(57)【要約】2型糖尿病と単一ヌクレオチド多型およびハプロタイプとの関連性を開示する。また、2型糖尿病を有する者、または2型糖尿病を発生するリスクのある者を同定する際の診断的適用、ならびに治療剤および治療方法の発見を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における2型糖尿病に対する易罹患性(susceptibility)を決定する方法であって、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置する、2型糖尿病と関連するSNPのアットリスク(at-risk)アレルを検出する工程を含む方法。
【請求項２】
SNPが配列番号：23または配列番号：23の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
SNPが配列番号：32または配列番号：32の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
SNPが配列番号：35または配列番号：35の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
SNPが配列番号：40または配列番号：40の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
SNPが配列番号：41または配列番号：41の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
SNPが配列番号：17または配列番号：17の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
SNPが配列番号：36または配列番号：36の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
SNPが配列番号：74または配列番号：74の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
SNPが配列番号：62または配列番号：62の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
SNPが配列番号：10または配列番号：10の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
SNPが配列番号：11または配列番号：11の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
SNPが配列番号：8または配列番号：8の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
SNPが配列番号：54または配列番号：54の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
SNPが配列番号：65または配列番号：65の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
SNPが配列番号：9または配列番号：9の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
SNPが配列番号：67または配列番号：67の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
SNPが配列番号：4または配列番号：4の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
SNPが配列番号：91または配列番号：91の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
SNPが配列番号：92または配列番号：92の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
SNPが配列番号：68または配列番号：68の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
SNPが配列番号：69または配列番号：69の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
SNPが配列番号：7または配列番号：7の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
SNPが配列番号：20または配列番号：20の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
SNPが配列番号：16または配列番号：16の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
SNPが配列番号：31または配列番号：31の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
SNPが配列番号：42または配列番号：42の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
SNPが配列番号：39または配列番号：39の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
SNPが配列番号：53または配列番号：53の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
SNPが配列番号：38または配列番号：38の相補体の内部に位置する、請求項1記載の方法。
【請求項３１】
配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３２】
試料における、2型糖尿病と関連するSNPを有する第1のポリヌクレオチドの存在または2型糖尿病を発生する傾向をアッセイするための方法であって、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、ストリンジェントな条件下で第1のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、第2のポリヌクレオチドと試料を接触させる工程を含む方法。
【請求項３３】
調節配列に機能的に連結される、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３４】
請求項33記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項３５】
配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを有する単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを生産するための方法であって；該ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で請求項34記載の組換え宿主細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項３６】
試料中の配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを有する単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの存在をアッセイする方法であって、コードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体と試料を接触させる工程を含む方法。
【請求項３７】
配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを有するポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物。
【請求項３８】
2型糖尿病と関連するSNPを含むポリヌクレオチドの発現を変化させる薬剤を同定する方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）発現のための条件下で、（1）配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPならびに（2）レポーター遺伝子と機能的に連結されるプロモーター領域を含むポリヌクレオチドを検査すべき薬剤と接触させる工程；
（b）薬剤の存在下で、レポーター遺伝子の発現のレベルを評価する工程；
（c）薬剤の非存在下で、レポーター遺伝子の発現のレベルを評価する工程；ならびに
（d）発現が薬剤によって変化したことを示す違いについて、工程（b）における発現のレベルを工程（c）における発現のレベルと比較する工程。
【請求項３９】
配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列を含む第2のポリヌクレオチドの一部と少なくとも部分的に相補的である第1のポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための方法であって、以下の工程：
a）ハイブリダイゼーションに適切な条件下で第2のポリヌクレオチドと試料を接触させる工程；ならびに
b）第1のポリヌクレオチドと第2のポリヌクレオチドとの間でハイブリダイゼーションが起こったかどうかを評価する工程を含み、
ハイブリダイゼーションが起こった場合、試料中に第1のポリヌクレオチドが存在する、方法。
【請求項４０】
第1のポリヌクレオチドの存在が、2型糖尿病または2型糖尿病を発生する傾向を示す、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
第2のポリヌクレオチドが第1のポリヌクレオチドの配列の一部と完全に相補的である、請求項39または40記載の方法。
【請求項４２】
第1のポリヌクレオチドの少なくとも一部の増幅をさらに含む、請求項39〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
第2のポリヌクレオチドが、99またはそれより少ないヌクレオチド長であり、かつ：（a）第1のポリヌクレオチド中の連続したヌクレオチドの配列と少なくとも80％同一であるか、または（b）第1のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズすることができるかのどちらかである、請求項39〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む第1のポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための試薬であって、第1のポリヌクレオチドの一部と少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含む第2のポリヌクレオチドを含む試薬。
【請求項４５】
第2のポリヌクレオチドが第1のポリヌクレオチドの一部と完全に相補的である、請求項44記載の試薬。
【請求項４６】
配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む第1のポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための試薬キットであって、以下を別々の容器に含む試薬キット：
a）配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列を含む1つまたは複数の標識された第2のポリヌクレオチド；ならびに
b）標識の検出のための試薬。
【請求項４７】
個体における2型糖尿病に対する易罹患性を診断する方法であって、図2に示したハプロタイプからなる群より選択される2型糖尿病と関連するハプロタイプを検出する工程を含む方法。
【請求項４８】
ハプロタイプの存在の検出に個体由来の核酸の酵素的増幅を含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
ハプロタイプの存在の検出に電気泳動解析をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
ハプロタイプの存在の検出に制限断片長多型解析をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項５１】
ハプロタイプの存在の検出に配列解析をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項５２】
個体における2型糖尿病に対する易罹患性を診断する方法であって、以下の工程を含む方法：
a）個体からポリヌクレオチド試料を得る工程；および
b）ハプロタイプの存在が2型糖尿病に対する易罹患性に相当する、図2に示したハプロタイプを含む、ハプロタイプの存在または不在についてポリヌクレオチド試料を解析する工程。
【請求項５３】
2型糖尿病と関連する遺伝子を同定する方法であって：（a）配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む遺伝子を同定する工程；ならびに（b）遺伝子が2型糖尿病と関連があることを示す違いについて、アットリスクアレルを有する個体における該遺伝子の発現を、アットリスクアレルを有さない個体における該遺伝子の発現と比較する工程を含む方法。
【請求項５４】
2型糖尿病を治療するために好適な薬剤を同定する方法であって：（a）配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む、ポリヌクレオチドを検査すべき薬剤と接触させる工程；ならびに（b）2型糖尿病を治療するために有用であると考えられる手法で、薬剤がポリヌクレオチドに結合し、ポリヌクレオチドを変化させ、またはポリヌクレオチドに影響を及ぼすかどうかを決定する工程を含む方法。
【請求項５５】
2型糖尿病を治療するために好適な薬剤を同定する方法であって：（a）配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含むポリヌクレオチドによりコードされた、ポリペプチドを検査すべき薬剤と接触させる工程；ならびに（b）2型糖尿病を治療するために有用であると考えられる手法で、薬剤がポリペプチドに結合し、ポリペプチドを変化させ、またはポリペプチドに影響を及ぼすかどうかを決定する工程を含む方法。
【請求項５６】
請求項55記載の方法によって同定される薬剤。
【請求項５７】
請求項56記載の薬剤を含む薬学的組成物。
【請求項５８】
治療的有効量の薬剤を含む請求項57記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
請求項38記載の方法によって同定される薬剤。
【請求項６０】
請求項59記載の薬剤を含む薬学的組成物。
【請求項６１】
治療的有効量の薬剤を含む請求項60記載の薬学的組成物。
【請求項６２】
特に実施例に対する参照を伴う、本明細書においてこれまでに記載されたような方法、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞、トランスジェニック動物、試薬、薬剤、および薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
炭水化物の利用が減少し、かつ脂質およびタンパク質の利用が亢進する代謝疾患である糖尿病は、インスリンの完全なまたは相対的な欠乏によって引き起こされる。より重篤な場合、糖尿病は、慢性高血糖、糖尿、水分および電解質の喪失、ケトアシドーシス、ならびに昏睡を特徴とする。長期の合併症には、神経障害、網膜症、腎症の発生、全身化した大小血管の退行性変化、ならびに感染症に対する易罹患性(susceptibility)の増加が含まれる。糖尿病の最も一般的な形態は、標的組織におけるインスリン分泌障害およびインスリン抵抗性に起因する高血糖を特徴とする2型の、非インスリン依存型糖尿病である。遺伝的要因および環境的要因の両方が本疾患に寄与している。例えば、肥満は本疾患の発生において主要な役割を果たしている。2型糖尿病は多くの場合、緩やかな始まりの軽症型の糖尿病である。
【０００２】
2型糖尿病の健康的意義は非常に大きい。1995年には、世界中で1億3500万人の糖尿病の成人がいた。2025年には、3億人近くが糖尿病を有すると推定されている。（King H., et al., Diabetes Care, 21 (9): 1414-1431 (1998)）。
【０００３】
2型糖尿病は強い家族性伝播を有することが示されている：2型糖尿病のある一卵性双生児ペアの40％はまた、1人または数人の糖尿病に罹った第一度近親者を有する。Barnett et al.20Diabetologia 87-93 (1981)。ピマインディアンでは、糖尿病になる相対的なリスクが、糖尿病の片方の親から生まれた子供については2倍増加し、および両親ともに罹患している場合は6倍増加する。Knowler, W. C., et al. Genetic Susceptibility to Environmental Factors. A Challenge for Public Intervention 67-74 (Almquist & Wiksele International: Stockholm, 1988)。1型糖尿病に冒された一卵性双生児についての約50％と比較して、2型糖尿病についての一卵性双生児の一致は、90％を上回ることが観察されている。Barnett, A. H., et al. 20 (2) Diabetologia 87-93 (1981)。2型糖尿病患者の糖尿病でない双子は、経口ブドウ糖負荷試験の後に、インスリン分泌の減少およびブドウ糖耐性の減少を有することが示された。Barnett, A. H., et al. 282 Brit. Med. J. 1656-1658 (1981)。
【０００４】
本疾患の高い罹患率および増加しつつある罹患人口は、2型糖尿病に関与するその他の遺伝的要因を規定し、および関連するリスク要因をより明確に規定するという、未だ対処されていない医学的必要性を示している。2型糖尿病を発生させる傾向を同定するための診断アッセイならびに本疾患の予防および治療のための治療剤もまた必要とされている。
【０００５】
ある集団（自然集団または例えば、合成分子のライブラリーなどの合成集団のいずれか）において複数の配列がありうる核酸配列を、本明細書において「多型部位」と呼ぶ。多型部位は、置換、挿入、または欠失に基づく配列の違いを考慮に入れることができる。そのような置換、挿入、または欠失は、フレームシフト、早過ぎる停止コドンの発生、ポリヌクレオチドによりコードされる1つまたは複数のアミノ酸の欠失または付加をもたらし、スプライス部位を変化させ、およびmRNAの安定性または輸送に影響を及ぼす可能性がある。多型部位が1ヌクレオチド長である場合、この部位を単一ヌクレオチド多型（「SNP」）と呼ぶ。
【０００６】
SNPは疾患感受性および薬物反応の相違の原因である遺伝的変化の最も一般的な形態である。SNPは、疾患リスクもしくは患者間の薬物反応の違いなどの多くの表現型評価項目のためのマーカーに直接的に資することができ、またはより一般的に、疾患リスクもしくは患者間の薬物反応の違いなどの多くの表現型評価項目のためのマーカーとして役立つことができる。
【０００７】
このような遺伝的要因の同定は、ある疾患を発生する傾向を有する個体の同定のための診断法、試薬、および試薬キットにつながる可能性がある。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、診断的介入および治療的介入が容易にできる単一ヌクレオチド多型（「SNP」）を有する候補遺伝子、および具体的には、遺伝子の核酸断片に焦点を当てた、個体を糖尿病に罹り易くしている遺伝的要因の同定に関する。
【０００９】
ある態様において、本発明は、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、組換え宿主細胞、トランスジェニック動物、および組成物だけでなく、配列同定番号（「配列番号」）1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列内に位置するSNPを含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。本発明はまた、2型糖尿病と関連するSNPの1つまたは複数のアットリスク(at-risk)アレルを検出することにより、個体における2型糖尿病に対する易罹患性を診断する方法を提供する。さらに、本発明は、2型糖尿病と関連する1つまたは複数のハプロタイプを検出することにより、個体における2型糖尿病に対する易罹患性を診断する方法を提供する。
【００１０】
薬剤それ自体およびこれらの薬剤を含む薬学的組成物だけでなく、本疾患の経過を変化させることができる薬剤を同定する方法もまた、本発明により意図されている。
【００１１】
ヒトゲノムにおいて最も頻度の高いDNA配列の変化である単一ヌクレオチド多型は、広範な生物学的および生化学的適用に向けてますます多くの重要性を得ている。SNPは、ヒト集団の進化の歴史を探索するため、および法医学的試料を解析するために使用されている。SNPはまた、遺伝的解析において主要な役割を果たしている。さらに、異なる薬物有効性または副作用の根底にある遺伝的要因を解明するために、薬理遺伝学がこれらのDNA変化を利用している。最後に、SNPは複合疾患に関与する遺伝子を同定するのに役立つと考えられている。
【００１２】
本発明は、表現型が2型糖尿病と関連すると具体的に同定される特定の座または単一ヌクレオチド多型（SNP）の同定に関する。結果として、疾患の徴候が現れる前に、そのような個体に対して、例えば、食事の変更、運動、および／または投薬などの、介入を指示することができる。2型糖尿病の座に関与する遺伝子の同定によって、本疾患の過程に対するより良い理解への道が開かれ、それによって今度は、診断および治療法の改善がもたらされる可能性がある。
【００１３】
SNPを同定するために2型糖尿病に関係すると考えられる遺伝子を解析した。その後、糖尿病患者の症例および一致対照において、SNPを含む核酸配列をジェノタイピングした。その後、対照集団および糖尿病患者集団の解析において、2型糖尿病との関連を見出すために、統計的解析を行なった。186遺伝子中の1,769のSNPの解析後、あるSNPが統計的に2型糖尿病と関連することが分かった（p≦0.05）。
【００１４】
「SNP」という用語は、個体の集団の間で異なるヒトゲノムの特定の位置にある単一ヌクレオチド多型を指す。本明細書において使用される場合、SNPはその名前によって同定されてもよいし、または特定の配列内の場所によって同定されてもよい。図1の配列番号の中に同定されているSNPは括弧で示されている。例えば、図1の配列番号：1の「[G/A]」というSNPは、配列中のその位置のヌクレオチド塩基（またはアレル）が、グアニンまたはアデニンのいずれかであり得るということを示す。図1の2型糖尿病と関連するアレル（例えば、配列番号：1のグアニン）は、別の欄に示されている。図1の各配列番号のSNPに隣接するヌクレオチドは、ゲノム中のSNPの場所を同定するために用いられる隣接配列である。
【００１５】
本明細書において使用される場合、本発明の配列番号によって開示されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の相補体を包含する。さらに、本明細書において使用される場合、「SNP」という用語は、1組のアレルの中の任意のアレルを包含する。
【００１６】
「アレル」という用語は、SNPを規定している選ばれたヌクレオチドの中の特定のヌクレオチドを指す。
【００１７】
「マイナーアレル」という用語は、個体の集団内でメジャーアレルよりも低い頻度で生じるSNPのアレルを指す。
【００１８】
「メジャーアレル」という用語は、個体の集団内でマイナーアレルよりも高い頻度で生じるSNPのアレルを指す。
【００１９】
「アットリスクアレル」という用語は、2型糖尿病と関連するアレルを指す。図1および図3〜5は、本発明の多数のアットリスクアレルを示す。
【００２０】
「ハプロタイプ」という用語は、2つまたはそれより多くのSNP由来の特定のアレルの組み合わせを指す。
【００２１】
「アットリスク(at-risk)ハプロタイプ」という用語は、2型糖尿病と関連するハプロタイプを指す。図2は、本発明の多数のアットリスクハプロタイプを示す。
【００２２】
「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、1本鎖、2本鎖、および3重らせんの分子構造を含む任意の3次元構造を有してもよく、ならびに公知または未知の、任意の機能を果たしてもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な態様である：遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、短い干渉核酸分子（siNA）、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドはまた、メチル化された核酸分子および核酸分子類似体などの、修飾された核酸分子であってもよい。
【００２３】
「実質的に単離された」または「単離された」ポリヌクレオチドとは、本来は関連する配列を実質的に含まないポリヌクレオチドである。実質的に含まないということにより、本来は関連する物質を、少なくとも50％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％含まないことを意味する。「単離されたポリヌクレオチド」はまた、起源または操作によって：（1）本来は関連するポリヌクレオチドの全てもしくは一部と関連せず、（2）本来は連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドと連結し、または（3）本来は生じない、組換えポリヌクレオチドを含む。
【００２４】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いに少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または98％同一なヌクレオチド配列が典型的に互いにハイブリダイズしたまま残る、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明することを意図している。そのようなストリンジェントな条件は、当業者には公知であり、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y (1989), 6.3.1.-6.3.6に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）の中で、約45℃でのハイブリダイゼーション、その後、0.2×SSC、0.1％ SDSの中で、50〜65℃での1回または複数回の洗浄である。
【００２５】
「ベクター」という用語は、挿入されたDNAを運び、かつ宿主細胞で永続されうるDNA分子を指す。ベクターはクローニングベクター、クローニングビークル(vehicle)、またはビークルとしても公知である。「ベクター」という用語には、主として細胞内への核酸分子の挿入のために機能するベクター、主として核酸の複製のために機能する複製ベクター、ならびに主としてDNAまたはRNAの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターが含まれる。1つより多くの上記の機能を提供するベクターもまた含まれる。
【００２６】
「宿主細胞」には、ベクターのレシピエントまたは核酸分子および／もしくはタンパク質の組み込みのレシピエントとなり得る、またはベクターのレシピエントまたは核酸分子および／もしくはタンパク質の組み込みのレシピエントである個々の細胞または細胞培養が含まれる。宿主細胞は、1個の宿主細胞の子孫を含み、および子孫は、自然の、偶然の、または意図的な突然変異により、必ずしも（形態的にまたは全DNA量の点で）元々の親と完全に同一でなくてもよい。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞を含む。「単離された宿主細胞」は、それが由来した生物から物理的に分離された細胞である。
【００２７】
「個体」、「宿主」、および「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために、本明細書において互換的に使用される。
【００２８】
「形質転換」、「トランスフェクション」、および「遺伝的形質転換」は、例えば、リポフェクション、トランスダクション、感染、エレクトロポレーション、CaPO4沈殿、DEAE-デキストラン、粒子衝突などの、挿入に用いられる方法に関係なく、宿主細胞内への外来性ポリヌクレオチドの挿入または導入を指すために本明細書において互換的に使用される。外来性ポリヌクレオチドは、組み込まれないベクター、例えば、プラスミドとして維持されてもよいし、またはその代わりに宿主細胞ゲノム内に組み込まれてもよい。遺伝的形質転換は、一過性または安定的であってもよい。
【００２９】
本発明は、特に指示のない限り、当業者に可能な範囲の、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を利用する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、任意の用語の単数形は、その代わりに複数形を包含することができ、かつ逆もまた同じである。
【００３１】
本明細書において引用される全ての刊行物および参照は、任意の目的のために、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００３２】
本発明は、SNP（ある特定のヌクレオチド塩基）のある特定のアレルの存在が2型糖尿病を発生する傾向を示し、またはさもなければ、2型糖尿病患者を同定するために用いることができる、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される。別の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の少なくとも一部を含む。
【００３３】
本発明はまた、検査試料中に存在するヌクレオチド配列にハイブリダイズし、相補的であり、または部分的に相補的である、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む単離されたポリヌクレオチドに関する。ある態様において、単離されたポリヌクレオチドは、検査試料中に存在するヌクレオチド配列にハイブリダイズし、相補的であり、または部分的に相補的である、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される。さらなる態様において、単離されたポリヌクレオチドは、検査試料中に存在するヌクレオチド配列にハイブリダイズし、相補的であり、または部分的に相補的である、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の少なくとも一部を含む。
【００３４】
本発明はまた、2型糖尿病を発生させる傾向を示す図2で同定されたハプロタイプからなる群より選択される、1つまたは複数のハプロタイプを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３５】
さらに、標準的な分子生物学の技術および本明細書において提供された配列情報を用いて、本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の全てまたは一部を使用し、（例えば、Sambrook et al., 編., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y, 1989に記載されているような）標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を用いて、ポリヌクレオチドを単離することができる。
【００３６】
鋳型としてのcDNA、mRNA、またはゲノムDNA、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用い、標準的なPCR増幅技術によって、ポリヌクレオチドを増幅することができる。そのように増幅されたポリヌクレオチドを適切なベクターにクローニングし、およびDNA配列解析によって特徴付けすることができる。さらに、例えば、自動DNA合成装置を使用するなどの、標準的な合成技術を用いて、ポリヌクレオチドの全てまたは一部に相当するオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【００３７】
転写産物またはゲノム配列を検出するために、本発明のポリヌクレオチドの配列に基づいたプローブを使用することができる。プローブは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、酵素補助因子などの、それに付着した標識基を含んでもよい。対象由来の細胞の試料中のタンパク質をコードする核酸分子のレベルを測定すること、例えば、mRNAレベルを検出すること、またはタンパク質をコードする遺伝子が突然変異を起こしているかもしくは欠失しているかを決定することなどによって、タンパク質を発現し損なっている細胞または組織を同定するための診断検査キットの一部として、そのようなプローブを使用することができる。
【００３８】
ある態様において、本発明はまた、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを提供する。ある態様において、ポリペプチドは、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされる。別の態様において、ポリペプチドは、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の少なくとも一部を含む、ポリヌクレオチドによってコードされる。そのようなポリペプチドに結合する抗体もまた意図されている。
【００３９】
本発明はまた、図2で同定されたハプロタイプからなる群より選択されるハプロタイプを含む、ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを提供する。
【００４０】
ある態様において、本発明はまた、調節配列と機能的に連結される、図2で同定されたハプロタイプ、または配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含むベクターを提供する。ある態様において、ベクターは、調節配列と機能的に連結される、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列を含む。別の態様において、ベクターは、調節配列と機能的に連結される、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の少なくとも一部を含む。
【００４１】
ある態様において、本発明はまた、そのようなベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。ある態様において、本発明はまた、図2で同定されたハプロタイプ、または配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを生産する方法であって、発現に好適な条件下で、そのようなポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。ある態様において、発現のための条件下で、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列を含む、ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を培養することによって、ポリペプチドを生産する。別の態様において、発現のための条件下で、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の一部を含む、ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を培養することによって、ポリペプチドを生産する。
【００４２】
図2で同定されたハプロタイプ、または配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含むポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物も、本発明によってさらに意図されている。ある態様において、トランスジェニック動物は、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチドを含む。別の態様において、トランスジェニック動物は、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドを含む。
【００４３】
別の態様において、本発明のポリヌクレオチド、タンパク質、抗体、ベクター、および／または宿主細胞を含む組成物ならびにキットが意図されている。
【００４４】
本発明の1つの適用には、2型糖尿病を発生するより高いリスクのある者の予測が含まれる。母集団に対する個体のリスクを明確にするために、2型糖尿病に寄与する遺伝的要因を明確にする診断検査を、公知の臨床的リスク要因と共に、または公知の臨床的リスク要因とは別に使用してもよい。2型糖尿病のリスクのある個体を同定するための手段は、現在の臨床的リスク要因のより積極的な管理を含む、より良い予防法および治療計画をもたらすべきである。ある態様において、本発明は、個体における2型糖尿病に対する易罹患性を診断する方法であって、核酸における多型の存在が2型糖尿病に対する易罹患性を示す、特定の遺伝子または遺伝子断片の核酸における多型を検出する工程を含む方法を含む。
【００４５】
ある態様において、本発明は、個体における2型糖尿病または2型糖尿病に対する易罹患性を診断する方法であって、配列番号：1〜92に含まれるおよび図1で示されるSNPの特定のアレルの存在または不在を決定する工程を含む方法を含む。本発明のある局面において、方法は、図1で示される2型糖尿病と関連するアットリスクアレルの1つをスクリーニングする工程を含む。したがって、ある態様において、本発明は、個体における2型糖尿病に対する易罹患性を診断もしくは決定する方法、または2型糖尿病に罹患し易い個体をスクリーニングする方法であって、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置する、2型糖尿病と関連するSNPのアットリスクアレルを検出する工程を含む方法を提供する。ある態様において、SNPは、配列番号：23および配列番号：23の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：32および配列番号：32の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：35および配列番号：35の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：40および配列番号：40の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：41および配列番号：41の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：17および配列番号：17の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：36および配列番号：36の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：74および配列番号：74の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：62および配列番号：62の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：10および配列番号：10の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：11および配列番号：11相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：8および配列番号：8の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：54および配列番号：54の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：65および配列番号：65の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：9および配列番号：9の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：67および配列番号：67の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：4および配列番号：4の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：91および配列番号：91の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：92および配列番号：92の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：68および配列番号：68の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：69および配列番号：69の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：7および配列番号：7の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：20および配列番号：20の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：16および配列番号：16の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：31および配列番号：31の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：42および配列番号：42の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：39および配列番号：39の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：53および配列番号：53の相補体の内部に位置する。ある態様において、SNPは、配列番号：38および配列番号：38の相補体の内部に位置する。
【００４６】
ある態様において、本発明は、ハイブリダイゼーションに適切な条件下で、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列（または配列の一部）を含む単離されたポリヌクレオチドと試料を接触させる工程、ならびにハイブリダイゼーションが起こった場合、2型糖尿病と関連する（または関連しない）SNPのある特定のアレルを含むあるポリヌクレオチドが試料に存在する、試料中のポリヌクレオチドと単離されたポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーションが起こったかどうかを評価する工程を含む、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む試料中のポリヌクレオチドの存在を検出する方法を提供する。上記の方法のある態様において、単離されたポリヌクレオチドは、試料中に存在するポリヌクレオチドと完全に相補的である。上記の方法の別の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、試料中に存在するポリヌクレオチドと部分的に相補的である。別の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、試料中に存在するポリヌクレオチドと少なくとも80％同一であり、かつ該ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズすることができる。望ましい場合、当技術分野において公知の方法を用いて、試料中に存在するポリヌクレオチドの増幅を行なうことができる。
【００４７】
本発明はさらに、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列を含む第2のポリヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的である第1のポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための方法であって：（a）ハイブリダイゼーションに適切な条件下で第2のポリヌクレオチドと試料を接触させる工程、ならびに（b）第1のポリヌクレオチドと第2のポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーションが起こったかどうかを評価する工程を含み、ハイブリダイゼーションが起こった場合、試料中に第1のポリヌクレオチドが存在する方法を提供する。本明細書においてこれまでに記載した方法のある態様において、第1のポリヌクレオチドの存在は、2型糖尿病または2型糖尿病を発生する傾向を示す。該方法のさらなる態様において、第2のポリヌクレオチドは、第1のポリヌクレオチドの配列の一部と完全に相補的である。別の態様において、該方法はさらに、第1のポリヌクレオチドの少なくとも一部の増幅を含む。さらなる態様において、第2のポリヌクレオチドは99またはそれより少ないヌクレオチド長であり、かつ：（a）第1のポリヌクレオチド中の連続したヌクレオチドの配列と少なくとも80％同一であるか、または（b）第1のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズすることができるかのいずれかである。
【００４８】
配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置する2型糖尿病と関連するSNPのアレルを含む、ポリヌクレオチドによってコードされる2型糖尿病と関連するポリペプチドの存在について試料をアッセイする方法であって、ポリペプチドと特異的に結合する抗体と試料を接触させる工程を含む方法もまた、本発明によって意図されている。ある態様において、ポリペプチドと特異的に結合する抗体と試料を接触させることによって、（配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列を含む）ポリヌクレオチドによってコードされる試料中の2型糖尿病と関連するポリペプチドの存在をアッセイする。別の態様において、ポリペプチドと特異的に結合する抗体と試料を接触させることによって、（配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の少なくとも一部を含む）ポリヌクレオチドによってコードされる試料中の2型糖尿病と関連するポリペプチドの存在をアッセイする。
【００４９】
本発明はまた、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む第1のポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための試薬であって、第1のポリヌクレオチドの一部と少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含む第2のポリヌクレオチドを含む試薬を含む。試薬のある態様において、第2のポリヌクレオチドは、第1のポリヌクレオチドの一部と完全に相補的である。
【００５０】
本発明はまた、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む第1のポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための試薬キットであって、別々の容器に：（a）配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列を含む1つまたは複数の標識された第2のポリヌクレオチド；ならびに（b）標識の検出のための試薬を含む試薬キット、を包含する。
【００５１】
別の態様において、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置する、2型糖尿病と関連する（または関連しない）SNPのある特定のアレルを含むポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするために使用することができるポリヌクレオチドを含むキットが意図されている。2型糖尿病と関連する（または関連しない）SNPのアレルを含むポリヌクレオチドによってコードされる2型糖尿病と関連する（または関連しない）タンパク質の存在について、試料をアッセイするために使用することができる抗体を含むキットも意図されている。
【００５２】
個体における2型糖尿病に対する易罹患性を診断する別の方法は、対照試料と比較した検査試料中のポリペプチドの発現または組成物における変化の存在が2型糖尿病に対する易罹患性を示す、2型糖尿病と関連しないSNPのアレルを含むポリヌクレオチドによってコードされた対照試料中のポリペプチドの発現または組成物を決定する工程、およびそれを2型糖尿病と関連するSNPのアレルを含むこと以外は同一のポリヌクレオチドによってコードされた検査試料中のポリペプチドの発現または組成物と比較する工程を含む。
【００５３】
ある態様において、本発明はまた、個体におけるあるハプロタイプの存在または不在を決定する工程を含む、個体における2型糖尿病または2型糖尿病に対する易罹患性を診断する方法に関する。本発明のある局面において、方法は、図2に示されるアットリスクハプロタイプの1つをスクリーニングする工程を含む。したがって、本発明は、個体における2型糖尿病に対する易罹患性を診断するための方法、または2型糖尿病に対する易罹患性を有する個体をスクリーニングする方法であって、図2に示されるハプロタイプからなる群より選択される2型糖尿病と関連するハプロタイプを検出する工程を含む方法を包含する。
【００５４】
ハプロタイプの存在または不在は、例えば、個体由来の核酸の酵素的増幅、電気泳動解析、制限断片長多型解析、および／または配列解析を使用することを含む、様々な方法によって決定してもよい。
【００５５】
個体における2型糖尿病に対する易罹患性を診断する方法、または2型糖尿病に対する易罹患性について個体をスクリーニングするための方法であって：(a）個体からポリヌクレオチド試料を得る工程、ならびに(b）ハプロタイプの存在が2型糖尿病に対する易罹患性に相当する、図2で示されたハプロタイプを含む、ハプロタイプの存在または不在についてポリヌクレオチド試料を解析する工程を含む方法も含まれる。
【００５６】
ある態様において、個体における2型糖尿病に対する易罹患性を決定または診断する方法であって、図1または図2で同定された多数のSNPを検出する工程を含む方法が提供される。ある態様において、個体における2型糖尿病に対する易罹患性を決定する方法は、配列番号：23、32、35、40、41、17、および／または36で同定された多数のSNPを検出する工程を含む。別の態様において、個体における2型糖尿病に対する易罹患性を決定する方法は、配列番号：74、62、10、11、8、および／または54で同定された多数のSNPを検出する工程を含む。別の態様において、個体における2型糖尿病に対する易罹患性を決定する方法は、配列番号：65、9、67、4、91、92、68、および／または69で同定された多数のSNPを検出する工程を含む。別の態様において、個体における2型糖尿病に対する易罹患性を決定する方法は、配列番号：7、20、16、31、42、39、53、および／または38で同定された多数のSNPを検出する工程を含む。ある態様において、第1のポリヌクレオチドと相補的であるプローブポリヌクレオチドと試料を接触させることにより、図1の1つまたは複数のアットリスクアレルを含む第1のポリヌクレオチドの試料における存在についてアッセイする。
【００５７】
ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：23および配列番号：23の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：32および配列番号：32の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：35および配列番号：35の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：40および配列番号：40の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：41および配列番号：41の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：17および配列番号：17の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：36および配列番号：36の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：74および配列番号：74の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：62および配列番号：62の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：10および配列番号：10の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：11および配列番号：11相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：8および配列番号：8の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：54および配列番号：54の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：65および配列番号：65の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：9および配列番号：9の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：67および配列番号：67の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：4および配列番号：4の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：91および配列番号：91の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：92および配列番号：92の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：68および配列番号：68の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：69および配列番号：69の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：7および配列番号：7の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：20および配列番号：20の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：16および配列番号：16の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：31および配列番号：31の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：42および配列番号：42の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：39および配列番号：39の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：53および配列番号：53の相補体の内部に位置する。ある態様において、少なくとも1つのSNPは、配列番号：38および配列番号：38の相補体の内部に位置する。
【００５８】
本発明のある方法において、2型糖尿病治療剤が意図されている。2型糖尿病治療剤は、ポリペプチド活性および／または図2で同定されたハプロタイプもしくは配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含むポリヌクレオチドの発現を、変化させる（例えば、増強するまたは阻害する）薬剤であることができる。そのような薬剤には、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、受容体、結合剤、ペプチド模倣剤、融合タンパク質、プロドラッグ、抗体、ポリヌクレオチド発現を変化させる薬剤、本発明の遺伝子またはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの活性を変化させる薬剤、本発明の遺伝子またはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの転写後プロセッシングを変化させる薬剤、ポリペプチドと結合剤または受容体との相互作用を変化させる薬剤、遺伝子またはポリヌクレオチドによってコードされたスプライシング変異体の転写を変化させる薬剤、およびリボソームが含まれる。ある態様において、本発明はまた、本明細書において記載されるような2型糖尿病治療剤の少なくとも1つを含む薬学的組成物に関する。
【００５９】
2型糖尿病治療剤は、例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳をアップレギュレートすることによる、ポリペプチドの翻訳後プロセッシングを変化させることによる、スプライシング変異体の転写を変化させることによる、またはポリペプチド活性を妨害することによる（例えば、ポリペプチドに結合することによる、もしくは関心対象のポリペプチドと相互作用する別のポリペプチドに結合することによる）、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現、転写、もしくは翻訳をダウンレギュレートすることによる、または関心対象のポリペプチドとポリペプチド結合剤の相互作用を変化させることによるなどの、様々な手段で、ポリペプチド活性またはポリヌクレオチドの発現を変化させることができる。
【００６０】
ある態様において、本発明はまた、2型糖尿病治療剤を治療的有効量で個体に投与することによって2型糖尿病に苦しむ個体を治療する方法に関する。ある態様において、2型糖尿病治療剤はアゴニストであり、および別の態様において、2型糖尿病治療剤はアンタゴニストである。ある態様において、本発明はさらに、2型糖尿病の治療で使用するための薬物の製造のための2型糖尿病治療剤の使用に関する。
【００６１】
本明細書において記載されるような治療剤は、組成物の形で、または単独で、送達することができる。それらは、全身に投与することができ、または特定の組織に標的することができる。治療剤は、化学合成；組換え生産およびインビボ生産（例えば、トランスジェニック動物、全体として参照により本明細書に組み入れられる、Meadeらに対する米国特許第4,873,316号を参照）を含む、様々な手段によって生産することができ、ならびに当技術分野において公知の標準的な方法を用いて単離することができる。さらに、任意の上記の治療法の組み合わせ（例えば、mRNAを標的にするアンチセンス療法と併用したポリペプチドの投与；第2のスプライシング変異体を標的にするアンチセンス療法と併用した第1のスプライシング変異体の投与）を使用することもできる。
【００６２】
ある態様において、本発明はまた、当技術分野において公知の方法を用いて、本発明の治療剤の2型糖尿病に対する有効性をモニターする方法を包含する。本発明の別の適用は、ある特定の治療剤に対する個体の反応を予測するためのその使用である。例えば、SNPまたはハプロタイプを、薬物反応を予測しかつ所与の個体における治療剤の選択を導くための薬理ゲノム学的診断として用いてもよい。
【００６３】
別の態様において、本発明は、2型糖尿病と関連するSNPのアレルを含むポリヌクレオチドの発現を変化させる薬剤を同定する方法であって：（a）発現のための条件下で（1）配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置する2型糖尿病と関連するSNPのアレル、ならびに（2）レポーター遺伝子と機能的に連結されるプロモーター領域を含む、ポリヌクレオチドを検査すべき薬剤と接触させる工程；（b）薬剤の存在下で、レポーター遺伝子の発現のレベルを評価する工程；（c）薬剤の非存在下で、レポーター遺伝子の発現のレベルを評価する工程；ならびに（d）発現が薬剤によって変化したことを示す相違について、工程（b）における発現のレベルと工程（c）における発現のレベルを比較する工程を含む方法に関する。
【００６４】
別の態様において、本発明は、2型糖尿病を治療するために好適な薬剤を同定する方法であって：（a）図2で同定されたハプロタイプまたは配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む、ポリヌクレオチドを検査すべき薬剤と接触させる工程；ならびに（b）2型糖尿病の治療に有用であると考えられる手法で、薬剤がポリヌクレオチドに結合し、ポリヌクレオチドを変化させ、またはポリヌクレオチドに影響を及ぼすかどうかを決定する工程を含む方法に関する。
【００６５】
ある態様において、薬剤の存在下でのポリヌクレオチドの発現は、薬剤の非存在下での1つまたは複数のスプライシング変異体の発現と種類または量の点で異なる1つまたは複数のスプライシング変異体の発現を含む。
【００６６】
別の態様において、本発明は、2型糖尿病を治療するために好適な薬剤を同定する方法であって：（a）図2で同定されたハプロタイプまたは配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含むポリヌクレオチドによってコードされた、ポリペプチドを検査すべき薬剤と接触させる工程；ならびに（b）2型糖尿病の治療に有用であると考えられる手法で、薬剤がポリペプチドに結合し、ポリペプチドを変化させ、またはポリペプチドに影響を及ぼすかどうかを決定する工程を含む方法に関する。上記の方法によって同定される薬剤だけでなく、そのような薬剤を含む薬学的組成物もまた意図されている。
【００６７】
ある態様において、図2で同定されたハプロタイプまたは配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含むポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドが投与され、またはインサイチューで生成され、かつmRNAおよび／またはゲノムDNAに特異的にハイブリダイズする、「アンチセンス」療法で使用する。mRNAおよび／またはDNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、翻訳および／または転写を阻害することによって、mRNAおよび／またはDNAによってコードされるポリペプチドの発現を阻害する。アンチセンスポリヌクレオチドの結合は、従来の塩基対相補性によるか、または例えば、DNA 2本鎖に結合する場合は、2重らせんの主溝での特異的な相互作用を介してされうる。
【００６８】
アンチセンスコンストラクトを、例えば、発現プラスミドとして送達することができる。プラスミドが細胞内で転写される場合、それはポリペプチドをコードするmRNAおよび／またはDNAの一部に相補的であるRNAを生成する。あるいは、アンチセンスコンストラクトは、エクスビボで生成され、かつ細胞内に導入されるポリヌクレオチドプローブであることができ、その後、それはポリペプチドをコードするmRNAおよび／またはゲノムDNAにハイブリダイズすることによって発現を阻害する。ある態様において、ポリヌクレオチドプローブは、例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼなどの内在性ヌクレアーゼに抵抗性であり、それによってインビボでの安定性が与えられている、修飾されたオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための例示的な核酸分子は、DNAのホスホアミデート、ホスホチオエート、およびメチルホスホネート類似体である（その全てが全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,176,996号、第5,264,564号、および第5,256,775号も参照されたい）。さらに、アンチセンス療法で有用なオリゴマーを作成する一般的なアプローチはまた、例えば、その両方が全体として参照により本明細書に組み入れられる、Van der Krolら（Bio Techniques 6: 958-976 (1988)）；およびSteinら（Cancer Res. 48: 2659-2668 (1988)）によって記載されている。アンチセンスDNAに関しては、翻訳開始地点由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドを使用してもよい。
【００６９】
アンチセンス療法を行なうために、ポリペプチドをコードするmRNAに相補的であるオリゴヌクレオチドをデザインする。アンチセンスオリゴヌクレオチドはmRNA転写産物に結合し、かつ翻訳を妨げる。オリゴヌクレオチドが、RNAとハイブリダイズし、安定な2本鎖を形成することができるのに十分な相補性を有する限り、完全な相補性は必要とされない。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さの両方に依存すると考えられる。一般に、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが長ければ長いほど、それらが含んでもよく、および依然として安定な2本鎖（または、場合によって、3本鎖）を形成するRNAとの塩基ミスマッチが多くなる。当業者は、標準的な方法の使用により、許容できるミスマッチの程度を確認することができる。
【００７０】
アンチセンス療法で使用されるオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、またはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾体、1本鎖もしくは2本鎖であることができる。オリゴヌクレオチドを、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改良するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、（例えば、宿主細胞受容体をインビボで標的にするための）ペプチドなどのその他の付加基、または細胞膜（例えば、Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 648-652 (1987); PCT 国際公報番号：WO 88/09810参照）もしくは血液脳関門（例えば、PCT 国際公報番号：WO 89/10134参照）を超えた輸送を促進する薬剤、またはハイブリダイゼーションが誘発される切断剤（例えば、Krol et al., Bio Techniques 6: 958-976 (1988) 参照）、または挿入剤を含むことができる。（例えば、Zon, Pharm. Res. 5: 539-549 (1988) 参照）。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションが誘発される架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションが誘発される切断剤）と共役させてもよい。
【００７１】
ある態様において、アンチセンス分子は、2型糖尿病と関係するポリペプチドをインビボで発現する細胞に送達される。アンチセンスDNAまたはRNAを細胞に送達するために、多くの方法を使用することができる；例えば、アンチセンス分子を組織部位の中に直接注射することができ、または所望の細胞を標的にするよう設計された、修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上に発現した受容体もしくは抗原に特異的に結合するペプチドもしくは抗体に連結されたアンチセンス）を全身に投与することができる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強いプロモーター（例えば、pol IIIまたはpol II）の制御下に置かれている場合、組換えDNAコンストラクトが利用される。患者における標的細胞にトランスフェクトするために、そのようなコンストラクトを使用することによって、内在性の転写産物と相補的な塩基対を形成し、およびそれによってmRNAの翻訳を妨げると考えられる十分量の1本鎖RNAの転写が引き起こされる。例えば、それが細胞に取り込まれ、かつアンチセンスRNAの転写を導くように、ベクターをインビボに導入することができる。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスRNAを生成することができる限り、エピソームのまま残り、または染色体に組み込まれるようになることができる。組換えDNA技術および当技術分野において標準的な方法によって、そのようなベクターを構築することができる。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、またはウイルスベクターを、組織部位の中に直接導入することができる組換えDNAコンストラクトを調製するために使用することができる。あるいは、所望の組織に選択的に感染するウイルスベクターを使用することができ、その場合、別の経路で（例えば、全身性に）、投与を達成してもよい。本発明の別の態様において、小さい2本鎖の干渉RNA（RNA干渉 (RNAi)）を使用することができる。RNAiは、2本鎖RNAが導入され、かつ標的にされたmRNAの触媒分解を通じて、結果的に配列特異的な遺伝子サイレンシングが起こる転写後過程である。例えば、その全ての教示が全体として参照により本明細書に組み入れられる；Elbashir, S. M. et. al., Nature 411: 494-498 (2001); Lee, N. S., Nature Biotech. 19: 500-505 (2002); Lee, S-K. et al., Nature Medicine 8 (7): 681-686 (2002)を参照されたい。
【００７２】
ある態様において、本発明は、図2で同定されたハプロタイプまたは配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列で同定されているSNPを含む、ポリヌクレオチドの発現をダウンレギュレートする2本鎖RNAポリヌクレオチドを含む短い干渉核酸（「siNA」）分子を含む。ある態様において、本発明は、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列で同定されるSNPを含む遺伝子の発現を変化させるために、（[その全てが全体として参照により本明細書に組み入れられる]米国特許公報番号：US 2004/0192626 A1、US 2004/0203145 A1、およびUS 2004/0198682 A1に記載されたような）RNA干渉で使用されるポリヌクレオチド、組成物、および方法を含む。
【００７３】
標的相同組換えを用いて、遺伝子またはそのプロモーターを不活化または「ノックアウト」することにより、遺伝子産物の内在性発現を低下させることもできる。例えば、内在性遺伝子（遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）に相補的なDNAが隣接する変化をさせた、非機能的遺伝子（または完全に無関係なDNA配列）を用いて、選択可能なマーカーおよび／もしくは陰性選択可能なマーカーを伴って、または伴わないで、遺伝子をインビボで発現する細胞にトランスフェクトすることができる。標的相同組換えを介した、DNAコンストラクトの挿入は、遺伝子の不活化をもたらす。上に記載したような、適切なベクターを用いて、組換えDNAコンストラクトを必要とされるインビボの部位に直接投与し、または標的にすることができる。あるいは、同様の方法を用いて、変化させていない遺伝子の発現を増加させることができる：標的相同組換えを用いて、上で記載したような、細胞内の遺伝子の代わりに、変化させていない機能的遺伝子、もしくはその相補体、またはそれらの一部を含むDNAコンストラクトを挿入することができる。別の態様において、標的相同組換えを用いて、細胞に存在するポリペプチドとは異なるポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、DNAコンストラクトを挿入することができる。
【００７４】
あるいは、調節領域（すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的にして、体内の標的細胞内の遺伝子の転写を妨げる3重らせん構造を形成させることにより、遺伝子産物の内在性発現を低下させることができる。（一般的には、Helene, C., Anticancer Drug Des., 6 (6): 569-84 (1991); Helene, C., et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27-36 (1992); およびMaher, L. J., Bioassays 14 (12): 807-15 (1992) を参照されたい）；その全てが全体として参照により本明細書において組み入れられる。同様に、遺伝子産物の正常な生物学的活性、例えば、インビボ組織培養およびエクスビボ組織培養の両方における、組織分化を遮断することによる組織の操作において、本明細書において記載したアンチセンスコンストラクトを使用することができる。さらに、アンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェクション、または転写産物がRNA配列もしくは核酸配列に関してアンチセンスであるプラスミドを用いたトランスフェクション）を用いて、2型糖尿病および関連状態の発生に関わる経路に関与する1つまたは複数の遺伝子の役割を調べることができる。そのような技術を細胞培養に利用することができるが、トランスジェニック動物の創作に使用することもできる。
【００７５】
本明細書において記載した本発明のポリヌクレオチド、タンパク質、および／または治療剤を、投与に好適な薬学的組成物に組み入れることができる。そのような組成物は、典型的には、ポリヌクレオチド、タンパク質、および／または治療剤、ならびに薬学的に許容される担体を含む。本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」という言葉は、薬学的投与に適合する、任意のおよび全ての溶剤、分散剤、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびにそれらと同様の薬剤を含むよう意図されている。薬学的活性物質に対するそのような溶媒および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の溶媒または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除き、組成物におけるその使用が意図されている。補助的な活性化合物も組成物に組み入れることができる。
【００７６】
本発明の薬学的組成物を、その意図された投与の経路と適合するように処方する。投与の経路の例として、例えば、静脈内投与などの非経口投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（局所投与）、経粘膜投与、および直腸投与が含まれる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水などの滅菌希釈剤、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性の調整のための薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムなどの、酸または塩基で、pHを調整することができる。非経口の調製物は、アンプル、使い捨ての注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回分のバイアルに封入することができる。
【００７７】
注射可能な使用に好適な薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または滅菌水分散、および滅菌注射可能な溶液または滅菌注射可能な分散の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。静脈内投与について、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF; Parsippany, N. J.）またはリン酸緩衝化食塩水（PBS）が含まれる。組成物は滅菌したもので、かつ容易な注射可能性が存在する程度まで流動性があるべき場合もある。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、ならびにそれらと同様のもの）、ならびにそれらの好適な混合物を含む溶剤または分散剤であることができる。例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、適当な流動性を維持することができる。様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、およびそれらと同様のものによって、微生物の作用の防止を達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが望ましいと考えられる。吸収を遅延させる薬剤、例えば、マグネシウムモノステアラートおよびゼラチンを組成物中に含むことによって、注射可能な組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【００７８】
上に列挙した成分の1つまたは組み合わせと共に、活性化合物（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体）を適切な溶剤に必要とされる量で組み入れ、必要な場合には、その後に濾過滅菌を行なうことによって、滅菌注射可能な溶液を調製することができる。一般的に、塩基性分散剤および上に列挙した成分から必要とされるその他の成分を含む滅菌ビークルに活性化合物を組み入れることによって、分散を調製する。滅菌注射可能な溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製の方法の中には、活性成分、さらにそれまでに濾過滅菌したその溶液からの所望の付加成分の粉末を産生する真空乾燥および凍結乾燥がある。
【００７９】
経口組成物は通常、不活性な希釈剤または可食性担体を含む。それらをゼラチンカプセルに封入し、または圧縮して錠剤にすることができる。経口治療投与の目的で、活性化合物を賦形剤と共に組み込み、かつ錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用することができる。流動性のある担体中の化合物が、経口で適用され、かつ漱がれ、かつ吐き出され、または飲み込まれる、うがい薬として使用するための流動性のある担体を用いて、経口組成物を調製することもできる。薬学的に許容される結合剤、および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ、およびそれらと同様のものは任意の以下の成分、または似通った性質の化合物を含むことができる：微結晶性セルロース、ゴムトラガカント、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくは乳糖などの賦形剤、アルギン酸もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；マグネシウムステアラートなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペッパーミント、メチルサリチラート、もしくはオレンジ香料などの香料添加剤。
【００８０】
吸入による投与用に、好適な推進剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくは加圧ディスペンサー、または噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で化合物を送達する。
【００８１】
全身性投与は、経粘膜手段または経皮手段によることもできる。経粘膜投与または経皮投与用に、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤を製剤中に使用する。そのような浸透剤は当技術分野において一般的に公知であり、および例えば、経粘膜投与用に、洗剤、胆汁塩、およびフシジン酸を含む。鼻スプレーまたは坐剤の使用を通じて、経粘膜投与を達成することもできる。経皮投与用に、当技術分野において公知のような軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームの中に活性化合物を製剤化する。
【００８２】
直腸送達用の坐剤（例えば、カカオバターおよびその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤と共に）または停留浣腸の形態で化合物を調製することもできる。
【００８３】
ある態様において、埋め込みおよびマイクロカプセル化した送達系を含む、放出制御製剤などの、体内からの迅速な除去から化合物を保護すると考えられる担体と共に活性化合物を調製する。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸などの、生物分解可能な生体適合性のあるポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製の方法は、当業者には明白であると考えられる。Alza社およびNova Pharmaceuticals社から市販で材料を入手することもできる。（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞に標的にされるリポソームを含む）リポソーム懸濁液を薬学的に許容される担体として使用することもできる。例えば、米国特許第4,522,811号に記載されたような、当業者に公知の方法によって、これらを調製することができる。
【００８４】
経口組成物および非経口組成物を投薬単位形態で処方することは、投与の容易性および投薬の均一性のために有利である。本明細書において使用される投薬単位形態とは、治療される対象にとっての単位投薬として好適な物理的に個別の単位を指す；各単位は、必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療的効果を生み出すように計算された既定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態の仕様は、活性化合物の独特の特徴および達成される特定の治療的効果、ならびに個体の治療のためにそのような活性化合物を調合する当技術分野において固有の制限により決定され、ならびに活性化合物の独特の特徴および達成されたことに対する特定の治療的効果、ならびに個体の治療のためにそのような活性化合物を調合する当技術分野において固有の制限に直接依存する。
【００８５】
本発明の核酸分子をベクターに挿入し、および遺伝子治療ベクターとして使用することができる。例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第5,328,470号参照）によって、または定位注射（例えば、Chen et al.(1994) Proc. Natl Acad. Sci. USA 91: 3054-3057参照）によって、遺伝子治療ベクターを対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達ビークルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、例えば、レトロウイルスベクターなどの、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞から無傷のまま産生することができる場合、薬学的調製物は遺伝子送達系を産生する1つまたは複数の細胞を含むことができる。
【００８６】
薬学的組成物を、投与の取扱説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーの中に含めることができる。本発明の治療剤を含むキットが意図されている。
【００８７】
本発明の別の態様は、2型糖尿病を治療するための特定の薬物に対する個体の反応を予測するためのその使用である。一般に、患者が同じ薬物に同様には反応しないのは周知の現象である。所与の薬物に対する薬物反応の違いの多くは、ある遺伝子およびそれらが対応する経路における個体間での遺伝子およびタンパク質の違いに基づくと考えられている。本発明は、2型糖尿病と関連する特定のSNP、ハプロタイプ、および遺伝子を明確にする。現在のまたは将来の治療剤の中には、そのようなSNP、ハプロタイプ、および／または遺伝子と直接的にまたは間接的に関係している経路に影響を及ぼすことができ、ならびにしたがって、2型糖尿病リスクが一部そのようなSNP、ハプロタイプ、および／または遺伝子によって決定される患者において効果的であることができるものがあってもよい。他方、それらの同じ薬物が、該SNPおよび／またはハプロタイプの特定のアレルを有さない患者において、効果が弱いまたは効果がない可能性がある。したがって、本発明のSNPおよび／またはハプロタイプを、所与の個体における薬物反応を予測し、かつ治療剤の選択を導くための薬理ゲノム学的診断として使用することができる。
【００８８】
ある態様において、2型糖尿病の治療に対する薬物の有効性をモニターするための方法は、薬物による治療の前に、図1で同定されたSNPからなるSNPの群より選択される1つまたは複数のSNPを含む2型糖尿病と関連する遺伝子の発現のレベルをモニターする工程、薬物による治療の後に遺伝子の発現のレベルをモニターする工程、ならびに治療の前および治療の後の遺伝子の発現のレベルを比較する工程を含む。
【００８９】
別の態様において、2型糖尿病の治療における所与の治療剤の有効性を予測するための方法は、配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置する1つまたは複数のSNPの存在または不在について、スクリーニングする工程を含む。
【００９０】
別の態様において、2型糖尿病の治療における所与の治療剤の有効性を予測するための方法は、図2で同定された1つまたは複数のハプロタイプの存在または不在についてスクリーニングする工程を含む。
【００９１】
本発明の別の適用は、2型糖尿病に関与する律速経路の具体的な同定である。対照と比べて糖尿病患者で著しくより一般的な遺伝的変異のある疾患遺伝子は、2型糖尿病の発症における具体的に実証された原因段階を表している。すなわち、遺伝子が原因であるのか、または単に疾患過程に反応性であるのかという不確実性は排除される。疾患遺伝子によってコードされるタンパク質は、2型糖尿病素因の生物学的過程に関与する律速分子を規定している。そのような2型遺伝子によってコードされるタンパク質またはその分子経路におけるその相互作用タンパク質は、小分子治療、タンパク質治療、抗体治療、または核酸治療によって選択的に調節され得る薬物標的を表している。2型糖尿病に罹患した人口が増えつつあるため、そのような具体的情報が大いに必要とされている。
【００９２】
SNPに基づく関連によって2型糖尿病と関係があることがこれまでは公知でなかったが、本発明におけるSNPに基づく関連によって2型糖尿病と関係があることが発見された遺伝子には、以下のものが含まれる。
2008522597.tif 000002
（表1）2型糖尿病と関係があることが発見された遺伝子
【００９３】
ある態様において、本発明は、2型糖尿病と関連する遺伝子を同定する方法であって：（a）配列番号：1〜92により同定される配列および配列番号：1〜92により同定される配列の相補体からなる群より選択される配列の内部に位置するSNPを含む遺伝子を同定する工程；ならびに（b）遺伝子が2型糖尿病と関連があることを示す違いについて、アットリスクアレルを有する個体における遺伝子の発現を、アットリスクアレルを有さない個体における遺伝子の発現と比較する工程を含む方法に関する。
【００９４】
別の態様において、本発明は、2型糖尿病と関連する遺伝子を同定する方法であって：（a）図2で同定されたアットリスクハプロタイプを含む遺伝子を同定する工程；ならびに（b）遺伝子が2型糖尿病と関連があることを示す違いについて、アットリスクハプロタイプを有する個体における遺伝子の発現を、アットリスクハプロタイプを有さない個体における遺伝子の発現と比較する工程を含む方法に関する。
【００９５】
実施例
実施例1：研究集団
対照集団と2型糖尿病集団の間にあるようなSNPおよびSNPハプロタイプの存在下での変異を調べるために、合計600人の患者を研究に含めた。スウェーデン人のあるコホートをSNP発見のために用い、および別のポーランド人糖尿病患者のコホートを関連研究で用いた（表2参照）。追加の300人の一致対照由来の試料を関連研究で使用するために解析した。
2008522597.tif 000003
（表2）この研究で用いた症例試料および対照試料のまとめ
【００９６】
症例-対照研究から、表現型は単に「糖尿病」であった。BMI、ヘモグロビンAIC、心臓疾患（MIなど）、腎症などを含む、その他のサブ表現型を解析に含むことができた。試料は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、Ardlie et al., Testing for population subdivision and association in four case-control populations, Am J Hum Genet. 71: 304-311, 2002に詳述されたプロトコルに従って、Genomics Collaborative社（CGI）により収集された。
【００９７】
最後に、集団は大体同じ数の男性および女性を含んでいた（男性274人および女性326人）。試料はまた、糖尿病集団および非罹患集団における同数の男性（症例163人および対照163人）ならびに同数の女性（症例137人および対照137人）でうまく一致させた。
【００９８】
任意の集団に基づく研究において、未知の交絡因子に基づく誤った結果を避けるために、症例および対照を一致させることが重要である。遺伝的研究との関連では、これは、研究される表現型の傾向を与える遺伝子を含む領域を除き、症例集団および対照集団がゲノムにわたって遺伝的に同一であるべきであることを意味する。すなわち、ランダムな1セットのマーカーが、症例集団および対照集団において、広く類似したアレル頻度を示すべきである。患者および対照が、性別および民族について一致していただけでなく、同じ国（ポーランド）から選択されていたので、集団の階層化がこの研究に存在する可能性は低かった。しかしながら、集団の階層化について検証するために、FalushらによるSTRUCTURE 2.0というソフトウェアプログラム（2002年3月）を用いてデータを解析した；その全てが参照により本明細書に組み入れられる；Pritchard et al, Inference of population structure: Extensions to linked loci and correlated allele frequencies; GENETICS; 近刊（2003）; Pritchard et al., Inference of Population Structure Using Multilocus Genotype Data; GENETICS 155: 945-959（2000a）も参照されたい。STRUCTUREは、その全てが参照により本明細書に組み入れられる；Pritchard et al., Association mapping in structured population,. AM. J. HUM. GENET. 671: 170-81（2000）に記載されたようなモデルに基づくクラスタリング方法を実行する。プログラムは、いかなる介入もなく、データを予め規定した数のクラスターに分類することを許された。データセットは3つの基準に基づいて選ばれた150のマーカーからなっていた。第1に、マイナーアレルは集団全体で＞5％の頻度を有していなければならなかった。第2に、少なくとも80％の個体が遺伝子型を有することが必要とされ、および第3に、マーカーはセット中の任意のその他のマーカーに100kbよりも近接していてはいけない。
【００９９】
データの階層化分析によって、明確なクラスタリングは示されなかった。以下のことを含む様々な要因によって、構造がないことが示された：クラスターのそれぞれ由来の個体のゲノムの比率は、症例および対照について同じであり、全ての個体を混合した。すなわち、それらは全てのクラスター由来の遺伝子を有すると見なされ、およびより多くのパラメータを加えること（すなわち、より多くのクラスターを適合させること）によって、可能性を改善することはなかった。
【０１００】
要約すれば、症例と対照の間に一貫性のある遺伝的偏りはなかった。STRUCTUREにより作成された最適適合クラスターは、個々の試料の表現型と無関係であるように見えた。
【０１０１】
実施例2：試料収集および糖尿病集団候補遺伝子におけるSNP発見
SNP発見過程のために、糖尿病患者由来の三百（300）の試料を解析した。（糖尿病遺伝子と関与していると同定された）合計186の遺伝子をSNP発見のために利用した。これらの遺伝子のうち、ParAlleleのミスマッチ修復検出系（MRD）を利用して、62を解析し、341のSNPを検出した。その他の1659のSNPは、デノボシークエンス解析によって同定し、および公共データベース（National Center for Biotechnology Information）から同定した。
【０１０２】
SNP発見用に解析した186の遺伝子のうち、ミスマッチ修復検出プラットフォーム（MRD）を通じて、62を解析し、341のSNPを検出した。解析の目的は、これらの標的の中に、糖尿病集団および対照集団を含む研究集団における2％の頻度またはそれより高い頻度のSNPを検出することであった。全ての遺伝子のエクソンに関する情報は、Ensembl（The Sanger Centre, Cambridge, UK）ビルド33データベースから取得した。転写産物のすぐ上流の配列は調節配列が濃縮されているので、始めの350bpの上流をエクソン0とコード化した。エクソン0だけでなくそれぞれのエクソン、ヒトマウス相同も領域である合計990の領域を同定した。これらの領域の175はヒトマウス相同であり、および815は（エクソン0を含む）エクソンであった。遺伝子当たりのエクソンの数は、PPPIR3Cの場合のような2（エクソン0を含む）〜58（NOS2A）の範囲であった。幾つかの大きいエクソンは2つまたはそれより多くの標的に分けられ、かつ幾つかの間隔が近接している小さいエクソンの対は1つの標的を形成するように統合された。合計で、1011の標的を作成し、および999の単位複製配列を増幅するようにプライマーを設計した。
【０１０３】
実施例3：ミスマッチ修復検出（MRD）
MRDは、大腸菌（Escherichia coli）のミスマッチ修復系を利用して変異またはSNPを検出する。全体として参照により本明細書に組み入れられる、Modrich, P., Mechanisms and biological effects of mismatch repair, ANN REV, GENET, 25: 2259-53（1991）。形質転換した断片のプールを2つのプール：変異を持つプールおよび変異を持たないプールに分類するために特異株を人工的に作製する。MRDはこれまで多重変異走査のための方法として記載されてきた。全体として参照により本明細書に組み入れられる、Faham. M., et al., Mismatch repair detection（MDRD）：high-throughput scanning for DNA variations, HUM MOL. GENET, 10（16）; p1657-64（2001）。2つの異なる集団における共通の変異体アレルを発見するために、標準的なジデオキシターミネーターシークエンス解析と共にMRDを用いる。ある集団由来のプールしたゲノムDNAを鋳型として用いるPCR反応を、単一ハプロイドの個体由来のPCR断片と混合する。プールした集団が直接シークエンスされるSangerシークエンス解析は、ゲノムプール由来の希少なアレルを検出するのに十分な感度を有していない。その代わり、多くのPCR反応をプールし、およびハプロイド標準と比べて変異体アレルが濃縮されたコロニーのプールを生成するために1回のMRD反応を行なう。変異体が濃縮されたプール由来の1回の増幅反応を各々の単位複製配列について行ない、その後、検討した集団における共通でかつ希少な変異を同定するためにシークエンス反応を行なう。全体として参照により本明細書に組み入れられる、Fakhrai-Rad et al., SNP Discovery in Pooled Samples With Mismatch Repair Detection, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, 14: 1404-1412（2004）を参照されたい。
【０１０４】
この過程の最終的な結果は、多くの個体を増幅およびシークエンス解析する必要性が、多重化された方法で何千もの単位複製配列について実行されるプール濃縮過程に置き換えられるということである。したがって、シークエンス解析過程はハプロイド標準をシークエンス解析する作業およびMRDで濃縮されたプールの結果に要約される。偽陽性のSNP発見率を減らすために、典型的にはフォワード方向およびリバース方向の両方で単位複製配列のシークエンス解析をする。
【０１０５】
MRDに基づくSNP発見の感度は、非ゲノムDNAミスマッチのMRD濃縮により生じるバックグラウンドによって制限される。これらは2つの様式：オリゴヌクレオチド突然変異およびPCRエラーで生じる可能性がある。PCRプライマーにおけるオリゴのエラーおよびPCRエラーの両方が、任意の実際のDNA変異の非存在下で突然変異を含む1組の断片を導入する。これらの断片は実際の変異と一緒に濃縮されていると考えられ、バックグラウンドレベルより低い頻度で生じる突然変異を濃縮することは不可能であるということを意味している。これらの問題を最小限に抑えるために、低い割合の突然変異を有するオリゴおよび高い忠実度のポリメラーゼを用いるPCRを用いる。BRCA1遺伝子に変異のある患者を用いて対照実験を行なった。BRCA1エクソンにおける突然変異を同定するために、これらの患者のシークエンス解析が行なわれた。その後、個々のSNPが様々な頻度で発見される試料を作り出すように、これらのDNAをプールした。その後、これらのプールを濃縮し、かつシークエンス解析した。MRDは、単位複製配列が＞10％の頻度でSNPを示す場合には完全な再発見を伴って、1％程度の低い頻度の変異に対して非常に高い感度を示す。
【０１０６】
ヒト集団においては、MRDに基づくSNP発見の感度に対してその他の制限を課すその他の実際的な問題がある。これらのうちの第一は、複数のSNPがある特定のシークエンス解析断片上に生じる可能性があるということである。非常に異なる頻度を有する2つのSNPでこれが生じた場合、より高い頻度のSNPが濃縮されたプールで優勢になる傾向があると考えられ、より希少なSNPのシグナルは押さえられる。幾つかの方法で、この効果を緩和することができる。1つ目は、1つの断片（典型的には、〜300bpの断片を用いる）内で生じる複数のSNPの機会を最小限に抑えるために、相当に小さいPCR断片を用いることである。次に、共通のSNPが生じることが公知の場合には、これらのSNPを除くようにPCRプライマーを設計することができる。これらの制限は、典型的な手法での多くの個体のシークエンス解析および分析の非常に高い費用と比較検討されることになる。小集団の選択にポアソンノイズを導入することによって、古典的な手法でシークエンス解析される個体の数を減らすことにより、被覆率が減少する。
【０１０７】
実施例4：分子反転プローブを用いたSNPジェノタイピング
糖尿病患者由来の試料を利用したSNP発見段階の終了後に、2つ目の糖尿病患者のコホート由来の300の試料のセットおよび非糖尿病対照由来の300の試料のセットを含む別のセットの試料を、本計画のジェノタイピング段階のために利用した。
【０１０８】
SNPジェノタイピング用に分子反転プローブ（MIP）を利用した。1739のSNPに関する配列を解析した。これらのSNPのうちの合計1591はNCB1データベース（ビルド33）において独特であった。SNPのうちの327に隣接する40bpの配列は独特であった。（SNP発見で検出されなかった）公共データベース由来の102中82のバリデートされたSNPはゲノムにおいて独特であった。これにより、MIPプローブが設計されたちょうど2,000のSNPが与えられた。これら2,000のプローブのうち、1,769（88.4％）がバリデートされたアッセイを生み出した。その後、300の糖尿病症例ならびに300の民族および性別を一致させた対照において、これらのジェノタイピングを行なった。
【０１０９】
糖尿病に対する易罹患性において役割を果たす可能性がある186の遺伝子に関する情報を提供するために、これらのSNPを選んだ。これらの遺伝子は、21番染色体およびY染色体を除き、全ての染色体から少なくとも1つの遺伝子で、ゲノムにわたって位置している。遺伝子は0〜992kbまで大きさが様々である。遺伝子の長さは、各遺伝子の中で最も広く間隔が開いたSNP間の領域の大きさによって測定され、したがってただ1つのSNPのある遺伝子は0kbの大きさを有するものとして記録されることに留意されたい。
【０１１０】
この過程のオリゴヌクレオチドプローブは、増幅不能な分子から増幅可能な分子への単分子再配列を経る。この再配列は、ゲノムDNAおよびアレル特有の手法で生じる酵素的「ギャップ充填」過程によって媒介される。ギャップ充填過程は、プローブが環状化された重要な中間状態をもたらす。この状態は、全ての交差反応プローブおよび未反応プローブを分解すると考えられるエキソヌクレアーゼ処理を通じた単分子相互作用のための選別を可能にする。反転後、蛍光標識された一般的なPCRプライマーを用いてプローブを増幅する。全体として参照により本明細書に組み入れられる、Hardenbol et al., Multiplexed genotyping with sequence tagged molecular inversion probes, 21 NAT. BIOTECHNOL. (6): 673-78 (2003年6月)を参照されたい。
【０１１１】
アレルを同定するために、4回の同一の反応をSNPに対して用いる。単一のヌクレオチド種（A、C、G、またはT）を用いることにより、4回の多重化反応のそれぞれが異なるSNPアレルを得る。反転後、反転を経た全てのプローブが各々の反応で増幅されるように、共通のプライマー対を用いてPCRを行なう。これら4回の反応のそれぞれで異なる蛍光標識を用いることによって、4回の別々の反応に起因するMIPプローブ単位複製配列上にどの標識が存在するかを同定することで、SNPアレルを推測することができる。
【０１１２】
増幅後、4回の反応を汎用のオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズさせる。DNAアレイ上の対応する相補的なタグ部位における蛍光シグナルによって、相対的な塩基の取り込みを測定する。各プローブについて4つの強度値を作る。所与の個体についてSNPがホモ接合性であるか、またはヘテロ接合性であるかを決定するために、期待されるアレル塩基についての2つの値を比較し、および品質管理チェックとして、プローブについてのシグナル対ノイズを測定するために、2つの非アレル塩基をアレル塩基と比較する。
【０１１３】
実施例5：アレル関連性の結果のまとめ
経験的p値に関する分割表解析およびFisherの正確検定を用いて、マーカー-形質関連性を調べた。ある特定の研究のアレルのカイ2乗関連性検定（2×2、1 d.f.）からの結果のまとめを、SNPの数がp≦0.05で有意であることが分かった図3に示す。
【０１１４】
実施例6：遺伝子型関連性の結果のまとめ
ある特定の研究の遺伝子型のカイ2乗関連性検定（2×3、2 d.f.）からの結果のまとめを、SNPの数がp≦0.05で有意であることが分かった図4に示す。
【０１１５】
実施例7：劣性効果に関するカイ2乗検定
疾患に対する根本的な遺伝的易罹病性が加法的遺伝モデルに従う場合、アレル検定および遺伝子型検定の両方が最も適切であるが、遺伝子型検定はまた、優性に関する検定も含む。しかしながら、遺伝子型検定およびアレル検定の両方は、劣性アレル効果に対処しておらず、かつもし存在する場合には、それらは見落とされると考えられる。この問題に対処するために、各SNPのマイナーアレルが劣性効果（2×2、1 d.f.）としてモデル化される別の一連のカイ2乗検定を行なった。幾つかのSNPは劣性検定で有意であり（図5参照）、その中には、アレル検定で既に関係があるとされたものがあった。図6は、アレル関連性検定、遺伝子型関連性検定、および劣性効果に関するカイ2乗検定を用いて、2型糖尿病に関連することが分かったSNPのまとめを提供している。
【０１１６】
実施例8：アットリスクハプロタイプに関する評価
本明細書において記載されているハプロタイプは、2型糖尿病のない個体よりも2型糖尿病のある個体で頻度が高いことが分かっている。したがって、これらのハプロタイプは、個体における2型糖尿病または2型糖尿病に対する易罹患性に関する予測的価値を有する。本明細書において記載されるある態様において、2型糖尿病に関するリスクのある個体は、アットリスクハプロタイプが同定される個体である。
【０１１７】
ある態様において、アットリスクハプロタイプとは、2型糖尿病の有意なリスクを付与するハプロタイプである。ある態様において、ハプロタイプと関連する有意性はオッズ比で測定される。さらなる態様において、有意性は百分率で測定される。ある態様において、有意なリスクは、以下を含むが、これらに限定されない、少なくとも約1.2のオッズ比として測定される：1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、および1.9。さらなる態様において、少なくとも約1.2のオッズ比は有意である。さらなる態様において、少なくとも約1.5のオッズ比は有意である。さらなる態様において、少なくとも約1.7のリスクの有意な増加は有意である。さらなる態様において、リスクの有意な増加は、約25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、および98％を含むが、これらに限定されない、少なくとも約20％である。さらなる態様において、リスクの有意な増加は少なくとも約50％である。しかしながら、リスクが医学的に有意であるかどうかを同定することは、特定の疾患、ハプロタイプ、およびしばしば、環境的要因を含む、様々な要因に依存する可能性もあるということが理解される。
【０１１８】
蛍光に基づく技術（Chen, et al., Genome Res. 9, 492 (1999)）、PCR、LCR、ネスティッドPCR、および核酸増幅のためのその他の技術などの、SNPの存在についてジェノタイピングするための標準的な技術を用いることができる。ある態様において、本方法は、健常対照集団と比べて過度のまたはより高い頻度のSNPが、個体が2型糖尿病を有する、または2型糖尿病に対して易罹患性であることを示す、SNPの存在または頻度を個体において評価する工程を含む。2つまたはそれより多くのSNPの存在は、個体をスクリーニングするために用いることができるアットリスクハプロタイプの存在を示す可能性がある。例えば、アットリスクハプロタイプは、図2で同定されたハプロタイプ、図1で同定されたSNPの組み合わせ、または図1もしくは図2で同定されたSNPの組み合わせを含むことができる。アットリスクハプロタイプの存在は、2型糖尿病に対する易罹患性を示し、およびしたがって、本明細書において記載された治療方法のための標的集団の中に収まる個体を示す。
【０１１９】
実施例9：末梢血管疾患に関するSNP
明確な表現型である末梢血管疾患（「PVD」）との関連性も、糖尿病患者の中で調べた。PVDに対して検出された最も強い関連は、4番染色体上のMTP（ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質）遺伝子に位置する、配列番号：44（rs1491238）および配列番号：45（rs2306985）の中のSNPの「G」アレルであった。配列番号：44の中のrs1491238について、カイ2乗はχ2=18.0（p≦0.0001）であり、および配列番号：45の中のrs2306985について、カイ2乗はχ2=18.8（p=0.001）であった。「G」アレルに対するアレルオッズ比は、1未満であった；rs1491238について、OR=0.49（0.35〜0.68）、およびrs2306985について、OR=0.48（0.35〜0.67）。両方のSNPに対する集団寄与リスクは23％であり、これらのSNPのいずれか一方に少なくとも1つの「G」アレルのある集団の4分の1はPVDから守られている。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図1A〜1F（本明細書において「図１」と総称する）は、各配列内に括弧で示されたSNPのある配列番号：1〜92を示す。2型糖尿病と関連する各SNPのアレルを別の欄に示す。
【図２】図2A〜2KK（本明細書において「図２」と総称する）は、2型糖尿病と関連するハプロタイプを示す。
【図３】図3A〜3B（本明細書において「図３」と総称する）は、各SNPについて図1で同定されたアットリスクアレルが、アレルのカイ2乗関連性検定に基づいて、2型糖尿病とどのくらい関連するかを示す（p≦0.05における有意）。
【図４】各SNPについて図1で同定されたアットリスクアレルが、劣性効果に関するカイ2乗検定に基づいて、2型糖尿病とどのくらい関連するかを示す（p≦0.05における有意）。
【図５】各SNPについて図1で同定されたアットリスクアレルが、遺伝子型のカイ2乗関連性検定に基づいて、2型糖尿病とどのくらい関連するかを示す（p≦0.05における有意）。
【図６】6A〜6B（本明細書において「図６」と総称する）は、アレル関連性検定、遺伝子型関連性検定、および／または劣性効果に関するカイ2乗検定を用いて、2型糖尿病と関連することが分かったSNPのまとめを提供する。
【図１Ａ】
2008522597.tif 000004
【図１Ｂ】
2008522597.tif 000005
【図１Ｃ】
2008522597.tif 000006
【図１Ｄ】
2008522597.tif 000007
【図１Ｅ】
2008522597.tif 000008
【図１Ｆ】
2008522597.tif 000009
【図２Ａ】
2008522597.tif 000010
【図２Ｂ】
2008522597.tif 000011
【図２Ｃ】
2008522597.tif 000012
【図２Ｄ】
2008522597.tif 000013
【図２Ｅ】
2008522597.tif 000014
【図２Ｆ】
2008522597.tif 000015
【図２Ｇ】
2008522597.tif 000016
【図２Ｈ】
2008522597.tif 000017
【図２Ｉ】
2008522597.tif 000018
【図２Ｊ】
2008522597.tif 000019
【図２Ｋ】
2008522597.tif 000020
【図２Ｌ】
2008522597.tif 000021
【図２Ｍ】
2008522597.tif 000022
【図２Ｎ】
2008522597.tif 000023
【図２Ｏ】
2008522597.tif 000024
【図２Ｐ】
2008522597.tif 000025
【図２Ｑ】
2008522597.tif 000026
【図２Ｒ】
2008522597.tif 000027
【図２Ｓ】
2008522597.tif 000028
【図２Ｔ】
2008522597.tif 000029
【図２Ｕ】
2008522597.tif 000030
【図２Ｖ】
2008522597.tif 000031
【図２Ｗ】
2008522597.tif 000032
【図２Ｘ】
2008522597.tif 000033
【図２Ｙ】
2008522597.tif 000034
【図２Ｚ】
2008522597.tif 000035
【図２ＡＡ】
2008522597.tif 000036
【図２ＢＢ】
2008522597.tif 000037
【図２ＣＣ】
2008522597.tif 000038
【図２ＤＤ】
2008522597.tif 000039
【図２ＥＥ】
2008522597.tif 000040
【図２ＦＦ】
2008522597.tif 000041
【図２ＧＧ】
2008522597.tif 000042
【図２ＨＨ】
2008522597.tif 000043
【図２ＩＩ】
2008522597.tif 000044
【図２ＪＪ】
2008522597.tif 000045
【図２ＫＫ】
2008522597.tif 000046
【図３Ａ】
2008522597.tif 000047
【図３Ｂ】
2008522597.tif 000048
【図４】
2008522597.tif 000049
【図５】
2008522597.tif 000050
【図６Ａ】
2008522597.tif 000051
【図６Ｂ】
2008522597.tif 000052
【配列表】
2008522597000001.app
【国際調査報告】
2008522597.tif 000053
2008522597.tif 000054
2008522597.tif 000055
2008522597.tif 000056
2008522597.tif 000057
2008522597.tif 000058
2008522597.tif 000059