(57)【要約】  本発明は下記の式Ａの化合物またはこの医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグもしくは溶媒和物に関連する：オリゴ糖−スペーサー−ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト（Ａ）（式中、オリゴ糖は、４個から２５個の単糖ユニットを含む負荷電のオリゴ糖残基であり、荷電は正荷電の対イオンによって補われ、また、該オリゴ糖残基は、これ自体が（ＡＴ−ＩＩＩ媒介の）抗Ｘａ活性を有するオリゴ糖に由来する；スペーサーは結合または本質的に薬理学的に不活性な結合残基である；ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、互いに１０Åから２０Åの距離で残基内に位置する場合によりエステル化されたカルボキシラート部分および塩基性部分を典型的には含む、フィブリノーゲンのＲＧＤフラグメントおよび／またはＫ（ＱＡ）ＧＤフラグメントを模倣する残基である）。本発明の化合物は抗血栓活性を有しており、血栓性疾患を処置または予防することにおいて使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式Ａの化合物：
オリゴ糖−スペーサー−ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト      （Ａ）
（式中、
オリゴ糖は、４個から２５個の単糖ユニットを含む負荷電のオリゴ糖残基であり、該荷電は正荷電の対イオンによって補われており、及び該オリゴ糖残基は、これ自体が（ＡＴ−ＩＩＩ媒介の）抗Ｘａ活性を有するオリゴ糖に由来しており；
スペーサーは結合または本質的に薬理学的に不活性な結合残基であり；
ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、互いに１０から２０Åの距離で残基内に位置する場合によりエステル化されたカルボキシラート部分および塩基性部分を典型的には含む、フィブリノーゲンのＲＧＤフラグメントおよび／またはＫ（ＱＡ）ＧＤフラグメントを模倣する残基である）
またはこの医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグもしくは溶媒和物。
【請求項２】
スペーサーが本質的に薬理学的に不活性な結合残基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
スペーサーが１原子から５０原子の長さを有する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
スペーサーが少なくとも１つの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−部分を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
オリゴ糖が４個から１６個の単糖ユニットを有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
オリゴ糖が硫酸化五単糖残基である、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
五単糖残基が、下記の構造Ｂ：
【化１】
2008500960.tif 000030
（式中、Ｒ１は独立してＯＳＯ３−または（１−８Ｃ）アルコキシであり、荷電は正荷電の対イオンによって補われる）
を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
五単糖残基が、下記の構造Ｃ：
【化２】
2008500960.tif 000031
（式中、Ｒ１はＯＣＨ３またはＯＳＯ３−であり、荷電は正荷電の対イオンによって補われる）
を有する、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基が、Ｒｏ４３５０５４、ＳＣ５４７０１（キセミロフィバン）、ＲＷＪ５００４２、シブラフィバン（Ｒｏ４４３８８８）、ラミフィバン（Ｒｏ４４９８８３）、ＧＰＩ５６２、ＦＫ６３３、チロフィバン（ＭＫ３８３）、オルボフィバン（ＳＣ５７１０１）、エプチフィバチド（Ｃ６８２２）、ロキシフィバン（ＸＶ４５９）、エラロフィバン（ＲＷＪ５３３０８）、ＳＲ１２１５６６（ＳＲ１２１７８７の活性形態）、レフラダフィバン（ＢＩＢＵ５２）、ロトラフィバン（ＳＢ２１４８５７）、ガントフィバン（ＹＭ０２８）、Ｔ−２５０、ＥＦ５０７７、ＺＤ２４８６、ＴＡＫ０２９、ＴＰ９２０１またはＬ７０３０１４に由来する残基から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基が、下記の構造Ｄ：
−Ｙ−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｘ      （Ｄ）
（式中、Ｙは、Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｒ２）（Ｃ（Ｒ２）２ＣＯＯＨ）またはＮ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｒ２）（ＣＨ２アリール）−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｒ２）（Ｃ（Ｒ２）２ＣＯＯＨ）、Ｏ−フェニレン−Ｃ（Ｒ２）２−Ｃ（Ｒ２）（ＣＯＯＨ）−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｒ２）（Ｃ（Ｒ２）２ＣＯＯＨ）、Ｏ−フェニレン−Ｃ（Ｒ２）２−Ｃ（Ｒ２）（Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｏ−Ｃ（Ｒ２）２ＣＯＯＨ）であり、
Ｒ２は独立してＨまたは（１−４Ｃ）アルキルであり；及びアリールは、フェニル、ヒドロキシフェニル、チオフェニルまたはピリジニルであり、及びＲ３はピペリジニルである；
Ｘは、ベンズアミジン、（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−ベンズアミジン、（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−ベンズアミジン、または
【化３】
2008500960.tif 000032
（式中、ｎは０、１、２または３である）
である）
を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
下記の化合物：
【化４】
2008500960.tif 000033
2008500960.tif 000034
2008500960.tif 000035
から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
場合により修飾されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基を、（ａ）オリゴ糖に直接カップリングする工程、または、（ｂ）オリゴ糖−スペーサー残基にカップリングする工程、または、（ｃ）スペーサーにカップリングし、続いて、オリゴ糖−スペーサー残基にカップリングする工程を含む、式Ａの化合物を調製するための方法。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか一項に記載される化合物と、医薬的に好適な補助剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
治療において使用される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
血栓性疾患を処置または予防するための医薬品を製造するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載される化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗血栓化合物、該化合物を有効部分として含有する医薬組成物、ならびに、医薬品を製造するための該化合物の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
急性心筋梗塞、虚血および卒中は、アテローム硬化性冠状動脈における閉塞性血栓の形成によって引き起こされる。動脈血栓は、血小板（栓球）が（増大したレベルの）フィブリノーゲンと凝集することによって形成される。このプロセスは、フィブリノーゲンがフィブリン塊に切断される凝固系の刺激された状態および不均衡に関連する。これらの一次的および二次的な止血経路の１つにおける介入は（動脈）血栓症の処置において不可欠である。
【０００３】
セリンプロテアーゼは、血液凝固カスケードにおいて重要な役割を果たしている酵素である。このプロテアーゼ群のメンバーは、例えば、トロンビン、トリプシン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子およびプロテインＣである。トロンビンが凝固カスケードにおける最後のプロテアーゼ酵素である。トロンビンの主な機能は、フィブリンモノマーを生じさせるためのフィブリノーゲンの切断であり、この後、フィブリンモノマーは架橋され、不溶性ゲルを形成する。加えて、トロンビンは、このカスケードにおいてより上流での第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子の活性化によってこれ自身の産生を調節する。トロンビンはまた、細胞レベルでも重要な作用を有しており、この場合、トロンビンは特異的な受容体に対して作用して、血小板凝集、内皮細胞の活性化および繊維芽細胞の増殖を引き起こす。このように、トロンビンは止血および血栓形成において中心的な調節的役割を有している。第Ｘａ因子はプロトンビンのトロンビンへの変換を触媒する。第Ｘａ因子の阻害は血液凝固の阻害を効果的にもたらす。
【０００４】
血小板凝集は、いくつかの活性化因子によって、すなわち、トロンビンによってだけでなく、ＡＤＰ、コラーゲンおよびエピネフリンによっても開始される。すべての場合において、血小板凝集に至る最後の共通する経路は、フィブリノーゲンがこの受容体（重要な膜糖タンパク質複合体ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）に結合することである。従って、このタンパク質に対するフィブリノーゲン結合の阻害は、（動脈）血栓形成の防止および血栓性疾患の処置のために血小板凝集を阻害する非常に効果的な方法であると考えられる。
【０００５】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（αＩＩｂβ３）は、インテグリンファミリーに属する表面受容体である。インテグリンは２つの鎖（αサブユニットおよびβサブニット）から構成され、この場合、２つの鎖はカルシウム依存的に非共有結合性の結合によってつながれる。ＧＰＩＩｂは、二価カチオン結合ドメインを有するαサブユニット（αＩＩｂ）を構成し、これに対して、ＧＰＩＩＩａはプロタイプ（ｐｒｏｔｙｐｉｃａｌ）βサブニット（β３）である。様々なインテグリンが身体中の細胞から単離されており、これらは細胞−細胞接着および細胞−基質接着ならびにシグナル伝達の媒介因子である。３つの結合部位がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上に存在する：アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを認識する結合部位（ＲＧＤ結合部位）、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを認識する別の結合部位（ＫＱＡＧＤ結合部位）、および、Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを認識する結合部位（ＫＧＤ結合部位）。
【０００６】
循環している各々の血小板には、３５，０００個から１００，０００個のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体が存在しており、ほとんどが血小板表面に分布し、より小さいプールが内部リザーバーに存在する。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体は、血小板が外因性アゴニスト（例えば、ＡＤＰまたはトロンビンなど）によって活性化されるまではこの血漿リガンドと相互作用しない。このことが生じるとき、インサイドアウト（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）シグナルが生じ、この結果、複合体分子がフィブリノーゲンおよび他のリガントと結合することを可能にさせる、複合体の細胞外部分での配座変化がもたらされる。
【０００７】
フィブリノーゲンのα鎖（ＲＧＤ）フラグメントおよびγ鎖（ＫＱＡＧＤＶ）フラグメントを模倣する化合物はアンタゴニストとして作用する場合がある。ペプチドミメティック構造に基づく数多くの強力なＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが以前から記載されている。
【０００８】
いくつかの（非常に）強力な例が、Ｒｏ４３５０５４、キセミロフィバン、ＲＷＪ５００４２、チロフィバンおよびラミフィバンである。しかしながら、優れた効能および薬理学的プロフィールをインビトロで示す非常に多数のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストがさらに開発されていないか、または、血小板凝集の一貫した抑制がないこと、および、（部分的には）化合物の短い半減期により引き起こされ不明瞭な薬理学的挙動のために、後期段階の臨床試験に達した後で保留されている。短い半減期は遊離薬物の血漿中レベルにおける大きな変動をもたらし、用量応答における個体間の変動性の一因になり得る（治療をモニターすることが要求される）。
【０００９】
様々なＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストによるすべての大規模な臨床試験において、治療効果が軽微にすぎず、また、さらに糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニスト処置群の患者（経口処置）において死亡率の増大さえも観測されたことが、Ｈ．Ｄａｒｉｕｓによって、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．、２００１、１０３、Ｓ１１７からＳ１２４においてさらに報告されていた。これらの薬物の狭い治療域および限られた生物学的利用率が、血小板のフィブリノーゲン受容体の調節についての依然として非常に限られた知識とともに、この治療失敗の原因であると考えられた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
まとめると、（血小板凝集阻害の一貫したレベルを達成するために）好ましくはより長い半減期とともに予測可能な抗血栓作用を有するＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、今回、凝固カスケード経路および血小板凝集経路の両方において２つの重要な標的（各々、第Ｘａ因子およびＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ）を阻害することによって混合型の薬理学的プロフィールを好ましくは有する阻害剤である新規な化合物が見出されている。
【００１２】
本発明の化合物は、下記の式Ａ：
オリゴ糖−スペーサー−ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト      （Ａ）
（式中、
オリゴ糖は、４個から２５個の単糖ユニットを含む負荷電のオリゴ糖残基であり、この場合、荷電は正荷電の対イオンによって補われ、また、該オリゴ糖残基は、これ自体が（ＡＴ−ＩＩＩ媒介の）抗Ｘａ活性を有するオリゴ糖に由来する；
スペーサーは結合または本質的に薬理学的に不活性な結合残基である；
ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、互いに１０Åから２０Åの距離で残基内に位置する場合によりエステル化されたカルボキシラート部分および塩基性部分を典型的には含む、フィブリノーゲンのＲＧＤフラグメントおよび／またはＫ（ＱＡ）ＧＤフラグメントを模倣する残基である）
を有し、
またはこの医薬的に許容される塩またはこのプロドラッグもしくは溶媒和物である。
【００１３】
本発明の化合物は、凝固因子ＸａのＡＴＩＩＩ媒介による阻害と、フィブリノーゲンがこの受容体に結合することに拮抗することによる血小板凝集の阻害との両方によって効果的な抗血栓剤である。ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤が抗凝固治療と組み合わされる当分野で公知の混合治療（例えば、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｇ．Ｄｒｕｇｓ（２００３）、１２（９）、１５６７、および、米国特許出願公開第２００３／０１９９４５７号Ａ１に記載される治療など）と比較したとき、本発明の化合物の薬物動態学的プロフィールおよび薬力学的プロフィールは、血小板凝集のより一貫した抑制、および、用量応答におけるより小さい個体間の変動性をもたらしている。本発明の化合物のさらなる利点は、薬理学的プロフィールを調整することができることである：例えば、（ａ）オリゴ糖のタイプを変えることによって、ＡＴＩＩＩに対する結合が影響を受け、これにより、Ｘａ阻害活性の増大または低下がもたらされ、従って、各々、より長い半減期またはより短い半減期がもたらされ、また、（ｂ）ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストのタイプを変えることによって、血小板凝集の阻害を増大または低下させることができ、また、（ｃ）スペーサーの長さを変えることによって、各化合物の個々の薬理学的活性のさらなる調整が可能である。
【００１４】
オリゴ糖を含む他のコンジュゲートが報告されており、これらは、五単糖および直接的なトロンビン阻害剤の合成コンジュゲート（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９９、９（１４）、２０１３から８；ＷＯ  ９９／６５９３４；ＷＯ  ０１／４２２６２）、または、２つのオリゴ糖（この場合、オリゴ糖の一方が、もう一方のオリゴ糖のＡＴ−ＩＩＩ媒介による抗Ｘａ活性に加えて、間接的なＡＴ−ＩＩＩ媒介の抗トロンビン活性を示す）のコンジュゲート（欧州特許第０，６４９，８５４号）である。このような化合物は、抗血栓化合物でもあるが、凝固カスケードの因子に対して作用するだけである。一方で、本発明の化合物はまた、循環している血小板の表面に存在するＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対しても作用する。従って、作用機構は他のタイプの抗血栓コンジュゲートの各々とは大きく異なる。本発明の化合物に関しては、２つの相補的な抗血栓治療が１つだけの薬物物質において利用可能である。
【００１５】
本発明の化合物は、血栓性疾患を処置し、（可能であれば）予防するために有用である。これには、凝固カスケードが活性化される数多くの血栓状態および前血栓状態が含まれ、これらには、深部静脈血栓症、肺塞栓症、血栓性静脈炎、血栓症または塞栓症からの動脈閉塞、血管形成術中または血管形成術後の動脈再閉塞、動脈傷害または浸襲的心臓学的手法の後での再狭窄、術後の静脈の血栓症または塞栓症、卒中および心筋梗塞が含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
単糖ユニットが４個から２５個である任意の負荷電のオリゴ糖残基が本発明の化合物において使用可能である。本発明の好適な化合物は、オリゴ糖が硫酸化オリゴ糖残基またはリン酸化オリゴ糖残基である化合物である。好ましくは、オリゴ糖残基は、これ自体が（ＡＴ−ＩＩＩ媒介の）抗Ｘａ活性を有するオリゴ糖に由来し、例えば、欧州特許第０．４５４，２２０号、欧州特許第０，５２９，７１５号、ＷＯ  ９７／４７６５９、ＷＯ  ９８／０３５５４およびＷＯ  ９９／３６４４３に開示されるオリゴ糖などに由来する。本発明による好ましい化合物は、オリゴ糖残基が４個から１６個の単糖ユニットを有する化合物であり、最も好ましくは、オリゴ糖残基が硫酸化五単糖残基である化合物である。好ましい五単糖残基は下記の構造Ｂを有する：
【００１７】
【化５】
2008500960.tif 000002
（式中、Ｒ１は独立してＯＳＯ３−または（１−８Ｃ）アルコキシであり、この場合、荷電は正荷電の対イオンによって補われる）。
【００１８】
特に好ましい五単糖は下記の構造Ｃを有する：
【００１９】
【化６】
2008500960.tif 000003
（式中、Ｒ１はＯＣＨ３またはＯＳＯ３−であり、
この場合、荷電は正荷電の対イオンによって補われる）。構造Ｃの最も好ましい五単糖において、Ｒ１はＯＣＨ３である。
【００２０】
スペーサーは結合または本質的に薬理学的に不活性な連結残基である。好ましい実施形態において、スペーサーは、好ましくは１個から５０個の原子（オリゴ糖残基の酸素原子は含まれない）を有する本質的に薬理学的に不活性な連結残基である。スペーサーの化学的性質は、本発明の化合物の抗血栓活性のために大きな重要性を有していない。しかしながら、本発明の化合物のスペーサーは好ましくは柔軟である。好適なスペーサーを当業者によって容易に設計することができる。スペーサーのより好ましい長さは１０原子から３５原子であり、特に１０原子から２８原子である。合成上の理由のために、より長いスペーサーはあまり好適でないと見なされ、しかしながら、より長いスペーサーを問題なく本発明の化合物において適用することができる。好ましいスペーサーは少なくとも１つの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−部分を含有する。より好ましいスペーサーはより多くの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−部分を含有し、好ましくは、６個の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−部分を含有する。最も好ましいスペーサーは＊−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−（ＣＨ２）２−であり、この場合、＊により示される末端がオリゴ糖残基の酸素に結合する。
【００２１】
ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基に対するスペーサーの結合部位は、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト活性が損なわれないならば、本質的には自由に選ぶことができる。従って、典型的に存在するカルボキシラート部分（場合によりエステル化される）および塩基性部分は影響を受けないままにしておかなければならない。
【００２２】
本発明による好ましい化合物において、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基は、Ｒｏ４３５０５４、ＳＣ５４７０１（キセミロフィバン）、ＲＷＪ５００４２、シブラフィバン（Ｒｏ４４３８８８）、ラミフィバン（Ｒｏ４４９８８３）、ＧＰＩ５６２、ＦＫ６３３、チロフィバン（ＭＫ３８３）、オルボフィバン（ＳＣ５７１０１）、エプチフィバチド（Ｃ６８２２）、ロキシフィバン（ＸＶ４５９）、エラロフィバン（ＲＷＪ５３３０８）、ＳＲ１２１７８７、レフラダフィバン（ＢＩＢＵ５２）、ロトラフィバン（ＳＢ２１４８５７）、ガントフィバン（ＹＭ０２８）、Ｔ−２５０、ＥＦ５０７７、ＺＤ２４８６、ＴＡＫ０２９、ＴＰ９２０１、Ｌ７０３０１４、ＳＲ１２１５６６（ＳＲ１２１７８７の活性形態）に由来する残基から選択される。前記残基の誘導体はまた、化学修飾された残基を含み、この場合、（場合によりエステル化された）カルボキシラート部分および塩基性部分（または保護された塩基部分）を含む部分は保持される。
【００２３】
好ましいＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基は下記の構造Ｄを有する：
Ｙ−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｘ      （Ｄ）
（式中、Ｙは、Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｒ２）（Ｃ（Ｒ２）２ＣＯＯＨ）またはＮ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｒ２）（ＣＨ２アリール）−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−：Ｃ（Ｒ２）（Ｃ（Ｒ２）２ＣＯＯＨ）、Ｏ−フェニレン−Ｃ（Ｒ２）２−Ｃ（Ｒ２）（ＣＯＯＨ）−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｒ２）（Ｃ（Ｒ２）２ＣＯＯＨ）、Ｏ−フェニレン−Ｃ（Ｒ２）２−Ｃ（Ｒ２）（Ｃ（Ｏ）−Ｒ３−Ｏ−Ｃ（Ｒ２）２ＣＯＯＨ）であり、
ただし、Ｒ２は独立してＨまたは（１−４Ｃ）アルキルである；アリールは、フェニル、ヒドロキシフェニル、チオフェニルまたはピリジニルであり、Ｒ３はピペリジニルである；
Ｘは、ベンズアミジン、（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−ベンズアミジン、（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−ベンズアミジン、または
【００２４】
【化７】
2008500960.tif 000004
（式中、ｎは０、１、２または３である）。
【００２５】
本発明の最も好ましい化合物は、実施例に記載されるような化合物ＩＩ、化合物Ｖ、化合物ＶＩＩＩ、化合物Ｘ、化合物ＸＩ、化合物ＸＩＩ、化合物ＸＩＩＩ、化合物ＸＩＶ、化合物ＸＶおよび化合物ＸＶＩであり、このなかでも、化合物ＸＩＩＩが最も好ましい。
【００２６】
正荷電の対イオンは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＣａ２＋などを意味する。好ましくは、式（Ａ）の化合物はこのナトリウム塩の形態である。
【００２７】
塩基性部分という用語は、任意の周知の塩基性部分（例えば、アミン、アミジン、グアニジンおよびピペリジンなど）を意味する。
【００２８】
表現「互いに１０Åから２０Åの距離で」により、結合に沿って測定されるだけでなく、別の基に関して２つの基の空間的配向が意味される。周知のモデル化技術が、距離を決定するために当業者には利用可能である（例えば、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９４、３７、２５３７から２５５１を参照のこと）。
【００２９】
（１−８Ｃ）アルキルという用語は、１個から８個の炭素原子を有する分枝状アルキル基または非分枝状アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシルおよびオクチルなどを意味する。メチルおよびエチルが好ましいアルキル基である。
【００３０】
用語「プロドラッグ」は、活性な化合物に体内で代謝される化合物（例えば、式Ａの化合物のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基における塩基性部分（例えば、アミノ基またはベンズアミジノ基など）が、例えば、ヒドロキシ基、（１−６Ｃ）アルコキシ基または（１−６Ｃ）アルコキシカルボニル基により保護されている化合物）を意味する。
本発明による溶媒和物には、水和物が含まれる。
【００３１】
本発明の化合物は、例えば、Ｒｏ４３５０５４、ＲＷＪ５００４２またはＳＣ５４７０１（キセミロフィバンの薬理学的活性形態）、チロフィバン、ラミフィバン、もしくはこれらのアナログに由来する、より初期に記載されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストを、当分野で一般に公知の様々な方法を使用して、アミノ酸、ペプチドミメティクスまたはさらなる官能基（例えば、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨまたは−ＯＨなど）で場合により修飾することによって調製することができる。このような修飾されたＲＧＤアナログを合成する一例が、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、３５７から３７９（２００１）に記載され、この場合、化合物は、標的化された薬物送達のための潜在的なベクターとして示唆されている。本発明によれば、場合により修飾されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト部分はオリゴ糖に直接カップリングされる（ａ）か、または、場合により修飾されたＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト部分はオリゴ糖−スペーサー残基にカップリングされる（ｂ）か、または、場合により修飾されたＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト部分はスペーサーにカップリングされ（ｃ）、続いて、オリゴ糖−スペーサー残基にカップリングされる（これらは、例えば、ＷＯ  ９９／６５９３４、ＷＯ  ０１／４２２６２から知られている方法によって行われる）。任意の好適なオリゴ糖をこの目的のために使用することができ、例えば、文献において知られているオリゴ糖（例えば、欧州特許第０，４５４，２２０号および欧州特許第０，５２９，７１５号から知られているオリゴ糖、しかし、これらの供給源に限定されない）または市販のオリゴ糖をこの目的のために使用することができる。オリゴ糖は、当分野で公知の様々な方法によって、例えば、Ｂｕｉｊｓｍａｎ，Ｒ．ら（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９９、９、２０１３から２０１８）により記載されるような方法によって適切な時点でリン酸することができる。オリゴ糖に対するスペーサーのカップリングを、例えば、欧州特許第０，６４９，８５４号に記載される方法を使用することによって行うことができる。
【００３２】
本発明の化合物のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト部分（のための基礎）として役立ち得る公知のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの他の例（しかし、これらの例に限定されない）：化合物Ｒｏ４３８８５７（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５、４３９３（１９９２））、Ｒｏ４８３６５７、ＢＩＢＬ１２、ＦＫ６３３、ＧＲ１４４０５３、ＥＭＤ７６３３４、ＳＲ１２１５６６、ＳＢ２０８６５１、ＳＣ５４６８４、ＳＣ５２０１２、ＤＭＰ７５４、ＦＲ１５８９９９、ＧＲ２００９７６、ＸＶ７８８、ＭＫ３８３（チロフィバン）、ＲＷＪ５３３０８、ＺＤ２４８６、Ｌ７０９７８０、ＲＧＤ８９１、Ｔ２５０、Ｃ６８２２、ＢＩＢＵ１０４、ＳＢ２１４８５７、ＳＣ５７１０１、Ｇ７４５３、ＴＡＫ０２９、ＸＶ４５４、ＸＶ４５９、Ｌ７３４２１７、ＤＭＰ８０２、ＳＲ１２１７８７、ＴＰ９２０１、ＤＭＰ７５７、ＳＣ５２０１２、ＲＰＲ１０９８９１、ＹＭ６８１２８、ＭＥ３２２９、ＭＥ３２３０、ＣＴ５０３５２、ＭＫ８５２、Ｓ１１９７、ＤＭＰ７２８、ＳＣ５７３４５、Ｌ７３８１６７、ＧＲ２３３５４８、ＲＯ４３８８５７、ＴＡ９９３、ＹＭ３３７、ＢＩＢＷ１９４、ＢＩＢＵ１２９、ＢＩＢＷ９８、テトラフィブリシン、Ｌ７０３０１４、ＢＩＢＵ２５１、ＧＲ９１６６９、ＲＧ１３９６５、Ｇ７４４６、ＰＳ０２８、ＸＲ３００、ＮＳＬ９４０３、Ｌ７５６５６８、Ｓ１７６２、Ｌ７４６２２３、Ｌ７６７６８５、ＮＳＬ９５３０１、Ｇ４１２０、ＳＢ２０７０４３、ＧＲ８３８９５、Ｐ２４６、Ｌ７３９７５８、ＸＲ２９９、ＳＶ８７３、ＲＷＪ５０２２８、ＸＱ８７０、ＥＦ５１５４、ＡＲ０５１０、Ｇ７５７０、Ｇ７４４２、Ｇ７４６４、ＲＷＪ５２６５６、ＴＡＫ０２４、ＭＳ１８０、ＭＳ２８１６８、ＸＵ０６３、ＸＵ０６５、Ｌ７３４１１５、ＳＭ２０３０２、ＴＳ９４３、ＮＳＬ９６１８４、ＵＲ１２９４７、ＸＵ０５７、Ｌ７５００３４、ＵＲ３２１６、ＵＲ２９２２、ＣＰ４６３２、ＡＲ０５９８、ＳＣ７９９９２、ＳＣ４９９２、ＲＧＤ０３９、ＭＥ３２７７、Ｔ２５０、ＳＣ５７０９９Ｂ、ＳＫＦ１０６７６０、ＳＫＦ１０７２６０、ＲＷＪ５２６５４、ＰＳＡ０６１３、ＣＧＨ４００、ＮＳＬ９５３１７、ＸＴ１１１、ＲＷＪ２７７５５、Ｌ７３６６２２、ＳＣ４６７４９、ＳＭ２０３０２、ＹＭ５７００２９、ＣＹ３１１１７６および、欧州特許第０，５２９，８５８号、ＷＯ  ９６／２０１７２、欧州特許第０，４９６，３７８号、欧州特許第０，５３０，５０５号、Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３、５３９（１９９５）、ＷＯ  ９３／０８１７４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５、８８６１（１９９３）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３、３４５３（２０００）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３、３３７（１９９５）、米国特許第５，２３９，１１３号、米国特許第５，３４４，９５７号、米国特許第５，９７３，００３号、米国特許第５，７０３，１２５号、ＷＯ  ９６／３７４６４、ＷＯ  ９３／０７８６７、米国特許第５，３７８，７１２号、欧州特許第４４５，７９６号、米国特許第５，２７３，９８２号、米国特許第５，７７０，５７５号、ＷＯ  ０１／６０２８１３、欧州特許第６５６，３４８号、米国特許第５，７２６，１８５号、欧州特許第５０５，８６８号、欧州特許第５６０，７３０号、米国特許第５，５６１，１１２号、欧州特許第５１３，６７５号、米国特許第５，５７４，０１６号、ＷＯ  ９４／０９０３０、欧州特許第４７８，３６３号、米国特許第５，２９２，７５６号、米国特許第５，２０６，３７３号、ＷＯ  ９３／１６９９４、米国特許第５，３１２，９２３号、欧州特許第７４３，３０２号、米国特許第５，６５８，９２９号、米国特許第５，８８０，１３６号、米国特許第５，８１４，６４３号および米国特許第６，０４０，３１７号に記載される化合物。
【００３３】
また、フィブリノーゲンのＲＧＤフラグメントおよび／またはＫ（ＱＡ）ＧＤフラグメントを模倣し、典型的には、互いに１０Åから２０Åの距離で残基内に位置する場合によりエステル化されたカルボキシラート部分および塩基性部分を含む新たに設計されたＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基を含む化合物も本発明に含まれる。
【００３４】
ペプチドカップリング、すなわち、本発明の化合物を調製するための上記方法における手順工程を、ペプチドフラグメントをカップリング（または縮合）するための当分野で一般に公知の方法によって行うことができ、例えば、アジド法、混合無水物法、活性化エステル法、カルボジイミド法などによって、または、好ましくは、ＴＢＴＵのようなアンモニウム／ウロニウム塩の影響のもと、特に、触媒作用のラセミ化抑制化合物（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールのような化合物）の添加とともに行うことができる。概略が、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｉｓｉ，Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３巻、Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８１年）に示される。
【００３５】
化合物に存在するアミン官能基は、α−アミノ基を保護するためにペプチド化学において一般に使用される基を意味するＮ−保護基（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基またはフタロイル（Ｐｈｔｈ）基のようなＮ−保護基）によって合成手順時に保護することができ、もしくは、アジド部分の脱マスク化によって導入することができる。アミノ保護基およびこの除去方法の概略が上述のＴｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｉｓｉ，Ｂｉｏｌｏｇｙ（第３巻）に示される。
【００３６】
アミジン官能基は、存在する場合には、カップリング工程においては非保護のままにしておくことができ、または、カルバマート（例えば、アリルオキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルなど）を使用して保護することができる。アミジン官能基は、好ましくは、１，２，４−オキサジアゾリン−５−オン部分を前駆体として使用することによって穏和な条件のもとで導入される。
【００３７】
カルボン酸基を、α−カルボン酸基を保護するためにペプチド化学において一般に使用される基（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルエステルなど）によって保護することができる。修飾されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストのカルボン酸基は、好ましくは、ベンジルエステルとして保護される。保護基の除去を、このような保護基の性質に依存して種々の方法で行うことができる。通常、脱保護は、酸性条件下、スカベンジャーの存在下で行われるか、または還元性条件（例えば、接触水素化など）で行われる。
【００３８】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストをオリゴ糖にコンジュゲート化するための必要条件は、オリゴ糖残基またはオリゴ糖−スペーサー誘導体に直接カップリングすることができるか、もしくは、スペーサーを介してオリゴ糖−スペーサー誘導体にカップリングすることができる直交性の反応性アンカー基（例えば、カルボキシラート基など）の存在である。このようなコンジュゲート化を可能にするために、ほとんどの場合において、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストのさらなる修飾が必要である。
【００３９】
式Ｉの化合物への途中でのスペーサー由来の構築用ブロックの構築を、アミノ酸、この誘導体またはペプチドミメティクスの段階的な導入による線形様式、もしくは、中間構築物のブロックカップリングによる収束様式のいずれかで、当分野で周知の方法を使用して様々な方式で達成することができる。
【００４０】
本発明の化合物は、遊離塩基の形態で存在し得るが、医薬的に許容される塩の形態で反応混合物から単離することができる。医薬的に許容される塩はまた、式（Ｉ）の遊離塩基を有機酸または無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸およびアスコルビン酸など）により処理することによって得ることができる。
【００４１】
本発明の化合物はキラルな炭素原子を有する場合があり、従って、純粋なエナンチオマーとして、または、エナンチオマーの混合物として、または、ジアステレオマーを含有する混合物として得ることができる。純粋なエナンチオマーを得るための様々な方法が当分野で周知である（例えば、光学活性な酸およびラセミ混合物から得られる塩の結晶化、または、キラルなカラムを使用するクロマトグラフィー）。ジアステレオマーについては、順相カラムまたは逆相カラムを使用することができる。
【００４２】
本発明の化合物は腸管経路または非経口経路によって投与することができる。本発明の化合物およびこの組成物の正確な用量および治療法は、必然的に、医薬品が投与されている個々の対象の必要性、病気または必要性の程度、および、医師の判断に依存する。一般には、非経口投与は、より大きく吸収に依存する他の投与方法よりも低い投薬量を必要とする。しかしながら、１日投薬量は、ヒトについては、好ましくは０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００４３】
本発明の化合物を用いて製造される医薬品はまた、（急性）抗血栓治療において佐剤として使用することができる。このような場合において、医薬品は、このような疾患状態を処置することにおいて有用な他の化合物（例えば、アスピリン、クロピドグレルまたはスタチン類など）とともに投与される。
【００４４】
医薬的に好適な補助剤、例えば、標準的な参考書、Ｇｅｎｎａｒｏら、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０；特に、第８部：医薬調製物およびこの製造を参照のこと）に記載されるような補助物と混合される場合、本発明の化合物は、固体の投薬単位物（例えば、ピル、錠剤など）に圧縮成形することができ、もしくは、カプセルまたは坐薬に加工することができる。医薬的に許容される液体によって、化合物は、例えば、注射調製物として使用するための溶液、懸濁物、エマルションの形態で、または、鼻腔スプレー剤として使用するためのスプレー剤として適用することができる。
【００４５】
投薬単位物（例えば、錠剤）を作製するために、従来の添加剤（例えば、賦形剤、着色剤およびポリマー結合剤など）の使用が意図される。一般には、活性な化合物の機能を妨害しない任意の医薬的に許容される添加剤を使用することができる。
【００４６】
組成物が一緒に投与され得る好適なキャリアには、好適な量で使用されるラクトース、デンプンおよびセルロース誘導体など、またはこれら混合物が含まれる。
【００４７】
本発明は下記の実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【００４８】
使用される略号。
Ａｑ．＝水性
Ａｌａ＝アラニン
Ａｌｌｏｃ＝アリルオキシカルボニル
Ａｓｐ＝（Ｌ）−アスパラギン酸
ＡＴＩＩＩ＝アンチトロンビンＩＩＩ
Ｂｎ＝ベンジル
Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｂｔ＝ベンゾトリアゾール
ｔ−Ｂｕ＝ｔｅｒｔ−ブチル
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤｉＰＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルアミド
ＥＤＣ＝１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
Ｅｔ＝エチル
ＥＳＩ＝エレクトロスプレーイオン化
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ＨＯＢｔ＝Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＮＭＭ＝Ｎ−メチルモルフォリン
Ｍｅ＝メチル
ＭＳ＝質量分析
Ｐｈｅ＝（Ｌ）−フェニルアラニル
ｓａｔ．＝飽和
ＲＴ＝室温
ＴＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
Ｔｏｓ＝トルエン−４−スルホニル
ＴＲＡＰ＝トロンビン受容体アゴニストペプチド
Ｔｙｒ＝Ｌ−チロシン
Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル
【００４９】
（スキーム  １）
エチル＝Ｎ−（４−（シアノ−ベンゾイル）−β−アラニン（２）
エチル＝β−アラニン．ＨＣｌ（２．８１ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）および４−シアノベンゾイルクロリド（３．０３ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３０ｍＬ）中に含む懸濁物をＲＴで一晩撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、ａｑ．クエン酸（３％）、ａｑ．ＮａＨＣＯ３およびＨ２Ｏにより洗浄した。乾燥（ＭｇＳＯ４）および溶媒のエバポレーションにより、化合物２を得た（２．５２ｇ、５６％）。
【００５０】
Ｎ−（４−［１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル］ベンゾイル）−β−アラニンエチルエステル（３）
化合物２（２．５０ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（７０ｍＬ）に溶解した。ヒドロキシルアミン．ＨＣｌ（０．９９ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２．４９ｍＬ、１７．３ｍｍｏｌ）を加え、混合物をＲＴで一晩撹拌した。１．５時間の還流を行った後、反応は完了していた。生成物が冷却および濃縮（約１０ｍＬ以下）によって析出し、生成物をろ過し、ＥｔＯＨにより洗浄し、真空下で乾燥した。
【００５１】
微量のＨ２Ｏをピリジンとの共エバポレーション（１５ｍＬで３回）によって粗ヒドロキシベンズアミジン（２．８ｇ、１０ｍｍｏｌ）から除き、この後、粗ヒドロキシベンズアミジンをピリジン（１００ｍＬ）に溶解した。クロロギ酸エチル（１．４３ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を還流温度で１８時間撹拌した。反応を、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）に注ぐことによって停止させ、この後、ＥｔＯＡｃによる抽出（７５ｍＬで３回）を行った。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濃縮した。残留ピリジンをトルエンとのエバポレーションによって除いた。再結晶（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により、生成物をわずかにピンク色の固体として得た（２．４８ｇ、８１％）。
【００５２】
Ｎ−（４−［１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル］ベンゾイル）−β−アラニン（４）
化合物３（０．６０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン／Ｈ２Ｏの混合物（１０ｍＬ、１／１、ｖ／ｖ）に溶解した。ａｑ．ＮａＯＨ（２．０ｍＬ、２Ｎ）を加え、混合物をＲＴで３時間撹拌した。反応混合物をＤｏｗｅｘＨ＋により中和し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、得られた白色の固体を真空下で乾燥した。収量：０．５１ｇ（９３％）。
【００５３】
１−アジド−１−デオキシ−テトラエチレングリコール（５）
テトラエチレングリコール（９０ｇ、０．４６ｍｏｌ）を０℃に冷却し、水酸化ナトリウム（３．０ｇ、７５ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＨ２Ｏ中に含む溶液を加え、続いて、１００ｍＬのＴＨＦを加えた。混合物を３０分間激しく撹拌した。５０ｍＬのＴＨＦに溶解したｐ−トルエンスルホニルクロリド（８．８ｇ、４６ｍｍｏｌ）を、均一な混合物を保つために激しく撹拌しながら、０℃でゆっくり加えた。５時間撹拌した後、混合物を４００ｍＬのＨ２Ｏに注いだ。溶液をＤＣＭにより抽出した（２０ｍＬで４回）。有機層を一緒にして、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）およびブライン（２０ｍＬ）により洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）した。ろ過後、溶媒を減圧下で除いて、モノトシラートをオイルとして得た。
【００５４】
この粗化合物をＥｔＯＨ（１２０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１８ｍＬ）の混合物に溶解した。アジ化ナトリウム（３．２５ｇ、５０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を６０℃で一晩撹拌した。ＥｔＯＨを真空（５０ｍｂａｒ、５０℃）下でエバポレーションし、１５０ｍＬのＥｔＯＡｃを加えた。溶液をブライン（２０ｍＬ）により洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。ろ過後、溶媒を減圧（５０ｍｂａｒ、５０℃）下で除いて、アジド５をオイルとして得た（６．２５ｇ、２工程で６２％の収率）。
【００５５】
１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６）
化合物５（１．１５ｇ、５．２５ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、水酸化ナトリウムの５０％ａｑ．溶液（１２．５Ｎ、５ｍＬ）、硫酸水素テトラブチルアンモニウム（０．３４ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）およびブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（４．２７ｍＬ、２６．３ｍｍｏｌ）を加えた。懸濁物をＲＴで激しく撹拌した。３時間後、混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、ブライン（１０ｍＬ）、塩酸（２Ｎ、５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）により洗浄した。ａｑ．層をＥｔＯＡｃで抽出し、この後、有機層を一緒にして乾燥（ＭｇＳＯ４）した。濃縮後、粗生成物をシリカゲル（２０ｇ）カラムクロマトグラフィー（溶出液：ヘプタン→ＥｔＯＡｃ、１／０→０／１）によって精製した。適切な画分の濃縮により、アジドを淡黄色のオイルとして得た（１．２５ｇ、７１％）。Ｒｆ：０．８（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、９５／５、ｖ／ｖ）。
【００５６】
アジドの還元を、酢酸（０．２ｍＬ）を含有するＥｔＯＨ（３０ｍＬ）において１０％Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ）での水素化によって行った。４時間後、触媒を２層のＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ａフィルターでのろ過によって除いた。ろ液を濃縮し、ＤＣＭ（２５ｍＬ）に溶解し、Ａｒｇｏｎａｕｔ  ＭＰ炭酸塩型樹脂で処理して、酢酸を除いた。樹脂をろ過によって除き、溶媒のエバポレーションにより、化合物６を１．１７ｇの収量（１００％）で得た。
【００５７】
（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（７）
化合物６（３．６０ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）およびＺ−Ｐｈｅ−ＯＨ（３．５１ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解した。ＨＯＢｔ（１．３９ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．８３ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（３．３８ｍＬ、２３．４ｍｍｏｌ）を続けて加え、溶液を一晩撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、ｓａｔ．ａｑ．ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬで２回）、５％ａｑ．クエン酸（１０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１０ｍＬ）により洗浄した。有機相を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、減圧下で濃縮した。精製をシリカゲル（７５ｇ）カラムクロマトグラフィー（溶出液：ＥｔＯＡｃ→ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、９５／５、ｖ／ｖ）によって行い、化合物７を無色のオイルとして得た（４．９５ｇ、７２％）。Ｒｆ：０．５（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、９５／５、ｖ／ｖ）。
【００５８】
（Ｌ−フェニルアラニル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８）
化合物７（２．４２ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）を、酢酸（０．４ｍＬ）を含有するＥｔＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）の存在下、Ｈ２雰囲気のもとで撹拌した。１６時間後、混合物をろ過し、濃縮した。酢酸を、トルエンにおける生成物の濃縮およびＤＣＭ（２０ｍＬ）におけるＡｒｇｏｎａｕｔ  ＭＰ炭酸塩型樹脂（１．３ｇ）による処理を繰り返すことによって除いた。樹脂をろ過し、溶媒をエバポレーションして、化合物８を無色のオイルとして得た（１．６９ｇ、９０％）。Ｒｆ：０．０５（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、９５／５、ｖ／ｖ）。
【００５９】
（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（９）
化合物８（１．６９ｇ、３．７１ｍｍｏｌ）を、ＴＥＡの代わりにＮＭＭ（０．８４ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ、ｐＨ８．３にて）を使用して、化合物７の合成について以前に記載されたように、Ｂｏｃ−ＡｓｐＢｎ−ＯＨ（１．２０ｇ、３．７１ｍｍｏｌ）にカップリングした。処理後、黄色のオイルが得られ、これをシリカゲル（５０ｇ）カラムクロマトグラフィー（溶出液：ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（２／１）→ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（９５／５、ｖ／ｖ））によって精製して、化合物９を無色のオイルとして得た（２．３０ｇ、８２％）。Ｒｆ：０．６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）。
【００６０】
（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１０）
Ｂｏｃ保護の化合物９（１．０９ｇ、１．４３ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃにおける塩酸の１．５Ｎ溶液（１０ｍＬ）により処理した。ＲＴで１００分間撹拌した後、反応混合物を冷却し（０℃）、ｓａｔ．ａｑ．ＮａＨＣＯ３の冷却された溶液（１５ｍＬ）に注ぐことによって中和した。ａｑ．層をＥｔＯＡｃで抽出し（１０ｍＬで２回）、有機層を一緒にして、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）により洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）した。濃縮により、粗化合物１０が得られ、これを、精製することなく、次の反応において使用した。Ｒｆ：０．２（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、９５／５、ｖ／ｖ）。
【００６１】
（｛Ｎ−（４−［１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル］ベンゾイル）−β−アラニル｝−Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１１）
カルボン酸４（０．１２ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）およびアミン１０（粗化合物、最大で０．４０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した。ＨＯＢｔ（５０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（９４ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（８８μＬ、０．６１ｍｍｏｌ）を続けて加え、溶液を一晩撹拌した。褐色の溶液をＥｔＯＡｃおよび２−ブタノールの混合物（１０ｍＬ、１／１、ｖ／ｖ）で希釈し、３％クエン酸（５ｍＬ）、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３（５ｍＬ）およびブライン（５ｍＬ）により抽出した。ａｑ．相をＥｔＯＡｃで連続して抽出し、有機層を一緒にして、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を除いて、粗化合物１１を得た（０．２７ｇ、７８％）。これを、精製することなく、次の反応において使用した。Ｒｆ：０．２（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）。
【００６２】
（｛Ｎ−（４−［１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル］ベンゾイル）−β−アラニル｝−Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸（１２）
化合物１１（０．２ｇ、粗化合物、最大で０．２２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）およびＴＦＡ（３ｍＬ）の混合物において撹拌した。２時間後、溶液を濃縮し、残留するＴＦＡを、トルエンにおける反復した濃縮（５ｍＬで３回）によって除いた。生成物を調製用ＨＰＬＣ−ＭＳによって精製して、化合物１２を純粋な形態で得た（０．１１ｇ、９から３工程で５６％）。
【００６３】
（｛Ｎ−（４−アミジノベンゾイル）−β−アラニル｝−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（Ｉ）
【００６４】
【化８】
2008500960.tif 000005
【００６５】
化合物１１（６５ｍｇ、粗化合物、最大で７１μｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）および酢酸（０．１ｍＬ）の混合物に溶解した。１０％Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ）を加え、混合物をＨ２ガスの雰囲気のもとで一晩撹拌した。触媒を２層のＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ａフィルターでのろ過によって除き、ろ液を濃縮した。生成物を、調製用ＨＰＬＣ−ＭＳおよび凍結乾燥を適用することによって純粋な形態で得た。収量：７．７ｍｇ（１４％、ＥＳＩ−ＭＳ：７８７［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００６６】
スペーサー由来のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト（１２、２３、３１、３３、４３、５０、５２、５４、６２）を五単糖６３にコンジュゲート化するための一般的手順（スキーム８およびスキーム９を参照のこと）
スペーサー由来のカルボン酸（３３μｍｏｌ）（すなわち、化合物１２、化合物２３、化合物３１、化合物３３、化合物４３、化合物５０、化合物５２、化合物５４または化合物６２）を、ＤＭＦとの共エバポレーション（２ｍＬで２回）によって乾燥し、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解して、ＴＢＴＵ（１０．５ｍｇ、３３μｍｏｌ）およびＤｉＰＥＡ（５．７μＬ、３３μｍｏｌ）の存在下、Ｎ２雰囲気のもとで撹拌した。１時間後、アミノスペーサー含有五単糖６３（５６ｍｇ、３１μｍｏｌ）を加えた。反応混合物をＲＴで一晩撹拌し、イオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ−Ｑ）および逆相クロマトグラフィー（Ｌｕｎａ  Ｃ１８）によって分析した。五単糖が完全に消費された後、反応混合物を濃縮した（５０℃未満、１５ｍｍＨｇ）。
【００６７】
（粗）生成物（Ｈ２Ｏにおいて１０ｍｇ／ｍＬ）を、１０％Ｐｄ／Ｃ（粗生成物に関して重量で等量を加えた）での水素化（Ｈ２）によって脱保護した。１６時間後、溶液を脱ガスし、０．４５μＭのＨＰＬＣ用フィルターでろ過し、減圧下で濃縮した（５０℃未満、１５ｍｍＨｇ）。コンジュゲートを、イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロース、緩衝液：Ｈ２Ｏ→２Ｍ  ＮａＣｌ）、これに続く、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムによる脱塩（Ｈ２Ｏ）および凍結乾燥によって精製した。
【００６８】
メチル＝Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−｛（｛Ｎ−（４−アミジノベンゾイル）−β−アラニル｝−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニル）−（１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル）−（１−アザ−４，７，１０−トリオキサドデシル）−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−３−Ｏ−メチル−２，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド八ナトリウム塩（ＩＩ）
【００６９】
【化９】
2008500960.tif 000006
【００７０】
生成物を、一般的手順に従った、１２（２１．４ｍｇ、２４．８μｍｏｌ）と五単糖６３（４２．４ｍｇ、２３．６μｍｏｌ）とのコンジュゲート化、精製および脱保護によって得た。白色の固体、収量：３４ｍｇ（４２％、２工程）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ，ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ３．３８−３．３２（８ｘ  ｓ，３４Ｈ，８ｘ  ＯＭｅ）；環Ｄ：５．３６（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．１８（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．０４（ｄ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．８０（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．４７（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）、３．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｅ：４．５９（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、３．８２（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．６２（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．４５（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）、３．１５（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｆ：５．２７（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．４９（ｔ，１Ｈ，Ｈ３）、４．３３（ｄ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．２０（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）、４．０８（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．８６（ｔ，１Ｈ，Ｈ４）；環Ｇ：４．９２（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ１）、４．５４（ｄ，１Ｈ，Ｈ５）、４．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ３）、３．３７（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｈ：４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．２５（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）、４．２２（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．９２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ５）、３．６６（ｔ，１Ｈ，Ｈ４）、３．５８（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）；スペーサー：３．９６（ｓ，２Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｏ）、３．６２−３．５１（ｍ，２６Ｈ，１３ｘ  ＣＨ２Ｏ）、３．３３−３．３０（ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ（Ｏ）ＣＨ２，ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−Ｐｈｅ）、３．２５（ｍ，１Ｈ，ＯＣＨ２ａＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−Ｐｈｅ）、３．１７（ｍ，１Ｈ，ＯＣＨ２ｂＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−Ｐｈｅ）；ペプチド：７．８４（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍベンズアミジン）、７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍベンズアミジン）、７．２５（ｔ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍ  Ｐｈｅ）、７．２０（ｔ，１Ｈ，Ｈａｒｏｍ  Ｐｈｅ）、７．０９（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍ  Ｐｈｅ）、４．５１（ｄｄ，１Ｈ，ＣＨ  Ａｓｐ）、４．３８（ｔ，１Ｈ，ＣＨ  Ｐｈｅ）、３．６０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎβ−Ａｌａ）、２．８３（ｄＡＢ，２Ｈ，ＣＨ２Ｐｈｅ）、２．５２（ｔ，２Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ２β−Ａｌａ）、２．４４（ｄＡＢ，２Ｈ，ＣＨ２  Ａｓｐ）。ＥＳＩ−ＭＳ：計算値：２５１１．４；実測値：ｍ／ｚ１２６７．９［Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ］２＋、１２５６．９［Ｍ＋２Ｈ］２＋、１２４５．９［Ｍ＋２Ｈ−Ｎａ］２＋、８５２．９［Ｍ＋Ｈ＋２Ｎａ］３＋、８４５．５［Ｍ＋２Ｈ＋Ｎａ］３＋、８３８．３［Ｍ＋３Ｈ］３＋、６３９．９［Ｍ＋２Ｈ＋２Ｎａ］４＋、１２３２．８［Ｍ−２Ｎａ］２−、１２２１．７［Ｍ−３Ｎａ＋Ｈ］２−、１２１０．８［Ｍ−４Ｎａ＋２Ｈ］２−、１１９９．８［Ｍ−５Ｎａ＋３Ｈ］２−、８１４．１［Ｍ−３Ｎａ］３−。
【００７１】
【化１０】
2008500960.tif 000007
【００７２】
（スキーム  ２）
４−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）ベンゾニトリル（１４）
４−アミノベンゾニトリル（１３、２．９５ｇ、２５ｍｍｏｌ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（８．０ｍＬ、３５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）およびピリジン（４ｍＬ）の混合物において７５℃で撹拌した。１６時間後、赤色の反応混合物を冷却し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、塩酸（１Ｎ、１５ｍＬ）、ｓａｔ．ａｑ．ＮａＨＣＯ３（１５ｍＬ）およびブライン（１５ｍＬ）により洗浄した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濃縮した。暗褐色のオイルをシリカゲル（７５ｇ）カラムクロマトグラフィー（溶出液：ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、１／５→１／２、ｖ／ｖ）によって精製し、これにより、化合物１４を、３０％以下のビス−Ｂｏｃ保護生成物を含有するオレンジ色のオイルとして得た（３．２５ｇ、６０％）。後者の混合物を、さらに精製することなく、次の反応において使用した。
【００７３】
４−（１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル）アニリン（１６）
化合物１４（３．２５ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）を、化合物３の調製について以前に記載されたように、オキサジアゾロン１５に変換した。得られた明るいオレンジ色の粗固体をＤＣＭ（１５ｍＬ）およびＴＦＡ（８ｍＬ）の混合物において５時間撹拌した。減圧下での濃縮およびトルエンとのエバポレーション（１０ｍＬで２回）により、褐色の固体を得た。これをシリカゲル（４０ｇ）カラムクロマトグラフィー（溶出液：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物１６を得た（１．８１ｇ、３工程で６９％）。Ｒｆ：０．５（ＥｔＯＡｃ）。
【００７４】
Ｎ−［４−（１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル）フェニル］スクシンアミド酸（１７）
アニリン誘導体１６（０．８９ｇ、５．０ｍｍｏｌ）をピリジン（２５ｍＬ）に溶解した。無水コハク酸（０．７５ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（６３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）と一緒に加え、混合物を１００℃で一晩撹拌した。溶液を減圧下で濃縮し、薄い褐色の固体をＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏの混合物（６０ｍＬ、５／３５／１、ｖ／ｖ／ｖ）から再結晶した。ろ過後、母液を１０ｍＬ以下に濃縮して、カルボン酸１７を固体として得た。これを真空下において５０℃で１６時間乾燥した。収量：１．２８ｇ（９２％）。Ｒｆ０．３（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、１００／１０／１、ｖ／ｖ／ｖ）。
【００７５】
（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１８）
化合物６（０．９４ｇ、３．１ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ−ＡｓｐＢｎ−ＯＨ（０．９９ｇ、３．１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８ｍＬ）に溶解した。ＨＯＢｔ（０．３６ｇ、３．１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（０．７４ｇ、３．８ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（０．３４ｍＬ、６．２ｍｍｏｌ）を続けて加え、溶液を一晩撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、ｓａｔ．ａｑ．ＮａＨＣＯ３（５ｍＬで２回）、５％ａｑ．クエン酸（５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）により洗浄した。有機相を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、減圧下で濃縮した。精製をシリカゲル（２０ｇ）カラムクロマトグラフィー（溶出液：ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、３／１→１／０、ｖ／ｖ）によって確立して、化合物１８を無色のオイルとして得た（１．１５ｇ、６１％）。Ｒｆ０．７（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、９５／５、ｖ／ｖ）。
【００７６】
（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１９）
化合物１８（０．５１ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を、化合物１０の合成について以前に記載されたのと同じ反応条件および処理手順に従って４５分間処理した。生成物１９を、さらに精製することなく、次の反応において使用した。
【００７７】
Ｎ−｛［４−（１，２，４−オキサジアゾール５−オニル）フェニル］スクシンアミル−（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル）｝−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２０）
化合物１７（０．３０ｍｍｏｌ）および化合物１９（０．３０ｍｍｏｌ）を、１１の合成について以前に記載されたようにカップリングした。粗化合物２０（０．１７ｇ、７５％）を、さらに精製することなく、次の反応において使用した。Ｒｆ０．３（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）。
【００７８】
Ｎ−｛（４−ベンズアミジノ）スクシンアミル｝−Ｌ−アスパルチル−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（ＩＩＩ）
【００７９】
【化１１】
2008500960.tif 000008
【００８０】
２０（３２ｍｇ、４１μｍｏｌ）の接触水素化をＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨの混合物において行った。ろ過、濃縮、および、調製用ＨＰＬＣ−ＭＳによる精製により、スペーサー誘導体ＩＩＩを白色の固体として得た。収量：２０ｍｇ（７７％）。ＥＳＩ−ＭＳ：６４０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００８１】
Ｎ−［４−（１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル）フェニル］スクシンアミル｝−（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２２）
オキサジアゾロン１７（２４ｍｇ、８８μｍｏｌ）および粗アミン１０（最大で５８ｍｇ、８８μｍｏｌ）を、化合物１１の合成について以前に記載されたようにカップリングした。粗生成物２２を、さらに精製することなく、次の反応において使用した。Ｒｆ０．６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）。
【００８２】
Ｎ−［４−（１，２，４−オキサジアゾール５−オニル）フェニル］スクシンアミル｝−（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸（２３）
粗化合物２２（最大で８８μｍｏｌ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）およびＴＦＡ（１．０ｍＬ）の混合物において撹拌した。２時間後、溶液を濃縮し、生成物を調製用ＨＰＬＣによって精製した。適切な画分の濃縮により、化合物２３を３１ｍｇの収量で得た（最後の３工程で４１％）。
【００８３】
Ｎ−｛（４−ベンズアミジノ）スクシンアミル｝−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニル−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（ＩＶ）
【００８４】
【化１２】
2008500960.tif 000009
【００８５】
粗化合物２２（最大で８０ｍｇ、８７μｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（７ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）の混合物において１０％Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ）での接触水素化によって脱保護した。２４時間後、混合物をろ過し、濃縮し、粗生成物を調製用ＨＰＬＣによって精製した。化合物ＩＶを、凍結乾燥後、１０．５ｍｇの収量（１５％）で白色の泡状物として単離した。ＥＳＩ−ＭＳ：７８７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００８６】
メチル＝Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−｛［Ｎ−（４−ベンズアミジル）スクシンアミル］−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニル）−（１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル）−（１−アミノ−４，７，１０−トリオキサドデシル）｝−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−３−Ｏ−メチル−２，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド八ナトリウム塩（Ｖ）
【００８７】
【化１３】
2008500960.tif 000010
【００８８】
カルボン酸２３（３０．０ｍｇ、３４．８μｍｏｌ）の五単糖６３（５９．４ｍｇ、５６．４μｍｏｌ）へのコンジュゲート化、これに続く精製および脱保護を一般的手順に従って行った。コンジュゲートＶを白色の固体として得た。収量：３７．５ｍｇ（４８％、２工程）。
【００８９】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ，ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ３．４３−３．３２（８ｘ  ｓ，３４Ｈ，８ｘ  ＯＭｅ）；環Ｄ：５．３６（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．２１（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．０５（ｄ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．７９（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．４８（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）、３．３３（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｅ：４．５８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、３．７９（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．６５（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．４８（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）、３．１５（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｆ：５．２６（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．４８（ｔ，１Ｈ，Ｈ３）、４．３２（ｄ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．２２（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、４．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２）、４．０８（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．８４（ｔ，１Ｈ，Ｈ４）；環Ｇ：４．９８（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ１）、４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｈ５）、４．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ３）、３．３７（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｈ：４．９８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２）、４．２１（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．９２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ５）、３．６６（ｔ，１Ｈ，Ｈ４）、３．５８（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）；スペーサー：３．９６（ｓ，２Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｏ）、３．６１−３．５１（ｍ，２６Ｈ，１３ｘ  ＣＨ２Ｏ）、３．３８−３．３０（ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ（Ｏ）ＣＨ２，ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−Ｐｈｅ）、３．１９（ｍ，１Ｈ，ＯＣＨ２ａＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−Ｐｈｅ）、３．１２（ｍ，１Ｈ，ＯＣＨ２ｂＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−Ｐｈｅ）；ペプチド：７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍベンズアミジン）、７．６３（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍベンズアミジン）、７．２５（ｔ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍ  Ｐｈｅ）、７．２０（ｔ，１Ｈ，Ｈａｒｏｍ  Ｐｈｅ）、７．０９（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍ  Ｐｈｅ）、４．４４（ｄｄ，１Ｈ，ＣＨ  Ａｓｐ）、４．３８（ｔ，１Ｈ，ＣＨ  Ｐｈｅ）、２．９０（ｄＡＢ，２Ｈ，ＣＨ２Ｐｈｅ）、２．７５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２スクシニル）、２．５５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２スクシニル）、２．４３（ｄＡＢ，２Ｈ，ＣＨ２  Ａｓｐ）。ＥＳＩ−ＭＳ：計算値：２５１１．４；実測値：ｍ／ｚ１２６７．８［Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ］２＋、１２５６．８［Ｍ＋２Ｈ］２＋、１２４５．８［Ｍ＋２Ｈ−Ｎａ］２＋、８５２．８［Ｍ＋Ｈ＋２Ｎａ］３＋、８４５．５［Ｍ＋２Ｈ＋Ｎａ］３＋、８３８．２［Ｍ＋３Ｈ］３＋、６３９．９［Ｍ＋２Ｈ＋２Ｎａ］４＋、１２３２．７［Ｍ−２Ｎａ］２−、１２２１．７［Ｍ−３Ｎａ＋Ｈ］２−、１２１０．７［Ｍ−４Ｎａ＋２Ｈ］２−、１１９９．７［Ｍ−５Ｎａ＋３Ｈ］２−、８１４．１［Ｍ−３Ｎａ］３−。
【００９０】
【化１４】
2008500960.tif 000011
【００９１】
（スキーム  ３）
Ｎ−３−［４−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）ピペリジンプロピオニル］−（Ｒ）−（−）−ニペコチン酸エチル（２６）
３−（Ｎ−Ｂｏｃ−ピペリジル）プロピオン酸（２４、１．００ｇ、３．８９ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（１．３８ｇ、４．２８ｍｍｏｌ）およびＤｉＰＥＡ（２．７０ｍＬ、１５．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２０ｍＬ）における混合物を５分間撹拌した。次いで、（Ｒ）−ニペコチン酸エチルの（Ｌ）−酒石酸塩（２５、０．６１ｇ、３．８９ｍｍｏｌ）を加え、溶液を２時間撹拌した。反応を５％ａｑ．ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）により停止させ、３％クエン酸水溶液（２０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２０ｍＬ）により洗浄した。ａｑ．相をＤＣＭで抽出し（１０ｍＬで３回）、有機層を一緒にして乾燥（ＭｇＳＯ４）した。化合物２６（２．３４ｇ）を茶黄色がかったオイルとして得た。これを、さらに精製することなく、次の反応において使用した。Ｒｆ０．７（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、９３／７、ｖ／ｖ）。
【００９２】
Ｎ−３−［４−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）ピペリジンプロピオニル］−（Ｒ）−（−）−ニペコチン酸エチル（２８）
粗化合物２６（最大で３．８９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）およびＴＦＡ（１０ｍＬ）の混合物において撹拌した。１時間後、溶液を減圧下で濃縮した。微量のＴＦＡを、トルエンにおける反復した濃縮（１０ｍＬで３回）によって除いた。続いて、粗ピペリジン誘導体２７をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、この後、ＤｉＰＥＡ（２．０２ｍＬ、１１．７ｍｍｏｌ）および（Ｎ）−ベンジルオキシカルボニルオキシスクシンイミド（１．９４ｇ、７．７９ｍｍｏｌ）を加えた。一晩撹拌した後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、ｓａｔ．ａｑ．ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）、３％ａｑ．クエン酸およびＨ２Ｏ（１０ｍＬ）により洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮し、これにより、Ｚ保護の化合物２８を無色のオイルとして得た（１．３７ｇ、３工程で８２％）。Ｒｆ：０．５（ＥｔＯＡｃ）。
【００９３】
Ｎ−３−［４−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）ピペリジンプロピオニル］−（Ｒ）−（−）−ニペコチン酸（２９）
化合物２８（０．３５ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）を含む、１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）の溶液および０．５Ｍ  ＮａＯＨ（２０ｍＬ）の溶液を１時間撹拌した。Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ４−Ｈ＋イオン交換樹脂による中和、ろ過、および濃縮により、カルボン酸誘導体２９をわずかに黄色がかったオイルとして得た（１．２７ｇ、１００％）。Ｒｆ：０．０５（ＥｔＯＡｃ）。
【００９４】
｛Ｎ−３−［４−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）ピペリジンプロピオニル］−（Ｒ）−（−）−ニペコチル｝−（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３０）
化合物２９（０．２４ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）および粗化合物１９（最大で０．６０ｍｍｏｌ）の混合物を、ＤＣＭ（５ｍＬ）におけるＥＤＣ（０．１４ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（９０μＬ、０７８ｍｍｏｌ）と一緒に、５時間撹拌した。溶液をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、ｓａｔ．ａｑ．ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）、３％ａｑ．クエン酸およびＨ２Ｏ（１０ｍＬ）により洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物３０をシリカゲル（５ｇ）カラムクロマトグラフィー（溶出液：ＥｔＯＡｃ／ヘプタン／ＭｅＯＨ、２／１／０→９／０／１、ｖ／ｖ／ｖ）によって精製した。収量：０．２９ｇ（５３％）。Ｒｆ０．６（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、７／１、ｖ／ｖ）。
【００９５】
｛Ｎ−３−［４−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）ピペリジンプロピオニル］−（Ｒ）−（−）−ニペコチル｝−（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸（３１）
化合物３０（０．２９ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）およびＴＦＡ（５ｍＬ）の混合物において撹拌した。３時間後、混合物を濃縮し、トルエンで繰り返しエバポレーションした（１０ｍＬで３回）。生成物を調製用ＨＰＬＣによって精製して、３１を０．２３ｇの収量（８６％）で得た。
【００９６】
｛Ｎ−３−［４−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）ピペリジンプロピオニル］−（Ｒ）−（−）−ニペコチル｝−（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル）−Ｌ−フェニルアラニル−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３２）
化合物２９（０．１７ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）および粗化合物１０（０．２５ｇ、最大で０．３８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した。ＨＯＢｔ（５９ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（９４ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（８８μＬ、０．６３ｍｍｏｌ）を続けて加え、溶液を一晩撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、ｓａｔ．ａｑ．ＮａＨＣＯ３（５ｍＬで２回）、５％ａｑ．クエン酸（５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）により洗浄した。有機相を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、減圧下で濃縮した。精製をシリカゲル（５ｇ）カラムクロマトグラフィー（溶出液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１／０→９５／５、ｖ／ｖ）によって行い、化合物３２を無色のオイルとして得た（０．２４ｇ、６０％）。Ｒｆ０．３（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９５／５、ｖ／ｖ）。
【００９７】
｛Ｎ−３−［４−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）ピペリジンプロピオニル］−（Ｒ）−（−）−ニペコチル｝−（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル）−Ｌ−フェニルアラニル−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸（３３）
化合物３２（０．２０ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を、化合物３１の合成について以前に記載されたように脱保護および精製した。収量：５０ｍｇ（３０％）。
【００９８】
｛Ｎ−３−［４−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）ピペリジンプロピオニル］−（Ｒ）−（−）−ニペコチル｝−（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３４）
化合物２９（０．６９ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）およびＡｓｐＢｎ−Ｏ−ｔ−Ｂｕエステル（０．５４ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５ｍＬ）における撹拌された混合物に、ＴＢＴＵ（０．５８ｇ、１．８０ｍｍｏｌ）およびＤｉＰＥＡ（０．９０ｍＬ、５．４ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、ｓａｔ．ａｑ．ＮａＨＣＯ３（５ｍＬで２回）、５％ａｑ．クエン酸（５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）により洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。シリカゲル（２５ｇ）カラムクロマトグラフィー（溶出液：ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、１／２→１／０、ｖ／ｖ）により、純粋な化合物３４を明黄色のオイルとして得た（０．８４ｇ、７３％）。Ｒｆ：０．６（ＥｔＯＡｃ）。
【００９９】
Ｎ−｛［Ｎ−３−（４−ピペリジンプロピオニル）−（Ｒ）−（−）−ニペコチル］−Ｌ−アスパルチル｝−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（ＶＩＩ）
【０１００】
【化１５】
2008500960.tif 000012
【０１０１】
化合物３１（３５ｍｇ、３９μｍｏｌ）を、ＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）の混合物において１０％Ｐｄ／Ｃ（３０ｍｇ）での接触水素化によって脱保護した。１６時間後、混合物を２層のＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｃフィルターでろ過し、濃縮した。化合物ＶＩＩを白色の泡状物として凍結乾燥後に２４ｍｇの収量（９２％）で得た。ＥＳＩ−ＭＳ：６７３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１０２】
Ｎ−｛［Ｎ−３−（４−ピペリジンプロピオニル）−（Ｒ）−（−）−ニペコチル］−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニル｝−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（ＩＸ）
【０１０３】
【化１６】
2008500960.tif 000013
【０１０４】
化合物３２（４５ｍｇ、４３μｍｏｌ）を、化合物ＶＩＩの合成について以前に記載されたように脱保護した。調製用ＨＰＬＣおよび凍結乾燥により、純粋なＩＸを８．８ｍｇの収量（２６％）で得た。ＥＳＩ−ＭＳ：８２０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１０５】
１｛Ｎ−３−［４−ピペリジンプロピオニル］−（Ｒ）−（−）−ニペコチル｝−Ｌ−アスパルタート（ＶＩ）
【０１０６】
【化１７】
2008500960.tif 000014
【０１０７】
化合物３４（４７ｍｇ、７１μｍｏｌ）を、ＤＣＭ（５ｍＬ）およびＴＦＡ（５ｍＬ）の混合物において撹拌することによって脱保護した。５時間後、混合物を濃縮し、トルエンで繰り返しエバポレーションした（５ｍＬで３回）。粗中間体を、１，４−ジオキサン（５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）の混合物において１０％Ｐｄ／Ｃ（３０ｍｇ）での接触水素化に供した。３時間後、混合物を２層のＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｃフィルターでろ過し、続いてフィルターをＭｅＯＨにより洗浄した。ろ液を濃縮し、調製用ＨＰＬＣによって精製して、化合物ＩＶを白色の泡状物として凍結乾燥後に９．８ｍｇの総収量（３９％）で得た。ＥＳＩ−ＭＳ：３８４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１０８】
メチル＝Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−｛［Ｎ−３−（４−ピペリジンプロピオニル）−（Ｒ）−（−）−ニペコチル−（Ｌ）−アスパルチル］−（１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル）−（１−アザ−４，７，１０−トリオキサドデシル）｝−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−３−Ｏ−メチル−２，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド八ナトリウム塩（ＶＩＩＩ）
【０１０９】
【化１８】
2008500960.tif 000015
【０１１０】
カルボン酸誘導体３１（５１ｍｇ、５９μｍｏｌ）の五単糖誘導体６３（１０５ｍｇ、５６μｍｏｌ）へのコンジュゲート化、これに続く、粗生成物の脱保護、および精製を一般的手順に従って行った。化合物ＶＩＩＩを純粋な形態で凍結乾燥後に得た。収量：１０１ｍｇ（２工程で７６％）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、６００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、回転異性体の混合物）：δ５．３９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１環Ｄ）、５．３１（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ−１環Ｆ）、５．００（ｄ，１Ｈ）、４．９５（ｂｓ，１Ｈ）、４．６１（ｂｓ，１Ｈ）、４．５９（ｄ，１Ｈ）、４．５０（ｍ，１Ｈ）、４．３４（ｄ，１Ｈ）、４．２７−４．２０（ｍ，７Ｈ）、４．１９−４．１５（ｍ，２Ｈ）、４．１０−４．０３（ｍ，３Ｈ）、４．０２（ｓ，２ＨＣＨ２  Ａｃ  スペーサー）、３．９２（ｄｄｄ，１Ｈ）、３．８８（ｄｄｄ，１Ｈ）、３．８６−３．７５（ｍ，７Ｈ）、３．７１（ｄｄ，１Ｈ）、３．６９−３．５２（ｍ，３８Ｈ）、３．４９−３．４３（ｍ，１４Ｈ）、３．４０−３．３０（ｍ，１２Ｈ）、３．２６−３．１１（ｍ，４Ｈ）、２．９６−２．８９（ｍ，３Ｈ）、２．７７（ｍ，１Ｈ）、２．６８（ｍ，１Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ：計算値：２３９７．４；実測値：ｍ／ｚ１２２１．６［Ｍ＋２Ｎａ］２＋、１２１０．６［Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ］２＋、１１９９．６［Ｍ＋２Ｈ］２＋、８２２．１［Ｍ＋３Ｎａ］３＋、８１４．８［Ｍ＋２Ｈ＋Ｎａ］３＋、８０７．４［Ｍ＋Ｈ＋２Ｎａ］３＋、１１７５．７［Ｍ−２Ｎａ］２−、１１６４．７［Ｍ−３Ｎａ＋Ｈ］２−、１１５３．８［Ｍ−４Ｎａ＋２Ｈ］２−、７７６．２［Ｍ−３Ｎａ］３−、７６８．９［Ｍ−４Ｎａ＋Ｈ］３−、７６１．５［Ｍ−３Ｎａ＋Ｈ］３−、５７０．９［Ｍ−５Ｎａ＋Ｈ］４−、５７６．４［Ｍ−４Ｎａ］２−、４５６．５［Ｍ−５Ｎａ］５−。
【０１１１】
メチル＝Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−｛［Ｎ−３−（４−ピペリジンプロピオニル）−（Ｒ）−（−）−ニペコチル−（Ｌ）−アスパルチル−（Ｌ）−フェニルアラニル］−（１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル）−（１−アザ−４，７，１０−トリオキサドデシル）｝−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−３−Ｏ−メチル−２，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド八ナトリウム塩（Ｘ）
【０１１２】
【化１９】
2008500960.tif 000016
【０１１３】
化合物３３（３２．４ｍｇ、３２．８μｍｏｌ）を、一般的手順に従って、五単糖６３（５６．０ｍｇ、３１．２μｍｏｌ）にコンジュゲート化し、脱保護し、精製して、生成物Ｘを白色の粉末として得た。収量：４９ｍｇ（２工程で６２％）。
【０１１４】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ，ＨＨ−ＣＯＳＹ，回転異性体の１：１混合物）：δ７．３２−７．１９（ｍ，５Ｈ，Ｈ−ａｒｏｍ  Ｐｈｅ）、５．３９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１環Ｄ）、５．２９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１環Ｆ）、４．９９（ｄ，１Ｈ）、４．９３（ｂｓ，１Ｈ）、４．５９（ｄ，１Ｈ）、４．５３（ｓ，１Ｈ）、４．５０−４．４３（ｍ，３Ｈ）、４．３３（ｄ，１Ｈ）、４．２６−４．１５（ｍ，８Ｈ）、４．１３−４．０８（ｍ，３Ｈ）、４．０６−４．０２（ｄ，１Ｈ）、３．９８（ｄ，１Ｈ  ＣＨ２  Ａｃ  スペーサー）、３．９４−３．７８（ｍ，９Ｈ）、３．７４（ｂｓ，１Ｈ）、３．６８−３．５２（ｍ，３８Ｈ）、３．５０−３．４２（ｍ，１４Ｈ）、３．３８−３．３０（ｍ，１２Ｈ）、３．２７−２．８５（ｍ，６Ｈ）、２．８０−２．７０（ｍ，２Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ：計算値：２５４６．４；実測値：ｍ／ｚ１２７３．２［Ｍ＋２Ｈ］２＋、１２８４．２［Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ］２＋、１２９５．２［Ｍ＋２Ｎａ］２＋、８５６．５［Ｍ＋２Ｈ＋Ｎａ］３＋、８６３．８［Ｍ＋Ｈ＋２Ｎａ］３＋、８７１．１［Ｍ＋３Ｎａ］３＋、１２３８．３［Ｍ＋Ｈ−３Ｎａ］２−、１２２７．３［Ｍ＋２Ｈ−４Ｎａ］２−、１２１６．３［Ｍ＋３Ｈ−５Ｎａ］２−、８２５．２［Ｍ−３Ｎａ］３−、８１７．９［Ｍ−４Ｎａ＋Ｈ］３−、８１０．５［Ｍ−５Ｎａ＋２Ｈ］３−、８０３．２［Ｍ−６Ｎａ＋３Ｈ］３−、６１３．１［Ｍ−４Ｎａ］４−、６０７．７［Ｍ−５Ｎａ＋Ｈ］４−、４８５．９［Ｍ−５Ｎａ］５−、４０１．１［Ｍ−６Ｎａ］６−。
【０１１５】
【化２０】
2008500960.tif 000017
【０１１６】
（スキーム  ４）
Ｎ−（４−［１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル］フェニルスクシンアミル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルタート（３６）
化合物１７（１．０ｇ）をＤＭＦ（３５ｍＬ）中に含む撹拌された溶液に、Ｎ２雰囲気下、ＮＭＭ（３５１μＬ）を加え、続いて、クロロギ酸イソブチル（４４０μＬ）を加えた。５分後、Ａｓｐ（Ｂｎ）（ｔ−Ｂｕ）（１．１２ｇ）を加え、続いて、ＤｉＰＥＡ（５８６μＬ）およびＤＭＡＰ（７．８ｍｇ）を加えた。１時間後、Ｈ２Ｏを加え、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した（２回）。有機層をｓａｔ．ＮａＣｌ溶液により洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。トルエンを加え、この後、生成物３５が沈殿した。ヘプタンを加え、生成物を５５％の収率でろ過した。Ｒｆ＝０．５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ９：１：０．１）。
【０１１７】
３５（８４３ｍｇ）に、ＤＣＭおよびＴＦＡの混合物（４０ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）を加え、３時間撹拌した。この後、混合物をトルエンの添加後に濃縮して、３６を定量的収率で得た。Ｒｆ：０．２（Ｔｏｌ／ＥｔＯＡｃ、８：２、ｖ／ｖ）。
【０１１８】
Ｎ−アリルオキシカルボニル−Ｌ−チロシン（３８）
チロシン（１０ｇ）を４Ｎ  ａｑ．水酸化ナトリウム（３０ｍＬ）中に含む、氷浴で冷却されている撹拌溶液に、クロロギ酸アリル（６．４ｍＬ）を２０分かけてゆっくり加えた。添加が完了した後１０分して、氷浴を除き、４Ｎ  ａｑ．水酸化ナトリウム（３０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）を加えた。ＲＴで２時間後、ＭｅＯＨ（６０ｍＬ）を加えた。さらに２時間後、反応混合物をＥｔ２Ｏで抽出した。ａｑ．混合物を氷浴で冷却し、３６％から３８％塩酸を使用してｐＨ２から３に酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出液を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で濃縮して、Ａｌｌｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ（３８）をオイルとして得た（１４．５ｇ、８８％）。Ｒｆ０．３５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、８９／１０／１、ｖ／ｖ／ｖ）。
【０１１９】
Ｎ−アリルオキシカルボニル−４−Ｏ−ベンジル−Ｌ−チロシン（３９）
Ａｌｌｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ（３８、５．５ｇ）をＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＦの体積の半分を減圧下で除いた。残渣をＮ２雰囲気下で０℃に冷却し、水素化ナトリウム（６０％分散物、１．９ｇ）を少量ずつ加えた。懸濁物を０℃で１時間撹拌した。この後、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した臭化ベンジル（１．８８ｍＬ）を加えた。ＲＴで１時間後、２Ｎ塩酸（７ｍＬ）を加え、混合物を減圧下で濃縮した。残渣にＨ２Ｏ（５ｍＬ）を加え、ｐＨを、２Ｎ  ａｑ．水酸化ナトリウムを使用して９に調節し、トルエンおよびＥｔＯＡｃの混合物により洗浄した。ＥｔＯＡｃを加え、混合物を、２Ｎ塩酸を使用してｐＨ３に酸性化した。有機層を分離し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、８９／１０／１、ｖ／ｖ／ｖ）を使用して精製した。カラムからの生成物をＥｔＯＡｃに溶解し、Ｈ２Ｏにより洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮して、化合物３９を得た（４．６６ｇ、７７％）。Ｒｆ０．５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、８９／１０／１、ｖ／ｖ／ｖ）。
【０１２０】
（Ｎ−アリルオキシカルボニル−４−Ｏ−ベンジル−Ｌ−チロシル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４０）
ａｌｌｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｎ）−ＯＨ（３９、０．６１ｇ）および１５−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６）（０．５４ｇ）をＴＨＦ（２ｍＬ）中に含む撹拌された溶液に、ＴＢＴＵ（０．７ｇ）およびＮＭＭ（０．３８ｍＬ）を加えた。１６時間後、１５−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６）（０．１８ｇ）、ＴＢＴＵ（０．１ｇ）を加え、ｐＨを、ＮＭＭを使用して７に調節した（湿ったｐＨ試験紙）。３日後、反応混合物をろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン／ＥｔＯＨ、６５／３３／２から５０／０／１に、ｖ／ｖ／ｖ）を使用して精製して、表題化合物４０を得た（０．７ｇ、６７％）。Ｒｆ０．２５（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン／ＥｔＯＨ、６６／３３／１、ｖ／ｖ／ｖ）。
【０１２１】
１５−Ｎ−（４−Ｏ−ベンジル−Ｌ−チロシル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４１）
化合物４０（０．４３ｇ）をＤＣＭ（１５ｍＬ）中に含む撹拌された溶液に、Ｈ２Ｏ（７５μＬ）、水素化トリブチルスズ（０．４ｍＬ）およびＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（１２ｍｇ）を加えた。反応をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／エタノール、２５／１、ｖ／ｖ）によってモニターした。反応が完了した後、反応混合物を０℃で冷却し、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）を加え、２Ｎ塩酸を使用してｐＨ４に酸性化した。有機層を分離し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９５／５）からＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｎ−メチルモルホリン（４５０／５０／３）へのグラジエント）を使用して精製して、表題化合物４１を得た（０．３６ｇ、７８％）。Ｒｆ０．４（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１０／１、ｖ／ｖ）。
【０１２２】
１５−Ｎ−｛４−［１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル］フェニルスクシンアミル−（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル）−（４−Ｏ−ベンジル−Ｌ−チロシル）｝−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカン酸（４３）
化合物４１（３６０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）および化合物３６（２４１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した。この混合物にＮＭＭ（１０８μＬ、０．９８ｍｍｏｌ）を加え、続いて、ＴＢＴＵを加えた。混合物を一晩撹拌した。溶液をＰＶＤＦ（０．４５μｍ）フィルターでろ過した。精製をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ＤＣＭ→ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９５／５、ｖ／ｖ）によって行い、化合物４２をオイルとして得た（５６０ｍｇ、１００％）。Ｒｆ：０．５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）。この化合物の加水分解を、化合物１２の調製について記載されたように行った。精製をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、９０／１０／３、ｖ／ｖ／ｖ）によって行い、化合物４３を得た（１８５ｍｇ、３９％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：７．７０（ＡＢ，４Ｈ，Ｈａｒｏｍベンズアミジン）、７．３２（ｍ，１０Ｈ，Ｂｎ）、７．１２（ｄ，２Ｈ，Ｔｙｒ）、６．８８（ｄ，２Ｈ，Ｔｙｒ）、５．１０（ｄ，２Ｈ，ＣＨ２Ｂｎ）、５．００（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２ベンジル）、４．６７（ｍ，１Ｈ）、４．４８（ｍ，１Ｈ）、４．０６（ｓ，２Ｈ）、３．６１（ｍ，１０Ｈ）、３．５２（ｍ，２Ｈ）、３．４１（ｍ，２Ｈ）、３．３２（ｍ，２Ｈ）、３．１０−２．４０（ｍ，８Ｈ）。
【０１２３】
メチル＝Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチルー４−Ｏ−＜１２−［１５−｛Ｎ−（４−ベンズアミジニル）スクシンアミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−チロシル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル｝］−１２−アザ−３，６，９−トリオキサドデシル＞−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−３−Ｏ−メチル−２，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド八ナトリウム塩（ＸＩ）
化合物４３（６２．２ｍｇ）と五単糖６３（１１０ｍｇ）とのコンジュゲート化、これに続く脱保護および精製を一般的手順に概略されるように行った。収量：２２ｍｇ（２工程で１４％）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ，ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ３．５４−３．３０（８ｘ  ｓ，３４Ｈ，８ｘ  ＯＭｅ）；環Ｄ：５．２８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．１４（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、３．９７（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．７２（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．３７（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）、３．２４（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．１２（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｅ：４．５０（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、３．７３（ｍ，３Ｈ，Ｈ３，４，５）、３．１６（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｆ：５．１６（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．３９（ｍ，２Ｈ，Ｈ３．４）、４．２４（ｄ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．１４（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、４．００（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）、３．９７（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）；環Ｇ：４．８４（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ１）、３．９７（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．６６（ｍ，２Ｈ，Ｈ２．３）；環Ｈ：４．９１（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．１４（ｍ，２Ｈ，Ｈ２．６ａ）、４．０８（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．８４（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．５１（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）；スペーサー：３．８８（ｓ，２Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｏ）、３．５４−３．２４（ｍ，３２Ｈ）ペプチド：７．５９（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍベンズアミジン）、７．５３（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍベンズアミジン）、６．８４（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍ  Ｔｙｒ）、６．６３（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍ  Ｔｙｒ）、４．３８（ｄｄ，１Ｈ，ＣＨ  Ａｓｐ）、４．２１（ｔ，１Ｈ，ＣＨ  Ｔｙｒ）、２．７０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２  Ｔｙｒ）、２．４７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２  Ａｓｐ）、２．３０（ｄｄ，１Ｈ，ＣＨ２  Ａｓｐ）、２．７４−２．４０（ｍ，４Ｈ，スクシニル）。
【０１２４】
【化２１】
2008500960.tif 000018
【０１２５】
（スキーム  ５）
１５−ヒドロキシ−３，６，９，１２−テトラオキサ−テトラデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４４）
テトラエチレングリコール（４０ｍＬ）およびＴＨＦ（１５ｍＬ）の撹拌された混合物に、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２．８ｇ）を加えた。反応混合物を、透明な溶液が得られるまで４０℃から５０℃で加熱した。この溶液を０℃に冷却し、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（４ｍＬ、２４６ｍｍｏｌ）を一度に加えた。冷却浴を除き、反応混合物をＲＴで２時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、ブラインにより２回洗浄した。２つのブライン層をＥｔＯＡｃで４回抽出した。有機層を一緒にして、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で濃縮して、化合物４４を得た（４．６６ｇ）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ４．０３（ｓ，２Ｈ）、３．６０−３．７６（ｍ，１６Ｈ）、１．４７（ｓ，９Ｈ）。
【０１２６】
１４−（トルエン−４−スルホニルオキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサ−テトラデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４５）
化合物４４（４．６６ｇ）をＤＣＭ（３０ｍＬ）中に含む撹拌された混合物に、０℃で、ＮＭＭ（２ｍＬ）およびｐ−トルエンスルホニルクロリド（３．２ｇ）を加えた。冷却を除き、反応混合物をＲＴで１８時間撹拌した。ブラインを加え、混合物をＤＣＭで３回抽出した。有機層を一緒にして、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で濃縮して、出発物質を依然として含有するオイルを得た（７．４ｇ）。このオイルをＤＣＭ（３０ｍＬ）およびＮＭＭ（２ｍＬ）に再び溶解し、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（３．２ｇ）を撹拌溶液に０℃で加えた。ＲＴで２日後、ブラインを加え、混合物をＤＣＭで３回抽出した。有機層を一緒にして、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（ｈｅｐｔａｎｅｓ）、１／１、ｖ／ｖ）を使用して精製して、化合物４５を得た（４．６ｇ、６６％）。Ｒｆ０．１５（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（ｈｅｐｔａｎｅｓ）１／１、ｖ／ｖ）。
【０１２７】
１４−［４−Ｏ−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−チロシンベンジルエステル）］−３，６，９，１２−テトラオキサ−テトラデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４７）
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＢｎ（４６、０．６ｇ）、化合物４５（１．０ｇ）、炭酸セシウム（０．８２ｇ）およびヨウ化ナトリウム（０．１２ｇ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）中に含む撹拌された溶液を、Ｎ２雰囲気下、７０℃で加熱した。２０時間後、反応混合物をＲＴに冷却し、ブラインを加えた。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した（４回）。有機層を一緒にして、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／トルエン、１／２から１／１（ｖ／ｖ）へのグラジエント）を使用して精製して、化合物４７を得た（０．９２ｇ、８０％）。Ｒｆ：０．１５（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（ｈｅｐｔａｎｅｓ）、１／１、ｖ／ｖ）。
【０１２８】
１４−＜４−Ｏ−｛４−［１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル］フェニルスクシンアミル−（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル）−Ｌ−チロシンベンジルエステル｝］＞−３，６，９，１２−テトラオキサ−テトラデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４９）
化合物４７（０．４２ｇ）を酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（４ｍＬ）中に含む撹拌された溶液に、０℃で、ジオキサン中に４Ｎ塩化水素を含む溶液（２ｍＬ）を加えた。２時間後、硫酸（０．０４ｍＬ）を加え、３０分後、さらなる量の硫酸（０．０４ｍＬ）を加えた。さらに３０分後、炭酸水素ナトリウムのｓａｔ．ａｑ．溶液を加え、混合物をＥｔＯＡｃで４回抽出した。有機層を一緒にして、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で濃縮して、化合物４８を得た（０．１４ｇ）。この化合物をＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解し、この撹拌された溶液に、化合物３６（０．１１ｇ）、ＴＢＴＵ（８４ｍｇ）および３０μＬのＮＭＭを加えた。２時間後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ、１／０から９／１（ｖ／ｖ）へのグラジエント）を使用して精製し、化合物４９を得た（９０ｍｇ、３６％）。Ｒｆ０．５（ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ９／１、ｖ／ｖ）。
【０１２９】
１４−＜４−Ｏ−｛４−［１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル］フェニルスクシンアミル−（Ｏ−ベンジル−Ｌ−アスパルチル）−Ｏ−ベンジル−Ｌ−チロシル｝−３，６，９，１２−テトラオキサ−テトラデカノアート（５０）
化合物４９（９０ｍｇ）をジオキサンに溶解し、減圧下で濃縮した。残渣をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。２時間後、ジオキサン（５ｍＬ）を加え、混合物を減圧下で濃縮した。残渣をアセトニトリルに溶解し、減圧下で濃縮した。残渣を、ＨＰＬＣ（カラム、ＬＵＮＡ  １０ｕ  Ｃ１８（２）、２５０ｘ５０ｍｍ；流速、５０ｍＬ／分；グラジエント、３％の０．１Ｎ  ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、４７％のアセトニトリルおよび５０％のＨ２Ｏ／アセトニトリル（１０／１、ｖ／ｖ）から、３％の０．１Ｎ  ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、９０％のアセトニトリルおよび７％のＨ２Ｏ／アセトニトリル（１０／１、ｖ／ｖ）へ、３０分で）を使用して精製し、化合物５０を得た（７３ｍｇ、８５％）。ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ  ９７０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１３０】
メチル＝Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−＜１２−Ｎ−［１４−｛Ｎ−（４−ベンズアミジニル）スクシンアミル−Ｌ−アスパルチル−４−Ｏ−Ｌ−チロシル）］−３，６，９，１２−テトラオキサ−テトラデカノイル｝−１２−アザ−３，６，９−トリオキサドデシル＞−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−３−Ｏ−メチル−２，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド八ナトリウム塩（ＸＩＩ）
生成物を、一般的手順に従って、化合物５０（４０．３ｍｇ、４１．５μｍｏｌ）の五単糖６３（７１．１ｍｇ、３９．５μｍｏｌ）へのコンジュゲート化、これに続く精製および脱保護によって得た。生成物を白色の綿毛状固体として得た。収量：６３．５ｍｇ（６０％、２工程）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ，ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ３．４３−３．３２（８ｘ  ｓ，３４Ｈ，８ｘ  ＯＭｅ）；環Ｄ：５．３６（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．２１（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．０５（ｄ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．７７（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．４４（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）、３．３１（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．１９（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｅ：４．５８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、３．７９（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．６７（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．４４（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）、３．１６（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｆ：５．２８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．４８（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）、４．３２（ｄ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．１８（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）、４．１５（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、４．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．８６（ｔ，１Ｈ，Ｈ４）；環Ｇ：４．９２（ｂｓ，−１Ｈ，Ｈ１）、４．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ３）、３．３１（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）、３．１８（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）；環Ｈ：４．９８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２）、４．２２（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．９３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ５）、３．５９（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．５７（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）；スペーサー：３．９６（ｓ，２Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｏ）、３．６１−３．５１（ｍ，２６Ｈ，１３ｘ  ＣＨ２Ｏ）、３．３８−３．３０（ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ（Ｏ）ＣＨ２，ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−Ｐｈｅ）、３．１９（ｍ，１Ｈ，ＯＣＨ２ａＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−Ｐｈｅ）、３．１２（ｍ，１Ｈ，ＯＣＨ２ｂＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−Ｐｈｅ）；ペプチド：７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍベンズアミジン）、７．６２（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍベンズアミジン）、７．０１（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍ  Ｔｙｒ）、６．７７（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍ  Ｔｙｒ）、４．５７（ｄｄ，１Ｈ，ＣＨ  Ａｓｐ）、４．２８（ｄｄ，１Ｈ，ＣＨ  Ｔｙｒ）、２．８７（ｄＡＢ，２Ｈ，ＣＨ２  Ｔｙｒ）、２．５０（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２スクシニル）、２．４８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２スクシニル）、２．４８（ｄＡＢ，２Ｈ，ＣＨ２  Ａｓｐ）。
【０１３１】
【化２２】
2008500960.tif 000019
【０１３２】
（スキーム  ６）
ベンジル＝Ｎ−（３−カルボキシベンゼンスルホニル）−４−Ｏ−｛４−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−４−ピペリジニル）ブチル−Ｌ−チロシン（５２）
化合物５１（１２３ｍｇ、これは、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００１、２９、３５７から３７９に記載されるように調製される）をアセトニトリルおよびＨ２Ｏの混合物（１０ｍＬ、６／４、ｖ／ｖ）に溶解した。炭酸カリウム（３８１ｍｇ）を加え、溶液を０℃に冷却した。３−カルボキシベンゼンスルホニルクロリドを１５分かけて少量ずつ加え、混合物を０℃で３０分間撹拌し、次いでＲＴで１時間撹拌した。溶液を再び０℃に冷却し、さらなる量の３−カルボキシベンゼンスルホニルクロリド（１０２ｍｇ）を加えた。３０分後、反応混合物をＲＴに加温し、一晩撹拌した。混合物を１Ｎ塩酸によりｐＨ１に酸性化し、減圧下で濃縮し、粗生成物をＥｔＯＡｃに溶解した。有機層を１Ｎ塩酸により洗浄し、次いでＮａＣｌのｓａｔ．溶液により洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濃縮して、化合物５２を得た（０．１１ｇ、７３％）。Ｒｆ０．５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）。ＭＳ（ＥＳＩ）Ｍ＋＝７２９。
【０１３３】
ベンジル＝Ｎ−＜３−｛［１４−Ｎ−（１４−アザ−１−カルボキシ−２，５，８，１１−テトラオキサ−テトラデシル）］ケト｝ベンゼンスルホニル＞−４−Ｏ−｛４−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−４−ピペリジニル）ブチル｝−Ｌ−チロシン（５４）
粗化合物５２（２１６ｍｇ）および化合物６（４９ｍｇ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した。ＴＢＴＵ（１４５ｍｇ）およびＮＭＭ（８２ｕＬ）を加え、混合物をＲＴで一晩撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３、クエン酸およびｓａｔ．ＮａＣｌにより洗浄した。ａｑ．相を一緒にして、酢酸エチルで抽出し、この後、有機層を一緒にして、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮して、０．３１ｇの６８を褐色のオイルとして得た。次いで、粗化合物５３をＤＣＭ（５ｍＬ）およびＴＦＡ（２．５ｍＬ）の混合物において撹拌した。４時間後、混合物を濃縮した。生成物を調製用ＬＣ／ＭＳ（Ｃ１８、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ、０．０１％ＴＦＡ）によって精製し、８４ｍｇの化合物５４を得た。
【０１３４】
メチル＝Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−＜＜１２−Ｎ−＜３−｛［１４−Ｎ−（１４−アザ−１−カルボニル−２，５，８，１１−テトラオキサ−テトラデシル）］ケト｝ベンゼンスルホニル＞−４−Ｏ−｛４−（４−ピペリジニル）ブチル｝−Ｌ−チロシン＞−１２−アザ−３，６，９−トリオキサドデシル＞＞−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−３−Ｏ−メチル−２，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド八ナトリウム塩（ＸＩＩＩ）
カルボン酸５４（５３ｍｇ）の五単糖６３（９５ｍｇ）へのコンジュゲート化、これに続く精製および脱保護を一般的手順に従って行った。コンジュゲートＸＩＩＩを白色の泡状物として得た。収量：７７ｍｇ（２工程で５８％）。
【０１３５】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ，ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ３．４３−３．３２（８ｘ  ｓ，３４Ｈ，８ｘ  ＯＭｅ）；環Ｄ：５．３９（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．２２（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．０４（ｄ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．７９（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．４６（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）、３．３４（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｅ：４．５９（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、３．８２（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．６６（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）、３．２０（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｆ：５．２８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．４８（ｔ，１Ｈ，Ｈ３）、４．３４（ｄ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．２２（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）、４．０９（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．８５（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）；環Ｇ：４．９２（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ１）、４．５２（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ５）、４．０９（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈ３）、３．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｈ：４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．２２（ｍ，２Ｈ，Ｈ２，Ｈ６ａ）、４．１６（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．９１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ５）、３．６８（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．６０（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）；スペーサー：３．９１（ｓ，２Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｏ）、３．６６−３．３２（ｍ，３２Ｈ，１６ｘ  ＣＨ２）。ペプチド：７．８５（ｄｔ，１Ｈ，Ｈａｒｏｍ）、７．７５（ｔ，１Ｈ，Ｈａｒｏｍ）、７．６２（ｄｔ，１Ｈ，Ｈａｒｏｍ）、７．４３（ｔ，１Ｈ，Ｈａｒｏｍ）、６．８３（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍ  Ｔｙｒ）、６．４８（ｄ，２Ｈ，ＨａｒｏｍＴｙｒ）、３．８６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２Ｏ）、３．６５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１  Ｔｙｒ）、３．３６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ）、２．９１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ）、１．９１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ピペリジル）、１．７２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ブチル）、１．５９（ｍ，１Ｈ，ＣＨピペリジル）、１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ブチル）、１．３６（ｍ，４Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ１２７２．３［Ｍ＋２ＴＥＡ−２Ｈ］２−、８１４．５［Ｍ＋ＴＥＡ−３Ｈ］３−、７９９．１［Ｍ−３Ｈ］３−、５８５．０［Ｍ−４Ｈ］４−。
【０１３６】
メチル＝Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−＜＜１２−Ｎ−＜Ｎ−（３−ケト−ベンゼンスルホニル）−４−Ｏ−｛４−（４−ピペリジニル）ブチル｝−Ｌ−チロシン＞−１２−アザ−３，６，９−トリオキサドデシル＞＞−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−３−Ｏ−メチル−２，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド八ナトリウム塩（ＸＩＶ）
カルボン酸５２（２２．５ｍｇ）の五単糖６３（５２．６ｍｇ）へのコンジュゲート化、これに続く精製および脱保護を一般的手順に従って行った。コンジュゲートＸＩＶを白色の泡状物として得た。収量：３８．４ｍｇ（２工程で５８％）。
【０１３７】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ，ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ３．４３−３．３２（８ｘ  ｓ，３４Ｈ，８ｘ  ＯＭｅ）；環Ｄ：５．３９（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．２２（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．０４（ｄ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．７９（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．４６（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）、３．３４（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｅ：４．５８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、３．８２（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．６６（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）、３．１８（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｆ：５．２８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．４９（ｔ，１Ｈ，Ｈ３）、４．３４（ｄ，１Ｈ，Ｈ６ａ）、４．２０（ｍ，１Ｈ，Ｈ２）、４．０８（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．８５（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）；環Ｇ：４．９４（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ１）、４．５４（ｂｓ，１Ｈ，Ｈ５）、４．０８（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈ３）、３．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２）；環Ｈ：４．９８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１）、４．２２（ｍ，２Ｈ，Ｈ２，Ｈ６ａ）、４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｈ６ｂ）、３．９２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ５）、３．６８（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、３．６０（ｍ，１Ｈ，Ｈ３）；スペーサー：３．６２−３．３８（ｍ，１６Ｈ，８ｘ  ＣＨ２）。ペプチド：７．８３（ｄｔ，１Ｈ，Ｈａｒｏｍ）、７．７１（ｔ，１Ｈ，Ｈａｒｏｍ）、７．６２（ｄｔ，１Ｈ，Ｈａｒｏｍ）、７．４２（ｔ，１Ｈ，Ｈａｒｏｍ）、６．８１（ｄ，２Ｈ，ＨａｒｏｍＴｙｒ）、６．４６（ｄ，２Ｈ，Ｈａｒｏｍ  Ｔｙｒ）、３．８４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２Ｏ）、３．６６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１  Ｔｙｒ）、３．３３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ）、２．９０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ）、１．９３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ピペリジル）、１．７２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ブチル）、１．５９（ｍ，１Ｈ，ＣＨピペリジル）、１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ブチル）、１．３４（ｍ，４Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ１１５５．２［Ｍ＋２ＴＥＡ−２Ｈ］２−、７３６．３［Ｍ＋ＴＥＡ−３Ｈ］３−、７０２．６［Ｍ−３Ｈ］３−。
【０１３８】
【化２３】
2008500960.tif 000020
【０１３９】
（スキーム  ７）
１４−［４−Ｏ−（Ｎ−アリルオキシカルボニル−Ｌ−チロシル）］−３，６，９、１２−テトラオキサ−テトラデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５５）
化合物３８（１．０ｇ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解し、１０ｍＬのＤＭＦを減圧下で除いた。残渣をＮ２雰囲気下において０℃で冷却し、水素化ナトリウム（６０％分散物、０．３４ｇ）を少量ずつ加えた。懸濁物を０℃で１時間撹拌した。この後、ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した化合物４５（１．３ｇ）を加えた。ＲＴで２４時間後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣にＨ２Ｏ（５０ｍＬ）を加え、混合物をＥｔＯＡｃにより洗浄した。ＥｔＯＡｃおよび固体の塩化ナトリウムを加え、混合物を、２Ｎ  ａｑ．塩酸を使用してｐＨ３に酸性化した。有機層を分離し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、９４９／５０／１、ｖ／ｖ／ｖ）を使用して精製した。カラムからの生成物をＥｔＯＡｃに溶解し、Ｈ２Ｏにより洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮して、化合物５５を得た（０．６ｇ、３７％）。Ｒｆ０．４（ＥｔＯＡｃ／ピリジン／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ  ２７０／１６／９／４、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）。
【０１４０】
２−［（４−ピペリジニル）オキシ］酢酸ベンジル（５７）
２−［（４−ピペリジニル）オキシ］酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（５６）を、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９２、３５、４３９３から４４０７において以前に記載されたように調製した。化合物５６（４．３ｇ、２０ｍｍｏｌ）に５０ｍＬのＤＣＭ／ＴＦＡ（１：１）を加え、溶液を約３０分間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物をＥｔＯＨ（４０ｍＬ）およびＮＭＭ（７ｍＬ）の混合物に溶解し、これにジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（４．８ｇ、２２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を約５５時間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣に４Ｍ  ＮａＯＨ（２５０ｍＬ）およびＥｔ２Ｏを加え、層を抽出後に分離した。Ｈ２Ｏ層を、２Ｎ塩酸を使用してｐＨ３に酸性化し、続いて、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機層を一緒にして、乾燥し（硫酸マグネシウム）、濃縮して、２−［４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ピペリジニル）オキシ］アセタートを得た（２．１ｇ、４０％）。後者の粗生成物をアセトン（２５ｍＬ）およびトリエチルアミン（３．４ｍＬ）に溶解した。臭化ベンジル（９６５μＬ、８．１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を一晩撹拌した。氷水（２００ｍＬ）およびＥｔＯＡｃを加えた。混合物を２Ｎ塩酸によりｐＨ３に酸性化した。有機層をｓａｔ．ＮａＨＣＯ３およびブラインにより洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮して、７６０ｍｇの粗生成物を得た。生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、１／１、ｖ／ｖ）を使用して精製し、４１８ｍｇ（１５％）の純粋な生成物を得た。Ｒｆ：０．４７（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、１／１、ｖ／ｖ）。後者の生成物をＤＣＭ／ＴＦＡ（１０ｍＬ、１／１、ｖ／ｖ）に溶解し、１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、トルエン（５ｍＬ）を加えた。ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解し、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３により洗浄した。ａｑ．層をＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機層を一緒にして、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮して、３３１ｍｇ（１００％）の表題化合物５７を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ，ＨＨ）：δ７．３７（ｍ，５Ｈ，Ａｒ）、６．００（ｓ，２Ｈ）、４．１７（ｓ，２Ｈ）、３．５６（ｍ，１Ｈ）、３．１６（ｍ，１Ｈ）、２．７６（ｍ，１Ｈ）、１．９８（ｍ，１Ｈ）１．６３（ｍ，１Ｈ）。
【０１４１】
１４−｛［４−Ｏ−（Ｎ−アリルオキシカルボニル−Ｌ−チロシル）］−２−［（４−ピペリジニル）オキシ］アセタートベンジルエステル｝−３，６，９，１２−テトラオキサ−テトラデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５８）
化合物（５５）（４００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）および化合物（５７）（２１５ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）のカップリングを、化合物６４について以前に記載されたように行った。生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９５／５、ｖ／ｖ）を使用して精製し、５８７ｍｇ（９１％）の表題化合物５８を得た。Ｒｆ０．６５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、９５／５／０．３、ｖ／ｖ／ｖ）。
【０１４２】
１４−｛４−Ｏ−Ｌ−チロシル−２−［（４−ピペリジニル）オキシ］アセタートベンジルエステル｝−３，６，９，１２−テトラオキサ−テトラデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５９）
化合物５８（５８７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５ｍＬ）中に含む溶液に、Ｈ２Ｏ（７５μＬ）、モルホリン（１１５μＬ、１．３２ｍｍｏｌ）およびＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２を続けて加えた。３時間後、反応混合物をＨ２Ｏ／ブライン（１／１、ｖ／ｖ）混合物に注ぎ、これをＤＣＭで抽出した。有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）を使用して精製し、４３３ｍｇ（８９％）の表題化合物５９を得た。Ｒｆ０．６６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）。
【０１４３】
Ｎ−（４−［１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル］安息香酸（６０）
ｐ−シアノ安息香酸メチルエステル（５．０ｇ、３１ｍｍｏｌ）を、化合物３の合成について記載されるように、対応するオキサジアゾリノンに変換した。粗生成物（４．６ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（５０ｍＬ）の混合物に溶解した。Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）を加え、これにより、懸濁物が得られ、続いて、４Ｎ  ａｑ．ＮａＯＨ（１０ｍＬ）を加えた。６時間後、有機溶媒を減圧下での蒸留によって除いた。ａｑ．層をＥｔＯＡｃ／トルエン（１／２、ｖ／ｖ）で抽出し、２Ｎ塩酸により酸性化し、沈殿物をろ過した。粗生成物を減圧下において４０℃で乾燥して、４．２ｇ（９７％）の化合物６０を得た。ＥＳＩ−ＭＳ：２０７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１４４】
１４−｛｛Ｎ−（４−［１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル］ベンゾイル）−｛４−Ｏ−Ｌ−チロシル−２−［（４−ピペリジニル）オキシ］アセタートベンジルエステル｝｝−３，６，９，１２−テトラオキサ−テトラデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６１）
化合物５９（４３３ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）および化合物６０（１３４ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍＬ）中に含む溶液に、ＴＢＴＵ（２２７ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（１３０μＬ、１．１８ｍｍｏｌ）を加えた。ＲＴでの１６時間の撹拌の後、反応混合物を減圧下で濃縮した。ＥｔＯＡｃを加え、有機層をブラインにより洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮した。生成物をＨＰＬＣ（Ｃ１８、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって精製して、３３７ｍｇ（６４％）の化合物６１を得た。ＥＳＩ−ＭＳ：８９１［Ｍ＋Ｈ］＋、９１３［Ｍ＋Ｎａ］＋、８３５［Ｍ−ｔＢｕ＋Ｈ］＋。
【０１４５】
１４−｛｛Ｎ−（４−［１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル］ベンゾイル｝−｛４−Ｏ−Ｌ−チロシル−２−［（４−ピペリジニル）オキシ］アセタートベンジルエステル｝｝−３，６，９，１２−テトラオキサ−テトラデカノアート（６２）
ｔ−Ｂｕエステルの加水分解を、化合物１２の調製について以前に記載されたように行った。生成物をＨＰＬＣ（Ｃ１８、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／３％  ０．１Ｎ  ＴＦＡ（ａｑ））によって精製して、１８１ｍｇ（５７％）の所望する化合物６２を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：７．９１（ＡＢ，４Ｈ，Ｈａｒｏｍベンズアミジン）、７．３５（ｍ，５Ｈ，Ｂｎ）、７．１９（ｄ，２Ｈ，Ｔｙｒ）、６．８８（ｄｄ，２Ｈ，Ｔｙｒ）、５．２４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ  Ｔｙｒ）、５．１８（ｄ，２Ｈ，ＣＨ２Ｂｎ）、４．１７（ｄ，２Ｈ）、４．１０（ｓ，２Ｈ）、４．０８（ｍ，２Ｈ）、３．８０（ｍ，２Ｈ）、３．６５（ｍ，１４Ｈ）、３．５８（ｍ，１Ｈ）、３．３２（ｍ，２Ｈ）、３．０７（ｍ，２Ｈ）、１．８２−１．０１（ｍ，４Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ：８３５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１４６】
メチル＝Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−＜［１−アミノ−４，７，１０−トリオキサドデシル］−１４−｛｛Ｎ−（４−［１，２，４−オキサジアゾール−５−オニル］ベンゾイル｝−｛４−Ｏ−Ｌ−チロシル−２−［（４−ピペリジニル）オキシ］アセタートベンジルエステル｝｝−３，６，９，１２−テトラオキサ−テトラデカノイル＞−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−３−Ｏ−メチル−２，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシド八ナトリウム塩（ＸＶ）
化合物６２（５１．７ｍｇ）と五単糖６３（１０６ｍｇ）とのコンジュゲート化、これに続く脱保護および精製を一般的手順に従って行った。収量：１２７ｍｇ（２工程で８７％）。
【０１４７】
【化２４】
2008500960.tif 000021
【０１４８】
【化２５】
2008500960.tif 000022
2008500960.tif 000023
【０１４９】
【化２６】
2008500960.tif 000024
【０１５０】
【化２７】
2008500960.tif 000025
【０１５１】
薬理学的データ
Ｉ．ａ．ＡＤＰにより誘導されるヒト血小板凝集の阻害についてのインビトロ試験
序論：
アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）にインビトロで加えることにより、血小板凝集が誘導される。この凝集は、ＰＲＰの光学的濃度（ＯＤ）を測定することによって評価することができる。本実施例において記載されるインビトロ試験が、ヒト血小板のＡＤＰ誘導による凝集に対する試験化合物の阻害活性を明らかにするために使用された。マイクロプレート読み取り装置が、数個の化合物の活性を同時に測定するために使用される。
【０１５２】
試験媒体：１０日前の期間から薬物を何ら服用していない健康な志願者から得られた血小板。
【０１５３】
参照化合物：このアッセイでは、チロフィバン（ｉ．ｖ．注入用の０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度として購入されたＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＭＳＤ））が、５μＭのＡＤＰにより誘導されるヒト血小板凝集を３０ｎＭから６０ｎＭ（ＩＣ５０）の濃度で５０％阻害する。
【０１５４】
ビヒクル：試験化合物は、好ましくは、ＭＱ  Ｈ２Ｏに１ｍＭの濃度で溶解されなければならない。代わりのビヒクルは、ＭＱ  Ｈ２Ｏにおける０．９％ＮａＣｌである。化合物溶液（ＭＱ  Ｈ２ＯまたはＭＱ  Ｈ２Ｏにおける０．９％ＮａＣｌのいずれかでの溶液）は、ＭＱ  Ｈ２Ｏにおける０．９％ＮａＣｌでさらに希釈される。
【０１５５】
技術：
試薬
１．多血小板血漿（ＰＲＰ）：
自由放出血（少なくとも１００ｍＬ）を健康な志願者から採取し、蒸留Ｈ２Ｏにおける０．１体積の３．８％クエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ（ｗ／ｖ）に集める。最終濃度は０．３８％クエン酸ナトリウムである。
【０１５６】
クエン酸塩添加血液をＲＴにおいて１，６００Ｎ／ｋｇ（１６０ｇ）で遠心分離する。１５分後、ブレーキをオフにして、遠心分離を中断し、上清（＝ＰＲＰ）を集める。
２．ＡＤＰ（Ｋｏｒｄｉａ／Ｃｈｒｏｎｏ−ｐａｒ＃３８４）。使用前に、０．９％ＮａＣｌにおける５０μＭの溶液を調製する。
【０１５７】
装置
１．Ｓｙｓｍｅｘ血球計数装置モデルＫＸ−２１。
２．６２０ｎｍのフィルター、１，０００ｒｐｍおよび３７℃の一定温度で設定された旋回振とう機を有するＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ｉＥＭＳ読み取り装置ＭＦ。吸収がＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ｉＥＭＳプログラムにより測定される。
３．ニードルを伴う血液採取システム６００ｍＬ、ａｒｔ  Ｐ４２０３（ＮＰＢＩ）。
４．９６ウエル平底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）。
【０１５８】
手順
上清（ＰＲＰ）中の血小板を、Ｓｙｓｍｅｘ血球計数装置を使用して計数し、上清をＰＰＰにより希釈して、４００，０００±５０，０００個／μＬの血小板を含有するＰＲＰを得る。ＰＲＰは、少なくとも２０分間、但し３時間を超えることなく、ＲＴで安定化させなければならない。
【０１５９】
ＡＤＰ誘導による凝集
１５０μＬのＰＲＰをピペットでマイクロプレートのウエルに入れる。様々な濃度（化合物あたり７つの濃度）またはビヒクルにおける３０μＬの試験化合物を加え、マイクロプレートをＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ｉＥＭＳ読み取り装置ＭＦに入れて３７℃で置く。この後、光学的濃度（ＯＤ６２０）を６２０ｎｍで測定する。読み取り装置内で２分間振とう（１，０００ｒｐｍ）した後、ＯＤは二度測定する。これは、血小板の安定性（自発的な血小板凝集の非存在）を確認するためである。この後、２００μＬの５０μＭ  ＡＤＰ溶液を加え、ＯＤを１４分間にわたって６２０ｎｍで１分毎に速度論的に測定する（図１）。２つの測定の間で、プレートを１，０００ｒｐｍで４０秒間振とうする。各試験化合物を、異なる志願者から得られたＰＲＰを使用して少なくとも２回の実験で調べる。通常、試験化合物の最大最終濃度は１Ｅ−６Ｍから１Ｅ−７Ｍの間であり、化合物の濃度は、２５％未満の血小板凝集阻害が得られるまで、１／２ずつ低下する。
【０１６０】
ＡＤＰ誘導による凝集の応答の評価
各化合物濃度における平均ＯＤ（ビヒクルを含む）をｔ＝０分およびｔ＝１０分において計算する。各濃度におけるパーセント阻害を、下記の式を使用して計算する：
１００％−｛（ＯＤ化合物（ｔ＝０分）−ＯＤ化合物（ｔ＝１０分））／（ＯＤビヒクル（ｔ＝０分）−ＯＤビヒクル（ｔ＝１０分））｝ｘ１００
試験化合物のＩＣ５０は、ＡＤＰ誘導による血小板凝集が５０％低下する試験化合物の濃度である。このために、パーセント阻害の値が化合物の濃度に対してプロットされる。この後、試験化合物のＩＣ５０、ｎＨ（Ｈｉｌｌ勾配）および効力を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ３．０を（可変勾配とともに）使用して計算する。
【０１６１】
必要量：２ｍｇ。
【０１６２】
参考文献：Ｓａｌｍｏｎ，Ｄ．Ｍ．（１９９６）、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８４、２１３から２１６。
【０１６３】
【表１】
2008500960.tif 000026
【０１６４】
Ｉ．ｂ．ＴＲＡＰにより誘導されるヒト血小板凝集の阻害についてのインビトロ試験
序論：トロンビン受容体アゴニストペプチド（ＴＲＡＰ）を洗浄ヒト血小板（ＷＰＬ）にインビトロで加えることにより、血小板凝集が誘導される。この凝集は、ＷＰＬの光学的濃度を測定することによって明らかにすることができる。本実施例において記載されるインビトロ試験が、ヒト血小板のＴＲＡＰ誘導による凝集を阻害する試験化合物の活性を分析するために使用される。マイクロプレート読み取り装置が、数個の化合物の活性を同時に測定するために使用される。
【０１６５】
試験媒体：１０日前の期間から薬物を何ら服用していない健康な志願者から得られた血小板。
【０１６６】
参照化合物：このアッセイでは、チロフィバン（ｉ．ｖ．注入用の０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度として購入されたＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＭＳＤ））が、５μＭのＴＲＡＰにより誘導されるヒト血小板凝集を３０ｎＭから６０ｎＭ（ＩＣ５０）の最終濃度で５０％阻害する。
【０１６７】
ビヒクル：試験化合物は、好ましくは、ＭＱ  Ｈ２Ｏに１ｍＭの濃度で溶解されなければならない。代わりのビヒクルは、ＭＱ  Ｈ２Ｏにおける０．９％ＮａＣｌである。化合物溶液（ＭＱ  Ｈ２ＯまたはＭＱ  Ｈ２Ｏにおける０．９％ＮａＣｌのいずれかでの溶液）は、ＭＱ  Ｈ２Ｏにおける０．９％ＮａＣｌでさらに希釈される。
【０１６８】
技術：
試薬
１．多血小板血漿（ＰＲＰ）：
自由放出血（少なくとも１００ｍＬ）を健康な志願者から採取し、ＭＱ  Ｈ２Ｏにおける０．１体積の３．８％クエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ（ｗ／ｖ）に集める。最終濃度は０．３８％クエン酸ナトリウムである。クエン酸塩添加血液を、ＲＴで、Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔａｎｔａ／ＡＰ遠心分離機において１，６００Ｎ／ｋｇ（１６０ｇ）（７５０ｒｐｍ）で遠心分離する。１５分後、ブレーキをオフにして、遠心分離を中断し、上清（＝ＰＲＰ）を集める。
２．洗浄血小板（ＷＰＬ）：
１ｍｌのＰＲＰあたり１μＬの、新しく作製されたＰＧＩ２溶液を加えた後、懸濁物を、ＲＴで、Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔａｎｔａ／ＡＰ遠心分離機において１３，５００Ｎ／ｋｇ（１，３５０ｇ）（すなわち、２，８００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離する。ペレットを、５ｎｇ／ｍＬのＰＧＩ２を含有する同じ体積の新鮮なＷａｔｓｏｎ緩衝液に穏やかに再懸濁した後、懸濁物を再びＲＴで１，３５０ｇ（２，８００ｒｐｍ）において１０分間遠心分離する。最終的な血小板ペレットをＷａｔｓｏｎ緩衝液に再懸濁して、約４００，０００±５０，０００個／ｍＬの血小板を得る。
３．Ｗａｔｓｏｎ緩衝液：
ＭＱ  Ｈ２Ｏにおいて、１３４ｍＭのＮａＣｌ、２．９ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＮａＨＣＯ３、０．３４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、１ｍＭのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、５ｍＭのグルコースおよび５ｍＭのＨＥＰＥＳ。ｐＨを１ＭのＮａＯＨにより７．４に調節する。
４．プロスタグランジンＩ２（Ｓｉｇｍａ、Ｐ６１８８、粉末）：
１ＭのＫＯＨにおける１ｍｇ／ｍＬのＰＧＩ２ストック溶液を１００μＬの小分け物にして−２０℃で貯蔵する。使用直前に、ＭＱ  Ｈ２Ｏにおける氷冷０．９％ＮａＣｌでの５μｇ／ｍＬの溶液を調製する。
５．ヒトフィブリノーゲン（Ｋｏｒｄｉａ／ＥＲＬ、ａｒｔ  ｎｒ：ＦＩＢ２、粉末）：
０．５ｇのフィブリノーゲン粉末を真空下で５０ｍＬのＭＱ  Ｈ２Ｏに溶解する。このストック溶液を１ｍＬの小分け物にして−２０℃で貯蔵する。使用直前に、生理的食塩水における０．５ｍｇ／ｍＬの溶液を調製する。
６．ＴＲＡＰ
使用前に、ＭＱ  Ｈ２Ｏにおける０．９％ＮａＣｌでの５０μＭ  ＴＲＡＰの溶液を調製する。各試験のために、新鮮な溶液を作製する。
【０１６９】
装置
１．Ｓｙｓｍｅｘ血球計数装置モデルＫＸ−２１
２．４０５ｎｍのフィルター、１，０００ｒｐｍおよび３７℃の一定温度で設定された旋回振とう機を有するＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ｉＥＭＳ読み取り装置ＭＦ。吸収がＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ｉＥＭＳプログラムにより測定される。
３．ニードルを伴う血液採取システム６００ｍＬ、ａｒｔ  ｎｒ：Ｐ４２０３（ＮＰＢＩ）。
４．９６ウエルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）平底。
【０１７０】
手順：ＷＰＬの濃度を、Ｓｙｓｍｅｘ血球計数装置を使用して計数し、懸濁物をＷａｔｓｏｎ緩衝液で希釈して、４００，０００±５０，０００個／μＬの血小板の濃度を得る。使用前に、ＷＰＬは、少なくとも２０分間、但し３時間から４時間を超えることなく、室温で安定化させられる。
【０１７１】
ＴＲＡＰ誘導による凝集：１５０μＬのＷＰＬをピペットでマイクロプレートのウエルに入れる。１５μＬの試験化合物またはビヒクルおよび１５μＬのフィブリノーゲン溶液を加え、マイクロプレートをマイクロプレート読み取り装置に入れて３７℃で置く。この後、光学的濃度（ＯＤ）を４０５ｎｍで測定し、読み取り装置内で２分間振とうした後、ＯＤ４０５を、血小板の安定性（自発的な血小板凝集の非存在）を確認するために再び測定する。２０μＬの５０μＭ  ＴＲＡＰ溶液を加え、ＯＤ４０５を１４分間にわたって４０５ｎｍで１分毎に速度論的に測定する。２つの測定の間で、プレートを１，０００ｒｐｍで４０秒間振とうする（図１）。試験化合物のＩＣ５０を決定するために、各試験化合物を、異なる志願者から得られたＷＰＬを使用して少なくとも２回の実験で調べる。化合物の通常の開始濃度はインキュベーション媒体において１Ｅ−６Ｍから１Ｅ−７Ｍの間であり、化合物の濃度は、２５％未満の血小板凝集阻害が得られるまで、１／２ずつ低下する。
【０１７２】
応答の評価：各化合物の平均ＯＤ（ビヒクルを含む）をｔ＝０分およびｔ＝１０分において計算する。各濃度におけるパーセント阻害を、下記の式を使用して計算する：
１００％−｛（ＯＤ化合物（ｔ＝０分）−ＯＤ化合物（ｔ＝１０分））／（ＯＤビヒクル（ｔ＝０分）−ＯＤビヒクル（ｔ＝１０分））｝ｘ１００
化合物の濃度をパーセント阻害の値に対してプロットする。試験化合物のＩＣ５０、ｎＨ（Ｈｉｌｌ勾配）および効力を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ３．０を（可変勾配とともに）使用して計算する。試験化合物のＩＣ５０は、ＴＲＡＰ誘導による血小板凝集が５０％低下する試験化合物の濃度である。
【０１７３】
必要量：２ｍｇ。
【０１７４】
参考文献：Ｓａｌｍｏｎ，Ｄ．Ｍ．（１９９６）、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８４、２１３から２１６。
【０１７５】
【表２】
2008500960.tif 000027
【０１７６】
ＩＩ．緩衝液における抗第Ｘａ因子活性の測定
（マイクロタイタープレート法）
序論：
活性化された第Ｘ（Ｘａ）因子は凝固カスケードにおける因子であり、この活性はアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）によってわずかに阻害される。抗凝固剤はＸａを直接的に阻害することができるか、または、ヘパリンのように、ＡＴ−ＩＩＩの阻害活性を強めることによってＸａを阻害することができる。抗Ｘａ活性を、ＡＴ−ＩＩＩの存在下での発色性基質Ｓ−２２２２の加水分解速度を測定することによって評価することができる。このアッセイが、Ｋａｂｉ緩衝液におけるヘパリノイド調製物の抗Ｘａ活性を明らかにするために使用される。
【０１７７】
試験媒体：Ｋａｂｉ緩衝液
参照化合物：国際標準ヘパリン（１１．４抗ＸａＵ／ｍｇ）。
【０１７８】
技術：
試薬
１．Ｋａｂｉ緩衝液
緩衝液の組成：ＮａＣｌ、１０．１７ｇ（１７４ｍｍｏｌ）；エデト酸二ナトリウム二水和物、３．２６ｇ（９．６ｍｍｏｌ）；トロメタミン（Ｔｒｉｓ）、６．１１ｇ（５０．４ｍｍｏｌ）；超純粋Ｈ２Ｏ＊で１Ｌにする。溶液のｐＨを塩酸（０．１０ｍｏｌ／Ｌ）により７．４に調節する。
＊すべてのａｑ．溶液について、超純粋Ｈ２Ｏ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ規格）が使用される。
２．Ｘａ溶液
ウシの第Ｘａ因子（Ｋａｂｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、スウェーデン）をＫａｂｉ緩衝液に溶解して、１．５Ｕ／ｍＬ（０．７５ｎＫａｔ／ｍＬ）を含有する溶液を得る。
３．Ｓ−２２２２溶液
Ｓ−２２２２（Ｋａｂｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を超純粋Ｈ２Ｏに溶解して、０．３７５ｍｇ／ｍＬ（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有する溶液を得る。
４．ＡＴ−ＩＩＩ溶液
ヒトＡＴ−ＩＩＩ（Ｋａｂｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）をＫａｂｉ緩衝液に溶解して、０．２５Ｕ／ｍＬを含有する溶液を得る。新鮮な溶液を毎日調製しなければならない。
５．較正サンプルの標準溶液
標準ヘパリンをＫａｂｉ緩衝液に溶解して、約０．２５抗ＸａＵ／ｍＬを含有する標準溶液を得る。
【０１７９】
手順：
試験サンプルの調製
各調製物を超純粋Ｈ２Ｏに溶解し、Ｋａｂｉ緩衝液により希釈して、０．０２抗ＸａＵ／ｍＬから０．２抗ＸａＵ／ｍＬの範囲での必要とされる濃度にした。
【０１８０】
Ｘａ活性の測定
各試験サンプル（０．０５ｍＬ）をＲＴでピペットによりマイクロタイタープレートのウエルに入れた。ＡＴ−ＩＩＩ溶液（０．０５ｍＬ）を各サンプルに加え、プレートを、Ｖａｒｉ振とう機を使用して振とうする。
【０１８１】
Ｘａ溶液のアリコート（０．０５ｍＬ）を、ＡＴ−ＩＩＩ溶液を加えた後１０分して各ウエルにピペットで加え、プレートを再び振とうする。Ｘａ溶液を加えた後、正確に２分して、０．１ｍＬのＳ−２２２２溶液をピペットで各ウエルに加え、プレートを再び振とうする。すべての添加について、１２チャンネルピペットが使用される。
【０１８２】
残存する量のＸａにより、Ｓ−２２２２の加水分解が触媒され、この速度がＲＴで２分および２２分のインキュベーション期間の後で吸光光度法により各々測定される。各サンプルの吸光度を、Ｒｅａｄｅｒ  Ｍｉｃｒｏｅｌｉｓａ（モデル３１０Ｃ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ、Ｏｓｓ、オランダ））を使用して４０５ｎｍで測定し、吸光度の増大（ΔＯＤ）を計算する。各試験サンプルを二回測定する。１０サンプル毎、ブランク（０．０５ｍＬのＫａｂｉ緩衝液）が含められる。
【０１８３】
較正曲線
較正サンプルの標準溶液のアリコートから、一連の希釈度を作製する（希釈係数：１、ヘパリンサンプルについては３つ）。得られた標準サンプル（約１５サンプル）は０．０１抗ＸａＵ／ｍＬから０．２５抗ＸａＵ／ｍＬの間を含有しなければならない。各処理において、各標準サンプルの０．０５ｍＬを、Ｘａ活性の測定のところで記載されたように、少なくとも３回試験する。較正曲線を、直線を、ｌｏｇ（抗ＸａＵ／ｍＬの値）に対する
ｌｏｇ｛（平均ΔＯＤ（ブランク）−平均ΔＯＤ（標準サンプル））／平均ΔＯＤ（標準サンプル）｝
に、最小二乗法を使用して近似することによって得る。
【０１８４】
応答の評価：
各サンプルについて、平均抗Ｘａ活性（Ｕ／ｍＬ単位で）を、較正曲線を使用して求める。
【０１８５】
比較のために、フリーの五単糖ＸＸＩＩ（コンジュゲートのオリゴ糖部分の「母体化合物」）の抗Ｘａ活性データもまた示される。
【０１８６】
【表３】
2008500960.tif 000028
【０１８７】
薬物動態学
モルモット（ＤＨ）に０．５μｍｏｌ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の抗凝固剤を投与した。五単糖ＸＸＩＩ（コンジュゲートのオリゴ糖部分の「母体化合物」）およびコンジュゲートＶＩＩＩの半減期を、血漿の抗Ｘａ活性を上記のように特定の時間間隔でエクスビボ測定することによって間接的に求めた。参照用のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト（ＸＶＩＩ、ＸＩＸおよびＸＸ；スキーム１０を参照のこと）の半減期を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、血漿中濃度を特定の時間間隔で測定することによって求めた。
【０１８８】
【化２８】
2008500960.tif 000029
【０１８９】
結論：
本発明のコンジュゲート化合物ＶＩＩＩの半減期は、参照用のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストと比較したとき、著しく長くなっている。
【国際調査報告】
2008500960.tif 000036
2008500960.tif 000037
2008500960.tif 000038