(57)【要約】【課題】Ａ群連鎖球菌属（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）を検出するための組成物、方法及びキット。【解決手段】特に、きわめて低いレベルのＡ群連鎖球菌属核酸を検出するための増幅プライマー及びハイブリダイゼーションプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを記載する。【選択図】図１
2008519603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）核酸を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブであって：
標的相補的塩基配列、及び場合により、検出すべき核酸に対して相補的でない１以上の塩基配列を含む、プローブ配列を含み、
ここで、前記標的相補的塩基配列は、配列番号３の配列に含まれる１３〜２２個の連続塩基又はその相補配列を含み、ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよく、
ここで、前記ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、最高３０塩基の長さであり、化膿連鎖球菌由来の核酸にハイブリダイズする他の塩基配列を含まない、前記ハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項２】
プローブ配列が前記の検出すべき核酸に対して相補的でない１以上の任意塩基配列を含む、請求項１のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項３】
さらに、検出可能な標識を含む、請求項２のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項４】
さらに発蛍光団部分及び消光体部分を含み、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが分子ビーコンである、請求項２のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項５】
標的相補的塩基配列が、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群から選択される、請求項４のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項６】
プローブ配列が検出すべき核酸に対して相補的でない１以上の任意塩基配列を含まない、請求項１のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項７】
さらに、検出可能な標識を含む、請求項６のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項８】
検出可能な標識が化学発光性標識及び蛍光標識からなる群から選択される、請求項７のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項９】
標的相補的塩基配列が、配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１からなる群から選択される、請求項８のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項１０】
生物試料中に存在する可能性のある化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）核酸配列を増幅するためのキットであって：
３’末端標的相補的配列、及び、場合により、増幅すべき化膿連鎖球菌核酸配列に対して相補的でない第１プライマー上流配列を含む、第１プライマーであって、第１プライマーの３’末端標的相補的配列は、配列番号２の配列に含まれる２０個の連続塩基を含み、ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよく；並びに
３’末端標的相補的配列、及び、場合により、増幅すべき化膿連鎖球菌核酸配列に対して相補的でない第２プライマー上流配列を含む、第２プライマーであって、第２プライマーの３’末端標的相補的配列は、配列番号１の配列に含まれる２６個の連続塩基を含み、ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよい；
を含む、前記キット。
【請求項１１】
第１プライマー及び第２プライマーの長さが各々最高６０塩基である、請求項１０のキット。
【請求項１２】
第１プライマーの３’末端標的相補的配列及び第２プライマーの３’末端標的相補的配列の長さが各々最高３３塩基である、請求項１０のキット。
【請求項１３】
第２プライマーの３’末端標的相補的配列の長さが最高２８塩基である、請求項１２のキット。
【請求項１４】
第１プライマーが第１プライマー上流配列を含む、請求項１３のキット。
【請求項１５】
第１プライマー上流配列がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列を含む、請求項１４のキット。
【請求項１６】
第１プライマーの３’末端標的相補的配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群から選択され、第２プライマーの３’末端標的相補的配列が、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択される、請求項１３のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００４年１１月９日に出願された米国仮特許出願Ｎｏ．６０／６２６，４３８に基づく優先権を主張する。この先行出願の開示内容全体を本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明はＡ群連鎖球菌属（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（ＧＡＳ））を検出するための診断アッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、より一般的にはＡ群β−溶血連鎖球菌属として知られ、急性咽頭炎、副鼻腔炎、リンパ腺炎、膿皮症、心内膜炎、髄膜炎、敗血症、扁桃炎、膿痂疹（とびひ）及び上気道感染症を含む、ヒトの多くの感染症の病原体である。化膿連鎖球菌感染症は、治療せずに放置すると、腎炎、リウマチ熱及び猩紅熱等の重篤な合併症が起きる場合があり、特に深刻である。全般的にＡ群β−溶血連鎖球菌属はペニシリンＧに対して感受性である。本事実により、患者がペニシリンに対してアレルギー性でなければ、この生物は抗微生物薬感受性検査が必要ない。
【０００４】
全ての連鎖球菌感染症のうち９０％以上が化膿連鎖球菌に起因する。鼻咽頭、皮膚、膣又は直腸に定着した無症候性保菌者が、近密な対人接触によりこの生物を伝播すると考えられる。汚染した食物も、ヒトにおける伝播及び感染の原因となりうる。
【０００５】
化膿連鎖球菌の仮同定は、伝統的に生理的及び生化学的特性に基づいていた。これには、コロニー形態、ヒツジ血液寒天上でのβ−溶血活性、グラム菌株、バシトラシンに対する感受性、及びＬ−ピロリドニル−β−ナフチルアミド（ＰＹＲ）加水分解能があげられる。ラテックス凝集等の市販の抗体検査は、連鎖球菌Ａ群抗原を標的とした。場合によっては、これらの検査はＡ群抗原を含む扁桃連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）のいくつかの菌株と陽性反応する場合があることが示された。さらに、当該検査の結果は疑わしいため、反復検査しなければならない場合もあった。血清学的分類法は化膿連鎖球菌の最終同定に選択される方法であった。ランスフィールドの血清学的分類は、細胞壁から抽出した属特異的炭水化物抗原及び属特異的抗血清から決定される。この方法は時間と経費がかさむ可能性があり、大部分の検査室は、伝統的な生理的及び生化学的方法に依存している。
【０００６】
より最近になって、咽頭スワブからＡ群連鎖球菌性咽頭炎を診断する際にＤＮＡプローブアッセイが役立つようになった。ＤＮＡプローブアッセイは、Ａ群連鎖球菌のＤＮＡ及びＲＮＡを定性検出するために核酸ハイブリダイゼーションを用いる。本検査は、咽頭スワブから化膿連鎖球菌を最終同定するための非主観的で精確かつ迅速な同定法を提供する。同定は、化膿連鎖球菌に特有の特異的リボソームＲＮＡ配列の検出に基づく。本検査では、咽頭スワブから試料調製後６０分以内に化膿連鎖球菌が同定される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Ａ群連鎖球菌検出の感度、精度及び特異性を高めることにより；定性的及び定量的測定能を提供することにより；かつ増幅と検出のリアルタイムでの組み合わせによってコピーレベルの低い標的の検出速度を高めることにより、ＤＮＡプローブアッセイを改良する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明の第１の観点は、化膿連鎖球菌核酸を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブに関する。このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、標的相補的塩基配列、及び場合により、検出すべき核酸に対して相補的でない１以上の塩基配列を含む、プローブ配列を含む。標的相補的塩基配列は、配列番号３の配列に含まれる１３〜２２個の連続塩基又はその相補配列を含み、ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよい。一般に、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは最高３０塩基の長さであってもよい。好ましい態様において、プローブ配列は検出すべき核酸に対して相補的でない１以上の任意塩基配列を含む。より好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは検出可能な標識を含む。例えば、プローブは発蛍光団部分及び消光体部分を含むことができる。そのような場合、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）でもよい。分子ビーコンの例としては、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群から選択される標的相補的塩基配列があげられる。他の好ましい態様では、プローブ配列は、検出すべき核酸に対して相補的でない１以上の任意塩基配列を含まない。より好ましくは、このハイブリダイゼーションアッセイプローブは検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、化学発光性標識及び蛍光標識でもよい。プローブの例としては、配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１からなる群から選択される標的相補的塩基配列があげられる。
【０００９】
本発明の他の観点は、生物試料中に存在する可能性のある化膿連鎖球菌核酸配列を増幅するためのキットに関する。本キットは第１プライマーを含むが、これには３’末端標的相補的配列、及び場合により、増幅すべき標的核酸に対して相補的でない第１プライマー上流配列がある。第１プライマーの３’末端標的相補的配列は、配列番号２の配列に含まれる２０個の連続塩基を含み、ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよい。キットは第２プライマーも含むが、これには３’末端標的相補的配列、及び場合により、増幅すべき標的核酸に対して相補的でない第２プライマー上流配列がある。第２プライマーの３’末端標的相補的配列は、配列番号１の配列に含まれる２６個の連続塩基を含み、ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよい。キットの好ましい態様では、第１プライマー及び第２プライマーの長さは各々最高６０塩基である。他の好ましい態様では、第１プライマーの３’末端標的相補的配列及び第２プライマーの３’末端標的相補的配列の長さは各々最高３３塩基である。この場合、第２プライマーの３’末端標的相補的配列の長さは最高２８塩基であることがより好ましい。よりさらに好ましくは、第１プライマーは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列等の第１プライマー上流配列を含む。キットの他の好ましい態様では、第１プライマーの３’末端標的相補的配列の長さが最高３３塩基であり、第２プライマーの３’末端標的相補的配列の長さが最高２８塩基である場合、第１プライマーの３’末端標的相補的配列は配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群から選択され、第２プライマーの３’末端標的相補的配列は配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
定義
本発明の目的に関して以下の用語の意味は、そうではないことを本明細書に明記しない限り下記のとおりである。
【００１１】
本明細書中「生物試料」は、ヒト、動物又は環境試料から得られるいずれかの組織又はポリヌクレオチド含有材料である。本発明の生物試料としては、末梢血、血漿、血清若しくは他の体液、骨髄若しくは他の臓器、生検組織、又は生物由来の他の材料があげられる。生物試料を、組織又は細胞構造を破壊するために処理し、これにより細胞内成分を溶液中へ放出させることができるが、本溶液としては、酵素、緩衝液、塩類、界面活性剤等があげられる。
【００１２】
本明細書中「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ及びその配列中に存在する可能性があり、かつそのポリヌクレオチドと相補配列をもつ第２分子とのハイブリダイゼーションを妨げない、合成ヌクレオチド類似体又は他の分子を意味する。
【００１３】
本明細書中「検出可能な標識」は、検出できるか又は検出可能な応答をもたらすことができる化学物質種である。本発明の検出可能な標識をポリヌクレオチドプローブに直接又は間接的に連結させることができ、これには放射性同位体、酵素、ハプテン、色素又は検出可能な色を付与する粒子（例えばラテックスビーズ又は金属粒子）等の発色団、発光性化合物（例えば生物発光性、リン光性又は化学発光性部分）及び蛍光性化合物があげられる。
【００１４】
「均一検出可能な標識」は、標的配列にハイブリダイズしたプローブ上にその標識があるかを決定することにより均一系で検出できる標識を表わす。すなわち、均一に検出できるな標識は、ハイブリダイズした標識をハイブリダイズしていない標識又は標識プローブから物理的に分離せずに検出できる。ＧＡＳ核酸検出のために標識プローブを用いる場合、均一に検出できる標識が好ましい。均一系標識の例は、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号及びＮｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号に詳述されている。均一系アッセイ法に使用できる好ましい標識としては、化学発光性化合物があげられる（例えばＷｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；及びＡｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号を参照）。好ましい化学発光性標識としては、標準ＡＥ又はその誘導体（例えばナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−又は３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−又は３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−又は３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、及び２−メチル−ＡＥ）等のアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物があげられる。
【００１５】
「均一系アッセイ」は、特異的プローブのハイブリダイゼーションの程度を決定する前に、ハイブリダイズしたプローブをハイブリダイズしていないプローブから物理的に分離する必要がない検出法を表わす。例えば、本明細書に記載する均一系アッセイ法の例では、適切な標的にハイブリダイズした場合に蛍光信号を発する分子ビーコンその他の自己報告プローブ、ハイブリッド２本鎖中に存在しなければ化学的手段で選択的に破壊できる化学発光性アクリジニウムエステル系標識、及び当業者に慣用される他の均一に検出できる標識を使用できる。
【００１６】
本明細書中「増幅」は、標的核酸配列、その相補配列又はフラグメントの多数のコピーを得るためのインビトロ手順を表わす。
「標的核酸」又は「標的」は、標的核酸配列を含む核酸を意味する。一般に、増幅すべき標的核酸配列は、向かいあって配置された２つのプライマーの間に位置し、各プライマーに対して完全に相補的な標的核酸部分を含むことになる。
【００１７】
「標的核酸配列」又は「標的配列」又は「標的領域」は、特異的なデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド配列であって、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列及びそれに対して相補的なデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド配列の全部又は一部を含む配列を意味する。
【００１８】
「転写関連増幅（transcription associated amplification）」は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写体を調製するいかなるタイプの核酸増幅をも意味する。「転写介在増幅（Transcription Mediated Amplification）」（ＴＭＡ）という転写関連増幅法の例は、一般にＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸及びプロモーター−鋳型相補的オリゴヌクレオチドを用い、場合によって、１以上の類似オリゴヌクレオチドを含んでもよい。下記に詳細に開示されるように、ＴＭＡの変法が当技術分野で周知である：Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号；Ｋａｃｉａｎら、ＷＯ９３／２２４６１号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＷＯ８８／０１３０２号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＷＯ８８／１０３１５号；Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号；Ｕｒｄｅａら、米国特許第４，８６８，１０５号及び第５，１２４，２４６号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＷＯ９４／０３４７２号；並びにＲｙｄｅｒら、ＷＯ９５／０３４３０号。本明細書に開示する核酸増幅法を実施するには、Ｋａｃｉａｎらの方法が好ましい。
【００１９】
本明細書中「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」は、少なくとも２個、一般に約５〜約１００個の化学物質サブユニットの高分子鎖であり、各サブユニットはヌクレオチド塩基部分、糖部分、及びサブユニットを直線的な空間配置に結合する連結部分を含む。一般的なヌクレオチド塩基部分は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）であるが、水素結合できる他の稀な又は修飾されたヌクレオチド塩基が当業者に周知である。オリゴヌクレオチドは、場合により、糖部分、塩基部分、及び主鎖構成要素のいずれかの類似体を含んでもよい。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドのサイズは、約１０〜約１００残基の範囲である。オリゴヌクレオチドは天然源から精製することができるが、好ましくは多様な周知の酵素法又は化学的方法を用いて合成される。
【００２０】
本明細書中「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進して検出可能なハイブリッドを形成する条件下で、核酸中、好ましくは増幅した核酸中の、標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。プローブは場合により検出可能な部分を含んでもよく、これはプローブの末端（１以上）に結合してもよく、内部にあってもよい。標的ポリヌクレオチドと結合するプローブのヌクレオチドは、検出可能な部分がプローブ配列の内部にある場合のように、厳密に連続していなくてもよい。検出は直接的（すなわち、標的配列又は増幅した核酸に直接ハイブリダイズするプローブから生じる）又は間接的（すなわち、プローブを標的配列又は増幅した核酸に連結する中間分子構造体にハイブリダイズするプローブから生じる）のいずれでもよい。プローブの「標的」は一般に、プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に標準的な水素結合（すなわち塩基対合）によって特異的にハイブリダイズする増幅核酸配列内に含まれる配列を表わす。プローブは、標的特異的配列及び、場合により、検出すべき標的配列に対して相補的でない他の配列を含んでもよい。これらの非相補配列には、プロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、又はプローブの三次元配座に寄与する配列（例えばＬｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号を参照）を含めることができる。「十分に相補的」である配列は、プローブオリゴヌクレオチドを、プローブの標的特異的配列に対して完全には相補的でない標的配列に安定にハイブリダイズさせることができる。
【００２１】
本明細書中「増幅プライマー」は、標的核酸又はその相補配列にハイブリダイズして核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドである。例えば増幅プライマー又はより簡単に「プライマー」は、場合により修飾オリゴヌクレオチドであり、鋳型核酸にハイブリダイズすることができ、かつ、３’末端はＤＮＡポリメラーゼ活性によって延長できてもよい。一般にプライマーには、ＧＡＳ核酸に対して相補的な下流配列、及び場合により、ＧＡＳ核酸に対して相補的でない上流配列があってもよい。この任意の上流配列は、例えばＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして作用することができるか又は制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含んでもよい。
【００２２】
「実質的に相同」、「実質的に対応している」又は「実質的に対応する」とは、対象オリゴヌクレオチドに、基準塩基配列内に存在する少なくとも１０個の連続塩基領域に対して少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％相同、より好ましくは少なくとも９０％相同、最も好ましくは少なくとも１００％相同である少なくとも１０個の連続塩基領域を含む塩基配列があることを意味する（ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物を除く）。当業者であれば、種々の％の相同性で許容されない程度の非特異的ハイブリダイゼーションを阻止しつつ、オリゴヌクレオチドを標的配列にハイブリダイズさせることができるハイブリダイゼーションアッセイ条件に対する改変を容易に認識するであろう。類似性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基のオーダーを比較して判定され、構造の相違が相補的塩基との水素結合を阻害しない限り、２つの配列の間に存在する可能性のある他の構造の相違は考慮されない。２つの配列の相同性の程度は、比較される少なくとも１０個の連続塩基の各組中に存在する不適正塩基対合の数により表わすこともできるが、これは０〜２個の塩基差であってよい。
【００２３】
「実質的に相補」とは、対象オリゴヌクレオチドに、標的塩基配列内に存在する少なくとも１０個の連続塩基領域に対して少なくとも７０％相補的、好ましくは少なくとも８０％相補的、より好ましくは少なくとも９０％相補的、最も好ましくは少なくとも１００％相補的である、少なくとも１０個の連続塩基領域を含む塩基配列があることを意味する（ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物を除く）。当業者であれば、種々の％の相補性で許容されない程度の非特異的ハイブリダイゼーションを阻止しつつ、オリゴヌクレオチドを標的配列にハイブリダイズさせることができるハイブリダイゼーションアッセイ条件に対する改変を容易に認識するであろう。相補性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基のオーダーを比較することにより判定され、構造の相違が相補的塩基との水素結合を阻害しない限り、２つの配列に存在する可能性のある他の構造の相違は考慮されない。２つの配列の相補性の程度は、比較される少なくとも１０個の連続塩基の各組中に存在する不適正塩基対合の数により表わすこともできるが、これは０〜２の不適正塩基対合であってよい。
【００２４】
「十分に相補的」とは、一連の相補的塩基間の水素結合により他の塩基配列にハイブリダイズしうる連続核酸塩基配列を意味する。相補的塩基配列は、オリゴヌクレオチドの塩基配列中の各位置において標準塩基対合（例えばＧ：Ｃ、Ａ：Ｔ又はＡ：Ｕ対合）により相補的であってもよく、あるいは標準水素結合により相補的ではない１以上の残基を含んでもよい（非塩基ヌクレオチドを含む）が、この相補的塩基配列全体は適切なハイブリダイゼーション条件下で他の塩基配列と特異的にハイブリダイズすることができる。連続塩基は、オリゴヌクレオチドを特異的にハイブリダイズさせる予定の配列に対して、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約１００％、相補的である。適切なハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、塩基配列組成に基づいて容易に推定でき、又は習慣の試験法を用いて経験的に決定できる（例えばSambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual.第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー, 1989) 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51及び11.47-11.57章、特に9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47及び11.55-11.57章を参照）。
【００２５】
「捕捉オリゴヌクレオチド」は、標的配列と固定化オリゴヌクレオチドを塩基対ハイブリダイゼーションによって特異的に結合させるための手段を提供する、少なくとも１つの核酸オリゴヌクレオチドを意味する。捕捉オリゴヌクレオチドは、好ましくは２つの結合領域、すなわち標的配列結合領域と固定化プローブ結合領域を含む。通常はこれら２つの結合領域は同一オリゴヌクレオチド上で連続しているが、捕捉オリゴヌクレオチドは、１以上のリンカーにより互いに結合した２つの異なるオリゴヌクレオチド上に存在する、標的配列結合領域と固定化プローブ結合領域を含んでもよい。例えば、固定化プローブ結合領域が第１オリゴヌクレオチド上に存在し、標的配列結合領域が第２オリゴヌクレオチド上に存在し、これら２つの異なるオリゴヌクレオチドが、第１及び第２オリゴヌクレオチドの配列に特異的にハイブリダイズする第３オリゴヌクレオチドであるリンカーとの水素結合により結合していてもよい。
【００２６】
「固定化プローブ」又は「固定化核酸」は、直接又は間接的に捕捉オリゴヌクレオチドを固定化支持体へ結合させる核酸を意味する。固定化プローブは、試料中の結合した標的配列を結合していない物質から分離するのを容易にする固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
「分離」又は「精製」は、生物試料中の１以上の成分を試料の１以上の他の成分から分離することを意味する。試料成分には一般に水溶液相中の核酸が含まれ、本相はタンパク質、炭水化物、脂質、及び標識プローブ等の物質も含有しうる。好ましくは、分離又は精製の工程により、試料中に存在する他の成分のうち少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、よりさらに好ましくは少なくとも約９５％が分離される。
【００２８】
「ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物」又は「ＲＮＡ及びＤＮＡの同等塩基」は、同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性をもつＲＮＡ及びＤＮＡ等の分子を意味する。ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物には異なる糖部分（すなわちリボース対デオキシリボース）があり、ＲＮＡ中のウラシル及びＤＮＡ中のチミンの存在により異なる場合がある。同等物の特定配列に対する相補性は同程度であるため、ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物間の相異が相同性の相違の原因となることはない。
【００２９】
「本質的に〜からなる」は、本発明の基本的で新規な特性を実質的に変化させない１以上の他の成分、１以上の組成物又は１以上の工程が本発明の組成物又はキット又は方法に含まれてもよいことを意味する。本特性としては、全血又は血漿等の生物試料中のＧＡＳ核酸を選択的に検出する能力があげられる。本発明の基本的で新規な特性に実質的影響を与える１以上の成分、１以上の組成物又は１以上の工程はいずれも本用語に含まれない。
【００３０】
発明の詳細な記述
本明細書に、血液、血漿、血清若しくは他の体液又は組織等の生物試料中のＧＡＳ核酸を選択的に検出するための組成物、方法及びキットを開示する。本発明のプライマー、プローブ及び方法は診断に使用できる。
【００３１】
概論と大要
本発明には、生物試料中のＧＡＳ核酸を検出するのに特に有用な組成物（プライマー及びプローブ）、方法及びキットが含まれる。当該用途に適切なオリゴヌクレオチド配列を設計するために、まず既知のＧＡＳ核酸配列を比較して、診断アッセイにおいて細菌ゲノムの標的として使用できる候補領域を同定した。これらの比較の結果、図１に模式的に示すプライマー及びプローブを用いる検出のための標的として、ＧＡＳゲノム３つの異なる領域（配列番号１〜３）を選択した。増幅及び増幅した配列の検出に用いるのに適切な合成オリゴヌクレオチドを設計するための出発点として、比較した配列間で比較的変異が少ない配列部分を選択した。
【００３２】
本分析に基づいて、下記に示す増幅プライマー及びプローブ配列を設計した。当業者であれば、ＧＡＳその他の細菌標的に特異的ないかなるプライマー配列で、Ｔ７プロモーター配列を含むか又は含まないものを、以下に示す種々のプライマーベースのインビトロ増幅法でプライマーとして使用できることを認識するであろう。本明細書に開示する配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＧＡＳ核酸を検出するアッセイで相互機能を果たすことができることも意図される。例えば交互検出アッセイで、本明細書に開示するハイブリダイゼーションプローブを増幅プライマーとして用い、本明細書に開示する増幅プライマーをハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。さらに捕捉オリゴヌクレオチドを増幅前の標的核酸にハイブリダイズさせてこれを捕捉するために使用できることも意図される。
【００３３】
本明細書に開示する増幅プライマーは、特に、標的特異的プライマーの組み合わせから数種のアンプリコンを調製できる多重増幅反応の成分として意図される。例えば、本明細書に開示する好ましいＧＡＳ特異的プライマーは、関係ない細菌のポリヌクレオチドを当該アッセイを実質的に妨げずに増幅できる、多重増幅反応に用いることが意図される。
【００３４】
有用な増幅方法
本発明に関して有用な増幅方法としては、転写介在増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification、ＮＡＳＢＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification、ＳＤＡ）、並びに自己複製ポリヌクレオチド分子と複製酵素、例えばＭＤＶ−Ｉ  ＲＮＡ及びＱ−ベータ酵素を用いる増幅法があげられる。これら種々の増幅法を実施する方法は、各々米国特許第５，３９９，４９１号；公開欧州特許出願第０５２５８８２号；米国特許第４，９６５，１８８号；米国特許第５，４５５，１６６号；米国特許第５，４７２，８４０号；及びLizardi et al., BioTechnology 6:1197(1988)中に記載されている。核酸増幅反応の実施方法を記載したこれらの文献の開示内容を本明細書に援用する。
【００３５】
本発明のきわめて好ましい態様では、ＧＡＳ核酸配列はＴＭＡプロトコルで増幅される。このプロトコルによれば、ＤＮＡポリメラーゼ活性をもたらす逆転写酵素が内因性ＲＮａｓｅ  Ｈ活性をも備えている。本方法に用いられるプライマーの１つは、増幅すべき標的核酸の１つの鎖に対して相補的な配列の上流に位置するプロモーター配列を含む。この増幅法の第１工程では、プロモーター−プライマーがＧＡＳ標的の特定部位にハイブリダイズする。逆転写酵素により、プロモーター−プライマーの３’末端が延長されて標的ＲＮＡの相補的ＤＮＡコピーが作製される。対向鎖プライマーと新たに合成されたＤＮＡ鎖との相互作用にともない、本プライマーの末端から逆転写酵素により第２ＤＮＡ鎖が合成され、これにより二本鎖ＤＮＡ分子が形成される。ＲＮＡポリメラーゼが本二本鎖ＤＮＡ鋳型中のプロモーター配列を認識して転写を開始する。新たに合成されたＲＮＡアンプリコンが各々ＴＭＡプロセスに再入して新たな複製サイクルの鋳型として用いられることにより、ＲＮＡアンプリコンが指数関数的に増加する。ＤＮＡ鋳型は各々１００〜１０００コピーのＲＮＡアンプリコンを作製できるため、このような増加により１００億のアンプリコンが１時間未満で得られる。本プロセス全体は自動触媒反応で、定温で行われる。
【００３６】
プライマーの構造特性
前記のように、「プライマー」は、核酸増幅反応に関与できる、場合により修飾されたオリゴヌクレオチドを表わす。好ましいプライマーには、鋳型核酸にハイブリダイズすることができ、かつＤＮＡポリメラーゼ活性により延長される３’末端がある。プライマーの５’側領域は標的核酸に対して相補的でなくてもよい。５’側−非相補領域にプロモーター配列が含まれる場合を「プロモーター−プライマー」という。当業者であれば、プライマーとして機能できるいかなるオリゴヌクレオチド（すなわち、３’末端が標的配列に特異的にハイブリダイズし、かつＤＮＡポリメラーゼ活性により延長されるようなオリゴヌクレオチド）をも５’側にプロモーター配列を含有させてプロモーター−プライマーとして機能できるように修飾できることを認識できるであろう。また、いかなるプロモーター−プライマーも、プロモーター配列を除去することにより修飾又はプロモーター配列なしで合成しても、依然としてプライマーとして機能できる。
【００３７】
修飾された塩基部分がＧ、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＵと非共有結合を形成しうる限り、かつ少なくとも１つの修飾ヌクレオチド塩基部分又は類似体を含むオリゴヌクレオチドと一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションが立体障害を受けない限り、プライマーのヌクレオチド塩基部分を修飾することができる（例えばプロピン基の付加により）。有用なプローブの化学組成に関して後記のように、本発明のプライマーの窒素塩基は、一般的な塩基（Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その既知の類似体（例えば、その塩基部分としてヒポキサンチンを有するイノシン、すなわち「Ｉ」；The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36, Adams et al.著, 第11版, 1992を参照）、プリン塩基又はピリミジン塩基の既知の誘導体（例えばＮ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−又はアザ−プリン類及びデアザ−又はアザ−ピリミジン類、５又は６位に置換基があるピリミジン塩基、２、６又は８位に改変又は置換された置換基があるプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、及びＯ４−アルキル−ピリミジン（Ｃｏｏｋ、ＷＯ９３／１３１２１号を参照）、及びポリマーの１以上の残基の代わりに非窒素塩基が主鎖に含まれる「非塩基」残基（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号を参照）でもよい。プライマー主鎖を構成する一般的な糖部分にはリボース及びデオキシリボースが含まれるが、２’−Ｏ−メチルリボース（２’−ＯＭｅ）、ハロゲン化糖、及び他の修飾された糖部分も使用できる。通常は、プライマー主鎖の連結基はリン含有部分、最も一般的にはホスホジエステル結合であるが、他の結合、例えばホスホロチオエート、メチルホスホナート、並びにリンを含まない結合、例えば「ロックされた核酸（locked nucleic acid）」（ＬＮＡ）中の結合、及び「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）中のペプチド様結合も、本明細書中に開示するアッセイに用いることを意図する。
【００３８】
有用なプローブ標識系及び検出可能部分
特異的核酸ハイブリダイゼーションをモニターするのに使用できるいかなる標識系及び検出系も、本質的に本発明に使用できる。有用な標識群としては、放射性標識、酵素、ハプテン、結合オリゴヌクレオチド、化学発光性分子、蛍光性部分（単独で又は「消光体」部分と組み合わせて）、及び電気的検出法に適用できるレドックス活性部分があげられる。好ましい化学発光性分子としては、Ａｒｎｏｌｄらの米国特許第５，２８３，１７４号に開示される均一保護アッセイに用いられる系及びＷｏｏｄｈｅａｄらの米国特許第５，６５６，２０７号に開示される多数の標的を単一反応で定量するアッセイに用いられる系のアクリジニウムエステルがあげられる。これらの特許文献に含まれる開示内容を本明細書に援用する。好ましい電気的な標識法及び検出法は、米国特許第５，５９１，５７８号及び第５，７７０，３６９号並びにＷＯ９８／５７１５８号に開示されており、当該開示内容を本明細書に援用する。本発明の標識として有用なレドックス活性部分としては、Ｃｄ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｆｅ及びＲｕ等の遷移金属があげられる。
【００３９】
本発明のプローブに特に好ましい検出可能な標識は、均一系アッセイ系で検出できる（すなわち、この場合、混合物中において結合した標識プローブは結合していない標識プローブと比較して検出可能な変異、例えば安定性又は異なる分解性を示す）。他の均一検出可能な標識、例えば蛍光性標識及び電気的に検出可能な標識を本発明の実施に使用することを意図するが、均一系アッセイに用いるのに好ましい標識は化学発光性化合物（例えばＷｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；又はＡｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号に記載のもの）である。特に好ましい化学発光性標識としては、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物、例えば標準ＡＥ又はその誘導体、例えばナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−又は３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−又は３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−又は３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、及び２−メチル−ＡＥがあげられる。
【００４０】
ある用途において、ハイブリダイズしていないプローブを予め検出前に除去しなくても被験試料中のプローブ：標的２本鎖を容易に検出するには、少なくともある程度の自己相補性を示すプローブが望ましい。例えば、別個の自己相補的領域（「標的結合ドメイン」及び「標的閉鎖ドメイン」を含む）を含む「分子トーチ」という構造体を設計する；これらの領域は結合領域により結合され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズしている。変性条件下に置かれると、分子トーチのこれら２つの相補領域（これらは完全相補的でも部分相補的でもよい）が融解し、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件が再生された際に標的結合ドメインが標的配列にハイブリダイズできる状態になる。分子トーチは、標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインより標的配列へハイブリダイゼーションしやすいように設計される。分子トーチの標的結合ドメインと標的閉鎖ドメインには、分子トーチが自己ハイブリダイズしている場合は分子トーチが標的核酸にハイブリダイズした場合とは異なる信号を発するように配置された相互作用性標識（例えば蛍光体／消光体の対）があり、これにより、存続可能標識が結合しているハイブリダイズしていないプローブの存在下で試料中のプローブ：標的２本鎖を検出できる。分子トーチは米国特許第６，３６１，９４５号で詳しく記載されており、その開示内容を本明細書に援用する。
【００４１】
本発明で使用できる自己相補的ハイブリダイゼーションアッセイプローブの他の例は、一般に「分子ビーコン」という構造体である。分子ビーコンは、標的相補的領域をもつ核酸分子、標的核酸配列が存在しない場合はプローブを閉鎖コンホメーションに保持する親和性対（又は核酸アーム）及びプローブが閉鎖コンホメーションにある場合に相互作用する標識対を含む。分子ビーコンの標的相補的配列が標的核酸にハイブリダイズすると、親和性対のメンバーが分離してプローブが開放コンホメーションに移行する。開放コンホメーションへの移行は、標識対、例えば発蛍光団と消光体（例えばＤＡＢＣＹＬとＥＤＡＮＳ）の相互作用が低下することにより検出できる。分子ビーコンについては米国特許第５，９２５，５１７号に詳しく記載されており、その開示内容を本明細書に援用する。ＧＡＳ特異的核酸配列の検出に有用な分子ビーコンは、本明細書に開示するプローブ配列の１つのいずれかの末端に、発蛍光団を含む第１核酸アーム及び消光体部分を含む第２核酸アームを付与して作製することができる。本構造体において、本明細書に開示するＧＡＳ特異的配列は、得られる分子ビーコンの標的相補的「ループ」部として用いられる。
【００４２】
分子ビーコンは、好ましくは検出可能な標識の相互作用性対で標識される。好ましい検出可能な標識は、ＦＲＥＴ又は非−ＦＲＥＴエネルギー移動機序により相互作用する。蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）では、発色団間の共鳴相互作用でエネルギー量子が分子又は分子系中の吸収部位から利用部位へ、原子間距離より極めて遠い距離を、熱エネルギーに変換されず、かつ供与体と受容体が運動衝突せずに無放射伝達される。「供与体」は最初にエネルギーを吸収する部分であり、「受容体」はその後エネルギーが移動する部分である。ＦＲＥＴのほか、供与分子から受容分子へ励起エネルギーを移動させることができる「非−ＦＲＥＴ」エネルギー移動法が少なくとも３つある。
【００４３】
２つの標識を、一方の標識から放出されたエネルギーがＦＲＥＴ又は非−ＦＲＥＴのいかなる機序でも第２標識で受容又は吸収されるのに十分近づけて保持した場合、これら２つの標識は「エネルギー移動関係」にあるという。例えば、分子ビーコンがステム２本鎖を形成して閉鎖状態に保持され、分子ビーコンの一方のアームに結合した発蛍光団からの蛍光発光が他方のアーム上の消光体部分により消光される場合がその例である。
【００４４】
本発明の分子ビーコンにきわめて好ましい標識部分には、発蛍光団と蛍光消光特性がある第２部分（すなわち「消光体」）があげられる。本態様では、特定の信号は特定波長の蛍光のようであるが、可視光信号でもよい。蛍光を伴う場合、発光の変化は、好ましくはＦＲＥＴ又は放射エネルギー移動若しくは非−ＦＲＥＴモードによる。閉鎖状態の相互作用標識対がある分子ビーコンを適切な周波数の光で刺激すると、第１レベルの蛍光信号が発せられる。これは極めて低くてもよい。この同じ分子ビーコンが開放状態にあって適切な周波数の光で刺激された場合、発蛍光団と消光体部分は互いに十分に離れているため、エネルギー移動は実質的に除外される。その条件下では、消光体部分は発蛍光団部分からの蛍光を消光できない。発蛍光団を適切な波長の光エネルギーで刺激すると、第１レベルより高い第２レベルの蛍光信号が発せられるであろう。これら２つのレベルの蛍光の差を検出及び測定することができる。この態様で発蛍光団と消光体部分を用いると、分子ビーコンは「開放」コンホメーションにおいてのみ「オン」であり、プローブが標的に結合していることを、容易に検出できる信号の発生によって示す。標識部分間の相互作用を調節してプローブの配座状態がプローブから発せられる信号を変化させる。
【００４５】
ＦＲＥＴペアと非−ＦＲＥＴペアを区別しない場合、本発明に使用できる供与体／受容体標識対の例としては、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド（Texas Red）／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２、及びフルオレセイン／ＱＳＹ７色素があげられる。当業者であれば、供与色素と受容色素が異なる場合に受容体の増強蛍光の発生又は供与体の蛍光の消光によりエネルギー移動を検出できることを理解するであろう。供与体種と受容体種が同一の場合、蛍光の偏光が生じてエネルギーを検出できる。ＤＡＢＣＹＬ及びＱＳＹ ７色素等の非蛍光性受容体では、直接（すなわち増強していない）受容体励起から発せられるバックグラウンド蛍光の潜在的問題が有利に排除される。供与体−受容体対の一方のメンバーとして使用できる好ましい発蛍光団部分としては、フルオレセイン、ＲＯＸ及びＣＹ色素（例えばＣＹ５）があげられる。供与体−受容体対の他方のメンバーとして使用できるきわめて好ましい消光体部分としては、ＤＡＢＣＹＬ及びＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ部分があげられ、これらはBiosearch Technologies, Inc.（カリフォルニア州ノバート）から入手できる。
【００４６】
標識を核酸に結合させる合成技術及び標識を検出する方法は当業界で周知である（例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版（Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９)、１０章；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号；Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号；及びＢｅｃｋｅｒら、欧州特許出願第０７４７７０６号を参照）。
【００４７】
プローブの化学組成
本発明のプローブはポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体を含み、場合によりそれに共有結合した検出可能な標識を保有する。プローブのヌクレオシド又はヌクレオシド類似体には窒素複素環塩基又は塩基類似体が含まれ、本ヌクレオシドが例えばホスホジエステル結合により互いに連結してポリヌクレオチドを形成している。したがって、プローブは一般的なリボ核酸（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むことができるし、これらの分子の化学的類似体をも含むことができる。プローブ主鎖は当該技術分野で既知の様々な結合から構成できるが、これには１以上の糖−ホスホジエステル結合、ロックされた核酸（ＬＮＡ）結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」という場合もある；Ｈｙｌｄｉｇ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、ＷＯ９５／３２３０５に記載）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホナート結合、又はその組み合わせがあげられる。プローブの糖部分は、リボース若しくはデオキシリボース、又は２’−Ｏ−メチルリボース及び２’ハライド置換体（例えば２’−Ｆ）等の既知の置換基がある類似化合物でもよい。窒素塩基は、一般的な塩基（Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その既知の類似体（例えばイノシン、すなわち「Ｉ」；The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36, Adams et al.著,第11版,1992を参照）、プリン塩基又はピリミジン塩基の既知の誘導体（例えばＮ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−又はアザ−プリン類及びデアザ−又はアザ−ピリミジン類、５又は６位に置換基があるピリミジン塩基、２、６又は８位に改変又は置換した置換基があるプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、及びＯ４−アルキル−ピリミジン（Ｃｏｏｋ、ＷＯ９３／１３１２１号を参照）、並びにポリマー中１以上の残基の代わりに主鎖に非窒素塩基が含まれる「非塩基」残基（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号を参照）でもよい。プローブはＲＮＡ及びＤＮＡ中の一般的な糖、塩基及び結合のみを含んでもよく、あるいは一般的な成分と置換体の両方を含んでもよい（例えば、メトキシ主鎖により結合した一般的な塩基、又は一般的な塩基及び１以上の塩基類似体を含む核酸）。
【００４８】
種々の長さ及び塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブをＧＡＳ核酸の検出に使用できるが、本発明に好ましいプローブの長さは最高３０ヌクレオチド、より好ましくは１３〜２７ヌクレオチドである。しかし後者の特異的プローブ配列を核酸クローニングベクター若しくは転写体又は他のより長い核酸に提供することもでき、これらもＧＡＳ核酸の検出に使用できる。
【００４９】
ＧＡＳ特異的増幅プライマー及び検出プローブの選択
目的とする特性をもつ増幅プライマー及びプローブの設計に有用な指針を以下に記載する。ＧＡＳ核酸の増幅及び探査に最適な部位は、約２００塩基の連続配列内に各々約２０塩基以上の長さの３つのＧＡＳゲノム保存領域である。１以上のプロモーター−プライマーを含む一組のプライマーについてみられる増幅度は、オリゴヌクレオチドがそれらの相補配列にハイブリダイズする能力、及びそれらが酵素により延長される能力を含む、幾つかの要因に依存する。ハイブリダイゼーション反応の程度及び特異性は多数の要因により影響されるので、それらの要因の操作が個々のオリゴヌクレオチド（標的に対して完全に相補的であっても、そうでなくても）の厳密な感度及び特異性を決定するであろう。アッセイ条件を変えたことに対する影響は当業者に既知であり、Ｈｏｇａｎらの米国特許第５，８４０，４８８号に記載されており、その開示内容を本明細書に援用する。
【００５０】
標的核酸配列の長さ、つまり、プライマー配列又はプローブ配列の長さが重要である場合がある。場合により、特定の標的領域から、目的とするハイブリダイゼーション特性をもつプライマー又はプローブとなる、位置及び長さの異なる数種類の配列が生じる可能性がある。完全には相補的でない核酸がハイブリダイズすることはできるが、通常であれば、完全に相同な塩基配列の最大長がハイブリッドの安定性を決定するであろう。
【００５１】
増幅プライマー及びプローブは、オリゴヌクレオチド：非標的核酸ハイブリッドの安定性を最小限にするように配置すべきである。増幅プライマー及びプローブは、標的配列と非標的配列を識別しうることが好ましい。プライマー及びプローブを設計する際、Ｔｍ値で表わされる融解温度の差を可能な限り大きくすべきである（例えば少なくとも２℃、好ましくは５℃）。
【００５２】
非特異的延長（プライマー二量体又は非標的の複製）の程度も増幅効率に影響を与える可能性がある。このためプライマーは、特に配列の３’末端における自己−又は交差−相補性が低くなるように選択される。不要なプライマー延長を減らすために、ホモポリマー領域は長くせず、ＧＣ含量を高めないようにする。この点、一般的に利用されるコンピューターソフトウェアが設計に役立つ。利用できるコンピューターソフトウェアとしては、ＭａｃＤＮＡＳＩＳ（商標）２．０（Hitachi Software Engineering American Ltd.）及びＯＬＩＧＯ  ｖｅｒ．６．６（Molecular Biology Insights;コロラド州カスケード）があげられる。
【００５３】
当業者であれば、ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖相補核酸が連結して水素結合した二本鎖を形成することを認識するであろう。２つの鎖の一方が完全又は部分的にハイブリッドに含まれると、その鎖は新たなハイブリッドの形成に関与しにくくなるのは当然である。当該配列の実質的な部分が一本鎖であるようにプライマー及びプローブを設計することにより、ハイブリダイゼーションの速度及び程度が大幅に高まる。標的が組込みゲノム配列である場合、それは天然には二本鎖で存在するであろう（ポリメラーゼ連鎖反応の生成物の場合と同様に）。この二本鎖標的はプローブとのハイブリダイゼーションに対して本来的に阻害性であり、ハイブリダイゼーション工程の前に変性する必要がある。
【００５４】
ポリヌクレオチドが標的にハイブリダイズする速度は、標的結合領域における標的二次構造の熱安定性の尺度となる。ハイブリダイゼーション速度の標準尺度はＣ０ｔ１／２であり、これはリットル当たりのヌクレオチドのモル数に秒を掛けたものとして測定される。例えばこれは、プローブ濃度にその濃度で最大ハイブリダイゼーションの５０％が生じる時間を掛けたものである。この値は、種々の量のポリヌクレオチドを一定量の標的に一定時間ハイブリダイズさせて決定される。Ｃ０ｔ１／２は、当業者に慣用される標準法によりグラフから得られる。
【００５５】
好ましい増幅プライマー
増幅反応を行うのに有用なプライマーは、標的結合に関与せず、かつ増幅又は検出の操作に実質的に影響を与える可能性がなく、外来配列の存在を挿入するために、種々の長さであってよい。例えば、本発明の増幅反応を行うのに有用なプロモーター−プライマーには、ＧＡＳ標的核酸にハイブリダイズするための少なくとも最小限の配列、及びその最小限の配列の上流に位置するプロモーター配列がある。しかし、増幅反応におけるプライマーの有用性を妨げずに、標的結合配列とプロモーター配列の間に配列を挿入してプライマーの長さを変えることができる。さらに、増幅プライマー及びプローブの長さは、目的とする相補配列をハイブリダイズするための最小限の必須要件にオリゴヌクレオチドの配列が適合する限り、任意に選択できる。
【００５６】
表１及び２は、ＧＡＳ核酸を増幅するためのプライマーとして用いたオリゴヌクレオチド配列の具体例を示す。表１は、ＧＡＳ核酸の一方の鎖に対するＧＡＳ標的相補的プライマーの配列を示す。表１に示した具体的プライマーには全て、配列番号１の配列に含まれる標的相補的配列がある。
【００５７】
【表１】
2008519603.tif 000003
【００５８】
表２は、ＧＡＳ核酸の対向鎖に対するＧＡＳ標的相補的プライマーと対応するプロモーター−プライマーの両方の配列を示す。前記のように、全てのプロモーター−プライマーが、３’末端にＧＡＳ標的配列に対して相補的な配列を含有し、５’末端にＴ７プロモーター配列ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号８）を含有していた。表２中に配列番号１４〜１８と表示したプライマーは、各々配列番号９〜１３で示したＧＡＳ標的相補的プライマーに対応するプロモーター−プライマーである。表２に示した具体的プライマーには全て、配列番号２の配列に含まれる標的相補的配列がある。
【００５９】
【表２】
2008519603.tif 000004
【００６０】
ＧＡＳ核酸配列を増幅するための好ましいプライマーの組としては、表２に挙げたプライマー等のＧＡＳ標的配列にハイブリダイズする第１プライマー、及び、表１に挙げたプライマー等の第１プライマーの延長生成物の配列に対して相補的な第２プライマーがあげられる。きわめて好ましい態様では、第１プライマーは５’末端にＴ７プロモーター配列を含むプロモーター−プライマーである。
【００６１】
好ましい検出プローブ
本発明の他の側面は、ＧＡＳ核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用できるオリゴヌクレオチドに関する。ＧＡＳ核酸中に存在する標的核酸配列を増幅する方法は、アンプリコンを検出するための任意の工程をさらに含んでもよい。この検出方法には、標的核酸配列又はその相補配列に緊縮ハイブリダイゼーション条件下で優先的にハイブリダイズすることにより検出に対して安定なプローブ：標的二本鎖を形成するハイブリダイゼーションアッセイプローブと被験試料とを接触させる工程が含まれる。次いで、被験試料中のＧＡＳ核酸の存在又は不存在の指標として、このハイブリッドが被験試料中に存在するかを判定する工程がある。これには、プローブ：標的二本鎖の検出があげられ、好ましくは均一系アッセイ系があげられる。
【００６２】
ＧＡＳ核酸配列の検出に有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブとしては、ＧＡＳ標的核酸配列に対して実質的に相補的である塩基配列があげられる。したがって、本発明のプローブはＧＡＳ標的核酸配列の一方の鎖又はその相補配列にハイブリダイズする。これらのプローブは、場合により、ターゲティングする核酸領域の外側に他の塩基があってもよく、これらはＧＡＳ核酸に対して相補的であっても、なくてもよい。
【００６３】
好ましいプローブは、化学発光性分子で標識したプローブについては約６０℃及び塩類濃度０．６〜０．９Ｍに相当する緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、分子ビーコンプローブについては４２℃及び塩類濃度２０〜１００ｍＭに相当する緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするのに十分に標的核酸に対して相同性である。好ましい塩類としては、塩化リチウム、塩化マグネシウム及び塩化カリウムがあげられるが、他の塩類、例えば塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウムもハイブリダイゼーション溶液に用いられる。あるいは、高緊縮ハイブリダイゼーション条件の例としては、０．４８Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、並びに各々１ｍＭのＥＤＴＡ及びＥＧＴＡにより、又は０．６ＭのＬｉＣｌ、１％のラウリル硫酸リチウム、６０ｍＭのコハク酸リチウム、並びに各々１０ｍＭのＥＤＴＡ及びＥＧＴＡで提供される。
【００６４】
本発明のプローブには、ＧＡＳゲノムのあるドメインに対して相補的、又は相当する配列がある。ＧＡＳ核酸配列を検出するのに好ましいプローブには、標的相補的塩基配列を、化学発光性分子で標識したプローブの長さは１３〜２４ヌクレオチド、分子ビーコンプローブの長さは２５〜２７ヌクレオチドである、検出すべき核酸に対して相補的でないいずれかの塩基配列と共に含む、プローブ配列がある。ＧＡＳ核酸配列を検出するのに好ましい特定のプローブには、化学発光性分子で標識したプローブの長さは１３〜２４ヌクレオチドの長さ、分子ビーコンプローブの長さは１５〜１７ヌクレオチドである、標的相補的塩基配列がある。もちろん、これらの標的相補的配列は線状配列でよく、あるいは分子ビーコンの構造中、又は検出すべきＧＡＳ標的配列に対して相補的でない他の１以上の任意核酸配列がある構築体中に含まれていてもよい。前記のように、プローブとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、組み合わせＤＮＡ及びＲＮＡ、核酸類似体から構成されてもよく、あるいは１以上の修飾ヌクレオシド（例えばリボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換をもつリボヌクレオシド）があげられる。
【００６５】
端的には、本発明に関して目的とする標的核酸を検出するのに好ましいプローブは、幾つかの特定したプローブドメインのうち１以上に含まれる配列又はその相補配列を含有し、ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよい。例えば、ＧＡＳ核酸を検出するのに好ましいハイブリダイゼーションアッセイプローブとしては、配列番号３の配列に含有される標的相補的塩基配列があげられる。検出すべき核酸に対して相補的でない任意配列をプローブの標的相補的配列に連結させることができる。
【００６６】
本発明の好ましいプローブには検出可能な標識が含まれる。１態様では、この標識は、非ヌクレオチドリンカーによりプローブに結合したアクリジニウムエステルである。例えば、リンカーにより結合した化学発光性アクリジニウムエステル化合物で検出プローブを標識できるが、これは、実質的に米国特許第５，５８５，４８１号、並びに米国特許第５，６３９，６０４号、特に１０欄６行〜１１欄３行、及び例８に記載される。本特許文献に含まれる開示内容を本明細書に援用する。他の態様で、この標識は、発蛍光団、及び蛍光消光特性をもつ第２部分を含む。
【００６７】
表３には、ＧＡＳアンプリコンの検出に用いる化学発光性ハイブリダイゼーションアッセイプローブのオリゴヌクレオチド配列を示す。
【００６８】
【表３】
2008519603.tif 000005
【００６９】
表４は、ＧＡＳアンプリコンの検出に用いる分子ビーコンプローブのループ部に含まれるＧＡＳ標的相補的オリゴヌクレオチド配列及び対応する分子ビーコンプローブの完全配列を示す。各々の分子ビーコンは、分子ビーコンのループ部に含まれるＧＡＳ標的相補的配列に付与された５’側ＣＣＧＡＧアーム配列及び３’側ＣＵＣＧＧアーム配列を含む。表４に配列番号２３〜２５と表示したループ部は、各々配列番号２６〜２８と表示した分子ビーコンに対応する。本発明方法に用いるＧＡＳ特異的分子ビーコンは全て、配列番号３の配列に含有される１５〜１７個の連続ヌクレオチドを含む標的相補的配列をもち、ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物が存在してもよい。表４に示す標的相補的配列を、独立して分子ビーコンのループ領域に取り込ませた。本発明方法に用いた分子ビーコンは各々、それの５’末端にフルオレセイン発蛍光団、及びその３’末端にＤＡＢＣＹＬ消光体部分を含んでいた。
【００７０】
【表４】
2008519603.tif 000006
【００７１】
ＧＡＳ核酸配列を検出するための交互プローブを対向センスＧＡＳ鎖にハイブリダイズさせることができるので、本発明には、表３及び４に示す配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドも含まれる。
【００７２】
前記のように、任意数の異なる主鎖構造体を、本発明のハイブリダイゼーションプローブのオリゴヌクレオチド配列の足場として使用できる。極めて好ましい態様では、ＧＡＳアンプリコンの検出に用いるプローブ配列は、メトキシ主鎖又は核酸主鎖中の少なくとも１つのメトキシ結合を含む。
【００７３】
ＧＡＳポリヌクレオチド配列を増幅及び検出するための好ましい方法
本発明の好ましい方法を後記の実施例により記載及び説明する。図１はＧＡＳ核酸の標的領域（濃い水平の実線で示す）を検出するために使用できる１つの系を模式的に示す。この系は、少なくとも３つのオリゴヌクレオチド（より短い実線で示す）を含む；１つのＴ７プロモーター−プライマー：これには、ＧＡＳ配列に標的領域において特異的にハイブリダイズする配列、及びＴ７プロモーター配列（「Ｐ」）（二本鎖である場合にはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに対する機能性プロモーターとして作用する）を含まれる；１つの非Ｔ７プライマー：これには、Ｔ７プロモーター−プライマーを用いて標的領域配列から作成された第１鎖ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする配列が含まれる；並びに１つの標識プローブ：これにはこれら２つのプライマーを用いて増幅した標的領域の一部に特異的にハイブリダイズする配列が含まれる。
【００７４】
前記のように、２つのプライマーを用いる標的領域の増幅は、いかなる当業者に慣用の多様な既知の核酸増幅反応によっても達成できる。好ましい態様では、転写関連増幅反応、例えばＴＭＡを用いる。そのような態様では、標的核酸の単一コピーから多数の核酸鎖が生成するので、増幅した配列に結合している検出プローブにより標的を検出できる。好ましくは、転写関連増幅には２種類のプライマー（１つはＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列（図１中に「Ｐ」と表示）を含有するので、プロモーター−プライマーという）、２種類の酵素（逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼ）、及び基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）を、適切な塩類及び緩衝液と共に用いて、核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写体を製造する。
【００７５】
図１については、転写介在増幅に際して、Ｔ７プロモーター−プライマーとして示す第１プライマーに標的核酸がハイブリダイズする。逆転写酵素を用いて、標的ＲＮＡを鋳型として用いて、Ｔ７プロモーター−プライマーから相補的ＤＮＡ鎖を合成する。非Ｔ７プライマーとして示す第２プライマーが、新たに合成されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズし、逆転写酵素の作用により延長されて、ＤＮＡ二本鎖を形成して二本鎖Ｔ７プロモーター領域が形成される。次いでＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、この機能性Ｔ７プロモーターを用いて多数のＲＮＡ転写体を生成する。ＴＭＡの自己触媒作用機序は、ＲＮＡ転写体を鋳型として用いるｃＤＮＡ合成工程に続くハイブリダイゼーション工程及び重合工程各々によりさらに転写体を産生して標的領域に特異的な核酸配列を増幅する。
【００７６】
検出工程には、上記の増幅したＲＮＡ転写体、すなわちアンプリコンに特異的な、少なくとも１種類の検出プローブが用いられる。好ましくは、検出プローブは均一検出系を用いて検出できる標識で標識される。例えば、後記のように標識プローブはアクリジニウムエステル化合物で標識することができ、これから化学発光信号を発生させて検出することができる。あるいは標識プローブは、発蛍光団、又は発蛍光団と消光体部分を含むことができる。分子ビーコンは、均一検出系に使用できる当該標識プローブの１態様である。
【００７７】
ＧＡＳ核酸を検出するためのキット
本発明には、細菌の核酸鋳型を用いてポリヌクレオチド増幅反応を行うためのキットも含まれる。ある好ましいキットとしては、標的相補的塩基配列を含有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを含み、場合により、検出すべき標的を増幅するためのプライマー又は他の補助オリゴヌクレオチドがあげられる。他の好ましいキットとしては、インビトロ増幅反応において標的核酸を増幅するために使用できる一対のオリゴヌクレオチドプライマーがあげられる。キットの例としては、増幅すべきＧＡＳ核酸配列の対向鎖に対して相補的な第１及び第２増幅オリゴヌクレオチドがあげられる。キットはさらに、１以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを含むことができる。本発明によるさらに他のキットは、増幅の前にＧＡＳ鋳型核酸を他の種から精製するための捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含むことができる。
【００７８】
本発明の一般原則は、限定されない下記の実施例からより十分に理解できる。
【実施例１】
【００７９】
実施例１は、幾つかのハイブリダイゼーションプローブを同定した方法を記載する。その後、これらをＧＡＳ核酸検出のためのアッセイに用いた。これらのプローブを結合するための標的として、１つの合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。
【００８０】
実施例１
ＧＡＳ核酸を検出するためのオリゴヌクレオチド
ＡＥ標識オリゴヌクレオチド
標準的実験法により、２’−ＯＭｅヌクレオチド類似体を用いてＡＥ標識した合成オリゴヌクレオチドを製造した。ＡＥ標識した合成オリゴヌクレオチドの配列を表３に示す。
【００８１】
表３に挙げたＡＥ標識した合成オリゴヌクレオチドは各々、開示内容が本明細書に援用される米国特許第５，５８５，４８１号及び第５，６３９，６０４号に記載の方法により、内部に配置した非ヌクレオチドリンカーによりオリゴヌクレオチド構造体に結合したＡＥ部分で標識した。配列番号１９中の非ヌクレオチドリンカーは、位置６と７の間又は位置９と１０の間に配置した。配列番号２０中の非ヌクレオチドリンカーは、位置１２と１３の間又は位置１５と１６の間に配置した。配列番号２１中の非ヌクレオチドリンカーは、位置５と６の間又は位置８と９の間に配置した。配列番号２２中の非ヌクレオチドリンカーは、位置１１と１２の間に配置した。本リンカー位置を全て用いて、この標識技術の多様性を確認した。
【００８２】
ハイブリダイゼーション反応物には、比活性１〜２×１０８ＲＬＵ／ｐｍｏｌのＡＥ標識オリゴヌクレオチド１×１０６ＲＬＵ／反応、及び表５に記載の合成ＧＡＳ  ＲＮＡ標的リゴヌクレオチド２ｐｍｏｌ／反応が含まれていた。
【００８３】
【表５】
2008519603.tif 000007
【００８４】
各試料中のハイブリダイズしたＡＥ標識オリゴヌクレオチドによる化学発光を、１ｍＭ硝酸及び０．１％（ｖ／ｖ）過酸化水素の自動注入後に１Ｎ水酸化ナトリウム含有溶液を注入するように作製されたＬｅａｄｅｒ４５０ＨＣでアッセイした。化学発光反応の結果を相対光単位（relative light units（ＲＬＵ））で測定した。この方法で得た代表的な結果を表６にまとめる。表中に示した数値は平均信号／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を示す。
【００８５】
【表６】
2008519603.tif 000008
【００８６】
表６に示す結果は、本方法で試験したＡＥ標識オリゴヌクレオチド各々が、合成ＧＡＳ  ＲＮＡ標的リゴヌクレオチドとの相互作用により検出可能なＳ／Ｎ比の数値をもたらすことを示した。配列番号２１（５，６）を除き、本方法に用いたＡＥ標識オリゴヌクレオチド全てが実質的に１０より大きいＳ／Ｎ値であった。実際に、本明細書に記載するいかなるプローブに結合した検出可能な標識の配置も変更でき、これらは本発明の範囲に含まれる。具体的に、上記の異なる位置の１つに標識がある各プローブは、本発明プローブの好ましい態様である。
【００８７】
次に、表３に示す配列があるハイブリダイゼーションアッセイプローブを、一連の増幅プライマーが生物試料中のＧＡＳ核酸を検出できることを証明するために用いた。本配列があるプローブ又はその相補配列は、ＲＮＡ及びＤＮＡの同等物並びにヌクレオチド類似置換体が存在してもよく、各々本発明の特に好ましい態様である。
【００８８】
分子ビーコン
合成分子ビーコンを、２’−ＯＭｅヌクレオチド類似体を用いて標準的実験法により製造した。合成分子ビーコンの配列を表４に示す。
【００８９】
ハイブリダイゼーション反応物には、分子ビーコン１０ｐｍｏｌ／反応、及び表５に示す合成ＧＡＳ  ＲＮＡ標的リゴヌクレオチド３０ｐｍｏｌ／反応が含まれていた。分子ビーコンのハイブリダイゼーション反応は、２０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するＴＲＩＳ緩衝液１００μｌの反応容量中、合成ＧＡＳ  ＲＮＡ標的リゴヌクレオチドが存在しないか又は存在する中で６０℃１０分間行った後、４２℃で６０分間インキュベートした。
【００９０】
４２℃で３０秒毎にＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ２０００計測器（Corbett Research、オーストラリア、シドニー）を用いて蛍光を測定した。蛍光反応の結果を相対蛍光単位（ＲＦＵ）で測定した。ハイブリダイゼーション反応終了後、反応温度を１℃ずつ上昇させ、得られたＲＦＵを測定し、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ２０００計測器に備えられたデータ分析ソフトウェアを用いて分子ビーコンの融解温度（Ｔｍ）を決定した。ハイブリダイゼーション反応について得た代表的な結果及び融解温度測定値を表７にまとめる。
【００９１】
表７に示す数値は、標的が存在する場合に測定した終点ＲＦＵを標的が存在しない場合に測定した終点ＲＦＵで割ることにより計算された平均信号／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す。標的が存在しない場合の分子ビーコンの融解温度計算値は分子ビーコンのステム構造の安定性を判定するのに有用であり、一方、標的配列にハイブリダイズした分子ビーコンの融解温度はハイブリッドの安定性に関する情報を提供する。
【００９２】
【表７】
2008519603.tif 000009
【００９３】
表７に示す結果は、合成ＧＡＳ  ＲＮＡ標的リゴヌクレオチドに結合すると、各々の分子ビーコンのＳ／Ｎ比の数値が強くなることを示した。さらに、標的が存在しない場合の分子ビーコンの融解温度は、この分子ビーコンのステム構造が安定であり、これにより、分子ビーコンの非特異的「開放」がさらに低い温度で阻止されることを証明した。合成ＧＡＳ  ＲＮＡ標的リゴヌクレオチドが存在する場合に分子ビーコンの融解温度が高いと、実験条件下で安定なハイブリッドが形成されたことが示された。
【実施例２】
【００９４】
実施例２は、ＧＡＳ核酸に有用な増幅プライマーを同定した方法を記載する。
実施例２
増幅プライマーの同定
精製リボソームＲＮＡを、プライマー対のセットを用いる増幅反応でＧＡＳ標的核酸源として用いた。開示内容が本明細書に援用される米国特許第５，３９９，４９１号の記載に本質的に従ってＴＭＡ反応を行った。種々のプライマー組み合わせについて、０又は５０フェムトグラムのＧＡＳ  ｒＲＮＡを用いて増幅反応を実施した。水又は標的ｒＲＮＡを、３ｐｍｏｌ／反応のＴ７プライマー及び１５ｐｍｏｌ／反応の非Ｔ７プライマーを含有する増幅試薬（最終濃度：５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２〜８．５），３５ｍＭ ＫＣｌ，４ｍＭ ＧＴＰ，４ｍＭ ＡＴＰ，４ｍＭ ＵＴＰ，４ｍＭ ＣＴＰ，１ｍＭ ｄＡＴＰ，１ｍＭ ｄＴＴＰ，１ｍＭ ｄＣＴＰ，１ｍＭ ｄＧＴＰ，２０ｍＭ ＭｇＣｌ２，２０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及び５％（ｗ／ｖ）グリセロール）に添加した。混合物（１５μｌ）を６０℃で１０分間インキュベートして４２℃に５分間冷却した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの混合物５μｌを反応物に添加して渦撹拌した。次いで反応物を４２℃で１時間インキュベートし、ＡＥ標識オリゴヌクレオチドを含有するプローブ試薬２０μｌを添加した。次いで反応物を６０℃で１５分間インキュベートして５０μｌの選択試薬を添加し、６０℃で１０分間インキュベートした。
【００９５】
各試料中のハイブリダイズしたＡＥ標識オリゴヌクレオチドによる化学発光を、１ｍＭ硝酸及び０．１％（ｖ／ｖ）過酸化水素の自動注入後に１Ｎ水酸化ナトリウム含有溶液を注入するように作製されたＬｅａｄｅｒ４５０ＨＣによりアッセイした。化学発光反応の結果を相対光単位（ＲＬＵ）で測定した。本方法で得た代表的な結果を表８にまとめる。
【００９６】
【表８】
2008519603.tif 000010
【００９７】
表８に示す結果は、全ての被験プライマーの組み合わせがＧＡＳ核酸を増幅することを示した。アンプリコンをＡＥ標識オリゴヌクレオチド配列番号１９（６，７）で検出した。本方法で得た結果は、ＧＡＳ核酸の一方の鎖に対して相補的なプライマー各々を対向鎖ＧＡＳ核酸に対して相補的な少なくとも１つのプライマーと対にすると、増幅ベースのアッセイが行われることも証明した。表８に示す結果からさらに、前記のプライマー及びＡＥ標識オリゴヌクレオチドは投入鋳型レベルがきわめて低いＧＡＳ核酸を検出するための高感度アッセイに使用できることが示された。
【００９８】
上記被分析体検出系の多用性をさらに説明するために、アンプリコン産生をリアルタイム増幅法で時間関数としてモニターした。増幅反応物に含有させたアンプリコン特異的分子ビーコンが、アンプリコン合成の連続モニタリング手段を提供した。経時的に増大する蛍光発光により、アンプリコンが生成し、これが分子ビーコンにハイブリダイズして分子ビーコンにより、開放配置の検出可能な転移がおこったことが示された。
【００９９】
分子ビーコンは、標的相補的配列をもつ核酸分子、標的の不存在下では相補的塩基対合により相互作用してステム構造（すなわち閉鎖配置）を形成する親和性対（すなわち核酸アーム）及びプローブが閉鎖配置にある場合に相互作用する標識対の１セットを含む。当業者であれば、分子ビーコンの構造中に含まれる標的相補的配列が一般にプローブの一本鎖ループ領域の形であることを理解するであろう。標的核酸とプローブの標的相補的配列がハイブリダイズすると、親和性対の構成要素が分離し、これによりプローブが開放配置に移行する。この移行は、標識ペア（これらは、例えば発蛍光団と消光体であってよい）の構成要素間の相互作用が低下することにより検出できる。分子ビーコンは、開示内容を本明細書に援用する米国特許第５，９２５，５１７号に十分に記載されている。
【０１００】
市販のソフトウェアを利用して、ＧＡＳ核酸由来のアンプリコンに特異的な分子ビーコンを用いて得た時間依存性の結果を分析した。この分析から得た結果から、増幅反応に含まれる標的コピー数と蛍光信号がバックグラウンド閾値を超えた時間（すなわち出現時間）との間に、実質的に直線関係が示された。後記の結果により確認されるように、本方法はきわめて広範にわたる被分析標的量を定量するのに有用であった。より具体的には、既知量の被分析ポリヌクレオチドを検量標準品として用いると、測定した出現時間を標準曲線と比較することにより被験試料中に存在する被分析体の量を判定できる。
【０１０１】
後記の方法に用いた増幅反応は、増幅と検出を同時に行うため、定温で、検出工程のために中断されずに操作されたという事実から、分子ビーコンには厳密な要求が課された。より具体的には、本方法は、分子ビーコンがアンプリコンを結合し、アンプリコンを指数的増幅機序で鋳型として用いるのを妨げてはならなかったために成功した。実際に、分子ビーコンの存在下で増幅反応が効率的に進行し得たという知見から、本プローブと当該標的との相互作用が増幅反応に不可逆的に妨害せず有害でなかったことが示される。
【実施例３】
【０１０２】
実施例３は、各々相互作用性の発蛍光団／消光体対で標識した分子ビーコンプローブをＴＭＡ反応における時間依存性アンプリコン産生のモニタリングに用いた方法を記載する。実施例３に記載する分子ビーコンは増幅核酸生成物の一方の鎖のみにハイブリダイズしたが、相補的プローブ配列が対向核酸鎖にハイブリダイズすることも予想されるため、本発明の範囲に含まれる。
【０１０３】
実施例３
アンプリコン産生のリアルタイムモニタリング
３’側−消光体に結合した制御ポアガラス（ＣＰＧ）及び５’側−発蛍光団で標識したホスホルアミダイトを用いた標準固相ホスファイトトリエステル化学反応により、Perkin -Elmer（カリフォルニア州フォスター・シティー）ＥＸＰＥＤＩＴＥモデル８９０９自動合成装置でＧＡＳアンプリコンに対する結合特異性がある分子ビーコンを合成した。分子ビーコンの構築のため発蛍光団としてフルオレセインを用い、消光体としてＤＡＢＣＹＬを用いた。分子ビーコンは全て２’−０Ｍｅヌクレオチド類似体を用いて構築した。ＣＰＧ試薬及びホスホルアミダイト試薬はGlen Research Corporation（バージニア州スターリング）から購入した。合成後、濃水酸化アンモニウム（３０％）で６０℃２時間処理してプローブを脱保護し、固体支持体マトリックスから解離させた。次いで、当業者に慣用の標準法を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＨＰＬＣでプローブを精製した。
【０１０４】
リアルタイム増幅及び検出法に用いた核酸標的は、既知濃度の精製ｒＲＮＡであった。種々の標的濃度を三重試験した。分子ビーコンを０．２ｐｍｏｌ／μｌ（３ｐｍｏｌ／反応）のレベルで用いた。鋳型コピー数５０／反応から鋳型コピー数５×１０８／反応までを用いて、ＧＡＳ核酸を増幅する反応を実施した。
【０１０５】
本質的に実施例２に記載した塩類及び試薬、標的ポリヌクレオチド並びに分子ビーコンを含有する緩衝液１５μｌを含む反応物を乾式加熱ブロックにより６０℃で１０分間インキュベートして、プライマーのアニーリングを促進した。この６０℃でのインキュベーション工程後、反応物を４２℃の加熱ブロックへ移し、次いで２分間インキュベートした。ＭＭＬＶ逆転写酵素及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ酵素を含有する酵素試薬５μｌずつを、反復ピペッターで各反応物に添加した。試験管を手短に渦撹拌して４２℃に予熱したＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ２０００（Corbett Research、オーストラリア、シドニー）ローターへ移した。４２℃で増幅反応を行い、３０秒毎に蛍光を読みとり、Ｒ２０００に付属の標準ソフトウェアを用いて結果をリアルタイムで分析した。異なる分子ビーコン及び異なるプライマー組み合わせを用いて本方法で得た代表的な結果を各々表９及び１０に示す。
【０１０６】
【表９】
2008519603.tif 000011
【０１０７】
表９に示す結果から、１つの特定のプライマー組み合わせ及び異なるＧＡＳ特異的分子ビーコンを含む増幅反応により、プラトーに達するまで経時的に増大する望ましい蛍光信号が発せられることが確認された。本方法に用いた分子ビーコンは各々、その５’末端にフルオレセイン発蛍光団、３’末端にＤＡＢＣＹＬ消光体部分を含んでいた。全ての結果が三重試験に含まれる反応に基づいた。表９に示す結果は、各々の分子ビーコンがコピー数５０／反応という低さまで増幅生成物を検出できることも示した。分子ビーコン配列番号２８のみがコピー数５０／反応のレベルで２／３の複製物を検出したが、分子ビーコン配列番号２６及び配列番号２７はこのレベルで３種類の複製物全てを検出した。表９に示す結果はさらに、前記のプライマー及び分子ビーコンは投入鋳型レベルのきわめて低いＧＡＳ核酸を検出するための高感度アッセイに使用できることを表わす。
【０１０８】
【表１０】
2008519603.tif 000012
【０１０９】
表１０に示す結果から、異なるプライマー組み合わせ及び特定の分子ビーコン（配列番号２６）を含む増幅反応により、プラトーに達するまで経時的に増大する望ましい蛍光信号を発することが確認された。全ての結果が三重試験に含まれる反応に基づいた。
【０１１０】
試験した各プライマー組み合わせにより、少なくともある程度の時間依存性−被分析体検出が得られた。この方法で試験した、異なるプライマー組み合わせは、リアルタイムアッセイ様式で若干異なる挙動を示した。例えば、配列番号７と１５のプライマーの組み合わせを含む反応はきわめて迅速に高い標的数を検出し、これに対し他のプライマー組み合わせは標的コピー数５０／反応という低さまでＧＡＳ核酸を極めて高感度で検出できた。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＧＡＳ核酸（濃い水平線で表わす）内の標的領域を検出するために用いることのできる種々のポリヌクレオチドを示す模式図である。下記の核酸の位置を標的領域に対比して示す：「非Ｔ７プライマー」及び「Ｔ７プロモーター−プライマー」はＴＭＡを実施するために用いる２つの増幅プライマーを表わし、ここで「Ｐ」はＴ７プロモーター−プライマーのプロモーター配列を示し、「プローブ」は増幅核酸を検出するために用いるプローブを表わす。
【図１】
2008519603.tif 000013
【配列表】
2008519603000001.app