(57)【要約】様々な化学物質のイオン移行チャネルでの効果を研究するため、大量処理パッチクランプ測定システムおよびその方法を提供する。一つ以上のパッチクランプ構成が確立され、それぞれ、ピペットに密着した細胞を含む。ピペットは、ピペット固定具に取り付けられる。ピペット固定具および一つ以上のウェルからなるプレートを、各細胞がウェルの内部にあるよう、相対的に移動する。細胞の電気特性を測定する。
2008500516.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大量処理パッチクランプ測定を実施するための方法であって、
一つ以上の細胞および一つ以上のピペットを含む一つ以上のパッチクランプ構成を確立するステップであって、各パッチクランプ構成は前記ピペットに密着している細胞を含むステップと、
前記一つ以上のピペットをピペット固定具に取り付けるステップと、
前記ピペット固定具および一つ以上の第一のウェルを含むプレートを、前記一つ以上の細胞が前記一つ以上の第一のウェルの内部にあるよう、相対的に移動するステップと、
前記一つ以上の細胞の少なくとも一つの電気特性を測定するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
確立する動作はインサイドアウトパッチクランプ構成を確立するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定する動作は、基準電極が一つ以上のウェルの一つに含まれる試液に電気的に接触するようになっていて、パッチ電極が一つ以上のピペットの一つに含まれるピペット液に電気的に接触するようになっている、前記基準電極および前記パッチ電極の間の電流を測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記一つ以上のピペットのそれぞれが電極を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
一つ以上のピペットをピペットホルダに配置するステップをさらに含み、前記ピペットホルダは可動プラットフォームに連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
取り付け動作が、
前記プラットフォームを前記ピペット固定具に相対的に移動するステップと、
前記一つ以上のピペットを前記ピペット固定具に取り付けるステップと、
前記一つ以上のピペットを前記ピペットホルダからはずすステップと、
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記可動プラットフォームが前記プレートを保持する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記可動プラットフォームが実質的に円錐形または管状である液体洗浄システムを持つように構成される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記一つ以上の細胞の少なくとも一つが前記液体洗浄システムの内部にあるよう、前記ピペット固定具および前記液体洗浄システムを相対的に移動するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記一つ以上の細胞の少なくとも一つを洗浄するために液体を前記液体洗浄システムへ送り込むステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記一つ以上のウェルの少なくとも一つが試験物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記一つ以上のウェルの少なくとも一つが洗浄液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ピペット固定具およびプレートを相対的に移動させることによって、前記一つ以上の細胞を前記一つ以上の第一のウェルから除去するステップと、
前記ピペット固定具および前記プレートを相対的に移動させることによって、前記一つ以上の細胞を一つ以上の第二のウェルへ挿入するステップと、
をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記一つ以上の第二のウェルが前記一つ以上の試験物質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記一つ以上の第二のウェルが前記一つ以上の洗浄液を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記一つ以上の第一のウェルが前記一つ以上の試験物質を含み、前記第二のウェルが、一つ以上の異なる試験物質あるいは異なる濃度の同試験物質のうち少なくとも一つを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ピペット固定具および前記プレートを相対的に移動させることによって、前記一つ以上の細胞を前記一つ以上の第二のウェルから除去するステップと、
前記ピペット固定具および前記プレートを相対的に移動させることによって、前記一つ以上の細胞を一つ以上の第三のウェルへ挿入するステップと、
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記一つ以上の第二のウェルが前記一つ以上の第三のウェルと異なる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プラットフォームおよび前記ピペット固定具を相対的に移動させることによって前記一つ以上の細胞を前記一つ以上の第一のウェルから除去するステップと、
前記ピペット固定具および前記液体洗浄システムを相対的に移動させることによって、前記一つ以上の細胞を前記液体洗浄システムへ挿入するステップと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
確立する動作が前記一つ以上の各細胞と前記一つ以上の各ピペット間の高抵抗電気シールを確立するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記高抵抗電気シールが少なくとも一つの細胞と少なくとも一つのピペットの間に形成されているかどうかを判断するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記一つ以上の各細胞を外気へ曝すステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
測定する動作に基づいた電気計測データを処理するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記確立する動作が、前記一つ以上のピペットの内部に空気圧をかけて、前記一つ以上の細胞を前記ピペット内部の位置から前記ピペットの開口へ移動させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
パッチクランプ測定システムを自動化するコンピュータプログラムコードでコード化されたコンピュータ可読の媒体であり、前記プログラムコードは、一つ以上の細胞を一つ以上のピペットの一つ以上の先端に装着し、
前記一つ以上のピペットを前記ピペット固定具に取り付け、
前記一つ以上の各細胞がそれぞれ一つ以上の各第一のウェルの内部にあるよう、前記ピペット固定具および一つ以上のウェルを含むプレートを相対的に移動させ、
一つ以上の各細胞の少なくとも一つの電気特性を測定する、
ために効果的である、コンピュータ可読の媒体。
【請求項２６】
膜の特性を測定する装置であって、
一つ以上のピペットに連結されるピペット固定具であって、各ピペットは、各ピペットの先端にパッチクランプ構成における膜を有する高電気抵抗シールを備えるようになっているピペット固定具と、
一つ以上のマルチウェルプレートを含む電動式プラットフォームと、
一つ以上の各ピペット先端が前記一つ以上のウェルの内部にあるよう、前記電動式プラットフォームおよび前記ピペット固定具を相対的に移動するように構成されたモーター制御器と、
を含む装置。
【請求項２７】
前記一つ以上の各ウェルが試験物質を含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
各膜の電気特性を測定するように構成された測定装置をさらに含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項２９】
パッチクランプ測定をするための装置と、先端試料台、主増幅器、および電極を含む装置をさらに含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項３０】
前記モーター制御器は、電動式プラットフォームをＸ、ＹおよびＺの方向へ移動することができる、請求項２６に記載の装置。
【請求項３１】
前記測定装置で得られた測定値を処理するためのデータ取得システムをさらに含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項３２】
前記モーター制御器を制御するためのモーター制御システムをさらに含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項３３】
前記モーター制御器を制御し、前記測定装置で得られた測定値を処理するためのデータ取得および制御システムをさらに含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項３４】
前記一つ以上のウェルの少なくとも一つが洗浄溶液を含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項３５】
洗浄溶液を前記ピペット先端へ流し、それによって前記膜を洗浄するように構成された洗浄装置をさらに含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項３６】
洗浄溶液を細胞へ流すように構成された洗浄装置であって、
ほぼ円錐形の洗浄容器であって、前記洗浄容器および一つ以上のピペットは、ピペットの一部および前記細胞が洗浄容器の内部に収まるよう相対的に移動可能な、ほぼ円錐形の洗浄容器と、
洗浄溶液が前記細胞を洗浄するように前記洗浄容器を流れるよう、前記洗浄溶液を前記洗浄容器へ送り込むように構成されたポンプと、
を含む洗浄装置をさらに含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項３７】
ポンプは、液体がらせん状に下方へ前記洗浄装置を通過するよう、液体を前記洗浄装置へ送り込むように構成された、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記ポンプは、洗浄溶液が時計回りまたは反時計回りに円を描くように前記洗浄容器を通過するよう、前記洗浄溶液を送り込むように構成された、請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
前記膜は細胞の膜であって、各ピペットはピペット先端を有し、細胞の一部が一つ以上のピペットの外部に曝されるよう、ピペット内部の細胞をそのピペットの内部から前記ピペットの先端へと移動するように構成された空気圧制御システムをさらに含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項４０】
各ピペットは、一つ以上のピペットの内部にある各細胞を前記ピペットの先端、そしてインサイドアウトパッチクランプ構成へと移動させるように構成された空気圧制御システムをさらに含み、前記ピペット先端を含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項４１】
前記試験物質は薬剤を含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項４２】
前記薬剤は、小分子、ペプチド、毒素、および抗体のうち少なくとも一つを含む、請求項４１に記載の装置。
【請求項４３】
前記膜はヒト細胞膜である、請求項２６に記載の装置。
【請求項４４】
前記ピペット固定具、電動式プラットフォームおよびモーターが入っている、ファラデー箱をさらに含む、請求項２６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体膜研究に使用するパッチクランプ法を実施するための多重チャネルシステムに関する。さらに特定すると、本発明は、大量処理および低容量要件をもつパッチクランプシステムに関する。より広い意味では、本発明は、薬物および他の化学物質の電気生理学的効果の試験について言及する。また、本発明は大量処理化学スクリーニングのための装置およびその装置の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
多くの細胞過程は、キャリアタンパク質およびイオンチャネルの活動による細胞膜電位の変化により制御される。キャリアタンパク質は、特定の溶質と結合し、生体細胞膜の一方の面そして反対側の面に溶質結合部位を連続的にさらす立体構造の変化により、それらを生体細胞膜の脂質二重層を介して移動させる。
【０００３】
キャリアタンパク質と異なり、イオンチャネルタンパク質は、イオンおよび他の分子を一つの面から反対側の面に通過させる生体膜に細孔を形成する膜貫通タンパク質である。イオンチャネルには様々な種類がある。例えば、「漏出チャネル」、「電位依存型チャネル」、「リガンド依存性チャネル」、およびＧタンパク質のようなタンパク質との相互作用により調節されるチャネルがある。
【０００４】
イオンチャネルタンパク質は、主に特定のイオンの浸透を媒介する。例えば、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、クロライド（Ｃｌ−）、カルシウム（Ｃａ２＋）チャネルが確認されている。イオンチャネルは、細胞膜の反対側の電荷の相違である、細胞膜電位を引き起こす大きな原因である（Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓら、上記参照）。
【０００５】
多様なキャリアタンパク質およびイオンチャネルは、医薬品の新しい標的の豊富な一群を表す。多くの化学物質、化合物およびリガンドは、キャリアタンパク質および／またはイオンチャネル活動に影響することで知られる。
【０００６】
イオンチャネル活動は、パッチクランプ分析の技法を使用して測定することができる。マイクロピペットを使用して膜のパッチを電気的に隔離し、電位固定状態下でそのパッチのチャネルタンパク質を研究するという一般的な考えは、Ｎｅｈｅｒ、ＳａｋｍａｎｎおよびＳｔｅｉｎｂａｃｋにより、「Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｃｈ  Ｃｌａｍｐ，Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  Ｃｕｒｒｅｎｔｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｏｐｅｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｃｅ」（Ｐｆｕｌｕｅｇｅｒ  Ａｒｃｈ、３７５；２１９〜２７８、１９７８）で要約されている。
【０００７】
パッチクランプ技法は、生物学および医学で大きな進展を示す。例えば、本技法は、単一イオンチャネルタンパク質を介して流れるイオンの測定を可能にし、薬剤に反応する単一イオンチャネルの研究を可能にする。簡単に言えば、一般的なパッチクランプ技法において、細いガラスピペット（基本的に、先端の直径が約１μｍ）が細胞膜の表面に対して押し付けられる。ピペット先端は、細胞にしっかりと密着され、膜の極小のパッチのいくつかのイオンチャネルタンパク質を隔離する。これらのチャネルの活動を電気的に測定（単一チャネル記録）するか、または、膜のパッチを破断して、全細胞膜のチャネル活動を測定（全細胞記録）することができる。
【０００８】
単一チャネル記録および全細胞記録の双方の間、個々のチャネル亜型が、膜に「電位固定」を行うことにより、さらに分解される。フィードバックループの使用により、「電位固定」は、膜に電位勾配をかけ、全体的なチャネルの活動を制限および制御し、個々のチャネル亜型の分離を可能にする。
【０００９】
このような実験での時間分解および電位制御は目を見張るものがあり、しばしばミリ秒またはμ秒の範囲に至る。しかし、薬剤的なスクリーニングでの一般的な方法としてのパッチクランプ技法の主な障害は、１日に試験できる化合物の数が限られていることである。さらに、一般的な技法は、サンプル化合物の変化率の遅さ、およびパッチクランプピペットに必要とされる位置的な厳密性により、さらに制限される。
【００１０】
パッチクランプ技法の処理量を制限する主な要因は、溶解された試験化合物を細胞およびパッチへ送る、灌流システムの特質である。つまり、細胞は、溶液中で灌流され（すなわち水浴）、試験化合物は、細胞での効果を測定することができる溶液へ送られる。既存のパッチクランプの構成では、細胞は生理的食塩液で継続的に灌流される、大型の実験チャンバー（０．２〜２ｍｌウェル）に置かれる。化学薬品は、それを含む少数の溶液ボトルに接続された弁のチャンバー注入口を変えることにより適用される。この技法には、いくつかの欠点がある。まず、一回に接続されうる異なる化合物の数は、ボトルの数により制限される。二番目に、試験サンプルおよび支持液に必要な容量は、高価な化学物質を大量に必要とする。三番目に、細胞およびパッチの周りの溶質組成物を変える時間は依然長く、これが律速段階となる。よって、パッチクランプ記録法における処理量を増加する試みがいくつかあった。
【００１１】
Ｕキャピラリーおよび他のシステムのように、神経伝達物質調節されたチャネルを活性化する化合物の部分的適用のための複雑なシステムの改善は、有効適用時間を削減した。しかし、そのような急速適用システムにより交換された浴溶液の容量は、かなり大きい。そのような大容量の必要性は、試薬コストが高く、また数多くの様々な濃度の化学物質に対し数多くの試験を行うのに必要とされる時間が膨大となるため、医療産業におけるこれらの過程の使用を制限する。これらの先行技術のシステムは、従来のパッチクランプの実験で使用されるシステムと実質的に同一である、Ｕキャピラリーを満たす供給システムに柔軟性がないことと、その容量が低いことによって、さらに制限される。
【００１２】
Ｗｅａｖｅｒら（以下、「Ｗｅａｖｅｒ」）により、２００１年７月６日に出願された、米国特許第０９／９００，６２７号は、細胞の電気性質を測定できるシステムを開示した。Ｗｅａｖｅｒシステムは、細胞膜に固定するためにピペット先端を使用しない。むしろ、複数の多孔面の細孔が、複数の細胞膜に固定され密着される。多孔面の一面は外側電極に結合され、もう一面は測定電極に結合される。多孔面がマイクロチップである一実施例において、各細胞は、その外側および測定電極に結合され、細胞の特性測定を可能とさせた。試験溶液は、一つ以上の多孔面に適用されると、パッチクランプ記録により、結合された細胞が測定される。複数の多孔面がマルチウェルプレートで同時に試験されるために、システムは自動化され得る。
【００１３】
Ｎｏｒｗｏｏｄら（以下、「Ｎｏｒｗｏｏｄ」）により、２００１年３月２１日に出願された、米国特許出願第１０／２３９，０４６号（公開番号ＵＳ２００３／０１３９３３６Ａｌ）は、パッチクランプ構成を確立するための自動システムを提供する。Ｎｏｒｗｏｏｄシステムは、パッチピペットが、キャピラリーチューブの底から懸濁された液滴のような、懸濁液の液体空気界面に位置する細胞に固定することに限定される。チューブ内の圧力の増加（または減少）によって、液体‐空気界面である円形凸部は外側（または内部）にふくれる。Ｎｏｒｗｏｏｄシステムにおいて、細胞は、パッチ前はパッチピペットの外側にある。また、空気圧力システムは、細胞液体を保持し、懸濁する第二チューブに適用される。空気圧力はパッチピペット自体には適用されない。
【００１４】
Ｏｌｅｓｅｎら（集合的に、以下「Ｏｌｅｓｅｎ」）の米国特許第６，０６３，２６０号、６，１１７，２９１号および６，４７０，２２６号は、パッチピペット自動的に細胞浴から選択された細胞をパッチさせる、コンピュータ化されたモーター制御システムである、大量処理パッチクランプシステムを開示した。ピペット先端および細胞は、パッチクランプ測定のために、一つ以上の試験化学液および洗浄溶液を含む灌流チャンバーに固定されたままである。自動サンプラーは、代替的に多様な源から灌流チャンバーに液体を導く弁を制御する。よって、Ｏｌｅｓｅｎシステムにおいて、多数のチューブおよびポンプが、試験化学物質および洗浄浴槽をインターフェースチャンバーの内外へ送るために使用される。
【００１５】
Ｆａｒｂら（以下、「Ｆａｒｂ」）の米国特許第６，０４８，７２２号は、複数の試験および洗浄溶液でパッチされた細胞を灌流する、自動パッチクランプ灌流システムを開示した。試験および洗浄溶液は、複数の貯蔵槽から多重バレル多岐チューブを介して、パッチされた細胞を含む記録チャンバーに排出される。弁は、一定の時間で、どの溶液が細胞を灌流するかを制御する。Ｏｌｅｓｅｎシステムのように、Ｆａｒｂシステムは、試験化学物質および洗浄浴槽を記録チャンバー内外へ送るための多数のチューブおよびポンプを必要とする。
【００１６】
Ｗｅａｖｅｒ、Ｎｏｒｗｏｏｄ、Ｏｌｅｓｅｎ、およびＦａｒｂの開示は、本明細書で参照することによりその全体が組み込まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
急速で、低コストな高処理スクリーニングの方法を必要とする。そのような高処理スクリーンは、イオンチャネル活動を調整する薬剤を研究し、特定するために貴重である。よって、そのような薬剤は多様な疾患の治療に役立つ。
【課題を解決するための手段とその効果】
【００１８】
本発明の一実施例によると、様々な化学物質のイオン移行チャネルでの効果を研究するため、大量処理パッチクランプ測定システムおよびその方法を提供する。一つ以上のパッチクランプ構成が確立され、それぞれ、ピペットに密着した細胞を含む。ピペットはピペット固定具に取り付けられる。ピペット固定具および一つ以上のウェルを含むプレートは、各細胞がウェルの内部にあるよう、相対的に移動される。細胞の電気特性が測定される。
【００１９】
本発明の他の実施例によると、パッチクランプ測定システムを自動化するためのコンピュータプログラムコードでコード化されたコンピュータ可読の媒体を提供する。プログラムコードは、次のステップを行うために効果的である。一つ以上の細胞は、一つ以上のピペットの一つ以上の先端に装着される。一つ以上のピペットは、ピペット固定具に取り付けられる。ピペット固定具および一つ以上のウェルを含むプレートは、一つ以上の各細胞がそれぞれ一つ以上の各第一のウェルの内部にあるよう、相対的に移動される。一つ以上の各細胞の少なくとも一つの電気特性が測定される。
【００２０】
本発明の他の実施例よると、膜の特性を測定する装置を提供する。ピペット固定具は、一つ以上のピペットに連結され、各ピペットは、各ピペットの先端にパッチクランプ構成における膜を有する高電気抵抗シールを備えるようになっている。電動式プラットフォームは、一つ以上のマルチウェルプレートを含む。モーター制御器は、一つ以上の各ピペット先端が一つ以上のウェルの内部にあるよう、電動式プラットフォームおよびピペット固定具を相対的に移動するよう構成される。
【００２１】
本発明は、多重チャネルパッチクランプのシステムを提供し、薬剤化合物などの化学物質のスクリーニングシステムを使用する。具体的には、システムは、イオンチャネル移行での化合物の効果の研究を促進するために使用されてよい。
【００２２】
本発明の一実施例は、細胞の全体に対するイオンチャネルの細胞内領域の試験を提供する。本発明の他の実施例は、一つの細胞に関する複数の試験を実施が可能となるのに十分安定な全細胞構成を提供する。本発明の他の実施例は、迅速に薬剤化合物を細胞から洗い落とすことが可能な高拡散特性を有する全細胞構成を提供し、イオンチャネルスクリーニング過程を促進する。
【００２３】
本発明の一実施例は、一つの細胞の測定および記録を行うために使用されてよい。本発明の他の実施例は、複数の単細胞が複数の電極に付いている自動パッチクランプ記録のために使用されてよい。この実施例に従いパッチクランプを自動化すると、手動操作および波形解析に伴う誤りは減少する。この実施例に従い複数のパッチクランプを自動化すると、パッチクランプ実験のスピードおよび処理量は増加する。具体的には、自動化によって、薬剤適用の的確なタイミング（例えば、化学物質、化合物またはリガンドの追加）が可能となり、不注意による誤りが減少することに伴い、実験データの質、異なる研究者間での特異なプロトコル変化、および手動操作による騒音が改善される。試験の効率およびスピードが上がるため、自動化によって大量の化学ライブラリに対する大量の平行スクリーニングが可能となる。これは、イオンチャネル活性、ひいては細胞学的電気特性（例えば、細胞膜条件）に影響を与えるスクリーニング剤に対して特に有効である。
【００２４】
本発明の他の実施例は、既存の技術を利用し、自動パッチクランプのコスト削減のため、既存の手段を簡略化する。
【００２５】
本発明の他の実施例は、大量処理パッチクランプ測定を実施するための装置を提供する。装置は、パッチクランプ測定を実施するための従来の電子機器からなり、先端試料台、主増幅器および電極、パッチクランプ測定中に一つ以上のピペットを保持するための多重チャネルピペット固定具、一つ以上のピペットを垂直配向に保持するピペットホルダ、ピペットホルダおよび一つ以上のマルチウェル化合物プレートを保持するためのプラットフォーム、試験化合物を含む化合物プレート、細胞をピペット先端へ移動させることが可能な空気圧制御システム、プラットフォームのＸ、ＹおよびＺ方向への移動、化合物プレートの移動、ピペットホルダの移動を制御するためのＸＹＺ主ネジロボット、データ取得、ロボット動作制御、空気圧調整するためのデータ取得および制御システムを含む。本装置は、自動処理設備やロボット機器が商業的に利用可能であるため、特に有用である。例えば、そのような自動ロボットシステムの一つとしてＶｅｌｍｅｘ，Ｉｎｃ．から入手可能なＢｉＳｌｉｄｅ  ＸＹＺがある。
【００２６】
本発明の他の実施例は、試験化合物を細胞から除去するための液体洗浄システムを提供する。液体洗浄システムは、液体で灌流される一つ以上の円筒型または円錐型のトラフ、トラフに接続されるポンプ、液体で灌流することが可能なポンプを含む。液体洗浄システムは、随意に、液体の動きを送る際に使用する内翼を含んでよい。
【００２７】
本発明の他の実施例は、パッチクランプ測定を実行する方法を提供する。その方法は、少なくとも一つのピペット先端の内部に少なくとも一つの細胞を位置付け、細胞を外気に曝すことによって、インサイドアウト全細胞パッチクランプ構成を作成するステップと、一連の試験化合物を含む化合物プレートが一列目のピペットに連動するよう、化合物プレートを位置付けるステップと、細胞が試験化合物に接触している間に、その細胞のパッチクランプ測定を行うステップと、化合物プレートをピペット固定具から外すステップと、濯ぎを行うステップと、化合物プレートが二列目のピペットに連動するよう化合物プレートを位置付けるステップと、細胞が試験化合物に接触している間に、その細胞のパッチクランプ測定を行うステップと、濯ぎと測定のステップを目的回数繰り返すステップとを含み、同化合物プレートあるいは異なる化合物プレートは、各反復の間、ピペットの列に連動する。
【００２８】
本発明の他の実施例は、大量処理パッチクランプ測定を実施する方法に対するものであり、細胞を、電極を含むピペットに装着するステップと、ピペットを一つ以上の化合物プレートおよび／または液体洗浄システムを保持することが可能な可動プラットフォームにあるピペットホルダに配置するステップと、プラットフォームを、空気圧制御システムに接続されていて、ピペットがピペット固定具に取り付けられるように位置付けられているピペット固定具に相対的に移動するステップと、プラットフォームを、ピペットがピペットホルダからはずされ、ピペット固定具に安定し他状態で取り付けられているピペット固定具に相対的に移動するステップと、プラットフォームを、ピペット先端が一組目の試験化合物を含む複数のウェルを含む化合物プレートに接触している、ピペット固定具に相対的に移動するステップと、電極と第一の試験化合物の両方に接している細胞をピペット先端に位置付けするための空気圧制御システムを使用するステップと、第一の試験化合物に接している細胞の電気的活動を測定するステップとを含む。
【００２９】
大量処理パッチクランプ測定を実施する方法の代替の実施例において、第一の試験化合物に接している細胞の電気的活動を測定した後、プレートおよび固定具は、ピペットが一組目のウェルから外れ、同プレートの二組目のウェルへ挿入されるよう、再度、相対的に移動する。細胞は再度除去され、新しい組のウェルへ再挿入され、除去および挿入過程は、何度でも繰り返しが可能である。洗浄システムおよび固定具は、細胞が洗浄システムへ挿入され、洗浄液を細胞へ送ることによって、洗浄システムが細胞を洗浄するよう、相対的に移動されてよい。細胞は、各細胞測定の前後あるいは他の時に洗浄されてよい。
【００３０】
本発明の前述および他の目的、利点および特徴となる性質は、以下の例示的な実施例の説明と添付の図面から明らかとなるが、図面において、同様の参照番号は、多様な図を通して同様の要素を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の要旨は、２００４年５月３日にファイルされた、代理人整理番号３８５２３．００００６１号の「大量処理および低容量条件をもつインターフェースチャンバーシステムを利用した、急速灌流システムおよびパッチクランプ技法」と表題される米国出願に関する。この出願は、本明細書で参照することによりその全体が組み込まれる。
【００３２】
図１〜１０は、本発明の好ましい実施の形態を示す。プラットフォーム１は、一つ以上のマルチウェル化合物プレート３、ピペットホルダ７および随意に液体洗浄システム２１を保持するために使用されてよい。ピペット４０は、被験細胞３０を予め装着している。ピペットホルダ７は、細胞３０を予め装着したピペット４０を格納するために使用されてよい。廃棄エリア４９は、使用済みおよび不要なピペット４０を収集するために随意に使用されてよい。固定具連結器１７を含むピペット固定具５は、パッチクランプの最中にピペット４０を固定し吊るされるように構成される。スタンド６は、先端試料台の電子機器１８および固定具連結器１７を保持するために使用されてよい。空気圧制御システム７０は、細胞３０を押したり引いたり、および／またはピペット４０を操作するために使用されてよい。各ウェル３Ａの列の間にあるピペット４０の先端を洗浄するために、別の液体システム２１を使用して化合物を除去してよい。ロボット２３は、プラットフォーム１、９６‐ウェルプレート３および／またはピペット固定具５の動作を制御するために使用されてよい。データ取得および制御システム２５は、データの取得、ロボット２３の動作および空気圧の調節をするために使用されてよい。
【００３３】
図１は、本発明の一実施例による、多重チャネルパッチクランプシステムのトップダウン図を示す。システムは、ＸＹＺロボット２３、モーター駆動のプラットフォーム１、ピペットを格納するためのピペットホルダ７、一つ以上の貯蔵槽３Ａを含むウェルプレート３、使用済みピペット用廃棄エリア４９、固定具連結器１７を含むピペット固定具５、および先端試料台の電子機器１８を含む。ファラデー箱２０は、パッチクランプシステムを囲み、収納する。
【００３４】
可動プラットフォーム１は、好ましくは一つ以上のマルチウェル化合物プレート３、一つ以上のピペットホルダ、および液体洗浄システム２１を収納できるほどの大きさである（図６は、プラットフォーム１の等角投影図を示す）。プラットフォーム１は、好ましくはモーター、さらに好ましくはステッピングモーターを使用する３軸主ネジロボット２３（図３参照）で駆動する。図１に示すように、プラットフォーム１は、主ネジに取り付けられているプラットフォーム車にボルトで固定されてよい。３軸主ネジロボット２３は、市販されており、Ｖｅｌｍｅｘ社から購入することができる。
【００３５】
可動プラットフォーム１は、ウェルプレート３および予め装着されたピペットホルダ７に連結される。例えば、ウェルプレート３およびピペットホルダ７は、可動プラットフォーム１の上に置かれているプラットフォームであり、および／または可動プラットフォーム１に取り付けられる。プラットフォーム１は、Ｘ、ＹおよびＺ方向に可動である。よって、プラットフォーム１は、上下左右、斜めの任意の方向、または任意の非線形の三次元の経路を移動することができる。プラットフォーム１は、ウェルプレート３およびピペットホルダ７を移動させるように構成される。例えば、ピペットホルダ７およびウェルプレート３を（異なる時間で）ピペット固定具５直下の位置へ移動させてよい。
【００３６】
一つ以上のマルチウェルプレート３の各々は、好ましくは一つ以上のウェル３Ａを含む。本明細書で使用されるように、「ウェル」という用語は、少量の液体を収容することが可能な任意の表面を意味する。これには、貯蔵槽およびくぼみ、および少量の液体が、液体の表面張力によって維持される明らかな水滴を形成する平面も含まれる。ウェルプレート３には、浅いウェル３Ａが８ｘ１２の行列構成などのウェルプレート３上に横列および／または縦列に配置される４８〜３８４‐ウェルプレートなど、浅いウェル３Ａが多く集中する。例えば、プレート３は、４８（６ｘ８）または９６（８ｘ１２）のウェル形式の化合物プレートを含んでよい。そのような配列は、ウェル３Ａの充填およびピペット４０の先端をウェル３Ａにある液体に接触させることを自動的に行うのに役立つ。高密度の化合物プレートごとのウェル３Ａは、好ましくは試験に必要な試験化学薬品または化合物の量を減らし、ウェル間の移動速度を増す。
【００３７】
ウェル３Ａは、一つ以上の試験物質、中性溶液、または洗浄液を含むように構成される。試験物質は、薬剤または他の化学薬品を含んでよい。好ましくは、試験物質は、膜のイオンチャネルに効果を有する化学薬品を含む。中性溶液は、不活性水または不活性食塩水などの任意の不活性薬品を含んでよい。好ましくは、中性溶液は、細胞および細胞膜に化学的に反応したり、干渉したりすることはない。洗浄液は、例えば、試験物質を洗い流すなど、細胞を洗浄できる任意の溶液を含んでよい。
【００３８】
各ウェル３Ａは、好ましくは約１０ｕＬの最小液体量（試液の量など）、および約１０ｍＬの最大液体量を収容できる。これらの量は、正確なパッチクランプ測定を実施するために必要な試液の量に相当する。ウェル３Ａに収容されうる最小量は、１０ｕＬ、２０ｕＬ、３０ｕＬ、５０ｕＬ、および８０ｕＬである。収容されうる最大量は、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、および５ｍＬである。試液量は、これらの最小および最大量の任意の組み合わせとなる。例えば、量は、３０ｕＬおよび０．５ｍＬの間、または５０ｕＬおよび５ｍＬの間でよい。さらに好ましくは、量は、２０ｕＬおよび１ｍＬの間である。例えば、各ウェルが０．３〜０．３５ｍＬまでの溶液を収容するよう作られた９６‐ウェルプレートがあるとする。ウェル３Ａは、さらに食塩水などの中性溶液を含んでよい。例えば、ウェル３Ａのいくつか（またはウェルの列）は、一つ以上の異なる濃度の試験物質を含み、同時に同じ又は異なるプレートの他のウェル（またはウェルの列）は、中性溶液または洗浄液を含んでよい。
【００３９】
ピペットホルダ７は、一つ以上のピペットを保持および／または格納するための任意の手段を含んでよい。ピペットホルダ７は、ピペットが開口部７Ａに挿入され、開口部７Ａの内壁によって所定の位置に保持されるよう、一サイズおよび一形状の円形開口部などの複数の保持装置７Ａを含んでよい。例えば、ピペットは、開口部７Ａより狭いピペット先端を有し、ピペットの中心部は、開口部７Ａより広くてよい。ピペットは、ピペットホルダ７に挿入されるとき、ピペット先端は穴にはまるが、ピペットの広い部分は、開口部７Ａに連結し、ピペットが開口部７Ａの内壁によって所定の位置に保持されるようにする。ピペットホルダ７は、パッチクランプ測定の前（または後）に一つ以上のピペットをそれによって保持してよい。
【００４０】
ピペットホルダ７は、可動プラットフォーム１に取り付けられる。ピペットホルダ７に保持されるピペットは、プラットフォーム１を移動させることによって移動されてよい。例えば、予め装着されたピペットは、ピペットがピペット固定具５に取り付けられるよう、可動プラットフォーム１を通じで移動されてもよい（図４Ｂ参照）。
【００４１】
ピペット固定具５は、好ましくは可動プラットフォーム１に連結されないが、ピペットを保持するように構成される。ピペットホルダ７に保持されるピペットは、ピペットホルダ７に保持されるピペットがピペット固定具１の真下にくるよう、プラットフォーム１（その次にピペットホルダ７）を移動させることによって、ペット固定具５へと移動することができる。そして、ピペットホルダ７は、ピペットが固定具５に取り付けられるよう、固定具５の方向へ上に移動されてよい。例えば、ピペットは、ピペットへ取り付けられるように構成された固定具に挿入されてよい。そして、ピペットホルダ７は下降し、ピペットホルダ７はピペットに連結されなくなる。一実施例において、ピペットホルダ７は、ピペットがピペット固定具５に連結された後、ピペットを解放する。
【００４２】
ウェルプレート３をピペット固定具５の方向へ上に移動させるために可動プラットフォーム１を使用して、ピペット先端にある細胞は、ウェル３Ａにある試験物質（または洗浄液）に効果的に挿入される。このとき、パッチクランプ測定は、下記の説明のように電極および先端試料台の電子機器１８を使用して行われる。
【００４３】
本発明によると、開示された装置は、先端試料台、ＨＥＫＡ  ＥＰＣ９／２パッチクランプ増幅器、および／または他の市販または現地で製造された増幅器、および一つ以上の電極を含む、従来のパッチクランプ測定用の電子機器を使用する。好ましくは、本発明の装置は、多重チャネルデータを処理するよう設計され、同時記録を容易にする増幅器を使用する。電流、電圧、抵抗、容量、および他の電気的記録は、各増幅器のために取得されてよい。データ選別およびアナログからデジタルへの処理は適用され、データは、例えばデータ取得および制御システム２５のコンピュータに保存されてよい。
【００４４】
先端試料台の電子機器１８は、パッチクランプ測定の電子機器を制御するように構成される。そのような電子機器は、当技術分野でよく知られている。例えば、先端試料台の電子機器１８は、ＨＥＫＡ  ＥＰＣ９／２‐チャネル増幅器を含んでよい。先端試料台の電子機器１８は、主増幅器および一つ以上の電極と併せて使用される。例えば、電子機器１８は、パッチクランプ測定などの場合、電子機器１８に接続される一つ以上の電極を渡る電圧および／または電流を測定してよい。そのようなパッチクランプ測定などの場合、別の電極（好ましくは素線）は、基準電極となり、他の電極は測定電極となる。連結器１７は、先端試料台の電子機器１８を電極、データ取得および制御システム２５へ接続し、基準電極から先端試料台へ接続する。
【００４５】
データ取得および制御システム２５は、処理装置、データベースおよび／またはコンピュータを含んでよい。データ取得および制御システム２５は、好ましくは素線を通して、先端試料台の電子機器１８に連結される。データ取得および制御システム２５は、空気圧制御システム７０、ロボット２３、およびプラットフォーム１に連結してもよい（例えば、素線および他の電子制御装置）。
【００４６】
データ取得および制御システム２５は、ロボット２３の動作、パッチクランプ電子機器および信号キャプチャー、および空気圧制御を制御する。例えば、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ６．０インターフェース（または他のプログラム）などのプログラムは、Ｖｅｌｍｅｘ社のＸＹＺ‐３Ｄステージソフトウェア２５、ＨＥＫＡ社のＰｕｌｓｅソフトウェア、空気圧制御システム７０への、およびそこからの信号を調整するために使用されてよい。ソフトウェアは、システムにおける部品１、７０、２３、および他の電子部品の動作を制御する。例えば、ソフトウェアは、電極のパッチクランプ測定を行うための測定機能を制御してよい。自動細胞電気生理学装置を制御し、監視するためのコンピュータソフトウェアは、詳細に記述され、当技術分野でよく知られている（Ｆａｒｂらの米国特許第６，０４８，７２２号など参照）。
【００４７】
好ましくは、ソフトウェアまたは自動ルーチンは、試験化学薬品または化合物の搬送、測定器制御、データ取得、および画面上のインターフェースを通じての波形解析を一体化する。例えば、ユーザは、マウス、キーボード、ジョイスティック、または他の入力装置などの従来のコンピュータ入力を使用する、図１のパッチクランプシステムの操作と連動し、および／またはそれを制御する。このような方法で、パッチクランプ記録セッションのすべての局面は、測定器制御を調整するためマウス（または他の入力装置）を使用して、画面上のインターフェースを通じて制御される。例えば、自動プロトコルは、一度のキー押しによる用量反応、逆転電位、調節効果、および反復適用実験を開始し、実行するために開発される。さらに、波形解析ルーチンは、自動的に反応振幅、発症時間、および脱感作時定数などのパラメータを測定し、この情報を、データ取得および制御システム２５に連結するディスクなど、直接ディスクに保存することができる。
【００４８】
ファラデー箱２０は、パッチクランプシステムを囲う（図２参照）。ファラデー箱２０は、ケージ外の源以外によって生じることのない電界などのケージ内の不要な電界を排除する。これは、パッチクランプ測定では、不要な電界によって正常に機能しなくなる高感度電子測定を必要とするので、有効である。よって、ファラデー箱２０は、パッチクランプ測定部品（ピペット、細胞、および電極など）を囲み、それらをデータ取得および制御システム２５および他の電子部品、およびパッチクランプ測定の不要な電気障害を引き起こす可能性のある配線から分離する。
【００４９】
廃棄エリア４９は、パッチクランプ測定が行われた後、使用済みピペットが格納されるエリアである。例えば、ピペット固定具５に取り付けてあるピペット４０に高圧のパルスを印加することによって、ピペットは、固定具５から廃棄エリア４９へと排出されてよい。ピペットは、例えば、ピペット固定具５のピペットへの取り付けが緩む、またはそうでなければピペットから外れる場合に、ただ単に廃棄エリア４９へと落とされてもよい。一つ以上のピペットまたは他の物体をある場所から他の場所へ移す他の方法も、考慮されてよい。
【００５０】
図２は、図１の多重チャネルピペットシステムの右正面図を示す。図２は、支持スタンド６、空気圧制御システム７０、データ取得および制御システム２５、ＸＹＺロボット２３、可動プラットフォーム１、一つ以上のウェルプレート３、ピペットホルダ７、およびファラデー箱２０を示す。
【００５１】
支持スタンド６は、先端試料台の電子機器１８および／またはピペット固定具５（図示せず）を支持してよい。支持スタンド６は、当技術分野でよく知られている任意の支持スタンドを含んでよい。好ましくは、支持スタンド６は固定されている。しかし、一実施例において、支持スタンドは、ピペット固定具５を動かすことができる可動の装置である。例えば、支持スタンド６は、ピペットがピペット固定具５から廃棄エリア４９へ落ちることができるよう、ピペット固定具を廃棄エリア４９の上部にある位置へ移動させてよい。
【００５２】
空気圧制御システム７０は、各ピペットの内部の空気圧を制御するように構成される。ピペット内部に空気圧を印加することによって、空気圧制御システム７０は、さらに図１０で説明するように、ピペット内部の細胞をピペット先端へと移動させてよい。
【００５３】
図３は、ロボット２３の典型的な実施例をさらに詳細に示す。図解に示すように、ロボット２３は、ＲＳ２３２通信プロトコルを通してコンピュータに制御された、Ｖｅｌｍｅｘ社の３軸電動の（ステッピングモーターによる）プラットフォームを含む。４８‐（または９６など）ウェルプレートを含むプレキシグラスプレートは、Ｖｅｌｍｅｘ社の３軸プラットフォームに連結される。ロボット２３は、好ましくはプラットフォームの動作を制御し、よって、ウェルプレート３、ピペットホルダ、および／または液体洗浄システム２１の動作を制御する。上記のように、ロボット２３の動作は、データ取得および制御システム２５によって制御されてよい。
【００５４】
図４Ａ〜４Ｃは、本発明の一実施例による、ピペット固定具５を示す。ピペット固定具５は、好ましくはパッチクランプの最中にピペット４０を固定し吊るすために使用されうる固定具連結器１７を含む。ピペット固定具５は、それによってピペット４０に取り付けることが可能であってよい（または代わりに、ピペット４０がピペット固定具５に取り付けることが可能であってよい）。ピペット固定具５は、一定の実質的な垂直位にピペット４０を保持してよい。ピペット固定具５は、空気圧制御システム７０および基準電極４５を接続するために使用されてもよい。
【００５５】
電流システムの各チャネルに関して、パッチピペット外部にある電極（槽および／または基準電極４５）およびパッチピペット内部にある電極４の二つの電極があることを注意しなければならない。両電極４、４５は、同じ増幅器に連結されてよい。増幅器は、これら二つの電極４、４５間の電流および／または電圧を測定してよい。測定情報は、細胞膜の特性を測定するために使用されてよい。ピペットは、ガラスピペット、パッチピペット、または自らの形状および電気抵抗に依存しているマイクロ電極であることにさらに注意しなければならない。
【００５６】
図４Ａは、ピペット固定具５の平面図を示す。ピペット固定具５は、一つ以上のピペット４０を収容するための複数の開口部５１を含む。各大開口部５１に隣接する小開口部５２は、パッチクランプ測定を実行するために使用されうる基準電極４５（例えば、槽電極）を収容してよい。支持穴５３は、例えば、ネジまたは他の連結装置を使用して、固定具を固定するために使用されてよい。
【００５７】
図４Ｂは、８つのピペット４０およびピペット固定具５によって一定の垂直配向に保持される基準電極４５の横断面図を示す。ピペット内の空気圧は、ホルダ５７の側面にある開口部を通って印加される。
【００５８】
ピペット４０は、形状がチューブ状および／または円筒型である、任意のチューブ状の装置または装置の任意の部分、を含んでよい。ピペット４０は、一端または両端が空洞である。例えば、ピペット４０は、マイクロピペットなどの任意のキャピラリーチューブであってよい。ピペットは、ピペット先端４０Ａを含む。先端４０Ａは、好ましくはほぼ円形の開口部を輪郭付ける。ピペット先端４０は、哺乳類、昆虫、両生類、または他の細胞などの、細胞３０または細胞膜３０Ａ（図１０Ａ〜１０Ｃ参照）に取り付けが可能であるサイズおよび形状であってよい。例えば、先端の開口部１０Ａは、約０．１〜１０ミクロンの直径であってよい。好ましくは、先端の開口部１０Ａは、約１マイクロメートルの直径である。ピペット４０が細胞３０に取り付けられると、パッチピペットと呼ばれる場合がある。本明細書で使用されるように、「パッチピペット」という用語は、細胞３０に取り付ける、パッチクランプ技法で使用される任意のチューブを意味する。
【００５９】
好ましくは、ピペット４０は、生体膜にしっかりと密着し、パッチクランプ測定に対して有効な誘電的特性を有し、多様な化学物質に対して実質的に不活性である任意の非導電材料から作られることが可能である。さらに好ましくは、ピペット４０は、グラスおよび／またはプラスチック（例えば、ポリスチレン）で作られる。
【００６０】
本発明の一実施例において、バーブコネクタおよびバーブＴ字コネクタの間に配置されるポリウレタンチューブは、ピペット４０を所定の位置に保持し、空気圧制御システム７０の密閉した接続を維持するために使用されてよい。ピペット固定具５は、各ピペット４０を所定の位置に保持するために、各ピペット４０の軸に沿って様々な位置にピペット４０をはめ込み、固定させてよい。各ピペット４０の先端は、ピペット４０の先端を、パッチクランプ測定および細胞の洗浄のためにより簡単に細胞３０へ接近できるよう曝すため、ピペット固定具５の表面を越えて延伸してよい。
【００６１】
ピペット４０の実質的な垂直位は、パッチクランプ測定のために細胞３０をピペット先端４０に安定させる。一定の位置は、細胞３０およびピペット先端４０Ａの間にあるギガシールを維持するために役立つ。また通常は、細胞３０は、ピペット４０内の液体４１より高密度なので、ピペットの垂直位は、細胞をピペット４０の先端４０Ａの下部に維持し易くする。
【００６２】
図４Ｃは、ピペット固定具５に連結する一つのピペット４０（図４Ｂ）の横断面図を示す。図４Ｃに示すように、各ピペットは、ポリウレタン（または、他のポリマーまたは同様な材料）チューブ５４によって所定の位置に保持されてよい。例えば、ピペット４０は、電動式プラットフォーム１がピペット固定具５にピペット４０へ連結させるとき、ピペット固定具５に連結してよい。例えば、ピペット固定具５は、ピペットホルダ７からピペット４０を「つかむ」ことをしてよい。各ピペットを「つかむ」際（および／または同時に一組のピペット４０を「つかむ」）、ピペット４０は、図４Ｃに示す位置へとピペット固定具５に挿入されてよい。図４Ｃに示すように、ピペットは、ピペット固定具５の穴を垂直に通り、ピペット固定具５に取り付けられた下部プラスチック固定具５９を通り、そしてチューブ５４を上方へ通過して延伸してよい。ピペット４０の上部先端４０Ｂは、下部プラスチック固定具５９および上部プラスチック固定具５５の間に配置されてよい。ピペット４０は、ピペット固定具５、プラスチック固定具５９、およびチューブ５４によって適宜に所定の位置で保持されてよい。上部先端４０Ｂは、空気が先端４０Ｂを通過してピペットへ出入りできるよう、開いていてよい。
【００６３】
当然のことながら、チューブ５４および図４Ｃに示すいくつかの他の部品は、この横断面図が円形を示していなくても、円筒型またはそうでなければ他の円形であってよい。例えば、チューブ５４は、図解ページの上下に延伸する一つの円筒型のチューブを含んでよく、ピペット４０、プラスチック固定具５６、およびピペット４０へと流れが出入りする空気の一部を含むかもしれない空洞を輪郭付けてよい。
【００６４】
上部プラスチック固定具５５は、バーブ「Ｔ字」型を含んでよい。下方向きの部分は、ピペット４０の方向へ延伸するバーブプラスチック固定具５６を含んでよい。上方向きの部分は、電極４を通過させ（例えば、ＤＡＳ２５へ）、そうでなければ、気密シールを電極４の周囲に作成し、空気をプラスチック固定具５５へ出入りさせない一体型部品５５Ａを含んでよい。水平部は、柔軟性のあるチューブ５８に連結した（および囲まれた）他のバーブプラスチック固定具５６を含んでよい。柔軟性のあるチューブ５８、上部プラスチック固定具５５、および柔軟性のあるチューブ５６は、空気（および空気圧の変化）が圧力コントローラ７３およびピペット４０の間を移動するための気密経路も含んでよい。
【００６５】
ポリウレタンチューブ５４は、プラスチック固定具５６を接続してよい。プラスチック固定具５６は、気密シールをチューブ５４およびプラスチック固定具５６の間に固定し易くするためのバーブ接続金具を含んでよく、それによって、外気がピペット４０へ入らないようにするとされる。特定のピペット４０に関して、チューブ５４（図４Ｂおよび４Ｃに示すように）は、ピペット４０に連結した一つのプラスチック固定具５９からピペット４０Ｂの上端の上部に位置する他のプラスチック固定具５５へと垂直に延伸してよい。プラスチック固定具５９は、ピペット固定具５に連結されてよい。
【００６６】
ピペット４０は、プラスチック固定具５６間のポリマーチューブ５４（仕様に対応するかもしれない）に圧入されてよい。ピペット４０は、チューブ５４を膨張させ、例えば、ピペットがまず図４Ｂに示す位置へ挿入されるときなど、ピペットの外壁にそって収縮してよい。
【００６７】
もう一つの組のチューブ５８（または場合により同じチューブ５４）は、圧力コントローラ７３に接続してよい（図７参照）。チューブ５４、５８およびプラスチック固定具は、圧力コントローラ７３（図示せず）およびピペット４０内部の間にある連続的で気密な接続を含んでよい。すなわち、チューブは、圧力コントローラ７３およびピペット４０の間にある邪魔のない連続的な空気の経路を提供してよい。各ピペット４０は、圧力コントローラ７３に接続する別のチューブシステム５８を有してよい。このような方法で、各ピペットのギガシールは、別々に作成され、監視される。他の実施例において、ピペット４０は、接続を共有してよい。
【００６８】
各ピペット４０は、好ましくは電極４を含む（図１０Ａ〜Ｃも参照）。電極４は、ピペット４０の内部にあってよく、電子増幅器に取り付けられてよい。本明細書で使用されるように、「電極」という用語は、ピペット液から増幅器への電気信号の物理的なトランスミッターまたは伝導体を意味する。電極４がピペット４０の内部にあり、キャピラリー溶液４１に接触しているとき、ピペット４０は、パッチ電極となる。本明細書で使用されるように、「パッチ電極」という用語は、全てが細胞につながっている、さらに電極４を含むパッチピペットを意味する（図示せず）。よって、「パッチ電極」および「キャピラリー電極」は本発明の目的により、互換性がある。
【００６９】
電極４は、電極４および基準電流または浴電極４５などの他の基準電流の間にある電流および／または電圧を測定する装置（例えば、パッチクランプ増幅器）に取り付けられてよい。ある実施例において、一つ以上の電極４、４５は、マイクロ電極を含んでよい。本明細書で使用されるように、「マイクロ電極」という用語は、個々の細胞３０からの信号を記録するために適切なサイズのパッチ電極を意味する。好ましくは、パッチ電極４の先端は、パッチクランプ構成において細胞３０の電気特性を測定可能にするために細胞と接触しうる（または、細胞に接触する溶液４１）。本明細書で使用されるように、「パッチクランプ」という用語は、細胞膜３０Ａの小面積との接触にパッチ電極を位置付けることにより、生体膜からの信号を記録するためのパッチ電極構造を意味する。パッチクランプは、細胞膜３０Ａの小面積との接触にパッチ電極４を位置付け、次に細胞膜３０Ａ（パッチ）の小面積を破断することにより、細胞３０の全膜からの信号の記録を可能にする、パッチ電極構造を意味する「全細胞パッチクランプ」かもしれない（図１０Ａ〜Ｃ参照）。通常、これは、細胞がピペット４０の内部に配置され、膜のパッチが大気暴露によって破断するとき、「インサイドアウト全細胞」として行われてよい。
【００７０】
図４Ｂおよび４Ｃに示すように、ピペット４０の内部にあるパッチ電極４の端部は、カールされていてよい。ある実施例において、カールは、ピペット４０が固定具５を通ってシールを作成する柔軟性のあるチューブ５４へと上方へ押されるとき結合および干渉問題を回避する。
【００７１】
図５Ａ〜５Ｄは、ピペットホルダ７の典型的な実施例を示す。図５Ａは、ピペットホルダ７の平面図を示し、図５Ｂは、ピペットホルダ７の側面図を示す。
【００７２】
ピペットホルダ７は、一つ以上の穴、溝またはピペット４０を取り付けられる、または格納できる連結装置で任意の面を含んでよい。例えば、ピペット４０は、ピペット４０が垂直に、または実質的に垂直位でホルダ７に配置されるよう、ピペットホルダ７の穴に挿入されてよい。ここで、ピペットホルダ７は通常水平面方向に平面である。ピペット４０の先端は、ピペットホルダ下部を通って突き出してよく、ピペット４０の残部は、ピペットホルダ７の表面上に突き出ていてよい（図５Ａ〜Ｄ参照）。
【００７３】
ピペットホルダ７は、ピペット４０がピペット固定具５に装着される前に、予め装着されたピペット４０を収容するための複数の開口部７１を含んでよい。各大開口部７１に隣接する小開口部７２は、基準電極４５を収容してよい。好ましくは、ピペットホルダ７は、予め装着されたピペット４０の複数のグループを保持するための開口部７１の複数の列を有する。例えば、一つのピペットのグループは、特定のサイズ、年齢、計測履歴、種類、温度、浴溶液、または他の同様な特徴を有する細胞を含んでよい。ピペットホルダ７は、ピペットホルダ７を支持し、ホルダのピペット４０がピペットホルダ７に配置されている間、テーブルなどの面（または他の面）に接触することがないよう、ホルダとの間に十分な距離を維持する、支持脚７０２を含んでもよい。
【００７４】
本発明の好ましい実施の形態において、ピペットホルダ７は、ピペット固定具５をピペット４０に容易にはめ込められるよう、実質的に垂直方向に予め装着されたピペット４０を保持する。ピペットホルダ７の予め装着されたピペット４０は、ロボット２３がピペット４０をピペット固定具５の下の位置へ移動し、その後、ピペット４０がピペット固定具５によって固定されるように、ピペットホルダ７を上昇させるとき、ピペット固定具５へ装着することができる。
【００７５】
図５Ｃおよび５Ｄは、パッチクランプ構成を確立する前、および／またはパッチクランプ測定を実施する前に、ピペットを所定の位置で保持するピペットホルダ５を使用して、ピペット４０を所定の位置に保持するための二つの異なる方法を示す。
【００７６】
図５Ｃは、徐々に細くなる穴を使用する方法、またはピペット４０をプラットフォーム１の上部で吊るした状態にするために挿入する方法を示す（図１参照）。ピペット４０は、徐々に細くなる穴７０１に挿入される。穴４０は、ピペット４０が穴７０１の内面、つまりピペットホルダ７の内面、を接触せずに穴を通ることができない幅を有してよい。穴７０１およびピペット４０の間の摩擦によって、ピペットホルダ７は、効果的にピペット４０をつかみ、それがホルダ７を通って垂直に移動しないようにする。ホルダ７は、ある程度、ピペットの横移動も妨げる。
【００７７】
図４Ｄは、ピペット４０を所定の位置に保持するための可変ポリマーＯリングの弾力性質を使用する他の方法を示す。ここにおいて、ピペットホルダ７は、上部および下部の支持体７０４、７０５、および支持体７０４、７０５の動作を制御する作動装置７０３を含んでよい。ピペット４０は、上部支持体７０４の穴および下部支持体７０５の他の対応する穴を通って挿入される。図４Ｄに示す時点では、ピペット４０は、必ずしもしっかりと所定の位置に保持されない。すなわち、ピペット４０は、上部および下部支持体７０４、７０５の内部に緩くはまってよい。具体的には、ピペット４０は、上部および下部支持体７０４、７０５にそれぞれ連結する上部および下部Ｏリング７０６、７０７に接触しなくてよい。すなわち、Ｏリングの内径７０８は、ピペット４０の直径より大きくてよい。よって、この際にピペット４０を所定の位置に維持するために、人または他の保持手段が、ピペット４０を保持、換言すれば、ピペット４０が支持体７０４、７０５の穴を通って滑り落ちることを防ぐ、ものでもよい。代替的に、穴は、穴の表面およびピペット４０の間の摩擦によってピペット４０が垂直に移動しないような十分に小さいサイズであってよい。
【００７８】
ピペット４０が図４Ｄに示す位置にくると、作動装置７０３は、上部および下部支持体７０４、７０５をお互いの方向へ移動させてよい。作動装置７０３は、モーター駆動または空気圧駆動であってもよい支持体７０４、７０５が一体になると（図示せず）、上部および下部Ｏリング７０６、７０７は、互いに接触し、圧迫してよい。Ｏリングを圧迫すると、各Ｏリングの内径７０８が減少する（例えば、Ｏリングが平たくなる）。二つの支持体７０４、７０５をお互いに近づけると、さらなるＯリングの圧迫が生じ、内径７０８の大きさがさらに減少する。Ｏリングの直径は、最終的にはＯリング７０６、７０７がピペット４の外壁に接触してつかむまで減少する。この時点で、ピペット４０は、Ｏリング７０６、７０７によって効果的に所定の位置に保持することができる。
【００７９】
図５Ｃおよび５Ｄはそれぞれ一つのピペットを示し、当然のことながら図解に示す方法は、多数のピペット４０に使用されてよい。例えば、図５Ｃのピペットホルダ５は、一つのピペット４０ではなく、八つの異なる先細の穴に八つのピペット４０を保持してよい。
【００８０】
図６は、モーター駆動のプラットフォーム１の構成部品となりうるプレキシガラスプレート１Ａの実施例を示す。プレキシガラスプレート１Ａは、パッチクランプ実験を実施するために必要な多くの装置を支持するために使用されてよい。本発明の好ましい実施の形態において、モーター駆動のプラットフォーム１は、ウェルプレート３を支持するために使用される。
【００８１】
図７は、本発明の一実施例による、空気圧制御システム７０を示す。空気圧制御システム７０は、データ取得および制御システム２５、圧力調整器／コントローラ７３（制御システム２５によって制御されうる電圧または電流入力信号のいずれかによって制御されうる）、および正気圧および負気圧を圧力コントローラ７３にそれぞれ供給するための空気圧（＋Ｐ）および真空（−Ｐ）源７４を含んでよい（または連結されてよい）。空気圧および真空源７４、７５は、空気チューブ（図示せず）を通ってシステム７０に接続されてよい。圧力コントローラ７３は、空気圧源７４、７５からの圧力変化を受けるための正の供給口７６および負の供給口７７に連結されてよい。圧力コントローラ７３は、正および負圧をピペット４０へ運ぶための運搬口７８をさらに含んでよい。このような方法で、ＤＡＳ２５は、細胞３０をピペット４０Ａの先端へ移動させ、空気に曝されるときに破裂させ、細胞膜３０ａおよびピペット先端４０Ａの間にギガシールを形成させるよう、圧力コントローラ７３を制御することができる（図１０Ａ〜１０Ｃ参照）。
【００８２】
空気圧制御システム７０は、ピペット４０の内部に印加される空気圧を制御する（図示せず）。圧力調整器７３の力および信号は、データ取得および制御システム２５によって制御されてよい。ピペット内部に空気圧を印加することによって、細胞３０はピペット先端４０Ａへ移動または流れる。図７に示すように、空気圧は、実測パッチクランプシール抵抗に基づいた、データ取得および制御システム２５の調製ソフトウェアによって調節されてよい。ギガシール用の印加圧力は、０．７から３．０ｐｓｉｇの範囲で変動する。
【００８３】
本発明の一実施例において、空気圧制御システム７０は、次のように操作されてよい。第一に、設定点を、例えば、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃログラムなどを使用して、確立してよい。設定点は、データ取得および制御システム２５を通じて圧力コントローラ７３へ送信されてよい。第二に、圧力コントローラ７３は、例えば、比例、積分、微分（ＰＩＤ）制御ループを使用して、入力された設定点の圧力を満たすために、弁の位置を変更してよい。そして第三に、圧力信号は、ユーザフィードバックのためにＤＡＳ２５へ戻されてよい。圧力信号は、圧力コントローラ７３によって測定されてよい。抵抗測定結果は、例えば、１〜２０Ｈｚの周波数で更新され（コンピュータおよびＤＡＣ２５の性能による）、空気圧は、例えば、５００ミリ秒（または、秒などの他の時間枠）以内など、新しい設定点の値に更新されてよい。これらの信号は、例えば、ＲＳ‐２３２接続などを使用して送信されてよい。
【００８４】
当技術分野で知られている様々な圧力制御プロトコルは、ピペット４０内での細胞３０の配置に使用されてよい。これらは、傾斜的（継続的な増加）または拍動的な（段階的な増加）方法での空気圧の印加を含むかもしれない。
【００８５】
図８は、液体洗浄システム２１の実施例を示す。本発明の一実施例において、別の液体洗浄システム２１は、例えば、複数のパッチクランプテストを行う細胞３０に対して、パッチクランプ測定の前後に、細胞３０から化学物質を洗い流すために使用される。図８は、コーンまたはトラフ２２が個々のピペット４０またはピペット４０の列を濯ぐために灌流することができる、ピペット洗浄システム２１の略図を示す。当然のことながら複数のコーンが使用される場合もあるが、単一のコーン２２が示される。例えば、コーン２２の列（または一連の列）は、ピペット４０の列（または一連の列）を同時に洗浄することが可能である。ポンプは、洗浄溶液をこれらのトラフ２２に灌流するために使用されてよい。図８に矢印で示すらせん状の液路は、最小限の細胞３０のシール妨害を確保するために注意深く制御されてよい。好ましくは、この液路は、洗浄液を接面からピペットの球状面に入らせることによって目的を果たす。随意に、内翼は、液体の動きを導くために使用されてよい。
【００８６】
液体洗浄システム２１の利点は、より多くの化合物を試験できるようになることである。濯ぎの列は、通常、試験化合物の列の間を十分に濯ぐために必要である。しかし、液体洗浄システム２１は、そのような濯ぎ列の必要性を取り除くので、洗浄／濯ぎの代わりに、化合物を試験するために使用されるより多くの列を備えることができる。
【００８７】
図９は、本発明の一実施例によって細胞の特性を測定する、本明細書で説明する（例えば、図１）システムを使用する方法を示すフローチャートである。以下に詳細に説明されるこの典型的な方法において、パッチクランプ構成は、複数のマイクロピペットのために確立される。パッチクランプ測定は、各細胞が薬剤などの試験物質に曝されている際に、複数の細胞に対して行われる。ピペットおよび膜は洗浄され、膜は、追加のパッチクランプ測定用に、他の試験物質に曝される。
【００８８】
ステップ１６０１において、細胞３０（例えば、ＣＨＯ‐Ｋ１細胞）は、ピペット４０に装着される。各ピペット４０は、パッチクランプ測定で使用されるためにピペットの内部に電極を有する。好ましくは、細胞３０は、注射器または小さいキャピラリーチューブ、好ましくはＷＰＩ社のＭｉｃｒｏＦｉｌＴＭキャピラリーニードルなどの他の手段を使用して、ピペット４０に注入する方法で装着する。
【００８９】
ステップ１６０２において、ピペット４０は、可動プラットフォーム１上にあるピペットホルダ７に配置される。例えば、八つのピペット４０は、ピペットホルダ７の列に配置されてよい。プラットフォーム１は、それぞれ試験化合物、対照物質または洗浄溶液を含む、一つ以上のマルチウェル化合物プレート３も保持する。
【００９０】
細胞３０は、ピペット４０がピペットホルダ７に配置された後に、ピペット４０に装着されてよいことに注意する。
【００９１】
ステップ１６０３において、プラットフォーム１は、ピペット４０（列に配置された複数のピペット、または他の配列に配置された複数のピペットなど）をピペット固定具５に安定した状態で取り付けるよう、ピペット固定具５に相対的に移動される。プラットフォームは、まず、ピペット４０が所定の位置に保持された状態のピペットホルダ７を、ピペット固定具５に沿って整列するように移動することができる。このステップでは、ピペットホルダ７は、まず、ピペット固定具５の直下の位置へと移動されてよい。その後、プラットフォーム１は、ピペットホルダ７によって保持されているピペット４０がピペット固定具５に安定した状態で取り付けられるよう、ピペット固定具の方へ上部に移動されてよい。ピペット固定具５は、ピペット４０をピペット固定具５に連結するための連結装置を含んでよい。
【００９２】
そして、ピペットホルダ７は、ピペット４０がピペット固定具５のみに連結されるよう、ピペット４０から外されてよい。好ましい実施の形態において、ピペット４０は、ピペット先端４０Ａが、例えば床など、下方向に向く実質的に垂直方向でピペット固定具５から安定した状態で吊るされる。
【００９３】
ステップ１６０４において、空気圧は、空気圧制御システム２１によってピペット４０の内部に印加され、各細胞３０を、ピペット４０を通過して移動させる。このステップを成し遂げる方法の一つは、図７に関して本明細書で説明する。好ましい実施の形態において、細胞３０は、最終的にピペット４０の先端４０Ａに到達する。このステップ１６０４の間、適切なシール、例えばギガオームシール、がピペット先端４０Ａおよび細胞膜３０Ａの間に確立する。シールがピペット先端および細胞（または巻膜など、その一部）の間に確立するとき、細胞およびピペットは、パッチクランプ構成にあると考えられる。ピペット先端４０Ａでは、細胞３０は外気に曝され、それにより、細胞壁３０Ａの一部は、自然に破裂し、「インサイドアウト全細胞」構成を作成するかもしれない（図１０Ａ〜１０Ｃ参照）。
【００９４】
細胞３０を位置付けするために使用される通常の圧力は、０．７から３ｐｓｉｇである。このステップ１６０４は、 好ましくは２〜６０秒、さらに好ましくは５〜１５秒かかる。細胞３０がピペット先端４０Ａに位置付けられると、ピペット４０内部の圧力は、０．０ｐｓｉｇに変更されてよい（ピペット内部とピペット外部の圧力の差圧がゼロということを示す）。ピペット内部の圧力は、正差圧０〜１ｐｓｉに変更してもよい。ある正圧は、シールの安定性を確保するために必要となる場合がある。
【００９５】
空気圧を印加する代わりに、上記の出願で開示されたものなど、細胞３０をピペット先端４０Ａに取り付ける他の手段が使用することができる。また、インサイドアウト全細胞構成の他に、他の種類の細胞構成も使用できる。例えば、ピペット先端４０が空気ではなく、生理食塩水または他の溶液に曝されると、細胞３０は破裂せず、細胞３０は他の種類のパッチクランプ測定の状態に置かれるかもしれない。
【００９６】
ステップ１６０５において、パッチクランプ構成は、一つ以上のピペット４０に対して検証されてよい。例えば、抵抗測定は、例えばギガシールなど、適切なシールが膜３０Ａおよびピペット４０のピペット先端４０Ａの間に形成されることを検証するために行われてよい。パッチクランプ構成が検証されるとき、膜３０Ａは、インサイドアウト全細胞パッチクランプ測定などのパッチクランプ測定の準備ができている。シールは、本明細書で説明される方法の様々なそれに続くステップを通じて、継続的に監視されてよい。
【００９７】
ステップ１６０６において、細胞は、空気に曝されてよい。例えば、細胞はピペット先端にあり、ピペット内部に向いたり、ピペット壁に接触したり、していない細胞膜の一部は、外気に曝されていてよい。このステップ１６０６は、図１０Ｃに関して説明するように生じるかもしれない（図１０Ａ〜１０Ｃ参照）。空気に曝されると、細胞膜は破裂し、細胞は、その後、インサイドアウト全細胞パッチクランプ構成となるかもしれない。パッチクランプ構成は、細胞が破裂する前ではなく破裂した後に、ステップ１６０５において検証されることに注意する。
【００９８】
ステップ１６０７において、ウェルプレート３およびピペット固定具５は、ピペット固定具５によって所定の位置に保持されるピペット４０の先端４０Ａにある膜３０Ａがウェルプレート３の第一のウェル３Ａに含まれる一つ以上の第一の物質に挿入されるよう、相対的に移動されてよい。ウェル３Ａにある物質は、各濃度の薬剤、食塩水、洗浄溶液、対照物質または他の化学物質を含んでよい。例えば、一つのウェルは一種類の薬液を含み、他のウェルは異なる濃度の薬剤を有する同様の溶液を含んでよい。好ましくは、各第一のウェル３Ａは、同一の物質を含む。
【００９９】
ウェル３Ａにある各物質は、好ましくは先端試料台の電子機器１８などの測定装置に連結した基準電極４５と電気接触している。例えば、基準電極４５は、ウェル３Ａの内部にあり、試液と物理的に接触していてよい。このような方法で、基準電極４５は、パッチクランプ測定のために、物質および膜３０Ａを通過する電流を伝導してよい。
【０１００】
このステップ１６０７の間、膜３０Ａは、ウェル３Ａの効力によって、物質および電極の両方に接触しているはずであり、膜も、ピペット４０の内部にある他の電極４を接触しているはずである。電極４は、従来のパッチクランプ法によると、ピペット４０の内部（ピペットの本体など）のどこにあってもよい。
【０１０１】
ステップ１６０８において、膜３０Ａの電気特性は測定される。例えば、パッチクランプ測定は、膜３０Ａが第一のウェル３Ａにある第一の物質を接触している際に行われる。このような方法で、例えば、膜３０Ａのイオンチャネルでの第一の試験物質の効果が測定されてよい。
【０１０２】
好ましい実施の形態において、一つ以上の電極および／または細胞３０または細胞膜３０Ａを渡る電流、電極および／または細胞３０または細胞膜３０Ａを渡る電圧、電気抵抗、インピーダンス、光蛍光、プラズモン共鳴、機械的共振、流動性、および／または剛性のうち一つ以上のパラメータ（例えば電気特性）が細胞３０において測定されてよい。細胞膜において発現したタンパク質は、印加された電気的、機械的力などによって左右されるので、それらの構造によって変化するかもしれない。
【０１０３】
ステップ１６０９において、ピペット固定具５およびウェルプレート３は、第一のウェル３Ａがピペット先端４０Ａ（および本明細書では膜３０Ａ）から外れるよう、相対的に移動される。例えば、ウェルプレート３は、ピペット固定具５（およびそこに安定した状態で取り付けられたピペット４０）が所定の位置にある間に、ピペット固定具５から離れた下方向へ移動することができる。代替的に、ピペット固定具５は、上方へ移動され、ウェルプレート３から離されることによって、同様の結果を得ることができる。
【０１０４】
ステップ１６１０において、膜３０Ａおよび／またはピペット４０は、随意に洗浄される。洗浄ステップ１６１０は、過程のこの段階またはパッチクランプ測定後の他の段階で行われてよい。好ましくは、洗浄は膜３０Ａに付着している液体に残る任意の試験物質も最終的に膜３０Ａでの活動レベルを下回るまで希釈されるよう、２〜５回行われる。
【０１０５】
一実施例において、ピペットおよび液体洗浄システム２１は、図８に示すように、ピペット先端４０Ａが液体洗浄システム２１の内部にあるよう、相対的に移動されてよい。そして液体は、各ピペット先端４０Ａおよび対応する膜３０Ａを通過してよい。複数のピペット４０は、複数の液体洗浄システム２１を使用して、同時に洗浄されてよく、各ピペット４０は、一つの液体洗浄システム２１を使用して、個別に順に洗浄されてもよい。
【０１０６】
他の実施例において、膜３０Ａおよび／またはピペット先端４０Ａは、洗浄液を含むウェル３Ａへ挿入されることによって洗浄されてよい。洗浄溶液を含むウェル３Ａは、第一の物質を含むウェル３Ａに隣接してよい。例えば、洗浄溶液は、第一の試験物質の含むウェル３Ａの他の列に隣接するウェル３Ａの一つ以上の列にあってよい。ステップ１６０８のパッチクランプ測定の後、ピペット先端４０Ａの列は、洗浄溶液を含んでいるウェル３Ａの２〜５の列に挿入されてよく、それにより、２〜５回洗浄される。物質および洗浄溶液のそのような位置付けは、ピペット先端４０Ａを移動して洗浄するために必要なステップおよび時間を最小限にする。
【０１０７】
洗浄後、ピペット先端４０Ａは、液体洗浄システム２１および洗浄ウェル３Ａから取り外される。そしてピペット４０は、追加のパッチクランプ測定の準備が整う。膜３０Ａが低濃度の試験物質を含むウェル３Ａから高濃度の試験物質を含むウェル３Ａへ移動される場合、洗浄ステップ１６１０は、標準的検査実習によると、排除されるかもしれない。
【０１０８】
ステップ１６１１において、ステップ１６０７〜１６０９は、第二組目の物質を含む第二組目のウェル３Ａに対して繰り返される。すなわち、ピペット先端４０Ａ（および本明細書に含まれる膜３０Ａ）および異なる組のウェル３Ａは、ピペット先端４０Ａがウェル３Ａにある第二の物質に接触するよう、相対的に移動される。一つ以上のパッチクランプ測定が行われ、膜３０Ａは、ピペット先端４０Ａがウェル３Ａから取り外されるよう、ピペット固定具５およびウェルプレート３を相対的に移動することによって、再度、物質から除去される。好ましくは、第二組のウェル３Ａは、第一組のウェル３Ａとは異なり、それに隣接する（またはステップ１６１０の洗浄ウェル３Ａに隣接する）。代替的に、他の実施例において、膜３０Ａは、このステップ１６１１において、同じ組のウェル３０Ａに再度組み合わされる。
【０１０９】
ステップ１６１２において、追加のパッチクランプテストは、同じ、または異なる膜３０Ａで行われてよい。例えば、ステップ１６０７〜１６０９は、第三組目の試験物質を含むウェル３Ａの第三の列に使用するピペット４０に対して繰り返されてよい。試験物質は、異なる薬剤または異なる濃度の既にテストされた薬剤を含む。
【０１１０】
また、異なるピペット４０（ピペットの異なる列など）は、同じまたは異なるウェル３Ａを使用して、一つ以上の一連のパッチクランプ測定および／または洗浄を実施するために使用される。この過程は、目的回数繰り返される。このような方法で、複数のパッチクランプ測定は、複数の膜および複数の薬剤（または各濃度の薬剤）に対して行われる。一つの細胞３０は、様々な測定に使用される。
【０１１１】
ステップ１６１３において、ピペット４０は、ピペット固定具５から外される。ピペットは、廃棄エリアまたは容器４９へ送られる（例えば、落とされる）。例えば、一列のピペット４０でのパッチクランプ試験を終了すると、ピペット４０は、プラットフォーム１をピペット固定具５から離す（例えば、下方向へ）ことによって、化合物プレート３から取り外されてよい。そしてピペット４０は、高圧のパルスをピペット４０の列に与えることによって、ピペット固定具５から取り外され、廃棄エリア４９へ排出する。代替的に、ピペット４０をピペット固定具５に連結する装置は、ピペット４０を取り外し、ピペットを廃棄エリア４９へ送る。
【０１１２】
ステップ１６１４において、全過程は、他の組（例えば、列）のピペット４０および細胞３０に対して繰り返されてよい。過程は、第二組目のピペット４０が細胞３０を装着しているかということと、ピペット４０がピペットホルダ７に配置されているかによって、ステップ１６０１、１６０２、または１６０３から繰り返されてよい。
【０１１３】
ステップ１６１５において、パッチクランプ測定の結果は、データ取得および制御システム２５で処理される。結果は、各測定時など、任意の時点で処理されてよい。分析は、ＰｕｌｓｅｆｉｔあるいはＯｒｉｇｉｎ７などの、様々な市販のソフトウェア製品を使用して実施されてよい。
【０１１４】
本明細書で開示される方法を含む、他の方法も考えられる。
【０１１５】
当然のことながら、すべてのピペットおよびウェルを使用する必要はない。いくつかのウェルおよびペットは、一連のパッチクランプ測定に対して空のままであってよい。一実施例において、その方法は、一つのピペットおよび一つのウェルのみを使用する。同様に、当然のことながら、上述のステップが装置の好ましい使用方法を具体化する一方、当業者は特定の用途に適合するよう、ステップを追加したり削除したりしてよい。 
【０１１６】
好ましくは、本発明による方法は、複数の電位固定増幅器によるデータ取得装置に対して多重化した複数の記録要素を使用する。そのような増幅器は、電流クランプまたは位相固定の増幅器モードにおいても使用される。この処置は、高時間分解を提供し、すべてのウェルを実質的に同時に測定する。
【０１１７】
好ましくは、本発明による方法は、非常に少量の試験化合物を使用する。量が少ないと、次の試験の前に洗浄する化合物が少なくなるので、洗浄も少なくて済む。
【０１１８】
好ましくは、それらの方法は、温度および空気が制御された環境で行われる。これによって、細胞３０の研究を促す生理学的緩衝液、ガス交換、および温度のより正確な概算が得られる。
【０１１９】
様々な異なる細胞の種類は、本システムによって検査することができる。検査可能ないくつかの細胞の不完全なリストには、次が含まれる。Ｊｕｒｋａｔリンパ腫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、イオンチャネル／細胞系を含む輸送タンパク）、海馬、大脳皮質、脳幹、視床、へんとう体、視床下部、中脳、脊髄、および他のＣＮＳニューロンなどの神経組織からの一次細胞、神経節ニューロン、後根神経節ニューロン、および神経内分泌細胞、骨格筋、平滑筋、心筋、免疫細胞、血球、上皮、内皮、植物および遺伝子組み細胞。本発明の好ましい実施の形態において、ピペット２に密着し、テストされた細胞３０は、動物細胞である。細胞３０は、哺乳類、昆虫、または両生類の細胞であってよい。さらに好ましくは、細胞３０は、自然に、または既知の分子の生物学的技法によって人工的に導入されて、その細胞膜３０Ａにイオンチャネルまたは輸送タンパクを含む。よりさらに好ましくは、細胞３０は、ヒトの細胞など、哺乳類の細胞である。
【０１２０】
図１０Ａ〜１０Ｃは、本発明の一実施例による、インサイドアウトパッチクランプ構成における細胞３０の位置付け過程を示す。図１０Ａ〜１０Ｃは、細胞３０がピペット４０内でパッチクランプのための位置へ移動されるところのピペット４０および細胞３０を示す。細胞３０は、図１０Ａに示すように、ピペット内部のどこかの位置で開始してよい。例えば、不安定でない細胞３０は、ピペット４０の上部の広い部分を通ってピペット４０内部へ装着されてよい。細胞３０が先端に到着し、適切に構成すると（例えば、細胞膜３０Ａがピペット先端４０Ａでギガオームシールを形成する）、図１０Ｃに示すように、外気への暴露によって自然に細胞破裂が生じる。
【０１２１】
図１０Ａは、ピペット４０の内部の位置にある細胞３０を示す。空気圧制御システム７０は、ピペット４０にある細胞３０または液体４１に空気圧を印加し、それによって細胞３０はピペット先端４０の方へ下方に移動してよい。引力によって、この過程は容易なるかもしれない。
【０１２２】
図１０Ｂに示すように、細胞３０は、最終的にピペット先端４０へ到達する。この位置で細胞は外気に曝され、それによりその曝された細胞膜３０Ａは破裂する。
【０１２３】
図１０Ｃに示すように、破裂した細胞３１は、ピペット先端４０またはその近くに留まる、インサイドアウト全細胞構成を生じさせる。ここでは、破裂した全細胞３１はピペット４０の内部にあり、細胞膜３０Ａ内部の一部は、ピペット４０から外向きのピペット先端４０で曝される。吸引は必要ではないが、細胞膜３０Ａおよびピペット先端４０Ａの間にギガオームシール（またはギガシールと称される）を作成するために、ピペット４０の内部が吸引されてよい。そして破裂した細胞３１は、ピペット４０の先端４０Ａで曝される膜３０Ａの一部に渡る、インサイドアウト全細胞パッチクランプ測定の準備が整う。
【０１２４】
図１１は、本発明の一実施例による、「インサイドアウト」全細胞パッチの等価電子回路を示す。構成は、全細胞３０が細胞３０および膜３０Ａの内部が外向きになっているピペット４０内にあるので、この名称が付いた。
【０１２５】
電子回路は、パッチクランプ測定を行うために使用される典型的な任意の電子回路を含んでよい。ここでは、ＨＥＫＡ ＥＰＣ９／２増幅器が使用されてよい。
【０１２６】
ギガシール４０１は、細胞３０およびピペット４０の間に形成される。シール４０１のため、ピペット４０内部の圧力（Ｐｉ）は、通常は大気圧である、ピペット４０外部の圧力（Ｐａｔｍ）とは異なってよい。外部の圧力と比較して、ピペット４０内部の異なる相対圧力Ｐｉは、ギガシールを作成する。イオンチャネル４０２は、ギガシール４０１を形成する膜に沿って、およびそれに渡って存在する。
【０１２７】
回路の図解は、基礎的なパッチクランプ測定の回路を形成するレジスタおよびコンデンサの間の接続を示す。電流（Ｉ）および電圧（Ｖ）は、回路において測定される。実測電流は、通常、一つ以上のイオンチャネル４０２を通って流れる電流である。
【０１２８】
[実施例：本発明の方法を使用して得られた結果]
いくつかの実験は、本明細書で説明する方法を使用して実施された。イオンチャネルの結果は、図１２〜１７に示される。
【０１２９】
図１２は、本発明の一実施例による、一つのピペットおよび一つの細胞に対する外向きカリウム電流を示す。これらの電流は、−７０ｍＶの保持電位から−１１０ｍＶへの５００秒長プレパルスに先行され、＋４０ｍＶの試験電圧によって誘発された。図１２で見られる信号対雑音の欠乏は、高質の信号を示す。電流トレースは、５分間隔で得られた。
【０１３０】
図１３は、本発明の一実施例による、安定したピーク電流振幅を表したグラフを示す。ピーク電流は、図１２で使用された設定によって、一つのピペットおよび一つの細胞に対して測定された。図１３に示すように、ピーク電流は、多数の測定を通して比較的安定した（１３ｎＡ付近）。安定したピーク電流の測定値によって、研究者は薬物効果およびパッチクランプ構成の悪さを確実に区別することができる。ほとんどのパッチクランププロトコルは、一つのテスト済み化合物濃度につき１０分間の比較的安定した測定を要求する。図１３に示すように、本発明の一実施例のピーク電流は、４０分以上の間非常に安定した状態で（１３ｎＡ付近）、次の２０〜３０分にわずかな（５〜１０％、０．５〜１ｎＡ）低下を見せた。
【０１３１】
図１４〜１７は、本発明の一実施例による、システムの急激な発生および流出の特徴を説明する。これらの特徴は、「インサイドアウト」全細胞構成の高い拡散率に一致する。二つの代表的な実験が図８〜１１に示される。
【０１３２】
図１４は、本発明の一実施例による、試験化合物を有する外向きカリウム電流を表すグラフを示す。特に、図１４は、２０ｍＶの増加における−６０ｍＶから４０ｍＶの範囲で０．５秒テストパルスのための、一つのピペットにある第一の細胞に対する外向きカリウム電流を示す。各テスト増加は、−１１０ｍＶの０．５秒長過分極プレパルスに続き、パルス間では−７０ｍＶを維持した。第一の（最左）プロットでは、電流の測定は、細胞が対照溶液に浸されている間に行われた。そして細胞は、１０ｍＭの４‐ＡＰ浴溶液に入れられ、第二の（中間）プロットの測定値が記録された。４‐ＡＰと呼ばれる化学薬品は、これらのイオンチャネルの薬理学的遮断薬である。そして細胞は、４‐ＡＰ溶液を洗い落とし、再度、対照溶液に浸された。測定値は、第一および第二のプロットと同様に記録され、結果は、第三の（最右）のプロットに示される。インサイドアウト全細胞パッチクランプ測定の目的のため、対照および４‐ＡＰ浴は細胞内調節を示した。 
【０１３３】
図１４に示す結果は、細胞内調節を示す１０ｍＭの４‐ＡＰ浴溶液は、カリウム電流振幅を約５０％遮断したことを説明する（第一および第三のプロットと比較して、真中のプロット参照）。洗浄後の結果（右のプロットに表示）が４‐ＡＰ浴の適用前の最初の対照の状況で得られた結果とほぼ同一の結果なので、これらの結果も、効果は流出灌流によって完全に（または、少なくとも実質的に）可逆するとういことを示す。
【０１３４】
図１５は、本発明の一実施例による、印加された膜電圧（Ｖ）の機能としてのカリウム電流振幅（Ｉ）の反応を表すグラフを示す。これらの結果は、電流振幅対膜電圧プロットにおける図１４の結果を示す。ここでは、黒い四角い点は、図１４の最左のプロットに相当し、黒い丸は、１０ｍＭの４‐ＡＰ浴溶液の存在下でのカリウム電流の減少を示す、図１４の真中のプロットに相当し、白い丸は、図１４の最右のプロットにおける、４‐ＡＰが洗い流された後の測定値に相当する。図１５に示されるように、細胞が１０ｍＭの４‐ＡＰ浴溶液の中にあるときの膜上の電流（塗りつぶされた黒丸で表示）は、細胞が対照溶液の中にあるときの電流の５０％以下であった。さらに、洗浄後の対照溶液を使用した測定値（白丸で表示）は、浸す前に得られた結果（塗りつぶされた黒四角で表示）とほぼ同一の結果であり、化学物質を洗浄することによって細胞をうまく前の状態へも戻せる、可逆過程を示す。
【０１３５】
図１６は、第二の細胞の反応を示す。図１６は、図１４に同様の遮断が第一の細胞に関して示されているように、４‐ＡＰによる第二の細胞膜におけるイオンチャネルの薬理学的遮断を説明する。真中のプロットは、薬剤である４‐ＡＰが作用している間の電流を示す。この電流は、それぞれ薬物作用の前後での対照溶液における測定値に相当する、左および右のプロットより、約５０％低い。このデータに関して、電流対時間の分析は図１７に示される。
【０１３６】
高品質のピペットグラス電極を使用して、７０〜８０％の成功率（正確なギガシールおよびその後の全細胞形成）は、ＣＨＯ‐Ｋ１、Ｕ９３７、およびＨＥＫ２９３を含む、多数の細胞系に対して定期的に観察された。多くの他のシステムが自動化される一方、シールの質はまだ文献には明確に述べられていない。本発明のシステムによって、一日に数百という細胞をテストすることが可能である。
【０１３７】
図１７は、システムの流出能力を説明し、左、真中、右のプロットに相当する薬物作用の前、最中、後の電流振幅を示す。結果は、洗浄後の測定値（最右データの組）は細胞が対象物質に曝されたときの測定値とほぼ同じであることを示す。
【０１３８】
測定は１０秒間隔で行われ、測定値は各試験物質に対して非常に一定した。よって、たった１０秒の間隔は、様々な定常状態レベルに戻すために必要であり、再度、インサイドアウト構成の高い拡散率の特徴を示す。
【０１３９】
本発明により、任意の小分子、有機化合物、ペプチド、毒素、抗体、またはタンパク質、特に医療および農業ライブラリにある文書類は、例えば、パッチクランプ測定において試験物質として使用され、細胞膜に適用される。
【０１４０】
本発明により、本明細書で開示された装置および方法は、化合物を特定するための選別、または細胞の電気特性に影響を与える過程において使用されてよい。特定可能な化合物の限定されない例には、神経伝達物質、神経伝達物質アナログ、酵素阻害薬、イオンチャネルモジュレータ、Ｇタンパク質およびそれらのリガンド、モジュレータ、受容体、輸送阻害剤、ホルモン、ペプチド、毒素、抗体、製薬用薬剤、化学物質、およびこれらの化合物の任意の組み合わせがある。
【０１４１】
興味深い特定の化合物には、イオンチャネルモジュレータ（遮断薬、開口薬、ゲート修飾薬）、プリン作動、コリン作用、セロトニン作動、ドーパミン作用、麻酔薬、ベンゾジアゼピン、バルビツール酸系催眠薬、ステロイド、アルコール、金属カチオン、カンナビノイド、コレシストキニン、サイトカイン、興奮性アミノ酸 、ガンマアミノ酪酸、ガングリオシド、ヒスタミン感作、メラトニン、神経ペプチド、神経毒、エンドセリン、ＮＯ化合物、オピオイド、シグマ受容体リガンド、ソマトスタチン、タキキニン、アンジオテンシン、ボンベシン、ブラジキニン、プロスタグランジン、およびこれらの化合物の任意の組み合わせがある。
【０１４２】
本明細書で開示される選別によって特定されうる細胞過程には、細胞‐細胞の相互作用、細胞‐細胞融合、ウイルス感染、エンドサイトーシス、エクソサイトーシス、膜の再生利用、および膜‐リガンドがある。すべての細胞過程は、細胞の一つ以上の電気特性において測定可能な変更を生じさせることが可能なので、本発明は、そのような過程を研究するために使用される。同様に、これらの研究は、細胞過程を調節する化合物を発見するために使用される。
【０１４３】
本発明の利点は、コストおよび灌流システムの内部に残り得る残渣による不慮の汚濁を著しく削減する、追加のチューブまたは付属品の必要性を省くことである。試験化合物は、灌流システムに使用するチューブによく付着するので、そのようなシステムは、さらなるチューブの洗浄および／または取替えを必要とする。本発明は、この問題を排除する。
【０１４４】
本発明の利点は、一つのウェルから他のウェルへの膜の移動を速くすることができることである。ピペットは、一つのウェルから移動させ、他のウェルに挿入させることができる。化合物の希釈および灌流システム調整のための時間のかかる操作の必要性はない。重要なことには、灌流による細胞を含む浴チャンバーの在中物を取り替えるための遅いステップは、一つのウェルから次のウェルへピペットを移動するのにかかる時間を少なくする。さらに、本発明は、コストおよび灌流システムの内部に残り得る残渣による不慮の汚濁を著しく削減する、追加のチューブまたは付属品の必要性を省く。試験化合物は、灌流システムに使用するチューブによく付着し、チューブの洗浄または取替えを必要とする。この問題は、本明細書に記述されるシステムおよび方法によって排除される。
【０１４５】
当然のことながら、本明細書で示され、記述された本発明の特定の実施例は、具体例にすぎない。多くの変形、変更、代替および等価物が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、当該分野に精通した者により実行されるだろう。特に、本明細書で使用された用語は、関連する仕様で使用される類似した用語の下で幅広く読まれるべきである。よって、本明細書に記載および添付の図で示される全ての主題内容は、例示的であり、制限されるものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により独立して定義されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】典型的な多重チャネルパッチクランプシステムの平面図を示す。
【図２】図１の多重チャネルピペットシステムの正面図を示す。
【図３】典型的なＸＹＺ主ネジロボットを示す。
【図４Ａ】典型的なピペット固定具部分組立品を示す。
【図４Ｂ】典型的なピペット固定具部分組立品を示す。
【図４Ｃ】典型的なピペット固定具部分組立品を示す。
【図５Ａ】典型的なピペットホルダ部分組立品を示す。
【図５Ｂ】典型的なピペットホルダ部分組立品を示す。
【図５Ｃ】典型的なピペットホルダ部分組立品を示す。
【図５Ｄ】典型的なピペットホルダ部分組立品を示す。
【図６】典型的なプレートを示す。
【図７】典型的な空気圧制御システムを示す。
【図８】典型的なピペット洗浄トラフを示す。
【図９】パッチクランプ測定を実施する典型的な方法を示す、フローチャートである。
【図１０Ａ】細胞をインサイドアウト構成に位置付けする典型的な過程を示す。
【図１０Ｂ】細胞をインサイドアウト構成に位置付けする典型的な過程を示す。
【図１０Ｃ】細胞をインサイドアウト構成に位置付けする典型的な過程を示す。
【図１１】「インサイドアウト」全細胞パッチの典型的な等価電子回路を示す。
【図１２】４‐ＡＰの効果および流出を示す、典型的なインサイドアウトパッチクランプ構成のカリウム電流を表すグラフである。
【図１３】典型的なインサイドアウトパッチクランプ構成の安定したピーク電流振幅を表したグラフを示す。
【図１４】試験化合物を有する典型的なインサイドアウトパッチクランプ構成の外向きカリウム電流を表したグラフを示す。
【図１５】典型的な インサイドアウトパッチクランプ構成のカリウム電流振幅作用を印加膜電圧の機能として表したグラフを示す。
【図１６】化学薬品である４‐ＡＰを有する典型的なインサイドアウトパッチクランプ構成のカリウム電流作用を表したグラフを示す。
【図１７】典型的なインサイドアウトパッチクランプ構成のカリウム電流振幅時間トレースを表したグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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