(57)【要約】  本発明は、質量数１２５のヨウ素同位体（ｉｓｏｔｏｐ）で標識されたアデノジン（ａｄｅｎｏｚｉｎ）Ａ３受容体リガンド類、リガンド類の中で好ましくは拮抗薬およびその異性体、それらを含む実験材料、一般式（Ｉ）の化合物およびその異性体の調製方法、一般式（ＩＩ）の新しい中間体ならびにそれらの調製に関する。2008519816.tif 000022
2008519816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2008519816.tif 000014
［式中、Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基、または炭素数３から６のシクロアルキル基を表し、または１つまたはそれ以上の直鎖または分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基、直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルコキシ基またはハロゲン原子で場合により置換されるフェニル基、チエニル基またはフリル基を表し；または５員または６員の芳香族複素環（この芳香族複素環は１個、２個または３個の窒素原子を含む。）を表し；または１つまたはそれ以上の直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基、直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルコキシ基またはハロゲン原子で場合により置換される５員の芳香族複素環（この芳香族複素環は１個の窒素原子および１個の酸素原子または１個の窒素原子および１個の硫黄原子を含む。）を表し、
Ｒ２は、水素原子を表し；または直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基を表すか；またはフェニル基、ベンジル基、チエニル基またはフリル基（これらはメチレンジオキシ基または１つまたはそれ以上の直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基または直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルコキシ基、ヒドロキシル基、トリフルオロメチル基もしくはシアノ基またはハロゲン原子で場合により置換される。）を表し；または１つまたはそれ以上の直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基、直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルコキシ基またはハロゲン原子で場合により置換される、５員または６員の芳香族複素環（この芳香族複素環は１個、２個または３個の窒素原子または１個の窒素原子および１個の酸素原子または１個の窒素原子および１個の硫黄原子を含む。）を表す。］
の化合物およびそれらの異性体。
【請求項２】
請求項１に記載の、一般式（Ｉ）：
【化２】
2008519816.tif 000015
（式中、Ｒ１は、フェニル基またはチエニル基またはフリル基を表し、Ｒ２は、４−メトキシフェニル基、３−メチルフェニル基、３−メトキシフェニル基、２−チエニル基、３−チエニル基、２−フリル基または３−フリル基を表す。）
の化合物およびそれらの異性体。
【請求項３】
請求項１から２に記載の下記化合物：
４−メトキシ−Ｎ−（６−［１２５Ｉ］ヨード−４−ベンジルアミノ−３−シアノキノリン−２−イル）ベンズアミド、４−メトキシ−Ｎ−（６−［１２５Ｉ］ヨード−４−［２−チエニルメチルアミノ］−３−シアノキノリン−２−イル）ベンズアミド。
【請求項４】
一般式（Ｉ）：
【化３】
2008519816.tif 000016
（式中、Ｒ１およびＲ２は請求項１で定義された意味を有する。）
の化合物の調製方法であって、一般式（ＩＩ）：
【化４】
2008519816.tif 000017
（式中、Ｒ１およびＲ２は請求項１で定義された意味を有し、Ｒ３は直鎖または分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基を表す。）
のトリアルキル−スタンニル化合物を酸化剤の存在下において［１２５Ｉ］ＮａＩと反応させることを特徴とする、前記方法。
【請求項５】
酸化剤として、例えば過酸化水素などの過酸化物、または例えばＮ−クロロ−スクシンアミドなどのＮ−ハロゲノ−スクシンアミド、またはクロロスルホンアミド好ましくはクロラミンＴが用いられることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
非担持［１２５Ｉ］ＮａＩが用いられることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記反応が室温において水性メタノール媒体（pH３）中で実施されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
生成物がＲＰ−ＨＰＬＣ法により反応混合物から分離されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ＲＰ−ＨＰＬＣ法による前記分離の間、シリカゲルベースのＣ１８修飾パッキングが固定相として用いられ、該分離が０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含むメタノール−水二成分溶離液の系を用い、０．９ml／分の流速でＵＶ検出およびオンライン放射能検出下で行われることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
一般式（ＩＩ）：
【化５】
2008519816.tif 000018
（式中、Ｒ１およびＲ２は請求項１で定義された意味を有し、Ｒ３は直鎖または分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基を表す。）
の化合物およびそれらの異性体。
【請求項１１】
請求項１に記載の、一般式（ＩＩ）：
【化６】
2008519816.tif 000019
（式中、Ｒ１およびＲ２はフェニル基またはチエニル基を表し、Ｒ３はメチル基またはブチル基を表す。）
の化合物。
【請求項１２】
一般式（ＩＩ）：
【化７】
2008519816.tif 000020
（式中、Ｒ１およびＲ２は請求項１で定義された意味を有し、Ｒ３は直鎖または分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基を表す。）
の化合物の調製方法であって、一般式（ＩＩＩ）：
【化８】
2008519816.tif 000021
（式中、Ｒ１およびＲ２は請求項１で定義された意味を有する。）
の化合物を、有機溶媒中において塩基およびパラジウム触媒の存在下において、ヘキサアルキルジスタンナンと反応させることを特徴とする、前記方法。
【請求項１３】
有機溶媒として、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、好ましくはＮ−メチル−２−ピロリドンを用いることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
塩基として、例えばトリアルキルアミン、好ましくはトリエチルアミンなどの有機塩基、または例えばアルカリ水酸化物、アルカリ炭酸塩もしくはアルカリ酢酸塩、好ましくは酢酸カリウムなどの無機塩基を用いることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
触媒として、酢酸パラジウム、塩化パラジウム、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、好ましくはテトラキス（トリ（ｏ−トリル）ホスフィン）パラジウム（０）触媒を用いることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ヘキサアルキルジスタンナンとして、ヘキサブチルジスタンナンを用いることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量数１２５のヨウ素同位体（ｉｓｏｔｏｐ）で標識されたアデノジン（ａｄｅｎｏｚｉｎ）Ａ３受容体リガンド類、リガンド類の中で好ましくは拮抗薬およびその異性体、それらを含む実験材料、一般式（Ｉ）：
【０００２】
【化９】
2008519816.tif 000003
の化合物類およびその異性体類の調製方法、一般式（ＩＩ）：
【０００３】
【化１０】
2008519816.tif 000004
の新しい中間体類、およびそれらの調製に関する。
【背景技術】
【０００４】
アデノシンは、いくつかの内因性分子（ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、核酸）の周知の構成要素である。そのほか、アデノシンは、多くの生理的プロセスにおいて重要な調節の役割を果たす。心臓機能へのアデノシンの効果は、１９２９年にすでに発見されている（Ｄｒｕｒｙ  ａｎｄ  Ｓｚｅｎｔｇｙｏｅｒｇｙｉ，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６８：２１３，１９２９）。アデノシンによって媒介される生理学的機能の増大する数の同定、および新しいアデノシン受容体サブタイプ類の発見は、特異的リガンドを治療へ応用する可能性を提供する（Ｐｏｕｌｓｅ，Ｓ  Ａ．  ａｎｄ  Ｑｕｉｎｎ，Ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６：６１９，１９９８）。
【０００５】
今日までに、アデノシンに対する受容体は、Ａ１、Ａ２およびＡ３の３つの主なクラスに分類されてきた。Ａ１サブタイプは、Ｇｉ膜タンパク質と共役することによりアデニル酸シクラーゼを阻害することの部分的な原因となり、他のセカンドメッセンジャー系に部分的に影響を及ぼす。Ａ２受容体サブタイプはさらに２つのサブタイプ（Ａ２ａおよびＡ２ｂ）に細分することができ、これらの受容体はアデニル酸シクラーゼ活性を刺激する。近年、アデノシンＡ３受容体の配列がラット精巣ｃＤＮＡライブラリーから同定された。後に、これは、新規な機能性アデノシン受容体と一致することが証明された。Ａ３受容体の活性化はいくつかのセカンドメッセンジャー系（アデニル酸シクラーゼを阻害し、ホスホリパーゼＣおよびＤを刺激する。）にも関連する。
【０００６】
アデノシン受容体はいくつかの器官中に見られ、それらの機能を調節する。Ａ１およびＡ２ａ受容体の両方は、中枢神経系および心臓血管系において重要な役割を果たす。中枢神経系（ＣＮＳ）において、アデノシンはシナプス伝達物質の放出を阻害し、その作用はＡ１受容体により媒介される。心臓において、Ａ１受容体はまた、アデノシンの陰性変力作用、変時性作用および変伝導作用を媒介する。線条体中に比較的大量に存在するアデノシンＡ２ａ受容体は、シナプス伝達の調節において、ドーパミン受容体と機能的相互作用を示す。内皮細胞および平滑筋細胞上のＡ２ａアデノシン受容体は、アデノシン誘発性血管拡張の原因である。
【０００７】
ｍＲＮＡの同定に基づくと、Ａ２ｂアデノシン受容体は様々な組織に広く分布している。これら受容体は、ほぼすべての細胞型において同定されているが、その発現は腸および膀胱において最も高い。このサブタイプもまた、おそらく血管緊張の調節に重要な調節機能を有し、マスト細胞の機能に役割を果たしている。
【０００８】
組織分布がタンパク質レベルで検出されるＡ１およびＡ２ａ受容体とは反対に、Ａ２ｂおよびＡ３受容体の存在は、それらのｍＲＮＡレベルに基づいて検出された。Ａ３アデノシン受容体についての発現レベルは他のサブタイプと比較してむしろ低く、種依存性が高い。Ａ３アデノシン受容体は、主に中枢神経系、精巣、免疫系において発現し、即時型過敏反応におけるマスト細胞からのメディエーターの放出の調節に関与するとみられる。
【０００９】
治療上の使用について、分子がアデノシン受容体のＡ１、Ａ２ａおよびＡ２ｂサブタイプに結合しないか、または濃度が非常に高い場合のみ結合することを確認することが不可欠である。本発明は、アデノシン受容体のＡ３サブタイプに対して顕著な選択性を有する、質量数１２５のヨウ素同位体で標識された一般式（Ｉ）の化合物ならびにそれらの塩、溶媒和物および異性体に関する。
【００１０】
［３Ｈ］−ＭＲＥ３００８−Ｆ２０アデノシンＡ３受容体拮抗薬放射性リガンドは、文献（Ｐ．Ｇ．Ｂａｒａｌｄｉ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１０，２０９−２１１，２０００）から知られている。［３Ｈ］ＰＳＢ−１１  Ａ３受容体拮抗薬放射性リガンドもまた、知られている（Ｃ．Ｈ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１２，５０１−５０３，２００２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らの目的は、質量数１２５のヨウ素同位体（ｉｓｏｔｏｐ）で標識された、拮抗性効果のＡ３放射性リガンド類を調製することであった。何故ならば、これらは、リガンド類がトリチウムで標識されたものと比較してより高い特異的な活性を有するためである。この目的は、アデノシンＡ３受容体に対する強い親和性を有するが、同時にサブタイプ内での高い選択性を示す（すなわち、Ａ１、Ａ２ａおよびＡ２ｂ受容体に対してはるかに高い濃度で結合する。）放射性リガンドを調製することであった。さらなる目的は、種々の組織におけるＡ３受容体の特徴づけに対して、およびＡ３拮抗薬の作用の機構の研究に適する放射性リガンドを得ることであった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の主題は、一般式（Ｉ）：
【００１３】
【化１１】
2008519816.tif 000005
［式中、Ｒ１は、水素原子または直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基、または炭素数３から６のシクロアルキル基を表し、または１つまたはそれ以上の直鎖または分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基、直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルコキシ基またはハロゲン原子で場合により置換されるフェニル基、チエニル基またはフリル基を表し；または５員または６員の芳香族複素環（この芳香族複素環は１個、２個または３個の窒素原子を含む。）を表し；または１つまたはそれ以上の直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基、直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルコキシ基またはハロゲン原子で場合により置換される５員の芳香族複素環（この芳香族複素環は１個の窒素原子および１個の酸素原子または１個の窒素原子および１個の硫黄原子を含む。）を表し、
Ｒ２は、水素原子を表し；または直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基を表し；またはフェニル基、ベンジル基、チエニル基またはフリル基（これらは、メチレンジオキシ基または１つまたはそれ以上の直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基または直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルコキシ基、ヒドロキシル基、トリフルオロメチル基もしくはシアノ基またはハロゲン原子で場合により置換される。）を表し；または１つまたはそれ以上の直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基、直鎖もしくは分枝鎖の炭素数１から４のアルコキシ基またはハロゲン原子で場合により置換される、５員または６員の芳香族複素環（この芳香族複素環は１個、２個または３個の窒素原子または１個の窒素原子および１個の酸素原子または１個の窒素原子および１個の硫黄原子を含む。）を表す。］
の化合物類およびそれらの異性体類である。
【００１４】
上記の置換基の詳細な意味は、以下のとおりである。
【００１５】
直鎖または分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基とは、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、好ましくはエチル基またはメチル基を意味する。
【００１６】
直鎖または分枝鎖の炭素数１から４のアルコキシ基とは、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、好ましくはエトキシ基またはメトキシ基を意味する。
【００１７】
炭素数３から６のシクロアルキル基とは、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基またはシクロヘキシル基を意味する。
【００１８】
１個または２個または３個の窒素原子を含む芳香族複素環とは、ピロール環、イミダゾール環、ピラゾール環、１，２，３−トリアゾール環、１，２，４−トリアゾール環、ピリジン環、ピリミジン環、ピリダジン環、ピラジン環および１，３，４−トリアジン環を意味する。これらの環は、炭素数１から４のアルキル基もしくは炭素数１から４のアルコキシ基またはハロゲン原子で場合により置換される。
【００１９】
１個の窒素原子および１個の酸素原子または１個の硫黄原子を含む芳香族複素環とは、オキサゾール環、イソオキサゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環を意味する。これらの環は、炭素数１から４のアルキルもしくはアルコキシ基またはハロゲン原子で場合により置換される。
【００２０】
一般式（Ｉ）の化合物の好ましい群は、
Ｒ１が、フェニル基、チエニル基またはフリル基を表し、
Ｒ２が、４−メトキシフェニル基、３−メチルフェニル基、３−メトキシフェニル基、２−チエニル基、３−チエニル基、２−フリル基または３−フリル基を表す化合物により形成される。
【００２１】
特に好ましいのは、上記の基準に応じて、以下の化合物、
４−メトキシ−Ｎ−（６−［１２５Ｉ］ヨード−４−ベンジルアミノ−３−シアノキノリン−２−イル）ベンズアミド
４−メトキシ−Ｎ−（６−［１２５Ｉ］ヨード−４−［２−チエニルメチルアミノ］−３−シアノキノリン−２−イル）ベンズアミド、
である。
【００２２】
本発明のさらなる主題は、一般式（Ｉ）：
【００２３】
【化１２】
2008519816.tif 000006
の化合物類および一般式（ＩＩ）：
【化１３】
2008519816.tif 000007
の中間体類の調製である。
【００２４】
本発明の調製方法において用いられる一般式（ＩＩ）の中間体類は新規である。一般式（ＩＩ）において、置換基Ｒ１およびＲ２は上記で定義したような意味を有し、Ｒ３は直鎖または分枝鎖の炭素数１から４のアルキル基、好ましくはメチル基またはブチル基を表す。
【００２５】
本発明による方法において、一般式（Ｉ）の化合物類は酸化剤の存在下において一般式（ＩＩ）の適切な化合物を非担持［１２５Ｉ］ＮａＩと反応させることによって調製される。
【００２６】
この反応は、室温において水性メタノール媒体（pH３）中で実施される。
【００２７】
酸化剤として、過酸化物類（例えば、過酸化水素）、Ｎ−ハロゲノ−スクシンアミド類（例えば、Ｎ−クロロ−スクシンアミド）またはクロロスルホンアミド（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｐｈｏｎａｍｉｄｅ）、好ましくはクロラミンＴを用いることができる。
【００２８】
生成物は、固定相としてシリカゲルベースのＣ１８修飾パッキングおよび溶離液の系として０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含むメタノール−水二成分混合物を用いて、流速０．９ml／分による逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）法により精製される。検出は２７２nmでＵＶにより実施される。放射能の検出は流動液体シンチレーション法により実施される。
【００２９】
本発明によれば、一般式（ＩＩ）：
【００３０】
【化１４】
2008519816.tif 000008
の化合物は、一般式（ＩＩＩ）：
【００３１】
【化１５】
2008519816.tif 000009
（式中、Ｒ１およびＲ２は上記で定義したような意味を有し、Ｘはヨウ素原子または臭素原子を表す。）
の適切なキノリンから、このキノリンをパラジウム触媒、有機塩基または無機塩基および有機溶媒の存在下においてヘキサアルキルジスタンナン化合物と反応させることによって調製することができる。一般式（ＩＩ）の生成物は単離される。ハロゲン原子のトリアルキル−スタンニル基との交換は、有機溶媒（例えば、ジオキサンまたはジメチルホルムアミド、または好ましくはＮ−メチル−２−ピロリドン）中で実施される。この反応は広範な温度範囲、好ましくは２０℃から１００℃の間で実施することができる。有機塩基として、トリアルキルアミン、好ましくはトリエチルアミンを適用することができる。無機塩基として、アルカリ水酸化物、アルカリ炭酸塩およびアルカリ酢酸塩、好ましくは酢酸カリウムを用いることができる。この反応において、酢酸パラジウム、塩化パラジウムまたはテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）触媒を用いることができるが（Ｚ．Ｐ．Ｚｈｕａｎｇ．Ｍ．Ｐ．Ｋｕｎｇ，Ｃ．Ｈｏｕ，Ｄ．Ｍ．Ｓｋｏｖｒｏｎｓｋｙ，Ｔ．Ｌ．Ｇｕｒ，Ｋ．Ｐｌｏｓｓｌ，Ｊ．Ｑ．Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｖ．Ｍ．Ｙ．Ｌｅｅ，Ｈ．Ｆ．Ｋｕｎｇ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ４４，１９０５，（２００１））、本発明者らは、テトラキス（トリ（ｏ−トリル）ホスフィン）パラジウム（０）触媒を用いて、より速い反応およびより良好な収率を達成することを見出した。
【００３２】
一般式（ＩＩＩ）：
【００３３】
【化１６】
2008519816.tif 000010
の化合物類は、特許出願ＷＯ０２／０９６８７９中に記載された方法により合成することができる。
【００３４】
本発明による方法は反応模式図１に示される。
【００３５】
【化１７】
2008519816.tif 000011
【００３６】
本発明のさらなる詳細は、実施例において、特許請求の範囲をこれら実施例に制限することなく、示される。
【実施例１】
【００３７】
４−メトキシ−Ｎ−（６−［１２５Ｉ］ヨード−４−ベンジルアミノ−３−シアノキノリン−２−イル）ベンズアミド
一般式（Ｉ）中、Ｒ１はフェニル基を表し、Ｒ２は４−メトキシフェニル基を表す。  ａ．）４−メトキシ−Ｎ−（６−トリブチルスタンニル−４−ベンジルアミノ−３−シアノキノリン−２−イル）ベンズアミドの０．１mg／mlメタノール溶液の８μlにトリフルオロ酢酸の１％（ｖ／ｖ）メタノール溶液の２５μl（１．１nmol）および７０MBq［１２５Ｉ］ＮａＩ溶液（２１μl）を添加する。この反応混合物に、０．１mg／mlクロラミンＴ水溶液の５μl（２nmol）を添加し、混合物を室温で１５分間撹拌する。インキュベーション時間後、０．１mg／mlピロ亜硫酸ナトリウム溶液の７μl（３．５nmol）の添加により反応を停止し、直ちに生成物をＵＶおよび放射能検出を適用してＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いて精製する。この方法により、表題化合物の３１MBqを放射化学的純度＞９５％で得る（モル活性８１．４GBq／mmol）。精製された生成物をメタノール−水（０．１％ＴＦＡ）３：１混合物中に貯蔵する（活性濃度：２９MBq／ml）。
【００３８】
ｂ．）４−メトキシ−Ｎ−（６−トリブチルスタンニル−４−ベンジルアミノ−３−シアノキノリン−２−イル）ベンズアミド
４−メトキシ−Ｎ−（６−ヨード−４−ベンジルアミノ−３−シアノキノリン−２−イル）ベンズアミドの０．３３ｇをＮ−メチル−２−ピロリドンの５mlに溶解し、その溶液に酢酸カリウムの２４０mg、テトラキス（トリ（ｏ−トリル）ホスフィン）パラジウム（０）の５０mgおよびヘキサブチルジスタンナンの０．６mlを添加する。反応混合物を室温でアルゴン雰囲気下、１６時間撹拌し、次いで水の２０ml中に注ぎ、トルエンの２０ml（×２回）で抽出する。収集したトルエン相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させる。蒸発残渣を、溶離液としてクロロホルム−酢酸エチル（１０：０．５）混合物を用いてシリカゲルカラムによりクロマトグラフィー分離する。精製画分の蒸発後、表題化合物の２５０mgを得る。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ０．９（ｍ，９Ｈ），１．１（Ｍ，６Ｈ），１．３（ｍ，６Ｈ），１．５５（ｍ，６Ｈ），３．８（ｓ，３Ｈ），５．０８（ｄ，２Ｈ），７．０６（ｄ，２Ｈ），７．２−７．４（ｍ，５Ｈ），７．５５（ｄ，２Ｈ），７．９−８．１（ｍ，３Ｈ），８．６６（ｍ，１Ｈ），１０．７（ｓ，１Ｈ）．
【実施例２】
【００３９】
４−メトキシ−Ｎ−（６−［１２５Ｉ］ヨード−４−［２−チエニルメチルアミノ］−３−シアノキノリン−２−イル）ベンズアミド
一般式（Ｉ）中、Ｒ１はチエニル基を表し、Ｒ２は４−メトキシフェニル基を表す。  ａ．）４−メトキシ−Ｎ−（６−トリブチルスタンニル−４−［２−チエニルメチルアミノ］−３−シアノキノリン−２−イル）ベンズアミドの０．１mg／mlメタノール溶液の８μl（１．１nmol）にトリフルオロ酢酸の１％（ｖ／ｖ）メタノール溶液の２５μl（１．１nmol）および７０MBq  ［１２５Ｉ］ＮａＩ溶液（２１μl）を添加する。反応混合物に０．１mg／mlのクロラミンＴ水溶液の５μl（２nmol）を添加し、その混合物を室温で１５分間撹拌する。インキュベーション時間後、０．１mg／mlピロ亜硫酸ナトリウム溶液の７μl（３．５nmol）の添加により反応を停止し、直ちに生成物をＵＶおよび放射能検出を適用しながらＲＰ−ＨＰＬＣ法により精製する。この方法により、２８MBqの表題化合物を放射化学的純度＞９５％で得る（モル活性８１．４GBq／mmol）。精製された生成物を、メタノール−水（０．１％ＴＦＡ）３：１溶媒混合物中に貯蔵する（活性濃度：２８MBq／ml）。
【００４０】
ｂ．）４−メトキシ−Ｎ−（６−トリブチルスタンニル−４−［２−チエニルメチルアミノ］−３−シアノキノリン−２−イル）ベンズアミド  ４−メトキシ−Ｎ−（６−ヨード−４−［２−チエニルメチルアミノ］−３−シアノキノリン−２−イル）ベンズアミドの０．３ｇをＮ−メチル−２−ピロリドンの５mlに溶解し、この溶液に酢酸カリウムの２４０mg、テトラキス（トリ（ｏ−トリル）ホスフィン）パラジウム（０）の５０mgおよびヘキサブチルジスタンナンの０．６mlを添加する。反応混合物を室温でアルゴン雰囲気下、１６時間撹拌し、次いで水の２０mlに注ぎ、トルエンの２０ml（×２回）で抽出する。収集したトルエン相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させる。蒸発残渣を、溶離液としてクロロホルム−酢酸エチル（１０：０．５）混合物を用い、シリカゲルカラムによりクロマトグラフィー分離する。精製画分の蒸発により表題化合物の２３５mgを得る。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ０．９（ｍ，９Ｈ），１．１（Ｍ，６Ｈ），１．３（ｍ，６Ｈ），１．５５（ｍ，６Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），５．１（ｄ，２Ｈ），６．９−７．１７（ｍ，４Ｈ），７．４３−７．５４（ｍ，２Ｈ），８．０３（ｍ，３Ｈ），８．７２−８．８２（ｍ，２Ｈ），１０．８６（ｓ，１Ｈ）
【実施例３】
【００４１】
Ａ．／生物学的方法
ヒトアデノジンＡ１受容体結合
膜懸濁液の調製：ヒトＡ１受容体を発現するクローン化チャイニーズハムスターの卵巣細胞（以下：ＣＨＯ−ｈＡ１）を回収し、これらをＰＢＳで３回洗浄し、遠心分離（１０００×ｇ、１０分）し、１５００／分の回転速度で均質化する（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｐｏｔｔｅｒ  Ｓ）。緩衝液は５０mM  ＴｒｉｓＨＣｌ、pH７，４。この均質化された混合物を遠心分離し（４３．０００ｇ、１０分）、ペレットを上記の緩衝液中にタンパク質濃度が５mg／mL（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）になるように調整しながら懸濁し、２Ｕ／mLのＡＤＡを完成させる。
【００４２】
結合手順：ＣＨＯ−ｈＡ１膜調製物（タンパク質含有量５０μg）を、インキュベーション緩衝液（５０mM  ＴｒｉｓＨＣｌ、pH７．４、２Ｕ／mL  アデノシンデアミナーゼ）中、試験化合物および１０nM  ［３Ｈ］ＣＣＰＡ（２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチル−アデノシン）（８０．０００dpm）の存在下にインキュベートする。非特異的結合は、室温で３時間、１００μLの全容量中、１０μM  Ｒ−ＰＩＡ（Ｎ６−［Ｌ−２−フェニルイソプロピル］アデノシン）の存在下で規定される。Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｂガラスファイバーフィルター（０．５％ポリエチルイミン中に３時間予浸したもの）で濾過し、９６−穴Ｂｒａｎｄｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ上で１mLの氷冷５０mM  ＴｒｉｓＨＣｌ（pH７．４）で４回洗浄する。活性の検出：ベータカウンター（１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ，Ｗａｌｌａｃ）中、ＨｉＳａｆｅ−３混合物の存在下、９６−穴プレート中で行う。阻害［％］＝１００−（（試験化合物の存在下での活性−非特異的活性）／（全活性−非特異的活性））＊１００。
【００４３】
ヒトアデノシンＡ２ａ受容体結合
膜（ＨＥＫ−２９３細胞中に形質移入したヒトＡ２ａアデノシン受容体、供給元：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）の７μgを、インキュベーション緩衝液（５０mM  ＴｒｉｓＨＣｌ、１０mM  ＭｇＣｌ２、１mM  ＥＤＴＡ、２Ｕ／mL  アデノシンデアミナーゼ、pH７．４）中、試験化合物および２０nM  ［３Ｈ］ＣＧＳ−２１６８０（２−［ｐ−（２−カルボニルエチル）フェニルエチルアミノ］−５’−Ｎ−エチルカルボキサミド−アデノシン）（２００．０００dpm）の存在下でインキュベートする。非特異的結合は、室温で９０分間、１００μLの全容量中、１００μgのＮＥＣＡ（５’−Ｎ−エチルカルボキサミド−アデノシン）の存在下で規定される。真空下においてＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｂガラスファイバーフィルター（０．５％ポリエチルイミン中に３時間予浸したもの）で濾過し、９６−穴Ｂｒａｎｄｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ上で１mLの氷冷緩衝液（５０mM  ＴｒｉｓＨＣ１、１０mM  ＭｇＣｌ２、１mM  ＥＤＴＡ、０．９％ＮａＣｌ、pH７．４）で４回洗浄する。活性の検出：ベータカウンター（１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ，Ｗａｌｌａｃ）中、２００μLのＨｉＳａｆｅ−３混合物の存在下で行う。阻害［％］＝１００−（（試験化合物の存在下での活性−非特異的活性）／（全活性−非特異的活性））＊１００。
【００４４】
ヒトアデノシンＡ２ｂ受容体結合
結合手順：膜（ＨＥＫ−２９３細胞に形質移入したヒトＡ２ｂアデノシン受容体、供給元：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）の２０．８μgを、インキュベーション緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM  ＭｇＣｌ２、１mM  ＥＤＴＡ、０．１mM  ベンズアミジン、２Ｕ／mL  アデノシンデアミナーゼ、pH６．５）中、試験化合物および３２．４nM  ［３Ｈ］ＤＰＣＰＸ（８−シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチン）（８００．０００dpm）存在下でインキュベートする。非特異的結合は、室温で３０分間、１００μLの全容量中、１００μM  ＮＥＣＡ（５’−Ｎ−エチルカルボキサミド−アデノシン）の存在下で規定される。２５Hgmmの真空下においてＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃガラスファイバーフィルター（０．５％ポリエチルイミン中に３時間予浸したもの）で濾過し、９６−穴Ｂｒａｎｄｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ上で１mLの氷冷５０mM  ＴｒｉｓＨＣｌ（pH６．５）で４回洗浄する。活性の検出：ベータカウンター（１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ，Ｗａｌｌａｃ）中、２００μLのＨｉＳａｆｅ−３混合物の存在下で行う。阻害［％］＝１００−（（試験化合物の存在下での活性−非特異的活性）／（全活性−非特異的活性））＊１００。
【００４５】
ヒトアデノシンＡ３受容体結合
膜懸濁液の調製：ヒトＡ３受容体を発現するクローン化チャイニーズハムスターの卵巣細胞（以下：ＣＨＯ−ｈＡ３）を回収し、これらをＰＢＳで３回洗浄し、遠心分離（１０００×ｇ、１０分）し、１５００／分の回転速度で均質化する（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｐｏｔｔｅｒ  Ｓ）。緩衝液：５０mM  Ｔｒｉｓ、１０mM  ＭｇＣｌ２、１mM  ＥＤＴＡ、pH８．０。このホモジナイズされた混合物を遠心分離し（４３．０００ｇ、１０分）、ペレットを上記の緩衝液中にタンパク質濃度が０．１mg／mL（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）になるように調整しながら懸濁し、２Ｕ／mLのＡＤＡを完成させる。
【００４６】
［１２５Ｉ］ＡＢ−ＭＥＣＡの存在下での受容体結合：
ＣＨＯ−ｈＡ３膜調製物（タンパク質含有量２μg）を、インキュベーション緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ、１０mM  ＭｇＣｌ２、１mM  ＥＤＴＡ、２Ｕ／mL  アデノシンデアミナーゼ、pH８．０）中、試験化合物および０．５nMの［１２５Ｉ］ＡＢ−ＭＥＣＡ（４−アミノ−３−ヨード−ベンジル−５’−Ｎ−メチルカルボキサミド−アデノシン）（１００．０００cpm）存在下でインキュベートする。非特異的な放射性配位子の結合は、室温で６０分間、５０μLの全容量中、１００μM  Ｒ−ＰＩＡ（Ｎ６−［Ｌ−２−フェニルイソプロピル］アデノシン）の存在下で規定される。２５Hgmmの真空下においてＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃガラスファイバーフィルター（０．５％ポリエチルイミン中に３時間予浸したもの）で濾過し、９６−穴Ｂｒａｎｄｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ上で１mLの氷冷緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ、１０mM  ＭｇＣｌ２、１mM  ＥＤＴＡ、pH８）で４回洗浄する。活性の検出：ガンマカウンター（１４７０Ｗｉｚａｒｄ，Ｗａｌｌａｃ）で行う。阻害［％］＝１００−（（試験化合物の存在下での活性−非特異的活性）／（全活性−非特異的活性））＊１００。
【００４７】
実施例２／ａの放射性ヨウ素を含む化合物の存在下における受容体結合：
ＣＨＯ−ｈＡ３膜調製物（タンパク質含有量４μg）を、インキュベーション緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ、pH８．０、１０mM  ＭｇＣｌ２、１mM  ＥＤＴＡ、０．０８％ＣＨＡＰＳ、０．５％ＢＳＡ、２Ｕ／mL  アデノシンデアミナーゼ）中、試験化合物および実施例２／ａで記載した放射性ヨウ素（１００．０００cpm）を含む０．５nMの化合物の存在下でインキュベートする。非特異的な放射性リガンドの結合は、室温で６０分間、５０μLの全量中、１００μM  Ｒ−ＰＩＡ（Ｎ６−［Ｌ−２−フェニルイソプロピル］アデノシン）の存在下で規定される。吸着を低減するために同位体（ｉｓｏｔｏｐ）調製物および反応混合物をポリエチレンチューブ中に保持する。２５Hgmmの真空下においてＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃガラスファイバーフィルター（０．５％ポリエチルイミン中に３時間予浸したもの）で濾過し、９６−穴Ｂｒａｎｄｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ上で１mlの氷冷緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ（pH８）、１０mM  ＭｇＣｌ２、１mM  ＥＤＴＡ、０．０８％ＣＨＡＰＳ、０．２５％ＢＳＡ）で４回洗浄する。放射能の検出：ガンマカウンター（１４７０Ｗｉｚａｒｄ，Ｗａｌｌａｃ）で行う。阻害［％］＝１００−（（試験化合物の存在下での活性−非特異的活性）／（全活性−非特異的活性））＊１００。
【００４８】
Ｂ．／生物学的結果
Ｉ  出発物質としての実施例２／ｂにおいて示した非標識ヨウ素含有化合物（すなわち、実施例２／ａにおいて示した新しい放射性リガンドの非標識類似物）のアデノシン受容体サブタイプに対する、公知の放射性リガンドの存在下における親和性
実施例２／ｂの出発化合物のアデノシンＡ３受容体に対する親和性（Ｋｉ＝１．５nM）は、他のアデノシン受容体サブタイプと比較して少なくとも１０００倍の選択性を発揮する（表１）。
【００４９】
表１  実施例２／ｂの出発化合物のアデノシン受容体に対する親和性に関する特徴づけ
【００５０】
【表１】
2008519816.tif 000012
【００５１】
ＩＩ／Ａ  放射性リガンドの特徴付けのために用いられるスキャッチャード解析による実施例２／ａの新しい放射性ヨウ素含有化合物の、ヒトアデノシンＡ３受容体についての調査
放射性同位体（ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐ）飽和曲線に基づいて、スキャッチャード解析（Ｇ．Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９４９）により、ＣＨＯ−ｈＡ３膜調製における、実施例２／ａの新しい放射性リガンドの解離定数（ＫＤ）を定量する。調査した濃度範囲（０．１５６nM−１０nM）において、放射性リガンドはタンパク質の４μgを含む膜調製物の存在下において、ただ１つの結合部分に結合する。ＫＤ値は４nM、最大結合容量は９８５フェムトモル／１mgタンパク質であることが分かった（図１を参照のこと）。
【００５２】
図１：ＣＨＯ−ｈＡ３膜調製物の存在下における、実施例２／ａの新しい放射性リガンドのスキャッチャード飽和曲線
【００５３】
ＩＩ／Ｂ  ４μgのＣＨＯ−ｈＡ３調製物の存在下における、基準化合物の親和性値に基づく公知アデノシンＡ３放射性リガンドの実施例２／ａの新しい放射性リガンドとの比較
ＫＤ値を測定し、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ等式（Ｙ．Ｊ．Ｃｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｗ．Ｈ．Ｐｒｕｓｏｆｆ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９，１９７３）により、調査した基準化合物のＫｉ定数および実施例２／ｂの出発化合物（すなわち、実施例２／ａの新しい放射性リガンドの非標識類似物）のＫｉ定数をＩＣ５０値に基づいて算出した。基準化合物は、公知のおよび新しいラドリガンドの存在下において同様の親和性値を示し、それにより実施例２／ａの放射性リガンドの適合性が証明された。新しい放射性リガンドの非標識類似物は、同位体（ｉｓｏｔｏｐ）標識形態（４．０nMおよび１．３nM）のＫＤ値とほぼ等しいＫｉ値を示し、新しい放射性リガンドの特異的結合もまた証明された（表２を参照のこと）。
【００５４】
表２  ４μgのＣＨＯ−ｈＡ３調製物の存在下における、公知アデノシンＡ３放射性リガンドと実施例２／ａの新しい放射性リガンドとの、基準化合物の親和性値を用いての比較。
【００５５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＣＨＯ−ｈＡ３膜調製物の存在下における、実施例２／ａの新しい放射性リガンドのスキャッチャード飽和曲線である。
【図１】
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【国際調査報告】
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