(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞培養に適した形状を有する細胞培養容器を提供することができ、さらに安価で観察が容易な細胞培養容器を提供する。【解決手段】細胞培養に適した形状を有する細胞培養容器、さらに安価で観察が容易な細胞培養容器を提供する。細胞培養容器１００は、蓋体１０と、容器本体２０と、板状基板３０を備えている。蓋体１０は、容器本体２０の開口部を覆う。容器本体２０は、細胞等の被培養物を収容する。板状基板３０は、容器本体２０の底部に形成された貫通孔を覆う。さらに、板状基板３０には、被培養物を培養するための微細凹凸パターンが形成されている。【選択図】図１
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【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも被培養物を収容する容器本体と、前記容器本体の開口部を覆う蓋体と、前記容器本体の底部に形成された貫通孔を覆う板状基板とを備えた細胞培養容器であって、
前記板状基板には、前記被培養物を培養するための微細凹凸パターンが形成されている細胞培養容器。
【請求項２】
被培養物を収容する容器本体と、前記容器本体の開口部を覆う蓋体を備えた細胞培養容器であって、
前記容器本体の底部には、前記被培養物を培養するための微細凹凸パターンが形成されている細胞培養容器。
【請求項３】
前記板状基板の厚さは、前記容器本体の底部の厚さよりも薄いことを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記板状基板の厚さは、０．０３ｍｍ〜１ｍｍであることを特徴とする請求項３記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記微細凹凸パターンにより複数の空間構造が形成され、該空間構造の幅が０．０１μｍ〜１０００μｍ、長さが０．０１μｍ〜１０００μｍ、高さが０．０１μｍ〜１０００μｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記微細凹凸パターンにより複数の空間構造が形成され、該空間構造は少なくとも一つの隣接する他の空間構造と互いに連通することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記微細凹凸パターンが設けられた領域に表面処理が行われていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項８】
前記板状基板は、透明樹脂基板であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記板状基板の面積は、前記容器本体の底部の面積２０％〜６０％であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項１０】
前記容器本体の底部の貫通孔の含む領域に凹部を設け、
前記板状基板を当該凹部に嵌入することを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項１１】
前記板状基板は、嵌合部材により前記凹部に着脱可能に固定されることを特徴とする請求項１０記載の細胞培養容器。
【請求項１２】
前記嵌合部材は、自己接着性樹脂よりなることを特徴とする請求項１１記載の細胞培養容器。
【請求項１３】
前記嵌合部材の厚さは、前記凹部の凹み以上であることを特徴とする請求項１１記載の細胞培養容器。
【請求項１４】
前記底面部に設けられた貫通孔は円形又は四角形であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項１５】
前記板状基板の形状が円形又は四角形であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項１６】
前記蓋体又は容器本体に灌流のための開口を設けたことを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養容器。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、薬物などの効果判定やその毒性を試験する場合に、培養細胞を用いて行うバイオアッセイ法、および治療を目的とした細胞の培養方法に用いられる細胞培養容器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索および薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。
単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くは細胞培養の方法により培養皿や試験管のなかで培養が行われている。この培養系のなかで種々の検査が行われる。
【０００３】
これらのアッセイは、通常均一な培養系を設定し、評価する薬物等の量、濃度などを変えてその効果をみるものである。そのため培養に用いる培養器も一定の均一に形成されたものが用いられる。この培養器は、培養皿というものが一般的に用いられる。培養皿として一般的に用いられているものには、シャーレ、または６ウェルプレート、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェルの各プレートがある（特許文献１参照）。最近の微量化への流れから、更に小口径で多数の培養皿からなる３８４ウェルプレートも使用され始めている。
また、被培養物の所定部位の位置特定を可能とするためにグリッド座標が設けられた培養容器も提案されている（特許文献２参照）。これらの培養皿や培養容器の底部は平坦な平板状である。
【０００４】
しかしながら、組織細胞の培養は、底部が平板状の細胞培養皿や培養容器で行うと、細胞が薄く伸びて方向性のない形態を取り、生体内で持っていた機能を示さなくなってしまう問題を有していた。細胞の活性を確認する方法として、老廃物の排出によるＰＨの変化や、炭酸ガスの放出を電気化学センサ等で測定が可能である。生体組織の測定データと、培養皿で培養した細胞の測定データを比較することが試みられているが、生体組織のデータを再現する値が、培養皿では再現できていないのが現状である。理由として、１個のウェルプレートは容器形状であるが、数ミクロンから数１０ミクロンのサイズである細胞にとっては、平板上での培養と変わらないことが考えられる。特に、培養が難しい、例えば肝細胞等の組織細胞の増殖では、生体内で持っていた機能をさせることが更に困難となる。
【０００５】
係る問題を解決する方法として、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微細な容器パターンを形成し、その微細な容器パターン内で細胞を培養させることが試みられている（特許文献３参照）。細胞を微細容器パターン内で培養し、立体的に細胞を増殖させることで、生体内で持っていた機能を発現しようとするものである。
【０００６】
しかしながら、この方法は、一部のバイオアッセイ法、または一部の治療を目的とした細胞培養にしか適用できないことが現状である。例えば、生体の心臓における心筋細胞は、脳からの電気シグナルの伝達によって、拍動している。生体の心筋細胞は、その拍動機能を行うために、方向性を持った配列で構成されている。したがって、バイオテクノロジー分野のなかで、人工臓器の組織再生に関する研究では、生体組織と同様、伸展方向が制御された細胞培養が必要とされるのに対し、現状の培養皿上での培養は、立体的な培養が困難であることに加え、伸展方向が制御できないため、研究試験の目的においても適用できない問題を有している。
【０００７】
また、治療を目的とした心筋培養の一つに、心筋梗塞により壊死した心筋組織の一部に、培養された心筋組織を移植することで、救命するための研究が行われている。心臓は、脳からの電気シグナルによって、心臓全体が大きく拍動している。心筋梗塞により、一部の心筋組織が壊死すると、心筋内での信号伝達が遮断されるため、心臓は細動といわれる小さな収縮を繰り返すことになる。この結果、心臓内への血液の滞留によって、血栓が生じ、脳組織に運ばれた場合は、脳梗塞といった２次的な症例を引き起こすことになる。細動が長期に至れば、死に至る可能性もある。この治療においては、人工臓器そのものを完成することが目的でなく、一部の組織の代替であるために、早期に実現することが望まれている。
【０００８】
しかしながら、現状の培養皿上での培養は、立体的な培養が困難であることに加え、伸展方向が制御できないため、この目的においても適用できない問題を有している。
【０００９】
【特許文献１】特開平１１−１６９１６６号公報
【特許文献２】特開２００１−１７１５７号公報
【特許文献３】特開平８−３２２５９３号公報
【考案の開示】
【考案が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、従来の細胞培養容器において細胞培養を行なうと、細胞が薄く伸びて生体内で有していた機能を示さなくなってしまうという問題がある。
本考案は、このような問題を解決するためになされたものであり、細胞培養に適した形状を有する細胞培養容器を提供することを第１の目的とする。さらに、安価で観察が容易な細胞培養容器を提供することを第２の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
かかる目的を達成するために、本考案にかかる細胞培養容器は、少なくとも被培養物を収容する容器本体と、前記容器本体の開口部を覆う蓋体と、前記容器本体の底部に形成された貫通孔を覆う板状基板とを備えた細胞培養容器であって、前記板状基板には、前記被培養物を培養するための微細凹凸パターンが形成されたものである。
【００１２】
本考案にかかる他の観点による細胞培養容器は、被培養物を収容する容器本体と、前記容器本体の開口部を覆う蓋体を備えた細胞培養容器であって、前記容器本体の底部には、前記被培養物を培養するための微細凹凸パターンが形成されたものである。
【００１３】
ここで、前記板状基板の厚さは、前記容器本体の底部の厚さよりも薄いことが好ましく、特に、前記板状基板の厚さは、０．０３ｍｍ〜１ｍｍであることが望ましい。
【００１４】
また、前記微細凹凸パターンにより形成され、被培養物が配置、培養される空間構造の幅が０．０１μｍ〜１０００μｍ、長さが０．０１μｍ〜１０００μｍ、高さが０．０１μｍ〜１０００μｍであることが望ましい。そして、前記微細凹凸パターンにより複数の空間構造が形成され、該空間構造は少なくとも一つの隣接する他の空間構造と互いに連通することが好ましい。
【００１５】
また、前記微細凹凸パターンが設けられた領域に表面処理が行われていることが望ましく、板状基板は、透明樹脂基板であることが望ましい。そして、板状基板の面積は、前記容器本体の底部の面積の１０％〜６０％であるのが好適である。
【００１６】
さらに、前記容器本体の底部の貫通孔の含む領域に凹部を設け、前記板状基板を当該凹部に嵌入するようにするとよい。特に、板状基板は、嵌合部材により前記凹部に着脱可能に固定されることが望ましい。また、嵌合部材は、自己接着性樹脂よりなることが好ましい。さらに、前記嵌合部材の厚さは、前記凹部の凹み以上であることが望ましい。
【００１７】
ここで、前記底面部に設けられた貫通孔は円形又は四角形であることが望ましく、前記板状基板の形状が円形又は四角形であることが望ましい。さらに、前記蓋体又は容器本体に灌流のための開口を設けるとよい。
【考案の効果】
【００１８】
本考案によれば、細胞培養に適した形状を有する細胞培養容器を提供することができ、さらに、安価で観察が容易な細胞培養容器を提供することができる。
【考案を実施するための最良の形態】
【００１９】
組織細胞の培養を市販されている細胞培養皿（シャーレ、またはウェルプレート）上で行うと、培養細胞は薄く伸びて方向性のない形態を取る。研究者は、細胞の活性を確認する方法として、老廃物の排出によるＰＨの変化や、炭酸ガスの放出を電気化学センサ等によって、生体組織の測定データと、培養皿で培養した細胞の測定データとを比較することを試みているが、生体組織のデータを示す値が、培養皿では再現できていないのが現状である。したがって、市販されている細胞培養皿上での培養では、生体内では持っていた機能を培養細胞が示していないと判断されている。そこで、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微細な容器パターンを形成し、その微細な容器パターン内で細胞を培養し、立体的に細胞を増殖させることで、生体内で持っていた機能を発現せしめるための研究が開始されたところである。
【００２０】
しかしながら、微細な容器パターンを有する培養皿上で培養した細胞からなる組織を、実際に治療に適用しようと考えた場合、培養細胞からなる組織の構造が生体と同じ配列構造を示していないため、細胞の立体的な培養が可能になっても治療用途に適用するには大きな障害が存在しているのが現状である。例えば、心筋梗塞により一部の心筋組織が壊死した結果、心筋内での信号伝達が遮断され、心臓が細動を引き起こす症例に適用する場合、心筋細胞の伸展方向が制御された組織を移植するのでなければ、心筋の信号伝達を回復させ、正常な心臓の拍動を再生させることができない。
【００２１】
本考案に係る細胞の培養方法によると、微細凹凸パターンを設けることにより、立体的な増殖が可能であることに加え、培養細胞の伸展方向が制御でき、かつ個々の空間構造で培養した細胞が連結することにより、生体組織と同様な組織を、所望の面積、厚さで得ることが可能となる。すなわち、医師、医工学の研究者、患者の望む培養組織を実現できる。微細凹凸パターンは、例えば、側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を配置するための複数の空間構造を有し、さらに、側壁に開口部を設けることで、複数の空間構造が連通した連結構造を形成することにより、実現可能である。
側壁を複数有することで、複数の空間構造を作製し、要求される用途に応じて空間構造のエリアサイズを設定する。
【００２２】
細胞培養において、擬似足場となる接着斑は、側壁面および／あるいは空間構造面に形成される。そして、細胞は空間構造内の中央で立体的に生育し、骨格構造を形成する。対向する側壁にも伸展した細胞は、開口部によって、それぞれの空間構造で培養された細胞どうしが結合し、伸展方向が制御された培養組織を製造することが可能となる。培養する細胞種に応じ、側壁、空間構造、開口部の寸法を設定することにより、多様な培養系において伸展方向の制御が可能になると推測される。開口部とは、側壁によって形成された空間構造どうしが、連結するための構造を開口部とする。例えば、側壁どうしの隙間、側壁の凹み構造、側壁の内部に形成されたトンネル構造等も開口部として細胞の接着斑どうしを結合するのに有効である。
【００２３】
板状基板や細胞培養容器の底部に形成された側壁、および側壁によって形成される空間構造の寸法は、細胞を培養する目的において最適な範囲であることが必要である。側壁によって形成される空間構造が、大きすぎると、細胞は平板上での培養と同様、薄く伸びて立体的な構造を示さず、その伸展方向を制御することはできない。空間構造が小さすぎると、その空間構造に細胞が入ることができなくなる。したがって、空間構造の寸法は、培養する細胞種に応じて、単一、または複数個が収納できる範囲とすることが望ましい。
【００２４】
本考案にかかる細胞培養容器の構造を図を用いて説明する。図１は、蓋体を装着した状態の細胞培養容器を示す一部断面図である。本考案にかかる細胞培養容器１００は、蓋体１０、容器本体２０、板状基板３０を備えている。蓋体１０を装着した状態の細胞培養容器１００は、円柱状の形状を有し、その上面及び底面の直径は例えば２０ｍｍ〜８０ｍｍであり、高さは５ｍｍ〜４０ｍｍである。
【００２５】
蓋体１０は、図２の一部断面図に示されるように、上面部１１と側壁部１２を有している。本例の上面部１１は、正円形状の平板からなる。側壁部１２は、上面部１１の縁部から略垂直に円筒状に突出して形成される。図２において下側に開口を有するように、側壁部１２が形成されている。この例にかかる蓋体１０は、円筒状の形状を有しているが、四角筒状の形状を有していてもよい。側壁部１２により形成された開口には、後述する容器本体２０の側壁部２２が嵌入される。図１に示されるように、この例にかかる蓋体１０の側壁部１２の高さは、容器本体２０の側壁部２２の高さよりも低いため、嵌合状態において、蓋体１０の側壁部１２の先端部は、容器本体２０の側壁部２２の中間付近に位置する。
【００２６】
図３に示されるように、容器本体２０は、側壁部２２と底部２３を備え、上方に開口した開口部２１が形成される。容器本体２０の開口部２１内に被培養物や培養液が収容される。開口部２１は、蓋体１０を装着することによって覆われ、密閉状態となる。本例の底部２３は、その中央部に貫通孔２４が形成され、リング状の平板からなる。本例の貫通孔２４は、円形であるが、四角形等の多角形であってもよい。側壁部２２は、底部２３の縁部から略垂直に円筒状に突出して形成される。図３において上側に開口部２１を形成するように、側壁部２２が形成されている。
【００２７】
容器本体２０の側壁部２２には、灌流するための貫通孔（開口）を設けてもよい。灌流するための貫通孔は、入口及び出口ともに容器本体２０の側壁部２２に設けてもよいが、入口は蓋体１０の上面部１１に設けてもよい。
蓋体１０や容器本体２０は、例えばプラスチック素材やガラスよりなる。蓋体１０や容器本体２０は、精度が要求されないため、板状基板３０よりも安価な素材を用いることが望ましい。
【００２８】
板状基板３０は、容器本体２０とは別体で構成されている。このため、蓋体１０や容器本体２０とは異なる材料により微細加工が必要な板状基板３０の材料を選択することができる。例えば、蓋体１０や容器本体２０に安価な素材を用い、微細加工が必要な板状基板３０に高価な素材を用いることによって細胞培養容器を全体として安価かつ精度よく製造することが可能となる。
【００２９】
板状基板３０の一面には、微細な凹凸パターンが形成されている。この板状基板３０の微細な凹凸パターンが形成された面上に被培養物が配置され、培養される。微細凹凸パターンは、被培養物を培養するために形成され、より詳細には、被培養物に対して接着、増殖、分化、伸展、配向等の制御を行うために形成されている。特に、板状基板３０は平板であるため、細胞培養容器の底部に微細凹凸パターンを形成する場合と比較して、微細凹凸パターンを容易に形成することができる。微細凹凸パターンの具体的な構造については後に詳述する。
【００３０】
板状基板３０は、容器本体２０の底部２３に形成された貫通孔２４を覆うような大きさを有する。本例の板状基板３０は、当該貫通孔２４が円形であるため、当該貫通孔２４よりも直径が大きい円形の平板よりなる。板状基板３０の形状は円形でなくとも、四角形などの多角形状であってもよい。板状基板３０の面積は、板状基板３０の破壊を防止するという観点から、底部２３の面積の２０％〜６０％程度がよく、より好ましくは、４０％〜６０％程度がよい。２０％未満であると、被培養物を培養する面積が小さくなり、６０％を越えると板状基板の貼り合せが難しいためである。
【００３１】
ここで、図４は図１のＰ部分を拡大した断面図である。図４に示されるように、容器本体２０の底部２３の貫通孔２４の近傍は、板状基板３０が嵌入される凹部２３１が設けられている。即ち、底部２３の厚みは、貫通孔２４の近傍において他の部分よりも薄く形成されている。凹部２３１は、円形に切り欠かれた形状を有している。凹部２３１の直径ａは、例えば１０ｍｍ〜５０ｍｍであり、貫通孔２４の直径ｂは５〜４０ｍｍである。板状基板３０は、凹部２３１に例えば接着剤により接着固定される。このように、底部２３に凹部２３１を設けることによって、板状基板３０を容器本体２０に貼り合せるときの位置合わせが容易になり、これによって被培養物の培養中に接着剤等の染み出しを防止できる。
【００３２】
板状基板３０の厚さは、例えば、０．０３ｍｍ〜１ｍｍであり、より好ましくは、０．１ｍｍ〜０．３ｍｍである。０．０３ｍｍ未満であると、微細凹凸パターンの加工が難しく、１ｍｍを越えると顕微鏡観察において充分な焦点距離が得られないためである。特に、被培養物を顕微鏡等を用いて高倍率により観察する場合には、倍率に応じた厚さを選択することが好ましい。特に、対物レンズが１００倍以上の高倍率により被培養物を観察する場合には、０．２ｍｍ以下の板厚であることが望ましい。
【００３３】
図５に示されるように、板状基板３０を嵌入するための凹部２３２を内側に設けてもよい。この場合には、内側から板状基板３０が凹部２３２内に嵌入される。このとき、板状基板３０の厚さを凹部２３２の凹み以上とすることで、灌流の際に培養液が滞留する影響を抑制できる。
【００３４】
さらに、図６Ａに示されるように、内側に設けられた凹部２３２に嵌入された板状基板３０を押圧固定する嵌合部材４０を設けるようにしてもよい。嵌合部材４０は、図７に示されるように、外側に設けられた凹部２３３に板状基板３０を押圧固定する場合にも用いられる。
また、図６Ａに示すように、嵌合部材４０の内径を凹部２３２における貫通孔の内径より小さくすることにより、嵌合部材４０の反対側から板状基板３０に押圧して板状基板３０を取り外す場合、被培養物を培養している微細パターン領域にダメージを与えることなく容易に板状基板３０を取り外すことが可能となる。
【００３５】
本例の嵌合部材４０は、中央部に貫通孔が設けられたリング形状を有し、市販のシール材により形成可能である。嵌合部材４０は、例えば、自己粘着性を有するポリジメチルシロキサン等のシリコンゴム系樹脂よりなる。
【００３６】
このように、嵌合部材４０により板状基板３０を固定する構成を採用することによって、被培養物を培養後、板状基板３０のみを取り外し、移植等を行なうことができる。
【００３７】
板状基板３０は、気泡を排除し、細胞を固定化するために、表面処理を施すことが好ましい。気泡を排除し、基板表面に培養液を接触させるためには、基板表面を親水化することが効果的である。基板表面を親水化するための表面処理の方法は、種々の方法が適用できる。例えば、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射などを用いる方法、親水性の高分子材料を水溶液に溶解させコートする方法、蒸着重合、プラズマ重合などがあげられる。また、コートした高分子材料の培養液中への耐溶解性を高める方法としては、基板表面の官能基にコート材料をグラフトさせる方法が知られている。
【００３８】
細胞を固定化するには、基板表面の疎水化、不活性金属の成膜、または細胞の付着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法が挙げられる。疎水化の方法として、例えば、スパッタリング、蒸着などによる疎水性金属の成膜、蒸着重合、プラズマによる高分子材料の成膜などがあげられる。不活性金属の成膜には、例えば、金を蒸着、またはスパッタリングする方法などがあげられる。また、表面処理の際、一部分を被覆しておき、任意の部分を改質することも可能である。
【００３９】
板状基板３０に使用される材質は、表面処理の効率から、プラスチック素材が好適である。板状基板３０は、２Ｐ樹脂により微細凹凸パターンを形成したガラス基板であってもよい。また、細胞の成長過程を観察していく場合、例えば蛍光顕微鏡を用いて観察するときには透過光観察が可能な透明材料が好ましい。樹脂材料としては特に限定されないが、例えば、アクリル系樹脂、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂（ＭＳ樹脂）、ポリカーボネート系樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリグリコール酸などのエステル系樹脂、ポリビニルアルコールエチレン・ビニルアルコール共重合樹脂などの酢酸ビニル系樹脂、スチレン系エラストマーなどの熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン樹脂、ポリビニルブチラール系樹脂、ポリエチレン、シクロオレフィン等のオレフィン系樹脂等を挙げることができる。これら樹脂はさらに他モノマーが共重合したものであってもよい。
【００４０】
細胞培養容器１００および板状基板３０をプラスチック素材により成形する場合には、成形方法は、金属構造体を型として、樹脂成形品を形成する方法が好適である。金属構造体は、細胞培養容器１００では、例えば、鋼材をボールエンドミルにより切削加工を実施することにより形成できる。板状基板３０では、例えば、ＵＶ光を露光光源としたフォトリソグラフ法によりレジストパターン体を作製、その表面にスパッタリング法によりニッケルを堆積させた後、電気メッキを実施することにより形成できる。
【００４１】
樹脂成形品の形成方法は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。蓋体１０・容器本体２０については射出成形により成形し、精度が要求される板状基板３０についてはプレス成形により成形することが望ましい。所定の寸法を選択した金属構造体を型として射出成形で樹脂成形品を形成する場合、金属構造体の形状を高い転写率で樹脂成形品に再現することが可能である。転写率を確認する方法としては、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）等を使用して行うことができる。
【００４２】
これらの樹脂は必要に応じて滑剤、光安定剤、熱安定剤、防曇剤、顔料、難燃剤、帯電防止剤、離型剤、ブロッキング防止剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤などの１種または２種以上を含有することができる。
【００４３】
次に、図８を用いて、板状基板３０に形成された微細凹凸パターンの構造例について説明する。図８は、板状基板３０の上面図である。図に示されるように、複数の側壁３１が格子状に形成されている。側壁３１と隣接する側壁３１の間に開口部３２が設けられている。４つの側壁３１に囲まれた領域が空間構造３３である。この例では、空間構造３３は全て同じ面積を有してる。
【００４４】
細胞を培養するための空間構造３３において、側壁３１の壁部または空間構造３３の底部などに細胞の増殖を促進するためのさらに微細な凹凸パターンを有してもよい。この微細な凹凸パターンを有することで、細胞の固定化に必要な擬似足場と呼ばれる接着斑が形成しやすくなり、細胞の分化、増殖を促進することが可能となる。
【００４５】
空間構造３３の幅は、好ましくは０．０１μｍ〜１０００μｍであり、さらに好ましくは、５μｍ〜５００μｍである。空間構造３３の長さは、好ましくは０．０１μｍ〜１０００μｍであり、さらに好ましくは、５μｍ〜５００μｍである。空間構造３３の高さは、好ましくは０．０１μｍ〜１０００μｍであり、さらに好ましくは、５μｍ〜５００μｍである。側壁３１の幅は、好ましくは０．０１μｍ〜１０００μｍであり、さらに好ましくは、１μｍ〜５００μｍである。側壁３１の長さは、好ましくは０．０１μｍ〜１０００μｍであり、さらに好ましくは、１μｍ〜５００μｍである。側壁３１の高さは、好ましくは０．０１μｍ〜１０００μｍであり、さらに好ましくは、１μｍ〜５００μｍである。
【００４６】
本例における側壁３１の高さは２０μｍ、幅（Ｉ３）は１０μｍ、長さ（Ｉ１，Ｉ４）は６０μｍである。隣接する側壁３１の端部間の距離（Ｉ２，Ｉ５）は４０μｍ、隣接する平行な側壁３１の距離（Ｉ６，Ｉ７）は１００μｍである。微細凹凸パターンのサイズは本例に限らず、被培養物の種類等に応じて適宜選択可能である。また、微細凹凸パターンは上記のものに限られず、図９および図１０に示すような形状でもよい。さらに、図１１Ａ〜１９に示すような形状でもよいが、それらに限定されるものではない。
【００４７】
図１１Ａおよび図１１Ｂに示す形状では、凹凸パターンは２段の階段状に形成されている。図１１Ａは平面図、図１１Ｂは、図１１ＡのＡ−Ａ'断面図である。板状基板３０の培養面には、２段の側壁３１が形成される。すなわち、格子状に形成された第１の側壁３１１の上に直方体状の第２の側壁３１２がマトリクス状に形成されている。この第１の側壁３１１及び第２の側壁３１２によって形成される空間が空間構造３３となる。すなわち、隣接する第１の側壁３１１の間の空間及び第２の側壁３１２の間の空間が空間構造３３になる。第１の側壁３１１と隣接する第１の側壁３１１との間及び第２の側壁３１２と隣接する第２の側壁３１２との間の空間により、細胞を培養するための空間構造３３が形成される。第１の側壁３１１及び第２の側壁３１２は底面に対して略垂直に形成されている。従って、空間構造３３は２段の凹凸を有する階段状となる。第１の側壁３１１は、図１１Ａに示すように矩形状の空間構造３３の四辺を囲むよう格子状に配置されている。第２の側壁３１２は、隣接する空間構造３３の間の第１の側壁３１１の上に島状に配置されている。第２の側壁３１２は、矩形状の空間構造３３の四辺のそれぞれに対して設けられている。
【００４８】
図１２Ａ〜図１２Ｃに示す形状では、図１１Ａおよび図１１Ｂに示した空間構造３３に加え、その底面に凹み３４が形成されている。図１２Ａは平面図、図１２Ｂは図１２Ａに示された点線内の構成を拡大して示す平面図、図１２Ｃは、図１２ＢのＢ−Ｂ'断面図である。隣接する第１の側壁３１１の間において、底面に凹み３４が設けられている。凹み３４は隣接する第１の側壁３１１の間において、複数設けられている。従って、第１の側壁３１１の近傍において、板状基板３０の断面形状は、３段の階段状となる。凹み３４は空間構造３３の底面にマトリクス状に配置されている。
【００４９】
図１３の斜視図に示す形状では、２段の階段状の側壁３１が一列に並んで設けられている。側壁３１のそれぞれは奥行き方向に延在して設けられている。隣接する側壁３１の間の空間構造３３は培養液が流れる凹溝となる。隣接する空間構造３３は、側壁３１の外側で互いに連通している。ここで、隣接する側壁３１の間の空間構造３３が細胞を培養するための培地となる。図１３に示す形状にすることによって、飛躍的な培地の確保が可能となる。なお、板状基板３０の表面上において、複数の側壁３１が配列されている方向を幅方向とし、それと直交する方向を奥行き方向とする。ここで、第１の側壁３１１と第１の側壁３１１の上に設けられた第２の側壁３１２の奥行き方向の大きさは略一致している。
【００５０】
図１４の斜視図に示す形状では、２段の階段状の側壁３１がマトリクス状に配列されている。すなわち、図１４に示す例では、第１の側壁３１１の上に、第１の側壁３１１よりも小さい第２の側壁３１２が配置された構成を有している。この第１の側壁３１１及び第２の側壁３１２からなる側壁３１がマトリクス状に配列されている。隣接する空間構造３３は、第１の側壁３１１の上側で互いに連通している。側壁３１と側壁３１との間の空間構造３３において、細胞が培養される。すなわち、空間構造３３が細胞の培地となる。図１４に示す形状にすることによって、飛躍的な培地の確保が可能となる。
【００５１】
図１５の斜視図に示す形状では、第１の側壁３１１と第１の側壁３１１よりも高い第２の側壁３１２がそれぞれ異なる箇所に設けられている。すなわち、高さの異なる第１の側壁３１１と第２の側壁３１２とが別々に設けられている。具体的には、第２の側壁３１２が板状基板３０の両端にそれぞれ設けられ、その間に複数の第１の側壁３１１が設けられている。第２の側壁３１２は、板状基板３０の端縁に沿って設けられている。第２の側壁３１２は、中央に設けられた第１の側壁３１１よりも高くなっている。すなわち、第２の側壁３１２が第１の側壁３１１の側壁よりも高い橋梁となる。これにより、ＰＨの維持、細胞からの産出物質の拡散防止が可能となる。第１の側壁３１１は、第２の側壁３１２が設けられている方向に沿って１列に配列されている。そして、各々の第１の側壁３１１は、第２の側壁３１２が設けられている方向と直交する方向に設けられている。側壁のそれぞれは奥行き方向に延在して設けられている。隣接する側壁の間の空間構造３３は培養液が流れる凹溝となる。これにより、第２の側壁３１２と直交する方向に培養液が流れる。すなわち、板状基板３０の中央部を介して一端から他端へ、培養液が流れる。これにより、産出物質の拡散防止が可能となる。また、隣接する空間構造３３は、第１の側壁３１１の上側で互いに連通している。これにより、培養液を循環させることができる。
【００５２】
図１６の斜視図に示す形状では、図１５に示す例と同様に、第１の側壁３１１によって形成される空間構造３３が、板状基板３０の底面に複数の凹みとして設けられている。板状基板３０の両端には、それぞれ第２の側壁３１２が設けられている。すなわち、２つの第２の側壁３１２はそれぞれ板状基板３０の端辺に沿って設けられている。
【００５３】
図１７の斜視図に示す形状では、複数の空間構造３３が１枚の基板上に形成されている。空間構造３３は基板面上に縦、横に並んで配列されている。この空間構造３３の間には、溝状の開口部３２が設けられている。ここで、板状基板３０の表面上において、図１７中の横方向を幅方向とし、それと直交する縦方向を奥行き方向とする。図１７に示す例では、幅方向に４つ、奥行き方向に３つの空間構造３３が形成された板状基板３０を示している。すなわち、板状基板３０には、１２個の空間構造３３がマトリクス状に形成されている。ここでは、幅方向に隣接する空間構造３３は、１つの開口部３２で連通されている。一方、奥行き方向に隣接する空間構造３３は、２つの開口部３２で連通されている。すなわち、奥行き方向に隣接する空間構造３３の間の開口部３２には、第１の側壁３１が設けられている。この第１の側壁３１によって、奥行き方向に隣接する空間構造３３の間の開口部３２が、２つに区分けされている。
【００５４】
図１８の斜視図に示す形状では、２枚の基板を貼り合わせることによって板状基板３０を形成している。すなわち、第１の基板３０１と第２の基板３０２とを貼り合わせることによって板状基板３０が形成される。ここで、第１の基板３０１に貫通孔を形成して空間構造３３としている。この場合、第２の基板３０２の接合面が、空間構造３３の底面となる。第２の基板３０２の表面には、開口部３２を形成するための微細な溝が形成される。そして、貫通孔が形成された第１の基板３０１と開口部３２が形成された第２の基板３０２とを密着させる。このとき、第２の基板３０２の開口部３２が形成されている面が接合面となって、貼り合わせられる。第２の基板３０２の開口部３２は、隣接する貫通孔を結ぶ位置に所定の形状で設けられている。また、貫通孔は、平面形状が円形になっている。開口部３２は貫通孔が設けられている位置まで延在される。これにより、隣接する空間構造３３が底面側で連通する。
【００５５】
図１９の斜視図に示す形状では、複数の空間構造３３が１枚の基板上に形成されている。空間構造３３は基板面上に縦、横に並んで配列されている。この空間構造３３の間には、溝状の開口部３２が設けられている。ここで、板状基板３０の表面上において、図１９中の横方向を幅方向とし、それと直交する方向を奥行き方向とする。本実施例では、幅方向に４つ、奥行き方向に４つの空間構造３３が形成された板状基板３０を示している。すなわち、板状基板３０には、１６個の空間構造３３がマトリクス状に形成されている。本実施例では、斜め方向に隣接する空間構造３３も開口部３２によって連通されている。すなわち、開口部３２は、幅方向及び奥行き方向だけでなく、その間の斜め方向にも設けられている。また、本実施例では、図１８に示す例と異なり、斜め方向の開口部３２同士が交差していない。すなわち、斜め方向の開口部３２は全て同じ方向に設けられている。よって、１つの空間構造３３に対して、その周囲に設けられた最大６個の空間構造３３が連通される。この６個の空間構造３３を、正六角形となるよう配置してもよい。
【００５６】
高さが１μｍ以下の凹凸パターンを形成する方法としては、例えば、サンドブラスト処理があげられ、更に小さな凹凸パターンを形成する場合には、Ａｒプラズマによるエッチング処理等があげられる。
高さが１μｍ以上の凹凸パターンを形成する方法としては、例えば、シリコン材料、ガラス材料へのドライエッチング、ウェットエッチング等が想定できる。樹脂材料への成形方法として、例えば、押し出し成形、射出成形、ホットエンボス成形、ナノインプリント成形、ブロー成形、カレンダー成形、キャスト成形、プレス成形等が採用可能である。
【００５７】
複数個の凹または凸パターンを有し、さらに、凹パターンの上部または凸パターンの底部に連通する面を有する細胞培養容器を用いて、培養細胞の伸展方向を制御することが期待される。
複数個の凹パターンを有する板状基板等を用いて細胞培養を行うと、凹パターンにおいて、連通する上部のみに培養することが可能となる。凹パターンの底部の面積が広いと、底部にも培養した細胞が伸展することとなるため、凹パターン底部の縦、横寸法の両方、または、片方を１μｍから５００μｍの範囲とすることが好ましい。凹パターン底部の縦寸法のみを１μｍから５００μｍの範囲とし、横寸法は、例えば、神経細胞や血管内皮細胞の培養において、１ｍｍ、１０ｍｍ、５０ｍｍと設定することにより、目的に応じた培養細胞の長さを実現することが可能となる。
【００５８】
複数個の凸パターンを有する板状基板等を用いて細胞培養を行うと、凸パターンにおいて、連通する底部のみに培養することが期待される。凸パターンの上部の面積が広いと、上部にも培養した細胞が伸展することとなるため、凸パターン上部の縦、横寸法の両方、または、片方を１μｍから５００μｍの範囲とすることが好ましい。凸パターン上部の縦寸法のみを１μｍから５００μｍの範囲とし、横寸法は、例えば、神経細胞や血管内皮細胞の培養において、１ｍｍ、１０ｍｍ、５０ｍｍと設定することにより、目的に応じた培養細胞の長さを実現することが可能となる。
【００５９】
凹または凸パターンの深さ、または高さは、細胞が凹凸を認識するために必要であり、１μｍ〜５００μｍの範囲とすることが好ましい。
【００６０】
細胞培養における擬似足場となる接着斑は、連通する面または凹凸パターンの側壁面に形成され、細胞が伸展可能な連通する面に増殖することによって伸展方向が制御されうる。
上述の例では、微細凹凸パターンを容器本体とは別体の板状基板に形成したが、これに限らず、容器本体の底部に形成するようにしてもよい。微細凹凸パターンを有する板状基板３０を備えた細胞培養容器１００以外にも、容器本体２０と板状基板３０とが一体になり、その底部に微細凹凸パターンが加工されている細胞培養容器であってもよい。容器本体と微細凹凸パターンを一体化できるため、該細胞培養容器の成形をする上で板状基板３０を貼り合わせる工程がなく、コンタミの混入を防ぐことができる。
さらに、微細凹凸パターンに近接して培養液や試薬等の液体を導入するための流路を設けるようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本考案にかかる細胞培養容器の一部断面図である。
【図２】本考案にかかる細胞培養容器の蓋体の一部断面図である。
【図３】本考案にかかる細胞培養容器の容器本体の一部断面図である。
【図４】本考案にかかる細胞培養容器の一部拡大断面図である。
【図５】本考案にかかる細胞培養容器の一部拡大断面図である。
【図６Ａ】本考案にかかる細胞培養容器の一部拡大断面図である。
【図６Ｂ】本考案にかかる細胞培養容器の一部拡大断面図である。
【図７】本考案にかかる細胞培養容器の一部拡大断面図である。
【図８】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す上面図である。
【図９】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す上面図である。
【図１０】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す上面図である。
【図１１Ａ】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す上面図である。
【図１１Ｂ】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す断面図である。
【図１２Ａ】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す上面図である。
【図１２Ｂ】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す一部拡大上面図である。
【図１２Ｃ】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す一部拡大断面図である。
【図１３】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。
【図１４】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。
【図１５】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。
【図１６】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。
【図１７】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。
【図１８】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。
【図１９】本考案にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。
【符号の説明】
【００６２】
１０  蓋体
２０  容器本体
３０  板状基板
４０  嵌合部材
１００  細胞培養容器
【図１】
0003139350.tif 000003
【図２】
0003139350.tif 000004
【図３】
0003139350.tif 000005
【図４】
0003139350.tif 000006
【図５】
0003139350.tif 000007
【図６Ａ】
0003139350.tif 000008
【図６Ｂ】
0003139350.tif 000009
【図７】
0003139350.tif 000010
【図８】
0003139350.tif 000011
【図９】
0003139350.tif 000012
【図１０】
0003139350.tif 000013
【図１１Ａ】
0003139350.tif 000014
【図１１Ｂ】
0003139350.tif 000015
【図１２Ａ】
0003139350.tif 000016
【図１２Ｂ】
0003139350.tif 000017
【図１２Ｃ】
0003139350.tif 000018
【図１３】
0003139350.tif 000019
【図１４】
0003139350.tif 000020
【図１５】
0003139350.tif 000021
【図１６】
0003139350.tif 000022
【図１７】
0003139350.tif 000023
【図１８】
0003139350.tif 000024
【図１９】
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