(57)【要約】  本発明は、ＤＲ５アゴニストとＧＳＫ３βアンタゴニストまたはｈＣＤＣ４アンタゴニストのいずれかを組み合わせることによる、癌細胞におけるアポトーシスを誘発するための方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞においてアポトーシスを誘発する方法であって：
ＭＹＣ発現およびＤＲ５発現癌細胞と：
(ｉ)ＤＲ５アゴニスト；および
(ii)グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β(ＧＳＫ３β)アンタゴニストまたはｈＣＤＣ４アンタゴニスト
を接触させる方法。
【請求項２】
癌細胞が動物内にあり、そして接触段階が、アゴニスト(ｉ)およびアンタゴニスト(ii)を該動物に投与することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
動物がヒトである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
動物がヒトではない、請求項２記載の方法。
【請求項５】
接触段階が細胞とＧＳＫ３βアンタゴニストの接触を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
接触段階が細胞とｈＣＤＣ４アンタゴニストの接触を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＤＲ５アゴニストが抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＤＲ５アゴニストがＴＲＡＩＬである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
治療的有効量の：
(ｉ)ＤＲ５アゴニスト；および
(ii)グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β(ＧＳＫ３β)アンタゴニストまたはｈＣＤＣ４アンタゴニスト
を含む、組成物。
【請求項１０】
ＧＳＫ３βアンタゴニストを含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
ｈＣＤＣ４アンタゴニストを含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
ＤＲ５アゴニストが抗体である、請求項９記載の組成物。
【請求項１３】
ＤＲ５アゴニストがＴＲＡＩＬである、請求項９記載の組成物。
【請求項１４】
癌細胞におけるアポトーシスを誘発する薬剤を同定するための方法であって：
(ｉ)ｈＣＤＣ４ポリペプチドのホスホデグロン(phosphodegron)結合性フラグメントを含むポリペプチドに１種以上の薬剤を接触させ(ここで、ホスホデグロンはＬＰＴＰＰ(配列番号２)を含み、配列番号２中のスレオニンはリン酸化されている)；
(ii)ホスホデグロンのポリペプチド結合を阻害する１種以上の薬剤を選択し、それにより、癌細胞におけるアポトーシスを誘発する薬剤を同定する
ことを含む、方法。
【請求項１５】
ホスホデグロンがＫＫＦＥＬＬＰＴＰＰＬＳＰＳＲＲ(配列番号１)を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
(iii)選択した１種以上の薬剤を、ＭＹＣを発現する癌細胞とＤＲ５アゴニスト存在下で接触させ；そして
(iv)癌細胞において、該細胞を該薬剤の非存在下でＤＲ５アゴニストと接触させたときよりもさらにアポトーシスを誘発する薬剤を選択する
ことをさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドが固体支持体支持体に結合している、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
ポリペプチドが第一蛍光標識と会合（associated with）しており、そしてホスホデグロンが第二蛍光標識と会合（associated with）しており、該ポリペプチドが該ホスホデグロンと結合したときに、該第一および第二標識が相互作用して蛍光シグナルを発し、ここで、薬剤の存在下での蛍光シグナルの減少が、該薬剤が該ポリペプチドの該ホスホデグロンへの結合を阻害することを示す、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
第一蛍光標識がユウロピウムであり、そして第一蛍光標識が、該ポリペプチドに結合する抗体に結合しており；そして
第二蛍光標識がアロフィコシアニン(ＡＰＣ)およびＣ−フィコシアニン(ＣＰＣ)から成る群から選択される、
請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５  Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９(ｅ)の下、米国仮出願番号６０／６６５,６４６(２００５年３月２４日出願)および６０／７１７,６４４(２００５年９月１５日出願)に対する優先権の利益を主張する。これらの優先権出願の開示は、引用により、その全体として、かつすべての目的に関して、本明細書に包含される。
【背景技術】
【０００２】
ＭＹＣ癌原遺伝子は、転写因子のベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックスロイシンジッパーファミリーのメンバーである(Luscher, B., (2001). Gene 277, 1-14)にレビューされている。ヒトゲノム中の遺伝子の１５％もの数において、プロモーターを結合すると考えられることから(Patel, J.H., Loboda, A.P., Showe, M.K., Showe, L.C. and McMahon, S.B., (2004). Nat Rev Cancer 4, 562-568)、ＭＹＣは、血管形成、ゲノム不安定性、分化の阻害、増殖、不死化および代謝を含む癌発達の種々のアレイにおいて役割を有する(レビューのために(Oster, S.K., Ho, C.S., Soucie, E.L. and Penn, L.Z., (2002). Adv Cancer Res 84, 81-154)参照)。逆説的に、ある状況下で、ＭＹＣはまた、通常腫瘍促進よりも抑制に関連するアポトーシス細胞死に対して細胞を感作できる(Pelengaris, S., Khan, M. and Evan, G., (2002). Nat Rev Cancer 2, 764-776.)。
【０００３】
ＭＹＣは、ヒト腫瘍の７０％までで増幅され、転座され、変異され、または他の方法で脱制御されていると概算され(Nilsson, J.A. and Cleveland, J.L., (2003). Oncogene 22, 9007-9021)、ＭＹＣ活性化が大部分のヒト癌における必須段階であり得ることを示唆する。トランスジェニックマウス腫瘍形成試験はＭＹＣの重要な役割の証拠となっており腫瘍開始、進行および維持におけるＭＹＣの機能を証明する(Jonkers, J. and Berns, A., (2004)Cancer Cell 6, 535-538)。癌との明確な関係にもかかわらず、その活性の薬理学的阻害の成功は、まだ達成されていない。
【０００４】
ＤＲ５は、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)スーパーファミリーのアポトーシス誘発サイトカインである、ＴＲＡＩＬ(腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド、ａｐｏ２Ｌ、ＴＮＦＳＦ１０としても既知)の受容体である(LeBlanc, H.N. and Ashkenazi, A., (2003)Cell Death Differ 10, 66-75.; Ozoren, N. and El-Deiry, W.S., (2002)Neoplasia 4, 551-557にレビュー)。組み換えヒトＴＲＡＩＬおよび、その２個の死誘発受容体に対するアゴニスト抗体、ＤＲ４およびＤＲ５は、現在、癌治療剤として広範な前臨床および臨床試験中である。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
一つの局面において、本発明は癌細胞におけるアポトーシスを誘発する方法を提供する。本方法は、ＭＹＣ発現およびＤＲ５発現癌細胞と(ｉ)ＤＲ５アゴニスト；および(ii)表１に挙げるＭＹＣ相互作用遺伝子(例えば、ＧＳＫ３β)のアンタゴニストまたはｈＣＤＣ４アンタゴニストの接触を含む。ある態様において、本癌細胞は動物体内にあり、接触段階は、表１に挙げるＭＹＣ相互作用遺伝子(例えば、ＧＳＫ３β)のアゴニストまたはｈＣＤＣ４アンタゴニストの動物への投与を含む。ある態様において、本動物はヒトである。ある態様において、本動物はヒトではない。ある態様において、本接触段階は、細胞と、表１に挙げるＭＹＣ相互作用遺伝子(例えば、ＧＳＫ３β)のアゴニストの接触を含む。ある態様において、本接触段階は、細胞とｈＣＤＣ４アンタゴニストの接触を含む。ある態様において、本ＤＲ５アゴニストは抗体である。ある態様において、本ＤＲ５アゴニストはＴＲＡＩＬである。
【０００６】
本発明はまた癌細胞におけるアポトーシスを誘発する方法を提供する。ある態様において、本方法は、ＭＹＣ発現およびＤＲ５発現癌細胞と、ＤＲ５アゴニストを接触させ；そして細胞内に、表１に挙げるＭＹＣ相互作用遺伝子(例えば、ＧＳＫ３β)またはｈＣＤＣ４の発現を阻害するアンチセンスまたはｓｉＲＮＡを挿入することを含む。本発明はまた治療的有効量の(ｉ)ＤＲ５アゴニスト；および(ii)表１に挙げるＭＹＣ相互作用遺伝子のアゴニスト(例えば、ＧＳＫ３β)またはｈＣＤＣ４アンタゴニストを含む、組成物も提供する。ある態様において、本ＤＲ５アゴニストは抗体である。ある態様において、本ＤＲ５アゴニストはＴＲＡＩＬである。
【０００７】
本発明はまた癌細胞におけるアポトーシスを誘発する薬剤を同定する方法も提供する。ある態様において、本方法は(ｉ)ｈＣＤＣ４ポリペプチドのホスホデグロン(phosphodegron)結合性フラグメントを含むポリペプチドに１種以上の薬剤を接触させ(ここで、ホスホデグロンはＬＰＴＰＰ(配列番号２)を含み、配列番号２中のスレオニンはリン酸化されている)；そして(ii)ホスホデグロンのポリペプチド結合を阻害する１種以上の薬剤を選択し、それにより、癌細胞におけるアポトーシスを誘発する薬剤を同定することを含む。ある態様において、本ホスホデグロンはＫＫＦＥＬＬＰＴＰＰＬＳＰＳＲＲ(配列番号１)を含む。ある態様において、本方法はさらに選択した１種以上の薬剤を、ＭＹＣを発現する癌細胞とＤＲ５アゴニスト存在下で接触させ；そして(iv)癌細胞において、該細胞を該薬剤の非存在下でＤＲ５アゴニストと接触させたときよりもさらにアポトーシスを誘発する薬剤を選択することを含む。
【０００８】
これらの方法のいくつかにおいて、本ポリペプチドは固体支持体に結合している。ある態様において、本ポリペプチドが第一蛍光標識と会合しており、そして本ホスホデグロンが第二蛍光標識と会合しており、該ポリペプチドが該ホスホデグロンと結合したときに、該第一および第二標識が相互作用して蛍光シグナルを発し、ここで、薬剤の存在下での蛍光シグナルの減少が、該薬剤が該ポリペプチドの該ホスホデグロンへの結合を阻害することを示す。ある態様において、本第一蛍光標識はユウロピウムであり、そして本第一蛍光標識が、該ポリペプチドに結合する抗体に結合しており；そして本第二蛍光標識がアロフィコシアニン(ＡＰＣ)およびＣ−フィコシアニン(ＣＰＣ)から成る群から選択される。
【０００９】
本発明はまた、個体における癌細胞のアポトーシスを誘発する方法を提供する。ある態様において、本方法は、ＤＲ５アゴニストを個体に投与することを含み、ここで、該個体中の癌細胞は、ｈＣＤＣ４またはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β(ＧＳＫ３β)をコードするポリヌクレオチド中に、野生型ｈＣＤＣ４またはＧＳＫ３βポリペプチドと比較してｈＣＤＣ４またはＧＳＫ３βの活性の低下をもたらす変異を有することが予め決定されている。ある態様において、本方法は、投与段階前に、個体における癌細胞のｈＣＤＣ４またはＧＳＫ３β遺伝子型の決定を含む。ある態様において、本方法は、癌細胞のｈＣＤＣ４遺伝子型の決定を含む。ある態様において、本方法は、癌細胞のＧＳＫ３β遺伝子型の決定を含む。ある態様において、ＤＲ５アゴニストは、ＤＲ５およびＴＲＡＩＬに結合する抗体から成る群から選択される。
【００１０】
本発明はまた個体における癌細胞のアポトーシスを誘発する方法を提供する。ある態様において、本方法はＤＲ５アゴニストを個体に投与することを含み、ここで、該個体中の癌細胞はＴ５８位に変異を有することが予め決定されている。ある態様において、本変異はＴ５８ＩまたはＴ５８Ａである。ある態様において、本方法は投与段階前に、個体における癌細胞のＭＹＣ遺伝子型の決定を含む。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は抗ＤＲ５アゴニスト抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を記載する。相補性決定領域(ＣＤＲ)は囲っている。残りのアミノ酸はフレームワーク領域(ＦＲ)の一部である。
【００１２】
図２は図１に示す抗ＤＲ５アゴニスト抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を記載する。相補性決定領域(ＣＤＲ)は囲っている。残りのアミノ酸はフレームワーク領域(ＦＲ)の一部である。
【００１３】
図３は図１および２に示す可変領域のＤＮＡコーディング配列である。
【００１４】
定義
“ＧＳＫ３βアンタゴニスト”または“ｈＣＤＣ４アンタゴニスト”は、各々ＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４を部分的に(例えば、少なくとも５、１０、２０、５０％以上)または完全に刺激を遮断し、減少し、防止し、活性化遅延し、不活性化し、または脱感作する化合物である。アンタゴニストは、例えば、抗体、有機小分子(例えば、１５００ダルトン未満)などを含み得る。
【００１５】
“ＤＲ５アゴニスト”はＤＲ５の活性化を刺激し、増加させ、活性化し、活性化を増強し、感作し、または上方制御する化合物である。アゴニストは、例えば、抗体、有機小分子(例えば、１５００ダルトン未満)などを含み得る。アゴニストはＤＲ５への結合について既知のＤＲ５リガンド(例えば、ＴＲＡＩＬ)と競合し、ＭＹＣおよびＤＲ５を発現する癌細胞におけるアポトーシスを誘発し得るが、必ずしもではない。ある態様において、ＤＲ５アゴニストにより誘発されるアポトーシスの量は、ＴＲＡＩＬにより誘発されるアポトーシスと比較して、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１５０％、２００％またはそれより多い。
【００１６】
ここで使用する用語“癌”は、患者体内の細胞が以上な、制御されない増殖を受けている状態を意味するために使用する。この異常な細胞は増殖して固形腫瘍を形成し得るか、または多数の細胞を形成し得る(例えば、白血病)。
【００１７】
本発明の目的で、用語“癌細胞”は、膵臓、結腸、乳房、前立腺、腎臓、肺、卵巣、胃、食道、肝細胞、または頭頚部癌細胞、黒色腫細胞、白血病細胞、および多発性骨髄腫細胞を含むが、これらに限定されない、異常に増殖する全ての細胞を意味する。ある態様において、本癌細胞は初代培養および不死化細胞株を含む細胞培養で増殖する。いくつかの他の態様において、本癌細胞は動物、好ましくは哺乳動物中にある。ここで使用する用語“哺乳動物”は、ラット、マウス、イヌ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトを含むが、これらに限定されない。
【００１８】
ここで使用する“ホスホデグロン”は、リン酸化されたポリペプチドを意味する。
【００１９】
“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形いずれかのデオキシリボヌクレオチド(例えば、ＤＮＡ)またはリボヌクレオチド(例えば、ＲＮＡ)およびそれらのポリマーを意味する。本用語は、合成され、天然に存在し、および天然に存在しない、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の方法で代謝される既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含む核酸も含む。このような類似体の例は、ホスホロチオエート、ホスホロアミデイト、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸(ＰＮＡ)を含む。
【００２０】
特記しない限り、特定の核酸配列はまたその保存的に修飾された変異体(例えば、縮重コドン置換)および相補配列、ならびに明示する配列も含むことも含意する。特に、縮重コドン置換は、１箇所以上の選択した(または全ての)コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列の産生により達成し得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081(1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608(1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。
【００２１】
用語“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”はアミノ酸残基のポリマーに言及するために本明細書で交換可能に使用する。これらの用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学摸倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【００２２】
用語“アミノ酸”は、天然に存在するおよび合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の方法で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸摸倣物を意味する。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによりコードされるもの、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したアルファ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このような類似体は修飾されたＲ基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を維持する。アミノ酸摸倣物は、アミノ酸の一般的化学構造と異なるが、天然に存在するアミノ酸と類似の方法で機能する化学化合物を意味する。
【００２３】
“配列同一性の割合”は、比較ウィンドにわたり２個の最適に配置した配列の比較により決定し、ここで比較ウィンド中のポリヌクレオチド配列は、２個の配列の最適配置のために、付加または欠失を含まない配列参照配列(例えば、本発明のポリペプチド)と比較して付加または欠失(すなわち、ギャップ)を有してよい。割合は、マッチ位置の数を得るために、両配列に存在する同一核酸塩基またはアミノ酸残基の数を決定し、マッチ位置の数を比較ウィンドにおける全位置の数で割り、その結果を１００倍して、配列同一性の割合を得ることにより計算する。
【００２４】
２個またはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列に関する用語“同一”または“同一性”割合は、は、同じ配列である２個以上の配列または部分配列を意味する。２個の配列は、比較ウィンド、または下記配列比較アルゴリズムの１個を使用して測定した指定領域にわたり比較し、最大対応のために配置したときまたは手動アラインメントおよび目視により、２個の配列が、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを明記する割合で有するならば(すなわち、特定領域、または特記しないとき、全配列にわたり６０％同一性、所望により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一性)、“実質的に同一”である。本発明は、図１および図２に例示するポリペプチドと実質的に同一の配列を含むポリペプチドを提供する。所望により、本同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長である領域にわたり、またはより好ましくは１００から５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド長の領域にわたり、存在する。
【００２５】
配列比較のために、典型的に１個の配列は参照配列として働き、それに対して、試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列配位を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用でき、あるいはパラメータを指定できる。次いで、本配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一性を計算する。
【００２６】
ここで使用する“比較ウィンド”は、２個の配列を最適に配置した後、配列を同じ連続位置の数の参照配列と比較し得る２０から６００、通常約５０から約２００、さらに普通には約１００から約１５０から成る群から選択される連続位置の数のいずれか一個のセグメントに対する参照を含む。比較のための配列の配置の方法は当分野で既知である。比較のための配列の最適配置は、例えば、SmithおよびWaterman(1970)Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch(1970)J. Mol. Biol. 48:443の相同性配置アルゴリズムにより、PearsonおよびLipman(1988)Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の方法類似法の検索により、これらのアルゴリズムのコンピュータを利用した実行により(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ)、または自動配置および目視により(例えば, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1995 supplement)参照)行うことができる。
【００２７】
配列同一性割合および配列類似性の決定に適するアルゴリズムの２個の例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２.０アルゴリズムであり、これらは各々Altschul et al. (1977)Nuc. 酸 Res. 25:3389-3402、およびAltschul et al. (1990)J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Informationを通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に、クエリ配列における長さＷの短いワードを同定することにより高得点配列対(ＨＳＰ)を同定し、これはデータベース配列中の同じ長さのワードと配置したときに、マッチであるか、またはある正の値閾値スコアＴを満たす。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ぶ(Altschul et al., supra)。これらの最初の隣接ワードヒットが、それらを含むより長いＨＳＰを発見するための検索を開始するための種として働く。本ワードヒットは、累積配列配置が増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長できる。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメータＭ(マッチング残基のペアの報償スコア；常に＞０)およびＮ(ミスマッチング残基のペナルティスコア；常に＜０)を使用して計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの伸長は：累積配置スコアが、その最大に達成された値から量Ｘまで低下したとき；累積スコアが、１個以上の負のスコアリング残基配置の累積により０またはそれ未満になったとき；またはいずれかの配列の末端に到達したときに中止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、配置に感受性および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム(ヌクレオチド配列について)は、デフォルトとして１１のワード長(Ｗ)、１０の期待値(Ｅ)、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較物を使用する。アミノ酸配列のために、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、および１０の期待値(Ｅ)、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス(Henikoff and Henikoff(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915参照)配置(Ｂ)、１０の期待値(Ｅ)ｏｆ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較物を使用する。
【００２８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた２個の配列の間の類似性の統計学的解析も行う(例えば、Karlin and Altschul(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787参照)。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１個の指標は、最小合計確率(Ｐ(Ｎ))であり、これはｍ、２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列のマッチが偶然起こるかもしれない確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸の参照核酸に対する比較での最小合計確率が約０.２未満、より好ましくは約０.０１未満、および最も好ましくは約０.００１未満であるとき、参照配列に類似であると見なす。
【００２９】
発明の詳細な記載
細胞におけるアポトーシスの誘発
本発明は、一部、ＧＳＫ３βのような多くのＭＹＣ相互作用遺伝子(表１に列記)またはｈＣＤＣ４によりコードされるタンパク質の阻害が、癌細胞をＤＲ５アゴニスト誘発アポトーシスの誘発に対して感作するという驚くべき発見に基づく。従って、本発明のある態様は、これらのＭＹＣ相互作用遺伝子(例えば、ＧＳＫ３β)またはｈＣＤＣ４を、ＤＲ５受容体の誘発と組み合わせて、阻害するために提供する。
【００３０】
アポトーシスが誘発される細胞は、典型的にＭＹＣ発現癌細胞またはＤＲ５アゴニストに感受性の他の細胞である。アポトーシスが誘発される細胞は、インビボまたはインビトロにあり得る。ある態様において、本発明の方法は、エキソビボで行い、すなわち、細胞サンプルを個体から採取し、アポトーシスをサンプル由来の癌細胞で誘発し、そして処置細胞を個体に戻す。
【００３１】
ＤＲ５アゴニスト
全てのＤＲ５アゴニストを、本発明に従い使用できる。ＤＲ５アゴニストの例は、例えば、抗ＤＲ５アゴニスト抗体およびＴＲＡＩＬを含む。例えば、Griffith TS, et al., Curr Opin Immunol. 10(5):559-63(1998)参照。
【００３２】
全ての抗ＤＲ５抗体アゴニストを、本発明の方法の方法に従い使用できる。ＤＲ５(細胞死受容体５とも言う)は、リガンドＴＲＡＩＬの受容体である。例えば、Pan et al., Science 277:815-8(1997);Sheridan, et al., Science 277:818-21 3(1997);Walczak et al, EMBO J. 16:5386-97 4(1997)参照。抗ＤＲ５抗体は以前に、例えば、ＰＣＴ  ＷＯ０１／８３５６０(抗体ＴＲＡ−８；ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１４２８)およびＰＣＴ  ＷＯ０２／０７９３７７に記載されている。
【００３３】
加えて、抗ＤＲ５アゴニスト抗体アゴニストをここに記載する。例示した抗ＤＲ５抗体アゴニストの重および軽鎖の可変領域は図１および図２に示す。またＰＣＴ特許公開ＷＯ２００４／０５０８９５も参照。ある態様において、本発明で使用する抗ＤＲ５アゴニスト抗体は、ＤＲ５への結合について図１および図２に記載の可変領域を有する抗体と競合する。ある態様において、本発明で使用するＤＲ５抗体アゴニストは、図１および図２に例示するＣＤＲと実質的に同じＣＤＲを有する。抗ＤＲ５抗体の例は、図１および図２に示す軽および／または重鎖可変領域配列を含む抗体の特性を有するものを含む。
【００３４】
全てのタイプの抗体アゴニストを本発明の方法に従い使用できる。一般に、使用する抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は当分野で既知の任意の方法により産生できる(例えば、ハイブリドーマ、組み換え発現および／またはファージ・ディスプレイを使用)。
【００３５】
本発明の抗体は架橋していなくてよく、または投与前に他に処置しなくてよい。しかしながら、ある態様において、本発明の抗体は架橋している。架橋(例えば、ヘテロまたはホモ２官能性化学架橋剤を使用)は当分野で既知である。あるいは、安定な多価Ｆａｂｓ(例えば、三量体または四量体など)を投与できる。例えば、ＰＣＴ  ＷＯ９９／２７９６４参照。
【００３６】
多くの態様において、本発明の抗ＤＲ５抗体は他のポリペプチドに結合しない。ある態様において、本抗ＤＲ５抗体は、ＴＮＦ受容体ファミリーの他の受容体(例えば、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲ３、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＦＡＳ、ＤｃＲ３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１３７、ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＲＡＮＫ、ＯＰＧ、ＤＲ３、ＴＲ２、ＮＧＦＲ、ＴＮＦＲ１、およびＴＡＣ１)に結合しない。ある態様において、本抗ＤＲ５抗体はＤＲ４、ＤＴＲ１、ＤＴＲ２またはＯＰＧに結合しない。
【００３７】
本発明の抗ＤＲ５アゴニスト抗体は非常に強力であり得る。例えば、ある態様において、標準皮下腫瘍アブレーションアッセイにおいて、本発明の抗体は腫瘍サイズを体重１kgあたり１mg未満(そして、ある態様において、０.５０mg／kg、０.０５mg／kg、または０.０１mg／kgまたはそれ未満)の濃度で動物に２週間１日３回投与したとき、５０％まで減少でき、そしてその１０倍量を使用したとき腫瘍を完全に消失できる。
【００３８】
ある場合、本発明の抗ＤＲ５抗体は、抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)がないか、減少しているように設計できる。例えば、ある態様において、本発明の抗体はＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−２Ａ、ＩｇＧ−３またはＩｇＧ−４  Ｆｃ領域を含む。
【００３９】
ヒト化抗体
ある態様において、本発明に従い使用する抗体は、非ヒト抗ＤＲ５抗体アゴニスト由来の領域とヒト抗体の領域から成るキメラ(例えば、マウス／ヒト)抗体である。例えば、キメラＨ鎖は、ヒト重鎖定常領域の少なくとも一部に結合した非ヒト抗体の重鎖可変領域の抗原結合領域(例えば、図１および図２に示す配列)を含み得る。このヒト化またはキメラ重鎖は、ヒト軽鎖定常領域の少なくとも一部に結合した非ヒト抗体の軽鎖可変領域の抗原結合領域(例えば、図１および図２に示す配列)を含むキメラＬ鎖と組み合わせてよい。ある態様において、本重鎖定常領域はＩｇＭまたはＩｇＡ抗体であり得る。
【００４０】
本発明のキメラ抗体は一価、二価、または多価免疫グロブリンであり得る。例えば、一価キメラ抗体は、上記のとおり、キメラＬ鎖とジスルフィド結合を介して結合しているキメラＨ鎖から形成された二量体(ＨＬ)である。二価キメラ抗体は、少なくとも１個のジスルフィド架橋を介して結合した２個のＨＬ二量体から形成された四量体(Ｈ２ Ｌ２)である。多価キメラ抗体は鎖の凝集に基づく。
【００４１】
例示する抗ＤＲ５抗体アゴニストの可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図３に示す。本発明の抗体のＤＮＡ配列は、当分野で既知の方法により、同定され、クローン化され、発現のために原核または真核細胞に転移される。このような方法は、一般にSambrook et al., supra、ならびにCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel et al., eds., 1989)に記載されている。特に組み換え抗体およびヒト化抗体の発現に適する発現ベクターおよび宿主細胞は、当分野で既知である。下記文献は、本発明の実施において使用できる組み換え免疫グロブリンの発現に適した方法およびベクターの代表である：Weidle et al., Gene, 51:21-29(1987);Dorai et al., J. Immunol., 13(12):4232-4241(1987);De Waele et al., Eur. J. Biochem., 176:287-295(1988);Colcher et al., Cancer Res., 49:1738-1745(1989);Wood et al., J. Immunol., 145(a):3011-3016(1990);Bulens et al., Eur. J. Biochem., 195:235-242(1991);Beggington et al., Biol. Technology, 10:169(1992);King et al., Biochem. J., 281:317-323(1992);Page et al., Biol. Technology, 2:64(1991);King et al., Biochem. J., 290:723-729(1993);Chaudary et al., Nature, 339:394-397(1989);Jones et al., Nature, 321:522-525(1986);MorrisonおよびOi, Adv. Immunol., 44:65-92(1988);Benhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:12051-12055(1994);Singer et al., J. Immunol., 150:2844-2857(1993);Cooto et al., Hybridoma, 13(3):215-219(1994);Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033(1989);Caron et al., Cancer Res., 32:6761-6767(1992);Cotoma et al., J. Immunol. Meth., 152:89-109(1992)。さらに、組み換え抗体の発現に適したベクターは市販されている。
【００４２】
機能的免疫グロブリンを発現できる宿主細胞は、例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞のような哺乳動物細胞；ＣＯＳ細胞；ＮＳＯおよびＳＰ２／Ｏ細胞のような骨髄腫細胞；大腸菌のような細菌細胞；出芽酵母のような酵母細胞；および他の宿主細胞を含む。
【００４３】
一本鎖抗体
ある態様において、本発明の抗体は一本鎖抗体である(例えば、図１および図２の配列の１個以上を含む)。一本鎖Ｆｖｓおよび抗体の製造に使用できる技術の例は、米国特許４,９４６,７７８および５,２５８,４９８；Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88(1991);Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999(1993);およびSkerra et al., Science 240:1038-1040(1988)に記載されているものを含む。
【００４４】
ヒト抗体
ある態様において、ヒト抗体を本発明に従い、使用する。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用したファージ・ディスプレイ法の使用を含む種々の方法により製造できる。例えば、Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93(1995)、米国特許４,４４４,８８７および４,７１６,１１１；およびＰＣＴ公報ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１参照。
【００４５】
ある態様において、本発明の方法はファージ・ディスプレイを使用して製造する。例えば、機能的抗体ドメインを、それをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上に提示させる。このようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えば、ヒトまたはマウス)から発現される抗原結合ドメインの提示に使用できる。ＤＲ５と結合する抗原結合ドメインを発現するファージをＤＲ５で、例えば、標識ＤＲ５を使用して、選択または同定できる。これらの方法に使用するファージは、典型的に、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかに組み換えにより融合したＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現される、ｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。本発明の抗体の製造に使用できるファージ・ディスプレイ法の例は、Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50(1995);Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186(1995);Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958(1994);Persic et al., Gene 187:9-18(1997);Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280(1994)；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公報ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許５,６９８,４２６；５,２２３,４０９；５,４０３,４８４；５,５８０,７１７；５,４２７,９０８；５,７５０,７５３；５,８２１,０４７；５,５７１,６９８；５,４２７,９０８；５,５１６,６３７；５,７８０,２２５；５,６５８,７２７；５,７３３,７４３および５,９６９,１０８に開示のものを含む。
【００４６】
アゴニスト抗体の製造
アゴニスト抗体は、抗ＤＲ５抗体を製造し、次いで各抗体をＤＲ５仲介事象、例えば、癌細胞におけるアポトーシス誘発の引き金を引く能力について試験することにより同定できる。当分野で既知の種々のアッセイをアポトーシスの誘発の検出に使用できる。
【００４７】
一つのアッセイにおいて、ＤＯＨＨ−２またはＪｕｒｋａｔ細胞を候補抗体アゴニストと接触させ、次いで、抗体濃度の関数として生存能をモニターする。抗体濃度の増加に連れて減少する細胞生存能(例えば、増加したアポトーシスによる)は、本抗体がアゴニストであることを示す。細胞生存能は、生存細胞では蛍光を発するが、死亡細胞では発しないアルマール・ブルーの添加によりアッセイできる。ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ２００４／０５０８９５に記載の通り、アゴニスト抗体を、ＤＲ５に対して惹起させたハイブリドーマをスクリーニングし、次いで、該ハイブリドーマ上清を、ＤＯＨＨ−２またはＪｕｒｋａｔ細胞においてアポトーシスを誘発する能力についてスクリーニングすることにより同定できる。適当なポジティブまたはネガティブコントロールを、結果を確認するために使用できる。例えば、ＤＲ５仲介ＴＲＡＩＬ誘発アポトーシスを完了しない細胞株は、候補抗ＤＲ５アゴニストに応答してアポトーシスを完了しないはずである。
【００４８】
ＭＹＣ相互作用遺伝子のアンタゴニスト
表１に示すＭＹＣ相互作用遺伝子(例えば、ＧＳＫ３β)によりコードされるポリペプチドの活性または発現を阻害する全ての分子を、ここに記載の通りアポトーシスを誘発するためにＤＲ５アゴニストと組み合わせて使用できる。例としてＧＳＫβを使用して、アンタゴニストは、例えば、ＧＳＫ３βに結合し、その活性を阻害する抗体、ならびに小分子阻害剤を含む。広範なＧＳＫ３βアンタゴニストが、一部糖尿病におけるＧＳＫ３の役割のために既知である。ある態様において、ＧＳＫ３βアンタゴニストは、ＧＳＫ３αのような他のキナーゼを含む他のキナーゼを著しく阻害しない。ＧＳＫ３βアンタゴニストの一例はＬｉＣｌである。ある態様において、本ＧＳＫ３βアンタゴニストはＬｉＣｌではない。ＧＳＫ３βアンタゴニストの例は、例えば、ＷＯ００／３８６７５および米国特許公報２００５／００２６９４６、２００５／０００４２０１、２００５／０００４２０２、２００４／０２６６８１５、２００４／０２０９８７８、２００４／０１９２７１８、２００４／０１９２６９８、２００４／０１８６１１９、２００４／０１８６１１３、２００４／０１６２２３４、２００４／０１３８２７３、２００４／０１０６５７４、２００４／００９２５３５、２００４／００８２５８１、２００４／００７７６９９、２００４／００７７６４２、２００４／００５９１１３、２００４／００５４１８０、２００４／０００６０９５、２００４／０００６０９４、２００３／０２２５０８５、２００３／０２１２０７９、２００３／０１９４７５０、２００３／０１０５０７５、２００３／００７８２８０、２００３／００６０６２９、２００３／００５５０９７、２００２／０１９８２１９、２００２／０１６０４７８、２００２／０１５１５７４、２００２／０１４７１４６、２００１／００５２１３７および米国特許番号６,６０８,０６３に記載されている。
【００４９】
ＧＳＫ３β阻害剤の例は、式１および２で表されるものを含む。例えば、これらの分子の詳細およびそれらの製造法についてＷＯ０４／０４３４６７およびＷＯ０１／０７２７４５を参照。
【００５０】
【化１】
2008536820.tif 000002
【００５１】
ＧＳＫ３βを阻害するさらなる薬剤が、当分野で既知の任意の方法により同定できる。例えば、化合物は、標準結合酵素アッセイ(例えば、Fox et al., Protein Sci 7:2249(1998))またはキナーゼ活性の決定に使用する他のアッセイを使用して、ＧＳＫ３βを阻害するそれらの能力について、下記の方法においてスクリーニングできる。
【００５２】
ｈＣＤＣ４アンタゴニスト
任意のｈＣＤＣ４アンタゴニストを本発明に従い使用できる。アンタゴニストは、例えば、抗体アンタゴニストまたは他の有機小分子阻害剤を含む。
【００５３】
ｈＣＤＣ４は、Ｅ３リガーゼとして働くskp-cullin-Fbox(ＳＣＦ)複合体は、ユビキチンの細胞基質への結合を促進し、該細胞基質は２６Ｓプロテアソームによる分解のためにそれらを標的とできる。例えば、Cardozo and Pagano, Mol. Cell. Biol. 5:739-751(2004)参照。ＳＣＦ複合体内のｈＣＤＣ４の機能は基質認識である。ｈＣＤＣ４は、Ｓｋｐ１に結合するそのＮ末端領域内にＦｂｏｘモチーフを含み、それによりｈＣＤＣ４をＳＣＦ複合体に固定する。ｈＣＤＣ４中のＦｂｏｘとＷＤ４０反復の間の柔軟なリンカーは、ＷＤ４０反復により形成された環状β−プロペラモチーフが、適当な基質を認識することを可能にし、それによりこれらの基質をユビキチン化のためにＳＣＦに集める。本ｈＣＤＣ４環状β−プロペラモチーフは、ＭＹＣの場合スレオニン(Ｔ)がＧＳＫ３βによりリン酸化されているＫＫＦＥＬＬＰＴＰＰＬＳＰＳＲＲ(配列番号１)である、標的基質内のホスホデグロンモチーフを認識する。最小ホスホデグロン配列はＬ＊ＴＰＸＸコンセンサスであり、それはＭＹＣの場合ＬＰＴＰＰである。故に、ＧＳＫ３βはＭＹＣをリン酸化し、Ｆｂｗ７による認識を可能にし、それによりＭＹＣをＳＣＦ複合体に集め、その場所でそれがユビキチン化され、その後２６Ｓプロテアソームにより分解される。
【００５４】
ｈＣＤＣ４の作用機序から、多くのスクリーニングアッセイを行うことができる。ある態様において、本活性リガーゼ複合体を候補アンタゴニストと接触させ、その後、リガーゼ活性の減少について試験できる。リガーゼ活性は直接的または間接的に、例えば、標的タンパク質のユビキチン化の、またはタンパク質標的のユビキチン仲介分解の変化の測定により、測定できる。
【００５５】
あるいは、候補アンタゴニストの存在下でのｈＣＤＣ４またはそのホスホデグロン結合性フラグメントのホスホデグロン(すなわち、ＭＹＣからのＬＰＴＰＰ配列を含むリン酸化ポリペプチド)への結合の妨害を測定するアッセイを、ｈＣＤＣ４アンタゴニストの同定に使用できる。一般に、ｈＣＤＣ４のＷＤ４０反復はホスホデグロン結合に含まれる。例えば、Nash et al., Nature 414(6863):498-9(2001)参照。従って、ｈＣＤＣ４のホスホデグロン結合性フラグメントは、一般に、ｈＣＤＣ４のＷＤ４０反復の少なくともいずれか１個(例えば、ＦＢＷ７αのアミノ酸５３３−５７２、ＦＢＷ７βのアミノ酸４８２−５２１およびＦＢＷ７γのアミノ酸３７７−４１６に位置するＷＤ４０反復＃３)を含む。ある態様において、本ホスホデグロン結合性フラグメントは、ｈＣＤＣ４の全てのＷＤ４０反復を含む(例えば、ＦＢＷ７αのアミノ酸４６７−７３５、ＦＢＷ７βのアミノ酸４１６−６８４およびＦＢＷ７γのアミノ酸３１１−５７９)。本ホスホデグロン結合性フラグメントは発現でき、異種アミノ酸配列との融合タンパク質として本発明のアッセイに使用できる。ｈＣＤＣ４−ホスホデグロン結合を、タンパク質−タンパク質結合を測定するための当分野で既知の任意の方法により行うことができる。ある態様において、本方法は、ｈＣＤＣ４ポリペプチド、またはその活性フラグメントを第一で標識し、ホスホデグロンを第二標識で標識し、ここで、２個の標識の近接が(例えば、ｈＣＤＣ４がホスホデグロンに結合しているとき)、２個の標識が近接ではないときには発生しない検出可能なシグナルをもたらす。近接のときにシグナルを発生する標識の例は、ユウロピウムとアロフィコシアニン(ＡＰＣ)またはＣ−フィコシアニン(ＣＰＣ)の対合である。標識はｈＣＤＣ４ポリペプチドおよびホスホデグロンに直接、または間接的に結合し得る。間接的結合は、例えば、標識の、ｈＣＤＣ４ポリペプチドおよびホスホデグロンのいずれかに結合する抗体への標識、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)のような一般的融合パートナーとのそれらの１個の融合物を含む。あるいは、ビオチン／ストレプトアビジンのような種々の結合対を標識の結合に使用できる。例えば、ある態様において、結合メンバーの１個がビオチニル化されており、ビオチニル化メンバーを、標識に結合したストレプトアビジンと接触させることにより標識する。標識によるシグナルは、例えば、標準蛍光検出器を使用して検出できる。候補阻害剤存在下での結合の阻害は、近接標識からのシグナルの減少により検出できる。
【００５６】
ｈＣＤＣ４またはＭＹＣ相互作用遺伝子の発現のｓｉＲＮＡ阻害
本発明のある態様において、ＤＲ５アゴニストの投与と組み合わせて、ｈＣＤＣ４または表１に示すＭＹＣ相互作用遺伝子(例えば、ＧＳＫ３β)を阻害するために、発現を妨害する小ポリヌクレオチドを使用できる。ある態様において、本ポリヌクレオチドは所望の標的ｍＲＮＡの少なくともフラグメントのセンス、アンチセンス、または両方の配向を含む。
【００５７】
アンチセンス技術は既知である。一般に、ｍＲＮＡ標的(例えば、ｈＣＤＣ４またはＧＳＫ３βをコードするｍＲＮＡ)の少なくとも一部(例えば、少なくとも５、１０、２０、またはそれ以上の連続ヌクレオチド)に少なくとも実質的に相補的な核酸配列を、発現の阻害が望まれる細胞内で産生するか、細胞に投与する。ＧＳＫ３βアンチセンス分子の例は、例えば、米国特許番号６,３２３,０２９に記載されている。
【００５８】
ＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４の発現を阻害するｓｉＲＮＡは、またＤＲ５アゴニストと組み合わせて投与できる。“ｓｉＲＮＡ”は、細胞、例えば、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)および体内、例えば、哺乳動物体内(ヒトを含む)における特異的遺伝子の干渉の原因となり、そして転写後サイレンシングをもたらし得る低分子干渉ＲＮＡを意味する。ＲＮＡ干渉の減少は、Bass, Nature 411:428-29(2001);Elbahir et al., Nature 411:494-98(2001);およびFire et al., Nature 391:806-11(1998)；およびＷＯ０１／７５１６４に記載および検討され、干渉ＲＮＡの製造法も記載されている。ｓｉＲＮＡは自己相補配列または二本鎖配列を含むヘアピンループを含み得る。本ｓｉＲＮＡは、典型的に１００個より少ない塩基対および、例えば、約３０bpsまたはそれより少なくてよい塩基対を有し、そして相補ＤＮＡ鎖または合成アプローチの使用を含む当分野で既知のアプローチにより製造できる、ここに記載の遺伝子産物をコードする配列および核酸に基づく。本ｓｉＲＮＡは、細胞、例えば、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)および体内、例えば、哺乳動物体内(ヒトを含むかまたは所望により除く)における特異的遺伝子の干渉の原因となり、そして転写後サイレンシングをもたらし得る。本発明に従うｓｉＲＮＡの例は、２９bps、２５bps、２２bps、２１bps、２０bps、１５bps、１０bps、５bpsまたはほぼそれに近いまたはその間の任意の整数の塩基対を有し得る。最適阻害性ｓｉＲＮＡを設計するためのツールは、DNAengine Inc. (Seattle, WA)およびAmbion, Inc. (Austin, TX)から利用可能なものを含む。
【００５９】
１個のＲＮＡｉ技術は遺伝子構築物を用い、その中にセンスおよびアンチセンス配列を、ドナーおよびアクセプタースプライシング部位と共に適切なスプライシング配向でイントロン配列にフランキングな領域に配置する。あるいは、種々の長さのスペーサー配列を用いて、構築物中の配列の自己相補領域を分け得る。本遺伝子構築物転写産物の加工中、イントロン配列は出され、センスおよびアンチセンス配列ならびにスプライスジャンクション配列が二本鎖ＲＮＡ形成のために結合することを可能にする。次いで選択したリボヌクレアーゼが二本鎖ＲＮＡに結合して開裂し、それにより特異的ｍＲＮＡ遺伝子配列の分解に至る事象のカスケードが開始し、そして特異的遺伝子が沈黙する。
【００６０】
発現を阻害するポリヌクレオチドが天然に存在するヌクレオチドを含み得るが、本発明は、以下に記載のもののようなオリゴヌクレオチド摸倣体を含むが、これに限定されない他のオリゴマー核酸化合物を含み得る。本発明の阻害性ポリヌクレオチド(例えば、アンチセンス、センスまたはそれらの組み合わせ)は、例えば、約８から約３０またはそれ以上の核酸塩基(すなわち約８から約３０またはそれ以上結合したヌクレオシド)を含み得る。例えば阻害性オリゴヌクレオチドは、約１２から約２５核酸塩基を含み得る。本発明において有用な阻害性ポリヌクレオチドの具体例は、修飾格または天然ではないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを含む。
【００６１】
本発明の阻害性ポリヌクレオチドは、ヒトを含む動物への投与により、(直接的または間接的に)ポリヌクレオチドを提供できる、任意の薬学的に許容される塩、エステル、またはこのようなエステルの塩、または任意の他の化合物と組み合わせ得る。
【００６２】
アンチセンスまたはｓｉＲＮＡはまた、発現カセットの一部として細胞に送達できる。ある態様において、本発現カセットは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して送達する。
【００６３】
アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング
ＤＲ５アゴニスト、ＧＳＫ３βアンタゴニストおよび／またはｈＣＤＣ４アンタゴニストは、多くの当分野で認識される方法により同定できる。
【００６４】
標的に結合するある分子がその標的を活性化または阻害し得るため、ある態様において、結合アッセイを予備スクリーニングとして行う。結合アッセイは、通常標的タンパク質またはその活性もしくは不活性フラグメントと、１個以上の試験薬を接触させ、タンパク質と試験薬が結合複合体を形成するのに十分な時間放置する。形成された何らかの結合複合体は、多くの確立された分析技術のいずれかを使用して検出できる。タンパク質−タンパク質結合アッセイは、非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の共沈または共遊走、およびウェスタン・ブロット上の共遊走を測定する方法を含むが、これらに限定されない(例えば、Bennet, J.P. and Yamamura, H.I. (1985) “Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods,” in Neurotransmitter Receptor Binding (Yamamura, H. I., et al., eds.), pp. 61-89参照)。他の結合アッセイは、本発明のポリペプチドに結合する分子の同定のための質量分析またはＮＭＲ技術または標識基質の置換の使用を含む。このようなアッセイに使用する本発明のポリペプチドは、天然に発現させ、クローン化し、または合成され得る。加えて、哺乳動物または酵母２ハイブリッドアプローチ(例えば、Bartel, P.L. et. al. Methods Enzymol, 254:241(1995)参照)も、宿主細胞中で一緒に発現させたときに相互作用するかまたは結合するポリペプチドまたは他の分子の同定に、または、このような結合(例えば、ｈＣＤＣ４のホスホデグロンへの結合)を妨害する分子の同定のために使用できる。
【００６５】
加えて、哺乳動物または酵母２ハイブリッドアプローチ(例えば、Bartel, P.L. et. al. Methods Enzymol, 254:241(1995)参照)を使用して、宿主細胞中で一緒に発現させたときに相互作用するかまたは結合するポリペプチドまたは他の分子の同定できる。
【００６６】
薬剤はまた特定の標的タンパク質の活性を活性化する(すなわち、ＤＲ５の場合アゴニストとして働く)またはアンタゴナイズする(ＧＳＫ３βおよびｈＣＤＣ４の場合)それらの能力について直接選択できる。ＤＲ５、ＧＳＫ３βおよびｈＣＤＣ４の活性アッセイの例をここに記載する。しかしながら、ここに記載の特定の活性アッセイは単に例であり、直接的または間接的に標的の活性を測定するために設計された任意のアッセイを、本発明で使用できる。
【００６７】
ここに記載の通り、本発明者らはＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４いずれかの阻害、一方ＤＲ５は活性化が、ＤＲ５活性化単独よりもある種の細胞(例えば、癌細胞、および特にＭＹＣ発現細胞)におけるアポトーシスのより大きな誘発をもたらすことを決定している。故に、ある態様において、既知のＤＲ５アゴニストを、１種以上の候補ＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４アンタゴニストの存在下で細胞(例えば、ＭＹＣ発現細胞)と接触させ、該細胞のアポトーシスの増加を、ＤＲ５アゴニスト処置単独と比較して検出する。同様に、アポトーシスアッセイを使用して、細胞(例えば、ＭＹＣ発現細胞)と候補ＤＲ５アゴニストを接触させ、アポトーシスの増加を検出することにより、ＤＲ５アゴニストを同定できる。さらなる実験を行い、ＤＲ５受容体がアポトーシスを仲介するか否かを決定し得る。
【００６８】
細胞生存能またはアポトーシスを決定するための種々のアッセイは当分野で既知である。このような方法は、縮合したまたは円い形態、細胞質の縮小およびブレブ形成、ミドコンドリアを含む細胞オルガネラの構造の保護、およびクロマチンの縮合および縁取りのようなアポトーシスの１個以上の形態学的特徴の存在を決定するための光顕微鏡を含む。アポトーシスはまた、末端デオキシトランスフェラーゼ仲介(ＴｄＴ)ｄＵＴＰビオチンニック末端標識(ＴＵＮＥＬ)(Gavriel et al., J. Cell Biol. 119:493(1992);Gorczyca et al., Int. J Oncol. 1:639(1992))を使用して測定できる。APOPTAG(ONCOR, Inc.;Gaithersburg Md.)、PhiPhiLux(登録商標)(OncoImmunin, Inc.)および“同種カスパーゼアッセイ”(Roche Molecular Biochemicals)は、アポトーシス細胞の同定のために市販されているキットである。加えて、アポトーシスは、アガロースゲル電気泳動を使用したヌクレオソームＤＮＡフラグメントの検出によりアッセイできる(Gong et al., Anal. Biochem. 218:314(1994))。アポトーシスまたは抗アポトーシス活性はまた、Tepper et al., Anal. Biochem. 203:127(1992)およびTepperおよびStudzinski, J. Cell Biochem. 52:352(1993)に記載の通り、ミドコンドリアＤＮＡ対核ＤＮＡ比の変化の決定により検出および定量できる。当業者は、アポトーシスまたは抗アポトーシス活性についてのこれら、または他のアッセイを慣用の方法を使用して行い得ることを理解する。生存能スクリーニングは、例えば、アルマール・ブルーを使用したハイスループット形式で行い得る。あるいは、カスパーゼ活性測定を測定する市販のキットを使用して、アポトーシス検出を目的とした類似のスクリーニングを行い得る。
【００６９】
本発明の方法で試験される薬剤は、全ての小分子化合物、またはタンパク質、糖、核酸、脂質のような生物学的物質、またはそれらの組み合わせであり得る。あるいは、試験薬は小有機分子またはペプチドであり得る。本質的に、本発明のアッセイにおいて全ての化合物を可能性のあるモジュレーターまたはリガンドとして使用できるが、水性または有機(とりわけＤＭＳＯベースの)溶液に溶解できる化合物を最もしばしば使用する。本アッセイは、アッセイ段階を自動化しアッセイの通常の源からの化合物を提供することにより、大きな化学ライブラリーのスクリーニングのために設計され、これは典型的に並行で行う(例えば、自動装置アッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形式)。Sigma(St. Louis, MO)、Aldrich(St. Louis, MO)、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs, Switzerland)などを含む化学化合物の多くの供給社が存在することは認識されよう。一般に、試験すべき化合物は、１pMから１００mMの範囲で存在する。
【００７０】
ある態様において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の潜在的治療化合物(恐らくモジュレーター化合物)を含む、コンビナトリアル化学またはペプチドライブラリーの提供を含む。このような“コンビナトリアル化学ライブラリー”または“リガンドライブラリー”を、ここに記載の１個以上のアッセイに付し、所望の特徴的活性を示すこれらのライブラリーメンバー(特定の化学種またはサブクラス)を同定する。このようにして同定した化合物は、慣用の“リード化合物”として働き得、またはそれ自体可能性のあるまたは実際の治療剤として使用できる。
【００７１】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬のような多数の化学“構成要素”の組み合わせにより、化学合成または生物学的合成のいずれかにより作成した多様な化学化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーのようなリニアー・コンビナトリアル化学ライブラリーを、ある化合物長(すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸数)を得るために、全ての可能な方法で化学構成要素(アミノ酸)を組み合わせることにより形成する。何百万もの化学化合物を、化学構成要素のこのようなコンビナトリアルミキシングにより合成できる。
【００７２】
コンビナトリアル化学ライブラリーの製造およびスクリーニングは当業者に既知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーは、ペプチドライブラリーを含むが、これに限定されない(例えば、米国特許５,０１０,１７５、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493(1991)およびHoughton et al., Nature 354:84-88(1991))。化学的に別種のライブラリーを製造するための他の化学も使用できる。このような化学は：ペプトイド(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９７３５)、コード化されたペプチド(例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２０２４２)、無作為バイオオリゴマー(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０００９１)、ベンゾジアゼピン(例えば、米国特許５,２８８,５１４)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソマー(diversomer)(Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913(1993))、ビニル性ポリペプチド(Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568(1992))、グルコース折り畳みを有する非ペプチド性ペプチド摸倣体(Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218(1992))、小化合物ライブラリーの類似有機合成物(Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661(1994))、オリゴカルバメート(Cho et al., Science 261:1303(1993))、および／またはペプチジルホスホネート(Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658(1994))、核酸ライブラリー(Ausubel, BergerおよびSambrook, all supra参照)、ペプチド核酸ライブラリー(例えば, 米国特許5,539,083参照), 抗体ライブラリー(例えば, Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314(1996)およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７参照)、炭水化物ライブラリー(例えば、Liang et al., Science, 274:1520-1522(1996)および米国特許５,５９３,８５３参照)、小有機分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C&EN, Jan 18, page 33(1993)；イソプレノイド、米国特許５,５６９,５８８；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許５,５４９,９７４；ピロリジン、米国特許５,５２５,７３５および５,５１９,１３４；モルホリノ化合物、米国特許５,５０６,３３７；ベンゾジアゼピン、５,２８８,５１４など参照)を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
コンビナトリアルライブラリーを製造するための装置は市販されている(、例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA参照)。加えて、多くのコンビナトリアルライブラリーがそれ自体市販されている(例えば、ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MDなど参照)。
【００７４】
最初に上記のスクリーニング法のいずれかにより同定した薬剤を、明白な活性の確認のためにさらに試験できる。さらなる試験のために選択したモジュレーターを、癌、腫瘍形成、腫瘍阻害、転移または他の癌関連表現型に対する効果について試験できる。
【００７５】
例えば、化合物の効果を動物で評価できる。標準マウス腫瘍モデルは、癌細胞をインプラントし、腫瘍を形成するＳＣＩＤマウスの使用を含む。ある態様において、候補アゴニストまたはアンタゴニストを、組み合わせてまたは単独で、動物に投与し、腫瘍に対する効果を決定できる。
【００７６】
本発明のハイスループットアッセイにおいて、数千またはそれ以上の異なる潜在的モジュレーターを１日にスクリーニングすることができる。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルを、潜在的モジュレーターに対するアッセイに使用でき、または、濃度もしくはインキュベーション時間の影響を観察するならば、各５−１０ウェルで１個のモジュレーターを試験できる。故に、１個の標準マイクロタイタープレートは、約１００個(例えば、９６個)のモジュレーターをアッセイできる。１５３６ウェルプレートを使用するならば、１個のプレートは約１００から約１５００種の異なる化合物を容易にアッセイできる。１日あたり数個の異なるプレートをアッセイすることが可能であり；約６,０００−２０,０００個、１００,０００個またはそれ以上の異なる化合物のスクリーニングのためのアッセイが、本発明の統合されたシステムを使用して可能である。加えて、試薬操作のための微流体アプローチを使用できる。
【００７７】
医薬組成物
本発明の抗体および薬剤は、哺乳動物対象に、例えば、癌腫、神経膠腫、中皮腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、膠芽細胞腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、およびバーキットリンパ腫、頭頚部癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌、食道の癌、胃癌、膵臓癌、肝胆道癌、胆嚢の癌、小腸の癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、尿道癌、精巣癌、子宮頸癌、膣癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、膵臓内分泌癌、カルチノイド癌、骨癌、皮膚癌、網膜芽腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫を含むが、これらに限定されない癌を含む過増殖性障害の処置のために直接投与できる(さらなる癌についてはCANCER:PRINCIPLESおよびPRACTICE(DeVita, V.T. et al. eds 1997)を参照)。
【００７８】
本発明の組成物の投与は、処置すべき組織と最終的に接触させるために化学療法化合物ｗｐ挿入するために通常使用される経路のいずれかにより行い得る。抗体および薬剤は適当な方法で、所望により薬学的に許容される担体と共に投与する。このような抗体および薬剤の適当な投与法は利用可能であり、当業者に既知であり、１個以上の経路を特定の組成物の投与に使用できるが、特定の経路が、他の経路よりしばしばより速くより有効な応答を提供し得る。
【００７９】
薬学的に許容される担体は、一部、投与する特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用する特定の方法により決定する。それにより、本発明の医薬組成物のための広範な適当な製剤が存在する(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985参照)。
【００８０】
本抗体および薬剤は、単独でまたは他の適当な組成物と共に、吸入を介して投与するエアロゾル製剤にされ得る(すなわち、それらは“噴霧可能である”)。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような許容される加圧噴射剤に入れてよい。
【００８１】
投与に適当な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を等張にする溶質を含み得る水性および非水性溶液、等張滅菌溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、濃化剤、安定化剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液を含む。本発明の実施に際し、組成物は、例えば、経口的に、局所的に、静脈内に、腹腔内に、膀胱内にまたは髄腔内に投与できる。所望により、本組成物は鼻腔内に投与する。本化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルのような容器に密閉された単位投与量または多投与量で提示できる。溶液および懸濁液は先に記載の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から製剤できる。本モジュレーターはまた調製された食事または薬剤の一部としても投与できる。本発明の化合物はまた、所望の治療または効果に依存して、１種以上のさらなる活性剤(例えば、化学療法剤)と組み合わせて有効に使用できる。
【００８２】
本発明の内容の範囲内で、患者に投与すべき用量は、長期間対象に有益な応答を起こすのに十分であるべきである。本投与量は、用いる特定のモジュレーターの効力および対象の状態、ならびに体重、または処置すべき領域の表面面積により決定する。投与量はまた特定の対象への特定の化合物またはベクターの投与に附随する何らかの有害な副作用の存在、性質および程度により決定する。
【００８３】
本ＤＲ５アゴニストおよびＧＳＫ３βアンタゴニストまたはｈＣＤＣ４アンタゴニストは一緒に混合して投与してよく、または各々個々に投与してよい。本ＤＲ５アゴニストおよびＧＳＫ３βアンタゴニストまたはｈＣＤＣ４アンタゴニストは一緒に投与してよいが、その必要はない。
【００８４】
ＤＲ５アゴニストのＧＳＫ３β−またはｈＣＤＣ４−個体への使用
ＤＲ５アゴニストでのＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４のいずれかの相乗作用の観察およびアポトーシスの誘発の観点から、本発明のある態様は、個体からの癌細胞におけるＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４の遺伝子型を検出し、次いで該個体が機能的ＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４対立遺伝子を欠く癌細胞を有するならば、該個体にＤＲ５アゴニストを投与することを含む。
【００８５】
ＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４の活性を低下させる全ての変異が、ＤＲ５アゴニストでの処置のために選択され得る個体を示す。故に、ＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４のコーディング配列の変化をもたらす(すなわち、特定位置への異なるアミノの挿入、コーディング配列中への停止コドンの挿入、欠失または逆位などをもたらす)ヌクレオチド変異は、これらのタンパク質の活性に影響する。本発明を特定の癌のタイプでの使用に制限することを意図しないが、ｈＣＤＣ４の変異は乳房および卵巣癌で以前に観察されている。例えば、Cardozo & Pagano, Mol. Cell. Biol. 5:739-751(2004)参照。
【００８６】
多くの診断試験が、個体からの癌細胞中のＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４の遺伝子型を決定するために使用できる。典型的に、生検は、個体内の癌細胞を得ることを含む。次いで、本ＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４遺伝子配列を分析し、それらが活性を阻害する何らかの変異を含むか否かを決定し得る。ある態様において、癌細胞の染色体は、遺伝子(複数もある)を有効に除外する、長い欠失または転座を有する。あるいは、点変異または小欠失が、得られるコードされたタンパク質の機能的変化を示し得る。天然に存在する活性ＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４タンパク質に存在することが知られている以外の異なるアミノ酸へのコーディングをもたらす何らかのヌクレオチド変化が、その逆の証拠がない限り、ＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４各々の活性を阻害する変異と見なされる。
【００８７】
ＧＳＫ３βまたはｈＣＤＣ４中の変異を検出する方法は、ヌクレオチド配列決定および／またはポリヌクレオチド増幅(例えば、ＰＣＲ)および、例えば、標的遺伝子がヌクレオチドミスマッチを含むならば明白なハイブリダイゼーションをさせないハイブリダイゼーション条件を使用した、プローブ標的中の配列変化の検出を可能にするプローブハイブリダイゼーション技術を含むがこれらに限定されない。
【００８８】
他の態様において、個体は野生型Ｔ５８位に変異を含むＭＹＣの対立遺伝子の存在についてスクリーニングする。これらの態様において、Ｔ５８位に隣接するＭＹＣ対立遺伝子の少なくとも一部を単離し、配列決定するか、または他の方法で検出する。アミノ酸配置により示して、その位置でコードされているスレオニン以外のアミノ酸、またはその位置でのアミノ酸の欠失が、本癌細胞がＤＲ５アゴニストでの処置に特に感受性であることを示す。ＭＹＣ中のＴ５８以外の何らかの変化がＤＲ５アゴニストに対する増加した感受性を誘発し得、ある態様において、該変異はＴ５８ＡまたはＴ５８Ｉから選択される。ＭＹＣ中のＴ５８で変異を含む癌は以前に記載されており、バーキットリンパ腫を含む。例えば、Chang et al., Mol. Cell. Biol. 20(12):4309-4319(2000)参照。当業者は、しかしながら、Ｔ５８変異を含む全ての癌が、ＤＲ５アゴニストが誘発するアポトーシスの誘発により感受性であることを認識する。故に、本発明の方法は、ＭＹＣのＴ５８位での変異を有する個体の同定、およびそのような変異を有する個体へのＤＲ５アゴニストの投与のために提供される。
【実施例】
【００８９】
ここに記載の実施例は、本発明を、限定ではなく、説明することを意図する。
【００９０】
ＭＹＣ癌原遺伝子はヒト癌においてしばしば脱制御されている。我々は、ＭＹＣと総合的致死相互作用を示す遺伝子を発見するために低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)のキナーゼ特異的(kinase-directed)ライブラリーをスクリーニングした。我々は、特にＭＹＣ過発現細胞におけるアポトーシスのポテンシエーターとして、多くの遺伝子を同定し、それらを表１に示す。スクリーニングしたヒットの中で、我々は、ＤＲ５細胞死受容体アゴニストに対するＭＹＣ依存性感受性の制御におけるＧＳＫβの役割をさらに試験した。我々は、関係するＧＳＫ３αではなくＧＳＫ３βのｓｉＲＮＡ仲介サイレンシングが、スレオニン残基５８上のＭＹＣのリン酸化を防止し、それによりＭＹＣのＥ３ユビキチンリガーゼ構成要素ｈＣＤＣ４(本実施例では“ｈＦＢＷ７”と呼ぶ)による認識を阻害することを発見した。ＧＳＫ３β−ＦＢＷ７軸の減弱はＭＹＣを安定化し、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５の表面レベルの上方制御、インビトロでのＤＲ５誘発アポトーシスの増強、およびインビボ腫瘍異種移植片モデルにおけるＤＲ５アゴニスト処置効果のＣＤＣ４(本実施例ではＦｂｗ７と呼ぶ)による増強をもたらす。これらの結果は、ＧＳＫ３βおよびＦＢＷ７、ならびに表１に記載する他のＭＹＣ相互作用遺伝子を、癌治療標的として同定する。本データはまたＧＳＫ３β生存シグナル伝達経路において有用な基質としてのＭＹＣを示し、そして、逆説的に、ＭＹＣ過発現腫瘍が、ＭＹＣ癌遺伝子機能を増加させる薬剤により処置可能であることを証明する。
【００９１】
【表１】
2008536820.tif 000003
【００９２】
低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)による遺伝子サイレンシングに基づいたハイスループット細胞表現型スクリーニング法は、哺乳動物細胞における新規な総合的致死相互作用を同定する方法を提供する可能性がある(Deveraux, Q.L., Aza-Blanc, P., Wagner, K.W., Bauerschlag, D., Cooke, M.P. and Hampton, G.M., (2003) Semin Cancer Biol 13, 293-300; Paddison, P.J. and Hannon, G.J., (2002) Cancer Cell 2, 17-23; Willingham, A.T., Deveraux, Q.L., Hampton, G.M. and P., A.-B., (2004) Oncogene 23, 8392-8400にレビュー)。ここで我々はヒトキナーゼのスーパーファミリーに対するｓｉＲＮＡの焦点を絞ったライブラリーを用い、その不活性化がＭＹＣ過剰発現と総合的に致死である遺伝子を同定した。同定された遺伝子の中には、細胞死受容体誘発アポトーシスの抑制において重要ではあるが、まだほとんど特徴付けられていない役割を有する遺伝子であるグリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ(ＧＳＫ３β)があった(Hoeflich, K.P., Luo, J., Rubie, E.A., Tsao, M.S., Jin, O. and Woodgett, J.R., (2000)Nature 406, 86-90.;Jope, R.S. and Johnson, G.V., (2004). Trends Biochem Sci 29, 95-102.;Liao, X., Zhang, L., Thrasher, J.B., Du, J. and Li, B., (2003). Mol Cancer Ther 2, 1215-1222)。我々は、ＧＳＫ３βがＭＹＣをリン酸化し、Ｅ３ユビキチンリガーゼ構成要素ＦＢＷ７(ＦＢＸＷ７、ｈＣＤＣ４、ＡＧＯ、およびＳＥＬ１０としても既知)の認識のために標的とする能力が、そのＭＹＣとの総合的致死相互作用の根底にあることを示す。これらの結果は、ＧＳＫ３βおよびＦＢＷ７を癌治療標的として同定し、そして、癌治療のための新規な、経験に反した：癌遺伝子機能の抑制ではなくむしろ増加であるというアプローチを証明する。
【００９３】
結果
キナーゼ特異的ｓｉＲＮＡライブラリーのスクリーニングは、多くの遺伝子のノックダウンとＭＹＣ過発現の間の総合的致死相互作用を同定する
そのノックダウンがＭＹＣ過発現と総合的に致死である遺伝子を同定するために、我々は、６２４個のｓｉＲＮＡの配列されたライブラリー(Aza-Blanc, P., Cooper, C.L., Wagner, K., Batalov, S., Deveraux, Q.L. and Cooke, M.P., (2003)Mol Cell 12(3):627-37)を、ＭＹＣ発現レベルのみが異なる細胞株の同系ペアにおけるＤＲ５仲介アポトーシスを異なって増強する能力についてスクリーニングした。３８４ウェル細胞培養プレートに配列されたｓｉＲＮＡライブラリーを、低内因性ＭＹＣレベルを発現する不死化したが形質転換していない腎臓上皮性細胞ＨＡ１Ｅに、または組み込まれたレトロウイルス性プロウイルスからＭＹＣを異所性に発現するその形質転換派生物ＨＡ１Ｅ−ＭＹＣのいずれかに逆トランスフェクトした(Wang, Y., Engels, I.H., Knee, D.A., Nasoff, M., Deveraux, Q.L. and Quon, K.C., (2004)Cancer Cell 5:501-512.)。アポトーシスに対する感受性を高めるために、本ｓｉＲＮＡトランスフェクトした細胞を、ＤＲ５に特異的なアゴニスト性モノクローナル抗体(ＤＲ５−Ａ)(Ren, Y.G., Wagner, K.W., Knee, D.A., Aza-Blanc, P., Nasoff, M. and Deveraux, Q.L., (2004)Mol Biol Cell 15, 5064-5074.;Wang, Y., Engels, I.H., Knee, D.A., Nasoff, M., Deveraux, Q.L. and Quon, K.C., (2004)Cencer Cell 5, 501-512)で２４時間処理し、その後細胞生存能をアッセイした。試験した６２４個のｓｉＲＮＡのうち、１４個がＭＹＣ発現細胞を、その非ＭＹＣ発現カウンターパートよりも２倍を超えて感作した。表１に示す通り、これらのｓｉＲＮＡにより標的となる遺伝子およびそれらのコードするタンパク質産物を、ここでは、ＭＹＣ相互作用遺伝子およびＭＹＣ相互作用ポリペプチドと各々呼ぶ。これらのｓｉＲＮＡの１個、ＧＳＫ３βにより標的とされる遺伝子を、さらなる試験に選択した。
【００９４】
ＧＳＫ３βのｓｉＲＮＡ仲介ノックダウンが、ＭＹＣ発現細胞におけるアポトーシスを特異的に増強することを確認するために、我々は、細胞生存能アッセイを、ＧＳＫ３βならびに関連アイソフォームＧＳＫ３βに対する複数の非重複ｓｉＲＮＡを使用して、ＤＲ５−Ａ濃度の範囲で繰り返した。試験した全てのＤＲ５−Ａ濃度で、ＧＳＫ３βを標的とする各ｓｉＲＮＡ(２個のｓｉＲＮＡ、および４個のｓｉＲＮＡの“smartpool”プール)が、ＭＹＣ過発現ＨＡ１Ｅ−ＭＹＣ細胞をＤＲ５−Ａの作用に対して感作したが、同系親細胞株にはほとんどまたは全く影響がなかった。ＧＳＫ３βアイソフォームに対するｓｉＲＮＡは、ＧＳＫ３β  ｓｉＲＮＡと同程度まで標的タンパク質発現を減少させたにもかかわらず、ＨＡ１ＥまたはＨＡ１Ｅ−ＭＹＣ細胞のいずれも感作しなかった。
【００９５】
同様に、一般的に用いられるＧＳＫ３阻害剤である塩化リチウム(ＬｉＣｌ)はＨＡ１Ｅ−ＭＹＣを、濃度依存的方法でＤＲ５−Ａに対して感作するが、ＨＡ１Ｅ細胞はしない。浸透圧の変化のコントロールとしてＬｉＣｌを塩化カリウム(ＫＣｌ)に変えても、いずれの細胞株でもＤＲ５−Ａ感受性は顕著に影響しなかった。２個のさらなる市販の小分子ＧＳＫ３阻害剤(６−ブロモインジルビン−３−オキシム(Meijer, L., Skaltsounis, A.L., Magiatis, P., Polychronopoulos, P., Knockaert, M., Leost, M., Ryan, X.P., Vonica, C.A., Brivanlou, A., Dajani, R., Crovace, C., Tarricone, C., Musacchio, A., Roe, S.M., Pearl, L. and Greengard, P., (2003). Chem Biol 10, 1255-1266)およびＡＲ−Ａ０１４４１８(Bhat, R., Xue, Y., Berg, S., Hellberg, S., Ormo, M., Nilsson, Y., Radesater, A.C., Jerning, E., Markgren, P.O., Borgegard, T., Nylof, M., Gimenez-Cassina, A., Hernandez, F., Lucas, J.J., Diaz-Nido, J. and Avila, J., (2003)J Biol Chem 278, 45937-45945)は、ＬｉＣｌと同様の結果となった。これらの化学阻害剤はいずれもαおよびβ  ＧＳＫ３アイソフォームを区別しないが、これらのデータは、上記のｓｉＲＮＡ結果と合わせたとき、ＧＳＫ３βアイソフォームの減少または阻害が、特にＭＹＣ過発現細胞におけるＤＲ５仲介アポトーシスを促進するとの強い証拠を提供する。
【００９６】
ＭＹＣのＧＳＫ３βおよびＦＢＷ７依存性リン酸化および分解がＭＹＣ発現細胞のＤＲ５−Ａ仲介アポトーシスに対する感受性を決定する
ＧＳＫ３βとＭＹＣの間の総合的致死関係は、細胞生存およびアポトーシスに作用するためにＧＳＫ３βがＭＹＣを介して作用しているはずであることを示唆する。最近、ＧＳＫ３はＭＹＣをスレオニン残基５８(Ｔ５８)でリン酸化することにより、ＭＹＣタンパク質安定性を制御することが示された(Gregory, M.A., Qi, Y. and Hann, S.R., (2003)J Biol Chem 278, 51606-51612)。この部位でのリン酸化はＣｄｃ４ホスホデグロンまたはＣＰＤと名付けられた認識部位を作り、ＭＹＣがＳＣＦ(Skp-Cullin-F-box)ユビキチンリガーゼ複合体のＦ−ｂｏｘ含有構成要素であるＦＢＷ７による分解のために認識および標的とされることを可能にする(Welcker, M., Orian, A., Jin, J., Grim, J.A., Harper, J.W., Eisenman, R.N. and Clurman, B.E., (2004)Proc Natl Acad Sci U S 101, 9085-9090.;Yada, M., Hatakeyama, S., Kamura, T., Nishiyama, M., Tsunematsu, R., Imaki, H., Ishida, N., Okumura, F., Nakayama, K. and Nakayama, K.I., (2004)EMBO J 23, 2116-2125)。ＭＹＣのＴ５８でのリン酸化および続くＦＢＷ７依存性分解がＧＳＫ３βによる細胞生存の制御に役割を有するかどうかを決定するために、我々は、ＦＢＷ７機能の抑制がＧＳＫ３βの涸渇を摸倣するか否かを試験した。ＦＢＷ７およびＧＳＫ３βに対するｓｉＲＮＡは、ＨＡ１Ｅ細胞ではなくＨＡ１Ｅ−ＭＹＣ細胞においてＭＹＣタンパク質レベルを増加させ、ＤＲ５−Ａに対する感受性を高め、ＧＳＫ３βおよびＦＢＷ７がＭＹＣ依存性アポトーシスの制御に共通経路で作用することを示唆する。顕著なことに、ＧＳＫ３βおよびＦＢＷ７タンパク質発現のｓｉＲＮＡ仲介サイレンシングはＨＡ１Ｅ−ＭＹＣおよびＨＡ１Ｅ細胞で同等であり、ＨＡ１Ｅ細胞における感受性の欠損がＧＳＫ３βまたはＦＢＷ７の下方制御の失敗が原因ではなかったことを示唆する。ＧＳＫ３βおよびＦＢＷ７両方のｓｉＲＮＡがＨＡ１Ｅ−ＭＹＣ細胞におけるＭＹＣタンパク質レベルを増加させるが、ＧＳＫ３βに対するｓｉＲＮＡのみがＭＹＣ  Ｔ５８リン酸化を防止し、ＦＢＷ７機能がＧＳＫ３β依存性ＭＹＣ  Ｔ５８リン酸化の下流であることを示し  −  先の観察と一致する(Welcker, M., Orian, A., Jin, J., Grim, J.A., Harper, J.W., Eisenman, R.N. and Clurman, B.E., (2004)Proc Natl Acad Sci U S 101, 9085-9090;Yada, M., Hatakeyama, S., Kamura, T., Nishiyama, M., Tsunematsu, R., Imaki, H., Ishida, N., Okumura, F., Nakayama, K. and Nakayama, K.I., (2004)EMBO J 23, 2116-2125)。
【００９７】
レトロウイルスによって挿入したＭＹＣがＴ５８でアラニンに変異している(ＭＹＣＴ５８Ａ)ＨＡ１Ｅ細胞において、それはもはやＧＳＫ３βによりリン酸化されず、故に、ＦＢＷ７により認識されず(Welcker, M., Orian, A., Jin, J., Grim, J.A., Harper, J.W., Eisenman, R.N. and Clurman, B.E., (2004)Proc Natl Acad Sci U S 101, 9085-9090;Yada, M., Hatakeyama, S., Kamura, T., Nishiyama, M., Tsunematsu, R., Imaki, H., Ishida, N., Okumura, F., Nakayama, K. and Nakayama, K.I., (2004). EMBO J 23, 2116-2125)、ＧＳＫ３βまたはＦＢＷ７  ｓｉＲＮＡいずれも細胞をＤＲ５−Ａに対して感作できず、野生型(ｗｔ)ＭＹＣで行った類似の実験と著しい対照をなした。これらの結果は、ＭＹＣが、アポトーシスにさらに感作するために、ＧＳＫ３βまたはＦＢＷ７のいずれかに対するｓｉＲＮＡのためにＴ５８でリン酸化されていることを示す。顕著なことに、本ＭＹＣＴ５８Ａ対立遺伝子は、ＨＡ１Ｅ細胞をＤＲ５−Ａ誘発アポトーシスに対して感作するのにｗｔ  ＭＹＣよりも有効であり、ｗｔ  ＭＹＣと、ＧＳＫ３βまたはＦＢＷ７に対するｓｉＲＮＡの組み合わせと同程度感作した。一緒にして、これらのデータは、ＧＳＫ３βの不活性化が、ＭＹＣのＴ５８でのリン酸化を防止し、それによりＦＢＷ７依存性ＭＹＣ認識および分解を防止することによりＤＲ５アゴニストに対する感受性を増強するモデルを強く立証する。
【００９８】
ＧＳＫ３β−ＦＢＷ７  ＣＰＤ認識モジュールの不活性化によるＭＹＣの安定化はＤＲ５受容体レベルを増加させ、カスパーゼ−８プロセシングを刺激する
以前に、我々はＭＹＣの異所性発現が、細胞表面上のＤＲ５受容体の上方制御、およびＤＲ５アゴニストにより誘発されるアポトーシスへのその後の感作をもたらすことを示した(Wang, Y., Engels, I.H., Knee, D.A., Nasoff, M., Deveraux, Q.L. and Quon, K.C., (2004)Cancer Cell 5, 501-512)。故に、我々は発現されたＭＹＣの、ＦＢＷ７またはＧＳＫ３β涸渇による、さらなる安定化が、表面ＤＲ５受容体レベルにさらに影響するか否かを試験した。種々のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＡ１Ｅ−ＭＹＣ細胞のフローサイトメトリー分析は、ＧＳＫ３βおよびＦＢＷ７涸渇細胞の両方が、コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞に対してＤＲ５受容体を増加させることを示した。対照的に、ＤＲ５を標的とするｓｉＲＮＡは細胞表面ＤＲ５発現を減少させ、これらのアッセイにおいて用いる試薬の特異性を確認する。顕著なことに、ＧＳＫ３βまたはＦＢＷ７涸渇細胞における増加したＤＲ５受容体レベルは、カスパーゼ−８の増加した活性化およびタンパク質分解プロセシングと関連し、故に、増加した受容体レベルを増加した機能的アポトーシスシグナリングと相関させる。ＧＳＫ３βおよびＦＢＷ７  ｓｉＲＮＡは、ＨＡ１Ｅ細胞におけるＤＲ５受容体に検出可能な影響を有さず、低ＭＹＣ発現、例えば非形質転換細胞での細胞におけるＧＳＫ３β／ＦＢＷ７依存性ＭＹＣ分解プロセスの妨害はＤＲ５細胞表面発現および続くＤＲ５アゴニストへの感作に十分ではないことを示唆する。
【００９９】
ヒト腫瘍由来細胞においてＭＹＣ安定性を制御するＧＳＫ３β−ＦＢＷ７モジュールの妨害は、ＤＲ５表面受容体レベルを上方制御し、そしてＤＲ５−Ａ誘発アポトーシスを増加する
我々の結果が、高内因性ＭＹＣレベルのヒト腫瘍由来材料で再現できるかどうかを決定するために、我々はヒト結腸癌腫細胞株、ＨＣＴ１１６を用いた。以前に、我々は、ＭＹＣを過剰発現するが(Wang, Y., Engels, I.H., Knee, D.A., Nasoff, M., Deveraux, Q.L. and Quon, K.C., (2004)Cancer Cell 5, 501-512)、ＦＢＷ７に関しては野生型(ｗｔ)である(Rajagopalan, H., Jallepalli, P.V., Rago, C., Velculescu, V.E., Kinzler, K.W., Vogelstein, B. and Lengauer, C., (2004)Nature 428, 77-81)この細胞株が、ＤＲ５−Ａで処理したときにアポトーシスに付されること、およびこの感受性は内因性ＭＹＣ機能を必要とすることを示した(Wang, Y., Engels, I.H., Knee, D.A., Nasoff, M., Deveraux, Q.L. and Quon, K.C., (2004)Cancer Cell 5, 501-512)。ＨＡ１Ｅ−ＭＹＣ細胞と同様、ＨＣＴ１１６は、ＧＳＫ３βではなく、ＧＳＫ３βおよびＦＢＷ７に対するｓｉＲＮＡによりＤＲ５−Ａに感作できた。重要なことに、これらのｓｉＲＮＡは、ＤＲ４  ＴＲＡＩＬ受容体に対するアゴニスト性抗体に対して感作せず、ＧＳＫ３βおよびＦＢＷ７仲介感作におけるＤＲ５の役割を強調した。さらに、ＦＢＷ７の１個または両方のコピーが相同的組み換え(各々ＦＢＷ７＋／−およびＦＢＷ７−／−、(Rajagopalan, H., Jallepalli, P.V., Rago, C., Velculescu, V.E., Kinzler, K.W., Vogelstein, B. and Lengauer, C., (2004)Nature 428, 77-81))により破壊されているＨＣＴ１１６の派生物は、ｓｉＧＳＫ３βおよびｓｉＦＢＷ７親ＨＣＴ１１６株と比較したとき、同様にＤＲ５−Ａに過敏性であった。興味深いことに、ＦＢＷ７のヘテロ接合性およびホモ接合性破壊はＤＲ５−Ａによるアポトーシスを強く増強し、ＦＢＷ７がハプロ不全腫瘍サプレッサー遺伝子として作用できるという観察と一致するが(Mao, J.H., Perez-Losada, J., Wu, D., Delrosario, R., Tsunematsu, R., Nakayama, K.I., Brown, K., Bryson, S. and Balmain, A., (2004)Nature 432, 775-779)、効果はホモ接合体でより劇的であった。ｓｉＲＮＡのまたは遺伝子欠失によるＦＢＷ７遺伝子サイレンシングは、ウェスタン・ブロットまたはＰＣＲ分析により確認した。
【０１００】
同様に、ＦＢＷ７に天然に存在するヘテロ接合性変異を担持する結腸癌腫細胞株ＨＴ１１５はＤＲ５−Ａに非常に感受性であった。顕著なことに、ＤＲ５−Ａに対する感受性は、ＨＴ１１５細胞におけるｗｔ  ＦＢＷ７  ｃＤＮＡの安定な過剰発現により救済できた。ＨＴ１１５に存在する変異であるＣ１１５３Ｔは、結腸癌において見られる最も頻繁に起こるＦＢＷ７変異の一つであり(Rajagopalan, H., Jallepalli, P.V., Rago, C., Velculescu, V.E., Kinzler, K.W., Vogelstein, B. and Lengauer, C., (2004)Nature 428, 77-81.;Rajagopalan, H. and Lengauer, C., (2004)Cell Cycle 3, 693-694)、そしてその基質認識ドメインチュの第三のＷＤ４０反復における重要なアルギニン残基を変異させ、それによりその基質と結合する能力が妨害される(Orlicky, S., Tang, X., Willems, A., Tyers, M. and Sicheri, F., (2003)Cell 112, 243-256.;Rajagopalan, H., Jallepalli, P.V., Rago, C., Velculescu, V.E., Kinzler, K.W., Vogelstein, B. and Lengauer, C., (2004)Nature 428, 77-81.)。
【０１０１】
ＨＡ１Ｅ−ＭＹＣ細胞におけるように、ＨＣＴ１１６親細胞におけるＧＳＫ３βまたはＦＢＷ７を標的としたｓｉＲＮＡｓのトランスフェクションは、増加した細胞表面ＤＲ５受容体レベルをもたらした。ＦＢＷ７をヘテロ接合性またはホモ接合性いずれかで相同的組み換えにより妨害したときに、ＤＲ５受容体レベルの同様な増加が観察され、この増加はホモ接合性細胞でわずかに大きかった。ＨＣＴ１１６  ＦＢＷ７＋／−細胞において、ＤＲ５細胞表面発現はｓｉＧＳＫ３βまたはｓｉＦＢＷ７のトランスフェクションによりさらに増加した。しかしながら、機能的ＦＢＷ７を欠くＨＣＴ１１６  ＦＢＷ７−／−細胞へのＧＳＫ３βまたはＦＢＷ７  ｓｉＲＮＡの挿入後に、ＤＲ５受容体レベルのさらなる増加は観察されなかった。これらの結果は、ＧＳＫ３βがＤＲ５受容体レベルを機能的ＦＢＷ７の存在下でのみ制御し、故に、ＤＲ５受容体レベルを制御するためにＧＳＫ３βがＦＢＷ７の上流で作用するとの説得力のある証拠を提供する。興味深いことに、ＤＲ５  ｓｉＲＮＡはＦＢＷ７＋／−およびＦＢＷ７−／−細胞においてＭＹＣレベルを増加させ、これはＤＲ５の欠損が、ＭＹＣ過発現細胞にとって生存利点を提供することを示し得る。
【０１０２】
ＦＢＷ７の多くの基質がＭＹＣに加えて同定されており、最も著明なものはサイクリンＥである(Koepp, D.M., Schaefer, L.K., Ye, X., Keyomarsi, K., Chu, C., Harper, J.W. and Elledge, S.J., (2001)Science 294, 173-177)。ＭＹＣと同様、サイクリンＥは、残基、Ｔ３８０上のリン酸化後にＦＢＷ７により認識され、ＧＳＫ３により作用され(Welcker, M., Singer, J., Loeb, K.R., Grim, J., Bloecher, A., Gurien-West, M., Clurman, B.E. and Roberts, J.M., (2003)Mol Cell 12, 381-392)、ＧＳＫ３β−ＦＢＷ７  ＣＰＤ認識モジュールがまたＤＲ５−Ａ誘発アポトーシスを制御するためにサイクリンＥを介して作用するかもしれない可能性を惹起する。ＤＲ５仲介細胞死のＧＳＫ３β／ＦＢＷ７コントロールにおけるそれらの相対的役割に取り組むために、我々は、ＭＹＣおよびサイクリンＥに対するｓｉＲＮＡがＦＢＷ７  ｗｔ、ヘテロ接合性およびホモ接合性変異体ＨＣＴ１１６細胞を、ＤＲ５−Ａ誘発アポトーシスから救済する能力について試験した。サイクリンＥを標的とするｓｉＲＮＡは効率的にサイクリンＥ発現を沈黙させるが、細胞生存能に顕著な影響を有さず、ＭＹＣ  ｓｉＲＮＡは全３個の遺伝子型、ならびに天然に存在するヘテロ接合性変異体ＨＴ１１５において生存能を高めた。ＨＣＴ１１６シリーズの細胞株における量的に類似なレスキューが、ＭＹＣ機能をドミナントネガティブＭＹＣ対立遺伝子、ＭＡＤＭＹＣの安定なレトロウイルス発現により減少させたならば得られ(Berns, K., Hijmans, E.M. and Bernards, R., (1997)Oncogene 15, 1347-1356)、そして細胞表面からのＤＲ５の下方制御を伴った。これらの結果は、ＦＢＷ７の妨害によるＤＲ５アゴニストへの感作がＭＹＣ活性を仲介し、そしてサイクリンＥ機能に無関係であることを示す。
【０１０３】
興味深いことに、サイクリンＥのｓｉＲＮＡ仲介ノックダウンはＤＲ５誘発アポトーシスに影響を有しないが、以前に記載の通り(Rajagopalan, H., Jallepalli, P.V., Rago, C., Velculescu, V.E., Kinzler, K.W., Vogelstein, B. and Lengauer, C., (2004)Nature 428, 77-81;Rajagopalan, H. and Lengauer, C., (2004)Cell Cycle 3, 693-694)、ＦＢＷ７妨害により誘発される小核−  染色体不安定性の代理  −  の形成に対して強い抑制効果を有した。対照的に、ＭＹＣ  ｓｉＲＮＡはＦＢＷ７涸渇細胞における小核形成に影響を有しなかった。これらのデータは、故に、２個の重要なＦＢＷ７標的の機能を線引きし、ＦＢＷ７涸渇細胞において、ＤＲ５感受性の得られる増加はＭＹＣ安定化に依存し、一方、染色体安定性の増加はサイクリンＥ安定化に依存することを示す。
【０１０４】
可能性のある治療標的としてのＧＳＫ３β−ＦＢＷ７モジュール
ＭＹＣ過発現と、ＧＳＫ３β−ＦＢＷ７モジュールの構成要素の間の総合的致死関係は、標的ＧＳＫ３またはＦＢＷ７が、ＤＲ５アゴニストと組み合わせて使用したとき、有効な治療戦略であることを示す。これをインビボで証明するために、我々は、免疫不全マウスにおける皮下異種移植腫瘍としてＨＣＴ１１６  ＦＢＷ７＋／＋およびＦＢＷ７＋／−細胞を増殖させた。ＨＣＴ１１６  ＦＢＷ７−／−細胞はインビボでほとんど増殖せず、故に試験から除外した。腫瘍が約８０mm３の平均容積に到達したとき、腫瘍担持マウスを１００μg  ＤＲ５−Ａで１日おきに合計７回の処置まで処置し、またはコントロールとして緩衝液のみで処置した。処置レジメン終了時に、ＦＢＷ７＋／−腫瘍はＤＲ５−Ａに対して有意に大きい応答を示し、８８.０５の平均腫瘍容積に対し、ＨＣＴ１１６  ＦＢＷ７＋／＋腫瘍で２２３.２７であり(ｐ＝０.００８６６)、ＧＳＫ３またはＦＢＷ７のターゲティングは、ＤＲ５アゴニストとの組み合わせ治療として有効であることを示す。
【０１０５】
結論
ここで、我々は、その不活性化が特にＭＹＣ過発現細胞におけるアポトーシスを促進する多数の遺伝子の同定を報告する。これらの遺伝子の中で、ＧＳＫ３βおよびＦＢＷ７は、ユビキチン仲介タンパク質分解に含まれるタンパク質の対である。可能性のある癌治療剤標的としてのこれらの遺伝子の同定とは別に、我々の結果は、ＧＳＫ３βおよびＦＢＷ７仲介細胞生存シグナリングの重要な機構を解明し、そして、逆説的に、ＭＹＣ過発現腫瘍がＭＹＣ癌遺伝子機能を増加させる薬剤により処置可能であるはずであることを示唆する。
【０１０６】
ＧＳＫ３β−ＦＢＷ７軸の抑制によりもたらされるＤＲ５仲介アポトーシスに対する感作は、ＤＲ５アゴニストが臨床においてどのように用いることができるかの重要な暗示を有する。ＭＹＣ上のＴ５８  ＧＳＫ３βリン酸化部位での変異がバーキットリンパ腫においてしばしば観察され(Bhatia, K., Huppi, K., Spangler, G., Siwarski, D., Iyer, R. and Magrath, I., (1993)Nat Genet 5, 56-61.)、そしてプロテアソームによるその分解により阻害されることが示されており(Gregory, M.A. and Hann, S.R., (2000)Mol Cell Biol 20, 2423-2435)、一方、不活性化ＦＢＷ７変異は、乳房、卵巣、子宮内膜、膵臓、および結腸直腸癌腫を含む、種々の固形腫瘍型で報告されている(Calhoun, E.S., Jones, J.B., Ashfaq, R., Adsay, V., Baker, S.J., Valentine, V., Hempen, P.M., Hilgers, W., Yeo, C.J., Hruban, R.H. and Kern, S.E., (2003). Am J Pathol 163, 1255-1260;Rajagopalan, H., Jallepalli, P.V., Rago, C., Velculescu, V.E., Kinzler, K.W., Vogelstein, B. and Lengauer, C., (2004)Nature 428, 77-81.;Spruck, C.H., Strohmaier, H., Sangfelt, O., Muller, H.M., Hubalek, M., Muller-Holzner, E., Marth, C., Widschwendter, M. and Reed, S.I., (2002)Cancer Res 62, 4535-4539)。
【０１０７】
小分子ＧＳＫ３阻害剤は、糖尿病、神経変性疾患、および双極性障害を含む、いくつかの適応症のために現在開発中である(Cohen, P. and Goedert, M., (2004)Nat Rev Drug Discov 3, 479-487.)。このような阻害剤での長期処置が、β−カテニンなどのようなＧＳＫ３β発癌性標的の安定化を介して腫瘍発生率を増加させるかもしれないとの懸念は、動物モデルにおいて実証されておらず(Gould, T.D., Gray, N.A. and Manji, H.K., (2003)Pharmacol Res 48, 49-53.)、リチウムで処置した双極性患者も増加した発癌率を示さない(Cohen, Y., Chetrit, A., Cohen, Y., Sirota, P. and Modan, B., (1998)Med Oncol 15, 32-36)。故に、ＭＹＣ分解の間接的遮断により、このような阻害剤は、特にＤＲ５アゴニストまたはヒストンデアセチラーゼ阻害剤、インターフェロン、レチノイド、および三酸化砒素のような少なくとも一部ＴＲＡＩＬシグナル伝達経路を利用する他の治療剤と組み合わせたとき、ＭＹＣ過発現癌に対して有効であり得る(Akay, C. and Gazitt, Y., (2003)Cell Cycle 2, 358-368.;Altucci, L., Rossin, A., Raffelsberger, W., Reitmair, A., Chomienne, C. and Gronemeyer, H., (2001)Nat. Med. 7, 680-686.;Clarke, N., Jimenez-Lara, A.M., Voltz, E. and Gronemeyer, H., (2004)EMBO J 23, 3051-3060;Insinga, A., Monestiroli, S., Ronzoni, S., Gelmetti, V., Marchesi, F., Viale, A., Altucci, L., Nervi, C., Minucci, S. and Pelicci, P.G., (2005)Nat Med 11, 71-76;Nebbioso, A., Clarke, N., Voltz, E., Germain, E., Ambrosino, C., Bontempo, P., Alvarez, R., Schiavone, E.M., Ferrara, F., Bresciani, F., Weisz, A., de Lera, A.R., Gronemeyer, H. and Altucci, L., (2005)Nat Med 11, 77-84)。
【０１０８】
材料および方法
細胞株
遺伝子学的に定義された不死化ＨＡ１Ｅ細胞をRobert Weinberg(Whitehead Institute, Cambridge, MA)から得て、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％ＦＣＳを補ったイーグルの最少必須培地で増殖させた。結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６およびそのＦＢＷ７＋／−およびＦＢＷ７−／−派生物をBert Vogelstein(Johns Hopkins University, Baltimore, MD)から得て、上記の通り補ったＭｃＣｏｙの５Ａ培地で増殖させた。結腸癌細胞株ＨＴ１１５はEuropean Collection of Cell Culturesから得て、上記の通り補ったＤＭＥＭで増殖させた。
【０１０９】
レトロウイルス
レトロウイルスをPhoenix-A前駆細胞へのリポフェクタミン２０００(Invitrogen)仲介トランスフェクションにより製造した(Garry Nolan, Stanford University, Stanford, CA)。レトロウイルス感染は、標的細胞を２７００rpmで９０分、２５℃で２０mM  ＨＥＰＥＳおよび８μg／mlポリブレンを含む５０％レトロウイルス上清と共に遠心分離することにより行った。典型的に２ラウンドの感染を行った。使用したレトロウイルスベクターはＭＹＣについてはＬＺＲＳ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ、ＭＡＤＭＹＣについてはｐＢＡＢＥｐｕｒｏ、およびＭＹＣまたはＭＹＣ−Ｔ５８ＡについてはｐＷＺＬｂｌａｓｔであった。１μg／mlピューロマイシンまたはブラストサイジンを選択のために使用した。
【０１１０】
ｓｉＲＮＡライブラリースクリーニング
先に記載のようにｓｉＲＮＡコレクションを調製し、播種した(Aza-Blanc, P., Cooper, C.L., Wagner, K., Batalov, S., Deveraux, Q.L. and Cooke, M.P., (2003)Mol Cell 12(3):627-37)。ｓｉＲＮＡコレクションは、３８０個の既知のおよび予測されるキナーゼ、１００個の未知機能の遺伝子、およびアポトーシス経路において役割を有することが既知の遺伝子を含む１４４個の目的の既知の遺伝子の各々を特異的に沈黙させるように設計した６２４個のｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、３８４ウェルマイクロタイタープレート中、デュプリケートで８ng／ウェルで配置した。ｓｉＲＮＡライブラリーをＨＡ１ＥおよびＨＡ１Ｅ−ＭＹＣ細胞にトランスフェクトするために、我々は逆トランスフェクションを使用した。簡単に言うと、１０μlのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ／リポフェクタミン２０００(１２５：１)混合物を各ウェルに分配し、４０μlの細胞の分配後ｓｉＲＮＡとインキュベートさせた。４８時間後、１０μlの架橋ＤＲ５−Ａを一組のプレートに添加し、１μg／mlの最終濃度に到達させた。さらに２４時間後、各ウェルの細胞生存能をCell Titer-Glo(Promega, Madison, WI)で測定した。各３８４ウェルプレートについて、シグナルを、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ(ｓｉＧＬ３)を含む同じプレート上の２４ウェルの平均で各ウェルを割ることにより標準化し、１００倍して標準化された生存能を得た(“％生存能”)。
【０１１１】
抗体
免疫ブロット法のための抗体は、示す供給社から得た：ＭＹＣ−９Ｅ１０(Santa Cruz)、Ｔ５８−ホスホＭＹＣ(＃９４０１、Cell Signaling)、カスパーゼ−８(１２Ｆ５、Biosource)、ＦＬＩＰ(ＮＦ−６、Axxora)、ＦＢＷ７(MoBiTec)、ＧＳＫ３(Stressgen)、サイクリンＥ(ＨＥ１２、Pharmingen)およびＤＲ５Ａ(ＧＮＦで製造)。インビトロアポトーシスアッセイのために、ＤＲ５−ＡをＦ(Ａｂ’)２フラグメントヤギ抗マウス抗Ｆｃ(Jackson ImmunoResearch)と１時間、室温で１：３重量比でインキュベートすることにより架橋させた。ウェスタン・ブロット分析を先に記載の通り行った。
【０１１２】
ｓｉＲＮＡ
全ｓｉＲＮＡ  smartpool(ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、サイクリンＥ、ＭＹＣを標的)をDharmaconから購入した。使用した個々のｓｉＲＮＡはQiagenから購入した：ｓｉＧＳＫ３α(GTG ATT GGC AAT GGC TCA T)、ｓｉＧＳＫ３β−１(GTA TTG CAG GAC AAG AGA T)、ｓｉＧＳＫ３β−Ｓ(GC AAA TCA GAG AAA TGA AC)、ｓｉＦＢＷ７−２(GGG CAA CAA CGA CGC CGA A)、ｓｉＦＢＷ７−３(AAG GCA CTC TAT GTG CTT TCA)、ｓｉＭＹＣ(CAC GTC TCC ACA CAT CAG CAC AA)；コントロールｓｉＲＮＡ  ｓｉＧＬ３(ベクターｐＧＬ３からのルシフェラーゼ遺伝子に対する)AAC TTA CGC TGA GTA CTT CGA TT。
【０１１３】
細胞を９６ウェルプレート中２０ng／ウェルで、または６ウェルプレート中６００ng／ウェルで、製造者の指示に従いリポフェクタミン２０００(Invitrogen)を使用してトランスフェクトし、ＤＲ５Ａで処理するかまたはトランスフェクション４８時間後のＦＡＣＳ分析、免疫ブロット法または半定量的ＲＴ−ＰＣＲのために調製した。
【０１１４】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをRNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用して抽出した。１μg  ＲＮＡをThermalScript System(Invitrogen)を使用して逆転写した。次いで、１μl  ｃＤＮＡを、下記プライマーを使用したＰＣＲ増幅に使用した：ＦＢＷ７＿前向き(AAG TTG GAC CAT GGT TCT GAG)、ＦＢＷ７＿後向き(A CAC AGC GGA CTG CTG CAA C)、ＤＲ５Ｒ＿前向き(ATG GAA CAA CGG GGA CAG AAC)、およびＤＲ５Ｒ＿後向き(TTA GGA CAT GGC AGA GTC TGC)。
【０１１５】
ＦＡＣＳ
細胞を上記の通りｓｉＲＮＡトランスフェクトし、トランスフェクション４８時間後、Accutaseで回収し、ペレット化し、１０μg／ml  ＤＲ５Ａ(マウス抗体)とハンクス緩衝液(０.１％０.５Ｍ  ＥＤＴＡ、０.１％１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、１％ＰＢＳおよび０.１％ナトリウムアジドを添加)中で９０分、４℃でインキュベートし、２回洗浄し、１：１０００希釈ＡＰＣ(アロフィコシアニン架橋ヤギ抗マウス二次抗体(Molecular Probs))と３０分インキュベートし、再び洗浄し、ＦＡＣＳで分析した。
【０１１６】
細胞死アッセイ
ウェルあたり８０００〜１００００個の細胞を、９６ウェルプレート中の適当な細胞培養培地に播種し、ＬｉＣｌ／ＫＣｌと８時間インキュベートするか、またはｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクション４８時間後ＤＲ５Ａでさらに２０時間処置した。細胞生存能をトリプリケートでCell TiterGlo(Promega)により製造社の指示に従い測定した。
【０１１７】
救済実験
ＨＴ１１５細胞を、完全長ＦＢＷ７γをコードするｐＣＭＶ６−ＦＢＷ７で、Fugene ６トランスフェクション試薬(Roche)を使用してトンラスフェクトした。ｐＢＡＢＥｐｕｒｏを、１：４重量比で共トランスフェクトし、２μg／mlピューロマイシンでの選択を可能にした。安定な細胞を、９６ウェルプレートに播種して一晩接着させ、ＤＲ５−Ａで２０時間処理し、細胞生存能アッセイをその後行った。
【０１１８】
動物実験
３×１０６  ＨＣＴ１１６  ＦＢＷ７＋／＋またはＦＢＷ７＋／−細胞を、雌、８週齢Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに、２７ｇ針を使用した皮下注射によりインプラントした。各群について、８匹中８匹の動物で腫瘍が形成され、３方向をカリパスを使用して測定し、容積を式(Ｌ×Ｗ×Ｈ)／２を使用して計算した。腫瘍が８０mm３の平均容積に到達したとき、マウスを最小および最大腫瘍を除外して腫瘍容積により順位付けし、１００μg  ＤＲ５−Ａまたは媒体コントロール(５０mM  クエン酸ナトリウム、ｐＨ  ７.０；１４０mM  ＮａＣｌ)のＩＰ注射のために偶数順位と奇数順位に分けた。マウスを１日おきに合計７回処置した。全ての動物は管理され、実験はIACUC committee of the Genomics Institute of the Novartis Research Foundationにより承認されたプロトコールで行った。
【０１１９】
本発明は、理解を明瞭にする目的で、説明および実施例の方法で幾分詳細に記載しているが、本発明の教示に鑑みて、添付の特許請求の範囲の範囲または精神から逸脱することなくそれにある種の変化および修飾を成し得ることは、当業者には容易に明らかである。
【０１２０】
本明細書中で引用する全ての刊行物、データベース、Genbank配列、特許、および特許出願は、各々が、具体的にそして個々に引用により包含させることが示されたのと同程度、引用により本明細書に包含させる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】抗ＤＲ５アゴニスト抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を記載する。相補性決定領域(ＣＤＲ)は囲っている。残りのアミノ酸はフレームワーク領域(ＦＲ)の一部である。
【図２】図１に示す抗ＤＲ５アゴニスト抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を記載する。相補性決定領域(ＣＤＲ)は囲っている。残りのアミノ酸はフレームワーク領域(ＦＲ)の一部である。
【図３】図１および２に示す可変領域のＤＮＡコーディング配列である。
【図１】
2008536820.tif 000004
【図２】
2008536820.tif 000005
【図３】
2008536820.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月19日(2007.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008536820000001.app
【国際調査報告】
2008536820.tif 000007