(57)【要約】  薬学的に許容可能な液体担体中約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度での血小板由来成長因子及び薬学的に許容可能な固体担体を含む組成物を、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨へ適用させることにより、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨の成長を促進させる方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の骨、歯周組織、靱帯又は軟骨の成長を促進する方法であって、薬学的に許容可能な液体担体及び薬学的に許容可能な固体担体中約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む移植材料を、該哺乳類へ投与することを含み、該移植材料が、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨の成長を促進する方法。
【請求項２】
前記ＰＤＧＦが約０．３ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＤＧＦが０．３ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬学的に許容可能な固体担体が、生体適合性結合剤、骨置換剤又はゲルの１つ又は複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生体適合性結合剤が天然又は合成ポリマーである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記天然又は合成ポリマーが多糖、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、コラーゲン、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（α−ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ乳酸、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコール酸、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−ｃｏ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド、及びそれらの共重合体及び混合物から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記天然又は合成ポリマーがコラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸及びポリメチルメタクリレートから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記生体適合性結合剤がアルギン酸、アラビアガム、グァーガム、キサンタンガム、ゼラチン、キチン、キトサン、キトサン酢酸塩、キトサン乳酸塩、コンドロイチン硫酸、Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサン、デキストラン、フィブリン接着剤、グリセロール、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、セルロース、グルコサミン、プロテオグリカン、デンプン、乳酸、プルロニック、グリセロリン酸ナトリウム、コラーゲン、グリコーゲン、ケラチン、絹、及びそれらの誘導体及び混合物から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記生体適合性結合剤がヒアルロン酸ナトリウム又はその誘導体である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体適合性結合剤がヒアルロン酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体適合性結合剤がメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体適合性結合剤がカルボキシメチルセルロースである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記デキストランがα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン又はデキストラン硫酸ナトリウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記デンプンがヒドロキシエチルデンプン又は可溶性デンプンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記骨置換剤がリン酸カルシウム、硫酸カルシウム又は脱灰骨から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リン酸カルシウムがリン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、難結晶性ヒドロキシアパタイト、非晶質リン酸カルシウム、メタリン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、リン酸七カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム及びリン酸八カルシウムから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リン酸カルシウムがｉｎ  ｖｉｖｏ投与時に硬化リン酸カルシウムを形成するペースト又はパテとして供給される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記リン酸カルシウムが硬化リン酸カルシウムとして供給される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記リン酸カルシウムが生体吸収性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記リン酸三カルシウムがβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記β−ＴＣＰがミクロン又はサブミクロンサイズの粒子のマトリクスを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記β−ＴＣＰ粒子が約５０００μｍ未満のサイズを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記β−ＴＣＰ粒子が約１００〜約５０００μｍの範囲のサイズを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記β−ＴＣＰ粒子が約１００〜約３０００μｍの範囲のサイズを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記β−ＴＣＰ粒子が約２５０〜約２０００μｍの範囲のサイズを有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記β−ＴＣＰ粒子が多孔質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記β−ＴＣＰ粒子が４０％を上回る多孔質である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記β−ＴＣＰ粒子が６５％を上回る多孔質である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記β−ＴＣＰ粒子が９０％を上回る多孔質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記β−ＴＣＰが移植に適した形状で供給される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記形状が球体、円筒体及びブロック体から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記脱灰骨が皮質骨又は海綿質骨である、請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】
前記薬学的に許容可能な液体担体が水、生理学的に許容可能な緩衝液又は細胞培養培地から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記生理学的に許容可能な緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が生物学的に活性な作用物質を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記生物学的に活性な作用物質が抗体、抗生物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、抗癌剤、成長因子、抗炎症剤及びワクチンから選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質が骨形成タンパク質である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記骨形成タンパク質がインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、トランスフォーミング成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）、トランスフォーミング成長因子−β２（ＴＧＦ−β２）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）又はオステオゲニンから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記移植材料が自己骨髄又は自己血小板抽出物を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＰＤＧＦが部分的に又は実質的に精製されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰＤＧＦが天然供給源又は組換えによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記天然供給源が血液、血小板、血清、血小板濃縮物、多血小板血漿（ＰＲＰ）又は骨髄を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記天然供給源が多血小板血漿（ＰＲＰ）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記移植材料が、投与後少なくとも１日間、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨へＰＤＧＦを送達する、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記移植材料が、投与後約２８日未満の間、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨へＰＤＧＦを送達する、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記移植材料が、投与後約２１日未満の間、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨へＰＤＧＦを送達する、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記移植材料が、投与後約１４日未満の間、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨へＰＤＧＦを送達する、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記移植材料が、投与後約１日〜約１４日間、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨へＰＤＧＦを送達する、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記骨、歯周組織、靱帯又は軟骨が損傷している、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記骨、歯周組織、靱帯又は軟骨を成長させる工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
移植材料を投与する前に皮膚の外科的皮弁を作製することにより、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨を露出させる工程、及び前記移植材料を投与した後に前記皮弁を戻す工程を更に含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
骨又は歯周組織を滑らかに削って有機物を除去する工程を、工程（ａ）の前で、かつ、皮膚の外科的皮弁を作製し、骨、歯周組織又は靱帯を露出させる工程の後に更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
投与時に、ＰＤＧＦが３００μｇ／日以下の平均速度で移植材料から放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
投与時に、ＰＤＧＦが１００μｇ／日未満の平均速度で移植材料から放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
投与時に、ＰＤＧＦが５０μｇ／日未満の平均速度で移植材料から放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
投与時に、ＰＤＧＦが１０μｇ／日未満の平均速度で移植材料から放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
投与時に、ＰＤＧＦが１μｇ／日未満の平均速度で移植材料から放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
薬学的に許容可能な液体担体が滅菌されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
ＰＤＧＦが、ＰＤＧＦ  ＡＡ、ＰＤＧＦ  ＢＢ、ＰＤＧＦ  ＣＣ又はＰＤＧＦ  ＤＤ、あるいはそれらの組合せ又は誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
ＰＤＧＦがＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ＰＤＧＦがＰＤＧＦ−ＡＢである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
哺乳類の骨、歯周組織、靭帯又は軟骨の成長を促進する方法であって、（ａ）薬学的に許容可能な液体担体及び薬学的に許容可能な固体単体中０．３ｍｇ／ｍＬ以下の範囲の濃度の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む移植材料を、該哺乳類へ投与することを含み、該移植材料が、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨の成長を促進する方法。
【請求項６３】
薬学的に許容可能な液体中約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の血
小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含むバイアル。
【請求項６４】
前記液体が滅菌酢酸ナトリウム緩衝液である、請求項６３に記載のバイアル。
【請求項６５】
約０．３ｍｇ／ｍＬの濃度のＰＤＧＦを含む、請求項６３に記載のバイアル。
【請求項６６】
前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項６３に記載のバイアル。
【請求項６７】
前記ＰＤＧＦが、２℃〜８０℃の範囲の温度で貯蔵される場合に、少なくとも３６ヶ月間、緩衝液中で安定である、請求項６４に記載のバイアル。
【請求項６８】
前記ＰＤＧＦが、２℃〜８０℃の範囲の温度で貯蔵される場合に、少なくとも２４ヶ月間、安定である、請求項６４に記載のバイアル。
【請求項６９】
前記ＰＤＧＦが、２℃〜８０℃の範囲の温度で貯蔵される場合に、少なくとも１８ヶ月間、安定である、請求項６４に記載のバイアル。
【請求項７０】
前記ＰＤＧＦが、２℃〜８０℃の範囲の温度で貯蔵される場合に、少なくとも１２ヶ月間、安定である、請求項６４に記載のバイアル。
【請求項７１】
約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む液体を吸収している多孔質リン酸カルシウムを含む移植材料。
【請求項７２】
前記ＰＤＧＦの濃度が約０．３ｍｇ／ｍＬである、請求項７１に記載の移植材料。
【請求項７３】
前記リン酸カルシウムがリン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、難結晶性ヒドロキシアパタイト、非晶質リン酸カルシウム、メタリン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、リン酸七カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム及びリン酸八カルシウムから選択される、請求項７１に記載の移植材料。
【請求項７４】
前記ＰＤＧＦが滅菌液体中に供給される、請求項７１に記載の移植材料。
【請求項７５】
前記液体が酢酸ナトリウム緩衝液である、請求項７４に記載の移植材料。
【請求項７６】
約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む滅菌液体をリン酸カルシウム材料に浸透させることを含む、移植材料を調製する方法。
【請求項７７】
前記ＰＤＧＦの濃度が、約０．３ｍｇ／ｍＬである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記リン酸カルシウムが、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、難結晶性ヒドロキシアパタイト、非晶質リン酸カルシウム、メタリン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、リン酸七カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム及びリン酸八カルシウムから選択される、請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は骨及び結合組織の治癒に関する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
成長因子は、細胞表面上の受容体に結合するタンパク質であり、細胞増殖及び／又は細胞分化を活性化するという主要な結果を伴う。多くの成長因子が非常に多くの機能を有し、多数の異なる細胞型において細胞分裂を刺激する一方で、特定の細胞型に特異的なものもある。成長因子の例としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、上皮成長因子（ＥＧＦ）及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）が挙げられる。ＰＤＧＦは循環血小板の顆粒、血管平滑筋細胞、内皮細胞、マクロファージ及びケラチノサイトを含む、様々な細胞型に見出される陽イオン性の熱安定性タンパク質であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質合成及び線維芽細胞によるコラーゲン生産を刺激することが知られている。ＰＤＧＦはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて線維芽細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞及びグリア細胞の分裂促進因子及び走化性作用物質として作用することも知られている。
【０００３】
組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）は、動物及びヒトの両方において創傷治癒及び骨再生を刺激することが示されている。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、慢性糖尿病の足の痛みの治癒を促進するために、ヒトに局所的に塗布して使用することが米国及び欧州の両方で認可されている。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢはまた、単独あるいは他の成長因子と併用して、歯周再生、即ち歯の周辺の骨、セメント質及び靱帯の再成長を改善させるのに有効であることが知られている（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，１２４，３１６号を参照）。
【発明の開示】
【０００４】
［発明の概要］
本発明者は今回、低用量のｒｈＰＤＧＦ（約０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬ）が、骨、歯周組織、靱帯及び軟骨の修復を促進することを実証した。少量のｒｈＰＤＧＦは、β−ＴＣＰに吸着させ、修復部位に移植することができ、その結果、ｒｈＰＤＧＦがｉｎ  ｖｉｖｏで放出される。β−ＴＣＰへのｒｈＰＤＧＦの添加は、未処理のβ−ＴＣＰと比較して、骨芽細胞の接着及び増殖を促進することが示されている。
【０００５】
第１の態様では、本発明は、移植材料が骨、歯周組織、靱帯又は軟骨の成長を促進するように、約１．０ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含有する移植材料を投与することにより、例えばヒトのような哺乳類において骨、歯周組織、靱帯又は軟骨の成長を促進する方法を特徴とする。ある実施形態では、ＰＤＧＦは、０．３ｍｇ／ｍＬ以下の量で投与される。別の実施形態では、ＰＤＧＦは、約０．１〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の量で投与される。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦは、約０．２〜約０．７５ｍｇ／ｍＬ、約０．２５〜約０．６ｍｇ／ｍＬ、及び約０．２５〜約０．５ｍｇ／ｍＬの量で投与される。ある実施形態では、ＰＤＧＦは、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ又は約１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．３ｍｇ／ｍＬの量で投与される。別の実施形態では、ＰＤＧＦは、部分的に又は実質的に精製されている。また更なる実施形態では、ＰＤＧＦは、他の混入物質から単離又は精製されている。更なる実施形態では、Ｐ
ＤＧＦは、投与時に０．３ｍｇ／日の平均速度で移植材料から放出される。別の実施形態では、投与時にＰＤＧＦは３００μｇ／日の平均速度で移植材料から放出される。また更なる実施形態では、ＰＤＧＦは、１００μｇ／日未満、５０μｇ／日未満、１０μｇ／日未満又は１μｇ／日未満の平均速度で移植材料から放出される。好ましくは、ＰＤＧＦは、数日、例えば、１日、２日、５日、１０日、１５日、２０日又は２５日、あるいは最大２８日以上にわたって送達される。
【０００６】
本発明の第２の態様は、移植材料が骨、歯周組織、靱帯又は軟骨の成長を促進し、成長するように、約１．０ｍｇ／ｍＬ未満の量の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及び薬学的に許容可能な担体を含有する移植材料を投与することにより、例えばヒトのような哺乳類において骨、歯周組織、靱帯又は軟骨の成長を促進する方法を特徴とする。好ましくは、ＰＤＧＦは約０．３ｍｇ／ｍＬ以下である。ある実施形態では、ＰＤＧＦは、約０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬの範囲で投与される。他の実施形態では、ＰＤＧＦの量は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ又は１．０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．３ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、ＰＤＧＦは、部分的に又は実質的に精製されている。また更なる実施形態では、ＰＤＧＦは、他の混入物質から単離又は精製されている。移植材料を哺乳類に投与する前に、上記方法は、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨を露出させるために皮膚の外科的皮弁を作製する工程、及び投与工程後に皮弁を戻す工程を更に包含することができる。更に別の実施形態では、上記方法は、外科的皮弁の作製後、移植材料の骨、歯周組織、靱帯又は軟骨への投与前に、骨又は歯周組織から有機物を除去するために骨又は歯周組織を滑らかに削る工程を更に包含することができる。更に別の実施形態では、上記方法は、損傷又は罹患した骨、歯周組織、靱帯又は軟骨の成長を促進する。更に別の実施形態では、上記方法は、例えば、抜歯、歯槽堤増大、審美的移植及びサイナスリフトのような外科的治療の結果、新規骨形成が必要とされる位置における骨の成長を促進する。
【０００７】
本発明の第３の態様は、例えばヒトのような哺乳類において骨、歯周組織、靱帯又は軟骨の成長を促進するための移植材料を特徴とする。上記移植材料は、薬学的に許容可能な担体（例えば、生体適合性結合剤、骨置換剤、液体又はゲル）及び約１．０ｍｇ／ｍＬ未満の濃度の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む。好ましくは、ＰＤＧＦは約０．３ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で移植材料中に存在する。ある実施形態では、ＰＤＧＦは約０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬの範囲で投与される。他の実施形態では、ＰＤＧＦの量は約０．１ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ又は１．０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．３ｍｇ／ｍＬである。ある実施形態では、移植材料の薬学的に許容可能な担体は、ＰＤＧＦを含む溶液（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のＰＤＧＦを含有する溶液）を吸収することが可能な生体適合性結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース）又は骨置換剤（β−ＴＣＰ）から構成されるスキャフォールドあるいはマトリクスを含む。別の実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、自重の少なくとも約２５％に等しい量のＰＤＧＦ溶液を吸収することが可能である。他の実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、自重の少なくとも約５０％、７５％、１００％、２００％、２５０％又は３００％に等しい量のＰＤＧＦ溶液を吸収することが可能である。ある実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦを含有する溶液中に薬学的に許容可能な担体を浸すことにより、移植材料の薬学的に許容可能な単体により吸収される。好ましくは、ＰＤＧＦは約１．０ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で溶液中に存在する。別の実施形態では、ＰＤＧＦは約０．３ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で溶液中に存在する。別の実施形態では、ＰＤＧＦは約０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で溶液中に存在する。更に他の実施形態では、ＰＤＧＦは約０．１ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ又は１．０ｍｇ／ｍＬの量で溶液中に存在し、好ましくは０．３ｍｇ／ｍＬの量で溶液中に存在する。別の実施形態では、ＰＤＧＦは部分的に又は実質的に精製されている。また更なる実施形態では、ＰＤＧＦは他の混入物質から単離又は精製されている。
【０００８】
本発明の第４の態様は、例えばヒトのような哺乳類において、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨の成長を促進するための移植材料を調製する方法を特徴とする。上記方法は、約１．０ｍｇ／ｍＬ未満の量の部分的に精製されたか又は精製された血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を、薬学的に許容可能な担体物質と混合する工程を包含する。好ましくは、ＰＤＧＦは、約０．３ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で薬学的に許容可能な担体物質と混合される。ある実施形態では、ＰＤＧＦは、約０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の量で薬学的に許容可能な担体物質と混合される。他の実施形態では、ＰＤＧＦは、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ又は１．０ｍｇ／ｍＬの量で混合される。別の実施形態では、ＰＤＧＦは、０．３ｍｇ／ｍＬの量で混合される。更に別の実施形態では、ＰＤＧＦは、薬学的に許容可能な担体により吸収されて、移植材料を生じる。
【０００９】
本発明の第５の態様は、薬学的に許容可能な液体中約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含有するバイアルを特徴とする。本発明のこの態様のある実施形態では、上記液体は、滅菌酢酸ナトリウム緩衝液である。別の実施形態では、バイアルは、約０．３ｍｇ／ｍＬの濃度のＰＤＧＦを含有する。更に別の好ましい実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢである。更に他の実施形態では、ＰＤＧＦは、約２℃〜８０℃の範囲の温度で貯蔵される場合、少なくとも約１２ヶ月、好ましくは少なくとも約１８ヶ月、より好ましくは少なくとも約２４ヶ月、最も好ましくは少なくとも約３６ヶ月間、酢酸ナトリウム緩衝液中で安定である。
【００１０】
本発明の第６の態様は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含有する液体を中に吸収している多孔質リン酸カルシウムを含む移植材料を特徴とする。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦの濃度は約０．３ｍｇ／ｍＬであり、リン酸カルシウムは、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、難結晶性ヒドロキシアパタイト、非晶質リン酸カルシウム、メタリン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、リン酸七カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム及びリン酸八カルシウムから選択され、ＰＤＧＦは、滅菌液体、例えば酢酸ナトリウム緩衝液中に供給される。
【００１１】
本発明の第７の態様は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む滅菌液体中にリン酸カルシウム材料を浸すことにより移植材料を調製する方法を特徴とする。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦの濃度は約０．３ｍｇ／ｍＬであり、リン酸カルシウムは、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、難結晶性ヒドロキシアパタイト、非晶質リン酸カルシウム、メタリン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、リン酸七カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム及びリン酸八カルシウムから選択される。
【００１２】
本発明の態様のうちのある実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦホモ二量体及びＰＤＧＦヘテロ二量体、例えばＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤ、並びにそれらの組合せ及び誘導体を含む。
【００１３】
本発明の態様のうちのある実施形態では、移植材料における薬学的に許容可能な担体物質は、以下の生体適合性結合剤（例えば、天然又は合成ポリマー）、骨置換剤、液体及びゲルの１つ又は複数であるか、あるいはそれらを更に含む。別の好ましい実施形態では、移植材料は、薬学的に許容可能な固体担体により吸収される薬学的に許容可能な液体担体中に存在するＰＤＧＦを含む。
【００１４】
本発明の態様のうちの別の実施形態では、移植材料は、０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬの範囲、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ又は１．０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．３ｍｇ／ｍＬ、あるいは更には０．１ｍｇ／ｍＬ未満の量の単離されたか、
部分的に精製されたか、実質的に精製されたか、あるいは精製されたＰＤＧＦを、薬学的に許容可能な担体物質、例えば、天然又は合成ポリマー（例えば、コラーゲン、ポリグリコール酸及びポリ乳酸）のような生体適合性結合剤、骨置換剤（例えば、リン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム又はヒドロキシアパタイト）、硫酸カルシウム又は脱灰骨（例えば、脱灰凍結乾燥した皮質骨又は海綿質骨）あるいは市販のゲル又は液体（即ち、粘性若しくは不活性のゲル又は液体）と混合することにより調製される。
【００１５】
幾つかの実施形態では、移植材料の担体物質は、１つ又はそれ以上の生体適合性結合剤であるか、あるいはそれらを更に含む。生体適合性結合剤は、混合された物質間で粘着力を生じるか、又はそれを促進する作用物質である。適切な生体結合性結合剤の非限定的な例としては、多糖、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（α−ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ乳酸、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリル酸メチル、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−ｃｏ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド、並びにそれらの共重合体及び混合物から選択されるポリマーが挙げられる。更なる結合剤としては、アルギン酸、アラビアガム、グァーガム、キサンタンガム、ゼラチン、キチン、キトサン、キトサン酢酸塩、キトサン乳酸塩、コンドロイチン硫酸、Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサン、デキストラン（例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン又はデキストラン硫酸ナトリウム）、フィブリン接着剤、グリセロール、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、セルロース（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロース）、グルコサミン、プロテオグリカン、デンプン（例えば、ヒドロキシエチルデンプン又は可溶性デンプン）、乳酸、プルロニック、グリセロリン酸ナトリウム、コラーゲン、グリコーゲン、ケラチン、絹、並びにそれらの誘導体及び混合物が挙げられる、幾つかの実施形態では、生体適合性結合剤は水溶性である。水溶性結合剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける移植材料の移植直後に移植材料から溶解して、移植材料にマクロ多孔質性を導入する。このマクロ多孔性は、移植部位での破骨細胞及び骨芽細胞の接近、及びそれに伴うそれらの再形成活性を増強することにより移植材料の骨伝導性を増大させる。
【００１６】
生体適合性結合剤は、様々な量で、且つ組成物の調製中の様々な段階で移植材料へ添加することができる。当業者は、目的の用途に必要とされる結合剤の量及び添加方法を決めることが可能である。
【００１７】
ある実施形態では、担体物質は、水、緩衝液及び細胞培地から選択される液体であるか、あるいはそれらを含む。上記液体は、任意の範囲のｐＨで使用され得るが、ほとんどの場合、ｐＨ５．０〜８．０の範囲で使用される。ある実施形態では、ｐＨは、移植材料中に存在するＰＤＧＦの長期にわたる安定性及び有効性、あるいは別の目的の生物学的活性作用物質の長期にわたる安定性及び有効性に合わせて選択される。ほとんどの実施形態に
おいて、液体のｐＨは、ｐＨ５．５〜７．４の範囲である。適切な緩衝液としては、炭酸塩、リン酸塩（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）並びにＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ及びＭＯＰＳのような有機緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。ほとんどの場合、緩衝液は、宿主組織との生体適合性、及び生物学的活性作用物質との適合性に関して選択される。核酸、ペプチド又は抗生物質が移植材料中に含まれるほとんどの用途において、通常のリン酸緩衝生理食塩水で十分である。
【００１８】
本発明の態様のうちの別の実施形態では、移植材料の担体物質は、１つ又はそれ以上の骨置換剤であるか、あるいはそれらを更に含む。骨置換剤は、永続的に又は一時的に骨を置換するのに使用することができる作用物質である。移植後、骨置換剤は身体に保持されるか、身体に吸収されて骨と置換される。例示的な骨置換剤としては、例えば、リン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム（例えば、β−ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト、難結晶性ヒドロキシアパタイト、非晶質リン酸カルシウム、メタリン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、リン酸七カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム及びリン酸八カルシウム）、硫酸カルシウム又は脱灰骨（例えば、脱灰凍結乾燥した皮質骨又は海綿質骨）が挙げられる。ある実施形態では、担体物質は、生体吸収性である。別の実施形態では、骨置換剤は、ミクロン又はサブミクロンサイズの粒子、例えばナノサイズの粒子のマトリクスとして供給される。粒子は、サイズが約１００μｍ〜約５，０００μｍの範囲、より好ましくは約２００μｍ〜約３，０００μｍの範囲、最も好ましくは約２５０μｍ〜約２，０００μの範囲であるか、あるいは粒子は、約１ｎｍ〜約１，０００ｎｍの範囲、好ましくは約５００ｎｍ未満、より好ましくは約２５０ｎｍ未満である。別の実施形態では、骨置換剤は、多孔質組成物を有する。組成物の多孔性が組成物への細胞遊走及び細胞浸潤を促進し、細胞が細胞外骨マトリクスを分泌することができるので、組成物の多孔性は望ましい特徴である。また、組成物の多孔性は、血管形成のための手段を提供する。多孔性はまた、活性物質の吸収及び放出の増強、並びに細胞−マトリクス相互作用のための表面積増大をもたらす。好ましくは、組成物は、４０％を上回る、より好ましくは６５％を上回る、最も好ましくは９０％を上回る多孔性を有する。組成物は、移植に適した形状（例えば、球体、円筒体及びブロック体）で供給されるか、あるいは使用する前に寸法をあわせて、形成することができる。好ましい実施形態では、骨置換剤はリン酸カルシウム（例えば、β−ＴＣＰ）である。
【００１９】
骨置換剤はまた、流動性の成形用ペースト又はパテとして供給される。好ましくは、骨置換剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける移植前又は移植後に、自硬化して、硬化リン酸カルシウムを形成するリン酸カルシウムペーストである。本発明のリン酸カルシウム構成成分は、当該技術分野で既知の任意の生体適合性リン酸カルシウム材料である。リン酸カルシウム材料は、様々な方法のいずれか１つにより、任意の適切な出発成分を使用して生産することができる。例えば、リン酸カルシウム材料としては、非晶質アパタイト型リン酸カルシウムが挙げられる。リン酸カルシウム材料は、結晶性ヒドロキシアパタイト固体を形成するための、結晶性リン酸カルシウム反応物の固体酸−塩基反応により生産することができる。リン酸カルシウム材料を生産する他の方法は当該技術分野で既知であり、そのうちの幾つかを以下に記載する。
【００２０】
リン酸カルシウム材料は、難結晶性アパタイト型（ＰＣＡ）リン酸カルシウム又はヒドロキシアパタイト（ＨＡ）である。ＰＣＡ材料は、米国特許出願第５，６５０，１７６号、同第５，７８３，２１７号、同第６，０２７，７４２号、同第６，２１４，３６８号、同第６，２８７，３４１号、同第６，３３１，３１２号及び同第６，５４１，０３７号に記載され、これらは全て、参照により本明細書に援用される。ＨＡは、例えば米国再発行特許第３３，２２１号及び同第３３，１６１号に記載されている。これらの特許は、リン酸カルシウム再石灰化組成物の調製、及び該リン酸カルシウム組成物に基づいた微細結晶性、非セラミックの段階的に吸収可能なヒドロキシアパタイト担体材料の調製を開示して
いる。リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）及びリン酸一カルシウム（ＭＣＰ）、又はその一水和物形態（ＭＣＰＭ）から構成される類似したリン酸カルシウム系は、米国特許第５，０５３，２１２号及び同第５，１２９，９０５号に記載されている。このリン酸カルシウム材料は、結晶性ヒドロキシアパタイト固体を形成するための結晶性リン酸カルシウム反応物の固体酸−塩基反応により生産される。
【００２１】
結晶性ＨＡ材料（一般的に炭酸塩含水燐灰石と称される）は、流動性で、成形用であり、ｉｎ  ｓｉｔｕで硬化可能であるように調製される（米国特許第５，９６２，０２８号）。これらのＨＡ材料（一般的に炭酸ヒドロキシアパタイトと称される）は、上記反応物を非水性液体と混合して実質的に一様な混合物を提供し、必要に応じて混合物を形成し、水の存在下で（例えば、移植の前又は後に）混合物を硬化させることにより形成することができる。硬化中、混合物は、固体状且つ本質的に一体アパタイト型構造に結晶化する。
【００２２】
反応物は概して、リン酸塩供給源、例えば実質的に水を含まないリン酸又はリン酸塩、アルカリ土類金属、特にカルシウムの供給源から成り、任意に結晶性核、特にヒドロキシアパタイト又はリン酸カルシウム結晶、炭酸カルシウム及び生理学的に許容可能な潤滑剤、例えば本明細書中に記載の非水性液体のいずれかから構成される。乾燥成分は、混合物として予め混合されて、続いて実質的に一様な混合が行われる条件下で、非水性液体成分と混合される。
【００２３】
リン酸カルシウム材料は、その生物学的吸収性、生体適合性及びその最小結晶化度を特徴とする。結晶特性は、実質的に自然骨と同様である。好ましくは、リン酸カルシウム材料は、生理学的条件下において５時間未満で硬化し、実質的には約１〜５時間で硬化する。好ましくは材料は、約１０〜３０分以内に実質的に硬化する。生理学的条件下における硬化速度は、参照により本明細書に援用される米国特許第６，０２７，７４２号に記載されるように幾つかの簡単なパラメータを変更することにより、治療の必要性に応じて変化させることができる。
【００２４】
ある実施形態では、生じた生体吸収性リン酸カルシウム材料は、ヒドロキシアパタイトの約１．６７という理想的な化学量論値と比較した場合に、約１．６未満のカルシウム対リン酸塩のモル比を有する「カルシウム欠乏性」である。
【００２５】
望ましいリン酸カルシウムは、湿潤環境下、体温又は体温付近の温度で５時間未満、好ましくは１０〜３０分以内に硬化することが可能である。望ましい材料は、１〜５ｇのペレットとして移植される場合に、少なくとも８０％が１年以内に吸収される材料である。好ましくは、材料は完全に吸収される。
【００２６】
本発明の態様のうちの幾つかの実施形態では、移植材料は、１つ又は複数の生物学的活性作用物質を更に含み得る。本発明の移植材料に組み込むことができる生物学的活性作用物質としては、有機分子、無機分子、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、遺伝子、遺伝子断片、遺伝子調節配列及びアンチセンス分子）、核タンパク質、多糖類、糖タンパク質及びリポタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の移植材料に組み込むことができる生物学的活性化合物の種類としては、抗癌剤、抗生物質、鎮痛剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、酵素阻害剤、抗ヒスタミン剤、抗痙攣剤、ホルモン剤、筋弛緩剤、鎮痙剤、眼用剤、プロスタグランジン、抗鬱剤、抗精神病物質、栄養素、骨誘導タンパク質、成長因子及びワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
抗癌剤としては、アルキル化剤、白金剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍抗生物質、抗有糸分裂剤、アロマターゼ阻害剤、チミジル酸合成阻害剤、ＤＮＡアンタゴニスト、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ポンプ阻害剤、ヒストンアセチルト
ランスフェラーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、リボヌクレオシド還元酵素阻害剤、ＴＮＦαアゴニスト／アンタゴニスト、エンドセリンＡ受容体アンタゴニスト、レチノイン酸受容体アゴニスト、免疫調節剤、ホルモン及び抗ホルモン剤、光力学剤、並びにチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。
【００２８】
表１で示される任意の生物学的活性作用物質を使用することができる。
【００２９】
【表１−１】
2008516675.tif 000002
【表１−２】
2008516675.tif 000003
【表１−３】
2008516675.tif 000004
【表１−４】
2008516675.tif 000005
【００３０】
抗生物質としては、アミドグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルミシン、ストレプトマイシン、アミカシン、ネオマイシン）、バシトラシン、コルバペネム（例えば、イミペネム／シスラスタチン）、セファロスポリン、コリスチン、メテナミン、モノバクタム（例えば、アズトレオナム）、ペニシリン（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナトシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、メズロシリン、アズロシリン）、ポリミキシンＢ、キノロン及びバンコマイシン；並びにクロラムフェニコール、クリンダンヤン、マクロライド（例えば、エリトロマイシン、アジトロマイシン、クラリトロマイシン）、リンコムヤン、ニトロフラントイン、スルホンアミド、テトラサイクリン（例えば、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、デメクロサイクリン）及びトリメトプリムのような静菌剤が挙げられる。また、メトロニダゾール、フルオロキノロン及びリタンピンも含まれる。
【００３１】
酵素阻害剤は酵素反応を阻害する物質である。酵素阻害剤の例としては、塩化エドロホニウム、Ｎ−メチルフィゾスチグミン、臭化ネオスチグミン、硫酸フィゾスチグミン、タクリン、タクリン、１−ヒドロキシマレイン酸塩、ヨードツベルシジン、ｐ−ブロモテト
ラミゾール、１０−（α−ジエチルアミノプロピオニル）−フェノチアジン塩酸塩、塩化カルミダゾリウム、ヘミコリニウム−３，３，５−ジニトロカテコール、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤Ｉ、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤ＩＩ、３−フェニルプロパルギルアミン、Ｎ６−モノメチル−Ｌ−アルギニン酢酸塩、カルビド−パ、３−ヒドロキシベンジルヒドラジン、ヒドララジン、クロルギリン、デプレニル、ヒドロキシルアミン、リン酸イプロニアジド、６−ＭｅＯ−テトラヒドロ−９Ｈ−ピリド−インドール、ニアラミド、パルジリン、キナクリン、セミカルバジド、トラニルシプロミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル−２，２−ジフェニル吉草酸塩酸塩、３−イソブチル−１−メチルキサンテン、パパベリン、インドメタシン、２−シクロオクチル−２−ヒドロキシエチルアミン塩酸塩、２，３−ジクロロ−ａ−メチルベンジルアミン（ＤＣＭＢ）、８，９−ジクロロ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンズアゼピン塩酸塩、ｐ−アミノグルテチミド、ｐ−アミノグルテチミド酒石酸塩、３−ヨードチロシン、α−メチルチロシン、アセタゾールアミド、ジクロルフェナミド、６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾールスルホンアミド及びアロプリノールが挙げられる。
【００３２】
抗ヒスタミン剤としては、特にピリラミン、クロルフェニラミン及びテトラヒドラゾリンが挙げられる。
【００３３】
抗炎症剤としては、コルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症剤（例えば、アスピリン、フェニルブタゾン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イブプロフェン、ピロキシカム及びフェナメート）、アセトアミノフェン、フェナセチン、金塩、クロロキン、Ｄ−ペニシラミン、メトトレキサートコルヒチン、アロプリノール、プロベネシド及びスルフィンピラゾンが挙げられる。
【００３４】
筋弛緩剤としては、メフェネシン、メトカルボマール、塩酸シクロベンザプリン、塩酸トリヘキシルフェニジル、レボド−パ／カルビド−パ及びビペリデンが挙げられる。
【００３５】
鎮痙剤としては、アトロピン、スコポラミン、オキシフェノニウム及びパパベリンが挙げられる。
【００３６】
鎮痛剤としては、アスピリン、フェニブタゾン、イドメタシン、スリンダク、トルメチク、イブプロフェン、ピロキシカム、フェナメート、アセトアミノフェン、フェナセチン、硫酸モルフィン、硫酸コデイン、メペリジン、ナロルフィン、オピオイド（例えば、硫酸コデイン、クエン酸フェンタニル、重酒石酸ヒドロコドン、ロペラミド、硫酸モルフィン、ノスカピン、ノルコデイン、ノルモルフィン、テバイン、ノル−ビナルトルフィミン、ブプレノルフィン、クロルナルトレキサミン、フナルトレキサミオン、ナルブフィン、ナロルフィン、ナロキソン、ナロキソナジン、ナルトレキソン及びナルトリンドール）、プロカイン、リドカイン、テトラカイン及びジブカインが挙げられる。
【００３７】
眼用剤としては、フルオレセインナトリウム、ローズベンガル、メタコリン、アドレナリン、コカイン、アトロピン、α−キモトリプシン、ヒアルロニダーゼ、ベタキサロール、ピロカルピン、チモロール、チモロール塩及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３８】
プロスタグランジンは、当該技術分野で認識され、様々な生物学的効果を有する、天然の、化学的に関連した、長鎖ヒドロキシ脂肪酸の一種である。
【００３９】
抗鬱剤は、鬱病を防ぐ又は軽減することができる物質である。抗鬱剤の例としては、イミプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、デシプラミン、アモキサピン、ドキセピン、マプロチリン、トラニルシプロミン、フェネルジン及びイソカルボキシアジドが挙げられる。
【００４０】
成長因子は、その持続的な存在により細胞の生存能力又は寿命が改善される因子である。栄養素としては、好中球活性化タンパク質、単球走化性タンパク質、マクロファージ炎症性タンパク質、血小板因子、血小板塩基性タンパク質及びメラノーマ成長刺激活性；上皮成長因子、トランスフォーミング成長因子（α）、線維芽細胞成長因子、血小板由来内皮成長因子、インスリン様成長因子（ＩＧＦ、例えば、ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩ）、グリア由来の成長神経栄養因子、繊毛の神経栄養因子、神経成長因子、骨成長／軟骨誘導性因子（α及びβ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターロイキン（例えば、インターロイキン１からインターロイキン１０を含む、インターロイキン阻害剤又はインターロイキン受容体）、インターフェロン（例えば、インターフェロンα、β及びγ）、エリスロポイエチンを含む造血因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子；腫瘍壊死因子、β−１、β−２、β−３を含むトランスフォーミング成長因子（β）、トランスフォーミング成長因子（α）、インヒビン及びアクチビン；並びにＯＰ−１、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のような骨形態形成タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
ホルモン剤としては、エストロゲン（例えば、エストラジオール、エストロン、エストリオール、ジエチルスチベストロール、キネストロール、クロロトリアニセン、エチニルエストラジオール、メストラノール）、抗エストロゲン剤（例えば、クロミフェン、タモキシフェン）、プロゲスチン（例えば、メドロキシプロゲステロン、ノルエチンドロン、ヒドロキシプロゲステロン、ノルゲストレル）、抗プロゲスチン剤（ミフェプリストン）、アンドロゲン（例えば、シピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン、ダナゾール、テストラクトン）、抗アンドロゲン剤（例えば、酢酸シプロテロン、フルタミド）、甲状腺ホルモン（例えば、トリヨードチロン、チロキシン、プロピルチオウラシル、メチマゾール及びヨージキソド）、及び下垂体ホルモン（例えば、コルチコトロピン、スムトトロピン、オキシトシン及びバソプレシン）が挙げられる。ホルモン剤は、一般的にホルモン補充療法及び／又は避妊目的に用いられる。プレドニゾン等のステロイド系ホルモンはまた、免疫抑制剤及び抗炎症剤として使用される。
【００４２】
生物学的活性作用物質はまた、望ましくはアクチビン、インヒビン及び骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含むトランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーとして既知のタンパク質のファミリーから選択される。ある実施形態では、活性物質は、骨形成活性並びに他の成長及び分化型活性を有することが開示されている、一般的にＢＭＰとして既知であるタンパク質のサブクラスから選択される少なくとも１つのタンパク質を含有する。これらのＢＭＰとしては、例えば米国特許第５，１０８，９２２号、同第５，０１３，６４９号、同第５，１１６，７３８号、同第５，１０６，７４８号、同第５，１８７，０７６号及び同第５，１４１，９０５号に開示されるＢＭＰタンパク質ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７；ＰＣＴ国際公開ＷＯ９１／１８０９８号に開示されるＢＭＰ−８；並びにＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／００４３２号に開示されるＢＭＰ−９；ＰＣＴ国際公開ＷＯ９４／２６８９３号に開示されるＢＭＰ−１０；ＰＣＴ国際公開ＷＯ９４／２６８９２号に開示されるＢＭＰ−１１；あるいはＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／１６０３５号に開示されるＢＭＰ−１２又はＢＭＰ−１３；ＢＭＰ−１４；米国特許第５，６３５，３７２号に開示されるＢＭＰ−１５；あるいは米国特許第５，９６５，４０３号に開示されるＢＭＰ−１６が挙げられる。本発明のリン酸カルシウム組成物における活性作用物質として有用であり得る他のＴＧＦ−βタンパク質としては、Ｖｇｒ−２(Jones他, Mol. Endocrinol., 6:1961, 1992)並びにＰＣＴ国際公開ＷＯ９４／１５９６５号、同ＷＯ９４／１５９４９号、同ＷＯ９５／０１８０１号、同ＷＯ９５／０１８０２、同ＷＯ９４／２１６８１号、同ＷＯ９４／１５９６６号、同ＷＯ９５／１０５３９号、同ＷＯ９６／０１８４５、同ＷＯ９６／０２５５９号等に記載されるものを含む他の成長及び分化因子（ＧＤＦ）が挙げられる。また、ＷＯ９
４／０１５５７号に開示されるＢＩＰ、特開平７−２５０６８８号に開示されるＨＰ００２６９、及びＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／１６０９９号に開示されるＭＰ５２も本発明で有用であり得る。上記出願の全ての開示は、参照により本明細書に援用される。本発明で使用することができるＢＭＰのサブセットとしては、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４及びＭＰ５２が挙げられる。活性作用物質は、最も好ましくはＢＭＰ−２であり、その配列は、米国特許第５，０１３，６４９号に開示され、この開示は、参照により本明細書に援用される。テリパラチド（Ｆｏｒｔｅｏ（商標））、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ（登録商標）、プロスタグランジンＥ２、ＬＩＭタンパク質、オステオゲニン又は脱灰骨基質（ＤＢＭ）のような当該技術分野で既知の他の骨形成剤もまた使用することができる。
【００４３】
生物学的活性作用物質は、化学的に合成されるか、組換えによって生産されるか、あるいは生物学的活性作用物質が天然で見出される供給源から精製される。活性作用物質は、ＢＭＰ又は他の二量体タンパク質のようなＴＧＦ−βである場合、ホモ二量体であっても、他のＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−６のそれぞれ１つのモノマーから構成されるヘテロ二量体）やアクチビン、インヒビン及びＴＧＦ−β１のようなＴＧＦ−βスーパーファミリーの他の成員（例えば、ＢＭＰ及びＴＧＦ−βスーパーファミリーの関連成員のそれぞれ１つのモノマーから構成されるヘテロ二量体）とのヘテロ二量体であってもよい。かかるヘテロ二量体タンパク質の例は、例えばＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０９２２９号に記載され、この明細書は、参照により本明細書に援用される。
【００４４】
更なる生物学的活性作用物質としては、ヘッジホッグ、フラズルド、コーディン、ノギン、ケルベロス及びフォリスタチンタンパク質が挙げられる。これらのファミリーのタンパク質は概ね、Sashay他, Cell, 79:779-790, 1994（コーディン）、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９４／０５８００号（ノギン）及びFukui他, Devel. Biol., 159:131, 1993（フォリスタチン）に記載されている。ヘッジホッグタンパク質は、ＷＯ９６／１６６６８号、ＷＯ９６／１７９２４号及びＷＯ９５／１８８５６号に記載されている。フラズルドファミリータンパク質は、フリズルドとして知られている受容体タンパク質ファミリーの細胞外結合ドメインに対して高い相同性を有する、近年発見されたタンパク質のファミリーである。フリズルドファミリーの遺伝子及びタンパク質は、Wang他, J. Biol. Chem., 271:4468-4476, 1996に記載されている。活性作用物質はまた、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／０７９８２号に開示される切断型可溶性受容体のような他の可溶性受容体を含む。ＷＯ９５／０７９８２号の教示から、切断型可溶性受容体が多数の他の受容体タンパク質に関して調製できることが当業者に理解されよう。上記刊行物は、参照により本明細書に援用される。
【００４５】
例えば骨形成活性の増大といった、提示性又は浸潤性の前駆細胞あるいは他の細胞の目的の活性を刺激するのに有効である骨形成タンパク質などの生物学的活性タンパク質の量は、処理される不具合の大きさ及び性質、並びに用いられる担体によって変わる。概して、送達されるタンパク質の量は、約０．１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１〜約１００ｍｇ、最も好ましくは約１０〜約８０ｍｇの範囲である。
【００４６】
上述した作用物質の送達に関する標準的なプロトコル及びレジメンは、当該技術分野で既知である。生物学的活性作用物質は、移植部位に適切な投与量の作用物質が送達される量で移植材料に導入される。たいていの場合、投与量は、当業者に既知で、問題となっている特定の作用物質に適用可能なガイドラインを使用して決定される。本発明の移植材料中に含まれる生物学的活性作用物質の例示的な量は、状態のタイプ及び程度、特定の患者の全体的な健康状態、活性作用物質の処方、及び使用される送達担体の生体吸収性のような変化させることができる要素によって変わると考えられる。標準的な臨床試験を使用して、任意の特定の生物学的活性作用物質に関する投与量及び投薬頻度を最適化することができる。
【００４７】
本発明の態様のうちのある実施形態では、組成物は、自己骨髄又は自己血小板抽出物を更に含有することができる。
【００４８】
上記態様のうちの別の実施形態では、ＰＤＧＦ及び／又は他の成長因子は、天然供給源（例えば、血小板）から得ることができ、より好ましくは、組換えＤＮＡ技術により生産することができる。天然供給源から得る場合、ＰＤＧＦ及び／又は他の成長因子は、生体液から得ることができる。生体液としては、生体に関連した任意に処理した又は未処理の液体（懸濁液を含む）が挙げられ、特に全血、温血又は冷血及び保存血液又は新鮮血液のような血液；生理食塩水、栄養分及び／又は抗凝固薬溶液を包含するがこれらに限定されない少なくとも１つの生理学的溶液で希釈された血液のような処理血液；血小板濃縮物（ＰＣ）、アフェレーシスを行った血小板、多血小板血漿（ＰＲＰ）、乏血小板血漿（ＰＰＰ）、無血小板血漿、血漿、血清、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、血漿から得られる構成成分、濃厚赤血球（ＲＰＣ）、軟膜（ＢＣ）のような血液成分；血液又は血液成分に由来するか、あるいは骨髄に由来する血液製剤；血漿から分離され、且つ生理学的液体中に再懸濁された赤血球；並びに血漿から分離され、且つ生理学的液体中に再懸濁された血小板が挙げられる。生体液は、本発明に従って処理される前に、白血球を除去するように処理しても良い。本明細書中で使用する場合、血液製剤又は生体液は、上記の構成成分、及び他の手段により得られ、類似した特性を有する類似の血液製剤又は生体液を指す。ある実施形態では、ＰＤＧＦは、多血小板血漿（ＰＲＰ）から得られる。ＰＲＰの調製は、米国特許第６，６４９，０７２号、同第６，６４１，５５２号、同第６，６１３，５６６号、同第６，５９２，５０７号、同第６，５５８，３０７号、同第６，３９８，９７２号及び同第５，５９９，５５８号に記載され、これらは、参照により本明細書に援用される。
【００４９】
本発明の態様のうちのある実施形態では、移植材料は、少なくとも１日よりも長い期間、移植部位でＰＤＧＦを送達する。幾つかの実施形態では、移植材料は、少なくとも７日、１４日、２１日又は２８日間、移植部位でＰＤＧＦを送達する。好ましくは、移植材料は、約１日〜７日、１４日、２１日又は２８日間、移植部位でＰＤＧＦを送達する。別の実施形態では、移植材料は、約１日より長いが、約１４日未満の期間、移植部位でＰＤＧＦを送達する。
【００５０】
「生体吸収性」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて移植材料が吸収又は再形成される能力を意味する。吸収プロセスは、体液、酵素又は細胞の作用による元の移植材料の分解及び排除を含む。吸収された材料は、宿主により新規組織の形成で使用されてもよく、あるいは宿主により再利用されてもよく、あるいは排出されてもよい。
【００５１】
「分化因子」とは、１つ又はそれ以上の標的細胞の軟骨又は骨形成能力を有する細胞への分化を刺激する、少なくとも６つのアミノ酸鎖を含むポリペプチドを意味する。
【００５２】
「ナノメートルサイズの粒子」とは、１，０００ナノメートル未満の粒子として一般的に定義されるサブミクロンサイズの粒子を意味する。ナノメートルサイズの粒子は、分子性物質とマクロン物質との中間状態である固体粒子材料である。ナノメートルは、メートルの１０億分の１として定義される（１ナノメートル＝１０９ｍ）。ナノメートル材料は、ナノスケールサイズを有する粉末、繊維、フィルム又はブロックとして知られている。
【００５３】
「歯周組織」は、歯を取り囲み、支持する組織を意味する。歯周組織は、歯を支持、保護し、栄養を供給する。歯周組織は、骨、セメント質、上顎骨及び下顎骨の歯槽突起、歯周靱帯並びに歯肉から構成される。セメント質は、歯根の象牙質を完全に覆う組織の薄い石灰化された層である。セメント質は、根の発達中、及び歯の寿命全体にわたって形成されて、歯周靱帯線維に対する接着領域として機能する。歯槽突起は、歯が包埋され、歯根
が支持される上顎骨及び下顎骨の骨性部分である。歯槽は、歯根が歯周靱帯により保持される歯槽突起内の腔である。ある槽と別の槽とを分割する骨は、歯間中隔と呼ばれる。多根歯が存在する場合、上記骨は、根間中隔と呼ばれる。歯槽突起は、皮質板、歯槽頂、骨梁及び固有歯槽骨を包含する。
【００５４】
「成長促進」とは、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨の治癒、並びにかかる組織及び構造の再生を意味する。好ましくは、骨、歯周組織、靱帯又は軟骨は、損傷又は創傷しており、再生又は治癒を必要とする。
【００５５】
「歯周組織成長促進」とは、疾患又は外傷により損傷している歯槽骨、セメント質及び介在する歯周靱帯を含む歯の支持組織の再生又は治癒を意味する。
【００５６】
「精製された」とは、担体物質との混合前に、９５重量％又はそれ以上である成長又は分化因子、例えば、ＰＤＧＦを意味し、即ち、該因子が天然で関連する他のタンパク質、脂質及び炭水化物を実質的に含まない。「実質的に精製された」という用語は、例えばわずか５〜９５重量％、好ましくは６５〜９５％の因子を有する、より低い純度の因子を指す。精製されたタンパク質調製物は概して、ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要なバンドを生じる。最も好ましくは、本発明の移植材料で使用される精製された因子は、アミノ末端アミノ酸配列分析により判断すると純粋である。「部分的に精製された」という用語は、生産するのに例えば遠心分離による収集及び分離を必要とするＰＲＰ、ＰＰＰ、ＦＦＰ又は任意の他の血液製剤に関連して供給されるＰＤＧＦを指す。
【００５７】
一例として、約１．０ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦを有する溶液は、約５０％の純度である場合、約２．０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質を構成する。
【００５８】
本発明の移植材料は、結合組織、骨及びセメント質の成長を促進することにより、少なくとも部分的に歯周組織の再生を促進する。移植材料は、結合組織、骨及びセメント質を生産する細胞の成長並びに分化を直接促進するように調製することができる。あるいは、移植材料は、例えば結合組織、骨及びセメント質の成長を促進するのに必要な細胞を誘引することにより間接的に作用するように調製することができる。本発明の組成物を使用した再生は、全身性抗生物質又は外科的デブリドマン単独により達成される治療よりも、歯周疾患又は骨創傷のより有効な治療である。
【００５９】
ＰＤＧＦ、ポリペプチド成長因子及び分化因子は、固相ペプチド合成、あるいは組換えＤＮＡ技術により、ヒト組織、又は例えば血小板などの細胞から得られる。従って、「ポリペプチド成長因子」又は「分化因子」という用語は、組織又は細胞由来の材料、組換えあるいは合成材料を意味する。上記因子が例えば、ＰＤＧＨなどの二量体である場合、組換え因子は、培養された原核細胞又は真核細胞に上記因子の両方のサブユニットをコードするＤＮＡ配列を挿入し、続いてヘテロ二量体（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ）を形成するように、翻訳されたサブユニットを上記細胞によってプロセシングさせることにより作製される組換えへテロ二量体である。あるいは、サブユニットの一方だけをコードするＤＮＡ（例えば、ＰＤＧＦのＢ鎖又はＡ鎖）は細胞に挿入することができ、続いてこれを培養して、ホモ二量体因子（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ又はＰＤＧＦ−ＡＡホモ二量体）を生産する。本発明の方法で使用するＰＤＧＦとしては、ＰＤＧＦホモ及びヘテロ二量体、例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤ、並びにそれらの組合せ及び誘導体が挙げられる。
【００６０】
本発明のＰＤＧＦ又は他の成長因子の濃度は、例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第６，２２１，６２５号、同第５，７４７，２７３号及び同第５，２９０，７０８号に記載されるような酵素結合イムノアッセイ、あるいはタンパク質濃度を決定する
ための当該技術分野で既知の任意のアッセイを使用することにより決定することができる。本明細書中で提供される場合、ＰＤＧＦのモル濃度は、ＰＤＧＦ二量体の分子量（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＭＷ＝約２５ｋＤａ）に基づいて決定される。
【００６１】
本発明の方法及び移植材料は、哺乳類の骨性創傷、例えば骨折、移植材料受容部位及び歯周疾患の部位を治療するのに使用することができる。移植材料は、自然治癒（即ち、外因性作用物質を添加しない）又は全身性抗生物質の添加により補助される治癒と比較して、結合組織の成長及び修復を促進し、骨形成を促進する。自然治癒、従来の外科的療法又は抗生物質とは異なり、本発明の移植材料は、損傷又は罹患した組織、あるいは歯周疾患に冒された部位の適用される場合、骨、結合組織（例えば、軟骨及び靱帯）の増強並びにセメント質の形成を促進する。これらの組織の回復は、冒された部位において予後の改善をもたらす。これらの因子の、新規骨形成を刺激する能力により、該因子は他のタイプの感染又は外科的外傷若しくは突発的外傷により引き起こされる骨障害の処理に適用可能となる。
【００６２】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の本発明の実施形態の説明、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【００６３】
［発明の詳細な説明］
ここで、本発明の幾つかの実施形態について記載する。骨及び歯周組織治癒剤としてのＰＤＧＦの使用を示す２つの例を以下に提示する。
［実施例］
【実施例１】
【００６４】
ＰＤＧＦの調製
部分的に精製されたか、又は精製されたＰＤＧＦを、上記の薬学的に許容可能な担体物質のいずれかと組み合わせることにより、本発明に従って、例えば歯周疾患又は外傷後の骨創傷は処理されて、骨、セメント質及び結合組織を含む歯周組織は再生される。精製されたＰＤＧＦは、組換え供給源又はヒト血小板から得ることができる。市販の組換えＰＤＧＦは、R&D Systems Inc.(ミネアポリス、 ミネソタ州)、BD Biosciences (サンノゼ,
カリフォルニア州)及びChemicon, International (テメキュラ、 カリフォルニア州)から入手することができる。部分的に精製されたＰＤＧＦ及び精製されたＰＤＧＦはまた、以下の通りに調製することができる：
【００６５】
５００〜１，０００ユニットの洗浄ヒト血小板ペレットを１ＭのＮａＣｌ（血小板１ユニット当たり２ｍＬ）中に懸濁させて、１００℃で１５分間加熱する。続いて、上清を遠心分離により分離して、沈殿物を１ＭのＮａＣｌで２度抽出する。
【００６６】
抽出物を合わせて、０．０８ＭのＮａＣｌ／０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析して、緩衝液で平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−５０と４℃で一晩混合する。続いて、混合物をカラム（５×１００ｃｍ）へ注いで、０．０８ＭのＮａＣｌ／０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で十分に洗浄して、分画１０ｍＬを回収しながら１ＭのＮａＣｌで溶出する。
【００６７】
活性分画をプールして、０．３ＭのＮａＣｌ／０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析して、遠心分離して、０．３ＭのＮａＣｌ／０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した２．５×２５ｃｍのブルーセファロース(Pharmacia)カラムに４℃で通す。続いて、カラムを緩衝液で洗浄して、部分的に精製されたＰＤＧＦを、１ＭのＮａＣｌ及びエチレングリコールの１：１溶液で溶出する。
【００６８】
部分的に精製されたＰＤＧＦ分画を、１ＭのＮａＣｌで希釈して（１：１）、１Ｍの酢酸に対して透析して、凍結乾燥させる。凍結乾燥したサンプルを０．８ＭのＮａＣｌ／０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解させて、緩衝液で平衡化した１．２×４０ｃｍのＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−５０カラムに通す。続いて、ＰＤＧＦをＮａＣｌ勾配（０．０８〜１Ｍ）で溶出する。
【００６９】
活性分画を合わせて、１Ｍの酢酸に対して透析して、凍結乾燥させて、少量の１Ｍの酢酸中に溶解する。０．５ｍＬ分を、１Ｍの酢酸で平衡化した１．２×１００ｃｍのＢｉｏｇｅｌ  Ｐ−１５０カラム（１００〜２００メッシュ）にかける。続いて、２ｍＬ分画を回収しながら、ＰＤＧＦを１Ｍの酢酸で溶出する。
【００７０】
タンパク質１００〜２００ｍｇを含有する各活性分画を凍結乾燥させて、０．４％トリフルオロ酢酸１００ｍＬ中に溶解し、ｐｈｅｎｙｌ  Ｂｏｎｄａｐａｋカラム(Waters)を用いた逆相高速液体クロマトグラフィに付す。線形アセトニトリル勾配（０〜６０％）による溶出により、純粋なＰＤＧＦが生じる。
【００７１】
組換えＤＮＡ技術により作製されるＰＤＧＦは、以下の通りに調製することができる：
ヒト血小板に由来する血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、２つのポリペプチド配列（ＰＤＧＦ−Ｂ及びＰＤＧＦ−Ａポリペプチド(Antoniades, H.N. and Hunkapiller. M., Science 220:963-965, 1983))を含有する。ＰＤＧＦ−Ｂは、７番染色体上に局在化する遺伝子によりコードされ(Betsholtz, C. 他, Nature 320:695-699)、ＰＤＧＦ−Ａは、２２番染色体上に局在化する（Dalla-Favera, R., Science 218:686-688, 1982)ｓｉｓ癌遺伝子(Doolittle, R. 他, Science 221:275-277, 1983)によりコードされる。ｓｉｓ遺伝子は、ＰＤＧＦ−２ポリペプチドに密接に関連するサル肉腫ウイルス（ＳＳＶ）のトランスフォーミングタンパク質をコードする。ヒト細胞ｃ−ｓｉｓはまた、ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする(Rao, C.D. 他, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83: 2392-2396, 1986)。ＰＤＧＦの２つのポリペプチド鎖は、別個の染色体に局在化する２つの異なる遺伝子によりコードされるため、ヒトＰＤＧＦがＰＤＧＦ−Ｂ及びＰＤＧＦ−Ａのジスルフィド結合したヘテロ二量体、あるいは２つのホモ二量体（ＰＤＧＦ−ＢＢホモ二量体及びＰＤＧＦ−ＡＡホモ二量体）の混合物、又はヘテロ二量体及び２つのホモ二量体の混合物から構成される可能性が存在する。
【００７２】
ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする遺伝子を含有するサル肉腫ウイルスに感染した培養液中の哺乳類細胞は、ＰＤＧＦ−Ａポリペプチドを合成すること、及びそれをジスルフィド結合したホモ二量体へプロセシングすることが示された(Robbins 他, Nature, 305:605-608, 1983)。更に、ＰＤＧＦ−Ａホモ二量体は、ヒトＰＤＧＦに対して産生される抗血清と反応する。更に、培養線維芽細胞のＤＮＡ合成を刺激し、１８５ｋＤの細胞膜タンパク質のチロシン残基のリン酸化を誘導し、特異的細胞表面ＰＤＧＦ受容体との結合に関してヒト（１２５Ｉ）−ＰＤＧＦと競合する可能性があるという点で、分泌されるＰＤＧＦ−Ａホモ二量体の機能特性は、血小板由来ＰＤＧＦの機能特性と類似している(Owen, A. 他, Science, 225:54-56, 1984)。類似した特性が、培養正常ヒト細胞（例えば、ヒト動脈内皮細胞）又はｓｉｓ／ＰＤＧＦ−２遺伝子を発現するヒト悪性細胞に由来するｓｉｓ／ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子産物に関して示された(Antoniades, H. 他, Cancer Cells, 3:145-151, 1985)。
【００７３】
組換えＰＤＧＦ−Ｂホモ二量体は、発現ベクターを使用して、マウス細胞にｃ−ｓｉｓ／ＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子のｃＤＮＡクローンを導入することにより得られる。発現に使用するｃ−ｓｉｓ／ＰＤＧＦ−Ｂクローンは、正常なヒト培養内皮細胞から得られた(Collins. T. 他, Nature, 216:748-750, 1985)。
【００７４】
ＰＤＧＦの使用
単独あるいは他の成長因子と併用したＰＤＧＦは、骨治癒、骨成長及び外傷若しくは疾患により負傷した歯の支持構造の再生又は治癒を促進するのに有用である。ＰＤＧＦはまた、抜歯部位の治癒、下顎堤増強、あるいは歯移植部位の治癒を促進するのに有用である。骨治癒はまた、骨折部位、感染部位（例えば、骨髄炎）又は腫瘍部位で促進される。ＰＤＧＦはまた、例えば、歯周靱帯などの靱帯及びセメント質の成長並びに治癒を促進するのに有用である。
【００７５】
使用に際して、ＰＤＧＦ又は他の成長因子若しくは分化因子は、治癒又は再生を必要とする領域へ直接適用される。概して、ＰＤＧＦ又は他の成長因子若しくは分化因子は、液体又は固体として吸収性又は非吸収性担体中で適用され、続いてその部位を、包帯又は隣接組織で覆う。骨成長を促進するのに十分な量は一般的に、面積１ｃｍ２に対して５００ｎｇ〜５ｍｇであるが、上限は、実際には１ｃｍ２に対して１ｍｇであり、適用されるＰＤＧＦの好ましい量は０．３ｍｇ／ｍＬである。
【実施例２】
【００７６】
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処理した骨伝導性スキャフォールドによる歯周再生
歯周組織及び骨成長を促進におけるＰＤＧＦの有効性は、以下の研究により実証される。
【００７７】
イヌでのｉｎ  ｖｉｖｏ研究
ビーグル犬は、推定上の歯周再生材料及び歯周再生手順を試験するために最も広く使用される動物モデルである（Wikesjo 他, J. Clin. Periodontol., 15:73-78, 1988、Wikesjo 他, J. Clin. Periodontol., 16:116-119, 1999、Cho 他, J. Periodontol., 66:522-530, 1995、Giannobile 他, J. Periodontol., 69:129-137, 1998、及びClergeau 他, J.
Periodontol., 67:140-149, 1996)。歯垢及び歯石の蓄積は、周囲の骨量損失を招く歯肉炎を誘導する可能性があり、イヌ及びヒトにおける歯周炎の病因を比較することができる。しかしながら、自然発生する疾患では、欠損が均一ではない。更に、イヌ科ブリーダーの集団において口腔衛生に対してより多くの留意がなされているため、自然の歯周疾患を有する動物を得ることは、不可能になってきている。従って、外科的に誘導される水平クラスＩＩＩ分岐モデルは、歯周治癒及び再生を研究するための最も一般的に使用されるモデルの１つとなっている。
【００７８】
水平クラスＩＩＩ分岐欠損を有するビーグル犬を本発明のＰＤＧＦ組成物を使用して処理した。１５匹の成体ビーグル犬は、６０個の処理欠損を与えた。４２個の欠損に対して、処理の２ヶ月後に生検を行い、１５個の欠損に対して、処理の４ヶ月後に生検を行った。
【００７９】
欠損作製
数多くの研究者により記載されるような「臨界サイズ」の歯周欠損モデルが利用された（例えば、Wikesjo, 1988及び1999（上記）、Giannobile（上記）、Cho（上記）及びPark
他, J. Periodontol., 66:462-477, 1955を参照）。全体的な健康問題及び口腔衛生問題のない１６匹の雄ビーグル犬（２〜３歳）における下顎四分円を使用した。投薬の１ヶ月前に、動物にアトロピン（０．０２ｍｇ／ｋｇ）及びアセプロマジン（０．２ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射で鎮静させた約３０分後に、ペントバルビタールナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ）のＩＶ注射で麻酔した。リドカインＨＣｌ＋エピネフリン１：１００，０００による手術領域の局所浸潤後に、全層粘膜骨膜弁を後屈させて、第１及び第３の小臼歯（Ｐ１及びＰ３）を抜歯した。更に、第１の臼歯の頭頂部の近心部位を切除した。
【００８０】
続いて、チゼル及び水冷カーバイド掘削器及びダイアモンド掘削器を使用して、分岐領
域を含むＰ２及びＰ４の全周囲を取り囲むように歯槽骨を切除した。分岐円蓋から骨の稜まで５ｍｍの距離になるように、水平骨欠損を作製した。欠損は、歯の幅に応じて約１ｃｍ幅であった。全ての実験歯の根をキュレット及び超音波器で滑らかに削り、セメント質を取り出すために先細ダイアモンド掘削器を取り付けた。標準骨欠損を作製した後、歯肉弁を縫合して、一次的な閉鎖を行った。動物に軟食を与えて、研究の継続期間中、毎日クロルヘキシジン洗浄を施した。
【００８１】
移植材料の適用
１５匹の動物の各下顎四分円におけるＰ２及びＰ４の歯周欠損を、封筒法を使用して処理前に無作為化した。欠損作製の約４週間後に、上記のように動物に再麻酔して、両方の下顎四分円において全層皮弁を後屈させた。今後の組織学的基準点として役立つように、１／２ラウンド掘削器を使用して、残存骨稜の歯根表面に切痕をつけた。汚れた層の洗浄及び除去の目的で、これまでに記載されるように、上記部位を滅菌生理食塩水で洗浄して、歯根をクエン酸で処理した（例えば、Cho（上記）及びPark（上記）を参照）。この期間中に、歯周欠損を満たすのに十分な量のβ−ＴＣＰ又はＤＦＤＢＡに、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液（０．３又は１．０ｍｇ／ｍＬ）を浸透させて、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ／移植材料混合物を、約１０分間、滅菌手術スタンド上に放置した。その後、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを浸透させた移植材料を、骨再生にとって理想的なレベルの穏やかな圧力で欠損へ詰め込んだ。
【００８２】
移植材料の移植後に、隣接歯間の断続４．０発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）縫合を使用して、粘膜骨膜弁をエナメルセメント接合部（ＣＥＪ）に対してほぼ水平に縫合した。弁の縫合後に、グルコン酸クロルヘキシジンゲルを歯及び歯肉周辺に穏やかに配置した。
【００８３】
処理群及び対照群
欠損を以下のいずれかで処理した：
１．β−ＴＣＰ
２．β−ＴＣＰ＋ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）
３．β−ＴＣＰ＋ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）
４．イヌＤＦＤＢＡ
５．イヌＤＦＤＢＡ＋ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）
６．イヌＤＦＤＢＡ＋ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）
７．偽手術（開放皮弁デブリドマンのみで処理、移植材料なし）
【００８４】
処理群１つ当たり６個の欠損に対して、２ヶ月目に生検を行った（総計４２個の部位）。更に、処理群１、２及び３における５個の欠損に対して、４ヶ月後に生検を行った（総計１５個の部位）。
【００８５】
【表２】
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【００８６】
そして、８週では、１１匹のイヌにおける４２個の部位に関して７群に分割した。１６週では、４匹のイヌにおける１５個の部位に関して３群に分割した（１匹のイヌに、８週間ずらして２つの処理手術を施し、それにより８週及び１６週の時点それぞれにおいて２つの部位を提供した）。
【００８７】
術後の処理
手術後の最初の４週間、イヌに軟食を与えることにより手術部位を保護した。最適な治癒をするために、ペニシリンＧベンザチンによる全身抗生物質処理を最初の２週間行い、歯垢制御は、実験全体にわたって２％グルコン酸クロルヘキシジンによる毎日の洗浄により維持された。縫合は３週後に除去した。
【００８８】
データ収集
データ収集点に関する論理的根拠
８週の時点は、このモデルに関して文献で報告される最も一般的な時点であって、歴史的データが十分存在することから選択した。例えば、Wilesjo 他（上記）及びGiannobile
他（上記）もまた、同じモデルにおいて、ＢＭＰ−１及びＯＰ−１の再生効果を評価するために８週を選択している。更に、Park 他（上記）は、８週目にビーグル犬モデルにおいてＧＴＲ膜を有する調整済歯根表面及びＧＴＲ膜を有さない調整済歯根膜表面へ直接適用されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの影響を評価した。これらの研究は、様々な処理様式において、潜在的な有意な効果を示すのに、８週の期間が最適であることを強く示唆している。
【００８９】
１６週の時点は、成長因子処理の長期にわたる影響を評価するのに選択した。これまでの研究（Park 他（上記）)は、この時点までには、骨欠損の実質的な自発的治癒が見られることを示唆している。それにもかかわらず、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処理が、骨再形成の変化、腫瘍形成又は歯根吸収のような任意の例外的で異常な組織応答をもたらすかどうかを評価することが可能である。
【００９０】
生検及び処理評価
生検時には、動物に４％パラホルムアルデヒドを灌流させ、屠殺した。続いて、下顎骨を取り出して固定液中に入れた。根尖周囲Ｘ線写真を撮影して、ダイアモンドソーを使用して、処理部位を個々のブロックへ切断した。番号を付した（見えないように）ブロック
をガーゼで包み、４％ホルムアルデヒドの溶液中に浸し、加工処理して分析した。
【００９１】
加工処理中に、生検材料をエタノール中で脱水させて、メタクリル酸メチル中に浸潤及び包埋した。厚さ約３００μｍの未脱灰切片は、冷却剤を伴った低速ダイアモンドソーを使用して得られた。切片を乳白色のアクリルガラス上へ接着させて、最終厚さ約８０μｍにまで研磨して、トルイジンブルー及び塩基性フクシンで染色した。段階的な連続切片は、近遠心面で得られた。
【００９２】
組織形態計測的分析を被覆スライド上で実施した。以下のパラメータを評価した。
【００９３】
１．完全新規付着組織（ＣＮＡＡ）の長さ：古い骨と新規骨の冠側位との間の距離として測定される歯周再生であって、新規骨と新規セメント質の間に機能的に配向された歯周靱帯を有する新規セメント質に新規骨が隣接する場合に限る。
【００９４】
２．新規骨充填（ＮＢ）：分岐部内に形成される新規骨の断面積として測定される。
【００９５】
３．結合組織充填（ＣＴ）：歯肉結合組織により占有される分岐部内の領域として測定される。
【００９６】
４．空隙（ＶＯ）：組織が存在しない退縮領域。
【００９７】
結果
Ａ．臨床的観察
臨床的には、全ての部位は良好に治癒した。手術後１週間以内に引き締まったピンク色の歯肉が存在することにより示されるように、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで処理した部位はより迅速に治癒するという印象を受けた。処理部位の目視検査により評価した場合、有害反応はどの処理群においてもなかった。β−ＴＣＰ又はＤＦＤＢＡを単独で付与した群では、歯肉退縮が増大するようであった。
【００９８】
Ｂ．Ｘ線写真観察
Ｘ線写真上で、他の群と比較して、群２、群３（それぞれ、β−ＴＣＰ＋ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ  ０．３及び１．０ｍｇ／ｍＬ）及び群６（ＤＦＤＢＡ＋ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ  １．０ｍｇ／ｍＬ）において、Ｘ線不透過の増大によって判断されるような、２ヵ月目における骨形成の増大の徴候が見られた（図１Ａ〜図１Ｇ）。４ヶ月目に、２ヶ月の時点と比較して、全ての群において骨形成の増大の徴候が見られた。任意の群において、任意の異常骨再形成、歯根吸収又は強直のＸ線写真上の徴候は見られなかった。
【００９９】
【表３】
2008516675.tif 000007
【０１００】
Ｃ．組織形態計測的分析：
新規セメント質、新規骨及び新規歯周靱帯（ＣＮＡＡ）並びに新規骨充填、結合組織充填及び空隙スペースの長さの組織形態計測的評価を行い、パーセントとして表す。ＣＮＡＡの場合、各試験群に関する値は、ＣＮＡＡ測定値（ｍｍ）／利用可能なＣＮＡＡ長（ｍｍ）の合計×１００％を表す。骨充填、結合組織充填及び空隙スペースが評価されて、総合的な分岐部欠損領域のパーセントとして表される。
【０１０１】
一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、処理群間の全体的な差に関して試験して、スチューデントｔ検定を使用して対比較を行った。群間の有意な差が、番号を付したスライドの分析時に見出された。表４は、２ヶ月目における結果を示す。
【０１０２】
【表４】
2008516675.tif 000008
【０１０３】
移植材料なしの手術群及び手術＋β−ＴＣＰ単独群における歯周再生（ＣＮＡＡ）平均パーセントは、それぞれ２７％及び３７％であった。これに比べて、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有するβ−ＴＣＰ群は、移植材料なしの手術又はＤＦＤＢＡ単独よりも有意に高い歯周再生を示した（ｐ＜０．０５）（手術単独の場合２７％、及びＤＦＤＢＡ単独の場合１３％に対して、０．３及び１．０ｍｇ／ｍＬ濃度に関してそれぞれ５９％及び４６％）。最後に、０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有するβ−ＴＣＰ群は、同種移植片と組み合わせた同濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢよりも有意に高い歯周再生を示した（ｐ＜０．０５）（２１％に対して５９％）。
【０１０４】
骨充填は、β−ＴＣＰ単独（２８．０％）、手術単独（３４％）又はＤＦＤＢＡ単独（６％）処理群よりもβ−ＴＣＰ＋０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（８４．０％）及びβ−ＴＣＰ＋１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（７４．２％）群で有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。また、ＤＦＤＢＡ＋０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群と比較して、β−ＴＣＰ＋０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群に関して有意に高い骨充填が見られた（ｐ＜０．０５）（それぞれ、８４％及び２０％）。
【０１０５】
ＤＦＤＢＡ群及び手術単独群からの８週のデータを検査している分析の群（群４、群５、群６及び群７）は、歯周再生（ＣＮＡＡ）に関して、ＤＦＤＢＡ群と手術単独との間で統計学的に有意な差を示さなかった。ＤＦＤＢＡ単独に対して、１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈ
ＰＤＧＦ−ＢＢにより増強したＤＦＤＢＡで処理した部位においては、より高い再生の傾向が見られた。ＤＦＤＢＡ単独に対して、ＤＦＤＢＡ＋１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで処理した部位の方が有意に大きな骨充填が見られた（ｐ＜０．０５）（それぞれ、４６％及び６％）。ＤＦＤＢＡ単独又は手術単独と比較して、０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有するＤＦＤＢＡで処理した部位において、より大きな骨充填の傾向が見られた。しかしながら、ＤＦＤＢＡ単独で処理した部位は、手術単独よりも少ない欠損への骨充填を示し（それぞれ、６％及び３４％）、欠損の大部分において充填がないか、又は充填が歯肉（軟）結合組織から構成されていた。
【０１０６】
処理の４ヶ月後に、歯周再生において有意な差が依然として存在した。β−ＴＣＰ単独は、広範囲にわたる強直の結果として、３６％の再生をもたらしたのに対して、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有するβ−ＴＣＰで処理した部位は、０．３ｍｇ／ｍＬ及び１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度で５８％及び４９％の平均再生を有していた。実質的な骨充填は、３つ全ての処理群に存在した。β−ＴＣＰ単独は７０％の骨充填をもたらし、β−ＴＣＰ＋０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦは１００％の充填をもたらしたのに対して、１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦは、７５％の充填を有していた。
【０１０７】
Ｄ．組織学的評価
組織学的評価は、加工処理中に生じた問題に起因して評価が不可能であった１つを除く全ての生検材料に関して実施した。
【０１０８】
代表的な顕微鏡写真を図１Ａ〜１Ｇ及び図２Ａ〜２Ｃに示す。図１Ａは、手術単独（移植片なし）で処理した部位の結果を示す。この検体は、切痕領域及び限られた領域においてわずかな距離だけ冠状に伸長する歯周再生（新規骨（ＮＢ）、新規セメント質（ＮＣ）及び歯周靱帯（ＰＤＬ））を示す。分岐部領域は、最小の新規骨（ＮＢ）形成を伴って、濃密な軟結合組織（ＣＴ）により主に充填される。
【０１０９】
β−ＴＣＰ単独で処理した部位に関して（図１Ｂ）、手術単独の検体において観察されるものと同様に、切痕の基部から短い距離だけ冠状に伸長する歯周再生が見られる。手術単独の検体で見られたように、新規骨形成はほとんど見られず、分岐部の大部分は、軟結合組織により満たされていた。
【０１１０】
一方、図１Ｃは、β−ＴＣＰ＋０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで処理した部位において得られた結果を示す。新規骨、新規セメント質及び分岐部の全表面に沿って伸長する歯周靱帯を伴う有意な歯周再生が示される。更に、分岐領域は、円蓋へと分岐部の全高さを伸長させる新規骨で充填される。
【０１１１】
β−ＴＣＰ＋１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで処理した部位の代表的な結果を図１Ｄに示す。分岐部において有意な歯周再生が見られるのに対して、分岐部の全表面に沿って伸長しない。分岐部の円蓋にある任意の組織の空隙（ＶＯ）である小スペースと一緒に欠損の歯冠部で観察される軟結合組織とともに存在する新規骨形成が見られる。
【０１１２】
図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃは、同種移植片処理群に関して得られる結果を示す。ＤＦＤＢＡ単独群に関する代表的な結果（図２Ａ）は、冠状方向にほんのわずかに伸長する切痕領域に限られる非常に乏しい歯周再生を示す。新規骨形成は限られており、残留ＤＦＤＢＡ移植材料の表面に沿った少量の骨形成から成る（淡いピンク色の島に沿って染色している暗赤色）。更に、新規骨は、冠状に伸長して、分岐部内の大部分の領域を充填する広範囲にわたる軟結合組織により取り囲まれる。最後に、大きな空隙スペースは、軟結合組織の冠状の範囲から分岐部の円蓋にまで伸長する。
【０１１３】
ＤＦＤＢＡ＋０．３ｍｇ／ｍＬ及び１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに関する組織学的結果をそれぞれ図２Ｂ及び図２Ｃに示す。両群は、歯根の切痕の基部から短かく冠状に伸長する完全新規付着組織（新規骨、新規セメント質及び歯周靱帯）（矢印）を伴い、ＤＦＤＢＡ単独と比較してより大きな歯周再生を示す。分岐領域内で軟結合組織による有意な分岐部の充填が見られたが、両群においてはより大きな骨充填が見られた。
【０１１４】
結論
研究の結果に基づいて、適切な担体材料（例えば、β−ＴＣＰ）と組み合わせて０．３ｍｇ／ｍＬ又は１．０ｍｇ／ｍＬのいずれかのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを使用して歯周欠損の処理をすることにより、β−ＴＣＰを用いた移植片若しくは骨同種移植片単独、又は移植片なしの歯周手術のような現行の生成物あるいは操作よりも高い歯周再生をもたらす。
【０１１５】
０．３ｍｇ／ｍＬ及び１．０ｍｇ／ｍＬ濃度のｒｈＰＤＧＦによる処理は、歯周再生をもたらした。０．３ｍｇ／ｍＬ濃度のｒｈＰＤＧＦは、β−ＴＣＰと混合した１．０ｍｇ／ｍＬ濃度のｒｈＰＤＧＦと比較してより高い歯周再生及び骨充填パーセントを示した。
【０１１６】
β−ＴＣＰは、任意の濃度でｒｈＰＤＧＦと混合されると、同種移植片よりも有効であった。新規骨は、全ての群において一般的に時間とともに（０週、８週及び１６週）成熟した（再形成した）。ｒｈＰＤＧＦ群において強直又は歯根吸収の増大は見られなかった。実際に、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで処理した部位は、対照部位より強直の程度が抑えられる傾向があった。この見解は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが歯周靱帯細胞に対して分裂促進性であり走化性であるという事実に起因する。
【０１１７】
材料及び方法
利用した材料：試験物質及び対照物質
利用したβ−ＴＣＰは、歯周用途に関して最適化された粒子径（０．２５〜１．０ｍｍ）であった。イヌ科モデルを使用した研究に基づいて、投与されたβ−ＴＣＰは、３ヶ月以内に約８０％吸収されて、治癒プロセス中に自家骨に置換される。
【０１１８】
ＤＦＤＢＡは、Musculoskeletal Transplant Foundation (MTF)により供給された。当該材料は、骨格組織に対して影響しないと考えられる外科的な操作を試験する別の研究の終了後に屠殺されたイヌの骨から作製されたイヌの同種移植片であった。
【０１１９】
組換えｈＰＤＧＦ−ＢＢは、BioMimetic Pharmaceuticalsにより供給され、ヒトへの使用に関してＦＤＡに認可されているｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの唯一の供給業者であるChiron, Inc.により製造された。このｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、Ｒｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）の商品名で創傷治癒製品としてＦＤＡにより認可された。
【０１２０】
２つの別個の濃度の滅菌ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ０．５ｍＬを含有する１ｍＬ容のシリンジは、ヒト材料に関するＦＤＡ基準及び現行の適正製造工程基準（ｃＧＭＰ）に従って調製された。試験した濃度は、０．３ｍｇ／ｍＬ及び１．０ｍｇ／ｍＬを含んでいた。
【０１２１】
β−ＴＣＰは、滅菌粒子０．５ｃｃを含むバイアルで供給された。
【０１２２】
ＤＦＤＢＡは、滅菌脱灰凍結乾燥したイヌの骨同種移植片１．０ｃｃを含む２．０ｍＬ容のシリンジで供給された。
【０１２３】
材料調製
外科的操作時に、最終移植用移植片は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液をマトリクス材料と混合することにより調製された。簡潔に述べると、骨欠損を完全に充填するのに十分な量の
ＴＣＰ又は同種移植片を滅菌皿へ配置した。続いて、マトリクスを完全に浸透させるのに十分なｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を添加して、材料を混合して、骨欠損中に配置する前に、室温で約１０分間、外科用トレー上に置いた。
【０１２４】
β−ＴＣＰ材料との１０分間のインキュベーションは、成長因子の最大吸収を得るのに十分である（付録Ａを参照のこと）。これはまた、外科医が臨床設定において、歯周欠損に生成物を配置する前にとるのに適切な時間量でもある。同様に、商業市場では、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及びマトリクス材料は、キット中の別個の容器中で供給され、材料は、配置前に直接混合させることができる。このキットの方法は、生成物の貯蔵寿命／安定性に対する配慮を大幅に低減する。
【実施例３】
【０１２５】
ヒトにおける歯周骨欠損の処理のためのＰＤＧＦの使用
組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）の、ヒト被験体における歯周骨の再生に対する効果に関して試験した。２つの試験群に、０．３ｍｇ／ｍＬ（群Ｉ）又は１．０ｍｇ／ｍＬ（群ＩＩ）のいずれかでｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを投与した。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、酢酸ナトリウム緩衝液中で調製され、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の担体により投与された。対照群である群ＩＩＩは、酢酸ナトリウム緩衝液のみの中のβ−ＴＣＰが投与された。
【０１２６】
臨床研究の目的は、１つ（１）〜３つ（３）の骨内壁の歯周欠損の管理におけるβ−ＴＣＰ及び０．３ｍｇ／ｍＬ又は１．０ｍｇ／ｍＬのいずれかのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む移植片材料の安全性並びに有効性を評価すること、並びに骨及び軟組織におけるその再生能力を評価することであった。
【０１２７】
処理の研究計画及び継続期間
この研究は、天然歯列に隣接した骨欠損を処理するために外科的介入を必要とする被験体における二重盲式の、コントロールされたプロスペクティブな無作為化された並列設計の多施設臨床試験であった。被験体は、それぞれ約６０人の被験体の３つ（３）の処理群（総計１８０人）となるように等比率で無作為化した。研究の継続期間は、研究材料の移植後６ヶ月（６）であった。研究には１８０人の被験体が登録された。
【０１２８】
診断及び主要な参加基準
骨欠損を矯正するための外科的処理を必要とする少なくとも１つの部位における進行性歯周疾患を有する２５〜７５歳の男性及び女性の被験体が研究のために許可された。他の治験対象患者の基準としては、１）最初の来院時に７ｍｍ以上の深さのプロービングポケットを有し、２）外科的デブリドマン後、少なくとも１つの骨壁を伴う４ｍｍ以上の縦骨欠損（ＢＤ）を伴い、３）欠損の完全な組織被覆を可能にするのに十分に角化された組織、及び４）歯尖に対して少なくとも３ｍｍの冠状の欠損のＸ線写真根拠を有することが挙げられた。１日最大１箱を喫煙する被験体及びクラスＩ＆ＩＩ分岐部の異常を伴う歯を有する被験体は、特に許容された。
【０１２９】
投与の用量及び様式
処理キットは全て、β−ＴＣＰ（活性対照）０．２５ｇ、及び酢酸ナトリウム緩衝溶液単独（群ＩＩＩ）、０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（群Ｉ）又は１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（群ＩＩ）のいずれか０．５ｍＬを含有した。
【０１３０】
完全なデブリドマン及び歯根平滑化後に、β−ＴＣＰが完全に浸透するように、試験溶液を滅菌容器中でβ−ＴＣＰと混合させた。歯根表面は、テトラサイクリン、ＥＤＴＡ又はクエン酸のいずれかを使用して調整した。続いて、水和した移植片を骨欠損へ詰め込ん
で、歯間縫合により組織皮弁を固定して、外科的部位の完全な被覆を行った。
【０１３１】
有効性測定
第１の有効性測定としては、手術前と術後６ヶ月との間での臨床的アタッチメントレベル（ＣＡＬ）の変化が挙げられる（群ＩＩＩに対する群Ｉ）。第２の有効性測定は、以下の結果：１）Ｘ線写真評価に基づいた手術前から術後６ヶ月までの線形骨成長（ＬＢＧ）及び骨充填％（％ＢＦ）（群ＩＩＩに対する群Ｉ及び群ＩＩ）、２）手術前と術後６ヶ月との間のＣＡＬの変化（群ＩＩＩに対する群ＩＩ）、３）手術前と術後６ヶ月の間のプロービングポケットの深さの低減（ＰＤＲ）（群ＩＩＩに対する群Ｉ及び群ＩＩ）、４）手術前と術後６ヶ月の間の歯肉退縮（ＧＲ）（群ＩＩＩに対する群Ｉ及び群ＩＩ）、５）術後の最初の３週間の外科的部位の創傷治癒（ＷＨ）（群ＩＩＩに対する群Ｉ及び群ＩＩ）、６）手術前と術後３ヶ月（３）及び６ヶ月（６）の間のＣＡＬの変化に関する曲線の下の面積（群ＩＩＩに対する群Ｉ及び群ＩＩ）、７）術後６ヶ月（６）の％ＢＦに関する９５％信頼下限（文献(Parashis 他, J. Perodontol., 69:751-758, 1998)で公開されている脱灰凍結乾燥した骨同種移植片（ＤＦＤＢＡ）に対する群Ｉ、群ＩＩ及び群ＩＩＩ）、８）術後６ヶ月（６）の線形骨成長に関する９５％ＬＣＢ（文献(Persson 他, J. Clin. Periodontol., 27:104-108, 2000)で公開されている脱灰凍結乾燥した骨同種移植片（ＤＦＤＢＡ）に対する群Ｉ、群ＩＩ及び群ＩＩＩ）、９）手術前と術後６ヶ月（６）の間のＣＡＬの変化に関する９５％ＬＣＢ（ＥＭＤＯＧＡＩＮ（登録商標）に対する群Ｉ、群ＩＩ及び群ＩＩＩ、PMA P930021, 1996）、及び１０）手術前と術後６ヶ月（６）の間のＣＡＬの変化に関する９５％ＬＣＢ（ＰＥＰＧＥＮ  Ｐ−１５（商標）に対する群Ｉ、群ＩＩ及び群ＩＩＩ、PMA P990033, 1999）から構成された。
【０１３２】
統計学的方法
安全性及び有効性のデータを研究して、記述統計学により要約した。カテゴリー測定は、計数及びパーセントとして表示され、連続型変数は、平均値、メジアン、標準偏差及び範囲として表示された。試験生成物処理群（群Ｉ及び群ＩＩ）と対照（群ＩＩＩ）との間の統計学的比較は、カテゴリー変数に関してはΧ二乗検定及びフィシャーの正確確率検定、及び連続型変数に関してはｔ検定又は分散分析法（ＡＮＯＶＡ）を使用して行った。順序変数に関する処理群間の比較は、コクラン・マンテル・ヘンツェル法を使用して行った。ｐ≦０．０５（片側）は、ＣＡＬ、ＬＢＧ及び％ＢＦに関して統計学的に有意であるとみなされた。
【０１３３】
安全性データは、臨床的及びＸ線写真により評価される、有害事象の頻度及び重篤性により評価された。手術前に３つの処理群間に有意な差は見られなかった。また、３つの処理群の間で、有害事象（ＡＥ、全ての原因）の発生において観察される統計学的に有意な差は見られなかった。安全性分析は、移植材料の移植に起因する被験体に対する任意の危険性の増大は確認されなかった。
【０１３４】
有効性結果の概要
統計学的分析からの結果により、β−ＴＣＰ単独の活性対照（群ＩＩＩ）、並びにＤＦＤＢＡ、ＥＭＤＯＧＡＩＮ（登録商標）及びＰＥＰＧＥＮ  Ｐ−１５（商標）を含むこれまでの対照と比較して、２つの処理群（群Ｉ及び群ＩＩ）に関して臨床的及び統計学的に有意な有益性の両方が明らかとなった。
【０１３５】
術後３ヶ月、手術前からの統計学的に有意なＣＡＬの獲得が、群ＩＩＩに対する群Ｉにおいて観察され（ｐ＝０．０４１）、ＣＡＬの獲得に関してＰＤＧＦが有意な初期的な有益性を有することを示した。術後６ヶ月、この傾向は、群ＩＩＩを上回る群Ｉにおいて更に続いたが、この差は、統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．２００）。手術前と術後６ヶ月の間のＣＡＬの獲得に関する累積効果（即ち、速度）を表す曲線分析の下の面積（
ＡＣＵ）は、群ＩＩＩと比較して群Ｉを支持する統計学的有意差に近づいた（Ｐ＝０．０５４）。更に、全ての処理群に関する９５％信頼下限（ＬＣＢ）分析は、ＥＭＤＯＧＡＩＮ（登録商標）及びＰＥＰＧＥＮ  Ｐ−１５（商標）により６ヶ月（６）に観察されるＣＡＬの獲得と比較して、群Ｉ及びＩＩの有効性を立証した。
【０１３６】
ＣＡＬの観察される臨床的な有益性の他に、線形骨成長（ＬＢＧ）及び骨充填パーセント（％ＢＦ）を含むＸ線写真分析は、群ＩＩＩに対する群Ｉ及び群ＩＩの骨獲得における統計学的に有意な改善を明らかにした。％ＢＦは、Ｘ写真上測定される、新規骨で充填された本来の骨欠損のパーセントとして定義した。ＬＢＧは、群ＩＩＩ（０．９ｍｍ、ｐ＜０．００１）と比較した場合、群Ｉ（２．５ｍｍ）において有意な改善を示した。ＬＢＧはまた、群ＩＩＩと比較した場合、群ＩＩ（１．５ｍｍ）において有意な改善を示した（ｐ＝０．０２１）。
【０１３７】
骨充填パーセント（％ＢＦ）は、群ＩＩＩ（１８％）と比較した場合、群Ｉ（５６％）及び群ＩＩ（３４％）でそれぞれｐ＜０．００１及びｐ＝０．０１９となり、術後６ヶ月に有意に増大した。線形骨成長及び骨充填％の両方に関する術後６ヶ月の信頼区間の９５％下限は、歯周移植操作において最も広く使用される材料であるＤＦＤＢＡに関する公開されたＸ線写真結果と比較して、群Ｉ及び群ＩＩの有効性を立証した。
【０１３８】
術後３ヶ月目に、ＣＡＬで観察される有益な効果と一致して、群ＩＩＩと比べて群Ｉにおいて有意に少ない歯肉退縮（ＧＲ）が見られた（ｐ＝０．０４１）。統計学的に有意な差は、術後６ヶ月目にＰＤＲ及びＧＲでは観察されなかった。３週目に完全な創傷治癒（ＷＨ）を示す部位の数の記述的分析により、群ＩＩ（６０％）及び群ＩＩＩ（５５％）に対する群Ｉ（７２％）での改善が明らかとなり、治癒の改善傾向を示した。
【０１３９】
臨床的結果及びＸ線写真結果に関する累積的な有益な効果を評価するために、複合有効性分析を行って、６ヶ月（６）目でのＣＡＬ＞２．７ｍｍ及びＬＢＧ＞１．１ｍｍにより定義されるような首尾よい結果を伴う患者のパーセントを確定した。成功したＣＡＬ及びＬＢＧ基準点は、上記の「有効性測定」のセクションで確認されるように、移植された移植片によりこれらのパラメータに関して達成される平均レベルにより確立された。群Ｉの患者の６１．７％及び群ＩＩの患者の３７．９％が、群ＩＩＩの患者の３０．４％と比較して、成功の複合基準点を満たすか、又はそれを超過することが結果により示され、群ＩＩＩに対する群Ｉの統計学的に有意な有益性をもたらした（ｐ＜０．００１）。％ＢＦは、ｐ値が０．００３であり、群ＩＩＩ（４４．６％）に対する群Ｉ（７０．０％）に関する類似した有益性を明らかにした。
【０１４０】
要約すると、群Ｉは、β−ＴＣＰ単独の活性対照群（群ＩＩＩ）と比較して、３ヶ月（３）でのＣＡＬ及びＧＲ、並びに６ヶ月（６）でのＬＢＧ及び％ＢＦに関して統計学的に有益な結果を達成した。これらの結果の臨床的有意性は、これまでの対照との比較により更に確認される。ＰＤＧＦ含有移植材料は、歯周骨欠損の処理に関して６ヶ月までに臨床的有効性及びＸ線写真において示される有効性を達成することが結論付けられる。
【０１４１】
【表５】
2008516675.tif 000009
【０１４２】
０．３ｍｇ／ｍＬ及び１．０ｍｇ／ｍＬでＰＤＧＦを含有する移植材料（即ち、β−ＴＣＰ）は、最大６ヶ月間研究される１８０人の患者を含む大規模な無作為化臨床試験において、中程度の歯周炎から進行性の歯周炎を有する歯の周囲における歯槽骨の回復及び臨床的アタッチメントにおいて安全且つ有効であることが示された。これらの結論は、以下で要約される有効なＸ線写真測定及び臨床的測定に基づく。
【０１４３】
上記のＰＤＧＦ含有移植材料の生体適合性データ、及び個々の構成成分（即ち、β−ＴＣＰ単独又はＰＤＧＦ単独）のこれまでの安全な利用と一致して、研究により局所的又は全身性の有害事象の徴候は示されなかった。移植材料に起因する有害事象は見られず、移植材料は安全であることがわかった。
【０１４４】
結論
０．３ｍｇ／ｍＬ又は１．０ｍｇ／ｍＬのいずれかでＰＤＧＦを含有するβ−ＴＣＰの移植は、活性対照と比較して、３ヶ月目でＣＡＬが有意に改善されたことにより示されるように、軟組織アタッチメントレベル及び骨の回復のための有効な処理であることがわかった。本発明者の見解はまた、手術前と術後６ヶ月の間でのＣＡＬの獲得の改善を示したＡＵＣ分析とも一致する。０．３ｍｇ／ｍＬ又は１．０ｍｇ／ｍＬのいずれかでＰＤＧＦを含有するβ−ＴＣＰの移植はまた、活性対照と比較して、有意に改善されたＬＢＧ及び％ＢＦに基づいた有効な処理であることがわかった。β−ＴＣＰ単独の活性対照と比較して軟組織測定及び硬組織測定の両方の複合分析により示されるような有意に改善された臨床的結果もまた、上記の処理プロトコルの有効性を実証している。最後に、０．３ｍｇ／ｍＬ又は１．０ｍｇ／ｍＬのいずれかでＰＤＧＦを含有するβ−ＴＣＰを投与することの結果は、臨床的及びＸ線写真上の両方で、有効性の基準点を超過することがわかった。
【０１４５】
この治験の結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの動物及びヒトの研究からの広範且つ確証的なデータとともに、ＰＤＧＦ含有移植材料が、歯周欠損において軟組織及び硬組織再生を刺激するが、０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬの範囲（例えば、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ又は１．０ｍｇ／ｍＬ）におけるＰＤＧＦが移植材料中に投与される場合にその効果はより有意であったことを実証している。更に、０．３ｍｇ／ｍＬの量で移植材料中に投与されるＰＤＧＦは、軟組織及び骨を有効に再生させた。
【０１４６】
他の実施形態は、併記の特許請求の範疇である。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】Ａ：処理の８週間後の骨形成に対する影響を示す顕微鏡写真を示す図である。骨形成に対する手術単独の影響を示す顕微鏡写真である。Ｂ：処理の８週間後の骨形成に対する影響を示す顕微鏡写真を示す図である。骨形成に対するβ−ＴＣＰ単独の影響を示す顕微鏡写真である。Ｃ：処理の８週間後の骨形成に対する影響を示す顕微鏡写真を示す図である。骨形成に対するβ−ＴＣＰ＋０．３ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦの影響を示す顕微鏡写真である。Ｄ：処理の８週間後の骨形成に対する影響を示す顕微鏡写真を示す図である。骨形成に対するβ−ＴＣＰ＋１．０ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦの影響を示す顕微鏡写真である。Ｅ：処理の８週間後の骨形成に対する影響を示す顕微鏡写真を示す図である。骨形成に対する脱灰凍結乾燥した骨同種移植片（ＤＦＤＢＡ）単独の影響を示す顕微鏡写真である。Ｆ：処理の８週間後の骨形成に対する影響を示す顕微鏡写真を示す図である。骨形成に対する脱灰凍結乾燥した骨同種移植片（ＤＦＤＢＡ）＋０．３ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦの影響を示す顕微鏡写真である。Ｇ：処理の８週間後の骨形成に対する影響を示す顕微鏡写真を示す図である。骨形成に対する脱灰凍結乾燥した骨同種移植片（ＤＦＤＢＡ）＋１．０ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦの影響を示す顕微鏡写真である。
【図２】Ａ：処理の１６週間後の骨形成に対する影響を示す顕微鏡写真を示す図である。骨形成に対するβ−ＴＣＰ単独の影響を示す顕微鏡写真である。Ｂ：処理の１６週間後の骨形成に対する影響を示す顕微鏡写真を示す図である。骨形成に対するβ−ＴＣＰ＋０．３ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦの影響を示す顕微鏡写真である。Ｃ：処理の１６週間後の骨形成に対する影響を示す顕微鏡写真を示す図である。骨形成に対するβ−ＴＣＰ＋１．０ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦの影響を示す顕微鏡写真である。
【図１】
2008516675.tif 000010
【図２】
2008516675.tif 000011