(57)【要約】  リボ核酸（ＲＮＡ）、好ましくは短い干渉ＲＮＡに共有結合させられたポリアミンを含む共役体が、記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸（ＲＮＡ）へ共有結合させられたポリアミンを含む共役体。
【請求項２】
前記ＲＮＡは、オリゴＲＮＡである、請求項１に記載の共役体。
【請求項３】
前記ＲＮＡは、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の共役体。
【請求項４】
前記ポリアミンは、プトレッシン、スペルミン、スペルミジン、ヒルドニン、及びそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項１、２、又は３に記載の共役体。
【請求項５】
前記ポリアミンは、式（Ｉ）：
Ｅ−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｂ−Ａ−Ｂ−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｅ      （Ｉ）
の化合物からなる群より選択されると共に、
Ａは、Ｃ２からＣ６までのアルケン、並びに、Ｃ３からＣ６までのシクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアリールからなる群より選択され；
Ｂは、独立して、単結合並びにＣ１からＣ６までのアルキル及びアルケニルからなる群より選択され；
Ｄは、独立して、Ｃ１からＣ６までのアルキル及びアルケニル、並びに、Ｃ３からＣ６までのシクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアリールからなる群より選択され；
且つ、
Ｅは、メチルである、請求項１、２、又は３に記載の共役体。
【請求項６】
プトレッシン、スペルミン、スペルミジン、ヒルドニン、及びそれらの誘導体、並びに、式（Ｉ）：
Ｅ−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｂ−Ａ−Ｂ−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｅ      （Ｉ）
の化合物からなる群より選択されたポリアミンを含む共役体であって、
Ａは、Ｃ２からＣ６までのアルケン、並びに、Ｃ３からＣ６までのシクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアリールからなる群より選択され；
Ｂは、独立して、単結合並びにＣ１からＣ６までのアルキル及びアルケニルからなる群より選択され；
Ｄは、独立して、Ｃ１からＣ６までのアルキル及びアルケニル、並びに、Ｃ３からＣ６までのシクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアリールからなる群より選択され；
且つ、
Ｅは、メチルであり；且つ、
該ポリアミンは、ｓｉＲＮＡへ共有結合させられる、共役体。
【請求項７】
前記ポリアミンは、細胞質ゾルの酵素によって加水分解可能である結合によって、前記ｓｉＲＮＡへ結合させられる、請求項６に記載の共役体。
【請求項８】
生細胞へＲＮＡを起動させる方法であって、
当該方法は、
該共役体を生じるように、ポリアミンへＲＮＡを共役させること：及び
そして該共役体を該生細胞へ接触させること
を含む、方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡは、プトレッシン、スペルミン、スペルミジン、ヒルドニン、それらの誘導体、及び、式（Ｉ）：
Ｅ−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｂ−Ａ−Ｂ−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｅ      （Ｉ）
の化合物からなる群より選択されたポリアミンへ共役させられると共に、
Ａは、Ｃ２からＣ６までのアルケン、並びに、Ｃ３からＣ６までのシクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアリールからなる群より選択され；
Ｂは、独立して、単結合並びにＣ１からＣ６までのアルキル及びアルケニルからなる群より選択され；
Ｄは、独立して、Ｃ１からＣ６までのアルキル及びアルケニル、並びに、Ｃ３からＣ６までのシクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアリールからなる群より選択され；
且つ、
Ｅは、メチルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡは、前記ポリアミンに共役させられる、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
生細胞へＲＮＡを起動させるための材質の組成物であって、
当該組成物は、リボ核酸（ＲＮＡ）へ共有結合させられたポリアミンを、それの薬学的に適切な担体との組み合わせで、含む、組成物。
【請求項１２】
前記ＲＮＡは、オリゴＲＮＡである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＲＮＡは、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリアミンは、プトレッシン、スペルミン、スペルミジン、ヒルドニン、それらの誘導体、及び、式（Ｉ）：
Ｅ−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｂ−Ａ−Ｂ−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｅ      （Ｉ）
の化合物からなる群より選択されると共に、
Ａは、Ｃ２からＣ６までのアルケン、並びに、Ｃ３からＣ６までのシクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアリールからなる群より選択され；
Ｂは、独立して、単結合並びにＣ１からＣ６までのアルキル及びアルケニルからなる群より選択され；
Ｄは、独立して、Ｃ１からＣ６までのアルキル及びアルケニル、並びに、Ｃ３からＣ６までのシクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアリールからなる群より選択され；
且つ、
Ｅは、メチルである、請求項１１、１２又は１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
序
本発明は、一般にリボ核酸（ribonucleic acid）（ＲＮＡ）を、及び、特に短い干渉ＲＮＡ（short interfering RNA）（ｓｉＲＮＡ）を、含有する共役体を作る際の、並びに、治療薬として共役体（conjugate）を使用する際の、ギャップを埋める。短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、通俗的な科学の文献において“最近の五年間におけるターゲットの検証における最も評判なものの一つ”と称されてきた。この熱狂は、ｓｉＲＮＡが、ターゲットにされた遺伝子の発現を特異的に抑制することに効能のあるものであることが示されてきたという事実のおかげである。
【０００２】
ｓｉＲＮＡの作用を介した遺伝子の発現のこの配列に特異的な転写後の沈黙は、真菌類及び植物において最初に発見された天然に起こる過程であると共に、細菌の及び動物の細胞において起こることが後に示された。短い干渉ＲＮＡは、酵素によってか又は化学合成によってかのいずれかで得られた、短い（およそ２１−２５個のヌクレオチド）ＲＮＡのフラグメントである。短い干渉ＲＮＡは、ターゲットにされたメッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA）（ｍＲＮＡ）の配列に特異的な劣化を含むことによって、機能する。効力のある抗ウィルス性の及び抗癌性の薬物としてのｓｉＲＮＡの潜在能力は、科学界において広く受け入れられる。しかしながら、この潜在能力が、薬学的な組成物の形態で現実になる前に、ｓｉＲＮＡをそれらの意図されたターゲットへ送り出すことにおける根本的な問題が、解決されるものでなければならない。
【０００３】
その送出の問題の根本には、ｓｉＲＮＡがポリアニオンであるということがある。このように、脂質の二層にわたるｓｉＲＮＡの援助を受けてない浸透は、無視できるものである。従来、ｓｉＲＮＡは、陽イオン性のリポソームを、又はポリエチレンイミン類を伴ったポリプレックスを、使用することで、細胞へ送り出される。ｓｉＲＮＡを送り出すためのリポソームの使用が、いくらかの成功を示してきたとはいえ、リポソームの送出のビヒクルの主要な不都合は、多くの細胞のタイプを、リポソームを使用することでは形質移入することができないというものである。また、数個の細胞のタイプを、顕著な生物学的な効果を生じさせる効率を伴って、リポソームで形質移入することができない。さらには、リポソームの送出のビヒクルを使用する実験では、細胞の数個の異なる手技が、要求される。手短に言えば、その過程は、厄介なものである。
【０００４】
同様に、ポリエチレンイミン類は、それらが、高い分子量の重合体であるので、細胞の中へ送り出すことが困難なものである。このように、ポリエチレンイミン−ｓｉＲＮＡポリプレックスの生体内での送り出しは、高い分子量の陽イオン性の複合体の全身の送り出しに固有な全ての障害物によって悩まされる：それら複合体は、意図されたサイトへのそれらの道筋を作ること、ターゲットにされた組織の中へ管外に遊出すること、などをしなければならない。従って、細胞外の環境からターゲットの細胞の細胞質の中へのｓｉＲＮＡの分子を移動させる方法は、試験管内で（例、培養された及び体幹の細胞において）及び生体内で（例、薬物としてのｓｉＲＮＡの全身の送出で）遺伝子を沈黙させるためのｓｉＲＮＡの治療的な使用における顕著な飛躍的前進であるであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の概要
このように、本発明は、天然に起こる過程を模倣するｓｉＲＮＡ用の効能のある細胞の送出の系を作り出すための方法、及び、結果として生じるｓｉＲＮＡの送出の系である。多数の抗生物質及び低い分子量の酵素の阻害剤は、アミン類に共役してきた。アミンの部位は、しばしば、生物学的な活性を増加させることに重大なものである。これらの化合物の多数において、アミンの部位は、共役体を細胞の中へ輸送するために要求された構造的な要素を提供するものである。特に、多数の抗生物質の抗菌性の活性は、（部分的には）グリコシドの、芳香族の、又は、ポリケチドの部位へ共役させられたアミン類又はポリアミン類のおかげである。陽イオン性のポリアミンの残基は、細胞の中へ抗生物質の輸送を容易にするように機能する。適切な例は、ストレプトマイシン（図４を参照のこと）であるが、それは、アミノグリコシドであると共に、そこでは、輸送する残基が、アミノグアニジノ基である。同様に、抗生物質のブレオマイシン−フレオマイシンの基（図２を参照のこと）においては、変性させられたスペルミン及びスペリミジンの基は、輸送する残基である。（スパガリン、ラテロスポラミン（laterosporamine）、エデイン（edein）類、グリスペリン（glisperin）Ａ、Ｂ、及びＣ、並びに、グリコシンナモイルスペルミジン類のような）スペリミジンに共役させられた抗生物質及び抗腫瘍性のもの（図３を参照のこと）においては、共役させられたスペルミジンの部位は、細胞の中への生物学的に活性な作用薬の輸送体である。また、カナマイシン類と呼ばれたアミノグリコシドの抗生物質の言及は、なされるべきである。カナマイシン類においては、アミノの部位は、グリコシド類を細胞の中へ輸送する。これは、また、スクアラミン（図７を参照のこと）、幅広いスペクトル、ツノザメ科、メジロザメ科又はトラザメ科のサメの組織から単離されたステロイドの抗生物質に当てはまるものである。これらの化合物において、硫酸化された胆汁酸が、スペルミジンのアミノプロピル第一級アミンへ融合させられる。その分子のスペルミジン部位が、細胞膜にわたってその分子の残部を運ぶように作用するものである。
【０００６】
本発明においては、天然の及び／又は合成のポリアミンの基は、１）細胞質において破壊されると共にｓｉＲＮＡ部位を遊離なものに設定するか；又は２）その共役体のｓｉＲＮＡの部分が、ＲＮＡを誘導する沈黙する複合体（RNA-inducing silencing complex）（ＲＩＳＣ）分子へ結び付くことを、及び、それによって、ｓｉＲＮＡによってターゲットにされた特異的なｍＲＮＡを開裂させることを、なお可能とする一方で無傷なもののままにするか：いずれかの結合を介して、ｓｉＲＮＡの分子へ共有結合させられる（Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，ＲＮＡｉ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ｐ．７，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００３を参照のこと）。
【０００７】
本発明における使用のための好適なポリアミン類は、好ましくは、スペルミジン及びそれの誘導体、スペルミン及びそれの誘導体、並びに、ヒルドニン（hirudonine）及びそれの誘導体である。図１及び６を参照のこと。大部分の細胞は、担体に媒介されたエネルギー依存性の機構によって、ポリアミン類を摂取する。多数の細胞（例えば、ヒトの繊維芽細胞、マウスの白血病の細胞、ラットのモーリス（Morris）肺がん細胞、など。）は、全てのポリアミン類についての単一の輸送体を有するように見える。このように、一般的な提案として、輸送体の特異性は、ひどく厳密なものであることはない。例えば、アルキル置換基で置換されたポリアミン類の誘導体が、また、天然のポリアミン類を起動させる同じ輸送体の系によって、細胞の中へ効率的に輸送されることは、先の仕事から知られることである。
【０００８】
また、ポリアミン類は、リボ核酸へのポリアミン類の大きい結び付きの親和性の理由のために、ｓｉＲＮＡ用の理想的な担体である。ポリアミン類は、特にスペルミンは、リボソームへ強く結び付くと共に、トランスファーＲＮＡ（transfer RNA）（ｔ−ＲＮＡ）の構成する部分である。強塩基性のポリアミン類は、静電的な電荷のみならず水素結合によって、ｔ−ＲＮＡへ結び付く（Ｆｒｙｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９９２）８９：９１８６；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：９３）。トランスファーＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのサイズのおおざっぱに二倍のリボヌクレオチドであるが、しかし、リボヌクレオチドの鎖は、類似の構造を有する。いずれの特定の生物学的な機構に束縛されることなく、ｔ−ＲＮＡの複合体において、スペルミン又はスペルミジンは、リボヌクレオチドのループへ結び付く；ｓｉＲＮＡにおいては、ポリアミンは、ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡを誘導する沈黙の複合体へ結び付くまで、ｓｉＲＮＡのアニールされた二本鎖の鎖へ結び付くこと、及び、その鎖を安定化させることができるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の第一の実施形態は、リボ核酸（ribonucleic acid）（ＲＮＡ）へ共有結合させられたポリアミンを含む共役体に向けられる。ＲＮＡの共役体が、オリゴＲＮＡであることは、好適なことであると共に、最も好ましくは、ＲＮＡが、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であることである。
【００１０】
共役体のポリアミンの部分は、限定無しに、いずれのポリアミンでもあることができる。好適なポリアミン類は、プトレッシン（putrescine）、スペルミン（spermine）、スペルミジン（spermidine）、ヒルドニン（hirudonine）、及びそれらの誘導体からなる群より選択されたものである。それらの誘導体内に明白に含まれるのは、米国特許第６，３９２，０９８号明細書及び米国特許第６，７９４，５４５号明細書に開示された立体配座的に制限されたポリアミン化合物である。より具体的には、立体配座的に制限されたポリアミン類について、共役体のポリアミンの部分は、好ましくは、式Ｉ：
Ｅ−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｂ−Ａ−Ｂ−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｅ      （Ｉ）
の化合物より選択されると共に、
そこでは、Ａは、Ｃ２からＣ６までのアルケン、並びに、Ｃ３からＣ６までのシクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアリールからなる群より選択される；
Ｂは、独立して、単結合並びにＣ１からＣ６までのアルキル及びアルケニルからなる群より選択される；
Ｄは、独立して、Ｃ１からＣ６までのアルキル及びアルケニル、並びに、Ｃ３からＣ６までのシクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアリールからなる群より選択される；並びに、
Ｅは、メチルである；と共に、その共役体のポリアミンの部分は、それらの薬学的に適切な塩である。
【００１１】
以下により詳細に詳述したように、これらの立体配座的に束縛されたポリアミン類を、以下に続く一般的な反応スキームに従って作ることができる：
式ＩＩ：
ＨＯ−Ｂ−Ａ−Ｂ−ＯＨ      （ＩＩ）
の化合物が、式ＩＩＩ：
ＰＲＯＴ−Ｏ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ｏ−ＰＲＯＴ      （ＩＩＩ）
の化合物を生じさせるために、保護試薬と、好ましくはメシチレンスルホニル＝クロリドと、反応させられると共に、
そこでは、ＰＲＯＴは、保護基である。
【００１２】
そして、式ＩＩＩの化合物は、式Ｖ：
Ｅ−Ｎ（ＰＲＯＴ）−Ｄ−Ｎ（ＰＲＯＴ）−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ｎ（ＰＲＯＴ）−Ｄ−Ｎ（ＰＲＯＴ）−Ｅ      （Ｖ）
の化合物を生じさせるために、式ＩＶ：
Ｅ−Ｎ（ＰＲＯＴ）−Ｄ−ＮＨ−（ＰＲＯＴ）      （ＩＶ）
の化合物と反応させられる。
【００１３】
式ＩＩＩの中間体及び式ＩＶの中間体の両方において、保護基、ＰＲＯＴが、メシチレンスルホニル部位であることは、大いに好適なことである。
【００１４】
そして、式Ｖの化合物は、式Ｉの化合物（Ｅ−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｂ−Ａ−Ｂ−ＮＨ−Ｄ−ＮＨ−Ｅ）を生じさせるために、脱保護される。
【００１５】
本発明の第二の実施形態は、生細胞へＲＮＡを起動させる方法へ向けられる。その方法は、共役体を生じさせるために、ポリアミンにＲＮＡを共役させること；及び、そして、生細胞へ共役体を接触させることを含む。ＲＮＡが、プトレッシン、スペルミン、スペルミジン、ヒルドニン、及びそれらの誘導体からなる群より選択されたポリアミンへ共役させられることは、好適なことである。ｓｉＲＮＡが、ポリアミンへ共役させられることは、また、好適なことである。
【００１６】
本発明の第三の実施形態は、生細胞へＲＮＡを起動させるための材質の組成物に向けられると共に、その組成物は、薬学的に適切な担体との組み合わせで、リボ核酸（ribonucleic acid）（ＲＮＡ）へ共有結合させられたポリアミンを含む。
【００１７】
本発明においては、ポリアミンの輸送体は、リボヌクレオチドを、それらが、細胞に入ると、解放することになる、折りたたみ可能な結合によって、ｓｉＲＮＡへ結び付けられる。生体内に投与されたとき全身の毒性の全くないものであるｓｉＲＮＡでポリアミン類の不連続の共役体を作ることは、ほ乳類の細胞において天然に起こる過程を変調することによって、遺伝子の機能を研究するための道筋を開くと共に、究極的には、疾患を処置するための新しい遺伝子に特異的な治療薬に至る。このように、ここに開示された共役体は、細胞の外側から且つ細胞質及び／又は核の中へｓｉＲＮＡを送り出すための高度に有用なものである。
【００１８】
１．細胞の中への天然の生産物のポリアミン輸送：
このような組織を培養するための能力のみならず、動物の組織におけるポリアミンの偏在及び不可欠性の認識は、ほ乳類の細胞におけるポリアミンの輸送の非常に多く研究に帰着してきた。ポリアミンの合成の特異的な阻害剤による腫瘍細胞の成長の阻害及び外因的なポリアミン類による成長の回復は、ポリアミンの摂取の研究に対する主要な刺激であってきた。例えば、［１４Ｃ］−ベンジルアミンの摂取の数個のモード：細胞の表面への吸着（吸着された分子は、洗浄することによって大部分において除去可能なものである）；特異的な過程を示す飽和性の細胞内の輸送；並びに、拡散及び内部の結び付きのミックスを連想させる、より遅い非飽和性の摂取は、明白なものである（Ｃｏｈｅｎ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９８，ｐｐ．４６７）。
【００１９】
ほ乳類の細胞；プトレッシン、スペルミジン、及びスペルミンに存在する三個の天然のポリアミン類がある（図１を参照のこと）。Ｓｅｉｌｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｚｅｕｒｅ（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２２：２１１によって手短に述べられたように、ほ乳類の細胞におけるポリアミンの摂取は、一般に、特異的な飽和性のものであると共に、エネルギーを要求すると共に、担体で媒介されたものである。ポリアミンの輸送を、また、ＲＮＡを要求する過程及びタンパク質の合成において規制することができる。ほ乳類の三個の膜の受容体についてのデータの再検討は、アミノ酸のための非常に多くの輸送タンパク質並びに真正細菌及び真菌類から単離されたポリアミン類に対するこれらのタンパク質の著しい類似性又は相同性を記述してきた（Ｒｅｉｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２：２０）。これらのデータは、ほ乳動物の細胞からの受容体タンパク質が、これらの微生物の輸送タンパク質と共通の起源を共有する変性させられた輸送タンパク質として記述されることもあることを提案する。
【００２０】
多数の細胞は、マイクロモルの範囲におけるＫｍの値を伴った、プトレッシン、スペルミジン、及びスペルミン用の単一の輸送体を有する。ナトリウム依存性の系及びナトリウム非依存性の系の両方が、検出されてきた。癌におけるポリアミン輸送体の治療学上の重要性を力説するが、査閲者は、輸送体の系を欠く白血病の細胞系統の減少した毒性を指摘した。プトレッシンの摂取の数個の新しい阻害剤は、スペルミジンのものよりも活発に、このジアミンの摂取を阻害する、Ｍｉｎｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００：４５７を参照のこと。これは、また、黒色腫の細胞におけるこれらの異なるポリアミン類の輸送が、異なることを示す。
【００２１】
ヒトの血小板におけるプトレッシンの摂取は、飽和性の且つエネルギー依存性のものであるが、しかし、複雑なものに見える。ヒトの赤血球内の研究は、それが、ポリアミン類を合成することができないものであるが、細胞の表面におけるポリアミン受容体のサイト並びに、主として（＞９５％）内部の可溶性の区画の中へのプトレッシン、スペルミジン、及びスペルミンの摂取を立証した。Ｍｏｕｌｉｎｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，６６：３８５。その摂取は、４℃で最小限のものであったと共に、これは、主として、細胞の間質への結び付きに関係した。３７℃で、血清からのプトレッシン及びスペルミジンの摂取は、スペルミンがゆっくりと入ったのに対して、相対的に急速なものであった。血漿からの飽和性のプトレッシン及びスペルミジンの摂取についてのＫｍの値は、それぞれ、１２５及び３．６μＭであった。
【００２２】
マウスの細胞の一つの糸において、Ｎａ＋及びスペルミジンの両方が、１：１の関係性で細胞に入ることが示された。Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３４５。その輸送は、それが、ＡＴＰを枯渇させる、２−デオキシグルコースによって影響を及ぼされなかったので、ＡＴＰ非依存性のものであるように見えた。ほ乳類の細胞の多数のより多くの糸の検査は、スペルミジンの摂取が、各々の事例において若干異なっているとはいえ、Ｎａ＋の濃度によって影響を及ぼされなかったことを示した。Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，５８：１７２。その摂取は、一般に、イオン透過孔及びいくつかのポリアミンの類自体によって阻害された。アスパラギンで細胞を前負荷することは、神経芽細胞腫の細胞におけるプトレッシンの摂取のもののみならず、二つの糸におけるプトレッシンの摂取を加速させた。Ｒｉｎｅｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：４５７０。ヒトの大腸癌の細胞によるプトレッシンの摂取は、アスパラギンによって＞３００倍に刺激される。ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５６：Ｇ８６８。プトレッシンの摂取についてのアスパラギンの効果の性質は、いくつかのヒトの癌細胞において大いに誇張されるものであるように見えた。アスパラギンが、膜のＮａ＋／Ｈ＋の対向輸送を活性化させる、Ｈ＋の押し出しを誘発する、及び、Ｎａ＋依存性の細胞内のアルカリ化を引き起こすことは、知られたことである。Ｆｏｎｇ  ａｎｄ  Ｌａｗ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５５：９３７。
【００２３】
多種多様な動物の細胞での研究は、ポリアミンの輸送の機構の共通の応答を示した。にもかかわらず、いくつかの組織の細胞及び癌細胞は、単一の共通の機構を所有するように見えた。対照的に、ブタの腎臓のＬＬＣ−ＰＫ細胞系統と同様の、他のものは、数個のより多くの識別系を明かした。後者の細胞は、異なる細胞のエリアに局在化したナトリウム依存性の輸送体及びナトリウム非依存性の輸送体の両方を含有した。Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６５：６０９。
【００２４】
動物の細胞の中へのポリアミン類の前述した輸送の機構の利点をとることによって、異なる薬物及び化学薬剤は、天然のポリアミン類へ共有結合的に付けられたと共に、このように細胞の中へ輸送された。相対的に無毒性の化合物、ニトロイミダゾール−スペルミジン共役体は、細胞に入ったと共に、遊離のスペルミジンの摂取を阻害した、Ｈｏｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３：７６３を参照のこと。また、たとえ末端の置換基が、相当に大きいものであるとしても、鉄のキレート化剤のスペルミンの共役体が、腫瘍の細胞の中へ効率的に輸送されることを、述べることができる。Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：５４７８，２００３を参照のこと。また、ナフタルイミド類を備えたポリアミン共役体は、細胞の中へ効率的に送り出される。Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３１（２）：４０７；ポリアミン類と共役させられたインデノイソキノリン類（トポイソメラーゼＩ阻害剤）は、癌細胞の中へ送り出される，Ｎａｇａｒａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：５７１２；Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤（Bowman-Birk inhibitor）（“ＢＢＩ”，８０００Ｄａのポリペプチド）として知られたタンパク質分解酵素の阻害剤のスペルミン共役体は、肺及び肝臓にＢＢＩを局在化させる際に非常に有効なものであると共に、ポリリシンの共役体の不適格な毒性の何も有するものではない、Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０（１２）：１９０８。
【００２５】
天然の生産物は、細胞内の送り出し用のベクターとしてのポリアミン類の良好な試料採取器である。スペルミジン共役体のスパガリン及びエデイン類（図３を参照のこと）のみならず、ブレオマイシン（様々な化学構造について、図２を参照のこと）の言及は、ポリアミンのベクターのそれらの広い配列と共に、並びに、ストレプトマイシン、ジグアニジノ誘導体（図４を参照のこと）の言及が、なされるべきである。クマロイルアグマチンのような、植物に見出されたアミノグアニジン類、及び、ホルダチン（hordatine）類（図５を参照のこと）は、輸送用の強塩基性のグアニジンの残基、またヒルドニン（hirudonine）（図６を参照のこと）に見出された残基、重要な細菌性の且つ植物のポリアミンの重要性を例示する。スクアラミン（squalamine）（図７を参照のこと）は、スペルミジン−ステロイドであるが、そこでは、スペルミジンの部位は、細胞の中への送り出しのベクターである。これらの天然の生産物の全てが、ポリアミンの部位を含む。
【００２６】
本発明者は、ポリアミンの輸送の機構の特異性が、驚くほど、許容的なものであることを見出してきた。スペルミン及びホモスペルミン（homospermine）の類自体、ペンタミン（pentamine）類、及び、異なるオリゴアミン類を含む、２４個のポリアミン様の化合物を精査した後、それらが、ヒトの細胞の中へ効率的に輸送されることが、見出されたことであった。このように、主題の共役体は、ヒトの細胞を含む、ほ乳類の細胞の中へ効率的に輸送されることが、期待される。
【００２７】
２．小さい干渉ＲＮＡ（small interfering RNA）（ｓｉＲＮＡ）の合成：
小さい干渉ＲＮＡ（Small interfering RNA）（ｓｉＲＮＡ）は、約２１−２３個のリボヌクレオチドの二本鎖にされたフラグメントである。ｓｉＲＮＡの分子が、ｍＲＮＡの劣化の媒介物であること、及び、上に述べられたフラグメントのパターンで化学的に合成された二重鎖が、ｍＲＮＡの開裂を案内することが可能であることが、示されてきた。Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１５：１８８。ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡに媒介された開裂における現在のところ受け入れられた一連の事象は、図８において概略的に与えられる。図８に示されたように、ｓｉＲＮＡは、３’のオーバーハング、通常（ＴＴ）又は（ＵＵ）と共に、（図８の上部における５’から３’までに示した、赤色の）対にされたセンス鎖及び（図８の上部における３’から５’に示された、青色の）アンチセンス鎖を含む、図８における符号“ａ”を参照のこと。ｓｉＲＮＡの経路は、長い二本鎖にされた（ｄｓ）ＲＮＡが、取るに足らない名前“ダイサー（Dicer）”を有するＲＮアーゼＩＩＩの酵素によって、ＡＴＰ依存性の反応において、ｓｉＲＮＡの中へと開裂させられるとき、開始する。そして、これらのｓｉＲＮＡが、ＲＮＡに誘発される沈黙の複合体（RNA-inducing silencing complex）（ＲＩＳＣ）の中へ組み込まれる。一旦連結が解かれると、ｓｉＲＮＡの一本鎖にされたアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣの複合物をメッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA）（ｍＲＮＡ、それは、一本鎖にされたものである）へ案内すると共にｍＲＮＡの相補的な配列をターゲットにする。これは、（図８の符号“ｂ”に示されたような）ターゲットにされたｍＲＮＡのヌクレオチド鎖切断の開裂に帰着する。しかしながら、また、化学的に合成されたｓｉＲＮＡの二重鎖において、アンチセンス鎖のみならずセンスの両方ｍＲＮＡをターゲットにすることを提案するデータがある。この過程は、図９に概略的に例示される。図９に示されたように、形質移入されたｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣの中へ組み込まれると共に、センス又はアンチセンス鎖のいずれか（それらは、図９には表されたものではない）は、ターゲットにされたｍＲＮＡにおける相補的な配列を認識することに役に立つことができる。Ｄｕｘｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓ．，１１７：３３９を参照のこと。
【００２８】
化学的な過程によるｓｉＲＮＡの合成、精製、及びアニーリングは、ますます通俗なものになっている。例えば、Ｍｉｃｕｒａ（２００２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４１（１３）：２２６５及びＨｏｂａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｍｏｎｓａｔｓｈｅｆｔｅ  ｆｕｒ  Ｃｈｅｍｉｅ，１３４：８５１，２００３を参照のこと。化学的に合成されたＲＮＡのオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡの技術の鍵となる構成要素によるものである。ヌクレオシドのカップリングは、図１０に例示されたような従来の且つ周知のホスホルアミダイトの化学によって、達成される。その過程が、当業者に周知なものであるので、それを、極めて詳細には記載しないことにする。全部の処理については以下に続く段落における引用文献を参照のこと。また、慣行のＲＮＡの合成における繁栄する商業的な市場がある。例えば、いずれの指定された配列のｓｉＲＮＡを、多数の他の会社の中から、例えば、ＳｙｎＧｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ），Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｔｅｘａｓ）、及びＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）から購入することができる。付加的に、多数の大学を本拠地とした研究室は、また、公衆に対する慣行のＲＮＡの合成のサービスを販売する（多数の他のものの中から、例、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ［Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ］及びＫａｎｓａｓ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ［Ｍａｎｈａｔｔａｎ，Ｋａｎｓａｓ］）。
【００２９】
適切な保護基の構造における改善は、ＤＮＡの合成についての事例のものであるような生産物の質の水準及びアクセス可能なオリゴヌクレオチドの長さまで日常的なＲＮＡの構成をとってきた。ロバストなＲＮＡの構成のストラテジーについての要望は、新しい及び高級化された保護基の作製に帰着した。これらの手順は、１９９８年に導入されたと共に、様々な特許によってカバーされる（例えば、Ｐｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，９８６，０８４号明細書を参照のこと）と共に、科学文献（Ｐｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ，８４：３７７３）に記載される。（いくつかの技術的な調節の後における商業的な自動化されたＤＮＡの合成において使用された）大部分の一般的な手順は、“ＴＯＭ”保護基（２’−Ｏ−トリイソプロピルシリルオキシメチル）の使用をする（それは、２’−Ｏの位置におけるＴＯＭ保護基で保護されたリボヌクレオシドである、図１０Ａを参照のこと）。この保護基は、ＤＮＡの合成に使用された古典的な２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基に対して優れたものである。
【００３０】
図１０Ａに示されたもののような保護されたヌクレオチドの構築は、リボヌクレオシドの核酸塩基の環外のアミノ基におけるＮ−アセチル化で開始すると共に、５’−Ｏ−ＤＭＴを与えるための５’の酸素におけるトリチル化が後に続けられる。そして、これは、２’−Ｏ−ＴＯＭの誘導体を与えるための２’の酸素における“トミル化（TOMylation）”が後に続けられる。最後に、２−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミド＝クロリダイト（2-cyanoethyldiisopropylphosphoramido chloridite）を使用する３’の酸素における“ホスフィチル化”のステップは、図１０Ａに示された３’−Ｏ−ＣＥＰＡ誘導体を生じさせる。オリゴリボヌクレオチドの中へのホスホルアミダイトの組み込みは、良好に詳細に記録される。Ｍｉｃｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２９：３９９７；Ｈｏｂａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１；６０５；Ｍｉｃｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３９：９２２；Ｍｉｃｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２０：１２８７；及びＥｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，８３：２２３８を参照のこと。
【００３１】
オリゴリボヌクレオチド用の別の基礎単位は、図１０Ｂに描かれる。この保護されたリボヌクレオシドは、米国特許第６，１１１，０８６号明細書において１９９８年に最初に報告された、Ｓｃａｒｉｎｇｅ（２０００），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３１７：３をもまた参照のこと。図１０Ｂに示された保護されたヌクレオシドの背後の理論的根拠は、合成のリボヌクレオチドの２’−Ｏ基における最終的な脱保護についての穏やかに酸性の水性の条件に対する要求であった。穏やかな酸性の条件に対してそれ自体が不安定なものである、５’−Ｏにおける保護基が、ＤＭＴであるとすれば、これを、達成することはできない。従って、ＤＭＴは、２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル（2’-O-bis(2-acetoxyethyloxy)methyl）（ＡＣＥ）オルトエステルと一緒に、５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリル＝エーテル（5’-O-bis(trimethylsiloxy)cyclododecyloxysilyl ether）（ＤＯＤ）で置き換えられた。ここで、３’−ＯＨ基は、（図１０ＡのＴＯＭで保護されたヌクレオシドにおいて使用された）シアノエチル基が、ＤＯＤを開裂させるために必要とされたフッ素化物の試剤に対して不安定なものであることを証明したので、メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（methyl-N,N-diisopropylphosphoramidite）として誘導される。この保護されたリボヌクレオシドとのカップリングの収率は、９９％よりも高いものである。
【００３２】
オリゴヌクレオチドの集合の後に、ホスファートのメチルの保護基は、ＤＭＦ中で２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオール酸二ナトリウム三水和物（disodium 2-carbamoyl-2-cyanoethylene-1,1-dithiolate trihydrate）（Ｓ２Ｎａ２）で取り除かれる（図１２を参照のこと）。そして、塩基性の条件（４０％の水性のメチルアミン）は、環外のアミノ基におけるアシル保護基及び２’−オルトエステル類におけるアセチル基の除去と一緒に、固体の支持体からオリゴヌクレオチドの開裂を引き起こす。結果として生じる２’−Ｏ−ビス（２−ヒドロキシエチルオキシ）メチルオルトエステル類は、アセチル基の除去の前よりも十倍を超えて不安定なものである。その結果として、非常に穏やかな条件（ｐＨ３．８，３０分，６０℃）は、最終的な脱保護のステップに要求されるものの全てである。５’−Ｏ−ＤＯＤ基は、フッ素物の試剤で開裂させられる。この手順によって得られた粗オリゴリボヌクレオチドの公開されたＨＰＬＣクロマトグラムは、印象的なものであると共に、ほとんど無い副産物を提示する。
【００３３】
オリゴリボヌクレオチドの自動化された合成の一般的なスキームは、図１１（ＰＧ＝保護基）に描かれる。その合成は、樹脂への付着によって３’の端から開始する。脱保護は、ＲＮＡの生産物の劣化無しに、二つのステップで、最初にエタノール／水中のＣＨ３ＮＨ２で、テトラヒドロフラン中のＢｕ４ＮＦが後に続けられることで、達成される。その過程を、顕著な生産物の劣化が結果として生じる前に、約１５０単量体単位の生産物まで繰り返すことができる。
【００３４】
３．立体配座的に束縛されたポリアミン類の合成：
プトレッシン、スペルミン、スペルミジン、及びヒルドニンを含む、天然に生ずるポリアミン類のホストを、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅ及びＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅのような多くの世界中の供給業者から商業的に購入することができる。Ａｌｄｒｉｃｈのカタログ番号は、プトレッシン（Ｄ１，３２０−８）、スペルミン（Ｓ３８３−６）、及びスペルミジン（Ｓ３８２−８）：である。ヒルドニン（ジグアニルスペルミジン，ＣＡＳ  Ｎｏ．２４６５−９７−６）についてのＦｉｓｈｅｒのカタログ番号は、ＩＣＮ２２２５９５である。
【００３５】
本発明における使用に適切な立体配座的に束縛されたポリアミン類は、好ましくは、米国特許第６，３９２，０９８号明細書及び米国特許第６，７９４，５４５号明細書に開示されたもののように合成される。簡単に、様々な剛性の部位、環状の部位又は二重若しくは三重結合させられた部位のいずれかは、ポリアミンの骨格の中へ導入される。
【００３６】
最初にターゲットにされた場所は、ポリアミンの中央の１，４−ジアミノブタンのセグメントであった。それのねじれ型の立体配座において、四個の半重なり型の立体配座の回転異性体は、ジアミノブタンのセグメントのまわりで可能なものである。四個は、鏡像異性の関係を有する。中央のジアミノブタンのセグメントのＣ−１の位置とＣ−３の位置との、又は、Ｃ−２の位置とＣ−４の位置との、間の結合の導入は、シクロプロパン環を発生させる。Ｃ−２の位置とＣ−３の位置との間の付加的な結合の導入は、立体配座的に制限されたアルケンの誘導体を発生させる。シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルの部位を、同じストラテジーの後に続く構造の中へ導入することができる。
【００３７】
このアプローチを使用することで、四個の立体配座的に半剛性の構造が、得られたが、それらは、スペルミンの四個の半重なり型の立体配座の構造を模倣する。半剛性の構造の二個は、他の二個のエピマーである。
【００３８】
本発明の目的について、主題の化合物のシス及びトランス異性体が、中央に位置させられた環の構造又は不飽和によって与えられた制限された結合の回転のおかげで、非常に明白な三次元の立体配座を仮定することに留意することは、重要なことである。ポリアミン類の純粋な単離されたシスの形態及び純粋な単離されたトランスの形態を含む、（光学的に活性な又はそうでない）全ての幾何異性体、並びに、それらの混合物は、明白に、本発明の範囲内にある。付加的に、主題の化合物の全ての位置異性体は、明白に、本発明の範囲内にある。式ＩのＡ又はＤが、周期性の部位であるとき、二個のＢの置換基又はアミノの部位は、それぞれ、相互に関して１，２又は１，３又は１，４の位置に配向させられることもある。
【００３９】
（ａ）シクロプロピル環を含有するスペルミン類似体：
スペルミンのシス及びトランスのシクロプロピル類似体は、以下において、スキーム１、２、３、４、４Ａ、５、及び５Ａに例示された反応を介して調製された。
【００４０】
スキーム１及び２を参照して、シクロプロピルジエスエル１及び２は、最初に、それらのヒドラジド１０３及び４へと転換されたと共に、ヒドラジドは、それぞれ、ジアミン５及び６へと転換された。そして、ジアミン５及び６は、アミド７及び８を与えるために、メシチル化されたと共に、そして、アミドは、それぞれ、１０及び１１を与えるために、９でアルキル化された。保護基の加水分解は、トランス類似体１２及びシス類似体１３を生じさせた。
【００４１】
今スキーム３を参照することで、別個の反応において、トランスシクロプロピルジエステル１は、ベンジルアミン（ＢｎＮＨ２）との反応によって、アミド１４へと転換されたと共に、アミドは、アミン１５へ還元されたと共にアミンは１６へアルキル化された。そして、フタリル残基は、１７を与えるために、ヒドラジンで開裂させられた。そして、化合物１７は、１８を与えるための水素添加分解によって脱保護されたか；又は１９へ十分にアルキル化されたかのいずれかであったと共に、ベンジル残基は、２０を与えるための水素添加分解によって開裂させられた。
【００４２】
スキーム４を参照して、アミン１５は、また、２２を与えるために、２１でアルキル化された。そして、化合物２２は、トランスシクロプロピル類似体２３を生じさせるために、脱保護された。
【００４３】
２３への代替の（及び好適な）経路は、スキーム４Ａに与えられる。ここで、３−エチルアミノプロピオニトリル１０１は、対応するアミン１０２へと転換されたが、それは、そして、３を生じさせるために、メシチル化された。並行の合成において、シスジエステル１は、ジアルコール１５’へ還元されたが、それは、そして、ジメシチル誘導体１６’を生じさせるために、メシチル化された。水素化ナトリウムの存在において、３及び１６’を反応させることは、２２’を生じさせた。
【００４４】
【化１】
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【００４５】
【化２】
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【００４６】
【化３】
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【００４７】
【化４】
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【００４８】
【化５】
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【００４９】
【化６】
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【００５０】
【化７】
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そして、スキーム４と同じ様式で、２２’は、トランスシクロプロピル類似体２３を生じさせるために、脱保護された。
【００５１】
今スキーム５を参照することで、別個の反応において、シスシクロプロピルジエステル２は、ジアルコール２４へ還元された。そして、ジアルコールは、アミン２５へと転換されたと共に、アミンは、２６へのメシチル化によって保護された。そして、化合物２６は、２７を生じさせるために、９でアルキル化されたと共に、そして、シスシクロプロピルテトラアミン２８を生じさせるために、脱保護された。
【００５２】
２８への代替の（及び好適な）経路は、スキーム５Ａに与えられる。ここで、シスシクロプロピルジエステル２は、スキーム５におけるのと同じ様式で、ジアルコール２４へ還元される。そして、化合物２４は、２５’を生じさせるために、メシチル化によって保護された。そして、化合物２５’は、２７を生じさせるために、３と反応させられた。脱保護することは、テトラアミン２８を生じさせた。
【００５３】
（ｂ）シクロブチル環を含有するスペルミン類似体：
スペルミンのシス及びトランスのシクロブチル類似体は、以下において、スキーム６、７、８、８Ａ、９、及び９Ａに例示された反応を介して、調製された。
【００５４】
今スキーム６及び７を参照することで、シクロブチル誘導体の合成は、それぞれ、トランス及びシスの１，２−ジアミノブタン２９及び３０と共に開始した。これらの化合物は、最初に、アミド３１及び３２へ転換されたと共に、そして、それぞれ、３３及び３４へアルキル化された。そして、化合物３３及び３４は、トランステトラアミン３５（スキーム６）及びシステトラアミン３６（スキーム７）を生じさせるために、脱保護された。
【００５５】
スキーム８及び９を参照して、別個の反応において、トランスシクロブチルエステル３７及びシスシクロブチルジエステル３８は、それぞれのジアルコール３９及び４０へ還元されたが、ジアルコールは、ジアミン４１及び４２へと転換された。そして、ジアミン４１及び４２は、それぞれ、４３及び４４を生じさせるためのメシチル化によって保護された。そして、これらの化合物は、４５及び４６を与えるために、アルキル化された。そして、保護基は、トランスシクロブチルテトラアミン４７（スキーム８）及びシステトラアミン４８（スキーム８）を生じさせるために、取り除かれた。
【００５６】
【化８】
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【００５７】
【化９】
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【００５８】
【化１０】
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【００５９】
【化１１】
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【００６０】
【化１２】
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【００６１】
【化１３】
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４７及び４８への代替の（及び好適な）経路は、それぞれ、スキーム８Ａ及び９Ａに与えられる。シス及びトランスのジエステル３７及び３８は、スキーム８及び９におけるものと同じ様式で、それぞれのジアルコール３９及び４０へ還元された。そして、化合物３９及び４０は、それぞれ、４１’及び４２’を生じさせるために、メシチル化された。３との４１’及び４２’の反応は、４５（スキーム８Ａ）及び４６（スキーム９Ａ）を生じさせる。脱保護することは、所望の生産物４７及び４８を生じさせる。
【００６２】
（ｃ）不飽和を含有するスペルミン類似体：
スペルミンのシス及びトランスの不飽和の類似体は、スキーム１０、１０Ａ、１１、及び１１Ａに例示された反応を介して調製された。
【００６３】
スキーム１０を参照することで、トランスジエステル４９は、ジアルコール５０へ還元されたが、それは、そして、トランスジアミン５１へと転換された。スキーム１１を参照することで、シスジアミン５２は、商業的に入手可能なシスジアルコール４３’から得られた。スキーム１０及びスキーム１１の両方を参照して、化合物５１及び５２は、それぞれ、５３及び５４を与えるためのメシチル化によって、保護された。化合物５３及び５４は、５５及び５６へアルキル化されたと共に、トランステトラアミン５７（スキーム１０）及びシステトラアミン５８（スキーム１１）を生じさせるために、最後に脱保護された。
【００６４】
５７及び５８への代替の（及び好適な）経路は、それぞれ、スキーム１０Ａ及び１１Ａに与えられる。シス及びトランスのジアルコール５０’及び５０は、スキーム１０及び１１におけるものと同じ様式で、得られた。そして、化合物５０’及び５０は、それぞれ、５１’及び５２’を生じさせるために、メシチル化された。３との５１’及び５２’の反応は、５５（スキーム１０Ａ）及び５６（スキーム１１Ａ）を生じさせる。脱保護することは、所望の生産物５７及び５８を生じさせる。
【００６５】
上の一般的なプロトコルの後に続けることで、並びに、適切な及び周知の出発の試剤を使用することで、Ａ及びＤが、独立に、Ｃ５の又はＣ６のシクロアルキル、シクロアルケニル、又は、シクロアリールであるところのものを含む、式Ｉの化合物の全てを、容易に得ることができる。式Ｉの化合物の例示的な列挙は、表１に与えられる。
【００６６】
【化１４】
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【００６７】
【化１５】
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【００６８】
【化１６】
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【００６９】
【化１７】
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【００７０】
【表１】
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純粋な共役体は、それらの薬学的に適切な塩のみならず、明白に、本発明の範囲内にある。用語“薬学的に適切な塩”によって、主題の共役体のいずれの塩の形態をも、意味されると共に、それは、それらを、選ばれた経路による投与に対してより受け入れられるものにする。広い範囲のこのような塩は、薬学的な技術における業者には周知のものである。好適な薬学的に適切な塩は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、及び同様のもののような酸付加塩である。
【００７１】
４．ｓｉＲＮＡのポリアミン共役体の合成
上に述べたデータに基づいて、図１３に示された三個のヌクレオシドを調製することができる。ヌクレオシドＡは、２’−Ｏ−ＴＯＭのヌクレオシドである、ヌクレオシドＢは、２’−Ｏ−ＡＣＥのヌクレオシドである、及び、ヌクレオシドＣは、５’−チオールのヌクレオシドである。ヌクレオシドＣは、それの核酸塩基においてアセチル化される５’−チオリボシドから調製されると共に、それの２’−Ｏ−ＡＣＥ誘導体へと転換されると共に３’の位置で最終的にホスフィチル化される。
【００７２】
ヌクレオシドＢは、５’−Ｏにおいてポリアミンの鎖へ付けられる。リンカーは、好ましくは、（図１４に示されたような）カルバマート結合である。このリンカーを、５’−Ｏにおけるクロロホルマートを介してか、又は、アルキルイソシアナートへアルコールを付加することによってか、のいずれかで添付することができる。いずれかの事例において、ポリアミンの残基は、カルバマート結合によって、リボースへ付けられることになる。ポリアミンの鎖は、ＦＭＯＣ、トリフルオロアセタート、及び同様のもののような、アルカリに不安定な保護基で保護される。オリゴヌクレオチドの鎖が、（図１１に示されたような）３’の端から５’の端まで成長すると、ポリアミンで共役されたヌクレオシドは、合成の最後のステップで付けられることになる。（図１０に示されたような）穏やかなアルカリ性の条件の下での樹脂からのオリゴヌクレオチドの解放は、また、ポリアミンの鎖における保護基を開裂することになる。２’−Ｏを遊離させるために必要な穏やかな酸の条件は、カルバマート結合に影響を及ぼすものではないことになると共に、ポリアミンの残基へ共有結合的に結び付けられたオリゴヌクレオチドが、得られることになる。結果として生じるポリアミン−ＲＮＡ共役体は、他のポリアミンの共役体のものと同じ様式で、生細胞へと輸送される。
【００７３】
アニーリングに関して、二重鎖のｓｉＲＮＡの鎖は、独立に構築される；センス鎖は、所望の配列のヌクレオチドで構築される、そして、アンチセンス鎖は、対応する相補的な塩基で構築される。一本鎖は、二重鎖を形成するために、互いに温置される（ｐＨ７．４，１分，９０℃）。この対合は、ｓｉＲＮＡをアニールすることとして知られたものである。本発明の好適な実施形態において、ポリアミンの部位は、センス鎖の５’−Ｏへ付けられる（図８を参照のこと）。
【００７４】
ヌクレオシドＣは、５’−チオリボースを使用することで、構築される。ポリアミンから誘導された残基（好適な残基の例示的な列挙については、図１５を参照のこと）は、短いチオアルキルのリンカーに付けられる。図１５に例示されたＮ−チオエチルポリアミンの残基を、Ｓ−ベンジルシステインアミンと共に開始することで、得ることができると共に、そして、確立された手順の後に続く継続的なアルキル化によってポリアミンの鎖を増強する。Ｖａｌａｓｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）及びそれにおける参考文献、並びに、最終的に、ベンジル基を開裂させるための水素添加分解を使用することで、チオール基を脱保護することによって。
【００７５】
５’−Ｓ−オリゴリボヌクレオシドへジスルフィドで連結されたポリアミンの合成は、ジアミン、知られたチオールの酸化剤での混合物の処理によって達成される。そして、共役したヌクレオシドは、以上において議論されたようなセンスオリゴリボヌクレオチドの鎖へ付けられる。センスオリゴリボヌクレオチドの鎖は、２’−Ｏの位置で脱保護される、ポリアミンの保護基は、開裂させられると共に、そして、鎖は、相補的なアンチセンス鎖へアニールされる。いずれの特定の生物学的な機構又は現象に限定されることがない一方で、このアプローチの背後における理論的根拠は、以下に続くようなものである：ポリアミンは、ｓｉＲＮＡ二重鎖の原形質膜にわたる輸送を容易にすることになると共に、共役体は、細胞質の中へ自由に転座されることになる。そして、ジスルフィド結合は、チオール類によって細胞質において還元されることになると共に、それによって、共役体のｓｉＲＮＡの部分を解放する。解放されたｓｉＲＮＡは、配列に特異的なｍＲＮＡの劣化を引き起こすために、進行することになるが、それは、それの予め決定された配列に基づいて達成することが、設計されたものであった。
【００７６】
たとえ共役体が、細胞の中への送り出しの後で無傷のままであるとしても、ｓｉＲＮＡの二つの鎖は、細胞質への共役体の送り出しの後に、ＲＩＳＣにおいて部分的に解離することになる。これは、一本鎖のアンチセンスｓｉＲＮＡが、細胞において内因性の遺伝子の発現を沈黙させることができるものであると、ｓｉＲＮＡの二重鎖の機能に影響を及ぼすものでないことになる。
【００７７】
オリゴリボヌクレオチドのポリアミンの共役体の合成に対する第三のアプローチは、ペプチダーゼを首尾良く模倣すると共に分子内の触媒された開裂の方式によってそれに結び付けられた遊離のアミド類及びエステル類を設定するリンカーを使用する。ポリアミンの鎖及びヌクレオシドは、Ｋｅｍｐの三酸（Ｋｅｍｐ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒａｋｉｓ（１９８１），Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６：５１４０）を通じて連結される。この注目すべき三酸は、全てのアキシャルの配向に三個のカルボキシラートを有する。一個のカルボキシルは、（アミドとして）アミンへ結び付けられると共に、第二のカルボキシルは、アルコールとエステルを形成する。約６のｐＨで、分子は、無水物の分子内の形成を介して、アミンの残基を最初に解放することになる。そして、アルコールは、分子内の無水物の転位によって解放されることになる（図１６を参照のこと）。細胞質に入るとき、共役体は、いろいろなペプチダーゼ、並びに、アミド結合及びエステル結合の両方を開裂することになる、リソソーム酵素によって直面せさられることになる。この開裂は、カルボキシラートのアキシャルの幾何学的配置によって援助される。無水物の形成の間における内部の圧縮の軽減は、このように、加水分解の酵素に駆動された加速に寄与する。Ｋｅｍｐの酸におけるファンデルワールス（van der Waals）の接触距離は、非常に短いものであると共に、エネルギー的に高価な脱溶媒和の過程を、このように避けることができる。
【００７８】
合成は、Ｋｅｍｐの酸塩化物−無水物を使用する、図１６を参照のこと。ポリアミンとの反応によって、ポリアミドが、形成される。ヌクレオシドＡの５’−Ｏのアルコールでの無水物の開環は、アミド及びエステルで置換されたＫｅｍｐの酸を生じる。そして、アミド及びヌクレオシドＡのエステルでこのように置換されたＫｅｍｐの酸は、３’−Ｏ−ＣＥＰＡ基を通じて、センスリボヌクレオチドの成長する縁へカップリングされる（例、図１１を参照のこと）。ＴＯＭ保護基、Ｎ−アセチル、及び、ポリアミンにおける保護基は、穏やかなアルカリ中で開裂させられる。そして、エステルアミドのリボヌクレオチドは、アンチセンス鎖とアニールされると共に細胞質へと輸送される。
【００７９】
ポリアミドの連鎖が、ポリアミンの鎖からオリゴリボヌクレオチドを遊離させることになる、細胞質のペプチダーゼによって最初に開裂させられることになることは、期待されることである。細胞のエステラーゼによるエステル基の開裂は、ｓｉＲＮＡの二重鎖の解放と共に後に続くことになる。たとえ後者の加水分解が、遅い（時間の）ものであるとしても、細胞におけるｓｉＲＮＡのリンガー（linger）が、数時間の間に劣化無しであることは、指摘されることであるべきである。このように、アミドの連鎖及びエステルの連鎖の両方の加水分解を達成するための十分な時間がある。分配されたＫｅｍｐの酸は、ｐＨ７．４での血漿において安定なものである。ヌクレオシドＡは、この合成のシークエンスにおいて好適なものであると共に、低いｐＨの条件へのヌクレオシドＢにおける２’−Ｏでのオルトエステルの保護基の感度のために（及び、また、共役させられたオリゴヌクレオチドの脱保護の間において置換されたＫｅｍｐの酸における開裂を回避するために）、ヌクレオシドＢはそうではない。
【００８０】
オリゴリボヌクレオチドとポリアミンを共役させるための第四のアプローチは、加水分解のステップのシークエンスの後で崩壊するコネクター連鎖の構築に基づいたものであることになる；第一のものが、酵素的な開裂を伴うと共に第二のものが、第一のステップが起こった後に自発的に進行する加溶媒分解を伴う。コネクター連鎖は、図１７に示されたように構築される。（酸に安定な基；例、トリフルオロアセタートで保護された）ポリアミンの単位は、カルバマート結合を通じてリシンのα−アミノ基へ結び付けられることになる（ＰＧ−１は、ε−ＦＭＯＣであることができるであろう）；そして、リシンは、ｐ−アミノベンジルアルコールでの処理によってそれの対応するアミドへと転換される。ｐ−ニトロフェニルイソシアナートへのベンジルアルコールの付加は、ｐ−ニトロアニリド１ａに帰着する。α−アミノ残基における保護基の開裂は、１ｂを与える。
【００８１】
化合物１ｂは、ｐ−ニトロアニリンの解放と共にトリプシンの存在下で、急速な加水分解を受けることになる。本発明においては、ｐ−ニトロアニリンの残基は、単純な追い出し反応を介して、ヌクレオシドＡで置き換えられる（図１５を参照のこと）。２ａを与えるためのリシンの残基のα−アミノ基におけるＰＧ１の脱保護の後で、リシンの残基におけるアミド結合を、トリプシン及び／又はリソソームのタンパク質分解酵素カテプシンＢ及びＬによって加水分解することができるが、それによってベンジル＝カルバマート３を解放する（図１７を参照のこと）と共に、それは、ヌクレオシドＡ及びｐ−アミノベンジルアルコールへの自発的な加溶媒分解を受けることになる。
【００８２】
手短に言えば、化合物２ａは、ポリアミンの鎖へ折りたたみ可能なリンカーを通じて結び付けられたセンスリボヌクレオチド鎖を得るためのオリゴヌクレオチドの構築の最後のステップとして使用される。相補的なＲＮＡ鎖でアニールすることが後に続けられた、α−リシンにおけるポリアミンの保護基のもの及びＰ１のみならず、ＴＯＭの保護基の開裂は、生細胞へ送り出されると共に加水分解の後にそれの構成成分の部位へと崩壊する共役させられたｓｉＲＮＡの複合体を与える。
【００８３】
５．投与及び薬学的な単位の剤形：
上述した共役体が、生細胞の中へＲＮＡを起動させることに有効なものであるので、共役体は、ヒトを含む、生体内で、ほ乳動物の治療的に処置することに、及び、ほ乳類の細胞の中へのＲＮＡの起動を要求するいずれの処置の療法においても、試験管内で、ほ乳類の細胞を処置することに、適切なものである。手短に言えば、共役体は、細胞外の空間からほ乳類の細胞の細胞質の中へ、ｓｉＲＮＡを含む、ＲＮＡを移動させることに有用なものである。
【００８４】
ヒトの又はヒトでない患者に対する主題の複合体の投与を、薬学的な技術において知られたいずれの手段によっても、成し遂げることができる。好適な投与の経路は、純なもの又は選ばれた投与の経路に適切な薬学的な担体との組み合わせでのいずれかで、静脈内の投与、動脈内の投与、腫瘍内の投与、筋肉内の投与、腹腔内の投与、及び、皮下の投与を含む、非経口的なものである。処置の方法は、また、経口的な投与に対して受け入れられるものである。
【００８５】
全ての医薬品と同様に、投与されたポリアミン−ＲＮＡ共役体の濃度又は量が、処置される不快の重症度、投与のモード、処置される主体の条件及び年齢、並びに、使用される特定のポリアミン−ＲＮＡ共役体又は共役体の組み合わせに依存して、変動することになることは、留意されなければならない。
【００８６】
ここに記載された共役体は、錠剤、丸剤、粉末の混合物、カプセル、注射剤、溶液、坐剤、乳濁物、分散物、食品のプレミックスの形態で、及び、他の適切な形態で、投与可能なものである。ここに記載された共役体を含有する薬学的な剤形は、都合良くは、非毒性の薬学的な有機の担体又は非毒性の薬学的な無機の担体と混ぜられる。典型的な薬学的に許容可能な担体は、例えば、マンニトール、尿素、デキストラン、乳糖、ジャガイモ及びトウモロコシのデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、エチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、炭酸カルシウム、エチル＝オレアート、イソプロピル＝ミリスタート、ベンジル＝ベンゾアート、炭酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カリウム、ケイ酸、並びに、他の従来用いられた許容可能な担体を含む。薬学的な剤形は、また、乳化剤、保存剤、又は、湿潤剤、及び、同様のもののような非毒性の補助的な物質を含有することもある。
【００８７】
錠剤、カプセル、及び、粉末のような、固体の形態を、従来の錠剤にする及びカプセルを充填する機械類を使用することで、製作することができるが、それは、当技術において周知のものである。固体の剤形は、賦形剤、潤滑剤、乾燥剤、結合剤、着色剤、崩壊剤、乾燥流動調整剤、防腐剤、及び同様のものを含む、当技術に知られたいずれの数の付加的な不活性な含有物をも含有することもある。
【００８８】
経口摂取用の液体の形態を、水性の及び非水性の担体、懸濁物、水中油及び／又は油中水の乳濁物、及び同様のものを含む、知られた液体の担体を使用することで、調合することができる。液体の調合物は、また、着色剤、芳香剤、調味料、粘度調整剤、防腐剤、安定化剤、及び、同様のものを含む、いずれの数の付加的な不活性な含有物を含有することもある。
【００８９】
非経口的な投与について、主題の共役体は、付加的な界面活性剤又は補助剤有り又は無しで、水又は油のような、生理学的に許容可能な希釈剤又は無菌の液体の担体における共役体の溶液又は懸濁物の注射可能な投与量のものとして投与されることもある。担体の油の例示的な列挙は、動物及び植物油（ピーナッツ油、大豆油）、石油から誘導された油（鉱物油）、及び合成の油を含むであろう。一般的には、注射可能な単位投薬量について、水、生理食塩水、水性の右旋性ブドウ糖及び関係付けられた糖質の溶液、並びに、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールのような、エタノール及びグリコールの溶液は、好適な液体の担体である。
【００９０】
選ばれた薬学的な単位投与量は、例えば、約１μＭから約１０ｍＭまでの、ターゲットの細胞との接触の点での共役体の濃度を提供するために、好ましくは、製作されると共に投与される。より好適なものは、約１μＭから約１００μＭまでの濃度である。この濃度は、もちろん、投与の選ばれた経路及び処置される主体の質量に依存することになる。上に述べた範囲より上の及びより下の濃度は、本発明の範囲内にある。
【００９１】
関連出願の相互参照
ここに文献によって援用された、２００４年１１月４日に出願された米国仮出願シリアル番号６０／６２４，９０６に対する優先権は、これによって、請求される。
【００９２】
文献の援用
以下に引用された論文及び先行特許の全ては、ここに文献によって援用される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、プトレッシン、スペルミジン、及びスペルミンの化学構造を描く。
【図２】図２は、ブレオマイシンの部類の化合物の化学構造を描く。
【図３】図３は、スパガリン並びにエデインＡ及びＢの化学構造を描く。
【図４】図４は、ストレプトマイシンの化学構造を描く。
【図５】図５は、４−クマロイルアグマチン並びにホルダチンＡ、Ｂ、及びＭの化学構造を描く。
【図６】図６は、ヒルドニンの化学構造を描く。
【図７】図７は、スクアラミンの化学構造を描く。
【図８】図８は、ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡで媒介された配列に特異的な開裂を例示する概略的なものである。
【図９】図９は、ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡで媒介された配列に特異的な開裂を例示すると共にＲＮＡを誘導する沈黙の複合体（ＲＩＳＣ）を例示する概略的なものである。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、オリゴリボヌクレオチドｓｉＲＮＡを製作するために使用することができる保護されたリボヌクレオオシドの化学構造を描く。
【図１１】図１１は、ホスホラマダイトに基づいたオリゴリボヌクレオチドの合成を例示する反応スキームである。
【図１２】図１２は、図１０Ｂに示されたリボヌクレオシドの脱保護を例示する反応スキームである。
【図１３】図１３は、本発明における使用のための三個の異なる保護されたリボヌクレオシドの化学構造を描く。
【図１４】図１４は、本発明に従ったポリアミン−ｓｉＲＮＡの共役体のある系列を描く。
【図１５】図１５は、本発明に従ったポリアミン−ｓｉＲＮＡの共役体の別の系列を描く。
【図１６】図１６は、本発明に従ったポリアミン−ｓｉＲＮＡの共役体の更に別の系列を描く。
【図１７】図１７は、本発明に従ったポリアミン−ｓｉＲＮＡの共役体を製作するための一般的な反応スキームを描く。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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