(57)【要約】  本発明は、ＨＣＶ  Ｅ２の結合に関与する領域として本明細書中に特定されているＳＲ-ＢＩ標的領域に結合する抗原結合性タンパク質に関する。特定された標的領域は、配列番号１、２、３または４の一本鎖抗体が結合する領域である。
2008509657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１可変領域と第２可変領域とを含んでなり、第１および第２可変領域が、配列番号１標的領域、配列番号２標的領域、配列番号３標的領域および配列番号４標的領域よりなる群から選ばれる１以上の標的領域に結合する、単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項２】
ａ）第１可変領域が、配列番号１のアミノ酸３１−３５を含む第１ＣＤＲ、配列番号１のアミノ酸５０−６６を含む第２ＣＤＲおよび配列番号１のアミノ酸９９−１０８を含む第３ＣＤＲを含むＶｈ領域であり、第２可変領域が、配列番号１のアミノ酸１５８−１７０を含む第１ＣＤＲ、配列番号１のアミノ酸１８６−１９２を含む第２ＣＤＲおよび配列番号１のアミノ酸２２５−２３５を含む第３ＣＤＲを含むＶｌ領域であるか、
ｂ）第１可変領域が、配列番号２のアミノ酸３１−３７を含む第１ＣＤＲ、配列番号２のアミノ酸５２−６７を含む第２ＣＤＲおよび配列番号２のアミノ酸１００−１１４を含む第３ＣＤＲを含むＶｈ領域であり、第２可変領域が、配列番号２のアミノ酸１６４−１７６を含む第１ＣＤＲ、配列番号２のアミノ酸１９２−１９８を含む第２ＣＤＲおよび配列番号２のアミノ酸２３１−２４１を含む第３ＣＤＲを含むＶｌ領域であるか、
ｃ）第１可変領域が、配列番号３のアミノ酸３１−３５を含む第１ＣＤＲ、配列番号３のアミノ酸５０−６６を含む第２ＣＤＲおよび配列番号３のアミノ酸９９−１０８を含む第３ＣＤＲを含むＶｈ領域であり、第２可変領域が、配列番号３のアミノ酸１５８−１７０を含む第１ＣＤＲ、配列番号３のアミノ酸１８６−１９２を含む第２ＣＤＲおよび配列番号３のアミノ酸２２５−２３５を含む第３ＣＤＲを含むＶｌ領域であるか、または
ｄ）第１可変領域が、配列番号４のアミノ酸３１−３５を含む第１ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸５０−６６を含む第２ＣＤＲおよび配列番号４のアミノ酸９９−１０８を含む第３ＣＤＲを含むＶｈ領域であり、第２可変領域が、配列番号４のアミノ酸１５８−１７０を含む第１ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸１８６−１９２を含む第２ＣＤＲおよび配列番号４のアミノ酸２２５−２３５を含む第３ＣＤＲを含むＶｌ領域である、請求項１記載の抗原結合性タンパク質。
【請求項３】
該結合性タンパク質が抗体またはそのフラグメントである、請求項２記載の結合性タンパク質。
【請求項４】
ａ）第１可変領域が配列番号１のアミノ酸１−１１９よりなり、第２可変領域が配列番号１のアミノ酸１３６−２４５よりなるか、
ｂ）第１可変領域が配列番号２のアミノ酸１−１２５よりなり、第２可変領域が配列番号２のアミノ酸１４２−２５１よりなるか、
ｃ）第３  Ｖｈ領域が配列番号３のアミノ酸１−１１９よりなり、第３  Ｖｌ領域は配列番号３のアミノ酸１３６−２４５よりなるか、または
ｄ）第４  Ｖｈ領域が配列番号４のアミノ酸１−１１９よりなり、第４  Ｖｌ領域が配列番号４のアミノ酸１３６−２４５よりなる、請求項３記載の結合性タンパク質。
【請求項５】
該結合性タンパク質が抗体である、請求項４記載の結合性タンパク質。
【請求項６】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項５記載の結合性タンパク質。
【請求項７】
該結合性タンパク質が一本鎖抗体であり、該Ｖｈ領域が約５〜１６アミノ酸長のアミノ酸リンカーにより該Ｖｌ領域に連結されている、請求項３記載の結合性タンパク質。
【請求項８】
ａ）第１可変領域が配列番号１のアミノ酸１−１１９よりなり、第２可変領域が配列番号１のアミノ酸１３６−２４５よりなるか、
ｂ）第１可変領域が配列番号２のアミノ酸１−１２５よりなり、第２可変領域が配列番号２のアミノ酸１４２−２５１よりなるか、
ｃ）第１可変領域が配列番号３のアミノ酸１−１１９よりなり、第２可変領域が配列番号３のアミノ酸１３６−２４５よりなるか、または
ｄ）第１可変領域が配列番号４のアミノ酸１−１１９よりなり、第２可変領域が配列番号４のアミノ酸１３６−２４５よりなる、請求項７記載の結合性タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の抗原結合性タンパク質をコードする組換え遺伝子を含んでなる核酸。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項記載の結合性タンパク質と医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項記載の結合性タンパク質の有効量を細胞に与える工程を含んでなる、該細胞におけるＨＣＶ複製の抑制方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項記載の結合性タンパク質の有効量を患者に投与する工程を含んでなる、患者におけるＨＣＶの治療方法。
【請求項１３】
該患者が、ＨＣＶに感染したヒトである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項９記載の核酸を含んでなる組換え細胞であって、該細胞内で該ヌクレオチド配列が発現される、組換え細胞。
【請求項１５】
請求項１４記載の組換え細胞を、該細胞内で該ヌクレオチド配列が発現される条件下で成長させ、該抗原結合性タンパク質を単離する工程を含んでなる、抗原結合性タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣＶの複製を抑制するスカベンジャー受容体Ｂ１に対する抗原結合性タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願において引用されている参考文献は、特許請求されている本発明に対する先行技術であることを自認するものではない。
【０００３】
世界の人口の約３％はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染していると見積もられている（Ｗａｓｌｅｙら，Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．２０：１−１６，２０００）。ＨＣＶへの曝露は少数の場合には明らかな急性疾患を引き起こすが、ほとんどの場合には、該ウイルスは、肝炎を引き起こす慢性感染を確立し、肝不全および肝硬変へと徐々に進行させる（Ｓｔｒａｄｅｒら，ＩＬＡＲ  Ｊ．４２：１０７−１１６，２００１）。疫学的調査は、肝細胞癌の発生におけるＨＣＶの重要な役割を示している（Ｓｔｒａｄｅｒら，ＩＬＡＲ  Ｊ．４２：１０７−１１６，２００１）。
【０００４】
ＨＣＶはいくつかの異なる遺伝子型（１〜６）および亜型（ａ〜ｃ）に分類されうる。該遺伝子型および亜型の分布は地理的にもリスクグループ間においても様々である（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．１４３：２４９３−２５０３，１９９８）。
【０００５】
ＨＣＶゲノムは、約３０００アミノ酸の前駆体ポリタンパク質をコードする約９．５ｋｂの一本鎖ＲＮＡよりなる（Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３６２−３６４，１９８９，Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３５９−３６２，１９８９）。該ＨＣＶポリタンパク質は、Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂの順序でウイルスタンパク質を含有する。該前駆体タンパク質の切断は、成熟した構造的および非構造的ウイルスタンパク質を与える（Ｎｅｄｄｅｒｍａｎｎら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８：４６９−４７６，１９９７）。
【０００６】
その感染サイクルの一部として、ＨＣＶは細胞内に侵入する。宿主細胞のＬＤＬ受容体およびＣＤ８１分子は推定ＨＣＶ受容体として特定されている。該ＬＤＬ受容体は、ウイルスに付随するＬＤＬ粒子への結合を介してウイルスのインターナリゼーションを媒介すると示唆されている（Ａｇｎｅｌｌｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１２７６６−１２７７１，１９９９）。ＣＤ８１分子は、ＨＣＶ遺伝子型１ａ由来の組換えエンベロープタンパク質Ｅ２に基づいて、ＨＣＶ  Ｅ２に結合すると示唆されている（Ｐｉｌｅｒｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：９３８−９４１，１９９８）。
【０００７】
ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ２は、ＣＤ８１には無関係にヒト肝細胞癌細胞に結合することが判明した。ヒト肝細胞へのＥ２の結合をもたらす受容体がヒトスカベンジャー受容体クラスＢ型１（ＳＲＢ１）として特定された（Ｓｃａｒｓｅｌｌｉら，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１：５０１７−５０２５，２００２）。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、ＨＣＶ  Ｅ２結合に関与する領域として本明細書中に特定されているＳＲＢ１標的領域に結合する抗原結合性タンパク質に関する。特定されている標的領域は、配列番号１、２、３または４の一本鎖抗体が結合する領域である。
【０００９】
したがって、本発明の第１の態様は、第１可変領域と第２可変領域とを含んでなる単離された抗原結合性タンパク質に関する。第１および第２可変領域は、配列番号１標的領域、配列番号２標的領域、配列番号３標的領域および配列番号４標的領域から選ばれる１以上の標的領域に結合する。
【００１０】
「単離（された）」に対する言及は、天然で見出されるものとは異なる形態を示す。そのような異なる形態は、例えば、天然で見出されるものとは異なる純度および／または天然では見出されない構造体でありうる。天然では見出されない構造体には、異なる領域が互いに組合されている組換え構造体、例えば、ヒトフレームワークスカフォールド上に１以上のマウスＣＤＲが挿入されているヒト化抗体、抗体結合性タンパク質からの１以上のＣＤＲが別のフレームワークスカフォールド内に挿入されたハイブリッド抗体、ならびに軽および重可変ドメインをコードする遺伝子がランダムに一緒に組合された天然ヒト配列に由来する抗体が含まれる。
【００１１】
単離されたタンパク質は、好ましくは、血清タンパク質を実質的に含有しない。血清タンパク質を実質的に含有しないタンパク質は、ほとんど又は全ての血清タンパク質を欠く環境中に存在する。
【００１２】
「可変領域」は重鎖または軽鎖からの抗体可変領域の構造を有する。抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、フレームワーク上に隔てて存在する３つの相補性決定領域を含有する。相補性決定領域は主として、特定のエピトープの認識をもたらす。
【００１３】
配列番号１、２、３または４に関して定義される標的領域は、対応する一本鎖抗体が結合するＳＲＢ１領域である。例えば、配列番号１標的領域は、配列番号１のポリペプチドが結合する領域である。
【００１４】
特定されている標的領域と同じ標的領域へのタンパク質結合は、その特定されている標的領域への結合に関して配列番号１、２、３または４と競合する。例えば、ＳＲＢ１への結合に関して配列番号１のポリペプチドと競合するタンパク質は配列番号１標的領域に結合する。
【００１５】
「タンパク質」または「ポリペプチド」なる語は連続的なアミノ酸配列を示し、最小または最大のサイズの限界を示すものではない。タンパク質またはポリペプチド内に存在する１以上のアミノ酸は例えばグリコシル化およびジスルフィド結合形成のような翻訳後修飾を含有しうる。
【００１６】
好ましい抗原結合性タンパク質はモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」なる語は、同じ又は実質的に同じ相補性決定領域および結合特異性を有する抗体の一群を示す。モノクローナル抗体における変異は、同じ構築物から抗体が産生された場合に生じるものである。
【００１７】
モノクローナル抗体は、例えば、特定のハイブリドーマから、および該抗体をコードする１以上の組換え遺伝子を含有する組換え細胞から産生されうる。該抗体は２以上の組換え遺伝子によりコードされることが可能であり、この場合、例えば、１つの遺伝子は重鎖をコードし、１つの遺伝子は軽鎖をコードする。
【００１８】
本発明のもう１つの態様は医薬組成物を記載する。該組成物は抗原結合性タンパク質と医薬上許容される担体とを含有する。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は、抗原結合性タンパク質をコードする組換え遺伝子を含有する核酸を記載する。組換え遺伝子は、適切な転写およびプロセシングのための調節要素（これは翻訳および翻訳後要素を含みうる）と共にポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する。該組換え遺伝子は宿主ゲノムから独立して存在することが可能であり、あるいは宿主ゲノムの一部でありうる。
【００２０】
組換え核酸は、その配列および／または形態により天然では存在しない核酸である。組換え核酸の具体例には、精製された核酸、天然で見出されるものとは異なる核酸が得られるよう一緒に組合された２以上の核酸領域、天然で互いに付随している１以上の核酸領域（例えば、上流または下流領域）の非存在が含まれる。
【００２１】
本発明のもう１つの態様は、細胞におけるＨＣＶ複製の抑制方法を記載する。該方法は、抗原結合性タンパク質の有効量を該細胞に与えることを含む。
【００２２】
本発明のもう１つの態様は、患者におけるＨＣＶ複製の抑制方法を記載する。該方法は、抗原結合性タンパク質の有効量を該患者に投与することを含む。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、抗原結合性タンパク質をコードする組換え核酸を含む組換え細胞を記載する。
【００２４】
本発明のもう１つの態様は、抗原結合性タンパク質の製造方法を記載する。該方法は、抗原結合性タンパク質をコードする組換え遺伝子を含む細胞を、該ヌクレオチド配列が該細胞内で発現される条件下で成長させ、該抗原結合性タンパク質を単離することを含む。
【００２５】
「単離（された）」なる語は１以上の細胞成分からの該タンパク質の分離を示す。好ましくは、該タンパク質は実質的に精製されている。
【００２６】
個々の用語が互いに矛盾しない限り、「または」なる語は一方または両方の可能性を示す。時には、一方または両方の可能性を強調するために、「および／または」のような語が使用される。
【００２７】
「含む（含んでなる）」のような非限定的用語は追加的な要素または工程を許容する。時には、追加的な要素または工程の可能性を強調するために、非限定的用語と共に又はそれを伴わずに「１以上」のような語が使用される。
【００２８】
特に明示されない限り、単数表現は単数に限定されない。例えば、「細胞」は複数の「細胞」を除外するものではない。時には、複数の存在の可能性を強調するために、１以上のような語が使用される。
【００２９】
本発明の他の特徴および利点は、本明細書に記載されている更なる説明から明らかである。記載されている実施例（具体例）は、本発明の実施において有用な種々の成分および方法を例示するものである。該実施例は、特許請求されている発明を限定するものではない。本開示に基づけば、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を特定し使用することが可能である。
【００３０】
発明の詳細な説明
本出願は、細胞へのＨＣＶ  Ｅ２結合を抑制するために標的化されうる特定のＳＲＢ１領域を特定するものである。後記の実施例は、配列番号１〜４の一本鎖抗体がＨＣＶ  Ｅ２結合を抑制しうること、配列番号２または４可変領域を含有するＩｇＧ分子がＨＣＶ  Ｅ２結合を抑制しうること、および配列番号２がＨＣＶ複製を抑制しうることを示している。
【００３１】
ＨＣＶ  Ｅ２結合の抑制は研究手段として及び治療上有用でありうる。研究手段の用途には、ＨＣＶの結合および複製を研究するための、ならびに同じ領域に結合する追加的な結合性タンパク質を特定するための手段としての、該結合性タンパク質の使用が含まれる。治療用途には、患者におけるＨＣＶを治療し又はその始動を抑制するための、適当な薬理学的特性（例えば、効力、および許容されない毒性が存在しないこと）を有する化合物の使用が含まれる。
【００３２】
標的ＳＲＢ１は、膜貫通ドメインによりアミノ末端およびカルボキシル末端の両方において細胞膜につなぎ止められた大きな細胞外ループを含有する糖タンパク質である（Ｋｒｉｅｇｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １０８：７９３−７９７，２００１）。ＳＲ−Ｂ１は肝細胞およびステロイド産生性組織において高度に発現され、コレステロールおよびリン脂質の選択的細胞取り込みをもたらす（Ａｃｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：５１８−５２０，１９９６，Ｕｒｂａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３３４０９−３３４１５，２０００）。
【００３３】
配列番号９は、配列番号１、２、３および４の一本鎖抗体を得るために使用されるＳＲ−Ｂ１のアミノ酸配列を示す。配列番号９は、抗原結合性タンパク質に関する参照のフレームとして使用されうる。
【００３４】
Ｉ．抗原結合性タンパク質
抗原結合性タンパク質は、エピトープへの特異的結合をもたらす抗体可変領域を含有する。該抗体可変領域は例えば完全抗体、抗体フラグメント、および抗体または抗体フラグメントの組換え誘導体中に存在しうる。
【００３５】
図１および２は、異なるタイプの抗原結合性タンパク質のいくつかの具体例を示す。図１は完全ＩｇＧ分子および種々の抗体領域を例示する。ＩｇＧ分子は４本のポリペプチド鎖を含有し、２本はより長い重鎖であり、２本はより短い軽鎖である。重鎖および軽鎖はそれぞれ、定常領域および可変領域を含有する。可変領域内には、抗原特異性をもたらす超可変領域が存在する（例えば、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．およびＳｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１９９９；ならびにＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。
【００３６】
２本の重鎖カルボキシル領域は、Ｆｃ領域を与えるようジスルフィド結合により連結された定常領域である。Ｆｃ領域は、補体およびマクロファージ活性化のような生物活性をもたらすのに重要である。Ｆｃ領域を構成する２本の重鎖ポリペプチドのそれぞれは、ヒンジ領域を介して異なるＦａｂ領域内に伸長する。
【００３７】
高等脊椎動物においては、２つのクラスの軽鎖および５つのクラスの重鎖が存在する。軽鎖はκまたはλである。重鎖は該抗体クラスを決定し、α、δ、ε、γまたはμのいずれかである。例えば、ＩｇＧはγ重鎖を有する。γ１、γ２、γ３およびγ４のような異なるタイプの重鎖に関するサブクラスも存在する。重鎖は、ヒンジおよび尾部領域に、特徴的なコンホメーションを付与する（Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。
【００３８】
サブクラスは更に詳細に特徴づけられうる。例えば、ＩｇＧ２サブタイプは更に、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂに分類されうる（Ｈａｈｎ  Ｇ．Ｓ．（１９８２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｔｅｓ．Ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ．Ｓ．Ｅ．Ｒｉｔｚｍａｎｎ（編）Ａｌａｎ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＴｕｒｎｅｒ  Ｍ．Ｗ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＥＪ．Ｈｏｌｂｏｒｏｗ  ＆  Ｗ．Ｇ．Ｒｅｅｖｅｓ（編）Ｇｒｕｎｅ  ＆  Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ）。
【００３９】
抗体可変領域を含有する抗体フラグメントには、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦａｂ２領域が含まれる。各Ｆａｂ領域は、可変領域と定常領域とから構成される軽鎖、および可変領域と定常領域とを含有する重鎖領域を含有する。軽鎖は、定常領域を介してジスルフィド結合により重鎖に連結されている。Ｆａｂ領域の軽鎖および重鎖可変領域は、抗原結合に関与するＦｖ領域を与える。
【００４０】
また、抗体可変領域は、一本鎖抗体および小型抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）のような、可変領域を含有するタンパク質の一部でありうる。一本鎖抗体は、リンカーにより互いに連結された軽鎖および重鎖可変領域を含有する（図２を参照されたい）。該リンカーは例えば約５〜１６アミノ酸でありうる。小型抗体は、約８０ｋＤａの二価二量体へと自己集合する一本鎖−ＣＨ３融合タンパク質である。
【００４１】
可変領域の特異性は、より保存的な隣接領域（フレームワーク領域と称される）の間に介在する３つの超可変領域（相補性決定領域とも称される）により決定される。フレームワーク領域および相補性決定領域に関連したアミノ酸は、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１に記載されているとおりに番号付けされ、整列（アライン）されうる。
【００４２】
ＩＩ．配列番号１〜４標的領域
配列番号１、２、３および／または４が結合するＳＲ−Ｂ１領域は、ＨＣＶ  Ｅ２の結合を抑制する標的領域となる。配列番号１〜４の一本鎖抗体は必ずしも、異なる領域に結合するわけではない。配列番号１および４は同一エピトープを認識するはずである。配列番号１および４は非常に高い相同性を有し、ＣＤＲ３内に１つの異なるアミノ酸を有し、フレームワーク領域内に少数の若干の変化を有する。
【００４３】
本明細書に記載の抗原結合性タンパク質は、ＨＣＶ  Ｅ２の結合に関与するＳＲ−Ｂ１標的領域に結合する。ＨＣＶ  Ｅ２の結合の抑制は、ＨＣＶ  Ｅ２の結合に関与する部位との相互作用により生じると予想されるが、ＨＣＶ  Ｅ２の結合に関与する領域は、ＨＣＶ  Ｅ２の結合と直接的には相互作用しない領域を含みうる。例えば、標的化領域は、ＨＣＶ  Ｅ２に直接結合する異なる領域に適切なコンホメーションを付与するのに関与しうる。
【００４４】
配列番号１〜４の一本鎖抗体は、ＨＣＶ  Ｅ２結合を抑制するのに使用されうる抗原結合性タンパク質の具体例である。配列番号１〜４は、標的化領域に結合する他の抗原結合性タンパク質を設計するためにも使用されうる。他の結合性タンパク質の設計は、例えば、配列番号１〜４に記載の配列情報を用いて配列番号１〜４を誘導体化すること、または同一領域に結合するタンパク質を実験的に特定するための手段として配列番号１〜４を使用することを含む技術を用いて行われうる。
【００４５】
配列番号１〜４は、抗原結合性タンパク質内に組込まれうる可変領域配列および相補性決定領域配列を与える。図３Ａおよび３Ｂは配列番号１〜４のアミノ酸配列を示し、種々の相補性決定領域、フレームワーク領域およびリンカー領域の位置を示す。
【００４６】
抗原結合性タンパク質がＨＣＶ  Ｅ２結合およびＨＣＶ複製を抑制しうることは、例えば後記実施例に記載されているような方法を用いて評価されうる。ＨＣＶ  Ｅ２結合を抑制する抗原結合性タンパク質は、他の抗原結合性タンパク質を得るための出発構築物として使用されうる。
【００４７】
ＩＩ．Ａ．一本鎖抗体の修飾
既知配列（例えば、配列番号１、２、３または４）の一本鎖抗体は、安定性を増強するために及び抗原結合性を増強するために誘導体化されうる。安定性に影響を及ぼす要因には、定常ドメイン境界部における全ＩｇＧ分子の境界部に隠れている疎水性残基の露出；分子間相互作用をもたらす、Ｆｖ表面上の疎水性領域の露出；およびＦｖベータシートの内部または通常はＶＨとＶＬとの境界部の疎水性残基が含まれる（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｃＦｖｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｐ．２３７−２５４  ｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＷｅｌｓｃｈｏｆおよびＫｒａｕｓｓ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，２００３）。
【００４８】
安定性は、安定性に影響を及ぼす、問題のある残基を置換することにより、増強されうる。埋もれた疎水性残基および露出した疎水性残基は潜在的に問題である。問題のある残基を考慮した一本鎖抗体の安定性を増強するための技術は当技術分野でよく知られている（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｃＦｖｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｐ．２３７−２５４  ｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｗｅｌｓｃｈｏｆ  ａｎｄ  Ｋｒａｕｓｓ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，２００３）。
【００４９】
一本鎖抗原のアフィニティーは、例えば部位特異的突然変異誘発および鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）のような技術を用いて増強されうる。部位特異的突然変異誘発は、１以上の相補性決定領域アミノ酸を置換し次いでより高いアフィニティーを有する抗体を特定するために行われうる（Ａｚｚａｚｙら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：４２５−４４５，２００２）。
【００５０】
鎖シャフリングは、抗原に結合する可変領域の新規組合せを得るために行われうる。鎖シャフリングは、一本鎖抗体ライブラリーを得るために一本鎖抗体可変領域（例えば、ＶＨ）を異なる可変領域（例えば、ＶＬ）のレパートリーと組合せることにより行われうる。得られたライブラリーは、該抗原に特異的であることが判明している可変領域と、ランダムな可変領域とを含有する。増強されたアフィニティーを有する該抗原に結合する一本鎖抗体を特定するために、該ライブラリーを該抗原に対してパンニングすることが可能である。
【００５１】
ＩＩ．Ｂ．可変領域情報に基づく抗原結合性タンパク質の構築
配列番号１〜４の一本鎖抗体からの可変領域および相補性決定領域は抗原結合性タンパク質内に組込まれうる。可変領域を抗体または抗体フラグメント内に組込むための技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｚｚａｚｙら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：４２５−４４５，２００２，Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８，１９９７）。そのような技術の一例は以下のとおりである。
【００５２】
１）ＶＨおよびＶＬ領域に特異的なＰＣＲプライマーを使用して、Ｆｖドメインを別々に増幅する。該プライマーは、スプライス部位を与えるユニーク（唯一の）制限部位を導入するための及び追加的なアミノ酸をコードするための追加的なヌクレオチドを含みうる。
２）増幅された該可変コード領域を哺乳類発現カセット内に組込む。ＶＨコード核酸は、ヒト重鎖（例えば、ヒトγ４重鎖）を発現させるためのカセットを含有するプラスミド内に挿入することが可能であり、ＶＬコード領域は、軽鎖（例えば、ヒトγ軽鎖）を発現するベクター内に導入することが可能である。どちらのベクターも、リーダー配列と抗体の定常領域配列との間にイントロンを含有すべきである。該イントロンは、増幅されたＦｖドメインをクローニングするのに適したユニーク制限部位を含有すべきである。
３）ＩｇＧの産生は、２９３−ＥＢＮＡ内にＶＨおよびＶＬ発現ベクターをコトランスフェクトすることにより達成されうる。
【００５３】
抗体または抗体フラグメント内に可変領域を組込むためには、概説されている方法の多数の変法が用いられうる。そのような変法には、例えば、異なるタイプの抗体軽鎖および重鎖またはそれらのフラグメントをコードするベクターの使用、単一のベクターの使用、および異なるタイプの宿主細胞の使用が含まれる。
【００５４】
相補性決定領域を抗体または抗体フラグメント内にグラフティングするための技術も当技術分野でよく知られている。そのような技術は全般的には、マウス可変領域をヒト抗体フレームワーク上にグラフティングし必要に応じて更なる修飾を行うことによるマウス抗体のヒト化に関して記載されている（例えば、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ＣＤＲ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ，ｐ  ８１−１００，  Ｆｒｏｍ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ２０７：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＷｅｌｓｃｈｏｆおよびＫｒａｕｓｓ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，２００３）。
【００５５】
別の実施形態においては、抗原結合性タンパク質は完全抗体、抗体フラグメント、または抗体もしくは抗体フラグメントの組換え誘導体であり、ここで、
ａ）第１可変領域は、配列番号１のアミノ酸３１−３５を含む第１ＣＤＲ、配列番号１のアミノ酸５０−６６を含む第２ＣＤＲおよび配列番号１のアミノ酸９９−１０８を含む第３ＣＤＲを含むＶｈ領域であり、第２可変領域は、配列番号１のアミノ酸１５８−１７０を含む第１ＣＤＲ、配列番号１のアミノ酸１８６−１９２を含む第２ＣＤＲおよび配列番号１のアミノ酸２２５−２３５を含む第３ＣＤＲを含むＶｌ領域であり、
ｂ）第１可変領域は、配列番号２のアミノ酸３１−３７を含む第１ＣＤＲ、配列番号２のアミノ酸５２−６７を含む第２ＣＤＲおよび配列番号２のアミノ酸１００−１１４を含む第３ＣＤＲを含むＶｈ領域であり、第２可変領域は、配列番号２のアミノ酸１６４−１７６を含む第１ＣＤＲ、配列番号２のアミノ酸１９２−１９８を含む第２ＣＤＲおよび配列番号２のアミノ酸２３１−２４１を含む第３ＣＤＲを含むＶｌ領域であり、
ｃ）第１可変領域は、配列番号３のアミノ酸３１−３５を含む第１ＣＤＲ、配列番号３のアミノ酸５０−６６を含む第２ＣＤＲおよび配列番号３のアミノ酸９９−１０８を含む第３ＣＤＲを含むＶｈ領域であり、第２可変領域は、配列番号３のアミノ酸１５８−１７０を含む第１ＣＤＲ、配列番号３のアミノ酸１８６−１９２を含む第２ＣＤＲおよび配列番号３のアミノ酸２２５−２３５を含む第３ＣＤＲを含むＶｌ領域であり、
ｄ）第１可変領域は、配列番号４のアミノ酸３１−３５を含む第１ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸５０−６６を含む第２ＣＤＲおよび配列番号４のアミノ酸９９−１０８を含む第３ＣＤＲを含むＶｈ領域であり、第２可変領域は、配列番号４のアミノ酸１５８−１７０を含む第１ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸１８６−１９２を含む第２ＣＤＲおよび配列番号４のアミノ酸２２５−２３５を含む第３ＣＤＲを含むＶｌ領域であり、
ｅ）第１可変領域は配列番号１のアミノ酸１−１１９よりなり、第２可変領域は配列番号１のアミノ酸１３６−２４５よりなり、
ｆ）第１可変領域は配列番号２のアミノ酸１−１２５よりなり、第２可変領域は配列番号２のアミノ酸１４２−２５１よりなり、
ｇ）第１可変領域は配列番号３のアミノ酸１−１１９よりなり、第２可変領域は配列番号３のアミノ酸１３６−２４５よりなり、または
ｈ）第１可変領域は配列番号４のアミノ酸１−１１９よりなり、第２可変領域は配列番号４のアミノ酸１３６−２４５よりなる。
【００５６】
ＩＩ．Ｃ．抗原結合性タンパク質の更なる同定
一本鎖抗体配列番号１、２、３または４は、標的化領域に結合する他の抗原結合性タンパク質を特定するために使用されうる。特定は、種々の技術、例えば、ＳＲＢ１に結合する配列番号１、２、３または４と競合する抗原結合性タンパク質に関するスクリーニング、一本鎖抗体配列番号１、２、３または４により認識されるエピトープのマッピング、および他の抗原結合性タンパク質を選択するための該エピトープ自体の使用により行うことが可能である。
【００５７】
競合アッセイにおいて使用する抗原結合性タンパク質は、ＳＲＢ１を抗原として使用して製造されうる。一本鎖抗体、抗体または抗体フラグメントのような抗原結合性タンパク質を製造するための技術は当技術分野でよく知られている。そのような技術の具体例には、ファージディスプレイ技術の利用、げっ歯類抗体の特定およびヒト化、ならびにＸｅｎｏＭｏｕｓｅまたはＴｒａｎｓ−Ｃｈｒｏｍｏマウスを使用するヒト抗体の製造が含まれる（Ａｚｚａｚｙら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：４２５−４４５，２００２，Ｂｅｒｇｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３２４（１）：１４−４０，２００２）。
【００５８】
ＩＩＩ．タンパク質の製造
抗原結合性タンパク質は、好ましくは、組換え核酸技術を用いて又はハイブリドーマの使用により製造される。組換え核酸技術はタンパク質合成のための核酸鋳型の構築を含む。ハイブリドーマは、抗原結合性タンパク質を産生する不死化細胞系である。
【００５９】
抗原結合性タンパク質をコードする組換え核酸は、実際にはコード化タンパク質のための工場として働く宿主細胞内で発現されうる。該組換え核酸は、宿主細胞ゲノムから自律して又は宿主細胞ゲノムの一部として存在する、抗原結合性タンパク質をコードする組換え遺伝子を与えうる。
【００６０】
組換え遺伝子は、タンパク質の発現のための調節要素と共にタンパク質をコードする核酸を含有する。一般には、組換え遺伝子内に存在する調節要素には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および場合によってはオペレーターが含まれる。真核細胞内でのプロセシングのための好ましい要素はポリアデニル化シグナルである。抗体関連イントロンも存在しうる。抗体または抗体フラグメントの製造のための発現カセットの具体例は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｐｅｒｓｉｃら．Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８，１９９７，Ｂｏｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３９：１５３−１６６，２０００，Ｌｉａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４７：１１９−１３０，２００１）。
【００６１】
細胞内の組換え遺伝子の発現は、発現ベクターを使用して促進される。好ましくは、発現ベクターは、組換え遺伝子に加えて、宿主細胞内での自律的複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位および潜在的な高コピー数をも含有する。抗体および抗体フラグメントの製造のための発現ベクターの具体例は当技術分野でよく知られている（Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８，１９９７，Ｂｏｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３９：１５３−１６６，２０００，Ｌｉａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４７：１１９−１３０，２００１）。
【００６２】
所望により、当技術分野でよく知られた技術を用いて（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，Ｍａｒｋｓら，国際出願番号ＷＯ  ９５／１７５１６（国際公開日１９９５年６月２９日）を参照されたい）、抗体をコードする核酸を宿主染色体内に組込むことが可能である。
【００６３】
組換え抗原結合性タンパク質の発現には、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ））および真核生物（例えば、酵母、バキュロウイルスおよび哺乳類）に由来する細胞系を含む多種多様な細胞系が使用されうる（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１９９９）。
【００６４】
組換え抗原結合性タンパク質の発現のための好ましい宿主は、適切な翻訳後修飾を伴って抗原結合性タンパク質を産生しうる哺乳類細胞である。翻訳後修飾には、ジスルフィド結合形成およびグリコシル化が含まれる。もう１つのタイプの翻訳後修飾はシグナルペプチドの切断である。
【００６５】
適切なグリコシル化は抗体機能のためには重要となりうる（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６１：１−２０，２００２）。天然に存在する抗体は、重鎖に結合した少なくとも１つのＮ結合炭水化物を含有する（前掲）。他のＮ結合炭水化物およびＯ結合炭水化物が存在することが可能であり、抗体機能のためには重要となりうる（前掲）。
【００６６】
効率的な翻訳後修飾のためには種々のタイプの哺乳類宿主細胞が使用されうる。そのような宿主細胞の具体例には、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｏ）、ＨｅＬａ、Ｃ６、ＰＣ１２および骨髄腫細胞が含まれうる（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６１：１−２０，２００２，Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８，  １９９７）。
【００６７】
ハイブリドーマは、不死化された抗体産生細胞系である。ハイブリドーマは、例えばＡｕｓｕｂｅｌ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８およびＫｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７，１９７５に記載されているような技術を用いて製造されうる。
【００６８】
ＩＶ．併用療法
適当なＳＲ−Ｂ１部位に結合する抗原結合性タンパク質は、ＨＣＶを抑制するために、およびＨＣＶ患者をそれ単独で又は１以上の他の抗ＨＣＶ剤と組合せて治療するために使用されうる。現在承認されている抗ＨＣＶ剤はインターフェロンα、およびリボバリンと組合されたインターフェロンαである。ＨＣＶ感染を治療するためには、種々の形態のインターフェロンα、例えば組換えインターフェロンおよびペグリル化（ｐｅｇｌｙｌａｔｅｄ）インターフェロンが使用されうる（Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：１−１６，２００３，Ｗａｌｋｅｒら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  １４：１−２１，２００３）。
【００６９】
多種多様な抗ＨＣＶ剤が種々の臨床開発段階にある。開発中の種々の抗ＨＣＶ剤には、種々のＨＣＶ標的に対する物質が含まれる。種々のＨＣＶ標的の具体例には、ＨＣＶポリメラーゼおよびＨＣＶ  ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼが含まれる（Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：１−１６，２００３，Ｗａｌｋｅｒら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  １４：１−２１，２００３）。
【００７０】
Ｖ．投与
医薬投与全般の指針は例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；ならびにＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されている。
【００７１】
医薬上許容される担体は抗原結合性タンパク質の保存または投与を促進する。タンパク質溶液製剤を安定化するために使用される物質には、炭水化物、アミノ酸および緩衝化塩が含まれる（Ｍｉｄｄａｕｇｈら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １３７：３３−５８，１９９９）。
【００７２】
抗原結合性タンパク質は皮下、筋肉内または粘膜経路のような種々の経路により投与されうる。皮下および筋肉内投与は、例えば針またはジェット・インジェクターを使用して行われうる。粘膜運搬、例えば鼻腔内運搬は、吸着部位における、より長い保持時間をもたらす増強剤または粘膜付着剤の使用を含みうる（Ｍｉｄｄａｕｇｈら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７３７：３３−５８，１９９９）。
【００７３】
適当な投与計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路；所望の効果；ならびに使用する特定の化合物を含む、当技術分野においてよく知られた要因を考慮して決定される。用量は１．０μｇ〜１．０ｍｇ全タンパク質の範囲よりなると予想され、本発明の種々の実施形態においては、該範囲は０．０１ｍｇ〜１．０ｍｇおよび０．１ｍｇ〜１．０ｍｇである。
【００７４】
ＶＩ．実施例
以下に記載の実施例は本発明の種々の特徴を更に詳しく例示するものである。該実施例は本発明の実施のための有用な方法をも例示する。これらの実施例は、特許請求されている本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７５】
ＳＲＢ１特異的ファージ抗体を得るための実験方法
ＣＡＴ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ファージライブラリーＣＳを、ＳＲＢ１に結合する一本鎖抗体に関してスクリーニングした。該ライブラリーは、ｐＩＩＩタンパク質のＮ末端への融合体として繊維状ファージの表面上に露出した重鎖および軽鎖抗体の可変部を含有する一本鎖抗体を提供する。ＶＨ領域はＳｅｒおよびＧｌｙのリンカーによりＶＬ領域に連結されている。
【００７６】
ＳＲＢ１受容体に特異的に結合する抗体を提示するファージを選択するために、ファージ富化のために全細胞を使用した。該ライブラリー（１０１１ファージ）を１０７個のＣＨＯ細胞と共に室温で１時間プレインキュベートし、ついで遠心分離した。上清中に存在する未結合ファージを回収し、ヒトＳＲＢ１受容体（配列番号９）を発現するＣＨＯ細胞と共に１時間インキュベートした。ついで細胞をＰＢＳで数回洗浄し、溶出バッファー（トリエチルアミン、１００ｍＭ）に２５分間再懸濁させ、ついでＴｒｉｓ．ＨＣｌでｐＨを調節した。回収されたファージをＴＧ１細胞への感染により増幅し、前記のとおりに更に２ラウンドの選択に付した。
【００７７】
第３ラウンドの選択の後、３×１０５個のファージを回収した。陰性対照としてのＣＨＯ細胞と平行して、ＳＲＢ１発現ＣＨＯ細胞を使用して、これら（１４４個のファージ）のサンプルを、細胞に基づくＥＬＩＳＡにおいて試験した。これらのうち、１１個のファージクローンがＳＲＢ１に特異的であると評価された。ついでＨＣＶ  Ｅ２結合能に関してクローンを試験した。
【実施例２】
【００７８】
ＨＣＶ  Ｅ２の抑制
ファージコンテクストの外部で産生された、配列番号１、２、３および４をコードするクローンは、ＨｅｐＧ２細胞へのＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の結合を抑制することが可能であった。ＨｅｐＧ２はヒトヘパトーマ細胞系である。
【００７９】
細胞を解離させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．２％  ＢＳＡ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（洗浄バッファー）中で洗浄した。４×１０５個の細胞を種々の濃度（０．５−５−２０−４０μｇ／ｍｌ）の一本鎖抗体または無関係な一本鎖対照Ｄ５に室温で３０分間結合させた。ついで細胞を組換え可溶性Ｅ２と共に室温で１時間インキュベートした。抗Ｅ２ラットｍＡｂ  ６／１ａ（Ｐａｔｅｌら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２８７３−２８８３，２０００）および二次抗ラットＰＥ結合ｍＡｂにより結合を表示した。該細胞に付随する蛍光をＦＡＣＳ分析により測定した。
【００８０】
図６に示すとおり、配列番号１、２、３および４の抗ＳＲＢ１一本鎖抗体はＨｅｐＧ２細胞系へのＥ２タンパク質の結合を抑制した。縦軸は、抗体と共にプレインキュベートされていない細胞に対する、ＨｅｐＧ２細胞へのＥ２タンパク質の結合の比率（％）を表す。該実験は二重に行い、該二重サンプルの平均が示されている。
【実施例３】
【００８１】
配列番号２の一本鎖抗体を使用するＨＣＶ感染の抑制
ＨＣＶ  Ｅ２の結合を抑制しうる一本鎖抗体がＨＣＶの複製をも抑制しうることを、配列番号２の一本鎖抗体を使用して実証した。
【００８２】
外科的肝臓切除からの、単離されたヒト肝細胞を、３×１０５細胞／ウェルの密度で２４ウェルマイクロプレートに播いた。細胞を付着させ回収し（２４時間）、ついで培地を、異なる濃度の抗ＳＲＢ１一本鎖抗体配列番号２（２５および５μｇ／ｍｌ）または対照としての最高濃度（２５μｇ／ｍｌ）の無関係な一本鎖抗体Ｆｖを含有する新鮮なものと交換した。
【００８３】
肝細胞を、示されている量の一本鎖抗体と共に３７℃で１時間プレインキュベートし、ついで培地を、同量の一本鎖抗体および一定量（１００μｌ）の感染性ヒト血清（ＨＣＶ慢性患者由来のもの）を含有する新鮮なものと交換した。細胞を該ウイルスと共に１８時間インキュベートして感染を生じさせ、ついでそれを洗浄し、４日間インキュベートした。全ＲＮＡを抽出し、ウイルス複製を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
【００８４】
典型的には、感染の４日後に１０４〜１０５コピーのゲノム／ウェルが検出される。測定されたウイルスＲＮＡが活性な複製に由来することを確かめるために、ウイルスレプリカーゼの小分子インヒビターを陽性対照として加えた。図７に示すとおり、配列番号２の抗ＳＲＢ１一本鎖（ｓｃＦＶＣ１１）は培養ヒト肝細胞のＨＣＶ感染を阻止しうる。
【実施例４】
【００８５】
一本鎖抗体からのＩｇＧ産生
配列番号２または配列番号４の可変領域を含有するＩｇＧ４分子を産生させた。配列番号２または４可変領域を、ＶＨおよびＶＬ領域に特異的なプライマーを使用するＰＣＲにより別々に増幅した。該プライマーは、ユニーク制限部位の導入のための追加的なヌクレオチド、およびスプライス部位に相当し追加的なアミノ酸をコードする塩基を含有していた。
【００８６】
該増幅産物を２つの別々の哺乳類発現ベクターに導入した。ＶＨは、ヒトγ４重鎖の発現のためのカセットを含有するｐＥＵ８．２内に挿入し、ＶＬは、ヒトλ軽鎖の定常領域を発現するベクターｐＥＵ４．２内に導入した。どちらのベクターも、リーダー配列と抗体の定常領域配列との間にイントロンを含有する。該イントロンは、増幅された可変ドメインをクローニングするのに適したユニーク制限部位を含有する。
【００８７】
ＩｇＧの産生は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２９３−ＥＢＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にＶＨおよびＶＬ発現ベクターをコトランスフェクトし８日間まで上清を集めることにより達成された。Ｈｉ−ＴｒａｐプロテインＡカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を製造業者の指示に従い使用して、ＩｇＧを培地から精製した。
【実施例５】
【００８８】
抗ＳＲＢ１  ＩｇＧを使用するＨＣＶ  Ｅ２タンパク質結合の抑制
配列番号２または４可変領域を含有する抗ＳＲＢ１  ＩｇＧがＨＣＶ  Ｅ２結合を抑制する能力を評価するために、ヒトＳＲ−Ｂ１受容体を安定に発現するＣｈｏ７細胞（Ｓｃａｒｓｅｌｌｉら，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１（１９）：５０ｌ７−５０２５，２００２）を使用した。細胞をを解離させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．２％  ＢＳＡ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（洗浄バッファー）中で洗浄した。４×１０５個の細胞を種々の濃度（６０−１２−２．４μｇ／ｍｌ）の抗体に室温で３０分間結合させた。ついで細胞を組換え可溶性Ｅ２（Ｈｉｓタグを含有するもの）と共に室温で１時間インキュベートした。
【００８９】
抗ペンタＨｉｓビオチンコンジュゲートおよびストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥにより結合を表示した。該細胞に付随する蛍光をＦＡＣＳ分析により測定した。図８に示すとおり、抗ＳＲＢ１  ＩｇＧ４配列番号２および４はＣｈｏ７細胞系へのＥ２タンパク質結合を抑制した。無関係なＩｇＧを陰性対照として使用した。
【００９０】
他の実施形態も特許請求の範囲内である。いくつかの実施形態が示され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されうる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１はＩｇＧ分子の構造を例示する。「ＶＬ」は軽鎖可変領域を意味する。「ＶＨ」は重鎖可変領域を意味する。「ＣＬ」は軽鎖定常領域を意味する。「ＣＨ１」、「ＣＨ２」および「ＣＨ３」は重鎖定常領域を意味する。
【図２】図２は一本鎖抗体の構造を例示する。「ＶＬ」は軽鎖可変領域を意味する。「ＶＨ」は重鎖可変領域を意味する。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは配列番号１、２、３および４の一本鎖抗体のアミノ酸配列アライメントを示すし、種々の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、フレームワーク領域（「ＦＷ」）およびリンカーを示す。「ＳＥＱ１」は配列番号１を意味する。「ＳＥＱ２」は配列番号２を意味する。「ＳＥＱ３」は配列番号３を意味する。「ＳＥＱ４」は配列番号４を意味する。ＣＤＲは、この図に例示されているものより長くなりうる。記載されているアライメントにおいては、該ＣＤＲにおける共通のギャップが省略されている。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは配列番号１、２、３および４の一本鎖抗体のアミノ酸配列アライメントを示すし、種々の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、フレームワーク領域（「ＦＷ」）およびリンカーを示す。「ＳＥＱ１」は配列番号１を意味する。「ＳＥＱ２」は配列番号２を意味する。「ＳＥＱ３」は配列番号３を意味する。「ＳＥＱ４」は配列番号４を意味する。ＣＤＲは、この図に例示されているものより長くなりうる。記載されているアライメントにおいては、該ＣＤＲにおける共通のギャップが省略されている。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、配列番号１、２、３および４をコードする核酸配列を例示する。図４Ａは、配列番号１をコードする核酸配列（配列番号５）を例示する。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｄは、配列番号１、２、３および４をコードする核酸配列を例示する。図４Ｂは、配列番号２をコードする核酸配列（配列番号６）を例示する。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｄは、配列番号１、２、３および４をコードする核酸配列を例示する。図４Ｃは、配列番号３をコードする核酸配列（配列番号７）を例示する。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｄは、配列番号１、２、３および４をコードする核酸配列を例示する。図４Ｄは、配列番号４をコードする核酸配列（配列番号８）を例示する。
【図５】図５は配列番号９のアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、ＨｅｐＧ２細胞系へのＥ２タンパク質結合を抑制する配列番号１、２、３および４の一本鎖抗体の能力を例示する結果を示す。縦軸は、一本鎖抗体と共にプレインキュベートされなかった細胞に対する、ＨｅｐＧ２細胞へのＥ２タンパク質結合の比率を表す。対照として、無関係な一本鎖抗体を使用した（Ｄ５）。この実験は二重に行い、該二重サンプルの平均が示されている。
【図７】図７は、配列番号２の一本鎖抗体（「ｓｃＦＶＣ１１」）による培養ヒト肝細胞のＨＣＶ感染の抑制を例示する結果を示す。定量ＰＣＲにより全ＲＮＡに関してウイルス複製を測定し、それをＨＣＶコピー数／３５００００細胞として表した。該実験は三重ウェルにおいて行い、値は標準偏差と共に示されている。配列番号２の一本鎖抗体を２つの異なる濃度（２５および５μｇ／ｍｌ）で試験した。対照として、無関係な一本鎖抗体（ＦＶ）を２５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。感染の抑制の陽性対照として、ＨＣＶインヒビター（「Ｐｏｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」）を使用した。
【図８】図８は、ＣＨＯ７細胞系へのＥ２タンパク質結合を抑制する配列番号２または配列番号４可変領域を含有するＩｇＧ４分子の能力を例示する結果を示す。陰性対照として、無関係なＩｇＧを使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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