【事件の表示】
　特許第２７５２７１４号「アスペルギルス株構築用手段としての遺伝子置換」の請求項１ないし１５に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７５２７１４号の請求項１ないし１３に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第２７５２７１４号に係る発明についての出願は、平成１年８月１６日（パリ条約による優先権主張１９８８年８月１６日、欧州特許機構）に特願平１−２１１２１０号として出願され、平成１０年２月２７日にその特許の設定登録がなされ、その後、友野　宏より特許異議申立がなされ、２回取消理由通知がなされ、平成１２年１２月１４日に訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正請求
１．訂正の内容
(1)特許請求の範囲の請求項１に係る記載「対象となる遺伝子の表現が可能な表現構築体を含む形質転換された糸状菌宿主であって、該表現構築体が分泌タンパク質をコードする高度に表現される遺伝子を含む所定のターゼット座で、該糸状菌宿主のクロモソーム中に組み込まれており、かつターゲット座中の高度に表現される遺伝子が、不活性化されている前記糸状菌宿主。」を、「対象となる遺伝子の表現が可能な表現構築体を含む形質転換された糸状菌宿主であって、該表現構築体が分泌タンパク質をコードする高度に表現される遺伝子を含む所定のターゼット座で、該糸状菌宿主のクロモソーム中に組み込まれており、ターゲット座中の高度に表現される遺伝子が該表現構築体の組み込みにより不活性化されており、及び該表現構築体が一段階遺伝子置換により前記ターゲット座に組み込まれていることを特徴とする前記糸状菌宿主。」と訂正する。
(2)特許請求の範囲の請求項２及び請求項３を削除する。
(3)特許請求の範囲の請求項１０乃至１４に係る記載「DAN構築体」又は「DAN配列」を「DNA構築体」又は「DNA配列」と訂正する。
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項(1)は、「かつターゲット座中の高度に表現される遺伝子が、不活性化されている」を「ターゲット座中の高度に表現される遺伝子が該表現構築体の組み込みにより不活性化されており、及び該表現構築体が一段階遺伝子置換により前記ターゲット座に組み込まれていることを特徴とする」に訂正するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当する。
　訂正事項(2)は、請求項を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当する。
　訂正事項(3)は、「DAN構築体」又は「DAN配列」を「DNA構築体」又は「DNA配列」と訂正するものであって、「DAN」は「DNA」の誤記であることは明らかであるから、この訂正は誤記の訂正に該当する。
　そして、上記いずれの訂正も新規事項に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　
３．独立特許要件
　訂正された請求項１乃至請求項１３に係る発明（以下、「本件発明１乃至１３」という。）は、後述の「III．３．判断」の項に記載のように、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえないから、本件発明１乃至１３は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４,２項、及び同条３項で準用する１２６条２項から４項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要
　訂正前の本件請求項１乃至１５に係る発明は、甲第１及び２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができない。
　　　　　　　　　記
甲第１号証：Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（1987）２０９，７１〜７７頁
甲第２号証：特開昭６３−９４９８１号公報
　
２．甲各号証の記載内容
　甲第１号証には、
「同時形質転換によるTrp−変異の誘導
　これらの形質転換体をトリプトファンを各培地上における分生子のスタブ接種によりTrp−変異体に対しスクリーニングした。Xho-I消化されたpAN92-20により得られた１５０のAmdS＋、LacZ＋形質転換体のうち、二つのトリプトファン栄養体を見いだした。Xho-I消化されていないDNAを用いた場合には、１５０のAmdS＋、LacZ＋、Trp-コロニーはTaおよびTbとした。」（７３頁右欄下から６行〜７４頁左欄１８行）、
「TrpC−、LacZ＋形質転換体であるT4およびT17において、元々存在するtrpC遺伝子を含む４．２kbの野生型XhoI断片が存在しなかった。」（７４頁右欄下から１１〜９行）、
「trpC遺伝子座における予想される遺伝子置換にはtrpC-lacZハイブリッド遺伝子のみならずAmdS配列も関与していた。」（７５頁右欄９〜１２行）が記載されている。
　甲第２号証は、「トリコダーマの形質転換」に係るもので、
「１．トリコダーマ（・・・）の形質転換に使用するためのベクターシステムであって、
ａ)目的とするタンパク質生成物をコードする遺伝子、
ｂ)目的とする生成物の発現を制御するために機能可能的に結合されたプロモーター／エンハンサーを含む遺伝子発現を促進する機能、及び
ｃ)選択マーカーを含んでなるベクターシステム。」（特許請求の範囲の項）、
「最良のＴ．リーセイ突然変異体によって産生された細胞外タンパク質の量は、培養液体１ｌ当り２０〜３０ｇであり、これは合計細胞タンパク質の５０％以上である。分泌されたタンパク質の主要部分は、セルラーゼを含み、そしてその間には、CBHI成分が最も豊富であり、そして分泌されたセルラーゼタンパク質の６０％まで示す。」（３頁左下欄５〜１２行）、
「本発明はまた、宿主生物のある酵素活性を産生する遺伝子を変性又は不活性化するためにも使用され得る。例として、セルラーゼ−陰性Ｔ．リセイ菌株が構成され得る。この突然変異生成は、欠失されたセルラーゼ遺伝子を担持するプラスミドによるトリコダーマ　リーセイの形質転換に基づかれる。染色体セルラーゼ遺伝子産でのプラスミドの同質組換えは、内在性Ｔ．リーセイ　セルラーゼ遺伝子の挿入不活性化を引き起こす。形質転換のために使用されるプラスミドは、セルラーゼコード領域の一部を含み、そして不活性タンパク質を産生する。５’を末端とする配列は含まれない。フレームシフト変異がまた、切断されたコード領域に導入され得る。選択マーカー（・・・）又はスクリーニングのためのマーカー（・・・）が形質転換のために使用されるプラスミドに連結され得る。組換え後、マーカーは、２種の得られた欠陥性セルラーゼ遺伝子の間に、配置されるであろう。その方法の原理は第１図に示される。」（７頁左上欄３行〜右上欄２行）、
「cbh１−株はまた、cbh１プロモーターを用いる場合、異質タンパク質の有効な産生のためにも重要である。」（１０頁左下欄２〜４行）が記載されている。
　
３．判断
　本件発明１は、対象となる遺伝子の表現が可能な表現構築体を含む形質転換された糸状菌宿主であって、該表現構築体が分泌タンパク質をコードする高度に表現される遺伝子を含む所定のターゼット座で、該糸状菌宿主のクロモソーム中に組み込まれており、ターゲット座中の高度に表現される遺伝子が該表現構築体の組み込みにより不活性化されているものであって、「該表現構築体が一段階遺伝子置換により前記ターゲット座に組み込まれていること」を特徴とするものである。
　しかるに、甲第１号証には、lacZ遺伝子がターゲット座であるtrpC遺伝子座に組み込まれて、lacZを発現しかつTrp要求性である形質転換体が記載されており、また、甲第２号証には、トリコダーマ　リーセイにおいて、セルラーゼ遺伝子の挿入不活性化を生じさせることが記載されているものの、これらにおいては、宿主以外の遺伝子は、宿主のクロモソームに単に挿入されるものであって、本件発明１のように、２カ所での相同組換えにより達成される「一段階遺伝子置換」に係るものではない。
　そうすると、本件発明１は、甲第１号証及び甲第２号証に記載された事項から導き出せるものではなく、しかも、本件発明１は、上記構成を採用することにより本件明細書記載の所期の効果を奏するものである。
　したがって、本件発明１は、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　また、本件発明２乃至６は、請求項１に係る発明を引用するものであるから、上記請求項１に係る発明についての判断と同様の理由により、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　そして、本件発明７乃至１２は、本件発明１に係る糸状菌宿主に組み込むための「DNA構築体」であり、本件発明１３は、本件発明１乃至６に係る糸状菌宿主を栄養培地中において育成することを含む対象となるタンパクの製法に関するものであるから、それぞれ、上記請求項１に係る発明についての判断と同様の理由により、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　
３．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１乃至１３についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明１乃至１３についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年１２月２０日（２０００．１２．２０）
【訂正の要旨】
（訂正の要旨）
（１）特許請求の範囲の請求項１に係る記載「対象となる遺伝子の表現が可能な表現構築体を含む形質転換された糸状菌宿主であって、該表現構築体が分泌タンパク質をコードする高度に表現される遺伝子を含む所定のターゼット座で、該糸状菌宿主のクロモソーム中に組み込まれており、かつターゲット座中の高度に表現される遺伝子が、不活性化されている前記糸状菌宿主。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として「対象となる遺伝子の表現が可能な表現構築体を含む形質転換された糸状菌宿主であって、該表現構築体が分泌タンパク質をコードする高度に表現される遺伝子を含む所定のターゼット座で、該糸状菌宿主のクロモソーム中に組み込まれており、ターゲット座中の高度に表現される遺伝子が該表現構築体の組み込みにより不活性化されており、及び該表現構築体が一段階遺伝子置換により前記ターゲット座に組み込まれていることを特徴とする前記糸状菌宿主。」と訂正する。
（２）特許請求の範囲の請求項２及び請求項３を特許請求の範囲の減縮を目的として削除する。
（３）特許請求の範囲の請求項１０乃至１４に係る記載「ＤＡＮ構築体」又は「ＤＡＮ配列」を、誤記の訂正を目的として「ＤＮＡ構築体」又は「ＤＮＡ配列」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
アスペルギルス株構築用手段としての遺伝子置換
（５７）【特許請求の範囲】
　　【請求項１】　対象となる遺伝子の表現が可能な表現構築体を含む形質転換された糸状菌宿主であって、該表現構築体が分泌タンパク質をコードする高度に表現される遺伝子を含む所定のターゲット座で該糸状菌宿主のクロモソーム中に組み込まれており、ターゲット座中の高度に表現される遺伝子が該表現構築体の組み込みにより不活性化されており、及び該表現構築体が一段階遺伝子置換により前記ターゲット座に組み込まれていることを特徴とする前記糸状菌宿主。
　　【請求項２】　前記宿主が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）である請求項１に記載の形質転換された糸状菌宿主。
　　【請求項３】　前記宿主が、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）である請求項１または２に記載の形質転換された糸状菌宿主。
　　【請求項４】　ターゲット座中の高度に表現される遺伝子が、グルコアミラーゼ遺伝子である請求項３に記載の形質転換された糸状菌宿主。
　　【請求項５】　対象となる遺伝子が、キモシン、インターロイキン、ホスホリパーゼ、リパーゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、β−ガラクトシダーゼ又は細胞壁分解酵素をコードしている請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換された糸状菌宿主。
　　【請求項６】　表現構築体が、宿主を選別するためのマーカーを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換された糸状菌宿主。
　　【請求項７】　ＤＮＡ構築体であって、ａ）転写開始調節領域、その下流に存在し、該転写開始調節領域の転写調節を受ける対象となる遺伝子、更にその下流に存在する転写終結調節領域を含む表現カセット，ｂ）形質転換された宿主を選別するための選別マーカー遺伝子；及びｃ）糸状菌宿主に内存する、分泌タンパク質をコードする高度に表現される遺伝子を含む、所定のターゲット座５′及び３′領域に相同の５′及び３′ブランキング領域を含み、ｄ）表現カセット及びｂ）選択マーカー遺伝子がともに前記５′及び３′フランキング領域の間にある前記ＤＮＡ構築体。
　　【請求項８】　５′フランキング領域が、対象となる遺伝子の転写を調節する転写開始調節領域と相同である請求項７に記載のＤＮＡ構築体。
　　【請求項９】　５′フランキング領域の相同部分が、対象となる遺伝子の生成物の分泌のためのシグナル配列をコードしているＤＮＡ配列を含む請求項８に記載のＤＮＡ構築体。
　　【請求項１０】　３′ブランキング領域の一部分が、対象となる遺伝子の転写終結調節領域と相同である請求項７に記載のＤＡＮ構築体。
　　【請求項１１】　内在性ターゲット座が、グルコアミラーゼ遺伝子である請求項７〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築体。
　　【請求項１２】　対象となる遺伝子が、キモシン、インターロイキン、ホスホリパーゼ、リパーゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、β−ガラクトシダーゼ又は細胞壁分解酵素をコードしている請求項７〜１１のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築体。
　　【請求項１３】　請求項１〜６のいずれか１項に記載した形質転換された糸状菌宿主を栄養培地中において育成することを含む対象となるタンパクの製法。
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
　本発明は糸状菌形質転換体を用いた形質転換および表現に関するものである。
（従来の技術）
　表現可能なＤＮＡで生育性の細胞を形質転換する可能性は新規かつ改良された生成物に対し多くの方法を切開いた。この可能性は哺乳動物のタンパクの大多数を生成すること可能にしたが、これらタンパクはこの方法によらなければ容易に得ることはできなかった。他の例、特に血液タンパクにおいて、このようなタンパクの製造に天然資源を用いる必要性が、一般的に知られた肝炎およびエイズの問題のために増々許容し難くなってきた。医薬品として用いる哺乳類タンパクに加えて、多くの工業的方法での用途が見出されている他の多くのタンパク、特に酵素がある。キモシンはチーズの生産において使用でき、リパーゼは特にエステル交換反応における利用が見出されており、プロテアーゼは特に食品での利用があり、また医学的用途なども見出されている。
　これらの様々な製品の生産においては、該製品製造の経済性が特に興味の対象となる。関連する第１の局面は所定の製品の表現の程度である。第２の重要な点は特定の宿主内での該生成物の安定性である。第３の関心事は、特に該生成物が医薬または食品添加物とされるような場合には、該生成物の単離および精製である。
　このようなタンパク製品を生産する場合、機能性のシグナル配列に依存して、該製品は細胞質内に保持されるか、あるいは栄養培地内に分泌される。異る宿主は別々の分泌生成物並びに異る分泌率を有する。ここで分泌は誘発性でも非−誘発性でも良い。多くの状況下では、分泌は多くの利点をもたらす。というのはこの場合該生成物は実質上細胞内タンパクおよび細胞デブリを含まない栄養培地から単離できるからである。かくして、分離は単に該宿主によって分泌された他のタンパクおよび細胞の溶解または分解に起因する少量のタンパクについて行えばよい。従って、単離並びに精製の容易な条件下で対象とする生成物を効率良く表現かつ分泌する系を得ることが実質上の興味の対象となる。
　糸状菌の形質転換については数人の著者により記載されている。例えば、チルバーン（Ｔｉｌｂｕｒｎ）等、ジーヌ（Ｇｅｎｅ）、１９８３、２６、２０５−２２１；ジョンおよびペバーディ（Ｊｏｈｎ　ａｎｄ　Ｐｅｂｅｒｄｙ）、エンザイム　マイクロバイオロジー＆テクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）、１９８４、６、３８６−３８９；バランス（Ｂａｌｌａｎｃｅ）＆ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）、Ｇｅｎｅ，１９８５、３６、３２１−３３１；ファンハルチングスベルツ（ＶａｍＨａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ）等、モレキュラージーヌ＆ジュネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、１９８７、２０６、７１−７５；グーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）等、カレントジュネティックス（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．）、１９８７、１１、４９９−５０３；ＥＰ−Ａ−０１３４４３８および０２３８０２３並びに国際特許出願（ＰＣＴ）Ｗ０８６／０６０９７。
　菌種、例えばアスペルギルス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス　オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｒｙｚａｅ）、ムコール　ミエハイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ）およびトリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）が酵素、例えば食品工業で用いる酵素の工業的生産において広く用いられている（例えば、ストリーカート（Ｓｔｒｉｊｋａｒｔ）、アントニーファンリーペンノエク（Ａｎｔｏｎｉｅ　ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ）、１９８７、５３、３５７−３６２参照）。これら菌種の使用はその分泌能力に基くものである。Ａ．ニガーおよびＡ．オリザエはこの工業生産のために大量にかつ工業的規模で使用され、しかもその醗酵特性について十分に特徴付けされた微生物である。遺伝子工学的技法がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）に適用された形質転換体から作られ、これは付随的に有用な生成物を合成する（カレン（ＣｕＩｌｅｎ）等、バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９８７、５、３６９−３７６；ギン（Ｇｗｙｎｎｅ）等、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８７、５、７１３−７１９；ウプシャル（Ｕｐｓｈａｌｌ）等、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８７、５、１３０１−１３０４）。これらの場合において、選ばれたタンパクが通常宿主の分泌するタンパクの他に表現され、結果として選ばれたタンパクをこれらから分離する必要がある。
　遺伝子置換はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）について実証されている（例えば、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）等、モレキュラーセルバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９８５、５、１７２１；ファンハンチングスベルツ（Ｖａｎ　Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ）等、上記文献；グーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）等、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８７、１１、４９９−５０３；ウエルナーズ（Ｗｅｍａｒｓ）等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９８７、２０９、７１−７７）。生合成、例えばアミノ酸、ヌクレオチド合成の経路の一部をなす酵素をコードする遺伝子については、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）に関連して、様々な方法な用いられている。ミラー等（上記文献）は、変性相同遺伝子のみを含む制限フラグメントによるＴｒｐ　Ｃ遺伝子の一段階遺伝子置換または環状プロスミドを用いた二段階法を用いている。“一段階”遺伝子置換では単一の遺伝子置換で２つの交叉事象の出現を必要とし（第７図参照）、また二段階法では、第１段階は単一の組込み事象であり、これに伴って組込まれた遺伝子コピーを遊離し、かつ在来遺伝子を放出する組換え（第２段階）が起こる。この第２段階の出現は該組込み遺伝子コピーのフェノタイプをスクリーニングすることにより選別される。
　アミノ酸代謝経路における多くの遺伝子、例えばＴｒｐ　ＣおよびＡｒｂ　Ｂの自然の表現程度はほんの中程度にあるにすぎないことが知られている。これら遺伝子によりコードされた酵素は全細胞タンパクの極わずかな部分を占めるにすぎない。しかし、これら遺伝子は必須である。というのは、これらを失うことにより栄養要求性となり、かつその生育培地に代謝物またはアミノ酸を供給する必要性が生ずる。従って、これら遺伝子置換および類似遺伝子の遺伝子置換両者とも容易に達成され、かつ形質転換体を容易に単離できる（エッサー＆モーア）（Ｅｓｓｅｒ　ａｎｄＭｏｈｒ）、プロセスバイオケミストリー（Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９８６、１５３−１５９）。
　Ａ．ニガーについて同様な結果がファンハルチングスペルツ等の上記文献およびグーセン等の上記文献（ｐｙｒ　Ｇ座に関する）に報告されている。このｐｙｒ　Ｇ遺伝子はウリジンに導く生合成路からの酵素をコードする。これらの例において、遺伝子置換は容易に選別し得る遺伝子状態にあり、従って該遺伝子は形質転換における選別マーカーとして用いられた。
　上記文献に記載された生成タンパクのいずれもＡ．ニデュランスまたはＡ．ニガーにより分泌されないことに注目すべきである。
　従って高活性で表現されかつ全細胞タンパクの大部分を占めるタンパクをコードする遺伝子座、および細胞により活発に分泌されるタンパクをコードする遺伝子座に対する遺伝子置換系を得る必要性がある。
（発明が解決しようとする課題、課題を解決するための手段）
　糸状菌用の表現系は、分泌効率のよい宿主を用いて得られ、該宿主は高度に現されかつ分泌されるタンパクをコードする配列の座に相同組換えするために工夫されたカセットをもつ。
　有利には、組込みはマーカータンパクを含むことができ、ここで表現カセットはターゲヅト遺伝子の５′−および３′−非コード領域と境界をなしている。この形質転換体は高度の表現および高効率の分泌をもたらす場合によりプロテアーゼ阻害剤が栄養培地内に加えられていて、所定の生成物のタンパク分解を防止している。
　高効率の表現系は糸状菌を用いて得られる。この系は表現構築体の組込み用分泌宿主を用いる。この表現構築体は組込み用の対象とする遺伝子を含み、これは相同組換に対してターゲット座の３′−および５′−非コード領域と境界をなしている。このターゲット座は分泌タンパクをコードする遺伝子を含む。形質転換体宿主の育生および誘発は所定の生成物の効率的な表現および分泌、並びに単離し易さをもたらす。これは栄養培地中に該ターゲット座の表現生成物がないことによる。
　対象とする宿主は糸状菌であり、これはその内在タンパクの高効率の分泌性をもつ。アスペルギルス、特に、ニガー、アワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）またはオリザエの工業的生産株は特に興味がある。また、トリコデルマ　リーゼイ、Ｍ．ミエハイおよびアスペルギルス、例えば、Ａ．フィクーム（ｆｉｃｕｕｍ）などを用いることができる。
　該表現構築体は対象とする遺伝子を含み、該遺伝子は通常シグナル配列をもち、この配列は該宿主内で機能性であり、かつ表現生成物を分泌する。相同組換えの大部分に対し、このシグナル配列は該ターゲット座における遺伝子のシグナル配列と相同もしくは実質的に相同である。しかし、シグナル配列は分泌するように工夫することができる。例えば、フォン　ハイン（ＶｏｎＨｅｉｊｎｅ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８３、１３３、１７−２１；およびパールマン＆ハルボルソン（Ｐｏｒｌｍａｎ　ａｎｄ　ｈａｌｖｏｒｓｏｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８３、１６７、３９１−４０９参照。この表現生成物および対象とする遺伝子は宿主に対し相同でも非相同でもよい。ここで、“相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）”とは野性型の宿主に固有のタンパクを意味し、一方“非相同（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）”とは該宿主にとって外来性のタンパクを意味し、かつ自然にはみられない変異体を含むものとする。
　対象とする遺伝子はそれ自体のシグナル配列をもつことができ、あるいは宿主のシグナル配列もしくは適当ならば合成シグナル配列に結合できる。選ばれた特定のシグナル配列は対象とする遺伝子およびターゲット座に応じて変えることができる。特に興味あることは、その部位における組込みに対し相同の付随的領域をもち、かつ高効率の分泌を可能ならしめることが知られているターゲット座をもつシグナル配列を用いることである。このシグナル配列をコードするＤＮＡ配列は直接プロセシングシグナル（開裂認識サイト）をコードする配列を介して、成熟タンパクをコードする配列に、あるいは短いブリッジ（通常は１０コドン未満）を介して結合できる。
　対象とする遺伝子のためのオープン読取り枠に対する領域５′は転写開始調節領域を含んでいる。宿主内で機能性の任意の領域を用いることができる。しかし、多くの場合、使用する領域は該ターゲット座の領域と相同である。これは該ターゲット座の表現生成物を対象とする表現生成物で置換した効果である。内在性タンパクの表現および分泌の程度が効率の良い生産をもたらす程度に、この転写開始調節領域は通常満足であることがわかっている。しかし、いくつかの例において、野性型遺伝子よりも高い転写率を得たい場合、あるいは特定の誘発剤を用いて誘発性表現を得たい場合がある。これらの例において、転写開始調節領域としては、該ターゲット座における領域とは違ったものが使用される。糸状菌内で機能性の多数の転写開始調節領域が知られている。これら領域はグルコアミラーゼ、真菌アミラーゼ、酸性ホスファターゼ、ＧＡＰＤＨ、ＴｒｐＣ、ＡｍｄＳ、ＡｌｃＡ、ＡｌｄＡ、ヒストンＨ２Ａ、Ｐｙｒ４、Ｐｙｒ　Ｇ、イソペニシリンＮシンセターゼ、ＰＧＫ、酸性プロテアーゼ、アシルトランスフェラーゼ、などをコードする遺伝子を含む。
　このターゲット座は高度に表現されたタンパク遺伝子、即ち醗酵工程の終点において少なくとも約０．１ｇ／ｌの濃度まで表現生成物を分泌する遺伝子をコードすることが好ましい。この工程の期間は、特に望むタンパク生成物に応じて変えることができる。このような遺伝子の例として、グルコアミラーゼ（ＡＧ）をコードするものを例示する。他の興味ある遺伝子は真菌α−アミラーゼ、酸性ホスファターゼ、プロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、リパーゼ、フィターゼおよびセロバイオヒドロラーゼを包含する。
　対象とする遺伝子はある意図された用途をもち得る任意の遺伝子である。アスペルギルスに非相同な選ばれたタンパクは、例えばキモシン、インターロイキン、血液凝集素因子、例えば第ＶＩＩＩまたは第１Ｘ因子、ホスホリパーゼ、リパーゼおよび細胞壁分解酵素（植物細胞壁にある多糖類を分解する酵素）である。アスペルギルスに相同なタンパクの例はフィターゼ、ホスファターゼ、キシラナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、レンネット（ｒｅｎｎｅｔｓ）、グルコースオキシダーゼおよびアミラーゼである。
　転写集結調節領域は対象とする遺伝子、ターゲット座または任意の他の有利な配列からのものであり得る。該構築体が更に対象とする遺伝子から転写方向に興味ある下流配列を含む場合には、該ターゲット座と相同であるような転写終結調節領域は相同ブランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域よりも実質的に小さい。
　選別マーカーが通常使用される。これは表現構築物の一部であっても、またこれとは別のものであってもよく、従って対象とする遺伝子とは異なる部位に組込むことができる。本発明の組換え分子は工業生産に用いることのできる宿主株に形質転換されることが好ましいので、この形質転換をモニタするための選別マーカーは優性選別マーカーであることが好ましい。即ち、これらの選別マーカーが用い得るものであるためには、宿主株に何等の変異も導入してはならない。その例は、規定した栄養源上で形質転換体が生育し得るようなマーカー（例えばＡ．ニデュランスａｍｄＳ遺伝子は唯一の窒素源としてのアセタミド上でのＡ．ニガー形質転換体の生育を可能とする）あるいは抗生物質耐性を授与されたマーカー（例えばｂｌｅ遺伝子にはフレオマイシン耐性が、またｈｐｈ遺伝子にはハイグロマイシンＢ耐性が与えられている）などである。
　この選別遺伝子は該マーカーの独立の表現を可能とするそれ自身の転写および翻訳開始並びに終止調節領域をもっている。前述の如く、多くの転写開始調節領域が知られており、また該マーカー遺伝子との組合せで使用できる。抗生物質耐性を用いた場合、選別用の抗生物質濃度は抗生物質によって異り、一般には約３０〜３００μｇ／／ｍｌの範囲である。
　様々な配列を公知の方法で結合できる。公知の方法は、例えば制限、補足制限サイトの結合および結合、突出部で閉鎖することによる（ｂｙ　ｆｉｌｌｉｎｇ　ｉｎｏｖｅｒｈａｎｇｓ）ブラントエンディングおよびブラント結合、Ｂａ１３１切除、プライマー修復、インビトロ変異誘発、などである。必要ならば、ポリリンかおよびアダプタを用いることができ、公知の方法で導入もしくは除去して、表現構築物の組立てを容易なものとすることができる。この構築物の合成の各段階において、フラグメントを制限酵素消化、配列決定、ハイブリッド化などによってクローニング、かつ分析できる。多数のベクタをクローニングのために使うことができ、特定の選択は本発明では特にしないが、通常クローニングはＥ．コリ内で行われる。
　フランキング領域は少なくとも部分的にターゲット座のオープン読取り枠を含み、特にシグナル配列、該ターゲット座の遺伝子の調節領域５’および３’を含み、あるいは該調節領域を越えて伸びていてもよい。オープン読取り枠を含むフランキング領域のタンパクは、通常機能性生成物を表現し得る完全な遺伝子をコードしない。通常フランキング領域は少なくとも１００ｂｐ、一般に少なくとも２００ｂｐあるいは５００ｂｐ以上であってもよい。フランキング領域は該ターゲット遺伝子を崩壊させてその表現を阻止するように選ばれる。これは５′領域に隣接するオープン読取り枠に表現カセットを挿入することにより、該ターゲット遺伝子の全体または一部を該表現構築物で置換することにより、あるいは該ターゲット座における転写開始調節領域と該オープン読取り枠との間に該表現構築体を介在させることにより達成できる。既に述べたように、該終止調節領域が該ターゲット座における領域と相同である場合、該３′−フランキング領域は該構築体中にある終止調節領域よりも実質的に大きいはずである。
　この構築体は、綿状または環状のクローニングベクタとして宿主内で形質転換されるか、あるいは必要ならばクローニングベクタから分離できる。このプラスミドは通常該表現構築体の末端約１ｋｂｐ内で線状とされている。様々な方法が糸状菌の形質転換のために知られている。これらの方法はプロトプラスト融合または形質転換、エレクトロポレーション、および細胞内へのマイクロプロジェクタイルファイアリング（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ　ｆｉｒｉｎｇ）などを含む。プロトプラスト形質転換が好都合であることがわかり、有利に使用できる。対象とする真菌株の菌糸体は、まずＫＣ１またはソルビトールなどの浸透圧安定剤の存在下での該細胞壁の酵素消化によりプロトプラストに転化する。プロトプラストによるＤＮＡの取込みはＣａＣ１２およびポリエチレングリコールの濃厚液を加えることによって促進される。ポリエチレングリコールはプロトプラストの凝集を生じ、このような工程により形質転換ＤＮＡは該凝集体に含められ、かつプロトプラストにより取込まれる。プロトプラストは後に浸透圧安定化剤を含む固体培地上で再生できる。場合によっては該培地は該形質転換ＤＮＡがコードする耐性に対する選別剤をも含む。
　形質転換体につき選別を行った後、対象とする遺伝子の存在を種々の方法で決定することができる。抗生物質を用いることにより、表現生成物が宿主に対して非相同である場合には、対象の遺伝子の表現の存在を検知できる。また、サザンまたはノーザンブロットを用いて、組込まれた遺伝子またはその転写生成物の存在を検出できる。
　次に、細胞を適当な培地中で育生する。プロテアーゼ阻害剤を低濃度で使用できる。該阻害剤は、例えばフェニルメチルスルホニルフルオライド、α２−マクログロブリン、ペプスタチンなどである。通常、その濃度は約１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲にある。このプロテアーゼ遺伝子を不活性化し、所定のタンパクの分解を防止もしくは低減することが可能である。
　有利に使用できるターゲット座はＡ．ニガーまたはＡ．アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子Ａ．オリザエの真菌アミラーゼ遺伝子、Ｔ．リーゼイのセロバイオヒドロラーゼまたはムコールミエハイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ）の酸性プロテアーゼ遺伝子である。
　この形質転換体はバッチ式または連続式リアクタ中で育生でき、そこで栄養培地が単離されかつ所定の生成物が抽出される。必要に応じて種々の該生成物の精製法が用いられる。例えば、ＨＰＬＣまたは分離用薄層クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法、溶媒−溶媒抽出法、電気泳動法およびこれらの組合せなどが用いられる。
（実施例）
　以下の実施例は例示のためであった、本発明を限定するために与えられるのではない。
実施例１：種々の表現カセットの構築Ａ．方法論すべての構築体は、例えばマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等のモレキュラークローニング、アラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）Ｎ．Ｙに記載の標準的分子生物学的手法を用いて作製した。
　プラスミドｐＡＢ６−１、ｐＡＢ６−２Ａ、ｐＡＢ６−３およびｐＡＢ６−４Ａ．ニガーについて公開されたヌクレオチド配列に基くオリゴヌクレオチドプローブ（第１図）〔ボエル（Ｂｏｅｌ）等、ＥＭＢＯ　Ｊ．１９８４、３、１０９７−１１０２；ボエル等、Ｍｏｌ、＆Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１９８４、４、２３０６−２３１５〕を用いて、ｐＵＣ１９〔ヤニツシューペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、Ｇｅｎｅ、１９８５、３３、１０３−１１９；例えばドイツのべーリンガーマンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）から入手可）中の３−４ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントまたは１３−１５ＫｂＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含むプラスミドライブラリーからＡ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子を単離した。このオリゴヌクレオチドプローブはイントロン２を包囲する配列由来のものであり、４２−量体は該イントロンの３’に位置し、かつＡＧ−ｍＲＮＡと同じ極性を有する。２４−量体は該イントロン２の上流側にあり、該ｍＲＮＡに逆平行であるように選ばれる。プラスミドｐＡＢ６−１は１４．５ｋｂＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上にＡＧ−遺伝子を含む。プラスミドｐＡＢ６−２Ａにおいて、完全なＡＧ−遺伝子には３．４ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメント上にある。プラスミドｐＡＢ６−３は該ＡＧ−遺伝子の直ぐ上流にある１．８ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントを含み、このフラグメントは多分調節配列を含み、かつｐＡＢ６−１からサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ）されている。ｐＡＢ６−１のもう一つのサブクローンであるプラスミドｐＡＢ６−４はＡＧ−遺伝子の上流領域および該遺伝子の５′−末端の一部を含む（第２図の地図参照）４．６ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを含有する。すべてのフラグメントはｐＵＣ１９にクローニングされた。
　プラスミドｐＡＢ６４−４０プラスミドｐＡＢ６−２Ａ（第２図）をＡｃｃＩおよびＴ４ポリメラーゼで処理して、ブラントエンドをもつＡｃｃＩフラグメントを生成した。ターミネータを含む、ＡＧ−遺伝子の３′フランキング配列を含有する１．２ｋｂフラグメントを単離した。牛キモシンｃＤＮＡ（ＥＰ−Ａ−０７７１０９参照）を含むプラスミドｐＵＲ１５２４を部分的にＳａｌＩとＥｃｏＲＩとで消化した。キモシンｃＤＮＡを含むフラグメントを単離し、付着末端をＴ４−ＤＮＡポリメラーゼで閉鎖し、つブラントエンドフラグメントをＳａｌ　Ｉリンカーで結合した。このフラグメントをＳａｌＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、結合してｐＰＡ１５３−２０９とした（ファンプテン（Ｖａｎ　Ｐｕｔｔｅｎ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８６、１６８、７２８−７３３）。これはＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されていた。得られた構築体、ｐＲＣＨ４をＢｃｌＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理してブラントエントを生成した。次いでＡＧ−ターミネータを含むＡｃｃＩフラグメントをこの部位に結合して、ｐＡＢ６４−１０を得た。この構築体において、ＢｃｌＩ閉鎖部位、キモシン遺伝子の３′は保存される。
　次に、プラスミドｐＡＢ６−３（第２図）をＥｃｏＲＩで部分的に消化し、Ｔ４ポリメラーゼで処理した。このブクター中に、再度Ｔ４ポリメラーゼ処理した後プラスミドｐＡＢ６−４のＨｉｎｄＩＩＩ＋ＢｃｏＲＩフラグメントが結合された。得られた構築体はｐＡＢ６−３１であり、これは中央に崩壊されたＥｃｏＲＩサイトとＡＧ−遺伝子に隣接した独特のＥｃｏＲＩサイトとをもつＡＧ−遺伝子の３．６ｋｂ上流側フラグメントを含む。この独特のＥｃｏＲＩサイトに、キモシンｃＤＮＡ＋ＡＧ−ターミネータを含むｐＡＢ６４−１０からのＥｃｏＲＩで部分的に消化されたフラグメントを結合した。生成する構築体はｐＡＢ６４−２０である。該ターミネータと該ベクターとの間にあるＥｃｏＲＩサイトはＥｃｏＲＩで部分消化して崩壊され、次いでＴ４ポリメラーゼ処理し、かつ結合する。この新たな構築体はｐＡＢ６４−４０であり、これは、今度ＡＧ−上流配列とキモシンｃＤＮＡ（Ｆｉｇ．３）との接合部に存在する独特のＥｃｏＲＩサイトを含む。
　プラスミドｐＡＮ７６−１プラスミドｐＡＮ７−１（ブント（Ｐｕｎｔ）等、Ｇｅｎｅ．１９８７、５６、１１７−１２４）をＨｉｎｄＩＩＩで消化した。このサイトに、ＡＧ−遺伝子の３′にあるｐＡＢ６−１（Ｆｉｇ．２）からのＳａｌＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを結合した。該結合の前にＳａｌＩサイトをＴ４ポリメラーゼで閉鎖した。この構築体（ｐＡＮ７６−１；Ｆｉｇ．４）から、ＨｙｇＢ遺伝子＋３′フランキングＡＧフラグメントを、ＳｔｕＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離した。
　ファージｍＡＢ６４−０調節配列とＡＧ−プロモータとを含む、プラスミドｐＡＢ６−２Ａ由来の小さなＥｃｏＲＩ＋ＮｒｕＩフラグメントを単離し、これを、牛キモシンｃＤＮＡを含むプラスミドｐＲＣＨ４のＳａｌＩ＋ＢｃｌＩフラグメントと共に、ＥｃｏＲｉおよびＢａｍＨＩで消化したファージＭ１３ｍｐ１１〔メッシング＆ビエイラ（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ａｎｄ　ｖｉｅｉｒａ）、Ｇｅｎｅ，１９８２、１９、２６９−２７６；例えばスウェーデンのファルマシア　インコーポレーテッド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ．）から入手可能〕に結合し、かつＳａｌＩサイトにおいてＴ４ポリメラーゼで処理した。生成した構築体、ファージｍＡＢ６４−０はＡＧとプレプロキモシンとの融合タンパクを含み（Ｆｉｇ．５）、これをインビトロでの変異形成にかけた。
　Ｂ．特定の表現カセット牛キモシン用の３種の表現カセットをｍＡＢ６４−０から作製した。各々はＡＧ調節領域と牛キモシンｃＤＮＡとの異なる融合サイトを含んでいる。
　この目的のために、以下の３種のオリゴヌクレオチドを消化した。
　＃１：５′−ＡＴ　ＴＡＣ　ＡＣＣ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　ＡＴＧ　ＡＧＧ　ＴＧＴ　ＣＴＣ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　３′＃２：５′−ＴＧＣ　ＡＣＡ　ＧＧＧ　ＴＴＧ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＣＣ　ＡＧＧ　ＡＴＣ　ＣＣＴ　ＣＴ　３′＃３：５′　−ＡＣＧ　ＧＡＴ　ＡＡＣ　ＣＣＧ　ＧＡＣ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＣＣ　ＡＧＧ　３′これらオリゴヌクレオチドはＡＧ−プロモータをプレプロキモシン（＃１）にあるいはＡＧ−プロモータとシグナルペプチドとをプロキモシン（＃２）に接合するのに用いた。オリゴ＃３を用いて、成熟ＡＧ−遺伝子の７１アミノ酸とプロキモシンとの間で融合タンパクを得た。
　これら構築体の同定は生成構築体（ｍＡＢ６４−２、ｍＡＢ６４−３、およびｍＡＢ６４−５）のｓｓＤＮＡの配列決定により行った。これらの構築体から所定の遺伝子融合体を含むＥｃｏＲＩフラグメントを単離し、ｐＡＢ６４−４０に挿入して、夫々ｐＡＢ６４−４２、ｐＡＢ６４−４３およびｐＡＢ６４−４５を得た。これらプラスミドｐＡＢ６４−４２、ｐＡＢ６４−４３およびｐＡＢ６４−４５に、ｐＡＮ７６−１から単離したＳｔｕＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを挿入した。このフラグメントはＡＧ−遺伝子のＨｙｇＢ遺伝子＋３′−フランキングエレメントを含んでいた。最終的な構築体はｐＡＢ６４−７２、ｐＡＢ６４−７３およびｐＡＢ６４−７５である、これらは該表現カセットに固有のＨｉｎｄＩＩＩサイト３′と３′フランキング領域とを含む（Ｆｉｇ．６）。
実施例２：アスペルギルスニガーを形質転換することによる遺伝子置換本発明によるＡ．ニガーの形質転換は、ファンハルチングスベルツ等およびイエルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）等の上記文献記載の方法を用いて行った。
　Ａ．ニガーＤＳ２９７５（この株のサンプルを１９８８年８月１０日付でＣＢＳに、第５１３．８８号として寄託した）を３４℃にて２４時間あるいは必要ならばそれ以上育生した。この菌糸体を滅菌ナイロン布を通して濾過することにより収穫し、０．６ＭＭｇＳ０４で洗浄した（最大、１００ｍｌ培養液当たり１２．５ｍｌ）。この菌糸体を、次に滅菌チューブに移し、秤量し、１ｇ当たり（湿潤重量）５ｍｌの浸透培地（１．２ＭＭｇＳ０４、１０ｍＭの燐酸塩で緩衝、ｐＨ５．８）中に再懸濁した。ノボジィム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）２３４（ノボ（ＮＯＢＯ）社、デンマーク；浸透培地中２０ｍｇ／ｍｌ）を湿潤重量で１ｇ当たり１ｍｌおよびＢＳＡ（シグマ（ｓｉｇｍａ）社、オランダ、浸透培地中で１２ｍｇ／ｍｌ）を湿潤重量で１ｇにつき０．５ｍｌ加えた後、プロトプラストを形成させ、一方で２５−２７℃にておだやかに（５０ｒｐｍ）振盪した。プロトプラスト形成を規則的な間隔で顕微鏡観察することによりモニタした。プロトプラスト形成完了後、１５ｍｌのプロトプラスト溶液を３０ｍｌのコレックス（Ｃｏｒｅｘ）チューブに移し、１０ｍｌのトラップバッファ（ｔｒａｐｐｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）（０．６Ｍソルビトール、１００ｍＭトリス／ＨＣｌｐＨ７．０）のオーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）を該プロトプラスト懸濁液上に注意深く展開した。このチューブをスイングロー夕（ｓｗｉｎｇ−ｏｕｔ　ｒｏｔｅｒ）で４℃にて５０００ｒｐｍで１５分間遠心した。プロトプラストをその勇断を防ぐために、広い開口をもつ無菌パスツールピペットで間期から注意して集めた。この相分離は遠心後に大きなペレットがみられるようになるまで繰返した。この場合、ペレットを注意深く浸透培地に再懸濁し、新たなトラップバッファのオーバーレイを設け、遠心を繰返した。プロトプラストを集め、これを冷ＳＴＣ（１．２Ｍソルビトール；１０ｍＭトリスＨＣｌ；ｐＨ７．５；５０ｍＭＣａＣ１２）に再懸濁し、４℃で３０００ｒｐｍにて１０分間遠心することにより注意深く洗浄した。この洗浄は、汚染粒子を含まないプロトプラスト処方物が得られるまで繰返した。このプロトプラストペレットを冷ＳＴＣに最終濃度１×１０８プロトプラスト（ＰＰＳ）／ｍｌとなるように懸濁させた。
　プロトプラストは即座に使用するか、あるいは４℃にて一夜保存した。保存した場合、プロトプラストを翌日冷ＳＴＣで再度洗浄した。
　形質転換のために、１０７プロトプラストを２５μ１のＳＴＣ中の１０μ９のＤＮＡあるいは１０μ１のＴＥ（ＴＥは１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、を含み、ｐＨは８．０）中にＤＮＡに加えた。遺伝子置換達成のため、プラスミド構築体ｐＡＢ６４−７２、ｐＡＢ６４−７３およびｐＡＢ６４−７５を、これらすべての選別マーカーおよびＡＧ−遺伝子（第６図）の３′フランキング領域の直ぐ下流にある固有ＨｉｎｄＩＩＩ制限サイトで切断することにより線状化した。
　このプロトプラストとＤＮＡとの混合物を室温にて２５分間インキューベットした。次に、ＰＥＧ−溶液（６０％ポリエチレングリコール４０００、ブロカセフ（Ｂｒｏｃａｃｅｆ）／ＢＤＨ；１０ｍＭトリス／ＨＣｌｐＨ５．７；５０ｍＭＣａＣ１２）を一部づつ、２００μ１、２００μ１および８５０μ１というように転化した。各部分のＰＥＧを添加した後、該混合物を注意深くホモジナイズし、ＰＥＧの最後の部分を添加した後室温にて２０分間インキュベートした。大きなプラスミド（＞１．８ｋｂ）の沈殿がしばしばみられた。これは６０％ＰＥＧ溶液を２５％ＰＥＧ溶液で替えることにより防止された。
　形質転換されたプロトプラストを冷ＳＴＣ１０〜１５ｍｌで、穏やかに混合し、５０００ｒｐｍで４℃にて１０分間遠心することにより洗浄した。このプロトプラストを１００μ１のＳＴＣに再懸濁し、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（シグマ（ｓｉｇｍａ）Ｈ２６３８）を含む選別プレート上で注意深く平板分離した。ハイグロマイシン耐性コロニーを、単一の単離芽胞から出発して、更に分析した。
実施例３：遺伝子置換の証明Ａ．サザンプロット法実際に該形質転換体中で遺伝子置換が起こっているか否かを確定するため、サザンプロット法を用いて、該形質転換体からのグルコアミラーゼ特異性ＤＮＡがないことを立証した。グルコアミラーゼ遺伝子に対して相同のＤＮＡフラグメントを放射性とし、電気泳動によりＤＮＡを分離し、かつナイロン膜に染色体ＤＮＡを固定した後、該形質転換体のＤＮＡにハイブリッド化する。極めて少量の相同ＤＮＡがこの方法で検出できる。形質転換に用いた３種の構築体各々の数種の形質転換体からＤＮＡを単離した。標準的手法で菌糸体を液体窒素中で粉砕した後に、ＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動で分離し、ジーヌスクリーンプラス（Ｇｅｎｅ　Ｓｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ）（ＴＭ）ナイロン膜（米国デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）社）にプロットした。まず、このプロットを放射性ＡＧ−特異性プローブ（ＡＧ内部Ｂａｍ　ＨＩ＋Ｂｇｌ　ＩＩフラグメント（Ｆｉｇ．２））ハイブリッド化した。このプローブを用いても何等ハイブリット化信号を示さない形質転換体（ＡＧ−遺伝子がいまだ形質転換体中に存在すると３．４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントの存在が予想される）は他のプローブでのスクリーニングに付されて、遺伝子置換の発生が確認される。このため、ＥｃｏＲ１消化物を放射性ｐＡＢ６４−７５（あらゆる必須のプラスミド由来のフラグメントの存在を確認するためのもの）および放射性ｐＵＣ１９（バクテリアＤＮＡのないことを立証するためのもの）両者とハイブリッド化した。これらの実感の結果は、すべての予想されたプラスミド由来のフラグメントの存在（牛キモシンｃＤＮＡを含む）およびはじめに分析された３６形質転換体のうちの７種におけるバクテリアＤＮＡの不在を示した。すべての選別された形質転換体の単一のキモシン表現カセットを含む。
　Ｂ．ウエスタンプロット法生物体のゲノムから選別された遺伝子のないことは様々な方法で確証できる。上記節Ａで記載したサザンプロットハイブリッド化は用いたプローブと相同の遺伝物質のないことを立証するための強力な手段の一つである。特定の遺伝子がないことを明らかにするためのもう一つの方法は対象とする遺伝子（この場合グルコアミラーゼ遺伝子）の生成物でないことを明らかにすることである。ある処方中におけるタンパクの存在または不在を立証する極めて高感度の技法はウエスタンプロット法である。この方法においては、対象とするタンパクに対して生成される特定の抗体を用いて、該特定のタンパクの存在、不在を明らかにする。これらの抗体は該タンパクに結合するが、該抗体はニトロセルロース膜に固定されている。次いで、第１の抗体処方に対して生成される第２の抗体処方が使用される。この第２の抗体処方は酵素と結合する。この酵素は無色の基質を着色生成物に変えることができる。着色バンドは免疫源性物質が存在するスポット上に出現する。該物質は第１抗体処方と反応できる。
　牛キモシン遺伝子で置換されたＡＧ−遺伝子をもつものとしてサザンプロット法で選別された形質転換体は殿粉の存在下で生育して、ＡＧ調節領域を誘発し、かつ醗酵上澄はウエスタンプロット法で分析され、宿主菌株の発酵上澄と比較された。各２０μ１の上澄を７．５％ポリアクリルアミドーＳＤＳゲル上に重層し、タンパクバンドを電気泳動で分離した。このゲルを標準的プロトコールで、ニトロセルロース膜上で電気泳動によりプロットした。このニトロセルロース膜を、市販の処方をＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーで精製して得た。グルコアミラーゼに対して生成するポリクローナル抗血清で数回洗浄した後インキュベートした。この膜の第２抗体接合処方物での処理は該形質転換体処方物に着色バンドを示さなかったが、宿主処方物ではほぼグルコアミラーゼサイズのバンドがあった。この実験は、選別された形質転換体において、抗ＡＧ一血清と反応し得る物質は合成されないことを示しており、従ってＡＧ−遺伝子は牛キモシン遺伝子で置換されたことが結論付けられる。
　Ｃ．分泌タンパクの量に及ぼす遺伝子置換の影響グルコアミラーゼはＡ．ニガーによって分泌される全タンパクの実質的部分をなす（例えばカレン（Ｃｕｌｌｅｎ）等の上記文献）。従って、グルコアミラーゼ遺伝子の他のタンパク遺伝子による置換は、Ａ．ニガー形質転換体により分泌されるタンパクの量に影響し、発酵ブロスのタンパク含量における減少は、他の分泌タンパクの精製を容易にする。更に、分泌経路の能力が制限されていれば、細胞からのグルコアミラーゼの除去は、他のタンパクに対して該分泌経路を開放する。
　分泌タンパクの量に与える遺伝子置換の効果を調べるために、発酵上澄のタンパク含有率を標準的方法で測定し、宿主のデータと比較した。第１表はかくして得た結果を総めたものである。
第１表：発酵ブロスのタンパク含量（実施例４参照）
菌株タンパク濃度（ｍｇ／ｍｌ）
　Ａ．ニガーＤＳ２９７５０．１４３Ａ．ニガーＤＳ２９７５＋ｐＡＢ６４−７２０．０９６Ａ．ニガーＤＳ２９７５＋ｐＡＢ６４−７３０．０８２Ａ．ニガーＤＳ２９７５＋ｐＡＢ６４−７５０．０７６この実験で得られた結果は、分析された形質転換体中に高度に表現されたグルコアミラーゼ遺伝子がないことと一致している。
実施例４：キモシンおよびＡＧ−シグナルペプチドを用いたＡ．ニガーによる牛キモシンの表現および分泌実施例２記載の如く、線状化したｐＡＢ６４−７２およびｐＡＢ６４−７３でＡ．ニガーを形質転換した、この形質転換体中での遺伝子置換の出現は実施例３のようにして確認した。単一の芽胞単離体から始めて、選別された形質転換体をキモシンの産生および分泌につき分析した。キモシンは通常チモーゲンとして分泌され、この分泌された酵素は短いＮ−末端ペプチド（プロキモシン）の存在のために不活性である。このチモーゲンは、例えば酵素を用いた開裂によってこの短いＮ−末端ペプチドを除去することにより、またはキモシンの場合には低ｐＨの下でインキュベートすることにより活性化される。従って、分泌されたキモシンの活性を正確に測定するこめには、すべての分泌されたプロキモシンを低ｐＨ処理によってその活性型に転化する。
　Ａ．ＡＧ−遺伝子の遺伝子置換を含むＡ．ニガーの形質転換体の発酵選別された形質転換体の約１０７個の芽胞を、液状予備培養培地１００ｍｌを含む振盪フラスコ内でインキュベートした。この培地はＫＨ２Ｐ０４（１ｇ／ｌ）、マルトース（３０ｇ／Ｉ）、酵母抽出物（５ｇ／ｌ）、水解カゼイン（１０ｇ／１）ｋｇＳ０４・７Ｈ２０（０．５ｇ／１）およびツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）（３ｇ／ｌ）を含んでいた。これら培養物を３４℃にて４８時間育生した。サンプルををキモシン産生の分析のため、およびｍＲＮＡ単離のために採取した。この培養物１０ｍｌを１００ｍｌの発酵培地に接種した。この発酵培地はＫＨ２Ｐ０４（１ｇ／１）、コーンスターチ（７０ｇ／１）、酵母抽出物（１２．５ｇ／１）、水解カゼイン（２５ｇ／１）、Ｋ２Ｓ０４（２９／１）、ｋｇＳ０４・７Ｈ２０（０．５９／１）、ＺｎＣ１２（０．０３ｇ／１）、ＣａＣ１２（０．０２９／１）、ＭｇＳ０４・４Ｈ２０（０．０１ｇ／１）およびＦｅＳ０４（０．３ｇ／１）を含んでいた。これら培養物を３４℃にて４８時間インキュベートした。再び、サンプルをキモシン産生分析のため、およびｍＲＮＡ単離のために採取した。
　Ｂ．菌糸体サンプル中のｍＲＮＡ濃度の測定菌糸体を収穫し、蒸留水で洗浄し、ＲＮアーゼを含まない乳鉢と乳棒とを用いて、液体窒素中で微粉末に粉砕した。この粉末をホモゲナイズ用バッファ（４Ｍのグアニジンイソチオシアネート、５ｍＭナトリウムシトレートｐＨ７．０；０．１Ｍのβーメルカプトェタノール；０．５％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウロイルザルコシンナトリウム塩（シグマ（ｓｉｇｍａ）社Ｌ−５１２５）に２ｍｌ／９で溶解し、３７℃にて３０分間インキュベートした。５０００ｒＰｍで１５分間遠心した後の上澄に０．４ｇ／ｍ１のＲＮアーゼを含まないＣｓＣｌを加えた。この溶液を、５．７ｍＣｓＣｌクッションを０．１ＭＥＤＴＡに溶かしたものの上に注意深く重層し、Ｔｉ４２．１ロータ中で２０°にて３８０００ｒｐｍで１７時間遠心した。透明なＲＮＡペレットを、グアニジンイソチオシアネート溶液を除去した後に、ＲＮアーゼを含まないバッファ（１０のトリスーＨＣｌｐＨ７．４；５ｍＭのＥＤＴＡ；１％ＳＤＳ）中に溶解した。等量のクロロホルム−ブタノール（４：１）混合物により抽出した後、ＲＮＡをナトリウムアセテートおよびエタノールで沈殿させ、ＲＮＡアーゼを含まない水に溶解した。
　ＲＮＡサンプルを電気泳動に付し、標準的方法を用いてジーヌスクリーンプラヌ（ＴＭ）上にブロツトした。このブロツトをＡＧおよびキモシンｍＲＮＡに相同のオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリッド化した。このために、該オリゴヌクレオチド配列をＡＧ−リーダから選別した。該ＡＧ−リーダはＡＧ−ｍＲＮＡおよびキモシン−ＡＧ融合ｍＲＮＡ（すべての構築体において、ＡＧーキモシン融合体は翻訳開始（ｐＡＢ６４−７２）位置あるいは翻訳開始位置を越えた位置（ｐＡＢ６４−７３および７５）にある）両者に存在する。従って、あらゆる転写体はＡＧ−リーダを含む。
　殿粉含有培地中で菌糸株を培養した後、ハリブリッド化ＲＮＡ分子はすべてのサンプル中に検出され、最大収率はｐＡＢ６４−７３について得られた。宿主内で、このハイブリッド化ｍＲＮＡはＡＧ−ｍＲＮＡに予想される長さを有し、形質転換体中のハイブリッド化ｍＲＮＡは種々の表現カセットに対し期待される長さであった。宿主中のＡＧに対するｍＲＮＡの濃度はｐＡＢ６４−７３形質転換体中のキモシンｍＲＮＡ濃度と同じであった。このことはこれら形質転換体中のＡＧ座におけるハイブリッド遺伝子が元ＡＧ−伝子の効率と同じ効率で転写されることを示している。
　Ｃ．Ａ．ニガーによる牛キモシンの分泌の証明形質転換体および宿主両者の発酵ブロスのサンプルを１２．５％ポリアクリルアミドーＳＤＳゲル中で電気泳動した。次いで、このゲルを標準的方法を用いてニトロセルロース上にプロットした。精製キモシンに対して生成するモノクローナル抗体を用いて、キモシンの免疫的検出を行った。
　対照として、精製キモシンをも電気泳動し、同じ実験においてブロットした。すべての形質転換体サンプル中における正確な長さのバンドの存在（ただし宿主サンプルにはない）は、テストした２種の構築体のいずれを用いても牛キモシンの表現および分泌を示している。最大キモシン収率は構築体ｐＡＢ６４−７３について得られたが、ｐＡＢ６４−７２形質転換体によるキモシンの分泌も、Ａ．ニガー中で該キモシンシグナルペプチドが機能性であることを示している。
　凝固活性を、基質として脱水スキムミルク（ディフコ（ＤＩＦＣＯ）社）を用い、かつ標準として公知力価の牛レネットを用い、標準的プロトコールに従って測定した。ｐＡＢ６４−７３について、収率は１８〜４５ＭＣＵ／ｍｌであり、ｐＡＢ６４−７２では７〜１５ＭＣＵ／ｍｌであった。（ここで１ＭＣＵは３５℃にて４０分以内に１ｍｌのミルクを凝固させるキモシンの量である。）
　発酵ブロス中に得られたキモシンの量はＨ．５ｍｇ／１までであり、これはＡ．ニデュランスの形質転換体につき報告されている値よりも実質的に大きく、これは恐らく類似のキモシン表現カセットのコピーを多量にもっていると思われる（０．５〜２．５ｍｇ／１；クラン（ｃｕｎａｎ）等、上記文献および０〜７ｍｇ／１；ＥＰ−Ａ−０２１５５９４号）
実施例５：Ａ．ニガー由来のＡＧ−プロキモシン融合タンパクの表現および分泌線状化したｐＡＢ６４−７５をＡ．ニガーに形質転換させた。上記実施例記載のように、選別形質転換体を分析した。キモシン特異的ｍＲＮＡがこの形質転換体につき立証され、その表現レベルはｐＡＢ６４−７２とｐＡＢ６４−７３との中間的値を示した。これら形質転換体によるキモシンの分泌はウエスタンプロット法および凝固アッセイ両方で立証され、その活性は１７〜２９ＭＣＵ／ｍｌであった。
実施例６：形質転換体中でのキモシン表現および宿主中でのＡＧ−遺伝子表現の調節ＡＧ−プロモータの機能性を、唯一の炭素源としてキシロースを含む培地で菌糸体を育生することにより、宿主および選別形質転換体中で検定した。この場合、ＡＧ−プロモータは誘起されず（ヌンベルグ（Ｎｕｎｂｅｒｇ）等、Ｍｏｌ．Ｃｅｎ．Ｂｏｉｌ．，１９８４、４、２３０６−２３１５）かつＡＧ−プロモータの制御下にあるＡＧー遺伝子および牛キモシン遺伝子いずれによっても表現は期待されない。次に、菌糸体を、ＡＧープロモータの誘起が生ずることが知られている殿粉含有培地（ヌンベルグ等の上記文献）に接種する。この予想された誘発は、キシロース生育菌糸体中における特異的ｍＲＮＡの不在に反して、殿粉上で育成した場合には、宿主中のＡＧ−特異的ｍＲＮＡおよび形質転換体中のキモシン特異的ｍＲＮＡの存在により、ノーザンブロッティング実験から立証された。また、誘発条件下でのキモシンの分泌は発酵ブロスのイムノブロットあるいは発酵ブロスの凝固活性の測定により立証される。キシロース育生培養物中には、凝固検定によってキモシン活性はみられず、またウエスタンプロット実験の結果もこの場合には負であった。これらの実験は、牛キモシン遺伝子の表現の調節がＡＧ−遺伝子の調節に類似していることおよびグルコアミラーゼ遺伝子の表現に関する一般的知見と一致していることを示している。
実施例７：プロテアーゼ阻害剤の存在下でのキモシンの表現Ａ．ニガーにより分泌されるプロテアーゼに対するキモシンの感度をプロテアーゼ阻害剤の存在または不在下で形質転換体を培養することにより調べた。
　このために、構築体ｐＡＢ６４−７３（実施例３Ａ）を含む宿主菌株ＤＳ２９７５の形質転換体を実施例４記載のようにして培養した。この培地にペプスタチンおよびα２−マクログロブリンを最終濃度１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌとなるように加えあるいはプロテアーゼ阻害剤を添加しなかった（“−”）。数回に亘りある間隔でサンプルを採取し、分泌されたキモシンの量を実施例３Ｂ記載のようにウエスタンプロット法で検定した。結果を第２表に与える。
　このデータは、発酵ブロス中に存在するプロテアーゼによる分解に対してキモシンは感受性であることを示している。これらプロテアーゼの不活性化（プロテアーゼ阻害剤の添加により例示される）はキモシンの収率の増大に導き、プロテアーゼの存在下で、発酵ブロス中におけるキモシンの長期に亘る存在から判断すると、安定性も増大することがわかる。
　上記結果から、本発明の表現系はタンパクの高効率での産生を与えることがわかる。更に、高濃度で産生される分泌タンパクを表現する遺伝子を含む座に対象とする遺伝子を導入することにより、該対象とする遺伝子の高濃度での産生が得られる。このように、宿主細胞の分泌負荷を減じて、所定の生成物を高い分泌率で得ることができる。初めに、分泌の点で有効な宿主を用いることにより、本発明系を対象とする生成物、例えば医薬、工業的酵素などの工業生産のために使用することができる。
　本明細書で引用したすべての刊行物および特許出願を本発明の参考文献とする。
　以上、本発明をその理解を容易にするために例示および実施例によって詳細に記載してきたが、上記特許請求の範囲または発明の精神を逸脱することなく、ある種の変更並びに改良を施し得ることは、本発明の教示に照らして、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図はＡ．ニガーグルコアミラーゼ（ＡＧ）遺伝子を単離するのに用いられたオリゴヌクレオチドを示した図であり、
第２図は、実施例で用いられたＡ．ニガーグルコアミラーゼ（ＡＧ）遺伝子、構築されたサブクローンおよびハイブリッド形式プローブの地図であり、
第３図は、ｐＡＢ６４−４０の構成を示す図であり、
第４図はｐＡＮ７６−１の模式的な表示であり、
第５図はｍＡＢ６４−０の模式的な表示であり、
第６図はｐＡＢ６４−７２、ｐＡＢ６４−７３およびｐＡＢ６４−７５の模式的表示であり、および
第７図はグルコアミラーゼ座での遺伝子置換の模式的表示である。