(57)【要約】  本発明は、ＨＩＦ−１αとｐ３００との間の相互作用の阻害が有益である病態の治療のための医薬組成物の調製のための、特に固形腫瘍の治療のための抗血管新生薬としての、一般式（Ｉ）の化合物（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＸは本文の説明に定義されている通りである）の使用に関する。
2008525340.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＦ−１αとｐ３００との間の相互作用の阻害が有益である病態の治療のための医薬組成物の調製のための、一般式（Ｉ）の化合物の使用
【化１】
2008525340.tif 000014
［式中、
Ｒ1は、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ2は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｘは、酸素または硫黄であり；
「アルキル」は、１から１０個の炭素原子、好ましくは１から８個の炭素原子を含む線状または分岐状の炭化水素（シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、シアノ、スルホンアミド、アミノスルホニル、アシル、アシルオキシおよび置換アミノから独立に選択される１つまたは複数の基によって任意選択で置換されている）であり；
「アリール」は、６から１４個の炭素原子を含む不飽和環状芳香族炭化水素（アルキル、アリール、ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、シアノ、スルホンアミド、アミノスルホニル、アシル、アシルオキシ、ニトロ、および置換アミノから独立に選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択で置換されている）であり；
「ヘテロアリール」は、窒素、酸素および硫黄から好ましくは選択される１個または複数の原子を含む、単環のまたは縮合した５から１０員の芳香族環（アルキル、アリール、ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、シアノ、スルホンアミド、アミノスルホニル、アシル、アシルオキシ、ニトロおよび置換アミノから独立に選択される１つまたは複数の基によって任意選択で置換されている）であり；
「シクロアルキル」は、３から８個の炭素原子を含む環状アルキル基（アルキル、アリール、ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、シアノ、スルホンアミド、アミノスルホニル、アシル、アシルオキシ、ニトロおよび置換アミノから選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択で置換されている）であり；
「ヘテロシクロアルキル」は、窒素、酸素および硫黄から好ましくは選択される１個または複数の原子を含む、飽和または部分不飽和の単環または縮合環（アルキル、アリール、ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、シアノ、スルホンアミド、アミノスルホニル、アシル、アシルオキシ、ニトロおよび置換アミノから独立に選択される１つまたは複数の基によって任意選択で置換されている）であり；
「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、線状、環状または分岐状で１価の炭化水素基（アルキル、アシル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ハロアルキル、アルコキシおよび置換アミノから独立に選択される１つまたは複数の基によって任意選択で置換されている）であり；
「アルコキシ」は、線状または分岐状のＣ1〜Ｃ4アルコキシ基であり；
「置換アミノ」は、−ＮＲＲ基であり、式中、各Ｒ基は、水素、アシル、アルキル、シクロアルキル、アリールから独立に選択されるか、あるいは、Ｒ基は、窒素原子と一緒になって、５または６員の複素環を形成していてもよく；
「ハロゲン」または接頭辞「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を意味し；
「アシル」は、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ”基を意味し、式中、Ｒ”は、水素、ヒドロキシ、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アリール（アルキル基、ハロアルキル、アルコキシ、ハロゲンおよび置換アミノ基の１つまたは複数により任意選択で置換されている）、ヘテロアリール（アルキル基、ハロアルキル、アルコキシ、ハロおよび置換アミノ基の１つまたは複数により任意選択で置換されている）、ならびに環（アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、ハロおよび置換アミノ基の１つまたは複数により任意選択で置換されている）から好ましくは選択される］。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物において、
Ｒ1がフランであり、フェニルまたは置換フェニル基（カルボキシ、メトキシカルボニル、シアノ、スルホンアミドおよびヒドロキシエトキシから選択される１つまたは複数の基によって置換されている）により任意選択で置換されており；
Ｒ2がフェニルまたはベンジル（メチル、トリフルオロメチル、メトキシ、メチレンジオキシから選択される１つまたは複数の基により任意選択で置換されている）であるか、あるいは、（２−チエニル）−メチル、モルホリニル−プロピル、フェニルエチルおよび（３，４−ジメトキシフェニル）エチルであり；
Ｘが硫黄である
請求項１に記載の使用。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物が以下から選択される、請求項２に記載の使用
２−［５−（３−ベンジル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フラン−２−イル］安息香酸メチルエステル（１）；
４−｛５−［３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸（２）；
４−｛５−［３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（３）；
４−｛５−［３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（４）；
４−［５−（３−ベンジル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）フラン−２−イル−］ベンゾニトリル（５）；
４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］フラン−２−イル−｝ベンゾニトリル（６）；
４−［５−（３−ベンジル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フラン−２−イル］ベンゼンスルホンアミド（７）；
４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゼンスルホンアミド（８）；
４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（９）；
４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸（１０）；
４−｛５−［３−（３，４−メチレンジオキシベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゼンスルホンアミド（１１）；
４−｛５−［３−（３，４−メチレンジオキシベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（１２）；
４−｛５−［３−（２−チエニル）メチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（１３）；
４−｛５−［３−（２−チエニル）メチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゾニトリル（１４）；
４−｛５−［３−（２−チエニル）メチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゼンスルホンアミド（１５）；
４−｛５−［３−（モルホリン−４イル−プロピル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（１６）；
４−｛５−［３−（３，４−ジメトキシフェニル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸（１７）；
４−｛５−［３−［２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゾニトリル（１８）；
４−｛５−［３−（２−フェニル）エチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゾニトリル（１９）；
４−｛５−［３−［２−（フェニル）エチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸（２０）；
４−｛５−［３−［２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（２１）；
２−｛５−［４−［３−（２−フェニル）エチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル］フェノキシ｝エタノール（２２）；
３−ベンジル−５−［［５−（２−メトキシフェニル）フラン−２−イリデンメチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン（２３）；
２−［５−（３−ベンジル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フラン−２−イル］安息香酸（２４）。
【請求項４】
抗血管新生薬の調製のための、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
固形腫瘍の治療薬の調製のための、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記腫瘍が、肺癌、乳癌、前立腺癌、神経芽細胞腫、多型性神経膠芽腫、黒色腫、中枢神経系癌、扁平上皮細胞口腔癌、子宮頸癌、卵巣、食道、腎臓、結腸、頭頸部の癌およびオリゴデンドリオグリオーマから選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記細胞を式（Ｉ）の化合物の有効量と接触させることを含む、細胞におけるＶＥＧＦ産生の阻害方法。
【請求項８】
以下から選択される化合物
４−｛５−［３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸（２）；
４−｛５−［３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（３）；
４−｛５−［３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（４）；
４−［５−（３−ベンジル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）フラン−２−イル−］ベンゾニトリル（５）；
４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］フラン−２−イル−｝  ベンゾニトリル（６）；
４−［５−（３−ベンジル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フラン−２−イル］ベンゼンスルホンアミド（７）；
４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゼンスルホンアミド（８）；
４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（９）；
４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸（１０）；
４−｛５−［３−（３，４−メチレンジオキシベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゼンスルホンアミド（１１）；
４−｛５−［３−（３，４−メチレンジオキシベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（１２）；
４−｛５−［３−（２−チエニル）メチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（１３）；
４−｛５−［３−（２−チエニル）メチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゾニトリル（１４）；
４−｛５−［３−（２−チエニル）メチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゼンスルホンアミド（１５）；
４−｛５−［３−（３，４−ジメトキシフェニル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸（１７）；
４−｛５−［３−［２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゾニトリル（１８）；
４−｛５−［３−（２−フェニル）エチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゾニトリル（１９）；
４−｛５−［３−［２−（フェニル）エチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸（２０）；
４−｛５−［３−［２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（２１）；
２−｛５−［４−［３−（２−フェニル）エチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル］フェノキシ｝エタノール（２２）；
３−ベンジル−５−［［５−（２−メトキシフェニル）フラン−２−イリデンメチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン（２３）；
２−［５−（３−ベンジル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フラン−２−イル］安息香酸（２４）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、転写因子であるＨＩＦ−１αとそのコアクチベーターであるｐ３００との間の相互作用を阻害でき、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）の産生を防止できるチアゾリジノン化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血管内皮細胞増殖因子は、生理的、また生理病理学的な血管新生の過程において重要な役割を演じる。かなりの数のメカニズムがＶＥＧＦ遺伝子の調節に関与しており、これらのメカニズムの中で、基本的な役割は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの低酸素条件下でのＶＥＧＦｍＲＮＡレベルの可逆的な増加によって実証されたように、組織の酸素分圧によって演じられている。ＶＥＧＦｍＲＮＡの発現の増加は、転写因子であるＨＩＦ−１（低酸素誘導因子−１、（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ−１））によって主に媒介されており、この転写因子はＶＥＧＦ遺伝子のプロモーター領域の認識部位に結合する。
【０００３】
非常に多くの実験データは、ＨＩＦ−１が酸素ホメオスタシスの全体的な調節因子であり、ＨＩＦ−１の活性障害が、腫瘍細胞の存続、増殖、浸潤および転移能獲得（ｍｅｔａｓｔａｔｉｚａｔｉｏｎ）を促進することを示している（１）。したがって、ＨＩＦ−１活性の阻害に焦点を合わせた治療戦略が癌患者を延命させることができるであろうと示唆された（２）。
【０００４】
ＨＩＦ−１は、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１βサブユニットからなるヘテロ２量体であり、２量体化し、ｂＨＬＨ−ＰＡＳドメインを通じてＤＮＡに結合する（３）。ＨＩＦ−１αサブユニットの発現は、ＶＨＬタンパク質のＨＩＦ−１αへの結合により媒介されるユビキチン化およびプロテアソームによる分解の過程を通して、組織の低酸素分圧によって厳格に調節されている（４）。このような相互作用は、ＨＩＦ−１αが４０２および５６４プロリン残基で水酸化されている場合に起こる。酸素は、ＨＩＦ−１αを修飾するプロリル−ヒドロキシラーゼに対する制限基質である（５）。ＨＩＦ−１αの発現は、Ｏ2濃度の減少につれて指数関数的に増加し、ＨＩＦ−１の全体的活性レベルを決定する。
【０００５】
ＨＩＦ−１αのトランス活性化ドメインの機能もまた、酸素分圧により制御される負の調節を受けている。Ｎ−末端トランス活性化ドメインは、ＶＨＬによる、またＨＩＦ−１阻害因子（ＦＩＨ−１）（これはＶＨＬおよびＨＩＦ−１αの両方に結合する）による、ヒストンデアシラーゼの動員を通じて負の調節を受けている（６）。
【０００６】
ＨＩＦ−１の活性化は、ＶＥＧＦのような遺伝子の転写を促進するＨＩＦ−１ドメインの活性化により物理的に相互作用する、ｐ３００／ＣＢＰコアクチベーター（ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ）により起こる（７）。ｐ３００およびＣＢＰの両方は、Ｓｔａｔ−３、ＮＦ−κＢ、ｐ５３のような他の転写因子に対するコアクチベーターである。
【０００７】
ｐ３００／ＣＢＰとＨＩＦ−１との相互作用は転写に不可欠であり、最近の刊行物は、腫瘍増殖に対するＨＩＦ−１／ｐ３００相互作用の重要性を実証した（８）。ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性化ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）は、ｐ３００とＣＢＰのドメイン（ＣＨ１として知られている）に結合する。ＣＢＰとｐ３００のＨＩＦ−１αへの結合は、ＦＩＨ−１によって、Ｃ−末端活性化ドメインにあるアスパラギン８０３の酸素依存性水酸化を通じて、負の調節を受けている。このように、低酸素により、ＨＩＦ−１のプロテアソームによる分解および転写活性の両方が引き起こされる。
【０００８】
ＨＩＦ−１αのＴＡＤ−Ｃと、ｐ３００またはＣＢＰのＣＨ１ドメインとの間の相互作用の構造上の詳細は解明されている（９、１０）。Ｈｉｆ−１αの活性の負の調節因子と考えられている（１１）ｐ３００／ＣＢＰとＣＩＴＥＤ２タンパク質（ｐ３５srjとしても知られている）との間の相互作用の詳細もまた公表されている。
【０００９】
ＨＩＦ−１の活性化は、血管新生因子、グルコース輸送体、解糖系酵素、生存、侵潤および転移因子の産生に関与するかなりの数の遺伝子（これらは腫瘍の進行にとって特に重要である）の転写を誘導する。
【００１０】
Ｈｉｆ−１αの異常発現は、７０％を超えるヒトの腫瘍およびこれらの転移において認められ、血管新生および腫瘍の進行の増加に結び付けて考えられた（１２〜１４）。臨床診療において、Ｈｉｆ−１αの異常発現は、治療法の失敗と、多くの腫瘍病態（例えば、非小細胞肺癌（１５）、口腔扁平上皮細胞癌（１６）、初期子宮頸癌（１７）、頭頸部癌（１８）、ｐ５３変異卵巣癌（１９）、オリゴデンドリオグリオーマ（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｉｏｇｌｉｏｍａ）（２０）、ＢＣＬ−２陽性食道癌（２１）の死亡率増加に関連していた。
【００１１】
ＨＩＦ−１活性を阻害するための様々な手法が文献に記載されている。これらのいくつかは、Ｈｉｆ−１αに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＨｉｆ−１αの優性阻害型（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍ）の使用を示唆した。
【００１２】
薬理学的手法の中で、間接的メカニズムを通じて作用するＨｉｆ−１α活性阻害剤、例えば、ＰＩ３Ｋ−ｍＴＯＲ阻害剤（２２〜２３）およびＭＥＫＫ（２４）阻害剤（これらはＨｉｆ−１αの活性を制御する情報伝達に作用する）；ＨＳＰ９０シャペロンタンパク質の阻害剤（２５）；チオレドキシン還元酵素阻害剤（これらは細胞のレドックス状態を修飾するように作用する）（２６）；微小管を不安定にする分子、例えば、２−メトキシエストラジオール（２７）、ならびにエポチロン（２８）が記載されている。最近、ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍において、ＰＸ−４７８（メルファランＮ−オキシド）によるＨｉｆ−１αレベルの構成的および低酸素誘導阻害が報告された。この化合物は著しい抗腫瘍作用を示す。しかし、この化合物の作用メカニズムはこれから完全に明らかにされなければならない（２９）。
【００１３】
最後に、ケトミン（ｃｈａｅｔｏｍｉｎｅ）（ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｓｐ．）真菌のジチオジオキソピペラジン代謝物）がＨｉｆ−１αのｐ３００への結合を妨げると報告された。この化合物は、ｐ３００のＣＨ１ドメイン構造を変えるように作用するので、Ｈｉｆ−１αとの相互作用が妨げられる。担癌マウスへのケトミン投与は、腫瘍および腫瘍増殖における低酸素誘導転写を阻害する（３０）。これらの結果、ＨＩＦ−１αとｐ３００との間の結合を阻害できるさらなる化合物を提供することは有益であろう。
【００１４】
ＵＳ  ２００４／００２５２６  Ａ１は、ホスホリパーゼＤの阻害剤として使用するためのチアゾリジノン化合物を開示し、ＷＯ  ９８／５３７９０は、抗腫瘍剤として有用なチアゾリジノンを開示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
発明の開示
いくつかのチアゾリジノンが、低酸素条件下の腫瘍細胞におけるＨｉｆ−１αおよびｐ３００との間の相互作用を阻害し、ＶＥＧＦの産生を防止することが、今や見出された。したがって、これらの化合物は、血管新生および腫瘍増殖の制御にとって有用である。
【００１６】
このように、本発明は、ＨＩＦ−１αとｐ３００との間の相互作用の阻害が有益である病態の治療のための医薬組成物の調製のための、一般式（Ｉ）
【００１７】
【化１】
2008525340.tif 000003
【００１８】
［式中、
Ｒ1は、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ2は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｘは、酸素または硫黄である。］
の化合物の使用に関する。
【００１９】
本出願の目的では、
「アルキル」は、１から１０個の炭素原子、好ましくは１から８個の炭素原子を含む線状または分岐状の炭化水素（シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、シアノ、スルホンアミド、アミノスルホニル、アシル、アシルオキシおよび置換アミノから独立に選択される１つまたは複数の基によって任意選択で置換されている）であり；
「アリール」は、６から１４個の炭素原子を含む不飽和環状芳香族炭化水素（アルキル、アリール、ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、シアノ、スルホンアミド、アミノスルホニル、アシル、アシルオキシ、ニトロおよび置換アミノから独立に選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択で置換されている）であり；
「ヘテロアリール」は、窒素、酸素および硫黄から好ましくは選択される１個または複数の原子を含む、単環のまたは縮合した５から１０員の芳香族環（アルキル、アリール、ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、シアノ、スルホンアミド、アミノスルホニル、アシル、アシルオキシ、ニトロおよび置換アミノから独立に選択される１つまたは複数の基によって任意選択で置換されている）であり；
「シクロアルキル」は、３から８個の炭素原子を含む環状アルキル基（アルキル、アリール、ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、シアノ、スルホンアミド、アミノスルホニル、アシル、アシルオキシ、ニトロおよび置換アミノから選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択で置換されている）を意味し；
「ヘテロシクロアルキル」は、窒素、酸素および硫黄から好ましくは選択される１個または複数の原子を含む、飽和または部分不飽和の単環または縮合環（アルキル、アリール、ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、シアノ、スルホンアミド、アミノスルホニル、アシル、アシルオキシ、ニトロおよび置換アミノから独立に選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択で置換されている）であり；
「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、線状、環状または分岐状で１価の炭化水素基（アルキル、アシル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ハロアルキル、アルコキシおよび置換アミノから独立に選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択で置換されている）であり；
「アルコキシ」は、線状または分岐状のＣ1〜Ｃ4アルコキシ基であり；
「置換アミノ」は、−ＮＲＲ基であり、式中、各Ｒ基は、ハロゲン、アシル、アルキル、シクロアルキル、アリールから独立に選択されるか、あるいは、Ｒ基は、窒素原子と一緒になって、５または６員の複素環を形成していてもよく；
「ハロゲン」または接頭辞「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を示し；
「アシル」は、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ”基を意味し、式中、Ｒ”は、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アリール（アルキル基、ハロアルキル、アルコキシ、ハロゲンおよび置換アミノ基の１つまたは複数により任意選択で置換されている）、ヘテロアリール（アルキル基、ハロアルキル、アルコキシ、ハロおよび置換アミノ基の１つまたは複数により任意選択で置換されている）、ならびに環（アルキル基、ハロアルキル、アルコキシ、ハロおよび置換アミノ基の１つまたは複数により任意選択で置換されている）から好ましくは選択される。本発明による好ましい化合物は、以下である化合物である：
Ｒ1が置換または非置換のフランであり；
Ｒ2が置換または非置換のフェニルまたはベンジルであるか、あるいは、（２−チエニル）−メチル、モルホリニル−プロピル、フェニルエチルおよび（３，４−ジメトキシフェニル）エチルであり；
Ｘが硫黄である。
【００２０】
「置換フラン」は、フェニル基（上に示されたものから、好ましくは、カルボキシ、メトキシカルボニル、シアノ、スルホンアミドおよびヒドロキシエトキシから選択される１つまたは複数の基により任意選択で置換されている）により置換されたフラン基を好ましくは意味する。「置換フェニルまたはベンジル」は、メチル、トリフルオロメチル、メトキシ、メチレンジオキシから選択される１つまたは複数の基により置換された、フェニルまたはベンジルを意味する。
【００２１】
最も好ましいのは以下の化合物である。
【００２２】
２−［５−（３−ベンジル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フラン−２−イル］安息香酸メチルエステル（１）；
４−｛５−［３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸（２）；
４−｛５−［３−（３，４，５−トリメトキシベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（３）；
４−｛５−［３−（２−トリフルオロメチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（４）；
４−［５−（３−ベンジル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）フラン−２−イル−］ベンゾニトリル（５）；
４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］フラン−２−イル−｝ベンゾニトリル（６）；
４−［５−（３−ベンジル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フラン−２−イル］ベンゼンスルホンアミド（７）；
４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゼンスルホンアミド（８）；
４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（９）；
４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸（１０）；
４−｛５−［３−（３，４−メチレンジオキシベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゼンスルホンアミド（１１）；
４−｛５−［３−（３，４−メチレンジオキシベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（１２）；
４−｛５−［３−（２−チエニル）メチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（１３）；
４−｛５−［３−（２−チエニル）メチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゾニトリル（１４）；
４−｛５−［３−（２−チエニル）メチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゼンスルホンアミド（１５）；
４−｛５−［３−（モルホリン−４イル−プロピル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（１６）；
４−｛５−［３−（３，４−ジメトキシフェニル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸（１７）；
４−｛５−［３−［２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゾニトリル（１８）；
４−｛５−［３−（２−フェニル）エチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝ベンゾニトリル（１９）；
４−｛５−［３−［２−（フェニル）エチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（２０）；
４−｛５−［３−［２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステル（２１）；
２−｛５−［４−［３−（２−フェニル）エチル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル］フェノキシ｝エタノール（２２）；
３−ベンジル−５−［［５−（２−メトキシフェニル）フラン−２−イリデンメチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン（２３）；
２−［５−（３−ベンジル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フラン−２−イル］安息香酸（２４）。
【００２３】
これらの化合物の中で、最も好ましいのは、２−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステルである。
【００２４】
前記化合物は、化合物１および１６を除いて、本発明のさらなる目的である。
【００２５】
本発明の化合物は知られている方法により、例えば、ＵＳ  ２００４／０００２５２６  Ａ１に記載されているもの（これらの方法は、３位で適切に置換された２−チオキソ−チアゾリジン−４−オンと、適切に置換されたフランアルデヒドとの間の縮合を含む）、または、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４４，４２５７（２００３）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１２，２６８１（２００２）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１，２３９０（１９９８）に記載されている方法により合成できる。
【００２６】
以下のスキームは、特に、４−｛５−［３−（４−メチルベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝安息香酸メチルエステルの合成を例示する。
【００２７】
【化２】
2008525340.tif 000004
【００２８】
【化３】
2008525340.tif 000005
【００２９】
［式中、ＭはＬｉ、ＺｎまたはＢｕ3Ｓｎであり、ＤＢＡはジベンジリデンアセトンである］
別法として、化合物（ＩＩＩ）は、以下の次のスキームにより合成できる。
【００３０】
【化４】
2008525340.tif 000006
【００３１】
【化５】
2008525340.tif 000007
【００３２】
【化６】
2008525340.tif 000008
【００３３】
スキーム１〜５に報告されている全ての試薬は知られている方法により調製でき、市販されている。
【００３４】
本発明の化合物は、ＨＩＦ−１αとｐ３００との間の相互作用を、０．５から２５μＭの範囲のＩＣ50で、また、低酸素条件下の腫瘍細胞におけるＶＥＧＦの産生を、０．１０から１００μＭの範囲のＩＣ50で阻害する。
【００３５】
したがって、本発明の化合物は、ＨＩＦ−１αとｐ３００との間の相互作用の阻害が有益である病態の治療のための医薬組成物の調製のために使用できる。これらの組成物は、固体、半固体または液体（好ましくは溶液の形態の）、懸濁液、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、シロップ、座薬、エアロゾルまたは制御放出系であり得る。これらの組成物は、様々な経路を通して、特に、経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、直腸および鼻腔内の経路により投与できる。投薬単位当たりの活性成分の量は、形態および投与経路、化合物、治療しようとする疾患に依存するが、一般に、０．１から１０００ｍｇ、好ましくは１から６００ｍｇの範囲である。医薬組成物の調製原理および方法は当業者に知られており、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（レミントンの薬学）」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ（ペンシルベニア州））に記載されている。
【００３６】
適切に製剤された本発明の化合物は、血管新生が病因として含まれる多くの病態、例えば、様々な形態の固形腫瘍、糖尿病網膜症、関節リウマチ、乾癬、エマンジオーマ（ｅｍａｎｇｉｏｍａ）、強皮症、血管新生緑内障の治療のために使用できる。式（Ｉ）の化合物に特に敏感である固形腫瘍には、肺癌、乳癌、前立腺癌、神経芽細胞腫、多型性神経膠芽腫、黒色腫、中枢神経系癌、扁平上皮細胞口腔癌、子宮頸癌、卵巣、食道、腎臓、結腸、頭頸部の癌およびオリゴデンドリオグオーマが含まれる。
【００３７】
それゆえに、本発明はまた、細胞におけるＶＥＧＦの産生を阻害するための方法にも関し、この方法は、前記細胞と式（Ｉ）の化合物の有効量とを接触させることを含む。
【００３８】
本発明は、以下の実験の部においてより詳細に例示される。
【００３９】
実験の部
化合物の合成
一般的手順Ａ
実施例  −  ４−（５−ホルミル−フラン−２−イル）安息香酸メチルエステル
５−ブロモフルアルデヒド（２．４３ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）、４−（メトキシカルボニル）フェニルボロン酸（２．５０ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）（１９２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびフッ化カリウム（２．４２ｇ、４１．７ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（１００ｍｌ）溶液に、トリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィン（１０重量％、１０１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のヘキサン溶液を加えた。６５〜７０℃で４時間加熱した後、混合物を室温に冷却し、塩化メチレン（１５０ｍｌ）により処理した。１０分間撹拌した後、Ｃｅｌｉｔｅを通して混合物を濾過し、濾液を減圧下に濃縮した。残留物を、酢酸エチル−ヘキサン混合物（１：１）により溶離させるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、４−（５−ホルミル−フラン−２−イル）安息香酸メチルエステル（２．６ｇ、収率８１％）を得た。
【００４０】
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ９．７０（ｓ，１Ｈ）、８．１０（ｄ，２Ｈ）、７．９０（ｄ，２Ｈ）、７．３５（ｄ，１Ｈ）、６．９５（ｄ，１Ｈ）、３．９８（ｓ，３Ｈ）。
【００４１】
一般的手順Ｂ
実施例  −  ３−（３−モルホリノ−４−イル−プロピル）−２−チオキソ−チアゾリジン−４−オン
ビス（カルボキシメチル）トリチオカルボナート（４９８ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１３８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）および４−（３−アミノプロピル）モルホリン（２８８ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）の水（２０ｍｌ）懸濁液を１２時間還流した。水（１０ｍｌ）を加えた後、混合物を室温まで冷却し、１０％メタノール−塩化メチレン（３×５０ｍｌ）により抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下に濃縮した。残留物を、１０％メタノール−塩化メチレンにより溶離させるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、３−（３−モルホリノ−４−イル−プロピル）−２−チオキソ−チアゾリジン−４−オン（２５２ｍｇ、収率４８％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ４．１０（ｄｄ，２Ｈ）、３．９５（ｓ，２Ｈ）、３．５５〜３．７０（ｍ，４Ｈ）、２．３０〜２．５０（ｍ，６Ｈ）、１．７０〜１．９０（ｍ，２Ｈ）。
【００４２】
一般的手順Ｃ
実施例  −  ４｛５−［３−（３−モルホリノ−４−イル−プロピル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝−安息香酸メチルエステル
４−（５−ホルミル−フラン−２−イル）安息香酸メチルエステル（５９ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）および３−（３−モルホリノ−４−イル−プロピル）−２−チオキソ−チアゾリジン−４−オン（７２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍｌ）溶液にピペリジン（１滴）を加えた。６時間加熱還流した後、混合物を減圧下に濃縮した。残留物を、１０％メタノール−塩化メチレンにより溶離させるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、標題の化合物（３２ｍｇ、収率２５％）を得た。
【００４３】
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ８．１５（ｄ，２Ｈ）、７．７５（ｄ，２Ｈ）、７．５０（ｓ，１Ｈ）、６．９５〜７．０５（ｍ，２Ｈ）、４．２０（ｔ，２Ｈ）、３．９５（ｓ，３Ｈ）、３．９０（ｔ，２Ｈ）、３．５８〜３．７５（ｍ，２Ｈ）、２．３０〜２．６０（ｍ，６Ｈ）、１．８０〜２．００（ｍ，２Ｈ）。
４−（５−ホルミル−フラン−２−イル）ベンゼンスルホニルアミド
エタノール（６５ｍｌ）中の４−（トリブチルスタンニル）ベンゼンスルホニルアミド（２．７７ｇ、６．２１ｍｍｏｌ）およびビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（４３６ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）の混合物を、アルゴン雰囲気下に１８時間還流した。室温に冷却した後、エチルエーテル（２００ｍｌ）を加えて、Ｃｅｌｉｔｅを通して混合物を真空濾過した。濾液を減圧下に濃縮し、残留物を、２０％酢酸エチル−ヘキサンにより溶離させるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、標題の化合物（４５０ｍｇ、収率２９％）を得た。
【００４４】
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ９．７０（ｓ，１Ｈ）、７．９０〜８．１０（ｍ，４Ｈ）、７．４０（ｄ，１Ｈ）、７．００（ｄ，１Ｈ）、４．９０（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）。
３−ベンジル−２−チオキソ−チアゾリジン−４−オン
一般的手順Ｂに従って、ビス（カルボキシメチル）−トリチオカルボナート（２．５０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）をベンジルアミン（１．０７ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）と反応させた。７０％塩化メチレン−ヘキサンにより溶離させるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーの後、標題の化合物（９６０ｍｇ、収率４３％）を得た。
４−［５−（３−ベンジル−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フラン−２−イル］−ベンゼンスルホンアミド
４−（５−ホルミル−フラン−２−イル）ベンゼンスルホニルアミド（５０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）および３−ベンジル−２−チオキソ−チアゾリジン−４−オン（４４．６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍｌ）溶液に、ピペリジン（１滴）を加え、混合物を３０分間還流した。０〜５℃に冷却後、固体を濾過し、冷エタノール（２×５ｍｌ）で洗い、真空下に乾燥して標題の化合物（７３ｍｇ、収率８０％）を得た。
【００４５】
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：ｄ  ７．９５〜８．２５（ｍ，４Ｈ）、７．７５（ｓ，１Ｈ）、７．２０〜７．５５（ｍ，１０Ｈ）、５．２５（ｓ，２Ｈ）。
４−（５−ホルミル−フラン−２−イル）−ベンゾニトリル
一般的手順Ａに従って、５−ブロモフルアルデヒド（３．５０ｇ、０．２ｍｏｌ）を、４−シアノボロン酸（２．９４ｇ、０．２ｍｏｌ）と反応させた。混合物の通常のワークアップ、および５０％酢酸エチル−ヘキサンにより溶離させるシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーによる精製の後、標題の化合物（２．６０ｇ、収率６６％）を得た。
【００４６】
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ９．７０（ｓ，１Ｈ）、８．００（ｄ，２Ｈ）、７．８０（ｄ，２Ｈ）、７．４０（ｄ，１Ｈ）、７．００（ｄ，１Ｈ）。
２−チオキソ−３−（３，４−ジメトキシ−フェニルエチル）−チアゾリジン−４−オン
一般的手順Ｂに従って、ビス（カルボキシメチル）チオカルボナート（９０５ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）を、３，４−ジメトキシ−ベンジルアミン（３６３ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）と反応させ、７０％塩化メチレン−ヘキサンにより溶離させるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーの後、標題の化合物（４２０ｍｇ、収率７１％）を得た。
【００４７】
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ６．７０〜６．９０（ｍ，３Ｈ）、４．２０（ｔ，２Ｈ）、４．００（ｓ，２Ｈ）、３．９０（ｓ，３Ｈ）、３．８５（ｓ，３Ｈ）、２．９５（ｔ，２Ｈ）。
４−（５−｛３−［２−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−エチル］−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル｝−フラン−２−イル）−ベンゾニトリル
一般的手順Ｃに従って、４−（５−ホルミル−フラン−２−イル）−ベンゾニトリル（３９．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、２−チオキソ−３−（３，４−ジメチル−ベンジル）−チアゾリジン−４−オン（５９．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）と反応させて、標題の化合物（５８ｍｇ、収率６１％）を得た。
【００４８】
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ７．９５〜８．２５（ｍ，４Ｈ）、７．７５（ｓ，１Ｈ）、７．６０（ｄ，１Ｈ）、７．４０（ｄ，１Ｈ）、６．７〜６．９０（ｍ，３Ｈ）、４．２５（ｔ，２Ｈ）、３．７５（ｓ，３Ｈ）、３．７０（ｓ，３Ｈ）、２．９５（ｓ，２Ｈ）。
３−（２−フェニルエチル）−２−チオキソ−チアゾリジン−４−オン
一般的手順Ｂに従って、ビス（カルボキシメチル）トリチオカルボナート（９０５ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）を、２−フェニルエチルアミン（２４２．４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）と反応させた。７０％塩化メチレン−ヘキサンにより溶離させるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーの後、標題の化合物（２４６ｍｇ、収率５２％）を得た。
【００４９】
1ＨＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．１５〜７．４０（ｍ，５Ｈ）、４．２０（ｔ，２Ｈ）、３．９５（ｓ，２Ｈ）、３．００（ｔ，２Ｈ）。
４−［５−（４−オキソ−３−（２−フェニルエチル）−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フラン−２−イル］−ベンゾニトリル
一般的手順Ｃに従って、４−（５−ホルミル−フラン−２−イル）−ベンゾニトリル（３９．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、３−（２−フェニルエチル）−２−チオキソ−チアゾリジン−４−オン（４７．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）と反応させて、標題の化合物（６４ｍｇ、収率７６％）を得た。
【００５０】
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ７．９５〜８．２５（ｍ，４Ｈ）、７．７５（ｓ，１Ｈ）、７．５５（ｄ，１Ｈ）、７．４０（ｄ，１Ｈ）、７．１０〜７．３５（ｍ，５Ｈ）、４．２４（ｔ，２Ｈ）、３．００（ｔ，２Ｈ）。
３−チオフェンメチル−２−チオキソ−チアゾリジン−４−オン
一般的手順Ｂに従って、ビス（カルボキシメチル）トリチオカルボナート（９０５ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）を、２−（アミノメチル）チオフェン（２２６．４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）と反応させて、標題の化合物（３２０ｍｇ、収率７０％）を得た。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ７．１５〜７．３５（ｍ，２Ｈ）、６．８５〜７．０５（ｍ，１Ｈ）、５．３５（ｓ，２Ｈ）、４．００（ｓ，２Ｈ）。
４−［５−（４−オキソ−３−チオフェン−２−イル−メチル−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フラン−２−イル］−安息香酸メチルエステル
一般的手順Ｃに従って、４−（５−ホルミル−フラン−２−イル）安息香酸メチルエステル（４６．０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、３−チオフェンメチル−２−チオキソ−チアゾリジン−４−オン（４５．８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）と反応させて、標題の化合物（３８．７ｍｇ、収率４４％）を得た。
【００５１】
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ８．１５（ｄ，２Ｈ）、７．８５（ｄ，２Ｈ）、７．５０（ｓ，１Ｈ）、７．２０〜７．３０（ｍ，２Ｈ）、６．９０〜７．０５（ｍ，３Ｈ）、５．５０（ｓ，２Ｈ）、３．９８（ｓ，３Ｈ）。
４−［５−（４−オキソ−３−（２−フェニルエチル）−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フラン−２−イル］−安息香酸メチルエステル
一般的手順Ｃに従って、４−（５−ホルミル−フラン−２−イル）安息香酸メチルエステル（４６．０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、３−（２−フェニルエチル）−２−チオキソ−チアゾリジン−４−オン（４７．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）と反応させて、標題の化合物（３９．２ｍｇ、収率４４％）を得た。
【００５２】
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ８．００（ｄ，２Ｈ）、７．６５（ｄ，２Ｈ）、６．７０〜７．１５（ｍ，８Ｈ）、４．１５（ｔ，２Ｈ）、３．８８（ｓ，３Ｈ）、２．８５（ｔ，２Ｈ）。
４−（５−｛３−［２−（３，４−ジメトキシフェニル）−エチル］−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル｝−フラン−２−イル）−安息香酸メチルエステル
一般的手順Ｃに従って、４−（５−ホルミル−フラン−２−イル）安息香酸メチルエステル（４６．０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、２−チオキソ−３−［２−（３，４−ジメトキシ−フェニルエチル］−チアゾリジン−４−オン（５９．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）と反応させて、標題の化合物（４６．７ｍｇ、収率４６％）を得た。
【００５３】
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ８．２０（ｄ，２Ｈ）、７．８５（ｄ，２Ｈ）、７．５０（ｓ，１Ｈ）、６．８５〜７．０５（ｍ，５Ｈ）、４．４５（ｔ，２Ｈ）、４．００（ｓ，３Ｈ）、３．８８（ｓ，３Ｈ）、３．８５（ｓ，３Ｈ）、２．９５（ｔ，２Ｈ）。
３−（４−メチル−ベンジル）−２−チオキソ−チアゾリジン−４−オン
一般的手順Ｂに従って、ビス（カルボキシメチル）トリチオカルボナート（９０５ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）を、４−メチル−ベンジルアミン（２４２ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）と反応させて、標題の化合物（２５０ｍｇ、収率５３％）を得た。
【００５４】
1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ７．４０（ｄ，２Ｈ）、７．１５（ｄ，２Ｈ）、５．２０（ｓ，２Ｈ）、４．００（ｓ，２Ｈ）、２．３５（ｓ，３Ｈ）。
４−｛５−［３−（４−メチル−ベンジル）−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝−安息香酸メチルエステル
一般的手順Ｃに従って、４−（５−ホルミル−フラン−２−イル）安息香酸メチルエステル（４６．０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、３−（４−メチル−ベンジル）−２−チオキソ−チアゾリジン−４−オン（４７．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）と反応させて、標題の化合物（４６．７ｍｇ、収率４６％）を得た。
【００５５】
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ８．２０（ｄ，２Ｈ）、７．８５（ｄ，２Ｈ）、７．５０（ｓ，１Ｈ）、７．４０（ｄ，１Ｈ）、７．１５（ｄ，１Ｈ）、６．９０〜７．０５（ｍ，４Ｈ）、５．３０（ｓ，２Ｈ）、３．９５（ｓ，２Ｈ）、２．３０（ｓ，３Ｈ）。
Ｂｉｏｔ−ＨＩＦ−１α786〜826／ＧＳＴ−ｐ３００323/423の阻害に対する予備的生化学アッセイ
本発明の化合物を、Ｈｉｆ−１αとｐ３００との間の相互作用を阻害する能力について、蛍光アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ（商標））を用いて評価した。Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ＳＪ  ａｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３，１０（７），５０４−５１２に記載されている手順を適切に改変した。
【００５６】
Ｃ末端７８６〜８２６アミノ酸に対応するビオチン化ヒトＨｉｆ−１αフラグメント（ビオチン化Ｈｉｆ−１α786〜826）を、ＡｎａＳｐｅｃ  Ｉｎｃ（サンノゼ、カリフォルニア州、米国）から入手し、さらに精製することなく使用した。
【００５７】
ＧＳＴ−ｐ３００323〜423フラグメントを発現する構築物で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。前記構築物は、発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｎｏ．２７−４５−８０−０１）に、アミノ酸３２３から４２３の範囲のｐ３００の領域をコード化するＤＮＡ配列をクローニングすることによって得た。このＤＮＡ配列はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって得た。タンパク質の発現は１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導した。バクテリアを、適切な緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．００）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＺｎＳＯ4、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌのリゾチームおよび１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌタブレット（ＥＤＴＡフリー）（Ｒｏｃｈｅ、カタログＮｏ．１  ８７３  ５８０））の存在下に超音波によって溶解し、可溶性画分に存在するＧＳＴ融合タンパク質を、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｎｏ．２７−４５７４−０１）で精製した。タンパク質の最終濃度はＢｒａｄｆｏｒｄに従ってＢｉｏｒａｄアッセイにより求め（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，２４８，（１９７６））、試料の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。試料を５０％のグリセロール中、−８０℃で保存した。
【００５８】
アッセイを、ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルプレートを用いて以下の通り実施した。
【００５９】
Ｃ９６  ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、製品Ｎｏ．４４６６１２）を、ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中１μｇ／ｍｌの最終濃度のストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ；製品Ｎｏ．Ｓ  ４７６２）により、一夜インキュベートした。次いで、各ウェルを３×３００μｌのＴＢＳＴ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０）により洗った。次に、各ウェルに、１０ｎＭのビオチン化Ｈｉｆ−１α786〜826のＴＢＳＢ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、製品Ｎｏ．Ａ  ２１５３））溶液を１００μｌ入れ、２５℃で１時間インキュベートした。各プレートの最後の列には、ＴＢＳＢ緩衝液だけを入れた。次いで、各ウェルを３×３００μｌのＴＢＳＴ緩衝液で洗った。こうして調製したプレートをアッセイプレートに用いた。
【００６０】
別途、各ウェルに、１０μＭの濃度にＤＭＳＯに溶かした各試験化合物の１０μｌを含むプレート（ドータープレート）を調製した。このプレートに、インキュベーション緩衝液（ＴＢＳＢ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５ｍＭのＤＴＴ、１０μＭのＺｎＣｌ2を添加）で希釈したＧＳＴ−ｐ３００323〜423の１１１ｐＭ溶液を１００μｌ加え、全体を混合した。ドータープレートに入っている混合物の１００μｌを、直ちにアッセイプレートに移した。
【００６１】
各ドータープレートは、最後の２列（ここには、各ウェルに１０μｌのＤＭＳＯを入れた）以外は、１０μＭの濃度の８０種の異なる化合物により準備した。これらの２列はポジティブ（列１１、＋Ｈｉｆ−１）およびネガティブ（列１２、−Ｈｉｆ−１）コントロールに用いた。
【００６２】
２５℃で１時間のインキュベーションの後、各ウェルを３×３００μｌのＴＢＳＴ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０）で洗った。次いで、各ウェルに、１０μＭのＺｎＣｌ2を含むＴＢＳＴ緩衝液の１００μｌに溶かしたユウロピウム標識抗ＧＳＴ抗体（標識化ＤＥＬＦＩＡ  Ｅｕ−Ｎ１；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ；製品Ｎｏ．Ａ  Ｄ  ０２５１）の６０．８ｎｇを加えた。室温で１時間のインキュベーションの後、各ウェルを３×３００μｌのＴＢＳＴ緩衝液で洗い、次いで、信号増幅液（増強液、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  製品Ｎｏ．１２４４−１０５）を加えた。
【００６３】
次に、プレートを、時間分解蛍光モードでＦＵＳＩＯＮアルファ−ＦＰ−ＨＴリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて読み取った。
【００６４】
化合物の活性を次の様にして計算した。プレート試験の列１２におけるネガティブコントロールの蛍光平均値を他の全てのウェルの蛍光値から引いた。次いで、各ウェルに対して得られた蛍光値を、列１１におけるポジティブコントロールの蛍光平均値（この値は最大の信号値、１００％を表す）によって割り、パーセンテージの値で表した。阻害値を、各ウェルについて計算した信号パーセンテージの１００に対する差として表した。
【００６５】
９０μＭから０．１７８μＭの範囲の異なる１０の濃度で各列に化合物が存在するドータープレートを用いて、容量−反応曲線を計算でき、それからＩＣ50値（信号を５０％抑制するのに必要な化合物の濃度）を得た。媒体のみを含む列１１および１２はコントロールであった。
【００６６】
本発明のいくつかの化合物について得たＩＣ50値を表１に報告する。データは２回の独立した実験の平均である。
【００６７】
【表１】
2008525340.tif 000009
【００６８】
ＶＥＧＦ産生の阻害
前記のＨｉｆ−１α／ｐ３００アッセイにおいて阻害活性を有する化合物を、ホタルルシフェラーゼのオープンリーディングフレームがラットＶＥＧＦ遺伝子プロモーターの制御の下にあるベクターを安定に発現させるように遺伝的に改変されたヒト肝臓癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ−ＶＥＧＦルシフェラーゼ）での細胞試験を用いて評価した。
【００６９】
デフェロキサミン（これは低酸素症を引き起こす）によるＨｉｆ−１の誘導は、ＶＥＧＦプロモーターの活性化を通じてルシフェラーゼの転写を誘導し、次いで、ルシフェラーゼ活性を増加させ、この活性を市販のキットにより測定できる。Ｈｉｆ−１α／ｐ３００複合体に干渉する化合物は、Ｈｉｆ−依存ルシフェラーゼ活性化を阻害し、結果的にルシフェラーゼ活性を低下させる。したがって、このアッセイにより、ＶＥＧＦプロモーターに向かう化合物の活性（これはＶＥＧＦの産生と続いての腫瘍血管新生に不可欠である）を評価できる。
【００７０】
以下の手順に従って、Ｈｅｐ−３Ｂ−ＶＥＧＦルシフェラーゼ細胞系を得た。
【００７１】
ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ−３Ｂ（ＡＴＣＣ参照Ｎｏ．ＨＢ−８０６４）を、２ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中、２．５×１０5個の細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種し、翌日、Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（登録商標））を用いてトランスフェクトした。各ウェルにおいて、トランスフェクション混合物は、６μｌのトランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ  ６、１μｇのｐｘｐ２−ＶＥＧＦ−ルシフェラーゼリポータープラスミド（ラットＶＥＧＦプロモーター、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  アクセス番号Ｕ２２３７３、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２２），１３３３３−１３３４０，１９９５）、および１０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）（これは細胞をネオマイシンに対して耐性にする）を含んでいた。トランスフェクションを、製造業者の教示に従って実施した。
【００７２】
適切な細胞ポピュレーション（表現型としてネオマイシンに耐性である）を、「限界希釈」法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に基づくクローニング手法によって選択した。ルシフェラーゼ発現／活性（ルシフェラーゼアッセイ）および上澄み中における分泌されたＶＥＧＦの定量（ＥＬＩＳＡ分泌ＶＥＧＦ試験）のための後のアッセイを、安定にトランスフェクトされた選択株で実施した。
【００７３】
以下の実験プロトコルを用いた。
【００７４】
第１日。Ｈｅｐ−３Ｂ−ＶＥＧＦルシフェラーゼ細胞を、１×１０4個の細胞／ウェル／培地１２５μｌの濃度で、「ブランク」９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種し、次に、一夜サーモスタット（３７℃／ＣＯ2５％）内に放置して付着させた。
【００７５】
第２日。化合物の「３．２倍の作業液」（前もって培地に調製した、ＤＭＳＯ濃度は１．６％ｖ／ｖである）の７５μｌを細胞に加えた（中途容積／ウェル＝２００μｌ、化合物中途濃度＝１．２倍、ＤＭＳＯ中途濃度＝０．６％）。サーモスタット内での１時間のインキュベーションの後、低酸素を、デフェロキサミンの６倍（６００μＭ）保存溶液を４０μｌ／ウェル加えることによって化学的に誘導した（最終容積／ウェル＝２４０μｌ、化合物の最終濃度＝１倍、ＤＭＳＯの最終濃度＝０．５％、デフェロキサミンの最終濃度＝１倍≒１００μＭ）。次いで、プレートをさらに１８〜２０時間サーモスタットに入れた。
【００７６】
第３日。ルシフェラーゼアッセイおよび分泌ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ試験を次の通り実施した。
分泌ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ試験
分泌されたＶＥＧＦの定量化を、「ＤｕｏＳｅｔ  Ｅｌｉｓａ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ヒトＶＥＧＦ」キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。
【００７７】
Ｈｅｐ３Ｂ／ＶＥＧＦルシフェラーゼクローン細胞を有する「ブランク」９６ウェルプレートから１００μｌ／ウェルの上澄みを、透明な９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に移し、キット製造業者の指示に従ってアッセイを実施した。
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼリポーター遺伝子発現の定量化は、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって実施した。上澄みを取り除き、ＰＢＳにより一度洗った後、４０μｌ／ウェルのＢｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ試薬を、Ｈｅｐ３Ｂ／ＶＥＧＦ−ルシフェラーゼ細胞を有するブランク９６ウェルプレートに加えた。リポーター遺伝子の発現レベルを、ルミノメーターによりプレートを読み取ることによって求めた。
【００７８】
本発明のいくつかの化合物についてのＩＣ50値（ルシフェラーゼ信号の５０％阻害または分泌ＶＥＧＦの５０％減少を引き起こす化合物濃度）を表２に報告する。
【００７９】
【表２】
2008525340.tif 000010
【００８０】
2008525340.tif 000011
【００８１】
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【００８２】
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【国際調査報告】
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