子を形質膜を横切って輸送するのに使用することもできる〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗ．Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６，Ｓ５９−Ｓ６２（２０００）〕。従って、この方法の一つの態様では、開示された化合物は、被験体の細胞の送達される核酸である。別の態様では、核酸の送達は、遺伝子処置の目的のためである。従って、提示されているのは、遺伝子処置の改善された方法であり、ここで、遺伝子をソノポレーションにより送達することができ、音波保護剤を遺伝子と併せて投与する。別の態様では、被験体内の、ソノポレーションにより損傷を受けてはならない神経細胞または筋肉細胞のような非増殖性細胞に、核酸が送達される。
【０１０４】
核酸に基づく送達系に関する方法は、当該技術分野で周知である。簡潔に、トランスファーベクターは、遺伝子を細胞内に送達するのに使用される任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）であってもよいし、遺伝子を送達する一般的な戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部であってもよい（Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８（１９９３））。本明細書で使用されるプラスミドまたはウイルスベクターは、開示された核酸を劣化させることなく細胞内に輸送し、かつ遺伝子が送達される細胞内で遺伝子発現を生じるプロモーターを含む因子である。一部の実施態様において、プロモーターは、ウイルスまたはレトロウイルスのいずれかに由来する。細胞に送達される核酸は、一般的に、発現制御系を含有する。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス系に挿入された遺伝子は、通常、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含有して、所望の遺伝子産物の発現を制御するのを助ける。
【０１０５】
プロモーターは、一般的に、転写開始点に関して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的な相互作用を必要とするコア要素を含有し、且つ上流要素および応答要素を含有してもよい。哺乳類の宿主細胞においてベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、多様な供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはサイトメガロウイルスのようなウイルスのゲノムから得ることができるか、または異種哺乳類プロモーターから、例えばβアクチンプロモーターから得ることができる。
【０１０６】
エンハンサーは、一般的に、転写開始点からの非固定距離で機能するＤＮＡの配列を意味し、転写単位に対して５′（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：９９３（１９８１））または３′（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））である。更に、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３））、ならびにコード配列それ自体の中（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））が可能である。これらは、通常、長さが１０〜３００ｂｐであり、シス型で機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターの転写を増大するために機能する。
【０１０７】
真核宿主細胞（酵母菌、真菌、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を与えることがある転写の停止に必要な配列を含有してもよい。これらの領域は、ｍＲＮＡコード組織因子タンパク質の非翻訳部分におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。３′非翻訳領域は、転写停止点も含む。転写単位は、ポリアデニル化領域も含有することが好ましい。この領域の一つの利点は、転写単位が加工され、ｍＲＮＡのように輸送される可能性を増やすことである。発現構築物におけるポリアデニル化信号の同定および使用は、十分に確立されている。異種ポリアデニル化信号が遺伝子導入構築物で使用されることが好ましい。特定の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化信号から誘導され、約４００個の塩基を含む。転写された単位は、他の標準的な配列のみを含有するかまたは上記の配列と組み合わせて含有して、構築物からの発現または構築物の安定性を改善することができる。
【０１０８】
送達工程は、当該技術分野で既知の技術を使用して、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで実施することができる。工程（ａ）の後、超音波放射を、細胞をソノポレーションする上で有効な強度および時間で適用する。本明細書で使用される「ソノポレーションする」という用語は、大型または疎水性の分子（例えば、薬剤または核酸）の進入を促進するように、障壁を一時的に透過するため、障壁として作用する生体の表面（例えば、被験体の皮膚または細胞の形質膜）に超音波を適用することを意味する。「ソノポレーション」の使用は、超音波が開始剤を示す場合を除いて、障壁を透過する特定の機構に限定することを意図しない。例えば、本明細書で使用されるソノポレーションには、少なくとも部分的には造影剤の崩壊、超音波誘導微小気泡の崩壊、ならびに／または超音波および音響キャビテーションの物理的効果に起因する、脂質膜のような生体障壁の透過が含まれる。
【０１０９】
ソノポレーションと音波保護の両方の効果は、特定の障壁、即ち、標的となった細胞型および環境により異なる。しかし、最適な周波数は、使用されるそれぞれの細胞型および音波保護剤によって日常的および経験的に決定することができる。一つの態様では、音波保護に使用される超音波の周波数が２０ＫＨｚ〜５ＭＨｚである。
【０１１０】
ソノポレーションは、培養細胞への遺伝子のトランスフェクションの方法として認識される（Ｍｉｌｌｅｒ  ＤＬら、Ｓｏｍａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｎｏｖ；２７（１−６）：１１５−３４）（ソノポレーションによる細胞への核酸の送達方法の教示について、本明細書中に参考として援用される）。超音波を、ソノポレーションの効果を増強するＯｐｔｉｓｏｎまたはＡｌｂｕｎｅｘのような造影剤と共に使用して、多様な細胞株を裸プラスミドＤＮＡによりインビボならびにインビトロでトランスフェクションする（Ｔａｎｉｙａｍａ  Ｙ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００２  Ｍａｒ；９（６）：３７２−８０）（ソノポレーションの教示について、本明細書中に参考として援用される）。ソノポレーションは、細胞表面に一過性孔（一般的には５μｍ未満）の形成をもたらし、これは、細胞への導入遺伝子の急速な移動を説明する。多くの研究における随伴性の細胞死という難問は、超音波の有害な化学的効果、例えばラジカル損傷から細胞を保護し、同時に、遺伝子トランスフェクションのために細胞膜に孔を機械的に形成することを依然として可能にする方法の必要性を強調する。
【０１１１】
本明細書で使用される「音波泳動（ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」とは、超音波を使用して皮膚および他の生体膜を通して化合物の浸透を増大させる、ソノポレーションのサブタイプを意味する。米国特許第５，４２１，８１６号、米国特許第５，６１８，２７５号、米国特許第６，７１２，８０５号および米国特許第６，４８７，４４７号は、皮膚を通した化合物の超音波媒介送達の教示について、本明細書中に参考として援用される。
【０１１２】
薬物のような化合物の、経皮および／または皮内送達は、経口および注入方法を含む従来の送達方法に対して幾つかの利点を提供する。これは、所定の薬剤用量を局部に制御された一定の速度および均一の分布で送達する、非侵襲性の、簡便な、無痛の方法である。
【０１１３】
化合物の経皮および／または皮内送達は、角質層（即ち、皮膚の最も外側の層）を通して化合物を輸送することを必要とする。角質層は、体に入るあらゆる化学品に対して強力な化学障壁を提供し、５００Ｄａ（ダルトン）未満の分子量を有する低分子のみが、処置効果が得られる速度で皮膚を通って受動的に拡散することができる。ダルトンは、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ（１９９６）により出版された“Ｓｔｅａｄｍａｎ’ｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ”によると、炭素原子１２個の質量の１／１２に等しい質量単位として定義される。従って、超音波を使用して皮膚に開口部をもたらし、それを通って大型の分子を送達することができる。
【０１１４】
音波泳動は、安全な使用で適用することができるように、超音波パラメーターの範囲により制限される〔Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ．Ｓ．  ＆  Ｋｏｓｔ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５６，５８９−６０１（２００４）〕。音波泳動のための「低周波数超音波」が記載され、およそ２０ＫＨｚ〜４５０ＫＨｚの範囲が提示される〔Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ．Ｓ．  ＆  Ｋｏｓｔ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５６，５８９−６０１（２００４）；Ｍｕｔｏｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ９２，１３７−１４６（２００３）〕。低周波数超音波では、音響キャビテーションが主な機構であり、それによって音波泳動が作動する〔Ｍｅｒｉｎｏ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９２，１１２５−１１３７（２００３）；Ｌａｖｏｎ，Ａ．  ＆  Ｋｏｓｔ，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ９，６７０−６７６（２００４）；Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，Ｓ．  ＆  Ｋｏｓｔ．Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５６，５８９−６０１（２００４）〕。角質層（ＳＣ）はおよそ１５μｍの厚さを有するため、キャビテーションはこの周波数ではＳＣ内で生じることができない。なぜなら、２０〜１００ＫＨｚでの気泡の共鳴半径が１０〜１００μｍであるからである〔Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，Ｓ．  ＆  Ｋｏｓｔ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５６，５８９−６０１（２００４）〕。代わりに、キャビテーションは、皮膚と変換器との間の伝播物質で生じることができる。ＳＣの表面近くの気泡の球形崩壊は衝撃波を生じ、ＳＣ脂質二重層膜を破損することができ、その結果、ＳＣ上のキャビテーション気泡の非対称崩壊から噴出する高速液体がＳＣ内に浸透し、それによって、ＳＣの脂質を無秩序にし、水輸送チャンネルを開ける〔Ｌａｖｏｎ，Ａ．  ＆  Ｋｏｓｔ，  Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  ９，  ６７０−６７６  （２００４）；  Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，Ｓ．  ＆  Ｋｏｓｔ，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５６，  ５８６−６０１  （２００４）〕。
【０１１５】
気泡の共鳴サイズは比較的に小さい（３ミクロン未満）ため、高周波数超音波が使用される場合、ＳＣにキャビテーションが生じる可能性についての証拠も存在する〔Ｍａｃｈｅｔ，  Ｌ．  ＆  Ｂｏｕｃａｕｄ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ２４３，  １−１５  （２００２）〕。しかし、高および低周波数の両方の音波泳動の安全性の態様は、未だに対処されていない〔Ｌａｖｏｎ，  Ａ．  ＆  Ｋｏｓｔ，  Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  ９，  ６７０−６７６  （２００４）〕。低周波数キャビテーションは、ラジカルの形成に関連することが公知であり、ＳＣの上または近くでの気泡の崩壊は、機械的効果だけでなく、ＳＣに対して潜在的に損傷を与えるフリーラジカル効果も生じる。
【０１１６】
従って、皮膚領域におけるインビボ音波泳動、ならびに化合物の経皮および／または皮下送達を実施する改善された方法が、提示される。音波泳動は、例えば、局所または全身処置のいずれかにおける皮膚を通した薬剤のような、化合物の無痛で迅速な送達を可能にする。一つの態様では、方法が、薬学的に受容可能なキャリア中の本明細書で提示された界面活性剤のいずれかを、皮膚に投与することを含む。
【０１１７】
一つの例では、上記方法は、更に、所定量の薬剤溶液を含有し、第１末端部と第２末端部を有し、第２末端部が多孔質膜で覆われている容器を使用できることを提供することを含む。次に、超音波ホーンの先端を容器の第１末端部を通して薬剤溶液の中に浸し、次に多孔質膜を皮膚領域と接触させる。超音波放射を、キャビテーション気泡を発生する上で有効な強度、時間、および皮膚からの距離で適用する。一つの態様では、超音波の周波数が２０ＫＨｚ〜５ＫＨｚである。別の態様では、超音波の周波数が２０ＫＨｚ〜５００ＫＨｚである。キャビテーション気泡は崩壊し、そのエネルギーを皮膚領域に伝え、従って、皮膚領域に孔の形成を引き起こす。超音波放射の強度および皮膚からの距離も、超音波噴出を発生する上で有効であり、次に超音波噴出は、多孔質膜を通して薬剤溶液を駆動し、皮膚領域に孔を形成する。
【０１１８】
本明細書に記載される界面活性剤のいずれも、単独で、または他の界面活性剤と組み合わせて使用して、ソノポレーション時に生じる音波媒介細胞崩壊から細胞を保護することができる。一つの態様では、この界面活性剤は、少なくとも１つの疎水性基を有する炭水化物を含む。別の態様では、この界面活性剤は、前述の式Ｉを有する少なくとも１つの単位を有している。更なる態様では、この界面活性剤は、ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、メチル−６−Ｏ（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド、３−シクロヘキシ−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシド、または６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボキシル−α−Ｄ−グルコピラノシドである。
【０１１９】
別の態様では、バイオリアクターの中の細胞の代謝活性を増強する方法が本明細書で開示されている。一つの態様では、上記方法は、
ａ．本明細書に記載される任意の界面活性剤を含む組成物を細胞に送達する工程であって、この界面活性剤は、キャビテーション気泡の気液界面に蓄積し、ラジカルをクエンチする、工程、および
ｂ．バイオリアクターの中の細胞の代謝活性を増強する上で十分な超音波周波数に細胞を供する工程、
を包含する。
【０１２０】
バイオリアクターは、植物、動物、または微生物の細胞を含み、その代謝活性は、特定のプロセスの効果を決定する。これらの細胞の代謝活性を増強することは、バイオテクノロジープロセスの効果を有意に増強することができる。超音波は、いくつかの機構を通してバイオリアクターの性能を増強することを示した。音波処理は、一般的に細胞の破損に関連するが、超音波パラメーターを注意深く制御することによって有益な効果を生じ、同時に、超音波の有害な効果を最小限にする（Ｓｉｎｉｓｔｅｒｒａ，  Ｊ．Ｖ．  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ３０，  １８０−１８５）。生物学的プロセスによる汚染物質破壊の有益な効果を得るために使用できる、非常に狭い領域の超音波周波数が存在する（Ｓｃｈｌａｆｅｒ，  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ４０，  ２５−２９）。
【０１２１】
音波保護剤の添加は、超音波強度のより柔軟な使用を可能にすることができ、そのためプロセスとって超音波の選択はあまり重要ではない。このことは、キャビテーション誘導性の物理的プロセス（例えば、増強された混合および質量輸送のためのアコースティックストリーミング）の有益な効果をもたらすことができ、同時に、超音波誘導不活性化から微生物を保護することができる。従って最適な周波数は、使用されるそれぞれの細胞型および音波保護剤によって日常的および経験的に決定することができる。一般的に超音波の周波数は、２０ＫＨｚ〜５ＭＨｚである。更に、異なる細胞は超音波損傷に対して異なる感受性を有することが公知であるので（Ｃｈｉｓｔｉ，  Ｙ．  ２００３，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１，  ８９−９３）、音波保護剤は、超音波不活性化から多種多様な微生物集団を保護することができ、それによって、異なる汚染物質分解経路で微生物を一つの系で同時に働かせることを可能にする。
【０１２２】
別の態様では、本明細書で開示されているのが、腫瘍の処置を当該処置の必要な被験体にする方法であって、
（ａ）有効量の界面活性剤を腫瘍の領域に投与する工程であって、この界面活性剤は、キャビテーション気泡の気液界面に蓄積し、ラジカルをクエンチする、工程、および
腫瘍を高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）に供し、それによって腫瘍を処置する工程、
を包含する方法である。「被験体」とは個体を意味する。被験体は霊長類のような哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。「被験体」という用語には、ネコ、イヌ等のような飼育動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）および実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット等）を挙げることができる。「処置」または「処置する」は、望ましくない状態の被験体または系に組成物を投与することを意味する。被験体への組成物の投与の効果は、状態の症状の低減または予防、状態の重篤度の低減、または状態の完全な除去ではあるがこれらに限定されない効果を有することができる。「有効量」とは、所望の結果を達成する上で必要な処置量を意味する。ＨＩＦＵと音波保護の両方の効果は、標的となる細胞型および環境により異なる。しかし最適な周波数は、使用されるそれぞれの細胞型および音波保護剤によって日常的および経験的に決定することができる。一般的に超音波の周波数は、２０ＫＨｚ〜５ＭＨｚである。
【０１２３】
超音波診断画像装置を含む多様な種類の超音波装置のいずれも、本発明の実施で使用してもよく、特定の型または様式の装置は本発明の方法にとって重要ではない。また適切なものは、超音波温熱療法を施すために設計された装置であり、当該装置は、米国特許第４，６２０，５４６号、第４，６５８，８２８号および第４，５８６，５１２号で記載されている。これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。装置は、共鳴振動数（ＲＦ）スペクトル分析器を使用するのが好ましい。また、プローブを介して標的細胞または組織に直接接触するように設計された超音波装置も好ましい。これらの装置は、例えばＨＩＦＵまたはソノポレーションのときに超音波で内部臓器または組織を標的にするために使用できる。本発明の音波保護剤を、開示された方法を使用し、同じ門脈を介して、これらの臓器および組織に向かわせることができる。
【０１２４】
ＨＩＦＵおよび音波保護により処置できる腫瘍には、例えば、子宮筋腫、乳腺腫瘍、前立腺ガン、良性前立腺肥大症、肝腫瘍、腎腫瘍、脳腫瘍、原発性悪性骨腫瘍、リンパ節の腫瘍、肺および胸膜、膵臓、軟組織、および副腎の腫瘍を挙げることができる。
【０１２５】
音波保護剤の投与様式には、例えば、経膣処置、経直腸的処置、経頭蓋処置、肺への吸入、または心臓への注入を挙げることができる。
【０１２６】
本明細書に記載される界面活性剤のいずれも、腫瘍の処置時に生じる超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護するために、単独でかまたは組み合わせて使用することができる。一つの態様では、被験体において腫瘍を処置するために使用される界面活性剤は、少なくとも１つの疎水性基を有する炭水化物を含む。別の態様では、前述の式Ｉを有する少なくとも１つの単位を有している。更なる態様では、上記界面活性剤は、ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、メチル−６−Ｏ（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド、３−シクロヘキシ−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシド、または６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボキシル−α−Ｄ−グルコピラノシドである。
【０１２７】
別の態様では、本明細書に記載されている界面活性剤のいずれかを細胞に投与することを含む、超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護する方法であって、前記界面活性剤が、キャビテーション気泡の気液界面に蓄積し、ラジカルをクエンチする方法が本明細書中で開示される。「ラジカルをクエンチする」という語句は、キャビテーション気泡に存在するラジカルの濃度を低減させる界面活性剤の能力として本明細書に定義される。反応性ラジカルの例には、第一級ラジカル、細胞毒性ラジカル、または細胞毒性ラジカルの前駆体を含むが、これらに限定されない。第一級ラジカルの例には、Ｈ・およびＯＨ・を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
理論に束縛されることを望むわけではないが、本明細書で提示される界面活性剤のクエンチ機構の最初の工程は、反応性ラジカルによる界面活性剤の水素原子の急速な引き抜きを含む。界面活性剤がアルキル化炭水化物である場合、環炭素からの水素引き抜きが、界面活性剤のアルキル鎖からの水素原子の引き抜きに優先して起こり、それは、ラジカルと細胞培地の疎水性成分との反応と競合する（図８ｂを参照）。このことは、そうでなければ酸素が急速に加わって、細胞膜を損傷する可能性がある、有機ペルオキシルラジカルのような細胞毒性基質誘導反応性酸素種を生成する可能性がある細胞培地の疎水性成分に形成される、炭素中心ラジカルの数を有意に低減させる。従って、界面活性剤は、有害なラジカルをクエンチする（即ち、その濃度を低減させる）。例えば、Ｄ−グルコースは、水溶液中でヒドロキシルラジカルにより比較的急速な水素引き抜き反応を受けることができる〔Ｂｏｔｈｅ，Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｓｏｎｎｔａｇ，１９７７〕。酸素が、グルコピラノシド環に形成された炭素中心ラジカルに急速に加わって、主にα−ヒドロキシペルオキシラジカルを形成する。しかし、グルコピラノシド環構造に形成されたα−ヒドロキシペルオキシラジカルは、ヒドロペルオキシラジカル（ＨＯ・２）の急速な脱離、またはペルオキシラジカルの生体分子反応による細分化反応のいずれかに起因して、比較的寿命が短い。これらの反応の速度は、いくつかの変数、即ちグルコピラノシド環のＨ引き抜き部位および酸素の濃度により制御され、左右される拡散と同等の速さが可能である。
【０１２９】
前述の脱離反応は、ヒドロペルオキシラジカルの形成を伴うが、中性のｐＨで、ヒドロペルオキシラジカルは、超酸化物との不均化反応によって分解して、Ｈ２Ｏ２を生成する。ペルオキシラジカルのような基質誘導反応性酸素種と比較して、この方法で形成された比較的低濃度のＨ２Ｏ２は、細胞膜において脂質過酸化連鎖反応を開始するほど効果的であるとは予測されない。
【０１３０】
上記の機構は、細胞毒性有機ペルオキシルラジカルおよび他の基質誘導反応性酸素種の産生が、どのようにして、音波崩壊時に、開示された音波保護剤の存在下で減少し、それによって、超音波誘導細胞崩壊から細胞を保護するかの、一つの可能な説明を提供する。
【０１３１】
超音波により生じた有害なラジカルをクエンチする界面活性剤の能力は、部分的には、キャビテーション気泡の気／液界面に蓄積する能力に基づく。界面活性剤の親水性末端基は、水分子に強く引き寄せられ、疎水性基と水との引力はごく僅かなものである。従って、理論に束縛されることを望むわけではないが、界面活性剤分子は、界面活性剤の親水性末端基が一般的に水に向かい、疎水性末端基がキャビテーション気泡の気／液界面を指すように整列した後、キャビテーション気泡の気／液界面に吸着することができると考えられる。キャビテーション気泡の激しい崩壊の後、吸着分子がホットスポットの界面領域全体にわたって無作為に分布し、それは、周囲条件下におけるキャビテーション気泡の界面領域と比較して、異なる特性（例えば、高温および高圧、低誘電率）を有する。
【０１３２】
本明細書で使用できる適切な超音波周波数は、一般的に約２０ＫＨｚ〜約１０ＭＨｚ、通常約２０ＫＨｚ〜約１ＭＨｚである。強度は、約０．１ワットから約１５０ワット、一般的に約５ｗ〜約２０ｗである。持続時間は、使用する環境に応じて広範囲にわたって変わることができる。一般的に適切な時間は、約１秒間から約２時間である。他の適切な超音波曝露条件は、当該技術分野で公知であり、本明細書で提供されている。標的細胞および界面活性剤、またはこれらの組み合わせにとって好ましい曝露条件は、経験的に決定することができる。
【０１３３】
本明細書に記載される界面活性剤の濃度は、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００ｍＭを含むが、これらに限定されない、０．１〜約１００ｍＭの範囲が可能である。本明細書で提示される界面活性剤のいずれも、単独または組み合わせのいずれかで使用することができる。標的細胞を保護するのに適切な濃度は、経験的に決定することができる。
【０１３４】
本明細書に記載される界面活性剤のいずれも、単独で、またはキャビテーション気泡の気／液界面への音波保護剤の吸着を促進する他の溶質と組み合わせて、使用することができる。例えば、特定の不純物（例えば、オクタノール）は、気／液界面への界面活性剤の吸着を促進することが公知であり、塩は、気／液界面へのイオン性界面活性剤の吸着を促進することが公知である。
【０１３５】
本明細書に記載される界面活性剤のいずれも、単独で、または１つ以上の界面活性剤と組み合わせて使用して、ラジカルをクエンチすることによって、超音波媒介細胞崩壊から細胞を保護する。一つの態様では、上記界面活性剤は、少なくとも１つの疎水性基を有する炭水化物を含む。別の態様では、上記界面活性剤は、前述の式Ｉを有する少なくとも１つの単位を有する。更なる態様では、上記界面活性剤は、ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、メチル−６−Ｏ（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド、３−シクロヘキシ−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシド、または６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボキシル−α−Ｄ−グルコピラノシドの組み合わせである。従って、上記界面活性剤は、例えば、ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドとヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドとノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシドとｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドと２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシドとメチル−６−Ｏ（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド、３−シクロヘキシ−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシドと６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボキシル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシドとオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシドとヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシドとｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシドとｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、メチル−６−Ｏ（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドと３−シクロヘキシ−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシド、６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボキシル−α−Ｄ−グルコピラノシドとヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドとオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシドとｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドとｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、メチル−６−Ｏ（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドと６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボキシル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシドとノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシドとｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシドとメチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド、または３−シクロヘキシ−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシドとヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドの組み合わせであり得る。
【０１３６】
界面活性剤の組み合わせは、あらゆる比率が可能である。例としては、所定の組み合わせで、界面活性剤は、界面活性剤の総濃度の約０．００１％〜９９．９９９％が可能である。標的細胞を保護するのに適切な濃度は、経験的に決定することができる。
【０１３７】
本明細書で開示されているように、最適なグルコピラノシドおよびその濃度、ならびに一つ細胞型では細胞崩壊をもたらすが、別の細胞型では音波保護的である超音波の好ましい周波数は、選択の問題である。従って、提示されているのは、細胞または細胞の混合（異種）集団中の細胞の音波保護のために界面活性剤を選択する方法であって、少なくとも第１および第２の細胞型を含む混合細胞培養により出発し、培養に界面活性剤または界面活性剤の組み合わせを所定の濃度で添加し、細胞を所定の周波数、強度および持続時間で超音波に曝露し、第１および第２の細胞型の生存を監視することを含む方法である。
【０１３８】
更に提示されているのが、細胞型の混合集団にいる第１細胞型を選択的に殺処理し、同時に、第２細胞型を保護する方法であって、適切な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせを、本明細書で提示される選択方法により確認された適切な濃度で細胞に投与し、第１および第２の細胞型に適切な本明細書で確認された超音波条件で細胞を曝露し、ここで、超音波条件が第１細胞型を音波崩壊し、界面活性剤が第２細胞型を音波崩壊から保護することを含む方法である。
【０１３９】
例えば、提示されているのは、患者の血液中で、白血病細胞のような標的細胞を選択的に殺処理し、同時に、残りの細胞を保護する方法であって、患者の血液を単離し、適切な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせを、本明細書で提示される選択方法により確認された適切な濃度で血液に投与し、細胞に適切な本明細書で確認された超音波条件で血液を曝露し、ここで、超音波条件が標的細胞を音波崩壊し、界面活性剤が音波崩壊から残りの細胞を保護し、血液から界面活性剤を濾過し、血液を患者に戻すことを含む方法である。
【０１４０】
超音波のキャビテーション効果から健常な組織を保護するが、キャビテーション誘導音波崩壊から罹患組織を有効に保護しない音波保護界面活性剤を選択することもできる。例えば、罹患組織を、切除および音波崩壊の両方により殺処理し、同時に周囲の健常な組織を音波崩壊から保護するように、ＨＩＦＵ処置を選択的音波保護剤と組み合わせることができる。標的細胞を保護するのに適切な濃度は、経験的に決定することができる。同様に、標的細胞および界面活性剤または界面活性剤の組み合わせに好ましい曝露条件は、経験的に決定することができる。
【実施例】
【０１４１】
以下の実施例は、本明細書で特許請求される化合物、組成物、物品、装置、および／または方法がどのようにして作製され、評価されたかを、完全な開示および記載によって、当業者に提示するために記載され、純粋に例示的なものであり、開示を制限するものではない。数字（例えば、量、温度等）に関する正確性を確実にする努力がなされたが、いくらかの誤差および偏差があることを考慮に入れなければならない。特に指示がない限り、部は重量部であり、温度は℃または周囲温度であり、圧力は大気圧または近大気圧である。
【０１４２】
（実施例１：Ｎ−アルキル−グルコピラノシドは、超音波誘導細胞崩壊からＨＬ−６０細胞を保護する）
化学品：ニトロソスピントラップ３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。Ｄｕｌｂｅｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）をＢｉｏｆｌｕｉｄｓから得た。メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭＧＰ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得て、ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＨＧＰ、≧９８％）、ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＨｅｐＧＰ  ９８％超）、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ  ９９％以上）およびデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＧＰ  ９９％以上）をＦｌｕｋａから入手し、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（αＯＧＰ）、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＡＮＡＭＥＧ−７）、３−シクロヘキシル−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシド（Ｃｙｇｌｕ−３）、６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボキシル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＭＨＣ−α−ＧＰ）をＡｎａｔｒａｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｍａｕｍｅｅ，ＯＨ，ＵＳＡ）から入手した。
【０１４３】
細胞：ＨＬ−６０骨髄性白血病細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１０％ウシ胎児血清含有ＰＲＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の懸濁液で増殖させた。ＨＬ−６０細胞集団は、ＣＯ２（５％）含有雰囲気中、３７℃でインキュベートしたときに、２３±１時間（時間±ＳＥＭ）毎に二倍になった。細胞を採集し、新たなＲＰＭＩ培地で再懸濁し、実験開始まで２５℃で保持した（一般的には１時間未満）。細胞濃度は、超音波誘導細胞融解に対する細胞濃度の影響の可能性があるため、全ての実験で一定（約５×１０５細胞／ｍｌ）に保持した（Ｂｒａｙｍａｎ，Ａ．Ａ．ら、１９９６）。超音波の前および後のインタクト細胞の画分を、サンプリングスタンド（ＩＩａ型）に接続したＣｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（ＩＩｅ型）を使用して決定した。インタクト細胞数は、音波崩壊の前および後に、ベル型曲線（例えば、図１ａ）下の粒子の総数をカウントすることによって決定した。細胞崩壊率は、音波崩壊前のインタクト細胞数から細胞崩壊後のインタクト細胞数を減算することによって決定した。この値を音波崩壊前のインタクト細胞数で除算し、１００を乗じて、細胞崩壊率の値を得た。
【０１４４】
再生アッセイ：図５では、再生アッセイを１０日間実施して、細胞崩壊に対して１００％の保護が生じた濃度のＨＧＰまたはＯＧＰのいずれかの存在下における超音波処置後、細胞の長期生存能力を決定した。処置細胞懸濁液の長期生存能力を、全く同じ条件下に保持された未処置コントロール細胞懸濁液の長期生存能力と比較した（図５）。音波崩壊の直後、処置（またはコントロール）試料１ｍｌのアリコート１００μｌをＣｏｕｌｔｅｒ計数器の分析に使用し、１００％の細胞が超音波処置で生存したことを確認した。細胞の生存能力は、少量（約２０μｌ）の懸濁液をトリパンブルー染色法で使用して決定した。残りの細胞懸濁液約０．９ｍｌを新たな媒質で３ｍｌに希釈し、遠心分離し、新たな媒質で洗浄し、最後に新たな媒質（２ｍｌ）に再懸濁した。次に、この細胞が懸濁している新たな媒質２ｍｌの内の１００μｌを使用して、細胞濃度を決定した。この細胞濃度は、「細胞処置後０日目の細胞濃度」（Ｃｉ）と定義する。次に細胞懸濁液を、５％ＣＯ２インキュベーター中に３７℃で合計１０日間保持した。
【０１４５】
１０日間にわたり、細胞を、健常な細胞集団に必要な栄養素を補充するために、時々遠心沈降し、新たな媒質に再懸濁しなければならなかった。元の細胞懸濁液のアリコート１００μｌを使用して、新たな媒質に再懸濁する前（Ｃｆｉｎａｌ）および後（Ｃｉｎｉｔｉａｌ）の両方の細胞濃度を測定した。この工程は、必要ではあるが、元の細胞濃度Ｃｉと比較すると、任意の日の予測される細胞数を僅かに過少に見積もることになる。この小さいながらも有意な過少見積もりを説明するため、本発明者らは、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器による細胞数の検出のために少量のアリコートを定期的に抽出しなかったように観察される実際の細胞数を計算した。これは、Ｃｆｉｎａｌを、１日または２日前に測定したＣｉｎｉｔｉａｌ初期で除算することにより決定される「再生率」を計算し、この比率を（Ｃｉ）と比較して、「実際の細胞集団」を得ることにより行った。この計算は、単に便宜上のために行い、図５に示されているように、処置された試料の再生能力を、同じように１０日間にわたって処置されたコントロール試料と比較したことを留意するべきである。この方法の確認は、コントロール試料の細胞が、本研究におけるインキュベーション条件下におけるＨＬ−６０細胞に関して予測されるように、およそ毎日（図５）で倍になる事実によって示される。
【０１４６】
超音波曝露：特に記載のない限り、空気に曝露され、かつ１．０５７ＭＨｚで稼働する音波処理浴（Ｌ３  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，ＥＬＡＣ−Ｎａｕｔｉｋ  ＧｍｂＨ，変換器モデル番号７４  ０５１  ８０５２；Ｃｅｓａｒ発生器モデル番号７５００  １８００３）の中央に固定された、１３×１００ｍｍの使い捨て高圧滅菌パイレックス（登録商標）チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）における超音波音場で、細胞懸濁液（１ｍｌ）を音波処理した。活性炭（１ｍｌ）の懸濁液の音波崩壊は帯域を生成せず、このことは、試料溶液１ｍｌでは目に見える定在波が存在しないことを示す。細胞による実験では、超音波変換器の電気出力を通常１０Ｗに設定した。発明者等は、以前に、これらの条件下における音波処理浴溶液の空間的に平均化された出力を０．６ワット／ｃｍ２とし（Ｓｏｓｔａｒｉｃ，Ｊ．Ｚ．およびＲｉｅｓｚ，Ｐ．Ｊ．２００２）、この熱量的に決定された入力は発生器の出力の関数として１０から６０Ｗに直線的に増加する（Ｓｏｓｔａｒｉｃ，Ｊ．Ｚ．およびＲｉｅｓｚ，Ｐ．Ｊ．２００２）と特徴付けた。本研究では、発生器の出力は、超音波強度として示した。しかし、発生器の出力は、以前の研究を参照して熱量的に決定された出力と比較することもでき、実験設定の図も入手可能である（Ｓｏｓｔａｒｉｃ，Ｊ．Ｚ．およびＲｉｅｓｚ，Ｐ．Ｊ．２００２）。結合水の温度は２５℃であった。細胞実験は、グルコピラノシドを細胞懸濁液に添加した５〜１０分以内に完了し、それぞれのデータ点は、平均±ＳＥＭを表し、ここでｎ＝５〜８である。この研究で使用される最高濃度でＭＧＰ、ＨＧＰ、ＨｅｐＧＰおよびＯＧＰに１５分間ＨＬ−６０細胞を曝露しても、１２０時間にわたる細胞の再生率に有害な効果を与えなかったことが見出された。しかし、細胞のＤＧＰへの１５分間の曝露は、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器およびトリパンブルー染色法で確認されたように、細胞の大集団の即座の溶解をもたらした。このため、発明者等は、ＨＬ−６０細胞の超音波誘導細胞崩壊に対するＭＧＰ、ＨＧＰ、ＨｅｐＧＰおよびＯＧＰの効果しか研究しなかった。ＯＧＰは、膜タンパク質の非細胞崩壊抽出に使用されており、多様な細胞が、およそ７ｍＭ〜３０ｍＭ濃度のＯＧＰに最長３０分間曝露され（Ｊｏｌｌｙ，Ｃ．Ｌ．ら、２００１；Ｌａｚｏ，Ｊ．Ｓ．およびＱｕｉｎｎ，Ｄ．Ｅ．１９８０；  Ｌｅｇｒｕｅ．Ｓ．Ｊ．ら、１９８２）、細胞崩壊効果は観察されなかった。本研究は、濃度３ｍＭ未満のＯＧＰおよび最長１０分間の曝露時間および以前の研究に基づいて実施し、この界面活性剤は、本研究の条件下では有意な量の膜タンパク質を抽出する上で有効であるとは予測されなかった（Ｌａｚｏ，Ｊ．Ｓ．およびＱｕｉｎｎ，Ｄ．Ｅ．１９８０；Ｌｅｇｒｕｅ，Ｓ．Ｊ．ら、１９８２）。
【０１４７】
機械的脆弱性試験：細胞の機械的脆弱性に対するグルコピラノシドの効果を、細胞懸濁液に機械的剪断応力を誘導することによって決定した。これには、ホウケイ酸固体ガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，平均粒径３ｍｍ）を１０ｍＬ含有する、１２５ｍｌの大きさのねじ蓋付き円錐形フラスコ中の懸濁液に、ＨＬ−６０細胞１０ｍＬを入れることを含み、他で記載された方法（Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎ，Ｅ．Ｌ．ら、１９９３；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗ．ら、２００３）と類似している。次に試料をＢｕｒｒｅｌｌ手関節作動振盪器（モデル番号７５、Ｂｕｒｒｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）により、５０％の出力で３０分間振盪した。この方法を使用して、最高８個の試料溶液を一度に扱うことができた。同時に８個の細胞懸濁液を振盪することによって、Ｂｕｒｒｅｌｌ振盪器における試料の位置が、機械的に溶解した細胞の比率（３０±２％）に対して有意な影響を与えないことを決定した。グルコピラノシドを含有する試料において、界面活性剤をＤＰＢＳ  １ｍｌに溶解し、細胞懸濁液９ｍｌに加えた。
【０１４８】
電子スピン共鳴（即ち、ＥＳＲまたはＥＰＲ）測定：ＨＧＰ（５ｍＭ）があるかまたはない細胞懸濁液（１ｍｌ）を、ＤＢＮＢＳ（３ｍｇ／ｍｌ）の存在下で音波処理した。これは、炭素中心ラジカルのスピントラッピングに有効である。音波崩壊の前に、ＤＢＮＢＳを含有する試料溶液をパイレックス（登録商標）チューブの中に入れ、「ｓｕｂａシール」（Ａｌｄｒｉｃｈにより供給）を使用して大気から密閉した。針を通して試料をアルゴンガスで５分間泡立てた。針を、試料溶液の真上に上げて、音波崩壊の間、アルゴンガスを細胞懸濁液の上を通過させた（１．０５７ＭＨｚ、ｐ＝６０Ｗ、１５秒間）。懸濁液をアルゴンでパージして酸素を除去し、それによって、ＤＢＮＢＳによりスピントラッピングできない有機ペルオキシルラジカルの形成を回避した。音波崩壊の直後、試料をＥＳＲの平坦な石英セルの中に移した。ＥＳＲスペクトルを、変調周波数１００ｋＨｚのＶａｒｉａｎ  Ｅ−９  Ｘ帯域分光計で記録した。一般的な器具の設定は、振幅変調１Ｇ、時定数０．１２８ｓ、スキャン速度０．８３Ｇｓ−１であった。
【０１４９】
ＨＬ−６０細胞の細胞崩壊の比率は、１０５７Ｈｚでの音波崩壊に続いて、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒを使用する細胞サイズ分布の測定によって決定した（図１）。本発明者らは、本発明の超音波系における音波崩壊の効果を研究するために、この技術の有効性をトリパンブルー排除アッセイにより確認した。ＨＬ−６０細胞の平均サイズは、音波崩壊前にＣｏｕｌｔｅｒ計数器の結果から決定し、細胞平均直径の１３μｍに相当するおよそ６５０μｍ３（図１ａ）であった。
【０１５０】
１．０５７ＭＨｚでの細胞懸濁液１ｍｌの音波崩壊に続いて、ＨＬ−６０細胞の元のサイズ分布の周りの粒子数が減少し、同時に、更により小さな粒子サイズ（約１００μｍ３）の増加が観察され、元の細胞（平均粒子容量６５０μｍ３）が細胞崩壊を受けたことを示す。この極端な例が図１ｂに示されており、ほぼ全ての細胞が即座の細胞崩壊を受けた条件下で、音波崩壊が行われた。超音波誘導細胞崩壊は、音波崩壊の直前に細胞懸濁液へのＨＧＰ（５ｍＭ）の添加によって排除された（図１ｃ）。図１ｃの細胞サイズ分布は、未処置の健常な細胞で示されるものと類似しているように見える（図１ａ）ことに留意すること。
【０１５１】
即座の細胞崩壊からのＨＬ−６０細胞の保護に対するＭＧＰ、ＨＧＰ、ＨｅｐＧＰ、ＯＧＰ、αＯＧＰ、ＡＮＡＭＥＧ−７、Ｃｙｇｌｕ−３、およびＭＨＣ−α−ＧＰの濃度の効果を、図２、図１９、図２０、図２１および図２２に示す。これらの実験の音波崩壊の条件は、いずれかの特定の添加剤の非存在下における音波崩壊の直後、およそ３５〜４０％の細胞崩壊が観察されるものであった。図２に示されるｎ−アルキルグルコピラノシドでは、ｎ−アルキル鎖の長さが増加すると、より顕著な保護効果がもたらされ、ＯＧＰは僅か２ｍＭの濃度のバルク溶液で細胞を完全に保護した。非界面活性誘導体であるＭＧＰは、研究した濃度範囲（０〜３０ｍＭ，図２の挿入部分）で細胞崩壊に対して効果がなかった。ＯＧＰのα−アノマーであるαＯＧＰは、３ｍＭまで極僅かな保護作用を示した（図１９）。しかし、α−Ｄ−グルコピラノシドでもあるＡＮＡＭＥＧ−７（Ａｎａｔｒａｃｅ，Ｍａｕｍｅ，ＯＨ）（図２０）およびＭＨＣ−α−ＧＰ（図２２）は、３ｍＭで完全に保護的であった。５ｍＭでのＣＹＧＬＵ−３（Ａｎａｔｒａｃｅ，Ｍａｕｍｅ，ＯＨ）による完全な音波保護もまた、示される（図２１）。音波崩壊後に１００％の保護が起こったことを示すＣｏｕｌｔｅｒ計数器の結果は、トリパンブルー染色法により確認され、健常な細胞のみが、未処置細胞と同様の濃度で観察された。
【０１５２】
図３に示されているように、実験は、超音波強度および曝露時間の範囲下で、音波崩壊から細胞を保護するＨＧＰ（５ｍＭ）の有効性を示すために実施した。この場合、ＨＧＰは、ＨＧＰ（５ｍＭ）の非存在下でほぼ１００％の細胞集団が細胞崩壊を受ける極限の条件の音波崩壊中でさえも、細胞崩壊から細胞を保護できたことを示した。
【０１５３】
図４に示されているように、この劇的な保護効果は、種々の濃度のＨＧＰ、ＨｅｐＧＰ、およびＯＧＰの存在下で２４時間にわたる音波崩壊後の細胞の再生生存可能性を研究する、一連の実験を通して確認された。実験誤差の範囲内で、全ての処置試料は、未処置コントロール試料と同じ比率で再生し続けた。
【０１５４】
図５に示されているように、この効果の更なる確認は、比較的厳しい条件下で超音波により処置された、ＨＧＰ（５ｍＭ）により細胞崩壊から保護された細胞の再生能についての広範囲な調査を行うことによって得た。１０日間の間、処置細胞が未処置コントロール細胞と同等の比率で再生し続けることは明らかである。
【０１５５】
キャビテーション誘導性剪断応力は、即座に細胞崩壊をもたらす上で十分強力であると考えられる。従って、提示される界面活性剤は、機械的に誘導した剪断応力の効果に対して細胞を安定化できるかどうかを試験することが必要である。図６は、試験したグルコピラノシド、即ちＨＧＰ（１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ）、ＨｅｐＧＰ（０．１ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ）、ＭＧＰ（１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ）、またはＯＧＰ（０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ）の内、機械的に誘導した細胞崩壊からＨＬ−６０細胞を保護したものはなかったことを示す。事実、比較的高濃度でＨｅｐＧＰ界面活性剤は、機械的剪断応力に対して細胞膜の有意な不安定化をもたらした。
【０１５６】
細胞の保護は、界面活性剤によるキャビテーションプロセスの減衰によって可能となった。界面活性剤が細胞懸濁液における不活性キャビテーションプロセルに影響を与えることができるかどうかを決定するため、本発明者らは、図７に示されているように、ＤＢＮＢＳによるスピントラッピングおよび電子スピン共鳴の技術を使用して、ＨＧＰ（５ｍＭ）の存在下または非存在下で細胞懸濁液における炭素中心ラジカル形成の程度を決定した。これらの実験はアルゴンガス下で実施して、炭素中心ラジカルのために、ＤＢＮＢＳと酸素との競合反応を回避した。ＨＧＰの非存在下では、細胞懸濁液の音波崩壊は、主に、窒素結合定数Ｎ＝１．５ｍＴを有する第三級（Ｒ３−・Ｃ）炭素中心ラジカルを生じた。第二級（Ｒ２−・Ｃ）炭素中心ラジカルからの極少量の寄与も観察される。主な第三級炭素中心ラジカル成分のシミュレーションから、０．８μＭの炭素中心ラジカル収量を決定した。音波崩壊前のＨＧＰ（５ｍＭ）の細胞懸濁液への添加は、第三級および第二級の両方の炭素中心ラジカルならびに極少量の第一級（Ｒ−・ＣＨ２）成分を含むＥＳＲスペクトルを生じた。主にＥＳＲスペクトルの第三級および第二級の炭素中心ラジカル成分のシミュレーションから、１．６μＭの炭素中心ラジカル総収量を決定した。これは、ＨＧＰの非存在下における細胞懸濁液の音波崩壊後に観察される炭素中心ラジカル収量よりも二倍高い。
【０１５７】
（実施例２：ｎ−アルキル−グルコピラノシドによる音波保護に対する超音波周波数の効果）
化学品：Ｄｕｌｂｅｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）をＢｉｏｆｌｕｉｄｓから得た。メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭＧＰ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得て、ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＨＧＰ  ９８％以上）、ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＨｅｐＧＰ  ９８％超）、およびオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ  ９９％以上）をＦｌｕｋａから得た。
【０１５８】
細胞：ＨＬ−６０骨髄性白血病細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１０％ウシ胎児血清を含有するＰＲＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の懸濁液で増殖させた。ＨＬ−６０細胞の集団は、ＣＯ２（５％）含有雰囲気中、３７℃でインキュベートしたときに、２３±１時間（時間±ＳＥＭ）毎で二倍になった。細胞を採集し、新たなＲＰＭＩ培地で再懸濁し、実験開始まで２５℃で保持した（一般的には１時間未満）。細胞濃度は、超音波誘導細胞融解に対する細胞濃度の影響の可能性があるため、全ての実験で一定（約５×１０５細胞／ｍｌ）に保持した（Ｂｒａｙｍａｎ，Ａ．Ａ．ら、１９９６）。超音波の前および後のインタクト細胞の画分を、サンプリングスタンド（ＩＩａ型）に接続したＣｏｕｌｔｅｒマルチサイザー（ＩＩｅ型）を使用して決定した。インタクト細胞数は、音波崩壊の前および後に、ベル型曲線（例えば、図１ａ）下の粒子の総数をカウントすることによって決定した。細胞崩壊率は、音波崩壊前のインタクト細胞数から細胞崩壊後のインタクト細胞数を減算することによって決定した。この値を音波崩壊前のインタクト細胞数で除算し、１００を乗じて、細胞崩壊率の値を得た。
【０１５９】
超音波曝露：特に記載のない限り、空気に曝露され、且つ周波数１０５７ＫＨｚもしくは３５４ｋＨｚ（ＵＳＷ５１−０５２型、モデル番号７４−０５１−８０５２）または６１４ｋＨｚ（ＵＳＷ５１−０５１型、モデル番号７４−０５１−８０５１）で稼働する音波処理浴（Ｌ３  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＥＬＡＣ−Ｎａｕｔｉｋ  ＧｍｂＨ；Ｃｅｓａｒ発生器モデル番号７５００  １８００３）の中央に固定された、１３×１００ｍｍの使い捨て高圧滅菌パイレックス（登録商標）チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ＮＹ）における超音波音場で、細胞懸濁液（１ｍｌ）を音波処理した。４２ｋＨｚ音波崩壊を同様な方法であるが、Ｂｒａｎｓｏｎ超音波浴（モデル番号１５１０）を使用して実施した。活性炭（１ｍｌ）の懸濁液の音波崩壊は帯域を生成せず、このことは、試料溶液１ｍｌでは目に見える定在波が存在しないことを示す。超音波変換器（１０５７／３５４、６１４ｋＨｚ）の電気出力を通常１０Ｗに設定した。発明者等は、以前に、これらの条件下における音波処理浴溶液における空間的に平均化された出力を０．６ワット／ｃｍ２とし（Ｓｏｓｔａｒｉｃ，  Ｊ．Ｚ．  ａｎｄ  Ｒｉｅｓｚ，  Ｐ．Ｊ．  ２００２）、この熱量的に決定された入力は発生器の出力の関数として１０から６０Ｗに直線的に増加する（Ｓｏｓｔａｒｉｃ，  Ｊ．Ｚ．  ａｎｄ  Ｒｉｅｓｚ，  Ｐ．Ｊ．  ２００２）と特徴付けた。本研究では、発生器の出力は、超音波強度として示した。しかし、発生器の出力は、以前の研究を参照して熱量的に決定された出力と比較することもでき、実験設定の図も入手可能である（Ｓｏｓｔａｒｉｃ，  Ｊ．Ｚ．  ａｎｄ  Ｒｉｅｓｚ，  Ｐ．Ｊ．  ２００２）（本発明の方法のプロトコールの開示について、本明細書中に参考として援用される）。４２ｋＨｚで変換器を使用して、浴の出力を元の値の５０％に減少した。結合水の温度は全ての周波数で２５℃であった。細胞実験は、グルコピラノシドを細胞懸濁液に添加した５〜１０分以内に完了し、それぞれのデータ点は、平均±ＳＥＭを表し、ここでｎ＝５〜８である。ＨＬ−６０細胞のこの研究で使用される最高濃度でのＭＧＰ、ＨＧＰ、ＨｅｐＧＰおよびＯＧＰへの１５分間の曝露は、１２０時間にわたる細胞の再生率に有害な効果を与えなかったことが見出された。ＯＧＰは、膜タンパク質の非細胞崩壊抽出に使用されており、多様な細胞が、およそ７ｍＭ〜３０ｍＭ濃度のＯＧＰに最長３０分間曝露され（Ｊｏｌｌｙ，  Ｃ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００１；  Ｌａｚｏ，  Ｊ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｑｕｉｎｎ，  Ｄ．Ｅ．  １９８０；  Ｌｅｇｒｕｅ．  Ｓ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９８２）、崩壊効果は観察されなかった。本研究は、濃度３ｍＭ未満のＯＧＰおよび最長１０分間の曝露時間および以前の研究に基づいて実施し、この界面活性剤は、本研究の条件下では有意な量の膜タンパク質を抽出する上で有効であるとは予測されなかった（Ｌａｚｏ，  Ｊ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｑｕｉｎｎ，  Ｄ．Ｅ．  １９８０；  Ｌｅｇｒｕｅ，  Ｓ．Ｊ．  ａｔ  ａｌ．  １９８２）。
【０１６０】
ＨＬ−６０の細胞崩壊の比率は、Ｃｏｕｌｔｅｒマルチサイザーを使用して、細胞サイズ分布を測定することによって決定した。この方法は、音波崩壊の直後のトリパンブルー排除アッセイを使用して測定した細胞崩壊率と十分に相関しており、他の文献で詳細に説明されている（Ｍｉｙｏｓｈｉ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）。全周波数での細胞懸濁液の音波崩壊は、特定の比率の細胞が超音波曝露中に即座に細胞崩壊を受けるという結果をもたらした。この即座の超音波誘導細胞崩壊（即ち、細胞崩壊率）を図２、図１０〜１２において濃度０で示す。
【０１６１】
１ＭＨｚでの音波崩壊の直前における細胞懸濁液へのＨＧＰ、ＨｅｐＧＰまたはＯＧＰの添加は、図２に示すように細胞崩壊の比率の濃度依存的減少をもたらした。超音波誘導細胞崩壊からのおよそ１００％の保護が、濃度２ｍＭ（ＯＧＰ）、３ｍＭ（ＨｅｐＧＰ）、および５ｍＭ（ＨＧＰ）で観察された。細胞を完全に保護するために必要なグルコピラノシドの濃度は、グルコピラノシドのｎ−アルキル鎖長の順序に従い、最長のｎ−アルキル鎖を有する界面活性剤（ＯＧＰ）が、超音波誘導細胞崩壊から細胞を保護するのに最も効果的であることは、興味深く注目される。更に、非表面活性誘導体であるＭＧＰは、最高３０ｍＭの濃度でさえも、１ＭＨｚでの細胞崩壊率に影響を与えない。従って、１ＭＨｚ超音波からグルコピラノシドによる細胞の保護は、グルコピラノシドの濃度だけでなく、これらの溶質の界面活性剤特性によっても左右される。
【０１６２】
音波崩壊の周波数が１ＭＨｚから４２ｋＨｚに低下した場合（図２、図９〜１２を参照）、ＨＬ−６０細胞の保護（１ＭＨｚ）から４２ｋＨｚでのＨＬ−６０細胞の極少量の音波感作へＨＧＰ、ＨｅｐＧＰおよびＯＧＰが移行する。しかしＭＧＰは、その濃度（１０〜３０ｍＭの範囲）または音波崩壊の周波数に関係なく、細胞崩壊の比率に影響を与えなかった。超音波からＨＬ−６０細胞を保護するそれぞれのグルコピラノシドの能力に対する超音波周波数の効果についての理解を得るため、細胞崩壊の比率を濃度０で値１に正規化し、４つの異なる周波数でそれぞれのグルコピラノシドの濃度の関数としてグラフ化した（図１２ａ〜１２ｄ）。細胞崩壊率の正規化は、特定のグルコピラノシドの全ての濃度で観察される細胞崩壊率を、濃度０で観察される細胞崩壊率で除算することによって達成した。
【０１６３】
異なる周波数での超音波誘導細胞崩壊に対するそれぞれの界面活性剤の効果を比較すると、図１２ａでは、ＯＧＰは１ＭＨｚで細胞を細胞崩壊から完全に保護するが、６１４ｋＨｚでは、細胞集団の５０％しか保護することができないことが示されている。周波数が３５４ｋＨｚまたは４２ｋＨｚに低下すると、ＯＧＰは弱い音波感作物質として作用し、それによって細胞崩壊率が増加する。図１２ｂにおいて、ＨｅｐＧＰは、１ＭＨｚおよび６１４ｋＨｚで細胞を細胞崩壊から完全に保護する。図１２ｃにおいて、ＨＧＰは、１ＭＨｚ、６１４ＫＨｚおよび３５４ｋＨｚで細胞を完全に保護するが、４２ｋＨｚでは保護しない。図１２ｄにおいて、ＭＧＰは、あらゆる超音波周波数で超音波誘導細胞崩壊に対して事実上効果がない。
【０１６４】
周波数が１ＭＨｚから４２ｋＨｚに低下すると、細胞崩壊率に対する表面活性グルコピラノシド（即ち、ＯＧＰ、ＨｅｐＧＰおよびＨＧＰ）の効果に２つの注目すべき傾向が存在する。第１は、音波崩壊の周波数が低下すると、グルコピラノシドは、超音波誘導細胞崩壊から細胞を保護する上で有効性が低くなる。第２は、超音波誘導細胞崩壊から細胞を保護する、最長ｎ−アルキル鎖を有するグルコピラノシド（ＯＧＰ）の能力は、ＨｅｐＧＰおよびＨＧＰと比較すると、音波崩壊の周波数により最も影響を受ける。
【０１６５】
（実施例３：音波保護剤としてのマルトピラノシドおよびチオガラクトピラノシド）
化学品：Ｄｕｌｂｅｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）をＢｉｏｆｌｕｉｄｓから得た。ヘキシルβ−Ｄ−マルトピラノシド（ＨＭＰ）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＯＭＰ）、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＰＰＭＰ）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（ＯＴＧＰ）、およびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧａｌＰ）をＡｎａｔｒａｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｍａｕｍｅｅ，ＯＨ，ＳＡ）から得た。
【０１６６】
細胞：ＨＬ−６０骨髄性白血病細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１０％ウシ胎児血清含有ＰＲＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の懸濁液で増殖した。ＨＬ−６０細胞の集団は、ＣＯ２（５％）含有雰囲気中、３７℃でインキュベートしたとき、２３±１時間（時間±ＳＥＭ）毎で二倍になった。細胞を採集し、新たなＲＰＭＩ培地で再懸濁し、実験開始まで２５℃で保持した（一般的には１時間未満）。細胞濃度は、超音波誘導細胞融解に対する細胞濃度の影響の可能性があるため、全ての実験で一定（約５×１０５細胞／ｍｌ）に保持した（Ｂｒａｙｍａｎ，  Ａ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９６）。超音波の前および後のインタクト細胞の画分を、サンプリングスタンド（ＩＩａ型）に接続したＣｏｕｌｔｅｒマルチサイザー（ＩＩｅ型）を使用して決定した。インタクト細胞数は、音波崩壊の前および後に、ベル型曲線（例えば、図１ａ）下の粒子の総数をカウントすることによって決定した。細胞崩壊率は、音波崩壊前のインタクト細胞数から細胞崩壊後のインタクト細胞数を減算することによって決定した。この値を音波崩壊前のインタクト細胞数で除算し、１００を乗じて、細胞崩壊率の値を得た。
【０１６７】
超音波曝露：特に記載のない限り、空気に曝露され、且つ周波数１０５７ＫＨｚもしくは３５４ｋＨｚ（モデル番号ｘｘ）または６１４ＫＨｚ（モデル番号ｘｘ）で稼働する音波処理浴（Ｌ３  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＥＬＡＣ−Ｎａｕｔｉｋ  ＧｍｂＨ；Ｃｅｓａｒ発生器モデル番号７５００  １８００３）の中央に固定された、１３×１００ｍｍの使い捨て高圧滅菌パイレックス（登録商標）チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ＮＹ）における超音波音場で、細胞懸濁液（１ｍｌ）を音波処理した。４２ｋＨｚ音波崩壊を同様な方法であるが、Ｂｒａｎｓｏｎ超音波浴（モデル番号ｘｘ）を使用して実施した。活性炭（１ｍｌ）の懸濁液の音波崩壊は帯域を生成せず、このことは、試料溶液１ｍｌでは目に見える定在波が存在しないことを示す。超音波変換器（１０５７／３５４、６１４ｋＨｚ）の電気出力を通常１０Ｗに設定した。発明者等は、以前に、これらの条件下における音波処理浴溶液の空間的に平均化された出力を０．６ワット／ｃｍ２とし（Ｓｏｓｔａｒｉｃ，  Ｊ．Ｚ．  ａｎｄ  Ｒｉｅｓｚ，  Ｐ．Ｊ．  ２００２）、この熱量的に決定された入力は発生器の出力の関数として１０から６０Ｗに直線的に増加する（Ｓｏｓｔａｒｉｃ，  Ｊ．Ｚ．  ａｎｄ  Ｒｉｅｓｚ，  Ｐ．Ｊ．  ２００２）と特徴付けた。本研究では、発生器の出力は、超音波強度として示した。しかし、発生器の出力は、以前の研究を参照して熱量的に決定された出力と比較することもでき、実験設定の図も入手可能である（Ｓｏｓｔａｒｉｃ，  Ｊ．Ｚ．  ａｎｄ  Ｒｉｅｓｚ，  Ｐ．Ｊ．  ２００２）。４２ｋＨｚで変換器を使用して、浴の出力を元の値の５０％に減少した。結合水の温度は全ての周波数で２５℃であった。細胞実験は、グルコピラノシドを細胞懸濁液に添加した５〜１０分以内に完了し、それぞれのデータ点は、平均±ＳＥＭを表し、ここでｎ＝５〜８である。ＨＬ−６０細胞のこの研究で使用される最高濃度でのＭＧＰ、ＨＧＰ、ＨｅｐＧＰおよびＯＧＰへの１５分間の曝露は、１２０時間にわたる細胞の再生率に有害な効果を与えなかったことが見出された。ＯＧＰは、膜タンパク質の非細胞崩壊抽出に使用されており、多様な細胞が、およそ７ｍＭ〜３０ｍＭ濃度のＯＧＰに最長３０分間曝露され（Ｊｏｌｌｙ，  Ｃ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００１；  Ｌａｚｏ，  Ｊ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｑｕｉｎｎ，  Ｄ．Ｅ．  １９８０；  Ｌｅｇｒｕｅ．  Ｓ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９８２）、崩壊効果は観察されなかった。本研究は、濃度３ｍＭ未満のＯＧＰおよび最長１０分間の曝露時間および以前の研究に基づいて実施し、この界面活性剤は、本研究の条件下では有意な量の膜タンパク質を抽出する上で有効であるとは予測されなかった（Ｌａｚｏ，  Ｊ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｑｕｉｎｎ，  Ｄ．Ｅ．  １９８０；  Ｌｅｇｒｕｅ，  Ｓ．Ｊ．  ａｔ  ａｌ．  １９８２）。
【０１６８】
ＨＬ−６０の細胞崩壊の比率は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒを使用して、細胞サイズ分布を測定することによって決定した。この方法は、音波崩壊の直後のトリパンブルー排除アッセイを使用して測定した細胞崩壊率と十分に相関しており、他の文献で詳細に説明されている（Ｍｉｙｏｓｈｉ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）。全周波数での細胞懸濁液の音波崩壊は、特定の比率の細胞が超音波曝露時に即座に細胞崩壊を受けるという結果をもたらした。この即座の超音波誘導細胞崩壊（即ち、細胞崩壊率）を濃度０で示す。
【０１６９】
ＨＬ−６０細胞の１ＭＨｚ誘導細胞崩壊に対するマルトピラノシド（ＨＭＰ、ＯＭＰ、ＰＰＭＰ）チオグルコピラノシド（ＯＴＧＰ）、およびチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧａｌＰ）の効果を図１３〜１７に示す（それぞれのデータ点は、４〜６回の平均である）。図１３〜１７を図２に示されるＨＧＰのデータと比較することができる。
【０１７０】
グルコピラノシド含有界面活性剤は、このような保護効果を作り出すことができる唯一の種類の界面活性剤ではない。保護効果は、２つの特性を持つあらゆる溶質にとって一般的である。ａ）溶質は界面活性を有し、ｂ）溶質はラジカルをその供給源でクエンチする。図１３の例によって示されているように、グルコピラノシドだけでなく、これを達成することができるいくつかの異なる分子が存在する。
【０１７１】
ヘキシル−マルトピラノシドは、ヘキシル−グルコピラノシドと比較して、この周波数（１ＭＨｚ）でこれらの細胞（ＨＬ−６０）を保護するのにより効果的であり、即ちＨＧＰでは約５ｍＭであるのと比較して、ＨＭＰでは１ｍＭのみで完全に保護する（図２）。このことは、分子の頭部基が、１つしか糖部分を有さないＨＧＰよりも効果的に細胞毒性ラジカルを「クエンチ」することができる、２つの糖部分を有するという事実に起因することができる。
【０１７２】
（実施例４：長期細胞生存に対する音波保護剤の効果）
図１８は、「再生率」を示し、これは、生存細胞集団がＨＧＰの存在下または非存在下で超音波により処置を受けた後、再生し続ける能力の指標である。再生率は、単に、処置日に存在する細胞数で処置の１日または２日後に存在する細胞数を除算したものである。グラフが示しているものは、コントロール（「音波なし」のバーを参照）が毎日その数を倍にしていることである。「３５４ｋＨｚ、０ｍＭ」および「６１４ｋＨｚ、０ｍＭ」のバーは、保護剤の非存在下で超音波により処置を受けた細胞を表す。即ち、これらは最初の超音波処置で生存した元の細胞集団の比率を表す（特定の比率の集団は即座に細胞崩壊を受けた）。最後に、「３５４ｋＨｚ、７ｍＭ」および「６１４ｋＨｚ、７ｍＭ」のデータは、即座の細胞崩壊から保護された１００％の細胞を表す。「音波なし」および７ｍＭ（ＨＧＰ）のバーは、全て同率で再生し続ける。しかし、ＨＧＰで保護されない超音波処置細胞を表す「０ｍＭ」と標示されたバーは、「音波なし」コントロールまたは２つの「７ｍＭ］保護試料と比較すると、有意に遅い率で再生する。この保護されていない「０ｍＭ］の集団における再生率の低減は、２つの理由、ａ）細胞の再生能が超音波の効果によって減退したか、またはｂ）元の超音波処置で生存した細胞の比率がより長期の生物学的経路、例えばアポトーシスによりゆっくりと死亡した、のうちの１つで生じる可能性がある。結論として、データでは、細胞の音波崩壊時の音波保護物質の存在が、超音波の生物学的に有害な効果に対する長期的な保護も提供することを示す。
【０１７３】
（実施例５：限局性前立腺腺ガンおよび良性前立腺肥大症を含む前立腺ガンの処置）
患者は処置前夜に入院し、処置のおよそ２時間前に直腸結腸調製物のために浣腸を受けた。処置は右側臥位で寝ている患者で施した。患者は処置の間は不動のままでいなければならず、従って処置前に脊髄麻酔をした。超音波プローブを直腸に挿入し、超音波ビームを、処置される前立腺の領域に経直腸的に焦点を合わせた。前立腺へのＨＩＦＵの適用方法としては、１）４ＭＨｚ、２１１エレメントＰＺＴおよびピエゾコンポジット（ｐｉｅｚｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）円筒形経直腸段階アレイ（Ｆｏｃｕｓ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、２）冷却バルーンと一体化したカテーテル系方向性尿道移動アプリケーター（Ｒｏｓｓ，  Ａ．Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｈｙｓ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ４９（２００４）  １８９−２０４）、３）Ｓｏｎｏｂｌａｔｅ−２００  ＨＩＦＵ装置（Ｆｏｃｕｓ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）（Ｕｃｈｉｄａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｒｏｌｏｇｙ，  ５９（３），  ２００２，  ３９４−３９８）、および４）Ａｂａｌｔｈｅｒｍ（ＥＤＡＰ  ＴＭＳ  Ｓ．Ａ．，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ，ｗｗｗ．ｅｄａｐ−ｈｉｆｕ．ｃｏｍ）が挙げられる。
【０１７４】
超音波プローブは、水性結合媒質を有する膨張性バルーンにより覆われている。挿入の前に、薬理学的に受容可能なペーストを、直腸壁と接触するバルーンの外側に添加する。ペーストは、使用される音波保護物質に応じて０．１〜３０ｍＭの濃度の音波保護物質を含有する。バルーンは挿入後に膨張し、処置中に液体がバルーンを通して循環しているため、それによってアプリケーターが直腸壁と接触することを防ぎ、また直腸壁を冷却することを助ける。音波保護物質を有するペーストは、バルーンの外側壁と直腸壁との間にあり、それによって焦点の合っていない領域において超音波の高い強度から直腸壁を保護する。焦点領域（即ち、前立腺）における超音波の吸収は、８５〜１００℃の温度増加をもたらし、焦点に位置する細胞を破壊する。焦点は、最大で高さ２４ｍｍおよび直径２ｍｍに及ぶ寸法を有する楕円形である。腫瘍または前立腺の全体を処置するために、４００発から６００発の超音波を一般的に適用する。
【０１７５】
一般的に前立腺膨張が起こり、従って尿道へのカテーテルの挿入は、一般的に排尿のために処置後３〜８日間が必要である。前立腺が処置時に膨張するため、一般的には、チューブを尿道に挿入して尿道の狭窄を防ぐ。必要に応じて、処置時に尿道の細胞への可能性のあるあらゆる損傷を避けるために、音波保護物質充填チューブを尿道に挿入する。チューブは音波保護物質に対して多孔質であり、それによって音波保護物質がチューブから拡散し、尿道の細胞と接触することを可能にし、それによって超音波誘導損傷から保護する。音波保護物質溶液は、使用される音波保護物質および使用される音波崩壊の周波数に応じて、約０．１〜３０ｍＭの濃度の音波保護物質を含有する、薬理学的に受容可能な水溶液である。
【０１７６】
（実施例６：穿刺血管の処置のための音響止血）
ヒトの血管から血管を遮断することなく止血するために、ＨＩＦＵ変換器（Ｓｏｎｉｃ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｗｏｏｄｉｎｖｉｌｌｅ，ＷＡ）を、周波数５００ｋＨｚ〜５ＭＨｚ、空間平均強度１００Ｗ／ｃｍ２〜４０００Ｗ／ｃｍ２で使用する。表面の処置、または開放創の処置、または手術中の処置では、変換器は、水溶液を有する円錐形ハウジングを備えている。ハウジングの先端は、約３ｍｍの開口部を有し、適切なポリマー膜、例えばｍｙｌａｒ（登録商標）またはポリウレタンで覆われている。コーン形状は、焦点が膜上にあるようなものであり、膜は、処置される血管（静脈または動脈）と直接接触している。処置は、ＨＩＦＵの１０〜２０秒間の適用、その後の出血が止まったかの確認を含む。音波保護物質は、処置前に粘稠液として破裂領域に０．１〜３０ｍＭの濃度で直接適用することができる。処置時間は、とりわけ破裂の大きさに応じて、１０秒間から３分間の間で変動する。これは、外膜の凝固をもたらし、血管壁の周りにフィブリン網状組織を作り出す上で十分であると思われる。
【０１７７】
危機的な速度では出血が起こらない場合には、処置の０．５〜５分前に、封入ナノサイズ粒子またはマイクロサイズ粒子に封入して、ＩＶによって音波保護物質を投与することもできる。マイクロまたはナノサイズ粒子は、更に、損傷部位に蓄積することを可能にする機能性を有することができる。例えば、脂質シェルを有する微小気泡は、オプソニン作用による白血球に結合することができ、それによって、微小気泡の表面に付着している血清補体が、活性化白血球に存在するいくつかの異なるレセプターと腫瘍部位で結合することができる（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９５，５７，８２７−８７２）。
【０１７８】
肝臓における止血は、造影剤の存在下で更に増強することができる。生理食塩水中の濃度０．０９ｍｌ／ｋｇ〜０．３ｍｌ／ｋｇのＯｐｔｉｓｏｎ（登録商標）を腸間膜静脈に注入し、それは門脈に流れ出る。造影剤は肝臓葉に入り、これは、超音波画像を使用して、肝臓のエコー反射性の有意な増大により確認することができる。注入後の時間は約０．５〜５分である。同様に、肝臓を音波保護物質に、音波保護物質を０．１〜３０ｍＭの濃度で腸間膜静脈に直接注入するか、またはミクロスフィアによるか、もしくはこのセクションの初めに記載された薬学的に受容可能な他の送達装置により封入されている適切な生物学的媒質におよそ１００ｍＭまでのより高い濃度で溶解された、ポリマーミクロスフィアに封入された形態のいずれかで、曝露する。ＨＩＦＵ装置は、単一エレメントユニットとして、およそ７５０ｋＨｚ〜５ＭＨｚの周波数で操作することができる。マルチエレメントユニットを、集束およびインサイチュ処置の超音波画像のために使用することもできる。例えば、７５０ｋＨｚ〜５ＭＨｚの内部エレメントとより低い周波数、例えば１００〜５００ｋＨｚの外部エレメントを使用することができる。この方法における１つまたは２つの周波数の重ね合わせは、より大きい範囲の超音波効果を作り出すことを可能にする。通常の超音波強度は１００〜５０００Ｗ／ｃｍ２の範囲である。超音波アプリケーターを、手動または自動のいずれかで出血領域上を走査することができる。超音波投与は、加熱を防ぐために１〜５秒間の連続的な短時間の発射であることができるか、またはアプリケーターがオンおよびオフのままでいる時間の長さを自動的に制御し、オン：オフ比がミリセカンドの時間目盛りである、自動パルスモードで連続的に適用することができる。当該レジームでは、オンおよびオフの時間は約１ｍｓ〜１０００ｍｓであることができ、オン：オフ比は１：１０００〜１：１の範囲である。
【０１７９】
Ａｌｂｕｎｅｘのような造影剤の添加は、外傷に続く血管または動脈損傷（破裂）のインビボ超音波診断検出において極めて重要である。しかし、血液中の造影剤の存在は、インビトロ血液試料に対してＨＩＦＵの適用中に、キャビテーション過程を通して溶血反応を増大することが示されている。以下に、止血のための音波保護物質の使用を記載する。
【０１８０】
Ａｌｂｕｎｅｘの全身濃度は、製造者の最大値である体重の０．３ｍｌ／ｋｇよりも低くすることができる。体重７０ｋｇおよび血液量５Ｌを想定すると、Ａｌｂｕｎｅｘの最大許容濃度は、投与の数分後で体内に均一に分布されていると想定して、血液１ｍｌ当たり４．２μｌの造影剤として推定することができる。音波保護物質をポリマーミクロスフィアのコアもしくは他の送達剤に組み込むことができるか、または造影剤との混合物として導入することができる。ＨＩＦＵを破裂血管または動脈に適用すると、造影剤がキャビテーションを促進するが、同時に、処置領域においてポリマーミクロスフィアを破裂し、音波保護物質の放出を促進する。従ってＨＩＦＵは、組織を加熱し、血管または動脈の破裂部位に凝固を作り出すことによって作用し、一方、音波保護物質は、キャビテーション誘導溶血反応および細胞崩壊それぞれから血液および周囲組織を保護する。使用される音波保護物質の濃度は、封入形態で約１〜１００ｍＭであり、外傷領域におけるミクロスフィアの超音波誘導破裂後に、薬学的に受容可能な濃度までかなり低下し、ここで溶質の音波保護特性は依然として存在する。
【０１８１】
（実施例７：子宮筋腫および他の子宮ガン、子宮類線維症の超音波媒介熱切除時の周囲の健常な組織の保護、ならびに子宮出血の制御）
使用される変換器は、Ｖａｉｚｙ，Ｓ．および共同研究者らにより開発された（Ｃｈａｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ８２（３），２００４）経膣的変換器と性質が類似している、１〜４ＭＨｚの周波数で稼働する画像誘導ＨＩＦＵ装置であり得る。アプリケーターは、変換器と膣壁の間に冷却を提供し、且つ直接の接触を防止する、バルーンを通して循環する脱気水溶液を有するバルーンにより覆われている。音波保護物質（０．１〜３０ｍＭ）をペーストの形態でバルーン壁の外面に適用する。このことは、バルーンと膣壁との間の直接の音響結合を確実にし、同時に膣壁の細胞を超音波媒介損傷から保護する。実時間画像化は、超音波適用装置と一体化した手持ち超音波システム（ＳｏｎｏＳｉｔｅ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ，ｗｗｗ．ｓｏｎｏｓｉｔｅ．ｃｏｍ）を使用して達成することができる。
【０１８２】
処置前に、患者を手術台の上で腹部を上向きにして落ち着かせる。バルーンカテーテルを尿道に挿入し、膀胱を最低２００ｍＬの生理食塩水で満たして、経腹的超音波画像を改善する。超音波映像プローブを使用して、子宮および骨盤構造の位置が確認されると、拡張器を使用して、膣の中に十分な大きさのチューブを挿入して、音波保護物質を有する十分な量のペーストで覆われている、空気が抜けたバルーンで覆われたＨＩＦＵアプリケーターの挿入を助ける。バルーンに、水溶液（５０〜２００ｍＬ）を充填し、アプリケーターを、焦点が処置される子宮の領域に合うように位置する。音波処理を、１〜１０秒間隔で音響出力２０〜１００Ｗにより、または空間平均時間平均１０００〜４０００Ｗ／ｃｍ２によって実施し、これは、組織に壊死を引き起こす上で十分であり、超音波画像にエコースポットを出現させる。コンピュータの指示および超音波画像を使用して、連続的なスポットを次々と配置して、大きな容量を処理することができる。音波保護物質を、処置の１〜３０分前に、記載されたような封入形態により、封入濃度１〜１００ｍＭでＩＶ注入を介して子宮に適用する。超音波が子宮内でポリマーミクロスフィアを破裂させると、音波保護物質が放出され、それによって全ての組織をキャビテーション誘導損傷から保護し、同時に、超音波の直接吸着によって処置領域の熱的切除を可能にする。
【０１８３】
Ｈｙｎｙｎｅｎおよび共同研究者らにより記載されているように、経膣的適用を必要としない、超音波適用のための代替的処置法を使用することもできる（Ｔｅｍｐａｎｙ，  Ｃ．Ｍ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，  ２６６（３），  ２００３，  ８９７−９０５）。この場合、超音波を臨床ＭＲ画像互換性集束超音波システムと共に適用する（ＥｘＡｂｌａｔｅ  ２０００；  Ｉｎ−Ｓｉｇｈｔｅｃ−ＴｘＳｏｎｉｃｓ，  Ｈａｉｆａ，  Ｉｓｒａｅｌ，  ｗｗｗ．ｉｎｓｉｇｈｔｅｃ．ｃｏｍ）。周波数１．０〜１．５ＭＨｚで稼働する集束圧電変換器アレイは、超音波音場を発生させる。アレイは、水タンクの中に置かれる。コンピュータが、焦点の位置および凝固組織量を制御する。薄プラスチック膜窓が水タンクを覆い、超音波が患者の骨盤を貫通することを可能にする。柔軟なゲルパッドが患者の形の輪郭に沿って、薄プラスチック膜を覆う。脱気水をゲルに注いで、患者と超音波変換器との間で良好な音響結合を確実にする。この場合も音波保護物質は、封入形態で子宮に送達される。
【０１８４】
（実施例８：乳ガン、肝臓ガン、および腎臓ガンの超音波媒介処置時の周囲の組織の保護）
Ｅｘａｂｌａｔｅ  ２０００（ＩｎＳｉｇｈｔｅｃ  Ｃｏ，ｗｗｗ．ｉｎｓｉｇｈｔｅｃ．ｃｏｍ）またはＵｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｏｄｅｌ−ＪＣ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｈｏｎｇｑｕｉｎ  ＨＡＩＦＵ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｃｈｉｎａ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈａｉｆｕ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ）のような超音波曝露システムを使用して、乳腺、腎臓および肝臓の腫瘍を処置することができる。これらの器具は、０．８〜１．８ＭＨｚの範囲で稼働し、これは、音波保護物質の最大音波保護特性の範囲である。
【０１８５】
ミクロスフィアは、Ｋｅｎｎｉｔｈ  Ｓｕｓｌｉｃｋおよび共同研究者らにより記載されているように（米国特許第５，４９８，４２１号、第５，６３５，２０７号、第５，６３９，４７３号、第５，６５０，１５６号および第５，６６５，３８２号）、任意の薬学的に受容可能な方法で形成される。ポリマーミクロスフィアは、使用される音波保護物質に応じて１〜１００ｍＭの濃度で音波保護物質を含む、薬学的に生存可能な溶液を含む。粒径は３〜４．５ミクロンであり、粒子濃度は５〜８×１０８粒子／ｍＬであり、任意の１人の患者への総用量は、１５ｍＬを超えない。静脈内注入は、連続的であり、用量は１秒当たり１ｍＬを超えない。投与のおよそ０．５〜５分後、処置を始めることができる。超音波ビームの焦点領域に入るミクロスフィアは、ミクロスフィアに対する超音波の物理的作用により破裂する。このことは、焦点におけるおよび焦点領域における音波保護物質の突然の放出をもたらす。ミクロスフィア内に封入されている最初の比較的高濃度の音波保護物質は、処置領域において急速に希釈されて非毒性レベルとなるが、音波保護物質は、依然としてその音波保護能を保持している。従って、処置される領域における音波保護物質の最終濃度は、直ぐに、使用される音波保護剤に応じて約０．１〜３０ｍＭになる。
【０１８６】
気泡が破裂し、音波保護剤を放出するようにガス用の空間が存在する必要があるため、微小気泡は、音波保護物質を有する溶液で完全に充填されることができないことに留意するべきである。別の方法は、一緒に使用される種々の量の音波保護溶液で充填されている微小気泡の混合物（空の気泡から完全に充填された気泡まで）を有することである。この方法では、音波保護物質溶液をそれほど有していない気泡は、激しく振動し、破裂して、部分的または完全に充填された微小気泡の近くで物理的な力を作り出し、それらも破裂させる。あるいは、電場または磁場、熱または光を、当該条件下で破裂しやすい粒子に適用することを含む、他の技術の適用によって、微小気泡を破裂させることができる。
【０１８７】
微小気泡が、超音波で処置される部位で十分な濃度に達することを確実にするために、特殊な標的方法を使用することができる。例えば、微小気泡が罹患組織の領域、例えば腫瘍細胞の領域にしか発現しない抗体を認識するように、微小気泡シェルまたはモノクローナル抗体および他のリガンドの固有の特性を微小気泡シェルと共役させることができる。微小気泡を特定の部位へ向かわせる別の方法として、微小気泡シェルに比較的大きな静電荷を持たせることができる。外部的に適用される電場を使用して、粒子を処置部位へ向かわせることができる、および／または処置領域に比較的高濃度の微小気泡を捕捉し、保持することができる。
【０１８８】
投与の前に、例えば抹消静脈に２０ゲージ血管カテーテルにより静脈内利用手段を作り出す。破損を防ぐように注意深く取り扱うポリマー微小気泡を、適切な滅菌液の中に懸濁する。室温であるべきである粒子懸濁液を、ＩＶラインまたは短い延長チューブを通して、０．５〜１ｍＬ／秒の安定した速度で投与する。処置領域の超音波走査を使用して、微小気泡の増加が観察され、それは超音波音場にいくらかのコントラストをもたらす。
【０１８９】
音波保護物質をＨＩＦＵ処置の１〜３０分前に使用して、キャビテーション誘導損傷から乳腺、腎臓および肝臓の健常な細胞を保護し、同時に、焦点での超音波の吸収によって腫瘍の熱的切除が生じることを可能にする。微小気泡は、腫瘍の領域における蓄積を可能にする、特定の機能性を有することができる。例えば、直径１０〜２００ｎｍの微小気泡は、最も可能性があることとして、腫瘍の微小血管の内皮統合性が損なわれるために、広範囲の腫瘍型で優先的に蓄積することができる。このことは、ナノサイズリポソームで観察され、これはこの方法で腫瘍に蓄積する（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９１；８８（２４）：１１４６０−４）。
【０１９０】
（実施例９：低周波数および高周波数音波泳動の間の組織の保護）
音波泳動は、例えばインスリン、マンニトール、ヘパリン、モルヒネ、カフェイン、リグノカイン、ＤＮＡ（皮膚の遺伝子処置用）のような、そうでなければ皮膚に浸透することができない巨大分子の送達に使用できる。音波泳動の間に、超音波は、空気の高い音響インピーダンスのために、結合媒質を介して変換器から皮膚に伝達する。結合媒質は、油、水油乳液、水性ゲルまたは軟膏であり得る。超音波アプリケーターは、高（３〜１０ＭＨｚ）、中（０．７〜３ＭＨｚ）または低（１６〜７００ｋＨｚ）の周波数のいずれかで稼働することができる。超音波強度は、輸送される分子の大きさに応じて、従って皮膚を通過させるために必要な孔の大きさに応じて、０．１〜５０Ｗ／ｃｍ２の範囲が可能である。
【０１９１】
５５ｋＨｚで稼働するＳｏｎｏＰｒｅｐ（登録商標）皮膚透過装置（Ｓｏｎｔｒａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，  ｗｗｗ．ｓｏｎｔｒａ．ｃｏｍ）を音波泳動に使用することができる。処置前に、被験体の皮膚に、使用される音波保護物質に応じて０．１〜１００ｍＭの濃度の音波保護物質を含む、ゲル、ペースト、軟膏、乳液、または同様の物質を適用する。薬剤送達（遺伝子トランスフェクション）は、ゲル、ペースト、軟膏、乳液等の中に薬剤（ベクター／裸ＤＮＡ）を組み込むことによって、インサイチュで実施することができる。あるいは、一度皮膚がソノポレーションされると、特定の薬剤の薬学的に受容可能なまたは必要とされる用量を含有するパッチを音波泳動領域に適用する。皮膚の孔は、角質層（皮膚の外層）を通った薬剤の拡散を可能にするほど十分に長く開いたままの状態になる。音波泳動は、局所麻酔薬、例えばＥＭＬＡ（登録商標）クリーム（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ．ｃｏｍ）が効くまでに必要な遅延時間を劇的に減少するため、音波保護物質を、濃度０．１〜１００ｍＭの前記クリームと混合して、皮膚の細胞をキャビテーション誘導損傷から保護することができる。
【０１９２】
更に、処置の１〜３０分前に、封入された音波保護剤を、患者に静脈内投与することができる。皮膚を超音波で処置すると、音波保護物質を有するポリマーミクロスフィアが皮膚の下層で破裂し、それによって皮膚の下層、血管および毛細血管をキャビテーション誘導損傷および細胞崩壊から保護する。
【０１９３】
あるいは、結合媒質は、０．１〜１００ｍＭの音波保護物質を含むことができる。高周波数音波（１〜５ＭＨｚ）は、皮膚の上層の音波泳動によりおよびその結果、吸着される。このことは、音波保護物質が皮膚の下層にゆっくりと拡散することを可能にする。これが生じると、徐々により低い周波数の超音波を使用して、皮膚の下層にキャビテーションを作り出し、皮膚の更に下層の領域への音波保護物質の浸透を可能にし、音波保護剤は、続いて適用されるより低い超音波周波数でのキャビテーション誘導細胞損傷および細胞崩壊に対して保護する。
【０１９４】
（実施例１０：脳腫瘍、血管血栓症、および血液脳関門の破損の超音波媒介処置における細胞の保護）
４０ｋＨｚから２ＭＨｚの下限および上限で、より適切には１００ｋＨｚから１ＭＨｚの範囲で、超音波周波数を経頭蓋適用に使用する。超音波の適用は、２ＭＨｚ以上の超音波診断ユニットを使用してインサイチュで監視して、焦点領域の遥か外側の波のより高いエネルギー沈積を引き起こし得る定在波の形成を避ける。定在波の形成は、パルス超音波レジームを使用することによって避けることができる。血栓における超音波の強度は、血栓崩壊を達成するために、０．１Ｗ／ｃｍ２〜３５Ｗ／ｃｍ２の時間平均の範囲にあり、とりわけ、０．１Ｗ／ｃｍ２〜１０Ｗ／ｃｍ２にある。１Ｗ／ｃｍ２未満のより低い範囲における強度を、血管血栓症の処置には超音波造影剤の存在下で、特に発作の処置には組織プラスミノーゲン活性化物質（ｔ−ＰＡ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）およびアルテプラーゼのような医薬血栓崩壊剤の存在下で、血餅を成功裏に血栓崩壊するために効果的に使用することができる。処置持続時間は約１５分から最大４時間までであるが、１５分間から１時間の処置時間が最も一般的である。
【０１９５】
超音波処置用の微小気泡またはナノサイズ気泡は、前述のように、０．１〜１００ｍＭの濃度で音波保護物質を封入して調製する。微小気泡を薬学的に受容可能な溶液に懸濁し、超音波曝露の１〜１５分前に体重１ｋｇ当たり０．０５ｍＬ〜０．９ｍＬの最大濃度でＩＶにより投与する。
【０１９６】
更に、血栓破壊の場合では、マイクロまたはナノ気泡は、血小板および／または血餅のフィブリン成分を認識する、表面上で共役したリガンドを有することができ、それによって、超音波により処置される領域により容易に蓄積する。例として、ＭＲＺ−４０８粒子（ＩｍａＲｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ）は、活性化血小板の表面上の血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターを標的にする。血栓部位またはＢＢＢ破損が起きている領域への超音波の適用が続いて行われる。超音波誘導血栓崩壊では、処置はｔ−ＰＡ等の血栓溶解剤の存在下で実施することもでき、超音波処置前に薬学的に受容可能な用量を投与することもできる。ポリマーミクロスフィアの破裂は、強度が十分高い場合、超音波によって引き起こすことができる。あるいは、ポリマー粒子からの音波保護物質の放出は、電気的または磁気的な刺激を含む他の形態のエネルギーによって達成することができる。一度音波保護物質が超音波処置の領域に放出されると、組織を通して拡散して、領域全体を、超音波媒介損傷および細胞の保護から保護し、同時に、細胞を損傷するかまたは細胞崩壊を作り出すかまたは出血を起こすことなく、血栓崩壊を増強するかまたは血液脳関門を一時的に透過する、超音波の物理的効果を可能にする。
【０１９７】
現在、体の他の領域における血栓の処置、例えば、心筋梗塞または深部静脈血栓症の処置では、カテーテル媒介処置が使用されている。超音波処置は潜在的にこの種の侵襲的処置法に代わることができるが、超音波はカテーテル処置と共に使用することもできる。最初に、抗血栓溶解剤のヘパリン、その後ワルファリンによって、ＩＶ注入後の血栓を安定化することができる。次にカテーテルを使用して、血栓を除去する。カテーテルは、更に、音波保護物質を血栓の領域に０．１ｍＭ〜３０ｍＭの濃度で送達することができる。この段階で、超音波を血栓の領域に適用して、処置の間に物理的効果によって血流を増強し、同時に、周囲の組織をキャビテーション誘導損傷から保護する。ごく最近では、小型化された超音波変換器を有するカテーテルが、動脈内への超音波および血栓溶解剤の送達のために開発されている。変換器は、１００ｋＨｚ〜３００ｋＨｚの範囲で稼働し、超音波曝露の前に、血栓領域への音波保護物質の送達に使用することもできる。
【０１９８】
（実施例１１：遺伝子処置、ならびにインビトロおよびインビボでの細胞への薬剤送達（ソノポレーション）時の細胞および周期組織の保護）
超音波曝露は、細胞培地に懸濁されている細胞と直接接触させるか、あるいは結合媒質（これは、静止しているかまたは回転する管、板、円錐形フラスコ、細胞培養フラスコ、皿、もしくは他の容器中に懸濁しているかまたは付着している細胞に波を伝える）で満たされている浴と接触させるかのいずれかで、平板型変換器により実施される。例えば結合媒質は、前音波処理された水溶液であり得る。前音波処理は、溶液を脱気すること、および結合媒質を取り囲む外側水ジャケットにより制御できる、一定の平衡温度に達することを可能にする。結合媒質の脱気は、結果の再現性および結合媒質におけるキャビテーション気泡形成の低減にとって重要であり、これは結合媒質を通る波の経路に影響を与えることができる。温度制御は、再現性キャビテーション条件を確実にするために重要である。脱気処置に必要な時間の長さは、他の変数の内、使用される結合液体の容量、超音波曝露条件および曝露温度により異なる。目安として、３５４〜１０５７ｋＨｚの周波数範囲の曝露条件では、キャビテーションの開始から最大可能キャビテーション効果までの広範囲の強度において、１０℃〜３０℃の温度範囲およびＭｉｌｌｉ−Ｑ濾水を含む結合液で、およそ１０〜１５分間の曝露時間が、結合媒質における定常状態に達する上で十分である。曝露温度は、氷点超から４０℃の範囲のいずれかであることができるが、大部分の細胞株にとって、２０℃〜３７℃の範囲で十分である。低温、例えば２０℃での音波処理の一つの目的は、細胞培養培地からの水の低蒸発率により、音波崩壊時に培地の容量を有意に変化させないことを確実にすることである。第２には、低温は、全ての場合ではないが、一般的に、音化学および音ルミネセンスを含む音響キャビテーション効果を促進する傾向がある。このことは、極めて特定の超音波強度範囲、即ち低強度の方に向かっている範囲において、特定の超音波曝露条件下、特に１ＭＨｚを超える場合には当てはまらないことがある。従って、代替的な曝露システムは、より多い容量の浴に浸けた変換器またはより多い容量（即ち、１〜８ガロンタンクの水）の浴に向かって超音波を照射する変換器から構成される。また、細胞を有する容器を浴に浸けることができ、超音波を、細胞を有する容器を通して、システム中に波の反射および定在波の形成を防止するために吸収材を有する浴の一端まで通過させることができる。この方法にて、照射される試料に超音波の焦点が合う。更に、この場合の容器は、超音波の吸収または反射がほとんどなく超音波がチャンバを通過することを可能にする、極めて薄いＭｙｌａｒ（登録商標）窓により各末端部を閉鎖している、テフロン（登録商標）、金属または適切なプラスチック円筒状ハウジングの形態で構成することができる。かかる多量の浴水では、一般的な脱気システムを使用して処置前に水を脱気する。
【０１９９】
使用される音波崩壊の周波数は、２０ｋＨｚ〜２ＭＨｚの範囲である。超音波強度は、０．０１Ｗ／ｃｍ２〜１００Ｗ／ｃｍ２の範囲であり、超音波造影剤の存在下または非存在下のいずれかでキャビテーション閾値を超える強度で作用することが好ましい。曝露時間は約５秒から５分であり、連続的またはパルスモードのいずれかである。超音波造影剤は、キャビテーションの閾値を有意に低下させ、即ち、これらはキャビテーション促進剤である。任意の所定のシステムにおいて、造影剤をシステムに添加することまたはしないことが有益であるかどうかを決定する必要がある。一般的には、比較的小さい比率のソノポレーション細胞が、比較的大きな比率の細胞崩壊でもたらされる。しかし、細胞崩壊を回避するために、音波保護物質を、音波崩壊の直前に、容器の中の細胞に加える。使用される音波保護物質の濃度は、細胞崩壊から細胞を保護する程度を達成し、同時に、超音波または超音波と微小気泡が細胞をソノポレーションする物理的効果を可能にするために、０．２５ｍＭ〜３０ｍＭの範囲である。ソノポレーションの後、細胞を所定の細胞株に適切なインキュベーション条件下で５〜６０分間インキュベートし、一般的な条件は、５％ＣＯ２雰囲気および温度３７℃を含む。これらを新たな培地ですすいで、ソノポレーションされたが、未だに細胞培地に残っている音波保護物質および薬剤、裸ＤＮＡ、ＤＮＡベクターまたはその他の材料を除去する。
【０２００】
体内の奥深くに位置する細胞のソノポレーションでは、ＥｘＡｂｌａｔｅ  ２０００（Ｉｎ−Ｓｉｇｈｔｅｃ−ＴｘＳｏｎｉｃｓ，Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ，ｗｗｗ．ｉｎｓｉｇｈｔｅｃ．ｃｏｍ）またはＵｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｏｄｅｌ−ＪＣ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｈｏｎｇｑｕｉｎ  ＨＡＩＦＵ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｈｉｎａ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈａｉｆｕ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ）のようなシステムを使用して、超音波エネルギーの焦点を処置部位に合わせることができる。例えば皮膚または筋肉組織のより表面的な処置において、非集束変換器を、適切な結合基質と組み合わせて適用することができる。超音波条件は、周波数が２０ｋＨｚ〜２ＭＨｚの範囲、超音波強度が約０．１Ｗ／ｃｍ２〜５０Ｗ／ｃｍ２の範囲が可能である。濃度０．１〜１００ｍＭでミクロスフィアに封入された音波保護物質のより深い組織への送達は、ソノポレーションプロセスを助けるエコー造影剤を伴うＩＶ注入によって達成することができる。音波保護ミクロスフィアとエコー造影剤の混合物は、例えばＯｐｔｉｓｏｎまたはＡｂｕｎｅｘ造影剤気泡を含有する微小気泡溶液を、最大濃度０．３ｍｌ／ｋｇ体重で投与することができる。処置は、十分に高濃度の微小気泡が処置部位に達した時に始まることができ、これは、処置領域の連続的な超音波走査により確認される。超音波は音波保護微小気泡を、直接的に（部分的に充填された気泡）、または超音波の間接的な作用および音波保護物質溶液充填微小気泡に近接するガス充填微小気泡／エコー造影剤の崩壊によって破裂する。
【０２０１】
先に考察したような、微小気泡破裂の代替的な形態を使用することもできる。関心のあるプラスミドまたは裸ＤＮＡまたは薬剤を、遺伝物質または薬剤を封入するミクロスフィアまたはリポソームと共に送達して、処置部位で放出することもできる。表面的な組織、例えば皮膚および筋肉組織の処置では、トランスフェクション物質、薬剤および音波保護物質を、組織への直接注入により直接的に投与することもできる。
【０２０２】
（実施例１２：水晶体超音波吸引術または音波泳動の超音波処置時の内皮細胞の保護）
角膜は、少量（５〜１０％）の薬剤しか眼の前房へ通過させない生体障壁である。周波数約４００〜９００ｋＨｚの中程度の範囲の超音波によって、２〜３倍の増強を達成することができ、一過性の内皮細胞損傷がキャビテーション効果によって引き起こされる（Ｚｄｅｒｉｃ，Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ．，２００４，２３，１３４９−１３５９）。しかし、音波保護物質の使用は、内皮細胞を損傷から保護することができ、また、より高い強度の超音波を使用することを可能にし、それによって、ソノポレーション効果を有意に増強し、同時により高い超音波強度でキャビテーション誘導損傷から内皮細胞を保護する。
【０２０３】
超音波装置、例えばＵＺＴ−１．０３  Ｏ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐａｒｔｕｓ，  Ｍｏｓｃｏｗ，  Ｒｕｓｓｉａ）は、直径０．５〜３ｃｍの平坦変換器から構成され、これは、最終的に角膜の直径に基づいて決定される。局部麻酔の投与後、アイキャップを患者の目の上の位置に置く。アイキャップの一端は、まぶたの下に置いて眼の表面とキャップの間を一時的に密閉できる適切な材料で作製される。キャップに、眼に送達される０．１〜１００ｍＭの濃度範囲の音波保護物質および薬剤を有する薬学的に受容可能な水溶液を添加する。この溶液は、診療所で一般的に使用される緩衝塩類点眼剤が可能である。変換器を角膜の上方の短い距離（０．１〜１ｃｍ）に位置させ、患者の角膜の直径と同様の直径であるように変換器を選択したため、角膜全体に超音波を供給する。超音波条件は、周波数範囲が２０ｋＨｚ〜２ＭＨｚであり、最適な周波数は、１００ｋＨｚ〜８００ｋＨｚの範囲である。超音波強度は、使用される周波数に応じて０．１〜５Ｗ／ｃｍ２の範囲である（キャビテーション閾値は超音波周波数が増加すると増加するため、強度が高いと高い周波数が予測される）。処置レジームは、０．５〜１０分間の合計時間で、パルス超音波発射または連続超音波適用のいずれかから構成することができる。例えばより短い処置時間は、低周波数ではあるが高超音波強度の処置と組み合わせて使用する。超音波処置の後、アイキャップを患者の眼の上に１〜５分間置いたままにする。この時間の間、音波保護物質および薬剤を有する結合溶液をデカントし、同時に、薬剤のみを有する新たな溶液をアイキャップに加えて、音波保護された内皮細胞の間の細胞外空間に作り出された任意の孔を通って薬剤が拡散させる。
【０２０４】
更に、音波保護物質を使用して、水晶体超音波吸引術時の高エネルギー超音波の使用で生じ得る角膜損傷を防止することができる。一般的な麻酔薬の適用後、眼を局所用ポビドンヨードで洗浄する。まぶた検鏡の挿入後、角膜切開を上部側頭角膜四角法（ｓｕｐｅｒｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｑｕａｄｒａｎｇｅ）で実施する。出力５０〜８０％、灌注１５〜２５ｍｌ／分に設定された、水晶体超音波乳化吸引プローブ（例えば、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｔｅｎ  Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｐｈａｃｏｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ａｌｃｏｎ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ，ＵＳＡ）を、角膜、レンズ、または他の眼構造に接触することなく、前眼房の中に挿入する。プローブを前眼房の中央で作動させる。水晶体超音波吸引の時間は、１〜１０分間が可能である。水晶体超音波吸引器は、プローブを１：１パルスモードで稼働して加熱を避けることを可能にする、可変電圧制御により制御されるべきである。処置前に音波保護物質を灌注溶液に濃度０．１〜１００ｍＭで加え、それによって細胞を超音波誘導細胞崩壊から保護する。
【０２０５】
（実施例１３：超音波バイオリアクター中の植物、動物、または微生物の細胞の保護）
バイオリアクター中の微生物、植物、および動物の細胞（「生体」）の増強された代謝産生を、より効率的なバイオテクノロジープロセスにおいてもたらすことができる。バイオリアクターに使用できる生物体の例は、Ａｎａｂａｅｎａ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ、シアノバクテリア、Ｓｅｌｅｎａｓｔｒｕｍ  ｃａｐｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ細胞、ハイブリドーマ培養物、Ｐｅｔｕｎｉａハイブリドーマ植物細胞、チョウセンニンジン懸濁細胞、Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ細胞、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｉｓｐｏｒａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ  ＮＲＲＬ  １５２６のような糸状菌細胞、およびＣＨＯ細胞である。制御された音波処理、即ち比較的低出力の音波処理を、生体に対して最小限の損傷でバイオリアクタープロセスを増強する試みに使用する。超音波は、細胞内およびその外側で拡散を増強し、それによって反応および代謝収量の比率を増強する。あるいは、特定のバイオリアクターでは、生体を添加する前に、システムを前音波処理して、例えばスラッジをより小さい粒子に破壊するかまたは大型分子をより容易に生物分解され得る低分子に分解することができる。この例は、廃水蒸留所での生物分解で示されている（Ｐｒｅｅｔｉ  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｓｏｎｏｃｈｅｍ．，  １１（２００４）  １９７−２０３）。当該プロセスは、バイオリアクター中の生体の存在下で超音波をより高い強度で使用する場合に、有意に増強され、時間およびエネルギー効率が良くなる。問題はより高い超音波強度の使用であり、同時に、超音波曝露時間は、生体の保持に有害な効果を有し、それは、例えばより長い曝露時間のより高い超音波強度は、許容できないレベルの細胞破損および細胞崩壊をもたらすからである。従って、記載されているのは、バイオリアクタープロセスを増強し、同時に生体を超音波媒介から生体を保護するために、低または高出力音波処理を使用する一般的な方法である。
【０２０６】
バイオリアクターの設計は、目的のバイオテクノロジープロセスおよびプロセスの規模に左右される。リアクターシステムは、固定システムまたは連続流液システムであることができる（Ｙｕｓｕｆ  Ｃ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２１（２），  ２００３）（音波バイオリアクター設計の教示について、その全体が参考として本明細書に開示される）。音波崩壊は、周波数範囲２０ｋＨｚ〜１ＭＨｚ、最適な周波数範囲１００ｋＨｚ〜５００ｋＨｚで実施することができる。後者の周波数範囲は、５００ｋＨｚ超の周波数と比較して、キャビテーション生成能力との間で良好なバランスがあり、例えば、より良好な質量移動をもたらす。更に、１００ｋＨｚ〜５００ｋＨｚの範囲も、１００ｋＨｚ未満の周波数と比較して、音波保護物質がより良好な保護能力を有すると予想される範囲である。固定バイオリアクターシステムにおいて、音波保護物質を、音波崩壊の前に、使用される音波保護物質に応じて最終濃度０．１ｍＭ〜１００ｍＭでバイオリアクターに直接加えることができる。濃度は、更に１０倍高くすることができ、即ち、特定のシステムに応じて１ｍＭ〜１Ｍにすることができる。例えば、非晶質表面をもつ大量の小型粒子物質を有するバイオリアクターは、添加された音波保護物質の多くを溶液から吸着することができる。あるいは、特定の生物体は、音波保護物質を消化することができる。これに対抗するために、より高濃度の音波保護物質を添加して、音波保護剤として作用するために、バルク溶液およびキャビテーション気泡の界面で音波保護物質の十分な利用能を確実にすることが必要となる。
【０２０７】
バイオリアクターへの音波保護物質の添加を達成する最良の方法は、音波保護物質を高濃度の貯蔵液の形態で添加することである。例えば、貯蔵液は、１〜１００ｍＭの範囲の濃度の音波保護物質の水溶液が可能である。従って、バイオリアクターへ添加する音波保護貯蔵液容量は、バイオリアクタープロセスの容量の１０分の１に等しく、バイオリアクター中の音波保護物質の最終濃度は０．１〜１０００ｍＭとなる。この場合も、高濃度の貯蔵液を、例えば多量の非晶質粒子を有する音波バイオリアクターに使用することができる。バイオリアクターの大きさに応じて、反応系を循環させて、システム全体を通して音波保護物質の均質な分布を確実にする。流液バイオリアクターにおいて、音波保護物質の貯蔵液を、即座の音波保護物質の定常状態濃度が０．１〜１００ｍＭの濃度範囲、またはそれ以上を維持するように決定された速度で、バイオリアクターに連続的に添加する。
【０２０８】
このようにして、この方法は、超音波バイオリアクターにとって２つの新たな可能性を開く。第１には、反応系を前処理し、次に生物分解のために生体を添加するのではなく、ここでは、超音波をインサイチュで適用し、同時に、生体を超音波キャビテーション誘導細胞崩壊から保護する。第２には、生体が既に存在するシステムにおいて、音波保護物質は生体を損傷から保護し、それによって、生体の実質的な細胞崩壊または破壊を生じることなく、生物学的プロセスを増強し、また、より高い強度の超音波を使用してプロセスを更に増強することを可能にする。超音波曝露の時間、超音波強度、超音波変換器の数およびその幾何学的配置は、関心のあるバイオ反応、および使用される生体の種類により異なる。多様な生体に対するバイオリアクターの異なる超音波条件の効果は、当該技術分野で公知である（Ｙｕｓｕｆ  Ｃ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２１（２），  ２００３）（バイオリアクター中の生体に対する超音波の効果の教示について、参考として本明細書に援用される）。
【０２０９】
（実施例１４：細胞の大きさ）
グルコピラノシドは、より大きいサイズのＨＬ−５２５細胞を超音波誘導細胞崩壊から保護することもできる（図２３〜２６）。ＨＬ−６０細胞の保護の場合のように（図１２ａ〜１２ｄ）、ＨＬ−５２５細胞の保護効果も超音波周波数に依存している。しかし、ＨＬ−５２５細胞の保護とそれらのより小さいＨＬ−６０対応物と間に明確な差がある。例えば、１ＭＨｚの音波崩壊周波数では（図２を図２６と比較すること）、ＯＧＰおよびＭＧＰは２つの細胞に対して異なる保護効果を有してことが明確である。同様に６１４ｋＨｚでは、ＯＧＰの保護効果は、ＨＬ−６０細胞と比較してＨＬ−５２５細胞ではあまり顕著ではなかった（図９を図２５と比較すること）。これらは、異なる細胞株に対するこれらの分子の保護効果に選択性があることを示している。
【０２１０】
（実施例１５：機械的破壊）
図２７に示されているように、ＨＬ−５２５細胞は、一般的に影響を受けないＨＬ−６０対応物と比較して（図６）、グルコピラノシドの存在で引き起こされる機械的破壊経路の増加に僅かに感受性がある。例えば、ＯＧＰ（３ｍＭ）はＨＬ−５２５細胞の機械的破壊を増強する有意な効果を有したが（図２７）、ＨＬ−６０細胞の機械的破壊に対して効果がなかった（図６）。このことは、少なくとも部分的に、なぜＯＧＰが、ＨＬ−６０細胞と比較して、１ＭＨｚおよび６１４ｋＨｚでＨＬ−５２５細胞に対してより小さい保護効果を示すかを説明する可能性がある。
【０２１１】
（実施例１６：血液中の罹患細胞の選択的破壊）
グルコピラノシドおよびグルコピラノシドの混合物と組み合わせた超音波の使用を、特定の血液疾患の処置として使用することができる。例えば、慢性骨髄性白血病患者での過剰白血球数は、血液の他の細胞成分を損傷することなく、過剰白血球の選択的な超音波細胞崩壊により制御することができる。このことは、そうでなければ慢性長期骨髄性白血病の患者で白血球数を制御するのに必要になる、ブスルファンのような毒性の高い薬剤の使用を回避する。患者は、腎不全の患者の血液から不純物を取り除くために使用される局所血液透析処置と、ほぼ同様の手法を受けることができる。
【０２１２】
患者は、動静脈（ＡＶ）瘻またはＡＶグラフトのいずれかによって、動脈と静脈を腕の皮膚の下で外科的に結合するか、またはそれぞれ外科的にドナーの静脈にグラフトして、内部利用手法を受けることができる。この手法は、血管系が、一般的な透析処置に必要な１分間当たり２５０ミリリットルの血流を支持することを可能にする。一般的な４時間の処置時間の間、６０リットルの血液が透析システムを通って再循環し、これは平均的な人でおよそ１０サイクルに相当する。手術の数週間後、患者を最初の血液透析／超音波処置のために準備することができる。局所麻酔を患者の皮膚の接触点に適用する。直接透析器へ行く軟性チューブに接続している２本の針を、動脈と静脈に挿入する。動脈からの出口は、一般的な透析器に入る前に、血液処置のための超音波ユニットにつながれる。血液が血液透析器に入る前に、グルコピラノシドを必要な用量でシステムに注入する。グルコピラノシドの定常状態濃度は、０．１〜５ｍＭの範囲であることができ、罹患細胞に対する超音波の有害な効果を最大限にし、同時に細胞崩壊から健常な細胞を保護するために、グルコピラノシドの多様な混合物を使用することができる。注入の直後、血液を、周波数２０ｋＨｚ〜５ＭＨｚおよび強度１〜８０Ｗで稼働する超音波変換器のアレイから構成される超音波ユニットの中を流通させて、処置する。次に血液を一般的な透析ユニットの中に送る。最初にポンプを通過し、抗凝固血薬を血液に加えて凝固を防ぐ。血液は透析器を通過し、そこで、透析器の半透膜と接触した後でグルコピラノシドを含む不純物が除去される。透析器の直ぐ後ろのエアトラップおよびライン全体を通した検出器が、安全性を維持するために血液内の圧力を監視する。次に皮膚における二番目の入口は、処置された血液を静脈に導入することを可能にする。それぞれの透析処置は、およそ１〜４時間かかり、患者の白血球数が１立方ミリメート当たり５０，０００細胞に上昇した時に実施することができる。処置は、患者の白血球数が１立方ミリメート当たりちょうど１０，０００未満に低下した時に止めることができる。
【０２１３】
本明細書の全体にわたって、多様な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示は、その全体が、本発明が関わる技術の状態をより完全に記載するため、参考として本明細書に援用される。
【０２１４】
多様な変更および変形を、本発明の範囲および精神から逸脱することなく本発明において実施できることが、当業者には明らかである。本発明の他の実施態様が、本明細書および本明細書で開示された発明の実施を考慮すると、当業者に明らかである。本明細書および実施例は例示としてのみ考慮され、本発明の真の範囲および精神は、特許請求の範囲により示されていることが意図される。
【０２１５】
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【０２１８】
【数４】
2008516635.tif 000008
【０２１９】
【数５】
2008516635.tif 000009
【０２２０】
【数６】
2008516635.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、幾つかの実施態様を説明し、記載と共に開示された組成物および方法を説明する。
【図１】（ａ）健常な未処置ＨＬ−６０細胞をＣｏｕｌｔｅｒ計数器で測定した、ＨＬ−６０細胞の粒子サイズの分布である。ＨＬ−６０細胞の１．０５７ＭＨｚで１５秒間および出力＝３０Ｗの音波崩壊の効果を、（ｂ）添加剤なし、および（ｃ）ＨＧＰ  ５ｍＭの存在下で示す。＊示されるグラフは、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器のモニター読み取りから取った写真の編集版である。元の写真を僅かに回転し、トリミングし、色調を調整して、図１を生成した。従って、ａ、ｂおよびｃのｘ軸の値または粒子分布の相対的高さは正確ではないが、オリジナルと非常に近い近似値である。
【図２】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、グルコピラノシド濃度（０〜１０ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対する多様なグルコピラノシドの効果である。○ＭＧＰ；■ＨＧＰ；△ＨｅｐＧＰ；◆ＯＧＰ。挿入部分は、グルコピラノシド濃度０〜３０ｍＭでのこの効果を示す。条件：超音波１．０５７ＭＨｚ、空気暴露２９８Ｋ、出力＝１０Ｗ、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝５〜８）。
【図３】ＨＧＰ（５ｍＭ）の存在下で多様な出力および超音波暴露時間で超音波（１．０５７ＭＨｚ）に暴露されたＨＬ−６０細胞（懸濁液１ｍｌ）のＣｏｕｌｔｅｒ計数器分析である。細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝５〜８）。
【図４】１．０５７ｋＨｚ、時間＝５秒間、ｐ＝１０Ｗおよび多様なグルコピラノシドでの音波崩壊後の再生アッセイである。細胞を２４時間再生させた。再生比±ＳＤ（ｎ＝６〜８）は、２４時間の再生後にカウントした細胞数を、インキュベーションの開始時にカウントした細胞数で除算して算出する。
【図５】コントロール（□、即ち音波崩壊なし）および比較的厳しい音波崩壊条件：周波数＝１．０５７ＭＨｚ；時間＝１５秒間；ＨＬ−６０細胞１ｍｌ；ＨＧＰ  ５ｍＭおよび出力＝（ａ）●４０Ｗ；（ｂ）×６０ＷのＨＬ−６０細胞再生アッセイである。示されている対数スケールでは、エラーバーは、データ点の大きさの範囲内である。コントロールデータ点は１０％未満の標準偏差で三連で行った。音波崩壊ポイントは、１０％未満の標準偏差で、６個の個別の細胞懸濁液の平均を表す。
【図６Ａ】出力５０％に設定したＢｕｒｒｅｌ手関節作動振盪器を使用して決定した細胞の機械的脆弱性である。１２５ｍｌ円錐形フラスコ中のホウケイ酸ガラスビーズ１０ｍｌ。１０％ＤＰＢＳ溶液を含有する細胞培地中の多様なグルコピラノシド（ＨＧＰ、ＨｅｐＧＰ、ＭＧＰ、およびＯＧＰ）の存在下または非存在下（コントロール）での細胞懸濁液１０ｍｌ。振盪を、３０秒間にわたって行った。それぞれのデータ点は±ＳＤを表し、ｎ＝５である。
【図６Ｂ】出力５０％に設定したＢｕｒｒｅｌ手関節作動振盪器を使用して決定した細胞の機械的脆弱性である。１２５ｍｌ円錐形フラスコ中のホウケイ酸ガラスビーズ１０ｍｌ。１０％ＤＰＢＳ溶液を含有する細胞培地中の多様なグルコピラノシド（ＨＧＰ、ＨｅｐＧＰ、ＭＧＰ、およびＯＧＰ）の存在下または非存在下（コントロール）での細胞懸濁液１０ｍｌ。振盪を、３０秒間にわたって行った。それぞれのデータ点は±ＳＤを表し、ｎ＝５である。
【図７】ＤＢＮＢＳ（３ｍｇ／ｍｌ）；（ａ）グルコピラノシドなし、および（ｂ）ＨＧＰ  ５ｍＭの存在下における細胞懸濁液の音波崩壊の後で観察されるＥＳＲスペクトルである。第三級炭素中心ラジカルを１と標示し、第二級炭素中心ラジカルを２と標示する。第一級炭素中心ラジカルを３と標示する。音波崩壊の条件：周波数＝１．０５７ＭＨｚ；時間＝１５秒間；出力＝６０Ｗ；アルゴン飽和溶液；温度＝２５℃。
【図８】周波数１ＭＨｚの音波崩壊時の、（ａ）ＲＰＭＩ  １６４０培地中、および（ｂ）２〜５ｍＭ濃度のＨＧＰ、ＨｅｐＧＰまたはＯＧＰのグルコピラノシド界面活性剤の存在下、の細胞懸濁液の音波崩壊の間に不活性キャビテーション気泡の周りで生じる事象の説明である。
【図９】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、グルコピラノシド濃度（０〜１０ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対する多様なグルコピラノシドの効果である。○ＭＧＰ；■ＨＧＰ；△ＨｅｐＧＰ；◆ＯＧＰ。条件：超音波６１４ｋＨｚ、空気曝露２９８Ｋ、出力＝２０Ｗ、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝５〜８）。ＭＧＰデータは、他の実験の超音波出力の半分（即ち１０Ｗ）で集めた。
【図１０】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、グルコピラノシド濃度（０〜１０ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対する多様なグルコピラノシドの効果である。○ＭＧＰ；■ＨＧＰ；◆ＯＧＰ。条件：超音波３５４ｋＨｚ、空気曝露２９８Ｋ、出力＝１５Ｗ、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝５〜８）。
【図１１】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、グルコピラノシド濃度（０〜１０ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対する多様なグルコピラノシドの効果である。○ＭＧＰ；■ＨＧＰ；◆ＯＧＰ。条件：超音波４２ｋＨｚ、空気曝露２９８Ｋ、出力＝元の５０％減、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝５〜８）。
【図１２Ａ】グルコピラノシドの音波保護特性に対する超音波周波数の効果である。図１２ａ〜１２ｄのデータは、グルコピラノシド濃度０で正規化して、任意の特定のグルコピラノシド：（ａ）ＯＧＰ；（ｂ）ＨｅｐＧＰ；（ｃ）ＨＧＥおよび（ｄ）ＭＧＰの音波保護能力に対する超音波周波数の効果を比較した。
【図１２Ｂ】グルコピラノシドの音波保護特性に対する超音波周波数の効果である。図１２ａ〜１２ｄのデータは、グルコピラノシド濃度０で正規化して、任意の特定のグルコピラノシド：（ａ）ＯＧＰ；（ｂ）ＨｅｐＧＰ；（ｃ）ＨＧＥおよび（ｄ）ＭＧＰの音波保護能力に対する超音波周波数の効果を比較した。
【図１２Ｃ】グルコピラノシドの音波保護特性に対する超音波周波数の効果である。図１２ａ〜１２ｄのデータは、グルコピラノシド濃度０で正規化して、任意の特定のグルコピラノシド：（ａ）ＯＧＰ；（ｂ）ＨｅｐＧＰ；（ｃ）ＨＧＥおよび（ｄ）ＭＧＰの音波保護能力に対する超音波周波数の効果を比較した。
【図１２Ｄ】グルコピラノシドの音波保護特性に対する超音波周波数の効果である。図１２ａ〜１２ｄのデータは、グルコピラノシド濃度０で正規化して、任意の特定のグルコピラノシド：（ａ）ＯＧＰ；（ｂ）ＨｅｐＧＰ；（ｃ）ＨＧＥおよび（ｄ）ＭＧＰの音波保護能力に対する超音波周波数の効果を比較した。
【図１３】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＨＭＰ）濃度（０〜３ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対するＨＭＰの効果である。条件：超音波１．０５７ＭＨｚ、空気曝露２９８Ｋ、出力＝１０Ｗ、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝４〜６）。
【図１４】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＯＭＰ）濃度（０〜３ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対するＯＭＰの効果である。条件：超音波１．０５７ＭＨｚ、空気曝露２９８Ｋ、出力＝１０Ｗ、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図１５】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（ＯＴＧＰ）濃度（０〜３ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対するＯＴＧＰの効果である。条件：超音波１．０５７ＭＨｚ、空気曝露２９８Ｋ、出力＝１０Ｗ、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図１６】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、２−プロピル−１−ペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＰＰＭＰ）濃度（０〜３ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対するＰＰＭＰの効果である。条件：超音波１．０５７ＭＨｚ、空気曝露２９８Ｋ、出力＝１０Ｗ、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図１７】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧａｌＰ）濃度（０〜２５ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対するＩＰＴＧａｌＰの効果である。条件：超音波１．０５７ＭＨｚ、空気曝露２９８Ｋ、出力＝１０Ｗ、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図１８】ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＨＧＰ）の存在下または非存在下における超音波による処置の後で再生し続ける、生存細胞集団の能力の指標である、「再生率」である。再生率は、処置の１または２日後に存在する細胞数を、処置の日に存在する細胞数で除算したものである。
【図１９】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（αＯＧＰ）濃度（０〜３ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対するαＯＧＰの効果である。条件：超音波１．０５７ＭＨｚ、空気曝露２９８Ｋ、出力＝１０Ｗ、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図２０】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＡＮＡＭＥＧ−７）濃度（０〜５ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対するＡＮＡＭＥＧ−７の効果である。条件：超音波１．０５７ＭＨｚ、空気曝露２９８Ｋ、出力＝１０Ｗ、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図２１】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、３−シクロヘキシル−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシド（Ｃｙｇｌｕ−３）濃度（０〜５ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対するＣＹＧＬＵ−３の効果である。条件：超音波１．０５７ＭＨｚ、空気曝露２９８Ｋ、出力＝１０Ｗ、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図２２】Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器分析の後、６−Ｏ−メチル−ｎ−ヘプチルカルボキシル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＭＨＣ−α−ＧＰ）濃度（０〜５ｍＭ）の関数として観察した、細胞崩壊率に対するＭＨＣ−α−ＧＰの効果である。条件：超音波１．０５７ＭＨｚ、空気曝露２９８Ｋ、出力＝１０Ｗ、音波崩壊時間＝５秒間、細胞崩壊率±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図２３】ＨＬ−５２５細胞の音波崩壊に対するグルコピラノシド（ＭＧＰ、ＨＧＰ、ＯＧＰ）の効果である。条件：４２ｋＨｚ、出力５０％、５秒間、２０℃、音波崩壊率±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図２４】ＨＬ−５２５細胞の音波崩壊に対するグルコピラノシド（ＭＧＰ、ＨＧＰ、ＨｅｐＧＰ、ＯＧＰ）の効果である。条件：３５４ｋＨｚ、１５Ｗ、５秒間、２０℃、音波崩壊率±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図２５】ＨＬ−５２５細胞の音波崩壊に対するグルコピラノシド（ＭＧＰ、ＨＧＰ、ＨｅｐＧＰ、ＯＧＰ）の効果である。条件：６１４ｋＨｚ、２０Ｗ、５秒間、２０℃、音波崩壊率±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図２６】ＨＬ−５２５細胞の音波崩壊に対するグルコピラノシド（ＭＧＰ、ＨＧＰ、ＨｅｐＧＰ、ＯＧＰ）の効果である。条件：１０５７ｋＨｚ、１０Ｗ、５秒間、２０℃、音波崩壊率±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図２７】ＨＬ−５２５細胞の機械的脆弱性に対する異なる濃度のグルコピラノシド（ＭＧＰ、ＨＧＰ、ＨｅｐＧＰ、ＯＧＰ）の効果である。条件：出力５０％、振盪３０分間、ホウケイ酸ガラスビーズ１０ｍＬ、細胞懸濁液１０ｍＬ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
2008516635.tif 000025
【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
2008516635.tif 000029
【図１４】
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【図１５】
2008516635.tif 000031
【図１６】
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【図１７】
2008516635.tif 000033
【図１８】
2008516635.tif 000034
【図１９】
2008516635.tif 000035
【図２０】
2008516635.tif 000036
【図２１】
2008516635.tif 000037
【図２２】
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【図２３】
2008516635.tif 000039
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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2008516635.tif 000046
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