(57)【要約】  本発明は、哺乳類ＧＰＲ３９遺伝子およびそれにコードされる産物、ならびに食欲、痛覚等の調節における使用に関する。また、本発明は、ＧＰＲ３９タンパクを含む医薬組成物および保健品に関する。本発明による食欲または痛覚を抑制する保健品および医薬組成物は、安全で有効な量（例えば、０．０１−９９％）の哺乳類ＧＰＲ３９タンパク質のアンタゴニストおよび食品学的または医薬的に許容可能な担体（例えば、１−９９．９９ｗｔ％）を含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の食欲または痛覚を調節するための保健品または医薬組成物の製造における、哺乳類ＧＰＲ３９タンパク質またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストの使用。
【請求項２】
前記医薬組成物または保健品が、安全で有効な量の哺乳類ＧＰＲ３９タンパク質および医薬的に許容可能な担体を含む；または、
前記医薬組成物または保健品が、安全で有効な量の哺乳類ＧＰＲ３９タンパク質のアンタゴニストおよび医薬的に許容可能な担体を含む；
請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＧＰＲ３９タンパク質が、ヒト、ラットおよびマウスから成る群から選択される動物由来である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記医薬組成物または保健品が、前記組成物の総重量を基準として０．０１−９０ｗｔ％の量でＧＰＲ３９タンパク質を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記保健品または医薬組成物が、錠剤、カプセル、顆粒剤または溶液剤の形態である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
安全で有効な量の哺乳類ＧＰＲ３９タンパク質のアンタゴニストおよび食品学的または医薬的に許容可能な担体を含む、食欲または痛覚を抑制するための保健品または医薬組成物。
【請求項７】
以下の工程を含む、食欲または痛覚を低下させるための候補薬剤をスクリーニングする方法：
（１）ＧＰＲ３９遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、哺乳動物の細胞株に導入することで、ＧＰＲ３９タンパク質を発現する細胞株を作製する；
（２）工程（１）で得られたＧＰＲ３９タンパク質を発現する細胞株の培養液に、試験化合物を入れ、ＧＰＲ３９タンパク質の発現量の変化を検出する；ここにおいて、ＧＰＲ３９タンパク質の発現量の増加を抑制する化合物が、食欲または痛覚を低下させる候補薬剤となる。
【請求項８】
前記ＧＰＲ３９タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４または６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
以下の工程を含む、食欲または痛覚を増強するための候補薬剤をスクリーニングする方法：
（１）ＧＰＲ３９遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、哺乳動物の細胞株に導入することで、ＧＰＲ３９タンパク質を発現する細胞株を作製する；
（２）工程（１）で得られたＧＰＲ３９タンパク質を発現する細胞株の培養液に、試験化合物を入れ、ＧＰＲ３９タンパク質の発現量の変化を検出する；ここにおいて、ＧＰＲ３９タンパク質の発現量の増加を促進する化合物が、食欲または痛覚を増強させる候補薬剤となる。
【請求項１０】
前記ＧＰＲ３９タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４または６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物の分野に関し、具体的には、哺乳動物のＧＰＲ３９遺伝子およびそれがコードする産物の、食欲および痛覚等の調節における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
食欲とは、動物の有する食物および水の摂取に対する欲のことであり、食欲と肥満は密接な関係があり、多くの肥満症患者の食欲は旺盛である。また、特定の人々、例えば慢性疾患の患者は、食欲不振で、栄養不良になりやすいことがある。従って、長い間食欲を調節する方法の研究が行われてきた。また、痛覚に対する理解も、極めてわずかである。
【０００３】
ＧＰＲ３９遺伝子は、Ｇタンパク質共役型受容体の１つであり、生物情報学的な推測によると、ＧＰＲ３９タンパク質は４５３個のアミノ酸から成り、成長ホルモン促進分泌物質受容体（ＧＨＳＲ）の特徴である７つの膜貫通領域を含む。ＧＰＲ３９遺伝子は他の遺伝子との相同性が低く、成長ホルモン促進分泌物質受容体（ＧＨＳＲ）およびニューロテンシン受容体１（ＮＴＲ１）だけに一定の相同性を持っている（それぞれ２７％および３２％）。蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーションにより、当該遺伝子は染色体２ｑ２１−ｑ２２に存在することが示された。［ＭｃＫｅｅ ＫＫ， Ｔａｎ ＣＰ， Ｐａｌｙｈａ ＯＣ， Ｌｉｕ Ｊ， Ｆｅｉｇｈｎｅｒ ＳＤ， Ｈｒｅｎｉｕｋ ＤＬ， Ｓｍｉｔｈ ＲＧ， Ｈｏｗａｒｄ ＡＤ， Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ ＬＨ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｈｕｍａｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅｓ （ＧＰＲ３８ ａｎｄ ＧＰＲ３９） ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． １９９７ Ｄｅｃ １５；４６（３）：４２６−３４］。
【０００４】
細胞を用いた実験から、ＧＰＲ３９は、イノシトールリン酸およびＣＲＥ経路により、
低いレベルで下流分子を活性化するが、ＳＲＥにより持続的に高いレベルで下流のシグナルを活性化できることが証明された。［Ｂｉｒｇｉｔｔｅ Ｈｏｌｓｔ１， Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｄ．Ｈｏｌｌｉｄａｙ２， Ａｎｄｅｒｓ Ｂａｃｈ１， Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｅ．Ｅｌｌｉｎｇ３， Ｈｅｌｅｎ Ｍ．Ｃｏｘ２＆ Ｔｈｕｅ Ｗ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ１，３Ｃｏｍｍｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｇｈｒｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００４ Ｓｅｐ ２１］。しかしながら、当該遺伝子の機能、特に個体レベルにおける機能は、まだ明らかになっていない。
【０００５】
現在までに、食欲および痛覚に関連がありまたは影響する様々なタンパク質について、理解できていることは極めて少ない。それゆえ、当該分野において、食欲および痛覚に関連する新規のタンパク質の発見し、食欲および痛覚を調節する薬剤を開発する必要に迫られている。
【発明の概要】
【０００６】
従って、本発明の目的は、食欲に関わるタンパク質、すなわちＧＰＲ３９タンパク質、および食欲の調節におけるその使用を提供することである。
【０００７】
また、本発明の別の目的は、ＧＰＲ３９タンパク質およびそのアゴニストまたはアンタゴニストを含む医薬組成物および保健品を提供することである。
【０００８】
第１の側面において、本発明は、哺乳動物の食欲または痛覚を調節するための保健品または薬物組成物の製造における、哺乳類ＧＰＲ３９タンパク質またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストの使用を提供する。
【０００９】
一実施態様において、当該医薬組成物は、安全で有効な量の哺乳類ＧＰＲ３９タンパク質および医薬的に許容可能な担体を含み；または
当該医薬組成物は、安全で有効な量の哺乳類ＧＰＲ３９タンパク質のアンタゴニストおよび医薬的に許容可能な担体を含む。
【００１０】
他の実施態様において、当該ＧＰＲ３９タンパク質は、ヒト、ラットおよびマウスからなる群から選択される動物のＧＰＲ３９タンパク質である。より好ましくは、当該ＧＰＲ３９タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４または６に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１１】
別の実施態様において、当該医薬組成物は、組成物の総重量に基づいて、０．０１−９０ｗｔ％のＧＰＲ３９タンパク質を含有する。
【００１２】
別の実施態様において、当該保健品または医薬組成物の剤形は、錠剤、カプセル、顆粒剤または溶液剤である。
【００１３】
第２の側面において、本発明は、安全で有効な量（例えば０．０１−９９％）の哺乳類ＧＰＲ３９タンパク質のアンタゴニストおよび食品学的または医薬的に許容可能な担体を含む、食欲または痛覚を抑制する保健品または医薬組成物を提供する。
【００１４】
より好ましくは、当該アンタゴニストは、ＧＰＲ３９タンパク質に対する抗体、ＧＰＲ３９遺伝子のアンチセンス核酸またはｉＲＮＡである。
【００１５】
第３の側面において、本発明は、以下の工程を含む、食欲または痛覚を低下させる候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する：
（１）ＧＰＲ３９遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、哺乳動物の細胞株に導入することで、ＧＰＲ３９タンパク質を発現する細胞株を作製する；
（２）工程（１）で得られたＧＰＲ３９タンパク質を発現する細胞株の培養液に、試験化合物を入れ、ＧＰＲ３９タンパク質の発現量の変化を検出する；ＧＰＲ３９タンパク質の発現量の増加を抑制する化合物は、食欲または痛覚を降下させる候補薬剤となる。
【００１６】
より好ましくは、当該ＧＰＲ３９タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４または６に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１７】
第４の側面において、本発明は、以下の工程を含む、食欲または痛覚を増強する候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する：
（１）ＧＰＲ３９遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、哺乳動物の細胞株に導入することで、ＧＰＲ３９タンパク質を発現する細胞株を作製する；
（２）工程（１）で得られたＧＰＲ３９タンパク質を発現する細胞株の培養液に、試験化合物を入れ、ＧＰＲ３９タンパク質の発現量の変化を検出する；ＧＰＲ３９タンパク質の発現量の増加を促進する化合物は、食欲または痛覚を増強させる候補薬剤となる。
【００１８】
より好ましくは、当該ＧＰＲ３９タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４または６に示されるアミノ酸配列を有する。
【発明の詳細な説明】
【００１９】
本発明者らは、鋭意検討を行い、様々な動物行動学のモデルにより、ＧＰＲ３９遺伝子の機能について研究を行った。意外にも、ＧＰＲ３９が、食欲および痛覚の調節に関わることを発見した。これに基づき、本発明を完成した。
【００２０】
具体的には、本発明者は、生物情報学的分析を用いて、ＧＰＲ３９のアンチセンス核酸およびミスセンス核酸を設計して合成し、そのそれぞれを、Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロ注射器を用いてマウスの側脳室に定量的に注射した；それぞれの実験において３つの群、すなわちアンチセンス核酸実験群、ミスセンス核酸対照群および生理食塩水対照群をたてた。実験群と対照群との間の代謝および動物行動学の実験における差を観察した。行動学の実験の内容には、オープンフィールド行動試験、ホールボード試験、テールフリック試験、ステップダウン試験が含まれる。
【００２１】
実験結果から、実験群のマウスの摂食量は対照群より有意に少ないこと、オープンフィールド行動試験において実験群のマウスの直立回数は対照群に比べて有意に多いこと、テールフリック試験において実験群のマウスのテールフリック時間は対照群に比べて有意に長いことが示された。このことから、ＧＰＲ３９遺伝子が抑制されると、マウスの食欲が下がり、直立回数は増加し、痛覚が鈍感になることが示された。言い換えると、正常な発現の場合、当該遺伝子の機能は、マウスの摂食の調節、運動および痛覚に関連するということである。
【００２２】
本願で使用される「ＧＰＲ３９タンパク質」および「ＧＰＲ３９ポリペプチド」という用語は互換的に使用することが可能であり、神経系を含む様々な系において発現し、且つそのアミノ酸配列は、ヒト、ラットまたはマウスのＧＰＲ３９のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の相同性のあるポリペプチドを表わす。そのほか、ＧＰＲ３９の活性のある断片、保存的ポリペプチド、または活性のある誘導体も本発明に用いることができる。
【００２３】
マウスのＧＰＲ３９タンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２に示される。（またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＢＣ  ０８５２８５）。
【００２４】
ヒトのＧＰＲ３９タンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および４に示される。（またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ  ００１５０８）。
【００２５】
ラットのＧＰＲ３９タンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６に示される。（またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＸＭ  ２２２５７８）。
【００２６】
タンパク質の相同性の比較によると、ヒトのＧＰＲ３９タンパク質とマウスのＧＰＲ３９タンパク質には高い相同性（８２％以上の相同性）がある。マウスＧＰＲ３９タンパク質の構造および組織分布の特異性は、ＧＰＲ３９タンパク質が食欲、運動および／または痛覚を制御することが可能であることを示唆する。従って、ヒトＧＰＲ３９タンパク質もヒトの食欲または痛覚に関連する可能性がある。
【００２７】
ＧＰＲ３９ヌクレオチドの全長配列またはその断片は、通常、ＰＣＲによる増幅、組換えまたは人工的な合成の方法により得られる。ＰＣＲ増幅法として、既に公開されたヒトのＧＰＲ３９、マウスのＧＰＲ３９のヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列をもとにプライマーを設計し、そして市販のｃＤＮＡライブラリー、または当業者に既知の通常の方法に従って作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いて増幅することで、所望の配列が得られる。配列が長い場合、通常２回または複数回のＰＣＲ増幅を行い、増幅されたそれぞれの断片を、正確な順序でつなぐ必要がある。
【００２８】
一旦所望の配列が得られれば、組換え法を用いて、所望の配列を大量に得ることができる。これは、通常、当該クローンをベクターに入れ、さらに細胞に導入し、その後、通常の方法にて増殖させた宿主細胞から分離することで所望の配列を得ることができる。
【００２９】
また、特に配列の長さが短い場合、人工的な合成の方法により所望の配列を取得してもよい。通常、多数の小さい断片を合成し、その後、連結することで所望の配列が得られる。
【００３０】
現在、本発明によるタンパク質（またはその断片もしくは誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、完全な化学合成によって取得することができる。そして、このＤＮＡ配列を、当該分野において既知の様々なＤＮＡ分子（またはベクター）および細胞に導入することができる。また、化学合成によって本発明のタンパク質配列に変異を導入してもよい。
【００３１】
本発明に用いることが可能なＧＰＲ３９タンパク質は、対応するコード配列を宿主細胞に導入し（直接導入、またはＧＰＲ３９コード配列を含むベクターを導入）、適当な条件で形質転換した宿主細胞を培養してＧＰＲ３９タンパク質を発現させ、その後、分離および精製することにより、ＧＰＲ３９タンパク質が得られる。
【００３２】
具体的には、本発明によるＧＰＲ３９タンパク質またはポリペプチドは多くの用途がある。これらの用途には以下が含まれる（しかし、これらに限定されない）：ＧＰＲ３９タンパク質の機能の低下または喪失による疾病（例えば、食欲の低下）の治療における、直接の薬剤としての用途、および、ＧＰＲ３９タンパク質の機能を促進する抗体、ポリペプチドまたはそれらのリガンドのスクリーニングにおける用途。発現した組換えＧＰＲ３９タンパク質を用いてポリペプチドライブラリーをスクリーニングすることは、治療的に価値があり、ＧＰＲ３９タンパク質の機能を刺激することができるポリペプチド分子を探すことに有用である。
【００３３】
別の側面において、本発明には、ＧＰＲ３９のＤＮＡまたはその断片にコードされるポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体やモノクローナル抗体、特にモノクローナル抗体が含まれる。ここにおいて「特異的」とは、抗体が、ＧＰＲ３９遺伝子の産物または断片に結合できることを示す。好ましくは、ＧＰＲ３９遺伝子産物や断片のみに結合し、他の関係ない抗原分子を識別および結合しない抗体のことを示す。本発明において抗体は、ＧＰＲ３９タンパク質に結合し抑制することができる分子を含み、またＧＰＲ３９タンパク質の機能に影響を与えない抗体も含む。
【００３４】
本発明は、完全なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体だけではなく、免疫活性のある抗体断片、例えば、Ｆａｂ’または（Ｆａｂ）２断片；抗体の重鎖；抗体の軽鎖；またはキメラ抗体（例えば、マウス抗体の結合特異性を有するが、ヒト由来の抗体部分を残している抗体）を含む。
【００３５】
本発明による抗体は、当業者に既知の様々な技術によって製造することができる。例えば、精製したＧＰＲ３９遺伝子産物または抗原性のあるその断片を動物に投与し、ポリクローナル抗体の産生を誘導することができる。同様に、ＧＰＲ３９タンパク質または抗原性のあるその断片を発現する細胞で動物を免疫させて、抗体を作ることができる。本発明によるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて製造することができる（Ｋｏｈｌｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ２５６；４９５， １９７５； Ｋｏｈｌｅｒら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１， １９７６； Ｋｏｈｌｅｒら， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２９２， １９７６； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら， Ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８１参照）。本発明による各種の抗体は、ヒト、ラットまたはマウスのＧＰＲ３９遺伝子産物の断片または機能領域を用いて、通常の免疫技術で得ることができる。これらの断片または機能領域は、組換え技術にてまたはタンパク質合成装置を用いて製造することができる。修飾されていない形態のＧＰＲ３９遺伝子産物と結合する抗体は、原核細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）が生産した遺伝子産物で動物を免疫して作製することができる；翻訳後修飾された形態のもの（例えばグリセシル化またはリン酸化タンパク質またはポリペプチド）と結合する抗体は、真核細胞（例えば酵母または昆虫細胞）で生産された遺伝子産物で動物を免疫して作製することができる。
【００３６】
抗ＧＰＲ３９タンパク質抗体は、生検標本中のＧＰＲ３９タンパク質を検出するために、免疫組織化学に使用することが可能である。
【００３７】
ポリクローナル抗体は、ＧＰＲ３９タンパク質またはポリペプチドで免疫された動物、例えばウサギ、ヒツジ等で製造することができる。多数のアジュバンドが、免疫反応の増強を増強するために使用することができ、この例にはフロイントアジュバンド等を含むが、これに限定されない。
【００３８】
各種の通常のスクリーニング方法にて本発明によるタンパク質を利用し、例えば、抑制剤、アゴニストまたはアンタゴニストなどのＧＰＲ３９タンパク質と相互作用する物質をスクリーニングすることができる。スクリーニングの場合、ＧＰＲ３９タンパク質を、生物学的アッセイ中に加え、試験化合物の存在下におけるＧＰＲ３９タンパク質とその受容体との相互作用の変化を検出し、当該化合物がアンタゴニストであるかどうかを決定してよい。また、試験化合物を、ＧＰＲ３９タンパク質と共に実験動物に投与し、対照と比較した場合の動物の食欲または痛覚における変化を検出することで、当該化合物が、ＧＰＲ３９タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストであるかが示される。
【００３９】
また、ＧＰＲ３９遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、さらに哺乳類の細胞株に導入してＧＰＲ３９タンパク質を高発現する細胞株を作製し、この細胞株中のＧＰＲ３９タンパク質を標的として使用して、ＧＰＲ３９タンパク質を活性化するまたは抑制する作用をもつ薬剤をスクリーニングすることができる。ＧＰＲ３９タンパク質を発現するこの細胞株の培養液に、試験化合物を入れ、ＧＰＲ３９タンパク質の発現量の変化を検出する。ＧＰＲ３９タンパク質の発現を促進する化合物は、食欲または痛覚の低下を治療する候補薬剤であり、ＧＰＲ３９タンパク質の発現を抑制する化合物は食欲または痛覚を抑制する薬剤とすることができる。
【００４０】
本発明によるタンパク質、およびその抗体、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト等を治療において使用（投与）することで、異なる効果を提供することができる。通常、これらの物質を、無毒で、不活性でおよび医薬的に許容可能な水性担体中に配合することができる。ここにおいて、この担体のｐＨ値は、配合される成分の性質や治療すべき疾病によって変化するが、ｐＨ値は通常約５−８で、好ましくは約６−８である。調製された医薬組成物は、通常の様態で投与することができ、例えば、筋肉、静脈内、皮下、経口または局所の投与などを含むが、これらに限定されない。
【００４１】
正常的なＧＰＲ３９ポリペプチドは、直接疾病の治療に用いることが可能であり、例えば食欲または痛覚の低下に対する治療に使用することができる。本発明によるＧＰＲ３９タンパク質を使用する場合、その他の食欲低下を治療する薬剤と共に使用してもよい。
【００４２】
本発明はさらに、安全で有効な量の本発明によるＧＰＲ３９タンパク質および医薬的に許容可能な担体または賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノールおよびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。医薬製剤は、投与の経路に適すようにすべきである。本発明による医薬組成物は、注射剤として調製することができ、例えば、生理食塩水またはブドウ糖およびその他の補助剤を含有する水溶液を用いて通常の方法により調製される。錠剤やカプセルのような医薬組成物は通常の方法で調製することができる。注射剤、液剤、錠剤およびカプセルといった医薬組成物は、無菌条件にて製造することが好ましい。活性成分の投与量は治療的有効量であり、例えば、１日当り約０．１μｇ−５ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明によるポリペプチドはその他の治療薬と併用してもよい。
【００４３】
医薬組成物を使用する場合、安全で有効な量のＧＰＲ３９タンパク質またはその阻害剤、アゴニストを哺乳動物に使用する。ここにおいて、この安全で有効な量とは、通常、一日当り少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ体重、最大で約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは１日当り約０．１μｇ−約１００μｇ／ｋｇ体重である。もちろん、具体的な使用量は投与の様態、患者の健康状態などを考慮すべきであり、これらは熟練の医師の技術的範囲である。
【００４４】
ＧＰＲ３９タンパク質のポリヌクレオチドもまた、各種の治療に使用することができる。遺伝子治療技術は、ＧＰＲ３９タンパク質の発現の低下または異常な／不活性のＧＰＲ３９タンパク質の発現による細胞の増殖、発育または代謝の異常の治療に使用することができる。ＧＰＲ３９遺伝子の組換えウイルスベクターを構築する方法は、公開された文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．）を参照するができる。また、組換えヒトＧＰＲ３９遺伝子をリポゾームに入れ、さらに細胞内に導入してもよい。
【００４５】
ポリヌクレオチドを組織または細胞内に導入する方法は、ポリヌクレオチドを直接に体内組織に注入する方法、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにてポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、ウイルス、ファージまたはプラズミド等）を細胞内に導入し、さらにその細胞を体内に移植する方法を含む。
【００４６】
また、本発明は、ＧＰＲ３９タンパク質のレベルを定量的に測定および定位的に測定する診断試験方法を提供する。これらの試験は当該分野において公知の技術、およびＦＩＳＨ測定法および放射性免疫測定法を含む。試験にて測定されたタンパク質のレベルは、各種疾病におけるＧＰＲ３９タンパク質の重要性の解釈およびＧＰＲ３９タンパク質が作用する疾病の診断に用いられる。
【００４７】
サンプル中にＧＰＲ３９タンパク質が存在するかどうかを検出する方法の一つとして、ＧＰＲ３９タンパク質に特異的な抗体を利用して検出する方法がある。この方法には、サンプルとＧＰＲ３９タンパク質の特異的抗体とを接触させ、抗体複合物が形成されるかどうかの観察が含まれ、抗体複合物が形成されることで、サンプル中にＧＰＲ３９タンパク質が存在することが示される。
【００４８】
ＧＰＲ３９タンパク質のポリヌクレオチドは、ＧＰＲ３９タンパク質の関連疾病の診断および治療に使用することができる。診断においては、ＧＰＲ３９タンパク質のポリヌクレオチドは、ＧＰＲ３９タンパク質が発現されるかどうかの検出、または疾病の状態におけるＧＰＲ３９タンパク質の異常な発現の検出に使用することができる。例えば、ＧＰＲ３９のＤＮＡ配列は生検標本に対するハイブリダイゼーションに用いられ、それによってＧＰＲ３９タンパク質の発現異常を判断することができる。ハイブリダイゼーション技術には、サザンブロット法、ノーザンブロット法、インサイチュ・ハイブリダイゼーションなどが含まれる。これらの技術方法は何れも公知の確立された技術であり、関連する試薬キットを市販品として入手することができる。本発明によるポリヌクレオチドは、その一部または全てをプローブとしてマイクロアレイまたはＤＮＡチップ（「遺伝子チップ」とも呼ばれる）の上に固定し、組織中における遺伝子の発現の差異の分析および遺伝子診断に使用することができる。ＧＰＲ３９タンパク質特異的プライマーを用いて、ＲＮＡ−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの増幅を行うことにより、ＧＰＲ３９遺伝子の転写産物を測定することもできる。
【００４９】
ＧＰＲ３９遺伝子の突然変異の検出は、ＧＰＲ３９タンパク質が関連する疾病の診断に使用することができる。ＧＰＲ３９タンパク質の突然変異の様態は、正常な野生型ＧＰＲ３９ ＤＮＡ配列に対する点突然変異、転座、欠失、組換えまたはその他の異常等を含む。例えば、サザンブロット法、ＤＮＡ配列分析、ＰＣＲおよびインサイチュ・ハイブリダイゼーションなどの既知の技術によって突然変異を検出することができる。また、突然変異はタンパク質の発現に影響する可能性があるため、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法により遺伝子の突然変異の有無を間接的に判断することもできる。
【００５０】
本発明のＧＰＲ３９タンパク質は、食欲が低下した対象の治療ばかりでなく、正常な個体における食欲の増強にも使用することができる。また、ＧＰＲ３９タンパク質のアンタゴニストは正常な個体における食欲の抑制に使用することができる。従って、本発明はさらに、哺乳類ＧＰＲ３９タンパク質もしくはその活性断片またはそれらのアゴニストを含む食欲を促進する保健品を提供する。また、本発明は、哺乳類ＧＰＲ３９タンパク質のアンタゴニストを含む食欲を抑制する保健品を提供する。本発明の保健品は、保健品分野の一般的な方法により、哺乳類ＧＰＲ３９タンパク質またはその活性断片（またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニスト）を適当な稀釈剤、食品等と混合して製造することができる。保健品は、好ましくは、錠剤、顆粒剤、経口剤である。
【００５１】
また、本発明は、治療すべき患者に安全で有効な量の正常ＧＰＲ３９タンパク質またはその活性断片もしくはアゴニストを投与する工程を含む、食欲低下を治療する方法を提供する。
【００５２】
また、本発明は、治療すべき患者に安全で有効な量のＧＰＲ３９タンパク質のアンタゴニストを投与する工程を含む、食欲を制御する方法を提供する。
【００５３】
また、本発明は、所定の対象に対し安全で有効な量のＧＰＲ３９タンパク質またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含む、哺乳動物の食欲または痛覚を調節する方法を提供する。
【実施例】
【００５４】
以下に、具体的な実施例によって本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためのものだけで、本発明の範囲を限定するものではないと理解される。以下の実施例において、特に具体的な条件を説明していない実験方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらの分子クローニング：研究室マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）で述べられるような通常の条件にて、またはメーカーが推奨する条件にて行われる。
【００５５】
１．材料および器械：
１．１  試薬
１．１．１  アンチセンス核酸：中国科学院上海生命科学研究院生物化学および細胞生物学研究所によって設計し、上海捷倍思基因技術有限会社によって合成した：
アンチセンス核酸の核酸配列 ５’−ＴＣＧ ＧＡＴ ＣＴＧ ＡＴＴ ＧＧＧ ＣＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
ミスセンス核酸の核酸配列 ５’−ＴＴＧ ＧＧＴ ＣＴＧ ＡＴＣ ＧＧＡ ＣＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
１．１．２  ペントバルビタールナトリウム、広州南方化玻会社から購入。
【００５６】
１．２  器械
１．２．１  ステンレス製代謝ケージ  中国製
１．２．３  Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロ注射器
１．２．３  オープンフィールド行動学測定システム（Ｆｌａｘ Ｆｉｅｌｄ Ｓｙｓｔｅｍ）、アメリカＳＤ社製
１．２．４  赤外線テールフリック測量機（ＴＦＬ機）、アメリカＳｔｏｅｌｔｉｎｇ社製
１．２．５  ホールボード計数器（Ｈｏｌｅｂｏａｒｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ），アメリカＳｔｏｅｌｔｉｎｇ社製
１．２．６  ステップダウン測量機、中国製。
【００５７】
１．３  実験動物
１．３．１  近交系ＢＡＬＢ／ｃマウス、オス、２０−２２グラム、ＳＰＦ級、中国科学院上海実験動物センターから入手
１．３．２  遠交系ＩＣＲマウス、オス、２０−２２グラム、ＳＰＦ級、中国科学院上海実験動物センターから入手。
【００５８】
実施例１
ＧＰＲ３９の機能の研究
本実施例では、アンチセンス核酸技術を利用してＧＰＲ３９の機能を研究した。アンチセンス核酸技術は、塩基対同士の相補的な結合の原則により、アンチセンス核酸と標的遺伝子または発現したそのｍＲＮＡとの特異的な結合を利用し、標的遺伝子の転写および翻訳を低下させることにより、標的タンパク質の発現を減少または阻止する。本実施例はアンチセンス核酸によりマウスＧＰＲ３９の発現を一時的に低下させ、当該遺伝子の代謝の機能およびその他の行動学的機能を調べた。
【００５９】
（ａ）方法
１．アンチセンス、ミスセンス核酸の設計、合成および溶液の調製
生物情報学的方法を用いて、関連遺伝子のｃＤＮＡにおける翻訳開始領域またはその他の領域から部分的な核酸配列を選択し、アンチセンス核酸およびミスセンス核酸を設計および合成した。アンチセンス核酸およびミスセンス核酸を、それぞれ０．５μｇ／μｌの溶液として調製し、別の試験管に分け、標記してから−２０℃の冷凍庫に保存して使用に供した。
【００６０】
２．側脳室への注射
１％のペントバルビタールナトリウム溶液でマウスを麻酔（１２０μｌ／２０ｇ体重）し、７５％アルコールに浸した綿でマウスの頭部を消毒し、頭部の正中線の眼球の少し後の位置にて頭皮を０．６−０．８ｍｍ切り、頭蓋骨を露出させた。頭蓋骨の継ぎ目を見つけ、頭蓋骨の正中線の一側面にて、骨の継ぎ目から後１ｍｍぐらいの位置に血管を避けて破骨針で頭骨に小さい穴をあけた。Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロ注射器を用いて、実験群のマウスの側脳室に４μｌのアンチセンス核酸溶液をゆっくり注射した。生理食塩水の対照群およびミスセンス核酸の対照群には、それぞれ生理食塩水およびミスセンス核酸溶液を注射した。注射時間は２−３分とし、注射完了後針頭を３０秒ぐらい保持し、液体が完全に脳組織に浸透した後に慎重に抜き取った。全ての処置が終わった後、マウスを注意深く代謝ケージに入れた。
【００６１】
３．代謝実験
「マウスの摂食、摂水量およびタンパク質代謝における、４つの遺伝子の機能の研究」（敖紅ら、中国実験動物学報、１０（１）：１０−１５，２００２）に記載される方法で代謝実験を行った。具体的な方法は以下のようにした：
全ての実験には、実験用マウスを３０匹用い、アンチセンス核酸群、ミスセンス核酸対照群および生理食塩水対照群に、各群１０匹のマウスとなるよう３群に分けた。実験は、以下の階段を含む。
【００６２】
３．１適応階段
動物センターから得たマウスを飼育部屋に運び、２日間、飼育部屋の飼養ケージで飼養した。マウスが食餌および水を自由に摂取できるようにし、室内の照明は蛍光灯を用い、照明時間は朝６時から午後６時までの計１２時間とした。
【００６３】
３．２実験階段
実験１日目の午前に、適応させたマウスを、1群１０匹で無作為に３群に分けた。マウスの体重を個々に測定し、番号を付し、ステンレス製代謝ケージに入れた。ケージには、重量測定したマウス用食餌箱および重量測定した給水ボトルを設置した。マウスは自由に行動させ、ケージに適応させた。
【００６４】
実験２日目の午前の同じ時間に、再びマウスの体重を測定し、食餌箱の測定からマウスの摂食量を計算し、給水ボトルの重量測定からマウスの摂水量を計算した。食餌および水を交換し、その重量を測定し、マウスの糞を収集して重量を測定した。
【００６５】
実験３日目の午前に２日目の手順を繰り返した。データをコンピューターに入力し、各群の実験データに大きな差異があるかどうかを検定した。もし差異がなければ、午後に１回目の側脳注射を行った。
【００６６】
続く４日間、上記の手順を繰り返した。つまり、午前に体重、食餌箱および給水ボトルの重量を測定し、午後に側脳室注射を行った。
【００６７】
各マウスに連続５日間注射した後、実験８日目および９日目に注射を停止した。マウスの体重、食餌箱および給水ボトルの重量を測定した。継続して各群のマウスの代謝の状態を観察した。
【００６８】
４．行動学試験
４．１オープンフィールド行動（Ｏｐｅｎ Ｆｉｅｌｄ Ｂｅｈａｖｉｏｒ）：
測定システム全体を均一に８つの格子に分け、マウスの行動に伴って赤外線が遮断されるたびに装置に自動的に記録させ、その結果をまとめ、統計処理を行った。
【００６９】
４．２テールフリック試験（Ｔａｉｌ Ｆｌｉｃｋ Ｌａｔｅｎｃｙ Ｔｅｓｔ）：
本実験において、光強度は８８に設定した。固定した状態とし且つ苦しませないように、綿布で実験マウスの体を包み、尾部のみを露出させた。マウスの尾の先端から約１．５ｃｍの部分を、輻射熱源の孔上に置き、連続的に３回を測定し、２回目以降の実験結果を統計分析に供した。
【００７０】
４．３、ホールボード試験（Ｈｏｌｅ−ｂｏａｒｄ ｔｅｓｔ）
マウスをホールボード計数器に置き、マウスが５分間ホールを探る回数を測定した。
【００７１】
４．４ステップダウン法試験（Ｓｔｅｐ Ｄｏｗｎ Ｔｅｓｔ）：
注射が完了したその日にステップダウンの訓練を行った。マウスをプラスチック製のステップダウン装置に入れ、約１分間その環境に適応させた。その後、マウスをステップに追い込み、回路板に電流を流した。マウスは、ステップから降りると感電するため、感電を避けるためすぐにステップに逃げることになる。感電から３分間ステップを離れなかったマウスを、訓練に合格したマウスとして代謝ゲージに戻した。２４時間後、マウスを再びステップに置き、回路板に電流を流さない状態で、ステップに置いた直後からマウスがステップから降りるまでの時間を記録した。４８時間後に上記の実験を繰り返し、時間を記録した。
【００７２】
５．実験の手順
１日目および２日目は、マウスを代謝ケージ内の環境および新しい摂食、摂水の方法に適応させた。３、４、５、６、７日目は、毎日1回、側脳室注射を行った。１日目から９日目まで毎日、各群のマウスの代謝の状態を観察し、８日目に行動学的実験を行った。
【００７３】
６．統計分析
Ｐｒｉｓｍソフトウェアを利用して、実験データの統計分析を行った。
【００７４】
（ｂ）結果
１．代謝実験における摂食量の変化の結果
ＢＡＬＢ／ｃマウスの代謝実験おける摂食量の変化の結果を図１に表す。実験結果から、３群のマウスにおいて、側脳室注射の後に、摂食量が全て下がることが示された。これは、マウスが麻酔剤および手術を受けたためであった。引き続き注射を行うと、対照群のマウスの摂食量は全て一定の程度で増加したが、実験群のマウスの摂食量は減少し続け、５日目には最小値に達し、生理食塩水群と比べて有意な差がみられた。５日目の注射が終了すると、３群のマウスの摂食量は、次第に同程度のレベルに回復した。
【００７５】
ＩＣＲマウス実験群と対照群の摂食量の比較結果は図２に表す。図中、３日目が、３群のマウスにおいて注射を開始した時点であった。アンチセンス核酸群のマウスの摂食量は、６日目において対照群と比べて顕著に下がり、ｔ検定により有意な差が見られた。（アンチセンス核酸群と生理食塩水群との比較ではｐ＜０．０５、アンチセンス核酸群とミスセンス核酸群との比較ではｐ＜０．０１）。
【００７６】
２．みかけの消化率
みかけの消化率の計算式＝（１日に摂取するタンパク質の窒素含有量−１日に排出する糞便の窒素含有量）／１日に摂取するタンパク質の窒素含有量×１００％。
【００７７】
３群のＢＡＬＢ／ｃマウスのみかけの消化率の測定結果を図３に表す。ｔ検定により、３群の間では有意な差がないことが示された。
【００７８】
３．行動学的実験の結果
３．１ 直立回数
５回の側脳室注射の終了後、実験マウスに対してオープンフィールド行動試験を行った。オープンフィールド行動試験において、時間は１時間と設定し、後半３０分のデータを用いて統計分析を行った。ＩＣＲマウスの、オープンフィールド試験における直立回数を図４に表す。ｔ検定により、アンチセンス核酸群のマウスと２つの対照群との間に、有意な差が示された（アンチセンス核酸群と生理食塩水との比較においてｐ＜０．０５、アンチセンス核酸群とミスセンス核酸群との比較においてｐ＜０．０５）。この結果から、実験群のマウスの直立行動が対照群に比べて多いこと、即ち運動能力が対照群に比べて高いことが示された。
【００７９】
３．２ テールフリック実験
マウスのオープンフィールド行動試験の直後に、テールフリック試験を行った。ＩＣＲマウスのテールフリック試験の結果を図５に表す。この結果から、実験群のマウスは痛覚に対して鈍感であること、即ち痛覚が下がったことが示された。ｔ検定によりアンチセンス核酸群のマウスと２つの対照群との間には有意な差が見られた（アンチセンス核酸群と生理食塩水群との比較ではｐ＜０．０５、アンチセンス核酸群とミスセンス核酸群との比較ではｐ＜０．０５）。
【００８０】
検討
上記の実験結果から、ＧＰＲ３９遺伝子の発現が下がった場合、実験群のマウスの摂食量は対照群に比べて有意に減少したが、３群のみかけの消化率には有意な差が見られないことが確認された。これによって、当該遺伝子が正常に発現することでマウスの食欲は増加し、当該遺伝子が過度に発現することで動物の肥満が引き起こされる可能性があることが示された。
【００８１】
同時に、行動学的実験の結果は、当該遺伝子が摂食の調節に関連することばかりでなく、直立および痛覚にも関連することを示唆した。しかし、実験ではマウスの尿を収集しておらず、このことがマウスの代謝率の統計に若干影響を与える恐れがある。
【００８２】
当該遺伝子と摂食の調節との相関性から、ＧＰＲ３９遺伝子が、ダイエット用薬剤の開発および肥満関連疾病の治療に対して潜在的な応用価値があることが、この実験結果から示唆される。薬剤を用いて、適当に当該遺伝子の発現を抑制し、または当該遺伝子の発現産物と拮抗させることができれば、食欲を調節してダイエットを実現することが可能になる。しかし、摂食の調節経路における当該遺伝子の分子機構および内因性リガンドが十分に解明されていないため、今後、細胞学および分子生物学のレベルにおいて更に幅広い研究が必要である。
【００８３】
実施例２
ＧＰＲ３９タンパク質を含む組成物
表１に示す量で、組換えＧＰＲ３９タンパク質、乳糖、クロスポピドン（アイエスピー社（ＩＳＰ））、アスパルテーム（Ｔｈｅ ＮｕｔｒａＳｗｅｅｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）を秤量し、各成分を均一に混合した。得られた混合物を４０メッシュのふるいに２回通し、得られた材料を容器に入れた。当該容器に１０％デンプンスラリーを適量加え、軟性材料を調製した。この軟性材料を２０メッシュのふるいに通し、圧力をかけて湿性顆粒を製造した。当該顆粒を乾燥したエナメル皿に置き送風恒温乾燥箱に入れ、７０℃で２時間乾燥させた。乾燥した顆粒の重量を測定し、１重量％の比率（乾燥した顆粒の重量で計算）でステアリン酸マグネシウムを入れ、均一に混合した後、ＺＤＹ−８型単発式打錠機（上海遠東製薬器械工場、ＺＤＹ−８型）でプレスし、ＧＰＲ３９タンパク質を含む口腔崩解錠剤を１０００錠製造した。
【表１】
2008536880.tif 000002
【００８４】
製造した口腔崩解錠剤は、食欲を促進する保健品または薬品として、虚弱で食欲減退を引き起こした患者または食欲不振の人に適用した。２人の食欲不振の患者に対し、１回に１錠ずつ、１日２回使用した。一週間で、２人は食欲の向上を感じた。
【００８５】
本発明に係る全ての文献は、それらの全体が本願に援用される。また、上述した記載を基に、当業者が本発明に様々な改変または修正をすることが可能であり、それらの等価な様態は、同様に本発明の請求の範囲に含まれると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、ＢＡＬＢ／Ｃマウス実験群と対照群との間の摂食量の比較を表す。横軸は実験の日数、縦軸は各群１０匹のマウスの１日の平均摂食量である。図中、３日目が３群のマウスの注射開始時であり、６日目にアンチセンス核酸群のマウスは生理食塩水郡に比べて摂食量が顕著に下がっており、ｔ検定により有意な差が示された（アンチセンス核酸群は生理食塩水群に対してｐ＜０．０５）。
【図２】図２は、ＩＣＲマウス実験群と対照群との間の摂食量の比較を表す。横軸は実験の日数で、縦軸は各群１０匹のマウスの１日の平均摂食量である。図中、３日目が３群のマウスの注射開始時であり、６日目にアンチセンス核酸群のマウスは生理食塩水群に比べて摂食量が顕著に下がっており、ｔ検定により有意な差が示された（アンチセンス核酸群は生理食塩水群に対してｐ＜０．０５、アンチセンス核酸群はミスセンス核酸群に対してｐ＜０．０１）。
【図３】図３は、３群のＢＡＬＢ／ｃマウスのみかけの消化率の平均値を表す。ｔ検定により、３群の間には有意な差が見られなかった。みかけの消化率の計算式＝（１日に摂取するタンパク質の窒素含有量−１日に排出する糞便の窒素含有量）／１日に摂取するタンパク質の窒素含有量×１００％。
【図４】図４は、ＩＣＲマウス実験群と対照群の直立行動の比較結果を表す。図中、縦軸は各群のマウスの直立回数の平均値である。オープンフィールド行動試験の時間を１時間と設定し、後半の３０分間のデータを用いて統計分析を行った。ｔ検定により、アンチセンス核酸群のマウスと２つの対照群との間に有意な差が見られた（アンチセンス核酸群は生理食塩水群に対してｐ＜０．０５、アンチセンス核酸群はミスセンス核酸群に対して＜０．０５）。
【図５】図５は、ＩＣＲマウスのテールフリック試験の結果を表す。図中、横軸は異なる３群のマウスであり、縦軸は群ごとのマウスのテールフリックの平均時間である。ｔ検定により、アンチセンス核酸群と２つの対照群の間に有意な差が見られた（アンチセンス核酸群は生理食塩水群に対してｐ＜０．０５、アンチセンス核酸群はミスセンス核酸群に対してｐ＜０．０５、ｎ＝１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008536880.tif 000009
2008536880.tif 000010
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