(57)【要約】  修飾ナトリウム利尿化合物およびその複合体が複合体において開示されている。具体的には、それと付着した少なくとも１つの修飾部分を含むＢＮＰの複合形態が提供される。修飾ナトリウム利尿化合物複合体は、ｃＧＭＰ産生を刺激し、ＮＰＲ−Ａ受容体に結合する活性、および一部の実施形態において、非修飾対応物ナトリウム利尿化合物と比べ循環中の半減期の改善を保持する。化合物および複合体の経口、非経口、経腸、皮下、肺、および静脈内形態が、心臓状態、特にうっ血性心不全に対する治療薬および／または療法として調製されうる。さまざまな長さおよび構成を有するオリゴマー構造を含んで成る修飾部分も開示されている。天然配列以外のアミノ酸配列を有するナトリウム利尿化合物の類似体も開示されている。
2008500375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナトリウム利尿分子ＮＰＲ−Ａ結合部位と、
少なくとも１つの修飾部分複合部位と、
を含む生物活性ナトリウム利尿化合物と、
前記修飾部分複合部位に付着した少なくとも１つの修飾部分と、を含むナトリウム利尿化合物複合体であって、
前記ナトリウム利尿化合物複合体が、対応する非複合ナトリウム利尿化合物に対して酵素分解に対する耐性の増大、循環半減期の増大、バイオアベイラビリティの増大、および効果の持続期間の延長から成る群から選択される１つもしくはそれ以上の利点を示す、ナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項２】
前記ナトリウム利尿化合物が、ペプチド、もしくは脳ナトリウム利尿ペプチドの生物活性ペプチド断片、心房性ナトリウム利尿ペプチド、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド、またはデンドロアスピス（ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドを含む、請求項１に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項３】
前記ナトリウム利尿化合物が、Ｌｙｓ３Ａｒｇ、Ｌｙｓｌ４Ａｒｇ、Ａｒｇ３０Ｌｙｓ、Ｌｙｓ２７Ａｒｇ、およびＡｒｇ３１Ｌｙｓから成る群から選択される１つもしくはそれ以上の変異体を有する天然ｈＢＮＰ配列を含む、請求項１に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項４】
前記ナトリウム利尿化合物が、１つもしくはそれ以上の挿入、欠失、または伸長を有する天然ｈＢＮＰ配列を含む、請求項１に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項５】
前記修飾部分が、式
【化１】
2008500375.tif 000104
［式中、各々のＣは、独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル部分であり、かつｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であるとともに、
各々のＰＡＧは、独立して選択され、ｎ個のサブユニットを有するポリアルキレングリコール部分であり、かつ、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５であり、
各々Ｘは、独立して選択され、架橋部分である。］を有する、請求項１に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項６】
前記修飾部分が、式 
【化２】
2008500375.tif 000105
を有する、請求項５に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項７】
前記修飾部分が、式
【化３】
2008500375.tif 000106
を有する、請求項５に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項８】
過剰なレベルの細胞外液によって特徴づけられる状態を治療する方法であって、前記方法が薬学的に許容される量の請求項５に記載のナトリウム利尿化合物複合体をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項９】
前記修飾部分が、式
【化４】
2008500375.tif 000107
を有する、請求項１に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項１０】
前記修飾部分が、式
【化５】
2008500375.tif 000108
を有する、請求項５に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項１１】
前記修飾部分が、式
【化６】
2008500375.tif 000109
を有する、請求項１に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項１２】
前記修飾部分が、式
【化７】
2008500375.tif 000110
を有する、請求項５に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項１３】
前記修飾部分が、式
【化８】
2008500375.tif 000111
を有し、
かつ、前記ナトリウム利尿化合物がｈＢＮＰであり、前記修飾部分がＬｙｓ３で結合されるとともに、前記ナトリウム利尿化合物複合体がモノ複合体である、請求項５に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項１４】
前記ナトリウム利尿化合物が、ｈＢＮＰである、請求項９に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項１５】
前記ナトリウム利尿化合物が、ｈＢＮＰである、請求項１０に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項１６】
前記ナトリウム利尿化合物が、ｈＢＮＰである、請求項１１に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項１７】
前記ナトリウム利尿化合物が、ｈＢＮＰである、請求項１２に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項１８】
前記ナトリウム利尿化合物が、ｈＢＮＰであり、前記修飾部分がＬｙｓ３で結合されており、かつ前記ナトリウム利尿化合物複合体が、モノ複合体である、請求項９に記載のナトリウム利尿化合物複合体。 
【請求項１９】
前記ナトリウム利尿化合物が、ｈＢＮＰであり、前記修飾部分がＬｙｓ３で結合されており、かつ前記ナトリウム利尿化合物複合体が、モノ複合体である、請求項１０に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項２０】
前記ナトリウム利尿化合物が、ｈＢＮＰであり、前記修飾部分がＬｙｓ３で結合されており、かつ前記ナトリウム利尿化合物複合体が、モノ複合体である、請求項１１に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項２１】
前記ナトリウム利尿化合物が、ｈＢＮＰであり、前記修飾部分がＬｙｓ３で結合されており、かつ前記ナトリウム利尿化合物複合体が、モノ複合体である、請求項１２に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【請求項２２】
請求項９に記載のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１０に記載のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１１に記載のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１２に記載のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１４に記載のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１５に記載のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１６に記載のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１７に記載のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１８に記載のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１９に記載のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
請求項２０に記載のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
請求項２１に記載のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３４】
請求項９に記載のナトリウム利尿化合物複合体を製造する方法であって、前記方法が前記修飾部分を前記ナトリウム利尿化合物に化学的に結合する工程を含む、方法。
【請求項３５】
請求項１０に記載のナトリウム利尿化合物複合体を製造する方法であって、前記方法が前記修飾部分を前記ナトリウム利尿化合物に化学的に結合する工程を含む、方法。
【請求項３６】
請求項１１に記載のナトリウム利尿化合物複合体を製造する方法であって、前記方法が前記修飾部分を前記ナトリウム利尿化合物に化学的に結合する工程を含む、方法。
【請求項３７】
請求項１２に記載のナトリウム利尿化合物複合体を製造する方法であって、前記方法が前記修飾部分を前記ナトリウム利尿化合物に化学的に結合する工程を含む、方法。   
【請求項３８】
請求項１４に記載のナトリウム利尿化合物複合体を製造する方法であって、前記方法が前記修飾部分を前記ナトリウム利尿化合物に化学的に結合する工程を含む、方法。
【請求項３９】
請求項１５に記載のナトリウム利尿化合物複合体を製造する方法であって、前記方法が前記修飾部分を前記ナトリウム利尿化合物に化学的に結合する工程を含む、方法。
【請求項４０】
請求項１６に記載のナトリウム利尿化合物複合体を製造する方法であって、前記方法が前記修飾部分を前記ナトリウム利尿化合物に化学的に結合する工程を含む、方法。
【請求項４１】
請求項１７に記載のナトリウム利尿化合物複合体を製造する方法であって、前記方法が前記修飾部分を前記ナトリウム利尿化合物に化学的に結合する工程を含む、方法。
【請求項４２】
請求項１８に記載のナトリウム利尿化合物複合体を製造する方法であって、前記方法が前記修飾部分を前記ナトリウム利尿化合物に化学的に結合する工程を含む、方法。
【請求項４３】
請求項１９に記載のナトリウム利尿化合物複合体を製造する方法であって、前記方法が前記修飾部分を前記ナトリウム利尿化合物に化学的に結合する工程を含む、方法。
【請求項４４】
請求項２０に記載のナトリウム利尿化合物複合体を製造する方法であって、前記方法が前記修飾部分を前記ナトリウム利尿化合物に化学的に結合する工程を含む、方法。
【請求項４５】
請求項２１に記載のナトリウム利尿化合物複合体を製造する方法であって、前記方法が前記修飾部分を前記ナトリウム利尿化合物に化学的に結合する工程を含む、方法。
【請求項４６】
請求項９に記載のナトリウム利尿化合物複合体の薬学的に純粋な組成物。
【請求項４７】
請求項１０に記載のナトリウム利尿化合物複合体の薬学的に純粋な組成物。
【請求項４８】
請求項１１に記載のナトリウム利尿化合物複合体の薬学的に純粋な組成物。
【請求項４９】
請求項１２に記載のナトリウム利尿化合物複合体の薬学的に純粋な組成物。
【請求項５０】
請求項１４に記載のナトリウム利尿化合物複合体の薬学的に純粋な組成物。
【請求項５１】
請求項１５に記載のナトリウム利尿化合物複合体の薬学的に純粋な組成物。
【請求項５２】
請求項１６に記載のナトリウム利尿化合物複合体の薬学的に純粋な組成物。
【請求項５３】
請求項１７に記載のナトリウム利尿化合物複合体の薬学的に純粋な組成物。
【請求項５４】
請求項１８に記載のナトリウム利尿化合物複合体の薬学的に純粋な組成物。
【請求項５５】
請求項１９に記載のナトリウム利尿化合物複合体の薬学的に純粋な組成物。
【請求項５６】
請求項２０に記載のナトリウム利尿化合物複合体の薬学的に純粋な組成物。
【請求項５７】
請求項２１に記載のナトリウム利尿化合物複合体の薬学的に純粋な組成物。
【請求項５８】
ｍが１であり、Ｘが−Ｏ−であり、ｎが４であり、Ｃが−ＣＨ３である、請求項５に記載のナトリウム利尿化合物複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願
本出願は、２００４年５月２６日に出願され、係属中の、「ナトリウム利尿化合物、複合体、およびその使用」という名称の米国仮特許出願第６０／５７４，４３６号に基づき、この優先権を主張する。これらの出願の各々開示の全体は、その全体が参照により本明細書で援用され、かつ各々のかかる特許出願の出願日の利点は、それによってかかる請求の範囲によって合法的に果たされているすべての目的のために請求される。
【０００２】
２．政府支援の声明
主題発明は、ＮＩＨ助成第１Ｒ４３ＨＬ０７４５２９−０１号によって支援された研究プロジェクトの下、政府支援により行われた。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
技術分野
【０００３】
３．発明の分野
本発明は、ナトリウム利尿化合物複合体および変異ナトリウム利尿化合物の分野、およびこれらのうっ血性心疾患とこの状態に関連した状態の治療における使用に関する。例えば、本発明の組成物は、経口、経鼻、静脈内、または皮下投与に適切な製剤で使用されうる薬理的活性ナトリウム利尿剤およびプロドラッグを提供する。本発明は、ナトリウム利尿化合物複合体、化合物類、およびそれらを含有する製剤を調製する方法のほか、これらの複合体および化合物を使用する方法をも提供する。一例として、ナトリウム利尿化合物複合体は、ＮＰＲ−Ａ結合モチーフを含むナトリウム利尿ペプチド、少なくとも１つの修飾部分複合部位を含み、かつ修飾部分複合部位と付着した少なくとも１つの修飾部分をも含む。一の実施形態において、化合物複合体は、天然ナトリウム利尿ペプチドの残留薬理活性を有し、かつバイオアベイラビリティの改善、タンパク質分解活性に対する耐性の増強、および／または血流における活性の延長など増強された特性を有する。他の実施形態において、化合物複合体は、加水分解性プロドラッグとして提供されるが、これは天然ナトリウム利尿ペプチドに対してプロドラッグ形態における削減された薬理活性を有しうるとともに、インビボでのプロドラッグの加水分解時に活性ナトリウム利尿化合物が放出される。
【０００４】
本発明は、組換えペプチドおよびタンパク質の分野のほか、これらの組換えペプチドおよびタンパク質を調製するための方法にも関する。具体的には、ナトリウム利尿ペプチドおよびタンパク質の類似体が本明細書で開示されている。本発明の類似体ナトリウム利尿化合物は、一の実施形態においては、対応するナトリウム利尿ペプチドの天然配列に対する少なくとも１つの置換アミノ酸を有するアミノ酸配列を有するとして記載されうる。一の実施形態において、本発明の類似体ナトリウム利尿化合物は、脳型ナトリム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、とりわけヒトＢＮＰ（ｈＢＮＰ）、ウロジラチン（ｕｒｏｄｉｌａｔｉｎ）、イヌ脳ナトリウム利尿ペプチド（ｃＢＮＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、とりわけヒトＡＮＰ（ｈＡＮＰ）、デンドロアスピスナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）、またはＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、特にヒトＣＮＰ（ｈＣＮＰ）の天然形態の薬理活性を有するとして記載されうる。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
心血管疾患は、性別または民族性に関係なく米国における主要な死亡原因である。これらの疾患のうち、うっ血性心不全（ＣＨＦ）が、患者数の増加している唯一の疾患である（マシー（Ｍａｓｓｉｅ）とサー（Ｓｈａｈ）１９９７年、パッカー（Ｐａｃｋｅｒ）とコーン（Ｃｏｈｎ）１９９９年）。米国心臓協会によると、ＣＨＦによる退院数および死亡数はいずれも１９７９〜１９９９年にほぼ２．５倍上昇した。現在、約５百万人のアメリカ人がＣＨＦと診断されており、約５５万の新しい症例が毎年発生している（米国心臓協会２００１年）。この生命にかかわる状態は、多大な経済的影響を伴う。実際に、これが唯一最大のメディケア支出である（ケイサー（Ｋａｙｓｅｒ）２００２年）。ＣＨＦを治療するための直接および間接の費用は、５６０億ドルと推定されている（フッサール（Ｈｕｓｓａｒ）２００２年）。ＨＦの治療のための入院費は、すべてを含めた全形態の癌の治療の２倍超である（オコンネル（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ）とブリストフ（Ｂｒｉｓｔｏｗ）１９９４年）。
【０００６】
ＣＨＦは一般的な死亡原因であり、治療のための高い間接費を伴い、かつ死亡率が高い。いったん患者がＣＨＦと診断されると、１年死亡率は約２０％である（米国心臓協会２００１年）。同じ状態の再入院の確率はきわめて高く、再入院の幾つかの研究が最近行われている（チン（Ｃｈｉｎ）とゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ）１９９７年、クルムホルツ（Ｋｒｕｍｈｏｌｚ）、パレント（Ｐａｒｅｎｔ）ら、１９９７年、クルムホルツ（Ｋｒｕｍｈｏｌｚ）、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、２０００年）。診断の１年以内の３５％を上回る再入院率は一般的である（ツチハシ（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ）、ツツイ（Ｔｓｕｔｓｕｉ）ら、２００１年）。かかる頻度の再発は結果として多数の救急医療の訪問や患者の入院をもたらす（クルムホルツ（Ｋｒｕｍｈｏｌｚ）、パラン（Ｐａｒｅｎｔ）ら、１９９７年）。多数の入院および不十分な治療が、ＣＨＦ患者によって直面される現在の状況を規定する。
【０００７】
最近の無作為化研究では、在宅介入が潜在的にＣＨＦ患者の再入院率を減少させ、生存を延長させ、かつ生活の質を改善させうることが示された（スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）、マーリー（Ｍａｒｌｅｙ）ら、１９９９年）。社会経済的要因で考察された独立した研究において、ツチハシ（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ）らは、外来および在宅診療が死亡率を削減し、ＣＨＦと関連する全体的な費用を低下させるために必要であると結論づけた（ツチハシ（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ）、ツツイ（Ｔｓｕｔｓｕｉ）ら、２００１年）。明らかに、外来ベースで使用されうる広範な用途の新しい療法がこの成長市場において是が非でも必要である。
【０００８】
脳型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は、心血管、腎、および内分泌恒常性に関与しているペプチドのファミリーの１つである。これは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）発見のほぼ１０年後の１９８８年に発見された（スドウ（Ｓｕｄｏｈ）、カンガワ（Ｋａｎｇａｗａ）ら、１９８８年）。これは最初、ブタ脳から単離されたが、血管の平滑筋および内皮細胞における受容体でその活性が知られている。ＢＮＰは心臓によって産生される内因性ペプチドである。これは最初、プレプロＢＮＰとして産生され、その後に２倍短縮し、１個のジスルフィド結合を有する３２アミノ酸ペプチドの活性形態となる。
【０００９】
図１に示されているように、ＢＮＰは、細胞表面上の膜結合タンパク質であるナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）に結合する。結合イベントは、グアニル酸シクラーゼによるシトソルにおけるｃＧＭＰの合成を誘発する。これは、ＢＮＰがそれと関連する心血管、腎、および内分泌作用を達成するこの二次メッセンジャーによるものである。ＢＮＰの調節は幾つかの異なる手段によって達成される。ＮＰＲ−Ａに結合し、ｃＧＮＰ産生を刺激するＢＮＰ分子は循環から除去されるが、ＢＮＰが反応を引き起こすことなく除去される他の手段がある。除去の最も一般的な手段は、クリアランス受容体であるナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ（ＮＰＲ−Ｃ）との結合によるものである。ＮＰＲ−Ｃとの結合と同時に、ペプチドは細胞へ取り入れられ、酵素的に開裂される。クリアランスの次の主要な手段は、細胞表面上の膜結合酵素である、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）によって分解される。最後に、ＢＮＰは腎臓ろ過によって少しばかり除去される。
【００１０】
正常の状態下、ＢＮＰは心房および心室において少量で産生される。しかし、心室が心不全中に伸ばされると、産生されるＢＮＰの量は大きく増加する。心房は依然として関係しているが、心室は産生の主要部位となる。心臓は、ＣＨＦの発生時に不全中に起こる心身の伸びに反応してＢＮＰを産生する。ＢＮＰの効果としては、ナトリウム利尿、排出、血管拡張、および拡張期血圧の低下が挙げられる。これらの効果は、二次メッセンジャーである環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の作用によってもたらされる。ｃＧＭＰの産生は、ＢＮＰが、血管、腎、および肺における内皮細胞の表面上に位置した膜結合受容体であるナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）と相互作用すると誘発される。ＢＮＰの血漿濃度は、ＣＨＦの重症度の増大とともに増加的に上昇する。この上昇にもかかわらず、ＢＮＰの有利な効果が重篤なＣＨＦにおいて鈍化し、顕性ＣＨＦにおける相対的な欠乏状態の可能性を上昇させる。あるいは、ＢＮＰの血漿濃度を測定するために現在使用されるアッセイではプレプロＢＮＰと成熟形態とが特異的に区別されないため、このプロホルモンは顕性ＣＨＦにおけるその成熟形態に十分には加工されえない。したがって、心臓が産生しうるＢＮＰの量が克服され、またはプレプロＢＮＰが十分にその活性形態へ変換されず、そのためその有利な作用を削減する。心疾患発症時におけるその早期の産生のため、ＢＮＰはＣＨＦを発現する危険性の高い患者を検出する診断マーカーとして重要になった（ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）、バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔ）ら、１９９６年、マクドナー（ＭｃＤｏｎａｇｈ）、ロブ（Ｒｏｂｂ）ら、１９９８年、リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）、ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ）ら、１９９８年、ナガヤ（Ｎａｇａｙａ）、ニシキミ（Ｎｉｓｈｉｋｉｍｉ）ら、２０００年、カワイ（Ｋａｗａｉ）、ハタ（Ｈａｔａ）ら、２００１年、  マイセル（Ｍａｉｓｅｌ）、クリシュナスワミー（Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ）ら、２００２年、マクネイリー（ＭｃＮａｉｒｙ）、ガルデット（Ｇａｒｄｅｔｔｏ）ら、２００２年）。
【００１１】
ＢＮＰは幾つかの方法で心不全を軽減するように機能する。その名称が暗示するように、ＢＮＰはナトリウム利尿および尿量増加をもたらすが、これらはうっ血を減少させる。これは血管拡張としても機能するが、その効果は幾つかの他の作用によって増強される。これらの機能のうち最も顕著なものは、ＢＮＰがレニン−アンジオテンシン−アルドステロン系（ＲＡＡＳ）の干渉において果たす役割である。これは、血管収縮性ペプチドアンジオテンシンの生成における重要な酵素であるレニンの阻害をもたらす。これは、抑制されずに放置された上皮細胞内層血管組織の過成長を阻害し、血流を大きく削減しうる。ＢＮＰが心不全を軽減するように機能する最終的な方法がその変弛緩効果である。これにより心室の心筋弛緩が改善され、結果として低い拡張期血圧が生じる。
【００１２】
薬剤としてのペプチドの使用における実際的制限が存在する。腸および血流におけるタンパク質分解は、治療薬としてペプチドを使用する主要な障壁である。非内因性ペプチドで経験される別の問題は免疫原性である。これらの問題の結果として、製薬工業の方法は、医薬品化学を使用する小さな非ペプチド分子を生成することであった。この方法は成功したが、費用がかかり、時間がかかり、かつ薬物動態および毒性に関して不確実性を伴う。さらに、ペプチド受容体でのアゴニスト活性を有する小さな有機分子の同定は例外的に困難な課題であることが判明した。
【００１３】
「ペグ化（PEGylated）」タンパク質の使用はこれまで十分に確立されているが、それらは注射用に制限されている。本発明は、ヒト脳型ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ）などポリペプチドの経口的に利用可能な複合体を提供する。具体的には、本発明は、うっ血性心不全の治療における製剤中の治療的ペプチドおよびタンパク質に結合されたＰＡＧを含む複合体を提供する。次いで、これらの製剤はタンパク質分解酵素に対してｈＢＮＰを保護するように機能し、それによってヒトナトリウム利尿ペプチド受容体Ａのアゴニストとしてのこの薬剤の有効な使用を可能にする。このアゴニスト活性の結果として、ｃＧＭＰの産生が増強される。
【００１４】
２００１年８月、ｈＢＮＰ（天然ペプチド）が、急性うっ血性心不全の治療用に商標名Ｎａｔｒｅｃｏｒ（登録商標）（ネシリチド（Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ）でＦＤＡによって承認された。Ｎａｔｒｅｃｏｒ（登録商標）は、１２年以上でＣＨＦの治療用に承認された最初の薬剤であった。これは４８時間にわたる静脈内連続注入によって投与される。この薬剤は高価であり、入院を必要とするため、Ｎａｔｒｅｃｏｒ（登録商標）は最も急性の症例に対してのみ使用される。このように高価で不便であるにもかかわらず、Ｎａｔｒｅｃｏｒ（登録商標）は、患者が集中治療室で費やす時間を削減することによって、一部の他の療法よりも高価ではないとみなされうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
現在、ほぼ５百万人のアメリカ人がＣＨＦを有し、５５万の新しい症例が毎年報告されている（米国心臓協会、２００１年）。現在、ＣＨＦの治療に対する直接費用２百億ドルをはるかに上回る（米国心臓協会、２００１年）。心損傷が起こる前に心不全の発症を検出するために新たに利用可能な診断法により、外来または在宅環境で使用されうる有用性が拡大した薬剤の大きな必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
５．発明の概要
本発明は、大まかには、幾つかの天然起源ナトリウム利尿ペプチド、タンパク質、類似体、およびそれらの天然起源対応物に対して１つもしくはそれ以上の利点を有する、これらナトリウム利尿ペプチドの化学複合体の変形および修飾形態を含む。一例として、これらの利点の一部としては、タンパク質分解に対する耐性の増大、血流における持続性の時間の改善、および／または細胞膜障壁を横断する能力の改善が挙げられる。
【００１７】
本発明の一の実施形態によるナトリウム利尿化合物複合体は、ナトリウム利尿タンパク質受容体Ａ結合モチーフ（ＮＰＲ−Ａ）、少なくとも１つの修飾部分複合部位、および前記修飾部分複合部位に付着した少なくとも１つの修飾部分を含むナトリウム利尿化合物を含む。複合体の一部として前記ナトリウム利尿化合物に付着した修飾部分によって、ナトリウム利尿化合物複合体は、本明細書に記載される修飾部分を含むことがない天然ナトリウム利尿化合物に対する修飾親水性を有し得る。一例として、かつ非限定的に、本明細書でより完全に記載されているように、修飾部分はさまざまなサイズ、形状、置換、および構成のオリゴマーの形態を取りうる。
【００１８】
場合によっては、ナトリウム利尿化合物複合体は、少なくとも部分的に、天然ナトリウム利尿化合物の対応する非複合形態に対してタンパク質分解など酵素分解に対する耐性の増大によって特徴づけられる。これらの化合物複合体は、さらに追加的に、対応する非複合ナトリウム利尿化合物に対してｃＧＭＰ刺激活性など生物活性の治療上重要な割合の保持によって特徴づけられうる。保持されたｃＧＭＰ刺激活性は通常、インビトロで測定されるナトリウム利尿ペプチドの非複合形態のｃＧＭＰ活性の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、９５％、もしくはさらに９９％超または１００％である。非修飾（非複合）ナトリウム利尿化合物に対して修飾部分を有する本発明のナトリウム利尿化合物複合体の改善された特性の他の例としては、ＧＩ管を通過し、血流に入るナトリウム利尿化合物の能力の改善、ナトリウム利尿化合物の親水性、疎水性、または両親媒性の改善、水性環境または有機溶媒におけるナトリウム利尿化合物の溶解性の改善、細胞膜を横断するナトリウム利尿化合物の能力の改善、血液脳障壁を横断するナトリウム利尿化合物の能力の改善、特定の受容体、細胞、組織、または臓器を標的にするナトリウム利尿化合物の能力の改善、およびナトリウム利尿化合物の薬物動態プロフィールの改善が挙げられる。好ましい実施形態において、ナトリウム利尿化合物の生物活性剤要素の分解は、約２時間未満、約２のｐＨで、非修飾（非複合）生物活性ナトリウム利尿化合物の分解より小さい。ナトリウム利尿化合物のナトリウム利尿化合物要素は、例えば、血漿、プロテアーゼ、肝ホモジネート、酸性状態および／または塩基性状態の存在下に非複合ナトリウム利尿化合物よりもナトリウム利尿化合物複合体の要素としてより安定でありうる。
【００１９】
本発明のナトリウム利尿ペプチド複合体は、天然ペプチドと関連する抗圧、心血管、腎、および／または内分泌効果を誘発しうる。一の実施形態において、ナトリウム利尿ペプチドの修飾は、ｈＢＮＰなどペプチドをタンパク質分解から保護し、腸壁を通じて全身循環への送達を促進させ、結果としてナトリウム利尿、排出、および／または血管拡張をもたらす。本発明のナトリウム利尿ペプチド複合体は、したがって、（入院環境下に数日間の連続的静脈内注入による代わりに）経口製剤として有効に送達されうる。この利点は、これまで可能ではなかった自己投与を可能にすることによって他のＣＨＦ療法と関連する入院費を削減することが予想され、かつナトリウム利尿ペプチド、とりわけｈＢＮＰの治療的使用を拡大し、早期（例えば、クラス１）および慢性ＣＨＦならびに急性ＣＨＦを含むことが予想される。本発明の好ましい実施形態が、分解酵素に対する耐性を増加させ、かつ腸上皮にわたって経口送達および輸送に適切である非免疫原性ペプチド複合体である。
【００２０】
本発明は、ナトリウム利尿化合物複合体の調製のための幾つかの方法をも提供する。これらの修飾部分は、例えば、直鎖および分岐鎖ＰＡＧの形態または他のポリマー構造を取りうる。
【００２１】
６．定義 
特に規定がない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される同じ意味を有する。本発明の説明において使用される術語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、本発明の限定は意図されていない。見出しは読者の便宜のために使用され、これも本発明の限定は意図されていない。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、本明細書でそれらの商標によって参照されるブランド薬の添付文書と同様、その全体が参照により本明細書で援用される。
【００２２】
単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別に示さない限り、複数形を含むことが意図されている。
【００２３】
明細書および本明細書に記載された請求の範囲で使用される以下の語は、示されている意味を有する。
【００２４】
「アミノ酸」は、他に特に規定がない限り、そのＬまたはＤ立方異性体形態での天然起源、人工、または合成のアミノ酸として本明細書では定義される。「残基」という語は「アミノ酸」と同義に使用され、アミノ酸の所定配列における特定の位置を有するとしばしば示される。
【００２５】
本開示で使用されるすべてのアミノ酸の略語は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（ｂ）に記載されているように米国特許商標局によって採用されているものである。以下の一文字のアミノ酸の表示は本発明の説明において使用される。Ｘａａは不明または未指定のアミノ酸を示すために使用される。本明細書で提供される構造の上記特定の残基の整数は、残基の位置番号を規定する。この残基番号は、以下に記載される一文字のアミノ酸用語とともに使用され、置換が、例えば、ｈＢＮＰおよびＡＮＰのナトリウム利尿ペプチド類似体において行われる残基を示す。
【００２６】
したがって例えば、アルギニン（Ｒ）が野生型ｈＢＮＰの残基位置番号３でリシン（Ｋ）を置換する変異ｈＢＮＰが合成されている場合、「ＢＮＰＫ３Ｒ」または「ｈＢＮＰ（１−３２）Ｋ３Ｒ」という用語が使用される。複数の置換が、以下に例示される各々の置換を分離するコンマで同じやり方で示されている。
【００２７】
「ｈＢＮＰ（１−３２）Ｋ３Ｒ、Ｋ１４Ｒ、Ｋ２７Ｒ」という語は、残基位置３（すなわち、Ｋ３Ｒ）でのリシンに対するアルギニンの置換、残基位置１４（すなわち、Ｋ１４Ｒ）でのリシンに対するアルギニンの置換、および位置２７（すなわち、Ｋ２７Ｒ）でのリシンに対するアルギニンの置換により上記のｈＢＮＰを有する三重の変異ｈＢＮＰを示す。他の変異体は類似のやり方で定義される。
【００２８】
「ｈＢＮＰ（１−３２）Ｋ３Ｒ、Ｋ１４Ｒ」という語は、ｈＢＮＰの残基３および１４で、アルギニンで置換されたリシンを有する二重変異体を示す。
【表１】
2008500375.tif 000003
【００２９】
「両親媒性」は、水および脂質中で溶解し、かつ／または親水性および脂溶性を有する能力を意味し、「両親媒性部分」および「両親媒性」という語は、両親媒性であり、かつ／または、ポリペプチドまたは非ポリペプチド薬剤と付着されると、結果として生じる複合体、例えば、ＰＥＧ脂肪酸オリゴマー、糖脂肪酸オリゴマーの両親媒性を増大させる部分を意味する。
【００３０】
「生物活性」は、アゴニスト、部分的アゴニスト、またはアンタゴニストなど治療的または薬理的活性を有する薬剤を指す。
【００３１】
本明細書で提供される「有効量」は、非毒性であるが所望の治療効果を提供するために十分な量を指す。以下で指摘されるように、必要とされる正確な量は、対象の年齢、一般状態、治療される状態の重症度、投与される特定の生物活性剤などに応じて、対象によって異なる。個々の症例における適切な「有効」量は、関連文章および文献の参照によって、かつ／またはルーチンの実験を使用することによって当業者によって決定されうる。
【００３２】
「加水分解性」は、生理学的状態で加水分解にかけられる分子結合を指す。
【００３３】
「親水性」は、水中で溶解する能力を意味し、かつ「親水性部分」または「親水性物質」という語は、親水性であり、かつ／または、別の化学物資と付着すると、かかる化学物質の親水性を増加させる部分を指す。例としては、ポリエチレングリコールなどの糖およびポリアルキレン部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
「脂溶性」は、脂肪および脂肪組織に蓄積する化学薬品など、脂肪に対する親和性、脂質中で溶解する能力、および／または生体膜を貫通し、これと相互作用し、かつ／また横断する能力を有することを意味し、かつ「脂溶性部分」または「親油性」は、脂溶性であり、かつ／または、別の化学物質に付着すると、かかる化学物質の脂溶性を増加させる部分を意味する。
【００３５】
「低アルキル」は、１、２、３、４、５、または６個の炭素原子を有する置換または非置換アルキル部分を指す。
【００３６】
「単分散」は、混合物中の化合物の約１００パーセントが同じ分子量を有する化合物の混合物を指す。
【００３７】
本発明による組成物の塩、担体、賦形剤、または希釈剤などの要素の点で「薬学的に許容される」は、これが生物活性剤の生物活性を除去することなく本発明のナトリウム利尿化合物複合体と混合され、かつ過度の有害な副作用（毒性、刺激、およびアレルギー反応など）なしに本明細書で提供される対象により適切に使用されるという点で組成物の他の成分と適合する要素である。副作用は、それらのリスクが医薬組成物によって提供される利点を上回る場合に「過度」となる。薬学的に許容される要素の例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどエマルジョン、マイクロエマルジョン、およびさまざまなタイプの湿潤剤など標準薬学的担体のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
「ポリアルキレングリコール」またはＰＡＧは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、およびポリブチレングリコール（ＰＢＧ）、およびその組合せ（例えば、ＰＥＧ、ＰＰＧ、ＰＰＧ、およびＰＢＧサブユニットから選択される２つもしくはそれ以上の異なるＰＡＧ単位など２つもしくはそれ以上の異なるＰＡＧサブユニットの組合せを含む直鎖または分岐鎖ポリマー）などの直鎖または分岐鎖ポリアルキレングリコールポリマーを指し、かつポリアルキレングリコールのモノアルキルエーテルを含む。特定の実施形態において、ポリアルキルグリコールはポリエチレングリコールまたは「ＰＥＧ」である。「ＰＥＧサブユニット」という語は、単一ポリエチレングリコール単位、すなわち、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−を指す。「ＰＰＧサブユニット」という語は、単一ポリプロピレングリコール単位、すなわち、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−を指す。「ＰＢＧサブユニット」という語は、単一ポリプロピレングリコール単位、すなわち、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−である。ＰＡＧサブユニットは、メチル、エチル、またはプロピル側鎖などアルキル側鎖をも含みうる。
【００３９】
「プロドラッグ」は、対象への投与と同時に、そのプロドラッグが代謝され生物活性剤をもたらすように化学的に誘導されている生物活性剤を指す。
【００４０】
本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療するステップ（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、対象の状態（例えば、１つもしくはそれ以上の症状）における改善、その状態の進行の遅延、疾患または病気の発症の予防または遅延、正常な生理学的機能の増強等を含む、疾患または病気で苦しむ対象へ利点を与えるタイプの処置を指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
８．発明の詳細な説明
本発明の一の実施形態によるナトリウム利尿化合物複合体は、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ結合モチーフ（ＮＰＲ−Ａ）、少なくとも１つの修飾部分複合部位、および前記修飾部分複合部位に付着した少なくとも１つの修飾部分を含むナトリウム利尿化合物を含む。複合体の一部として前記ナトリウム利尿化合物に付着した修飾部分によって、ナトリウム利尿化合物複合体は、本明細書に記載される修飾部分を含むことがない天然ナトリウム利尿化合物に対する修飾親水性を有し得る。一例として、かつ非限定的に、本明細書でより完全に記載されているように、修飾部分はさまざまなサイズ、形状、置換、および構成のオリゴマーの形態を取りうる。
【００４２】
８．１  ナトリウム利尿化合物
本発明のナトリウム利尿化合物複合体は、ＮＰＲ−Ａなどナトリウム利尿ペプチド受容体のための結合部位のほか、それと修飾部分を結合するための複合部位を含むナトリウム利尿化合物を含む。
【００４３】
８．１．１  天然ナトリウム利尿ペプチド
ナトリウム利尿化合物は、ヒト、イヌ、およびラットなどさまざまな種からのＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ、もしくはＤＮＰ、ウロジラチンなど天然ナトリウム利尿ペプチドのアミノ酸配列を有しうる。好ましい天然ナトリウム利尿ペプチドは、ヒトＢＮＰ、ラットＢＮＰ、イヌＢＮＰ、またはｈＡＮＰである。天然配列は、プロナトリウム利尿ペプチドおよびプレプロペプチドを含むことも意図されている。
【００４４】
８．１．２  ナトリウム利尿化合物類似体
ナトリウム利尿化合物は、天然ナトリウム利尿ペプチドの生物活性類似体（ナトリウム利尿類似体）でもありうる。例えば、生物活性類似体が、切断、欠失、挿入、置換、代替、側鎖伸長、および融合タンパク質、もしくは最初の化合物の生物活性を除去することがない上記の組合せを有する天然ナトリウム利尿化合物でありうる。好ましくは、類似体は、天然または人工のＮＰＲ−Ａ結合モチーフを含み、かつＮＰＲ−Ａに対する活性の一部もしくは全部を保持する。
【００４５】
ナトリウム利尿ポリペプチド類似体は、さまざまな手段によって獲得されうる。例えば、一部のアミノ酸は、相互結合能を除去することなく天然ナトリウム利尿ペプチド構造における他のアミノ酸に置換されうる。場合によっては、当業界で記載されているように、かかる修飾は結果として、ＮＰＲ−Ｃに対して、クリアランス受容体であるＮＰＲ−Ａに対する親和性の増加をもたらし、結果として半減期の拡大が生じた。
【００４６】
好ましくは、類似体は、ＮＰＲ−Ａ結合モチーフなどナトリウム利尿分子結合モチーフを含む。
【００４７】
ナトリウム利尿ペプチドは、例えば、以下の配列によって定義されうる。
【００４８】
ＣＦＧＲＸＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ（配列番号２）
式中、Xは、修飾部分複合部位を含むアミノ酸残基などの化合物である。一部の実施形態におけるXは、修飾部分が付着しうるアミノ酸を含んで成る。例えば、Xは、修飾部分が付着されうるアミノ酸ＬｙｓまたはＣｙｓを含む。別の実施形態において、Ｘはリシン以外でありうるが、これらの実施形態において、非複合ペプチドも本発明の態様であり、ここでＸは、複合部位が生成されうるアルギニンまたはおよびリシン以外のアミノ酸である。
【００４９】
これらの実施形態の別の構造が以下である。
【００５０】
ＣＦＧＲＸ１ＭＤＲＩＸ２ＧＬＧＣ（配列番号 ）
式中、Ｘ１はリシンであり、Ｘ２は１〜４個のアミノ酸である。Ｘ２は、Ｓ、ＳＳ、ＳＳＳ、ＳＳＳＳ、Ｋ、ＫＳ、ＫＳＳ、またはＫＳＳＳでありうる。ＫがＸ２またはＸ２の配列の一部として含まれる場合、修飾部分複合部位。
【００５１】
ナトリウム利尿化合物は、例えば、以下の構造を有し得る。
【００５２】
Ｘ１−ＣＦＧＲＸ３ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ２（配列番号 ）
式中、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１が存在し、Ｘ１は１〜１０個のアミノ酸であり、ここでＸ２は１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸であり、かつＸ３はアルギニンなどのリシン以外である。例えば、Ｘ１はｈＢＮＰのＮ末端から１−１０個のアミノ酸残基配列のすべてまたはＣ末端断片を含みうる。一実施形態において、Ｘ１はＳＰＺ１ＭＶＱＧＳＧ−（配列番号  ）、ＳＰＺ１ＭＶＱＧ、ＳＰＺ１ＭＶＱ、ＳＰＺ１ＭＶ、ＳＰＺ１Ｍ、ＳＰＺ１、ＰＺ１ＭＶＱＧＳＧ、Ｚ１ＭＶＱＧＳＧを含み、ここでＺ１はリシンまたはアルギニンである。Ｚ１がリシンである場合、修飾部分複合部位が提供される。別の実施形態において、Ｘ２はｈＢＮＰのＣ末端から１−６個のアミノ酸残基配列のすべてまたはＮ末端断片を含みうる。一実施形態において、Ｘ２は配列Ｚ２ＶＬＲＲＨ（配列番号  ）、Ｚ２ＶＬＲＲ（配列番号  ）、Ｚ２ＶＬＲ（配列番号  ）、Ｚ２ＶＬ、Ｋ、Ｒ、ＲＶＬＲＲ（配列番号  ）、ＲＶＬＲ（配列番号  ）、ＲＶＬ、ＲＶ、またはＲであり、ここでＺ２はリシンまたはアルギニンである。Ｚ２がリシンである場合、修飾部分複合部位が提供される。Ｚ１がリシンである場合、Ｚ２はリシン以外でありうるとともに、Ｚ２がリシンである場合、Ｚ１はリシン以外でありうる。あるいは、Ｘ１およびＸ２はナトリウム利尿ペプチドから得られるＮ末端およびＣ末端尾アミノ酸配列でありうる。一部の実施形態において、Ｎ末端および／またはＣ末端尾配列が存在し、具体的にはｈＢＮＰまたはその断片のＮ末端およびＣ末端尾配列ではない。非複合ナトリウム利尿化合物も本発明の態様であることが理解されるであろう。
【００５３】
一の実施形態において、ナトリウム利尿化合物類似体は以下のアミノ酸配列を含む。
【００５４】
Ｘ１ＭＶＱＧＳＧＣ１ＦＧＲＸ２ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ２Ｘ３（配列番号 ）
式中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は各々が独立してＬｙｓおよびＬｙｓ以外のアミノ酸から成る群から選択され、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の少なくとも１つはＬｙｓであり、かつＸ１、Ｘ２、およびＸ３の少なくとも１つはＬｙｓ以外のアミノ酸であるとともに、Ｃ１およびＣ２はシステインであり、ジスルフィド結合によって結合されうる。非複合ペプチド類似体も本発明の態様であることが理解されるであろう。
【００５５】
一実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の少なくとも１つはＡｒｇである。別の実施形態において、Ｘ１はＬｙｓであり、Ｘ２はＡｒｇであるとともに、Ｘ３はＡｒｇである。この実施形態は、本明細書に記載されたアミノ酸配列、Ｘ１に対するＮ末端、および／またはＸ３に対するＣ末端をも含みうる。例えば、Ｎ末端尾配列は、存在する場合、Ｓ−またはＳＰ−でありうるとともに、Ｃ末端尾は、存在する場合、−ＶＬＲＲＨ、−ＶＬＲＲ、−ＶＬＲ、−ＶＬ、または−Ｖでありうる。一部の実施形態において、Ｎ末端および／またはＣ末端尾配列が存在し、具体的にはｈＢＮＰまたはその断片のＮ末端およびＣ末端尾ではない。
【００５６】
別の実施形態において、ナトリウム利尿ペプチド類似体は以下のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
ＣＦＧＲＸ１ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＸ２（配列番号  ）
式中、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１つは、修飾部分と結合した修飾部分複合部位を含んで成るアミノ酸素であり、もう１つは他のアミノ酸または非複合Ｌｙｓである。一実施形態において、Ｘ１は修飾部分とその側鎖で結合されたＬｙｓであり、Ｘ２は別のアミノ酸、例えばＧｌｙまたはＡｒｇである。あるいは、Ｘ２は修飾部分とその側鎖で結合されたＬｙｓであり、Ｘ１は別のアミノ酸、例えばＧｌｙ、Ａｒｇ、またはリシン以外のアミノ酸である。別の実施形態において、Ｘ１は修飾部分とその側鎖で結合されたＬｙｓであり、Ｘ２は非複合Ｌｙｓである。あるいは、Ｘ２は修飾部分とその側鎖で結合されたＬｙｓであり、Ｘ１は非複合Ｌｙｓである。非複合ペプチド類似体も本発明の態様であることが理解されるであろう。
【００５８】
実質的にすべてのナトリウム利尿ペプチドが本発明により修飾されうる。一例として修飾に適切な候補であるペプチド／タンパク質がＰＣＴＵＳ第０２１７５６７号明細書に記載されており、これは具体的には参照により本明細書で援用される。例えば、ＢＮＰは、好ましくはオリゴマーの複合部位として役立つ天然配列におけるＬｙｓ残基を含む。ＢＮＰが天然ペプチドである本発明の一の実施形態においては、ペプチドの結合領域から複合部位を除去し、または結合部位を除去することが望ましい場合がある。オリゴマーがペプチド配列の特定のＬｙｓ残基で付着しないことが望ましい場合は、Ｌｙｓはアルギニンなど別のアミノ酸で置換されうる。例えば、この領域における非加水分解性オリゴマーによる複合が活性にとって有害になりうるが、出願人は意外にもＬｙｓ１４での複合が結果として大量の保持活性をもたらすことを発見した。したがって、同様の化学特性を有するが容易に複合されないアミノ酸でかかる複合部位を置換することが望ましい場合がある。例えば、ｈＢＮＰ配列において、Ｌｙｓ１４はＡｒｇで置換され、それによって天然ＢＮＰに対するペプチド配列のＬｙｓ３でペプチドの複合に有利に働きうる。アミノ酸置換は、容易に複合可能ではないアミノ酸でＬｙｓを置換するように選択されうる。
【００５９】
場合によっては、複合に対する追加の部位を添加することが望ましい。例えば、一の実施形態において、プラスに帯電したアミノ酸残基がＬｙｓ残基で置換され、例えば、ＡＮＰペプチド（天然配列）において、Ａｒｇ２７がＬｙｓで置換されうる。
【００６０】
変異および複合が結果として生じるペプチド複合体の活性、および具体的にはＮＰＲ−Ａに対するその親和性を除去することがないような複合部位を添加する変異が選択されうる。一の実施形態において、ナトリウム利尿化合物は、１つもしくはそれ以上のＬｙｓ残基を有する天然ｈＢＮＰアミノ酸配列がｈＢＮＰ配列内に挿入され、かつ／およびｈＢＮＰ配列の端に添加され、かつ／または１つもしくはそれ以上の天然Ｌｙｓ残基が削除され、または同類置換で置換されると定義される。好ましくは、かかる置換または挿入はナトリウム利尿ペプチドの尾アミノ酸配列の１つもしくはそれ以上においてある。
【００６１】
複合部位は、一の実施形態において、Ｎ末端尾、例えば、Ｎ末端尾アミノ酸配列内の挿入または置換において、またはその近くで、好ましくは、Ｎ末端で挿入、置換、もしくは添加され、またはＮ末端から１、２、３、４、または５個のアミノ酸で配置され、あるいは、ループを生成するＣｙｓ架橋の一部を形成するＮ末端ＣｙｓからのＮ末端方向における１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸で配置される。好ましい実施形態において、ナトリウム利尿化合物は、Ｌｙｓ３→Ａｒｇ、Ｌｙｓ１４→Ａｒｇ、Ａｒｇ３０→Ｌｙｓ、およびＬｙｓ２７→Ａｒｇから成る群から選択される１つもしくはそれ以上の変異体を有する天然ｈＢＮＰ配列と定義されるが、１つもしくはそれ以上の変異体はナトリウム利尿ペプチド化合物の生物活性を除去することがない。オリゴマーなど２つ以上の修飾部分の添加が酵素安定性を改善し、かつ／または吸収を高めるうる。
【００６２】
ナトリウム利尿ペプチド類似体の多くは、ｈＢＮＰのＣｙｓ１０−Ｃｙｓ２６など天然ナトリウム利尿ペプチドのループ要素を含み、ここでＣｙｓ１０およびＣｙｓ２６はジスルフィド結合によって結合され、それによってループを形成する。場合によっては、ループは、かかる置換、欠失、および／または挿入が天然配列の活性を除去することがない限り、天然配列と異なるアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含みうる。かかる変異ループ配列の例が、シェーンフェルダ（Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄａ）ら、「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ」、ＦＥＢＳ  Ｌｔｔｅｒｓ  ４１４（１９９７年）２６３−２６７頁において見出されうるが、その全体の開示は参照により本明細書で援用され、受容体Ｃ（ＮＰＲ−Ｃ）と比べナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）に優先的に結合するＢＮＰの変形が記載されている。（米国特許第６，５２５，０２２号明細書および米国特許第６，０２８，０５５号明細書）。一例として、ナトリウム利尿ループは、ループのナトリウム利尿活性を除去することがない、例えば、場合によっては、ループが天然ループの配列（例えば、ｈＢＮＰの天然ループ）を有し、かつ１、２、３、４、５、６、７、または８個の同類置換を有する、１つもしくはそれ以上の同類置換を有する天然ループを含みうる。別の実施形態において、ループは、生物活性を除去することがない一連のアミノ酸を除去することによって短縮される。一の実施形態において、ペプチド類似体はｈＢＮＰのＣｙｓ１０−Ｃｙｓ２６ループを含むが、ここでＬｙｓ１４がＧｌｙまたはＡｒｇで置換されている。別の実施形態において、ループのＳＳＳＳ要素が変化または削除されている。
【００６３】
また、ナトリウム利尿ペプチドループまたは天然ループの類似体は、天然ナトリウム利尿ペプチドの尾、例えば、ｈＢＮＰ１−９およびｈＢＮＰ２７−３２などＮ末端尾および／またはＣ末端尾を含みうる。これらの尾は、生物活性を除去することがない単一のアミノ酸またはペプチドである。場合によっては、これらの尾は、かかる置換、欠失、および／または挿入が天然配列の有利な活性を除去することがない限り、天然配列と異なるアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含みうる。一実施形態において、尾は天然配列に基づくが、１つもしくはそれ以上のアミノ酸によって切断されている。例えば、Ｎ末端尾は、存在する場合、以下のｈＢＮＰ断片８−９、７−９、６−９、５−９、４−９、３−９、２−９、および１−９から、および１つもしくはそれ以上のＬｙｓ残基がＧｌｙまたはＡｒｇ残基で置換される上記の断片のいずれかから選択されうる。同様に、Ｃ末端尾は、存在する場合、ｈＢＮＰ断片２７−２８、２７−２９、２７−３０、２７−３１、および２７−３２から、および１つもしくはそれ以上のＬｙｓ残基がＧｌｙまたはＡｒｇ残基で置換される上記の断片のいずれかから選択されうる。好ましいループ＋尾ナトリウム利尿ペプチドの例は、ｈＢＮＰ断片１−２９、ｈＢＮＰ断片１−２６、および１つもしくはそれ以上のＬｙｓ残基がＧｌｙまたはＡｒｇで置換されている上記ｈＢＮＰ断片のいずれかを含む。
【００６４】
上記の類似体に加えて、本発明における使用に適した多種多様の類似体が当業界で記載されている。例えば、１９９２年５月１９日に発行され、その全体の開示が参照により本明細書で援用される、米国特許第５，１１４，９２３号明細書では、式Ｒ１−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｒ２［式中、Ｒ１は（Ｈ）、Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、およびＲ３−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−［式中、Ｒ３はヒトタンパク質もしくはそのＣ末端部の１−９９位の１０２個のアミノ酸配列である]であり、かつＲ２は（ＯＨ）、ＮＨ２、ＮＨＲ’もしくはここで修飾部分’および修飾部分”は独立して低アルキル（１−４Ｃ）であり、またはＲ２はＬｙｓ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ、もしくはそのアミド（ＮＨ２，ＮＨＲ’、もしくはＮＲ’修飾部分”）である］のナトリウム利尿活性を有するペプチドが記載されている。
【００６５】
１９９０年２月に発行され、その全体の開示が参照により本明細書で援用される米国特許第４，９０４，７６３号明細書でもＸ−Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ−ＯＨなど、本発明における使用に適切なナトリウム利尿ペプチド類似体が記載されており、ここでＸはＨ、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、またはＨ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙである。
【００６６】
１９９０年２月２７日に発行された米国特許第４，９０４，７６３号明細書（その全体の開示が参照により本明細書で援用される）では、Ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｙ（式中、２個のシステインはジスルフィド結合によって架橋されている）［式中、ＸはＨまたはＨ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙを意味し、かつＹは−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＯＨ、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＯＨ、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、もしくはＡｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ、またはその塩を示す］を含む本発明における使用に適切な他のナトリウム利尿ペプチド類似体が記載されている。１９８９年１２月１４日に公開されたＰＣＴ公報国際公開第８９１２０６９号パンフレットにおける使用に適切な別の一連の類似体。
【００６７】
本発明における使用に適したさらに一連のナトリウム利尿ぺプチド類似体が、２００３年６月１２日に公開され、その全体の開示が参照により本明細書で援用される米国特許出願公開第２００３０１０９４３０号明細書に記載されている。この刊行物では、式：Ｒ１−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｌｅｕ／Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ／Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｒ２［式中、Ｒ１は、（Ｈ）、Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／ＭｅｔＭｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、またはブタ、イヌ、もしくはヒトＢＮＰの天然上流配列の１０から１０９個のアミノ酸、またはその合成物から成る群から選択され、Ｒ２は、（ＯＨ）、ＮＨ２、またはＮＲ’Ｒ”であり、ここでＲ’およびＲ”は独立して低アルキルであり（この場合、１−４Ｃ）、もしくはＡｓｎ／Ｌｙｓ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｔｙｒ／Ｈｉｓであり、または、式がＲ１−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−  Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｒ２であり、かつＲ１がＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−であり、Ｒ２がＡｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒではありえないという条件で、そのアミドである（ＮＨ２またはＮＲ’Ｒ”）］のナトリウム利尿活性を有するペプチドが記載されている。
【００６８】
さらに別の一連の類似体が、１９９７年１１月２６日に発行された、Ｓｃｉｏｓ、欧州特許第０５４２８６３Ｂ１号明細書に記載されているが、ここではＮ末端〜Ｃ末端を含んで成る融合タンパク質が記載されている。すなわち、Ｓｔａｐｈ  Ｖ８開裂部位としてＧｌｕ残基またはＡｓｐ−Ｇｌｙ配列を含有することがない約１０〜約５０ｋＤａの担体タンパク質、前記担体のＣ末端に位置したＧｌｕ残基またはＡｓｐ−Ｇｌｙ配列を含んで成るＳｔａｐｈ  Ｖ８開裂、および、および前記開裂部位に融合されたＳｔａｐｈ  Ｖ８開裂部位を含有しないペプチドを含んで成り、ここで前記融合タンパク質は約８．０もしくはそれ以上のｐＩを示す。この特許では６〜２０個のアミノ酸のＮ末端リーダーの使用も記載されている。
【００６９】
本発明における使用に適切な他のナトリウム利尿ペプチド類似体が、２００２年７月４日に刊行されたダイイチ（Ｄａｉｉｃｈｉ）の米国特許出願公開第２００２００８６８４３号明細書（その全体の開示は参照により本明細書で援用される）に記載されているが、ここでは生理学的に活性のポリペプチドＸ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ＯＨ［ここで２つのシステインが架橋されている］が記載されており、ここでＸはＨ、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、またはＨ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−である。
【００７０】
かかる置換を行うにおいて、アミノ酸の水治療指標が考慮されうる。ポリペプチドに対して相互生物機能を与えることにおける水治療アミノ酸指標の重要性は、一般に当業界で理解されている。アミノ酸の相対的水治療特徴が結果として生じるポリペプチドの二次構造に貢献し、次いで他の分子を有するタンパク質の相互作用を規定することが認められている。各々のアミノ酸は、その疎水性および荷電特性に基づき以下の通り水治療指標が割り当てられている。すなわち、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸塩（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸塩（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、Ｌｙｓ（−３．９）、およびＡｒｇ（−４．５）。当業者によって理解されるように、特定のアミノ酸が同様の水治療指標を有する他のアミノ酸によって置換され、さらに結果として同様の生物活性を有するポリペプチドが生じ、すなわち、さらに生物学的に機能上同等のポリペプチドが獲得されうる。かかる変更を行うにおいて、その水治療指標が互いの±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、互いの±１内であるものが特に好ましく、互いの±０．５内であるものがさらに特に好ましい。
【００７１】
当業界では、同様のアミノ酸の置換が親水性に基づき有効に行われるうることも理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号明細書は、その開示が本明細書でその全体が援用され、その隣接したアミノ酸の親水性によって抑制されるタンパク質の最大の局所平均親水性が、そのタンパク質の生物特性と相関することを提供する。米国特許第４，５５４，１０１号明細書に詳述されているように、以下の親水性の値がアミノ酸残基に割り当てられている。すなわち、Ａｒｇ（＋３．０）、Ｌｙｓ（±３．０）、アスパラギン酸塩（±３．０±１）、グルタミン酸塩（±３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。当業者によって理解されるように、アミノ酸は同様の親水性の値を有するもう１つに置換され、さらに生物学的同等物、特に免疫学的に同等のポリペプチドを得ることができる。かかる変更において、その親水性の値が互いの±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、互いの±１内のものが特に好ましく、かつ互いの±０．５内のものがさらに特に好ましい。
【００７２】
上記の概略のように、アミノ酸置換／挿入は、アミノ酸側鎖置換の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、荷電、サイズなどに基づきうる。さまざまな上記の特性を考慮に入れる例示的な置換（すなわち、ポリペプチドの生物活性を大きく変化させることなく交換されうるアミノ酸）が当業者には公知であり、例えばＡｒｇおよびＬｙｓ、グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩、セリンおよびトレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、およびバリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。
【００７３】
当業者によって理解されるように、ナトリウム利尿ペプチド（例えば、ＢＮＰ）類似体は、伝統的な（溶液）方法、固相方法、半合成方法、および組換えＤＮＡ方法を含むがこれらに限定されないさまざまな認定されたペプチド合成方法によって調製されうる。
【００７４】
８．１．３  マルチＢＮＰペプチド
ナトリウム利尿化合物は、配列において２つもしくはそれ以上のナトリウム利尿化合物単位を有し、場合により、ナトリウム利尿化合物単位間にスペーサー配列を含むマルチペプチドでもありうる。この化合物は、場合により、ナトリウム利尿ペプチド化合物の一方または両方の端でリーダーおよび／または伸長配列をも含んで成りうる。例えば、限定ではなく一例として、かつ各々のマルチペプチドの構造および／または式を限定することなく、以下の構造を有し得る。すなわち、
ＮＰ−［ＮＰ］ｎ、
ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］ｎ、
リーダー−ＮＰ−［ＮＰ］ｎ、
リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］ｎ、
リーダー−［スペーサー−ＮＰ］ｎ、
リーダー−［スペーサー−ＮＰ］ｎ−伸長、
リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］ｎ−伸長、
式中
ｎは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０でありうる、
ＮＰはナトリウム利尿化合物ペプチドまたはナトリウム利尿ペプチド類似体であり、
スペーサーはアミノ酸残基、または酵素もしくは酵素カクテルによって開裂される一連のアミノ酸残基、好ましくは、ＮＰに存在しないアミノ酸のアミノ酸残基または配列（例えば、Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ、Ａｒｇ−Ｔｈｒ、Ａｒｇ−Ｉｌｅ）でありうる。
【００７５】
リーダーは、例えば、単一アミノ酸、アミノ酸配列、ペプチド（例えば、リーダーペプチドまたは単一ペプチド）、またはタンパク質でありうるとともに、リーダーはＮ末端を複合から遮断するように選択され、マルチペプチド（例えば、酵素カクテルによって開裂可能な（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−：Ｖ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）、（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−または（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ［式中、Ｘはアミノ酸でありうる］またはフリン（Ｆｕｒｉｎ）によって開裂可能な（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−、ウロキナーゼによって開裂可能な（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−、エンテロキナーゼによって開裂可能な（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓまたは（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−、ファクターＸａまたはファクター１０ａによって開裂可能な（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒまたは（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−）の精製を補助し、可溶性を改善し、かつ／または細胞からの分泌（例えば、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）、および／または精製（例えば、（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）を補助し、リーダーは、好ましくは、酵素または化学的開裂によって、好ましくは、ＮＰを開裂しない酵素によってマルチペプチドから開裂可能であり、リーダーは天然ＮＰからのリーダーペプチドでありうる。
【００７６】
伸長は、例えば、単一アミノ酸、アミノ酸配列、ペプチド（例えば、リーダーペプチドまたは単一ペプチド）、またはタンパク質でありうるとともに、伸長はＣ末端を複合から遮断するように選択され、マルチペプチド（例えば、（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）の精製を補助し、可溶性を改善し、かつ／または細胞からの分泌（例えば、酵素カクテルによって開裂可能なＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−：Ｖ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）およびエンドプロテイナーゼ（Ａｓｐ−Ｎ）、Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−またはＡｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ［式中、Ｘは任意のアミノ酸でありうる］またはフリン（Ｆｕｒｉｎ）によって開裂可能なＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−、酵素カクテルウロキナーゼおよびカルボキシペプチダーゼＢによって開裂可能なＡｒｇ−Ｖａｌ−、エンテロキナーゼによって開裂可能なＡｓｐ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｉｌｅ−、ファクターＸａまたはファクター１０ａによって開裂可能なＡｒｇ−ＴｈｒまたはＡｒｇ−Ｉｌｅ−）を補助し、伸長は、好ましくは、酵素または化学的開裂によって、好ましくは、ＮＰを開裂しない酵素によってマルチペプチドから開裂可能である。
【００７７】
スペーサーに含まれ、またはＮＰからリーダーおよび／または伸長を分離するような酵素開裂部位は、好ましくは、単一酵素または酵素カクテルが開裂部位のすべてを開裂するように選択される。例えば、開裂部位Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇはフリン（Ｆｕｒｉｎ）によって開裂されうる。
【００７８】
一の実施形態において、リーダーは（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、スペーサーは  ＧｌｕＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕである。この実施形態はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）によって開裂されうる。結果として生じる生成物はＮＰ−ＧｌｕまたはＮＰ−Ｇｌｕ複合体である。
【００７９】
別の実施形態において、リーダーは（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−（−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）（式中、Ｘはアミノ酸である）であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−（−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）（式中、Ｘはアミノ酸である）であり、かつスペーサーはＡｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（式中、Ｘはアミノ酸である）である。この実施形態はフリン（Ｆｕｒｉｎ）によって開裂されうる。結果として生じる生成物はＮＰまたはＮＰ複合体である。
【００８０】
別の実施形態において、リーダーは（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌであり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌであり、スペーサーはＡｒｇ−Ｖａｌである。この実施形態はウロキナーゼ／カルボキシペプチダーゼＢカクテルによって開裂されうる。結果として生じる生成物はＮＰまたはＮＰ複合体である。
【００８１】
別の実施形態において、リーダーは（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−（−Ａｓｐ−Ｌｙｓまたは−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ）であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−（−Ａｓｐ−Ｌｙｓまたは−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ）であり、スペーサーはＡｓｐ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｉｌｅ）である。この実施形態はエンテロキナーゼによって開裂されうる。結果として生じる生成物はＮＰまたはＮＰ複合体である。
【００８２】
別の実施形態において、リーダーは（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−（−Ａｒｇ−Ｔｈｒまたは−Ａｒｇ−Ｉｌｅ）であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−（−Ａｒｇ−Ｔｈｒまたは−Ａｒｇ−Ｉｌｅ）であり、スペーサーはＡｒｇ−ＴｈｒまたはＡｒｇ−Ｉｌｅである。この実施形態はファクターＸａまたはファクター１０ａ／カルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルによって開裂されうる。結果として生じる生成物はＮＰまたはＮＰ複合体である。
【００８３】
別の実施形態において、スペーサーはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、リーダーはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇである。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体は、管理条件下にトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルを使用して放出されうる。
【００８４】
別の実施形態において、スペーサーはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり、リーダーはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり、伸長は（Ｈｉｓ）６−ＡＡＡ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり、式中、ＡＡＡは長さが３〜４０個、好ましくは、３−１５個のアミノ酸残基からのアミノ酸配列である。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体は、管理条件下にトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルを使用して放出されうる。
【００８５】
別の実施形態において、スペーサーはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、リーダーはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇである。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はトロンビンおよびカルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルを使用して放出されうる。
【００８６】
別の実施形態において、スペーサーはＡｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、リーダーはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇである。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はトロンビンおよびカルボキシペプチダーゼＡ酵素カクテルを使用して放出されうる。
【００８７】
別の実施形態において、スペーサーはＭｅｔ−Ｍｅｔであり、リーダーはＭｅｔ−Ｍｅｔであり、伸長は（Ｈｉｓ）６−ＡＡＡ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔであり、式中、ＡＡＡは長さが３〜４０個のアミノ酸残基からの任意のアミノ酸配列である。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＣＮＢｒを使用して放出されうる。
【００８８】
別の実施形態において、スペーサーはＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、リーダーはＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕである。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）およびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎカクテルを使用して放出されうる。
【００８９】
別の実施形態において、スペーサーＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、リーダーはＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕである。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）によって放出され、ＮＰ−Ｇｌｕ、ＮＰ  Ｇｌｕの新規ＮＰ類似体、または複合体を得ることができる。
【００９０】
別の実施形態において、スペーサーはＧｌｕ−Ｇｌｕであり、リーダーはＣ末端でＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａであり、伸長はＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（Ｈｉｓ）６−Ｇｌｕであり、Ｃ末端は融合パートナーである、適切な融合タンパク質と結合され、これは、例えば、エンテロキナーゼによって開裂可能でありうる。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）によって放出され、ＮＰ−Ｇｌｕ、ＮＰ  Ｇｌｕの新規ＮＰ類似体または複合体を得ることができる。
【００９１】
別の実施形態において、スペーサーはＧｌｕ−Ｇｌｕであり、リーダーはＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、および伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、式中、Ｎ末端は融合パートナーである、適切な融合タンパク質と結合され、これは、例えば、エンテロキナーゼによって開裂可能でありうる。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）によって放出され、ＮＰ−Ｇｌｕ、ＮＰ  Ｇｌｕの新規ＮＰ類似体または複合体を得ることができる。
【００９２】
別の実施形態において、スペーサーはＧｌｕ−Ｇｌｕであり、リーダーはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕであり、伸長はＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕであり、Ｃ末端は融合パートナーである、適切な融合タンパク質と結合されている。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）によって放出され、ＮＰ−Ｇｌｕ、ＮＰ  Ｇｌｕの新規ＮＰ類似体または複合体を得ることができる。
【００９３】
別の実施形態において、スペーサーはＧｌｕ−Ｇｌｕであり、リーダーはＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、伸長はＧｌｕ−（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、式中、Ｎ末端は融合パートナーである、適切な融合タンパク質と結合されている。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）によって放出され、ＮＰ−Ｇｌｕ、ＮＰ  Ｇｌｕの新規ＮＰ類似体または複合体を得ることができる。
【００９４】
８．２  修飾部分
修飾部分は、ＢＮＰペプチド化合物など、ナトリウム利尿化合物を修飾する部分であり、本明細書に記載されているように所望の特性を有する化合物を提供する。例えば、修飾部分は、（ＧＩ管、および／または血流など）さまざまな環境下にナトリウム利尿化合物の分解速度を削減しうるため、ナトリウム利尿化合物が修飾形態では、かかる環境下、修飾部分の非存在下に分解されるほどには分解されない。好ましい修飾部分は、ナトリウム利尿化合物複合体が、親ナトリウム利尿化合物の生物活性の治療上重要な割合を保持することを可能にするものである。
【００９５】
８．２．１  安定性、可溶性、および／または生物活性をもたらす部分
ナトリウム利尿化合物と付着され、親ナトリウム利尿化合物の安定性、可溶性、および／または生物活性を修飾する本明細書に記載されたナトリウム利尿化合物複合体を形成しうる多数の部分がある。例としては、親水性ポリマーまたはオリゴマー、両親媒性ポリマーまたはオリゴマー、および脂溶性ポリマーまたはオリゴマーが挙げられる。
【００９６】
ポリマー（または短鎖オリゴマー）はその骨格において弱いまたは分解性の連鎖を含みうる。例えば、ポリアルキレングリコールは、加水分解の影響を受けやすいラクチド、グリコール、炭酸塩、エステル、カルバメートなど、加水分解に不安定な連鎖を含みうる。これはポリマーが低分子量の断片へ開裂されることを可能にする。かかるポリマーの例が、例えば、ハッベル（Ｈｕｂｂｅｌｌ）らの米国特許第６，１５３，２１１号明細書に記載されている。
【００９７】
典型的な親水性、両親媒性、および脂溶性ポリマーおよびオリゴマーが以下により詳しく記載されている。
【００９８】
８．２．２  親水性部分
親水性部分は、ポリアルキレングリコール部分、他の親水性ポリマー、糖部分、ポリソルベート部分、およびその組合せを含むがこれらに限定されない当業者によって理解されるさまざまな親水性部分でありうる。
【００９９】
８．２．２．１  ポリアルキレングリコール部分
ポリアルキレングリコールは、繰返しアルキレングリコール単位を有する化合物である。一部の実施形態において、単位はすべて同一である（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール）。他の実施形態において、アルキレン単位は異なる（例えば、ポリエチレン−コ−プロピレングリコール、またはＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））。ポリマーはランダムコポリマー（例えば、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドが共重合化されている場合）、もしくは分岐鎖またはグラフトコポリマーである。
【０１００】
ポリエチレングリコール、すなわちＰＥＧは、好ましいポリアルキレングリコールであり、きわめて望ましい特性を有し、食品医薬品局によって一般に安全とみなされている（ＧＲＡＳ）ため生物用途において有用である。ＰＥＧは式−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−［式中、ｎは約２〜約４０００もしくはそれ以上でありうる］を有する。ＰＥＧは通常、無色、無臭、水溶性または水混和性（分子量による）、熱安定性、化学的に不活性、加水分解に安定性、および一般に非毒性である。ＰＥＧは生体適合性でもあり、通常、体内において免疫反応を引き起こすことはない。本発明の好ましいＰＥＧ部分は、優先の増加する順に示されている以下の範囲から選択される多くのＰＥＧサブユニットを含む。すなわち、２−５０、２−４０、２−３０、２−２５、２−２０、２−１５、２−１０。特定の実施形態において、修飾部分は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のサブユニットを含む。
【０１０１】
ＰＥＧは単分散され（例えば、いずれも２００１年６月４日に出願され、その全体の開示が参照により本明細書で援用される、米国特許出願第０９／８７３，７３１号明細書および同第０９／８７３，７９７号明細書において出願人によって以前に記載されている通り）または一般的に市場で供給されているように多分散されうる。単分散によって、ポリアルキレングリコールが単一の分子量、もしくは比較的狭い範囲の分子量を有しうることが意味される。比較的低い分子量の単分散ポリマーを使用する１つの利点は、それらが容易に明確な複合体分子を形成する点であり、これにより再現可能な合成およびＦＤＡの認可が促進されうる。
【０１０２】
ＰＥＧは、（ナトリウム利尿化合物の残りの部分に複合される前に）各々の末端でヒドロキシル基を有する直鎖ポリマーでありうる。ＰＥＧは、メトキシ−ＰＥＧ（またはｍＰＥＧ）など、アルコキシＰＥＧでもありうるが、ここで一方の末端は比較的不活性のアルコキシ基であると同時に、他方の末端は（ナトリウム利尿化合物と結合されている）ヒドロキシル基である。ＰＥＧは分岐鎖でもありうるが、これは、一の実施形態において、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとして表すことができ、ここでＲは、ペンタエリトリトールまたはグリセロールなどの中心（通常は多価）コア薬剤を表し、ｍは腕の数を表す。各々の分岐は異なり、例えば、エーテルおよび／またはエステルで終わりうる。腕の数ｍは３〜１００以上であり、かつ１つもしくはそれ以上の末端ヒドロキシル基がナトリウム利尿化合物の残りの部分に結合され、または別の方法で化学修飾にかけられる。他の分岐鎖ＰＥＧは、式（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ）ｐＲ−Ｚ［式中ｐ＝２または３であり、ＲはＬｙｓまたはグリセロールなどの中心コアを表し、Ｚはいつでも化学活性化にかけられるカルボキシルなどの基を表す］によって表されるものを含む。さらに別の分岐鎖形態、ペンダントＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の端ではなく、またはこれに加えてＰＥＧ骨格に沿ったカルボキシルなどの反応基を有する。分岐したＰＥＧは、分岐鎖ＰＥＧの別の形態である式ＰＥＧ（−ＬＣＨＸ２）ｎ［式中、Ｌは連結基であり、Ｘは活性化末端基である］によって表されうる。ポリエチレングリコールすなわちＰＥＧという語は、直鎖または分岐鎖ＰＥＧのすべての形態を表し、またはこれらを含み、ポリアルカレングリコール、すなわちＰＥＧは直鎖または分岐鎖ＰＥＧのすべての形態を含む。
【０１０３】
８．２．２．２  糖部分
本明細書に記載されたナトリウム利尿化合物は、当業者によって周知のような糖部分を含みうる。一般に、糖部分は少なくとも１つのショ糖群の炭水化物生成物である。典型的な糖部分としては、グリセロール部分、モノ、ジ、トリ、およびオリゴ糖、およびでんぷん、グリコーゲン、セルロース、および多糖類粘剤など多糖類が挙げられるがこれらに限定されない。特定の単糖類としては、グルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、およびセドヘプツロースなどＣ６以上（好ましくはＣ６〜Ｃ８）の糖が挙げられ、二および三糖類としては、スクロース、セルビオース、マルトース、ラクトース、およびラフィノースなど２個もしくは３個の単糖単位（好ましくはＣ５〜Ｃ８）を有する部分が挙げられる。糖部分を含む修飾部分の例は以下の通りである。
【化１】
2008500375.tif 000004
【０１０４】
糖部分を使用する複合は、米国特許第５，６８１，８１１号明細書、同第５，４３８，０４０号明細書、および同第５，３５９，０３０号明細書に記載されているが、その全体の開示は参照により本明細書で援用される。
【０１０５】
８．２．２．３  ポリソルベート部分
ポリソルベート部分は、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンで誘導されたポリソルベートを含むがこれらに限定されない、当業者によって理解されるさまざまなポリソルベート部分でありうる。ポリソルベート部分を使用する複合は、米国特許第５，６８１，８１１号明細書、同第５，４３８，０４０号明細書、および同第５，３５９，０３０号明細書に記載されているが、その全体の開示は参照により本明細書で援用される。
【０１０６】
８．２．２．４  生体適合性水溶性ポリカチオン性部分
一部の実施形態において、生体適合性水溶性ポリカチオン性ポリマーが使用されうる。生体適合性水溶性ポリカチオン性ポリマーとしては、例えば、ペンダント基として付着したプロトン化複素環を有するポリマーが挙げられる。「水溶性」は、全体のポリマーが、緩衝食塩水、または共溶媒として少量の添加有機溶媒を有する緩衝食塩水など水溶液中、２０〜３７℃の温度で可溶性であることを意味する。一部の実施形態において、ポリマー自体は水溶液中で本質的に十分に可溶性ではないが、ＰＥＧ鎖など水溶性ポリマーによるグラフトによって溶液に至らされる。例としては、ポリ（Ｄ−Ｌｙｓ）、ポリ（オルニチン）、ポリ（Ａｒｇ）、およびポリ（ヒスチジン）、およびポリ（Ｎ，Ｎ，Ｎ−塩化トリメチルアミノアクリレート）、ポリ（メタクリルアミドプロピルトリメチル塩化アンモニウム）、および天然またはキトサンなど合成多糖類など四級アミンのポリ（アミノスチレン）、ポリ（アミノアクリレート）、ポリ（Ｎ−メチルアミノアクリレート）、ポリ（Ｎ−エチルアミノアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアクリレート）、ポリ（アミノメタクリレート）、ポリ（Ｎ−メチルアミノ−メタクリレート）、ポリ（Ｎ−エチルアミノメタクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメタクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノメタクリレート）、ポリ（エチレンイミン）、ポリマーなど非ペプチドポリアミンを含む天然または合成アミノ酸またはアミノ酸の混合物のポリ−Ｌ−Ｌｙｓおよび他のプラスに帯電したポリアミン酸などポリマー骨格またはポリマー側鎖のいずれかでアミン基を有するポリアミンが挙げられる。
【０１０７】
８．２．２．５  他の親水性部分
他の親水性ポリマーも使用されうる。例としては、ポリ（オキシエチル化グリセロール）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）、およびポリ（オキシエチル化グルコース）などのポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（ビニルアルコール）（「ＰＶＡ」） 、デキストラン、炭水化物を基材としたポリマーなどが挙げられる。ポリマーはホモポリマーもしくはランダムまたはブロックコポリマー、および上記ポリマー、直鎖または分岐鎖のモノマーに基づくターポリマーでありうる。
【０１０８】
適切な追加のポリマーの特定の例としては、ポリ（オキサゾリン）、二官能性ポリ（アクリロイルモルホリン）（「ＰＡｃＭ」）、およびポリ（ビニルピロリドン）（「ＰＶＰ」）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＶＰおよびポリ（オキサゾリン）は当業界で公知のポリマーであり、それらの調製は当業者に容易に明らかなはずである。ＰＡｃＭおよびその合成と使用は米国特許第５，６２９，３８４号明細書および同第５，６３１，３２２号明細書に記載されており、その開示はその全体が参照により本明細書で援用される。
【０１０９】
８．２．３  生体接着性ポリアニオン部分
特定の親水性ポリマーは、潜在的に有用な生体接着性特性を有するように思われる。かかるポリマーの例は、例えば、マチオビッツ（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ）らの米国特許第６，１９７，３４６号明細書に見られる。カルボキシル基を含有するポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸））は生体接着性特性を示し、かつ本明細書に記載されたナトリウム利尿化合物で容易に複合される。ポリ（ラクチド−コ−グリコール）、ポリ無水物およびポリオルトエステルなど分解時にカルボン酸基を露呈する迅速生体内分解性ポリマーも生体接着性ポリマーである。これらのポリマーは、ナトリウム利尿化合物を胃腸管へ送達するために使用されうる。ポリマーが分解すると、それらはカルボン酸基を露呈し、それらが胃腸管に強く接着することを可能にし、ナトリウム利尿化合物複合体の送達を補助しうる。
【０１１０】
８．２．４  脂溶性部分
一の実施形態において、修飾部分は脂溶性部分を含んで成る。脂溶性部分は、アルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分、アリール部分、アリールアルキル部分、アルキルアリール部分、脂肪酸部分、アダマンタンチル、およびコレステリルのほか、脂溶性ポリマーおよび／またはオリゴマーを含むがこれらに限定されない、当業者によって理解されるさまざまな脂溶性部分でありうる。
【０１１１】
アルキル部分は、飽和または不飽和、直鎖、分岐鎖、または環状炭化水素鎖である。一部の実施形態において、アルキル部分は少なくとも１、２、３個、もしくはそれ以上の炭素原子を有する。他の実施形態において、アルキル部分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個の炭素原子を有する直鎖、飽和または不飽和アルキル部分である。例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、およびエイコシルなど飽和、直鎖アルキル部分、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルなど飽和、分岐鎖アルキル部分、およびビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがこれらに限定されない上記飽和アルキル部分由来の不飽和アルキル部分が挙げられる。他の実施形態において、アルキル部分は低アルキル部分である。さらに他の実施形態において、アルキル部分はＣ１〜Ｃ３低アルキル部分である。一の実施形態において、修飾部分は具体的にアルキル部分で構成されることはなく、または具体的に低アルキル部分で構成されることはなく、または具体的にアルカン部分で構成されることはなく、または低アルカン部分で構成されることはない。
【０１１２】
アルキル基は、非置換の場合、または１つもしくはそれ以上の置換基で置換されている場合があり、かかる置換基は、好ましくは、複合体の合成の方法に干渉すること、または複合体の生物活性を除去することはない。潜在的に干渉性の官能性は、官能性を非干渉性にするために保護基で適切に遮断されうる。各々の置換基は、場合により、追加の非干渉性置換基で置換されうる。「非干渉性」という語は、本発明の方法に従って実行される反応に有害な影響を及ぼさない置換基を特徴づける。
【０１１３】
脂肪酸部分は、天然または合成、飽和または不飽和、直鎖または分岐鎖脂肪酸部分を含むさまざまな脂肪酸部分でありうる。一の実施形態において、脂肪酸部分は、少なくとも２、３、４個もしくはそれ以上の炭素原子を有する。他の実施形態において、脂肪酸部分は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の炭素原子を有する。
【０１１４】
修飾部分がアリール環である場合、環は、分子内でカルバメート部分と反応し、その加水分解を補助しうるように配置されている求核官能基（ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨＲ’）で官能化されうる。一の実施形態において、求核基は、加水分解され、またはその他の方法でインビボで分解される能力がある保護基で保護され、その結果は、保護基が保護されていない場合、複合体の加水分解、かつ結果として生じる親ナトリウム利尿化合物の放出が促進される。
【０１１５】
８．２．５  両親媒性部分
一の実施形態において、修飾部分両親媒性部分を含む。多くのポリマーおよびオリゴマーが両親媒性である。これらはしばしば、親水性および脂溶性部分を含み、直鎖、分岐鎖、またはグラフトポリマー、またはコポリマーなどオリゴマーおよび／またはポリマーの形態でありうる、ブロックコポリマー、分岐鎖コポリマー、またはグラフトコポリマーである。
【０１１６】
記載された親水性ポリマーまたはオリゴマーは、本明細書に記載された脂溶性および親水性部分のいずれかの組合せを含みうる。かかるポリマーまたはオリゴマーは通常、少なくとも１つの反応性官能基、例えば、ハロ、ヒドロキシル、アミン、チオール、スルホン酸、カルボン酸、イソシアネート、エポキシ、エステルなどを含み、これらはしばしばポリマーの末端にある。これらの反応性官能基は、脂溶性直鎖または分岐鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキルまたはアルキルアリール基、もしくは脂溶性ポリマーまたはオリゴマーを付着し、それによって親水性ポリマーまたはオリゴマーの脂溶性を増大させる（かつそれによって、それらに一般に両親媒性を与える）ために使用されうる。
【０１１７】
脂溶性基は、例えば、モノまたはジカルボン酸に由来し、または必要に応じて、無水物または酸塩化物などカルボン酸の反応性同等物に由来しうる。脂溶性基の適切な前駆体の例は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、イソ酪酸、トリメチル酢酸、カプロン酸、カプリル酸、ヘプタン酸、カプリン酸、ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セラチン（ｃｅｒａｔｉｃ）酸、モンタノ酸、イソステアリン酸、イソノナン酸、２−エチルヘキサン酸、オレイン酸、リシノール酸、リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、ダイズ脂肪酸、リンシード脂肪酸、脱水ヒマシ脂肪酸、トール油脂肪酸、キリ油脂肪酸、ヒマワリ脂肪酸、サフラワー脂肪酸、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸無水物、オルトフタル無水物、テレフタル酸、イソフタル酸、アジピン酸、アゼライン酸、セバシン酸、テトラヒドロフタル無水物、ヘキサヒドロフタル無水物、コハク酸、およびポリオレフィンカルボン酸である。
【０１１８】
末端脂溶性基は同等である必要はなく、すなわち、結果として生じるコポリマーは、同一または異なる末端脂溶性基を含みうる。脂溶性基は、１つもしくはそれ以上の一または二官能性アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキル、または上記のアルキルアリール基に由来しうる。
【０１１９】
８．２．５．１  ＰＥＧ／アルキル修飾部分
修飾部分は、１つもしくはそれ以上の直鎖または分岐鎖ポリアルキレングリコール部分および／または１つもしくはそれ以上の直鎖または分岐、置換または非置換アルキル部分を含む直鎖または分岐鎖ポリマー部分でありうる。しかし、特定の実施形態において、修飾部分は具体的にアルキル部分で構成されることはなく、他の実施形態において、修飾部分は具体的にアルカン部分から構成されることはない。一部の実施形態におけるポリアルキレングリコール部分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のＰＡＧサブユニット、好ましくはＰＥＧもしくはＰＰＧサブユニットまたはその組合せを含む。アルキル部分は、飽和または不飽和であり、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の炭素原子である。アルキル部分は、好ましくは、アルカン部分である。
【０１２０】
修飾部分は、例えば、式
【化２】
2008500375.tif 000005
【０１２１】
［式中、各々のＣは、独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル部分であり、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり、各々のＰＡＧは、独立して選択され、ｎ個のサブユニットを有するポリアルキレングリコール部分であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５であり、各々のＸは、独立して選択され、ＰＡＧをＣに結合する架橋部分であり、好ましくは−Ｃ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。一の実施形態において、Ｃｍ−Ｘ部分はなく、ＰＡＧｎ部分は、−ＯＨ部分または−ＯＣＨ３部分などキャッピング基で終わる。例えば、ＰＡＧはメトキシ終端またはヒドロキシ終端ＰＥＧであり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のＰＥＧサブユニットを有しうる。］を有しうる。
【０１２２】
好ましい実施形態において、修飾部分は、式
【化３】
2008500375.tif 000006
【０１２３】
［Ｃ、ｍ、Ｘ、およびｎは、式１で上記されている通りである。好ましくは、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。Ｘは、好ましくは、０であり、ｍは、好ましくは、１である。］を有しうる。
【０１２４】
別の好ましい実施形態において、修飾部分は、式
【化４】
2008500375.tif 000007
【０１２５】
［式中、ｎは式１で上記されている通りである。好ましくは、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。］を有する。
【０１２６】
別の態様において、修飾部分は、式
【化５】
2008500375.tif 000008
【０１２７】
［式中、ＰＡＧはｎ個のサブユニットを有するポリアルキレングリコール部分であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５であり、Ｘは−Ｏ−、または−ＮＨ−であり、各々ｏは、独立して選択され、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。］を有しうる。
【０１２８】
別の態様において、修飾部分は、式
【化６】
2008500375.tif 000009
【０１２９】
［式中、各々のＣは、独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル部分であり、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり、各々のＰＡＧは、独立して選択され、ｎ個のサブユニットを有するポリアルキレングリコール部分であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５であり、各々のＸは、独立して選択され、ＰＡＧをＣに結合する架橋部分であり、好ましくは−Ｃ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であり、ｏは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
【０１３０】
Ｃｍ−Ｘ部分はない場合もあり、ＰＡＧｎ部分は、−ＯＨ部分または−ＯＣＨ３部分で終わる。例えば、ＰＡＧはメトキシ終端またはヒドロキシ終端ＰＥＧであり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のサブユニットを有しうる。］を有しうる。
【０１３１】
別の態様において、修飾部分は、式
【化７】
2008500375.tif 000010
【０１３２】
［式中、各々Ｃは独立して選択され、ｍ個の炭素を有する飽和または不飽和アルキル部分であり、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり、各々のＰＡＧは独立して選択され、ｎ個のサブユニットを有するポリアルキレングリコール部分であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５であり、各々のＸは独立して選択され、ＰＡＧをＣに結合する架橋部分であり、好ましくは−Ｃ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。］を有しうる。
【０１３３】
式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶのオリゴマーはそれ自体、本発明の態様であることが理解されるであろう。オリゴマーは、例えば、第一級アルコールまたは活性化オリゴマーとして提供されうる（例えば、８．７．１の項を参照）とともに、インスリン、カルシトニン、インターフェロン、成長ホルモン等などＢＮＰ以外の生物活性化合物を複合するために使用されうる。
【０１３４】
別の態様において、修飾部分は、式
【化８】
2008500375.tif 000011
【０１３５】
［式中、各々のＲは、独立して選択され、上式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのいずれかである。］を有しうる。
【０１３６】
具体的に好ましい実施形態において、修飾部分は以下の式
【化９】
2008500375.tif 000012
【化１０】
2008500375.tif 000013
【０１３７】
（この最後の修飾部分は、モノ複合体としてヒトＢＮＰのＬｙｓ３と結合され、結果として生じる部分はＢＮ−０５４と呼ばれる）から選択される。
【０１３８】
好ましい実施形態において、修飾部分は、式
【化１１】
2008500375.tif 000014
【０１３９】
［式中、Ｃ、ｍ、Ｘ、およびｎは式Ｉで上記されている通りである。］を有する。
【０１４０】
別の好ましい実施形態において、修飾部分は、式
【化１２】
2008500375.tif 000015
【０１４１】
［式中、ｎは式Ｉで上記されている通りである。］を有する。
【０１４２】
複合体の親水性／脂溶性など薬学的特性は、ＰＥＧモノマーの数、アルキル鎖のタイプおよび長さ、ＰＥＧペプチド連鎖の性質、および複合部位の数を調節することによって変動されうる。ＰＥＧペプチド連鎖の正確な性質は、それが生理学的ｐＨまたは血漿中での加水分解に対して安定および／または感受性であるように変動されうる。
【０１４３】
８．２．６  塩形成部分
一の実施形態において、修飾部分は塩形成部分を含む。塩形成部分は、カルボン酸塩およびアンモニウムを含むがこれらに限定されない、当業者によって理解されるさまざまな適切な塩形成部分でありうる。修飾部分が塩形成部分を含む一部の実施形態において、ナトリウム利尿化合物複合体は塩の形態で提供される。この実施形態において、ナトリウム利尿化合物複合体は、クロロ、ブロモ、ヨード、リン酸、酢酸、炭酸、硫酸、トシレート、およびメシラートなどの陰イオン、またはナトリウム、カリウム、カルシウム、リチウム、およびアンモニムなどの陽イオンを含むがこれらに限定されない、当業者によって理解される適切な薬学的に許容される対イオンと関連している。
【０１４４】
修飾部分は、親水性部分、脂溶性部分、両親媒性部分、塩形成部分、およびその組合せを含みうる。好ましい実施形態において、修飾部分は、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ３［式中、ｐは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である］、（ＣＨ２）ｑＣＨ３［式中、ｑは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である］、ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒＯＨ［式中ｒは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である］、Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３、ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）２、Ｃ（ＣＨ３）３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｔＣＨ３［式中、ｓは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０であり、ｔは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である］、および（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｚＣＨ３［式中、ｙは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０であり、ｚは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である］から成る群から選択される。
【０１４５】
特定の目的の修飾部分の上記の例は、本発明の例示として意図されており、決して限定とみなすべきではない。当業者は、特定の官能性を達成する複合の適切な部分が、本明細書で開示され、請求された化学複合機序の結合内で可能であることを理解するであろう。したがって、添加部分は、本明細書で開示された本発明の原理に従って選択され、使用されうる。
【０１４６】
８．３  複合法
本発明のナトリウム利尿化合物複合体は、対応する非複合ナトリウム利尿化合物複合体に対して異なるレベルの生物活性を有しうる。一部の実施形態において、ナトリウム利尿化合物は、非修飾形態の活性の一部もしくは全部を保持するが、修飾部分との複合の程度などの因子によって、分子上の複合部位の選択および修飾部分の選択は、インビボ分解の影響を受けやすくなく、したがって、血漿半減期の増加を示す。例えば、本発明のナトリウム利尿化合物は、その修飾部分の関連性を促進するために適した適切な付着（すなわち、修飾部分複合）部位においてナトリウム利尿化合物構造での１、２、３、４、５、もしくはそれ以上の部位で修飾部分を含むように修飾されうる。一例として、かかる適切な複合部位は、Ｌｙｓアミノ酸残基などアミノ酸残基を含む。
【０１４７】
多くの実施形態において、例えば、生物活性剤は、部分的に、受容体における活性部位との結合によって機能する。しばしば、アミノ酸残基などの官能基が修飾されると、薬剤はもはや活性部位において結合しない。例えば、ＢＮＰの場合、ペプチドは結合ＮＰＲ−Ａに対する特定の親和性を有する。ナトリウム利尿分子が修飾基を含むように修飾される部位によって、ＢＮＰが受容体に対して有する親和性は同じである場合があり、または削減されている場合がある。一部の実施形態において、ナトリウム利尿化合物複合体は、天然の非複合ナトリウム利尿化合物複合体よりも低い活性を有するが、タンパク質分解に対する耐性および血漿半減期または細胞膜を横断する能力の増大など非複合ナトリウム利尿化合物複合体に対して改善された特性を保持する。削減された活性が、例えば、ナトリウム利尿化合物の長期の放出が望ましい場合に好ましい場合がある。
【０１４８】
一の実施形態において、ナトリウム利尿化合物複合体はモノ複合体である。他の実施形態において、ナトリウム利尿化合物複合体は、ジ複合体、トリ複合体、テトラ複合体、ペンタ複合体などのマルチ複合体である。ナトリウム利尿化合物での修飾部分の数は、ナトリウム利尿化合物での複合部位の数によってのみ限定される。さらに他の実施形態において、本発明のナトリウム利尿化合物複合体はモノ、ジ、トリ、テトラ、および／またはペンタ修飾部分複合体の混合物である。例えば、一の実施形態において、生物活性ナトリウム利尿化合物はｈＢＮＰであり、これはその３２個の天然アミノ酸配列内に含まれ、Ｎ末端、Ｌｙｓ３、Ｌｙｓ１４、Ｌｙｓ２７を含む４つの好ましい複合部位を含む。発明者の研究は、ｈＢＮＰおよび関連ナトリウム利尿ペプチドおよび類似体のきわめて好ましい方法として、Ｎ末端、Ｌｙｓ３、Ｌｙｓ１４、Ｌｙｓ２７で複合されるモノ複合体、およびＬｙｓ３／ｌｙｓ１４およびＬｙｓ３／Ｌｙｓ２７でのジ複合体を指摘する。
【０１４９】
修飾部分は、好ましくは、ナトリウム利尿化合物と共有結合される。修飾部分での２つ以上の部分がナトリウム利尿化合物と共有結合されうる。結合では加水分解性もしくは非加水分解性結合またはその２つの混合物（すなわち、異なる複合部位での異なる結合）が使用されうる。
【０１５０】
一の実施形態において、ナトリウム利尿化合物は、加水分解性結合（例えば、エステル、炭酸、またはカルバメート結合）を利用して修飾部分と結合される。加水分解性結合の使用は、プロドラッグとして作用するナトリウム利尿化合物複合体を提供する。プロドラッグ方法は、ナトリウム利尿化合物修飾部分複合体が、修飾部分複合部位がナトリウム利尿化合物の結合領域にある場合など、活性にある（すなわち、複合体がナトリウム利尿化合物の主要な作用機序によって身体に影響を及ぼす能力を欠く）ことが望ましい場合がある。加水分解性結合の使用は、１つもしくはそれ以上の修飾部分がそのそれぞれのナトリウム利尿化合物修飾部分複合体から開裂されると、時限放出性または制御放出性効果、所定の時間にわたってナトリウム利尿化合物を投与するステップをも提供しうる。
【０１５１】
他の実施形態において、ナトリウム利尿化合物は、非加水分解性結合（例えば、カルバメート、アミド、または他の結合）を使用して修飾部分に結合される。非加水分解性結合の使用は、ナトリウム利尿化合物修飾部分複合体が長時間、好ましくは、少なくとも２時間、血流中に循環させることが望ましい場合に好ましい場合がある。ナトリウム利尿化合物を非加水分解性のやり方で修飾部分と共有結合するために使用される結合は通常、共有結合、エステル部分、炭素部分、カルバメート部分、アミド部分、および二次アミン部分から成る群から選択される。
【０１５２】
さらに他の実施形態において、部分的プロドラッグ方法が使用されうるが、ここでは修飾部分の一部が加水分解される。例えば、米国特許第６，３０９，６３３号明細書（その全体の開示は参照により本明細書で援用される）では親水性および脂溶性要素を含んで成る修飾部分が記載されているが、ここでは脂溶性要素がインビボで加水分解し、マイクロペグ化複合体を得る。
【０１５３】
２つ以上の修飾部分（すなわち、複数の修飾部分）はナトリウム利尿化合物と結合されうる。複数の修飾部分は好ましくは同一である。しかし、複数の修飾部分は互いに異なる場合もあり、あるいは、複数の修飾部分の一部は同一であり、一部は異なることがありうると理解される。複数の修飾部分がナトリウム利尿化合物と結合される場合、１つもしくはそれ以上の修飾部分をナトリウム利尿化合物と加水分解性結合で結合し、１つもしくはそれ以上の修飾部分をナトリウム利尿化合物と非加水分解性結合で結合することが好ましい場合がある。あるいは、複数の修飾部分をナトリウム利尿化合物と結合される結合のすべては加水分解性でありうるが、さまざまな程度の加水分解性を有し、例えば、１つもしくはそれ以上の修飾部分が、体内の加水分解によってナトリウム利尿化合物から緩徐に除去されるようになっている。
【０１５４】
修飾部分は、求核ヒドロキシル官能基および／またはアミノ官能基を含むがこれらに限定されないさまざまな求核残基でナトリウム利尿化合物と結合されうる。求核ヒドロキシル官能基は、例えば、セリンおよび／またはチロシン残基で見られ、求核アミノ官能基は、例えば、ヒスチジンおよび／またはＬｙｓ残基、および／またはポリペプチドの１つもしくはそれ以上のＮ末端で見られうる。修飾部分がナトリウム利尿ペプチドのＮ末端と結合される場合、結合は好ましくは二次アミンを形成する。
【０１５５】
８．４  複合体の合成
例示的な合成は以下に記載された実施例において記載されている。反応条件（例えば、選択モル比、溶媒混合物、および／またはｐＨ）は、周知の原理に従って制御されうる。例えば、Ｌｙｓのアミノ官能基での複合は、反応溶液のｐＨをＬｙｓのｐＫａ未満に維持することによって抑制されうる。
【０１５６】
ナトリウム利尿化合物複合体の混合物は、例えば、ＨＰＬＣを使用して分離および単離され、ナトリウム利尿化合物複合体、例えば、モノ、ジ、またはトリ複合体を提供する。特定の単離複合体の複合の程度（例えば、単離分子がモノ、ジ、またはトリ複合体に関係なく）は、質量分析を含むがこれに限定されない当業者によって理解されるさまざまな方法を使用して測定および／または確認されうる。特定の複合体構造（例えば、ｈＢＮＰモノ複合体のＬｙｓ３、Ｌｙｓ１４、Ｌｙｓ２７、またはＮ末端）は、配列分析、ペプチド、マッピング、選択的酵素開裂、および／またはエンドペプチダーゼ開裂を含むがこれらに限定されない、当業者によって理解されるさまざまな方法を使用して測定および／または確認されうる。
【０１５７】
ナトリウム利尿化合物における１つもしくはそれ以上の反応部位が、例えば、ナトリウム利尿化合物をＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、またはＮ−（９−フルオレニルメトロキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）など適切なブロック試薬とナトリウム利尿化合物を反応させることによってブロックされうる。この方法は、例えば、ポリペプチドの１つもしくはそれ以上のＮ末端での修飾部分を有する不飽和ナトリウム利尿化合物複合体（すなわち、すべての求核残基が複合されているわけではない複合体）を形成することが望まれる場合に好ましい場合がある。かかるブロッキングの後、ブロックされたナトリウム利尿化合物の実質的に単分散混合物は活性化修飾部分の実質的に単分散混合物と反応され、１つもしくはそれ以上の求核残基と結合した修飾部分を有し、かつ他の求核残基と結合したブロッキング部分を有するナトリウム利尿化合物複合体の混合物を提供する。複合反応後、ナトリウム利尿化合物修飾部分複合体は、当業者によって理解されるように非ブロック化されうる。必要に応じて、ナトリウム利尿化合物複合体の混合物は、次いで、上記の通り分離され、ナトリウム利尿化合物複合体の混合物を提供しうる。あるいは、ナトリウム利尿化合物修飾部分複合体の混合物はブロック化前に分離されうる。
【０１５８】
意外な本発明の態様において、発明者は、ナトリウム利尿化合物に隣接した（すなわち、ナトリウム利尿化合物とＰＥＧ部分との間に位置した）アルキル部分を有するＰＥＧ−アルキル部分を使用するｈＢＮＰ複合体の合成が結果としてきわめて望ましいＬｙｓ３複合部位で優先的な複合が生じることを発見した。したがって、一の態様において、本発明は、ＰＥＧアルキルオリゴマーのアルキル要素を活性化し、活性化ＰＥＧアルキルオリゴマーをｈＢＮＰと結合するステップを含んで成るＬｙｓ３でｈＢＮＰを優先的に複合する方法を提供する。
【０１５９】
８．５  医薬組成物
本明細書に記載されたナトリウム利尿化合物複合体を含む医薬組成物が調製されうる。かかる組成物は通常、薬学的に許容される担体と組合せた、またはこれと混合した修飾ナトリウム利尿化合物を含む。担体は、もちろん、医薬組成物中の他の生物と適合性であると意味で許容される必要があり、患者に有害であってはならない。担体は固体または液体、または両方であってよく、好ましくは、単位用量製剤、例えば、約０．０１重量％または０．５重量％〜約９５重量％または９９重量％のナトリウム利尿化合物複合体を含有しうる錠剤としてのプロドラッグで形成されうる。医薬組成物は、場合により１つもしくはそれ以上の副成分を含む要素を混合するステップを含むがこれに限定されない製剤の公知の方法のいずれかによって調製されうる。
【０１６０】
本発明の実施形態による医薬組成物はとしては、経口、直腸、経鼻、局所、吸引（例えば、エアロゾルによって）、口腔（例えば、舌下）、経膣、非経口（例えば、皮下、筋内、皮内、関節内、胸膜内、腹腔内、脳内、動脈内、または静脈内）、 局所（すなわち、気道表面を含む皮膚および粘膜表面）および経皮投与に適切なものが挙げられるが、所定の症例における最も適切な経路は、治療される状態の性質および重症度、および使用される特定のプロドラッグの性質に依存する。
【０１６１】
経口投与に適切な医薬組成物は、カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤、または錠剤など個別単位で与えられ、各々が所定量のプロドラッグを、粉末または顆粒として、水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、または油中水もしくは水中油エマルジョンとして含有する。かかる製剤は、プロドラッグおよび適切な担体（上記の１つもしくはそれ以上の副成分を含有しうる）の関連性をもたらすステップを含む製剤の適切な方法によって調製されうる。一般に、本発明の実施形態による医薬組成物は、プロドラッグを液体もしくは微粉化した固体担体、またはその両方と均一かつ密接に混合し、次いで、必要に応じて、結果として生じる混合物を成形することによって調製される。例えば、プロドラッグを含有する粉末または顆粒を、場合により１つもしくはそれ以上の副成分と圧縮または成形することによって錠剤が調製されうる。圧縮錠剤は、適切な機械で、場合により結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、および／または表面活性／分散剤と混合された粉末または顆粒など自由流動形態で混合物を圧縮することによって調製されうる。成形された錠剤は、適切な機械で、不活性液体結合剤で湿潤した粉末化合物を成形することによって製造されうる。
【０１６２】
口腔（舌下）投与に適切な医薬組成物としては、風味ベース、通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカント中のプロドラッグを含んで成るトローチ剤のほか、ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシアなど不活性ベース中のプロドラッグを含んで成る芳香錠が挙げられる。
【０１６３】
非経口投与に適切な本発明の実施形態による医薬組成物は、その調製液が、好ましくは、対象レシピエントの血液と等張性であるプロドラッグの滅菌水性および非水性注射液を含んで成る。これらの調製液は、組成物に対象レシピエントの血液との等張性を与える抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および溶質を含有しうる。水性および非水性滅菌懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含みうる。組成物は、例えば、単位用量またはマルチ用量容器、例えば密閉されたアンプル剤またはバイアルで与えられ、かつ滅菌液体担体、例えば、使用直前に注射用の食塩水または水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されうる。即席の注射液および懸濁液が、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製されうる。例えば、密閉容器に単位剤形のプロドラッグを含んで成る注射可能な安定した滅菌組成物が提供されうる。プロドラッグは、適切な薬学的に許容される担体で再構成され、対象へのその注射に適した液体組成物を形成ることが可能である凍結乾燥物の形で提供される。単位剤形が通常、約１０ｍｇ〜約１０グラムのプロドラッグを含んで成る。プロドラッグが実質的に水不溶性である場合、生理学的に許容される十分な量の乳化剤が十分な量で使用され、水性担体中でプロドラッグを乳化する。かかる有用な乳化剤の１つがホスファチジルコリンである。
【０１６４】
皮膚への局所適用に適切な医薬組成物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、またはオイルの形態を取る。使用されうる担体としては、石油ゼリー、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮エンハンサー、およびその２つもしくはそれ以上の組合せを含む。
【０１６５】
経皮投与に適切な医薬組成物は、長時間レシピエントの表皮との密接を保つように適合された個別パッチとして与えられうる。経皮投与に適切な組成物は、イオン導入によっても送達され（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ３（６）：３１８（１９８６年）を参照））、かつ通常、場合によりプロドラッグの緩衝水性溶液の形態を取りうる。適切な製剤は、クエン酸またはビス／トリス緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含んで成り、かつ０．１〜０．２Ｍ活性成分を含有する。
【０１６６】
８．６  投与および治療の方法
本発明のナトリウム利尿化合物複合体および薬学的製剤は、非修飾（非複合）ナトリウム利尿化合物に対して１つもしくはそれ以上の改善された特性を示し、修飾部分の添加は、生物活性ナトリウム利尿化合物を、さまざまな環境下（胃腸管（ＧＩ管）など）での分解から保護することができ、非修飾形態では、かかる環境下での修飾部分の非存在下で分解されるよりも分解されなくなる。具体的には、本発明の特定の修飾形態は、全身循環中に生物活性ナトリウム利尿化合物の薬学的に許容される量を最終的に提供する投与量で経口投与されうる。すなわち、十分な量のナトリウム利尿化合物がＧＩ管で存続して血流に入り、生物活性ナトリウム利尿化合物がｃＧＭＰの産生を誘発するのに十分な薬理的活性量で全身に存在するようになる。好ましくは、修飾部分の添加は、経口投与される非複合ナトリウム利尿化合物の血流への送達に対して経口投与時に経口投与される非複合ナトリウム利尿化合物の血流への送達を改善する。より好ましくは、経口投与されるナトリウム利尿化合物複合体のための活性化合物の血流への送達の改善は、経口投与される非複合親生物活性ナトリウム利尿化合物の血流への送達の少なくとも２倍である。さらにより好ましくは、経口投与されるナトリウム利尿化合物複合体のための活性化合物の血流への送達の改善は、経口投与される非修飾（非複合）生物活性ナトリウム利尿化合物の血流への送達の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００倍である。したがって、本発明のナトリウム利尿化合物複合体の投与は、非修飾生物活性ナトリウム利尿化合物の投与に対して生物活性ナトリウム利尿化合物のより大きなバイオアベイラビリティを提供しうる。投与の（入院環境下に何日にもわたる連続的静脈内注入による代わりに）経口経路により、他のＣＨＦ療法と関連した入院費が削減され、かつ／またはｈＢＮＰの治療的使用が拡大され、早期および慢性ＣＨＦならびに急性ＣＨＦを含めることができる。
【０１６７】
したがって、一の態様において、本発明は、治療有効量の本発明のナトリウム利尿化合物複合体をそれを必要とする対象に投与することによってナトリウム利尿ペプチド化合物を使用する治療の影響を受けやすい疾患状態を治療する方法を提供する。ナトリウム利尿化合物複合体は、例えば、非経口および経腸経路を含むさまざまな経路によって適切に投与されうる。好ましい経路の例としては、経口、皮下、舌下、口腔、経鼻、静脈内、および筋内が挙げられる。
【０１６８】
幾つかの方法が、心不全の治療のための本発明のナトリウム利尿化合物複合体の用途において使用されうる。例えば、ナトリウム利尿化合物複合体は、好ましくは、経口剤形のみでの単剤療法として与えられうることが想定される。あるいは、ナトリウム利尿化合物複合体は、併用療法の一部としてより便利な治療薬とともに使用されうる。現在使用されている薬剤の主要なカテゴリーとしては以下が挙げられる。
【０１６９】
利尿剤−体液貯留および結果として生じるＣＨＦと関連した心臓の伸長を軽減する。
【０１７０】
血管拡張剤−動脈および静脈を拡大させ、血流の増加を可能にする。
【０１７１】
強心剤−心筋の収縮力を増大させる。
【０１７２】
ジギタリス剤−心臓の収縮力を増大させ、心拍数を削減する。
【０１７３】
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤−その合成の最終段階における血管収縮アンジオテンシンＩＩの産生を阻害する。
【０１７４】
アンジオテシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）−アンジオテンシンの産生を可能にするが、その動脈活性を阻害する。
【０１７５】
カルシムチャンネル遮断薬−カルシウム流入を阻害し、結果として血管および平滑筋の弛緩をもたらす。
【０１７６】
硝酸塩−平滑筋を弛緩し、静脈および動脈を拡張する。
【０１７７】
ベータ遮断薬−カテコールアミンの作用を遮断し、結果として心臓に対するストレスが低下し、収縮の力および速度を低下させる。
【０１７８】
ナトリウム利尿化合物複合体の利点の一部は最初にＣＨＦを治療する他の方法との関係で考慮され、連続的に注入される、その非修飾形態でのナトリウム利尿ペプチドの現在の使用と比較されうる。本発明の経口ナトリウム利尿化合物複合体は、ナトリウム利尿および過剰な水の除去によりうっ血を軽減することが予想されうるナトリウム利尿および利尿特性を示す。かかる機能は現在、利尿剤およびカリウム補給剤で対処されている。本発明のナトリウム利尿化合物複合体は、現在、血管拡張剤、カルシウムチャンネル遮断薬、および硝酸塩を使用して達成される血管および心筋弛緩特性を有することが予想される。本発明のナトリウム利尿化合物複合体は、ＡＣＥ阻害剤およびＡＲＢを使用して現在達成されるレニン−アンジオテンシン−アルドステロン系（ＲＡＡＳ）を阻害することが予想される。さらに、ナトリウム利尿化合物複合体は、強心およびジギタリス剤と関連したマイナスの効果および突然死のリスクを欠くことが予想される。ナトリウム利尿化合物複合体は、幾つかのグループの心血管薬の利点の、全部ではないが、多くを有すると同時に、従来の療法のマイナス効果の量を削減し、またはこれを欠く場合がある。
【０１７９】
本発明のナトリウム利尿化合物複合体は、ＮＡＴＲＥＣＯＲ（登録商標）（ネシリチド、シオス社（Ｓｃｉｏｓ，Ｉｎｃ．）、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州（ＣＡ）によって製造）に対する利点をも有する。その利点の一部は、本発明の実施形態による両親媒性オリゴマーが提供する薬物動態プロフィールの増大に起因しうる。例えば、プロテアーゼ（ＮＥＰなど）による分解に対する耐性が、非複合ペプチドと比べ長い循環半減期をもたらしうる。重要な利点は、経口送達されるかかるオリゴマーで複合されたＢＮＰまたはＡＮＰの能力に起因しうる。例えば、ＮＡＴＲＥＣＯＲ（登録商標）は、４８時間にわたって連続的注入によって投与され、用量当たりの高コストおよび入院費を伴う。本発明の実施形態による経口ｈＢＮＰ化合物複合体が全体的に低コストで投与することができ、外来ベースで利用可能であり、かつ自己投与されうる。ＣＨＦの最も急性の症例を有する入院患者による使用に限定される代わりに、本発明の実施形態による経口本発明は慢性ＣＨＦの漸進的な発症を有する患者に使用されうる。投与の容易さ、病院資源の需要削減、および／または低コストにより、予防的療法としてのナトリウム利尿化合物複合体の有用性が支援され、心不全のハイリスクにある患者のために（例えば、自宅で）自己投与される。したがって、本発明の実施形態によるｈＢＮＰ化合物複合体の経口製剤は、ＮＡＴＲＥＣＯＲ（登録商標）の全部ではないが、多くの利点を有することが予想され、薬物動態プロフィールの改善、投与の大幅な容易さ、入院費の削減、慢性ＣＨＦを含む適応の拡大、および早期の心血管疾患における有用性という利点を示す。
【０１８０】
親ナトリウム利尿化合物を摂取している、または摂取したいと思っている対象は、代わりとして（または追加的に）本明細書に記載されたナトリウム利尿化合物製剤を摂取することができる。例えば、ＮＡＴＲＥＣＯＲ（登録商標）など非経口投与されるナトリウム利尿化合物を使用して従来治療されている疾患患者は、本明細書に記載された薬剤の有効量の修飾形態を使用して治療されうる。有利には、かかる薬剤が以前、注射または静脈内投与によってのみ投与された場合、ナトリウム利尿化合物は、吸入、または、より好ましくは、経口投与によって投与されうる。
【０１８１】
一の実施形態において、本発明は、生物活性剤を対象に送達する方法を提供するが、ここで生物活性剤は本発明の修飾ナトリウム利尿化合物の要素として経口投与され、経口投与されたナトリウム利尿化合物の一部はＧＩ管に無傷に存続し、腸壁を横断して血流に入り、ＧＩ管を出た後、ナトリウム利尿化合物の一部もしくは全部がインビボで加水分解され、薬学的に許容される量の生物活性剤を得る。加水分解は、例えば、血流または肝において起こりうる。この方法において、ナトリウム利尿化合物の修飾形態は、対応する経口投与される非複合生物活性剤の経口バイオアベイラビリティに対して経口投与される生物活性剤の経口バイオアベイラビリティを増強する。
【０１８２】
その使用が本発明の範囲にあるナトリウム利尿剤の有効量は、薬剤によって、また患者によってばらつきがあり、患者の年齢や状態および送達の経路などの要因に左右される。かかる投与量は、当業者に周知のルーチンの薬理学的方法に従って決定されうる。一般的な提案としては、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの投与量が治療効果を有するが、全重量は患者の体重に基づき計算されている。高レベルでの毒性の懸念は、静脈内投与量を約１０ｍｇ／ｋｇまでなど低レベルに制限しうるが、全重量は活性ベースの重量に基づき計算されている。約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの投与量が経口投与のために使用されうる。通常、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの投与量が筋内注射のために使用されうる。投与の頻度は通常、１日１、２、または３回であり、または必要に応じて、条件を制御する。治療の継続期間は治療される状態のタイプによって決まり、患者の寿命と同じ期間でありうる。
【０１８３】
本発明に従って治療される適切な対象としては、鳥類および哺乳類対象、好ましくは、哺乳類が挙げられるがこれに限定されない。本発明による哺乳類としては、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）、ウサギ、霊長類、ヒトなどが挙げられるがこれらに限定されず、また子宮内の哺乳類を含む。本発明に従って治療される必要のある哺乳類対象が適切である。ヒト対象が好ましい。両性およびすべての発達段階（すなわち、新生児、乳児、小児、青年、成人）のヒト対象が本発明に従って治療されうる。
【０１８４】
本発明による例示的な鳥類としては、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ウズラ、キジ、走鳥類（例えば、ダチョウ）、および飼い鳥（例えば、オウムおよびカナリア）が挙げられ、かつ卵内の鳥が挙げられる。
【０１８５】
８．７  アッセイ
本発明のナトリウム利尿ペプチド類似体は、天然ペプチドと関連している心血管、腎、および／または内分泌効果を誘発しうる。細胞ベースのアッセイを使用し、どの複合体がヒトナトリウム利尿ペプチド受容体Ａの優れたアゴニストであり、ｃＧＭＰの適切な産生をもたらすかを証明することができる。生化学アッセイを使用し、どの複合体がタンパク質分解酵素に対する適切な保護を提供するかを証明することができる。インビボ実験を使用し、どの複合体が所望のバイオアベイラビリティを与えるかを証明することができる。主要な複合体を確立したイヌモデルで試験することができる。望ましい候補が、ラットおよびイヌにおける詳細な薬物動態、薬力学的、および毒性試験にかけることができる。本発明の実施形態によるＢＮＰ複合体は、早期の、慢性、および急性うっ血性心不全の治療に有用であろう。
【０１８６】
本発明の新規ペプチドおよび新規複合体は、インビトロでヒトナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）でのアゴニスト活性について試験されうる。ＢＮＰの血管弛緩、ナトリウム利尿、および利尿特性は、二次メッセンジャー、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）に帰する。ｃＧＭＰの産生は、ＢＮＰがＮＰＲ−Ａに結合すると活性化される酵素であるグアニル酸シクラーゼによって達成される。ｃＧＭＰ産生は、内因性にＮＰＲ−Ａを発現するヒト大動脈内皮細胞の培養中で測定されうる。したがって、本発明のナトリウム利尿化合物複合体およびナトリウム利尿ペプチド類似体の相対的活性は、これらの細胞におけるｃＧＭＰ産生のレベルによって測定されうる。
【０１８７】
本発明の複合体は、プロテアーゼに対する耐性の増大について試験されうる。一般に、経口送達される薬剤は、ペプシン、トリプシン、および／またはキモトリプシンなど消化酵素にさらされる。ペプチド薬剤の場合、これらの酵素は特に問題となりうる。しかし、ペプチド複合はこれらの酵素に対する耐性を増大させることが証明されている。消化酵素カクテルを使用し、本発明のｈＢＮＰ複合体および他の複合体の消化管のプロテアーゼに対する耐性の増大について試験することができる。ナトリウム利尿化合物複合体は、好ましくは、対応する非複合ナトリウム利尿化合物よりもタンパク質分解の影響を受けやすくなく、すなわち、複合体は対応する非複合化合物よりも緩徐に消化する。
【０１８８】
複合体は、経口バイオアベイラビリティについて試験されうる。複合体の経口バイオアベイラビリティは、例えば、ラットにおいて試験されうる。複合体は、胃腸管に強制経口投与され、血流中のｈＢＮＰ複合体の存在は利用可能なラジオイムノアッセイ法を使用して測定されうる。本発明の実施形態による複合体は、好ましくは、口腔および／または利用可能な経口的であり、すなわち、治療有効量の複合体を口腔および／または経口経路で送達されうる。
【０１８９】
複合体は、経口投与のその追加の利点とともに天然ナトリウム利尿ペプチド（例えば、ｈＢＮＰ）の活性の一部もしくは全部を保持しうる。かかる化合物は、急性ＣＨＦの治療と関連した費用を低下させ、および／またはこの治療薬の適用性を拡大して早期および慢性ＣＨＦを含めることができる。
【０１９０】
一の態様において、本発明は、本発明のナトリウム利尿化合物複合体または一連のかかるナトリウム利尿化合物複合体を分析するナトリウム利尿化合物を分析するステップを含んで成るデータ生成し、かかる分析に由来するデータを編集する方法を提供する。したがって、データ自体は、本発明のさらに別の実施形態、およびこのデータの使用を構成すると理解される。
【０１９１】
８．８  分岐鎖オリゴマー修飾部分
本発明は、幾つかのＰＥＧ直鎖および分岐鎖、アミン、マイクロペグ化、およびアルキルＰＥＧ修飾部分をも提供する。
【０１９２】
８．８．１  分岐鎖オリゴマー修飾部分の式
本発明は式
【化１３】
2008500375.tif 000016
【０１９３】
［式中、Ｒは−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、またはＣ（Ｏ）Ｘ’（ここでＸ’はハロゲン化物（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）またはｐ−ニトロフェノールである）など活性化部分であり、または、
【化１４】
2008500375.tif 000017
【０１９４】
Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＡＧ、およびｎは式Ｉについての上記の通りである。］を有する化合物を提供する。
【０１９５】
本発明は式
【化１５】
2008500375.tif 000018
【０１９６】
［式中、ＲはＨ（Ｒと結合したＰＡＧにおける原子はＯであり、したがって、終端部分はＯＨであると理解される）、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、またはＣ（Ｏ）Ｘ’（ここでＸ’はハロゲン化物（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）またはｐ−ニトロフェノールである）など活性化部分であり、または、
【化１６】
2008500375.tif 000019
【０１９７】
ＰＡＧ、ｎ、Ｘ、およびｏは式ＩＩについて上記されている通りである。］を有する化合物をも提示する。
【０１９８】
さらに別の実施形態において、式
【化１７】
2008500375.tif 000020
【０１９９】
［式中、Ｒは−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、またはＣ（Ｏ）Ｘ’またはＯＣ（Ｏ）Ｘ’（ここでＸ’はハロゲン化物（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）またはｐ−ニトロフェノールである）など活性化部分であり、または、
【化１８】
2008500375.tif 000021
【０２００】
Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＡＧ、およびｏは式ＩＩＩについての上記の通りである。］を有する化合物が提供される。
【０２０１】
別の態様において、修飾部分は、式
【化１９】
2008500375.tif 000022
【０２０２】
［式中、Ｒは−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、またはＣ（Ｏ）Ｘ”（ここでＸ”はハロゲン化物（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）またはｐ−ニトロフェノールである）など活性化部分であり、または、
【化２０】
2008500375.tif 000023
【０２０３】
Ｘ’は
【化２１】
2008500375.tif 000024
【０２０４】
Ｃ、ｍ、ＰＡＧ、ｎ、およびＸは式ＩＶについての上記の通りである。］を有しうる。
【０２０５】
別の態様において、修飾部分は、式
【化２２】
2008500375.tif 000025
【０２０６】
［式中、Ｒ３は−ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または、など活性化部分
【化２３】
2008500375.tif 000026
【０２０７】
Ｒ１およびＲ２は各々独立して選択され、上記の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのいずれかである。］を有しうる。
【０２０８】
８．８．２  オリゴマー修飾部分を製造する方法
本発明は、本明細書で開示された修飾部分を調製するための幾つかの方法をも提供する。式
【化２４】
2008500375.tif 000027
【０２０９】
の化合物を製造する方法が提供されるが、式中、Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＡＧ、およびｎは式Ｉについて上記されている通りである。この方法は、式
Ｃｍ−Ｘ−ＰＡＧｎ−ＯＨ
の化合物を式
【化２５】
2008500375.tif 000028
【０２１０】
（Ｃｌは、別のハロゲン化物など、別の離脱基で置換されることに注意）の化合物と塩基および溶媒の存在下に反応させ、式
【化２６】
2008500375.tif 000029
【０２１１】
の生成物を得、この生成物を式
Ｃｍ−Ｘ−ＰＡＧｎ−ＯＨ
の化合物とルイス酸および溶媒の存在下に反応させ、
【化２７】
2008500375.tif 000030
【０２１２】
［式中、Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＡＧ、およびｎは式Ｉについて上記されている通りである。Ｃｌは、Ｂｒなど別のハロゲン化物で置換されうる。一例として、塩基はさらにＮａＨと規定され、溶媒はさらにテトラヒドロフランと規定されうる。この方法において使用されるルイス酸もさらにＢＦ３ＯＥｔ２と規定されうる。］を得るステップを含むと記載されうる。
【０２１３】
本発明の別の方法も、式
【化２８】
2008500375.tif 000031
【０２１４】
［式中、Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＡＧ、およびｎは式Ｉについて上記されている通りである。］の化合物を製造するために開示されている。この方法はさらに生成物
【化２９】
2008500375.tif 000032
【０２１５】
［式中、Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＡＧ、およびｎは上記の通りである。］をパラニトロクロロギ酸エステルまたは炭酸ジシクシミジルと反応させるステップを含むと規定されうる。
【０２１６】
本発明のさらに別の実施形態が、式
【化３０】
2008500375.tif 000033
【０２１７】
［式中、ＰＡＧ、ｎ、Ｘ、およびｏは式ＩＩについての上記の通りである。］の化合物を製造する方法が提供される。この方法はさらに式
【化３１】
2008500375.tif 000034
【０２１８】
（Ｃｌは、別のハロゲン化物など、別の離脱基で置換されることに注意）の化合物［式中、ｏは式Ｉについて上記の通りである。］を式
ＨＯ−ＰＡＧｎ−Ｘ
［式中、Ｘは−ＮＨまたは−ＯＨである。］の化合物と溶媒中で反応させ、式
【化３２】
2008500375.tif 000035
【０２１９】
［式中、ＰＡＧ、ｎ、Ｘ、およびｏは式ＩＩについて上記されている通りである。］の化合物を得るステップを含むと記載されうる。
【０２２０】
本発明は、式
【化３３】
2008500375.tif 000036
【０２２１】
［式中、ＰＡＧ、ｎ、Ｘ、およびｏは式ＩＩについての上記の通りである。］の化合物を製造する方法をも提供する。この方法は、生成物
【化３４】
2008500375.tif 000037
【０２２２】
（式中、ＰＡＧ、ｎ、Ｘ、およびｏは式ＩＩについての上記の通りである。）を炭酸ジスクシニミジル、パラニトロクロロギ酸エステル、ホスゲン、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドなど活性化剤を使用して活性化するステップを含むと記載されうる。
【０２２３】
本発明のさらに別の実施形態は、式
【化３５】
2008500375.tif 000038
【０２２４】
［式中、Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＡＧ、およびｏは式ＩＩＩについての上記の通りである。］の化合物を製造する方法を提供する。この方法は、本明細書で上記の式ＸＩＩとして同定された生成物を式
【化３６】
2008500375.tif 000039
【０２２５】
の化合物と、溶媒中の塩基の存在下に［式中、ｏは式ＩＩＩについて上記されている通りである。］反応させるステップを含むと記載されうる。この方法の好ましい実施形態において、塩基はＫ２ＣＯ３であり、溶媒は水性および／または有機溶媒である。
【０２２６】
また、本発明は、さらに式
【化３７】
2008500375.tif 000040
【０２２７】
［式中、Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＡＧ、およびｏは式ＩＩＩについての上記の通りである。］の式の化合物を製造する方法を提供する。この方法は一般に上記の式ＸＩＶを調製する方法に従って製造される化合物を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの活性化剤と反応させるステップを含む。
【実施例】
【０２２８】
９．実施例
以下の実施例は、本発明のモデルを例示するために含まれている。以下の実施例の特定の態様は、本発明を実施する最良の態様を明らかにすると考えられる技術および方法に関して記載されている。本開示および本発明の関連業界において周知の技術の一般レベルに照らして、当業者は、以下の実施例が例示のみが意図されており、多くの変更、改造、修正が本発明の範囲を逸脱することなく使用されうることを理解するであろう。
【０２２９】
９．１  ＰＥＧ−アルキル修飾部分（炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル２−［２−（２−{２−［２−（２−ヘキサデシロキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ}−エトキシ）−エトキシ］−エチルエステル（ＩＩ））の活性化
ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、Ｉ（０．２０２ｇ、０．４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍＬ）中に溶解し、炭酸ジスクシニミジル（ＤＳＣ、０．１５７ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。次いでトリエチルアミン（０．１２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を滴下し、１０分後に反応混合物は透明になった。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。約１６時間の攪拌後、粗反応液を蒸発させて乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上に乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。粗生成物の混合物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／メタノール、１０：１）によって精製し、表題の化合物ＩＩ  ０．２５８ｇ（８１％）を油として得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ６４８．８４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【化３８】
2008500375.tif 000041
【０２３０】
９．２  分岐鎖ＰＥＧアミン修飾部分（炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル２−［２−（２−ヘキシル−デカノイルアミノ）−エトキシ］−エチルエステル（ＩＶ））の合成
塩化チオニル（５．５ｇｍ、４６．６ｍｍｏｌ）を３０分間にわたって１００ｍＬ四塩化炭素中２−ヘキシル−デカン酸Ｉ（１０ｇｍ、３８．９ｍｍｏｌ）の溶液に滴下した。添加を完了した後、反応混合物を３時間還流した。反応が完了した後、四塩化炭素を蒸留によって除去し、反応混合物を濃縮させて粗酸塩化物を得た。粗酸塩化物を分別蒸留によって精製し、ＩＩを透明液体（１０．１ｇｍ、９１％）として得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ２７５．８７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２３１】
１０ｍＬジクロロメタン中の２−（２−アミノ−エトキシ）−エタノール（５７５ｇ、５．４７ｍｍｏｌ）の冷却溶液に２−ヘキシル−塩化デカノイル塩化ＩＩ（７５０ｍｇ、  ２．７４ｍｍｏｌ）を３０分間にわたって滴下した。添加を完了した後、反応混合物温度の温度を２５℃に上昇させた。反応物を室温下に一夜攪拌した。約２０時間の攪拌後、粗組成物を１ＮＨＣｌで酸化させ、Ｈ２Ｏ  １０ｍｌで希釈した。次いで、反応混合物をジクロメタンで抽出した。次いで有機層を１Ｎ  ＨＣｌ、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上に乾燥させ、ろ過して濃縮させた。粗製品をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、勾配溶離：ＣＨＣｌ３中２−５％メタノール）によって精製し、単分散化合物ＩＩＩ  ９０２ｍｇ（９６％）を灰色がかった白色固体として得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ３４４．５４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２３２】
単分散分岐鎖Ｃ１６−ＰＥＧ２  ＩＩＩ（２００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍＬ）および炭酸ジスクシニミジル（ＤＳＣ、０．２２４ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）中に溶解した。次いでトリエチルアミン（０．１１８ｇ、１．１７ｍｍｏｌ）を滴下し、１０分後に反応混合物は透明になった。反応物を室温下に一夜攪拌した。約１６時間の攪拌後、粗反応液を蒸発させて乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上に乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／メタノール、１０：１）によって精製し、０．２０６ｇ（７４％）の油ＩＶ（０．２０６ｇ、収率７４％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ４８５．６３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【化３９】
2008500375.tif 000042
【０２３３】
９．３  ＰＥＧ−アルキル修飾部分（１６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサデカン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル）の合成および活性化
エタノール中（３００ｍＬ）中の単分散１６−ブロモ−ヘキサデカン酸（１５．３ｇ、４５ｍｍｏｌ）の溶液にＨ２ＳＯ４（１．５ｍＬ、３１．２５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を４８時間攪拌した。粗反応混合物を水で希釈し、ジクロロメタン（２×３００ｍＬ）で抽出した。有機層をＨ２Ｏ（３００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２×３００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４を乾燥させ、蒸発して乾燥させ、灰色がかった白色固体ＩＩ（１６．０３ｇ、収率９８％）を得た。
【０２３４】
ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中の単分散へプタエチレングリコールモノメチルエーテル（８．５１ｇ、２５ｍｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔ−ブトキシド（３．１ｇ、２７．５ｍｍｏｌ、小部分約３０分超）を添加した。次いで、反応混合物を１時間攪拌し、次いでＴＨＦ（９０ｍＬ）中に溶解したＩＩ（１０ｇ、２７．５ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を一夜攪拌した。粗反応混合物を、セライトによってろ過し（ＣＨ２Ｃｌ２洗浄、約２００ｍＬ）、蒸発させ乾燥させて油を得た。原油をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、勾配溶離：ＣＨＣｌ３中２〜５％メタノール）によって精製し、透明黄色油ＩＶ、２．４８ｇ（１６％）を得た。
【０２３５】
単分散化合物ＩＶ（２．２２ｇ、３．５６ｍｍｏｌ）の油に１Ｎ  ＮａＯＨ（５０．０ｍＬ）、２５ｍＬメタノール、２５ｍＬエタノールを添加し、反応混合物を２４時間攪拌した。粗反応混合物を濃縮、酸性化し（ｐＨ約２）、ＮａＣｌで飽和し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×７５ｍＬ）で洗浄した。有機層を混合し、飽和ＮａＣｌ洗浄、ＭｇＳＯ４乾燥させ、蒸発させ乾燥させて単分散化合物Ｖを白色固体として得た。粗固体をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）によって精製し、Ｖ、８５８ｍｇ（４０％）を得た。
【０２３６】
単分散ｍＰＥＧ７−Ｃ１６−酸Ｖ（３２４ｍｇ、５４４ｍｍｏｌ）を１５ｍｌの無水塩化メチレン、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミド（９４ｍｇ、８１６ｍｍｏｌ）および１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの溶液中に溶解した。無水塩化メチレン中ＨＣｌ（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ、１５６ｍｇ、８１６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を２４時間攪拌し、次いで１Ｎ  ＨＣｌ、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上に乾燥させ、ろ過して濃縮した。粗製品をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、勾配溶離：ＣＨＣｌ３中２−５％メタノール）によって精製し、単分散活性化ＭＰＥＧ７−Ｃ１６  ＶＩを透明油（２９０ｍｇ、７７％）として得た。
【化４０】
2008500375.tif 000043
【０２３７】
９．４  ＰＥＧ−アルキル修飾部分（１２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ドデカン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル）の活性化
単分散ｍＰＥＧ７−Ｃ１２−酸Ｉ（５００ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの無水塩化メチレン、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１６０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）および１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの溶液中に溶解した。無水塩化メチレン中ＨＣｌ（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ、２３３ｍｇ、１．３９０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を２４時間攪拌し、次いで１Ｎ  ＨＣｌ、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上に乾燥させ、ろ過して濃縮した。粗製品をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、勾配溶離：ＣＨＣｌ３中２〜５％メタノール）によって精製し、単分散活性化ＭＰＥＧ７−Ｃ１６  ＶＩを透明油（３７０ｍｇ、６２％）として得た。
【化４１】
2008500375.tif 000044
【０２３８】
９．５  ＰＥＧ修飾部分（炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル２−メトキシ−エチルエステル）の合成
単分散分岐鎖ＭＰＥＧ１  Ｉ（２００ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍＬ）中に溶解し、炭酸ジスクシニミジル（ＤＳＣ、ＩＩ、１．００ｇ、３．９４ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチルアミン（０．３９９ｇ、３．９４ｍｍｏｌ）を滴下し、１０分後に反応混合物は透明になった。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。約１６時間の攪拌後、粗反応液を蒸発させて乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）により固体ＩＩＩ（０．３４６ｇ、収率６０％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ２１８．０９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【化４２】
2008500375.tif 000045
【０２３９】
９．６  加水分解性マイクロペグ化修飾部分（ヘキサン酸２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルオキシ）−エチルエステル）の合成
単分散分岐鎖Ｃ６−ＰＥＧ１  Ｉ（１００ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）中に溶解し、炭酸ジスクシニミジル（ＤＳＣ、ＩＩ、０．２４０ｇ、０．９３６ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチルアミン（０．０９５ｇ、０．９３６ｍｍｏｌ）を滴下し、１０分後に反応混合物は透明になった。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。約１６時間の攪拌後、粗反応液を蒸発させて乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）により固体ＩＩＩ（０．１４６ｇ、収率７８％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ３０２．２９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【化４３】
2008500375.tif 000046
【０２４０】
９．７  直鎖ｍＰＥＧ修飾部分（炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル２−（２−メトキシ−エトキシ）−エチルエステル）の合成
単分散分岐鎖ＭＰＥＧ２  Ｉ（４７０ｍｇ、３．９１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍＬ）中に溶解し、炭酸ジスクシニミジル（ＤＳＣ、ＩＩ、１．５０ｇ、５．８７ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチルアミン（０．５９４ｇ、５．８７ｍｍｏｌ）を滴下し、１０分後に反応混合物は透明になった。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。約１６時間の攪拌後、粗反応液を蒸発させて乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）により固体ＩＩＩ（０．６３２ｇ、収率６２％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ２６２．２３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【化４４】
2008500375.tif 000047
【０２４１】
９．８  加水分解性マイクロペグ化修飾部分（ドデカン酸２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルオキシ）−エトキシ］−エチルエステル）の合成
単分散分岐鎖Ｃ１２−ＰＥＧ２  Ｉ（２００ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）中に溶解し、炭酸ジスクシニミジル（ＤＳＣ、ＩＩ、０．２６５ｇ、１．０３５ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチルアミン（０．１０４ｇ、１．０３５ｍｍｏｌ）を滴下し、１０分後に反応混合物は透明になった。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。約１６時間の攪拌後、粗反応液を蒸発させて乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）により固体ＩＩＩ（０．２４７ｇ、収率８３％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ４３０．５０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【化４５】
2008500375.tif 000048
【０２４２】
９．９  直鎖ＰＥＧ修飾部分（炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エチルエステル）の合成
単分散分岐鎖ＭＰＥＧ３  Ｉ（２００ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍＬ）中に溶解し、炭酸ジスクシニミジル（ＤＳＣ、ＩＩ、０．４６８ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチルアミン（０．１８４ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）を滴下し、１０分後に反応混合物は透明になった。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。約１６時間の攪拌後、粗反応液を蒸発させて乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）により固体ＩＩＩ（０．２０６ｇ、収率５５％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ３０６．１１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【化４６】
2008500375.tif 000049
【０２４３】
９．１０  加水分解性マイクロペグ化修飾部分（ヘキサン酸２−｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチルエステル）の合成
単分散分岐鎖Ｃ６−ＰＥＧ３  Ｉ（２００ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍＬ）中に溶解し、炭酸ジスクシニミジル（ＤＳＣ、ＩＩ、０．３０９ｇ、１．２０９ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチルアミン（０．１２２ｇ、１．２０９ｍｍｏｌ）を滴下し、１０分後に反応混合物は透明になった。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。約１６時間の攪拌後、粗反応液を蒸発させて乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）により固体ＩＩＩ（０．２０３ｇ、収率６４％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ３９０．４０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【化４７】
2008500375.tif 000050
【０２４４】
９．１１  ベンジル削減加水分解性オリゴマー（６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸４−（４−ニトロ−フェノキシカルボニルオキシメチル）−フェニルエステル）の合成
カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（３．６４ｇ、３２．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ  ２５０ｍＬ中に溶解した。ＴＨＦ  １０ｍＬ中のＭＰＥＧ６アルコール（９．５８ｇ、３２．３ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を２時間攪拌した。市販のエチル６−ヒドロキシ−ヘキサノエートから調製されたメシラート（７．０ｇ、２９．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ  １５ｍＬ中に溶解し、ＰＥＧ溶液に添加した。反応物を室温下に一夜攪拌した。反応物をＭｅＯＨ  ２５ｍＬで急冷し、短パッドのセライトを通じてろ過した。ろ過物を真空下に濃縮し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／２％ＭｅＯＨ）によって精製し、３．１９ｇ（２５％）のＩを得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ４６１．０７（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０２４５】
エチルエステルを加水分解するために、１．１ｇ（２．５１ｍｍｏｌ）のＩを１Ｎ  ＮａＯＨ  ３５ｍＬで処理した。６時間後、最初に濁った混合物が透明な黄色の溶液になった。混合物をＮａＣｌで飽和し、ｐＨが２になるまで濃縮ＨＣｌで酸性化した。溶液をＣＨ２Ｃｌ２  １００ｍＬで抽出した。有機物をＮａ２ＳＯ４上に乾燥させ、ろ過し、真空下に濃縮して０．８０ｇ（７８％）のカルボン酸ＩＩを得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ４１１．０７（Ｍ＋Ｈ）＋、４３３．１０（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０２４６】
カルボン酸ＩＩＩ（０．８０ｇ、９５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２  １６ｍ中に溶解し、Ｎ２下に配置した。この溶液に、ＥＤＣ  ０．４８６ｇ（２．５ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）０．２８８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）を添加した。５時間後、さらにＥＤＣ  ０．２ｇおよびＮＨＳ  ０．１２ｇを添加して反応を完了させた。ＴＬＣにより未反応のカルボンが残っていないことが示された場合、混合物をＣＨ２Ｃｌ２  ６０ｍＬで希釈し、冷却１Ｎ  ＨＣｌ（１×１００ｍＬ）、冷水（２×１００ｍＬ）、および塩水（３×１００ｍＬ）で洗浄した。有機物をＮａ２ＳＯ４上に乾燥させ、ろ過し、真空下に濃縮して０．７１ｇ（７１％）のＩＩＩを得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ５０８．１７（Ｍ＋Ｈ）＋、５３０．０７（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０２４７】
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２  １２０ｍＬ中に、４−ヒドロキシベンジルアルコール（２．９３ｇ、３．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ  ２．９８ｇ（２４．４ｍｍｏｌ）を溶解した。化合物ＩＩＩ（１．２ｇ、（２．３７ｍｍｏｌ）を別のＣＨ２Ｃｌ２  ４０ｍＬ中に溶解し添加した。反応物を室温下に一夜攪拌した。混合物を１Ｎ  ＨＣｌ（２×２００ｍＬ）および塩水（２×２００ｍＬ）で洗浄した。有機物をＮａ２ＳＯ４上に乾燥させ、ろ過し、蒸発させて乾燥させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／１０％ＭｅＯＨ）によって精製し、０．７０１ｇ（５８％）のオリゴマーＩＶを得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ５３９．１０（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０２４８】
オリゴマーＩＶ（０．５６２ｇ、１．０９ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２  １５ｍＬ中に溶解した。この溶液にＴＥＡ  ０．２３ｍＬ（１．６４ｍｍｏｌ）およびｐ−ニトロ−フェニルクロロギ酸エステル  ０．３２９ｇ（１．６４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温下に一夜攪拌した。次いで混合物を追加的なＣＨ２Ｃｌ２  １５ｍＬで希釈し、１Ｎ  ＨＣｌ  １５ｍＬで洗浄後、水１５ｍｌで洗浄した。有機物をＭｇＳＯ４上に乾燥させ、ろ過し、濃縮して乾燥させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、勾配溶離：３／１ＥｔＯＡｃ／ヘキサンＥｔＯＡｃ）によって精製し、５０４ｍｇ（７４％）の活性化オリゴマーを得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ６８２．７２（Ｍ＋Ｈ）＋、７０４．７２（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【化４８】
2008500375.tif 000051
【０２４９】
９．１２  アリールカルバメート加水分解性修飾部分（炭酸４−（６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ−｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキシルオキシ）−フェニルエステル４−ニトロ−フェニルエステル）の合成
ＭＰＥＧ６アルコール（１０．０ｇ、３３．７ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２  ４０ｍＬ中に溶解し、結果として生じる溶液を氷浴中で０℃に冷却した。ＴＥＡ（５．６４ｍＬ、４０．５ｍｍｏｌ）を添加し、次いで塩化メタンスルホニル  ３．１３ｍＬ（４０．５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を３０分間０℃下に攪拌し、次いで氷浴から除去し、室温にさせ、一夜攪拌した。反応混合物をさらにＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３および水で洗浄した。有機物をＭｇＳＯ４上に乾燥させ、ろ過し、真空下に濃縮して１２．４ｇ（９８％）のＭＰＥＧ６メシラート、Ｉを得た。
【０２５０】
１，６ヘキサンジオールの溶液を６．３１１ｇのジオール（５３．４１ｍｍｏｌ）および１８０ｍＬの乾燥ＴＨＦから調製した。溶液を０℃に冷却し、Ｎ２雰囲気下に配置した。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５．９９６ｇ、５３．４１ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、結果として生じる混合物を１時間攪拌した。ＴＨＦ  ３０ｍＬ中のＩ（１０．０ｇ、２６．７ｍｍｏｌ）を混合物に添加した。すべてをさらに３０分間、０℃下に攪拌し、次いで室温に加熱し、一夜攪拌した。反応混合物を、セライトを通じてろ過した。セライトをＣＨ２Ｃｌ２ですすぎ、複合ろ過物を真空下に濃縮した。残留物をＣＨ２Ｃｌ２中に再溶解し、水で洗浄した。有機物をＮａ２ＳＯ４上に乾燥させ、ろ過し、蒸発させて乾燥させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／１０％ＭｅＯＨ）による精製。一部の材料を予備的ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／１０  ％  ＭｅＯＨ）によって追加的に精製した。複合収率は３．９２３ｇ（３７％）のＩＩであった。
【０２５１】
ＩＩ（３．９２３ｇ、９．８９ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２  １６ｍＬ中に溶解し、結果として生じる溶液を０℃に冷却し、Ｎ２下に配置した。トリエチルアミン（１．６５ｍＬ、１１．９ｍｍｏｌ）を添加し、次いで塩化メタンスルホニル  ０．９２ｍＬ（１１．９ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を０℃下にさらに３０分間攪拌し、次いで室温にさせ、一夜攪拌した。反応混合物をさらにＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣ３および水で洗浄した。有機物をＭｇＳＯ４上に乾燥させ、ろ過し、真空下に濃縮して４．２５ｇ（９１％）のメシラート、ＩＩＩを得た。
【０２５２】
乾燥ＴＨＦ  ５０ｍＬを含有するフラスコ中に、５．００１ｇ（２４．９７ｍｍｏｌ）の４−ベンジルオキシフェノールを溶解した。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．２０２ｇ、９．９８９ｍｍｏｌ）を添加し、結果として生じる混合物を不活性雰囲気下、室温で１時間攪拌した。ＴＨＦ  ２０ｍＬ中３．９５０ｇ（８．３２４ｍｍｏｌ）のＩＩＩの溶液を添加した。さらに１８時間後、全体の混合物をＭｅＯＨ  １０ｍＬで急冷し、短パッドのセライトを通じてろ過した。ろ過物を真空下に濃縮し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ  ２０：１）によって精製し、１．５８４ｇ（３３％）の化合物ＩＶを得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ、５７９．１６（Ｍ＋Ｈ）＋、６０１．１４（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０２５３】
化合物ＩＶ（０．６８３ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ  ２０ｍＬ中に溶解した。この溶液にＭｅＯＨ中５％１３６ｍｇのＰｄ／Ｃのスラリーを添加した。全体の混合物をＨ２下に配置し、ＴＬＣにより出発原料のすべてが消費されたことが確認されるまで攪拌した。次いで、混合物を、セライトを通じてろ過し、ろ過物を蒸発させて乾燥させ、４１２ｍｇ（７１％）のＶを得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ  ５１１．０９（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０２５４】
オリゴマーＶ（０．６０５ｇ、１．０９ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２  １５ｍＬ中に溶解した。この溶液にＴＥＡ  ０．２３ｍＬ（１．６４ｍｍｏｌ）およびｐ−ニトロ−フェニルクロロギ酸エステル  ０．３２９ｇ（１．６４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温下に一夜攪拌した。次いで混合物を追加的なＣＨ２Ｃｌ２  １５ｍＬで希釈し、１Ｎ  ＨＣｌ  １５ｍＬで洗浄後、水１５ｍｌで洗浄した。有機物をＭｇＳＯ４上に乾燥させ、ろ過し、濃縮して乾燥させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、勾配溶離：３／１  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン−Ｅ＋ＯＡｃ）によって精製し、４９１ｍｇ（７５％）の活性化オリゴマーを得た。ＥＳＩ  ＭＳ：  ｍ／ｅ、６５４．７１（Ｍ＋Ｈ）＋、６７５．７１（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【化４９】
2008500375.tif 000052
【０２５５】
９．１３  活性化オリゴマー部分の方法
本実施例では本発明のオリゴマー部分が活性化されうる方法が記載される。
【０２５６】
９．１３．１  方法Ｉ−ＤＳＣを使用する活性化 
アルキル−ＰＥＧ−ＯＨ、Ｉ（０．４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）をアセトニトリル（５ｍＬ）中に溶解し、炭酸ジスクシニミジル（ＤＳＣ、０．６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を添加した。次いでトリエチルアミン（１．２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を滴下し、１０分後に反応混合物は透明になった。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。約１６時間の攪拌後、粗反応液を蒸発させて乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上に乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）により活性化オリゴマーＩＩを得た。
【化５０】
2008500375.tif 000053
【０２５７】
９．１３．２  方法ＩＩ：ＮＨＳを使用する活性化
ＭＰＥＧ−アルキル−酸Ｉ（０．５４４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を１５ｍｌの無水塩化メチレン、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．８１６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）および１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの溶液中に溶解した。無水塩化メチレン中ＨＣｌ（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ、０．８１６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を添加した。反応物を数時間攪拌し、次いで１Ｎ  ＨＣｌ、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上に乾燥させ、ろ過して濃縮した。粗製品をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、勾配溶離：ＣＨＣｌ３中２〜５％メタノール）によって精製し、活性化ＭＰＥＧ−アルキル−酸ＩＩを得た。
【化５１】
2008500375.tif 000054
【０２５８】
９．１４  分岐鎖ＰＥＧによる修飾部分（６−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−１−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシメチル）−エトキシカルボニルアミノ］−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル）の合成
【化５２】
2008500375.tif 000055
【０２５９】
１．  テトラエチレングリコールモノメチルエーテル（１４．０ｇ、６７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（９０ｍＬ）中に溶解し、ＮａＨ（１．７７ｇ、７４ｍｍｏｌ）を部分的に添加し、反応物を２時間攪拌した。次いで、エピクロロヒドリン（２６．３ｍＬ、０．３４ｍｏｌ）を滴下し、反応物をＲＴ下に４８時間攪拌した。粗反応混合物を、セライトを通じてろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）で洗浄した。ろ過物をＨ２Ｏ（２×２５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）により透明油（１０．１５ｇ、収率５７％収率）の１を得た。
【化５３】
2008500375.tif 000056
【０２６０】
２．  テトラエチレングリコールモノメチルエーテル（７．９６ｇ、０．０３８ｍｏｌ）および１（１０．１、０．０３８ｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中に溶解し、ＢＦ３ＯＥｔ２（０．４８ｍＬ、０．００３８ｍｏｌ）を添加した。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（３００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１０：１）により透明油（４．５ｇ、収率２５％）の２を得た。
【化５４】
2008500375.tif 000057
【０２６１】
３．  ４−ニトロクロロギ酸エステル（２．８７ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）および２（４．５ｇ、９．５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（４５ｍＬ）中に溶解した。１０分間の攪拌後、ＴＥＡ（２．１ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液をＣＨ２Ｃｌ２（１３０ｍＬ）で希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（１７５ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１７５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１５：１）により黄色油（２．３８ｇ、収率４０％）の３を得た。
【化５５】
2008500375.tif 000058
【０２６２】
４．  ６−アミノカプロン酸（０．１２６ｇ、０．９６ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（０．２２１ｇ、１．６ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（ＤＩ、５ｍＬ）中に溶解した。次いで３（０．５ｇ、０．８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．７ｍＬ）中で溶解し、滴下した。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液をＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で希釈し、ＨＣｌでｐＨを約１に酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×２５ｍＬ）で洗浄し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ、１５：１）により透明油（０．４２８ｇ、収率８５％）の４を得た。
【化５６】
2008500375.tif 000059
【０２６３】
５．  方法ＩＩを使用する活性化：４（０．４０ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０８８ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１６０ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１０：１）により透明油（０．３２０ｇ、収率６９％）の５を得た。
【０２６４】
９．１５  直鎖ＰＥＧ−アルキル修飾部分（炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ヘキシルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチルエステル）の合成
【化５７】
2008500375.tif 000060
【０２６５】
１．  トリエチレングリコール（３０ｇ、０．２ｍｏｌ）をＮａＯＨ（８ｍＬのＨ２Ｏ中８ｇ）中に溶解し、１０分間攪拌した。次いで塩化ベンジル（７ｍＬ、０．０６２ｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１００℃に加熱し、一夜攪拌した。粗反応液を飽和ＮａＣｌ（５００ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×４００ｍＬ）で洗浄し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１０：１）により黄色油（９．８７ｇ、収率６７％）の１を得た。
【化５８】
2008500375.tif 000061
【０２６６】
２．  ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の１の溶液（９．８７ｇ、０．０４１ｍｏｌ）にＴＥＡ（７．１ｍＬ、０．０５４ｍｏｌ）を添加した。次いで、溶液を氷浴中で０℃に冷却し、次いでＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中に溶解した塩化メタンスルホニル（３．９ｍＬ、０．０４９ｍｏｌ）を滴下した。反応物を０℃下に０．５時間、次いでＲＴ下に４時間攪拌した。粗反応物を、セライトを通じてろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で洗浄し、ろ過物を飽和ＮａＨＣＯ３（１５０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させ、黄色油（１１．０６ｇ、収率８５％）の２を得た。
【化５９】
2008500375.tif 000062
【０２６７】
３．  テトラエチレングリコール（７．３２ｇ、０．０３８ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１４０ｍＬ）中に溶解し、ＮａＨを０．５時間にわたって部分的に添加し、反応物をさらに１時間攪拌した。次いで２（６．０ｇ、０．０１９ｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中に溶解し、滴下し、反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液を、セライトを通じてろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、蒸発させて乾燥させた。結果として生じる油をＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）中に溶解し、Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１５０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１０：１）により黄色油（３．８３ｇ、収率４９％）の３を得た。
【化６０】
2008500375.tif 000063
【０２６８】
４．  ２と同じ方法で調製：ヘキサノール（６．２ｍＬ、０．０５ｍｏｌ）、塩化メタンスルホニル（４．６ｍＬ、０．０５８ｍｏｌ）、ＴＥＡ（８．６ｍＬ、０．０６５ｍｏｌ）、およびＣＨ２ＣＬ２（６０ｍＬ）により黄色油（７．８ｇ、８６％収率）の４を得た。
【化６１】
2008500375.tif 000064
【０２６９】
５．  テトラヒドロフラン（１６０ｍＬ）中の３の溶液（５．４５ｇ、０．１３ｍｏｌ）にカリウムｔ−ブトキシド（１．６０ｇ、０．０１４４ｍｏｌ）を添加し、反応物を１．５時間攪拌した。次いでテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中に溶解した４（２．５９ｇ、０．０１４４ｍｏｌ）を滴下し、反応物を一夜攪拌した。粗反応液を、セライトを通じてろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、蒸発させて乾燥させた。結果として生じる油を酢酸エチル（１５０ｍＬ）中に溶解し、Ｈ２Ｏ（２×１５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）により黄色油（２．４０ｇ、収率３６％）の５を得た。
【化６２】
2008500375.tif 000065
【０２７０】
６．  酢酸エチル（１６ｍＬ）中の５の溶液（２．４ｇ、４．８ｍｍｏｌ）に活性炭素１０重量％（１．０ｇ）でパラジウムを添加し、反応管を隔壁で密閉した。次いで、Ｈ２を含有するバルーンを針によって隔壁へ挿入し、反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応混合物を、セライトを通じてろ過し、酢酸エチルで洗浄し、蒸発させて乾燥させ、透明油（１．６１ｇ、収率８２％）の６を得た。
【化６３】
2008500375.tif 000066
【０２７１】
７．  ホスゲン液（１５ｍＬのトルエン中２０％ホスゲン）を−１０℃に冷却し、トルエン（５ｍＬ）中に溶解した６（１．６０ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を−１０℃下に０．５時間、次いでＲＴ下に４時間攪拌した。次いで、ホスゲンおよびトルエンを蒸留し、結果として生じる油を真空下に乾燥させ、黄色油の７を得た。
【化６４】
2008500375.tif 000067
【０２７２】
８．  方法ＩＩを使用する活性化：７（１．６５ｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．４３７ｇ、３．８ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（２．７ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１５：１）により透明油（１．０６ｇ、５７％収率）の８を得た。
【０２７３】
９．１６  分岐鎖アルキル−ＰＥＧ−アルキル（６−［２−（２−｛２−［２−（２−ヘプチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−１−（２−｛２−［２−（２−ヘプチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシメチル）−エトキシカルボニルアミノ］−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル）の合成
【化６５】
2008500375.tif 000068
【０２７４】
１．  実施例９．１５に示されている同じ方法で調製：ヘキサノール（１８ｍＬ、０．１５ｍｏｌ）、塩化メタンスルホニル（１２．３ｍＬ、０．１６ｍｏｌ）、ＴＥＡ（２５ｍＬ、０．１８ｍｏｌ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（１８０ｍＬ）により黄色油（２３．１ｇ、収率８５％）の１を得た。
【化６６】
2008500375.tif 000069
【０２７５】
２．  テトラエチレングリコール（５０．５ｇ、０．２６ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３５０ｍＬ）中に溶解し、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２９．２ｇ、０．２６ｍｏｌ）を０．５時間にわたって部分的に添加した。反応物をさらに１時間攪拌し、次いでＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解した１（２３．０ｇ、０．１３ｍｏｌ）を添加した。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液を、セライトを通じてろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、蒸発させて乾燥させた。結果として生じる油をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）中に溶解し、Ｈ２Ｏ（２×３００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）により透明油（１８．５１ｇ、収率５１％）の２を得た。
【化６７】
2008500375.tif 000070
【０２７６】
３．  テトラヒドロフラン（６０ｍＬ）中の２の溶液（１０．０ｇ、３６ｍｍｏｌ）にＮａＨ（０．９５ｇ、４０ｍｍｏｌ）を部分的に添加し、反応物を０．５時間攪拌した。次いで、エピクロロヒドリン（１４．１ｍＬ、０．３４ｍｏｌ）を滴下し、反応物をＲＴ下に４８時間攪拌した。粗反応混合物を、セライトを通じてろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、蒸発させて乾燥させた。結果として生じる油をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ヘキサン、１０：１）により透明油（５．４６ｇ、収率４５％）の３を得た。
【化６８】
2008500375.tif 000071
【０２７７】
４．  ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の２（４．５４ｇ、１６ｍｍｏｌ）および３（５．４６、１６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＦ３．ＯＥｔ２（０．４８ｍＬ、０．００３８ｍｏｌ）を添加した。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル〜酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１０：１）により透明油（２．４０ｇ、収率２４％）の４を得た。
【化６９】
2008500375.tif 000072
【０２７８】
５．  ４−ニトロクロロギ酸エステル（１．１８ｇ、５．８ｍｍｏｌ）および４（２．４ｇ、３．９ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）中に溶解した。１０分間の攪拌後、ＴＥＡ（０．８９ｍＬ、６．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液をＣＨ２Ｃｌ２（７５ｍＬ）で希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）により黄色油（１．０４ｇ、収率３４％）の５を得た。
【化７０】
2008500375.tif 000073
【０２７９】
６．  ６−アミノカプロン酸（０．１５７ｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（０．２７６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（ＤＩ、８ｍＬ）中に溶解した。次いで５（０．８０ｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．０ｍＬ）中で溶解し、滴下した。３が添加された場合に形成された油滴およびエタノール（２ｍＬ）を添加し、反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液をＨ２Ｏ（３０ｍＬ）で希釈し、ＨＣｌでｐＨを約１に酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×３５ｍＬ）で洗浄し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、２０：１）により透明油（０．７２０ｇ、収率４６％）の６を得た。 
【化７１】
2008500375.tif 000074
【０２８０】
７．  方法ＩＩを使用する活性化：６（０．３５６ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０６３ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１１５ｇ、０．６ｍｍｏｌ）、およびＣＨ２ＣＬ２（３ｍＬ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）により透明油（０．１８０ｇ、収率４５％）の７を得た。
【０２８１】
９．１７  ヘキサン酸２−［２−（２−｛２−［２−［６−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルオキシ）−ヘキシルカルバモイルオキシ］−３−（２−｛２−［２−（２−ヘキサノイルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロポキシシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチルエステル
【化７２】
2008500375.tif 000075
【０２８２】
１．  実施例９．１５に示されている同じ方法で調製：テトラエチレングリコール（５８．２７ｇ、０．３ｍｏｌ）、ＮａＯＨ溶液（１２ｍＬのＨ２Ｏ中１２ｇ）、塩化ベンジル（１０．６ｍＬ、０．０９２ｍｏｌ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）により黄色油（１６．８ｇ、収率６４％）の１を得た。
【化７３】
2008500375.tif 000076
【０２８３】
２．  実施例９．１４に示されている同じ方法で調製：１（９．６ｇ、３４ｍｍｏｌ）、ＮａＨ（０．８９８ｇ、３７ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）、エピクロロヒドリン（１３．２ｍＬ、０．１７ｍｏｌ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）により透明油（６．７８ｇ、収率５８％）の２を得た。
【化７４】
2008500375.tif 000077
【０２８４】
３．  実施例９．１４に示されている同じ方法で調製：テトラエチレングリコール（４．８５ｇ、２０ｍｍｏｌ）、２（６．７８ｇ、２５ｍｍｏｌ）、ＢＦ３−ＯＥｔ２（０．２５ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（７５ｍＬ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ、２０：１）により透明油（２．８５ｇ、収率２７％）の３を得た。
【化７５】
2008500375.tif 000078
【０２８５】
４．  ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中３の溶液（２．８０ｇ、５．２ｍｍｏｌ）にＴＥＡ（０．８ｍＬ、５．７ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を０℃に冷却した。次いで、塩化ヘキサノイル（０．７３ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を０℃下に０．５時間、次いでＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液をＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１５：１）により黄色油（１．９５ｇ、収率５９％）の４を得た。
【化７６】
2008500375.tif 000079
【０２８６】
５．  酢酸エチル（２０ｍＬ）中の４の溶液（１．９４ｇ、３．１ｍｍｏｌ）にパラジウム（１．６０ｇ、活性炭素５重量％）を添加した。反応物を密閉し、Ｈ２下に一夜攪拌した。粗反応混合物を、セライトを通じてろ過し、酢酸エチルで洗浄し、蒸発させて乾燥させ、透明油（１．０９ｇ、収率６５％）の６を得た。
【化７７】
2008500375.tif 000080
【０２８７】
６．  ＣＨ２Ｃｌ２（１４ｍＬ）中５の溶液（１．０９ｇ、２．０ｍｍｏｌ）にＴＥＡ（０．３１ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を０℃に冷却した。次いで、塩化ヘキサノイル（０．２８ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を０℃下に０．５時間、次いでＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液をＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１５：１）により黄色油（０．６９８ｇ、収率５５％）の６を得た。
【化７８】
2008500375.tif 000081
【０２８８】
７．  実施例９．１４に示されている同じ方法で調製：４−ニトロクロロギ酸エステル（０．３３２ｇ、１．６５ｍｍｏｌ）、６（０．６９８ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．２８ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（７ｍＬ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）により黄色油（０．６８８ｇ、収率７８％）の７を得た。
【化７９】
2008500375.tif 000082
【０２８９】
８．  実施例９．１４に示されている同じ方法で調製：６−アミノ−１−ヘキサノール（０．１４２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、７（０．４８８ｇ、０．６ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．１２ｍＬ、０．９ｍｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１５：１）により透明油（０．３０ｇ、収率６５％）の８を得た。
【化８０】
2008500375.tif 000083
【０２９０】
９．  方法Ｉを使用する活性化：Ｎ，Ｎ’−炭酸ジスクシニミジル（０．１１８ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、８（０．３０ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（８０μＬ、０．５７ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（４ｍＬ）。洗浄により透明油（０．３４４ｇ、収率９０％）の９を得た。
【０２９１】
９．１８  ６−｛２−（２−｛２−［２−（２−ヘキシルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−１−［６−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキシルオキシメチル］−エトキシカルボニルアミノ｝−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル
【化８１】
2008500375.tif 000084
【０２９２】
１．  実施例９．１５に示されている同じ方法で調製：テトラエチレングリコールモノメチルエーテル（２５ｇ、０．１２ｍｏｌ）、ＴＥＡ（１９．５ｍＬ、０．１４ｍｏｌ）、塩化メタンスルホニル（１０．０ｍＬ、０．１３ｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）により黄色油（３１．３５ｇ、収率９１％）の１を得た。
【化８２】
2008500375.tif 000085
【０２９３】
２．  １，６−ヘキサンジオール（７．９３ｇ、０．０８４ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）中に溶解した。カリウムｔ−ブトキシド（１０．３７ｇ、０．０９２ｍｏｌ）を０．５時間にわたって部分的に添加し、さらに１時間攪拌した。次いで、テトラヒドロフラン（４０ｍＬ）中に溶解した１（１２．０ｇ、０．０４２ｍｏｌ）を添加漏斗によって滴下し、反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液を、セライトを通じてろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、蒸発させて乾燥させた。結果として生じる油をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）中に溶解し、Ｈ２Ｏ（２×３００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）により透明油（５．０９ｇ、収率３９％）の２を得た。
【化８３】
2008500375.tif 000086
【０２９４】
３．  テトラヒドロフラン（３５ｍＬ）中の２の溶液（５．０ｇ、１６ｍｍｏｌ）にＮａＨ（０．４２２ｇ、１７．６ｍｍｏｌ）を部分的に添加し、反応物をＲＴ下に２時間攪拌した。粗反応混合物を、セライトを通じてろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。次いで、エピクロロヒドリン（６．３ｍＬ、８．０ｍｍｏｌ）を滴下し、反応物をＲＴ下に４８時間攪拌した。結果として生じる油をＣＨ２Ｃｌ２（１２５ｍＬ）に溶解し、Ｈ２Ｏ（１２５ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（１２５ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１２５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、２０：１）により透明油（２．００ｇ、収率３４％）の３を得た。
【化８４】
2008500375.tif 000087
【０２９５】
４．  実施例９．１４に示されている同じ方法で調製：２（１．３４ｇ、４．８ｍｍｏｌ）、３（１．７５ｇ、４．８ｍｍｏｌ）、ＢＦ３・ＯＥｔ２（０．０６ｍＬ、０．４８ｍｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、２０：１）により透明油（１．０５ｇ、収率３４％）の４を得た。
【化８５】
2008500375.tif 000088
【０２９６】
５．  実施例９．１４に示されている同じ方法で調製：４−ニトロクロロギ酸エステル（０．４６４ｇ、２．３ｍｍｏｌ）、４（１．０ｇ、９．５ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（２．１ｍＬ、１．５５ｍｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル〜酢酸エチル／ＭｅＯＨ、２０：１）により黄色油（０．６６３ｇ、収率５３％）の５を得た。
【化８６】
2008500375.tif 000089
【０２９７】
６．  実施例９．１４に示されている同じ方法で調製：６−アミノカプロン酸（０．０５４ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、５（０．２７７ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（０．０９４ｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｏ（ＤＩ、５ｍＬ）により透明油（０．２６８ｇ、収率９６％）の６を得た。
【化８７】
2008500375.tif 000090
【０２９８】
７．  方法ＩＩを使用する活性化：６（０．２６８ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０４７ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．０８４ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１５：１）により透明油（０．１７８ｇ、収率５８％）の７を得た。
【０２９９】
９．１９  マルチ分岐鎖オリゴマーの合成
【化８８】
2008500375.tif 000091
【０３００】
１．  実施例９．１４における調製通り。 
【化８９】
2008500375.tif 000092
【０３０１】
２．  Ｌ−リジンエチルエステルジヒドロクロライド（０．３２ｇ、１．３ｍｍｏｌ）および１（１．７１ｇ、２．７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）中に溶解し、ＴＥＡ（０．９０ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温下に一夜攪拌した。粗反応液を蒸発させて乾燥させ、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）を溶解し、１ＭＨＣｌ（３０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ、２５：１）により透明油（１．０１ｇ、６６％収率）の２を得た。
【化９０】
2008500375.tif 000093
【０３０２】
３．  １Ｍ  ＮａＯＨ（ｌ０ｍＬ）中の２の溶液（１．０ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）をＲＴ下に６時間攪拌した。粗反応液を飽和ＮａＣｌ（５０ｍＬ）で希釈し、ｐＨ約２に酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させ、透明油（０．７２４ｇ、収率７４％）の３を得た。
【化９１】
2008500375.tif 000094
【０３０３】
４．  方法ＩＩを使用する活性化：３（０．０７０ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０９１ｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１８２ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（７ｍＬ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ、２０：１）により透明油（０．４８０ｇ、収率６３％）の４を得た。
【０３０４】
９．２０  糖−ＰＥＧ−アルキル修飾部分２，２−ジメチル−プロピオン酸４，５−ｂｉｓ−（２，２−ジメチル−プロピオニルオキシ）−６−（２，２−ジメチル−プロピオニルオキシメチル）−３−｛６−［２−（２−｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−ヘキサノイルアミノ｝−テトラヒドロ−ピラン−２−イルエステル）
【化９２】
2008500375.tif 000095
【０３０５】
１．  実施例９．１５に示されている同じ方法で調製：エチル６−ヒドロキシ−ヘキサノエート（８．０ｇ、０．０５ｍｏｌ）、塩化メタンスルホニル（４．６ｍＬ、０．０６ｍｏｌ）、ＴＥＡ（１０ｍＬ、０．０７２ｍｏｌ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（３２ｍＬ）により黄色油（１１．１５ｇ、収率９３％）の１を得た。
【化９３】
2008500375.tif 000096
【０３０６】
２．  テトラエチレングリコール（１９．１ｇ、０．０９８ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１９０ｍＬ）中に溶解し、ＮａＨ（１．６９ｇ、０．０７１ｍｏｌ）を０．５時間にわたって部分的に添加した。反応物をさらに１時間攪拌し、次いでテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中に溶解した１（２３．０ｇ、０．１３ｍｏｌ）を添加した。反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液を、セライトを通じてろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、蒸発させて乾燥させた。結果として生じる油をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、２５：１）により透明油（１．６０ｇ、収率１０％）の２を得た。
【化９４】
2008500375.tif 000097
【０３０７】
３．  １Ｍ  ＮａＯＨ（６ｍＬ）中の２の溶液（１．６０ｇ、４．７ｍｍｏｌ）をＲＴ下に２時間攪拌した。粗反応液を飽和ＮａＣＩ（２４ｍＬ）で希釈し、ｐＨ約２に酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させ、透明油（１．０８ｇ、収率７３％）の３を得た。
【化９５】
2008500375.tif 000098
【０３０８】
４．  ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−ガラクトースピラノシルアミン（０．８３６ｇ、１．６ｍｍｏｌ）および３（０．５０ｇ、１．６ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）中に溶解した。次いで、ＥＤＣＩ（０．３６８ｇ、１．９２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。一夜攪拌後、反応が不完了のままＥＤＣＩ（０．３６８ｇ、１．９２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をＲＴ下に一夜攪拌した。粗反応液をＣＨ２Ｃｌ２（２２ｍＬ）で希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（３０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ）により粘性油（０．３９７ｇ、収率３１％）の４を得た。
【化９６】
2008500375.tif 000099
【０３０９】
５．  方法Ｉを使用する活性化：４（０．３９７ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０６３ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．１０ｍＬ、０．７５ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（４ｍＬ）。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）により粘性油（０．２５６ｇ、収率５６％）の５を得た。
【０３１０】
９．２１  加水分解性、非加水分解性、およびペグ化利尿複合体
本実施例は、実質的にすべてのクラスのオリゴマー部分、特に非加水分解性オリゴマー、マイクロペグ化オリゴマー、および加水分解性オリゴマーを含むように修飾されているナトリウム利尿化合物複合体を提供するための本発明の有用性を明らかにするために提供されている。
【０３１１】
本ｈＢＮＰ複合体は、ペプチド上の異なる位置で複合されたさまざまなオリゴマーを利用して合成された。特性（受容体でのアゴニスト活性、タンパク質分解に対する耐性、および経口バイオアベイラビリティ）の最良の組合せを有する複合体は、インビボ試験でより広範囲におよぶ主要な候補となった。
【０３１２】
天然ｈＢＮＰは、契約ペプチド合成会社から得られた。複合において使用された両親媒性オリゴマーは、オリゴマーの供給元およびｈＢＮＰへの複合のために具体的に指定され合成されたオリゴマーに由来した。複合は、図２に示されている３層複合法に従った。クラス１のオリゴマーを最初に試験した。クラス１による広範囲な複合は活性が減少するため、クラス２のオリゴマーによるトリおよびテトラ複合体を調査した。クラス２の複合体は有効ではなかったため、２つのプロドラッグ複合体（クラス３のオリゴマー）が評価された。
【０３１３】
第１のクラスの複合体は非加水分解性である。このクラスの複合体のために、投与される医薬品成分（すなわち、複合体）は、受容体で作用する物質である。言い換えれば、オリゴマーおよびペプチドとのその付着は、投与の時点からクリアランスの時点まで無傷のままである。これらのオリゴマーは一般にアルキル部およびＰＥＧ部で構成されうる。複合体を経口的に利用可能にし、タンパク質分解に対して耐性のあるオリゴマーの効果を最大限にするために、アルキル部およびＰＥＧ部の長さは変更され、かつ順位は交換されうる。複合の程度（例えば、モノ、ジ複合体）も操作されうる。この第１のクラスの範囲である複合体を提供しうる一部のオリゴマーおよびかかる複合体を提供する方法が、エクウライブ（Ｅｋｗｕｒｉｂｅ）の米国特許第５，３５９，０３０号明細書、エクウライブ（Ｅｋｗｕｒｉｂｅ）の米国特許第５，４３８，０４０号明細書、エクウライブ（Ｅｋｗｕｒｉｂｅ）の米国特許第５，６８１，８１１号明細書、エクウライブ（Ｅｋｗｕｒｉｂｅ）の米国特許第６，１９１，１０５号明細書、１９９９年１２月３１日出願の米国特許出願第０９／４７４，９１５号明細書、１９９９年１２月１３日出願の米国特許出願第０９／４５９，４４３号明細書、および２００１年６月４日出願の米国特許出願第０９／８７３，７９７号明細書に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書で援用される。
【０３１４】
複合体の第２のクラスはマイクロペグ化される。このクラスの複合体のために、オリゴマーのアルキル部は、複合体が血流中にあると開裂される。これらの複合体は、複合が受容体のＮＰＲ−Ａとの結合に必要であるナトリウム利尿ペプチドの領域内で起こる場合に特に有用でありうる。かかる場合には、第１のクラスのオリゴマーは安定性および送達に有利でありうるが、活性にとって有害になりうる。第２のクラスの複合体では、その問題は低減され、またはなくなる。両親媒性オリゴマーは、消化管を通じて無傷のままであり、上部十二指腸における吸収を高める。循環にあると、アルキル部は開裂される。したがって、それが受容体に達すると、より小さなオリゴマーが循環ペプチドに付着される。一部の実施形態において、立体障害の減少は受容体での活性の増大をもたらす。この第２のクラスの範囲である複合体を提供しうる一部のオリゴマーおよびかかる複合体を提供する方法が、エクウライブ（Ｅｋｗｕｒｉｂｅ）らの米国特許第６，３０９，６３３号明細書、および２００１年１２月出願の米国特許出願第１０／０１８，８７９号明細書に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書で援用される。
【０３１５】
第３のクラスの複合体は完全に加水分解性である。このクラスの複合体のために、全体のオリゴマーは複合体が吸収されると開裂される。第２のクラスと同様、これらの複合体は、結合に必要である領域内で複合が起こると特に有用でありうる。しかし、マイクロペグ化複合体が依然として十分な活性を保持しない場合には、第３のクラスの複合体は、受容体結合に干渉するオリゴマーの可能性を完全に除去しうる。この場合、複合体は消化管を通じて無傷のままである。複合体が吸収されると、オリゴマーは開裂され、これは循環中に天然ペプチドを放出する。
【０３１６】
ｈＢＮＰの複合。両親媒性オリゴマー（Ｃ６ＰＥＧ７）のカルボキシル基は、ペプチド化学における一般的な活性化基である、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化される。活性化されると、オリゴマーは、水性またはＤＭＳＯ溶液のいずれかでペプチドと付着される。ｈＢＮＰは複合のための４つの部位、すなわち、３つのＬｙｓ残基とＮ末端である。反応の化学量論を変更することによって、複合（モノ、ジ、等）の程度は制御されうる。生成物分布は、反応条件を変更することによって変化されうる。複合のための好ましい部位が活性アッセイによって見出され、所望の複合体の優先的合成は、化学量論および反応条件を変更することによって得られうる。
【０３１７】
ＰＥＧ−アルキルオリゴマーの選択。アルカン（疎水性）およびＰＥＧ（親水性）要素の相対的長さを変更することによって、複合体の両親媒性および溶液構造は改善されうる。ＰＥＧ部は溶液中できわめて柔軟性であり、酵素に対する耐性において重要な役割を果たしうる。アルキル部は腸における吸収を高め、かつ／または細胞膜との相互作用を可能にしうる。後者の特徴は、標的が、ＮＰＲ−Ａなど、細胞表面上の膜−結合タンパク質である場合に特に重要でありうる。したがって、オリゴマーの選択は、酵素安定性および経口バイオアベイラビリティに関して複合体の有効性を決定しうる。
【０３１８】
ｈＢＮＰ複合体の精製。反応混合物は、イソプロパノール／水（０．１％トリフルオロ酢酸）で製造された溶媒勾配システムを備えた予備ＨＰＬＣカラム（Ｃ−１８）で精製される。溶媒は蒸発され、凍結乾燥されて乾燥生成物を生じる。複合体の純度は、逆相ＨＰＬＣおよび質量分析によって測定される。
【０３１９】
９．２１．１  クラス１のオリゴマー：非加水分解性
非加水分解性オリゴマー（クラス１）を利用した３０超の複合体が合成された。このクラスの複合体のために、投与される医薬品成分は受容体として作用する物質である。言い換えれば、オリゴマーおよびペプチドとのその付着は投与の時点からクリアランスの時点まで無傷のままである。ペプチドマッピング実験は、オリゴマーが付着されたｈＢＮＰでの部位を示した。反応に添加されるオリゴマーの量を変更することによって、生成物分布は歪められうる。形成された支配的なモノ複合体は、Ｌｙｓ３で複合され、支配的なジ複合体はＬｙｓ３およびｌｙｓ１４で付着したオリゴマーを有した。反応条件を変更することによって、トリ複合体およびテトラ複合体は唯一の生成物として形成されうる。トリ複合体によりＬｙｓ３、Ｌｙｓ１４、およびＬｙｓ２７でもオリゴマー付着が特徴づけられた。テトラ複合体はＮ末端での第４の付着を追加した。当初、入手可能なモノ、ジ、トリ、テトラ複合体のすべてがインビトロでの活性試験のために単離された。活性データに基づき、Ｌｙｓ３はクラス１のオリゴマーが焦点となった場合はモノ複合する。
【０３２０】
９．２１．２  クラス２のオリゴマー：マイクロペグ化
Ｌｙｓ１４およびＬｙｓ２７はＢＮＰの結合部に（または近くに）あるため、これらの部位のマイクロペグ複合はペプチドがより完全に複合され、依然として活性を保持することを可能にするという理論に基づき、マイクロペグ化（クラス２）を利用した８つの複合体が、合成された。両親媒性オリゴマーは消化管を通じて無傷のままであり、上部十二指腸における吸収を高める。循環に入ると、アルキル部は開裂される。したがって、それが受容体に達すると、より小さなオリゴマーが循環ペプチドと付着される。このクラスのトリおよびテトラ複合体はいずれもアルキル基の開裂前後に合成された。アルキル基が開裂された後でも、３もしくは４つの部位でＢＮＰに付着した小さなＰＥＧ単位は活性にとって有害となった（次項で示されるデータ）が、これらの複合体は治療上重要な程度の活性を保持した。
【０３２１】
９．２１．３  クラス３のオリゴマー：加水分解性オリゴマー
完全に加水分解性のオリゴマー（クラス３）を利用した８つの複合体が合成された。このクラスの複合体について、複合体は消化管を通じて無傷のままである。複合体が吸収されると、オリゴマーは開裂され、循環中に天然ペプチドを放出する。第２のクラスと同様、これらの複合体は、結合に必要である領域内で複合が起こる場合に有用である。しかし、マイクロペグ化複合体が依然として活性を保持しない状況では、第３のクラスの複合体は、受容体結合に干渉するオリゴマーの可能性を完全に除去する。モノ、ジ、トリ、およびテトラ複合体はこのクラスのオリゴマーで製造された。トリおよびテトラ複合体は安定ではなかった。２つの複合体が試験された。
【０３２２】
反応混合物はイソプロパノール／水（０．１％トリフルオロ酢酸）で製造された溶媒勾配システムを備えた予備ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８）で精製された。溶媒は蒸発され、凍結乾燥されて乾燥粉末である複合体を得た。複合体の純度は、逆相ＨＰＬＣおよび質量分析によって測定された。
【０３２３】
天然ＢＮＰは、天然、野生型ｈＢＮＰペプチドの活性の尺度を提供するアッセイにおいて検査された。使用された天然ｈＢＮＰは１−３２個のアミノ酸配列、ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ、（配列番号    ）であったが、ここでＣ１０およびＣ２６はジスルフィド結合によって接合され、結合を形成する。構成物の２９個の結果および構造は表１に示されている。ＢＮＰ複合体は、ＥＣ５０およびＥｍａｘについて評価され、これらの値は天然ペプチドについて同じ実験条件下に得られたものと比較された。オリゴマー部分を有さない天然ＢＮＰ（１−３２ａａ）と比較されたこれらのデータは表１に示されている。結果は、クラス１の修飾部分Ｌｙｓ３（ＢＮＰ−００２）を含んだモノ複合体ＢＮＰ、およびＬｙｓ１４またはＬｙｓ２７でクラス２の修飾部分を含むモノ複合体ＢＮＰを好む傾向を示す。モノ−１、モノ−２、モノ−３、およびモノ−４はＢＮＰのモノ複合体であり、それらがＨＰＬＣで溶離する順に分類されている。以下の表において、モノ−１ＢＮＰは、Ｌｙｓ−３ＢＮＰ残基で指示された修飾部分（オリゴマー構造）を含むＢＮＰペプチド複合体である。モノ−２およびモノ−３はＨＰＬＣで共溶離し、Ｌｙｓ−１４とＬｙｓ−２７の混合物である。ジ複合体は一般にＨＰＬＣで密接に溶離する混合物として得られる。主要なジ複合体はＬｙｓ３／Ｌｙｓ１４およびＬｙｓ３／Ｌｙｓ２７である。支配的なトリ複合体は、Ｌｙｓ３、Ｌｙｓ１４、およびＬｙｓ２７で複合される。「モノ−４」と特定された生成物は、ＢＮＰペプチドのＮ末端で修飾部分（オリゴマー）を含む。「モノ−１」は、ＢＮＰペプチドのＬｙｓ３で複合された修飾部分を含む。「モノ−２」生成物は、ＢＮＰペプチドのＬｙｓ１４、またはＢＮＰペプチドのＬｙｓ２７で複合された修飾部分（オリゴマー）を含む。結果については、図６ａ−図６ｄに記載された表を参照。
【０３２４】
９．２２  ナトリウム利尿ペプチドの候補−ウロジラチン、デンドロアスピスナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）、およびイヌナトリウム利尿ペプチド
本複合法は、多くの異なるナトリウム利尿ペプチドおよびこれらペプチドの類似体といっしょに使用され、薬理活性が保持され、細胞−膜透過性、および／またはプロテアーゼ耐性が高められた、任意の数の異なる生物活性ナトリウム利尿ペプチド複合体の実施形態を構成しうることが理解される。本明細書のいくつかの実施例に記載されたｈＢＮＰに加えて、これら候補のペプチドとしては、部分的なリストによって、生物学的に同等なペプチド／タンパク質の以下の集合から調製および／または単離されたペプチド、ペプチド断片、全ペプチド、およびマルチ構成ペプチドが挙げられる。これらの構成物およびその保存置換構成物を本発明の実施形態の調製、およびうっ血性心不全の治療において本明細書で規定された少なくとも１つの修飾部分を有する複合形態でこれらの構成物を含有する医薬調製物に含めることは本発明の範囲内にある。これらのペプチドは修飾複合部分に適した構造を有する。
【０３２５】
１．ウロジラチン（Ｎ末端で４つの追加の残基を有するｈＡＮＰ）
ＴＡＰＲＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＸ１Ｙ（配列番号    ）
アミノ酸Ｔは修飾部分複合部位を規定する。上記の配列において、Ｘ１はリシンまたはアルギニン以外のアミノ酸である。Ｘ１がリシンである場合、第２の修飾部分複合部位が提供されている。
【０３２６】
２．イヌナトリウム利尿ペプチド（イヌＮＰ）
イヌＢＮＰは、複合体の製造のために天然の利点を提供する。ループ領域で複合部位は存在しない。複合部位は、Ｎ−およびＣ−末端尾に存在する。これらの特徴は、活性の実質的な喪失のない複合を可能にするであろう。これはより小さな生成物分布をもたらし、結果として高い収率および容易な精製がもたらされる。
【０３２７】
ＳＰＸ１ＭＭＨＸ２ＧＧＣＦＧＲＲＬＤＲＩＧＳＬＳＧＬＧＣＮＶＬＲＸ３Ｙ（配列番号    ） 
Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のアミノ酸部位は、修飾部分複合部位を示す。この中性ペプチドでは、ペプチドの３つの部位すべてが修飾部分を有する複合のために利用可能である。ループ領域は、アミノ酸１０（Ｃ）〜アミノ酸２６（Ｃ）で特定される。３位、１４位、または２７位でのアミノ酸のいずれか２つまたは３つすべてが、ＡｒｇなどＬｙｓ以外の残基で置換されうることが想定される。
【０３２８】
３．デンドロアスピスナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）
ＥＶＸ１ＹＤＰＣＦＧＨ  Ｘ２ＩＤＲＩＮＨＶＳＮ  ＬＧＣＰＳＬＲＤＰＲＰＮＡＰＳＴＳＡ（配列番号    ）
Ｘ１およびＸ２のアミノ酸部位は修飾部分複合部位である。本実施例の場合、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸Ｌｙｓである。一部の実施形態において、Ｘ１はＡｒｇであり、またはＸ２はＡｒｇである。Ｎ末端も複合部位である。好ましくは、Ｘ１がリシンである場合、Ｘ２はアルギニン（またはリシン以外）である。場合により、ペプチドはＮ末端で追加的な複合部位を含みうる。
【０３２９】
４．Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）
ＧＬＳＫ１ＧＣＦＧＬＫ２ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号    ）
Ｋ１およびＫ２のアミノ酸部位は修飾部分複合部位である。本実施例では、Ｋ１およびＫ２はいずれもアミノ酸Ｌｙｓである。しかし、ペプチドの類似体が、ペプチドにおけるこれら位置のいずれかまたは両方でＬｙｓの代わりにＡｒｇ（Ｒ）を含みうる。場合により、ペプチドはＮ末端で追加的な複合部位を含みうる。
【０３３０】
５．ＡＮＰ（ヒト）（ラット）（ブタ）
ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＸＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ（配列番号    ）
本実施例において、ＸはＭｅｔ（Ｍ）またはＩｌｅ（Ｉ）であり、かつここで修飾部分複合部位はＮ末端にあり、またはＲはＫに変更され、修飾部分部位を提供する。
【０３３１】
９．２３  ヒトナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）でのアゴニスト活性
ＢＮＰの血管弛緩、ナトリウム利尿、および利尿特性は、二次メッセンジャーの環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）に原因がある。ｃＧＭＰの産生は、ＢＮＰが内皮細胞の表面上でナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）と結合する場合に活性化される酵素であるグアニル酸シクラーゼによって達成される。非加水分解性（クラス１）またはマイクロペグ化（クラス２）オリゴマーによる複合体の、ナトリウム利尿ペプチド受容体−Ａ（ＮＰＲ−Ａ）を発現するヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）におけるｃＧＭＰの産生を刺激する能力が評価された。マイクロペグ化グループについて、複合体は付着されたアルキル部の有無により試験された。完全に加水分解性のオリゴマー（クラス３）による複合体は、最終的に循環中に放出される化合物が天然ぺプチドであるため、本アッセイにおいて評価されなかった。
【０３３２】
非加水分解性（クラス１）オリゴマーを利用するトリおよびテトラ複合体はあまり活性ではなかった。したがって、マイクロペグ化（クラス２）オリゴマーを利用するトリおよびテトラ複合体が調製され、試験された。これらクラス２のオリゴマーから生成されたインビトロデータは表２に示されている。
【表２】
2008500375.tif 000100
【０３３３】
図３は、クラス１のオリゴマーを利用するさまざまなＬｙｓ−３複合体の活性曲線を示す。表２の４つの複合体は、ＢＮＰペプチドの天然形態で得られた活性のもの（表３）と最も近い平均Ｅｍａｘおよび平均ＥＣ５０を明らかに示し、したがってさらに他のアッセイで評価された。
【表３】
2008500375.tif 000101
【０３３４】
一次ＨＡＥＣは、ｃＧＭＰスクリーニングのためのクロネティクス社（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）から購入された。細胞を実験前日に１２ウェルプレートへ配置した。実験の当日、細胞を０．５ｍＭ  ＩＢＭＸとともに１０分間、３７℃下にプレインキュベートし、ホスホジエステラーゼを阻害した。試験化合物をさらに６０分間、３７℃下に細胞に添加し、細胞を溶解することによってインキュベートを停止し、ｃＧＭＰを測定した。ＥＬＩＳＡベースのｃＧＭＰキットを使用し、ｃＧＭＰ産生を測定した（ＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ−ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号Ｒ８０７４、モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ）、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州（ＣＡ））。このキットでは、９６ウェルフォーマットでの競合免疫アッセイによってｃＧＭＰが測定される。細胞溶解物をコーティングしたマイクロプレートに添加した後、抗ｃＧＭＰ抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ｃＧＭＰ複合体を添加した。プレートは２時間、室温下にインキュベートした後、４回洗浄した。基質溶液を添加し、各々のウェルの蛍光強度を定量した。蛍光信号強度は、ｃＧＭＰのレベルの上昇とともに低下した。天然ｈＢＮＰを各々実験で陽性対照として試験した。
【０３３５】
９．２４  ＢＮＰ複合体およびプロテアーゼに対する耐性の増大
インビトロで活性であったナトリウム利尿化合物は、トリプシンおよびキモトリプシンなどさまざまなプロテアーゼの存在下にその安定性について試験されている。プロテアーゼと複合されたこれら化合物の安定性は、トリプシンおよびキモトリプシンの存在下に化合物複合体の半減期によって決定されうる。したがって、これらのアッセイにおける幾つかの複合体評価は、天然ｈＢＮＰよりも長い半減期を有した。例えば、図４を参照。
【０３３６】
複合体を酵素で２〜１２０分間３７℃下にインキュベートした。１：１の１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：イソプロパノールクエンチング液を添加することによって消化を停止した。各々の実験でｈＢＮＰ複合体の消化を天然ｈＢＮＰの消化と比較した。各々の試料に残った親化合物の量をＨＰＬＣ分析によって定量した。
【０３３７】
９．２５  ＢＮＰ複合体および経口バイオアベイラビリティ
インビトロで活性であった複合体をその経口バイオアベイラビリティについてラットで試験した。複合体を経口強制によって胃腸管へ投与し、血流中のＢＮＰ複合体の存在を利用可能なラジオイムノアッセイ法を使用して分析した。ＢＮＰの検出用抗体は特異的であり、ラットＢＮＰとの交差反応は１％未満である。したがって、交差反応および内因性ラットＢＮＰによる干渉は問題ではなかった。
【０３３８】
体重約２５０ｇの成体雄ラットをｈＢＮＰおよびｈＢＮＰ複合体の経口バイオアベイラビリティを測定するために使用した。ラットを一夜絶食させ、水道水を自由に与えた（投与後１時間まで投与前２時間の水なし期間を除く）。
【０３３９】
投与前、ラットを秤量して体重によって投与群を通じて分布し、各々投与群の体重がほぼ同じになるようにした。ラット５匹を時点毎に使用した。液体脂肪酸製剤の複合体を２．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。投与後５、１５、３０、および６０分で採血した。全投与実験の中心静脈血液を採取し、遠心分離した。血漿試料を分析のために−８０℃下に凍結した。
【０３４０】
ｈＢＮＰの血漿濃度を血漿中のヒトＢＮＰの定量測定に特異的な市販の免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）によって測定した（ＳＨＩＯＮＯＲＩＡ（商標）ＢＮＰ、カタログ番号１２７０２４、塩野義製薬株式会社（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ  ＆  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）、大阪、日本）。血液を投与ラットからＥＤＴＡコーティングしたプラスチックのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）採血管ヘ取り出し、冷凍（２−８℃）遠心分離機において１６００−２０００ｘｇで５分間遠心分離した。プラスチック管中の試料を非フロストフリーフリーザーにおいて−８０℃下に分析まで保存した。５００μＬの試料をＩＲＭＡ用に使用した。１００μＬの試料を２００μＬの１２５Ｉ−ＢＮＰ試薬および抗ＢＮＰ抗体コーティングしたビーズとともに管へ添加した。各々の管をボルテックスし振盪せずに１８〜２２時間、２〜８℃下にインキュベートした。次いで、管を吸引し、２．０ｍＬの洗浄液（緩衝液＋０．０５％ＮａＮ３）で洗浄し、次いで再吸引した。洗浄工程を反復し、管の内容物を吸引した。各々管の残留放射能をガンマカウンターで計算した。放射能は試料中のｈＢＮＰまたはｈＢＮＰ複合体の濃度と正比例した。ｈＢＮＰ複合体の試料を正確に定量し、ｈＢＮＰ複合体と天然分子との間の抗体認識の差を可能にするために、適切なｈＢＮＰ複合体で得られた標準曲線から濃度を決定した。
【０３４１】
ラットに投与された４つの複合体は投与後５分の循環中ですべて検出可能であった（図５）。これら４つの複合体は、ＢＮＰ−００２、ＢＮ−０２１、ＢＮ−０２２、およびＢＮ−０２４であった。
【０３４２】
９．２６  ペプチド構造でのジ複合体、モノ複合体、およびトリ複合体ポリマー修飾の調製
本実施例は、最適な生物活性ペプチドのマルチ複合体形態の作製における本発明の有用性を証明するために提供されている。一例として、本説明では、ヒトナトリウム利尿ペプチド、ｈＢＮＰのモノ複合体、ジ複合体、およびトリ複合体形態が記載される。
【０３４３】
ｈＢＮＰに複合するためのプロトコール
オリゴマーはｈＢＮＰに複合するために使用される同じ方法によって付着されるであろう。１つの違いは、より多くの活性化オリゴマーが添加されうることである（１−１０当量、好ましくは、３−５当量）。
【０３４４】
リシンは配列の尾にある。多重複合部位はプロテアーゼの存在下に大きな安定性を与えると考えられる。ループ内の複合部位の欠如はＮＰＲ−Ａ結合モチーフでの結合に有利である。
【０３４５】
９．２７  ｈＢＮＰ両親媒性ポリマー複合体の合成
異なるサイズおよび化学組成物の両親媒性オリゴマーを使用することによって、ｈＢＮＰ複合体などペプチド複合体の吸収および分配特性が変更されうる。複合体スクリーニングは、どの複合体が天然ペプチドの活性を保持し、酵素に対する耐性の増強を示すかを判定するために使用される。所望の特性の組合せ（例えば、受容体でのアゴニスト活性、タンパク質分解に対する耐性、および経口バイオアベイラビリティ）を有する複合体は、より大規模なインビボ試験の主要な候補となりうる。
【０３４６】
９．２７．１  ＢＮＰに複合するための一般的方法
モノ複合体ｈＢＮＰではＬｙｓ３またはＬｙｓ１４、もしくはＬｙｓ２７、またはペプチドのＮ末端での部位が使用される。
【０３４７】
方法Ｉ：モノ複合体の調製
ｈ−ＢＮＰ（１当量）をＤＭＳＯ（１ｍＬ／３５ｍｇのｈ−ＢＮＰ）中に溶解した。活性化オリゴマー（１．１当量）を最小量のＴＨＦ中に溶解し、ＤＭＳＯ中のｈ−ＢＮＰの溶液に添加した。反応をＨＰＬＣによってモニタリングした。５０μＬの反応物を取り、それを０．１％ＴＦＡを含有する５００μＬのＨ２Ｏ中で希釈することによってＨＰＬＣモニタリングのための試料を調製した。反応は４５分間行われた。反応物が直ちに精製されなかった場合は、精製が実行されうるまでそれらを凍結した。
【０３４８】
方法ＩＩ：多重複合体の調製
ｈ−ＢＮＰ（１当量）をＤＭＳＯ（１ｍＬ／３５ｍｇのｈ−ＢＮＰ）中に溶解した。ｈ−ＢＮＰが溶解されると、ＴＥＡ（１２０当量）を添加し、溶液を５分間攪拌した。次いで、活性オリゴマー（ジ複合体で２．２当量、トリ複合体で４当量、テトラ複合体で５当量）を最小量のＴＨＦ中に溶解し、ＤＭＳＯ中のｈ−ＢＮＰの溶液に添加した。反応をＨＰＬＣによってモニタリングした。５０μＬの反応物を取り、それを０．１％ＴＦＡを含有する５００μＬのＨ２Ｏ中で希釈することによってＨＰＬＣモニタリングのための試料を調製した。反応は４５分間行われた。反応物が直ちに精製されなかった場合は、精製が実行されうるまでそれらを凍結した。
【０３４９】
ジ複合体ｈＢＮＰではｈＢＮＰ上のＬｙｓ３およびＬｙｓ１４、またはＬｙｓ３およびＬｙｓ２７の部位が使用される。
【０３５０】
トリ複合体ｈＢＮＰではＬｙｓ３、Ｌｙｓ１４、およびＬｙｓ２７の部位が使用される。
【０３５１】
９．２８  ナトリウム利尿化合物類似体
本実施例は、本発明の実施における使用ために生物活性ＢＮＰ様ペプチドおよびそのペプチド断片のさまざまな形態を提供するための本発明の有用性を証明するために提供されている。これらの変形形態、または類似体は、対応する天然ペプチド／タンパク質からの天然起源アミノ酸の代わりに１つもしくはそれ以上の変異アミノ酸の存在によって特徴づけられる。
【０３５２】
１．ｈＢＮＰループ領域のみの類似体
ＣＦＧＲＸＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−（配列番号１）
ここでＸはＬｙｓ以外のアミノ酸であり、またはＸはＡｒｇまたはＧｌｙである。
【０３５３】
２．ｈＢＮＰ−３ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類似体
−ＳＰＲＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ２−（配列番号    ）
ここで、Ｘ２は長さが１〜１０個のアミノ酸、好ましくは１〜６個のアミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ２はＫＶＬＲＲＨ、ＫＶＬＲＲ、ＫＶＬＲ、ＫＶＬ、ＫＶ、Ｋ、ＲＶＬＲＲＨ、ＲＶＬＲＲ、ＲＶＬＲ、ＲＶＬ、ＲＶ、またはＲである。
【０３５４】
３．ｈＢＮＰ−３変異部位の類似体、３Ａｒｇ、１４Ａｒｇ、２７Ａｒｇ
ＳＰＸ１ＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＸ２ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ３ＶＬＲＲＨ（配列番号    ）
式中、Ｘ１はＬｙｓまたはＬｙｓ以外のアミノ酸であり、Ｘ２はＬｙｓ以外のアミノ酸であり、Ｘ３はＬｙｓまたはＬｙｓ以外のアミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は独立してＡｒｇまたはＧｌｙである。一部の実施形態において、Ｘ１はＬｙｓであり、Ｘ２およびＸ３は独立してＡｒｇまたはＧｌｙである。好ましい実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３の少なくとも１つはＬｙｓである。
【０３５５】
４．ｈＢＮＰ−１４および２７Ａｒｇの類似体、および末端修飾部位、Ｘ１。
【０３５６】
Ｘ１ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＸ２ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ３ＶＬＲＲＨ−（配列番号    ）
ここでＸ１はＣ末端修飾部位（Ｓｅｒ）であり、Ｘ２およびＸ３はＬｙｓ以外のアミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ２およびＸ３は独立してＡｒｇまたはＧｌｙである。他の実施形態において、Ｘ２はＡｒｇであり、Ｘ３はＬｙｓである。
【０３５７】
５．ｈＢＮＰ−１４Ａｒｇの類似体
（一方または両方の尾がループまで短縮されているすべての断片）
Ｘ１−−−ＣＦＧＲＲＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ２（配列番号１）
ここで、Ｘ１は長さが１〜１０個のアミノ酸、好ましくは１〜９個のアミノ酸であり、かつＸ２は長さが１〜１０個、好ましくは１−６個のアミノ酸である。Ｘ１はＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＭＶＱＧＳＧＣ、ＶＱＧＳＧＣ、ＱＧＳＧＣ、ＧＳＧＣ、ＳＧＣ、ＧＣ、Ｃ、ＳＰＫ、ＳＰＫＭ、ＳＰＫＭＶ、ＳＰＫＭＶＱ、ＳＰＫＭＶＱ、ＫＭＶＱ、ＫＭＶ、ＫＭＶＱＧ、ＫＭＶＱＧＳ、ＫＭＶＱＧＳＧ、またはＫＭＶＱＧＳＧＣを含んで成りうる。Ｘ２はＫＶＬＲＲＨ、ＫＶＬＲＲ、ＫＶＬＲ、ＫＶＬ、ＫＶ、Ｋ、ＲＶＬＲＲＨ、ＲＶＬＲＲ、ＲＶＬＲ、ＲＶＬ、ＲＶ、またはＲを含んで成りうる。
【０３５８】
６．ｈＢＮＰ１−２９−３ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類似体
ＳＰＸ１ＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−ＫＶＬ（配列番号    ）  
ここでＸ１はＡｒｇ、またはＬｙｓ以外のアミノ酸である。
【０３５９】
７．ｈＢＮＰ１−２６−３ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類似体
ＳＰＸ１ＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ（配列番号  ）
ここでＸ１はＡｒｇ、Ｇｌｙ、またはＬｙｓ以外の他のアミノ酸である。
【０３６０】
８．ｈＢＮＰ−短縮Ｃ末端尾Ｌｙｓ１４Ａｒｇ、２７Ａｒｇ、またはＬｙｓ以外のアミノ酸の類似体
Ｘ１−ＣＦＧＲＲＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−ＲＶＬＲＲＨ（配列番号  ）  
ここでＸ１は長さが１〜１０個のアミノ酸、好ましくは、１〜９個のアミノ酸である。Ｘ１は、ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＭＶＱＧＳＧＣ、ＶＱＧＳＧＣ、ＱＧＳＧＣ、ＧＳＧＣ、ＳＧＣ、ＧＣ、またはＣを含んで成りうる。
【０３６１】
９．ｈＢＮＰ−Ｌｙｓ１４ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類似体
−ＣＦＧＲＸ１ＭＤＲＩＸ２ＧＬＧＣ−（配列番号 ）
ここでＸ１はＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸であり、Ｘ２は１〜４個のアミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ２はＳＳＳＳ、ＳＳＳ、ＳＳ、Ｓ、ＫＳＳＳ、ＫＳＳ、またはＫＳである。
【０３６２】
１０．ｈＢＮＰ−Ａｒｇ３０Ｌｙｓまたは荷電様の他の同等のアミノ酸の類似体
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＲＸ１ＲＨ（配列番号  ）
ここでＸ１はＬｙｓまたはＡｒｇ以外のアミノ酸の類似体である。
【０３６３】
１１．ｈＢＮＰ−２７ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類似体
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＸ１ＶＬＲＲＨ（配列番号  ）
ここでＸ１はＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸である。
【０３６４】
１２．  ｈＢＮＰの伸長形態
−ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−ＫＶＬＲＲＨ−Ｘ２（配列番号    ）
Ｘ２はＬｙｓ、Ｃｙｓ、またはＬｙｓ＋Ｘａａｎであり、ここでｎは１〜１００、１〜５０、または１〜１０であり、Ｘａａはアミノ酸、または独立して選択されるアミノ酸のクループ、または未知のアミノ酸である。
【０３６５】
１３．欠失変異体類似体−ｈＢＮＰ
−ＣＦＧＲＸ１ＭＤＲＩＸ２ＧＬＧＣ−（配列番号    ）
ここでＸ１はＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸であり、かつＸ２は、ＳＳＳＳ、ＳＳＳ、ＳＳ、Ｓ、ＫＳＳＳ、ＫＳＳ、またはＫＳなどの１〜４個のアミノ酸である。
【０３６６】
１４．ｈＢＮＰ類似体―受容体特異性
ＳＰＺ１ＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＺ２ＭＤＲＩＳＳＳＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｃ
ここでＺ１はアルギニンまたはリシン以外のアミノ酸であり、かつＺ２はアルギニンまたはリシン以外のアミノ酸であり、Ｘ１はＧｌｙ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはその保存置換であり、かつＸ２はＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅ、またはその保存置換であり、かつＸ３はＧｌｙ、Ａｒｇ、またはその保存置換である。本類似体の別の実施形態において、Ｚ１はリシンであり、Ｚ２はアルギニンまたはリシン以外のアミノ酸である。
【０３６７】
１５．ＡＮＰ類似体
ＫＣＦＫＧＫＮＤＲＸＩＫＸ２ＱＳＧＬＸ３Ｃ−ＮＳＦＫＹ
ここでＸ１はＴ、ａ、Ｒ、Ｈ、Ｐ、Ｅであり、
ここでＸ２はＫ、Ｎ−メチル、Ａｒｇ、Ｓ、Ｄ、またはＰであり、
ここでＸ３はＡｒｇ、Ｋ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｐ、Ｏｍ、Ｈａｒ、Ｈａｒ、ｐ−アミジノフェニルＡｌａ、Ｉ、Ｇｌｙ、またはＴｒｙ以外のプラス荷電を有する他のアミノ酸である。
【０３６８】
９．２６  ＢＮＰ複合体を製造する天然ＢＮＰおよびＢＮＰプロペプチドの組換え製造およびプロペプチド方法
投与の経口経路は、ＢＮＰペプチドの大量の供給を必要とする。ＢＮＰを供給する合成手段と関連した高い費用および供給量の制限により、複合ＢＮＰペプチドを調製するために組換え技術が好ましいであろう。複合体の産生のためのペプチドの供給のための組換え技術がここでは望ましい。
【０３６９】
９．２６．１  組換え技術の選択
目標は、グリコシル化がなく、容易な単離のために可溶性形態で分泌されるペプチドを有する小さいタンパク質（＞１０，０００Ｋ）を発現することが知られている高発現組換え技術を選択することである。
【０３７０】
大腸菌（Ｅ−ｃｏｌｉ）ベースの発現系（参照により本明細書で援用される、セイルハマー（Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ）らの米国特許第５，１１４，９２３号明細書）は、承認薬Ｎａｔｒｅｃｏｒ（登録商標）のバルクＢＮＰの製造に使用される。大腸菌の細菌系の使用は公知であり、短鎖タンパク質の組換え製造のために過去何十年も業界において十分に利用されている。大腸菌系は一般に実験室で使用に単純な系である。高収率のタンパク質発現を提供する高い細胞密度を有する多くの新しい大腸菌系が開発されている。しかし、一般に、その不溶性形態でタンパク質を封入体へ分泌し、かつ不適切に折畳まれる（システインアミノ酸残基間の不適切なジスルフィド結合）傾向のため大腸菌ベースの系を使用する制限がある。これらの制限はしばしば高い原価をもたらし、高価な下流処理ステップを使用してタンパク質を封入体から単離し、不適切な折畳みタンパク質をその天然状態に再折畳む必要がある。
【０３７１】
９．２７  プロタンパク質（プロＢＮＰ）配列の構成物
ナトリウム利尿化合物は配列に２つもしくはそれ以上のナトリウム利尿化合物単位を有し、場合によりナトリウム利尿化合物単位間のスペーサー配列を含むマルチペプチドでもあり、かつ構成物は、場合により、ナトリウム利尿ペプチド化合物のいずれかまたは両方の末端でのリーダーおよび／または伸長配列をも含んでなりうる。例えば、マルチペプチドを特定の構成物に限定することなく、マルチペプチドは以下の構造を有しうる。すなわち、
ＮＰ−［ＮＰ］ｎ、
ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］ｎ、
リーダー−ＮＰ−［ＮＰ］ｎ
リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］ｎ、
リーダー−［スペーサー−ＮＰ］ｎ、
リーダー−［スペーサー−ＮＰ］ｎ−伸長、
リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］ｎ−伸長、
ここで、ｎは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０であり、ＮＰはナトリウム利尿ペプチドまたはナトリウム利尿ペプチド類似体である。
【０３７２】
９．２９  プロＢＮＰ
本発明は、さらにプロ−Ｘ−ポリペプチドも提供するが、ここでＸはナトリウム利尿ペプチドである。ＢＮＰのためのプロ−Ｘ−ポリペプチドは、プロ部分としてリーダーペプチドを有するように設計されうるが、これは酵素開裂部位によってＢＮＰ配列に結合されうる。選択組換え技術でプロＢＮＰペプチドとしてペプチドの発現をコードする遺伝子配列が設計されうる。プロ部分は、発酵スキームからより有効な精製を補助するようにも選択されうる。プロＢＮＰペプチドはオリゴマーと発現後に複合され、次いで、プロ部分は選択酵素によって開裂され、動員または固定化され、高収率で従来のクロマトグラフ法によってより容易に精製されうるＢＮＰ複合体を提供しうる。特定の酵素開裂部位がプロ部分とＢＮＰ配列との間に含まれ、プロ部分は酵素的に開裂され、ＢＮＰ配列を得ることができる。
【０３７３】
９．２９．１  プロＢＮＰモデル合成
プロＢＮＰ構成物は、ＢＮＰ配列および追加の特定のアミノ酸を有する合成プロＢＮＰ モデルで評価されるであろう。この合成モデルはオリゴマーで複合され、特定の酵素によって開裂にかけられ、ＢＮＰオリゴマー複合体の産生をモニタリングする。
【０３７４】
９．２９．２  プロＢＮＰの設計
リーダー配列（プロ部分）は、合成モデルに基づく特定の酵素開裂配列を有する小さなペプチドを含みうる。他の機能的アミノ酸配列もリーダー／スペーサー配列において挿入され、プロＢＮＰタンパク質の容易な精製を可能にしうる。リーダー配列はプロ部分としても使用され、複合中の望ましくない修飾からＮ末端を保護しうるとともに、特定の酵素処置で開裂されうる。他の特徴もリーダーペプチド配列に組込まれ、プロＢＮＰとして、またはプロＢＮＰオリゴマー複合体としての単離の容易さも可能にしうる。リーダーペプチドはＢＮＰ配列のＣ末端にも付着されうる。リーダーペプチドは既知の融合タンパク質の付着を可能にするようにも設計されうる。
【０３７５】
９．２９．３  プロＢＮＰ発現
機能的に特定のリーダー配列が、選択組換え技術の発現遺伝子配列または発現カセットへの挿入のためにＢＮＰのＮ末端および／またはＣ末端で提供されうる。既知の融合タンパク質の発現配列（ガーケン（Ｇａｋｅｎ）ら、２０００年、融合タンパク質に関するその教示についてその全体の開示が参照により本明細書で援用される、を参照）も構成物の１つにおける発現遺伝子へ挿入されうる。確立した方法を使用することにより、細胞における有効な形質転換発現遺伝子がモニタリングされうる。好ましい形質転換分離株または細胞が単離され、設計されたタンパク質の発現について評価のために成長させうる。発現タンパク質が精製され、配列決定されうる。次いで、精製プロＢＮＰ構成物が評価されうる。選択細胞系は選択の将来の使用のために特徴づけられ、選択されうる。
【０３７６】
９．２９．４  トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ開裂スペーサーおよびＨｉｓタグリーダーペプチドによるプロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の構成
プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の全長のコード配列は、以下の式、すなわち、リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］ｎ［式中、
スペーサーはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、
リーダーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり、
伸長は（Ｈｉｓ）６−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）であり、
ＮＰはｈＢＮＰである。］
に従って提供されうる。
【０３７７】
本実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体は、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルを使用して放出されうる。
【０３７８】
（ａ）プラスミド構成
標準分子生物学の方法を使用して、プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１［（Ｈｉｓ）６−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）−ＢＮＰ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＢＮＰ  −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＢＮＰ  −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＢＮＰ−  Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＢＮＰ］のアミノ酸配列を発現するためにプラスミドを構成する。このプラスミドは、使用される宿主細胞（例えば、大腸菌）に最適化されるコドンである。
【０３７９】
このマルチペプチド配列をコードするＤＮＡ断片が、合成的にアセンブリされ、これはリーダー後配列から開始し、開裂部位はＨｉｓタグの３’／ＢＮＰ配列の５’の順序で添加される。配列のｃＤＮＡは、標準の方法を使用してポリアクリルアミドゲルから精製される。プラスミド構造は制限酵素分析によって確認される。
【０３８０】
（ｂ）発現および細胞回収
プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１を発現する大腸菌細胞をプロマルチペプチドを十分に産生する栄養物で培養する。（Ｈｉｓ）６タグプロ−ペンタＢＮＰを細胞から細胞破壊によって回収したのち遠心分離、接線ろ過／限外ろ過、均質化、および封入体の可溶化を行う。
【０３８１】
（ｃ）親和性クロマトグラフィーによるプロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の可溶化封入体からの単離
ＨｉＴｒｐキレート（Ｎｉ２＋）ＨＰカラム（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を調製し、カラムを１０カラム容量の蒸留水で洗浄し、貯蔵溶液を除去し、金属イオン溶液（ＮｉＳＯ４、Ｏ．１Ｍ）で荷電し、蒸留水で洗浄し、非結合を除去する。封入体可溶化後のろ過液をこのカラムに充填し、カラムを１０カラム容量の結合緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび２０ｍＭイミダゾール含有）で洗浄し、直線勾配１０カラム容量の溶離緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．５Ｍイミダゾール含有）を使用し、カラムを溶離し、その後に１００％で別の２カラム容量の溶離緩衝液で溶離する。この方法により、カラムのＮｉ２＋親和性へのキレート化によって細胞回収試料からの他の要素から（Ｈｉｓ）６タグペンタペプチドが精製される。ペンタペプチドの純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって＞３０％であると分析される。
【０３８２】
（ｄ）精製および分析
次いで、ペンタペプチドはさらにＣ−１８予備ＨＰＬＣによって＞７５％の純度に精製される。精製ペンタペプチドはＥＳ／ＭＳ分析によって分析され、プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の予想ＭＷのＭ＋１イオンピークが提供される。材料のマイクロシークエンシングを使用し、マルチペプチドのアミノ酸配列が確認される。
【０３８３】
９．２９．５  プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１からのＬｙｓ−３ＢＮＰ複合体の多重単位の製造
（ａ）ペンタペプチドの複合
プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１（３．２０×１０−４ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解する。この溶液に、４５ｕＬのトリエチルアミンを添加する。エタノール中活性化ＰＥＧ７−ヘキシルオリゴマー（１９．６×１０−４ｍｍｏｌ）溶液を添加する前に、５分間、溶液を攪拌させる。ＨＰＬＣ分析によりプロ−マルチペプチドが消費されていること（またはプロ−マルチペプチドの濃度がもはや低下していること）が示されるように反応を進行させた後、０．５ｍＬの５０％酢酸水溶液を添加することによって反応物をクエンチする。次いで、反応混合物を処理し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６へ移す。この混合物の主要な成分は、各々のＢＮＰ単位のＬｙｓ３でマルチペペプチドに複合されることが予想される。
【０３８４】
（ｂ）複合ＢＮＰ単位へのオリゴマー複合プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の酵素カクテル開裂
実施例２（ａ）からの生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌのアリコートをＨＰＬＣによって分析し、その中のポリペプチド濃度を測定する。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理、ウシ膵由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６中に調製する。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６中に調製する。
【０３８５】
次いで、粗混合物（１ｍｏｌ  ｅｑ．）をトリプシン（１．３９×１０−３ｍｏｌ  ｅｑ．）およびカルボキシペプチダーゼＢ（４．５６×１０−４ｍｏｌ  ｅｑ．）と反応させる。３０分後、アセトニトリル中１％トリフルオロ酢酸の添加によって反応物をクエンチする。反応の生成物混合物を処理し、ＨＰＬＣによって分析する。保持時間（対標準品）および質量スペクトル分析を使用し、同一性を測定する。反応の予想生成物は、Ｌｙｓ３ヘキシル−ＰＥＧ７−複合体ＢＮＰ、Ｌｙｓｌ４ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー−複合体ＢＮＰ、Ｌｙｓ２７ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー−複合体ＢＮＰ、Ｄｉヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー複合体ＢＮＰ、ＤｅｓＡｒｇ−ＨｉｓＢＮＰおよびＤｅｓＡｒｇ−Ｈｉｓヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー複合体（Ｌｙｓ３またはＬｙｓｌ４またはＬｙｓ２７）ＢＮＰである。この混合物の主要な組成物は、Ｌｙｓ３−ヘキシル−ＰＥＧ７−複合体ＢＮＰである。
【０３８６】
９．２９．６  粗複合混合物からのプロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１複合体の精製
実施例２（ｂ）に記載された複合反応から得られた各々の主要な生成物を逆相ＨＰＬＣを使用して単離する。カラム（内径１．０ｃｍ×長さ２５ｃｍ）をポリペプチドおよびタンパク質の分解に有用であることが周知の市販のＣ１８固定相でパックし、次いでＨＰＬＣ系へ組込む。この系を７５％移動相Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むＨ２Ｏ）および２５％移動相Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル）の混合物を含んで成る溶離緩衝液で平衡化する。実施例２１（ａ）からの生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液をカラムに加え、主要な生成物を分離し、アセトニトリル要素の割合が１２０分間にわたって２５％−５５％に増大する勾配溶離を使用して溶離する。一部分を採取し、ＨＰＬＣによって分析し、その中の生成物の同一性および純度を判定する。各々生成物の一般的な一部分をプールし、溶媒を回転蒸発によって除去する。各々の生成物ピークの同一性および純度をＨＰＬＣおよび質量分析によって判定する。予想生成物は、３つのマルチペプチドモノ複合体（ＢＮＰの各々の単位の他のＬｙｓ３またはＬｙｓ１４またはＬｙｓ２７で複合）、３つのマルチペプチドジ複合体（Ｌｙｓ３＆Ｌｙｓｌ４またはＬｙｓｌ４＆Ｌｙｓ２７またはＬｙｓ２７＆Ｌｙｓ３で複合）、１つのマルチペプチドトリ複合体（Ｌｙｓ３、Ｌｙｓｌ４、およびＬｙｓ２７で複合）、および１つのマルチペプチドテトラ複合体（リーダーペプチド、Ｌｙｓ３、Ｌｙｓｌ４およびＬｙｓ２７のＮ末端で複合）で構成される。
【０３８７】
９．２９．７  プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の単離複合体の酵素カクテル開裂からのＬｙｓ３−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー複合体ＢＮＰの調製
実施例３に記載された方法を使用して得られる複合体、モノ複合Ｌｙｓ３−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーＰｒｏ−ペンタペプチドＢＮＰ−１を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６中に溶解し、結果として生じる溶液をＨＰＬＣによって分析し、その中のポリペプチド濃度を測定する。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理、ウシ膵由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６中に調製する。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６中に調製する。次いで、粗混合物（１ｍｏｌ  ｅｑ．）をトリプシン（１．３９×１０−３ｍｏｌ  ｅｑ．）およびカルボキシペプチダーゼＢ（４．５６×１０−４ｍｏｌ  ｅｑ．）と反応させる。３０分後、アセトニトリル中１％トリフルオロ酢酸の添加によって反応物をクエンチする。生成物を処理し、ＨＰＬＣによって分析する。保持時間（対標準品）および質量スペクトル分析を使用し、同一性を測定する。反応の予想生成物は、使用された各々の複合体のそれぞれである。例えば、モノ複合Ｌｙｓ３−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー−複合プロ−ペンタペプチド  ＢＮＰ−１により、Ｌｙｓ３−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー−複合ＢＮＰおよびＤｅｓ  Ａｒｇ−Ｈｉｓ  Ｌｙｓ３−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー−複合ＢＮＰが提供される。
【０３８８】
９．２９．８  ホウ酸塩緩衝液／有機溶媒中のプロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１のＬｙｓ３での部位選択的複合
プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１（０．０１９５ｍｍｏｌ）を５ｍＬの５０ｍＭホウ酸中に溶解する。この溶液を４Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９．３にし、かつエタノール１ｍＬに添加し、水酸化ナトリウムでｐＨ１０．４〜１０．９に調節することができる。上記の攪拌溶液に１ｍＬエタノール中活性化メチルヘプタエチレングリコール（（ＰＥＧ７）−ヘキシル  オリゴマー）（７．５×０．０１９５ｍｍｏｌ）の溶液を添加することができる。複合（アシル化）反応の過程をＨＰＬＣによってモニタリングし、４Ｎ水酸化ナトリウムを使用してｐＨをｐＨ１０．５に維持する。反応が２０分後に完了していると思われた場合、４Ｎ水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ６．８にクエンチする。次いで、反応混合物を処理し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６へ移す。生成物混合物のＨＰＬＣプロフィールは、プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１のＢＮＰ単位の各々の単位のＬｙｓ３で＞４０％の複合を示した。
【０３８９】
９．２９．９  ホウ酸塩緩衝液／有機溶媒中の天然ｈＢＮＰのＬｙｓ３での部位選択的複合
プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１（０．０１９５ｍｍｏｌ）を５ｍＬの５０ｍＭホウ酸中に溶解する。この溶液を４Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９．３にし、かつエタノール１ｍＬに添加し、水酸化ナトリウムでｐＨ１０．４〜１０．９に調節することができる。上記の攪拌溶液に１ｍＬエタノール中活性化メチルヘプタエチレングリコール（（ＰＥＧ７）−ヘキシルオリゴマー）（１．６×０．０１９５ｍｍｏｌ）の溶液を添加することができる。複合（アシル化）反応の過程をＨＰＬＣによってモニタリングし、４Ｎ水酸化ナトリウムを使用してｐＨをｐＨ１０．５に維持する。反応が２０分後に完了していると思われた場合、４Ｎ水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ６．８にクエンチする。次いで、反応混合物を処理し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６へ移す。生成物混合物のＨＰＬＣプロフィールは、ＢＮＰ分子のＬｙｓ３で＞４０％の複合を示した。
【０３９０】
９．３０  予備クロマトグラフィー
逆相ＨＰＬＣ分析および精製をウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）２４８７デュアルλ吸光度検出器を備えたウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｐｒｅｐ−ＬＣシステムでＢＮ−０５４について実行した。ＤＭＳＯおよび水（１６ｍＬ）を含有する反応混合物をさらに０．１％ＴＦＡ水で希釈し、最終容積を１００ｍＬにした。各々２０ｍＬの５回の注入を予備カラムに実行した。カラムの仕様：対称Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ７μｍカラム、１９×３００ｍｍ。溶離勾配は以下を示したが、ここでＡは水中０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）であり、Ｂはアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）であった。検出は２２０ｎｍで設定された。
【表４】
2008500375.tif 000102
【０３９１】
一部分を採取し、９９６ダイオードアレイ検出器およびカラムヒーターを備えたウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）２６９０／５システムで分析クロマトグラフィーを使用してＢＮ−５４の存在について分析した。複合体をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）分析カラム、（５μｍ粒径、３００細孔サイズ、１５０×２ｍｍ）流速１．０ｍＬ／分、およびカラム温度６０℃。溶離勾配は２３分で０〜８０％Ｂであったが、ここでＡは水中０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂはアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）であった。検出は２２０ｎｍであった。
【０３９２】
ＢＮ−５４を含有する一部分を採取し、回転蒸発、凍結乾燥させてＢＮ−５４を白色粉末として得た。ＢＮ−５４のタンパク質含有量および純度を測定し、以下のように要約した。
【０３９３】
以下の表には異なるロットのＮｏｂｅｘ−ＢＮ０５４のタンパク質含有量が要約されている。
【表５】
2008500375.tif 000103
【０３９４】
関連したＢＮＰ標準を含む、異なるロットのＢＮ０５４の典型的なクロマトグラムが図８、９、および１０に含まれている。この精製方法は、本発明の他の複合体との使用に容易に適合される。
【０３９５】
参考文献一覧
以下の文献は、その全体が参照により援用される。
【０３９６】
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PCTUS0217567
【図面の簡単な説明】
【０３９７】
【図１】ＢＮＰの作用および調節の態様を示す図である。
【図２】３層複合法後のオリゴマー活性化および複合の典型的なスキームを示す図である。クラス１修飾部分は非加水分解性であり、クラス２修飾部分はマイクロべグ化であり、クラス３修飾部分は完全に加水分解性である。
【図３】ｈＢＮＰまたはｈＢＮＰ複合体の濃度の機能としてのＨＡＥＣ細胞の環状ＧＭＰ産生を示す図である（｜＝天然、▲＝ＢＮ−００２、▼＝ＢＮ−０２１、◆＝ＢＮ−０２２、●＝ＢＮ−０２４）
【図４】ＢＮＰおよびＢＮＰ複合体トリプシン消化を示す図である。（−●−＝時間（分）対％ＢＮ  Ｄ１、・●・＝時間（分）対％ＢＮＤ２、▼＝時間（分）対％ＢＮＤ２、▼＝時間（分）対％ＢＮ０３４  Ｄ１、｜＝時間（分）対％ＢＮ０３４  Ｄ２）
【図５】ラットにおける経口投与後さまざまな時点でのｈＢＮＰ複合体の血漿レベルを示す図である。（｜＝ＢＮ−００２、▲＝ＢＮ−０２１、◆＝ＢＮ−０２２、●＝ＢＮ−０２４）
【図６ａ−６ｄ】クラス１、２、および３における複合体の検査の構造および結果を示すデータである。
【図１】
2008500375.tif 000112
【図２】
2008500375.tif 000113
【図３】
2008500375.tif 000114
【図４】
2008500375.tif 000115
【図５】
2008500375.tif 000116
【図６Ａ】
2008500375.tif 000117
【図６Ｂ】
2008500375.tif 000118
【図６Ｃ】
2008500375.tif 000119
【図６Ｄ】
2008500375.tif 000120
【図７】
2008500375.tif 000121
【図８】
2008500375.tif 000122
【図９】
2008500375.tif 000123
【図１０】
2008500375.tif 000124
【配列表】
2008500375000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月1日(2007.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
ＣＦＧＲＸＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ（配列番号１）
式中、Xは、修飾部分複合部位を含むアミノ酸残基などの化合物である。一部の実施形態におけるXは、修飾部分が付着しうるアミノ酸を含んで成る。例えば、Xは、修飾部分が付着されうるアミノ酸ＬｙｓまたはＣｙｓを含む。別の実施形態において、Ｘはリシン以外でありうるが、これらの実施形態において、非複合ペプチドも本発明の態様であり、ここでＸは、複合部位が生成されうるアルギニンまたはおよびリシン以外のアミノ酸である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
ＣＦＧＲＸ１ＭＤＲＩＸ２ＧＬＧＣ（配列番号２）
式中、Ｘ１はリシンであり、Ｘ２は１〜４個のアミノ酸である。Ｘ２は、Ｓ、ＳＳ、ＳＳＳ、ＳＳＳＳ（配列番号３）、Ｋ、ＫＳ、ＫＳＳ、またはＫＳＳＳ（配列番号４）でありうる。ＫがＸ２またはＸ２の配列の一部として含まれる場合、修飾部分複合部位。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
Ｘ１−ＣＦＧＲＸ３ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ２（配列番号５）
式中、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１が存在し、Ｘ１は１〜１０個のアミノ酸であり、ここでＸ２は１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸であり、かつＸ３はアルギニンなどのリシン以外である。例えば、Ｘ１はｈＢＮＰのＮ末端から１−１０個のアミノ酸残基配列のすべてまたはＣ末端断片を含みうる。一の実施形態において、Ｘ１はＳＰＺ１ＭＶＱＧＳＧ−（配列番号６）、ＳＰＺ１ＭＶＱＧ（配列番号７）、ＳＰＺ１ＭＶＱ（配列番号８）、ＳＰＺ１ＭＶ（配列番号９）、ＳＰＺ１Ｍ（配列番号１０）、ＳＰＺ１、ＰＺ１ＭＶＱＧＳＧ（配列番号１１）、Ｚ１ＭＶＱＧＳＧ（配列番号１２）を含み、ここでＺ１はリシンまたはアルギニンである。Ｚ１がリシンである場合、修飾部分複合部位が提供される。別の実施形態において、Ｘ２はｈＢＮＰのＣ末端から１−６個のアミノ酸残基配列のすべてまたはＮ末端断片を含みうる。一の実施形態において、Ｘ２は配列Ｚ２ＶＬＲＲＨ（配列番号１３）、Ｚ２ＶＬＲＲ（配列番号１４）、Ｚ２ＶＬＲ（配列番号１５）、Ｚ２ＶＬ、Ｋ、Ｒ、ＲＶＬＲＲ（配列番号１６）、ＲＶＬＲ（配列番号１７）、ＲＶＬ、ＲＶ、またはＲであり、ここでＺ２はリシンまたはアルギニンである。Ｚ２がリシンである場合、修飾部分複合部位が提供される。Ｚ１がリシンである場合、Ｚ２はリシン以外でありうるとともに、Ｚ２がリシンである場合、Ｚ１はリシン以外でありうる。あるいは、Ｘ１およびＸ２はナトリウム利尿ペプチドから得られるＮ末端およびＣ末端尾アミノ酸配列でありうる。一部の実施形態において、Ｎ末端および／またはＣ末端尾配列が存在し、具体的にはｈＢＮＰまたはその断片のＮ末端およびＣ末端尾配列ではない。非複合ナトリウム利尿化合物も本発明の態様であることが理解されるであろう。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
Ｘ１ＭＶＱＧＳＧＣ１ＦＧＲＸ２ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ２Ｘ３（配列番号１８）
式中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は各々が独立してＬｙｓおよびＬｙｓ以外のアミノ酸から成る群から選択され、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の少なくとも１つはＬｙｓであり、かつＸ１、Ｘ２、およびＸ３の少なくとも１つはＬｙｓ以外のアミノ酸であるとともに、Ｃ１およびＣ２はシステインであり、ジスルフィド結合によって結合されうる。非複合ペプチド類似体も本発明の態様であることが理解されるであろう。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
一の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の少なくとも１つはＡｒｇである。別の実施形態において、Ｘ１はＬｙｓであり、Ｘ２はＡｒｇであるとともに、Ｘ３はＡｒｇである。この実施形態は、本明細書に記載されたアミノ酸配列、Ｘ１に対するＮ末端、および／またはＸ３に対するＣ末端をも含みうる。例えば、Ｎ末端尾配列は、存在する場合、Ｓ−またはＳＰ−でありうるとともに、Ｃ末端尾は、存在する場合、−ＶＬＲＲＨ（配列番号１９）、−ＶＬＲＲ（配列番号１９）、−ＶＬＲ、−ＶＬ、または−Ｖでありうる。一部の実施形態において、Ｎ末端および／またはＣ末端尾配列が存在し、具体的にはｈＢＮＰまたはその断片のＮ末端およびＣ末端尾ではない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
ＣＦＧＲＸ１ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＸ２（配列番号２０）
式中、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１つは、修飾部分と結合した修飾部分複合部位を含んで成るアミノ酸素であり、もう１つは他のアミノ酸または非複合Ｌｙｓである。一実施形態において、Ｘ１は修飾部分とその側鎖で結合されたＬｙｓであり、Ｘ２は別のアミノ酸、例えばＧｌｙまたはＡｒｇである。あるいは、Ｘ２は修飾部分とその側鎖で結合されたＬｙｓであり、Ｘ１は別のアミノ酸、例えばＧｌｙ、Ａｒｇ、またはリシン以外のアミノ酸である。別の実施形態において、Ｘ１は修飾部分とその側鎖で結合されたＬｙｓであり、Ｘ２は非複合Ｌｙｓである。あるいは、Ｘ２は修飾部分とその側鎖で結合されたＬｙｓであり、Ｘ１は非複合Ｌｙｓである。非複合ペプチド類似体も本発明の態様であることが理解されるであろう。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
ナトリウム利尿ペプチド類似体の多くは、ｈＢＮＰのＣｙｓ１０−Ｃｙｓ２６など天然ナトリウム利尿ペプチドのループ要素を含み、ここでＣｙｓ１０およびＣｙｓ２６はジスルフィド結合によって結合され、それによってループを形成する。場合によっては、ループは、かかる置換、欠失、および／または挿入が天然配列の活性を除去することがない限り、天然配列と異なるアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含みうる。かかる変異ループ配列の例が、シェーンフェルダ（Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄａ）ら、「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ」、ＦＥＢＳ  Ｌｔｔｅｒｓ  ４１４（１９９７年）２６３−２６７頁において見出されうるが、その全体の開示は参照により本明細書で援用され、受容体Ｃ（ＮＰＲ−Ｃ）と比べナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）に優先的に結合するＢＮＰの変形が記載されている。（米国特許第６，５２５，０２２号明細書および米国特許第６，０２８，０５５号明細書）。一例として、ナトリウム利尿ループは、ループのナトリウム利尿活性を除去することがない、例えば、場合によっては、ループが天然ループの配列（例えば、ｈＢＮＰの天然ループ）を有し、かつ１、２、３、４、５、６、７、または８個の同類置換を有する、１つもしくはそれ以上の同類置換を有する天然ループを含みうる。別の実施形態において、ループは、生物活性を除去することがない一連のアミノ酸を除去することによって短縮される。一の実施形態において、ペプチド類似体はｈＢＮＰのＣｙｓ１０−Ｃｙｓ２６ループを含むが、ここでＬｙｓ１４がＧｌｙまたはＡｒｇで置換されている。別の実施形態において、ループのＳＳＳＳ（配列番号３）要素が変化または削除されている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
上記の類似体に加えて、本発明における使用に適した多種多様の類似体が当業界で記載されている。例えば、１９９２年５月１９日に発行され、その全体の開示が参照により本明細書で援用される、米国特許第５，１１４，９２３号明細書では、式Ｒ１−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｒ２（配列番号２１）［式中、Ｒ１は（Ｈ）、Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号２２）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号２３）、Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号２４）、Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号２５）、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号２６）、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号２７）、およびＲ３−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号２８）［式中、Ｒ３はヒトタンパク質もしくはそのＣ末端部の１−９９位の１０２個のアミノ酸配列である]であり、かつＲ２は（ＯＨ）、ＮＨ２、ＮＨＲ’もしくはここで修飾部分’および修飾部分”は独立して低アルキル（１−４Ｃ）であり、またはＲ２はＬｙｓ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号２９）、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号３０）、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号３１）、もしくはそのアミド（ＮＨ２，ＮＨＲ’、もしくはＮＲ’修飾部分”）である］のナトリウム利尿活性を有するペプチドが記載されている。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
１９９０年２月に発行され、その全体の開示が参照により本明細書で援用される米国特許第４，９０４，７６３号明細書でもＸ−Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ−ＯＨ（配列番号３２）など、本発明における使用に適切なナトリウム利尿ペプチド類似体が記載されており、ここでＸはＨ、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、またはＨ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号３３）である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
１９９０年２月２７日に発行された米国特許第４，９０４，７６３号明細書（その全体の開示が参照により本明細書で援用される）では、Ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｙ（配列番号３４）（式中、２個のシステインはジスルフィド結合によって架橋されている）［式中、ＸはＨまたはＨ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙを意味し、かつＹは−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ（配列番号３５）、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＯＨ（配列番号３６）、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ（配列番号３７）、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＯＨ（配列番号３８）、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ（配列番号３９）、もしくはＡｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ（配列番号４０）、またはその塩を示す］を含む本発明における使用に適切な他のナトリウム利尿ペプチド類似体が記載されている。１９８９年１２月１４日に公開されたＰＣＴ公報国際公開第８９１２０６９号パンフレットにおける使用に適切な別の一連の類似体。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
本発明における使用に適したさらに一連のナトリウム利尿ぺプチド類似体が、２００３年６月１２日に公開され、その全体の開示が参照により本明細書で援用される米国特許出願公開第２００３０１０９４３０号明細書に記載されている。この刊行物では、式：Ｒ１−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｌｅｕ／Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ／Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｒ２（配列番号４１）［式中、Ｒ１は、（Ｈ）、Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号４２）、Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号４３）、Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号４４）、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号４５）、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号４６）、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／ＭｅｔＭｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号４７）、またはブタ、イヌ、もしくはヒトＢＮＰの天然上流配列の１０から１０９個のアミノ酸、またはその合成物から成る群から選択され、Ｒ２は、（ＯＨ）、ＮＨ２、またはＮＲ’Ｒ”であり、ここでＲ’およびＲ”は独立して低アルキルであり（この場合、１−４Ｃ）、もしくはＡｓｎ／Ｌｙｓ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号４８）、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ（配列番号４９）、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｔｙｒ／Ｈｉｓ（配列番号５０)であり、または、式がＲ１−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−  Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｒ２（配列番号５１）であり、かつＲ１がＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−であり、Ｒ２がＡｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ（配列番号５２）ではありえないという条件で、そのアミドである（ＮＨ２またはＮＲ’Ｒ”）］のナトリウム利尿活性を有するペプチドが記載されている。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
本発明における使用に適切な他のナトリウム利尿ペプチド類似体が、２００２年７月４日に刊行されたダイイチ（Ｄａｉｉｃｈｉ）の米国特許出願公開第２００２００８６８４３号明細書（その全体の開示は参照により本明細書で援用される）に記載されているが、ここでは生理学的に活性のポリペプチドＸ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ＯＨ（配列番号５３）［ここで２つのシステインが架橋されている］が記載されており、ここでＸはＨ、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、またはＨ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号５４）である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
８．１．３  マルチＢＮＰペプチド
ナトリウム利尿化合物は、配列において２つもしくはそれ以上のナトリウム利尿化合物単位を有し、場合により、ナトリウム利尿化合物単位間にスペーサー配列を含むマルチペプチドでもありうる。この化合物は、場合により、ナトリウム利尿ペプチド化合物の一方または両方の端でリーダーおよび／または伸長配列をも含んで成りうる。例えば、限定ではなく一例として、かつ各々のマルチペプチドの構造および／または式を限定することなく、以下の構造を有し得る。すなわち、
ＮＰ−［ＮＰ］ｎ、
ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］ｎ、
リーダー−ＮＰ−［ＮＰ］ｎ、
リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］ｎ、
リーダー−［スペーサー−ＮＰ］ｎ、
リーダー−［スペーサー−ＮＰ］ｎ−伸長、
リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］ｎ−伸長、
式中
ｎは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０でありうる、
ＮＰはナトリウム利尿化合物ペプチドまたはナトリウム利尿ペプチド類似体であり、  スペーサーはアミノ酸残基、または酵素もしくは酵素カクテルによって開裂される一連のアミノ酸残基、好ましくは、ＮＰに存在しないアミノ酸のアミノ酸残基または配列（例えば、Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号５５）、Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号５６）、Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号５７）、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ、Ａｒｇ−Ｔｈｒ、Ａｒｇ−Ｉｌｅ）でありうる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
リーダーは、例えば、単一アミノ酸、アミノ酸配列、ペプチド（例えば、リーダーペプチドまたは単一ペプチド）、またはタンパク質でありうるとともに、リーダーはＮ末端を複合から遮断するように選択され、マルチペプチド（例えば、酵素カクテルによって開裂可能な（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−（配列番号５８）：Ｖ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）、（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（配列番号５９）または（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号６０）［式中、Ｘはアミノ酸でありうる］またはフリン（Ｆｕｒｉｎ）によって開裂可能な（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（配列番号６１）、ウロキナーゼによって開裂可能な（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−（配列番号６２）、エンテロキナーゼによって開裂可能な（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号６３）または（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−（配列番号６４）、ファクターＸａまたはファクター１０ａによって開裂可能な（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ（配列番号６５）または（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−（配列番号６６））の精製を補助し、可溶性を改善し、かつ／または細胞からの分泌（例えば、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号６７））、および／または精製（例えば、（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号６８））を補助し、リーダーは、好ましくは、酵素または化学的開裂によって、好ましくは、ＮＰを開裂しない酵素によってマルチペプチドから開裂可能であり、リーダーは天然ＮＰからのリーダーペプチドでありうる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
伸長は、例えば、単一アミノ酸、アミノ酸配列、ペプチド（例えば、リーダーペプチドまたは単一ペプチド）、またはタンパク質でありうるとともに、伸長はＣ末端を複合から遮断するように選択され、マルチペプチド（例えば、（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号６８））の精製を補助し、可溶性を改善し、かつ／または細胞からの分泌（例えば、酵素カクテルによって開裂可能なＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−（配列番号６７）：Ｖ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）およびエンドプロテイナーゼ（Ａｓｐ−Ｎ）、Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（配列番号５６）またはＡｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号５７）［式中、Ｘは任意のアミノ酸でありうる］またはフリン（Ｆｕｒｉｎ）によって開裂可能なＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（配列番号６９）、酵素カクテルウロキナーゼおよびカルボキシペプチダーゼＢによって開裂可能なＡｒｇ−Ｖａｌ−、エンテロキナーゼによって開裂可能なＡｓｐ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｉｌｅ−、ファクターＸａまたはファクター１０ａによって開裂可能なＡｒｇ−ＴｈｒまたはＡｒｇ−Ｉｌｅ−）を補助し、伸長は、好ましくは、酵素または化学的開裂によって、好ましくは、ＮＰを開裂しない酵素によってマルチペプチドから開裂可能である。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
スペーサーに含まれ、またはＮＰからリーダーおよび／または伸長を分離するような酵素開裂部位は、好ましくは、単一酵素または酵素カクテルが開裂部位のすべてを開裂するように選択される。例えば、開裂部位Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号５６）はフリン（Ｆｕｒｉｎ）によって開裂されうる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
一の実施形態において、リーダーは（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号６８）であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号６８）であり、スペーサーは  ＧｌｕＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号７０）である。この実施形態はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）によって開裂されうる。結果として生じる生成物はＮＰ−ＧｌｕまたはＮＰ−Ｇｌｕ複合体である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
別の実施形態において、リーダーは（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−（−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号７１）またはＡｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）（配列番号７２）（式中、Ｘはアミノ酸である）であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−（−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号７１）またはＡｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号７２））（式中、Ｘはアミノ酸である）であり、かつスペーサーはＡｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号５６）またはＡｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号５７）（式中、Ｘはアミノ酸である）である。この実施形態はフリン（Ｆｕｒｉｎ）によって開裂されうる。結果として生じる生成物はＮＰまたはＮＰ複合体である。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
別の実施形態において、リーダーは（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ（配列番号７３）であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ（配列番号７３）であり、スペーサーはＡｒｇ−Ｖａｌである。この実施形態はウロキナーゼ／カルボキシペプチダーゼＢカクテルによって開裂されうる。結果として生じる生成物はＮＰまたはＮＰ複合体である。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
別の実施形態において、リーダーは（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−（−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号７４）または−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（配列番号７５））であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−（−Ａｓｐ−Ｌｙｓまたは−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ）であり、スペーサーはＡｓｐ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｉｌｅ）である。この実施形態はエンテロキナーゼによって開裂されうる。結果として生じる生成物はＮＰまたはＮＰ複合体である。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
別の実施形態において、リーダーは（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−（−Ａｒｇ−Ｔｈｒ（配列番号７６）または−Ａｒｇ−Ｉｌｅ（配列番号７７））であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−（−Ａｒｇ−Ｔｈｒ（配列番号７６）または−Ａｒｇ−Ｉｌｅ（配列番号７７））であり、スペーサーはＡｒｇ−ＴｈｒまたはＡｒｇ−Ｉｌｅである。この実施形態はファクターＸａまたはファクター１０ａ／カルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルによって開裂されうる。結果として生じる生成物はＮＰまたはＮＰ複合体である。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
別の実施形態において、スペーサーはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号７８）であり、リーダーはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号７９）であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号８０）である。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体は、管理条件下にトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルを使用して放出されうる。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
別の実施形態において、スペーサーはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号８１）であり、リーダーはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号８２）であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−ＡＡＡ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号８３）であり、式中、ＡＡＡは長さが３〜４０個、好ましくは、３−１５個のアミノ酸残基からのアミノ酸配列である。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体は、管理条件下にトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルを使用して放出されうる。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
別の実施形態において、スペーサーはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号８４）であり、リーダーはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号８５）であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号８６）である。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はトロンビンおよびカルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルを使用して放出されうる。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
別の実施形態において、スペーサーはＡｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号８７）であり、リーダーはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号８８）であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号８９）である。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はトロンビンおよびカルボキシペプチダーゼＡ酵素カクテルを使用して放出されうる。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
別の実施形態において、スペーサーはＭｅｔ−Ｍｅｔであり、リーダーはＭｅｔ−Ｍｅｔであり、伸長は（Ｈｉｓ）６−ＡＡＡ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ（配列番号９０）であり、式中、ＡＡＡは長さが３〜４０個のアミノ酸残基からの任意のアミノ酸配列である。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＣＮＢｒを使用して放出されうる。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
別の実施形態において、スペーサーはＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号９１）であり、リーダーはＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号９２）であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号５８）である。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）およびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎカクテルを使用して放出されうる。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
別の実施形態において、スペーサーＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号９３）であり、リーダーはＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号６７）であり、伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号６８）である。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）によって放出され、ＮＰ−Ｇｌｕ、ＮＰ  Ｇｌｕの新規ＮＰ類似体、または複合体を得ることができる。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
別の実施形態において、スペーサーはＧｌｕ−Ｇｌｕであり、リーダーはＣ末端でＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（配列番号９４）であり、伸長はＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（Ｈｉｓ）６−Ｇｌｕ（配列番号９５）であり、Ｃ末端は融合パートナーである、適切な融合タンパク質と結合され、これは、例えば、エンテロキナーゼによって開裂可能でありうる。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）によって放出され、ＮＰ−Ｇｌｕ、ＮＰ  Ｇｌｕの新規ＮＰ類似体または複合体を得ることができる。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
別の実施形態において、スペーサーはＧｌｕ−Ｇｌｕであり、リーダーはＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号６７）であり、および伸長は（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号６８）であり、式中、Ｎ末端は融合パートナーである、適切な融合タンパク質と結合され、これは、例えば、エンテロキナーゼによって開裂可能でありうる。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）によって放出され、ＮＰ−Ｇｌｕ、ＮＰ  Ｇｌｕの新規ＮＰ類似体または複合体を得ることができる。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
別の実施形態において、スペーサーはＧｌｕ−Ｇｌｕであり、リーダーはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（配列番号９６）であり、伸長はＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（配列番号９６）であり、Ｃ末端は融合パートナーである、適切な融合タンパク質と結合されている。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）によって放出され、ＮＰ−Ｇｌｕ、ＮＰ  Ｇｌｕの新規ＮＰ類似体または複合体を得ることができる。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
別の実施形態において、スペーサーはＧｌｕ−Ｇｌｕであり、リーダーはＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号６７）であり、伸長はＧｌｕ−（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号９７）であり、式中、Ｎ末端は融合パートナーである、適切な融合タンパク質と結合されている。この実施形態において、ＮＰまたはＮＰ複合体はＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）によって放出され、ＮＰ−Ｇｌｕ、ＮＰ  Ｇｌｕの新規ＮＰ類似体または複合体を得ることができる。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２３】
天然ＢＮＰは、天然、野生型ｈＢＮＰペプチドの活性の尺度を提供するアッセイにおいて検査された。使用された天然ｈＢＮＰは１−３２個のアミノ酸配列、ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ、（配列番号９８）であったが、ここでＣ１０およびＣ２６はジスルフィド結合によって接合され、結合を形成する。構成物の２９個の結果および構造は表１に示されている。ＢＮＰ複合体は、ＥＣ５０およびＥｍａｘについて評価され、これらの値は天然ペプチドについて同じ実験条件下に得られたものと比較された。オリゴマー部分を有さない天然ＢＮＰ（１−３２ａａ）と比較されたこれらのデータは表１に示されている。結果は、クラス１の修飾部分Ｌｙｓ３（ＢＮＰ−００２）を含んだモノ複合体ＢＮＰ、およびＬｙｓ１４またはＬｙｓ２７でクラス２の修飾部分を含むモノ複合体ＢＮＰを好む傾向を示す。モノ−１、モノ−２、モノ−３、およびモノ−４はＢＮＰのモノ複合体であり、それらがＨＰＬＣで溶離する順に分類されている。以下の表において、モノ−１ＢＮＰは、Ｌｙｓ−３ＢＮＰ残基で指示された修飾部分（オリゴマー構造）を含むＢＮＰペプチド複合体である。モノ−２およびモノ−３はＨＰＬＣで共溶離し、Ｌｙｓ−１４とＬｙｓ−２７の混合物である。ジ複合体は一般にＨＰＬＣで密接に溶離する混合物として得られる。主要なジ複合体はＬｙｓ３／Ｌｙｓ１４およびＬｙｓ３／Ｌｙｓ２７である。支配的なトリ複合体は、Ｌｙｓ３、Ｌｙｓ１４、およびＬｙｓ２７で複合される。「モノ−４」と特定された生成物は、ＢＮＰペプチドのＮ末端で修飾部分（オリゴマー）を含む。「モノ−１」は、ＢＮＰペプチドのＬｙｓ３で複合された修飾部分を含む。「モノ−２」生成物は、ＢＮＰペプチドのＬｙｓ１４、またはＢＮＰペプチドのＬｙｓ２７で複合された修飾部分（オリゴマー）を含む。結果については、図６ａ−図６ｄに記載された表を参照。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２５】
１．ウロジラチン（Ｎ末端で４つの追加の残基を有するｈＡＮＰ）
ＴＡＰＲＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＸ１Ｙ（配列番号９９）
アミノ酸Ｔは修飾部分複合部位を規定する。上記の配列において、Ｘ１はリシンまたはアルギニン以外のアミノ酸である。Ｘ１がリシンである場合、第２の修飾部分複合部位が提供されている。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２７】
ＳＰＸ１ＭＭＨＸ２ＧＧＣＦＧＲＲＬＤＲＩＧＳＬＳＧＬＧＣＮＶＬＲＸ３Ｙ（配列番号１００）
Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のアミノ酸部位は、修飾部分複合部位を示す。この中性ペプチドでは、ペプチドの３つの部位すべてが修飾部分を有する複合のために利用可能である。ループ領域は、アミノ酸１０（Ｃ）〜アミノ酸２６（Ｃ）で特定される。３位、１４位、または２７位でのアミノ酸のいずれか２つまたは３つすべてが、ＡｒｇなどＬｙｓ以外の残基で置換されうることが想定される。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２８】
３．デンドロアスピスナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）
ＥＶＸ１ＹＤＰＣＦＧＨ  Ｘ２ＩＤＲＩＮＨＶＳＮ  ＬＧＣＰＳＬＲＤＰＲＰＮＡＰＳＴＳＡ（配列番号１０１）
Ｘ１およびＸ２のアミノ酸部位は修飾部分複合部位である。本実施例の場合、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸Ｌｙｓである。一部の実施形態において、Ｘ１はＡｒｇであり、またはＸ２はＡｒｇである。Ｎ末端も複合部位である。好ましくは、Ｘ１がリシンである場合、Ｘ２はアルギニン（またはリシン以外）である。場合により、ペプチドはＮ末端で追加的な複合部位を含みうる。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２９】
４．Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）
ＧＬＳＫ１ＧＣＦＧＬＫ２ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号１０２）
Ｋ１およびＫ２のアミノ酸部位は修飾部分複合部位である。本実施例では、Ｋ１およびＫ２はいずれもアミノ酸Ｌｙｓである。しかし、ペプチドの類似体が、ペプチドにおけるこれら位置のいずれかまたは両方でＬｙｓの代わりにＡｒｇ（Ｒ）を含みうる。場合により、ペプチドはＮ末端で追加的な複合部位を含みうる。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３０】
５．ＡＮＰ（ヒト）（ラット）（ブタ）
ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＸＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ（配列番号１０３）
本実施例において、ＸはＭｅｔ（Ｍ）またはＩｌｅ（Ｉ）であり、かつここで修飾部分複合部位はＮ末端にあり、またはＲはＫに変更され、修飾部分部位を提供する。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５３】
２．ｈＢＮＰ−３ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類似体
−ＳＰＲＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ２−（配列番号１０４）
ここで、Ｘ２は長さが１〜１０個のアミノ酸、好ましくは１〜６個のアミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ２はＫＶＬＲＲＨ（配列番号１０５）、ＫＶＬＲＲ（配列番号１０５）、ＫＶＬＲ（配列番号１０６）、ＫＶＬ、ＫＶ、Ｋ、ＲＶＬＲＲＨ（配列番号１６）、ＲＶＬＲＲ（配列番号１６）、ＲＶＬＲ（配列番号１７）、ＲＶＬ、ＲＶ、またはＲである。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５４】
３．ｈＢＮＰ−３変異部位の類似体、３Ａｒｇ、１４Ａｒｇ、２７Ａｒｇ
ＳＰＸ１ＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＸ２ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ３ＶＬＲＲＨ（配列番号１０７）
式中、Ｘ１はＬｙｓまたはＬｙｓ以外のアミノ酸であり、Ｘ２はＬｙｓ以外のアミノ酸であり、Ｘ３はＬｙｓまたはＬｙｓ以外のアミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は独立してＡｒｇまたはＧｌｙである。一部の実施形態において、Ｘ１はＬｙｓであり、Ｘ２およびＸ３は独立してＡｒｇまたはＧｌｙである。好ましい実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３の少なくとも１つはＬｙｓである。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５６】
Ｘ１ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＸ２ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ３ＶＬＲＲＨ−（配列番号１０８）
ここでＸ１はＣ末端修飾部位（Ｓｅｒ）であり、Ｘ２およびＸ３はＬｙｓ以外のアミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ２およびＸ３は独立してＡｒｇまたはＧｌｙである。他の実施形態において、Ｘ２はＡｒｇであり、Ｘ３はＬｙｓである。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５７】
５．ｈＢＮＰ−１４Ａｒｇの類似体
（一方または両方の尾がループまで短縮されているすべての断片）
Ｘ１−−−ＣＦＧＲＲＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ２（配列番号１０９）
ここで、Ｘ１は長さが１〜１０個のアミノ酸、好ましくは１〜９個のアミノ酸であり、かつＸ２は長さが１〜１０個、好ましくは１−６個のアミノ酸である。Ｘ１はＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ（配列番号１１０）、ＰＫＭＶＱＧＳＧＣ（配列番号１１１）、ＫＭＶＱＧＳＧＣ（配列番号１１２）、ＭＶＱＧＳＧＣ（配列番号１１３）、ＶＱＧＳＧＣ（配列番号１１４）、ＱＧＳＧＣ（配列番号１１５）、ＧＳＧＣ（配列番号１１６）、ＳＧＣ、ＧＣ、Ｃ、ＳＰＫ、ＳＰＫＭ（配列番号１１７）、ＳＰＫＭＶ（配列番号１１８）、ＳＰＫＭＶＱ（配列番号１１９）、ＳＰＫＭＶＱ（配列番号１１９）、ＫＭＶＱ（配列番号１２０）、ＫＭＶ、ＫＭＶＱＧ（配列番号１２１）、ＫＭＶＱＧＳ（配列番号１２２）、ＫＭＶＱＧＳＧ（配列番号１２３）、またはＫＭＶＱＧＳＧＣ（配列番号１１２）を含んで成りうる。Ｘ２はＫＶＬＲＲＨ（配列番号１０５）、ＫＶＬＲＲ（配列番号１０５）、ＫＶＬＲ（配列番号１０６）、ＫＶＬ、ＫＶ、Ｋ、ＲＶＬＲＲＨ（配列番号１６）、ＲＶＬＲＲ（配列番号１６）、ＲＶＬＲ（配列番号１７）、ＲＶＬ、ＲＶ、またはＲを含んで成りうる。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５８】
６．ｈＢＮＰ１−２９−３ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類似体
ＳＰＸ１ＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−ＫＶＬ（配列番号１２４）  
ここでＸ１はＡｒｇ、またはＬｙｓ以外のアミノ酸である。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５９】
７．ｈＢＮＰ１−２６−３ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類似体
ＳＰＸ１ＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ（配列番号１２５）
ここでＸ１はＡｒｇ、Ｇｌｙ、またはＬｙｓ以外の他のアミノ酸である。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６０】
８．ｈＢＮＰ−短縮Ｃ末端尾Ｌｙｓ１４Ａｒｇ、２７Ａｒｇ、またはＬｙｓ以外のアミノ酸の類似体
Ｘ１−ＣＦＧＲＲＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−ＲＶＬＲＲＨ（配列番号１２６）  
ここでＸ１は長さが１〜１０個のアミノ酸、好ましくは、１〜９個のアミノ酸である。Ｘ１は、ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＭＶＱＧＳＧＣ、ＶＱＧＳＧＣ、ＱＧＳＧＣ、ＧＳＧＣ、ＳＧＣ、ＧＣ、またはＣを含んで成りうる。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６１】
９．ｈＢＮＰ−Ｌｙｓ１４ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類似体
−ＣＦＧＲＸ１ＭＤＲＩＸ２ＧＬＧＣ−（配列番号１２７）
ここでＸ１はＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸であり、Ｘ２は１〜４個のアミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ２はＳＳＳＳ（配列番号３）、ＳＳＳ、ＳＳ、Ｓ、ＫＳＳＳ（配列番号４）、ＫＳＳ、またはＫＳである。
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６２】
１０．ｈＢＮＰ−Ａｒｇ３０Ｌｙｓまたは荷電様の他の同等のアミノ酸の類似体
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＲＸ１ＲＨ（配列番号１２８）
ここでＸ１はＬｙｓまたはＡｒｇ以外のアミノ酸の類似体である。
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６３】
１１．ｈＢＮＰ−２７ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類似体
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＸ１ＶＬＲＲＨ（配列番号１２９）
ここでＸ１はＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸である。
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６４】
１２．  ｈＢＮＰの伸長形態
−ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−ＫＶＬＲＲＨ−Ｘ２（配列番号１３０）
Ｘ２はＬｙｓ、Ｃｙｓ、またはＬｙｓ＋Ｘａａｎであり、ここでｎは１〜１００、１〜５０、または１〜１０であり、Ｘａａはアミノ酸、または独立して選択されるアミノ酸のクループ、または未知のアミノ酸である。
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６５】
１３．欠失変異体類似体−ｈＢＮＰ
−ＣＦＧＲＸ１ＭＤＲＩＸ２ＧＬＧＣ−（配列番号１３１）
ここでＸ１はＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸であり、かつＸ２は、ＳＳＳＳ（配列番号３）、ＳＳＳ、ＳＳ、Ｓ、ＫＳＳＳ（配列番号４）、ＫＳＳ、またはＫＳなどの１〜４個のアミノ酸である。
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６６】
１４．ｈＢＮＰ類似体―受容体特異性
ＳＰＺ１ＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＺ２ＭＤＲＩＳＳＳＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｃ（配列番号１３２）
ここでＺ１はアルギニンまたはリシン以外のアミノ酸であり、かつＺ２はアルギニンまたはリシン以外のアミノ酸であり、Ｘ１はＧｌｙ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはその保存置換であり、かつＸ２はＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅ、またはその保存置換であり、かつＸ３はＧｌｙ、Ａｒｇ、またはその保存置換である。本類似体の別の実施形態において、Ｚ１はリシンであり、Ｚ２はアルギニンまたはリシン以外のアミノ酸である。
【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６７】
１５．ＡＮＰ類似体
ＫＣＦＫＧＫＮＤＲＸＩＫＸ２ＱＳＧＬＸ３Ｃ−ＮＳＦＫＹ（配列番号１３３）
ここでＸ１はＴ、ａ、Ｒ、Ｈ、Ｐ、Ｅであり、
ここでＸ２はＫ、Ｎ−メチル、Ａｒｇ、Ｓ、Ｄ、またはＰであり、
ここでＸ３はＡｒｇ、Ｋ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｐ、Ｏｍ、Ｈａｒ、Ｈａｒ、ｐ−アミジノフェニルＡｌａ、Ｉ、Ｇｌｙ、またはＴｒｙ以外のプラス荷電を有する他のアミノ酸である。
【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７６】
９．２９．４  トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ開裂スペーサーおよびＨｉｓタグリーダーペプチドによるプロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の構成
プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の全長のコード配列は、以下の式、すなわち、リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］ｎ［式中、
スペーサーはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号７８）であり、
リーダーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号７９）であり、
伸長は（Ｈｉｓ）６−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号８０）であり、
ＮＰはｈＢＮＰである。］
に従って提供されうる。
【手続補正５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７８】
（ａ）プラスミド構成
標準分子生物学の方法を使用して、プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１［（Ｈｉｓ）６−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）−ＢＮＰ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＢＮＰ  −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＢＮＰ  −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＢＮＰ−  Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＢＮＰ］（配列番号１３４）のアミノ酸配列を発現するためにプラスミドを構成する。このプラスミドは、使用される宿主細胞（例えば、大腸菌）に最適化されるコドンである。
【国際調査報告】
2008500375.tif 000125