(57)【要約】  以下の工程：−  マルチウェル基材のウェルのそれぞれと、同一又は異なるタンパク質溶液とを接触させる工程であって、前記ウェルの表面が、前記基材のものと同一であるか、あるいは表面処理及び／又はコーティングされて試験表面を提供している、工程、及び−  前記ウェルのそれぞれにおいて、タンパク質吸着レベルを測定する工程、を含む、1つ以上のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド溶液と、1つ以上の基材表面との相互作用を測定できる、マルチプレックスアッセイ方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
−  少なくとも1つのマルチウェル基材のウェルのそれぞれと、同一又は異なるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド溶液とを接触させる工程であって、前記ウェルの表面が、前記基材のものと同一であるか、あるいは表面処理及び／又はコーティングされて試験表面を提供している、工程、及び
−  前記ウェルのそれぞれにおいて、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド吸着レベルを測定する工程、
を含む、1つ以上のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド溶液と、1つ以上の基材表面との相互作用を測定できる、マルチプレックスアッセイ方法。
【請求項２】
前記ウェル表面が、複数の異なる表面コーティング及び／又は処理を含む、請求項１記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項３】
前記基材が、スライドガラスである、請求項１記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項４】
前記基材が、マイクロタイタープレートである、請求項１記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項５】
前記基材のウェルが、前記基材に適用される疎水性パターニング物質で創出される、請求項１記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項６】
前記基材が、2〜10,000の個別のウェルを含む、請求項５記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項７】
前記基材が、10〜1000の個別のウェルを含む、請求項６記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項８】
前記溶液が、バッファー、塩、安定剤、保存料、酸及び／又は塩基を含む、請求項１記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項９】
前記バッファーが、リン酸塩、クエン酸塩、及び／又は酢酸塩である、請求項８記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１０】
前記安定剤が、ヒトアルブミン又はグリセリンである、請求項８記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１１】
前記保存料が、フェノール、メタクレゾール、又はベンジルアルコールである、請求項８記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１２】
前記酸又は塩基が、クエン酸、水酸化ナトリウム、塩酸、又は酢酸である、請求項８記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１３】
前記タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドが、抗体、酵素、組み換えホルモン、組み換えインターフェロン、組み換え血液凝固カスケード因子、組み換えエリスロポエチン、ポリペプチド又はワクチン抗原である、請求項１記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１４】
前記ウェルそれぞれにおけるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド吸着レベルが、標識抗体で前記ウェルをインキュベートし、その結合量を測定するためにスキャンすることにより測定される、請求項１記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１５】
前記ウェルそれぞれにおけるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド吸着レベルが、酵素結合抗体を用いて調べ、シグナル増幅を測定することにより測定される、請求項１記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１６】
蛍光検出が、表面に結合したタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド量の直接的な指標として用いられる、請求項１記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１７】
以下の工程：
−  マルチウェル基材のウェルのそれぞれと、同一又は異なるワクチン溶液とを接触させる工程であって、前記ウェルの表面が、前記基材のものと同一であるか、あるいは表面処理及び／又はコーティングされて試験表面を提供している、工程、及び
−  前記ウェルのそれぞれにおいて、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド吸着レベルを測定する工程、
を含む、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含む1つ以上のワクチン溶液と、1つ以上の基材表面との相互作用を測定できる、マルチプレックスアッセイ方法。
【請求項１８】
前記ウェル表面が、複数の異なる表面コーティング及び／又は処理を含む、請求項１７記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項１９】
前記基材が、スライドガラスである、請求項１７記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項２０】
前記基材が、マイクロタイタープレートである、請求項１７記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項２１】
前記基材が、2〜10,000の個別のウェルを含む、請求項２０記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項２２】
前記溶液が、バッファー、塩、安定剤、保存料、酸及び／又は塩基を含む、請求項１７記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項２３】
以下の工程：
−  マルチウェル基材のウェルのそれぞれと、同一又は異なるポリヌクレオチド溶液とを接触させる工程であって、前記ウェルの表面が、前記基材のものと同一であるか、あるいは表面処理及び／又はコーティングされて試験表面を提供している、工程、及び
−  前記ウェルのそれぞれにおいて、ポリヌクレオチド吸着レベルを測定する工程、
を含む、1つ以上のポリヌクレオチド溶液と、1つ以上の基材表面との相互作用を測定できる、マルチプレックスアッセイ方法。
【請求項２４】
前記表面に結合したタンパク質が、タンパク質：色素複合体の形態である、請求項１６記載のマルチプレックスアッセイ。
【請求項２５】
以下の工程：
−  マルチウェル基材のウェルのそれぞれと、同一又は異なる生体分子溶液とを接触させる工程であって、前記ウェルの表面が、前記基材のものと同一であるか、あるいは表面処理及び／又はコーティングされて試験表面を提供している、工程、及び
−  前記ウェルのそれぞれにおいて、生体分子吸着レベルを測定する工程、
を含む、1つ以上の生体分子溶液と、1つ以上の基材表面との相互作用を測定できる、マルチプレックスアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
タンパク質は、それらが接触する表面に対して強い親和性を有する。医薬包装及び医療デバイスにおいて、この親和性は、しばしば、表面吸着に起因する、有益なタンパク質の損失をもたらす。表面吸着は、タンパク質の特性、表面の特徴、及びタンパク質溶液中の添加物を含む多くの因子により支配される。医薬包装者は、高い頻度で、容器を詰めすぎ、これが吸着によるタンパク質損失の主な原因となる。タンパク質吸着に耐性を示す表面を提供するために多くの試みがなされている。全てのタンパク質溶液の要求を満たし得る製品は全くなく、タンパク質吸着の量が、例えば、溶液のpH、表面コーティング、並びにタンパク質の特性及び濃度などの非常に多くの因子によって決まることが原因の一つとなって、包装パフォーマンスは非常に予測不可能なものである。これまで、それぞれ新規な医薬溶液が、特定の包装又はデバイスに対して試験され、吸着によるタンパク質損失を測定するために、溶液中に残ったタンパク質量が測定された。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、多種多様な化学的特性を有する、異種クラスの生体分子である。タンパク質と表面との相互作用の強度に関するいくつかの一般的な観察を実施できる。
【０００３】
【表１】
2008516249.tif 000002
【０００４】
現在の医薬包装製品又は医療デバイスの問題は、包括的なタンパク質阻止特性を提供するために必要とされる、それぞれの好ましい特性（positive traits）を有する製品が全くないことである。所望／非所望特性（表II）のこの「混合バッグ（mixed bag）」は、普遍的なタンパク質系医薬包装の適用に対して、製品のパフォーマンスを非常に予測できないものにする。この非予測可能性は、少なくとも1998年に遡る、様々な「タンパク質吸着」又は「タンパク質損失」研究の極めて相反する結果を考えた場合に明白である。この非予測可能性、及びどのようにしてタンパク質吸着／損失を真に防げるかについての知識の欠如により、医薬又は医療デバイス産業用の単一の低損失のタンパク質阻害包装製品又はデバイスを開発するための医薬包装又は医療デバイス産業の不可能性が最終的に明示される。
【０００５】
【表２】
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【非特許文献１】Emanuele Ostuni, Lin Yan, George M. Whitesides−Colloids and Surfaces Biointerfaces 1999, 15, 3−30
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以前の「タンパク質損失」及び「タンパク質吸着」研究の矛盾及び時に混乱させるような結果は、「損失」及び／又は「吸着」をアッセイするために用いられる試験手順及びアッセイの相違により、さらに複雑化されている。以前の試験において、研究期間、タンパク質濃度、試験温度、pH、界面活性剤（detergent）／添加物の使用などを含む試験パラメーターの多様性は、結果の最終的な解釈及び比較を困難又は不可能なものにしている。さらに、大部分の「タンパク質損失」アッセイは、ビシンコニン酸（BCA）技術などの技術を用いて実施されていたが、この技術は、吸着プロセス後のタンパク質濃度の測定のみを可能にするものであって、タンパク質が医薬包装内のどこに優先的に吸着されるのかという洞察を全く提供しないものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のアッセイは、薬剤調合者、医療デバイス開発者、及び医薬包装開発者が、少量の化合物含有溶液（＜＜1 mL）及び少量の潜在的医薬包装又はデバイス物質（表面積＜1 mm2）を用いながら、薬剤化合物の不可逆的吸着を阻害するために、製剤及び物質表面を最適化できるようにする。さらに、このような試験は、図1に示すとおりの、マルチプレックス様式（すなわち、2〜10,000の製剤／ウェル表面組み合わせを、単一のチップ系プラットフォームで評価できる）で達成できる。さらに、このような試験を、実際のフルスケール医薬包装において、さらに詳細な試験と組み合わせて、例えば、同定された表面候補に関して、図4に示すとおり、薬剤化合物のパフォーマンス及び安定性を完全に特徴付けることができ、それにより、医薬包装又は医療デバイス最適化のための全体的解決策を提供できる。
【０００８】
アッセイは、医薬包装者が、様々な潜在的な基材表面コーティング（例えば、シリカ、ポリマーでコーティングされたガラスなど）に対する様々な特定の条件下（例えば、pH、温度など）、様々な特定の添加物（例えば、バッファーなど）を含む溶液中、特定のタンパク質（例えば、組み換え薬剤、サイトカイン、酵素など）の吸着挙動を同時に直接比較できるようにする。マルチプレックスアッセイは、包装者が、最少量のタンパク質吸着及びそれによる製品損失しかもたらさないであろう特定の包装条件（例えば、表面コーティング、pH、添加物など）を同時に標的化できるようにする。
【０００９】
一般に、本発明は、1つ以上のタンパク質溶液と、1つ以上の基材表面との吸着相互作用を同時に測定できる、マルチプレックスアッセイに関する。簡潔には、それぞれのウェルが試験されるべき表面、例えば、基材表面それ自体、あるいは何らかの方法でコーティング又は処理されたものなどを有している、マルチプルウェルに基材を分割する。ついで、マルチプルウェル基材のそれぞれのウェルをタンパク質溶液にさらし、すなわち曝露し、それぞれの前記ウェル中のタンパク質吸着レベルを測定する。（「吸着」という用語は、アッセイされる溶液の構成成分と試験表面との間の相互作用の性質に対して、いずれの制限を加えることも意図されない。相互作用が、アッセイで検出されるのに十分なほど、表面と関連する構成成分を保つのに十分である限り、これは、前記用語の範囲内に含まれる。）
【００１０】
好ましくは、基材はスライドガラス又はマイクロタイタープレートである。それぞれの基材には、例えば疎水性パターニング物質などで創出される2〜10,000超のウェルが含まれてよい。好ましくは、基材には、基材当たり4超のウェルが含まれる。より好ましくは、基材には、基材当たり8超のウェルが含まれる。最も好ましくは、基材には、基材当たり16超のウェルが含まれる。タンパク質溶液には、医薬産業で一般的なものである、バッファー、塩、安定剤、保存料、酸及び／又は塩基などが含まれてよい。典型的には、試験されるべきタンパク質は、抗体、酵素、組み換えエリスロポエチン、組み換えホルモン、一般的なポリペプチド、ペプチド、ワクチンなどである。前記ウェルそれぞれにおけるタンパク質吸着レベルは、例えば、標識抗体でウェルをインキュベートし、結合タンパク質量を測定するためにスキャンすることなどにより測定されてよい。別法として、前記ウェルそれぞれにおけるタンパク質吸着レベルは、例えば、酵素結合抗体を用いて調べ、シグナル増幅を測定することなどにより測定されてよい。従って、様々な条件及び様々な溶液パラメーター下、基材表面に吸着するタンパク質量を容易に測定できる。
【００１１】
タンパク質吸着の影響を受けやすい表面には、医薬包装構成要素（例えば、ガラスバイアル、アンプル、ストッパー、キャップ、即時充填可能な（ready to fill）シリンジガラス及びプラスチック、カートリッジ系のシリンジ、純石英表面のバイアル、プラスチックでコーティングされたガラスバイアル、プラスチック及びガラス貯蔵ボトル、パウチ、ポンプ、スプレー、並びに全てのタイプの医薬容器）及び医療デバイス（例えば、カテーテル、ステント、インプラント、シリンジなど）が含まれる。タンパク質との接触が考えられ、タンパク質吸着の影響を受けやすい候補表面のいずれをも評価できる。
【００１２】
典型的には、アッセイ基材物質はガラス又はプラスチックである。好ましくは、基材物質は、SiO2系のスライドガラスである。最も好ましくは、前記ガラスには、医薬包装適用で用いられる市販の関連ガラス、例えば、65〜85重量％SiO2、3〜20重量％B2O3、0〜20重量％Al2O3、1〜15重量％Na2O、1〜15重量％K2O、0〜10重量％MgO、0〜10重量％CaO、及び0〜10重量％BaOを含むものなどが含まれる。
【００１３】
PTFEポリマー（ポリテトラフルオロエチレン）、フルオロポリマー、又はシリコーンなどの、様々な既知の市販のパターニング組成物を基材に適用し、疎水性境界領域を創出して、それによりウェルを創出できる。境界領域（すなわち、壁）は、反応アッセイを実施できるそれぞれのウェル表面（典型的には、底部）間にバリアを提供する。図6には、本発明のアッセイ及び方法で有用である、多数のウェルパターンを示す。パターンデザイン自体はフレキシブルであり、ヒトの想像力のみに限定され、かつ必要に応じて実験アッセイデザインに適合可能な、楕円形、四角形、長方形、星型などを含む対称性又は非対称性の幾何学的パターン（基材表面にわたって反復又は非反復）を作製するために用いられるグラフィックプログラムの制限のみに限定されるものである。ウェルは、基材上の2つ以上のウェル間の相互作用のための手段を提供するために、相互に連結（interconnect）されていてよく、又はされていなくてよい。ウェルへの基材のパターニングは、連続的というよりもむしろ平行した、マルチプルアッセイの処理を可能にする。発明の名称が「Low−Fluorescent, Chemically Durable Hydrophobic Patterned Substrates for the Attachment of Biomolecules」であるUS 10／778,332号に開示されているものなどのパターン化基材は、アッセイの間、交差汚染の心配をすることなく、試験されるべき様々な関連タンパク質溶液間の物理的分離を確保する。パターニング物質は、当分野で公知の方法により置かれる（deposit）。好ましくは、パターニング物質は、ガラス基材上へスクリーンプリンティングされ、明確な境界及びウェル領域を提供する。
【００１４】
パターン化基材（patterned substrate）のウェルは、一実施態様において、非コーティング及び非処理のままであり得、様々なタンパク質溶液に曝露される、まさに基礎をなす基材組成物を有することが企図される。ウェル領域がさらにコーティング又は処理されていない場合には、そのウェルの基材表面は非処理基材表面であるだろう。別法として、それぞれのウェルを、異なる試験コーティング又は表面処理で、処理又はコーティングできる。それぞれのウェルを同一の基材処理又はコーティング、あるいはマルチプレックス処理及び／又はコーティングで、処理又はコーティングできることも企図される。あるいは、いくつかのウェルを処理し、他のウェルをコーティングしてもよい。言うまでもなく、ウェルコーティング及び／又は処理の多種多様な組み合わせを、単一基材で試験できる。
【００１５】
基材表面には、非コーティング、コーティング、処理、又は非処理のウェル表面領域が含まれ、例えば：
1）ガラス（例えば、シリケート、ボレート、ボロシリケート、ホスフェートなど）；
2）ガラスチューブを医薬包装へと変えるために利用される処理を模倣するために、酸素バーナー（oxy−fuel flame）で熱処理されているガラス；
3）ポリマー材料、例えば、アクリル系、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリアセタール、ポリスチレン、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリイミド、ポリオレフィン、環状オレフィンコポリマー、特に二環式オレフィンコポリマー、又はポリマーフィルム；
4）ウェル表面に存在する、1つ以上の以下の官能基を有する有機コーティング：アミン、エポキシド、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、N−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル、スルホ−NHSエステル、塩化スルホニル、イミドエステル、カルボジイミド、酸無水物、ヨードアセチル、マレミド（malemide）、アジリジン、アクリロイル、ジスルフィド、ジアゾアセテート、アリールアジド、チオール（スルフヒドリル）、メルカプト、アセテート、ヒドロキシル、カーボネート、アルデヒド、アルカン、アルケン、カルボキシレート、エステル、エーテルなど（これは、潜在的官能基の非包括的リストである）；例えば前記官能基を含む、デンドリマー、ポリマー（ポリエチレングリコール−PEG）、ナノ粒子、及び高分岐ポリマーからなる有機コーティング／フィルム；
5）金属コーティング、例えば、金、銀、白金、パラジウムなど；
及び／又は
6）無機酸化物コーティング、例えば、SiO2、TiO2、ZrO2、Al2O3など；
などが含まれる。
【００１６】
多くの他の可能性も存在し、例えば、医薬包装及び医療デバイス分野で用いられる他の表面なども存在する。
【００１７】
他の典型的な表面処理又はコーティングには、ポリマーでコーティングされた表面、天然ガラス、エッチング加工されたガラス、熱処理されたガラス、PEG層でコーティングされたボロシリケートガラス、ヒアル（Hyal）、シリコン化ガラス又はプラスチック、TopPac、Type 1、Type 1 plusが含まれる。いずれの医薬包装又は医療デバイス表面、表面処理又はコーティングも、タンパク質溶液の様々なパラメーターに対して試験できることが企図される。タンパク質吸着に耐性を示す表面及び／又はコーティングに関して、豊富な一般知識が存在する。例えば、Emanuele Ostuni, Lin Yan, George M. Whitesides−Colloids and Surfaces Biointerfaces 1999, 15, 3−30を参照されたい。さらに、タンパク質吸着を減少させるように意図されている表面に関して、豊富な一般知識が存在する。例えば、Emanuele Ostuni, Robert G. Chapman, R. Erik Holmin, Shuichi Takayama, George M. Whitesides−Langmuir 2001, 17, 5605−5620を参照されたい。多種多様な表面コーティングの組み合わせが、単一の基材上に存在できる。これらの全ては、多数の利用可能な表面処理及び／又はコーティングの可能性を表す。
【００１８】
本明細書で用いられる場合、「タンパク質溶液」という用語は、様々な添加物を含んでもよい（典型的には）水溶液の存在下、関心のある特定のタンパク質を意味する。試験されるべき典型的なタンパク質溶液には、医薬的に関連のある部分、例えば、細胞、組織、及びそれらの誘導体などが含まれる。タンパク質の中には、天然又は組み換え技術により産生される、任意のポリアミノ酸鎖、ペプチド、タンパク質フラグメント、及び異なるタイプのタンパク質（例えば、構造的（structural）、膜、酵素、抗原、モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体、リガンド、レセプターなど）、並びにこれらの化合物の誘導体などが含まれる。特定のタンパク質薬剤には、抗体（例えば、CentocorのRemicade及びReoPro；GenentechのHerceptin；WyethのMylotarg、MedImmuneのSynagis）、酵素（例えば、GenentechのPulmozyme；GenzymeのCerezyme）、組み換えホルモン（例えば、GenentechのProtropin、ZymogeneticsのNovolin、LillyのHumulin）、組み換えインターフェロン（例えば、InterMune PharmaceuticalのActimmune；BiogenIdecのAvonex、ChironのBetaseron；AmgenのInfergen；Schering−PloughのIntron A；Hoffman−La RocheのRoferon）、組み換え血液凝固カスケード因子（例えば、GenentechのTNKase；CentocorのRetavase；Genetics InstituteのRefacto；BayerのKogenate）、及び組み換えエリスロポエチン（例えば、AmgenのEpogen；J&JのProcrit）、及びワクチン（例えば、GSKのEngerix−B；Merck&Co.のRecombivax HB）が含まれる。
【００１９】
典型的には、試験されるべき薬剤化合物は、様々な添加物を含んでいてもよい水溶液内に浸されるだろう。このような添加物は、タンパク質薬剤と、包装又はデバイス表面との結合に影響を及ぼす。典型的な添加物には、バッファー（例えば、リン酸塩、Tween、クエン酸塩、及び／又は酢酸塩）、生理学的濃度での塩化ナトリウムなどの塩、安定剤（例えば、ヒスタジン（histadine）などの抗酸化剤、EDTAなどのキレート剤、ヒトアルブミン又はグリセリンなど）、保存料（例えば、フェノール、メタクレゾール、ベンジルアルコールなど）、及び生理学的に安全なレベルに製剤のpHを調整するための酸又は塩基（例えば、クエン酸、水酸化ナトリウム、塩酸、酢酸など）が含まれる。
【００２０】
パターン化され、処理された基材を用いて、マルチプルな関連するタンパク質溶液パラメーター（継続期間、温度、濃度、pHなど）と様々な表面コーティング／処理との相互作用を、ごく少量のタンパク質を用いて同時に調べることができる。アッセイが終了した後、パターン化基材のそれぞれのウェルに吸着されたタンパク質の量を、タンパク質吸着のための既知の市販の検出方法を用いて検出できる。
【００２１】
タンパク質吸着を測定するための最も一般的な分析技術は、タンパク質を吸着している表面の光学的及び／又は電気的特性の変化をうまく利用している。これらの技術は、表面上の種の存在／不在の測定を提供する。いくつかの技術は、吸着タンパク質の量又は厚み（thickness）（SPR；偏光解析法；QCM；XPS；放射性同位体標識；溶質枯渇（solute depletion）；蛍光発光分光法）、コンフォメーション（ATR FT−IR；ラマン散乱；XPS；低角度X線反射率；走査型力顕微鏡法）、又は表面への結合エネルギー（走査型力顕微鏡法）に関するさらなる情報の測定を可能にする。表面プラズモン共鳴（SPR）は、金属フィルムの表面での屈折率変化、及びその表面付近での屈折率変化に対して非常に敏感である。SPRは、タンパク質吸着の前／間／後で測定でき、タンパク質吸着に関する動的及び熱力学的情報を測定できる。例えば、Jennifer M. Brockman, Anthony G. Frutos, Robert M. Corn−J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 8044−8051を参照されたい。偏光解析法を用いて、タンパク質吸着の前／後の屈折率変化を測定することにより、タンパク質が表面に吸着しているかどうかを測定でき、吸着タンパク質層の実験的な厚みを与えることができる。この検出方法は、基材がコーティングとは異なる屈折率を有する場合に有用である。例えば、Delana A. Nivens, David W. Conrad−Langmuir 2002, 18, 499−504；M. Mrksich, L. E. Dike, J. Tien, D. E. Ingber, G. M. Whitesides−Exp. Cell Res. 1997, 235, 305−313；及びKevin L. Prime, George M. Whitesides−J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 10714−10721を参照されたい。水晶振動子マイクロバランス（QCM）は、圧電効果を介して、タンパク質吸着に対する水晶振動子の振動基本周波数の変化を測定し、吸着タンパク質層の厚みをもたらす。弾性表面波（SAW）及びアコースティックプレートモード（acoustic plate mode；APM）デバイスは、タンパク質が、電極で変更された水晶の表面に吸着した場合の弾性表面波の変化（速度及び振幅）をうまく利用しており、タンパク質結合の存在又は不在を検出する。例えば、Robert Ros Seigel, Philipp Harder, Reiner Dahint, Michael Grunze, Fabien Josse−Anal. Chem. 1997, 69, 3321−3328を参照されたい。X線光電子分光法（XPS）はX線を用いて、原子から電子を放出させる；それぞれの原子は、異なるXPSスペクトルを有しており、単位面積当たりの原子数及び原子タイプの測定を可能にする。さらに、XPSを用いて、非タンパク質吸着表面と対比して、表面に吸着したタンパク質のスペクトルを測定することにより、タンパク質が表面に吸着しているかどうかを測定できる。減衰全反射フーリエ変換赤外（ATR FT−IR）分光法は、分子のねじれ、曲げ、回転、及び振動運動を調べる。スペクトルは、タンパク質の存在又は不在を測定するために用いられ得る情報を提供し、表面上でのそのコンフォメーションに関する情報を与える。低角度X線反射率測定法を用いて、界面での電子密度の変動（variation）を測定してよく、層のパッキング差（packing differences in layers）の解決を可能にする。放射性同位体標識を用いて、イオン化検出（ガイガーカウンター）又は液体シンチレーションにより、吸着タンパク質の量を定量化できる。例えば、Y. S. Lin, V. Hlady and J. Janatova−Biomaterials, 13,（1992）, p. 497を参照されたい。溶質枯渇は、表面への曝露前又は後の、溶液中のタンパク質量を測定する。走査型力顕微鏡法は、既知の位置でプローブチップを用いて、表面種を特徴付ける。プローブチップは、表面との化学的及び物理的相互作用を測定するために、特定の分子でコーティングされてよい。例えば、J. N. Lin, B. Drake, A. S. Lea, P. K. Hansma, and J. D. Andrade−Langmuir, 6,（1990）, p. 509を参照されたい。蛍光発光分光法は、分子固有の蛍光、又は分子上の蛍光標識の蛍光を測定
する。タンパク質は、蛍光標識されてよく、蛍光光度計を用いて検出されてよい。例えば、V. Hlady, Applied Spectroscopy 1991, 45, 246及びD. J. Sbrich and R. E. Imhof in Topics in Fluorescence Spectroscopy, J. R. Lakowicz Ed., Plenum, New York,（1991）, p.1を参照されたい。円偏光二色性は、偏光回転のマグニチュードを測定し、タンパク質の存在又は不在を検出する。例えば、C. R. McMillin and A. G. Walton−J. Colloid Interface Sci., 84,（1974）, p. 345を参照されたい。ラマン散乱は、赤外線に相補的であり、分極率変化を受ける分子の振動スペクトルを測定する。これを用いて、特定の分子／官能基の存在又は不在を測定する。例えば、T. M. Cotton in Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers, 2, J. D. Andrade Ed., Plenum Press, New York,（1985）, p. 161を参照されたい。一般に、本発明は、タンパク質分子を基材へ保持する力の性質により、多少なりとも限定されるものではない。
【００２２】
蛍光検出は、表面に結合されたタンパク質量に関する直接的な指標として利用可能である。この方法では、研究されるべきタンパク質を蛍光色素、例えば、DNA及びタンパク質マイクロアレイで典型的に用いられるもの（例えば、GE HealthcareのCy色素、Molecular ProbesのAlexa−flour色素、又は市販の他の色素）、並びにタンパク質を標識するために典型的に用いられるもの（ダンシルアミド、フルオレセイン）などと結合させる。これらの色素は、通常は、アミン反応性基（典型的には、NHS−エステル、アルデヒド又はエポキシド）を介してタンパク質に結合されており、容易に検出可能である。標識抗体の定量的な量は、マイクロアレイ分析（図3に図により示すとおり）のために用いられる、Axon、Perkin Elmer、Alpha Innotech、Tecan、Agilent、Affymetrixなどの様々な市販のスキャナーのいずれか一つを利用して、レーザースキャニングを介して洗浄後に測定され得る。この方法は、多くの異なるタンパク質へ適用することが容易であるが、主な注意は、タンパク質が修飾されていることであり、これは、いくつかの例において、非修飾タンパク質では生じないかもしれない、表面との相互作用を導き得る。これはまた、反応が、リジンのイプシロン−アミノ基及びアミノ末端基を主に伴うので、タンパク質上の電荷分布を変化させるだろう。別法は、吸着タンパク質を標識抗体で検出することを伴う。この間接的な方法は、タンパク質に特異的な抗体を得る工程と、それらを上記の同一のフルオロフォアで標識化する工程を伴う。
【００２３】
所望する場合には、本発明のマルチプレックスアッセイを、表IIIに記載したものなどの他のタンパク質損失／吸着アッセイと組み合わせて用いることができる。マルチプレックスアッセイが、所望の製剤及び表面の組み合わせを同定した場合には、以下のアッセイを用いて、フルスケールの医薬包装又は医療デバイス内のタンパク質損失を試験できる。
【００２４】
【表３】
2008516249.tif 000004
【００２５】
上記技術を、図5に図で示したアプローチで用いて、試験を促進でき、かつ包装サポートを提供して、それにより、医薬及び医療デバイス産業への解決策を提供できる。
【００２６】
従って、本発明のアッセイは、包装及び医療デバイス科学者が、今までにない新規薬剤組成物、例えば、小分子、抗体、タンパク質（天然又は組み換え）、サイトカイン、ワクチンなどの安定性を、多数の異なる包装及び製剤条件下、ごく制限された量の貴重な薬剤化合物を消費しながら、研究することを可能にするのに有用である。何万もの製剤／ウェル表面組み合わせを、単一のチップ系プラットフォームで評価できる。従って、所与のタンパク質系医薬化合物のために、物質表面と製品製剤との最適な組み合わせを急速に同定できる。物質の表面特性を調整（tailor）し、製剤を最適化できる能力は、表面吸着による貴重なタンパク質の損失を低減させるか、又は排除し、かつアッセイから、実現可能で拡張可能なプロトタイプ又は市販バッチへの容易なスケールアップを可能にするだろう。
【００２７】
本出願は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに関して主に記載しているが、本発明の適用を生体分子に直接的に拡張することはルーチン（routine）であることから、他の生体分子、例えば、核酸、ポリヌクレオチド（例えば、DNA、RNA、mRNA、pDNAなど）、オリゴヌクレオチド、タンパク質／核酸複合体などにも本出願を適用できる。本発明の生体分子への適用はルーチンである。アッセイ方法及び技術（試薬、シグナリング方法論、検出方法論など）は全て周知である。
【００２８】
「生物学的特異性」という用語は、他の全てから種を同定するのに十分に独特である、正常タイプの生物学的な錠（lock）及びキータイプの結合を意味し、例えば、抗体−抗原（タンパク質）相互作用、レセプター−リガンド相互作用、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションなどを意味する。代わりに、ここでの表面の差異は、タンパク質を同定するのではなく、処理表面へのタンパク質存在物（entity）の吸着を変えるように意図されている。
【００２９】
さらに詳述しなくとも、当業者ならば、先の記載を用いて、本発明を最大限活用できると考えられる。従って、先の好ましい特定の実施態様は、単に例証として解釈されるべきであり、いかなる場合であっても、多少なりとも開示の残りを限定するものではない。
【００３０】
本明細書で引用される全ての出願の開示全体は、参照として援用される。
【００３１】
[実施例]
[実施例I]
（マルチプレックス製剤最適化プロトコル）
a）理想的には、一般的な形状の顕微鏡用スライド（名目上、25×75×1 mm3）又はマイクロタイタープレート（MTPフレーム内の基材が、公称寸法74×110×1 mm3を有する）である基材を選択する。
【００３２】
b）＜100μm〜数mmまで変動できるクロスセクションで、基材を個別のウェル（任意形状）へと区分する。これらのウェルは、例えば、出発基材上に疎水性パターンをスクリーン−プリンティングすることなどにより形成されてよく、この方法は、発明の名称が「Low Fluorescent, Chemically Durable Patterned Substrates for the Attachment of Biomolecules」である特許出願US 10／778,332号に記載されるとおりである。得られたパターン化基材は、図1の例により示される外観を呈すことができる。
【００３３】
c）図2に示すとおり、様々な薬剤化合物を用いてそれぞれ個別のウェル（図1）を調べる。薬剤化合物含有溶液は、ミリリットル、マイクロリットル、又はナノリットルピペッティングを介して、それぞれのウェル中へ入れられてよい。
【００３４】
d）研究の意図に基づいて、1秒〜12ヶ月以上の時間範囲で、ウェル表面と溶液とを相互作用させる；（例えば、ある種の経時研究は、＞1年の相互作用時間を必要としてよい）。図3に示すとおり、経時の間、シールされた上部構造（sealed superstructure）を利用して、蒸発を阻害できる。所望の場合には、水溶液をウェル中に入れる前に、ポリマー系上部構造を適用し、それに続いて蒸発リスクを排除するシール片を適用できる。
【００３５】
e）ウェル表面に不可逆的に吸着している薬剤化合物量を特徴付けるか、又は測定する。これは、上述の様々な方法、例えば、
i）タンパク質を吸着させた後、標識抗体でウェルをインキュベートし、洗浄し、ついで結合タンパク質量を測定するためにスキャンしてよい；
又は
ii）タンパク質を吸着させた後、ELISAアッセイと類似のシグナル増幅が可能となるように、酵素結合抗体を用いてウェルを調べ（interrogate）てよい；
又は
iii）異なるタイプのプローブを用いて、抗体（モノクローナル及びポリクローナル）、アフィボディ（affibody）、抗体フラグメント、オリゴヌクレオチド、アミン反応性フルオロフォア及び色素（例えば、Cy−色素及び上述の他のもの）、特異リガンド（例えば、蛍光標識ストレプトアビジンを用いて、ビオチン化タンパク質を検出する）、並びに関心のあるタンパク質と特異的に結合する小分子を含む、吸着タンパク質を検出できる；
などにより実施できる。
【００３６】
[実施例II]
2つのタイプのアッセイは、ガラス表面への、溶液中のタンパク質の吸着を実証する。シリコーン上部構造でウェルへと分割されたスライドガラスを使用することにより、100μL量のタンパク質溶液をインキュベートすることが可能になる。表面に結合したタンパク質を検出し、定量化するために、蛍光色素を用いて、適切な感度を確保する。2つのタイプのアッセイ、すなわち、直接及び間接アッセイについて述べる。
【００３７】
直接アッセイは、タンパク質がシアニン色素（Cy3）を含むように修飾された、タンパク質溶液に基づく（図7Aを参照されたい）。タンパク質溶液をスライドウェル中でインキュベートし、ついで除去する。過剰量のタンパク質：色素複合体を注射用蒸留水（WFI）で洗浄し；スライドを乾燥させ、ついで532 nmのレーザースキャナーを用いてスキャンする。蛍光シグナル量を、ウェルにわたって測定し、較正曲線（calibration curve）を用いてタンパク質量を計算する。
【００３８】
間接アッセイ（図7Bを参照されたい）においては、非標識タンパク質をウェル中でインキュベートする。インキュベーション時間の後、タンパク質溶液を除去し、WFIでウェルを洗浄する。NHS−エステルを含む蛍光色素をウェル中でインキュベートする。色素NHS−エステルは、タンパク質上のアミン基と反応し、蛍光部分は、表面に吸着したタンパク質と結合するようになる。ついで、過剰量の非反応色素をウェルから洗浄し、ウェルを乾燥させて、スライドを上記のとおりにスキャンする。さらに、特異タンパク質それぞれに対する較正曲線により、結合したタンパク質の定量化を実施する。
【００３９】
[実施例III]
マルチプレックスアッセイを用いて、異なるpHで、製剤化されたタンパク質の吸着を評価する。タンパク質は、等電点（pI）を有しており、等電点は、タンパク質の正味荷電がゼロであるpHである。pI未満のいずれのpHでも、タンパク質はプラスに帯電し、他方、pIを超えるpHでは、正味荷電はマイナスとなる。その一方で、ガラスのゼータ電位は、3超のいずれのpHにおいてもマイナスであり、従って、ガラスは、そのpHを超えるpHでは、マイナスに帯電する。
【００４０】
pHが5、6、7、8、及び9の100 mMリン酸バッファー中、Cy3蛍光色素（励起：532 nm、発光：535 nm）で標識したヒトIgGを製剤化する。IgGのpIは7.8であり、従って、大部分のpHで、タンパク質はプラスに帯電する。上述のとおり、スライド上に形成したウェル中で100μLのタンパク質溶液を72時間インキュベートする。インキュベーション後、100μLの注射用蒸留水（WFI）でスライドウェルを3回洗浄する。ついで、スライドをレーザースキャナー中でスキャンする。
【００４１】
図8に示す画像は、2つのタイプのガラス上でのIgG溶液の吸着を示す。pHが高くなると、マイナスに帯電したガラス表面からタンパク質を撥ね退けるマイナス電荷が増加するので、表面に吸着されるIgG−Cy3量が減少することを観察できる。この場合の最適な製剤は、イオン相互作用に起因する脱結合（de binding）を最小にするために、約9のpHで実施されるべきである。
【００４２】
[実施例IV]
一般に、タンパク質の異なる性質を考えると、異なるタンパク質は、同一表面に様々な程度で吸着することが予測される。この実験において、同一溶液中で製剤化された全ての異なるタンパク質の吸着を試験する。
【００４３】
高分子（フィブリノゲン、分子量340,000）〜低分子（インスリン、分子量5600）、酸性pI（アルブミン、pI＝5.2）〜塩基性pI（ヒストン、pI＝11.5）を含む、選択タンパク質におけるタンパク質特性の異なる側面を包含する。pHが5、7、及び9の100 mMリン酸バッファー中、全てを製剤化し、先の実施例で述べたとおりにインキュベートする。
【００４４】
図9に示す結果は、高度に塩基性のタンパク質（ヒストン）及び巨大タンパク質（フィブリノゲン）が、最も吸着する傾向にあることを示す。ヒストンの多量のプラス電荷間のイオンの引力と、タンパク質の多くの残基の同時相互作用を一度に可能にするフィブリノゲンのサイズとを考えると、これは道理にかなう。
【００４５】
[実施例V]
表面電荷の効果はまた、タンパク質の吸着を変更するだろう。ガラス上のマイナス電荷は、プラスに帯電したタンパク質を引き寄せる傾向にあるからである。プラスに帯電した表面は、それらを撥ね退け、マイナスに帯電したタンパク質を引き寄せる傾向にあるべきである。スライド表面にアミノシランコーティングを適用することにより、この理論を試験する。コーティングは、結果として、プロトン化されている、パックされた（packed）アミノ基の表面をもたらす。ついで、塩基性（ヒストン）及び酸性（アルブミン）タンパク質の両方で表面をインキュベートする。図10に示すとおり、非コーティングコントロールと比較した場合に、プラスに帯電したタンパク質は、プラスに帯電した表面上にほとんど吸着せず、他方、マイナスに帯電したタンパク質は、より吸着する。
【００４６】
[実施例VI]
タンパク質治療薬（therapeutic）の製剤の最適化は、異なるpH及び濃度での多くのタイプのバッファーを考慮できる。ここに記載の方法は、これらの変化を試験するスループットを高めることを狙いとする。
【００４７】
タンパク質溶液を異なるバッファーで作製し、スライドウェル中でインキュベートする（実施例1に記載のとおり）。ついで、タンパク質を洗浄し、スライドをスキャンする。図11Aの結果は、WFI（注射用蒸留水）中、タンパク質溶液でウェルをインキュベートすることと比較した場合の、異なるバッファー組成及び濃度の効果を実証する。ある種のバッファーは、表面へのタンパク質の吸着を60％程度低減できることを明らかに示す。
【００４８】
別の場合では、医薬産業で典型的に用いられる界面活性剤（Tween−20）の存在及び不在下における吸着に関して、同一のタンパク質溶液を比較する。図11Bの結果は、界面活性剤の添加が、タンパク質の結合を少なくとも50％低減することを明らかに示す。
【００４９】
この実施例は、ちょうど2つのマルチプレックス実験が、条件を最適化して、タンパク質の吸着を10倍低減できるので、タンパク質吸着を阻止する方法の有用性を示す。
【００５０】
先の記載及び実施例において、特記のない限り、全ての温度は、非補正（uncorrected）の摂氏で示され、全ての部及びパーセンテージは重量による。
【００５１】
先の実施例は、一般的又は具体的に記載した反応物質を置換することにより、及び／又は先の実施例で用いたもののために本発明の条件を操作することにより、類似して首尾よく反復できる。
【００５２】
先に記載から、当業者ならば、容易に、本発明の本質的特徴を確認でき、かつその精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更及び修正を行って、様々な使用及び条件にこれを適合させることができる。
【００５３】
本発明の様々な特徴及び付随する利点は、添付の図面と組み合わせて考えられる場合に、より理解されるので、より十分に理解されるだろう。添付図面では、参照的に、いくつかの観点から、特徴が同一又は類似部分を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図1には、区分された顕微鏡用スライドフォーマット（左）及びマイクロタイタープレートフォーマット（右）の画像を示す。このようなフォーマットは、約2〜＞1000の個別のウェルを含有するように設計できる。
【図２】図2には、処理されたウェル表面が、溶液中に浸された薬剤化合物とどのように相互作用できるかを説明する図的記述を示す。
【図３】図3には、典型的なアッセイに関与する工程を示す。第一に（上部左）、シリコーン系上部構造（superstructure）をパターン化基材に適用する。第二に（上部右）、1つ以上のタンパク質薬剤化合物を含む溶液を添加する。第三に（下部左）、デバイス上部にシール片を適用して、蒸発を防ぐ。最後に（下部右）、洗浄及び標識後、蛍光スキャンを介して、吸着タンパク質の量を定量化する。
【図４】図4には、マルチプレックスアッセイを第一に用いて、最適な包装条件をスクリーニングし、次に、それに続いて包装特異的試験を行い、最終的な製剤を達成するという、医薬包装を開発する全工程の1つの可能性を図的に記述したものを示す。
【図５】図5には、包装／製剤溶液を医薬産業に急速かつ効率的に提供するために、異なる技術をどのように組み合わせて用いるかを示す、図的記述を示す。
【図６】図6には、本発明のアッセイ適用に使用するための、様々な企図されるパターニングデザインを示す。
【図７】図7には、表面へのタンパク質吸着を測定するために開発された、直接及び間接アッセイ方法を示す。
【図８】図8には、ガラス表面へのIgGのイオンの引力に対する、異なるpHの効果を示す。
【図９】図9には、ガラスへの異なるタンパク質の吸着を示す。5つのタンパク質を用いる：IgG（G）、インスリン（I）、ヒストン（H）、フィブリノゲン（F）、C.アンヒドラーゼ（C）。3つの異なるpH（5、7、及び9）で、10μg／mLでこれらをインキュベートする。
【図１０】図10には、プラス及びマイナスに帯電したタンパク質の結合に対する、プラスに帯電した表面の効果を示す。
【図１１】図11には、異なるバッファー中（A）、並びにTween 20の存在及び不在下（B）、タンパク質でインキュベートされたスライドガラスウェル上のタンパク質製剤の最適化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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