(57)【要約】  本発明は、臍帯の羊膜から幹／前駆細胞を単離する方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで臍帯の他の成分から羊膜を分離するステップ、細胞増殖を可能にする条件下で羊膜組織を培養するステップ、および組織培養物から幹／前駆細胞を単離するステップを含む方法に関する。単離された幹細胞は、胚幹細胞様の特性を有することができ、様々な治療目的に用いることができる。一実施形態において、本発明は、細胞の有糸分裂増殖を可能にする条件下での、上皮および／または間葉幹／前駆細胞などの幹細胞の単離および培養に関する。さらに本発明は、単離された幹／前駆細胞を上皮および／または間葉細胞に分化する方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯の羊膜から幹／前駆細胞を単離する方法であって、
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで臍帯の他の成分から羊膜を分離するステップ、
（ｂ）細胞増殖を可能にする条件下で、ステップ（ａ）で得られた羊膜組織を培養するステップ、および
（ｃ）幹／前駆細胞を単離するステップ
を含む方法。
【請求項２】
（ａ”）酵素分離および直接組織外植からなる群から選択された方法によって、培養前に羊膜組織の細胞を分離するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
幹／前駆細胞が、胚幹細胞様の特性を有する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
幹／前駆細胞が、上皮および／または間葉幹／前駆細胞である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
（ｄ）細胞のクローン性増殖を可能にする条件下で、幹／前駆細胞を培養するステップ
をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
（ｅ）前記細胞の上皮細胞および／または間葉細胞への分化を可能にする条件下で、幹／前駆細胞を培養するステップ、および
（ｆ）分化した細胞を単離するステップ
をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上皮細胞が、皮膚上皮細胞、毛包細胞、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、網膜上皮細胞、肝上皮細胞、腎上皮細胞、膵上皮細胞、食道上皮細胞、小腸上皮細胞、大腸上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、膀胱上皮細胞、および子宮上皮細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
間葉細胞が、皮膚線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、腱細胞、靱帯線維芽細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、内分泌腺由来の細胞、神経外胚葉細胞、ならびに神経外胚葉細胞のすべての種類および派生種からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
（ｇ）単離した幹／前駆細胞を後の使用のために保存するステップ
をさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
保存が、低温保存を用いて行われる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法を用いて、臍帯の羊膜から単離された幹／前駆細胞。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法を用いて単離された幹／前駆細胞を含む細胞バンク。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法を用いて臍帯の羊膜から単離された幹／前駆細胞、またはその細胞抽出物を含む医薬組成物。
【請求項１４】
医薬組成物が、全身または局所使用に適応されている請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
局所使用に適応された医薬組成物が、軟膏剤、クリーム剤、およびローション剤からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
疾患を有する対象を処置する方法であって、請求項１から１０のいずれかに記載の方法を用いて単離された有効量の幹／前駆細胞を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１７】
疾患が、腫瘍性疾患、皮膚疾患、内臓内分泌不全、および神経障害からなる群から選択される、請求項１６に記載の処置方法。
【請求項１８】
組織異常が、先天性または後天性組織不全である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
内臓内分泌不全が、インスリン不全、インスリン不全に伴う糖尿病、テストステロン不全、貧血、低血糖、高血糖、膵臓不全、副腎不全、および甲状腺異常からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
神経障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ルー・ゲーリック病、およびハンチントン病である請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
皮膚疾患が、促進老化、または創傷である請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍性疾患が、癌である請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
癌が、扁平上皮細胞癌、乳腺管および小葉癌、肝細胞癌、鼻咽喉癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、またはそのような癌の任意の組合せからなり、それらの播種性（転移性）形態も含む群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
生体分子を産生するための、請求項１１に記載の幹／前駆細胞の使用。
【請求項２５】
生体分子が、タンパク質、ペプチド、有機小分子、オリゴ糖、多糖類、プロテオグリカン、および脂質からなる群から選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
哺乳動物細胞の培養における支持細胞層としての、請求項１１に記載の幹／前駆細胞の使用。
【請求項２７】
請求項１１に記載の幹／前駆細胞を培養する方法であって、
臍帯の羊膜から組織外植片を得るステップ、
適切な期間にわたって、適切な培地および培養条件において、組織外植片を培養するステップ
を含む方法。
【請求項２８】
組織外植片を新鮮な培地に曝露し、適切な期間にわたって、適切な条件において培養を継続するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法で得られた間葉幹細胞を培養するための、無血清細胞培養培地の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臍帯の羊膜から幹／前駆細胞を単離する方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで臍帯の他の成分から羊膜を分離するステップ、細胞増殖を可能にする条件下で羊膜組織を培養するステップ、および組織培養物から幹／前駆細胞を単離するステップを含む方法に関する。特に、本発明は、細胞の有糸分裂増殖を可能にする条件下での、上皮および／または間葉幹／前駆細胞などの胚の特性を有する幹細胞の単離および培養に関する。さらに本発明は、単離された幹／前駆細胞を上皮および／または間葉細胞に分化する方法、ならびにそれらの幹／前駆細胞の治療的使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、無制限に自己再生し、複数の細胞または組織型に分化する能力を有する細胞集団である。胚幹細胞（受精後約３から５日）は、無制限に増殖し、自発的にすべての組織型に分化することができる。したがって、それらの細胞は多能性幹細胞と称される（例えば、Smith,A.G.（２００１年）Annu.Rev.Cell.Dev.Biol. １７，４３５〜４６２に概説）。しかしながら、成体幹細胞はより組織特異的であり、より低い複製能力を有する可能性がある。しがたって、それらの細胞は複能性幹細胞と称される（例えば、Paul,G.等（２００２年）Drug Discov.Today ７，２９５〜３０２に概説）。胚幹細胞および成体幹細胞の「可塑性」は、それらの起源とは異なる組織に、ことによると胚性胚葉をまたがって分化転換する、それらの能力に依存する。
【０００３】
幹細胞が自己再生する能力は、原始未分化細胞の貯蔵所としてのそれらの機能に不可欠である。対照的に、たいていの体細胞は、テロメア短縮のために限定された自己再生能力を有する（例えば、Dice,J.F.（１９９３年）Physiol.Rev.７３，１４９〜１５９に概説）。したがって、幹細胞に基づく療法は、数多くのヒトおよび動物疾患の処置に有用である可能性を有する。
【０００４】
幹細胞、ならびに幹／前駆細胞は、種々の供給源に由来することができる。胚幹細胞および成体幹細胞の潜在的な「多分化」能は、広範囲にわたって特徴が明らかにされている。胚幹細胞の潜在能力が非常に高いものであっても、それらの使用には多くの倫理的問題が伴っている。したがって、骨髄間質、脂肪組織、真皮、および臍帯血由来の非胚性幹細胞が、代替供給源として提案されている。これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特に軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、星状細胞、および腱細胞に分化することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても分化され得るため、これらの幹細胞（一般に間葉幹細胞と称される）は中胚葉欠損修復および疾病管理の有望な候補となる。
【０００５】
しかしながら、臨床上の使用において、そのような間葉幹細胞の採取はいくつかの問題を引き起こす。それらの細胞を得るためには外科的処置を要するので（例えば、骨髄の採取は、局所麻酔、または場合によって全身麻酔を要する生検針を用いて行われる侵襲的技法である）、細胞の採取は患者にとって精神的かつ肉体的負担である。さらに、多くの場合、抽出される幹細胞の数はかなり少ない。さらに重要なことに、上皮細胞はこれらの細胞に由来せず、これらの細胞から分化されない。このことが幹細胞の他の可能な供給源の探求を促進した。
【０００６】
臍帯血は、造血幹／前駆細胞の豊富な供給源として認められている。しかしながら、間葉幹／前駆細胞の存在は議論を呼んでいる。一方において、そのような細胞は、満期臍帯血から単離、または首尾よく培養することができなかった（Mareschi,K.等（２００１年）Haematologica ８６，１０９９〜１１００）。他方で、Campagnoli,C.等（Blood（２００１年）９８，２３９６〜２４０２）、ならびにErices,A.等（Br.J.Haematol.（２０００年）１０９，２３５〜２４２）から得られた結果は、間葉幹細胞が造血前駆細胞と同時に、いくつかの胎児器官に存在し、早期胎児の血液中を循環していることを示唆している。したがって、国際特許出願ＷＯ０３／０７０９２２は、臍帯血から間葉幹／前駆細胞を単離し、培養増殖する方法、ならびにそのような細胞を様々な間葉組織に分化する方法を開示している。約６０％の単離効率が報告されている（Bieback,K等（２００４年）Stem Cells ２２，６２５〜６３４）。同じ研究で、臍帯血採取から細胞単離の期間、および用いられる血液試料の量は共に、そのような収率を達成するための重要なパラメータとして定められている。しかしながら、これらの幹／前駆細胞が実際に臍帯組織由来であるかどうかは依然として議論の余地がある。
【０００７】
最近、間葉幹／前駆細胞は、臍帯組織から、すなわち臍帯基質、ワルトン膠様質から首尾よく単離された（Mitchell,K.E.等（２００３年）Stem Cells ２１，５０〜６０；米国特許第５，９１９，７０２号；米国特許出願第２００４／０１３６９６７号）。これらの細胞は、例えば、それぞれ神経表現型、および軟骨組織に分化する能力を有することが示されている。さらに、間葉幹／前駆細胞は、臍帯内部に見出される３本の血管（動脈２本、静脈１本）の１つ、臍帯静脈の内皮、および内皮下層からも単離されている（Romanov,Y.A.等（２００３年）Stem Cells ２１，１０５〜１１０；Covas,D.T.等（２００３年）Braz.J.Med.Biol.Res.３６，１１７９〜１１８３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、これまで用いられているこれらのアプローチはいずれも剥皮（skin resurfacing）、肝臓修復、膀胱組織工学、および他の工学的に作られた表面組織などの上皮細胞に基づく療法の供給源としての上皮幹／前駆細胞の単離または培養には至っていない。このように、上皮幹／前駆細胞の単離および培養に有用な方法および信頼できる供給源が依然として求められている。さらに、再生医療および組織工学における種々の応用例に十分な量のそのような細胞を提供するために、倫理的に許容され、患者に生物医学的負担を課さない、上皮および間葉幹／前駆細胞を単離するための迅速かつ効率的な方法が依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、臍帯の羊膜から幹／前駆細胞を単離する方法であって、
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで臍帯の他の成分から羊膜を分離するステップ、
（ｂ）細胞増殖を可能にする条件下で、ステップ（ａ）で得られた羊膜組織を培養するステップ、および
（ｃ）幹／前駆細胞を単離するステップを含む方法を提供する。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、
（ａ”）酵素消化および直接組織外植からなる群から選択された技法によって、培養前に羊膜組織から細胞を分離するステップをさらに含む方法を提供する。
【００１１】
好ましい一実施形態において、本発明は、胚幹細胞様の特性を有する幹／前駆細胞を単離する方法を提供する。
【００１２】
他の好ましい実施形態において、本発明は、上皮および／または間葉幹／前駆細胞を単離する方法を提供する。
【００１３】
他の実施形態において、本発明は、
（ｄ）細胞のクローン性増殖を可能にする条件下で、幹／前駆細胞を培養するステップをさらに含む方法を提供する。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、
（ｅ）前記細胞の上皮細胞および／または間葉細胞への分化を可能にする条件下で、幹／前駆細胞を培養するステップ、および
（ｆ）分化した細胞を単離するステップをさらに含む方法を提供する。
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、
（ｇ）単離した幹／前駆細胞を後の使用のために保存するステップをさらに含む方法を提供する。
【００１６】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の幹／前駆細胞を培養する方法であって、
臍帯の羊膜から組織外植片を得るステップ、
適切な期間にわたって、適切な培地および培養条件において、組織外植片を培養するステップを含む方法を含む。他の実施形態において、本発明は、幹／前駆細胞、またはそれらの細胞抽出物の治療的使用を対象とする。これらの実施形態の１つは、疾患を有する対象を処置する方法であって、上述の本発明の方法によって単離された有効量の幹／前駆細胞を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態は、対応する医薬組成物を提供する。
【００１７】
本発明は、実施例と以下の図面を共に考えるとき、詳細な説明を参照してより良く理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（詳細な説明）
本発明は、臍帯の羊膜が、間葉および上皮幹／前駆細胞などの幹／前駆細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で首尾よく単離および増殖することのできる供給源であるという驚くべき発見に基づく。さらに驚くべき発見は、これらの細胞が胚幹細胞様の特徴を示すことである。羊膜（羊膜内膜とも呼ばれる）、すなわち胎盤および発育中の哺乳動物の胎芽を包む薄い最内膜性嚢は、近年、眼表面再建の天然基質として、および輪部上皮幹細胞を増殖するための生体基質として用いられている（例えば、Anderson,D.F.等（２００１年）Br.J.Ophthalmol.８５，５６７〜５７５；Gruterich,M.等（２００３年）Surv.Ophthalmol.４８，６３１〜６４６を参照）。しかしながら、少なくともヒトに関して、羊膜から幹／前駆細胞を単離する方法はこれまで記載されておらず、臍帯を覆う羊膜も幹細胞の供給源として報告されていない。
【００１９】
本発明は、臍帯の羊膜から幹／前駆細胞を単離する方法であって、
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで臍帯の他の成分から羊膜を分離するステップ、
（ｂ）細胞増殖を可能にする条件下で、ステップ（ａ）で得られた羊膜組織を培養するステップ、および
（ｃ）幹／前駆細胞を単離するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
本明細書では、「幹／前駆細胞」という用語は、無制限に自己再生し、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、筋細胞、または神経細胞などの複数の細胞または組織型に分化する能力を有する、臍帯に由来する任意の細胞を指す。さらに、これらの細胞は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、サル、またはヒトなどの任意の哺乳動物種に由来することができ、一実施形態において、ヒト由来の細胞が好ましい。
【００２１】
「胚幹細胞様の特性」という用語は、それらが胚幹細胞とほぼ同様、またはまったく同様に、自発的にすべての組織型に分化することができる臍帯に由来する細胞の能力を指し、それらが多能性幹細胞であることを意味する。
【００２２】
本明細書では、「羊膜」という用語は、発育中の哺乳動物の胎芽を包む薄い最内膜性嚢を指す。妊娠中、胎児は羊水と呼ばれる液体に囲まれ、衝撃から守られる。この流体は、胎児および胎盤と共に、羊膜と呼ばれる嚢に包まれており、羊膜は臍帯も覆っている。羊水はいくつかの理由により重要である。羊水は衝撃を和らげ、胎児を保護し、胎児の自由な動きを可能にする。羊水はさらに臍帯の浮遊を可能にし、臍帯が圧迫されて、胎盤血管の循環血液から導かれる酸素および栄養分の胎児への供給が断たれるのを防ぐ。羊膜嚢は、恒常性環境を維持し、外界から胎児の環境を守る羊水を含有する。このバリアはさらに、膣から上昇し、潜在的に感染を引き起こす可能性のある有機体（細菌またはウイルスなど）から胎児を保護する。
【００２３】
組織培養を行うための培地および試薬は、当分野でよく知られている（例えば、Pollard,J.W.およびWalker,J.M.（１９９７年）Basic Cell Culture Protocols、第２版、Humana Press，Totowa、ニュージャージー州；Freshney,R.I.（２０００年）Culture of Animal Cells、第４版、Wiley-Liss、Hoboken、ニュージャージー州を参照）。臍帯組織試料をインキュベート／搬送するのに適した培地の例には、これに限定されるものではないが、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ培地、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、およびＬ−１５培地が含まれ、いくつかの実施形態において、後者が好ましい。本発明による幹／前駆細胞の培養に適した培地の例には、これに限定されるものではないが、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、ＲＰＭＩ培地、EpiLife培地、およびMedium１７１が含まれ、いつくかの実施形態において、後者が好ましい。これらの培地には、ウシ胎児血清（fetal calf serum；ＦＣＳ）またはウシ胎児血清（fetal bovine serum；ＦＢＳ）、ならびに抗生物質、増殖因子、アミノ酸、阻害剤などを添加することができ、これは十分に当業者の一般知識の範囲内である。
【００２４】
一実施形態において、本発明は、
（ａ”）培養前に、酵素消化および／または直接組織外植技法によって羊膜組織から幹／前駆細胞を分離するステップをさらに含む方法を提供する。本明細書では、「酵素消化技法」という用語は、酵素を添加して、主な組織塊（ここでは臍帯の羊膜）から細胞を開裂することを意味する。その後、分離した細胞を収集する。本明細書では、「直接組織外植技法」という用語は、最初に酵素を用いずに組織を培地に入れることを意味する。次いで、慎重な条件下で、細胞を単独で主な組織塊から分離し、その後、細胞を採取し収集する。
【００２５】
酵素による処置、または直接組織外植によって、特定の組織または器官の細胞を分離する方法は、当分野でよく知られている（例えば、Pollard,J.W.およびWalker,J.M.（１９９７年）Basic Cell Culture Protocols、第２版、Humana Press、Totowa、ニュージャージー州；Freshney,R.I.（２０００年）Culture of Animal Cells、第４版、Wiley-Liss、Hoboken、ニュージャージー州を参照）。本発明の方法を行うために、組織分離を触媒する任意の酵素を用いることができる。好ましい実施形態において、その目的のためにコラゲナーゼが用いられる。この酵素は、粗製剤または精製形態で用いることができる。この酵素は、任意の原核生物または真核生物（もっとも好ましくはクロストリジウム ヒストリチクス（Clostridium hystolyticum）である）から精製することができ、あるいは遺伝子工学を用いて組み換えによって産生することもできる。任意の型のコラゲナーゼを用いることができ、すなわち１型、２型、３型、４型、またはそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態において、コラゲナーゼ１型の使用が好ましい。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、胚幹細胞様の特性を有する幹／前駆細胞を単離する方法を提供する。これらの細胞は最終的に、これに限定されるものではないが、形態的に上皮細胞または間葉細胞に分化することができる。
【００２７】
したがって他の実施形態において、本発明は、上皮および／または間葉幹／前駆細胞を単離する方法を提供し、上に開示のとおり、これらの細胞は胚幹細胞様の特性を有することができる。
【００２８】
上皮幹／前駆細胞には、これに限定されるものではないが、皮膚上皮細胞、毛包細胞、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、網膜上皮細胞、肝上皮細胞、腎上皮細胞、膵上皮細胞、食道上皮細胞、小腸上皮細胞、大腸上皮細胞、肺および気道上皮細胞、膀胱上皮細胞、または子宮上皮細胞などの任意の型の上皮細胞に分化することのできる上皮細胞様形態（すなわち、多面形）を示す任意の細胞が含まれる。
【００２９】
間葉幹／前駆細胞には、これに限定されるものではないが、皮膚線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、腱細胞、靱帯線維芽細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、内分泌腺由来の細胞、ならびに神経外胚葉細胞のすべての種類および派生種などの任意の型の間葉細胞に分化することのできる、間葉細胞様形態（すなわち、紡錘様形）を示す任意の細胞が含まれる。
【００３０】
他の実施形態において、本発明は、
（ｄ）細胞のクローン性増殖を可能にする条件下で、幹／前駆細胞を培養するステップをさらに含む方法を提供する。
【００３１】
「クローン性増殖」（「有糸分裂クローン性増殖」と呼ばれることもある）という用語は、細胞の分化プログラム初期に起こり、それによって幹／前駆細胞が特定の系統に決定され、その後、終末分化を受ける過程に関する。前駆細胞のクローン性増殖を誘発する条件が、種々の細胞型の間で著しく異なることは当分野でよく知られている。特定の方法に限定するものではないが、クローン性増殖の誘発は、一般に細胞増殖に最適化された培地で幹／前駆細胞を培養することによって達成される。そのような培地は多くの供給業者から市販され入手可能である。そのような培地の非限定的な例は、ＫＧＭ（登録商標）−ケラチノサイト培地（Cambrex）、ＭＥＧＭ−乳房上皮細胞培地（Cambrex）、EpiLife培地（Cascade Biologics）、またはMedium１７１（Cascade Biologics）である。あるいは、培養培地には、増殖因子などの細胞増殖を誘発する試薬を補うことができる。そのような試薬は、一例としてヒトケラチノサイト増殖添加剤キット（Cascade Biologics）など、単一溶液に混合することができ、あるいは個々に添加することもできる。そのような試薬には、これに限定されるものではないが、所与の細胞型のクローン性増殖を誘発する任意の適切な組合せで、増殖因子（例えば、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子−１、血小板由来増殖因子−ＢＢ、トランスフォーミング増殖因子−β１、インスリンなど）、ホルモン（ウシ下垂体抽出物など）、ヒドロコルチゾン、トランスフェリンなどが含まれる。「クローン性増殖」という用語には、例えば、いくつかの例としてヒト、マウス、ラット、サル、類人猿などの哺乳動物に細胞を注入することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を培養することも含まれる。
【００３２】
他の実施形態において、本発明は、
（ｅ）前記細胞の上皮細胞および／または間葉細胞への分化を可能にする条件下で、幹／前駆細胞を培養するステップ、および
（ｆ）分化した細胞を単離するステップをさらに含む方法を提供する。
【００３３】
他の実施形態において、本発明は、
（ｇ）単離した幹／前駆細胞を後の使用のために保存することをさらに含む方法を提供する。
【００３４】
真核細胞、特に哺乳動物細胞を保存および貯蔵するための方法およびプロトコールは、当分野でよく知られている（例えば、Pollard,J.W.およびWalker,J.M.（１９９７年）Basic Cell Culture Protocols、第２版、Humana Press、Totowa、ニュージャージー州；Freshney,R.I.（２０００年）Culture of Animal Cells、第４版、Wiley-Liss、Hoboken、ニュージャージー州を参照）。単離した上皮または間葉幹／前駆細胞の生物活性を維持する任意の方法を、本発明に関して用いることができる。好ましい一実施形態において、幹／前駆細胞は、低温保存を用いて維持および貯蔵される。
【００３５】
したがって、本発明はまた、上述の方法によって臍帯の羊膜から得られた前駆／幹細胞を対象とする。さらに、本発明は、本明細書に記載のとおり単離された１種または複数の前駆／幹細胞を含む、またはそれらからなる細胞バンクも対象とする。この前駆／幹細胞の細胞バンクは、個体の自己由来であるか、またはプールされていてもよく、その後、例えば再生医療、組織修復、および再建のために、さらに分化して用いることができる。
【００３６】
上述のとおり、本発明はさらに、上述の本発明の方法によって臍帯の羊膜から単離された幹／前駆細胞を含む医薬組成物を対象とする。この医薬組成物は、任意の種類であることができ、通常、治療的に許容される適切な担体／賦形剤と共に、幹／前駆細胞、またはその細胞抽出物を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は全身または局所使用に適応されている。
【００３７】
局所使用に適応された医薬組成物は、液体または粘性形態であることができる。それらの例には、軟膏剤、クリーム剤、およびローション剤などが含まれる。全身使用に適した医薬組成物の例は液体組成物であり、幹／前駆細胞、または細胞抽出物は、例えば注射または注入に適した緩衝剤に溶解されている。
【００３８】
したがって、本発明はさらに、疾患を有する対象を処置する方法に関する。この方法は、本明細書に記載のとおり単離された幹／前駆細胞、またはそのような細胞由来の細胞抽出物の有効量を対象に投与するステップを含む。
【００３９】
原則として、幹／前駆細胞を用いて処置されるのに適した任意の状態を、本発明の細胞または細胞抽出物で処置することができる。いくつかの実施形態において、疾患は、腫瘍性疾患、促進皮膚老化および皮膚疾患、組織異常、内臓内分泌不全、および神経障害からなる群から選択される。
【００４０】
処置される組織異常は、先天性または後天性組織不全であることができる。本発明の細胞で処置することのできる内臓内分泌不全の例には、これに限定されるものではないが、インスリン不全に伴う糖尿病、テストステロン不全、貧血、低血糖、高血糖、膵臓不全、副腎不全、および甲状腺不全が含まれる。
【００４１】
処置することのできる神経障害の例には、これに限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ルー・ゲーリック病、ハンチントン病、および神経系腫瘍状態が含まれる。
【００４２】
皮膚疾患の例は、創傷、または皮膚の損傷部、例えば日焼けした皮膚である。本発明では、皮膚の老化も皮膚疾患とみなされる。したがって、例えばローションまたはクリーム、あるいは他の任意の適切なビヒクルの成分としての、本発明の幹／前駆細胞またはそれらの細胞抽出物の局所送達または類似の送達は、日焼けした皮膚を修復するために用いることができ、さらに、それがなければ皮膚老化が促進される不足の増殖因子および関連ペプチド構成要素を補充し、強化することによって、皮膚の老化過程を遅らせる可能性もある。幹／前駆細胞はさらに、外傷などの体の損傷部位に移動し、局所修復過程に必要な細胞構成要素を形成する可能性がある（The Journal of Immunology, ２００１年、１６６：７５５６〜７５６２；またはInternational Journal of Biochemical and Cell Biology ２００４年、３６：５９８〜６０６を参照）。
【００４３】
特に最近の研究は、幹細胞が選択的に腫瘍組織を標的にし（Journal of the National Cancer Institute ２００４年、９６（２１）：１５９３〜１６０３）、インターフェロンなどの抗腫瘍剤の腫瘍性病巣への直接送達を可能にすることを実証しているため、腫瘍性疾患は癌であることができる。癌は皮膚癌から内臓の癌まで、任意の種類の癌であることができ、固形腫瘍を形成し得る癌を含む。処置される癌の例には、扁平上皮細胞癌、乳腺管および小葉癌、肝細胞癌、鼻咽喉癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、またはそのような癌の任意の組合せが含まれ、それらの播種性（転移性）形態も含む。腫瘍性疾患の処置の場合、本明細書に記載の臍帯羊膜由来幹細胞および／またはそれらの細胞抽出物は、直接処置および／または担体ビヒクルとして全身投与することができる。後者の抗腫瘍治療の場合、細胞は抗腫瘍剤を含む。
【００４４】
薬剤としての他の使用において、本発明の幹／前駆細胞は、遺伝子治療に用いることができる。この目的の場合、細胞は、細胞内で産生されるタンパク質をコードする核酸で形質転換することができる。核酸は、当業者によく知られている任意の種々の方法を用いて本発明の細胞に導入することができ、例えばウイルスベクターおよび／または脂質含有トランスフェクション組成物、例えばＩＢＡｆｅｃｔ（IBA GmbH、Gottingen、ドイツ）、Fugene（Roche）、GenePorter（Gene Therapy Systems）、リポフェクトアミン（Lipofectamine）（Invitrogen）、スーパーフェクト（Superfect）（Qiagen）、Metafecten（Biontex）、またはＰＣＴ出願ＷＯ０１／０１５７５５に記載のものが用いられる。関連する実施形態において、本発明の細胞は、適切なポリペプチドをコードする核酸で形質転換した後、このペプチドの組み換えによる産生に用いることができる。
【００４５】
上述のとおり、幹細胞抽出物は、正常組織の生理に相当する多様な増殖因子およびペプチドに富んでいる。そのような増殖因子および／またはペプチドは、内部恒常性を維持するために外部要素から体を保護している、すべてのヒトの表面層である皮膚などの体の露出部分に不足している可能性がある。したがってさらなる実施形態において、本発明の幹／前駆細胞、またはそれらの細胞抽出物は、内部恒常性の処置および／または維持に適している。
【００４６】
さらなる実施形態において、上の開示に従って、本発明の幹／前駆細胞は、任意の生体分子を産生するために用いることができる。この生体分子は、例えば、それらの細胞で天然に産生される任意の分子、またはそれをコードする核酸が組み換えＤＮＡ技術によって細胞に導入されている分子であることができる。本発明の細胞によって産生することのできる分子の例には、数例のみを挙げると、これに限定されるものではないが、タンパク質、例えばサイトカインなど、増殖因子、例えばインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、アクチビンＡ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＰＤＧＦなど、あるいはホルモン、例えばインスリン、またはエリスロポイエチンなど、あるいは輸送タンパク質、例えばトランスフェリンなど、増殖因子またはホルモンなどのペプチド（例えば、黄体ホルモン（ＬＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ））、有機小分子、例えばステロイドホルモン、オリゴ糖または多糖類、例えばヘパリン、またはヘパラン硫酸（これに関して、例えばＷＯ９６／２３００３またはＷＯ９６／０２２５９を参照のこと）、プロテオグリカン、糖タンパク質、例えばコラーゲン、またはラミニンなど、あるいは脂質が含まれる。
【００４７】
さらなる態様において、最近のアプローチに従って（例えば、Amit,M等、Human feeder layers for human embryonic stell cells, Biol Reprod ２００３年、６８：２１５０〜２１５６を参照）、本明細書に記載の幹／前駆細胞は、他の胚幹細胞、特にヒト胚幹細胞を培養するための支持細胞層として用いることができる。これらの実施形態の１つにおいて、支持細胞層としてヒト細胞を用いることによって、動物病原体または免疫原などの動物由来成分で細胞培養物が汚染されるリスクが最小限に抑えられるため、本発明の細胞は、好ましくはヒト由来である。これに関して、本発明の細胞は、無血清条件下で培養できることに留意されたい。したがって、支持細胞層としての細胞の使用、および無血清培地での細胞培養物の培養は、本明細書に後に記載、あるいは、例えばDraper等（Culture and characterization of human embryonic stem cell lines, Stem Cells Dev ２００４年、１３：３２５〜３３６）、または国際特許出願ＷＯ９８／３０６７９に記載のとおりである。
【００４８】
これに関して、移植手術および細胞に基づく療法においては、老化細胞の割合が最小である（すなわち、高品質の細胞の割合が高い）多量の低継代細胞が不可欠であり、それらは細胞増殖中にできるかぎり短期間で誘導される必要のあることに留意されたい。例えば、骨髄および臍帯血の間葉幹細胞は低量であり、したがって細胞移植に必要とされる十分な数の細胞を得るために、長期間の多数の継代にわたる増殖が必要となる。しかしながら、高継代細胞は品質が劣る傾向にあり、細胞の老化または癌性形質転換に通じる可能性がある。本発明では反復外植技法を用いることによって、低い継代数で多量の本発明の細胞を得られることが見出された。したがって、本発明はさらに、本発明の幹／前駆細胞を培養する方法であって、
臍帯の羊膜から組織外植片を得るステップ、
適切な期間にわたって、適切な培地および培養条件において、組織外植片を培養するステップ、
場合によって、組織外植片を新鮮な培地に曝露し、適切な期間にわたって、適切な条件において培養を継続するステップを含む方法に関する（図１５を参照）。
【００４９】
培養は、必要なだけ多くのサイクル（継代）で行うことができ、所望の細胞数が得られた時点で停止することができる。新鮮な培地への組織外植片の曝露は、細胞の増殖に用いた容器から使用した細胞培地を除去し、その容器に新鮮な培地を添加することによって行うことができる。使用した容器で培地を交換する代わりに、培地を充填した新しい容器に組織外植片を移すことによって、新鮮培地への曝露を達成することもできる。細胞の培養／繁殖に用いる組織外植片は、任意の適切な方法、例えば上述の「直接組織外植技法」（最初に酵素を用いずに組織を培地に入れ、次いで、慎重な条件下で、細胞を単独で主な組織塊から分離し、その後、細胞を採取し収集する）によって得ることができる。
【００５０】
組織外植片の培養は、哺乳動物細胞の培養に適した任意の培地で行うことができる。その例には、本発明の細胞の培養またはクローン性増殖に関して上に挙げた、市販され入手可能な通常の培地が含まれ、これに限定されるものではないが、例えばＫＧＭ（登録商標）−ケラチノサイト培地（Cambrex）、ＭＥＧＭ−乳房上皮細胞培地（Cambrex）、EpiLife培地（Cascade Biologics）、Medium１７１（Cascade Biologics）、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、またはＲＰＭＩ培地などである。培養は典型的に、それらの細胞が由来する種の細胞の培養に通常用いられる条件（温度、雰囲気）、例えば３７℃、ＣＯ２５％の空気雰囲気で行われる。一実施形態において、培養は、無血清、特にウシ血清を含まない培地を用いて行われる。培養（１継代）は、細胞の増殖に必要な任意の適切な期間行われ、これに限定されるものではないが、典型的には１日から数日、例えば約７日、または約８日の期間である。
【００５１】
本明細書に例示的に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素、限定なしに、適切に実施することができる。したがって、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」などの用語は、限定されることなく、広く解釈されるものとする。さらに、本明細書に用いた用語および語句は、限定ではなく説明のために用いたものであり、本明細書に示し記載した特徴またはその一部の同等物を、そのような用語および語句の使用において除外するものではなく、請求する本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、本発明を好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示したが、当業者は本明細書に開示されそこに具体化された本発明の修正および変形を行うことができ、そのような修正および変形は本発明の範囲内であるとみなされる。
【００５２】
本明細書において、本発明を広くかつ一般的に記載した。その一般的な開示の範囲内である、より狭い種および下位分類のそれぞれも本発明の一部を形成する。これには、削除される題材が本明細書に具体的に記載されているかどうかにかかわらず、その分類から任意の主題を除く条件または消極的限定付きで本発明の一般的な説明が含まれる。
【００５３】
他の実施形態は、添付の請求の範囲および非限定的な実施例の範囲内である。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループで記載されている場合、それによって本発明がマーカッシュグループの個々の要素、または要素のサブグループについても記載されているものと当業者は認識するであろう。
【実施例】
【００５４】
実施例１：臍帯組織の採取
子供を出産した後直ちに臍帯組織を採取した。研究室へ輸送する前に検体を濯いできれいにし、培養輸送培地（５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２５０μｇ／ｍｌのファンギゾン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンにより補助されたＬ−１５培地；すべての試薬はInvitrogenから購入した）を含有する５００ｍｌの無菌ガラス瓶に移した。研究室において、幹細胞抽出物を層流フード中、無菌条件下で処理した。まず、検体を無菌ステンレススチールトレイに移した。臍帯血管中に残存するすべての血液を複数回のシリンジ操作により除去し、５ＩＵ／ｍｌのヘパリン（シグマ製）により補助された、加温したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄した。ヘパリンを含有しない普通のＰＢＳを最後の洗浄に用いた。次に、臍帯組織検体を２ｃｍの長さの断片に裁断し、直径１０ｃｍの細胞培養皿中に移し、さらに７０％のエタノール、続いて抗菌剤混合物（５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２５０μｇ／ｍｌのファンギゾン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン；すべてInvitrogenから購入した）を含むＰＢＳを用い、溶液が澄明になるまで複数回洗浄し、消毒した。
【００５５】
実施例２：細胞分離／培養
まず、臍帯組織を切開し、ワルトン膠様質（すなわち、臍帯の基質）から臍帯羊膜を分離する。次に、単離された羊膜を細胞分離用に、小片（０．５ｃｍ×０．５ｃｍ）に裁断する。臍帯羊膜の小片を組織培養皿の上に載置することにより、上皮幹細胞または間葉幹細胞を単離するための異なる細胞培養条件で移植を行う。
【００５６】
間葉細胞の分離／培養のために、移植片を１０％のウシ胎仔血清（Hyclone）により補助された５ｍｌのＤＭＥＭ（Invitrogen）（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）中に浸漬し、ＣＯ２細胞培養インキュベーター中、３７℃で維持した。培地を２日または３日毎に交換した。細胞の成長を光学顕微鏡下で観察した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを用い、さらに増殖および低温保存するために、成長した細胞をトリプシン処理（０．１２５％のトリプシン／０．０５％のＥＤＴＡ）により収穫した。
【００５７】
上皮細胞の分離／培養のために、細胞培養の樹脂表面を該表面に組織サンプルを載置する前にコラーゲン１／コラーゲン４混合物（１：２）により被覆した。組織サンプルを５ｍｌのEpiLife培地または培地１７１（共にCascade Biologics製）中に浸漬した。培地を２日または３日毎に交換した。組織培養移植片からの細胞の成長を光学顕微鏡下で観察した。成長した細胞は、EpiLife培地または培地１７１を用い、トリプシン処理（０．１２５％のトリプシン／０．０５％のＥＤＴＡ）により収穫した。
【００５８】
細胞の酵素的抽出方法のために、臍帯羊膜を０．５ｃｍ×０．５ｃｍの小片に裁断し、０．１％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプ１溶液（Roche Diagnostics）中、３７℃で６時間消化した。サンプルを１５分毎に２分間ボルテックスした。細胞を４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより収穫した。上皮幹細胞または間葉幹細胞を単離するのに異なる２つの方法を採用した。
【００５９】
上皮幹細胞を単離するために、細胞ペレットを５０μｇ／ｍｌのインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、５０μｇ／ｍｌの血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、５μｇ／ｍｌの形質転換成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）および５μｇ／ｍｌのインスリン（すべてR&D Systemsから入手した）により補助されたEpiLife培地または培地１７１（共にCascade Biologics製）中に再分散させ、コラーゲン１／コラーゲン４混合物（１：２；Becton Dickinson）により１×１０６個／皿の細胞密度で予め被覆した１０ｃｍの組織培養皿上で計数し、播種した。２４時間後、加温したＰＢＳにより付着した細胞を洗浄し、培養培地をサプリメントを加えたEpiLife培地または培地１７１により置き換えた。培地を２日または３日毎に交換した。細胞の成長およびクローン形成の拡大を光学顕微鏡下で観察した。さらに増殖および低温保存するために、約７０％の集密度で、細胞をトリプシン処理（０．１２５％のトリプシン／０．０５％のＥＤＴＡ）により継代培養した。
【００６０】
間葉幹細胞を単離するために、細胞ペレットをＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中に再分散させ、１×１０６個／皿の細胞密度の１０ｃｍの組織培養皿上で計数し、播種した。培養培地を２日または３日毎に交換した。細胞の成長および増殖を光学顕微鏡下で観察した。約９０％の集密度で、細胞を上で説明したように継代培養した。
【００６１】
上皮幹細胞および間葉幹細胞を支持細胞層上で培養するために、臍帯内膜をコラゲナーゼ処理により消化し、致死的な放射線の照射またはGreen’s培地中のマイトマイシンＣで処理した３Ｔ３線維芽細胞（支持細胞層）により被覆した１０ｃｍの組織培養皿上で計数し、播種した。培養培地を２日または３日毎に交換した。コロニーの形成を光学顕微鏡下で観察し、写真撮影した。
【００６２】
実施例３：幹細胞／前駆細胞の同定
上皮細胞：図１は、組織移植の方法により調製された臍帯羊膜から成長する上皮細胞の写真を示す（４０×倍率）。写真は組織培養の２日目（図１Ａ）および５日目（図１Ｂ、Ｃ）に撮影した。細胞の形態分析は、多面形態の上皮様細胞を示した。臍帯部分の酵素消化は、２日目（図Ａ、Ｃ）および５日目（図Ｂ、Ｄ）において同様の上皮細胞（４０×倍率）を生成した（図２）。図７はGreen法を用い、支持細胞層上で培養された臍帯羊膜からの上皮幹細胞のコロニー形成を示す写真である（４０×倍率）。多面形態の上皮様細胞のコロニーは３日目から７日目まで急速に増殖した。
【００６３】
間葉細胞：臍帯羊膜から移植された間葉細胞の成長を、培養培地として１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）により補助されたＤＭＥＭを用いる組織培養皿中に載置後早くも４８時間で観察した（図３Ａ、Ｃ）（４０×倍率）。細胞は紡錘形態の特徴を有し、線維芽細胞に密接に類似し、インビトロにおいて容易にかつ迅速に移動し、および増殖した（図３Ｂ、Ｄ）（４０×倍率）。同様の観察は、コラゲナーゼの酵素消化（図４）により単離された細胞グループにおいて見られる。図４Ａは臍帯羊膜から２日目に単離された間葉細胞を示す。細胞の増殖は５日目に観察された（図４Ｂ）（４０×倍率）。図６および８は、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳの条件において非支持細胞層および支持細胞層上で培養された臍帯羊膜からの間葉幹細胞のコロニー形成を示す写真である（４０×倍率）。細長い形状の線維芽様細胞のコロニーは３日目から７日目に急速に増殖した。
【００６４】
ウェスタンブロット解析（図９）は、本発明に従って単離された臍帯羊膜（ＵＣＭＣ）および臍帯上皮細胞（ＵＣＥＣ）からの間葉幹細胞が、胚性幹細胞の特異マーカーである転写因子Octamer-4（Ｏｃｔ−４）をコードするＰＯＵ５ｆ１遺伝子を発現することを示す（Niwa,H.、Miyazaki,J.およびSmith,A.G.（２０００年）、Nat.Genet. ２４、３７２〜３７６）。このように、この分析はこれらの幹細胞の胚性様特性を示す。これらの細胞はまた結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、胎盤様成長因子ＰＬＧＦ、ＳＴＡＴ３、幹細胞因子（ＳＣＦ）、肝癌由来成長因子（ＨＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、フィブロネクチン、デコリン、シンデカン−１，２，３，４等の他の成長因子を高度に発現した。図９において、これらの遺伝子の発現をヒト真皮線維芽細胞、骨髄間葉細胞（ＢＭＳＣ）および脂肪由来間葉細胞（ＡＤＭＣ）と比較する。図９はまた、臍帯羊膜および上皮幹細胞培養の上清におけるＥＬＩＳＡ分析により検出された高分泌アクチビンＡおよびホリスタチン（両方のタンパク質は組織の修復および再生を促進し、血管新生を促進し、および胚性幹細胞培養を維持することがよく知られており、それにより、それぞれの遺伝子の発現が胚性特性のサインであり、細胞を分化する能力である）を、骨髄、脂肪由来幹細胞、ヒト真皮線維芽細胞および表皮ケラチノサイトと比較して示す。また、これらの結果は、本発明の細胞が、再生医学、加齢医学、組織修復、組織工学等のこれらの細胞領域の医療用途における有望な候補であることを示す。
【００６５】
間葉細胞は分泌されたサイトカインおよび成長因子の分析により、ヒトの骨髄間葉幹細胞との比較においてさらに特徴付けられた。臍帯上皮幹細胞（ＵＣＥＣ）はヒト表皮ケラチノサイトとの比較において分析した。この分析は以下のとおりに実施した：すなわち、ＵＭＭＣ、ＵＣＥＣ、真皮線維芽細胞、骨髄間葉細胞、表皮ケラチノサイトを集密度１００％（３７℃、５％ＣＯ２）まで成長培地中で培養し、次いで飢餓培地（無血清ＤＭＥＭ）中で４８時間同調させた。翌日、培地を次の新鮮な無血清ＤＭＥＭで置き換え、細胞をさらに４８時間培養した。馴化培地を収集、濃縮し、およびCytokine Array（RayBiotech,Inc、ジョージア州、米国）を用いて分析した。
【００６６】
この分析の結果は、ＵＣＭＣがインターロイキン−６（ＩＬ−６）；（ＭＣＰ１）；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）；インターロイキン−８（ＩＬ８）；ｓＴＮＦＲ１；ＧＲＯ；ＴＩＭＰ１；ＴＩＭＰ２；ＴＲＡＩＬＲ３；ｕＰＡＲ；ＩＣＡＭ１；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６（図１１）を分泌するのに対し、ＵＣＥＣはＩＧＦＢＰ−４；ＰＡＲＣ；ＥＧＦ；ＩＧＦＢＰ−２；ＩＬ−６；アンギオゲニン（angiogenin）；ＧＣＰ−２；ＩＬ１Ｒα；ＭＣＰ−１；ＲＡＮＴＥＳ；ＳＣＦ；ＴＮＦβ；ＨＧＦ；ＩＬ８；ｓＴＮＦＲ；ＧＲＯ；ＧＲＯ−α；アンフィレギュリン（Amphiregulin）；ＩＬ−１Ｒ４／ＳＴ２；ＴＩＭＰ１；ＴＩＭＰ２；ｕＰＡＲ；ＶＥＧＦ（図１２）を分泌することを示す。
【００６７】
したがって、このことは両方の細胞の型が、発生生物学、組織恒常性、組織修復および再生ならびに血管新生において重要な役割を果たすサイトカインおよび成長因子を多量に分泌することを示す。このことはさらに個々の医療用途における本発明の細胞の汎用性を示す。
【００６８】
加えて、本発明の細胞はさらにそれらの安全性概略に関し、指標としてマウスの奇形腫形成分析を用いて試験した。６匹のＳＣＩＤマウスをこれらの実験に使用した。２百万より多くのＵＣＭＣを含む懸濁液を無菌２５Ｇ針を用い、各ＳＣＩＤマウスの大腿筋に注射した。動物を６カ月間保持し、腫瘍の形成を評価した。これらのマウスにおいて、腫瘍の形成は見られなかった（データを示さず）。このことは、本発明の細胞が安全で、かつ良性または他の腫瘍を形成する能力のないことを示す。
【００６９】
実施例４：無血清培地における幹細胞／前駆細胞の培養
ＵＣＭＣ細胞を１０ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中、および無血清培地中、ＰＴＴ−１、ＰＴＴ−２およびＰＴＴ−３中で培養した。３つの培地ＰＴＴ−１、ＰＴＴ−２およびＰＴＴ−３は本発明者の１人、Ｄｒ  Ｐｈａｎにより調製した。すなわち、これらの３つの培地はウシ胎仔血清またはヒト血清を含有せず、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β、アクチビンＡ、ＢＭＰｓ、ＰＤＧＦ、トランスフェリン、インスリン等の異なるサイトカインおよび成長因子を含有する。成長因子の成分は分化成長特性を評価するために培地間で変更する。培養は以下のように実施した。異なる比率の成長因子およびサイトカインを基礎培地に添加した。ＵＣＭＣを解凍し、これらの培地中に１０日間保持した。細胞の増殖を光学顕微鏡下で観察した。
【００７０】
図１３は、４つの異なる培地グループ中でのＵＣＭＣの良好な成長を示し（図１３−１から図１３−５）、ここでＵＣＭＣ細胞の形態は、それぞれの培地中に存在するサイトカインまたは成長因子の比率または割合に応じて異なる。これに対し、骨髄および脂肪由来の間葉細胞はこれらの無血清培地中ではよく成長しなかった（図１３−６および図１３−７）。したがって、ＵＣＭＣの良好な成長は、本発明の細胞の頑健性および高い生存率を示し、成長特性は骨髄由来および脂肪由来の間葉細胞として間葉幹細胞の従来の供給源より優れていることを示す。この観点において、（ウシ）無血清培地をこれらの実験に用いたこと、および大部分のヒトの間葉細胞が無血清培地システムにおいて良好に成長しないことに注目するのは価値がある。したがって、細胞培養および増殖のためにウシ胎仔血清を使用する危険性が除去されているため、細胞療法において確定した無血清培地技術と関連して本発明の細胞を使用することは大きな利点がある。（ウシ血清の使用が長い間実践されており、細胞成長を典型的に最適化するが、その使用により牛海綿状脳症（狂牛病）のような動物原性感染症の感染の懸念が惹起された）。
【００７１】
実施例５：臍帯上皮および間葉幹細胞の遺伝子発現概略の特性
臍帯上皮および間葉幹細胞の遺伝子発現概略をＤＮＡマイクロアレイを用いて解析した。この目的のために、ＵＣＭＣおよびＵＣＥＣを成長培地中、３７℃、５％ＣＯ２で集密度１００％まで培養した。細胞を基礎培地中で４８時間同調させ、次いで新鮮な基礎培地に置き換え、さらに４８時間同調させた。全体のＲＮＡを収穫し、Silicon Genetics Microarray Serviceに送付した。データ解析をGeneSpring ７．２）を用いて行った。図１４は包括的遺伝子発現を要約する。ＵＣＥＣは２８０５５個の遺伝子の全体を発現し、ＵＣＭＣは３４４０７個の遺伝子の全体を発現した。両方の細胞型において２７３０８個の重複遺伝子の発現が存在し、発現された７４７個の遺伝子がＵＣＥＣに固有であり、発現された７０９９個の遺伝子がＵＣＭＣに固有であった。関心のある選択された遺伝子を図１４に示す。
【００７２】
両方の幹細胞型は胚性幹細胞および胚発生に関して１４０個の遺伝子を発現し、さらに、本発明の細胞が胚性幹細胞様の特性を有することを支持する：Ｎａｎｏｇ；α−胎児性タンパク質；Ｐｒｅ−β−細胞白血病転写因子３；ラミニンα５；癌胎児性抗原様１；アブヒドロラーゼ（abhydrolase）ドメイン含有２；デルタ様３（ショウジョウバエ）；マッスルブラインド（Muscleblind）様（ショウジョウバエ）；ＧＮＡＳ複合座；癌胎児性抗原関連細胞接着分子３；パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ２；妊娠特異的β−１−糖タンパク質２；癌胎児性抗原様１；胚性外胚葉発達（Embryonic ectoderm development）；母性胚性ロイシンジッパーキナーゼ（Maternal embryonic leucine zipper kinase）；絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン２；フォークヘッドボックス（Forkhead box）Ｄ３；ラジカルフリンジホモログ（ショウジョウバエ）；キネシンファミリーメンバー１Ｂ；ミオシン、ヘビーポリペプチド３、骨格筋、胚性；裂手／裂足先天性異常（欠指症）タイプ３；ＴＥＡドメインファミリーメンバー３；ラミニン、α１；絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン１；胎盤ラクトゲン；コルチコトロピン放出ホルモン受容体１；甲状腺刺激胚性因子；アリール−ハイドロカーボン受容体核輸送体２；膜frizzled関連タンパク質；ニューレグリン（Neuregulin）１’コラーゲン、タイプＸＶＩ、α１；ニューレグリン１；絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン１（胎盤ラクトゲン）；ＣＵＧ３回反復、ＲＮＡ結合タンパク質；絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン１（胎盤ラクトゲン）ビスチン（Bystin）様；ＭｙｏＤファミリーインヒビター；誘起されたレチノイン酸２；ＧＮＡＳ複合座；Ｐｒｅ−β−細胞白血病転写因子４；ラミニン、α２（メロシン、先天性筋ジストロフィー）；ＳＡＤ、ＤＰＰホモログ１に対するｍｏｔｈｅｒｓ（ショウジョウバエ）；タンパク質ｐｉｒに中程度の類似性を有するホモサピエンス転写配列；Ｄ２８９２８（ホモサピエンス）Ｄ２８９２８妊娠特異的β−１−糖タンパク質１Ｂ、流産−ヒト（フラグメント）；キネシン（Kinesin）ファミリーメンバー１Ｂ；Ｂｒｕｎｏ様４、ＲＮＡ結合タンパク質（ショウジョウバエ）；胚性脳特異的タンパク質；妊娠誘発成長インヒビター；ＳＭＡＤ、ＤＰＰホモログ５に対するｍｏｔｈｅｒｓ（ショウジョウバエ）；絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン２；アデニレートサイクラーゼ活性化ポリぺプチド１（下垂体）；癌胎児性抗原関連細胞接着分子；ラミニン、α３；タンパク質Ｏ−フコシル基転移酵素１；Ｊａｇｇｅｄ１（アラジル症候群）；ねじれ原腸形成（Twisted gastrulation）ホモログ１（ショウジョウバエ）；ＥＬＡＶ（胚致死、視覚異常、ショウジョウバエ）様３（Ｈｕ抗原Ｃ）；甲状腺刺激胚性因子；溶質キャリヤーファミリー４３、メンバー３；Inversin；ネフロン癆２（小児）；左右軸決定遺伝子（inversion of embryonic turning）；ホモサピエンスInversin（ＩＮＶＳ）、転写バリアント２、ｍＲＮＡ；ホモサピエンス転写配列；ホメオボックスＤ８；胚性Ｆｙｎ関連基質；ＥＬＡＶ（胚致死、視覚異常、ショウジョウバエ）様１（Ｈｕ抗原Ｒ）；ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス（basic helix-loop-helix）ドメイン含有、クラスＢ、２；オキシトシン受容体；奇形腫（teratocarcinoma）由来成長因子１；Ｆｍｓ−関連チロシンキナーゼ１（血管内皮成長因子／血管浸透性因子受容体）；アドレノメデュリン（adrenomedullin）；核受容体コアクチベータ６−ＣＵＧ３重反復、ＲＮＡ結合タンパク質１；ねじれ原腸形成ホモログ１（ショウジョウバエ）；癌胎児性抗原関連細胞接着分子４；タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプ、Ｒ；Ａｃｒｇ胚致死（マウス）最小領域相同遺伝子（ortholog）；ＥＰＨ受容体Ａ３；デルタ様１（ショウジョウバエ）；鼻胚性ＬＨＲＨ因子；転写因子ＣＰ２様１；裂手／裂足先天性異常（欠指症）タイプ３；Jagged2；ホモサピエンス転写配列；ニューレグリン１；裂手／裂足先天性異常（欠指症）タイプ１；溶質キャリヤーファミリー４３、メンバー３；ヒドロキシアシル−コエンザイムＡデヒドロゲナーゼ／３−ケトアシル−コエンザイムＡチオラーゼ／エノイル−コエンザイムＡヒドラターゼ（３機能性タンパク質）、αサブユニット；フコシル基転移酵素１０（α（１，３）フコシル基転移酵素）；Ａｃｒｇ胚致死（マウス）最小領域相同遺伝子（ortholog）；癌胎児性抗原関連細胞接着分子７；ヌクレオフォスミン（nucleophosmin）／ヌクレオプラスミン（nucleoplasmin）、２；ＩｇＧのＦｃフラグメント、受容体、輸送体、α；ねじれ原腸形成ホモログ１（ショウジョウバエ）；血管タンパク質ソーティング３５類似ホモサピエンス；母性−胚性３（ＬＯＣ１４６４８５）、ｍＲＮＡ；アブヒドロラーゼドメイン含有２；Ｔ、転写因子（brachyury）ホモログ（マウス）；ディスインテグリン（disintegrin）およびメタロプロテイナーゼドメイン１０；リボソームタンパク質Ｌ２９；エンドセリン転換酵素２；ＥＬＡＶ（胚致死、視覚異常、ショウジョウバエ）様１（Ｈｕ抗原Ｒ）；トロフィニン（trophinin）；ホメオボックスＢ６；ラミニン、α４；ホメオボックスＢ６；仮想タンパク質ＦＬＪ１３４５６；ＮＡＣＨＴ、ロイシンリッチ反復およびＰＹＤ含有５；ＥＬＡＶ（胚致死、視覚異常、ショウジョウバエ）様１（Ｈｕ抗原Ｒ）；非分化胚性細胞転写因子１；妊娠関連血漿タンパク質Ａ、パパリシン（pappalysin）１；セクレトグロビン（secretoglobin）、ファミリー１Ａ、メンバー１（ウテログロビン）；副甲状腺ホルモン様ホルモン；癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（胆汁糖タンパク質）；ラミニン、α１。
【００７３】
両方の幹細胞型はまた発生生物学、細胞成長および分化、細胞恒常性、細胞および組織の修復および再生に関して何千もの遺伝子を発現した。かかる成長因子およびそれらの受容体の例は以下のとおりである：（Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦｓ、ＩＧＦｓ、ＫＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦｓ、ＰＩＧＦ、アンギオポエチン、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦｓ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＨＤＧＦ、ＴＧＦ−β、アクチビンおよびインヒビン、ホリスタチン、ＢＭＰｓ、ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ、ＬＩＦ、ＷＮＴｓ、ＳＤＦｓ、オンコスタチンＭ、インターロイキン、ケモカインおよびその他多数）；ＭＭＰｓ、ＴＩＭＰｓ、細胞外マトリックス（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、インテグリン、シンデカン、デコリン、フィブロモルジン（fibromoludin）、プロテオグリカン、ｓｐａｒｃ／オステオネクチン、ムチン、ネトリン、グリピカン（Glypican）、軟骨関連タンパク質、マトリリン（matrilin）、ヒアルロナン、フィブリン、ＡＤＡＭＴＳ、バイグリカン（biglycan）、ジスコイジン（discoidin）、デスモソーム（desmosome）成分、ＩＣＡＭｓ、カドヘリン、カテニンおよびその他多数）；サイトケラチン。
【００７４】
これらはＵＣＭＣのみに存在する遺伝子のグループである。これらの遺伝子は以下に関係する：正常な生理的プロセス（インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ）；インスリン様４（胎盤）；レラキシン１；プラスミノーゲン；インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ）；インスリン様５；インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ）；インスリン様成長因子２（ソマトメジンＡ））、恒常性（radial spokehead1；ヘモクロマトーシス；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５；インターロイキン３１受容体Ａ；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞誘導因子１）；核受容体サブファミリー３、グループＣ、メンバー２；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２３；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２３；ミトコンドリアフェリチン；ペルオキシソーム増殖活性化受容体、ガンマ、コアクチベータ１、α；界面活性剤、肺関連タンパク質Ｄ；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１１；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド３；Ｅｇｌ  ｎｉｎｅホモログ２（C. elegans）；ペルオキシソーム増殖活性化受容体、ガンマ、コアクチベータ１，β；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；ＡＴＰアーゼ、Ｎａ＋／Ｋ＋輸送、α２（＋）ポリペプチド；ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド２；ヘモペキシン；リアノジン受容体３）、形態形成（スペクトリン、α、赤血球１（楕円赤血球症２）；ホメオボックスＤ３；眼欠損（Eyes absent）ホモログ１（ショウジョウバエ）；Ｒａｓホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＪ；白血球特異的転写１；エクトディスプラシン（Ectodysplasin）Ａ２受容体、グリピカン３；ペアボックス遺伝子（Paired box gene）７；コリン、セリンプロテアーゼ；Dishevelled、ｄｓｈホモログ１（ショウジョウバエ）；Ｒａｓホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＪ；Ｔ−ｂｏｘ３（ulnar mammary症候群）；コンドロイチンβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素；コンドロイチン１，４Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素；ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス１０；ミオシン、ヘビーポリペプチド９、非筋肉；黄体形成ホルモン／胎盤性性腺刺激ホルモン受容体；ラジカルフリンジホモログ（ショウジョウバエ）；分泌型Frizzled関連タンパク質５；無翅タイプＭＭＴＶ組込部位ファミリー、メンバー１１；眼欠損（Eyes absent）ホモログ２（ショウジョウバエ）；マッスルブラインド様（ショウジョウバエ）；Ｔ−ボックス５；Ｍａｂ−２１様１（C. elegans）；成長停止特異的２；中肢上の性櫛ホモログ１（ショウジョウバエ）；Ｔ−ボックス６；フィラミン結合ＬＩＭタンパク質１；メラノーマ細胞接着分子；Twistホモログ１（尖頭合指症）３；セートレ・ヒョツェン（Saethre-Chotzen）症候群）（ショウジョウバエ）；ホメオボックスＡ１１；ケラトカン（Keratocan）；線維芽細胞成長因子１（酸性）；カルボキシペプチドプチダーゼＭ；ＣＤＣ４２エフェクタータンパク質（Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ結合）４；ＬＩＭホメオボックス転写因子１，β；Engralledホモログ１；カルボキシペプチドプチダーゼＭ；線維芽細胞成長因子８（アンドロゲン誘起）；線維芽細胞成長因子１８；白血球特異的転写１；エンドセリン３；���ア様（Paired-like）ホメオドメイン転写因子１）、胚発生（妊娠特異的β１−糖タンパク質３；ＥＬＡＶ（胚致死、視覚異常、ショウジョウバエ）様４（Ｈｕ抗原Ｄ）；Ｇタンパク質−結合受容体１０；エクトディスプラシン（Ectodysplasin）Ａ２受容体、ＡＴＰ−結合カセット；サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー４；妊娠特異的β１−糖タンパク質１１；鼻胚性ＬＨＲＨ因子；レラキシン１；Ｎｏｔｃｈボックス４（ショウジョウバエ）；妊娠特異的β１−糖タンパク質６；ｐｉｈ−２Ｐ；ホモサピエンス妊娠誘発高血圧症候群関連タンパク質（ＰＩＨ２）；卵管糖タンパク質１、１２０ｋＤａ（ムチン９、オビダクチン（oviductin））；黄体ホルモン薬関連子宮内膜タンパク質；ミオシン、ライトポリぺプチド４、アルカリ；心房、胚性；プロラクチン；Ｎｏｔｃｈホモログ４（ショウジョウバエ）；Ｐｒｅ−β−細胞白血病転写因子１；ラジカルフリンジホモログ（ショウジョウバエ）；コルチコトロピン放出ホルモン；核受容体サブファミリー３、グループＣ、メンバー２；ニューレグリン２；マッスルブラインド様（ショウジョウバエ）；ミオシン、ライトポリぺプチド４、アルカリ；心房、胚性；ホモサピエンスｃＤＮＡ  ＦＬＪ２７４０１ｆｉｓ、クローンＷＭＣ０３０７１；胚体外、精子形成、ホメオボックス１様；インスリン様４（胎盤）；ヒト加工擬妊娠特異的糖タンパク質（ＰＳＧ１２）遺伝子、２スプライス部位Ｃ１およびＣ２の３’未翻訳領域を含有するエクソンＢ２Ｃ；Ｆｍｓ−関連チロシンキナーゼ１（血管内皮成長因子／血管浸透性因子受容体）；Ｐｒｅ−Ｂ−細胞白血病転写因子１；妊娠特異的β１−糖タンパク質３；癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（胆汁糖タンパク質）；ステロイドスルファターゼ（マイクロソーム）、アリールスルファターゼＣ、アイソザイムＳ；ホメオボックスＢ６；タンパク質Ｏ−フコシル基転移酵素１；ＬＩＭホメオボックス転写因子１，β；癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（胆汁糖タンパク質）；卵胞刺激ホルモン、βポリぺプチド；アンジオテンシノーゲン（セリン（またはシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレードＡ（α−１アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー８）；癌胎児性抗原関連細胞接着分子６（非特異的交差反応抗原）；プロテインキナーゼＣ、α結合タンパク質；コレクチン（Collectin）サブファミリーメンバー１０（Ｃ−タイプレクチン）；ラミニン、α１）、細胞外空間（カルボキシエステラーゼ１（単球／マクロファージセリンエステラーゼ１）；線維芽細胞成長因子５；プロガストリクシン（Progastricsin）（ぺプシノーゲンＣ）；精子関連抗原１１；前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン（kexin）タイプ２；ヒアルロナン結合タンパク質２；Ｓｅｍａドメイン、イムノグロブリンドメイン（Ｉｇ）、短い基本的ドメイン、（セマフォリン（semaphorin））３Ｆ；インターロイキン２；キモトリプシン様；ノリー病（Norrie disease）；ムチン５、サブタイプＡおよびＣ、気管気管支／胃の；カルボキシペプチダーゼＢ２（血漿、カルボキシペプチダーゼＵ）；ラジカルフリンジホモログ（ショウジョウバエ）；妊娠特異的β−１−糖タンパク質１１；メプリン（Meprin）Ａ、α（ＰＡＢＡぺプチドヒドロラーゼ��；タキキニン（Tachykinin）、プレカーサー１（物質Ｋ、物質Ｐ、ニューロキニン１、ニューロキニン２、ニューロキニンＬ、ニューロキニンα、ニューロぺプチドＫ、ニューロぺプチドガンマ）；線維芽細胞成長因子８（アンドロゲン誘起）；線維芽細胞成長因子１３；ヘモペキシン；乳癌２、早期発症；線維芽細胞成長因子１４；網膜分離症（Ｘ−関連、未成年）１；キチナーゼ３様１（軟骨糖タンパク質−３９）；ジストニン（Dystonin）；セクレトグロビン、ファミリー１Ｄ、メンバー２；ノギン（Noggin）；ＷＡＰ４−ジスルフィドコアドメイン２；ＣＤ５抗原様（スカベンジャー受容体システインリッチファミリー）；Scraple反応性タンパク質１；グレムリン（Gremlin）１ホモログ、システインノット（cysteine knot）スーパーファミリー（アフリカツメガエル）；インターロイキン１６（リンパ球走化性因子）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２６；Nucleobindin１；線維芽細胞成長因子１８；インスリン様成長因子結合タンパク質１；界面活性剤、肺関連タンパク質Ａ１；デルタ様１ホモログ（ショウジョウバエ）；コカイン−およびアンフェタミン−制御転写；メプリンＡ，β；インターロイキン１７Ｆ；補体因子Ｈ；システインリッチ分泌タンパク質２；ジストニン；ＷＡＰ４−ジスルフィドコアドメイン１；プロラクチン；界面活性剤、肺関連タンパク質Ｂ；線維芽細胞成長因子５；Dickkopfホモログ２（アフリカツメガエル）；精子関連抗原１１；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１１；メプリンＡ、α（ＰＡＢＡぺプチドヒドロラーゼ）；キチナーゼ３様２；Ｃ−ｆｏｓ誘起成長因子（血管内皮成長因子Ｄ）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４；ポリオウイルス受容体；ヒアルロノグルコサミニダーゼ１；卵管糖タンパク質１、１２０ｋＤａ（ムチン９、オビダクチン）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９；分泌型Frizzled関連タンパク質５；アメロゲニン（エナメル質形成不全症１、Ｘ−関連）；レラキシン１；ｓｐａｒｃ／オステオネクチン、ｃｗｃｖおよびｋａｚａｌ様ドメインプロテオグリカン（testican）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２６；線維芽細胞成長因子１（酸性）；アンギオポエチン様２；Ｆｍｓ−関連チロシンキナーゼ１（血管内皮成長因子／血管浸透性因子受容体）；ジストニン；インスリン様４（胎盤）；トランスコバラミンＩＩ；大球性貧血；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１；インスリン様成長因子結合タンパク質、酸不安定サブユニット；補体因子Ｈ；妊娠特異的β−１−糖タンパク質６；シルバーホモログ（マウス）；プロテオグリカン４；線維芽細胞成長因子１６；サイトカイン様タンパク質Ｃ１７；グラニュリシン（Granulysin）；アンギオポエチン様２；クロモグラニン（Chromogranin）Ｂ（セクレトグラニン（secretogranin）１）；Ｓｅｍａドメイン、イムノグロブリンドメイン（Ｉｇ）およびＧＰＩ膜アンカー、（セマフォリン）７Ａ；プレイオトロフィン（ヘパリン結合成長因子８、神経成長促進因子１）；クロライドイオンチャネル、カルシウム活性化、ファミリーメンバー３；セクレトグロビン、ファミリー１Ｄ、メンバー１；フィブリン１；ホスホリパーゼＡ２受容体１、１８０ｋＤａ）、および細胞外マトリックス（ＡＤＡＭＴＳ���１；ペリオスチン（Periostin）、）骨芽細胞特異的因子；グリピカン５；ロイシンリッチ反復ニューロン３；トランスグルタミナーゼ２（Ｃポリペプチド、プロテイン−グルタミン−ガンマ−グルタミル転移酵素）；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシン（reprolysin）タイプ）、２；微小繊維関連タンパク質４；グリピカン３；コラーゲン、タイプＶ、α３；メタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター；ケラトカン；軟骨オリゴマー基質タンパク質；ルミカン（lumican）；ヒアルロナンおよびプロテオグリカン関連タンパク質３；スタセリン（Statherin）；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシンタイプ）、３；スポンジン１、細胞外マトリックスタンパク質；キチナーゼ３様１（軟骨糖タンパク質−３９）；コラーゲン、タイプＩＶ、α３（グッドパスチュア抗原）；無翅タイプＭＭＴＶ組込部位ファミリー、メンバー７Ｂ；コラーゲン、タイプＩＶ、α２；リポカリン（Lipocalin）７；ヒアルロナンおよびプロテオグリカン結合プロテイン４；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシンタイプ）、５（アグリカナーゼ（aggrecanase）−２）；フィブロネクチン１；マトリリン１、軟骨マトリックスタンパク質；仮想タンパク質ＦＬＪ１３７１０；コンドロイチンβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素；マトリックスメタロプロテイナーゼ１６（膜挿入）；フォン・ヴィレブランド因子；コラーゲン、タイプＶＩ、α２；トランスメンブランプロテアーゼ、セリン６；マトリックスメタロプロテイナーゼ２３Ｂ；マトリックスメタロプロテイナーゼ１４（膜挿入）；ロイシンリッチ反復ニューロン３；ＳＰＡＲＣ様１（ｍａｓｔ９、ｈｅｖｉｎ）；ｓｐａｒｃ／オステオネクチン、ｃｗｃｖおよびｋａｚａｌ様ドメインプロテオグリカン（testican）３；Dermatopontin；コラーゲン、タイプＸＩＶ、α１（undulin）；アメロゲニン、Ｙ−関連；ナイドジェン（Nidogen、エンタクチン（enactin））；ＡＤＡＭＴＳ様２；ヒアルロナンおよびプロテオグリカン結合タンパク質２；
コラーゲン、タイプＸＶ、α１；Glyplcan６；マトリックスメタロプロテイナーゼ１２（マクロファージエラスターゼ）；アメロゲニン（エナメル質形成不全症１、Ｘ−関連）；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシンタイプ）、１５；トランスメンブランプロテアーゼ、セリン６；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシンタイプ）、１６；ｓｐａｒｃ／オステオネクチン、ｃｗｃｖおよびｋａｚａｌ様ドメインプロテオグリカン（testican）；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシンタイプ）、２０；コラーゲン、タイプＸＩ、α１；ヒアルロナンおよびプロテオグリカン結合タンパク質１；コンドロイチンβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素；アスポリン（Asporin）（ＬＲＲクラス１）；コラーゲン、タイプＩＩＩ、α１（エーラス・ダンロス症候群タイプＩＶ、常染色体優性）；分泌ホスホプロテイン１（オステオポンチン（osteopontin）、骨シアロタンパク質（bone sialoprotein）１、早期Ｔ−リンパ球活性化１）；マトリックスＧｌａタンパク質；フィブリン５；コラーゲン、タイプＸＩＶ、α１（undulin）；メタロプロテイナーゼ３の組織インヒビター（ソースビー眼底変性症、偽炎症性）；コラーゲン、タイプＸＸＶ、α１；軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質；コラーゲン、タイプＶＩ、α１；コンドロアドヘリン；コラーゲン、タイプＸＶ、α１；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシンタイプ）、１６；コラーゲン、タイプＩＶ、α４；デンチン（Dentin）マトリックス酸性リンタンパク質；コラーゲン、タイプＩＶ、α１；トロンボスポンジン反復含有１；マトリックスメタロプロテイナーゼ１６（膜挿入）；コラーゲン、タイプＩ、α２；フィブリンＩ；Tectorinβ；グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤ１；結腸直腸癌遺伝子における上方調節１）。細胞骨格：（フィラミンＢ、β（アクチン結合タンパク質２７８）；セントリン（Centrin）、ＥＦ−ｈａｎｄタンパク質、１；ＦＥＲＭドメイン含有３；架橋インテグレータ（Bridging integrator）３；Parvin、ガンマ；Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）１１；チロシンキナーゼ２；Kelch様４（ショウジョウバエ）；スぺクトリン，β、赤血球（球状赤血球症を含む、臨床タイプ１）；Ａｒｇ／Ａｂｌ相互作用タンパク質ＡｒｇＢＰ２；Advillin；スぺクトリン反復含有、核包膜１；カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、デルタ１；赤血球膜タンパク質バンド４．１様５；カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、α２；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド３；サルコグリカン、ガンマ（３５ｋＤａ  ジストロフィン関連糖タンパク質）；ネブリン（Nebulin）；チモシン（Thymosin），β、神経芽腫細胞において同定；３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ−１；ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質相互作用タンパク質；ジストニン；ハンチンチン相互作用タンパク質１；ＫＩＡＡ０３１６遺伝子産物；トロポモジュリン４（筋肉）；��癌における欠失１；ビリン様；シントロフィン（Syntrophin）、β１（ジストロフィン関連タンパク質Ａ１、５９ｋＤａ、基礎成分１）；プロテインキナーゼ、ｃＧＭＰ依存性、タイプ１；ケラチン８に類似するホモサピエンス；サイトケラチン８；ケラチン、タイプＩＩサイトケレタール（cytokeletal）８（ＬＯＣ３４５７５１）、ｍＲＮＡ；アデュシン（Adducin）１（α）；ニューロンにおけるプロテインキナーゼＣおよびカゼインキナーゼ基質３；ジストニン；ケル血液型；フィラミンＡ相互作用タンパク質１；成長停止（growth arrest）特異的２；クロモソーム１オープンリーディングフレーム１；スタスミン（Stathmin）様２；スぺクトリン、α、赤血球１（楕円赤血球症２）；ＦＫＳＧ４４遺伝子；キネシンファミリーメンバー１Ｃ；テンシン（Tensin）；カプチン（Kaptin）（アクチン結合タンパク質）；ニューロフィブロミン（Neurofibromin）２（両側性聴神経腫）；プレクストリン（Pleckstrin）相同性、Ｓｅｃ７およびコイルドコイル（coiled-coil）ドメイン２（サイトヘシン（cytohesin）−２）；アクチン関連タンパク質Ｔ１；ウィスコット・アルドリッチ症候群様；Kelch様４（ショウジョウバエ）；ファスシン（Fascin）ホモログ１、アクチン結合タンパク質（Strongylocentrotus purpuratus：アメリカムラサキウニ）；アンフィファイシン（Amphiphysin、乳癌を有するスティフマン症候群  １２８ｋＤａ  自己抗原）；多発性嚢胞腎障害（polycystic kidney disease）２様１；アンキリン（Ankyrin）２、ニューロンの；ＣＤＣ４２結合タンパク質キナーゼα（ＤＭＰＫ様）；仮想タンパク質ＦＬＪ３６１４４；Ａｒｇ／Ａｂｌ相互作用タンパク質ＡｒｇＢＰ２；フォルミン（Formin）様３；カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、β１、８８ｋＤａ；プロフィリン（Profillin）２；シナプトポジン（Synaptopodin）、ガンマ２；ホスホリパーゼＤ２；貪食および細胞運動性２（ｃｅｄ−１２ホモログ、C. elegans）；ニューロフィラメント、ライトポリぺプチド６８ｋＤａ；ジストニン；アクチン様７Ｂ；キネシンファミリーメンバー１Ｃ；ＰＤＺおよびＬＩＭドメイン３；アデュシン２（β）；オブスクリン（obscurin）、細胞骨格カルモジュリンおよびタイチン（titin）相互作用ＲｈｏＧＥＦ；チューブリン、βポリぺプチドパラログ；フィラミンＡ相互作用タンパク質１；タリン（Talin）１；［２の断片１］に類似するホモサピエンスピッコロタンパク質（Aczonin）（ＬＯＣ３７５５９７）；ＣＤＣ４２エフェクタータンパク質（ＲｈｏＧＴＰアーゼ結合）４；シンデカン（Syndecan）１；フィラミンＡ、α（アクチン結合タンパク質２８０）；プロフィリン２；テンシン様Ｃ１ドメイン含有ホスファターゼ；仮想タンパク質ＭＧＣ３３４０７；ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼ１；フラボプロテインオキシドリダクターゼＭＩＣＡＬ２；Ｃａ２＋−依存性分泌活性化剤；Rabphilin３Ａ様（Ｃ２ドメインなし）；ミオシンＸＶＡ；プロテインキナーゼ、ｃＧＭＰ−依存性、タイプ１；ミオシン制御軽鎖相互作用タンパク質；キネシンファミリーメンバー１３Ｂ；筋肉ＲＡＳ腫瘍遺伝子ホモログ；スペクトリン、β、非赤血球１；ＴＡＯキナーゼ２；フィラミンＢ、β（アクチン結合タンパク質２７８）；ニューロフィブロミン２（両側性聴神経腫）；カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、α３；オブスクリン、細胞骨格カルモジュリンおよびタイチン相互作用ＲｈｏＧＥＦ；コロニン（Coronin）、アクチン結合タンパク質、１Ａ；赤血球膜タンパク質バンド４．１様１；スペクトリン、β、非赤血球４；チモシン、β４、Ｙ−関連；テクチン（Tektin）２（精巣）；Ｒａｓホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＪ；Ｄｂ１およびプレクストリン相同性ドメインを有するセリン／スレオニンキナーゼ；ジストロブレビン（Dystrobrevin）、β；アクチン、ガンマ２、平滑筋、腸の；Ｔｅｒａ様タンパク質；カスパーゼ８、アポトーシス関連システインプロテアーゼ；Kelch反復およびＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメイン含有１０；ムチン１、膜貫通；微小管関連タンパク質ｔａｕ；テンシン；Ｒａｓホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＦ（糸状仮足における）；アデュシン１（α）；アクチニン、α４；赤血球膜タンパク質バンド４．１様（楕円赤血球症１、ＲＨ結合）；Bicaudal Ｄホモログ２（ショウジョウバエ）；アンキリン３、ランヴィエ絞輪（アンキリン  Ｇ）；ミオシンＶＩＩＡ（アッシャー症候群１Ｂ（常染色体劣性、重症）；カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、α２；ケラチン８類似ホモサピエンス、タイプＩＩ細胞骨格−ヒト（ＬＯＣ２８５２３３）；ファスシンホモログ３、アクチン束化タンパク質、精巣；Ｒａｓホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＪ；ビーズ状のフィラメント構造タンパク質２、ファキニン（phakinin）；デスミン（Desmin）；ミオシンＸ；シグナル誘起増殖関連遺伝子１；シンデリン（Scinderin）；コアクトシン（Coactosin）様１（Dictyostelium：タマホコリカビ）；貪食および細胞運動性２（ｃｅｄ−１２ホモログ、C. elegans）；チューブリン、β４；Ｃａ２＋−依存性分泌活性化剤；ＦＥＲＭドメイン含有４Ａ；アクチン、α１、骨格筋；タリン１；カルデスモン（Caldesmon）１；フィラミン結合ＬＩＭタンパク質−１；微小管関連タンパク質ｔａｕ；シントロフィン、α１（ジストロフィン関連糖タンパク質Ａ１、５９ｋＤａ、酸性成分）；アデュシン２（β）；フィラミンＡ相互作用タンパク質１；ＰＤＺおよびＬＩＭドメイン３；赤血球膜タンパク質バンド４．１様４Ｂ；ＦＹＮ結合タンパク質（ＦＹＢ−１２０／１３０）；架橋インテグレータ３。細胞外：（トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシンタイプ）、２０；ＳＰＡＲＣ様１（ｍａｓｔ９、ｈｅｖｉｎ）；セリン（またはシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレードＧ（Ｃ１インヒビター）、メンバー１、（血管性浮腫、遺伝性）；ウロコルチン（Urocortin）；キモトリプシン様；血小板誘起成長因子βポリぺプチド（サル肉腫ウイルス性（ｖ−ｓｉｓ）腫瘍遺伝子ホモログ）；ＢＭＰ結合内皮制御前駆タンパク質；血小板因子Ｈ；絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン様１；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１８（肺性および活性化制御）；フィブロネクチン１；妊娠特異的β−１−糖タンパク質３；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシンタイプ）、３；CocoaCrisp；インスリン様４（胎盤）；無翅タイプＭＭＴＶ組込部位ファミリー、メンバー１１；軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質；膜貫通プロテアーゼ、セリン６；Ｃ−ｆｏｓ誘起成長因子（血管内皮成長因子Ｄ）；１２、メンバーＢ類似配列を有するファミリー（精巣上体）；タンパク質ホスファターゼ１、制御サブユニット９Ｂ、スピノフィリン（spinophilin）；トランスコバラミンＩＩ；大球性貧血；凝固因子Ｖ（プロアクセレリン、不安定因子）；ホスホリパーゼＡ２、グループＩＩＤ；腫瘍壊死因子、α−誘起タンパク質６；コラーゲン、タイプＸＶ、α１；ヒアルロナンおよびプロテオグリカン結合タンパク質３；コラーゲン、タイプＸＩＶ、α１（undulin）；インターロイキン１９；プロテアーゼインヒビター１５；コリン作動性受容体、ニコチン性、βポリぺプチド１（筋肉）；リシルオキシダーゼ様３；インスリン様成長因子結合タンパク質５；成長ホルモン１；カゼインβ；ＮＥＬ−様２（ニワトリ）；Ｉ因子（血小板）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２３；インターフェロン、α２；マトリックスメタロプロテイナーゼ１６（膜挿入）；マトリックスメタロプロテイナーゼ１２（マクロファージエラスターゼ）；グリピカン５；妊娠特異的β−１糖タンパク質３；線維芽細胞成長因子６；グレムリン１ホモログ、システインノットスーパーファミリー（アフリカツメガエル）；タンパク質Ｓ（α）；コンドロイチンβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素；グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤ１；線維芽細胞成長因子１（酸性）；スポンジン１、細胞外マトリックスタンパク質；骨形態形成タンパク質１；界面活性剤、肺関連タンパク質Ｂ；デンチンマトリックス酸性ホスホプロテイン；リポプロテイン、Ｌｐ（ａ）；ムチン１、膜貫通；マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ１（Ｒａ−反応性因子のＣ４／Ｃ２活性化成分）；メプリンＡ、β；；セクレトグロビン、ファミリー１Ｄ、メンバー１；アスポリン（ＬＲＲクラス１）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２５；サイトカイン様タンパク質Ｃ１７；インスリン様５；メプリンＡ、α（ＰＡＢＡぺプチドヒドロラーゼ）；スクレピー反応性タンパク質１；線維芽細胞成長因子１８；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９；
インヒビン、βＢ（アクチビンＡＢβポリぺプチド）；線維芽細胞成長因子８（アンドロゲン誘起）；グラニュリシン；コカイン−およびアンフェタミン−制御転写；コラーゲン、タイプ１、α２；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１７；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２３；ｓｐａｒｃ／オステオネクチン、ｃｗｃｖおよびｋａｚａｌ様ドメインプロテオグリカン（testican）３；ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ａ受容体、β３；ディフェンシン（Defensin）、α４、コルチコスタチン（corticostatin）；ロイシンリッチ反復ニューロン３；グリピカン６；マイトゲン−活性化プロテインキナーゼ２；凝固因子ＸＩ（血漿トロンボプラスミン前駆物質）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５；ジストニン；Frizzled関連タンパク質；凝固因子ＸＩＩＩ、Ａ１ポリぺプチド；インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ）；仮想タンパク質ＭＧＣ４５４３８；精子関連抗原１１；インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ）；ペリオスチン、骨芽細胞特異的因子；α−２−マクログロブリン；ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ａ受容体、α５；セリン（またはシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレードＡ（α−１アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー３；シルバーホモログ（マウス）；Frizzled関連タンパク質；コンドロアドヘリン（Chondroadherin）；コンドロイチンβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素；５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体３、ファミリーメンバーＣ；コラーゲン、タイプＶＩ、α２；トール（toll）様受容体９；アメロゲニン、Ｙ−関連；血管内皮成長因子Ｂ；Radial spokehead １；Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（血管内皮成長因子／血管浸透性因子受容体）；プロテアーゼインヒビター１６；インターロイキン２；クラステリン（Clusterin）（補体溶解インヒビター、ＳＰ−４０、４０、硫酸化糖タンパク質２、テストステロン抑制前立腺メッセージ、アポリポプロテインＪ）；卵胞刺激ホルモン、βポリぺプチド；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテイナーゼドメイン、１６；リゾチーム（腎アミロイドーシス）；ラジカルフリンジホモログ（ショウジョウバエ）；インスリン様成長因子結合タンパク質５；Taxilin；（アポリポプロテインＡ−Ｖ）；血小板由来成長因子Ｃ；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド３様１；線維芽細胞成長因子１６；コラーゲン、タイプＶＩ、α２；セリン（またはシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレードＣ（アンチトロンビン）、メンバー１；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１１；コラーゲン、タイプＩＶ、α４；Bruton無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ；インスリン様成長因子２（ソマトメジンＡ）；Ｋａｚａｌ−タイプセリンプロテアーゼインヒビタードメイン１；フィブリノーゲン、αポリペプチド；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１；インヒビン、βＥ；性ホルモン結合グロブリン、コラーゲン、タイプＩＶ、α１；レシチン−コレステロールアシル基転移酵素；システイン−リッチ分泌プロテイン２；ヒアルロナンおよびプロテオグリカン結合タンパク質１；ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ；リボヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＡファ���リー、Ｋ６；線維芽細胞成長因子１４；ＡＤＡＭＴＳ様２；コラーゲン、タイプＩＶ、α３（グッドパスチャー抗原）；アンギオポエチン２；アポリポプロテインＬ、３；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；ヒアルロナン結合タンパク質２；凝固因子ＶＩＩ（血清プロトロンビン転換促進因子）；コラーゲン、タイプＸＩＶ、α１（undulin）；卵管糖タンパク質１、１２０ｋＤａ（ムチン９、オビダクチン）；マトリリン１、軟骨マトリックスタンパク質；ムチン５、サブタイプＡおよびＣ、気管気管支／胃の；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１１ｂ（osteoprotegerin）；トランスグルタミナーゼ２（Ｃポリぺプチド、プロテイン−グルタミン−ガンマ−グルタミル転移酵素）；ケラトカン；コラーゲン、タイプＶ、α３；ＷＡＰ４ジスルフィドコアドメイン２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）リガンド１；セリン（またはシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレードＤ（ヘパリンコファクター）、メンバー１；分泌タンパク質ＬＯＣ３４８１７４；凝固因子Ｘ；インターロイキン１６（リンパ球走化性因子）；膵リパーゼ関連タンパク質２；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ３；グリシン受容体、α３；ＣＤ５抗原様（スカベンジャー受容体システインリッチファミリー）；仮想タンパク質ＭＧＣ３９４９７；凝固因子ＶＩＩＩ、凝固促進性成分（血友病Ａ）；Dermatopontin；；ノギン；分泌ＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有１；ＡＤＡＭＴＳ様１；α−１−Ｂ糖タンパク質；クロモソーム２０オープンリーディングフレーム１７５；無翅タイプＭＭＴＶ組込部位ファミリー、メンバー８Ｂ；フィブリン１；フィブリン５；カテプシンＳ；ナイドジェン（エンタクチン）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２６；内皮細胞特異的分子１；キチナーゼ３様１（軟骨糖タンパク質−３９）；ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ａ受容体、β１；セクレトグロビン、ファミリー１Ｄ、メンバー２；マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ１（Ｒａ−反応性因子のＣ４／Ｃ２活性化成分）；ＡＤＡＭＴＳ様１；Ｓｅｍａドメイン、イムノグロブリンドメイン（Ｉｇ）およびＧＰＩ膜アンカー、（セマフォリン）７Ａ；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシンタイプ）、１５；前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシンタイプ２；インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ）；Retinoschsis（Ｘ−関連、若年性）１；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシンタイプ）、１６；ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド２；線維芽細胞成長因子５；精子関連抗原１１；微小繊維関連タンパク質４；ポリオウイルス受容体；細胞外シグナル制御キナーゼ８；膜貫通プロテアーゼ、セリン６；プロテインキナーゼＣ、α；キチナーゼ３様２；インターロイキン９；アポリポプロテインＬ、６；界面活性剤、肺関連プロテインＡ１；コラーゲン、タイプＶＩ、α１；アポリポプロテインＬ、６；仮想タンパク質ＦＬＪ１３７１０；カルボキシぺプチダーゼＢ２（血漿、カルボキシぺプチダーゼＵ）；殺菌性／浸透性増加プロテイン様２；線維芽細胞成長���子５；分泌ホスホプロテイン１（オステオポンチン、骨slaloタンパク質１、早期Ｔ−リンパ球活性化１）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ３；肝癌における欠失１；内皮細胞特異的分子１；フォン・ヴィレブランド因子；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシンタイプ）、５（アグリカナーゼ−２）；Ｓｅｍａドメイン、イムノグロブリンドメイン（Ｉｇ）、短い基本ドメイン、分泌、（セマフォリン）３Ａ；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；スタセリン；細胞外シグナル制御キナーゼ８；メタロプロテイナーゼ３の組織インヒビター（ソースビー眼底変性症、偽炎症性）；血小板因子４（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド４）；界面活性剤、肺関連プロテインＤ；補体因子Ｈ；デルタ様１ホモログ（ショウジョウバエ）；ＷＡＰ４−ジスルフィドコアドメイン１；インスリン様成長因子結合タンパク質、酸不安定性サブユニット；乳癌２、早期発症；Ｐｒｅ−Ｂ−リンパ球遺伝子１；コルチコトロピン放出ホルモン；仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ４３４Ｂ０４４；プロラクチン誘起タンパク質；ＲＡＳグアニル放出タンパク質４；プロガストリクシン（ペプシノーゲンＣ）；Ｓｅｍａドメイン、イムノグロブリンドメイン（Ｉｇ）、短い基本ドメイン、分泌、（セマフォリン）３Ｆ；結腸直腸癌遺伝子における上方調節１；プロテオグリカン４；コリン作動性受容体、ニコチン性、δポリぺプチド；軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質；ＡＢＯ血液型（転移酵素Ａ、α１−３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素；転移酵素Ｂ、α１−３−ガラクトシル転移酵素）；インターロイキン１２Ａ（ナチュラルキラー細胞刺激因子１、細胞毒性リンパ球成熟因子１、ｐ３５）；線維芽細胞成長因子７（ケラチノサイト成長因子）；ＩＲＲＥ様３のＫｉｎ（ショウジョウバエ）；コリン作動性受容体、ニコチン性、αポリぺプチド２（ニューロン性）；口蓋、肺および鼻の上皮性悪性腫瘍関連；コラーゲン、タイプＸＶ、α１；Plelotrophin（ヘパリン結合成長因子８、神経突起成長促進因子１）；アンギオポエチン様２；ノリー病（偽網膜膠腫）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド３；キチナーゼ３様１（軟骨糖タンパク質−３９）；インター−α（グロブリン）インヒビターＨ３；アメロゲニン（エナメル質形成不全症１、Ｘ−関連）；表皮成長因子（β−ウロガストロン）；線維芽細胞成長因子１３；無翅タイプＭＭＴＶ組込部位ファミリー、メンバー７Ｂ；コリン作動性受容体、ニコチン性、αポリぺプチド；妊娠特異的β−１−糖タンパク質６；マトリックスメタロプロテイナーゼ１４（膜挿入）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２６；インターフェロン、α６；タキキニン、前駆体１（物質Ｋ、物質Ｐ、ニューロキニン１、ニューロキニン２、ニューロキニンＬ、ニューロキニンα、ニューロぺプチドＫ、ニューロぺプチドガンマ）；分泌型Frizzled関連タンパク質５；ヒアルロナンおよびプロテオグリカン関連タンパク質４；補体成分４Ｂ；マトリックスメタロプロテイナーゼ１６（膜挿入）；線維芽細胞成長因子７（ケラチノサイト成長因子）；アポリポプロテインＣ−ＩＩ；クロライドイオン��ャネル、カルシウム活性化、ファミリーメンバー３；テトラネクチン（Tetranectin）（プラスミノーゲン結合タンパク質）；コラーゲン、タイプＩＩＩ、α１（エーラス・ダンロス症候群タイプＩＶ、常染色体優性）；ＫＩＡＡ０５５６タンパク質；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４；ヘモペキシン（Hemopexin）インター−α（グロブリン）インヒビターＨ１；レラキシン１；マトリックスＧｌａタンパク質；トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（リプロリシンタイプ）、２；インターフェロン（α、βおよびω）受容体２；酸性ホスファターゼ、前立腺；グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、ガンマ８；マトリックスメタロプロテイナーゼ２３Ｂ；メプリンＡ、α（ＰＡＢＡぺプチドヒドロラーゼ）；ヒアルロノグルコサミニダーゼ１；アンジオテンシノーゲン（セリン（またはシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレードＡ（α−１アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー８）；軟骨中間層タンパク質、ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ；Purinergic受容体Ｐ２Ｘ、リガンド開口型イオンチャネル、７；グリピカン３；Tectoninβ；インターフェロン、α５；リポカリン７；血小板因子４バリアント１；Nucleobindin１；コラーゲン、タイプＸＩ、α１；胃抑制（Gastric Inhibitory）ポリペプチド；トロンボスポンジン反復含有１；５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体３ファミリーメンバーＤ；コラーゲン、タイプＸＸＶ、α１；成長分化因子（Growth differentiation factor）９；仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ４３４Ｂ０４４；エンドセリン３；ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド２；プロキネチシン（Prokineticin）２；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１１ｂ（osteoprotegerin）；メタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター；ジストニン；クロモグラニンＢ（セクレトグラニン１）；ヒアルロナンおよびプロテオグリカン結合タンパク質２；ロイシンリッチ反復ニューロン３；ルミカン；マトリリン１、軟骨マトリックスプロテイン；ホスホリパーゼＡ２、グループＩＩＡ（血小板、滑液）；カルボキシルエステラーゼ１（単球／マクロファージセリンエステラーゼ１）；
Ｓｐａｒｃ／オステオネクチン、ｃｗｃｖおよびｋａｚａｌ様ドメインプロテオグリカン（testican）；Dickkopfホモログ２（アフリカツメガエル）；ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ａ受容体、α３；妊娠特異的β１−糖タンパク質１１；インスリン様成長因子結合タンパク質１；ディフェンシン、β１０６；インターロイキン１７Ｆ；リガンド開口型イオンチャネルサブユニット；ホスホリパーゼＡ２受容体１、１８０ｋＤａ；Ｉ因子（補体）；ジストニン；ＬＡＧ１長寿保証（longevity assurance）ホモログ１（S. cerevisiae）；プロラクチン；Testis発現配列２６４；Ｓｅｍａドメイン、イムノグロブリンドメイン（Ｉｇ）、短い基本ドメイン、分泌、（セマフォリン）３Ｄ；分泌型Frizzled関連タンパク質２；分泌型Frizzled関連タンパク質４）。
【００７５】
ＵＣＥＣにおいてのみ存在する遺伝子のグループが存在する。これらの遺伝子は以下に関連する：恒常性（アルブミン；カルシウム−検出受容体；アクアポリン９；ラクトトランスフェリン。形態形成：ホメオボックスＨＢ９；上皮Ｖ様抗原１）。胚発生（レラキシン２；癌胎児性抗原関連細胞接着分子８；インドールアミン−ピロール２，３−ジオキシゲナーゼ；ＥＰＨ受容体Ａ３；甲状腺刺激胚性因子；妊娠特異的β１−糖タンパク質１；ラミニン、α３）、細胞外空間（界面活性剤、肺関連タンパク質Ａ１；妊娠特異的β１−糖タンパク質１；ラクトトランスフェリン；ＴＧＦ−α；アルブミン；ＦＧＦ−２３；Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ９（calgranulin Ｂ））、細胞外マトリックス（ラミニン、β４；ラミニン、α３；透明帯糖タンパク質４．構造分子活性；クロモソーム２１オープンリーディングフレーム２９；ラミニン、α３；微小管関連タンパク質２；ラミニン、β４；ケラチン６Ｂ；ラジニン（Ladinin）１；ケラチン６Ａ；オクルディン（Occludin）；ロリクリン（Loricrin）；赤血球膜タンパク質バンド４．１（楕円赤血球症１、ＲＨ結合）；クリスタリン（Crystallin）、βＡ２；眼レンズ構造タンパク質；コンタクチン（Contactin）関連タンパク質様４；クローディン（Claudin）１９；仮想タンパク質ＬＯＣ１４４５０１；ケラチン６Ｅ；ケラチン６Ｌ；レンズ内因性膜タンパク質２、１９ｋＤａ）、細胞骨格（微小管関連タンパク質２；赤血球膜タンパク質バンド４．１様５；ホモサピエンストリコヒアリン（trichohyalin）（ＴＨＨ）；ケラチン６Ｂ；ケラチン６Ａ；上皮Ｖ様抗原１；Ｈｏｏｋホモログ１（ショウジョウバエ）；ロリクリン；赤血球膜タンパク質バンド４．１（楕円赤血球症１、ＲＨ結合）；トロポモジュリン１；ＭＡＰ／微小管親和性制御キナーゼ；ケラチン６Ｅ；アクチン結合ＬＩＭタンパク質ファミリー、メンバー２）、細胞接着分子（カドヘリン１９、タイプ２；脊髄／リンパ球または混合系統白血病；クロモソーム２１オープンリーディングフレーム２９；ＩＲＲＥ様２のＫｉｎ；ラミニン、α３；シアロアドヘシン（Sialoadhesin；ＣＤ８４抗原（白血球抗原）；レクチン、ガラクトシド結合、可溶性、２（ガレクチン２）；上皮Ｖ様抗原１；ＣＤ９６抗原；尿細管間質性腎炎抗原；癌胎児性抗原関連細胞接着分子８；ＩＬ−１８；イムノグロブリンスーパーファミリー。メンバー１；インテグリン、β８；オルニチンアルバモイル転移酵素（arbamoyltransferase）；インテグリン、β６；コンタクチン関連タンパク質様４；コラーゲン、タイプＸＶＩＩ、α１；カドヘリン様２６；ムチンおよびカドヘリン様）、細胞分化（Cell Differentiation）タンパク質（プロテインチロシンホスファターゼ、受容体タイプ、Ｚ  ポリペプチド１；ラミニン、α３；ＣＤ８４抗原（白血球抗原）；ＥＤＲＦ２；ホモサピエンス赤血球分化関連因子２；腫瘍タンパク質ｐ７３様；ＮＢ４アポトーシス／分化関連タンパク質；ホモサピエンスＰＮＡＳ−１３３；２不存在において７に類似；インターロイキン２４；ケラチン６Ｂ；ケラチン６Ａ；デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＳＤＲファミリー）メンバー９；ギャップ接合タンパク質、β５（コネキシン３１．１）；イロコイホメオボックスタンパク質４；前腹部ホメオボックス２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１０；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１７；カルシウムイオンチャネル、電位依存性、β２サブユニット；パーキンソン病（常染色体劣性、未成年者）２、パーキン；カリクレイン７（キモトリプシンの、角質層）；グリア細胞欠損ホモログ２；ＡＰ−２α；プロテインチロシンホスファターゼ、受容体タイプ、Ｚポリペプチド１；トロポニンＴ１；Sciellin；グルコサミニル（Ｎ−アセチル）転移酵素２、Ｉ−分枝酵素；コラーゲン、タイプＸＶＩＩ、α１；サイトカインシグナル伝達抑制遺伝子２；Distal-lessホメオボックス１；ザイゴート停止（Zygote arrest）１；インターロイキン２０；成長分化因子３；ＦＧＦ−２３；無翅タイプＭＭＴＶ組込部位ファミリー、メンバー８Ａ。細胞外；クロモソーム２１オープンリーディングフレーム２９；ラミニン、α３；ラミニン、β４；インターロイキン２４；妊娠特異的β−１−糖タンパク質１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１１；界面活性剤、肺関連タンパク質Ａ１；Prepronoclceptin；５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体３Ｂ；癌胎児性抗原関連細胞接着分子８；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１０；ＩＬ−１８（インターフェロン−ガンマ−誘導因子）；ラクトトランスフェリン；アルブミン；Ｆａｓリガンド（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー６）；コリン作動性受容体、ニコチン性、βポリペプチド４；Cathelicidin抗菌性ペプチド；気道トリプシン様プロテアーゼ；Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ９（calgranulin Ｂ）；ＴＧＦ−α；カリクレイン１０；セリンプロテアーゼインヒビター、Kunitzタイプ１；ＷＮＴ１誘導性シグナル経路タンパク質３；レラキシン２；インターフェロン、カッパ；ディフェンシン、β１０３Ａ；ＩＬ−２０；透明帯糖タンパク質４；成長分化因子３；ＦＧＦ−２３；無翅タイプＭＭＴＶ組込部位ファミリー、メンバー８Ａ；補体因子Ｈ−関連５）、発生タンパク質（ＥＰＨ受容体Ａ３；ＮＩＭＡ（never in mitosis gene a：有糸分裂遺伝子ａではない）関連キナーゼ２；亜鉛フィンガータンパク質２８２；ＴＡＮＫ−結合キナーゼ１；ＭＲＥ１１減数分裂性組み換え１１ホモログＡ；Ｅ２Ｆ転写因子２；タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプ、Ｚポリペプチド；ホモサピエンスクローン１６１４５５クロモソームＸからの胸部発現ｍＲＮＡ；ラミニン、α３；ｖ−ｍｙｂ骨髄芽球ウイルス性腫瘍遺伝子ホモログ（鳥類）様１；Ｇ−タンパク質シグナル伝達の調節因子１１；微小管関連タンパク質２；膜貫通タンパク質１６Ａ；腺腫症結腸ポリポーシス２；ホメオボックスＨＢ９；セントロメアタンパク質Ｆ、３５０／４００ｋａ（mitosin）；ＣＤ８４抗原（白血球抗原）；ＥＤＲＦ２；ホモサピエンス赤血球分化関連因子２；腫瘍タンパク質ｐ７３様；ＮＢ４アポトーシス／分化−関連タンパク質；ホモサピエンスＰＮＡＳ−１３３；フォークヘッドボックスＰ２；ホモサピエンス胃関連分化発現タンパク質ＹＡ６１Ｐ（ＹＡ６１）；テネイシン（Tenascin）Ｎ；クロモソーム６オープンリーディングフレーム４９；亜鉛フィンガータンパク質４６２；亜鉛フィンガータンパク質７１（Ｃｏｓ２６）；ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボック��７；骨髄性細胞様４上に発現されたトリガー受容体；インターロイキン２４；妊娠特異的β−１−糖タンパク質１；コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン５（ニューログリカンＣ）；ケラチン６Ｂ；ケラチン６Ａ；デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＳＤＲファミリー）メンバー９；上皮Ｖ様抗原１；ギャップ接合タンパク質、β５（コネキシン３１．１）；Ｇタンパク質−結合受容体５１；インターフェロン制御因子６；ニューロトロピン５（ニューロトロピン４／５）；ＣＤ９６抗原；イロコイホメオボックスタンパク質４；インターロイキン１受容体様１；発現Ｇ−２およびＳ−相１；核受容体サブファミリー２、グループＥ、メンバー３；前腹部ホメオボックス２；亜鉛フィンガータンパク質２１５；クロモソーム４のＤＮＡ断片（固有）２３４発現配列；癌胎児性抗原関連細胞接着分子８；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１０；ＩＬ−１８；インドールアミン−ピロール２，３ジオキシゲナーゼ；アルブミン；カルシウム−検出受容体（カルシウム尿性高カルシウム血症１、重度新生児副甲状腺機能亢進症）；Ｆａｓリガンド（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー６）；ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー１７；カルシウムイオンチャネル、電位依存性、β２サブユニット；パーキンソン病（常染色体劣性、未成年者）２、パーキン；カリクレイン７（キモトリプシンの、角質層）；グリア細胞欠損ホモログ２；ＴＧＦ−α；甲状腺刺激胚性因子；ＡＰ−２α（活性化エンハンサー結合タンパク質２α）；カリクレイン１０；Ｇ−タンパク質シグナル伝達の調節因子７；プロテインチロシンホスファターゼ、受容体タイプ、Ｚポリペプチド１；セリンプロテアーゼインヒビター、Kunitzタイプ１；ＷＮＴ１誘導性シグナル経路タンパク質３；亜鉛ファミリーメンバー３内臓錯位（heterotaxy）１（odd-pairedホモログ、ショウジョウバエ）；ＴＴＫプロテインキナーゼ；トロポニンＴ１、骨格、遅い；Sciellin；ＴＧＦＢ−誘導因子２様、Ｘ−関連；カリクレイン８（ニューロプシン（neuropsin）／ovasin）；グルコサミニル（Ｎ−アセチル）転移酵素２、Ｉ−分枝酵素；アンキリン反復領域３０Ａ；レラキシン２；コラーゲン、タイプＸＶＩＩ、α１；前立腺において分化発現された遺伝子；ホスファターゼおよびアクチン調節因子３；サイトカインシグナル伝達の抑制遺伝子２；核受容体サブファミリー４、グループＡ、メンバー３；アンジオテンシンＩ転換酵素（ペプチジル−ジペプチダーゼＡ）１；仮想タンパク質ＭＧＣ１７９８６；Distal-lessホメオボックス１；ＬＡＧ１長寿保証ホモログ３（S. cerevisiae）；ザイゴート停止１；インターフェロン、カッパ；ＩＬ−２０；ＩＣＥＢＥＲＧ  カスパーゼ−１インヒビター；成長分化因子３；ＦＧＦ−２３；Testis発現配列１５；無翅タイプＭＭＴＶ組込部位ファミリー、メンバー８Ａ；ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス７；カルニチン欠損関連、心室１において発現された；プロキネチシン１；ＣＡＭＰ応答性要素結合タンパク質３様；カスパーゼ結合領域ファミリー、メンバー１５；ＦＬＪ２３３１１タンパク質）。
【００７６】
実施例６：臍帯上皮幹細胞（ＵＣＥＣ）の皮膚表皮ケラチノサイトへの直接分化
皮膚表皮ケラチノサイトへ直接分化するため、臍帯上皮幹細胞、ＵＣＥＣ細胞をケラチノサイト培養用の標準的な手順に従って培養した。細胞の単離方法は上記の方法に従った。次いでＵＣＥＣを無血清ケラチノサイト成長培地、ＫＧＭ、ＫＧＭ−２（Cambrex）、EpiLife（Cascade Biologics）において、または放射線照射もしくはマイトマイシン−Ｃ処理３Ｔ３マウス胚性給餌（embryonic feeder）層において３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＵＣＥＣ細胞形態はヒトの表皮ケラチノサイトに類似して分化した。上皮細胞は光学顕微鏡下で類似した形態を有し、従来のおよび商業的に入手可能な培地を用いて容易に線維芽細胞に変えることが可能である（図２参照）。
【００７７】
免疫蛍光分析は、培養したＵＣＥＣがケラチン、デスモソーム、ヘミデスモソーム、基底膜成分等の表皮ケラチノサイト分子マーカーをも発現することを示す（ＵＣＥＣがこれらの種々の上皮細胞マーカーを発現することにより、一般に上皮細胞としての資質を有することを示す図１０参照）。したがって、これらの結果は本発明の臍帯上皮前駆／幹細胞が、創傷治癒に用いることができ、かつ皮膚同等物の開発に大きな可能性を有する表皮ケラチノサイト等の皮膚細胞に分化し得ることを示す。
【００７８】
実施例７：臍帯内膜組織の反復組織移植を用いる臍帯上皮および間葉幹細胞の増殖
本発明の臍帯上皮および間葉幹細胞は、以下のように臍帯羊膜組織の反復組織移植を用いて増殖した。すなわち、方法の１日目において、組織移植片を組織培養皿上の成長培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ、EpiLife、ＫＧＭ、ＫＧＭ−２またはＭ１７１）に３７℃、５％ＣＯ２にプレーティングした；培地は２日または３日毎に交換した。細胞増殖を開始し、移植から７日間移行を継続した。その後、組織移植片を他の皿に移し、細胞増殖させた。この過程を移植片がさらなる外植（explantation）を妨げるサイズに縮小するまで続けた。このことに関連し、移植片からの細胞増殖および遊走過程の間、細胞は組織を消化し、分解するプロテアーゼを産生することから、移植片がさらなる組織移植が困難になる程度に小さくなるまで次第にサイズを縮小することは注目される。図１６は、このプロトコールを用いて達成される臍帯上皮および間葉幹細胞の迅速かつ力強い増殖過程を概略的に示す。このように、この研究はこのソースからＵＣＭＣおよびＵＭＥＭ細胞が高収率で得られ、さらに、骨髄または脂肪由来幹細胞等の他のソースの細胞と比較してこれらの細胞の生存能力および持続的な成長特性が反映することを示す。さらに、固体組織であること、ここで用いた反復移植技術は、本発明の細胞を組織のある部分のみからでなく完全な組織から均一に抽出できることを示す。このことは、細胞の変性を原因として、多くの発生により細胞を継代する代わりに、少ない継代で最大限の細胞数を誘導することを可能にする。
【００７９】
実施例８：臍帯間葉細胞（ＵＣＭＣ）の皮膚表皮線維芽細胞への直接分化
皮膚表皮線維芽細胞へ直接分化するため、臍帯間葉細胞、ＵＣＭＣ細胞を線維芽細胞培養用の標準的な手順に従って培養した。細胞の単離方法は上記実施例６に記載の方法に従った。次いでＵＣＭＣをＤＭＥＭまたは商業的に入手可能な線維芽細胞成長培地（ＦＧＭ）において培養した。ＵＣＭＣの細胞形態はヒトの表皮線維芽細胞に類似して分化した。間葉細胞は光学顕微鏡下で類似した形態を有し、従来のおよび商業的に入手可能な培地を用いて容易に線維芽細胞に変えることが可能である（図３参照）。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】組織培養の２日目（図１Ａ）および５日目（図１Ｂ、Ｃ）での直接組織移植の方法による臍帯羊膜からの上皮細胞の増殖を示す（４０×倍率）図である。細胞培養樹脂表面は、該表面に羊膜を載置する前にコラーゲン１／コラーゲン４混合物（１：２；Becton Dickinson）により被覆した。羊膜検体は５ｍｌのEpiLife培地または培地１７１（共にCascade Biologics製）中に浸漬した。培地を２日または３日毎に交換し、移植による細胞の成長を光学顕微鏡の下で観察した。マイクロ写真を上記のように異なる時間間隔で撮影した。観察された多面細胞形態は上皮細胞の典型である。
【図２】２日目（図Ａ、Ｃ）および５日目（図Ｂ、Ｄ）での同様の上皮（４０×倍率）細胞を産生する臍帯部分の酵素消化を示す図である。臍帯羊膜を０．５ｃｍ×０．５ｃｍの小さな断片に分け、０．１％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプ１溶液（Roche Diagnostics）中、３７℃で８時間消化した。サンプルを３０分毎に３分間ボルテックスした。細胞を４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより収穫した。細胞のペレットを５０μｇ／ｍｌのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、５０μｇ／ｍｌの血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、５μｇ／ｍｌの形質転換成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）および５μｇ／ｍｌのインスリン（すべてR&D Systemsから入手した）を補助したEpiLife培地または培地１７１（共にCascade Biologics製）中に再分散させ、コラーゲン１／コラーゲン４混合物（１：２；Becton Dickinson）により１×１０６個の細胞／皿の密度で予め被覆した１０ｃｍの組織培養皿上で計数し、播種した。２４時間後、加温したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により付着した細胞を洗浄し、培養培地をEpiLife培地または培地１７１（共にCascade Biologics製）により置き換えた。培地を２日または３日毎に交換し、細胞の成長を光学顕微鏡下で観察した。マイクロ写真を上記のように異なる時間間隔で撮影した。同様に細胞は典型的な上皮細胞の多面細胞形態を示した。
【図３】臍帯羊膜から移植された増殖している間葉細胞を示す図である。細胞の成長は、培養培地として１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）により補助されたＤＭＥＭを用いる組織培養皿中に載置した後早くも４８時間で観察された（４０×倍率）（図３Ａ、Ｃ）。移植片を１０％のウシ胎仔血清（Hyclone）により補助された５ｍｌのＤＭＥＭ（Invitrogen）（ＤＭＥＭ１０％  ＦＢＳ）中に浸漬した。培地を２日または３日毎に交換した。細胞増殖は光学顕微鏡下で観察した。マイクロ写真を異なる時間間隔で撮影した。細胞は紡錘形態の特徴を有し、線維芽細胞に密接に類似し、インビトロにおいて容易にかつ迅速に移動し、および増殖した（図３Ｂ、Ｄ）。
【図４】（４０×倍率）コラゲナーゼの酵素消化により単離された臍帯羊膜からの間葉細胞を示す図である。図４は２日目に臍帯羊膜から単離された間葉細胞を示す。細胞の増殖は５日目に観察された（図４Ｂ）。臍帯羊膜を０．５ｃｍ×０．５ｃｍの小さな断片に分け、０．１％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプ１溶液（Roche Diagnostics）中、３７℃で６時間消化した。サンプルを１５分毎に２分間ボルテックスした。細胞を４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより収穫した。細胞のペレットをＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中に再分散させ、１×１０８個／皿の細胞密度で１０ｃｍの組織培養皿上で計数し、播種した。培地を２日または３日毎に交換した。細胞の成長は光学顕微鏡下で観察した。マイクロ写真を異なる時間間隔で撮影した。同様に、細胞は線維芽細胞として間葉細胞の典型である紡錘形の形態を示した。
【図５】（４０×倍率）無血清培養条件（ＤＭＥＭ）および血清培養条件（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）での本発明の方法により単離された臍帯羊膜間葉細胞（ＵＣＭＣ、図５Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、正常な皮膚線維芽細胞（ＮＦ１０９細胞、図５Ａ、Ｂ）および脂肪由来の間葉細胞（ＡＤＭＣ、図５Ｃ、Ｄ）の形態を示す図である。図５は、より密度の高い細胞質を伴う血清リッチ状態（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）と比較してフラッター細胞（flatter cell）および密度のより低い細胞質により反映された血清飢餓状態（ＤＭＥＭのみ）において細胞が培養されたＮＦおよびＡＤＭＣの細胞形態の変化を示す（図５Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。無血清培地対血清のリッチな培地（図５Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）の同じ条件下で培養された両方のＵＣＭＣグループにおいて形態上の変化は観察されず、これらの後者の間葉細胞の性質および生理学上の違いを示した。
【図６】（４０×倍率）３Ｔ３支持細胞層を用いずに３日目および７日目においてＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で培養され、本発明に従って単離されたＵＣＭＣを示す図である。細胞は良好に成長し、放射状に拡大する代わりにコロニーを形成（垂直方向の成長）しているのが分かる。同様に、このことはそれらのより分化した対照と比較したこれらの間葉細胞の性質上の違いを示す。
【図７】（４０×倍率）３日目および７日目において３Ｔ３支持細胞層上で培養された臍帯上皮細胞（ＵＣＥＣ）のコロニー形成を示す図である。この外観は、ケラチノサイト幹細胞から誘導された正常な皮膚の外観と類似している。後者において、３Ｔ３支持細胞層は細胞が幹細胞であることを維持している。
【図８】（４０×倍率）３日目および７日目において３Ｔ３支持細胞層上で培養され、本発明に従って単離された臍帯間葉細胞（ＵＣＭＣ）の明らかなコロニーの形成を示す図である。３Ｔ３支持細胞層は、ヒト真皮線維芽細胞としての分化した間葉細胞の成長を抑制する。同様に、これはそれらのより分化した対照と比較したこれらの間葉細胞の性質上の違いを示す。
【図９】ウェスタンブロット解析を示す図であり、それにより、骨髄間葉細胞（ＢＭＳＣ）および脂肪由来間葉細胞（ＡＤＭＣ）において、ＵＣＥＣおよびＵＣＭＣにおけるいくつかの胚性幹細胞マーカーの発現とヒト真皮線維芽細胞（ＮＦ）におけるこれらのマーカーの発現とを比較した。図９は、臍帯間葉細胞および上皮幹細胞の培養上清において、骨髄細胞、脂肪由来幹細胞、ヒト真皮線維芽細および上皮ケラチノサイトと比較し、ＥＬＩＳＡ分析により検出されたアクチビンＡおよびホリスタチンの高い分泌を示す。
【図１０】（４０×倍率）サイトケラチン（ＣＫ）−ゼネラル、ＣＫ−１７、ＣＫ−６、ＣＫ−１０、ＣＫ−１９、ＣＫ−１８、ＣＫ−１６、ＣＫ−１５等の臍帯上皮幹細胞において発現された上皮細胞マーカー（図１０−１）；ヘミデスモソーム成分−インテグリンα６、インテグリンβ４；デスモソーム成分（図１０−２）；基底膜成分−ラミニン１、ラミニン５、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩ（図１０−３）およびインテグリン−β１、フィブロネクチン等の他の重要な細胞外マトリックス成分（図１０−４）の間接蛍光分析の結果を示す図である。
【図１１】ヒト骨髄間葉幹細胞と比較した、臍帯間葉幹細胞（ＵＣＭＣ）による分泌されたサイトカインおよび成長因子のサイトカインアレイ分析を示す図である。
【図１２】ヒト上皮ケラチノサイトと比較した、臍帯上皮幹細胞（ＵＣＥＣ）により分泌されたサイトカインおよび成長因子のサイトカインアレイ分析を示す図である。
【図１３】１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（図１３−１）、無血清培地ＰＴＴ−１（図１３−２）、無血清培地ＰＴＴ−２（図１３−３、図１３−４）、無血清培地ＰＴＴ−３（図１３−５）により補助され、ＤＭＥＭ中で培養されたＵＣＭＣ細胞を示す。図１３はまた無血清培地ＰＴＴ−３における脂肪由来間質細胞（図１３−６）および骨髄由来間質細胞（図１３−７）の成長を示す図である。
【図１４】ＤＮＡマイクロアレイにより分析された、臍帯上皮幹細胞および臍帯間葉幹細胞における包括的遺伝子発現を示す図である。ＵＣＥＣは２８０５５個の遺伝子の全体を発現し、ＵＣＭＣは３４４０７個の遺伝子の全体を発現した。両者の細胞型において、２７３０８個の重複遺伝子の発現がある。発現された７４７個の遺伝子はＵＣＥＣに固有であり、発現された７０９９個の遺伝子はＵＣＭＣに固有であった。関心のある選択された遺伝子をこの図に示す。両方の幹細胞型は、胚性幹細胞および胚発生に関する１４０個の遺伝子を発現した。
【図１５】臍帯内膜組織の反復移植を用いる臍帯上皮幹細胞および臍帯間葉幹細胞の増殖を説明する概略図である。
【図１６】臍帯羊膜の内膜（ＬＭ）、ワルトン膠様質（ＷＪ）、ならびにこのゼリー内に支持される２本の臍帯動脈（ＵＡ）および１本の臍帯静脈（ＵＶ）を表す臍帯の断面を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【図９−１０】
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【図９−１１】
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【図９−１２】
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【図９−１３】
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【図９−１４】
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【図９−１５】
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【図９−１６】
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【図９−１７】
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【図９−１８】
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【図９−１９】
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【図９−２０】
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【図９−２１】
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【図９−２２】
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【図９−２３】
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【図９−２４】
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【図９−２５】
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【図９−２６】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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