(57)【要約】  疼痛の治療または予防ならびに痛覚の低減のための方法および製品であって、Ｐ２Ｘ受容体阻害薬、ＴＮＰ‐ＡＴＰ、ＢＤＮＦアンチセンス分子またはＢＤＮＦｓｉＲＮＡのような作用物質の投与による哺乳類宿主における神経膠細胞由来脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）発現または活性の調節を包含する方法および製品。疼痛の治療または予防ならびに痛覚の低減のための化合物を同定するかまたは特性化するための関連方法も記載される。
2008516993.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における疼痛の治療または予防方法であって、前記被験者において神経膠由来ＢＤＮＦを低減することを包含する方法。
【請求項２】
以下の：
（ａ）神経膠細胞中でのＢＤＮＦ発現；
（ｂ）神経膠細胞からのＢＤＮＦの放出または分泌；
（ｃ）神経膠細胞の刺激；
（ｄ）神経膠細胞由来ＢＤＮＦ活性；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せ
からなる群から選択されるパラメーターを低減することを包含する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記神経膠細胞が前記被験者の中枢神経系中に位置する請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＤＮＦが配列番号２、４、６およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記疼痛のシグナルが末梢神経系（ＰＮＳ）細胞にまたは中枢神経系（ＣＮＳ）細胞に起源を有する請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記疼痛が神経障害性疼痛である請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記神経障害性疼痛が神経または神経路損傷に関連する請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記神経障害性疼痛が体性および内臓痛からなる群から選択される請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記神経障害性疼痛が化学的傷害に関連する請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記疼痛が慢性疼痛、慢性炎症性疼痛、関節炎に関連した疼痛、繊維筋痛、背痛、癌関連疼痛、消化器疾患に関連した疼痛、クローン病に関連した疼痛、自己免疫疾患に関連した疼痛、内分泌疾患に関連した疼痛、糖尿病性神経障害に関連した疼痛、幻肢痛、自発痛、慢性術後痛、慢性側頭下顎痛、灼熱痛、ヘルペス感染後神経痛、ＡＩＤＳ関連疼痛、ＩおよびＩＩ型複合性局所疼痛症候群、三叉神経痛、慢性背痛、脊髄損傷に関連した疼痛、薬剤摂取に関連した疼痛ならびに再発性急性疼痛からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記被験者における神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質を前記被験者に投与することを包含する請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記作用物質が神経膠細胞の刺激を低減または抑制し得る請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記作用物質がＡＴＰ受容体の阻害薬である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＴＰ受容体がＰ２Ｘ受容体である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記作用物質がＴＮＰ‐ＡＴＰである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記作用物質がＢＤＮＦ発現を抑制し得る請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
前記作用物質がアンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ様分子からなる群から選択される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記作用物質がアンチセンス分子である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記アンチセンス分子がＢＤＮＦをコードするｍＲＮＡの一部と実質的に相補性である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記アンチセンス分子が配列番号１、３および５から成る群から選択される配列と実質的に同一である核酸配列の一部と相補性である請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記作用物質がｓｉＲＮＡである請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記ｓｉＲＮＡの配列が配列番号７、８、９、１０およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記作用物質がくも膜下腔内に投与される請求項１２記載の方法。
【請求項２５】
前記被験者が哺乳類である請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳類がヒトである請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
被験者における痛覚の低減方法であって、前記被験者における神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減することを包含する方法。
【請求項２８】
以下の：
（ａ）神経膠細胞中でのＢＤＮＦ発現；
（ｂ）神経膠細胞からのＢＤＮＦの放出または分泌；
（ｃ）神経膠細胞の刺激；
（ｄ）神経膠細胞由来ＢＤＮＦ活性；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せ
からなる群から選択されるパラメーターを低減することを包含する請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質を前記被験者に投与することを包含する請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
前記作用物質が神経膠細胞の刺激を低減または抑制し得る請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記作用物質がＡＴＰ受容体の阻害薬である請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記ＡＴＰ受容体がＰ２Ｘ受容体である請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記作用物質がＴＮＰ‐ＡＴＰである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記作用物質がＢＤＮＦ発現を抑制し得る請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
前記作用物質がアンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ様分子からなる群から選択される請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記作用物質がアンチセンス分子である請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記アンチセンス分子がＢＤＮＦをコードするｍＲＮＡの一部と実質的に相補性である請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記アンチセンス分子が配列番号１、３および５から成る群から選択される配列と実質的に同一である核酸配列の一部と相補性である請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記作用物質がｓｉＲＮＡである請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
前記ｓｉＲＮＡの配列が配列番号７、８、９、１０およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一である請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記作用物質がくも膜下腔内に投与される請求項３０記載の方法。
【請求項４３】
被験者における疼痛の治療または予防のための組成物であって、以下の：
（ａ）前記被験者における神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質；および
（ｂ）製薬上許容可能な担体
を含む組成物。
【請求項４４】
前記作用物質が以下の：
（ａ）神経膠細胞中でのＢＤＮＦ発現；
（ｂ）神経膠細胞からのＢＤＮＦの放出または分泌；
（ｃ）神経膠細胞の刺激；
（ｄ）神経膠細胞由来ＢＤＮＦ活性；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せ
からなる群から選択されるパラメーターを低減し得る請求項４３記載の組成物。
【請求項４５】
前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項４３記載の組成物。
【請求項４６】
くも膜下腔内投与のために適合される請求項４３記載の組成物。
【請求項４７】
疼痛の治療または予防のためのその使用のための使用説明書と一緒に請求項４３記載の組成物を含むパッケージ。
【請求項４８】
以下の：
（ａ）被験者における神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質；および
（ｂ）前記被験者における疼痛の治療または予防のためのその使用のための使用説明書
を含むパッケージ。
【請求項４９】
前記作用物質が以下の：
（ａ）神経膠細胞中でのＢＤＮＦ発現；
（ｂ）神経膠細胞からのＢＤＮＦの放出または分泌；
（ｃ）神経膠細胞の刺激；
（ｄ）神経膠細胞由来ＢＤＮＦ活性；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せ
からなる群から選択されるパラメーターを低減し得る請求項４８記載のパッケージ。
【請求項５０】
前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項４８記載のパッケージ。
【請求項５１】
被験者における疼痛の治療または予防のための請求項４３記載の組成物の使用。
【請求項５２】
疼痛の治療または予防のための薬剤の調製のための請求項４３記載の組成物の使用。
【請求項５３】
被験者における疼痛の治療または予防のための神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質の使用。
【請求項５４】
被験者における疼痛の治療または予防のための薬剤の調製のための神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質の使用。
【請求項５５】
前記作用物質が以下の：
（ａ）神経膠細胞中でのＢＤＮＦ発現；
（ｂ）神経膠細胞からのＢＤＮＦの放出または分泌；
（ｃ）神経膠細胞の刺激；
（ｄ）神経膠細胞由来ＢＤＮＦ活性；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せ
からなる群から選択されるパラメーターを低減し得る請求項５３記載の使用。
【請求項５６】
前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項５３記載の使用。
【請求項５７】
前記作用物質が神経膠細胞の刺激を低減または抑制し得る請求項５３記載の使用。
【請求項５８】
前記作用物質がＡＴＰ受容体の阻害薬である請求項５７記載の使用。
【請求項５９】
前記ＡＴＰ受容体がＰ２Ｘ受容体である請求項５８記載の使用。
【請求項６０】
前記作用物質がＴＮＰ‐ＡＴＰである請求項５９記載の使用。
【請求項６１】
前記作用物質がＢＤＮＦ発現を抑制し得る請求項５３記載の使用。
【請求項６２】
前記作用物質がアンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ様分子からなる群から選択される請求項６１記載の使用。
【請求項６３】
前記作用物質がアンチセンス分子である請求項６２記載の使用。
【請求項６４】
前記アンチセンス分子がＢＤＮＦをコードするｍＲＮＡの一部と実質的に相補性である請求項６３記載の使用。
【請求項６５】
前記アンチセンス分子が配列番号１、３および５から成る群から選択される配列と実質的に同一である核酸配列の一部と相補性である請求項６３記載の使用。
【請求項６６】
前記作用物質がｓｉＲＮＡである請求項６２記載の使用。
【請求項６７】
前記ｓｉＲＮＡの配列が配列番号７、８、９、１０およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一である請求項６６記載の使用。
【請求項６８】
前記作用物質がくも膜下腔内投与のために適合される請求項５３記載の使用。
【請求項６９】
疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、以下の：
（ａ）試験化合物を、ＢＤＮＦを発現するかまたはＢＤＮＦ活性を有する神経膠細胞と接触させ；そして
（ｂ）前記ＢＤＮＦ発現または活性が前記試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定する
ことを包含する方法であり、前記低減が疼痛の治療または予防のために前記試験化合物が用いられ得るということの指標である方法。
【請求項７０】
前記神経膠細胞が刺激神経膠細胞である請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記刺激神経膠細胞がステップ（ａ）前にＡＴＰと接触されていた請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
前記刺激神経膠細胞が末梢神経または神経路損傷に対して後シナプス性である請求項７０記載の方法。
【請求項７３】
前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項６９記載の方法。
【請求項７４】
前記試験化合物がｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ様分子、オリゴヌクレオチドのアンチセンスおよびリボザイムから成る群から選択される請求項６９記載の方法。
【請求項７５】
疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、以下の：
（ａ）レポータータンパク質をコードし得るレポーター遺伝子を含む二次核酸と操作可能的に連結されるＢＤＮＦ遺伝子と普通は関連する転写的調節素子を含む一次核酸を含む神経膠細胞と試験化合物を接触させ；そして
（ｂ）レポーター遺伝子発現またはレポータータンパク質活性が前記試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定する
ことを包含する方法であり、レポーター遺伝子発現またはレポータータンパク質活性における前記低減が疼痛の治療または予防のために前記試験化合物が用いられ得るということの指標である方法。
【請求項７６】
前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、以下の：
（ａ）試験化合物を、ＢＤＮＦポリペプチドを分泌し得る神経膠細胞と接触させ；そして
（ｂ）前記ＢＤＮＦポリペプチドの分泌が前記試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定する
ことを包含する方法であり、前記ＢＮＤＦポリペプチドの分泌における低減が疼痛の治療または予防のために前記試験化合物が用いられ得るということの指標である方法。
【請求項７８】
前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、以下の：
（ａ）試験化合物を神経膠細胞と接触させ；そして
（ｂ）前記神経膠細胞の刺激が前記試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定する
ことを包含する方法であり、前記神経膠細胞の刺激における低減が疼痛の治療または予防のために前記試験化合物が用いられ得るということの指標である方法。
【請求項８０】
前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項７９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
本出願は、米国特許仮出願第60/620,722号（2004年10月22日提出）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）の35 U.S.C. §119 (e)下での利益を主張する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、神経膠細胞由来ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）の調節に関するし、特に被験者における疼痛を治療または予防するための神経膠細胞由来ＢＤＮＦの調節に関する。本発明は、疼痛の治療または予防のために用いられ得る化合物を同定するかまたは特性化する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
疼痛の治療および予防のための新規の且つ改良された方法ならびに作用物質に対する必要性は、医療における有意の進行中の関心事である。目下用いられている治療薬はほとんど、疼痛の実際の原因を治療することなく疼痛の症候の治療に集中する。さらに、これらの治療薬は必ずしも特異的でなく、多数の望ましくない副作用を引き起こし得る。
【０００４】
疼痛知覚に関与するメカニズムをより良好に定義する必要性が依然として存在する。痛覚の新規発見メカニズムに基づいて、疼痛の実際の原因での介入により疼痛を治療するかまたは予防し得る新規の且つ特異的治療薬を提供する必要性も依然として存在する。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
本発明は、疼痛の治療または予防のための神経膠細胞由来ＢＤＮＦの調節（例えば低減）に関する。本発明は、神経膠細胞由来ＢＤＮＦを調節（例えば低減）し得る化合物の同定または特性化にも関する。
【０００６】
第一の態様において、本発明は、被験者における疼痛を治療するかまたは予防する方法であって、被験者における神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減することを包含する方法を提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、被験者における痛覚の低減方法であって、被験者における神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減することを包含する方法を提供する。
【０００８】
さらに別の態様では、本発明は、被験者における疼痛の治療または予防のための組成物であって、（ａ）上記被験者における神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質；および（ｂ）製薬上許容可能な担体を含む組成物を提供する。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、疼痛の治療または予防のためのその使用のための使用説明書と一緒に本明細書中に記載の組成物を含むパッケージを提供する。さらに別の態様では、本発明は、（ａ）被験者における神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質；および（ｂ）上記被験者における疼痛の治療または予防のためのその使用のための使用説明書を含むパッケージを提供する。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、被験者における疼痛の治療または予防のための、および／または疼痛の治療または予防のための薬剤の調製のための本明細書中に記載された組成物の使用を提供する。さらなる態様では、本発明は、被験者における疼痛の治療または予防のための神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質の使用、および／または被験者における疼痛の治療または予防のための薬剤の調製のための神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質の使用を提供する。
【００１１】
さらに別の実施形態では、本発明は、疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、（ａ）試験化合物を、ＢＤＮＦを発現するかまたはＢＤＮＦ活性を有する神経膠細胞と接触させ；そして（ｂ）ＢＤＮＦ発現または活性が試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定することを包含する方法であり；低減が疼痛の治療または予防のために試験化合物が用いられ得るということの指標である方法を提供する。
【００１２】
さらに別の実施形態では、本発明は、疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、（ａ）レポータータンパク質をコードし得るレポーター遺伝子を含む二次核酸と操作可能的に連結されるＢＤＮＦ遺伝子と普通は関連する転写的調節素子を含む一次核酸を含む神経膠細胞と試験化合物を接触させ；そして（ｂ）レポーター遺伝子発現またはレポータータンパク質活性が試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定することを包含する方法であり；レポーター遺伝子発現またはレポータータンパク質活性における低減が疼痛の治療または予防のために試験化合物が用いられ得るということの指標である方法を提供する。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、（ａ）試験化合物を、ＢＤＮＦポリペプチドを分泌し得る神経膠細胞と接触させ；そして（ｂ）上記ＢＤＮＦポリペプチドの分泌が試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定することを包含する方法であり；ＢＮＤＦポリペプチドの分泌における低減が疼痛の治療または予防のために試験化合物が用いられ得るということの指標である方法を提供する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、（ａ）試験化合物を神経膠細胞と接触させ；そして（ｂ）上記神経膠細胞の刺激が試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定することを包含する方法であり；上記神経膠細胞の刺激における低減が疼痛の治療または予防のために試験化合物が用いられ得るということの指標である方法を提供する。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、（ａ）神経膠細胞中でのＢＤＮＦ発現；（ｂ）神経膠細胞からのＢＤＮＦの放出または分泌；（ｃ）神経膠細胞の刺激；（ｄ）神経膠細胞由来ＢＤＮＦ活性；および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せからなる群から選択されるパラメーターを低減し得る方法または作用物質を提供する。
【００１６】
別の実施形態では、神経膠細胞はマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択され、さらなる実施形態では、神経膠細胞は上記被験者の中枢神経系中に位置する。別の実施形態では、神経膠細胞は刺激神経膠細胞であり、さらなる実施形態では、刺激神経膠細胞はＡＴＰと接触されたことがあるか、および／または刺激神経膠細胞は末梢神経または神経路損傷に対して後シナプス性である。
さらなる別の実施形態では、ＢＤＮＦは配列番号２、４、６およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
さらに別の実施形態では、上記疼痛のシグナルは末梢神経系（ＰＮＳ）細胞にまたは中枢神経系（ＣＮＳ）細胞に起源を有する。複数の実施形態では、疼痛は神経障害性疼痛であり、さらなる一実施形態では、神経障害性疼痛は神経または神経路損傷に関連し、および／または体性および内臓痛からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、神経障害性疼痛は化学的傷害に関連する。さらなる一実施形態では、疼痛は、慢性疼痛、慢性炎症性疼痛、関節炎に関連した疼痛、繊維筋痛、背痛、癌関連疼痛、消化器疾患に関連した疼痛、クローン病に関連した疼痛、自己免疫疾患に関連した疼痛、内分泌疾患に関連した疼痛、糖尿病性神経障害に関連した疼痛、幻肢痛、自発痛、慢性術後痛、慢性側頭下顎痛、灼熱痛、ヘルペス感染後神経痛、ＡＩＤＳ関連疼痛、ＩおよびＩＩ型複合性局所疼痛症候群、三叉神経痛、慢性背痛、脊髄損傷に関連した疼痛、薬剤摂取に関連した疼痛ならびに再発性急性疼痛からなる群から選択される。
【００１８】
さらに別の実施形態では、当該方法は、被験者における神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質を上記被験者に投与することを包含する。別の実施形態では、当該使用、組成物およびパッケージは、このような作用物質を含む。一実施形態では、作用物質は神経膠細胞の刺激を低減または抑制し得るし、さらなる一実施形態では、作用物質はＡＴＰ受容体の阻害薬であり、さらなる一実施形態では、ＡＴＰ受容体はＰ２Ｘ受容体であり、さらなる一実施形態では、作用物質はＴＮＰ‐ＡＴＰである。別の実施形態では、作用物質はＢＤＮＦ発現を抑制し得るし、さらなる一実施形態では、作用物質はアンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ様分子からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、作用物質はアンチセンス分子であり、さらなる一実施形態では、アンチセンス分子はＢＤＮＦをコードするｍＲＮＡの一部と実質的に相補性であり、さらなる一実施形態では、アンチセンス分子は配列番号１、３および５から成る群から選択される配列と実質的に同一である核酸配列の一部と相補性である。さらに別の実施形態では、作用物質はｓｉＲＮＡであり、さらなる一実施形態では、ｓｉＲＮＡの配列は配列番号７、８、９、１０およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一である。さらに別の実施形態では、作用物質はくも膜下腔内に投与されるか、あるいはくも膜下腔投与のために適合される。
一実施形態では、被験者は哺乳類であり、さらなる一実施形態では、哺乳類はヒトである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
第一の態様において、本発明は、神経膠由来ＢＤＮＦの調節（例えば低減）に基づいた、疼痛の治療および予防のための方法および化合物に関する。本明細書中で用いる場合、「ＢＤＮＦ」または「脳由来神経栄養因子」は本明細書中で互換的に用いられ、そして種々のニューロン・プロセス、例えば神経形成、シナプス形成、損傷ネットワークの修復、発達中ニューロンの生存および分化、脳および脊髄中の成熟ニューロン、正常シナプス（例えば抑制性および／または興奮性）の維持、樹状突起および軸索成長および行動過程の調節（例えば抗うつ、気分安定化、記憶）に関与する神経栄養因子に関する。ＢＤＮＦポリペプチドは中枢神経系に遍在し、種々の細胞源、例えばニューロン（例えば一次感覚ニューロンおよび後シナプスニューロン）、神経膠細胞（例えばマイクログリア、星状細胞または乏突起膠細胞）、非神経免疫細胞（例えばリンパ球、例えばＴおよびＢリンパ球）、白血球、マクロファージおよび内皮細胞により産生される。複数の実施形態では、ＢＤＮＦは、配列番号２（ヒトＢＤＮＦ；図６も参照）または６（マウスＢＤＮＦ；図７も参照）のポリペプチド、その断片の配列、あるいはそれと実質的に同一である配列を含む。さらなる実施形態では、ＢＤＮＦは、配列番号２、４または６のポリペプチドまたはその断片をコードし得る核酸配列、あるいはそれと実質的に同一であるかまたはハイブリダイゼーション判定基準により関連づけられる配列によりコードされる（以下参照）。さらなる実施形態では、このような核酸配列は、配列番号１（ヒトＢＤＮＦ  ＤＮＡ；図６も参照）、３（マウスＢＤＮＦ  ＤＮＡ；図７も参照）または５（ラットＢＤＮＦ  ＤＮＡ；図１８も参照）の配列、その断片、あるいはそれと実質的に同一であるかまたはハイブリダイゼーション判定基準により関連づけられる配列を含み得る（以下参照）。
【００２０】
本発明は、（１）神経膠細胞中でのＢＤＮＦ発現；（２）神経膠細胞からのＢＤＮＦの放出または分泌；（３）神経膠細胞の刺激；および／または（４）神経膠細胞由来ＢＤＮＦ活性を低減することにより神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減するための方法も提供する。
【００２１】
したがって、一実施形態では、本発明は、神経膠由来ＢＤＮＦを低減することにより疼痛を治療するための方法に関する。本明細書中で用いる場合、「神経膠細胞」は、神経系の非ニューロン細胞と定義される。一実施形態では、神経膠細胞は神経系中に、そしてさらなる実施形態では、中枢神経系（例えば脊髄）中に位置する。一実施形態では、神経膠細胞はマイクログリア、星状細胞および乏突起膠細胞から選択される。一実施形態では、神経膠細胞は乏突起膠細胞である。乏突起膠細胞は、典型的には白質の髄鞘形成ならびに灰質中の周囲細胞体を形成する。それらは大型で、ニューロン周囲を包む派生物をほとんど有さない。別の実施形態では、神経膠細胞は星状細胞である。星状細胞は、典型的には血管およびニューロン間の連結を形成する。それらは乏突起膠細胞より小さく、広範な分岐を保有する。別の実施形態では、神経膠細胞はマイクログリアである。マイクログリアは、神経系において免疫機能を働かせる。一旦活性化または刺激されると、マイクログリアは壊死組織片を貪食し得る。それらは非常に小さい細胞であるが、しかし一旦活性化または刺激されると大きくなる。複数の実施形態において、神経膠細胞は通常は、ＯＸ‐４２（ＣＲ３／ＣＤ１１ｂ）、グリア原繊維酸性タンパク質および／またはＲＩＰを発現する。本明細書中で用いる場合、「神経膠細胞由来ＢＤＮＦ」という用語は神経膠細胞により産生され、放出されまたは分泌されるＢＤＮＦと定義され、そして複数の実施形態において、マイクログリア、星状細胞および／または乏突起膠細胞により産生されるかまたは分泌されるＢＤＮＦを含む。
【００２２】
さらなる実施形態では、ＢＤＮＦ活性または発現のモジュレーター（阻害薬）を用いて、被験者における疼痛を治療するかまたは予防し、あるいは痛覚を低減し得る。一実施形態では、阻害薬（例えば作用物質または化合物）はくも膜下腔内に投与され得る。一実施形態では、これらのモジュレーターは、ＢＤＮＦ下流シグナル伝達を低減し得る作用物質（例えばＢＤＮＦ受容体（例えばＴｒｋＢまたはｐ７５NTR）の阻害薬、例えばＫ‐２５２ａまたは抗ＴｒｋＢ抗体；ＭＡＰＫ（ｒａｓ有糸分裂活性化プロテインキナーゼ）経路の阻害薬；ＰＩＫ‐Ａｋｔ（ホスファチジルイノシトール‐３キナーゼ‐Ａｋｔ）経路の阻害薬；ＰＬＣγ（ホスホリパーゼＣγ）経路の阻害薬）である。別の実施形態では、これらのモジュレーターは、神経膠細胞の刺激（例えばＡＴＰ刺激）を抑制し得る化合物（例えばＰ２Ｘ（例えばＰ２Ｘ4およびＰ２Ｘ7）受容体の阻害薬、例えばＴＮＰ‐ＡＴＰ、ミノサイクリンおよびプロペントフィリン）である。さらに別の実施形態では、これらのモジュレーターは、ＢＤＮＦ発現を低減し得る化合物または作用物質（例えばｄｓＲＮＡ  ＢＤＮＦ、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ様分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム等）である。一実施形態では、作用物質または化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合、それは、ＢＤＮＦをコードするｍＲＮＡの一部と実質的に相補性であり、そしてさらなる一実施形態では、それは、配列番号１、３および５から成る群から選択さえる配列と実質的に同一である核酸配列の一部と相補性である。さらなる実施形態では、作用物質または化合物がｓｉＲＮＡである場合、ｓｉＲＮＡの配列は、配列番号７、８、９、１０およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一である。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、急性および慢性疼痛の治療に、さらに特定的には神経障害性疼痛の治療にも関する。「神経障害性疼痛」とは、本明細書中で用いる場合、中枢神経系における神経損傷（例えば化学的傷害後、圧挫または横切後、神経の圧迫後、疾患に起因する神経変性後、化学的傷害後）に関連した慢性疼痛を指す。一実施形態では、化学的傷害は化学療法に起因し得る。一実施形態では、神経障害性疼痛は、神経または神経路損傷に関連する。さらなる一実施形態では、神経障害性疼痛は、内臓および／または体性疼痛に関連する。複数の実施形態において、疼痛のシグナルは、末梢神経系細胞、あるいは神経膠細胞に対して経シナプス性である感覚繊維に起源を有し得る。複数の実施形態において、疼痛は、多数の症状、例えば慢性炎症性疼痛、関節炎に関連した疼痛、繊維筋痛、背痛、癌関連疼痛、消化器疾患に関連した疼痛、クローン病に関連した疼痛、自己免疫疾患に関連した疼痛、内分泌疾患に関連した疼痛、糖尿病性神経障害に関連した疼痛、幻肢痛、自発痛、慢性術後痛、慢性側頭下顎痛、灼熱痛、ヘルペス感染後神経痛、ＡＩＤＳ関連疼痛、ＩおよびＩＩ型複合性局所疼痛症候群、三叉神経痛、慢性背痛、脊髄損傷に関連した疼痛、薬剤摂取に関連した疼痛および／または再発性急性疼痛に関連し得る。一実施形態では、薬剤摂取に関連した疼痛は化学療法治療に関連した疼痛である。
【００２４】
本明細書中に記載される方法は、痛覚を低減するための神経膠細胞由来ＢＤＮＦの低減にも関する。「痛覚」とは、本明細書中で用いる場合、疼痛の感覚構成成分を指す。疼痛は、種々の刺激、例えば圧力、損傷、熱刺激または化学的（例えばイオン性）刺激（これらに限定されない）の結果であり得る。
【００２５】
「ＢＤＮＦ活性」とは、本明細書中で用いる場合、ＢＤＮＦに関連した任意の検出可能な表現型を指す。例えばＢＤＮＦ活性は、ＴｒｋＢチロシンリン酸化のレベル（例えばウエスタンブロッティングを使用）、ＭＡＰ（ＥＲＫ）経路活性化のレベル（例えばウエスタンブロッティングを使用）、Ａｋｔリン酸化のレベル（例えばウエスタンブロッティングを使用）、ＰＬＣγ経路活性化のレベル、神経伝達物質放出の報告のレベル、ＮＭＤＡ受容体リン酸化のレベル、細胞生存、細胞分化および細胞死（例えばアポトーシス）を測定することにより査定され得る。アポトーシスに関する多数の検定、例えばＴＵＮＥＬ染色、アネキシンＶ染色、ＦＡＣＳ分析、アガロース電気泳動、ウエスタンブロット、組織学、電子顕微鏡、カスパーゼ検定、ＥＬＩＳＡ、ミトコンドリア検定（例えばチトクロームＣ放出検定）、カテプシンおよびカルパイン検定等が用いられ得る。複数の実施形態において、ＢＤＮＦ活性は、神経細胞の（例えばＬＩニューロン）陰イオン逆転電位（Ｅ陰イオン）にも影響を及ぼし得る。陰イオン逆転電位は、例えばグラミシジン穿孔パッチクランプ記録法を用いることにより確定され得る（以下の実施例の節参照）。
【００２６】
「ＢＤＮＦ発現」は、ＢＤＮＦ転写体の産生および／またはＢＤＮＦポリペプチドまたはタンパク質の分泌の両方に関する。したがってＢＤＮＦ発現は、複数の実施形態において、直接的にタンパク質レベル（例えば免疫細胞化学、ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタン分析により）を、あるいはＢＤＮＦコード核酸のレベル（例えばＢＤＮＦ  ｍＲＮＡレベルまたは転写体）を査定することにより、確定され得る。これらのレベルは、例えば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応［ＲＴ‐ＰＣＲ］法、マイクロ・アレイベースの方法のような方法を用いることにより、あるいはノーザン分析により、確定され得る。
【００２７】
例えば神経膠細胞中でのＢＤＮＦ活性または発現を低減し得る化合物は、それらがＣＮＳ組織またはＣＮＳ細胞と接触するようなやり方で投与され得る。用いられ得る化合物としては、タンパク質の活性を直接または間接的に修飾するもの、ならびにタンパク質の産生および／または安定性を調節するもの（例えば転写、翻訳、突然変異、翻訳後修飾、リン酸化、分ピルおよび分解のレベルで）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
このような化合物の一クラスは、神経膠細胞の刺激の抑制により作用するものである。実際、ＢＤＮＦは、神経膠細胞の刺激（例えばＡＴＰ刺激）に応答して分泌される。多数の化合物がマイクログリアの活性化を抑制することが当該技術分野で既知である。神経膠細胞の活性化を抑制することにより、これらの化合物はＢＤＮＦの分泌を制限し、それにより疼痛の予防または治療のために用いられ得る。これらの化合物としてはＰ２Ｘ受容体（例えばＰ２Ｘ4およびＰ２Ｘ7）阻害薬、例えばＴＮＰ‐ＡＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
ＢＤＮＦの発現を限定するために用いられ得る別のクラスの化合物は、ＢＤＮＦ転写体のレベルを下げる化合物である。そうすることにより、これらの化合物は産生され得る、したがって疼痛を治療または予防するために用いられ得るＢＤＮＦポリペプチドの数を限定する。これらの化合物としてはｄｓＲＮＡ（例えば配列番号７、８、９または１０）、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ様分子、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
疼痛を治療するかまたは予防するために用いられ得るさらなるクラスの化合物または作用物質は、ＢＤＮＦシグナルの媒介を抑制し得る化合物である。これらの化合物は、例えばＢＤＮＦ受容体、例えばＴｒｋＢまたはｐ７５NTRに作用し得る。一実施形態では、ＢＤＮＦ受容体はＴｒｋＢ受容体である。ＴｒｋＢシグナル伝達を抑制し得る化合物としては、Ｋ‐２５２ａ（Calbiochemから市販）またはＴｒｋＢに対する中和抗体（抗ＴｒｋＢ抗体［例えばＩｇＧ］）（BD Transduction Laboratoriesから市販）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいはこれらの化合物は、ＢＤＮＦとその受容体との結紮時に活性化される種々のシグナル伝達経路に作用し得る。
【００３１】
さらに、ＢＤＮＦ発現の調節は、ＢＤＮＦ発現を調節する転写因子の調節（例えばリン酸化による媒介）からも生じ得る。このような転写因子としては、ＮＦκＢおよびＢｒｎ‐３ｃが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
さらに、ＢＤＮＦ活性の調節は、神経膠細胞からのＢＤＮＦ分泌を調節する（例えば低減する）ことによっても達成され得る。
【００３３】
本明細書中に記載される方法は、ＢＤＮＦ分解を調節する（例えば増強する）ことも意図する。このような分解増強は、ＢＤＮＦを産生する細胞（例えば神経膠細胞）中で、またはＢＤＮＦ受容体を保有する細胞（例えばＢＤＮＦ受容体、例えばＴｒｋＢまたはｐ７５NTRを有するニューロン細胞）中で細胞内的に起こり得る。後者の場合、その分解の前に、ＢＤＮＦはＢＤＮＦ受容体と接触後に、細胞内で移動されている。別の実施形態では、ＢＤＮＦが一旦分泌されると、分解速度増大も細胞外で観察され得る。
【００３４】
一実施形態では、本明細書中に記載される方法および使用は、脊椎動物被験者に当てはまる。別の実施形態では、被験者は哺乳類であり、さらなる実施形態では、ヒトである。
上記のように、活性を保有するＢＤＮＦの相同体、変異体および／または断片も、記載される方法において抑制され得る。相同体としては、ＢＤＮＦのアミノ酸配列と実質的に同一であり、ＢＤＮＦと有意の構造的および機能的相同性を共有するタンパク質配列が挙げられる。変異体としては、任意の修飾および／またはアミノ酸置換、欠失または付加によりＢＤＮＦと異なるタンパク質またはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。修飾は、ポリペプチド主鎖（即ちアミノ酸配列）、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含めてどこでも起こり得る。このような置換、欠失または付加は、1つまたは複数のアミノ酸を包含し得る。断片は、ＢＤＮＦの断片または一部、あるいはＢＤＮＦの相同体または変異体の断片または一部を包含する。
【００３５】
「相同性」または「相同な」とは、2つのペプチドまたは2つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、整列化配列中の各位置を比較することにより確定され得る。核酸間またはアミノ酸配列間の相同性の程度は、当該配列により共有される位置での同一のまたは整合するヌクレオチドまたはアミノ酸の数の一関数である。当該用語が本明細書中で用いられる場合、2つの配列が実質的に同一であり、そして配列の機能的活性が保存されるならば、所定の配列（核酸またはアミノ酸）は別の配列と「相同」である（本明細書中で用いる場合、「相同の」という用語は進化的関連性を意味しない）。2つの核酸配列または2つのアミノ酸配列は、最適に整列される（容認されたギャプを有する）場合、それらが少なくとも約50％の配列類似性または同一性を共有するならば、あるいは配列が限定機能モチーフを共有するならば、「実質的に同一である」とみなされる。代替的実施形態では、最適に整列された実質的に同一の配列における配列類似性は、少なくとも60％、70％、75％、80％、85％、90％または95％であり得る。本明細書中で用いる場合、配列間の相同性の所定パーセンテージは、最適整列化配列における配列同一性の程度を意味する。「非関連性」または「非相同性」配列は配列番号１〜１０のいずれかと40％未満の同一性を、しかし好ましくは約25％未満の同一性を共有する。
【００３６】
実質的相補性核酸は、一分子の「相補体」が他の分子と実質的に同一である核酸である。
同一性の比較のための配列の最適整列は、種々のアルゴリズム、例えばSmith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482の局所的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443の相同性アルゴリズム、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444の類似性検索方法、ならびにこれらのアルゴリズムのコンピューター処理履行（例えばＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, U.S.A.））を用いて実行され得る。配列同一性は、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10（発表済みデフォルト設定を使用）に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いても確定され得る。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/でのインターネットによる）を通して入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、先ず、データベース中の同一長さのワードで整列される場合にいくつかの正値閾値スコアＴと整合するかまたはそれを満たす問合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを包含する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる。最初の隣接ワードヒットは、より長いＨＳＰを見つけ出すための検索を開始するための種子として作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大され得る限り、各配列に沿った両方向で拡張される。各方向でのワードヒットの拡張は、以下のパラメーターが満たされると、停止される：累積アラインメントスコアはその最大達成値から量Ｘだけ減少する；1つまたは複数の負‐スコアリング残基アラインメントの累積のため、累積スコアはゼロまたはそれ以下になる；あるいはいずれかの配列の末端が到達される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を確定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）11、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリックス（Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）アラインメント（Ｂ）50、期待値（Ｅ）10（または1または0.1または0.01または0.001または0.0001）、Ｍ＝5、Ｎ＝4を、ならびに両鎖の比較を用い得る。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いる2つの配列間の統計学的類似性の一測定は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の整合が偶然に起こる確率の指標を提供する。本発明の代替的実施形態では、試験配列の比較における最小和確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、さらに好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は実質的に同一であると考えられる。
【００３７】
2つの核酸配列が実質的に相補性であるという代替的指標は、2つの配列が中等度緊縮下で、または好ましくは緊縮下で、互いにハイブリダイズする、ということである。中等度緊縮条件下でのフィルター結合配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、0.5 MＮａＨＰＯ4、7％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、1 mMＥＤＴＡ中で65℃で実施され、そして0.2×ＳＳＣ／0.1％ＳＤＳ中で42℃で洗浄する（Ausubel et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p. 2.10.3参照）。あるいは、緊縮条件下でのフィルター結合配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、0.5 MＮａＨＰＯ4、7％ＳＤＳ、1 mMＥＤＴＡ中で65℃で実施され、そして0.1×ＳＳＣ／0.1％ＳＤＳ中で68℃で洗浄する（Ausubel et al. (eds), 1989、上記、参照）。ハイブリダイゼーション条件は、当該配列によって、既知の方法に従って修飾され得る（Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, New York参照）。一般に、緊縮条件は、限定イオン強度およびｐＨでの特定配列に関する融点より約5℃低くなるよう選択される。
【００３８】
本発明はさらに、疼痛の予防および／または治療のための組成物であって、製薬上許容可能な担体と混合して神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質を含む組成物を提供する。複数の実施形態において、作用物質は（１）神経膠細胞中でのＢＤＮＦ発現；（２）神経膠細胞からのＢＤＮＦの放出または分泌；（３）神経膠細胞の刺激；および／または（４）神経膠細胞由来ＢＤＮＦ活性を低減し得る。一実施形態では、このような組成物は、ＣＮＳ神経細胞または組織、例えば脊髄組織または細胞への投与に適しており、あるいは適合される。さらなる実施形態では、このような組成物は、ＢＤＮＦ発現または活性の阻害薬であり得る。本明細書中で用いる場合、「阻害薬」とは、ＢＤＮＦ遺伝子の発現、ＢＤＮＦ  ｍＲＮＡまたは転写体の安定性、ＢＤＮＦ  ｍＲＮＡまたは転写体の翻訳、ＢＤＮＦポリペプチドの分泌を、直接または間接的に下向き調節するかまたは低減する化合物である。一実施形態では、「阻害薬」は、ＢＤＮＦ活性薬（例えばＢＤＮＦの遺伝子発現を増強する転写因子（例えばＮＦκＢおよびＢｒｎ‐３ｃ））をも下向き調節するかまたは抑制し得る。複数の実施形態において、ＢＤＮＦは、マイクログリア、星状細胞および／または乏突起膠細胞から得られる。さらなる実施形態では、組成物はくも膜下腔内投与のために適合され得る。
【００３９】
本発明はさらに、疼痛の治療または予防のための神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る上記組成物あるいは上記作用物質または化合物の使用を提供する。本発明はさらにまた、疼痛の治療または予防のための薬剤の調製のためのＢＤＮＦ活性または発現を低減し得る上記組成物または上記作用物質の使用を提供する。別の実施形態では、作用物質は、被験者のＣＮＳ組織、例えばＣＮＳ細胞への投与のために処方され得る。さらに別の実施形態では、作用物質はくも膜下腔内投与のために適合され得る。さらなる実施形態では、化合物は、例えばＢＤＮＦ発現または活性の阻害薬であり得る。
【００４０】
本発明はさらに、上記組成物または作用物質を、疼痛の治療または予防のためのそれらの使用のための使用説明書と一緒に含むキットまたはパッケージ（例えば商業用パッケージ）を提供する。
【００４１】
種々の実施形態では、神経膠細胞由来ＢＤＮＦを調節し得る、例えば低減し得る作用物質は、疼痛を治療するために処方物または薬剤中に治療的に用いられ得る。本発明は、神経膠細胞由来ＢＤＮＦを調節し得る、一実施形態では低減し得る治療的用量の作用物質が薬理学的に許容可能な処方物中で投与される医学的処置の対応する方法も提供する。したがって本発明は、ＢＤＮＦ活性または発現を調節し得る、一実施形態では低減し得る化合物、ならびに薬理学的に許容可能な賦形剤または担体を調節し得る化合物を含む治療用組成物も提供する。治療用組成物は、生理学的に許容可能なｐＨで水溶液に可溶性であり得る。
【００４２】
一実施形態では、本明細書中に記載される作用物質は、それがＣＮＳ組織またはＣＮＳニューロンと接触するようになるよう投与され得る。本明細書中で用いる場合、「中枢神経系」またはＣＮＳは、脳および脊髄（例えば腰部の）を含む神経系の部分である。それに対して「末梢神経系」またはＰＮＳは、脳および脊髄以外の神経系の部分である。一実施形態では、ＣＮＳ組織は表在性後角であり、さらなる実施形態では、椎弓板Ｉニューロンである。このようなものとして、複数の実施形態において、本発明の一作用物質は、直接的頭蓋内またはくも膜下腔内注射あるいは脳脊髄液中への注射によりin vivoでＣＮＳ細胞を治療するために投与され得る。あるいは作用物質は、血液脳関門を横断して、ＣＮＳに進入し得る形態で全身的に（例えば静脈内または経口的に）投与され得る。「神経性の」および「ニューロン性の」は、互換的に本明細書中で用いられ、ともにニューロンに関する。「非ニューロン性の」は、ニューロン以外の細胞に関して本明細書中で用いられ、そして神経系の細胞の情況では、ニューロン以外の神経系の細胞（例えば神経膠細胞）に関する。
【００４３】
本発明は、ＣＮＳ細胞中の神経膠細胞由来ＢＤＮＦを調節し得る、例えば低減し得る作用物質を含む製剤組成物（薬剤）も提供する。一実施形態では、このような組成物は、疼痛を治療するかまたは弱めるのに十分な治療的または予防的有効量で作用物質を、そして製薬上許容可能な担体を含む。「治療的有効量」とは、所望の治療的結果、例えば疼痛の低減を達成するために、必要な投薬量での必要な時間での、有効な量を指す。神経膠細胞由来ＢＤＮＦを調節し得る、一実施形態では低減し得る作用物質の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体における所望の応答を引き出す化合物の能力といった因子によって変わり得る。投薬量レジメンは、最適治療的応答を提供するよう調整され得る。治療的有効量は、化合物の任意の毒性または有害作用より治療的に有益な作用が勝っている量でもある。「予防的有効量」とは、所望の予防的結果、例えば疼痛の開始または疼痛の重症度の増大を防止するかまたは抑制することを達成するために、必要な投薬量での必要な時間での、有効な量を指す。予防的有効量は、治療的有効量に関して上記されたのと同様に確定され得る。任意の特定被験者に関しては、特定の投薬量レジメンが、個々の必要性に従って、ならびに組成物の投与を施すかまたは指示するヒトの専門的判断に従って、経時的に調整され得る。
【００４４】
本明細書中で用いる場合、「製薬上許容可能な担体」または「賦形剤」は、生理学的に適合性である任意のおよび全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗細菌薬および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤等を包含する。一実施形態では、担体は非経口投与に適している。あるいは担体は、静脈内、くも膜下腔内、舌下または経口投与に適切であり得る。製薬上許容可能な担体としては、滅菌水溶液または分散液、ならびに滅菌注射用溶液または分散液の即時調合調製物ための滅菌粉末が挙げられる。薬学的活性物質のためのこのような媒質および作用物質の使用は、当該技術分野で周知である。任意の慣用的媒質または作用物質が活性化合物と非相溶性である限りという点を除いて、本発明の製剤組成物中のその使用が意図される。補充活性化合物も、当該組成物中に組み入れられ得る。
【００４５】
治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵条件下で滅菌性且つ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高薬剤濃度に適したその他の秩序構造物として処方され得る。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒質であり得る。例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合は必要粒子サイズの保持により、そして界面活性剤の使用により、適正な流動性は維持され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えば一ステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによりもたらされ得る。さらに神経膠細胞由来ＢＤＮＦを調節し得る、一実施形態では低減または下向き調節し得る化合物は、持続放出性処方物中で、例えば徐放性ポリマーを含む組成物中で投与され得る。活性化合物は、制御放出処方物、例えば植込錠および微小封入送達系のように、迅速放出に対して化合物を保護する担体を用いて調製され得る。生分解性の生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）が用いられ得る。このような処方物の調製のための多数の方法は特許を得ているか、あるいは一般的に当業者に既知である。
【００４６】
滅菌注射用溶液は、上で列挙された成分のうちの1つまたは組合せとともに、適切な溶媒中に必要量で、活性化合物（例えば神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る化合物）を組み入れ、必要な場合には、その後濾過滅菌することにより調製され得る。一般に、塩基性分散媒質および上で列挙されたものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み入れることにより、分散液は調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、活性成分の粉末＋予め滅菌濾過されたその溶液からの任意の付加的な所望の成分を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。本発明の代替的態様に従って、神経膠細胞由来ＢＤＮＦを調節し得る、一実施形態では低減し得る化合物が、その溶解度を増強する1つまたは複数の付加的化合物を用いて処方され得る。
【００４７】
本発明の別の態様に従って、神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質を含む本発明の治療用組成物は、疼痛の治療または予防のためのそれらの使用のための使用説明書をさらに含む容器またはパッケージ（例えば商業用パッケージ）中で提供され得る。
【００４８】
神経膠細胞由来ＢＤＮＦの低減が本明細書中に記載されるような疼痛感覚の低減と相関するとすれば、本発明のさらなる態様は、ＢＤＮＦ阻害薬をコードする核酸分子、例えばｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを被験者に投与することによる疼痛の治療である。適切な投与方法としては、遺伝子療法が挙げられる（下記参照）。
【００４９】
本発明の核酸は、ＤＮＡの直接注射、受容体媒介性ＤＮＡ取込み、ウイルス媒介性トランスフェクションまたは非ウイルス性トランスフェクションおよび脂質ベースのトランスフェクション（これらはすべて、遺伝子療法ベクターの使用を包含し得る）のような方法を用いてin vivoで細胞に送達され得る。直接注射は、in vivoで細胞中に裸ＤＮＡを導入するために用いられてきた（例えばAcsadi et al. (1991) Nature 332:815-818；Wolff et al. (1990) Science 247: 1465-1468参照）。細胞中にin vivoでＤＮＡを注射するための送達装置（例えば「遺伝子銃」）が用いられ得る。このような装置は、商業的に入手可能であり得る（例えばBioRadから）。裸ＤＮＡは、ＤＮＡを陽イオン、例えばポリリシンと錯体を形成し、これを細胞表面受容体に関するリガンドと結合することによっても、細胞中に導入され得る（例えばWu, G. and Wu, C.H. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14621；Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 963-967；および米国特許第5,166,320号参照）。ＤＮＡ‐リガンド複合体と受容体との結合は、受容体媒介性エンドサイトーシスによるＤＮＡの取込みを促進し得る。エンドソームを崩壊し、それにより細胞質中に物質を放出するアデノウイルス・キャプシドに連結されるＤＮＡ‐リガンド複合体は、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避するために用いられ得る（例えばCuriel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8850；Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2122-2126参照）。
【００５０】
欠陥レトロウイルスは、遺伝子療法ベクターとしての使用のために十分に特性化されている（再検討のためには、Miller, A.D. (1990) Blood 76: 271参照）。組換えレトロウイルスを産生するための、そしてこのようなウイルスを用いてin vitroまたはin vivoで細胞を感染するためのプロトコールはCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14およびその他の標準実験室マニュアルに見出され得る。適切なレトロウイルスの例としてはｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられ、これらは当業者に周知である。適切なパッキングウイルス系統の例としては、．ｐｓｉ．Ｃｒｅ、．ｐｓｉ．２および．ｐｓｉ．Ａｍが挙げられる。レトロウイルスは、多数の異なる細胞型、例えば上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋原細胞、肝細胞、骨髄細胞中に、in vivoおよび／またはin vitroで、種々の遺伝子を導入するために用いられてきた（例えばEglitis, et al. (1985) Science 230: 1395-1398；Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460-6464；Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3014-3018；Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6141-6145；Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039-8043；Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8377-8381；Chowdhury et al. (1991) Science 254: 1802-1805；van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7640-7644；Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647；Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895；Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150: 4104-4115；米国特許第4,868,116号；米国特許第4,980,286号；PCT出願WO 89/07136；PCT出願WO 89/02468；PCT出願WO 89/05345およびPCT出願WO 92/07573参照）。
【００５１】
遺伝子療法ベクターとして用いるために、アデノウイルスのゲノムは、それが本発明の核酸化合物をコードし、発現するが、しかし正常溶解性ウイルス生活環において複製するその能力に関して不活性化されるよう、操作され得る（例えばBerkner et al. (1988) BioTechniques 6: 616；Rosenfeld et al. (1991) Science 252: 431-434；およびRosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143-155参照）。アデノウイルスＡｄ菌株５d1324型またはアデノウイルスの他の菌株（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）由来の適切なアデノウイルスベクターは、当業者で周知である。組換えアデノウイルスは、それらが有効な遺伝子送達ビヒクルであるべき分裂中細胞を必要とせず、そして広範な種々の細胞型、例えば気道上皮細胞（Rosenfeld et al. (1992)上記）、内皮細胞（Lemarchand et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6482-6486）、肝細胞（Herz and Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2812-2816）、および筋細胞（Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581-2584）を感染させるために用いられ得る。
【００５２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子療法目的のためにＤＮＡの送達のための遺伝子療法ベクターとして用いられ得る。ＡＡＶは、効率的複製および増殖的生活環のためのヘルパーウイルスとして別のウイルス、例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルスを要する天然欠損ウイルスである（Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. And Immunol. (1992) 158: 97-129）。ＡＡＶは、非分裂中細胞中にＤＮＡを組込むために用いられ得る（例えばFlotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349-356；Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822-3828；およびMcLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62: 1963-1973参照）。Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260に記載されたようなＡＡＶベクターは、細胞中にＤＮＡを導入するために用いられ得る（例えばHermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6466-6470；Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081；Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2: 32-39；Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51: 611-619およびFlotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3781-3790参照）。レンチウイルス遺伝子療法ベクターも、本発明に用いるために適合され得る。
【００５３】
遺伝子療法のための一般的方法は、当該技術分野で既知である（例えば米国特許第5,399,346号（Anderson等）参照）。遺伝物質を送達するための生体的合成カプセルは、ＰＣＴ公告WO 95/05452（Baetge等）に記載されている。造血細胞中への遺伝子移入の方法も報告されている（Clapp, D.W., et al., Blood 78: 1132-1139 (1991)；Anderson, Science 288: 627-9 (2000)；およびCavazzana-Calvo et al., Science 288: 669-72 (2000)参照）。
【００５４】
神経膠細胞由来ＢＤＮＦおよび疼痛間の相関に相関を考えると、このような神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る化合物が疼痛の予防および治療のために用いられ得る。したがって本発明はさらに、神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る化合物の同定および特性化のためのスクリーニング方法に関する。
【００５５】
したがって本発明はさらに、候補または試験化合物が神経膠細胞由来ＢＤＮＦ活性または発現を低減し得る、そして次に疼痛の予防および治療のために有用であるか否かを確定する方法を提供する。このような方法は、候補化合物の存在下対非存在下で、適切な系におけるＢＤＮＦ活性および／または発現を検定することを包含し得る。一実施形態では、当該方法は、ＢＤＮＦ活性を有するかまたはＢＤＮＦを発現する神経膠細胞を上記候補化合物と接触させ、そしてＢＤＮＦ活性または発現が試験化合物の存在下で低減されたか否かを確定することを包含する。ＢＤＮＦ活性または発現の低減は、試験化合物が疼痛の治療または予防のために用いられ得る、ということを示す。一実施形態では、神経膠細胞は刺激化神経膠細胞である（例えばＡＴＰ刺激神経膠細胞、あるいは末梢神経または神経路損傷に対して後シナプス性である）。別の実施形態では、神経膠細胞は、マイクログリア、星状細胞および乏突起膠細胞から選択される。さらなる実施形態では、神経膠細胞は、ＢＤＮＦを内因的に発現する。別の実施形態では、上記神経膠細胞は、ＢＤＮＦ遺伝子を発現するよう遺伝子工学処理された。本明細書中に記載される方法は、試験化合物、例えばｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ様分子、リボザイムおよび／またはオリゴヌクレオチドのアンチセンスに関してスクリーニングするために用いられ得る。
【００５６】
本発明は、疼痛の治療または予防において用いられ得る化合物を同定するかまたは特性化するための別のスクリーニング方法も提供する。一実施形態では、当該方法は、神経膠細胞を候補化合物と接触させ、そして神経膠刺激が試験化合物の存在下で低減されたか否かを確定することを包含する。神経膠細胞活性化の低減は、試験／候補化合物は、疼痛の治療または予防のために用いられ得る、ということを示す。一実施形態では、神経膠細胞は、刺激神経膠細胞（例えばＡＴＰ刺激神経膠細胞、あるいは末梢神経または神経路損傷に対して後シナプス性）である。別の実施形態では、神経膠細胞は、マイクログリア、星状細胞および乏突起膠細胞から選択される。
【００５７】
上記のように、本発明はさらに、ＢＤＮＦ遺伝子発現を低減し得る化合物の同定および特性化のための方法に関する。このような方法は、試験化合物の存在下対非存在下でＢＤＮＦ遺伝子発現を検定することを包含し得る。このような遺伝子発現は、対応するＲＮＡまたはタンパク質の検出により、あるいはレポーター遺伝子と操作可能的に連結されたＢＤＮＦ遺伝子と普通は関連した転写調節素子（単数または複数）を含む適切な受容体構築物の使用によって測定され得る。第一核酸配列が第二核酸配列と機能的関係で配置される場合、第一核酸配列は第二核酸配列と「操作可能的に連結され」得る。例えばプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列と操作可能的に連結される。一般的に、操作可能的連結ＤＮＡ配列は連続性であり、そして2つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、リーディングフレーム内に存在する。しかしながら例えばエンハンサーは一般的にプロモーターから数キロベース分離される場合に機能し、そしてイントロン配列は可変長を有し得るため、いくつかのポリヌクレオチド素子は操作可能的に連結され得るが、しかし連続性でない。「転写調節素子」とは、開始および終結シグナル、エンハンサー、およびプロモーター、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル（それらが操作可能的に連結されるタンパク質コード配列の転写を誘導するかまたは制御する）のようなＤＮＡ配列を指す総称的用語である。このようなレポーター遺伝子の発現は、例えば産生されるＲＮＡまたはタンパク質の量により、転写または翻訳レベルで測定され得る。ＲＮＡは、例えばノーザン分析により、または逆転写酵素‐ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）により、検出され得る（例えばSambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (second edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA参照）。タンパク質レベルは、親和性試薬（例えば抗体またはその断片［方法に関しては、例えばHarlow, E. and Lane, D (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY参照］；タンパク質と結合するリガンド）を用いて直接的に、あるいはその他の特性（例えば、グリーン蛍光タンパク質の場合には蛍光）により、または検出可能な物質（例えば変更された分光分析的特性を有する）を産生する酵素活性を必然的に生じ得るタンパク質の活性または検出可能な表現型（例えば細胞増殖の変化）の測定により、検出され得る。適切なレポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β‐Ｄガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよび／またはグリーン蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
一実施形態では、候補化合物はさらに、それがＢＤＮＦ媒介性過程またはＢＤＮＦ活性を調節し得るか否かを確定するために検定され得る。
本発明は、ＢＤＮＦを分泌する神経膠細胞の能力を低減するそれらの能力に基づいて疼痛の治療または予防に用いられ得る化合物に関するさらなるスクリーニング方法も提供する。一実施形態では、当該方法は、ＢＤＮＦを分泌し得る細胞（例えば神経膠細胞）の存在下で試験化合物を接触させ、そしてＢＤＮＦの分泌が試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定することを包含する。神経膠細胞からのＢＤＮＦ分泌の低減は、試験化合物が疼痛の治療または予防に用いられ得る、ということの指標である。一実施形態では、神経膠細胞は、刺激神経膠細胞である（例えばＡＴＰ刺激神経膠細胞、あるいは末梢神経または神経路損傷に対して後シナプス性）。一実施形態では、神経膠細胞は、マイクログリア、星状細胞および乏突起膠細胞から選択される。
【００５９】
本明細書中に記載されるスクリーニング方法は、単一試験化合物、あるいは複数の試験化合物または試験化合物のライブラリー（例えば組合せライブラリー）とともに用いられ得る。後者の場合、化合物の組合せにより提供される相乗作用も、同定され、特定化され得る。上記の化合物は、疼痛の予防および／または治療のために用いられ得るし、あるいは改善された特異性、効能および／または薬理学的（薬物動態的）特性を有する付加的化合物の開発および試験のためのリード化合物として用いられ得る。一実施形態では、化合物は、適切な作用部位で、例えばＣＮＳ組織中で（例えば脊髄中で）その活性形態に変えられるプロドラッグであり得る。ある種の実施形態では、本発明のスクリーニング／試験方法の1つまたは複数のステップは自動化され得る。
【００６０】
本発明の種々の実施形態が本明細書中に開示されているが、しかし当業者の共通の一般的知識に従って本発明の範囲内で、多数の適合および修正がなされ得る。このような修正は、実質的に同一の方法で同一結果を達成するために、本発明の任意の態様に代わる既知の等価物の置換を包含する。数字の範囲は、当該範囲を限定する数を含む。特許請求の範囲において、「〜を含む」という語は、大まかな用語として用いられ、「〜を包含するが、しかし限定されない」という語句と実質的に等価である。以下の実施例は本発明の種々の態様を例証するものであって、本明細書中に開示されるような本発明の広範な態様を限定しない。
【実施例】
【００６１】
実施例
実施例１  ‐  材料および方法
末梢神経損傷モデルおよび行動試験。    成体雄Sprague-Dawleyラットの坐骨神経注意にポリエチレン・カフ（長さ2 mm、内径0.7 mm）を外科的に埋め込むことにより、末梢神経損傷を誘導した。擬似手術（対照として使用）に関しては、すべての外科的手順を動物に施したが、但し、カフを埋め込まなかった。機械的刺激に対する50％引っ込め閾値または50％足引っ込め閾値を査定した。神経損傷後、2 gまたはそれ以下への機械的閾値の漸次低減（14〜17日間）を示した動物のみを、さらなる実験のために用いた。このモデルにおいて誘導された末梢神経損傷を有する動物では、マイクログリア活性化マーカーＯＸ‐４２に関するラベリング増大により示されるように、神経カフと同じ側の脊髄にマイクログリア活性化が認められた（図５Ｂおよび５Ｃ）。
【００６２】
切片調製。    前記のような成体（＞50日齢）雄ラットから、脊髄の傍矢状切片（300〜350 μm）を調製した。以下の：126ＮａＣｌ、26ＮａＨＣＯ3、10グルコース、2.5ＫＣｌ、2ＣａＣｌ2、2ＭｇＣｌ2、1.25ＮａＨ2ＰＯ4（95％Ｏ2／5％ＣＯを発泡、ｐＨ7.4）（mM）を含有する人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）を用いて、切片を連続還流（2〜3 ml／分）した。
【００６３】
記録法。    穿孔パッチ記録のために、以下の：130メチル硫酸カリウム（ＫＭｅＳＯ4）、5ＣｓＣｌ、2ＭｇＣｌ2、11ＢＡＰＴＡ、1ＣａＣｌ2、4ＡＴＰ、0.4ＧＴＰ、10ＨＥＰＥＳ（〜ｐＨ7.4）（mM）を含有する溶液をピペット先端に充填した。25 μg/mlグラミシジンＤ［グラミシジン・ストックは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中10 mg/mlであった］を補足したこの同一溶液をピペットに詰め戻した。アクセス抵抗が25〜45 MΩで安定である場合、この方式での記録を選択した。全細胞電圧クランプ記録法に関しては、グラミシジンＤを欠く上記溶液をピペットに充填した。マイクロピペットを介して加圧排出により10〜50分間、ＧＡＢＡを局所的に適用した。データ獲得およびＰＳＣの分析を、前記と同様に実施した；膜電位測定を前記と同様に補正した。ＬＩニューロンの入力抵抗も静止膜電位も、この試験に用いられる薬剤またはプロトコールのいずれかにより有意に影響を及ぼされなかった。測定値はすべて、指示された場合を除いて、平均±ＳＥＭとして示す。平均値の比較のためにスチューデントｔ検定を、分割表のためのカイ二乗検定を、そして反復測定に関する分散の混合要因分析（post-hocテューキーＨＳＤ検定）を用いて、統計学的有意を試験した。
【００６４】
マイクログリア培養。    記載されたような標準条件下で、ラット一次培養マイクログリアを調製した。要するに、Wistarラット新生仔から混合膠細胞培養を調製し、10％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中に10〜16日間保持した。フラスコを静かに振盪することにより一次培養からマイクログリアを分離し、プラスチック皿上で再プレートかした。細胞スクレーパーを用いて皿表面から細胞を取り出し、100 μlのＰＢＳ中に収集した；その後、細胞計数器を用いてマイクログリアの細胞密度を測定し、ＰＢＳの容積を調整して、最終密度を1000細胞／10 μlとした。この方法により、＞95％純度のマイクログリア培養を得た。ＡＴＰ刺激のために、精製マイクログリアをＡＴＰ（50 μM）とともに1時間インキュベートした。
【００６５】
くも膜下腔内注射およびＥＬＩＳＡ。    薬剤投与の少なくとも3日前に、ラットをペントバルビタールナトリウム（65 mg/kg）で麻酔し、腰椎カテーテル（ＰＥ‐１０ポリエチレン管）をくも膜下腔内に挿入した。手術からの回復時に、くも膜下腔内リドカイン（2％、30 μl）注射により下半身麻痺を誘導して、適正カテーテル局在化を確証した。リドカインに対する適切な一過性麻痺ならびに運動障害欠如を示す動物のみを、行動試験のために用いた。薬剤／ビヒクル投与後、動物を屠殺し、それらの脊柱を解剖して、カテーテルの精確な配置を視覚的に確証した。薬剤は、ＢＤＮＦ（10 μg/日または10 μg/注射）および抗ＴｒｋＢ抗体（2時間毎に12 μgまたは30 μg/注射）、ＴｒｋＢ‐Ｆｃ（5 μg/注射）（これらはすべて、生理食塩水プラス10％（v/v）ＤＭＳＯ中に調製した）を含有した。ウイルス媒介性形質導入に関しては、ＢＤＮＦおよびＥＧＦＰをコードするアデノウイルスベクターを1回（20 μl；2.0×1010ＰＦＵ／ml）投与した。用いた用量では、反射作用および行動観察を把握し、是正し、そして位置づけることにより査定されるように、運動障害または鎮静を生じる化合物はなかった。マイクログリアが小妨害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）でリポフェクトかされた実験に関して、抗ＢＤＮＦおよびスクランブルｓｉＲＮＡはDharmacon Inc.から入手した。ＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡは、4つのプール化２１‐ヌクレオチド二重鎖で構成された。4つの二重鎖の配列を以下に示す：
【００６６】
１）TCGAAGAGCTGCTGGATGA（配列番号７）
２）TATGTACACTGACCATTAA（配列番号８）
３）GAGCGTGTGTGACAGTATT（配列番号９）
４）GAACTACCCAATCGTATGT（配列番号１０）。
【００６７】
メーカーの使用説明書に従って、リポフェクタミン２０００TMとともにＢＤＮＦまたはスクランブルｓｉＲＮＡでマイクログリア培養をトランスフェクトした。要するに、ｓｉＲＮＡおよびリポフェクタミンを無血清培地中で希釈し、混合して、マイクログリア培養に付加した。トランスフェクトを5時間生じさせて、その後のくも膜下腔内注射のために上記と同様にマイクログリアを収集した。すべての場合に、30 μlのマイクログリア＋上清を正常ラットにくも膜下腔内注射した。  免疫組織化学。    還流浮動切片で、免疫組織化学検査を実施した。ＣＲ３／ＣＤ１１ｂを標識するＯＸ‐４２（セダルラン、1:1000）を、マイクログリアに関する特異的マーカーとして用いた。第一抗体とともに4℃で一晩インキュベーション後、切片をすすぎ、ビオチニル化抗マウスＩｇＧ（1:1000）とともに室温で1時間インキュベートした。次に切片を再びすすぎ、アビジン‐ビオチンペルオキシダーゼ複合体（Vector Laboratories）中に1時間浸漬した。最後に、0.003％過酸化水素を含有する0.05％３，３‘‐ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で陽性ラベリングを可視化した。
【００６８】
ＢＤＮＦ分泌を測定するために、上記の種々の実験条件下でマイクログリアを調製し、37℃で6時間インキュベートして、上記in vivo実験を模擬した。
【００６９】
カルシウム画像処理。    カルシウム画像処理のために脊髄切片を調製し、前記のようにＧＡＢＡに対する応答に関して試験した。マイクログリアの一次培養を上記と同様に調製し、標準カバーガラスに移して、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（＋0.01％ＤＭＳＯ）中の2.5 μMフラ‐２‐ＡＭとともに45分間インキュベートした。蛍光体負荷後、微小ピペットからのＡＴＰ（10 μM）の短時間（〜5秒）適用を用いて、個々のマイクログリア中の［Ｃａ2+］iの変化を惹起した。エピ蛍光光学機器を装備したZeiss Axioscope上の40×水浸対物レンズを用いて、［Ｃａ2+］iを蛍光定量的に測定した。ＣＣＤカメラと結合されたTILL Photonicsモノクロメーターを用いて画像を獲得し、当該領域（比演算のために）を明らかに異なるニューロン細胞体に関して抜き出した。
【００７０】
実施例２  ‐  結果
マイクログリアが椎弓板Ｉ（ＬＩ）ニューロン中のＥ陰イオンに影響を及ぼし得るか否かを調べるために、前記のようにin vivoでナイーブラットの腰椎レベルにくも膜下腔内カテーテルを介してマイクログリアを投与し、その後、これらの動物から調製した急性脊髄切片中のＬＩニューロンからの穿孔パッチおよび全細胞記録を作成した。各動物を屠殺する前に、侵害受容性引っ込め閾値を確定して、治療に応答する触覚性異痛の存在または非存在を確証した。ＡＴＰ（50 μM）で刺激されていたマイクログリアを投与した動物において、侵害受容性引っ込め閾値は漸進的に低減して、約5時間後に最小に達した（図１Ａ）。これに対して、対照非刺激マイクログリアで処理した動物では、引っ込め閾値の変化は認められなかった（図１Ａ）。大脳皮質および脊髄由来マイクログリアは、足引っ込め閾値において比較可能な低減を生じる、ということが判明した。皮質のサイズが大きいため、それはより大きなマイクログリアを生じ、したがってその後の検査のために用いた。
【００７１】
くも膜下腔内マイクログリア投与の5時間後に調製した切片から、電気生理学的記録を作成した。ＬＩニューロンからの電圧クランプ記録法を用いて、対照マイクログリアを注射したラットから採取した脊髄切片において、Ｅ陰イオンは−68.3±1.8 mV（ｎ＝6；図１Ｂ）である、ということが判明した。他方、ＡＴＰ刺激マイクログリアの投与後のラットからのＬＩニューロンでは、Ｅ陰イオンは−61.6±1.1 mV（ｎ＝16；ｐ<0.0001）であった。電流クランプ記録法を用いて、ＧＡＢＡは対照動物からのＬＩニューロンにおいて過分極を引き起こす（図１Ｃ上）が、一方、ＡＴＰ刺激マイクログリアが投与されていたラットからのニューロンにおいてＧＡＢＡは脱分極を生じる（図１Ｃ、下）、ということが判明した。したがってＡＴＰ刺激マイクログリアのくも膜下腔内投与はＬＩニューロンにおけるＥ陰イオンの脱分極シフトを生じ、そして過分極から脱分極にＧＡＢＡ惹起応答を転換した。抑制応答におけるこれらの変化は、ＡＴＰ刺激マイクログリアにより引き起こされる侵害受容性引っ込め閾値の低減と同時に起こる。
【００７２】
Ｅ陰イオンにおけるシフトを実行するために、ＡＴＰ刺激マイクログリアはＬＩ後角ニューロンにシグナルを送る。活性化マイクログリアは種々の生物学的活性シグナル伝達分子を分泌することが既知であり、そのうちの1つはＢＤＮＦであって、これは、感作および炎症に次いで起こる後角ニューロンの過敏性と、そして海馬における陰イオン勾配シフトとの両方に関与している。ナイーブラットにＢＤＮＦをくも膜下腔内投与して、それは、ＡＴＰ刺激マイクログリアにより生じたものに匹敵する足引っ込め閾値の低減を生じる、ということが判明した（図２Ａ）。
【００７３】
ＢＤＮＦがＥ陰イオンにおけるシフトを引き起こし得るか否かを確定するために、それをナイーブラットから採取した脊髄切片に浴適用した。ＢＤＮＦで処理した（>90分）切片におけるＬＩニューロン（ｎ＝9）のＥ陰イオンは、対照非処理切片からのＬＩニューロン（ｎ＝9；ｐ<0.005；図２Ｂ）のものより有意に低陰性である、ということが判明した。したがって、ＧＡＢＡに対する応答は、ＢＤＮＦ投与中は抑制性であるというよりむしろ興奮性であり得る、という可能性がある。カルシウム画像処理を用いたＬＩニューロン（ｎ＝96）における短時間ＧＡＢＡ適用後の細胞内カルシウム（［Ｃａ2+］i）のレベルをモニタリングすることにより、この組織を検査した。ＢＤＮＦを用いた還流中、そしてグルタメート受容体遮断薬の存在下で、［Ｃａ2+］iの上昇を伴ってＧＡＢＡに応答するニューロンの割合は経時的に増大し、80〜120分に記録されたニューロンの31％に達した（ｐ<0.05；図２Ｃ）。ＧＡＢＡA受容体遮断薬ビククリンを浴適用することにより［Ｃａ2+］iの上昇を防止して、作用がＧＡＢＡA受容体により媒介されることを確証した。したがって、切片におけるＢＤＮＦの短期投与はＥ陰イオンの脱分極シフトを引き起こし、そして約30％の細胞では、ＧＡＢＡに正味興奮を生じさせる、と結論づけられた。
【００７４】
ＢＤＮＦへのin vivoでの持続性長期曝露の作用を確定するために、くも膜下腔内カテーテルを介してＢＤＮＦ形質導入組換えアデノウイルス（ａｄＢＤＮＦ）を投与した（ｎ＝16）。このａｄＢＤＮＦは、4日間の注射後試験中に、足引っ込め閾値の漸進的低減を生じた。これに対して、ＢＤＮＦをコードしない対照アデノウイルスの注射は、同一期間中に足引っ込め閾値に影響を及ぼさなかった（ｎ＝6；ｐ<0.005；図２Ｄ）。ａｄＢＤＮＦ処理の長期作用のため、処置動物から採取した切片中のＥ陰イオンの変化に関して試験し得た。ａｄＢＤＮＦ注射ラット（ｎ＝7）からのＬＩニューロン中のＥ陰イオンは、対照アデノウイルスで処理したラットから測定されたいいより有意に低陰性である（ｎ＝4；ｐ<0.01；図２Ｅ、Ｆ）、ということが判明した。さらに、ＧＡＢＡ適用は、ａｄＢＤＮＦ注射ラットからのいくつかのＬＩニューロンに作用電位を発火させた（試験した7細胞のうち2つ）が、一方、これは対照条件では観察されなかった。したがってＢＤＮＦの短期投与と同様に、持続性局所放出は足引っ込め閾値の低減、Ｅ陰イオンにおける脱分極シフトを引き起こし、そしてＧＡＢＡの作用を抑制から興奮に切り替え得た。
【００７５】
これらの結果は、外因性ＢＤＮＦが触覚性異痛およびＥ陰イオンのシフトを生じるのに十分である、ということを示す。ＢＤＮＦが末梢神経損傷の後遺症の内因性媒介物質であり得るか否かを調べるために、ＴｒｋＢ受容体（抗ＴｒｋＢ）に対する機能遮断抗体ならびにＢＤＮＦ隔離融合タンパク質（ＴｒｋＢ‐Ｆｃ）（これらは各々、ＢＤＮＦの作用を遮断することが実証されている）を用いた。末梢神経損傷後2週間で異痛を発症していたラットに、くも膜下腔内カテーテルにより抗ＴｒｋＢまたはＴｒｋＢ‐Ｆｃを投与した。これらの作用物質の投与の前および後に、足引っ込め閾値を測定した。これらの作用物質の各々は、足引っ込め閾値における低減を短期間に逆転する（それぞれｎ＝7＆4、p<0.05；図３Ａ）ということが判明した。これに対して、末梢神経損傷を有するラットへのビヒクル投与は、引っ込め閾値の変化を生じなかった（図３Ａ）。ＢＤＮＦ‐ＴｒｋＢシグナル伝達がＬＩニューロンにおけるＥ陰イオンの神経損傷誘発性シフトのために必要であるか否かを確定するために、末梢神経損傷の2週間後に異痛を有するラットから採取した脊髄切片に短期的に適用した抗ＴｒｋＢの作用を調べた。抗ＴｒｋＢで処理した切片（ｎ＝7）中のＬＩニューロンのＥ陰イオンは、ビヒクル処理切片（ｎ＝6；p<0.05；図３Ｂ、Ｃ）と比較して有意により陰性であった、ということが判明した。総合すると、これらの知見は、末梢神経損傷に起因する触覚性異痛およびＬＩニューロンのＥの脱分極シフトの両方を持ちこたえるためには内因性ＢＤＮＦが必要である、ということを示す。
【００７６】
ＢＤＮＦ‐ＴｒｋＢシグナル伝達の妨害がＡＴＰ刺激マイクログリアを投与することにより生じる触覚性異痛およびＬＩニューロンＥにおけるシフトを防止するはずであるか否かを試験するために、ＡＴＰ刺激マイクログリアを抗ＴｒｋＢまたはＴｒｋＢ‐Ｆｃと一緒に投与した。ＡＴＰ刺激マイクログリアをこれらの遮断薬のいずれかと一緒に投与しても、くも膜下腔内注射後5時間に亘る足引っ込め閾値の変化は生じなかった（それぞれｎ＝8＆7；図４Ａ）。これに対して、異痛は、これらの作用物質を伴わないＡＴＰ刺激マイクログリアの投与後、漸進的に発症した（ｎ＝8）。ＡＴＰで刺激されたマイクログリアは、脊髄内の細胞からのＢＤＮＦの放出を引き起こし得る。遮断薬は、投与マイクログリアそれ自体からというよりむしろ、この供給源からのＢＤＮＦの作用を妨害し得る。これら2つの可能性間を区別するために、ＢＤＮＦに対して向けられる二本鎖ＲＮＡ（ＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡ）で培養マイクログリアを前処理した。この前処理後、マイクログリアをＡＴＰで刺激し、そしてナイーブラット中にくも膜下腔内注射した場合、引っ込め閾値の変化を引き起こすことはできなかった（ｎ＝7；図４Ａ）。ｓｉＲＮＡの潜在的非特異的作用に関して制御するために、ＡＴＰ刺激前にＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡのスクランブル・バージョンでマイクログリアを処理した；これらのマイクログリアは、強い異痛を引き出した（ｎ＝4；図４Ａ）。さらにまた抗ＴｒｋＢでまたはＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡで処理したマイクログリアにおけるＡＴＰ惹起カルシウム応答は、ビヒクル処理対照マイクログリアのものと異ならず、このことは、抗ＴｒｋＢまたはＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡによる処理がＡＴＰに対するマイクログリアの応答に影響を及ぼさなかった、ということを実証する（図４Ｄ）。しかしながらＢＤＮＦ‐ＴｒｋＢシグナル伝達の妨害は、マイクログリア誘導性触覚性異痛を防止した。
【００７７】
ＡＴＰ刺激マイクログリアにより生じるＥ陰イオンの脱分極シフトは、ＢＤＮＦ‐ＴｒｋＢシグナル伝達を妨害することにより防止され得る。ＡＴＰ刺激マイクログリアを抗ＴｒｋＢと一緒に施された、またはＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡ前処理後の動物からのＬＩニューロンにおけるＥ陰イオンは、非刺激マイクログリアを施された動物からのＬＩニューロンにおけるものと有意に異ならない、ということが判明した。しかしながらこれらの群のラットのいずれかから採取したＬＩニューロンにおけるＥ陰イオンは、ＡＴＰ刺激マイクログリアをビヒクルとともに投与されていた動物から採取したＬＩニューロンのものと比較して、有意により陰性であった（図４Ｃ）。したがって抗ＴｒｋＢおよびＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡは、ＡＴＰ刺激マイクログリアにより誘導されたＥ陰イオンのシフトを防止した。
【００７８】
さらにＡＴＰ刺激（ｎ＝3）は培養中のマイクログリアからのＢＤＮＦの放出を生じたが、しかしビヒクル対照（ｎ＝4）は生じなかった（p<0.001；図４Ｅ）。Ｐ２Ｘ受容体遮断薬ＴＮＰ‐ＡＴＰで培養を処理することにより、ＡＴＰのこの作用を遮断した（ｎ＝3；p<0.05）。さらに、ＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡによるマイクログリアの前処理は、ＡＴＰ刺激によるＢＤＮＦの放出を防止した（ｎ＝3；p<0.001）。これらの知見を上記の行動および電気生理学的結果と合わせて考えると、ＡＴＰ刺激マイクログリアにより引き起こされる足引っ込め閾値の低減およびＬＩニューロンにおけるＥ陰イオンのシフトはともに、ＢＤＮＦ‐ＴｒｋＢシグナル伝達を、そしてＢＤＮＦの供給源がマイクログリアそれ自体であることを必要とする、と結論づけられた。
【００７９】
マイクログリアＡＴＰシグナル伝達の抑制が末梢神経損傷により引き起こされるＥ陰イオンのシフトを抑制し得るか否かを試験するために、マイクログリア中のＰ２Ｘ受容体に作用を及ぼすことにより、神経損傷誘導性触覚性異痛を逆転することが示されているＴＮＰ‐ＡＴＰを用いた。末梢神経損傷の2週間後に異痛ラットから採取した脊髄切片に、ＴＮＰ‐ＡＴＰを短期的に浴適用した。ＴＮＰ‐ＡＴＰの存在下では、ＬＩニューロンのＥ陰イオンは−59.3±1.8 mV（ｎ＝6）であったが、これは、神経損傷動物から採取した非処理切片からのＬＩニューロンにおけるもの（−49.3±4.5 mV、ｎ＝6、p<0.05）と比較して、有意により陰性であった。したがってＰ２Ｘ受容体活性化は、末梢神経損傷を有する銅粒におけるＥ陰イオンの脱分極シフトを持ちこたえるために必要である、と結論づけられた。さらに全実験条件を通しての足引っ込め閾値とＬＩニューロンにおけるＥ陰イオンとの間の逆相関が判明したが、これは、マイクログリアおよび異痛間の重要な機械学的リンクとしてのＥ陰イオンを示唆する。
【００８０】
ニューロン起源のＢＤＮＦが脳および脊髄における抑制シナプスの正常代謝回転のために必要である、ということは明らかである；実際、長期後シナプス性可塑性を誘発することが既知の刺激パターンは、表在性後角における一次求心性神経からのＢＤＮＦの放出を引き出すことが実証されている。しかしながら、ＢＤＮＦ機能遮断抗体の適用は長期可塑性の誘導のみを弱め、維持に影響を及ぼさないことが実証されているので、正常可塑性のためにはＴｒｋＢ受容体の短期活性化のみが必要である、ということは明らかである。これに対して、抑制の病態生理学的抑圧はＴｒｋＢ受容体の反復的活性化を必要とし得る：中和抗体（抗ＴｒｋＢ）の適用によるＴｒｋＢ抑制は、ここでは、疼痛過敏を、ならびにＬＩニューロン陰イオン勾配の低減（神経損傷から生じる）を迅速に弱めることが示された。したがって本明細書中に記載される試験は、それが、正常ニューロン機能のために重要な無傷過程（即ちＢＤＮＦのニューロン性プール）を残しながら、疾患を触媒する過程を排除するための戦略を表すため、すべてのＢＤＮＦ作用を操作するというよりむしろ、神経障害性疼痛の治療的介入のためにマイクログリア由来ＢＤＮＦを標的にするという利点を実証する。したがって一実施形態では、本明細書中に記載される方法は、正常ニューロン性過程に及ぼす作用を全くまたは実質的に全く生じない。
【００８１】
本出願全体を通して、種々の参考文献は、本発明に関する当該技術分野の状態をより詳述に記載するために参照される。これらの参考文献の記載内容は、参照により本明細書中で援用される。
【００８２】
【化１】
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【００８３】
【化２】
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【００８４】
【化３】
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【００８５】
【化４】
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【００８６】
【化５】
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【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１Ａ−Ｂ】図１：  くも膜下腔内カテーテル誘発性異痛によるラットへのＡＴＰ刺激マイクログリアの脊髄送達ならびに椎弓板Ｉニューロンの膜貫通陰イオン勾配の脱分極シフト。  Ａ：ナイーブラットにおいて、ＡＴＰ刺激マイクログリア（皮質または脊髄起源）の局所脊髄送達は平均足引っ込め閾値（ＷＤ50）の有意の低減を引き起こしたが、静止マイクログリアの場合はそうではなかった。  Ｂ：左：  静止マイクログリア‐およびＡＴＰ刺激マイクログリア‐注射ラットからのＬＩニューロンで記録された平均Ｅ陰イオンの比較（細胞の静止膜電位における有意の変化は認められなかった、ということに留意）。  右：  ＡにおけるＡＴＰ刺激または静止マイクログリアで処理されたラットから得られた切片中の種々の値のＶｍでＬＩニューロン中で測定されるＧＡＢＡにより誘発される平均ピーク電流。水平標準誤差バーはニューロン間差を表す。  差込図‐代表的生トレース。
【図１−Ｃ】Ｃ：  静止膜電位で、ＧＡＢＡに対する後シナプス応答はＷＤ50＝3.4 gを有するラットから得られたＬＩニューロンにおいて脱分極性であったが、それに対比して、ＷＤ50＝12.6 gを有するラットから得られたＬＩニューロンにおける応答の場合は、ＧＡＢＡは過分極性であった、ということを示す、電流クランプ記録方式での、代表的トレース。
【図２Ａ−Ｃ】図２：  後角におけるＢＤＮＦの濃度増強は、侵害受容性過敏、ならびに椎弓板Ｉニューロンの膜貫通陰イオン勾配の脱分極シフトを引き出した。  Ａ：  生理食塩水対照（有意の低減を引き起こさなかった）と比較して、無傷ラットの腰椎後角への組換えヒトＢＤＮＦ（20 μg）のくも膜下腔内送達は、1時間以内にＷＤ50の有意の且つ一過性の低減を引き起こした。  Ｂ：  ＢＤＮＦ（50 ng/ml； ＞90分間）で処理された切片対対照ＡＣＳＦ（ナイーブ）の切片における平均Ｅ陰イオンの有意の脱分極。  Ｃ：  ＢＤＮＦで還流される切片における暫時ＧＡＢＡ適用は細胞内カルシウム（［Ｃａ2+］i）のビククリン感受性増大を引き起こし得る、ということを示す、フラ‐２‐ＡＭ‐負荷ＬＩニューロンからのカルシウム測定の代表的トレース。ＧＡＢＡに応答しない細胞の生存能力をＫＣｌ媒介性応答により確証した。  下右差込図：  ［Ｃａ2+］iのＧＡＢＡ媒介性上昇を示すＬＩニューロンの割合は、80〜120分間の連続ＢＤＮＦ還流中に漸増的に増大して31％に達した（χ2補正＝5.15）。これに対して、ＢＤＮＦの非存在下で同様の時間に亘って［Ｃａ2+］iの上昇を伴って応答したのは2％の細胞のみであった（Ｃ；χ2補正＝6.74）。
【図２Ｄ−Ｇ】Ｄ：  ＢＤＮＦ形質導入アデノウイルスベクター（ａｄＢＤＮＦ）のくも膜下腔内投与は、注射後4日間に亘って持続したＷＤ50の遅延性または漸進的低減を誘発した。これに反して、ＢＤＮＦをコードしない対照アデノウイルス（ａｄＧＦＰ）の投与は、足引っ込め閾値の低減を引き起こさなかった。  Ｅ：  ＤにおけるａｄＢＤＮＦ処理ラット対ａｄＧＦＰ処理ラットから得られた切片におけるＬＩニューロン中の平均Ｅ陰イオンの有意の脱分極。  Ｆ：  ＤにおけるａｄＢＤＮＦまたはａｄＧＦＰで処理されたラットから得られた切片中の種々の値のＶｍでＬＩニューロン中で測定されるＧＡＢＡにより誘発される平均ピーク電流。水平標準誤差バーはニューロン間差を表す。  Ｇ：  ａｄＢＤＮＦ処理ラットから得られた切片におけるＬＩニューロンへの暫時ＧＡＢＡ適用は作用電位を引き出す、ということを示す、電流クランプ記録方式での、代表的トレース。
【図３Ａ−Ｃ】図３：  末梢神経損傷を有するラットにおける椎弓板Ｉニューロンにおける逆異痛をシグナル伝達するＢＤＮＦ‐ＴｒｋＢの機能的抑制およびＥ陰イオンの脱分極シフト。  Ａ：  末梢神経損傷（ＰＮＩ）に応答する強い異痛を表示したラットの腰椎後角への抗ＴｒｋＢまたはＴｒｋＢ‐Ｆｃのくも膜下腔内投与は、ＷＤ50の有意の増大を引き起こした。  Ｂ：  ＧＡＢＡに対する後シナプス性応答はＰＮＩラットから得られるＬＩニューロンにおいて静止から脱分極しつつあったが、一方、これらの電位は抗ＴｒｋＢで還流された切片において精子から過分極しつつあったことを示す、電流記録方式での、代表的トレース。  Ｃ：  ＰＮＩラットから得られる切片中の2つのＬＩニューロン、即ち、一方は対照ＡＣＳＦで還流される切片から得られるもの、他方は抗ＴｒｋＢ還流（1 μg/ml）の2時間後の切片から得られるものにおける暫時局所ＧＡＢＡ適用に対する応答の、電圧クランプ記録方式での、代表的電流‐電圧プロット。  差込図：  ＰＮＩを受けていたラットから得られる切片の抗ＴｒｋＢ還流がＬＩニューロンにおけるＥ陰イオンの有意の過分極を引き出した、ということを示すプールデータ。
【図４Ａ−Ｃ】図４：  マイクログリア由来ＢＤＮＦは異痛ならびに椎弓板Ｉニューロンの膜貫通陰イオン勾配の脱分極シフトを誘発した。  Ａ：  抗ＴｒｋＢまたはＴｒｋＢ‐ＦｃとともにインキュベートされたＡＴＰ刺激マイクログリアの局所脊髄送達も、ＢＤＮＦ妨害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）でリポフェクトされたものも、足引っ込め閾値（ＷＤ50）における有意の変化を引き起こさなかった。しかしながらスクランブル・バージョンの妨害ＲＮＡ（Ｓｃｒ．ｓｉＲＮＡ）を用いたＡＴＰ刺激マイクログリアのリポフェクションは、5時間後にＷＤ50を有意に低下させた。  Ｂ：  アンチＴｒｋＢと組合せたＡＴＰ刺激マイクログリアまたはＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡでリポフェクトされたＡＴＰ刺激マイクログリアで処理されたラットから得られたＬＩニューロンにおいて、ＧＡＢＡに対する後シナプス応答が過分極しつつあったことを示す、電流クランプ記録方式での、代表的トレース。  Ｃ：  アンチＴｒｋＢと混合されたＡＴＰ刺激マイクログリアまたはＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡでリポフェクトされたＡＴＰ刺激マイクログリアの局所的脊髄送達を受けていたラットから得られたＬＩニューロンから測定された平均Ｅ陰イオンが、ＡＴＰ刺激マイクログリアを注射されたラットからのＬＩニューロンから測定されたものより有意に陰性であった、ということを示すプール化データ。
【図４Ｄ−Ｆ】Ｄ：  ＡＴＰの暫時適用に対する細胞の応答がアンチＴｒｋＢまたはＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡへのマイクログリアの曝露による影響を受けなかった、ということを示す、フラ‐２‐ＡＭ‐負荷マイクログリアからのカルシウム測定の代表的トレース。  Ｅ：  燐酸塩緩衝生理食塩水ビヒクル（ＰＢＳ）、ＡＴＰ、ＡＴＰ＋ＴＮＰ‐ＡＴＰ（10 μM）またはＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡによる前処理後のＡＴＰを用いた処理後5時間の培養マイクログリアの上清中のＢＤＮＦタンパク質のＥＬＩＳＡベースの測定。  Ｆ：  Ｅ陰イオンおよびＷＤ50間の関係を実証する相関プロット。このプロットにおけるデータは、ＷＤ50およびＥ陰イオンの両方が同一ラットで記録された場合のものだけを含む。
【図５Ａ−Ｂ】図５：  ＰＮＩ後、成体ラットの機械的刺激に対する侵害受容性引っ込め閾値（ＷＤ50）は2〜3週間の過程中、有意に低下したが、しかし擬似手術後には低下しなかった。  ＢおよびＣ：  ＯＸ‐４２染色（活性化マイクログリアを表示する）は、擬似手術ラット（左）と比較して、ＰＮＩラット（右）の同側後角の方がはるかに強い、ということを示す顕微鏡写真。Ｃにおけるスケール・バーは0.2 mmである；ＳＤＨ  ｉｐｓｉ＝ＰＮＩに対して同側の表在性後角。
【図５Ｃ−Ｄ】ＢおよびＣ：  ＯＸ‐４２染色（活性化マイクログリアを表示する）は、擬似手術ラット（左）と比較して、ＰＮＩラット（右）の同側後角の方がはるかに強い、ということを示す顕微鏡写真。Ｃにおけるスケール・バーは0.2 mmである；ＳＤＨ  ｉｐｓｉ＝ＰＮＩに対して同側の表在性後角。Ｄ：  ＰＮＩを受けていたラットから得られた切片上へのＴＮＰ‐ＡＴＰ（1 μM）の還流はＬＩニューロンにおけるＥ陰イオンの有意の過分極を引き出した、ということを示すプール化データ。
【図６】図６：  ヒトＢＤＮＦのコード配列（配列番号１、寄託番号M37762）およびポリペプチド配列（配列番号２、寄託番号AAA51820）。
【図７】図７：  マウスＢＤＮＦのコード配列（配列番号３、寄託番号BC034862）およびポリペプチド配列（配列番号４、寄託番号AAH34862）。
【図８】図８：  ラットＢＤＮＦのコード配列（配列番号５、寄託番号AY176065）およびポリペプチド配列（配列番号６、寄託番号AAO17828）。
【図１Ａ−Ｂ】
2008516993.tif 000008
【図１−Ｃ】
2008516993.tif 000009
【図２Ａ−Ｃ】
2008516993.tif 000010
【図２Ｄ−Ｇ】
2008516993.tif 000011
【図３Ａ−Ｃ】
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【図４Ａ−Ｃ】
2008516993.tif 000013
【図４Ｄ−Ｆ】
2008516993.tif 000014
【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2008516993000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月21日(2007.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における疼痛の治療または予防用組成物であって、当該被験者において神経膠由来ＢＤＮＦを低減することができる作用物質、及び医薬として許容される担体を含む前記組成物。
【請求項２】
被験者における痛覚の低減用組成物であって、当該被験者において神経膠由来ＢＤＮＦを低減することができる作用物質、及び医薬として許容される担体を含む前記組成物。
【請求項３】
前記剤が、以下の：
（ａ）神経膠細胞中でのＢＤＮＦ発現；
（ｂ）神経膠細胞からのＢＤＮＦの放出または分泌；
（ｃ）神経膠細胞の刺激；
（ｄ）神経膠細胞由来ＢＤＮＦ活性；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せ
からなる群から選択されるパラメーターを低減することができる、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記神経膠細胞が前記被験者の中枢神経系中に位置する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記疼痛のシグナルが末梢神経系（ＰＮＳ）細胞にまたは中枢神経系（ＣＮＳ）細胞に起源を有する、請求項１、及び３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記疼痛が神経障害性疼痛である、請求項１、及び３〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記神経障害性疼痛が神経または神経路損傷に関連する、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記神経障害性疼痛が体性および内臓痛からなる群から選択される、請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
前記神経障害性疼痛が化学的傷害に関連する、請求項７記載の組成物。
【請求項１１】
前記疼痛が慢性疼痛、慢性炎症性疼痛、関節炎に関連した疼痛、繊維筋痛、背痛、癌関連疼痛、消化器疾患に関連した疼痛、クローン病に関連した疼痛、自己免疫疾患に関連した疼痛、内分泌疾患に関連した疼痛、糖尿病性神経障害に関連した疼痛、幻肢痛、自発痛、慢性術後痛、慢性側頭下顎痛、灼熱痛、ヘルペス感染後神経痛、ＡＩＤＳ関連疼痛、ＩおよびＩＩ型複合性局所疼痛症候群、三叉神経痛、慢性背痛、脊髄損傷に関連した疼痛、薬剤摂取に関連した疼痛ならびに再発性急性疼痛からなる群から選択される、請求項１、及び３〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記作用物質がＢＤＮＦ発現を抑制し得る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記作用物質がアンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ様分子からなる群から選択される、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
前記作用物質がくも膜下腔内に投与される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記被験者が哺乳類である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記哺乳類がヒトである、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
以下の：
（ａ）被験者における神経膠細胞由来ＢＤＮＦを低減し得る作用物質；および
（ｂ）前記被験者における疼痛の治療または予防のためのその使用のための使用説明書
を含むパッケージ。
【請求項１８】
前記作用物質が以下の：
（ａ）神経膠細胞中でのＢＤＮＦ発現；
（ｂ）神経膠細胞からのＢＤＮＦの放出または分泌；
（ｃ）神経膠細胞の刺激；
（ｄ）神経膠細胞由来ＢＤＮＦ活性；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組合せ
からなる群から選択されるパラメーターを低減し得る、請求項１７記載のパッケージ。
【請求項１９】
前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される、請求項１７又は１８に記載のパッケージ。
【請求項２０】
疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、以下の：
（ａ）試験化合物を、ＢＤＮＦを発現するかまたはＢＤＮＦ活性を有する神経膠細胞と接触させ；そして
（ｂ）前記ＢＤＮＦ発現または活性が前記試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定する
ことを包含する方法であり、前記低減が疼痛の治療または予防のために前記試験化合物が用いられ得るということの指標である前記方法。
【請求項２１】
前記神経膠細胞が刺激神経膠細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記刺激神経膠細胞がステップ（ａ）前にＡＴＰと接触されていた、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記刺激神経膠細胞が末梢神経または神経路損傷に対して後シナプス性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記試験化合物がｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ様分子、オリゴヌクレオチドのアンチセンスおよびリボザイムから成る群から選択される、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、以下の：
（ａ）レポータータンパク質をコードし得るレポーター遺伝子を含む二次核酸と操作可能的に連結されるＢＤＮＦ遺伝子と普通は関連する転写的調節素子を含む一次核酸を含む神経膠細胞と試験化合物を接触させ；そして
（ｂ）レポーター遺伝子発現またはレポータータンパク質活性が前記試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定する
ことを包含する方法であり、レポーター遺伝子発現またはレポータータンパク質活性における前記低減が疼痛の治療または予防のために前記試験化合物が用いられ得るということの指標である前記方法。
【請求項２６】
疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、以下の：
（ａ）試験化合物を、ＢＤＮＦポリペプチドを分泌し得る神経膠細胞と接触させ；そして
（ｂ）前記ＢＤＮＦポリペプチドの分泌が前記試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定する
ことを包含する方法であり、前記ＢＮＤＦポリペプチドの分泌における低減が疼痛の治療または予防のために前記試験化合物が用いられ得るということの指標である前記方法。
【請求項２７】
前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2008516993.tif 000020
2008516993.tif 000021
2008516993.tif 000022