(57)【要約】  当該発明は、胃抑制ペプチド（GIP）の拮抗薬であるペプチド・アナログを提供する。GIP1-42をベースとする前記ペプチドは、酵素であるジペプチジル・ペプチダーゼ IV（DPP IV）による分解への高い抵抗性を持つ置換及び／又は修飾を含む。本発明は、N末端で修飾したGIPの製法及び糖尿病の治療のための前記ペプチド・アナログの使用方法も同様に提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
GIP（3-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含む、GIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログ。
【請求項２】
GIP（1-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含み、かつ、Glu3にアミノ酸置換を持つ、GIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログ。
【請求項３】
前記Glu3にて置換されるアミノ酸が、以下の：プロリン、ヒドロキシプロリン、リジン、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファンから成る群から選ばれる、請求項1又は2に記載のペプチド・アナログ。
【請求項４】
前記プロリンをGlu3に対して置換する、請求項3に記載のペプチド・アナログ。
【請求項５】
少なくとも1つのリジン残基のイプシロンアミノ基における脂肪酸付加による修飾をさらに含む、請求項1又は2に記載のペプチド・アナログ。
【請求項６】
前記修飾が、C-16パルミタート基の、リジン残基のイプシロンアミノ基への連結である、請求項5に記載のペプチド・アナログ。
【請求項７】
前記リジン残基がLys16である、請求項6に記載のペプチド・アナログ。
【請求項８】
前記リジン残基がLys37である、請求項6に記載のペプチド・アナログ。
【請求項９】
GIP（1-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含み、かつ、第1、第2、又は第3アミノ酸残基にアミノ酸修飾を持つ、GIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログ。
【請求項１０】
前記N末端のアミノ酸残基がアセチル化される、請求項9に記載のペプチド・アナログ。
【請求項１１】
少なくとも1つのリジン残基のイプシロンアミノ基における脂肪酸付加による修飾をさらに含む、請求項10に記載のペプチド・アナログ。
【請求項１２】
前記修飾が、C-16パルミタート基の、リジン残基のイプシロンアミノ基への連結である、請求項11に記載のペプチド・アナログ。
【請求項１３】
前記リジン残基がLys16である、請求項12に記載のペプチド・アナログ。
【請求項１４】
前記リジン残基がLys37である、請求項12に記載のペプチド・アナログ。
【請求項１５】
肥満症、インスリン抵抗性、インスリン抵抗性メタボリック症候群（シンドロームX）、又は2型糖尿病の処置のための薬剤の調製における、請求項1〜14のいずれか1項に記載のアナログの使用。
【請求項１６】
請求項1〜14のいずれか1項に記載のペプチド・アナログを含む医薬組成物。
【請求項１７】
医薬として許容される担体をさらに含む、請求項16に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ペプチド・アナログが医薬として許容される塩の形態である、請求項16に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ペプチド・アナログが医薬として許容される酸付加塩の形態である、請求項16に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
治療上有効量の請求項16に記載の組成物をインスリン抵抗性の治療が必要な哺乳動物に投与するステップを含むインスリン抵抗性の治療方法。
【請求項２１】
治療上有効量の請求項16に記載の組成物を肥満症の治療が必要な哺乳動物に投与するステップを含む肥満症の治療方法。
【請求項２２】
治療上有効量の請求項16に記載の組成物を2型糖尿病の治療が必要な哺乳動物に投与するステップを含む2型糖尿病の治療方法。
【請求項２３】
以下の：GIP（1-12）、GIP（1-13）、GIP（1-14）、GIP（1-15）、GIP（1-16）、GIP（1-17）、GIP（1-18）、GIP（1-19）、GIP（1-20）、GIP（1-21）、GIP（1-22）、GIP（1-23）、GIP（1-24）、GIP（1-25）、GIP（1-26）、GIP（1-27）、GIP（1-28）、GIP（1-29）、GIP（1-30）、GIP（1-31）、GIP（1-32）、GIP（1-33）、GIP（1-34）、GIP（1-35）、GIP（1-36）、GIP（1-37）、GIP（1-38）、GIP（1-39）、GIP（1-40）、GIP（1-41）、及びGIP（1-42）の中の1つから成るベース・ペプチド；
を含む、GIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログであって、
以下の修飾：
1つ以上の残基でのアミノ酸置換；
1つ以上の残基に対するリジンのアミノ酸置換；
Glu3でのアミノ酸置換；
少なくとも1つのリジン残基のイプシロンアミノ基における脂肪酸付加による修飾；及び
N末端のアセチル化による修飾、
の1つ以上を有する前記ペプチド・アナログ。
【請求項２４】
前記アナログがGlu3に対して置換したプロリンを有する、請求項23に記載のペプチド・アナログ。
【請求項２５】
少なくとも1つのリジン残基のイプシロンアミノ基における脂肪酸付加による修飾をさらに含む、請求項23に記載のペプチド・アナログ。
【請求項２６】
前記修飾がC-16パルミタート基の、リジン残基のイプシロンアミノ基への連結である、請求項25に記載のペプチド・アナログ。
【請求項２７】
前記リジン残基がLys16である、請求項26に記載のペプチド・アナログ。
【請求項２８】
前記リジン残基がLys37である、請求項26に記載のペプチド・アナログ。
【請求項２９】
肥満症、インスリン抵抗性、インスリン抵抗性メタボリック症候群（シンドロームX）、又は2型糖尿病の処置のための薬剤の調製における、請求項23〜28のいずれか1項に記載のアナログの使用。
【請求項３０】
請求項23〜28のいずれか1項に記載のペプチド・アナログを含む医薬組成物。
【請求項３１】
医薬として許容される担体をさらに含む、請求項30に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記ペプチド・アナログが医薬として許容される塩の形態である、請求項30に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記ペプチド・アナログが医薬として許容される酸付加塩の形態である、請求項30に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
治療上有効量の請求項30に記載の組成物をインスリン抵抗性の治療が必要な哺乳動物に投与するステップを含むインスリン抵抗性の治療方法。
【請求項３５】
治療上有効量の請求項30に記載の組成物を肥満症の治療が必要な哺乳動物に投与するステップを含む肥満症の治療方法。
【請求項３６】
治療上有効量の請求項30に記載の組成物を2型糖尿病の治療が必要な哺乳動物に投与するステップを含む2型糖尿病の治療方法。
【請求項３７】
GIP（3-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含む、GIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログであって、天然のGIPと比べた時に、酵素DPP IVによる分解に抵抗性がある前記ペプチド・アナログ。
【請求項３８】
GIP（1-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含み、かつ、Glu3にアミノ酸置換を持つ、GIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログであって、天然のGIPと比べた時に、酵素DPP IVによる分解に抵抗性がある前記ペプチド・アナログ。
【請求項３９】
GIP（3-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含む、GIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログであって、インスリン分泌を調節する前記ペプチド・アナログ。
【請求項４０】
GIP（1-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含み、かつ、Glu3にアミノ酸置換を持つ、GIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログであって、インスリン分泌を調節する前記ペプチド・アナログ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
当該出願は、2004年2月25日付けで出願された英国出願番号第GB0404124.0号の利益を主張する。先の出願の教示全体を本明細書中に援用する。
【０００２】
本発明の分野
当該発明は、インスリンの放出と血糖濃度の制御に関する。より特に、本発明は、2型糖尿病の治療用医薬品としての胃抑制ペプチド（GIP）拮抗薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
肥満症及び糖尿病は、今後20年以内に世界中で大流行すると予測され、かつ、現行の治療は正常なインスリン感受性又はグルコース恒常性を回復させず、その点が消耗性の糖尿病合併症、そして早世をもたらす。
【０００４】
胃抑制ポリペプチド（GIP）及びグルカゴン様ペプチド-1（7-36）アミド（切断GLP-1；tGLP-1）は、摂食に反応して腸管内の内分泌細胞から分泌される2つの重要なインスリン放出ホルモンである。自律神経と一緒に、それらは、血糖恒常性と栄養素代謝の制御において膵島を支援する極めて重要な役割を担っている。
【０００５】
GIPは、炭水化物、タンパク質、そして特に脂肪の摂取の後に腸の内分泌K細胞から血流中に放出される（Meier, J. J.ら、2002年、Regul. Pept. 107:1〜13ページ）。GIPは、胃酸分泌を抑えるその能力を通して当初発見されたが（Brown, J. Cら、1969年、Can. J. Physio. Pharmacol. 47：113〜114ページ）、しかしその主な生理学的役割は、一般に、インスリン分泌を高めて、食後の高血糖を下げるのを助けるために膵島を標的とするインクレチン・ホルモンの役割であると現在考えられている（Creutzfeldt, W.、2001年、Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 109：S288〜S303年）。GIPは、膵ベータ細胞上にあるGIPレセプターに結合した特定のGタンパク質に結合することを通して作用する（Wheeler, M. B.ら、1995年、Endocrinology 136：4629〜4639年）。その姉妹インクレチン・ホルモンであるグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）のように、インスリン分泌を刺激するこの能力に加えて膵ベータ細胞の増殖及び分化に対する潜在的に有益なその他の作用が、2型糖尿病の治療にGIP又はGLP-1のレセプター作動薬を使うことへの大きな関心を呼んだ（Creutzfeldt, W.、2001年、Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 109：S288〜S303ページ；Holz, G. G.ら、2003年、Curr. Med. Chem. 10：2471〜2483ページ）。
【０００６】
GIPが摂食によって腸から放出されるインスリン分泌の強力な、かつ、天然の刺激因子として機能するので、GIP作用に対抗する拮抗薬が、GIPのインスリン放出作用を妨げて、そして経口耐糖能及び栄養素の摂取に対する血糖反応の両方を低下させると広く期待された。実際、今まで公開された全ての研究が、GIPがエンテロインシュラー・アクシス（enteroinsular axis）の主要な生理学的な構成要素であり、そしてGIPの機能的除去が2型糖尿病表現型に向けて代謝特徴を動かすグルコース恒常性欠陥を引き起こすことを示している（Gault, V. A.ら、2002年、Biochem. Biophys. Res. Comnun. 290：1420〜1426ページ）。
【０００７】
ジペプチジル・ペプチダーゼIV（DPP IV；EC 3.4.14.5）は、血清中のGIP及びtGLP-1の不活化に関与する重要な酵素として同定された。これは、それぞれ主な代謝産物GIP（3-42）及びGLP-1（9-36）アミドを生み出すN末端のジペプチドTyr1-Ala2及びHis7-Ala8の迅速な取り外しによって生じる。これらの切断ペプチドは、生理活性を欠くか、又はGIP又はtGLP-1レセプターの拮抗薬としての役割を果たしさえすると報告されている。インビボにおけるこれらのインクレチン・ホルモンの得られた生物学的な半減期は、5分以下であると推定され、従って非常に短い。DPP IVは、ジプロチンA（diprotin A）（DPA、0.1mmol/l）の添加によって血清中で完全に抑制される。
【０００８】
正常なグルコース調節、及び膵臓のB細胞感受性の立場で、この短い作用持続時間は、恒常性を維持するための制御に対する一時的な調整を容易にするのに有利である。しかし、インクレチン・ホルモン、特にインスリン非依存性糖尿病（NIDDM）治療におけるtGLP-1の見込まれる治療的役割に関する現在の目標は、好都合な投与経路を見つけることに加えて、多数の要素によって妨げられている。これらの中で最も注目に値するものは、迅速なペプチド分解、及び（20分間でピーク濃度を迎える）迅速な吸収、並びに高い投薬量のために、かつ、食事との正確なタイミングのために結果として生じる必要性である。最近の治療的戦略は、ペプチド吸収を遅らせるため、及びDPP IVの特異的抑制因子を使ったGLP-1分解の抑制のための析出製剤（precipitated preparations）に注目した。見込まれる治療的役割は、DPP IVの特異的抑制因子、イソロイシン・チアゾリジド（isoleucine thiazolidide）、恐らくインクレチン・ホルモンtGLP-1及びGIPを異化から保護することによってグルコース処置した糖尿病肥満Zuckerラットにおいて下げられた血糖及び高められたインスリン分泌の観察によっても同様に示唆される。
【０００９】
研究は、耐糖能障害（IGT）又はNIDDMの患者の様々な群において、tGLP-1注入が膵臓B細胞感受性、インスリン分泌の変動、及び改善された血糖制御を回復させることを示した。より長期間の研究は、経口の効果的な又は持続性のtGLP-1アナログを開発するための主な動機を提供する、NIDDM治療、さらに場合によりIDDM治療におけるtGLP-1注射の顕著な利益も同様に示す。DPP IV分解に耐性がある構造的に修飾されたtGLP-1のアナログを作り出すために、いくつかの試みがなされた。血清中半減期の顕著な延長が、His7-グルシトールtGLP-1、及びGly、Aib（アミノイソ酪酸）、Ser、又はThrで8位にて置換されたtGLP-1アナログによって観察される。しかし、これらの構造的な修飾は、レセプター結合及びインスリン分泌活性を低下させると思われ、それによってタンパク質分解からの保護の利益の一部に支障を来たす。His7-グルシトールtGLP-1を使った最近の研究において、DPP IV及び血清による分解に対する抵抗性が、インスリン放出活性の重大な喪失を伴った。
【００１０】
GIPは、tGLP-1と同じ分解経路だけでなく、インスリン及びソマトスタチン分泌物の刺激、並びにグルコース処分の増大を含めた多くの類似した生理学的な作用も共有する。これらの作用は、tGLP-1の抗高血糖特性における主要な側面と考えられ、従ってGIPがNIDDM治療として類似した潜在能力を持ちうるという良い期待がある。実際には、GIPによる代償は、tGLP-1ノックアウト・マウスで観察されたわずかなグルコース恒常性障害を明らかにするために行なわれる。初期の研究は別として、GIPの抗糖尿病の潜在能力は検討されず、そして放射免疫測定（RIA）によって推定されたいわゆる生理学的濃度にて注入される時に、一部の人々からより効能があるインスリン分泌促進物質と考えられているので、tGLP-1がより魅力的であるように思われるかもしれない。
【００１１】
従って、インスリンの放出を引き起こすことができ、さらにDPP IVによる迅速な分解に対して抵抗性であることもできるGIPアナログを含む糖尿病治療の必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１２】
本発明の概要
DPP IVによる迅速な分解に抵抗性があるGIP拮抗薬ペプチドが、本明細書中に開示される。
【００１３】
本発明は、GIP（3-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含むGIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログを含む。本発明は、GIP（1-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含み、かつ、Glu3にアミノ酸置換を有するGIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログも同様に含む。
【００１４】
Glu3にて置換されるアミノ酸は、以下：プロリン、ヒドロキシプロリン、リジン、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファンから成る群から選ばれうる。特に、プロリンはGlu3を置換しうる。前記ペプチド・アナログは、少なくとも1つのリジン残基のイプシロンアミノ基における脂肪酸付加による修飾をさらに含みうる。リジン残基は、Lys16又はLys37であってもよい。
【００１５】
GIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログは、GIP（1-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基、及び1位、2位、又は3位のアミノ酸残基でのアミノ酸修飾を含んでもよい。前記N末端アミノ酸残基は、アセチル化されてもよい。それは、少なくとも1つのリジン残基のイプシロンアミノ基における脂肪酸付加による修飾をさらに含んでもよい。前記修飾は、例えばC-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18、又はC-20パルミタート基の、リジン残基のイプシロンアミノ基への連結であってもよい。前記リジン残基は、Lys16又はLys37であってもよい。
【００１６】
本発明は、GIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログであって、以下の：GIP（1-12）、GIP（1-13）、GIP（1-14）、GIP（1-15）、GIP（1-16）、GIP（1-17）、GIP（1-18）、GIP（1-19）、GIP（1-20）、GIP（1-21）、GIP（1-22）、GIP（1-23）、GIP（1-24）、GIP（1-25）、GIP（1-26）、GIP（1-27）、GIP（1-28）、GIP（1-29）、GIP（1-30）、GIP（1-31）、GIP（1-32）、GIP（1-33）、GIP（1-34）、GIP（1-35）、GIP（1-36）、GIP（1-37）、GIP（1-38）、GIP（1-39）、GIP（1-40）、GIP（1-41）、及びGIP（1-42）の中の1つから成るベース・ペプチドを含むものも同様に含む｛ここで、上記ベース・ペプチドは、以下の修飾：（1）Glu3でのアミノ酸置換、（2）少なくとも1つのリジン残基のイプシロンアミノ基での脂肪酸付加による修飾；及び（3）N末端アセチル化による修飾の中の1つ以上を有する。｝。そのようなペプチド・アナログは、Glu3を置換したプロリンを持ってもよい。それは、リジン残基のイプシロンアミノ基に連結したC-16パルミタート基の形態をとる修飾も同様に有することができる。前記修飾は、リジン残基のイプシロンアミノ基への、例えばC-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18、又はC-20パルミタート基の連結であってもよい。前記リジン残基は、Lys16又はLys37であってもよい。
【００１７】
本発明は、GIP（3-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含むGIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログであって、天然のGIPと比べた時に、酵素DPP IVによる分解に対して抵抗性を持つものをさらに含む。
【００１８】
GIP（1-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含み、かつ、Glu3にアミノ酸置換を持つGIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログであって、天然のGIPと比べた時に、酵素DPP IVによる分解に抵抗性をもつものも同様に含む。
【００１９】
さらに、本発明は、GIP（3-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含むGIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログであって、インスリン分泌を調節するものを含む。
【００２０】
本発明は、GIP（1-42）のN末端から少なくとも12個のアミノ酸残基を含み、かつ、Glu3にアミノ酸置換を持ったGIP（1-42）（配列番号1）のペプチド・アナログであって、インスリン分泌を調節するものも同様に含む。
【００２１】
本発明は、肥満症、インスリン抵抗性、インスリン抵抗性メタボリック症候群（シンドロームX）、又は2型糖尿病の処置のための薬剤の調製におけるいずれかのアナログの使用も同様に含む。
【００２２】
本発明は、前記ペプチド・アナログを含む医薬組成物を同様に含む。前記医薬組成物は、医薬として許容される担体をさらに含むことができる。前記ペプチド・アナログは、医薬として許容される塩、又は医薬として許容される酸付加塩の形態であることができる。
【００２３】
さらなる側面において、本発明は、インスリン抵抗性、肥満症、又は2型糖尿病を治療する方法を含む｛ここで、上記方法は、治療上有効量の上記医薬組成物をそのような治療が必要な哺乳動物に投与することを含む。｝。
【００２４】
当該発明により、2型糖尿病治療のために改善された特徴を有する生物学的に活性なGIP（1-42）の効果的なペプチド・アナログであって、GIP（1-42）のN末端から少なくとも15個のアミノ酸残基を含み、そして1〜3位に少なくとも1つのアミノ酸置換又は修飾を持ち、かつ、Tyr1グルシトールGIP（1-42）を含まないものが提供される。
【００２５】
ヒトとブタのGIP（1-42）の構造が、以下に示される。ブタのペプチドは、18位及び34位のたった2つのアミノ酸置換によって異なる。
【００２６】
前記アナログは、少なくとも1つのリジン残基のイプシロンアミノ基における脂肪酸付加による修飾を含んでもよい。
【００２７】
本発明は、少なくとも1つのリジン残基のイプシロンアミノ基における脂肪酸付加を有するTyr1グルシトールGIP（1-42）を含む。
【００２８】
GIP（1-42）アナログは、インスリン分泌を刺激するか、グルコース処分を高めるか、グルコース吸収を遅らせる高められた能力を持っていても、又は天然のGIPと比べた場合に血漿中での高められた安定性を示してもよい。それらは、分解に対する高められた抵抗性も同様に持っていてもよい。
【００２９】
これらの特性のどれもが、治療薬としての前記アナログの効力を高める。
【００３０】
1、2、及び3位にD-アミノ酸置換、及び／又は1位にN-糖化、N-アルキル化、N-アセチル化、若しくはN-アシル化アミノ酸を持ったアナログは、インビボにおける分解に抵抗性を持つ。
【００３１】
例えば、GIP（1-42）Gly2、GIP（1-42）Ser2、GIP（1-42）Abu2、GIP（1-42）Aib2、GIP（1-42）D-Ala2、GIP（1-42）Sar2、及びGIP（1-42）Pro3といった第2及び第3アミノ末端残基における様々なアミノ酸置換が含まれる。
【００３２】
アミノ末端が修飾されたGIPアナログは、N糖化GIP（1-42）、N-アルキル化GIP（1-42）、N-アセチル化GIP（1-42）、N-アセチル-GIP（1-42）、及びN-イソプロピル-GIP（1-42）を含む。
【００３３】
他の安定化されたアナログは、2位と3位でアミノ末端残基の間にペプチド・イソスター結合を持つものを含む。これらのアナログは、アミノ末端のジペプチドTyr1-Ala2の取り外しによってGIPの不活化に主に関与する血漿酵素のジペプチジル・ペプチダーゼIV（DPPIV）に対する抵抗性を持ちうる。
【００３４】
特定の態様において、本発明は、血糖可動域の抑制においてヒト又はブタGIPより強力なペプチドであって、以下の：
（a）GlyによるAla2の置換；
（b）SerによるAla2の置換；
（c）AbuによるAla2の置換；
（d）AibによるAla2の置換；
（e）D-AlaによるAla2の置換；
（f）Sar（サルコシン）によるAla2の置換；
（g）ProによるGlu3の置換；
（h）アセチル化によるTyr1の修飾；
（i）アシル化によるTyr1の修飾；
（j）アルキル化によるTyr1の修飾；
（k）糖化によるTyr1の修飾；
（l）Ala2-Glu3結合の、psi［CH2NH］結合への転換；
（m）Ala2-Glu3結合の、安定なペプチド・イソスター結合への転換；及び
（n）（n-イソプロピル-H）1GIP、
から成る群から選ばれる1つ以上の修飾を伴うGIP（1-42）、又はN末端から15〜30個までのアミノ酸残基（すなわち、GIP（1-15）GIP（1-30）から成るGIP（1-42）のN末端断片から成るものを提供する。
【００３５】
本発明は、糖尿病の処置のための薬剤の調製におけるTyr1-グルシトールGIPの使用も同様に提供する。
【００３６】
本発明は、改善された薬学的特性を有するGIPアナログを含む改善された医薬組成物をさらに提供する。
【００３７】
その他の可能性のあるアナログは、一般遺伝暗号によってコードされていない特定の一般的に遭遇するアミノ酸、例えばβ-アラニン（β-ala）、又はその他のω-アミノ酸、例えば3-アミノ・プロピオン酸、4-アミノ酪酸など、オルニチン（Orn）、シトルリン（Cit）、ホモアルギニン（Har）、t-ブチルアラニン（t-BuA）、t-ブチルグリシン（t-BuG）、N-メチルイソロイシン（N-MeIle）、フェニルグリシン（Phg）、並びにシクロヘキシルアラニン（Cha）、ノルロイシン（Nle）、システイン酸（Cya）及びメチオニンスルホキシド（MSO）、D体の中性若しくは酸性アミノ酸の置換、又はD体のチロシンの、チロシンによる置換を含む。
【００３８】
当該発明により、医薬として許容される賦形剤との混合剤の状態で効果的な量の本明細書中に記載のペプチドを含む、2型糖尿病の治療に有用な医薬組成物も同様に提供する。
【００３９】
本発明は、GIP又はそのアナログのN-末端を修飾する方法であって、C末端から最後から2番目のN末端アミノ酸までペプチドを合成し、Fmoc保護されたTyr（tBu）-Wang樹脂としてバブラー・システムにチロシンを加え、上記チロシンのN末端を脱保護し、かつ、変性剤と反応させ、その反応を終了に向かわせ、Wang樹脂から修飾されたチロシンを切断し、そしてその修飾されたチロシンをペプチド合成反応に加えるステップを含む前記方法も同様に提供する。
【００４０】
好ましくは、作用物質はグルコース、無水酢酸、又はピログルタミン酸である。
【００４１】
本発明は、ここで、以下の制限されることのない実施例、及びその中に添付した図面への言及によって証明される。
【００４２】
詳細な説明
本明細書中に開示されたペプチド・アナログは、酵素DPP IVによる分解に対する抵抗性を発揮する。これらのアナログは、天然のGIP（1-42）ペプチドの第1、第2、及び／又は第3残基の変更を伴うものを含み、ここで上記変更は、DPP IVによる切断を妨げるか又は遅らせる。前記変更は、例えばアシル化、アセチル化、アルキル化、糖化、2つのアミノ酸の間の結合の、例えばpsi-［CH2NH］結合若しくは安定なイソスター結合への変換、あるいはイソプロピル基の付加による最初の3つのアミノ酸の1つ以上の化学修飾を含むことができる。前記変更は、1位、2位、及び／又は3位での、異なる天然のアミノ酸又は遺伝暗号によってコードされていないアミノ酸のいずれかへのアミノ酸置換も同様に含むことができる。その他の変更も同様に可能であり、その目的は、依然としてインスリン分泌が可能なままであるが、DPP IVによるペプチドの分割を防ぐことである。これは、ペプチドのその他の領域での変更によって、例えば依然としてインスリン分泌が可能なままで、DPP IV分割を防ぐために3次元構造を変える変更によって達成されてもよい。
【００４３】
好ましいの変更は、第1、第2、及び第3残基での第1、第2、及び第3残基のアミノ酸置換から成る化学修飾、並びにタンパク質全体にわたるリジン残基の化学修飾を含む。
【００４４】
特に好ましいの変更は、Tyr1のアセチル化、及びC-16パルミタート基の、リジン残基（特に、Lys16又はLys37）のイプシロンアミノ基への連結、又は特にプロリンによるGlu3の置換を含む。前記修飾は、例えばC-8、C-10、C-12、C-14、C-18、又はC-20パルミタート基の、リジン残基のイプシロンアミノ基への連結であることもできる。
【００４５】
急性とは対照的に、長期間の、Glu3が置換された形態のGIP、例えば（Pro3）GIPを使ったGIPレセプター拮抗作用が、肥満症に関係するインスリン抵抗性及び併発した耐糖能障害を改善することが分かった。これは、肥満症、インスリン抵抗性、及び2型糖尿病の治療に対する思いがけないアプローチを明らかにした。
【００４６】
以下の実施例1で記載されるように、GIPタンパク質のN-末端で修飾されたバージョンは、修飾されたタンパク質のアナログと同様に調製される。その後、タンパク質及びそのアナログは、インビボにおけるそれらの抗高血糖及びインスリン放出特性について実施例2において評価され、そしてアミノペプチダーゼ分解に対する十分な抵抗性、及び天然のGIPと比べてさらに高いグルコース降下活性を示すことが見出された。
【００４７】
42アミノ酸のGIPは、食物の摂取を受けて十二指腸及び空腸の内分泌K細胞から循環内に放出される重要なインクレチン・ホルモンである。GIPの種間での高度の構造的な保存は、このペプチドが代謝の重要な役割を担っているという見解を支持する。GIPの分泌は、自律神経からの注目に値する入力なしに、腸内腔内に能動的に運び込まれた栄養素によって直接的に刺激される。GIP放出の最も重要な刺激因子は、より弱い効果を発揮するアミノ酸を伴う、単糖及び不飽和長鎖脂肪酸である。tGLP-1と同様に、GIPのインスリンを放出効果は、厳密にグルコースに依存している。これは、低血糖に対する保護を与えて、それによってあらゆる現行の又は可能性のある新しい抗糖尿病薬の最も望ましい特性の1つを実現させる。
【００４８】
当該結果は、Tyr1-グルシトールGIPが血清及びDPP IV分解に対する完全な抵抗性を示すことを初めて証明する。ESI-MSを使った当該研究は、インビトロにおいて天然のGIPがGIP（3-42）に相当する4748.4Daの主な分解産物に急速に切断されることを示し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析を使った先の所見を立証した。血清分解は、インビボにおけるGIP不活化の主要な酵素としてこれを確認したDPP IVの特異的拮抗阻害剤であるジプロチンA（Ile-Pro-Ile）によって完全に抑制された。対照的に、Tyr1-グルシトールGIPは、最長で12時間、血清又はDPP IVと一緒にインキュベーションした後にほとんど完全に原型を保ったままだった。これは、アミノ末端のTyr1残基でのGIPの糖化がDPP IVから可能性がある切断部位を隠し、N末端からのTyr1-Ala2ジペプチドの取り外しを防いでGIP（3-42）の形成を防ぐことを示す。
【００４９】
インビトロにおけるDPP IVに対する保護と一致して、Tyr1-グルシトールGIPの投与は、グルコースと一緒にラットに投与された時に、そのペプチドの抗高血糖活性及びインスリン放出作用を大幅に高めた。天然のGIPは、多くの先の研究において観察されたように、インスリン放出を高め、そして血糖可動域を減少させた。しかし、GIPのアミノ末端の糖化は、インスリンの曲線下面積（AUC）から見積もられるように、そのペプチドのインスリン放出及び抗高血糖作用をそれぞれ62%及び38%まで高めた。詳細な動力学的分析は、サンプリング時間の必然的な制限のために難しいが、しかし注射の30分後において、GIPとは対照的に、Tyr1-グルシトールGIP後のより高いインスリン濃度がより長い半減期を示唆した。血糖上昇は、両方のペプチド処置群において少量であり、そしてTyr1-グルシトールGIP注射後のグルコース濃度は、GIP後より一貫して低かった。GIPのインスリン分泌促進作用はグルコースに依存しているので、Tyr1-グルシトールGIPの相対的なインスリン放出効力が、当該インビボ実験において大幅に過小評価されていると思われる。
【００５０】
グルコース応答クローン化B細胞を使った当該発明者らの実験室でのインビトロの研究において、Tyr1-グルシトールGIPのインスリン放出効力はGIPより数桁程度大きく、そしてその有効性は生理学的な範囲内のグルコース濃度の変化に対してより感受性が高かったことを示した。
【００５１】
当該インビボ観察と一緒に、これは、GIPのN末端の糖化がDPP IV分解に対する抵抗性を与える一方で、レセプター結合及びB細胞に対するインスリン分泌効果を高めることを示唆する。Tyr1-グルシトールGIPのこれらの特質は、DPP IV抵抗性がGIP（3-42）へのペプチドの分解を妨げ、それにより半減期を延ばし、そして原型を保った生物学的に活性なペプチドの有効な濃度を高めるインビボにおいて、十分に示される。よって、糖化GIPは、レセプターでの高められた効力、並びに改善されたDPP IV抵抗性の両方によってインビボにおけるインスリン分泌を高めることが可能である。よって、多数の研究は、GIP（3-42）、並びにGIP（4-42）及びGIP（17-42）を含めたその他のN末端で修飾された断片がインスリン放出を刺激するのに弱い効果しかないか、又は不活性であることを示した。さらに、GIPのN末端欠失が、GIPレセプターを形質移入されたチャイニーズハムスター腎臓細胞［9］におけるレセプター拮抗薬特性を生じるという証拠が存在し、GIP異化作用の阻害が、切断GIP（3-42）によるレセプター・レベルでの可能性のあるフィードバック拮抗作用も同様に減少させることを示唆する。
【００５２】
そのインスリン分泌促進作用に加えて、GIPの多数の他の可能性のある重要な膵外性作用が、高められた抗高血糖活性、及びTyr1-グルシトールGIPの他の有益な代謝効果に寄与するかもしれない。これらは、脂肪細胞内へのグルコースの取り込みの刺激、脂肪酸の増大された合成、及び脂肪組織内のリポタンパク質リパーゼの活性化を含む。GIPは、経口の脂肪負荷に応じた血漿トリグリセリド・クリアランスも同様に促進する。肝臓において、GIPがグリコーゲン分解のインスリン依存性阻害を高めることが示された。GIPは、脂肪組織におけるグルカゴン刺激を受けた脂肪分解、並びに肝臓のグルコース産生の両方を同様に減少させる。
【００５３】
最後に、最近の研究結果は、マウスの単離された横隔膜筋肉においてGIPがグルコース取り込み及び代謝に対する強力な効果を持つことを示す。この後者の作用は、tGLP-1と共有されることができ、どちらのペプチドもソマトスタチン分泌の刺激、及び胃内容排出と栄養素吸収の減速という追加の利点がある。
【００５４】
この研究は、アミノ末端のTyr1残基におけるGIPの糖化が血清ペプチダーゼのタンパク質分解作用の障害を通してGIP異化作用を制限して、それによりインビボにおけるその半減期を延長することを証明する。この効果は、高められた抗高血糖活性及びインビボにおける上昇したインスリン濃度と同時に生じ、そのようなDPP IV抵抗性アナログがNIDDMのための可能性のある有用な治療薬であることを示唆する。Tyr1-グルシトールGIPはこの点で特に興味深いように思われる、なぜなら、最近tGLP-1に関して観察されたように、そのようなGIPアミノ末端修飾がグルコース依存性のインスリン分泌促進効力を害するよりむしろ高めるからである。
【００５５】
実施例3の表1で示されるように、糖化GIP、アセチル化GIP、GIP（Ser2）は、DPP IVによるインビトロにおける分解に対して天然のGIPに比べてより抵抗性である。これらのデータからGIP（Sar2）は抵抗性がより低いように思われる。表2で示されるように、DPP IVデータから試験したペプチドの中で抵抗性が最も低かったように思われるGIP（Sar2）を含めて、試験した全てのアナログが血漿分解に対する抵抗性を示した。DPAは、GIPの、並びにGIP（Abu2）、GIP（Ser2）、及び糖化GIPの場合の分解の完全な廃止を含めて試験した全てのアナログの分解を実質的に抑制した。これは、DPP IVがインビボにおけるGIPの分解の主要な要因であることを示す。
【００５６】
図17〜30で示されるように、糖化GIPアナログは、天然のGIPに比べてかなり大きなインスリン分泌促進反応を示した。N末端アセチル化されたGIPは、類似したパターンを示し、そしてGIP（Ser2）アナログも同様に強い反応を引き起こした。
【００５７】
これらの試験から、GIP（Gly2）及びGIP（Pro3）は、インスリン放出の点で最小の効能しかないアナログのように思われる。試験された他の安定したアナログ、すなわちGIP（Abu2）及びGIP（Sar2）は、グルコース濃度及び利用された用量に依存した反応性の複雑なパターンを示した。よって、非常に低い濃度が、高血糖条件（16.7mMのグルコース）下で非常に強力であった。これは、これらのアナログでも、インビボにおける分解と組み合わせたインスリン分泌促進能力がペプチド効力を決定する2型糖尿病の治療において治療として有用であると証明しうることを示唆する。
【００５８】
糖尿病の治療用インスリン放出作用物質としてのGIP及びGLP-1の可能な治療のための使用に対する主な制限は、ジペプチジル・ペプチダーゼ-IV（DPP-IV；EC 3.4.14.5）によるインビボにおけるそれらの急速な分解である。この酵素は、前記の2つのペプチドからアミノ末端のジペプチドを迅速に除去し、生理活性を欠くGIP（3-42）及びGLP-1（9-36）を作り出す（Gault, V. A.ら、2002年、Biochem. Bioplzys. Res. Commun. 290：1420〜1426ページ）。安定な、アミノ末端で修飾された形態のGIP及びGLP-1を探索する中で、切断部位に近い3位での単独のプロリン置換を伴う新規合成GIPアナログである（Pro3）GIPが、強力なGIPレセプター拮抗薬として機能することが分かった。
【００５９】
以下に、実施例4で示されるように、（Pro3）GIP、他のGlu3が置換された形態のGIP、及びGIP（3-42）は、インビボでもインビトロでも強力なGIPレセプター拮抗薬である。（Pro3）GIPを使った正常なマウスにおける慢性GIPレセプター拮抗作用の効果を評価した実験は、大幅であるが、可逆的な耐糖能の低下を証明した。これは、摂食に続いてグルコース処分の調節に関与する重要なインスリン放出腸ホルモンとしての広く認識されたGIPの生理学的な役割と完全に一致している（Meier, J. J.ら、2002年、Regul. Pept. 107：1〜13ページ）。
【００６０】
最も顕著に、そして正常なマウスと全く対照的に、本明細書中に開示された実験は、11日間の肥満性糖尿病ob/obマウスへの慢性（Pro3）GIP投与が耐糖能障害及び糖尿病状態を全く悪化させないことを示す。驚いたことに、この肥満インスリン抵抗性モデルにおけるGIPレセプター拮抗作用は、糖化HbA1c、血漿グルコース及びインスリン濃度、耐糖能、並びにインスリン感受性の極めて大幅な改善に関係した。膵臓インスリン量も同様に減少し、そして肥満突然変異体の特徴的な膵島肥大が部分的に回復に向かっていた。これらの後者の観察は、改善されたインスリン抵抗性の結果として（Pro3）GIP後の内因性インスリンの減少した分泌要求を示す。
【００６１】
実際に、ob/obマウスを用いて11日間、（Pro3）GIP処置を行ったインスリン感受性試験は、エンテロインシュラー・アクシスから成るインスリンを放出するGIP要素の機能的消失を代償するだけではない、組織のインスリン不感受性の大幅な改善を明らかにした。インスリン感受性に対するこの効果に関与する正確な機構は知られていないが、しかし、脂肪組織代謝に対する循環GIPの直接作用の消失が有望な候補である。同様に、注目に値することは、肥満性糖尿病ob/obマウスにおける（Pro3）GIPのこれらの有益な作用の全てが処置中止後9日以内に覆されるという事実だった。
【００６２】
これらの結果は、（Pro3）GIP、及び胃腸ホルモンGIPのGlu3置換又はN末端切断型ベースの他のアナログが、ヒトの肥満症、いわゆるインスリン抵抗性（メタボリック）症候群、及び2型糖尿病の治療のためにインスリン抵抗性を軽減する重要な治療手段を提示することができることを示す。
【００６３】
いくつかの研究は、2型糖尿病の治療のためにDPP IV抑制因子又はGLP-1及びGIPの安定したアナログを使ってインクレチン作用を高めることを試みた（Green, B. D.ら、2004年、Curr. Rharm. Des. 10：印刷中；Drucker, D. J.ら、Diabetes Care 10：2929〜2940ページ）。そのようなアプローチは、インクレチン作用が糖尿病に欠けていて、かつ、代謝の混乱に関与する根本的な欠陥が外因性GLP-1又はGIP投与によって乗り越えられるかもしれないという可能性に頼っている。糖尿病におけるGLP-1及びGIPアナログの有益、かつ、可能性のある治療的役割に関するいくらかの証拠がある（Meier, J. J.ら、2002年、Regul. Pept. 107：1〜13ページ；Gault, V. A.ら、2003年、Biochem Biophys Res Commun 308：207〜213ページ；Holst, J. J.ら、2004年、Xm. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 287：E199〜E206ページ；Green, B. D.ら、2004年、Curr. Pharm. Des. 10：印刷中；Drucker, D. J.ら、Diabetes Care 10：2929〜2940ページ）。それにもかかわらず、糖尿病の病態生理におけるインクレチン・ホルモンの可能性のある関与の理解が欠けており、部分的に、特に高濃度で循環するDPP IVに生成された主な切断ペプチド型、GLP-1（9-36）及びGIP（3-42）を用いた、古典的なGLP-1及びGIPの放射免疫測定の交差反応に起因する（Meier, J. J.ら、2002年、Regul. Pept. 107：1〜13ページ）。いくつかの臨床研究が、2型糖尿病におけるGLP-1の分泌の欠陥及びGIPの作用の欠陥の存在を示唆するように思える（Holst, J. J.ら、2004年、Am. J. Playsiol. Endocrinol. Metab. 287：E199〜E206ページ）。しかし、そのような結論の根拠は、多くの先の矛盾するヒトでの研究（Morgan, L. M.、"Insulin secretion and the enteroinsular axis,"：Nutrient regulation of insulin secretion中、Flatt, P. R.編、London, Portland Press, 1992年、1〜22ページ）、及びGIPに対する膵ベータ細胞の報告された不感受性（Vilsboll, T.ら、2002年、Diabetologia 45：1111〜1119ページ）が特定の細胞の欠陥よりむしろ全般性分泌機能不全を反映するかもしれない可能性（Meier, J. J.ら、2003年、Metabolism 52：1579〜1585ページ）を考えると、印象的ではない。実際には、GLP-1を含む全てのインスリン分泌促進物質に対する分泌反応は、2型糖尿病において障害が起きた（Kjems, L. L.ら、2003年、Diabetes 52：380〜386ページ；Flatt, P. R.ら、"Defective insulin secretion in diabetes and insulinoma," Nutrient regulation of insulin secretion中、Flatt P. R.編、London, Portland Press, 1992年、341〜 386ページ）。よって、糖尿病治療のためのGLP-1及びGIPの提案された使用は、DPP IV抵抗性により改善された効力、軽減された腎クリアランス、及び／又は高められたGIPレセプター活性と受容体後活性を有するインクレチン・ホルモンのアナログを提供するためにペプチド工学に頼る（Gault, V. A.ら、2003年、Biochem Biophys Res Commun 308：207〜213ページ）。
【００６４】
単独の動物モデルをヒト2型糖尿病の複雑な病因に一致させることはできないが、マウスのob/ob症候群の研究は、過食症、高インスリン血症、及び進行性の肥満性糖尿病に関係する代謝崩壊の間の相互作用に関するGIPの顕著な異常性を明らかにした（Flatt, P. R.ら、1983年、Diabetes 32：433〜435ページ；Flatt, P. R.ら、1984年、J. Endocrinol. 101：249〜256ページ；Bailey, C. J.ら、1986年、Acta Endocrinol.（Copenh）112：224〜229ページ）。これらの動物は、レプチン欠乏によって促進された、著しい肥満及び重度のインスリン抵抗性を併発した非インスリン依存性糖尿病モデルである（Bailey, C. J.ら、"Animal syndromes resembling type 2 diabetes," Textbook of Diabetes、第3版、Pickup J. C. & Williams G.編、Oxford, Blackwell Science Ltd.、2003年、25.1〜25.30ページ）。さらに、最近の調査研究は、レプチンとエンテロインシュラー・アクシスの間の相互作用（Anini, Y.ら、2003年、Diabetes 52：252〜259ページ）、及び脂肪細胞上のGIPレセプター（「GIP-R」）の過剰刺激がob/obマウスにおける脂肪沈着に対する重要な寄与因子であると考えられることを示唆している（Miyawaki, K.ら、2002年、Nat. Med. 8：738〜742ページ）。
【００６５】
以下に、実施例5で示されるように、安定し、かつ、特異的なGIP-R拮抗薬である（Pro3）GIPの連日注射は、ob/obマウスで証明されるように、GIP-Rを化学的に除去して、そして肥満症−糖尿病における内因性の循環GIPの役割を評価するために使われることができる。その結果は、インスリン抵抗性及び併発した代謝障害におけるGIPの主要な役割を明らかにし、そしてGIP-R拮抗薬が肥満症によって促進された形態の2型糖尿病を治療する新規、かつ、有効な手段を提供するかもしれないという最初の実験的な証拠を提供する。
【００６６】
正常なマウスにおけるGIP-Rのノックアウトは、耐糖能の顕著な障害、及び食物摂取量、体重、又は基礎グルコース若しくはインスリン濃度に対する目立った効果のない食事に誘発されたインスリン分泌をもたらすことが示された（Miyawaki, K.ら、1999年、Proc. Nat. Acad. Soi. USA 96：14843〜14847ページ）。遺伝的GIP-Rノックアウト・マウスを用いたより最近の研究は、これらの所見を裏付け、その上GIPがエンテロインシュラー・アクシスに大いに関与することを示した（Pederson, R. A.ら、1998年、Diabetes 47：1046〜1052ページ；Pamir, N.ら、2003年、Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284：E931〜939ページ）。しかし、GLP-1及びGIPのレセプターのダブルノックアウトは、グルコース恒常性の驚くほどわずかな悪化しかもたらさず（Hansotia, T.ら、2004年、Diabetes 53：1326〜 1335ページ；Preitner, F.ら、2004年、J. Clin. Invest. 113：635〜645ページ）、GLP-1及びGIPレセプターの生涯を通じた欠損の代償機構の可能性のある上方制御を示す。
【００６７】
前記アナログである（Pro3）GIPは、高度に安定であり、かつ、DPP IVが介在する分解に対する抵抗性を持つ特異的、かつ、強力なGIP-R拮抗薬として使用されることができる（Gault, V. A.ら、2002年、Biochenz. Biophys. Res. Commun. 290：1420〜1426ページ）。急性に（Pro3）GIPを使うことで、本明細書中に開示された結果は、ob/obマウスにおける摂食に対する血漿インスリン反応、及びエンテロインシュラー・アクシスへのGIPの関与を明らかにした（Gault, V. A.ら、2003年、Diabetologia 46：222〜230ページ）。GLP-1-R拮抗薬であるエキセンディン（9-39）の効果との比較は、GIPがエンテロインシュラー・アクシスのインスリン放出作用に大いに寄与することを示し、そして主な生理学的なインクレチンであることを示す（Gault, V. A.ら、2003年、Diabetologia 46：222〜230ページ）。11日間の、1日1回の正常なマウスに対する（Pro3）GIPの投与は、減少したインスリン感受性に関係する耐糖能の可逆的な障害をもたらす（Irwin, N.、2004年、Biol. Chem. 385：845〜852ページ）。膵臓インスリン量及び膵島形態と共に、基礎及び食後のインスリン分泌は変化しなかった。よって、高められたインスリン分泌と無関係のように見えるインスリン作用に対する内因性GIPの可能性のある重要な追加の効果を明らかにすることを除いて、毎日の（Pro3）GIPによる長期間のGIP-R機能の化学的消失は、マウスの遺伝的GIP-Rノックアウトによって誘発される表現型を模倣することができる。
【００６８】
決して、この予測されたシナリオ、及び正常なマウスにおけるGIP-Rの遺伝的又は化学的ノックアウトの後に観察された代謝の悪化を再現することなく（Miyawaki, K.ら、1999年、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96：14843〜14847ページ；Irwin, N.、2004年、Biol. Chem. 385：845〜852ページ）、11日間、毎日（Pro3）GIPで処置したob/obマウスは、糖尿病の状態の著しい改善を示した。これは、減少した空腹時高血糖及び基礎高血糖、低下した糖化ヘモグロビン、改善された耐糖能、並びに摂食後の有意に減少した血糖可動域を含む。特に、基礎及びグルコースに刺激された血漿インスリン濃度は減少し、インスリン感受性が高血糖を抑えるように（Pro3）GIP後に有意に改善したに違いないことを示唆する。実際には、（Pro3）GIP投与の11日後に行なわれたインスリン感受性試験は、外因性インスリンのグルコース降下作用の57%の上昇を明らかにした。ob/ob症候群の重症度は、インスリン、スルホニル尿素、メトホルミン、及びチアゾリデンジオンを含めた現行の抗糖尿病薬についての難しい試験を表すことを配慮し（Flatt, P. R.ら、"Defective insulin secretion in diabetes and insulinoma," Nutrient regulation of insulin secretion中、Flatt P. R.編、London, Portland Press, 1992年、341〜386ページ；Stevenson, R. W.ら、1995年、The Diabetes Annual 9：175〜191ページ；Wiernsperger, N. F.、"Preclinical pharmacology of biguanides," Handbook of Experiniental Pharmacology 119：305〜358ページ、1996年）、（Pro3）GIPを使ったGIP-R遮断によるそのような迅速、かつ、可逆的な変化の誘導は前例がない。
【００６９】
前述の効果が（Pro3）GIP処置したob/obマウスの食物摂取量又は体重のいずれかの変化から独立して観察されたことに留意することが重要である。これは、内因性GIPが摂食活動に対する効果を欠くという見解と一致する（Meier, J. J.ら、2002年、Regul. Pept. 107：1〜13ページ）。しかし、体重に関する観察結果は、GIP-R機能を遺伝的ノックアウトするためob/obマウスの異種交配での所見と対照をなす（Miyawaki, K.ら、2002年、Nat. Med. 8：738〜742ページ）。よって、これらのトランスジェニック・マウスにおいて、GIP-R機能の生まれた時からの枯渇が、対照（Lepob/Lepob）マウスと比べての減少した体重増加、並びに脂肪過多症及びインスリン抵抗性の顕著な改善に関係した（Miyawaki, K.ら、2002年、Nat. Med. 8：738〜742ページ）。この以前の研究において、インスリン感受性の改善は、これが大幅に末梢グルコース処分を高める場合に、軽減された脂肪組織質量の単純な結果だったかもしれない（Bailey, C. J.ら、"Animal syndromes resembling type 2 diabetes," Textbook of Diabetes、第3版、Pickup J. C. & Williams G.編、Oxford, Blackwell Science Ltd.、2003年、25.1〜25.30ページ）。しかし、即座に観察され、かつ、摂食又は体重に対する効果のない当該結果は、代わりとなる機構の関与をはっきりと示している。
【００７０】
GIP-R拮抗薬である（Pro3）GIPが、ベータ細胞過形成、高インスリン血症、及びインスリン抵抗性にどの位対抗するかの説明である図49で描かれるAstonバックグラウンドに対するob/ob症候群の年齢依存性進行の主要な画期的出来事の正しい認識から生じる当該データに関する最も有望な説明は、改善された耐糖能障害及び糖尿病管理をもたらす。GIP-Rノックアウトob/obマウスにおける研究によって示唆された脂肪細胞の機能及び脂肪蓄積に対するGIPの可能性のある長期間の直接的な作用は、割愛された。
【００７１】
二重劣性ob突然変異及び得られたレプチン欠乏のために、若いob/obマウスは、深刻な初期過食症を患う（Bailey, C. J.ら、1982年、Int. J. Obes. 6：11〜21ページ）。多大な腸内分泌刺激は、K細胞の過形成、並びに著しく高められた濃度の腸内及び循環GIPをもたらす（Flatt, P. R.ら、1983年、Diabetes 32：433〜435ページ；Flatt, P. R. ら、1984年、J. Endocrinol 101：249〜256ページ；Bailey, C. J.ら、1986年、Acta Endocrinol（Copenh）112：224〜229ページ）。これが、著しい高インスリン血症及び悪化していくインスリン抵抗性（Flatt, P. R.ら、1981年、Horm Metab Res 13：556〜560ページ）と共に、膵島肥大、そしてベータ細胞の過形成を次々に促進する（Bailey, C. J.ら、1982年、Int. J. Obes. 6：11〜21ページ）。この方法は、上昇する基礎高血糖及び耐糖能障害に関して顕わになる。よって、ベータ細胞の代償がインスリン抵抗性を緩やかに高めようとする著しい高インスリン血症をもたらす、らせん状悪循環が確立されている（Bailey, C. J.ら、1982年、Int. J. Obes. 6：11〜21ページ；Flatt, P. R.ら、1981年、Horm Metab Res 13：556〜560ページ）。この前後関係から見れば、毎日の（Pro3）GIPによるGIP-R機能の化学的な消失は、ベータ細胞刺激及び高インスリン血症を減少させることは明らかである。しかし、グルコース恒常性のさらなる障害を引き起こす代わりに、インスリン感受性の優先的な著しい改善が、メタボリック症候群の十分な改善をもたらす。このシナリオに関するさらなる支持は、（Pro3）GIP処置したob/obマウスにおける膵島肥大及びベータ細胞の過形成の部分的な改善である（図48）。特に、平均膵島直径は、より高い割合の小さな又は中程度の直径（0.1〜15mm）のものによって置き換えられた最も大きな膵島（>15mm）によって縮小した。これらの効果は、処置の9日間の中止によって大部分は覆され、成体ob/obマウスの活性な膵島及びベータ細胞増殖という考え方を支持した（Bailey, C. J.ら、1982年、Int. J. Obes. 6：11〜21ページ）。最近の観察は、GIPがベータ細胞に対する細胞分裂刺激及び抗アポトーシス作用物質としての役割を担うことを示している（Pospisilik, J. A.ら、2003年、Diabetes 52：741〜750ページ；Trumper, A.ら、2001年、Mol. Endocrinol. 15：1559〜1570ページ；Ehses, J. A.ら、2003年、Endocrinology 144：4433〜4445ページ；Trumper, A.ら、2002年、J. Endocrinol. 174：233〜246ページ）。よって、膵島サイズに対する（Pro3）GIPの負の効果は、ベータ細胞の減少した増殖と増加したアポトーシスの組み合わせを反映すると考えられる。
【００７２】
図5に示される結果は、GIP-R拮抗薬である（Pro3）GIPの連日投与が、ob/obマウスにおける耐糖能を改善し、かつ、インスリン抵抗性及び膵島の構造と機能の異常を改善することを初めて証明した。特に、これらの効果は、9日間の（Pro3）GIPの中断によって覆された。あらゆる明らかな副作用が存在しないことは、正常なマウス（Irwin, N.、2004年、Biol. Chem. 385：845〜852ページ）及び生まれた時からGIP-R欠損症の遺伝的に作り上げられたマウス（Miyawaki, K.ら、2002年、Nat. Med. 8：738〜742ページ）における以前の観察とも一致する。当該観察は、肥満性インスリン抵抗性糖尿病の発症における内因性GIPの主要な役割を挙げている。より重要なことに、前記データは、GIP-R拮抗薬、例えば（Pro3）GIPがインスリン抵抗性の軽減を通して肥満性2型糖尿病を治療するための新規の、生理学的、かつ、有効な手段を提供することを示す。
【００７３】
実施例6において、2つの新規の長時間作用型のN末端で修飾されたGIPアナログであるN-AcGIP（LysPAL16）及びN-AcGIP（LysPAL37）を開発するために、脂肪酸の誘導体化が使われた。
【００７４】
分解研究は、ジペプチジル・ペプチダーゼIV（DPP IV）を用いて実行された。サイクリックAMP産生は、GIPレセプター形質移入CHL線維芽細胞を使って評価された。インビトロにおけるインスリン放出は、BRIN-BD11細胞において評価された。急性及び慢性ペプチド投与に対するインスリン分泌促進及び血糖反応は、肥満性糖尿病（ob/ob）マウスにおいて評価された。
【００７５】
GIPとは対照的に、どちらのアナログもDPP IV分解に対する抵抗性を示した。前記アナログは、サイクリックAMP産生も同様に刺激し、そして対照と比べて有意に改善されたインビトロにおけるインスリン分泌を示した。ob/obマウスにおけるグルコースと一緒のN-AcGIP（LysPAL16）又はN-AcGIP（LysPAL37）の投与は、GIPと比べて血糖可動域を大幅に減少させ、かつ、インスリン分泌促進反応を改善した。N-AcGIP（LysPAL37）を用いた用量−反応研究は、たとえ6.25nmoles/kgでも、血糖可動域全体の極めて大幅な減少と、循環インスリンの増加を明らかにした。14日間にわたるN-AcGIP（LysPAL37）によるob/obマウスの1日1回の注射は、生理的食塩水又は天然のGIPと比べて、血漿グルコースを大幅に減少させ、ヘモグロビンを糖化し、そして耐糖能を改善した。グルコースに対するインスリン反応の顕著な増大とインスリン感受性の注目すべき改善と一緒に、血漿及び膵臓インスリンが大幅に増加した。GIPレセプター脱感作に関する証拠は見つからず、そしてN-AcGIP（LysPAL37）の代謝効果は、摂食又は体重のあらゆる変化と無関係であった。
【００７６】
これらの結果は、新規の、脂肪酸を誘導体化しN末端で修飾したGIPアナログ、例えばN-AcGIP（LysPAL37）が2型糖尿病の治療に関して重要な可能性を持っているかもしれないことを示す。
【００７７】
腎クリアランスとGIPの酵素分解の両方に対抗するための1つのアプローチは、N末端修飾と共に脂肪酸誘導体化の利用に関係する。脂肪酸誘導体化が、インスリン（Kurtzhals, P.ら、1995年、Biochem. J. 312：725〜731ページ）及び姉妹インクレチン・グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）（Knudsen, L. B.ら、2000年、J. Med. Clielit. 43：1664〜1669ページ；Green, B. D.ら、2004年、Biol. Chem. 385：169〜177ページ；Kim, J. G.ら、2003年、Diabetes 52：751〜759ページ）の半減期を延長することは先に示された。DPP IVに対して著しい抵抗性を示す、多数の、N末端で修飾されたGIPアナログが開発された（Hinke, S. A.ら、2002年、Diabetes 51：656〜661ページ；Gault, V. A.ら、2002年、Biochem. J. 367：913〜920ページ；Gault, V. A.ら、2003年、J. Endocrinol. 176：133〜141ページ；O'Harte, F. P. M.ら、1999年、Diabetes 48：758〜765ページ）。これらの、最も特に、アセチル、グルシトール、ピログルタミル、又はFmoc付加物の付加を伴うGIPのTyr1で修飾されたものの中のいくつかが、インビトロにおけるGIPレセプターにおいて高められた活性を示する（Gault, V. A.ら、2002年、Biochem. J. 367：913〜920ページ；O'Harte, F. P. M.ら、1999年、Diabetes 48：758〜765ページ；O'Harte, F. P. M.ら、2002年、Diabetologia 45：1281〜1291ページ）。分解抵抗性及び高められた細胞活性の結果として、これらのアナログは、肥満症−糖尿病の動物に対して急性的に投与された時に、高められ、かつ、延長された抗高血糖活性及びインスリン放出活性を示す（Hinke, S. A.ら、2002年、Diabetes 51：656〜661ページ；Gault, V. A.ら、2002年、Biochem. J. 367：913〜920ページ；Gault, V. A.ら、2003年、J. Endocrinol. 176：133〜141ページ；O'Harte, F. P. M.ら、1999年、Diabetes 48：758〜765ページ；O'Harte, F. P. M.ら、2002年、Diabetologia 45：1281〜1291ページ）。これらのうち、N-AcGIPが、大幅に血漿インスリン反応を増大させ、かつ、ob/obマウスに対するグルコースの結合投与に続く血糖可動域を縮小させる最も有効なDPP IV抵抗性アナログとして浮上した（O'Harte, F. P. M.ら、2002年、Diabetologia 45：1281〜1291ページ）。
【００７８】
実施例6は、新規の第2世代の脂肪酸を誘導体化した、N-末端で修飾されたN-AcGIPアナログである、N-AcGIP（LysPAL16）及びN-AcGIP（LysPAL37）の代謝安定性、生理活性、及び抗糖尿病性の潜在能力を評価するために設計された。どちらのGIPアナログもN末端（Tyr1）アセチル基と組み合わせて、16位又は37位のLysのイプシロンアミノ基に連結したC-16パルミタート基を含む（O'Harte, F. P. M.ら、2002年、Diabetologia 45：1281〜1291ページ）。DPP IV分解に対する相対的安定性、インスリン分泌、及びサイクリックAMP特性は、肥満性糖尿病ob/obマウスにおける急性反応及び用量反応の研究と一緒にインビトロにおいて調査される。最も有効なアナログであるN-AcGIP（LysPAL37）が、グルコース恒常性、膵ベータ細胞機能、及びインスリン感受性について評価前に14日間、1日1回の腹腔内注射によりob/obマウスに投与される。高められた濃度のN-AcGIP（LysPAL37）への長期曝露によるGIPレセプター作用の可能性のある脱感作も同様に調査された。その結果は、2型糖尿病の治療のための可能性のある治療薬としての新規の第2世代のN末端でアセチル化されたGIPアナログであるN-AcGIP（LysPAL37）の詳しい裏付けを示す。
【００７９】
それらの多くの特質にもかかわらず、それらの天然の対応物のように、GIP及びGLP-1のDPP IV抵抗性アナログは、依然として腎臓の濾過にさらされている。この問題を回避するために、GLP-1作用の持続時間を改善するのに脂肪酸誘導体化が使われた（Knudsen, L. B.ら、2000年、J. Med. Chem. 43：1664〜1669ページ；Green, B. D.ら、2004年、Biol. Chem. 385：169〜177ページ；Kim, J. G.ら、2003年、Diabetes 52：751〜759ページ）。胃内容排出の減速のためだと思われる吐き気の促進への傾向にもかかわらず、最も期待できるアナログであるNN2211（リラグルチド）が、2型糖尿病の対象の血糖制御を改善するのに有効であると思われる（Agerso, H.ら、2002年、Diabetologia 45：195〜202ページ）。
【００８０】
実施例6は、2つの特定の修飾、すなわちN末端アセチル化とC末端脂肪酸誘導体化を天然のGIPホルモンに導入した結果について説明する。N末端アセチル化は、DPP IVに対する安定性を大幅に高めるために先に記載のように利用された（O'Harte, F. P. M.ら、2002年、Diabetologia 45：1281〜1291ページ）。対照的に、循環タンパク質に結合することによって生物学的な半減期を延長するために、Lys6又はLys37イプシロンアミノ基でのC-16パルミタート残基の結合が導入された（Kurtzhals, P.ら、1995年、Biochem. J. 312：725〜731ページ）。天然のペプチドと異なり、どちらのGIPアナログもDPP IVによる酸素的分解に対して完全に抵抗性であると思われ、N-AcGIPを用いた先の観察を裏付けた（O'Harte, F. P. M.ら、2002年、Diabetologia 45：1281〜1291ページ）。さらに、どちらのアナログも、インビトロにおける細胞系で試験される時、天然のGIP及びN-AcGIPに類似した又はわずかに優れたインスリン放出及びサイクリックAMP産生の特性を示した（O'Harte, F. P. M.ら、2002年、Diabetologia 45：1281〜1291ページ）。
【００８１】
脂肪酸誘導体化GIPアナログのインビボにおける抗高血糖及びインスリン分泌促進の潜在能力を評価するために、肥満性糖尿病（ob/ob）マウスが利用された。ob/ob症候群は、過食症、著しい肥満症、中程度の高血糖、及び重度の高インスリン血症を示す広く研究された、自然発症の肥満症及び糖尿病のモデルである（Bailey, C. J.ら、1982年、Int. J. Obesity 6：11〜21ページ）。前の研究で説明されるように（Gault, V. A.ら、2002年、Biochem. J. 367：913〜920ページ；Gault, V. A.ら、2003年、J. Endocrinol. 176：133〜141ページ）、天然のGIPは、この突然変異動物モデルの重度のインスリン抵抗性を反映して、ob/obマウスにおいて血糖可動域をやや減少させただけであった（Bailey, C. J.ら、1982年、Int. J. Obesity 6：11〜21ページ）。著しく対照的に、アナログがその上Lys16又はLys37にてパルミタート分子でさらに置換された両方のN-アセチル化GIP（N-AcGIP（LysPAL16）及びN-AcGIP（LysPAL37））は、天然のペプチドと比べての血漿グルコース・レベルを有意に降下させた。これは、特にN-AcGIP（LysPAL37）の場合に、有意に高められたインスリン放出活性によって達成された。十分に低い血漿グルコースにもかかわらず、60分での両方の脂肪酸誘導体化GIPアナログに対する有意に持続的なインスリン分泌促進反応は、延長された血漿中の半減期を示す。これは、両方のパルミタート誘導体化GIPアナログが血清アルブミンに結合し、それにより腎臓によるそれらのクリアランスを有意に害したためであるかもしれない（Meier, J. J.ら、2004年、Diabetes 53：654〜662ページ）。しかし、新規GIPアナログに関する高感度、かつ、特異的な免疫学的測定法の確立を含むさらなる研究が、そのような作用を確認するために必要とされる。
【００８２】
N-AcGIP（LysPAL37）は、インビボにおいてN-AcGIP（LysPAL16）を上回るより持続的な、有意に高められたインスリン放出効力を示す最良の脂肪酸誘導体化アナログであるように思われた。N-AcGIP（LysPAL37）の増強された効力の原因は、はっきりしないままであるが、1つの説明は延長された半減期である。もう1つの可能性は、そのペプチドのC末端により近いLysに連結した脂肪酸鎖は、N末端に配置されていることが知られているその分子の生理活性部位に対する有害な影響があまりない可能性があるのかもしれない（Gault, V. A.ら、2002年、Biosei. Rep. 22：523〜528ページ；Hinke, S. A.ら、2001年、Biochim. Biophys. Acta 1547：143〜55ページ；Manhart, S.ら、2003年、Biochemistry 42：3081〜3088ページ）。しかし、2つのパルミタート置換されたアナログのインビトロにおける生理活性の間の類似点は、これを起こりにくくする。
【００８３】
N-AcGIP（LysPAL37）がインビボにおいて2つのアナログの中でより強力だったので、それが用量反応研究でさらに利用された。2型糖尿病の対象で時々観察されるように、天然のGIP自体がob/obマウスにおいて非常にわずかな影響しか与えないことを考慮すること（Nauck, M. A.ら、1993年、J. Clin. Invest. 91：301〜307ページ；Meier, J. J.ら、2004年、Diabetes 53：220〜224ページ；Vilsbll, T.ら、2002年、Diabetologia 45：1111〜 1119ページ）、N-AcGIP（LysPAL37）が、最も低い用量の6.25nmoles/kgであっても、グルコースと投与される時に、有意なグルコース降下活性及びインスリン分泌促進活性を示したとは注目すべきことである。N-AcGIP（LysPAL37）がアルブミン結合にさらされることを考慮すれば、それが低い濃度であっても高度に生物学的に活性なままであるという事実は、著しい効力を示唆する。
【００８４】
腹腔内注射（12.5nmoles/kg）による若年成体ob/obマウスへのN-AcGIP（LysPAL37）の連日投与は、14日までに血漿グルコース濃度の漸進的な降下及び糖化モグロビンの有意な減少をもたらした。これは耐糖能の大幅な改善に関係した。重要なことに、グルコース恒常性の改善が単なる体重減少の結果にすぎないという可能性を排除して、食物摂取量と体重は変化しなかった。これらの観察は、N-AcGIP（LysPAL37）が研究期間にわたり摂食に影響するあらゆる不都合で有毒な作用を及ぼさなかったことも同様に示す。これは、GIPが胃内容排出を抑制しないことを示す最近の研究と一致している（Meier, J. J.ら、2003年、Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286：621〜625ページ）。14日間のob/obマウスへの天然GIPの連日投与は、あらゆる指標計測に対しても効果がなく、インビボにおける天然のGIPの非常に短い半減期と一致した。
【００８５】
期待どおり、N-AcGIP（LysPAL37）の有益な作用の主要成分は、ベータ細胞への効果に関係した。よって、研究される年齢にて、天然のGIPはob/obマウスにおけるインスリン分泌に対する弱い刺激物質であるが、新規脂肪酸誘導体化アナログを与えられたob/obマウスにおいて血漿及び膵臓インスリン濃度が上昇した。これは、プロインスリン遺伝子発現のプロモーターとしてのGIPの作用と一致し（Wang, Y.ら、1996年、Mol. Cell. Endocrinol. 116：81〜87ページ）、そして糖尿病のこの動物モデルにおいてN末端で修飾されたGIPアナログについて報告された増強された効力を実証する（Hinke, S. A.ら、2002年、Diabetes 51：656〜661ページ；Gault, V. A.ら、2002年、Biochem. J. 367：913〜920ページ；Gault, V. A.ら、2003年、J. Endocrinol. 176：133〜141ページ；O'Harte, F.P.M.ら、1999年、Diabetes 48：758〜765ページ；O'Harte, F.P.M.ら、2002年、Diabetologia 45：1281〜1291ページ）。さらに、グルコースに対するインスリン反応は、N-AcGIP（LysPAL37）を与えられたob/obマウスにおいて有意に高められた。膵ベータ細胞グルコース反応性を増強させるか又は回復させるこの能力は、同じようにGLP-1で観察された（Holz, G. G.ら、1993年、Nature 28：362〜365ページ；Flamez, D.ら、1998年、Diabetes 47：646〜652ページ）。血糖制御に関する観察結果と同様に、これらの特質のいずれもが天然のGIPの連日注射によって再現されなかった。
【００８６】
14日間の処置後に実施したインスリン感受性試験の結果は、N-AcGIP（LysPAL37）によってob/obマウスにおいて達成された糖尿病状態の改善がインスリン分泌の増強作用によるだけではなかったことを示す。よって、これらの動物は、GIP又は生理的食塩水で処置した群と比べてインスリン感受性の有意な改善も同様に示した。高インスリン血症がインスリン受容体機能の下方制御であると一般に考えられていることを考慮すると（Marshall, S.ら、1981年、Diabetes 30：746〜753ページ）、これは、N-AcGIP（LysPAL37）が他の代償効果を発揮しうることを示唆する。この側面を評価するためにさらなる研究が必要であるが、しかし、可能性は、逆調節ホルモンの阻害、並びに膵臓以外の部位、例えば筋肉、脂肪組織、及び肝臓に対する効果を含む（Morgan, L. M.ら、1996年、Biochem. Soc. Trans. 24：585〜591ページ；O'Harte, F. P. M.ら、1998年、J. Endocrinol. 156：237〜243ページ；Yip, R. G.ら、1998年、Endocrinology 139：4004〜4007ページ）。
【００８７】
N-AcGIP（LysPAL37）の抗高血糖効果に寄与するあらゆる作用の所見にかかわらず、GIP又はGLP-1の安定なアナログによる長期治療に関する現在想定される問題は、ホルモン・レセプター作用の脱感作に関係する（Delmeire, D.ら、2004年、Biochem. PharmacoL 68：33〜39ページ）。これは、ラットにおける膵ベータ細胞のGIPへの長期曝露中に観察されたが（Tseng, C. C.ら、1996年、Am. J. Physiol. 270：E661〜E666ページ）、14日間のN-AcGIP（LysPAL37）による処置がN-AcGIP（LysPAL37）のグルコース降下又はインスリン放出作用を損なわせたという証拠はなかった。よって、N-AcGIP（LysPAL37）の抗糖尿病性作用は、上記アナログがグルコースと一緒に急性的に投与された時に、疑いもなく明白だった。さらに、そのような実験におけるN-AcGIP（LysPAL37）の急性効果は、14日間のN-AcGIP（LysPAL37）、天然のGIP、又は生理的食塩水のいずれかの注射を受けたob/obマウス群において同一であった。
【００８８】
そのようなデータは、N-AcGIP（LysPAL37）に対する長期露出がob/obマウスにおける先天的なGIPレセプターの脱感作を誘発せず、かつ、恐らく克服することがないことをはっきりと示す。これらの肥満性糖尿病齧歯動物におけるGIPの高い循環濃度を考慮すると（Flatt, P. R.ら、1983年、Diabetes 32：433〜435ページ；Flatt, P. R.ら、1984年、J. Endocrinol. 101：249〜256ページ）、ob/obマウスにおいて明らかなGIPに対するベータ細胞の無反応性を、GIPの不適切な分泌及び代謝による単純なレセプター脱感作に結び付けたくなる。
【００８９】
本明細書中に示されたデータは、37位にてLysに連結したパルミタート基を担持するN末端でアセチル化されたGIPが、一般に利用される肥満症−糖尿病の動物モデルにおいて、DPP IVに対する抵抗性、並びに強力、かつ、長期作用性のグルコース降下活性によって明らかになる生理活性の目覚しい特性を示すことを証明した。この活性特性は、2型糖尿病1日1回の治療のための長期作用性の脂肪酸誘導体化N末端修飾GIPアナログの開発に大きな励みを与える。
【００９０】
当該発明のペプチド・アナログは、糖尿病、2型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン抵抗性メタボリック症候群（シンドロームX）、及び肥満症を含めたインスリン・レベルの不適当な調節に起因する病気及び状態を治療するのに使用する。
【００９１】
当該発明の方法によって製造されたペプチド・アナログは、そのアナログが医薬として許容される担体と組み合わせられる医薬組成物の状態で使用されることができる。そのような組成物は、（前記アナログ及び担体に加えて）、希釈剤、増量剤、塩、緩衝物質、安定化剤、可溶化剤、及び当該技術分野で周知の他の材料も同様に含んでもよい。用語「医薬として許容される」は、有効成分の生理活性の有効性を妨げない無毒の材料を意味する。前記担体の特徴は投与経路に依存する。
【００９２】
医薬組成物の状態で、又は当該発明の方法を実施するために使用される当該発明のペプチド・アナログの投与は、種々の従来法で、例えば、経口摂取、吸入、局所適用、又は皮膚、皮下、腹腔内、腸管外、又は静脈内の注射によって実施されることができる。投与は、内的又は外的なものであることができ；そして、局所的（local, topical）又は全身的であることができる。
【００９３】
本願発明のペプチド・アナログを含む組成物は、例えば、単位用量の注射として静脈内に投与されることができる。当該発明の治療用組成物に関して使われる時、用語「単位用量」は、対象のために単位投薬量として好適な物理的に別個の単位を表し、各々の単位が必要とされる希釈剤、すなわち担体又は媒体と関連して所望の治療的効果を引き起こすように計算された活性物質の所定の分量を含む。
【００９４】
非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝物質、静菌薬、及び対象とする受益者の血液で当該製剤を等張にする溶質を含みうる水性又は非水性の無菌注射液；並びに懸濁化剤及び増粘剤を含みうる水性又は非水性の無菌懸濁液を含む。製剤は、単位用量又は複数回用量の容器、例えば密閉されたアンプル及びバイアル内に提供されてもよく、そして使用直前に無菌の液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とする冷凍乾燥（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。
【００９５】
即席の注射液及び懸濁剤は、先に記載された種類の無菌の粉末、顆粒、及び錠剤から調製できる。
【００９６】
治療上有効量の当該発明の組成物が経口投与される時、当該発明の組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、又はエリキシル剤の形態である。錠剤の形態で投与される時、本発明の医薬組成物は、固形の担体、例えばゼラチン又はアジュバントをさらに含んでもよい。錠剤、カプセル剤、及び散剤は、約5〜95%の当該発明のタンパク質、そして好ましくは約25〜90%の当該発明のタンパク質を含む。液体形態で投与される時、液体担体、例えば水、石油、動物又は植物起源の油、例えばピーナッツ油、鉱油、ダイズ油、若しくはゴマ油、又は合成油が加えられてもよい。前記医薬組成物の液体形態は、生理的食塩水溶液、デキストロース又は他のサッカリド溶液、あるいはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコールをさらに含んでもよい。液体形態で投与される時、前記医薬組成物は、約0.5〜90重量%の当該発明の組成物、そして好ましくは約1〜50%の当該発明の組成物を含む。
【００９７】
治療上有効量の、当該発明の組成物が静脈注射、皮膚注射、又は皮下注射によって投与される時、当該発明の組成物は、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形態である。pH、等浸透圧、安定性などを十分に考慮した、そのような非経口的に許容されるタンパク質溶液の調製は、当業者の範囲内にある。静脈内注射、皮膚注射、又は皮下注射のための好ましい医薬組成物は、当該発明の組成物に加えて等張の媒体、例えば塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、デキストロース注射剤、デキストロース及び塩化ナトリウム注射剤、乳酸加リンゲル注射剤、又は当該技術分野で知られている他の媒体を含むべきである。当該発明の医薬組成物は、安定化剤、防腐剤、緩衝物質、抗酸化剤、又は当業者に知られている他の添加剤も同様に含んでもよい。
【００９８】
持続性放出又は徐放性放出デリバリー・システムの使用も同様に含まれる。本明細書において、徐放性放出マトリックスは、酸素又は酸/塩基加水分解、あるいは溶解によって分解可能な材料、通常ポリマーで作製されるマトリックスである。いったん体内に挿入されれば、前記マトリックスは、酵素と体液による作用を受ける。徐放性放出マトリックスは、望ましくは、生体適合材料、例えばリポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド・コグリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）、ポリアンヒドリド、ポリ（オルト）エステル、ポリタンパク質、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、及びシリコーンから選ばれる。好ましいの生物分解性マトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリド、又はポリラクチド・コグリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）のいずれか1つのマトリックスである。
【００９９】
治療用組成物は、その中に、例えば無機酸又は有機酸によって生み出されうる医薬として許容される前記成分の塩を含むことができる。「医薬として許容される塩」は、正しい医学的判断の範囲内で、過度の中毒性、過敏、アレルギー反応などなしにヒト及び下等動物の組織との接触状態での使用に好適であり、かつ、妥当な利益／危険性の割合に見合っているそれらの塩を意味する。医薬として許容される塩は、当該技術分野で周知である。例えば、S. M. Berge.らは、その全体が本明細書中に援用されるJ. Pharmaceutical Sciences（1977）66：1ページ以下参照の中で詳細に医薬として許容される塩を説明している。医薬として許容される塩は、無機酸、例えば塩化水素又はリン酸、又は酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成される（ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される）酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基で形成された塩は、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基によっても同様に生み出されうる。前記塩は、本発明の化合物の最後の単離及び精製中に現場で、又は遊離塩基性官能基を好適な有機酸と反応させることによって独立して調製してもよい。代表的な酸付加塩は、これだけに制限されることなく、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシメタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸、ニコチン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、及びウンデカン酸塩を含む。また、塩基性窒素含有基は、例えばメチル、エチル、プロピル、及びブチルの塩化物、臭化物、及びヨウ化物のような低級ハロゲン化アルキル；ジメチル、ジエチル、ジブチル、及びジアミルの硫酸塩のようなジアルキルの硫酸塩；長鎖ハロゲン化合物、例えばデシル、ラウリル、ミリスチル、及びステアリルの塩化物、臭化物、及びヨウ化物；ベンジル及びフェネチルの臭化物などのようなハロゲン化アリールアルキルのような作用物質を用いて四級化されることができる。水又は油に溶解性又は分散性の産物がそれによって得られる。医薬として許容される酸付加塩を形成するために利用されうる酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、及びリン酸のような無機酸、並びにシュウ酸、マレイン酸、コハク酸、及びクエン酸のような有機酸を含む。
【０１００】
本明細書において、用語「医薬として許容される」、「生理学的に容認される」、及びその文法上の変形体は、それらが組成物、担体、希釈剤、及び試薬を表す場合、互換的に使用され、そして最小限の好ましくない生理学的な効果、例えば吐き気、めまい、胃の不調などだけで哺乳動物に又はその表面に投与が可能である物質を表す。その中に溶かされたか又は分散された有効成分を含む薬学的組成物の調製は、当該技術分野で十分に理解されていて、処方に基づいて限定される必要はない。通常、そのような組成物は、溶液又は懸濁液のような注射剤として調製されるが、しかし使用前に液体を使った溶液又は懸濁液のために好適な固体形態も同様に調製されることができる。調製品も同様に乳化されることができる。
【０１０１】
前記有効成分は、医薬として許容され、かつ、有効成分に適合する賦形剤と、そして本明細書中に記載の治療方法における使用に好適な量で混合されることができる。好適な賦形剤は、例えば水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、又はその組み合わせ物を含む。さらに、所望であれば、前記組成物は、その有効成分の有効性を高める少量の補助物質、例えば湿潤剤若しくは乳化剤、pH緩衝剤などを含むことができる。
【０１０２】
当該発明の医薬組成物中の当該発明のペプチド・アナログの量は、治療される状態の性質及び重さに、その患者が受けた事前治療の性質、並びに障害のタイプ、個人の年齢、性別、病状を含めたその他の種々の要素に依存する。結局、担当医が、それぞれの個人の患者を治療するためのアナログの量を決定する。初めに、担当医は、低用量のペプチド・アナログを投与して、患者の反応を観察する。前記患者について最善の治療効果が得られるまでペプチド・アナログのより大きな用量が投与されることができ、その時点で投薬量がさらに増やされることはない。
【０１０３】
投薬量の決定方法に対する追加の手引きは、標準的な参考文献、例えばSpilker, Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd. , New York、1984年、7〜13ページ及び54〜60ページ；Spilker, Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd., New York、1991年、93〜101ページ；Craigら、Modern Pharnaacology、第2版、Little Brown and Co., Boston、1986年、127〜133ページ；Speight, Aoeiy's Dnug Treatnaent：Principles and Practices of Clinical Pharmacology and Therapeutics、第3版、Williams and Wilkins, Baltimore、1987年、50〜56ページ；Tallaridaら、Principles in General Phamacology, Springer-Verlag, New York、1998年、18〜20ページ；並びにOlson, Clinical Pharsnacology Made Ridiculously Simple, MedMaster, Inc., Miami、1993年、1〜5ページの中に見ることができる。
【実施例】
【０１０４】
実施例1：N末端で修飾されたGIP及びそのアナログの調製
GIPのN末端修飾は、原則的に3段階の方法である。まず第一に、自動ペプチド合成機（Applied Biosystems, California, USA）を用いて、GIPを、（Fmoc-Gln（Trt）-Wang樹脂（Calbiochem Novabiochem, Beeston, Nottingham, UK）から始めて）そのC末端から最後から二番目のN末端アミノ酸（Ala2）に至るまで合成する。前記合成は、標準的なFmocペプチド化学プロトコールに従う。第二に、天然のGIP（Tyr）のN末端アミノ酸を、Fmoc保護されたTyr（tBu）-Wang樹脂として手動バブラー・システムに加える。このアミノ酸を、そのN末端で脱保護し（DMF中のピペリジン（20%v/v））、そしてその反応を完了させるために必要に応じて最長で24時間まで高濃度のグルコース（糖化、水素化シアノホウ素ナトリウムを用いて還元条件下にて）、無水酢酸（アセチル化）、ピログルタミン酸（ピログルタミル）などと反応させる。反応の完全性を、利用可能な遊離のα-アミノ基の存在を決定するニンヒドリン試験を使って監視する。第三に（いったん反応が完成すれば）、ここで構造的に修飾されたTyrを、Wang樹脂から切断し（95%のTFA及び5%の適当なスカベンジャ。注意：Tyrは問題があるアミノ酸であるとみなされており、特別な配慮を必要とするかもしれない）、それ故に、必要量のN末端で修飾されたTyrを、合成を実行する自動ペプチド合成機に直接加え、それよってN末端で修飾されたTyrをGIP（Ala2）のαアミノにとじ合わせて、GIPアナログの合成を完了する。このペプチドを、（前述のとおり）Wang樹脂から切り離し、そして標準的なブフナー濾過、沈殿、ロータリー・エバポレータによる留去、及び乾燥技術を使って仕上げる。
【０１０５】
実施例2：Tyr1-グルシトールGIPの調製及びインビボにおけるその特性
以下の実施例は、インビボにおけるその抗高血糖及びインスリン放出特性についての評価と一緒にTyr1グルシトールGIPの調製を調査する。その結果は、この新規GIPアナログが天然のGIPと比べて大幅なアミノペプチダーゼ分解への抵抗性と増強されたグルコース降下活性を示すことをはっきりと証明する。
【０１０６】
調査の設計及び方法
材料：ヒトGIPをAmerican Peptide Company（Sunnyvale, California, USA）から購入した。HPLC用アセトニトリルを、Rathburn（Walkersburn, Scotland）から入手した。配列決定用トリフルオロ酢酸（TFA）を、Aldrich（Poole, Dorset, UK）から入手した。デキストランT-70、活性炭、水素化シアノホウ素ナトリウム、及びウシ血清アルブミン・フラクションVを含めたその他の化学薬品の全てを、Sigma（Poole, Dorset, UK）から購入した。ジプロチンA（DPA）をCalbiochem-Novabiochem（UK）Ltd.（Beeston, Nottingham, UK）から購入し、RIAのためのラット・インスリン標準をNovo Industria（Copenhagen, Denmark）。逆相Sep-Pakカートリッジ（C-18）を、Millipore-Waters（Milford, MA, USA）から購入した。これらの実験で使われた全ての水を、Milli-Q浄水システム（（Millipore Corporation, Milford, Massachusetts, USA））を使って精製した。
【０１０７】
Tyr1-グルシトールGIPの調製：ヒトGIPを、24時間、pH7.4にて、10mmol/lのリン酸ナトリウム緩衝物質中の還元条件下で、グルコースとインキュベートした。前記反応を、0.5mol/lの酢酸（30μl）の添加によって終了させ、その混合物を、Vydac（C18）（4.6×250mm）分析用HPLCカラム（The Separations Group, Hesperia, California, USA）に適用し、そしてグラジエント溶出条件を、水/TFA及びアセトニトリル/TFA溶媒を使って確立した。糖化ピークに対応するフラクションを溜め合わせ、AES 1000 Speed-Vac濃縮機（Life Sciences International, Runcorn, UK）を使って真空下で乾燥させ、そしてSupelcosil（C-8）（4.6×150mm）カラム（Supelco Inc., Poole, Dorset, UK）によって均質状態まで精製した。
【０１０８】
DPP IVによるGIP及びTyr1-グルシトールGIPの分解：HPLC精製したGIP又はTyr1グルシトールGIPを、50mmol/lのトリエタノールアミン-HCl、pH7.8を用いて500μlに仕上げた反応混合物中、37℃にて様々な時間、DPP-IV（5mU）と共にインキュベートした（ペプチド終濃度は1μmol/l）。酸素反応を、0、2、4、及び12時間後に5μlの10%（v/v）TFA/水の添加によって終了させた。0.12%（v/v）TFAを用いてサンプルを1.0mlの終量に仕上げ、HPLC分析の前に−20℃で保存した。
【０１０９】
ヒト血漿によるGIP及びTyr1-グルシトールGIPの分解：6人の絶食した健康なヒト対象から得た溜め合わせたヒト血漿（20μl）を、50mmol/lのトリエタノールアミン/HCL緩衝物質pH7.8を含む500μlに仕上げた反応混合物中、0及び4時間、GIP又はTyr1-グルシトールGIP（10μg）と共に37℃でインキュベートした。4時間のインキュベーションを、ジプロチンA（5mU）の存在下でも同様に実施した。前記反応を、5μlのTFAの添加によって終了させ、そして0.1%v/vのTFA/水を使って終量を1.0mlに調整した。サンプルを遠心分離機（13,000g、5分)にかけ、そして0.1%（v/v）のTFA/水で前もって準備し、そして洗浄されたC-18 Sep-Pakカートリッジ（Millipore-Waters）にその上清を適用した。20mlの0.12% TFA/水で洗浄した後に、結合物質を、2mlの80%（v/v）アセトニトリル／水での溶出によって放出させ、そしてSpeed-Vac濃縮機（Runcorn, UK）を使って濃縮した。HPLC精製の前に、0.12%（v/v）のTFA/水を用いて量を1.0mlに調整した。
【０１１０】
分解されたGIP及びTyr1-グルシトールGIPのHPLC分析：サンプルを、0.12%（v/v）のTFA/H2Oで平衡化したVydac C-18 wideporeカラムに1.0ml/分の流速で適用した。70%のアセトニトリル中、0.1%（v/v）TFA/H2Oを使って、溶出溶媒中のアセトニトリル濃度を、直線的グラジエントを利用して、15分間で0%から31.5%に、30分間で38.5%に、そして5分間で38.5%から70%に上げた。吸光度を、206nmにて観察し、そしてピーク面積を、モデル2221LKB積分器を使って評価した。手作業で回収したサンプルを、Speed-Vac濃縮機を使って濃度した。
【０１１１】
エレクトロスプレー・イオン化質量分析（ESI-MS）：（DPP IV及び血漿インキュベーションからの）GIP、並びにTyr1-グルシトールGIPの原型を保ったもの及び分解断片を含むESI-MS分析のためのサンプルを、HPLCによってさらに精製した。ペプチドを、100μlの水の中に溶かし（約400pmol）、そしてmicrobore C-18 HPLCカラム（150×2.0mm、Phenomenex, Ltd., Macclesfield, UK）を備えたLCQ卓上質量分析計（Finnigan MAT, Hemel Hempstead, UK）に適用した。（30μlのダイレクト・ループ注入）サンプルを、35%（v/v）アセトニトリル/水のアイソクラチック条件下で0.2ml/分の流速で注入した。質量スペクトルを、四極子イオントラップ質量分析器から得、そして記録した。スペクトルを、150〜2000の質量対電荷（m/z）の範囲にわたる全イオン・スキャン・モードを使って収集した。飛び出した複数の荷電イオン及び以下の方程式：
Mr=iMi−iMh
｛ここで、Mr=分子量；Mi=m/z比；i=電荷数；Mh＝プロトンの質量。｝を使ってGIP及び関連する構造の分子量をESI-MSの特徴から決定した。
【０１１２】
GIP及びTyr1-グルシトールGIPのインビボにおける生理活性：血漿グルコース及びインスリン濃度に対するGIP及びTyr1-グルシトールGIPの効果を、10〜12週齢の雄ウィスターラットを使って調査した。前記動物を、12時間が明／12時間が暗のサイクルを用いた22±2℃に空調管理された部屋の中に個別に収容した。飲料水及び標準的な齧歯動物維持食（Trouw Nutrition, Belfast, Northern Ireland）を自由摂取させた。グルコース単独で（18mmol/kg体重）、あるいはGIP又はTyr1-グルシトールGIP（10nmol/kg）のいずれかと組み合わせての腹腔内注射の前に18時間、食物を撤収した。試験溶液を、8ml/kg体重の終量で投与した。血液サンプルを、0、15、30、及び60分に、覚醒ラットの尾の切断部先端から冷やしたフッ化物／ヘパリン微小遠心管（Sarstedt, Numbrecht, Germany）内に採取した。サンプルを、13,000gで約30秒間、Beckman微小遠心機を使って遠心分離した。血漿サンプルを等分し、そしてグルコース及びインスリンの測定前に−20℃で保存した。全ての動物研究を、動物（科学的処置）法1986に従って行った。
【０１１３】
分析：血漿グルコースを、Beckman Glucose Analyzer II［33］を使った自動ブドウ糖酸化酵素手順によってアッセイした。先に記載のように、血漿インスリンを、デキストラン炭末放射免疫測定によって測定した［34］。曲線下の血漿グルコース及びインスリン面積の増加面積（AUC）を、基準除去法を伴う台形公式［35］を利用したコンピュータ・プログラム（CAREA）を使って計算した。結果を、平均±SEMとして表し：対応のないスチューデントt-検定を使って値を比較した。P＜0.05の場合、データ群は有意に異なるとみなされた。
【０１１４】
DPP IVによるGIP及びTyr1-グルシトールGIPの分解：図1は、GIP（図1a）又はTyr1-グルシトールGIP（図1b）とDPP IVとの0、2、4、及び12時間のインキュベーションから得られる産物のHPLC分離から得られた典型的なピーク特徴を説明する。t=0においてGIP及びTyr1-グルシトールGIPの保持時間は、それぞれ21.93分及び21.75分だった。GIPの分解が、4時間のインキュベーション後にはっきりと分かった（54%原型を保った）、そして12時間までに、原型を保ったGIPの大半（60%）が、21.61分の保持時間を持つ単一の産物に変換された。Tyr1-グルシトールGIPは、2〜12時間のインキュベーションを通してほとんど完全に原型を保ったままだった。分離は、15分間で0%から31.5%のアセトニトリル、30分間で38.5%、そして5分間で38.5から70%のアセトニトリルの直線的グラジエントを使ったVydac C-18カラムによるものだった。
【０１１５】
ヒト血漿によるGIP及びTyr1-グルシトールGIPの分解：図2は、0及び4時間のGIP又はTyr1-グルシトールGIPのヒト血漿とのインキュベーションから得られた産物の一連の典型的なHPLC特徴を示す。22.06分の保持時間を持つGIP（図2a）は、21.74分の保持時間を持つ主な分解ピークの出現を生じさせる、血漿との4時間以内のインキュベーションによって容易に代謝された。対照的に、類似した条件下でのTyr1-グルシトールGIPのインキュベーションは（図2b）、期間中、21.77分の保持時間で観察される単一ピークしか持たない、いずれの検出可能な分解断片ピークの形成も生じなかった。4時間のインキュベーション中のGIPに対するDPP IVの特異的抑制因子であるジプロチンAの添加は、血漿によるペプチドの分解を完全に抑えた。原型を保ったGIP、GIP（3-42）、及びTyr1-グルシトールGIPに相当するピークは示される。特異的DPP IV抑制因子トリペプチドDPAに相当する主なピークは、16〜29分の保持時間で最下部のパネルに表示されている。
【０１１６】
ESI-MSによるGIP分解断片の同定：図3は、ESI-MSを使ったGIP（図3A）、Tyr1-グルシトールGIP（図3B）、及びGIPの主な血漿分解断片（図3C）について得られたモノアイソトピック分子量を示す。分析されるペプチドを、図2に示す血漿インキュベーションから精製した。ペプチドを、100μlの水中に溶かし（約400pmol）、そしてmicrobore C-18 HPLCカラムを備えたLC/MSに適用した。（30μlのダイレクト・ループ注入）サンプルを、35%アセトニトリル／水のアイソクラチック条件下、0.2ml/分の流速で適用した。四極子イオントラップ質量分析器を使って、質量スペクトルを記録した。150〜2000の質量対電荷（m/z）範囲にわたり全イオン・スキャン・モードを使ってスペクトルを収集した。GIP及び関連する構造の分子量（Mr）を、飛び出した複数の荷電イオン、及び以下の方程式Mr=iMi−iMhを使ってESI-MS特徴から判断した。前記ペプチドの正確な分子量（Mr）を、調査の設計及び方法で先に規定されるように方程式Mr=iMi−iMhを使って計算した。スペクトルを平均した後に、飛び出した複数の電荷種（M+3H）3+及びを（M+4H）4+を、それぞれ原型を保ったMrが4981.8及び4983.2Daに相当する1661.6及び1246.8のm/zにてGIPから検出した（図3A）。同じように、Tyr1-グルシトールGIPについて、（M+4H）4+及び（M+5H）5+を、それぞれ、Mrが5146.8及び5146.5Daの原型を保った分子量に相当する1287.7及び1030.3のm/zにて検出した（図3B）。四重荷電GIPとN末端で修飾されたGIP種（163.6Da）の観察された分子量の間の相違は、後者のペプチドがTyr1-グルシトールGIPに相当する単独のグルシトール付加物を含んでいたことを示した。図3Cは、飛び出した複数の荷電種（M+3H）3+及び（M+4H）4+が、それぞれMrが4748.4及び4748Daの原型を保ったものに相当する1583.8及び1188.1のm/zにてGIPの主な断片から検出された（図3C）。これは、ペプチドGIP（3-42）のN末端で切断された形態の理論的質量と一致する。この断片は、DPP IVインキュベーションの主な分解産物でもあった（データ未掲載）。
【０１１７】
血漿グルコース恒常性に対するGIP及びTyr1-グルシトールGIPの効果：図4及び5は、血漿グルコース及びインスリン濃度に対する腹腔内（ip）のグルコース単独（18mmol/kg）（対照群）、並びにGIP又はTyr1-グルシトールGIP（10nmol/kg）と組み合わせたグルコースの効果を示す。
【０１１８】
図4Aは、グルコース単独（18mmol/kg）（対照群）、あるいはGIP又はTyr1-グルシトールGIP（10nmol/kg）のいずれかと組み合わせたグルコースのi.p.後の血漿グルコース濃度を示す。注射時間を矢印（0分）によって示す。図4Bは、注射後0〜60分間の血漿グルコースAUC値を示す。値は、6匹のラットについての平均±SEMである。**P＜0.01、***P＜0.001は、GIP及びTyr1-グルシトールGIPと比較し；†P＜0.05、††P＜0.01は、非糖化GIPと比較した。図5Aは、グルコース単独（18mmol/kg）（対照群）、あるいはGIP又は糖化GIPのいずれかと組み合わせたグルコース（10nmol/kq）のi.p.後の血漿インスリン濃度を示す。注射時間を矢印によって示す。図5Bは、血漿インスリンAUC値を注射後90分まで各々3つの群について計算したものを示す。注射時間を矢印（0分）によって示す。血漿インスリンAUCを、注射後0〜60分間評価する。値は6匹のラットについての平均±SEMである。*P＜0.05、**P＜0.001は、GIP及びTyr1-グルシトールGIPと比較し；†P＜0.05、††P＜0.01は、非糖化GIPと比較した。
【０１１９】
対照群と比べて、血漿グルコース濃度及び曲線下面積（AUC）は、GIP又はTyr1-グルシトールGIPの投与の後で有意に低かった（図4A、B）。さらに、AUCと共に15及び30分の個々の値は、GIPと比べた場合に、Tyr1-グルシトールGIP投与の後で有意に低かった。公表したGIPのインスリン放出特性と一致して、両方のペプチド処置群の血漿インスリン濃度は、グルコース単体の投与後の値と比べて、15及び30分で有意に上昇した（図5A）。AUCとして推定される全体的なインスリン反応は、2つのペプチド処置群についても同様に有意に高かった（図5B）。GIP処置群より低い通常のグルコース濃度にもかかわらず、Tyr1-グルシトールGIPの後の、AUCとして計算される血漿インスリン反応は、GIP後より有意に高かった（図5B）。30分での血漿インスリンの有意な上昇は特に注目すべきものであり、低下した血糖刺激に直面していてもTyr1-グルシトールGIPのインスリンを放出作用がGIPよりもさらに長期化されることを示唆する（図4A、5A）。
【０１２０】
実施例3：GIPの追加のN末端の構造的な修飾
この実施例は、DPPによる及び血漿中の不活化を防ぐGIPの追加のN末端の構造的な修飾の能力、並びにインスリン放出効力及び潜在的な治療的価値におけるそれらの関連した増加をさらに考察する。天然のヒトGIP、糖化GIP、アセチル化GIP、N末端アミノ酸置換を持つ多数のGIPアナログを試験した。
【０１２１】
材料及び方法：高速液体クロマトグラフィー（HPLC）用アセトニトリルをRathburn（Walkersburn, Scotland）から入手した。配列決定用トリフルオロ酢酸（TFA）をAldrich（Poole, Dorset, UK）から入手した。ジペプチジル・ペプチダーゼIVをSigma（Poole, Dorset, UK）から購入し、及びジプロチンAをCalbiochem Novabiochem（Beeston, Nottingham, UK）から購入した。RPMI 1640組織培養培地、ウシ胎仔血清、ペニシリン、及びストレプトマイシンを、全てGibco（Paisley, Strathclyde, UK）から購入した。これらの実験で使われた全ての水をMilli-Q浄水システム（Millipore, Milford, Massachusetts, USA）を使って精製した。使用したその他の化学薬品の全てが、最高純度が入手可能なものであった。
【０１２２】
GIP及びN末端で修飾したGIPアナログの合成：GIP、GIP（Abu2）、GIP（Sar2）、GIP（Ser2）、GIP（Gly2）、及びGIP（Pro3）を、Fmoc-Gln-Wang樹脂を用いて開始する標準的な固相Fmoc手順を使ってApplied Biosystemsの自動ペプチド合成機（モデル432A）により連続して合成した。トリフルオロ酢酸：水、チオアニソール、エタンジチオール（90/2.5/5/2.5、全量20ml/g樹脂）による前記樹脂からの切断に続いて、その樹脂を濾過によって取り除き、そして減圧下で上記濾液の量を減少させた。沈殿物が観察されるまで無水ジエチルエーテルをゆっくり加えた。その沈殿物を低速遠心分離によって採集し、ジエチルエーテル中に再懸濁し、そして再び遠心分離機にかける、この手順を少なくとも5回実施する。その後、そのペレットを、真空内で乾燥させ、Waters Millennium 2010クロマトグラフィーシステム（ソフトウェア・バージョン2.1.5）の逆相HPLCによって純粋であると判断した。N末端糖化及びアセチル化したGIPを、公表されている方法をわずかに変更して調製した。
【０１２３】
実施例2で記載されるように、エレクトロスプレー・イオン化質量分析（ESI-MS）を実施した。実施例2で記載されるように、DPP IV及びヒト血漿によるGIP及び新規GIPアナログの分解を実施した。
【０１２４】
インスリン分泌細胞の培養：BRIN-BD11細胞［30］を、10%（v/v）のウシ胎仔血清、1%（v/v）の抗生物質（100U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン）、及び11.1mMのグルコースを含むRPMI-1640組織培養培地を使って無菌組織培養フラスコ（Corning, Glass Works, UK）中で培養した。LEECインキュベーター（Laboratory Technical Engineering, Nottingham, UK）を使って、前記細胞を5%のCO2及び95%の空気から成る雰囲気中、37℃で維持した。
【０１２５】
インスリン分泌に関する急性試験：実験前に、前記細胞を、トリプシン/EDTA（Gibco）を用いて組織培養フラスコ表面から採集し、24マルチウェルプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）内に1ウェルにつき1.5×105細胞の密度で播種し、そして37℃で一晩、接着させた。インスリン放出に関する急性試験の前に、1.1mMのグルコースを補った1.0mlのクレブス・リンゲル重炭酸イオン緩衝液（115mMのNaCl、4.7mMのKCl、1.28mMのCaCl2、1.2mMのKH2PO4、1.2mMのMgSO4、10mMのNaHCO3、5g/lのウシ血清アルブミン、pH7.4）中、37℃で40分のプレインキュベーションが先行した。GIP又はGIPアナログの濃度範囲（10-13〜10-8M）を伴う2つのグルコース濃度（5.6mMと16.7mM）で、試験インキュベーションを実施した（n=12）。20分のインキュベーションの後に、前記緩衝液を各ウェルから取り出し、そして放射免疫測定［31］によるインスリン測定のためにアリコート（200μl）を使用した。
【０１２６】
統計分析：結果を平均±S.E.M.で表し、そして値を対応のないスチューデントt-検定を使って比較した。P＜05の場合、データ群を有意に異なるとみなした。
【０１２７】
ESI-MSによるGIP及びGIPアナログの構造同定：前記ペプチドのモノアイソトピック分子量を、ESI-MSを使って測定した。スペクトルを平均した後に、飛び出した複数の荷電種（M+3H）3+及び（M+4H）4+を各ペプチドについて検出した。計算した分子量は、合成GIP及びN末端アナログの各々の構造の同一性を立証した。
【０１２８】
DPP-IVによるGIP及び新規GIPアナログの分解：図6〜11は、0、2、4、8、及び24時間のDPP IVと、GIP、GIP（Abu2）、GIP（Sar2）、GIP（Ser2）、糖化GIP、及びアセチル化GIPのインキュベーションから得られる反応産物のHPLC分離から得られる典型的なピーク特徴を説明する。表1に要約された結果は、糖化GIP、アセチル化GIP、GIP（Ser2）が、インビトロにおけるDPP IVによる分解に対して天然のGIPより抵抗性であること示す。これらのデータから、GIP（Sar2）は抵抗性がより低いように思われる。
【０１２９】
【表１】
2008500280.tif 000002
【０１３０】
ヒト血漿によるGIP及びGIPアナログの分解：図12〜16は、0、2、4、8、及び24時間のヒト血漿と、GIP及びGIPアナログのインキュベーションから得られる代表的な一連のHPLC特徴を示す。DPAの存在下での24時間のインキュベーション後にも同様に観察を行なった。表2に要約されるこれらの結果は、DPP IVインキュベーションとほぼ同程度であったが、しかしインビボの条件をより一層厳密に反映する条件は酵素的にあまり厳正ではない。GIPは血漿によって急速に分解された。相対的に、DPP IVデータから試験したペプチドの中で抵抗性が最も低いように思われたGIP（Sar2）を含めて試験した全てのアナログが、血漿分解に対して抵抗性を示した。DPAは、GIP（Abu2）、GIP（Ser2）、及び糖化GIPの場合には分解の完全な廃止を伴い、大幅にGIP及び試験した全てのアナログの分解を抑制した。これは、DPP IVがインビボにおけるGIPの分解の主な要因であることを示す。
【０１３１】
【表２】
2008500280.tif 000003
【０１３２】
インスリン分泌に対するGIP及び新規GIPアナログの用量依存的効果：図17〜30は、5.6及び16.7mMのグルコースでのBRIN-BD11細胞からのインスリン分泌に対するGIP、GIP（Abu2）、GIP（Sar2）、GIP（Ser2）、アセチル化GIP、糖化GIP、GIP（Gly2）、及びGIP（Pro3）の濃度範囲の効果を示す。天然のGIPは、インスリン分泌の顕著な、かつ、用量に依存した刺激を引き起こした。先の研究［28］と一致して、糖化GIPアナログは、天然のペプチドと比べて大幅に大きなインスリン分泌促進反応を示した。N末端アセチル化GIPは類似したパターンを示し、そしてGIP（Ser2）アナログも同様に強い反応を引き起こした。これらの試験から、GIP（Gly2）とGIP（Pro3）は、インスリン放出の点で最も効能の少ないアナログであるように思われた。試験されたその他の安定なアナログ、すなわちGIP（Abu2）及びGIP（Sar2）は、グルコース濃度及び利用された用量に依存した複雑なパターンの反応性を示した。よって、非常に低い濃度は、高血糖条件（16.7mMのグルコース）下で非常に効能があった。これは、これらのアナログでさえ、インビボにおける分解と組み合わされたインスリン分泌促進能力がペプチド効力に影響する2型糖尿病の治療において治療として有用であると証明できることを示唆する。
【０１３３】
実施例4：肥満症に関係するインスリン抵抗性及び合併した耐糖能障害を改善するGlu3が置換されたGIP
この実施例は、Glu3が置換された形態のGIP、すなわち（Pro3）GIPを使ったGIPレセプター拮抗作用、並びに肥満症に関係するインスリン抵抗性及び合併した耐糖能障害を調査する。
【０１３４】
細胞株及び動物：インビトロにおけるインスリン分泌を、クローン化膵ベータ細胞株BRIN-BD11（McClenaghan, N. H.ら、1996年、Diabetes 45：1132〜1140ページ）を使って評価した。インビトロにおけるサイクリックAMP産生を、ヒトGIPレセプター（Gremlich, S.ら、1995年、Diabetes 44：1202〜1208ページ）を安定に形質移入されたチャイニーズハムスター肺（CHL）線維芽細胞を使って計測した。インビボにおける研究を、8〜12週齢の肥満性糖尿病ob/obマウス（Bailey C. J.ら、1982年、Int. J. Obesity 6：11〜21ページ）及び正常な対照マウスで実施した。
【０１３５】
ペプチド合成及び特徴づけ：Glu3が置換されたアナログを、前もって添加したFmoc-Gln-Wang樹脂から、標準的な固相Fmocペプチド化学（Fields, G. B.ら、1990年、Int. J. Pept. Protein Res. 35：161〜214ページ）を使ってApplied Biosystemsの自動ペプチド合成機（モデル432A）により連続して合成した。その合成ペプチドを、Waters Millenium 2010クロマトグラフィー・システム（ソフトウェア・バージョン2.1.5）の逆相HPLCによって純粋であると判断した。精製したペプチド・アナログの分子量を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間（MALDI-TOF）質量分析を使って測定した。サンプルを、10μlのH2O中に溶かし（約40pmol/l）、ステンレス・サンプル・プレート上に置いて、そして室温で乾燥させた。その後、サンプルを、アセトニトリル／エタノール（1/1）中でマトリックス溶液（10mg/mlのα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸溶液）と混合し、そして室温で乾燥させた。その後、分子量を、相対的なピーク強度に対する質量対電荷（m/z）比として記録し、そしてVoyager-DE BioSpectrometry Workstation（PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, USA）による理論値を使って比較した。
【０１３６】
組織培養：ヒトGIPレセプターを安定に形質移入されたチャイニーズハムスター肺（CHL）線維芽細胞を、10%（v/v）のウシ胎仔血清、1%（v/v）の抗生物質（100U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン）を含むDMEM組織培養培地中で培養した。BRIN-BD11細胞を、10%（v/v）のウシ胎仔血清、1%（v/v）の抗生物質（100U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン）を含むRPMI-1640組織培養培地を使って培養した。LEECインキュベーター（Laboratory Technical Engineering, Nottingham, UK）を使って、細胞を5%のCO2及び95%の空気から成る雰囲気中、37℃にて無菌の組織培養フラスコ（Corning Glass Works, Sunderland, UK）内で維持した。
【０１３７】
インスリン放出に関する急性試験：BRIN-BD11細胞からのインスリン放出を、細胞単層を使って測定した（McClenaghan, N. H.ら、1996年、Diabetes 45：1132〜1140ページ）。細胞をトリプシン/EDTA（Gibco）を用いて採集し、1ウェルにつき1.0×105細胞の密度で24マルチウェルプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）内に播種し、そして37℃で一晩、接着させた。急性試験の前に、細胞を、1.0mlの、11mMのグルコースを補ったクレブス・リンゲル重炭酸イオン緩衝液（115mMのNaCl、4.7mMのKCl、1.28mMのCaCl2、1.2mMのKH2PO4、1.2mMのMgSO4、10mMのNaHCO3、0.5%（w/v）のウシ血清アルブミン、pH7.4）中、37℃で40分間プレインキュベートした。インスリン放出に関する急性試験を、図面で示されるように、天然のGIP（10-7M）の存在下、様々な濃度のGlu3が置換されたアナログ及びGIP（3-42）を使って、5.6mMのグルコースにて37℃で20分間、実施した。インキュベーション後に、緩衝液のアリコートを取り出し、そしてインスリン放射免疫測定（Flatt, P. R.ら、1981年、Diabetologia 20：573〜577ページ）のために−20℃で保存した。
【０１３８】
サイクリックAMP産生に関する急性試験：GIPレセプター形質移入CHL細胞を、1ウェルにつき1.0×105細胞の密度で12ウェルプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）内に播種した。その後、細胞を48時間、増殖させた後にトリチウム化アデニン（2μCi；TRK311、Amersham, Buckinghamshire, UK）を添加し、そして0.5%（w/v）のウシ胎仔血清を補った1mlのDMEM中、37℃で6時間、インキュベートした。その後、前記細胞を、HBS緩衝液（130mMのNaCl、20mMのHEPES、0.9mMのNaHPO4、0.8mMのMgSO4、5.4mMのKCl、1.8mMのCaCl2、25mMのグルコース、25μMのフェノールレッド、pH7.4）で2度洗浄した。その後、その細胞を、天然のGIP（10-7M）の不存在（対照）又は存在下、ホルスコリン（FSK、10μM）又は様々な濃度の（Pro3）GIPに37℃で10分間、さらした。前記培地を取り出した後に、細胞を、0.1mMの非標識cAMP及び0.1mMの非標識ATPを含む1mlの5%トリクロロ酢酸（TCA）で溶解させた。その後、細胞内のトリチウム化cAMPを、先に記載されるように、Dowex及びアルミナ交換樹脂で分離した（Widmann, C.ら、1993年、Mol. Pharmacol. 45：1029〜1035ページ）。
【０１３９】
肥満性糖尿病ob/obマウスにおける（Pro3）GIP投与の急性インビトロ効果：血漿グルコース及びインスリン反応を、グルコース（18mmol/kg体重）を伴うGIP（25nmol/kg体重）の複合注射直後の天然のGIP、（Pro3）GIP（25mnol/kg体重）、又は生理的食塩水（0.9%（w/v）のNaCl；対照）の腹腔内（i.p.）注射後に8〜12週齢の肥満性糖尿病ob/obマウスを使って評価した。全ての試験溶液を、8ml/kg体重の終量で投与した。血液サンプルを、注射直前、注射の15、30、及び60分後に、覚醒マウスの尾の切断部先端から冷やしたフッ化物/ヘパリン微小遠心管（Sarstedt, Numbrecht, Germany）の中に採取した。血液サンプルを、Beckman微小遠心機（Beckman Instruments, UK）を使って、13000gで30秒間、直ちに遠心分離し、そしてグルコース及びインスリンの測定前に−20℃で保存した。
【０１４０】
肥満性糖尿病ob/obマウスにおける摂食に対する血漿グルコース及びインスリン反応への（Pro3）GIPの急性インビボ効果：血漿グルコース及びインスリン反応を、生理的食塩水（0.9%（w/v）のNaCl；対照）又は（Pro3）GIP（25nmol/kg体重）の腹腔内注射の前に18時間、食物を撤収した8〜12週齢のob/obマウスを使って評価した。注射の後に、そのマウスを15分間、再度摂食させた。血液サンプルを、注射直前、注射の15、30、60、及び120分後に、覚醒マウスの尾の切断部先端から冷やしたフッ化物/ヘパリン微小遠心管（Sarstedt, Numbrecht, Germany）の中に採取した。血液サンプルを、Beckman微小遠心機（Beckman Instruments, UK）を使って、13000gで30秒間、直ちに遠心分離し、そしてグルコース及びインスリンの測定前に−20℃で保存した。
【０１４１】
肥満性糖尿病ob/obマウス及び正常なマウスにおける血漿グルコース、インスリン、及び糖化HbA1cに対する慢性（Pro3）GIP投与の効果：8〜12週齢の肥満性糖尿病ob/obマウス及び正常な対照マウスを、生理的食塩水（0.9%（w/v）のNaCl）又は（Pro3）GIP（生理的食塩水中に25nmol/kg体重）のいずれかの1日1回の皮下注射（17:00h）を受ける群に無作為に分けた。11日後に、処置をやめた。食物摂取量と体重を毎日記録した。血液サンプルを、覚醒マウスの尾の切断部先端から冷やしたフッ化物/ヘパリン・コートしたグルコース微小遠心管（Sarstedt, Numbrecht, Germany）の中に採取した。血液サンプルを、グルコース、インスリン、及びHbA1c測定前にBeckman微小遠心機（Beckman Instruments, UK）を使って、13000gで30秒間、直ちに遠心分離した。
【０１４２】
ob/obマウス及び正常なマウスにおける耐糖能に対する（Pro3）GIPでの慢性処置の効果：血漿グルコース及びインスリン濃度を、生理的食塩水（0.9%（w/v）のNaCl）又は（Pro3）GIP（25nmol/kg体重/日）のいずれかで11日間、処置したob/obマウス及び正常なマウスにおいて、グルコース（18mmol/kg体重）の腹腔内投与の後に計測した。この試験を、慢性（Pro3）GIP処置の中止の9日後に繰り返した。血液サンプルを、注射直前、並びに注射の15、30、及び60分後に、覚醒マウスの尾の切断部先端から冷やしたフッ化物/ヘパリン微小遠心管（Sarstedt, Numbrecht, Germany）の中に採取した。血液サンプルを、Beckman微小遠心機（Beckman Instruments, UK）を使って、13000gで30秒間、直ちに遠心分離し、そしてグルコース及びインスリンの測定前に−20℃で保存した。
【０１４３】
ob/obマウスにおける外因性インスリンのグルコース降下効果に対する（Pro3）GIPでの慢性処置の効果：インスリンのグルコース降下効果を、インスリン（50U/kg体重）の急性腹腔内投与の後に11日の生理的食塩水（0.9%（w/v）NaCl）及び（Pro3）GIP（25nmol/kg体重/日）処置したob/obマウスにおいて血漿グルコース反応を計測することによって評価した。血液サンプルを、注射直前、並びに注射の30及び60分後に、覚醒マウスの尾の切断部先端から冷やしたフッ化物/ヘパリン微小遠心管（Sarstedt, Numbrecht, Germany）の中に採取した。血液サンプルを、Beckman微小遠心機（Beckman Instruments, UK）を使って、13000gで30秒間、直ちに遠心分離し、そしてグルコースの測定前に−20℃で保存した。
【０１４４】
ob/obマウスにおける膵臓インスリン量及び合併した膵島肥大に対する（Pro3）GIPでの慢性処置の効果：膵臓組織を、生理的食塩水（0.9%（w/v）NaCl）又は（Pro3）GIP（25nmol/kg体重/日）のいずれかでの11日間の処置後の非絶食ob/obマウスから摘出した。膵臓サンプルを、個々にアルミニウム箔に包み、そして液体窒素中で素早く冷凍した。その後、個々の摘出した膵臓サンプルを、包埋し、薄片に切断し、そしてインスリンについて免疫組織化学的に染色したか、又は膵臓インスリン量の測定のために透過処理した。
【０１４５】
HbA1c、血漿グルコース、及びインスリン濃度の測定：HbA1cを、Menari HA-8140キット（BIOMEN, Berkshire, UK）を使ってイオン交換高速液体クロマトグラフィーによって全血で計測した。血漿グルコースをBeckman Glucose Analyzer IIを使って自動ブドウ糖酸化酵素手順によってアッセイし（Stevens, J. F.、1971年、Clinica ChemicaActa 32：199〜201ページ）、そして血漿インスリンをRIAによって測定した（Flatt, P. R.ら、1981年、Diabetologia 20：573〜577ページ）。血漿グルコース及びインスリン曲線下の増分面積（AUC）を、基準の減算を伴う台形公式（Burington, R. S.、1973年、Handbook of Mathematical Tables and Formulae, New York, McGraw Hill）を利用したコンピュータ・プログラム（CAREA）を使って計算した。
【０１４６】
統計分析：結果を、平均±SEMとして表した。値を、対応のないスチューデントt-検定を使って比較し、そしてP＜0.05の場合に、データ群が有意に異なるとみなした。
【０１４７】
結果
GIP刺激されたサイクリックAMP産生及びインスリン分泌は、（Pro3）GIPによって用量依存的な様式で抑制され、（Pro3）GIPが強力な機能的GIPレセプター拮抗薬であることを示唆した。
【０１４８】
GIPレセプターを形質移入したチャイニーズハムスター肺（CHL）線維芽細胞を、天然のGIP（10-7M）の存在下で、10-12〜10-6Mの（Pro3）GIPとインキュベートした。結果を、図32A及び32Bに示す。図32Aは、ペプチド濃度（M）（x軸）の上昇に伴う最大反応パーセント（y軸）として3H-cAMPの産生を示す折れ線グラフである。図32Bは、5.6mMのグルコース（対照）（白棒）、GIP（灰色棒）、（Pro3）GIP（線入り棒）、及び（Pro3）GIP+GIP（10-7M）（黒棒）に関して、ペプチド濃度（M）（x軸）の上昇に伴うインスリン分泌物（y軸）の棒グラフを示す。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001は、グルコース対照と比較し、ΔΔP＜0.01、ΔΔΔP＜0.001は、同じ濃度にて天然のGIPと比較した。値は、3〜8個の観察についての平均±SEMである。
【０１４９】
（Pro3）GIPは、2.6μMのIC50値でGIP誘発したcAMP形成を抑制した。10-7MのGIPの不存在及び存在下で）天然のGIP及び（Pro3）GIPにさらされたBRIN-BD11細胞のインスリン放出活性。
【０１５０】
GIP刺激したインスリン分泌は、棒グラフである図33A〜33Fで示されるように、GIP（3-42）、（Hyp3）GIP、（Lys3）GIP、（Tyr3）GIP、（Trp3）GIP、及び（Phe3）GIPによって用量依存的様式で抑制された。図33Aは、10-7MのGIP（y軸）対GIP（10-7M）のlog10（白棒、対照）及びGIP（10-7M）+GIP（3-42）（黒棒）の割合（％）として3H-cAMP産生を示す。図33B〜33Fは、GIP（10-7M）（白棒、対照）及び（Hyp3）GIP（図33B）、（Lys3）GIP（図33C）、（Tyr3）GIP（図33D）、（Trp3）GIP（図33E）、及び（Phe3）GIP（図33F）を含めたGlu3が置換された形態のGIP（黒棒）についてペプチド濃度（M）（x軸）の関数として（ng/106細胞/20分で）インスリン分泌（y軸）を示す。*P＜0.05、**P＜0.01は、GIP（10-7M）対照と比較した。値は、3〜8個の観察についての平均±SEMである。
【０１５１】
図34A〜34Dは、（Pro3）GIPの急性投与が肥満性糖尿病ob/obマウスにおける耐糖能（図34A、34B）及び血漿インスリン（図34C、34D）反応に対するGIPの作用を完全に中和することを示した、2つの折れ線グラフ（図34A、34C）及び2つの棒グラフ（図34B、34D）のセットである。図34A及び34Cは、グルコース（対照；黒逆三角）、グルコース+GIP（黒菱形）、及びグルコース+（GIP+（Pro3）GIP）（白三角）について、時間（x軸）に伴う血漿グルコース・レベル（Fig.34A、y軸）及び血漿インスリン・レベル（図34C、y軸）を示す折れ線グラフである。図34B及び34Dは、グルコース単独（白棒）、GIP（灰色棒）、及びグルコース+（GIP+（Pro3）GIP）（黒棒）についての血漿グルコースAUCを示す棒グラフである。
【０１５２】
グルコース単独（18mmol/kg体重）、あるいは天然のGIP又は天然のGIPに加えて（Pro3）GIP（25nmol/kg体重）のいずれかと組み合わせたi.p.投与後の血漿グルコース及びインスリン濃度。注射時間を、矢印（0分）によって示す。血漿グルコース及びインスリンAUC値を、注射の0〜60分後について得る。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001は、グルコース単独と比較した。ΔΔP＜0.01、ΔΔΔP＜0. 001は、天然のGIPと比較した。
【０１５３】
（Pro3）GIPの急性投与は、ob/obマウスにおけるGIPのインスリン放出作用、及び耐糖能の関連した改善を完全に中和した。実際に、（Pro3）GIP（白三角）後の血糖可動域は、グルコースが単独で投与された時（黒逆三角）よりもひどかった。
【０１５４】
図35A〜35Dは、肥満性糖尿病ob/obマウスにおける生理学的な食事で刺激されたインスリン放出及び血糖可動域に対する（Pro3）GIPの効果を示す。血漿グルコース及びインスリン濃度を、対照としての生理的食塩水（0.9%（w/v）のNaCl）又は（Pro3）GIP（25nmol/kg体重）のi.p.投与の前に15分間、再度摂食させたマウスにおいて計測した。注射時間を矢印（15分）で示す。
【０１５５】
その結果を、2つの折れ線グラフ（図35A、35C）及び2つの棒グラフ（図35B、35D）のセットである図35A〜35Dで示す。図面は、生理的食塩水対照（黒逆三角）及び（Pro3）GIP（◇）について時間とともに血漿インスリン（図35A）及び血漿グルコース（図35C）を、そして生理的食塩水対照（白棒）及び（Pro3）GIP（黒棒）について血漿インスリンAUC（図35B）及び血漿グルコースAUC（図35D）をそれぞれ示す。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001は、生理的食塩水単独と比較した。
【０１５６】
（Pro3）GIPの急性投与は、摂食に対するインスリン反応を減少させ、そしてob/obマウスにおける関連した血糖可動域を悪化させた。（Pro3）GIP拮抗薬による内因性GIPの機能的消失から成るこれらの効果は、摂食後のインスリン分泌及び血糖可動域の調節において認められているGIPの役割と完全に一致している。
【０１５７】
肥満性糖尿病ob/obマウスの血漿グルコース及びインスリン濃度に対する11日間の（Pro3）GIPの慢性投与の効果も同様に調査した。古典的な考え方及び先に記載した実験、並びに図32〜35に示した結果によると、11日間にわたる（Pro3）GIPの連日投与による内因性GIPの機能的消失が、インスリン分泌を抑制し、そして耐糖能の著しい悪化を引き起こすことが見込まれる。
【０１５８】
しかし、正反対のことが、ob/obマウスにおける（Pro3）GIPでの慢性処置中に起こった。これは、11日間の生理的食塩水単独（0.9%（w/v）のNaCl；対照として；白棒）又は（Pro3）GIP（25nmol/kg体重；黒棒）の毎日の皮下注射の後の血漿グルコース（図36A）及びインスリン（図36B）濃度を示す2つの棒グラフのセットである図36に示される。値は、6匹のマウスについての平均±SEMであり、そして*P＜0.05は生理的食塩水単独と比較した。11日間の（Pro3）GIP（黒棒）の慢性投与は、対照に対して肥満性糖尿病ob/obマウスにおける血漿グルコース及び血漿インスリン濃度を減少させる。
【０１５９】
生理的食塩水（対照、白棒）及び（Pro3）GIPで処置した肥満性糖尿病ob/obマウスにおいてHbA1c（図37A）、膵臓インスリン量（図37B）、及び合併した膵島肥大（図37C）に対する11日間の（Pro3）GIPの慢性投与の効果を調査した。HbA1c、膵臓インスリン量、及び平均膵島直径を、肥満性糖尿病ob/obマウスへの生理的食塩水単独（白棒）又は（Pro3）GIP（25nmol/kg体重；黒棒）のいずれかの11日の毎日の皮下注射の後に計測した。値は、6匹のマウスについての平均±SEMであり、そして*P＜0.05、***P＜0.001は、生理的食塩水処置群と比較した。
【０１６０】
ob/obマウスにおける慢性（Pro3）GIP投与の有益な効果は、ob/ob突然変異体の著しい膵島肥大の部分的な矯正を伴うHbA1c及び膵臓インスリン貯蔵の有意な減少に関係した。（Pro3）GIP処置したob/obマウスにおいて食物摂取量変化なしに、約7%の体重減少があった。この効果は前記短い研究期間を上回る有意性を達成しなかったが、しかし、この観察は、GIP拮抗作用が長期抗肥満症作用も同様に持ちうることをはっきりと示唆する。
【０１６１】
肥満性糖尿病ob/obマウスにおける耐糖能及び血漿インスリンに対する11日間の（Pro3）GIPの慢性投与の効果を、生理的食塩水（対照、白）又は（Pro3）GIP（黒）で処置された肥満性糖尿病ob/obマウスにおける血漿グルコース・レベル（図38A、38B）及び血漿インスリン・レベル（図38C、38D）を示す折れ線グラフ（図38A、38C）及び棒グラフ（図38B、38D）のセットである図38A〜38Dに示す。血漿グルコース及びインスリン濃度を、グルコース（18mmol/kg体重）の腹腔内投与の前、及び投与後に間隔を置いて計測した。矢印は、注射時間（t=0）を示す。値は、6匹のマウスについての平均±SEMであり、そして*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001は、生理的食塩水処置群と比較した。
【０１６２】
（Pro3）GIPでの11日の処置後に、ob/obマウスにおける耐糖能が、循環インスリンの変化なしに、大幅に改善した（図38）。
【０１６３】
図39は、肥満性糖尿病ob/obマウスにおけるインスリン感受性に対する11日間の（Pro3）GIPの慢性投与の効果を示す。生理的食塩水及び（Pro3）GIPで処置されたob/obマウスの血漿グルコース濃度を、外因性インスリン（50U/kg体重；t=0）の腹腔内投与の前、及びその後に間隔を置いて計測した。値は、6匹のマウスについての平均±SEMであり、そして*P＜0.05は、生理的食塩水処置群と比較した。図39で示されるように、（Pro3）GIPの慢性投与は、インスリン感受性の有意な改善を引き起こした。
【０１６４】
興味深いことに、肥満性糖尿病ob/obマウスにおける11日間の（Pro3）GIPの慢性投与の有益な効果は、処置の中止の9日後に覆された。これは、生理学的な効果と一致しており、図40に示される。生理的食塩水（対照、白四角）又は（Pro3）GIP（黒三角）で処置されたマウスについて、グルコース（18mmol/kg体重）の腹腔内投与の前、及びその後で血漿グルコース濃度を計測した。矢印は、注射時間（t=0）を示す。値は、6匹についての平均±SEMである。
【０１６５】
図41A及び41Bは、正常なマウスにおける耐糖能に対する11日間の（Pro3）GIPの慢性投与の効果を示す一対の折れ線グラフである。血漿グルコース濃度を、グルコース（18mmol/kg体重）の腹腔内投与の前、及びその後で計測した。矢印は、注射時間（t=0）を示す。値は、6匹についての平均±SEMであり、そして*P＜0.05、**P＜0.01は、生理的食塩水処置群と比較した。
【０１６６】
ob/obマウスにおける有益な作用と全面的な対照をなして、11日間の（Pro3）GIP（白三角）での正常なマウスの慢性の毎日の処置が、処置の中止の9日後に覆される（図41B）、対照（黒四角）と比較して耐糖能の著しい悪化をもたらした（図41A）。
【０１６７】
実施例5：毎日の（Pro3）GIP投与による胃抑制ポリペプチド・レセプター作用の化学的な消失が、肥満症−糖尿病における耐糖能を改善し、そしてインスリン抵抗性及び膵島構造の異常を改善する。
【０１６８】
胃抑制ポリペプチド（GIP）は、栄養素の摂取に反応して内分泌K細胞によって分泌される重要なインクレチン・ホルモンである。この研究は、安定、かつ、特異的なGIP-R拮抗薬である（Pro3）GIPを使って、肥満症−糖尿病の様相に対するGIPレセプター（GIP-R）作用の化学的な消失の効果を調査した。若年成体ob/obマウスは、11日間にわたり生理食塩水媒体又は（Pro3）GIPの1日1回のi.p.注射を受けた。非空腹時の血漿グルコース・レベル及びグルコース負荷に対する全体的な血糖可動域（AUC）は、対照と比べて（Pro3）GIP処置されたマウスにおいて有意に減少した（1.6倍；P＜0.05）。GIP-R消失は、全体的な血漿グルコース（1.4倍；P＜0.05）、及び摂食に対するインスリン反応（1.5倍；P＜0.05）も同様に有意に降下させた。これらの変化は、（Pro3）GIPで処置された群における有意に高められた（1.6倍；P＜0.05）インスリン感受性に関係する。（Pro3）GIPの連日注射は、ob/obマウスの膵臓インスリン量を減少させ（1.3倍；P＜0.05）、そして肥満症に関係する膵島肥大及びベータ細胞過形成を部分的に矯正した。（Pro3）GIPのこれらの広範囲の有益な効果は、9日の処置中止の後に覆され、そして食物摂取量及び体重とは無関係で、それらは変化しなかった。これらの研究は、肥満症に関係する耐糖能障害におけるGIPの役割を浮き彫りにし、そしてインスリン抵抗性の緩和、及び2型糖尿病の治療のための薬物の新しいクラスとして特異的GIP-R拮抗薬の可能性を強調する。
【０１６９】
調査の設計及び方法
動物：英国のAston大学で維持されるコロニー由来の肥満性糖尿病（ob/ob）マウス（Bailey, C. J.ら、1982年、Int. J. Obes. 6：11〜21ページ）を、12〜16週齢で使用した。動物は、年齢を適合させて、群に分け、そして12時間が明：12時間が暗のサイクルを用いた22±2℃で空調管理された部屋の中に個々に収容した。飲料水及び標準的な齧歯動物維持食（Trouw Nutrition, Belfast, Northern Ireland）を自由摂取させた。全ての動物研究を、英国動物（科学的処置）法1986に従って行った。（Pro3）GIP投与の後に、有害事象は観察されなかった。
【０１７０】
（Pro3）GIPの合成、精製、及び特徴づけ：（Pro3）GIPを、Applied Biosystemsの自動ペプチド合成機（モデル432 A）により連続して合成した。（Pro3）GIPを、Waters Millenium 2010クロマトグラフィー・システム（ソフトウェアバージョン2.1.5）の逆相HPLCによって精製し、続いてエレクトロスプレー・イオン化質量分析（ESI-MS）を使って特徴づけした。
【０１７１】
ob/obマウス研究のための実験プロトコール：最初に、（Pro3）GIPの延長された生理活性を、投与の4時間後の18時間絶食ob/obマウスにおいて調査した。それ以来、11日間にわたり、マウスは、生理的食塩水媒体（0.9%（w/v）のNaCl）又は（Pro3）GIP（25nmol/kg体重）のいずれかの1日1回のi.p.注射（17:00時）を受けた。それに続く9日間の間、（Pro3）GIP投与中止の後に観察を継続した。食物摂取量及び体重を毎日記録した一方で、血漿グルコース及びインスリン濃度を2〜6日の間隔で監視した。糖化ヘモグロビンの測定のための全血を、11及び20日目に採取した。腹腔内耐糖能（18mmol/kg体重）、天然のGIPに対する代謝反応（25nmol/kg体重）、及びインスリン感受性（50のU/kg体重）試験を、11及び20日目に実施した。18時間絶食したマウスを、15分の摂食に対する代謝反応を調査するため使用した。別の系列において、膵臓組織を、11日の処置期間の終わり、又は（Pro3）GIP中止の後の9日にて摘出し、そして免疫組織化学、又は5ml/gの氷冷した酸−エタノールでの抽出後のインスリン測定（750mlのエタノール、235mlの水、15mlの濃HCl）のために加工した。図面に示された時点にて覚醒マウスの尾静脈の切断部先端から採取した血液サンプルを、Beckman微小遠心機（Beckman Instruments, UK）を使って、13,000gで30秒間、直ちに遠心分離した。その後、得られた血漿を、新しいEppendorf管中に等分し、そしてグルコース及びインスリンの測定の前に−20℃で保存した。
【０１７２】
生化学的分析：血漿グルコースを、Beckman Glucose Analyzer II （Beckman Instruments, Galway, Ireland）を使って自動ブドウ糖酸化酵素手順（Stevens, J. F.、1971年、Clin. Chem. Acta 32：199〜201ページ）によってアッセイした。血漿及び膵臓のインスリンを、改良デキストラン・コート炭末放射免疫測定（Flatt, P. R.ら、1981年、Diabetologia 20：573〜577ページ）によってアッセイした。VersaMax Microplate分光光度計（Molecular Devices, Wokingham, Berkshire, UK）を使って洗浄及び溶出緩衝液の吸光度（415nm）の測定と一緒に陽イオン交換カラム（Sigma, Poole, Dorset, UK）を使って糖化ヘモグロビンを測定した。
【０１７３】
免疫細胞化学：4%のパラホルムアルデヒド/PBS中で固定し、パラフィン内に包埋した組織を、8μmに薄切りした。蝋を取り除いた後に、切片を、ブロッキング血清（Vector Laboratories, CA, USA）と一緒にインキュベートした後で、インスリン抗体にさらした。その後、組織サンプルを、ビオチン化された普遍的な、汎特異的二次抗体（Vector Laboratories, CA, USA）、そしてストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ事前形成複合体（Vector Laboratories, CA, USA）と一緒に連続してインキュベートした。洗浄に続いて、染色した膵臓組織を、ヘマトキシリン（BDH Chemicals, Dorset, UK）で対比染色し、その後、酸メタノール（500mlのメタノール、500mlのH2O、及び2.5mlの濃HCl）中に浸した後に、脱水し、そしてDepex（BDH Chemicals, Dorset, UK）に取り付けた。染色したスライドを、JVCカメラ・モデルKY-F55B（JVC, London, UK）に備え付けらた顕微鏡（Nikon Eclipse E2000, Diagnostic Instruments Incorporated, Michigan, USA）下で見て、そしてKromoscan画像ソフトウェア（Kinetic Imaging Limited, Faversham, Kent, UK）を使って分析した。各切片内の膵島ごとの平均数及び直径を、ステージマイクロメーター（Graticules Limited, Tonbridge, Kent, UK）で較正した接眼レンズ目盛を使って盲検方式で評価した。各膵島の最長の及び最短の直径を、前記目盛で測定した。その後、これらの2つの値の合計の2分の1を平均膵島直径とみなした。約60〜70枚の無作為の切片を、各マウスの膵臓から調査した。
【０１７４】
統計：結果を、平均±SEMとして表す。ANOVA、それに続くスチューデント−ニューマン−クールス事後検定を使って、データを比較した。基準の減算を伴う台形公式を使って、曲線下面積（AUC）分析を計算した（Burington, R. S., Handbook of Mathematical Tables and Formulae, New York, McGraw-Hill, 1973年）。P＜0.05を統計的に有意であるとみなした。
【０１７５】
結果
投与の4時間後の血漿グルコース及びインスリン濃度に対する（Pro3）GIPの効果を調査した。結果を、投与の4時間後、天然のGIPへの血漿グルコース及びインスリン反応に対する（Pro3）GIPの効果を示す2つの折れ線グラフ（図42A、42C）及び2つの棒グラフ（図42B、42D）のセットである図42A〜42D中に示す。試験を、18時間絶食ob/obマウスにおける（Pro3）GIP（25nmoles/kg体重）又は生理的食塩水（0.9%のNaCl）の投与の4時間後に行った。血漿グルコース及びインスリン濃度を、天然のGIP（25nmoles/kg体重）と組み合わせたグルコース（18mmoles/kg体重）のi.p.投与の前、及びその後で計測した。0〜60分のグルコース又はインスリン曲線下増分面積（AUC）を、右側のパネルで示す。値は、8匹のマウスについての平均±SEMを表す。*P＜0.05及び**P＜0.01は、生理的食塩水単独の群と比較した。
【０１７６】
図42A〜42Dで示されるように、4時間前の（Pro3）GIP投与は、グルコースと一緒に与えられた天然のGIPに対する血漿グルコース及びインスリン反応を害した。生理的食塩水処置対照と比べて、AUCグルコース及びインスリンの値を、それぞれ151%まで増加させ（P＜0.05）及び25%まで減少させた（P＜0.05）。これは、延長された生物学的半減期を支持し、そして1日1回の注射の根拠を形成する。
【０１７７】
食物摂取量、体重、及び非空腹時血漿グルコース、及びインスリン濃度に対する（Pro3）GIPの効果を調査した。結果を、ob/obマウスにおける食物摂取量（図43A）、体重（図43B）、血漿グルコース（図43C）、及びインスリン（図43D）濃度に対する毎日の（Pro3）GIP投与の効果を示す2つの折れ線グラフ及び2つの棒グラフのセットである図43A〜43Dに示す。指標を、生理的食塩水又は（Pro3）GIP（25nmol/kg体重/日）での処置の前の5日間、（黒棒によって示される）その間の11日間、及びその後の9日間に計測した。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。*P＜0.05は、生理的食塩水群と比較した。
【０１７８】
（Pro3）GIPの投与は、食物摂取量及び体重に対する効果がなかった（図43A及び43B）。11日目に、（Pro3）GIPを受けたob/obマウスにおいて、血漿グルコースが、有意に低い（P＜0.05）濃度まで減少した（図43C）。処置の中止は、対照レベルに向けて血漿グルコース濃度を戻した。このパターンと一致して、糖化ヘモグロビンは、連日注射の前、又はその中止から9日間よりも（Pro3）GIPでの11日間の処置後で有意に低かった（P＜0.05）（それぞれ、8.0±0.3%、6.9±0.2%、7.7±0.4%）。血漿インスリン・レベルの有意な変化は、処置期間中又はその後で認められなかった。しかし、血漿インスリン濃度が、（Pro3）GIP処置中に徐々に減少する全体的な傾向があった（図43D）。
【０１７９】
耐糖能に対する（Pro3）GIPの効果を、ob/obマウスにおけるグルコースへの耐糖能及び血漿インスリン反応に対する毎日の（Pro3）GIP投与の効果を示す指し込み棒グラフを伴う4つの折れ線グラフのセットである図44A〜44Dに示す。試験を、11日間の（Pro3）GIP（25nmoles/kg体重/日；黒三角；黒棒）又は生理的食塩水（対照；白四角；白棒）での毎日の処置後（図44A、44C）、あるいは処置の中止の9日後（図44B、44D）に実施した。グルコース（18mmoles/kg体重）を、矢印によって示される時点で投与した。（Pro3）GIP処置の完全な効果を証明するために、いずれの場合にも同一の基準の減算を伴う、注射の0〜60分後の血漿グルコース（図44A、44B）及びインスリン（図44C、44D）のAUC値を、指し込み図中に示す。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。*P＜0.05、**P＜0.01、及び***P＜0.001は、生理的食塩水群と比較した。
【０１８０】
11日間の（Pro3）GIPの連日投与は、腹腔内グルコースの15、30、及び60分後に血漿グルコース濃度の有意な減少（P＜0.001）をもたらした（図44A）。これを、対照と比べて2.1倍減少した（P＜0.01）有意に減少した0〜60分のAUC値（図44A）によって確認した。血漿インスリン濃度も同様に、（Pro3）GIP処置群において腹腔内グルコース注射の15、30、及び60分後の有意に（P＜0.05）減少した（図44A）。0〜60分のAUC値も同様に有意に減少した（P＜0.001）。興味深いことには、11日処置したob/obマウスに天然のGIP（25nmoles/kg体重）と一緒にグルコースを投与した時に、ほとんど同じパターンが観察された（データ未掲載）。これは、GIP作用が（Pro3）GIP処置群において効果的に中和されたという見解を支持する。9日間（研究の20日目）の（Pro3）GIP処置の中止が、1つの時点で認められた低グルコースが介在した血漿インスリン濃度（15分；P＜0.05）を伴った、腹腔内グルコースに対するほとんど同じ血漿グルコース及びインスリン反応をもたらした（図44）。
【０１８１】
摂食への代謝反応及びインスリン感受性に対する（Pro3）GIPの効果を、図45及び46に示す。図45A〜45Dは、18時間絶食したob/obマウスにおける摂食へのグルコース（図45A、45B）及びインスリン（図45C、45D）反応に対する毎日の（Pro3）GIP投与（黒三角；黒棒）又は生理的食塩水（白四角；白棒）の効果を示す2つの折れ線グラフ（図45A、45C）及び2つの棒グラフ（図45B、45D）のセットである。試験を、11日間の（Pro3）GIP（25nmol/kg体重/日）又は生理的食塩水での毎日の処置の後に実施した。矢印は、摂食時間（15分）を示す。摂食の0〜105分後のAUC値も同様に示される。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。*P＜0.05は、生理的食塩水群と比較した。
【０１８２】
図46A〜46Dは、ob/obマウスにおけるインスリン感受性に対する毎日の（Pro3）GIP投与の効果を示す2つの折れ線グラフ（図46A、46C）及び2つの棒グラフ（図46B、46D）のセットである。試験を、11日間（図46A、46B）又は処置の中止後の9日間（図46C、46D）の（Pro3）GIP（25nmol/kg体重/日；黒逆三角；黒棒）又は生理的食塩水（白四角；白棒）での毎日の処置の後に実施した。インスリン（50U/kg体重）を、矢印によって示された時点での腹腔内注射によって投与した。注射の0〜60分後のAUC値も同様に示される。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。*P＜0.05は、生理的食塩水群と比較した。
【０１８３】
15分の摂食への血漿グルコース及びインスリン反応は、11日間、（Pro3）GIPで処置されたob/obマウスにおいて30及び60分で有意に減少した（P＜0.05）（図45）。同じように、AUCグルコース及びインスリンは、0.3〜0.5g/マウス/15分の類似した食物摂取量にもかかわらず、（Pro3）GIP処置されたob/obマウスにおいて有意に（P＜0.05）減少した。図46A及び45Bで示されるように、インスリンの血糖降下作用は、11日間、（Pro3）GIPで処置したob/obマウスにおいて、AUC計測及び注射後の評価に関して有意に（P＜0.05）増加した。（Pro3）GIP処置の9日間の中止に続く反応は、生理的食塩水で処置した対照（図45C、45D）に類似していた。
【０１８４】
膵臓インスリン及び膵島形態に対する（Pro3）GIPの効果を、図47A〜47D、及び図48A〜48Fに示す。前記47A〜47Dは、ob/obマウスにおける膵臓の重量（図47A）、インスリン量（図47B）、膵島数（図47C）、及び膵島直径（図47D）に対する毎日の（Pro3）GIP投与効果を示す4つの棒グラフのセットである。指標を、11日間及び処置の中止の9日後（20日目）の（Pro3）GIP（25nmol/kg体重/日；黒棒）又は生理的食塩水（白棒）での毎日の処置後に計測した。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。*P＜0.05及び***P＜0.001は、生理的食塩水群と比較した。図48A〜48Fは、ob/obマウスにおける膵島サイズ及び形態に対する毎日の（Pro3）GIP投与の効果を示す2つの棒グラフ（図48A、48D）と4枚の顕微鏡写真（図48B、48C、48E、48F）のセットである。
【０１８５】
（Pro3）GIP処置は、膵臓の重量に対する効果がなかった（図47A）。しかし、膵臓インスリン量は、対照と比べて11日間、（Pro3）GIPを与えられたob/obマウスにおいて有意に（P＜0.05）減少した（図47B）。1枚の膵臓切片あたりの膵島数で有意差は観察されなかったが（図47C）、しかし、平均膵島直径は、（Pro3）GIP処置されたob/obマウスにおいて著しく、かつ、有意に（P＜0.001）減少した（図47D）。これらの効果は、20日目の（Pro3）GIPの中止によって事実上覆されるが、平均膵島直径は、有意に（P＜0.05）減少したままであった。図48Aで示されるように、より詳細な分析は、11日目の膵島直径の減少が、小さい（＜0.10mm）及び中程度の（0.1〜0.15mm）の直径を有する膵島の割合の増加を伴う、より大きな直径（>0.15mm）の膵島のパーセンテージの有意な減少（P＜0.001）によるということを明らかにした。図48Dは、処置の中止の後の類似した分析が小さい膵島のパーセンテージの有意な（P＜0.05）上昇が依然として明らかであることを示す。11日間の（Pro3）GIP処置されたob/obマウス（図48B）及び生理的食塩水で処置された対照（図48C）からのインスリンについて免疫組織学的に染色した膵臓の代表的な画像（×40の倍率）は、（Pro3）GIP処置によって誘発された膵臓の膵島形態の劇的な変化を説明する。20日目のインスリンについて免疫組織学的に染色した膵臓も同様に示される（図48E、48F）。
【０１８６】
指標を、11日間の（Pro3）GIP（25nmol/kg体重/日）又は生理的食塩水での毎日の処置の後（図48A）、並びに処置の中止の9日後（図48D）に計測した。大きい（>0.15mm）直径、中程度の（0.1〜0.15mm）直径、及び小さい（＜0.1mm）直径に分類される膵島の割合を示す。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。図48B、48C、48E、及び48Fは、（Pro3）GIP（図48B）又は生理的食塩水（図48C）での11日間の処置の後のインスリンについて染色した膵臓の代表的なイメージである（×40の倍率）。（Pro3）GIP（図48E）又は生理的食塩水（図48F）での処置の中止の9日後の対応するイメージも同様に示す。矢印は膵島を示す。
【０１８７】
実施例6：N末端でアセチル化された、並びにLys16及びLys37で置換されたGIP 
この実施例は、脂肪酸誘導体化したN末端で修飾したGIPアナログの、代謝安定性、生理活性、及び抗糖尿病性の潜在能力を調査する。これらは、GIPタンパク質のN末端のTyr1アセチル基、及び16位又は37位のいずれかのリジンのイプシロンアミノ基に連結したC-16パルミタート基を有するN-AcGIP（LysPAL16）そしてN-AcGIP（LysPAL37）である。
【０１８８】
材料及び方法
動物：英国のAston大学で維持されるコロニー由来の肥満性糖尿病（ob/ob）マウスを、12〜17週齢で使用した。遺伝的背景及び使用したコロニーの特徴は他の場所で詳細に概説された（Bailey, C. J.ら、1982年、Int. J. Obesity. 6：11〜21ページ；Gault, V. A.ら、2003ページ、J. Endocrinol. 176：133〜141ページ）。動物を、12時間が明：12時間が暗のサイクルを用いた22±2℃で空調管理された部屋の中に個々に収容した。飲料水及び標準的な齧歯動物維持食（Trouw Nutrition, Belfast, Northern Ireland）を自由摂取させた。全ての試験溶液を、5ml/kg体重の終量でi.p.注射によって投与した。血液を、注射の直前及び図中に示された時間にて、覚醒マウスの尾静脈の切断部先端から冷やしたフッ化物／ヘパリン微小遠心管内に採取した。血漿を、13,000gで約30秒間、Beckman微小遠心機を使って分離し、そしてグルコース及びインスリンの測定前に−20℃で保存した。全ての動物研究を、英国動物（科学的処置）法1986に従って行った。前記ペプチドのいずれの急性又は慢性の投与の後にも悪影響は観察されなかった。
【０１８９】
材料：高速液体クロマトグラフィー（HPLC）用アセトニトリルをRathburn（Walkersburn, UK）から入手した。トリフルオロ酢酸（TFA）及びトリクロロ酢酸（TCA）をAldrich（Poole, Dorset, UK）から入手した。DPP IV、イソブチルメチルキサンチン（IBMX）、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、サイクリックAMP、及びATPの全てをSigma（Poole, Dorset, UK）から購入した。Fmoc保護したアミノ酸はCalbiochem Novabiochem（Nottingham, UK）からのものだった。RPMI-1640及びDMEM組織培養培地、ウシ胎仔血清、ペニシリン、並びにストレプトマイシンの全てをGibco（Paisley, Strathclyde, UK）から購入した。サイクリックAMPアッセイのために使用したクロマトグラフィーカラム、Dowex AG50 WX、及び中和アルミナAG7をBio-Rad（Life Science Research, Alpha Analytical, Larne, UK）から入手した。これらの実験で使われた全ての水を、Milli-Q浄水システム（Millipore, Milford, MA, USA）を使って精製した。使用したその他の化学薬品の全てが、最高純度が入手可能なものであった。
【０１９０】
GIP及び関連するアナログの合成、精製、及び特徴づけ：天然のGIPを、先に記載されるように標準的な固相Fmocペプチド化学（ABI 432Aペプチド合成機）を使って連続して合成した（O'Harte, F. P. M.ら、2002年、Diabetologia 45：1281〜1291ページ）。N-AcGIP（LysPAL16）及びN-AcGIP（LysPAL37）を、16又は37位のLysのイプシロンアミノ基をC-16パルミタート脂肪酸と結合させることを除いて天然のGIPと同じ方法で合成した。さらに、アセチル添加物を、N末端Tyr1に組み込んだ。前記合成ペプチドを、Waters Millenium 2010クロマトグラフィー・システム（ソフトウェアバージョン2.1.5）の逆相HPLCによって純粋であると判断し、そして先に記載されるように、その後マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間質量分析（MALDI-ToF MS）を使って特徴づけした（Gault, V. A.ら、2002年、Cell. Biol. Int. 27：41〜46ページ）。
【０１９１】
DPP IV分解の研究：GIP及び脂肪酸誘導体化GIPアナログを、精製したブタ・ジペプチジル・ペプチダーゼIV（50mmol/lのトリエタノールアミン-HCl中に5mU；pH7.8）と一緒に37℃で0、2、4、8、及び24時間インキュベートした（最終ペプチド濃度2mmol/l）。続いて、前記反応を、10%（v/v）TFA/水の添加によって終了させ、そして反応産物を、HPLCを使って分離した。反応産物を、Vydac C-4カラム（4.6×250mm；The Separations Group, Hesparia, CA）に適用し、そして主な分解物であるGIP（3-42）を、原型を保ったGIPから分離した。カラムを、10分で0%から40%に、その後35分で40%から75%まで上げられる溶出溶媒中のアセトニトリル濃度をもつ70%アセトニトリル／水中の0.1%（v/v）TFAを使って、1.0ml/分の流速にて0.12%（v/v）TFA/水で平衡化した。SpectraSystem UV2000検出器（Thermoquest Limited, Manchester, UK）を使って206nmにおいて吸光度を監視し、MALDI-ToF MS分析の前にピークを手作業で回収した。HPLCピーク面積データを、インキュベーションをとおして残留した原型を保ったペプチドの割合（%）を計算するために使用した。
【０１９２】
細胞及び細胞培養：ヒトGIPレセプターを安定に形質移入したチャイニーズハムスター肺（CHL）線維芽細胞（Gremlich, S.ら、1995年、Diabetes 44：1202〜1208ページ）を、10%（v/v）のFBS、1%（v/v）の抗生物質（100U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン）を含むDMEM組織培養培地中で培養した。クローン化膵臓BRIN-BD11細胞（McClenaghan, N. H.ら、1996年、Diabetes 45：1132〜1140ページ）を、10%（v/v）のFBS、1%（v/v）の抗生物質（100U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン）、及び11.1mmol/lのグルコースを含むRPMI-1640培地を使って培養した。LEECインキュベーター（Laboratory Technical Engineering, Nottingham, UK）を使って、細胞を5%のCO2及び95%の空気から成る雰囲気中、37℃で維持した。
【０１９３】
インビトロにおける生理活性：細胞内のサイクリックAMP産生を、GIPレセプター形質移入CHL線維芽細胞（O'Harte, F. P. M.ら、2002年、Diabetologia 45：1281〜1291ページ）を使って計測した。手短に言えば、CHL細胞を、1ウェルにつき105細胞の密度で12ウェルプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）に播種し、そして48時間、増殖させた後にトリチウム化アデニン（2μCi；TRK311；Amersham, Buckinghamshire, UK）を添加した。その後、前記細胞を、0.5%（w/v）のBSAを補った1mlのDMEM中、37℃で6時間インキュベートし、続いてHBS緩衝液（pH7.4）で2度洗浄した。その後、細胞を、1mmol/lのIBMXの存在下でHBS緩衝液中のGIP/GIPアナログ（10-13〜10-6mol/l）に37℃で15分間さらした。続いて、その媒体を取り除き、そして前記細胞を、0.1mmol/lの非標識サイクリックAMP及び0.1mmol/lの非標識ATPを含む1mlの5%TCAで溶解させた。その後、細胞内のサイクリックAMPを、先に記載されるようにDowex及びアルミナ交換樹脂により分離した（O'Harte, F. P. M.ら、2002年、Diabetologia 45：1281〜1291ページ）。
【０１９４】
インスリン放出研究を、先に記載されるようにクローン化膵臓BRIN-BD11細胞を使って実施した（O'Harte, F. P. M.ら、2002年、Diabetologia 45：1281〜1291ページ）。要するに、BRIN-BD11細胞を、1ウェルにつき105細胞の密度で24ウェルプレートに播種し、そして37℃で一晩、接着させた。インスリン放出について急性試験に先立ち、1.1mmol/lのグルコースを補った1.0mlのクレブス・リンゲル重炭酸イオン緩衝液中、37℃で40分インキュベーションした。試験インキュベーションを、5.6mmol/lのグルコースの存在下、（10-13〜10-6mol/l）の濃度範囲のGIP及びGIPアナログを用いて実施した。20分のインキュベーションの後に、前記緩衝液を各ウェルから取り出し、そしてアリコート（200μl）をインスリンの測定に使用した。
【０１９５】
ob/obマウスにおけるN-AcGIP（LysPAL16）及びN-AcGIP（LysPAL37）の効果：グルコース投与（18mmoles/kg体重）に続く（6.25〜25nmoles/kg体重の）GIP及びN-AcGIP（LysPAL）アナログの代謝及び用量反応効果を、18時間絶食したマウスで調査した。長期間の効果を評価するために、ob/obマウス群に、生理的食塩水媒体（0.9%、w/v、NaCl）、（共に12.5nmoles/kg体重/日にて）天然のGIP、又はN-AcGIP（LysPAL37）の1日1回の腹腔内注射（17:00h）を14日間、与えた。食物摂取量及び体重を毎日記録した。血漿グルコース及びインスリン濃度を、2〜6日間隔で監視した。14日目に、腹腔内の耐糖能（18mmoles/kg）及びインスリン感受性（50U/kg）を評価するために、動物群を使用した。別の系列において、14日間の処置後のGIPレセプター脱感作の可能性を調査するために、2つの実験プロトコールを利用した。生理的食塩水、GIP、又はN-AcGIP（LysPAL37）のいずれかから成る通常注射の急性代謝効果を、グルコース（18mmoles/kg）と一緒に投与された時に監視した。第2に、グルコースと一緒に与えられたN-AcGIP（LysPAL37）の急性効果を、全3群のマウスにおいて調査した。14日の処置期間の終わりに、5ml/gの氷冷酸−エタノール（75%のエタノール、2.35%のH2O、1.5%のHCl）での抽出に続くインスリンの測定のために、膵臓組織を摘出した。糖化ヘモグロビンの測定のために、全血を採取した。
【０１９６】
生化学分析：血漿グルコースを、Beckman Glucose Analyser II（Beckman, Galway,Ireland）を使った自動グルコース酸化酵素手順（Stevens, J. F.、1971年、Clin. Chem. Acta 32：199〜201ページ）によってアッセイした。先に記載されるように、血漿インスリンを、デキストラン−炭末RIAによって測定した（Flatt, P. R.ら、1981年、Diabetologia 20：573〜577ページ）。VersaMaxマイクロプレート・分光光度計（Molecular Devices, Wokingham, Berkshire, UK）を使った洗浄緩衝液と溶出緩衝液の吸光度（415nm）の測定により陽イオン交換カラム（Sigma, Poole, Dorset, UK）を使って、糖化ヘモグロビンを測定した。
【０１９７】
統計：結果を、平均±SEMとして表す。データを、対応のないスチューデントt-検定を使って比較した。必要に応じて、反復測定ANOVA又は一元配置ANOVA、続くスチューデント−ニューマン−クールス事後検定によって、データを比較した。血漿グルコース及びインスリン曲線下の増分面積（AUC）を、基準の減算を伴う台形公式（Burington, R. S.、1973年、Handbook of Mathematical Tables and Formulae, McGraw-Hill, New York）を利用したコンピュータ・プログラムを使って計算した。p＜0.05の場合に、データ群が有意に異なるとみなした。
【０１９８】
結果
MALDI-ToF MSによる構造的な特徴づけ：合成及びHPLC精製に続いて、MALDI-ToF MSを使って、GIP、N-AcGIP（LysPAL16）、及びN-AcGIP（LysPAL37）について、分子量を得た（以下の表3）。天然のGIPについての質量対電荷（m/z）比は、理論質量の4982.4Daと非常に密接に対応する4983.7Daと算出された。同じように、N-AcGIP（LysPAL16）及びN-AcGIP（LysPAL37）についてのm/z比は、それぞれ5268.9Da及び5267.7Daだった。これらの値は、理論質量（5266.1Da）と非常に密接に相関があり、それ故に、前記合成ペプチドの各々について正しい構造を確認した。
【０１９９】
【表３】
2008500280.tif 000004
【０２００】
DPP IVによる分解：以下の表4は、DPP IVとのインキュベーション後に残った原型を保ったペプチドの割合（%）を説明する。天然のGIPの分解は、たった2時間後に、ペプチドの52±3%しか原型を保っていないことが明らかだった。8時間のインキュベーション後に、天然のペプチドは、完全にGIP（3-42）に分解された。対照的に、N-AcGIP（LysPAL16）及びN-AcGIP（LysPAL37）は両方とも、DPP IVとの24時間のインキュベーション後でさえ、完全に原型を保ったままであった（分解断片が明らかでなかった）。
【０２０１】
【表４】
2008500280.tif 000005
【０２０２】
サイクリックAMP産生の変化：図50Aは、ヒトGIPレセプターを安定に発現しているCHL細胞において、カラムクロマトグラフィーによって測定された、GIP（黒三角）、並びに脂肪酸誘導体化GIPアナログであるN-AcGIP（LysPAL16）（白四角）及びN-AcGIP（LysPAL37）（黒丸）による細胞内サイクリックAMP産生を示す。各実験を三連（n=3）で実施し、そしてその結果を、最大GIP反応に対する割合（%）として表した（平均±SEM）。
【０２０３】
サイクリックAMP産生における濃度に依存した（10-6〜10-13mol/l）増加を、ヒトGIPレセプターを形質移入したCHL細胞を使って天然のGIP（EC50値18.2nmol/l）を用いて観察した（図50A）。同様に、N-AcGIP（LysPAL16）及びN-AcGIP（LysPAL37）の両者は、それぞれ12.1及び13.0nmol/lの算出されたEC50値を有し、天然のGIPの刺激パターンに類似した刺激パターンをたどった。両方のアナログのより低いEC50値は、高められたサイクリックAMP刺激効力を示唆する。
【０２０４】
インビトロにおけるインスリン放出活性：図50Bは、クローン化膵ベータ細胞株であるBRIN-BD11におけるグルコース（5.6mmo/lのグルコース；白棒）、GIP（線入り棒）、並びに脂肪酸誘導体化GIPアナログであるN-AcGIP（LysPAL16）（灰色棒）及びN-AcGIP（LysPAL37）（黒棒）のインスリン放出活性を示す。プレインキュベーション（40分）の後に、様々な濃度のペプチドの効果を、20分間のインキュベーション中のインスリン放出について試験した。値は、8つの別々の観察についての平均±SEMである。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001は、対照（5.6mmol/lのグルコース単独）と比較した。
【０２０５】
強力なインスリン分泌促進ホルモンとしてのその役割と一致して、天然のGIPは、対照（5.6mmol/lのグルコース単独）と比べて、インスリン分泌を用量依存的に刺激した（p＜0.01〜p＜0.001）（図50B）。同様に、N-AcGIP（LysPAL16）及びN-AcGIP（LysPAL37）ともに、グルコース誘発インスリン分泌を有意に刺激した（p＜0.05〜p＜0.001）。サイクリックAMP及びインスリン分泌のデータに基づいて、両GIPアナログとも、天然のペプチドと少なくとも等しい効力を有するように思われる。
【０２０６】
ob/obマウスにおける代謝効果：図51A〜51Dは、18時間絶食ob/obマウスにおけるGIP及び脂肪酸誘導体化GIPアナログのグルコース降下効果（図51A、51B）、及びインスリン放出活性（図C51、51D）を示す2つの折れ線グラフ（図51A、51C）及び2つの棒グラフ（図51B、51D）のセットである。血漿グルコース及びインスリン濃度を、対照としてグルコース単独の（18mmoles/kg体重；○；白棒）、あるいはGIP（黒三角；線入り棒）、又はGIPアナログであるN-AcGIP（LysPAL16）（白四角；灰色棒）及びN-AcGIP（LysPAL37）（黒丸；黒棒）（25nmoles/kg体重）との組み合わせによるi.p.注射の前、及びその後で計測した。0〜60分のグルコース又はインスリン曲線下の増分面積（AUC）を、右側のパネルで示す。値は、8匹のマウスについての平均±SEMを表す。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001は、グルコース単独と比較し、Δp＜0.05、ΔΔp＜0.01、及びΔΔΔp＜0.001は、天然のGIPと比較し、γγγp＜0.001は、N-AcGIP（LysPAL16）と比較した。
【０２０７】
実験群の基礎血中グルコース・レベルは、研究開始時点では有意に異なることはなかった（p＞0.05）。グルコース単独の注射の後に、血漿グルコース・レベルは急速に上昇し、60分で40.3±1.5mmol/lの値に達した。天然のGIPは、監視した各々の時点で血漿グルコースを降下させたが、しかし、これは、AUC値によって明らかにされるように、全体的なグルコース可動域に関して有意性に達することはなかった（図52B）。N-AcGIP（LysPAL16）及びN-AcGIP（LysPAL37）の投与は、グルコース単独と比べた時に、各々の時点での血漿グルコースの有意な降下（p＜0.01〜p＜0.001）、及び有意に低下したグルコースAUC（p＜0.01〜p＜0.001）を引き起こした。その上、N-AcGIP（LysPAL16）及びN-AcGIP（LysPAL37）は、天然のGIPと比べた時に、全体的なグルコース可動域を減少させた（p＜0.05、p＜0.001）。
【０２０８】
対応する血漿インスリン反応を、図51C及び51Dで説明する。グルコース単独（対照）の投与後に、血漿インスリンの最大の上昇を15分で観察し、その後、それらは残りの45分間にわたり基礎レベルに向かって下降した。天然のGIPの投与は、グルコース単独と比べて、全体的なインスリン分泌促進反応を有意に高めた（p＜0.05）。グルコースと一緒に投与されるN-AcGIP（LysPAL16）又はN-AcGIP（LysPAL37）は、最大の血漿インスリン濃度を15分において観察した。両方のアナログに関する延長された生理活性は、30〜60分はっきりと明らかだった。
【０２０９】
グルコース介在性血漿インスリン濃度は、対照（p＜0.01〜p＜0.001）及びGIP処置動物（p＜0.05〜p＜0.001）の両方と比較して有意に高かった。N-AcGIP（LysPAL16）及びN-AcGIP（LysPAL37）に対応するAUC値は、天然のGIP（1.5倍及び2.3倍、それぞれ；p＜0.01〜p＜0.001）と比べて、全体的なグルコース介在性インスリン放出の有意な増大を明らかにした。N-AcGIP（LysPAL37）は、インスリン分泌を刺激することにおいてNAcGIP（LysPAL16）より有意により強力であった（1.5倍：p＜0.001）。
【０２１０】
ob/obマウスにおける用量依存的な代謝効果：図52A及び52Bは、グルコースと一緒にob/obマウスに投与された時の、GIP及びより強力なアナログであるN-AcGIP（LysPAL37）の用量依存的な抗高血糖効果、及びインスリン分泌促進効果を説明する。
【０２１１】
それらは、18時間絶食したob/obマウスにおけるGIP及びN-AcGIP（LysPAL37）の用量依存的効果を示す棒グラフのセットである。グルコース単独の（18mmoles/kg体重；白棒）、あるいはGIP（線入り棒）、又はN-AcGIP（LysPAL37）（各々6.25、12.5、及び25nmoles/kg体重；黒棒）と組み合わせてのi.p.投与の0〜60分後のグルコース（図52A）及びインスリン（図52B）に関する曲線下増分面積（AUC）。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。**p＜0.01及び***p＜0.001は、グルコース単独と比較し、ΔΔp＜0.01及びΔΔΔp＜0.001は、同じ用量にて天然のGIPと比較した。
【０２１２】
データは、便宜のために、全体的なAUC反応として表される。この様式で表されて、天然のGIPは、試験したいずれの用量においてもAUCグルコース及びインスリンに有意に影響しなかった。N-AcGIP（LysPAL37）は、天然のGIPよりも有意により強力であり（p＜0.01〜p＜0.001）、そして投与した全ての用量において、顕著な用量依存的な抗高血糖作用及びインスリン分泌促進作用を示した（図52A、52B）。何と、試験した最も低い濃度のN-AcGIP（LysPAL37）（6.25nmoles/kg）でさえ、グルコース単独と比べての有意に高い抗高血糖特性を持っていた（p＜0.001）。この観察と一致して、6.25nmoles/kgのN-AcGIP（LysPAL37）は、グルコース単独と比べて、顕著なインスリン反応（2.0倍；p＜0.01）を誘発した。
【０２１３】
ob/obマウスにおける長時間作用性効果：ob/obマウスにおける食物摂取量、体重、糖化ヘモグロビン、並びに非空腹時血漿グルコース及びインスリン濃度に対する14日間のN-AcGIP（LysPAL37）の連日注射の効果を、食物摂取量（図53A）、体重（図53B）、血漿グルコース（図53C）、インスリン（図53D）、及び糖化ヘモグロビン（図53E）に対するN-AcGIP（LysPAL37）（12.5nmoles/kg/日）（黒丸；黒棒）の連日投与の効果を示すグラフのセットである図53A〜53Eに示す。天然のGIP（12.5nmoles/kg/日；黒三角；線入り棒）又は生理的食塩水媒体（対照；白四角；白棒）を、水平の黒棒によって示される14日間、投与した。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。*p＜0.05、**p＜0.01は、対照と比較した。ΔΔp＜0.01は、天然のGIPと比較した。
【０２１４】
GIP又はN-AcGIP（LysPAL37）は、体重又は食物摂取量に対して効果がなかった（図53A、53B）。血漿グルコース及びインスリン濃度も同様に14日間の天然のGIPでの処置によって変化しなかった（図53C、53D）。対照的に、N-AcGIP（LysPAL37）の連日注射は、14日目で有意に（p＜0.05）降下した濃度をもたらした、血漿グルコースの漸進的な降下をもたらした（図53C）。この時、糖化ヘモグロビンも同様にN-AcGIP（LysPAL37）処置したob/obマウスにおいて有意に（p＜0.01）減少した（図53E）。これらの変化は、高められたインスリン濃度に向かう傾向に付随して起こるが、しかし、これらは時間枠研究を上回る統計的な有意性を達成しなかった（図53D）。
【０２１５】
N-AcGIP（LysPAL37）でのob/obマウスの長期処置の耐糖能に対する効果：図54A〜54Dは、グルコースへの耐糖能（図54A、54B）及び血漿インスリン反応（図54C、54D）に対する毎日のN-AcGIP（LysPAL37）投与の効果を示す2つの折れ線グラフ（図54A、54C）及び2つの棒グラフ（図54B、54D）のセットである。試験を、N-AcGIP（LysPAL37）（12.5nmoles/kg/日；黒丸；黒棒）、天然のGIP（12.5nmoles/kg/日；黒三角；線入り棒）、又は生理的食塩水媒体（対照；白四角；白棒）のいずれかの14日の連日注射の後に実施した。グルコース（18mmoles/kg）を、矢印で示した時点で、腹腔内注射によって投与した。注射の0〜60分後の血漿グルコース及びインスリンAUCを、右側のパネルに示す。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001は、対照と比較した。Δp＜0.05、ΔΔp＜0.01、ΔΔΔp＜0.001は、天然のGIPと比較した。
【０２１６】
糖化ヘモグロビンに対する効果と一致して、N-AcGIP（LysPAL37）での14日間のob/obマウスの処置は、耐糖能の有意な改善をもたらした（図54A、54B）。試験全体にわたる血漿グルコース濃度、及び全体的な0〜60分のAUCは、降下した（p＜0.01〜p＜0.001）。これは、後期段階の間の高まったインスリン濃度（p＜0.05）、及びより高い（p＜0.01）全体的なAUCインスリン反応と同時に起きた（図54C、54D）。対照的に、天然のGIPの連日投与は、14日間の生理的食塩水注射を受けた対照ob/obマウスと比べて、グルコースへの耐糖能又は血漿インスリン反応に対する効果がなかった（図54）。
【０２１７】
インスリン感受性に対するN-AcGIP（LysPAL37）でのob/obマウスの長期処置の効果、及び膵臓インスリン量に対するN-AcGIP（LysPAL37）でのob/obマウスの長期処置の効果：図55A〜55Dは、インスリン感受性（図55A、55B）、並びに膵臓の重量（図55C）及びインスリン量（図55D）に対する毎日のN-AcGIP（LysPAL37）投与の効果を示す1つの折れ線グラフ及び3つの棒グラフである。観察を、N-AcGIP（LysPAL37）（12.5nmoles/kg/日；黒丸；黒棒）、天然のGIP（12.5nmoles/kg/日；黒三角；線入り棒）、又は生理的食塩水媒体（対照；白四角；白棒）の14日の連日注射の後に実施した。図55Aにおいて、インスリン（50U/kg）を、矢印で示した時点にて腹腔内注射によって投与した。注射の0〜60分後の血漿グルコースAUC値を右側のパネル示す。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。*p＜0.05、**p＜0.01は、対照と比較した。Δp＜0.05、ΔΔp＜0.01は、天然のGIPと比較した。
【０２１８】
14日間の処置後の3群のマウスのインスリン感受性を、図55A、55Bに示す。生理的食塩水又は天然のGIPの連日注射を受けたob/obマウスと比べて、N-AcGIP（LysPAL37）は、インスリン感受性の有意な改善を引き起こした。個々のグルコース濃度も0〜60分のAUC値も、他の2つの群とは有意に異なった（p＜0.01）。対照的に、天然のGIPでの毎日の処置は、ob/obマウスの特徴的なインスリン抵抗性に影響を及ぼさなかった（図55A、55B）。
【０２１９】
天然のGIP又はN-AcGIP（LysPAL37）での14日間のob/obマウスの処置は、生理的食塩水処置した対照と比べて膵臓の重量に影響を及ぼさなかった（図55C、55D）。同じように、膵臓のインスリン量は、GIP及び生理的食塩水で処置した群において類似していた。しかし、N-AcGIP（LysPAL37）での連日投与は、他の群の各々と比べてインスリン量が有意に増加した（p＜0.01）（図55C、55D）。
【０２２０】
N-AcGIP（LysPAL37）でのob/obマウスの長期処置後のGIPレセプター脱感作についての評価：図56A〜56Dは、14日間の連日注射後のN-AcGIP（LysPAL37）及び天然のGIPのグルコース降下（図56A、56B）及びインスリン放出（図56C、56D）活性を示す2つの折れ線グラフ（図56A、56C）及び2つの棒グラフ（図56B、56D）のセットである。グルコース（18mmoles/kg）を、単独で（白四角；白棒）、あるいはN-AcGIP（LysPAL37）（黒丸；黒棒）又は天然のGIP（黒三角；線入り棒）（共に25nmoles/kg）のいずれかと組み合わせての腹腔内注射によって、矢印によって示された時点で投与した。注射の0〜60分後の血漿グルコース及びインスリンAUC値を、右側のパネルに示す。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。*P＜0.05、**p＜0.01は、グルコース単独と比較した。Δp＜0.05、ΔΔp＜0.01は、天然のGIPと比較した。図57A〜57Dは、N-AcGIP（LysPAL37）（12.5nmoles/kg/日；黒丸；黒棒）、天然のGIP（12.5mnoles/kg/日；黒三角；線入り棒）、又は生理的食塩水媒体（対照；白四角；白棒）のいずれかでの14日の連日注射の後のN-AcGIP（LysPAL37）の急性グルコース降下（図57A、57B）及びインスリン放出効果（図57C、57D）を示す2つの折れ線グラフ（図57A、57C）及び2つの棒グラフ（図57B、57D）のセットである。N-AcGIP（LysPAL37）（25nmoles/kg）を、矢印で示された時点でグルコース（18mmoles/kg）と一緒に腹腔内注射によって投与した。注射の0〜60分後の血漿グルコース及びインスリンAUC値を、右側のパネルに示す。値は、8匹のマウスについての平均±SEMである。*p＜0.05、**p＜0.01は、対照注射を受けたマウスと比較した。Δp＜0.05、ΔΔp＜0.01は、天然のGIPの注射を受けた群と比較した。
【０２２１】
図56A〜56Dで示されるように、14日間のN-AcGIP（LysPAL37）でのob/obマウスの処置は、腹腔内グルコースで急性的に投与される時、有意に血糖可動域を加減し（p＜0.01）、そして血漿インスリン濃度を高める（p＜0.01）ペプチドの能力を妨げなかった。対照的に、天然のGIPの急性投与へのob/obマウスの反応は、14日間、GIP又は生理的食塩水で処置を受けたマウスにおいてほとんど同じだった（図56A〜56D）。N-AcGIP（LysPAL37）での慢性処置の後のGIPレセプター脱感作の欠如をさらに実証するために、グルコースと一緒に投与される前記アナログの急性効果を、N-AcGIP（LysPAL37）、天然のGIP、又は生理的食塩水での14日の処置後の3群の各々において調査した（図57A〜57D）。先に述べた群におけるより低い基礎値は別として、グルコース及びインスリン反応は、血漿グルコース及びインスリン濃度の両方に関する類似した0〜60分のAUC量と一致した。
【０２２２】
本願発明は、その好ましい態様への言及によって詳しく示され、かつ、説明される一方で、当業者にとっては当然のことながら、形態及び細部の様々な変更が、添付の請求項によって包含される本発明の範囲から逸脱することなくそこに加えられうる。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１ａ】DPP IVによるGIPの分解を説明する。
【図１ｂ】DPP IVによるGIP及びTyr1グルシトールGIPの分解を説明する。
【図２ａ】ヒト血漿によるGIPの分解を説明する。
【図２ｂ】ヒト血漿によるGIP及びTyr1グルシトールGIPの分解を説明する。
【図３】GIP、Tyr1-グルシトールGIP、及びGIP（3-42）の主な分解断片のエレクトロスプレー・イオン化質量分析を説明する。
【図４】血漿グルコース恒常性に対するGIP及び糖化GIPの効果を示す。
【図５】血漿インスリン反応に対するGIPの効果を示す。
【図６】GIP（1-42）のDPP-IV分解を説明する。
【図７】GIP（Abu2）のDPP-IV分解を説明する。
【図８】GIP（Sar2）のDPP-IV分解を説明する。
【図９】GIP（Ser2）のDPP-IV分解を説明する。
【図１０】N-アセチル-GIPのDPP-IV分解を説明する。
【図１１】糖化GIPのDPP-IV分解を説明する。
【図１２】GIPのヒト血漿分解を説明する。
【図１３】GIP（Abu2）のヒト血漿分解を説明する。
【図１４】GIP（Sar2）のヒト血漿分解を説明する。
【図１５】GIP（Ser2）のヒト血漿分解を説明する。
【図１６】糖化GIPのヒト血漿分解を説明する。
【図１７】5.6mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及びGIP（Abu2）の効果を示す。
【図１８】16.7mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及びGIP（Abu2）の効果を示す。
【図１９】5.6mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及びGIP（Sar2）の効果を示す。
【図２０】16.7mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及びGIP（Sar2）の効果を示す。
【図２１】5.6mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及びGIP（Ser2）の効果を示す。
【図２２】16.7mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及びGIP（Ser2）の効果を示す。
【図２３】5.6mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及びN-アセチル-GIP 1-42の効果を示す。
【図２４】16.7mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及びN-アセチル-GIP 1-42の効果を示す。
【図２５】5.6mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及び糖化GIP 1-42の効果を示す。
【図２６】16.7mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及び糖化GIP 1-42の効果を示す。
【図２７】5.6mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及びGIP（Gly2）の効果を示す。
【図２８】16.7mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及びGIP（Gly2）の効果を示す。
【図２９】5.6mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及びGIP（Pro3）の効果を示す。
【図３０】16.7mMグルコースでインキュベートしたBRIN-BD11細胞からのインスリン放出に対する様々な濃度のGIP 1-42及びGIP（Pro3）の効果を示す。
【図３１Ａ】ヒト胃抑制ポリペプチド（GIP）（配列番号1）の1次構造を示す。
【図３１Ｂ】ブタ胃抑制ポリペプチド（GIP）（配列番号2）の1次構造を示す。
【図３２Ａ】それぞれ、インビトロにおけるGIPに刺激されたサイクリックAMP産生と、インスリン分泌に対する（Pro3）GIPの効果を示す折れ線グラフと、棒グラフである。
【図３２Ｂ】それぞれ、インビトロにおけるGIPに刺激されたサイクリックAMP産生と、インスリン分泌に対する（Pro3）GIPの効果を示す折れ線グラフと、棒グラフである。
【図３３Ａ】A〜Fは、インビトロにおけるGIPに刺激されたインスリン分泌に対するGlu3が置換された形態のGIPとGIP（3-42）の効果を示す6つの棒グラフのセットである。
【図３３Ｂ】A〜Fは、インビトロにおけるGIPに刺激されたインスリン分泌に対するGlu3が置換された形態のGIPと、GIP（3-42）の効果を示す6つの棒グラフのセットである。
【図３３Ｃ】A〜Fは、インビトロにおけるGIPに刺激されたインスリン分泌に対するGlu3が置換された形態のGIPと、GIP（3-42）の効果を示す6つの棒グラフのセットである。
【図３３Ｄ】A〜Fは、インビトロにおけるGIPに刺激されたインスリン分泌に対するGlu3が置換された形態のGIPと、GIP（3-42）の効果を示す6つの棒グラフのセットである。
【図３３Ｅ】A〜Fは、インビトロにおけるGIPに刺激されたインスリン分泌に対するGlu3が置換された形態のGIPと、GIP（3-42）の効果を示す6つの棒グラフのセットである。
【図３３Ｆ】A〜Fは、インビトロにおけるGIPに刺激されたインスリン分泌に対するGlu3が置換された形態のGIPと、GIP（3-42）の効果を示す6つの棒グラフのセットである。
【図３４Ａ】（Pro3）GIPの急性投与が、肥満性糖尿病ob/obマウスにおける耐糖能（図34A、34B）及び血漿インスリン（図34C、34D）反応に対するGIPの作用を完全に中和することを示した、2つの折れ線グラフ（図34A、34C）及び2つの棒グラフ（図34B、34D）のセットである。
【図３４Ｂ】（Pro3）GIPの急性投与が、肥満性糖尿病ob/obマウスにおける耐糖能（図34A、34B）及び血漿インスリン（図34C、34D）反応に対するGIPの作用を完全に中和することを示した、2つの折れ線グラフ（図34A、34C）及び2つの棒グラフ（図34B、34D）のセットである。
【図３４Ｃ】（Pro3）GIPの急性投与が、肥満性糖尿病ob/obマウスにおける耐糖能（図34A、34B）及び血漿インスリン（図34C、34D）反応に対するGIPの作用を完全に中和することを示した、2つの折れ線グラフ（図34A、34C）及び2つの棒グラフ（図34B、34D）のセットである。
【図３４Ｄ】（Pro3）GIPの急性投与が、肥満性糖尿病ob/obマウスにおける耐糖能（図34A、34B）及び血漿インスリン（図34C、34D）反応に対するGIPの作用を完全に中和することを示した、2つの折れ線グラフ（図34A、34C）及び2つの棒グラフ（図34B、34D）のセットである。
【図３５Ａ】（Pro3）GIP急性投与が、肥満性糖尿病ob/obマウスにおける生理学的な、食事に刺激されたインスリン放出を低下させ、及び血糖可動域を悪化させることを示した、2つの折れ線グラフ（図35A、35C）及び2つの棒グラフ（図35B、35D）のセットである。
【図３５Ｂ】（Pro3）GIP急性投与が、肥満性糖尿病ob/obマウスにおける生理学的な、食事に刺激されたインスリン放出を低下させ、及び血糖可動域を悪化させることを示した、2つの折れ線グラフ（図35A、35C）及び2つの棒グラフ（図35B、35D）のセットである。
【図３５Ｃ】（Pro3）GIP急性投与が、肥満性糖尿病ob/obマウスにおける生理学的な、食事に刺激されたインスリン放出を低下させ、及び血糖可動域を悪化させることを示した、2つの折れ線グラフ（図35A、35C）及び2つの棒グラフ（図35B、35D）のセットである。
【図３５Ｄ】（Pro3）GIP急性投与が、肥満性糖尿病ob/obマウスにおける生理学的な、食事に刺激されたインスリン放出を低下させ、及び血糖可動域を悪化させることを示した、2つの折れ線グラフ（図35A、35C）及び2つの棒グラフ（図35B、35D）のセットである。
【図３６Ａ】AとBは、11日間の（Pro3）GIPの慢性投与が肥満性糖尿病ob/obマウスの血漿グルコース及びインスリン濃度を減少させることを示した、2つの棒グラフのセットである。
【図３６Ｂ】AとBは、11日間の（Pro3）GIPの慢性投与が肥満性糖尿病ob/obマウスの血漿グルコース及びインスリン濃度を減少させることを示した、2つの棒グラフのセットである。
【図３７Ａ】A〜Cは、11日間の（Pro3）GIPの慢性投与が、肥満性糖尿病ob/obマウスの糖化HbA1c、膵臓インスリン量、及び併発した膵島肥大を減少させることを示した3つの棒グラフのセットである。
【図３７Ｂ】A〜Cは、11日間の（Pro3）GIPの慢性投与が、肥満性糖尿病ob/obマウスの糖化HbA1c、膵臓インスリン量、及び併発した膵島肥大を減少させることを示した3つの棒グラフのセットである。
【図３７Ｃ】A〜Cは、11日間の（Pro3）GIPの慢性投与が、肥満性糖尿病ob/obマウスの糖化HbA1c、膵臓インスリン量、及び併発した膵島肥大を減少させることを示した3つの棒グラフのセットである。
【図３８Ａ】11日間の（Pro3）GIPの慢性投与が、循環インスリンの変化なしに肥満性糖尿病ob/obマウスの耐糖能を改善することを示した2つの折れ線グラフ（図38A、38C）及び2つの棒グラフ（図38B、38D）のセットである。
【図３８Ｂ】11日間の（Pro3）GIPの慢性投与が、循環インスリンの変化なしに肥満性糖尿病ob/obマウスの耐糖能を改善することを示した2つの折れ線グラフ（図38A、38C）及び2つの棒グラフ（図38B、38D）のセットである。
【図３８Ｃ】11日間の（Pro3）GIPの慢性投与が、循環インスリンの変化なしに肥満性糖尿病ob/obマウスの耐糖能を改善することを示した2つの折れ線グラフ（図38A、38C）及び2つの棒グラフ（図38B、38D）のセットである。
【図３８Ｄ】11日間の（Pro3）GIPの慢性投与が、循環インスリンの変化なしに肥満性糖尿病ob/obマウスの耐糖能を改善することを示した2つの折れ線グラフ（図38A、38C）及び2つの棒グラフ（図38B、38D）のセットである。
【図３９】11日間の（Pro3）GIPの慢性投与が、肥満性糖尿病ob/obマウスのインスリン感受性を改善することを示した折れ線グラフである。
【図４０】肥満性糖尿病ob/obマウスにおける11日間の（Pro3）GIPの慢性投与の有益な効果が、処置中止の9日後に覆されることを示した折れ線グラフである。
【図４１Ａ】AとBは、11日間の（Pro3）GIPの慢性投与が、処置中止の9日後に覆される正常なマウスにおける耐糖能障害を引き起こすことを示した2つの折れ線グラフのセットである。
【図４１Ｂ】AとBは、11日間の（Pro3）GIPの慢性投与が、処置中止の9日後に覆される正常なマウスにおける耐糖能障害を引き起こすことを示した2つの折れ線グラフのセットである。
【図４２】投与の4時間後の天然のGIPに対する血漿グルコース及びインスリン反応に対する（Pro3）GIPの効果を示した2つの折れ線グラフ（図42A、42C）及び2つの棒グラフ（図42B、42D）のセットである。
【図４３】ob/obマウスにおける食物摂取量（図43A）、体重（図43B）、血漿グルコース（図43C）、及びインスリン（図43D）濃度に対する毎日の（Pro3）GIP投与の効果を示した2つの折れ線グラフ及び2つの棒グラフのセットである。
【図４４】A〜Dは、ob/obマウスにおける耐糖能及びグルコースへの血漿インスリン反応に対する毎日の（Pro3）GIP投与の効果を示した、挿入された棒グラフを伴う4つの折れ線グラフのセットである。
【図４５】A〜Dは、18時間絶食したob/obマウスにおける食事へのグルコース（図45A、45B）及びインスリン（図45C、45D）反応に対する毎日の（Pro3）GIP投与（黒三角；黒棒）又は生理的食塩水（白四角；白棒）の効果を示した2つの折れ線グラフ（図45A、45C）及び2つの棒グラフ（図45B、45D）のセットである。
【図４６】A〜Dは、ob/obマウスにおけるインスリン感受性に対する毎日の（Pro3）GIP投与の効果を示した2つの折れ線グラフ（図46A、46C）及び2つの棒グラフ（図46B、46D）のセットである。
【図４７】A〜Dは、ob/obマウスにおける膵臓の重量（図47A）、インスリン量（図47B）、膵島数（図47C）、及び膵島直径（図47D）に対する毎日の（Pro3）GIP投与の効果を示した4つの棒グラフのセットである。
【図４８】A〜Fは、ob/obマウスにおける膵島サイズ及び形態に対する毎日の（Pro3）GIP投与の効果を示した2つの棒グラフ（図48A、48D）及び4つの顕微鏡写真（図48B、48C、48E、48F）のセットである。
【図４９】GIPレセプター（「GIP-R」）拮抗薬、（Pro3）GIPがどのようにベータ細胞過形成、高インスリン血症、及びインスリン抵抗性に対抗して改善された耐糖能障害及び糖尿病管理に至るのかの説明である。
【図５０】クローン化膵ベータ細胞株BRIN-BD11におけるGIP（黒三角）、並びに脂肪酸誘導体化GIPアナログN-AcGIP（LysPAL16）（白四角）及びN-AcGIP（LysPAL37）（黒丸）による細胞内サイクリックAMP産生（図50A）、そしてグルコース（5.6mmo/lのグルコース；白棒）、GIP（線の入った棒）、並びに脂肪酸誘導体化GIPアナログ（図50B）N-AcGIP（LysPAL16）（灰色棒）及びN-AcGIP（LysPAL37）（黒棒）のインスリン放出活性をそれぞれ示した折れ線グラフと棒グラフである。
【図５１】18時間絶食したob/obマウスにおける、GIP及び脂肪酸誘導体化GIPアナログのグルコース降下効果（図51A、51B）、及びインスリン放出活性（図51C、51D）を示した2つの折れ線グラフ（図51A、51C）及び2つの棒グラフ（図51B、51D）のセットである。
【図５２】18時間絶食したob/obマウスにおけるGIP及びN-AcGIP（LysPAL37）の用量依存的効果を示した一対の棒グラフである。
【図５３】食物摂取量（図53A）、体重（図53B）、血漿グルコース（図53C）、インスリン（図53D）、及び糖化ヘモグロビン（図53E）に対する毎日のN-AcGIP（LysPAL37）（12.5nmoles/kg/日）（黒丸；黒棒）投与の効果を示したグラフのセットである。
【図５４】耐糖能（図54A、54B）及びグルコースへの血漿インスリン反応（図54C、54D）に対する毎日のN-AcGIP（LysPAL37）投与の効果を示した2つの折れ線グラフ（図54A、54C）及び2つの棒グラフ（図54B、54D）のセットである。
【図５５】インスリン感受性（図55A、55B）、並びに膵臓の重量（図55C）及びインスリン量（図55D）に対する毎日のN-AcGIP（LysPAL37）投与の効果を示した1つの折れ線グラフ及び3つの棒グラフである。
【図５６】14日間の連日注射後のN-AcGIP（LysPAL37）及び天然のGIPのグルコース降下（図56A、56B）及びインスリン放出（図56C、56D）の活性を示した2つの折れ線グラフ（図56A、56C）及び2つの棒グラフ（図56B、56D）のセットである。
【図５７】N-AcGIP（LysPAL37）（12.5nmoles/kg/日；黒丸；黒棒）、天然のGIP（12.5nmoles/kg/日；黒三角；線の入った棒）、又は生理的食塩水媒体（対照；白四角；白棒）のいずれかの14日間の連日注射後のN-AcGIP（LysPAL37）の急性グルコース軽減（図57A、57B）、及びインスリン放出（図57C、57D）の効果を示した2つの折れ線グラフ（図57A、57C）及び2つの棒グラフ（図57B、57D）のセットである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008500280.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
2008500280.tif 000039
【図３２Ａ】
2008500280.tif 000040
【図３２Ｂ】
2008500280.tif 000041
【図３３Ａ】
2008500280.tif 000042
【図３３Ｂ】
2008500280.tif 000043
【図３３Ｃ】
2008500280.tif 000044
【図３３Ｄ】
2008500280.tif 000045
【図３３Ｅ】
2008500280.tif 000046
【図３３Ｆ】
2008500280.tif 000047
【図３４Ａ】
2008500280.tif 000048
【図３４Ｂ】
2008500280.tif 000049
【図３４Ｃ】
2008500280.tif 000050
【図３４Ｄ】
2008500280.tif 000051
【図３５Ａ】
2008500280.tif 000052
【図３５Ｂ】
2008500280.tif 000053
【図３５Ｃ】
2008500280.tif 000054
【図３５Ｄ】
2008500280.tif 000055
【図３６Ａ】
2008500280.tif 000056
【図３６Ｂ】
2008500280.tif 000057
【図３７Ａ】
2008500280.tif 000058
【図３７Ｂ】
2008500280.tif 000059
【図３７Ｃ】
2008500280.tif 000060
【図３８Ａ】
2008500280.tif 000061
【図３８Ｂ】
2008500280.tif 000062
【図３８Ｃ】
2008500280.tif 000063
【図３８Ｄ】
2008500280.tif 000064
【図３９】
2008500280.tif 000065
【図４０】
2008500280.tif 000066
【図４１Ａ】
2008500280.tif 000067
【図４１Ｂ】
2008500280.tif 000068
【図４２】
2008500280.tif 000069
【図４３】
2008500280.tif 000070
【図４４】
2008500280.tif 000071
【図４５】
2008500280.tif 000072
【図４６】
2008500280.tif 000073
【図４７】
2008500280.tif 000074
【図４８】
2008500280.tif 000075
【図４９】
2008500280.tif 000076
【図５０】
2008500280.tif 000077
【図５１】
2008500280.tif 000078
【図５２】
2008500280.tif 000079
【図５３】
2008500280.tif 000080
【図５４】
2008500280.tif 000081
【図５５】
2008500280.tif 000082
【図５６】
2008500280.tif 000083
【図５７】
2008500280.tif 000084
【国際調査報告】
2008500280.tif 000085
2008500280.tif 000086
2008500280.tif 000087