(57)【要約】  開示するのは、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を有するタンパク質の加水分解物であって、加水分解物は、少なくとも１個のプロリン残基を含む２〜８個のアミノ酸からなる長さを有するペプチド中に濃縮されているタンパク質の加水分解物、そのようなタンパク質の加水分解物から誘導できる単離ペプチド又はそれらの混合物、並びにそのようなタンパク質の加水分解物又は単離ペプチドの、特に、肥満、２型糖尿病及び免疫学的障害からなる群から選択されるＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態の予防及び／又は治療に用いるための、医薬品、栄養補助食品、飲料又は食品を製造するための使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を有するタンパク質の加水分解物であって、少なくとも１個のプロリン残基を含む２〜８個のアミノ酸からなる長さを有するペプチド中に濃縮されている、上記加水分解物。
【請求項２】
前記タンパク質の加水分解物が、乳タンパク質の加水分解物である、請求項１に記載のタンパク質の加水分解物。
【請求項３】
前記タンパク質の加水分解物が、カゼインの加水分解物である、請求項２に記載のタンパク質の加水分解物。
【請求項４】
３〜７個のアミノ酸からなる長さを有するペプチドを、２０重量％から８０重量％の間で含有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載のタンパク質の加水分解物。
【請求項５】
前記ペプチドが、
【化１】
2008525430.tif 000012
から選択される、請求項１から４までのいずれか一項に記載のタンパク質の加水分解物。
【請求項６】
前記ペプチドが、ＶＰＹＰＱ、ＶＰＬＧＴＱ、ＬＰＶＰＱＫ、ＫＶＬＰ、ＬＰＬ及びＩＰＩから選択される、請求項５に記載のタンパク質の加水分解物。
【請求項７】
タンパク質の加水分解物から誘導できる単離ペプチドであって、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を有し、且つ
【化２】
2008525430.tif 000013
、又はそれらの２種以上の混合物から選択される、上記ペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、ＶＰＹＰＱ、ＶＰＬＧＴＱ、ＬＰＶＰＱＫ、ＫＶＬＰ、ＬＰＬ及びＩＰＩから選択される、請求項７に記載の単離ペプチド又は混合物。
【請求項９】
請求項１から６までのいずれか一項に記載のタンパク質の加水分解物、又は請求項７若しくは８のいずれか一項に記載の単離ペプチド若しくは混合物の、ＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態の予防及び／又は治療に用いるための、医薬品、栄養補助食品、飲料又は食品を製造するための使用。
【請求項１０】
前記ＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態が、肥満、２型糖尿病及び免疫学的障害からなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
肥満の予防及び／又は治療のための、請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１２】
２型糖尿病の予防及び／又は治療のための、請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１３】
免疫学的障害の予防及び／又は治療のための、請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１４】
関節リウマチ、多発性硬化症及びグレーブス病からなる群から選択される自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のペプチド中に濃縮されているタンパク質の加水分解物、当該の単離ペプチド、並びに当該のタンパク質の加水分解物又は単離ペプチドの、ＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態の予防及び／又は治療に用いるための、医薬品、栄養補助食品、飲料又は食品を製造するための使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）は、Ｎ末端ジペプチダーゼ活性を有する多機能性の膜貫通型糖タンパク質である。これは、大部分の哺乳類細胞上に、肝臓、腎臓、小腸、唾液腺、血液細胞及び血漿等、種々の組織に存在する。しかし、ＤＰＰ−ＩＶの生理学的な役割については、ほとんど知られていない。
【０００３】
ＤＰＰ−ＩＶは、免疫、炎症及び内分泌の機能に関与する細胞内プロセスに関係があるとされている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては、ＤＰＰ−ＩＶは、多くのホルモン及びケモカイン、例えば、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）等を切断することが示されている。
【０００４】
ＧＬＰ−１は、食後に放出されるインクレチンホルモンである。ＧＬＰ−１は、インスリンの生合成及び分泌に対するグルコース誘導性の刺激、グルカゴン分泌抑制、遺伝子発現の調節、β細胞に対する栄養性の効果、食物摂取の抑制、並びに胃内容排出の緩徐化をはじめとする、多面的な作用を有する。これらの効果は、上昇した血糖の正常化並びに満腹感及び体重の調節に寄与する。ＧＬＰ−１は、２型糖尿病の対象において食後及び空腹時の糖血症を軽減すること、したがって、２型糖尿病の治療における有用な新しい治療薬となる可能性があることが示されている。さらに、ＧＬＰ−１を使用して、満腹感を高めること、さらには肥満を予防及び治療することも可能性であろう。例えば、Ｃｏｎａｒｅｌｌｏ，Ｓ．Ｌ．ら、２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００：６８２５−６８３０；Ｄｅａｃｏｎ，Ｃ．Ｆ．ら、１９９８，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ｖｏｌ．４７：７６４−７６９；Ａｈｒｅｎ，Ｂ．ら、２００２，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，ｖｏｌ．２５：８６９−８７５；Ｎａｓｌｕｎｄ，Ｅ．ら、１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，ｖｏｌ．６８：５２５−５３０；Ｍｅｎｅｉｌｌｙ，Ｇ．Ｓ．ら、２００３，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，ｖｏｌ．２６：２８３５−２８４１を参照されたい。
【０００５】
しかし、ＧＬＰ−１は、血漿中で急速に分解し、そのため、約１〜２分の非常に短い半減期を有する。ＧＬＰ−１の分解に主として関与する酵素は、ＤＰＰ−ＩＶである。したがって、ＤＰＰ−ＩＶを阻害することによって、ＧＬＰ−１の循環中の半減期を延長させ、それによって、治療薬として作用することができるまでＧＬＰ−１の濃度を上昇させることが可能であろう。
【０００６】
また、ＤＰＰ−ＩＶは、Ｔ細胞の活性化及び増殖にも関与することが示されている。免疫系において、ＤＰＰ−ＩＶは、主として、Ｔ細胞の表面に発現する。ＤＰＰ−ＩＶの発現は、分裂促進性又は抗原性の刺激によって急速に増加することが示されている。さらに、ＤＰＰ−ＩＶの阻害は、抗原誘発性のＴ細胞のクローンの活性化を抑制することができ、したがって、免疫疾患、特に、自己免疫疾患、例えば、ＭＳ及び関節リウマチ等、における治療介入に有用である可能性があることも示されている。逆に、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、免疫調節性サイトカインＴＧＦ−β１の産生を刺激する。例えば、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｄ．ら、２０００．「免疫の機能及び疾患における細胞ペプチダーゼ  ２（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２）」、Ｌａｎｇｎｅｒ及びＡｎｓｏｒｇｅ編、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１５５−１６０；Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ，Ａ．ら、２０００，「免疫の機能及び疾患における細胞ペプチダーゼ  ２（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２）」、Ｌａｎｇｎｅｒ及びＡｎｓｏｒｇｅ編、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１４５−１５３；並びにＴａｎａｋａ  Ｓ．ら、１９９７．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ．，ｖｏｌ．１９：１５−２４を参照。
【０００７】
現在、数種の化合物、例えば、バリン−ピロリジド（Ｄｅａｃｏｎ，Ｃ．Ｆ．ら、上記）、１−［［２−［（５−シアノピリジン−２−イル）アミノ］エチルアミノ］アセチル］−２−シアノ−（Ｓ）−ピロリジン（Ａｈｒｅｎら、上記）、Ｌｙｓ［Ｚ（ＮＯ２）］−チアゾリジド及びＬｙｓ［Ｚ（ＮＯ２）］−ピロリジド（Ｒｅｉｎｈｏｌｄら、上記）等、がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び動物モデルで、ＤＰＰ−ＩＶ活性を阻害するために使用されている。しかし、そのような化合物には、注射による投与を必要とすることが多く、且つ化学薬品がしばしばそうであるように、副作用を示すことがあるという欠点がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
タンパク質、特に、乳タンパク質は、一般に、一連の生物学的に活性なペプチドの前駆体として知られている。タンパク質が生物学的に活性な分子の前駆体であるという事実は、上記のＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態のいずれかにおいて役立つ食品等、機能性の食品の開発に向けて、特に注目に値する。食物タンパク質の加水分解物は、よく使用される食品成分であり、且つ天然に由来し、したがって、肥満、２型糖尿病及び免疫学的障害等のＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態を予防又は治療するためのＤＰＰ−ＩＶの阻害において、機能的な効果を得るために、合成した成分を必要としない。
【０００９】
したがって、ＤＰＰ−ＩＶの活性を阻害し、それによって、上記で特定したＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態の予防及び治療において役立つタンパク質の加水分解物を提供することが望まれている。タンパク質の加水分解物、例えば、乳タンパク質の加水分解物等をＤＰＰ−ＩＶの阻害に使用できる可能性があることが見出された。しかし、そのような加水分解物内で、そのような阻害に関与する要因は、まだ知られていない。加水分解されたタンパク質の試料は、非常に複雑であり、数百種に及ぶ異なる分子を含有する可能性があり、それらの数百種に及ぶ異なる分子が、そのような試料中の生理活性がある化合物を同定するのを困難にする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ここに、本発明の発明者らは、ＤＰＰ−ＩＶの活性を阻害する、タンパク質の加水分解物から、生理活性ペプチドを同定するに至った。当該の生理活性ペプチド又は当該の生理活性ペプチド中に濃縮されているタンパク質の加水分解物は、好都合に、ＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態、例えば、肥満、２型糖尿病及び免疫学的障害等を自然に予防又は治療するために使用することができる。約４０種のタンパク質の加水分解物に対して、ＨＰＬＣによる粗抽出液を分離することができる方法である、オンラインの液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−生化学的検出（ＢＣＤ）−質量分析（ＭＳ）を実施し、その後、生理活性がある化合物の存在を、オンラインの生化学的アッセイによって検出した。オンラインの分画及び特徴付けのためのこの方法は、Ｖａｎ  Ｅｌｓｗｉｊｋらによって詳細に記載されている（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ（２００３）１０２０：４５−５８）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
したがって、本発明の第１の態様は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を有するタンパク質の加水分解物に関するものであり、当該の加水分解物は、少なくとも１個のプロリン残基を含む２〜８個のアミノ酸からなる長さを有するペプチド中に濃縮されている。そのようなペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＤＰＰ−ＩＶ活性を阻害する能力があり、したがって、肥満、２型糖尿病又は免疫学的障害等のＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態を予防及び／又は治療するために使用することができる可能性があることが見出された。
【００１２】
ＤＰＰ−ＩＶは、Ｎ末端の第２の残基（Ｎ末端の最後から第２番目の残基）として、プロリン（Ｐ）（及び、程度は劣るが、Ａｌａ；Ａ）を有し、好ましくは最後のＮ末端残基として、リシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）を有する物質を好むことが明確に記載されている（Ｄａｖｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２０００）１２２：４２５−４３２）。
【００１３】
約４０種のタンパク質の加水分解物から、本発明の発明者らは、ＤＰＰ−ＩＶ活性を阻害する能力がある、約２１種のペプチド配列を同定した。これらのペプチドは、３〜７個のアミノ酸からなる種々の長さを有し、通常、疎水性、及び特に、ペプチド配列中のプロリン（Ｐ）残基の存在を特徴とする。当該の阻害性ペプチドは、プロリン残基を、第１、２、３又は４番目のＮ末端残基として含むが、ほとんどの場合、第２番目のＮ末端残基として含む。また、プロリンは、Ｃ末端残基又は最後から第２番目のＣ末端残基としても存在する。プロリン残基には、ほとんどの場合、ロイシン、バリン又はフェニルアラニン（Ｆ）が隣接するが、程度は劣るが、グルタミン（Ｑ）、アラニン、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）及びチロシン（Ｙ）が隣接することがある。２１種のペプチド配列中、プロリン残基に荷電残基が隣接する、阻害性の配列が１種のみ同定された。この隣接する荷電残基は、ヒスチジンである。同様に、極性アミノ酸である、セリン、スレオニン、アスパラギン及びグルタミンの中で、グルタミンのみが、ＤＰＰ−ＩＶを阻害することが見出されたペプチド中の隣接残基であると同定された。プロリン残基が、第２番目のＮ末端の上に位置し、且つこのプロリン残基のいずれかの側上にバリン、イソロイシン及び／又はロイシン、最も好ましくは、片側又は両側上にロイシンが隣接するペプチドに、最も強力なＤＰＰ−ＩＶ阻害活性が見出された。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「タンパク質の加水分解物」とは、１種又は複数のタンパク質を最小の加水分解度で加水分解することによって誘導したペプチドの混合物を指す。すなわち、ペプチド結合の全量に対する加水分解したペプチド結合のパーセントは、５％、好ましくは、１０％、より好ましくは、２０％、最も好ましくは、３０％である。加水分解度は、好ましくは、５〜７０％の間、最も好ましくは、１０〜５０％の間、最も好ましくは、２０〜４０％の間である。加水分解物が、２〜８個のアミノ酸からなるペプチドを２０〜１００重量％の間、より好ましくは、２５〜７５％の間、最も好ましくは、３０〜６０重量％間で含有することが好ましい。特に好ましくは、３〜７個のアミノ酸からなるペプチドを２０〜８０重量％の間、最も好ましくは、３０〜６０重量％の間で含有する加水分解物である。５００Ｄａを上回る分子量を有するペプチドの重量パーセントが、７５％未満、好ましくは、７０％未満であり、且つ１０００Ｄａを上回る分子量を有するペプチドの重量パーセントが、５０％未満、好ましくは、３５％未満であるのが好ましい。
【００１５】
タンパク質は、１種のタンパク質源から誘導できるか、又は複数のタンパク質源から誘導してもよい。そのようなタンパク質源の例は、微生物（酵母、細菌、真菌）、植物（例えば、ダイズ、エンドウマメ、ワタ、トウモロコシ、コムギ）、動物、並びに乳、血液、肉、卵及びゼラチン等、動物に由来するタンパク質源である。したがって、１種又は複数のタンパク質は、例えば、微生物由来のタンパク質、植物タンパク質、くず肉、魚、甲殻類又は軟体動物に由来するタンパク質、乳タンパク質及び卵タンパク質等の動物タンパク質であることができる。
【００１６】
当該のタンパク質の加水分解は、当技術分野で既知のいずれかの手段によって実施することができる。それらの例として、化学的な加水分解又は酵素による加水分解があげられる。化学的な加水分解の方法の非限定的な例が、当技術分野では周知であり、例えば、臭化シアンを使用する加水分解、酸による加水分解、例えば、塩酸を使用する加水分解、又は１種若しくは複数のタンパク質を含む１種若しくは複数のタンパク質源の発酵による加水分解を含む。酵素による加水分解の方法の非限定的な例も、当技術分野では周知であり、精製した酵素製剤又は粗酵素製剤を使用する加水分解を含む。使用する酵素製剤は、エンド−若しくはエキソ−ペプチダーゼ、プロテアーゼ又はそれらの混合物を含むことができ、それらの例として、トリプシン、キモトリプシンＡ、Ｂ及びＣ、ペプシン、レンニン、微生物アルカリプロテアーゼ、パパイン、フィシン、ブロメライン、カテプシンＢ，コラゲナーゼ、微生物中性プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、Ｂ及びＣ、カルノシナーゼ、アンセリナーゼ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＶ８プロテアーゼ並びに当業者に周知であるさらに多くの酵素製剤があげられる。また、これらのプロテアーゼの組合せも使用することができる。また、市販の酵素製剤、例えば、Ａｌｋａｌａｓｅ、Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｅ  ８００ｓ、Ｎｅｕｔｒａｓｅ、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（いずれもＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク、から入手可能）、Ｐｒｏｔｅｘ  ６．０Ｌ、Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＦＰ（いずれもＧｅｎｅｎｃｏｒ、米国、から入手可能）、Ｃｏｒｏｌａｓｅ  Ｌ１０（Ｒｏｈｍ、ドイツ）、Ｐｅｐｓｉｎ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）、パパイン、パンクレアチン、ｐｒｏｌｅａｔｈｅｒ  Ｎ及びＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｎ（Ａｍａｎｏ、日本）等、又はそれらの組合せも使用することができる。また、組換えＤＮＡ技術によって調製した酵素も使用することができる。
【００１７】
タンパク質の加水分解物は、好ましくは、Ｎ末端の最後から第２番目にプロリン残基を有するペプチドを生成する酵素を使用するタンパク質の切断によって得る。そのような酵素は、例えば、ＣｙｓエンドプロテアーゼＥＰ−Ａ及びＥＰ−Ｂ等、１種又は複数のシステインエンドプロテアーゼであることができるが、上記で議論したように、その他の適切な酵素のいずれかであってもよい。
【００１８】
ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を有するタンパク質の加水分解物は、下記に記載するように測定したＤＰＰ−ＩＶ阻害活性が、出発タンパク質加水分解物に対して増加する場合、並びに／又はそのようなペプチドの存在が、一般的なタンパク質若しくはペプチドの分画及び分析の手法によって実証される場合には、「少なくとも１個のプロリン残基を含む２〜８個のアミノ酸からなる長さを有するペプチド中に濃縮されている」とみなされる。それらの手法の例として、Ｖａｎ  Ｅｌｓｗｉｊｋら（上記）に記載されている質量分析等があげられるが、例えば、連続エドマン分解又はＥＬＩＳＡ法等の特定のペプチドを標的とする特異的アフィニティーアッセイと組み合わせた、ＨＰＬＣ又はその他の分画法等、その他の手法もあげられる。タンパク質の加水分解物、好ましくは、乳タンパク質の加水分解物、より好ましくは、カゼインタンパク質の分解物を、抽出、沈殿、ろ過、限外ろ過、ナノろ過、精密ろ過、又は従来のカラムクロマトグラフィー（好ましくは、イオン交換若しくはアフィニティークロマトグラフィー）、又は上記の手法のいずれかの組合せによって分画し、（さらに）ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を単離することができる。このようにして、ペプチドの混合物又は単一のペプチドを含む画分を、出発タンパク質加水分解物に比べて、ＤＰＰ−ＩＶに対する阻害効果が増加したものと同定することができる。そのようなペプチドの混合物又は単一のペプチドも、本発明に含まれる。さらに、そのようなぺプチドを、組換えＤＮＡ技術によって、例えば、そのようなぺプチドをコードするＤＮＡを適切な宿主内で発現させて調製することができ、又は化学合成によって調製することができると考えられる。
【００１９】
タンパク質の加水分解物は、いずれのタンパク質加水分解物であってもよく、特に、食物タンパク質の加水分解物であることができる。というのは、そのような加水分解物は、食品グレードとみなされ、比較的容易に得ることができるからである。
【００２０】
本明細書で使用する場合、実施例１のＤＰＰ−ＩＶ阻害アッセイにおいて、最大で、１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは、８００μｇ／ｍｌ、より好ましくは、６００μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは、４００μｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは、最大で３００μｇ／ｍｌのＩＣ５０（すなわち、ＤＰＰ−ＩＶ活性の５０％を阻害する（特定のタンパク質の加水分解物中の）阻害剤の濃度）が示される場合に、加水分解物は、「ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性」を示す。
【００２１】
プロリンが、乳タンパク質の加水分解物中に豊富に存在し、且ついくつかの本発明で同定されたペプチド配列が、乳タンパク質中に存在することから、本発明の好ましい実施形態では、タンパク質の加水分解物は、乳タンパク質の加水分解物であり、したがって、容易に得ることができる。乳タンパク質の加水分解物は想定したＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を提供することが分かっている。乳は、いずれかの哺乳動物、特に、ウシ、ヒツジ又はヤギ、好ましくは、ウシに由来することができる（牛乳）。
【００２２】
本発明による好ましい実施形態では、タンパク質の加水分解物は、カゼインの加水分解物である。本発明で同定されたペプチド配列の多くが、１種又は複数のカゼインの配列中に存在し、したがって、カゼインから調製した加水分解物から容易に得ることができることが見出された。別の実施形態では、タンパク質の加水分解物は、乳清タンパク質の加水分解物、例えば、β−ラクトグロブリン由来である。
【００２３】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ペプチドは、３〜７個のアミノ酸からなる長さを有する。最も強力なＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、そのような長さを有することが見出された。
【００２４】
好ましいペプチドは、トリペプチド配列、ＺＰＸ又はＸＰＺの１個を含有する。ただし、Ｚは、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）又はフェニルアラニン（Ｆ）であり、Ｘは、Ｚ、又はグルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）若しくはチロシン（Ｙ）である。それらの例として、ＩＰＩ、ＬＰＬ、ＶＰＦ、ＦＰＩ、ＬＰＡ、ＩＰＹ、ＬＰＱ、ＨＰＩ、ＧＰＦ、ＭＰＬ等があげられる。これらのトリペプチド配列は、３〜８個のアミノ酸からなるペプチドの一部であることができ、その他のアミノ酸は、好ましくは、コムギ、ダイズ及び乳のタンパク質等の自然のタンパク質に存在するようなアミノ酸である。乳タンパク質に由来するペプチドの例を以下に示す。
【化１】
2008525430.tif 000002
ただし、好ましいペプチドは、少なくとも下線を施したトリペプチド配列を有し、且つ０から４又は５個までの周囲のアミノ酸をさらに有し、より好ましくは、プロリン残基（Ｐ）が、Ｎ末端から第２番目の残基であるぺプチドである。これらのペプチドを、そのまま、又はいずれかの混合物、特に、加水分解物の一部として使用することができる。
【００２５】
より好ましい実施形態では、本発明による、タンパク質の加水分解物中に濃縮されているペプチドは、
【化２】
2008525430.tif 000003
、並びに１個又は２個のプロリン残基を含む、少なくとも３個のアミノ酸を有する、これらのペプチドに由来する切断されたペプチドから選択される。オンラインＬＣ−ＢＣＤ−ＭＳによって、これらの特定のペプチドが、ＤＰＰ−ＩＶの強力な阻害剤であり、したがって、肥満、２型糖尿病及び免疫学的障害等のＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態の予防及び／又は治療に、好都合に利用できることが見出された。
【００２６】
本発明による、タンパク質の加水分解物中に濃縮されているペプチドは、ＶＰＹＰＱ、ＶＰＬＧＴＱ、ＬＰＶＰＱＫ、ＫＶＬＰ、ＬＰＬ及びＩＰＩからなる群から選択されるのが最も好ましい。これらのペプチドは、最も強力なＤＰＰ−ＩＶ阻害剤として同定された。したがって、これらのペプチドは、特に興味深い。
【００２７】
別の態様では、本発明は、タンパク質の加水分解物に由来する単離ペプチドに関するものであり、当該のペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を有し、且つ少なくとも１個のプロリン残基を含む２〜８個のアミノ酸からなる長さを有し、当該のペプチドは、
【化３】
2008525430.tif 000004
からなる群、又はそれらの２種以上の混合物から選択される。特に、これらのペプチドは、非常に強力なＤＰＰ−ＩＶ阻害性の化合物であることが見出された（例えば、実施例１を参照）。さらに、別のペプチド、すなわち、ＬＦ、ＬＬ、ＩＩ、ＬＣ及びＶＴＫＣＣＴＥも、ＤＰＰ−ＩＶ阻害性の化合物であることが見出されたことに留意されたい。ＤＰＰ−ＩＶ阻害アッセイを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施した。それに従って、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を有するものとしている。しかし、中等度のＤＰＰ−ＩＶ阻害活性しか示さない化合物が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、相当に向上した効果を示すことがあるという事実が、当業者には知られている。ペプチドは、上記で議論したように、３〜７個のアミノ酸からなる長さを有するのが好ましい。
【００２８】
当業者には、本発明によるペプチドを得る適切な方法、例えば、適切なタンパク質の加水分解物、例えば、カゼインの加水分解物等を分画する方法、又は組換えＤＮＡ技術若しくは化学合成によって合成する方法が知られている。これらは、このようなペプチドを得るための一般的な方法である。
【００２９】
好ましい実施形態では、上記で議論した同一の理由から、本発明による単離ペプチドは、ＶＰＹＰＱ、ＶＰＬＧＴＱ、ＬＰＶＰＱＫ、ＫＶＬＰ、ＬＰＬ及びＩＰＩからなる群から選択され、又は本発明による混合物は、当該の群の２種以上から選択される。
【００３０】
第３の態様では、本発明は、本発明によるタンパク質の加水分解物又は本発明による単離ペプチド若しくは混合物の、ＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態の予防及び／又は治療に用いるための、医薬品、栄養補助食品、飲料又は食品を製造するための使用に関するものである。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「予防」という用語は、症状が観察される前に、ＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態の出現を防止することを指す。したがって、１種又は複数のタンパク質の加水分解物を利用して、有害なＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態が起きるのを防止することができ、したがって、１種又は複数のタンパク質の加水分解物を使用して、いずれかの対象、特に、健康を改善又は安定化させる必要がある対象でそうすることができる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「ＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態」とは、ＤＰＰ−ＩＶの作用が原因で発生する（少なくとも部分的に）、又は悪化する、したがって、ＤＰＰ−ＩＶが、発症において重要な役割を果たしている、いずれかの有害な状態を指す。ＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態の非限定的な例として、肥満、２型糖尿病等の障害、並びに自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ及びグレーブス病、等の免疫学的障害がある。ＤＰＰ−ＩＶの阻害が有益であると考えられる、その他の自己免疫疾患は、１型糖尿病、自己免疫性溶血性貧血、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、全身性エリテマトーデス、原発性胆汁性肝硬変、シェーグレン症候群、慢性活動性肝炎、混合性結合組織疾患、強皮症及び慢性特発性血小板減少性紫斑病である。
【００３３】
本発明の一実施形態では、ＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態は、肥満、２型糖尿病及び免疫学的障害からなる群から選択される。これらの障害の発症におけるＤＰＰ−ＩＶの関与については、文献に明確に記載されており、したがって、これらの障害は、本発明による加水分解物又はペプチドの主たる標的となる。
【００３４】
一実施形態では、本発明によるタンパク質の加水分解物又は単離ペプチドを、対象の満腹感を高めるための、医薬品、栄養補助食品、飲料又は食品の製造に使用する。ＧＬＰ−１は、胃内容排出を緩徐化させ、食物摂取を抑制するので、ＧＬＰ−１の分解酵素であるＤＰＰ−ＩＶを阻害することによって得られるＧＬＰ−１のより長い循環中の半減期は、対象の満腹感を高め、それによって、当該の対象の空腹感が低下し、食物摂取が減少することになるであろう。特に、過体重の対象、例えば、肥満である対象又はやや過体重である対象等、にとって、１種又は複数の本発明によるタンパク質の加水分解物の投与によるＤＰＰ−ＩＶの阻害は、有益であろう。しかし、医薬品、栄養補助食品、飲料又は食品を利用して、過体重にならない程度に特定の体重を維持することができ、したがって、それらを使用して、美容目的、すなわち、外見を安定化又は／及び改善するために、体重を安定化及び／又は改善させることができる。
【００３５】
したがって、さらなる実施形態では、本発明によるタンパク質の加水分解物又は単離ペプチドを、肥満の予防及び／又は治療に用いるための、医薬品、栄養補助食品、飲料又は食品の製造に使用する。上記に記載した理由から、１種又は複数の本発明によるタンパク質の加水分解物の投与は、肥満の予防及び／又は治療において好都合である可能性が高い。
【００３６】
別の実施形態では、本発明によるタンパク質の加水分解物又は単離ペプチドを、血糖値を低下させるための、医薬品、栄養補助食品、飲料又は食品の製造に使用する。血糖値は、本加水分解物の摂取によって低下し、その結果、グルコースの管理が改善されることが見出されており、このことは、糖尿病の対象において、特に好都合である。
【００３７】
さらなる実施形態では、本発明によるタンパク質の加水分解物又は単離ペプチドを、膵臓のβ細胞の質量を増加させるための、医薬品、栄養補助食品、飲料又は食品の製造に使用する。膵臓のβ細胞の質量は、本加水分解物又はペプチドの摂取によって増加し、その結果、インスリン応答が改善され、それによって、グルコースの管理が改善されることが見出されており、このことは、糖尿病の対象において、特に好都合である。
【００３８】
なおさらなる別の実施形態では、本発明によるタンパク質の加水分解物又は単離ペプチドを、２型糖尿病の予防及び／又は治療に用いるための、医薬品、栄養補助食品、飲料又は食品の製造に使用する。２型糖尿病の特徴は、インスリン抵抗性であり、それによって、体のインスリンに対する応答が不適切になり、高血糖に至る。糖尿病には、多くの場合、肥満が伴う。ＧＬＰ−１は、血糖値の正常化並びに満腹感及び肥満（体重）の調節に寄与し、ＤＰＰ−ＩＶを阻害して、ＧＬＰ−１の循環中の半減期を延長させることによって、ＧＬＰ−１の濃度を増加させることから、１種又は複数の本発明によるタンパク質の加水分解物の投与によるＤＰＰ−ＩＶの阻害は、２型糖尿病の予防及び／又は治療に寄与することが期待される。
【００３９】
なお別の実施形態では、本発明によるタンパク質の加水分解物又は単離ペプチドを、免疫学的障害の予防及び／又は治療に用いるための、医薬品、栄養補助食品、飲料又は食品の製造に使用する。上記で議論したように、ＤＰＰ−ＩＶは、特定の免疫学的障害の発症において重要な役割を果たしていると考えられている。ＤＰＰ−ＩＶの阻害は、そのような免疫学的障害に対して有益な効果を有し、したがって、１種又は複数の本発明によるタンパク質の加水分解物の投与は、ＤＰＰ−ＩＶ活性を阻害し、そのような免疫学的障害の予防及び／又は治療を達成することができるとみなされている。
【００４０】
ＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害による、自己免疫疾患の抑制が、十分に確立されている（上記）ことから、そのような免疫学的障害は、自己免疫疾患であることが好ましい。好ましくは、当該の自己免疫疾患は、上記で議論した同一の理由から、関節リウマチ、多発性硬化症及びグレーブス病から選択される。
【００４１】
医薬品又は栄養補助食品に使用するためには、所望の投与形態の医薬品を得るために、当該の製剤を、いずれかの適切な担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤等と組み合わせることができる。当該の医薬品又は栄養補助食品は、経口投与されることが好都合である。「栄養補助食品」という用語は、特異な栄養的又は薬用の成分を提供し、要求されるエネルギー量の全部（すなわち、一般に、２０００又は２５００ｋｃａｌ／日未満）を提供するわけではない、いずれかの食品成分として、当技術分野では知られており、この用語には、粉末の形態の栄養補助食品、又は医薬品、及び健康飲料等の健康製品が含まれる。消費する前に食品に添加することができる成分、又はそのまま消費することができる製剤も含まれる。
【００４２】
意図する使用のために、本発明によるタンパク質の加水分解物又は単離ペプチドを、単独、又は適切な薬学的製剤中で、薬学的に許容される担体との混合物として投与することができる。このような薬学的製剤は、本発明のさらなる目的でもある。
【００４３】
当該の製剤の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬学ハンドブック（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、Ｍａｒｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．に記載されているもの等、周知の方法及び賦形剤を使用して調製することができ、経口投与に用いる、錠剤、カプセル、シロップ等であり、非経口投与に適する形態は、許容される液体、インプラント等中の滅菌した溶液又は懸濁液である。
【００４４】
投与量は、治療しようとする病理学的な状態の種類及び重症度、患者の体重及び性別等のいくつかの要因によって異なり、経験のある専門家であれば容易に決定できるであろう。好ましくは、本発明の加水分解物は、活性ペプチドの濃度によって異なるが、２ｍｇ及び１０ｇの間のレベルで投与される。加水分解物の用量レベルは、好ましくは、１０ｍｇ及び５ｇの間、より好ましくは、１日あたり、５０ｍｇ及び１ｇの間である。活性画分、特に、２〜８個のアミノ酸を有するペプチドの画分に関しては、投与の好ましいレベルとして、個体あたり、１ｍｇ及び１ｇの間のペプチド混合物／日であり、この画分のより好ましい用量レベルとしては、１０及び５００ｍｇの間／日である。
【００４５】
飲料又は食品に使用するためには、本発明によるタンパク質の加水分解物又は単離ペプチド又はそれらの混合物を、いずれかの通常の食品成分と組み合わせることができる。「飲料」という用語は、強壮剤及びシロップ、並びに水又は別の液体成分中に溶解させる、用時調製用の飲料を調製するための乾燥粉末の製剤を含むことを意味する。
【００４６】
本発明による加水分解物内のペプチドの分子量は、１種又は複数のタンパク質源の分子量によって異なることができる。加水分解の程度が高い場合には、本ペプチドは、通常、加水分解の程度が低い場合より、低分子量となるであろう。
【００４７】
酵素による加水分解によって、適切な程度の加水分解を得ることができ、具合よく実施できるので、１種又は複数のタンパク質の加水分解物を、上記で議論したような酵素による加水分解によって得るのが好ましい。さらに、酵素による加水分解に利用する酵素は、簡単なカラムクロマトグラフィー、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー等、によって、タンパク質の加水分解物から容易に分離する、又は熱、酸、塩基若しくは阻害剤の添加によって不活性化することができる。
【００４８】
治療しようとする病理学的な状態の種類及び重症度、対象の体重及び性別等によって異なるが、好ましくは、本発明によるタンパク質の加水分解物又は単離ペプチドを、０．０００１〜０．１ｇ／体重ｋｇの量で投与する。経験のある専門家であれば、そのような要因を容易に決定し、考慮に入れるであろう。そのような範囲を使用して、ＤＰＰ−ＩＶを十分に阻害して、本明細書に開示した障害及び疾患の予防及び／又は治療に要求されるようにＤＰＰ−ＩＶを所望通り阻害することができるであろう。
【００４９】
また、本発明は、上記で議論したような、いずれかのＤＰＰ−ＩＶが仲介する状態を予防及び／又は治療する方法にも関するものであり、当該の方法は、本発明によるタンパク質の加水分解物又は単離ペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００５０】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために利用されるものであって、本発明の範囲を限定する意味は全くない。
【実施例】
【００５１】
実施例１：ＤＰＰ−ＩＶ活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける測定
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓｉｇｍａ  Ｇ−０５１３）をＤＰＰ−ＩＶの基質として使用して、３８５ｎｍにおける吸収の増加を測定することによって、ＤＰＰ−ＩＶ活性を決定することができる。ＤＰＰ−ＩＶ活性の減少が、阻害の測定値である。
【００５２】
１３．１５２ｍｇのＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリド（基質；Ｓｉｇｍａ  Ｇ−０５１３）を１ｍｌのトリス緩衝液、ｐＨ８．０、に溶解した。ＤＰＰ−ＩＶ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ−７０５２）をトリス緩衝液、ｐＨ８．０、に溶解し、１．１単位／ｍｌとした。基質をトリス緩衝液、ｐＨ８．０、で５０倍に希釈した。タンパク質の加水分解物をトリス緩衝液、ｐＨ８．０、中で希釈し、１ｗｔ％タンパク質溶液として、試料を調製した。次いで、試料を段階希釈し、ある範囲の試料の濃度を得た。その後、５０μｌの段階希釈が異なる試料及び５０μｌの希釈した基質を、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルにピペットで計り入れた。次いで、１００μｌの希釈した酵素を、９６ウェルのプレートの各ウェルにピペットで計り入れた。次いで、３８５ｎｍにおける吸収の増加を測定し、タンパク質分解物の種々の異なる濃度におけるＤＰＰ−ＩＶ活性を決定し、そこから、ＩＣ５０（すなわち、ＤＰＰ−ＩＶ活性の５０％を阻害する阻害剤（特定のタンパク質の加水分解物）の濃度）を求めることができた。加水分解物の全てに、５％超の加水分解度（ＤＨ）が認められた。対照として、加水分解度（ＤＨ）が０％である、２種の加水分解されていないタンパク質（カゼインナトリウム、ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、オランダ、製及びＢｉｐｒｏ、Ｄａｖｉｓｃｏ  Ｆｏｏｄｓ、ＵＳＡ、製）を試験した。オルトフタルジアルデヒド法を使用して、加水分解度を測定した。この方法は、当技術分野では、周知である。こうして、多くのタンパク質の加水分解物、特に、カゼインの加水分解物が、２９０〜１０００μｇ／ｍｌの範囲のＩＣ５０を有するが、加水分解されていないタンパク質は、本酵素を阻害しないことが明らかになった。
【００５３】
実施例２：ＤＰＰ−ＩＶ阻害性ペプチドを含有するタンパク質の加水分解物の調製
加水分解物１：
１０００グラムのカゼイン（ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、オランダ）を、７．２リットルの水に溶解した。ｐＨ及び温度を、それぞれ８．８及び５５℃に調節した後、増量して正確に８リットルとした。次いで、４０グラムのＡｌｋａｌａｓｅ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク）、４グラムのＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｎ（Ａｍａｎｏ、日本）、及び４グラムのＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）を、混合液に添加した。１８時間インキュベートした後、９０℃、１０分間の熱による不活性化によって反応を停止させた。５０℃まで冷却した後、混合液を３ｋＤａのカットオフを有するろ過膜でろ過し、透過水を乾燥させた。
【００５４】
加水分解物２：
１４００グラムのカゼイン（ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、オランダ）を、７．２リットルの水に溶解した。ｐＨ及び温度を、それぞれ８．３及び５０℃に調節した後、増量して正確に８リットルとした。１．５グラムのＴｒｙｐｓｉｎ  ＰＴＮ  ６．０（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク）及び２００ｍｌのエタノールを添加した。次いで、混合液を、一様に撹拌しながら、２時間インキュベートした。９グラムのＣｏｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰ  Ｆ（Ｒｏｈｍ、デンマーク）及び１００ｍｌのエタノールを添加した。さらに２１時間インキュベートした後、９０℃、１０分間の熱による不活性化によって反応を停止させた。次いで、混合液を５０℃まで冷却した後、乾燥させた。
【００５５】
加水分解物３：
１０００グラムの乳清タンパク質の濃縮物（ＷＰＣ８０；Ａｒｌａ、デンマーク）を、７．２リットルの水に溶解した。ｐＨ及び温度を、それぞれ８．３及び６０℃に調節した後、増量して正確に８リットルとした。１２グラムのＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｎ（Ａｍａｎｏ、日本）及び２５０ｍｌのエタノールを添加した。次いで、混合液を、一様に撹拌しながら、１８時間インキュベートした。９０℃において、１０分間熱を加えることによって反応を停止させた。得られた混合液を５０℃まで冷却した後、３ｋＤａのフィルターでろ過し、乾燥させた。
【００５６】
加水分解物２の分析：
乾燥させた加水分解物２を、水中に再溶解させ、３ｋＤａのろ過膜でナノろ過を実施した。濃縮水及び透過水を用いて、ＤＰＰ−ＩＶ阻害効力及び質量バランス（濃縮水及び透過水対全加水分解物）を試験した。ＤＰＰ−ＩＶの阻害は、上記の実施例１で記載した方法に従って実施され、質量バランスには、オルトフタルジアルデヒド法を使用した。簡単に説明すると、この方法は、タンパク質及びペプチド中に存在する第一級アミン基のような、第一級アミン基のオルトフタルジアルデヒドによる修飾に基づいている。この方法のために、試料を、０．１Ｍホウ砂、１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ９．３、に溶解した。混合した後、オルトフタルジアルデヒド試薬を添加し、次いで、室温において、１０分間インキュベートした。吸光度を３４０ｎｍで測定した。質量バランスは、濃縮水及び透過水の吸光度を、加水分解物中のタンパク質の全量と関係付けることによって決定した。表１は、出発加水分解物と比較して、透過水のＤＰＰ−ＩＶ阻害活性が、２倍に増加することを示している。
【００５７】
【表１】
2008525430.tif 000005
【００５８】
実施例３：タンパク質の加水分解物中の生理活性を有する化合物のさらなる同定
実施例２にしたがって調製した種々のタンパク質の加水分解物を、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性に関して、さらに検討した。Ｖａｎ  Ｅｌｓｗｉｊｋら（上記）で議論されているように、高分解能スクリーニング（ＨＲＳ）装置を使用して、加水分解されたタンパク質の試料をＤＰＰ−ＩＶ阻害活性に関して分析した。
【００５９】
実施例１で開示したようなバイオアッセイフォーマットに基づいた基質の変換を通して、ＤＰＰ−ＩＶの阻害をモニターした。ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性データに加え、ＨＰＬＣの溶出物の一部を質量分析装置に送ることによって、化学的情報をリアルタイムで得た。このようにして、単回のクロマトグラフィーの実行中に、活性の情報と、生化学的に活性な化合物の化学的特徴との両方を得た。適用したアッセイの条件においては、基質を飽和させることによって、最大の酵素活性が確実に得られた。ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を有する化合物を表２に同定する。
【００６０】
【表２】
2008525430.tif 000006
【００６１】
表２中、相対力価は、この試験で化合物が示した（ＬＰＬ及びＩＰＩによる）最高のシグナルと比較した、実施例１のＤＰＰ−ＩＶ阻害アッセイにおいて得られた化合物が示したシグナルである。加水分解物中の対応するペプチドの推定される量及びそれらの加水分解物のＩＣ５０に基づくと、１００％の力価は、約５μＭのＩＣ５０に相当し、このことから、６％の相対力価は、約１２０μＭのＩＣ５０に相当することが推定される。
【００６２】
実施例４：ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を有し、且つＤＰＰ−ＩＶ阻害活性中に濃縮されているタンパク質の加水分解物の調製及び活性
加水分解物４、５及び６：
１００グラムのカゼインナトリウムを、１８００ｇの水に撹拌しながら溶解した。ｐＨを７に調節した。次いで、水を加え、最終量を２０００ｍｌとした。表３に特定するプロテアーゼ（ブロメライン、Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｓｅ  ＣＳ１５０Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、パパイン）１グラムを水に溶解し、添加した後、混合液を、内部温度５０℃において、２４時間インキュベートした。次いで、９５℃において５分間加熱することによって、酵素反応を停止し、次いで、混合液を凍結乾燥した。凍結乾燥生成物を水に溶解し、３０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄を、１ｋＤａのカットオフ値を有するＵＦフィルターで透析ろ過した。出発材料、乾燥させた遠心分離ペレット、乾燥させたＵＦ濃縮水及び乾燥させたＵＦ透過水のＤＰＰ−ＩＶ阻害効果を決定した（表３、図１、２、３）。
【００６３】
【表３】
2008525430.tif 000007
【００６４】
実施例５：ＤＰＰ−ＩＶ阻害性の加水分解物を含有する錠剤の調製
錠剤重量８５０ｍｇ
【表４】
2008525430.tif 000008
【００６５】
粉末をあらかじめ混合したが、ステアリン酸マグネシウムは、混合の最後の数分まで待って加えた。直接圧縮して錠剤を調製した（圧縮圧２０ｋＮ、硬度：１６０Ｎ）。
【００６６】
実施例６；ＤＰＰ−ＩＶ阻害性の加水分解物を含有するチョコレートカラメルバーの調製
【表５】
2008525430.tif 000009
【００６７】
実施例７：ＤＰＰ−ＩＶ阻害性の加水分解物を含有する加熱処理ヨーグルト飲料の調製
【表６】
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【００６８】
乳を水と混合した。実施例３による加水分解物２、砂糖及びマルチトールを添加し、連続して撹拌しながら溶解させ、次いで、低温殺菌した（９０℃、５分間）。発酵温度（４２℃）まで冷却した後、種菌を添加した。ｐＨが４．３に達するまで、発酵させた。乳酸を使用して、ｐＨを３．８〜４．０まで下げた。ペクチンを、激しく撹拌しながら添加した。混合物を、７０℃まで加熱し、１２０／２０ｂａｒでホモゲナイズした後、香料を添加した。充填後、生成物を低温殺菌した（８０℃／３分間）。
【００６９】
実施例８：ＤＰＰ−ＩＶ阻害性の加水分解物を含有する飲料の調製
【表７】
2008525430.tif 000011
【００７０】
全乾燥成分を水中に溶解し、ｐＨを、はじめは、クエン酸（全量に関して、＋／−０．１４％）でｐＨ３．８付近に、次いで、リンゴ酸（全量に関して、＋／−０．６６％）でｐＨ３．５付近に調節した。溶液を、７０℃まであらかじめ加熱した後、ペクチンのプレミックス（水中４％）を添加した。ホモゲナイズした（１５０ｂａｒ）後、生成物を充填後、低温殺菌、又は低温殺菌後、無菌的に充填した。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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