(57)【要約】本発明は、“ユビキチン様タンパク質”のスーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みを有するタンパク質、及び、その断片又は融合タンパク質の修飾タンパク質に関する。前記修飾の結果、前記タンパク質は、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有する。本発明は、また、前記タンパク質の製造及び利用の方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域であってβシート領域の少なくとも１つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む領域における１以上のアミノ酸の修飾に起因して、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが維持されているタンパク質。
【請求項２】
前記修飾のために選択されるタンパク質が、ヒトユビキチンと少なくとも３０％のアミノ酸配列の同一性及びユビキチン様折り畳みモチーフを有し、かつ／又は、“ユビキチン関連タンパク質”のタンパク質ファミリーに属する請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記修飾のために選択されるタンパク質が、ユビキチン様折り畳みモチーフを有し、好ましくは、ＳＵＭＯ‐１、ＦＡＵ、ＮＥＤＤ‐８、ＵＢＬ‐１、Ｒｕｂ１、ＡＰＧ８、ＩＳＧ１５、ＵＲＭ１、ＨＵＢ１、ＧＤＸ、ｅｌｏｎｇｉｎＢ、ＰＬＩＣ２（Ｎ末ドメイン）、ヒトｐａｒｋｉｎ（Ｎ末ドメイン）からなる群から選択される請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が、ヒトユビキチン又はその他の哺乳類のユビキチンである前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記修飾が、前記タンパク質の表面の５から１０アミノ酸、好ましくは６から８アミノ酸の隣接する領域を含み、好ましくはその２から４アミノ酸が表面露出βシートにある前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項６】
第１及び第４βシート鎖の表面露出アミノ酸が修飾され、必要に応じて、さらに、哺乳類ユビキチンの非βシート領域の第６２から６５番目の領域が修飾された前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記修飾が、置換、挿入、欠失、化学修飾又はこれらの組み合わせであり、一次配列で直接隣接した又は直接隣接していないアミノ酸を少なくとも部分的に１以上、好ましくは、置換を含み、好ましくは、一次配列において隣接していない修飾されたアミノ酸が、二次構造において隣接した結合パートナーに対する結合領域を形成する前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項８】
修飾、好ましくは、置換される一次配列において直接隣接したアミノ酸の数が、２から８の直接隣接したアミノ酸であり、より好ましくは、３から７、又は、４から６、又は、２から４の直接隣接したアミノ酸である前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項９】
一次配列において互いに直接隣接した修飾されたアミノ酸の部分が、βシート鎖の開始又は終結部分であって、前記部分が、２以上のアミノ酸長、好ましくは、２又は３のアミノ酸長である前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１０】
一次配列において互いに直接隣接する５以上のアミノ酸が修飾、好ましくは、置換され、そのうちの１、２以上、好ましくは、２又は３の直接隣接したアミノ酸が、βシート鎖領域の開始又は終結部分を形成する前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記修飾が、前記タンパク質表面上で隣接する領域を形成するアミノ酸において行われる前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１２】
請求項１の野生型タンパク質において、ユビキチンの天然結合パートナーへの結合に関与する領域に属さない位置のアミノ酸が修飾されている前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記タンパク質、好ましくは、ユビキチンのβ鎖に存在する少なくとも２５％のアミノ酸が修飾されている前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１４】
さらに、前記タンパク質のループ領域のアミノ酸が修飾されている前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１５】
ヒトユビキチン又はそれに相同なタンパク質であって、少なくとも８個のユビキチンの表面露出アミノ酸が修飾、好ましくは、置換されており、前記修飾アミノ酸が結合パートナーに対する結合親和性を有する領域を含む前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記８個の表面露出アミノ酸のうち少なくとも６個が、前記タンパク質のβシート領域に指定される領域内に存在する請求項１５記載のタンパク質。
【請求項１７】
修飾、好ましくは、置換された少なくとも５個のアミノ酸が、一次配列において互いに直接隣接している請求項１５又は１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記タンパク質のアミノ末端βシート鎖及び／又はカルボキシ末端βシート鎖に位置するアミノ酸が修飾されている前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１９】
さらに、カルボキシ末端βシート鎖に続くループに位置するアミノ酸が修飾されている前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記修飾タンパク質が、第２、４、６、６２、６３、６４、６５及び６６番目の位置で、置換、欠失、挿入、及び／又は、化学修飾、好ましくは、置換されたヒトユビキチンである前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２１】
修飾のために選択されるタンパク質が、既に挿入、欠失、置換及び／又は化学修飾され、前記タンパク質の生物学的及び／又はタンパク質化学的機能が、廃棄され又は新規に生成された前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２２】
修飾の後に、合計して少なくとも１０、好ましくは、少なくとも１５のユビキチンのアミノ酸が置換された請求項２１記載のタンパク質。
【請求項２３】
置換、挿入及び／又は欠失による改変のために選択されるタンパク質が、第４４、４８、５４、７０、７２及び７５番目の位置の１以上においてアミノ酸が置換され、第７６番目のアミノ酸が欠失されたヒトユビキチンであって、本質的に天然の結合パートナーとの相互作用を示さないユビキチンである請求項２１又は２２記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記タンパク質が、第４５番目の位置においてフェニルアラニンからトリプトファンへの置換を含むヒトユビキチンである前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２５】
ランダム突然変異生成により選択されたアミノ酸のランダム置換が行われた前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記結合パートナーが、抗原又はハプテンである前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２７】
予め定められた結合パートナーに対するＫDで表される結合親和性が、１０-6Ｍから１０-12Ｍ、さらにより好ましくは、１０-8Ｍから１０-12Ｍ、又は、１０-9Ｍから１０-12Ｍである前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２８】
“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、１以上のアミノ酸の修飾に起因して、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが維持されているタンパク質であり、下記方法により得ることができるタンパク質。
ａ）修飾するタンパク質を選択し；
ｂ）結合パートナーを決定し；
ｃ）βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域におけるアミノ酸を選択し；
ｄ）前記選択アミノ酸を、好ましくは、置換、挿入、欠失、及び／又は、化学修飾により修飾し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフを維持し；
ｅ）前記修飾タンパク質を、工程ｂ）で決定した結合パートナーと接触させ、
ｆ）工程ｂ）で予め定めた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出する。
【請求項２９】
前記タンパク質が、部位特異的な共有結合により、同じ又は異なる特異性のタンパク質に結合されており、二価又は二重特異的な結合特性を示す前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項３０】
前請求項の１以上に記載のタンパク質の製造方法であって、前記タンパク質が、“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域であってβシート領域の少なくとも１つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む領域における１以上のアミノ酸の修飾に起因して、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが保持されているタンパク質であって、下記工程を含む製造方法。
ａ）修飾するタンパク質を選択する工程。
ｂ）結合パートナーを決定する工程。
ｃ）βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の表面露出領域におけるアミノ酸を選択する工程。
ｄ）前記選択アミノ酸を、置換、挿入、欠失、及び／又は、化学修飾により修飾し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフを維持する工程。
ｅ）前記修飾タンパク質を、工程ｂ）で決定した結合パートナーと接触させる工程。
ｆ）工程ｂ）で予め定めた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出する工程。
【請求項３１】
工程ｃ）からｄ）が、前記修飾タンパク質の化学合成により行われる請求項３０記載の製造方法。
【請求項３２】
工程ｄ）における修飾が、対応する修飾タンパク質に属するＤＮＡを改変する遺伝子工学により行われ、前記タンパク質の発現が、原核若しくは真核生物宿主又はインビトロで行われる請求項３１記載の製造方法。
【請求項３３】
工程ｄ）において、遺伝子ライブラリが確立される請求項３０記載の製造方法。
【請求項３４】
工程ｄ）において、ランダム突然変異生成により選択されたアミノ酸のランダム置換が行われる前請求項の１以上に記載の製造方法。
【請求項３５】
工程ｅ）において、予め定められた結合パートナーとの接触が、適切な選択方法、好ましくは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＣＩＳディスプレイ、又は、細胞表面ディスプレイ法、酵母表面ディスプレイ、バクテリア表面ディスプレイ、特に好ましくは、ファージディスプレイ法により行われる前請求項の１以上に記載の製造方法。
【請求項３６】
工程ｆ）において、予め定められた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質の検出が、ＥＬＩＳＡ、プラズモン表面共鳴分光法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量計、又は、分析的超遠心分離法の１以上の方法により行われる前請求項の１以上に記載の製造方法。
【請求項３７】
工程ｆ）の後に、検出された予め定められた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質の単離及び／又は質向上の工程が続く前請求項の１以上に記載の製造方法。
【請求項３８】
前記タンパク質が、それ自体公知の方法により、その結合親和性、その結合特異性、及び／又は、安定性、溶解度、若しくは、収率などのその他のタンパク質特性が成熟される前請求項の１以上に記載の製造方法。
【請求項３９】
前記タンパク質が、部位特異的な共有結合により同じ又は異なる特異性のタンパク質に結合され、それにより、二価又は二重特異的タンパク質が得られる前請求項の１以上に記載の製造方法。
【請求項４０】
前請求項の１以上に記載のタンパク質の使用であって、それ自体公知の方法、例えば、クロマトグラフィー又は吸収技術における、対応する結合パートナーの検出、定量、分離、及び／又は対応する結合パートナーの単離のための使用。
【請求項４１】
前請求項の１以上に記載のタンパク質の使用であって、対応する結合パートナーが直接又は間接的に関与する疾病の診断、予防及び治療のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフ（フォールディングモチーフ）を有するタンパク質、及び、その断片又は融合タンパク質の修飾タンパク質であって、前記修飾の結果として以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を示すタンパク質に関し、並びに、これらのタンパク質の調製方法及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチンは、小型、単量体、細胞質性のタンパク質であって、配列が高度に保存され、原生動物から脊椎動物まで既知の全ての真核生物に存在するタンパク質である。前記生命体において、ユビキチンは、細胞のタンパク質の制御分解の調節において重要な役割を果たす。この目的のために、分解に向かうことになっているタンパク質は、酵素のカスケードの通過の間にユビキチン又はポリユビキチン鎖に共有結合され、この標識のために選択的に分解される。最近の結果によれば、ユビキチン又はユビキチンによるタンパク質の標識は、別の細胞プロセス、例えば、いくつかのタンパク質のインポートやその遺伝子制御などにおいても同様に重要な役割を果たす（Marx, 2002；非特許文献１）。
【０００３】
その生理的機能の解明に加えて、そもそも、その構造的及びタンパク質化学的特性のために、ユビキチンは、研究対象となっている。ユビキチンのポリペプチド鎖は、７６アミノ酸からなり、並外れてコンパクトなα／β構造に折り畳まれて（フォールドされて）いる（Vijay-Kumar, 1987；非特許文献２）。そのペプチド鎖の８７％のほとんどは、水素結合により、二次構造要素の形成に関与している。顕著な二次構造としては、３回転半のαへリックス、及び、４つの鎖からなる逆平行のβシートが挙げられる。これらの要素の特徴的な配置―タンパク質表面に露出した逆平行βシート、その裏側にαへリックスが包まれ、前記αヘリックスが前記βシート上に垂直に横たわる―は、一般的に、いわゆるユビキチン様折り畳みモチーフとみなされる。それ故、ユビキチンは、タンパク質スーパーファミリー（“ユビキチン様タンパク質”）又は、タンパク質ファミリー（“ユビキチン関連タンパク質”）の名称の起源となっている（Murzin et al., 1995；非特許文献３）。これらのタンパク質ファミリーは、例えば、ＳＵＭＯ‐１（Muller et al., 2001；非特許文献４）、ＦＡＵ（Michiels et al., 1993；非特許文献５）、ＮＥＤＤ‐８（Kumar et al., 1993；非特許文献６）、ＵＢＬ‐１（Jones and Candino, 1993；非特許文献７）及びＧＤＸ（Filippi et al., 1990；非特許文献８）などのような、前記モチーフ及び一次配列におけるユビキチンに対する高度の同一性を有するタンパク質を含む。その他の構造的特徴は、前記αへリックスと前記βシート間のタンパク質内部における際立った疎水領域である。
【０００４】
その小さなサイズのため、ユビキチンの人工的な調製は、化学合成によっても、バイオテクノロジー手法によっても、同様に実施できる。その有利な折り畳み特性に起因して、ユビキチンは、遺伝子工学により、微生物、例えば、大腸菌などを使用して比較的大量にその細胞質又はペリプラズム空間に産生されうる。ペリプラズムにおける優勢な酸化条件のため、後者の戦略は、一般的に、分泌タンパク質の産生に用いられる。簡単で効率的なバクテリア調製のため、ユビキチンは、産生に問題のある他の異種タンパク質の調製のための融合パートナーとして使用されうる。ユビキチンへの融合を用いて、改善された溶解度及びそれによる改善された収率が達成されうる。このアプローチは、本発明において、ユビキチンを普遍的人工結合タンパク質として提供するために実施され、ユビキチンのタンパク質化学的特性の全く新規な利用を可能とする。
【０００５】
天然の機能が人工的な用途―例えば、バイオテクノロジー、生物学的分析、又は、医学など―に利用されるこれらのタンパク質の中で、抗体（即ち、免疫グロブリン）は、主要な機能を果たす。任意に考えうる物質のほとんどに対して特異的に非共有結合する抗体の能力は、抗体を、リガンド、受容体若しくはその他の標的分子の認識、結合又は分離が必要な生物科学的用途のほとんど全てにとって、最も重要なツールとする。近年発達した大腸菌における抗体断片の機能的生合成方法は、免疫グロブリンの利用可能性をさらに拡大させたが、同時に、その困難性及び限界を示した。
【０００６】
従来のタンパク質化学的方法によって主に得ることができたＦａｂ‐及びＦｖ‐断片（Skerra and Pluckthun, 1988；非特許文献９）に加えて、遺伝子工学的手法を用いて、免疫グロブリンの分子構造（Dubel and Kontermann, 2001に概説；非特許文献１０）、特に、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）（Bird et al., 1988；非特許文献１１）、ジスルフィド架橋Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）（Brinkmann et al., 1993；非特許文献１２）並びに、二価（Carter et al., 1992；非特許文献１３）及び二重特異性抗体断片（例えば、ｄｉａｂｏｄｙ（二重特異性抗体）、Holliger et al., 1993；非特許文献１４）に起因した異なる人工的なコンストラクト（作成物）を開発することができた。診断及び治療における使用のため、二機能を有するタンパク質を、組換えＩｇ断片のエフェクター分子への遺伝学的融合により得ることができる。このようにして、その他と共通して、アルカリホスファターゼ（Muller et al., 1999；非特許文献１５）及び緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Griep et al., 1999；非特許文献１６）への融合物を得ることができる。抗体断片の放射性同位体又は細胞毒性物質への融合物（免疫毒素複合体；Reiter and Pastan, 1998；非特許文献１７）は、がん治療に対して潜在的に非常に重要である。この場合、それぞれのＩｇ断片の腫瘍細胞特異的表面タンパク質への選択的結合が、部位特異的な治療応用（腫瘍ターゲティング）に利用される。
【０００７】
大腸菌における抗体断片の調製法は、診断及び治療に対して十分な質及び量の提供ができるのみならず、それらのタンパク質及びその免疫化学的特性の簡単かつ迅速な修飾ができる。バクテリア宿主の容易な取り扱い性は、標準的な分子生物学的手法を用いたベクターにコードされる異種タンパク質遺伝子の直接的な改変を可能にする。標的抗体工学（Kontermann and Dubel, 2001；非特許文献１８）を用いることにより、抗体断片は、例えば、結合親和性又は宿主適合性などについて最適化されうる。また、最も異なる標的物質、例えば、低分子量構造物若しくはタンパク質などに対して向けられた特異的な抗体又はその断片は、それぞれ、人工的に、即ち、免疫系から離れて、調製することができる。そのような進化した方法により、抗体断片の合成ライブラリを、ランダム変異を導入して調製し、その範囲内でヒトのレパートリーに近づけることができる（Knappik et al., 2000；非特許文献１９）。例えば、ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイ（Winter, 1998, Hoogenboom et al., 1998; Hanes et al., 2000；非特許文献２０〜２２）などのような戦略を適切に選択して用いることにより、望ましい結合特性を有する機能的Ｉｇ断片を成功裏に単離される。このようにして、例えば、古典的な免疫期間に毒性効果又は単なる弱い免疫反応を誘起するような抗原に対する結合タンパク質も得ることができる。
【０００８】
上述したような抗体工学により提供される成果及び実現性にもかかわらず、いくつかの不利点が、抗体の実用を制限しうる。すなわち、それらを十分量供給することが問題となる。機能的抗体の産生は、真核細胞培養系、すなわち、並外れてコストが集中される方法で実施されるからである。さらに、そのサイズに起因する抗体分子の低組織透過性、及び、血清中の長期滞留時間（遅い血中クリアランス）は、それぞれ、多くの治療の適用を妨害する。より小型の抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂ断片（上記参照）などは、バクテリアで、それ故基本的には低コストで、調製することができる。しかしながら、この組換え産物の収率は、望ましくない折り畳み特性及びいくつかのジスルフィド結合の形成の必要性が原因で、望ましいレベルよりも低い。さらに、組換え抗体断片は、しばしば、安定性を欠き、親抗体に比べて低い結合活性を示す。
【０００９】
そのような制限を回避するため、抗体結合の原理、つまり、保存されたタンパク質骨格上に位置する超可変表面露出領域を用いた結合を他のタンパク質に付与する試みがなされている（Skerra, 2000；非特許文献２３）。これは、本質的な可変ループが、人工的な結合特性を生むために変化されることを意味する。この目的のため、通常、天然型の結合タンパク質、例えば、リポカリン（Beste et al., 1999；非特許文献２４）又は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Koide et al., 1998；非特許文献２５）などのようなものが、抗体と同じような方法で、可動性“ループ”構造から結合部位が形成される開始点として使用される。そして、その可動性“ループ”構造の修飾は、天然型のものとは異なるリガンドの認識を可能とする。
【００１０】
あるいは、ＷＯ０１／０４１４４（特許文献１）によれば、それ自体は結合部位を欠いたβシート構造タンパク質において、結合部位をそのタンパク質表面に人工的に作り出すことができる。これを用いて、新規に作り出された人工結合部位（下記参照）、例えば、γ‐クリスタリン（眼レンズの構造タンパク質）のバリエーションであって、予め定められた物質と定量化できるほどの親和性及び特異性で相互作用するものを得ることができる。既に存在する結合部位、及び上記で見本として述べたような可動性“ループ”構造から形成された結合部位の修飾と対照的に、これらは、ＷＯ０１／０４１４４（特許文献１）において表面βシート上に新規に生成されたものである。しかしながら、ＷＯ０１／０４１４４（特許文献１）は、単に、新規結合特性の生成のための比較的大きなタンパク質の改変を述べているに過ぎない。そのサイズに起因して、ＷＯ０１／０４１４４（特許文献１）に記載のタンパク質は、いくばくかの努力のみを必要とする方法によって遺伝子工学レベルで修飾されうる。さらに、これまでのところ、開示されたタンパク質において、全アミノ酸に対するパーセンテージの単位で比較的少ない割合のみが修飾されている。これは、そのタンパク質の全体的な構造を維持するためである。それ故、タンパク質表面の比較的小さな領域のみしか、それ以前に存在しなかった結合特性の生成のために利用できない。さらに、ＷＯ０１／０４１４４（特許文献１）は、小型の低分子量分子に対する結合特性の生成を実験レベルで開示しているのみで、より大きな分子、例えば、タンパク質などのようなものに対しては開示していない。
【特許文献１】国際公開第０１／０４１４４号パンフレット
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【非特許文献２４】Beste, G., Schmidt, F.S., Stibora, T., and Skerra, A. (1999) Small antibody-like proteins with predescribed Ligand specificities derived from the lipocalin fold. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1898-1903.
【非特許文献２５】Koide, A., Bailey, C.W., Huang, X., and Koide, S. (1998) The fibronectin type III domain as a scaffold for novel binding proteins. J. Mol. Biol. 284, 1141-1151.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
それ故、本発明は、選択された結合パートナーに対して以前は存在しなかった新規な結合親和性を示し、上述した不利点を示さないタンパク質の提供を目的とする。本発明は、また、抗体の代替分子であって、上述した抗体の不利点を示さない代替分子の生成を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、この目的は、請求項１に記載の修飾タンパク質であって、大部分は開始タンパク質、例えば、ユビキチンなどのタンパク質構造に基づき、その表面に人工的に生成された結合部位を有するタンパク質を提供することで達成される。
【００１３】
特に、本発明は、“ユビキチン様タンパク質”のスーパーファミリーのタンパク質、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフをそれぞれ有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域であってβシート領域の少なくとも１つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む領域における１つ以上のアミノ酸の修飾に起因して以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を示し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが保持されているタンパク質を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
上述のとおり、本発明は、置換、挿入、欠失、化学修飾又はこれらの組み合わせにより修飾され、“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリーのタンパク質、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、この修飾に起因して以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を示し、下記方法により得ることができるタンパク質に関する。
ａ）修飾するタンパク質を選択し；
ｂ）結合パートナーを決定し；
ｃ）βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域におけるアミノ酸を選択し；
ｄ）前記選択アミノ酸を、置換、挿入、欠失、及び／又は、化学修飾により修飾し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフを保持し；
ｅ）前記修飾タンパク質を、工程ｂ）で決定した前記結合パートナーと接触させ、
ｆ）工程ｂ）で予め定めた前記結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出する。
【００１５】
さらに、本発明は、それぞれ、上述したユビキチンに基づく修飾タンパク質の調製方法、及び、これらの修飾タンパク質の使用方法を提供することを目的とする。
【００１６】
したがって、本発明は、さらに、“ユビキチン様タンパク質”のスーパーファミリーのタンパク質、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフをそれぞれ有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、１つ以上のアミノ酸の修飾に起因して予め定められた結合パートナーに対する以前は存在しなかった結合親和性を示し、下記方法により得ることができるタンパク質の調製方法を開示する。
ａ）修飾するタンパク質を選択する工程。
ｂ）結合パートナーを決定する工程。
ｃ）βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の表面露出領域におけるアミノ酸を選択する工程。
ｄ）前記選択アミノ酸を、好ましくは、置換、挿入、欠失、及び／又は、化学修飾により修飾し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフを保持する工程。
ｅ）前記修飾タンパク質を、工程ｂ）で決定した前記結合パートナーと接触させる工程。
ｆ）工程ｂ）で予め定めた前記結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出する工程。
【００１７】
このように、本発明は、それぞれ、タンパク質又はポリペプチドの修飾により調製され、それぞれ、本願において定義するユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質又はポリペプチドを提供する。これらは、“ユビキチン様タンパク質”タンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有する全てのタンパク質、及び、これらのタンパク質の断片又は融合タンパク質を含むタンパク質であって、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するという条件付きのタンパク質である。これらのタンパク質又はポリペプチドから開始して、この開始タンパク質又はポリペプチドの１つ以上のアミノ酸が修飾される。前記修飾は、特に、アミノ酸の置換を含み、また、同様に、１つ以上のアミノ酸の挿入及び欠失、並びに、アミノ酸の化学修飾を含む。これらの修飾は、修飾されるタンパク質の少なくとも１つの表面露出領域において実行される。少なくとも１つのアミノ酸の前記修飾は、βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖を含み、前記βシート鎖は、前記タンパク質の表面に局在する必要がある。結合パートナー又はリガンドが、前記修飾タンパク質に測定しうる親和性で結合できるように接近可能とするためである。本発明のその他の実施態様として、βシート領域のβシート鎖の改変に加えて、非βシート領域も同様に修飾される。前記領域は、表面露出であることが好ましい。前記予め定めた結合パートナーに対する結合親和性に影響を与え、好ましくは、結合親和性を増大させ、ひいては、特異性を向上させるためである。
【００１８】
当該技術分野の当業者は、１つ以上のアミノ酸の修飾のためのそれ自体公知のさまざまな技術を利用できる。これらは以下により詳細に記載する。加えて、Ausuebel et al., 1994及び Sambrook et al., 1989の刊行物を参照できる。
【００１９】
ユビキチンの非表面露出コア領域におけるアミノ酸修飾は、既に公知である（Finucane et al., Biochemistry, vol. 38, No. 36, 1999 又は Lazar et al., Protein Science (1997), 6: 1167-1178）。その中でなされた改変は、結合に関与しない位置に対して行われており、疎水性コア内という位置に起因して、溶媒又は予定される結合パートナーに接近できない。
【００２０】
以下において、“以前に存在しなかった結合特性”、及び、新規に生成された人工結合部位の用語の意味を、それぞれ、本発明に照らして説明する。これらの用語は、その修飾タンパク質が、以前は前記修飾領域において予め定められた結合パートナー又はユビキチンの天然の結合パートナーに対して結合特性を示さないことを意味する。本発明のその他の実施態様において、修飾されるタンパク質は、予め定められる結合パートナーに対して結合親和性を示さないものが選択される。前記結合パートナーは、また、リガンドとして定義できるが、本発明により修飾されたタンパク質に対して測定可能な親和性を有する。本発明において、定量化できる結合特性、すなわち、前記パートナーが結合する親和性の存在のための最低限の値は、形成される複合体の解離定数ＫD＝１０-5Ｍ又はそれ未満である。１０-5Ｍ及びそれ未満の値は、定量化できる結合親和性とみなすことができる。用途に依存して、１０-6Ｍ〜１０-12Ｍの値が好ましく、例えば、クロマトグラフィーの用途であれば、１０-7Ｍ〜１０-11Ｍの値がより好ましく、又は、例えば、診断若しくは治療の用途であれば、１０-9Ｍ〜１０-12Ｍの値がより好ましい。さらに好ましい結合親和性は、１０-7Ｍ〜１０-10Ｍの範囲であって、好ましくは、〜１０-11Ｍの範囲である。結合親和性の測定方法は、それ自体公知であり、以下のページでさらに述べる。
【００２１】
本発明において、修飾は、アミノ酸の置換、挿入、欠失、又は、化学修飾を意味することを意図される。
【００２２】
本発明において、修飾されるタンパク質として、“ユビキチン様タンパク質”スーパーファミリーのタンパク質を使用できる。本発明において、このスーパーファミリーは、Murzin et al. (1995)においてリスト化される下位集団を含む。これらは、例えば、“ユビキチン関連タンパク質”、“ＵＢＸドメイン”、“ＧＡＢＡＲＡＰ様”、“ＲＡＳ結合ドメイン”などのタンパク質ファミリーを含む。好ましくは、“ユビキチン関連タンパク質”のタンパク質ファミリーのタンパク質が使用される。本発明において、これらのタンパク質は、同様に、ユビキチン様折り畳みモチーフを含む。これらの例としては、ＳＵＭＯ‐１、ＦＡＵ、ＮＥＤＤ‐８、ＵＢＬ‐１、及び、ＧＤＸ、並びに、Ｒｕｂ１、ＡＰＧ８、ＩＳＧ１５、ＵＲＭ１、ＨＵＢ１、ｅｌｏｎｇｉｎＢ、ＰＬＩＣ２（Ｎ末ドメイン）、ヒトｐａｒｋｉｎ（Ｎ末ドメイン）などが挙げられる。
【００２３】
本発明において使用できるユビキチン様タンパク質スーパーファミリーに由来するタンパク質は、広範囲に特徴付けされている。単なる例示として、次のインターネットサイトを参照できる：http://bip.weizmann.ac.il/scop/index.html。このサイトによれば、ユビキチン様タンパク質のファミリーは、ユビキチン関連タンパク質のファミリーが属するスーパーファミリーとして定義される。このスーパーファミリーの全てのメンバーは、主に、逆平行様式に配置されたβシートにより特徴付けされ、α及びβのセグメントに細分される。その折り畳みは、β‐グラスプ（Ｇｒａｓｐ）として定義され、ひいては、ユビキチン様として定義される。そのコア領域は、次のように定義される：β（２）‐α‐β（２）。ここで、数字は、鎖の数を示し、そして、βシートを形成する鎖の総計を示す。混合したβシートの配置は、２１４３であって、前記シートを上から見て左から右に見た場合（アミノ末端が底部で、カルボキシ末端が上部）の鎖の位置を意味する。それ故、ユビキチン様タンパク質のメンバーの特徴は、前記タンパク質の１つの表面に露出した逆平行βシートであって、その裏側にαへリックスが包まれ、前記αへリックスが前記βシートの上に垂直に横たわる。このユビキチン様折り畳みモチーフは、本発明において使用され修飾されうるタンパク質の特徴であって、前記ファミリーのメンバーと他のタンパク質とを明確に区別することができる。この定義を考慮すると、ＰＬＩＣ‐２のユビキチン様Ｎ末端ドメイン及びｐａｒｋｉｎのユビキチン様ドメインも同様に、本発明に含まれる。
【００２４】
当該技術分野の当業者は、配列比較、いわゆるアライメントを用いて、又は、構造的考察により、そのタンパク質がユビキチン様タンパク質のタンパク質スーパーファミリーのメンバーか否かについて、予め判断することができる。当然ながら、最後の証拠は、いつも構造解析から得られる。例えば、Ｘ線結晶学又は多次元核磁気共鳴分光学による構造解析が挙げられる。最近では、遺伝学的アルゴリズムを使用した構造解析もまた、よい予測を与えうる。
【００２５】
ユビキチンスーパーファミリーについてのさらなる情報は、例えば、Larsen et al., 2002の刊行物に見ることができる。加えて、Buchberger et al., 2001の刊行物を参照できる。Buchbergerは、典型的なβグラスプの折り畳みを、β‐β‐α‐β‐β‐α‐βの構成の二次構造、即ち、２１５３４の配置の“混合シート”を形成する５本のβ鎖が配置されたユビキチン様タンパク質の特徴として表現する。この点において、ＵＢＸは、その一次配列において、例えば、ユビキチンと有意な相同性は有さない（Buchberger et al., 2001）。しかし、この事実にもかかわらず、ＵＢＸは、その三次元構造が、例えば、ユビキチンのそれと同一であるため、ユビキチン様タンパク質として分類されることを指摘しなければならない。この点において、ユビキチンの４８及び４９の位置のアミノ酸は、しばしば余分なβ鎖とみなされる（Vijay-Kumar, 1987）。この第５の鎖は、構造において前記ヘリックスの後ろ側に位置し、２１５３４の配置を“混合シート”に与えているが、しかしながら、２アミノ酸のみからなり、２アミノ酸のこの鎖をβシート鎖ということができるかどうかは、実際疑問に思われうる。しかしながら、上記で説明したとおり、Buchberger et al., 2001によれば、２１５３４の配置を有するタンパク質も同様に問題なくユビキチン様タンパク質のスーパーファミリーに分類することができる。本発明において、より詳細は上記に記載した２１４３の定義は、ユビキチンにおけるβ鎖の配置として選択される。
【００２６】
上述したファミリー及びスーパーファミリーのタンパク質は、通常、高度に保存されている。現在の知識によれば、例えば、ユビキチンは、全ての哺乳類で同一のアミノ酸配列を有する。酵母のユビキチンは、この配列と３つのアミノ酸のみ異なる。ヒトユビキチン又は哺乳類のユビキチンは、それぞれ、７６アミノ酸からなり、初めの方に記述した前記構造を有する。
【００２７】
本発明において、修飾されるタンパク質は、修飾される開始タンパク質、例えば、ヒトユビキチンに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％若しくは５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は、少なくとも９５％のそのアミノ酸配列における同一性を有するタンパク質であって、どのような場合であっても、前記タンパク質は、上記で詳細に定義したとおりのユビキチン様折り畳みモチーフを有する。
【００２８】
本発明において、上述のタンパク質の断片も、それらが上述したユビキチン様折り畳みモチーフを有する限り含まれ、上述のタンパク質の他のタンパク質への融合物も同様である。そのような断片及び融合タンパク質の場合、本発明の枠組みにおいて言及されるアミノ酸の位置は、常に、ヒトユビキチンにおけるそれぞれの位置を参照する。融合パートナーの例としては、（レポーター）酵素、毒素、又は、その他の結合タンパク質などが挙げられる。さらに、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光及び／又は発光物質などのような低分子量物質への化学的結合も実施できる。
【００２９】
融合タンパク質の場合、既に融合されたタンパク質を本発明に従って修飾できる。しかしながら、修飾又は選択の後にセグメントを融合することも、同様に本発明に含まれる。どちらの場合であっても、当該技術分野の当業者に公知の方法により実施できる。
【００３０】
本発明において、修飾タンパク質の調製のために選択されるタンパク質は、ヒトユビキチン又はその他に由来するユビキチン、例えば、その他の哺乳類のユビキチンが好ましい。それ故、以下においては、特に、ヒトユビキチンを例示的に使用して本発明について記載する。ヒトユビキチンの修飾は、以下で、突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）として参照され、予め定められた結合パートナーに対して以前は存在しなかった結合親和性を示すタンパク質を得るためのいくつかの実施例を用いて説明する。哺乳類のユビキチンとしては、哺乳類の分野の中でも、特に、げっ歯類、家畜及び農業動物のユビキチンを使用できる。本発明により調製されたタンパク質の使用分野が既知の場合、即ち、本発明の修飾タンパク質が、例えば、ヒトの疾病治療のための医薬組成物として使用される場合、ヒトタンパク質を修飾される開始タンパク質として使用することが好ましい。このことは、対応する使用分野でも適用される。以下に示される説明は、単に例としてヒトユビキチンに基づいていることに留意すべきである。この明細書の詳細な説明及び示される実施例に基づいて、当該技術分野の当業者は、本発明に従い、ユビキチン特異的折り畳みモチーフを有するタンパク質をさらに修飾できる。それ故、本発明は、ヒトユビキチン又は一般的なユビキチンに限定されない。しかしながら、この点についての指示及び説明は、本発明の特に好ましい例示的な実施態様とみなされる。
【００３１】
上述のとおり、ヒト及び哺乳類のユビキチンは、それぞれ、７６アミノ酸を有している。逆平行βシートの形成に寄与する４つのβ鎖のアミノ酸は、本発明において、また、ＰＤＢデータベース（http://www.rcsb.org/pdb/index.html）の構造１ＵＢＱに一致して、次の位置のアミノ酸である。
【００３２】
第１鎖（アミノ末端）：２〜７；  第２のβシート鎖：１２〜１６；  第３鎖：４１〜４５；  第４鎖（カルボキシ末端）：６６〜７１。前記鎖の位置は、前記シートを上から見て（アミノ末端が底部で、カルボキシ末端が上部）、左から右に見た場合、第２鎖、第１鎖、第４鎖、第３鎖であって、第１鎖と第４鎖の間のポリペプチド鎖がαヘリックスを形成する。
【００３３】
修飾されるアミノ酸の選択と修飾：
対応する構造データ、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（商標）（Berman et al., 2000; http://www.rcsb.org/pdb）から自由に入手できる構造データに基づき、開始タンパク質、例えば、ユビキチンタンパク質骨格におけるアミノ酸の位置であって、その側鎖が表面に露出している、即ち、溶媒又は予定される結合パートナーの方に向いているアミノ酸の位置は、コンピューター解析を用いて突き止めることができる。さらに、開始タンパク質、例えば、ユビキチンのアミノ酸であって、そのランダムな置換がタンパク質骨格の安定性にマイナスの効果を与えないか、与えてもわずかであると推定されるアミノ酸も、コンピューター解析により同定できる。この情報は、各単一アミノ酸の結合部位の要素としての適合性についての第一の指標とすることができ、また、その次に実験的検証を必要とする。本発明の好ましい実施態様においては、例えば、ヒトユビキチンの第２、４、６、６２、６３、６４、６５及び６６番目の位置のアミノ酸が、その表面露出及びランダム置換に対する全体的構造の許容度に起因して、選択された。前述の位置は、それぞれ、アミノ末端の第１βシート鎖の始まり部分（位置２、４、６）、及び、ループ部分（位置６２、６３）、又は、カルボキシ末端の第４βシート鎖の始まり部分（位置６４、６５、６６）で、互いに空間的に近接して局在し、それらのアミノ酸側鎖でユビキチン表面上に隣接する領域を形成する（図１）。解析される領域のランダムアミノ酸置換（“ランダム化”）によって、―抗体の抗原結合部位と同様の様式で―その他の点では無傷なユビキチンのタンパク質構造上に超可変表面露出領域を生成できる。
【００３４】
ＰｒｏＳＡＩＩソフトウエア（“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”、Proceryon Biosciences、ザルツブルグ）を使用して、例えば、１０4のバリエーションのタンパク質安定性を、ユビキチン（ＷＴ）及び“対照エピトープ”残基が置換されたバリエーション（ランダム化された位置は、第２４、２８、３１、３２、３５、３７、３８、３９番目）からランダムに得られた同数のサンプルと比較して測定することができた。この場合、前記結合部位の領域がランダムに置換されてインシリコで生成されたバリエーションの約１９％が、少なくとも、ユビキチン（ＷＴ）と同程度の安定を示す。一方、約９０％が、前記“対照エピトープ”を有するものに比べてより安定である（図２）。このコンピューターに基づく結果は、適したアミノ酸の選択の基礎として使用できる。
【００３５】
好ましい実施態様によれば、―入手可能なヒトユビキチンの構造データから開始して―結合部位が生成される領域の８アミノ酸の位置が、まず、選択された。この領域の一次配列のランダムな改変（ランダム変異導入）及びそれに続く特異的選択により、予め定められたハプテン若しくは抗原、又は、予め定められた結合パートナー全般に対して、それぞれ、望ましい結合活性を示すバリエーションを得ることができる。このようにして得られた修飾タンパク質に新規な結合特性が与えられるけれども、これらは、構造及びタンパク質化学的性質において開始タンパク質と高度に同一のままである。それ故、それらは、予め定めたリガンドに対する高い親和性及び特異性とともに、例えば、小さなサイズ、高い安定性、コスト効率が高い調製、及び、容易な修飾などのような利点も提供する。この点において、人工結合タンパク質の生成のための骨格構造としてのユビキチンの適合性は、予測することはできなかった。なぜなら、１）広範囲のアミノ酸置換に対する骨格の許容度は、ユビキチンの小さなサイズのために予測できなかったからであり、２）強固で柔軟性がないと見られているβシートを含む人工結合部位の機能性は、前には可能であるとは見られていなかったからである。
【００３６】
本発明において、抗原は、抗体に結合される物質を参照する。抗原の用語は、ハプテン、ペプチド、タンパク質、糖、ＤＮＡなどを含む。Roche Lexikon Medizin（4th edition; http://www.gesundheit.de/roche）から、抗原及びハプテンについて次の定義を得ることができ、本発明においても使用される。
【００３７】
抗原（ＡＧ）：免疫系により異種（“非自己”）であると認識されるあらゆるものの称号。ほとんどの場合、免疫反応を引き起こし、免疫に至る（＝“免疫原”）；アレルギー（＝“アレルゲン”）及びアトピー（＝“アトピゲン”）の場合、それぞれ、この免疫反応が拡大する。ＡＧは、体液性（抗原抗体反応）及び／又は細胞性防御反応（免疫、下記参照）を誘導する。ＡＧが免疫系により許容される場合（免疫寛容）、“免疫寛容原”ともいう。主に、免疫反応に関与する化学的に同定可能な機能性（決定基）を有する複合体やより大きな分子量の物質（タンパク粒、多糖、ヌクレオチド、及び多くの合成化合物）は、抗原として有効である。分類としては、１）完全ＡＧ、ほとんどの場合より大きな分子量であり、それ自身で免疫反応を誘導できるものとして、及び、２）低分子量ハプテン（＝half antigen）、より大きなキャリア分子と結合した後でのみ免疫原として作用するものとして、分類される。例えば、異種‐、アロ‐又は同系‐、自系ＡＧ；自己‐、ヘテロ‐、移植‐、抗腫瘍ウイルスＡＧなどと呼ばれる。
【００３８】
ハプテン：抗原（ＡＧ）の特異性に関与し、又は、その構造（決定基）に起因して抗体と特異的に結合できる簡単な、低分子量化合物であるが、完全ＡＧと対照的にアレルギーを生じることはできない。キャリアと呼ばれるタンパク粒と結合した後に完全な抗原（抗原）となる。
【００３９】
本発明を使用すれば、例えば、腫瘍マーカーなどのような非免疫原性物質に対し結合パートナーとして結合特性を有するユビキチンのバリエーションを同様に生成できることに留意すべきである。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様において、修飾、好ましくは、置換は、一次配列において直接隣接する少なくとも２又はそれ以上のアミノ酸について部分的に行う。ここで、互いに前記直接隣接するアミノ酸は、三次構造において、そのタンパク質のβシート鎖の少なくとも一部分に位置することがより好ましい。一般的に、タンパク質におけるどのアミノ酸の置換も、そのタンパク質の安定性の低下を伴う。単一置換は、たいてい、隣接するアミノ酸の影響に起因して広範囲に不安定化することなく許容されうる。しかしながら、全体の領域、即ち、例えば、いくつかの隣接アミノ酸からなる構造全体が変化した場合、直接的に隣接するアミノ酸に起因する安定化の効果はもはや期待できない。それ故に、これまでの従来技術においては、互いに直接隣接しないアミノ酸のみがユビキチンにおいて修飾された。直接隣接するアミノ酸の修飾によるこのような広範囲にわたるタンパク質の改変の後に、前記タンパク質の安定性が実質的に低下しないことは驚愕すべきことであった。ユビキチン又はユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質における２つの直接的に隣接するアミノ酸がタンパク質の安定性及び構造にマイナスの影響を与えることなく置換できるという事実単独でも、驚愕すべきことであり、予期することができなかったことである。
【００４１】
特に、比較的小さなユビキチンの場合、直接隣接したアミノ酸の修飾は、なおさら、互いに直接隣接していないアミノ酸の場合よりも遺伝子工学によりこのタイプの修飾を施すことが一層容易になるという利点を有する。それ故、この実施態様において、大多数の修飾タンパク質の簡易化された生成が、タンパク質レベル及びＤＮＡレベルにおいて提供されうる。
【００４２】
直接隣接したアミノ酸の置換数は、好ましくは、２〜１０であり、より好ましくは、２〜８の一次配列において互いに直接隣接したアミノ酸であり、さらに好ましくは、３〜７又は４〜６の一次配列において互いに直接隣接したアミノ酸である。
【００４３】
一次配列において互いに直接隣接したアミノ酸が置換された場合、これらのアミノ酸の部分がβシート鎖領域に及ぶことができる。βシート鎖領域にわたるこの部分は、２以上のアミノ酸長、好ましくは、２又は３つのアミノ酸長を有することができる。それ故、直接隣接したアミノ酸の領域は、βシート鎖領域の始まりの部分又は終わりの部分であって、好ましくは、約２〜３のアミノ酸の長さを有する。
【００４４】
さらに好ましい実施態様において、５以上の直接隣接したアミノ酸が修飾、好ましくは、置換される。ここで、２以上、好ましくは、２又は３の直接隣接したアミノ酸が、βシート鎖領域の始まりの部分又は終わりの部分を形成する。この場合、好ましくは、８、９又は１０のアミノ酸、特に好ましくは、８アミノ酸が、直接隣接した修飾アミノ酸の総数の上限とみなすことができる。
【００４５】
ユビキチンのβシート鎖における直接隣接したアミノ酸の修飾の場合であって、これらのアミノ酸がβシート鎖の始まり又は終わりである場合、一般的に、これらのアミノ酸は、全て表面に露出している。この場合、全てのアミノ酸が、新規な結合特性の生成に関与していると推測することができる。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様において、これらのアミノ酸は、新規な結合特性を有する領域であって、タンパク質の表面上の隣接する領域を形成する領域を生成するために修飾される。このようにして、以前は存在しなかった結合特性を有する隣接する領域を生成することができる。本発明において、“隣接する領域”は、次の事項を参照する：それらの側鎖のチャージ、空間構造及び疎水性／親水性に起因して、アミノ酸が類似する様式でそれらの環境と相互作用する。前記環境は、溶媒、一般には水、又は、例えば、空間的にアミノ酸に近い他の分子がなりうる。タンパク質についての構造情報及びそれぞれのソフトウエアを用いて、前記タンパク質の表面を特徴付けできる。例えば、タンパク質の原子と溶媒との間の界面領域は、このようにして、どのようにこの界面領域が構成され、その表面領域が溶媒に接近できるのかについて、又は、どのようにチャージが表面上に配置されているかについての情報を含み、視覚化できる。隣接する領域は、例えば、適切なソフトウエアを使用したこのタイプの視覚化により、明らかにすることができる。このような方法は、当該技術分野の当業者に公知である。本発明によれば、基本的に、表面露出領域全体を、新規結合特性の生成のため修飾される表面上の隣接する領域として使用することができる。好ましくは、この目的のために、修飾は、さらに、αヘリックス領域を含むことができる。
【００４７】
タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域であって、βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖が含む領域のアミノ酸を修飾することが重要である。βシート構造は、本質的にシート状であり、ほぼ完全に伸長していることにより定義される。連続したポリペプチド鎖のセグメントから形成されるαヘリックスと対照的に、βシートは、ポリペプチド鎖の異なる領域から形成されうる。このようにして、一次構造では空間的に一層遠くに離れた領域が、互いに近接することができる。β鎖は、一般的に、５〜１０アミノ酸長であって、ほぼ完全に伸長した立体構造である。β鎖は、互いに近接しており、一方の鎖のＣ＝Ｏ基と他方の鎖のＮＨ基との間で、また、逆の場合も同じに、水素結合が形成される。βシートは、いくつかの鎖から形成され、シート状の構造を有することができ、Ｃα原子の位置が、シート状平面の上と下の間を行ったり来たりする。アミノ酸側鎖は、このパターンに従い、従って、二者択一的に、上の方向又は下の方向を指す。β鎖の方向に依存して、シートは、平行シート及び逆平行シートに分類される。本発明においては、両方ともに、変異され請求されたタンパク質の調製に使用される。
【００４８】
βシート構造の突然変異生成のため、タンパク質において表面に近いβシート領域が選択される。表面露出アミノ酸は、入手可能なＸ線結晶学構造により同定することができる。結晶構造が入手できない場合には、コンピューター解析を用いて、入手可能な一次構造（www.embl heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html）により表面露出βシート領域及び各アミノ酸位置の接近性を予測し、又は、３ｄタンパク質構造をモデル化し（www.expasy.ch/swissmo/SWISS-MODEL.html）、こうして潜在的な表面露出アミノ酸についての情報を得る試みをすることができる。
【００４９】
しかしながら、βシートにおける突然変異生成を実施して、突然変異させるアミノ酸位置の時間のかかる事前選択を省くことも可能である。βシート構造をコードするＤＮＡ領域を、ＤＮＡ環境から単離し、ランダム突然変異を導入し、その後、以前にそれらが除去されたタンパク質をコードするＤＮＡに再び組み込む。この後に、望ましい結合特性を有する変異体の選択工程が続く。
【００５０】
本発明のその他の実施態様において、表面に近いβシート領域は、既に上記で詳しく述べたとおり選択でき、これらの選択された領域内の突然変異導入するアミノ酸位置を同定できる。このように選択されたアミノ酸位置は、その後、部位特異的突然変異生成によりＤＮＡレベルで突然変異を導入する。即ち、特定のアミノ酸をコードするコドンを、予め選択されたその他の特異的なアミノ酸をコードするコドンに置換する。この置換は、ランダム突然変異生成により実施してもよい。この場合、置換されるアミノ酸位置は確定されるが、新規でまだ決定されないアミノ酸をコードするコドンは確定されない。
【００５１】
表面露出アミノ酸は、周囲の溶媒に接近可能である。タンパク質のアミノ酸の接近性が、モデルトリペプチドＧｌｙ‐Ｘ‐Ｇｌｙのアミノ酸の接近性と比較して、８％を超える場合、そのアミノ酸は、表面露出と呼ばれる。これらのタンパク質領域又は各アミノ酸位置もまた、それぞれ、本発明により選択される予定される結合パートナーに対する好ましい結合部位である。加えて、Connolly et al., 1983及びShrake et al., 1973を参照でき、その完全な開示は、参照することにより本願に含まれる。
【００５２】
新規に生成された人工結合部位の領域のアミノ酸置換によりその親タンパク質及び互いに異なるユビキチンタンパク質骨格のバリエーションは、それぞれの配列セグメントの標的突然変異導入により生成できる。この場合、例えば、極性、チャージ、溶解度、疎水性若しくは親水性などのような特定の特性を有するアミノ酸は、それぞれ、その他の特性を有するアミノ酸と入れ替え又は置換できる。置換に加えて、“突然変異生成”の用語は、また、挿入及び欠失を含む。タンパク質レベルでの修飾は、当該技術分野の当業者に公知の方法に従い、アミノ酸側鎖の化学変換により実施できる。
【００５３】
それぞれの配列セグメントの突然変異生成の開始点として、例えば、ユビキチン様タンパク質のｃＤＮＡが機能を果たす。前記ｃＤＮＡは、当該技術分野の当業者に公知の方法により調製され、改変され、増幅されうる。比較的狭い範囲の一次配列（約１〜３アミノ酸）におけるユビキチンの部位特異的改変には、市販の試薬及び方法が自由に使用できる（“Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ”、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；“Ｍｕｔａｇｅｎｅ Ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ”、ＢｉｏＲａｄ）。より広範な領域の部位特異的突然変異生成には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の特異的な実施形態が、当該技術分野の当業者に利用可能である。この目的のために、所望の位置に縮退した塩基対組成を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドの混合物が、例えば、突然変異の導入に使用できる。これは、例えば、イノシンなどのような、ゲノムＤＮＡでは自然発生しない塩基対アナログを使用しても、同様に、達成することができる。
【００５４】
βシート領域の１つ以上のβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域の突然変異生成の開始点として、例えば、ユビキチン様タンパク質のｃＤＮＡ又は同様のゲノムＤＮＡがなりうる。さらに、前記タンパク質をコードする遺伝子は、また、合成的に調製しうる。
【００５５】
それ自体公知のさまざまな突然変異生成方法が利用可能であり、それらは、部位特異的突然変異導入法、ランダム突然変異導入法、ＰＣＲ突然変異導入法、又は、これらに類似の方法である。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様において、突然変異を起こすアミノ酸位置は、予め定められる。修飾されるアミノ酸の選択は、修飾されるタンパク質に依存して、及び／又は、選択された結合パートナーに依存して行われる。この場合、一般的に、さまざまな変異体のライブラリが確立され、それ自体公知の方法を使用してスクリーニングされる。当然、修飾されるアミノ酸の事前選択は、修飾されるタンパク質について十分な構造情報が入手できる場合には、特に容易に実施できる。しかしながら、そのような構造情報がなくても、ランダム突然変異生成及びそれに続く選択を採用する方法を使用し、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質を変化させ、予め定められたリガンド又は結合パートナーそれぞれに対する結合親和性を取り入れることが可能である。
【００５７】
例えば、ＰＣＲ、化学的突然変異生成、又は、バクテリアの突然変異誘発株の使用により標的突然変異生成及びより長い配列セグメントの突然変異生成を行う方法は、同様に、従来公知技術に属し、本発明において使用できる。
【００５８】
本発明の一実施態様において、突然変異生成は、アミノ酸コドンＮＮＫを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドのアセンブリにより実施される。しかしながら、その他のコドン（トリプレット）も同様に使用できると理解される。
【００５９】
突然変異は、βシート構造が維持されるように実施される。一般的に、突然変異生成は、タンパク質の表面に露出する安定したβシート領域の外側で行われる。それは、部位特異的及びランダム突然の両方の突然変異生成を含む。比較的狭い範囲の一次配列（約３〜５アミノ酸）を含む部位特異的突然変異生成は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ(QuickChage)又はＢｉｏ‐Ｒａｄ(Mutagen phagemid in vitro mutagenesis kit)の市販のキットで生成できる（US-A-5,789,166; US-A-4,873,192参照）。
【００６０】
より広い領域に部位特異的突然変異を生成する場合には、ＤＮＡカセットを調製する必要がある。ここで、突然変異を起こす領域は、突然変異させる位置及び変化していない位置を含むオリゴヌクレオチドのアセンブリにより得ることができる（Nord et al., 1997; McConell and Hoess, 1995）。ランダム突然変異生成は、突然変異誘発株におけるＤＮＡの増殖により、又は、ＰＣＲ増幅（エラープローンＰＣＲ）により導入できる（例えば、Pannekoek et al., 1993）。この目的のため、エラー率が増大したポリメラーゼが使用される。導入される突然変異度を向上させるため、又は、異なる突然変異を組み合わせるため、ＰＣＲ断片の突然変異を、ＤＮＡシャフリングにより組み合わせることができる（Stemmer, 1994）。これらの突然変異生成戦略と酵素の概説は、Kuchner and Arnold (1997)の概説中に提供される。このランダム突然変異を選択したＤＮＡ領域において実施するために、突然変異生成に使用するＤＮＡカセットもまた作成する必要がある。
【００６１】
本発明の１つの実施例において、ユビキチンの第２、４、６、６２、６３、６４、６５及び６６番目の位置のアミノ酸のランダム置換は、ＰＣＲにより特に容易に行うことができる。なぜなら、前述の位置は、タンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端の近傍に局在しているからである。従って、操作されるコドンは対応するｃＤＮＡ鎖の５'及び３'末端である。このように、変異原性ＰＣＲ反応に使用する第一のオリゴデオキシヌクレオチドは、―突然変異される第２、４及び６番目の位置のコドンは別にして―ユビキチンのアミノ末端のコード鎖と配列が一致する。従って、第二のオリゴデオキシヌクレオチドは、―突然変異される第６２、６３、６４、６５及び６６番目の位置のコドンは別にして―カルボキシ末端のポリペプチド配列の非コード鎖と少なくとも部分的に一致する。両方のオリゴデオキシヌクレオチドにより、ユビキチンタンパク質骨格をコードするＤＮＡ配列を鋳型として使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を実施できる。
【００６２】
さらに、得られた増幅産物を、例えば、制限酵素認識配列を導入する側面オリゴデオキシヌクレオチドを使用したその他のポリメラーゼ連鎖反応に加えることができる。適切な制限酵素で加水分解した後、得られた合成ＤＮＡ分子は、例えば、しかるべく調製されたクローニング若しくは発現ベクターの核酸配列にライゲーション、即ち、連結することができる。そのような方法や系は、当該技術分野の当業者に公知である。これらの系は、例えば、Novagen (Madison, WI)、IBA (Gottingen)又は、New England Biolabs (Beverly, MA)から市販される。本発明においては、後に続く予め定められたハプテン若しくは抗原に対する結合特性を有するユビキチンバリエーションを単離する選択方法で使用するのに適したベクター系に、得られた遺伝子カセットを導入することが好ましい。
【００６３】
本発明の好ましい実施態様において、修飾されていないユビキチンにおいて、ユビキチンの天然型の結合パートナーへの結合に関与する領域に属さないアミノ酸のみが、新規な結合特性の生成のために修飾される。このことによって確実に、既に存在するユビキチンの結合特性は改変されない。
【００６４】
修飾のための領域は、基本的に、それらが予定される結合パートナーに接近可能かどうか、及び、タンパク質の全体的な構造が修飾を許容できると推測されるかどうかに関して選択される。
【００６５】
本発明において、タンパク質、好ましくは哺乳類のユビキチン中のβ鎖に存在するアミノ酸の少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも２５％が、以前は存在しなかった結合特性を生成するために修飾され、好ましくは、置換される。最大で好ましくは約４０％のβ鎖に存在するアミノ酸、より好ましくは最大で約３５％、さらにより好ましくは３０％が、修飾され、好ましくは置換される。
【００６６】
本発明の実施例において、例えば、β鎖に存在する２４アミノ酸のうち６個が修飾され、予め定められた結合パートナーに対する結合特性を生成した。より多数のアミノ酸を修飾のために選択することにより、結合親和性を有するタンパク質のより大きなライブラリを生成でき、これらの修飾タンパク質のいずれかが、予め定められた結合パートナーに対する定量化可能な及び／又は高い結合親和性を示す可能性を向上できる。
【００６７】
さらに、β鎖の修飾に加え、タンパク質のその他の表面露出領域の修飾もまた、実施できる。好ましくは、例えば、ループ領域における修飾である。β鎖における修飾領域に加え、これらの修飾領域も、新規に生成される結合に関与しうる。
【００６８】
本発明のその他の好ましい実施態様において、ユビキチン、好ましくは哺乳類又はヒトのユビキチンの表面露出アミノ酸のうち、少なくとも６個、好ましくは少なくとも８個を修飾することができ、前記修飾としては、置換が好ましい。これらの少なくとも６個の表面露出修飾アミノ酸は、その後、予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有する領域を形成する。この点において、前記表面露出アミノ酸のうち、少なくとも４個、好ましくは少なくとも６個、さらに好ましくは少なくとも８個が、βシート領域内であること、即ち、βシート鎖内又はいくつかのβ鎖に分布していることが、特に好ましい。少なくとも５個の修飾された、好ましくは置換されたアミノ酸が一次配列において互いに直接隣接することがさらに好ましい。
【００６９】
本発明のその他の好ましい実施態様において、タンパク質の４つのβ鎖のうち、少なくとも２つ、好ましくは正確に２つのβ鎖におけるアミノ酸が修飾され、新規な結合特性を生成する。前記４つのβ鎖のうち３又は４つにおける修飾も同様に、選択された結合パートナーに対する以前は存在しなかった結合特性の生成のために好ましい。
【００７０】
アミノ末端及びカルボキシ末端鎖におけるアミノ酸を修飾、好ましくは置換して、新規な結合特性を生成することが、特に好ましい。この点において、さらに、カルボキシ末端βシート鎖に隣接するループにおけるアミノ酸を修飾、好ましくは置換することが、さらに好ましい。
【００７１】
哺乳類ユビキチン、好ましくはヒトユビキチンの下記位置：第２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６番目における修飾、好ましくは置換が、特に好ましい。これらのアミノ酸は、ユビキチンの表面上において隣接する表面露出領域を形成する。そして、このことが、結合パートナーに対する以前は存在しなかった結合親和性を有する修飾タンパク質の生成に対して特に適していることがわかった。
【００７２】
本発明において、新規な結合特性の生成のためのアミノ酸置換は、任意の所望のアミノ酸で行うことができる。即ち、新規な結合特性の生成のために修飾が行われる場合には、そのアミノ酸が、置換されるアミノ酸と同様の化学的特性又は側鎖を有していることに配慮する必要はなく、所望する任意のアミノ酸をこの目的に使用できる。
【００７３】
本発明において、例えば、置換、挿入、欠失及び／又は化学的修飾などのようなその他の修飾により、この修飾の前に既にタンパク質の生物学的及び／又はタンパク質化学的機能がスイッチオフされた若しくは新たに加えられたものも、選択された結合パートナーに対する以前は存在しなかった結合親和性の生成のための修飾されるタンパク質とみなされうる。従って、ユビキチンの天然型結合パートナーに対する結合特性は、例えば、スイッチオフすることができる。
【００７４】
従って、本発明の一実施態様において、第４５番目の位置のアミノ酸フェニルアラニンがトリプトファンに置換されたヒトユビキチンのバリエーションが使用された。このようにして、ユビキチンの構造及び安定性が維持されたまま、前記置換に起因してユビキチンと比較して分光学的特性が向上したタンパク質を提供できた。
【００７５】
本発明のその他の実施態様において、例えば、ヒトユビキチンの第４４、４８、５４、７０、７２及び７５番目の位置が置換され、第７６番目のアミノ酸が欠失された。このようにして、ユビキチンの構造及び安定性が維持されたまま、もはやユビキチンの本来の機能を果たすことができないタンパク質を提供できた。
【００７６】
このタイプの既に前修飾がされたユビキチンが以前には存在しなかった結合特性の生成に使用される場合、ユビキチンは、野生型ユビキチン又は一般的な哺乳類ユビキチンのアミノ酸を総計で少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個置換して、最終的に好ましく得られる。実施例において、このようにして、１４個の置換及び欠失を有し、その原構造を維持した修飾ユビキチンが得られた。ユビキチンのアミノ酸総数に基づけば、これは、約２０％のパーセンテージに相当する。このことは、並外れて驚愕すべきことであり、予測できないことであった。なぜなら、一般的に、もっと低いパーセンテージで、すでに、タンパク質の折り畳みに支障を来たすには十分だからである。
【００７７】
本発明において、選択されたアミノ酸の修飾工程は、好ましくは、ランダム突然変異生成、即ち、選択されたアミノ酸のランダムな置換による遺伝子レベルでの突然変異生成により実施される。好ましくは、工程ｄ）における修飾は、それぞれのタンパク質に属するＤＮＡの改変のための遺伝子工学的手法により行われる。好ましくは、その後、そのタンパク質の発現が、原核生物又は真核生物において行われる。
【００７８】
本発明において、修飾タンパク質は、さらに好ましくは、化学的修飾により調製されうる。この実施態様において、請求項１の工程ｃ）からｄ）は、１つの工程で実施される。
【００７９】
予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を用いたアミノ酸の選択と測定：
選択されたアミノ酸の修飾によりタンパク質ライブラリを確立した後、前記修飾タンパク質を、本発明に従い、予め定められた結合パートナーと接触させた。結合親和性が存在する場合には、状況に応じて、パートナーの相互の結合が容易となる。
【００８０】
本発明において、接触は、好ましくは、適した提示と選択方法、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ若しくは細胞表面ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ若しくはバクテリア表面ディスプレイの方法、好ましくは、ファージディスプレイ法により行われる。完全な開示としては、下記の参考文献を参照できる：Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 572-579； Wells and Lowmann, Curr. Opin. Struct. Biol. 2 (1992), 597-604； Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual (1996), Academic Press。上述の方法は、当該技術分野の当業者に公知であり、それらの改変を含み、本発明において使用できる。
【００８１】
本発明において、修飾タンパク質が予め定められた結合パートナーに対して定量化可能な結合親和性を有するかどうかの測定は、好ましくは、１つ以上の下記方法により行うことができる：ＥＬＩＳＡ、プラズモン表面共鳴分光法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量計、及び、分析的超遠心分離法。
【００８２】
本願に適合するファージディスプレイのタイプは、本発明における結合特性を示すユビキチンのバリエーションに対する選択方法の実施例として以下に記載される。同様の様式で、例えば、バクテリア（バクテリア表面ディスプレイ；Daugherty et al., 1998）若しくは酵母細胞（酵母表面ディスプレイ；Kieke et al., 1997）において提示する方法、又は、例えば、リボソームディスプレイ（Hanes and Pluckthun, 1997；He and Taussig, 1997）、シス（ＣＩＳ）ディスプレイ（Odegrip et al., 2003）若しくはｍＲＮＡディスプレイなどのような無細胞選択システムを適用できる。後者の場合、遺伝子型と表現型との一時的な物理的結合が、リボソームを介したタンパク質バリエーションの適切なｍＲＮＡへの結合により達成される。
【００８３】
ここで記載されるファージディスプレイ法において、ユビキチンの組換えバリエーションは、線状ファージ上に提示され、一方、提示されるバリエーションをコードするＤＮＡは、同時に、ファージエンベロープ中に、一本鎖の形で詰め込まれる。このようにして、親和性の向上という枠組みにおいて、特定の特性を有するバリエーションをライブラリから選択されることができ、それらの遺伝情報は、適切なバクテリアへの感染により増幅でき、又は、別の濃縮サイクルに加えることができる。ファージ表面上における突然変異されたユビキチンの提示は、アミノ末端シグナル配列、好ましくは、ＰｅｌＢシグナル配列、及び、ファージのキャプシド又は表面タンパク質―キャプシドタンパク質ｐＩＩＩ又はその断片へのカルボキシ末端融合が好ましい―への遺伝子融合により達成される。さらに、コードされるタンパク質は、例えば、親和性クロマトグラフィーによる検出及び／若しくは精製に使用される親和性タグ若しくは抗体エピトープ、又は、親和性濃縮の過程で融合タンパク質の特異的な切断のためのプロテアーゼ認識配列などのような機能要素をさらに含むことができる。さらに、アンバーストップコドンを、ユビキチンバリエーションの遺伝子と、ファージのキャプシドタンパク質又はその断片のコード領域との間に存在させることができ、このコドンは、部分的に、適切なサプレッサー株において翻訳中に認識されず、１個のアミノ酸が導入されることになる。
【００８４】
予め定められたハプテン又は抗原に対する結合特性を有するユビキチンバリエーションの単離に関する選択方法に適したバクテリアのベクターであって、前述の融合タンパク質の遺伝子カセットが挿入されるベクターは、ファスミドという。数ある中でも、それは、線状ファージ（例えば、Ｍ１３又はｆ１）又はその一部分を含み、例えば、Ｍ１３Ｋ０７などのようなヘルパーファージを用いたファージミドを有するバクテリア細胞に多重感染する場合には、ファスミドＤＮＡ閉鎖のファージキャプシド内へのパッケージングをもたらす。このようにして生成されたファージミドは、バクテリアから分泌され、それぞれのコードされたユビキチンバリエーションを―キャプシドタンパク質ｐＩＩＩ又はその断片への融合の結果―その表面に提示する。天然型ｐＩＩＩキャプシドタンパク質は、ファージミド中に存在し、適合するバクテリア株に再感染する能力及びそれ故に同一ＤＮＡを増幅する可能性を保持する。従って、ユビキチンバリエーションの表現型―即ち、その潜在的結合特性―とその遺伝子型との間の物理的結合が確保される。この実施例において、ファスミドｐＭＵＢＩ−１（図３）は、この目的のために作成され、ユビキチンバリエーションのコード鎖の挿入及びファージミドの調製に使用される。
【００８５】
得られたファスミドを、そこに提示されたユビキチンバリエーションの予め定められたハプテン又は抗原への結合について当該技術分野の当業者に公知の方法により選択することができる。この目的のために、提示されたユビキチンバリエーションを、一時的に、例えば、マイクロタイタープレートに結合した標的物質に固定することができ、非結合バリエーションを分離した後に特異的に溶出することができる。前記溶出は、例えば、１００ｍＭトリエチルアミンなどのような塩基性溶液により好ましく行うことができる。あるいは、前記溶出は、酸性条件化で、タンパク質分解又は感染されたバクテリアの直接添加により行うことができる。このようにして得られたファージミドは、再増幅することができ、予め定められたハプテン又は抗原に対する結合特性を有するユビキチンバリエーションの選択と増幅の連続サイクルにより質を高めることができる。
【００８６】
このようにして得られたユビキチンバリエーションのさらなる特徴付けは、ファージミド、即ち、ファージに融合した形で、又は、同一遺伝子カセットを適した発現ベクターにクローニングした後に可溶性タンパク質の形で行うことができる。適切な方法は、当該技術分野の当業者に公知であるか、又は、文献に記載されている。前記特徴付けは、例えば、ＤＮＡ配列、それ故、単離されたバリエーションの一次配列の決定を含みうる。さらに、単離されたバリエーションの親和性及び特異性を、例えば、ＥＬＩＳＡ若しくはプラズモン表面共鳴分光法などのような免疫学的標準方法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量計、又は、分析的超遠心分離法などにより検出できる。安定解析法については、例えば、化学的又は物理的アンフォールディングに関連した分光法が、当該技術分野の当業者に公知である。
【００８７】
同様に使用されるリボソームディスプレイ法において、ユビキチンのバリエーションは、無細胞転写／翻訳系により調製され、対応するｍＲＮＡ及びリボソームの複合体として提示される。この目的のために、上述したとおり、バリエーションの遺伝子が発現及びタンパク質生合成のための対応する調節配列と融合した形で存在するＤＮＡライブラリが、基礎として使用される。遺伝子ライブラリの３'末端のストップコドンの欠失、及び、適切な実験条件（低温、高Ｍｇ2+濃度）の結果、新生タンパク質、ｍＲＮＡ及びリボソームからなる三重複合体が、インビトロ転写／翻訳の間、維持される。
【００８８】
これらの複合体は、そこに提示されたユビキチンバリエーションの予め定められたハプテン又は抗原への結合について当該技術分野の当業者に公知の方法により選択することができる。この目的のために、リボソーム複合体上に提示されたユビキチンバリエーションを、一時的に、例えば、マイクロタイタープレートに結合した標的物質に固定することができ、又は、溶液中で結合後に磁性粒子に結合することができる。非結合バリエーションを分離した後に、リボソーム複合体を破壊することにより、結合活性を有するバリエーションの遺伝子情報を、ｍＲＮＡの形で特異的に溶出することができる。前記溶出は、例えば、５０ｍＭ  ＥＤＴＡにより好ましく行うことができる。このようにして得られたｍＲＮＡは、単離して適切な方法を用いてＤＮＡに逆転写でき（逆転写反応）、このようにして得られたＤＮＡは、再増幅できる。
【００８９】
インビトロ転写／翻訳、選択及び増幅の連続サイクルにより、予め定められたハプテン又は抗原に対する結合特性を有するユビキチンバリエーションの質を高めることができる。
【００９０】
このようにして得られたユビキチンバリエーションのさらなる特徴付けは、上述したとおり、同一遺伝子カセットを適した発現ベクターにクローニングした後に可溶性タンパク質の形で行うことができる。適切な方法は、当該技術分野の当業者に公知であるか、又は、文献に記載されている。
【００９１】
好ましくは、（ｄ）工程、即ち、予め定められた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質の検出工程の後に、検出したタンパク質の単離及び／又は質向上の工程が続く。
【００９２】
ユビキチン様折り畳みモチーフを有する本発明の修飾されたタンパク質の発現に続き、それ自体公知の方法により、これらをさらに精製して、質を高めることができる。選択される方法は、当該技術分野の当業者にそれ自体公知のいくつかの要因、例えば、使用される発現ベクター、宿主生物、予定使用分野、タンパク質サイズ、及びその他の要因に依存する。簡易精製のために、本発明の修飾されたタンパク質を、分離物質に対して増大した親和性を有するその他のペプチド配列に融合することができる。好ましくは、そのような融合物は、ユビキチンタンパク質の機能性に有害な影響を示さないもの又は特異的プロテアーゼ切断部位の導入により精製後に分離可能なものが選択される。そのような方法は、また、当該技術分野の当業者に公知である。
【００９３】
本発明において、また、直前に記載の方法において、例えば、ハプテン又は抗原などの予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有するユビキチンのバリエーションは、概ね単離することができる。
【００９４】
本発明において提供される修飾タンパク質の結合パートナーとして、生物学的及び医学的に活性であり、関連する全ての分子を用いることができる。予定される結合パートナーを以下に例示的に記す。しかしながら、複数個のその他の考えられるリガンドをこのリストに加えることができることに留意すべきである。抗体と抗原との関係と同様に、予定される結合パートナーのリストは、さらなる予定されるリガンドにより完成されうる。
【００９５】
好ましくは、結合パートナーは、生物学的受容体であって、好ましくはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ；例えば、ヒトＧＬＰ−１受容体、ヒトＰＴＨ受容体）、又は、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦ／Ｒ１−４、Ｅｐ−ＣＡＭ、又は、そのリガンド若しくはドメイン、腫瘍マーカー（前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ））、サイトカイン（腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ‐β））、インターロイキン（例えば、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１１、ＩＬ‐１２）、成長因子（例えば、ＮＧＦ（神経成長因子）及びそのプロフォーム、ＰｒｏＮＧＦ、ＢＭＰｓ、ＥＧＦ、ＭＩＡ、ＭＩＡ‐２、ＦＧＦｓ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＰＤＧＦ、ＰｌＧＦ、ＩＧＦｓ）、キナーゼ、インテグリン（例えば、糖タンパク質受容体ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ））、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、Ｆ４フィンブリン、Ｔ及びＢ細胞抗原、好ましくは、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３４、ＣＤ４７、ＣＤ５６、ＣＤ８３、ＣＤ１５４、ＣＴＬＡ‐４、免疫グロブリン若しくはその一部部分、例えば、全抗体（例えば、免疫グロブリンＧ、Ｅ、Ｍ）、例えば、ヒト免疫グロブリンＭのＦｃ部分若しくは抗原結合部位領域の抗体セグメント、若しくは糖（ルイスＹ、ルイスＸ）、又は、毒素、例えば、マイコトキシン、若しくは、ホルモン、例えば、ヒドロコルチゾンである。
【００９６】
本発明の特別な利点は、修飾タンパク質又はユビキチンが、細胞内環境及び細胞外環境で活性を有すること、即ち、細胞の内部及び外部の両方でそれぞれの結合パートナーに結合することである。
【００９７】
本発明の修飾タンパク質又はユビキチンが、ハプテン、即ち、小さい分子、及び、抗原、即ち、例えばタンパク質などのような大きな分子の両方に定量化可能な様式で結合できることは、特に有利な点である。本発明の修飾されたタンパク質のこの可変性により、有望な新規に生成される結合パートナーが、このようにして、結合パートナーの幅広い範囲であまねく提供される。
【００９８】
本発明のタンパク質は、さらに、検出及び定量、並びに、それぞれの結合パートナーの分離と単離のために使用できる。
【００９９】
その他の応用は、それぞれの結合パートナーが関与する疾病の診断及び治療においてである。
【０１００】
既に述べたとおり、本発明は、また、新規に生成された人工結合部位の外側に位置する各アミノ酸位置の標的改変に関する。このようにして、例えば、天然ユビキチンにおいて生物学的機能を果たすアミノ酸に占められている位置を、その他のアミノ酸により占有することができる。このようにして、例えば、ユビキチン化カスケードの酵素との相互作用などの生物学的機能が不活性であるが、その骨格及びタンパク質化学的特性がほぼ開始タンパク質と同一であるユビキチンタンパク質骨格が得られる。これは、例えば、大腸菌における発現率の測定、例えば、化学的若しくは物理的アンフォールディングについての蛍光若しくは円偏向二色性測定などの分光法による安定性の解析、又は、例えば、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的標準検査によって実施できる。
【０１０１】
Ａｒｇ５４及びＡｒｇ７２をそれぞれＬｅｕとする置換により、例えば、ユビキチン活性酵素Ｅ１との相互作用を阻害できる（Burch and Haas, 1994）。さらに、その他にも、Ｌｙｓ４８及びＶａｌ７０〜Ｇｌｙ７６のアミノ酸が、ユビキチン結合酵素Ｅ２との相互作用に関与し、適切な置換により無効にされる（Miura et al., 1999）。さらに、ユビキチンのタンパク質分解されるタンパク質への結合又はポリユビキチン鎖への選択的共有結合は、それぞれ、Ｇｌｙ７５及びＧｌｙ７６残基を介して起こり、適切な置換により無効にされうる。最終的に、Ｉｌｅ４４Ａｌａ及びＶａｌ７０Ａｌａの置換は、ユビキチンの２６Ｓプロテアソームへの接触、そして、ユビキチン標識化タンパク質の分解をほぼ無効とする（Beal et al., 1996）。従って、本発明の好ましい実施態様において、Ｉｌｅ４４Ａｌａ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｒｇ５４Ｌｅｕ、Ｖａｌ７０Ａｌａ、Ａｒｇ７２Ｌｅｕ、Ｇｌｙ７５Ａｌａの置換及びＧｌｙ７６の欠失を有する修飾ユビキチン骨格は、新規結合特性を有する修飾ユビキチンの調製の開始タンパク質として機能を果たす。上述した方法により測定されるとおり、この修飾ユビキチンタンパク質骨格は、その構造及びそのタンパク質特性について、即ち、安定性、折り畳み、大腸菌における産生、ユビキチン抗血清との相互作用などについて、大部分は同一である。
【０１０２】
異なる文献において別々に述べられた修飾が、１つのユビキチンに、本質的にその構造又は安定性を変えることなく集約できたことは、驚くべきことである。
【０１０３】
本発明の基礎をなす記載したアプローチにより、驚くべきことに、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質を基礎として、一方で、新規に生成された結合特性を示し、他方で、大部分ユビキチンのタンパク質化学的特性を示す修飾タンパク質を得ることができる。この点において、ユビキチンを基礎とした修飾タンパク質は、好ましくは、１０-6Ｍ若しくはそれ未満、例えば、１０-6〜１０-12Ｍの解離定数を示し、これは、抗体若しくはその断片のそれにそれぞれ相当する。さらに、驚くべきことに、必要に応じて、タンパク質などのような大きな分子、又は、ハプテン若しくはホルモンなどのような小さな分子に対して向けられた特異的結合特性を有する修飾タンパク質を生成することが可能である。予め定められた標的物質又は標的物質の分類を、高い選択性で結合できる。新規に生成された親和性及び特異性がある人工結合部位の観察された前記機能性は、前には予測できなかった。なぜなら、結合部位の広範な領域が、一般に強固で柔軟性がないとみなされるβシートに位置しているからである。他方、天然の一般的な結合部位―例えば、抗体のそれ―は、柔軟性の“ループ”構造から形成される。
【０１０４】
この場合に使用されるユビキチン骨格が、ポリペプチド鎖の折り畳みにマイナスの影響を与えることなく一次配列において行われる広範囲の改変を明確に許容することは、さらに驚くべきことである。これは、アミノ酸置換の数―野生型ユビキチンの約２０％―について予測できなかったのみならず、タンパク質骨格において変化されるアミノ酸位置の位置取りにもまた起因する。従って、一般に強固で柔軟性がないとみなされるβシート内における、とりわけ、直接隣接したアミノ酸の置換に対する許容度は、事前に予測できなった。
【０１０５】
得られたユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の突然変異ＤＮＡから開始して、前記タンパク質は、公知の遺伝子工学手法を用いて調製できる。この点において、その産生は、原核生物宿主内で行うことが好ましい。低コスト及び高収率のためである。しかしながら、真核生物又は無細胞系の使用は排除されない。一般的に、ＤＮＡ配列の適した発現ベクターへの挿入、及び、適した生物へのトランスフォーメーション、トランスフェクション又はインフェクションの後、外来性の修飾タンパク質は、バクテリアの転写／翻訳系によって合成される。この目的のために、調製方法は、新規結合特性を有する個々の修飾タンパク質に適合させることができる。このようにして、例えば、大腸菌が宿主として使用される場合、ユビキチンを基礎とした修飾タンパク質を、適したシグナル配列を用いてペリプラズム空間に分泌させることができ、又は、細胞質内に調製できる。本発明の修飾タンパク質が、細胞内で折り畳みされずに凝集する場合には、このような封入体からの機能的な再折り畳みも、また、可能である。無細胞系は、例えば、低発現率な又は宿主生物に対する毒性効果を有するバリエーションの場合に有利となりうる。組換えタンパク質の調製及び精製のための遺伝子工学の適した手法は、それぞれ、当該技術分野の当業者に公知であり、文献に記載されている（例えば、Sambrook et al., 2001）。
【０１０６】
したがって、人工結合部位の生成により新規な結合親和性を有するユビキチンを基礎とした修飾タンパク質であって、その極めて可変な表面が、例えば、ハプテン、ペプチド、タンパク質、及びその他の高分子又はホルモンなどのより小さい分子などのような予め定められたリガンドに対する分子認識可能な修飾タンパク質の提供が可能である。
【０１０７】
さらに、ランダム化された領域の可変表面特性に起因して、結合特性と異なる特性を有するユビキチンを基礎とした修飾タンパク質を、適切な選択方法を用いて、得ることができる。これらは、例えば、予め定められた化学反応に対する以前は存在しなかった新規な触媒活性を含む。この特性は、例えば、結合パートナーが、それぞれの反応が触媒されるような様式で前記修飾タンパク質により結合された分子又は遷移状態である場合に、得ることができる。
【０１０８】
このように、本発明は、以前は存在しなかった新規結合特性の導入のための骨格分子としてのユビキチンなどのような分子の提供を含む。
【０１０９】
さらに、本発明において、遺伝子ライブラリを、工程ｄ）の方法、例えば、ランダム突然変異生成により、確立できる。その実施態様の１つとして、本発明は、また、このように調製された遺伝子ライブラリを含み、特に、第２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６番目のアミノ酸位置が置換されたヒトユビキチンから確立された遺伝子ライブラリを含む。
【０１１０】
さらに、タンパク質骨格を、さらなる機能を修飾タンパク質に与えるために、人工結合部位の外側を標的として修飾することができる。これは、例えば、適した試薬との化学的結合によるタンパク質複合物を得るための―好ましくは、アミノ及びカルボキシ末端における―さらなるアミノ酸の導入又は個々のアミノ酸若しくはペプチドの置換を含む。そのような融合は、また、修飾タンパク質遺伝子の融合パートナー遺伝子への遺伝子工学手法を用いた結合により、直接調製することができる。これは、抗体と対照的に、バクテリア宿主により、たった1つの外来遺伝子、ひいては、たった１つのペプチド鎖が発現され、機能的に折り畳みされるという事実により、簡易化される。そのような融合パートナーは、酵素、細胞毒素、修飾タンパク質が同じ若しくは異なる結合特異性を有する結合及び多量体化ドメインであってもよい。
【０１１１】
本発明により提供されるユビキチンに典型的な折り畳みモチーフを有する修飾タンパク質は、同じ又は異なる特異性のタンパク質に、部位特異的に共有結合することができる。このようにして、１つ以上の結合パートナーに対する二価若しくは二重特異的な結合特性を得ることができる。
【０１１２】
このように、例えば、上述の方法で得られた２つの同一のユビキチンバリエーションであって、同一抗原に結合するものは、当該技術分野の当業者に公知の方法を用いた単一システイン残基の付加導入を介して、部位特異的に互いに共有結合させることができる。そのような二価結合特性は、一価のもの（結合活性効果）と比べてより強い明白な結合をすることにより特徴付けされる。
【０１１３】
同様に、異なる抗原に結合する２つのユビキチンバリエーションを適当な方法により互いに結合させることができ、それにより、単独で二重特異性の結合分子を得られる。そのようなヘテロ２量体の選択的形成のため、正又は負の荷電アミノ酸からなり、融合パートナーのカルボキシ末端に融合されるポリペプチド鎖を使用することができる。正反対に荷電したアミノ酸が使用される場合、これらの、いわゆるポリイオンタグは、互いに静電相互作用を受け、異なる特異性の結合タンパク質を１：１という望ましい割合で互いに結合させる。がん治療において、そのような二重特異性薬剤を、免疫系のエフェクター細胞と接触させて、例えば、腫瘍細胞などの適当な表面構造に的を絞ることにより、その腫瘍細胞を標的として破壊することができる。
【０１１４】
さらに、上述の選択方法の１つにより単離され、既に特異的抗原に対して結合特性を示すユビキチンバリアントは、修飾して、その親和性及び／又は特異性の質をさらに向上させることができる。この目的のために、アミノ酸の新たな標的及び／又はランダム置換を、結合部位の中及び／又は外に生成できる。そのような成熟方法に適切な方法は、当該技術分野の当業者に公知である。既に得られたユビキチンバリエーションの成熟は、親和性及び特異性を含むが、これらに限定されない。向上しうるその他のタンパク質特性としては、例えば、安定性、溶解度、及び原核生物内における産生レベルなどが挙げられる。本発明との関連では、例えば、ユビキチンバリエーションの免疫グロブリンＭのＦｃ部分への結合親和性が、このようにして、結合部位内の２つのアミノ酸の標的置換により、１０倍向上した。
【０１１５】
本発明により提供されるユビキチンを基礎とした修飾タンパク質は、抗体及びその断片と同様の様式で、幅広い用途で使用できる。これは、診断及び治療の用途、並びに、クロマトグラフィー法を含む。このように、標的物質を、任意の生物分析試験、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット及びその他により、直接検出できる。さらに、本発明の修飾タンパク質であって、例えば、免疫グロブリンに結合し、酵素若しくはフルオロフォアに結合された修飾タンパク質は、適切な試験系において、汎用二次レポーター分子として適している。それらの有利な特性に起因して、ユビキチンを基礎とした修飾タンパク質は、例えば、腫瘍若しくは感染症の治療などの治療上の使用に好ましく応用される。このようにして、修飾タンパク質の特異的結合による受容体又はリガンドの封鎖に基づく効果が利用されうる。同様に、適したエフェクターとの結合に起因して腫瘍上の表面タンパク質に結合する新規結合特性を有する修飾タンパク質は、そのような細胞を標的として破壊することができ、又は、その腫瘍組織において適当な前毒素を選択的に活性化できる。
【０１１６】
本発明において修飾され選択されたタンパク質は、このように、広範囲の考えられる用途が得られる。それらは、医学、薬学の分野のみならず、分析論、栄養食品工業、栄養補助品、化粧品、医学的及び非医学的診断及び分析の分野などで利用できる。当然に、利用分野は、選択した結合パートナーのタイプに依存する。
【０１１７】
ヒト及び獣医学の薬物療法及び予防法の分野において、薬学的に効果のある薬剤は、それ自体公知の方法により調製できる。生薬に依存して、これらの組成物を、経静脈的に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、経皮的に又はその他の適用方法により、投与できる。製剤調製の種類は、治療する疾病、その疾病の重篤度、治療される患者、及び、医学の技術分野の当業者に公知のその他の因子に依存する。その投与は、注射若しくは注入による非経口的、その他の従来採用される方法による全身的、直腸的な投与であってよい。
【０１１８】
前記組成物は、治療上有効な用量を含むように構成される。投与される用量は、治療される生物、疾病の種類、患者の年齢及び体重、並びに、それ自体公知のさらなる因子に依存する。
【０１１９】
前記組成物は、それ自体公知の助剤を含むことができる。これらは、例えば、分解防止化剤、界面活性剤、塩、緩衝剤、着色剤などを含む。
【０１２０】
前記医薬組成物は、液体製剤、クリーム、局所投与用のローション、エアロゾル、パウダー剤、顆粒剤、タブレット剤、座薬、カプセル剤、乳剤、又は、リポソーム製剤の剤形であってよい。前記組成物は、好ましくは、無菌、非発火性かつ等張性であって、薬学上それ自体従来公知で許容できる添加剤を含む。加えて、米国薬局方規則を参照できる。
【０１２１】
以下の実施例は、本発明のさらなる説明のために提供される。本発明が、一例として、特にユビキチンの修飾について実施される。しかしながら、本発明はこれらに限定されない。以下の実施例は、上記の記載に基づき本発明の実施可能性を単に示すだけである。本発明の完全なる開示のため、本願及び添付書類において引用された文献を参照でき、これらは、その全体が、参照により本願に取り込まれる。
【０１２２】
以下に本発明を実施例及び添付図面を用いてより詳細に説明する。
【０１２３】
図１：表面に人工的に生成された結合部位を有する野生型ユビキチン（ＰＤＢコード： 1ｕｂｉ; Vijay-Kumar et al., 1987）の結晶構造。二次構造要素の三次元表示を、ＰｙＭＯＬプログラム（DeLano Scientific, San Francisco）を使用して行った。実施例として調製されるライブラリにおいてランダムに置換される残基は、第２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６番目を含み、それらを側鎖とともに示す。
【０１２４】
図２：野生型ユビキチン（ＰＤＢコード：ｌｕｂｉ）の表面上における結合部位の生成。調製されるライブラリにおいてランダムに置換される残基（薄灰色で示される第２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６番目の位置）を、その各位置におけるアミノ酸置換がおよぼしうる溶媒への露出及び安定化又は不安定化効果についてコンピューターで解析して選択した。次に、ＰｒｏＳＡＩＩソフトウエアを使用して、１０4個のバリエーションのタンパク質安定性を、ユビキチン（ＷＴ）及び“対照エピトープ”（濃灰色で示される第２４、２８、３１、３２、３５、３７、３８、３９番目）の残基が置換された同数のランダムに採用されたバリエーションサンプルと比較して測定した。安定性の測定として、複合Ｃα／Ｃβ電位（“ｚｐ‐ｃｏｍｂ”）が測定される。結合部位領域においてランダムに置換されたインシリコで生成されたバリエーションの約１９％が、少なくともユビキチン（ＷＴ）と同じ高さの安定性を示した。一方、約９０％が、“対照エピトープ”を有するものよりもより安定であった。それ故、解析した領域におけるランダムなアミノ酸置換による結合部位の生成は、ユビキチンのタンパク質構造によりその安定性に大幅な影響を与えることなく許容される。このコンピューター手法は、適切な表面露出アミノ酸を選択する際に役に立つ。
【０１２５】
図３：ファージディスプレイによるＭＵＢＩバリエーションの選択において使用するファスミドベクターｐＭＵＢＩ‐１。ｐＭＵＢＩ‐１は、ファージライブラリの調製に使用され、ＰｅｌＢシグナル配列、ユビキチンバリエーションの遺伝子、ＭｙＣＵＴタグ及びファージキャプシドタンパク質（ａａ２５３‐４０６、ΔｇｐＩＩＩ）の融合タンパク質をテトラサイクリンプロモータ／オペレータ（ｔｅｔp/o）の転写制御下にコードする。アンバー（Ａｍｂｅｒ）は、融合遺伝子中のアンバーストップコドンの位置を参照する。ＭＵＢＩの突然変異された遺伝子カセットの挿入は、２つのＳｆｉＩ制限酵素部位を介して行われる。ｆ１Ｉｇ、ｂｌａP、ｔｅｔＲ、Ｏｒｉ、ＣｏｌＥ１、及びＣａｔは、ファージｆ１の遺伝子間領域、β‐ラクタマーゼプロモータの制御化のテトラサイクリンリプレッサー遺伝子、複製起点、及び、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を参照する。
【０１２６】
図４：ユビキチンバリエーションのファージディスプレイライブラリの作成方法。
【０１２７】
図５：ＥＬＩＳＡにおける、ｒｅｃＧＬＰ１−Ｒに対するファージディスプレイにより選択されて得られたユビキチンバリエーションＳＰＵ‐１‐Ｄ１０の、組換えにより調製されたヒトＧＬＰ‐１受容体のアミノ末端ドメインへの結合。適切な数のウェルのマイクロタイタープレートをｒｅｃＧＬＰ１−Ｒ及びＢＳＡ、又は、組換えで調製したヒトＰＴＨ受容体（ｒｅｃＰＴＨ‐Ｒ）のアミノ末端ドメインでそれぞれ満たして一晩４℃とした。残りの結合部分は、ＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎを含む３％ＢＳＡで飽和させた（２時間、室温（ＲＴ））。ＳＰＵ‐１‐Ｄ１０を、ＰＢＳＴ０．１中で連続希釈して加え、９０分３０℃とした。結合した修飾タンパク質をユビキチン抗血清（ＰＢＳＴ０．１中、１：１０、６０分、３０℃）及びペルオキシダーゼ結合ウサギ抗体（ＰＢＳＴ０．１中、１：２０００、６０分、３０℃）で検出した。検出は、Ｐｉｅｒｃｅ社のＩｍｕｎｏＰｕｒｅキットを使用して行った。工程間で、ＰＢＳＴ０．１で３回洗浄し、色原体検出前では、ＰＢＳでさらに３回洗浄した。シグナル強度は、Ｈ2ＳＯ4で呈色反応を止めた後に４０５ｎｍで検出し、修飾タンパク質に相当する濃度をプロットした。平衡条件下でのＫD値の測定は、非線形回帰により行った。
【０１２８】
図６：リボソームディスプレイにより選択され得られたユビキチンバリエーションＳＰＷ‐１１‐Ａ１のＶＥＧＦへのＥＬＩＳＡにおける結合。図５に記載された方法と同じようにこの実験を行った。平衡条件下でのＫD値の測定は、非線形回帰により行った。
【０１２９】
図７：リボソームディスプレイにより選択され得られたユビキチンバリエーションＳＰＵ‐１１‐５８のＶＥＧＦへのＢＩＡＣＯＲＥにおける結合。ＣＭ５チップチャネルの表面に、最初に、ＶＥＧＦを固定し、参照チャネルは非チャージのままとした。異なる濃度のＳＰＵ‐１１‐５８のそれぞれの場合において、結合事象のネットシグナルを得た。全ての溶液のインジェクション時間は、流速３５μｌ／分で２分とした。異なる濃度のＳＰＵ‐１１‐５８（１．３μＭ、０．６５μＭ、０．３２５μＭ、０．１６３μＭ、０．０８１μＭ）の結合シグナルを、インジェクション開始から重ねて示す。各測定後、表面を１０ｍＭ  ＨＣｌで１５秒パルスして再生した。平衡条件下でのＫD値の測定は、ＢＩＡ計算ソフトウエア３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ）により行った。
【０１３０】
図８：ヒドロコルチゾンに対する選択で得られたユビキチンバリエーションＳＰＵ‐３‐Ｈ１３のステロイドへのＥＬＩＳＡにおける結合。マイクロタイタープレートの３つのウェルをＢＳＡ結合ヒドロコルチゾン、テストステロン及びエストラジオール、又は、ＢＳＡでそれぞれ満たし、ＳＰＵ‐３‐Ｈ１３（４μＭ）又は結合部位領域を変化させていないユビキチンタンパク質骨格（５０μＭ）と、それぞれＰＢＳＴ０．１中でインキュベーションした（９０分、３０℃）。結合の検出は、Ｐｉｅｒｃｅ社のＩｍｕｎｏＰｕｒｅキットを使用して、Ｎｉ−ＮＴＡ／ペルオキシダーゼ複合体で行った（ＰＢＳＴ０．１中、１：５００、６０分、３０℃）。ブロッキングと洗浄：図５参照。シグナル強度は、Ｈ2ＳＯ4で呈色反応を止めた後に４０５ｎｍで検出し、３つの測定の平均値をプロットした。
【０１３１】
図９：部位特異的ランダム突然変異生成を用いた親和性成熟後のユビキチンバリエーションＳＰＵ‐２‐Ａ７及びＳＰＵ‐２Ａ７（６２／６３）のＦｃＩｇＭへのＥＬＩＳＡにおける結合の比較。図５に記載された同じ実験方法を行った。平衡条件下でのＫD値の測定は、非線形回帰により行った。
【０１３２】
図１０：単一カルボキシ末端システイン残基を介して２つのユビキチンを基礎としたタンパク質の部位特異的共有結合についてのＳＤＳ‐ＰＡＧＥ解析。２０μＬの非結合タンパク質（レーン１）及び結合反応後サンプル（レーン２）をアプライした。電気泳動後、ゲルをクーマシーで染色した。サイズ標準（レーンＭ）の分子量をｋＤａで示す。
【実施例１】
【０１３３】
新規に生成された結合親和性を有する修飾タンパク質の選択ための合成ユビキチン遺伝子の提供
遺伝子工学作業は、当該技術分野の当業者に公知の標準プロトコール、例えば、Sambrook et al. (2001)などのようなものにより行った。
【０１３４】
人工結合タンパク質の調製のための開始点としてのＩｌｅ４４Ａｌａ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｒｇ５４Ｌｅｕ、Ｖａｌ７０Ａｌａ、Ａｒｇ７２Ｌｅｕ、Ｇｌｙ７５Ａｌａの置換、及び、Ｇｌｙ７６欠失を有する修飾ユビキチンタンパク質骨格のＤＮＡ配列（配列番号１）の調製のため、以下のような方法を行った。遺伝子合成のＰＣＲ反応は、合成される遺伝子の塩基対配列の６つのオリゴデオキシヌクレオチド（配列番号２、３、４、５、６、７；各０．１μＭ）を各２．５μＬ鋳型として含む５０μＬの容量中で行った。採用したオリゴデオキシヌクレオチドの配列は、それぞれ、４０〜５０塩基対長であって、交互に３'及び５'末端が約１５塩基重複する人工遺伝子のコード及び非コードＤＮＡ鎖のセグメントに相当する。さらに、前記サンプルは、各２．５μＬの側面プライマー（配列番号８及び９；１０μＭ）及び５μＬの１０ｘＴａｑバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ９．０、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００）、３μＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、及び、４μＬのｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、各２．５ｍＭ）を含む。Ｈ2Ｏで満たした後、反応サンプルをサーモサイクラー中で、変性のため９４℃で２分間熱した。次に、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加熱中に加え（ホットスタート）、ＰＣＲプログラムを開始した。インキュベーションは、９４℃／１分、５５℃／１分及び７２℃／１．５分のサイクルを２５サイクル行った。最終インキュベーションは、７２℃で５分行った。
【０１３５】
望ましいＰＣＲ産物は、分析アガロースゲル電気泳動を用いて同定し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ反応クリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してサンプルから精製した。１．０ｎｇの単離ＤＮＡを、二次増幅の鋳型として使用した。今回は、同様に５０μＬの容量でＰｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。この目的のため、５μＬの供給される１０ｘＰｆｕバッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ４、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）及び４μＬのｄＮＴＰミックスを使用し、Ｈ2Ｏで満たした。さらに、前記サンプルは、適切な制限酵素認識部位を導入するための側面プライマー（配列番号８、９；１０μＭ）を含む。望ましいＰＣＲ産物を、調製用アガロースゲル電気泳動を用いて単離し、クローニングベクターｐＣＲ（商標）４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（商標）へ、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔ（商標）ＴＯＰＯ（商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造業者の取扱説明書に従って挿入した。供給された化学的コンピテント細胞に対応するライゲーション反応サンプルを導入し、ＬＢ／ａｍｐ／ｋａｎ培地のアガープレートにスプレッドした。前記プレートを３７℃で１６時間インキュベーションし、成長したコロニーについて望ましいライゲーション産物に関して分析した。この目的のため、プラスミド挿入キット（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を使用して、製造業者の取扱説明書にしたがってミニスケールでプラスミドＤＮＡを調製し、前記ＰＣＲ産物に側面プライマーにより導入された制限酵素認識部位に対するＤＮＡエンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で制限酵素処理を施した。配列解析は、挿入された遺伝子カセット領域における予測される切断パターンを有するプラスミド上で行った。この目的のため、サイクルリーダー（商標）オートＤＮＡシーケンシスキット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を製造業者の取扱説明書に従って使用し、また、０．５μｇのプラスミドＤＮＡ及び１．０ピコモルの各蛍光標識プライマーを使用した。新規に合成されるＤＮＡ鎖はポリメラーゼ反応中に標識され、統計的なダイデオキシヌクレオチドの塩基特異的な取り込みにより終了する。得られた蛍光ＤＮＡ断片は、溶液シーケンシング装置においてポリアクリルアミド尿素ゲル電気泳動によりその後分離され、隣接したレーンのＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔのバンドパターンにより視覚化された。
【０１３６】
的確なＤＮＡ配列を有する遺伝子カセットは、調製的ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限酵素処理によりクローニングベクターｐＣＲ（商標）４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（商標）から切り出し、調製アガロースゲル電気泳動により単離した。修飾ユビキチンタンパク質骨格の遺伝子の発現ベクターｐＥＴ２０Ｂ（−）（Ｎｏｖａｇｅｎ）への挿入は、対応するタンパク質の産生のために行い、ファスミドベクターｐＭＵＢＩ‐１への挿入は、ユビキチンバリエーションのライブラリの作成のために行った。
【実施例２】
【０１３７】
ユビキチンバリエーションライブラリの調製
合成ユビキチン遺伝子のアミノ及びカルボキシ末端の８コドンのランダム部位特異的突然変異生成のため、２連続のＰＣＲ反応を行った。第１増幅工程は、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して１０ｘ５０μＬの容量で行った。この目的のため、５μＬの供給された１０ｘＰｆｕバッファー及び４μＬのｄＮＴＰミックスをサンプルごとに使用し、Ｈ2Ｏで満たした。さらに、各サンプルには、好ましい塩基対置換の導入のため、２．５μＬの側面プライマー（配列番号１０、１１；１０μＭ）を含ませた。鋳型として、非突然変異型合成ユビキチン遺伝子を含む１．０ｎｇのｐＭＵＢＩ‐１を使用した。２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼ（上記参照）の添加に続き、９４℃／１分、６０℃／１分及び７２℃／１．５分のサイクルを２５サイクル、インキュベーションした。最終インキュベーションは、７２℃で５分行った。採用した鋳型ＤＮＡの選択的分解のため、反応サンプルごとに１０ＵのＤｐｎＩを付加し、３７℃で１時間インキュベーションを行った。望ましいＰＣＲ産物は、調製アガロースゲル電気泳動及びＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。
【０１３８】
第２増幅工程は、１，０００μＬのサンプル容量で行い、第１のＰＣＲ反応で得られた約１．０ｎｇの産物を使用し、Ｔａｑポリメラーゼを採用した。反応サンプルをピペットで取り、前記容量の２０倍となるように適合させ、上述したとおり、１０ｘＴａｑバッファー、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰミックス、及び、５'末端がビオチン標識され、互換性がないＳｆｉＩエンドヌクレアーゼの制限酵素認識部位を有する側面プライマー（配列番号１２、１３；１０μＭ）を含ませた。Ｈ2Ｏで満たした後、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼを加熱中に添加し（上述参照）、ＰＣＲプログラムを開始した。９４℃／１分、６０℃／１分及び７２℃／１．５分のサイクルを２５サイクル、インキュベーションした。最終インキュベーションは、７２℃で５分行った。
【０１３９】
得られた増幅産物の次の切断は、ＰＣＲ反応サンプル中で直接行った。この目的のため、総容積４，０００μＬにおいて、完結したＰＣＲ反応溶液を、対応する容量の供給された１０ｘバッファーＩＩ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ジチオトレイトール）、１０ｘＢＳＡ溶液及びＨ2Ｏと混合した。さらに、４，０００Ｕの制限酵素ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、５０℃１６時間インキュベーションした。ＤＮＡを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ反応クリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して前記サンプルから単離し、４００μＬの滅菌水に再懸濁した。ＳｆｉＩにより切断されなかったＰＣＲ産物の分離のため、単離されたＤＮＡを同容積の１．０ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジンが表面に結合した磁性ビーズ（“ダイナビーズキロベースバインダー”）を含む“結合溶液”（Ｄｙｎａｌ）と混合し、ローラーミキサー上で室温（ＲＴ）４．５時間インキュベーションした。場合に応じてビオチン標識化ＤＮＡを提示するビーズを一晩沈殿させ、ＳｆｉＩにより完全切断されたＤＮＡであってビオチン標識化末端を有さないものは上清に残った。このようにして得られた、望ましい位置で突然変異生成されＳｆｉＩにより切断されたユビキチン遺伝子を、滅菌水に溶解し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して脱塩し、最終的にＨ2Ｏ中で２００ｆｍｏｌ／μＬの濃度とした。
【０１４０】
受容ベクターの調製のため、ファスミドｐＭＵＢＩ‐１を、ＳｆｉＩを用いて製造業者の取扱説明書に従って切断し、より大きな（ベクター）断片を調製アガロースゲル電気泳動及びＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。分子内ライゲーションを回避するため、その５'末端を脱リン酸化した。この目的のため、０．５Ｕのエビ（Pandalus borealis）由来アルカリホスファターゼ及び供給されたバッファーを、総容積２００μＬで使用した。前記混合物を、３７℃９０分インキュベートした。そしてＤＮＡを、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して前記サンプルから単離し、脱塩した（ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット）。前記ベクター断片ＤＮＡをＨ2Ｏ中５０ｆｍｏｌ／μＬの濃度とした。ライゲーションのため、１．６ｐｍｏｌのＰＣＲ断片と８．０ｐｍｏｌのｐＭＵＢＩ‐１のベクター断片とを２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）存在下、総容量１，６００μＬ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ‐８．０００）で、１６℃３日間インキュベーションした。前記サンプルを６５℃で１５分加熱後、ＤＮＡを沈殿させた。この目的のため、１００μＬの各反応溶液を、１００μＬエタノール及び１０μＬの５Ｍ  ＮａＡｃ、ｐＨ３．０と混合し、−２０℃で１６時間維持した。続いて、遠心分離を行い（６０分、１２，５００ｇ）、サンプルをエタノール（７０５ｖ／ｖ、−２０℃）で洗浄し、再度遠心分離した。沈殿したＤＮＡを最終的に６０μＬの滅菌水に溶解した。
【０１４１】
エレクトロポレーションのため、遺伝子パルサー（商標）ＩＩシステム（Ｂｉｏｒａｄ）及び１．０ｍｍの電極空間を有するキュベット（Ｂｉｏｚｙｍ）を、低温室内４℃で使用した。３．５μＬの上述で得られた溶液を使用して、エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の取扱説明書に従って形質転換した。得られた細胞懸濁液を５枚のＬＢ／クロラムフェニコールアガープレート（２０ｘ２０ｃｍ）にプレートした。前記プレートを３７℃１６時間インキュベーションし、生育したコロニーをカウントした。作成されたライブラリは、２．８×１０7個の独立したコロニーを含んでおり、ライブラリにおいてそれぞれ１０，０００倍提示される。その後、総計１００ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むＳＯＣ培地でコロニーを浮かせて遊離させ、１．０ｍＬに分注して−８０℃で保存した。得られた中からランダムに選択した１２クローンからＱｉａｇｅｎ社のＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用してファスミドベクターを単離し、突然変異生成させたユビキチン遺伝子領域のＤＮＡ配列を解析した。全てのクローンは、機能的配列を有しており、即ち、挿入又は欠失による読み枠のシフトがなく、さらに、突然変異生成させた位置において質的に完全に異なる置換を有していた。突然変異生成させた領域の外側におけるランダム置換は見られなかった。
【実施例３】
【０１４２】
ファージ表面におけるユビキチンバリエーションの調製とタンパク質及びハプテンに対するユビキチンバリエーションの選択
表面に提示された突然変異ユビキチンのファージミドバリエーションの産生のため、１００ｍＬの２ｘＹＴ／クロラムフェニコール培地に、１．０ｍＬの実施例２で得られたグリセロール培地を植菌し、３７℃、１６時間、２２０ｒｐｍでインキュベーションした。この定常期培地の１０ｍＬを１Ｌの２ｘＹＴ／クロラムフェニコール培地に植菌し、細胞密度がＯＤ600＝０．４となるまで３７℃、２２０ｒｐｍで撹拌した。１０13ｃｆｕのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージで感染を行い、３７℃で撹拌することなく３０分インキュベーションした。５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加した後、前記サンプルを３７℃、３０分、２２０ｒｐｍで撹拌し、その後、培地を無水テトラサイクリン（保存溶液：ＤＭＦ中２．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度を０．２ｍｇ／Ｌに調整することでｐＭＵＢＩ‐１の遺伝子発現を誘導した。その後、インキュベーター温度を２６℃に低減し、１６時間、２２０ｒｐｍで撹拌した。最終的に、細胞を遠心分離で沈殿させ（３０分、１２，０００ｇ、４℃）廃棄した。上清はろ過した（０．４５μｍ）。含まれるファージミドは、１／４容量の２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６，０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌを添加して沈殿させ、氷上で１時間インキュベーションし、遠心分離して沈殿させた（３０分、１２，０００ｇ、４℃）。その後、ファージミドを、４ｍＬの氷冷ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、２ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4）に溶解し、氷上に３０分置き、遠心分離して（３０分、１２，０００ｇ、４℃）保存した。前記上清を、ＰＢＳ中４％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と１：１で混合し、ローラーミキサー上で室温、３０分インキュベーションし、親和性向上において直接使用した。
【０１４３】
予め定められた標的物質に結合する表面提示ユビキチンバリエーションを有するファージミドを単離するための親和性マトリクスとして、マイクロタイタープレートの各２４ウェルをそれぞれの物質でコートした。組換え技術により調製されたヒトＧＬＰ‐１受容体（ｒｅｃＧＬＰ‐１Ｒ；Bazarsuren et al., 2002）のアミノ末端ドメイン、ヒト免疫グロブリンＭのＦｃ部分（ＦｃＩｇＭ）及びＢＳＡに結合したヒドロコルチゾン（ＨＣ）を標的物質として使用し、４℃一晩でマイクロタイタープレート上に固定化した。
【０１４４】
前記マイクロタイタープレート表面上の空いている結合部位は、各ウェルを４００μＬのＰＢＳ中４％ＢＳＡを用いて室温で９０分インキュベーションしてブロックした。その後、１００μＬの調製したファージミド溶液を各ウェルにピペットで取り、室温で９０分インキュベーションした。非結合ファージミドは、その後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ０．０５）で２回洗浄し、４００μＬのＰＢＳ中４％ＢＳＡで５分インキュベーションした後、激しいタッピングとともにＰＢＳで２回洗浄することにより除去した。親和性マトリクスに結合したファージミドは、最終的に、各ウェルにつき１００μＬの１００ｍＭトリエチルアミンで溶出し、室温１０分インキュベーションした。溶出されたファージミドを含む溶液は、各標的物質に依存して別々にまとめて、１／２容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加して速やかに中和した。それぞれの場合で得られた溶液を、感染用大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅの２０ｍＬ培養液、細胞密度ＯＤ600＝０．４に移して、３７℃、３０分、２２０ｒｐｍで撹拌した。マイクロタイタープレートのウェルを再度洗浄し（５ｘＰＢＳＴ、０．０５、１ｘＰＢＳ）、細胞密度ＯＤ600＝０．４の大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅの培養液を１００μＬ添加した。３７℃、３０分のインキュベーションの後、これらの細胞を先に感染させたものとまとめた。各細胞懸濁液を、概ね１０5〜１０7コロニー形成クローンを含むＬＢ／クロラムフェニコール培地のアガープレート（２０ｘ２０ｃｍ）にプレートした。前記プレートを３７℃、１６時間インキュベーションし、生育したコロニーを１０ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むＳＯＣ培地でコロニーを浮かせて遊離させ、１．０ｍＬに分注して−８０℃で保存した。
【０１４５】
繰り返しのファージ産生及び新たな親和性向上サイクルのため、バクテリア細胞培養液の１０倍低い培養液容量及びよりストリンジェントな洗浄条件を選択し、上述の方法を繰り返した（第２ラウンド：ＰＢＳＴを用いた３ｘ洗浄、ＰＢＳ中４％ＢＳＡを用いた５分インキュベーション３回、及び、ＰＢＳを用いた３ｘ洗浄；第３ラウンド：ＰＢＳＴ０．１を用いた６ｘ洗浄、ＰＢＳ中４％ＢＳＡを用いた５分インキュベーション３回、及び、ＰＢＳを用いた３ｘ洗浄）。
【実施例４】
【０１４６】
標的物質に特異的に結合するモノクローナルファージミドの単離と特徴付け（単一ファージＥＬＩＳＡ）
ｒｅｃＧＬＰ１‐Ｒ、ＦｃＩｇＭ、及び、ＨＣに対する親和性向上の第３ラウンド後に得られたクローンから、９６個をランダムに選択して、各抗原又はハプテンへの結合に対する単一ファージＥＬＩＳＡで解析した。この目的のため、単一コロニーを３００μＬの２ｘＹＴ／クロラムフェニコール培地に植菌し、３７℃、１８時間、２２０ｒｐｍで撹拌した。この定常培養液の８０μＬを、４ｍＬの２ｘＸＴ／クロラムフェニコール培地に植菌し、３７℃、４時間、１８０ｒｐｍで撹拌した。並行作業を可能とするため、４つの“ディープウェル”プレート（Ｑｉａｇｅｎ、各２４ウェル）を使用した。ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞に１０11ｃｆｕのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させた後、３７℃、３０分のインキュベーションを行った。さらに、３７℃、３０分、１８０ｒｐｍの後、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを添加した。その後、３７℃、３０分、２２０ｒｐｍの撹拌を続け、培地を無水テトラサイクリン（保存溶液：ＤＭＦ中１．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度を０．２ｍｇ／Ｌに調整することでｐＭＵＢＩ‐１の遺伝子発現を誘導した。その後、インキュベーター温度を２２℃に低減し、１６時間、１８０ｒｐｍで撹拌した。最終的に、細胞を遠心分離で沈殿させ（３０分、５，０００ｇ、４℃）、上清を、新しい“ディープウェル”に移した。含まれるファージミドは、１容量の２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６，０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌを添加して沈殿させ、氷上で１時間インキュベーションし、遠心分離して沈殿させた（３０分、５，０００ｇ、４℃）。その後、ファージミドを１．０ｍＬの氷冷滅菌ＰＢＳに溶解し、６％ＰＢＳＴと１：１で混合し、室温、１時間インキュベーションした。
【０１４７】
ＥＬＩＳＡを行うため、分析するモノクローナルファージミドにつきマイクロタイタープレートの１つのウェルを４℃の抗原で満たし、１つをＢＳＡ溶液で満たした。ウェルのプラスチック表面の空いている結合部位の飽和は、３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）ＰＢＳＴ０．５でブロックした。その後、ウェルをＰＢＳＴ０．１で３回リンスし、タップアウトした。その後、上述のように調製したファージミド溶液の１００μＬをプレートの各ウェルにピペットで取った。２時間のインキュベーション後、ＰＢＳＴ０．１を用いて３回洗浄した。結合したファージミドを検出するために、Ｍ１３抗体ペルオキシダーゼ結合物（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をＰＢＳＴ０．１で１：５，０００の比率で希釈し、１００μＬを各ウェルに添加した。室温、１時間のインキュベーションの後、ＰＢＳＴ０．１を用いて３回リンスし、ＰＢＳを用いて３回リンスした。最終的に、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅキット（Ｐｉｅｒｃｅ）の１００μＬをピペットでウェルにとり、１５分後、２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を１００μＬ添加して呈色反応を停止させた。吸光度は、Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｒｅｍｏｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
【０１４８】
ＥＬＩＳＡにおいて、各抗原に対して比較的強い結合シグナルを示し、ＢＳＡには示さなかったファージミド（約２０個）に由来するユビキチンバリエーションのＤＮＡを配列番号１４のプライマー及び上述の方法を用いて配列決定した。分析したＤＮＡ配列の一部分は、読み枠のシフト又はアンバーストップコドンを示し、それ以上使用しなかった。このようにして得られ、さらに分析されたユビキチンバリエーションのアミノ酸置換を、例示的に表１にリスト化する。
【０１４９】
（表１）異なる標的物質に対するファージディスプレイ選択後のユビキチンを基礎とした修飾タンパク質における新規に生成された結合部位領域のアミノ酸置換
【０１５０】
【表１】
2008500953.tif 000002
1ＳＰＵ：結合ポケットに置換がないユビキチンタンパク質骨格
【実施例５】
【０１５１】
インビトロ転写／翻訳システムにおけるユビキチンバリエーションの調製及びリボソームディスプレイを用いたタンパク質に対するユビキチンバリエーションの選択
インビトロ転写／翻訳のための発現コンストラクトの提供、及び、リボソームディスプレイを用いた結合タンパク質の選択は、Schaffitzel et al. (2001)に従って行った。しかしながら、これとは対照的に、本ケースでは、抗体断片のライブラリは使用せず、実施例２で記載したものと同様のユビキチンバリエーションのライブラリを使用した。これらのライブラリの１つは、Ｉｌｅ４４Ａｌａ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｒｇ５４Ｌｅｕ、Ｖａｌ７０Ａｌａ、Ａｒｇ７２Ｌｅｕ、Ｇｌｙ７５Ａｌａの置換、及び、Ｇｌｙ７６欠失を有する修飾ユビキチンタンパク質骨格のＤＮＡ配列（配列番号１）に基づき調製された。第２のライブラリは、Ｐｈｅ４５Ｔｒｐの置換を有する修飾ユビキチンタンパク質骨格のＤＮＡ配列（配列番号１５）に基づき調製された。
【０１５２】
第１工程において、実施例２と同様に、８コドンに突然変異生成されたライブラリを表すユビキチンバリエーションの合成遺伝子を、配列番号１又は１５に基づき、ＰＣＲを用いて調製した。これは、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して５０μＬの容量で行った。この目的のため、５μＬの提供される１０ｘＰｆｕバッファー及び４μＬのｄＮＴＰミックスを使用し、Ｈ2Ｏで満たした。さらに、サンプルには、望ましい塩基対置換を導入するため、２．５μＬの側面プライマー（配列番号１に基づくライブラリに対しては配列番号１６及び１７、配列番号１５に基づくライブラリに対しては配列番号１８及び１９；１０μＭ）を含ませた。鋳型として、配列番号１又は１５の非突然変異型合成ユビキチンを有するプラスミドＤＮＡ１．０ｎｇを使用した。２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを添加した後、９４℃／１分、６５℃／１分及び７２℃／１．５分のサイクルを２５サイクル、インキュベーションした。最終インキュベーションは、７２℃で５分行った。望ましいＰＣＲ産物は、調製アガロースゲル電気泳動及びＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。
【０１５３】
バクテリオファージＭ１３のエンベロープタンパク質ＩＩＩの一部を含み、インビトロ翻訳の過程で新生タンパク質をリボソームのチャネルから押し出しユビキチンバリエーションの最適な提示を可能とするスペーサは、２つの連続するＰＣＲ反応において合成された。これは、第１に、５μＬの提供された１０ｘＰｆｕバッファー、４μＬのｄＮＴＰミックス及び適量のＨ2Ｏを使用した総容積５０μＬで行った。さらに、前記サンプルには、２．５ｍｌの各側面プライマー（配列番号２０、２１；１０μＭ）並びに１．０ｎｇのバクテリオファージＭ１３ＤＮＡを含ませた。２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを添加した後、９４℃／１分、６５℃／１分及び７２℃／１．５分のサイクルを２５サイクル、インキュベーションした。最終インキュベーションは、７２℃で５分行った。望ましいＰＣＲ産物は、調製アガロースゲル電気泳動及びＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、第２のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。これは、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して５０μＬの容量で行った。この目的のため、５μＬの提供される１０ｘＰｆｕバッファー及び４μＬのｄＮＴＰミックスを使用し、Ｈ2Ｏで満たした。さらに、サンプルには、２．５μＬの側面プライマー（配列番号２２、２１；１０μＭ）を含ませた。鋳型として、先のＰＣＲ反応に由来するＤＮＡ１．０ｎｇを使用した。２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを添加した後、９４℃／１分、５５℃／１分及び７２℃／１．５分のサイクルを２５サイクル、インキュベーションした。最終インキュベーションは、７２℃で５分行った。望ましいＰＣＲ産物は、調製アガロースゲル電気泳動及びＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。
【０１５４】
以下の工程において、８コドンに突然変異導入されたライブラリを表すユビキチンバリエーションの合成遺伝子を、リンキングＰＣＲ反応を用いて調製したスペーサＤＮＡに融合させた。これは、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して５０μＬの容量で行った。この目的のため、５μＬの供給される１０ｘＰｆｕバッファー及び４μＬのｄＮＴＰミックスを使用し、Ｈ2Ｏで満たした。さらに、サンプルには、２．５μＬの側面プライマー（配列番号２３、２１；１０μＭ）を含ませた。鋳型として、５００ｎｇのライブラリＤＮＡ及び先のＰＣＲ反応に由来する５００ｎｇのスペーサＤＮＡを使用した。２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを添加した後、９４℃／１分、５５℃／１分及び７２℃／１．５分のサイクルを２５サイクル、インキュベーションした。最終インキュベーションは、７２℃で５分行った。望ましいＰＣＲ産物は、調製アガロースゲル電気泳動及びＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。
【０１５５】
最終工程において、インビトロ転写／翻訳反応のための適切な制御配列（Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部位）が、さらなるＰＣＲ反応により導入され、線状発現コンストラクトが完成した。反応は、５００μＬのサンプル容量で行われ、先のＰＣＲ反応で得られた産物の約５００ｎｇを採用し、Ｔａｑポリメラーゼを使用した。反応サンプルは、１０倍容量に適合するようにピペットで取り、実施例２に記載のとおり、１０ｘＴａｑバッファー、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰミックス、及び、側面プライマー（配列番号２４、２１；１０μＭ）を含ませた。Ｈ2Ｏで満たした後、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼを添加し、ＰＣＲプログラムを開始した。９４℃／１分、６５℃／１分及び７２℃／１．５分のサイクルを２５サイクル、インキュベーションした。最終インキュベーションは、７２℃で５分行った。望ましいＰＣＲ産物は、調製アガロースゲル電気泳動及びＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、インビトロ転写／翻訳反応に直接使用できた。
【０１５６】
インビトロ転写／翻訳反応のため、ＲＴＳ１００大腸菌キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３１８６１４８）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した。この目的のため、２４．０μＬの大腸菌溶解物、２０．０μＬの反応混合物、２４．０μＬのアミノ酸ミックス（Ｍｅｔ以外）、２．０μＬのメチオニン、１０．０μＬの反応バッファー（１０ｘ）、２．０μＬのＭｇＡｃ（５００ｍＭ）、２．０ｍＬの抗ｓｓｒＡ  ＤＮＡ（２００μＭ）、及び、２０．０μＬの各ＤＮＡライブラリ（０．５〜１．０μｇ）を注意深くピペットで混合し、３０℃又は３７℃、６０分インキュベーションした。以下の工程は、低温室又は氷上で行った。サンプルを氷上で５分冷却し、反応を４００μＬの３％ＢＳＡを含むＷＢＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＡｃ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を添加して停止させた。このバッファーには、必要に応じて２．５ｍｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）を含ませてもよい。サンプルの不溶部分を５分、１３，０００ｒｐｍ、４℃で沈殿させた。ユビキチンバリエーション、対応するｍＲＮＡ及びリボソームからなる三重複合体は、上清に残ったままであった。
【０１５７】
予め定められた標的物質に結合した表面に提示されたユビキチンバリエーションを有する三重リボソーム複合体の単離用の親和性マトリクスとして、マイクロタイタープレートの２つのウェルを対応する物質でコートした。標的物質として、組換え技術により調製した成長因子ＶＥＧＦを標的物質として使用し、４℃一晩でマイクロタイタープレート上に固定化した。前記マイクロタイタープレート表面上の空いている結合部位は、各ウェルを４００μＬのＷＢＴ中３％ＢＳＡを用いて室温で９０分インキュベーションしてブロックした。ブロッキング溶液を除去した後、２５０μＬのインビトロ転写／翻訳反応から得た三重リボソーム複合体を含む溶液をウェルごとに添加し、４℃、６０分、５０ｒｐｍでインキュベーションした。次に、非結合の複合体を、例えば、ＷＢＴを用いた５回の洗浄（ウェルごと３００μＬ、３分、４℃、５０ｒｐｍ）及び激しいタッピングで除去した。前記親和性マトリクスに結合した複合体を、最終的に、ウェルにつき１００ｍＬのＥＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ；なお、このバッファーは、必要に応じて５０μｇ／ｍＬの酵母由来ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を含んでもよい）を加えて４℃、５分、５０ｒｐｍのインキュベーションをして、ｍＲＮＡ、タンパク質及びリボソームサブユニットに分離した。
【０１５８】
得られた懸濁液からのＲＮＡの単離は、室温で可能な限り迅速に、ＱｉａｇｅｎのＲＮＡｅａｓｙキット（Ｃａｔ．Ｎｒ．７４１０４）を使用し、製造業者の取扱説明書に従って行った。この場合、ＲＮＡの溶出は、最終工程において、３０μＬのＲＮａｓｅフリーＨ2Ｏを用いて行った。このように得られたＲＮＡ溶液に含まれるであろう線状発現コンストラクトＤＮＡの分解のため、ＤＮａｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。この目的のため、３μＬのＤＮａｓｅバッファー（１０ｘ）及び３μＬのＤＮａｓｅＩ（１Ｕ／μＬ）を添加し、室温で１５分インキュベーションした。その後、３μＬの２５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加し、６５℃、１０分インキュベーションすることで、ＤＮａｓｅを失活させた。このようにして得られたＲＮＡを、逆転写反応により補完した。この目的のため、まず、８．５μＬのＲＮＡを、０．５μＬのオリゴデオキシヌクレオチドＴ７ｔｅ（配列番号２１；１０μＭ）及び４．０μＬのｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）と混合し、６５℃、５分インキュベーションし、その後、１分氷上に置いた。次に、４．０μＬのＲＴバッファー（５ｘ）、１．０μＬのＤＴＴ（０．１Ｍ）、１．０μＬのＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および１．０μＬのＳＳ逆転写酵素ＩＩＩ（２００Ｕ／μＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、さらなる成分として添加し、５５℃、６０分インキュベーションした。
【０１５９】
逆転写反応から得た反応サンプルを、質が向上したユビキチンバリエーションの遺伝情報の新しい再増幅用、及び、新しい選択サイクルの制御配列の再導入用のＰＣＲに直接使用した。この目的のため、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、総容量５０μＬで２連続のＰＣＲ反応を行った。この目的のため、５μＬの供給される１０ｘバッファー（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む）及び４μＬのｄＮＴＰミックスを使用し、Ｈ2Ｏで満たした。さらに、前記サンプルには、各２．５μＬの側面プライマー（配列番号２３、２１；１０μＭ）及び２．５μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含めた。鋳型として、２．５又は５．０μＬの先のＲＴ反応物を使用した。０．７５μＬのポリメラーゼ（３．５Ｕ／μＬ）を加えた後、９４℃／１５秒、５０℃／３０秒及び７２℃／１．０分のサイクルを２５サイクル、インキュベーションした。最終インキュベーションは、７２℃で７分行った。望ましいＰＣＲ産物は、調製アガロースゲル電気泳動及びＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、二次ＰＣＲ反応に直接使用できた。次に、５μＬ供給される１０ｘバッファー（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む）及び４μＬのｄＮＴＰミックスを使用し、Ｈ2Ｏで満たした。さらに、前記バッチには、各２．５μＬの側面プライマー（配列番号２４、２１；１０μＭ）を含めた。鋳型として、先のＰＣＲ反応物から得た総ＤＮＡを使用した。０．７５μＬのポリメラーゼ（３．５Ｕ／μＬ）を加えた後、９４℃／１５秒、５０℃／３０秒及び７２℃１．０分のサイクルを２５サイクル、インキュベーションした。最終インキュベーションは、７２℃で７分行った。望ましいＰＣＲ産物は、調製アガロースゲル電気泳動及びＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、インビトロ転写／翻訳の新しい選択サイクルに直接使用できた。
【０１６０】
また、各遺伝子は、発現ベクターｐＥＴ２０Ｂ（−）にクローニングした（上述参照）。これにより、そのＤＮＡ配列について得られたユビキチンバリエーションの解析、大腸菌における組換え技術による調製、及び、固定化金属キレートアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によるカルボキシ末端融合６ヒスチジンペプチド（下記参照）を使用したワンステップ精製が可能となる。このようにして得られ、さらに分析されたユビキチンバリエーションのアミノ酸置換を、例示的に表２にリスト化する。
【０１６１】
（表２）異なる標的物質に対するリボソームディスプレイ選択後のユビキチンを基礎とした修飾タンパク質における新規に生成された結合部位領域のアミノ酸置換
【０１６２】
【表２】
2008500953.tif 000003
1ＳＰＵ：結合ポケットに置換がないユビキチンタンパク質骨格
【実施例６】
【０１６３】
ユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の調製と精製
ファージミドから選択され、ＥＬＩＳＡにおいて比較的強い結合シグナルを示し、機能的なＤＮＡ配列を有するユビキチンバリエーションのタンパク質化学的特性の特徴付けを、各遺伝子を発現ベクターｐＥＴ２０Ｂ（−）にクローングした後に行った（上述参照）。これにより、大腸菌ＢＬ２１／ｐＵＢＳを用いた組換え技術による各バリエーションの調製、及び、固定化金属キレートアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によるカルボキシ末端融合６ヒスチジンペプチドを使用したワンステップ精製が可能となる。
【０１６４】
新規な結合特徴を有するユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の組換え技術による調製のため、５０ｍＬの２ｘＹＴ／ａｍｐ／ｋａｎ培地へ単一コロニーを植菌し、３７℃、１６時間、２２０ｒｐｍで撹拌した。この前培養を用いて、１．５Ｌの２ｘＹＴ／ａｍｐ／ｋａｎ培地へ１：５０の比率で植菌し、細胞密度ＯＤ600＝０．５となるまで、３７℃、２２０ｒｐｍでインキュベーションした。１ｍＭ／Ｌのα‐Ｄ‐イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により外来遺伝子の発現を誘導した後、撹拌をさらに３７℃、２２０ｒｐｍで３時間続けた。その後、細胞を遠心分離により沈殿させ（３０分、５，０００ｇ、４℃）、４０ｍＬのＮＰＩ−２０（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール）に再懸濁した。２００μｇ／ｍＬのリゾチーム及び５００Ｕのベンゾナーゼを用いて、室温３０分のインキュベーション、及び、１５秒ｘ５回の超音波パルスにより、細胞を破壊した。細胞の残滓を、遠心分離により沈殿させ（３０分、１５，０００ｇ、４℃）、総可溶性細胞タンパク質を含む上清を、直接、後に続くＩＭＡＣに使用できた。
【０１６５】
クロマトグラフィーは、ＡＫＴＡ（商標）エクスプローラＦＰＬＣユニット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で、５ｍＬＨｉＴｒａｐキレートＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用し、室温、流速５ｍＬ／分で行った。まず、カラムを５カラム容量のＮＰＩ‐２０で平衡化し、そこに、総細胞タンパク質を通過させた。非結合タンパク質を、３０カラム容量のＮＰＩ‐２０を用いてリンスして洗い出した。溶出は、合計２０カラム容量のイミダゾール２０ｎＭ〜２５０ｍＭ直線勾配により行った。溶出物は、２．５ｍＬのフラクションで回収した。精製ユビキチンバリエーションを含むフラクションを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析してまとめた。組換えユビキチンバリエーションの収率は、培養容量に対して、１０〜３０ｍｇ／Ｌであった。
【実施例７】
【０１６６】
新規結合特性を有するユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の結合特性の特徴付け
各ケースで選択され、実施例６に記載のように精製されたユビキチンバリエーションのｒｅｃＧＬＰ１‐Ｒ、ＦｃＩｇＭ及びＨＣへの結合を、Ｎｉ／ＮＴＡペルオキシダーゼ結合物（Ｑｉａｇｅｎ）又はラビット由来ユビキチン抗血清（Ｓｉｇｍａ）を用いたＥＬＩＳＡにより検出した。この目的のため、マイクロタイタープレートのウェルを各抗原及び非特異的結合の検出のためのＢＳＡなどで４℃一晩満たし、残りの結合部分を飽和させるため、ＰＢＳＴ０．５中３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を用いて２時間ブロックした。前記プレートを、ＰＢＳＴ０．１を用いて３回リンスしタップアウトした。その後、ＰＢＳＴ０．１中の連続濃度（無希釈から１：１６希釈までの範囲）の修飾精製タンパク質溶液１００μＬを、プレートのウェルにピペットで取った。２時間のインキュベーションの次に、ＰＢＳＴ０．１を用いて３回リンスした。結合した修飾タンパク質の検出のため、Ｎｉ／ＮＴＡペルオキシダーゼ結合物を１：５００の比率で希釈し、又は、ユビキチン抗血清をＰＢＳＴ０．１中で１：１０の比率で希釈し、それぞれの１００μＬをウェルに加えた。室温、１時間のインキュベーションの次に、直接、Ｎｉ／ＮＴＡペルオキシダーゼ複合体の検出（下記参照）、又は、ラビット抗体ペルオキシダーゼ複合体（ＰＢＳＴ０．１中１：２，５００）とインキュベーションを室温、１時間行った。検出のため、ウェルをＰＢＳＴ０．１で３回リンスし、次に、ＰＢＳで３回リンスした。最後に、１００μＬのＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅキットをピペットでとり、１５分後に、１００ｍＬの２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を添加して呈色反応を止めた。吸光度は、Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｒｅｍｏｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を用いて４５０ｎｍで測定した。得られた吸収強度の値は、“シグマプロット”コンピュータプログラムにより評価した。この目的のため、各ケースで測定された吸光度を採用した対応するタンパク質濃度に対してプロットし、得られたカーブを下記式（１）を使用した非線形回帰により適合させた。
【０１６７】
【数１】
2008500953.tif 000004
【０１６８】
固定化抗原と修飾タンパク質との間の結合／解離平衡を前提として、
ｘ＝採用した修飾タンパク質濃度、
ｙ＝抗原／修飾タンパク質複合体濃度（リポーター酵素の酵素活性により間接的に測定したもの）、
ａ＝固定化した抗原の総濃度、
ｂ＝解離定数（ＫD）である。
【０１６９】
実施例３及び４においてｒｅｃＧＬＰ１‐Ｒに対するファージディスプレイを用いた親和性向上で得られたユビキチンバリエーションＳＰＵ‐１‐Ｄ１０に対するこの種類のＥＬＩＳＡ実験で得られた結合曲線を、例示的に図５に示す。さらに、図６に、実施例５においてＶＥＧＦに対するリボソームディスプレイを用いた親和性向上で得られたユビキチンバリエーションＳＰＷ‐１１‐Ａ１の結合曲線を示す。選択された新規結合特性を有するユビキチンを基礎とした修飾タンパク質それぞれの結合データを表３にまとめる。
【０１７０】
ユビキチンバリエーションの予め定められた抗原への結合の定量解析のため、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００システム（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定のため、検体を固定化できるキャリア（センサーチップ）を装置の中に置き、そこに一体化されているマイクロフローシステム（一体化μ流体カートリッジ、ＩＦＣ）に結合した。これにより、前記チップ表面を横切るバッファー容器からの連続的な液体の流れ、及び、溶液検体キャリアへの結合の溶液中の準検出が可能となった。
【０１７１】
まず、標的分子の測定のため、例えば、ＶＥＧＦを、製造業者の取扱説明書に従い、第１級アミン基を介したＮＨＳ／ＥＤＣ結合によりセンサーチップＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ）のカルボキシメチルデキストラン表面に結合させた。測定は、２５℃、３５μＬ／分の連続流バッファー中で行った。ランニングバッファー及び使用したタンパク質の溶媒として、０．００５％のＰ−２０界面活性剤（Ｂｉａｃｏｒｅ）が補完されたＰＢＳ（ろ過滅菌及び脱気されたもの）を使用した。異なる濃度の固定化されたＶＥＧＦと、サンプルループを通って注入されたユビキチンバリエーションとの相互作用は、発生したＳＰＲシグナルにより検出できた。シグナルを、時間に依存する、いわゆる、共鳴単位（ＲＵ）として定量化し、対応する結合曲線を作成した。得られた結合曲線を、ＢＩＡ計算ソフトウエア（バージョン３．１；Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して計算し、解離定数（ＫD）の値を決定した。実施例５においてＶＥＧＦに対するリボソームディスプレイを用いた親和性向上で得られたユビキチンバリエーションＳＰＷ‐１１‐５８のそのようなＢＩＡＣＯＲＥ実験により得られた結合曲線を、例示的に図７に示す。選択された新規結合特性を有するユビキチンを基礎とした修飾タンパク質それぞれの結合データを表３にまとめる。
【０１７２】
（表３）ユビキチンを基礎とした修飾タンパク質と異なる標的物質との複合体の解離定数
【０１７３】
【表３】
2008500953.tif 000005
【０１７４】
さらに、修飾タンパク質の結合特異性について評価した。この目的のため、単一の適当な濃度の修飾タンパク質を使用して上述のようにＥＬＩＳＡ実験を行った。この目的のため、マイクロタイタープレートのウェルを標的物質及び構造的に似た物質で満たした。実施例３及び４においてＨＣに対する親和性向上で得られたユビキチンバリエーションＳＰＵ‐３‐Ｈ１３に対するＥＬＩＳＡ実験で得られた結合曲線を、例示的に図８に示す。
【実施例８】
【０１７５】
部位特異的二次的突然変異生成によるユビキチンを基礎とした結合タンパク質の結合特性の改善
ＦｃＩｇＭに対して新規な結合特性を示すユビキチンバリエーションＳＰＵ‐２‐Ａ７に基づき、親和性成熟についての一般的に適用可能な戦略を確立した。これは、まず、ＤＮＡレベルの結合部位内で選択した位置の新しくランダムに生成された新規置換、及び、後に続く、９６個のバリエーションの並行した発現、精製、結合分析を含む。この“９６フォーマット”を使用して、前記戦略を実験室のロボットに移行でき、そして、高い生産性で、バリエーションの解析ができる。
【０１７６】
この目的のため、２つの位置のコドン（第６２、６３番目、及び、第６４、６５番目）に、２つのサンプルで並行してＰＣＲを用いてランダムに突然変異させた。対応する反応は、総容積５０μＬで行い、約１．０ｎｇのｐＥＴ２０Ｂ（−）に挿入されたＳＰＵ‐２‐Ａ７の遺伝子を使用し、Ｔａｑポリメラーゼを採用した。反応サンプルは、実施例２に記載のとおり、１０ｘＴａｑバッファー、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰミックス、及び、側面プライマー（第６２、６３番目の突然変異には配列番号１２及び２５、第６４、６５番目の突然変異には配列番号１２及び２６；１０μＭ）をピペットで取った。Ｈ2Ｏで満たした後、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼを添加し、ＰＣＲプログラムを開始した。９４℃／１分、６５℃／１分及び７２℃／１．５分のサイクルを２５サイクル、インキュベーションした。最終インキュベーションは、７２℃で５分行った。望ましいＰＣＲ産物は、調製アガロースゲル電気泳動及びＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。第６２／６３番目又は第６４／６５番目の位置に突然変異導入されたＳＰＵ‐２‐Ａ７のライブラリを表す得られたＤＮＡ断片を、それぞれ、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで制限酵素切断し、調製アガロースゲル電気泳動により単離した。修飾ＳＰＵ‐２‐Ａ７の遺伝子ライブラリを、発現ベクターｐＥＴ２０Ｂ（−）（Ｎｏｖａｇｅｎ、実施例１参照）に挿入し、対応するタンパク質の産生に使用した。
【０１７７】
エレクトロコンピテント大腸菌、例えば、Ｎｏｖａ−Ｂｌｕｅ又はＢＬ−２１細胞の形質転換の後、発現ベクターの形で得られた前記ライブラリのクローンの遺伝子情報を含む単一コロニーを得た。９６個のこれらの単一コロニーを使用して、３００μＬの２ｘＹＴ／ａｍｐ／ｋａｎにそれぞれ植菌し、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩撹拌した。この培養物の１００μＬを、９６ｘ４ｍＬの２ｘＹＴａｍｐ／ｋａｎにそれぞれ植菌し、３７℃、２２０ｒｐｍで、細胞密度ＯＤ600＝０．５となるまで撹拌した。この目的のため、この場合に４つの２４ウェル培養プレート（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。１ｍＭ／Ｌのα‐Ｄ‐イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により外来遺伝子の発現を誘導した後、撹拌をさらに３７℃、１８０ｒｐｍで３時間、又は、３０℃、１８０ｒｐｍで一晩続けた。その後、細胞を遠心分離により沈殿させ（３０分、４，０００ｇ、４℃）、上清を除去した。細胞破壊は、物理的溶解（凍結融解ショック）又は化学的溶解（界面活性剤）及びリゾチーム（２００μｇ／ｍＬ）及びベンゾナーゼ（最終容量で１０Ｕ／ｍＬ）の添加により行った。得られた総細胞タンパク質からのＳＰＵ‐２‐Ａ７のバリエーションの精製は、ＱｉａｇｅｎのＢｉｏＲｏｂｏｔ９６００キット及び手動の真空ステーション（ＱＩＡｖａｃ９６、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。得られたタンパク質溶液は、ＦｃＩｇＭへの結合について、実施例７の実験の準備的実験相当する定性的なＥＬＩＳＡ実験で解析した。
【０１７８】
遺伝子の機能性の検証又は得られた置換の解析のため、前記ＥＬＩＳＡにおいて比較的強い結合シグナルを示すＳＰＵ‐２‐Ａ７のバリエーションについて、ＤＮＡ塩基配列決定をした。期待できる候補を、１．５Ｌスケールで組換え技術により調製し、カルボキシ末端に融合させた６ヒスチジンペプチドを使用した固定化金属キレートアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて精製した。親和性の定量化のため、実施例７に記載のように、濃度非依存ＥＬＩＳＡを、成熟の基礎としたユビキチンバリエーションであるＳＰＵ‐２‐Ａ７と比較して行った。ユビキチンバリエーションＳＰＵ‐２‐Ａ７及びＥＬＩＳＡ実験から得られたＳＰＵ‐２‐Ａ７（６２／６３）の結合曲線を、例示的に図９に示す。この親和性成熟バリエーションは、ＫD＝１．０μＭを示し、ＳＰＵ‐２‐Ａ７と比較して、１０倍の結合強度の改善を示した。
【実施例９】
【０１７９】
２つの同一のユビキチンを基礎としたタンパク質のビス‐マレイミド試薬によるカルボキシ末端の単一システイン残基を介した結合
２つの同一のユビキチンバリエーションの結合を、この目的のために特異的に導入したシステイン残基を介して、ビス‐マレイミドヘキサン（ＢＭＨ、Ｐｉｒｃｅ）を用いて行った。まず、プロリンが後に続くシステインの適当なコドンをこの目的のために、３'末端の読み枠に、即ち、６ヒスチジンペプチドの後のタンパク質のカルボキシ末端に導入した。このように、最後のプロリン残基は、結果として得られるタンパク質を産生及び精製中のタンパク質分解から保護する。対応する塩基対のｐＥＴ２０Ｂ（−）への挿入は、クイックチェンジ（商標）部位特異的突然変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて製造業者の取扱説明書に従って、配列番号２７及び２８のオリゴデオキシヌクレオチド及び鋳型としてユビキチンバリエーションの遺伝子（配列番号１５）を使用して行った。結果として得られたクローンをＤＮＡシーケンシングにより解析し、望ましい挿入部分を持つ発現プラスミドを有するコロニーを実施例６における組換え体の産生と精製に使用した。
【０１８０】
精製されたタンパク質を、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５ｍＭ  β‐メルカプトエタノールを含むＰＢＳに対して透析を行い、後に続くＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを反応バッファーとして使用した結合反応に約１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用した。この目的のため、最初に、タンパク質溶液を１００ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）に調整し、室温で１時間インキュベーションすることで、フリーのシステイン残基を還元した。その後、ＰＤ１０セファデックスＧ−２５Ｍカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて還元剤をタンパク質から分離し、過剰な２倍のモル濃度の結合試薬（ストック溶液：ＤＭＳＯ中、１００ｍＭ  ＢＭＨ）を加え、室温で１時間インキュベーションした。過剰なＢＭＨはＰＤ１０カラムを使用して分離した。存在する可能性がある単独で反応した結合試薬を分離するため、等モル量の新しく還元したタンパク質を再度添加し、結合サンプルを得た。この二次結合工程は、室温で２時間行った。
【０１８１】
この方法で得られた結合サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０）で解析し、結合度を計算した。上述の方法では、約４０％であった。
【０１８２】
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【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１は、野生型ユビキチン（ＰＤＢコード：１ｕｂｉ）の表面上の新規に生成された人工結合部位を示す。
【図２】図２は、第２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６番目の位置をランダムに置換した１０4個のバリエーションのタンパク質安定性について、ユビキチン（ＷＴ）及び対照エピトープと比較したコンピューター解析の結果を示す。
【図３】図３は、新規結合特性を有するユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の選択に使用するファスミドベクターｐＭＵＢＩ‐１を説明する。
【図４】図４は、ユビキチンバリエーションのライブラリの作成の方法を説明する。
【図５】図５は、ファージディスプレイにより選択されたユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の対応するタンパク質への結合を検出するＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【図６】図６は、リボソームディスプレイにより選択されたユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の対応するタンパク質への結合を検出するＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【図７】図７は、リボソームディスプレイにより選択されたユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の対応するタンパク質への結合を検出するＢＩＡＣＯＲＥ実験の結果を示す。
【図８】図８は、ファージディスプレイにより選択されたユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の対応するハプテンへの結合を検出するＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【図９】図９は、ファージディスプレイにより選択され、二次的な突然変異生成により得られたユビキチンを基礎としたＩｇＭ  Ｆｃへの結合タンパク質であるバリエーションＳＰＵ‐３‐Ａ７のその抗原への改善された結合を検出するＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【図１０】図１０は、ビス‐マレイミドヘキサンにより、単一カルボキシ末端システイン残基を介して２つのユビキチンを基礎としたタンパク質の部位特異的共有結合の実験の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１８４】
配列番号１：修飾ユビキチンタンパク質骨格のＤＮＡ配列
配列番号２〜７：鋳型
配列番号８〜１４：プライマー：
配列番号１５：ライブラリの基礎としての修飾ユビキチン配列
配列番号１６〜２６：プライマー
配列番号２７、２８：オリゴデオキシヌクレオチド
配列番号２９〜３４：ユビキチン変異体ライブラリの構築
【図１】
2008500953.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2008500953000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月29日(2005.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチン様折り畳みモチーフを有する“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域であってβシート領域の少なくとも１つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む領域における前記タンパク質表面上の隣接する領域を形成するアミノ酸の修飾に起因して、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが維持され、βシート領域の表面露出アミノ酸の少なくとも４アミノ酸が修飾されているタンパク質。
【請求項２】
前記修飾のために選択されるタンパク質が、ヒトユビキチンと少なくとも３０％のアミノ酸配列の同一性及びユビキチン様折り畳みモチーフを有し、かつ／又は、“ユビキチン関連タンパク質”のタンパク質ファミリーに属する請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記修飾のために選択されるタンパク質が、ユビキチン様折り畳みモチーフを有し、好ましくは、ＳＵＭＯ‐１、ＦＡＵ、ＮＥＤＤ‐８、ＵＢＬ‐１、Ｒｕｂ１、ＡＰＧ８、ＩＳＧ１５、ＵＲＭ１、ＨＵＢ１、ＧＤＸ、ｅｌｏｎｇｉｎＢ、ＰＬＩＣ２（Ｎ末ドメイン）、ヒトｐａｒｋｉｎ（Ｎ末ドメイン）からなる群から選択される請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が、ヒトユビキチン又はその他の哺乳類のユビキチンである前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記修飾が、前記タンパク質の表面の５から１０アミノ酸、好ましくは６から８アミノ酸の隣接する領域を含み、好ましくはその２から４アミノ酸が表面露出βシートにある前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項６】
第１及び第４βシート鎖の表面露出アミノ酸が修飾され、必要に応じて、さらに、哺乳類ユビキチンの非βシート領域の第６２から６５番目の領域が修飾された前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記修飾が、置換、挿入、欠失、化学修飾又はこれらの組み合わせであり、一次配列で直接隣接した又は直接隣接していないアミノ酸を少なくとも部分的に１以上、好ましくは、置換を含み、好ましくは、一次配列において互いに隣接していない修飾されたアミノ酸が、二次構造において、隣接した結合パートナーに対する結合領域を形成する前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項８】
修飾、好ましくは、置換される一次配列において互いに直接隣接したアミノ酸の数が、２から８の直接隣接したアミノ酸であり、より好ましくは、３から７、又は、４から６、又は、２から４の直接隣接したアミノ酸である前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項９】
一次配列において互いに直接隣接した修飾されたアミノ酸の部分が、βシート鎖の開始又は終結部分であって、前記部分が、２以上のアミノ酸長、好ましくは、２又は３のアミノ酸長である前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１０】
一次配列において互いに直接隣接する５以上のアミノ酸が修飾、好ましくは、置換され、そのうちの１、２以上、好ましくは、２又は３のアミノ酸が、βシート鎖領域の開始又は終結部分を形成する直接隣接したアミノ酸を形成する前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１１】
請求項１の野生型タンパク質において、ユビキチンの天然結合パートナーへの結合に関与する領域に属さない位置のアミノ酸が修飾されている前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記タンパク質、好ましくは、ユビキチンのβ鎖に存在する少なくとも２５％のアミノ酸が修飾されている前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１３】
さらに、前記タンパク質のループ領域のアミノ酸が修飾されている前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１４】
ヒトユビキチン又はそれに相同なタンパク質であって、少なくとも８個のユビキチンの表面露出アミノ酸が修飾、好ましくは、置換されており、前記修飾アミノ酸が結合パートナーに対する結合親和性を有する領域を含む前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記８個の表面露出アミノ酸のうち少なくとも６個が、前記タンパク質のβシート領域に指定される領域内に存在する請求項１４記載のタンパク質。
【請求項１６】
修飾、好ましくは、置換された少なくとも５個のアミノ酸が、一次配列において互いに直接隣接している請求項１４又は１５に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記タンパク質のアミノ末端βシート鎖及び／又はカルボキシ末端βシート鎖に位置するアミノ酸が修飾されている前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１８】
さらに、カルボキシ末端βシート鎖に続くループに位置するアミノ酸が修飾されている前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記修飾タンパク質が、第２、４、６、６２、６３、６４、６５及び６６番目の位置で、置換、欠失、挿入、及び／又は、化学修飾、好ましくは、置換されたヒトユビキチンである前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２０】
修飾のために選択されるタンパク質が、既に挿入、欠失、置換及び／又は化学修飾され、前記タンパク質の生物学的及び／又はタンパク質化学的機能が、廃棄され又は新規に生成された前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２１】
修飾の後に、合計して少なくとも１０、好ましくは、少なくとも１５のユビキチンのアミノ酸が置換された請求項２０記載のタンパク質。
【請求項２２】
置換、挿入及び／又は欠失による改変のために選択されるタンパク質が、第４４、４８、５４、７０、７２及び７５番目の位置の１以上においてアミノ酸が置換され、第７６番目のアミノ酸が欠失されたヒトユビキチンであって、本質的に天然の結合パートナーとの相互作用を示さないユビキチンである請求項２０又は２１記載のタンパク質。
【請求項２３】
前記タンパク質が、第４５番目の位置においてフェニルアラニンからトリプトファンへの置換を含むヒトユビキチンである前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２４】
ランダム突然変異生成により選択されたアミノ酸のランダム置換が行われた前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２５】
前記結合パートナーが、抗原又はハプテンである前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２６】
予め定められた結合パートナーに対するＫDで表される結合親和性が、１０-6Ｍから１０-12Ｍ、さらにより好ましくは、１０-8Ｍから１０-12Ｍ、又は、１０-9Ｍから１０-12Ｍである前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２７】
“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、１以上のアミノ酸の修飾に起因して、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが保持されているタンパク質であり、下記方法により得ることができるタンパク質。
ａ）修飾するタンパク質を選択し；
ｂ）結合パートナーを決定し；
ｃ）βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域におけるアミノ酸を選択し；
ｄ）前記選択アミノ酸を、好ましくは、置換、挿入、欠失、及び／又は、化学修飾により修飾し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフを維持し；
ｅ）前記修飾タンパク質を、工程ｂ）で決定した結合パートナーと接触させ、
ｆ）工程ｂ）で予め定めた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出する。
【請求項２８】
前記タンパク質が、部位特異的な共有結合により、同じ又は異なる特異性のタンパク質に結合されており、二価又は二重特異的な結合特性を示す前請求項の１以上に記載のタンパク質。
【請求項２９】
前請求項の１以上に記載のタンパク質の製造方法であって、前記タンパク質が、“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域であってβシート領域の少なくとも１つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む領域における１以上のアミノ酸の修飾に起因して、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが保持されているタンパク質であって、下記工程を含む製造方法。
ａ）修飾するタンパク質を選択する工程。
ｂ）結合パートナーを決定する工程。
ｃ）βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の表面露出領域におけるアミノ酸を選択する工程。
ｄ）前記選択アミノ酸を、好ましくは、置換、挿入、欠失、及び／又は、化学修飾により修飾し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフを維持する工程。
ｅ）前記修飾タンパク質を、工程ｂ）で決定した結合パートナーと接触させる工程。
ｆ）工程ｂ）で予め定めた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出する工程。
【請求項３０】
工程ｃ）からｄ）が、前記修飾タンパク質の化学合成により行われる請求項２９記載の製造方法。
【請求項３１】
工程ｄ）における修飾が、対応する修飾タンパク質に属するＤＮＡを改変する遺伝子工学により行われ、前記タンパク質の発現が、原核若しくは真核生物宿主又はインビトロで行われる請求項３０記載の製造方法。
【請求項３２】
工程ｄ）において、遺伝子ライブラリが確立される請求項３１記載の製造方法。
【請求項３３】
工程ｄ）において、ランダム突然変異生成により選択されたアミノ酸のランダム置換が行われる前請求項の１以上に記載の製造方法。
【請求項３４】
工程ｅ）において、予め定められた結合パートナーとの接触が、適切な選択方法、好ましくは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＣＩＳディスプレイ、又は、細胞表面ディスプレイ法、酵母表面ディスプレイ、バクテリア表面ディスプレイ、特に好ましくは、ファージディスプレイ法により行われる前請求項の１以上に記載の製造方法。
【請求項３５】
工程ｆ）において、予め定められた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質の検出が、ＥＬＩＳＡ、プラズモン表面共鳴分光法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量計、又は、分析的超遠心分離法の１以上の方法により行われる前請求項の１以上に記載の製造方法。
【請求項３６】
工程ｆ）の後に、検出された予め定められた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質の単離及び／又は質向上の工程が続く前請求項の１以上に記載の製造方法。
【請求項３７】
前記タンパク質が、それ自体公知の方法により、その結合親和性、その結合特異性、及び／又は、安定性、溶解度、若しくは、収率などのその他のタンパク質特性が成熟される前請求項の１以上に記載の製造方法。
【請求項３８】
前記タンパク質が、部位特異的な共有結合により同じ又は異なる特異性のタンパク質に結合され、それにより、二価又は二重特異的タンパク質が得られる前請求項の１以上に記載の製造方法。
【請求項３９】
前請求項の１以上に記載のタンパク質の使用であって、それ自体公知の方法、例えば、クロマトグラフィー又は吸収技術における、対応する結合パートナーの検出、定量、分離、及び／又は対応する結合パートナーの単離のための使用。
【請求項４０】
前請求項の１以上に記載のタンパク質の使用であって、対応する結合パートナーが直接又は間接的に関与する疾病の診断、予防及び治療のための使用。
【国際調査報告】
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