(57)【要約】  本明細書は、配列番号：１７〜１２７（以下「ターゲット」）を含むポリペプチド配列及びそれらのフラグメント、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの発現阻害剤を使用して、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解及び炎症を阻害する化合物の同定方法並びに使用方法を開示し、これは配列番号：１７〜１２７のポリペプチドをコードする天然型ポリヌクレオチド配列に相補的な核酸配列又は人為的に加工した該核酸配列を含み、関節リウマチなどの慢性関節変性疾患及び／又は炎症性疾患の治療用若しくは予防用前記作用物質を含む医薬組成物に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解を阻害する化合物を同定する方法であって、化合物を、配列番号：１７〜３２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチド及びそれらのフラグメントと接触させること；及び、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解に関連する化合物−ポリペプチド特性を測定すること、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、インビトロ無細胞調製物中にある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、哺乳動物細胞に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記特性が、前記ポリペプチドへの前記化合物の結合親和性である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記特性が、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解の指標となる生化学的マーカーを産生する生物学的経路の不活性化である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記指標がＭＭＰ１である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号：１７〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、市販のスクリーニングライブラリーの化合物、及び配列番号：１７〜１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドへの結合親和性を有する化合物、からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が、ファージディスプレイライブラリー又は抗体フラグメントライブラリー中のペプチドである、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解、又は炎症の阻害に効果的な作用物質であって、前記作用物質が、配列番号：１〜１６からなる群から選択される核酸配列中の連続した約１７個〜約３０個のヌクレオチドからなる天然型ポリヌクレオチド配列に相補的な核酸配列、又は該天然型ポリヌクレオチド配列から人為的に加工された核酸配列を含む、前記作用物質。
【請求項１１】
請求項１０記載の作用物質を発現する哺乳動物細胞内のベクター。
【請求項１２】
リバースＭＭＰ−１アッセイでＭＭＰ−１の発現を減少させるのに効果的である、請求項１０記載の作用物質。
【請求項１３】
前記ベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター又はセンダイウイルスベクターである、請求項１１記載の作用物質。
【請求項１４】
前記アンチセンスポリヌクレオチド及び前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に相補的な１７個〜２５個のヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号：１〜１６からなる群から選択される核酸配列中の連続した１７個〜２５個のヌクレオチドから選択される、請求項１０記載の作用物質。
【請求項１５】
前記ｓｉＲＮＡが、前記センス鎖をさらに含む、請求項１４記載の作用物質。
【請求項１６】
前記センス鎖が、配列番号：１２８〜１４１及び２３１〜２４４からなる群から選択される、請求項１５記載の作用物質。
【請求項１７】
前記ｓｉＲＮＡが、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とを連結させるループ領域をさらに含む、請求項１６記載の作用物質。
【請求項１８】
前記ループ領域が、配列番号：８７１〜８７２からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１７記載の作用物質。
【請求項１９】
前記作用物質が、配列番号：１２８〜１４１及び２３１〜２４４からなる群から選択される核酸配列に相補的な核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム又はｓｉＲＮＡである、請求項１８記載の作用物質。
【請求項２０】
医薬として許容し得る担体との混合物中に、治療的有効量の請求項１０記載の作用物質を含む、ＥＣＭ分解阻害医薬組成物。
【請求項２１】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解が関与する疾患を患っている対象又は該疾患に感受性である対象において、該疾患を治療及び／又は予防する方法であって、前記対象に請求項２０記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
前記疾患が関節変性疾患である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患が関節リウマチである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解が関与する疾患の治療及び／又は予防用薬剤の製造における、請求項１０〜１９記載の作用物質の使用。
【請求項２５】
前記疾患が、関節変性疾患及び炎症性疾患からなる群から選択される、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
前記疾患が関節リウマチである、請求項２４又は２５記載の使用。
【請求項２７】
異常なマトリクスメタロプロテイナーゼ活性によって特徴付けられる状態の治療方法であって、請求項１０記載のマトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤の治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
ＭＭＰ１の異常な細胞性発現が関与する疾患から選択される状態の治療方法であって、請求項１０記載のマトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤の治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項２９】
対象において、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解が関与する病理的状態、又は該状態への感受性を診断する方法であって、前記対象から得られる生体サンプル中に存在する配列番号：１７〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１量のポリペプチドを測定すること、及び前記第１量を健常者の集団内で測定されたポリペプチドの量の範囲と比較すること（ここで健常者で測定された量の範囲に比較しての前記生体サンプル中のポリペプチド量の増加は、前記病理的状態の存在の指標となる）、を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００４年１０月１５日に出願された米国特許仮出願第60/619,384号への優先権を主張し、該開示は引用によって本明細書に組み込まれる。。
（発明の分野）
本発明は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の分解をもたらす経路に関与するタンパク質の発現を阻害し得る化合物及び発現阻害剤の同定方法に関するものであり、それらの阻害は、関節変性疾患並びに細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解及び／又は炎症が関与する疾患の予防並びに治療に有用である。
【０００２】
細胞外マトリクスの分解が関与する疾患は、これらに限定されないが、乾癬性関節炎、若年性関節炎、早期関節炎、反応性関節炎、変形性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、腱炎及び歯周病のような筋骨疾患、ガン転移、呼吸器系疾患（ＣＯＰＤ、喘息）、腎臓繊維症及び肝臓繊維症、アテローム性動脈硬化症及び心不全のような心血管系疾患、並びに神経の炎症及び多発性硬化症のような神経系疾患を含む。主に関節変性が関与する疾患は、これらに限定されないが、乾癬性関節炎、若年性関節炎、早期関節炎、反応性関節炎、変形性関節炎、強直性脊椎炎を含む。
【０００３】
関節リウマチ（ＲＡ）は、炎症及び関節構造の破壊によって特徴付けられる、慢性の関節変性疾患である。該疾患が調べられなかった場合、該疾患は実質的な身体障害、関節機能性の喪失のための痛み、並びに早死にすらもたらす。それゆえ、ＲＡ治療の目的は、該疾患を遅延させるのではなく、関節の破壊を停止させるための緩解を実現することである。該疾患の予後の重篤さに加え、（世界規模で、成人の０．８％が冒される）ＲＡの高い罹患率は、強い社会経済的衝撃を意味する。（ＲＡの総説として、発明者らは、Smolen及びSteinerの文献 (2003)；Lee及びWeinblattの文献 (2001)；Choy及びPanayiの文献 (2001)；O'Dellの文献 (2004)並びにFiresteinの文献 (2003)を引用する）
【０００４】
ＲＡが自己免疫性疾患であることは広く受け入れられているが、該疾患の「開始段階」を駆動する詳細な機構に関する合意は得られていない。知られているのは、傾向宿主（predisposed host）において、初期誘発物質（initial trigger）（群）が、様々な細胞型（Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞、樹状細胞など）の活性化をもたらす事象のカスケードを媒介する。これに付随し、関節内及び関節の周辺組織内で、様々なサイトカインの増強産生が認められる（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）。該疾患が進行するにつれて、細胞の活性化並びにサイトカイン産生カスケードは自己永続的となる。この初期段階においてすでに、関節構造の破壊はかなり明らかである。該患者の３０パーセントは、診断時に骨の侵食の証拠となるＸ線像を有し、この割合は２年後に、６０パーセントにまで増加する。
【０００５】
ＲＡ患者の関節の組織学的解析は、ＲＡ関連性の分解過程に関与する機構を明らかに証拠付けた。滑膜は、関節夾膜を滑液腔から分離する亜裏打ち（sublining）領域及び裏打ち領域からなる細胞層である。炎症の起きた滑膜は、ＲＡの病態生理の中核をなす。滑膜性関節は、それぞれが軟骨層で被覆され、関節腔で隔てられ、かつ滑膜及び関節夾膜で囲まれる、隣接する２つの骨の末端からなるものとして示される。滑膜は、滑膜の裏打ち（軟骨及び骨の上張り）からなり、これは滑膜細胞の薄い層（１〜３個の細胞）、並びに高度に血管新生化される亜裏打ち結合組織層からなる。滑膜は、軟骨を除くほとんど全ての関節内構造を被覆する。健常者とＲＡ患者との間の滑膜における組織学的差異を図１に示す。
【０００６】
関節炎の他の多くの形態のように、関節リウマチ（ＲＡ）は、局部的活性化又は浸潤単核球に加え、様々な型の単核球の重大な流入によって特徴付けられる滑膜の炎症性反応（「滑膜炎」）によってはじめに特徴付けられる。裏打ち層は肥厚型（該裏打ち層は２０個の細胞より厚くなり得る）となり、滑膜は膨張する。しかしそれに加えて、ＲＡの顕著な特徴は、関節の破壊である。関節腔は、軟骨変性及び隣接する骨の破壊の徴候に伴って狭まるか又は消失し、また「糜爛（erosion）」と称される現象が起こる。滑膜の破壊部分は、「パンヌス（pannus）」と称される。滑膜細胞によって分泌された酵素は、軟骨変性をもたらす。
【０００７】
この解析は、ＲＡ関連性の関節変性の原因となる主要エフェクターがパンヌスであり、ここで、様々なタンパク質分解酵素を産生することによって、滑膜性線維芽細胞は軟骨糜爛及び骨糜爛の最も重要な駆動体であることを示す。進行型ＲＡの患者において、パンヌスは、隣接する軟骨の変性を媒介し、関節腔の狭小化をもたらし、かつ近接する骨及び軟骨を侵襲する可能性がある。コラーゲンＩ型又はコラーゲンＩＩ型は、それぞれ骨組織及び軟骨組織の主要構成要素であり、パンヌスの破壊的特性及び侵襲特性は、コラーゲン分解プロテアーゼ、主にマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の分泌によって媒介される。軟骨の下の骨、及び軟骨に隣接する骨の糜爛もまたＲＡ過程の一部であり、骨及びパンヌスの接触部分で、破骨細胞の存在から主に生じる。破骨細胞は骨組織に接着して閉じた区画を形成し、その中で破骨細胞は、骨組織を分解するプロテアーゼ（カテプシンＫ、ＭＭＰ９）を分泌する。関節内の破骨細胞集団は、活性化されたＳＦ及びＴ細胞によって、ＮＦｋＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）の受容体活性化因子の分泌によって誘導される前駆細胞からの骨芽細胞形成によって、異常に増加する。
【０００８】
様々なコラーゲン型が、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の安定性を規定するのに重要な役割を担う。例えば、コラーゲンＩ型及びコラーゲンＩＩ型は、それぞれ骨及び軟骨の主要な構成要素である。典型的には、コラーゲンタンパク質は、コラーゲン繊維として言及される多量体構造へと組織化される。天然型コラーゲン繊維は、タンパク質分解的切断に非常に抵抗性である。ＥＣＭ分解タンパク質の数種の型（マトリクス−メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びカテプシン）のみが、天然型コラーゲンを分解する能力を有していることが報告されている。カテプシンの中で、主に破骨細胞において活性であるカテプシンＫが最も特徴付けられている。
【０００９】
マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は様々な生理的役割をもち、例えばそれらは、他のプロテアーゼの成熟化、成長因子、及び細胞外マトリクス構成要素の分解に関与する。ＭＭＰの中で、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３及びＭＭＰ１４が、コラーゲン分解特性を有することが知られている。ＭＭＰ１はＭＭＰファミリーの一員であり、骨及び軟骨の重要な構成要素である天然型コラーゲンを分解することができる。滑膜性線維芽細胞（ＳＦ）によるＭＭＰの増強発現と関節炎疾患の進行との間の相関関係はよく確立されており、関節の糜爛過程の前兆である（Cunnaneらの論文, 2001）。それゆえＲＡとの関連で、ＭＭＰ１は、高度に関連するコラーゲン分解タンパク質を表す。インビトロにおいて、ＲＡの病態に関連するサイトカインを用いた培養ＳＦの処理（例えば、ＴＮＦ−α及びＩＬ１β）は、これらの細胞によってＭＭＰ１の発現を増加させる（Andreakosらの論文, 2003）。
【００１０】
また、ＥＣＭ分解タンパク質の活性は、関節の変性にも関与する、ＲＡ以外の様々な疾患の進行の原因となる又は該進行に関連する可能性がある。これらの疾患は、乾癬性関節炎、若年性関節炎、早期関節炎、反応性関節炎、変形性関節炎及び強直性脊椎炎を含むが、これらに限定されない。本発明に従って同定された化合物、並びに本明細書で記載するような、ＭＭＰ発現に関与する標的を使用して治療し得る他の疾患は、骨粗鬆症、腱炎及び歯周病のような筋骨疾患 (Gapskiらの論文、2004)、ガン転移 (Coussensらの論文、2002)、呼吸器系疾患 (COPD、喘息) (Suzukiらの論文、2004)、肺繊維症、腎臓繊維症 (Schanstraらの論文、2002)、慢性Ｃ型肝炎関連性肝臓繊維症 (Reiffらの論文、2005)、アテローム性動脈硬化症及び心不全のような心血管系疾患 (Creemersらの論文、2001)、並びに、神経の炎症及び多発性硬化症のような神経系疾患(Rosenberg、2002)である。そのような疾患を患っている患者は、ＥＣＭを酵素分解から保護する治療によって利益を得ることができる。
【００１１】
（報告されている展開）
NSAIDS（非ステロイド性抗炎症薬）は、ＲＡに伴う痛みを低減させ、患者の生活の質を向上させるために使用される。しかしながらこれらの薬剤が、ＲＡ関連性の関節破壊を停止させることはない。
コルチコステロイドは、Ｘ線検査で検出されるようなＲＡの進行を減速させることが見出され、一部の患者（３０〜６０％）を治療するために低用量で使用される。しかしながら、長期のコルチコステロイド使用には深刻な副作用（皮膚の薄化、骨粗鬆症、白内障、高血圧、高脂血症）が伴う。
【００１２】
合成DMARD（疾患修飾性抗リウマチ薬）（例えば、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン）は主に、ＲＡの免疫炎症性構成要素に対処する。主な不都合点は、これらの薬剤が、限定的な有効性のみを有することである（DMARDによって関節破壊が遅延されるのみであり、疾患の長期継続的進行は阻害されない）。有効性の欠如は、メトトレキサートを用いた治療の２４時間後において、平均で３０％の患者のみしか、ACR50スコアを達成しないという事実によって示される。米国リウマチ学会によると、これは、患者の３０％のみしか、それらの症状の５０％の回復を達成しないということを意味する（O'Dellらの論文, 1996）。さらに、DMARDの作用の詳細な機構は多くの場合明らかでない。
【００１３】
生物学的DMARD（インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムバブ、リツキシマブ、CTLA4-Ig）は治療用タンパク質であり、ＲＡの病態生理学において重要な役割を有するサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）又は細胞（例えば、Ｔ細胞又はＢ細胞）を不活化させる（Kremerらの文献, 2003；Edwardsらの文献, 2004）。ＴＮＦ−α遮断薬（インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムバブ）とメトトレキサートとの併用療法は、現在利用可能な最も効果的なＲＡ治療であるが、この治療でさえ、１２ヶ月の治療後において、患者の５０〜６０％においてしか病徴の改善（ACR50）が達成されていないこと（St Clairらの論文, 2004）は特筆に値する。抗ＴＮＦ−α薬に警告を発するいくつかの有害事象が存在し、この型の薬剤に関連する副作用を浮き彫りにしている。感染（結核）血液学的事象及び脱髄性障害の危険性の増大は、ＴＮＦ−α遮断薬に記載されている（Gomez-Reinoらの文献, 2003も参照されたい）。深刻な副作用に加えて、ＴＮＦ−α遮断薬はまた、不快な方法での投与（注射部位反応を伴う頻繁な注射）並びに高い生産費用という生物学的治療部門の一般的な不便を共有する。後期開発段階におけるより新しい作用物質は、Ｔ細胞共刺激分子及びＢ細胞を標的とする。これらの作用物質の有効性は、ＴＮＦ−α遮断薬の有効性に類似していることが予想される。様々な標的療法が、類似してはいるが限定的な有効性を有するという事実は、ＲＡの病原因子の多重度が存在することを示唆する。これはまた、ＲＡに関連する病原性事象の発明者らの理解の欠如の指標となる。
【００１４】
ＲＡに対する現在の治療は、限定的有効性（患者の３０％に適切な治療がない）のために満足のいくものではない。これは、緩解を達成させるためのさらなる戦略を必要としている。緩解は、余病が、進行的な関節損傷、すなわち進行的な能力障害の危険性に耐えるまで必要とされる。ＲＡ治療に現在使用される薬剤の主要標的を表す、ＲＡ疾患の免疫炎症性構成要素の阻害は、該疾患の主要な特徴である関節変性の阻害をもたらしはしない。
【００１５】
ＲＡ患者の関節の組織学的解析は、関節変性の主因を示す高悪性度で侵襲性組織としてのパンヌスを明らかに同定する。パンヌス内において、滑膜性線維芽細胞は、ＲＡ発病の根底に横たわる異常に誘発された免疫系の開始と最終的な関節糜爛との間の関連性を表す。現在、長期にわたってパンヌスの糜爛活性を効率的に根絶するＲＡ治療がないので、パンヌスの生成及び／又は該活性を阻害する新規薬剤並びに／若しくは薬剤標的の発見は、新規ＲＡ治療の開発の重要な画期的出来事を表現するであろう。
本発明は、特定のタンパク質が、ＭＭＰ１などの細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解プロテアーゼの発現をもたらす経路に機能するという発見に基づいており、これらのタンパク質の活性阻害剤は、そのようなプロテアーゼの異常に高い発現が関与する疾患の治療に有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、関節変性疾患及び炎症性疾患の治療に有用な分子標的及び化合物、並びにそれらの同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解を阻害する化合物を同定する方法に関するものであり、化合物を、配列番号：１７〜３２（本明細書では以降「ターゲット（TARGET）」）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド及びそれらのフラグメントと、前記ポリペプチドが前記化合物に結合可能な条件下で接触させること、並びに細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解に関連する化合物−ポリペプチド特性を測定すること、を含む。
【００１８】
本方法の態様は、ターゲットのポリペプチド又はそれらのフラグメントを使用する化合物のインビトロアッセイを含み、そのようなフラグメントは配列番号：３３〜１２７に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ細胞アッセイは、ターゲットの阻害に続いて、例えば、ターゲット発現レベル、ターゲット酵素活性及び／又はマトリクスメタロプロテイナーゼ−１レベルを含む有効な指標を観測することを含む。
【００１９】
本発明はまた、（１）アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む発現阻害剤であって、前記ポリヌクレオチドが配列番号：１７〜１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然型ポリヌクレオチド配列に相補的な核酸配列、又は該天然型ポリヌクレオチド配列から設計される核酸配列を含む、前記発現阻害剤、並びに（２）前記発現阻害剤を含み、関節リウマチなどの慢性関節変性疾患の治療又は予防に有用な医薬組成物、に関するものである。
【００２０】
本発明の別の実施態様は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解が関与する状態に苦しむ又は感受性である対象に、効果的にターゲットの発現を阻害する量の発現阻害剤、若しくは効果的にターゲット活性を阻害する量の活性阻害剤を含む医薬組成物を投与することによる、前記状態の治療又は予防方法である。
本発明のさらなる態様は、対象におけるターゲット発現のレベルの指標の測定を含む、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解によって特徴付けられる病態に関連する診断方法である。
本発明の別の態様は、炎症、特に異常なマトリクスメタロプロテアーゼ活性の疾患的特徴が関与する疾患の治療に有用な、治療方法、医薬組成物並びにそのような化合物の製造における、本化合物の使用に関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（詳細な説明）
下記の用語は、そのすぐ後に記載する意味を有することを意図し、本明細書並びに本発明の意図する範囲を理解することに有用である。
用語「作用物質」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド並びに小分子を含む、任意の分子を意味する。
用語「アゴニスト」は、最も広い意味で、リガンド結合受容体を刺激するリガンドをさす。
【００２２】
用語「アッセイ」は、化合物の特定の特性を測定するために使用する任意の工程を意味する。「スクリーニングアッセイ」は、化合物のコレクションから、それらの活性に基づいて化合物特徴付ける又は選択するために使用する工程を意味する。
用語「結合親和性」は、非共有結合的関係で、２以上の化合物が互いにどの程度強く相互作用するかを記載する特性である。結合親和性は、定性的（「強い」、「弱い」、「高い」又は「低い」など）又は定量的（ＫＤの測定など）によって、特徴付けることができる。
【００２３】
用語「担体」は、医薬組成物の製剤に使用する非毒性物質を意味し、医薬組成物に媒体、容積及び／又は使用可能な形態を提供する。担体は、賦形剤、安定剤又は水性ｐＨ緩衝液などの、１以上のそのような物質を含んでよい。生理的に許容し得る担体の例は、リン酸、クエン酸及び他の有機酸を含む水性緩衝液成分又は固体緩衝液成分；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／若しくはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びPLURONICS（商標）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００２４】
用語「複合体」は、２以上の化合物が互いに結合する場合に作られる実体を意味する。
用語「化合物」は、本明細書において、本発明のアッセイとの関連で記載する「テスト化合物」又は「薬剤候補化合物」の文脈で使用する。そのようなものとして、これらの化合物は、合成又は天然資源に由来する有機化合物若しくは無機化合物を含む。該化合物は、比較的低い分子量で特徴付けられるポリヌクレオチド、脂質又はホルモン類似体などの無機化合物若しくは有機化合物を含む。他の生体高分子有機テスト化合物は、約２個〜約４０個のアミノ酸を含むペプチド、並びに抗体又は抗体複合体などの約４０個〜約５００個のアミノ酸を含むより大きなポリペプチド、を含む。
【００２５】
用語「状態」又は「疾患」は、症状の露呈（すなわち、疾病）又は異常な臨床的指標（例えば、生化学的指標）の顕在化を意味する。あるいは、用語「疾患」は、そのような症状又は異常な臨床的指標を進行させる遺伝的リスク若しくは環境的リスク又は傾向をさす。
用語「接触」又は「接触させること」は、インビトロ系又はインビボ系のいずれかにおいて、少なくとも２つの部分が結集することを意味する。
【００２６】
用語「ポリペプチドの誘導体」は、それらのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素に関するものであり、該ポリペプチドの連続する一続きのアミノ酸を含み、かつ例えば、該ポリペプチドの天然型形態のアミノ酸配列に比較してアミノ酸変異を有するポリペプチドのようなタンパク質の生物活性を保持する。誘導体は、該ポリペプチドの天然型形態のアミノ酸配列に比較して、付加型天然型アミノ酸残基、変更アミノ酸残基、グリコシル化アミノ酸残基、アシル化アミノ酸残基又は非天然型アミノ酸残基をさらに含んでもよい。それはまた、例えば前記アミノ酸配列に共有結合的又は非共有結合的に結合するレポーター分子若しくは他のリガンドのようなポリペプチドの天然型形態のアミノ酸配列に比較して、１以上の非アミノ酸置換基を含んでもよい。
【００２７】
用語「ポリヌクレオチドの誘導体」は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及びオリゴヌクレオチドに関するものであり、該ポリヌクレオチドの天然型形態の核酸配列に比較した場合に核酸変異を有し得るポリヌクレオチドのような一続きのポリヌクレオチド又は核酸残基を含む。誘導体は、ＰＮＡ、ポリシロキサン、及び２'−Ｏ−(２−メトキシ) エチル-ホスホロチオエートなどの修飾骨格、非天然型核酸残基、又はメチル-、チオ-、硫酸、ベンゾイル-、フェニル-、アミノ-、プロピル-、クロロ-、及びメタノカルバヌクレオシドなどの１以上の核酸置換基、若しくはその検出を促進させるレポーター分子を有する核酸をさらに含んでもよい。
【００２８】
用語「ＥＣＭ分解タンパク質」及び「ＥＣＭ分解活性」はそれぞれ、骨及び軟骨に見出される細胞外マトリクスを分解可能なタンパク質及び活性をさす。
用語「有効量」又は「治療的有効量」は、医師又は他の臨床医に診断される対象の生物学的反応又は医学的反応を誘起させる化合物若しくは作用物質の量を意味する。
用語「内因性」は、哺乳動物が自然的に産生する物質を意味するものとする。用語「プロテアーゼ」、「キナーゼ」又はＧタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）に関連する内因性は、哺乳動物（例えば、限定しないが、ヒト）によって自然に産生されるものを意味するものとする。対照的に、この文脈における用語非内因性は、哺乳動物（例えば、限定しないが、ヒト）によって自然に産生されないものを意味するものとする。両方の用語は、「インビボ」及び「インビトロ」の両方を記載するのに使用できる。例えば、限定ではないが、スクリーニングアプローチにおいて、内因性ターゲット又は非内因性ターゲットを、インビトロのスクリーニング系に引用してもよい。限定ではないがさらなる例として、哺乳動物のゲノムを操作して非内因性ターゲットを含ませた場合、インビボ系を用いる候補化合物のスクリーニングが利用可能である。
【００２９】
用語「発現性核酸」は、タンパク質性分子、ＲＮＡ分子、又はＤＮＡ分子をコードする核酸を意味する。
用語「発現」は、内因性発現、及び形質導入による過剰発現の両方を含む。
用語「発現阻害剤」は、細胞内で本来発現する特定のポリペプチド又はタンパク質の転写、翻訳及び／又は発現に選択的に干渉するように設計したポリヌクレオチドを意味する。より詳細には、「発現阻害剤」は、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードするポリリボヌクレオチド配列内の、少なくとも約１７個の連続するヌクレオチドに同一又は相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子若しくはＲＮＡ分子を含む。典型的な発現阻害剤分子は、リボザイム、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子、自己相補的一本鎖ｓｉＲＮＡ分子、遺伝的アンチセンス構築物、及び修飾された安定化骨格を有する合成ＲＮＡアンチセンス分子を含む。
【００３０】
用語「発現性核酸」は、タンパク質性分子、ＲＮＡ分子、又はＤＮＡ分子をコードする核酸を意味する。
用語「ポリヌクレオチドのフラグメント」は、完全な配列の活性に、同一である必要性はないが実質的に類似性を示す一続きの連続した核酸残基を含むオリゴヌクレオチドをさす。
用語「ポリペプチドのフラグメント」は、完全な配列の機能的活性に、同一である必要性はないが実質的に類似性を示す一続きの連続したアミノ酸残基を含むペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素をさす。
【００３１】
用語「ハイブリダイゼーション」は、塩基対を介して、一方の核酸鎖が相補鎖と結合することによる、任意の工程を意味する。用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補塩基間の水素結合形成の効力により、２つの核酸配列間で形成される複合体をさす。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成してよく（例えば、Ｃ０ｔ解析又はＲ０ｔ解析）、又は溶液中に存在する核酸配列と、固相支持体（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン又はスライドガラス、若しくは細胞又はそれらの核酸が固定されている任意の他の適切な基質）上に固定化された別の核酸配列との間で形成してもよい。用語「厳しい条件」は、ポリヌクレオチドと、特許請求の範囲に記載のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを可能にする条件をさす。厳しい条件は、塩濃度、例えばホルムアミドのような有機溶媒の濃度、温度、並びに当業者に周知の他の条件によって規定することができる。特に、塩濃度の低下、ホルムアミド濃度の増大、又はハイブリダイゼーション温度の上昇は、厳しさを増大させ得る。
【００３２】
用語「反応」との関連での用語「阻害する」又は「阻害すること」は、反応が、化合物の不在下とは対照的に、化合物の存在下で低減すること又は阻害されることを意味する。
用語「阻害」は、タンパク質又はポリペプチドの発現の不在若しくは最少化をもたらす過程の減少、該過程の下方制御、又は該過程に対する刺激の除去をさす。
用語「誘導」は、タンパク質又はポリペプチドの発現をもたらす過程の誘発、上方制御又は刺激をさす。
用語「リガンド」は、内因性の天然型受容体に特異的な内因性の天然型分子を意味する。
【００３３】
用語「医薬として許容し得る塩」は、本発明化合物の非毒性無機酸付加塩及び有機酸付加塩並びに塩基付加塩をさす。
これらの塩は、本発明に有用な化合物の最終単離及び精製の間、インサイチュウで調製することができる。
用語「ポリペプチド」は、タンパク質、タンパク質性分子、タンパク質画分、ペプチド、オリゴペプチド、酵素（キナーゼ、プロテアーゼ、ＧＰＣＲ酵素など）に関するものである。
【００３４】
用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖形態又は二本鎖形態のポリ核酸、及びセンス方向又はアンチセンス方向のポリ核酸、厳しい条件下で特定のポリ核酸にハイブリダイズする相補的ポリ核酸、並びにその塩基対の少なくとも約６０％で相同なポリヌクレオチド、及びより好ましくはその塩基対の７０％、最も好ましくは９０％、並びに最も特別な実施態様においてはその塩基対の１００パーセントが共通なポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、ポリリボ核酸、ポリデオキシリボ核酸、及びそれらの合成類似体を含む。ポリヌクレオチドはまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリシロキサン、及び２'−Ｏ−（２−メトキシ）エチルホスホロチオエートなどの修飾骨格を有する核酸を含む。ポリヌクレオチドを、その長さが、約１０塩基〜約５０００塩基、好ましくは約１００塩基〜約４０００塩基、より好ましくは約２５０塩基〜約２５００塩基の範囲で変化する配列によって記載する。ポリヌクレオチドの一実施態様は、約１０塩基〜約３０塩基の長さを含む。ポリヌクレオチドの特別な実施態様は、約１７個〜約２２個のヌクレオチドからなるポリリボヌクレオチドであり、より一般的には低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として記載する。別の特別な実施態様は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリシロキサン、及び２'−Ｏ−（２−メトキシ）エチルホスホロチオエートなどの修飾骨格を有する核酸、又は非天然型核酸残基を含む核酸、若しくはメチル-、チオ-、硫酸、ベンゾイル-、フェニル-、アミノ-、プロピル-、クロロ-、及びメタノカルバヌクレオシドなどの１以上の核酸置換基を含む核酸、又はその検出を促進させるレポーター分子含む核酸である。
【００３５】
用語「ポリペプチド」は、タンパク質（ターゲットなど）、タンパク質性分子、タンパク質ペプチド及びオリゴペプチド画分に関するものである。
用語「溶媒和物」は、１以上の溶媒分子と本発明に有用な化合物の物理的会合を意味する。この物理的会合は水素結合を含む。場合によっては、溶媒和物は、例えば１以上の溶媒分子が、結晶性固体の結晶格子に組み込まれる場合に単離可能である。「溶媒和物」は、液相溶媒和物と単離可能な溶媒和物の両方を含む。代表的溶媒和物は、水和物、エタノラート及びメタノラートを含む。
【００３６】
用語「対象」は、ヒト及び他の哺乳動物を含む。
用語「ターゲット（TARGET又はTARGETS）」は、本明細書に記載するアッセイに従って同定され、ＭＭＰ１の発現レベルの調節に関与するタンパク質（群）を意味する。
「治療的有効量」は、医師又は他の臨床医に診断される対象の生物学的又は医学的反応を誘起させる薬剤若しくは医薬品の量を意味する。特に、細胞外マトリクス分解によって特徴付けられる病態の治療に関して、用語「効果的なマトリクスメタロプロテアーゼ阻害量」は、細胞外マトリクス分解が有意に減少するような対象の疾患罹患組織におけるＭＭＰ−１産生の生物学的に有意な減少をもたらす本発明の化合物の有効量を意味することを意図する。マトリクスメタロプロテアーゼ阻害特性を有する化合物、又は「マトリクスメタロプロテアーゼ阻害化合物」は、有効量で細胞に与える場合、そのような細胞におけるＭＭＰ−１の産生の生物学的に有意な減少をもたらすことができる化合物を意味する。
【００３７】
用語「治療（treating）」は、進行の阻止又は該病態を変化させる意図をもって実施し、それによって障害、疾患又はそのような障害又は状態の１以上の症状を含む状態を緩和させる介入を意味する。したがって、「治療（treating）」は、治療的処理、及び予防的処置（prophylactic measure）又は予防的処置（preventative measure）の両方をさす。治療が必要な対象は、該障害が予防すべき対象に加えて、すでに障害となった対象を含む。本明細書で使用するように、関連用語「治療（treatment）」は、用語「治療（treating）」を先に定義したように、障害、症状、疾患又は病理状態を治療する行動をさす。
【００３８】
（細胞外マトリクス分解に関連するターゲットに基づく出願人の発明）
ＳＦによるＭＭＰ１発現は、インビボにおいて、軟骨変性に関与する糜爛性表現型に対するＳＦの活性化に関連するのと同様に、ＥＣＭ分解に関与する。これは、関節変性の減少をもたらすＭＭＰ群の阻害剤であるＴＩＭＰ１を過剰発現するアデノウイルスにより、関節炎表現型が自然発症的に進行するＴＮＦα遺伝子組換えマウスへの投与によって示されている（Shettらの論文, Arthritis Rheum. (2001) 44:2888-98）。それゆえ、ＳＦによるＭＭＰ１発現の阻害は、ＲＡの治療に対して有益な治療的アプローチを提示する。したがって、活性化ＳＦにおける候補タンパク質の発現の減少が、ＭＭＰ１の減少を付随的にもたらすのであれば、それからそのようなタンパク質はＭＭＰ１発現の減少に関与し、かつＲＡ治療の治療戦略の開発の関連標的である。本発明者は、本明細書で「Ａｄ−ｓｉＲＮＡ」として言及するｓｈＲＮＡライブラリーの発現を媒介する組換えアデノウイルスをスクリーニングすることによって、そのような標的タンパク質を同定している。本明細書で使用するコレクションはさらに、「アデノウイルスｓｉＲＮＡライブラリー」又は「サイレンスセレクト（SilenceSelect）」コレクションとして言及する。これらのライブラリーは組換えアデノウイルスを含み、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づく機構（WO03/020931）によって、標的遺伝子の発現レベルを減少させるｓｈＲＮＡの細胞内発現を媒介するノックダウン（ＫＤ）ウイルス又はＡｄ−ｓｉＲＮＡとしてさらに言及する。スクリーニング研究を、以下の実施例１に記載する。
【００３９】
先に記載したように、本発明は、以下に記載する実施例での様々な選別の結果として同定されたターゲットポリペプチドが、ＭＭＰ１の上方制御及び／又は誘導のみならず、細胞外マトリクス分解の上方制御及び／又は誘導にすらも機能する因子であるという、本発明者の発見に基づく。ＥＣＭ分解タンパク質の活性は、関節の変性を伴う疾患を含む、細胞外マトリクスの進展的変性に関連する様々な疾患の進行の原因であり、かつ関連すると考えられる。
【００４０】
一態様において、本発明は、細胞外マトリクス分解を阻害する薬剤候補化合物のアッセイ方法に関連し、前記ポリペプチドが前記化合物へと結合することを可能にさせる条件下で、前記化合物を、配列番号：１７〜１２７のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれらのフラグメントと接触させること、並びに前記ポリペプチドと化合物との複合体形成を検出する、ことを含む。複合体形成を測定する好ましい一手段は、前記ポリペプチドへの前記化合物の結合親和性を測定することである。
【００４１】
より詳細には、本発明は、細胞外マトリクス分解を阻害する作用物質の同定方法に関するものであり、該方法は：
（ａ）哺乳動物細胞集団を、ターゲットポリペプチド又はそれらのフラグメントに対する結合親和性を阻害する１以上の化合物に接触させること、及び、
（ｂ）細胞外マトリクス分解に関連する化合物−ポリペプチド特性を測定すること、
をさらに含む。
【００４２】
前記化合物−ポリペプチド特性は上述のように、ターゲットの発現及び／又は活性に関連し、当業者によって選択される測定可能な事象であることに言及する。該測定可能な特性は、例えば、配列番号：３３〜１２７などのポリペプチドターゲットのペプチドドメインに対する結合親和性、又は細胞外マトリクス分解の多くの生化学的マーカーの任意の１つのレベルであってよい。細胞外マトリクス分解は、例えば、ＭＭＰポリペプチド及び／又はカテプシンポリペプチドの発現などの前記過程の間に誘導される酵素のレベルを測定することによって測定可能である。
本発明の好ましい実施態様において、ターゲットポリペプチドは、表１に一覧化したような、配列番号：１７〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
【表１】
2008516593.tif 000003
2008516593.tif 000004
【００４４】
本発明の別の特別な実施態様は、配列番号：１９〜２２、２５、２６、２９、３０及び３２として同定したキナーゼターゲットを含む。本発明の別の特別な実施態様は、配列番号：１７、１８、２４及び２７として同定したイオンチャネルターゲットを含む。さらに好ましい実施態様は、配列番号：２３として同定した核ホルモン受容体（ＮＨＲ）ターゲットである。
【００４５】
当業者の選択によって、本アッセイ方法を、各々が前記薬剤候補化合物が実際に前記ポリペプチド上で作用し、それによって細胞外マトリクス分解を阻害するかどうかを決定するために設計する、一連の測定として機能させるために設計してよい。例えば、前記ポリペプチド又はそれらのフラグメントへの化合物の結合親和性を測定するために設計したアッセイは、前記テスト化合物を対象に投与した場合に細胞外マトリクス分解を阻害するのに有用であるかを解明するのに必要ではあるが十分ではない。
【００４６】
そのような結合に関する情報は、異なる特性を測定し、さらに例えばＭＭＰ−１発現などの生化学的経路を低減させ得るアッセイに使用する、一連のテスト化合物を同定するのに有用であり得る。そのような第二アッセイを設計し、前記テスト化合物が前記ポリペプチドに対する結合親和性を有し、実際には細胞外マトリクス分解を阻害することを確認してもよい。誤った陽性の読み取りを防ぐために、常に適切なコントロールを置くべきである。
【００４７】
これらの測定を行う順番は、本発明の実施に決定的であるとは考えられず、任意の順番で実施可能である。例えば、前記ポリペプチドに対する前記化合物の結合親和性に関する情報が知られていない場合、一連の化合物のスクリーニングアッセイをはじめに実施してよい。あるいは、ポリペプチドドメインに対して結合親和性を有するものとして同定した一連の化合物、又は前記ポリペプチドの阻害剤であるものとして同定した化合物の群を選別してもよい。しかしながら、本アッセイが薬剤候補化合物の最終的使用に意味を有するためには、細胞外マトリクス分解活性の測定が必要である。それでもなお、本発明の前記ポリペプチドへの結合親和性の制御及び測定を含む検証的研究は、任意の治療的適用又は診断的適用に有用な化合物を同定することに有用である。
本アッセイ方法を、１以上のターゲットタンパク質又はそれらのフラグメントを使用して、インビトロで実施してよい。選択したターゲットの典型的タンパク質ドメインフラグメントのアミノ酸配列は、下記表中に一覧化した配列番号：３３〜１２７である。
【００４８】
【表１Ａ】
2008516593.tif 000005
2008516593.tif 000006
2008516593.tif 000007
【００４９】
化合物と前記ポリペプチドターゲットとの結合親和性は、表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Biacore）、標識化合物を用いる飽和結合解析（例えば、スキャッチャード及びリンドモ（Lindmo）解析）、微分紫外分光光度計、蛍光偏光アッセイ、蛍光イメージングプレートリーダー (FLIPR)システム、蛍光共鳴エネルギー転移及び生物発光共鳴エネルギー転移の使用などの、当業者に既知の方法で測定可能である。また、化合物の結合親和性は、解離定数（Ｋｄ）、又はＩＣ５０若しくはＥＣ５０で表現することができる。ＩＣ５０は、前記ポリペプチドへの別のリガンドの結合の５０％阻害に必要な化合物濃度を示す。ＥＣ５０は、ターゲット機能を測定する任意のアッセイにおける、最大効率の５０％を得るのに必要な濃度を示す。解離定数Ｋｄは、リガンドが前記ポリペプチドにどの程度よく結合するかの尺度であり、該ポリペプチド上の結合部位のちょうど半分が飽和するのに必要なリガンド濃度に等しい。高親和性結合を有する化合物は、例えば１００ｎＭ〜１ｐＭ程度の低いＫｄ値、低いＩＣ５０値及び低いＥＣ５０値を有し；中程度親和性結合から低親和性結合は、例えばマイクロモラー程度の高いＫｄ値、高いＩＣ５０値及び高いＥＣ５０値に関連する。
【００５０】
また、本アッセイ方法を細胞性アッセイで実施してよい。ターゲットを発現している宿主細胞は内因性発現を有する細胞、又は例えば形質導入によってターゲットを過剰発現している細胞であり得る。前記ポリペプチドの内因性発現が、容易に測定可能な基線を決定するのに十分でない場合、ターゲットを過剰発現する宿主細胞を使用してもよい。過剰発現は、ターゲット基質の最終生成物のレベルが、内因性発現による活性レベルよりも高いという利点を有する。したがって、現在利用可能な技術を使用してそのようなレベルを測定することは、より容易である。
【００５１】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）分解を減少させる化合物の同定方法の一実施態様は、ターゲットポリペプチド又はそれらの機能的フラグメント若しくは誘導体を発現している哺乳動物細胞集団を培養すること；前記細胞集団におけるＥＣＭ分解の第一レベルを測定すること；任意の時間に該細胞集団を活性化させること；化合物又は化合物群の混合物に前記細胞集団を曝露すること；前記化合物又は前記化合物群の混合物への前記細胞集団の曝露中、若しくは曝露後に、前記細胞集団におけるＥＣＭ分解の第二レベルを測定すること；並びに、ＥＣＭ分解を減少させる化合物（群）を同定すること；を含む。先に記載したように、ＥＣＭ分解は、ターゲットポリペプチド及び／又は既知のＥＣＭ分解タンパク質の発現並びに／若しくは活性を測定することで測定してよい。好ましい実施態様において、前記ＥＣＭ分解タンパク質はコラーゲンを分解することができ、より好ましくはコラーゲンＩ型及び／又はコラーゲンＩＩ型を分解することができる。本発明の別の好ましい実施態様において、前記ＥＣＭ分解タンパク質はマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）であり、より好ましくは、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３及びＭＭＰ１４からなる群から選択される。この文脈において、最も好ましいＥＣＭ分解タンパク質はマトリクスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ１）である。さらに別の好ましい実施態様において、前記ＥＣＭ分解タンパク質はカテプシンＫである。
【００５２】
ＥＣＭ分解タンパク質の発現は、特異抗体を使用するウエスタンブロッティング、又は特定のＥＣＭ分解タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するＥＬＩＳＡなどの、当業者に既知の方法で測定できる。
ＥＣＭ分解タンパク質の活性は、蛍光性の小ペプチド基質を使用することによって測定することができる。しかしながら、これらの基質の特異性はしばしば限定される。一般的に、これらの基質の使用は、他のプロテアーゼの干渉を避けた生化学的アッセイにおける精製プロテアーゼの試験に限定される。本発明者は、ハイスループットモードで、培養細胞上清などの複雑な培地中のコラーゲン分解酵素の活性の検出を可能にさせるプロトコルを開発した。このプロトコルは、基質として蛍光ラベルで標識した天然型コラーゲンを使用する。
【００５３】
本発明者は、「ノックダウン」ライブラリーを使用することによって、ＥＣＭ分解に関与するターゲット遺伝子群を同定した。この型のライブラリーは、細胞内で、該対応遺伝子産物の発現及び活性に加えて、特定遺伝子の発現を阻害又は抑制するｓｉＲＮＡ分子を、組換えアデノウイルスによって細胞へと形質導入することによる選別である。ウイルスベクター内の各ｓｉＲＮＡは、特定の天然の遺伝子に対応する。ＥＣＭ分解を抑制するｓｉＲＮＡを同定することによって、特定の遺伝子発現とＥＣＭ分解との間の直接的な関連性を示すことができる。ノックダウンライブラリー（本明細書において、それらのタンパク質発現産物は「ターゲット」ポリペプチドとして言及される）を使用して同定したターゲット遺伝子群を、その次に本発明の化合物同定方法に使用して、ＥＣＭ分解を阻止するために使用することができる。実際に、表２（配列番号：１２８〜１４１及び２３１〜２４４）に一覧化した配列を含むｓｈＲＮＡは、これらターゲット遺伝子の発現及び／又は活性を阻害し、細胞のＥＣＭ分解活性を減少させ、これらはＥＣＭ分解におけるターゲットの役割を裏付ける。
【００５４】
【表２】
2008516593.tif 000008
【００５５】
化合物の存在下又は不在下で実施する、キナーゼによる基質のリン酸化を測定することによる、該キナーゼ活性を測定する特定の方法は、当業者に周知である。
イオンチャネルは膜タンパク質複合体であり、それらの機能は、生体膜を通るイオンの拡散を促進させることである。膜又は脂質二重層は、疎水性で、親水性分子及び荷電分子への低誘電体バリアを構築する。イオンチャネルは、前記膜の疎水的内部を通る、高伝導性で親水性の経路を提供する。イオンチャネルの活性は、古典的なパッチクランプ法を使用して測定できる。ハイスループットの蛍光に基づくアッセイ又はハイスループットのトレーサーに基づくアッセイもまた、イオンチャネルの活性を測定するのに広く使用できる。これらの蛍光に基づくアッセイは、イオンチャネルを開けるか又は閉じる能力に基づく化合物を選別し、それによって膜を通る特定の蛍光色素濃度を変化させる。トレーサーに基づくアッセイの場合、細胞内外のトレーサー濃度の変化は、放射能測定又はガス吸収分析法で測定する。
【００５６】
核受容体の活性化は、リガンドが結合することによって誘導される受容体の立体構造変化が関与すると考えられる。プロテアーゼ保護アッセイの結果は、核ホルモンのアゴニスト及びアンタゴニストが、受容体タンパク質を異なる立体構造に適合化させることを裏付けた（Keidelらの論文 Mol Cell. Biol. 14:287 (1994)；Allanらの論文. J. Biol.Chem. 267:19513 (1992)）。したがって、プロテアーゼ保護アッセイを使用して、ＮＨＲの活性を測定することができる。活性化補助因子又はリプレッサーの動員は、ＮＨＲ活性の評価用に開発された別のアッセイに基づく。
【００５７】
化合物の存在下又は不在下で実施する、デヒドロゲナーゼによる基質の酸化を測定する、デヒドロゲナーゼ活性特異的な測定方法は、当業者に周知である。
プロテアーゼであるポリペプチドによる基質の切断を測定することによって、前記化合物による阻害を測定する特定の方法は、当業者に周知である。古典的には、基質は、標的プロテアーゼによって切断され得る基質であるペプチド配列を介して消光剤に連結する蛍光基を使用する。該リンカーの切断は、蛍光基と消光剤を分離させ、蛍光の増幅を生じさせる。
【００５８】
表４は、以下に記載するＭＭＰ１アッセイに対して、出願人のノックダウンライブラリーを使用して同定した多数の他のポリペプチド型を一覧表にしている。そのようなポリペプチドは、エフェクタータンパク質を活性化させることができるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であり、細胞内の二次メッセンジャーレベルの変化をもたらす。ＧＰＣＲの活性は、そのような二次メッセンジャーの活性レベルを測定することによって測定可能である。細胞内における２つの重要かつ有用な二次メッセンジャーは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）及びＣａ２＋である。活性レベルは、ＥＬＩＳＡ又は放射性技術、若しくはＣａ２＋と接触したときに蛍光あるいは発光シグナルを生じさせる基質を使用することによって直接的に、又はレポーター遺伝子解析によって間接的に、当業者に既知の方法で測定できる。典型的には、１以上の二次メッセンジャーの活性レベルを、二次メッセンジャーに応答性のプロモーターによって制御されるレポーター遺伝子を用いて測定してよい。すでに知られたそのような目的で使用されるプロモーターは、細胞内のサイクリックＡＭＰレベルに応答性であるサイクリックＡＭＰ応答性プロモーター、及び細胞内の細胞質性Ｃａ２＋レベルに感受性であるＮＦ−ＡＴ応答性プロモーターである。レポーター遺伝子は一般的に、容易に検出可能な遺伝子産物を有する。レポーター遺伝子は、細胞へ安定的に感染又は一過的に形質移入させることができる。有用なレポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、強化型緑色蛍光タンパク質、不安定化色色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼである。
【００５９】
前記ポリペプチドを発現している細胞は、先に記載したように、天然に該ポリペプチドを発現している細胞であってよく、又は該細胞に形質移入をして該ポリペプチドを発現させてもよいことは理解されるべきである。
一実施態様において、本発明の方法は、前記細胞集団を前記ポリペプチドのアゴニストと接触させる工程をさらに含むことが好ましい。これは、特定の選択した細胞集団におけるポリペプチドの発現が、その活性の適切な検出に低すぎる場合の方法として有用である。アゴニストを使用することによって、前記ポリペプチドを誘発させてよく、前記化合物が該ポリペプチドを阻害する場合に、適切な読み出しが可能である。同様な考え方を、ＥＣＭ分解の測定に適用する。好ましい実施態様において、本方法に使用する細胞は哺乳動物の滑膜性線維芽細胞であり、ＥＣＭ分解活性を誘導するために使用してよい誘発物質は、関節炎の分野で関連するサイトカイン：例えば、ＴＮＦアルファ、ＩＬベータ、ＩＬ６、ＯＳＭ、ＩＬ１７、ＩＬ１５、ＩＬ１８及びＭＩＦ１アルファである。別の好ましい実施態様において、前記誘発物質は、単球、マクロファージ、Ｔ細胞及びＢ細胞などの、関節炎の分野に関連するサイトカイン産生細胞を接触させることによって産生される因子の混合物である。サイトカイン産生細胞は、因子群の複雑かつ不偏的混合物を産生させることによる接触に応答する。また、使用するサイトカイン産生細胞がパンヌス内に見出される場合、この誘発に適用したサイトカインは、関節リウマチ患者の滑液中に見出され、最終的に産生された因子の混合物は、関節炎患者の関節に存在する因子群を含むであろう。
【００６０】
本発明はさらに、細胞外マトリクス分解を阻害する化合物を同定する方法に関するものであり：
（ａ）化合物を、配列番号：１７〜１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること；
（ｂ）前記ポリペプチドに対する前記化合物の結合親和性を測定すること；
（ｃ）前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞集団を、少なくとも１０マイクロモラーの結合親和性を示す化合物と接触させること；及び、
（ｄ）細胞外マトリクス分解を阻害する化合物を同定すること；
を含む。
【００６１】
前記細胞集団を、例えば培地中での直接的インキュベーション、又は該細胞内への核酸の移入による異なる手段を介して、前記化合物又は化合物の混合物に曝露させてもよい。そのような移入を、例えば裸の単離ＤＮＡ、又はＲＮＡでの直接的形質移入、若しくは組換えベクターなどの送達系手段による様々な手段によって達成してよい。また、リポソーム又は他の脂質に基づくベクターなどの他の送達手段を使用してもよい。好ましくは、前記核酸化合物は、組換えウイルスなどの（組換え）ベクターの手段で送達する。
【００６２】
ハイスループット用に、抗体フラグメントライブラリー、ペプチドファージライブラリー、ペプチドライブラリー（例えば、ＬＯＰＡＰ（商標）、Sigma Aldrich社）、脂質ライブラリー（BioMol社）、合成化合物ライブラリー（例えば、ＬＯＰＡＣ（商標）、Sigma Aldrich社）又は天然化合物ライブラリー（Specs, TimTec社）などの化合物ライブラリーを使用してよい。
【００６３】
好ましい薬剤候補化合物は、低分子量化合物である。低分子量化合物は、例えば５００ダルトン以下の分子量を有し、生体システムにおける良好な吸収及び透過性を有するであろう化合物であり、結果的に５００ダルトンよりも大きな分子量を有する化合物よりも、より成功的な薬剤候補でありそうな化合物である（Lipinskiらの論文. (1997)）。ペプチドは、別の好ましい薬剤候補化合物のクラスを含む。ペプチドは優れた薬剤候補であり得、生殖ホルモン及び血小板凝集阻害剤などの商業的に価値の高い数々の例がある。天然化合物は、薬剤候補化合物の別の好ましいクラスである。そのような化合物を天然資源中に見出して抽出し、その後合成してよい。脂質は、別の好ましい薬剤候補化合物のクラスである。
【００６４】
薬剤候補化合物の別の好ましいクラスは、抗体である。また、本発明は、ターゲットに対して指示された抗体を提供する。これらの抗体は、内因的に産生されて前記細胞内のターゲットに結合してもよく、又は前記組織に添加して該細胞外に存在するターゲットポリペプチドに結合してもよい。これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。本発明は、ＦＡｂフラグメント及びＦＡｂ発現ライブラリーの製品、並びにＦｖフラグメント及びＦｖ発現ライブラリーの製品に加え、キメラ抗体、一本鎖抗体及びヒト化抗体を含む。別の実施態様において、前記化合物は、天然型単一ドメイン抗体の最も小さな機能的フラグメントであるナノボディ（nanobody）（Cortez-Retamozoらの論文、2004）であってよい。
【００６５】
特定の実施態様において、ポリクローナル抗体を本発明の実施に使用してよい。当業者はポリクローナル抗体の調製方法を知っている。ポリクローナル抗体は、哺乳動物に、例えば免疫作用物質と、所望であればアジュバントの１回以上の注射することによって、抗体価を上げることができる。典型的には、該免疫作用物質及び／又はアジュバントを、複数回の皮下注射又は腹腔内注射によって、哺乳動物内に注入する。また、抗体を、そのままのターゲットタンパク質又はポリペプチド、フラグメント、若しくはコンジュゲート（conjugate）を含む誘導体、あるいは細胞膜に埋め込まれたターゲットなどのターゲットタンパク質又はポリペプチドの他の抗原決定基、若しくはファージディスプレイライブラリーなどの抗体可変領域のライブラリーに対して産生してよい。
【００６６】
免疫した哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質に前記免疫作用物質を連結させることは有用であり得る。そのような免疫原性タンパク質の例は、これらに限定されないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン及びダイズトリプシン阻害因子を含む。使用してよいアジュバントの例は、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート（dicorynomycolate））を含む。当業者は過度の実験をせずに、免疫プロトコルを選択してよい。
【００６７】
いくつかの実施態様において、前記抗体はモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体は、当業者に既知の方法を使用して調製してよい。本発明のモノクローナル抗体は、該宿主が該抗体への免疫応答を開始することを妨げる「ヒト化」であってよい。「ヒト化抗体」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに／若しくは非ヒト免疫グロブリンに由来する軽可変ドメイン構造及び／又は重可変ドメイン構造の他の部分であるが、該分子の残りの部分が１以上のヒト免疫グロブリン由来である抗体である。また、ヒト化抗体は、提供者又は受容者の非修飾軽鎖又はキメラ軽鎖に結合したヒト化重鎖によって特徴付けられる抗体を含み、その逆のものも含む。抗体のヒト化は、当業者に既知の方法で達成してよい（例えば、Mark及びPadlanの文献, (1994)、『実験薬理学ハンドブック（The Handbook of Experimental Pharmacology）』「４章  モノクローナル抗体のヒト化」、１１３巻、Springer-Verlag, New Yorkを参照されたい）。遺伝子導入動物を使用してヒト化抗体を発現させてもよい。
【００６８】
また、ヒト化抗体は、ファージディスプレイライブラリー（Hoogenboom及びWinterの論文, (1991) J. Mol. Biol. 227:381 8；Marksらの論文 (1991). J. Mol. Biol. 222:581-97）を含む、当業者に既知の様々な技術を使用して産生することもできる。Coleらの論文、及びBoernerらの論文の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Coleらの文献,(1985) 『モノクローナル抗体及びがん治療（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）』, Alan R. Liss, 77頁；Boernerらの論文 (1991). J. Immunol, 147(1):86-95）。
【００６９】
一本鎖抗体の産生用の当業者に既知の技術を適用して、本発明のターゲットポリペプチド及びタンパク質に対する一本鎖抗体を産生することができる。該抗体は、一価抗体であってよい。一価抗体の調製方法は、当業者に周知である。例えば、免疫グロブリン軽鎖及び修飾重鎖の組換え発現を含む方法である。一般的には、重鎖の架橋を防ぐために、Ｆｃ領域の任意の点で該重鎖を切断する。あるいは、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換する、又は架橋を防ぐために削除する。
【００７０】
二重特異性抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体であり、少なくとも２つの異なる抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又は受容体若しくは受容体サブユニットに対する結合特異性を有する抗体である。本事例において、一方の結合特異性はターゲットの１ドメインであるが、もう一方の結合特異性はターゲットの同一又は異なる別のドメインである。
【００７１】
二重特異性抗体の作成方法は、当業者に既知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産物は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づいており、該２つの重鎖は異なる特異性を有する（Milstein及びCuelloの論文, (1983) Nature 305:537-9）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の無作為的組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の潜在的混合体を産生し、そのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィー段階は通常、正しい分子の精製を達成させる。同様な手順は、Trauneekerらの論文 (1991) EMBO J. 10:3655-9に記載される。
【００７２】
別の好ましい実施態様に従って、本アッセイ方法は、ターゲットに対する結合親和性を有するものとして同定された薬剤候補化合物、及び／又は１以上のターゲットに対するアンタゴニスト活性などの下方制御活性を有するものとしてすでに同定された薬剤候補化合物を使用する。
本発明はさらに細胞外マトリクス分解を阻害する方法に関連し、配列番号：１〜１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列の、少なくとも約１７個〜約３０個の連続したヌクレオチドを補完するポリリボヌクレオチド配列を含む、発現阻害剤と哺乳動物細胞を接触させることを含む。
【００７３】
本発明の別の態様は、細胞外マトリクス分解の阻害方法に関連し、哺乳動物細胞内における、ターゲットポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドの翻訳を阻害する発現阻害剤に、哺乳動物細胞を接触させることを含む。特定の実施態様は、ターゲットｍＲＮＡと発現阻害剤を対合させ、それによってターゲットポリペプチドの発現を下方制御又は阻害するのに機能する、少なくとも１つのアンチセンス鎖を含むポリヌクレオチドを含む組成物に関するものである。好ましくは該阻害剤はアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み、前記阻害剤は、配列番号：１〜１６からなる群から選択される天然型ポリヌクレオチド配列に相補的な核酸配列、又は該配列から人為的に加工した核酸配列を含む。
【００７４】
本発明の特別な実施態様は、前記発現阻害剤が、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号：１〜１６をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号：１〜１６に対応するポリリボヌクレオチドの部分に十分に相同な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡ；該ｓｉＲＮＡ、好ましくは該ｓｈＲＮＡが、ターゲットポリリボヌクレオチドからターゲットポリペプチドへの翻訳に干渉するような、ｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡ）からなる群から選択される方法に関するものである。
【００７５】
本発明の別の実施態様は、前記発現阻害剤が、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号：１〜１６をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号：１〜１６に対応するポリリボヌクレオチドの部分に十分に相同な低分子干渉ＲＮＡ（該ｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡがターゲットポリリボヌクレオチドからターゲットポリペプチドへの翻訳に干渉するような、ｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡ）を発現する核酸である方法に関するものである。好ましくは、該発現阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡであり、配列番号：１〜１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列の、少なくとも約１７個〜約３０個の連続したヌクレオチドを補完するポリリボヌクレオチドを含む。より好ましくは、該発現阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡであり、配列番号：１〜１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列の、少なくとも約１７個〜約２５個の連続したヌクレオチドを補完するポリリボヌクレオチドを含む。特別な実施態様は、配列番号：１２８〜１４１及び２３１〜２４４からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を補完するポリリボヌクレオチド配列を含む。
【００７６】
アンチセンス核酸を使用する遺伝子発現の下方制御は、翻訳レベル又は転写レベルで達成することができる。好ましくは、本発明のアンチセンス核酸は、具体的には、ターゲットポリペプチドをコードする核酸又は対応するメッセンジャーＲＮＡの全体若しくは一部にハイブリダイズすることができる核酸フラグメントである。さらに、その一次転写産物のスプライシングを阻害することによって、ターゲットポリペプチドをコードし得る核酸配列の発現を減少させるアンチセンス核酸を設計してよい。ターゲットをコードする核酸の発現を下方制御する又は阻害し得る、任意の長さのアンチセンス配列が、本発明の実施に適する。好ましくは、該アンチセンス配列は、少なくとも約１７個のヌクレオチドである。アンチセンス核酸、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの調製及び使用、並びにオリゴ及び遺伝的アンチセンスの使用は、当業者に既知である。
【００７７】
発現阻害剤の一実施態様は、配列番号：１〜１６を含む核酸に対するアンチセンスである核酸であり、例えばアンチセンス核酸（例えば、ＤＮＡ）をインビトロで細胞に導入するか、又は遺伝子治療としてインビボで対象に投与して、配列番号：１〜１６を含む核酸の細胞性発現を阻害してもよい。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１７個〜約１００個のヌクレオチドを含む配列、及びより好ましくは約１８個〜約３０個のヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス核酸は、反対方向に発現する、配列番号：１〜１６の配列から選択される、約１７個〜約３０個の連続するヌクレオチドから調製してよい。
【００７８】
アンチセンス核酸は好ましくはオリゴヌクレオチドであり、完全にデオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、又は両方のいくつかの組み合わせから構成してよい。アンチセンス核酸は、合成オリゴヌクレオチドであり得る。該オリゴヌクレオチドは、所望であれば、安定性及び／又は選択性を向上させるために化学的に修飾してよい。オリゴヌクレオチドは細胞内ヌクレアーゼによる分解に影響を受けやすいので、該修飾は例えば、ホスホジエステル結合の遊離酸素を置換する硫黄基の使用を含み得る。この修飾は、ホスホロチオエート結合とよばれる。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、水溶性、ポリアニオン性、かつ内因性ヌクレアーゼに抵抗性である。さらに、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがそのターゲット部位にハイブリダイズすると、該ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖は該ハイブリッド分子のｍＲＮＡ構成要素を切断する内因性酵素リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈを活性化させる。
【００７９】
さらに、ホスホラミダイト及びポリアミド（ペプチド）結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成できる。これらの分子は、ヌクレアーゼ分解に非常に抵抗性であるべきである。さらに、化学基を、糖部分の２'炭素と、ピリミジンの５位炭素（Ｃ−５）に付加し、安定性を高め、そのターゲット部位へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合を促進させることができる。修飾は、当業者に既知の他の修飾に加えて、２'-デオキシ、Ｏ−ペントキシ、Ｏ−プロポキシ、Ｏ−メトキシ、フルオロ、メトキシエトキシホスホロチオエート、修飾塩基を含み得る。
【００８０】
ターゲットのレベルを減少させる発現阻害剤の別の型はリボザイムである。リボザイムは、触媒ドメインと基質結合ドメインを別々に有する触媒ＲＮＡ分子（ＲＮＡ酵素）である。基質結合配列は、ヌクレオチド相補性、また場合によっては非水素結合による相互作用によって、そのターゲット配列と結合する。触媒部分は、特定部位でターゲットＲＮＡを切断する。リボザイムの基質ドメインを人為的に加工して、それを特定のｍＲＮＡ配列へと指示させることができる。リボザイムは、相補的塩基対を介して、ターゲットｍＲＮＡを認識し、それから結合する。いったん正しいターゲット部位へと結合すると、リボザイムは酵素的に作用してターゲットｍＲＮＡを切る。リボザイムによるｍＲＮＡの切断は、対応するポリペプチドの合成を指示するそのｍＲＮＡの能力を破壊する。一度リボザイムがそのターゲット配列を切断すると、リボザイムは放出され、繰り返し他のｍＲＮＡに結合して切断することができる。
【００８１】
リボザイムの形態は、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、デルタ肝炎ウイルスモチーフ、グループＩイントロンモチーフ又はＲＮａｓｅＰ ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡガイド配列との関連で）、若しくはアカパンカビＶＳ ＲＮＡモチーフを含む。ハンマーヘッド構造又はヘアピン構造を有するリボザイムは、細胞内で真核生物プロモーターから発現可能（Chenらの論文,(1992) Nucleic Acids Res. 20:4581-9）であるので、容易に調製される。本発明のリボザイムは、真核生物細胞内で、適切なＤＮＡベクターから発現可能である。所望であれば、該リボザイム活性を、第二リボザイムによる一次転写産物からのその放出によって増強させてよい（Venturaらの論文,(1993) Nucleic Acids Res. 21:3249-55）。
【００８２】
リボザイムは、オリゴデオキシリボヌクレオチドを、転写後にターゲットｍＲＮＡにハイブリダイズする配列に隣接するリボザイムの触媒ドメイン（２０ヌクレオチド）と結合させることによって、化学的に合成してよい。該オリゴデオキシリボヌクレオチドを、プライマーとして基質結合配列を使用することによって増幅させる。該増幅産物を真核生物性の発現ベクターにクローン化する。
【００８３】
リボザイムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はウイルスベクターに挿入した転写単位から発現する。リボザイム配列の転写は、真核生物性ＲＮＡポリメラーゼＩ（pol (I)、ＲＮＡポリメラーゼ II (pol II)、又はＲＮＡポリメラーゼ III (pol III)のプロモーターから駆動される。pol IIプロモーター又はpol IIIプロモーターからの転写産物は、全細胞において高レベルで発現するであろう。所与の細胞型での所与のpol IIプロモーターのレベルは、近傍の遺伝子制御配列に依存するであろう。原核生物性ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適切な細胞内で発現する場合、原核生物性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターも使用する（Gao及びHuangの論文, (1993) Nucleic Acids Res. 21:2867-72）。これらのプロモーターから発現したリボザイムが哺乳動物細胞内で機能し得ることは示されている（Kashani-Sabetらの論文,(1992) Antisense Res. Dev. 2:3-15）。
【００８４】
特に好ましい阻害剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、好ましくはスモールヘアピン（small hairpin）ＲＮＡ「ｓｈＲＮＡ」）である。ｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡは、抑制されたＲＮＡに相同な配列である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）による遺伝子抑制の転写後過程を媒介する。本発明に従ったｓｉＲＮＡは、配列番号：１〜１６、好ましくは配列番号：１２８〜１４１及び２３１〜２４４に記載される配列からなる群から選択される、連続した１７個〜２５個のヌクレオチド配列に相補的又は相同な１７個〜２５個のヌクレオチドからなるセンス鎖、及び該センス鎖に相補的な１７個〜２５個のヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む。最も好ましいｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、これらは互いに、及びターゲットポリヌクレオチド配列に１００パーセント相補的である。好ましくは該ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を連結させるループ領域を含む。
【００８５】
本発明に従った自己相補的一本鎖ｓｈＲＮＡ分子ポリヌクレオチドは、ループ領域リンカーによって連結されたセンス部分及びアンチセンス部分を含む。好ましくは、該ループ領域配列は、４〜３０ヌクレオチド長であり、より好ましくは５〜１５ヌクレオチド長であり、最も好ましくは８ヌクレオチド長である。最も好ましい実施態様において、該リンカー配列は、UUGCUAUA (配列番号：871)又はGUUUGCUAUAAC (配列番号：872)である。自己相補的一本鎖ｓｉＲＮＡはヘアピンループを形成し、普通のｄｓＲＮＡよりもより安定である。さらに、それらはベクターからより容易に産生される。
【００８６】
アンチセンスＲＮＡと同様に、ｓｉＲＮＡを修飾して核酸分解に対する抵抗性を確認、又は活性を増幅、若しくは細胞分布を促進、あるいは細胞の取り込みを増進させることができ、そのような修飾は、修飾されたヌクレオシド内結合、修飾核酸塩基、修飾糖、及び／又は１以上の部分又はコンジュゲートへの該ｓｉＲＮＡの化学的結合から構成してもよい。ヌクレオチド配列は、これらのｓｉＲＮＡ設計則（これらの法則の議論及びｓｉＲＮＡの調製例として、引用により本明細書に組み込まれる２００４年１１月４日に公開されたW02004094636、及びUA20030198627）に適合しないヌクレオチド配列に比較したターゲット配列の改良的減縮を与えるｓｉＲＮＡ設計則に従って選択する。
【００８７】
また、本発明は細胞外マトリクス分解を阻害し得るポリヌクレオチドを発現し得るＤＮＡ発現ベクター、及び発現阻害剤として先に記載した、組成物、並びに前記組成物の使用方法に関するものである。
これらの組成物及び方法の特別の態様は、ターゲットポリペプチドと選択的に相互作用し得る細胞内結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの誘導発現による、該ターゲットポリペプチドの発現の下方制御又は阻害に関するものである。細胞内結合タンパク質は、細胞内で、発現して前記ポリペプチドの機能を中和するポリペプチドと選択的に相互作用又は結合し得る全てのタンパク質を含む。好ましくは、細胞内結合タンパク質は中和抗体、又は配列番号：１７〜３２のターゲットポリペプチドの抗原決定基、好ましくは配列番号：３３〜１２７のドメインに結合親和性を有する中和抗体のフラグメントである。より好ましくは、該結合タンパク質は一本鎖抗体である。
【００８８】
この組成物の特別な実施態様は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号：１７〜３２をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、及び配列番号：１〜１６に対応するポリリボヌクレオチドの部分に十分に相同な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；該ｓｉＲＮＡが、ターゲットポリリボヌクレオチドからターゲットポリペプチドへの翻訳に干渉するようなｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される発現阻害剤を含む。
【００８９】
該発現阻害剤を発現するポリヌクレオチドは、好ましくはベクター内に含まれる。該ポリ核酸を、前記核酸配列を発現させ得るシグナルに機能的に連結させ、好ましくは、いったん該細胞内に導入するとアンチセンス核酸を発現する組換えベクター構築物を利用する細胞内に導入する。アデノウイルスベクター系、レトロウイルスベクター系、アデノ随伴ウイルスベクター系、レンチウイルスベクター系、単純ヘルペスウイルスベクター系又はセンダイウイルスベクター系を含む、様々なウイルスに基づく系が利用可能であり、これらの全てを使用して、ターゲット細胞内における発現阻害剤のポリヌクレオチド配列を導入し、発現させてよい。
【００９０】
好ましくは、本発明の方法に使用するウイルスベクターは複製欠損型である。通常、そのような複製欠損型ベクターは、該感染細胞における該ウイルスの複製に必要な、少なくとも１領域を包む。これらの領域は、任意の当業者に既知の技術で（全体的に、又は部分的に）削除するか、又は付加することで非機能的にすることができる。これらの技術は、全体削除、置換、（複製に）必須な領域に対する１個以上の塩基の部分的削除又は部分的付加を含む。そのような技術は、遺伝子操作技術を使用して、又は突然変異誘発物質で処理することによって、インビトロ（単離ＤＮＡ上で）又はインサイチュウで実施してよい。好ましくは該複製欠損型ウイルスは、該ウイルス粒子のキャプシド化に必要なゲノム配列を保持する。
【００９１】
好ましい実施態様において、ウイルス性成分はアデノウイルス由来である。好ましくは、媒体は、アデノウイルスキャプシド、又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体内に梱包されたアデノウイルスベクターを含む。アデノウイルスの生物学はまた、分子レベルで比較的よく知られている。アデノウイルスベクター用の多くのツールが開発され続けており、それゆえアデノウイルスキャプシドを、本発明のライブラリーにおける組み込みに好ましい媒体とさせている。アデノウイルスは、種々の細胞に感染し得る。しかしながら、異なるアデノウイルス血清型は、異なる細胞優先傾向を有する。本発明のアデノウイルスキャプシドが、好ましい実施態様において入り得るターゲット細胞集団を組み合わせ、拡張することは、該媒体が、少なくとも２種のアデノウイルス由来のアデノウイルス線維タンパク質を含む。好ましいアデノウイルス線維タンパク質配列は、血清型１７、４５及び５１である。これらのキメラベクターの技術又は構築及び発現は、引用によって本明細書に組み込まれる米国公開特許出願第20030180258号及び第20040071660号に開示される。
【００９２】
好ましい実施態様において、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルス後期タンパク質又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体をコードする核酸を含む。アデノウイルス後期タンパク質、例えばアデノウイルス線維タンパク質を都合に合わせて使用して、特定細胞へ該媒体をターゲット化させてよく、又は該細胞への該媒体の強化した送達を誘導してもよい。好ましくはアデノウイルス由来の核酸は、本質的に全てのアデノウイルス後期タンパク質をコードし、完全なアデノウイルスキャプシド又はその機能的部分、類似体及び／又は誘導体の形成を可能にさせる。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルスＥ２Ａ又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体をコードする核酸を含む。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、細胞内で、アデノウイルス由来の核酸の複製を少なくとも部分的には促進させる、少なくとも１つのＥ４領域タンパク質又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体をコードする核酸を含む。本出願の実施例に使用するアデノウイルスベクターは、本方法の処理発明に有用なベクターの典型である。
【００９３】
本発明の特定の実施態様は、レトロウイルスベクター系である。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組込みウイルスであり、それらの構築は当業者に既知である。レトロウイルスベクターは、ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」）ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）及びフレンドウイルスなどの、異なる型のレトロウイルスから構築できる。レンチウイルスベクター系もまた、本発明の実施に使用してよい。レトロウイルス系及びヘルペスウイルス系は、神経細胞の形質移入の好ましい媒体であり得る。
【００９４】
本発明の他の実施態様において、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）が利用できる。ＡＡＶウイルスは、感染細胞のゲノム内に、安定的かつ部位特異的様式で組み込まれる、比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、細胞増殖、細胞形態又は細胞分化にいかなる影響をも与えずに幅広い範囲の細胞に感染することができ、かつヒトの病理的状態には関与していないようである。
ベクター構築において、本発明のポリリボヌクレオチド作用物質を、１以上の制御領域に連結させてよい。適切な制御領域（群）の選択は、一般的な当業者のレベルの範囲内で日常的事項である。制御領域はプロモーターを含み、エンハンサー、サプレッサーなどを含んでよい。
【００９５】
本発明の発現ベクターに使用してよいプロモーターは、構成的プロモーター及び制御型（誘導性）プロモーターの両方を含む。プロモーターは、宿主次第で、原核生物性又は真核生物性であってよい。原核生物（バクテリオファージを含む）プロモーターの中で、本発明の実施に有用なプロモーターは、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ラムダＰ.sub.rプロモーター、Ｐ.sub.1プロモーター、及びｔｒｐプロモーターである。真核生物（ウイルスを含む）プロモーターの中で、本発明の実施に有用なプロモーターは、遍在性プロモーター（例えば、ＨＰＲＴ、アクチン、チューブリン）、中間径フィラメントプロモーター（例えば、デスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ）、治療遺伝子プロモーター（例えば、ＭＤＲ型、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子）、組織特異性を示し、かつ遺伝子導入動物で使用されてきた動物性転写制御領域を含む組織特異的プロモーター（例えば、平滑筋細胞内のアクチンプロモーター、又は内皮細胞において活性なＦｌｔプロモーター及びＦｌｋプロモーター）：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftらの論文,（1984）Cell 38：639-46；Ornitzらの論文、（1986）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50：399-409；MacDonaldの論文,（1987）Hepatology 7：425-515）；膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahanの論文,（1985）Nature 315：115-22）、リンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlらの論文、（1984）Cell 38：647-58；Adamesらの論文、（1985）Nature 318：533-8；Alexanderらの論文、（1987）Mol. Cell. Biol. 7：1436-44）、睾丸、乳腺、リンパ球、及び肥満細胞において活性なマウス乳ガンウイルス制御領域（Lederらの論文,（1986）Cell 45：485-95）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertらの論文,（1987）Genes and Devel. 1：268-76）、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufらの論文,（1985）Mol. Cell. Biol.,5：1639-48；Hammerらの論文,（1987）Science 235：53-8）、肝臓において活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyらの論文,（1987）Genes and Devel.、1：161-71）、骨髄性細胞において活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域（Mogramらの論文,（1985）Nature 315：338-40；Kolliasらの論文,（1986）Cell 46：89-94）、脳内の乏突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadらの論文,（1987）Cell 48：703-12）、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Saniの論文,（1985）Nature 314.283-6）、及び視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonらの論文,（1986）Science 234：1372-8）である。
【００９６】
本発明の実施に使用してよい他のプロモーターは、分裂細胞において優先的に活性化されるプロモーター、刺激に応答するプロモーター（例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体）、テトラサイクリン制御型転写モジュレーター、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＳＶ−４０プロモーター、Ｅ１ａプロモーター、及びＭＬＰプロモーターを含む。
【００９７】
追加的なベクター系は、患者へのポリヌクレオチド作用物質の導入を促進する非ウイルス性システムを含み、例えば、リポフェクションによって、所望の配列をコードするＤＮＡベクターをインビボで導入することができる。リポソーム介在性形質移入が直面する困難を制限するために設計した合成陽イオン性脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のインビボ形質移入用リポソームを調製できる（Felgner,らの論文,（1987）Proc. Natl. Acad Sci. USA 84：7413-7）；Mackeyらの論文,（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：8027-31；Ulmerらの論文,（1993）Science 259：1745-8を参照されたい）。陽イオン性脂質の使用は、負に荷電した核酸の封入を促進し、かつ負に荷電した細胞膜との融合を促進し得る（Felgner及びRingoldの論文,（1989）Nature 337：387-8）。核酸の輸送に特に有用な脂質化合物及び脂質組成物が、国際特許公報WO 95/18863及びWO 96/17823、並びに米国特許第5,459,127号に記載されている。インビボで、特定の器官に外因性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、確かな実用上の利点を有し、かつ、特定の細胞型への形質移入を指示することは、例えば、膵臓、肝臓、腎臓及び脳などの、細胞の不均質性を有する組織に特に都合がよい。標的化の目的で、脂質を他の分子と化学的に共役させてよい。例えば、ホルモン又は神経伝達物質のような標的化ペプチド、及び、例えば抗体のようなタンパク質、又は非ペプチド分子を、化学的にリポソームに共役させることができる。また、他の分子、例えば、陽イオン性オリゴペプチド（例えば、国際特許公報WO 95/21931）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際特許公報WO 96/25508）、又は陽イオン性ポリマー（例えば、国際特許公報WO 95/21931）は、インビボでの核酸の形質移入を促進させるのに有用である。
【００９８】
また、裸プラスミドとして、インビボでＤＮＡベクターを導入することが可能である（米国特許第5,693,622号、第5,589,466号及び第5,580,859号を参照されたい）。治療目的用の裸ＤＮＡベクターは、当業者に既知の方法、例えば形質移入、電子穿孔法、微量注入、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクター輸送体の使用によって、所望の宿主細胞内に導入できる（例えば、Wilsonらの論文,（1992）J. Biol. Chem. 267：963-7；Wu及びWuの論文,（1988）J. Biol. Chem. 263：14621-4；Hartmutらの論文、１９９０年３月１５日に出願されたカナダ特許出願第2,012,311号；Williamsらの論文（1991）. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：2726-30を参照されたい）。また、受容体介在性ＤＮＡ送達アプローチも使用できる（Curielらの論文、（1992）Hum. Gene Ther. 3：147-54；Wu及びWuの論文,（1987）J. Biol. Chem.  262：4429-32）。
【００９９】
また、本発明は、ターゲット阻害剤として同定した１以上の化合物の有効量、及び／又は先に記載したような発現阻害剤を含む、生体適合性の細胞外マトリクス分解阻害組成物を提供する。
生体適合性組成物は、固体、液体、ゲル又は他の形態であってよい組成物であり、本発明の化合物、ポリヌクレオチド、ベクター及び抗体を活性形態、例えば生物活性に影響し得る形態で維持する。例えば、本発明の化合物は、ターゲットの逆アゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有するであろうし；核酸は複製、伝達内容を翻訳、又はターゲットの相補的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるであろうし；ベクターはターゲット細胞に形質移入させ、先に記載したようなアンチセンス、抗体、リボザイム又はｓｉＲＮＡを発現させることができるであろうし；抗体は、ターゲットポリペプチドドメインに結合するであろう。
【０１００】
好ましい生体適合性組成物は、例えば、塩イオンを含むトリス緩衝液、塩イオンを含むリン酸緩衝液、又は塩イオンを含むＨＥＰＥＳ緩衝液を使用して緩衝化された水溶液である。通常、塩イオン濃度は、生理的レベルと同等である。生体適合性溶液は、安定剤及び防腐剤を含んでよい。より好ましい実施態様において、生体適合性組成物は、医薬として許容し得る組成物である。そのような組成物は、局所、経口経路、非経口経路、鼻腔内経路、皮下経路、及び眼球内経路による投与用に製剤可能である。非経口投与は、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射、又は注入技術を含むものを意味する。該組成物を、所望の標準的で周知で非毒性の生理的に許容し得る担体、アジュバント及び媒体を含む用量単位製剤で、非経口的に投与してよい。
【０１０１】
本組成物発明の特に好ましい実施態様は、医薬として許容し得る担体との混合物で、先に記載したような治療的有効量の発現阻害剤を含む、細胞外マトリクス分解阻害組成物である。別の好ましい実施態様は、ＥＣＭ分解が関与する状態、又は該状態に対する感受性の治療又は予防用医薬組成物であって、効果的に細胞外マトリクス分解を阻害する量のターゲットアンタゴニスト又は逆アゴニスト、その医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、若しくは医薬として許容し得る担体との混合物中のそのプロドラッグを含む。
【０１０２】
経口投与用医薬組成物は、経口投与に適した用量で、当業者に周知の医薬として許容し得る担体を使用して製剤することができる。そのような担体は、該医薬組成物が、患者による経口摂取用に、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することを可能にする。経口使用用医薬組成物は、所望であれば、錠剤核又は糖衣錠核を得るために適切な助剤を添加した後、活性化合物と固形賦形剤を混合し、選択的にできた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工しることによって調製できる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖などの、炭水化物充填剤若しくはタンパク質充填剤；トウモロコシ、コムギ、イネ、イモ、又は他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、又はカルボキシメチル−セルロースナトリウムなどのセルロース；アラビア及びトラガカントを含むゴム；及び、ゼラチン並びにコラーゲンなどのタンパク質である。所望であれば、架橋結合したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤又は可溶化剤を添加してもよい。糖衣錠核を、濃縮糖溶液などの適切な被覆剤と合わせて使用してもよく、また糖衣錠核は、アラビアゴム、滑石、ポリビニル−ピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに適切な有機溶媒混合物又は有機溶媒混合物を含んでよい。染料又は色素を、製品の識別のため、若しくは活性化合物の量、すなわち用量を明らかにするために、錠剤被覆剤又は糖衣錠被覆剤に添加してもよい。
【０１０３】
経口的に使用可能な医薬製剤は、ゼラチンから作られる軟らかい密封カプセルに加えて、ゼラチンから作られた押し込み型カプセル、及びグリセロール又はソルビトールなどの被覆剤を含む。押し込み型カプセルは、ラクトース又はデンプンなどの充填剤若しくは結合剤、滑石又はステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、及び、選択的に安定剤と混合した活性成分を含み得る。軟らかいカプセル内で、活性化合物を、安定剤と共に、又は安定剤を含まずに、脂肪油、液体、若しくは液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解又は懸濁してよい。
【０１０４】
好ましい滅菌注射製剤は、非毒性の、非経口的に許容し得る溶媒又は希釈剤中の溶液若しくは懸濁液であり得る。医薬として許容し得る担体の例は、生理食塩水、緩衝食塩水、等張食塩水（例えば、リン酸一ナトリウム、又はリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム；塩化カルシウム又は塩化マグネシウム、又はそれらのような塩の混合物）、リンガー溶液、ブドウ糖、水、滅菌水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせであり、１，３−ブタンジオール及び滅菌固定油を、溶媒又は懸濁溶剤として都合に合わせて使用する。モノ−グリセリド、又はジ−グリセリドを含む、任意の無刺激性固定油を使用することができる。また、オレイン酸などの脂肪酸も注射製剤での使用が見出される。
【０１０５】
また、組成物媒質は、薬剤吸収スポンジとして機能し得る親水性ポリアクリル酸ポリマーなどの、任意の生体適合性又は非細胞毒性のホモポリマー若しくはヘテロポリマーから調製されるハイドロゲルであり得る。特に、酸化エチレン及び／又は酸化プロピレンから得られたような特定のハイドロゲルは市販されている。例えば、外科的介入の間、ハイドロゲルを、治療組織表面上に直接的に付着させることができる。
【０１０６】
本発明の医薬組成物の実施態様は、本発明のポリヌクレオチド阻害剤をコードする複製欠損型組換えウイルスベクター、及びポロクサマーなどの形質移入賦活剤を含む。ポロクサマーの例は、市販のポロクサマー４０７（BASF社、Parsippany、N.J.）、及び非毒性の生体適合性ポリオールである。組換えウイルスを含浸させたポロクサマーを、例えば、外科的介入の間、治療組織の表面上に、直接的に付着させてもよい。ポロクサマーは、より低い粘度を有しているが、ハイドロゲルと実質的に同じ利点を有する。
【０１０７】
また、活性発現阻害剤を、コロイド性薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）、又はマクロエマルジョンで、例えば界面重合によって調製したマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース、又はゼラチン−マイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリル酸）マイクロカプセル内のそれぞれに封入してよい。そのような手法は、『レミングトンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）』（１９８０）第１６版、Osol, A.編に記載されている。
【０１０８】
持続放出製剤を調製してよい。持続放出製剤の適切な例は、マトリクスが例えば薄膜又はマイクロカプセルのような造形品の形態中に前記抗体を含む、固体の疎水性重合体の半透性マトリクスを含む。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル樹脂）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドからなる、注入可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニル、及び乳酸−グリコール酸などの重合体は、１００日間以上にわたる分子の放出が可能であるが、特定のハイドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。封入された抗体が長時間体内に存在する場合、抗体は３７℃での水分への曝露の結果として変性又は凝集する可能性があり、生物活性の損失、及び免疫原性の変化の可能性をもたらす。関与する機構によって、安定化のために合理的な戦略を工夫してよい。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合であることが発見されたならば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、含水率を制御すること、適切な添加剤を使用すること、及び特定の重合体マトリクス組成物を開発することによって達成してよい。
【０１０９】
先に記載したように、治療的有効量は、前記症状又は前記状態を緩和させる、タンパク質、ポリヌクレオチド、ペプチド、又はその抗体、アゴニスト若しくはアンタゴニストの量を意味する。そのような化合物の治療効果及び毒性は、培養細胞又は実験動物での標準的な薬学的手法、例えばＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある用量）、及びＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）によって決定できる。治療効果に対する毒性の用量比が治療指数であり、これは比率、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。培養細胞アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトでの使用の用量範囲を策定することに使用する。そのような化合物の用量は血中濃度の範囲内にあるのが好ましく、毒性がほとんど若しくは全くないＥＤ５０を含む。該用量は、実施する投薬形態、患者の感受性、及び投与経路次第で、この範囲内で変化する。
【０１１０】
任意の化合物に関して、治療的有効量を、培養細胞アッセイ、又は動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、若しくはブタのいずれかで、はじめに見積もることができる。また、所望の濃度範囲及び投与経路を達成するために、動物モデルを使用する。それから、そのような情報を使用して、ヒトでの投与に有用な用量及び経路を決定することができる。的確な用量は、治療患者を考慮して、それぞれの医師によって選択される。用量及び投与を調整して十分なレベルの活性部分を提供する、又は所望の効果を維持させる。考慮されてよい付加的因子は、患者の病状の重篤度、年齢、体重、及び性別；食事、所望の治療の持続時間、投与方法、投与の時間及び頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、及び治療に対する耐性／反応性を含む。特定の製剤の半減期及びクリアランス速度次第で、長時間作用性医薬組成物を、３〜４日毎、毎週、又は２週毎に１回投与してもよい。
【０１１１】
本発明に従った医薬組成物を、様々な方法で対象に投与してよい。 医薬組成物を、陽イオン性脂質と複合体を形成させ、リポソーム内に封入して標的組織に直接的に付加してよく、又は当業者に既知の他の方法で標的細胞へと送達してもよい。所望の組織への局所的投与を、直接注入、経皮吸収、カテーテル、輸液ポンプ、又はステントで実施してよい。ＤＮＡ、ＤＮＡ／媒体複合体、又は組換えウイルス粒子を、治療部位に局所的に投与する。送達の選択的経路は、これらに限定されないが、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、エアロゾル吸入、経口（錠剤形態、又は丸薬形態）、局所送達、全身送達、眼球送達、腹腔内送達、及び／又はくも膜下腔送達を含む。リボザイムの送達及び投与の実施例が、Sullivanらの文献WO 94/02595で提供されている。
【０１１２】
本発明に従った抗体を、ボーラスのみ、時間をかける注入、又はボーラス及び時間をかける注入の投与の両方で送達してよい。当業者は、異なるタンパク質用製剤よりも、異なるポリヌクレオチド用製剤を利用する可能性がある。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置に特異的である。
本明細書において先に論じたように、組換えウイルスを使用して、本発明で有用なポリヌクレオチド作用物質をコードするＤＮＡを導入してよい。本発明に従った組換えウイルスは一般的に、約１０４〜約１０１４ｐｆｕの用量形態で製剤及び投与する。ＡＡＶ及びアデノウイルスの場合、約１０６〜約１０１１ｐｆｕの用量を使用するのが好ましい。用語ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）は、ウイルス粒子懸濁液の感染力に対応し、適切な培養細胞へ感染させ、形成されたプラークの数を測定することで決定する。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を決定するための手法は、先行技術中に詳細に説明されている。
【０１１３】
また、本発明は、細胞外マトリクス分解が関与する病態を患う対象に、本明細書に記載するような細胞外マトリクス分解を阻害する医薬組成物、好ましくは治療的有効量の本発明の発現阻害剤を投与することを含む、細胞外マトリクス分解の阻害方法を提供する。細胞外マトリクス分解が関与する疾患は、乾癬性関節炎、若年性関節炎、早期関節炎、反応性関節炎、変形性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、腱炎及び歯周病などの筋骨疾患、ガン転移、呼吸器系疾患（ＣＯＰＤ、喘息）、腎臓繊維症及び肝臓繊維症、アテローム性動脈硬化症及び心不全などの心血管系疾患、並びに神経の炎症及び多発性硬化症などの神経系疾患を含む。本発明に従った治療により好ましい疾患は、乾癬性関節炎、若年性関節炎、早期関節炎、反応性関節炎、変形性関節炎、強直性脊椎炎などの変形性関節疾患である。本方法に従う治療の最も好ましい変形性関節疾患は、関節リウマチである。また、本発明は、炎症性疾患の治療方法を提供する。
【０１１４】
前記患者への本発明の発現阻害剤の投与は自己投与、及び他人による投与の両方を含む。該患者は、現在の疾患又は病状の治療を必要としていてもよく、又は骨代謝の障害に冒される疾患及び病状の危険性を阻止又は減少させるための予防的治療を望んでいてもよい。対象患者に、経口的に、経皮的に、吸入、注入を介して、経鼻的に、直腸的に、又は徐放性製剤を介して、本発明の発現阻害剤を送達してよい。
【０１１５】
本方法の好ましい投与計画は、前記患者における異常なレベルの細胞外マトリクス分解を減少させる、及び好ましくは前記変性の原因である自己永続的過程を終結させるのに十分な時間、本発明の発現阻害剤の効果的阻害量を、炎症によって特徴付けられる病態を患っている対象に投与することを含む。本方法の特別な実施態様は、前記患者の関節におけるコラーゲン分解及び骨変性をそれぞれ低減又は阻止する、及び好ましくは前記変性の原因である自己永続的過程を終結させるのに十分な時間、マトリクスメタロプロテアーゼを阻害する量の本発明の発現阻害剤を、関節リウマチの進行を患っている対象、若しくは該進行に感受性の対象に投与することを含む。
【０１１６】
また、本発明は、先に記載したような、細胞外マトリクス分解が関与する疾患の治療用薬剤又は予防用薬剤の調製用作用物質の使用に関するものである。好ましくは、該病理的状態は関節炎である。より好ましくは、該病理状態は関節リウマチである。
先に記載したような本発明の実施に有用なポリペプチド又はポリヌクレオチドを、溶液中で遊離、固相支持体に固定、細胞表面上に付着、又は細胞内に位置させてよい。本方法を実施するために、該アッセイの自動化を適合させるのに加えて、ターゲットポリペプチド又は前記化合物のどちらか一方を固定化して、該ポリペプチドの非複合体形態からの複合体の分離を促進させる。ターゲットポリペプチドと化合物との相互作用（例えば、結合の）は、反応物質を含む、任意の適切な容器内で達成できる。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心管を含む。一実施態様において、ポリペプチドをマトリクスに結合させることができるドメインを付加した融合タンパク質が提供可能である。例えば、ターゲットポリペプチドに「Ｈｉｓ」タグを付加し、その後にＮｉ−ＮＴＡマイクロタイタープレート上に吸着させることができる、又はターゲットポリペプチドとのＰｒｏｔＡ融合体をＩｇＧに吸着させることができ、それから該ポリペプチドを細胞溶解物（例えば、（３５）Ｓ標識）及び候補化合物と混合し、該混合物を複合体系性に有利な条件下（例えば、生理的条件の塩及びｐＨ）でインキュベートする。インキュベーションの後、該プレートを洗浄して結合していない全ての標識を除去してマトリクスを固定する。放射能の量は直接的に、又は該複合体の解離の後の上清で測定できる。あるいは、該複合体をマトリクスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、標準的な電気泳動技術を使用して、ゲルからターゲットタンパク質に結合しているタンパク質のレベルを定量することができる。
【０１１７】
マトリクス上にタンパク質を固定する他の手法もまた、化合物を同定する方法に使用可能である。例えば、ターゲット又は前記化合物のどちらかを、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して固定することができる。本発明の、ビオチン化ターゲットタンパク質分子は、当業者に周知の技術を使用するビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）（例えば、ビオチン化キット（biotinylation kit）、Pierce Chemicals社、Rockford、Ill.）から調製することができ、ストレプトアビジンで被覆した９６ウエルプレート（Pierce Chemical社）のウエル内に固定させることができる。あるいは、ターゲットと反応するが、前記化合物へのターゲットの結合には干渉しない抗体を、該プレートのウエルに誘導体化することができ、抗体結合によって、ターゲットをウエル内に補足することができる。先に記載したように、前記ターゲットが存在する該プレートのウエル内で、標識候補化合物の調合液をインキュベートし、ウエル内に補足された複合体の量を定量することができる。
【０１１８】
配列番号：１〜１６のターゲットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定する。本発明者は本明細書で、これらの遺伝子を標的とするＡｄ−ｓｉＲＮＡを用いた哺乳動物細胞の形質移入が、細胞外マトリクス分解を促進させる因子の放出を減少させることを示す。
また、本発明は、ＥＣＭ分解が関与する病理的状態の診断方法に関するものであり、対象のゲノムＤＮＡ内の、配列番号：１〜１６の少なくとも１つの核酸配列を測定すること；該配列を、データベース及び／又は健常者から得た核酸配列と比較すること；及び、病理的状態の発現に関連するあらゆる差異を同定すること；を含む。
【０１１９】
さらに本発明の別の態様は、対象の細胞外マトリクス分解が関与する病理的状態、又は該状態への感受性を診断する方法に関するものであり、生体サンプル中の配列番号：１７〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量を測定すること；及び該量を、健常者におけるポリペプチド量と比較すること（ここで、健常者に比較したポリペプチド量の増加が、該病理的状態の存在の指標となる）；を含む。
さらに、本発明を下記の図面及び実施例で説明する。
【実施例】
【０１２０】
並べられたアデノウイルスｓｈＲＮＡ（スモールヘアピンＲＮＡ）発現ライブラリー（WO99/64582に記載される産物及び使用法）との組み合わせで使用する場合、下記アッセイは、滑膜性線維芽細胞（ＳＦ）の能力を調節してＭＭＰ１を産生させ、かつ軟骨の重要な構成要素であるコラーゲンを分解させる因子の発見に有用である。候補因子を、一次アッセイを介してはじめに選別し、次に二次アッセイで選別する。
【０１２１】
実施例１は、マトリクスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ１）のタンパク質レベルの検出用ＥＬＩＳＡを使用するアデノウイルスｓｉＲＮＡライブラリーの一次アッセイスクリーニングの開発及び設定を記載し、「リバースＭＭＰ１アッセイ（reverse MMP1 assay）」として本明細書で言及する。実施例２は、該スクリーニング及びその結果を記載する。実施例3は、非特異的方法で、ＭＭＰ１発現を阻害する任意の標的を取り除く選別を記載する。実施例４は、内因性ＳＦの発現用標的の部分集合の試験を記載する。実施例５は、サイトカイン誘導性のＭＭＰ１発現の阻害用Ａｄ−ｓｉＲＮＡの部分集合を試験する用量反応実験を記載する。実施例６は、本明細書において、より機能的に配向し、かつＳＦの上清中のコラーゲン分解を検出する「コラーゲン分解アッセイ」に言及する第二アッセイを記載する。実施例７は、サイトカイン誘導性のＩＬ−８発現の阻害用Ａｄ−ｓｉＲＮＡの部分集合の試験を記載する。
【０１２２】
（使用したコントロールウイルス）：
これらの調査に使用するコントロールウイルスを、以下に一覧化する。ｄＥ１/ｄＥ２Ａアデノウイルスを、以下に記載するアダプタープラスミドとWO99/64582に記載されるPER.E2Aパッケージング細胞内のヘルパープラスミドpWEAd5AflII-rITR.dE2Aとの共形質移入で作成する。
（Ａ）ネガティブコントロールウイルス：
Ad5-LacZ：WO02/070744においてpIPspAdApt6-lacZとして記載される：
Ad5-ALPP：１．９ｋｂの挿入断片をNsiIを用いた消化によってpGT65-PLAP（Invitrogen社）から単離し、平滑末端化し、続いてEcoR1で消化し、EcoRI及びHpaIで消化したpIPspAdApt6にクローン化する。
Ad5-eGFP：WO02/070744においてpIPspAdApt6-EGFPとして記載される。
Ad5-eGFP_KD：標的配列：GCTGACCCTGAAGTTCATC (配列番号：245)。WO03/020931に記載されるように、Sap1部位を使用してベクターへとクローン化して作成したウイルス。
【０１２３】
Ad5-ルシフェラーゼ_v13_KD：標的配列：GCTGACCCTGAAGTTCATC (配列番号：246)。WO03/020931に記載されるように、Sap1部位を使用してベクターへとクローン化して作成したウイルス。
Ad5-DCK_v1_KD：標的配列ATGAAGAGCAAGGCATTCC (配列番号：247)。WO03/020931に記載されるように、Sap1部位を使用してベクターへとクローン化して作成したウイルス。
Ad5-PRKCL1_v1_KD：標的配列TGCCTGGGACCAGAGCTTC (配列番号：248)。WO03/020931に記載されるように、Sap1部位を使用してベクターへとクローン化して作成したウイルス。
Ad5-TNFSF15_v1_KD：標的配列GGAAGTAATTGGATCATGC (配列番号：249)。WO03/020931に記載されるように、Sap1部位を使用してベクターへとクローン化して作成したウイルス。
Ad5-M6PR_v1_KD：標的配列：GCTGACCCTGAAGTTCATC (配列番号：250)。WO03/020931に記載されるように、Sap1部位を使用してベクターへとクローン化して作成したウイルス。
【０１２４】
（Ｂ）ポジティブコントロールウイルス：
Ad5-MMP1：pIPspAdapt6プラスミドへとクローン化したＭＭＰ１をコードするｃＤＮＡを、古典的なフィルターコロニーハイブリダイゼーション法によって、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（WO02/070744を参照されたい）から単離する。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを細菌へと形質転換し、寒天プレート上にまく。（Q-pix装置（Q-pix device）(Genetix社)を使用して）数千個のコロニーを拾い、寒天プレート上に再配置する。細菌を成長させた後、これらのプレート上にハイブリダイゼーションフィルターを被せる。これらのフィルターに、ＭＭＰ１特異的プローブを用いた古典的ハイブリダイゼーション手順を適用する。このプローブは、下記のプライマーを使用する胎盤ｃＤＮＡライブラリーでのＰＣＲから得る：
上流：GTTCTGGGGTGTGGTGTCTCACAGC (配列番号：873)；及び、
下流：CAAACTGAGCCACATCAGGCACTCC (配列番号：874)。
ハイブリダイゼーション後のフィルター上の陽性シグナルスポットに対応する細菌コロニーを拾い、プラスミド調製に使用する。５'配列の検証は、該挿入断片の５'配列がNM_002421に対応することを裏付ける。
【０１２５】
Ad5-MMP13：ＭＭＰ１３のｃＤＮＡを、ＰＣＲによって、ヒト滑膜性線維芽細胞由来ｃＤＮＡ標本から単離する。１４９８ｂｐのＰＣＲ産物を、HindIII/EcoRIクローニング法を使用して、pIPspAdapt6へとクローン化する。配列検証は、該挿入断片が、NM_002427の１８ｂｐ〜１４９７ｂｐに対応することを裏付ける。
Ad5-MYD88：このｃＤＮＡは、pIPspAdapt6で構築されたヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離する。MYD88の発現を媒介するウイルスは、Galapagos Genomics社で行ったゲノム選別の１つでヒットしたものとして同定する。該挿入断片配列の検証は、該挿入断片がNM_002468の４０ｂｐ〜９３０ｂｐに対応することを裏付する。
Ad5-MMP1_v10_KD：標的配列：GCTGACCCTGAAGTTCATC (配列番号：251)。WO03/020931に記載されるように、Sap1部位を使用してベクターへとクローン化して作成したウイルス。
Ad5-PRKCE_v11_KD：標的配列GTCATGTTGGCAGAACTC (配列番号：252)。WO03/020931に記載されるように、Sap1部位を使用してベクターへとクローン化して作成したウイルス。
【０１２６】
（実施例１）：リバースＭＭＰ１アッセイの開発
ＭＭＰ１を産生する滑膜性線維芽細胞（ＳＦ）の能力を最初に試験することによって、ＭＭＰ１アッセイを開発する。
ＭＭＰ１を産生するＳＦの能力を評価するにあたり、これらの細胞を、前炎症性ＩＬ１βシグナル伝達経路に関与するＭＹＤ８８アダプター分子の発現を媒介する組換えアデノウイルスで感染させた。このウイルスは、これらの細胞におけるＭＭＰ１発現を増加させることが予期される（Vincenti及びBrinckerhoffの文献, 2002を参照されたい）。
【０１２７】
６ウエルプレートの１ウエルにつき４０，０００個のＳＦを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種し、各々のウエルは、ｅＧＦＰ、ＭＹＤ８８又はＭＭＰ１（１細胞あたり７５００個のウイルス粒子（ｖｐ／細胞）の感染多重度（ＭＯＩ）で）の発現を媒介する組換えアデノウイルスで感染させる、若しくは非感染のまま（ブランク）である。はじめに、ＳＦによるＭＭＰ１の発現を、リアルタイム定量ＰＣＲを用いて、ｍＲＮＡレベルで測定する。コントロールウイルスで感染させた細胞のＲＮＡは、メーカーの説明書に従いＳＶ  ＲＮＡ単離キット（SV RNA isolation kit）（Promega社）を使用して、感染４８時間後に調製する。ｃＤＮＡは、マルチスクライブ（Multiscribe）逆転写酵素（50U/μl、Applied Biosystems社）及びランダム六量体を使用して、このＲＮＡから調製する。ｃＤＮＡ合成を、１×ＴａｑＭａｎ緩衝液Ａ（ＰＥ Applied Biosystems社）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰにつき終濃度５００μＭ）、２．５ｍＭのランダム六量体、０．４Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、及び１．２５Ｕ／μｌのマルチスクライブ逆転写酵素からなる２５μｌの総容積で実施する。該混合物を、２５℃で１０分、４８℃で３０分及び９５℃で５分間、インキュベートする。特定のＤＮＡ産物を、結果として生じるｃＤＮＡから、適切なプライマー対を使用する４０回のＰＣＲサイクルの間に、アンプリタック・ゴールド（AmpliTaq Gold）ＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems）を用いて増幅させる。該特定のＤＮＡ産物の増幅は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００配列検出システム上でモニターする。次のリアルタイムＰＣＲ反応は、１×ＳＹＢＲグリーンミックス（SYBR Green mix）（Applied Biosystems社）、３００ｎＭフォワードプライマー及び３００ｎＭリバースプライマーからなる２５μｌの総容積中に、５μｌのＲＴ反応生成物を含む。各サンプルを、２回反復で解析する。ＰＣＲ反応を以下のプログラムを使用して実施する：９５℃での１０分間に続き、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）のサイクルを４０サイクル。各ＰＣＲ反応の後、該産物を９５℃で１５秒間及び６０℃で１５秒間インキュベートし、続いて２０分かけて９５℃に温度を上昇させ、最後は９５℃の１５秒間で終結させる。ＭＭＰ１の検出に使用したプライマー対の配列を、表３に一覧化する。
【０１２８】
【表３】
2008516593.tif 000009
【０１２９】
ＰＣＲ反応用の内部較正物質として使用される１８Ｓ  ｒＲＮＡのレベルを、市販のプライマー対、及びTaqmanプローブ（TaqMan（登録商標）リボソームＲＮＡコントロール試薬（TaqMan Ribosomal RNA Control Reagents）、Applied Biosystems社）を使用して測定するＳＹＢＲグリーン法を使用して、ＭＭＰ１を検出する。増幅プロット、及び生じる閾値Ｃｔ値は、該サンプル中に存在する特定のｍＲＮＡ量の指標である。デルタ−デルタＣｔ値が存在し、これはＡｄ５−ｅＧＦＰ感染コントロールサンプルにおける発現レベルと比較して、ポジティブコントロールウイルスで感染させたサンプルにおけるＭＭＰ１  ｍＲＮＡの標準化した（１８Ｓ較正物質と比較した）レベルを意味する。結果は、非感染ＳＦ、又はＡｄ５−ｅＧＦＰ感染ＳＦと比較して、ＭＹＤ８８を発現するＳＦで、ＭＭＰ１  ｍＲＮＡレベルの強い上方制御を示す（図２、パネルＡ）。
【０１３０】
また、ＳＦによって発現されたＭＭＰ１のレベルを、ウエスタンブロッティングによって、タンパク質レベルでも測定する。感染２日後に、リアルタイムＰＣＲ実験用に示した様々な組換えアデノウイルスを用いて感染させた細胞の上清を回収し、古典的なＴＣＡ沈殿によって１５倍に濃縮する。上清の１５μｌを、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。これらの実験用に使用する培地は、Ｍ１９９培地＋１％ＦＢＳである。ＭＭＰ１コントロールサンプル用に、Ａｄ５−ＭＭＰ１で感染させた非濃縮細胞上清をゲル上で泳動する。該分離タンパク質を、ニトロセルロース膜上に転写する。該転写の質、及び該サンプルの等しい泳動を、該膜のポンソー−Ｓ（Ponceau−S）染色で検証する。一次抗体としてヤギ抗ＭＭＰ１ポリクローナル抗体（R&D Systems社、１／５００希釈）、及び二次抗体としてＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギ抗体（DAKO社、１／１００００希釈）、並びにＥＣＬプラスＨＲＰ基質（Amersham Biosciences社）を使用して、免疫検出を実施する。ウエスタンブロッティングは、Ａｄ５−ｅＧＦＰ感染細胞と比較して、Ａｄ５−ＭＹＤ８８の発現を媒介するアデノウイルスを用いて感染させたＳＦの上清中のＭＭＰ１タンパク質レベルの強い増加を示す。非常に強いシグナルが、Ａｄ５−ＭＭＰ１感染細胞の上清で検出される（図２、パネルＢ）。
【０１３１】
Ａｄ５−ＭＹＤ８８感染ＳＦの上清に存在する高レベルのＭＭＰ１タンパク質を、市販のＭＭＰ１活性ＥＬＩＳＡ（ＲＰＮ２６２９、Amersham Biosciences社）を用いて確認する。このＥＬＩＳＡでは、ＭＭＰ１はウエルに固定化された抗体によって捕捉され、該量をその後、ＭＭＰ１基質の変換に基づいて定量化する。製造業者によって推奨されるように、（ウエスタンブロッティング実験で示したように調製した）５０μｌのＳＦの非濃縮上清を、このＥＬＩＳＡで処理する（図２、パネルＣ）。
【０１３２】
これらの実験は、一般的なＳＦの能力、並びにスクリーニング及び検証実験、特に炎症経路の誘起後のＭＭＰ１タンパク質産生に使用する細胞処理単位をを確認する。
ＭＭＰ１の測定用３８４ウエルフォーマットＥＬＩＳＡを開発する。様々なＥＬＩＳＡプロトコルと同様、様々な一次抗体を試験する。下記のプロトコルを開発して検証し、３８４ウエルプレート内のＳＦの上清中のＭＭＰ１レベルを測定する：白色ルミトラック（Lumitrac）600の384ウエルプレート（Greiner社）を、２μg/mlの抗MMP１抗体MAB１３４６（Chemicon社）で被覆する。抗体を、緩衝液４０（１ＬのミリＱ（ｍｉｌｌｉＱ）水中に、１．２１ｇのトリス塩基（Sigma社）、０．５８ｇのNaCl（Calbiochem社）及び５mlの１０%NaN３（Sigma社）、pH８．５に調整）で希釈する。４℃で一晩インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ（１０ＬのｍｉｌｌｉＱ中に８０ｇのＮａＣｌ、２ｇのＫＣｌ（Sigma社）、１１．５ｇのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ及び２ｇのＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で洗浄し、１００μｌ／ウエルのカゼイン緩衝液（ＰＢＳ中に２％カゼイン（VWR International社））でブロックする。翌日、ＥＬＩＳＡプレートからカゼイン緩衝液を除去し、５０μｌ／ウェルのＥＣ緩衝液（１ＬのｍｉｌｌｉＱ中に４ｇのカゼイン、２．１３ｇのNa２HPO４（Sigma社）、２ｇのウシアルブミン（Sigma社）、０．６９ｇのNaH２PO４・H２O（Sigma社）、０．５ｇのCHAPS（Roche社）、２３．３gのＮａＣｌ、４ｍｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８（Invitrogen社）、５ｍｌの１０％ＮａＮ３、ｐＨ７．０に調整）で置換する。０．２５ｍＭのDTT（Sigma社）を加え、サンプルプレートを解凍する。ＥＣ緩衝液の除去後、サンプルの２０μｌを該ＥＬＩＳＡプレートへ移す。４℃で一晩のインキュベーション後、該プレートをＰＢＳで２回、ＰＢＳＴ（０．０５％のTween20（Sigma社）を含有するPBS）で１回洗浄し、３５μｌ／ウエルのビオチン化抗ＭＭＰ１抗体溶液（Ｒ＆Ｄ社）とインキュベートする。この二次抗体を、緩衝液Ｃ（２ＬのｍｉｌｌｉＱ中に０．８２ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、４．８２ｇのＮａ２ＨＰＯ４、４６．６ｇのＮａＣｌ、２０ｇのウシアルブミン及び４ｍｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８、ｐＨ７．０に調整）で、５μｇ／ｍｌの濃度に希釈する。室温で２時間のインキュベーションの後、先に記載したように該プレートを洗浄し、５０μｌ／ウエルのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート体（Biosource社）とインキュベートする。ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート体を、緩衝液Ｃで０．２５μｇ／ｍｌの濃度に希釈する。４５分後、先に記載したように該プレートを洗浄し、５０μｌ／ウエルのBM Chem ELISA基質（Roche社）と５分間インキュベートする。読み出しは、２００ミリ秒の積算時間を有するルミノスキャン上昇照度計（Luminoscan Ascent Luminometer）（Labsystems社）、又はエンビジョンリーダー（Envision reader）（Perkin Elmer社）で実施する。
【０１３３】
開発したＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡで得られた典型的結果を図３に示す。この実験用に、３０００個のＳＦを９６ウエルプレートの内のＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種する。２４時間後、ＳＦを、ＡＬＰＰ、ＭＹＤ８８、ＭＭＰ１の発現を媒介するアデノウイルスを用いて１００００ＭＯＩで感染させるか、又は非感染のままにする。感染翌日、該細胞の培地を、１％ＦＢＳを添加したＭ１９９培地（Invitrogen社）で置換する。４８時間のインキュベーションの後、該上清を回収して３８４ウエルプレートへ移し、先に記載したＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡ手法を実施する。前記シグナルの３．５倍を超える強い上方制御が観察される。この実験は、ＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡの強さ及び特異性を示した。
【０１３４】
ＲＡの分野に関連するサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ１β及びＯＳＭ）又はそれらの組合せを用いて処理したＳＦによるＭＭＰ１発現の増加をモニターする。結果を、図４の白色バーとして示す。この実験用に、ＳＦを９６ウエルプレートに３０００細胞／ウエルで播種する。２４時間後に、該培地を、１％ＦＢＳを添加したＭ１９９培地に交換する。培地変更翌日、サイトカイン又はそれらの組合せを、各サイトカインの最終濃度が２５ｎｇ／ｍｌになるまで該培地に加える。図３に記載しているように、サイトカイン添加７２時間後に、該上清を収集してＥＬＩＳＡで処理する。図４の白色のバーで示すように、ＴＮＦαのみが、非処理細胞のほぼ３倍のＭＭＰ１発現の増加を誘導する。ＴＮＦα及びＯＳＭ及び／又はＩＬ１βの組合せを用いたＳＦの誘起は、さらにより高いＭＭＰ１発現レベルをもたらす。この実験は、開発したＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡの感度が、ＲＡの発病に関係するサイトカインによって誘導されるＳＦによるＭＭＰ１発現の増加を測定するのに十分であることを証明する。
【０１３５】
上記の実験と平行して、同じサイトカイン又はサイトカインの組み合わせを用いて、Ｍ１９９培地＋１％ＦＢＳ中で４８時間処理したＴＨＰ１細胞の上清（Ｍ１９９＋１％ＦＢＳで２倍希釈）を用いて、同じプロトコルを使用してＳＦを誘起させる。これらのサンプルのＭＭＰ１レベルを、図4に灰色バーで示す。ＴＮＦα処理ＴＨＰ１細胞の上清単独で、非処理のＴＨＰ１細胞上清のレベルに比較して、４．５倍を超えるＭＭＰ１発現を誘導する。該４．５倍の増加は、組換えＴＮＦα単独を用いての３倍の誘導を超え、かつ３種の精製サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ１ｂ、ＯＳＭ）の混合物によって得られるほぼ５倍の誘導に等しい。それゆえ、ＴＮＦα誘導ＴＨＰ１細胞の上清は、ＴＮＦαに加えて、ＳＦのＭＭＰ１発現を活性化させる付加的な前炎症性因子を含む。このＴＮＦαを主成分とする誘起物質混合物（ＴＨＰ−１細胞をＴＮＦαと接触させることで調製される）は、おそらくＲＡ患者の関節に存在する因子群を含み、それゆえＲＡに関連性を有する。さらに、このＴＮＦαに基づく複雑な誘発は、「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」として言及し、「リバースＭＭＰ１アッセイ」の基礎として使用する。
【０１３６】
「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」によるSFの活性化は、齧歯類におけるコラーゲン誘導性関節炎を強力に減少させる、潜在的な抗炎症性作用物質であるデキサメタゾンを用いてＳＦを処理することで、用量依存的様式で阻害可能である（Yangらの論文, 2004）（図５）。ＳＦを９６ウエルプレートに、３０００細胞／ウエルの密度で播種する。播種２４時間後、様々な濃度のデキサメタゾンを該細胞に添加する。一晩のインキュベーション後、各細胞からの培地を、ＴＮＦα（Ｍ１９９＋０．５％ＦＢＳで５０％希釈）処理ＴＨＰ−１細胞上清で交換し、先に記載したのと同濃度のデキサメタゾンを添加する。処理２４時間後、該上清を回収し、先に記載したＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡに使用する。ＳＦによるＭＭＰ１発現は、デキサメタゾンの添加によって用量依存的様式で減少し、約１ｎＭのＩＣ５０値を示す（図５を参照されたい）。このデータは、活性化ＳＦによるＭＭＰ１発現を、生理的関連阻害剤の添加によって減少させることができることを示し、「リバースＭＭＰ１アッセイ」の原理に正当性を与える。
【０１３７】
（実施例２）：リバースＭＭＰ１アッセイにおける１１，７４４個の「Ａｄ−ｓｉＲＮＡ」のスクリーニング
（一次スクリーニング）
リバースＭＭＰ１アッセイを使用して、ＳＦにおけるｓｈＲＮＡの発現を媒介する、１１，７４４個の異なる組換えアデノウイルスの整列したコレクションを選別する。これらのｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる機構によって、相同配列を含む遺伝子の発現レベルの減少をもたらす。該整列したコレクションに含まれる１１，７４４個のＡｄ−ｓｉＲＮＡは、５０４６個の異なる転写産物を標的とする。平均で、各転写産物は、２〜３個の独立なＡｄ−ｓｉＲＮＡによって標的化される。スクリーニング過程の模式的説明を図６に示す。以下により詳細に述べるように、ＳＦを３８４ウエルプレートに播種し、その日のうちに、各ウエルを別々のＡｄ−ｓｉＲＮＡで感染させた整列ｓｈＲＮＡライブラリーで感染させる。感染５日後、該培地を交換し、細胞をＴＮＦα処理ＴＨＰ−１細胞の上清で誘起させる。該誘発物質の添加２日後に、上清を回収し、ＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡに使用する。
【０１３８】
異なるスクリーニング実施間の、該アッセイの質を評価する３８４ウエルプレートを作成する。このプレートの構成を図７Ａに示す。ウエルを、サイレンスセレクトアデノウイルスコレクションと同じ条件下で作成したコントロールウイルスで満たす。該ウイルスは、対角に並んだ３セットの４８個のポジティブコントロールウイルス（P1 (Ad5-DCK_v1_KD), P2 (Ad5-PRKCL1_v1_KD), P3 (Ad5-TNFSF15_v1_KD)）、合間の３セットの４８個のネガティブコントロールウイルス（N1 (Ad5-eGFP_v5_KD), N2 (Ad5-Luc_v15_KD), N3 (Ad5-eGFP_v1_KD), B1: ブランコ（blanco）, 非感染）。コントロールプレートの各ウエルは、５０μｌのウイルス粗溶解物を含んだ。このコントロールプレートの複数回分の一定分量を産生し、−８０℃で保存する。
【０１３９】
最適スクリーニングプロトコル：初代（passage 1）ＲＡＳＦ（Cell Applications社）を、１０％ウシ胎仔血清（ＩＣＮ社）、１００単位／ｍｌのペニシリン（Invitrogen社）及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Invitrogen社）を添加したＤＭＥＭ培地（Invitrogen社）で培養し、３７℃及び１０％ＣＯ２でインキュベートする。該細胞を、週に一度、１／３分割によって継代培養する。本スクリーニングで用いたＲＡＳＦの最大継代数は１１である。スクリーニング用に、ＳＦを０．１％ゼラチン（Merck社）で被覆された透明な３８４ウエルプレート（Greiner社）内に、２５μlの滑膜細胞増殖培地（Synovial Cell growth medium）（Cell Applications社）中、１５００細胞／ウエルの密度で播種する。翌日、前記サイレンスセレクトコレクション（WO 03/020931）由来Ａｄ−ｓｉＲＮＡウイルスを、ＳＦを含む３８４ウエルプレートの各々のウエルへと移す。アデノウイルスの平均力価は１×１０９ウイルス粒子／ｍｌであり、これは約１７００ＭＯＩであることを意味する。サイレンスセレクトコレクションを３８４ウエルプレート内に保存し、９６／３８４−チャンネルディスペンサーを使用してＳＦへと移す。感染５日後、該培地を除去し、該ウエルを１％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地を１度添加してすすぎ、次に該培地を除去する。それから該ウエルを、１％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地で２倍希釈した、６０μｌの「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」で満たす。該「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」の添加２日後、該上清を３８４ウエルプレート（Greiner社）中に回収し、ＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡの次の工程まで、−８０℃で保存する。該感染物をすすぎ、培地回収段階を、TECAN Freedomピペット（TeMO96、TeMO384及びRoMaを搭載したTecan Freedom 200、Tecan AG社、Switzerland）を用いて実施する。２５μｌの回収上清をＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡに使用する。ＥＬＩＳＡ段階を、実施例１に示すように実施する。
【０１４０】
該「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」を、１０％ＦＢＳ（Invitrogen社）並びにペニシリン（１００単位／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Invitrogen社）を添加したＲＰＭＩ培地（Invitrogen社）で浮遊培養した継代８〜１６代目のＴＨＰ−１細胞から産生させる。該培養物を毎週、２×１０５細胞／ｍｌの細胞密度に希釈し、１．５×１０６細胞／ｍｌを超えることを避ける。該「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」の産生は、１×１０６細胞／ｍｌの密度で、１％血清含有Ｍ１９９培地中のＴＨＰ−１細胞を播種することで開始される。播種の翌日、組換えヒトＴＮＦα（Sigma社）を、２５ｎｇ／ｍｌの終濃度になるまで、培養フラスコに添加する。前記サイトカインの添加４８時間後、該上清を回収し、次の使用まで、一定分量で、−８０℃で保存する。各「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」の新たな処理単位を、ＳＦによるそのＭＭＰ１発現誘導効率で特徴付ける。
【０１４１】
先に記載したスクリーニングプロトコルを用いて試験したコントロールプレートの成績の代表例を図７Ｂに示す。各ウエルで得られた未加工の発光シグナルを示す。ポジティブコントロールサンプルを、１つの３８４ウエルサイレンスセレクトプレートの限定的な予備スクリーニングで得た、３個の最も強力なヒットとして選択する。
厳しいカットオフを適用する、すなわち、全１４４個のネガティブコントロールの平均から１．８２倍の標準偏差を差し引く。下記のこのカットオフで得点化したサンプルを、陽性ヒットとみなす。これらの陽性ヒットを、灰色の背景上の白色の番号として示す。予想通り、本アッセイでのポジティブコントロールウイルスは非常に良好で、それぞれＰ１，Ｐ２及びＰ３ポジティブコントロールサンプルのカットオフは、８８％、８１％及び９４％のサンプルで下にある。感染ウエルに比較して非感染ウエルがより低いシグナルを示すように、ブランコサンプルはしばしば陽性の得点である。この理由は知られていない。ウイルス不在にも関わらず、サンプルが陽性となることを除外するために、定量的リアルタイムＰＣＲのウエル当たりのアデノウイルス粒子量を調べるのと同様に、ヒットウイルスが増殖する場合、細胞変性作用（ＣＰＥ）を調べることによって、全ウエルのウイルス含有量をモニターする（Maらの文献, 2000）。前記３個のネガティブコントロールウイルスについて、Ｎ１ウイルスが、毒性によって同じ擬陽性を生じる。スクリーニングの間、Ｎ１ネガティブコントロールに対する約５％の擬陽性を許容する。この実施例２においては、４８サンプル（＋／−４％）中の２サンプルが、Ｎ１コントロールに対して陽性のスコアである。
【０１４２】
３０×３８４ウエルプレート上に収容される、５０４６個の転写産物を標的化する１１，７４４個のＡｄ−ｓｉＲＮＡからなる、完全なサイレンスセレクトコレクションを、先に記載したプロトコルに従う「リバースＭＭＰ１アッセイ」で選別する。各Ａｄ−ｓｉＲＮＡプレートを、一次選別において２回重複で選別し、選別を繰り返す。そのようにして、４つのデータ点を、各々のＡｄ−ｓｉＲＮＡから得る。一次選別及び反復選別の両方での少なくとも１個のデータ点を下記の閾値で得点化した場合、Ａｄ−ｓｉＲＮＡウイルスをヒットとして選び出す。スクリーニング結果及びヒットを同定するために行った解析の代表例を図８に示す。
【０１４３】
ヒットと称するためのカットオフ値を決定するために、標準偏差に加えて、プレート上の全てのデータ点で平均を計算する。それから該平均から該標準偏差を差し引いたものとして、カットオフ値を定義する。このカットオフを、図８に示すグラフ中の横線として示す。図８に示すデータは、下記のプレート平均に対する相対的発現である：サンプルの相対的シグナル＝［（該サンプルの未加工発光シグナル）−（該プレート全体の平均シグナル）］／（該プレート全体の標準偏差）。一次選別（図８Ａ）及び該反復選別（図８Ｂ）における、全ての３８４個のＡｄ−ｓｉＲＮＡで獲得された２回反復シグナルの平均を示す。ヒットとして同定されたデータ点を丸で示す。カットオフよりも下に得点化された合計４０８個のヒットを、以下に論じる３ＭＯＩ反復選別で単離する。ほとんど全ての同じＡｄ−ｓｉＲＮＡが、一次選別及び反復選別の両方で陽性のスコアである。これらのデータは、スクリーニング及びサイレンスセレクトコレクションの質の指標となる。
【０１４４】
図９に、リバースＭＭＰ１アッセイに対するサイレンスセレクトコレクションのスクリーニングで得られた全てのデータ点を示す。一次選別（Ｙ軸）において、２回反復サンプルから得られた平均化した相対的発光を、反復選別（Ｘ軸）で得られた対応するＡｄ−ｓｉＲＮＡの平均化した相対的発光に対してプロットする。カットオフ（−１．８２倍の標準偏差）を破線で示す。ヒットとして選び出したＡｄ−ｓｉＲＮＡのデータ点を三角形で示し、ヒットでないＡｄ−ｓｉＲＮＡのデータ点を四角形で示す。一次選別のデータと反復選別のデータとの間に見られる強い対称性（該データ点は、直線の周りに集中する）は、該スクリーニングの質及び再現性の指標となる。
【０１４５】
（「３」ＭＯＩ反復選別）
先に同定した４０８個のヒットを再増殖させる。サイレンスセレクトコレクション由来のヒットしたＡｄ−ｓｉＲＮＡサンプルの粗溶解物を取り出し、９×９６ウエルプレート内のネガティブコントロールと共に配置する。未精製溶解物の容器を、バーコード（Screenmates（商標）、Matrix technologies社）で標識し、該プレート上で質のチェックを実施する。そのような「３」ＭＯＩ反復選別プレートの一般的配置を図１０Ａに示す。該ウイルスを増殖させるために、９６ウエルプレートの各ウエル内に、１０％の非加熱不活性化ＦＣＳを含む２００μｌのＤＭＥＭ中の２．２５×１０４個のPerC6.E2A細胞を播種し、１０％ＣＯ２の加湿インキュベータ内で、３９℃で一晩インキュベートする。先に記載したような９６ウエルプレートに配列させた、各々のヒットしたＡｄ−ｓｉＲＮＡからの１μｌの粗溶解物をそれから添加し、９６ウエルディスペンサーを使用して、PerC6E2A細胞のウエルを分ける。１０％ＣＯ２の加湿インキュベータ内での７日から１０日のインキュベーション後、完全なＣＰＥを観察することができたという条件で、該再増殖プレートを−２０℃で凍結させる。
【０１４６】
「３」ＭＯＩ反復選別用に、ＳＦを、滑膜細胞増殖培地（Cell Applications社）中３０００細胞／ウエルの密度で、９６ウエルプレート（Greiner社, 組織培養処理）に播種する。翌日、９６ウエルディスペンサー（TECAN freedom 200）を使用して、先に記載した再増殖プレート内に含まれる粗溶解物の３μｌ、６μｌ又は１２μｌを用いてＳＦに感染させる。感染５日後、VacuSafe装置（Integra社）を使用して該プレートから培地を除去し、２倍希釈した１００μｌのＴＮＦαを主成分とする誘起物質を添加する。２日のインキュベーション後、９６ウエルディスペンサー（TECAN Freedom 200）を使用して培地を回収し、実施例１に記載したプロトコルに従ったリバースＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡの次なる工程で使用するまで、３８４ウエルプレート中で−８０℃保存する。
【０１４７】
ＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡからのデータを以下のように解析する：ヒットと称するためのカットオフ値を決定するために、各プレートに関して、ネガティブコントロールの平均を計算する。各ＭＯＩに関して、ネガティブコントロールの３％未満が、該９プレート全体のヒットとして得点化されるような割合を選択する。該割合は、３μｌ、６μｌ及び１２μｌの感染に対して、それぞれ２３％、２６％及び１９％である。試験した４０８個のヒットの３３９個を、２回重複の１ＭＯＩで得点化し、ヒットとして同定する。それゆえ、一次選別のヒットの８４％は、再増殖させたＡｄ−ｓｉＲＮＡ物質を使用する、この３ＭＯＩ反復選別で確認する。
【０１４８】
（標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡの品質管理）
PER.C6（Ｃ）細胞の誘導体（Crucell社, Leiden, The Netherlands）を使用して、９６ウエルプレート内で標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡを増殖させ、続いて該標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡウイルスにコードされるｓｉＲＮＡの配列決定を行う。PERC6.E2A細胞を、１８０μｌのPER.E2A培地中４０，０００細胞／ウエルの密度で、９６ウエルプレートに播種する。それから細胞を、１０％ＣＯ２加湿インキュベータ内で、３９℃で一晩インキュベートする。翌日、細胞を、標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡを含むサイレンスセレクトストックからの１μｌの未精製細胞溶解物を用いて感染させる。細胞をさらに、細胞変性作用（典型的には感染７日後、該細胞の膨張及び凝集として示される）が出現するまで、３４℃、１０％ＣＯ２でインキュベートする。該上清を回収し、滅菌ＰＣＲチューブ内の１２μｌの粗溶解物に、４μｌの溶解緩衝液（１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Roche Molecular Biochemicals社, カタログ番号745 723）及び０．４５％のTween-20（Roche Molecular Biochemicals社, カタログ番号1335465）を添加しＭｇＣｌ２を含有する１×エクスパンドハイフィデリティー（Expand High Fidelity）緩衝液（Roche Molecular Biochemicals社, カタログ番号1332465）、を添加することによって、該ウイルス粗溶解物を処理する。これらのチューブを５５℃で２時間インキュベートし、続いて９５℃で１５分間の不活化を行う。ＰＣＲ反応用に、１μｌの溶解物を、ＭｇＣｌ２を含む５μｌの１０×エクスパンドハイフィデリティー緩衝液、０．５μｌのｄＮＴＰミックス（各ｄＮＴＰは１０ｍＭ）、１μｌの「フォワードプライマー」（１０ｍＭストック、配列：5' CCG TTT ACG TGG AGA CTC GCC 3'）（配列番号：８７９）、１μｌの「リバースプライマー」（１０ｍＭストック、配列：5' CCC CCA CCT TAT ATA TAT TCT TTC C）（配列番号：８８０）、０．２μｌのエクスパンドハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼ（３．５Ｕ／μｌ、Roche Molecular Biochemicals社）、及び４１．３μｌのＨ２Ｏ、からなるＰＣＲマスターミックスに添加する。下記のように、PE Biosystems GeneAmp PCR system 9700でＰＣＲを実施する：該ＰＣＲ混合物（全量で５０μｌ）を９５℃で５分間インキュベートし；各サイクルを９５℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃４分で実行し、これを３５サイクル繰り返す。最後の６８℃のインキュベーションを７分間で実施する。該ＰＣＲ混合物の５μｌを、２μｌの６×ゲルローディング（gel loading）緩衝液と混合し、０．５μｇ／μｌの臭化エチジウムを含む０．８％アガロースゲル上で泳動し、該増幅産物を分離する。該増幅フラグメントのサイズを、同一ゲル上に泳動した標準ＤＮＡラダーから概算する。予想サイズは約５００ｂｐである。配列決定解析用に、前記pIPspAdapt6-U6プラスミドのSapI部位に隣接するベクター配列に相補的なプライマーを使用するＰＣＲによって、標的アデノウイルスによって発現されるｓｉＲＮＡ構築物を増幅させる。該ＰＣＲフラグメント配列を決定し、前記予想配列と比較する。全ての配列が、該予想配列と同一であることが見出される。
【０１４９】
（実施例３Ａ）：非特異的様式でＭＭＰ１発現レベルに影響を与えるヒットを除外する「リバースＭＭＰ１アッセイ」の３３９個のヒットの試験
リバースＭＭＰ１アッセイにおいてＭＭＰ１の発現の減少をもたらすような、Ａｄ−ｓｉＲＮＡによるＳＦの一般的毒性（生存率の減少）を除去するために、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega社)を使用する。このアッセイは、代謝的に活性な細胞の存在に比例して存在するＡＴＰの量に基づいて、培養物中の生存細胞の数を測定する。このアッセイにおいて、細胞を、１００μｌの滑膜細胞増殖培地（Cell Applications社）中３０００細胞／ウエルの密度で、白色の９６ウエルプレート内で培養する。一晩のインキュベーション後、細胞を、リバースＭＭＰ１アッセイから確認されたヒットを用いて感染させる。感染５日後、該培地を除去し、１％ＦＢＳを添加した５０μｌのＭ１９９培地で置き換える。該プレート及びその内容物を、室温で３０分間平衡化させる。５０μｌのcelltiter-Glo試薬を該ウエルに添加した後、暗条件下、軌道振盪機（５分）上でインキュベーションする。luminoskan Ascent （Labsystems社）照度計で、100ｍｓの積算時間で、測定を実施する。
【０１５０】
一次試験において、３ＭＯＩ反復選別プレート（図１０Ａに示す配置）内に含まれる１２μｌのウイルスを使用してＲＡＳＦを感染させ、読み出しを先に記載するように実施する。ヒットウイルスがもたらす一般的毒性を測定するために、該プレートに含まれる全てのデータ点（５０個のヒット、及び１０個のコントロール）に対するシグナルの平均化し、全てのデータ点の１．５倍の標準偏差を差し引くことによって、カットオフを計算する。一次選別におけるカットオフ値より下に得点化されたヒットは、以下のように再試験する：該ヒットを取り出し、（図１０Ｂに示す配置に従って）９６ウエルプレートに配置し、先に記載したプロトコルに従って、３ＭＯＩ（３μｌ、６μｌ及び１２μｌ）でＳＦを感染させるために使用する。反復選別用に、全てのコントロールのシグナルを平均化し、該コントロール全ての標準偏差の２倍を差し引くことによって、カットオフを計算する。１ＭＯＩで２回重複のカットオフより下に得点化されたヒットは、毒性を誘導するものとみなす。
【０１５１】
ＳＦによるＴＩＭＰ−２の分泌を測定して、リバースＭＭＰ１アッセイにおいてＭＭＰ１の発現の減少をもたらすものとしての、Ａｄ−ｓｉＲＮＡによるＳＦ分泌活性の一般的抑制因子を除去する。ＴＩＭＰ−２は、ＳＦが構成的に発現し分泌するタンパク質である。ＳＦ上清へのＴＩＭＰ−２の分泌を、分泌の小分子阻害剤であるブレフェルジンＡの添加によって阻害する。ＳＦのＴＩＭＰ−２タンパク質分泌のレベルを、ＥＬＩＳＡによって検出する。ＲＡＳＦ細胞を、１００μｌの滑膜増殖培地中３０００細胞／ウエルで、９６ウエルのゼラチン被覆プレート内に播種する。一晩のインキュベーション後、細胞を感染させ、３７℃の１０％ＣＯ２インキュベータ内で５日間インキュベートする。ウイルスを除去し、１００μｌのＭ１９９＋１％ＦＢＳ（ＨＩ）培地を、該細胞の上部に適用する。さらなる４８時間のインキュベーション後に該上清を回収し、−２０℃で保存する。実質的にはＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡに概要を示すように、ＴＩＭＰ２レベルを標準的ＥＬＩＳＡアッセイで測定する。手短に述べると、３８４ウエルの白色グライナー（Greiner）プレート（Lumitrac 600）を、ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌの抗ｈＴＩＭＰ２捕捉抗体（カタログ番号MAB9711；R&D systems社）４０μｌを用いて、４℃で一晩被覆する。８０μｌの０．１％カゼイン緩衝液を用いて室温で４時間ブロッキングし、洗浄段階（３０μｌのＥＣ緩衝液）の後、４０μｌの該サンプルを該ウエルに添加する。プレートを４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳＴ（0.05% Tween-20）及びＰＢＳでの２回の洗浄後、４０μｌのビオチン化抗ｈＴＩＭＰ２検出抗体（緩衝液Ｃ中に１００ｎｇ／ｍｌ）（カタログ番号BAF971；R&D systems社）をウエルに添加する。室温での２時間のインキュベーション後、プレートを再び洗浄し、緩衝液Ｃで１／３０００希釈した４０μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（カタログ番号SNN2004；BioSource社）の添加後、さらに４５分間室温でインキュベートする。最後に、プレートを洗浄し、５０μｌのBM Chemiluminescence ELISA substrate（ＰＯＤ）（カタログ番号1582950；Roche Diagnostic社）をウエルに添加する。暗条件下での５分のインキュベーション後、発光を照度計（Luminoscan Ascent）で定量する。
【０１５２】
これらの実験に適用した先に記載した手順（プレートの配置、ＭＯＩ、カットオフの決定方法）は、前記毒性測定（すなわち、１２μｌの感染容積、及び３μｌ、６μｌ、１２μｌの感染容積での再試験）に記載されるものと同一であるが、一次試験に適用したカットオフが、全てのサンプルの平均から、全てのサンプルの２倍の標準偏差として決定されることのみが異なる。このアッセイにおいて、該再試験における少なくとも１ＭＯＩの２回反復のカットオフより下のＴＩＭＰ２レベルの減少を媒介するウイルスは、ＳＦの一般的な分泌機構に影響を与えるものとみなす。
【０１５３】
毒性アッセイ及びＴＩＭＰ分泌アッセイで試験した３３９個のヒットからの１６個が、これらのアッセイで陽性を得点し、特定の方法で、サイトカイン誘導性ＭＭＰ１発現の減少を媒介すると考えられる。そのようなものとして、３２３個のヒットを、サイトカイン誘導性ＭＭＰ１発現の調節物質として同定し、そのうちの１６個を最も好ましいヒットとし、表１に一覧化する。
この実験から、発明者らは、これらのヒット及びそれらの発現タンパク質と関連性のある遺伝子が、これらの研究によって、ＳＦにおけるＭＭＰ１発現を調節することが示された価値ある薬剤標的であることを示すと結論を下す。
【０１５４】
【表４】
2008516593.tif 000010
【０１５５】
2008516593.tif 000011
【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
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【０１６１】
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【０１６２】
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【０１６３】
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【０１６４】
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【０１６５】
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【０１６６】
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【０１６７】
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【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０１７１】
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【０１７２】
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【０１７３】
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【０１７４】
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【０１７５】
（実施例３Ｂ）：追加アッセイ及び除外基準の適用
「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」で処理したＲＡ  ＳＦの上清がコラーゲン分解の潜在能力を有するという知見に基づき、「リバースコラーゲン分解アッセイ」を使用して、前記一次「リバースＭＭＰ１アッセイ」によって同定した３２３個のヒットをさらに優先順位づけする。天然型コラーゲンの分解は、複数のプロテアーゼ（コラゲナーゼ）によって介在され、コラーゲン分解の減少は、ＭＭＰ１発現のみの読み出しと比較して、より厳しい読み出しである。ＲＡ  ＳＦによる、サイトカイン誘導性コラーゲン分解のＲＡ  ＳＦ（ＫＤウイルスを用いる）におけるターゲット発現減少の効果を、社内で開発したアッセイを使用して試験する。このアッセイにおいて、ＦＩＴＣ標識天然型コラーゲンの分解は、蛍光シグナルの増加を生じる。（このアッセイのプロトコルを、実施例６の説明に詳細に記載する（図１２））。
【０１７６】
「リバースＭＭＰ１アッセイ」で同定した３２３個のヒットＫＤウイルスを、各プレートが、４個のポジティブコントロールウイルスと１６個のネガティブコントロールウイルスと共に６０個のヒットウイルスを含むような、９６ウエルプレート（「ヒットプレート」）内に並べる。完全滑膜成長培地（Cell Applications社）中、３０００細胞／ウエルの密度で９６ウエルプレート内に播種したＲＡ  ＳＦを、その翌日、該「ヒットプレート」に含まれる５μｌ又は１０μｌのウイルスで感染させる。適用したウイルスを、６１個の中性ウイルス（neutral virus）Ad5-ルシフェラーゼ-v13_KDの添加によって完全化する。このコレクションは、観察された効果が、前記細胞に適用したウイルスと異なる結果にならないことを保証する。感染５日後、活性化段階を実施する。この段階は、全てのウエルにおいて、１５μｌの「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」を添加した４５μｌのＭ１９９培地による、前記成長培地の置換を含む。４日後、該上清を回収し、図１２に示す実験に記載するプロトコルに従った、小規模型コラーゲンＩ型分解アッセイに適用する。各標的ＫＤウイルスの２つの独立な増殖物質を両方のＭＯＩで２回試験し、各ＭＯＩにつき４個のデータ点を生じさせる。該結果を以下のように解析する：各プレートに、全てのネガティブコントロールの平均から全てのネガティブコントロールの標準偏差の２．１倍（感染５１個）又は１．６倍（感染１０１個）を差し引いたものよりも低い蛍光値に対応するサンプルを、本アッセイで陽性反応を与えるものみなす。本アッセイで陽性の読み出しを与える４個のデータ点のうちの３個を生じさせる全ての標的ＫＤウイルスを、ＲＡ  ＳＦによる「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」誘導性コラーゲン分解を有意に減少させるものとみなす。あるいは、試験した各ＭＯＩで、本アッセイで（４個のデータ点のうち）２個の陽性反応を生じさせる全ての標的ＫＤウイルスを、コラーゲン分解を有意に減少させるものとみなす。試験した３２３個の標的ＫＤウイルスの１９２個が、ＲＡ  ＳＦによる「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」誘導性コラーゲン分解を有意に減少させた。
【０１７７】
好ましいヒットを選択するために、発明者らは、ＲＡ  ＳＦによる、ＬＰＳ誘導性又はＴＮＦα誘導性のＩＬ８発現における（ＫＤウイルスを用いる）ＲＡ  ＳＦの標的発現減少効果を試験する第二アッセイを使用した。このアッセイは、（１）病原体に対する患者の反応にＬＰＳシグナル伝達が必要であり、その完全な阻害は患者の自然免疫を損なう恐れがあるので、選択した標的ＫＤウイルスが、ＲＡ  ＳＦにおけるＬＰＳシグナル伝達をそれほど阻害しないことを確認し；かつ（２）該標的が、炎症マーカーのＴＮＦα誘導性発現を促進しないことを確認する。ケモカインＩＬ８を、このアッセイの読み出しとして選択する。このケモカインは、炎症部位（ＲＡの場合では関節）への免疫系細胞（例えば、単球、好中球）の動員に役割を担い、局部的な炎症をｓらに増加させる。ＩＬ８の増加は、ＲＡ治療の望む特性ではない。
【０１７８】
「リバースＭＭＰ１アッセイ」で同定し、「リバースコラーゲン分解アッセイ」で陽性の読み出しを与えた標的ＫＤウイルスを、以下のようなＬＰＳ／ＴＮＦα誘導性ＩＬ８アッセイで試験する：各プレートが、２０個のネガティブコントロールウイルスと共に６０個の標的ウイルスを含むような、９６ウエルプレート（「ヒットプレート」）内に、１９２個の標的ＫＤウイルスを並べる。１日目に、ＳＦ（継代９〜１２代目）を、完全滑膜成長培地（Cell Applications社）中、１ウエルあたり３０００細胞の密度で、９６ウエルプレート内に播種する。翌日、該細胞を、先に記載した９６ウエルプレート内に並べた標的ＫＤウイルスの２種類の量（６μｌ又は１２μｌ）で感染させる。その後、各ウエルでの、１０％胎児ウシ血清（加熱不活化済）及び誘発物質（２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦα又は１μｇ／ｍｌのＬＰＳ）を添加した１５０μｌのＤＭＥＭでの成長培地の置換を含む活性化段階前の５日間、該細胞をインキュベートする。活性化段階の４８時間後、８０μｌの上清を回収し、これを希釈したものを、図１３に示す実験に記載したようなＩＬ−８  ＥＬＩＳＡに使用する。ＴＮＦαを用いて誘起させたサンプル用に、４０倍希釈物をＰＢＳ＋１％ＢＳＡで作成し、ＬＰＳサンプル用に、１６倍希釈を実施する。これらの希釈物からの３５μｌを、ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡに使用する。２つの独立に調製した前記標的ＫＤウイルスを、２ＭＯＩで２回の独立実験で試験し、試験した各標的ＫＤウイルスのＭＯＩにつき、４個のデータ点を生じる。
【０１７９】
以下のようにデータを解析する：前記標的の発現を減少させるように設計したＫＤウイルスを含む９６ウエルプレートも、２０個のネガティブコントロールを含んだ。以下のように、ＩＬ８発現の阻害割合を、ネガティブコントロールウイルスに対する相対的割合として計算する：はじめに、（ＩＬ８不在下での）該ＥＬＩＳＡのバックグラウンドシグナルを、全てのサンプルの全ての値から差し引く。その後、全てのプレートに下記式を適用する：％阻害＝［１００×（（（全てのネガティブコントロールの平均値）−標的サンプル値）／（全てのネガティブコントロールの平均値））］。ＴＮＦα誘導性及びＬＰＳ誘導性ＩＬ８アッセイにおけるそれらの成績によって、全ての標的ＫＤウイルスを順位づけする。ＲＡ  ＳＦによる、ＴＮＦα誘導性ＩＬ８発現の強力な増加を生じさせる標的ＫＤウイルスの５％と同様に、ＬＰＳ誘導性ＩＬ８の強力な阻害を与える標的ＫＤウイルスの１０％はより好ましくないとみなす。そのようなものとして、このアッセイで試験した１９２個の標的ＫＤウイルスのうちの４０個を、より好ましくないとみなす。さらに、本発明をさらなる特異性で規定するのに使用する除外基準を、以下に記載する。
【０１８０】
本発明で同定したターゲットは、ＲＡの治療用に開発した小分子阻害剤の同定に基づくことを示す。そのようなものとして、ヒトでの実験を実施する前に、関節炎の実験的モデルにおいて、そのようなＲＡ治療の新たな候補を試験することが必要である。一般的には、ラット又はマウスにけるコラーゲン誘導性関節炎モデルを、関節炎の実験的モデルとして使用する。その結果として、ラット又はマウスにおいてオルソログを見出すことができなかったターゲットは、あまり好ましくない。（実験カスケード（「リバースＭＭＰ１」一次アッセイ、「リバースコラーゲン分解」二次アッセイ、及び「ＴＮＦα／ＬＰＳ  ＩＬ８誘導アッセイ」）を通じて同定した）１５２個の標的の解析は、２７個がラット又はマウスでオルソログがなく、１２５個のみが好ましい標的であることを示した。さらなる除外基準は、以下のインシリコ（in silico）解析を含む：
【０１８１】
「薬剤利用可能性」。本開発の小分子阻害剤が、短い時間枠内で最も成功見込みのないことを測定できた場合、標的を除外した。この解析は、薬理学的慣例に基づき、特定のターゲットが属する遺伝子クラスの一般的な薬剤利用可能性の評価を含んだ。さらに、ターゲットの小分子阻害剤の発見を可能にさせるアッセイの存在を調査する。発明者らは、このアッセイに使用した１２５個のターゲットのうち６９個がアッセイに利用可能であることを見出した。
【０１８２】
「危険特性（Risk profile）」。対応する「ノックアウトマウス」の表現型が疾患性又は致死性である標的遺伝子は、小分子を用いてのこれらの遺伝子産物の阻害が、この表現型の部分的な原因となることが予想されるので、より低い優先順位を有するとみなす。前記細胞又は生物体の基礎代謝機能に重要な役割を果たすターゲットもまた、より低い優先順位を与える。危険特性は、解析した６９個の標的のうち１８個で高いとみなす。
「疾患関連性」。既に、炎症過程又は自己免疫過程に関連するターゲットは、より好ましいとみなす。
実験及び解析なしで済ませたセットは、３２３個の標的のリストから、１６個の最も好ましいターゲットの現在のセットの限定を許容した。
【０１８３】
（実施例４）：ＲＡ患者の滑膜由来のヒト初代滑膜性線維芽細胞で同定した特定標的の発現レベルの解析
特定の同定した標的の発現レベルを、初代ヒト滑膜性線維芽細胞の少なくとも２種の異なる分離体で測定する。
ＲＡＳＦ分離体を、Cell Applications 社（カタログ番号 404-05）製の凍結保存された継代２代目として得る。これらの細胞を培養し、１０％（ｖ／ｖ）加熱不活化済ＦＢＳ（ＩＣＮ社）及び１×Pen/Strep (Invitrogen社)を添加したＤＭＥＭ（Invitrogen社）中で増殖させる。発現解析用に、細胞を継代１１代目まで培養する。
【０１８４】
ＲＮＡ調製用に、初代ヒト滑膜性線維芽細胞を、６ウエルプレート内の１０ｃｍのペトリディッシュ（５００，０００細胞／ディッシュ）に播種する。一晩のインキュベーション後、培地を、１×Pen/Strepを含む１％（ｖ／ｖ）加熱不活化済ＦＢＳを添加する、６ｍｌのＭ１９９培地で交換する。２４時間後、総ＲＮＡを、ＳＶ  ＲＮＡ単離キット（Promega社）を使用して抽出する。
【０１８５】
各々のサンプル中のＲＮＡ濃度を、「リボグリーンＲＮＡ定量キット（Ribogreen RNA quantitation kit）」（Molecular Probes社）を使用して、蛍光分析的に定量する。各標本由来の同等量のＲＮＡを、Applied Biosystems社製の「タックマン逆転写キット（Taqman reverse transcription kit）」を用いて、第一鎖ｃＤＮＡへと逆転写する。手短に述べると、５０ｐｍｏｌのランダム六量体、１０ＵのＲｎａｓｅ阻害剤、２５Ｕのマルチスクライブ逆転写酵素、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び各々０．５ｍＭのｄＮＴＰを含む、２０μｌの反応混合物につき４０ｎｇのＲＮＡを含ませる。該反応混合物を２５℃で１０分間インキュベートし、続いて４８℃で３０分間インキュベーションし、サーモサイクラー（thermocycler）（Dyad, MJ Research社）で逆転写酵素の熱不活化（５分、９５℃）させる。該プログラム終了後、反応物をすぐに４℃まで冷却する。得られたｃＤＮＡの複数回の凍結／融解サイクルを避けるため、異なるサンプルを９６ウエルプレート内に貯蔵し、一定分量に分け、−２０℃で保存する。
【０１８６】
「ABI PRISM 7000配列検出システム分析機器（ABI PRISM 7000 Sequence Detection System Instrument）」を使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を行う。設計前の、遺伝子特異的タックマンプローブ（Taqman probe）及び定量的遺伝子発現のプライマー対を、「応需型アッセイ（Assays on Demand）」遺伝子発現産物の一部として、Applied Biosystems社から購入する。これらの市販のキットは供給業者によって質が調べられており、本サンプル中の標的ｃＤＮＡの量の定量的測定を可能にさせる。「応需型アッセイ」遺伝子発現産物を、供給業者から届けられたプロトコルに従って使用する。該ＰＣＲ混合物は、総量２５μｌ中の、１×「（タックマンユニバーサルＰＣＲマスターミックスno AmpErase UNG）Taqman Universal PCR Mastermix no AmpErase UNG」及び１×「タックマン遺伝子発現応需型アッセイミックス（Taqman Gene Expression Assay on Demand mix）」並びに（１〜１００ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡへと転換した）５μｌのレトロ転写反応産物からなる。９５℃１０分間の開始変性段階の後、９５℃１５秒間及び６０℃１分間からなる４０サイクルで、該ｃＤＮＡ産物を増幅させる。異なるサンプル間における、ｃＤＮＡの開始量の可変性を標準化するために、製造業者の説明書に従い、前開発型β−アクチン「応需型アッセイ」プライマーセット及びタックマンプローブ並びに「タックマンユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Taqman Universal PCR Mastermix）」（全てApplied Biosystems社）を使用して、同じｃＤＮＡを用いる増幅反応を、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンで実施する。剰余のゲノムＤＮＡから生じる全ての混入を同定するため、同条件ではあるが該逆転写酵素を添加しない条件下で実施するコントロール（−ＲＴ）逆転写反応由来産物を用いたリアルタイムＰＣＲ反応を、各サンプルに含ませる。閾値サイクル値（Ｃｔ）は例えば、各サンプルに関して、興味のある遺伝子の増幅量が固定した閾値に達したサイクル数を測定する。各サンプルに関して、該標的遺伝子から得られたＣｔ値から内因性コントロール（βアクチン）のＣｔ値を差し引くことによって、ΔＣｔ値を測定する。活性型であろうとなかろうと、このヒットで得られたΔＣｔ値が、利用可能な２つの滑膜性分離体の少なくとも１つで１３．３よりも低い場合、遺伝子は初代ヒトＳＦで発現しているものとみなす。９．９よりも低いΔＣｔ値を有する遺伝子は、ＲＡＳＦにおいて高度に発現しているものとみなす。発現プロファイリング実験の結果を、表５に要約する。非誘発型ＳＦの２つの分離体における様々な標的で得られたβ−アクチンと比較したΔＣｔ値を、この表５に記載する。
【０１８７】
【表５】
2008516593.tif 000031
【０１８８】
（実施例５）：ILK、CHRNA5、NQO2、KCNF1、SLC9A8、ARAF1、AXL、FGFR3、NR2F6、SCN9A、MAPK13及びDGKBのＲＡＳＦ発現のＡｄ−ｓｉＲＮＡの減少は、用量依存的様式で、サイトカイン誘導性ＭＭＰ１発現を阻害する
先に記載したように、前記サイレンスセレクトコレクションのスクリーニングは、サイトカイン誘導性のＲＡＳＦ  ＭＭＰ１発現を減少させる能力を阻害するＡｄ５−ｓｉＲＮＡのセットを同定する。これらのウイルスの部分集合を、「リバースＭＭＰ１アッセイ」の用量反応実験で、様々な濃度で試験する。
【０１８９】
ＳＦ（継代９〜１０代目）を、完全滑膜成長培地（Cell Applications社）中３０００細胞／ウエルの密度で、９６ウエルプレートに播種する。翌日、増加的量（３μｌ、７．５μｌ、１２μｌ又は１５μｌ）のAd5-MMP1_v10_KD (ポジティブコントロール)又はAd5-ルシフェラーゼ_v13_KD (ネガティブコントロール)を用いて、該細胞を感染させる。中性ウイルスAd5-ルシフェラーゼ_v13_KDの添加によって該添加ウイルスを補正し、各ウエル中の該細胞上の最終ウイルス容積を１５μｌにする。このコレクションは、観察された効果が、該細胞に適用したウイルスの違いから生じたのではないことを保証する。それから、活性化段階前の５日間、該細胞をインキュベートする。この段階は、全てのウエルにおける、２５μｌの「複合的誘発物質」を添加した７５μｌのＭ１９９培地での前記成長培地の置換を含む。該活性化段階の４８時間後、該上清を回収し、先に記載したように、ＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡに使用する。図１１Ａは、２回反復の平均を示す。
【０１９０】
この実験は明らかに、ＲＡＳＦへの増加的量のＡｄ５−ｓｉＲＮＡの適用が、ＲＡＳＦにおける前記標的の発現の減少の増大をもたらすことを示す。この場合において、該細胞に増加的量のAd5-MMP1_v10_KDを適用することは、該細胞内のＭＭＰ１タンパク質発現の高度な減少をもたらす。（図１１Ａ）まとめると、ＲＡＳＦに適用する増加的量のＡｄ５−ｓｉＲＮＡが、ＲＡＳＦにおける標的の発現の減少の増大をもたらすにつれて、表１に一覧化した遺伝子を標的化する増加的量のＡｄ５−ｓｉＲＮＡもまた、サイトカイン誘導性ＭＭＰ１発現の減少の増大をもたらすことが予想される。そのような容量反応実験の結果を、図１１Ｂに示す。
【０１９１】
これらの容量反応実験で使用するＡｄ−ｓｉＲＮＡを、WO03/020931に記載される手順に従って作成する。ｓｉＲＮＡ上に設計し、組換えアデノウイルスを作成するために使用したこれらの遺伝子の標的配列を表１に一覧化する。表１に一覧化した複数のＡｄ−ｓｉＲＮＡ標的化遺伝子を使用して該細胞を感染させるという違いのみを有するポジティブコントロール及びネガティブコントロールに関して、前記ＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡにおけるＡｄ５−ｓｉＲＮＡ効率を、先に記載したように試験する。該細胞を感染させるために使用するウイルスを、ネガティブコントロールとして使用するAd5-eGFP-v5_KD、Ad5-ルシフェラーゼ-v13_KD及びAd M6PR-v1_KD、並びにポジティブコントロールとして使用するAd5-MMP1-v10_KDと共に、図１１Ｂに示す。該実験結果を図１１Ｂに示す。
【０１９２】
図１１Ｂに示すデータを以下のように計算する：解析した各々のプレートに関して、１５μｌでのAd5-MMP1_v10-KD（ポジティブコントロール）の未加工シグナル（ＲＬＵ）を、最も可能性の低いシグナル（すなわち、獲得し得るＭＭＰ１発現の最も大幅な減少）とみなし、それゆえ、本アッセイのバックグラウンドとして設定する。このプレートの全てのシグナルを、このバックグラウンドシグナルから調整する。それから各々のＭＯＩに関して、特定のAd5-標的-KDウイルスから得られるシグナルを、同プレート上から得られるネガティブコントロールウイルス（Ad5-eGFP-v5_KD、Ad5-ルシフェラーゼ-v13_KD又はAd-M6PR-v1_KD）のシグナルに対して標準化する（除算する）。図１１Ｂは、ＲＡＳＦ内のILK、CHRNA5、NQO2、KCNF1、SLC9A8、ARAF1、AXL、FGFR3、NR2F6、SCN9A、MAPK13及びDGKBの発現における減少を媒介するＡｄ−ｓｉＲＮＡウイルスが、これらの細胞によるサイトカイン誘導性ＭＭＰ１発現の有意な減少をもたらすことを示す。明らかに、より多量のＡｄ５−ｓｉＲＮＡは、ＭＭＰ１発現レベルのより大幅な減少をもたらす。これらの結果は、該細胞に適用したＡｄ５−ｓｉＲＮＡの量が、得られたＭＭＰ１発現の減少の強度を決定することを示す。
【０１９３】
この実験から発明者らは、これらの遺伝子が、ＳＦにおけるＭＭＰ１発現を調節することが示された価値ある薬剤標的であることを示し、小分子化合物などの阻害剤によるこれらの遺伝子由来のタンパク質産生の活性阻害は、「リバースＭＭＰ１アッセイ」における「複合サイトカイン」誘導性ＭＭＰ１発現を減少させることが予測される、と結論を下す。また発明者らは、そのような作用物質によるこれらの遺伝子由来のタンパク質産物の活性阻害もＲＡ患者に観察される関節変性を減少させるであろうと考える。
【０１９４】
表１は、表１で特定した全ての標的遺伝子から得られた複数のＫＤ配列を一覧化する。異なるＡｄ−ｓｉＲＮＡを、ターゲットｍＲＮＡ内の異なる標的配列から作成する。Ａｄ−ｓｉＲＮＡウイルスのいくつかは、「リバースＭＭＰ１アッセイ」で有効性を示すが、発明者らは、これらのＡｄ−ｓｉＲＮＡウイルスのいくつかが、「リバースＭＭＰ１アッセイ」で有効性を示さないことを観察する。しかしながら、全てのｓｈＲＮＡが、標的の発現を減少させるのに有効ではないことは理解すべきである。ｓｉＲＮＡ分解機構に対する標的ＲＮＡの物理的利用可能性（例えば、他の細胞性タンパク質に密接に近接する及び／又は該タンパク質に結合する全てのターゲットｍＲＮＡの３次元的折り畳みであり、ｓｉＲＮＡの会合用の結合部位を提供するために、ｍＲＮＡの画分のみを「曝露」させてよい）、該標的タンパク質の効力、特定のｓｈＲＮＡそれ自体に影響を与える分解過程などを含む、ノックダウン効率におけるこの差をもたらす多くの原因があり得る。より詳細には、「リバースＭＭＰ１アッセイ」における特定のＡｄ−ｓｉＲＮＡの低効率は、該細胞によるサイトカイン誘導性ＭＭＰ１発現を減少させるのに必要とされる標的遺伝子発現の減少レベルによって説明可能である。いくつかの標的は、ＭＭＰ１経路を遮断するのに５０％の減少のみを必要とする可能性があるが、他の標的は、同効果を達成するのに９０％を必要とする可能性がある。いくつかの標的は、標的の減少を補う代謝経路に関与する可能性があるが、他の標的にはない。結果として、高用量でこれらのウイルスを試験することは、リバースＭＭＰ１アッセイでより高い効率をもたらす可能性がある。
【０１９５】
（実施例６）：  ILK、CHRNA5、NQO2、KCNF1、SLC9A8、ARAF1、AXL、FGFR3、NR2F6、SCN9A、MAP12、MAPK13及びDGKBのＲＡＳＦ発現のＡｄ−ｓｉＲＮＡ誘導性の減少は、サイトカイン誘導性コラーゲン分解を阻害する
特定のＭＭＰ亜型（例えば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１３）はコラゲナーゼであり、顕著な天然型コラーゲン分解能力を有する。天然型コラーゲンは、タンパク質分解事象に非常に抵抗性である、安定な線維内に組織化される。そのようなものとして、天然型コラーゲンの分解を使用して、ＭＭＰ１のみならず、ＲＡＳＦによって産生されるコラゲナーゼの完全な補完物をモニターする。本明細書に記載するのは開発したアッセイであり、ＲＡＳＦ培養上清中での、天然型コラーゲンのサイトカイン誘導性の分解を検出する。
【０１９６】
「小規模型コラーゲンＩ型分解アッセイ」プロトコル：（特に明記しない場合、試薬類はChondrex社, Redmond社, Washington社 (コラゲナーゼアッセイキット)製である）。９６ウエルプレート（Ｖ−ボトム（V-bottom）, Greiner）の１ウエルあたりを、９μｌの溶液Ｂ及び１μｌのトリプシン溶液で満たす。ウエル毎に１０μｌのサンプル（ＲＡＳＦ上清）を添加し、続いて３４℃で１５分間インキュベーションする。インキュベーション後、１μｌのＳＢＴＩを添加する。２０μｌのＦＩＴＣ−コラーゲン混合物（１０μｌのＦＩＴＣ標識コラーゲンＩ型＋１０μｌの溶液Ａ）を該活性化サンプルに添加し、続いて３４℃で２４時間のインキュベーションを行う。１μｌの１，１０フェナントロリンを、該反応混合物に添加する。１μｌのエンハンサー溶液（エラスターゼ）を添加し、続いて３４℃で３０分間インキュベーションする。該反応混合物が室温の時点で、４０μｌの抽出緩衝液を添加し、該プレートを密封（ヌンクシール（Nunc seals））し、ボルテックスする。４０００ｒｐｍで２５分間の遠心分離（ベックマン遠心機（Beckman centrifuge））後、５０μｌの上清を黒色Ｆ−ボトムプレート（Greiner社）へと移し、蛍光をフルオスターリーダー（Fluostar reader）（BMG社）で測定する（４８０ｎｍの励起波長、５２０ｎｍの発光波長）。
【０１９７】
「小規模型コラーゲンＩ型分解アッセイ」におけるＡｄ５−ｓｉＲＮＡ効率を、以下のように試験する：ＳＦ（継代９〜１０代目）を、完全滑膜成長培地（Cell Applications社）中３０００細胞／ウエルの密度で、９６ウエルプレート内に播種する。翌日、該細胞を、図１２Ａに示す５μｌ又は１０μｌのＡｄ−ｓｉＲＮＡで感染させる。これらのＫＤウイルスを、１２個のネガティブコントロールウイルスと共に９６ウエルプレート上に並べる。該添加ウイルスを、中性ウイルスAd5-ルシフェラーゼe-v13_KDの添加によって補正し、全てのウエルで、該細胞上の最終容量を１５μｌにする。このコレクションは、観察される効果が、該細胞に適用する該ウイルス添加における差からは生じないことを保証する。それから、活性化段階前に、該細胞をインキュベートする。この段階は、全てのウエルでの、１５μｌの「複合的誘発物質」を添加した４５μｌのＭ１９９培地による、前記成長培地の置換を含む。４日後、該上清を回収し、先に記載したプロトコルに従って、小規模型コラーゲンＩ型分解アッセイに使用する。該結果を以下のように解析する：１２個のネガティブコントロールから得られた蛍光シグナルを、全てのプレートに関して平均化する。各々のプレート及び各々のＭＯＩ（５μｌ又は１０μｌ）に関して、表１に一覧化した遺伝子を標的化するＫＤウイルスを用いて感染させた細胞から放出されるサンプルで観察された蛍光シグナルを、ネガティブコントロールの平均パーセント（１００％に設定）として表現する。図１２Ａに示すデータは、２回重複測定の平均値である。表２に一覧化する遺伝子を標的化するＡｄ−ｓｉＲＮＡは、初代ヒトＳＦによる、複合的誘発物質誘導性コラーゲン分解の明らかな減少を媒介する。発明者らはこの実験から、これらの遺伝子は、ＲＡＳＦによるＭＭＰ１発現のみならず、ＲＡＳＦによるコラーゲン分解もまた調節することが示される価値ある薬剤標的を示すと結論を下す。同様に、小分子化合物などの阻害剤によるこれらの遺伝子のタンパク質産物の活性の阻害は、ＳＦによる「複合サイトカイン」誘導性コラーゲン分解を減少させることを予測させる。また、発明者らは、そのような作用物質によるこれらの遺伝子のタンパク質産物の活性の阻害が、ＲＡ患者において観察される関節変性を減少させるであろうと考える。
【０１９８】
同様な実験（図１２Ｂ）において、Ad5-MMP1 v1O-KDウイルスは、ＳＦによるサイトカイン誘導性コラーゲン分解を大幅に減少させることを示し、これはＭＭＰ１が、ＳＦによるサイトカイン誘導性コラーゲン分解に関与する主要なコラゲナーゼであることを示唆する。この実験を、図１２Ａに示す実験に記載するプロトコルに従って実施する。図１２Ｂに示すデータは、８個のデータ点から放射される未加工蛍光シグナル全体の平均及び標準偏差である。そのようなものとして、この実験は、ＭＭＰ１発現のＳＦの調節が、ＲＡに関連する軟骨変性を減少させるのに十分であることを示す。そのようなものとして、ＲＡＳＦによるＭＭＰ１の減少は、骨及び軟骨の主要構成要素の１つである天然型コラーゲンの減弱された分解の前兆である。
【０１９９】
（実施例７）：Ａｄ−ｓｉＲＮＡによる、ARAF1、CHRNA5、DGKB、FGFR3、ILK、KCNF1、MAPK12、MAPK13、NQO2、NR2F6及びSCN9AのＲＡＳＦにおける発現の減少は、サイトカイン誘導性ＩＬ−８発現を阻害する。
（先の実施例に記載した実験に従い同定した）ターゲットの特性（profile）をよりよく理解するために、並びにＭＭＰ１とは異なる別の炎症性マーカーであるＩＬ８のターゲット発現減少効果の特異性を調べるために、下記の実施例を使用する。このサンプルは、ＲＡ  ＳＦでのＴＮＦα誘導性ＩＬ８発現におけるターゲット発現減少の効果を測定する。ＩＬ８の発現はＴＮＦαによって増加し、炎症性事象に役割を担う。さらに、ＩＬ８受容体の小分子阻害剤は、関節炎の動物モデルにおいて効力を有することが示されている（Weidner-Wells MAらの論文, Bioorg Med Chem Lett. (2004)14:4307-11、「小分子インターロイキン−８（ＩＬ−８）受容体アンタゴニストの新規クラスである、３，５−ジアリールイソオキサゾール及び３，５−ジアリール−１，２，４−オキサジアゾールの合成並びに構造−活性関連性」を参照されたい）。そのようなものとして、ＩＬ８発現阻害を達成することは、ＲＡ治療の望ましい特徴である。
【０２００】
「ＩＬ−８アッセイ」プロトコル：ＳＦ（継代９〜１２代目）を、完全滑膜成長培地（Cell Applications社）中３０００細胞／ウエルの密度で、９６ウエルプレート内に播種する。翌日、該細胞を、２種類の量（６μｌ又は１２μｌ）のＫＤウイルスで感染させる。それから活性化段階前の５日間、該細胞をインキュベートする。該活性化段階は、全てのウエルでの、１０％胎児ウシ血清（加熱不活化済）及び誘発物質（２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦアルファ）を添加した１５０μｌのＤＭＥＭでの該成長培地の置換を含む。活性化段階の４８時間後、８０μｌの上清を回収し、以下に記載するようなＩＬ−８  ＥＬＩＳＡでの使用のために希釈する。ＴＮＦαで誘起させたサンプル用に、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで４０倍希釈液を作成する。これらの希釈液からの３５μｌを、ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡプレートに添加する。
【０２０１】
白色ルミトラック６００（Lumitrac 600）３８４ウエルプレート（Greiner社）を、０．５μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−８抗体MAB208（R&D社）で被覆する。該抗体を、１×ＰＢＳ（Gibco社）で希釈する。４℃で一晩のインキュベーション後、プレートを、１×ＰＢＳＴ（１０ＬのミリＱ中に、８０ｇのＮａＣｌ、2gのＫＣｌ (Sigma社)、１１．５ｇのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２０及び２ｇのＫＨ２ＰＯ４；pH 7.4 ＝１０×ＰＢＳ溶液＋０．０５％のtween (sigma社)）で１回、ＰＢＳ１×で１回洗浄し、８０μｌのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ＋５％スクロース＋０．０５％ＮａＮ３）でブロッキングする。翌日、該プレートを逆さにして該ブロッキング緩衝液を該ＥＬＩＳＡプレートから取り除き、吸収紙上で軽くたたく。該プレートを、９０μｌのＰＢＳＴと、９０μｌのＰＢＳ１×で洗浄する。その直後、該プレートに３５μｌの希釈上清を添加することによってさらに処理する。４℃で一晩のインキュベーション後、該プレートを（先に記載したように）ＰＢＳＴで１回、ＰＢＳで１回洗浄し、１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中の３５μｌ／ウエルのビオチン化抗ＩＬ８抗体溶液BAF208（R&D社）５０ｎｇ／ｍｌと共にインキュベートする。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを先に記載したように洗浄し、５０μｌ／ウエルのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（Biosource社）と共にインキュベートする。ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートを、１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１／２０００倍希釈する。４５分後、プレートを先に記載したように洗浄し、５０μｌ／ウエルのBM Chem ELISA基質（Roche社）と共に５分間インキュベートする。ルミノスキャン上昇照度計(Labsystems社)を用いて、１００ｍｓの積算時間で、読み出しを実施する。
【０２０２】
該９６ウエルプレート内に、２０個のネガティブコントロールを含ませる。ＩＬ８発現の阻害割合を以下のように計算する。はじめに、ＥＬＩＳＡのバックグラウンドシグナル（ＩＬ８不在下）を、全てのサンプルの全ての値から差し引く。それから下記式を適用する：％阻害＝［１００×（（（全てのネガティブコントロールの平均値）−ターゲットサンプルの値）／（全てのネガティブコントロールの平均値））］。図１３に示す結果から、発明者らは、ほとんどのターゲットの発現が、MAPK12、MAPK13及びARAF1に見られる最も強力な効果、並びにSLC9A8及びAXLに見出される最も弱い効果を伴って、減弱されたＴＮＦα駆動性ＩＬ８発現を媒介したと結論を下す。
【０２０３】
【表６】
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【０２０４】
以下の配列は、配列番号：１〜２４４に対応する：
【表７】
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【０２０５】
【表８】
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【０２０６】
【表９】
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【０２０７】
【表１０】
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【０２０８】
【表１１】
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【０２０９】
【表１２】
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【０２１０】
【表１３】
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【０２１１】
【表１４】
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【０２１２】
【表１５】
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【０２１３】
【表１６】
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【０２１４】
【表１７】
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【０２１５】
【表１８】
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【０２１６】
【表１９】
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【０２１７】
【表２０】
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【０２１８】
【表２１】
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【０２１９】
【表２２】
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【０２２０】
【表２３】
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【０２２１】
【表２４】
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【０２２２】
【表２５】
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【０２２３】
【表２６】
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【０２２４】
【表２７】
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【０２２５】
【表２８】
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【０２２６】
【表２９】
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【０２２７】
【表３０】
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【０２２８】
【表３１】
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【０２２９】
【表３２】
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【０２３０】
【表３３】
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【０２３１】
【表３４】
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【０２３２】
【表３５】
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【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】正常な関節と、関節リウマチにおけるその変化の模式図（Smolen及びSteinerの文献, 2003より）。
【図２】滑膜性線維芽細胞によるＭＭＰ１発現の性質決定。パネルＡにおいて、ＳＦ溶解物中に存在するＭＭＰ１のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲで測定する。これらのＭＭＰ１レベルを、同サンプルのリアルタイムＰＣＲによって同様に測定した１８Ｓのレベルに対して標準化する。パネルＢは、ＭＭＰ１特異的ポリクローナル抗体を使用するＭＭＰ１タンパク質レベルの検出用ウエスタンブロッティングに使用した上清から検出されたＭＭＰ１シグナルを示す。パネルＣは、市販のＭＭＰ１「活性ＥＬＩＳＡ（activity ELISA）」（Amersham Biosciences社）に前記上清を適用した結果を示す。示されたシグナルは、試験したサンプルに存在するＭＭＰ１活性に比例する。
【０２３４】
【図３】様々なモデルアデノウイルスを用いて誘起させたＳＦによるＭＭＰ１の発現増加。非感染ＳＦ、及び表示のモデル組換えアデノウイルスを用いて感染させたＳＦからのＳＦ上清をＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡに適用し、発光生成基質を使用することによって測定したＭＭＰ１レベルを示す。
【図４】関節リウマチ病理に関連する様々なサイトカインを用いて誘起させたＳＦによるＭＭＰ１の発現増加。ＳＦ上清をＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡに適用し、発光生成基質を使用することによって測定したＭＭＰ１レベルを示す。白色のバーは、非処理ＳＦ、及び表示のサイトカイン又はサイトカイン群の組み合わせを用いて処理したＳＦからのＳＦ上清のＭＭＰ１レベルを示す。灰色のバーは、非処理ＴＨＰ１、又は表示のサイトカイン又はサイトカイン群の組み合わせを用いて処理したＴＨＰ１の上清を用いて処理したＳＦ上清のＭＭＰ１レベルを示す。
【０２３５】
【図５】既知の抗炎症性化合物による、ＳＦによるＭＭＰ１の「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」誘導性発現の用量依存的阻害。「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」及び様々な濃度の抗炎症性化合物を用いて処理したＳＦからのＳＦ上清をＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡに使用し、ＭＭＰ１発現阻害割合対抗炎症性化合物の対数濃度を示す。
【図６】「リバースＭＭＰ１アッセイ」を使用するサイレンスセレクトコレクションのスクリーニングの模式的説明図。
【図７】リバースＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡアッセイで得られたコントロールプレートの配置及び成績。
【０２３６】
【図８】２回反復の一次選別（Ａ）及び反復選別（Ｂ）で試験するサイレンスセレクトコレクションの３８４個のＡｄ−ｓｉＲＮＡの部分集合で実施した、リバースＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡアッセイ成績の代表例。
【図９】リバースＭＭＰ１アッセイに対するサイレンスセレクトコレクションのスクリーニングで得られた全てのデータ点を示す。一次選別（Ｙ軸）における二回重複サンプルから得られた平均化相対的発光データを、反復選別（Ｘ軸）で得られた対応Ａｄ−ｓｉＲＮＡの平均化相対的発光データに対してプロットする。
【０２３７】
【図１０】リバースＭＭＰ１アッセイの３ＭＯＩ反復選別（１０Ａ）、並びに該リバースＭＭＰ１アッセイの反復選別の細胞毒性及び分泌（１０Ｂ）用に作成したプレートの配置。
【図１１】Ａｄ−ｓｉＲＮＡによる、初代ＳＦにおけるターゲットの発現の減少が、用量依存的様式で、サイトカイン誘導性ＭＭＰ１発現を阻害する。コントロール遺伝子（１１Ａ）及び表１に一覧化した遺伝子を標的化するＡｄ−ｓｉＲＮＡの様々な量を用いて感染させたＳＦ由来の上清をＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡに使用し、ＭＭＰ１レベル（１１Ａ）又は該ネガティブコントロールに関連するＭＭＰ１レベル（１１Ｂ）を示す。
【０２３８】
【図１２】Ａｄ−ｓｉＲＮＡによる初代ＳＦにおけるターゲットの発現の減少は、サイトカイン誘導性天然型コラーゲン分解を阻害する。表示のＡｄ−ｓｉＲＮＡで感染させた「ＴＮＦαを主成分とする誘起物質」処理ＳＦ由来のＳＦ上清を、コラーゲン分解アッセイに使用する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、該コントロールに比較して、分解されたコラーゲンの割合を示す。図１２Ｂは、未処理蛍光シグナルを示す。
【図１３】Ａｄ−ｓｉＲＮＡによる初代ＳＦにおけるターゲットの発現の減少は、ＴＮＦα誘導性ＩＬ−８発現を調節する。表示のＡｄ−ｓｉＲＮＡで感染させたＳＦ由来の上清をＩＬ−８ＥＬＩＳＡアッセイに使用し、ネガティブコントロールに対するＩＬ−８発現の阻害割合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月18日(2007.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008516593000001.app
【国際調査報告】
2008516593.tif 000081
2008516593.tif 000082
2008516593.tif 000083
2008516593.tif 000084
2008516593.tif 000085
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