【事件の表示】
　特許第２９１３５５６号「試料中の物質の測定法」の請求項１ないし４に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２９１３５５６号の請求項１ないし３に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第2913556号に係る発明についての出願は、平成２年２月20日に特願平２−40376号として出願され、平成11年４月16日にその特許の設定登録がなされ、その後、上坂陽子より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、訂正請求（後日取下げ）がなされた後、再度の取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成13年２月26日に訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正請求
１．訂正の内容
(1)特許請求の範囲の請求項１乃至４に係る記載を、
「１．無機リンを生成する酵素反応系を介在させて試料中の物質を測定する方法において、無機リンを生成する酵素反応系に無機リンを測定する酵素反応系を組み合わせて無機リンの生成量を測定し、無機リンの生成量に基づいて試料中の物質を測定することからなり、上記の無機リンを生成する酵素反応系が無機リンにより反応が阻害される酵素反応を含むものであり、生成した無機リンによる当該阻害を無機リンを測定する酵素反応系で回避し、また無機リンを測定する酵素反応系がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する系であることを特徴とする試料中の物質の測定法。
２．無機リンを生成する酵素反応系に試料を付す前に、試料を無機リンを基質とする酵素反応系に付して試料中の内因性無機リンを消費させる処理をする請求項１記載の試料中の物質の測定法。
３．試料中の物質が５’−ヌクレオチダーゼである請求項１又は２記載の試料中の物質の測定法。」と訂正する。
(2)明細書11頁12行の「測定する」を「測定することからなり、上記第１の反応系が無機リンにより反応が阻害される酵素反応を含むものであり、生成した無機リンによる当該阻害を第２の反応系で回避し、また無機リンを測定する酵素反応系がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する系であることからなる試料中の物質の測定」と訂正する。
(3)明細書13頁4〜9行の「なお、本発明の測定法の・・・適用することができる。」を削除する。
(4)明細書13頁12行の「反応系である。」を「反応系であり、当該無機リンを測定する酵素反応系はＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する系である。」と訂正する。
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項(1)は、請求項１に「上記の無機リンを生成する酵素反応系が無機リンにより反応が阻害される酵素反応を含むものであり、生成した無機リンによる当該阻害を無機リンを測定する酵素反応系で回避し、また無機リンを測定する酵素反応系がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する系であること」という事項を直列的に付加するものであり、しかも、請求項の１つを削除するものであるから特許請求の範囲の減縮に該当し、訂正事項(2)は、訂正事項(1)に伴う訂正である。
　そして、上記いずれの訂正も新規事項に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　
３．独立特許要件
　当審が通知した２回目の取消理由の概要は、請求項１に係る発明は、甲第１号証或いは刊行物イに記載された発明であるから特許法２９条１項３号の規定に該当する、請求項２乃至４に係る発明は、甲第１、３乃至４号証及び刊行物イ乃至ロに記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから同法２９条２項の規定により特許を受けることができないというものであるところ、以下に検討する。
(1)訂正された請求項１に係る発明（以下、「本件発明１」という。）について
  甲第１号証（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 55,379-387(1973)）には、
「ＩＤＰ＋Ｈ２Ｏ−（Ｍｇ２＋）→ＩＭＰ＋Ｐｉ              （１）
　Ｐｉ＋イノシン→リボース−１−リン酸＋ヒポキサンチン （２）　
  ヒポキサインチン＋２Ｈ２Ｏ＋２Ｏ２→尿酸＋２Ｈ２Ｏ２　　　　（３）」（３８０頁最下部）、「標準曲線。既知量の無機リンをイノシン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びキサンチンオキシダーゼとインキュベートすると、化学量論的な量の尿酸が生成する（図２）。
　無機リンと尿酸との間の相関関係と比例関係は極めて良好であることや、pH７．４，２９３nmでの尿酸の吸光度係数が１３．０×１０３Ｍ−１cm−１であることが分かる。ブランク値が０．３６８と比較的高いのは、イノシン由来のヒポキサンチンや酵素製剤由来のリンが完全に除去できていないことによる。」（３８２頁「標準曲線」の項）、「ヌクレオシドジホスファターゼアッセイ。試薬：
　ａ．NDPアーゼ反応混合液（略）
　ｂ．EDTA溶液（略）
　ｃ．指示酵素混合液（略）
　ｄ．リン標準混合液（略）
操作：適量のヌクレオシドホスファターゼ（・・・）を０．５ｍＬのNDPアーゼ反応混合液と１０分間インキュベートし、次いでこの反応を０．４５ｍＬのEDTAを添加することによって停止させた。EDTAの後に酵素を添加することによりコントロールを調製して、酵素製剤に含まれているかもしれないあらゆるリン又はＵＶ光吸収性成分を測定した。０．４５ｍＬのEDTA溶液を０．５ｍＬのEDTA溶液を０．５ｍＬのトリス−酢酸緩衝液、pH７．４に添加することによりブランクを作成した。
　各試験管に、０．０５ｍＬの指示酵素混合液を添加し、６０分後に２９３nmの吸光度を読んだ。
計算：最初の酵素溶液１ｍＬ当たりのヌクレオシドジホスファターゼの単位数は：式（６）（省略）で算出される。」（３８３頁「ヌクレオシドホスファターゼアッセイ」の項）が、記載されている。
　上記「次いでこの反応を０．４５ｍＬのEDTAを添加することによって停止させた。」との記載によると、甲第１号証では、NDPアーゼ反応混合液を添加後、一度反応を停止させ、その後指示混合液を添加しているのに対し、本件発明１においては、このような工程はない。
　しかも、本件発明１では、無機リンを測定する反応系が「ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づく系」であって、甲第１号証が、尿酸の生成量を測定するものである点で相違する。
　また、刊行物イ（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 151,282-285(1985)）には、「従って、われわれは、イノシン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びキサンチンオキシダーゼの存在下で尿酸を生成する指示反応系を結合して、無機リンの生成を測定することによる、Ｐ５Ｎ（ピリミジン−５’−ヌクレオチダーゼ）活性を測定する１段階連続分光測光法を開発した。この方法は、従来公知の方法よりも単純かつ迅速なものである。」（２８２頁右欄１０〜１８行）、「以下のように、連続的な無機リン（Ｐｉ）の酵素的測定によりＰ５Ｎをアッセイした：
　ＣＭＰ又はＵＭＰ−（Ｐ５Ｎ）→シチジン又はウリジン＋Ｐｉ
　Ｐｉ＋イノシン−（ＮＰ）→リボース−１−Ｐ＋ヒポキサンチン
　ヒポキサンチン＋２Ｏ２＋２Ｈ２Ｏ−（ＸＯ）→尿酸＋２Ｈ２Ｏ２  　　　　　　　　　」（２８２頁左欄１１〜１７行）、「但し、ＮＰはプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ＸＯはキサンチンオキシダーゼを示す。」（２８２頁左欄下から２〜１行）、「原則として、この反応系を用いれば、Ｐ５Ｎ活性は、尿酸或いはＨ２Ｏ２を検出することにより測定できる。しかしながら、赤血球はカタラーゼを最も多く含むものの１つであり、その活性は３×１０６μmol／ｈ／ml（赤血球）であるため、Ｐ５Ｎ活性は尿酸を検出することにより測定した。」（２８３頁左欄１８〜２４行）、「このアッセイ用のインキュベーション混合物は、２５μmolのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．４，８．０μmolのイノシン、０．０１５ＩＵのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＮＰ）、０．０１５ＩＵのキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）、及び０．２〜１．５mgの溶血血液ヘモグロビンを全量１．００ｍＬで含有した。この混合物を溶血血液なしで３７℃で１０分間インキュベートした。溶血血液を添加して反応を開始した後、３００nmで分光測定した。自動キュベットポジショナーと一定温度循環器とを備えたギルフォードモデル（・・・）２５２スペクトロフォトメーターを用い、栓を抜いたキュベット中３７℃でＰ５Ｎ活性測定を行った。」（２８３頁左欄２５〜３９行）が、
　刊行物ロ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.74,No.9,3701-3704(1977)）には、「無機リンは、ピリミジン５’−ヌクレオチダーゼの競合阻害剤であることが示され、溶血血液中の無機リンは基質であるシチジン−１−リン酸に対する酵素のＫｍ値を増大させる原因となるだろう。」（３７０１頁左欄１５〜１８行）が、それぞれ記載されている。
　そこで、刊行物ロの記載を踏まえると、刊行物イには、「無機リンを生成する酵素反応系に無機リンを測定する酵素反応系を組み合わせて無機リンの生成量を測定し、無機リンの生成量に基づいて試料中の物質を測定することからなり、上記の無機リンを生成する酵素反応系が無機リンにより反応が阻害される酵素反応を含む」ことは記載されているが、無機リンを測定する反応系が、刊行物イにおいては、尿酸を検出することにより測定するのに対し、本件発明１は「ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する」点で相違する。
　以上のとおり、本件発明１は、甲第１号証或いは刊行物イに記載された発明であるとはいえない。
　
(2)訂正された請求項２に係る発明（以下、「本件発明２」という。）について
　本件発明２と刊行物ロに記載された事項を踏まえた刊行物イに記載された発明とを対比すると、両者は「無機リンを生成する酵素反応系に無機リンを測定する酵素反応系を組み合わせて無機リンの生成量を測定し、無機リンの生成量に基づいて試料中の物質を測定することからなり、上記の無機リンを生成する酵素反応系が無機リンにより反応が阻害される酵素反応を含む」点で一致し、前者は、(イ)「無機リンを生成する酵素反応系に試料を付す前に、試料を無機リンを基質とする酵素反応系に付して試料中の内因性無機リンを消費させる処理をする」工程、及び(ロ)「無機リンを測定する酵素反応系がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する」工程を有するが、後者は有さない点で相違する。
　しかるに、甲第３号証（Clinica Chimica Acta 172,131-140(1988)）には、「イントロダクション　鎖長が規定されたオリゴ糖や誘導体を基質として用いるカップリングエンザイム法を、血清や尿中のα−アミラーゼ活性のアッセイに使用することが近年提唱されている［１−７］。かかる基質の一つであるマルトペンタオース（Ｇ５）は、α−アミラーゼによる切断部位が一つだけであり、すい臓及びだ液α−アミラーゼのいずれも同様にそれを低分子化する［８］。それゆえに、化学量論的なアッセイには基質Ｇ５は都合が良い。
　しかしながら、試料中のグルコースやマルトースの存在は、この基質の利用を妨害する［１，９］。ゲルろ過や固定化グルコースオキシダーゼカラムを利用して、内因性グルコースを除去する方法が提案されている［１，１０］。代替案として、ヘンケルは、内因性グルコースを除去するための酵素的方法を報告している［１１］。」（１３１〜１３２頁「イントロダクション」の項）が記載されており、この記載によると、所期の酵素反応を正確に実施するためには、予め酵素反応に有害な内因性の物質を酵素的方法により除去することが有効であると理解できるので、上記相違点(イ)は、甲第３号証の記載から、当業者にとって格別なものとはいえない。
　一方、相違点(ロ)に関し、甲第４号証（Methods of Enzymatic Analysis,Third Edition,vol.IV106-113(1984)）には、「NADPHの生成による吸光度の増加によって検出される、イノシン５−リン酸（IMP）の１分間当たりの加水分解量は、５’−ヌクレオチダーゼの触媒活性の基準である。」との記載があるものの、「(a)IMP＋H2O−（５’−ヌクレオチダーゼ）→イノシン＋Pi　(b)イノシン＋Pi−（ＮＰ）→ヒポキサンチン＋リボース−１−リン酸」、及び「測定のための最適化された条件：最適化のためには、リンの影響を確認する必要があった：プリンヌクレオシドホスホリラーゼは基質としてリンを要求するが、リンは５’−ヌクレオチダーゼを阻害する。アッセイに際して、０．００２モル／Ｌの濃度の存在下では、５’−ヌクレオチダーゼ反応を阻害せず、最適な反応速度として十分である。」との記載を踏まえると、甲第４号証で、NADPHの生成量に基づいて測定する対象は、「無機リン」というよりもむしろ「イノシン」であるといえる。
　そうすると、甲第４号証には、「無機リンを測定する酵素反応系がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する」ことは開示されていないから、結局、本件発明２は、刊行物イ、刊行物ロ、甲第３号証及び甲第４号証に記載された発明から当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　また、甲第１号証に記載された発明は、「(1)本件発明１について」の項で検討したように、本件発明１に対して「NDPアーゼ反応混合液を添加後、一度反応を停止させ、その後指示混合液を添加」するという事項が更に相違点として挙げられるところ、刊行物イ、刊行物ロ、甲第３号証及び甲第４号証には、この相違点に関し示唆すらされていないから、結局、本件発明２は、甲第１号証、甲第３号証及び甲第４号証に記載された発明から当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
(3)訂正された請求項３に係る発明（以下、「本件発明３」という。）について
　本件発明３は、本件発明１又は本件発明２を引用するものであるから、(1)及び(2)で検討したのと同じ理由により、甲第１号証，甲第３号証，甲第４号証，刊行物イ及び刊行物ロの記載に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　したがって、本件発明１は、甲第１号証或いは刊行物イに記載された発明ではなく、本件発明２及び３は、甲第１、３乃至４号証及び刊行物イ乃至ロに記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
４．むすび
　また、「III.１.特許異議申立の理由の概要」に記載したその他の特許異議申立の理由についても、「２．判断」の項に記載のように理由がないものであるから、本件発明１乃至３は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　したがって、本件訂正請求は、特許法１２０条の４,２項、及び同条３項で準用する１２６条２項から４項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要
　訂正前の本件請求項１に係る発明は、甲第１号証乃至甲２号証（特開昭60-160898号公報）に記載された発明である、並びに、同請求項１乃至４に係る発明は、甲第１乃至４号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条１項３号或いは同条２項の規定により特許を受けることができない。
２．判断
Ａ．特許法２９条１項３号について
　甲第２号証には、
「(1)ヌクレオシドと生体酵素量のヌクレオシド−ホスホリラーゼの存在下で無機リン酸塩を変換して、形成された塩素又はリボース−１−ホスフェートを定量的に測定する無機リン酸塩の酵素による測定方法。
(19)ホスファターゼと組合せて亜リン酸エステルの定量測定に用いる特許請求の範囲第１項ないし第１５項のいずれか１に記載の無機燐酸塩の酵素による測定方法。」（特許請求の範囲の項）、「ここで述べる無機燐酸塩の酵素による測定は、例えばヌクレオシド−ホスホリラ−ゼ（・・・）の酵素作用による反応（・・・）に基づいている。
 　ホスフェート＋イノシン−（ヌクレオシド−ホスホリラーゼ）→ヒポキサンチン
　＋リボーゼ−１−ホスフェート     ・・・（略）・・・
　ヒポキサンチン＋２Ｏ２＋２Ｈ２Ｏ−（キサンチンオキシダーゼ）→尿酸＋２Ｈ２Ｏ２（４Ｏ２−）
　次の測定方法を使用することができる。
(11)形成された尿酸の光度測定（・・・）　　　　」（３頁右上欄１５行〜右下欄４行）、「この発明の酵素による測定方法は、無機燐酸の存在を測定するだけでなく、更に燐酸塩分離酵素の活性を連続して直接測定することが容易にできる。従って多くの分野での使用が可能である。特定のホスホダーゼを用いれば亜燐酸エステルの濃度を測定できる。」（５頁左下欄２〜７行）が記載されている。
　上記記載によると、甲第２号証は「無機リン酸塩の酵素による測定方法」に係るもので、本件発明１が「無機リンを生成する酵素反応系を介在させて試料中の物質を測定する方法」であるのと相違する。
　したがって、本件発明１は、甲第２号証に記載された発明であるとはいえない。
（甲第１号証については、「II．３．(1)」を参照。）
　
Ｂ．特許法２９条２項について
　「II．３．(1)」で検討したように、甲第１号証は、「NDPアーゼ反応混合液を添加後、一度反応を停止させ、その後指示混合液を添加」するものであって、無機リンにより反応が阻害される酵素反応において、生成する無機リンによる阻害を回避しようとする思想が全くないのであるから、甲第１号証と甲第２号証に記載された発明を組み合わせても、本件発明１の構成が導き出せるものではない。
　また、本件発明２及び本件発明３については、「II．３．(2)」を参照。
　したがって、本件発明１乃至３は、甲第１号証乃至甲第４号証に記載された発明に基づき、当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
３．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１乃至３についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明１乃至３についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年３月２１日（２００１．３．２１）
【訂正の要旨】
（訂正の要旨）
（１）特許請求の範囲の請求項１乃至４に係る記載を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「１．無機リンを生成する酵素反応系を介在させて試料中の物質を測定する方法において、無機リンを生成する酵素反応系に無機リンを測定する酵素反応系を組み合わせて無機リンの生成量を測定し、無機リンの生成量に基づいて試料中の物質を測定することからなり、上記の無機リンを生成する酵素反応系が無機リンにより反応が阻害される酵素反応を含むものであり、生成した無機リンによる当該阻害を無機リンを測定する酵素反応系で回避し、また無機リンを測定する酵素反応系がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する系であることを特徴とする試料中の物質の測定法。
２．無機リンを生成する酵素反応系に試料を付す前に、試料を無機リンを基質とする酵素反応系に付して試料中の内因性無機リンを消費させる処理をする請求項１記載の試料中の物質の測定法。
３．試料中の物質が５’−ヌクレオチダーゼである請求項１又は２記載の試料中の物質の測定法。」と訂正する。
（２）明細書１１頁１２行の「測定する」を、明りょうでない記載の釈明を目的として「測定することからなり、上記第１の反応系が無機リンにより反応が阻害される酵素反応を含むものであり、生成した無機リンによる当該阻害を第２の反応系で回避し、また無機リンを測定する酵素反応系がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する系であることからなる試料中の物質の測定」と訂正する。
（３）明細書１３頁４〜９行の「なお、本発明の測定法の・・・適用することができる。」を明りょうでない記載の釈明を目的として削除する。
（４）明細書１３頁１２行の「反応系である。」を明りょうでない記載の釈明を目的として「反応系であり、当該無機リンを測定する酵素反応系はＮＡＤＨ又はＮＡＤ　ＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する系である。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
試料中の物質の測定法
（５７）【特許請求の範囲】
　１．無機リンを生成する酵素反応系を介在させて試料中の物質を測定する方法において、無機リンを生成する酵素反応系に無機リンを測定する酵素反応系を組み合わせて無機リンの生成量を測定し、無機リンの生成量に基づいて試料中の物質を測定することからなり、上記の無機リンを生成する酵素反応系が無機リンにより反応が阻害される酵素反応を含むものであり、生成した無機リンによる当該阻害を無機リンを測定する酵素反応系で回避し、また無機リンを測定する酵素反応系がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する系であることを特徴とする試料中の物質の測定法。
　２．無機リンを生成する酵素反応系に試料を付す前に、試料を無機リンを基質とする酵素反応系に付して試料中の内因性無機リンを消費させる処理をする請求項１記載の試料中の物質の測定法。
　３．試料中の物質が５´−ヌクレオチダーゼである請求項１又は２記載の試料中の物質の測定法。
【発明の詳細な説明】
＜産業上の利用分野＞
　本発明は試料中の物質の測定法に関する。より詳細には、臨床検査等の分野で用いられ、試料中の酵素、化学成分等の物質を測定（定量）する方法に関する。
＜従来の技術及び発明が解決しようとする課題＞
　従来より酵素の活性を測定する酵素活性測定法や化学成分を酵素反応を用いて測定する酵素的測定法が種々の分野で用いられている。特に、臨床検査の分野では、生体組織、臓器、体液等に含まれる種々の酵素や化学成分の増加、減少が各種疾患と密接な関係を有し、臨床診断上有用な情報として利用できるので、これらを測定する酵素活性測定法及び酵素的測定法が広く用いられている。例えば、酵素５´−ヌクレオチダーゼ（ＥＣ３．１．３．５）は５´−リボヌクレオチドを無機リンとヌクレオシドに加水分解する酵素であり、血清中の５´−ヌクレオチダーゼ活性は閉塞性肝機能障害で上昇することが知られており、臨床的には主に肝胆道疾患の診断に有用である。最近、この５´−ヌクレオチダーゼ活性の測定法として、下記式に示される酵素反応系を用いて生成されたアデノシンを測定する２つの方法が報告されている。
　上記及び後記の反応式において用いられている略号の意味は以下のとおりである。
５´−ＡＭＰ：５´−アデノシン一リン酸
Ｐｉ：無機リン
５´−ＮＤ：５´−ヌクレオチダーゼ
Ｇ６ＰＤＨ：グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
ＰＣ：ホスホコリン
　上述の方法▲１▼は色素の生成を可視部での吸光度の増加として、▲２▼はＮＡＤＨの減少を紫外部での吸光度の減少として測定することにより５´−ヌクレオチダーゼ活性を測定するもので、これらの方法は臨床検査の分野において自動分析装置へも応用できる有用な方法であると言われている。しかしながら、これらの方法は何れも５´−ＡＭＰ（５´−アデノシン一リン酸）が５´−ヌクレオチダーゼによってアデノシンと無機リンに加水分解された際、無機リンが生成物として反応系に蓄積され、これが５′−ヌクレオチダーゼの酵素活性を阻害するという問題がある。更に、試料が生体試料の場合、試料中に内因性無機リン（即ち、試料中に当初から含まれている無機リン）が含まれていることがあり、この内因性無機リンと生成した無機リンとにより、５´−ヌクレオチダーゼの酵素活性が著しく阻害されるというケースもある。そのため、上記の方法においては、測定値の信頼性に欠けるという問題がある。
　上記の５´−ヌクレオチダーゼ以外にも臨床検査上重要であり且つ無機リンを生成する反応を触媒する酵素は多数ある。それらの中には、５´−ヌクレオチダーゼと同様に生成した無機リンにより活性が阻害される酵素の例も多く、例えば、ストレプロマイシン−６−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．３９）、４−ニトロフェニルホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．４１）、ホスホアミダーゼ（ＥＣ３．９．１．１）、チアミン−トリホスファターゼ（ＥＣ３．６．１．２８）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）、アシルホスファターゼ（ＥＣ３．６．１．７）、ヌクレオシドホスファターゼ（ＥＣ３．６．１．６）、アデノシントリホスファターゼ（ＥＣ３．６．１．３）、ピロホスファターゼ（ＥＣ３．６．１．１）、メチルグリオキサールシンセターゼ（ＥＣ４．２．９９．１１）、エタノールアミンホスフェートホスホリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．７）、スレオニンシンセターゼ（ＥＣ４．２．９９．２）、ＡＴＰシトレート（ブロー３Ｓ）リアーゼ（ＥＣ４．１．３．８）、ホスホ−２−ケト−３−デオキシ−オクトネートアルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１６）、ホスホセリンホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．３）、３´−ヌクレオチダーゼ（ＥＣ３．１．３．６）、３−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８）、グルコース−６−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．９）、グルコース−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１０）、フルクトース−ビスホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１１）、ビスホスホグリセレートホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１３）、ホスホリラーゼホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１７）、グリセロール−２−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３，１９）、ホスホグリセレートホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２０）、スクロースホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２４）、６−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．２６）、ホスファチジルグリセロホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２７）、ＡＤＰホスホグリセレートホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２８）、ヌクレオチダーゼ（ＥＣ３．１．３．３１）、デオキシヌクレオチド−３´−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．３４）、ホスファチジルイノシトール−ビスホスフェートホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．３６）、アスパルテートカルバモイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．３．２）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．３．３）、リジンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．３．３２）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、スクシニル−ＣｏＡシンセターゼ（ＥＣ６．２．１．４）、アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＥＣ６．２．１．１０）、γ−グルタミルシステインシンセターゼ（ＥＣ６．３．２．２）、グルタチオンシンセターゼ（ＥＣ６．３．２．３）、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼ（ＥＣ６．３．２．６）、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼ（ＥＣ６．３．３．１）、５，１０−メテニルテトラヒ��ロフォレートシンセターゼ（ＥＣ６．３．３．２）、ＣＴＰシンセターゼ（ＥＣ６．３．４．２）、アデニロスクシネートシンセターゼ（ＥＣ６．３，４．４）、カルバモイルホスフェートシンセターゼ（アンモニア）（ＥＣ６．３．４，１６）、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼ（ＥＣ６．３．５．３）、ピルベートカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．１）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．３）、メチルクロトニ−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．２．７）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．２．８）、アルギノスクシネートシンセターゼ（ＥＣ６．３．４．５）、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．５．１．６）、カルノシンシンセターゼ（ＥＣ６．３．２．１１）等が挙げられ、これらの酵素活性を測定する場合にも生成した無機リンの影響を受けるという問題がある。
　また、化学成分の測定手段として、当該化学成分を基質とする酵素反応系により測定する酵素的測定においても、無機リンを生成する酵素反応系が用いられており、生成した無機リンが蓄積されて酵素反応が阻害される結果、反応速度の遅延、測定精度や定量限界の低下などの影響を受ける。このような基質（化学成分）の例のうち、特に臨床検査で有用なものとしてリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等）が挙げられ、その測定法として、例えば、下記反応式（３）に示される反応系からなる酵素的測定法が知られている。
反応式（３）
　このように、従来から用いられている酵素活性測定法及び酵素的測定法においては、無機リンを生成する酵素反応系を介在させて酵素活性又は化学成分量を測定する方法が用いられているが、この酵素反応系においては、生成した無機リンが反応系に蓄積されて酵素反応が阻害されるため、測定された酵素活性値や化学成分量の信頼性に欠けるという問題がある。
　本発明は上記従来技術の欠点を解決すべく創案されたもので、無機リンを生成する酵素反応系を用いた酵素活性測定法及び酵素的測定法において測定値の精度を向上させ得る測定方法を提供することを目的とする。
＜課題を解決するための手段及び作用＞
　上記の課題を解決すべくなされた本発明の測定法は、無機リンを生成する酵素反応系を介在させて試料中の物質を測定する方法において、無機リンを生成する酵素反応を含む酵素反応系であって、試料中の測定対象酵素の作用又は測定対象化学成分を基質とする酵素反応に基づき、一又は二以上の酵素反応を介して試料中の酵素活性又は化学成分量に対応する量の無機リンを生成させる反応系（以下、第１の反応系という）と、生成した無機リンを測定する酵素反応系（以下、第２の反応系という）とが組み合わされ、第１の反応系で生成した無機リン量を第２の反応系で測定し、無機リンの生成量に基づいて試料中の物質を測定することからなり、上記第１の反応系が無機リンにより反応が阻害される酵素反応を含むものであり、生成した無機リンによる当該阻害を第２の反応系で回避し、また無機リンを測定する酵素反応系がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する系であることからなる試料中の物質の測定方法（以下、第１の測定法という）であり、また、試料を上記第１の反応系に付す前に、無機リンを基質とする酵素反応系により試料中の内因性無機リンを反応させてこれを消費した後、上記第１の測定法にて試料中の物質を測定する方法（以下、第２の測定法という）である。
　本発明は上記の構成よりなり、第１の測定法においては、無機リンを生成する第１の反応系と、上記反応系で生成した無機リンを測定する第２の反応系が組み合わされており、第１の反応系で生成された無機リンは、第２の反応系で基質として利用されて他の物質に変換されるので、反応系に無機リンが蓄積されることを回避でき、酵素活性の阻害が抑制される。
　また、第２の測定法は、試料が生体試料（血液、血清、血漿、尿など）のように内因性無機リンが含まれている可能性がある試料に好適に用いられる。この場合、上記第１の方法により無機リン量を測定すると、この内因性無機リンの量も加算される結果、測定対象物質量が多く測定されるおそれがあるが、第２の測定法では、試料中に存在する内因性無機リンを先に反応させてこれを消費させる処理をした後、第１の測定法により試料中の測定対象物質を測定するので、内因性無機リンの影響を除去することができる。
　本発明の第１の測定法において、第１の反応系である無機リンを生成する酵素反応系を介在させて測定される物質としては、例えば、前述の酵素及び化学成分が挙げられ、これらの物質の測定法は一又は二以上の酵素反応より構成されるが、何れも無機リンを生成する酵素反応が包含されている。
　上記の第１の反応系と組み合わせて用いられる第２の反応系は、第１の反応系で生成した無機リンを測定する反応系であり、当該無機リンを測定する酵素反応系はＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの生成量に基づいて無機リンを測定する系である。ここで用いられる無機リンの測定法には種々のものが挙げられ、本発明の目的を満足できるものであれば特に限定されない。その例としては、無機リンとスクロースからグルコース−１−リン酸を生成させるスクロースホスホリラーゼを用いた反応系、無機リンとマルトースからグルコース−１−リン酸を生成させるマルトースホスホリラーゼを用いた反応系、無機リンとグリコーゲンからグルコース−１−リン酸を生成させるホスホリラーゼａを用いた反応系、無機リンとイノシンからリボース−１−リン酸を生成させるプリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いた反応系等が挙げられ、これらの反応系は例えば、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１４２，ｐ．５５６，１９８４、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２２，ｐ．１１７９，１９７６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１９，ｐ．３００，１９６７、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５５，Ｐ．３７９，１９７３等に詳述されている。更に、それぞれの酵素反応については、例えば、「酵素ハンドブック、朝倉書店発行、１９８４年版」に記載されている。
　斯くして、第１の測定法は、上述の無機リンの測定法等により求められた無機リン量に基づいて試料中の測定対象物質の量を求めるものである。なお、試料が内因性無機リンを含む生体試料等の場合、第１の測定法により求められた測定値は内因性無機リンの量も加算された値となる。この場合には、試料中の内因性無機リンを別途測定し、上記測定値から減算することにより測定対象物質量を求めることができるが、より好ましい態様としては、事前に試料中の内因性無機リンを消費して内因性無機リンの影響を除去した後、第１の測定法を用いて測定対象物質を測定する第２の測定法が採用される。この方法によれば、操作が簡便になり、自動分析化に適するという利点を有する。試料中の内因性無機リンの影響を除去する方法としては、種々の方法が用い得るが、例えば、試料を第２の反応系、即ち無機リンを測定する反応系に付して無機リンを事前に消費する方法、試料中の内因性無機リンを第２の反応系に関与しない物質に変換する反応に付し、内因性無機リンを事前に他の物質に変換して消費する方法等が挙げられる。
　次に、本発明の測定法を具体的に示すため、一例として、５´−ヌクレオチダーゼにより５´−ＡＭＰからアデノシンと無機リンを生成させる反応系と、スクロースホスホリラーゼを用いる無機リンの測定法の反応系を組み合わせて、５´−ヌクレオチダーゼの酵素活性を測定する例をもって説明する。この反応系は下記反応式（４）で表すことができる。
反応式（４）
　上記反応式（４）に示されるように、無機リンの量はＮＡＤＨの生成量を測定することにより求められ、無機リンの生成量は試料中の５´−ヌクレオチダーゼの酵素活性と相関するので、ＮＡＤＨの生成量を波長３４０ｎｍの吸光度の増加として測定することにより５´−ヌクレオチダーゼの酵素活性を測定（定量）できる。この酵素反応系によれば、５´−ヌクレオチダーゼにより５´−ＡＭＰより生成した無機リンは反応系に蓄積されることがなく消費されるので、５´−ヌクレオチダーゼに対する無機リンの反応阻害を抑制することができる。
　次に、上記の５´−ヌクレオチダーゼの酵素活性測定の具体的な手法の一例を説明する。まず、無機リンを含まない適当な緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ等）に、５´−ＡＭＰ、スクロース、スクロースホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース−１，６−二リン酸、ＮＡＤ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを適当量溶解した試薬液を調製する。次いで、この試薬液に精製水を加え、加温（例えば、３７℃、５分間程度）してブランクとする。一方、上記の精製水の代りに、試料を必要に応じて上記緩衝液で適宜希釈した検体を用い、同様な操作を行ってブランクを対照にして３４０ｎｍの吸光度の上昇をレートアッセイ法又はエンドポイント法で測定し、ＮＡＤＨ生成量を測定する。
　かくして求められたＮＡＤＨ生成量から５´−ヌクレオチダーゼの酵素活性を求める方法としては、例えば、５´−ヌクレオチダーゼ活性が既知の標準試料を用いて、上記と同様な操作によりＮＡＤＨ生成量を測定して検量線を作成し、この検量線と測定されたＮＡＤＨ生成量を対比する方法が挙げられる。
　なお、測定検体中の５´−ヌクレオチダーゼ活性は、通常、２００Ｕ／ｌ程度以下に調整するのが好ましい。この場合、試薬液中の試薬濃度としては、５′−ＡＭＰは０．１〜１ｍＭ程度、好ましくは０．５ｍＭ程度、スクロースは１０〜５００ｍＭ程度、好ましくは１００〜２００ｍＭ程度、スクロースホスホリラーゼは１〜２０Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは５〜１５Ｕ／ｍｌ程度、ホスホグルコムターゼは０．５〜２Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１Ｕ／ｍｌ程度、グルコース−１，６−二リン酸は５〜３０μＭ程度、好ましくは１５〜２５μＭ程度、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは５〜３０Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１５〜２５Ｕ／ｍｌ程度、ＮＡＤは１〜１０ｍＭ程度、好ましくは２〜５ｍＭ程度に調整するのが好ましいが、この濃度範囲に限定されるものではない。また、試薬液には、ホスホグルコムターゼの活性化剤として二価金属イオン（好ましくはＭｇ２＋）、５´−ＡＭＰの非特異的加水分解を抑制するためにβ−グリセロリン酸、並びに試料中の乳酸デヒドロゲナーゼの作用によるＮＡＤＨ生成を抑制するためにオキサミン酸（又はその塩）を添加するのが好ましい。これらの添加剤の試薬液中の濃度としては、二価金属イオンは１〜３０ｍＭ程度、好ましくは５〜２０ｍＭ程度、β−グリセロリン酸は１０〜５０ｍＭ程度、好ましくは２０〜３０ｍＭ程度、オキサミン酸又はその塩は１〜３０ｍＭ程度、好ましくは５〜２０ｍＭ程度に調整される。
　なお、試料が内因性無機リンを含む生体試料等の場合、前述のように内因性無機リンを事前に消費し、内因性無機リンの影響を除去する第２の測定法で測定するのが好ましい。上記の５´−ヌクレオチダーゼ活性を測定する場合において、試料中の内因性無機リンの影響を除去する方法の代表的な例としては下記の方法が挙げられる。
　（１）試薬液の組成物から５´−ＡＭＰを除いておき、そこに試料を加え試料中の内因性無機リンを先に反応させる。次に５´−ＡＭＰを加え、試料中の５´−ヌクレオチダーゼの活性値を上述の方法にて測定する。
　（２）上述の反応式（４）で示される酵素反応系において、ＮＡＤからＮＡＤＨを生成させる反応系にかえて、波長３４０ｎｍでの吸光度の変化に関係しない反応、例えば、下記反応式（５）で示される反応系を組み合わせる。
反応式（５）
　この反応式（５）の酵素反応を含む測定反応系を構成する組成物から５´−ＡＭＰを除いておき、そこに試料を加えると試料中の内因性無機リンが反応して消費される。次に、この反応系に元のＮＡＤからＮＡＤＨを生成させる反応系と、上記の反応が進行しないようホスホグルコースイソメラーゼの阻害剤である６−ホスホグルコネートとを加え、更に５´−ＡＭＰを加えて反応を開始すると、試料中の５´−ヌクレオチダーゼの活性値はＮＡＤＨの生成量として定量することができる。
　ところで、前述した基質たる試料中の物質も同じ趣旨で測定できる。この場合、内因性無機リンの消費は、反応系から無機リンを生成する酵素を除き、試料を加えて反応させることによって実施することができる。
　なお、本発明は上述の例に限定されるものではなく、例えば、前記反応式（４）ではＮＡＤからＮＡＤＨを生成させる反応が用いられているが、酵素の種類によってはＮＡＤＰからＮＡＤＰＨを生成させる反応に変更することができ、また、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈを直接測定する代りに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈで還元され、発色する色素（例えば、テトラゾリウム塩など）を用いて可視部の吸光度を測定する方法に変更する等、本発明の要旨を変更しない範囲で適宜変更することができる。
＜発明の効果＞
　以上のように、本発明の第１の測定法によれば、反応系に無機リンが蓄積されることがないので、無機リンによる酵素反応の阻害が抑制され、試料中の物質を高精度且つ迅速に測定することができる。また、第２の測定法においては、上記第１の測定法の効果に加え、試料中に存在する内因性無機リンを消費してから測定対象物質の測定を行うので、内因性無機リンを含む可能性がある生体試料等についても正確な測定が可能である。更に、本発明の測定法は自動分析装置での測定にも応用できるので、臨床検査等の分野での測定の迅速化に寄与できる有用な方法である。
＜実施例＞
　以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
　ヒト血清中の５´−ヌクレオチダーゼの活性値の定量を、５´−ＡＭＰを基質とし、スクロースホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤからなる反応系を用いて測定した。
　試薬液として下記のような組成の溶液を調製し、これを２．０ｍｌとり、それに精製水１００μｌを加えて３７℃で５分間加温した後、０．５ｍＭの５´−ＡＭＰを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を０．５ｍｌ加え、波長３４０ｎｍでの吸光度を測定してこれをブランクとする。一方、精製水の代わりにヒト血清を用いて同様の操作を行い、３７℃で５分間加温して内因性無機リンを除去した後、０．５ｍＭの５´−ＡＭＰを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を０．５ｍｌ加え、ブランクを対照にして波長３４０ｎｍにおける１分間あたりの吸光度変化量を求め、予め作成した検量線から５´−ヌクレオチダーゼの活性値を求めた。このようにしてヒト血清１０例について測定した結果を第１表に示す。
試薬液組成
　スクロースホスホリラーゼ　　　　　８Ｕ／ｍｌ
　スクロース　　　　　　　　　　１５０ｍＭ
　ホスホグルコムターゼ　　　　　　　１Ｕ／ｍｌ
　グルコース−１，６−二リン酸　　２０μＭ
　グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ　　２０Ｕ／ｍｌ
　ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　３ｍＭ
　β−グリセロリン酸　　　　　　　２５ｍＭ
　塩化マグネシウム　　　　　　　　１０ｍＭ
　オキサミン酸　　　　　　　　　　１０ｍＭ
　ＨＥＰＥ　Ｓ（ｐＨ７．０）　　　５０ｍＭ
実施例２
　ヒト血清中の５´−ヌクレオチダーゼの活性値の定量を、５´−ＡＭＰ、スクロースホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコースイソメラーゼを用いた反応系による内因性無機リンの除去と、次にホスホグルコースイソメラーゼの反応を阻害してその代わりにグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの反応系を加えた系により測定した。
　試薬液は下記のような２種類の組成のものを調製し、まず試薬液（Ｉ）を２．０ｍｌとり、それにヒト血清１０μｌを加え３７℃で５分間加温した。次に、試薬液（ＩＩ）を０．５ｍｌ加え、波長３４０ｎｍにおける１分間あたりの吸光度変化量を求め、予め作成した検量線からヒト血清中の５´−ヌクレオチダーゼの活性値を求めた。このようにしてヒト血清１０例について測定した結果を同じく第１表に示す。
試薬液（Ｉ）組成
　スクロースホスホリラーゼ　　　　８Ｕ／ｍｌ
　スクロース　　　　　　　　　１５０ｍＭ
　ホスホグルコムターゼ　　　　　　１Ｕ／ｍｌ
　グルコース−１，６−二リン酸　２０μＭ
　ホスホグルコースイソメラーゼ　　５Ｕ／ｍｌ
　β−グリセロリン酸　　　　　　２５ｍＭ
　塩化マグネシウム　　　　　　　１０ｍＭ
　オキサミン酸　　　　　　　　　１０ｍＭ
　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）　　　５０ｍＭ
試薬液（ＩＩ）組成
　ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　３ｍＭ
　グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ　２０Ｕ／ｍｌ
　６−ホスホグルコネート　　　　１５ｍＭ
　５´−ＡＭＰ　　　　　　　　０．５ｍＭ
　塩化マグネシウム　　　　　　　１０ｍＭ
　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）　　　５０ｍＭ
参考例
　ヒト血清中の５´−ヌクレオチダーゼの活性値の定量を、前記の方法▲１▼に記載される測定原理に基づく市販試薬（アスカ純薬・シグマ）を用いた従来法により行った。ヒト血清１０例について測定した結果を同じく第１表に示す。
　第１表に示されるように、本発明の方法である実施例１及び実施例２による測定値にはほとんど差がないが、これと従来の方法である参考例による測定値と比較すると、参考例による方法の方が低値を示している。これは、本発明の測定法においては、無機リンによる阻害がないことを示唆するものである。