(57)【要約】本発明は、以下の段階を含む、真核細胞における遺伝子の発現の不活性化のための方法に方向付けられる：（I）細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含むDNAであって、該化合物が該遺伝子の発現を不活性化し得、細胞表面タンパク質の発現のための該発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための該発現カセットが同一ベクターDNA上に位置する、DNAを用いた真核細胞のトランスフェクション、および（II）該細胞表面タンパク質を発現する細胞の濃縮および／または選択。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、真核細胞における遺伝子の発現の不活性化のための方法
a）細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含むDNAを用いて真核細胞を形質転換する段階であって、該化合物が該遺伝子の発現を不活性化し得、細胞表面タンパク質の発現のための該発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための該発現カセットが同一ベクターDNA上に位置する、段階、
b）該細胞表面タンパク質を発現する細胞の濃縮および／または選択の段階。
【請求項２】
RNAi化合物が、ヘアピンコンフォメーションを有するRNAである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞表面タンパク質を発現する細胞の濃縮および／または選択が、細胞ソーティングの手段によって行われる、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
l-NGFRの発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含み、該化合物が真核細胞において遺伝子の発現を不活性化し得る、ベクター。
【請求項５】
以下を含む、組成物
a）トランスフェクション試薬、
b）細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含み、細胞表面タンパク質の発現のための該発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための該発現カセットが同一ベクターDNA上に位置する、DNA。
【請求項６】
以下を含む、キット
a）細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含むベクター、
b）該細胞表面タンパク質に対して作製されたモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗血清。
【請求項７】
抗体が、検出可能な実体で標識化された、または固体支持体に共有結合的に結合された、請求項6記載のキット。
【請求項８】
以下を更に含む、請求項6または7記載のキット
c）トランスフェクション試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RNAiの手段による遺伝子不活性化の分野に関する。より正確には、本発明は、それぞれのRNAi媒介遺伝子サイレンシング効果を有する細胞集団の濃縮および単離のための選択原理の分野に関する。特に、本発明は、腫瘍学およびアポトーシスの分野において、遺伝子発現の一過性および長期サイレンシングのためのRNAiを用いる機能的遺伝子解析に適用可能である。
【背景技術】
【０００２】
背景先行技術
RNAi媒介遺伝子サイレンシングの現象は、線虫（Caenorhabditis elegans）の系において最初に記述され、長い二本鎖RNA分子のマイクロインジェクションが、対応する遺伝子の不活性化をもたらすことが報告された（US 6,506,559（特許文献1））。後に、RNAi媒介遺伝子サイレンシングは、脊椎動物（EP 1 114 784（特許文献2））、哺乳動物、および特にヒト細胞（EP 1 144 623（特許文献3））において開示されてきた。これらの系においては、関心対象の特異的遺伝子を一過性にノックダウンするために、19〜29bpの短い二本鎖RNA分子がトランスフェクションされた場合に、遺伝子不活性化が成功裡に達成される。
【０００３】
RNA媒介遺伝子不活性化のメカニズムは、これまで研究されてきた様々な生物において、わずかに異なっているように見える。しかしながら、すべての系において、RNA媒介遺伝子サイレンシングは、いわゆるRISC複合体の一部であるエンドヌクレアーゼ、アルゴノート2（Argonaute2）によって誘導される標的mRNAの転写後分解に基づく（WO 03/93430（特許文献4））。分解の配列特異性は、RISC複合体中にロードされる特異的アンチセンスRNA鎖のヌクレオチド配列によって決定される。
【０００４】
導入の適切な可能性は、二本鎖RNA分子自体をトランスフェクションすること、または、標的RNA分子の一部と同一である配列を有する短い二本鎖RNA化合物を直接もたらすDNAベクター構築物のインビボ発現を含む。多くの場合において、いわゆるshRNA構築物が、遺伝子サイレンシングのために成功裡に使用されてきた。これらの構築物は、細胞への導入後に二本鎖RNA化合物に加工されて、その配列が元のRNA分子のステムに対応することで特徴付けられるステムループRNAをコードする。
【０００５】
shRNA構築物を含む、安定に形質導入、またはトランスフェクションされた細胞の同定は、CD-4のような細胞表面マーカーを共発現させる手段によって既に行われてきた（Barton, G.M., and Medzhitov, R., Proc. Natl. Acad. Science USA 99 (2002) 14943-14945（非特許文献1））。しかしながら、本発明に先立って、細胞表面マーカーの共発現は、人工的に導入されたshRNAを発現する細胞の濃縮または選択には使用されてきていない。
【０００６】
RNAi発現構築物を用いてトランスフェクションされた細胞を含むトランスフェクションされた細胞の選択は、異なる方法で達成され得る。最も一般的には、ベクターが、ハイグロマイシン耐性遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子のような、真核細胞の抗生物質耐性遺伝子を含む。トランスフェクションされた細胞の検出、濃縮、および少なくとも部分的な選択のためのもう一つの方法は、宿主細胞において発現していないか、または有意に低い程度で発現しているかいずれかの表面抗原をコードする発現カセットの使用である。
【０００７】
続いて、細胞の濃縮は、フローサイトメトリー法によって達成されてもよい。一つの顕著な例は、トランスフェクションされた細胞を同定するための表面マーカーとしての、低親和性神経成長因子受容体l-NGFRの形態の使用である（Machl, A.W., et al., Cytometry 29 (1997) 371-374（非特許文献2））。
【０００８】
通常数週間を必要とする抗生物質選択方法のほかにも、shRNA発現構築物を含むサイレンシングベクターを用いてトランスフェクションされた生細胞は、これまで、インビボで活性を有する蛍光マーカータンパク質として高感度緑色蛍光タンパク質（Enhanced Green Fluorescent Protein）（EGFP）を発現するための付加的な発現構築物を使用して、濃縮され、かつ選択されてきた。一過性にトランスフェクション／形質導入された細胞の解析を可能にするために、shRNAおよび高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）を共発現するベクターが探究されてきた（Kojima, S., et al., Biotechniques 36 (2004) 74-79（非特許文献3））。EGFPを発現する細胞もまた、フローサイトメトリー法によって濃縮されてもよい。
【０００９】
しかしながら、選択マーカーとしてのEGFPの使用は、いくつかの欠点を有する：第一に、EGFPの過剰発現は、使用される細胞型に依存して変化する程度で、トランスフェクションされた細胞において、細胞障害性効果を発揮する可能性がある。第二に、EGFPの蛍光シグナルは、様々な固定技術によって撹乱されるタンパク質のコンフォメーションに大きく依存するため、この戦略は細胞の固定を軽減する適用に限定される。第三に、標的遺伝子のサイレンシングが細胞死を誘導する場合において、損傷を受けた膜を有する細胞は可溶性EGFPを保持することができないため、EGFPは有用なマーカーではない（Chalfie, M., and Kain, S., (eds), in Green Fluorescent Protein: properties, applications and protocols, Wiley-Liss, New York, 1998（非特許文献4）、 およびHarvey, K.J., et al., Cytometry 43 (2001) 273-278（非特許文献5））。
【００１０】
そのため、RNAi構築物を用いてトランスフェクション／形質導入された細胞の選択のために改善された方法を提供することが、本発明の目的であった。一つの局面において、RNAi構築物を用いてトランスフェクションされた細胞の迅速な濃縮および選択のための改善されたRNAiの方法を提供することが、本発明の目的であった。特に、一過性発現の段階においてアポトーシス過程の解析を可能にする、RNAi媒介遺伝子サイレンシングのための改善された方法を提供することが、本発明の目的であった。
【００１１】
【特許文献１】US 6,506,559
【特許文献２】EP 1 114 784
【特許文献３】EP 1 144 623
【特許文献４】WO 03/93430
【非特許文献１】Barton, G.M., and Medzhitov, R., Proc. Natl. Acad. Science USA 99 (2002) 14943-14945
【非特許文献２】Machl, A.W., et al., Cytometry 29 (1997) 371-374
【非特許文献３】Kojima, S., et al., Biotechniques 36 (2004) 74-79
【非特許文献４】Chalfie, M., and Kain, S., (eds), in Green Fluorescent Protein: properties, applications and protocols, Wiley-Liss, New York, 1998
【非特許文献５】Harvey, K.J., et al., Cytometry 43 (2001) 273-278
【発明の開示】
【００１２】
本発明の簡単な説明
このように、本発明は、RNAi発現構築物を用いてトランスフェクションされた細胞の改善された、かつ加速された濃縮および選択のための方法、組成物、およびキットを提供する。
【００１３】
第一の局面において、本発明は、以下の段階を含む、真核細胞における遺伝子の発現の不活性化のための方法に方向付けられる
a）細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含むDNAを用いて真核細胞を形質転換する段階であって、該化合物が該遺伝子の発現を不活性化し得、細胞表面タンパク質の発現のための該発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための該発現カセットが同一ベクターDNA上に位置する、段階、
b）該細胞表面タンパク質を発現する細胞の濃縮および／または選択の段階。
【００１４】
好ましくは、該RNAi化合物は、ヘアピンコンフォメーションを有するRNAである。
【００１５】
また好ましくは、該細胞表面タンパク質を発現する細胞の該濃縮および選択は、細胞ソーティングの手段によって行われる。
【００１６】
第二の局面において、本発明は、以下を含む組成物に方向付けられる
a）トランスフェクション試薬、
b）細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含むDNAであって、該化合物が遺伝子の発現を不活性化し得、細胞表面タンパク質の発現のための該発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための該発現カセットが同一ベクターDNA上に位置する、DNA。
【００１７】
好ましくは、該組成物は、唯一の型のベクターDNAを所持する。このように、細胞表面タンパク質の発現のための該発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための該発現カセットは、同一ベクターDNA上に位置する。
【００１８】
第三の局面において、本発明は、l-NGFRの発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含み、該化合物が真核細胞において遺伝子の発現を不活性化し得る、ベクターに方向付けられる。
【００１９】
第四の局面において、本発明は、以下を含むキットに方向付けられる
a）細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含み、該化合物が遺伝子の発現を不活性化し得る、ベクター、
b）該細胞表面タンパク質に対して作製されたモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗血清。
【００２０】
特定の態様において、該抗体は、検出可能な実体で標識化され、または、固体支持体に共有結合的に結合される。
【００２１】
もう一つの特定の態様において、上記に記述された一つと相互に排他的でなく、本発明に係るキットは、トランスフェクション試薬を更に含む。
【００２２】
本発明の詳細な説明
上記で開示されたように、本発明は、以下の段階を含む、真核細胞における遺伝子の発現の不活性化のための方法に方向付けられる
a）細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含むDNAであって、該化合物が該遺伝子の発現を不活性化し得、細胞表面タンパク質の発現のための該発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための該発現カセットが同一ベクターDNA上に位置する、DNAを用いた真核細胞のトランスフェクション、ならびに
b）該細胞表面タンパク質を発現する細胞の濃縮および／または選択。
【００２３】
本発明の文脈において、「遺伝子の発現の不活性化」という用語は、RNAi化合物によって媒介される特異的な標的RNAの分解として定義されるものとする。RNAi化合物自体は、RNAi化合物、または、内因性の細胞ヌクレアーゼによって続いてRNAi化合物に加工されるRNAi化合物前駆体の発現のための発現カセットを用いたトランスフェクションの後に合成される。
【００２４】
好ましい態様において、遺伝子発現の該不活性化は、一過性の不活性化である。本発明の文脈において、一過性の不活性化とは、選択圧の適用無しでの、細胞集団中のある遺伝子の発現の不活性化として定義されている。本文脈において、導入された細胞表面マーカーを共発現する細胞の濃縮は、それぞれの解析的アッセイが、トランスフェクション自体後数日以内に行われ得るという利点を提供する。更に、一過性トランスフェクションアッセイは、宿主ゲノムへの組込み事象に起因する増殖の損害による効果と関連付けられる、安定な形質転換体を産生する問題を回避する。
【００２５】
もう一つの態様において、永久的な不活性化を達成するために、組換え的に発現させた細胞表面マーカーでの濃縮が、安定なトランスフェクタントの単離を促進し、かつ、多くの場合には加速する。
【００２６】
非常に短い期間内に、RNAiが遺伝子機能を明らかにするための高度に特異的、かつ強力なツールとなることが判明し、および、そのために、学界および製薬産業において、標的確認のために広く使用されている。これまで、二つの主要な遺伝子サイレンシング戦略がインビトロ研究について明らかになってきている：低分子干渉RNA（siRNA）および低分子ヘアピン型RNA（shRNA）である（Tuschl, T., Nat. Biotechnol. 20 (2002) 446-448）。化学的に合成されたsiRNAの使用は、むしろ高いトランスフェクション効率への強い依存によって妨害され、適用を、効果的にトランスフェクション可能な細胞株へ限定する。それにもかかわらず、異なるトランスフェクション効率のために、結果がなお実験間で変動し得、かつ、元来単に一過性である。対照的に、ベクター由来のshRNAは、達成された遺伝子サイレンシング効果の持続期間において、siRNAよりすぐれている。更に、それらは、レポーター遺伝子または選択マーカーとの組み合わせ、およびウイルスベクターを経た送達のようなベクターに基づく発現系のすべての利点を提供する（Brummelkamp, T.R., and Bernards, R., Nat. Rev. Cancer 3 (2003) 781-789）。このように、shRNA発現ベクターは、低いトランスフェクション効率に基づく制限を克服する。これらのベクターについて刊行された研究の大抵は、標的遺伝子の発現が、この遺伝子に対して作製されたshRNAの安定な発現のためにサイレンシングされた細胞株に基づく（Caplen, N.J., Gene Ther. 11 (2004) 1241-1248）。しかしながら、安定な細胞クローンの産生は、単調でかつ長々しい過程に類似している。
【００２７】
本発明に係るRNAi化合物は、適切な発現カセットによって発現され、かつ、配列が不活性化されるべき標的mRNAと同一／相補的である、好ましくは19〜29ヌクレオチドの長さのステムを含むshRNAであってもよい。または、RNAi化合物のセンスおよびアンチセンス鎖は、逆のプロモーターを有する一つのDNA断片より別々に転写されてもよい。更にまたは、RNAi化合物のセンスおよびアンチセンス鎖は、適切な長さおよび配列のRNAをコードする二つの独立したDNAより転写されて生じてもよい。
【００２８】
上記で開示されたように、本発明は、RNAi化合物の手段による遺伝子サイレンシングの概念を、選択マーカーとして細胞表面タンパク質を使用する概念と組み合わせる。細胞表面に発現されるレポーター遺伝子は、毒性、およびアポトーシスの解析についての有用性の欠乏のような、EGFPの使用と関連付けられる制限を克服し得る。低親和性神経成長因子受容体の切断型で、これによってシグナル伝達について不活性であるl-NGFRは、細胞表面に発現され、かつ細胞生物学的解析について高度に有用なマーカーであることが判明してきている（Phillips, K., et al., Nat. Med. 2 (1996) 1154-1156、およびMachl, A.W., et al., Cytometry 29 (1997) 371-374）。この価値あるレポーターであるl-NGFRをshRNAベクター（pHC_ベクターと称される）と組み合わせることが、トランスフェクション効率から独立して、サイレンシングされた細胞の一過性および高容量（high-content）の多パラメトリック（multiparametric）解析を成功裡に可能にする。
【００２９】
以下の三つの要求を満たすとの条件で、高レベルのRNAi化合物を発現するトランスフェクタントの濃縮および選択のためのマーカーとして、発現産物が細胞表面上に位置する任意の種類の遺伝子を使用することは、本発明の範囲内である：
a）それぞれの宿主細胞は、対応する内因性タンパク質を高レベルで発現するべきでない。
b）表面マーカーの発現は、宿主細胞の通常のシグナル伝達経路の変化をもたらすべきでない。
c）加えて、これらの細胞表面タンパク質は、細胞内シグナル伝達領域について切断されている。そのような切断された細胞表面タンパク質の例は、l-NGFR、H-2K、およびCD4である（Milteny: Biotec: MACSelect Transfected Cell Selection User Manual）。
【００３０】
本発明は、一般に、いわゆる二本鎖RNAヌクレアーゼ、ダイサー（Dicer）およびRISC複合体を発現するすべての生細胞、または、換言すれば、RNA媒介遺伝子サイレンシングが観察され得るすべての細胞に適用可能である。このように、本発明は、植物、真菌、無脊椎動物細胞、および脊椎動物細胞由来のすべての型の真核細胞に適用され得る。好ましくは、本発明は、哺乳動物細胞、および特にヒト細胞または細胞株に適用可能である。
【００３１】
本発明の範囲内で、細胞形質転換体は、本技術分野において公知である実質的に任意の種類のトランスフェクション方法で取得されてもよい。例えば、ベクターDNAは、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションの手段によって細胞に導入されてもよい。または、FuGENE 6（Roche Diagnostics）、X-tremeGENE（Roche Diagnostics）、およびLipofectamine（商標）（Invitrogen）のようなリポフェクション試薬が使用されてもよい。更にまたは、細胞表面タンパク質およびRNAi化合物のための発現カセットを含むベクターDNAは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに基づく適切なウイルスベクター系によって細胞に導入されてもよい（Singer, O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 5313-5314）。
【００３２】
本発明に係る発現カセットを含むDNAは、環状プラスミドベクター、または、制限酵素断片、もしくは好ましくはPCR産物のような直鎖状DNA断片のいずれかであってもよい。
【００３３】
トランスフェクションされるDNAは、一つ、または二つの独立したベクターDNAのいずれかを含んでもよい。一つの態様において、細胞表面タンパク質の発現、およびRNA化合物の発現のための発現カセットは、異なるDNAベクター上に位置する。好ましい態様において、細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNA化合物の発現のための発現カセットは、同一ベクター上に位置する。この場合において、二つの転写物がお互いに干渉することは避けられる必要がある。しかしそれでも、同一ベクターDNA上に位置する双方の発現カセットを有することは、発現された細胞表面マーカーを基礎とする細胞ソーティングの手段による、RNAi化合物を発現する形質転換体のその後の選択を促進するため、高度に有利である。
【００３４】
本発明の文脈において、「発現カセット」という用語は、プロモーター配列、宿主細胞内で発現されてくるように望まれたRNAをコードするDNA配列、および、任意で、転写を終結するのに有用な転写終結配列を含む遺伝子構築物として定義される。
【００３５】
細胞表面タンパク質の発現のための発現カセットは、細胞表面タンパク質自体をコードするDNA、および、細胞表面タンパク質の安定した／構成的な発現を提供するポリメラーゼII（Pol II）プロモーターを含む。適当な強いプロモーターの例は、CMVプロモーター、SV40プロモーター、およびPGKプロモーターである。好ましくは、発現カセットはまた、Pol II転写物の正確な終結を提供するSV40転写終結要素を含む。
【００３６】
RNAi化合物を構成する転写物または複数の転写物は、CMVプロモーターのようなPol IIプロモーター、または、H1、U6、もしくは7SKプロモーターのようなPol IIIプロモーターのいずれかより転写され得る。Pol IIIが媒介する転写の場合、RNA産物前駆体の適切な3'プロセシングのために、転写されたRNAの3'末端にTTTTのPol III転写終結配列を有することが必須である（Dykxhoorn, D., et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 (2003) 457-467）。
【００３７】
一つの好ましい態様において、RNAi化合物は、ヘアピンコンフォメーションを有するRNA、すなわちshRNAである。活性を有するRNAi化合物として、そのような分子は、H1およびU6プロモーターからの転写が通常Gで開始する事実のために、5'末端がGヌクレオチドで開始してもよい。分子のステムは、通常19〜29塩基対であり、好ましくは、19〜23塩基対の長さである。分子の内部ループは、4〜40、好ましくは4〜9ヌクレオチドの１本鎖である。3'末端には、突出が存在してもよい。Pol IIIプロモーターの使用の場合には、Pol IIIプロモーターの転写終結シグナルのために突出はUUUUであってもよい。細胞内で発現されたとき、これらのヘアピン構築物は、RNA遺伝子サイレンシングを媒介し得る、活性を有する二本鎖分子に急速に加工される（Dykxhoorn, D., et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 (2003) 457-467）。
【００３８】
もう一つの好ましい態様において、RNAi化合物を転写するためのプロモーターは、外部のシグナル刺激によってプロモーター活性がオンに切り換えられ得ることで特徴付けられる誘導性プロモーターであってもよい。原理的には任意の種類のプロモーターと組み合わされてもよいそのようなプロモーター系の例は、tetリプレッサー系、ホルモン誘導性プロモーター系（Harvey, D.M., and Caskey, C.T., Curr. Opin. Chem. Biol. 2 (1998) 512-518）、組織特異的プロモーター、またはCRE系（Ventura, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 10380-10385）である。主として好ましいのは、Pol IIIプロモーターと適切なtetリプレッサー系との組み合わせである（Invitrogen: BLOCK-iT Inducible H1 RNAi Entry Vector User Manual）。
【００３９】
加えて、例えばハイグロマイシンまたはネオマイシン耐性のような、形質転換された細胞へ抗生物質耐性を付与する第三の発現カセットを提供することが可能である。
【００４０】
本発明の文脈において、「濃縮」という用語は、トランスフェクション段階を経験した細胞の集団を二つの分集団に分離する任意の方法であって、第一の分集団が第二の分集団より高い割合のトランスフェクションされた細胞を有する、方法を含むものとする。
【００４１】
本発明の文脈において、「細胞の選択」という用語は、トランスフェクション手順を経験した細胞の集団が、その後実際にトランスフェクションされた細胞に濃縮されている、任意の方法を意味するものとする。
【００４２】
当業者は、上記の定義がある程度は部分的に重複していることを理解するであろう。このように、多くの場合における細胞の濃縮および選択は、本明細書において開示される同一の方法によって達成されてもよい。
【００４３】
本発明の範囲内で、トランスフェクションされた細胞は、発現された細胞表面タンパク質マーカーの細胞外エピトープに対して作製される標識化されたモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗血清により、顕微鏡観察で同定されてもよい。
【００４４】
本発明の範囲内で、トランスフェクションされた細胞の濃縮および選択は、フローサイトメトリー的ツールで達成されてもよい。細胞表面マーカーに対して作製された蛍光標識化されたモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗血清で細胞を標識化した後、標識化された細胞が、蛍光標示式細胞分取器（fluorescence activated cell sorter）によって、カウントされる、または濃縮されるいずれかであってもよい。
【００４５】
本発明の別の態様において、トランスフェクションされた細胞の濃縮または選択は、発現された細胞表面タンパク質に対して作製された抗体でコートされた表面が、成功裡にトランスフェクションされた細胞にのみ結合するために使用されるという原理に基づく。好ましくは、共有結合的に結合されたモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗血清を含む適切なビーズが、固体支持体として使用される。非常に有効な態様において、トランスフェクションされた細胞は、面倒で高価で、かつ時間を浪費する細胞ソーティング方法および器械の必要なく、容易に適用可能で、かつ市販されている方法である、「磁気活性化細胞分離（magnetic activated cell sorting）」（MACS）と呼ばれる技術によって濃縮され、かつ選択される。
【００４６】
技術の詳細な記述は、MACSelectトランスフェクションされた細胞選択の使用者マニュアル（Milteny: Biotec: MACSelect Transfected Cell Selection User Manual)において与えられる。簡潔には、トランスフェクション手順を経験した細胞集団が、導入された発現カセットのためにトランスフェクションされた細胞において発現する表面マーカーに結合する抗体でコートされた磁気ビーズとインキュベーションされる。このとき、表面マーカーを発現する排他的にトランスフェクションされた細胞は、マイクロビーズに結合し得る。その後、試料はマイクロビーズで標識化されたトランスフェクションされた細胞、ならびにトランスフェクションされていない細胞の混合物を含み、磁気分離器、または相当する分離カラムにロードされる。トランスフェクションされていない細胞と比較して、これらの常磁性ビーズで標識化された細胞は、磁気カラム材料に選択的に結合する。磁場を除去することによって、標識化された細胞はカラムより放出される。
【００４７】
そのため、主要な局面において、本発明は、適切な細胞表面マーカーを使用する手段によってRNAi形質転換体を濃縮する、および／または選択する、改善された方法に方向付けられる。細胞表面マーカーの使用は、関心対象の特異的遺伝子をサイレンシングするためにRNAi化合物を発現する細胞集団内で、トランスフェクションされた細胞の即時の濃縮および選択を可能にする。
【００４８】
通常、適切な細胞表面タンパク質の手段による選択は、16〜48時間後すでに、細胞表面マーカーの発現が起きるとすぐに行われ得る。結果として、標的遺伝子発現についてサイレンシングされた細胞の生化学的、および表現型解析が、トランスフェクション後すぐに研究され得、組織培養において細胞が多数世代に渡って増殖させられる際の任意の可能性のある長期間人工産物を排除する。更に、適切な細胞表面タンパク質マーカーを使用する手段による選択は、数回反復され得る。
【００４９】
もう一つの局面において、本発明は、l-NGFRの発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含み、該化合物が遺伝子の発現を不活性化し得る、ベクターに方向付けられる。好ましくは、RNAi化合物の発現のための該発現カセットは、ステムが遺伝子サイレンシング媒介化合物として作用してもよいステムループヘアピンRNAを提供する。shRNA発現カセットと共にl-NGFRレポーターをコードするベクターは、個々の標的遺伝子発現についてサイレンシングされた細胞の量的な多パラメトリック解析を初めて可能にする。l-NGFRに基づくshRNA pHC_ベクターを使用することによって、様々な細胞株およびプライマリー（primary）細胞が、トランスフェクション効率から独立して、mRNAおよびタンパク質発現と同様に、細胞周期分布、アポトーシス誘導、細胞構造について解析され得る。
【００５０】
更にもう一つの局面において、本発明は、以下を含む組成物に方向付けられる
a）トランスフェクション試薬、
b）好ましくはl-NGFRである細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含むDNAであって、該化合物が遺伝子の発現を不活性化し得、細胞表面タンパク質の発現のための該発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための該発現カセットが同一ベクターDNA上に位置する、DNA。
【００５１】
好ましくは、該トランスフェクション試薬は、FuGENE 6、X-tremeGENE（双方ともRoche Diagnostics）、またはLipofectamine（商標）（Invitrogen）である。
【００５２】
また好ましくは、該組成物は、唯一の型のベクターDNAを所持する。
【００５３】
更なる局面において、本発明は、以下を含むキットに方向付けられる
a）好ましくはl-NGFRである細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含み、該化合物が遺伝子の発現を不活性化し得る、ベクター、
b）該細胞表面タンパク質に対して作製されたモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗血清。
【００５４】
RNAi化合物の発現のための発現カセットは、Pol IIプロモーターまたはPol IIIプロモーターであってもよいプロモーター、最終的に遺伝子サイレンシングを媒介するRNAi化合物として作用するであろう特異的配列を挿入するためのクローニング部位、および、好ましくは対応する転写終結配列を含む。
【００５５】
特定の態様において、該抗体は、蛍光実体のような検出可能な実体で標識化され、または、固体支持体に共有結合的に結合される。例えば、該固体支持体は、ビーズ、好ましくは磁気ビーズであってもよい。
【００５６】
もう一つの特定の態様において、上記に記述された一つと相互に排他的でなく、本発明に係るキットは、異なる細胞表面タンパク質をコードする異なる発現カセットを有するいくつかの異なるベクターを含む。これは、顧客が、トランスフェクションされることになっている特定の細胞株に適切な濃縮および選択系を選択することを可能にするであろう。
【００５７】
キットが、トランスフェクション試薬、好ましくはリポフェクション試薬、ならびに、細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含み、該化合物が該遺伝子の発現を不活性化し得る、一つまたはいくつかのベクターDNAを含む場合もまた、本発明の範囲内である。
【００５８】
加えて、そのようなキットはまた、該細胞表面タンパク質に対して作製されたモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗血清を含んでもよい。任意で、該抗体は、蛍光実体のような検出可能な実体で標識化され、または、固体支持体に共有結合的に結合される。例えば、該固体支持体は、ビーズ、好ましくは磁気ビーズであってもよい。
【００５９】
以下の実施例、参照文献、配列表、および図面は、本発明の理解を援助するために提供され、その真実の範囲は、添付された特許請求の範囲において示される。
【００６０】
実施例1
l-NGFRおよびU6プロモーター駆動shRNA発現カセット双方をコードするベクターの産生のためのクローニング戦略
高容量のためにpHCと称されるU6プロモーター駆動shRNAカセットを共発現するl-NGFRベクターを産生するため、SV40初期プロモーターおよびポリアデニル化配列の前後関係を伴うl-NGFR ORFが、l-NGFR発現ベクターより、以下のプライマーを用いてPCRによって増幅された。
2008522636.tif 000002
【００６１】
l-NGFRのPCR断片は、HindIIIおよび部位特異的突然変異誘発（Stratagene）によって産生された単一のXhoI制限酵素部位を用いて、pSilencer U6 2.1 Hygro（Ambion）にサブクローン化された。続いて、shRNA配列をコードする様々なDNAオリゴヌクレオチド（Metabion(Germany)によって化学的に合成された）がアニールされ、かつpHCにライゲーションされて、pHC_luc、pHC_eg5、およびpHC_Her2が産生された：
2008522636.tif 000003
2008522636.tif 000004
2008522636.tif 000005
【００６２】
すべてのヘアピンは、ループ構造として9bpの配列TTCAAGAGA（SEQ ID NO: 17）を含む。pHCベクターは、所望の標的遺伝子をサイレンシングする安定なトランスフェクタントの産生と同様に、一過性トランスフェクションを必要とするアッセイのために使用され得る。
【００６３】
実施例2
細胞表面上に発現されるHER2タンパク質のノックダウン効率
SKBR3細胞が、HER2に対して作製されたshRNAをコードする4種類の異なるpHC_Her2構築物を用いてトランスフェクションされた。これらの細胞では発現されていないルシフェラーゼを標的とするpHC_lucを用いたトランスフェクションが、陰性対照となった。pHC_lucおよびpHC_Her Fugene 6（Roche Diagnostics）トランスフェクション細胞におけるHER2発現は、l-NGFRと同様にHer2について細胞を染色し、その後フローサイトメトリー解析によって決定された。l-NGFR陽性細胞にゲーティングすることによって、トランスフェクションされた細胞集団の排他的解析が可能である。結果は図2に示される。ヒストグラムプロットにおいて、黒色のヒストグラムはトランスフェクションされていない細胞（l-NGFR陰性）のHER2発現を示し、灰色のヒストグラムは同一の試料から記録されたトランスフェクションされた細胞（l-NGFR陽性）のHER2発現を示す。ヒストグラムプロットにおける破線のグラフは、アイソタイプ対照染色を示す。X軸上およびヒストグラムの上の数字は、HER2発現の平均蛍光強度を指す；FL2高度：HER2発現（間接免疫蛍光染色1st AB: rhu MAB 2C4（Genentech）、2nd AB: 抗ヒトIgG-PE抱合体（Caltag））；l-NGFR発現はFITC標識抗l-NGFR抗体（Boehringer Mannheim）で検出された。pHC_Her D2、pHC_Her id1、pHC_Her id2、およびpHC_Her id4は、HER2に対する4種類の異なるshRNAをコードする4種類の異なるベクター構築物を示す。
【００６４】
フローサイトメトリー解析により決定されたように、HER2の成功裡のサイレンシングは、1-NGFR発現と非常によく相関した。このように、細胞表面上に発現されるタンパク質は、l-NGFRおよびshRNA発現カセットをコードするpHC_ベクターを活用する発明的な高容量RNAiアプローチに使用可能である。
【００６５】
実施例3
一過性トランスフェクション実験における磁気細胞分離（MACS）によるl-NGFR陽性細胞の濃縮
MACSelect l-NGFR System（Miltenyi Biotech）が、実施例2に従ったpHC_lucのトランスフェクションの96時間後に、l-NGFR陽性細胞を濃縮するために使用された。ヒストグラム（図3）において、トランスフェクションされていない細胞集団のl-NGFR発現（黒色のカーブ）が、pHC_lucをトランスフェクションされた細胞集団の、それぞれMACSソーティング前（上のパネル、灰色のカーブ）およびMACSソーティング後（下のパネル、灰色のカーブ）のl-NGFR発現と比較された。ここで、l-NGFRの発現は、＜抗マウス＞Alexa488 Ab（Molecular Probes）を適用する＜抗l-NGFR>マイクロビーズ標識化細胞のフローサイトメトリー検出によって決定された。ヒストグラムにおける数字は、磁気細胞分離前および後のマイクロビーズ標識化細胞の割合を指す。
【００６６】
このように、レポーターとしてのl-NGFRの適用は、磁気細胞ソーティングを経てサイレンシングされた細胞を濃縮するための独特の選択肢を提供する。
【００６７】
実施例4
非ソート細胞と比較された磁気ソート細胞におけるノックダウン効率、および、細胞質タンパク質eg5のサイレンシングにより誘導された表現型の変化
A:キネシンタンパク質eg5は、有糸分裂の紡錘体集合において重要な役割を果たす。活発に増殖している細胞において一貫してeg5発現をノックダウンすることは、G2/M停止の誘導、続いてアポトーシスをもたらす。HCT-116細胞の細胞周期解析が、pHC_luc（対照）およびpHC_eg5のFugene 6トランスフェクション（Roche Diagnostics）の96時間後に、FITC標識抗l-NGFR抗体およびDNA色素Hoechst 33342での細胞の二重染色によって行われた。図4aのヒストグラムプロットは、l-NGFR陽性細胞へのゲーティング無しおよびありで（それぞれ、上および下のパネル）、pHC_luc（黒色のカーブ）またはpHC_eg5（破線のカーブ）を用いてトランスフェクションされた細胞の細胞周期分布を表示する。ヒストグラムにおける矢印は、pHC_eg5を用いてトランスフェクションされた細胞のG2/M相高度を指す。MACSソーティング前および後のHCT-116細胞におけるeg5タンパク質発現のウエスタンブロット解析（実施例3参照）。細胞からの全タンパク質溶解物が、pHC_luc（陰性対照）およびpHC_eg5を用いたトランスフェクションの96時間後に取得された。試料は以下のように命名された：-MACS：トランスフェクション後の元の試料におけるpHCをトランスフェクションされた細胞の濃縮前のeg5発現；Neg：フロースルー細胞集団のeg5発現（トランスフェクションされていないl-NGFR陰性細胞は、MACSカラムに結合しない）；+MACS：濃縮された細胞集団のeg5発現（MACSカラムより溶出された、トランスフェクションされたl-NGFR陽性細胞画分）。
【００６８】
B：実施例4Aにおいて記述されたのと同一の解析が、非常に良好にトランスフェクション可能であるPC3細胞において行われ、図4bに示される。しかし、この細胞株においてさえも、l-NGFR陽性細胞にゲーティングすることは、大いに表現型解析の結果を改善する。同時に、MACSによるI-NGFR陽性細胞の濃縮は、ウエスタンブロットによるノックダウン効率の検出を改善する。
【００６９】
このように、l-NGFR発現に基づく磁気ソーティングは、すでに、一過性にトランスフェクションされた細胞において、様々な生化学的方法（RT-PCR、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティングのような）によるノックダウン効率の検出を可能にする。
【００７０】
実施例5
一過性トランスフェクションアッセイにおいて細胞質タンパク質eg5のサイレンシングにより誘導された表現型の変化
HCT-116細胞の細胞周期解析が、pHC_luc（対照）およびpHC_eg5のトランスフェクションの72時間後に、実施例4のようにFITC標識抗l-NGFR抗体およびDNA色素Hoechst 33342での細胞の二重染色によって行われた。図5において、l-NGFR発現は、Hoechst 33342の蛍光強度の直線目盛りに対してlog10としてプロットされる。R1：トランスフェクションされていない（l-NGFR陰性）細胞；R2：トランスフェクションされた（l-NGFR陽性）細胞。矢印は、pHC_eg5を用いてトランスフェクションされた細胞のG2/M相高度を指す。
【００７１】
細胞質に位置するタンパク質は、l-NGFRおよびshRNA発現カセットをコードする本発明のpHC_ベクターを活用する高容量RNAiに従って使用可能であることが、結論付けられ得る。
【００７２】
実施例6
一過性トランスフェクションアッセイにおいてeg5のサイレンシングにより誘導された表現型の変化の多パラメトリック解析
実施例4のようにトランスフェクションされたアポトーシス細胞の、アネキシンV（Roche）およびDAPI（Roche）についての二重染色による検出が、トランスフェクション72時間後のeg5がサイレンシングされた細胞におけるアポトーシスの割合を決定するために、l-NGFR検出と組み合わされた。アネキシンV陽性細胞がアポトーシス性、アネキシンV/DAPI二重染色細胞がアポトーシス‐ネクローシス性、およびDAPI陽性細胞がネクローシス性として評価された。結果は図6に示される。矢印は、eg5発現についてサイレンシングされたl-NGFR陽性（＝トランスフェクションされた）細胞におけるアポトーシスの誘導、続くネクローシスを指す。R1：トランスフェクションされていない（l-NGFR陰性）細胞；R2：トランスフェクションされた（l-NGFR陽性）細胞。
【００７３】
膜の完全性が損傷を受けている瀕死の細胞において、EGFPのような細胞質タンパク質は、細胞膜に結合されているl-NGFRと比較して容易に失われる。これは、アポトーシス性およびアポトーシス‐ネクローシス性細胞の双方が、l-NGFR発現について陽性の染色であることを指す。このように、pHC_ベクターを含むl-NGFRの使用は、サイレンシング時にアポトーシスを誘導する標的の解析を促進する。
【００７４】
参照文献の一覧表
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Brummelkamp, T.R., and Bernards, R., Nat. Rev. Cancer 3 (2003) 781-789 Caplen, N.J., Gene Ther. 11 (2004) 1241-1248
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欧州特許第1114784号
欧州特許第1144623号
Harvey, D.M., and Caskey, C.T., Curr. Opin. Chem. Biol. 2 (1998) 512-518
Harvey, K.J., et al., Cytometry 43 (2001) 273-278
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Phillips, K., et al., Nat. Med. 2 (1996) 1154-1156
Singer, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15 (2004) 5313-5314
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米国特許第6,506,559号
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国際公開公報第WO 03/93430号
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】l-NGFRおよびU6プロモーター駆動shRNA発現カセット双方をコードするベクターの産生のためのクローニング戦略。
【図２】細胞表面上に発現されるHER2タンパク質のノックダウン効率。
【図３】一過性トランスフェクション実験における磁気細胞分離（MACS）によるl-NGFR陽性細胞の濃縮。
【図４】非ソート細胞と比較された磁気ソート細胞におけるノックダウン効率、および、細胞質タンパク質eg5のサイレンシングにより誘導された表現型の変化。
【図５】一過性トランスフェクションアッセイにおいて細胞質タンパク質eg5のサイレンシングにより誘導された表現型の変化。
【図６】一過性トランスフェクションアッセイにおいてeg5のサイレンシングにより誘導された表現型の変化の多パラメトリック解析。
【図１】
2008522636.tif 000006
【図２】
2008522636.tif 000007
【図３】
2008522636.tif 000008
【図４Ａ】
2008522636.tif 000009
【図４Ｂ】
2008522636.tif 000010
【図５】
2008522636.tif 000011
【図６】
2008522636.tif 000012
【配列表】
2008522636000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月3日(2006.5.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、真核細胞における遺伝子の発現の不活性化のための方法
a）細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含むDNAを用いて真核細胞を形質転換する段階であって、該化合物が該遺伝子の発現を不活性化し得、細胞表面タンパク質の発現のための該発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための該発現カセットが同一ベクターDNA上に位置する、段階、
b）該細胞表面タンパク質を発現する細胞の濃縮および／または選択の段階。
【請求項２】
RNAi化合物が、ヘアピンコンフォメーションを有するRNAである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞表面タンパク質を発現する細胞の濃縮および／または選択が、細胞ソーティングの手段によって行われる、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
l-NGFRの発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含み、該化合物が真核細胞において遺伝子の発現を不活性化し得る、ベクター。
【請求項５】
以下を含む、組成物
a）FuGENE 6、X-tremeGENE、またはLipofectamine（商標）のようなリポフェクション試薬である、トランスフェクション試薬、
b）細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含み、細胞表面タンパク質の発現のための該発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための該発現カセットが同一ベクターDNA上に位置する、DNA。
【請求項６】
以下を含む、キット
a）細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含むベクター、
b）該細胞表面タンパク質に対して作製されたモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗血清。
c）FuGENE 6、X-tremeGENE、またはLipofectamine（商標）のようなリポフェクション試薬である、トランスフェクション試薬。
【請求項７】
抗体が、検出可能な実体で標識化された、または固体支持体に共有結合的に結合された、請求項6記載のキット。
【請求項８】
以下の段階を含む、遺伝子の発現の不活性化のためのRNAi構築物によりトランスフェクションされた細胞の選択のための方法
a）細胞表面タンパク質の発現のための発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための発現カセットを含むDNAを用いて真核細胞を形質転換する段階であって、該化合物が該遺伝子の発現を不活性化し得、細胞表面タンパク質の発現のための該発現カセット、およびRNAi化合物の発現のための該発現カセットが同一ベクターDNA上に位置する、段階
b）該細胞表面タンパク質を発現する細胞の濃縮および／または選択の段階。
【国際調査報告】
2008522636.tif 000013
2008522636.tif 000014