(57)【要約】  本発明は、特定の［１，４］ジアゼピノ［６，７，１−ｉ〜］キノリン誘導体ならびにそれらの調製および使用方法に関する。具体的に言うと、本発明は、式Ｉ（式中の様々な置換基は、本明細書中で定義する）の化合物に関する。本発明は、式Ｉの化合物を含む医薬組成物、その化合物の製造方法、およびその化合物の使用方法も提供する。【選択図】図１
2008519056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2008519056.tif 000095
［式中、
各ＲnおよびＲn'（この場合、ｎは、１から８である）について：
各ＲnおよびＲn'は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＣＨ3Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−ＯＳＯ3Ｈ、もしくは−Ｏ−Ｇであり；または
Ｒnおよびその対応するＲn'（この場合、ｎは、２、３、４、６、７もしくは８である）は、それらが結合している炭素と一緒になって、Ｃ＝Ｏを形成し；または
Ｒnとその対応するＲn+1と（この場合、ｎは、１、２、３、４、５もしくは７である）が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、各対応するＲn'およびＲ(n+1)'は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＣＨ3Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−ＯＳＯ3Ｈ、もしくは−Ｏ−Ｇであり；
Ｇは、式：
【化２】
2008519056.tif 000096
を有し、
式中、記号*をつけた窒素は、場合によりＮ−オキシドを形成し；
Ｘ−Ｙは、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ（Ｏ）、ＣＨ2Ｎ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、またはＣＲ9ＨＮＲ10であり；
Ｒ9は、水素、ヒドロキシ、または−ＯＳＯ3Ｈであり；
Ｒ10は、水素、アセチル、−ＳＯ3Ｈ、−Ｇ、または−Ｃ（Ｏ）−ＯＧであり；
Ｚは、水素、ヒドロキシ、−ＯＳＯ3Ｈ、または−Ｏ−Ｇであり；但し、
Ｚが、ヒドロキシであるときには、（ａ）Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、およびＲ10のうちの１つは、水素でないこと；または（ｂ）Ｘ−Ｙが、ＣＲ9ＨＮＲ10であることを条件とし；ならびに、
Ｘ−Ｙが、ＣＨＲ9ＮＲ10であるときには、Ｚ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、およびＲ10のうちの少なくとも１つは、Ｈでないことをさらなる条件とする］
の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項２】
ＺおよびＲ1からＲ8のうちの少なくとも１つが、−ＯＨである、請求項１に記載の化合物または塩。
【請求項３】
Ｘ−Ｙが、ＣＲ9ＨＮＲ10である、請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項４】
Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈである、請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項５】
Ｒ7およびＲ8のうちの少なくとも１つが、−ＯＨである、請求項４に記載の化合物または塩。
【請求項６】
Ｒ6が、−ＯＨである、請求項４に記載の化合物または塩。
【請求項７】
Ｒ3およびＲ4のうちの少なくとも１つが、−ＯＨである、請求項４に記載の化合物または塩。
【請求項８】
Ｒ1、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、およびＺのうちの少なくとも１つが、−ＯＨである、請求項４に記載の化合物または塩。
【請求項９】
Ｒ9が、Ｈであり、Ｒ10が、アセチルである、請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項１０】
Ｒ7およびＲ8のうちの少なくとも１つが、−ＯＨである、請求項９に記載の化合物または塩。
【請求項１１】
Ｘ−Ｙが、ＣＨ＝Ｎである、請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項１２】
Ｒ1からＲ6のうちの少なくとも１つが、−ＯＨである、請求項１１に記載の化合物または塩。
【請求項１３】
Ｒ2からＲ4のうちの少なくとも１つが、−ＯＨである、請求項１１に記載の化合物または塩。
【請求項１４】
Ｒ1からＲ6、Ｒ9、Ｒ10およびＺのうちの少なくとも１つが、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｇ、−Ｏ−Ｇ、または−Ｇである、請求項１に記載の化合物または塩。
【請求項１５】
Ｘ−Ｙが、ＣＲ9ＨＮＲ10である、請求項１４に記載の化合物または塩。
【請求項１６】
Ｒ9およびＲ10が、Ｈである、請求項１５に記載の化合物または塩。
【請求項１７】
Ｚ、Ｒ3、およびＲ4のうちの少なくとも１つが、−Ｏ−Ｇである、請求項１５に記載の化合物または塩。
【請求項１８】
Ｒ1からＲ6、Ｒ9、およびＺのうちの少なくとも１つが、−Ｏ−Ｇである、請求項１４に記載の化合物または塩。
【請求項１９】
Ｒ2とＲ3とが一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、ならびにＲ3'およびＲ4のうちの少なくとも１つが、−Ｏ−Ｇである、請求項１４に記載の化合物または塩。
【請求項２０】
Ｒ4およびＲ4'が、それらが結合している炭素と一緒になって、Ｃ＝Ｏを形成する、請求項１５に記載の化合物または塩。
【請求項２１】
Ｒ10が、−Ｇである、請求項２０に記載の化合物または塩。
【請求項２２】
Ｒ10が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｇである、請求項１５に記載の化合物または塩。
【請求項２３】
Ｒ10が、アセチルである、請求項１５に記載の化合物または塩。
【請求項２４】
Ｒ1からＲ6、Ｒ9、およびＺのうちの少なくとも１つが、−Ｏ−Ｇである、請求項２３に記載の化合物または塩。
【請求項２５】
Ｒ7およびＲ8のうちの少なくとも１つが、−Ｏ−Ｇである、請求項２３に記載の化合物または塩。
【請求項２６】
Ｒ1からＲ9、およびＺのうちの少なくとも１つが、−ＯＳＯ3Ｈである、請求項１に記載の化合物または塩。
【請求項２７】
Ｘ−Ｙが、−ＣＨＲ9ＮＲ10である、請求項２６に記載の化合物または塩。
【請求項２８】
Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈである、請求項２６または請求項２７に記載の化合物または塩。
【請求項２９】
Ｒ1からＲ6のうちの少なくとも１つが、−ＯＳＯ3Ｈである、請求項２８に記載の化合物または塩。
【請求項３０】
Ｒ2およびＲ3のうちの少なくとも１つが、−ＯＳＯ3Ｈである、請求項２８に記載の化合物または塩。
【請求項３１】
Ｒ3が、−ＯＳＯ3Ｈである、請求項２８に記載の化合物または塩。
【請求項３２】
Ｒ9およびＺのうちの少なくとも１つが、−ＯＳＯ3Ｈである、請求項２６または請求項２７に記載の化合物または塩。
【請求項３３】
Ｘ−Ｙが、ＣＲ9ＨＮＲ10であり、この場合、Ｒ9が、Ｈであり、Ｒ10が、−ＳＯ3Ｈである、請求項１に記載の化合物または塩。
【請求項３４】
Ｒnのうちの少なくとも２つおよびその対応するＲn+1（この場合、ｎ＝１〜５）が、それらが結合している炭素間で二重結合を形成する、請求項３３に記載の化合物または塩。
【請求項３５】
Ｒnおよび対応するＲn'が、それらが結合している炭素と一緒になって、Ｃ＝Ｏを形成する、請求項１に記載の化合物または塩。
【請求項３６】
Ｒ4およびＲ4'が、それらが結合している炭素と一緒になって、Ｃ＝Ｏを形成する、請求項３５に記載の化合物または塩。
【請求項３７】
Ｘ−Ｙが、ＣＲ9ＨＮＲ10である、請求項３６に記載の化合物または塩。
【請求項３８】
Ｒ10が、−Ｇである、請求項３６または請求項３７に記載の化合物または塩。
【請求項３９】
Ｒ9およびＲ10が、Ｈである、請求項３６または請求項３７に記載の化合物または塩。
【請求項４０】
Ｘ−Ｙが、Ｃ（Ｏ）ＮＨである、請求項１に記載の化合物または塩。
【請求項４１】
Ｘ−Ｙが、ＣＨ＝Ｎである、請求項１に記載の化合物または塩。
【請求項４２】
Ｒ1からＲ6のうちの少なくとも１つが、−ＯＨである、請求項４１に記載の化合物または塩。
【請求項４３】
Ｒ2からＲ4のうちの少なくとも１つが、−ＯＨである、請求項４２に記載の化合物または塩。
【請求項４４】
Ｒ6とＲ7の間の窒素が、Ｎ−オキシドを形成する、請求項４２に記載の化合物または塩。
【請求項４５】
Ｒnのうちの少なくとも１つおよびその対応するＲn+1（この場合、ｎ＝１〜５）が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、ならびに各Ｒn'およびＲ(n+1)'が、独立して、水素、ヒドロキシ、ＣＨ3Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−ＯＳＯ3Ｈ、または−Ｏ−Ｇである、請求項１に記載の化合物または塩。
【請求項４６】
ｎ＝２である、請求項４５に記載の化合物または塩。
【請求項４７】
Ｒ2'＝Ｈ、ならびにＲ3'またはＲ4が、−Ｏ−Ｇである、請求項４５に記載の化合物または塩。
【請求項４８】
Ｘ−Ｙが、ＣＨＲ9ＮＲ10である、請求項４５に記載の化合物または塩。
【請求項４９】
Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈである、請求項４８に記載の化合物または塩。
【請求項５０】
少なくとも２つのＲnについて、各々の前記Ｒnおよびその対応するＲn+1（この場合、ｎ＝１〜５）が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成する、請求項４５に記載の化合物または塩。
【請求項５１】
Ｘ−Ｙが、ＣＨＲ9ＮＲ10である、請求項５０に記載の化合物または塩。
【請求項５２】
Ｒ10が、Ｈであり、ＺまたはＲ9が、−ＯＳＯ3Ｈである、請求項５１に記載の化合物またはその塩。
【請求項５３】
Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈである、請求項５０に記載の化合物または塩。
【請求項５４】
Ｒ9が、Ｈであり、Ｒ10が、−ＳＯ3Ｈである、請求項４５に記載の化合物または塩。
【請求項５５】
Ｒ9が、Ｈであり、Ｒ10が、アセチルである、請求項４５に記載の化合物または塩。
【請求項５６】
化合物６ａ：
【化３】
2008519056.tif 000097
（この式中、各Ｌ、Ｌ1、およびＬ2は、脱離基である）
とＤＣＤＱ：
【化４】
2008519056.tif 000098
を、カップリング試薬の存在下、化合物７：
【化５】
2008519056.tif 000099
を生じさせるために十分な条件下で反応させること；ならびに
前記脱離基Ｌ1およびＬ2を除去すること
を含む、式Ｍ６：
【化６】
2008519056.tif 000100
の化合物の調整方法。
【請求項５７】
Ｌが、式：
【化７】
2008519056.tif 000101
を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
Ｌ1およびＬ2が、低級アルキルおよびアセチルから独立して選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
Ｌ1が、メチルであり、各Ｌ2が、アセチルである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
化合物７のグルクロニル部分のＬ1およびＬ2保護基を除去することにより化合物７を脱保護化し、それにより、Ｍ６代謝物を形成することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記カップリング試薬が、ＢＯＰ、ＤＣＣおよびＥＤＣから選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記カップリング試薬が、ＢＯＰである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
化合物６と前記カップリング試薬およびＤＣＤＱとの前記反応が、アミンの存在下で行われる、請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
前記アミンが、ヒューニッヒ塩基である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
化合物６と前記カップリング試薬およびＤＣＤＱとの前記反応が、溶媒中で行われる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記溶媒が、ＣＨ2Ｃｌ2である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記化合物７が、脱保護化前にカラムクロマトグラフィー精製に付される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
前記脱保護化が、アルコール中、塩基の存在下で行われる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
前記塩基が、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、およびＫＯＨから選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記アルコールが、低級アルキルアルコールである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記脱保護化が、ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ／ＴＨＦ中、ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏで行われる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ／ＴＨＦの割合が、約２．５：１．０：０．５である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記脱保護化が、０℃で１時間行われる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｍ６代謝物を精製することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７５】
化合物６ａが、触媒および求核試薬を使用して化合物５：
【化８】
2008519056.tif 000102
のアリル保護基を除去することにより調製される、請求項５７に記載の方法。
【請求項７６】
前記触媒が、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記求核試薬が、モルホリンである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記化合物５が、
カルボン酸２：
【化９】
2008519056.tif 000103
とＤＰＰＡを、アシルアジド中間体を生じさせるために十分な条件下で反応させること；
得られたアシルアジドを、イソシアネート３：
【化１０】
2008519056.tif 000104
を生じさせるために十分な条件下で加熱すること；ならびに
前記加熱段階の結果物を、化合物５を生じさせるために十分な条件下、２，３，４−トリアセチル−１−ヒドロキシグルクロン酸エステル４：
【化１１】
2008519056.tif 000105
で処理すること
によって調製される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記反応段階が、塩基の存在下で行われる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記塩基が、Ｅｔ3Ｎである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記化合物２が、ジフェン酸無水物と過剰のアリルアルコールを触媒の存在下で反応させることにより調製される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記アリルアルコールが、プロプ−２−エン−１−オールである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記触媒が、ＤＭＡＰである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
【化１２】
2008519056.tif 000106
から成る群より選択される化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８５】
請求項８４に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
【請求項８６】
【化１３】
2008519056.tif 000107
から成る群より選択される化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８７】
請求項８６に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
【請求項８８】
【化１４】
2008519056.tif 000108
から成る群より選択される化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８９】
請求項８８に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
【請求項９０】
【化１５】
2008519056.tif 000109
から成る群より選択される化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項９１】
請求項９０に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
【請求項９２】
【化１６】
2008519056.tif 000110
から成る群より選択される化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項９３】
請求項９２に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
【請求項９４】
【化１７】
2008519056.tif 000111
から成る群より選択される化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項９５】
請求項９４に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
【請求項９６】
【化１８】
2008519056.tif 000112
から成る群より選択される化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項９７】
請求項９６に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
【請求項９８】
請求項１から５５のいずれか一項に記載の化合物または塩と、１つまたはそれ以上の医薬的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項９９】
請求項１に記載の化合物もしくは塩またはその化合物もしくは塩を含む組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、統合失調症、統合失調様障害、統合失調感情障害、妄想障害、物質誘発性精神病性障害、Ｌ−ＤＯＰＡ誘発性精神病、アルツハイマー型認知症関連精神病、パーキンソン病関連精神病、レヴィー小体病関連精神病、認知症、記憶障害またはアルツハイマー病関連知能欠陥障害に罹患している患者の治療方法。
【請求項１００】
前記患者が、統合失調症に罹患している、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
請求項１に記載の化合物もしくは塩またはその化合物もしくは塩を含む組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、双極性障害、うつ病、気分発作、不安障害、適応障害または摂食障害に罹患している患者の治療方法。
【請求項１０２】
前記双極性障害が、双極Ｉ型障害、双極ＩＩ型障害、または気分循環性障害であり；前記うつ病が、大うつ病、気分変調性障害または物質誘発性気分障害であり；前記気分発作が、大うつ病発作、そう病発作、混合型発作または軽そう病発作であり；前記不安障害が、パニック発作、広場恐怖症、パニック障害、特定恐怖症、社会恐怖症、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、急性ストレス障害、全般性不安障害、分離不安障害または物質誘発性不安障害である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
症状が、うつ病、双極性障害または気分発作である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項１に記載の化合物もしくは塩またはその化合物もしくは塩を含む組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、てんかん、睡眠障害、偏頭痛、性的機能不全、薬物嗜癖、アルコール嗜癖、胃腸障害または肥満に罹患している患者の治療方法。
【請求項１０５】
請求項１に記載の化合物もしくは塩またはその化合物もしくは塩を含む組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、外傷、卒中または脊髄損傷に関連した中枢神経系欠損症に罹患している患者の治療方法。
【請求項１０６】
Ｚ、各Ｒnおよび各Ｒn'が、Ｈであり、Ｘ−Ｙが、ＣＲ9ＨＮＲ10である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０７】
Ｒ9が、Ｈである、請求項１０６に記載の化合物。
【請求項１０８】
Ｒ9が、Ｈであり、Ｒ10が、−Ｃ（Ｏ）−ＯＧである、請求項１０６に記載の化合物。
【請求項１０９】
請求項１０６から１０８のいずれか一項に記載の化合物と、１つまたはそれ以上の医薬的に許容される担体とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗精神病薬および抗肥満薬として有用である特定の［１，４］ジアゼピノ［６，７，１−ｉｊ］キノリン誘導体の代謝物と、それらの調製プロセスと、それらを含有する医薬組成物と、それらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
約５百万人の人々が、統合失調症に侵されている。現在、最も普及している統合失調症治療薬は、ドーパミン（Ｄ２）受容体拮抗作用とセロトニン（５−ＨＴ2A）受容体拮抗作用を兼ね備えた「非定型」抗精神病薬である。典型的な抗精神病薬に対する非定型抗精神病薬の効力および副作用の生じやすさに関して報告されている進歩にも関わらず、これらの化合物は、統合失調症のすべての症状を適切に治療せず、体重増加をはじめとする問題ある副作用を随伴する（Allison, D. B., et al., Am. J. Psychiatry, 156: 1686-1696; Masand, P. S., Exp. Opin. Pharmacother. 1: 377-389, 2000; Whitaker, R., Spectrum Life Sciences. Decision Resources. 2: 1-9, 2000）。体重増加を生じさせることのない統合失調症における気分障害または認知障害の治療に有効な新規抗精神病薬は、統合失調症の治療の有意な進歩を象徴する。
【０００３】
５−ＨＴ2C作動薬（アゴニスト）および部分作動薬は、統合失調症の治療への新規治療アプローチの代表である。いくつかの系列の証拠が、統合失調症の治療法としての５−ＨＴ2C受容体作動作用の一定の役割を支持している。５−ＨＴ2C拮抗薬（アンタゴニスト）での研究は、これらの化合物が、ドーパミンのシナプス中レベルを増加させ、パーキンソン病の動物モデルにおいて有効であり得ることを示唆している（Di Matteo, V., et. al., Neuropharmacology 37: 265-272, 1998; Fox, S. H., et. al., Experimental Neurology 151: 35-49, 1998）。統合失調症の陽性症状は、ドーパミンレベルの上昇を随伴するので、５−ＨＴ2C拮抗薬のものとは反対の作用を有する化合物、例えば、５−ＨＴ2C作動薬および部分作動薬は、シナプス中ドーパミンレベルを減少させるはずである。最近の研究により、５−ＨＴ2C作動薬は、前頭皮質および側坐核、クロザピンのような薬物の重要な抗精神病作用を媒介すると考えられる脳領域、におけるドーパミンレベルを減少させることが実証された（Millan, M. J., et. al., Neuropharmacology 37: 953-955, 1998; Di Matteo, V., et. al., Neuropharmacology 38: 1195-1205, 1999; Di Giovanni, G., et. al., Synapse 35: 53-61, 2000）。対照的に、５−ＨＴ2C作動薬は、線条、錐体外路副作用と最も親密な関係がある脳領域、におけるドーパミンレベルを減少させない。加えて、最近の研究により、５−ＨＴ2C作動薬は、腹側被蓋領域（ＶＴＡ）での発火を減少させるが、黒質では減少させないことが実証された。黒質線状体経路と比較して中脳辺縁系経路における５−ＨＴ2C作動薬の特異的な効果は、５−ＨＴ2C作動薬が、辺縁系選択性を有する、および一般的な抗精神病薬に随伴する錐体外路系副作用を生じさせる可能性が低いことを示唆している。
【０００４】
非定型抗精神病薬は、高い親和性で５−ＨＴ2C受容体と結合し、５−ＨＴ2C受容体拮抗薬または逆作動薬として機能する。体重増加は、クロザピンおよびオランザピンなどの非定型抗精神病薬に随伴する問題ある副作用であり、これは、５−ＨＴ2C拮抗作用が体重増加を増す原因であることを示唆していた。逆に、５−ＨＴ2C受容体の刺激は、食物摂取および体重を減少させることが知られている（Walsh et. al., Psychopharmacology 124: 57-73, 1996; Cowen, P. J., et. al., Human Psychopharmachology 10: 385-391, 1995; Rosenzweig-Lipson, S., et. al., ASPET abstract, 2000）。結果として、５−ＨＴ2C作動薬および部分作動薬は、現行の非定型抗精神病薬に随伴する体重増加を生じさせる可能性が低い。実際、５−ＨＴ2C作動薬および部分作動薬は、肥満（過剰な体脂肪または脂肪組織を特徴とし、ＩＩ型糖尿病、心血管疾患、高血圧、高脂血症、卒中、変形性関節症、睡眠時無呼吸症、胆嚢疾患、痛風、一部の癌、一部の不妊症および早期死亡率のような共存症を随伴する医学障害）の治療用として、大きな関心が寄せられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
化合物（９ａＲ，１２ａＳ）−４，５，６，７，９，９ａ，１０，１１，１２，１２ａ−デカヒドロ−シクロペンタ［ｃ］［１，４］ジアゼピン［６，７，１−ｉｊ］キノリン（以下、ＤＣＤＱ）：
【化１９】
2008519056.tif 000003
は、強力な５−ＨＴ2C作動薬である。関連公開出願ＷＯ０３／０９１２５０およびＵＳ２００４／０００９９７０参照（これらは、各々、その全文が、本明細書に参考として組み込まれる）。ＤＣＤＱは、統合失調症に関連した気分障害または認知障害を治療する際にも有効であり得る。ＤＣＤＱは、いくつかのインビトロおよびインビボモデルでは、いくつかの代謝物に変換される。これらの代謝物は、それ自体そのままで、またはＤＣＤＱに変換するプロドラッグとして、ＤＣＤＱにより治療することができる疾病、疾患または症状の治療に興味深いものと見ることができる。これらの代謝物は、ＤＣＤＱの効果をさらに研究するためにも有用であり得る。本発明は、これらならびに他の重要な目的に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一部の実施形態は、式Ｉ：
【化２０】
2008519056.tif 000004
［式中、
各ＲnおよびＲn'（この場合、ｎは、１から８である）について：
各ＲnおよびＲn'は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＣＨ3Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−ＯＳＯ3Ｈ、もしくは−Ｏ−Ｇであり；または
Ｒnおよびその対応するＲn'（この場合、ｎは、２、３、４、６、７もしくは８である）は、それらが結合している炭素と一緒になって、Ｃ＝Ｏを形成し；または
Ｒnとその対応するＲn+1と（この場合、ｎは、１、２、３、４、５もしくは７である）が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、各対応するＲn'およびＲ(n+1)'は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＣＨ3Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−ＯＳＯ3Ｈ、もしくは−Ｏ−Ｇであり；
Ｇは、式：
【化２１】
2008519056.tif 000005
を有し、
式中、記号*をつけた窒素は、場合によりＮ−オキシドを形成し；
Ｘ−Ｙは、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ（Ｏ）、ＣＨ2Ｎ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、またはＣＲ9ＨＮＲ10であり；
Ｒ9は、水素、ヒドロキシ、または−ＯＳＯ3Ｈであり；
Ｒ10は、水素、アセチル、−ＳＯ3Ｈ、−Ｇ、または−Ｃ（Ｏ）−ＯＧであり；
Ｚは、水素、ヒドロキシ、−ＯＳＯ3Ｈ、または−Ｏ−Ｇであり；但し、
Ｚが、ヒドロキシであるときには、（ａ）Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、およびＲ10のうちの１つは、水素でないこと；または（ｂ）Ｘ−Ｙが、ＣＲ9ＨＮＲ10であることを条件とし；ならびに、
Ｘ−Ｙが、ＣＨＲ9ＮＲ10であるときには、Ｚ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、およびＲ10のうちの少なくとも１つは、Ｈでないことをさらなる条件とする］
の化合物を含む。
【０００７】
一部の実施形態において、本発明は、ＺおよびＲ1からＲ8のうちの少なくとも１つが、−ＯＨである、式Ｉの化合物を提供する。
【０００８】
一部の実施形態において、本発明は、Ｒ1からＲ6、Ｒ9、Ｒ10およびＺのうちの少なくとも１つが、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｇ、−Ｏ−Ｇ、または−Ｇである、式Ｉの化合物を提供する。
【０００９】
一部の実施形態において、本発明は、Ｒ1からＲ9およびＺのうちの少なくとも１つが、−ＯＳＯ3Ｈである、式Ｉの化合物を提供する。
【００１０】
一部の実施形態において、本発明は、Ｘ−Ｙが、ＣＲ9ＨＮＲ10であり、この場合、Ｒ9が、Ｈであり、Ｒ10が、−ＳＯ3Ｈである、式Ｉの化合物を提供する。
【００１１】
一部の実施形態において、本発明は、Ｒnおよび対応するＲn'が、それらが結合している炭素と一緒になって、Ｃ＝Ｏを形成する、式Ｉの化合物を提供する。
【００１２】
一部の実施形態において、本発明は、Ｘ−Ｙが、Ｃ（Ｏ）ＮＨである、式Ｉの化合物を提供する。
【００１３】
一部の実施形態において、本発明は、Ｘ−Ｙが、ＣＨ＝Ｎである、式Ｉの化合物を提供する。
【００１４】
一部の実施形態において、本発明は、Ｒnのうちの少なくとも１つおよびその対応するＲn+1（この場合、ｎ＝１〜５）が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、ならびに各Ｒn'およびＲ(n+1)'が、独立して、水素、ヒドロキシ、ＣＨ3Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−ＯＳＯ3Ｈ、または−Ｏ−Ｇである、式Ｉの化合物を提供する。
【００１５】
一部の実施形態において、本発明は、少なくとも７５％の純度を有する、単離された形態または実質的に純粋な形態の式Ｉの化合物を提供する。他の実施形態において、本発明は、少なくとも８０％の純度を有する式Ｉの化合物を提供する。他の実施形態において、本発明は、少なくとも８５％の純度を有する式Ｉの化合物を提供する。他の実施形態において、本発明は、少なくとも９０％の純度を有する式Ｉの化合物を提供する。他の実施形態において、本発明は、少なくとも９５％の純度を有する式Ｉの化合物を提供する。
【００１６】
一部の実施形態において、本発明は、式Ｉの化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
一部の実施形態において、本発明は、式Ｉの化合物または式Ｉの化合物を含む医薬組成物をその必要がある患者に投与することにより、５ＨＴ2Cに関連した症状、疾病または疾患を治療する方法を提供する。
【００１８】
一部の実施形態において、本発明は、式Ｍ６：
【化２２】
2008519056.tif 000006
の化合物の調製方法を提供し、この方法は、
化合物６ａ：
【化２３】
2008519056.tif 000007
（この式中、各Ｌ、Ｌ1、およびＬ2は、脱離基である）
とＤＣＤＱ：
【化２４】
2008519056.tif 000008
を、カップリング試薬の存在下、化合物７：
【化２５】
2008519056.tif 000009
を生じさせるために十分な条件下で反応させること；ならびに
前記脱離基Ｌ1およびＬ2を除去して化合物Ｍ６を形成すること
を含む。
【００１９】
一部の実施形態において、本発明は、Ｌが、式：
【化２６】
2008519056.tif 000010
を有する方法を提供する。
【００２０】
一部の実施形態において、本発明は、Ｌ1およびＬ2が、低級アルキルおよびアセチルから独立して選択される、例えば、Ｌ1が、メチルであり、各Ｌ2が、アセチルであるときの方法を提供する。
【００２１】
好ましいカップリング剤は、ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム（ＢＯＰ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および塩酸１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）である。
【００２２】
一部の実施形態において、本発明は、化合物７のグルクロニル部分のＬ1およびＬ2保護基を除去することにより化合物７を脱保護化すること、その結果、Ｍ６代謝物を形成することをさらに含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記脱保護化段階は、アルコール、好ましくは低級アルコール中、塩基、好ましくはＮａＯＨ、ＬｉＯＨまたはＫＯＨの存在下で行われる。一部の好ましい実施形態において、約２．５：１．０：０．５の好ましい比率でのＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ／ＴＨＦ中のＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏが使用される。一部の実施形態において、前記脱保護化反応は、０℃で１時間行われる。
【００２３】
一部の実施形態において、化合物６とカップリング試薬およびＤＣＤＱとの反応は、アミン、好ましくはヒューニッヒ塩基の存在下で行われる。この反応は、好ましくは、溶媒、例えばＣＨ2Ｃｌ2中で行われる。
【００２４】
一部の実施形態において、化合物７は、脱保護化前にカラムクロマトグラフィーに付される。
【００２５】
一部の実施形態において、本発明は、Ｍ６代謝物の精製をさらに提供する。
【００２６】
一部の実施形態において、本発明は、化合物６ａが、触媒および求核試薬、好ましくはモルホリンを使用して、化合物５：
【化２７】
2008519056.tif 000011
のアリル保護基を除去することにより調製される方法を提供する。一部の実施形態において、前記触媒は、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4である。
【００２７】
一部の実施形態において、本発明は、化合物５が、
カルボン酸２：
【化２８】
2008519056.tif 000012
とＤＰＰＡを、アシルアジド中間体を生じさせるために十分な条件下で反応させること；
得られたアシルアジドを、イソシアネート３：
【化２９】
2008519056.tif 000013
を生じさせるために十分な条件下で加熱すること；ならびに
前記加熱段階の結果物を、化合物５を生じさせるために十分な条件下、２，３，４−トリアセチル−１−ヒドロキシグルクロン酸エステル４：
【化３０】
2008519056.tif 000014
で処理すること
によって調製される方法を提供する。一部の実施形態において、この反応工程は塩基、好ましくはＥｔ3Ｎの存在化で行われる。
【００２８】
一部の実施形態において、本発明は、前記化合物２が、ジフェン酸無水物と過剰のアリルアルコール、好ましくはプロプ−２−エン−１−オールを、触媒、好ましくはＤＭＡＰの存在下で反応させることにより調製される方法を提供する。
【００２９】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本開示を読むことにより当業者に明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
一部の態様において、本発明は、ＤＣＤＱの代謝物、それらの製造方法、および様々な疾患を治療するためのそれらの使用方法に関する。
【００３１】
一部の態様において、本発明は、
式（Ｉ）：
【化３１】
2008519056.tif 000015
［式中、
各ＲnおよびＲn'（この場合、ｎは、１から８である）について：
各ＲnおよびＲn'は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＣＨ3Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−ＯＳＯ3Ｈ、もしくは−Ｏ−Ｇであり；または
Ｒnおよびその対応するＲn'（この場合、ｎは、２、３、４、６、７もしくは８である）は、それらが結合している炭素と一緒になって、Ｃ＝Ｏを形成し；または
Ｒnとその対応するＲn+1と（この場合、ｎは、１、２、３、４、５もしくは７である）が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、各対応するＲn'およびＲ(n+1)'は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＣＨ3Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−ＯＳＯ3Ｈ、もしくは−Ｏ−Ｇであり；
記号*をつけた窒素は、場合によりＮ−オキシドを形成し；
Ｇは、式：
【化３２】
2008519056.tif 000016
を有し、
Ｘ−Ｙは、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ（Ｏ）、ＣＨ2Ｎ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、またはＣＲ9ＨＮＲ10であり；
Ｒ9は、水素、ヒドロキシ、または−ＯＳＯ3Ｈであり；
Ｒ10は、水素、アセチル、−ＳＯ3Ｈ、−Ｇ、または−Ｃ（Ｏ）−ＯＧであり；
Ｚは、水素、ヒドロキシ、−ＯＳＯ3Ｈ、または−Ｏ−Ｇであり；但し、
Ｚが、ヒドロキシであるときには、（ａ）Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、およびＲ10のうちの１つは、水素でないこと；または（ｂ）Ｘ−Ｙが、ＣＲ9ＨＮＲ10であることを条件とし；
Ｘ−Ｙが、ＣＨＲ9ＮＲ10であるときには、Ｚ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、およびＲ10のうちの少なくとも１つは、Ｈでないことをさらなる条件とする］
の化合物に関する。
【００３２】
ＤＣＤＱ（すなわち、Ｘ−ＹがＣＨＲ9ＮＲ10であり、ＺおよびＲ1からＲ10の各々がＨである、式Ｉの化合物）の調製方法は、米国特許出願公開第２００４／０００９９７０号（本明細書により、その全文が、ここに参考として組み込まれる）に開示されている。ＤＣＤＱそれ自体は、本明明細書に開示する式Ｉの化合物の範囲内であるとは解釈されない。
【００３３】
一部の実施形態において、本発明は、式Ｉのヒドロキシ化合物を提供する。好ましくは、ＺおよびＲ1からＲ8のうちの少なくとも１つは、ヒドロキシである。
【００３４】
一部の実施形態において、本発明は、Ｘ−ＹがＣＲ9ＨＮＲ10である、式Ｉのヒドロキシ化合物をさらに提供する。こうしたヒドロキシ化合物の一部の例としては、式中、
Ｒ9およびＲ10が、各々、Ｈであり；
Ｒ7およびＲ8のうちの少なくとも１つが、−ＯＨであり；
Ｒ6が、−ＯＨであり；
Ｒ3およびＲ4のうちの少なくとも１つが、−ＯＨであり；または
Ｒ1、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＺのうちの少なくとも１つが、−ＯＨである
ものが挙げられる。
他の実施形態において、本発明は、Ｘ−ＹがＣＲ9ＨＮＲ10であり、Ｒ10がアセチルである、式Ｉのヒドロキシ化合物を提供する。こうしたヒドロキシ化合物の一部の好ましい例としては、式中、
Ｒ7およびＲ8のうちの少なくとも１つが、−ＯＨである；
ものが挙げられる。
他の実施形態において、本発明は、Ｘ−ＹがＣ＝Ｎである、式Ｉのヒドロキシ化合物を提供する。一部の好ましい実施形態において、Ｒ1からＲ6のうちの少なくとも１つは、−ＯＨである。他の好ましい実施形態において、Ｒ2からＲ4のうちの少なくとも１つは、−ＯＨである。
【００３５】
他の実施形態において、本発明は、Ｒ1からＲ6、Ｒ9、Ｒ10およびＺのうちの少なくとも１つが、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｇ、−Ｏ−Ｇ、または−Ｇである、式Ｉのグルクロニル化合物を提供する。
【００３６】
一部の好ましい実施形態において、本発明は、Ｘ−ＹがＣＲ9ＨＮＲ10である、グルクロニル化合物を提供する。一部の好ましい実施形態において、Ｒ9およびＲ10は、Ｈである。他の好ましい実施形態において、Ｚ、Ｒ3およびＲ4のうちの少なくとも１つは、−Ｏ−Ｇである。他の好ましい実施形態において、Ｒ1からＲ6、Ｒ9およびＺのうちの少なくとも１つは、−Ｏ−Ｇである。
【００３７】
なお、さらなる実施形態において、本発明は、Ｒ2とＲ3とが一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、ならびにＲ3'およびＲ4のうちの少なくとも１つが、−Ｏ−Ｇである、式Ｉのグルクロニル化合物を提供する。
【００３８】
他の実施形態において、本発明は、Ｒ10が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｇまたは−Ｇである、式Ｉのグルクロニル化合物を提供する。一部の実施形態において、Ｒ4とＲ4'とが、それらが結合している炭素と一緒になって、Ｃ＝Ｏを形成する、前記化合物を提供する。
【００３９】
一部の実施形態において、本発明は、Ｘ−Ｙが、−ＣＨＲ9ＮＲ10であり、この場合、Ｒ10が、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｇである、グルクロニル化合物を提供する。
【００４０】
一部の好ましい実施形態において、本発明は、Ｚ、各ＲnおよびＲn'が、Ｈであり、Ｘ−Ｙが、−ＣＨＲ9ＮＲ10である、式Ｉの化合物を提供する。一部のこうした実施形態において、Ｒ9は、Ｈである。好ましい実施形態において、Ｒ9は、Ｈであり、Ｒ10は、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｇである。
【００４１】
他の実施形態において、本発明は、Ｒ10がアセチルである、式Ｉのグルクロニル化合物を提供する。好ましい実施形態において、Ｒ1からＲ6、Ｒ9およびＺのうちの少なくとも１つが、−Ｏ−Ｇである、前記誘導体をさらに提供する。さらに他の実施形態において、Ｒ7およびＲ8のうちの少なくとも１つは、−Ｏ−Ｇである。
【００４２】
一部の実施形態において、本発明は、Ｒ1からＲ9およびＺのうちの少なくとも１つが、−ＯＳＯ3Ｈである、式Ｉのスルフェート化合物を提供する。
【００４３】
一部の好ましい実施形態において、本発明は、Ｘ−Ｙが−ＣＨＲ9ＮＲ10である、前記スルフェート化合物を提供する。一部のこうした実施形態において、Ｒ9およびＲ10は、各々、Ｈである。一部のこうした実施形態において、Ｒ1からＲ6のうちの少なくとも１つは、−ＯＳＯ3Ｈである。さらなる実施形態において、Ｒ2およびＲ3のうちの少なくとも１つは、−ＯＳＯ3Ｈである。一部の実施形態において、Ｒ3は、−ＯＳＯ3Ｈである。
【００４４】
一部の実施形態において、本発明は、Ｒ9およびＺのうちの少なくとも１つが、−ＯＳＯ3Ｈである、式Ｉのスルフェート化合物を提供する。
【００４５】
一部の実施形態において、本発明は、式Ｉのスルファメート化合物を提供する。一部の実施形態において、本発明は、Ｘ−ＹがＣＲ9ＨＮＲ10であり、Ｒ10が、−ＳＯ3Ｈである、前記スルファメート化合物を提供する。他の実施形態において、本発明は、Ｒnのうちの少なくとも２つおよびその対応するＲn+1（この場合、ｎ＝１〜５）が、それらが結合している炭素間の二重結合を形成する、前記スルファメート化合物を提供する。
【００４６】
一部の実施形態において、本発明は、Ｒnおよびその対応するＲn'が、それらが結合している炭素と一緒になって、Ｃ＝Ｏを形成する、式Ｉのケト化合物を提供する。一部の好ましい実施形態において、ｎ＝４である。さらなる好ましい実施形態において、Ｘ−Ｙは、ＣＲ9ＨＮＲ10であり、好ましくは、Ｒ10は、−Ｇである。他の実施形態において、Ｒ9およびＲ10は、Ｈである。
【００４７】
式Ｉのケト化合物の他の実施形態は、Ｘ−ＹがＣ（Ｏ）ＮＨである化合物を提供する。
【００４８】
一部の実施形態において、本発明は、式Ｉのイミン化合物を提供する。一部の実施形態において、Ｘ−Ｙは、ＣＨ＝Ｎである。一部のこうした実施形態において、Ｒ1からＲ6のうちの少なくとも１つは、−ＯＨである。他のこうした実施形態において、Ｒ2からＲ4のうちの少なくとも１つは、−ＯＨである。さらに他のこうした実施形態において、化合物は、Ｎ−オキシドであり得、この場合、Ｒ6およびＲ7が結合している炭素間の窒素が、Ｎ−オキシドを形成する。
【００４９】
なお、さらなる実施形態において、本発明は、１つまたはそれ以上の二重結合を含有する、式Ｉのデヒドロ化合物を提供する。これらの実施形態において、Ｒnのうちの少なくとも１つとその対応するＲn+1と（この場合、ｎ＝１〜５）が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、各Ｒn'およびＲ(n+1)'が、独立して、水素、ヒドロキシ、ＣＨ3Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−ＯＳＯ3Ｈ、または−Ｏ−Ｇである、前記化合物を提供する。一部の好ましい実施形態において、ｎ＝２である。さらなる好ましい実施形態において、ｎ＝２、Ｒ2'＝Ｈ、およびＲ3'またはＲ4は、−Ｏ−Ｇである。なお、さらなる実施形態において、Ｘ−Ｙは、ＣＨＲ9ＮＲ10であり、この場合のＲ9およびＲ10は、好ましくはＨである。
【００５０】
他の実施形態において、少なくとも２つのＲnについて、各々の前記Ｒnおよびその対応するＲn+1（この場合、ｎ＝１〜５）が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成する、式Ｉのジ−デヒドロ化合物を提供する。一部の好ましい実施形態において、本発明は、Ｘ−Ｙ＝ＣＨＲ9ＮＲ10をさらに提供する。さらなる実施形態において、Ｒ10は、Ｈであり、およびＺまたはＲ9は、−ＯＳＯ3Ｈである。さらに他の実施形態において、Ｘ−Ｙ＝ＣＨＲ9ＮＲ10であり、Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈである。
【００５１】
一部の実施形態において、本発明は、Ｒ10が−ＳＯ3Ｈまたはアセチルである、前記式Ｉのジ−デヒドロ化合物を提供する。
【００５２】
本発明の一部の態様において、式Ｉの化合物は、単離された形態で提供される。
【００５３】
本発明の他の態様において、式Ｉの化合物は、少なくとも７５％の純度の実質的に純粋な形態で提供される。他の態様において、本化合物は、少なくとも８０％の純度である。他の態様において、本化合物は、少なくとも８５％の純度である。他の態様において、本化合物は、少なくとも９０％の純度である。他の態様において、本化合物は、少なくとも９５％の純度である。
【００５４】
本明細書で用いる場合、アセチルは、ＣＨ3−Ｃ（＝Ｏ）−を指す。
【００５５】
本明細書で用いる場合、アルキルは、脂肪族炭化水素鎖、例えば炭素原子数１から６のものを指し、ならびに、限定はされないが、直鎖および分枝鎖、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオ−ペンチル、ｎ−ヘキシルおよびイソヘキシルを含む。低級アルキルは、１から３個の炭素原子を有するアルキルを指す。
【００５６】
ＢＯＰは、ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムを指す。
【００５７】
本明細書で用いる場合、カルバモイルは、基、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ＜を指す。
【００５８】
ＤＣＣは、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを指す。
【００５９】
ＤＩＢＡＨおよびＤＩＢＡＬは、同義で、水素化ジイソブチルアルミニウムを指す。
【００６０】
ＤＭＰＡは、４−ジメチルアミノピリジンを指す。
【００６１】
ＤＰＰＡは、ジフェニルホスホリルアジドを指す。
【００６２】
ＥＤＣは、塩酸１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドを指す。
【００６３】
本明細書で用いる場合、グルクロニルは、基：
【化３３】
2008519056.tif 000017
を指す。
【００６４】
本明細書で用いる場合、ハロゲン（またはハロ）は、塩素、臭素、フッ素およびヨウ素を指す。ヒューニッヒ塩基は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、本明細書ではｉ−Ｐｒ2ＮＥｔとも示す。
【００６５】
ＰｙＢＯＰは、ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムを指す。
【００６６】
本発明の化合物は、不斉炭素原子を含有し、そのため、光学異性体およびジアステレオ異性体を生じさせる。本発明は、そのような光学異性体およびジアステレオ異性体；ならびにラセミ体および分割された、エナンチオマー的に純粋なＲおよびＳ立体異性体；ならびにＲおよびＳ立体異性体の他の混合物、ならびにそれらの医薬的に許容される塩を包含する。
【００６７】
エナンチオマーが好ましい場合、一部の実施形態では、対応するエナンチオマーが実質的にないものを提供することがある。例えば、対応するエナンチオマーが実質的にないエナンチオマーは、分離技術により単離もしくは分離される、または対応するエナンチオマーなしで調製される化合物を指す。本明細書で用いる場合、「実質的にない」は、化合物が、一方のエナンチオマーのほうが有意に大きい比率で構成されていることを意味する。好ましい実施形態において、本化合物は、少なくとも約９０重量％の好ましいエナンチオマーで構成される。本発明の他の実施形態において、本化合物は、少なくとも約９９重量％の好ましいエナンチオマーで構成される。好ましいエナンチオマーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ならびにキラル塩の形成および結晶化をはじめとする当業者には公知の任意の方法によりラセミ混合物から単離することができ、または本明細書において説明する方法により調製することができる。例えば、Jacques, et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen, S. H., et al., Tetrahedron 33:2725(1977); Eliel, E.L. Sterochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); Wilen, S. H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E. L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972) 参照。
【００６８】
当業者には、式（Ｉ）の互変異性体が存在し得ることもわかる。本発明は、式（Ｉ）に示していなかったとしても、すべてのそのような互変異性体を包含する。
【００６９】
本発明において有用な化合物は、式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容される塩も包含する。「医薬的に許容される塩」とは、医薬的に許容される塩基と式（Ｉ）の化合物を付加させて対応する塩を形成することにより形成される、任意の化合物を意味する。用語「医薬的に許容される」とは、毒物学的見地から医薬用途での使用が許容され、活性成分と有害に相互作用しない物質を意味する。モノ−およびビス−塩をはじめとする医薬的に許容される塩としては、例えば、限定はされないが、酢酸、乳酸、クエン酸、桂皮酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、シュウ酸、プロピオン酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、グリコール酸、ピルビン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、サリチル酸、安息香酸および同様に公知の許容可能な酸のような、有機および無機酸から誘導されたものが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００７０】
式Ｉの化合物の非限定的な例としては、本明細書で詳述するインビトロおよびインビボ試験により同定されたもの、ならびに図１〜４に示される代謝経路に示すものが挙げられる。そのような例としては、以下に示すものが挙げられる。所与の置換基の結合が、枠で囲んで示されている場合、示されている置換基が、その枠内の１つまたはそれ以上の利用可能な炭素原子いずれに結合していてもよいと解釈する。
【化３４】
2008519056.tif 000018
【化３５】
2008519056.tif 000019
【化３６】
2008519056.tif 000020
【化３７】
2008519056.tif 000021
【化３８】
2008519056.tif 000022
【化３９】
2008519056.tif 000023
【化４０】
2008519056.tif 000024
【化４１】
2008519056.tif 000025
【化４２】
2008519056.tif 000026
【化４３】
2008519056.tif 000027
【化４４】
2008519056.tif 000028
【化４５】
2008519056.tif 000029
2008519056.tif 000030
【化４６】
2008519056.tif 000031
【化４７】
2008519056.tif 000032
【化４８】
2008519056.tif 000033
【化４９】
2008519056.tif 000034
【化５０】
2008519056.tif 000035
【化５１】
2008519056.tif 000036
【化５２】
2008519056.tif 000037
【化５３】
2008519056.tif 000038
【化５４】
2008519056.tif 000039
【００７１】
これらの提案合成（合成案）は、単なる例示である。他の合成を利用して本発明の様々な化合物を製造できることは、当業者には理解されるであろう。加えて、上に記載した任意のスキーム中の中間体が、式Ｉの化合物であってもよく、必要な場合には、次の段階に行かずに回収および精製することができることは、当業者には理解されるであろう。例えば、上記ニトロンは、単離および精製することができる。さらに、これらの合成を変更して、本明細書において式Ｉにより説明されている関連化合物を生じさせることができることは、当業者には理解されるであろう。これらの方法、化合物および中間体のこれらおよび他の変形および変更は、本明細書に開示する本発明の範囲および精神をもって考えられる。
治療方法
【００７２】
ＤＣＤＱおよび関連化合物の結合親和性は、関連公開出願ＷＯ０３／０９１２５０およびＵＳ２００４／０００９９７０（これらは、各々、本明細書の参考として組み込まれる）に十分詳細に記録されている。従って、ＤＣＤＱの投与後に形成する代謝物も、精神病性障害および他の疾患を治療する際にＤＣＤＱと同様に用いることができる。
【００７３】
本発明の化合物は、脳セロトニン受容体の２Ｃサブタイプに対する作動薬および部分作動薬であり、そのため、精神病性障害、例えば、統合失調症（妄想型、解体型、緊張病型および未分化型を含む）、統合失調様障害、統合失調感情障害、妄想障害、物質誘発性精神病性障害、および別様に指定されていない精神病性障害；Ｌ−ＤＯＰＡ誘発性精神病；アルツハイマー型認知症関連精神病；パーキンソン病関連精神病；レヴィー小体病関連精神病；双極性障害、例えば、双極Ｉ型障害、双極ＩＩ型障害および気分循環性障害；うつ病、例えば、大うつ病、気分変調性障害、物質誘発性気分障害、および別様に指定されていないうつ病；気分発作（mood episode）、例えば、大うつ病発作（major depressive episode）、そう病発作（manic episode）、混合型発作（mixed episode）および軽そう病発作（hypomanic episode）；不安障害、例えば、パニック発作、広場恐怖症、パニック障害、特定恐怖症、社会恐怖症、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、急性ストレス障害、全般性不安障害、分離不安障害、物質誘発性不安障害、および別様に指定されていない不安障害；適応障害、例えば、不安及び／又は抑うつ気分を伴う適応障害；知能欠陥障害、例えば、認知症、アルツハイマー病、および記憶障害；摂食障害（例えば、摂食亢進、過食症または精神性食欲不振）ならびに哺乳動物に存在し得るこれらの精神障害の組み合わせをはじめとする、精神障害の治療のために興味深い。例えば、気分障害、例えばうつ病または双極性障害は、統合失調症などの精神病性障害を伴うことが多い。上述の精神障害のさらに完全な説明は、the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition, Washington, DC, American Psychiatric Association (1994)において見出すことができる。
【００７４】
本発明の化合物は、てんかん；偏頭痛；性的機能不全；睡眠障害；胃腸障害、例えば、胃腸運動の機能不全；および肥満とその後続共存症（ＩＩ型糖尿病、心血管疾患、高血圧、高脂血症、卒中、変形性関節炎、睡眠時無呼吸症、胆嚢疾患、痛風、一部の癌、一部の不妊症および早期死亡率を含む）の治療のためにも興味深い。本発明の化合物を使用して、例えば外傷、卒中および脊髄損傷に関連した、中枢神経系欠損症を治療することもできる。従って、本発明の化合物を使用して、問題の疾病または外傷中または後の中枢神経系の活動のさらなる低下を改善または抑制することができる。これらの改善には、運動および自動運動性技能、制御、協調ならびに強度の維持または改善が含まれる。
【００７５】
従って、本発明は、哺乳動物、好ましくは人間における上に挙げた各疾病の治療方法を提供し、これらの方法は、本発明の化合物の治療有効量をその必要がある哺乳動物に投与することを含む。本明細書で用いる場合、「治療すること」とは、疾患を部分的にまたは完全に緩和、抑制、予防、改善及び／又は軽減することを意味する。例えば、本明細書で用いる場合、「治療すること」は、問題の症状を部分的にまたは完全に緩和、抑制または軽減することを含む。本明細書で用いる場合、「哺乳動物」は、温血脊椎動物、例えば人間を指す。本明細書で用いる場合、「提供する」は、本発明の化合物もしくは組成物を直接投与すること、または体内で当量の活性化合物もしくは活性物質を形成する誘導体もしくは類体を投与することの、いずれかを意味する。
医薬組成物
【００７６】
式Ｉの少なくとも１つの化合物、それらの混合物、及び／又はそれらの医薬的塩、ならびにそれらの医薬的に許容される担体を含む、中枢神経系の疾病状態または症状を治療または制御するための医薬組成物も、本発明に包含される。こうした組成物は、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 17th edition, ed. Alfonoso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985) に記載されているような、許容される製薬手順に従って調製される。医薬的に許容される担体は、調合物中の他の成分と相溶性であり、生物学的に許容されるものである。
【００７７】
本発明の化合物は、ニートで、または通常の製薬用担体と併用（この比率は、化合物の溶解度および化学的性質、選択される投与経路および標準的な薬理学的慣例により決定される）で、経口または非経口投与することができる。製薬用担体は、固体である場合もあり、液体である場合もある。
【００７８】
適用可能な固体担体は、着香剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、充填剤、潤滑剤、圧縮助剤、結合剤もしくは錠剤崩壊剤または封入材料としての役割も果たすことができる１つまたはそれ以上の物質を含むことがある。粉末の場合の担体は、微粉活性成分との混合物である微粉固体である。錠剤の場合、活性成分は、必要圧縮特性を有する担体と適する比率で混合され、所望の形状およびサイズに圧縮される。粉末および錠剤は、好ましくは、９９％以下の活性成分を含有する。適する固体担体としては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリジン、低融点蝋およびイオン交換樹脂が挙げられる。
【００７９】
液体担体は、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップおよびエリキシルを製造する際に使用することができる。本発明の活性成分を、医薬的に許容される液体担体、例えば、水、有機溶媒、両方の混合物または医薬的に許容される油もしくは脂肪に、溶解または懸濁させることができる。この液体担体は、他の適する医薬品添加物、例えば、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存薬、甘味料、着香剤、懸濁化剤、増粘剤、着色料、粘度調節剤、安定剤または浸透圧調節剤を含有することもある。経口および非経口投与用の液体担体の適する例としては、水（特に、上記の添加剤、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液、を含有するもの）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコール、を含む）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、ヤシ油および落花生油）が挙げられる。非経口投与用の担体は、油性エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルであり得る。滅菌液体担体は、非経口投与用の滅菌液状形態組成物において使用される。加圧組成物用の担体は、ハロゲン化炭化水素または他の医薬的に許容される噴射剤であり得る。
【００８０】
滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、腹腔内または皮下注射により、投与することができる。滅菌溶液を静脈内投与することもできる。経口投与は、液体組成物または固体組成物、いずれの形態であってもよい。
【００８１】
本発明の化合物は、従来どおりの坐剤の形態で直腸内または膣内投与することができる。鼻腔内または気管支内吸入または通気法による投与のために、本発明の化合物を水性または部分水性溶液に調合することができ、それを、その後、エーロゾルの形態で利用することができる。本発明の化合物は、本活性化合物と、その活性化合物に対して不活性であり、皮膚に対して非毒性であり、全身吸収のために薬剤を皮膚を介して血流に送り出すことができる担体とを含有する経皮パッチの使用により、経皮投与することもできる。この担体は、クリームおよび軟膏、ペースト、ゲルならびに閉鎖用具などのかなり多数の形態をとることができる。クリームおよび軟膏は、粘稠体、または水中油型もしくは油中水型、いずれかの半固体エマルジョンであり得る。本活性成分を含有する石油または親水性石油に分散された吸収性粉末から成るペーストも適する。活性成分を血流に放出するために、様々な閉塞用具、例えば、担体とともにまたは伴わずに活性成分を含有するレザバーを覆う半透膜、または活性成分を含有するマトリックス、を使用することができる。他の閉塞用具は、文献において知られている。
【００８２】
好ましくは、本医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、エマルジョン、顆粒または坐剤のような、単位剤形である。こうした形態での組成物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量で小分けされる。単位剤形は、パッケージされた組成物、例えば、小包にした粉末、バイアル、アンプル、充填済み注釈または液体が入っているサッシェであり得る。単位剤形は、例えば、カプセルもしくは錠剤それ自体であってもよいし、パッケージされた形態の適切な数の任意のその組成物であってもよい。
【００８３】
投与必要量は、利用される個々の組成物、投与経路、提示されている症状の重症度、および治療を受ける個々の被験者によって変わる。標準的な薬理試験手順で得られた結果に基づき、活性化合物の予測推定日用量は、約０．０２μｇ／ｋｇ〜約４０００μｇ／ｋｇ、または約５００ｍｇ／日以下である。これらの投与量範囲は、単なる推定量であり、当業者は、患者の体重、症状の重症度および他の要因をはじめとする多数の要因に依存して適切な用量を突き止めることができるである。治療は、一般に、その化合物の最適用量より低い、少ない投与量で開始されるである。その後、その投与量を、それらの状況下で最適な効果が達成されるまで増加させる。経口、非経口、経鼻または気管支内投与のための正確な投与量は、投与する医師が、治療する個々の被験者での経験を基に決定することになろう。
【実施例】
【００８４】
代謝物化合物
ＤＣＤＱの放射標識バージョン、［14Ｃ］ＤＣＤＱを使用することにより、ＤＣＤＱの代謝をインビトロおよびインビボモデルで個々に調査した。この試験により、いくつかの代謝経路およびいくつかの有意な代謝物が判明した。これらの試験は、下の実験セクションでさらに詳細に説明する。
【００８５】
［14Ｃ］ＤＣＤＱの代謝は、性別を越えてプールされた雄（オス）および雌（メス）のＣＤ−１マウス、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット、ビーグル犬およびヒト肝臓ミクロソーム由来の肝臓ミクロソームとのインキュベーション、ならびに凍結保存された男性ヒト肝細胞により調査した。ＤＣＤＱを、ミクロソームインキュベーションおよびヒト肝細胞において、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５およびカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）をはじめとする酸化代謝物に変換させた。
【００８６】
腸溶コーティングカプセルでの１４．１から１６．７ｍｇ／ｋｇの塩酸［14Ｃ］ＤＣＤＱの単回投与後の４匹の雄ビークル犬で、［14Ｃ］ＤＣＤＱのインビボ代謝をさらに調査した。血漿において観察された主要代謝物としては、ヒドロキシＤＣＤＱ（Ｍ１、Ｍ２およびＭ３）、Ｎ−オキシドＤＣＤＱ（Ｍ５）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ７）、ヒドロキシＤＣＤＱイミン（Ｍ１５）、ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）が挙げられた。血漿において検出されなかったヒドロキシＤＣＤＱのスルフェートコンジュゲート（Ｍ１６）およびジアゼピニルＤＣＤＱカルボン酸（Ｍ１７）は、尿サンプルにおいて観察された。ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ２、Ｍ３およびＭ１９）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ１８）およびヒドロキシＤＣＤＱイミン（Ｍ１５）は、糞便抽出物において検出された。ＤＣＤＱは、主要経路として酸化代謝を用いてイヌにおいて広範囲にわたって代謝されたが、ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）の形成も観察された。
【００８７】
単回経口投与（５ｍｇ／ｋｇ）後の雄および雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、［14Ｃ］ＤＣＤＱのインビボ代謝をさらに試験した。血漿において検出された代謝物としては、ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ１０）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ７）、および第ＩＩ相代謝物ＤＣＤＱスルファメート（Ｍ１２）、ジ−デヒドロＤＣＤＱスルファメート（Ｍ１４）、ヒドロキシＤＣＤＱスルフェート（Ｍ８およびＭ１３）、ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびアセチル化ヒドロキシＤＣＤＱ（Ｍ１１）が挙げられた。ラットでは、ＤＣＤＱが広範囲にわたって代謝されて、主として酸化代謝物になった。
【００８８】
このように、ＤＣＤＱの代謝物は、いくつかの代謝経路によって作られ、それらの経路の一部は、いくつかの種を越えて共通である。こうした代謝は、５ＨＴ2C受容体による影響を受ける疾患および疾病、及び／又はＤＣＤＱの投与により治療することができる疾患および疾病を治療する際に有用であり得る。
【００８９】
【化５５】
2008519056.tif 000040
代謝物Ｍ６は、ＣＨ2Ｃｌ2中、カップリング試薬およびアミンの存在下でＤＣＤＱとグルクロニル担体６をカップリングさせて化合物７を生じさせることにより、得ることができる。この生成物、化合物７は、当分野において公知の方法に従って、好ましくはカラムクロマトグラフィー精製により、好ましくは溶離剤としてＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いて、精製することができる。カップリング試薬は、限定はされないが、ＢＯＰ、ＤＣＣおよびＥＤＣをはじめとする、任意の適するカップリング試薬から選択することができる。ＢＯＰは、好ましいカップリング試薬である。適するアミンとしては、Ｅｔ3Ｎ、ピリジンおよびヒューニッヒ塩基が挙げられるが、これらに限定はされない。ヒューニッヒ塩基が好ましい。グルクロニル担体６は、当業者には公知の方法により調製することができる。Ｌ1は、脂肪族脱離基、例えば、限定はされないが、Ｃ1からＣ6アルキル、メチル、エチル、プロピル、好ましくはメチルである。各Ｌ2は、アセチル基およびベンジル系の基から独立して選択される脱離基である。アセチル基が好ましい。グルクロニル担体６は、好ましくは、第二アミングルクロニルカルバメート６、例えば、Ruben G. G. Leeders, Hans W. Scheeren, Tetrahedron Letters 2000, 41, 9173-9175 において検討されているシェーレン（Scheeren）のプロトコルを基に設計することができるものである。
【００９０】
【化５６】
2008519056.tif 000041
次に、化合物７を塩基加水分解に付し、その結果、すべての脱離基、糖部分の２、３、４位のＬ2ならびにＬ1、の脱保護化を行って、最終生成物Ｍ６代謝物を生じさせる。塩基加水分解は、Ｃ1〜Ｃ3脂肪族アルコール中で、塩基、例えばＮａＯＨ、ＬｉＯＨおよびＫＯＨを使用して行う。ＬｉＯＨが好ましい塩基であり、ＭｅＯＨが好ましいアルコールである。有機溶媒の除去および凍結乾燥を用いて、定量収率で粗生成物Ｍ６を生じさせることができる。その後、その粗製Ｍ６の精製を、当業者には公知の方法によって行うことができる。
【００９１】
【化５７】
2008519056.tif 000042
化合物６は、好ましくは、求核試薬としてＰｄ（ＰＰｈ3）4およびモルホリンを使用することにより触媒される、化合物５のアリル基の脱保護化によって、調製することができる。新しい触媒が好ましい。加えて、触媒を添加する前に、場合によってはその反応溶液をＮ2でバブリングしてもよい。このようにして、さらに精製することなく、粗製グルクロニル担体６を定量収率で得る。
【００９２】
【化５８】
2008519056.tif 000043
化合物５は、高収率で、ワンポット反応で、調製することができる。トルエン中、Ｅｔ3Ｎの存在下、ＤＰＰＡ、ＮａＮ3またはＴＭＳＮ3のうちの１つでの化合物２のインサイチューでの処理により、アシルアジド１０を生成し、それを、好ましくは８０℃に１．５時間加熱して、イソシアネート３を生じさせる。化合物３を単離する必要はなく、その後、１−ヒドロキシグルクロン酸エステル４で、好ましくは室温で一晩、処理して、表題化合物５を得る（スキーム３）。化合物４は、米国特許第６，３８０，１６６号Ｂ１（本明細書に参考として組み込まれる）に記載されている手順に従って調製することができる。３０℃での1Ｈ  ＮＭＲは、Ａｒ−Ａｒ結合周辺の拘束回転のため全シグナルが二重であることを示す。
【００９３】
化合物４において、Ｌ1は、脂肪族脱離基、例えば、限定はされないが、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、メチル、エチルおよびプロピル、好ましくはメチルである。各Ｌ2は、アセチル基およびベンジル系の基から独立して選択される脱離基である。アセチル基が好ましい。
【００９４】
化合物２
モノアリルエステル２を調製するために、ジフェン酸無水物を出発材料として選択し、触媒の存在下、過剰のアリルアルコールで処理した。適する触媒としては、Ｅｔ3Ｎ、ヒューニッヒ塩基、ピリジン、アミン、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、ＫＰＨ、および他の無機塩基が挙げられる。化合物２について定量収率を達成することができる。
【００９５】
【化５９】
2008519056.tif 000044
化合物５は、高収率で、ワンポット反応で、調製することができる。トルエン中、Ｅｔ3Ｎの存在下、ＤＰＰＡ、ＮａＮ3またはＴＭＳＮ3のうちの１つでの化合物２のインサイチューでの処理により、アシルアジド１０を生成し、それを、好ましくは８０℃に１．５時間加熱して、イソシアネート３を生じさせる。化合物３を単離する必要はなく、その後、１−ヒドロキシグルクロン酸エステル４で、好ましくは室温で一晩、処理して、表題化合物５を得る（スキーム３）。化合物４は、米国特許第６，３８０，１６６号Ｂ１（本明細書に参考として組み込まれる）に記載されている手順に従って調製することができる。３０℃での1Ｈ  ＮＭＲは、Ａｒ−Ａｒ結合周辺の拘束回転のため全シグナルが二重であることを示す。
【００９６】
化合物４において、Ｌ1は、脂肪族脱離基、例えば、限定はされないが、Ｃ1からＣ6アルキル、メチル、エチルおよびプロピル、好ましくはメチルである。各Ｌ2は、アセチル基およびベンジル系の基から独立して選択される脱離基である。アセチル基が好ましい。
【００９７】
カルバモイルグルクロニル代謝物（Ｍ６）の例示的合成
ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド代謝物（Ｍ６）の例示的合成をスキーム１に示す：
【化６０】
2008519056.tif 000045
【００９８】
総論
ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  ３００を用い、３００ＭＨｚ（1Ｈおよび13Ｃ）で記録し、化学シフトは、ＴＭＳ内部標準に対するｐｐｍで同定した。分析的および分取ＴＬＣは、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅから入手したＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ−２５４プレコーティングプレートを用いて行った。２５４ｎｍのＵＶまたは１０％ＫＭｎＯ4水溶液指示薬を使用して、化合物を可視化した。ＨＰＬＣ分析は、ＰＤＡ（モデル２９９６）ＵＶ検出器を装備したＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５  ＨＰＬＣ装置を用いて判定した。質量スペクトルは、Ｆｉｎｎｉｇａｎ質量分析装置を用いて記録した。
【００９９】
【化６１】
2008519056.tif 000046
１Ｌフラスコに、ジフェン酸無水物（４０ｇ、１７８ｍｍｏｌ）、アリルアルコール（３００ｍＬ）およびＤＭＡＰ（２．１８ｇ、１７．８ｍｍｏｌ、１０ｍｏｌ％）を充填した。その反応混合物を１２時間攪拌した。過剰のアリルアルコールを減圧下、４０℃で蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）に再び溶解し、ＮａＨＳＯ4水溶液（０．５Ｎ、２００ｍＬ）、ブライン（２００ｍＬ×３）および水（２００ｍＬ×３）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、シリカゲルパッド（５００ｇ）に通し、そのパッドをＥｔＯＡｃ（１Ｌ）で洗浄し、減圧下で濃縮乾固させた。ヘプタンとともに蒸留することにより極微量のアリルアルコールを除去して、モノアリルエステル２（５０ｇ、１００％）を無色の油として得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：８．０３−７．９９（ｍ，２Ｈ），７．５６−７．３９（ｍ，４Ｈ），７．１９−７．１６（ｍ，２Ｈ），５．７４−５．６１（ｍ，１Ｈ），５．１７−５．０６（ｍ，２Ｈ），４．５２−４．４９（ｍ，２Ｈ）．
【０１００】
【化６２】
2008519056.tif 000047
５００ｍＬフラスコに、窒素雰囲気下で、ビフェニル−２，２’−ジカルボン酸２’−アリルエステル２（５．２ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）、トルエン（１００ｍＬ）、ＤＰＰＡ（４．８ｍＬ、２２．１ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＥｔ3Ｎ（３．１ｍＬ、２２．１ｍｍｏｌ、１．２当量）を充填した。その反応混合物を室温で一晩攪拌し、その後、１．５時間、８５℃に加熱して、インサイチューで中間体イソシアネート３を生じさせた。その混合物を室温に冷却した。この混合物に、２，３，４−トリアセチル−１−ヒドロキシグルクロン酸エステル４（３．７ｇ、１１ｍｍｏｌ、０．６当量）を添加し、一晩攪拌した。その混合物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で希釈し、その後、ＮａＨＳＯ4水溶液（０．５Ｎ、２００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２００ｍＬ）、ブライン（２００ｍＬ×２）および水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水ＮａＳＯ4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。シリカゲル（２２ｇ）と混合したその残留物（１１ｇ）を、シリカゲル（５００ｇ）を詰めたカラム（４．５×５０ｃｍ）に負荷した。そのカラムをＥｔＯＡｃ／ヘプタン（２：８、６Ｌ；３：７、４Ｌ；４：６、４Ｌ）で洗浄した。画分（６０ｍＬ／画分）を回収し、溶媒を蒸発させて、化合物５（５．５ｇ、８２％）を得た。ＨＰＬＣ、ＲＴ＝７．７３分、純度：８１．４４％。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3），Ａｒ−Ａｒ結合周辺の拘束回転のため全シグナルが二重である，８．０３−７．９３（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．２３（ｍ，２Ｈ），７．１８−７．０５（ｍ，２Ｈ），６．４９，６．４２（２ｓ，1Ｈ，ＮＨ），５．７４，５．７３（２ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，1Ｈ，β−アノマー），５．７０−５．５７（ｍ，1Ｈ），５．３３−５．０１（ｍ，５Ｈ），４．５４−４．４８（ｍ，２Ｈ），４．１６（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，1Ｈ），３．７３，３．７２（２ｓ，３Ｈ），２．０４−１．９５（３ｓ，９Ｈ）。ＭＳ：ｍ／ｚ：［６３６  Ｍ＋Ｎａ］+．
【０１０１】
【化６３】
2008519056.tif 000048
５００ｍＬフラスコに、３，４，５−トリアセトキシ−６−（２’−アリルオキシカルボキシルビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）テトラヒドロ−ピラン−２−カルボン酸メチルエステル５（５．３ｇ、８．６５ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（４００ｍＬ）およびモルホリン（３．８ｍＬ、４３．３ｍｍｏｌ、５当量）を充填した。その反応混合物を２時間、室温で攪拌し、この間、その溶液を窒素でバブリングした。その後、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4（３００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、３ｍｏｌ％）を添加した。その反応混合物をさらに１５分間攪拌し、Ｅｔ2Ｏ（１Ｌ）で希釈し、ＮａＨＳＯ4（０．５Ｎ、３００ｍＬ）、ブライン（３００ｍＬ×２）、水（４００ｍＬ×２）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥させ、蒸発させて、化合物６（５．３ｇ、１００％、ＨＰＬＣ：純度８４％）を得た。この化合物をさらに精製せずに次の段階で使用した。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3），Ａｒ−Ａｒ結合周辺の拘束回転のため全シグナルが二重である，８．０５−７．１５（ｍ，８Ｈ），５．７２，５．７０（２ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，1Ｈ），５．３６−５．０２（ｍ，２Ｈ），４．１８，４．１３（２ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，1Ｈ），３．７７−３．７３（ｍ，1Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），２．０３−１．９８（３ｓ，９Ｈ）。ＭＳ：ｍ／ｚ：５７２［Ｍ−Ｈ］-．
【０１０２】
【化６４】
2008519056.tif 000049
５００ｍＬフラスコに、３，４，５−トリアセトキシ−６−（２’−カルボキシルビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）テトラヒドロピラン−２−カルボン酸メチルエステル６（５．０ｇ、８．７ｍｍｏｌ）、ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）およびＢＯＰ（４．２ｇ、９．６ｍｍｏｌ、１．１当量）を充填した。その混合物を、溶液になるように室温、窒素雰囲気下で攪拌した。この溶液に、ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）中のＤＣＤＱ（２．５ｇ、９．６ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミン（７．６ｍＬ、４３．５ｍｍｏｌ、５当量）の溶液を１滴ずつ１０分間で添加した。その反応混合物を一晩攪拌し、セライトに通して濾過した。有機層を水（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（カラム：４．５×５０ｃｍ、シリカゲル：５００ｇ、溶媒：ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（２／８、４Ｌ）、（３／７、８Ｌ）、５０ｍＬ／画分）により精製して、化合物７（４．０ｇ、ＨＰＬＣ：７４％）を得、さらにＣＨ2Ｃｌ2中のスラリーから化合物７（３．５２ｇ、６８．８％、ＨＰＬＣ：９６％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：７．１２−７．０８（ｍ，1Ｈ），６．９８−６．９６（ｍ，1Ｈ），６．８６−６．７７（ｍ，1Ｈ），５．８１，５．７９（２ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，1Ｈ，β−アノマー），５．１０−４．９０（ｍ，２Ｈ），４．６３−４．３６（ｍ，２Ｈ），４．１７−４．１２（ｍ，1Ｈ），３．８８−３．６８（ｍ，1Ｈ），３．６４，３．５９（２ｓ，３Ｈ），３．４０−３．２１（ｍ，1Ｈ），３．０４−２．５９（ｍ，４Ｈ），２．３０−２．１４（ｍ，1Ｈ），２．０５−１．９５（３ｓ，９Ｈ），１．７０−１．２０（ｍ，５Ｈ）。ＭＳ：ｍ／ｚ  ５８９［Ｍ＋Ｈ］+．
【０１０３】
【化６５】
2008519056.tif 000050
ＴＨＦ（６４ｍＬ）中の化合物７（５．０ｇ、８．５ｍｍｏｌ）の溶液にＭｅＯＨ（３１９ｍＬ）およびＨ2Ｏ（７０ｍＬ）を添加した。その溶液を０〜５℃に冷却した（氷水浴）。そしてＨ2Ｏ（５８ｍＬ）中のＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ（２．１ｇ、５１ｍｍｏｌ、６等量）の溶液［０．１Ｎ ＬｉＯＨ／ＭｅＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ2Ｏ］を１滴ずつ２０分間で添加した。その反応混合物を０〜５℃で２時間、Ｎ2雰囲気下で攪拌した。脱保護化の進行を逆相ＴＬＣ（ＳｉＯ2−Ｃ18 ＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ、３／７）でモニターした。その反応混合物をＨ2Ｏ（５００ｍＬ）で希釈し、２０℃でのＨＯＡｃ（３．１ｇ、５１ｍｍｏｌ）の添加により中和した。減圧下、２２℃で溶媒を濃縮し、得られた水性懸濁液を凍結乾燥させて、粗製Ｍ６代謝物（６．２ｇ、１００％）を得た。Ｂｉｏｔａｇｅシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｏｒｉｚｏｎ）を用い、溶離剤として、２ ＣＨＣＨ3／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏを使用することによりその粗製化合物（１．２ｇ）をさらに精製して、Ｍ６（４００ｍｇ）を純度９５％（ＨＰＬＣ）で得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，Ｄ2Ｏ交換）：７．１３−６．９９（ｍ，２Ｈ），６．８７−６．８０（ｍ，1Ｈ），５．０９（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，1Ｈ，β−アノマー），４．７７−４．５８（ｍ，1Ｈ），４．１９−４．１２（ｍ，1Ｈ），３．９３（ｍ，1Ｈ），３．４０−２．８７（９ｍ，９Ｈ），２．６８−２．６０（ｍ，1Ｈ），２．２４−１．９９（ｍ，３Ｈ），１．６３−１．２０（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１７３．３，１７３．１，１５４．６，１５４．０，１４７．３，１３２．５，１３２．４，１３０．９，１３０．６，１３０．１，１２７．９，１２７．７，１２１．４，１２１．１，９６．９，９６．３，７７．１，７６．９，７５．３，７３．２，７２．９，７２．６，５６．９，５６．１，５５．６，５０．９，５０．４，４８．７，４１．７，３５．０，３４．９，３２．５，３２．３，２９．８，２４．１；ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ），ｍ／ｚ  ４４９［Ｍ＋Ｈ］+．
【０１０４】
参照
１．ＨＰＬＣ装置：Ｗａｔｅｒｓ  ２６９０
サンプル調製：２〜３滴の反応混合物を２ｍＬのアセトニトリルに添加し、よく振盪して溶液にし、ＨＰＬＣ分析に付す。
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ18 ３μｍ ７×５３ｍｍ
カラム温度：２５℃
移動相：溶媒Ａ＝１９００ｍＬ Ｈ2Ｏ、１００ｍＬ ＣＨ3ＣＮ、１ｍＬ Ｈ3ＰＯ4；
溶媒Ｂ＝１９００ｍＬ ＣＨ3ＣＮ、１００ｍＬ Ｈ2Ｏ、１ｍＬ Ｈ3ＰＯ4；
【０１０５】
【表１】
2008519056.tif 000051
２．Ｍ６の最終精製のためのＢｉｏｔａｇｅ  Ｆａｓｈ−１２（Ｈｏｒｉｚｏｎ）法
移動相
Ａ：ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ（８：２：０．２）
Ｂ：ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ（７：３：０．５）
カラム量による勾配（ＣＶ、１２０ｍＬ／ＣＶ）
２（ＣＶ）：Ａ １００％
５（ＣＶ）：Ａ １００％→Ｂ １００％
３（ＣＶ）：Ｂ １００％
サンプル負荷：８ｍＬの移動相Ａに１．２ｇの粗製Ｍ６を溶解し、サンプレットに注入する。
流量：４０ｍＬ／分
ＵＶ：２５４ｎｍ
画分：１２ｍＬ／画分、合計９６の画分
【０１０６】
インビトロ／インビボ代謝物試験
ＤＣＤＱは、強力な５−ＨＴ2C作動薬であり、抗精神病活性を予測するいくつかの動物モデルにおいて有効であり、非定型抗精神病薬プロフィールを有する。これらのモデルにおけるＤＣＤＱの挙動プロフィールは、錐体外路副作用が少ない、非定型抗精神病薬様活性と一致した。５−ＨＴ2C作動薬ＤＣＤＱは、統合失調症に関連した気分障害または認知障害を治療する際にも有効であり得る。
【０１０７】
ＤＣＤＱのいくつかの代謝物を、インビボおよびインビトロモデルによって同定した。それらの経路の背後にある理論に拘束されず、図１〜４は、これらの化合物に至る提案代謝経路（代謝経路案）を示すものである。
【０１０８】
マウス、ラット、イヌおよび人間の肝臓ミクロソームにおけるならびに凍結保存ヒト肝細胞における［14Ｃ］ＤＣＤＱのインビトロ代謝
［14Ｃ］ＤＣＤＱの代謝は、性別を越えてプールされた雄および雌ＣＤ−１マウス、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット、ビーグル犬およびヒト肝臓ミクロソーム由来のミクロソームならびに凍結保存された男性ヒト肝細胞とのインキュベーションにより調査した。ヒト肝臓ミクロソームを使用して、主要酸化代謝物Ｍ１およびカルバモイルグルクロニドＭ６の形成についてのＫm値は、それぞれ、１０．８および５６．１μＭであった。
【０１０９】
種間差をＤＣＤＱ代謝に関して観察した。酸化代謝は、肝ミクロソームインキュベーションにおけるＤＣＤＱについての主要経路であった。ＤＣＤＱのいくつかのヒドロキシ代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４）をＮＡＤＰＨの存在下、ヒト肝臓ミクロソームで検出した。代謝物Ｍ１は、他の種では検出されなかった。代謝物Ｍ２およびＭ３は、イヌおよびラットでも観察された。代謝物Ｍ４は、ラットにおいても検出されたが、マウスおよびイヌにおいては検出されなかった。マウスは、他の種ほど広範な代謝を有さないようであり、Ｍ２は、マウス肝臓ミクロソームで検出された唯一の代謝物であった。ＤＣＤＱイミンのＮ−オキシド（Ｍ５）は、イヌおよびヒトで検出されたが、マウスおよびラット肝臓ミクロソームでは観察されなかった。すべての種由来の肝臓ミクロソームにおけるＤＣＤＱイミン（Ｐ３）ならびに現在未同定の生成物Ｐ１およびＰ２の形成は、ＮＡＤＰＨ依存性ではなかった。さらなる調査が必要である。性別差は、マウス、ラットおよびイヌについてのミクロソームインキュベーションでは観察されなかった。
【０１１０】
ＵＤＰＡＧの存在下、ＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）が、イヌおよびヒトで検出されたが、マウスおよびラット肝臓ミクロソームでは検出されなかった。ヒドロキシ代謝物の形成は、ＮＡＤＰＨの存在下でも、ＵＤＰＧＡの存在下でも、ヒト肝臓ミクロソームでの主要代謝経路であり、一方、カルバモイルグルクロニドは、５０μＭ ＤＣＤＱ濃度でのヒト肝細胞における主要代謝物であった。
【０１１１】
要約すると、ＤＣＤＱは、ミクロソームインキュベーションおよびヒト肝細胞において酸化代謝物およびカルバモイルグルコニドに変換された。
【０１１２】
序論
本試験は、肝臓ミクロソームおよびヒト肝細胞におけるＤＣＤＱのインビトロ生体内変換を調査するものであった。シトクロムＰ４５０およびＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ依存性経路を試験し、ＤＣＤＱ代謝物をＬＣ／ＭＳにより特性付けした。
【０１１３】
材料および方法
材料
塩酸［14Ｃ］ＤＣＤＱ（Ｌｏｔ  Ｌ２５０７３−４２）は、Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの標識合成グループ（ニューヨーク州、パールリバー）が合成した。［14Ｃ］ＤＣＤＱの放射化学的純度は、９８．９％であり、化学的純度は、ＵＶ検出により９９．９％であった。［14Ｃ］ＤＣＤＱの比放射能は、塩酸塩として２２２．９μＣｉ／ｍｇであった。［14Ｃ］ＤＣＤＱの化学構造を、14Ｃ標識の位置とともに示す。９８．６％の化学的純度を有する非標識塩酸ＤＣＤＱ（Ｌｏｔ  ＰＢ３３１２）は、Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ニューヨーク州、パールリバー）が合成した。別の指示がない限り、ＤＣＤＱまたは［14Ｃ］ＤＣＤＱに言及するときには、その塩酸塩と考える。
【化６６】
2008519056.tif 000052
【０１１４】
凍結保存ヒト肝細胞、肝細胞浮遊培地および肝細胞培養基は、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州、ボルティモア）から入手した。肝細胞は、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが判定して５５および４３ｐｍｏｌ／細胞数１０６／分のテストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性を有する２人の男性個体由来のもの（Ｌｏｔ ０７０、５７歳およびＬｏｔ  ＤＲＬ、４４歳）であった。ＣＤ−１マウス、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットおよびビーグル犬由来の、下の表２に挙げる肝臓ミクロソームもＩｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。
【０１１５】
【表２】
2008519056.tif 000053
【０１１６】
被験者３、６、１５、１７、１８および１９由来のヒト肝臓ミクロソームは、ＩＩＡＭ（ペンシルバニア州、エクストン）から受け取った肝臓から作製した。これらのミクロソームは、Dr.Andrew Pakinsonが作製および特性付けしたものであり、Parkinson A. Preparation and characterization of human liver microsomes. Wyeth-Ayerst Research GTR-25617, 1994（これは、本明細書に参考として組み込まれる）に記載されている。ミクロソーム製剤は、使用するまで、２５０〜５００μＬのアリコートで、−７０℃で保管した。次の表は、この試験で使用したヒト肝臓ミクロソームの特性のリストである。
【０１１７】
【表３】
2008519056.tif 000054
【０１１８】
Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄシンチレーションカクテル、Ｕｌｔｉｍａ  Ｆｌｏシンチレーションカクテル、Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ  Ｅ＋シンチレーションカクテルおよびＣａｒｂｏ−Ｓｏｒｂ  Ｅ二酸化炭素吸収剤は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（マサチューセッツ州、ウェルズリー）から購入した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）グレードの水およびアセトニトリルは、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ニュージャージー州、ギブスタウン）から入手した。ウリジン５’−ジホスホグルクロン酸三アンモニウム塩（ＵＤＰＧＡ）およびＥＤＴＡは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミズーリ州、セントルイス）から入手した。酢酸アンモニウムおよび塩化マグネシウムは、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ  Ｉｎｃ．（ニュージャージー州、フィリップスバーグ）から入手した。他のすべての試薬は、分析グレードまたはそれ以上であった。
【０１１９】
方法
マウス、ラット、イヌおよびヒトの肝臓ミクロソームと［14Ｃ］ＤＣＤＱのインキュベーション
［14Ｃ］ＤＣＤＱをインキュベーション中の非放射標識ＤＣＤＱと混合した（１：３または１：５）。ミクロソームインキュベーションは、０．５ｍＬの０．１Ｍリン酸カリウムバッファ、ｐＨ７．４中でインキュベートした［14Ｃ］ＤＣＤＱ、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）および肝臓ミクロソームから成るものであった。水中の［14Ｃ］ＤＣＤＱ（２０μＬ）を、バッファ、塩化マグネシウム溶液およびミクロソームが入っているインキュベーション管に添加した。混合後、それらの管を、振盪水浴中、３７℃で、２分間、プレインキュベートした。ＵＤＰＧＡまたはＮＡＤＰＨ再生系の添加により、反応を開始させた。ＵＤＰＧＡを、水中２０ｍＭ溶液の５０μＬアリコートとしてインキュベーションに添加して、２ｍＭの最終濃度を得た。ＮＡＤＰＨ再生系（３０μＬ）をインキュベーションに添加して、ＣＹＰ４５０媒介代謝を評価した。このＮＡＤＰＨ再生系は、グルコース−６−ホスフェート（２ｍｇ／ｍＬ）、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（０．８単位／ｍＬ）およびＭＡＤＰ+（２ｍｇ／ｍＬ）から成るものであった。対照インキュベーションは、同じ条件下でだが、ＮＡＤＰＨ再生系、ＵＤＰＧＡまたはミクロソームを用いずに行った。すべてのインキュベーションは、二重重複で行った。０．５ｍＬ氷冷メタノールの添加により、インキュベーションを停止させた。サンプルをボルテックス混合した。変性したタンパク質を、４３００ｒｐｍおよび４℃で１０分間の遠心分離（モデルＴ２１超遠心分離機、Ｓｏｒｖａｌｌ）によって分離した。タンパク質ペレットを０．５ｍＬのメタノールで抽出した。上清をサンプルごとに併せ、混合し、Ｚｙｍａｒｋ  ＴｕｒｂｏＶａｐ  ＬＶエバポレーター（マサチューセッツ州、ホプキントンのＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において窒素流下、約０．３ｍＬの量に蒸発させた。その濃縮サンプルを遠心分離し、アリコートをラジオアッセイし、ＨＰＬＣにより分析した。この方法によって、反応混合物から平均９２．１％の放射能を回収した。
【０１２０】
ＮＡＤＰＨまたはＵＤＰＧＡの存在下でのヒト肝臓ミクロソームとのインキュベーションにおけるＤＣＤＱ代謝についての初期速度条件を決定した。経時的試験のためのインキュベーションは、２０μＭの［14Ｃ］ＤＣＤＱおよび０．５ｍｇ／ｍＬのミクロソームタンパク質を含有し、ならびに０、５、１０、２０、３０、４０、５０および６０分間、穏やかに振盪しながら３７℃でインキュベートした。タンパク質依存試験は、０、０．１、０．２５、０．５、０．７５および１．０ｍｇ／ｍＬのミクロソームタンパク質とともに２０分間インキュベートした２０μＭの［14Ｃ］ＤＣＤＱを用いて行った。
【０１２１】
Ｋm値は、ＮＡＤＰＨ再生系と２０分間、またはＵＤＰＧＡと１０分間、［14Ｃ］ＤＣＤＱとともにインキュベートした０．５ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓ミクロソームを用いて決定した。使用した［14Ｃ］ＤＣＤＱ濃度は、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５および１００μＭであった。
【０１２２】
シトクロムＰ４５０媒介およびＵＧＴ媒介代謝の種間差を評価するために、［14Ｃ］ＤＣＤＱを、ＮＡＤＰＨ再生系またはＵＤＰＧＡの存在下、マウス、ラット、イヌまたはヒト由来の０．５ｍｇ／ｍＬ肝臓ミクロソームタンパク質とともに２０分間、インキュベートした。アッセイ条件は、上で説明したものと同じであり、ＤＣＤＱ濃度は、シトクロムＰ４５０媒介代謝およびＵＧＴ媒介代謝について、それぞれ、１２μＭおよび５６μＭであった。
【０１２３】
サンプルは、放射能フロー検出より、およびＬＣ／ＭＳにより、代謝について分析した。
【０１２４】
ヒト肝細胞の作製
凍結保存ヒト肝細胞が入っているバイアルを、穏やかに振盪しながら、氷がほとんど溶けるまで、３７℃の水浴の中で解凍した。それらのバイアルを水浴から取り出し、完全に解凍するまで、３０〜６０秒間、室温で穏やかな振盪し続けた。各バイアルからの肝細胞浮遊液を、氷上の予冷した５０ｍＬビーカーに、直ちに移した。各ビーカーに、１２ｍＬの氷冷肝細胞浮遊培地を、細胞が固まらないように手で時々、穏やかに振盪しながら、１分かけて１滴ずつ添加した。それらの細胞浮遊液を１５ｍＬ管に移し、１００ｇの力で３分間、４℃で遠心分離した（モデルＴ２１超遠心分離機、Ｓｏｒｖａｌｌ）。上清を捨て、ペレットを４ｍＬの氷冷肝細胞培養基に再び浮遊させた。それらの細胞浮遊液は、約３．１×１０６個の生存可能肝細胞／ｍＬを含有していた。平均生存率は、トリパンブルー排除および血球計算器を用いて判定して、７６．０％であった。
【０１２５】
ヒト肝細胞と［14Ｃ］ＤＣＤＱのインキュベーション
細胞浮遊液を１２ウエルプレートに１ウエル当たり１．０ｍＬで分配した。インキュベーションは、２人のドナー由来のプールされた肝細胞を用いて行った。水中の［14Ｃ］ＤＣＤＱを肝細胞浮遊液に１０または５０μＭの最終濃度で添加した。インキュベーションは、５％ ＣＯ2を供給したインキュベーターにおいて、３７℃で４時間、行った。インキュベーション終了時、各ウエルへの２００μＬ冷メタノールの添加により、反応を停止させた。各ウエルの収容物を１５ｍＬ遠心管に移し、３０秒間、超音波処理した。６ｍＬメタノールとボルテックス混合し、その後、遠心分離した後、上清を清浄な試験管に移し、ＴｕｒｂｏＶａｐエバポレーターにおいて約０．５ｍＬに蒸発させた。残留物をＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳによって分析した。
【０１２６】
ＨＰＬＣ分析
内臓オートサンプラーを有するＷａｔｅｒｓ  ｍｏｄｅｌ  ２６９０  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（マサチューセッツ州、ミルフォードのＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）を分析に使用した。分離は、フィルター（４×２ｍｍ）カートリッジに連結したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ18（２）カラム（２×１５０ｍｍ、５μｍ）（カリフォルニア州、トランスのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いて遂行した。２５０ｎｍをモニターするように設定した可変波長ＵＶ検出器、および２５０μＬ ＬＱＴＲフローセルを有するＦｌｏ−Ｏｎｅ  β  Ｍｏｄｅｌ  Ａ５２５放射能フロー検出器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）をデータ収集に使用した。Ｕｌｔｉｍａ  Ｆｌｏｗ  Ｍ  シンチレーション液の流量は、５：１のシンチレーションカクテルの移動相に対する混合比をもたらす、１ｍＬ／分であった。オートサンプラー内のサンプルチャンバーは、４℃で維持し、一方、カラムは、約２０℃の周囲温度であった。移動相は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５（Ａ）およびメタノール（Ｂ）からなり、０．２ｍＬ／分で送液した。線形勾配条件は、次のとおりであった：
【０１２７】
【表４】
2008519056.tif 000055
【０１２８】
液体クロマトグラフィー／質量分析法
オートサンプラーおよびダイオードアレイＵＶ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  １１００  ＨＰＬＣシステム（カリフォルニア州、パロアルトのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＬＣ／ＭＳ分析に使用した。ＵＶ検出器は、２００から４００ｎｍをモニターするようにに設定した。選択したＬＣ／ＭＳ分析について、固体シンチレーションフローセルを装備したβ−Ｒａｍ  ｍｏｄｅｌ  ３放射能フロー検出器（フロリダ州、テンパのＩＮ／ＵＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用してラジオクロマトグラムを得た。分離は、上で説明したものと同じ条件下でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）カラム（２×１５０ｍｍ、５μｍ）を用いて遂行した。
【０１２９】
代謝物の特性付けに用いた質量分析装置は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ−２四極子飛行時間型ハイブリッド質量分析装置（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｒｐ．）であった。この質量分析装置は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースを装備しており、陽イオンモードで操作した。フルＭＳおよびＭＳ／ＭＳスキャンには、それぞれ、５および３０ｅＶの衝突エネルギー設定を用いた。この質量分析装置の設定を下に列記する。
【０１３０】
【表５】
2008519056.tif 000056
【０１３１】
データ解析
Ｆｌｏ−Ｏｎｅ分析用ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、バージョン３．６）を利用して、放射能ピークを積分した。コンピュータープログラムＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌｌ（登録商標）９７を使用して、平均および標準偏差を算出し、スチューデントｔ検定を行った。Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ、バージョン４．０）をＬＣ／ＭＳデータの収集および解析に利用した。
【０１３２】
結果
ヒト肝臓ミクロソームでのＫm値の決定
ヒト肝臓ミクロソームについて、［14Ｃ］ＤＣＤＱからの代謝物形成についての初期速度条件およびＫm値を決定した。時間依存性試験において、主要酸化代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４）のＮＡＤＰＨ依存形成は、２０分間、直線的であり、カルバモイルグルクロニド（Ｍ６）の形成は、１０分間、直線的であった（データは示さない）。タンパク質依存性試験において、酸化代謝およびカルバモイルグルクロニド形成は、０．５ｍｇ／ｍＬミクロソームタンパク質まで、直線的であった。ヒト肝臓ミクロソームにおける主要酸化代謝物Ｍ１およびカルバモイルグルクロニドＭ６の形成についてのＫm値は、それぞれ、１０．８および５６．１μＭであった。ヒト肝臓ミクロソームにおける代謝物Ｍ２、Ｍ３およびＭ４の形成についてのＫm値は、８．９から１３．８μＭの範囲であった。ヒト肝臓ミクロソームにおける代謝物Ｍ５形成についてのＫm値は、３６．２μＭであった。
【０１３３】
マウス、ラット、イヌおよびヒトの肝臓ミクロソームによる［14Ｃ］ＤＣＤＱ代謝
ミクロソームインキュベーションに関する種間比較のための、Ｐ４５０媒介およびＵＧＴ媒介代謝についてのＤＣＤＱ濃度は、それぞれ、１２および５６μＭであり、これらがおおよそのＫm値であった。ＮＡＤＰＨ再生系の存在下、４つのヒドロキシ代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４）がヒトミクロソームで検出された。代謝物Ｍ１は、他の種では検出されなかった。代謝物Ｍ２およびＭ３は、イヌおよびラットで観察された。代謝物Ｍ４もラットにおいては検出されたが、マウスおよびイヌでは検出されなかった。マウスは、他の種ほど広範な代謝を有さないようであり、Ｍ２は、マウス肝臓ミクロソームで検出された唯一の代謝物であった。ＤＣＤＱイミンのＮ−オキシド（Ｍ５）は、イヌおよびヒトで検出されたが、マウスおよびラットではされなかった。他の３つのピーク（Ｐ１、Ｐ２およびＤＣＤＱイミンＰ３）も、ミクロソームインキュベーションにおいて観察された。Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の形成は、ＮＡＤＰＨ依存性ではなかった。これらの生成物は、ミクロソームを伴わない対照インキュベーションでは形成されなかった（データは示さない）ので、それらの形成は、Ｐ４５０以外の酵素によって触媒され得る。
【０１３４】
ＵＤＰＧＡの存在下、ＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）の形成が、イヌおよびヒトの肝臓ミクロソームで検出されたが、マウスおよびラットではされなかった。ＤＣＤＱ（２０μＭ）を、ＮＡＤＰＨおよびＵＤＰＧＡ、両方の存在下でヒト肝臓ミクロソームとともにインキュベートしたとき、ヒドロキシ代謝物の形成が主要代謝経路であり、少量のカルバモイルグルクロニドしか検出されなかった。マウス、ラットおよびイヌについてのミクロソームインキュベーションにおいて、性別差は観察されなかった。
【０１３５】
ヒト肝細胞による［14Ｃ］ＤＣＤＱ代謝
ＤＣＤＱをヒト肝細胞とともにインキュベートしたとき、５０μＭ ＤＣＤＱ濃度では、カルバモイルグルクロニド（Ｍ６）が最も顕著な代謝物であった。５０μＭ ＤＣＤＱ濃度では酸化代謝物も観察されたが、カルバモイルグルクロニドほど豊富ではなかった。１０μＭ ＤＣＤＱとヒト肝細胞を含有するインキュベーションは、カルバモイルグルクロニドのものに近いレベルで酸化代謝物を生産した。ヒトミクロソームインキュベーションにおいて形成された代謝物に加えて、別の代謝物（Ｍ７）が検出された。ミクロソーム中で形成されたＤＣＤＱイミン（Ｐ３）も、肝細胞インキュベーションにおいて観察された。
【０１３６】
ＬＣ／ＭＳ分析による代謝物の特性付け
ＤＣＤＱおよびその代謝物についてのＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により、質量スペクトルを得た。これらの化合物の構造的特徴を表６にまとめる。
【０１３７】
【表６】
2008519056.tif 000057
【０１３８】
各々の試験において同定したＤＣＤＱおよびその代謝物の質量スペクトルの特性付けを、以下でさらに説明する。
【０１３９】
考察
ＤＣＤＱ代謝に関して種間差が観察された。酸化生成物は、肝ミクロソームインキュベーションにおけるＤＣＤＱについての主要代謝経路であった。ＤＣＤＱのいくつかのヒドロキシ代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４）が、ＮＡＤＰＨの存在下、ヒト肝臓ミクロソームで検出された（図１）。代謝物Ｍ２およびＭ３は、イヌおよびラット肝臓ミクロソームでも観察された。マウスは、他の種ほど広範な代謝を有さず、Ｍ２が、マウス肝臓ミクロソームで検出された唯一の代謝物であった。ＤＣＤＱイミンのＮ−オキシド（Ｍ５）は、イヌおよびヒトについてのミクロソームインキュベーションにおいて検出されたが、マウスおよびラット肝臓ミクロソームではされなかった。ＵＤＰＧＡの存在下、ＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）がイヌおよびヒトで検出されたが、マウスまたはラットではされなかった。ヒドロキシ代謝物の形成は、ＮＡＤＰＨとＵＤＰＧＡ、両方の存在下でのヒト肝臓ミクロソームでの主要代謝経路であり、一方、カルバモイルグルクロニドＭ６は、５０μＭ ＤＣＤＱ濃度でのヒト肝細胞における主要代謝物であった。Ｐ４５０以外の酵素系も、ＤＣＤＱイミン（Ｐ３）および他の生成物（Ｐ１およびＰ２）の形成によりＤＣＤＱ代謝に寄与し得る。生成物Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の形成は、ＮＡＤＰＨ依存性ではなかった。それらは、肝臓ミクロソームおよび肝細胞とのすべてのインキュベーション中に一般に存在したので、さらなる調査が必要である。ミクロソームインキュベーションにおいて、マウス、ラットおよびイヌについては性別差が観察されたかった。
【０１４０】
要約すると、ＤＣＤＱは、ミクロソームインキュベーションおよびヒト肝細胞において、酸化代謝物およびカルバモイルグルクロニドに変換された。
【０１４１】
単回（５ｍｇ／ｋｇ）経口栄養投与後の雄および雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける［14Ｃ］ＤＣＤＱのインビボ代謝
梗概
本試験は、単回経口投与（５ｍｇ／ｋｇ）後の雄および雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける［14Ｃ］ＤＣＤＱのインビボ代謝を調査したものである。雄ラットからは投与後２、４、８および２４時間の時点で、雌ラットからは投与後２および８時間の時点で、血液、血漿および脳を採取した。投与後０〜８および８〜２４時間間隔で、雄ラットから尿および糞便を回収した。
【０１４２】
雄ラットにおいて、血漿放射能濃度は、投与後２、４、８および２４時間の時点で、それぞれ、６３２±１４４、６５９±１６．５、４６５±４３．１、および４６．９±８．３０ｎｇ当量／ｍＬであった。雌ラットについて、投与後２時間の時点での６５８±１８９ｎｇ当量／ｍＬの平均血漿中放射能濃度は、雄ラットに類似していたが、投与後８時間の時点での３３８±６０．７ｎｇの平均放射能濃度は、雄ラットより低かった。平均血液対血漿比は、投与後２時間と８時間の間で約１．１であった。これは、ＤＣＤＱおよびその代謝物の血液細胞への分配が制限されていることを示している。
【０１４３】
ＤＣＤＱは、投与後２時間と８時間の間で、血漿中放射能の平均１３％から２０％に相当した。２４時間血漿サンプルは、低放射能濃度のためプロフィールを分析しなかった。代謝プロフィールの変化は、時間が経つにつれて明白でなくなった。血漿において検出された代謝物としては、ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ１０）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ７）、ならびに第ＩＩ相代謝物ＤＣＤＱスルファメート（Ｍ１２）、ジ−デヒドロＤＣＤＱスルファメート（Ｍ１４）、ヒドロキシＤＣＤＱスルフェート（Ｍ８およびＭ１３）、ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびアセチル化ヒドロキシＤＣＤＱ（Ｍ１１）が挙げられた。血漿代謝物プロフィールは、性別に関連した相違を示した。ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ１、Ｍ２およびＭ３）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ７）およびヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）が、雄ラット血漿における主要代謝物であった一方で、ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ３）、ヒドロキシＤＣＤＱスルフェート（Ｍ８）、ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびＤＣＤＱスルファメート（Ｍ１２）が、雌ラットにおける主要代謝物であった。主な性別差は、スルフェートまたはスルファメートの形成にあった。
【０１４４】
尿中排泄は、経口投与されたＤＣＤＱの主要排泄経路であり、投与量の６６．７％を占めた。血漿サンプルにおいて観察された主要代謝物は、尿においても検出され、この場合、ＤＣＤＱは、投与量の１％未満を占めた。ヒドロキシ代謝物（Ｍ１およびＭ３）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ７）およびグルクロニド（Ｍ９）が、尿における主要代謝物であった。投与された放射能の平均２１．１％が、糞便において回収された。代謝物Ｍ３、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１およびほんの微量のＤＣＤＱが、雄ラットの糞便において検出された。
【０１４５】
脳組織における放射能は、投与後２、４および８時間の時点で、血漿におけるより有意に高かった。脳放内射能濃度は、雄ラットについては投与後２、４、８および２４時間の時点で、それぞれ、５．１２±１．２８、４．９４±０．４４、３．２５±０．９９および０．０３７±０．００２μｇ当量／ｇ組織であり、一方、雌ラットについての濃度は、投与後２および８時間の時点で、それぞれ、６．３８±２．２２および２．８５±０．６８μｇ当量／ｇ組織であった。投与後２時間と８時間の間の平均脳対血漿中放射能比は、６．９から９．６の範囲であった。これは、脳組織による有意な取り込みを示している。投与の２４時間後までに、この平均脳対血漿中放射能比は、０．８に低下した。ＤＣＤＱは、投与後２時間と８時間の間で雄および雌ラットについての脳放射能の平均９０より高い％を占めた。脳内放射能の放射能濃度およびクロマトグラフ分布に基づき、平均脳対血漿中ＤＣＤＱ比は、４９．９から５６．１の範囲になると推定された。投与後２時間と８時間の間で、有意な性別差および経時的変化はなかった。雄および雌のラットの脳では、少量の代謝物Ｍ１、Ｍ３、Ｍ７、Ｍ１０およびＭ１１しか検出されなかった。これらのデータは、ＤＣＤＱは血液脳関門を容易に横断するが、脳組織への代謝物の取り込みは制限されていることを示したいた。脳対血漿中放射能比は、投与後８時間後には脳からのクリアランスが急激に発生することも示唆していた。これらの比が投与の２４時間後までに６．９から０．８に低下したためである。
【０１４６】
要約すると、ラットでは、ＤＣＤＱが広範囲にわたって代謝されて、主として酸化代謝物になった。雄ラットと雌ラットの血漿プロフィールは、ＤＣＤＱおよびその酸化代謝物のスルフェートコンジュゲートとスルファメートコンジュゲートで異なった。ＤＣＤＱは、脳における主薬物関連成分であるが、少量の代謝物しか観察されず、性別差は明らかではなかった。ＤＣＤＱは、脳血液関門を容易に横断したが、代謝物の取り込みは、少量の酸化代謝物に限られていた。
【０１４７】
序論
様々なマスバランス試験は、投与放射能の平均６４．３％が尿において回収されたことで、尿がラットにおける主要排泄経路であることを示した。肝臓ミクロソームでのインビボ試験は、酸化代謝物がラットにおけるＤＣＤＱの主要代謝経路であることを示した。（Iwasaki K, Shiraga T, Tada K, Noda K, Noguchi H, Age- and sex- related changes in amine sulphoconjugation in Sprague-Dawley strain rats. Comparison with phenol and alcohol sulphoconjugations. Xenobiotica. 1986; 16: 717-723）。本試験は、単回５ｍｇ／ｋｇ経口投与後のラットにおける［14Ｃ］ＤＣＤＱの代謝を調査したものである。
【０１４８】
材料および方法
材料
塩酸［14Ｃ］ＤＣＤＱは、上で検討したインビトロ試験において説明したように、Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの標識合成グループ（ニューヨーク州、パールリバー）が合成した。Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄシンチレーションカクテル、Ｕｌｔｉｍａ  Ｆｌｏシンチレーションカクテル、Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ  Ｅ＋シンチレーションカクテルおよびＣａｒｂｏ−Ｓｏｒｂ  Ｅ二酸化炭素吸収剤は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（マサチューセッツ州、ウェルズリー）から購入した。Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ（ニュージャージー州、フィリップスバーグ）から入手し、メチルセルロースは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から入手したものであった。抽出のためおよびクロマトグラフ分析のために使用した溶媒は、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ニュージャージー州、ギブスタウン）からのＨＰＬＣまたはＡＣＳ試薬グレードのものであった。
【０１４９】
方法
薬物投与および検体収集
薬物の調製、動物への投与、および検体収集は、ペンシルバニア州、カレッジビルのＷｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈで行った。投与用賦形剤は、水中２％（ｗ／ｗ） Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％メチルセルロースを含有した。投与当日、［14Ｃ］ＤＣＤＱ（１２．２ｍｇ）および非標識ＤＣＤＱ（３６．５ｍｇ）をその賦形剤に溶解して、約２ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。
【０１５０】
投与時点で、体重３１８から３４５グラムであった雄ラットおよび体重２２７から２５５グラムであった雌ラットは、マサチューセッツ州、ウィルミントンのＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。絶食させてないラットに、胃内栄養法により、２．５ｍＬ／ｋｇの量で、ＤＣＤＱの単回５ｍｇ／ｋｇ（〜３００μＣｉ／ｋｇ）用量を与えた。動物にＰｕｒｉｎａ  ｒａｔ  ｃｈｏｗおよび水を適宜供給し、個々に代謝ケージに入れておいた。用量投与後２、４、８および２４時間の時点で雄ラットを犠牲にした。雌ラットは、用量投与後２および８時間の時点で犠牲にした。
【０１５１】
犠牲にした時点で、心臓穿刺により、血液サンプルを、血液凝固阻止薬としてＥＤＴＡが入っている試験管に回収し、それらを氷の上に置いた。５０μＬのアリコートを燃焼および放射能含有率決定のために除去した。４℃での遠心分離により、残りの血液から直ちに血漿を得た。５０ｍＬの冷却滅菌生理食塩水での潅流後、脳を切除した。尿サンプルは、投与後０〜８および８〜２４時間間隔でドライアイス上に回収した。糞便は、室温で、投与後０〜８および８〜２４時間間隔で回収し、前に説明したとおり均質化した。投与前および後の生体試料および投与溶液アリコートは、分析まで約−７０℃で保管した。
【０１５２】
放射能判定
血漿（２０μＬ）および尿（５０μＬ）アリコートを放射能濃度について分析した。用量、血漿および尿の放射能判定は、シンチレーション液として１０ｍＬのＵｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄを使用して、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  Ｍｏｄｅｌ  ３１００  ＴＲ／ＬＬ液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で行った。
【０１５３】
脳および糞便サンプルを計量し、水中で、それぞれ、約１：１および５：１の容量対重量比で均質化した。血液アリコート（５０μＬ）、脳ホモジネート（０．１グラム）および糞便ホモジネート（０．２グラム）をＣｏｍｂｕｓｔｏ−ｐａｄｓを具備するＣｏｍｂｕｓｔ−ｃｏｎｅｓに配置し、燃焼した。Ｏｘｉｍａｔｅ−８０  Ｒｏｂｏｔｉｃ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｓａｍｐｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を装備したモデル３０７  Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｏｘｉｄｉｚｅｒを燃焼に用いた。遊離した14ＣＯ2をＣａｒｂｏ−Ｓｏｒｂ  Ｅ  二酸化炭素吸収剤で捕捉し、ＰｅｒｍａＦｌｕｏｒ（登録商標）Ｅ＋液体シンチーレーションカクテルと混合し、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  Ｍｏｄｅｌ  ３１００  ＴＲ／ＬＬ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でカウントした。前記オキシダイザーの酸化効率は、９８．２％であった。
【０１５４】
２５０μＬ ＬＱＴＲフローセルを備えたＦｌｏ−Ｏｎｅ  β  Ｍｏｄｅｌ  Ａ５２５放射能検出器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を、ＨＰＬＣのためのインライン放射能検出に使用した。Ｕｌｔｉｍａ  Ｆｌｏｗ  Ｍシンチレーション液の流量は、５：１のシンチレーションカクテルの移動相に対する混合比をもたらす、１ｍＬ／分であった。検出限界は、脳については約１ｎｇ当量／ｇ、血漿については２ｎｇ当量／ｍＬ、糞便については５ｎｇ当量／ｇおよび尿については１０ｎｇ当量／ｍＬであった。
【０１５５】
用量分析
投与前および投与後溶液のアリコートを水中２５％メタノールで希釈し、上で説明したように放射能濃度について分析した。１０μＬの希釈溶液中の約１００，０００ ＤＰＭをＨＰＬＣにより放射化学的純度および化学的純度について分析した。その投与懸濁液の比放射能を判定するために、非放射標識ＤＣＤＱをメタノールに溶解し、水中２５％メタノールで希釈し、ＨＰＬＣによって同時に分析して、標準曲線を作成した。希釈投与溶液のアリコート（１０μＬ）をＨＰＬＣカラムに注入し、ＵＶ検出後１分間隔で画分を回収した。各画分における放射能を判定した。放射能のバックグラウンドレベルを得るために、ブランク注入からの画分も回収した。
【０１５６】
血漿代謝物プロフィール
血漿サンプルをＨＰＬＣにより代謝物プロフィールについて分析した。１．５ｍＬ血漿アリコートを３．０ｍＬメタノールと混合し、約１０分間、氷の上に置き、その後、遠心分離した。上清を清浄な試験管に移した。タンパク質ペレットを３．０ｍＬメタノールで１回抽出した。各サンプルの沈殿および抽出からの上清をプールし、混合し、Ｚｙｍａｒｋ  ＴｕｒｂｏＶａｐ  ＬＶ（マサチューセッツ州、ホプキントンのＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｃｅｎｃｅｓ）において窒素下、２２℃で約０．３ｍＬに蒸発させた。その濃縮抽出物を遠心分離し、上清量を測定し、１０μＬアリコートを二重重複で放射能について分析することにより、抽出効率を決定した。上清のアリコート（５０〜２００μＬ）を、放射能フロー検出器を備えたＨＰＬＣによって分析した。ＬＣ／ＭＳによっても血漿抽出物を分析した。
【０１５７】
糞便および尿の分析
糞便ホモジネートを代謝物プロフィールについて分析した。糞便ホモジネートの１グラムのアリコートを２ｍＬメタノールと混合し、約１０分間、氷の上に置き、遠心分離した。上清を清浄な試験管に移した。残留物を２ｍＬの水：メタノール（３：７）混合物で３回抽出した。各サンプルの上清を併せ、約１ｍＬに蒸発させ、遠心分離した。上清の１０μＬのアリコートを放射能について分析することにより、抽出効率を決定した。放射能フロー検出器を備えたＨＰＬＣにより、上清のアリコート（５０〜２００μＬ）をプロファイリングのために分析した。サンプルをＬＣ／ＭＳにより分析して、放射能ピークの特性付けもした。
【０１５８】
尿を放射能濃度について分析し、ＨＰＬＣカラムへの直接注入により代謝物プロフィールについて分析した。代謝物同定のために尿サンプルでのＬＣ／ＭＳ分析も行った。
【０１５９】
脳における代謝物プロフィール
脳ホモジネートを代謝物プロフィールについて分析した。脳ホモジネートの１グラムのアリコートを等量のメタノールと混合し、約１０分間、氷の上に置き、遠心分離した。上清を清浄な試験管に移した。残留物を１ｍＬメタノールで３回抽出した。各サンプルの上清を併せ、約０．５ｍＬに蒸発させ、遠心分離した。上清の１０μＬのアリコートを放射能について分析することにより、抽出効率を決定した。放射能フロー検出器を備えたＨＰＬＣにより、上清のアリコート（１００〜２００μＬ）をプロファイリングのために分析した。サンプルをＬＣ／ＭＳによって分析して、放射能ピークの特性付けも行った。
【０１６０】
高速液体クロマトグラフィー
内臓オートサンプラー内臓を有するＷａｔｅｒｓ  ｍｏｄｅｌ  ２６９０  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（マサチューセッツ州、ミルフォードのＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）を分析に使用した。分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ18（２）カラム（１５０×２．０ｍｍ、５μｍ）（カリフォルニア州、トランスのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いて遂行した。オートサンプラー内のサンプルチャンバーは、４℃で維持し、一方、カラムは、約２０℃の周囲温度であった。上で説明した、２５０ｎｍをモニターするように設定した可変波長ＵＶ検出器およびＦｌｏ−Ｏｎｅ  β  Ｍｏｄｅｌ  Ａ５２５放射能フロー検出器をデータ収集に使用した。ＨＰＬＣ移動相は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５（Ａ）およびメタノール（Ｂ）からなり、０．２ｍＬ／分で送液した。クロマトグラフ条件Ａを用量分析に用い、一方、条件Ｂを尿および血漿、脳および糞便抽出物の分析に用いた。
【０１６１】
【表７】
2008519056.tif 000058
【０１６２】
ＬＣ／ＭＳ分析
オートサンプラーおよびダイオードアレイＵＶ検出器を具備するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  １１００  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（デラウェア州、ウィルミントンのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、血漿および尿サンプルのＬＣ／ＭＳ分析に使用した。ＵＶ検出器は、２００から４００ｎｍをモニターするように設定した。選択したＬＣ／ＭＳ分析については、固体シンチラントフローセルを装備したβ−Ｒａｍ  ｍｏｄｅｌ  ３放射能フロー検出器（フロリダ州、タンパのＩＮ／ＵＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用してラジオクロマトグラムを得た。これには、内臓オートサンプラーと、２１０〜３５０ｎｍに設定したモデル９９６ダイオードアレイＵＶ検出器とが装備されていた。ＨＰＬＣフローをＲａｄｉｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ  １５０ＴＲフローシンチレーションアナライザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）と質量分析装置の間で分割した。他のＨＰＬＣ条件は、上で説明した条件Ｂと同じであった。
【０１６３】
血漿および尿についての代謝物特性付けに使用した質量分析装置は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ−２四極子飛行時間型ハイブリッド質量分析装置（Ｗａｔｅｒｓ）であった。この質量分析装置は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースを装備しており、陽イオンモードで操作した。フルＭＳおよびＭＳ／ＭＳスキャンには、それぞれ、５および３０ｅＶの衝突エネルギー設定を用いた。質量分析装置の設定を下に列記する。
【０１６４】
【表８】
2008519056.tif 000059
【０１６５】
糞便サンプルを分析するために、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｍｉｃｒｏ質量分析装置（Ｗａｔｅｒｓ）も使用した。これは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースを装備しており、陽イオンモードで操作した。この質量分析装置の設定を下に列記する。
【０１６６】
【表９】
2008519056.tif 000060
【０１６７】
選択反応モニタリング（ＳＲＭ）モードでのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＬＣ／ＳＲＭ）を前記トリプル四極子質量分析装置で行って、糞便サンプル中のＤＣＤＱおよびその代謝物をモニターした。モニターした遷移を下に列記する。
【０１６８】
【表１０】
2008519056.tif 000061
【０１６９】
データ解析および統計学的評価
Ｆｌｏ−Ｏｎｅ分析用ソフトウェア（Ｐａｃｋａｒｄ、バージョン３．６）を利用して、放射能ピークを積分した。コンピュータープログラムＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌｌ（登録商標）９７を使用して、平均および標準偏差を算出し、スチューデントｔ検定を行った。Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ、バージョン４．０）をＬＣ／ＭＳデータの収集および解析に利用した。
【０１７０】
結果
用量分析
投与溶液中の［14Ｃ］ＤＣＤＱの放射化学的純度および推定化学的純度は、それぞれ、９９．０±０．３％および９９．６±０．１％であった。投与前アリコートと投与後アリコートは、同じ純度を有した。投与溶液中の［14Ｃ］ＤＣＤＱの比放射能は、塩酸塩として４８．２μＣｉ／ｍｇであった。平均薬物濃度は、塩酸塩として２．４８ｍｇ／ｍＬ、または遊離塩基として２．１４ｍｇ／ｍＬであった。投与したＤＣＤＱの実際の用量は、遊離塩基として５．２から５．４ｍｇ／ｋｇ、または塩酸塩として６．１から６．３ｍｇ／ｋｇの範囲であった。
【０１７１】
血漿中放射能濃度および代謝物プロフィール
［14Ｃ］ＤＣＤＱの単回経口投与後の血液および血漿中の放射能濃度を表１１にまとめる。
【０１７２】
【表１１】
2008519056.tif 000062
【０１７３】
雄ラットにおいて、平均血漿中放射能濃度は、投与後２、４、８および２４時間の時点で、それぞれ、６３２、６５９、４６５および４６．９ｎｇ当量／ｍＬであった。雌ラットにおける２時間での６５８ｎｇ当量／ｍＬの平均血漿中放射能濃度は、雄ラットに類似していたが、投与後８時間の時点での３３８ｎｇ当量／ｍＬの平均血漿中濃度は、雄ラットにおけるより有意に低かった。血液サンプルは、すべての時点で血漿より有意に高い放射能濃度を有した。平均血液対血漿中放射能比は、投与後２、４および８時間の時点での雄および雌ラットについては約１．１から、投与後２４時間での雄ラットの約１．５の範囲にわたった。これは、ＤＣＤＱおよびその代謝物の血液細胞への分配が制限されていることを示している（表１２）。
【０１７４】
【表１２】
2008519056.tif 000063
【０１７５】
血漿抽出物は、２、４および８時間サンプルについての全血漿中放射能の平均８２から９６％を含有した。代謝物プロフィールは、低い放射能濃度のため、２４時間血漿サンプルからは得られなかった。ＤＣＤＱは、ラットにおいて広範囲にわたって代謝された。親薬物は、血漿抽出物における全放射能の平均１３から２０％に相当し、雄雌間でまたは経時的に明らかな相違はなかった（表１３および１４）。いくつかのヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ１０）ならびにケトＤＣＤＱ（Ｍ７）が血漿において検出された（図１）。血漿において観察された第ＩＩ相代謝物としては、ＤＣＤＱスルファメート（Ｍ１２、雌血漿中のみに多量）、ジ−デヒドロＤＣＤＱスルファメート（Ｍ１４、雌血漿中のみに多量）、ヒドロキシＤＣＤＱスルフェート（Ｍ８およびＭ１３）、ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびアセチル化ヒドロキシＤＣＤＱ（Ｍ１１）が挙げられた（図１）。血漿中放射能の分布率は、投与後８時間の時点で顕著に低かった代謝物Ｍ８を除き、時間の経過とともに有意には変化しなかった。代謝物Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ７およびＭ９は、雄ラットにおける主要代謝物であり、一方、Ｍ３、Ｍ８、Ｍ９およびＭ１２は、雌ラットにおける主要代謝物であった。これは、代謝物プロフィールにおける性別差を示している（表１３および１４）。血漿抽出物において検出された多数の比較的少量の代謝物は、特性付けしなかったが、併せると、血漿中放射能の１９〜３８％に相当した。それらの分布率に基づく個々のタンパク質の血漿中濃度を表４に提示する。ＤＣＤＱ濃度は、一般に、雄および雌ラット血漿中の個々の代謝物各々の濃度と等しいか、それ以上であった。雄ラットでは、代謝物Ｍ１、Ｍ３＋Ｍ９およびＭ７が、最も高い濃度を示したが、雌ラットでは、代謝物Ｍ３＋Ｍ９およびＭ８が、より顕著な代謝物であった。
【０１７６】
【表１３】
2008519056.tif 000064
【０１７７】
【表１４】
2008519056.tif 000065
【０１７８】
尿中排泄物および代謝物プロフィール
尿は、主要排泄経路であり、放射能投与量の６６．７±５．０％が、投与後最初の２４時間、３２．５％が、０〜８時間、および３４．２％が、８〜２４時間の尿サンプルにおいて回収された。主要血漿代謝物の大部分が、尿中でも検出された（表１５）。雄ラット由来の尿における主要代謝物としては、ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ７）およびヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）が挙げられた（表１５）。０〜２４時間の尿における個々の代謝物は、投与用量の約２から１６％に相当し（表１６）、一方、ＤＣＤＱは、その用量の１％未満に相当した。０〜８時間の回収物と８〜２４時間の回収物についての代謝物分布は似ていた。
【０１７９】
【表１５】
2008519056.tif 000066
【０１８０】
【表１６】
2008519056.tif 000067
【０１８１】
糞便中排泄および代謝物プロフィール
糞便中排泄は、雄ラットについて投与後最初の２４時間に回収された投与放射能の２１．１±２．１％を占めた。８〜２４時間糞便サンプルについての抽出効率は、６４．３％であり、一方、放射能の平均８９．５％が、対照糞便ホモジネート中での［14Ｃ］ＤＣＤＱのインキュベーションから抽出された。ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ３およびＭ４）、ヒドロキシＤＣＤＱスルフェート（Ｍ８）、ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびアセチル化ヒドロキシＤＣＤＱ（Ｍ１１）は、８〜２４時間糞便抽出物における主要代謝物であり、親薬物は極微量しか検出されなかった。代謝物プロフィールは、０〜８時間糞便サンプルからは、低放射能のため（投与放射能の０．１％未満）、得なかった。３７℃で２４時間の糞便ホモジネート中での［14Ｃ］ＤＣＤＱのインキュベーションは、検出可能な分解を示さなかった。
【０１８２】
脳における放射能含有率および代謝物プロフィール
脳組織には、放射能の平均８４．５％が抽出された。脳内放射能濃度は、投与後８時間までは血漿より高く、ＤＣＤＱは、ラットの脳における主薬物関連成分であった。ＤＣＤＱは、投与後２、４および８時間の時点で雄ラットについては脳抽出物における放射能の平均で９０より高い％、および雌ラットについては投与後２および８時間の時点で９４より高い％を占めた（表１７）。雄および雌のラットの脳における平均放射能濃度は、類似しており、２時間（雄および雌について、それぞれ、５．１および６．４μｇ当量／ｇ）から８時間（雄および雌について、それぞれ、３．２および２．８μｇ当量／ｇ）でわずかに減少しただけであった。２４時間まで、脳内濃度は、雄ラットについては平均０．０４μｇ当量／ｇで、血漿中より低かった。投与後２時間と８時間の間の平均脳対血漿中放射能比は、雄ラットについては６．９から８．２、および雌ラットについては８．７から９．６であり、雄ラットについては２４時間の時点で０．８に減少した。雄ラットと雌ラットの間に、脳内放射能含有率および脳対血漿中放射能比に関して有意な差は無かった。脳対血症中ＤＣＤＱ比は、放射能比よりずっと高かった（表１７）。平均脳対血漿中ＤＣＤＱ比は、時間または性別とは無関係に、４９．９と５６．１の間であった。ほんの少量の代謝物Ｍ７、Ｍ１０およびＭ１１が、雄および雌のラットの脳において検出され、各代謝物は、脳内放射能の平均４．５％未満に相当した。２つのさらなる少量代謝物（Ｍ１およびＭ３）が雄のラットの脳において観察された。投与後８時間までに、大部分の代謝物が、検出できなくなり、ＤＣＤＱのみが観察された。
【０１８３】
【表１７】
2008519056.tif 000068
【０１８４】
ＬＣ／ＭＳ分析による代謝物の特性付け
ＤＣＤＱおよびその代謝物についてのＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により、質量スペクトルを得た。これらの化合物の構造的特徴を表１８にまとめる。ＤＣＤＱおよびその代謝物の質量スペクトルの特性付けは、本明細書中で説明する他の試験からの特性付けに伴って、以下で検討する。
【０１８５】
【表１８】
2008519056.tif 000069
【０１８６】
考察
ＤＣＤＱは、単回経口５ｍｇ／ｋｇ投与後、ラットにおいて広範囲にわたって代謝され、酸化代謝が、その主要代謝経路であった。ＤＣＤＱは、投与後２時間と８時間の間で血漿中放射能の平均１３％から２０％、ならびに投与後０〜８および８〜２４時間での全尿中放射能の２％未満に相当した。血漿において観察された代謝物としては、ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ１０）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ７）、ならびに第ＩＩ相代謝物、例えば、ＤＣＤＱスルファメート（Ｍ１２）、ジ−デヒドロＤＣＤＱスルファメート（Ｍ１４）、ヒドロキシＤＣＤＱスルフェート（Ｍ８およびＭ１３）、ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびアセチル化ヒドロキシＤＣＤＱ（Ｍ１１）が挙げられた（図１）。血漿における放射能の分布率は、投与後２および４時間の時点より８時間の時点でのほうが有意に低かった代謝物Ｍ８を除き、時間の経過とともに有意には変化しなかった。血漿代謝物プロフィールは、雄ラットと雌ラットの間での差を示さなかった。ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ１、Ｍ２およびＭ３）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ７）およびヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）が、雄ラット血漿における主要代謝物であった一方で、ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ３）、ヒドロキシＤＣＤＱスルフェート（Ｍ８）、ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびＤＣＤＱスルファメート（Ｍ１２）が、雌ラットにおける主要代謝物であった。主な性別差は、スルフェートまたはスルファメートの形成にあった。アルコールおよび脂環式アミンに対するスルホトランスフェラーゼ活性は、雄ラットおけるより雌ラットにおけるほうが顕著に高いと報告されていたので、これらの性別差は予測ができた。（Nariomi Y, Niwa T, Shiraga T, Iwasaki K, Noda K.  Isolation and characterization of an alicyclic amine N-sulfotransferase from female rat liver.  Biological & Pharmaceutical Bulletin. 1994; 7: 1008-1011）。
【０１８７】
主要血漿代謝物の大部分が、尿中においても検出された。類似のプロフィールが、０〜８時間および８〜２４時間尿サンプルについて得られた。雄ラットから尿における主要代謝物としては、ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ７）およびヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）が挙げられた。０〜２４時間の尿における各々の個々の代謝物は、投与用量の約２から１６％に相当し、一方、ＤＣＤＱは、その用量の１％未満に相当した。８〜２４時間糞便サンプルでは、ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ３およびＭ４）、ヒドロキシＤＣＤＱスルフェート（Ｍ８）、ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびアセチル化ヒドロキシＤＣＤＱ（Ｍ１１）が、観察された主要代謝物であり、親薬物は極微量しか検出されなかった。
【０１８８】
脳組織における放射能は、投与後２、４および８時間の時点で、血漿中より有意に高かった。ＤＣＤＱは、雄および雌ラットについての脳内放射能の平均で９０より高い％を占めた。投与後２時間と８時間の間の平均脳対血漿中放射能比は、６．９から９．６の範囲であり、これは、脳組織により取り込みを示していた。投与後２４時間までに、平均脳対血漿中放射能比は、０．８に低下した。雄ラットと雌ラットの間に、脳内放射能含有率および脳対血漿中放射能比に関して有意な差はなかった。平均脳対血漿中ＤＣＤＱ比は、４９．９から５６．１の範囲であり、投与後２時間と８時間の間で性別差および経時的変化はなかった。少量の代謝物Ｍ７、Ｍ１０およびＭ１１が、雄および雌のラットの脳において検出された。これらのデータは、ＤＣＤＱは血液脳関門を容易に横断するが、脳組織への代謝物の取り込みは制限されていることを示していた。脳対血漿中放射能比は、脳からのクリアランスが、投与後８時間後に容易に発生することも示唆していた。その比が、投与後２４時間までに６．９から０．８に低下したからである。脳への放射能の分配は明らかであるが、血液細胞への分配は限られており、投与後２時間と８時間の間の血液対血漿比は、約１．１でしかなかった。
【０１８９】
ＤＣＤＱの代謝は、ラット肝臓ミクロソームでの前のインビトロ代謝試験と比較して、本試験のほうが広範囲にわたるようであった。ラット肝臓ミクロソームでは３つの酸化代謝物（Ｍ２、Ｍ３およびＭ４）だけが観察され、性別差は観察されなかった。しかし、ラットにおいて観察されたスルフェートおよびスルファメートの形成に関する性別差は、いずれのインビトロ系においても調査しなかった。ラット肝臓ミクロソームで検出された代謝物Ｍ２、Ｍ３およびＭ４に加えて、他の酸化代謝物（Ｍ１、Ｍ７およびＭ１０）およびいくつかの第ＩＩ相代謝物（Ｍ８、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３およびＭ１４）もラットにおいて観察された（図１）。
【０１９０】
要約すると、ラットではＤＣＤＱが広範囲にわたって代謝されて、主として酸化代謝物になった。雄および雌ラットについての血漿プロフィールは、ＤＣＤＱのスルフェートおよびスルファメートコンジュゲートならびに一部の酸化代謝物に関して異なった。ＤＣＤＱは、脳における主薬物関連成分であるが、少量の代謝物しか観察されず、性別差は明らかでなかった。ＤＣＤＱは、血液脳関門を容易に横断したが、代謝物の取り込みは少量の酸化代謝物に限られていた。
【０１９１】
単回１５ｍｇ／ｋｇ経口カプセル投与後の雄イヌにおける［14Ｃ］ＤＣＤＱのインビボ代謝
梗概
本試験は、腸溶コーティングカプセルでの１４．１から１６．７ｍｇ／ｋｇの塩酸［14Ｃ］ＤＣＤＱの単回投与後の４匹の雄ビーグル犬において［14Ｃ］ＤＣＤＱの代謝を調査したものである。血漿サンプルは、投与後２、４、８、２４および４８時間の時点で回収した。糞便および尿は、投与後０〜８、８〜２４および２４〜４８時間間隔で回収した。サンプルを放射能含有率および代謝物プロフィールについて分析した。
【０１９２】
放射能の血漿中濃度は、投与後２、４、８、２４および４８時間の時点で、それぞれ、４２２±５７３、５６４±７４８、５２８±５６６、１３４０±５０８および５０７±１３５ｎｇ当量であった。投与後２、４および８時間の時点で４から１６４０ｎｇ当量／ｍＬの範囲のわたる血漿中放射能濃度の大きな個体間変動が、観察された。最高血漿中放射能濃度は、投与後４時間の時点での濃度が最高であったイヌ２を除き、２４時間の時点で発生した。データは、投与後最初の２４時間に観察された放射能の排泄に関する変動と一致した。この変動性は、一部のイヌにおけるＤＣＤＱの遅い、持続性の吸収、および腸溶コーティングカプセルと関係があり得る。イヌについての平均血液対血漿中放射能比は、約０．７２であった。
【０１９３】
ＤＣＤＱは、イヌにおいて広範囲にわたって代謝された。酸化代謝がその主要代謝経路であるが、ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニドの形成も観察された。ＤＣＤＱは、投与後、２および４時間の時点で血漿中放射能の１．９％から２１％、８および２４時間の時点で３％未満に相当し、４８時間の時点では検出されなかった。ＤＣＤＱは、すべての時点において尿中放射能の平均１１％未満を占めた。糞便抽出物では、放射能の５４％から９７％が親化合物によるものだった。２および４時間の血漿において観察された主要代謝物としては、ヒドロキシＤＣＤＱ（Ｍ１、Ｍ２およびＭ３）、Ｎ−オキシドＤＣＤＱ（Ｍ５）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ７）、ヒドロキシＤＣＤＱイミン（Ｍ１５）、ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）が挙げられた（図１）。投与後８、２４および４８時間の時点では、代謝物Ｍ３およびＭ９が血漿中放射能の大部分を占めていた。代謝物Ｍ２、Ｍ３、Ｍ５およびＭ６は、ＮＡＤＰＨの存在下でのイヌ肝臓ミクロソームでのＤＣＤＱのインビトロインキュベーションにおいても観察された。イヌ血漿において観察された代謝物は、代謝物Ｍ７を除き、イヌの尿においても検出された。血漿では検出されなかったヒドロキシＤＣＤＱのスルフェートコンジュゲート（Ｍ１６）およびジアゼピニルＤＣＤＱカルボン酸（Ｍ１７）が、尿サンプルにおいて観察された。ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ２、Ｍ３およびＭ１９）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ１８）およびヒドロキシＤＣＤＱイミン（Ｍ１５）は、糞便抽出物において検出された。ＤＣＤＱの広範囲にわたる代謝および持続性の経口吸収が、おそらく、イヌにおける約２５．４％の比較的低い経口バイオアベイラビリティの原因であった。
【０１９４】
イヌにおけるＤＣＤＱの代謝は、ラットとの多少の相違を示した。いくつかの異なる酸化代謝物が、ラットおよびイヌにおいて観察された。酸化代謝物Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８およびＭ１９は、ラットでは観察されず、一方、ラットで観察されたヒドロキシ代謝物Ｍ４は、イヌでは検出されなかった。イヌでよりラットでのほうが多くの第ＩＩ相代謝物が観察された。スルフェートＭ８およびＭ１３、ならびにスルファメートＭ１２およびＭ１４は、ラットでは観察されたが、イヌではされなかった。スルフェートＭ１６は、イヌでは観察されたが、ラットではされなかった。イヌ血漿および尿において検出されたＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニドは、ラット血漿および尿では観察されなかった。
【０１９５】
要約すると、ＤＣＤＱは、イヌにおいて広範囲にわたって代謝され、主要代謝経路として酸化代謝を有するが、ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニドの形成も観察された。
【０１９６】
序論
マスバランス試験は、ラットの尿には経口用量の平均６４．３％が排泄され、一方、腸溶コーティングカプセルの投与後のイヌの尿においてその用量の３２．７％が回収されたことを示した。ＮＡＤＰＨおよびＵＤＰＧＡの存在下でイヌ肝臓ミクロソームとともにインキュベートしたとき、［14Ｃ］ＤＣＤＱは、いくつかの酸化代謝物およびカルバモイルグルクロニドに変換された。前の代謝試験ラットは、ＤＣＤＱが広範囲にわたって代謝され、酸化代謝がラットにおける主要経路であることを示した。本試験は、イヌへの単回経口カプセル投与後の［14Ｃ］ＤＣＤＱの代謝を調査したものである。
【０１９７】
材料および方法
材料
塩酸［14Ｃ］ＤＣＤＱは、上のインビボ試験において説明したように、Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの標識合成グループ（ニューヨーク州、パールリバー）が合成した。Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄシンチレーションカクテル、Ｕｌｔｉｍａ  Ｆｌｏシンチレーションカクテル、Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ  Ｅ＋シンチレーションカクテルおよびＣａｒｂｏ−Ｓｏｒｂ  Ｅ二酸化炭素吸収剤は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（マサチューセッツ州、ウェルズリー）から購入した。ＥＤＴＡは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から入手した。抽出のためおよびクロマトグラフ分析のために使用した溶媒は、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ニュージャージー州、ギブスタウン）からのＨＰＬＣまたはＡＣＳ試薬グレードのものであった。
【０１９８】
方法
カプセル作製および分析
約１１ｍｇの塩酸［14Ｃ］ＤＣＤＱおよび９４０ｍｇの非標識塩酸ＤＣＤＱをメタノールに溶解し、その後、窒素流下で蒸発乾固させた。カプセル（＃２）には動物の体重に従って正確な量（１２６．７〜１３８．１ｍｇ）の混合原薬を充填した。その後、それらの充填ゼラチンカプセルを手作業で腸溶コーティングした。
【０１９９】
余分なカプセルの中の原薬を放射化学的純度および比放射能について分析した。原薬のアリコートをＤＭＳＯに溶解し、水で希釈し、放射能フロー検出器を備えたＨＰＬＣおよび２５０ｎｍでのＵＶ検出によって分析した。比活性を判定するために、原液をメタノールで希釈することにより５つの異なる濃度の非標識ＤＣＤＱ溶液を調製し、ＨＰＬＣによって分析して、標準曲線を作成した。［14Ｃ］ＤＣＤＱのＵＶピークを調査して、その標準曲線に対するＤＣＤＱの量を算出した。［14Ｃ］ＤＣＤＱピークの周囲の画分を、ＵＶ検出後、１分間隔で回収した。各画分における放射能を液体シンチレーションカウンティング（ＬＳＣ）によって判定した。バックグラウンド放射能レベルを得るために、ブランク注入からの画分も回収した。
【０２００】
薬物投与および検体収集
４匹の雄ビーグル犬は、投与時点で７．６から９．８ｋｇの体重であり、研究施設内コロニー由来のものであった。［14Ｃ］ＤＣＤＱが塩酸塩として入っている１つの腸溶コーティングカプセルを各イヌに与えた。投与の２時間前に動物に給餌し、Ｐｕｒｉｎａ  ｄｏｇ  ｃｈｏｗおよび水を適宜供給し、代謝ケージに個々に収容した。
【０２０１】
用量投与後２、４、８、２４および４８時間の時点で頚動脈から血液サンプルを採取して、血液凝固阻止薬としてカリウムＥＤＴＡが入っている試験管に入れ、その後、氷の上に置いた。５０μＬのアリコートを燃焼のために除去し、放射能含有率を判定した。４℃での遠心分離により、残りの血液から直ちに血漿を得た。尿サンプルは、投与後０〜８、８〜２４および２４〜４８時間間隔でドライアイス上に回収した。糞便サンプルは、室温で、投与後０〜８、８〜２４および２４〜４８時間間隔で回収し、均質化した。これらの生体試料を分析まで約−７０℃で保管した。
【０２０２】
放射能判定
血漿の５０μＬおよび尿の１００〜２００μＬのアリコートを放射能濃度について分析した。用量、血漿および尿の放射能濃度は、シンチレーション液として５〜１０ｍＬのＵｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄを使用して、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  Ｍｏｄｅｌ  ３１００  ＴＲ／ＬＬ  ＬＳＣで行った。
【０２０３】
糞便を計量し、水中で、約５：１の容量対重量比で均質化した。血液のアリコート（２００μＬ）および糞便ホモジネートのアリコート（０．２５〜０．５３グラム）を、Ｃｏｍｂｕｓｔｏ−ｐａｄｓを具備するＣｏｍｂｕｓｔ−ｃｏｎｅｓ上に配置し、燃焼した。Ｏｘｉｍａｔｅ−８０  ｒｏｂｏｔｉｃ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｓａｍｐｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を装備したモデル３０７  Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ｓａｍｐｌｅ  ｏｘｉｄｉｚｅｒを血液および糞便サンプルの燃焼に用いた。遊離した14ＣＯ2をＣａｒｂｏ−Ｓｏｒｂ  Ｅ  二酸化炭素吸収剤で捕捉し、ＰｅｒｍａＦｌｕｏｒ（登録商標）Ｅ＋液体シンチーレーションカクテルと混合し、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  Ｍｏｄｅｌ  ３１００  ＴＲ／ＬＬ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でカウントした。燃焼効率は、９８．９％であった。
【０２０４】
血漿プロフィールについては、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ放射分析マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、回収したＨＰＬＣ画分における放射能を分析した。ＴｏｐＣｏｕｎｔによる検出限界は、約１ｎｇ当量／ｍＬであった。２５０μＬ ＬＱＴＲ フローセルを備えたＦｌｏ−Ｏｎｅ  β  Ｍｏｄｅｌ  Ａ５２５放射能検出器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、尿および糞便サンプルについてのデータを得た。Ｕｌｔｉｍａ  Ｆｌｏｗ  Ｍシンチレーション液の流量は、５：１のシンチレーションカクテルの移動相に対する混合比をもたらす、１ｍＬ／分であった。Ｆｌｏ−Ｏｎｅ検出器による検出限界は、尿については約２００ｎｇ当量／ｍＬおよび糞便については１２ｎｇ当量／ｍＬであった。
【０２０５】
血漿代謝物プロフィール
血漿サンプルをＨＰＬＣにより代謝物プロフィールについて分析した。血漿のアリコートを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する冷メタノールの２回量と混合し、約２分間、氷の上に置き、その後、遠心分離した。上清液を清浄な試験管に移し、Ｚｙｍａｒｋ  ＴｕｒｂｏＶａｐ  ＬＶ（マサチューセッツ州、ホプキントンのＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において窒素下、２２℃で蒸発させて、約０．３ｍＬの量にした。残留物を遠心分離し、上清量を測定し、２０μＬアリコートを二重重複で放射能について分析することにより抽出効率を決定した。上清の２００μＬアリコートをＨＰＬＣカラムに注入し、流出液を２０秒間隔で９６ウエル Ｌｕｍａｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に回収した。それらのプレートを４０℃のオーブンで一晩乾燥させ、ＴｏｐＣｏｕｎｔによって分析した。血漿抽出物は、ＬＣ／ＭＳによっても分析した。
【０２０６】
糞便および尿の分析
糞便ホモジネートを代謝物プロフィールについて分析した。糞便ホモジネートの１グラムのアリコートを２ｍＬメタノールと混合し、約１０分間、氷の上に置き、遠心分離した。上清を清浄な試験管に移した。残留物を、２ｍＬの水：メタノール（３：７）混合物で３回抽出した。各サンプル由来の上清を併せ、約１ｍＬに蒸発させ、遠心分離した。抽出効率は、上清の１０μＬのアリコートを放射能について分析することにより決定した。上清のアリコート（５０〜２００μＬ）を、放射能フロー検出器を備えたＨＰＬＣによって、代謝物プロフィールについて分析した。ＬＣ／ＭＳによってサンプルを分析して、放射能ピークの特性付けも行った。
【０２０７】
尿は、放射能濃度について分析し、ならびに放射能フロー検出器を備えたＨＰＬＣにより、ＨＰＬＣカラムへの直接注入によって、代謝物プロフィールについて分析した。代謝物同定のために尿サンプルでのＬＣ／ＭＳ分析も行った。
【０２０８】
高速液体クロマトグラフィー
内臓オートサンプラーを有するＷａｔｅｒｓ  ｍｏｄｅｌ  ２６９０  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（マサチューセッツ州、ミルフォードのＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）を分析に使用した。分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ18（２）カラム（１５０×２．０ｍｍ、５μｍ）（カリフォルニア州、トランスのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いて遂行した。オートサンプラーのサンプルチャンバーは、４℃で維持し、一方、カラムは、約２０℃の周囲温度であった。２５０ｎｍをモニターするように設定した可変波長ＵＶ検出器およびＦｌｏ−Ｏｎｅ  β  Ｍｏｄｅｌ  Ａ５２５放射能検出器をデータ収集に使用した。ＨＰＬＣ移動相は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）からなり、０．２ｍＬ／分で送液した。クロマトグラフ条件Ａを用量分析に用い、一方、条件Ｂを尿および血漿、脳および糞便抽出物の分析に用いた。
【０２０９】
【表１９】
2008519056.tif 000070
【０２１０】
ＬＣ／ＭＳ分析
オートサンプラーおよびダイオードアレイＵＶ検出器を具備するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  １１００  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（カリフォルニア州、パトアルトのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ＬＣ／ＭＳ分析に使用した。ＵＶ検出器は、２００から４００ｎｍをモニターするように設定した。選択したＬＣ／ＭＳ分析については、固体シンチラントフローセルを装備したβ−Ｒａｍ  ｍｏｄｅｌ  ３放射能フロー検出器（フロリダ州、タンパのＩＮ／ＵＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用してラジオクロマトグラムを得た。ＬＣ条件は、上に記載の条件Ｂと同じであった。
【０２１１】
代謝物の特性付けに使用した質量分析装置は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ−２四極子飛行時間型ハイブリッド質量分析装置（Ｗａｔｅｒｓ）であった。この質量分析装置は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースを装備しており、陽イオンモードで操作した。フルＭＳおよびＭＳ／ＭＳスキャンには、それぞれ、５および３０ｅＶの衝突エネルギー設定を用いた。この質量分析装置の設定を下に列記する。
【０２１２】
【表２０】
2008519056.tif 000071
【０２１３】
データ分析および統計学的評価
Ｆｌｏ−Ｏｎｅ分析用ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、バージョン３．６）を利用して、放射能ピークを積分した。ＤａｔａＦｌｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｕｔｉｌｉｔｙ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ｂｅｔａ  バージョン０．５５）を使用して、Ｆｌｏ−Ｏｎｅ  ＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアにおけるプロセッシングのためにＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴマイクロプレートカウンターからのＡＳＣＩＩファイルをＣＲ形式に変換した。コンピュータープログラムＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌｌ（登録商標）９７を使用して、平均および標準偏差を算出し、スチューデントｔ検定を行った。Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ、バージョン４．０）をＬＣ／ＭＳデータの収集および解析に用いた。
【０２１４】
結果
カプセル内容の分析
カプセルに充填した［14Ｃ］ＤＣＤＱは、約９８．９％の平均放射化学的純度および９９％より高い化学的純度（紫外線検出による）を有した。カプセル内の［14Ｃ］ＤＣＤＱの比活性は、塩酸塩として２．１８μＣｉ／ｍｇであった。投与した実際のＤＣＤＱ用量は、遊離塩基として１２．２から１４．４ｍｇ／ｋｇの範囲であった。
【０２１５】
血漿中放射能濃度および代謝プロフィール
［14Ｃ］ＤＣＤＱの単回カプセル投与後の血液および血漿中の放射能濃度を表２１にまとめる。
【０２１６】
【表２１】
2008519056.tif 000072
【０２１７】
平均血漿中放射能濃度は、投与後２時間の時点での４２３ｎｇ当量／ｍＬから２４時間の時点での１３４０ｎｇ当量／ｍＬの範囲にわたった。最高放射能濃度は、投与後４時間の時点での濃度が最高であったイヌ２を除き、一般には投与後２４時間の時点で発生した。投与後２、４および８時間の時点で４から１６４０ｎｇ当量／ｍＬの範囲にわたる大きな個体間変動が、血漿中放射能濃度に関して観察された。データは、投与後最初の２４時間に観察された放射能の排泄の大きな変動と一致している。これらの変動は、一部のイヌにおけるＤＣＤＱの遅い、持続性の吸収に起因し得る。血中放射能濃度は、血漿中放射能レベルより低く、平均血液対血漿中放射能比は、約０．６８から０．７９の間の範囲であった（表２２）。これらの比を基にすると、ＤＣＤＱおよびその代謝物の血液細胞への分配は、制限されていた。
【０２１８】
【表２２】
2008519056.tif 000073
【０２１９】
抽出回収率は、血漿中放射能の７１％より高かった。ＤＣＤＱは、イヌにおいて広範囲にわたって代謝された（表２３および２４）。投与後２および４時間の時点で、ＤＣＤＱは、血漿中放射能の１．９から２１％に相当した。ＤＣＤＱは、投与後８および２４時間の時点で血漿中放射能の３％未満に相当し、４８時間の時点では検出できなかった（表２３および２４）。２および４時間の血漿において観察された主要代謝物としては、ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ２およびＭ３）、Ｎ−オキシドＤＣＤＱ（Ｍ５）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ７）、ヒドロキシＤＣＤＱのイミン（Ｍ１５）、ヒドロキシＤＣＤＱのグルクロニド（Ｍ９）およびＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）が挙げられた。類似したプロフィールが、８、２４および４８時間血漿サンプルについて観察されたが、これらの遅いほうの時点での放射能の大部分は、ヒドロキシ代謝物Ｍ３およびグルクロニドＭ９によるものであり、これらはクロマトグラフィーで分離されなかった。２および４時間サンプルでは、多数の比較的少量の代謝物が、血漿中放射能の６．２％から４２％を占めた。これらの代謝物は、低濃度のため、特性付けられなかった。
【０２２０】
【表２３】
2008519056.tif 000074
【０２２１】
【表２４】
2008519056.tif 000075
【０２２２】
尿代謝物プロフィール
糞便中排泄は、尿中排泄より多かったとはいえ、尿が、イヌにおけるＤＣＤＱの主要排泄経路であった。非常に多数の代謝物が、尿において検出された。ＤＣＤＱは、すべての時点について尿中放射能の平均１１％未満に相当した（表２５）。主要代謝物としては、ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ２およびＭ３）、Ｎ−オキシドＤＣＤＱ（Ｍ５）、ヒドロキシＤＣＤＱのイミン（Ｍ１５）、ヒドロキシＤＣＤＱスルフェート（Ｍ１６）、ジアゼピニルＤＣＤＱカルボン酸（Ｍ１７）、ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）が挙げられた（図１）。
【０２２３】
【表２５】
2008519056.tif 000076
【０２２４】
糞便代謝物プロフィール
糞便中放射能の平均７０．２％が、抽出されたが、ブランク糞便ホモジネートでは、その放射能の平均８８．２％が、［14Ｃ］ＤＣＤＱのインキュベーションから抽出された。糞便抽出物において、ＤＣＤＱは主要放射性成分であり、全放射能の５４．４％から９６．７％に相当した。糞便において検出された代謝物としては、ヒドロキシＤＣＤＱ（Ｍ２、Ｍ３およびＭ１９）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ１８）および特性付けされていないピーク（Ｍ２０）が挙げられた。最も豊富な代謝物Ｍ１８は、糞便抽出物における全放射能の１６．４％以下に相当した。ヒドロキシＤＣＤＱのグルクロニド（Ｍ９）およびＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）は、糞便では検出されなかった。３７℃で２４時間の糞便ホモジネート中での［14Ｃ］ＤＣＤＱのインキュベーションは、明らか分解を示さなかった（データは示さない）。
【０２２５】
ＬＣ／ＭＳ分析による代謝物特性付け
ＤＣＤＱおよびその代謝物についてのＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により、質量スペクトルを得た。これらの化合物の構造的特徴を表２６に要約する。本明細書に記載の各試験からのＤＣＤＱおよびその代謝物の質量スペクトルの特性付けは、以下でさらに検討する。
【０２２６】
【表２６】
2008519056.tif 000077
【０２２７】
考察
投与後２、４および８時間の時点で４から１６４０ｎｇ当量／ｍＬの範囲にわたる大きな個体間変動が、血漿中放射能濃度において観察された。データは、投与後最初の２４時間に観察された放射能の排泄に関する変動と一致した。投与後最初の２４時間、尿中排泄は、投与放射能の０から２５％まで様々であり、一方、糞便抽出物は、０から２３％の範囲にわたった。最高血漿中放射能濃度は、投与後４時間の時点での濃度が最高であったイヌ２を除き、２４時間の時点で発生した。この変動性は、一部のイヌではＤＣＤＱの遅い、持続性の吸収、およびことによると腸溶コーティングカプセルと関係があり得る。イヌについての平均血液対血漿中放射能比は、投与後２時間と８時間の間のラットについての約１：１と比較して、約０．７２であった。これは、イヌの血液細胞へのＤＣＤＱおよびその代謝物の取り込みがラットのものより少ないことを示している。
【０２２８】
［14Ｃ］ＤＣＤＱを含有する腸溶コーティングカプセルの投与後、ＤＣＤＱは、ラットにおいて見られたのと同様、イヌにおいても広範囲にわたって代謝された（図１）。酸化代謝物が、主要代謝経路であった一方で、ラットにおいて観察されなかったＤＣＤＱカルバモイルグルクロニドの形成も観察された。ＤＣＤＱは、投与後２および４時間の時点で血漿中放射能の１．９％から２１％、８および２４時間の時点で３％未満に相当し、４８時間の時点では検出されなかった。ＤＣＤＱは、すべての時点において尿中放射能の平均１１％未満を占めた。糞便中出物では、放射能の５４．５％から９６．７％が、親化合物によるものであった。投与後２および４時間の時点での血漿代謝物としては、ヒドロキシＤＣＤＱ（Ｍ１、Ｍ２およびＭ３）、Ｎ−オキシドＤＣＤＱ（Ｍ５）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ７）、ヒドロキシＤＣＤＱイミン（Ｍ１５）、ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）が挙げられた。投与後８、２４および４８時間の時点での放射能の大部分は、ヒドロキシ代謝物Ｍ３およびグルクロニドＭ９によるものであり、これらは、クロマトグラフィーにより分離されなかった。代謝物Ｍ２、Ｍ３、Ｍ５およびＭ６は、ＮＡＤＰＨの存在下でのイヌ肝臓ミクロソームとのＤＣＤＱのインビトロインキュベーションにおいても観察された。イヌ血漿において観察された代謝物は、代謝物Ｍ７を除き、イヌ尿においても検出された。血漿では検出されなかったヒドロキシＤＣＤＱのスルフェートコンジュゲート（Ｍ１６）およびジアゼピニルＤＣＤＱカルボン酸（Ｍ１７）が、尿サンプルにおいて観察された。ヒドロキシＤＣＤＱ代謝物（Ｍ２、Ｍ３およびＭ１９）、ケトＤＣＤＱ（Ｍ１８）およびヒドロキシＤＣＤＱイミンが、糞便抽出物において検出された。代謝物Ｍ６の形成は、ＧＩ管内で起こり得る加水分解のため、実際より低く見積もることができる。おそらく、ＤＣＤＱの広範囲にわたる代謝および持続性経口吸収が、イヌにおける約２５．４％の比較的低い経口アベイラビリティーの原因であった。
【０２２９】
イヌにおけるＤＣＤＱの代謝は、ラットとの多少の相違を示した（図１）。いくつかの異なる酸化代謝物が、ラットおよびイヌにおいて観察された。酸化代謝物Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８およびＭ１９は、ラットでは観察されず、一方、ラットで観察されたヒドロキシ代謝物Ｍ４は、イヌでは検出されなかった。イヌでよりラットでのほうが多くの第ＩＩ相代謝物が観察された。スルフェートＭ８およびＭ１３、ならびにスルファメートＭ１２およびＭ１４は、ラットでは観察されたが、イヌではされなかった。スルフェートＭ１６は、イヌでは観察されたが、ラットではされなかった。イヌ血漿および尿において検出されたＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニドは、ラット血漿および尿では観察されなかった。
【０２３０】
要約すると、ＤＣＤＱは、イヌにおいて広範囲にわたって代謝され、主要代謝経路として酸化代謝を有するが、ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニドの形成も観察された。
【０２３１】
ＬＣ／ＭＳ分析による代謝物の特性付け
上の試験で同定したＤＣＤＱおよびその代謝物についてのＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により、質量スペクトルを得た。それらの各試験からのＤＣＤＱおよびその代謝物の質量スペクトルの特性付けを、以下で検討する。
【０２３２】
ＤＣＤＱ
代謝物との比較のために、ＤＣＤＱ標準物質の質量スペクトル特性を検査した。ＤＣＤＱのＬＣ／ＭＳスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン、［Ｍ＋Ｈ］+が、ｍ／ｚ ２２９で観察された。衝突誘発開裂（ＣＩＤ）から得られたＤＣＤＱのｍ／ｚ ２２９質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキーム（フラグメンテーションスキーム案）は、分子イオンからのメチレンアミン、エチリデンアミンおよびエチリデン−メチル−アミンの喪失によって、それぞれ、ｍ／ｚ ２００、１８６および１７１のプロダクトイオンが生成されたことを示した。前記分子イオンからのプロペン基の喪失により、ｍ／ｚ １８７のフラグメントが生成され、メチレンアミンおよびエチリデンアミンのさらなる喪失により、ｍ／ｚ １５８および１４４のフラグメントが生成された。シクロペンチル−メチレンアミン基の喪失により、ｍ／ｚ １３２のフラグメントイオンが生成された。
【０２３３】
代謝物Ｍ１：ラットおよびイヌのインビトロおよびインビボ試験から
Ｍ１についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２４５で観察された。Ｍ１のｍ／ｚ ２４５質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、モノヒドロキシル化を示唆する１６Ｄａの増加を示した。その分子からのプロペンの喪失により、ｍ／ｚ ２０３のフラグメントが生成され、これは、ＤＣＤＱのｍ／ｚ １８７の対応するイオンより１６Ｄａ高かった。ｍ／ｚ １７１および１８６のフラグメントイオンは、ＤＣＤＱのプロダクトイオンスペクトルの場合と同じであった。これは、示したような分子のジアゼパン部分においてヒドロキシル化が発生したことを示していた。そのため、Ｍ１は、ヒドロキシＤＣＤＱであると考えた。
【０２３４】
代謝物Ｍ２：ラットおよびイヌのインビトロおよびインビボ試験から
Ｍ２についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２４５で観察された。Ｍ２のｍ／ｚ ２４５質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、モノヒドロキシル化を示唆する１６Ｄａの増加を示した。その分子からのプロペンの喪失により、ｍ／ｚ ２０３のフラグメントが生成され、これは、ＤＣＤＱのｍ／ｚ １８７の対応するイオンより１６Ｄａ高かった。これは、シクロペンタン環が生体内変換部位でないことを示していた。ｍ／ｚ １３２のフラグメントイオンは、ＤＣＤＱについてと同じであった。これは、ジアゼパン部分が生体内変換部位でないことを示していた。ｍ／ｚ １６９および１８４のフラグメントイオンは、それぞれ、ｍ／ｚ １７１および１８６のＤＣＤＱについての対応するイオンより、２Ｄａ低かった。これは、ヒドロキシル化の結果としてのピリジン環からのＨ2Ｏの喪失を示していた。そのため、Ｍ２は、ヒドロキシＤＣＤＱであると考えた。
【０２３５】
代謝物Ｍ３：ラットおよびイヌのインビトロおよびインビボ試験から
Ｍ３についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２４５で観察された。Ｍ３のｍ／ｚ ２４５質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、モノヒドロキシル化を示唆する１６Ｄａの増加を示していた。エチリデンアミンの喪失により、ｍ／ｚ ２０２のフラグメントが生成され、これは、ＳＡＸ−１８７についてのｍ／ｚ １８６の対応するイオンより１６Ｄａ高かった。ｍ／ｚ １５８および１４４のフラグメントイオンは、ＤＣＤＱのプロダクトイオンスペクトルの場合と同じであった。これは、示したような分子のシクロペンタン部分においてヒドロキシル化が発生したことを示していた。そのため、Ｍ３は、ヒドロキシＤＣＤＱであると考えた。
【０２３６】
代謝物Ｍ４：ラットのインビトロおよびインビボ試験から
Ｍ４についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２４５で観察された。Ｍ４のｍ／ｚ ２４５質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、モノヒドロキシル化を示唆する１６Ｄａの増加を示していた。その分子イオンからのＨ2Ｏの喪失により、ｍ／ｚ ２２７のフラグメントが生成された。ＤＣＤＱについてのｍ／ｚ １４４のプロダクトイオンも観察された。これは、示したような分子のシクロペンタン部分においてヒドロキシル化が発生したことを示しており、これは、ＤＣＤＱについてのｍ／ｚ １８６の対応するイオンからのエチリデンアミンおよびＨ2Ｏの喪失により生成された、ｍ／ｚ １８４プロダクトの存在とも一致する。このイオンについて測定された正確な質量は、１８４．１１２０Ｄａであった。これは、Ｃ13Ｈ14Ｎについての理論質量の３．６ｐｐｍの範囲内であった。そのため、Ｍ４は、ヒドロキシＤＣＤＱであると考えた。
【０２３７】
代謝物Ｍ５：インビトロ試験から
Ｍ５についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２４３で観察された。Ｍ５について測定された正確な質量は、２４３．１４７８Ｄａであり、これは、Ｃ15Ｈ19Ｎ2Ｏについての理論質量の７．９ｐｐｍの範囲内であった。これは、ＤＣＤＱについての分子式と比較して１個の酸素の追加および２個の水素原子の喪失に相当する。ｍ／ｚ １３０のフラグメントイオンは、ＤＣＤＱについての対応するイオンより２Ｄａ低く、これは、イミン形成を示唆していた。移動相においてＨ2Ｏの代わりにＤ2Ｏを用いたＬＣ／ＭＳにより、Ｍ５には交換可能なプロトンが存在しないことが確認された。これは、Ｍ５がＮ−オキシドであることを示していた。そのため、Ｍ５は、ＤＣＤＱイミンのＮ−オキシドであると考えた。
【０２３８】
代謝物Ｍ６：イヌのインビトロおよびインビボ試験から
Ｍ６についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ４４９で観察された。Ｍ６のｍ／ｚ ４４９質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからの１７６Ｄａの減少によって、ｍ／ｚ ２７３のフラグメントが生成されたことを示し、これは、Ｍ５がグルクロニドコンジュゲートであること示していた。ｍ／ｚ ２７３からの４４Ｄａのさらなる減少によりｍ／ｚ ２２９が生成され、これは、ＤＣＤＱについての分子イオンでもあった。そのため、Ｍ６は、ＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニドであると考えた。
【０２３９】
代謝物Ｍ７：ラットおよびイヌのインビトロおよびインビボ試験から
Ｍ７についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２４３で観察された。Ｍ７のｍ／ｚ ２４３質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからのメチレンアミン、エチリデンアミンの喪失によって、ｍ／ｚ ２１４および２００のプロダクトイオンが生成されたことを示し、これらは、ＤＣＤＱについての、ｍ／ｚ ２００および１８６の対応するイオンよりそれぞれ１４Ｄａ大きかった。これは、ＤＣＤＱからの１個の酸素原子の追加および２個の水素原子の喪失を示唆していた。ｍ／ｚ １３２、１４４および１５８のプロダクトイオンは、ＤＣＤＱと同じであり、これは、生体内変換がピリジンおよびシクロペンタン環で発生したことを示していた。移動相においてＨ2Ｏの代わりにＤ2Ｏを用いるＬＣ／ＭＳにより、Ｍ７には交換可能なプロトンが１つだけあることが確認され、これは、ジアゼパン環におけるＮＨ基由来のものであった。そのため、Ｍ７は、ケトＤＣＤＱであると考えた。
【０２４０】
代謝物Ｍ８：ラットインビボ試験から
Ｍ８についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ３２５で観察された。Ｍ８のｍ／ｚ ３２５質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからのプロペンの喪失によってｍ／ｚ ２８３のプロダクトイオンが生成されたことを示し、これは、生体内変換がシクロペンタン環上で発生しなかったことを示していた。ｍ／ｚ ２８３のプロダクトイオンからのメチレンアミン、エチリデンアミンの喪失、ならびにその後のスルフェート基の喪失により、ｍ／ｚ １５８および１４４のプロダクトイオンが、それぞれ、生成された。その分子イオンからのエチリデンアミンの喪失により、ｍ／ｚ ２８２のプロダクトイオンが生成され、その後のスルホネート基およびＨ2Ｏの喪失により、ｍ／ｚ ２０２および１８４のプロダクトイオンが、それぞれ、生成された。ｍ／ｚ １３２のフラグメントイオンは、ＤＣＤＱについてと同じであり、これは、そのジアゼパン部分が、生体内変換部位でないことを示していた。そのため、Ｍ８は、ヒドロキシＤＣＤＱのスルフェートコンジュゲートであると考えた。
【０２４１】
代謝物Ｍ９：ラットおよびイヌのインビボ試験から
Ｍ９についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ４２１で観察された。Ｍ９のｍ／ｚ ４２１質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからの１７６Ｄａの減少によってｍ／ｚ ２４５のフラグメントイオンが生成されたことを示し、これは、ヒドロキシＤＣＤＱのグルクロニド化を示していた。エチリデンアミンおよびグルクロン酸の喪失によって、ＤＣＤＱについてのｍ／ｚ １８６の対応するイオンより１６Ｄａ高いｍ／ｚ ２０２のフラグメントが生成された。ｍ／ｚ １８７のフラグメントイオンは、生体内変換がシクロペンタン環において発生したことを示唆していた。そのため、Ｍ９は、ヒドロキシＤＣＤＱのグルクロニドであると考えた。
【０２４２】
代謝物Ｍ１０
Ｍ１０についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２４５で観察された。Ｍ１０のｍ／ｚ ２４５質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、モノヒドロキシル化を示唆する１６Ｄａの増加を示していた。ｍ／ｚ １７１および１８６のフラグメントイオンは、ＤＣＤＱのプロダクトイオンスペクトルの場合と同じであり、これは、示したような分子のジアゼパン部分においてヒドロキシル化が発生したことを示していた。そのため、Ｍ１０は、ヒドロキシＤＣＤＱであると考えた。
【０２４３】
代謝物Ｍ１１：ラットインビボ試験から
Ｍ１１についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２８７で観察された。Ｍ１１のｍ／ｚ ２８７質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからのＨ2Ｏの喪失によってｍ／ｚ ２６９のフラグメントイオンが生成されたことを示した。４２Ｄａのさらなる減少によって、アセチル化を示すｍ／ｚ ２２７が生成された。ｍ／ｚ １７１および１８６のフラグメントイオンは、ＤＣＤＱのプロダクトイオンスペクトルの場合と同じであり、これは、生体内変換が、示したような分子のジアゼパン部分において発生したことを示していた。そのため、Ｍ１１は、アセチル化ヒドロキシＤＣＤＱであると考えた。
【０２４４】
代謝物Ｍ１２：ラットインビボ試験から
Ｍ１２についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ３０９で観察された。Ｍ１２のｍ／ｚ ３０９質量スペクトルのプロダクトイオンは、８０Ｄａの減少により、ＤＣＤＱの分子イオンであるｍ／ｚ ２２９のプロダクトイオンが生成されたことを示した。これは、硫酸化を示していた。メチレンアミン、エチリデンアミンのさらなる喪失によって、ＤＣＤＱについてと同じであるｍ／ｚ ２００および１８６のプロダクトイオンが生成された。そのため、Ｍ１２は、ＤＣＤＱのＮ−スフェートであると考えた。
【０２４５】
代謝物Ｍ１３：ラットインビボ試験から
Ｍ１３についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ３２５で観察された。Ｍ１３のｍ／ｚ ３２５質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、［Ｍ＋Ｈ］+からの８０Ｄａの減少によって、ＤＣＤＱについての［Ｍ＋Ｈ］+より１６Ｄａ大きいｍ／ｚ ２４５が生じたことを示していた。これは、Ｍ１３がヒドロキシＤＣＤＱのスルフェートコンジュゲートであることを示していた。そのため、Ｍ１３は、ヒドロキシＤＣＤＱのスフェートコンジュゲートであると考えた。
【０２４６】
代謝物Ｍ１４：ラットインビボ試験から
Ｍ１４についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ３０５で観察された。Ｍ１４のｍ／ｚ ３０５質量スペクトルのプロダクトイオン、ｍ／ｚ ２２５質量スペクトルのプロダクトイオン、およびＭ１４についての提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからの８０Ｄａの減少によって、ｍ／ｚ ２５５のイオンが、生成されたことを示し、これは、Ｍ１４がスルフェートであることを示していた。エチリデンアミンおよびエチリデン−メチル−アミンのさらなる喪失によって、ｍ／ｚ １８６および１７１のＤＣＤＱについての対応するイオンよりそれぞれ４Ｄａ小さい１８２および１６７のプロダクトイオンが、それぞれ、生成された。これは、シクロペンタン基の代謝を示していた。そのため、Ｍ１４は、ジ−デヒドロＤＣＤＱのスフェートコンジュゲートであると考えた。
【０２４７】
代謝物Ｍ１５：イヌインビボ試験から
Ｍ１５についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２４５で観察された。Ｍ１５のｍ／ｚ ２４５質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、ｍ／ｚ １８７のフラグメントイオンが、ＤＣＤＱについてのｍ／ｚ １７１の対応するイオンより１６Ｄａ大きいことを示し、これは、シクロペンタンまたはピリジン環のヒドロキシル化を示していた。ｍ／ｚ １３０のフラグメントイオンは、ＤＣＤＱについての対応するイオンより２Ｄａ小さく、これは、イミンの形成を示していた。移動相においてＨ2Ｏの代わりにＤ2Ｏを用いたＬＣ／ＭＳにより、Ｍ１５には交換可能なプロトンが１つだけあることが確認された。そのため、Ｍ１５は、ヒドロキシＤＣＤＱイミンであると考えた。
【０２４８】
代謝物Ｍ１６：イヌインビボ試験から
Ｍ１６についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ３２５で観察された。Ｍ１３のｍ／ｚ ３２５質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子からの８０Ｄａの減少によって、硫酸化を示すｍ／ｚ ２４５のプロダクトイオンが生成されたことを示した。その分子イオンからのプロペンの喪失によって、ｍ／ｚ ２８３のプロダクトイオンが生成され、これは、生体内変換が、シクロペンタン環上で発生しなかったことを示していた。エチリデンアミンの喪失によって、ｍ／ｚ ２８２のプロダクトイオンが生成され、その後のスルフェート基およびＨ2Ｏの喪失によって、それぞれ、ｍ／ｚ ２０２および１８４のプロダクトイオンが生成された。ＤＣＤＱについての１３２の対応するイオンより１６Ｄａ大きいｍ／ｚ １４８のプロダクトイオン、およびｍ／ｚ ２８２プロダクトイオンは、ヒドロシル化が、示したような分子のベンジル基において発生したことを示していた。そのため、Ｍ１６は、ヒドロキシＤＣＤＱのスルフェートコンジュゲートであると考えた。
【０２４９】
代謝物Ｍ１７：イヌインビボ試験から
Ｍ１７についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２５７で観察された。［Ｍ＋Ｈ］+の測定された正確な質量は、２５７．１９２９Ｄａであり、これは、Ｃ15Ｈ17Ｎ2Ｏ2についての理論質量の０．８ｐｐｍの範囲内であった。これは、ＤＣＤＱの分子式と比較して、２個の酸素原子の追加および４個の水素原子の喪失に相当した。その分子イオンからの４４Ｄａの減少によって、ｍ／ｚ ２１３のフラグメントが生成された。このフラグメントの測定された正確な質量は、２１３．１３７６Ｄａであり、これは、Ｃ14Ｈ17Ｎ2についての理論質量の７．６ｐｐｍの範囲内であった。これによって、４４の減少がＣＯ2の中和喪失によることが確認され、それは、Ｍ１７が、カルボン酸であることを示していた。ｍ／ｚ ２１３からのシクロペンテン、ペンタン、プロペンおよびＨＣＮのさらなる喪失によって、それぞれ、ｍ／ｚ １４５、１７１および１８６のフラグメントが生成された。ｍ／ｚ １３０のプロダクトイオンは、ＤＣＤＱについてのｍ／ｚ １３２の対応するイオンより２Ｄａ小さく、これは、イミンの形成を示していた。移動相においてＨ2Ｏの代わりにＤ2Ｏを用いたＬＣ／ＭＳにより、カルボン酸基由来のものである交換可能なプロトンがＭ１７には１つだけあることが確認された。そのため、Ｍ１７は、ベンゾ−ジアゼピニル−シクロペンタンカルボン酸（ジアゼピニルＤＣＤＱカルボン酸）であると考えた。
【０２５０】
代謝物Ｍ１８：イヌインビボ試験から
Ｍ１８についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２４３で観察された。Ｍ１８のｍ／ｚ ２４３質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからのプロペンおよびエチリデンアミン基の喪失によって、ｍ／ｚ １５８のプロダクトイオンが生成されたことを示した。その分子イオンからのメチレンアミン、エチリデンアミンの喪失によって、ＤＣＤＱについてのｍ／ｚ ２００および１８６の対応するイオンよりそれぞれ１４Ｄａ大きい、ｍ／ｚ ２１４および２００のプロダクトイオンが生成された。これは、ＤＣＤＱからの１個の酸素原子の追加および２個の水素原子の喪失を示唆していた。ＤＣＤＱについてのｍ／ｚ １３２の対応するイオンより１４Ｄａ大きいｍ／ｚ １４６のプロダクトイオン、およびｍ／ｚ ２００プロダクトイオンは、ベンジル基上で変性が発生したことを示していた。移動相においてＨ2Ｏの代わりにＤ2Ｏを用いたＬＣ／ＭＳにより、ジアゼパン環におけるＮＨ基由来のものである交換可能なプロトンがＭ１４には１つだけあることが確認された。そのため、Ｍ１８は、ケトＤＣＤＱであると考えた。
【０２５１】
代謝物Ｍ１９：イヌインビボ試験から
Ｍ１９についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２４５で観察された。Ｍ１９のｍ／ｚ ２４５質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、モノヒドロキシル化を示唆する１６Ｄａの増加を示した。ｍ／ｚ ２１６、２０２および１８７のプロダクトイオンは、ＤＣＤＱについてのｍ／ｚ ２００、１８６および１７１の対応するイオンよりそれぞれ１６Ｄａ大きく、これは、ジアゼパン基が、変性部位でないことを示していた。その分子イオンからのプロペンの喪失によって、ｍ／ｚ ２０３のフラグメントが生成され、メチレンアミンおよびエチリデンアミンのさらなる喪失によって、ｍ／ｚ １７４および１６０のフラグメントイオンが生成された。これらは、ＤＣＤＱについての対応するイオンより１６Ｄａ大きく、これは、ヒドロキシル化が、ベンゼン基またはピリジン基のいずれかで発生することを示していた。そのため、Ｍ１９は、ヒドロキシＤＣＤＱであると考えた。
【０２５２】
プロダクトＰ３：インビボ試験から
Ｐ３についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２２７で観察された。Ｐ３のｍ／ｚ ２２７質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、Ｐ３についての分子量がＤＣＤＱより２Ｄａ小さいことを示し、これは、二重結合の形成を示唆していた。ｍ／ｚ １３０のフラグメントイオンは、ＤＣＤＱについての対応するイオンより２Ｄａ小さく、これは、イミンの形成を示唆していた。そのため、Ｐ３は、ＤＣＤＱイミンであると考えた。
【０２５３】
ＤＣＤＱの単回経口５０ｍｇ／ｋｇ投与後のラット尿における代謝物Ｍ７、Ｍ９およびＭ１３の同定
梗概
この試験は、代謝物単離のためのラットの尿を入手するため、およびＤＣＤＱの選択された代謝物についてのより詳細な構造の同定を達成するために設計した。３匹の雄ラットおよび３匹の雌ラットにＤＣＤＱの単回５０ｍｇ／ｋｇ用量を与えた。０〜１２および１２〜２４時間間隔で尿を採取した。ＤＣＤＱ代謝物Ｍ７（ケトＤＣＤＱ）、Ｍ９（ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド）およびＭ１３（ヒドロキシＤＣＤＱスルフェート）を、尿から、二段階セミ分取ＨＰＬＣ法により、ＮＭＲスペクトル分析には十分な低マイクログラム量で単離した。ＭＳおよびＮＭＲスペクトル分析に基づき、Ｍ７およびＭ１３についての代謝部位は、１７位１７であった。Ｍ９の代謝部位は、１３位であった。
【０２５４】
序論
ＮＡＤＰＨおよびＵＤＰＧＡの存在下でラット肝臓ミクロソームとともにインキュベートしたとき、［14Ｃ］ＤＣＤＱは、いくつかの酸化代謝物に変換された。前の、ラットでの代謝試験は、ＤＣＤＱが、広範囲にわたって代謝されること、および酸化代謝が、ラットいおける主要代謝経路であることを示した。ヒドロキシＤＣＤＱのスルフェートおよびグルクロニドをはじめとする第２相代謝物もラットにおいて検出された。本試験は、代謝物単離のためのラットの尿を入手するため、およびＤＣＤＱの選択された代謝物についてのより詳細な構造の同定を達成するために設計した。
【０２５５】
材料および方法
材料
塩酸ＤＣＤＱは、上で説明したように、Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが合成した。Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ（ニュージャージー州、フィリップスバーグ）から入手し、メチルセルロースは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から入手したものであった。抽出のためおよびクロマトグラフ分析のために使用した溶媒は、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ニュージャージー州、ギブスタウン）からのＨＰＬＣまたはＡＣＳ試薬グレードのものであった。重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州、アンドーヴァー）から購入した。ＮＭＲ管（３ｍｍ）は、Ｗｉｌｍａｄ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏ．（ニュージャージー州、ブエナ）から購入した。
【０２５６】
方法
薬物投与および検体収集
薬物の調製、動物への投与、および検体収集は、ペンシルバニア州、カレッジビルのＷｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈで行った。投与用賦形剤は、水中２％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％（ｖ／ｖ）メチルセルロースを含有した。投与当日、非標識ＤＣＤＱ（２０５．７ｍｇ）をその賦形剤に溶解して、約１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。
【０２５７】
投与時点で、体重４１３から４７４グラムであった３匹の雄ラットおよび体重２７２から２９０グラムであった３匹の雌ラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州、ウィルミントン）から購入した。絶食させてないラットに、胃内栄養法により、５．０ｍＬ／ｋｇの量で、ＤＣＤＱの単回５０ｍｇ／ｋｇ標的用量を与えた。動物に標準的なラット用試料および水を適宜供給し、個々に代謝ケージに入れておいた。
【０２５８】
尿を０〜１２時間および１２〜２４時間間隔でドライアイスの上の容器に回収し、画分回収まで約−７０℃で保管した。
【０２５９】
液体クロマトグラフィー／質量分析法によるラットの尿の分析
ラット尿サンプルをＬＣ／ＭＳにより分析して、代謝物単離のために使用するラット尿サンプル中に存在するＤＣＤＱ代謝物を特性付けした。ＬＣ／ＭＳ分析に使用したＨＰＬＣシステムは、バイナリーポンプ、オートサンプラーおよびダイオードアレイＵＶ検出器を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  １１００  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（カリフォルニア州、パロアルトのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。オートサンプラー温度は、１０℃に設定した。ＵＶ検出器は、１９０から４００ｎｍをモニターするように設定した。分離は、Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８カラム（２５０×２．１ｍｍ×５μｍ）を用いて遂行した。カラム温度は、２０℃であった。使用した移動相勾配プログラムは、下に記載するとおりであった。
移動相Ａ：水中１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５
移動相Ｂ：メタノール
【０２６０】
【表２７】
2008519056.tif 000078
【０２６１】
代謝物の特性付けに使用した質量分析装置は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量分析装置（カリフォルニア州、サンホゼのＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）であった。これは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースが装備されており、陽イオンモードで操作した。この質量分析装置についての設定を下に列記する。
【０２６２】
【表２８】
2008519056.tif 000079
【０２６３】
液体クロマトグラフィーによる代謝物単離
代謝物単離に使用したＨＰＬＣシステムは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ＬＣ  ４０００ポンプ、サンプル注入のためのＷａｔｅｒｓ  ２７６７  Ｓａｍｐｌｅ  Ｍａｎａｇｅｒ、Ｗａｔｅｒｓ  ９９６ダイオードアレイＵＶ検出器、およびＧｉｌｓｏｎ  ＦＣ２０４  フラクションコレクター（ウィスコンシン州、ミドルトンのＧｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ．）から成るものであった。ＵＶ検出器は、２１０〜４５０ｎｍをモニターするように設定した。フラクションコレクターは、１分間隔で画分を回収するように設定した。ＨＰＬＣ移動相勾配は、流量が４．７ｍＬ／分であったことを除き、ＬＣ／ＭＳ分析について上で説明したとおりであった。移動相は、ＨＰＬＣ条件ごとに以下で説明するとおりであった。画分回収中、質量スペクトル分析は行わなかった。
【０２６４】
２つのＨＰＬＣ条件を用いて代謝物を単離した。ＨＰＬＣ条件１は、ラットの尿から代謝物を分画するために用いた。ＨＰＬＣ条件２は、ＨＰＬＣ条件１を用いて回収したＤＣＤＱ代謝物画分をさらに精製するために用いた。ＨＰＬＣ条件１および２のために用いたカラムおよび移動相を下に列記する。
ＨＰＬＣ条件１
カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８セミ分取カラム（２５０×１０ｍｍ、５μｍ）（ペンシルバニア州、ベルフォンテのＳｕｐｅｌｃｏ）。
移動相Ａ：水中１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５
移動相Ｂ：メタノール。
ＨＰＬＣ条件２
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−ＣＮセミ分取カラム（２５０×９．４ｍｍ、５μｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
移動相Ａ：水中０．０２％トリフルオロ酢酸
移動相Ｂ：メタノール中０．０２％トリフルオロ酢酸
【０２６５】
ＨＰＬＣ条件２からの代謝物Ｍ７、Ｍ９およびＭ１３を含有する画分を併せ、Ｚｙｍａｒｋ  ＴｕｒｂｏＶａｐ（マサチューセッツ州、ホプキントンのＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して窒素下で蒸発乾固させた。乾燥した代謝物をＮＭＲスペクトル分析に付した。
【０２６６】
単離されたＭ７、Ｍ９およびＭ１３の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル分析
ＮＭＲスペクトル分析のために、単離されたＤＣＤＱ代謝物Ｍ７、Ｍ９およびＭ１３のサンプルを、各々、１５０μＬの１００％ ＤＭＳＯ−ｄ６に溶解し、窒素ガス雰囲気下で個別の３ｍｍ ＮＭＲ管に移した。Ｎａｌｏｒａｃ ５ｍｍ ｚ勾配インダイレクト検出プローブ（Ｖａｒｉａｎ）を装備したＶａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  ５００  ＭＨｚ  ＮＭＲ スペクトロメーター（カリフォルニア州、パロアルト）を用いて、一次元（１Ｄ）プロトンＮＭＲおよび二次元（２Ｄ）ＮＭＲ（ＣＯＳＹ、ＲＯＥＳＹ）データを収集した。
【０２６７】
データ解析
ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（バージョン１．３）を使用して、ＬＣ／ＭＳシステムを制御し、ＬＣ／ＭＳデータを解析した。画分回収に用いたＨＰＬＣ装置の制御には、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（バージョン４．０）を使用した。ＶＮＭＲプログラム（バージョン６．１Ｃ、Ｖａｒｉａｎ）を使用して、ＮＭＲスペクトルデータを収集し、処理し、表示した。
【０２６８】
結果
ＬＣ／ＭＳおよびＮＭＲスペクトル分析によるＤＣＤＱ代謝物の特性付け
この試験では、ＤＣＤＱ代謝物Ｍ７、Ｍ９およびＭ１３を、より詳細な構造特性付けのためのＮＭＲスペクトル分析を行うために十分な量で単離した。この報告書で提示するＭ７（ケトＤＣＤＱ）、Ｍ９（ヒドロキシＤＣＤＱグルクロニド）およびＭ１３（ヒドロキシＤＣＤＱスルフェート）についての構造の同定が、以前の報告書で提示されたものに取って代わることになる。ＤＣＤＱ、Ｍ７、Ｍ９およびＭ１３の構造を、それらのＮＭＲナンバリングスキームとともに、図５にまとめる。質量よびＮＭＲスペクトル分析によるＭ７、Ｍ９およびＭ１３の同定を、以下で検討する。
【０２６９】
ＤＣＤＱ
代謝物との比較のために、ＤＣＤＱ標準物質の質量スペクトルおよびＮＭＲ特性を検査した。ＤＣＤＱのＬＣ／ＭＳスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン、［Ｍ＋Ｈ］+が、ｍ／ｚ ２２９で観察された。衝突誘発開裂（ＣＩＤ）から得られたＤＣＤＱのｍ／ｚ ２２９質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからのメチレンアミンおよびエチリデンアミンの喪失によって、それぞれ、ｍ／ｚ ２００および１８６のプロダクトイオンが生成されたことを示した。その分子イオンからのプロピル基の喪失により、ｍ／ｚ １８７が生成され、エチリデンアミンのさらなる喪失により、ｍ／ｚ １４４が生成された。シクロペンチル−メチレンアミン基の喪失により、ｍ／ｚ １３２プロダクトイオンが生成された。
表２９は、ＤＣＤＱについての1Ｈ  ＮＭＲ化学シフトデータをまとめたものである。これらのデータを、単離された代謝物との比較に使用した。
【０２７０】
【表２９】
2008519056.tif 000080
【０２７１】
代謝物Ｍ７
Ｍ７についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ２４３で観察された。Ｍ７のｍ／ｚ ２４３質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからのメチレンアミン、エチリデンアミンの喪失によって、ＤＣＤＱについてのｍ／ｚ ２００および１８６の対応するイオンよりそれぞれ１４Ｄａ大きいｍ／ｚ ２１４および２００のプロダクトイオンが、それぞれ生成されたことを示した。これは、ＤＣＤＱからの１個の酸素原子の追加および２個の水素原子の喪失を示唆していた。ｍ／ｚ １３２、１４４および１５８のプロダクトイオンは、ＤＣＤＱについてと同じであり、これは、生体内変換がシクロペンタン環で発生したことを示していた。
【０２７２】
表３０は、Ｍ７についての化学シフトおよび帰属のリストである。代謝物は、１Ｄ ＮＭＲスペクトルおよび２Ｄ  ＣＯＳＹスペクトルからの情報を用いて帰属させた。１Ｄ 1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、芳香族環が、直列に結合した３つの芳香族共鳴の影響を受けないことを示した。取得可能なデータをもって、Ｈ１２をＨ２４と区別することはできなかった。ジアゼピン環におけるプロトンは、塩共鳴（Ｈ４）から９．１０および８．６２ｐｐｍに帰属させた。２Ｄ  ＣＯＳＹデータは、３つのプロトンが、３．２０ｐｐｍ（Ｈ３）ならびに４．２８および４．１５ｐｐｍ（Ｈ５）のプロトンに結合していることを示した。これらのＨ３プロトンは、３．３４および３．０６（Ｈ２）のプロトンにも結合していた。これらの結果により、ジアゼピン環が損なわれていないことが確認された。
【０２７３】
【表３０】
2008519056.tif 000081
【０２７４】
１Ｄ 1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、２．５ｐｐｍのアップフィールドに３つの共鳴があり、一方、ＤＣＤＱについては７つの共鳴があるため、ＤＣＤＱに対してシクロペンチル領域での変化が発生したことも示した。残りのプロトンの帰属は、Ｈ１１プロトンから始めた。３．１６ｐｐｍおよび３．０１ｐｐｍでの共鳴は、ＤＣＤＱについて観察された結合定数との比較に基づき、Ｈ１１に帰属させた。３．０１ｐｐｍでの共鳴は、三重線であり、３．１６ｐｐｍでの共鳴は、二重二重線であった。これらは、ＤＣＤＱについても観察された。Ｈ１１プロトンは、両方とも、２．５９ｐｐｍでの共鳴（Ｈ１０）に結合していた。そのＨ１０共鳴は、３．４７ｐｐｍでの別の１つの共鳴（Ｈ９）に結合していた。そのＨ９共鳴は、２．５３ｐｐｍおよび１．７６ｐｐｍのメチレン対（Ｈ１５）に結合していた。それらのＨ１５共鳴は、２．３２ｐｐｍおよび２．１４ｐｐｍのもう１つのメチレン対（Ｈ１６）に結合していた。Ｈ１７に帰属させることができる共鳴はなく、これは、代謝部位をＣ１７位と示していた。Ｈ１６プロトンのダウンフィールドシフトは、Ｃ１７でのカルボニル酸素と一致する。そのため、Ｍ７を１７−ケトＤＣＤＱと同定した。
【０２７５】
代謝物Ｍ９
Ｍ９についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ４２１で観察された。Ｍ９のｍ／ｚ ４２１質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからの１７６Ｄａの減少によって、ＤＣＤＱ分子より１６Ｄａ大きいｍ／ｚ ２４５が生成されたことを示し、これは、ヒドロキシＤＣＤＱのグルクロニド化を示していた。［Ｍ＋Ｈ］+からのエチリデンアミンの喪失によって、ｍ／ｚ ３７８が生じた。これは、変わっていないエチレンアミン部分を示していた。ｍ／ｚ ３７８からのグルクロン酸（１７６Ｄａ）の喪失によって、ＤＣＤＱについてのｍ／ｚ １８６の対応するイオンより１６Ｄａ高いｍ／ｚ ２０２が生じた。これによって、代謝部位としてのシクロペンタン環の３つのメチレン基が削除された。ｍ／ｚ ２０３のプロダクトイオンは、ＤＣＤＱについての１８７の対応するイオンより１６Ｄａ大きかった。これらのデータは、代謝部位としてのベンジルまたはテトラヒドロピリジン基のいずれかと一致した。
【０２７６】
表３１は、図５におけるナンバリングスキームを用いたＭ９についてのＮＭＲ化学シフトおよび帰属のリストである。１Ｄ ＮＭＲスペクトルからの情報、ならびにＭ９における通しの結合相関関係を示す２Ｄ ＣＯＳＹ分析実験およびＭ９における通しの空間的ＮＯＥ近接を示すＲＯＥＳＹ分析実験の結果を用いて、大部分の代謝物を帰属させることができた。Ｃ２上のメチレンプロトン由来の共鳴は、オーバーラップのため、帰属させられなかった。それらの共鳴は、３．３５ｐｐｍと３．１５ｐｐｍの間に位置した。Ｍ９  ＤＣＤＱについてのＮＭＲスペクトルのアップフィールド領域は一致した。ＣＯＳＹ実験を用いるこの領域のさらなる分析により、ペンチル環構造は損なわれていないことが確認された。Ｍ９についての１Ｄ 1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいて、グルクロン酸由来の共鳴も見ることができた。これらの共鳴のうちのいくつかは、スペクトルのオーバーラップのため、明瞭に帰属させることができなかった。共鳴する未帰属プロトンに適する量の代謝物が、３．３５から３．１５ｐｐｍ領域に存在した。
【０２７７】
【表３１】
2008519056.tif 000082
【０２７８】
５００ＭＨｚ １Ｄ 1Ｈ  ＮＭＲスペクトルの検査により、芳香族領域についての共鳴が、ＤＣＤＱのＮＭＲスペクトルとは変わったことが判明した。これらの芳香族共鳴のうちの２つは、ＤＣＤＱについての３つから残っていたものであった。これらの芳香族共鳴間の２．５Ｈｚでの結合は、プロトン間のメタ配向の特徴である。これにより、グルクロン酸の位置はＣ１３に決まった。このグルクロン酸の位置は、Ｈ１２がＨ５プロトンに対してＮＯＥを有し、Ｈ１４がＨ９に対してＮＯＥを有することを示したＲＯＥＳＹ実験の結果によって、さらに裏付けられた。これらの結果により、Ｈ１２およびＨ１４の位置は芳香族環の反対端に決まった。両方の芳香族プロトンが、グルクロン酸環の芳香族部分に対するＮＯＥも有した。これらすべての結果が、グルクロン酸コンジュゲーションがＣ１３にあることと一致した。
【０２７９】
代謝物Ｍ１３
Ｍ１３についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ３２５で観察された。Ｍ１３のｍ／ｚ ３２５質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、［Ｍ＋Ｈ］+からの８０Ｄａの減少によって、ＤＣＤＱについての［Ｍ＋Ｈ］+より１６Ｄａ大きいｍ／ｚ ２４５が生じたことを示した。これは、Ｍ１３がヒドロキシＤＣＤＱのスルフェートコンジュゲートであることを示していた。その分子からのエチリデンアミンの喪失により、ｍ／ｚ ２８２が生じた。ＤＣＤＱについても観察された、ｍ／ｚ １４４および１３２におけるプロダクトイオンの存在は、シクロペンタン環の３つのメチレン位置のうちの１つが、代謝部位であることを示していた。
【０２８０】
表３２は、Ｍ１３についての化学シフトおよび帰属のリストである。１Ｄ 1Ｈ  ＮＭＲスペクトル、２Ｄ ＣＯＳＹスペクトルおよび２Ｄ ＲＯＥＳＹスペクトルからの情報を用いて、代謝物を帰属させた。Ｍ１３についての１Ｄ 1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、芳香族環が、７．１５ｐｐｍ（Ｈ１２）、６．９１ｐｐｍ（Ｈ１３）および７．２３ｐｐｍ（Ｈ１４）の３つの結合したプロトンの影響を受けないことを示した。これらの帰属は、Ｈ１２から、Ｈ５と同定された４．１７ｐｐｍおよび４．１４ｐｐｍでの共鳴までのＲＯＥを観察することによって、確認した。ジアゼピン環中のプロトンは、塩共鳴（Ｈ４）から９．０４および８．５７ｐｐｍに帰属させた。２Ｄ ＣＯＳＹデータは、これらのプロトンが、３．２２ｐｐｍおよび３．２０ｐｐｍ（Ｈ３）ならびに４．１７および４．１４ｐｐｍ（Ｈ５）でのプロトンに結合していることを示した。そえらのＨ３プロトンは、３．３４および３．１４（Ｈ２）でのプロトンにも結合していた。これらの結果により、ジアゼピン環は損なわれていないことが確認された。
【０２８１】
【表３２】
2008519056.tif 000083
【０２８２】
１Ｄ 1Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ（表３２）は、シクロペンチル領域において変化が発生したことを示した。Ｍ１３については２．５ｐｐｍのアップフィールドに５つの共鳴が存在し、一方、ＤＣＤＱ ＮＭＲスペクトルには７つの共鳴が存在したからである。１１位のプロトンは、ＤＣＤＱについてのものとのそれらの類似性を基に、帰属させた。２．６８ｐｐｍでの三重共鳴は、ＤＣＤＱに固有のものであった。この共鳴は、３．２３ｐｐｍ（Ｈ１１）での共鳴および２．４０ｐｐｍ（Ｈ１０）での別の共鳴と結合していた。そのＨ１０は、３．１５ｐｐｍ（Ｈ９）での共鳴に結合しており、４．２９ｐｐｍ（Ｈ１７）に弱く結合していた。Ｈ９は、２．２６ｐｐｍおよび１．３３ｐｐｍ（両方ともＨ１５）のメチレン対に結合していた。このメチレン対は、１．９７ｐｐｍおよび１．６７ｐｐｍ（両方ともＨ１６）の第二のメチレン対に結合していた。このＨ１６メチレンは、Ｈ１７に結合していた。１個のプロトンがシクロペンタン環から欠け、ならびに残りのプロトンの大きなダウンフィールドへのシフトは、近接するヘテロ原子を暗示していた。これらすべてのデータが、Ｃ１７位におけるスルフェート基の存在と一致した。そのため、Ｍ１３を１７−ヒドロキシＤＣＤＱスルフェートと同定した。
【０２８３】
考察
本試験は、代謝物単離のためのラットの尿を入手するため、およびＤＣＤＱの選択された代謝物についてのより詳細な構造の同定を達成するために設計した。３匹の雄ラットおよび３匹の雌ラットに、ＤＣＤＱの単回５０ｍｇ／ｋｇ用量を与えた。０〜１２および１２〜２４時間間隔で尿を回収した。ＮＭＲスペクトル分析に十分な低マイクログラム量での二段階セミ分取ＨＰＬＣ法により、尿からＤＣＤＱ代謝物Ｍ７（ケトＤＣＤＱ）、Ｍ９（ヒドロキシルＤＣＤＱグルクロニド）およびＭ１３（ヒドロキシルＤＣＤＱスルフェート）を単離した。ＭＳおよびＮＭＲスペクトル分析に基づき、Ｍ７およびＭ１３についての代謝部位は、１７位１７であった。Ｍ９についての代謝部位は、１３位であった。この試験によって同定したＭ７、Ｍ９およびＮ１３についての構造の同定により、上で検討したラットインビボ試験のものをさらに洗練した。
【０２８４】
健常なヒト被験者における［14Ｃ］ＤＣＤＱの経口投与後のインビボ代謝
様々な投薬量でのＤＣＤＱの単回または複数回経口用量を施した健常なヒト被験者の血漿および尿におけるＤＣＤＱの代謝物プロフィールを判定した。加えて、選択したサンプルにおける主要ＤＣＤＱ代謝物（Ｍ６、カルバモイルグルクロニド）の相対濃度を決定した。
【０２８５】
ＤＣＤＱおよびいくつかのＤＣＤＱ代謝物を血漿および尿において同定した。ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）は、血漿と尿の両方において主薬物関連成分であった。ＤＣＤＱイミンＮ−オキシド（Ｍ５）、不変ＤＣＤＱ、ＤＣＤＱイミン（Ｐ３）および他の比較的少量の薬物関連成分も、血漿において観察された。不変ＤＣＤＱ、ＤＣＤＱ Ｎ−オキシドグルクロニド（Ｍ４０）、ヒドロキシルＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ３８）、ヒドロキシルＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド（Ｍ３７）および多数の比較的少量の薬物関連成分が尿に排泄された。
【０２８６】
血漿中のＭ６の濃度は、投与量の増加に伴って増加し、大きな個体間変動が観察された。血漿中Ｍ６濃度は、投与後６から２４時間まで経時的に減少した。Ｍ６対ＤＣＤＱ血漿濃度比は、投与後１２および２４時間の時点でより６時間の時点でのほうが高かった。投与後６時間の時点で、この平均比は、３５．４から７６．６の範囲であった。絶食被験者と３００ｍｇのＤＣＤＱを受けた摂食被験者の間に、Ｍ６濃度およびＭ６対ＤＣＤＱ比に関して統計学的に有意な差はなかった。尿における平均Ｍ６対ＤＣＤＱ比は、８４から１０１８の範囲であった。
【０２８７】
これらの結果は、ＤＣＤＱが、ＤＣＤＱを経口摂取した健常なヒト被験者において第Ｉ相および第ＩＩ相代謝を受けること、およびカルバモイルグルクロニド化が、その主要代謝経路であることを示していた。動物試験とは対照的に、ヒトではカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）の形成が、主要代謝経路であり、Ｍ６が、ヒト血漿および尿における主薬物関連代謝物であった。
【０２８８】
材料および方法
方法
９８．６％の化学的純度を有する塩酸ＤＣＤＱは、Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ニューヨーク州、パールリバー）が合成した。ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニドは、Ｗｙｅｔｈ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（カナダ、モントリオール）が合成したものであり、９５．５％の純度を有した。内部標準（ｄ8−ＤＣＤＱ、ｌｏｔ  Ｌ２７３４７−１４０−Ａ）は、Ｗｙｅｔｈ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＲａｄｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇｒｏｕｐ（ニューヨーク州、パールリバー）が合成した。報告重水素分布は、ｄ0〜ｄ5 ０％、ｄ6 ０．１％、ｄ7 ２．７％、およびｄ8 ９７．１％であった。抽出およびクロマトグラフ分析のために使用した溶媒は、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ニュージャージー州、ギブスタウン）からのＨＰＬＣまたはＡＣＳ試薬グレードのものであった。
【０２８９】
方法
薬物投与および検体収集
薬物投与および検体収集は、健常な被験者ならびに統合失調症および統合失調感情障害を有する被験者に経口投与されたＤＣＤＱの安全性、許容度、薬物動態および薬力学についての無作為化、二重盲検、プラシーボ対照、漸増単回用量試験で行った。検体は、代謝プロフィールについて、およびカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）のＤＣＤＱに対する比率についての分析まで、約−７０℃で保管した。
【０２９０】
サンプル作製
２５ｍｇ複数回漸増用量試験においてＤＣＤＱに中等度および高度に暴露された２人の被験者を、代謝プロフィールについてＬＣ／ＭＳによっても分析した。被験者９および４１から第１日および第１４日に採取した８時間血漿サンプルを、以下に説明するように処理し、分析した。代謝プロフィールについて分析したサンプルには内部標準を添加しなかった。
【０２９１】
５０ｍｇ単回用量グループにおける絶食被験者２５、２８および３０、２００ｍｇ単回用量グループにおける絶食被験者５０、５１、５４、３００ｍｇ単回用量グループにおける絶食被験者７４、７６、７９、３００ｍｇ単回用量グループにおける摂食被験者８３、８４、８６、および５００ｍｇ単回用量グループにおける絶食被験者９２、９４、９６由来の血漿サンプルを、ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）濃度について分析した。内部標準ｄ８−ＤＣＤＱ（２５μＬの２００ｎｇ／ｍＬメタノール溶液）を１００μＬの血漿サンプルに添加し、その後、３００μＬのアセトニトリルを添加した。サンプルを混合し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１５Ｃ遠心分離機（ニューヨーク州、ウェストバリーのＢｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）において１０分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。各サンプルの上清を清浄な試験管に移し、ＴｕｒｂｏＶａｐ  ＬＶエバポレーター（マサチューセッツ州、ホプキントンのＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において窒素流下で蒸発乾固させた。残留物を５０μＬのメタノールで再構成し、その後、１５０μＬの水を添加した。サンプルを混合し、上で説明したとおり遠心分離した。上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって分析した。標準曲線のためのサンプルは、合成Ｍ６でスパイクした対照血漿を用いて調製した。標準曲線のために使用したＭ６の濃度は、０から２５００ｎｇ／（ｍＬ血漿）の範囲であった。
【０２９２】
前記単回用量グループにおける同じ被験者由来の０〜４、４〜１２および１２〜２４時間尿サンプルを、Ｍ６のＤＣＤＱに対する比について分析した。内部標準は、尿サンプルの分析には使用しなかった。サンプルを対照尿サンプルで２０倍に希釈し、ＬＣ／ＭＳにより直接分析した。ヒト尿におけるＭ６対ＤＣＤＱ比を概算するために、対照尿サンプルを２００ｎｇ／ｍＬのＤＣＤＱおよび１０００、５０００または１００００ｎｇ／ｍＬのＤＣＤＱカルボニルグルクロニドでスパイクし、ＬＣＭＳによって分析した。
【０２９３】
液体クロマトグラフィー／質量分析
３つのＬＣ／ＭＳシステムをこの作業に使用した。ＬＣ／ＭＳシステム１は、代謝物の特性付けのための血漿および尿サンプルの分析に用いた。ＬＣ／ＭＳシステム２は、尿におけるＤＣＤＱ代謝物の特性付けのための追加ＭＳ／ＭＳデータを得るために用いた。ＬＣ／ＭＳシステム３は、血漿および尿サンプルにおける代謝物Ｍ６（ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド）のセミ分取分析のために用いた。
【０２９４】
ＬＣ／ＭＳシステム１
ＬＣ／ＭＳシステム１は、代謝物の特性付けのための血漿および尿サンプルの分析に用いた。このＬＣ／ＭＳシステムとともに使用したＨＰＬＣ装置は、オートサンプラー、バイナリーポンプおよびダイオードアレイＵＶ検出器を具備するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  １１００  ＨＰＬＣシステム（カリフォルニア州、パロアルトのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から成るものであった。ＵＶ検出器は、２１０から３５０ｎｍをモニターするように設定した。ＨＰＬＣ移動相は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５（Ａ）およびメタノール（Ｂ）からなり、０．２ｍＬ／分で送液した。線形移動相勾配（ＨＰＬＣ勾配１）を下に示す。ＬＣ／ＭＳサンプル分析中、６分までの初期フローは質量分析装置からそらし、その後、代謝物を評価した。
【０２９５】
【表ａ】
2008519056.tif 000084
【０２９６】
ＬＣ／ＭＳシステム１での代謝物の特性付けに使用した質量分析装置は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ−Ｄｅｃａイオントラップ質量分析装置（カリフォルニア州、サンホゼのＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）であった。この質量分析装置は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースが装備されており、陽イオンモードで操作した。このＬＣＱ質量分析装置についての設定を下に列記する。
【０２９７】
【表ｂ】
2008519056.tif 000085
【０２９８】
ＬＣ／ＭＳシステム２
ＬＣ／ＭＳシステム２は、尿におけるＤＣＤＱ代謝物の特性付けのための追加ＭＳ／ＭＳデータを得るために用いた。ＬＣ／ＭＳシステム２とともに使用したＨＰＬＣ装置は、Ｗａｔｅｒｓ  ｍｏｄｅｌ  ２６９５  ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（マサチューセッツ州、ミルフォードのＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）から成るものであった。これは、内臓オートサンプラーおよびモデル９９６ダイオードアレイＵＶ検出器を装備していた。ＵＶ検出器は、２１０から４００ｎｍをモニターするように設定した。ＨＰＬＣカラム、移動相、流量、質量分析装置からのフローアレイの分流、および勾配は、ＬＣ／ＭＳシステム１について上で説明したとおりであった。カラム温度は、２５℃であった。
【０２９９】
ＬＣ／ＭＳシステム２での代謝物の特性付けに使用した質量分析装置は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｍｉｃｒｏトリプル四極子質量分析装置（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）であった。この質量分析装置は、エレクトロスプレーインターフェースを装備しており、陽イオンモードで操作した。この質量分析装置の設定を下に列記する。
【０３００】
【表ｃ】
2008519056.tif 000086
【０３０１】
ＬＣ／ＭＳシステム３
ＭＳシステム３は、血漿および尿サンプルにおける代謝物Ｍ６（ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド）のセミ分取分析のために用いた。このＬＣ／ＭＳシステムのためのＨＰＬＣ装置は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＭＳポンプおよびオートサンプラーを具備するＴｈｅｒｍｏ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＨＰＬＣ（カリフォルニア州、サンホゼのＴｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）から成るものであった。分離は、５マイクロメートル Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）カラム、１５０×２ｍｍ（カリフォルニア州、トランスのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いて遂行した。オートサンプラーおよびカラム温度は、それぞれ、５℃および４０℃に設定した。ＨＰＬＣ移動相は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ａ）およびメタノール（Ｂ）からなり、０．２ｍＬ／分で送液した。線形移動相勾配（ＨＰＬＣ勾配２）を下に示す。ＬＣ／ＭＳサンプル分析中、３分までの初期フローは質量分析装置からそらし、その後、代謝物を評価した。
【０３０２】
【表ｄ】
2008519056.tif 000087
【０３０３】
ＬＣ／ＭＳシステム３でのセミ分取分析に用いた質量分析装置は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍトリプル四極子質量分析装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）であった。この質量分析装置は、エレクトロスプレーインターフェースを装備しており、陽イオンモードで操作した。この質量分析装置の設定を下に列記する。
【０３０４】
【表ｅ】
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以下の設定を用いて、ＤＣＤＱおよびＭ６について、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）モードでのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析（ＬＣ／ＳＲＭ）を行った。
【０３０５】
【表ｆ】
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【０３０６】
データ解析および統計学的評価
コンピュータープログラムＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌｌ（登録商標）９７を用いて、平均および標準偏差を算出し、スチューデントｔ−検定を行った。ＬＣ／ＭＳデータの収集および分析には、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（バージョン１．３）およびＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（バージョン４．０）を用いた。Ｍ６の内部標準に対するピーク面積比を、血漿サンプルにおけるＭ６の定量に用いた。
【０３０７】
結果
代謝物プロフィールおよび血漿中Ｍ６濃度
ＤＣＤＱおよび８つのＤＣＤＱ代謝物をヒト血漿において同定した（表３３）。ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）は、単回用量試験と複数回用量試験の両方におけるすべての用量グループにおいて、血漿中の主薬物関連成分であった。ＤＣＤＱイミンＮ−オキシド（Ｍ５）、不変ＤＣＤＱ、ＤＣＤＱイミン（Ｐ３）ならびに極微量のヒドロキシルＤＣＤＱ、ヒドロキシルＤＣＤＱイミン、ヒドロキシルＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）およびケトＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ２２）も血漿において観察された。分析したすべてのサンプルにおける代謝物プロフィールは、性質的に類似していた。
血漿Ｍ６濃度は、投与量の増加とともに増加し、大きな個体間変動が観察された（表３４）。分析した３つの時点のうち、Ｍ６濃度は、投与後６時間の時点で最も高く、投与後１２および２４時間の時点では時間の経過とともに減少していた。Ｍ６血漿中濃度のＤＣＤＱ血漿中濃度に対する比も、投与後６時間の時点で最も高く、一般に、時間の経過とともに低下した。投与後６時間の時点での平均比は、３５．４から７６．６の範囲であった。絶食被験者と３００ｍｇのＤＣＤＱを受けた摂食被験者の間でのＭ６濃度およびＭ６対ＤＣＤＱ比に関して統計学的に有意な差はなかった。
【０３０８】
尿における代謝物プロフィールおよびＭ６対ＤＣＤＱ比
ＤＣＤＱおよびいくつかのＤＣＤＱ代謝物を尿において同定した。ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）は、血漿の場合同様、尿における主薬物関連成分であった。不変ＤＣＤＱ、ＤＣＤＱ Ｎ−オキシドグルクロニド（Ｍ４０）、ヒドロキシルＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ３８）、ヒドロキシルＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド（Ｍ３７）ならびに極微量のＤＣＤＱイミン（Ｐ３）、ヒドロキシルＤＣＤＱ（Ｍ１およびＭ３２）、ヒドロキシルＤＣＤＱイミン（Ｍ２９）、ケトＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ２２）、ヒドロキシルＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ９）、ヒドロキシルＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド（Ｍ３３、Ｍ３６およびＭ３９）、ＤＣＤＱイミングルクロニド（Ｍ３４）およびジヒドロキシルＤＣＤＱイミングルクロニド（Ｍ３５）も尿において観察された。
カルバモイルグルクロニド（Ｍ６）は、親薬物よりずっと高い濃度で尿中に存在した（表３５）。平均Ｍ６対ＤＣＤＱ比は、８４から１０１８の範囲にわたり、大きな変動が観察された。これらの比は、５００ｍｇ投薬グループにおけるほうが他の用量グループにおけるより低いようであった。
【０３０９】
液体クロマトグラフィー／質量分析質量スペクトルによる代謝物の特性付けは、ヒト血漿および尿におけるＤＣＤＱおよびその代謝物についてのＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって達成した。表３３は、本試験において特性付けしたＤＣＤＱ代謝物をまとめたものである。Ｍ６（ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド）は、血漿と尿の両方における主ＤＣＤＱ関連成分であったので、不変ＤＣＤＱの相対濃度は、比較的低かった。そのため、血漿または尿中の不変ＤＣＤＱとほぼ等しいまたはそれ以上の濃度で存在するＤＣＤＱ関連成分のみの質量スペクトルの特性付けを、以下でより詳細に検討する。
【０３１０】
ＤＣＤＱ
ＤＣＤＱ基準標準物質の質量スペクトル特性を、代謝物との比較のために検査した。ＤＣＤＱのＬＣ／ＭＳスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン、［Ｍ＋Ｈ］+が、ｍ／ｚ ２２９で観察された。［Ｍ＋Ｈ］+からのＮＨ3の喪失により、ｍ／ｚ ２１２が生じた。その分子イオンからのメチレンアミン、エチリデンアミンおよびプロピリデンアミンの喪失により、それぞれ、ｍ／ｚ ２００、１８６および１７１のプロダクトイオンが生成された。その分子イオンからのプロペン基の喪失により、ｍ／ｚ １８７が生成され、メチレンアミンおよびエチリデンアミンのさらなる喪失によって、ｍ／ｚ １５８および１４４が生じた。［Ｍ＋Ｈ］+からのシクロプロペンの喪失により、ｍ／ｚ １６１が生じた。シクロペンチル−メチレンアミン基の喪失により、ｍ／ｚ １３２のプロダクトイオンが生成された。
【０３１１】
代謝物Ｍ５
代謝物Ｍ５は、ｍ／ｚ ２４３の［Ｍ＋Ｈ］+を生じさせ、これは、ＤＣＤＱより１４Ｄａ大きく、Ｐ３より１６Ｄａ大きかった。これらのデータは、Ｍ５が、ケトＤＣＤＱ代謝物、ヒドロキシルＤＣＤＱイミンまたはＤＣＤＱイミンＮ−オキシドであることを示唆していた。［Ｍ＋Ｈ］+からのＮＨ3およびＨ2Ｏの喪失により、それぞれ、ｍ／ｚ ２２６および２２５が生じ、これは、酸素原子の追加と一致した。その分子イオンからのメチレンアミンの喪失によって、酸素の追加、および２つの水素の喪失による二重結合の存在と一致するｍ／ｚ ２１３が生成されると考えた。ｍ／ｚ １３０のプロダクトイオンはＰ３についても観察され、ＤＣＤＱについてのｍ／ｚ １３２の対応するイオンより２Ｄａ小さかった。これらのデータは、Ｍ５もイミン基を含有することを示しており、これにより、考慮すべきものからケトＤＣＤＱがはずれた。Ｍ５のＨＰＬＣ保持時間は、ＤＣＤＱよりも、Ｐ３（ＤＣＤＱイミン）よりも長く、これは、インビトロ代謝試験1においても観察され、Ｎ−オキシド化と一致した。そのため、Ｍ５をＤＣＤＱイミンＮ−オキシドと同定した。
【０３１２】
代謝物Ｍ６
Ｍ６についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ４４９で観察され、これは、ＤＣＤＱより２２０Ｄａ大きかった。その分子イオンからの１７６Ｄａの減少により、ｍ／ｚ ２７３が生成され、これは、Ｍ６が、グルクロニドであることを示していた。ｍ／ｚ ２７３からの４４Ｄａのさらなる減少によりｍ／ｚ ２２９が生じ、これは、ＤＣＤＱについての分子イオンでもあった。ｍ／ｚ ２１２および１８６のプロダクトイオンは、ＤＣＤＱについても観察され、これは、Ｍ６がＤＣＤＱのコンジュゲートであることと一致した。それゆえ、Ｍ６をＤＣＤＱのカルバモイルグルクロニドと同定した。
【０３１３】
代謝物Ｍ３８
Ｍ３８についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ４２１で観察され、これは、ＤＣＤＱより１９２Ｄａ大きかった。［Ｍ＋Ｈ］+からのＮＨ3の喪失によりｍ／ｚ ４０４が生じ、これは、ジアゼパン環上の不変アミノ基を示唆していた。その分子イオンからの１７６Ｄａの減少によってｍ／ｚ ２４５が生成され、これは、ヒドロキシルＤＣＤＱ代謝物についての分子イオンでもあった。ｍ／ｚ ２４５からのＮＨ3およびＨ2Ｏの喪失によって、それぞれ、ｍ／ｚ ２２８および２２７が生成された。これらのデータは、Ｍ３８が、ヒドロキシルＤＣＤＱのグルクロニドであることを示していた。ｍ／ｚ ３６２のプロダクトイオンは、ＤＣＤＱについてのｍ／ｚ １８６の対応するイオンより１７６Ｄａ大きく、これは、キノリン−シクロペンタン部分のグルクロニド化を示していた。ｍ／ｚ ３６２および２６９のプロダクトイオンは、グルクロン酸部分を含み、フラグメンテーションスキームに示したように、ジアゼピン、キノリンおよびシクロペンタン環のフラグメンテーションの結果であったと考えた。これらのデータは、キノリン窒素のグルクロニド化およびジアゼパン環のヒドロキシル化と一致した。そのため、Ｍ３８をヒドロキシルＤＣＤＱグルクロニドと同定した。
【０３１４】
代謝物Ｍ４０
Ｍ４０についての［Ｍ＋Ｈ］+は、ｍ／ｚ ４２１で観察され、これは、ＤＣＤＱより１９２Ｄａ大きかった。［Ｍ＋Ｈ］+からのＨ2Ｏの喪失によりｍ／ｚ ４０３が生じた。［Ｍ＋Ｈ］+からの見掛けのＮＨ3の喪失は観察されず、これは、ジアゼパン環上の変性アミノ基を示唆していた。その分子イオンからの１７６Ｄａの減少によりｍ／ｚ ２４５が生成され、これは、ヒドロキシルＤＣＤＱ代謝物についての分子イオンでもあった。しかし、Ｍ４０についてのｍ／ｚ ２４５の相対強度は、代謝物Ｍ３８について観察されたものより弱かった。ｍ／ｚ ２４５からの酸素原子の喪失によって、ＤＣＤＱについての分子イオンでもあるｍ／ｚ ２２９が生じた。代謝物Ｍ３８について観察されたようなｍ／ｚ ２４５ではなく、イオントラップ質量スペクトルにおける基本ピークとしてのｍ／ｚ ２２９の存在との組み合わせで、これらのデータは、Ｎ−オキシドの存在を示していた。ｍ／ｚ ２２８、２２７、２１２および２１０それぞれのプロダクトイオンは、フラグメンテーションスキームに示したように、ｍ／ｚ ２４５および２２９からのＨ2ＯおよびＮＨ3の喪失によって生成された。Ｍ４０のＨＰＬＣ保持時間は、Ｍ３８より長く、これは、Ｍ４０がＮ−オキシドであることとも一致した。ｍ／ｚ ２００および１８６のプロダクトイオンは、ＤＣＤＱについても観察され、Ｍ４０についての対応するＮ−オキシドプロダクトイオンからの酸素原子の喪失の結果であると考えた。ｍ／ｚ ３６０および２７１のプロダクトイオンは、グルクロン酸部分を含み、フラグメンテーションスキームに示したようにジアゼピン、キノリンおよびシクロペンタン環のフラグメンテーションの結果であったと考えた。これらのデータは、ジアゼピン環のアミノ基のグルクロニド化およびキノリン窒素のＮ−オキシド化と一致した。そのため、Ｍ４０は、ＤＣＤＱ Ｎ−オキシドグルクロニドであると考えた。
【０３１５】
考察
ＤＣＤＱは、人間において代謝された。ＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド（Ｍ６）は、血漿と尿の両方における主薬物関連成分であった。ＤＣＤＱイミンＮ−オキシド（Ｍ５）、不変ＤＣＤＱ、ＤＣＤＱイミン（Ｐ３）が、血漿において観察された他の主要薬物関連成分であった。不変ＤＣＤＱ、ＤＣＤＱ Ｎ−オキシドグルクロニド（Ｍ４０）、ヒドロキシルＤＣＤＱグルクロニド（Ｍ３８）、ヒドロキシルＤＣＤＱカルバモイルグルクロニド（Ｍ３７）は、尿に排泄された。
血漿中Ｍ６濃度は、投薬量の増加とともに増加し、大きな個体間変動が観察された。Ｍ６濃度は、投与後６から２４時間まで経時的に減少した。Ｍ６血漿中濃度のＤＣＤＱ血漿中濃度に対する比率は、投与後１２および２４時間の時点より６時間の時点のほうが高かった。投与後６時間の時点での平均比は、３５．４から７６．６の範囲であった。対照的に、ずっと低い量のＭ６が、前のインビトロおよびインビボ試験では検出された。絶食被験者と３００ｍｇのＤＣＤＱを受けた摂食被験者との間にＭ６濃度およびＭ６対ＤＣＤＱ比に関して統計的に有意な差はなかった。尿における平均Ｍ６対ＤＣＤＱ比は、８４から１０１８の範囲にわたった。要約すると、ＤＣＤＱは、健常なヒト被験者において第Ｉ相および第ＩＩ相代謝を受け、カルバモイルグルクロニド化が、その主要代謝経路であった。動物試験とは対照的に、カルバモイルグルクロニド（Ｍ６）の形成が、ヒトにおける主要代謝経路であり、Ｍ６が、ヒト血漿および尿における主薬物関連代謝物であった。
【０３１６】
【表３３】
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【０３１７】
【表３４】
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【０３１８】
【表３５】
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【０３１９】
本明細書に引用されているすべての参考文献（論文、原報、特許、特許出願、公報および本を含むが、これらに限定はされない）は、それら全文、本明細書に参考として組み込まれる。本出願は、２００４年、１１月５日出願の米国仮特許出願第６０／６２５，３３５号（このすべての内容が、その全文、本明細書に参考として組み込まれる）の優先権の利益を主張するものである。
【図面の簡単な説明】
【０３２０】
【図１】インビトロおよびインビボ試験において同定したＤＣＤＱの提案代謝経路のフローチャートである。
【図２】ラット胆汁中排泄試験において同定したＤＣＤＱの提案代謝経路のさらなるフローチャートである。
【図３】マウスにおいて同定したＤＣＤＱの提案代謝経路のさらなるフローチャートである。
【図４】ヒト血漿において同定したＤＣＤＱの提案代謝経路のさらなるフローチャートである。
【図５】ラット胆汁中排泄試験において同定したＤＣＤＱ、Ｍ７、Ｍ９およびＭ１３の構造およびＮＭＲナンバリングスキームを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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