(57)【要約】  動物における炎症性応答の抑制に役立つ新規製剤が提供される。該製剤は、、第1成分として有効量のクルクミノイド種を、そしてアルファ酸種又はベータ酸種又はその誘導体からなる群から選択される第2成分を有効量含む。該組成物は、物理的又は化学的創傷あるいは生物学的剤又は未知の病因に起因する異常免疫刺激に応答して相乗的抗炎症作用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病の処置方法であって、糖尿病を有する個体に、クルクミノイドから選択される第1成分並びにアルファ酸及びベータ酸から選択される第2成分を含む組成物を投与することを含む、前記の方法。
【請求項２】
前記クルクミノイドが、クルクミン、デメトキシクルクミン及びビスデメトキシクルクミンから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記アルファ酸が、フムロン、コフムロン、イソフムロン、イソプレフムロン、フルポン、アドフムロン、キサントフモールA及びキサントフモールBから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記ベータ酸が、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、テトラヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロコルプロン及びジヒドロイソフムロンから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が医薬的に許容される担体中に製剤化される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、さらに、抗酸化剤、ビタミン及びミネラルからなる群から選択される1以上のメンバーを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、さらに、タンパク質、脂質、炭水化物、グルコサミン、コンドロイチン硫酸及びアミノ糖からなる群から選択される1以上のメンバーを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記第1又は第2成分が、単糖、二糖、アミノ酸、スルフェート、スクシネート、アセテート又はグルタチオンとコンジュゲートしている、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
糖尿病を有する個体に、ホップのCO2抽出物を含む組成物を投与することを含む、糖尿病の処置方法。
【請求項１０】
前記アルファ酸が、フムロン、コフムロン、イソフムロン、イソプレフムロン、フルポン、アドフムロン、キサントフモールA及びキサントフモールBから選択される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベータ酸が、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、テトラヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロコルプロン及びジヒドロイソフムロンから選択される、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
前記必須オイルが、ミルセン、フムレン、ベータ-カリオフィレン、ウンデカン-2-オン、及び2-メチル-ブト-3-エン-オールからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が医薬的に許容される担体中に製剤化される、請求項9に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、2002年10月25日出願のU.S.S.N. 10/282,236の継続出願であり、該出願は参照することにより本願に組み込まれる。さらに本願は、2001年10月26日出願の米国仮出願No. 60/335,062の利益を主張し、該出願は参照することにより本願に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、全般に、誘導性シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)の発現及び／又は活性の相乗的阻害をを示す組成物に関する。該組成物は、構成性シクロオキシゲナーゼ(COX-1)にほとんど又は全く著しい影響を与えることなく、誘導性シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)の誘導性及び／又は活性の阻害に相乗的に機能することができる。
【０００３】
関連技術の記載
炎症性疾患は5000万人以上の米国人に影響を与えている。過去10〜15年にわたる分子学的及び細胞学的な免疫学分野での基礎研究の結果、これらの免疫学的ベースの疾患の診断、処置及び予防へのアプローチは劇的に変化した。その1つの例はシクロオキシゲナーゼ酵素の誘導性型の発見である。構成性シクロオキシゲナーゼ(COX)は、1976年に初めて精製され、1988年にクローン化され、アラキドン酸(AA)からプロスタグランジン(PG)への合成において機能する。その精製の3年後、COX活性を有する誘導性酵素が同定され、COX-2と命名され、一方構成性COXはCOX-1との用語を当てられた。
【０００４】
COX-2遺伝子発現は、前炎症性サイトカイン及び成長因子の制御下にある。従って、COX-2は、炎症及び細胞成長の制御の両方において機能すると推測される。COX-2は多くの組織で誘導性である一方、脳及び脊髄では構成性に存在し、ここでは痛み及び熱の神経伝達において機能し得る。COXの2つのアイソフォームは構造においてほとんど同一であるが、基質及び阻害剤選択性において並びに細胞内での位置において、重要な相違がある。胃内壁の完全性を保持し、危険にさらされた腎臓において正常な腎機能を維持する、保護PGは、COX-1によって合成される。その一方、免疫細胞においてCOX-2によって合成されるPGは、炎症過程の中心である。
【０００５】
炎症の処置のための理想的な製剤は、COX-1の活性に影響を与えることなく、COX-2の誘導及び活性を阻害するものであろう。しかしながら、従来の非ステロイド性及びステロイド性抗炎症薬剤は、COX-1に影響を与えることなくCOX-2を阻害するという特異性を欠き、長期間使用した場合に胃腸系の損傷を起こす危険性があった。
【０００６】
数々の研究は、胃腸(GI)への副作用の相対的発生頻度が、薬剤の相対的COX-2特異性と相関可能なことを示す。COX-1よりもCOX-2への特異性が高いほど、GI不調の発生頻度が低い。従って、COX-2特異性が約3.0と報告されているクルクミンよりも、COX-2特異性がわずか0.6であるアスピリンは、GIの悩みの発生頻度が大きい。しかしながら、GI不調の可能性を顕著に減少させるのに必要なCOX-2特異性として一般に受け入れられているのは、5.0である。
【０００７】
従って、COX-1代謝にほとんどもしくは全く影響を及ぼさないまま、COX-2酵素活性の発現を特異的に阻害又は予防することのできる組成物の同定は、有害な副作用なしに、充分に低い投与量で又は現在の臨床的投与量で用いることができるため、有用である。
【０００８】
医師は一般に、変形性関節炎の処置のために非ステロイド性又はステロイド性抗炎症薬剤を用いる。これらの薬剤は、しかしながら、軟骨促進能及び保護能に欠けるだけでなく、軟骨の変質又は軟骨合成の減少を実際に引き起こすため、長期間の治療にはよく適してはいない。さらには、多くの非ステロイド性抗炎症薬剤は、長期間用いると胃腸系を損傷させる。従って、を用いる。関節炎の新規な処置が緊急に必要とされている。
【０００９】
グルコサミンは関節保護特性があるため、2つの欠点：(i)グルコサミン処置への応答速度は、抗炎症薬剤による処置よりも遅い；及び(ii) グルコサミンは、変質性の軽減の期待値を満たさないことがあり得る；を除き、変形性関節炎のための治療剤として魅力的である。グルコサミンと非ステロイド性抗炎症剤とを比較する研究において、例えば、1日に1500mgのグルコサミン硫酸を1200mgのイブプロフェンと比較したニ重盲検の研究は、最初の2週間は、イブプロフェン患者においてグルコサミン処置患者よりも痛みスコアが早く減少したことを示した。しかしながら、グルコサミンを与えた患者では試験期間中に亘って痛みスコアの低下が継続し、2つのグループ間での差異は顕著になり、8週目には、グルコサミンが有利であった(Lopes Vaz, A., Double-blind clinical evaluation of the relative efficacy of ibuprofen and glucosamine sulphate in the management of osteoarthritis of the knee in outpatients, 8 Curr. Med Res Opin. 145-149 (1982))。従って、グルコサミンは関節炎の痛み及び炎症を緩和し得るが、入手可能な抗炎症性薬剤よりもその速度は遅い。
【００１０】
さらに、現在入手可能なグルコサミン製剤は、変形性関節炎及びリウマチ関節炎の潜在的原因を攻撃又は緩和するのに最適に製剤化されていない。また、多くの市販入手可能なハーブ系サプリメント及び栄養補助食品と同様、入手可能な製剤は、それらの安全性及び有効性を保証し得る使用歴や制御下での臨床試験がない。
【００１１】
軟骨代謝の正常化や変形性関節炎の処置のために理想的な製剤は、有効な抗炎症性活性と共に、適切な軟骨保護を提供する。変形性関節炎のための最適な栄養補助食品は、グルコサミンによって提供される全身関節再構築特性を促進し、いかなる有害な副作用も生じさせることなく炎症性応答を緩和するものでなくてはならない。低価格で製造され、政府の規制を満たすものでなければならない。
【００１２】
発明の要約
従って、COX-1にほとんど又は全く影響を与えることなくCOX-2によるプロスタグランジン合成を特異的に阻害又は予防しうる天然の化合物製剤を同定することは有用であろう。そのような製剤は、関節組織の健全性維持のため、関節炎又は他の炎症性状態の処置のために有用であり得、これまで見出されていなかった。「特異的又は選択的COX-2阻害剤」という用語は、COX-1を上回ってCOX-2を選択的に阻害する化合物又は化合物の混合物を包含する。好ましくは、組成物は、COX-1阻害におけるメディアン有効濃度より少なくとも5倍高い、COX-2阻害におけるメディアン有効濃度を有する。例えば、試験製剤のCOX-2阻害におけるメディアン有効濃度が0.2μg/mLであるならば、COX-1阻害におけるメディアン有効濃度が1μg/mL以上でない限り、該製剤はCOX-2特異的であるとは考えられない。
【００１３】
好ましい態様は、第1成分としてクルクミノイド種を含み、クルクミノイドの抗炎症性作用を相乗的に増進させることができる第2化合物を含む組成物を提供する。該組成物は、クルクミノイド種を含む第1成分並びにアルファ酸、ベータ酸及びその誘導体からなる群から選択されるメンバーを含む第2成分を有効量含む。ある態様において、該アルファ酸はフムロンである。他の態様において、該ベータ酸はルプロンである。他の態様において、該クルクミノイドはクルクミンである。
【００１４】
ある態様において、組成物はさらに、グルコサミン及びコンドロイチン硫酸からなる群から選択されるメンバーを含む。
【００１５】
好ましい態様はまた、動物において炎症又は炎症ベースの疾患を処置する方法であって、炎症の徴候を有する動物に、クルクミノイド種を含む第1成分並びにアルファ酸、ベータ酸及びその誘導体からなる群から選択されるメンバーを含む第2成分を有効量含む組成物を供することを含む方法を提供する。
【００１６】
好ましい態様はまた、動物において変形性関節炎の症状を低減させる方法であって、炎症の徴候を有する動物に、クルクミノイド種を含む第1成分並びにアルファ酸、ベータ酸及びその誘導体からなる群から選択されるメンバーを含む第2成分を有効量含む組成物を供することを含む方法を提供する。
【００１７】
好ましい態様の詳細な記載
本願明細書及び添付の請求の範囲において用いられる場合、単一形「a」「an」及び「the」は、文脈が他に明確に指図しない限り複数の指示対象を含むことに留意されるべきである。
【００１８】
好ましい態様は、COX-2の発現及び／又は活性に相乗的な阻害効果を有する組成物を提供する。より特定すれば、該組成物は、以下ににさらに特定して記載するように、第1成分としてクルクミノイドを含み、第2成分としてアルファ酸、ベータ酸及びその誘導体からなる群から選択されるメンバーを含む。好ましい態様によって提供される組成物は、栄養補助食品又は治療組成物として製剤化することができる。該組成物は、COX-1への著しい効果なしに、COX-2の誘導能及び／又は活性を相乗的に阻害するよう機能することが出来る。
【００１９】
本明細書において「栄養補助食品」という用語は、生理機能における構造的又は機能的変化に影響を与えるために消費される組成物をいう。「治療組成物」という用語は、疾患を処置又は予防するために投与される任意の化合物をいう。
【００２０】
本明細書において「クルクミノイド」及び「活性クルクミノイド」という用語は、COX-1にほとんど又はは全く影響を及ぼさないまま、COX-2の誘導能及び／もしくは活性を阻害することのできる、又は炎症性応答の重症度を阻害もしくは低減することのできる、クルクミノイド属内の種をいう。クルクミノイドは、天然産物から抽出するか、又は化学的に合成することができる。
【００２１】
Curcuma longa(ウコン、アキウコン)の根茎から単離された黄色色素性画分は、ジシンナモイルメタン群に属するクルクミノイド類を含有する。クルクミノイド類は3〜5パーセント程度まで存在する。これらはCurcuma longaの最も重要な活性成分であると考えられており、Curcuma longaの生物学的活性に寄与すると考えられている。これらの主要な活性は抗炎症であるが、クルクミノイドは抗酸化、抗アレルギー、創傷治癒、抗痙攣、抗細菌、抗真菌、及び抗腫瘍の活性も同様に有することが報告されている。クルクミン(図1B)は、1815年に単離され、1910年に構造的に同定された。Curcuma longaから単離された他のクルクミノイドには、デメトキシクルクミン(図1C)、ビスデメトキシクルクミン(図1D)、クルクミンのシス-トランス幾何異性体 (図1E)、及びシクロクルクミン(図1F)を含む。クルクミノイドは、Curcuma longaに加えて他の植物、例えばジャワウコン(Curcuma xanthorrhiza)及びガジュツ(Curcuma zedoaria)中にも見出され得る。
【００２２】
クルクミノイドは、その抗炎症活性についてよく知られる。ウコン(turmeric)は、アーユルヴェーダ医学で使用される最古の抗炎症薬の1つである。クルクミノイドの抗炎症活性は、炎症反応モデル、例えばカラゲーニン、綿尖、ホルムアルデヒド、及びに肉芽嚢のような化学的又は物理的刺激物において評価されてきた。ヒトの二重盲検での臨床的試みは、1200mgクルクミノイド/日、5〜6週間の用量で慢性関節リウマチにおける効能を実証した。しかしこれらの用量では、消化器(GI)の不快感及び胃への刺激の徴候がしばしば報告された。高用量のクルクミノイドに起因するGIの不調及び胃への刺激は、クルクミノイドが、アスピリン及びアスピリン様抗炎症薬剤と類似の様式でプロスタグランジンの産生に作用するという事実によると思われる。
【００２３】
図1[A]に示したような、そして図1[B]のクルクミンにより具体的に例示したようなクルクミノイド属は、好ましくは、例えばSabinsa (121 Ethel Road West, Piscataway, NJ)より市販にて入手することのできるような、医薬用グレードの植物抽出物である。使用し得る他のクルクミノイドは、デメトキシクルクミン(図1[C])、ビスデメトキシクルクミン(図1[D])、シス-トランスクルクミン(図1E)、及びシクロクルクミン(図1F)を含む。使用するクルクミノイドは、Curcuma longa Lより容易に得ることができる。医薬用グレードのクルクミノイド抽出物は、約70パーセントより高いクルクミノイド含有量を有するようと規格化されている。医薬用、植物グレードの抽出物は、好ましくは、広く安全で効率的な手順をパスするべきである。好ましい態様において使用する場合、抽出物は約1〜99重量パーセントのクルクミノイド含有量を有する。好ましくは、最小のクルクミノイド含有量は、約70重量パーセントである。あるいはクルクミノイドは、化学合成において知られる標準的な技術を用いて合成し得る。
【００２４】
本明細書において「ホップ抽出物」という用語は、(1)ホップ植物の生成物を溶媒に暴露する、(2)該ホップ植物の生成物から該溶媒を分離する、及び(3)該溶媒を除去する、ことから得られる固体材料をいう。
【００２５】
本明細書において「溶媒」という用語は、ホップ植物の生成物から固体材料を抽出するために必要な特徴を保有する水性又は有機性の性質の液体をいう。溶媒の例は、水、水蒸気、過熱した水、メタノール、エタノール、ヘキサン、クロロホルム、液体CO2、液体N2、又はそのような材料の任意の組み合わせを含むであろうがこれに限定されない。
【００２６】
本明細書において「CO2抽出物」という用語は、ホップ植物の生成物を液体又は超臨界のCO2調製液に暴露させた後、CO2を除去することから得られる固体の材料をいう。
【００２７】
本明細書において「アルファ酸」という用語は、ホップ植物の生成物から単離される化合物をいい、フムロン、コフムロン、イソフムロン、イソプレフムロン(isoprehumulone)、フルポン(hulupone)、アドフムロン、キサントフモールA及びキサントフモールBを含むがこれらに限定されない。
【００２８】
本明細書において「ベータ酸」という用語は、集合的にルプロン類として知られている化合物をいい、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、テトラヒドロイソフムロン及びヘキサヒドロコルプロンを含むがこれらに限定されない。
【００２９】
本明細書において「必須オイル画分(essential oil fraction)」という用語は、ミルセン、フムレン、ベータ-カリオフィレン、ウンデカン-2-オン及び2-メチル-ブト-3-エン-オールを含む成分の、複合的混合物をいう。
【００３０】
本明細書において「脂肪」という用語は、脂肪酸のトリアシルグリセロールエステルをいう。
【００３１】
本明細書において「ワックス」という用語は、極度に長鎖(＞25炭素)の脂肪アルコール又は脂肪酸のトリアシルグリセロールエステル又はエーテルをいう。
【００３２】
1つの形又は別の形でのホップの抽出は、水及びエタノール中への抽出が最初に試みられた19世紀初頭まで150年以上さかのぼる。今日もなお、エタノール抽出物はヨーロッパで役立っているが、明らかに主要な抽出物は、有機溶媒抽出物(ヘキサン)及びCO2抽出物(超臨界及び液体)である。CO2(典型的には60バール圧かつ5〜10℃)は液体状態にあり、相対的にマイルドな非極性溶媒で、ホップのソフトレジン及びオイルに対して非常に特異的である。臨界点を超えると、典型的には300バール圧かつ60℃で、CO2は気体及び液体の双方の特性を有し、はるかに強い溶媒である。多様な抽出物の近似組成を表1に比較する。
【００３３】
【表１】
2008519852.tif 000002
【００３４】
最もシンプルな方法ではホップの抽出は、ホップを製粉、ペレット化、そして再度製粉して、リュープリンを分散させ、充填カラムに溶媒を通してレジン成分を集め、最後に溶媒を除去して全抽出物又は“純粋な”レジン抽出物を得ることを伴う。
【００３５】
主な有機抽出溶媒は強い溶媒であり、事実上すべてのリュープリン成分に加え、それら溶媒は、植物色素、クチクラワックス、水及び水溶性の材料も抽出する。
【００３６】
超臨界CO2は有機溶媒より選択的であり、より少量のタンニン及びワックス、そしてより少量の水、したがって水溶性成分を抽出する。この溶媒はクロロフィルのような一部の植物色素を確かに抽出するが、有機溶媒の場合よりむしろ少ない。液体CO2は、ホップ用に商業的に使用される最も選択的な溶媒であり、したがって最も純粋な全レジン及びオイルの抽出物を生成する。この溶媒は、ハードレジン又はタンニンをほとんど抽出せず、植物ワックスもずっと低レベルで、植物色素は抽出せず、そして水及び水溶性の材料もより少量しか抽出しない。
【００３７】
この選択性及びよりマイルドな溶媒の特性の結果として、ホップの単位重量当たりの液体CO2抽出物の絶対収率は、他の記載した溶媒を使用する場合より低い。加えて液体CO2を用いてのアルファ酸の収率(89-93%)は、超臨界CO2の場合(91-94%)又は有機溶媒の場合(93-96%)より低い。抽出後、溶媒を除去する過程があり、有機溶媒に関するこの過程は揮発を引き起こすための加熱を伴う。それにもかかわらず、微量の溶媒が抽出物中にどうしても残る。しかしながら、CO2の除去は、CO2を揮発させるために単に圧を抜くことを伴うだけである。
【００３８】
好ましい態様において、アルファ酸、ベータ酸、又はその誘導体は、ホップから抽出されるか又は化学的に合成されることが出来る。好ましくは、アルファ酸、ベータ酸、又はその誘導体は、ホップから抽出され、より好ましくは超臨界CO2によって抽出される。
【００３９】
図2[A]に示し、そして図2[B]のフムロンにより具体的に例示したようなアルファ酸属、及び図3[A]に示し、そしてルプロン(図3[B])により具体的に例示したようなベータ酸属は、好ましくは、例えばHopunion (Yakima,WA)より市販にて入手することのできるような、医薬用グレードの植物抽出物である。
【００４０】
骨再吸収の阻害剤としてのホップ抽出物由来のフムロンの同定が、Tobe et al. 1997において報告された(Bone resorption Inhibitors from hop extract. Biosci. Biotech. Biochem 61(1): 158-159)。同グループによるその後の研究は、フムロンの作用機序をMC3T3,E1細胞のTNF-α刺激後のCOX-2遺伝子転写の阻害として特徴付けた(Yamamoto, K. 2000. Suppression of cyclooxygenase-2 gene transcription by humulon of bee hop extract studied with reference to glucocorticoid. FEBS Letters 465: 103-106)。しかしながら、これらの参照文献は骨粗鬆症及びCOX-2遺伝子転写への適用における、フムロンのみの使用を開示する。
【００４１】
好ましい態様は、クルクミノイド分子を改変してより高い効力かつ低い毒性を達成するために、相乗的に作用する第2の成分を添加する。従って、好ましい態様は、クルクミノイドを、アルファ酸、ベータ酸、及びその誘導体からなる群から選択される第2の分子と組み合わせたときに、そのような組み合わせが標的細胞において相乗作用を産ずることの発見に関連する。そのような相乗的応答の1つは、誘導性COX-2の特異的阻害であろう。
【００４２】
それぞれの属の代表的な種を表2に示す。表2中で各属の下にリストされた種のうち、少なくとも1つのアスタリスク(*)を含むものが好ましく、2つのアスタリスク(**)を含むものが特に好ましい。
【００４３】
【表２】
2008519852.tif 000003
【００４４】
好ましくは、好ましい態様は活性ルクミノイド及びホップ抽出物の活性成分又はその誘導体を使用する。本明細書中において、用語「活性クルクミノイド」、「ホップ抽出物の活性成分」又はその誘導体は、天然に生ずるか又は合成された誘導体であって、COX-1にほとんどもしくは全く影響を及ぼさないまま、COX-2の誘導能及び/もしくは活性を阻害することのできる、又は炎症応答の重症度を阻害もしくは低減することのできる、それぞれの属の範囲内の種をいう。
【００４５】
好ましい態様は、クルクミノイド、アルファ酸、ベータ酸又はその誘導体のコンジュゲートを用いることも出来る。クルクミノイド、アルファ及びベータ酸又はその誘導体の「コンジュゲート」とは、単糖類又は二糖類、アミノ酸、スルフェート、スクシネート、アセテート及びグルタチオンから成る群から選択されるメンバーと、共有結合又はコンジュゲートした、クルクミノイド、アルファ酸及びベータ酸を意味する。好ましくは、単糖類又は二糖類は、グルコース、マンノース、リボース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、マルトース及びフルクトースから成る群から選択されるメンバーとすることができる。
【００４６】
ある態様は、有効量のクルクミン並びにフムロン及びルプロンからなる群から選択される少なくとも1つの化合物を含む組成物である。
【００４７】
アルファ酸又はベータ酸によるCOX-2酵素の活性阻害は、クルクミノイドとともに、デュアルな相乗作用を提供することが出来る。よって、アルファ酸及びベータ酸からなる群から選択される第2の化合物は、クルクミノイドの抗炎症活性を増加させることが出来る。好ましい態様の組成物は結果として、通常必要とされるより少ない投与量のクルクミノイドでより選択的にCOX-2活性に作用する。望ましいCOX-2阻害を達成するためのクルクミノイド投与量の減少によって、この化合物からの副作用の可能性はほぼ指数関数的に減少する。アルファ酸及びベータ酸からなる群から選択される第2の化合物は、非限定的に、肝保護、抗腫瘍促進、抗高脂血症、抗高血糖症及びクルクミノイドのCOX-1阻害による潰瘍形成に対する保護のような利益を提供することができる。
【００４８】
好ましくは、好ましい栄養補助食品の1日投与量(mg/kg/日)は、動物の体重1kgに対し、約0.001〜約30.0mgのクルクミノイド、及び約0.5〜約20.0mgのアルファ酸又はベータ酸を送達するよう製剤化されるであろう。
【００４９】
局所適用に好ましい態様の組成物は、以下のいずれかを含むであろう：約0.001〜約1wt%、好ましくは約0.01〜約1wt%のクルクミノイド、及び約0.025〜約1wt%、好ましくは約0.05〜約1wt%のアルファ酸又はベータ酸。
【００５０】
好ましい態様の組成物は、以下の範囲内の血清濃度を生ずるであろう：約0.0001〜約10μMのクルクミノイド、及び約0.001〜約10μMのアルファ酸又はベータ酸。
【００５１】
好ましい態様において、組成物は、グルコサミン又はコンドロイチン硫酸をさらに含むことができる。グルコサミンは、変形性関節炎の処置に有効で安全であるとして一般に受け入れられている。従って、グルコサミン又はコンドロイチン硫酸をさらに含む組成物は、関節機能の正常化又は変形性関節炎の症状の減少を助けることができる。
【００５２】
クルクミノイド、及びアルファ酸、ベータ酸又は誘導体の組み合わせに加え、食品用である本発明の組成物は、非限定的に、その他の天然成分の中間代謝物、抗酸化剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂質、炭水化物及びアミノ糖などの様々な添加物、並びに、非限定的に、錠剤及びカプセルの製造における標準的な賦形剤であるタルク及びステアリン酸マグネシウムのような不活性成分などを含んでよい。
【００５３】
好ましい態様の組成物は、さらに医薬的に受容可能な担体を含むことができる。本明細書において「医薬的に受容可能な担体」は、任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、等張剤及び吸収遅延剤、甘味剤等を含む。これらの医薬的に受容可能な担体は、希釈剤、結合剤及び接着剤、滑剤、崩壊剤、着色剤、膨張剤、芳香剤、甘味剤、ならびに種々の材料、例えば特定の治療組成物を調製するために必要であると思われるバッファー及び吸収剤を含むがこれに限定されず、広範囲な材料から調製してよい。医薬的に活性な物質のためのそのような媒体及び剤の使用は当該技術分野において周知である。活性成分と不適合でない限り、好ましい態様における任意の媒体又は剤の使用が企図される。1つの態様において、タルク及びステアリン酸マグネシウムが製剤中に含まれる。好ましい成分は、Astac Brand 400 USP タルク粉末及び混じり気のない(veritable)グレードのステアリン酸マグネシウムである。食品用のバー(dietary bar)又は機能食品としての本組成物の製造に影響のあることが知られているその他の成分は、芳香剤、糖、アミノ糖、タンパク質及び／又は修飾スターチ、ならびに油脂及びオイルを含むことができる。
【００５４】
好ましい態様の栄養補助食品、ローション又は治療用組成物は、当業者に公知の任意の様式で製剤化することができる。1つの態様において組成物は当業者に利用可能な技術を用いてカプセル又は錠剤に製剤化される。カプセル又は錠剤の形態において、成体のヒト又は動物に対して推奨される1日の用量を、1〜6個のカプセル又は錠剤中に含有させることが好ましい。しかしながら、組成物は、他の使い勝手のよい剤形、例えば注入可能な溶液又は懸濁液、スプレー用の溶液又は懸濁液、ローション、ガム、ロゼンジ、食品又はスナックの品目に製剤化することもできる。食品、スナック、ガム又はロゼンジの品目は、甘味剤、芳香剤、オイル、スターチ、タンパク質、果物又は果物の抽出物、野菜又は野菜の抽出物、穀物、動物性脂肪又はタンパク質を含む、任意の摂取可能な成分を含むことができる。それ故本発明の組成物は、シリアル、スナック品目(例えばチップス)、バー、ガムドロップ、チューイングキャンディー又はゆっくり溶けるロゼンジ中に製剤化することができる。好ましい態様は、急性及び慢性双方の、全てのタイプの炎症ベース疾患の治療を企図することができる。本発明の製剤は炎症応答を低減し、それにより患部組織の治癒を促進し、又はさらなる損傷を予防する。医薬的に受容可能な担体も本発明の組成物及び製剤中に使用し得る。
【００５５】
好ましい態様によれば、動物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、鳥類、ウマ、反芻動物又は他の温血動物からなる群から選択されるメンバーであり得る。好ましい態様は、主にヒトの処置に向けられる。投与は、当業者に利用可能な任意の方法、例えば経口、局所、経皮、経粘膜又は非経口経路によることができる。
【００５６】
以下の表3は、COX-2酵素の発現及び活性が役割を果たし得る疾患のリストを提供し、従って、好ましい態様の組成物によって正常化又は処置される適切な標的である。
【００５７】
【表３】
2008519852.tif 000004
【００５８】
COX-2の発見は、COX-1により作られる胃及び腎臓内の保護PGを除去せずに炎症を低減する薬剤のデザインを可能にした。好ましい態様の組成物は、非限定的に、対象における炎症の処置のため、他の炎症関連疾病処置のため、例えば、疼痛及び頭痛の処置における鎮痛剤として、又は発熱の処置における解熱剤として有用であろう。好ましい態様の組成物は、血管疾患、偏頭痛、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、強皮症、リウマチ熱、I型糖尿病、重症筋無力症、多発性硬化症、サルコイドーシス、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群、多発筋炎、歯肉炎、過敏症、外傷後に起こる腫張、心筋虚血のような疾患における、炎症の処置に有用であろう。好ましい態様の組成物は、有害な副作用が著しく少ないというさらなる利点を有し、抗炎症剤として有用である。
【００５９】
好ましい態様はまた、グルコサミン又はコンドロイチン硫酸が関節の動きを正常化する機能又は変形性関節炎の徴候を減少させる機能の速度を増加させる組成物を提供することができる。例えば、好ましい態様の組成物は、リューマチ性関節炎、脊椎関節炎、痛風性関節炎、変形性関節炎、全身性エリテマトーデス及び若年性関節炎を含むがこれらに限定されない関節炎の処置に有用であろう。
【００６０】
そのような、好ましい態様の組成物は、喘息、気管支炎、月経痙攣、腱鞘炎、滑液包炎及び例えば乾癬、湿疹、火傷及び皮膚炎のような皮膚関連状態の処置にも有用であろう。
【００６１】
好ましい態様の組成物はまた、炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過敏性腸症候群及び潰瘍性大腸炎のような胃腸状態の処置並びに結腸直腸癌のような癌の予防又は処置にも有用であろう。
【００６２】
好ましい態様の組成物はまた、網膜障害、結膜炎、ブドウ膜炎、眼の光恐怖症のような眼疾患、及び眼組織の急性外傷の処置において有用であろう。化合物はまた、ウイルス感染に関連した肺炎症及び嚢胞性線維症のような肺性炎症の処置において有用であろう。化合物はまた、アルツハイマー病を含む皮質痴呆のような特定の神経系疾患の処置にも有用であろう。COX-2介在性PGE2生合成の阻害剤として、これらの組成物は、アレルギー性鼻炎、呼吸窮迫症候群、内毒素性ショック症候群、アテローム硬化症並びに卒中、虚血及び外傷に起因する中枢神経系障害の処置にも有用であろう。
【００６３】
以下の実施例は、説明を意図しており、好ましい態様を如何様に限定するものではない。
【実施例】
【００６４】
実施例1
クルクミノイド及びホップ抽出物による、ネズミB細胞におけるプロスタグランジンE2産生の相乗的阻害
本実施例は、好ましい態様であるクルクミノイド及びホップ抽出物の組み合わせの、クルクミノイド単独と比較した、優れたCOX-2阻害能及び選択性を例証する。
【００６５】
RAW 264.7細胞におけるCOX-2介在PEG2産生の阻害
(装置) 天秤,分析用,Ohaus Explorer(Ohaus Model #E01140, Switzerland)、安全キャビネット(biosafety cabinet)(Forma Model #F1214, Marietta, Ohio)、ピペット,100〜1000μL(VWR, Catalog #4000-208, Rochester, NY)、細胞手動カウンター(VWR, Catalog #23609-102, Rochester, NY)、CO2インキュベーター(Forma Model #F3210, Marietta, Ohio)、血球計(Hausser Model #1492, Horsham, PA)、顕微鏡,倒立(Leica Model #DM IL, Wetzlar, Germany)、マルチチャネルピペット,12-チャネル(VWR, Catalog #53501-662, Rochester, NY)、ピペット補助器具(VWR, Catalog #53498-103, Rochester, NY)、ピペット,0.5〜10μL(VWR, Catalog #4000-200, Rochester, NY)、ピペット,100〜1000μL(VWR, Catalog #4000-208, Rochester, NY)、ピペット,2〜20μL(VWR, Catalog #4000-202, Rochester, NY)、ピペット, 20〜200μL(VWR, Catalog #4000-204, Rochester, NY)、PURELAB Plus Water Polishing System(U.S. Filter, Lowell, MA)、冷蔵庫, 4℃(Forma Model #F3775, Marietta, Ohio)、ボルテックス攪拌器(VWR Catalog # 33994-306, Rochester, NY)、水浴(Shel Lab Model #1203, Cornelius, OR)。
【００６６】
(細胞、化学薬品、試薬及び緩衝液) 細胞スクレーパー(Corning Catalog #3008, Corning, NY)、ジメチルスルホキシド(DMSO)(VWR, Catalog #5507, Rochester, NY)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Mediatech, Catalog #10-013-CV, Herndon, VA)、ウシ胎児血清, 加熱不活性化(FBS-HI)(Mediatech, Catalog #10-011-CV, Herndon, VA)、リポ多糖(LPS)(Sigma Catalog#L-2654, St. Louis, MO)、マイクロ遠心チューブ1.7mL(VWR, Catalog #20172-698, Rochester, NY)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech, Catalog #30-001-CI, Herndon, VA) 、0.5-10μLピペット用ピペットチップ(VWR, Catalog #53509-138, Rochester, NY)、100-1000μLピペット用ピペットチップ(VWR, Catalog #53512-294, Rochester, NY)、2-20μL及び20-200μLピペット用ピペットチップ(VWR, Catalog #53512-260, Rochester, NY)、ピペット, 10mL(Becton Dickinson Catalog#751, Marietta, OH)、ピペット, 2mL(Becton Dickinson Catalog#7507, Marietta, OH)、ピペット, 5mL(Becton Dickinson Catalog#7543, Marietta, OH)、RAW 264.7細胞(American Type Culture Collection Catalog #TIB-71, Manassas, VA)、試験化合物(液体CO2ホップ抽出物, Hopunion, Yakima, WAより) (クルクミン, Sigma (St. Louis, MO)より)(Product C 1386), 65-70% Curcuma longa 粉末)、組織培養プレート, 96穴 (Becton Dickinson Catalog#3075, Franklin Lanes, NJ)、超純水(Resistance=18メガオーム-cm脱イオン水)。
【００６７】
(一般的手順)-ATCCより入手したRAW 264.7細胞をDMEM培地中で増殖させ、対数増殖期に維持した。DMEM増殖培地は以下のように作成した：DMEM 500mLのビンに、加熱不活性化FBS 50mL及びペニシリン/ストレプトマイシン 5mLを加え、4℃で保存した。これを使用前に水浴中で37℃に温めた。最適な結果のためには3ヶ月内に使用すべきである。
【００６８】
実験第1日、96ウェル組織培養プレートにおいて1ウェル当たり0.2 mLの増殖培地中に、対数増殖期のRAW 264.7細胞を1ウェル当たり8×104細胞にて蒔いた。プレーティングの6〜8時間後に各ウェルから増殖培地100μLを抜き取り、新鮮な培地100μLに置換した。RAW 264.7細胞におけるCOX-2の発現を誘導するために使用する、LPSの1.0mg/mL溶液は、1mL DMSO中に1.0mg LPSを溶解することにより調製した。これを溶解するまで混合し4℃で保存した。使用直前に、これを室温にて又は37℃水浴中で融解させた。
【００６９】
実験第2日、試験材料をDMSO中の1000倍ストックとして調製した。例えば、試験材料の最終濃度を10μg/mLとするならば、10mgの試験材料を1mLのDMSOに溶解することによって10mg/mLのストックを調整した。新鮮な試験材料を実験2日目に調製した。1.7 mLマイクロ遠心チューブ中にFBSを含まないDMEM 1mLを加え、0.05、0.10、0.5及び1.0μg/mLの試験濃度を得た。試験材料の1000倍DMSOストック 2μLを、FBSを含まない培地 1mLに加えた。チューブは試験材料の最終濃度の2倍濃縮を含有した。チューブをインキュベーター中に10分間置き平衡化させた。
【００７０】
第1日に調製した細胞プレートの各ウェルから培地 100mLを抜き取った。平衡化した最終濃度の2倍の試験化合物 100mLを細胞に加え、90分間インキュベーションした。FBSを含まないDMEM中のLPSを、10mLの培地に1mg/mLDMSOストック44μLを加えることにより調製した。刺激する細胞の各ウェルに20μLのLPS(LPSの最終濃度 は0.4μg/mLのLPS)を加えた。LPS刺激を24時間続け、その後、各ウェルからの培地上清を、培地中のPGE2含量測定のための清浄なマイクロ遠心チューブに移した。
【００７１】
クルクミノイド及びホップ抽出物によるCOX-I酵素阻害の測定
試験化合物がCOX-1のPGE2合成を阻害する能力を、Noreen, Y., et al. (J. Nat. Prod. 61, 2-7, 1998)に本質的に記載されたように測定した。
【００７２】
(装置) 天秤(2400 g, Acculab VI-2400, VWR Catalog #11237-300, Rochester, NY)、天秤, 分析用, Ohaus Explorer (Ohaus Model #E01140, Switzerland)、安全キャビネット(Forma Model #F1214, Marietta, Ohio)、フリーザー, -3O℃(Forma Model #F3797)、フリーザー, -8O℃超低温(Forma Model #F8516, Marietta, OH)、加熱攪拌プレート(VWR Catalog #33918-262, Rochester, NY)、製氷機(Scotsman Model #AFE4OOA-1A, Fairfax, SC)、マルチチャネルピペット, 12-チャネル(VWR, Catalog #53501-662, Rochester, NY)、マルチチャネルピペット, 8-チャネル(VWR, Catalog #53501-660, Rochester, NY)、Orbital shaker platform(Scienceware #F37041-0000, Pequannock, NJ)、pH測定器(VWR Catalog #33221-010, Rochester, NY)、ピペット補助器具(VWR, Catalog #53498-103, Rochester, NY)、ピペット, 0.5〜10μL(VWR, Catalog #4000-200, Rochester, NY)、ピペット, 100〜1000μL(VWR, Catalog #4000-208, Rochester, NY)、ピペット, 2〜20μL(VWR, Catalog #4000-202, Rochester, NY)、ピペット, 20〜200μL(VWR, Catalog #4000-204, Rochester, NY)、PURELAB Plus Water Polishing System(U.S. Filter, Lowell, MA)、冷蔵庫, 4℃(Forma Model #F3775, Marietta, Ohio)、真空チャンバ(Sigma Catalog #Z35, 407-4, St. Louis, MO)、ボルテックス攪拌器(VWR Catalog # 33994-306, Rochester, NY)。
【００７３】
(供給品及び試薬) 96穴丸底プレート(Nalge Nunc #267245, Rochester, NY)、アラキドン酸(Sigma Catalog #A-3925, St. Louis, MO)、遠心管, 15mL, 円錐型, 滅菌(VWR Catalog #20171-008, Rochester, NY)、COX-I酵素(ヒツジ) 40,000単位/mg (Cayman Chemical Catalog #60100, Ann Arbor, MI)、ジメチルスルホキシド(DMSO) (VWR Catalog #5507, Rochester, NY)、100%エタノール(VWR Catalog #MK701908, Rochester, NY)、エピネフリン(Sigma Catalog #E-4250, St. Louis, MO)、グルタチオン(還元) (Sigma Catalog # G-6529, St. Louis, MO)、目盛付シリンダー1000mL(VWR Catalog #24711-364, Rochester, NY), ヘマチン(ブタ)(Sigma catalog # H-3281, St. Louis, MO)、塩酸(HCl)(VWR Catalog #VW3110-3, Rochester, NY)、キムワイプ(Kimberly Clark Catalog #34256, Roswell, GA)、マイクロ遠心チューブ1.7 mL (VWR Catalog #20172-698, Rochester, NY)、NaOH (Sigma Catalog #S-5881, St. Louis, MO)、0.5-10μLピペット用ピペットチップ(VWR, Catalog #53509-138, Rochester, NY)、100-1000μLピペット用ピペットチップ(VWR, Catalog #53512-294, Rochester, NY)、2-20μL及び20-200μLピペット用ピペットチップ(VWR, Catalog #53512-260, Rochester, NY)、プロスタグランジンE2 (Sigma Catalog # P-5640, St. Louis, MO)、プロシタグランジンF2アルファ(Sigma Catalog # P-0424, St. Louis, MO)、攪拌棒, 磁性(VWR Catalog #58948-193, Rochester, NY)、貯蔵ボトル 1000 mL (Corning Catalog #1395-1L, Coming, NY)、貯蔵ボトル 100 mL (Corning Catalog #1395-100, Coming, NY)、ホップのCO2抽出物(Hopunion, Yakima, WA)、クルクミン(Sigma, St. Louis, MO, (Product C 1386), 65-70% Curcuma longa粉末)、トリス-HCl (Sigma Catalog #T-5941, St. Louis, MO)、超純水(レジスタンス=18メガオーム-cm 脱イオン水)。
【００７４】
(一般的手順) 酸素フリーの1.0Mトリス-HCl緩衝液(pH 8.0)を以下のように調整した。1000 mLビーカー中で、12.11g Trizma HClを900mLの超純水に溶解した。ビーカーを攪拌棒と共に攪拌プレート上に配置した。NaOHを、pHが8.0に達するまで加えた。容積を、最終容積100OmLに調整し、1000mL貯蔵ボトル中で貯蔵した。
【００７５】
トリス-HCl緩衝液を、上蓋を緩めて真空チャンバ中に配置し、緩衝液からの発泡が止まるまで空気ポンプのスイッチを入れた。その後真空チャンバを止め、貯蔵ボトルをきつく覆った。酸素フリーのトリスHCl緩衝液を用いるたびにこの工程を繰り返した。
【００７６】
1mLの酸素フリーのトリス- HCl緩衝液に、1.3mgの(-)エピネフリン、0.3mgの還元グルタチオン及び1.3mgのヘマチンを加えることにより、1mLの補因子(cofactor)溶液を調製した。試験材料の溶液を必要に応じて調製した。すなわち、10mgのアスピリンを計量し、1mLのDMSO中に溶解した。
【００７７】
酵素、すなわちプロスタグランジンE2又はプロスタグランジンF2アルファは、以下のように酸素フリーのトリス-HCl緩衝液に溶解した：氷上で、 40,000単位/mLの酵素6.5μLを取り、酸素フリーのトリス-HCl緩衝液643.5μLに加えた。この酵素溶液は60回の反応に充分であった。COX-1酵素溶液を以下のように調製した：15mLの遠心管中で、1回の反応当たり40,000単位/mLのCOX-1酵素10μLを、50μLの補因子溶液を含む酸素フリーのトリス-HClに加えた。混合物を氷上で5分インキュベートした。60回の反応について、650μLの酵素を、3.25mLの補因子溶液を含む酸素フリーのトリス-HCl緩衝液に加えた。
【００７８】
96穴プレートの各穴中で、60μLの酵素溶液を20μLの試験溶液と混合した。試験溶液の最終濃度は、100, 50, 25, 12.5, 6.25及び3.12μg/mLであった。プレートを氷上で10分プレインキュベートした。20μLのアラキドン酸(30μM)を加え、37℃で15分間インキュベートした。
【００７９】
100mL貯蔵ボトル中で12.1N HClを希釈することにより、2M HClを調製した。83.5mLの超純水を加え、次いで16.5mLの12.1N HClを加えた。これを100mL貯蔵ボトル中に保管し、安全キャビネット中に置いた。10μLの2M HClを加え、反応を終了させた。最終溶液を、PGE2アッセイの上清として使用した。
【００８０】
培地中のPGE2濃度の測定
手順は、Hamberg, M.及びSamuelsson, B.(J. Biol. Chem. 1971. 246, 6713-6721)に本質的に記載されたものに準じ、ただし、市販の非放射性手順を用いた。
【００８１】
(装置) フリーザー, -3O℃(Forma Model #F3797)、加熱攪拌プレート(VWR Catalog #33918-262, Rochester, NY)、マルチチャネルピペット, 12-チャネル(VWR, Catalog #53501-662, Rochester, NY)、orbital shaker platform(Scienceware #F37041-0000, Pequannock, NJ)、ピペット補助器具(VWR, Catalog #53498-103, Rochester, NY)、ピペット, 0.5〜10μL(VWR, Catalog #4000-200, Rochester, NY)、ピペット, 100〜1000μL(VWR, Catalog #4000-208, Rochester, NY)、ピペット, 2〜20μL(VWR, Catalog #4000-202, Rochester, NY)、ピペット, 20〜200μL(VWR, Catalog #4000-204, Rochester, NY)、プレートリーダー(Bio-tek Instruments Model #Elx800, Winooski, VT)、 PURELAB Plus Water Polishing System(U.S. Filter, Lowell, MA)、冷蔵庫, 4℃(Forma Model #F3775, Marietta, Ohio)。
【００８２】
(化学薬品、試薬及び緩衝液)
プロスタグランジンE2 EIAキット-モノクローナル480穴(Cayman Chemical Catalog # 514010, Ann Arbor, MI)、遠心管, 50mL, 円錐型, 滅菌(VWR Catalog #20171-178, Rochester, NY)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM) (Mediatech Catalog #10-013-CV, Herndon, VA)、目盛付シリンダー100mL(VWR Catalog #24711-310, Rochester, NY)、キムワイプ(Kimberly Clark Catalog #34256, Roswell, GA)、マイクロ遠心チューブ1.7 mL (VWR Catalog #20172-698, Rochester, NY)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech Catalog #30-001-CI, Herndon, VA)、0.5-10μLピペット用ピペットチップ(VWR, Catalog #53509-138, Rochester, NY)、100-1000μLピペット用ピペットチップ(VWR, Catalog #53512-294, Rochester, NY)、2-20μL及び20-200μLピペット用ピペットチップ(VWR, Catalog #53512-260, Rochester, NY)、ピペット25mL (Becton Dickinson Catalog #7551, Marietta, OH)、貯蔵ボトル100mL (Corning Catalog #1395-100, Corning, NY)、貯蔵ボトル1000mL (Coming Catalog #1395-1L, Coming, NY)、超純水(レジスタンス=18メガオーム-cm 脱イオン水)。
【００８３】
(一般的手順) EIA緩衝液濃縮物(EIA Buffer Concentrate)(vial #4)の内容物を90mlの超純水で希釈して、EIA緩衝液を調製した。全ての結晶が除去されるようVial #4を数回洗浄し、100mL貯蔵ボトル中に置き、4℃で保管した。
【００８４】
洗浄緩衝液濃縮物(Wash Buffer Concentrate)(vial #5)超純水で1:400で希釈することにより、洗浄緩衝液を調整した。次いで、0.5ml/LのTween 20 (vial #5a)を加えた(正確な計測のためシリンジを用いた)。2.5mlの洗浄緩衝液濃縮物、0.5mlのTween-20及び997mlの超純水を加え1L洗浄緩衝液濃縮物を調整した。溶液を1L貯蔵ボトル中4℃で保管した。
【００８５】
プロスタグランジンE2標準物を、以下のように再構成した。エタノール中で数回充填及び排出を繰り返すことによって、200μLピペットチップを平衡化させた。このチップを用いて、100μLのPGE2標準物(vial #3)を1.7mLマイクロ遠心チューブに移した。900μlの超純水を該チューブに加え、これを 4℃で保存した(6週間まで安定であった)。プロスタグランジンE2アセチルコリンエステラーゼトレーサーを、以下のように再構成した。50mL遠心管中で、100μLのPGE2トレーサー(vial #2)を、30mLのEIA緩衝液と混合し、4℃で保存した。
【００８６】
プロシタグランジンE2モノクローナル抗体を以下のように再構成した。50mL遠心管中で、100μLのPGE2抗体(vial #1)を30mLのEIA緩衝液と混合し、4℃で保存した。
【００８７】
5mLのペニシリン/ストレプトマイシンを500mLのDMEM 中に加えることにより、ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMを調製し、4℃で保存した。
【００８８】
プレートを以下のように準備した：各プレートは、少なくとも2つのブランク(B)、2つの非特異的結合穴(NSB)、2つの最大結合穴(B０)及び2重の8点の標準曲線ランを(Sl -S 8)を有した。各試料は、少なくとも2つの希釈濃度でアッセイし、各希釈を2重のランで行った。
【００８９】
標準物を以下のように調製した：8つの1.7mLマイクロ遠心チューブを、チューブ1〜8とラベルした。900μLのDMEMをチューブ1に加え、500μLのDMEMをチューブ2〜8に加えた。100μLのPGE2標準物をチューブ1に加え混合した。500mLの溶液をチューブ1から取ってチューブ2に加え、この工程をチューブ8まで繰り返した。
【００９０】
50mLのEIA緩衝液及び50μlのDMEMをNSB穴に加えた。50μlのDMEMをB0穴に加えた。50mLの溶液をチューブ#8から取り、最低濃度の標準物穴両方(S 8)に加えた。50mLをチューブ#7から取り、次の2つの穴のそれぞれに加えた。これをチューブ#1まで続けた(8つの標準物全てについて同じピペットを用い、新たな各標準物はその標準物中でピペッティングを行ってチップを平衡化させるよう留意した)。P200を用い、50μlの各濃度の各試料を試料穴に加えた。
【００９１】
l2チャネルピペットを用い、全活性(TA)及びブランク(B)穴以外の各穴に、プロスタグランジンE2アセチルコリンエステラーゼトレーサー50μlを加えた。l2チャネルピペットを用い、全活性(TA)、(NSB)及びブランク(B)穴以外の各穴に、プロスタグランジンE2モノクローナル抗体50μlを加えた。プレートをプラスチックフィルム(item #7)で覆い、4℃で18時間インキュベートした。
【００９２】
プレートを以下のように操作した：50mL遠心管中で、エルマン試薬(vial #8)の100μLバイアル1つを50mLの超純水によって再構成した 。これを光から保護し、同日に使用した。穴を洗浄し、l2チャネルピペットを用いて洗浄緩衝液で5回リンスした。200mLのエルマン試薬をl2チャネルピペットを用いて各穴に加え、5μLのトレーサーをPl0ピペットを用いて全活性(TA)穴に加えた。プレートをプラスチックフィルムで覆い、暗所中60〜90分、オービタルシェーカー上に置いた。
【００９３】
405及び420nmの間の単波長を用いてBio-tek プレートリーダーでプレートを読んだ。各プレートを読む前に、底部をキムワイプで拭いた。プレートは、穴における吸収が0.3〜0.8A.U.の範囲内のときに読まれなければならない。穴の吸収が1.5を超えた場合にはこれを洗い、新鮮なエルマン試薬を加え、その後再度操作した。
【００９４】
相乗及び組み合わせ指数の計算
クルクミノイドとアンドログラホリドとの間の相乗をCalcuSyn (BIOSOFT, biosoft.com)を用いて評価した。この統計学的パッケージは、T-C Chou及びP. Talaly (Trends Pharmacol. Sci. 4:450-454)に記載されたメディアン効果(半数効果、50%効果)法を用いて多剤の用量-効果の算出を行う。上記文献を本明細書に参照として援用する。
【００９５】
簡潔には、可能な最もシンプル式：fa/fu=(C/Cm)mにおいて“用量”及び“効果”を相関させる。式中、Cは化合物の濃度又は用量であり、Cmは、効力を示す有効な用量の中央値である。Cmは、メディアン効果プロットのx切片から決定される。試験材料の濃度により影響を受ける分画はfaであり、濃度により影響を受けない分画はfuである(fu=1-fa)。指数部mは、用量-効果曲線のシグモイド性又は形を示すパラメータである。このパラメータは、メディアン効果プロットの傾きにより見積もられる。
【００９６】
メディアン効果プロットは、x=log(C)対y=log(fa/fu)のグラフであり、Chouのメディアン効果等式の対数形をベースとする。メディアン効果の式に対するデータの適合度は、メディアン効果プロットの線形相関の相関係数rにより表される。通常、酵素又は受容体系からの実験データはr＞0.96、組織培養からはr＞0.90、動物系からはr＞0.85を有する。
【００９７】
試験化合物の相乗作用は組み合わせ指数(combination index)(CI)パラメータを用いて定量した。Chou-TalalyのCIは、多剤の用量-効果をベースとしており、酵素の動力学的モデルから導かれている(Chou, T-C. and Talaly, P. (1977) A simple generalized equation for the analysis of multiple inhibitions of Michaelis-Menten kinetic systems. J. Biol. Chem. 252: 6438-6422 )。この等式は相乗作用又は拮抗作用よりむしろ相加的効果のみを決定する。しかし、われわれは、ChouとTalalyにより1983年に提案された(Trends Pharmacol. Sci. (1983) 4:450-454)期待される相加的効果よりも高い効果として相乗作用を、そして期待される相加的効果よりも低い効果として拮抗作用を定義する。相加的効果としてCI=1との表記を使用し、同じ作用様式を有する相互に排他的な化合物に関して、又は全体として独立した作用様式を有する相互に非排他的な薬剤に関して、我々は以下の関係を得る：CI＜1、=1、及び＞1は、それぞれ相乗作用、相加作用、及び拮抗作用を示す。
【００９８】
2成分の組み合わせの期待されるメディアン阻害濃度は、以下の関係を用いて予測した：
[1/IC50期待値] = [A/IC50A] + [B/IC50B]
式中、Aは組み合わせ中の成分Aのモル分率であり、Bは組み合わせ中の成分Bのモル分率である。
【００９９】
表4は、RAW 264.7細胞アッセイにおけるCOX-2のPGE2産生に対する、クルクミン及びホップ抽出物のメディアン阻害濃度の、観測値及び期待値を示す。クルクミンとホップ抽出物の10:1組み合わせについてのIC50期待値は1.6μg/mLであり、一方、観測値は0.77μg/mL、すなわち2倍の大きさであった。このレベルの差異は予期せぬものであり、クルクミンとホップ抽出物の10:1組み合わせの、組み合わせCOX-2阻害活性についての新規発見である。
【０１００】
【表４】
2008519852.tif 000005
【０１０１】
RAW 264.7細胞モデルにおけるPGE2のCOX-2産生阻害に対する、クルクミンとホップ抽出物の10:1組み合わせについての統計分析を表5に示す。この組み合わせCIは、IC50、IC75及びIC90について、それぞれ0.490、0.472及び0.454であった。これらのCI値は、用量-応答曲線の全てにわたって、クルクミンとホップ抽出物との間の強力な相乗を示す。
【０１０２】
【表５】
2008519852.tif 000006
【０１０３】
RAW 264.7細胞モデルにおけるクルクミン単独のCOX-2メディアン阻害濃度は、4.01μg/mLであった(表6)。クルクミンによるCOX-2酵素活性の阻害は、IC5010.0μg/mLと、幾分高かった。ホップ抽出物はCOX-2によるPGE2阻害についてIC50 0.21μg/mLを示し、COX-1酵素阻害についてのIC50は6.25μg/mLと予測された：クルクミン単独のCOX-2特異性は2.5であり、ホップ抽出物については29.5であった。クルクミンとホップ抽出物の11の処方は48.6〜11.2の間のCOX-2特異性を示し、メディアンCOX-2特異性は17.4であった。クルクミンとホップ抽出物の組み合わせは全て、予期せぬことに、COX-2の阻害を介して特異的にPGE2産生を制限するようデザインされた医薬製品において最小値として提案されているノミナルな5.0よりも、大きなCOX-2特異性を示した。この発見は、クルクミンとホップ抽出物の組み合わせが、COX-1阻害に伴って見られるGI副作用なしに、有力な抗炎症性製剤として機能することが出来ることを示す。
【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
実施例2 外傷後の関節機能の正常化
本発明の代表的組成物としての栄養補助食品は経口製剤(すなわち錠剤)であることができ、以下の組み合わせのうちの１つを供給するものであろう：(a)クルクミノイド15mg/kg/日及びフムロン6.0mg/kg/日；(b)クルクミノイド15mg/kg/日及びウプロン6.0mg/kg/日；(c) クルクミノイド15mg/kg/日及びジヒドロイソフムロン6.0mg/kg/日。運動又は反復的動きストレスに起因する肉体的外傷の後の関節の動きの正常化は、2〜10用量の後に生じると期待されるであろう。この結果は、全ての動物において期待されるであろう。
【０１０６】
実施例3 酒土性座瘡(Acne Rosacea)の処置におけるローション製剤の臨床的有効性
ローションは、以下のうちの１つを含むよう設計された：(a)クルクミノイド0.1%wt及びフムロン0.5%；又は(b)クルクミノイド0.1%wt及びルムロン0.5%。これを健康担当医によって診断され、独立した委員会に認定された皮膚科医に確認された、酒土性座瘡赤鼻を示す患者の患部に適用した。1週間前に、患部の表面領域の定量及び赤みの診断のために、自己評価テストを行った。加えて、患者の処置状態を知らない専門臨床スタッフにより同様の変化をスコア化した。これらの評価を、0、7、14及び21日目に繰り返した。
【０１０７】
研究開始時に、患者をランダムに試験製剤又はプラセボに割り当てた。試験製剤又はプラセボを1日1又は2回患部に適用した。例えば糖尿病、高血圧等の健康状態の処置は、研究中認められた。4回の観察期間のそれぞれについて、試験製剤とプラセボとの間のスコアを統計的に比較した。ローション製剤である本発明の組成物で処置した患者において、評価した各項目の患者のスコアが試験前スコアから20%より大きく改善した場合、改善したと考えた。組み合わせ製剤とプラセボコントロールの間で、改善を示した人の%を比較した。2つの群における差異は、帰無仮説が棄却され正しいとされるときの期待値が5%未満である場合、統計的に有意であると考えられた。
【０１０８】
実施例4 乾癬の処置におけるローション製剤の臨床的有効性
本実施例は、実施例3に記載したのと同様の手順で行った。ただし、組成物は、患者のの担当医によって診断され、独立した委員会に認定された皮膚科医に確認された乾癬を示す患者の患部に適用した。1週間前に、患部表面領域の定量及び皮膚状態の診断のために、自己評価テストを行った。加えて、患者の処置状態を知らない専門臨床スタッフにより同様の変化をスコア化した。これらの評価を、0、7、14及び21日目に繰り返した。
【０１０９】
研究開始時に、患者をランダムに試験製剤又はプラセボに割り当てた。試験製剤又はプラセボを1日1又は2回患部に適用した。例えば糖尿病、高血圧等の健康状態の処置は、研究中認められた。4回の観察期間のそれぞれについて、試験製剤とプラセボとの間のスコアを統計的に比較した。試験ローション製剤である本発明の組成物で処置した患者において、評価した各項目の患者のスコアが試験前スコアから20%より大きく改善した場合、改善したと考えた。組み合わせ製剤とプラセボコントロールの間で、改善を示した人の%を比較した。2つの群における差異は、帰無仮説が棄却され正しいとされるときの期待値が5%未満である場合、統計的に有意であると考えられた。
【０１１０】
実施例5 アルツハイマー病の処置における製剤の有効性
実施例2に記載の経口製剤を、患者の担当医によって診断され、独立した委員会に認定された神経科医に確認された初期段階のアルツハイマー病(AD)を示す患者に投与した。臨床試験2週間前に、患者は、ミニ精神状態試験(MMSE)、アルツハイマー病評価スケール(ADAS)、ボストン命名試験(BNT)及び兆候試験(TT)のような適切な精神神経学的試験を受けた。神経性神学的試験は、臨床試験の0日目、6週間目及び3ヶ月目に繰り返した。試験は、患者の処置法を知らない精神神経科医によって行われた。
【０１１１】
研究開始時に、患者をランダムに試験製剤又はプラセボに割り当てた。試験製剤及びプラセボを1日1又は2回経口服用した。例えば糖尿病、高血圧等の健康状態の処置は、研究中認められた。各3回の観察期間のそれぞれについて、試験製剤とプラセボとの間のスコアを統計的に比較した。処置なしでは、臨床試験の過程での試験スコアの顕著な低下がADの自然な経過であった。試験製剤である本発明の組成物で処置した患者は、臨床試験の過程で患者のスコアが同一のまま又は改善した場合に改善したと考えた。
【０１１２】
実施例6 大腸癌の処置及び予防における経口製剤
実施例2に記載の経口製剤を、患者の担当医によって診断され、独立した委員会に認定された腫瘍学者に確認された初期段階の大腸癌を示す患者に投与した。
【０１１３】
研究開始時に、患者をランダムに試験製剤又はプラセボに割り当てた。試験製剤及びプラセボを1日1又は2回経口服用した。例えば糖尿病、高血圧等の健康状態の処置は、研究中認められた。1、2、6及び12ヶ月目に内視鏡を用いた評価を行った。4回の追跡臨床調査のいずれか1回の間における腫瘍の再発の形跡を、処置失敗と考えた。試験製剤とプラセボとの間の処置失敗%を比較した。記載の実験条件下で、コントロール群に対し、試験材料は腫瘍発生を低下させることが予想された。2つの群における差異は、帰無仮説が棄却され正しいとされるときの期待値が5%未満である場合、統計的に有意であると考えられた。
【０１１４】
実施例7 過敏性腸症候群の処置のための経口製剤
実施例2に記載の経口製剤を、患者の担当医によって過敏性腸症候群であると診断された患者に投与した。24時間以内に正常な腸機能が回復した。
【０１１５】
実施例8 変形性関節炎における関節機能の正常化
実施例2に記載の組成物を用いて、グルコサミン又はコンドロイチン硫酸の存在又は非存在下、2〜20投与の後に、関節炎による関節硬直の正常化が起こる。加えて、該組成物は、従来の非ステロイド抗炎症剤のようにこれらの2つのプロテオグリカン成分の正常関節再構築効果を妨害することがない。
【０１１６】
まとめると、特定の態様は、誘導性COX-2活性の阻害のための組成物であってCOX-1活性への影響が最小であり、前記組成物は、第1成分として有効量のクルクミノイド種を含み、アルファ酸種、ベータ酸種又はその誘導体からなる群から選択される第2成分の有効量を含む。クルクミノイド種は、好ましくはクルクミン、デメトキシクルクミン又はビスデメトキシクルクミンである。アルファ酸種は、好ましくは、フムロン、コフムロン、イソフムロン、イソプレフムロン、フルポン、アドフムロン、キサントフモールA又はキサントフモールBである。ベータ酸種は、好ましくは、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、テトラヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロコルプロン又はジヒドロイソフムロンである。本発明の組成物の第1又は第2成分は、医薬的グレード又は植物もしくは植物抽出物由来であり得る。第1又は第2成分は、単糖類又は二糖類、アミノ酸、スルフェート、スクシネート、アセテート又はグルタチオンのような化合物とのコンジュゲートでもあり得る。好ましい態様の組成物は医薬的に許容される担体中に製剤化することができ、抗酸化剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂質、炭水化物、グルコサミン、コンドロイチン硫酸又はアミノ糖のような添加物を含むことが出来る。
【０１１７】
他の態様は、炎症の徴候を示す動物における該徴候の低減のための、好ましい態様の組成物の栄養補助食品の方法を含む。組成物は、約0.001〜約30.0mg体重/日の各クルクミノイド種及び約0.5〜約20.0mg/kg体重/日のアルファ酸種又はベータ酸種を前記投与が提供するような投与形態に製剤化される。組成物は、約0.1〜約50μMの各クルクミノイド種及び約0.001〜約50μMの各アルファ酸種又はベータ酸種の血清濃度を維持するのに充分量投与される。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、鳥類、爬虫類、両生類、ウマ又は反芻動物であり得る。投与は、経口、局所、経皮又は経粘膜送達系であり得る。
【０１１８】
従って、様々な製剤のうち、第1成分としてクルクミノイドを含み、アルファ酸及びベータ酸からなる群から選択される第2の化合物を含む組成物が開示された。これらの組み合わせは、物理的又は化学的創傷あるいは生物学的剤又は未知の病因に起因する異常免疫刺激に対して相乗的抗炎症作用を提供することが出来る。本発明の精神から離れることなく、様々な変更及び自明な性質の修飾を行うことができ、そしてそのような変更及び修飾は全て添付の請求の範囲によって定義される本発明の範囲に含まれると考えられることは、当業者に容易に明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図1[A]-[F]は、クルクミノイド属の一般的化学構造を[A]並びにそれぞれクルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン、クルクミンのシス-トランス幾何異性体及びシクロクルクミンである、該属における種としての[B]、[C]、[D]、[E]及び[F]を図示する。
【図２】図2[A]及び[B]は、それぞれアルファ酸属の一般化学構造及び該属における種としてのフムロンを図示する。
【図３】図3[A]及び[B]は、それぞれベータ酸属の一般化学構造及びルプロンを図示する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際調査報告】
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