(57)【要約】本発明は、リポソームの一つまたは複数の脂質が一つまたは複数のポリマーに可逆的にまたは不可逆的にカップリングし、リポソームはsiRNAを含む、リポソームを含む非ウイルス送達ベクターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームの一つまたは複数の脂質が一つまたは複数のポリマーに可逆的または不可逆的にカップリングし、かつ該リポソームはsiRNAを含む、リポソームを含む送達ベクター。
【請求項２】
一つまたは複数のポリマーに可逆的にまたは不可逆的にカップリングするリポソームの一つまたは複数の脂質が、リポソームの表面において露出している、請求項1記載の送達ベクター。
【請求項３】
リポソームが式(I)の一つまたは複数のアミノキシ基含有脂質を含む、請求項1または請求項2記載の送達ベクター：
2008509205.tif 000055
式中、Bは脂質であり；Xは自由選択の(optional)リンカー基であり、R2はHまたはヒドロカルビル基である。
【請求項４】
アミノキシ基含有脂質がCPAである、請求項3記載の送達ベクター。
【請求項５】
リポソームが一つまたは複数のカチオン性脂質および/または一つまたは複数の非カチオン性共脂質(co-lipid)を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の送達ベクター。
【請求項６】
カチオン性脂質が少なくとも1つの脂環式基を含む、請求項5記載の送達ベクター。
【請求項７】
少なくとも1つの脂環式基がコレステロールである、請求項6記載の送達ベクター。
【請求項８】
カチオン性脂質がN1-コレステリルオキシカルボニル-3,7-ジアザノノナン-1,9-ジアミン(CDAN)である、請求項6または請求項7記載の送達ベクター。
【請求項９】
非カチオン性共脂質がホスファチジルエタノールアミンである、請求項5記載の送達ベクター。
【請求項１０】
非カチオン性共脂質がジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)である、請求項9記載の送達ベクター。
【請求項１１】
ポリマーが一つまたは複数のアルデヒドおよび/またはケトン基を含む、前記請求項のいずれか一項記載の送達ベクター。
【請求項１２】
ポリマーがPEGである、前記請求項のいずれか一項記載の送達ベクター。
【請求項１３】
リポソームが約0.1〜約5%PEGとカップリングしている、請求項12記載の送達ベクター。
【請求項１４】
リポソームが、一つもしくは複数の薬剤を含むか、またはその一つもしくは複数の薬剤に可逆的にもしくは不可逆的にカップリングしている、前記請求項のいずれか一項記載の送達ベクター。
【請求項１５】
リポソームの一つまたは複数の脂質が一つまたは複数のポリマーおよび一つまたは複数の薬剤に可逆的にまたは不可逆的にカップリングし、かつ該リポソームはsiRNAを含む、リポソームを含む標的化送達ベクター。
【請求項１６】
薬剤が糖、炭水化物、およびリガンドからなる群より選択される、請求項15記載の標的化送達ベクター。
【請求項１７】
糖がグルコース、マンノース、ラクトース、フルクトース、マルトトリオース、マルトヘプトースからなる群より選択される、請求項16記載の標的化送達ベクター。
【請求項１８】
リガンドが抗体である、請求項16または請求項17記載の標的化送達ベクター。
【請求項１９】
請求項1〜14のいずれか一項記載の送達ベクターまたは請求項15〜18のいずれか一項記載の標的化送達ベクターを、細胞、組織、または器官の環境に提供する工程を含む、siRNAを送達するための方法。
【請求項２０】
細胞、組織、または器官へのsiRNAの送達に用いるための、請求項1〜14のいずれか一項記載の送達ベクターまたは請求項15〜18のいずれか一項記載の標的化送達ベクター。
【請求項２１】
細胞、組織、または器官へのsiRNAの送達用の組成物の製造における、請求項1〜14のいずれか一項記載の送達ベクターまたは請求項15〜18のいずれか一項記載の標的化送達ベクターの使用。
【請求項２２】
(i)siRNAをリポソームと接触させる工程；および
(ii)工程(i)において形成されたリポソームをポリマーに可逆的にまたは不可逆的にカップリングさせる工程
を含む、
リポソームの一つまたは複数の脂質が一つまたは複数のポリマーに可逆的にまたは不可逆的にカップリングし、かつ該リポソームはsiRNAを含む、リポソームを含む送達ベクターを調製するためのプロセス。
【請求項２３】
(iii)工程(i)または工程(ii)で形成されたリポソームを一つまたは複数の薬剤に可逆的にまたは不可逆的にカップリングさせるさらなる工程を含む、請求項22記載のプロセス。
【請求項２４】
(i)siRNAをリポソームと接触させる工程；
(ii)工程(i)において形成されたリポソームをポリマーに可逆的にまたは不可逆的にカップリングさせる工程；および
(iv)工程(i)または工程(ii)で形成されたリポソームを一つまたは複数の薬剤と可逆的にまたは不可逆的にカップリングさせる工程
を含む、
リポソームの一つまたは複数の脂質が一つまたは複数のポリマーおよび一つまたは複数の薬剤に可逆的にまたは不可逆的にカップリングし、かつ該リポソームはsiRNAを含む、リポソームを含む標的化送達ベクターを調製するためのプロセス。
【請求項２５】
(i)請求項1〜18のいずれか一項記載のベクターを提供する工程；
(ii)任意で、ベクターを凍結保護剤と接触させる工程；および
(iii)ベクターを凍結乾燥する工程
を含む方法。
【請求項２６】
凍結保護剤がスクロース、トレハロース、およびラクトースからなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
(iv)使用に先立ってベクターを再水和させるさらなる工程を含む、請求項25または請求項26記載の方法。
【請求項２８】
請求項25または請求項26記載の方法によって得ることができる、または得られた凍結乾燥されたベクター。
【請求項２９】
脂質とカップリング部分の間の距離が少なくとも1.5nmである、脂質およびカップリング部分を含むリポソーム。
【請求項３０】
下記式の請求項29記載のリポソーム：
2008509205.tif 000056
式中、Bは脂質であり；Xはリンカー基であり、カップリングはカップリング部位であり、X骨格は少なくとも30個の原子を含む。
【請求項３１】
X骨格が少なくとも40個の原子を含む、請求項30記載のリポソーム。
【請求項３２】
Xが下記式の基であるか、または下記式の基を含む、請求項30または31記載のリポソーム：
2008509205.tif 000057
式中、nおよびmは独立して0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは2、3、または4、より好ましくは2または4である。
【請求項３３】
Xが下記式の基であるか、または下記式の基を含む、請求項30または31記載のリポソーム：
2008509205.tif 000058
式中、nおよびmは独立して0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは2、3、または4、より好ましくは2または4である。
【請求項３４】
Xが下記式の基であるか、または下記式の基を含む、請求項30または31記載のリポソーム：
2008509205.tif 000059
式中、mは0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは1、2、または3、より好ましくは1であり、nは0〜20、好ましくは5〜15、より好ましくは10、11、または12、より好ましくは11である。
【請求項３５】
Xが下記式の基であるか、または下記式の基を含む、請求項30または31記載のリポソーム：
2008509205.tif 000060
式中、mは0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは1、2、または3、より好ましくは1であり、nは0〜20、より好ましくは5〜15、より好ましくは10、11、または12、より好ましくは11である。
【請求項３６】
請求項1〜14のいずれか一項記載の送達ベクター、または請求項15〜18のいずれか一項記載の標的化送達ベクター、または請求項29〜35のいずれか一項記載のリポソームと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む薬学的組成物。
【請求項３７】
請求項1〜14のいずれか一項記載の送達ベクター、または請求項15〜18のいずれか一項記載の標的化送達ベクター、または請求項29〜35のいずれか一項記載のリポソーム、または請求項36記載の薬学的組成物の医療上有効量を対象に投与する段階を含む、対象における疾患を治療する方法。
【請求項３８】
疾患の治療で用いるための、請求項1〜14のいずれか一項記載の送達ベクター、または請求項15〜18のいずれか一項記載の標的化送達ベクター、または請求項29〜35のいずれか一項記載のリポソーム。
【請求項３９】
疾患の治療用の組成物の製造における、請求項1〜14のいずれか一項記載の送達ベクター、または請求項15〜18のいずれか一項記載の標的化送達ベクター、または請求項29〜35のいずれか一項記載のリポソームの使用。
【請求項４０】
疾患が肝臓病および/または肝臓損傷である、請求項37記載の方法、請求項39記載のベクター、または請求項39記載の使用。
【請求項４１】
siRNAを含む送達ベクターの調製における、ポリマーにカップリングしたリポソームの使用。
【請求項４２】
siRNAを含む標的化送達ベクターの調製における、ポリマーおよび一つまたは複数の薬剤にカップリングしたリポソームの使用。
【請求項４３】
実質的に本明細書において記載され、実施例または図面のいずれか1つを参照した送達ベクター。
【請求項４４】
実質的に本明細書において記載され、実施例または図面のいずれか1つを参照した方法。
【請求項４５】
実質的に本明細書において記載され、実施例または図面のいずれか1つを参照した使用。
【請求項４６】
実質的に本明細書において記載され、実施例または図面のいずれか1つを参照したリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、siRNAを含む非ウイルス送達ベクターに関する。また、本発明は、標的化非ウイルス送達ベクター、そのベクターを調製する方法、そのベクターを使用する方法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ウイルスDNA送達のための方法は、免疫応答、ウイルスDNAベクターを反復して送達できないこと、高ウイルス力価を生じさせるにおける困難性、および感染性ウイルスの可能性を含む多くの問題に悩んでいる。非ウイルス送達方法は、これらの問題がない代替システムを提供し、従って、遺伝子導入に対する余り有害でない非ウイルスアプローチの開発を促進した。
【０００３】
大きな可能性の非ウイルス導入システムは、通常、中性リン脂質およびカチオン性脂質からなるカチオン性リポソームの使用を含む。それらは、DNA、mRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、および薬物を細胞に導入するのに用いられてきた。多数のカチオン性リポソームが市販され、多くの新しいカチオン性脂質が最近合成されている。これらのリポソームの効率は、インビトロおよびインビボ双方によって説明されている。
【０００４】
動物および基本的な真核生物におけるRNAi、真菌におけるクエリング、および植物における転写後遺伝子サイレンシングは、RNAサイレンシングと集合的に呼ばれる現象の広いファミリーの例である(12,13)。特異的なRNA不活化の現象は、まず、ウイルス感染に対する防御メカニズムとして植物において(14)、および後に線虫(C. elegans)において(15,16)発見された。RNAサイレンシングの共通の特徴は、遺伝子発現のダウンレギュレーションについての特異的決定基として作用するsiRNAと呼ばれる小さな(21〜23nt)二本鎖RNAの生産である(13)。小さな二本鎖RNAの細胞内生産における鍵となる酵素はダイサー(Dicer)、長い二本鎖RNAを21〜23ntのユニットに消化するサイトゾルリボヌクレアーゼIIIである(13,17,18)。これらの短い二本鎖RNAは巻き戻されており、2つの鎖のうちの1つは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)と命名される、タンパク質および標的転写体の複合体と会合するようになり、これは、標的RNAの破壊に導く(19)。21〜23ヌクレオチドの合成二本鎖RNA配列(siRNA)がこのプロセスにおいて代わりを務めることができ、かつ培養された哺乳動物細胞における遺伝子機能を特異的にダウンレギュレートする能力を有するという発見(20)は、機能的ゲノミクスプログラムにおいて、および療法においてでさえRNAi概念の適用に対して門戸を開いた。インビボでの初期の研究は、成体マウスにおける外因性および内因性双方の遺伝子発現をダウンレギュレートする合成siRNAおよびトランスジェニックsiRNAの能力を証明した(21,22)。従って、siRNAに起因する潜在的副作用は少しではあるが、インターフェロン系の刺激となって出現する(23,24)。
【０００５】
多くの異なる核酸の送達が広く記載されてきたが、siRNAの送達に対する研究は予備的レベルにある。従って、プラスミドDNA(pDNA)およびオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)を細胞に送達するためのカチオン性脂質/リポソーム系の広く普及した使用にも拘らず(7,9,25〜28)、インビトロまたはインビボいずれかでの、カチオン性脂質/リポソームでのsiRNAの形成、およびその細胞への送達(siFection)に関する文献に報告されたものはほとんどない。siRNAでのカチオン性脂質/リポソーム系の形成に関する基本的研究すら未だ報告されていない。
【０００６】
本発明は、siRNAの非ウイルス送達の改良を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
siRNAの送達に対する研究が依然として予備的なレベルにある1つの理由は、全ての核酸がかなり似ており、匹敵する送達系を用いて匹敵する方法で細胞に送達すべきであるという明らかな混乱ある。例えば、オリゴヌクレオチド(ODN)、pDNAおよびsiRNAの同様な化学的性質のため、siRNAおよびODN/pDNAの処方は同様に挙動し、機械的には、2つの種は同様な特徴を呈すると予測する。
【０００８】
表面的には、これは真実である。pDNAおよびsiRNA双方は同一の負の電荷/ヌクレオチド(nt)比率を持つアニオン性ホスホジエステル骨格を有し、従って、カチオン性リポソーム/脂質系と静電的に相互作用して、核酸を細胞に導入できるカチオン性脂質-核酸(リポプレックス)粒子を形成するはずである。しかしながら、pDNAおよびsiRNAは、そうでなければ、相互に分子量および分子トポグラフィーが非常に異なり、潜在的に重要な結果を伴う。
【０００９】
全てのpDNAは、カチオン性薬剤でのそのホスホジエステル骨格の電荷の70〜90%の中和に引き続いて、60〜100nmの小さなナノ粒子に凝縮する(27〜31)。次いで、カチオン性薬剤凝縮pDNAは、球、トロイドおよびロッドのような、カチオン性凝縮剤に応じた種々の異なる形態で存在できる(27,28)。薬剤にも拘らず、約400ヌクレオチドに対応するpDNA凝縮のための最小サイズがある(32)。そのような挙動は、pDNAがカチオン性薬剤によってほとんど完全に封入され、または包まれ、ナノメーター粒子内での酵素的または物理的分解から保護されることを確実とする(26,33〜40)。
【００１０】
pDNAとは対照的に、siRNAは、既に小さなサブナノメーター核酸であるナノメーター寸法の粒子に凝集することができない。従って、siRNAとカチオン性脂質/リポソーム系の間の静電相互作用は、2つの潜在的な問題を引き起こす。第一に、過剰なサイズおよび貧弱な安定性のsiRNAリポプレックス(LsiR)粒子に導く比較的制御されない相互作用プロセス。第二に、siRNA分子の不完全な封入、それによる細胞への送達に先立ってのsiRNAの潜在的な酵素的または物理的分解。
【００１１】
そのような考慮は、pDNAおよびsiRNAが核酸の完全に異なる種類であることを明瞭とする。
【００１２】
従って、本発明は、部分的には、siRNAおよびポリマーにカップリングしたリポソームを含む非ウイルス送達ベクターが、標的遺伝子をダウンレギュレートするsiRNAの能力を損なうことなく、凝集に対してリポソームを劇的に安定化させるという驚くべき発見に基づく。特に、siRNAを含むリポソームは30〜60nmの平均サイズにて生じさせることができ、これは種々の量のポリマーと共にインキュベートすることができ、これは、ポリマー(例えば、ポリマーの官能基)と脂質との間に共有結合のような結合を形成することができる。
【００１３】
オリゴヌクレオチド(ODN)、pDNAおよびsiRNAの同様な化学的性質のため、siRNAおよびODN/pDNAの処方は同様に挙動し、機械的には、2つの種は同様な特徴を呈すると予測される。換言すれば、ペグ化(PEGylated)siRNA複合体は、低度のペグ化においてでさえ、標的遺伝子のダウンレギュレーションを媒介しないと予測されていた。なぜなら、本明細書において記載の文献は、これらの複合体が内部化されず、エンドソームから逃れられず、またはその生物学的な作用を媒介するのに必要な標的区画/分子を見出さない、のいずれかを示しているからである。
【００１４】
本明細書において示される証拠は、驚くべきことに、そのような仮定がsiRNAに適用されないことを示す。
【００１５】
また、本発明は、部分的には、本明細書において記載の非ウイルスベクターが薬剤(例えば、酸化されたIgG抗体のような標的部分)と共にさらにインキュベートすることができるという驚くべき発見に基づく。いずれかの特定の理論に拘束されるつもりはないが、むしろ、リポソームの表面に露出した脂質の過剰な遊離官能基を被覆するポリマー、非ウイルスベクター上の標的部分のようなリガンドの第二の層が形成されるようである。
【００１６】
本発明の概要局面
第一の局面において、本発明はリポソームを含む非ウイルス送達ベクターに関し、リポソームの一つまたは複数の脂質は、一つまたは複数のポリマーに可逆的にまたは不可逆的にカップリングし、かつリポソームはsiRNAを含む。
【００１７】
第二の局面において、本発明は、リポソームを含む標的化非ウイルス送達ベクターに関し、リポソームの一つまたは複数の脂質は、一つまたは複数のポリマー、および一つまたは複数の薬剤に可逆的にまたは不可逆的にカップリングし、かつリポソームはsiRNAに含む。
【００１８】
第三の局面において、本発明は、本発明の第一の局面による非ウイルス送達ベクター、または本発明の第二の局面による標的化送達ベクターを細胞、組織または器官の環境に提供する工程を含む、siRNAを細胞に送達する方法に関する。
【００１９】
第四の局面において、本発明は、細胞、組織または器官へのsiRNAの送達に用いるための、本発明の第一の局面による非ウイルス送達ベクター、または本発明の第二の局面による標的化送達ベクターに関する。
【００２０】
第五の局面において、本発明は、細胞、組織または器官へのsiRNAの送達用の組成物の製造における、本発明の第一の局面による非ウイルス送達ベクター、または本発明の第二の局面による標的化送達ベクターの使用に関する。
【００２１】
第六の局面において、本発明は、リポソームの一つまたは複数の脂質が一つまたは複数のポリマーに可逆的にまたは不可逆的にカップリングし、かつそのリポソームはsiRNAを含む、リポソームを含む非ウイルス送達ベクターを、調製するためのプロセスであって、(i)siRNAをリポソームに接触させる工程；および(ii)工程(i)において形成されたリポソームをポリマーに可逆的にまたは不可逆的にカップリングさせる工程を含むプロセスに関する。
【００２２】
第七の局面において、本発明は、リポソームの一つまたは複数の脂質が一つまたは複数のポリマーおよび一つまたは複数の薬剤に可逆的にまたは不可逆的にカップリングし、かつそのリポソームはsiRNAを含む、リポソームを含む標的化非ウイルス送達ベクターを、調製するためのプロセスであって、(i)siRNAをリポソームと接触させる工程；(ii)工程(i)で形成されたリポソームをポリマーに可逆的にまたは不可逆的にカップリングさせる工程；および(iii)工程(i)または(ii)で形成されたリポソームと一つまたは複数の薬剤とを可逆的または不可逆的にカップリングさせる工程を含むプロセスに関する。
【００２３】
第八の局面において、本発明は、(i)本発明の第一または第二の局面によるベクターを提供する工程；(ii)任意でベクターを凍結保護剤と接触させる工程；および(iii)ベクターを凍結乾燥する工程を含む方法に関する。
【００２４】
第九の局面において、本発明は、本発明の第八の局面による方法によって得ることができる、または得られた凍結乾燥ベクターに関する。
【００２５】
第十の局面において、本発明は、脂質およびカップリング部分を含むリポソームに関し、脂質とカップリング部分との間の距離は少なくとも1.5nmである。
【００２６】
第十一の局面において、本発明は、本発明の第一の局面による非ウイルス送達ベクター、または本発明の第二の局面による標的化送達ベクター、または第十の局面によるリポソーム、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物に関する。
【００２７】
第十二の局面において、本発明は、本発明の第一の局面による非ウイルス送達ベクター、または本発明の第二の局面による標的化送達ベクター、第十の局面によるリポソーム、または本発明の第十一の局面による薬学的組成物の医療的に有効な量を対象に投与する段階を含む、対象における疾患を治療する方法に関する。
【００２８】
第十三の局面において、本発明は、疾患の治療において用いるための、本発明の第一の局面による非ウイルス送達ベクター、または本発明の第二の局面による標的化送達ベクター、または第十の局面によるリポソームに関する。
【００２９】
第十四の局面において、本発明は、疾患の治療用の組成物の製造における、本発明の第一の局面による非ウイルス送達ベクター、または本発明の第二の局面による標的化送達ベクター、または第十の局面によるリポソームの使用に関する。
【００３０】
第十五の局面において、本発明は、siRNAを含む非ウイルス送達ベクターの調製における、ポリマーにカップリングしたリポソームの使用に関する。
【００３１】
第十六の局面において、本発明は、siRNAを含む標的化非ウイルス送達ベクターの調製における、ポリマーおよび一つまたは複数の薬剤にカップリングしたリポソームの使用に関する。
【００３２】
第十七の局面において、本発明は、実質的に本明細書において記載され、かつ実施例または図面のいずれか1つに参照された非ウイルス送達ベクターまたは標的化非ウイルス送達ベクターに関する。
【００３３】
第十八の局面において、本発明は、実質的に本明細書において記載され、かつ実施例または図面のいずれか1つを参照する方法に関する。
【００３４】
第十九の局面において、本発明は、実質的に本明細書において記載され、かつ実施例または図面のいずれか1つを参照する使用に関する。
【００３５】
第二十の局面において、本発明は、実質的に本明細書において記載され、かつ実施例または図面のいずれか1つを参照するリポソームに関する。
【００３６】
好ましい態様
好ましくは、一つまたは複数のポリマーに可逆的にまたは不可逆的にカップリングするリポソームの一つまたは複数の脂質はリポソームの表面に露出している。
【００３７】
好ましくは、リポソームは式(I)の一つまたは複数のアミノキシ基含有脂質を含む：
2008509205.tif 000002
式中、Bは脂質であり；Xは自由選択の(optional)リンカー基であり、R2はHまたはヒドロカルビル基である。
【００３８】
好ましくは、アミノキシ基含有脂質はコレステリル-(dPEG4)2-アミノキシ脂質(CPA)である。
【００３９】
好ましくは、リポソームは一つまたは複数のカチオン性脂質および/または一つまたは複数の非カチオン性共脂質(co-lipid)を含む。
【００４０】
好ましくは、カチオン性脂質は少なくとも1つの脂環式基を含む。
【００４１】
好ましくは、少なくとも1つの脂環式基はコレステロールである。
【００４２】
好ましくは、カチオン性脂質はN1-コレステリルオキシカルボニル-3,7-ジアザノノナン-1,9-ジアミン(CDAN)である。
【００４３】
好ましくは、非カチオン性共脂質はホスファチジルエタノールアミンである。より好ましくは、非カチオン性共脂質はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)である。
【００４４】
好ましくは、ポリマーは一つまたは複数のアルデヒドおよび/ケトン基を含む。より好ましくは、ポリマーはPEGである。
【００４５】
好ましくは、リポソームは約0.1〜約5%PEGとカップリングしている。
【００４６】
好ましくは、リポソームは一つまたは複数の薬剤を含むか、リポソームは一つまたは複数の薬剤に可逆的にまたは不可逆的にカップリングしている。
【００４７】
好ましくは、標的化非ウイルス送達ベクターの薬剤は糖、炭水化物、およびリガンドからなる群より選択される。
【００４８】
好ましくは、糖はグルコース、マンノース、ラクトース、フルクトース、マルトトリオース、マルトヘプトースからなる群より選択される。
【００４９】
好ましくは、リガンドは抗体である。
【００５０】
好ましくは、本発明の第六の局面によるプロセスは、工程(i)または工程(ii)で形成されたリポソームを一つまたは複数の薬剤と可逆的または不可逆的にカップリングさせるさらなる工程を含む。
【００５１】
好ましくは、凍結保護剤はスクロース、トレハロース、およびラクトースからなる群より選択される。
【００５２】
好ましくは、本発明の第八の局面による方法は、(iv)使用に先立ってベクターを再水和するさらなる工程を含む。
【００５３】
好ましくは、本発明の第十の局面によるリポソームは下記式のものである：
2008509205.tif 000003
式中、Bは脂質であり；Xはリンカー基であり、カップリングはカップリング部分であり、X骨格は少なくとも30個の原子を含む。
【００５４】
好ましくは、X骨格は少なくとも40個の原子を含む。
【００５５】
好ましくは、Xは下記式の基であるか、または下記式の基を含む：
2008509205.tif 000004
式中、nおよびmは独立して0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは2、3、または4、より好ましくは2または4である。
【００５６】
好ましくは、Xは下記式の基であるか、あるいは下記式の基を含む：
2008509205.tif 000005
式中、nおよびmは独立して0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは2、3、または4、より好ましくは2または4である。
【００５７】
好ましくは、Xは下記式の基であるか、あるいは下記式の基を含む：
2008509205.tif 000006
式中、mは0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは1、2、または3、より好ましくは1であり、かつnは0〜20、好ましくは5〜15、より好ましくは10、11、または12、より好ましくは11である。
【００５８】
好ましくは、Xは下記式の基であるか、あるいは下記式の基を含む：
2008509205.tif 000007
式中、mは0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは1、2、または3、より好ましくは1であり、かつnは0〜20、好ましくは5〜15、より好ましくは10、11、または12、より好ましくは11である。
【００５９】
好ましくは、疾患は肝臓病および/または肝臓損傷である。
【００６０】
利点
本発明は多数の利点を有する。これらの利点は以下の記載において明らかである。
【００６１】
その例として、本発明は、非ウイルス媒介方法を用いてsiRNAを送達する方法を提供するので有利である。
【００６２】
さらなる例として、本明細書において記載の非ウイルス送達ベクターは血清耐性であり、分解に対して感受性が低いので本発明は有利である。
【００６３】
さらなる例として、非ウイルス送達ベクターが標的遺伝子をダウンレギュレートするsiRNAの能力を損なうことなく凝集に対して劇的に安定化されるので、本発明は有利である。
【００６４】
さらなる例として、非ウイルス送達ベクターを抗体のようなさらなる薬剤でコートして、siRNAの対象となる特異的部位への送達用の標的化非ウイルス送達ベクターを生じさせることができるので、本発明は有利である。
【００６５】
発明の詳細な記載
siRNA
前記のように、siRNAは、多くの真核生物を通じて保存されている転写後遺伝子調節の方法であるいわゆる「RNA誘導干渉」(RNAi)概念の基礎である。
【００６６】
RNAiは、細胞に存在する短い(典型的には、30未満のヌクレオチド)二本鎖RNA分子によって誘導される(Fire A et al. (1998), Nature 391:806-811)。これらの短いdsRNA分子(またはsiRNA)は、1つのヌクレオチド分解まで、siRNAと配列相同性を共有するメッセンジャーRNAの破壊を引き起こす(Elbashir SM et al. (2001), Genes Dev, 15:188-200)。siRNAおよび標的とされたmRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体に結合し、これは標的とされたmRNAを切断すると考えられている。siRNAは多数代謝回転酵素とよく似て明らかにリサイクルされ、1つのsiRNA分子は約1000のmRNA分子の切断を誘導できる。従って、mRNAのsiRNA媒介RNAi分解は、標的遺伝子の発現を阻害するのに非常に効果的である。
【００６７】
本明細書において記載のsiRNAは、部分的に精製されたRNA、実質的に純粋なRNA、合成RNA、または組換えにより生産されたRNA、ならびに一つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および/または修飾によって天然に生じるRNAとは異なる改変されたRNAを含むことができる。
【００６８】
そのような改変は、siRNAをヌクレアーゼ消化に対して耐性またはよりいっそう耐性とする修飾を含む、例えば、siRNAの末端への、またはsiRNAの一つまたは複数の内部ヌクレオチドへの、修飾されたヌクレオチドのような非ヌクレオチド材料の付加を含むことができる。
【００６９】
多数の異なるタイプの修飾が当技術分野において公知である。これらはメチルホスホナートおよびホスホロチオアート骨格および/または分子の3'および/または5'末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の付加を含む。ヌクレオチド配列は当技術分野において入手できるいずれかの方法によって修飾することもできる。そのような修飾を行って、siRNAのインビボ活性または寿命を増強させることができる。
【００７０】
siRNAの1つまたは双方の鎖は3'突出を含んでいてよい。
【００７１】
従って、siRNAは、例えば、長さが1〜約6のヌクレオチド(これは、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含む)の少なくとも1つの3'突出を含むことができる。siRNA分子の双方の鎖が3'突出を含むならば、突出の長さは各鎖について同一または異なり得る。
【００７２】
siRNAの安定性を増強させるためには、3'突出を分解に対して安定化させることができる。突出は、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドのようなプリンヌクレオチドを含めることによって安定化させることができる。または、修飾されたアナログによるピリミジンヌクレオチドの置換は許容することができ、RNAi分解の効率に影響しない。
【００７３】
典型的には、siRNAは、標的mRNAを標的とする、長さが約19〜25の連続ヌクレオチドのような、長さが約17ヌクレオチド〜約29ヌクレオチドの短い二本鎖RNAを含む単離されたsiRNAの形態ある。siRNAは、標準的なワトソン-クリック塩基対合相互作用によって一緒にアニールされた、センスRNA鎖および相補的なアンチセンスRNA鎖を含む。センス鎖は、標的mRNA内に含まれる標的配列と同一である核酸配列を含む。
【００７４】
本明細書において用いるように、用語「単離されたsiRNA」は、siRNAが改変されているか、あるいはヒト介入を通じて天然状態から取り出されていることを意味する。単離されたsiRNAは実質的に純粋な形態で存在することができ、あるいは例えば、siRNAが送達された細胞のような非天然環境に存在することができる。
【００７５】
siRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は2つの相補的な一本鎖RNA分子を含むことができるか、あるいは2つの相補的な部分が塩基対合し、一本鎖ヘアピンによって共有結合された単一分子を含むことができる。
【００７６】
ヒトmRNAはそれらの各代替スプライス形態、同族体または変異体と共通した標的配列を含むことができる。従って、そのような共通標的配列を含む単一siRNAは、共通の標的配列を含む異なるRNA型のRNAi媒介分解を誘導することができる。
【００７７】
標的mRNAでの標的配列は、当技術分野において種々の方法を用い、標的mRNAに対応する、cDNA配列のような所与の配列より選択することができる。例えば、siRNAの合理的な設計はNat Biotechnol.(2004) 22(3):326-30に記載されている。siRNAは以下のガイドラインに基づいて設計することができる。まず、標的mRNAにおける21ヌクレオチド程度の配列が同定され、これは、AAジヌクレオチドで開始する。各AAを記録し、3'隣接ヌクレオチドは潜在的なsiRNA標的部位として同定される。これは、3'突出UUジヌクレオチドを持つsiRNAが最も効果的であるというElbashirらによる観察に基づく(EMBO J (2001) 20:6877-6888, Nature (2001) 411:494-498.2およびGenes ＆ Dev. (2001) 15:188-200)。しかしながら、3'末端ジヌクレオチド突出を持つsiRNAは、RNAiを効果的に誘導することが示されている。次いで、好ましくは、前記で確認された配列内からの標的部位は、一つまたは複数の以下の基準：(i)30〜50%GC含有量を持つsiRNAの選択；(ii)標的配列における>4のTまたはAのストレッチの回避；(iii)遺伝子配列の長さに沿った異なる位置におけるsiRNA標的部位の選択；および(iv)他のコーディング配列に対する相同性の16〜17より多い連続塩基対を持ついずれの標的配列をも排除、の一つまたは複数を用いてさらに選択される。
【００７８】
siRNA配列は、Kumiko Ui-Tei et al., Nucl. Acids Res. 2004, Vol 32, No.3, p.936-48に記載されているように、オフターゲット(off-target)ダウンレギュレーションを確認するアルゴリズムにまさに由来できる。
【００７９】
選択されたsiRNA配列がサイレンシングのために機能しないならば、以下の工程を用いることができる。遺伝子中の配列決定誤差および可能な多形について検索を行うことができる。siRNAによる標的認識の特異性についての研究は、siRNA二重鎖の対合領域に位置した単一の点突然変異が、標的mRNA分解を止めるのに十分であることを示す。第二および/または第三の標的も選択することができ、対応するsiRNAを調製し、テストすることができる。
【００８０】
siRNAサイレンシングはmRNAにおける単一標的を選択することによって大いに有効であるが、2つの独立したsiRNA二重鎖を設計し、それを使用して、サイレンシング効果の特異性を制御することが望ましい。
【００８１】
当業者に公知の多数の技術を用いてsiRNAを得ることができる。例えば、siRNAは、適当に保護されたリボヌクレオチドホスホルアミダイトおよび慣用的なDNA/RNA合成機を用いて化学的に合成することができる。siRNAは2つの別々の相補的なRNA分子として、あるいは2つの相補的領域を持つ単一のRNA分子として合成することができる。
【００８２】
siRNAの設計のためのさらなる方法は、例えば、QIAGEN、AmbionおよびOcimum Biosolutionsのウェブサイトで見出すことができる。
【００８３】
siRNAは、Dharmacon (USA)およびQiagen GmbH (Hilden, Germany)のようないくつかの会社から購入することもできる。
【００８４】
siRNAは、標識までもすることができる。その例として、siRNAは3'-FITC標識抗GFPで標識することができる。
【００８５】
siRNAは、当技術分野において公知の方法を用いて組換えにより生産することができる。例えば、siRNAは、いずれかの適当なプロモーターを用いて組換え環状または線状DNAプラスミドから発現させることができる。本発明の組換えプラスミドは、特定の組織における、または特定の細胞内環境におけるsiRNAの発現のための誘導性または調節可能プロモーターを含むこともできる。
【００８６】
組換えプラスミドから発現されるsiRNAは標準的な技術によって培養された細胞発現系から単離することができる。siRNAは、2つの別々の相補的なRNA分子として、あるいは2つの相補性領域を持つ単一RNA分子として組換えプラスミドから発現させることができる。
【００８７】
本発明のsiRNAを発現するのに適したプラスミドの選択、siRNAを発現させるための核酸配列を挿入するための方法、およびsiRNAを得る方法は、例えば、Science (2002) 296:550-553；Nat. Biothechnol. (2002) 20:497-500；Genes Dev. (2002), 16:948-958；Nat. Biothechnol. (2002) 20:500-505；およびNat. Biothechnol. (2002) 20:505-508に記載されている。
【００８８】
siRNA配列は、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、作成された免疫グログリン様分子、単一鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫共刺激分子、免疫変調分子、標的タンパク質のトランス優性陰性変異体、トキシン、条件トキシン、抗原、腫瘍サプレッサータンパク質、成長因子、膜タンパク質、血管活性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質および/またはリボザイムのような治療および/または診断適用のものを含むことができる。
【００８９】
標的mRNAは、カスパーゼ-3を刺激するのに用いられ、その結果、siRNAをトランスフェクトした細胞株においてアポトーシスの開始をもたらす抗アポトーシスタンパク質リビン-2(U73857)であってよく、またはそれに由来することができる。このmRNAを標的とするそのようなsiRNA配列の1つの例は
2008509205.tif 000008
である。
【００９０】
標的mRNAはHBV、HCVおよび/またはP-pgであってよく、あるいはそれに由来することができる。
【００９１】
siRNAは、HBV、HCVおよび/またはP-糖タンパク質であるか、またはそれに由来する標的mRNAを標的とすることができる。
【００９２】
特に、B型肝炎ウイルスの配列はB型肝炎ウイルス分離株2-AII-BR大Sタンパク質(S)遺伝子(アクセッション番号AY344099.1)；B型肝炎ウイルス分離株6-AIII-BR大Sタンパク質(S)遺伝子(アクセッション番号AY344104.1)；B型肝炎ウイルス分離株j13小表面タンパク質(S)遺伝子(アクセッション番号AY639927.1)；B型肝炎ウイルス分離株j7小表面タンパク質(S)遺伝子(アクセッション番号AY639924.1)；B型肝炎ウイルス分離株17993(アクセッション番号AY217367.1)；および/またはB型肝炎ウイルス分離株Q7-1(アクセッション番号AY217365.1)を含む。
【００９３】
好ましくは、HBV siRNA配列はHBVコア遺伝子の保存された配列に対して向けられる。より好ましくは、HBV siRNA配列は、
2008509205.tif 000009
からなる群より選択される。配列は、HBVコア遺伝子の保存された配列に対して向けられたGPboostアルゴリズムを用いて得られた。これらの19nt RNA配列の全ては、双方の3'鎖において2つのDNA塩基対dTdT突出を設けて、Dharmacon(Colorado, USA)によって化学的に合成された。全ての配列をPAGEで精製した。配列IA3は、インビトロおよびインビボにおけるHBV表面抗原のダウンレギュレーションの潜在的パターンを明らかにした(結果は示さず)。
【００９４】
C型肝炎ウイルスは肝臓関連罹患率および死亡率の主な原因の1つである。ウイルスは肝臓における執拗な感染を確立し、例えば、慢性肝炎、肝硬変および肝細胞癌の発生に導く。満足すべき治療は未だ開発されておらず、現在の治療、リバビリンと組み合わせたインターフェロンは患者の50%近くで失敗する。HCVウイルスは、構造および非構造タンパク質をコードする単一の長いオープンリーディングフレームを含む陽性標準RNAウイルスである。ウイルスゲノムの翻訳は、全てのウイルス株の99.6%においてやはり保存されている、5'末端における非翻訳領域(5'-UTR；アクセッション番号D31603)に位置する内部リボソーム進入部位(IRES)によって分解される。従って、それはsiRNA薬物についての理想的な標的を構成する。同様に、3'-UTR(アクセッション番号D63922)は高度に保存されており、インビボにてウイルス複製についての重要な役割を呈することが示されている。
【００９５】
C型肝炎ウイルスの配列はヒト肝炎ウイルスCキャプシドおよびエンベロープ：xタンパク質(アクセッション番号M55970.1)；全てのHCV分離株を通じて保存された5'-UTR領域(341nt)(アクセッション番号M55970.1)；および/またはNS3、NS4、NS5A、およびNS5Bのような非構造タンパク質を含む。
【００９６】
C型肝炎ウイルスの配列はC型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼの修飾された形態(アクセッション番号BD270935.1)を含む。
【００９７】
好ましくは、一つまたは複数のsiRNA配列はHCVの5'末端における非翻訳領域(5'-UTRアクセッション番号D31603)または3'-UTR(アクセッション番号D63922)に向けられる。より好ましくは、HCV配列は、
2008509205.tif 000010
からなる群より選択される。
【００９８】
これらの19nt RNA配列の全ては、双方の3'鎖において2つのDNA塩基対dTdT突出を設けて、Dharmacon(Colorado, USA)によって化学的に合成された。全ての配列はPAGE精製された。個々の配列の有効性を、Yokota et al., EMBO Reports 4, 6, 2003, 602ffによって記載されたsiRNA331(5'-GGUCUCGUAGACCGUGCAC)と比較した。
【００９９】
P-糖タンパク質(MDR1遺伝子産物)の配列はヒトP-糖タンパク質(ABCB1)(アクセッション番号AF399931.1)を含む。
【０１００】
また、本発明の範囲内には、本明細書において記載のヌクレオチド配列の変種、ホモログ、断片および誘導体が含まれる。
【０１０１】
好ましい態様において、siRNAは、例えば、HBV、HCVおよびP-pgタンパク質である、またはそれに由来する標的mRNAを標的とする、長さが約19〜25連続ヌクレオチドのような長さが約17ヌクレオチド〜約29ヌクレオチドからの短い二本鎖RNAを含む単離されたsiRNAの形態である。
【０１０２】
リポソーム
リポソームは、典型的には、封入された水性容量を含有する脂質二層膜を含む完全に閉じた構造である。リポソームは水性相(多重膜ベシクルまたはMLV)によって分離された多くの同心円脂質二層を含むことができるか、または、それらは単一の膜二層(単層ベシクル)を含むことができる。脂質二層は、疎水性「テイル」領域および親水性「ヘッド」領域を有する2つの脂質単分子層から構成される。膜二層において、脂質単分子層の疎水性(非極性)「テイル」は二層の中心に向けられ、他方親水性(極性)「ヘッド」は水性相に向けられる。
【０１０３】
本明細書において記載のリポソームで用いることができる脂質成分は一般には文献に記載される。一般に、これらはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジル酸、ホスファチジルイノシトールのようなリン脂質および/またはスフィンゴ脂質である。さらなる成分、例えば、コレステロールのようなステロール、あるいは脂肪酸(例えば、ステアリン酸、パルミチン酸)、リン酸ジエチルまたはコレステロールヘミスクシナートのような他の成分を用いることができる。さらに、リポソーム膜は保存剤を含有することもできる。リポソーム膜は、それらの分散挙動を修飾する成分を含有することもできる。それらは、例えば、ホスファチジルエタノールアミンのペグ化誘導体、GM1のような脂質、またはデキストランのパルミチン酸またはステアリン酸エステルのような糖および疎水性成分のコンジュゲートを含む。
【０１０４】
リポソームの基本的な構造は、当技術分野において公知の種々の技術によって作成することができる。
【０１０５】
例えば、リポソームは、典型的には、Banghamら(1965 J. Mol. Biol., 13:238-252)のプロセスを用いて調製されてきたが、それにより、有機溶媒に懸濁された脂質を、反応容器中で、減圧下で蒸発させて、乾燥したフィルムとする。次いで、適当な量の水性相を容器に加えて、混合物を攪拌する。次いで、混合物を、多重膜ベシクルが形成されるのに十分な時間の間、実質的に乱さずに放置する。
【０１０６】
リポソームは、多数の現在利用できる技術を用いて再現性よく調製することができる。多数のこれらの技術を用いて製造することができるリポソームの型は小さな単層ベシクル(SUV)[Papahadjapoulous and Miller, Biochem. Biophys. Acta., 135, p.624-638 (1967)参照]、逆相蒸発ベシクル(REV)[1980年11月25日に発行された米国特許第4,235,871号参照]、安定なプルリラメラーベシクル(SPLV)[1985年6月11日に発行された米国特許第4,522,803号参照]、および「Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesicles」という発明の名称の、Cullisらの1984年6月20日に出願された同時係属米国特許出願第622,690号に記載された押出し技術によって製造された大きな単層ベシクルを含む。
【０１０７】
好ましい態様においては、リポソームは以下の方法を用いて調製される。脂質は、硝酸および二塩化ジチメルシリルで予備処理した丸底フラスコへ、例えば、各々、CDAN、DOPEおよびアミノキシ脂質(CPA)のストック溶液の適当な量をピペットで入れ、溶媒を蒸発させ、次いで、ボルテックスによる激しい撹拌下で乾燥脂質フィルムを水で水和して、多重膜リポソームを生じさせることによって調製される。
【０１０８】
単層リポソームは、多重膜リポソームを30分間音波処理することによって製造できる。好ましくは、これは、約30nmよりも小さなサイズに到達するまで継続する。
【０１０９】
リポソームにsiRNAを加えるために、水中のsiRNAの溶液をボルテックスによる激しい撹拌下でこれらのリポソームに滴下する。好ましくは、これを、約0.1mg/mLの最終siRNA濃度に到達するまで継続する。
【０１１０】
得られたsiRNAリポプレックスは、典型的には、PCSによって測定された約30〜50nmの直径が尺度となる。
【０１１１】
本明細書において記載のベクターは凍結乾燥することができる。好ましくは、ベクターは凍結乾燥される。従って、さらなる局面において、(i)本明細書において記載のベクターを提供する工程；(ii)任意で、ベクターを凍結保護剤と接触させる工程；および(iii)ベクターを凍結乾燥する工程を含む方法が提供される。
【０１１２】
有利には、凍結乾燥されたベクターは長期間貯蔵することができる。貯蔵に続き、ベクターは使用に先立って水中で再水和することができる。
【０１１３】
有利には、スクロース、トレハロースおよびラクトースのような低温発生剤の存在下での凍結乾燥は、サイズ(PCS)および活性の項目においてベクターを損なわない。驚くべきことに、トレハロースの存在下で凍結乾燥されたベクターは、新たに調製されたベクターよりもいっそう優れていることが判明した。
【０１１４】
ポリマーは、例えば、1mg/mLにおいて、例えば、ポリエチレングリコール-α/γ-ビスアルデヒド(各々、Mw 2000または3400；NEKTAR, USA)の溶液を用いて加える。次いで、適当な量のポリマーをボルテックスによる撹拌下でsiRNAリポプレックスに加える。典型的には、この結果、種々の量のポリマーを持つ、共有結合により表面がペグ化されたsiRNAリポプレックスがもたらされる(例えば、0.1〜5%、m/m合計脂質)。容量の半分は減圧化で蒸発させることができ、使用、例えば、動物への注射に先立って、PBSの添加によって補うことができる。
【０１１５】
また、放射性標識、染料、化学発光および蛍光マーカー；コントラスト媒体；イメージング助剤；薬剤等を含む診断マーカーのようなリポソームにおける他の成分を含めるのがやはり望ましい。
【０１１６】
リポソームは、好ましくは、式(I)の一つまたは複数のアミノキシ基含有脂質を含む：
2008509205.tif 000011
式中、Bは脂質であり；Xは自由選択のリンカー基であり、およびR2はHまたはヒドロカルビル基である。好ましい脂質は、国際(PCT)特許出願番号PCT/GB01/05385のものである。
【０１１７】
ここで、式(I)の関係で用語「ヒドロカルビル基」は、少なくともCおよびHを含む基を意味し、任意で、一つまたは複数の他の適当な置換基を含むことができる。そのような置換基の例はハロ、アルコキシ、ニトロ、アルキル基、環状基などを含むことできる。環状基である置換基の可能性に加えて、置換基の組合せは環状基を形成することができる。ヒドロカルビル基が1より多いCを含むならば、炭素は相互に必ずしも連結される必要はない。例えば、炭素の少なくとも2つは適当なエレメントまたは基を介して連結することができる。従って、ヒドロカルビル基はヘテロ原子を含むことができる。適当なヘテロ原子は当業者に明らかであり、例えば、硫黄、窒素および酸素を含む。ヒドロカルビル基の非限定的例はアシル基である。
【０１１８】
典型的なヒドロカルビル基は炭化水素基である。本明細書において、用語「炭化水素」は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基のいずれか1つを意味し、その基は線状、分岐または環状、あるいはアリール基であり得る。用語「炭化水素」は、それらが任意で置換されている以外はそれらの基を含む。炭化水素がその上に置換基を有する分岐構造であれば、置換は炭化水素骨格上または分岐上のいずれかに存在することも；または、置換は炭化水素骨格上および分岐上に存在することもあり得る。
【０１１９】
ヒドロカルビル/炭化水素/アルキルは、直鎖でもまたは分岐鎖でもよく、および/または飽和でもまたは不飽和でもよい。
【０１２０】
1つの好ましい局面において、ヒドロカルビル/炭化水素/アルキルは、基において少なくとも1つのへテロ原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素基より選択することができる。
【０１２１】
1つの好ましい局面において、ヒドロカルビル/炭化水素/アルキルは少なくとも2つの炭素を含むヒドロカルビル基であってもよく、または、炭素およびヘテロ原子の合計数は少なくとも2である。
【０１２２】
1つの好ましい局面において、ヒドロカルビル/炭化水素/アルキルは、基において少なくとも1つのへテロ原子を含有するヒドロカルビル基より選択することができる。好ましくは、ヘテロ原子は硫黄、窒素および酸素より選択される。
【０１２３】
1つの好ましい局面において、ヒドロカルビル/炭化水素/アルキルは、基において少なくとも1つのへテロ原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素基より選択することができる。好ましくは、ヘテロ原子は硫黄、窒素および酸素より選択される。
【０１２４】
1つの好ましい局面において、ヒドロカルビル/炭化水素/アルキルは、基における少なくとも1つのへテロ原子を含有する、直鎖または分岐鎖アルキル基、好ましくはC1-10アルキル、より好ましくはC1-5アルキルより選択することができる。好ましくは、ヘテロ原子は硫黄、窒素および酸素より選択される。
【０１２５】
1つの好ましい局面において、ヒドロカルビル/炭化水素/アルキルは、基において少なくとも1つのへテロ原子を含有する、直鎖アルキル基、好ましくはC1-10アルキル、より好ましくはC1-5アルキルより選択することができる。好ましくは、ヘテロ原子は硫黄、窒素および酸素より選択される。
【０１２６】
ヒドロカルビル/炭化水素/アルキルは、
・C1-10ヒドロカルビル
・C1-C5ヒドロカルビル
・C1-C3ヒドロカルビル
・炭化水素基
・C1-C10炭化水素
・C1-C5炭化水素
・C1-C3炭化水素
・アルキル基
・C1-C10アルキル
・C1-C5アルキル
・C1-C3アルキル
から選択することができる。
【０１２７】
ヒドロカルビル/炭化水素/アルキルは、直鎖でもまたは分岐鎖でもよく、および/または飽和でもまたは不飽和でもよい。
【０１２８】
ヒドロカルビル/炭化水素/アルキルは、基において少なくとも1つのヘテロ原子を含有する直鎖または分岐鎖の炭化水素基であり得る。
【０１２９】
好ましくは、R2はHまたはヒドロカルビル基である。
【０１３０】
好ましい局面において、R2ヒドロカルビル基は、O、Nおよびハロゲンより選択される自由選択のヘテロ原子を含有する。
【０１３１】
好ましい局面において、R2はHである。
【０１３２】
好ましくは、脂質はコレステロール基であるか、またはコレステロール基に由来し、またはコレステロール基を含む。
【０１３３】
コレステロール基は、コレステロールまたはその誘導体でよく、またはそれに由来していてもよい。
【０１３４】
コレステロール誘導体の例は、置換された誘導体を含み、ここで、環状CH2またはCH基の一つまたは複数および/または直鎖CH2またはCH基の一つまたは複数は適当に置換されている。または、あるいは加えて、環状基の一つまたは複数および/または直鎖基の一つまたは複数は不飽和であり得る。
【０１３５】
好ましい態様において、コレステロール基は、コレステロールである。
【０１３６】
好ましい局面において、自由選択のリンカーXが存在する。
【０１３７】
好ましい局面において、Xはヒドロカルビル基である。
【０１３８】
好ましい局面において、リンカーXはポリアミン基を含むか、またはポリアミン基を介して脂質に連結される。
【０１３９】
ポリアミン基はDNA結合能力および得られたリポソームの遺伝子導入の効率を増加させるので、それは有利であると考えられる。
【０１４０】
1つの態様において、好ましくは、ポリアミン基は天然に生じないポリアミンである。好ましくは、本発明のポリアミン基のアミン基の2つまたはそれ以上は、天然に生じるポリアミン化合物のアミン基を分離する天然では見い出されない一つまたは複数の基によって分離される(すなわち、好ましくは、本発明のポリアミン基は非天然間隔を有する)。
【０１４１】
好ましくは、ポリアミン基は、エチレン(-CH2CH2-)基によって相互から分離される(相互から間隔が設けられる)ポリアミン基の少なくとも2つのアミンを含有する。
【０１４２】
好ましくは、ポリアミン基のアミンの各々はエチレン(-CH2CH2-)基によって分離される(相互から間隔が設けられる)。
【０１４３】
1つの好ましい局面において、Xは下記式の基であるか、または下記式の基を含む：
2008509205.tif 000012
式中、nおよびmは独立して0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは2、3、または4、より好ましくは2または4である。非常に好ましい局面において、mは2であり、かつnは4である。
【０１４４】
1つの好ましい局面において、Xは下記式の基であるか、または下記式の基を含む：
2008509205.tif 000013
式中、nおよびmは独立して0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは2、3、または4、より好ましくは2または4である。非常に好ましい局面において、mは2であり、かつnは4である。
【０１４５】
1つの好ましい局面において、リポソームは下記式のものである：
2008509205.tif 000014
式中、Bは脂質であり、nおよびmは独立して0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは2、3、または4、より好ましくは2または4である。非常に好ましい局面においては、mは2であり、かつnは4である。
【０１４６】
1つの好ましい局面において、Xは下記式の基であるか、または下記式の基を含む：
2008509205.tif 000015
式中、mは0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは1、2、または3、より好ましくは1であり、nは0〜20、好ましくは5〜15、より好ましくは10、11、または12、より好ましくは11である。
【０１４７】
1つの好ましい局面において、Xは下記式の基であるか、または下記式の基を含む：
2008509205.tif 000016
式中、mは0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは1、2、または3、より好ましくは1であり、nは0〜20、好ましくは5〜15、より好ましくは10、11、または12、より好ましくは11である。
【０１４８】
1つの好ましい局面において、リポソームは下記式のものである：
2008509205.tif 000017
式中、Bは脂質であり、mは0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは1、2、または3、より好ましくは1であり、nは0〜20、好ましくは5〜15、より好ましくは10、11、または12、より好ましくは11である。
【０１４９】
適当なポリアミンの典型的な例はスペルミジン、スペルミン、カルドペンタミン、ノルスペルミジン、およびノルスペルミンを含む。別の好ましいポリアミンはカルドペンタミンである。
【０１５０】
非常に好ましい態様において、アミノキシ基含有脂質はCPAである。
【０１５１】
好ましくは、リポソームは一つまたは複数のカチオン性脂質を含む。
【０１５２】
種々のカチオン性脂質は当技術分野において公知である。そのようなカチオン性脂質の例示的構造は国際公開公報第95/02698号の表1に提供されている。
【０１５３】
一般には、一価または多価いずれかのいずれのカチオン性脂質も使用できる。
【０１５４】
多価カチオン性脂質は一般に好ましい。
【０１５５】
カチオン性脂質は、アミン、アミドまたはその誘導体の飽和および不飽和アルキルおよび脂環式エーテルおよびエステルを含む。カチオン性脂質の直鎖および分岐鎖アルキルおよびアルケン基は1〜約25個の炭素原子を含むことができる。好ましい直鎖または分岐鎖のアルキルまたはアルケン基は6個またはそれ以上の炭素原子を有する。脂環式基は約6〜30個の炭素原子を含有することができる。好ましい脂環式基はコレステロールおよび他のステロイド基を含む。カチオン性脂質は、とりわけ、塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物、アセタート、トリフルオロアセタート、スルファート、ニトリット(nitrite)、およびニトラートを含む種々の対イオン(アニオン)で調製することができる。
【０１５６】
周知のカチオン性脂質は塩化N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウム(DOTMA)である。
【０１５７】
DOTMAおよび類似のジエステルDOTAP(1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3(トリメチルアンモニウム)プロパン)は市販されている。
【０１５８】
DOTMAに構造的に関連するさらなるカチオン性脂質は米国特許第4,897,355号に記載されている。
【０１５９】
DOTMAおよびDOTAPに関連するカチオン性脂質のもう1つの有用な群は、通常、DORIエーテルまたはDORIエステルと呼ばれる。DORI脂質は、トリメチルアンモニウム基のメチル基の1つがヒドロキシエチル基で置き換えられている点で、DOTMAおよびDOTAPとは異なる。DORI脂質のオレオイル基はパルミトイルまたはステアロイル基のような他のアルキルまたはアルケン基で置き換えることができる。DORI型脂質のヒドロキシル基は、例えば、カルボキシスペルミンのような、アミンへのエステル化のためのさらなる官能性化のための部位として用いることができる。
【０１６０】
本発明の送達ベクターまたは複合体で使用することができるさらなるカチオン性脂質は、細胞のトランスフェクションで有用な国際公開公報第91/15501号に記載されたものを含む。
【０１６１】
コレステロールがトリアルキルアンモニウム基に連結された3β[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)のようなカチオン性ステロール誘導体もまた本発明で使用することができる。DC-Cholは、いくつかの細胞株に対してDOTMA含有リポソームよりも効果的なトランスフェクションおよび低い毒性を提供すると報告されている。国際公開公報第97/45442号に記載されたもののようなDC-Cholポリアミン変種も使用することができる。
【０１６２】
カルボキシスペルミンを含有するポリカチオン性脂質もまた、本発明の送達ベクターまたは複合体で有用である。EP-A-304111は、5-カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシル-アミド(DOGS)およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン5-カルボキシスペルミルアミド(DPPES)を含むカルボキシスペルミン含有カチオン性脂質を記載する。さらなるカチオン性脂質は、各々、DOGSおよびDPPESのオクタデシルおよびパルミトイル基を他のアルキルまたはアルケン基で置き換えることによって得ることができる。
【０１６３】
好ましい態様において、カチオン性脂質は、アミン、アミドまたはその誘導体の少なくとも1つの飽和または不飽和脂環式エーテルまたはエステルを含む。脂環式基は約6〜30個の炭素原子を含有することができる。非常に好ましい脂環式基はコレステロールである。
【０１６４】
従って、非常に好ましい態様において、ポリカチオン性脂質はコレステロールベースの脂質である。
【０１６５】
好ましくは、コレステロールベースの脂質はN1-コレステリルオキシカルボニル-3,7-ジアザノノナン-1,9-ジアミン(CDAN)である：
2008509205.tif 000018
式中、Cholは下記式の基を示す。
2008509205.tif 000019
【０１６６】
好ましくは、本明細書において記載のリポソームは、リポソームまたは脂質凝集体を形成するための非カチオン性共脂質、好ましくは中性脂質を含む。
【０１６７】
本発明で有用な中性脂質は、とりわけ、レシチン；DOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)、POPE(パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン)およびDSPE(ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン)のようなホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルコリン；DOPC(ジオレオイルホスファチジルコリン)、DPPC(ジパルミトイルホスファチジルコリン)、POPC(パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン)およびDSPC(ジステアロイルホスファチジルコリン)のようなホスファチジルコリン；ホスファチジルグリセロール；DOPG(ジオレオイルホスファチジルグリセロール)、DPPG(ジパルミトイルホスファチジルグリセロール)、およびDSPG(ジステアロイルホスファチジルグリセロール)のようなホスファチジルグリセロール；ジオレオイル-またはジパルミトイルホスファチジルセリンのようなホスファチジルセリン；ジホスファチジルグリセロール；脂肪酸エステル；グリセロールエステル；スフィンゴ脂質；カルドリピン；セレブロシド；およびセラミド；およびその混合物を含む。中性脂質はコレステロールおよび他の3DOH-ステロイルを含む。
【０１６８】
好ましくは、非カチオン性共脂質はホスファチジルエタノールアミンである。より好ましくは、非カチオン性共脂質は、DOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)である。
【０１６９】
1つの好ましい局面において、脂質はイメージング適用で用いるのに適した脂質である。イメージング脂質は蛍光脂質、磁気共鳴イメージング脂質、核磁気共鳴イメージング脂質、電子顕微鏡およびイメージ処理脂質、電子スピン共鳴脂質および放射性イメージング脂質より選択される脂質であり得る。これらのクラスの各々における適当かつ好ましい脂質を以下に提示する。
【０１７０】
蛍光脂質：
例えば、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(5-ジメチルアミノ-1-ナフタレンスルホニル、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(1-ピレンスルホニル)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(カルボキシフルオレセイン)、1-オレオイル-2-[6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンズオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル]-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン、25-{N-[(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)-メチル]アミノ}-27-ノルコレステロール、-オレオイル-2-[6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンズオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル]-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(リスアミンローダミンBスルホニル)。
【０１７１】
磁気共鳴イメージングおよび核磁気共鳴イメージングのための脂質：
Gd-DTPA-ビス(ステアリルアミド)(Gd-BSA)；Gd-DTPA-ビス(ミリスチルアミド)(GdDTPA-BMA)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンジエチレントリアミンペンタアセタート：Gd3+(DMPEDTPA:Gd3+)；D35-1,2-ジヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン。
【０１７２】
電子顕微鏡およびイメージ処理：
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-{[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノジ酢酸]スクシニル}-(ニッケル塩)。
【０１７３】
電子スピン共鳴：
1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホテンポコリン、1-パルミトイル-2-ステアロイル(n-DOXYL)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン。
【０１７４】
放射性イメージング：
(99m)Tc-DTPA-ビス(ステアリルアミド)；(99m)Tc-DTPA-ビス(ミリスチルアミド)。
【０１７５】
さらに、一つまたは複数の両親媒性化合物を任意で取り込んで、その表面特性を修飾することもできる。本発明で有用な両親媒性化合物は、とりわけ、GLU4およびGLU7のようなネオ糖脂質、N-(O-メトキシ(ポリオキシエチレン)オキシカルボニル)ホスファチジルエタノールアミン、N-モノメトキシ(ポリオキシエチレン)スクシニルホスファチジルエタノール-アミンおよびポリオキシエチレンコレステリルエーテルのようなポリエチレングリコール脂質；アルキルグリコシド、アルキルメチルグルカミド、スクロースエステル、アルキルポリグリセロールエーテル、アルキルポリオキシエチレンエーテル、およびアルキルソルビタンオキシエチレンエーテルおよびステロイド系オキシエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーのようなブロックコポリマーを含む。
【０１７６】
従って、本発明の好ましい態様において、リポソームは一つまたは複数のアミノキシ基含有脂質、一つまたは複数のカチオン性脂質(より好ましくは、一つまたは複数のポリカチオン性脂質)、および一つまたは複数の非カチオン性共脂質(より好ましくは、中性脂質)を含む。
【０１７７】
より好ましくは、リポソームは式(I)の一つまたは複数のアミノキシ基含有脂質(好ましくは、CPA)および/またはその混合物；DOTMA、DOTAP、DORIエーテルまたはDORIエステル、(DC-Chol)、DOGS、DPPES、および/またはCDAN、および/またはその混合物からなる群より選択される一つまたは複数のポリカチオン性脂質；およびDOPE、POPE、DSPE、DOPC、DPPC、DSPC、DOPG、DPPG、DSPG、ポスファチジルセリン、ジホスファチジルグリセロール、脂肪酸エステル、グリセロールエステル、スフィンゴ脂質、カルドリピン、セレブロシドからなる群より選択される一つまたは複数の中性脂質；および/またはセラミド；および/またはその混合物を含む。
【０１７８】
より好ましくは、リポソームはCPA、CDANおよびDOPEからなる群より選択される一つまたは複数の脂質を含む。
【０１７９】
最も好ましくは、リポソームはCPA、CDANおよびDOPEを含む。
【０１８０】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明に従って用いる特定のリポソームが特別な利点を有することを見い出した。これらの利点は、siRNAを含む本送達ベクターのみならず、広い範囲の系に適用可能である。本発明者らは、最小の長さを有するリンカーを介してカップリング部分に連結された脂質を含む本リポソームが、標的化送達ベクターの調製を可能とすることを確認した。特に、そのようなリポソームを用いて、いくつかのリポソームが一つまたは複数のポリマーにカップリングし、かつ最小長さのリンカーを有するリポソームのカップリング部分(「長いリンカー」)が、ポリマーによって作り出されるシェルを超えて突出するベクターを調整することができる。次いで、長いリンカーを含むリポソームの突出カップリング部分を用いて、さらなる基にカップリングさせることができ、例えば、突出カップリング部分を用いて、抗体のような標的部分へカップリングさせることができる。
【０１８１】
従って、さらなる局面において、本発明は脂質およびカップリング部分を含むリポソームを提供し、ここで、脂質とカップリング部分の間の距離は少なくとも1.5nmである。好ましくは、脂質とカップリング部分の間の距離は少なくとも2nm、例えば少なくとも3nmまたは少なくとも5nmである。
【０１８２】
さらなる局面において、本発明は下記式のリポソームを提供する：
2008509205.tif 000020
式中、Bは脂質であり；Xはリンカー基であり、カップリングはカップリング部分であり、X骨格は少なくとも30個の原子を含む。
【０１８３】
用語「X骨格」とは、カップリングへのXの結合と、BへのXの結合との間のX部分内での直接的に結合した原子の最も短い鎖を意味する。
【０１８４】
好ましくは、X骨格は少なくとも40個の原子、例えば少なくとも60個の原子、例えば少なくとも50個の原子を含む。
【０１８５】
好ましくは、X骨格は少なくとも40個の炭素原子、例えば少なくとも60個の炭素原子、例えば少なくとも50個の炭素原子を含む。
【０１８６】
例として、本明細書において記載されるコレステリルアミノキシ脂質4は酸化されたIgG抗体をコンジュゲートするのに成功していない。なぜなら、コレステリル部分とアミノキシ官能基との間のスペーサーは十分に長くないからである。しかしながら、それは首尾よくポリエチレングリコール-ビスアルデヒド(Mw 2000および3400)をカップリングさせる。
【０１８７】
脂質Bは本明細書において記載のいずれの脂質であってもよい。特に好ましいのはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)のようなリン脂質、コレステロールのようなステロイドベースの脂質、ジシクロヘキシルアミンのようなアミンベースの脂質より選択される脂質である。
【０１８８】
リンカーXは本明細書において記載のいずれのリンカーであってもよい。リンカーとは、典型的には、非反応性リンカーを意味すると理解される。好ましくは、リンカーは親水性である。
【０１８９】
リンカーは、
・オクタデシル基のようなヒドロカルビル基
・ポリグリシンのようなペプチド由来のもの
・ポリ(エチレンカルボナート)、ポリエチレングリコール(PEG)、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド(HMPA)、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)、ポリ(D,L-ラクチド)(PLA)、およびポリ(グリコリド)(PGA)のようなポリマー
・デキストラン、ポリマンノース、ヒアルロン酸、オリゴ糖、デキストラン、プルランのような炭水化物
であり得る。
【０１９０】
いくつかの局面において、リンカーはそれ自体が化学的に反応性であってよく、例えば、リンカーはポリ(リシン)(PL)またはポリ(グルタミン酸)のようなペプチド由来であってよい。
【０１９１】
1つの好ましい局面において、Xは下記式の基であるか、下記式の基を含む：
2008509205.tif 000021
式中、nおよびmは独立して0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは2、3、または4、より好ましくは2または4である。非常に好ましい局面において、mは2であり、かつnは4である。
【０１９２】
1つの好ましい局面において、Xは下記式の基であるか、下記式の基を含む：
2008509205.tif 000022
式中、nおよびmは独立して0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは2、3、または4、より好ましくは2または4である。非常に好ましい局面において、mは2であり、かつnは4である。
【０１９３】
1つの好ましい局面において、Xは下記式の基であるか、または下記式の基を含む：
2008509205.tif 000023
式中、mは0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは1、2、または3、より好ましくは1であり、nは0〜20、好ましくは5〜15、より好ましくは10、11、または12、より好ましくは11である。
【０１９４】
1つの好ましい局面において、Xは下記式の基であるか、または下記式の基を含む：
2008509205.tif 000024
式中、mは0〜6、好ましくは1〜6、より好ましくは1、2、または3、より好ましくは1であり、nは0〜20、好ましくは5〜15、より好ましくは10、11、または12、より好ましくは11である。
【０１９５】
カップリングは本明細書において記載のいずれのカップリング部分であってもよい。特に好ましいのは求核性基、特に、アミン、チオール、アルコール、アミノキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、アジド、親電子基、特に、イソチオシアナート、アルデヒド、ケトン、イソシアナート、マレイミド、マイケル受容体、一般に、ハライド、トシラート、化学的脱離基、一般に、活性なエステル、光連結基(photoligative group)、特にアジドである。
【０１９６】
ポリマー
本明細書において用いるように、用語「ポリマー」とは、リポソームに含有される一つまたは複数の脂質と相互作用する、それに結合する、またはそれとカップリングする一つまたは複数の官能基を含むいずれのポリマーもいう。
【０１９７】
ポリマーは天然に生じるポリマーまたはその誘導体であってよい。
【０１９８】
ポリマーは化学的に修飾されたポリマーであってよく、そこでは、ポリマーは一つまたは複数の官能基を含むように修飾されている。
【０１９９】
より好ましい態様において、リポソームの一つまたは複数の脂質は、一つまたは複数のポリマーにカップリングしている。有利には、ポリマーにカップリングする脂質は、ポリマーがリポソーム表面に残るように、リポソームの表面に露出している。いかなる特定の理論にも拘束されることはないが、ポリマーは、リポソームの脂質とポリマーとの間の複数の相互作用を介してリポソームの表面を効果的にコートすると考えられる。
【０２００】
脂質とポリマーの間のカップリングは、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水性相互作用、共有結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、または双極子相互作用のようないずれのタイプの相互作用によって媒介されてもよい。
【０２０１】
好ましい態様において、相互作用は共有結合相互作用を介して媒介される。
【０２０２】
好ましくは、共有結合相互作用は、ポリマーの一つまたは複数の基(例えば、官能基)とリポソームの一つまたは複数の脂質との間で起こる。
【０２０３】
当業者であれば、ポリマーの一つまたは複数の基(例えば、官能基)とリポソームの一つまたは複数の脂質との間の所望の相互作用を達成するように適当な基を選択することができる。
【０２０４】
1つの好ましい局面において、共有結合相互作用はポリマーの一つまたは複数の基、およびアミン、チオール、アルコール、アミノキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、アジド、イソチオシアナート、アルデヒド、ケトン、イソシアナート、マレイミド、ハライド、トシラートおよびエステルより選択されるリポソームの一つまたは複数の脂質の一つまたは複数の官能基の間で起こる。特に好ましいのはアミノキシ基およびヒドラジン基である。
【０２０５】
より好ましくは、共有結合相互作用はポリマーの一つまたは複数のアルデヒドおよび/またはケトン基と、リポソームの一つまたは複数の脂質の一つまたは複数のアミノキシ官能基との間で起こる。
【０２０６】
有利には、アミノキシ基を含む脂質の提供は、アミノキシ基を介してのポリマーの脂質への単純な結合を可能とする。アルデヒドまたはケトン基を含むポリマーと反応した場合、ポリマーおよび脂質がアミド基を介して連結された化合物が提供される。そのような結合は「ワンポット」反応において単純に調製することができる。この方法は、単純な透析または過剰な非反応試薬による広範な精製手法を回避する。
【０２０７】
好ましくは、ポリマーは一官能性または二官能性ポリ(エチレングリコール(「PEG」))、ポリ(ビニルアルコール)(「PVA」)；ポリ(プロピレングリコール)(「PPG」)のような他のポリ(アルキレンオキシド)；およびポリ(オキシエチル化グリセロール)、ポリ(オキシエチル化ソルビトール)、およびポリ(オキシエチル化グルコース)のようなポリ(オキシエチル化ポリオール)等より選択される。
【０２０８】
US-A-2001/0021763を教示する発明の背景で議論したように、ポリマーは、前記ポリマーのモノマー、直鎖または分岐鎖、またはmPEGと同様な置換されたまたは置換されていない、およびリンカーへの結合で利用できる単一の活性部位を有する他のキャップド一官能性PEGに基づいて、ホモポリマーまたはランダムもしくはブロックコポリマーおよびターポリマー(terpolymer)であり得る。
【０２０９】
適当なさらなるポリマーの具体的な例は、ポリ(オキサゾリン)、ポリ(アクリロイルモルホリン)(「PAcM」)、およびポリ(ビニルピロリドン)(「PVP」)を含む。PVPおよびポリ(オキサゾリン)は当技術分野において周知のポリマーであり、それらの調製、およびmPEGについて記載の合成における使用は容易に当業者に明らかであるはずである。PAcM、ならびにその合成および使用はUS-A-5,629,384およびUS-A-5,631,322に記載されている。
【０２１０】
好ましい態様において、ポリマーは機能的アルデヒドおよび/またはケトン基を持つポリエチレングリコール(PEG)、またはその化学的誘導体である。
【０２１１】
好ましい態様において、ポリマーは2000〜1000の分子量を有する。好ましい態様において、ポリエチレングリコール(PEG)は2000〜1000の分子量を有する。
【０２１２】
好ましい態様において、ポリマーは一つまたは複数の脂質にカップリングすることができる一つまたは複数の官能基を有する。好ましい態様において、ポリマーは一つまたは複数の脂質にカップリングすることができる1または2、および1または2に過ぎない官能基を有する。
【０２１３】
PEGの異なるサイズを図1に記載するように用いることができ、これは、モノ-およびビス-アルデヒドPEGを含むことができる。
【０２１４】
ポリエチレングルコール(PEG)は、従前には、薬物送達系の生物理学特性を修飾するために使用されてきた。例えば、それを用いて、血清安定性を遺伝子送達ベクターに付与することができる(2-4)。この概念は、文献に記載されており、共通のコンセンサスは、遺伝子送達ビヒクルへのPEGの処方が遺伝子送達ベクターのトランスフェクション効率を劇的に低下させることである(5-8,42)。この現象がなぜ起こるかの最近の調査は、PEG処方非ウイルス遺伝子送達系が培養された細胞に等しく内部化されるが、劇的に変化した細胞内輸送を呈することを示唆する(9)。これらのPEG処方ベクターはエンドソームから放出されず、あるいはPEGによって誘導されたステルスはpDNAを細胞内に放出せず、あるいは分子としてのPEGは、細胞の核に向けての細胞微小管系に沿ってのpDNA細胞内輸送を阻害するように見える。同様の観察は、オリゴヌクレオチド(ODN)を負荷されたリポプレックスでなされている。Songおよび共同研究者らは、異なる長さのPEGを持つ単層DODAC/DOPE/PEG-脂質カチオン性リポソーム系が非ペグ化リポプレックスのようにエンドサイトーシスを行うが、それらのエンドソーム放出は厳格に処理されることを観察した(10)。部分的には、これらのデータに従い、Hoekstraおよび共同研究者らは、ODNリポプレックスに10mol%のPEG-ホスファチジルエタノールアミンを含めると、70%より多いチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるその内部化を阻害し、細胞内画分はエンドソーム/リソソーム経路に捕獲されたままであることとを報告した。Hoekstraは、リポプレックスへのPEGの処方の手法が、エンドソームから逃げるリポプレックスの能力に対して非常に重要であると注記した。リポソームをDSPE-PEGの存在下で形成し、次いで、ODNを負荷した場合、ODNの摂取はPEG/脂質-濃度依存的に強く阻害された。PEGのより低い用量(1%)においてでさえ、複合体の解離は阻害された。対照的に、DSPE-PEGを予め形成されたODNリポプレックスに取り込んだ場合、ペグ化はODNリポプレックスの外側周囲に制限され、そのようなペグ化複合体のみが送達での無益な使用を呈するようであり、但し、PEG脂質は交換可能なものを提供する(11)。
【０２１５】
これらの結果に基づき、siRNAと共に処方された非ウイルス送達ベクターはODNおよびpDNAで観察されたのと同一な傾向を呈すると予測される。
【０２１６】
驚くべきことに、これは当てはまらない。
【０２１７】
事実、リポソームの一つまたは複数の脂質がPEGのような一つまたは複数のポリマーに可逆的にまたは不可逆的にカップリングし、リポソームがsiRNAを含む、リポソームを含む非ウイルス送達ベクターは、標的遺伝子をダウンレギュレートするsiRNAの能力を損なうことなく、凝集に対してリポソームを劇的に安定化させる。
【０２１８】
従って、好ましい態様において、非ウイルス送達ベクターは、一つまたは複数のアミノキシ基を含有する式(I)の脂質、好ましくは、CPAおよび/またはその混合物；DOTMA、DOTAP、DORIエーテルまたはDORIエステル、(DC-Chol)、DOGS、DPPES、および/またはCDAN、および/またはその混合物からなる群より選択される一つまたは複数のポリカチオン性脂質；DOPE、POPE、DSPE、DOPC、DPPC、DSPC、DOPG、DPPG、DSPG、ホスファチジルセリン、ジホスファチジルグリセロール、脂肪酸エステル、グリセロールエステル、スフィンゴ脂質、カルドリピン、セレブロシドからなる群より選択される一つまたは複数の中性脂質；および/またはセラミド；および/またはその混合物を含むリポソームとカップリングした一つまたは複数のポリマーを含む。
【０２１９】
より好ましくは、非ウイルス送達ベクターは、一つまたは複数のアミノキシ基を含有する式(I)の脂質、好ましくは、CPAおよび/またはその混合物；DOTMA、DOTAP、DORIエーテルまたはDORIエステル、(DC-Chol)、DOGS、DPPES、および/またはCDAN、および/またはその混合物からなる群より選択される一つまたは複数のポリカチオン性脂質；DOPE、POPE、DSPE、DOPC、DPPC、DSPC、DOPG、DPPG、DSPG、ホスファチジルセリン、ジホスファチジルグリセロール、脂肪酸エステル、グリセロールエステル、スフィンゴ脂質、カルドリピン、セレブロシドからなる群より選択される一つまたは複数の中性脂質；および/またはセラミド；および/またはその混合物を含むリポソームとカップリングしたPEGを含む。
【０２２０】
より好ましくは、非ウイルス送達ベクターは、CPA、CDANおよびDOPEおよび/またはその混合物を含むリポソームとカップリングした一つまたは複数のポリマーを含む。
【０２２１】
最も好ましくは、非ウイルス送達ベクターは、CPA、CDANおよびDOPEおよび/またはその混合物を含むリポソームとカップリングしたPEGを含む。
【０２２２】
非ウイルス送達ベクター
本明細書において記載のように、送達ベクターは、典型的には、siRNAを含む一つまたは複数の脂質、およびリポソームに含むべきいずれかの他の成分を接触させることによって作成される。脂質は、一つまたは複数、好ましくは2つまたはそれ以上の脂質構成要素を含む予め形成されたリポソームの一部であってよい。この最終複合体は、使用するまで10%スクロース(w/v)を加えて、約-80℃で貯蔵することができる。
【０２２３】
本明細書において記載のように、複合体は、貯蔵目的のため、活性および粒子一体性の喪失なく、スクロース、トレハロースまたはラクトースのような低温発生剤の存在または不存在下、凍結乾燥することもできる。
【０２２４】
成分をいずれの順序でも組み合わせることが可能である。さらなる成分を加えるべき場合、それらはいずれの段階においても、しかしながら好ましくはsiRNAと一緒に加えることができる。
【０２２５】
非ウイルス送達ベクターは薬学的用途で特によく適合し得るが、それらはその適用に制限されず、食品用途、農業用途のために、イメージング適用のために、本明細書において記載のその他のために設計することができる。
【０２２６】
薬剤
siRNAに加えて、リポソームはその中に一つまたは複数の薬剤を含むこともできる。
【０２２７】
さらに、本明細書において記載のように、リポソームは一つまたは複数の標的部分のような一つまたは複数の薬剤に可逆的にまたは不可逆的にカップリングさせることができる。
【０２２８】
薬剤は有機化合物または他の化学物質であってよい。薬剤は、天然または人工的であるかを問わず、いずれかの適当な源から得ることが可能か、あるいは源によって生産することができる化合物であってよい。薬剤はアミノ酸分子、ポリペプチド、またはその化学的誘導体、またはその組合せであってよい。薬剤はセンスまたはアンチセンス分子、または抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはモノクローナルヒト化抗体であり得るポリヌクレオチド分子でさえあり得る。
【０２２９】
薬剤はまさに公知の薬物、または化合物、あるいはそのアナログであってもよい。
【０２３０】
薬剤はペプチド、ならびに小さな有機分子のような他の化合物を含むことができる化合物のライブラリーから設計することができるか、あるいはそれから得ることができる。
【０２３１】
例として、薬剤は天然物質、生物学的高分子、あるいは細菌、真菌、または動物(特に哺乳動物)細胞もしくは組織のような生物学的物質から作成された抽出物、有機または無機分子、合成薬剤、半合成薬剤、構造的または機能的模倣体、ペプチド、ペプチド模倣体、全タンパク質から切断されたペプチド、または(例えば、ペプチド合成機を用い、または組換え技術によって、あるいはその組合せによるような)合成により合成されたペプチド、組換え薬剤、抗体、天然または非天然薬剤、融合タンパク質またはその同等物、およびその変異体、誘導体または組合せであり得る。
【０２３２】
薬剤は有機化合物であり得る。いくつかの例では、有機化合物は2つまたはそれ以上のヒドロカルビル基を含む。
【０２３３】
薬剤はフルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード基のようなハロ基を含むことができる。
【０２３４】
薬剤は分岐していなくても、または分岐鎖であってもよいアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキレン、およびアルケニレン基の一つまたは複数を含むことができる。
【０２３５】
薬剤は立体異性体および/または幾何異性体として存在することができ、例えば、薬剤は一つまたは複数の不斉および/または幾何中心を有することができ、従って、2つまたはそれ以上の立体異性体および/または幾何形態で存在することができる。本発明では、これらの薬剤の全ての個々の立体異性体および幾何異性体、およびその混合物の使用が考えられる。
【０２３６】
薬剤はリポソームにおいて適用し、投与し、または用いるのが望まれるいずれかの化学物質または物質であってよく、限定されるものではないが、殺虫剤、除草剤、化粧剤、および香料、ビタミンおよびミネラルを含む栄養補助食品、調味料、および他の食品添加物、造影剤、染料、蛍光マーカー、放射性標識、プラスミド、ベクター、ウイルス粒子、トキシン、触媒などを含むことができる。
【０２３７】
薬剤は一つまたは複数の生物学的活性な薬剤を含むことができ、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与された場合に有益なまたは治療的化合物として作用して、疾患を予防し、緩和しまたは治療するいずれの分子も含む。これは、疾患に対して素因があり得るが、それを有すると診断されたことがない対象で疾患が起こるのを予防すること；疾患を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること；または疾患を軽減すること、すなわち、疾患の緩解を引き起こすことを含むことができる。
【０２３８】
薬剤の例は、限定されるものではないが、抗炎症剤；抗癌剤および抗腫瘍剤；抗生物質を含む抗微生物および抗ウイルス剤；抗寄生虫剤；血管拡張剤；気管支拡張剤、抗アレルギーおよび抗喘息剤；ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、およびリポタンパク質；炭水化物；受容体；成長因子；ホルモンおよびステロイド；神経伝達物質；鎮痛剤および麻酔剤；麻薬；触媒および酵素；ワクチン；DNAのような遺伝子物質を含む。
【０２３９】
薬剤はPEG、糖、炭水化物およびリガンドからなる群より選択することができる。
【０２４０】
糖は(図7に示すように)グルコース、マンノース、ラクトース、フルクトース、マルトトリオース、およびマルトヘプトースからなる群より選択することができる。
【０２４１】
化学合成方法
薬剤および/またはsiRNAは化学合成技術によって調製することができる。
【０２４２】
感応性の官能基が合成の間に保護されおよび脱保護されるのに必要であり得ることは当業者に明らかである。これは、例えば、T W Greene and P G M Wuts, John Wiley and Sons Inc.(1991)による「Protective Groups in Organic Synthesis」に、および「Protecting Groups」Georg Thieme Verlag (1994)においてP. J. Kocienskiによって記載された慣用的技術によって達成することができる。
【０２４３】
例えば、塩基感応性基を含む光学的中心を有する基質との反応において塩基を用いるならば、存在するいずれかの立体中心は、ある種の条件下では、ラセミ化し得ることは反応のいくつかの間に可能である。これは、例えば、グアニル化工程の間で可能である。当技術分野において周知のように、反応系列、条件、試薬、保護/脱保護方法などの選択によってこのような潜在的問題を回避することが可能なはずである。
【０２４４】
薬剤および/またはsiRNAは慣用的方法によって分離し、精製することができる。
【０２４５】
ジアステレオマーの分離は、慣用的な技術によって、例えば、式(I)の化合物またはその適当な塩または誘導体の立体異性体混合物の分別結晶化、クロマトグラフィーまたはH.P.L.C.によって達成することができる。式(I)の化合物の個々のエナンチオマーは、対応する光学的に純粋な中間体から、あるいは適当なキラル支持体を用いる対応するラセミ体のH.P.L.C.による、または適当に光学的に活性な酸または塩基との対応するラセミ体の反応によって形成されるジアステレオマー塩も分別結晶化による等の分解によって調製することもできる。
【０２４６】
薬剤および/またはsiRNAは、薬剤および/またはsiRNAを全体的にまたは部分的に合成するための化学的方法を用いて製造することができる。例えば、薬剤がペプチドを含めば、ペプチドは、固相技術によって合成し、樹脂から切断し、次いで、分取用高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる(例えば、Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY)。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定(例えば、エドマン分解手法；Creighton,前記)によって確認することができる。
【０２４７】
ペプチド阻害剤の合成は種々の固相技術(Roberge JY et al (1995) Science 269:202-204)を用いて行うことができ、自動化合成は、例えば、製造業者によって提供される指示書に従い、ABI 43 1 Aペプチド合成機(Perkin Elmer)を用いて達成することができる。加えて、薬剤を含むアミノ酸配列は、直接的合成の間に改変することができ、および/または他のサブユニットからの配列、またはそのいずれかの部分と化学的方法を用いて組み合わせて、種々の薬剤を生じさせることができる。
【０２４８】
本明細書において用いるように、用語「誘導体」または「誘導体化」は、薬剤の化学的修飾を含む。そのような化学的修飾の例は、水素の、ハロ基、アルキル基、アシル基またはアミノ基による置換ある。
【０２４９】
薬剤は、限定されるものではないが、化学的に修飾された薬剤のような修飾された薬剤であってよい。
【０２５０】
薬剤の化学的修飾は、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用または双極子相互作用を増強し、または低下させることができる。
【０２５１】
標的化非ウイルス送達ベクター
さらなる局面において、本発明は、非ウイルス送達ベクターの標的化送達に関する。
【０２５２】
非ウイルス送達ベクターの標的化送達は、ペプチドおよび/または他のリガンドのような一つまたは複数の薬剤(例えば、標的部分)の、リポソーム、好ましくはリポソームの表面への添加によって達成することができる。有利には、薬剤は、薬剤とリポソーム表面に露出したリポソームの一つまたは複数の脂質との間の相互作用を介してリポソームの表面にカップリングする。
【０２５３】
有利には、これは,siRNAの、標的部分のような、薬剤に結合することができる特異的細胞、器官、および組織への送達を可能とすることができる。典型的には、細胞、器官、および組織の間の結合は、細胞、器官、および/または組織と薬剤との間の特異的結合を介する。
【０２５４】
好ましい態様において、細胞、器官、および組織は肝臓であってよく、あるいは肝臓に由来していてもよい。本明細書において用いるように、用語「肝臓細胞」とは、肝臓に位置する細胞をいう。肝臓細胞は、限定されるものではないが、癌性肝臓細胞、肝細胞、クッパー細胞、伊東細胞、肝洞様血管をライニングする内皮細胞、肝血管をライニングする血管内皮細胞、および偶然に肝臓に存在するいずれかの起源のいずれかの細胞(例えば、異所起源転移性癌細胞)を含むことができる。
【０２５５】
好ましくは、肝臓細胞は肝細胞(例えば、HepG2細胞)である。
【０２５６】
有利には、本明細書において記載される非ウイルス送達ベクターは、そのような細胞、器官、および組織における強力な蓄積を呈する。
【０２５７】
もう1つの好ましい態様において、細胞、器官、および組織は脾臓、肺、および/またはリンパ節であってよいか、あるいはそれに由来するものであってよい。
【０２５８】
本明細書において用いるように、用語「特異的結合」とは、一つまたは複数の細胞、器官、および/または組織と薬剤との間の相互作用をいう。この相互作用は、典型的には、薬剤によって認識され、それにより、相互作用(例えば、結合)が起こることを可能とする、抗原決定基またはエピトープのような、細胞、器官および/または組織の特定の構造的特徴の存在に依存する。
【０２５９】
好ましくは、薬剤は糖、炭水化物、および/またはリガンドからなる群より選択される。
【０２６０】
好ましくは、糖は、グルコース、マンノース、ラクトース、フルクトース、マルトトリオース、マルトヘプトースからなる群より選択される。
【０２６１】
薬剤は、まさにリガンドであってもよい。
【０２６２】
リポソームの送達のために標的とされる部位に依存して、多くの異なるリガンドを使用することができる。
【０２６３】
リガンドは、ペプチドを含むことができる化合物、ならびに小さな有機分子のような他の化合物のライブラリーから設計し、または得ることができる。
【０２６４】
その例として、リガンドは天然物質、生物学的高分子、あるいは細菌、真菌、または動物(特に、哺乳動物)細胞または組織のような生物学的材料から作成される抽出物、有機または無機分子、合成リガンド、半合成リガンド、構造的または機能的模倣体、ペプチド、ペプチド模倣体、誘導体化リガンド、全タンパク質から切断されたペプチド、(例えば、ペプチド合成機を用いて、または組換え技術またはその組合せ、組換えリガンド、抗体、天然または非天然リガンド、融合タンパク質またはその同等物およびその変異体、誘導体または組合せによる等の)合成的に合成されたペプチドであり得る。
【０２６５】
好ましくは、リガンドは抗体である。
【０２６６】
本明細書において用いるように、用語「抗体」とは、完全な抗体、二特異的抗体または抗体断片をいい、Fv、ScFv、Fab'およびF(ab')2、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ、CDRグラフト化およびヒト化抗体を含む作成された抗体、およびファージディスプレイまたは代替技術を用いて生産された人工的に選択された抗体を含む。
【０２６７】
キメラ抗体とは、マウス抗体の一部と、ヒト抗体の一部との遺伝子工学により作成された融合をいう。一般には、キメラ抗体はおよそ33%のマウスタンパク質と67%のヒトタンパク質とを含有する。
【０２６８】
ヒト化抗体は、マウス抗体の定常領域をヒトタンパク質で置き換えることによってのみならず、抗体の可変領域の一部をヒトタンパク質で置き換えることによって得ることができる。一般には、ヒト化抗体はマウス5〜10%およびヒト90〜95%である。
【０２６９】
ヒト化抗体に対するより精巧なアプローチは、ヒト由来定常領域の提供のみならず、同様に、可変領域の修飾を含む。これは、抗体がヒト形態に対してできる限り密接に再形成されるのを可能とする。このアプローチは、例えば、Cancer Res (1993) 53:851-856、Nature (1988) 332:323-327、Science (1988) 239:1534-1536、Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88:4181-4185およびJ Immunol (1992) 148:1149-1154に報告されている。
【０２７０】
抗体の調製は、標準的な実験室的技術を用いて行われる。抗体は動物血清から得ることができ、あるいはモノクローナル抗体またはその断片の場合には、細胞培養で生産することができる。組換えDNA技術を用いて、細菌、または好ましくは哺乳動物細胞培養において、確立された手法に従って抗体を生産することができる。選択された細胞培養系は、好ましくは、抗体産物を分泌する。
【０２７１】
前述および他の技術は、例えば、Kohler and Milstein,(1975) Nature 256:495-497；米国特許第4,376,110号；Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual,(1988) Cold Spring Harborに議論されている。組換え抗体分子の調製のための技術は、前記した参考および、例えば、EP 0623679；EP 0368684およびEP 0436597に記載されている。
【０２７２】
抗体は、ファージディスプレイ技術を用いて選択し、創製することができる。バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築のための方法は当技術分野において周知である(例えば、Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 88:4363およびClackson et al. (1991) Nature, 352:624)。
【０２７３】
有利には、リガンドが抗体である場合、リポプレックスカップルド抗体(lipoplex coupled antibody)はその活性の実質的に全てを示す。
【０２７４】
好ましくは、リガンドは、RGDペプチド(インテグリン受容体)、葉酸受容体および/またはトランスフェリン受容体であるか、それに由来する受容体のような受容体である。
【０２７５】
薬学的な塩
非ウイルス送達ベクターは薬学的に許容される塩の形態で投与することができる。
【０２７６】
薬学的に許容される塩は当業者に周知であり、例えば、BergeらによってJ. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977)において言及されたものを含む。適当な酸付加塩は非毒性塩を形成する酸から形成され、ヒドロクロリド、ヒドロブロミド、ヒドロヨージド(hydroiodide)、ニトラート、スルファート、ビスルファート(bisulphate)、ホスファート、水素ホスファート(hydrogenphosphate)、アセタート、トリフルオロアセタート、グルコナート、ラクタート、サリチラート、シトラート、タルトラート、アスコルバート(ascorbate)、スクシナート、マレアート、フマラート、グルコナート、ホルマート、ベンゾアート、メタンスルホナート、エタンスルホナート、ベンゼンスルホナート、およびp-トルエンスルホナート塩を含む。
【０２７７】
一つまたは複数の酸性部分が存在する場合、適当な薬学的に許容される塩基付加塩は非毒性塩を形成する塩基から形成することができ、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、およびジエタノールアミンのような薬学的活性なアミンの塩を含む。
【０２７８】
薬学的活性な塩
非ウイルス送達ベクターは、薬学的に許容される塩として投与することができる。典型的には、薬学的に許容される塩は、適切には、所望の酸または塩基を用いて容易に調製することができる。塩は溶液から沈殿させ、濾過によって収集することができ、あるいは溶媒の蒸発によって回収することができる。
【０２７９】
薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は治療上有効量の非ウイルス送達ベクターを含むことができる。
【０２８０】
薬学的組成物はヒトおよび動物医薬におけるヒトまたは動物用法のためのものであってよく、典型的には、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤のいずれかの一つまたは複数を含む。治療用途のための許容される担体または希釈剤は薬学的分野において周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。薬学的担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図した投与の経路および標準的な薬務に従って選択することができる。薬学的組成物は担体、賦形剤または希釈剤として、あるいはそれらに加えて、いずれかの適当な結合剤、滑沢剤、沈殿防止剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。
【０２８１】
保存剤、安定化剤、色素および着香剤までも、薬学的組成物において提供することができる。保存剤の例は安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびp-ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。抗酸化剤および沈殿防止剤も用いることができる。
【０２８２】
異なる送達系に応じて、異なる組成物/処方の要件があり得る。その例として、本発明の薬学的組成物を処方して、ミニポンプを用いて、あるいは例えば、吸入または摂取溶液用の鼻スプレイまたはエアロゾルとして粘膜経路によって、あるいは送達のために組成物が注射形態によって処方される非経口的に、例えば、静脈内、筋肉内または皮下経路によって投与することができる。または、処方は設計され、多数の経路によって投与することができる。
【０２８３】
薬剤を胃腸粘膜を通じて粘膜投与すべき場合、胃腸管を通っての移動の間に安定なままとすることができ；例えば、それはタンパク質分解に対して耐性、酸性pHにおいて安定、および胆汁の洗浄性効果に対して耐性とすべきである。
【０２８４】
適当な場合、薬学的組成物は吸入によって、坐薬またはペッサリーの形態にて、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布粉の形態で局所的に、皮膚パッチの使用によって、澱粉またはラクトースのような賦形剤を含有する錠剤の形態で、あるいは単独または賦形剤と混合したカプセルまたは腔坐剤にて、あるいは着香剤または着色剤を含有するエリキシル、溶液または懸濁液の形態で経口により投与することができ、あるいは薬学的組成物は非経口、例えば、静脈内、筋肉内、または皮下注射することができる。非経口投与では、組成物は他の物質、例えば、溶液を血液に対して等張とするための十分な塩または単糖を含有することができる滅菌水溶液の形態で最良に用いることができる。頬側または舌下投与では、組成物は、慣用的に処方することができる錠剤またはロゼンジの形態で投与することができる。
【０２８５】
非ウイルス送達ベクターはシクロデキストリンと組み合わせて用いることができる。シクロデキストリンは、薬物分子と封入体、および非封入体複合体を形成することが公知である。薬物-シクロデキストリン複合体の形成は、薬物分子の溶解性、溶解速度、生物学的利用能および/または安定性の特性を修飾することができる。薬物-シクロデキストリン複合体は、一般には、ほとんどの投与形態および投与経路で有用である。薬物との直接的複合体化に対する代替法として、シクロデキストリンを補助的添加剤として、例えば、担体、希釈剤または可溶化剤として用いることができる。α-、β-およびγ-シクロデキストリンは最も普通に用いられ、適当な例は、国際公開公報(WO-A)第91/11172号、国際公開公報(WO-A)第94/02518号および国際公開公報(WO-A)第98/55148号に記載されている。
【０２８６】
非ウイルス送達ベクターを含む薬学的組成物は、対象となる疾患のための慣用的治療と組み合わせて用いることもできる。
【０２８７】
投与
非ウイルス送達ベクターは単独で投与することができるが、一般には、例えば、ベクターは、意図した投与経路および標準的な薬務に従って選択された適当な薬学的賦形剤、希釈剤、または担体と混合する場合、薬学的組成物として投与するであろう。
【０２８８】
例えば、非ウイルス送達ベクターは、即座の放出、遅延された放出、修飾された放出、維持された放出、パルスド放出、または制御放出の適用のために、着香剤または着色剤を含有していてもよい、錠剤、カプセル、腔坐剤、エリキシル、溶液または懸濁液の形態で投与することができる。
【０２８９】
医薬が錠剤であれば、錠剤は微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウムおよびグリシンのような賦形剤、澱粉(好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカ澱粉)、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよびある種の複合シリカートのような崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチンおよびアカシアのような造粒結合剤を含有することができる。加えて、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクのような滑沢剤を含めることができる。
【０２９０】
同様なタイプの固体組成物をゼラチンカプセル中の充填剤として使用することもできる。この点に関しての好ましい賦形剤はラクトース、澱粉、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁液および/またはエリキシルでは、薬剤は、種々の甘味剤または着香剤、着色物質または色素と、乳化剤および/または沈殿防止剤と、および水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン、およびその組合せのような希釈剤と組み合わせることができる。
【０２９１】
投与(送達)のための経路は、限定されるものではないが、(例えば、錠剤、カプセルとして、あるいは摂食溶液として)経口、局所、(例えば、吸入用の鼻スプレイまたはエアロゾルとして)粘膜、鼻、(例えば、注射形態により)非経口、胃腸、脊髄内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼内、皮内,頭蓋内、器官内、膣内、脳室内、大脳内、皮下、(硝子体内または眼房内を含む)、眼、経皮、直腸、頬側、膣、硬膜外、舌下のうちの一つまたは複数を含むことができる。
【０２９２】
用量レベル
典型的には、医師は、個々の対象に最も適する現実の用量を決定するであろう。
【０２９３】
いずれかの特定の患者のための特別な用量レベルおよび投与の頻度は変化させることができ、これは、使用する特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、一般的な健康、性別、食餌、投与の様式および時間、排出の速度、薬物組み合わせ、特定の症状の重症度および治療を受ける個人を含む多数の因子に依存する。
【０２９４】
処方
非ウイルス送達ベクターは、適当な担体、希釈剤または賦形剤の一つまたは複数と混合することによるなど当技術分野において公知の技術を用いることによって薬学的組成物に処方することができる。
【０２９５】
疾患
本発明の局面は、国際公開公報(WO-A)第98/09985号に列挙されたもののような疾患の治療および/または予防で用いることができる。
【０２９６】
参照を容易とするために、その列挙の一部をここに提供する：マクロファージ阻害性および/またはT細胞阻害性活性および、従って、抗炎症性活性；抗免疫活性、すなわち、炎症に関連しない応答を含む細胞性および/または液性免疫応答に対する阻害効果；ウイルスおよび/または他の細胞内病原体に関連する疾患；細胞外マトリックス成分およびフィブロネクチンに接着するマクロファージおよびT細胞の能力、ならびにT細胞におけるアップレギュレートされたfas受容体発現を阻害すること；以下を含む望まない免疫反応および炎症を阻害すること：リウマチ様関節炎を含む関節炎、過敏性に関連する炎症、アレルギー反応、喘息、全身エリテマトーデス、コラーゲン病および他の自己免疫疾患、アテローム性硬化症に関連する炎症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症心臓病、再灌流負傷、心臓停止、心筋梗塞、血管炎症障害、呼吸窮迫症候群、または他の心肺病、消化性潰瘍に関連する炎症、潰瘍性結腸炎、および胃腸管の他の疾患、肝線維症、肝硬変または他の肝臓病、甲状腺炎または他の腺病、糸球体腎炎または他の腎臓および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚病、歯周病または他の歯科疾患、精巣炎または精巣精巣上体炎、不妊症、精巣外傷または他の免疫関連精巣病、胎盤機能障害、胎盤不全、習慣性流産、子癇、子癇前症および他の免疫および/または炎症関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、眼内炎症(例えば、網膜炎または類嚢胞黄斑浮腫)、交感性眼炎、強膜炎、色素性網膜炎、変形性フォンデュ(fondus)病の免疫および炎症成分、眼外傷の炎症成分、感染によって引き起こされた眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血症視神経障害、過剰瘢痕(例えば、緑内障濾過手術後の)、眼インプラントに対する免疫および/または炎症反応、および他の免疫および炎症関連眼疾患、中枢神経系(CNS)またはいずれかの他の器官双方において、免疫および/または炎症の抑制が有益である自己免疫疾患または症状または障害に関連する炎症、パーキンソン病、パーキンソン病の治療からの合併症および/または副作用、AIDS関連認知症合併HIV関連脳障害、デビック病、シドナム舞踏病、アルツハイマー病およびCNSの他の変性疾患、症状、または障害、発作の炎症成分、ポリオ後症候群、精神医学的障害の免疫および炎症成分、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギラン-バレー症候群、シドナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、CNS圧迫またはCNS外傷またはCNSの感染の炎症成分、筋萎縮およびジストロフィーの炎症成分、および中枢および末梢神経系の免疫および炎症関連疾患、症状、または障害、外傷後炎症、敗血症ショック、感染症、外科処置の炎症性合併症または副作用、骨髄移植または他の移植合併症および/または副作用、遺伝子治療の炎症および/または免疫合併症および副作用(例えば、角膜、骨髄、器官、レンズ、ペースメーカー、天然または人工皮膚組織のような天然または人工の細胞、組織、および器官の移植の場合における移植片拒絶の予防および/または治療のための、液性および/または細胞性免疫応答を抑制または阻害するための、単球またはリンパ球の量を減少させることによって、単球または白血球増殖性病、例えば、白血病を治療または軽減するための、ウイルスキャリアでの感染、またはAIDSに関連する炎症による)。具体的癌関連障害は、限定されるものではないが、充実性腫瘍；白血病のような血液で生じる腫瘍；腫瘍転移；良性腫瘍、例えば、血管腫、視神経腫、神経線維症、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；リウマチ様関節炎、乾癬；眼血管形成病、例えば、糖尿病性網膜症、未成熟の網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、線維増殖症、ルベオーシス；オスラー-ウェッバー症候群；心筋血管形成；プラーク血管新生；毛細血管拡張症；血友病者の関節；血管線維症；創傷肉芽化；冠動脈側副枝；脳側副枝；動脈静脈奇形；虚血性四肢血管形成；血管新生緑内障；線維増殖症；糖尿病性血管新生；ヘリコバクター関連病、骨折、脈管形成、造血、排卵、月経、および胎盤形成を含む。
【０２９７】
本発明の局面は、IおよびII型糖尿病のような糖尿病の治療および/または予防で用いることができる。
【０２９８】
本発明の局面は急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、血液癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、女性生殖系の癌、男性生殖系の癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頚癌、子供横紋筋肉腫、子供肉腫、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、結腸および直腸癌、結腸癌、子宮内膜癌、子宮内膜肉腫、食道癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、胃腸管癌、毛様細胞白血病、頭および首癌、肝細胞癌、ホジキン病、下咽頭癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、白血病、白血病、肝臓癌、肺癌、悪性線維性組織球腫、悪性胸腺腫、メラノーマ、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経系癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、上皮小体癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、原発性CNSリンパ腫、前立腺癌、直腸癌、呼吸器系、網膜芽腫、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、胃癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、泌尿器系癌、子宮肉腫、膣癌、血管系、ヴュアルデンストレームマクログロブリン血症、およびウイルムス腫瘍のような癌の治療および/または予防で用いることもできる。
【０２９９】
好ましい態様において、疾患は肝臓病および/または肝臓損傷である、またはそれに関連する疾患、障害、または症状である。
【０３００】
肝臓損傷はアルコール、肝毒性薬物およびその組合せの暴露に関連し得る。例えば、損傷剤は抗痙攣剤、フェニトイン、カルバマゼピンおよびフェノバルビタール、エクスタシー(3,4-メチレンジオキシメタンフェタミン)のような娯楽薬物、抗結核剤、およびイソニアジドおよびリファンピシンのような化学治療剤を含むことができる。
【０３０１】
肝臓損傷は、細菌、寄生虫、真菌およびウイルス感染のような感染性作用物質とも関連し得る。例えば、肝臓損傷はアスペルギルス(Aspergillus)真菌感染、住血吸虫属(Schistosoma)寄生虫感染、およびアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルス(HSV)、エプスタイン-バーウイルス(EBV)およびパラミクソウイルス感染のような種々のウイルス感染に由来し得る。
【０３０２】
肝臓病は、限定されるものではないが、急性肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎、肝硬変、脂肪肝、アルコール性肝障害、薬物誘導肝障害(薬物中毒肝炎)、鬱血性肝炎、自己免疫肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肝性ポルフィリン症、胆管周囲炎、硬化性胆管炎、肝線維症および慢性活動性肝炎を含むことができる。
【０３０３】
使用
本明細書において記載の非ウイルス送達ベクターを用いて、siRNAを真核生物細胞、特に哺乳動物細胞のような細胞に効果的にトランスフェクトすることができる。
【０３０４】
本明細書において記載の非ウイルス送達ベクターを用いて、肝臓に効果的にトランスフェクトすることができる。
【０３０５】
非ウイルス送達ベクターは、遺伝子治療、DNAワクチン送達およびインビトロトランスフェクション実験のような種々のsiRNA送達適用に用いることができる。
【０３０６】
非ウイルス送達ベクターは、肝臓の、遺伝子治療、DNAワクチン送達およびインビトロトランスフェクション実験のような種々のsiRNA送達適用に用いることができる。
【０３０７】
非ウイルス送達ベクターを用いて、疾患に罹った患者に治療剤を投与することもできる。
【０３０８】
変種/ホモログ/誘導体
本発明は、ホモログおよび断片の使用も含む。
【０３０９】
ここで、用語「ホモログ」は、本明細書において記載のヌクレオチド配列とある相同性を有する存在を意味する。ここで、用語「相同性」は「同一性」と同等であり得る。
【０３１０】
本文脈では、相同配列は、対象配列に対して少なくとも75、85または90%同一、好ましくは少なくとも95または98%同一であり得るヌクレオチド配列を含むように採用される。典型的には、ホモログは、対象配列と、活性部位をコードする同一の配列を含む。相同性は同様性の点で考えることもできる(すなわち、同様な化学的特性/機能を有するアミノ酸残基)が、本発明の文脈では、配列同一性の点での相同性を表すのが好ましい。
【０３１１】
相同性比較は、眼によってあるいはより通常には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これらの市販されているコンピュータープログラムは、2つまたはそれ以上の配列の間の%相同性を計算することができる。
【０３１２】
%相同性は、連続配列にわたって計算することができ、すなわち、1つの配列を他の配列と整列させ、1つの配列中の各アミノ酸を他の配列中の対応するアミノ酸と、一度に1つの残基にて直接的に比較する。これは「アンギャップド」アライメントと呼ばれる。典型的には、そのようなアンギャップドアライメントは比較的短い数の残基にわたってのみ行われる。
【０３１３】
これは非常に簡単かつ一貫した方法であるが、それは、例えば、配列のそうでなければ同一の対において、1つの挿入または欠失が、次のアミノ酸残基をアライメントから外し、従って、全体的なアライメントが行われた場合に%相同性の大きな低下を潜在的にもたらすということを考慮していない。その結果、ほとんどの配列比較方法は、総じての相同性スコアを不適切にペナルティーを与えることなく可能な挿入および欠失を考慮する最適なアライメントを生じさせるように設計される。これは、配列アライメントにおいて「ギャップ」を挿入して、局所的な相同性を最大化しようとすることによって達成される。
【０３１４】
しかしながら、これらのより複雑な方法は「ギャップペナルティー」を、同一数の同一アミノ酸について、2つの比較される配列の間のより高い関連性を反映するできる限り少数のギャップを持つ配列アライメントが多くのギャップで1より多いより高いスコアを達成するようにアライメントで起こる各ギャップに帰属させる。「アフィンギャップコスト」が典型的には用いられ、これは、ギャップの存在に対して比較的高いコスト、およびギャップ中の各引き続いての残基に対してより小さなペナルティーを課す。これは、最も普通に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、もちろん、より少数のギャップにて最適なアライメントを生じる。ほとんどのアライメントプログラムは、ギャップペナルティーが修飾されるのを可能とする。しかしながら、配列比較のためにそのようなソフトウエアを用いる場合にデフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージを用いる場合、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルティーはギャップについて-12および各延長について-4である。
【０３１５】
従って、最大%相同性の計算は、まず、ギャップペナルティーを考慮して、最適アライメントを作り出すことを必要とする。そのようなアライメントを行うための適当なコンピュータープログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージである(University of Wisconsin, U.S.A.；Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387)。配列比較を実行することができる他のソフトウエアの例は、限定されるものではないが、BLASTパッケージ(Ausubel et al., 1999 ibid-Chapter 18参照)、FASTA(Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410)および比較ツールのGENEWORKSスイートを含む。BLASTおよびFASTAは共にオフラインおよびオンライン検索で利用できる(Ausubel et al., 1999 ibid，p.7-58から7-60参照)。しかしながら、いくつかの適用においては、GCG Bestfitプログラムを用いるのが好ましい。BLAST2 Sequencesと呼ばれるツールが、タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するのに利用することもできる(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8参照)。
【０３１６】
最終の%相同性は同一性の項目で測定することができるが、アライメントプロセス自体は、典型的には、全か無かの対比較に基づかない。事実、スケールド同様性スコアマトリックスが一般的には用いられ、これは、化学的同様性または進化の距離に基づいて各対様式比較にスコアを割り当てる。通常用いられるそのようなマトリックスの例は、BLOSUM62マトリックス、プログラムのBLASTスイートに対するデフォルトマトリックスである。GCG Wisconsinプログラムは、一般には、供給されれば、公のデフォルト値またはカスタムシンボル比較表いずれかを用いる(さらなる詳細についてはユーザーマニュアル参照)。いくつかの適用では、GCGパッケージについては公のデフォルト値、あるいは他のソフトウエアの場合には、BLOSUM62のようなデフォルトマトリックスを用いるのが好ましい。
【０３１７】
一旦ソフトウエアが最適なアライメントを生じると、%相同性、好ましくは%配列同一性を計算するのが可能である。ソフトウエアは、典型的には、これを配列比較の一部として行い、数値的結果を作り出す。
【０３１８】
本発明で用いるためのヌクレオチド配列は、それらの中に、合成または修飾されたヌクレオチドを含むことができる。多数の異なるタイプのオリゴヌクレオチドに対する修飾が当技術分野において公知である。これらはメチルホスホナートおよびホスホロチオアート骨格および/または分子の3'および/または5'末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の負荷を含む。本発明の目的では、本明細書において記載のヌクレオチド配列は、当技術分野において利用できるいずれかの方法によって修飾することができることは理解されるべきである。そのような修飾を行って、本発明で有用なヌクレオチド配列のインビボ活性または寿命を増強させることができる。
【０３１９】
本発明は、本明細書において記載の配列に対して相補的なヌクレオチド配列、またはいかなる誘導体、その断片もしくは誘導体の使用も含むことができる。
【０３２０】
配列の対立遺伝子も含まれる。「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は、タンパク質をコードする配列の代替形態である。対立遺伝子は突然変異、すなわち、核酸配列中の変化から生じ、一般には、その構造または機能が改変され得る、または改変され得ない改変されたmRNAまたはポリペプチドを生じる。好ましくは、機能は改変されない。いずれかの所与の遺伝子は対立遺伝子形態を有さず、一つまたは複数の対立遺伝子形態を有することができる。対立遺伝子を生起させる普通の突然変異変化は、一般には、アミノ酸の欠失、付加または置換に帰せられる。これらのタイプの変化の各々は単独で、あるいは他のものと組み合わせて、所与の配列において一または複数回起こり得る。
【０３２１】
用語「対立遺伝子」はSNP(一塩基多型)のような遺伝子的多型も含む。
【０３２２】
ヌクレオチド配列に関連した用語「断片」は、配列からのまたは配列への一つ(または複数)のヌクレオチド配列のいかなる置換、変異、修飾、置き換え、欠失または付加も含み、但し、得られたタンパク質は生物学的に活性を有するものとし、好ましくは、全長ヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質と少なくとも同等の生物学的活性である。断片は全長ヌクレオチド配列の50、60、70、80、90、95、96、97、98または99%を含み得る。
【０３２３】
さらなる局面において、細胞、組織または器官(例えば、肝臓)の環境へ、本明細書において記載の非ウイルス送達ベクターまたは標的化送達ベクターを提供する工程を含む、siRNAを細胞または細胞の環境に送達する方法も提供される。
【０３２４】
一般的な組換えDNAおよび方法技術
本発明は、特に断りの無い限り、当業者の能力内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の従来の技術を使用する。そのような技術は文献物中で説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology, ch.9, 13, and 16, John Wiley ＆ Sons, New York, N.Y.)；B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley＆ Sons；M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press；およびD. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press参照。
【０３２５】
ここで、本発明の実施において当業者を助けるように働かせることを意味する実施例によって本発明をさらに記載するが、断じて、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【０３２６】
実施例
材料および方法
薄層クロマトグラフィー
薄層クロマトグラフィー(TLC)を予めコートしたMerck-Kieselgel 60 F254アルミニウム裏打ちプレートで行い、適当には、紫外光、ヨウ素、酸性モリブデン酸アンモニウム(IV)、酸性エタノール性バニリン、または他の薬剤で見えるようにした。フラッシュカラムクロマトグラフィーをMerck-Kieselgel 60(230〜400メッシュ)で達成した。Brucker Esquire 3000、VG-7070BまたはJEOL SX-102機器を用いて質量スペクトルを記録した。残存同位体溶媒を内部参照として用い、1Hおよび13C NMR共鳴をAdvance Brucker 400 Ultrashield(商標)マシーンで記録した(s=シングレット、d=ダブレット、t=トリプレット、q=カルテット、quin=クインテット、br=ブロードシングレット)。
【０３２７】
siRNA
lacZ遺伝子産物のダウンレギュレーションを評価するために本実験を通じて用いられた抗β-gal siRNA-1
2008509205.tif 000025
はDharmacon(USA)から購入し、製造業者によって示されるように20μM溶液として貯蔵した。非特異的siRNA配列
2008509205.tif 000026
は、製造業者によって示されるように20μMで貯蔵されたDharmacon(USA)から入手した。3'-FITC標識抗GFP siRNA配列
2008509205.tif 000027
は、Qiagen GmbH(Hilden,Germany)から入手した。配列は、オフターゲットダウンレギュレーションを確認するアルゴリズムに由来するものでよい(Kumiko Ui-Tei et al., Nucl. Acids Res. 2004, Vol 32, No.3, p.936-48)。このアルゴリズムに由来する1つのそのような配列は、ATG開始コドンの上流のlacZ遺伝子648〜670位を標的とする抗β-Gal配列
2008509205.tif 000028
である。
この配列は、例えば、ヒト遺伝子TIMM8A(内部ミトコンドリア膜8ホモログAのトランスロカーゼ)およびNM＿01132.1(AFG3 ATPaseファミリー遺伝子3)その他の潜在的オフターゲットダウンレギュレーションを欠くことにおいてDharmacon配列とは異なる。
【０３２８】
リポソーム/リポプレックスの調製
全てのCDAN/DOPE/アミノキシ脂質は、各々、適当な量のCDAN、DOPEおよびアミノキシ脂質(CPA)のストック溶液を硝酸(HNO3、純粋；10分)および二塩化ジメチルシリル(Sigma,UK10；数分)で予備処理した丸底フラスコにピペットで入れ、溶媒を蒸発させ、次いで、ボルテックスによる激しい撹拌下で乾燥脂質フイルムを水(milliQ, 18Ω)で水和させて
2008509205.tif 000029
単層リポソームは、多重膜リポソームをSonomatic水浴(Longford Ultrasonics, UK)において30分間音波処理することによって生じさせた。リポソームを十分に音波処理することによって、溶液は完全に透明となり、リポソームのサイズはPCSによってもはや測定することができず、これは、リポソームのサイズが30nmよりも小さいことを示す。水中のsiRNAの溶液(0.28mg/mL)を、0.1mg/mLの最終siRNA濃度にて、ボルテックスによる激しい撹拌下でこれらのCDAN/DOPE/CPAリポソーム(3mg/mL)に滴下した。得られたsiRNAリポプレックスは、典型的には、PCSによって決定して30〜50nm直径と測定された。1mg/mLのポリエチレングリコール-α/γ-ビスアルデヒド(各々、Mw 2000または3400；NEKTAR, USA)を調製して、適当な量をボルテックスによる撹拌下でリポプレックスに加え、共有結合により表面がペグ化された、異なる量のPEG(0.1〜5%、m/m合計脂質)を有するsiRNAリポプレックスを得た。容量の半分を減圧下で蒸発させ、動物への注射に先立ってPBSの添加によって補った。
【０３２９】
細胞培養
増殖培地(DMEM/10%FCS/ペニシリン/ストレプトマイシン)中での実験から24時間前に、HeLaまたはIGROV-1細胞を40000細胞/ウェルにて48-ウェルプレートに接種し、37℃にて培養した(10%CO2)。トランスフェクションに先立って培地を新鮮な増殖培地で置き換えた。OptiMEM-I/DMEMはInvitrogen(UK)から購入した。
【０３３０】
インビボトランスフェクション
A.流体力学モデル
20〜25g体重のBalb/Cマウスに、尾静脈注射を介して、または腹腔への注射を介してsiRNA含有リポプレックス(200uL, 0.1mg/mL siRNA)を注射し、各々、8時間または24時間放置した。この各休止相の後、動物に10秒以内に2.5mL PBS中の1μgのpUMVC1(CMVプロモーター下でlacZ遺伝子をコードする、7528Bp, University of Michigan Vector Core；http://www.med.umich.edu/vcore/Plasmids/)を注射し、24時間放置し、その後、肝臓を切開し、標準ELISAテスト(ROCHE)を用いてβ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。得られた相対的光単位を、BCAアッセイ(Pierce)によって測定した合計細胞タンパク質含有量を通じて割ることによって標準化した。
【０３３１】
B.組換えアデノウイルス(lacZ)モデル
AdRSVβGalはTransgene(Strasbourg, France)から購入した。それは、E3領域の大部分が欠失されたタイプ-5アデノウイルスである。異なる量のストックをBalb/Cマウスに注射することによってウイルスを滴定し、約10000RLU/mgのタンパク質の肝臓発現が得られた力価を選択した。典型的には、15μLのウイルストックをPBS(200μL)中に希釈し、各々、Blab/Cマウスの尾静脈または腹腔内に注射した。2つのプロトコルは以下に従った：1.siRNAリポプレックスの注射に2時間先立ってのAdRSVβGalの注射(図5A)および2.AdRSVβGalの注射(腹腔内)に8時間先立っての動物当たり200μLのsiRNAリポプレックス(0.1mg/mL siRNA)の尾静脈-注射(図5B)。全てのβ-ガラクトシダーゼELISAアッセイをウイルス注射から24時間後に行った。
【０３３２】
トランスフェクション
製造業者の指示に従って、β-Galレポーター遺伝子(pUMVC1-β-Gal, 7528Bp)をPRIMOfect(商標)(IC-Vec Ltd., UK)でトランスフェクトした。典型的には、48-ウェルプレート当たり0.1μg(HeLa)または0.25μg(IGROV-1)pDNAをトランスフェクトした。合計核酸：脂質比率は指令マニュアルに推奨されたように1:12(w/w)であった。3時間のpDNAトランスフェクション後、トランスフェクションの培地を新鮮な増殖培地(150μL)で置き換え、その後、siFectionの直前に、新鮮なOptiMEM(最終容量100μL)中で調製したLsiR粒子を用いてLsiR siFection実験を行った。
【０３３３】
この実験に記載された全てのsiFectionは48-ウェルプレートで行った。この目的では、siRNA(0.1μg)を最終容量100μLまで新鮮なOptiMEMで希釈した。ボルテックスによる撹拌下で4.35μLのCDAN/DOPE(0.3mg/mL)を加えて(脂質/siRNA比率13:1[w/w]が得られ)、LsiRリポプレックスを5分間放置した。最後に、次いで、LsiR混合物を、(FCS/抗生物質を含む)完全な増殖培地(150μL)中の細胞を含有する所与の48-ウェルプレートの適当なウェルに導入し、37℃、10%CO2にて3時間インキュベートした。次いで、培地を新鮮な増殖培地で置き換え、β-Galレポーターアッセイ(Roche, UK)前に16〜72時間、細胞をインキュベートした。
【０３３４】
実施例1
ペグ化siRNAリポプレックス
図1Aを参照し、DOPE(140μL, CHCl3中10.68mg/mL)、CDAN・3HCl(271μL, CHCl3中4mg/mL)およびCPA(100μL, CHCl3中4.4mg/mL)を、硝酸およびジメチルジクロロシランで予備処理した丸底フラスコ(5mL)にピペットで入れ、溶媒を減圧下で除去し、脂質フイルムが形成され、これをボルテックスによる撹拌下で水(milliQ, 1mL)の添加によって水和した。引き続いて、多重膜リポソーム処方をsonomatic(登録商標)水浴(Longford Ultrasonics)中で30分間音波処理して、小さな単層ベシクル(SUV)を得た。250μLのこれらのリポソームを5mLのfalconチューブにピペットで入れ、siRNAの溶液(0.28mg/mL)をボルテックスによる激しい撹拌下で滴下し、続いて、ポリエチレングリコール-ビスアルデヒドを添加した(Mw 3400、7.8μL、10mg/mL；5%PEG/合計脂質)。試料を15分間室温で放置し、その後、PBS(483μL)を加えた。試料を室温で16時間放置した後、容量を750μLまで減少させて、0.1mg/mL siRNAのsiRNAリポプレックス(LsiR)を得た。
【０３３５】
図1Bを参照し、製造業者の指示に従い、pUMVC1-β-GalをPRIMOfect(商標)(IC-Vec Ltd., UK)でトランスフェクトした。典型的には、48-ウェルプレート当たり0.1μg(HeLa)または0.25μg(IGROV-1)pDNAをトランスフェクトした。3時間のpDNAトランスフェクション時間後、トランスフェクション培地を新鮮な増殖培地(150μL)で置き換えた。異なる量のPEG(0〜5%)を有するLsiR複合体をAに記載のように作成した。各実験では、3用量のsiRNAを選択し(0.02/0.1/0.5μg siRNA/ウェル；5/30/150nM)、OptiMEMで希釈して最終容量100μLを得、これを、150μLの新鮮な増殖培地を含有する各ウェル(48-ウェルプレート)に加え、β-Galレポーターアッセイ(Roche, UK)前に細胞を16〜72時間インキュベートした。
【０３３６】
実施例2
ペグ化siRNAリポプレックスの安定性
80%血清(FCS)中のペグ化(Mw 2000)siRNAリポプレックスの安定性を調べた。実施例1および図1に記載のように表面ペグ化LsiR複合体を作成し、光子相関法(PCS)によって粒子サイズを測定する前に、FCSと共に異なる時間の間インキュベートした。結果を図2に示す。PEGの増大程度に伴って、粒子サイズは調べた時間スケールにわたって増加しない。
【０３３７】
有利には、PEGをsiRNA負荷リポプレックスへポスト-カップリング(post-coupling)させることによって作成されたペグ化したsiRNAリポプレックスは、表面にカップリングさせたPEGの増大量に伴って血清安定性を呈する。
【０３３８】
実施例3
組織分布実験
リポソーム処方を、CDAN/DOPE/CPA700/[4-14C]コレステロール  39.95:50:10:0.05の最終モル比率にて、脂質[4-14C]コレステロール(Amersham Biosciences)で標識した。ボルテックスによる撹拌下で、siRNAのリポソームへの添加によって、siRNAリポプレックスを比率リポソーム/siRNA 13:1(w/w)で作成した。試料を合計容量の半分まで濃縮し、PBSを加えることによってもとの容量まで補った。200μl(0.1mg/mL siRNA)のこれらの複合体を、体重が約30gの各マウスの側方尾静脈に注射した。放射能を動物当たり約0.035μCIに調整した。
【０３３９】
1時間後に、マウスを麻酔し、心臓穿刺によって血液を得、15Uのヘパリンと直ちに混合した。合計血液重量は体重の6%であると仮定し、リポソームの血中濃度を計算した。頚椎脱臼後、肝臓、脾臓、腎臓、肺および心臓を切開し、秤量した。器官を5mL PBS/g器官の濃度にてPBS中でホモゲナイズした。200μLの各器官および100μLの血液のアリコットを、Solvableで60℃にて1時間可溶化した。次いで、試料を0.1mLのEDTA(0.1M)で処理し、続いて、0.1mLのアリコット中の0.3mL〜0.5mLの30%過酸化水素で処理した。室温での15〜30分後に、試料を60℃にてさらに1回1時間インキュベートした。次いで、10mLのUltima Gold(商標)を各バイアルに加え、液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定した。図3に示す結果は、器官当たりの注射された用量のパーセンテージとして表す(%ID)。
【０３４０】
PEGをsiRNA負荷リポプレックスへポスト-カップリングさせることによって生じたペグ化siRNAリポプレックスは、非ペグ化アナログとは異なる薬物動態学プロフィールを呈し、PEGの増大量に伴い肝臓で検出された量は徐々に減少した。
【０３４１】
実施例4
肝臓中のlacZ遺伝子のダウンレギュレーション
PEG2000(CHO)2(0.1%)でペグ化した200μLのLsiRをBalb/Cマウスに静脈内注射し、動物を8時間休ませ、その後、10秒以内に2.5mLのPBS中の1μgのpUMVC1-β-Galを注射した(筋力過多注射)。動物をpDNA注射24時間後に屠殺し、ELISAによってβ-ガラクトシダーゼ発現についてアッセイした。pDNAのみ、およびpDNA＋LsiR(GFP対照)は、β-Galの同一発現レベルを生じ、他方、LsiR(抗β-Gal)はβ-Galタンパク質の80%より多くダウンレギュレーションを媒介する。
【０３４２】
結果を図4に示す。
【０３４３】
驚くべきことに、1μgのpDNA(2mlのPBS中)の流体力学注射によって雌Balb/Cマウスの肝臓に導入されたlacZ遺伝子のダウンレギュレーションは、流体学的注射の8または24時間後に、20μgのsiRNAリポプレックス(PEG 0.1%)の全身送達後に80%より多く到達した。
【０３４４】
実施例5
ペグ化したLsiRリポプレックスでのアデノウイルスにより発現されたβ-Galタンパク質のダウンレギュレーション
アデノウイルスにより発現されたβ-Galタンパク質のダウンレギュレーションに対するペグ化のレベルに対する効果を調べるために、尾静脈注射(200μL合計容量)を介してAdRSVβGalを注射し、各々、0/0.1/5%PEG2000(CHO)2でペグ化されたLsiR(抗β-Gal)を注射する前に動物を2時間放置した。結果を図5Aに示す。
【０３４５】
アデノウイルスの注射経路の効果を調べるために、PEG3400(CHO)2(5%)でペグ化されたLsiRリポプレックスの静脈内注射から8時間後に、AdRSVβGalを腹腔内に注射した(200μL合計容量)。AVの注射の異なる経路のため、β-Galタンパク質の合計レベルは静脈内経路によって得られたレベルの10%まで低下した。
【０３４６】
結果を図5Bに示す。
【０３４７】
驚くべきことに、所与の用量のlacZ-アデノウイルス、および2時間後のウイルス感染で得られた尾静脈注射を介する20μgのsiRNAリポプレックス(PEG 0%/0.1%/5%)で感染させた雄Balb/Cマウスは、最高ペグ化siRNAリポプレックス(5%PEG)の最大ダウンレギュレーション(>70%)を示した。
【０３４８】
実施例6
(A)
HPLC分析
CDAN/CPA/DOPE(20:30:50、m/m/m)リポソームのHPLC分析を行った。30μLのリポソーム(3mg/mL)を70μLの水で希釈し、90μLのこの溶液をHPLCに注入した。蒸発光散乱検出器(ELS)によってピークを分析した。結果を図6Aに示す。
【０３４９】
CDAN/CPA/DOPE(20:30:50、m/m/m)の表面への抗体カップリングもまた調べた。2mgのウサギIgG(Sigma)を1mL NaOAc(20mM)、NaCl(0.15M)pH5.9に溶解し；別のチューブ中にて、1mLの新鮮なH5IO6を調製し、2つのチューブを合わせ、室温にて1.5時間放置した。全反応混合物を透析チューブ(Spectrum Labs, USA；MWCO 12000-14000)に導入するに先立って、0.5mLのエチレングリコールの添加によって反応をクエンチし、0.1M K2HPO4/0.1%トリトンXに対して16時間透析した。溶液を回収し、IgGOX濃度をBCAアッセイによって測定した。80μLのCDAN/CPA/DOPE(20:30:50、m/m/m；2mg/mL)および100μLの酸化されたIgGOX(0.94mg/mL)を37℃/16時間にてインキュベートし、分析のために90μLをHPLCに注入した。結果を図6Aに示す。非酸化IgGをリポソームと共にインキュベートした対照と比較して、rt=27分におけるCPAピークは48%だけ減少した。rt=36分における新しいピークが、タンパク質について示すλ=280nmにおける強力な吸光度にて観察され、これを単離し、SDS page上で分析し、オキシム結合を介する酸化されたFc-炭水化物単位を通じて共有結合された約20コピーのCPAと共にIgGであることが判明した。
【０３５０】
(i)PEG2000(CHO)2、続いての(ii)IgGOXとのリポソームの二重インキュベーションも行った。結果を図6Cに示す。驚くべきことに、CPA脂質のアミノキシ官能基の高い反応性は、CDAN/CPA/DOPE(20:30:50、m/m/m)リポソームのPEG2000(CHO)2(1%)のインキュベーションが、まず、酸化されたIgGOXとさらに反応して、抗体をペグ化リポソームの表面に抗体を共有結合によりコンジュゲートさせることができる血清保護リポソームを生じることを可能とする(図6C(B))。この目的で、各々、40、60、80または100μLの酸化されたIgGOX(0.94mg/mL)の添加の前に、30μLのCDAN/CPA/DOPE(20:30:50、m/m/m)リポソームを2μLのPEG2000(CHO)2(10-8mol)と共に15分/RTインキュベートした(図6C(B)、1-4)。反応混合物を16時間インキュベートし、分析のために90μLをHPLCに注入した(図6C(AおよびB))。rt=27分におけるCPAシグナルは、PEG(CHO)2との先立ってのインキュベーションにもかかわらず、IgGOX(底パネル)の増大量と共に徐々に減少し、これは、CPA脂質の残存する遊離アミノキシ基が、依然として、反応性であって、抗体をペグ化リポソームの表面に共有結合によりコジュゲートさせることを示す。rt=35分におけるHPLCシグナルは、タンパク質を示すλ=280nmにおいて強力な吸収を示すことに留意されたい。
【０３５１】
0.1〜1%合計脂質(リポプレックス中のモル比)にてペグ化された、siRNAおよびCDAN/DOPE/CPA(40/50/10；m/m/m)リポソームから作成されたLsiRリポプレックスは酸性pHにて酸化されたIgG抗体と共にインキュベートすることができ、その結果、酸化されたIgGとのインキュベーション前に(図6a)、および酸化されたIgGとのインキュベーション後に(図6b)、アミノキシリポソームのHPLC分析によって示されるように、その部分的に酸化された炭水化物単位を介して抗体がCPA脂質に共有結合カップリングした。
【０３５２】
(B)
(i)リポソームおよびIgGの調製
(CDAN/DOPE/CPA)：
164μLのDOPE(9.05mg/ml, 744g/mol)、279μLのCDAN・3HCl(3.88mg/mL, 680g/mol)および107μLのCPA(4mg/mL, 1075g/mol)を5mLの丸底フラスコ中で混合し、溶媒を約30℃にて蒸発させて、乾燥した脂質フイルムを形成した。1mLの水を加え、1分間ボルテックスで撹拌することによって、多重膜リポソームを作成した。リポソーム試料を20分間音波処理して<100nmサイズの小さな単層ベシクルを作成した。
【０３５３】
CDAN/DOPE/CPA:DSPErhod：
159μLのDOPE(9.05mg/ml, 744g/mol)、277μLのCDAN・3HCl(3.88mg/mL, 680g/mol)、45μLのCPA(8mg/mL, 1075g/mol)および25.8μLのDSPE-ローダミン(2mg/mL, 1301g/mol)を5mLの丸底フラスコ中で混合した。溶媒を約30℃にて蒸発させて、乾燥させた脂質フイルムを形成した。1mLの水を加え、1分間ボルテックスで撹拌することによって、多重膜リポソームを作成した。リポソーム試料を20分間音波処理して、<100nmサイズの小さな単層ベシクルを得た。
【０３５４】
IgGの酸化：
(a)260μLのIgGストック(0.38mg/mL)および260μLの過ヨウ素酸(水中20mM)を合わせ、暗所で室温にて30分間放置した。次いで、試料をNAP-5-カラム中で脱塩した。酸化の後、異なるIgG希釈を調製し(合計容量170μLまで水を充填した0μL〜170μLの酸化されたIgG)、30μLのリポソーム(3mg/mL)と混合した。40μgのタンパク質の試料をSDS pageゲルで分析した(図6d、A1、レーン2)。
【０３５５】
(b)200μLのIgGストック(0.38mg/mL)および200μLの過ヨウ素酸(水中20mM)を合わせ、暗所にて室温で1時間放置した。次いで、試料を酢酸ナトリウム緩衝液(20mM酢酸ナトリウムおよび150mM NaCl、pH5.5)に対して2時間透析した。酸化の後、異なるIgG希釈を調製し(合計容量170μLまで水を充填した0μL〜170μLの酸化されたIgG)、30μLのリポソームと混合した。40μgタンパク質の試料をSDS pageゲルで分析した(図6d、A1、レーン3)。
【０３５６】
(c)250μLのIgGストック(0.38mg/mL)および250μLの過ヨウ素酸(水中20mM)を合わせ、暗所にて室温で2時間放置した。次いで、試料を酢酸ナトリウム緩衝液(20mM酢酸ナトリウムおよび150mM NaCl、pH5.5)に対して2時間透析した。酸化の後、異なるIgG希釈を調製し(合計容量70μLまで水を充填した0μL〜70μLの酸化されたIgG)、30μLのリポソームと混合した。40μgのタンパク質の試料をSDS pageゲルで分析した(図6d、A1、レーン4)。
【０３５７】
IgGOX蛍光標識：
50μLのNHS-FITC(10mg/mL, DMSO)と共にインキュベートすることによって、70μL(0.2mg/mL)抗体を蛍光標識した。精製はスライド-A-Lyzerミニ透析ユニット、10000 MWCOで達成された。タンパク質濃度の測定は、BCAテストで行い、0.11mg/mLであることが判明した。
【０３５８】
ELISA：
NUNC-Immunoプレートの各ウェルに、5μLのHFN(1mg/mL)および40μLのトリス緩衝液(NaCl 0.25M、トリス0.02M、pH7.6)を加え、プレートを室温にて30分間インキュベートした。その後、プレートを洗浄緩衝液(トリス0.02M、NaCl 0.5M、トリトン0.5%、pH7.6)で3回洗浄した。3μLのBSA(1mg/mL)および40μLのトリス緩衝液を各ウェルに加えることによって、ウェルをブロックした。次いで、プレートを37℃にて1時間インキュベートした。この後、プレートを0〜60pmolの間の酸化されたIgG(0.18mg/mL)の異なる希釈液75μL、あるいはIgGOX-カップルドリポプレックス(0.11mg/mL、タンパク質)を加えた。プレートを37℃にて1時間インキュベートし、その後洗浄した。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(1:5000希釈)にカップリングさせた50μLのヒツジ抗マウス抗体を各ウェルに加えた。プレートを37℃にてさらに1時間インキュベートし、洗浄した。最後に、50μLのSIGMA FAST(商標)OPD基質を各ウェルに加え、405nmにおける吸光度をプレートリーダーで測定した。
【０３５９】
(ii)リポプレックスの形成
リポプレックス1；CDAN/DOPE/CPAおよびCy3-GFP標識siRNA
100μLのCDAN/DOPE/CPAリポソームストック(3mg/mL)を125μLの水と混合した。混合物をボルテックスで撹拌しつつ、75μLのsiRNA Cy3-GFP(0.4mg/mL)をゆっくりと溶液に加えた。53μLのPEG2000(CHO)2(0.135mg/mL)をリポプレックスに加え、1時間インキュベートした。100μLのIgGOX-(FITC)試料(0.11mg/mL)を混合物に加え、3時間インキュベートした。
【０３６０】
リポプレックス2；リポソームrhodおよび非標識siRNA
30μLのリポソームrhodストック(3mg/mL)をプラスチックエッペンドルフチューブにピペットで入れ、23μLのsiRNA(0.4μg/μL)をゆっくりとボルテックスで撹拌しつつリポソームに加えた。次いで、53μLのPEG2000(CHO)2(0.135mg/mL)をリポプレックスに加えた。100μLのIgGOX-(FITC)試料(0.11mg/mL)を混合物に加え、3時間インキュベートした。
【０３６１】
リポプレックスは、SORVALL RC M150 GX遠心機において、逆ショ糖勾配(20%、10%、5%および0%)によって、45000rpmにおいて4℃にて1.5時間精製した。(図6d、B)。ピンク色の層を各試料から取り出し、スライド-A-Lyzerミニ透析ユニット(10000 MWCO、Pierce)において透析し、減圧下で200μLの最終容量まで濃縮した。試料中のタンパク質濃度は、BCAアッセイを用いて測定した。30μLの各試料(0.11mg/mLタンパク質)を凍結乾燥し、15μLの負荷色素に再度溶解した。次いで、試料を12%トリス-グリシンSDS pageゲルに流した(図6D、A2、レーン3/4)。リポプレックスは、0.6cmカラム(0.2MPa、流速0.4mL/分、感度0.05/0.1)によるセファロースCL 6B, 20でのFPLCによっても精製した。酢酸ナトリウム緩衝液(20mM酢酸ナトリウムおよび150mM NaCl、pH5.5)を分離のために用い、検出器は280nmに設定した。次いで、集めた画分をロタバップ(rotavap)で濃縮し、PCSを測定した。典型的には、2つの画分を回収し、最初のものは200nmのリポプレックスサイズを与え、第二のものは10000nmのより小さな画分リポプレックスサイズを与え、これらは凝集したLsiR-IgGリポプレックスである(図6D、各々、レーン2および3)。
【０３６２】
(iii)結果
酸化後の抗体の一体性および活性は、各々、SDS pageおよびELISAによって確認した(図6D)。酸化された抗体の数は、過ヨウ素酸におけるインキュベーション時間および過ヨウ素酸の濃度によって制御することができる。典型的には、10mM過ヨウ素酸における1時間のインキュベーションは、活性を危うくすること無くリポソームおよびリポプレックス双方におけるCPA脂質に効果的にカップリングさせるのに十分な数の酸化された炭水化物を与える。インキュベーション時間の増大においてでさえ抗体は損傷されないことは図6D/A1から明らかである。リポプレックスおよびFPLCへのIgGOXのカップリング、またはショ糖勾配精製の後、SDSは、異なる量のCPA脂質がカップリングしたIgG Fc断片に帰すことができる50kD分子量ラダーよりも僅かに上方の3つの異なるバンドを明らかとする(図6D、レーン2/3)。LsiR-IgGリポプレックスのELISAは、リポプレックスカップルドの十分な抗体の数を示す。
【０３６３】
実施例7
コレステリルアミン 2
クロロギ酸コレステリル1(7.5g、0.0167mol)をエチレン-1,2-ジアミン(180ml)に溶解し、混合物を18時間攪拌した。反応を水でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機抽出物を乾燥し(MgSO4)、溶媒を真空中で除去して残渣を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2/MeOH/NH3=192:7:1、続いてCH2Cl2/MeOH/NH3=92:7:1(v/v)]によって精製し、純粋な生成物2(5.5g、73%)を白色固体として得た(mp 175〜177℃)：FTIR(ヌジョールマル(nujol mull))、νmax[cm-1]3338(アミン)、2977(アルカン)、2830(アルカン)、1692(カルバマート)。
2008509205.tif 000030
【０３６４】
実施例8
Boc-アミノキシコレステリル脂質 3
無水ジクロロメタン中のBoc-アミン-オキシ酢酸(145mg、0.758mmol)を、順次、DMAP(292mg、2.39mmol)、HBTU(373mg、0.987mmol)およびアミン2(272mg、0.576mmol)で処理し、混合物を窒素雰囲気下で室温で15時間攪拌した。反応を7%クエン酸水溶液でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。乾燥した(MgSO4)抽出物を真空中で濃縮して残渣を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(勾配20%酢酸エチル/ヘキサン〜65%酢酸エチル/ヘキサン)によって精製して、純粋なBoc-アミノキシコレステリル脂質3(302mg、81%)を得た。
2008509205.tif 000031
【０３６５】
実施例9
コレステリルアミノキシ脂質 4
次いで、プロパン-2-オール(3ml)中のBoc-アミノキシコレステリル脂質3(86mg、0.067mmol)をジオキサン(3ml)中の4M HClで処理し、混合物を室温で3時間攪拌した。溶媒を真空中で除去して、アミノキシ脂質4(37mg、98%)を得た。
2008509205.tif 000032
【０３６６】
実施例10
CPA化合物の合成
コレステリル-(dPEG4)2-アミノキシ脂質(CPA)6の合成は2つの段階で完了した。
1)短い保護されたPEG-アミノキシリンカー3の固相合成(PABoc、スキーム1)および
2)コレステリル-アミン(C)のPABoc3への溶液相カップリング(スキーム2)。
【０３６７】
PABoc3は、標準的なペプチドFmoc固相方法を用い、塩化2-クロロトリチルポリスチレン樹脂[PS-クロロトリチル-Cl](Argonaut, USA)で合成した。まず、短いPEGリンカー、N-Fmoc-アミド-dPEG4(商標)-酸(Quanta BioDesign, Inc., USA)を塩基性条件下で樹脂に負荷し、Fmoc保護基を引き続いてピペリジンで除去し、アミン1を得た(スキーム1)。次に、HBTUカップリング試薬(Novabiochem, UK)を用い、N-Fmoc-アミド-dPEG4(商標)-酸ユニットを1にカップリングさせ、Fmoc基を引き続いて再度脱保護した。得られたアミンをHBTU条件下でN-Boc-アミノオキシ酢酸(Novabiochem, UK)にカップリングさせ、樹脂結合PABoc2を得、次いで、これを温和な酸性条件下で樹脂から切断して、組成PABoc3を得、これはさらに精製することなく次の工程で続けるのに十分に純粋であると見なされた(TLC)。
【０３６８】
2008509205.tif 000033
スキーム1：Boc-アミノキシ-(dPEG4)2-CO2Hの合成
試薬および条件：a)N-Fmoc-アミド-dPEG4(商標)-酸(3当量)、DMF中のヒューニッヒ(Hunig)塩基(5当量)、2時間、室温；b)DMF中の20%ピペリジン(3×5分)、室温；c)N-Fmoc-アミド-dPEG4(商標)-酸(3当量)、HBTU(5当量)、DMF中のヒューニッヒ塩基(5当量)、1時間、室温；d)DMF中の20%ピペリジン(3×5分)、室温；e)Boc-アミノ-オキシ酢酸(3当量)、HBTU(5当量)、DMF中のヒューニッヒ塩基(5当量)、1時間、室温；およびf)DCM中の50%1,1,1-トリフルオロエタノール、1時間、室温。
【０３６９】
CPAの合成の完了をスキーム2に示す。簡単に述べれば、市販されているクロロギ酸コレステリル(Aldrich, UK)を過剰なエチレンジアミンで純物中で処理し、コレステリル-アミン4を得た。次いで、カップリング試薬としてHBTUを用い、PABoc3をアミン4にカップリングさせ、Boc-保護コレステリル-(dPEG4)2-アミノキシ3を得た(71%収率)。ジオキサン中の4M HClでのBoc基の脱保護によりCPA[コレステリル-(dPEG4)2-アミノキシ脂質、6](分析HPLCによると>97%収率)を得、これをさらに精製することなく生物学的実験で用いた。
【０３７０】
2008509205.tif 000034
スキーム2：CPA脂質の合成
試薬および条件：a)エチレンジアミン(大過剰)、室温、18時間、75%；b)Boc-アミノ-オキシ酢酸、HBTU、DMAP、塩化メチレン、室温、18時間、81%；およびc)4M HCl/ジオキサン、プロパン-2-オール、3時間、99%。
【０３７１】
コレステリル-Gly-PEG(n=11)-ヒドラジド(CP11Hyd)の合成
コレステリル-Gly-PEG(n=11)-ヒドラジド(CP11Hyd)の合成をスキーム3に示す。クロロギ酸コレステロール7のグリシン8での処理により、コレステリルグリシン9が良好な収率で得られる。次に、DMAPの存在下で、ペプチドカップリング剤HBTUを用い、O-(2-アミノエチル)-O-[2-(Boc-アミノ)エチル]デカエチレングリコールを9にカップリングさせて、Boc-保護コレステリル-グリシン-PEGn=11-アミン10を得る。Boc基のTFAでの除去により遊離アミン11を得、これは、今回はカップリング試薬としてポリスチレン結合-DCC由来樹脂PS-カルボジイミド(Argonaut, UK)を用い、Nh-tert-ブチルオキシカルボニル-コハク酸モノヒドラジド14をカップリングさせることにおいて直ちに用いるのに十分に純粋であった。従って、Boc-保護ヒドラジド12は2工程で良好な68%収率で得られた。ジオキサンまたはTFA中の4M HClでの12の処理により、所望のヒドラジド13が54%収率でスムーズに得られた。
【０３７２】
2008509205.tif 000035
スキーム3：CP11Hydの合成
試薬および条件：a)Et3N(1.2当量)、ジオキサン/水、12時間、室温、63%；b)O-(2-アミノエチル)-O-[2-(Boc-アミノ)エチル]デカエチレングリコール、HBTU、DMAP、DCM、2日、室温、97%；c)TFA/DCM(1:1)、1時間、室温；d)Nh-tert-ブチルオキシカルボニル-コハク酸モノヒドラジド14、Et3N、PS-カルボジイミド、DCM、24時間、室温、2工程で68%；e)ジオキサン、2-プロパノール中4M HCl、室温、3時間、54%。
【０３７３】
実験手法
材料および方法
Boc-アミノ-オキシ酢酸およびHBTUはNovabiochem(CN Biosciences, UK)から入手した。N-Fmoc-アミド-dPEG4(商標)-酸はQuanta BioDesign Ltd.(Powell, OH, USA)から購入した。PS-カルボジイミドおよびPS-クロロトリチル-Cl樹脂はArgonaut Technologies, Inc.(Foster City, CA, USA)から入手した。全ての他の化学物質は、特記しない限り、Sigma Aldrich(Dorset, UK)から購入した。乾燥したジクロロメタンを五酸化リンで蒸留し；他の溶媒はSigma-Aldrich(Dorset, UK)またはBDH Laboratory Supplies(Poole, UK)から予め乾燥して、または必要であれば購入した。HPLC-グレードのアセトニトリルはFisher Chemicals(Leicester, UK)から購入し、他のHPLC-グレードの溶媒はBDH Laboratory Supplies(Poole, UK)から購入した。薄層クロマトグラフィー(TLC)は予めコートしたMerck-Kieselgel 60 F254アルミニウム裏打ちプレートで行い、適切であれば、紫外光、ヨウ素、酸性モリブデン酸アンモニウム(IV)、酸性エタノール性バニリン、または他の試薬で目に見えるようにした。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Merck-Kieselgel 60(230〜400メッシュ)で達成された。重量スペクトルは、Bruker Esquire 3000、VG-7070BまたはJEOL SX-102機器を用いて記録した。1Hおよび13C NMRは、内部参照として残存同位体溶媒を用いてAdvance Brucker 400 Ultrashield(商標)マシーンで記録した(s=シングレット、d=ダブレット、t=トリプレット、q=カルテット、quin=クインテット、br=ブロードシングレット)。分析HPLC(Polymer Laboratories PL-ELS 1000蒸発光散乱検出器を備えたHitachi-LaChrom L-7150ポンプシステム)は、勾配0.1%水性TFA〜100%アセトニトリル(0.1%TFA)[0〜15分]、次いで、100%アセトニトリル(0.1%TFA)[15〜25分]、次いで、100%メタノール[25〜45分]でのVydac C4ペプチドカラムで行った。
【０３７４】
Boc-アミノキシ-(dPEG4)2-CO2H 3
2008509205.tif 000036
Boc-アミノキシ-(dPEG4)2-CO2H 3は標準的なペプチド固相合成戦略を用いて合成した：塩化クロロトリチル樹脂(1.27mmol/g負荷、55mg、0.070mmol)をDcm中で16時間膨潤させた。第一の酸を、樹脂を、DMF(15ml)中のN-Fmoc-アミド-dPEG4(商標)-酸(102mg、0.209mmol)およびヒューニッヒ塩基(60μl、0.349mmol)で1時間処理することによって樹脂に負荷した。Fmoc脱ブロッキングは、DMF中のピペリジン(20%)(2×5分)を用い、続いて、DMFで十分に洗浄することによって達成した。次に、得られた樹脂結合遊離アミンを、DMF(15ml)中のヒューニッヒ塩基(60μl、0.349mmol)中のHBTU(132.5mg、0.209mmol)で1時間活性化したN-Fmoc-アミド-dPEG4(商標)-酸(102mg、0.209mmol)と反応させた。(各カップリング工程では、3当量のアミノ酸、5当量のDIEAおよび3当量のHBTUを用いた。各カップリングは1時間行い、続いて、3当量のDIEAの存在下で、DMF中の無水酢酸(10%)でキャッピングした。最後に、Boc-アミノ-オキシ酢酸(40mg)をカップリングさせて樹脂結合生成物を得た。DCM中の50%トリフルオロエタノールからなる3mLの溶液を用い、化合物を4時間にわたって切断して、粗製残渣(40mg、0.058mmol)を得た。
2008509205.tif 000037
【０３７５】
コレステリル-アミン 4
2008509205.tif 000038
クロロギ酸コレステリル1(7.5g、0.0167mol)をエチレン-1,2-ジアミン(180ml)に溶解し、混合物を18時間攪拌した。反応を水でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機抽出物を乾燥し(MgSO4)、溶媒を真空中で除去して残渣を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2:MeOH:NH3 192:7:1→CH2Cl2:MeOH:NH3 92:7:1(v/v)]によって精製して、純粋な生成物2(5.5g、0.0116、73%)を白色固体(mp 175〜177℃)として得た：FTIR(ヌジョールマル)νmax 3338(アミン)、2977(アルカン)、2830(アルカン)、1692(カルバマート)cm-1。
2008509205.tif 000039
【０３７６】
Boc-アミノキシ-(dPEG4)2-コレステリル脂質(BocCPA) 5
2008509205.tif 000040
無水ジクロロメタン中のBoc-アミノキシ-(dPEG4)2-CO2H(40mg、0.058mmol)を、順次、DMAP(22mg、0.18mmol)、HBTU(24mg、0.063mmol)およびコレステリルアミン2(28mg、0.0.06mmol)で処理し、混合物を窒素雰囲気下で室温にて15時間攪拌した。反応を7%クエン酸水溶液でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。乾燥した(MgSO4)抽出物を真空中で濃縮して残渣を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(勾配DCM:MeOH:H2O)によって精製し、純粋なBoc-アミノキシ-(dPEG4)2-コレステリル脂質3(47mg、0.0411mmol、71%)を得た。
2008509205.tif 000041
【０３７７】
コレステリル-(dPEG4)2-アミノキシ脂質 6 (CPA)
2008509205.tif 000042
次いで、プロパン-2-オール(2ml)中のBoc-アミノキシ-(dPEG4)2-コレステリル脂質3(40mg、0.035mmol)をジオキサン(2ml)中の4M HClで処理し、混合物を室温にて3時間攪拌した。溶媒を真空中で除去して、CPA脂質4(37mg、98%)を得た。
2008509205.tif 000043
分析HPLC：1ピーク、RT31分。
【０３７８】
コレステリル-グリシン 9
2008509205.tif 000044
0℃のジオキサン(35ml)中のクロロギ酸コレステロール7(1g、2.23mmol)およびトリエチルアミン(424μl、2.9mmol)に、水(15ml)中に溶解したグリシン8を加えた。混合物を室温にて12時間攪拌し、次いで、反応を7%クエン酸水溶液でクエンチし、水性層をジクロロメタンで抽出し、有機抽出物を乾燥し(MgSO4)、真空中で濃縮した。得られた粗製残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン)によって精製して、生成物を白色粉末(680mg、1.39mmol、63%)として得た。
2008509205.tif 000045
【０３７９】
コレステリル-gly-PEG11-NHBoc 10
2008509205.tif 000046
コレステリル-グリシン9(150mg、0.309mmol)、O-(2-アミノエチル)-O-[2-(Boc-アミノ)エチル]デカエチレングリコール(Fluka, UK)(198mg、0.307mmol)、HBTU(117mg、0.309mmol)およびDMAP(114mg、0.927mmol)を無水ジクロロメタン(50ml)に溶解し、窒素雰囲気下で2日間攪拌した。反応を7%クエン酸水溶液でクエンチし、水性層をジクロロメタン/MeOH混合物で抽出し、有機抽出物を乾燥し(MgSO4)、真空中で濃縮した。得られた粗製残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(CHCL3/MeOH/H2O)によって精製して、生成物(335mg；0301mmol、97%)を得た。
2008509205.tif 000047
HPLC RT=27分(C-4カラム)；ES-MS 1136.4[M+Na]＋。
【０３８０】
コレステリル-gly-PEG11-(Boc-ヒドラジド) 12
2008509205.tif 000048
TFA；DCM(5ml:5ml)中のコレステリル-gly-PEG11-NHBoc10(300mg)を室温にて1時間攪拌した。溶媒を真空中で除去してアミン11を得、これをさらに精製することなく用いた(スキーム3参照)。従って、アミン11(60mg、0.059mmol)、Nh-tert-ブチルオキシカルボニル-コハク酸モノヒドラジド14(232mg、0.118mmol)(Dietzgen et al.；Z. Naturforsch. B；42, 4, (1987), pp.441〜453に従って合成)およびトリエチルアミン(16μl)およびポリスチレン結合DCC樹脂(負荷1.27mmol/g；140mg；0.1777mmol)、(Argonaut Technologies, UK)をジクロロメタン(10ml)中で24時間攪拌した。樹脂を濾過によって除去し、濾液を真空中で濃縮して残渣を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール/水)によって精製して、Boc-保護ヒドラジド12(49mg、0.040mmol、68%)を得た。
2008509205.tif 000049
HPLC RT=27分(C-4カラム)；ES-MS 1250.3[M+Na]+。
【０３８１】
コレステリル-gly-PEG11-ヒドラジド 13 (CP11hyd)
2008509205.tif 000050
コレステリル-gly-PEG11-(Boc-ヒドラジド)12(40mg、0.0326mmol)を2-プロパノール(3ml)に溶解し、次いで、ジオキサン(3ml)中の4M HClで処理した。混合物を3時間攪拌し、真空中で濃縮した。残渣をMeOHに対するエーテル沈殿によって精製して、灰色がかった白色ガム(20mg、0.0177mmol、54%)を得た。
2008509205.tif 000051
HPLC RT=27分(C-4カラム)；ES-MS 1150.3[M+Na]+。
【０３８２】
実施例11
凍結乾燥し再度水和させたLsiRリポプレックス
3mg/mL脂質のCDAN/DOPE(50:50、m/m)の凍結乾燥粉末を水和することによって、多重膜リポソームを脱イオン水中で調製した。siRNAを水中で希釈し、ボルテックスで撹拌しつつゆっくりとリポソームに加えて、脂質/siRNA比率12:1(w/w)での20μg/mL(siRNA)の最終siRNA濃度のLsiR複合体を得た。30%(w/v)のスクロース、トレハロースおよびラクトース(Sigma, UK)ストック溶液を調製し、これらの適当な容量をLsiRリポプレックスに加えて、各々、5、10および20%(w/v)の最終濃度を得た。複合体形成におけるLsiR濃度は、用いた凍結保護剤の量に依存して変化した。例えば、凍結保護剤を含まないLsiRを20μg/mLで調製したが、LsiR含有20%凍結保護剤は60μg/mLで調製した。25μLのリポプレックス(0.5μg siRNA)を凍結乾燥し、得られた粉末を20μg/mL(25μL)において、または5μg/mL(100μL)において、得られた粉末を水中で水和し、ボルテックスで撹拌し、室温にて15分間放置した。PCSによるこれらのLsiR粒子のサイズ測定は、粒子が、凍結乾燥/再水和プロセス前のものと同一のサイズを呈していた。
【０３８３】
pDNAトランスフェクションは、記載されたように0.2μg/ウェルのpDNA/ウェルを用いて行った。これらの凍結乾燥し/再水和したLsiRの0.1μg/ウェルを、pDNAトランスフェクションから3時間後に37℃/10%CO2において3時間インキュベートした。簡単に述べると、20μg/mL(siRNA)の新鮮なLsiRおよび凍結乾燥し/再水和したLsiRについては、5μLの各複合体を、増殖する細胞の各ウェル中の250μLの完全な増殖培地に加えた。5μg/mL(siRNA)の解凍し/再水和したLsiRでは、20μLの複合体を、増殖する細胞の各ウェル中の250μLの完全増殖培地に加えた。3時間のインキュベーションの後、siFECTion培地を取り出し、400μLの新鮮な完全増殖培地で置き換えた。
【０３８４】
結果を図8に示す。
【０３８５】
驚くべきことに、トレハロースの存在下で凍結乾燥し、かつ25または100μLいずれかの水中で再水和させたLsiRリポプレックスは、新たに調製されたLsiRリポプレックスよりもlacZレポーター遺伝子をダウンレギュレートするのにまさに良好である。
【０３８６】
前記明細書中で言及した全ての刊行物は参照により本明細書に組み入れられる。本発明の記載された方法およびシステムの種々の修飾および変形は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい態様との関連で記載してきたが、特許請求する発明はそのような特定の態様に不本意にも限定されるべきではないことは理解されるべきである。事実、化学、生物学および分子生物学あるいは関連分野における当業者に明白な、本発明を実施するための記載された態様の種々の修飾は以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０３８７】
参考文献
2008509205.tif 000052
2008509205.tif 000053
2008509205.tif 000054
【図面の簡単な説明】
【０３８８】
【図１】(a)PEGをsiRNA負荷リポプレックスへポスト-カップリングさせることによって生じたペグ化siRNAリポプレックスは、PEGのアルデヒド基およびアミノキシ脂質CPAのアミノキシ官能基の間で形成されたオキシム結合によって、PEGがsiRNAリポプレックスの表面に不可逆的にカップリングしても、特異的に標的とされた遺伝子の特異的ダウンレギュレーションを用量-応答依存的にインビトロで媒介する。(b)特異的遺伝子のこの特異的ダウンレギュレーションは、siRNAリポプレックスの表面にカップリングしたPEGの量に依存する。
【図２】PEGをsiRNA負荷リポプレックスへポスト-カップリングさせることによって生じたペグ化siRNAリポプレックスは、表面にカップリングしたPEGの増大量に伴って血清安定性を呈する。
【図３】PEGをsiRNA負荷リポプレックスへポスト-カップリングさせることによって生じたペグ化siRNAリポプレックスは、非ペグ化アナログとは異なる薬物動態学プロフィールを呈し、PEGの増大量に伴って肝臓で検出された量を徐々に減少させる。
【図４】驚くべきことに、(2mlのPBS中の)1μgのpDNAの流体力学的注射によって雌Balb/Cマウスの肝臓に導入されたlacZ遺伝子のダウン-レギュレーションは、流体力学的注射から8または24時間後に、20μgのsiRNAリポプレックス(PEG0.1%)の全身送達後に80%より多く到達した。
【図５】よりいっそう予期せぬことには、所与の用量のlacZ-アデノウイルスで感染させ、ウイルス感染から2時間後に、尾静脈注射を介して20μgのsiRNAリポプレックス(PEG 0%/0.1%/5%)を得た雄Balb/Cマウスは、最高ペグ化siRNAリポプレックス(5%PEG)の最大ダウンレギュレーション(>70%)を示した。
【図６】0.1〜1%合計脂質(リポプレックス中のモル比率)でペグ化されたsiRNAおよびCDAN/DOPE/CPA(40/50/10；m/m/m)リポソームから作成されたLsiRリポプレックスは酸性pHにおいて酸化されたIgG抗体と共にインキュベートすることができ、その結果、酸化されたIgGとのインキュベーション前に(図6a)および酸化されたIgGとのインキュベーション後に(図6b)、アミノキシリポソームのHPLC分析によって示されるように、CPA脂質への、その部分的に酸化された炭水化物ユニットを介しての抗体の共有結合カップリングがもたらされた。(i)PEG2000(CHO)2、続いての(ii)IgGOXとのリポソームの二重インキュベーションもまた行った(図6c)。図6dを参照し、図6d(A1)は、SDS PAGEゲルの結果を示す(12.5%トリス/グリシン)。Mw、分子量BenchMark(商標)Protein Ladder(Invitrogen)；レーン1、天然の非酸化ヒトフィブロネクチン(HFN)IgG；レーン2、30分/10mM過ヨウ素酸についてのHFN-IgGの酸化；レーン3、60分/10mM過ヨウ素酸についてのHFN-IgGの酸化；レーン4、120分/10mM過ヨウ素酸についてのHFN-IgGの酸化；ゲルをクマシーブルーで染色した。図6d(A2)はSDS pageゲルの結果を示す(12.5トリス/グリシン)。レーン1、天然の非酸化HFN-IgG；レーン2、FPLC精製後に共有結合カップリングしたHFN-IgGOXとLsiRリポプレックス、フラクション1；レーン3、FPLC精製後に共有結合カップリングしたHFN-IgGOXとLsiRリポプレックス、フラクション2。双方のFPLCフラクションは、そのFc断片は50kD分子量バンドの上方を移動する抗体を含有し、これは、Fcユニットの酸化された炭水化物にカップリングしたCPA-脂質の指標である。凝集の状態を示す、第1のフラクション(200nm)と比較して、かなりより高い粒子サイズ(10000nm)を呈する第2のフラクションでのリポプレックスの異なるサイズのため、FPLCにおける2つのバンドが生起する。ゲルは標準的な手法を用いて銀染色し、タンパク質バンドを可視化した。図6d(B)は、ショ糖勾配後に共有結合カップリングしたHFN-IgGOXとのLsiRリポプレックスの結果を示す。(矢印によって示される)蛍光バンドは、蛍光標識された(Cy3)-siRNAに由来する。図6d(C)は、IgGのヒトフィブロネクチン(HFN)への特異的結合を示すHFN-IgGOXのELISAの結果を示す。図6d(D)は、スクロース勾配における精製後の、共有結合カップリングしたHFN-IgGOXとLsiRリポプレックスのELISAの結果を示し、これは、天然および酸化されたHFN-IgGで観察されたのと同様な結合特徴を示す。
【図７】グルコース、マンノース、ラクトース、フルクトース、マルトトリオース、およびマルトヘプタオースのような天然炭水化物は、0.1〜1%合計脂質(リポプレックス中のモル比率)でペグ化したsiRNAおよびCDAN/DOPE/CPA(40/50/10；m/m/m)リポソームから作成されたLsiRリポプレックスと共にインキュベートして、CPA脂質のアミノキシ官能基とC1-炭水化物原子との共有結合コンジュゲーションを形成することができる。
【図８】HeLaでの凍結乾燥したLsiRでのβ-ガラクトシダーゼのダウン-レギュレーション。LsiR新鮮、新たに調製されたLsiR；LsiR 12 FD 25、凍結乾燥し、25μlの水中で再度水和したLsiR複合体、凍結保護剤無し；LsiR 12 FD 100、凍結乾燥し、100μlの水中で再度水和したLsiR複合体、凍結保護剤無し。グラフは、各々、25μl(FD25)または100μl(FD100)水のいずれかにおいて再度水和させた、5%/10%または20%(w/v)で用いた3種の凍結保護剤(スクロース、トレハロース、またはラクトース)の比較を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2008509205.tif 000062
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2008509205.tif 000067
【図６Ｂ】
2008509205.tif 000068
【図６Ｃ】
2008509205.tif 000069
【図６Ｄ】
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【図７】
2008509205.tif 000071
【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月23日(2007.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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