(57)【要約】本発明は、分子生物学および薬物送達の分野に関する。ある態様において、本発明は、中性（非電荷）リポソームを介する細胞へのsiNA（例えば、siRNA）の送達方法を提供する。これらの方法は、癌などの病気を治療するために用いられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）siRNAを含む短い阻害性リボ核酸（siRNA）成分、またはsiRNAをコードする核酸；および
（b）一つまたは複数のリン脂質を含む脂質成分を含み、該脂質成分は実質的に中性の電荷を有することを含む組成物。
【請求項２】
脂質成分がリポソームを形成する、請求項1記載の組成物
【請求項３】
siRNA成分が脂質成分にカプセル化される、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
組成物が薬学的に許容される担体に含まれる、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
脂質成分が中性リン脂質を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
中性リン脂質がホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンである、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
中性リン脂質が卵ホスファチジルコリン（「EPC」）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（「DLPC」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「DMPC」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「DPPC」）、ジステアロイルホスファチジルコリン（「DSPC」）、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン（「MPPC」）、1-パルミトイル-2-ミリストイルホスファチジルコリン（「PMPC」）、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン（「PSPC」）、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン（「SPPC」）、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）、1,2-ジスエテアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DAPC」）、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DBPC」）、1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DEPC」）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（「POPC」）、リソホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「DSPE」）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「DMPE」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「DPPE」）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「POPE」）、またはリソホスファチジルエタノールアミンである、請求項6記載の組成物。
【請求項８】
ホスファチジルコリンがDOPCである、請求項6記載の組成物。
【請求項９】
ホスファチジルエタノールアミンがジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「DOPE」）である、請求項6記載の組成物。
【請求項１０】
リン脂質成分が2以上のタイプの中性リン脂質を含む、請求項5記載の組成物。
【請求項１１】
脂質成分が正に荷電した脂質またはリン脂質、および負に荷電した脂質またはリン脂質を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１２】
脂質成分が、さらに、中性に荷電した脂質を含む、請求項11記載の組成物。
【請求項１３】
負に荷電したリン脂質がホスファチジルセリンまたはホスファチジルグリセロールである、請求項11記載の組成物。
【請求項１４】
負に荷電したリン脂質がジミリストイルホスファチジルセリン（「DMPS」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「DPPS」）、脳ホスファチジルセリン（「BPS」）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（「DLPG」）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「DPPG」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「DSPG」）、またはジオレオイルホスファチジルグリセロール（「DOPG」）である、請求項11記載の組成物。
【請求項１５】
組成物が、さらに、コレステロールまたはポリエチレングリコール（PEG）を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１６】
siRNAが18〜100ヌクレオベースの二本鎖核酸である、請求項1記載の組成物。
【請求項１７】
siRNAが18〜30ヌクレオベースである、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
siRNAが、過形成または癌性哺乳動物細胞の成長を促進する遺伝子の翻訳を阻害する、請求項1記載の組成物。
【請求項１９】
遺伝子がEphA2、病巣接着キナーゼ（FAK）、またはβ2アドレナリン作動性受容体（β2AR）である、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
siRNA成分が少なくとも2つのsiRNA、またはsiRNAをコードする核酸を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２１】
さらに化学療法剤を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２２】
細胞を請求項1〜21の治療組成物と接触させることを含む、治療上有効量のsiRNAを細胞に送達する方法。
【請求項２３】
細胞がヒト対象に含まれる、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
方法が、癌を治療する方法である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
癌の起源が膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
癌が卵巣癌である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
方法が、過形成疾患を治療する方法である、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
過形成疾患が前癌疾患である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
組成物が、細胞の成長を阻害するか、または細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
siRNAが遺伝子の翻訳を阻害し、該遺伝子の発現は癌性細胞の成長を促進する、請求項24記載の方法。
【請求項３１】
方法が、さらに、第二の抗癌療法を対象に投与することを含む、請求項24記載の方法。
【請求項３２】
第二の抗癌療法が外科的処置、放射線療法、免疫療法、化学療法、または遺伝子治療を含む、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
化学療法がドセタキセル、パクリタキセル、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（VP16）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、またはその組合せの投与を含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
化学療法がドセタキセルまたはパクリタキセルの投与を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
化学療法がsiRNA組成物の前に、間に、または後に送達される、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
化学療法がsiNA組成物の24、48、または72時間内に送達される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
治療組成物が静脈内または腹腔内投与される、請求項22記載の方法。
【請求項３８】
癌を有すると同定された、癌を有することが疑われると同定された、または癌を発症する傾向を有すると同定された対象に、有効量の請求項1〜21の組成物を投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、2005年4月15日に出願された米国特許仮出願第60/671,641号に対する優先権を主張する。
【０００２】
政府は、Department of Defenseからの補助金番号♯W81XWH-04-1-0227、およびNational Cancer Instituteからの補助金CA10929801に従って本発明において権利を所有する。
【０００３】
I. 発明の分野
本発明は、一般に、分子生物学、医学、腫瘍学、および治療化合物の送達の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、中性脂質組成物またはリポソームを介する、siNA（例えば、siRNA）を含む阻害性核酸の送達に関する。
【背景技術】
【０００４】
II. 先行技術の説明
短い干渉性RNA（siRNA）は当技術分野において周知であるが、インビボでのsiRNAの送達は非常に困難であることが判明しており、従って、siRNAの治療的潜在能力を制限する。C.elegans（Fire,1998）および哺乳動物細胞（Elbashir et al.,2001）におけるその記載以来、遺伝子サイレンシングの方法としてのsiRNAの使用は、タンパク質機能描写、遺伝子発見、および薬物開発において迅速に強力なツールとなった（Hannon,2004）。特異的RNA分解の有望性もまた、治療的様式としての可能な使用に対してかなりの刺激を生じたが、インビボsiRNA送達は困難なことが判明した（Ryther,2005）。
【０００５】
他の核酸に対して効果的な送達方法はsiRNAに対して必ずしも効果的ではない（Hassani,2005）。従って、インビボにてsiRNAを用いるほとんどの研究は、動物モデルへの導入（Brummelkamp,2002；Yang,2003）、またはsiRNAのウイルスベクターへの取り込み（Xia,2002；Devroe,2004）に先立って、細胞系における遺伝子発現の操作を含む。インビボでの「裸の」siRNAの送達は、部位特異的注入、または臨床的に現実的でない高圧手段を介するものに制限されてきた。インビボ取り込みを示し、正常な全身投与後のsiRNAによる内因性タンパク質のダウンレギュレーションを標的化した1つの研究はsiRNAの化学的修飾を必要とした（Soutschek,2004）。しかしながら、この化学的修飾は未知の毒性を有し、インビボでの対象への有意な毒性をもたらしかねない。さらに、この化学的修飾はsiRNA活性および/または寿命に影響し得る。
【０００６】
リポソームは従来薬物送達（例えば、化学治療剤の送達）で用いられてきた。リポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）は、ディスクレーマーなしでその全てを参照により本明細書にその全体を組み入れる、PCT公開WO02/100435A1、WO03/015757A1、およびWO04029213A2；米国特許第5,962,016号、第5,030,453号、第6,680,068号；および米国特許出願第2004/0208921号に記載されている。リポソームを作成する方法もWO04/002453A1に記載されている。さらに、中性脂質がカチオン性リポソームに取り込まれている（例えば、Farhood et al.,1995）。
【０００７】
カチオン性リポソームは、siRNAを種々の細胞型に送達するのに用いられてきた（Sioud and Sorensen,2003；米国特許出願第2004/0204377号；Duxbury et al.,2004；Donze and Picard,2002）。しかしながら、中性リポソームを用いてsiRNAを細胞に送達できるか、またはどの程度送達できるかは明らかでない。
【０００８】
中性リポソームは限定された程度しか、テストされていない。Miller et al.（1998）は、中性単層リポソームの取り込みを評価し；しかしながら、この研究は、カチオン性リポソームが中性リポソームよりも効率的に細胞によって接種されることを観察しており、したがって、中性リポソームがカチオン性リポソームよりも効率的であろうという考えから教示をそらす。中性リポソームは、米国特許出願第2003/0012812号においては治療アンチセンスオリゴヌクレオチドを送達するのに用いられた。しかしながら、中性リポソームを用いてsiRNAを送達できるか、またはどの程度そうできるかは明らかでない。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、短い干渉性リボ核酸（siRNA）、またはsiRNAをコードする核酸を含む、阻害性核酸の送達のための組成物および方法を提供する。ある態様において、阻害性核酸は、非荷電（中性）リポソームを介して細胞に送達することができる。本発明者らは、非荷電リポソームを用いて、siNAまたはsiRNAのような阻害性核酸をインビボにて細胞に効果的に送達することができることを発見した。特別な局面において、中性リポソームを用いるsiNA送達の結果、インビボにてカチオン性リポソームと比較して送達の有意な（約10倍）改良がもたらされる。また、本発明の方法は、癌または他の過形成疾患の治療に特に適していることも確認された。
【００１０】
本発明の態様は、siNA成分、および一つまたは複数のリン脂質を含む脂質成分を含む組成物に関し、該脂質成分は本質的に中性電荷を有する。ある局面において、脂質成分はリポソームの形態であってもよい。siNA（例えば、siRNA）はリポソームまたは脂質成分中にカプセル化することができるが、その必要はない。カプセル化するとは、対象となる剤と、または剤の周りとの会合によって溶液への自由な拡散に対して障害を形成する脂質またはリポソームを指し、例えば、リポソームは脂質層内に、あるいは脂質層内部またはその間の水性区画内に剤をカプセル化することができる。ある態様において、組成物は薬学的に許容される担体に含まれる。薬学的に許容される担体は、ヒト対象または患者への投与用に処方することができる。
【００１１】
ある態様において、脂質成分は本質的に中性の電荷を有する。なぜなら、それは中性のリン脂質または正味の中性の電荷を含むからである。ある局面において、中性リン脂質は、DOPC、卵ホスファチジルコリン（「EPC」）、ジラウロイルホスファチジルコリン（「DLPC」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「DMPC」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「DPPC」）、ジステアロイルホスファチジルコリン（「DSPC」）、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン（「MPPC」）、1-パルミトイル-2-ミリストイルホスファチジルコリン（「PMPC」）、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン（「PSPC」）、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン（「SPPC」）、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DAPC」）、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DBPC」）、1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DEPC」）、パルミトイルオレイルホスファチジルコリン（「POPC」）、リソホスファチジルコリン、またはジリノレオイルホスファチジルコリンのようなホスファチジルコリンであってもよい。他の局面において、中性リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「DOPE」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「DSPE」）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「DMPE」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「DPPE」）、パルミトイルオレイルホスファチジルエタノールアミン（「POPE」）、またはリソホスファチジルエタノールアミンのようなホスファチジルエタノールアミンであり得る。ある態様において、該リン脂質成分は1、2、3、4、5、6、7、8以上の種類またはタイプの中性リン脂質を含むことができる。他の態様において、リン脂質成分は2、3、4、5、6以上の種類またはタイプの中性リン脂質を含むことができる。
【００１２】
ある態様において、脂質成分は本質的に中性の電荷を有することができる。なぜなら、それは正に荷電した脂質および負に荷電した脂質を含むからである。脂質成分は、さらに、中性に荷電した脂質またはリン脂質を含んでもよい。正に荷電した脂質は正に荷電したリン脂質であってもよい。負に荷電した脂質は負に荷電したリン脂質であってもよい。負に荷電したリン脂質はジミリストイルホスファチジルセリン（「DMPS」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「DPPS」）、または脳ホスファチジルセリン（「BPS」）のようなホスファチジルセリンであってもよい。負に荷電したリン脂質はジラウロイルホスファチジルグリセロール（「DLPG」）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「DPPG」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「DSPG」）、またはジオレオイルホスファチジルグリセロール（「DOPG」）のようなホスファチジルグリセロールであってもよい。ある態様において、組成物は、さらに、コレステロールまたはポリエチレングリコール（PEG）を含む。ある態様において、リン脂質は天然のリン脂質である。他の態様において、リン脂質は合成リン脂質である。
【００１３】
阻害性核酸（siNA）はsiRNAまたはshRNA（短いヘアピンRNA）、リボザイム、または標的タンパク質をコードする、または標的タンパク質の発現を調節する核酸分子に特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸分子を含む。「特異的ハイブリダイゼーション」は、siRNA、shRNA、リボザイムまたはアンチセンス核酸分子が標的化された核酸分子にハイブリダイズし、その発現を調節することを意味する。好ましくは、「特異的ハイブリダイゼーション」は、他の遺伝子または転写体が影響しないことも意味する。siNAは二本鎖核酸であってよく、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、100〜18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、100、200、300、500以上のヌクレオベースまたはヌクレオベース対を含んでもよい。特別な局面において、二本鎖核酸は18〜30、19〜25、20〜23、または21連続ヌクレオベースまたはヌクレオベース対を含むことができる。ある態様において、siNAは、癌性または前癌性、あるいは過形成哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）の成長を促進する遺伝子の翻訳を阻害する。siNAは細胞においてアポトーシスを誘導し、および/または癌遺伝子または他の標的遺伝子の翻訳を阻害することができる。該遺伝子はEphA2、病巣接着キナーゼ（FAK）、またはβ2アドレナリン作動性受容体（β2AR）であってもよい。ある態様において、siNA成分はsiRNAの単一種を含む。他の態様において、siNA成分は、1、2、3、4以上の遺伝子を標的化するsiRNAの1、2、3、4以上の種を含む。組成物は、さらに、化学治療剤または他の抗癌剤を含んでもよく、これは、脂質成分または本発明のリポソームにカプセル化されていてもいなくてもよい。さらなる態様において、核酸成分はリポソームまたは脂質成分内にカプセル化される。
【００１４】
本発明のもう1つの局面は、細胞を本発明の中性脂質組成物と接触させることを含む、siNAを細胞に送達する方法を含む。該方法は、有効量の本発明の組成物を提供する。有効量は、対象において細胞、疾患または病気状態を減衰し、遅延させ、低下させ、または排除する治療成分の量である。細胞は、ヒトのような対象または患者に含まれていてよい。該方法は、さらに、癌または他の過形成疾患を治療する方法を含んでもよい。癌は膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮に由来するものであってもよい。ある態様において、癌は卵巣癌である。ある態様において、該方法は、さらに、非癌性病または過形成疾患を治療する方法を含む。細胞は前癌性、または癌性細胞であってもよい。ある態様において、該組成物および方法は細胞の成長を阻害し、細胞においてアポトーシスを誘導し、および/または癌遺伝子の翻訳を阻害する。siNAは、癌性細胞において過剰発現される遺伝子の翻訳を阻害することができる。該遺伝子はEphA2、病巣接着キナーゼ（FAK）、および/またはβ2アドレナリン作動性受容体（β2AR）であってもよい。
【００１５】
ある態様において、本発明の方法は、さらに、さらなる療法を対象に投与することを含む。さらなる療法は、化学治療剤（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル）、外科的処置、放射線療法、および/または遺伝子治療を投与することを含んでもよい。ある局面において、化学療法はドセタキセル、パクリタキセル、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（VP16）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、またはその組合せである。ある態様において、化学療法はドセタキセルまたはパクリタキセルのようなタキサンである。化学療法は、本発明の中性脂質組成物に対して前に、間に、後に、またはその組合せで送達することができる。化学療法は中性脂質組成物の0、1、5、10、12、20、24、30、48、または72時間以上内に送達することができる。中性脂質組成物、第二の抗癌療法、または中性脂質組成物および抗癌療法の双方は腫瘍内、静脈内、腹腔内、経口、またはその種々の組合せで投与することができる。
【００１６】
用語「ある」の使用は、特許請求の範囲および/または本明細書において用語「含む」と組み合わせて用いる場合、「1つ」を意味することができるが、「一つまたは複数」、「少なくとも1」および「1または1を超える」の意味とも合致する。本明細書において、「もう1つ」は少なくとも第二以上を意味することもできる。
【００１７】
本明細書において議論するいずれの態様も本発明のいずれかの方法または組成物に関して実施することができ、その逆も可能であると考えられる。さらに、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を達成することができる。
【００１８】
本出願を通じて、用語「約」は、値がデバイスについての誤差の固有の変動を含むのを示し、該方法は、該値、または実験対象の間に存在する変動を決定するのに利用されるために使用される。
【００１９】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみをいうのに明示的に示すのでなければ「および/または」を意味するのに用いられ、あるいは代替物は相互に排除される。
【００２０】
本明細書および特許請求の範囲で用いるように、用語「含む」（「含んでいる」のような「含む」のいずれかの形態）、「有する」（および「有している」のような「有する」のいずれかの形態）、「包含する」（および「包含している」のような「包含する」のいずれかの形態）、または「含有する」（および「含有する」のような「含有する」のいずれかの形態）は包括的、または可変的であって、さらなる引用されていないエレメントまたは方法工程を排除しない。
【００２１】
本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および特別な実施例は、本発明の特別な態様を示しつつ、説明のためのみに掲げることは理解されるべきである。なぜなら、本発明の精神および範囲内にある種々の変化および修飾はこの詳細な説明から当業者に明らかとなるからである。
【００２２】
実施態様の説明
本発明者らは、短い干渉性RNA（siRNA）のような阻害性核酸の使用に特に関連して、インビボ治療剤として用いるためのさらなる遺伝子サイレンシング組成物および方法を開発した。本発明の局面は、遺伝子発現の阻害剤の送達のために中性脂質組成物を利用する。特別な局面において、脂質組成物は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（DOPC）を含む。態様は、癌細胞生存、癌細胞成長および/または癌細胞転移、例えば、卵巣癌細胞において役割を演じる遺伝子の発現/翻訳をサイレンシングするまたは低下させることを含む。ある局面において、標的化すべき遺伝子は、限定されることなく、病巣接着キナーゼ（FAK）遺伝子、EphA2遺伝子、および/またはβ2AR遺伝子を含む。本発明のなおさらなる局面は、遺伝子発現療法の阻害剤を、一つまたは複数の抗癌剤と組み合わせることを含む。抗癌剤は化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子治療等を含む。特別な態様において、遺伝子発現の阻害剤をドセタキセルまたはパクリタキセル療法と組み合わせる。
【００２３】
本発明は、脂質組成物、ある局面においては、約0の正味の電荷を持つ脂質組成物、すなわち、中性脂質組成物を介する細胞への遺伝子発現の阻害剤（RNA干渉を行う剤、例えば、siRNA）の送達のための組成物および方法を提供する。ある態様において、脂質組成物は非荷電リポソームである。本発明者らは、非荷電リポソームを用いて、siNA（例えば、siRNA）をインビボにて細胞に効果的に送達することができ；さらに、中性リポソームを介するsiNAの送達の結果、インビボにてカチオン性リポソームと比較して送達の有意な（約10倍）改良がもたらされたことを見出した。これらの方法は、癌を治療するのに効果的に用いることができる。
【００２４】
I. 治療遺伝子サイレンシング
19981年におけるFireおよび同僚によるRNAiの発見以来、生化学メカニズムは迅速に特徴付けられてきた。長い二本鎖RNA（dsRNA）は、RNAaseIIIファミリーリボヌクレアーゼであるダイサーによって切断される。このプロセスは、長さが約21ヌクレオチドのsiRNAを生じる。これらのsiRNAは、mRNAを標的化するのにガイドされる多タンパク質RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に取り込まれる。RISCは相補的領域の中央において標的mRNAを切断する。哺乳動物細胞において、関連するミクロRNA（miRNA）は短いRNA断片（約22ヌクレオチド）であることが見出されている。MiRNAは、不完全なヘアピンRNA構造を持つより長い（約70ヌクレオチド）前駆体のダイサー媒介切断後に生じる。miRNAはmiRNA-タンパク質複合体（miRNP）に取り込まれ、これは標的mRNAの翻訳抑制に導く。
【００２５】
A. siRNA、またはそれをコードする核酸の送達
siRNA媒介遺伝子サイレンシングの有効性を改良するために、mRNA上の標的部位の選択のためのガイドラインがsiRNAの最適な設計のために開発されている（Soutschek et al.,2004；Wadhwa et al.,2004）。これらの戦略は、最大遺伝子ノックダウンを達成するためのsiRNA配列を選択する合理的アプローチを可能とすることができる。細胞および組織へのsiRNAのエントリーを容易とするために、プラスミド、およびアデノウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルスベクターを含む種々のベクターが用いられてきた（Wadhwa et al.,2004）。これらのアプローチの多くはインビトロ研究で成功してきたが、インビボ送達は、腫瘍のミクロ環境の複雑性に基づいてさらなる挑戦をもたらす。
【００２６】
リポソームは、種々の薬物を病気の組織に送達するための魅力的なキャリアーであるナノ粒子の形態である。最適なリポソームサイズは、腫瘍標的に依存する。腫瘍組織において、血管系は不連続であって、ポアサイズは100〜780nmで変化する（Siwak et al.,2002）。比較により、正常な血管内皮におけるポアサイズはほとんどの組織において＜2nmであり、毛細血管後細静脈においては6nmである。ほとんどのリポソームは直径が65〜125nmである。負に荷電したリポソームは中性または正に荷電したリポソームよりも循環からより迅速に除去されると考えられていた。しかしながら、最近の研究は、負に荷電した脂質のタイプが網状-内皮系（RES）によるリポソーム摂取の速度に影響することを示している。例えば、立体的に遮蔽されていない負に荷電した脂質（ホスファチジルセリン、ホスファチジル酸、およびホスファチジルグリセロール）を含有するリポソームは中性リポソームよりも迅速に除去される。関心対象には、カチオン性リポソーム（1,2-ジオレオイル-3-トリメチルマンモニウム-プロパン［DOTAP］）およびカチオン性-リポソーム-DNA複合体は、アニオン性、中性、または立体的に安定化された中性リポソームよりもエンドサイトーシスを介して脈管形成血管の内皮細胞によってより貪欲に結合され、内部化される（Thurston et al.,1998；Krasnici et al.,2003）。カチオン性脂質は腫瘍細胞のための理想的な送達ビヒクルではないかもしれない。なぜなら、腫瘍細胞との表面相互作用は、静電気的に導かれた結合部位バリア効果を生じ、送達系と腫瘍スフェロイドとのさらなる会合を阻害するからである（Kostarelos et al.,2004）。しかしながら、中性リポソームは良好な腫瘍内貫入を有するように見える。特別なリポソーム調製に伴う毒性もまた関心がもたれていた。カチオン性リポソームは、反応性酸素中間体の放出を促進することによって用量依存性毒性および肺炎症を誘導し、この効果は、DOTAPのような一価カチオン性リポソームよりも多価カチオン性リポソームでより顕著である（Dokka et al.,2000）。中性および負のリポソームは肺毒性を呈するようには見えない（Guitierrez-Puente et al.,1999）。カチオン性リポソームは、核酸を効果的に取り込みつつ、場合により、それらの安定な細胞内性質、および結果としてsiRNA内容物を放出できないことのため、インビボ遺伝子ダウンレギュレーションについて制限された成功を有した。
【００２７】
本発明者らは、中性特性、およびインビボにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達での成功のため、中性化された電荷を持つ中性を持つ脂質または脂質組成物、例えば、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（DOPC）を選択した。本発明者らは、最近、進行した卵巣癌の同所性モデルにおいて中性リポソームを用いる高度に効率的かつ有効なインビボsiRNA送達を示した（参照によりその全体を本明細書に組み入れる（Landen et al.,2005）。例えば、DOPC-siRNA複合体の静脈内注射は、カチオン性（正に荷電した）リポソーム（DOTAP）またはパッキングされていない「裸の」siRNAでのいずれかの送達よりも、腫瘍実質への有意により高い程度のsiRNA沈積を可能とした。DOPC処方は腫瘍実質における細胞の30％以上にsiRNAを送達したが、裸のsiRNAは細胞の約3％に送達されたに過ぎず、かつDOTAPはsiRNAのみを血管系に直ぐに隣接する腫瘍細胞に送達したに過ぎなかった。引き続いての研究において、本発明者らはEphA2受容体チロシンキナーゼmRNAに特異的なDOPC-siRNAの使用は、腫瘍においてタンパク質発現をダウンレギュレートし、HeyA8およびSKOV3ipl卵巣癌細胞系双方の腫瘍成長を低下することを示した。単独で用いる場合、EphA2ダウンレギュレーションは非特異的siRNAと比較して30〜50％の腫瘍成長の低下に導いた。パクリタキセルとの組合せにおいて、対照腫瘍と比較して95％までの成長のより大きな低下さえあった。組合せ療法は、パクリタキセル単独よりも60〜70％効果的であった。また、治療は、腹水形成および形成された節の合計数を低下させるのにも効果的であったが、腫瘍形成の発生に対して効果を有さなかった（Landen et al.,2005）。明白な毒性はDOPC-siRNA処置動物で観察されなかった。さらに、肝臓、腎臓、乳房、肺および脳を含む複数の器官の調査は組織学的毒性を明らかにしなかった。白脾髄のわずかな増加が全てのsiRNA処置動物において認められ、これは、一般的な炎症応答を示すことができる。
【００２８】
「標的化された」癌療法は、今日、アップフロントおよびサルベージ療法のための癌療法に取り込まれつつあるが、毒性に関する問題はかなりの臨床的問題を残したままである（Ellis et al.,2005）。正常な健康な成人組織において異なる過剰発現腫瘍を有し、かつほとんどないし全く発現を有さない遺伝子（例えば、EphA2）を標的化するためのsiRNAの使用は、毒性なしで腫瘍細胞の選択的標的化を可能とすることができる。
【００２９】
伝統的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNAは遺伝子-標的化に関して非常に選択的であるが、増大しつつあるデータは、オフターゲット（Jackson et al.,2003）または、免疫-活性化効果（Kim et al.,2004；Samuel,2004）が起こり得ることを示唆する。インターフェロン系は、二本鎖RNA（dsRNA）の存在に対してかなり感受性である。最近の研究は、化学的に合成されたsiRNAはそうではないが、ファージRNAポリメラーゼを用いて合成されたsiRNAは種々の細胞系においてインターフェロンの優れた誘導をトリガーすることができることを示唆する（Schifflelers et al.,2004；Jackson et al.,2003；Kim et al.,2004）。
【００３０】
siRNAはアンチセンス分子より安定であるように見えるが血清ヌクレアーゼはsiRNAを分解できる（Leung and Whittaker,2005）。従って、いくつかの研究グループは、部分的ホスホロチオエート骨格および2’-0-メチル糖修飾またはボラノホスフェートsiRNAを持つ化学的に安定化されたsiRNAのような修飾を開発した（Leung and Whittaker,2005）。Elmenおよび同僚はsiRNAを、合成RNA様高親和性ヌクレオチドアナログであるロックされた核酸（LNA）で修飾し、これは、遺伝子サイレンシング能力に影響することなく、siRNAの血清半減期を有意に増強させ、構造を安定化させた（Elmen et al.,2005）。化学的修飾（ピロリジンリンカーによるsiRNAのセンス鎖の3’末端へのコレステロールのコンジュゲーション）を含む別のアプローチも、機能に影響することなく全身送達を可能とすることができる（Soutschek et al.,2004）。本発明の局面は、記載された組成物および方法と組み合わせたこれらの修飾戦略の各々を用いることができる。
【００３１】
B. βアドレナリン作動性受容体、および癌細胞成長のストレス関連増悪
本発明者らは最近、卵巣腫瘍モデルを用いて脈管形成を促進することによって、慢性ストレスが腫瘍成長を加速することを示した。本発明者は、RT-PCRによって19の卵巣癌細胞系を、β1およびβ2アドレナリン作動性受容体（βAR）の存在または非存在についてスクリーニングした。βARヌル（A2780およびRMG2）および陽性（HeyA8およびSKOV3ip1）卵巣癌細胞を、ストレス開始から10日後にマウスに腹腔内注射した。β1、β2または双方の受容体に対するリポソーム（DOPC）siRNAを用いるブロッキング実験を行った。顕著には、β2 siRNAは、腫瘍重量、節の数、癌の転移の侵入パターンのストレス誘導増加を完全にブロックした。組み合わせたβ1およびβ2 siRNAで処理したマウスはβ2 siRNAのみの群と同様な結果を有した。これらの研究は、慢性ストレスの効果が、主として、卵巣癌細胞上のβ2ARを通じて媒介されることを示す。従って、βARの標的化は卵巣癌の管理のための治療的重要性を有し得る。
【００３２】
II. 脂質調製
本発明は、siNA（例えば、siRNA）のような阻害性核酸を脂質および/またはリポソームと会合させるための方法および組成物を提供する。siNAはリポソームの水性内部にカプセル化することができ、リポソームの脂質二重層内に介在させることができ、リポソームおよびポリヌクレオチド双方と会合する連結分子を介してリポソームに付着させることができ、リポソームに捕獲することができ、リポソームと複合体化することができ、脂質を含有する溶液中に分散させることができ、脂質と混合することができ、脂質と組み合わせることができ、脂質中に懸濁液として含有することができ、ミセルと共に含有させ、またはそれと複合体化させることができ、あるいはそうでなければ脂質と会合させることができる。本発明のリポソームまたはリポソームsiNA会合組成物は溶液中のいずれかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは二重層構造中に、ミセルとして、または「崩壊した」構造にて存在させることができる。また、それらは溶液中に単純に介在させることもでき、場合により、サイズまたは形状が不均一な凝集体を形成する。
【００３３】
脂質は天然の、または合成脂質であってもよい脂肪物質である。例えば、脂質は細胞質中で天然の脂肪液滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのような長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含有する当業者に周知の化合物のクラスを含む。その例は脂質ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）である。
【００３４】
「リポソーム」は、包まれた脂質二重層または凝集体の発生によって形成される種々の単層、多重膜および多小胞脂質ビヒクルを含む一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を持つ小胞構造を有するものとして特徴付けることができる。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水性溶液に懸濁している場合に自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造、および捕獲水、および脂質二重層の間の溶解した溶質の形成前に自己再編成を受ける（Ghosh and Bachhawat,1991）。しかしながら、本発明は、正常な小胞構造よりも溶液中に異なる構造を有する組成物も含む。例えば、脂質はミセル構造を採ることができるか、単純に、脂質分子の不均一凝集体として存在することができる。また、リポフェクタミン核酸複合体も考えられる。
【００３５】
リポソーム媒介ポリヌクレオチド送達およびインビトロでの外来性DNAの発現は非常に成功してきた。Wong et al.（1980）は、培養されたヒヨコ胚、HeLaおよび肝臓癌細胞における、リポソーム媒介送達および外来性DNAの発現の可能性を示した。Nicolau et al.（1987）は、静脈内注射後に、ラットにおける成功したリポソーム媒介遺伝子導入を達成した。
【００３６】
本発明のある態様において、脂質は赤血球凝集ウィルス（HVJ）と会合することができる。これは、細胞膜との融合を容易とし、リポソームカプセル化DNAの細胞進入を促進することが示されている（Kaneda et al.,1989）。他の態様において、脂質は核非ヒストン染色体タンパク質（HMG-1）と複合体化することができるか、または該タンパク質と組み合わせて使用することができる（Kato et al.,1991）。なおさらなる態様において、脂質はHVJおよびHMG-1双方と複合体化させることができるか、あるいはその双方と組み合わせて使用することができる。そのような発現ベクターがインビトロおよびインビボにおいてポリヌクレオチドの導入で成功して使用されてきたことにおいて、それらは本発明で適用することができる。
【００３７】
A. 中性リポソーム
本明細書において、「中性リポソームまたは脂質組成物」、あるいは「非荷電リポソームまたは脂質組成物」は、本質的に中性の正味の電荷を生じる一つまたは複数の脂質を有するリポソームまたは脂質組成物と定義される（実質的に非荷電）。「本質的に中性」、または「本質的に非荷電」とは、所与の集団（例えば、リポソームの集団）内の、もしあれば、少数の脂質が、もう1つの成分の反対電荷によって相殺されない電荷を含むことを意味する（例えば、成分の10％よりも少数が、より好ましくは5％よりも少数が、最も好ましくは1％よりも少数が非相殺電荷を含む）。本発明のある態様において、組成物を調製することができ、該組成物の脂質成分は本質的に中性であるが、リポソームの形態ではない。
【００３８】
ある態様において、中性リポソームまたは脂質組成物は、それ自体が中性であるほとんどの脂質および/またはリン脂質を含むことができる。ある態様において、両親媒性脂質を取り込むか、またはそれを用いて、中性のリポソームまたは脂質組成物を生じさせることができる。例えば、中性リポソームは、電荷が実質的に相互を相殺するように、正におよび負に荷電した脂質を合わせることによって生じさせることができる。そのようなリポソームについては、もしあれば、少数の荷電脂質が存在し、その電荷は反対に荷電した脂質によって相殺されない（例えば、荷電脂質の10％よりも少数、より好ましくは5％よりも少数が、最も好ましくは1％よりも少数が、相殺されない電荷を有する）。また、前記アプローチを用いて、組成物の脂質成分がリポソームの形態でない中性脂質組成物を生じさせることができることも認識される。
【００３９】
ある態様において、中性リポソームを用いて、siRNAを送達することができる。中性リポソームは、単一遺伝子の翻訳の抑制に向けられたsiRNAを含有することができ、あるいは中性リポソームは、複数遺伝子の翻訳の抑制に向けられた複数siRNAを含有することができる。さらに、中性リポソームは、siRNAに加えて、化学治療剤を含有することもできる；従って、ある態様において、化学治療剤およびsiRNAを同一または別々の組成物中で細胞（例えば、ヒト対象における癌性細胞）に送達することができる。中性リポソームを用いる利点は、カチオン性リポソームに応答して観察されてきた毒性とは対照的に、中性リポソームの結果としてほとんどまたは全く毒性がこれまで観察されていないことである。
【００４０】
B. リン脂質
本発明の脂質組成物はリン脂質を含むことができる。ある態様において、単一種類またはタイプのリン脂質を、リポソームのようなある種の脂質組成物で用いることができる（例えば、中性リポソームを生じさせるのに用いるDOPC）。他の態様において、1より多い種類またはタイプのリン脂質を用いることができる。
【００４１】
リン脂質はグリセロリン脂質およびある種のスフィンゴ脂質を含む。リン脂質は、限定されることなく、ジオレオイルホスファチジルコリン（「DOPC」）、卵ホスファチジルコリン（「EPC」）、ジラウロイルホスファチジルコリン（「DLPC」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「DMPC」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「DPPC」）、ジステアロイルホスファチジルコリン（「DSPC」）、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン（「MPPC」）、1-パルミトイル-2-ミリストイルホスファチジルコリン（「PMPC」）、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン（「PSPC」）、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン（「SPPC」）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（「DLPG」）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「DPPG」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「DSPG」）、ジステアロイルスフィングミエリン（「DSSP」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「DSPE」）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（「DOPG」）、ジミリストイルホスファチジン酸（「DMPA」）、ジパルミトイルホスファチジン酸（「DPPA」）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「DMPE」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「DPPE」）、ジミリストイルホスファチジルセリン（「DMPS」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「DPPS」）、脳ホスファチジルセリン（「BPS」）、脳スフィンゴミエリン（「BPS」）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（「DPSP」）、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DAPC」）、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DBPC」）、1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DEPC」）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「DOPE」）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（「POPC」）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「POPE」）、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミンおよびジリノレオイルホスファチジルコリンを含む。
【００４２】
リン脂質は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルエタノールアミンを含む；ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンは生理学的条件下で（すなわち、約pH7において）荷電していないので、これらの化合物は中性リポソームを生じさせるのに特に有用であり得る。ある態様において、リン脂質DOPCを用いて、非荷電リポソームまたは脂質組成物を生じさせる。ある態様において、リン脂質でない脂質（例えば、コレステロール）を用いることもできる。
【００４３】
リン脂質は天然または合成源からのものであってもよい。しかしながら、卵または大豆ホスファチジルコリン、脳ホスファチジン酸、脳または植物ホスファチジルイノシトール、心臓カルジオリピンおよび植物または細菌ホスファチジルエタノールアミンのような天然源からのリン脂質を（全ホスファチド組成の50％以上を構成する）一次ホスファチドとしてある態様で用いない。なぜなら、これは得られたリポソームの不安定性および漏出をもたらしかねないからである。
【００４４】
C. リポソームの生産
本発明のリポソームおよび脂質組成物は異なる方法によって作成することができる。例えば、ヌクレオチド（例えば、siRNA）は、エタノールおよびカルシウムが関連する方法を用いて中性リポソームにカプセル化することができる（Bailey and Sullivan,2000）。リポソームのサイズは、合成の方法に依存して変化する。水性溶液に懸濁させたリポソームは、一般には、球状小胞の形状であり、脂質二重層分子の一つまたは複数の同心層を有することができる。各層は式XYによって表される分子の平行アレイからなり、Xは親水性部分であって、Yは疎水性部分である。水性懸濁液において、同心層は、親水性部分が水相と接触したままにある傾向があり、疎水性領域が自己会合する傾向があるように配置される。例えば、水相はリポソーム内および外双方に存在する場合、脂質分子は、配置XY-YXのラメラとして公知の二重層を形成することができる。脂質の凝集体は、1より多い脂質分子の親水性および疎水性部分が相互に会合するようになると形成され得る。これらの凝集体のサイズおよび形状は、溶媒の性質、および溶液中の他の化合物の存在のような多くの異なる変数に依存する。
【００４５】
本発明に従って用いるのに適した脂質は商業的源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）は、Sigma Chemical Co.,から入手することができ、リン酸ジセチル（「DCP」）は、K＆K Laboratories（Plainview,N.Y.）から入手することができ、コレステロール（「Chol」）はCalbiochem-Behringから入手することができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）および他の脂質はAvanti Polar Lipids,Inc.（Birmingham,Ala.）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質のストック溶液は約-20℃で貯蔵することができる。クロロホルムは唯一の溶媒として用いることができる。なぜなら、それはメタノールよりも容易に蒸発するからである。
【００４６】
本発明の範囲内にあるリポソームは、公知の実験室的技術に従って調製することができる。ある態様において、リポソームは容器（例えば、ガラス、梨形状フラスコ）中の溶媒中でリポソーム脂質を混合することによって調製される。容器は、典型的には、リポソームの予測される懸濁液の容量よりも10倍大きな容量を有する。ロータリーエバポレーターを用い、溶媒は負圧下でほぼ40℃で除去することができる。溶媒は、リポソームの所望の容量に応じて、約5分〜2時間内に除去することができる。組成物は真空下でデシケーター中でさらに乾燥することができる。乾燥した脂質は、全ての脂質フィルムが再懸濁されるまで震盪することによって滅菌発熱物質なしの水中でほぼ25〜50mMリン脂質にて水和させることができる。次いで、水性リポソームをアリコットに分離することができ、各々をバイアルに入れ、凍結乾燥し、真空下でシールする。
【００４７】
リポソームは他の公知の実験室的手法：その内容を参照により本明細書に組み入れるBangham et al.（1965）の方法；その内容を参照により本明細書に組み入れるDRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE（1979）に記載されたGregoriadisの方法；その内容を参照により本明細書に組み入れるDeamer and Uster（1983）の方法；およびSzoka and Papahadjopoulos（1978）によって記載された逆相蒸発方法に従って調製することもできる。前記した方法は、水性物質を捕獲するそれらの各能力、およびそれらの各水性空間対脂質比率が異なる。
【００４８】
乾燥した脂質または凍結乾燥したリポソームは脱水し、阻害性ペプチドの溶液中で元に戻し、適切な溶媒（例えば、DPBS）で適当な濃度まで希釈することができる。次いで、混合物をボルテックスミキサー中で激しく震盪することができる。カプセル化されていない核酸は29,000gでの遠心分離によって除去し、リポソームペレットを洗浄することができる。洗浄されたリポソームは適当な合計リン脂質濃度（例えば、約50〜200mM）にて再懸濁させることができる。カプセル化された核酸の量は標準的な方法に従って測定することができる。リポソーム調製物中にカプセル化された核酸の量の測定の後、リポソームを適当な濃度まで希釈し、使用するまで4℃で貯蔵することができる。
【００４９】
III. 遺伝子発現の阻害
本明細書において、阻害性核酸または「siNA」は、短い干渉性核酸と定義される。siNAの例は、限定されることなく、RNAi、二本鎖RNA、およびsiRNAを含む。siNAは細胞中での遺伝子の転写または翻訳を阻害することができる。siNAは16〜1000以上のヌクレオチドの長さとすることができ、ある態様において、18〜100ヌクレオチド長とすることができる。ある態様においては、siNAは16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチド長とすることができる。siNAは核酸および/または核酸アナログを含むことができる。典型的には、siNAは細胞内での単一遺伝子の翻訳を阻害する；しかしながら、ある態様においては、siNAは細胞内で1より多い遺伝子の翻訳を阻害する。
【００５０】
siNA内では、核酸の成分は全体を通じて同一のタイプまたは均一である必要はない（例えば、siNAはヌクレオチドおよび核酸またはヌクレオチドアナログを含むことができる）。典型的には、siNAは二本鎖構造を形成し；二本鎖構造は、部分的にまたは完全に相補的な2つの別々の核酸から由来することができる。本発明のある態様において、siNAはただ1つの単一核酸（ポリヌクレオチド）または核酸アナログを含むことができ、それ自体を補充することによって二本鎖構造を形成することができる（例えば、ヘアピンループの形成）。siNAの二本鎖構造は、その間の全ての範囲を含む、16、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90〜100、150、200、250、300、350、400、450、500以上の連続ヌクレオベースを含むことができる。siNAは17〜35連続ヌクレオベース、より好ましくは18〜30連続ヌクレオベース、より好ましくは19〜25ヌクレオベース、より好ましくは20〜23連続ヌクレオベース、または20〜22連続ヌクレオベース、または21連続ヌクレオベースを含むことができ、それは、（同一核酸のもう1つの部分、または別の相補的核酸であり得る）相補的核酸とハイブリダイズして、二本鎖構造を形成する。
【００５１】
siNA（例えば、siRNA）は当技術分野において周知である。例えば、siRNAおよび二本鎖RNAは、その全てを参照によりその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第6,506,559号および第6,573,099号、ならびに米国特許出願第2003/0051263号、第2003/0055020号、第2004/0265839号、第2002/0168707号、第2003/0159161号、および2004/0064842号に記載されている。
【００５２】
A. RNA干渉
本発明の方法を実施するのに有用な本発明の剤は、限定するものではないが、FAKのsiRNA、EphA2、またはβ2ARを含む。典型的には、そのような剤は（i）各mRNAに結合し、（ii）シグナリングに干渉し、および/または（iii）増殖癌または腫瘍細胞を阻害することができる。好ましい態様において、細胞増殖を阻害する剤はFAKのsiRNAである。本発明は、RNA干渉を用いてFAK発現を変調する組成物および方法を提供する。これらの方法および組成物は、病気（例えば、癌）の治療、アポトーシスの誘導、および/または生物学的経路との干渉で有用である。
【００５３】
または、典型的には、小干渉性RNA（siRNA）と本明細書においていうことができる二本鎖RNA（dsRNA）の導入は、優れたかつ特異的遺伝子サイレンシング、RNA干渉またはRNAiと呼ばれる現象を誘導する。この現象は線虫C.elegansにおいて広く記載されている（Fire et al.,1998）が、トリパノソーマーからマウスの範囲の他の生物に分布している。議論する生物に応じて、RNA干渉は「共抑制」、「転写後遺伝子サインレンシング」、「センス抑制」、および「クエリング」といわれてきた。RNAiは魅力的なバイオテクノロジーツールである。なぜなら、それは、特異的遺伝子の活性をノックアウトするための手段を提供するからである。
【００５４】
本発明のある態様において、本発明の方法で用いる剤はFAKのsiRNA、EphA2、β2ARおよびその組合せである。siRNAを用いて、FAK、EphA2、および/またはβ2ARの発現レベルを低下させることができる。FAKのsiRNA、EphA2、および/またはβ2ARはFAK、EphA2、および/またはβ2ARのmRNAにハイブリダイズし、それにより、FAK、EphA2、および/またはβ2ARタンパク質の生産を減少させ、または阻害する。
【００５５】
RNAiを設計するにおいて、siRNAの性質、サイレンシング効果の持続、および送達系の選択のような考慮する必要があるいくつかの因子がある。RNAi効果を生じさせるためには、生物に導入されるsiRNAは典型的には外因性配列を含有する。さらに、RNAiプロセスは相同性依存性であり、従って、配列は、相同であるが遺伝子特異的ではない配列の間の交差干渉の可能性を最小化しつつ、遺伝子特異性を最大化するように注意深く選択されなければならない。好ましくは、siRNAは、siRNAの配列および阻害すべき遺伝子の間の80、85、90、95、98％を超えるまたは100％さえの同一性を呈する。標的遺伝子に対して約80％未満の配列は実質的に効率が低い。従って、FAKのsiRNA、EphA2、および/またはβ2AR、およびその発現を阻害すべきFAK、EphA2、および/またはβ2AR遺伝子の間の相同性がより大きければ、無関係の遺伝子の発現はあまり影響しなくなる。
【００５６】
加えて、siRNAのサイズは重要な考慮である。一般に、本発明は、FAK、EphA2、および/またはβ2ARのsiRNA分子に関し、これは、二本鎖または一本鎖であり、少なくとも約19〜25ヌクレオチドを含み、FAK、EphA2、および/またはβ2ARの遺伝子発現を変調できる。本発明との関係では、siRNAは好ましくは長さが500、200、100、50または25ヌクレオチド未満である。より好ましくは、siRNAは長さが約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチドである。
【００５７】
1つの局面において、本発明は、一般には、FAK、EphA2、および/またはβ2ARの少なくとも10であるが、30を超えない連続ヌクレオチドに対して実質的に相補的であり、FAK、EphA2、および/またはβ2AR遺伝子またはタンパク質の発現を低下させる、少なくとも1つのストランドを有する少なくとも19ヌクレオチドの単離されたsiRNA分子を特徴とする。本発明の好ましい態様において、siRNA分子は、ヒトFAK（各々、GenBankアクセッションNM＿005607およびNM＿153831、配列番号：5および6）、EphA2（GenBankアクセッションBC037166（GI：33879863）、配列番号：18）、および/またはβ2AR（GenBankアクセッションAF022953（GI：2570526）、配列番号：19）についてのmRNAの少なくとも10であるが、30を超えない連続ヌクレオチドに対して実質的に相補性である少なくとも1つのストランドを有する。各GenBankアクセッションを、2005年4月15日現在、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。なおさらなる局面において、単離されたsiRNAは、FAK、（各々、配列番号：5および6）、EphA2（配列番号：18）および/またはβ2AR（配列番号：19）の少なくとも19〜25連続ヌクレオチドに対して本質的に相補的である少なくとも1つのストランドを有する。本発明のある態様においては、siRNA核酸配列は
2008536874.tif 000002
である。
【００５８】
もう1つの好ましい態様において、FAK、EphA2、および/またはβ2ARのsiRNA分子は、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：18および配列番号：19に示された核酸配列の少なくとも10連続ヌクレオチドに対して少なくとも75、80、85、または90％相同、好ましくは95％、99％、または100％相同である配列を含む。過度な実験なしで、かつ本発明の開示を用い、FAK、EphA2、および/またはβ2AR発現を変調するFAK、EphA2、および/またはβ2ARのさらなるsiRNAを設計し、本発明の方法を実施するのに用いることができることが理解される。
【００５９】
siRNAは一つまたは複数のヌクレオチドの改変を含むことができる。そのような改変は19〜25ヌクレオチドRNAの末端、または（RNAの一つまたは複数のヌクレオチドにおける）内部へのような、非ヌクレオチド物質の添加を含むことができる。ある局面においては、RNA分子は3’-ヒドロキシル基を含有する。本発明のRNA分子中のヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む非標準ヌクレオチドを含むこともできる。二本鎖オリゴヌクレオチドは修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または当技術分野において公知の他の修飾された骨格を含有することができ、あるいは非天然ヌクレオチド間結合を含有することができる。siRNAのさらなる修飾（例えば、2’-O-メチルリボヌクレオチド、2’-デオキシ-2’-フルオロリボヌクレオチド、「普遍的塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、一つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および逆転したデオキシ塩基残基取り込み）は、（その各々を参照によりの全体を組み入れる）米国出願公開20040019001および米国特許第6,673,611号に見出すことができる。集合的に、前記した全てのそのような改変された核酸またはRNAは修飾されたsiRNAという。
【００６０】
好ましくは、RNAiはFAK、EphA2、および/またはβ2AR遺伝子またはタンパク質の細胞中での発現を、少なくとも10％、20％、30％、または40％、より好ましくは少なくとも50％、60％、または70％、最も好ましくは少なくとも75％、80％、90％、95％以上だけ減少させることができる。
【００６１】
siRNAの細胞への導入は、例えば、それからsiRNAを転写することができる核酸を含むベクターのマイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたはトランスフェクションを含む当技術分野において公知の方法によって達成することができる。あるいは、siRNAは、標的mRNA転写体に結合できる形態で細胞に直接的に導入することができる。持続性および膜浸透性を増加させるために、siRNAをリポソーム、ポリ-L-シリン、脂質、コレステロール、リポフェクチンまたはその誘導体と組合せ、またはそれで修飾することができる。ある局面において、コレステロールコンジュゲーテッドsiRNAを用いることができる（Song et al.,2003参照）。
【００６２】
IV. 核酸
本発明は、中性リポソームを介するsiNAの送達のための方法および組成物を提供する。siNAは核酸から構成されるので、核酸に関連する方法（例えば、核酸の生産、核酸の修飾、等）をsiNAの関連で用いることもできる。
【００６３】
用語「核酸」は当技術分野において周知である。本明細書において、「核酸」とは、一般には、ヌクレオベースを含む、DNA、RNAまたはその誘導体もしくはアナログの分子（すなわち、ストランド）をさす。ヌクレオベースは、例えば、DNAに見出される（例えば、アデニン「A」、グアニン「G」、チミン「T」またはシトシン「C」）、またはRNAで見出される（例えば、A、G、ウラシル「U」またはC）天然のプリンまたはピリミジン塩基を含む。用語「核酸」は用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、各々は用語「核酸」の亜属としてのものである。用語「オリゴヌクレオチド」とは、長さが3〜約100ヌクレオベースの間の分子をさす。用語「ポリヌクレオチド」とは、長さが約100ヌクレオベースよりも大きな少なくとも1つの分子をさす。
【００６４】
これらの定義は、一本鎖または二本鎖核酸分子をさす。二本鎖核酸は十分に相補的な結合によって形成されるが、いくつかの態様においては、二本鎖核酸は部分的または実質的相補的結合によって形成され得る。従って、核酸は、典型的には、分子を含む特定の配列の一つまたは複数の相補的なストランドまたは「相補体」を包含する二本鎖分子を含包するとができる。本明細書において、一本鎖核酸は接頭語「ss」によって示すことができ、二本鎖核酸は接頭語「ds」によって示すことができる。
【００６５】
A. ヌクレオベース
本明細書において、「ヌクレオベース」とは、例えば、少なくとも1つの天然の核酸（すなわち、DNAおよびRNA）に見出される天然のヌクレオベース（すなわち、A、T、G、CまたはU）およびそのようなヌクレオベースの天然のまたは非天然の誘導体およびアナログのような複素環塩基をさす。ヌクレオベースは、一般には、天然のヌクレオベース対合のために置き換えることができるように、少なくとも1つの天然のヌクレオベースとで一つまたは複数の水素結合を形成（「アニール」または「ハイブリダイズ」）することができる（例えば、AおよびT、GおよびC、ならびにAおよびUの間の水素結合）。
【００６６】
「プリン」および/または「ピリミジン」ヌクレオベースは、天然のプリンおよび/またはピリミジンヌクレオベースおよび、また、その誘導体およびアナログを包含し、限定されることなく、アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、チオールまたはアルキルチオール部分の一つまたは複数によって置換されたプリンまたはピリミジンを含む。好ましいアルキル（例えば、アルキル、カルボキシアルキルなど）部分は、約1、約2、約3、約4、約5、〜約6の炭素原子を含む。プリンまたはピリミジンの他の非限定的例はデアザプリン、2,6-ジアミノプリン、5-フルオロウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、8-ブロモグアニン、8-クロログアニン、ブロモチミン、8-アミノグアニン、8-ヒドロキシグアニン、8-メチルグアニン、8-チオグアニン、アザグアニン、2-アミノプリン、5-エチルシトシン、5-メチルシトシン、5-ブロモウラシル、5-エチルウラシル、5-ヨードウラシル、5-クロロウラシル、5-プロピルウラシル、チオウラシル、2-メチルアデニン、メチルチオアデニン、N,N-ジメチルアデニン、アザアデニン、8-ブロモアデニン、8-ヒドロキシアデニン、6-ヒドロキシアミノプリン、6-チオプリン、4-（6-アミノヘキシル/シトシン）などを含む。プリンおよびピリミジン誘導体またはアナログは、限定されることなく（略語/修飾された塩基記載）：ac4c/4-アセチルシチジン、Mam5s2U/5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、Chm5u/5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、Man q/β,D-マンノシルケオシン、Cm/2’-O-メチルシチジン、Mcm5s2u/5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、Cmnm5s2u/5-カルボキシメチルアミノ-メチル-2-チオウリジン、Mcm5u/5-メトキシカルボニルメチルウリジン、Cmnm5u/5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、Mo5u/5-メトキシウリジン、D/ジヒドロウリジン、Ms2i6a、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、Fm/2’-O-メチルプソイドウリジン、Ms2t6a/N-（（9-β-D-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル）カルバモイル）スレオニン、Gal q/β,D-ガラクトシルケオシン、Mt6a/N-（（9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル）N-メチル-カルバモイル）スレオニン、Gm/2’-O-メチルグアノシン、Mv/ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、I/イノシン、o5u/ウリジン-5-オキシ酢酸（v）、I6a/N6-イソペンテミルアデノシン、Osyw/ワイブトキソシン、m1a/1-メチルアデノシン、P/プソイドウリジン、m1f/1-メチルプソイドウリジン、Q/ケオシン、m1g/1-メチルグアノシン、s2c/2-チオシチジン、m1I/1-メチルイノシン、s2t/5-メチル-2-チオウリジン、m22g/2,2-ジメチルグアノシン、s2u/2-チオウリジン、m2a/2-メチルアデノシン、s4u/4-チオウリジン、m2g/2-メチルグアノシン、T/5-メチルウリジン、m3c/3-メチルシチジン、t6a/N-（（9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル）カルバモイル）スレオニン、m5c/5-メチルシチジン、Tm/2’-O-メチル-5-メチルウリジン、m6a/N6-メチルアデノシン、Um/2’-O-メチルウリジン、m7g/7-メチルグアノシン、Yw/ワイブトシン、Mam5u/5-メチルアミノメチルウリジン、またはX/3-（3-アミノ-3-カルボキシプロピル）ウリジン、（acp3）uを含む。
【００６７】
ヌクレオベースは、本明細書において記載された、または当業者に公知のいずれかの化学的または天然合成方法を用いてヌクレオシドまたはヌクレオチド中に含めることができる。
【００６８】
B. ヌクレオシド
本明細書において、「ヌクレオシド」とは、ヌクレオベースリンカー部分に共有結合したヌクレオベースを含む個々の化学ユニットをさす。「ヌクレオベースリンカー部分」の非限定的例は、限定されることなく、デオキシリボース、リボース、アラビノース、または5-炭素糖の誘導体もしくはアナログを含む5-炭素原子を含む糖（すなわち、「5-炭素糖」）である。5-炭素糖の誘導体またはアナログの非限定的例は2’-フルオロ-2’-デオキシリボースまたは炭素環糖を含み、炭素は糖環において酸素原子と置き換えられる。
【００６９】
ヌクレオベースリンカー部分へのヌクレオベースの異なるタイプの共有結合は当技術分野において公知である。非限定的例として、プリン（すなわち、AまたはG）を含むヌクレオベースまたは7-デアザプリンヌクレオベースが、典型的には、プリンまたは7-デアザプリンの9位置を5-炭素糖の1’位置に共有結合させる。もう1つの非限定的例において、ピリミジンヌクレオベース（すなわち、C、TまたはU）を含むヌクレオシドは、典型的には、ピリミジンの1位置を5-炭素糖の1’-位置に共有結合させる（Kornberg and Baker,1992）。
【００７０】
C. ヌクレオチド
本明細書において、「ヌクレオチド」とは、さらに、「骨格部分」を含むヌクレオシドをいう。骨格部分は、一般には、ヌクレオチドを、ヌクレオチドを含むもう1つの分子に、またはもう1つのヌクレオチドに共有結合させて、核酸を形成する。天然のヌクレオチドにおける「骨格部分」は、典型的には、5’-炭素糖に共有結合するリン部分を含む。骨格部分の結合は、典型的には、5’-炭素糖の3’-または5’-位置いずれかで起こる。しかしながら、特に、ヌクレオチドが天然の5-炭素糖、またはリン部分の誘導体またはアナログを含む場合に、他のタイプの結合が当技術分野において公知である。
【００７１】
D. 核酸アナログ
核酸は、ヌクレオベースの誘導体またはアナログ、ヌクレオベースリンカー部分および/または天然の核酸に存在してもよい骨格部分と含むことができ、または全部がそれから構成され得る。本明細書において、「誘導体」とは、天然の分子の化学的に修飾された、または改変された形態をさし、他方、用語「ミミック」または「アナログ」とは、天然の分子または部分に構造的に類似してもしなくてもよいが、同様な機能を保有する分子をいう。本明細書において、「部分」とは、一般には、より大きな化学的または分子構造のより小さな化学的または分子成分をさす。ヌクレオベース、ヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログまたは誘導体は当技術分野において周知であり、記載されてきた（例えば、参照により本明細書に組み入れるScheit,1980参照）。
【００７２】
ヌクレオシド、ヌクレオチド、または5-炭素糖を含む核酸および/または骨格部分誘導体またはアナログのさらなる非限定的例は、dsDNAとで三重ラセンを形成し、および/またはdsDNAの発現を妨げるプリン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,681,947号；特に、蛍光核酸プローブとして用いるためのDNAまたはRNAに見出されるヌクレオシドの蛍光アナログを取り込む核酸を記載する米国特許第5,652,099号および第5,763,167号；増強されたヌクレアーゼ安定性を保有するピリミジン環上の置換を持つオリゴヌクレオチドアナログを記載する米国特許第5,614,617号；核酸検出で用いる修飾された5-炭素糖（すなわち、修飾された2’-デオキシフラノシル部分）を持つオリゴヌクレオチドアナログを記載する米国特許第5,670,663号、第5,872,232号および5,859,221号；ハイブリダイゼーションアッセイで用いることができる水素以外の置換基で4’位置が置換された少なくとも1つの5-炭素糖部分を含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,446,137号；3’-5’ヌクレオチド間結合を持つデオキシリボヌクレオチド、および2’-5’ヌクレオチド間結合を持つリボヌクレオチド双方を持つオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,886,165号；ヌクレオチド間結合の3’-位置酸素が炭素によって置き換えられて、核酸のヌクレアーゼ抵抗性を増強させる修飾されたヌクレオチド間結合を記載する米国特許第5,714,606号；ヌクレアーゼ抵抗性を増強する一つまたは複数の5’メチレンホスホネートヌクレオチド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,672,697号；増強されたヌクレアーゼ安定性、および薬物または検出部分を送達する能力を提供するためにオリゴヌクレオチドの2’炭素に対する薬物または標識を含むことができる置換基部分の結合を記載する米国特許第5,466,786号および第5,792,847号；隣接する5-炭素糖部分の4’位置および3’位置を付着させて、増強された細胞摂取、ヌクレアーゼに対する抵抗性、および標的RNAへのハイブリダイゼーションを提供する、2または3炭素骨格結合を持つオリゴヌクレオチドアナログを記載する米国特許第5,223,618号；核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用な少なくとも1つのスルファメートまたはスルファミドヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,470,967号；改良されたヌクレアーゼ抵抗性、細胞取り込みおよびRNA発現の調節で用いられるホスホジエステル骨格部分を置き換える3または4原子リンカー部分を持つオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,378,825号、第5,777,092号、第5,623,070号、第5、610,289号および第5,602,240号；増強されたそれらの膜浸透性および安定性に対するオリゴヌクレオチドの2’-O位置に付着された疎水性担体薬物を記載する米国特許第5,858,988号；DNAまたはRNAへの増強されたハイブリダイゼーション；ヌクレアーゼに対する増強された安定性を保有する5’末端におけるアントラキノンにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,214,136号；DNAが、増強されたヌクレアーゼ抵抗性、結合親和性およびRNase Hを活性化する能力のための2’-デオキシ-エリスロ-ペントフラノシルヌクレオチドを含むPNA-DNA-PNAキメラを記載する米国特許第5,700,922号；およびDNAに連結されてDNA-RNAハイブリッドを形成するRNAを記載する米国特許第5,708,154号におけるものを含む。
【００７３】
E. ポリエーテルおよびペプチド核酸
ある態様において、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの誘導体またはアナログを含む核酸は本発明の方法および組成物で用いることができると考えられる。非限定的例は参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,908,845号に記載された「ポリエーテル核酸」である。ポリエーテル核酸においては、一つまたは複数のヌクレオベースが、ポリエーテル骨格中のキラル炭素原子に連結されている。
【００７４】
もう1つの非限定的例はその各々を参照により本明細書に組み入れる、米国特許第5,786,461号、第5,891,625号、第5,773,571号、第5,766,855号、第5,736,336号、第5,719,262号、第5,714,331号、第5,539,082号、およびWO92/20702に記載された、「PNA」としても公知の「ペプチド核酸」、「ペプチドベースの核酸アナログ」または「PENAM」である。ペプチド核酸は一般には、DNAおよびRNAのような分子と比較して増強された配列特異性、結合特性、および酵素分解に対する抵抗性を有する（Egholm et al.,1993；PCT/EP/01219）。ペプチド核酸が、一般には、ヌクレオベース部分、5-炭素糖ではないヌクレオベースリンカー部分、および/またはホスフェート骨格部分ではない骨格部分を含む一つまたは複数のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。RNAについて記載されたヌクレオベースリンカー部分の例は、アザ窒素原子、アミドおよび/またはウレイドテサを含む（例えば、米国特許第5,539,082号参照）。PNAについて記載された骨格部分の例は、アミノエチルグリシン、ポリアミド、ポリエチル、ポリチオアミド、ポリスルフィナミドまたはポリスルホンアミド骨格部分を含む。
【００７５】
ある態様において、米国特許第5,891,625号に記載されているように、ペプチド核酸のような核酸アナログを用いて、PCR（商標）におけるように核酸増幅を阻害し、偽陽性を低下させ、単一塩基変異体の間を区別することができる。核酸アナログの他の修飾および使用は当技術分野において公知であり、これらの技術および核酸アナログのタイプを本発明で用いることができると予測される。非限定的例において、米国特許第5,786,461号は、分子の溶解性を増強するためのPNA骨格に付着されたアミノ酸側鎖を持つPNAを記載する。もう1つの例において、PNAの細胞取り込み特性は、親油性基の付着によって増加される。米国特許出願117,363号は、PNAの細胞取り込みを増強するのに用いられるいくつかのアルキルアミノ部分を記載する。もう1つの例は、米国特許第5,766,855号、第5,719,262号、第5,714,331号および5,736,336号に記載されており、これは、配列特異性、溶解性および/または天然の核酸に対する結合親和性における改良を提供するための、天然の、および非天然のヌクレオベースおよびアルキルアミン側鎖を含むPNAを記載する。
【００７６】
F. 核酸の調製
核酸は、化学合成酵素生産または生物学的生産のような当業者に公知のいずれかの技術によって作成することができる。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的例は、ホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホルアミダイト化学を用いるインビトロ化学的合成、および参照により本明細書に組み入れるEP266,032に記載されたような固相技術によって、あるいは各々参照により本明細書に組み入れるFroehler et al.,1986および米国特許第5,705,629号によって記載されたようなデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体を介して作成される核酸を含む。本発明の方法において、一つまたは複数のオリゴヌクレオチドを用いることができる。オリゴヌクレオチド合成の種々の異なるメカニズムは、その各々を参照により本明細書に組み入れる、例えば、米国特許第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813号、第5,264,566号、第4,959,463号、第5,428,148号、第5,554,744号、第5,574,146号、第5,602,244号に開示されている。
【００７７】
酵素により生産された核酸の非限定的例は、PCR（商標）のような増幅反応において酵素によって生産されたもの（例えば、各々参照により本明細書に組み入れる米国特許第4,683,202号および米国特許第4,682,195号参照）、または参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,645,897号に記載されたオリゴヌクレオチドの合成を含む。生物学的に生産された核酸の非限定的な例は、細菌において複製された組換えDNAベクターのような、生細胞において生産された（すなわち複製された）組換え核酸を含む（例えば、参照により本明細書に組み入れるSambrook et al.2001参照）。
【００７８】
G. 核酸の精製
核酸は、ポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム遠心グラジエントで、あるいは当業者に公知のいずれかの他の手段（例えば、参照により本明細書に組み入れるSambrook et al.2001参照）によって精製することができる。
【００７９】
ある態様において、本発明は、単離された核酸である核酸に関する。本明細書において、用語「単離された核酸」とは、一つまたは複数の細胞の全ゲノムおよび転写された核酸のバルクから遊離して単離された、またはそうでなければそれを含まない核酸分子（例えば、RNAまたはDNA分子）をさす。ある態様において、「単離された核酸」とは、例えば、脂質またはタンパク質のような巨大分子、小さな生物学的分子等のような細胞成分またはインビトロ反応成分のバルクから遊離して単離された、またはそうでなければそれを含まない核酸をさす。
【００８０】
H. ハイブリダイゼーション
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズできる」は、二本鎖または三本鎖分子、または部分的な二本鎖または三本鎖性質を持つ分子を形成することを意味すると理解される。本明細書において、用語「アニールする」は「ハイブリダイズする」と同義語である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズできる」は、用語「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」を包含する。
【００８１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」は、相補的配列を含有する一つまたは複数の核酸ストランドの間におけるまたはそれ内でのハイブリダイゼーションを可能とする条件であるが、ランダム配列のハイブリダイゼーションを排除する。ストリンジェントな条件は、核酸および標的ストランドの間の、もしあれば、ほとんどミスマッチを許容しない。そのような条件は当業者に周知であり、高い選択性を必要とする適用で好ましい。非限定的適用は、遺伝子またはその核酸セグメントのような核酸の単離、または少なくとも1つの特異的mRNA転写体またはその核酸セグメントの検出等を含む。
【００８２】
ストリンジェントな条件は、約50℃〜約70℃の温度における約0.02M〜約0.15M NaClによって提供されるような低塩および/または高温条件を含むことができる。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、部分的には、特定の核酸の長さ、標的配列の長さおよびヌクレオベース含有量、核酸の電荷組成、およびハイブリダイゼーション混合物におけるホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他の溶媒の存在または濃度によって決定されると理解される。
【００８３】
また、これらの範囲、組成およびハイブリダイゼーションについての条件は非限定的例のみによって述べられ、特定のハイブリダイゼーション反応についての所望のストリンジェンシーは、一つまたは複数の陽性または陰性で対照との比較によってしばしば経験的に決定されることも理解される。考えられる適用に応じて、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用して、標的配列に向けての核酸の種々の程度の選択性を達成するのが好ましい。非限定的例において、ストリンジェントな条件下で核酸にハイブリダイズしない関連標的核酸の同定または単離は、低温および/または高イオン強度におけるハイブリダイゼーションによって達成することができる。そのような条件は「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と言われ、低ストリンジェンシーの非限定的な例は、約20℃〜約50℃の温度範囲にて約0.15M〜約0.9M NaClで行われるハイブリダイゼーションを含む。もちろん、特定の適用に適合させるために低または高ストリンジェンシー条件をさらに修飾するのは当業者の範囲内のことである。
【００８４】
V. 癌
本発明を用いて、癌のような病気を治療することができる。例えば、siRNAを非荷電リポソームを介して送達して癌を治療することができる。癌は固形腫瘍、転移性癌、または非転移性癌であってもよい。ある態様において、癌は膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮に由来するものであってもよい。ある態様において、癌はヒト卵巣癌である。加えて、癌は、具体的には、限定されることなく、以下の組織学的タイプのものであってもよい；新生物悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌腫；小細胞癌腫；乳頭癌腫；扁平細胞癌腫；リンパ系上皮癌腫；基底細胞癌腫；毛質細胞マトリックス癌腫；転移細胞癌腫；乳頭転移細胞癌腫；腺癌；ガストリノーマ悪性；胆管癌腫；肝細胞癌腫；組み合わせた肝細胞癌腫および胆管癌腫；小柱腺癌；アデノイド嚢胞性癌腫；腺腫様ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性結腸ポリポージス；固体癌腫；類癌腫、悪性；気管支-肺胞腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性癌腫；好酸性癌腫；好酸性腺癌；好塩基性癌腫；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌腫；小胞腺癌；乳頭および小胞腺癌；非カプセル化硬化性癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜癌腫；皮膚付属器官癌腫；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌腫；嚢胞腺癌腫；乳頭嚢胞腺癌腫；乳頭血清嚢胞腺癌腫；ムチン沈着症嚢胞腺癌腫；ムチン沈着症腺癌；環状体細胞癌腫；浸潤性管癌腫；髄質癌腫；小葉癌腫；炎症性癌腫；パジェット病、乳房；腺房細胞癌腫；アデノ鱗状癌腫；腺癌w/鱗状化生；胸腺腫、悪性；卵巣支質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒層細胞腫、悪性；男性ホルモン産生細胞腫、悪性；セルトリ細胞腫；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細腫、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性メラノーマ；メラニン欠乏性メラノーマ；表層拡大メラノーマ；巨大色素性母斑における悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；支質肉腫；混合腫瘍、悪性；ムルクリアン混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽細胞腫；癌腫肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚肉腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；皮質近接骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯牙形成腫瘍、悪性；エナメル芽細胞歯牙形成腫瘍；エナメル上皮腫、悪性；エナメル芽細胞線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；脳室上衣芽細胞腫；神経膠星状細胞腫；原形質神経膠星状細胞腫；原線維神経膠星状細胞腫；神経膠星状芽細胞腫；神経膠芽細胞腫；希突起神経膠腫；希突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節神経芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経形成腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；���ジキン；副肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球；悪性リンパ腫、大細胞、散漫；悪性リンパ腫、小胞；菌状息肉腫；他の特定非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性ミエローマ；肥満細胞肉腫；免疫増殖小腸；白血病；リンパ系白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ系細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基性白血病；好酸性白血病；単球白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球白血病；骨髄性白血病；および毛様細胞白血病。それにもかかわらず、本発明を用いて、非癌性病（例えば、真菌感染、細菌感染、ウイルス感染、および/または神経変性病）を治療することもできると認識される。
【００８５】
VI. 医薬製剤
siNAを含有する（例えば、リポソームの形態の）非荷電脂質成分の臨床的適用を行う場合、一般には、対象とする用途に適した薬学的組成物として脂質複合体を調製するのが有利である。これは、典型的には、発熱性物質、ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得るいずれかの他の不純物を本質的に含まない薬学的組成物を調製することを伴う。適当な緩衝液を使用して、複合体を安定とし、標的細胞による取込みを可能することもできる。
【００８６】
語句「医薬的にまたは薬理学的に許容される」とは、適切には、ヒトのような動物に投与する場合に、悪影響する、アレルギー性のまたは他の有害反応を生じない分子体および組成物をさす。siNAまたはさらなる有効成分を含む少なくとも1つの非荷電脂質成分を含有する薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に組み入れる、Remington：The Science and Practice of Pharmacy,21st,2005によって例示されるように本開示の観点から当業者に公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）投与では、製剤は、FDA Office of Biological Standardsによって要求される滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度標準を満足すべきであると理解される。
【００８７】
本明細書において、「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知のように、いずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、色素、それに類似の物質およびその組合せを含む。薬学的に許容される担体は、好ましくは、ヒトへの投与のために処方されるが、ある態様においては、非ヒト動物への投与のために処方されるが、ヒトへの投与では（例えば、政府の規制のため）許容できない薬学的に許容される担体を使用するのが望ましい。いずれかの従来の担体が有効成分に適合しないというのでなければ、治療または薬学的組成物におけるその使用が考えられる。
【００８８】
患者または対象に投与される本発明の組成物の現実的な投与量は、体重、疾患の重症度、治療すべき病気のタイプ、従前のまたは同時の治療的介入、患者の特発疾患、および投与の経路のような身体的および生理学的因子によって決定することができる。投与に責任を持つ実行者は、いずれにしても、組成物中の有効量の濃度、個々の対象のための適切な用量を決定する。
【００８９】
ある態様において、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約0.1％の活性化合物を含むことができる。他の態様において、活性化合物は、単位の重量の約2％〜約75％の間、または約25％〜約60％の間、例えば、その中に誘導可能ないずれかの範囲を含むことができる。他の非限定的例において、用量は、投与当たり、約1マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重〜約1000mg/kg/体重以上、およびその中に誘導可能ないずれかの範囲を含むことができる。本明細書において列挙された数から誘導可能な範囲の非限定的例において、約5μg/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重〜約500ミリグラム/kg/体重などの範囲を投与することができる。
【００９０】
遺伝子発現阻害剤は、用量当たり1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100以上のμgの核酸の用量を投与することができる。各用量は1、10、50、100、200、500、1000以上のμlまたはmlの容量であってもよい。
【００９１】
治療組成物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液はグリセロール、液体ポリエチレングリコール、その混合物中で、および油中で調製することもできる。貯蔵および使用の普通の条件下で、これらの製剤は、微生物の成長を妨げるための保存剤を含有する。
【００９２】
本発明の治療組成物は、有利には、液状溶液または懸濁液いずれかとしての注射用組成物の形態で投与される；注射に先立って液体中の溶液または液体中の懸濁液に適した固体形態を調製することもできる。これらの製剤は乳化することもできる。そのような目的での典型的な組成物は薬学的に許容される担体を含む。例えば、組成物は、リン酸緩衝化生理食塩水のミリリットル当たり10mg、25mg、50mgまたは約100mgのヒト血清アルブミンを含有できる。他の薬学的に許容される担体は、塩、保存剤、緩衝液などを含む水溶液、非毒性賦形剤を含む。
【００９３】
非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルである。水性担体は水、アルコール/水溶液、生理食塩水、塩化ナトリウムのような非経口ビヒクル、リンゲルデキストロースなどを含む。静脈内ビヒクルは流体および栄養補充物を含む。保存剤は抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスを含む。薬学的組成物の種々の成分のpHおよび正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。
【００９４】
さらなる処方は経口投与に適している。他の処方は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステリアン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような典型的な賦形剤を含む。組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性処方または粉末の形態をとる。
【００９５】
本発明の治療組成物は、古典的な医薬製剤を含むことができる。本発明による治療組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用できる限りいずれの通常の経路を介するものでもある。これは経口、鼻、頬、直腸、膣または局所を含む。局所投与は、化学療法誘導脱毛症または他の皮膚過剰増殖障害を防止するために皮膚癌の治療で特に有利である。あるいは、投与は同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によるものであってもよい。そのような組成物は、通常、生理学的に許容される担体、緩衝液または他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として投与される。肺の疾患の治療ではエアロゾル送達を用いることができる。エアロゾルの容量は約0.01ml〜0.5mlの間である。
【００９６】
治療組成物の有効量は、意図された目標に基づいて決定される。用語「単位用量」または「用量」とは、対象において用いるのに適した物理的に区別される単位をいい、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路および治療療法に関連する先に議論した所望の応答を生じるように計算された治療組成物の所定量を含有する。処置の数および単位用量双方に従って投与すべき量は保護または所望の効果に依存する。
【００９７】
治療組成物の正確な量は実行者の判断にも依存し、各個人に特有なものである。用量に影響する因子は、患者の身体的および臨床的状態、投与の経路、治療の意図した目標（例えば、徴候の軽減対治癒）、および特定の治療物質の効能、安定性および毒性を含む。
【００９８】
VII. 組合せ治療
ある態様において、本発明の組成物および方法は、第2のまたはさらなる療法と組み合わせた遺伝子発現の阻害剤、または遺伝子発現の阻害剤を発現することができる構築体を含む。組合せ療法を含む方法および組成物は、治療または保護効果を増強させ、および/またはもう1つの抗癌または抗過剰増殖療法の治療効果を増大させる。治療および予防方法および組成物は、癌細胞の殺傷および/または細胞過剰増殖の阻害のような、所望の効果を得るのに有効な組合せ量で提供することができる。このプロセスは、細胞を、遺伝子発現の阻害剤および第二の療法の双方と接触させることを含むことができる。組織、腫瘍、または細胞は、一つまたは複数の剤（すなわち、遺伝子発現の阻害剤または抗癌剤）を含む一つまたは複数の組成物または薬理学的処方と接触させることができ、あるいは組織、腫瘍および/または細胞を2以上の区別される組成物または処方と接触させることによることができ、ここに、1つの組成物は1）遺伝子発現の阻害剤；2）抗癌剤、または3）遺伝子発現の阻害剤および抗癌剤の双方を提供する。また、そのような組合せ療法は、化学療法、放射線療法、外科的療法、または免疫療法と組み合わせて用いることができる。
【００９９】
遺伝子発現の阻害剤は、抗癌治療の前に、間に、後に、またはそれに対する種々の組合せにて投与してもよい。投与は、同時から数分、日〜週の範囲の間隔とすることができる。遺伝子発現の阻害剤を抗癌剤とは別々に患者に提供する態様において、一般には、2つの化合物が有利には患者に対して組合せ効果を発揮することができるように、各送達の時間の間に有意な時間が過ぎないことを保証する。そのような例において、患者には、相互から約12〜24または72時間内に、より好ましくは、相互から約6〜12時間内に遺伝子発現の阻害剤療法および抗癌療法を提供してもよいと考えられる。いくつかの状況において、治療のための期間をかなり延長するのが望ましく、ここに、数日（2、3、4、5、6または7）〜数週間（1、2、3、4、5、6、7または8）が各投与の間に経過する。
【０１００】
ある態様において、治療の経過は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90日以上続く。1つの剤は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、および/または90日に与えることができ、そのいずれかの組合せ、もう1つの剤は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、および/または90日に与え、またはそのいずれかの組合せが行われる。1日（24時間）内に患者は剤の1または複数の投与を受けてもよい。さらに、治療の経過の後、抗癌治療が投与されない期間があると考えられる。この期間はその予後、強さ、健康などの患者の条件に応じて1、2、3、4、5、6、7日、および/または1、2、3、4、5週、および/または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12ヶ月以上継続してもよい。
【０１０１】
種々の組合せを使用することができる。以下の例では、遺伝子発現の阻害剤療法は「A」であって、抗癌療法は「B」である。
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【０１０２】
患者への本発明のいずれかの化合物または療法の投与は、もしあれば、剤の毒性を考慮して、そのような化合物の投与のための一般的なプロトコルに従う。従って、いくつかの態様において、組合せ療法に帰することができる毒性をモニターする工程がある。治療サイクルは必要であれば反復されると予測される。また、種々の標準的な療法ならびに外科的介入を記載された療法と組み合わせて適用してもよいと考えられる。
【０１０３】
具体的な局面において、標準的な療法は化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的療法または遺伝子治療を含み、本明細書において記載された遺伝子発現の阻害剤療法、抗癌療法、あるいは遺伝子発現の阻害剤療法および抗癌療法の双方と組み合わせて治療することができると考えられる。
【０１０４】
A. 化学療法
癌療法は、化学的および放射線ベースの治療両方との種々の組合せ療法を含む。化学療法は、例えば、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（VP16）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルメシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、あるいは前記のいずれかのアナログ、誘導体または変種を含む。
【０１０５】
B. 放射線療法
DNA損傷を引き起こし、広範に用いられてきた他の因子は、γ線、X線、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の指向された送達として通常は公知のものを含む。マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第5,760,395号および第4,870,287号）およびUV照射のような、DNA損傷因子の他の形態も考えられる。これらの因子の全てはDNA、DNAの前駆体、DNAの複製および修復および染色体の組み立ておよび維持に対して広い範囲の損傷を最も可能性が高い。X線についての用量範囲は、延長された期間（3〜4週間）についての50〜200レントゲンの日用量、から2000〜6000レントゲンの単一用量に及ぶ。放射性同位体についての用量範囲は広く変化し、同位体の半減期、発せられる放射線の強さおよびタイプおよび新形成細胞による取込みに依存する。
【０１０６】
用語「接触された」および「曝露された」は、細胞に適用される場合、本明細書においては、治療構築体および化学治療剤または放射線治療剤が標的細胞に送達され、または標的細胞に直接隣接して置かれるプロセスを記載するのに用いられる。細胞殺傷を達成するためには、例えば、双方の剤を、細胞を殺傷しまたは細胞が分裂するのを妨げるのに有効な組合せ量にて細胞に送達する。
【０１０７】
C. 免疫療法
癌治療の関係では、免疫治療剤は、一般には、癌細胞を標的化し、それを破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依拠する。トラスツズマブ（Herceptin（商標））はそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面のいくつかのマーカーに対して特異的な抗体であってもよい。抗体単独は療法のエフェクターとして働くことができ、あるいはそれは他の細胞を動員して、現実に細胞殺傷を行うことができる。抗体は薬物またはトキシン（化学治療剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラトキシン、百日咳トキシン等）にコンジュゲートすることもでき、単に、標的化剤として働かせることができる。あるいは、エフェクターは腫瘍細胞標的と直接的にまたは間接的にのいずれかで相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞は細胞傷害性T細胞およびNK細胞を含む。治療様式、すなわち、直接的な細胞傷害性活性および阻害、またはErbB2の低下の組合せは、ErbB2過剰発現癌の治療において治療的有効性を提供する。
【０１０８】
もう1つの免疫療法を、先に議論した遺伝子サイレンシング療法との組合せ療法の一部として用いることもできる。免疫療法の1つの局面において、腫瘍細胞は標的化に使用できる、すなわち、他の細胞の大部分には存在しないいくつかのマーカーを担わなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれも、本発明の関係で標的化で適する。通常の腫瘍マーカーは癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿系腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルLewis抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、erb Bおよびp155を含む。免疫療法の別の局面は、抗癌効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。免疫刺激分子も存在し、IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFNのようなサイトカイン、MIP-1、MCP-1、IL-8のようなケモカイン、FLT3リガンドのような成長因子を含む。腫瘍サプレッサーと組み合わせたタンパク質としての、または遺伝子送達を用いるのいずれかの免疫刺激分子を組み合わせると、抗腫瘍効果を増強することが示されている（Ju et al.,2000）。さらに、これらの化合物のいずれかに対する抗体を用いて、本明細書において議論した抗癌剤を標的化することができる。
【０１０９】
現在調査中の、または使用されている免疫療法の例は免疫アジュバント、例えば、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（米国特許第5,801,005号および第5,739,169号；Hui and Hashimoto,1998；Christodoulides et al.,1998）サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ；IL-1、GM-CSFおよびTNF（Bukowski et al.,1998；Davidson et al.,1998；Hellstrand et al.,1998）遺伝子療法、例えば、TNF、IL-1、IL-2、p53（Qin et al.,1998；Austin-Ward and Villaseca,1998；米国特許第5,830,880号および第5,846,945号）およびモノクローナル抗体、例えば、抗-ガングリオシドGM2、抗-HER-2、抗-p185（Pietras et al.,1998；Hanibuchi et al.,1998；米国特許第5,824,311号）である。一つまたは複数の抗癌療法を本明細書において記載された遺伝子サイレンシング療法と共に使用できると考えられる。
【０１１０】
能動的免疫療法において、抗原性ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、オートロガスまたは同種異系腫瘍細胞組成物「ワクチン」を一般には区別される細菌でアジュバントと共に投与する（Ravindranath and Morton,1991；Morton et al.,1992；Mitchell et al.,1990；Mitchell et al.,1993）。
【０１１１】
養子免疫療法において、患者の循環リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球をインビトロにて単離し、IL-2のようなリンホカインによって活性化し、あるいは腫瘍壊死についての遺伝子で形質導入し再度投与する（Rosenberg et al.,1988；1989）。
【０１１２】
D. 外科的処置
癌を持つ個人のほぼ60％は、予防的、診断的または段階的、治癒的および軽減的、外科的療法を含む、いくつかのタイプの外科的処置を受ける。治癒的外科的処置は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および/または別の療法のような他の療法と組み合わせて用いることができる癌治療である。
【０１１３】
治癒的外科的処置は切除を含み、癌性組織の全部または一部を物理的に除去し、切り出し、および/または破壊する。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去をいう。腫瘍切除に加えて、外科的処置による治療はレーザー外科的処置、冷凍外科的処置、電気外科的処置、および微視的に制御された外科的処置（Mohsの外科的処置）を含む。さらに、本発明は表層癌、前癌、または偶然量の正常な組織の除去と組み合わせて用いることができると考えられる。
【０１１４】
癌性細胞、組織または腫瘍の一部または全ての切り出しに際して、身体中にキャビティーを形成してもよい。治療は、灌流、直接的注射、または領域へのさらなる抗癌療法の局所的適応によって達成することができる。そのような治療は、例えば、1、2、3、4、5、6、または7日毎に、または1、2、3、4、および5週間毎に、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12月毎に反復することができる。これらの治療は、同様に、種々の用量のものとすることができる。
【０１１５】
E. 他の剤
他の剤を本発明と組み合わせて用いて、治療の治療効果を改良することができると考えられる。これらのさらなる剤は免疫変調剤、細胞表面受容体およびGAP接合のアップレギュレーションを行う剤、細胞静止および分化剤、細胞接着の阻害剤、過剰増殖細胞のアポトーシスインデューサーに対する感受性を増加させる剤、または他の生物学的剤を含む。免疫変調剤は腫瘍壊死因子；インターフェロンα、β、およびγ；IL-2および他のサイトカイン；F42Kおよび他のサイトカインアナログ；またはMIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES、および他のケモカインを含む。さらに、細胞表面受容体、あるいはFas-Fasリガンド、DR4またはDR5/TRAIL（Apo-2リガンド）のようなそれらのリガンドのアップレギュレーションは、過剰増殖細胞に対するオートクリンまたはパラクリン効果の確立によって、本発明のアポトーシス誘導能力を増強すると考えられる。GAP接合の数を上昇させることによる細胞間シグナリングの増加は隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させる。他の態様において、細胞静止または分化剤を本発明と組み合わせて用いて、治療の抗過剰増殖効果を改良することができる。細胞接着の阻害剤は、本発明の効果を改良すると考えられる。細胞接着阻害剤の例は病巣接着キナーゼ（FAK）阻害剤およびロバスタチンである。抗体c225のような、過剰増殖細胞のアポトーシスに対する感受性を増加させる他の剤を、本発明と組み合わせて用いて、治療効果を改良することができるとさらに考えられる。
【０１１６】
細胞傷害性化学療法薬物の導入に続いて癌の療法に多くの前進があった。しかしながら化学療法の結果の1つは、薬物抵抗性表現型の発生/獲得および複数薬物耐性の発生である。薬物耐性の発生は、そのような腫瘍の治療において主な障害のままであり、従って、遺伝子治療のような別のアプローチに対する明らかな要望が存在する。
【０１１７】
化学療法、放射線療法または生物学的療法と組み合わせて用いる療法のもう1つの形態は高体温を含み、これは、患者の組織を高温（106°Fまで）に暴露する手法である。外的または内的加熱デバイスを、局所的、領域的または全身高体温の適応に含めることができる。局所的高体温は、腫瘍のような小さな領域への熱の適応を含む。熱は、高周波数の波で外的に発生させ、体の外部のデバイスから腫瘍を標的化することができる。内的熱は、薄い加熱したワイヤー、または温水を満たした中空チューブ、移植されたマイクロ波アンテナ、またはラジオ周波数電極を含む滅菌プローブを含むことができる。
【０１１８】
患者の器官またな四肢を領域的療法のために加熱し、これは、磁石のような高エネルギーを生じるデバイスを用いて達成される。あるいは、患者の血液のいくらかを取り出し、内的に加熱される領域へ灌流される前に加熱することができる。癌が身体全体に拡大してしまった場合には、全身加熱を行うことができる。温水ブランケット、熱ワックス、誘導コイル、および熱チャンバーをこの目的で用いることができる。
【０１１９】
ホルモン療法を本発明と組み合わせて、または先に記載したいずれかの他の癌療法と組み合わせて用いることもできる。ホルモンの使用は、乳房、前立腺、卵巣または頸癌のようなある腫の癌の治療で使用して、テストステロンまたはエストロゲンのようなある種のホルモンのレベルを降下させ、あるいはその効果をブロックすることができる。この治療は、しばしば、治療オプションとして、あるいは転移の危険性を低下させるために、少なくとも1つの他の癌療法と組み合わせて用いられる。
【０１２０】
VII. キットおよび診断
本発明の種々の局面において、治療剤および/または他の治療および送達剤を含有するキットが考えられる。いくつかの態様において、本発明では、本発明の療法を調製し、および/または投与するためのキットが考えられる。該キットは、本発明の活性なまたは有効な剤を投与するのに用いることができる試薬を含むことができる。キットの試薬は、遺伝子発現の少なくとも1つの阻害剤、一つまたは複数の脂質成分、組合せ療法の一つまたは複数の抗癌成分、ならびに本発明の成分を調製し、処方し、および/または投与しあるいは、本発明の方法の一つまたは複数の工程を行うための試薬を含むことができる。
【０１２１】
いくつかの態様において、キットは、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、またはチューブのようなキットの成分と反応しない容器である適当な容器手段を含むことができる。容器は、プラスチックまたはガラスのような滅菌可能な材料から作成することができる。
【０１２２】
キットは、該方法の手法的工程を概説する指示書シートをさらに含むことができ、本明細書において記載された実質的に同一の手法に従い、あるいは当業者に公知である。
【０１２３】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含める。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施でよく機能する本発明者によって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができるのは当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示の観点から、開示された具体的な態様において多くの変形を成すことができ、本発明の精神および範囲を逸脱することなく類似または同様な結果を依然として得ることができると認識すべきである。
【０１２４】
実施例1
中性リポソームsiRNA送達を用いるインビボでの治療EphA2遺伝子標的化
I. 材料および方法
細胞系および培養。卵巣癌細胞系HeyA8およびSKOV3ip1（Apte,2004）を、15％FBSおよび0.1％ゲンタマイシン硫酸（Gemini Bioproducts,Calabasas,CA）を補足したRPMI-1640中で維持した。全てのインビトロ実験は60〜80％密集で行った。インビボ注射のために、細胞をトリプシン処理し、1000rpmにて4℃で7分間遠心し、2回洗浄し、200μlの腹腔内注射のために、5×106細胞/ml（SKOV3ip1）または1.25×106細胞/ml（HeyA8）の濃度にて、無血清ハンクスの平衡塩溶液（Gibco,Carlsbad,CA）中で戻した。
【０１２５】
siRNA構築体およびインビトロ送達
siRNAは、3つの処方において、Qiagen（Valencia,CA）から購入した。いずれかの公知のヒトmRNA
2008536874.tif 000004
と配列相同性を共有しないことがBLASTサーチによって示され、かつAlexa-555のタグを付した非サイレンシングsiRNA配列を用いて、インビボで投与した場合に、種々の組織における取込みおよび分布を決定した。受容体チロシンキナーゼEphA2のmRNAを標的化するように設計され、かつそのように示された（Duxbury,2004）標的配列
2008536874.tif 000005
を持つsiRNAを用いて、インビトロおよびインビボにてEphA2をダウンレギュレートした。非サイレンシングsiRNA構築体（Alexa-555タグがない前記した配列）を、EphA2標的化実験用の対照として用いた。インビトロ送達のために、5μg siRNAを30μlのリポフェクタミン2000（Qiagen）と共に室温にて10分間インキュベートし、35mm培養プレート中の80％密集の培養中の細胞に加えた。培地を6時間後に変化させ、ウエスタンブロット分析用の溶解物として細胞を48時間後に収集した。
【０１２６】
リポソーム調製物
インビボ送達のためのsiRNAを裸で（トランスフェクション剤なしで）投与し、DOTAP（N-［1-（2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルスルフェート；Roche,Indianapolis,IN）に取り込み、あるいはDOPCいずれかに取り込んだ。DOPCおよびsiRNAを、1：10 siRNA：DOPC（重量：重量）の比率にて、過剰の第三級ブタノールの存在下で混合した。Tween-20を、1：19 Tween-20：siRNA/DOPCの比率にて混合物に加えた。混合物をボルテックスし、アセトン/ドライアイス浴中で凍結し、凍結乾燥した。インビボ投与に先立って、この調製物を15μg/mlの濃度にて通常の0.9％生理食塩水で水和して、注射当たり150〜200μlにおいて所望の用量を達成した。リポソームに取り込まれなかったsiRNAの量を見積もるために、30,000公称分子量限界（NMWL）フィルターユニット（Millipore Corp,Billerica,MA）を用いて遊離siRNAをリポソームから分離した。リポソーム懸濁液をフィルターに加え、5,000gにて室温で40分間遠心した。画分を収集し、フィルターに捕獲された物質を0.9％生理食塩水で戻し、収集された画分および溶出物のsiRNAを分光光度法によって測定した。
【０１２７】
同所性インビボモデルおよび組織プロセッシング
雌無胸腺ヌードマウス（NCr-nu）はthe National Cancer Institute-Frederick Cancer Research and Development Center（Frederick,MD）から購入し、特異的病原体-フリー条件で収容した。それらを、the American Association for Accreditation of Laboratory Animal Careおよびthe U.S.Public Health Service Policy on Human Care and Use of Laboratory Animalsによって記載されたガイドラインに従ってケアし、全ての実験はthe MDACC Institutional Animal Care and Use Committeeによって認められ、監督された。組織における単一用量蛍光siRNAの取込み、またはEphA2に対する単一用量siRNAのサイレンシング能力を決定するための実験は、触診によって評価して、一旦、腹腔内腫瘍が0.5〜1.0cm3のサイズに到達すれば開始した。リポソームsiRNA（5μg）を、通常の圧力下で、200μlの静脈内ボーラスとして尾静脈に投与し、腫瘍および他の組織を注射後種々の時点で（1時間、6時間、48時間、4日、7日または10日）収穫した。組織検体を溶解物調製のためにスナップ凍結し、パラフィン包埋のためにホルマリン中で固定し、あるいは凍結されたスライド調整物のためにOCT培地中で凍結した。腫瘍の成長を評価するための長期実験のために、細胞注射から1週間後に療法を開始した。パクリタキセル100μgまたはビヒクルを1週間に1回腹腔内注射し；リポソーム中のsiRNA（非特異的またはEphA2標的化、150μg/kg）、または空のリポソームを、正常な圧力にて（マウス体重に依存して）150〜200μl容量で1週間当たり2回静脈内注射した。マウス（n＝10/群）を有害作用についてモニターし、4週間の療法の後に、あるいはマウスのいずれかが瀕死のように見え始めた場合に腫瘍を収穫した。マウス体重、腫瘍重量、および腫瘍の分布を記録した。生きた器官も収穫し、組織毒性の証拠のために病理学者によって剖検を行った。
【０１２８】
免疫蛍光および共焦点顕微鏡観察
免疫蛍光（IF）のための組織を屠殺したマウスから収集し、OCT培地中に直ちに入れ、迅速に凍結した。凍結されたセクションを従来の顕微鏡観察のために8μmセクションに切断し、共焦点顕微鏡観察のために30μmセクションに切断した。組織をアセトンで固定し、直ちに調べるか、あるいは（スカベンジングマクロファージを検出するための）f4/80または（内皮細胞を検出するための）CD31について共染色した。IF検出のために、スライドをリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中の5％正常ウマ血清および1％正常ヤギ血清（Invitrogen,Carlsbad,CA）でブロックし、ブロッキング溶液中の10μg/ml抗-f4/80抗体（Serotec,Oxford,UK）または0.625μg/mlの抗-CD31抗体に4℃にて1晩暴露し、PBSで洗浄し、ブロッキング溶液中の4μg/ml抗-ラット抗体-Alexa488（Molecular Probes,Eugene,OR）に室温にて1時間暴露した。スライドをPBSで洗浄し、1.0μg/ml Hoescht（Molecular Probes,PBS中）または10nM Sytoxグリーン（Molecular Probes,PBS中）いずれかに10分間暴露して、核を染色し、洗浄し、顕微鏡評価のためにプロピルガレートおよびカバーガラスで被覆した。従来の顕微鏡観察をZeiss AxioPlan 2顕微鏡、Hamamatsu ORCA-ER Digitalカメラ（Hamamatsu Corp,日本）、およびImageProソフトウェア（Media Cybernetics,Silver Spring,MD）で行った。30μmセクション内の三次元における蛍光をZeiss LSM 510共焦点顕微鏡およびLSM 510 Image Browserソフトウェア（Carl Zeiss,Inc.,Germany）で調べた。
【０１２９】
ウエスタンブロット
PBSで細胞を洗浄し、続いて、修飾されたRIPA溶解緩衝液（50mMトリス、150mM NaCl、1％トリトン、0.5％デオキシコレート＋25μg/mlロイペプチン、10μg/mlアプロチニン、2mM EDTA、および1mMオルトバナジン酸ナトリウム（Sigma Chemical Co,St,Louis,MO））中で4℃にて10分間インキュベートすることによって、培養された細胞の溶解物を調製した。細胞をプレートから掻き取り、13,000rpmにて4℃で20分間遠心し、-80℃で上清を貯蔵した。スナップ凍結組織から溶解物を調製するために、ほぼ30mm3切断の組織をRIPA中にて氷上で3時間インキュベートし、乳鉢および乳棒で破壊し、ホモジナイズし、遠心し、上清を-80℃で貯蔵した。腫瘍の3つの領域からの試料を収集し、個々にテストした。BCA Protein Assay Reagentキット（Pierce Biotechnology,Rockford,IL）を用いてタンパク質濃度を測定し、10％SDS-PAGE分離に供した。半乾燥電気詠動（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA）によってニトロセルロース膜に移した試料を、0.625μg/ml抗-EphA2抗体（Upstate,Lake Placid,NY）と共に4℃にて1晩インキュベートし、1μg/ml HRPコンジュゲーテッド抗-マウスIgG（Amersham,Piscataway,NJ）で検出し、増強されたケミルミネセンス検出キット（ECL,Pierce）を用いて発色させた。膜をβ-アクチン（0.1μg/ml抗-β-アクチン一次抗体（Sigma））についてテストして、同等な負荷を確認した。
【０１３０】
免疫組織化学
ホルマリン固定したパラフィン包埋セクションを、キシレン、100％エタノール、95％エタノール、80％エタノール、およびPBSで順次洗浄することによって脱パラフィン化した。0.2MトリスHCl（pH9.0）中のスチームクッカーで20分間加熱することによって、抗原検索を行った。冷却およびPBS洗浄の後に、内因性ペルオキシドをメタノール中の3％H2O2で5分間ブロックした。非特異的タンパク質および暴露された内因性マウスIgG抗体を、0.5％ブロッキング剤（TSAビオチン系キット,Perkin Elmer,Boston,MA）中の0.13μg/mlマウスIgG Fcブロッカー（Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME）で4℃にて1晩ブロックした。スライドを一次抗体、5μg/mlのマウス抗-EphA2クローンEA5、Michael Kinch博士（MedImmune,Inc.,Gaithersburg,MD）の親切な贈物中で4℃にて4時間インキュベートし、洗浄し、続いて、1.5μg/mlビオチニル化ウマ抗-マウス（Vector Labs,Burlingame,CA）と共に室温にて1時間インキュベートした。二次抗体シグナルを0.75μg/mlストレプトアビジン-HRP（DakoCytomation,Carpinteria,CA）で30分間増強させ、DAB（Phoenix Biotechnologies,Huntsville,AL）基質で7分間検出し、Gil No.3ヘマトキシリン（Sigma）で20秒間対比染色した。
【０１３１】
統計学的考慮
インビボ療法実験のために、腫瘍サイズの50％低下を検出するための電力分析によって示されるように（β誤差0.8）、各群において10匹のマウスを用いた。値が正規分布していればステューデントのt検定にて、そうでなければマン-ホイットニーランク総和検定にて、平均腫瘍サイズを、STATA8ソフトウェア（College Station,TX）を用いて統計学的有意性について分析した（p＜0.05であれば達成された）。
【０１３２】
II. 結果
C.elegans（Fire,1998）および哺乳動物細胞（Elbashir,2001）におけるその記載以来、遺伝子サイレンシングの方法としての短い干渉性RNA（siRNA）の使用は、タンパク質機能描写、遺伝子発見、および薬物開発において強力なツールに早々となった（Hannon,2004）。特異的RNA分解の有望性は、治療様式としての可能な使用についてかなりの刺激をやはり生じたが、インビボsiRNA送達は困難なことが判明した（Ryther,2005）。他の核酸について効果的な送達方法はsiRNAについて必ずしも効果的ではない（Hassani,2005）。従って、siRNAをインビボで用いるほとんどの研究は、動物モデルへの導入に先立っての細胞系における遺伝子発現の操作（Brummelkamp,2002；Yang,2003）、またはsiRNAのウイルスベクターの取り込み（Xia,2002；Devroe,2004）を含む。「裸の」siRNAのインビボでの送達は部位特異的注射、または臨床的に現実的でない高圧手段を介するものに制限されてきた。通常の全身投与後における内因性タンパク質のインビボ取り込みおよび標的ダウンレギュレーションを示す唯一の実験は、未知の毒性を有し、siRNAの活性または寿命に影響し得るsiRNAの化学的変調を必要とした（Soutschek,2004）。
【０１３３】
本発明者らは卵巣癌異種移植片マウスモデルを用いて、siRNAによるインビボ遺伝子サイレンシングの効率を調べてきた。卵巣癌は、2005年における合衆国での見積もられた22,220の症例および16,210の死亡にて、全ての婦人科学悪性疾患の中での最高死亡率が伴う（Jemal,2005）。卵巣癌患者の大部分は腫瘍細胞低下外科的処置および白金ベースの化学療法の初期療法に応答するが、これらのうち、約70％が再発し、病気に屈する。従って、卵巣癌を持つ婦人の結果を改善するためには、新規な治療戦略が緊急に必要とされる。幸いなことに、卵巣癌は好都合なマウスモデルを有する。成長パターン、および療法に対するそれらの応答においてヒト癌に似た腹腔内注射卵巣癌細胞形態は、ヒト患者における応答を予測する傾向がある（Voskoglou-Nomikos,2003）。
【０１３４】
EphA2は、ニューロン発生において鍵となる役割を演じるエフリンファミリーにおけるチロシンキナーゼ受容体である（Daniel,1996；Flenniken,1996）。成人において、それは主として上皮細胞において低い程度に発現される（Sulman,1997）。幾人かの研究者がヒト癌におけるEphA2の過剰発現を報告しており（Nemoto,1997；Walker-Daniels,1999；Ogawa,2000；Kinch,2003）、本発明者らは、卵巣癌における過剰発現の高い率は貧弱な臨床的結果に関連していることを示した（Thaker,2004）。EphA2は腫瘍性タンパク質として機能でき（Zelinski,2001）、ダウンレギュレーションは乳癌および膵臓癌の前臨床研究において腫瘍原性を低下させ（Noblitt,2004；Dobrzanski,2004；Duxbury,2004）、それを理想的な治療標的とする。
【０１３５】
本発明者らは、以前、中性脂質DOPC（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン）から構成されるリポソームを用いて、インビボにてアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達した（Gutierrez-Puente,1999）。ここに、本発明者らは、DOPCにおけるEphA2標的化siRNAを送達する可能性および有効性を決定することを願った。EphA2に対して向けられたsiRNAの治療的送達の結果、腫瘍の減少したタンパク質発現がもたらされ、卵巣癌の同所性のマウスモデルにおいて化学療法と組み合わせた場合に腫瘍成長を顕著に減少させた。
【０１３６】
siRNAのリポソームへの取り込み
有効な送達ビヒクルがインビボ送達で必要である。カチオン性リポソームは、核酸を効果的に取り込むが、場合により、それらの安定な細胞内性質および結果としてsiRNAの内容物を放出できないため、インビボ遺伝子ダウンレギュレーションについて制限された成功しか有さなかった。本発明者らは、この分子を成功して用いて、インビボにてアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達した（Gutierrez-Puente,1999）ので、DOPCを選択した。一緒に混合すると、90％を超えるリポソームが、蛍光につき顕微鏡で調べると、自然に蛍光タグを付けたsiRNAを取り込む。リポソームによって取り込まれなかったsiRNAの量を見積もるために、遊離siRNAをカラム濾過によってリポソームから分離し、siRNAを分光光度法によって測定した。siRNAの約65％がリポソームに取り込まれると見積もられる。本発明者らは、リポソーム核酸複合体が、-20℃で貯蔵した場合に少なくとも4週間安定であることを観察した。
【０１３７】
同所性移植卵巣腫瘍へのsiRNAの送達
siRNAが腫瘍細胞へ効果的に送達できるかを調べるために、本発明者らは、DOPC複合体中のフルオロクロームAlexa-555をタグを付けた非サイレンシングsiRNAを利用した。HeyA8同所性腫瘍を持つマウス（腫瘍細胞の腹腔内接種から15日後、図1A）に5μgのDOPCコンジュゲーテッド非サイレンシングsiRNA/Alexa-555を静脈内注射した。腫瘍を1時間、および4、7、または10日に収穫し、蛍光について調べた。注射から1時間後と早く、siRNAの点状発光が、非蛍光siRNAを注射した腫瘍の発光パターンには存在しない（図1B）個々の細胞の核周囲領域で認められた（図1C）。siRNAは調べた40×視野の80％で見られ、全ての腫瘍細胞の30％と見積もられた。蛍光は血管系に直ぐに隣接する双方の領域に存在し、また、CD31免疫蛍光共-局所化によって示されるように、腫瘍床には深かった。さらに、本方法はsiRNAの血管内皮細胞への送達も示した。
【０１３８】
siRNAが腫瘍細胞で存在し、かつマクロファージによって単純には一掃されないことを確認するために、別々のスライドをf4/80につき染色して、一掃するマクロファージを同定した。これらのマクロファージは核周囲siRNAを含有する腫瘍細胞のネストを囲むように見え、腫瘍細胞とほぼ同一のsiRNA取り込みの速度を有し（図1D）、siRNAが腫瘍細胞に直接的に送達されることを示唆する。蛍光シグナルは汚染二次抗体またはプロセッシングの人工物でないことを確認するために、30μmセクションを共焦点顕微鏡観察で調べた。この技術は、表面発光単独からよりはむしろ組織の中央内でのシグナル検出を可能とした。複数の深さにおける発光を評価した後に、三次元断面を作成した。横方向の図は、組織実質内の蛍光タグを付けたsiRNAの存在を明瞭に示す（図1E）。この図において、マクロファージ染色からの蛍光発光（緑色）は表面においてのみ認められた。なぜなら、検出抗体は組織を貫通するのに余りにも大きいからである。核染色からの発光（青色）は、組織を貫通するのに十分なくらい小さな色素（Hoescht）の結果である。1回の注射から4、7、および10日後に収集した腫瘍もまた、腫瘍内でのsiRNAの匹敵する分布を有することが認められた。この蛍光タグを付けたsiRNAは非特異的構築体であるので、mRNA標的化構築体の投与後の寿命はより短い持続のようである。
【０１３９】
DOTAPと複合体化したsiRNAの投与は、腫瘍組織内の蛍光の散在性の存在を示した（調べた全ての視野の7％）。しかしながら、観察された蛍光は、主として、（図1Fにおいて緑色に示される）CD31陽性内皮細胞に隣接し、リポソーム内容物が血管系において放出されたか、または捕獲されたかを問題とする。（リポソームカプセル化なしでの）裸の蛍光siRNAの投与後に、蛍光は稀にしか観察されなかった（40×視野の2％、細胞の＜1％、図1G）が、陽性細胞における所望の核周囲位置においては顕著に存在した。従って、DOPCリポソーム調製物は、DOTAPと比較してsiRNAの送達の見積もって10倍改良が伴い、裸のsiRNAよりも30倍改良された。
【０１４０】
生きた器官を通じてのsiRNAの組織分布
他の器官における分布を調べるために、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺および脳のセクションをDOPC中のAlexa-555-siRNAの単一用量後に蛍光について調べた。非蛍光siRNAで処理したマウスからの検体を調べて、バックグラウンド蛍光を測定した。肝臓、腎臓、および肺において有意なsiRNA取り込みおよび細胞質分布があった（各々、図2A、図2B、および図2C）。心臓においては少量の取り込みがあったが、未処理心臓組織のそれよりも有意に大きかった。脾臓、膵臓、および脳における内因性タンパク質産物によって発せられる蛍光は評価をより困難とし、リポソームがこれらの組織に取り込まれるというはっきりとした結論を排除する。
【０１４１】
DOTAP-複合体化された裸のsiRNA投与後の取り込みの同様なパターンが、腫瘍において見られるように他の器官で見られた。DOTAP複合体は、肝臓中の核周囲刺穿なしで血管系近くで複数の大きな蛍光シグナルを形成した。大きなシグナルにおける、および個々の細胞による血管系近くの双方における、腎臓において高レベルの取り込みがあった。裸のsiRNA投与の結果、肝臓および腎臓細胞の大きなパーセンテージによる取り込みがもたらされたが、蛍光シグナルはDOPC-複合体化siRNAによる取り込みと比較して多いに減少した。
【０１４２】
EphA2のリポソームsiRNAでのダウンレギュレーション
本発明者らは、以前、EphA2が卵巣癌を持つ患者のかなりのパーセンテージによって過剰発現されること、および過剰発現は貧弱な結果を予測することを示した（Thaker,2004）。さらに、このタンパク質は成人における低い相対的発現を有し、従って、魅力的な腫瘍選択的標的である。従って、本発明者らはモデルとしてEphA2を用いて、siRNA療法の効率をテストした。インビトロにて、EphA2 siRNAでトランスフェクトされたHeyA8およびSKOV3ip1双方の卵巣癌細胞系は、ウエスタンブロット分析によって測定して、対照siRNAでのトランスフェクションと比較してEphA2発現の95％減少を示した（データは示さず）。引き続いて、本発明者らは、同所性インビボモデルにおいてEphA2をサイレントとするDOPCリポソームsiRNAの能力をテストした。EphA2標的化siRNA-DOPCを腫瘍担持マウスに与え、種々の時点に腫瘍を収集した。腫瘍溶解物のウエスタンブロットによる（図3A）および免疫組織化学による（図3D）によるEphA2の測定は、単一用量抗-EphA2 siRNAの投与から48時間後に収集された腫瘍が、非特異的siRNAでの（図3B）または裸のsiRNAでの（図3C）処理と比較して、EphA2の発現を有意に減少させた。4日において抑制されたままでいたEphA2の発現は7日後においてより高く、10日までに正常なレベルに復帰した。従って、本発明者らは、引き続いての療法実験のために、抗-EphA2 siRNAの毎週2回の投与を用いた。
【０１４３】
リポソーム抗-EphA2 siRNAでのインビボ療法実験
雌ヌードマウス（細胞系当たりn＝50、群当たり10）の腹腔にHeyA8またはSKOV3ip1細胞を注射した。腫瘍細胞注射から1週間後に、動物を5つの処理群：1）空のリポソーム、2）非特異的siRNA-DOPC、3）EphA2標的化siRNA-DOPC、4）パクリタキセルおよび非特異的siRNA-DOPC、および5）パクリタキセルおよびEphA2標的化siRNA-DOPCにランダムに割り当てた。4週間の療法の後、動物を屠殺し、剖検を行った。腫瘍を切り出し、重量を測定した。抗-EphA2 siRNA、パクリタキセル＋対照siRNA、およびパクリタキセル＋抗-EphA2 siRNAでの処理は、全て腫瘍サイズを低下するのに有効であり、組合せ療法は対照siRNA単独での処理と比較して86〜91％低下に導いた（図4A、図4B）。EphA2のsiRNA単独での標的化は、対照siRNA単独と比較した場合、双方の系における腫瘍成長を減少させた（HeyA8：0.98g v.1.51g、各々、p＝0.155；SKOV3ip1：0.35g v.0.70g、各々、p＝0.020）。パクリタキセルと組み合わせたEphA2標的化siRNAは、非特異的siRNAおよびパクリタキセルと比較して腫瘍成長を有意に低下させた（HeyA8：0.21g v.0.84g、各々、p＜0.003；SKOV3ip1：0.04g v.0.22g、各々、p＜0.001）。腫瘍成長阻害（EphA2標的化単独での中程度の阻害、パクリタキセルと組み合わせた顕著な阻害）のこのパターンは、このマウスモデルにおける抗体ベースのEphA2-ダウンレギュレーションで観察されたのと同様である（データは示さず）。興味深いことに、非特異的siRNA-DOPCの投与の結果、腫瘍成長のいくらかの低下がもたらされたが、空のリポソームと比較した場合、HeyA8モデルにおいてのみ統計学的に有意であった。これらのデータは、特異的mRNA標的なしのsiRNAは、腫瘍成長に影響する非特異的効果を有することができるという以前の報告を裏付けることができ（Hannon,2004）、さらに、siRNA-DOPCが腫瘍実質に送達されるという本発明者らの仮説を裏付ける。
【０１４４】
リポソームsiRNA調製物、非サイレンシングであるもの、およびEphA2を標的化するものの双方で処理した動物における食習慣および罹病率のような挙動変化によって毒性は観察されなかった。マウスの体重は動物の5つの群の間で有意に異ならず、摂食および摂飲習慣は影響されなかったことを示唆する。器官セクションを広く証明された病理学者によってレビューし、5週間の療法の後に、組織学的毒性は、肝臓、腎臓、心臓、肺または脳で検出されなかった。白脾髄のサイズのわずかな増加が全ての四つのsiRNA群で認められ、これは一般的な炎症反応を示すことができる。
【０１４５】
本実験において、本発明者らは、DOPCリポソームを用いて遺伝子特異的siRNAの治療的送達を記載する。これらの実験は、卵巣癌の同所性モデルにおける、直接的送達、遺伝子標的化およびsiRNAの全身送達後の成長減衰を集合的に示す。この操作の重要性は、siRNAのリポソームへのパッキングが臨床的状況に迅速に移すことができることである。本明細書において示した操作に先立って、インビボでのsiRNAの最も成功したかつ再現性がある全身送達は、高容量の物質の迅速な注射であり（すなわち、見積もられた4mL合計血液容量を持つマウスへの2mL）、siRNAを流体力学的に肝臓に入れた（McCaffrey,2002）。そのような技術は臨床的状況においては使用できず、他方、リポソームは化学療法および他の送達系のために広く臨床的に用いられてきた。
【０１４６】
本実験における送達は他の生きた器官に対して効果的であったので、最も顕著には、肝臓および腎臓において、本方法は、ウイルス肝炎（McCaffrey,2002；Devroe,2004）およびHIV（Lori,2002）のような前臨床的モデルにおいてsiRNA療法に使用できることが示された非癌性疾患で用いることができる。しかしながら、送達のこの様式は組織特異的でなく、従って、siRNAでダウンレギュレートするように選択された遺伝子は正常な細胞による機能にとって非常に重要ではないことは重要である。あるいは、リポソームのさらなる修飾は腫瘍選択的送達を可能とすることができる（Park,1997；Dubey,2004）。
【０１４７】
siRNAがインビボ活性を有するという最初の証明は、マウスの肝臓においてルシフェラーゼ発現を効果的に減少させた裸のsiRNAの水力学的注射におけるものであった（McCaffrey,2002）。高圧静脈内注射の確認的報告（Lewis,2002；Klein,2003）と共に、他の者は、ウイルスベクター（Xia,2002；Devroe,2004）、網膜エレクトロポレーション（Matsuda,2004）における送達、および、直接的細胞内（Wianny,2000）、腫瘍内（Uchida,2004）、硝子体内（Reich,2003）、鼻内（Zhang,2004）、およびクモ膜下腔内（Dorn,2004）投与を用いて、siRNAがインビボで活性を有することを示した。これらの方法は前臨床状況で有用であるが、それらの送達方法およびウイルス遺伝子療法の傾向は臨床的適応可能性を制限されたものとする。
【０１４８】
Sorensenおよび同僚は、カチオン性リポソームにパッケージングされたsiRNA（DOTAP）を送達し、マウスを致死量のLPSから保護することによって肝臓および脾臓においてTNF-α発現を効果的に低下させた（Sorensen,2003）。本発明者らはDOTAPが血管系近くに蓄積され、肝臓および脾臓によって優先的に取り込まれ、全身または抗腫瘍療法におけるその有効性を制限することを見出した。Soutschekおよび同僚は、コレステロールとコンジュゲートしたsiRNAが複数器官への送達を改良し、およびApoBのダウンレギュレーションが肝臓および空腸で達成されたことを報告した（Soutschek,2004）。しかしながら、siRNA活性および効果の持続に対するコレステロールコンジュゲーションの効果、腫瘍への取り込みの効率、および毒性は知られていない。Duxburyおよび同僚は、裸のsiRNA標的化FAK（Duxbury,2003）、EphA2（Duxbury,2004）、またはCEACAM6（Duxbury,2004）の全身送達はタンパク質発現をダウンレギュレートし、単一の皮下注射された悪性膵臓細胞系の成長を減少させたことを示した。これらの結果によって裏付けられるように、裸のsiRNAは皮下部位に効果的に送達できるが、同所性部位にはそうできない可能性がある。
【０１４９】
最近の研究は、siRNAの特異性が最初に希望されたほどは絶対的であり得ないことを示唆する。遺伝子発現プロファイリングの分析は、RNAダウンレギュレーションが、21塩基対siRNA配列内で11と少数の相補的な塩基対で起こることを示唆した（Jackson,2003）。従って、siRNA設計において、交差反応性21塩基対配列についてのBLASTサーチは対象となるmRNAが唯一の標的であるという信頼性を有するのには不十分である。さらに、siRNAは殆ど完全な相補性のみのmRNAに結合し、分解することなく翻訳を妨げることができる（Lewis,2003）。これは、遺伝子発現の天然の調節のもう一つの方法であると考えられる内因的に生産されたミクロRNA（miRNA）によって用いられるメカニズムである（Ambros,2004）。siRNAのmiRNA経路へのクロスオーバー、または部分的相同性によるダウンレギュレーションは最小であるように見え、いくつかのsiRNA配列の参画を必要とするが、この能力は、遺伝子ダウンレギュレーションの特異性に関してなされた結論に注意すべきである。siRNA導入の問題である特異性のもう一つのレベルは、先天的免疫系の活性化にある。siRNA療法は、いくつかの状況においては、インターフェロンを活性化することが示されている（Kim,2004；Sledz,2003）。もちろん、癌の治療においては、毒性が制限される限りは、インターフェロン誘導はさらなる恩典のものである。これは、非特異的siRNA構築体での療法の結果、空のリポソームと比較して、腫瘍成長のいくらかの低下をもたらすという本明細書において示した知見によって裏付けられる。
【０１５０】
リポソームの毒性は制限されると考えられている。リポソーム化学療法は、卵巣癌および他の癌の治療でルーチン的に用いられる（Gabizon,2001）。（E1A遺伝子をコードする）アデノウイルスベクターを運ぶカチオン性リポソームでのI相試験において、処置から3時間後における発熱および疼痛は用量制限毒性であった（Hortobagyi,2001）。これは、本発明者らが現在予測できる副作用の最良の見積もりであるが、siRNAの送達は外来性とはあまり認識されず、宿主応答はほとんど確実に異なる。
【０１５１】
リポソームの電荷はリポソーム取り込みの組織特異性に影響する。マクロファージは負に荷電したリポソームを優先的に取り込むように見える（Miller,1998）。異なる悪性細胞系は正、中性または負の電荷に関する種々の取り込みパターンを有し、インビボ取り込みパターンはさらに異なり得る（Miller,1998）。リポソームメーキャップもまた、中性脂質のより高い割合を持つリポソームを用いるsiRNA送達にて細胞毒性に影響し、インビトロでの遺伝子発現をダウンレギュレートする危うい能力なしで低い細胞毒性に導く（Spagnou,2004）。明らかに、治療物質の送達についての最良なリポソームメーキャップの完全な理解は依然として進化している。siRNA送達では、DOPCのような中性脂質の使用は、siRNAの調製時におけるリポソームへの効果的な取り込み、細胞へのリポソームの取り込み、およびsiRNA内容物の細胞質への放出に伴う細胞内リポソームの崩壊の間のバランスを可能とすることが可能である。
【０１５２】
実験モデルにおけるsiRNAのインビボ送達は、ヒトで用いる可能性を提供することを示した。薬物のリポソーム送達は確立されており、かつ安全であり、siRNA送達でのそれらの使用はこの治療様式を臨床的に魅力的なものとすることができる。本発明者らはDOPC-複合体化siRNAが腫瘍および他の組織への送達を可能とし、対応する遺伝子標的化および低下した腫瘍成長を伴うことを示した。さらなる研究および注意深いアプローチでは、これは、癌療法のための、ならびに特異的遺伝子ダウンレギュレーションに使用できる他の疾患のための臨床的状況に取り込むことができるモデルである。
【０１５３】
実施例2
FAK標的化および組合せ療法
1. 材料および方法
細胞系および培養
樹立されたヒト卵巣癌細胞系SKOV3、SKOV3ip1およびHeyA8の誘導および源は先に記載した。タキサン耐性細胞系であるSKOV3-TR（Michael Seiden博士,Massachusetts General Hospital,Boston,MAの贈物）およびHeyA8-MDR（Isaiah Fidler博士,Department of Cancer Biology,University of Texas M.D. Anderson Cancer Centerからの贈物）も用いた。15％胎児ウシ血清および0.1％ゲンタマイシン硫酸を補足したRPMI 1640または修飾されたイーグル培地（Gemini Bioproducts；Calabasas,CA）における連続継代によって、全ての細胞系をインビトロにて維持し、増殖させた。全てのインビトロ実験は70〜80％密集培養で行った。
【０１５４】
siRNA合成
siRNAを合成し、次いで、高速液体クロマトグラフィー（Qiagen-Xeragon,Germantown,MD）を用いて精製した。FAK siRNAセンス：
2008536874.tif 000006
；アンチセンス：
2008536874.tif 000007
および対照siRNAセンス；
2008536874.tif 000008
アンチセンス：いずれかの公知のヒトmRNA配列に対して配列相同性を有さない
2008536874.tif 000009
を緩衝液（100ミリモル/L酢酸カリウム30ミリモル/L HEPES水酸化カリウム、2ミリモル/L酢酸マグネシウム、pH7.4）に20ピコモル/Lの最終濃度まで溶解させ、60秒間で90℃まで加熱し、37℃で60分間インキュベートし、さらに使用するまで-20℃で貯蔵した。
【０１５５】
リポソームsiRNA調製
インビボ送達用のsiRNAをリン脂質1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（DOPC）に取り込んだ。従前に記載されているように（Landen et al.,2005）、1：10（wt：wt）の比率にて、DOPCおよびsiRNAを過剰の第三級ブタノールの存在下で混合した。Tween-20を1：19の比率で混合物に加えた。混合物をボルテックスし、アセトン/ドライアイス浴中で凍結し、凍結乾燥した。インビボ投与の前に、この調製物を15μg/mlの濃度にて生理食塩水（0.9％）で水和して、注射当たり150〜200μlの所望の用量を達成した。リポソームによって取り込まれなかったsiRNAの量を見積もるために、30,000公称分子量限界を持つフィルターユニット（Millipore Corp,Billerica,MA）を用いることによって遊離siRNAをリポソームから分離した。リポソーム懸濁液をフィルターに加え、5,000gにて室温で40分間遠心した。画分を集め、フィルターに捕獲された物質を0.9％食塩水で戻し、集められた画分および溶離剤中のsiRNAの量を分光光度法によって測定した。
【０１５６】
試薬
ロイペプチン、アプロチニン、およびオルトバナジン酸ナトリウムはSigma Aldrich（St.Louis,MO）から入手し、EDTAはGibco-Invitrogen（Carlsbad,CA）から入手し、ドセタキセルはSanofi-Aventis（Bridgewater,NJ）から入手し、およびシスプラチンはLKT Laboratoriesから入手した。用いた一次抗体はマウス抗-FAK（Biosource International Camarillo,CA）、マウス抗増殖細胞核抗原（PCNA）クローンPC 10（Dako A/S,Copenhagen,Denmark）およびマウス抗-CD31（Pharmingen,San Diago,CA）であった。以下の二次抗体を比色免疫組織化学（IHC）分析で用いた：ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲーテッドヤギ抗-ウサギ免疫グロブリンG（IgG）；F（ab）2 Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,（West Grove,PA）；ビオチニル化マウス抗ヤギ（Biocare Medical,Walnut Creek,CA）；HRPコンジュゲーテッドストレプトアビジン（Dako A/S）；HRPコンジュゲーテッドラット抗マウスIgG2a（Serotec,Harlan Bioproducts for Science,Inc.,Indianapolis,IN）；HRPコンジュゲーテッドヤギ抗-ラットIgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA）および蛍光Alexa 488コンジュゲーテッドヤギ抗ウサギIgG（Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR）。
【０１５７】
ウエスタンブロッド分析
従前に記載されているように（Sood et al.,2004；Sood et al.,2002）、細胞を修飾されたRIPA緩衝液（50mMトリス、150mM NaCl、1％トリトン、0.5％デオキシコレート＋25pg/mlロイペプチン、10pg/mlアプロチニン、2mM EDTA、および1mMオルトバナジン酸ナトリウム（Sigma Chemical Co,St.Louis,MO））に溶解させた。細胞掻き取りによって試料を培養皿から取り出し、12,500rpmにて30分間遠心した。上澄みのFAKタンパク質濃度を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ試薬キット（Pierce,Rockford,IL）を用いて測定し、全細胞溶解物を7.5％SDS-PAGEによって分析した。次いで、半乾燥移動によって試料をニトロセルロース膜に移した（BioRad Laboratories,Hercules,CA）。膜を5％無脂肪乳でブロックし、0.25μg/mL抗-FAK抗体（Biosource,International Camarillo,CA）と共に室温にて1時間インキュベートした。抗体を0.167μg/mL HRPコンジュゲーテッド抗-マウス二次抗体（The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME）で検出し、増強されたケミルミネセンス検出キット（Pierce）で発色させた。β-アクチン（0.1μg/ml、抗-β-アクチン抗体、Sigma Chemical）の検出によって、同等な負荷を確認した。Scion Imagingソフトウェア（Scion Corporation,Frederick,MD）を用いて、デンシトメトリー分析を行った。
【０１５８】
細胞傷害性アッセイ
異なる条件下で細胞傷害性薬物のIC50濃度を決定するために、2×103細胞を96ウエルプレートに蒔き、37℃にて一晩インキュベートし、その後、対照またはFAK標的化siRNAいずれかを加えた。培地を、エタノールに溶解させた（Aventis Pharma,Bridgewater,NJから入手した）増大させる濃度のドセタキセル（最終の濃度範囲、培地中で調整された0.1〜10,000ナノモル/L）または水に溶解させた（LKT Laboratories,Inc.,St.Paul,MNから購入した）シスプラチンと48時間後に交換した。96時間のインキュベーション後に50μLの0.15％臭化3-（4，5-ジメチルチアゾール-2-イル）2,5-ジフェニルテトラゾリウムを各ウェルに加え、2時間インキュベートした。上清を除去し、細胞を100μLのDMSOに溶解させた。570nmにおける吸光度をFALCONマイクロプレートリーダー（Becton Dickinson Labware,Bedford,MA）を用いて記録し、細胞生存を、ブランクA570読みを差し引いた後に、対照状態を超えるパーセント増加または減少として表した。IC50濃度は最大および最小の読みの間のA570読みの中点を見出し、そのA570読みにおける成長曲線を横切る化学療法濃度を見出すことによって決定した。
【０１５９】
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ニック末端標識アッセイ
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ニック末端標識陽性細胞を、製造業者の指示に従って、Dead End Fluorometricターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ニック末端標識システム（APO-DIRECT,BD Biosciences/PharMingen,San Diego,CA）を用いて検出した。簡単に述べると、培養中の卵巣癌細胞を変化させる濃度のドセタキセルで処理し、12、24、48、または96時間後に収穫した。細胞を氷上で4％パラホルムアルデヒド溶液で25分間固定した。次いで、細胞をフルオレセイン-12-dUTPに暴露することによって細胞内DNA断片を標識し、ヨウ化プロピジウムおよびRNaseA溶液で処理し、フローサイトメトリー（EPICS XL,Beckman Coulter,Miami,FL）によって分析した。アポトーシス細胞のパーセンテージを3回の連続実験にわたって平均した。
【０１６０】
カスパーゼ活性
培養中の卵巣癌細胞（1×106）（6ウエルプレート）を細胞系特異的IC50またはIC90濃度においてドセタキセルの有無にて24時間処理した。PBSで洗浄した後、細胞を提供された50μLの細胞溶解緩衝液中で溶解させた。カスパーゼ-3、カスパーゼ-8、およびカスパーゼ-9活性を、カスパーゼ-3については基質DEVD-AFC、カスパーゼ-8についてはIETD-AFC、およびカスパーゼ-9についてはLEHD-AMCを用い、適当なアポトーシス検出キット（BD Biosciences/Clontech,Palo Alto,CA）で測定した。
【０１６１】
動物のケアおよび腫瘍細胞の同所性移植
雌無胸腺ヌードマウス（NCr-nu）はthe National Cancer Institute-Frederick Cancer Research and Development Center（Frederick,MD）から購入した。該マウスを収容し、the American Association for Accreditation of Laboratory Animal Careによって認可され、かつthe U.S. Department of Agriculture,the U.S. Department of Health and Human Services, and the National Institutes of Healthの現在の規制および標準に従った施設において特異的病原体フリー条件下で維持した。全ての実験は、The University of Texas M.D. Anderson Cancer Center,Institutional Animal Care and Use Committeeによって認可され、監督された。マウスが8〜12週齢になると、該マウスをこれらの実験で用いた。
【０１６２】
腫瘍を生じさせるためにSKOV3ip1、Hey A8-MDR細胞（1×106細胞/0.2ml HBSS）およびHey A8細胞（2.5×105細胞/0.2ml HBSS）をマウスに腹腔内（i.p.）に注射した。インビボ注射のために、細胞をトリプシン処理し、1000rpmにおいて4℃にて7分間遠心し、PBSで2回洗浄し、無血清ハンクス平衡塩溶液（HBSS,Life Technologies,Carlsbad,CA）中で戻した。トリパンブルー排除によって測定して＞95％生存率の単一細胞懸濁液のみをインビボ注射で用いた。マウス（群当たりn＝10）を療法の有害作用についてモニターし、35日（SKOV3ip1）または28日（HeyA8またはHeyA8-MDR）に、あるいはマウスのいずれかが瀕死に見え始めた場合に屠殺した。マウスの体重、腫瘍重量、および腫瘍の分布を記録した。組織検体を溶解物調製のためにスナップ凍結させ、パラフィン包埋のためにホルマリン中で固定し、あるいは凍結スライド調製のためにOCT化合物（Miles,Inc.,Elkhart,IN）上で凍結させた。
【０１６３】
ヌードマウスの腹腔における樹立されたヒト卵巣癌腫のための療法
マウスモデルにおいてFAK siRNAおよびドセタキセルの組合せの治療効果を評価するために、予備的用量応答実験を行い、FAK siRNAのための実験について、HeyA8細胞を腹腔内移植し、腹腔内腫瘍を触診によって評価できる場合に腫瘍注射から21日後に処理を開始した。マウスを3つの群（群当たりn＝10）にランダムに分布させ、PBS、200μl容量の150μg/kgで対照siRNAまたはFAK siRNAの単一用量によって処理した。処理の後に、有限の時点（24時間、48時間、96時間および6日）に3匹のマウスを屠殺した。蛍光IHC分析を、後に記載するように、いずれかの切り出された腹腔腫瘍で行った。
【０１６４】
予備的用量応答実験の結果に基づいて、3つの別々の療法実験のシリーズを最適なFAK siRNA投与を用いて開始した。腫瘍細胞を7日後に腹腔内注射し、マウスを5つの処理群にランダムに割り当てた。空のリポソーム毎週2回、非特異的対照FAK siRNA（3μg）毎週2回、毎週50μgドセタキセルと組み合わせた対照FAK siRNA（3μg）毎週2回、FAK siRNA毎週2回、および毎週50μgドセタキセルに加えてFAK siRNA（3μg）毎週2回。
【０１６５】
PCNAおよびCD31の免疫組織化学的決定
PCNA発現はパラフィン包埋腫瘍を用いてIHC分析によって測定した。セクション（8μm厚み）をキシレン中で脱パラフィン化し、アルコールの段階的シリーズ［100％、95％、80％エタノール/二重蒸留水（v/v）］で処理し、PBS（pH7.5）中で再度水和させた。0.1Mクエン酸緩衝液pH6.0中での5分間のマイクロ波加熱、続いての、メタノール中での3％H2O2での5分間の内因性ペルオキシドのブロッキングによって抗原の検索を行った。PBS洗浄×2後に、スライドをPBS中の5％正常ウマ血清および1％正常ヤギ血清で室温にて15分間ブロックし、続いて、ブロッキング溶液中で一次抗体（抗-PCNA、PC-10、マウスIgG、Dako）と共に4℃にて一晩インキュベートした。2回のPBS洗浄の後に、ブロッキング溶液中のホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした適当な二次抗体を室温にて1時間で加えた。HRPをDAB（Phoenix Biotechnologies,Huntsville,AL）基質で5分間検出し、洗浄し、Gil No3ヘマトキシリン（Sigma）で20秒間対比染色した。CD31についてのIHCを新たにカットした凍結組織で行った。これらのスライドを冷アセトン中で10分間固定し、抗原検索を必要としなかった。用いた一次抗体は抗-CD31（PECAM-1、ラットIgG,Pharmingen）であった。PCNAおよびCD31についての染色は4週間の療法試験の最後に集められた腫瘍で行った。二次抗体単独に暴露された対照腫瘍は特異的染色を示さなかった。
【０１６６】
微小血管密度（MVD）、PCNA、およびTUNEL陽性細胞の定量化
MVDを定量するために、×100最終倍率の10のランダム0.159mm2視野を各腫瘍について調べ（マウス当たり1つのスライド、群当たり5スライド、視野当たりの微小血管の数をカウントした。単一の微小血管はCD31に対して陽性に染色された区別されるクラスターまたは単一細胞と定義され、ルーメンの存在は微小血管としてのスコアリングに必要であった。PCNA発現を定量するために陽性細胞（DAB染色）の数を×100倍率の10のランダム0.159mm2視野でカウントした。TUNEL陽性細胞を定量するために緑色蛍光陽性細胞の数を×400倍率の10のランダムな0.011mm2視野でカウントした。
【０１６７】
顕微鏡分析
3,3-ジアミノベンジジン染色セクションを、3チップ電荷カップルドデバイスカラービデオカメラ（モデルDXC990；Sony,東京,日本）を備えたMicrophot-FX顕微鏡（Nikon,Garden City,NY）上で10×対物レンズで調べた。免疫蛍光顕微鏡観察は、HBO 100水銀ランプおよび緑色、赤色、青色蛍光（Chroma Technology,Brattleboro,VT）について個々に選択するための狭いバンドパスフィルターを備えたMicrophot-FXA顕微鏡（Nikon）上で20×対物レンズで行った。イメージは冷却された電荷カップルドデバイスカメラ（モデル5810；Hamamatsu,Bridgewater,NJ）およびOptimas Image Analysisソフトウェア（Media Cybernetics,Silver Spring,MD）を用いて捉えた。フォトモンタージュはMicrografx Picture Publisher（Corel,Dallas,TX）およびAdobe Photoshopソフトウェア（Adobe Systems,Inc.,San Jose,CA）を用いて調製した。フォトモンタージュはデジタルカラープリンター（モデルUP-D7000；Sony）で印刷した。
【０１６８】
統計学的解析
インビボ実験では、連続的変数（平均体重、腫瘍重量、MVD、PCNA）の差は、2つの群を比較するためのステューデントのt検定を用い、かつ統計学的に有意と考えられる0.05未満のp値との複数群比較のためのANOVAによって解析した。正規分布しなかった値については、マン-ホイットニーランク総和検定を用いた。the Social Sciences（SPSS： SPSS Inc.,Chicago,IL）についての統計学的パッケージを全ての統計学的解析で用いた。
【０１６９】
PCNAおよびCD31のIHC決定
PCNAの発現は、パラフィン包埋腫瘍を用いるIHC分析によって測定した。セクション（8μm厚み）を正に荷電したSuperfrostスライド（Fisher Scientific Co.,Houston,TX）に設置し、一晩乾燥した。セクションをキシレン中で脱パラフィン化し、段階的シリーズのアルコール［100％、95％、80％エタノール/二重蒸留水で（v/v）で処理し、PBS（pH7.5）中で再度水和させた。スライドを水に入れ、次いで、それを高出力のマイクロ波で5分間沸騰させることによって抗原を検索した。CD31の発現は、4μm厚みセクションに切断し、正に荷電したスライド上に設置された新鮮な凍結された組織を用いて測定した。スライドは-80℃で貯蔵し；セクションを冷アセトン中で10分間固定し、次いで、PBSで2回、各3分間洗浄した。陽性反応は、スライドを安定な3,3ジアミノベンジジンと共に10〜20分間インキュベートすることによって可視化した。セクションを蒸留水で濯ぎ、ギル（Gill）ヘマトキシリンで1分間対比染色し、Universalマウント（Research Genetics）で設置した。二次抗体単独に暴露された対照試料は特異的な染色を示さなかった。
【０１７０】
II. 結果
ドセタキセルに対する卵巣癌細胞系のインビトロ感受性
本発明者らは、まず、0.1〜10,000ナノモル/Lの範囲の用量にて、臭化3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムアッセイを用いることによって卵巣癌細胞系の成長に対するドセタキセルの効果を分析した。卵巣癌細胞の成長は、用量依存的に阻害された（図5）。SKOV3およびHeyA8細胞についてのIC50値は、各々、6.2および1ナノモル/Lであった。SKOV3-TRおよびHeyA8-MDRについてのIC50レベルは、各々、225および450ナノモル/Lであった（図5）。従って、SKOV3-TRおよびHeyA8-MDR細胞系は、各々、ドセタキセルに対して36倍および300倍より耐性であった。
【０１７１】
カスパーゼの活性は、ドセタキセル療法で増加する。カスパーゼの活性は、イニシエーターとしてのカスパーゼ-8およびカスパーゼ-9、およびエグゼクターとしてのカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7にて、シスプラチン媒介アポトーシスにおける重要な役割を果たすことが公知である（Thornberry and Lazebnik,1998）。従って、本発明者らは、IC50およびIC90レベルの双方を用いるドセタキセルでの処理の後に、基質DEVD-AFC（カスパーゼ-3）、IETD-AFC（カスパーゼ-8）およびLEHD-AMC（カスパーゼ-9）の遊離AFC（カスパーゼ-3およびカスパーゼ-8につき）およびAMC（カスパーゼ-9につき）への変換をテストすることによって、カスパーゼ-3、カスパーゼ-8およびカスパーゼ-9をアッセイした。シスプラチンを陽性対照として用いた。カスパーゼ-3の活性は、用量依存的に、SKOV3（ドセタキセルのIC50での2.8倍、およびIC90レベルでの5.4倍）およびHeyA8（ドセタキセルのIC50での1.8倍、およびIC90レベルでの2.5倍）細胞系において増大した。カスパーゼ-8の活性は、SKOV3細胞においては2.8倍〜3倍だけ、およびHeyA8細胞においては2.8倍〜は2.9倍だけ増大した。カスパーゼ-9の活性は、SKOV3においては1.35倍〜1.64倍だけ、およびHeyA8細胞においては、1.5倍〜1.6倍だけ増大した。対照的に、（感受性細胞系についてのIC50およびIC90レベルを用いる）ドセタキセル処理は、耐性細胞系SKOV3-TRおよびHeyA8-MDRにおいてカスパーゼ活性を誘導できなかった。
【０１７２】
病巣接着キナーゼはドセタキセルに応答して切断される。FAKはカスパーゼ-3によって切断され得ると報告されている（Gervais et al.,1998；Sasaki et al.,2002；Carragher et al.,2001）。卵巣癌細胞におけるドセタキセルによるカスパーゼレベルの変調に関する観察に基づいて、ドセタキセルでの処理後のFAK切断を調べ、タキサン感受性およびタキサン耐性細胞系の間でFAK切断の程度に差があるか否かを調べた。SKOV3細胞においては、FAKはドセタキセルへの暴露の48および72時間後に切断された（図7A）。71-kDa断片はドセタキセルでの処理の後に増加し、他方、125-kDa断片は減少した。同様な知見がHeyA8細胞で観察された（データは示さず）。しかしながら、タキサン耐性SKOV3-TRおよびHeyA8-MDR細胞は、ドセタキセルでの処理の後にFAK切断産物のいずれの増加も示さなかった（図7B）。カスパーゼ-3に対するFAK切断の依存性を調べるために、DEVDfmk（カスパーゼ-3阻害剤）の効果を調べた。DEVD-fmkの存在下において、ドセタキセル誘導FAK切断はブロックされた。これらの結果は、ドセタキセル媒介FAK切断がカスパーゼ-3を介して起こることを示唆する。
【０１７３】
病巣接着キナーゼは病巣接着キナーゼ特異的小干渉性をRNAでダウンレギュレートされる。次に、本発明者らは、siRNAを用いるFAKサイレンシングが卵巣癌細胞をドセタキセルに対して感受性化するか否かを調べようと思った。第一のトランスフェクション条件は、RNAifect試薬（μg/μL）に対するローダミンコンジュゲーテッド非サイレンシングsiRNAの種々の比率をテストすることによってこれらの細胞系で最適化し、1：6の比が最適であって、約90％トランスフェクション効率をもたらすと判断された。FAK siRNAでの処理の結果、処理の24時間後にFAK発現が検出可能に減少し、トランスフェクションの72時間後に90％の最大抑制がもたらされたが、対照（非サイレンシング）siRNAでの処理ではそうはならなかった（図8A）。アクチン発現は、対照またはFAK siRNA処理のいずれかによって影響されず、タンパク質発現の非特異的ダウンレギュレーションは起こらなかったことを示す。
【０１７４】
病巣接着キナーゼダウンレギュレーションは卵巣癌細胞をドセタキセルに対して感受性化する。ドセタキセルに対するヒト卵巣癌細胞のインビトロ感受性に対するsiRNAを用いるFAKサイレンシングの効果を測定した。増大させる濃度のドセタキセルでの処理の前に、卵巣癌細胞をFAK siRNAまたは非サイレンシングsiRNAに48時間暴露した。倍数差を、50％細胞傷害性が観察された時点において計算した。ドセタキセルの細胞傷害性は、SKOV3においてはFAKダウンレギュレーション後にはほとんど5倍より大きく、HeyA8細胞においては8倍より大きかった（図8Bおよび8C）。次に、タキサン耐性SKOV3-TRおよびHeyA8-MDR細胞におけるFAKサイレンシングの効果を調べた。同様の知見が、耐性細胞系で観察された（SKOV3-TRにおける感受性の4.8倍増加、およびHeyA8-MDR細胞において5.5倍増加；図8Dおよび8E）。対照siRNA処理は、ドセタキセルに対する卵巣癌細胞の感受性に影響しなかった。
【０１７５】
FAKサイレンシングおよびドセタキセル処理に応答してのカスパーゼ-3活性を調べた。カスパーゼ-3活性は、タキサン感受性細胞系においてはFAKダウンレギュレーション後にドセタキセルによって増強された（図9A）が、耐性細胞系においては増強されなかった（図9B）。FAK siRNAまたは対照siRNA単独での処理は、タキサン感受性またはタキサン-抵抗性細胞系いずれにおいてもカスパーゼ-3の活性を増強しなかった（図9Aおよび9B）。カスパーゼ-3活性は、ドセタキセルと組み合わせたFAK siRNAでの処理の後に、SKOV3細胞では6.1倍より高く、HeyA8細胞においては4.8倍より高かった（共に、ビヒクル単独での処理と比較したPs＜0.001）。カスパーゼ-3活性は、耐性細胞系におけるFAKダウンレギュレーション後にドセタキセルによってやはり増強された（図9B）。従って、FAK単独のダウンレギュレーションはカスパーゼ-3活性を増大させないが、FAK阻害はカスパーゼ-3活性のドセタキセル媒介誘導を増強させる。
【０１７６】
病巣接着キナーゼサイレンシングはドセタキセル誘導アポトーシスを増強させる。ドセタキセル媒介アポトーシスに対するFAK抑制に対する効果を調べた。本発明者らは、まず、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ニック末端標識アッセイを用いて卵巣癌細胞におけるドセタキセル単独によるアポトーシスの誘導を特徴付けた。細胞をIC50またはIC90レベルのドセタキセルいずれかでタキサン感受性細胞系につき処理し、12〜96時間の範囲の時間間隔で収穫した。対照細胞におけるアポトーシスのパーセンテージは、全ての細胞系において経時的に低いままであった（図10）。96時間のドセタキセル処理の後に、アポトーシス細胞の割合はSKOV3細胞では84％まで増大し、（図10A）、HeyA8細胞では66％まで増大した（図10B）。ドセタキセル誘導アポトーシスが事実カスパーゼに媒介されるか否かを判断するために、本発明者らは、72時間後にドセタキセルに応答してアポトーシス細胞の割合を有意に低下させたカスパーゼ-3阻害剤DEVD-fmkを用いた（図10C）（SKOV3においては72〜7％、およびHeyA8細胞においては56〜6％）。アポトーシスのレベルは、ドセタキセルでの処理に拘らずタキサン耐性細胞系においては低いままであり、DEVD-fmkによって影響されなかった（図10D）。
【０１７７】
アポトーシスがFAKサイレンシングによって影響されるか否かをテストするために、ドセタキセルのIC20レベルを用いた。卵巣癌細胞をFAK siRNAで48時間処理し、次いで、ドセタキセルを加えた。ドセタキセルのIC20レベルにおいては、約41％のアポトーシスがSKOV3細胞で観察され、HeyA8細胞においては42％アポトーシスが観察された（図11）。しかしながら、FAK siRNAと組み合わせて、アポトーシスはSKOV3細胞では83％まで増大し、HeyA8細胞では84％まで増大した（共に、ドセタキセル単独と比較した場合にはPs＜0.01）。次に、タキサン耐性細胞におけるアポトーシスに対するドセタキセルの有無にてのFAKサイレンシングの効果を調べた。いずれかの剤単独でのかなりのアポトーシスを誘導しなかったが、組合せの結果、SKOV3-TRおよびHeyA8-MDR細胞においてアポトーシスが顕著に増大した（図11B）。対照siRNAはドセタキセルと組み合わせてアポトーシスを増強しなかった（図11A〜11B）。これらの知見は、ドセタキセルと組み合わせたFAKサイレンシングはアポトーシスの誘導に対して相加的効果を少なくとも有することを示唆する。
【０１７８】
siRNAによるFAKのインビボダウンレギュレーション
本発明者らは、ドセタキセルと組み合わせたFAK発現の阻害、およびインビボ治療剤能力を調べた。療法実験の開始に先立って、インビボでのFAKをダウンレギュレートするDOPCに取り込まれたFAK標的化siRNAの能力を評価した。腹腔内HeyA8腫瘍を担うヌードマウスに単一用量のFAK siRNA i.p.を注射し、FAK発現のレベルを評価するためのウエスタンブロット分析および免疫組織化学のための注射から1、2、4、および6日後に腫瘍を収穫した。ウエスタンブロット分析は48時間以内にFAKレベルの＞80％低下を明らかとし、これは少なくとも4日間持続した（図12A）。FAK発現は単一処理後6日までに基礎レベルに戻り始めた。同様な結果が免疫組織化学で認められた（図12B）。FAK発現は対照siRNAによって影響されなかった。siRNA（150μg/kg）の毎週2回の投与を、引き続いての療法実験のための例示的な投与スケジュールとして選択した。
【０１７９】
DOPC-FAK siRNAでのインビボ療法実験
遺伝子発現のFAK標的化阻害の治療的潜在能力をテストするのに設計された実験のために、SKOV3ip1またはHeyA8卵巣癌細胞を無胸腺ヌードマウスの腹腔に移植した。数日後に、以下の5つの治療群：1）空のリポソーム；2）非特異的siRNA-DOPC；3）ドセタキセル＋非特異的siRNA-DOPC；4）FAK標的化siRNA-DOPC；および5）ドセタキセル＋FAK標的化siRNA-DOPCに従って、療法を開始した。動物を療法の4週間後に屠殺し、剖検を行った。SKOV3ip1およびHeyA8に対するこれらの療法の効果についてのデータを、各々、図6Aおよび6Bにまとめる。対照siRNA療法単独は、空のリポソームと比較してSKOV3ip1腫瘍に対して効果的でなかったが、約39％低下がHeyA8腫瘍で認められた（図6Aおよび6B）。FAK siRNA単独またはドセタキセル＋対照siRNAでの処理は、対照と比較して双方の細胞系で腫瘍の成長を阻害するのに効果的であった（54〜74％）（図13）。しかしながら、ドセタキセルと組み合わせたFAK siRNAでの処理の結果、腫瘍重量のより大きな低下さえもたらされた（94〜98％）（双方の細胞系について全ANOVAp値＜0.001）。さらに、組合せ療法は、2つの試験の各々においてドセタキセル＋対照siRNAよりも統計学的に優れていた（HeyA8についてp＝0.04、SKOV3ip1についてp＝0.02）。
【０１８０】
化学療法耐性は卵巣癌腫の管理において共通の臨床的な問題である。最初の療法での高い応答速度にも拘らず、ほとんどの患者は、タキサンおよび白金化学療法に対して耐性である再発腫瘍を発生する（McGuire et al.,1996）。本発明者らは、FAKダウンレギュレーションが化学療法耐性細胞系さえをドセタキセルに対して感受性化できることを示す。結果として、FAKダウンレギュレーション、およびHeyA8-MDR細胞系を用いる化学療法に対する耐性腫瘍の感受性化に対するその効果（図13C）を評価した。療法は、先に概説した5つの群に従ったヌードマウスへの腫瘍細胞の注射から7日後に開始した。このモデルでは、FAK siRNA単独の結果、対照と比較して腫瘍成長の約44％低下がもたらされ（図13C）が、この差は統計学的に有意ではなかった（p＝0.17）。しかしながら、FAK siRNAおよびドセタキセルの組合せは、ドセタキセル/対照siRNA（p＜0.006）およびFAK siRNA単独（p＜0.05）よりも優れていた。
【０１８１】
これらの実験の他の測定された変数からのデータを表1に示す。腫瘍形成の発生率は、対照siRNAまたは対照siRNA＋ドセタキセルいずれかにおいて有意に低下しなかった。FAK siRNA処理は、各々、SKOV3ip1およびHeyA8細胞系において組合せにより50および60％まで低下した、細胞系の双方における70％腫瘍発生率に個々に関連した。療法は、典型的には、注射から約5〜6週間後にSKOV3ip1細胞系で発生する腹水の発生を可能とするのにあまり長くは継続しなかった。食習慣および運動性のような挙動の変化によって判断されるように、処理の経路の間で、明らかな毒性は動物で観察されなかった。さらに、マウスの体重は動物の5つの群の間で有意に異ならず、摂食および摂飲習慣は影響されなかったことを示唆する。
【０１８２】
療法実験の結論において、HeyA8細胞におけるFAK発現を評価し、それは抑制されたままであった。FAKレベルは対照siRNA、空のリポソーム、または対照siRNA＋ドセタキセル群いずれかにおいて抑制されなかった（図14A）。しかしながら、ドセタキセル群でのFAK siRNAおよび組合せFAK siRNAにおいて、FAK発現の維持された抑制があった（図14A）。
【０１８３】
脈管形成、細胞増殖およびアポトーシスに対するFAK標的化の評価
FAK抑制は直接的な抗-腫瘍効果を有することが示されているが、出現証拠は、腫瘍ミクロ環境に対する効果も存在することを示す。抗-FAKベースの療法の効果の基礎となる潜在的メカニズムを決定するために、いくつかの生物学的終点に対するその効果を調べ、これは、脈管形成（MVD）、増殖（PCNA）およびアポトーシス（TUNEL）を含む。FAKおよび腫瘍脈管形成に関する増大する証拠のため（Kornberg et al.,2004；Mitra et al.,2005）、本発明者らは、前記した実験から収穫した腫瘍における血管密度を評価した（図14B）。空のリポソームと比較して、平均MVDがFAK siRNA単独またはドセタキセルと共にsiRNAで処理した腫瘍で低下した（各々、p値0.008および0.009）。MVDの最も有意な低下は組合せ療法群で起こった（6±2、p＜0.001）。VEGFおよびMMPの抑制を示唆する最近の実験に基づき（Mitra et al.,2005a； Mitra et al.,2005b,Shibata et al.,1998；Sein et al.,2000）、本発明者らは、これらのタンパク質について全ての群から収穫された腫瘍を調べた。事実、VEGFおよびMMP-9の双方の発現（図7C〜7D）は、単独、またはドセタキセルと組み合わせたFAK siRNA-DOPCで処理した動物からの腫瘍で実質的に低下し、抗血管メカニズムを示唆する。抗血管メカニズムをさらに特徴付けるために、本発明者らは、全ての群における処理の後にデュアル局所化（CD31およびTUNEL）免疫蛍光実験を行った。対照siRNAで処理した腫瘍は、内皮細胞で見られたアポトーシスを伴わない顕著な血管系を有した（図14E）。しかしながら、内皮細胞アポトーシスは、FAK siRNAおよびFAK siRNA＋ドセタキセル処理群双方において有意に増加した。内皮細胞に対するFAK siRNA媒介インビボ効果が直接的かを判断するために、本発明者らは、ImmortoMice（H-2k（b）-ts A58）（Langley et al.,2003）の卵巣から摘出されたマウス内皮細胞をFAK siRNAで処理した。ネズミFAKレベルは、インビボ実験のために用いたFAK siRNAによって変化されなかった（データは示さず）。
【０１８４】
次に、腫瘍細胞増殖に対するFAK標的化療法の効果を、PCNA染色を用いることによって調べた。PCNA発現の最小の低下が、空のリポソームまたは対照siRNA処理群いずれかと比較して、対照siRNA＋ドセタキセルまたはFAK siRNAいずれかによって観察された。PCNA発現は、ドセタキセルと共にFAK siRNAを受けるマウスからの腫瘍で有意に低下した（21±1.6％）（図14F）。最後に、TUNEL方法を用いることによって腫瘍細胞アポトーシスを評価した。アポトーシスを受けている細胞は緑色蛍光を呈した。最小腫瘍アポトーシスは、空のリポソーム、単一剤、またはドセタキセルと共に対照siRNA処理群いずれかで明らかであった。ドセタキセルとFAK siRNAとで、アポトーシスの有意な増加をもたらした（図14G）。
【０１８５】
【表１】
2008536874.tif 000010
【０１８６】
実施例3
βアドレナリン作動性受容体、および癌細胞成長のストレス関連増悪
本発明者らは、最近、卵巣腫瘍モデルを用いて、慢性ストレスが脈管形成を促進することによって腫瘍成長を加速することを示した。本発明者は、β1およびβ2アドレナリン作動性受容体（βAR）の存在または非存在についてRT-PCRによって19の卵巣癌細胞系をスクリーニングした。雌ヌードマウスを入手し、使用する前に1週間馴化させ、次いで、以下の群（n＝10）に分けた。対照（食物および水を与えず）および毎日2時間のストレス（物理的拘束、食物および水を与えず）。βARヌル（A2780およびRMG2）および陽性（HeyA8およびSKOV3ip1）卵巣癌細胞をストレス開始から10日後に腹腔内注射した。加えて、リポソーム（DOPC）siRNA〜β1、β2、または双方の受容体を用いるブロッキング実験を行った。全てのマウスを注射から21日後に剖検した。
【０１８７】
β陽性HeyA8注射マウスにおいて、腫瘍の重量は2倍増加し（p＝0.02）、腫瘍小節はストレスを与えたマウスにおいて3.5倍だけ増加した。ストレスを与えたβAR陽性マウスの50パーセントは、器官の実質を含むより侵入性の病気を有した。対照A2780マウスは0.38g±0.15および3.5±0.9腫瘍小節の平均腫瘍体重を有したのに対し、ストレスを与えたマウスでは0.38g±0.09および5±1.6であった。同様な結果がRMG2注射マウスで観察され、βARヌル細胞を注射したマウスはいずれも転移の侵入性パターンを呈しなかった。対照またはβ1 siRNAで処理したHeyA8注射マウスは、腫瘍重量において2〜3倍増加、および慢性ストレスに関する小節の数の2.5〜3倍増加を示した。顕著には、β2 siRNAは、腫瘍重量におけるストレス誘導増加、小節の数、および転移の侵入性パターンを完全にブロックした。β1およびβ2 siRNAの組合せで処理したマウスは、β2 siRNAのみの群と同様な結果を有した。これらの実験は、慢性ストレスの効果は、主として、卵巣癌細胞に対するβ2ARを介して媒介されることを示す。従って、βARの標的化は卵巣癌の管理に対して治療的意味を有し得る。
【０１８８】
I. 方法
卵巣癌細胞系および培養条件
HeyA8、SKOV3ip1、A2780およびRMG-IIヒト卵巣癌細胞系（Thaker et al.,2005）は、10％胎児ウシ血清（FBS）、ビタミン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、非必須アミノ酸（Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY）およびペニシリン-ストレプトマイシン（Flow Laboratories,Rockville,MD）を補足した完全最小必須培地（CMEM）（Gibco,Grand Island,NY）中で単層培養として成長させた。RMG-II細胞系はNaoto UenoおよびHiroaki Itamochi博士（M.D.Anderson Cancer Center,Houston,TX）からの親切な贈物として入手した。（Science Applications International Corporation,Frederick,MDによってアッセイして）腫瘍細胞はマイコプラズマおよび公知の病原性ネズミウイルスを含まなかった。
【０１８９】
動物
10匹の12週齢雌無胸腺ヌードマウス（NCr-nu）はthe Animal Production Area of the National Cancer Institute-Frederick Cancer Research and Development Center（Frederick,MD）から由来した。全ての実験は、Texas Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。
【０１９０】
腫瘍細胞の同所性移植、ストレス手法、剖検手法。マウスをストレス手法の開始前に1週間飼育条件に慣らした。拘束ストレス手法は従前の研究（Sheridan et al.,1991）に基づいて用いられ、円錐遠心管の代わりに新規なマウス拘束システム（Mouse Restraint System）（図15A）で置き換えた。このシステムにおいては、10匹までのマウスを個々のスロットに入れ、各スロットを、所望の時間の長さで動物を拘束するように調整することができる。本実験において、拘束ストレスは8a.m.〜10a.m.の間に開始し、2〜6時間、21日までの間継続した。卵巣癌細胞系を、0.25％トリプシンおよび0.02％EDTAへの短い暴露によって密集下培養から収穫し、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）に再懸濁させ、トリパンブルー色素排除によって＞95％生存率についてテストした。全ての群においてストレスを開始してから10日後に、HeyA8細胞を2.5×105細胞の濃度にてマウスに腹腔内注射し、他方、他の細胞系を0.2ml HBSS当たり1.0×106細胞にて注射した。動物を腫瘍注射から21日後に剖検し、腹腔中の腫瘍を切り出し、重量を測定し、位置決定のために記録した。免疫組織化学およびH＆E染色手法を、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍で行った。
【０１９１】
慢性β遮断およびストレス
マウスに、Alzet浸透圧ミニポンプ（DURECT Co.,Cupertino CA）の挿入に先立って、少なくとも21グラムの体重を達成させた。毎日2時間の拘束ストレスの開始から7日先立って、ポンプを首筋に挿入した。マウスを吸入させたメトキシプルラン（Medical Developments Australia Pty.Ltd,Melbourne,Australia）で麻酔し、PBS、または2mg/kg/日の用量のPBS中に希釈されたS-プラプラノロール塩酸（Sigma Co.,St.Louis,MO）を含有するAlzetポンプを移植し、これは、28日間の慢性連続受容体遮断を可能とする（Aarons and Molinoff,1982；Exton et al.,2002）。
【０１９２】
試薬。全ての試薬はSigmaまたはTocris Bioscience（Ellisville,MO）から購入した。
【０１９３】
小干渉性RNA構築体およびリポソーム調製物
β1AR
2008536874.tif 000011
またはβ2AR
2008536874.tif 000012
に対して標的化されたsiRNAはQiagen（Valencia,CA）から購入し、従前に記載されているように（Laden et al.,2005）、中性リポソーム1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（DOPC）に取り込んだ。
【０１９４】
VEGF-Rシグナリングの阻害
VEGF-Rシグナリングは、毎日、50mg/kgのVEGF-R249の経口チロシンキナーゼ阻害剤、PTK787/ZK232394（1-［4-クロロアニリノ］-4-［ピリジルメチル］フタラジン二塩酸）を用いてブロックした。
【０１９５】
リアルタイムRT-PCR分析
全RNAを抽出し（Trizol試薬；Invitrogen Co,Carlsbad,CA）、20μlの最終反応用量にてオリゴ（dT）プライマーおよびM-MLV逆転写酵素（Life Technologies,Inc.,Rockville,MD）を用いて逆転写した（42℃において60分）。PCR増幅はTaqMan 1工程RT-PCRマスターミックス試薬キット（PE Applied Biosystems,Foster City,CA）を備えたABI Prism 7700配列検出システムを用いて行う。定量的な値は、PCR産物の指数関数的成長に関連する蛍光シグナルの増加が、製造業者の指示に従った分析ソフトウェアを用いて、配列検出システムのレーザーディテクターによって検出し始めるCt値から得られる（各試料は、そのI8S含有量に基づいて正規化する）。VEGFプライマーは、Applied Biosystems（製品番号HS00173626-ml）から入手した。βAR発現は、以下のプライマー：β1AR
2008536874.tif 000013
；β2AR
2008536874.tif 000014
を用いる半定量的RT-PCRで調べた。
【０１９６】
プロモーター分析
VEGFプロモーターは、Lee Ellis博士（M.D.Anderson Cancer Center,Houston,TX）からの親切な贈物であった。卵巣癌細胞をVEGFプロモーター受容体構築体で一過的にトランスフェクトし（Invitrogen Lipofectamine 2000）、ルシフェラーゼの活性を従前に記載されているように三連で測定した（Reinmuth et al.,2001）。
【０１９７】
インビボでのノルエピネフリンおよびコルチコステロンの評価
器官ノルエピネフリン、エピネフリン、およびコルチコステロンのレベルは、HPLC（Agilent 1100  バイナリー  HPLC,Wilmington,DE）タンデムマススペクトロメトリー（Waters QuattroUltima,Waters,Milford,MA）を用いて定量した。凍結された粉砕卵巣、脾臓、および網組織の重量を測定し、HPLCグレードのメタノール（Fisher Scientific,Pittsburgh,PA）に懸濁させ、Misonix 3000組織ホモジナイザー（Misonix,Farmingdale,NY）を用いる超音波破壊によってホモジナイズした。試料を15000×gにおいて5℃で5分間遠心して、細胞デブリをペレット化し、次いで、0.1ml上清を分析のために20mM酢酸アンモニウム（pH3.5）と1：1混合した。
【０１９８】
エピネフリン、ノルエピネフリン、およびコルチコステロンのクロマトグラフィー分解能は、直線移動相グラジエント分離方法にて、Phenomenex Synergy 4μm Hydro-RP（150×2mm）分析カラム（Phenomenex,Torrance,CA）を用いて達成された。マススペクトロメトリー分析は、複数の反応モニタリング様式にて、電子スプレー陽性イオン化を用いて行った。エピネフリン、ノルエピネフリン、およびコルチコステロンを検出する特異的質量移動は、各々、184＞166、152＞134.9、および347＞328.9であった。
【０１９９】
免疫組織化学
パラフィンセクションをCD31（1：800希釈,Pharmingen,San Jose,CA）、MMP-2（1：500希釈,Chemicon,Temecula,CA）、MMP-9（1：200希釈,Calbiochem,San Diego,CA）、VEGF（1：500希釈,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA）およびbFGF（1：1,000希釈,Sigma,St.Louis,MO）について4℃で染色した。試料をビオチニル化ヤギ抗-ウサギ抗体で30分間染色し（予め希釈）、続いて、ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼで30分間染色し（1：300希釈）、3,3’-ジアミノベンジジン（DAB）中で5〜10分間可視化した。対照試料を二次抗体単独に曝露し、それは非特異的染色を示さなかった。
【０２００】
インサイチューハイブリダイゼーション（ISH）
特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドDNAプローブは、脈管形成遺伝子VEGFのmRNA転写体に対して相補的に設計された、
2008536874.tif 000015
。オリゴヌクレオチド配列の特異性は、FastAアルゴリズム（Radinsky,1993）を用いるGenEMBLデータベースによって最初に決定され、それは、標的遺伝子に対して100％相同性、および非特異的哺乳動物遺伝子配列に対して最小の相同性を示した。d（T）20オリゴヌクレオチドを用いて、各試料におけるmRNAの一体性を確認した。インサイチューハイブリダイゼーションは、最小の修飾を施こして従前に記載されているように行った（Radinsky,1993）。Microprobe手動染色システム（Fisher Scientific,Pittsburgh,PA）を用いて、組織セクションを染色した。このアッセイにおいて陽性反応は赤色に染色された。試料は対比染色されず；従って、吸光度はISH反応の産物のみに帰属できた。
【０２０１】
顕微鏡観察およびイメージ分析
セクションは、3チップ電荷カップルドデバイスカラービデオカメラ（モデルDXC990,Sony Corp.,東京,日本）を備えたNikon Microphot-FX顕微鏡（Nikon Inc.,Garden City,NY）で調べた。フォトモンタージュは、Micrografx Picture Publisher（Corel Inc.,Dallas,TX）およびAdobe Photoshopソフトウェア（Adobe Systems Inc.,San Jose,CA）を用いて調製した。イメージはOptimasイメージ分析ソフトウェア（Bothell,WA）を用いて分析した。
【０２０２】
微小血管密度（MVD）の定量化
MVDを定量するために、100×倍率の10のランダムな0.159mm2視野を各腫瘍について調べ、視野内の微小血管をカウントした。単一の微小血管はCD31（＋）に染色された細胞の区別されるクラスターと定義され、ルーメンの存在が微小血管としてのスコアリングのために必要であった。
【０２０３】
統計学的解析
平均腫瘍重量および腫瘍小節の数の比較は、SPSS（SPSS Inc.,Chicago,IL）を用いて偏差分析（ANOVA）およびt検定によって解析した。平均MVDおよびVEGF定量化の比較では、ステューデントt検定を利用した。p＜0.05は統計学的に有意と考えた。
【０２０４】
II. 結果
インビボ慢性ストレスモデルの特徴付け
以前の研究で、卵巣癌腫モデルにおける慢性ストレスの役割を分析したものがなく、従って、本発明者らは、動物を個々のルーサイトチャンバー中に毎日2〜6時間固定化した新規な物理的拘束モデルを開発した（図15A）。ヌードマウスにおけるカテコールアミンおよびコルチコステロンレベルに関するデータの不足のため、これらのホルモンの変化はストレスモデルにおいて特徴付けた。育成設定に対する1週間の馴化の後、動物に毎日の拘束ストレスを1、3、7、および14日与え、その後、組織カテコールアミン、およびコルチコステロンレベルを、卵巣、脾臓、および網を含む、腹腔（卵巣癌転移の部位）中の種々の組織においてHPLCによってアッセイした（血漿中カテコールアミンレベルはかなり不安定であったが、組織レベルはより信頼できることが公知である）（Cao et al.,2002；Paredes et al.,1998）。ストレスに続き、ノルエピネフリンレベルをこれらの器官において255〜358％だけ増加させ（図15B）、コルチコステロンレベルを488〜789％だけ増加させた（図15C）。同様な増加が6時間ストレスを与えた動物で見られた（データは示さず）が、対照マウスにおいては見られなかった。従って、拘束は、慢性ストレスに特徴的なHPAおよびSNS活性を誘導した。
【０２０５】
インビボにおける卵巣腫瘍成長に対するストレスの効果
引き続いての実験では、拘束ストレスの開始から7日後に、HeyA8卵巣癌細胞を接種したマウスにおいて腫瘍重量、腫瘍小節の数、および転移のパターンに対する効果を調べた。全てのマウスに、ストレスを与えた動物を拘束している時間の間には食物および水を与えず；従って、唯一の実験変数は拘束の存在対非存在であった。最初の実験においては、マウスを、0、2、または6時間の拘束ストレスを毎日合計して21日間受けるようにランダム化した（図16A）。腫瘍小節の数は2時間ストレス群においては2.5倍だけ増加し（p＝0.005）、6時間ストレス群においては3.6倍増加した（p＜0.001）。平均腫瘍重量もまた双方のストレスを与えた群において有意により高かった（2時間群において2.5倍、p＝0.01；6時間群において2.8倍、p＝0.005）。病気は全ての対照マウスにおいては腹腔に閉じ込められたが、ストレスを与えたマウスの50％においては肝臓または脾臓の実質まで拡大した（p＝0.01）。腫瘍小節の数および重量は、動物について、1日当たり2時間ストレスを与えたのと6時間ストレスを与えたのでは異なった。従って、2時間の拘束を引き続いての実験でルーチン的に使用した。
【０２０６】
これらの結果の一般性を評価するために、2時間毎日ストレスモデルを用いて、第二の実験をHeyA8およびSKOV3ip1卵巣癌細胞系両方で行った（図16B）。HeyA8細胞を注射したストレスを与えた動物は、対照群における3.1±0.3（レーン1〜4）と比較して、21日後に平均7.9±0.5（レーン6〜11）腫瘍小節を有した（t検定によるとp＜0.001）。平均腫瘍重量もまた、ストレスによって有意に増加した（対照群について1.12±0.15g対2時間ストレス群では2.17±0.24g、p＝0.002）。平行した結果が、SKOV3ip1卵巣癌細胞を注射したストレスを与えた動物で出現した（腫瘍小節：対照平均11.6±4.1（レーン4〜39）対ストレス平均28.7±2.0（レーン20〜38）、p＝0.002；腫瘍重量：対照平均0.19±0.04g対ストレス平均0.63±0.009g,p＝0.001）。ストレスを与えた動物の30パーセントは、対照群におけるゼロと比較して肝実質転移を有した（p＝0.06）。交感神経-副腎-髄質活性の変化を評価するために、双方の副腎のサイズを測定した（Paredes et al.,1998）。HeyA8細胞を接種した動物の中では、平均左側副腎直径は対照群では1.85±0.25mmであったのに対し、ストレスを与えた群では2.88±0.56mmであった（p＝0.003）。同様な変化が右側副腎で認められた（データは示さず）。
【０２０７】
βARが卵巣癌細胞に存在することを示す以前のインビトロデータ（Lutgendorf et al.,2003）に基づいて、一連の実験を行って、腫瘍成長のストレス誘導加速がβARシグナリングを介して媒介されるか否かを判断した。腫瘍細胞注射から4日後に出発し、HeyA8卵巣癌細胞を担うマウス（群当たりn＝10）を1）PBS；2）イソプロテレノール（非特異的β-アゴニスト）10mg/kg；3）テルブタリン（β2-アゴニスト）5mg/kg；4）キサモテロール（β1-アゴニスト）1mg/kg；または5）イソプロテレノール＋2mg/kgの非特異的β-アンタゴニストプロプラノロールいずれかで毎日処理した。対照群と比較して、イソプロテレノールでの処理は341％だけ腫瘍小節の平均数を（p＜0.001）、および266％だけ平均腫瘍重量を（p＝0.001）増大させ（図16C）、これは、固定化モデルで見られた変化と同様である。さらに、腫瘍負荷の同様な増加がβ2-アゴニストテルブタリンで認められたが、β1-アゴニストキサモテロールでは認められなかった。プロプラノロールは、腫瘍成長においてイソプロテレノール誘導増加をブロックした（図16C）。
【０２０８】
β-アドレナリンシグナリングもまた腫瘍成長に対する非薬理学的挙動ストレスの効果を媒介したことを確認するため、Alzetミニ浸透圧ポンプを外科的に移植して、2mg/kg/日のプロプラノロールとでの連続的なβ遮断を提供した。マウスにHeyA8細胞を注射し、以下の群にランダム化した（群当たりn＝10）：ストレス無しのプラセボAlzetポンプ、毎日2時間ストレスを与えるプラセボAlzetポンプ、ストレスを与えないプロプラノロールAlzetポンプ、および毎日2時間のストレスを与えるプロプラノロールAlzetポンプ（図16D）。プラセボで処理した動物の中では、ストレスは平均腫瘍重量および腫瘍小節の数双方を有意に増加させた（共にp＜0.01）。しかしながら、ストレスは、プロプラノロールで処理したマウスにおいて腫瘍重量または腫瘍小節の数を有意に増加させなかった（図16D）。ストレスを与えた動物の中では、肝臓、脾臓、膵臓、および横隔膜への実質転移のような侵入性病気が、プロプラノロール処理群における0％と比較して、プラセボ処理群の50％において認められた。
【０２０９】
ストレス誘導腫瘍成長についてのβARの関連性を確認するために、17のさらなる上皮卵巣癌細胞系をβAR1およびβAR2の存在についてスクリーニングした。2つの細胞系（A2780およびRMG-II）はRT-PCRおよびウエスタンブロットによると双方の受容体に対して陰性であった（データは示さず）。機能的βARの非存在は、βAR陰性細胞系のいずれもがノルエピネフリンまたはイソプロテレノールでの刺激後に細胞内cAMPレベルの増加を示さなかった（データは示さず）という事実によって確認された。腫瘍成長のストレス媒介増強はβARに依存するか否かを判断するために、マウスにA2780またはRMG-II細胞を腹腔内注射し、2時間の拘束ストレスパラダイムに供した。βARを担った卵巣癌細胞とは対照的に、ストレスは、βAR-陰性A2780またはRMG-II注射マウスにおいて腫瘍重量、小節の数、または拡大のパターンに有意に影響しなかった（図16E）。
【０２１０】
ストレス効果の原因である特異的βARをさらに規定するために、ヒトβ1ARまたはβ2ARに特異的なsiRNAを用いた。siRNAはHeyA8細胞においてβARを＞90％だけダウンレギュレートした（図17A）。マウスにおいてインビボ分布を容易とするために、siRNAを中性脂質リポソーム、DOPC（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン）に取り込んだ（Landen et al.,2005）。毎日の拘束ストレスを受けているHeyA8-注射マウス（群当たりn＝10）を対照、β1、β2、またはβ1＋β2 siRNAいずれかで1週間当たり3回処理した。対照およびβ1 siRNAは共に、腫瘍重量および小節のストレス誘導増強をブロックしなかった（ストレス効果はp＜0.001において有意に継続した）が、β2ARに対するsiRNAは腫瘍細胞成長のストレス媒介増強を効果的にブロックした（図16B）。組み合わせたβ1およびβ2 siRNAで処理したマウスは、β2 siRNA単独で処理した群と同様な結果を有した（図16B）。
【０２１１】
脈管形成に対する慢性ストレスの効果
ノルエピネフリンおよびエピネフリンが卵巣癌細胞によるVEGFの分泌を促進できることを示す以前のインビトロデータ（Lutgendorf et al.,2003）に基づいて、本発明者らは、ストレスがインビボにて同様な効果を誘導するか否かを判断しようと望んだ。血管内皮細胞マーカーCD31を免疫組織化学によってアッセイし、平均血管密度（MVD）を、対照、およびプラセボまたはプロプラノロールで処理したストレスを与えた動物からのHeyA8腫瘍試料においてカウントした（図18A）。プラセボで処理した動物の中では、平均MVDカウントはストレスを与えない動物において9.1±3.0（レーン5〜13）であったのに対し、ストレスを与えた動物においては27.1±10.7（レーン9〜37）であった（p＜0.001）（図18A）。しかしながら、プロプラノロールはMVDカウントのストレス誘導増加を効果的にブロックした（図18A）。同様に、毎日のイソプロテレノールまたはテルブタリンで処理した動物から収穫した腫瘍は、対照と比較して有意により高いMVDカウントを有し（p＜0.001）、プロプラノロールは同様にその増大をブロックした（図18B）。ストレスを与えた対対照腫瘍試料における増大した脈管形成は、インサイチューハイブリダイゼーションによって測定されたようにVEGFの有意な上昇が伴った（p＜0.001、図18A）。ストレスを与えた動物からの腫瘍試料の免疫組織化学もまた、VEGF、MMP-2、およびMMP-9の増大したタンパク質レベルを示した（図19）。
【０２１２】
カテコールアミンがストレスを与えたマウスにおいてVEGF生産を調節したメカニズムを決定するために、VEGF遺伝子の活性の転写変化を調べた。本発明者らは、以前、カテコールアミンが卵巣癌細胞系によるVEGFタンパク質生産を増加できたことを見出した（Lutgendorf et al.,2003）。RT-PCR分析は、この効果が増大したVEGF遺伝子転写によって媒介されることを示した；VEGF mRNA発現は、ノルエピネフリンでのSKOV3ip1細胞の処理の1.5時間後にピークの8.4倍だけ増加する（図20A）。この効果はプロプラノロールによってブロックされ、イソプロテレノールによって模倣され、これは鍵となるメディエーターとしてのβARを意味する（図20A）。その観察に合致して、βAR-陰性A2780卵巣癌細胞は、ノルエピネフリン処理後にVEGF発現の増加を示さなかった（データは示さず）。アデニリルシクラーゼアクチベーターフォスコリン（1μM）およびプロテインキナーゼA（PKA）アクチベータージブチリルcAMP（db-cAMP；1mM）もまたVEGF mRNAレベルを増加させ（図20A）、cAMP/PKAシグナリング経路がこれらのβAR依存性効果を媒介することを示唆する。その仮定に合致して、PKA阻害剤KT5720もまたVEGF mRNA発現に対するノルエピネフリンおよびフォスコリンの効果を有効にブロックした（図20A）。これらの効果がVEGFプロモーター活性の変調（対mRNA安定性の変化）に由来するか否かを判断するために、ヒトVEGF転写開始部位の上流に存在する2.8kbのゲノムDNAからのルシフェラーゼの発現を駆動するレポーター構築体に対するノルエピネフリンの効果を分析した。図20Bに示したように、1μMノルエピネフリンは、一過的にトランスフェクトされたSKOV3ip1細胞において、VEGFプロモーター活性を12.8倍までだけ増強させた。
【０２１３】
インビボにおけるストレス増強腫瘍成長におけるVEGFシグナリングの役割を規定するために、動物をVEGF-R2阻害剤PTK787で処理した。HeyA8-注射マウスを対照、ストレス有りの経口プラセボ、ストレス無しの毎日の50mg/kg経口PTK787、またはストレス有りのPTK787にランダム化した（群当たりn＝10）（図20C）。プラセボ処理動物において、平均腫瘍重量および小節数はストレスによって有意に上昇した（各々p＝0.007およびp＝0.01）。しかしながら、PTK787は腫瘍重量および小節の数双方に対するストレスの効果を有効にブロックした。PTK787は対照と比較して非ストレス付加動物において腫瘍成長に影響しなかった。
【０２１４】
本明細書において開示され主張される全ての組成物および/または方法は本開示の観点から過度の実験なしで行い、実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい態様の関係で記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、変形を、組成物および/または方法に、および本明細書において記載された方法の工程、または工程の配列において適用することができることが当業者に明らかである。より具体的には、化学的および生理学的に関連するある種の剤は本明細書において記載された剤に代えて、同一または類似の結果を達成しつつ、置き換えることができるのは明らかである。当業者に明白な全てのそのような同様な置換および修飾は、添付の特許請求の範囲によって定義される発明の精神、範囲、および概念内にあるとみなされる。
【０２１５】
文献
以下の文献は、それらが例示的な手法、または本明細書において記載されたのを補う他の詳細を提供する程度に、具体的に参照により本明細書に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０２１６】
以下の図面は本明細書においての一部を形成し、本発明のある局面をさらに示すために含める。本発明は、本明細書において示された特別な具体例の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の一つまたは複数を参照することによって良好に理解することができる。
【図１】図1A〜1Gは、単一siRNAの用量後におけるHeyA8腹腔内腫瘍組織に対するインビボsiRNA分布。（A）HeyA8腹腔内腫瘍のH＆E染色（原倍率×200）。（B）5μg非蛍光対照siRNAの腹腔内投与から48時間後における腫瘍での自己蛍光。腫瘍を収穫し、OCT培地中で凍結させ、スライドをアセトン中で固定し、Hoeschtに曝露して、観察の前に核を青色に染色した。（C）（A）で示された同一腫瘍内でのDOPCにカプセル化されたAlexa-555-siRNAの蛍光発光が細胞質内で赤色細孔として観察される。試料を（B）におけるのと同一に処理した。試料を前記したように処理し、加えて、抗-f4/80抗体に曝露して、スカベンジングマクロファージ、およびAlexa-488タグを付けた二次抗体を検出した。Alexa-555-siRNAが腫瘍細胞および周りのマクロファージ双方で観察される。（E）30μmセクションを共焦点顕微鏡観察で調べた。1μmごとに撮った写真をスタックし、横側から調べた。蛍光siRNAがセクション全体で認められ、高倍率三次元構成は、全てのsiRNAが核周辺にあることを示す（示さず）。蛍光Alexa488タグを付けた二次抗体（緑色）を表面に捕獲し、組織を貫通するには余りにも大きい。核をHoescht（青色）で標識する。（F）DOTAPにおいて複合体化したマウスの所与のAlexa-555-siRNAから収集した腫瘍をCD31-Alexa488（緑色）で染色して、内皮細胞を同定した。siRNAは貧弱な実質腫瘍取込みにて血管系近くで複合体化するように見える。（G）トランスフェクション試薬なしで単一の高-用量（10μg）siRNAの投与後に収集した腫瘍は稀にsiRNAを取り込むように見えるが、取り込みは細胞質全体に分布している。原倍率×400で示される（B-D）および（F-G）。
【図２】図2A〜2Iは、主な器官に対するインビボのsiRNA分布。肝臓（A、B、およびC）、腎臓（D、E、およびF）および肺（G、H、およびI）によるsiRNA取り込みを示す。これらの器官からの組織学的セクションを5μg DOPC-siRNAの静脈内注射後に収集した。これらの器官の（A、D、およびG）H＆E染色。器官実質細胞内の（B、E、およびH）Alexa-555-siRNA（赤色）。核（青色）およびf4/80（緑色）を同定するための共染色はマクロファージを器官細胞から区別する。腎臓においては、siRNAは小管および糸球体双方で認められる（（E）の下側）。（C、F、およびI）は非蛍光性siRNAの単一IV注射後における各組織の天然自己蛍光を示す。全ての写真は原倍率×400で撮った。
【図３】図3A〜3Dは、siRNAによるEphA2のインビボダウンレギュレーション。（A）各々、DOPC内で複合体化された、対照siRNA（レーン1〜2）またはEphA2標的化（レーン3〜5）siRNAの単一投与から48時間後に収集された正常位腫瘍からの溶解物のウエスタンブロット。腫瘍のサンプリング誤差について制御するために、レーン1aおよび1bは対照siRNAで処理された同一腫瘍からの別々の調製物である。同様に、レーン5aおよび5bは、EphA2標的化siRNAで処理された同一腫瘍からの別々の調製物である。レーン2、3、および4は、対照またはEphA2標的化siRNA/DOPCで処理されたさらなる腫瘍担持マウスからのものである。隣接セクションをH＆Eによって染色して、腫瘍の存在を確認した。（B）対照siRNA/DOPCで処理された組織のEphA2についての免疫組織化学染色。この過剰発現された（Thaker et al.,2004）膜結合タンパク質の典型的な小石外観が認められる。（C）トランスフェクション剤なしで（「裸の」）EphA2標的化siRNAの単一処理から48時間後のIHCを示し、それは、EphA2発現に対して検出可能な効果を有さなかった。（D）DOPC内にカプセル化されたEphA2標的化siRNAの処理は、単一用量から48時間後にEphA2発現を効果的にダウンレギュレートした。EphA2発現は単一処理から1週間後に回復する（図示せず）。原倍率×400で撮った図3B-3D。
【図４】図4A〜4Bは、siRNA媒介EphA2ダウンレギュレーションの治療効果。ヌードマウスに2.5×105 HeyA8細胞（A）または1.0×106 SKOV3ip1細胞（B）を腹腔内注射し、5群の1つにランダムに割り当て、注射から1週間後に療法を開始した。1）空のDOPCリポソーム、2）DOPCにおける対照siRNA、3）DOPCにおけるEphA2標的化siRNA、4）DOPCにおけるパクリタキセル＋対照siRNA、または5）DOPCにおけるパクリタキセル＋EphA2 siRNA。siRNA/リポソームを150μg/kg siRNAの用量にて1週間当たり2回注射した。100μgパクリタキセル（または群1〜3においてはビヒクル）を1週間当たり1回腹腔内注射した。対照動物が腫瘍容量から病的に見え始めると（細胞注射から4〜5週間後）、実験中の全ての動物を屠殺し、マウス重量、腫瘍重量、および腫瘍の位置を記録した。EphA2標的化siRNA単独は、対照siRNA（HeyA8 p＝0.155、SKOV3ip1 p＝0.020）と比較して腫瘍成長を減少させ、EphA2標的化siRNAのパクリタキセルへの添加は、対照siRNA＋パクリタキセルと比較して、67-82％だけ成長を低下させた（双方の系につきp＜0.003）。HeyA8についてのデータは、組合せとしての同一の統計学的結論を個々に与える2つの同一に行われた実験の平均を表す。
【図５】図5A〜5Bは、卵巣癌細胞成長に対するドセタキセルの効果：（A）HeyA8およびHeyA8-MDRまたは（B）SKOV3またはSKOV3-TR細胞を96ウエルプレート中で平板培養し、引き続いて、増大させる濃度のドセタキセルと共に96時間インキュベートし細胞の生存率を測定した。点、3つの独立した実験の平均；棒線、SE。
【図６】図6A〜6Cは、カスパーゼ-3（A）、カスパーゼ-8（B）、およびカスパーゼ-9（C）活性に対するドセタキセルの効果。卵巣癌細胞をドセタキセルで24時間処理し、市販されているキットを用いてカスパーゼ活性のフルオロメトリープロファイリングを行った。柱、3つの独立した実験の平均。棒線、SE。
【図７】図7A〜7Bは、ドセタキセル処理はFAK切断をもたらす。タキサン感受性（A）およびタキサン耐性（B）SKOV3細胞をドセタキセルの存在下で48または72時間培養した。カスパーゼ-3阻害剤DEVD-fmkの存在下または非存在下におけるSKOV3およびSKOV3-TR細胞でのFAKについてのウエスタンブロット分析。
【図８】図8A〜8Eは、卵巣癌細胞系におけるドセタキセル感受性に対するFAKサイレンシングの効果。（A）抗-FAKおよびアクチンモノクローナル抗体でプローブしたSKOV3全細胞溶解物のウエスタンブロット分析。底部、デンシトメトリーの結果。対照siRNAは未処理細胞と比較してFAK発現に有意に影響せず、他方、FAK特異的siRNAの結果、72時間までにFAK発現の＞90％抑制がもたらされた。（B）SKOV3、（C）HeyA8、（D）SKOV3-TR、および（E）HeyA8-MDR成長に対するドセタキセルの効果を、単独で、またはFAK siRNAまたは対照siRNAと組み合わせてテストした。点、3つの独立した実験の平均；棒線、SE。
【図９】図9A〜9Bは、FAK遺伝子サイレンシングは、（A）SKOV3およびHeyA8および（B）SKOV3-TRおよびHeyA8-MDR細胞においてドセタキセル誘導カスパーゼ-3活性を増強する。柱、3つの実験の平均；棒線、SE.＊、P＜0.01；＊＊、P＜0.001。
【図１０】図10A〜10Dは、（A）SKOV3およびSKOV3-TRまたは（B）HeyA8およびHeyA8-MDR卵巣癌細胞に対するドセタキセルの効果。アポトーシスのパーセンテージは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ミック末端標識によって決定した。細胞をタキサン感受性細胞系についてIC90濃度のドセタキセルの有無にて処理した。点、3つの異なる実験の平均；棒線、SE。（C）SKOV3およびSKOV3-TRおよび（D）HeyA8およびHeyA8-MDR卵巣癌細胞アポトーシスに対するカスパーゼ-3阻害剤（DEVD-fmk）の有無でのドセタキセルの効果。柱、3つの独立した実験の平均；棒線、SE。
【図１１】図11A〜11Bは、（A）SKOV3およびHeyA8および（B）SKOV3-TRおよびHeyA8-MDR卵巣癌細胞における、FAK siRNAの有無でのドセタキセル媒介アポトーシス。柱、3つの独立した実験の平均；棒線、SE。Doc、ドセタキセル。
【図１２】図12A〜12Bは、FAK siRNAによるFAKのインビボダウンレギュレーション。（A）DOPCに取り込まれたFAK siRNAまたは対照siRNAの単一投与から1、2、4、および6日後に収集した腫瘍試料からの溶解物のウエスタンブロット。p-アクチンに対するバンドの強度の定量を以下にグラフ化する。（B）単一用量から数日後における、対照siRNA（a）またはFAK siRNA 2（b）、4（c）、および6（d）での処理後のFAK発現についての免疫組織化学染色。（B）原倍率×200。
【図１３】図13A〜13Cは、FAK siRNA媒介FAKダウンレギュレーションの治療効果：ヌードマウスに2.5×105 HeyA8（A）1.0×106 SKOV3ip1（B）または2.5×105 HeyA8-MDR細胞（C）を腹腔内注射し、以下の群の1つにランダムに割り当て、細胞注射から1週間後に療法を開始した。1）空のDOPCリポソーム、2）DOPCにおける対照siRNA、3）DOPCにおける対照siRNA＋ドセタキセル、4）DOPCにおけるFAK siRNA、および5）DOPCにおけるFAK siRNA＋ドセタキセル。対照マウスは病的になると（腫瘍細胞注射から4〜6週間後）、動物を屠殺し、剖検を行った。標準偏差（左側）を伴った平均腫瘍重量および個々の体重（右側）を示す。
【図１４】図14A〜14Gは、（A）HeyA8正常位モデルにおける長期間の療法後のFAK発現の免疫組織化学（IHC）。（B）微小血管密度（MVD）をCD31についての免疫組織化学ペルオキシダーゼ染色後に測定した。100×視野当たりの血管の数をカウントした。各群からの代表的なスライドを示し、視野当たりの血管の平均数をグラフに示す。スライド当たり5つの視野、および群当たり少なくとも3つのスライドを調べた。VEGF（C）およびMMP-9（D）免疫組織化学ペルオキシダーゼシグナリングを、5つの療法群の各々から得られた腫瘍セクションで行った。（E）CD31陽性細胞およびアポトーシスを受けつつある細胞での免疫蛍光染色の代表的なイメージを示す。アポトーシスを受けつつある内皮細胞は黄色の蛍光によって同定することができる。（F）各群からの腫瘍セクションをPCNAについて染色した。強くPCNA陽性である癌細胞核の数をカウントし、細胞の合計数で割った。各郡からの代表的なセクションを示し（最終倍率×100）、PCNA陽性細胞の平均±SDパーセンテージをグラフ化する。スライド当たり4つの視野、および群当たり少なくとも3つのスライド（全て異なる動物から）をカウントした。（G）アポトーシスについては緑色フルオロフォアーを用いるTUNELでの、および核については青色フルオロフォアーを用いるHoeschtでの免疫蛍光染色を行い、代表的なスライドを各群から示す。アポトーシス細胞の数をカウントし、TUNEL陽性細胞の平均数±SDをグラフ化した。グラス当たり4つの視野、および群当たり少なくとも3つのスライド（全て異なる動物から）をカウントした。グラフ中の棒線は、図面に示した標識された柱に対応する。
【図１５】図15A〜15Cは、（A）マウス拘束系を物理的固定化のために利用して、慢性ストレスを引き起こした。空のマウス拘束系を左側に示す。マウスを個々のスロットに入れ（中央）レバーを固定化ストレスのために調整する（右側）。ストレスから1、3、7、および14日後の、HPLCタンデムマススペクトロメトリーを用いるヌードマウスにおける卵巣、脾臓、および網からの組織ノルエピネフリン（B）およびコルチコステロン（C）の定量。結果は各時点についての平均±s.e.m.；n＝3を表す。実線の棒線、拘束されたマウス；塗り潰ぶしていない棒線、対照マウス。
【図１６】図16A〜16Eは、腫瘍重量（左側）および小節（右側）は対照と比較して慢性的にストレスを与えたマウスで増加する。（A）HeyA8卵巣癌細胞を注射した対照、2時間毎日ストレスを与えた、および6時間毎日ストレスを与えたマウスにおける腫瘍重量および腫瘍小節の定量。平均腫瘍重量および小節は、対照およびストレスを与えた群の間で有意に上昇した。2時間および6時間ストレス群の間で統計学的差はなかった。（B）2つの異なるβ-アドレナリン作動性受容体（βAR）陽性卵巣癌細胞系（HeyA8およびSKOV3ip1）を注射したマウスにおける結果の確認。（C）固定化の効果は、化学ストレッサーイソプロテレノール（非特異的β-アゴネスト）、テルブタリン（β2-アゴネスト）によって模倣されるが、キサモテロール（β1-アゴネスト）によっては模倣されない。イソプレトロノール＋プロプラノロール（β-ブロッカー）双方で処理したマウスはストレスを与えなかったマウスと同様な腫瘍負荷を有する。（D）プロプラノロールは慢性ストレスの効果に逆作用し、βARの重要性が確認される。（E）βARヌル卵巣癌細胞系（A2780およびRMG-II）で注射したマウスが、慢性的にストレスを与えられるにも拘らず加速した腫瘍成長を加速しなかった。結果は群当たりの平均±s.e.m.；n＝10マウスを表す。＊p≦0.01；＊＊p≦0.001。
【図１７】図17A〜17Bは、β2-アドレナリン作動性受容体（β2AR）は、慢性ストレスにおける腫瘍成長および転移の加速において非常に重要な役割を果たす。（A）DOPCと複合体化した対照siRNA、β1 siRNA、またはβ2 siRNAの単一投与から48時間および96時間後に収集した正常位HeyA8腫瘍からのウエスタンブロット溶解物は、各々標的化されたβARのダウンレギュレーションを示す。（B）対照またはβ1 siRNAで処理された慢性ストレスを持つHeyA8注射マウスは、腫瘍重量において2〜3倍の増加、および腫瘍、小節において2.5〜3倍の増加を示した。より重要なことには、β2 siRNAは腫瘍の成長および転移に対するストレスの効果を完全にブロックした。結果は群当たりの平均±s.e.m.；n＝10マウスを表す。＊p≦0.01；＊＊p≦0.001。
【図１８】図18A〜18Bは、脈管形成は慢性的にストレスを与えた動物において増加する。（A）対照、およびプラセボまたはプロプラノロールポンプでストレスを与えたマウスからのHeyA8腫瘍試料をCD31につき染色し、平均血管密度（MVD）カウントを定量した。腫瘍試料をインサイチューハイブリダイゼーションによってVEGFにつき染色し、光学密度測定を計算した（p＜0.001）。（B）プラセボ、イソプロテレノール、テルブタリン、キサモテロールまたはイソプロテレノール＋プロプラノロール処理マウスからのHeyA8腫瘍試料をCD31およびVEGFにつき染色した。MVDは対照または組合せ療法群と比較して、イソプロテレノールおよびテルブタリン群においてより高かった。全ての写真は原点倍率×200で撮った。グラフ中の棒線は、写真中に示した標識した柱に対応する。＊p＜0.001。
【図１９】VEGF、bFGF、MMP-2、およびMMP-9についての免疫組織化学を、対照、およびプラセボおよびプロプラノロールで処理したストレスを与えた動物からのHeyA8腫瘍試料で行った。全ての写真は原倍率×200で撮った。
【図２０】図20A〜20Cは、VEGFはノルエピネフリン（NE）によって刺激し、これは、脈管形成に対する慢性ストレスの効果を媒介する。（A）VEGF mRNAは、SKOV3ip1細胞をノルエピネフリン1μM、イソプロテレノール1μM、フォルスコリン（cAMPのアクチベーター）1μM、またはジブチリルcAMP（db-cAMP）1mMで刺激した場合に有意に増加した。KT5720（1μM）はcAMP依存性プロテインキナーゼAの選択的阻害剤である。（B）SKOV3ip1（βAR陽性細胞系）においては、VEGFプロモーター活性は、ビヒクル対照と比較して、ノルエピネフリン処理後に12.8倍だけ増加した。（C）PTK787での処理は、HeyA8卵巣癌細胞を注射したマウスにおけるPBSおよびストレスと比較して、腫瘍重量および小節の数のストレス誘導増加をブロックした＊p≦0.01；＊＊p≦0.001。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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