(57)【要約】上皮由来の癌を有する患者において、ＡＤＡＭＴＳ−７の発現および活性は上方に調節される。従って、本発明は、上皮由来の癌（例えば乳癌、前立腺癌、膀胱癌、脳腫瘍および肝癌）の診断方法を対象とする。詳細には、生物学的サンプルにおけるＡＤＡＭＴＳ−７の存在は、上皮由来の癌が存在していることを指示する。それ故、生物学的サンプル（例えば尿または血液）におけるＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを測定することにより、患者の癌を診断するために使用することが可能な、迅速且つ簡単で安全なスクリーニング方法を提供する。
2008536098.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮由来の癌について患者の診断を容易化するための方法であって：
ａ．  該患者から生物学的サンプルを得るステップ；および
ｂ．  該生物学的サンプルにおいてＡＤＡＭＴＳ−７の存在または不在を検出するステップ；
を含み、ＡＤＡＭＴＳ−７の存在が上皮由来の癌の存在を示す方法。
【請求項２】
前記生物学的サンプルが、血液、組織、血清、尿、大便、痰、脳脊髄液、乳頭吸引液、および細胞溶解物から得られる上層液からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルが尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
患者における上皮由来の癌を診断するための方法であって：
ａ．  該患者から得られる試験サンプルに存在するＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを測定するステップ；
ｂ．  該試験サンプルにおけるＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを対照サンプルに存在するＡＤＡＭＴＳ−７のレベルと比較するステップ；
を含み、該対照サンプルにおけるＡＤＡＭＴＳ−７のレベルに比べ、該試験サンプルにおける相対的に高いレベルのＡＤＡＭＴＳ−７が上皮由来の癌を示す方法。
【請求項５】
前記試験サンプルおよび前記対照サンプルが、血液、組織、血清、尿、大便、痰、脳脊髄液、乳頭吸引液、および細胞溶解物から得られる上層液からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記試験サンプルおよび前記対照サンプルが尿である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記上皮由来の癌が、乳癌、基底細胞癌、腺癌、消化管癌、口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌、胃癌、結腸癌、肝癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、前立腺癌および腎細胞癌からなる群から選択される、請求項１または４に記載の方法。
【請求項８】
ＡＤＡＭＴＳ−７の存在または不在を、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質に特異的に結合する抗体ベースの結合部分を用いて検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質のレベルを測定することにより測定する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを、ＡＤＡＭＴＳ−７の活性を測定することにより測定する、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質のレベルを：
ａ．  前記試験サンプルまたはその調製物と、ＡＤＡＭＴＳ−７に特異的に結合する抗体ベースの結合部分とを接触させて、抗体−ＡＤＡＭＴＳ−７複合体を形成するステップ；および
ｂ．  該複合体の存在を検出し、これにより、存在しているＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを測定するステップ；
を含む方法により測定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体ベースの結合部分を、検出可能な標識で標識付けする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識が、放射性標識、ハプテン標識、蛍光標識および酵素標識からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体ベースの結合部分が抗体である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
尿サンプル中のＡＤＡＭＴＳ−７を検出するためのキットであって、尿サンプルを保持するための容器、およびＡＤＡＭＴＳ−７を特異的に結合する少なくとも一つの抗体を含むキット。
【請求項１７】
前記キットが、ＡＤＡＭＴＳ−７に特異的に結合する二つの抗体を含み、一方の抗体が固相に固定化されており、他方の抗体が検出可能に標識されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
更に、使用説明書を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
被験体の治療を指示する方法であって、該方法は、被験体から得られる生物学的サンプルにおけるＡＤＡＭＴＳ−７の存在について試験される該被験体を得るステップを含み、ここで、臨床医が試験結果を精査し、もし該生物学的サンプルがＡＤＡＭＴＳ−７の存在に関して陽性であるとき、該臨床医が、該被験体に対し、上皮由来の癌に対する治療を受けるように指示する方法。
【請求項２０】
前記生物学的サンプルが尿である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／６５３，８１８号（２００５年２月１７日出願）についての米国特許法第１１９条（ｅ）の下の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、患者から得られた生物学的サンプルにおいてＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを評価することにより、上皮由来の癌を診断および予後診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
癌の生存率における最も重要なファクターの一つは、早い段階での検出である。癌の初期事象を検出する臨床分析は、癌の進行を干渉および阻止する機会を提供する。遺伝子プロファイリングおよびプロテオミクスの発展に伴い、特定の癌を診断および予後診断するために使用することができる分子マーカーまたは「バイオマーカー」の同定がかなり進んできている。例えば、前立腺癌の場合には、抗原ＰＳＡ（前立腺特異抗原）が血液中において検出され得、そして、前立腺癌が存在することを示している。従って、前立腺癌のリスクを負った男性の血液は、ＰＳＡレベルの上昇により、迅速に、容易に、且つ安全にスクリーニングすることができる。
【０００４】
癌の検出分野でかなりの進展があったとは言え、当技術分野には、尚も、臨床的応用において容易に使用することができる、様々な癌に対する新たなバイオマーカーを同定する必要性が依然として存在する。例えば、これまでのところ、容易に検出可能なバイオマーカーを用いて乳癌の診断に利用できる方法は比較的僅かな選択肢しかなかった。ＥＧＦＲの過剰発現は、特にエストロゲン受容体の下方調節と相まって、乳癌患者における予後不良のマーカーである。乳癌に対する他の公知のマーカーは、血液中における高レベルのＭ２ピルビン酸キナーゼ（Ｍ２ＰＫ）（特許文献１）、血液中における高レベルのＺＮＦ２１７タンパク質（特許文献２）、および乳癌において新たに同定されたタンパク質であるＰＤＥＢＣの差次的発現を含み、このＰＤＥＢＣの差次的発現は、診断に有用である（特許文献３）。これらのバイオマーカーは代替的な診断方法を提供しているが、広範には使用されていない。更に、多くの組織化学的マーカー、遺伝子マーカーおよび免疫学的マーカーが使用されているにもかかわらず、臨床医にとっては、依然として、どの腫瘍が他の器官に転移するのかを予測するのが困難である。
【特許文献１】米国特許第６，３５８，６８３号明細書
【特許文献２】国際公開第９８／０２５３９号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／０１２４５４３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
バイオマーカーの同定は、疾患の診断、予後診断および治療を改善することと深く関わっている。それ故、当技術分野においては、迅速に、容易に、且つ安全に検出することができる代替的なバイオマーカーを同定する必要性が存在する。そのようなバイオマーカーは、癌を有する被験体の進行または治療、特に、その疾患における浸潤性の潜在的な転移段階を診断し、病期を決定し、モニタリングするために使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、脳腫瘍および肝癌を有する患者においては、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質が尿中に存在し、ＡＤＡＭＴＳ−７の発現および活性が上方に調節されている、という発見に基づくものである。従って、本発明は、上皮由来の癌の予後を評価するための方法、上皮由来の癌の診断を容易化するための方法、および上皮由来の癌の治療効力に対するマーカーを対象とする。詳細には、生物学的サンプル、例えば尿などで検出されるＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質の存在は、健常個体においてはＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質が有意なレベルでは検出されないため、癌の存在を予測する。従って、生物学的サンプル（例えば尿または血液）におけるＡＤＡＭＴＳ−７の存在または不在を測定することにより、患者における上皮由来の癌、例えば前立腺癌、乳癌、肝癌、脳腫瘍または膀胱癌などの診断および予後診断の両方に使用可能な、迅速で簡単で安全なスクリーニング方法を提供する。
【０００７】
一つの実施形態においては、患者における上皮由来の癌の診断を容易化するための方法が提供される。その方法は、患者から生物学的サンプルを得るステップ、およびその生物学的サンプルにおけるＡＤＡＭＴＳ−７（またはそのフラグメント）の存在または不在を検出するステップを含み、ここで、ＡＤＡＭＴＳ−７の存在は、上皮由来の癌が存在していることを示している。
【０００８】
別の実施形態においては、本方法は、患者から得た生物学的試験サンプルに存在するＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを測定するステップ、およびその観測されたＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを同じタイプの対照サンプルに存在するＡＤＡＭＴＳ−７のレベルと比較するステップを含む。対照サンプルと比べるときに、試験サンプルに存在する比較的高いレベルのＡＤＡＭＴＳ−７は、癌が存在していることを示している。好適には、本発明の方法は、上皮由来の癌を早期に検出するために用いられる。例えば、医師により、年に一度行われる健康診断の際に患者をスクリーニングすることができる。
【０００９】
「対照サンプル」という用語は、癌を有していないものと確信される一人もしくは複数の「正常」または「健常」な個体から得られた生物学的サンプルを表す。対照は、当該技術分野において広く知られている方法を用いて選択されてよい。一旦、対照集団でのあるレベルが明確になると、生物学的試験サンプルから得られた一連の結果をその既知のレベルと直接的に比較することができる。
【００１０】
「試験サンプル」という用語は、上皮由来の癌について試験される患者から得られた生物学的サンプルを表す。
【００１１】
生物学的サンプルは、例えば血液、組織（例えば腫瘍または乳房）、血清、大便、尿、痰、脳脊髄液、乳頭吸引液および細胞溶解物からもたらされる上層液から得ることができる。一つの好適な生物学的サンプルは尿である。
【００１２】
一つの態様においては、診断されるべき上皮由来の癌は、乳癌、基底細胞癌、腺癌、消化管癌（例えば口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌および胃癌）、結腸癌、肝癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、および皮膚癌（例えば扁平上皮細胞癌および基底細胞癌）、前立腺癌、腎細胞癌、ならびに身体の至る所で上皮細胞に影響を及ぼす他の公知の癌である。
【００１３】
本発明は、更に、上皮由来の癌を有する患者を治療すべく設計された治療計画の治療効力をモニタリングするためのＡＤＡＭＴＳ−７のレベルの評価も想定している。
【００１４】
一つの好適な実施形態においては、生物学的サンプルは尿サンプルである。しかし、血液、組織、血清、大便、痰、脳脊髄液、乳頭吸引液および細胞溶解物からもたらされる上層液の生物学的サンプルを使用することもできる。
【００１５】
本発明の一つの態様においては、生物学的試験サンプル中に存在するＡＤＡＭＴＳ−７のレベルは、試験サンプルまたはその調製物を、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質またはその一部に特異的に結合する抗体ベースの結合部分と接触させることにより測定される。この抗体ベースの結合部分は、検出することができるＡＤＡＭＴＳ−７との複合体を形成し、これにより、ＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを測定することが可能になる。
【００１６】
抗体をベースとしたイムノアッセイは、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質のレベルを測定するための好適な手段である。しかし、当業者にとって公知のあらゆる手段を用いてＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを評価することができる。例えば、幾つかの実施形態においては、ＡＤＡＭＴＳ−７の発現レベルは、ＡＤＡＭＴＳ−７のｍＲＮＡ転写物のレベルを測定することにより検定される。代替的に、ＡＤＡＭＴＳ−７のレベルは、ＳＥＬＤＩ質量分析法を含め、質量分析法により評価することができる。また、ＡＤＡＭＴＳ−７のレベルは、限定されないが、基質ゲル電気泳動（ザイモグラフィー）を含め、生物学的活性分析により評価することもできる。
【００１７】
一つの更なる実施形態においては、本発明は、生物学的サンプルにおけるＡＤＡＭＴＳ−７を測定するための手段を含むキットを提供する。
【００１８】
別の実施形態においては、被験体の治療を指示するための方法が提供される。その方法は、被験体から得られた生物学的サンプルにおけるＡＤＡＭＴＳ−７の存在について試験される被験体を得るステップを含み、臨床医がそれらの結果を精査し、もしその生物学的サンプルがＡＤＡＭＴＳ−７の存在に関して陽性であるとき、それに応じて、臨床医は、その被験体に対し、治療を受けるように指示する。その試験は、被験体が居住している場所と同じ地域で行われてもよいし、別の地域で行われてもよく、試験結果は、例えばウェブサイトを通じて利用可能に為され、またはその臨床医に送信される。
【００１９】
本発明の別の態様は以下で開示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、患者の生物学的サンプルに存在するＡＤＡＭＴＳ−７のレベルが上皮由来の癌の存在または不在と相関関係があることを発見した。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「上皮由来の癌」という用語は、上皮細胞から生じる癌を表し、これらに限定されないが、乳癌、基底細胞癌、腺癌、消化管癌、口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌および胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、乳癌および皮膚癌（例えば扁平上皮細胞癌および基底細胞癌）、前立腺癌、腎細胞癌、ならびに身体の至る所で上皮細胞に影響を及ぼす他の公知の癌を含む。
【００２２】
癌に関する「侵襲性の強い」または「浸潤性の」という用語は、腫瘍がその境界を越えて隣接する組織に広がる性質的傾向を表す（Ｄａｒｎｅｌｌ，Ｊ．（１９９０）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第三版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、ＮＹ）。浸潤性の癌は、腫瘍が特定の器官に限定される器官限局性の癌と対照をなすことができる。腫瘍の浸潤特性は、しばしば、タンパク質分解酵素、例えばコラゲナーゼなどの産生を伴い、これらのタンパク質分解酵素は、マトリックス物質および基底膜物質を分解し、腫瘍が、その被膜の境界を越えて広がることを可能にし、また、腫瘍が位置している特定の組織の境界を越えて広がることを可能にする。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「転移」という用語は、癌が発生元の器官から患者の付加的な遠位方向の部位へ拡散する状態を表す。腫瘍が転移するプロセスは多段階事象であり、細胞間マトリックスの局所的な侵害および破壊、血管、リンパ管または他の輸送チャンネル内への侵入、その循環内における生存、それらの脈管から二次的な部位への管外遊出、および新たな場所での増殖を含む（Ｆｉｄｌｅｒら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２８、１４９−２５０（１９７８）、Ｌｉｏｔｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｓ．４０、２２３−２３８（１９８８）、Ｎｉｃｏｌｓｏｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ  ９４８、１７５−２２４（１９８８）およびＺｅｔｔｅｒ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２、６０５−６１２（１９９０））。悪性細胞の運動性の増大は、動物およびヒトの腫瘍の転移能の増強と関連している（Ｈｏｓａｋａら、Ｇａｎｎ  ６９、２７３−２７６（１９７８）およびＨａｅｍｍｅｒｌｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２７、６０３−６１０（１９８１））。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「生物学的サンプル」は、患者、好適にはヒト患者から得られた生物学的物質のサンプルを表し、組織、組織サンプル、細胞サンプル（例えば組織生検、例えば吸引生検、ブラシ生検、表面生検、針生検、パンチ生検、切除生検、直視下生検、切開生検または内視鏡生検など）および腫瘍サンプルを含む。また、生物学的サンプルは生体液サンプルであってもよい。一つの好適な実施形態においては、生物学的サンプルは尿である。しかし、血液、血清、唾液、脳脊髄液、乳頭吸引液、および細胞溶解物から得られる上層液を使用することもできる。
【００２５】
また、本発明は、該発明の方法における生物学的サンプルの単離物の使用も包含する。本明細書で使用する場合、生物学的サンプルの「単離物」（例えば組織または腫瘍サンプルの単離物）は、サンプルから分離、誘導、抽出、精製または単離された物質または組成物（例えば生物学的な物質または組成物）を表し、好適には、その生物学的サンプルに関わる不所望の組成物及び／又は不純物もしくは汚染物質を実質的に含まない。
【００２６】
一つの好適な実施形態においては、生物学的サンプルは、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質またはＡＤＡＭＴＳ−７のｍＲＮＡの分解を防ぐべく処理される。分解を抑制または防止するための方法は、これらに限定されないが、生物学的サンプルをプロテアーゼ阻害剤またはＲＮＡアーゼ阻害剤を用いて処理する方法、生物学的サンプルを凍結させる方法、または生物学的サンプルを氷の上に置く方法を含む。好適には、分析する前には、生物学的サンプルまたは単離物は、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質またはＡＤＡＭＴＳ−７のＲＮＡの分解を防ぐことができるような条件下で恒常的に保持される。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「組織サンプル」は、被験体、好適にはヒト被験体の手つかずの組織から入手または除去された組織の小部分、断片、一部、セグメントまたはフラクションを表す。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「腫瘍サンプル」は、腫瘍、例えば被験体から入手または除去された（例えば被験体の組織から除去または抽出された）腫瘍、好適にはヒト被験体から入手または除去された腫瘍の小部分、断片、一部、セグメントまたはフラクションを表す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「原発腫瘍」は、被験体内における最初の部位において出現する腫瘍であり、原発腫瘍から離れた部位においてその被験体の身体に出現する「転移性腫瘍」と区別することができる。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「ＬＣＩＳ」は、インサイチュでの小葉癌を表す。ＬＣＩＳは、小葉性新生物とも呼ばれており、時には、非浸潤型の乳癌として分類されることがある。ＬＣＩＳは小葉の壁部を貫通しない。ＬＣＩＳは、通常、それ自体は浸潤性の癌にならないが、この状態を有する女性は、同じ側または反対側の乳房で浸潤性の乳癌が発現する高いリスクを負っている。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「ＤＣＩＳ」は、乳管内癌を表す。乳管内癌は、最も一般的なタイプの非浸潤性乳癌である。ＤＣＩＳの場合、悪性細胞は、乳管の壁部を通じてその乳房の脂肪組織に転移していない。コメド癌は、局所部分切除術後、他のタイプのＤＣＩＳよりも同じ領域で再発しやすいタイプのＤＣＩＳであり、他の形態のＤＣＩＳよりも、最終的な浸潤性乳管癌の発現と深いつながりを有している。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「ＡＤＡＭＴＳ−７」は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録、タンパク質、ＮＰ＿０５５０８７．２（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）（配列番号１）（図４）のＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質を表す。ＡＤＡＭＴＳ−７は、トロンボスポンジンタイプ１モチーフ、７を伴うジスインテグリン様のメタロプロテアーゼ（レプロリシンタイプ）である。「ＡＤＡＭＴＳ−７」という用語は、改変体、ホモログ、対立形質型、突然変異型およびそれらの同等物などの種も包含する。
【００３３】
本発明は、患者における上皮由来の癌の診断を容易化するための方法を対象としている。一つの実施形態においては、本方法は、患者から生物学的サンプルを得るステップ、およびその生物学的サンプルにおけるＡＤＡＭＴＳ−７（またはＡＤＡＭＴＳ−７のフラグメント）の存在または不在を検出するステップを含み、ここで、ＡＤＡＭＴＳ−７の存在は、上皮由来の癌が存在していることを示している。
【００３４】
別の実施形態においては、本方法は、癌を有している疑いのある患者から得られた試験サンプルにおけるＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを測定するステップ、およびその観測されたレベルを、対照サンプル、例えば癌を有していないことが確信される個人の患者または個人の集団から得られたサンプル中において見出されるＡＤＡＭＴＳ−７のレベルと比較するステップを含む。正常な対照サンプルにおいて観測されるレベルよりも高いレベルのＡＤＡＭＴＳ−７は、癌が存在することを示している。ＡＤＡＭＴＳ−７のレベルはあらゆる任意の単位で表されてよく、例えばデンシトメーター、照度計、活性分析またはＥｌｉｓａプレートリーダーから得られる単位として表すことができる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「対照サンプルにおけるレベルと比べ、試験サンプルにおける相対的に高いレベルのＡＤＡＭＴＳ−７」は、対照サンプル中に存在するＡＤＡＭＴＳ−７の量よりも大きなＡＤＡＭＴＳ−７の量を表す。「相対的に高いレベル」という用語は、統計学的に有意なレベル、または対照サンプル中において見出されるレベルを有意に上回るレベルを表す。好適には、「相対的に高いレベル」は、少なくとも２倍大きい。
【００３６】
「統計学的に有意な」または「有意に」という用語は、統計学的な有意性を表し、一般的には、正常なマーカーの濃度を２標準偏差（２ＳＤ）上回るか、またはそれより高いことを意味する。
【００３７】
比較の目的上、試験サンプルおよび対照サンプルは同じタイプのものであり、即ち、同じ生物学的なソースから得られる。この対照サンプルは、同じタイプの生物学的サンプルにおいて通常見られる濃度であって、健常個体から得られる濃度と同じ濃度のＡＤＡＭＴＳ−７を含有する標準サンプルであってもよい。例えば、生物学的サンプル、例えば尿、血液、脳脊髄液または組織などにおいて通常見られる量のＡＤＡＭＴＳ−７に対する標準的な正常対照サンプルが存在していてよい。
【００３８】
本発明の一つの態様においては、二次的診断ステップが実施されてよい。例えば、もしＡＤＡＭＴＳ−７のレベルが癌の存在を示すものであることが判明した場合、その後に、癌の存在を確認するため、癌を検出する付加的な方法を実施することができる。種々のあらゆる付加的診断ステップを用いることができ、例えばマンモグラフィー（乳癌）、超音波、ＰＥＴスキャニング、ＭＲＩもしくは他のあらゆるイメージング技術、生検、臨床検査、ダクトグラム（ｄｕｃｔｏｇｒａｍ）、またはあらゆる他の方法などを用いることができる。
【００３９】
また、本発明の方法は、癌を有する患者に対する適切な治療コースを決定するのにも有用である。治療コースは、癌の診断後または癌の治療後、患者に対して取られる治療的処置を表す。例えば、癌の再発、拡散または患者の生存に関する可能性の決定は、治療に保存的な方法を採用すべきか、もしくは根治的な方法を採用すべきか、または種々の治療法を組み合わせるべきかどうかを決定する上での助けとなり得る。例えば、癌が再発する可能性が高いときには、外科治療に前後して、化学療法、放射線療法、免疫療法、生物学的改変剤療法、遺伝子療法およびワクチンなどを施すことが有利であり得、または患者が治療されるタイムスパンを調節することが有利であり得る。
【００４０】
ＡＤＡＭＴＳ−７のレベルの測定
ＡＤＡＭＴＳ−７のレベルは、当業者にとって公知のあらゆる手段により測定されてよい。本発明においては、一般的に、抗体または抗体同等物を用いてバイオマーカータンパク質のレベルを検出することが好適である。しかし、バイオマーカーの発現を検出するための他の方法を使用することもできる。例えば、ＡＤＡＭＴＳ−７の発現レベルは、ｍＲＮＡ転写物の分析によりモニタリングされてよい。ＡＤＡＭＴＳ−７のｍＲＮＡを測定することは、例えば生物学的サンプルが腫瘍サンプルまたは組織サンプルである場合に好適であり得る。
【００４１】
ｍＲＮＡのレベルを評価するための方法は当業者に広く知られている。例えば、ＲＮＡ転写物の検出は、ノーザンブロット法により達成されてよく、そこでは、ＲＮＡの調製物が変性アガロースゲル上で走らされ、適切な支持体、例えば活性セルロース、ニトロセルロース、またはガラスもしくはナイロン膜などに移される。その後、標識された（例えば放射標識された）ｃＤＮＡまたはＲＮＡがその調製物にハイブリダイズされ、洗浄され、オートラジオグラフィーなどの方法により分析される。
【００４２】
ＲＮＡ転写物の検出は、更に、公知の増幅法を用いて実施することができる。例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、ポリメラーゼ連鎖反応を実施する方法（ＲＴ−ＰＣＲ）；または、米国特許第５，３２２，７７０号に記載されている如く、両方のステップで単一の酵素を使用する方法、または、Ｒ．Ｌ．ＭａｒｓｈａｌｌらによるＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ４：８０−８４（１９９４）に記載されている如く、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、対称ギャップ（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｇａｐ）リパーゼ連鎖反応を実施する方法（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）；は本発明の範囲内である。ＡＤＡＭＴＳ−７のｍＲＮＡ転写物を検出するための一つの適切な方法がＰａｂｉｃらによる参考文献Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３７（５）：１０５６−１０６６（２００３年）に記載されており、この参考文献は、参照により、その内容全体が本明細書に組み入れられる。
【００４３】
ここで利用することができる他の公知の増幅法は、これらに限定されないが、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８（１９９０）に記載されており、また、Ｎａｔｕｒｅ  ３５０（Ｎｏ．６３１３）：９１−９２（１９９１）にも記載されている、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」法または「３ＳＲ」法；公開欧州特許出願（ＥＰＡ）第４５４４６１０号に記載されている如きＱ−ベータ増幅法；（Ｇ．Ｔ．ＷａｌｋｅｒらによるＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：９−１３（１９９６）および欧州特許出願第６８４３１５号に記載されている如きストランド置換増幅法；ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ第９３２２４６１号に記載されている如き、標的媒介（ｔａｒｇｅｔ  ｍｅｄｉａｔｅｄ）増幅法；を含む。
【００４４】
インサイチュでのハイブリッド形成法による視覚化を使用することもでき、そこでは、放射活性物質で標識されたアンチセンスＲＮＡプローブが生検サンプルの薄い切片にハイブリダイズされ、洗浄され、ＲＮａｓｅで切断され、オートラジオグラフィー用の感光乳剤にさらされる。それらのサンプルは、サンプルの組織学的組成物を示すべく、ヘマトキシリンで染色されてよく、適切な光フィルターを用いる暗視野イメージングにより顕色（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）エマルジョンが示される。ジゴキシゲニンなどの非放射性標識を使用することもできる。
【００４５】
代替的に、ｍＲＮＡの発現は、ＤＮＡアレイ、チップまたはマイクロアレイで検出することができる。ＡＤＡＭＴＳ−７に対応するオリゴヌクレオチドがチップに固定化され、この後、そのチップが、患者から得られた試験サンプルの標識核酸と共にハイブリダイズされる。ＡＤＡＭＴＳ−７の転写物を含有するサンプルの場合には、陽性のハイブリダイゼーション信号が得られる。ＤＮＡアレイを調製する方法およびそれらのアレイの使用方法は、当技術分野において広く知られている（例えば米国特許第６，６１８，６７９６号；第６，３７９，８９７号；第６，６６４，３７７号；第６，４５１，５３６号；第５４８，２５７号；Ｕ．Ｓ．第２００３０１５７４８５号、ならびにＳｃｈｅｎａらによる１９９５年のＳｃｉｅｎｃｅ  ２０：４６７−４７０；Ｇｅｒｈｏｌｄらによる１９９９年のＴｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４、１６８−１７３；およびＬｅｎｎｏｎらによる２０００年のＤｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ５：５９−６５（これらの参考文献は、参照により、それらの内容全体が本明細書に組み入れられる）；を参照のこと）。Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ）を実施することもできる（例えば米国特許出願第２００３０２１５８５８号を参照のこと）。
【００４６】
ｍＲＮＡのレベルをモニタリングする場合には、例えば、試験されるべき生物学的サンプルからｍＲＮＡが抽出され、逆転写され、蛍光標識ｃＤＮＡプローブが作製される。この後、ＡＤＡＭＴＳ−７のｃＤＮＡにハイブリダイズすることができるマイクロアレイが、標識ｃＤＮＡプローブを用いてプロービングされ、スライドがスキャニングされ、蛍光強度が測定される。この強度は、ハイブリッド形成の強さおよび発現レベルと相関関係がある。
【００４７】
特に、生物学的サンプルが流体サンプルの場合、例えば血液または尿などであるときには、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質のレベルまたはＡＤＡＭＴＳ−７の活性を測定することもできる。一つの実施形態においては、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質のレベルは、生物学的サンプルをＡＤＡＭＴＳ−７またはＡＤＡＭＴＳ−７のフラグメントに特異的に結合する抗体ベースの結合部分と接触させることにより測定される。この後、抗体−ＡＤＡＭＴＳ−７複合体の形成がＡＤＡＭＴＳ−７のレベルの測定値として検出される。
【００４８】
「抗体ベースの結合部分」または「抗体」という用語は、イムノグロブリン分子およびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性な決定基、例えばＡＤＡＭＴＳ−７に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有している分子を含む。この「抗体ベースの結合部分」という用語は、全抗体、例えばあらゆるアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の抗体全体を含めるべく意図されており、また、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質と特異的に反応する抗体のフラグメントも含む。抗体は、従来技術を用いてフラグメント化することができる。従って、この用語は、特定のタンパク質と選択的に反応することができる、抗体分子のタンパク質分解作用により切断された部分または組換え技術によって調製された部分のセグメントを含む。そのようなタンパク質分解作用によるフラグメント及び／又は組換え技術によるフラグメントの非限定的な例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｄＡｂ、およびペプチドリンカーによって接合されたＶＬおよびＶＨドメインを含有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、二つもしくはそれ以上の結合部位を有する抗体を形成するために、共有結合または非共有結合により連結されていてよい。従って、「抗体ベースの結合部分」は、抗体および組換え抗体のポリクローナル、モノクローナルまたは他の精製調製物を含む。更に、「抗体ベースの結合部分」という用語は、ヒト化抗体、二重特異性抗体、および抗体分子から誘導される少なくとも一つの抗原結合決定基を有するキメラ分子を含めるべく意図されている。一つの好適な実施形態においては、抗体ベースの結合部分が検出可能に標識される。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「標識抗体」は、検出可能な手段によって標識された抗体を含み、これらに限定されないが、酵素で標識された抗体、放射活性物質で標識された抗体、蛍光物質で標識された抗体、および化学発光物質で標識された抗体を含む。また、抗体を検出可能なタグで標識することもでき、例えばｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＳＶ、ＦＬＡＧ、Ｖ５またはＨＩＳなどで標識することができる。
【００５０】
バイオマーカー（例えばＡＤＡＭＴＳ−７または図５のバイオマーカー）のレベルを検出するために抗体ベースの結合部分を使用する本発明の診断法および予後診断法において、生物学的サンプルに存在するバイオマーカーのレベルは、検出可能に標識された抗体から発せられる信号の強度と相関関係を有している。
【００５１】
一つの好適な実施形態においては、抗体ベースの結合部分は、抗体を酵素に連結することにより検出可能に標識される。次いで、酵素は、その酵素の基質に供されたときに、例えば分光光度計により、蛍光光度計により、または視覚的な手段により検出することができる化学的な部分を生成するような仕方で、その基質と反応するであろう。本発明の抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素は、これらに限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む。化学発光は、抗体ベースの結合部分を検出するために使用することができる別の方法である。
【００５２】
また、検出は、あらゆる他の様々なイムノアッセイを用いて達成することもできる。例えば、抗体を放射活性物質で標識することにより、ラジオイムノアッセイを用いてその抗体を検出することができる。放射性同位体は、ガンマ線カウンターまたはシンチレーションカウンターを使用する方法などにより、またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。本発明の目的にとって特に有用な同位体は、３Ｈ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃなどであり、好適には１２５Ｉである。
【００５３】
抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光物質で標識された抗体が適切な波長の光に曝露されるときには、蛍光により、その蛍光標識抗体の存在を検出することができる。数ある中で最も一般的に使用されている蛍光標識化合物は、ＣＹＥ染料、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレサミンである。
【００５４】
また、抗体は、蛍光発光金属、例えば１５２Ｅｕまたはランタニド系列の他の金属などで検出可能に標識することもできる。これらの金属は、金属キレート基、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などを用いて抗体に付着させることができる。
【００５５】
また、抗体は、抗体を化学発光化合物にカップリングさせることにより検出可能に標識することもできる。この後、その化学発光−抗体の存在は、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００５６】
上述の如く、ＡＤＡＭＴＳ−７のレベルは、イムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂａｎｔ）検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射性測定検定法（ＩＲＭＡ）、ウェスタンブロット法または免疫組織化学的検定法などにより検出することができ、それぞれの分析法については以下でより詳しく説明されている。極めて迅速であり得るＥＬＩＳＡまたはＲＩＡなどのイムノアッセイが、一般的にはより好適である。抗体アレイまたはタンパク質チップを使用することもでき、例えば米国特許出願第２００３００１３２０８Ａ１号；第２００２０１５５４９３Ａ１号；第２００３００１７５１５号、および米国特許第６，３２９，２０９号；第６，３６５，４１８号を参照のこと（これらの特許文献は、参照により、それらの内容全体が本明細書に組み入れられる）。
【００５７】
イムノアッセイ
「ラジオイムノアッセイ」は、標識された（例えば放射活性物質で標識された）形態の抗原を用いて抗原の濃度を検出および測定するための技術である。抗原に対する放射活性標識の例は、３Ｈ、１４Ｃおよび１２５Ｉを含む。生物学的サンプルにおける抗原ＡＤＡＭＴＳ−７の濃度は、生物学的サンプルにおける抗原を、その抗原に対する抗体への結合に関して、標識（例えば放射活性標識）抗原と競合させることにより測定される。標識抗原と非標識抗原との間の競合結合を確実化するため、標識抗原は、抗体の結合部位を飽和させるのに充分な濃度で存在する。サンプル中の抗原の濃度が高いほど、抗体に結合する標識抗原の濃度は低くなる。
【００５８】
ラジオイムノアッセイの場合、抗体に結合した標識抗原の濃度を決定するためには、抗原−抗体複合体を遊離抗原から分離しなければならない。抗原−抗体複合体を遊離抗原から分離するための一つの方法は、抗−アイソタイプの抗血清を用いて抗原−抗体複合体を沈降させることによるものである。抗原−抗体複合体を遊離抗原から分離するための別の方法は、ホルマリンで殺した（ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｋｉｌｌｅｄ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓを用いて抗原−抗体複合体を沈降させることによるものである。抗原−抗体複合体を遊離抗原から分離するための更に別の方法は、「固相ラジオイムノアッセイ」を実施することによるものであり、抗体がＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、ポリスチレンウェル、ポリ塩化ビニルウェルまたはマイクロタイターウェルに（例えば共有結合により）連結されている。抗体に結合した標識抗原の濃度を、既知濃度の抗原を有するサンプルに基づいて作成された標準曲線と比較することにより、生物学的サンプルにおける抗原の濃度を決定することができる。
【００５９】
「免疫放射性測定検定法」（ＩＲＭＡ）は、抗体試薬が放射活性物質で標識されているイムノアッセイである。ＩＲＭＡは、タンパク質、例えばウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）への結合体化などの技術により、多価抗原コンジュゲートを生成する必要がある。この多価抗原コンジュゲートは、一分子当たり少なくとも２個の抗原残基を有していなければならず、また、それらの抗原残基は、少なくとも２個の抗体がその抗原に結合することができるようにするのに充分な距離だけ離間していなければならない。例えば、ＩＲＭＡの場合、その多価抗原コンジュゲートを、固体表面、例えばプラスチック球などに付着させることができる。非標識の「サンプル」抗原および放射活性物質で標識された抗原に対する抗体が、上述の多価抗原コンジュゲートで被覆された球を含有する試験管に加えられる。サンプル中の抗原は、抗原抗体結合部位に関して、その多価抗原コンジュゲートと競合する。適切なインキュベーション時間の後、洗浄により非結合反応物が取り除かれ、その固相での放射能の量が決定される。結合した放射性抗体の量は、サンプル中の抗原の濃度に反比例する。
【００６０】
最も一般的な酵素免疫測定法は、「酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）」である。ＥＬＩＳＡは、標識された（例えば酵素が連結された）形態の抗体を用いて抗原の濃度を検出および測定するための技術である。種々の異なる形態のＥＬＩＳＡが存在し、それらのＥＬＩＳＡは当業者に広く知られている。ＥＬＩＳＡの技術分野において知られた標準的な技術は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ」（第２版、ＲｏｓｅおよびＢｉｇａｚｚｉ編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌらによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．、１９６４）；およびＯｅｌｌｅｒｉｃｈ，Ｍ．による１９８４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２：８９５−９０４に記載されている。
【００６１】
「サンドイッチＥＬＩＳＡ」の場合、抗体（例えば、抗−ＡＤＡＭＴＳ−７）が固相（即ち、マイクロタイタープレート）に結合され、抗原（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−７）を含有する生物学的サンプルに供される。この後、非結合抗原を取り除くべく、その固相が洗われる。次いで、標識抗体（例えば、酵素が連結された標識抗体）が、結合している状態の抗原（存在する場合）に結合され、抗体−抗原−抗体のサンドイッチを形成する。抗体に連結され得る酵素の例は、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼおよびＢ−ガラクトシダーゼである。酵素が連結された抗体は、基質と反応し、測定され得る呈色反応生成物を発生させる。
【００６２】
「競合ＥＬＩＳＡ」の場合には、抗体が、抗原（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−７）を含有するサンプルと共にインキュベートされる。この後、その抗原−抗体混合物は、抗原（即ち、ＡＤＡＭＴＳ−７）で被覆された固相（例えば、マイクロタイタープレート）と接触する。サンプルに存在する抗原の量が多いほど、固相への結合に利用できる遊離抗体の量が少なくなる。この後、固相に結合されたその一次抗体の量を決定すべく、標識された（例えば、酵素が連結された）二次抗体がその固相に加えられる。
【００６３】
「免疫組織化学的検定法」の場合には、組織の切片が特異タンパク質に関して試験され、この試験は、組織を、検定対象のタンパク質に特異的な抗体に供することにより行われる。この後、タンパク質の存在および量を決定するための数多くの方法のうちのいずれかの方法により、抗体が視覚化される。抗体を視覚化するために使用される方法の例は、例えば、抗体に連結された酵素（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼもしくはベータ−ガラクトシダーゼ）を介する方法、または化学的な方法（例えば、ＤＡＢ／基質クロモゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ））である。
【００６４】
診療医の好みにより、また、本開示に基づき、他の技術を用いて本発明のバイオマーカーを検出することができる。一つのそのような技法はウェスタンブロット法（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：４３５０（１９７９））であり、適切に処理されたサンプルがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走らされ、その後、固体の支持体、例えばニトロセルロースフィルターなどに移される。次いで、ＡＤＡＭＴＳ−７に特異的に結合する検出可能に標識された抗体を用いて、バイオマーカーのレベルを評価することができ、そこでは、その検出可能な標識から得られる信号の強度が、存在しているバイオマーカーの量に対応する。それらのレベルは、例えばデンシトメトリーにより定量化することができる。
【００６５】
質量分析法
更に、本発明のバイオマーカーは、質量分析法を用いて検出されてよく、例えばＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（飛行時間計測式（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ））、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動−質量分析法、核磁気共鳴分光分析法またはタンデム質量分析法（例えば、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなど）を用いて検出することができる。例えば、米国特許出願第２００３０１９９００１号、第２００３０１３４３０４号、第２００３００７７６１６号を参照のこと（これらの特許文献は、参照により本明細書に組み入れられる）。
【００６６】
質量分析法は、当技術分野において広く知られており、生体分子、例えばタンパク質などを定量及び／又は同定するために使用されている（例えば、Ｌｉらによる（２０００）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １８：１５１−１６０；Ｒｏｗｌｅｙらによる（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０：３８３−３９７；ならびにＫｕｓｔｅｒおよびＭａｎｎによる（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒａｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．８：３９３−４００を参照のこと）。更に、単離されたタンパク質の少なくとも部分的なデノボ配列決定を可能にする質量分析技術が開発されている。ＣｈａｉｔらによるＳｃｉｅｎｃｅ  ２６２：８９−９２（１９９３）；ＫｅｏｕｇｈらによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：７１３１−６（１９９９）；ＢｅｒｇｍａｎによるＥＸＳ  ８８：１３３−４４（２０００）において論評されている文献（ｒｅｖｉｅｗｅｄ）。
【００６７】
特定の実施形態においては、気相イオン分光光度計が使用される。別の実施形態においては、レーザー−脱離／イオン化質量分析法を用いてサンプルが分析される。最近のレーザー脱離／イオン化質量分析法（「ＬＤＩ−ＭＳ」）は、二つの主な変形様式で実践することができる：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）質量分析法および表面増強レーザー脱離／イオン化（「ＳＥＬＤＩ」）質量分析法。ＭＡＬＤＩの場合、被分析物がマトリックスを含有する溶液と混合され、一滴の液体が基体の表面に置かれる。この後、そのマトリックス溶液は、それらの生物学的分子と共に共結晶化する。基体が質量分析計に挿入される。レーザーエネルギーが基体表面に向けられ、生物学的分子を有意にフラグメント化することなく、生物学的分子を脱離およびイオン化する。しかし、ＭＡＬＤＩは、分析用ツールとして限界を有している。ＭＡＬＤＩは、サンプルを分画化するための手段を備えておらず、また、マトリックス材料は、特に低分子量の被分析物の場合、検出と干渉することができる。例えば、米国特許第５，１１８，９３７号（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐら）および米国特許第５，０４５，６９４号（Ｂｅａｖｉｓ  ＆  Ｃｈａｉｔ）を参照のこと。
【００６８】
ＳＥＬＤＩの場合には、脱離プロセスにおいて基体表面が積極的に関与するように、基体表面が改変されている。一つの変形様式においては、表面は、対象のタンパク質を選択的に結合する吸着剤及び／又は捕獲剤で誘導体化される。別の変形様式においては、表面は、レーザーが当たったときに脱離されないエネルギー吸収分子で誘導体化される。別の変形様式においては、表面は、対象のタンパク質を結合し、且つ、レーザーの適用時に壊される光分解性の結合を含有した分子で誘導体化される。これらのそれぞれの方法において、誘導体化剤は、一般的に、サンプルが適用される基体表面の特定の場所に局在化される。例えば、米国特許第５，７１９，０６０号およびＷＯ第９８／５９３６１号を参照のこと。これら二つの方法は、例えば、被分析物を捕獲するためにＳＥＬＤＩ親和性表面を使用し、且つ、エネルギー吸収材料をもたらすべく、マトリックス含有液体を、捕獲された被分析物に加えることにより組み合わせることができる。
【００６９】
質量分析計に関する更なる情報については、例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、第３版、Ｓｋｏｏｇ、Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９８５；およびＫｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４増補版、Ｖｏｌ．１５（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９５）、１０７１−１０９４頁を参照のこと。
【００７０】
マーカーまたは他の物質の存在の検出は、典型的には、信号強度の検出を含むであろう。これは、次に、基体に結合されたポリペプチドの量および特性を反映することができる。例えば、特定の実施形態においては、第一サンプルおよび第二サンプルのスペクトルから得られた信号強度のピーク値を（例えば視覚的に、またはコンピューター分析により）比較することにより、特定の生体分子の相対的な量を決定することができる。ソフトウェアプログラム、例えばＢｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｗｉｚａｒｄプログラム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）などを使用して、質量スペクトルの分析に役立てることができる。そのような質量分析計およびそれらの技術は当業者に広く知られている。
【００７１】
当業者であれば、質量分析計のいずれかの構成要素（例えば、脱離ソース、質量分析器、検出など）および様々なサンプル調製物は、本明細書で説明されている他の適切な構成要素もしくは調製物と、または当技術分野において公知のそれらと組合せ得ることが理解されよう。例えば、幾つかの実施形態においては、対照サンプルは重原子（例えば１３Ｃ）を含んでいてよく、これにより、試験サンプルを、同一の質量分析実行において、その既知の対照サンプルと混ぜ合わせることが可能になる。
【００７２】
一つの好適な実施形態においては、レーザー脱離飛行時間計測式（ＴＯＦ）質量分析計が使用される。レーザー脱離質量分析法においては、結合されたマーカーを伴う基体がインレットシステムに導入される。そのマーカーは、イオン化ソースからのレーザーにより脱離され、イオン化されて気相になる。発生したイオンはイオン光学アセンブリにより収集され、その後、飛行時間計測式質量分析器内において、イオンは、短い高電圧場を通じて加速され、高真空チャンバー内に送り込まれる。高真空チャンバーの遠端において、加速されたイオンは、様々に異なる時間を掛けて、高感度検出器の表面にぶつかる。飛行時間は、イオンの質量の関数であるため、イオンが形成されてからイオンが検出器に衝突するまでの間に要した時間を利用して、特定の質量対電荷比を有する分子の存在または不在を同定することができる。
【００７３】
幾つかの実施形態においては、第一サンプルまたは第二サンプルに存在する一つもしくはそれ以上の生体分子の相対的な量が、一部では、プログラマブルデジタルコンピューターを用いてアルゴリズムを実行することにより決定される。アルゴリズムは、第一質量スペクトルおよび第二質量スペクトルにおける少なくとも一つのピーク値を同定する。この後、アルゴリズムは、質量スペクトルのうち、第一質量スペクトルのピーク値の信号強度を第二質量スペクトルのピーク値の信号強度と比較する。相対的な信号強度は、第一サンプルおよび第二サンプルに存在している生体分子の量を表している。既知量の生体分子を含有する標準サンプルを第二サンプルとして分析することにより、第一サンプルに存在している生体分子の量を一層良好に定量化することができる。特定の実施形態においては、第一サンプルおよび第二サンプルに存在する生体分子の性質（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定することもできる。
【００７４】
一つの好適な実施形態においては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によりバイオマーカーのレベルが測定される。
【００７５】
他のアッセイ
また、ＡＤＡＭＴＳ−７のレベルは、例えば、これに限定されないが、ザイモグラフィーを含め、活性を測定する他の生物学的分析法により測定することもできる。ザイモグラフィーは、当業者に広く知られた分析法であり、ＨｅｕｓｅｎらによるＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、（１９８０）１０２：１９６−２０２；ＷｉｌｓｏｎらによるＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、（１９９３）１４９：６５３−６５８；ＨｅｒｎｏｎらによるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８６）２６１：２８１４−２８２８、ＢｒａｕｎｈｕｔらによるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：１３４７２−１３４７９；およびＭｏｓｅｓらによるＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８、１３９５−１３９９、１９９８年４月１日で説明されている（これらの参考文献は、参照により、それらの内容全体が本明細書に組み入れられる）。
【００７６】
抗体
本発明において使用するための抗体は商業的なソースから入手することができる。代替的に、ＡＤＡＭＴＳ−７またはバイオマーカーポリペプチドの一部に対する抗体を惹起することもできる。ＡＤＡＭＴＳ−７抗体を製造するのに有用な方法が米国出願第２００２／０１８２７０２号；第２００３／０２１２２５６号；第２００２０１１０８９４号およびＷＯ第０１／１１０７４号に開示されており、これらの特許文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００７７】
本発明において使用する抗体は、抗体を生成するための標準的な方法により製造することができ、例えばモノクローナル抗体の生成により製造することができる（Ｃａｍｂｅｌｌ，Ａ．Ｍ．によるＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４）；Ｓｔ．ＧｒｏｔｈらによるＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（１９９０）３５：１−２１；およびＫｏｚｂｏｒらによるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）。また、抗体は、当技術分野において広く知られている方法により、ファージ提示ライブラリーのような抗体ライブラリーをスクリーニングすべく、タンパク質の抗原性部分を使用することにより容易に得ることもできる。例えば、米国特許第５，７０２，８９２号（Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）およびＷＯ０１／１８０５８号（Ｎｏｖｏｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）は、バクテリオファージ提示ライブラリーおよび抗体結合ドメインフラグメントを製造するための選択方法を開示している。
【００７８】
ＡＤＡＭＴＳ−７検出キット
本発明は、上皮由来の癌の検出および予後診断的な評価を行うための商業的なキットも対象としている。このキットは、当業者に広く知られているどのような構成であってもよく、また、ＡＤＡＭＴＳ−７を検出するための本明細書で説明されている一つまたはそれ以上の方法を実施するのに有用などのような構成であってもよい。キットは、すべてではないにしても、生物学的サンプルに存在するＡＤＡＭＴＳ−７を検出するためのアッセイを実施する上で絶対に必要な試薬のうちの多くを提供している点で都合がよい。更に、このアッセイは、好適には、予め定められた量のＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質または核酸などの、キットに含まれている一つの標準サンプルまたは複数の標準サンプルと同時に実施され、従って、試験の結果を定量化することができ、または試験結果の正当性を確認することができる。
【００７９】
キットは、ＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを検出するための手段を含み、例えば、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質に選択的に結合する抗体もしくは抗体フラグメント、またはタンパク質をエンコードするｃＤＮＡの合成を可能にする一組のＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー、または例えばＡＤＡＭＴＳ−７のｍＲＮＡ発現を検出するＤＮＡプローブなどを含んでいる。診断アッセイキットは、好適には、標準的な二抗体結合フォーマットで構築され、一つのＡＤＡＭＴＳ−７−特異抗体が患者のサンプルに存在するＡＤＡＭＴＳ−７を捕獲し、そして、捕獲されたＡＤＡＭＴＳ−７を検出するために別のＡＤＡＭ−特異抗体が使用される。例えば、捕獲用の抗体は、固相、例えばアッセイプレート、アッセイウェル、ニトロセルロース膜、ビーズ、ディップスティック、または溶離カラムの構成要素などに固定化される。第二抗体、即ち、検出抗体は、典型的には、検出可能な標識、例えば比色分析用物質（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｇｅｎｔ）または放射性同位体などでタグ付けされる。
【００８０】
一つの好適な実施形態においては、キットは、尿サンプルに存在するＡＤＡＭＴＳ−７のレベルを検出するための手段を含む。特定の実施形態においては、キットは、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質を特異的に結合する、その上に固定化された抗−ＡＤＡＭＴＳ−７抗体またはフラグメントを有する「ディップスティック」を含む。この後、特異的に結合されたＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質は、例えば、比色分析用物質（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｇｅｎｔ）または放射性同位体で検出可能に標識された二次抗体を用いて検出することができる。
【００８１】
別の実施形態においては、アッセイキットは、（これらに限定されないが）以下の技術を用いてよい：競合および非競合アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、生物発光および化学発光アッセイ、蛍光分析によるアッセイ、サンドイッチアッセイ、免疫放射性測定アッセイ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡを含む酵素結合アッセイ、マイクロタイタープレートおよび免疫組織化学。それぞれのキットでのアッセイの範囲、感度、精度、信頼性、特異性および再現性は、当業者に広く知られた手段により定められる。
【００８２】
上で説明されているアッセイキットは、更に、使用説明書を提供するであろう。
【００８３】
以上または以下で引用されているすべての参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００８４】
本発明は、以下の実施例により更に例証される。
【００８５】
これらの実施例は、本発明の理解を促進させるために与えられたものであり、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【００８６】
実施例１  癌患者から得られた尿に存在する高分子量ゼラチナーゼとしてのＡＤＡＭＴＳ−７の同定
尿中ＡＤＡＭＴＳ−７の同定
本発明者らは、膀胱癌患者から得た尿サンプルにおいて見られる約１９０ｋＤａの高分子量ゼラチナーゼ（図１）をＡＤＡＭＴＳ−７として同定した。
【００８７】
アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーの組合せを用いて、ゼラチナーゼを部分的に精製した。高分子量ゼラチナーゼ種が富化された（膀胱癌患者からの）サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ染色液で染色した（図３）。約１９０ｋＤａのこのタンパク質バンドを切り取り、ゲル内トリプシン消化に供し、続いて、タンデム（Ｔａｎｄｅｍ）（ＭＳ−ＭＳ）質量分析に供した。約１９０ｋＤａのゼラチナーゼ種の質量分析は、１％のペプチドカバー率で、ＡＤＡＭＴＳ−７（トロンボスポンジンタイプ１モチーフ、７を伴うジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（レプロリシンタイプ）；トロンボスポンジンモチーフ、７プレプロプロテインを伴うジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）の存在を示した。ブラスト（Ｂｌａｓｔ）分析および文献調査は、質量分析法で同定されたペプチドがＡＤＡＭＴＳ−７（ＮＰ＿０５５０８７．２）と一致することを確証した。
【００８８】
実施例ＩＩ  乳癌、前立腺癌、膀胱癌、脳腫瘍および肝癌を有する患者では、ＡＤＡＭＴＳ−７の発現および活性が上方に調節される。
【００８９】
本発明者らは、癌に罹患した患者と罹患していない患者におけるＡＤＡＭＴＳ−７の活性および発現について試験した。乳癌、脳腫瘍、前立腺癌、膀胱癌および肝癌を有する患者から尿サンプルを採取した。ＡＤＡＭＴＳ−７の活性を検出すべく、５０μｌの非濃縮尿サンプルをゼラチンザイモグラフィーにより分析した。
【００９０】
ＡＤＡＭＴＳ−７のウェスタンブロット分析において、尿サンプルを、１０ｋＤａのカットオフ膜を伴う微小遠心スピンカラム（Ｖｉｖａｓｐｉｎ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて濃縮した。分析したすべてのサンプルは、２０μｇの総タンパク質に対して正規化した。イムノブロットは、ザイモグラムからではなく、通常のＢｉｓＴｒｉｓ４−１２％勾配ゲルから作製した。使用したＡＤＡＭＴＳ−７抗体は、Ｔｒｉｐｌｅ  Ｐｏｉｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから入手したウサギポリクローナル抗体−ＲＰ１−ＡＤＡＭＴＳ−７であり、このタンパク質のカルボキシ末端に向けられる。
【００９１】
図５Ａに示されているように、乳癌、脳腫瘍、前立腺癌、脳腫瘍、膀胱癌および肝癌を有する患者では、ＡＤＡＭＴＳ−７の活性が上方に調節された。ＡＤＡＭＴＳ−７活性は、年齢／性別がマッチングされた正常な対照（癌を伴わない患者）から得られた濃縮尿サンプルのザイモグラフィーによる平行分析では検出されなかった（図５Ｂ）。
【００９２】
図６Ａおよび６Ｂは、癌を有する患者および癌を伴わない患者から得られた尿サンプルにおけるＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質に対する代表的なイムノブロット染色を示している。図６Ｂに示されているように、乳癌、膀胱癌および前立腺癌を有する患者から得られた尿サンプルにおいては、ＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質が検出された。年齢／性別がマッチングされた正常な対照（癌を伴わない患者）から得られた濃縮尿サンプルのイムノブロット法による平行分析は、何らＡＤＡＭＴＳ−７を検出しなかった（図６Ａ）。
【００９３】
本明細書全体を通じ、引用されている参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
本明細書に組み込まれており、また、本明細書の一部を構成している添付図面は、本発明の種々の実施形態を明らかにするものであり、また、その解説と相まって、本発明の目的、利点および原理を説明する役割を果たしている。
【図１】図１は、ザイモグラフィーによる、膀胱癌患者から得られた尿における約１９０ｋＤａの高分子量ゼラチナーゼ種の存在を示している。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、膀胱癌患者の尿から得られた約１９０ｋＤａの高分子量ゼラチナーゼ種の部分的な精製を示している。図２Ａはザイモグラムである。図２Ｂは銀染色ゲルである。
【図３】図３は、ＨＭＷゼラチナーゼ種が富化されたサンプルの、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ  Ｓｔａｉｎで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。
【図４】図４は、ＡＤＡＭＴＳ−７（配列番号：１）のアミノ酸配列を示している。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、癌患者から得られた尿サンプルにおけるザイモグラフィーによるＡＤＡＭＴＳ−７の検出、および健常個体から得られた尿サンプルにおけるＡＤＡＭＴＳ−７の不在を示している。図５Ａは、癌患者から得られた尿サンプルにおける高ＭＷゼラチナーゼ種のゼラチンザイモグラムである；最初のレーンは分子量マーカー（ＭＷ）を表しており、１−９で示されているレーンは、５０μｌの非濃縮尿を使用した、個々の患者から得られた尿サンプルを表しており、レーン１は前立腺癌を有する患者から得られた尿サンプルであり、レーン２は脳腫瘍を有する患者から得られた尿サンプルであり、レーン３は膀胱癌を有する患者から得られた尿サンプルであり、レーン４は乳癌を有する患者から得られた尿サンプルであり、レーン５は乳癌を有する患者から得られた尿サンプルであり、レーン６は肝癌を有する患者から得られた尿サンプルであり、レーン７は肝癌を有する患者から得られた尿サンプルであり、レーン８は乳癌を有する患者から得られた尿サンプルであり、そしてレーン９は乳癌を有する患者から得られた尿サンプルである。矢印は、約１９０ｋＤａで走るＡＤＡＭＴＳ−７を指し示している。図５Ｂは、年齢／性別がマッチングされた正常な対照（癌を伴わない患者）から得られた尿サンプルのザイモグラフィーによる平行分析の結果を示している。すべてのケースにおいて、ＡＤＡＭＴＳ−７は検出することができなかった。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、癌を有する患者および癌を伴わない患者から得られた尿サンプルにおけるＡＤＡＭＴＳ−７タンパク質に対する代表的なイムノブロット染色を示している。図６Ｂは、４−１２％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で走らせた、癌患者から得られた尿の分析結果である：レーン１は前立腺癌を有する患者から得られた濃縮尿サンプルであり、レーン２は前立腺癌を有する患者から得られた濃縮尿サンプルであり、レーン３は乳癌を有する患者から得られた濃縮尿サンプルであり、レーン４は乳癌を有する患者から得られた濃縮尿サンプルであり、レーン５は膀胱癌を有する患者から得られた濃縮尿サンプルであり、レーン６は乳癌を有する患者から得られた濃縮尿サンプルであり、レーン７は乳癌を有する患者から得られた濃縮尿サンプルであり、レーン８は乳癌を有する患者から得られた濃縮尿サンプルである。図６Ａは、年齢／性別がマッチングされた正常な対照（癌を伴わない患者）から得られた濃縮尿サンプルのイムノブロット法による平行分析の結果を示している。乳癌、膀胱癌および前立腺癌を有する患者から得られた尿サンプルにおいて、上述の１９０ｋＤａ種が検出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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