(57)【要約】本発明は、プラスミノゲンアクチベータのＮ末端と融合したサーファクタントプロテイン前駆体を含むか、プラスミノゲンアクチベータのＮ末端またはＣ末端と融合した成熟型サーファクタントプロテインを含む組換えキメラタンパク質に関する。本発明はさらに、そのような融合タンパク質をコードする対応核酸分子およびそれらの生産法に関する。さらに、本発明は、そのような融合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに炎症性肺疾患および間質性肺疾患を予防かつ／または治療するための本発明の融合タンパク質の医薬用途に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
（ａ）  Ｃ末端プロペプチドを欠く、哺乳動物のサーファクタントプロテイン前駆体と、（ｂ）  哺乳動物のプラスミノゲンアクチベータと
を含んでなり、サーファクタントプロテイン前駆体がそのＣ末端でプラスミノゲンアクチベータのＮ末端と融合している融合タンパク質。
【請求項２】
タンパク質成分（ａ）または（ｂ）の一方がヒトタンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
タンパク質成分（ａ）および（ｂ）がいずれもヒトタンパク質である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
サーファクタントプロテイン前駆体が、サーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）またはサーファクタントプロテインＣ（ＳＰ−Ｃ）から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
サーファクタントプロテイン前駆体がサーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
融合タンパク質であって、
（ａ）  哺乳動物の成熟型サーファクタントプロテインと、
（ｂ）  哺乳動物のプラスミノゲンアクチベータと
を含んでなり、成熟型サーファクタントプロテインがそのＣ末端またはＮ末端で、それぞれプラスミノゲンアクチベータのＮ末端またはＣ末端と融合している融合タンパク質。
【請求項７】
タンパク質成分（ａ）または（ｂ）の一方がヒトタンパク質である。請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
タンパク質成分（ａ）および（ｂ）がいずれもヒトタンパク質である、請求項６または７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
成熟型サーファクタントプロテインが、サーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）およびサーファクタントプロテインＣ（ＳＰ−Ｃ）からなる群から選択される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
成熟型サーファクタントプロテインがサーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
哺乳動物のプラスミノゲンアクチベータが、高分子量２本鎖ウロキナーゼ−プラスミノゲンアクチベータ（ＨＭＷ−ｕ−ＰＡ）、低分子量２本鎖ｕ−ＰＡ（ＬＭＷ−ｕ−ＰＡ）、低分子量ｕ−ＰＡのＢ鎖、組換え１本鎖ｕ−ＰＡ（ｒ−ｓｃｕ−ＰＡ）、組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）、組換えｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ）、およびその変異体ｒ−ＰＡ、ｎ−ＰＡ、およびＴＮＫ−ｔ−ＰＡ、チスイコウモリだ液プラスミノゲンアクチベータα−１（ｂａｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼおよびスタフィロキナーゼ、ならびに触媒活性を有するそれらの突然変異体からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
配列番号６および配列番号７にそれぞれ示されているような、低分子量２本鎖ｕ−ＰＡ
（ＬＭＷ−ｕ−ＰＡ）のＮ末端と融合しているサーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）前駆体を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されているような、低分子量２本鎖ｕ−ＰＡ（ＬＭＷ−ｕ−ＰＡ）と融合している成熟型サーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）を含んでなる、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
Ｎ末端およびＣ末端のうち少なくともいずれか一方にタンパク質またはペプチドのアフィニティータグを有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項１６】
配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項１７】
配列番号１２または配列番号１３のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項１８】
核酸分子が、該核酸分子の発現を可能にする調節配列に作動可能に連結している、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
調節配列がプロモーター配列と転写終結配列とを含んでなる、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
ベクターに組み込まれていることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２１】
請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を生産する方法であって、
（ａ）  融合タンパク質をコードする核酸分子を適当なベクターに導入するステップと、（ｂ）  （ａ）で得た組換えベクターを適当な宿主細胞または適当な細胞抽出物に導入するステップと
を含んでなる方法。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含んでなる医薬組成物。
【請求項２４】
医薬組成物を製造するための請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２５】
医薬組成物が、炎症性肺疾患および間質性肺疾患の予防および治療のうち少なくともいずれか一方のための組成物である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
医薬組成物が線維素分解活性を有する、請求項２４または２５に記載の用途。
【請求項２７】
炎症性肺疾患および間質性肺疾患の予防および治療のうち少なくともいずれか一方を行う方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を、哺乳動物に、前記疾患の予防および治療のうち少なくともいずれか一方に十分な用量で投与するステップを含んでなる方法。
【請求項２８】
融合タンパク質を、腸管外投与、非腸管外（腸内）投与、および局所投与からなる群か
ら選択される投与により哺乳動物に投与する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
腸管外投与がエアロゾル投与または気道内導入による、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスミノゲンアクチベータのＮ末端と融合したサーファクタントプロテイン前駆体を含むか、プラスミノゲンアクチベータのＮ末端またはＣ末端と融合した成熟型サーファクタントプロテインを含む組換えキメラタンパク質に関する。本発明はさらに、そのような融合タンパク質をコードする対応核酸分子およびその生産法に関する。さらに、本発明は、そのような融合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに炎症性肺疾患および間質性肺疾患の予防および治療のうち少なくともいずれかのための本発明融合タンパク質の薬理学的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺障害（ＡＬＩ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）または特発性肺線維症（ＩＰＦ）などの多くの急性炎症性肺疾患および慢性間質性肺疾患は、実質的なサーファクタントの異常、例えば、サーファクタント組成の変化、血漿タンパク質の肺胞腔への滲出、またはフィブリンの肺胞腔内堆積を特徴とする（例えば、参考文献［１、２］参照）。
【０００３】
これらの病態下では、肺胞の止血バランスが凝血促進活性および抗線維素溶解活性へとシフトするので、肺胞腔の線維素溶解活性は著しく低下し、それに伴って、このコンパートメントの主要プラスミノゲンアクチベータであるウロキナーゼ−プラスミノゲンアクチベータ（ｕ−ＰＡ；ウロキナーゼとも称される）のレベルは低下するが、プラスミノゲンアクチベータインヒビター（ＰＡＩ−１）およびα２−アンチプラスミンの濃度が高くなる（参考文献［３〜５］）。そのような状態においては、（血管内皮、間質腔および肺胞上皮からなる）空気・血液関門の機能不全により肺胞腔内に漏れ出すフィブリノゲンは、急速にフィブリンに転換され、肺胞へのフィブリン堆積が観察される。
【０００４】
肺胞腔におけるフィブリン形成作用はほとんど未解明である。フィブリン形成作用は、肺出血の予防に有益な効果があるかもしれないし、創傷修復の初期の基盤としての機能を果たすかもしれない。一方、肺胞のフィブリンは、急性肺障害におけるガス交換障害の原因となることがあり、肺胞のフィブリンのクリアランスが遅れると、その後の線維芽細胞の侵入ならびに細胞外マトリクスタンパク質産生の一時的基盤となり、長い経過をたどるＡＲＤＳや肺線維症の特徴である線維増殖性の応答を促進し得る（参考文献［６〜８］参照）。
【０００５】
肺サーファクタントは、すべての哺乳動物の肺の肺胞表面を覆っているリポタンパク質複合体である（参考文献［９、１０］参照）。気液界面で表面張力を超低レベルに低下させると、低い生理的肺動脈圧の下での肺胞換気およびガス交換が可能になり、肺胞の崩壊を防止する。肺サーファクタントは、約９０％の脂質と、１０％のタンパク質とで構成される。脂質のうち、８０〜９０％はリン脂質であり、ホスファチジルコリンが最も豊富な成分である。今日まで、４種のサーファクタント関連タンパク質が同定されており、これらのタンパク質は、２つのグループ、すなわち、親水性サーファクタントプロテイン（ＳＰ）ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄと、疎水性サーファクタントプロテインＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃとに分類することができる（参考文献［１１、１２］参照）。
【０００６】
近年になって、外因性サーファクタント製剤の使用が、ＡＲＤＳまたはＩＲＤＳなどの病態におけるサーファクタント機能不全を修復するための興味深い方法となっている。例えば、国際出願公開公報（参考文献［１３］）は、少なくとも１種の修飾ＳＰ−Ｂと少なくとも１種の修飾ＳＰ−Ｃとを含む、新生児呼吸窮迫症候群または急性肺障害のための医
薬製剤を開示している。著者らは、修飾ＳＰ−Ｂを含む肺サーファクタント製剤に修飾ＳＰ−Ｃを加えることにより、有利な特性を有する医薬製剤が得られることを発見した。修飾サーファクタントプロテインは組換えタンパク質であり得る。米国特許文献（参考文献［１４］）には、リポソーム形成化合物と、肺表面を越えるリポソーム輸送の促進に有効な量の少なくとも１種の肺胞サーファクタントプロテインとを含む医薬活性化合物の肺投与用組成物が記載されている。最後に、米国特許文献（参考文献［１５］）には、リン脂質と混合するとサーファクタント活性を示す数種のＳＰ−Ｂ断片が記載されている。これらの断片は、呼吸器疾患の治療に有効な製剤の製造に適した化合物である。
【０００７】
サーファクタントの異常は、急性および慢性の呼吸不全の発症における重要事象を表すと考えられている。最小表面張力の上昇とリン脂質プロファイルおよびサーファクタントプロテインプロファイルの変化とを伴う、サーファクタントの生物物理学的機能の障害は、ＡＲＤＳ、重症肺炎および間質性肺疾患の患者において常に観察されている（参考文献［１、２］参照）。さらに、肺胞フィブリン形成は、これまで報告された最も強力なサーファクタント抑制機構に相当することが立証されている。肺サーファクタント存在下にフィブリン塊が生じると、リン脂質やサーファクタントプロテインＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃなどの疎水性サーファクタント成分が新生フィブリンマトリクスにほぼ完全に組み込まれ、それに伴って、表面張力低下特性が著しく低下した。さらに、サーファクタント抱合フィブリンは、独自の特性を有する肺胞腔内の独特な構造を表す。「正常な」（肺胞外）フィブリン塊と比べて、肺胞フィブリン塊は、塊構造の改変、機械的性質の変性、およびタンパク質分解に対する感受性の低下を特徴とする（参考文献［１］参照）。
【０００８】
したがって、肺胞の線維素溶解活性を増大させて上述の止血バランスの不均衡を修正することは、サーファクタント機能を修復するのに適当な治療法であろう。実際、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究でこの目的の達成に成功している。アデノウイルス媒介遺伝子導入によるウロキナーゼレベルの上方制御により、マウスのブレオマイシン誘発肺線維症の程度が軽くなった（参考文献［１６］）。さらに、潅流ウサギ肺では、ウロキナーゼ治療後にガス交換が著しく改善された（参考文献［１７］）。サーファクタント抱合フィブリンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断すると、フィブリンマトリクスに捕捉されたサーファクタント物質が救い出され、その表面張力低下特性が保全されることが分った（参考文献［１８、１９］）。
【０００９】
しかし、この方法は、線維素溶解薬を主として肺胞腔に配分しても、肺や肺以外の部位からの出血の誘発によって阻害される。さらに、サーファクタント機能に対する不利な作用も誘発される可能性がある。これらの制限を克服するためには、サーファクタント抱合フィブリンに対する線溶療法の選択性および効力を高めるツールを開発する必要がある。
【００１０】
ルパートら（Ｒｕｐｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ）は、最近、ヘテロ２官能性架橋剤を用いて、８Ｂ５Ｅと称される抗ＳＰ−Ｂモノクローナル抗体をヒトウロキナーゼに化学結合させて肺胞フィブリンを標的とするための上記のような分子ツールを確立した（参考文献［２０］）。別の研究（参考文献［２１］）では、同じ著者らが、ヒトウロキナーゼと精製ウシＳＰ−Ｂとの化学架橋を報告している。これらのハイブリッドタンパク質はいずれも、（１）天然ＳＰ−Ｂに比べて生物物理学的活性を保持し、（２）天然ｕ−ＰＡに比べて、サーファクタント抱合フィブリン塊の溶解に約２〜３倍も有効であり、ＰＡＩ−１耐性が約３〜５倍も高く、その結果、高い基質特異性を有するキメラ酵素をもたらすことが分った。一方、結合させようとするタンパク質、特に天然源から精製されるＳＰ−Ｂについて慣用の精製法で精製するために必要な労力のため、この方法は、多大な時間を必要とすると共に、非常に骨が折れるものである。しかし、この不利点は、２種の単離タンパク質（例えば、ウロキナーゼとＳＰ−Ｂ）を組換え産生させ、次いでそれらを化学架橋することにより部分的に克服し得る。
【００１１】
この目的のために、米国特許文献（参考文献［２２］）に従って、組換え成熟型ＳＰ−Ｂを得てもよい。この特許文献は、Ｎ末端のみにプロペプチドを有し、Ｃ末端にはプロペプチドがないＳＰ−Ｂ前駆体タンパク質を用いて、成熟型の肺胞ＳＰ−Ｂを産生させる方法を開示している。参考文献［２２］では、Ｎ末端プロペプチドのプロセシングは、遺伝子工学的に導入されたヒドロキシルアミン切断部位を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。これによって、成熟型ペプチドが遊離する。
【００１２】
組換えヒトウロキナーゼを、米国特許文献（参考文献［２３］）に従って得てもよい。さらに、例えば、以下の米国特許文献にはハイブリッドプラスミノゲンアクチベータが開示されている。すなわち、参考文献「２４」には、線維素溶解活性２本鎖ハイブリッドタンパク質が記載されており、これらの鎖は、同一の、または異なる２本鎖プロテアーゼ由来である。米国特許文献（参考文献［２５］）には、ｉｎ  ｖｉｖｏで塊を溶解させるための治療用量形態のフィブリン特異的２本鎖ウロキナーゼ−プラスミノゲンアクチベータが記載されており、参考文献［２６］には、ヒト組織−プラスミノゲンアクチベータおよびヒトウロキナーゼ−プラスミノゲンアクチベータの少なくとも２つの部分配列で構成された１本鎖キメラプラスミノゲンアクチベータの組換え産生が開示されている。参考文献［２３〜２６］に開示されているプラスミノゲンアクチベータは全身への適用に限定されている。
【００１３】
肺胞フィブリンを標的とするのに有効な線維素溶解ツールの別の好ましい特徴は、そのサーファクタント抱合フィブリン塊特異性であろう。米国特許文献（参考文献［２７］）には、リゾチームと、成熟型ＳＰ−Ｂペプチドの上流の１０アミノ酸残基を備えた、ＳＰ−ＢのＣ末端側プロペプチドとの融合タンパク質が記載されており、該タンパク質は、細菌感染症、特に細菌性呼吸器感染症を予防かつ／または治療するために、医薬として許容可能な媒体に含めて個体に投与される。リゾチームをサーファクタントプロテインの一部と融合させることにより、この酵素は、標的感染部位としての肺に送達される。このように、参考文献［２７］に従って、ＳＰ−Ｂ断片を用いて、該断片と融合した酵素活性の標的を身体の限定領域に絞ることができる。
【００１４】
それゆえに、サーファクタント抱合フィブリンに対する線溶療法に適した分子ツールが未だに必要とされている。上記参考文献［２０、２１」に記載されている２種のハイブリッドタンパク質は実際に有効ではあるが、いくつかの極めて重要な欠陥を有する。すなわち、第１に、化学結合には、結合させるタンパク質の精製が必要であり、精製はそれ自体極めて骨が折れるものであり、かつ多大な時間を必要とし得る（上記参照）。第２に、非常に多くの場合、実際に結合事象に関わるアミノ酸残基に関しては不明確であるため、得られる結合体の明確な組成および／または構造は不明である。第３に、所与の実験環境での化学結合に対してすべてのタンパク質やすべての架橋剤が適用可能なわけではなく、第４に、結合ステップの効率性は同じタイプの実験においても異なり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明が解決しようとする問題は、上記制限を克服すること、および、サーファクタント抱合フィブリン塊を特異的に標的として、その塊を効率的に溶解させるだけでなく、治療に十分な量で容易に生産し得る分子ツールを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的は、独立クレームの特徴を有する融合タンパク質およびそれらの生産法によって達成される。そのような融合タンパク質は、
（ａ）  Ｃ末端プロペプチドを欠く哺乳動物のサーファクタントプロテイン前駆体と、
（ｂ）  哺乳動物のプラスミノゲンアクチベータと
を含み、サーファクタントプロテイン前駆体はそのＣ末端でプラスミノゲンアクチベータのＮ末端と融合している。
【００１７】
あるいは、本発明の融合タンパク質は、
（ａ）  哺乳動物の成熟型サーファクタントプロテインと、
（ｂ）  哺乳動物のプラスミノゲンアクチベータと
を含み、成熟型サーファクタントプロテインはそのＣ末端またはＮ末端で、それぞれプラスミノゲンアクチベータのＮ末端またはＣ末端と融合している。
【００１８】
そのような本発明の「１本鎖」融合タンパク質は（化学結合により生成される「２本鎖」ハイブリッドタンパク質に比べて）、サーファクタントプロテインの生物物理学的特性と、プラスミノゲンアクチベータの線維素溶解活性とをいずれも保持しているようであり、かつ効率的に肺胞内サーファクタント抱合フィブリン塊を標的としている。さらに、本発明は、該新生組換えタンパク質のその後の精製も簡単であり、通常、１日で実施し得るという利点を提供する。その上、この組換え法を用いることにより、融合タンパク質を１：１として組み立てること、すなわち、融合タンパク質が規定の組成を有することが確実になる。
【００１９】
サーファクタントプロテインＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃのｉｎ  ｖｉｖｏにおける合成およびプロセシングを考慮すれば、本発明の融合タンパク質が明らかにサーファクタントプロテインの生物物理学的特性を保持しているということは、該タンパク質が哺乳動物のサーファクタントプロテインのＮ末端プロペプチドを含む故に、特に驚くべきことである。ＳＰ−ＢもＳＰ−Ｃも、ＩＩ型肺胞細胞により前駆体タンパク質として合成される。これらの前駆体は、分泌経路通過中に成熟型ペプチドへとプロセシングされる（参考文献［９、１０、１２］参照）。成熟型ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃはそれぞれ疎水性であるので、サーファクタントの脂質との結合前には前駆体タンパク質の形態で護送することが生理学的に不可欠である。さもないと、ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃはすぐに脂質膜を破壊し、その結果細胞溶解が生じるであろう（この理由で、これまで、ＨｅＬａ細胞またはＣＨＯ細胞などの培養細胞系における組換え成熟型ＳＰ−Ｂの産生が不可能であった）。
【００２０】
したがって、当然、プロペプチドは、成熟型サーファクタントプロテインが肺胞細胞への輸送中にその生物物理学的活性を発揮するのを妨げるものでなければならず、このことは、プロペプチドが、何らかの分子レベルの点で、成熟型サーファクタントプロテインの（その時点では極めて有害な）機能および細胞損傷特性に対する「シールド」を提供することを意味する。それゆえ、Ｎ末端プロペプチドの存在にもかかわらず、本発明の融合タンパク質が成熟型サーファクタントプロテインの生物物理学的特性を保有するようであることを発見したことは本発明者らにとって驚くべきことであった。
【００２１】
本発明の融合タンパク質は、個々の融合タンパク質の配列、従ってその生物物理学的特性の完全制御を可能にする組換えＤＮＡ技術を用いて作製される。アミノ酸配列内の突然変異は、確立された標準法を用いてＤＮＡレベルで極めて容易に達成することができる（参考文献［２８］）。
【００２２】
可能なアミノ酸配列改変は、挿入または欠失およびアミノ酸置換である。そのような置換は、保存的置換であり得る。すなわち、アミノ酸残基を化学的に類似したアミノ酸残基で置換する。アミノ酸残基の特性のまとめについては当業界では周知である。保存的置換の例は、以下のグループのメンバー間置換、すなわち（１）アラニン、セリン、およびトレオニン；（２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；（３）アスパラギンおよびグルタミン；（４）アルギニンおよびリシン；（５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、お
よびバリン；ならびに（６）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである。
【００２３】
一方、アミノ酸配列に非保存的改変を導入することも可能である。例えば、ＳＰ−Ｂは分子間および分子内ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基に富むので、１つの非保存的置換をシステイン残基のアラニンへの置換として、本発明の融合タンパク質の生物物理学的特性および触媒特性のうち少なくともいずれか一方に干渉し得るジスルフィド架橋の形成を阻止し得ることができる。別の可能な置換は、このタンパク質の疎水性を低下させるために、ＳＰ−Ｃの１つ以上のバリン残基を、例えばグリシンで置換することであってもよい。しかし、本発明の融合タンパク質の単一アミノ酸残基の変更だけでなく完全ドメインの変更も可能である。例えば、該タンパク質の、触媒反応に関与せず機能性３次元構造への折りたたみに重要ではない部分を除去して、融合タンパク質のサイズを小さくすることも可能であり、これは多くの点で有利であり得る。
【００２４】
一般に、そのようなアミノ酸配列修飾は、本発明の融合タンパク質の生物物理学的特性および／または触媒特性（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、膜透過性または経口投与の場合のその耐酸性）を高めることを目的としている。
【００２５】
用語「前駆体タンパク質」または「前駆体」は、本明細書では、その成熟型へと完全にプロセシングされてはおらず、依然としてそのＮ末端およびＣ末端のうち少なくともいずれかのプロペプチドを含んでいるタンパク質を指す。用語「タンパク質成分」または「成分」は、本発明の融合タンパク質を構成するサーファクタントプロテイン前駆体およびプラスミノゲンアクチベータを指す。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、本明細書に開示されているような融合タンパク質の少なくとも一方の成分、すなわち、それぞれ、サーファクタントプロテイン成分およびプラスミノゲンアクチベータ成分は、ヒトタンパク質である。最も好ましいのは、両成分が共にヒトタンパク質である融合タンパク質である（図２参照）。
【００２７】
本発明はさらに、共通のｍＲＮＡ前駆体分子の選択的スプライシングの結果としての、「野生型」タンパク質と称されるものとは異なるが、なお機能性である成分を含む融合タンパク質を包含する。
【００２８】
本発明の融合タンパク質のサーファクタントプロテイン成分は任意の公知サーファクタントプロテイン、すなわち、サーファクタントプロテインＳＰ−Ａ、−Ｂ、−Ｃまたは−Ｄであってよく、疎水性タンパク質ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃが好ましく、ＳＰ−Ｂが最も好ましい。すでに概説したように、肺サーファクタント存在下のフィブリン形成の結果、これら２種のタンパク質はフィブリン塊にほぼ完全に組み込まれるが、このことから、これらのタンパク質が、別のタンパク質（この場合にはプラスミノゲンアクチベータ）をサーファクタント含有塊に対して標的化するのに適した候補となっている。
【００２９】
ＳＰ−Ｂ前駆体（配列番号１）は、（２３アミノ酸のシグナルペプチドを含む）２００アミノ酸のＮ末端プロペプチドと１０２アミノ酸のＣ末端プロペプチドとがそれぞれ隣接している「成熟型ペプチド」（７９アミノ酸）を含む。（配列番号２に示されているような）Ｎ末端プロペプチドと成熟型ペプチドとを含む断片は、ＳＰ−Ｂの正しい折りたたみと輸送とに必要かつ十分であると証明された。ＩＩ型肺胞細胞では、Ｎ末端プロペプチドの除去および成熟型ＳＰ−Ｂ（配列番号３）の遊離が生じる。これまで、ＨｅＬａ細胞またはＣＨＯ細胞などいかなる従来型培養細胞系でも成熟型ＳＰ−Ｂを産生させることはできなかった（上記参照）。
【００３０】
したがって、本発明の好ましい実施形態において、融合タンパク質のサーファクタントプロテイン成分は配列番号２である。
本発明の別の好ましい実施形態において、融合タンパク質のサーファクタントプロテイン成分は配列番号３である。
【００３１】
ＳＰ−Ｃ前駆体（配列番号８）の翻訳後プロセシングはＳＰ−Ｂのものと極めて類似している。わずか３５アミノ酸の小タンパク質である成熟型ＳＰ−Ｃ（配列番号１０）は、その後Ｃ末端およびＮ末端のプロペプチドがそれぞれ切断されて産生される（参考文献［９、１０、１２］参照）。
【００３２】
本発明の別の実施形態において、融合タンパク質のサーファクタントプロテイン前駆体は、（配列番号９に示されているような）ＳＰ−Ｃである。
さらなる好ましい実施形態において、融合タンパク質のサーファクタントプロテイン成分は配列番号１０である。
【００３３】
本発明の目的、すなわち、サーファクタント抱合フィブリン塊の溶解に関して、それぞれＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃの好ましい融合パートナーは、ウロキナーゼ−プラスミノゲンアクチベータ（ｕ−ＰＡ）であるが、これはｕ−ＰＡが肺胞腔内の主要プラスミノゲンアクチベータであるからである。ウロキナーゼ−プラスミノゲンアクチベータも、１本鎖ｕ−ＰＡ（またはプロウロキナーゼ；配列番号４）と称される４１１アミノ酸の前駆体タンパク質として合成される。Ｌｙｓ１５８とＩｌｅ１５９との間で切断されると、高分子量２本鎖ｕ−ＰＡ（ＨＭＷ−ｕ−ＰＡ）が形成される。Ｌｙｓ１３５とＬｙｓ１３６との間の切断によるさらなるプロセシングにより低分子量２本鎖ｕ−ＰＡ（ＬＭＷ−ｕ−ＰＡ；配列番号５）が生成し、これは、高分子量型と同様な酵素活性を有すると報告されている。このタンパク質の２つの鎖は、Ｃｙｓ１４８とＣｙｓ２７９との間のジスルフィド架橋により結合している。しかし、本発明では、任意のタンパク質性プラスミノゲンアクチベータもしくはその断片またはその突然変異体を、該ポリペプチド分子がプラスミノゲンアクチベータ活性を有している限り、用いることが可能である。
【００３４】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、融合タンパク質のプラスミノゲンアクチベータはＬＭＷ−ｕ−ＰＡ（配列番号５）である。
本発明の融合タンパク質は、それぞれＳＰＵＣ１ＡおよびＳＰＵＣ１Ｂと称される、ＳＰ−Ｂ前駆体（ＳＰ−ＢΔＣ）およびＬＭＷ−ｕ−ＰＡのキメラを含む配列番号６および配列番号７からなる群から選択するのが最も好ましい（図１Ａおよび１Ｂ参照）。
【００３５】
本発明の別の特定の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、それぞれＳＰＵＣ２ＣおよびＳＰＵＣ３Ｂと称される、ＳＰ−Ｂ（ＳＰ−Ｂ成熟型）およびＬＭＷ−ｕ−ＰＡのキメラを含む配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択される（さらに図１Ｃおよび図１Ｄ参照）。
【００３６】
プラスミノゲンアクチベータ成分として組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ；配列番号１１）を含む融合タンパク質も好ましい。
本発明の融合タンパク質について適当なプラスミノゲンアクチベータの非限定的追加例は、高分子量２本鎖ｕ−ＰＡ（ＨＭＷ−ｕ−ＰＡ）、ＬＭＷ−ｕ−ＰＡのＢ鎖、組換え１本鎖ｕ−ＰＡ（ｒ−ｓｃｕ−ＰＡ）、組換えｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ）、およびその変異体ｒ−ＰＡ、ｎ−ＰＡ、ＴＮＫ−ｔ−ＰＡ、チスイコウモリだ液プラスミノゲンアクチベータα−１（ｂａｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ならびに触媒活性を有するそれらの突然変異体である。適当なプラスミノゲンアクチベータの例は図２にも示されている。
【００３７】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、融合タンパク質は、組換えタンパク質の検出および／または精製を容易にするために、そのＮ末端およびＣ末端のうち少なくともいずれか一方にタンパク質またはペプチドのアフィニティータグを有する。適当なアフィニティータグは、例えば、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓ６タグ、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）、またはＨＡタグである。
【００３８】
本発明はさらに、本明細書に記載されているような融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ＤＮＡおよびＲＮＡ）に関する。遺伝子コードの縮重により、あるコドンを、同じアミノ酸を指定する他のコドンで置換することができるので、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする特定の核酸分子には限定されず、機能性融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むすべての核酸分子を包含する。
【００３９】
さらに、本発明は、共通のｍＲＮＡ前駆体分子の選択的スプライシングによる、「野生型」核酸配列と称されるものとは異なる核酸配列を含む機能性融合タンパク質をコードする核酸分子を包含する。そのようなスプライシング事象には、成熟型ｍＲＮＡ分子内での、エキソン（すなわち、アミノ酸配列をコードする核酸配列）の選択的使用、エキソンシャッフリング（すなわち、エキソンの選択的配置）、およびイントロン（すなわち、通常アミノ酸配列をコードしない介在配列）の保持が含まれる。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、融合タンパク質の少なくとも一方の成分、すなわち、それぞれ、サーファクタント成分およびプラスミノゲンアクチベータ成分は、ヒト核酸配列によりコードされる。最も好ましいのは、両成分が共にヒト核酸配列でコードされる融合タンパク質である（図２参照）。
【００４１】
別の好ましい実施形態において、本明細書に開示されているような融合タンパク質のサーファクタントプロテイン成分をコードする核酸配列は、配列番号２および配列番号９からなる群から選択され、前者が好ましい。
【００４２】
本明細書に開示されているような融合タンパク質をコードする核酸配列は、サーファクタントプロテイン成分が配列番号３および配列番号１０からなる群から選択されるものも好ましく、前者の方が好ましい。
【００４３】
核酸分子が、配列番号６および配列番号７からなる群から選択される核酸配列を含むのが最も好ましい（図１Ａおよび１Ｂ参照）。
本発明のさらなる特定の好ましい実施形態において、核酸分子は、配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択される核酸配列を含む（図１Ｃおよび１Ｄ参照）。
【００４４】
本願に開示されている核酸分子を、１つの調節配列（または複数の調節配列）に「作動可能に連結」させて、この核酸分子の発現を可能にし得る。
ＤＮＡなどの核酸分子は、転写調節および翻訳調節のうち少なくともいずれか一方に関する情報を含む配列エレメントを含んでいる場合、「核酸分子を発現できる」または「ヌクレオチド配列を発現させ」得ると称され、そのような配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に「作動可能に連結」される。作動可能な連結とは、調節配列エレメントと発現される配列とが遺伝子発現を可能にするように結合される連結である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は種間で異なり得るが、一般に、これらの領域は、原核生物では、プロモーター自体すなわち転写開始を導くＤＮＡエレメントと、ＲＮＡに転写されると翻訳開始信号を送るＤＮＡエレメントとをいずれも含むプロモーターを含んでいる。そのようなプロモーター領域は、通常、転写および翻訳の開始に関与する５′非コード配列、例えば、原核生物では−３５／−１０ボックスおよびシャイン・ダルガノエレメントまたは真核生物ではＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列、および５′キャッピングエレメント
を含む。さらに、これらの領域は、エンハンサーまたはリプレッサーエレメントと共に、天然ポリペプチドを宿主細胞の特定コンパートメントに標的化するための翻訳されるシグナル配列およびリーダー配列を含み得る。
【００４５】
さらに、３′非コード配列は、転写終結、ポリアデニル化などに関与する調節エレメントを含み得る。しかし、これらの終結配列が特定の宿主細胞で十分に機能しない場合には、その細胞で機能するシグナルで置換し得る。
【００４６】
したがって、本発明の核酸分子は、調節配列、好ましくはプロモーター配列を含み得る。別の好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、プロモーター配列および転写終結配列を含む。適当な原核生物プロモーターは、例えば、ｌａｃＵＶ５プロモーターまたはＴ７プロモーターである。真核細胞における発現に有用なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーターまたはＣＭＶプロモーターである。
【００４７】
本発明の核酸分子は、ベクターまたは他のクローニング媒体、例えば、プラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミドまたは人工染色体にも組み込み得る。好ましい実施形態において、核酸分子は、ベクター、特に発現ベクターに組み込まれる。そのような発現ベクターは、上記調節配列および本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列のほかに、発現に用いる宿主に適合する種由来の複製配列および制御配列に加えて、形質転換またはトランスフェクションされた細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーを含みうる。核酸分子は真核生物のコード配列の発現に適した発現ベクターに組み込むのが最も好ましい。当技術分野では多数の適当なベクターが公知であり、市販されている。
【００４８】
本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、特に、そのような融合タンパク質のコード配列を含むベクターで、その遺伝子を発現し得る宿主細胞を形質転換し得る。形質転換は、標準法（参考文献［２８］）を用いて実施し得る。したがって、本発明はさらに、本明細書に開示されているような核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００４９】
本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現に適した条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する。適当な宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの原核生物、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞ＳＦ９もしくはＨｉｇｈ５、不死化哺乳動物細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞もしくはＣＨＯ細胞）、哺乳動物初代細胞または肺幹細胞などの真核細胞であり得る。
【００５０】
さらに、本発明は、本発明の融合タンパク質の組換え生産法に関する。この方法は、
（ａ）  適当なベクターに融合タンパク質をコードする核酸分子を導入するステップと、（ｂ）  （ａ）で得た組換えベクターを適当な宿主細胞または適当な細胞抽出物に導入するステップと
を含む。
【００５１】
ステップ（ａ）は、融合タンパク質のみをコードする核酸分子を用いて実施し得る。あるいは、ステップ（ａ）は、融合タンパク質コード配列が調節配列に作動可能に連結されている核酸分子を用いて実施し得る。場合により、本発明の核酸分子はさらに、組換え融合タンパク質の検出および精製のうち少なくともいずれか一方を容易にし得るアフィニティータグなどの融合パートナーをコードする配列とも融合させ得る。本発明の方法の別の実施形態において、本明細書に開示されているような融合タンパク質のサーファクタントプロテインおよびプラスミノゲンアクチベータ成分をそれぞれコードする核酸配列を、互
いに独立に適当なベクターに挿入してもよい。遺伝子発現は、転写および翻訳に必要なすべての要素を含む組換え細胞または適当な細胞抽出物で達成し得る。
【００５２】
さらに、本発明は、本発明の融合タンパク質の医薬用途に関する。１つの実施形態において、本発明は、炎症性肺疾患および間質性肺疾患の、予防および治療のうち少なくともいずれか一方のための方法に関し、この方法は、本明細書に開示されているような融合タンパク質を単独でまたは他の医薬活性化合物および医薬として許容可能な賦形剤と組み合せて、哺乳動物、特にヒトに投与するステップを含む。
【００５３】
本願記載の融合タンパク質で予防または治療し得る急性または慢性の炎症性肺疾患および間質性肺疾患または肺障害としては、急性（または成人）呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺障害（ＡＬＩ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、サルコイドーシス、過敏性肺臓炎、肺炎症、肺炎、気管支炎、喘息、嚢胞性線維症、再発性乳幼児突発性危急事態（ＡＬＴＥ）または乳幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ）におけるサーファクタント機能異常、先天性肺胞タンパク症および重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）が挙げられる。
【００５４】
本発明の融合タンパク質は、タンパク性薬物に治療上有効な、任意の腸管外、非腸管外（腸内）または局所（気管内）経路を介して投与し得る。例えば、腸管外投与法は、例えば注射液、輸液またはチンキ剤の形態での皮内、皮下、筋肉内または静脈内注射および輸液の技術に加えて、例えばエアロゾル混合物、噴霧剤または乾燥粉末の形態でのエアロゾル導入および吸入を含む。非腸管外投与法は、例えば、丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤もしくは懸濁剤の形態での経口投与、または座薬の形態での経直腸投与である。本発明の融合タンパク質は、所望に応じて、従来の医薬として許容可能な無毒性の賦形剤または担体、添加剤およびビヒクルを含む製剤として全身投与または局所投与し得る。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、最も好ましい施用方法であるエアロゾル投与または気道内導入により、哺乳動物、特にヒトに腸管外投与される。
本発明の融合タンパク質の投与量は、ある患者について所望の治療的応答を達成するために広い範囲内でさまざまであってよい。投与量は、例えば、融合タンパク質の酵素活性、すなわち線維素溶解活性やそのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、投与法、治療する疾患／障害の重篤度や患者の病状によって決まる。例えば、喘息の発作または急性肺障害などの急性の短期障害の治療は、維持可能な限りの高用量を用いると最も良く達成されるであろう。それに対し、間質性肺疾患または特発性肺線維症などの長期の慢性障害の治療には、任意選択で持続放出製剤として投与される低用量の方が適当であろう。所与の個体の治療に有効な投与量の確立は当業者のレベルの範囲内である。
【００５６】
一般に、体重１ｋｇ当たり融合タンパク質を約５００μｇ〜２００ｍｇの１日用量を投与するのが適当であろう。好ましい用量レベルは、長期投薬計画の場合には０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日、短期治療の場合には５０〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の範囲である。融合タンパク質は、単回容量として施用してもよいし、数回、例えば、２〜４回に分けて投与してもよい。
【００５７】
したがって、本発明はさらに、上記のような融合タンパク質と医薬として許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物に関する。特に、本発明は、線維素溶解活性を有する医薬組成物に関する。
【００５８】
本発明の組換え融合タンパク質は、医薬として許容可能な成分および確立された製造法（参考文献［２９］）を用いて組成物に配合し得る。医薬組成物の製造には、医薬として不活性な無機または有機賦形剤を使用し得る。例えば、丸剤、散剤、ゼラチンカプセル剤
または座薬の製造には、例えば、ラクトース、タルク、ステアリン酸およびその塩、脂肪、ろう、固体状または液状ポリオール、天然油および硬化油を用い得る。使用前に溶液またはエアロゾル混合物に再構成するための液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル混合物または散剤の製造に適した賦形剤としては、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、およびそれらの適当な混合物ならびに植物油が挙げられる。
【００５９】
さらに、上記医薬組成物は、例えば、充填剤、結合剤、湿潤剤、流動促進剤、安定剤、保存剤、乳化剤などの添加剤、さらに、溶剤もしくは可溶化剤、またはデポー剤の作用を達成するための作用剤を含み得る。後者は、融合タンパク質を、リポソーム、ナノ粒子およびマイクロカプセルなどの徐放もしくは持続放出または標的化送達システムに組み込み得るものである。
【００６０】
例えば、本発明の融合タンパク質は、市販のサーファクタント製剤に混ぜて、エアロゾル投与もしくは気管支内注入するか、または気管支鏡を用いて投与し得る。適当なサーファクタント製剤としては、例えば、２種の天然ウシサーファクタント製剤であるＳｕｒｖａｎｔａ（登録商標）およびＡｌｖｅｏｆａｃｔ（登録商標）、子牛肺サーファクタント抽出物であるＩｎｆａｓｕｒｆ（登録商標）や、疎水性タンパク質ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃを欠く合成サーファクタント組成物であるＥｘｏｓｕｒｆ（登録商標）が挙げられる。
【００６１】
以下の非限定的図面および実施例により、本発明をさらに説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
実施例１：  ＳＰＵＣ１Ａ  ｃＤＮＡのクローニング
標準法（参考文献［２８］）を用いて、ヒト低分子量ウロキナーゼ−プラスミノゲンアクチベータ（ＬＭＷ−ｕ−ＰＡ；配列番号５）のＮ末端と融合しているヒトＳＰ−ＢΔＣ（配列番号２）から構成されている融合タンパク質（ＳＰＵＣ１Ａ；配列番号６）をコードするベクターｐＳＰＵＣ１Ａ（図１Ａ）を構築した。各ｃＤＮＡ断片を、ＣＭＶプロモーターの制御下の、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の多重クローニング部位に挿入した。多重クローニング部位のＸｈｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にＳＰ−ＢΔＣ  ｃＤＮＡを、またＨｉｎｄＩＩＩ部位とＡｆｌＩＩ部位との間にＬＭＷ−ｕ−ＰＡ  ｃＤＮＡをクローニングした。
【００６３】
得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌を形質転換し、挿入部位に隣接するプライマーを用いたＰＣＲ分析により正しい挿入断片の存在について単一クローンのスクリーニングを行った。陽性の形質転換体を大腸菌で増幅させた。ベクター−ＤＮＡをイオン交換クロマトグラフィーで精製し、自動システム〔ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（Ｒ）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；パーキン・エルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）〕を用いて配列決定した。
【００６４】
実施例２：  ＣＨＯ細胞におけるＳＰＵＣ１Ａの発現
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を３７℃および１０％ＣＯ２下に単層培養した。増殖培地は、ＤＭＥＭとＤＭＥＭ−Ｆ１２との１：１混合物に、１０％ウシ胎児血清、２０ｍＭ  グルタミン、１００Ｕ／ｍ  ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加したものであった。製造業者の指示に従い、２．５μｇのｐＳＰＵＣ１ＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（商標）〔ライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ギブコＢＲＬ社（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）〕とを用いて、ＤＮＡのトランスフェクションを実施した。
【００６５】
［３５Ｓ］細胞標識および免疫沈降を用いて、ＳＰＵＣ１Ａ（配列番号６）の発現を解
析した（図３）。トランスフェクションの３５時間後、増殖培地を、１０％ＦＣＳおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加したがメチオニン／システインを含まないＤＭＥＭと交換した。４０分間のインキュベーション後、０．５ｍＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］−メチオニン／システイン〔Ｐｒｏ−ｍｉｘ［３５Ｓ］ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｅｌｌ  ｌａｂｅｉｎｇ  ｍｉｘ；アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）〕を用いて６時間かけて細胞を標識した。
【００６６】
次いで、上清（Ｓ）および細胞溶解物（Ｃ）を、それぞれ、抗ヒトｐｒｏ‐ＳＰ−Ｂウサギポリクローナル抗体〔ケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）〕および抗ヒトｕ−ＰＡマウスモノクローナル抗体〔アメリカン・ダイアグノスティカ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）〕を用いて免疫沈降させた。各チューブに、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）〔３０μｌ；ザイメッド・ラボラトリーズ社（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）〕およびウサギ血清（５μｌ）を加え、試料をローテーター上４℃で１２時間インキュベートした。１，０００×ｇで遠心分離した後、上清を新しいチューブに移し、３０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと５μｌの各抗体とを加えた。さらなるインキュベーション（１２時間、４℃）とそれに続く遠心分離の後、ペレットを洗浄緩衝液Ａ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０２％  ＳＤＳ、ｐＨ７．６）で４回、洗浄緩衝液Ｂ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）で２回洗浄した。試料をＬａｅｍｍｌｉバッファーに懸濁し、５分間沸騰させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。ゲルを４０％メタノール／１０％氷酢酸／４％グリセロール中で１時間固定し、エンハンサー溶液中で３０分インキュベートし、真空チャンバ内で乾燥させ、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ  ＭＲ）に曝露した。
【００６７】
予想サイズ（約６５ｋＤａ）の融合タンパク質を、その両成分に特異的な抗体によりそれぞれ検出することができた（図３）。このように、組換えＳＰＵＣ１ＡはＣＨＯ細胞で首尾良く発現させることができる。抗ヒトｕ−ＰＡマウスモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析（データは示さず）によるＳＰＵＣ１Ａの予備的定量化により、上清中３４〜５８ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度が測定された。
【００６８】
実施例３：  発色基質を用いたＳＰＵＣ１Ａの機能解析
発色基質クロモザイム（Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍｅ）Ｕ〔ロシュ・ダイアグノスティクス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）〕およびＳ−２２５１〔クロモジェニックス社（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）〕をそれぞれ用いて、ＣＨＯ細胞の上清中および溶解物中の組換えＳＰＵＣ１Ａ（配列番号６）のアミド分解活性を測定した。アッセイ緩衝液は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、および１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡからなるものであった。
【００６９】
クロモザイムＵはｕ−ＰＡの直接的な基質である。試験試料（トランスフェクションの２０時間後および４４時間後の細胞上清と、細胞溶解物）を５０μｌ容量でマイクロタイタープレートに移し、１００μｌのアッセイ緩衝液および１００μｌのクロモザイムＵ（１ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。５０μｌの酢酸（５０％溶液）を加えて反応を終結させ、４０５ｎｍで吸光度を測定した。一方、Ｓ−２２５１は、プラスミノゲンのプラスミンへの活性化後に切断される、ｕ−ＰＡの間接的な基質である。試験試料を同様にマイクロタイタープレートに移し、１００μｌのプラスミノゲン希釈液（５０μｇ／ｍｌ）、およびアッセイ緩衝液に溶かした１００μｌのＳ−２２５１（２ｍＭ）と混合した。インキュベーション後、５０μｌの酢酸を加えて反応を終結させ、４０５ｎｍで吸光度を測定した。ヒトの完全長ＳＰ−Ｂ（配列番号１）をコードするｐＳＰＢＦＬでトランスフェクションした細胞はネガティブコントロールの役割を果たし、ヒトＬＭＷウロキナーゼ−プラスミノゲンアクチベータ（配列番号５）をコードするｐＬＭＷ−ｕ−ＰＡでトランスフェクションした細胞はポジティブコントロールの役割を果たした。
【００７０】
ＣＨＯ細胞をｐＳＰＵＣ１Ａでトランスフェションした後、細胞上清中にアミド分解活性を検出することができた（図４）。しかし、この効果は、基質としてＳ−２２５１を用いた場合のプラスミノゲン添加後に一層顕著であった。ｐＳＰＢＦＬでトランスフェクションした細胞では、予想通り、測定可能なアミド分解活性は観察されなかった。ｐＬＭＷ−ｕ−ＰＡでトランスフェクションした細胞は、ｐＳＰＵＣ１Ａでトランスフェクションした細胞に比べてはるかに高レベルのｕ−ＰＡ活性を示した。この知見の理由はまだはっきりしないままであり、さらなる研究で取り組まなければならない。しかし、これらの結果により、組換えＳＰＵＣ１ＡはＣＨＯ細胞で異種により発現させても実際に機能性であることが確認される。
【００７１】
実施例４：  フィブリンゲルのオートグラフィによるＳＰＵＣ１Ａの機能解析
プラスミノゲンアクチベータ活性の第２の尺度として、ＣＨＯ細胞の上清および溶解物を、参考文献［３０］に記載されているように実施したフィブリンゲルのオートグラフィにより解析した。１０％アクリルアミドの展開用ゲルを用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試料を分離した。ＳＤＳを中和するために５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えた０．１Ｍ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．２にゲルを１．５時間浸し、次いで、指示用のフィブリンゲル上に置いた。手短に述べると、２％（ｗ／ｖ）アガロース溶液を沸騰させ、４５℃に冷却し、１４０μｇ／ｍｌのプラスミノゲンおよび０．８Ｕ／ｍｌのトロンビンを含む予め暖めたリン酸緩衝食塩水と混合した。フィブリノゲン（１ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＳ（３７℃）溶液を加え、混合物をガラスプレート上に注いだ。最終濃度は、１％  アガロース、３５μｇ／ｍｌ  プラスミノゲン、０．２Ｕ／ｍｌ  トロンビン、および２ｍｇ／ｍｌ
フィブリノゲンであった。フィブリンゲルを湿室で展開させ、写真を撮影した。プラスミノゲンアクチベータは、この指示用ゲルの不透明なフィブリンマトリックス中で暗い溶解ゾーンを形成することにより示された。
【００７２】
ｐＳＰＵＣ１ＡでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞においては、上清および細胞溶解物のいずれにおいても約６５ｋＤａの移動度の溶解ゾーンを同定することができた（データは示さず）。この知見は、上述した細胞標識／免疫沈降実験（図３；実施例２）および切断実験（図４；実施例３）で得られた結果と完全に一致し、さらに、組換えＳＰＵＣ１Ａの機能性を立証している。
【００７３】
【表１】
2008500001.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１Ａ】本発明の典型的な発現ベクターの略図。図１Ａおよび１Ｂに示されているベクターは、ＬＭＷ−ｕ−ＰＡのＮ末端と融合しているＳＰ−ＢΔＣで構成されている融合タンパク質（それぞれ配列番号６および配列番号７）をコードしている。ｐＳＰＵＣ１Ａ（図１Ａ）は、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロジェン社）由来であり、ｐＳＰＵＣ１Ｂ（図１Ｂ）は、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（インビトロジェン社）由来である。
【図１Ｂ】本発明の典型的な発現ベクターの略図。図１Ａおよび１Ｂに示されているベクターは、ＬＭＷ−ｕ−ＰＡのＮ末端と融合しているＳＰ−ＢΔＣで構成されている融合タンパク質（それぞれ配列番号６および配列番号７）をコードしている。ｐＳＰＵＣ１Ａ（図１Ａ）は、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロジェン社）由来であり、ｐＳＰＵＣ１Ｂ（図１Ｂ）は、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（インビトロジェン社）由来である。
【図１Ｃ】本発明の典型的な発現ベクターの略図。図１Ｃは、ＬＭＷ−ｕ−ＰＡのＮ末端と融合しているＳＰ−Ｂ成熟型で構成されている融合タンパク質（配列番号１２）をコードするｐＳＰＵＣ２Ｃを示しており、この融合遺伝子は、ＳＰ−Ｂシグナルペプチドをコードするセグメントおよび６ヌクレオチドのスペーサーエレメントの下流にある。
【図１Ｄ】本発明の典型的な発現ベクターの略図。図１Ｄは、ＬＭＷ−ｕ−ＰＡのＣ末端と融合したＳＰ−Ｂ成熟型からなる融合タンパク質（配列番号１３）をコードするベクターｐＳＰＵＣ３Ｂを示しており、ＬＭＷ−ｕ−ＰＡ  ｃＤＮＡは、ｕ−ＰＡシグナルペプチドをコードするセグメントおよび６ヌクレオチドのスペーサーエレメントの下流にある。
【図２】本発明の融合タンパク質の設計を示す略図。哺乳動物サーファクタントプロテイン成分はそのＣ末端で哺乳動物プラスミノゲンアクチベータのＮ末端と融合している。これらの成分の一方または両方はヒトタンパク質であり得る。これら２種のタンパク質成分は、図面の下部に示されている非限定的な例から選択し得る。重要なことは、サーファクタントプロテイン成分が成熟型サーファクタントプロテインである場合、成熟型サーファクタントプロテインをそのＮ末端でプラスミノゲンアクチベータのＣ末端と融合させ得ることも本発明の範囲内にあるということである。
【図３】チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における組換えＳＰＵＣ１Ａ（配列番号６）の発現成功を立証する図。ｐＳＰＵＣを用いたトランスフェクションの３５時間後、細胞を収穫し、［３５Ｓ］−メチオニン／システインで６時間標識した。図に示されている抗体を用いて上清（Ｓ）および細胞溶解物（Ｃ）を免疫沈降させ、結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。シグナルをオートラジオグラフィーで視覚化した。正しいサイズ（約６５ｋＤａ）の融合タンパク質を、該タンパク質の両成分にそれぞれ特異的な抗体により検出することができた。
【図４】ＣＨＯ細胞における、ＳＰＵＣ１Ａ（配列番号６）のアミド分解活性と、完全長ＳＰ−Ｂ（ＳＰ−ＢＦＬ；配列番号１）およびＬＭＷ−ｕ−ＰＡ（配列番号５）との比較について示す図。各ＤＮＡによるトランスフェクションの２０時間後（上清Ｓ、２２ｈ）または４４時間後（上清Ｓおよび細胞溶解物Ｃ、４４ｈ）に、細胞試料を収穫し、マイクロタイタープレートに移し、発色基質クロモザイムＵ（ｕ−ＰＡの直接的基質）およびＳ−２２５１（間接的基質、プラスミノゲンの添加が必要）とともにそれぞれインキュベートした。試料の吸光度（４０５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで測定した。ｐＳＰＵＣ１Ａでトランスフェクションした細胞はアミド分解活性を示したが、この活性は、プラスミノゲン添加後にさらに顕著になった。したがって、組換えＳＰＵＣは、ＣＨＯ細胞で発現させた場合、機能性である。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2008500001.tif 000009
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月6日(2006.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
（ａ）  Ｃ末端プロペプチドを欠く、哺乳動物のサーファクタントプロテイン前駆体と、（ｂ）  哺乳動物のプラスミノゲンアクチベータと
を含んでなり、サーファクタントプロテイン前駆体がそのＣ末端でプラスミノゲンアクチベータのＮ末端と融合している融合タンパク質。
【請求項２】
タンパク質成分（ａ）または（ｂ）の一方がヒトタンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
タンパク質成分（ａ）および（ｂ）がいずれもヒトタンパク質である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
サーファクタントプロテイン前駆体が、サーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）またはサーファクタントプロテインＣ（ＳＰ−Ｃ）から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
サーファクタントプロテイン前駆体がサーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
融合タンパク質であって、
（ａ）  哺乳動物の成熟型サーファクタントプロテインと、
（ｂ）  哺乳動物のプラスミノゲンアクチベータと
を含んでなり、成熟型サーファクタントプロテインがそのＣ末端またはＮ末端で、それぞれプラスミノゲンアクチベータのＮ末端またはＣ末端と融合している融合タンパク質。
【請求項７】
タンパク質成分（ａ）または（ｂ）の一方がヒトタンパク質である。請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
タンパク質成分（ａ）および（ｂ）がいずれもヒトタンパク質である、請求項６または７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
成熟型サーファクタントプロテインが、サーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）およびサーファクタントプロテインＣ（ＳＰ−Ｃ）からなる群から選択される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
成熟型サーファクタントプロテインがサーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
哺乳動物のプラスミノゲンアクチベータが、高分子量２本鎖ウロキナーゼ−プラスミノゲンアクチベータ（ＨＭＷ−ｕ−ＰＡ）、低分子量２本鎖ｕ−ＰＡ（ＬＭＷ−ｕ−ＰＡ）、低分子量ｕ−ＰＡのＢ鎖、組換え１本鎖ｕ−ＰＡ（ｒ−ｓｃｕ−ＰＡ）、組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）、組換えｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ）、およびその変異体ｒ−ＰＡ、ｎ−ＰＡ、およびＴＮＫ−ｔ−ＰＡ、ならびに触媒活性を有する該プラスミノゲンアクチベータの突然変異体からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
配列番号１９および配列番号２０にそれぞれ示されているような、低分子量２本鎖ｕ−ＰＡ（ＬＭＷ−ｕ−ＰＡ）のＮ末端と融合しているサーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）前駆体を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号２５および配列番号２６にそれぞれ示されているような、低分子量２本鎖ｕ−ＰＡ（ＬＭＷ−ｕ−ＰＡ）と融合している成熟型サーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）を含んでなる、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
Ｎ末端およびＣ末端のうち少なくともいずれか一方にタンパク質またはペプチドのアフィニティータグを有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項１６】
配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項１７】
配列番号１２または配列番号１３のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項１８】
核酸分子が、該核酸分子の発現を可能にする調節配列に作動可能に連結している、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
調節配列がプロモーター配列と転写終結配列とを含んでなる、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
ベクターに組み込まれていることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２１】
請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を生産する方法であって、
（ａ）  融合タンパク質をコードする核酸分子を適当なベクターに導入するステップと、（ｂ）  （ａ）で得た組換えベクターを適当な宿主細胞または適当な細胞抽出物に導入す
るステップと
を含んでなる方法。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含んでなる医薬組成物。
【請求項２４】
医薬組成物を製造するための請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２５】
医薬組成物が、炎症性肺疾患および間質性肺疾患の予防および治療のうち少なくともいずれか一方のための組成物である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
医薬組成物が線維素分解活性を有する、請求項２４または２５に記載の用途。
【請求項２７】
炎症性肺疾患および間質性肺疾患の予防および治療のうち少なくともいずれか一方を行う方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を、哺乳動物に、前記疾患の予防および治療のうち少なくともいずれか一方に十分な用量で投与するステップを含んでなる方法。
【請求項２８】
融合タンパク質を、腸管外投与、非腸管外（腸内）投与、および局所投与からなる群から選択される投与により哺乳動物に投与する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
腸管外投与がエアロゾル投与または気道内導入による、請求項２８に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月4日(2006.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
（ａ）  Ｃ末端プロペプチドを欠く、哺乳動物のサーファクタントプロテイン前駆体と、（ｂ）  哺乳動物のプラスミノゲンアクチベータと
を含んでなり、サーファクタントプロテイン前駆体がそのＣ末端でプラスミノゲンアクチベータのＮ末端と融合している融合タンパク質。
【請求項２】
タンパク質成分（ａ）または（ｂ）の一方がヒトタンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
タンパク質成分（ａ）および（ｂ）がいずれもヒトタンパク質である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
サーファクタントプロテイン前駆体が、サーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）またはサーファクタントプロテインＣ（ＳＰ−Ｃ）から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
サーファクタントプロテイン前駆体がサーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
融合タンパク質であって、
（ａ）  哺乳動物の成熟型サーファクタントプロテインと、
（ｂ）  哺乳動物のプラスミノゲンアクチベータと
を含んでなり、成熟型サーファクタントプロテインがそのＣ末端またはＮ末端で、それぞれプラスミノゲンアクチベータのＮ末端またはＣ末端と融合している融合タンパク質。
【請求項７】
タンパク質成分（ａ）または（ｂ）の一方がヒトタンパク質である。請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
タンパク質成分（ａ）および（ｂ）がいずれもヒトタンパク質である、請求項６または７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
成熟型サーファクタントプロテインが、サーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）およびサーファクタントプロテインＣ（ＳＰ−Ｃ）からなる群から選択される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
成熟型サーファクタントプロテインがサーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
哺乳動物のプラスミノゲンアクチベータが、高分子量２本鎖ウロキナーゼ−プラスミノゲンアクチベータ（ＨＭＷ−ｕ−ＰＡ）、低分子量２本鎖ｕ−ＰＡ（ＬＭＷ−ｕ−ＰＡ）、低分子量ｕ−ＰＡのＢ鎖、組換え１本鎖ｕ−ＰＡ（ｒ−ｓｃｕ−ＰＡ）、組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）、組換えｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ）、およびその変異体ｒ−ＰＡ、ｎ−ＰＡ、およびＴＮＫ−ｔ−ＰＡ、ならびに触媒活性を有する該プラスミノゲンアクチベータの突然変異体からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
配列番号１９および配列番号２０にそれぞれ示されているような、低分子量２本鎖ｕ−ＰＡ（ＬＭＷ−ｕ−ＰＡ）のＮ末端と融合しているサーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）前駆体を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号２５および配列番号２６にそれぞれ示されているような、低分子量２本鎖ｕ−ＰＡ（ＬＭＷ−ｕ−ＰＡ）と融合している成熟型サーファクタントプロテインＢ（ＳＰ−Ｂ）を含んでなる、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
Ｎ末端およびＣ末端のうち少なくともいずれか一方にタンパク質またはペプチドのアフィニティータグを有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項１６】
配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項１７】
配列番号１２または配列番号１３のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項１８】
核酸分子が、該核酸分子の発現を可能にする調節配列に作動可能に連結している、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
調節配列がプロモーター配列と転写終結配列とを含んでなる、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
ベクターに組み込まれていることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２１】
請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を生産する方法であって、
（ａ）  融合タンパク質をコードする核酸分子を適当なベクターに導入するステップと、（ｂ）  （ａ）で得た組換えベクターを適当な宿主細胞または適当な細胞抽出物に導入するステップと
を含んでなる方法。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含んでなる医薬組成物。
【請求項２４】
医薬組成物を製造するための請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２５】
医薬組成物が、炎症性肺疾患および間質性肺疾患の予防および治療のうち少なくともいずれか一方のための組成物である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
医薬組成物が線維素分解活性を有する、請求項２４または２５に記載の用途。
【国際調査報告】
2008500001.tif 000032
2008500001.tif 000033
2008500001.tif 000034
2008500001.tif 000035
2008500001.tif 000036