(57)【要約】  ＤＲ５レセプターに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗ＤＲ５抗体はファージディスプレイ技術を用いて同定したＣＤＲ配列を含有する。ＤＲ５抗体は、例えば、癌及び免疫関連症状を含む、Ａｐｏ-２Ｌ及び／又はＡｐｏ-２Ｌレセプターの生物学的活性の調節が望まれる方法に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図６、７又は８に記載の一又は複数のアミノ酸配列を含んでなる単離された抗ＤＲ５抗体。
【請求項２】
重鎖及び軽鎖を含んでなり、該重鎖が図６、７又は８に記載の一又は複数のアミノ酸配列を含有する可変領域を含むものである単離された抗ＤＲ５抗体。
【請求項３】
前記重鎖及び前記軽鎖が可動性リンカーにより結合されて一本鎖抗体となる、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
一本鎖Ｆｖ抗体である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
Ｆａｂ抗体である。請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
完全にヒトである、請求項２に記載の抗体。
【請求項７】
ＤＲ５レセプターに特異的に結合し、ＤＲ４レセプター、ＤｃＲ１レセプター又はＤｃＲ２レセプターに結合しない、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項８】
少なくとも一種類の哺乳動物癌細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項９】
Ａｐｏ-２リガンドのＤＲ５レセプターへの結合をブロック又は阻害する、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１ないし９の何れか一の抗体と担体を含んでなる組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物の疾患の治療方法。
【請求項１２】
前記疾患が免疫関連疾患である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患が癌である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（出願について）
この出願は、米国特許法１１９条に基づき、２００４年４月６日提出の米国特許仮出願番号第６０／５５９，９２８号の優先権を主張する出願であり、ここに出典明記により組み込まれるものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＤＲ５レセプターに結合する抗体に関する。そのような抗体は、例えばＡｐｏ-２Ｌ及び／又はＡｐｏ-２Ｌレセプターの生物学的活性の調節を目的とする方法で用いることができる。
【０００３】
（発明の背景）
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「ＬＴ-β」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ−２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ又はＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫとも称される)、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド（ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される）、及びＴＡＬＬ-１(ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定されている［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986)；Dealtryら, Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)；Pittiら, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)；Wileyら, Immunity, 3：673-682(1995)；Browningら, Cell, 72:847-856(1993)；Armitageら, Nature, 357:80-82(1992), 1997年1月16日公開のWO97/01633；1997年7月17日公開のWO97/25428；Marstersら, Curr. Biol., 8:525-528(1998)；Chicheporticheら, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；1998年7月2日公開のWO98/28426；1998年10月22日公開のWO98/46751；1998年5月7日公開のWO/98/18921；Mooreら, Science, 285:260-263(1999)；Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneiderら, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、Ａｐｏ−２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ)及びＡｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫ)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。
【０００４】
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬはサイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーとして数年前に同定された。［例えばWileyら, Immunity, 3:673-682 (1995); Pittiら, J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996)］。完全長ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは２８１アミノ酸長のＩＩ型膜貫通タンパク質である。ある細胞は、ポリペプチドの細胞外領域の酵素による切断を通して、そのポリペプチドの天然の可溶型を生じうる［Marianiら, J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)］。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型の結晶学的研究はＴＮＦ及び他の関連タンパク質の構造に類似したホモ三量体構造を明らかにする［Hymowitzら, Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Hymowitzら, Biochemistry, 39:633-644 (2000)］。しかし、他のＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、（ホモ三量体の各サブユニットの位置２３０の）３つのシステイン残基が併せて亜鉛原子を配位しており、亜鉛の結合が三量体の安定性と生物学的活性のために重要であるという独特の構造的特徴を有していることが分かった。［上掲のHymowitzら; Bodmerら, J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)］。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、リウマチ様関節炎のような自己免疫疾患を含む免疫系の調節、及びＨＩＶの治療に役割を担っている可能性があることが文献において報告されている［例えば、Thomasら, J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsenら, Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffithら, J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Songら, J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)；Jeremias ら., Eur. J. Immunol., 28:143-152 (1998)；Katsikis ら., J. Exp. Med., 186:1365-1372 (1997)；Miura ら., J. Exp. Med., 193:651-660 (2001)］。
【０００５】
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型はまた大腸、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣及び脳腫瘍を含むインビトロの様々な癌細胞並びに黒色腫、白血病、及び多発性骨髄腫においてアポトーシスを誘導することが報告されている［例えば、上掲のWileyら; 上掲のPittiら; Riegerら, FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenaziら, J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczakら, Nature Med., 5:157-163 (1999); Keaneら, Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutaniら, Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yuら, Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyanら, Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)を参照のこと］。マウス腫瘍モデルでのインビボ研究は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、単独で又は化学療法又は放射線療法と組み合わせて、実質的な抗腫瘍効果を生じうることを示唆している［例えば上掲のAshkenaziら;上掲のWalzcakら;Gliniakら, Cancer Res., 59:6153-6158 (1999);上掲のChinnaiyanら; Rothら, Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)を参照のこと］。多くのタイプの癌細胞とは対照的に、殆どの正常なヒト細胞タイプはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのある種の組換え形態によるアポトーシスの誘導に対して耐性があるように思われる［上掲のAshkenaziら;上掲のWalzcakら］。ＪｏらはＡｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬのポリヒスチジンタグ可溶型が正常な単離された非ヒトではなくヒト肝細胞においてインビトロにてアポトーシスを誘導したことを報告している［Joら, Nature Med., 6:564-567 (2000);またNagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)を参照のこと］。ある種の組換えＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ調製物は、例えばタグ分子の有無、亜鉛含有量、及び三量体の含有％に応じて、死亡対正常細胞に対する生化学的性質及び生物学的活性に関して変動しうると考えられている。［Lawrenceら, Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qinら, Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)］。
そのようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞応答の誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。既に、約５５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されている［Hohmanら, J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhausら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；１９９１年３月２０日に公開された欧州特許第４１７５６３号；Loetscherら, Cell, 61：351(1990)；Schallら, Cell, 61：361(1990)；Smithら, Science, 248：1019-1023(1990)；Lewisら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwinら, Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。それらのＴＮＦＲが細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有している。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶型ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出されている［Nophar, Yら, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, Tら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)；Hale等［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］。
【０００６】
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２-末端から出発して、１から４と命名される４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。［Schallら, 上掲；Loetscherら, 上掲；Smithら, 上掲；Nopharら, 上掲；Kohnoら, 上掲；Bannerら, Cell, 73:431-435 (1993)］。ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnsonら, Cell, 47：545(1986)；Radekら, Nature, 325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovicら, EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Malletら, EMBO J., 9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yoneharaら, 上掲及びItohら, Cell, 66:233-243(1991)］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Uptonら, Virology, 160：20-29(1987)；Smithら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Uptonら, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。
【０００７】
リンホトキシン-βを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、一般的にＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのほとんどのレセプターは一般的にＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；それぞれの場合に得られるタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
【０００８】
Panらは、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Panら, Science, 276：111-113(1997)；１９９８年７月３０日公開のＷＯ９８／３２８５６；１９９９年７月２９日公開の国際公報９９／３７６８４；２０００年１２月７日公開の国際公報００／７３３４９；２００２年８月１３日発行の米国特許第６，４３３，１４７号；２００２年１０月８日発行の米国特許第６，４６１，８２３号及び、２００２年１月２９日発行の米国特許第６，３４２，３８３号も参照］。ＤＲ４は細胞自殺機構に関与可能な細胞質デスドメインを含むと報告されている。Panらは、ＤＲ４がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
Sheridanら, Science, 277: 818-821 (1997)及びパンら, Science, 277: 815-818 (1997)においては、Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するレセプターと思われる他の分子が記載されている［１９９８年１１月１９日に公開の国際公開９８／５１７９３；１９９８年９月２４日公開の国際公開９８／４１６２９もまた参照のこと］。この分子は、ＤＲ５と呼ばれる（あるいは、Ａｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれている［例としてScreatonら, Curr. Biol., 7:693-696 (1997)；Walczakら, EMBO J., 16:5386-5387 (1997)；Wuら, Nature Genetics, 17:141-143 (1997)；１９９８年８月２０日公開の国際公開９８／３５９８６；１９９８年１０月１４日公開の欧州特許第８７０，８２７号；１９９８年１０月２２日公開の国際公開９８／４６６４３；１９９９年１月２１日公開の国際公開９９／０２６５３；１９９９年２月２５日公開の国際公報９９／０９１６５；１９９９年３月１１日公開の国際公報９９／１１７９１；２００２年８月１３日公開の米国公開特許２００２／００７２０９１；２００１年１２月７日公開の米国公開特許２００２／００９８５５０；２００１年１２月６日発行の米国特許第６，３１３，２６９号；２００１年８月２日公開の米国公開特許２００１／００１０９２４；２００３年７月３日公開の米国公開特許２００３／０１２５５５４０；２００２年１０月３１日公開の米国公開特許２００２／０１６０４４６、２００２年４月２５日公開の米国公開特許２００２／００４８７８５；２００３年５月２７日発行の米国特許第６，５６９，６４２号；２０００年６月６日発行の米国特許第６，０７２，０４７号；２００３年１１月４日発行の米国特許第６，６４２，３５８号）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞質デスドメインを含み、アポトーシスをシグナル伝達可能であると報告されている。Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＤＲ５の間に形成される複合体の結晶構造はHymowitzら, Molecular Cell, 4:563-571 (1999)に記載されている。
【０００９】
最近同定されたレセプターの更なるグループは、「デコイレセプター」と称され、シグナル伝達トランスデューサーというよりはむしろ阻害剤として機能すると考えられている。このグループには、ＤＣＲ１（ＴＲＩＤ、ＬＩＴ又はＴＲＡＩＬ-Ｒ３とも称される）［Panら, Science, 276：111-113(1997)；Sheridanら, Science, 277：818-821 (1997)；McFarlaneら, J. Biol. Chem., 272：25417-25420(1997)；Schneiderら, FEBS Letters, 416：329-334(1997)；Degli-Espostiら, J. Exp. Med., 186：1165-1170(1997)；及びMongkolsapayaら, J. Immunol., 160：3-6(1998)］及びＤＣＲ２（ＴＲＵＮＤＤ，又はＴＲＡＩＬ-Ｒ４とも称される）［Marstersら, Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)；Panら, FEBS Letters, 424：41-45(1998)；Degli-Espostiら, Immunity, 7：813-820(1997)］が含まれ、両者とも細胞表面分子であり、更にＯＰＧ［上掲のSimonetら；下掲のEmeryら］及びＤＣＲ３［Pitti等, Nature, 396:699-703(1998)］も含まれ、これら両者は分泌性の可溶性タンパク質である。Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬはＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称されるレセプターに結合すると報告されている。
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬは細胞表面「デスレセプター」ＤＲ４及びＤＲ５を通して作用してカスパーゼ、又は細胞死プログラムを実施する酵素を活性化させると考えられている。リガンド結合の際、ＤＲ４とＤＲ５は、双方共、ＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１［Kischkelら, Immunity, 12:611-620 (2000); Sprickら, Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmerら, Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)］と称されるデスドメイン含有アダプター分子を通してアポトーシス発動因子であるカスパーゼ-８を独立して補充し活性化することによってアポトーシスを惹起しうる。ＤＲ４及びＤＲ５とは対照的に、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２レセプターはアポトーシスをシグナル伝達しない。
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプターの概説については、Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308(1998)；Ashkenazi及びDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753(1997)；上掲のGruss及びDower；Nagata, Cell, 88:355-365(1997)；Locksleyら, Cell, 104:487-501 (2001)；Wallach, “TNF Ligand and TNF/NGF Receptor Families”, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, 377-411頁を参照。
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、ＤＲ５レセプターに結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体は、単量体、二量体、三量体、四量体、又はより高次のオリゴマー型である。場合によっては、抗体はオリゴマー複合体形成を容易にする異種性ペプチド配列に融合した抗体を含んでなるキメラ分子又は融合タンパク質である。一実施態様では、抗体は、ＤＲ５レセプターとＡｐｏ−２Ｌの相互作用を阻害する。場合によっては、抗体は、少なくとも一のＡｐｏ−２Ｌ関連生物学的活性、例えばＤＲ５レセプターを介したアポトーシスの誘導のアゴニストである。
ある実施態様では、抗ＤＲ５抗体は、図６、７又は８に記載のＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２又はＣＤＲ-Ｈ３として示す一又は複数のアミノ酸残基又は配列を含む。場合によっては、抗ＤＲ５抗体は、図６、７又は８に記載のＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２又はＣＤＲ-Ｈ３に示す配列と少なくとも８０％の同一性を有する一又は複数のアミノ酸配列を含む。更なる実施態様では、抗ＤＲ５抗体は、図６、７又は８に記載のＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２又はＣＤＲ-Ｈ３に示す配列と少なくとも９５％の同一性を有する一又は複数のアミノ酸配列を含んでもよい。場合によっては、本発明のＤＲ５抗体は、（以下の実施例に開示するような）ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイの測定による約０．１ｎＭから約２０ｍＭの範囲の濃度でＤＲ５レセプターに結合する。場合によっては、本発明のＤＲ５抗体は、（以下の実施例に開示するような）ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイの測定による約０．６ｎＭから約１８ｍＭのＩＣ５０値を示す。
【００１１】
本発明の関連した実施態様には、一又は複数のそのようなアミノ酸配列を含んでなる抗体をコードする核酸分子が含まれる。本発明の更なる実施態様には、そのような抗体をコードする核酸分子を含むベクター、並びにこれらのベクターを含む宿主細胞（例えば大腸菌）が含まれる。本発明の付加的な実施態様には、本発明の抗体をコードする核酸配列を内含するベクターを有する宿主細胞を調製して；（ｂ）培養培地を調製して；（ｃ）抗体を発現するのに十分な条件下にて培養培地中で宿主細胞を培養して；（ｄ）宿主細胞又は培養培地から抗体を回収して；（ｅ）抗体を精製する工程を含む、ＤＲ５レセプター抗体の生成方法を含む。
本発明のＤＲ５レセプター抗体は、当分野に公知の様々な方法のうちの何れかを用いて修飾されうる。本発明の好適な実施態様では、本発明の抗体は異種性分子又はポリペプチド配列に結合される。場合によっては、異種性ポリペプチド配列はロイシンジッパードメインである。場合によっては、異種性配列はアミノ酸配列グリシン-グリシン-メチオニンを含んでなる。場合によっては、抗体は一又は複数のリンカー分子又はポリオール基とコンジュゲート又は結合してもよい。
本発明のある実施態様では、抗体はＡｐｏ-２ＬとＤＲ５との間の相互作用をブロック又は阻害する。場合によっては、抗体は一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する。
【００１２】
また、本明細書では、上記の抗体の少なくとも一と担体内に含んでなる組成物を提供する。好適には、この組成物は無菌性である。加えて、本発明は上記の組成物の調整方法を提供する。特に望ましい実施態様では、結果として生じた組成物は薬学的に受容可能な製剤である。
また、本明細書に記載の抗体をコードする単離された核酸も提供され、例えばインビボ又はエクスビボ遺伝子治療に用いられうる。
本発明の他の実施態様は、哺乳動物細胞のＡｐｏ−２Ｌ及び／又はＡｐｏ−２Ｌレセプターの生物学的活性の調節方法である。本発明の好ましい実施態様は、哺乳動物細胞を有効量のここに記載のＤＲ５レセプター抗体に曝すことを含む、哺乳動物細胞のアポトーシス誘導方法である。前記哺乳動物細胞は例えば癌細胞でもよい。更なる態様では、本発明は、哺乳動物に有効量の本発明で提供されるＤＲ５レセプター抗体を場合によっては注射又は輸液によって投与することを含む、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患等の疾患の治療方法を提供する。場合によっては、疾患は癌、特に乳癌、肺癌又は大腸癌（又は直腸結腸癌）又は神経膠癌である。ここに記載の抗体は単独又は他の薬剤と共に投与されうる。
【００１３】
付加的な実施態様では、本発明は、ここに記載の抗体を包含する容器と抗体の使用；例えば、効果がある疾患治療へ抗体の使用についての指示書を含んでなるキットを提供する。場合によっては、疾患は癌、特に、乳癌、肺癌又は大腸癌（又は結腸直腸癌）又は神経膠癌である。
本発明の更なる他の実施態様は、ここに記載の抗体を内包する容器と、抗体の使用についての印刷された指示書を含んでなる製造品である。場合によっては、容器は、ボトル、バイアル、シリンジ又は試験管である。場合によっては、製造品は、注射用水、生理食塩水、リンガー溶液又はブドウ糖溶液を内包する第２の容器を含む。
【００１４】
特に、請求項の形式で述べた以下の実施態様を提供する：
１．図６、７又は８に記載の一又は複数のアミノ酸配列を含んでなる単離された抗ＤＲ５抗体。
２．重鎖及び軽鎖を含んでなり、該重鎖が図６、７又は８に記載の一又は複数のアミノ酸配列を含有する可変領域を含むものである単離された抗ＤＲ５抗体。
３．前記重鎖及び前記軽鎖が可動性リンカーにより結合されて一本鎖抗体となる、請求項２に記載の抗体。
４．一本鎖Ｆｖ抗体である、請求項３に記載の抗体。
５．Ｆａｂ抗体である。請求項２に記載の抗体。
６．完全にヒトである、請求項２に記載の抗体。
７．ＤＲ５レセプターに特異的に結合し、ＤＲ４レセプター、ＤｃＲ１レセプター又はＤｃＲ２レセプターに結合しない、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
８．少なくとも一種類の哺乳動物癌細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
９．Ａｐｏ-２リガンドのＤＲ５レセプターへの結合をブロック又は阻害する、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
１０．請求項１ないし９の何れか一の抗体と担体を含んでなる組成物。
１１．請求項１０に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物の疾患の治療方法。
１２．前記疾患が免疫関連疾患である、請求項１１に記載の方法。
１３．前記疾患が癌である、請求項１１に記載の方法。
【００１５】
（発明の詳細な記載）
Ａ．定義
「ＴＮＦファミリーメンバー」は広範囲の意味に使用され、構造又は機能に関し、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)にある程度の類似性を共有する種々のポリペプチドを称する。ＴＮＦファミリーのポリペプチドに関連したある種の構造的及び機能的特徴は、当該分野において公知であり、例えば、上述した本発明の背景に記載されている。限定されるものではないが、このようなポリペプチドには、当該分野でＴＮＦ-アルファ、ＴＮＦ-ベータ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(ＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(TWEAKとも称される)、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド(ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される)、及びＴＡＬＬ-１(Ｂ１ｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)と称されるポリペプチドが含まれる［例えば、Gruss及びDower, Blood 1995, 85：3378-3404；Pittiら, J. Biol. Chem., 1996, 271：12687-12690；Wileyら, Immunity, 1995, 3：673-682；Browning等, Cell, 1993, 72:847-856 ；Armitage等, Nature 1992, 357:80-82 、国際公開第97/01633号；国際公開第97/25428号；Marstersら, Curr. Biol., 1998, 8：525-528；Chicheporticheら, Biol. Chem. 1997, 272：32401-32410；Hahneら, J. Exp. Med. 1998, 188：1185-1190；国際公開第98/28426号；国際公開第98/46751号；及び国際公開第98/18921号；Mooreら, Science 1999, 285：260-263；Shuら, J. Leukocyte Biol. 1999, 65：680；Schneiderら, J. Exp. Med.,  1999,189：1747-1756；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem. 1999, 274：15978-15981(1999)を参照のこと］。
【００１６】
「ＤＲ５レセプター抗体」、「ＤＲ５抗体」又は「抗ＤＲ５抗体」とは、広義で少なくとも一型のＤＲ５レセプターに結合する抗体を意味する。場合によっては、ＤＲ５抗体は異種性配列又は分子に融合又は結合する。異種性配列は抗体がより高次の複合体又はオリゴマー複合体を形成させる又は形成を補助する。場合によっては、ＤＲ５抗体はＤＲ５レセプターに結合するが、任意の付加的なＡｐｏ-２Ｌレセプター（例えばＤＲ４、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２）と結合又は交差反応をしない。場合によっては、抗体はＤＲ５シグナル伝達活性のアゴニストである。
場合によっては、本発明のＤＲ５抗体は、（例えば以下の実施例に開示するような）ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイの測定による約０．１ｎＭから約２０ｍＭの範囲の濃度でＤＲ５レセプターに結合する。場合によっては、本発明のＤＲ５抗体は、（例えば以下の実施例に開示するような）ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイの測定による約０．６ｎＭから約１８ｍＭのＩＣ５０値を示す。
【００１７】
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」、「Ａｐｏ-２Ｌ」、及び「ＴＲＡＩＬ」という用語は、図１に示されたアミノ酸配列(配列番号：１)のアミノ酸残基１１４-２８１、９５-２８１、残基９２-２８１、残基９１-２８１、残基４１-２８１、残基１５-２８１、又は残基１-２８１、並びに上記配列の生物活性な断片、欠失、挿入又は置換変異体を含むポリペプチド配列を称するために、ここでは使用される。一実施態様において、ポリペプチド配列は、図１の残基１１４-２８１を含み、場合によっては図１の残基１１４-２８１からなる。場合によっては、ポリペプチド配列は、図１の残基９２-２８１又は残基９１-２８１を有する。Ａｐｏ-２Ｌポリペプチドは、図１に示す天然のヌクレオチド配列によりコードされ得る。場合によっては、残基Ｐｒｏ１１９をコードするコドンは、「ＣＣＴ」又は「ＣＣＧ」であってよい。他の一実施態様では、断片又は変異体は生物学的に活性であり、列挙されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ配列の何れかと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、そして更により好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは、図１にて提供されるコード化ポリヌクレオチド配列と、緊縮条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列によりコードされる。本定義は、少なくとも一の天然アミノ酸がアラニン残基によって置換された、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの置換変異体を包含する。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特定の置換変異体は、少なくとも一のアミノ酸がアラニン残基で置換されたものを包含する。これらの置換変異体には、例えば「Ｄ２０３Ａ」；「Ｄ２１８Ａ」及び「Ｄ２６９Ａ」として同定されているものが含まれる。この命名は、（図１に示されるの番号を用いて）位置２０３、２１８及び／又は２６９で、アスパラギン酸残基がアラニン残基によって置換された、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体を同定するのに使用される。場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ変異体はＰＣＴ出願国際公開第０１／００８３２号に公開された表１に列挙されている、一又は複数のアラニン置換基を含有していてもよい。置換変異体には、２００１年１月４日に公開されている国際公開第０１／００８３２号の表１において同定されている、一又は複数の残基置換が含まれる。また本定義は、組換え又は合成法により調製されるか、又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ供給源から単離された、天然配列Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬも包含する。本発明のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬには、ＰＣＴ出願国際公開第９７／２５４２８号及び国際公開第９７／０１６３３号に開示されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬと称されるポリペプチドも含まれる。「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」又は「Ａｐｏ２Ｌ」なる「用語は、一量体、二量体又は三量体形態のポリペプチドを含む、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ形態のものを一般的に称するために使用される。特に記載しない限りは、Ａｐｏ２Ｌに記載されているアミノ酸残基の全てのナンバリングが、図１(配列番号：１)のナンバリングに使用されている。例えば「Ｄ２０３」又は「Ａｓｐ２０３」は、図１に付与された配列の位置２０３にあるア���パラギン酸残基を意味する。
【００１８】
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン」又は「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ ＥＣＤ」なる用語は、膜貫通及び細胞質ドメインが本質的にないＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの形態を称する。通常、ＥＣＤはこのような膜貫通及び細胞質ドメインを１％未満、好ましくはこのようなドメインを０．５％未満有している。本発明のポリペプチドとして同定される任意の膜貫通ドメイン(類)は、疎水性ドメインのタイプのものを同定するのに、当該分野で常套的に使用されている基準に従い同定されると理解されるであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は多様であるが、多くの場合は、最初同定されたドメインのいずれかの末端において、約５アミノ酸を超えないと思われる。好ましい実施態様において、ＥＣＤは、膜貫通及び細胞質又は細胞内ドメインのない(膜に結合していない)ポリペプチドの、可溶性の細胞外ドメイン配列からなる。Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特定の細胞外ドメインは、ＰＣＴ出願国際公開第９７／０１６３３号及び国際公開第９７／２５４２８号に記載されている。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ単量体」なる用語は、Ａｐｏ２Ｌの細胞外ドメイン配列の共有鎖を称する。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ二量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ二量体」なる用語は、ジスルフィド結合を介して共有結合に連結した２つのＡｐｏ-２Ｌモノマーを称する。ここで使用される場合の用語には、独立したＡｐｏ２Ｌ二量体、及び三量体形態のＡｐｏ２Ｌが範囲に入る二量体(すなわち、互いに結合した、第２のＡｐｏ２Ｌ単量体)が含まれる。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ三量体」なる用語は、非共有結合している３つのＡｐｏ２Ｌ単量体を称する。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ凝集体」なる用語は、自己結合した高級オリゴマー性形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、例えばＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体、さらには六量体及びナノ量体(nanomeric)の形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを形成するものを称するために使用する。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単量体、二量体又は三量体(又は他の凝集体)の存在性及び量の決定は、当該分野で公知の方法及びアッセイ(市販されている物質を使用)、例えば天然サイズ排除ＨＰＬＣ(「ＳＥＣ」)、ドデシル硫酸ナトリウムを使用する変性サイズ排除(「ＳＤＳ-ＳＥＣ」)、逆相ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動によりなされ得る。
【００１９】
「Ａｐｏ-２リガンドレセプター」は、当分野では、図２及び３それぞれに示すポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を有する「ＤＲ４」及び「ＤＲ５」として称されるレセプターを含む。Panらにより、「ＤＲ４」と呼ばれるTNFレセプターファミリーのメンバーが開示されている（Pan等, Science, 276:111-113, 1997年；また、１９９８年７月３０日公開のＷＯ９８／３２８５６；１９９９年７月２９日公開の国際公報99／37684；２０００年１２月７日公開の国際公報００／７３３４９；２００２年８月１３日発行の米国特許第６，４３３，１４７号；２００２年１０月８日発行の米国特許第６，４６１，８２３号及び、２００２年１月２９日発行の米国特許第６，３４２，３８３号を参照）。このＤＲ４レセプターは、細胞自殺機構に関与しうる細胞質のデスドメインを有することが報告されている。Panらにより、ＤＲ４は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ  として知られるリガンドのレセプターと考えられることが開示されている。Sheridan等によるScience, 277:818-821（1997年）およびPan等によるScience, 277:815-818（1997年）には、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの他のレセプターが開示されている（１９９８年１１月１９日公開の国際公報９８／５１７９３；１９９８年９月２４日公開の国際公報９８／４１６２９も参照）。このレセプターはＤＲ５と称される（あるいは、該レセプターはＡｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２またはＫＩＬＬＥＲとも称される；Screaton等, Curr. Biol., 7:693-696, 1997年；Walczak等, EMBO J., 16:5386-5387, 1997年；Wu等, Nature Genetics, 17:141-143, 1997年；１９９８年８月２０日公開の国際公報９８／３５９８６；１９９８年１０月１４日公開の欧州特許第８７０，８２７号；１９９８年１０月２２日公開の国際公報９８／４６６４３；１９９９年１月２１日公開の国際公報９９／０２６５３；１９９９年２月２５日公開の国際公報９９／０９１６５；１９９９年３月１１日公開の国際公報９９／１１７９１；２００２年８月１３日公開の米国公開特許２００２／００７２０９１；２００１年１２月７日公開の米国公開特許２００２／００９８５５０；２００１年１２月６日発行の米国特許第６，３１３，２６９号；２００１年８月２日公開の米国公開特許２００１／００１０９２４；２００３年７月３日公開の米国公開特許２００３／０１２５５５４０；２００２年１０月３１日公開の米国公開特許２００２／０１６０４４６、２００２年４月２５日公開の米国公開特許２００２／００４８７８５；２００３年５月２７日発行の米国特許第６，５６９，６４２号；２０００年６月６日発行の米国特許第６，０７２，０４７号；２００３年１１月４日発行の米国特許第６，６４２，３５８号参照）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞質のデスドメインを有し、アポトーシスの信号を出すことができると報告されている。上記のように、Ａｐｏ−２Ｌの他のレセプターはＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧを含む（Sheridan等., 上掲；Marsters 等., 上掲；及びSimonet 等.,上掲）。ここで用いられるところの「Ａｐｏ−２Ｌレセプター」という用語は、天然配列レセプターとレセプター変異体を包含する。これらの用語はヒトを含む様々な哺乳動物で発現されるＡｐｏ−２Ｌレセプターを包含する。Ａｐｏ−２Ｌレセプター��、多くのヒト組織株で自然に起こるように内在的に発現されてもよいし、あるいは組換え又は合成方法によって発現されてもよい。「天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプター」には、天然由来のＡｐｏ−２Ｌレセプターと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。ゆえに、天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、任意の動物由来の天然に生じるＡｐｏ−２Ｌレセプターのアミノ酸配列を持ちうる。そのような天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、天然から単離してもよいし、組み換え又は合成手法により生成することもできる。特に、「天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプター」なる用語は、天然に生じる切断型又は分泌型のレセプター（例えば、可溶型を含む、さらには細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）、及び天然に生じる対立変異型を包含する。レセプター変異型は天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターの断片又は欠損変異型を含みうる。図３Ａは１９９８年１１月１９日公開の国際公報９８／５１７９３に公開されたヒトＤＲ５の４１１アミノ酸配列を示す。ヒトＤＲ５の転写スプライシング変異形は当分野で公知である。このＤＲ５スプライシング変異形は、１９９８年８月２０日に公開の国際公報９８／３５９８６に公開された図３Ｂ及び図３Ｃに示すヒトＤＲ５の４４０アミノ酸配列をコードする。また、ＤＲ５及びＤＲ５融合タンパク質のポリペプチド配列を以下の表９に示す。
【００２０】
「アンタゴニスト」なる用語は広義で用いられ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和する任意の分子を含む。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５の生物学的活性の例には、ＤＲ４又はＤＲ５へのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結合、アポトーシスの誘導並びに更に文献に報告されているものが含まれる。アンタゴニストは直接的ないし間接的形式で機能しうる。例えば、アンタゴニストは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＤＲ４ないしＤＲ５への直接的結合の結果としてのインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和するために機能するかもしれない。また、アンタゴニストは、例えば、他のエフェクター分子を遮断ないし阻害する結果としてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和するために間接的に機能するかもしれない。アンタゴニスト分子には、分子がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和することができる「二重」アンタゴニスト活性が含まれるかもしれない。
「アゴニスト」なる用語は広義で用いられ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化する任意の分子を含む。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５の生物学的活性の例には、ＤＲ４又はＤＲ５へのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結合、アポトーシス並びに更に文献に報告されているものが含まれる。アゴニストは直接的ないし間接的形式で機能しうる。例えば、アゴニストは、レセプター活性化又はシグナル伝達を起こすＤＲ４ないしＤＲ５への直接的結合の結果としてのインビトロ、インサイツないしインビボでのＤＲ４ないしＤＲ５の一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するために機能するかもしれない。また、アゴニストは、例えば、ＤＲ４又はＤＲ５の活性化ないしシグナル伝達を引き起こす他のエフェクター分子を刺激する結果としてのＤＲ４ないしＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するために間接的に機能するかもしれない。アゴニストは、ＤＲ４ないしＤＲ５の活性化ないし活性を亢進又は増強するように間接的に機能するエンハンサー分子として働きうることが考えられる。例えば、アゴニストは哺乳動物の内因性のＡｐｏ−２Ｌの活性を亢進しうる。例えば、これはＤＲ４ないしＤＲ５をプレ複合体化することによって、ないし、ＤＲ４ないしＤＲ５レセプターとのそれぞれのリガンドの複合体を安定化することによって達成することができる（Ａｐｏ−２ＬとＤＲ４ないしＤＲ５との天然複合体型を安定化するなど）。
【００２１】
ここで使用される場合の「タグ化」なる用語は、「タグポリペプチド」に融合した、抗体、又はポリペプチドを含有するキメラ分子を称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生するエピトープを提供するか、又はオリゴマー化（例えば、ロイシンジッパードメインを有するペプチドと生じるような）等の他のいくつかの機能を提供するのに十分な残基を有しているが、その長さは、一般的に抗体又はポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、タグ特異性抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基)を有する。
【００２２】
「二価の金属イオン」なる用語は、２つの正電荷を有する金属イオンを称する。限定するものでないが、二価の金属イオンの例には、亜鉛、コバルト、ニッケル、カドミウム、マグネシウム及びマンガンが含まれる。使用され得るこのような金属の特定の形態には塩の形態(例えば、製薬的に許容可能な塩の形態)、上述した二価の金属イオンの塩化物、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩及び硫酸塩の形態のものが含まれる。場合によっては、本発明で使用される二価の金属イオンは亜鉛、好ましくは硫酸亜鉛又は塩化亜鉛等の塩の形態をしている。
「単離された」とは、ここで開示された種々のペプチド又はタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたペプチド又はタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ペプチド又はタンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど、又は(３)質量分光分析又はペプチドマッピング技術による均一性が得られるように充分なほど精製される。その自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された材料には、組換え細胞内のインサイツのペプチド又はタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたペプチド又はタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００２３】
ここで同定されている配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法により達成可能であり、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のために、パーセントアミノ酸配列同一性値は、ジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムALINE-2を用いて得ることができる。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, CAを通して公的に入手可能である。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２４】
ハイブリッド形成反応の「ストリンジェント」は、通常、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなればなる程、適切なアニーリングのために温度を高くする必要があり、プローブが短くなればなる程、温度を低くする必要が生じる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点より低い環境に存在する場合、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにするが、低い温度はストリンジェントを低下させる。ハイブリッド形成反応のストリンジェントの更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００２５】
ここで定義される「高度のストリンジェント条件」は、(１)洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる；５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；(２)ハイブリッド形成中に変性剤を用いる；４２℃で、５０％(v/v)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は(３)４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を用いて、４２℃で０．２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)中にて洗浄及び５５℃の５０％ホルムアミド、次いで５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェント洗浄を用いるものによって同定され得る。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, New York：Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃で終夜インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中にておよそ３７−５０℃でフィルターの洗浄を含む。当業者であれば、プローブ長等の因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００２６】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を称す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００２７】
「抗体依存性細胞障害活性」または「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞を溶解する細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
「ヒトエフェクター細胞」とは、１つ又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。好ましくは、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。
【００２８】
「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表す。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」）及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ）を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照）。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Hasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。本明細書中のＦｃＲはＦｃγＲIIIａをコードする遺伝子内に遺伝的二形性などの多型を含有し、それによってＩｇＧ１に結合するレセプターの領域内に位置するアミノ酸位置１５８がフェニルアラニン（Ｆ）又はバリン（Ｖ）となる。ホモ接合体バリンＦｃγＲIIIａ（ＦｃγＲIIIａ-１５８Ｖ）は、ホモ接合体フェニルアラニンＦｃγＲIIIａ（ＦｃγＲIIIａ-１５８Ｆ）又はヘテロ（ＦｃγＲIIIａ-１５８Ｆ／Ｖ）レセプターと比較してインビトロでのＡＤＣＣ媒介を増加し、ヒトＩｇＧ１に対する親和性も高いことが示された。
【００２９】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。補体活性化経路は補体系（Ｃｌｑ）の第１補体が、同族抗原と結合した分子（例えば、抗体）に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
ここで「抗体」なる用語は、広い意味で用いられ、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成した多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を有する限りにおける抗体断片の範囲にわたる。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００３０】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞媒介性障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００３１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００３２】
任意の脊椎動物種からの抗体（イムノグロブリン）の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスが割り当てられる。無傷の抗体には５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等のサブクラス（イソ型）に分かれる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００３３】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公報９３／１１１６１；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリンの混入がないという利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628 (1991)およびMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作成することもできる。
【００３４】
ここで言うモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致するまたは類似する重鎖および／または軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致するまたは類似するものである（米国特許第4,816,567号；およびMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界サル）由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む（米国特許第５，６９３，７８０号）。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒトイムノグロブリン（免疫グロブリン）に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ヒト免疫グロブリン配列の高頻度可変ループがＦＲのすべて又は実質的にすべてである少なくとも一又は一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００３５】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
目的の抗原、例えば、ＤＲ５レセプターに「結合する」抗体とは、抗体が抗原発現細胞を標的とした治療薬又は診断剤として有用となるように十分な親和性及び／又は結合活性を有して抗原に結合することができるものである。
ここでの目的のための「免疫治療」とは、抗体を用いた哺乳動物（好ましくはヒト患者）の治療方法を意味し、この抗体はコンジュゲートされたもの又は「ありのままの」抗体でもよいし、又は一又は複数の細胞障害性剤などの薬剤やヘテロ分子とコンジュゲート又は融合して、それによって「免疫コンジュゲートを生成してもよい。
【００３６】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、アンタゴニスト又は抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、抗体が９５重量％より多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分な程度まで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「治療的有効量」という用語は、疑われる疾患又は症状を予防、寛解又は治療するのに効果的なＤＲ５抗体の量を意味する。
【００３７】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロンα、β、-ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１３、ＩＬ-１７等のインターロイキン（ＩＬ）；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞の破壊を引き起こす物質を称する。この用語は放射性アイソトープ（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学療法剤、及び細菌性、真菌性、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素等の毒素又はその断片を含むことが意図されている。
【００３８】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類、；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin ）；デュカロマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む）； エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin ）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin ）；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンフィーＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；ビスホスホナート類、例えばクロドロナート；エスペラマイシン(esperamicin）； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カリミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトロビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(アドリアマイシンＴＭ)(モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシン(mitomycins）、例えばマイトマイシンＣ、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin )のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＫＳ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)(GemzarＴＭ)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)(NavelbineＴＭ)；ノバントロン(novantron)；テニポシド；エダトレキサート(edatrexate)；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＴＰ-１１；トポイソメラーゼイン��ビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸等のレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン(NolvadexＴＭを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン(droloxifene)、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FarestonＴＭ)を含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(SERMs)；副腎におけるエストロゲン生成を調節する、アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼインヒビター、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、酢酸メゲステロール(MegaceＴＭ)、エグゼメスタン(exemestane)、ホルメスタン(formestane)、ファドロゾール、ボロゾール(vorozole)(RivisorＴＭ)、レトロゾール(letrozole)(FemaraＴＭ)、及びアナストロゾール(anastrozole)(ArimidexＴＭ)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【００３９】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」なる用語は、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、ここで同定された任意の遺伝子が発現する細胞、特に癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を称する。よって、成長阻害剤とは、Ｓ相において、このような細胞が発現する細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤(Ｓ相以外の場所において)、例えばＧ１停止及びＭ相停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ相ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、TAXOL、及びトポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣがＳ相停止に溢流する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬」と題された、癌の分子的基礎、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００４０】
ここでの目的における「生物学的に活性な」又は「生物学的活性」とは、（ａ）単一の薬剤として単独で、又は化学療法剤等の他の薬剤と組合せて、インビボ又はエキソビボで、少なくとも一種類の哺乳動物癌細胞又はウイルス感染した細胞においてアポトーシスを誘発又は刺激又は阻害する能力を有する（ｂ）ＤＲ５レセプターに結合及び／又は刺激可能である；又は(ｃ)天然又は天然に生じるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドの活性を保持していることを意味する。生物学的活性を測定するためのアッセイは、当該分野において公知の方法、例えばＤＮＡ断片化(例えば、Marsters等,Curr. Biology, 6：1669(1996)を参照)、カスパーゼ不活性化、ＤＲ５結合(例えば、１９９８年１１月１９日公開の国際公開第９８／５１７９３号を参照）、並びにＰＣＴ出願国際公開第９７／０１６３３号、国際公開第９７／２５４２８号、国際公開第０１／００８３２号及び国際公開第０１／２２９８７号に記載されているアッセイを使用して実施することができる。
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を称する。この活性は、当該分野で公知の、例えば細胞生死判別アッセイ(例えばアラマーブルーアッセイ又はＭＴＴアッセイ)、ＦＡＣＳ分析、カスパーゼ活性化、ＤＮＡ断片化(例えば、Nicolettiら, J. Immunol. Methods, 139：271-279(1991)を参照)、ポリ-ＡＤＰリボースポリメラーゼ、「ＰＡＲＰ」、切断アッセイにより、決定し測定することができる。
【００４１】
ここで使用される場合、「疾患」なる用語は、有効量のＤＲ５抗体により治療可能な任意の病気又は疾患を含む、ここに記載された組成物で治療することで恩恵を得るあらゆる症状を一般的に称する。これには、慢性及び急性の疾患、並びに問題の疾患に哺乳動物を罹患させる病理状態が含まれる。ここで治療される疾患の非限定的例には、良性及び悪性の腫瘍；炎症、血管由来及び免疫学的疾患、自己免疫疾患、関節炎(関節リウマチを含む)、多発性硬化症、及びＨＩＶ／ＡＩＤＳが含まれる。
「癌」、「癌性」又は「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を称するか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫、及び肉腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、消化管癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽細胞種、膵臓癌、多形成膠芽腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、結腸癌、及び頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００４２】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病理学的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語には、自己免疫疾患、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、及び免疫欠損症が含まれる。そのうちの一部が免疫又はＴ細胞媒介であり、本発明によって治療することが可能な免疫関連及び炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年型慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症）、自己免疫性血小板減少症（溶血性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（バセドウ病、橋本甲状腺炎、若年型リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患例えば多発性硬化症、特発性脱髄多発神経障害又はギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、及び他の非肝親和性ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患等の炎症性及び線維性肺疾患（潰瘍性大腸炎：クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚病を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、多形滲出性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が含まれる。感染症疾患には、AIDS（HIV感染）、A、B、C、D及びＥ型肝炎、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及び寄生虫症が含まれる。
【００４３】
本明細書の「自己免疫疾患」という語は広義で使用され、一般的な意味で、自己の組織成分に対する個体の体液又は細胞の免疫反応から正常又は健康な組織の破壊が生じる、哺乳動物の障害、又は状態を指す。例として、これらに限定するものではないが、エリテマトーデス、甲状腺炎、リウマチ様関節炎、乾癬、多発性硬化症、自己免疫糖尿病、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が挙げられる。
ここで使用される「処置する」又は「処置」又は「治療」とは、治癒的治療、予防的治療又は防止的治療を称する。連続的治療又は投与とは、一又は複数の日数、治療を中断することなく、少なくとも毎日であることを基本とし治療を行うことを称する。断続的治療又は投与、もしくは断続的な方法での治療又は投与とは、連続させることなく、むしろ事実的には周期的に治療することを称する。
ここで使用される「哺乳動物」なる用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む、哺乳類に分類される任意の哺乳動物を称する。本発明の好ましい実施態様において、哺乳動物はヒトである。
この出願では、特に示さない限り、特異的な使用に複数を含む。
【００４４】
Ｂ．本発明の例示的材料及び方法
ここに記載の本発明は、ＤＲ５レセプターに結合する抗体に関する。場合によっては、抗体はＡｐｏ−２ＬとＤＲ５との相互作用を阻害するアンタゴニストである。あるいは、抗体はＤＲ５シグナル伝達活性のアゴニストである。
本発明のＤＲ５抗体の生成方法を本明細書中に記載する。抗体の生成又は抗体のスクリーニングために用いられる抗原は、抗原あるいは所望のエピトープを含む抗原の一部の可溶型でもよい。あるいは又は加えて、細胞表面に抗原を発現する細胞を用いて抗体を生成、抗体のスクリーニングも可能である。抗体を生成するのに有用な抗原の他の型は当分野の技術者に周知である。
【００４５】
(ｉ)  ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより抱合させることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００４６】
(ｉｉ)  モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかながら存在する起こりうる天然に生じる突然変異体を除いて同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００４７】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカ培養細胞系統保存機関, Manassas, Virginia, ＵＳＡから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００４８】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
【００４９】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCaffertyら, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。更に、本発明のＤＲ５抗体を同定するためのファージディスプレイ技術を以下の実施例の項目で更に詳細に述べる。
【００５０】
ある実施態様では、軽鎖及び重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を同じ又は他の種由来のフレームワーク領域（ＦＲ）に移植してもよい。ある実施態様では、軽鎖及び重鎖の可変領域のＣＤＲはコンセンサスヒトＦＲに移植してもよい。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、ある実施態様では、様々なヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲを比較してコンセンサスアミノ酸配列を同定する。ある実施態様では、移植した可変領域は、元の抗体の定常領域とは異なる定量領域と共に用いてもよい。ある実施態様では、移植した可変領域は一本鎖Ｆｖ抗体の一部である。ＣＤＲ移植については、例えば米国特許第６１８０３７０号、同第５６９３７６２号、同第５６９３７６１号、同第５５８５０８９号及び同第５５３０１０１号に記載される。
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４，８１６，５６７号；Morrisonら, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００５１】
(ｉｉｉ)  ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００５２】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００５３】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,591,669号、同5,589,369号及び同5,545,807号を参照されたい。
【００５４】
別に、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンする。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号及び同５，５７３，９０５号を参照のこと。
【００５５】
(ｖ)  抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。
【００５６】
(ｖｉ)  二重特異性抗体
二重特異性抗体は少なくとも２つの異なるエピトープについて結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片として調整できる（例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体）。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法がＷＯ９３／８８２９及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００５７】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第５，７３１，１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること（米国特許第４，６７６，９８０号）及びＨＩＶ感染の治療（国際公報９１／００３６０、国際公報９２／２００３７３及び欧州特許第０３０８９号）等の用途が提案されてる。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４，６７６，９８０号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985)；Shalabyら,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)。
【００５８】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelnyら, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。３以上の抗原結合部位を有する抗体は国際公報０１／７７３４２(Miller及びPresta)に記載されており、特別に出典明記によりここに組み込まれる。
【００５９】
ここでの方法に用いる又は製造品に内包される抗体は場合によって細胞障害性剤と結合させる。
そのような抗体-細胞障害性剤コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は前述している。
また、抗体と一つ以上の小分子毒素のコンジュゲート、例えばカリケアミシン(calicheamicin)、マイタンシン(maytansine)(米国特許第5,208,020号）、トリコテン(trichothene）及びＣＣ１０６５もここにおいて考慮される。本発明の一実施態様では、アンタゴニストは、一つ以上のマイタンシン(maytansine)分子(例えば、抗体分子当たり約１から約１０のメイタンシン分子）と共役している。マイタンシンは、例えばＭａｙ−ＳＨ３へ還元されるＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅへ変換され、修飾抗体(Chariら，Cancer Research 52:127-131(1992))と反応してメイタンシノイド(maytansinoids)-抗体コンジュゲートを生じる。
【００６０】
あるいは、抗体は、一つ以上のカリケアマイシン(calicheamicin)分子を包含する。抗体のカリケアマイシンファミリーは、サブピコモル濃度で、二重鎖ＤＮＡの割れ目を作ることができる。使用されるであろうカリケアマイシンの構造類似体は、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチルγ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１（Hinmanら, Cancer Research 53:3336-3342(1993)及びLodeら，Cancer Research 58:2925-2928(1998)）を含む。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開の国際公開第９３／２１２３２を参照のこと。
本発明は、更に、核酸分解性活性(例えば、リボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮＡ分解酵素）と化合物との抗体コンジュゲートについて考慮する。
【００６１】
種々の放射性核種が放射性コンジュゲートアンタゴニスト又は抗体の生成に利用できる。具体例にはＡｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32及びＬｕの放射線各種が含まれる。
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシインミジル１-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)をアンタゴニスト又は抗体に放射性ヌクレオチドにコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬剤を放出を容易にする「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸易動性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari等 Cancer Research 52: 127-131 (1992))を用いてもよい。
【００６２】
あるいは、抗体及び細胞障害性剤を含んでなる融合タンパク質を、例えば組み換え技術又はペプチド合成で製造してもよい。
また、本発明の抗体を、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公報８１／０１１４５を参照）を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートさせてもよい。例えば国際公報８８／０７３７８及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。
そのようなコンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
【００６３】
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【００６４】
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(例えばNeubergerら, Nature 312:604-608(1984)参照。
抗体の他の修飾がここで検討される。例えば、抗体は、様々な非タンパク質性(nonproteinaceous)のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの1つに結合させてもよい。
抗体の血清半減期を延長するために、例として米国特許第５７３９２７７号に記載されているように抗体（特に抗体断片）内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを表す。あるいは又は付加的に、変更したＦｃＲｎ結合を有する変異形を産生するために抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列を変更することによって血清半減期を延長又は短縮しうる。ＦｃＲｎ結合及び／又は血清半減期を変更した抗体は国際公報００／４２０７２(Presta, L)に記載されている。
【００６５】
本発明の抗体は重合によって安定しうる。これは、多官能価のポリマーを介して直接的又は間接的に、多官能性架橋剤にて単量体鎖を架橋することによって達成しうる。通常、２つの実質的に同一のポリペプチドは、二機能性架橋剤によってそれらのＣ-又はＮ-末端で架橋される。薬剤は、末端アミノ及び／又はカルボキシル基を架橋するために用いられる。通常、両方の末端カルボキシル基又は両方の末端アミノ基は互いに架橋されるが、適当な架橋剤の選別によって、一方のポリペプチドのαアミノは他方のポリペプチドの末端カルボキシル基に架橋される。好ましくは、ポリペプチドはシステインそのＣ末端でシステイン置換される。公知技術の条件下で、ジスルフィド結合が末端システインの間に形成され、それによって、ポリペプチド鎖を架橋する。例えば、遊離システインの金属触媒性酸化によって、又は、適切に修飾されたシステイン残基の求核置換によってジスルフィド架橋が都合よく形成される。架橋剤は、ポリペプチドに存在するアミノ酸の作用側鎖の同一性に依存して選択する。例えば、ポリペプチド内のシステインがＣ末端以外の付加部位に存在する場合、ジスルフィド架橋は好ましくない。また、メチレン基架橋によって架橋されるペプチドも包含される。
抗体上の適切な架橋部位は、Ｎ末端アミノ及びＣ末端カルボキシル基を除いて、ペプチドの内部残基又は隣接配列に導入される残基の側鎖に位置する水酸基、スルフヒドリル、カルボキシル、イミノ、アミノ、並びにリジン残基上にみられるイプシロンアミノ基を含む。外部から添加する架橋剤による架橋は、例えば当分野で公知の多くの試薬のうちの何れかを用いるなどして、ポリペプチドのカルボジイミド処理を経て好適に達成される。適切な多官能価（通常二機能性）の架橋剤の他の例は、文献に示される。
【００６６】
Ｃ．本発明の典型的な製剤の調製
ここでの一般的な製剤の調製において、使用される成分の推奨される質又は「等級」は、製剤の最終的な用途に依存する。治療用途において、成分(群)は製薬品への添加剤として許容可能な等級(例えば「ＧＲＡＳ」)のものであることが好ましい。
ある実施態様では、ＤＲ５レセプター抗体と、抗体の溶解度及び／又は安定性を高めるのに十分なイオン強度を付与する賦形剤を含有する組成物が提供され、その組成物は６(又は約６)〜９(又は約９)のｐＨを有する。抗体は、例えば上述した方法のような、所望の純度のタンパク質を達成するのに適した任意の方法で調製され得る。ある実施態様では、ＤＲ５抗体は、宿主細胞において組換え的に発現されるか、化学的合成法により調製される。製剤中の抗体の濃度は、例えば製剤の意図される用途に応じて変わりうる。当業者であれば、過度の実験をすることなく、ＤＲ５抗体の所望の濃度を決定することができる。
【００６７】
ＤＲ５抗体の溶解度及び／又は安定性を高めるのに十分なイオン強度を付与する製剤中の一又は複数の賦形剤は、場合によってはポリイオン性の有機又は無機酸、アスパラギン酸塩、硫酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、カプチソール(Captisol)ＴＭ、Ｔｒｉｓ、アルギニン塩、又は他のアミノ酸、糖、及びポリオール類、例えばトレハロース及びスクロースである。好ましくは、十分なイオン強度を付与する製剤中の一又は複数の賦形剤は塩である。使用され得る塩には、限定されるものではないが、ナトリウム塩及びアルギニン塩が含まれる。使用される塩の種類及び塩の濃度は、製剤においてＤＲ５抗体が安定可能なように、製剤が比較的高いイオン強度を有するようになされることが好ましい。場合によっては、塩は約２０ｍＭ〜約０．５Ｍの濃度で製剤中に存在する。
組成物は、好ましくは６(又は約６)〜９(又は約９)、より好ましくは約６．５〜約８．５、さらに好ましくは約７〜約７．５のｐＨを有する。この実施態様の好ましい側面では、組成物は、組成物のｐＨを少なくとも約６〜約８に保持するためのバッファーをさらに含有する。使用され得るバッファーの例には、限定されるものではないが、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ及びヒスチジンが含まれる。Ｔｒｉｓを使用する場合、ｐＨは、場合によっては約７〜約８．５に調節され得る。Ｈｅｐｅｓ又はヒスチジンを使用する場合は、ｐＨは、場合によっては約６．５〜７に調節され得る。場合によっては、バッファーは、製剤中で約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で使用される。
【００６８】
特に液体製剤(又は再構成された凍結乾燥製剤)においては、組成物に一又は複数の界面活性剤を含有せしめることが望ましい場合がある。このような界面活性剤は、例えば非イオン性界面活性剤、中でもトゥイーン(TWEEN)ＴＭ又はプルロニクス(PLURONICS)ＴＭ(例えばポリソルベート又はポロキサマー)を含みうる。好ましくは、界面活性剤はポリソルベート２０(「トゥイーン２０」)を含む。界面活性剤は、場合によっては約０．００５％〜約０．２％の濃度で使用される。
本発明の製剤は、ＤＲ５抗体に加えて、上述した成分、さらには種々の例えばの賦形剤又は成分を含有していてもよい。場合によっては、製剤は、非経口投与のために、製薬的又は非経口的に許容可能な担体、すなわち使用される濃度及び用量で受容者に対して毒性がなく、製剤の他の成分と融和性のあるものを含有してよい。場合によっては、担体は非経口用担体、例えば受容者の血液と等張な溶液である。このような担体ビヒクルの例には、水、生理食塩水、又は緩衝溶液、例えばリン酸緩衝液(ＰＢＳ)、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。種々の任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th, Osol, A.編(1980)に、さらに記載されている。
【００６９】
ここで、製剤は一又は複数の保存料を含有してよい。具体例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンズアルコニウムクロリド(アルキル基が長鎖の化合物である、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物)、塩化ベンゼトニウムが含まれる。他の種類の保存料には、芳香族アルコール、メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン、及びｍ-クレゾールが含まれる。酸化防止剤には、アスコルビン酸及びメチオニン；保存料(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；塩化ベンゼトニウム；ブチルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；又はポリエチレングリセロール(ＰＥＧ)が含まれる。
【００７０】
このような担体のさらなる例には、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばグリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、塩化ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及びセルロースベースの物質が含まれる。ゲルベースの形態をした担体には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリラート、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールが含まれる。従来のデポー形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、及び除放性製剤が含まれる。
【００７１】
本発明の組成物は、ＤＲ５抗体が結晶又は非晶質の沈殿物の形態をした、液体製剤(液状溶液又は液状懸濁液)、及び凍結乾燥製剤、並びに懸濁製剤でありうる。
最終製剤が液体である場合、好ましくは≦２０℃で凍らせて保存される。また、製剤は凍結乾燥することもでき、場合によっては２−３０℃で保存されうる注射用の水で再構成されるパウダーとして提供することができる。
治療投与に使用される製剤は無菌でなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜(例えば０．２ミクロンの膜)を通した濾過により容易に達成される。治療用組成物は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルを具備する容器に配されている。
組成物は通常、単位毎又は多数回用量容器、例えば封入されたアンプル又はバイアルに、水溶液、又は再構成用の凍結乾燥された製剤として貯蔵される。容器は、当該分野で任意の入手可能な容器で、常法を用いて充填されるものであってよい。場合によっては、製剤は、注射ペン装置(又は、ペン装置に嵌合するカートリッジ)、例えば製剤の治療的送達に適した、当該分野で入手可能なもの(例えば、米国特許第5370629号を参照)に収容されうる。注射用溶液は、例えば注射用の水を使用し、凍結乾燥されたＤＲ５抗体製剤を再構成することにより調製することができる。
【００７２】
Ｄ．使用方法と他の応用例
ここに記載のＤＲ５抗体は、様々な治療的及び非治療的手段で用いることができる。これらの手段の中には、癌、免疫関連症状又はウイルス症状などの疾患を治療する方法がある。そのような治療的及び非治療的手段は、例えば国際公報９７／２５４２８、国際公報９７／０１６３３及び国際公報０１／２２９８７に更に記載されている。
本発明は、ＤＲ５抗体をコードする核酸を用いて、哺乳動物を治療することを目的とした遺伝子治療の使用を含む。ＤＲ５抗体をコードする核酸をこの目的で用いることができる。アミノ酸配列が公知になると、遺伝子コードの縮重を用いて様々な核酸分子を精製し、遺伝子治療に使用できるものを選択することができる。
遺伝子治療を目的として患者の細胞内に核酸を（場合によってはベクターに内包して）入れる方法には主に二つある：インビボ及びエクスビボ。インビボ送達のために、核酸は、患者に、通常ＤＲ５抗体が必要とされる部位に直接注入する。エクスビボ送達のために、患者の細胞を取り出し、核酸をこの単離した細胞に導入し、修飾した細胞を直接的又は、例えば患者内に埋めこんだ小胞膜内にカプセル抱合するかのいずれかにて患者に投与する。例として、米国特許第４８９２５３８号及び同第５２８３１８７号を参照。
【００７３】
生細胞に核酸を導入するために有用な方法は多種ある。その技術は、核酸が意図する宿主のインビトロ又はインビボで培養細胞へ形質移入するかどうかによって異なる。インビトロの哺乳動物細胞内へ核酸を移入するのに好適な技術には、リポソーム、電気穿孔法、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを用いたものが含まれる。遺伝子のエクスビボ送達に共通して用いるベクターはレトロウイルスである。
近年の好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルスベクターを用いた形質移入（例として、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質を元にしたシステム（例えば、遺伝子の脂質媒介性移入に有用な脂質はＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）が含まれる。ある場合には、核酸源に標的細胞を標的とした薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンドなどを供給することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシス関連の細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型に対して親和性があるカプシドタンパク質又はその断片、循環時に内部移行されるタンパク質に対する抗体、及び細胞内の限局した部位を標的として細胞内半減期を亢進するタンパク質のターゲティング及び／又は取り込みを促進するために用いてもよい。レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術は、例としてWu等., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987)；及び Wagner等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。近年公知になった遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概観については、Anderson 等., Science, 256: 808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公報 93/25673及びここに挙げた文献も参照のこと。
【００７４】
疾患を治療する本発明の方法では、ＤＲ５抗体の製剤は、注入又は注射を含む任意の適切な技術により、哺乳動物に直接投与することができる。特定の投与経路は、ＤＲ５抗体の使用による、知覚又は予想される任意の副作用を含む、患者の医薬履歴、及び是正する特定の疾患などに依存するであろう。非経口投与の例には、組成物の皮下、筋肉内、静脈内、動脈内及び腹膜内投与が含まれる。製剤は、好ましくは繰り返し静脈内(ｉ．ｖ．)、皮下(ｓ．ｃ．)、又は筋肉内(ｉ．ｍ．)注射又は注入、頭蓋内注入として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される(肺内送達については、例えば欧州特許第257956号を参照)。
注射の浸透圧は、皮下及び筋肉内注射において重要であり得る。注射用溶液が低張又は高張であると、注入時に、患者に痛みが生じるおそれがある。通常、ここで治療用の注射用製剤は、注射用溶液の相対浸透圧が約３００ｍｏｓｍ〜約６００ｍｏｓｍになるようにされることが好ましい。
【００７５】
また、ＤＲ５抗体製剤は、経口又は徐放性製剤の形態で投与することもできる。徐放性製剤の好適な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、当該マトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例は、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロース)、非水性媒体にスクロース-アセタート-イソブチラート(ＳＡＢＥＲＴＭ)が入ったもの、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリラート)(Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 1981, 15: 167-277 及びLanger, Chem. Tech., 1982, 12: 98-105又はポリ(ビニルアルコール) )、ポリラクチド(米国特許第3773919号、欧州特許第58481号)、Ｌ-グルタミン酸及びガンマエチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー(Sidman等, Biopolymers,  1983, 22: 547-556 )、非分解性エチレン-酢酸ビニル(Langer等, 上掲)、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLupron Depot(乳酸-グリコール酸コポリマ及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球)、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシブチル酸(欧州特許第133988号)を含む。全身作用性の薬剤を送達せしめる任意の一方法は、連続注入(例えば、徐放性装置又はミニポンプ、例えば浸透圧ポンプ又は皮膚パッチ)、又は注射(例えば、単一ボーラス投与を含む、静脈内又は皮下手段を使用する)による投与に係る。
【００７６】
組成物は、個々の患者の臨床的状態、組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び実務者に公知の他の要因を考慮に入れ、良好な医療行為に矛盾することのない様式で調製され、投薬されるであろう。
さらに付加的な治療が本方法において使用され得ることを考慮する。一又は複数の他の治療には、限定されるものではないが、放射線治療、サイトカイン(類)、成長阻害剤(類)、化学治療剤(類)、細胞障害剤(類)、チロシンキナーゼインヒビター、ｒａｓファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、血管形成インヒビター、及びサイクリン依存性キナーゼインヒビターなど、当該分野で公知であり、更に上記に定義されるものであり、ＤＲ５抗体と組み合わせて（例えば、同時に又は連続して）投与しうるものの投与が含まれる。さらに、治療は、ＣＤ２０抗体（RituxanＴＭを含む）又はＨｅｒレセプター抗体（HerceptinＴＭを含む）等の腫瘍又は他の細胞抗原を標的にする治療用抗体、並びに抗-血管形成抗体、例えば抗ＶＥＧＦ、又はＡｐｏ２Ｌレセプター、例えばＤＲ４を標的にする抗体をベースにしている。
【００７７】
化学治療剤の調製と用量スケジュールは、製造者の指示書に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定されて使用される。また、このような化学治療の調製と用量スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。場合によってはＤＲ５抗体を投与する前に細胞を一又は複数の化学療法剤に曝すことも有効でありうる。例として、ある種の癌細胞はＤＲ５抗体によるアポトーシス誘導に抵抗性を示すが、細胞を化学療法剤で前処理するとＤＲ５抗体に感受性となりうる。
また、他の抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、血管内皮因子(ＶＥＧＦ)、又は他のＴＮＦＲファミリーのメンバー(例えば、ＯＰＧ、ＤＲ４、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２)に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、あるいは付加的に、ここに開示した同一の又は二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。
【００７８】
ＤＲ５抗体製剤は、例えば上述の明細書の定義の項目に特に挙げた他の薬剤、サイトカイン、化学療法剤、抗体等と組み合わせて、例えば同時に又は連続して、本出願に記載の何れかの治療方法で投与されてもよい。例えば、ＤＲ５抗体製剤は前処理(このような任意の他の薬剤の投与前)として、例えば、さもなければ他の治療薬のアポトーシス効果に耐性のある癌細胞の前処理として投与されてもよい。
上記したように、本発明のＤＲ５抗体は様々な有用性を有する。例えば、ＤＲ５作用性ペプチドは、哺乳動物の病的状態、例えば癌又は免疫関連疾患の治療方法に用いてもよい。ここで記載されている様々な病的状態の哺乳動物の診断は、熟練した専門家によってなされることができる。診断用技術は、例えば、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断ないし検出をする分野において有用である。例えば、癌は、限定するものではないが、触診、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲなどを含む技術により同定してもよい。また、免疫関連疾患は直ちに同定されうる。全身エリテマトーデスにおいて、疾患の中心的媒体は、自己タンパク質／組織に対する自己応答性抗体の生成と続いて起こる免疫媒介性炎症である。腎臓、肺、筋骨格系、皮膚粘膜、目、中枢神経系、心血管系、消化管、骨髄及び血液を含む多数の器官および系が、臨床的に影響を受ける。
【００７９】
医師は、免疫及び／又は炎症性反応の介入が有益である多くの疾患に精通している。例えば、リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、主に複数の関節の滑膜に関連する慢性全身性自己免疫炎症疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成に付随し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体を生成する。関節中のこれらの複合体は、滑膜中へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発し；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば、関節空間／液でもしかりである。冒されている組織は、多くの場合対称的なパターンで、主に関節である。しかしながら、二つの主な形態の関節外疾患もまた生じる。一形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の典型的病巣、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発生である。関節外疾患の第二の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、これは、ＲＡ疾患過程の末期、時には関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これには、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う複数の器官において血管炎が付随する。多くの場合、患者には、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；その小結節は、末期には混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡにおいて生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【００８０】
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６歳未満で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子が陽性である患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は三つの主要なカテゴリー：小関節(pauarticular)、多関節及び全身性に細分類される。関節炎は重度で典型的には破壊的であり、関節強直症及び遅延成長に至る。他の徴候には慢性前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
脊椎関節症は、いくつかの共通した臨床的特徴とＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子産物の発現との共通の関連性を持つ疾患のグループである。該疾患には：Bechterew氏病(ankylosing sponylitis)、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。顕著な特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；炎症非対称性関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７（クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある血清学的に定義された対立遺伝子）との関連；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導に対する鍵として最も関わっている細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球で、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現された外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７に対して反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原性エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋細胞の反応を誘発すると仮定されている。
【００８１】
全身性硬化症（強皮症）は病因がよく知られていない。疾患の顕著な特徴は皮膚の硬結であり；これは活性な炎症プロセスにより誘発されると思われる。強皮症は局部的又は全身性であり：血管病巣が共通しており、微小血管系における内皮細胞傷害が全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準は、皮膚病巣における単核細胞浸潤の存在と、多くの患者において抗細胞核抗体の存在によって導かれる。多くの場合、ＩＣＡＭ-１が皮膚病巣の線維芽細胞の細胞表面でアップレギュレーションされ、これらの細胞とのＴ細胞の相互作用が疾患の病因においてある役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：結果的に異常なぜん動／運動性となる平滑筋萎縮症及び線維症：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対照的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されその機能を阻害する。
【００８２】
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症と、涙腺及び唾液腺の続く機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患に関連するか又はそれに伴う場合がある。この疾患は、双方とも小さいＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する自己抗体産生に関連している。病巣は乾性角結膜炎、口内乾燥症で、胆汁性硬変、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病を含む他の徴候又は関連を伴うものに至る。
全身性血管炎症は一次病巣が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として冒された脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、いくつかのケースでは最終的な末端器官機能障害になるといった疾患である。また、血管炎(vasculitides)は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の生成に関連した疾患等の続発症として又は二次病変として生じる場合がある。原発性全身性血管炎症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。その他の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、隔離されたＣＮＳ血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の発病メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
【００８３】
サルコイドーシスは、体内のほとんど全ての組織中における類上皮細胞肉芽腫の存在により特徴づけられる病因がよく知られていない病状であり；肺の関与が最も一般的である。病因は疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞型より放出される局部的又は全身的活性産物の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、及び発作性夜間血色素尿を含む自己免疫溶性血性貧血は、赤血球（いくつかの場合においては血小板もまた含む他の血液細胞）表面で発現した抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
他の臨床的環境における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、血小板破壊／除去が、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター-媒介メカニズムにより除去される結果として生じる。
【００８４】
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、及び萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に存在し多くの場合甲状腺に特異的なタンパク質と反応する抗体の産生を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。自然のモデル：ラット（ＢＵＦ及びＢＢラット）及びチキン（肥満チキン種）；誘導性モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)のいずれかでの動物の免疫化を含む実験用モデルが存在する。
Ｉ型真性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は膵臓ランゲルハンス島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリン又はインスリン様レセプターに対する抗体は、インスリン-非反応性の表現型をつくりだすことができる。
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産生される結果として直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応性である、腎臓中の抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果として間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の生成をもたらす他の免疫媒介疾患により、間接的続発症として免疫媒介腎疾患も誘発しうる。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として、器官機能が損なわれ、いくつかの場合では腎臓機能不全に進行する、病巣発達を腎組織に生じさせ／誘発する炎症反応が生じる。体液及び細胞免疫メカニズムの双方が障害の発病に関与しうる。
【００８５】
多発性硬化症；特発性脱随性多発神経障害又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱随性多発神経障害を含む中枢及び末梢神経系の脱髄疾患は、自己免疫に原因を有し、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に引き起こされる損傷の結果として神経脱髄が生じると考えられている。ＭＳにおいては、疾患の誘発及び進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウィルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。病巣は優勢なＴ細胞媒介小膠細胞の湿潤と、浸潤しているマイクロファージを含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病巣における優勢な細胞型である。オリゴデンドロサイトの細胞死と続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球により推進されていると思われる。
好球性肺炎；特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。その反応の阻害は治療的に有益であろう。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発病はＴリンパ球依存性である。
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。病巣にはＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴリンパ球依存性である。これらの疾患はＴリンパ球誘発性炎症、ＩｇＥ媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
【００８６】
拒絶反応及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を含む移植関連疾患はＴリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患は、限定するものではないがウィルス感染（限定するものではないがＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎）、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染（ＭＬＲを刺激する分子（又は誘導体／アゴニスト）を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる）を含む感染疾患、ＭＬＲを刺激し、治療に利用し、遺伝性、獲得性、感染誘発性（例えばＨＩＶ感染）、又は医原性（即ち、化学療法からのもの）免疫不全の状態に対する免疫反応を増強するために治療上用いることが可能な免疫欠損疾患（分子／誘導体／アゴニスト）、及び異常増殖である。
またここで診断方法を提供する。例えば、ＤＲ５抗体は、Ａｐｏ−２Ｌ又はＤＲ５関連の病理状態を有することがわかっている又は有すると思われる哺乳動物において、ＤＲ５レセプターを検出するために用いてもよい。該結合ペプチドは、例えば試料中のＤＲ５を検出ないし定量するアッセイで用いてよい。哺乳動物から得た細胞などの試料を標識した結合ペプチド存在下でインキュベートし、試料中の結合した標識結合ペプチドを検出することができる。様々な臨床的アッセイ手段を含むこのようなアッセイは、例えばVoller等., Immunoassays, University Park, 1981に記載のように当分野に公知である。
【００８７】
また本発明は、ここで記載されたＤＲ５抗体を収容するキットを提供する。典型的なキットは、上述した一又は複数の賦形剤にＤＲ５抗体のための容器、好ましくはバイアル；及び使用者にＤＲ５抗体製剤の使い方を指示する製品挿入物又はラベル等の使用説明書を具備する。これにより、好ましくは製薬用製剤が提供される。好ましくは、製薬用製剤は癌又は免疫に関連した病状を処置するためのものである。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は疾患の診断又は処置に有効なＤＲ５抗体製剤を収容しており、滅菌したアクセスポートを有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい)。容器上の又は容器に伴うラベルには、製剤が、選択された疾患の診断又は処置に使用されることが示されている。製造品は、注射用水、製薬的に許容可能な溶液、塩水、リンガー液、又はデキストロース溶液を収容する第２の容器をさらに具備する。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含むパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
全ての特許、特許出願、出版物、製品についての記載、及びプロトコルは、この出願を通して引用され、その開示は、出典明記によりそれらの全てがここに取り込まれる。本明細書中で使用した項目の表題は単に構造化するためのものであって、記載した内容を制限するためのものではない。
【００８８】
(実施例)
以下の実施例は例示目的のためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものでは決してない。実施例に示されている市販試薬は、特に記載しない限りは、製造者の使用説明書に従い使用した。以下の実施例及び明細書を通して、ＡＴＣＣ受託番号により特定されたそれらの細胞の供給源は、アメリカ培養細胞系統保存機関、マナッサス、バージニア州である。次の一連の実施例において、中間体及び終末産物を指すときに、共通のα−アミノ酸は標準の１−又は３−文字アミノ酸コードによって記載されていてもよい。共通のα−アミノ酸によって、ｍＲＮＡによってタンパク質に組み込まれるアミノ酸を意味する。標準的な略語は、The Merck Index, 10th Edition, pp Misc-2 - Misc-3に挙げられている。示さない限り、共通のα−アミノ酸は天然又はα炭素原子で「Ｌ」−構成を有する。コードが「Ｄ」の後にある場合、共通のα−アミノ酸の逆の光学異性体を示す。ノルロイシン（Ｎｌｅ）及びオルニチン（Ｏｒｎ）等の修飾型又は非一般的αアミノ酸は、U.S. Patent and Trademark Office Official Gazette 1114 TMOG, May 15, 1990に記載のように表示する。
【００８９】
実施例１  ｓｃＦｖライブラリＬＳＳ-２３３１Ｂの構築
「ＬＳＳ-２３３１Ｂ」と称するファージディスプレイｓｃＦｖライブラリは、ｓｃＦｖと遺伝子-３微量コートタンパク質（Ｐ３Ｃ）のＣ末端ドメインとの間に挿入されるロイシンジッパードメインによって二量化される二価のｓｃＦｖ成分をディスプレイするファジミドベクターを用いて構築された。このベクターは、「ｐＳ２０７２ａ」と称され、図４に示される配列を含んでなる。ベクターは、アルカリフォスファターゼ（ｐｈｏＡ）プロモータの制御下にヒト化抗体４Ｄ５可変ドメインを含有する。ヒト化抗体４Ｄ５は、主に重鎖及び軽鎖のヒトコンセンサス配列フレームワーク領域とＨｅｒ-２に特異的なマウスモノクローナル抗体由来のＣＤＲ領域を有する抗体である。抗Ｈｅｒ-２抗体の作製方法及び可変ドメイン配列の同一性は、米国特許第５，８２１，３３７号及び同第６，０５４，２９７号に示される。
ＬＳＳ-２３３１Ｂは、全３つの重鎖ＣＤＲ内のランダム化された残基を用いて作製した。ランダム化された特異的な残基は以下の通りである：ＣＤＲ-Ｈ１内の残基２８、３０、３１、３２及び３３；ＣＤＲ-Ｈ２内の残基５０、５２、５３、５４、５６及び５８；ＣＤＲ-Ｈ３内の残基９５、９６、９７、９８、９９及び１００。縮重コドン（３〜１４）の数を変化させて位置９５〜１００の間の６つの野生型コドンを置換することによって、ＣＤＲ-Ｈ３内に付加的に多様性を導入した。
【００９０】
ライブラリＬＳＳ-２３３１Ｂは、先に述べた方法(Sidhu, S. S.,等, Methods Enzymol. (2000), 328:333-363)を用いたKunkel等, Methods Enzymol. (1987), 154:367-382の方法により構築した。ｐＳ２０７２ａ（ｐＳ２０７２ｃと称する）の特定の「停止鋳型」バージョンは、重鎖の位置３０、３１、３２、３３、５３、５４、５６、９８、９９、１００及び１００ａのコドンの代わりにＴＡＡ停止コドンを置換することによって構築した。多様化されるべき位置の縮重コドンによる突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲ多様性の導入と、停止コドンの修復を同時に行った。オリゴヌクレオチド配列は以下の表１の下に示す。
【００９１】
表１  ライブラリＬＳＳ-２３３１Ｂの構築に用いた突然変異原性オリゴヌクレオチド。等モルのＤＮＡ縮重をＩＵＢコードで表す（Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｖ＝Ｇ／Ａ／Ｃ、Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｄ＝Ｇ／Ａ／Ｔ、Ｂ＝Ｇ／Ｔ／Ｃ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｈ＝Ａ／Ｔ／Ｃ）。
2008500969.tif 000002
【００９２】
オリゴヌクレオチドＨ１-１及びＨ２-１を用いてそれぞれＣＤＲ-Ｈ１及びＣＤＲ-Ｈ２に多様性を導入した。オリゴヌクレオチドＨ３-１、Ｈ３-２、Ｈ３-３、Ｈ３-４、Ｈ３-５、Ｈ３-６、Ｈ３-７、Ｈ３-８、Ｈ３-９、Ｈ３-１０、Ｈ３-１１およびＨ３-１２の等モル混合物を用いてＣＤＲ-Ｈ３に多様性を導入した。すべての変異原性オリゴヌクレオチドの同時取込みにより各々の位置で設計された多様性の導入とすべてのＴＡＡ停止コドンの修復が同時に起こるように、ランダム化されるすべてのＣＤＲの突然変異原性オリゴヌクレオチドを、単一の突然変異誘発反応液内のｐＳ２０２７ｃ鋳型に同時に組み込んだ。それによって、ホモ二量体ロイシンジッパー及びＰ３Ｃに融合したｓｃＦｖライブラリメンバーをコードしたオープンリーディングフレームを生成した。
突然変異誘発反応液を大腸菌ＳＳ３２０  (Sidhu, S. S.,等, Methods Enzymol. (2000), 328:333-363)に電気穿孔し、形質転換細胞を、Ｍ１３-ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)存在下にて終夜生育し、ファジミドＤＮＡを内包し、それらの表面上にＦａｂ断片をディスプレイするファージ粒子を産生した。ライブラリＬＳＳ-２３３１Ｂは、３×１０１０の異なるメンバーを含有した。
【００９３】
ライブラリ構築の後、以下の３工程の分類技術を用いて分類した：
分類１
１．Maxisorpイムノプレート１２ウェルに２μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルのコートヒトＤＲ５-ＥＣＤ（以下の表９参照）を入れ、４℃で一晩インキュベートする。
２．プレートの遮断：２００μｌのカゼインを含むＰＢＳを加えて室温にて１時間置く。
３．ファージの遮断：遮断用緩衝液（カゼイン）をファージ溶液に１：１の割合で加え、室温にて１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＴ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて５回すすぐ。
５．１００μｌのライブラリファージ溶液（ステップ４からのもの）をウェルに加え、室温にて２時間、ゆっくりと攪拌しながらインキュベートする。
６．プレートをＰＴ緩衝液にて１０回すすぐ。
７．第一の１２ウェルを５０μｌの０．１Ｍ ＨＣＬ、ｐＨ２にて２０分間溶出し、１．０Ｍトリス塩基（約１／６量）にて溶出物を中和する。
８．１．５ｍｌのファージ溶出物を５ｍｌのＸｌ１−ブルー細胞（ＯＤ６００＝１．０）に感染させる。３７℃で２０分間生育する。ＬＢ／カーブプレート上で力価を測定し、５０ｍｌの２ＹＴ／カーブＶＣＳに培養物を移して３７℃で一晩生育させる。
９．細胞を沈降させ、次の分類に用いるために上清を除去する。
【００９４】
分類２
１．ヒトＤＲ５-ＥＣＤにて１２ウェルをコートする。
２．プレートの遮断：２００μｌのスーパーブロック(Pierce Chemicals, Product # 37515)を加え室温にて１時間。
３．ファージの遮断：カゼインをファージ上清（分類１のステップ１２からのもの）に１：１の割合で加え、室温にて１時間インキュベートする。
４．０．３ｍｌのファージ溶出物を１ｍｌのＸｌ１−ブルー細胞（ＯＤ６００＝１．０）に感染させた。３７℃で２０分間生育した。ＬＢ／カーブプレート上で力価を測定し、２５ｍｌの２ＹＴ／カーブＶＣＳに培養物を移して３７℃で一晩生育させる。
５．細胞を沈降させ、次の分類に用いるために上清を除去した。
【００９５】
分類３
１．ヒトＤＲ５-ＥＣＤにて１２ウェルをコートする。
２．プレートの遮断：２００μｌのＰＢＳ／ＢＳＡを加え室温にて１時間。
３．ファージの遮断：スーパーブロックをファージ上清に１：１の割合で加え、室温にて１時間インキュベートする。
４−５．上記と同じ。
【００９６】
実施例２  ｓｃＦｖライブラリＬＳＳ-２３４４Ｆの構築
以下の相違以外は実施例１に記載のＬＳＳ-２３３１Ｂと同様に、「ＬＳＳ-２３４４Ｆ」と称するライブラリを構築した。
停止鋳型（ｐＧ４５０３ｆ）は重鎖内に点突然変異（Ｈ９１Ｓ）を生じるように一コドンがｐＳ２０７２ｃと異なる。ライブラリの構築に用いた突然変異原性オリゴヌクレオチドの配列は以下の表２に示す。
表２  ライブラリＬＳＳ-２３４４Ｆの構築に用いた突然変異原性オリゴヌクレオチド。等モルのＤＮＡ縮重をＩＵＢコードで表す（Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｖ＝Ｇ／Ａ／Ｃ、Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｄ＝Ｇ／Ａ／Ｔ、Ｂ＝Ｇ／Ｔ／Ｃ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｈ＝Ａ／Ｔ／Ｃ）。
2008500969.tif 000003
【００９７】
オリゴヌクレオチドＨ１-２、Ｈ１-３、Ｈ１-４及びＨ１-５（２：１：２：１の比率）を用いてＣＤＲ-Ｈ１内に多様性を導入した。オリゴヌクレオチドＨ２-２、Ｈ２-３、Ｈ３-４及びＨ４-５（２：１：２：１の比率）を用いてＣＤＲ-Ｈ２内に多様性を導入した。オリゴヌクレオチドＨ３-１３、Ｈ３-１４、Ｈ３-１５、Ｈ３-１６、Ｈ３-１７、Ｈ３-１８、Ｈ３-１９、Ｈ３-２０、Ｈ３-２１、Ｈ３-２２及びＨ３-２３の等モル混合物を有するＣＤＲ-Ｈ３に多様性を導入した。ライブラリＬＳＳ-２３４４Ｆは１．５×１０１０の異なるメンバーを含有した。
次いで、実施例１に記載の３工程の分類方法を用いて分類を行った。
【００９８】
実施例３  ＦａｂライブラリＬＳＳ-２３６９Ｂの構築
「ＬＳＳ-２３６９Ｂ」ファージディスプレイＦａｂライブラリは、遺伝子-３微量コートタンパク質（Ｐ３Ｃ）のＣ末端ドメインに融合したＦａｂ分子をディスプレイするファジミドベクターを用いて構築された。このベクターは、ｐＶ-０３５０-２と称され、図５に示される配列を含んでなる。ベクターは、アルカリフォスファターゼ（ｐｈｏＡ）プロモータの制御下に軽鎖内の３つの突然変異（Ｎ３０Ｓ、Ｒ６６Ｇ及びＨ９１Ｓ）を有するヒト化抗体４Ｄ５Ｆａｂを含有する。ヒト化抗体４Ｄ５は、主に重鎖及び軽鎖のヒトコンセンサス配列フレームワーク領域とＨｅｒ-２に特異的なマウスモノクローナル抗体由来のＣＤＲ領域を有する抗体である。抗Ｈｅｒ-２抗体の作製方法及び可変ドメイン配列の同一性は、米国特許第５，８２１，３３７号及び同第６，０５４，２９７号に示される。
ＬＳＳ-２３６９Ｂは、全３つの重鎖ＣＤＲ内のランダム化された残基を用いて作製した。ランダム化された特異的な残基は以下の通りである：ＣＤＲ-Ｈ１内の残基２８、３０、３１、３２及び３３；ＣＤＲ-Ｈ２内の残基５０、５２、５３、５４、５６及び５８；ＣＤＲ-Ｈ３内の残基９５、９６、９７、９８、９９、１００、１００ａ、１００ｂ及び１００ｃ。縮重コドン（７、８、９、１０又は１２）の数を変化させて位置９５〜１００の間の９つの野生型コドンを置換することによって、ＣＤＲ-Ｈ３内に付加的に多様性を導入した。
【００９９】
ライブラリＬＳＳ-２３６９Ｂは、先に述べた方法(Sidhu, S. S.,等, Methods Enzymol. (2000), 328:333-363)を用いたKunkel等, Methods Enzymol. (1987), 154:367-382の方法により構築した。ｐＶ-０３５０-２（ｐＶ-０３５０-２ｂと称する）の特定の「停止鋳型」バージョンは、重鎖の位置３０、３１、３２、３３、５３、５４、５６、９８、９９、１００及び１００ａのコドンの代わりにＴＡＡ停止コドンを置換することによって構築した。多様化されるべき位置の縮重コドンによる突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲ多様性の導入と、停止コドンの修復を同時に行った。オリゴヌクレオチドＨ１-１及びＨ２-１を用いてそれぞれＣＤＲ-Ｈ１及びＣＤＲ-Ｈ２に多様性を導入した（上記の表１を参照）。オリゴヌクレオチドＨ３-２４、Ｈ３-２５、Ｈ３-２６、Ｈ３-２及びＨ３-２８の等モル混合物を用いてＣＤＲ-Ｈ３内に多様性を導入した（以下の表３を参照）。
【０１００】
表３  ライブラリＬＳＳ-２３６９Ｂの構築に用いた突然変異原性オリゴヌクレオチド。等モルのＤＮＡ縮重をＩＵＢコードで表す（Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｖ＝Ｇ／Ａ／Ｃ、Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｄ＝Ｇ／Ａ／Ｔ、Ｂ＝Ｇ／Ｔ／Ｃ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｈ＝Ａ／Ｔ／Ｃ）。
2008500969.tif 000004
【０１０１】
すべての変異原性オリゴヌクレオチドの同時取込みにより各々の位置で設計された多様性の導入とすべてのＴＡＡ停止コドンの修復が同時に起こるように、ランダム化されるすべてのＣＤＲの突然変異原性オリゴヌクレオチドを、単一の突然変異誘発反応液内のｐＶ-０３５０-２ｂ鋳型に同時に組み込んだ。それによって、Ｐ３Ｃに融合したＦａｂライブラリメンバーをコードしたオープンリーディングフレームを生成した。
突然変異誘発反応液を大腸菌ＳＳ３２０  (Sidhu, S. S.,等, Methods Enzymol. (2000), 328:333-363)に電気穿孔し、形質転換細胞を、Ｍ１３-ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)存在下にて終夜生育し、ファジミドＤＮＡを内包し、それらの表面上にＦａｂ断片をディスプレイするファージ粒子を産生した。ライブラリＬＳＳ-２３６９Ｂは６．２×１０１０の異なるメンバーを含有した。
次いで、実施例１に記載の３工程の分類方法を用いて分類を行った。
【０１０２】
実施例４  ファージライブラリからの特異的な抗体の選択
上記の（実施例１、２及び３）各々のライブラリからのファージを、ヒトＤＲ５-ＥＣＤに結合するクローンをエンリッチするための結合選別工程により、別々に選別した（下記の表９参照）。結合選別は先に述べた方法(Sidhu等, supra)を用いて行われた。
ＮＵＮＣ９６穴Maxisorpイムノプレートを、捕獲標的（５μｇ／ｍＬのｈＤＲ５-ＥＣＤを含有するＰＢＳ）にて４℃で終夜コートして、ウシ血清アルブミン(BSA) (Sigma)にて２時間ブロックした。前述のように(Sidhu等, 上掲)、３７℃で一晩の生育の後、ファージをＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿することによって濃縮し、ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０(Sigma)に再懸濁した。ファージ溶液（１０１２ファージ／ｍＬ）を、コートしたイムノプレートに加えた。ファージ結合のために２時間インキュベーションした後、プレートを、ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０にて１０回洗浄した。結合したファージを１０分間、０．１Ｍ ＨＣｌにて溶出し、溶出液を１．０Ｍ トリス塩基にて中和した。溶出されたファージを、大腸菌ＸＬ１-ブルー内で増幅し、更なる選別に用いた。ライブラリＬＳＳ-２３４４Ｆ及びＬＳＳ-２３３１Ｂそれぞれを用いて、ｈＤＲ５-ＥＣＤへの結合についての３又は４ラウンドの選別を行った。ライブラリＬＳＳ-２３６９ＢはｈＤＲ５-ＥＣＤに対して２ラウンドの選別を行った後に、Ｆａｂをディスプレイするクローン（軽鎖のＣ末端に融合されたｇＤエピトープがある）を濃縮（エンリッチ）するために抗ｇＤエピトープ抗体に対して１ラウンドの選別（ラウンド２ａ）を行い、次いでｈＤＲ５-ＥＣＤに対する第３ラウンドの選別を行った。
【０１０３】
各々のライブラリについて、選別の最終ラウンドからの個々のクローンをカルベニシリン及びＭ１３-ＫＯ７を添加した２ＹＴ培養液 ５００μＬを含む９６ウェルフォーマッタで生育させ、培養液上清を、ファージＥＬＩＳＡ (Sidhu等, 上掲)に直接用いて、ｈＤＲ５-ＥＣＤでコートしたプレートには結合するが、ＢＳＡでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイ抗体を検出した。ＢＳＡでコートしたプレート上のＥＬＩＳＡシグナル（対照）より少なくとも１０倍大きいｈＤＲ５-ＥＣＤでコートしたプレート上のＥＬＩＳＡシグナルを表すものを陽性結合クローンと定義した。また、ＥＬＩＳＡアッセイ試験を行って、陽性結合クローンがＤＲ５レセプターに特異的に結合し、ＤＲ４、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２レセプター（例えばＡｐｏ-２リガンドが結合する他のレセプター）と交差反応を示さないことを確認した（データは示さない）。各々のライブラリからの陽性結合クローンを標準的な方法のＤＮＡ配列決定分析に用いた。ＬＳＳ-２３３１Ｂについて、１８０のクローンを配列決定したところ、６５の異なる配列が明らかとなった（図６）。ＬＳＳ-２３４４Ｆについて  １７６のクローンを配列決定したところ、３３の異なる配列が明らかとなった（図７）。ＬＳＳ-２３６９Ｂについて、９６のクローンを配列決定したところ、３の異なる配列が明らかとなった（図８）。
ライブラリＬＳＳ-２３３１Ｂ（実施例１を参照）から選択されたクローンのファージＥＬＩＳＡの結果は、下記の表４に示される。表４の「識別番号」は、特定のクローニングされた抗体に付した名前又はコードを指し、それぞれの識別子は図６に含まれるものに対応する。比較のためにカニクイザル（「ｃｙｎｏ」）ＤＲ５-ＩｇＧとヒトＤＲ５-ＥＣＤ（下記の表９参照）に対する各々の抗体の結合を表４に示した。
【０１０４】
表４  ファージＳｃＦｖ ＥＬＩＳＡ
2008500969.tif 000005
【０１０５】
Ｆａｂライブラリ（実施例３参照）から選択されるクローンのファージＥＬＩＳＡの結果を、下記の表５に示す。表５の「識別番号」は特定のクローニングされた抗体に付した名前又はコードを指し、それぞれの識別番号は図８に含まれるものに対応する。ヒトＤＲ５-ＥＣＤ（「ＨＤＲ５-ＥＣＤ」）、ヒトＤＲ５-ＩｇＧ（「ＨＤＲ５-ＩｇＧ」、表９）、マウスＤＲ５-ＩｇＧ（「ＭＤＲ５-ＩｇＧ」、表９）及び、カニクイザルＤＲ５-ＩｇＧ（「ＣＤＲ５-ＩｇＧ」、表９）に対する各々のこれらの抗体の結合を比較のために表５に示す。「Ｎ.Ｄ.」は「測定不可」を意味する。
2008500969.tif 000006
【０１０６】
実施例５  大腸菌発現を用いたＦａｂタンパク質の調整
（３４Ｂ８中の）コロニーを５ｍｌ ２ＹＴ＋５０μｇ／ｍｌ ｃａｒｂにピックアップし、細胞を、３７℃で１．５−２．５ＯＤまで生育させた。５ｍｌの培養物を、５００ｍｌの完全Ｃ.Ｒ.Ａ.Ｐ培地＋５０μｇ／ｍｌ ｃａｒｂに播種し、３０℃で１８−２４時間生育させた。細胞を遠心し、上清を別の容器に移した。ペレットを−２０℃で終夜凍結した。
細胞ペレットを氷上で解凍し、以下を加えた：ａ)ＴＥ（５ｍｌ／ｇ）２０ｍｌ；ＰＭＳＨ（５μｌ／ｇ）２０μ ｌ；１Ｍ ベンズアミジン（１μｌ／ｇ）４μｌ ；２５０ｍＭ ＥＤＴＡ（０．４ｍｌ／ｇ）２ｍｌ。細胞を十分に再懸濁して、少なくとも１時間、氷上に置いた。ショックを与えた細胞を、６０分間、１５Ｋｒｐｍにて遠心した。上清を精製するか又は細胞を５分間ホモジナイズした(ultraturex)。細胞をマイクロ流動器にて破壊し、６０分間、１５Ｋで遠心した。上清を０．４５μｍフィルタにろ過して、タンパク質カラムに流した（ＴＥ緩衝液にてカラムを事前に洗浄した）。カラムをＴＥ緩衝液にて洗浄し、０．１Ｍの酢酸＋１ｍＭのＥＤＴＡにて溶出し、１Ｍのトリス（ｐＨ８）によって中和し、その後ＰＢＳ緩衝液に取り替えた。次いで、ＯＤ２８０（ｃｏｎｃ＝１ＯＤ／０．４＝ｍｈ／ｍｌ）で測定した。
【０１０７】
次いで、発現タンパク質を以下のＥＬＩＳＡに従って試験した。マイクロタイタープレートウェルを、８０μｌの1μｇ／ｍｌ ヒトＤＲ５-ＥＣＤ（表９）（５０ｍＭの炭酸ナトリウムｐＨ９．６中）にて４℃で終夜コートした。コートを除去して、２００μｌのＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡ／０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０にてブロックして、室温で１時間暖めた。競合レセプター溶液（100μｌ／試料）を調整し、好適に亜飽和したビオチン標識抗体（抗体段階希釈物から予め測定したもの）を異なる濃度のＤＲ５レセプターによって調製した。混合物を室温で２時間インキュベートした。ＤＲ５-ＥＣＤでコートされたプレートを振とうし、ＰＢＳ＋０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０で１０回すすいだ。競合レセプターとビオチン標識抗体の混合液８０μｌを、非付着プレートからＤＲ５コートプレートに移して、室温で２０分間インキュベートした。結合用緩衝液にてＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン(Zymed)の１：５０００希釈液を作製した。プレートを、ＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ２０にて１０回すすぎ、８０μｌのＨＲＰ-ストレプトアビジン希釈液を添加して、室温で１時間インキュベートした。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液Ｂを等しい容量で混合した。プレートを、ＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ２０にて１０回すすぎ、８０μｌの基質を添加して、発達するようにインキュベートし、８０μｌの２．５Ｍ Ｈ２Ｓ０４にて反応を止めた。
【０１０８】
この抗体「ＢｄＦ２」を試験するＥＬＩＳＡの結果（図８の抗体ＩＤを参照）を下記の表６に示す。ヒトＤＲ５-ＥＣＤ、ヒトＤＲ５-ＩｇＧ（表９参照）、ヒトＤＲ4-ＩｇＧ（表９参照）、マウスＤＲ５-ＩｇＧ（表９）、及び、カニクイザルＤＲ５-ＩｇＧ（「Ｃｙｎｏ  ＤＲ５-ＩｇＧ」、表９）に対する抗体ＢｄＦ２の結合を比較のために表６に示す。「Ｎ.Ｄ.」は「測定不可」を意味する。
表６  Ｆａｂ ａｂｓ
2008500969.tif 000007
また、ヒトＤＲ５-ＥＣＤへのＢｄｆ２の結合を示すアッセイの結果を図９に示す。
【０１０９】
実施例６  結合アッセイ
ＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて結合アッセイを行った。ＣＭ５チップ（Biocare）を少なくとも３０分で室温まで暖めた。ＢＩＡｃｏｒｅ計測器を開き、チップを計測器に装備した。初回刺激は、ランニングバッファ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０／０．０１％ ＮａＡｚｉｄｅ）で処理した後、７０％グリセロールにて標準化した。製造業者の指示に従ってセンソグラムを行い、固定化タンパク質溶液（酢酸緩衝液ｐｈ５．５）を調製し、タンパク質を２０μｇ／ｍｌで希釈した。チップはＥＣＤ及びＮＨＳにて活性化した。タンパク質が１００ＲＵで固定するまで、５−３０μｌのタンパク質（ヒトＤＲ５-ＥＣＤ、Ｃｙｎｏ ＤＲ５-ＩｇＧ、マウスＤＲ５-ＥＣＤ又はヒトＤＲ４-ＩｇＧ、表９に記述されるすべて）を２０μｌ／分で注入した。次いで、チップを１Ｍ エタノールアミンでブロックした。試料を５０ｎＭ−５００ｎＭの濃度で始め、１：１に希釈した。
データはＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアプログラムを用いて分析して、タンパク質動態を測定した。
【０１１０】
実施例１に記載のライブラリから選択されるＳｃＦｖ抗体のＢｉａｃｏｒｅアッセイの結果を下記の表７に示す：
表７
2008500969.tif 000008
【０１１１】
実施例２に記載のライブラリからのＦａｂ抗体についてのＢｉａｃｏｒｅアッセイの結果を以下の表８に示す：
表８
2008500969.tif 000009
＊ＣＨＯ細胞から精製したタンパク質
＊＊大腸菌から精製したタンパク質
Ｎ.Ｄ.は「検出不可」を意味する。
【０１１２】
「ＢｄＦ1」と称されるＦａｂ抗体のＸ線結晶構造研究により、ヒトＤＲ５レセプターへの結合において、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結合部位と重なり合うＤＲ５レセプターの領域と、及びそのＣＤＲ-Ｈ３領域の残基が作用領域内に埋没されるＤＲ５レセプターの領域と抗体のＣＤＲ-Ｈ３領域が広く作用することが明らかとなった。（Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＤＲ５との間に形成される複合体の結晶構造についてはHymowitz等, Molecular Cell, 4:563-571 (1999)に記述される；また、２００１年３月２２日公開の国際公報０１／１９８６１を参照）。完全には理解できないが、ＤＲ５レセプター表面上での結合のための潜在的ホットスポットが現れていると思われる。これは、実施例３に記載のファージ-ディスプレイ技術で同定されたＡｐｏ-２リガンド／ＴＲＡＩＬ及びＦａｂ抗体によって利用される。
【０１１３】
実施例７  選択した抗体のインビトロ生物学的アッセイ
対照標準物質及び抗体「ＢｄＦ２」（図８参照）の２倍階段希釈を、９６ウェル組織培養プレート(Falcon)において行った。Ａｐｏ-２リガンド（アミノ酸１１４−２８１、ＰＣＴ  ＵＳ００／１７５７９に記載）は比較のために試験した。Ｃｏｌｏ-２０５（２００００細胞個／ウェル）のヒト大腸カルシノーマ細胞（ＡＴＣＣ）を９６ウェルプレートに播種した。プレートを２４時間、３７℃でインキュベートした。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ (Trek Diagnostic Systems, Inc.)を、２４時間のインキュベーション時間の最後の３時間に加えた。５３０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの発光で９６ウェル蛍光光度計を用いて蛍光発光を読み取った。結果は、相対的な蛍光発光単位（ＲＦＵ）で表した。４-パラメータ曲線フィッティングプログラム(Kaleidagraph)を用いてデータ分析した。
バイオアッセイの結果を図１０に示す。
【０１１４】
本発明は、本願明細書において記述される特定の実施例によって制限されるものではない。実際、本願明細書において記述される本発明に様々な変更を加えることは、前述の説明及び添付の図から当業者に明らかであろう。このような修飾は、添付の特許請求の範囲内であることを意図する。
【０１１５】
表９  実施例のアッセイに用いた試薬のポリペプチド配列
1.  ヒト DR5-ECD ポリペプチド
MSALLILALVGAAVADYKDDDDKLSALITQQDLAPQQRVAPQQKRSSPSEGLCPPGHHIS
EDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREED
SPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEETVTSSPGTPASP
CSLS   (配列番号:154)
2.  ヒト DR4 IgG 融合 ポリペプチド 
MAPPPARVHLGAFLAVTPNPGSAASGTEAAAATPSKVWGSSAGRIEPRGGGRGALPTSMG
QHGPSARARAGRAPGPRPAREASPRLRVHKTFKFVVVGVLLQVVPSSAATIKLHDQSIGT
QQWEHSPLGELCPPGSHRSERPGACNRCTEGVGYTNASNNLFACLPCTACKSDEEERSPC
TTTRNTACQCKPGTFRNDNSAEMCRKCSTGCPRGMVKVKDCTPWSDIECVHKESGNGHND
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG
VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK  (配列番号:155)
3.  ヒト DR5-IgG 融合 ポリペプチド
MEQRGQNAPAASGARKRHGPGPREARGARPGLRVPKTLVLVVAAVLLLVSAESALITQQD
LAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCD
SGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVH
KESGLAFQDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK  
(配列番号:156)
4.  カニクイザル DR4-IgG 融合 ポリペプチド
MGQQGPSAQARAGRVVGPRSAQGASPGLRVHKTLKFVVVGVLLQVVPGSAATIKVHDQSV
GTQQWEHSPLGELCPPGSHRSEHSGACNQCTEGVGYTSASNNLFSCLPCTACKSDEEERS
ACTRTRNTACQCKPGTFRNDDSAEMCRKCSTGCPRGKVKVKDCTPWSDIECVHNESGNGH
NVWAILIVTVVILVVLLLLVAVLMFCRRIGSGCGGNPKCMHRVFLWCLGLLRGPGAEDNA
HNMILNHGDSLSTFISEQQMESQEPADLTGVTVQSPGEAQCLLGPAEPEGSQRRRLLVPA
NGADPTETMMLFFDNFADIVPFNSWDQLMRQLGLTNNEIHMVRADTAGPGDALYAMLMKW
VNKTGQDASIHTLLDALERIGERHAKERIQDLLVDSGKFIYVEDGTGSAVSLE  
(配列番号:157)
5.  カニクイザル DR5-IgG 融合 ポリペプチド
MGQLRQSAPAASVARKGRGPGPREARGARPGLRVLKTLVLVVAAARVLLSVSADCAPITR
QSLDPQRRAAPQQKRSSPTEGLCPPGHHISEDSRECISCKYGQDYSTHWNDFLFCLRCTK
CDSGEVEVNSCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEICRKCRTGCPRGMVKVKDCTPWSDIEC
VHKESGIIIGVIVLVVIVVVTVIVWKTSLWKKVLPYLKGVCSGDGGDPEHVDSSSHSPQR
PGAEDNALNEIVSIVQPSQVPEQEMEVQEPAEQTDVNTLSPGESEHLLEPAKAEGPQRRG
QLVPVNENDPTETLRQCFDDFAAIVPFDAWEPLVRQLGLTNNEIKVAKAEAASSRDTLYV
MLIKWVNKTGRAASVNTLLDALETLEERLAKQKIQDRLLSSGKFMYLEDNADSATS 
(配列番号:158)
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ヒトＡｐｏ-２リガンドｃＤＮＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列と、それより得られるアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド位置４４７の「Ｎ」は、ヌクレオチド塩基が「Ｔ」又は「Ｇ」であることを示すために使用されている。
【図２Ａ】完全長ヒトＤＲ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４）と、それより得られるアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ヒトＤＲ４のヌクレオチド配列とアミノ酸配列のそれぞれは、Pan等, Science, 276:111 (1997)にも開示されている。
【図２Ｂ】完全長ヒトＤＲ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４）と、それより得られるアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ヒトＤＲ４のヌクレオチド配列とアミノ酸配列のそれぞれは、Pan等, Science, 276:111 (1997)にも開示されている。
【図３Ａ】１９９８年１１月１９日公開の国際公報９８／５１７９３に開示されているヒトＤＲ５の４１１アミノ酸配列（配列番号５）を示す。ヒトＤＲ５の転写スプライシング変異形は当分野において公知である。１９９８年８月２０日に公開の国際公報９８／３５９８６に開示されているように、このＤＲ５スプライシング変異形は図３Ｂ及び３Ｃに記載のヒトＤＲ５の４４０アミノ酸配列（配列番号６）をコードする。
【図３Ｂ】ヒトＤＲ５の転写スプライシング変異形は当分野において公知である。１９９８年８月２０日に公開の国際公報９８／３５９８６に開示されているように、このＤＲ５スプライシング変異形は図３Ｂ及び３Ｃに記載のヒトＤＲ５の４４０アミノ酸配列（配列番号６）をコードする。
【図３Ｃ】ヒトＤＲ５の転写スプライシング変異形は当分野において公知である。１９９８年８月２０日に公開の国際公報９８／３５９８６に開示されているように、このＤＲ５スプライシング変異形は図３Ｂ及び３Ｃに記載のヒトＤＲ５の４４０アミノ酸配列（配列番号６）をコードする。
【図４Ａ】実施例１に示すベクターｐＳ２０７２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図４Ｂ】実施例１に示すベクターｐＳ２０７２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図４Ｃ】実施例１に示すベクターｐＳ２０７２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図４Ｄ】実施例１に示すベクターｐＳ２０７２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図４Ｅ】実施例１に示すベクターｐＳ２０７２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図４Ｆ】実施例１に示すベクターｐＳ２０７２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図５Ａ】実施例３に示すベクターｐＶ-０３５０-２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図５Ｂ】実施例３に示すベクターｐＶ-０３５０-２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図５Ｃ】実施例３に示すベクターｐＶ-０３５０-２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図５Ｄ】実施例３に示すベクターｐＶ-０３５０-２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図５Ｅ】実施例３に示すベクターｐＶ-０３５０-２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図５Ｆ】実施例３に示すベクターｐＶ-０３５０-２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図５Ｇ】実施例３に示すベクターｐＶ-０３５０-２をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲのコード配列を下線で示す。
【図６Ａ】ｓｃＦｖライブラリから選択した各クローンに付したＩＤ（識別番号）（実施例１）と重鎖のＣＤＲ（ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２、ＣＤＲ-Ｈ３）の各々のアミノ酸配列（配列番号９−７７）を示す。
【図６Ｂ】ｓｃＦｖライブラリから選択した各クローンに付したＩＤ（識別番号）（実施例１）と重鎖のＣＤＲ（ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２、ＣＤＲ-Ｈ３）の各々のアミノ酸配列（配列番号９−７７）を示す。
【図７】ｓｃＦｖライブラリから選択した各クローンに付したＩＤ（識別番号）（実施例２）と重鎖のＣＤＲ（ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２、ＣＤＲ-Ｈ３）の各々のアミノ酸配列（配列番号７８−１１０）を示す。
【図８】Ｆａｂライブラリから選択した各クローンに付したＩＤ（識別番号）（実施例３）と重鎖のＣＤＲ（ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２、ＣＤＲ-Ｈ３）の各々のアミノ酸配列（配列番号１１１−１１５）を示す。
【図９】ヒトＤＲ５-ＥＣＤポリペプチドに対するＦａｂ抗体ＢｄＦ２の結合を試験するＥＬＩＳＡの結果をグラフで示す。
【図１０】インビトロでＣｏｌｏ２０５腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するＡｐｏ２ＬとＦａｂ抗体ＢｄＦ２の結合を試験するアラマーブルーアッセイの結果を示す。
【図１】
2008500969.tif 000010
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2008500969.tif 000012
【図３Ａ】
2008500969.tif 000013
【図３Ｂ】
2008500969.tif 000014
【図３Ｃ】
2008500969.tif 000015
【図４Ａ】
2008500969.tif 000016
【図４Ｂ】
2008500969.tif 000017
【図４Ｃ】
2008500969.tif 000018
【図４Ｄ】
2008500969.tif 000019
【図４Ｅ】
2008500969.tif 000020
【図４Ｆ】
2008500969.tif 000021
【図５Ａ】
2008500969.tif 000022
【図５Ｂ】
2008500969.tif 000023
【図５Ｃ】
2008500969.tif 000024
【図５Ｄ】
2008500969.tif 000025
【図５Ｅ】
2008500969.tif 000026
【図５Ｆ】
2008500969.tif 000027
【図５Ｇ】
2008500969.tif 000028
【図６Ａ】
2008500969.tif 000029
【図６Ｂ】
2008500969.tif 000030
【図７】
2008500969.tif 000031
【図８】
2008500969.tif 000032
【図９】
2008500969.tif 000033
【図１０】
2008500969.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月6日(2006.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ａ】
2008500969.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月16日(2007.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図６、７又は８に記載の一又は複数のアミノ酸配列を含んでなる単離された抗ＤＲ５抗体。
【請求項２】
重鎖及び軽鎖を含んでなり、該重鎖が図６、７又は８に記載の一又は複数のアミノ酸配列を含有する可変領域を含むものである単離された抗ＤＲ５抗体。
【請求項３】
前記重鎖及び前記軽鎖が可動性リンカーにより結合されて一本鎖抗体となる、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
一本鎖Ｆｖ抗体である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
Ｆａｂ抗体である。請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
完全にヒトである、請求項２に記載の抗体。
【請求項７】
ＤＲ５レセプターに特異的に結合し、ＤＲ４レセプター、ＤｃＲ１レセプター又はＤｃＲ２レセプターに結合しない、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項８】
少なくとも一種類の哺乳動物癌細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項９】
Ａｐｏ-２リガンドのＤＲ５レセプターへの結合をブロック又は阻害する、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１ないし９の何れか一の抗体と担体を含んでなる組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物を含有してなる、哺乳動物の疾患の治療のための医薬。
【請求項１２】
前記疾患が免疫関連疾患である、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
前記疾患が癌である、請求項１１に記載の医薬。
【国際調査報告】
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