(57)【要約】  本発明は組み換えＦＳＨを精製するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＳＨを：
（１）イオン交換クロマトグラフィー；
（２）固定化金属イオンクロマトグラフィー；及び
（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、
にかける段階を含んで成る、組み換えヒトＦＳＨ又はＦＳＨ変異型を精製するための方法。
【請求項２】
強陰イオン交換樹脂を用いて前記イオン交換クロマトグラフィーを実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記陰イオン交換樹脂がＱセファロースＦＦ、又は類似の特性を有する樹脂である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
溶離剤としてホウ酸緩衝液を用いて前記イオン交換クロマトグラフィーを実施する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ホウ酸緩衝液のｐＨが約８.５である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
三座のキレート基を有する樹脂を用いて前記固定化金属イオンクロマトグラフィーを実施する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記キレート基がイミノ二酢酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
キレーティングセファロースＦＦ、又は類似の特性を有する樹脂を用いて前記固定化金属イオンクロマトグラフィーを実施する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃａ2+、Ｍｇ2+及びＣｏ2+から選択される金属イオンを用いて前記固定化金属イオンクロマトグラフィーを実施する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｃｕ2+を用いて前記固定化金属イオンクロマトグラフィーを実施する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
溶離剤として酢酸アンモニウムを用いて前記固定化金属イオンクロマトグラフィーを実施する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記酢酸アンモニウム緩衝液が約９のｐＨを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
フェニルセファロースＦＦ ＨＳ、又は類似の特性を有する樹脂を用いて前記疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を実施する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
溶離剤として酢酸アンモニウム（５０ｍＭ）／硫酸アンモニウム（０.２５Ｍ）を用いて前記疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
固定化金属イオンクロマトグラフィーの段階の後であって、且つ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の段階の前に実施される、２段階目のイオン交換クロマトグラフィー（２ａ）を含んで成る、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記の２段階目のイオン交換クロマトグラフィーを弱陰イオン交換樹脂を用いて実施する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記の弱陰イオン交換樹脂がＤＥＡＥセファロースＦＦ樹脂、又は類似の特性を有する樹脂である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の段階の後に実施される、逆相クロマトグラフィー（４）の段階を更に含んで成る、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
樹脂としてＳｏｕｒｃｅ３０ＲＰＣ、又は類似の特性を有する樹脂を用いて前記逆相クロマトグラフィーを実施する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
２０％（ｖ／ｖ）の２−プロパノールを含む酢酸アンモニウム（５０ｍＭ、ｐＨ約７.６）を用いて前記逆相クロマトグラフィーを実施する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
逆相クロマトグラフィーの段階の後に実施される、限外濾過（５）の段階を含んで成る、請求項１８、１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＦＳＨを：
（０）限外濾過；
（１）溶離剤としてｐＨが約８.５の約５０ｍＭのホウ酸、約０.１３ＭのＮａＣｌを用いた、ＱセファロースＦＦ上での陰イオン交換クロマトグラフィー；
（２）段階（１）の溶出液を、金属イオンとしてＣｕ++、及び溶離剤としてｐＨが約９の約０.７５Ｍの酢酸アンモニウムを用いた、キレーティングセファロースｆｆ上での固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーの段階にかけること；
（２ａ）段階（２）の溶出液を、溶離剤としてｐＨが約８.５の約０.１１Ｍの酢酸アンモニウムを用いた、ＤＥＡＥセファロースＦＦ上での陰イオン交換クロマトグラフィーの段階にかけること；
（３）段階（２ａ）の溶出液を、溶離剤としてｐＨが約８.２５の約５０ｍＭの酢酸アンモニウム、約０.２５Ｍの硫酸アンモニウムを用いた、フェニルセファロースＦＦ ＨＳ上での疎水性相互作用クロマトグラフィーの段階にかけること；
（４）段階（３）の溶出液を、ｐＨが約７.６の約５０ｍＭの酢酸アンモニウム、約２０％の２−プロパノール（ｖ／ｖ）を用いた、ＳＯＵＲＣＥ３０ＲＰＣ上での逆相クロマトグラフィーの段階にかけること；
（５）段階（４）の溶出液を、限外濾過の段階にかけること；及び
（６）段階（５）の保持液を、ナノ濾過の段階にかけること、
にかける段階を含んで成る、ヒト組み換えＦＳＨを精製するための方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法により得られる、精製された組み換えヒトＦＳＨ又はＦＳＨ変異型。
【請求項２４】
請求項２３に記載のヒトＦＳＨ又はＦＳＨ変異型を含んで成る医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の精製、特に卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の精製の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、性腺刺激ホルモンのクラスに分類される注入可能なタンパク質である。ＦＳＨは、女性及び男性患者の双方における、不妊及び生殖疾患の処置において使用される。
【０００３】
本来、ＦＳＨは下垂体により産生される。薬学的使用に対しては、ＦＳＨは組み換え技術により産生することができ（ｒＦＳＨ）、又は閉経後の女性の尿から単離することができる（ｕＦＳＨ）。
【０００４】
ＦＳＨは、女性患者において、介助生殖技術（ＡＲＴ）のための排卵誘発（ＯＩ）及び過排卵誘起（ＣＯＨ）において使用される。排卵誘発のための典型的な処置計画においては、約６〜約１２日間、ＦＳＨ又は変異型（約７５〜３００ＩＵ ＦＳＨ／日）を毎日患者に注入投与する。過排卵誘起ための典型的な処置計画においては、約６〜約１２日間、ＦＳＨ又は変異型（約１５０〜６００ＩＵ ＦＳＨ／日）を毎日患者に注入投与する。
【０００５】
ＦＳＨは、精子減少症に苦しむ男性において精子形成を誘導するためにも用いられる。週２回の２５００ＩＵのｈＣＧとの組み合わせでの、週３回の１５０ＩＵのＦＳＨを用いる投与計画は、低ゴナドトロピン性性機能低下症に苦しむ男性における精子数の改善の獲得に成功した［Ｂｕｒｇｕｅｓ他;Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｌｆ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｌｅ ｈｙｐｏｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｃ ｈｙｐｏｇｏｎａｄｉｓｍ．Ｓｐａｎｉｓｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｍａｌｅ Ｈｙｐｏｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｈｙｐｏｇｏｎａｄｉｓｍ；Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．；１９９７，１２，９８０−６］。
【０００６】
生殖疾患の処置においてＦＳＨは重要であるので、高い純度且つ高い比活性のＦＳＨの提供が望まれている。ＦＳＨ処置は、繰り返しの注入を必要とする。高度に精製されたＦＳＨ調製物は皮下に投与することができ、患者による自己投与を可能にし、これにより患者の利便性と遵守を大幅に増大させる。
【０００７】
Ｌｙｎｃｈ他［Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｌｕｔｅｉｎｉｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ;Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ,１９８８，２８８，１２−１９］は、ヒト下垂体ＦＳＨを精製するための方法を説明する。この方法は、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィーを含む。この方法では、１６ＩＵ／ｍｇのＬＨを有する４９９０ＩＵ（免疫測定）／ｍｇの比活性の下垂体ＦＳＨが得られると言われている。タンパク質含量は、乾燥重量又は溶液中における２８０ｎｍでの吸収（１ｇ／ｌに対するＡ2801cmは１に等しいとする）により決定した。
【０００８】
国際公開９８／２００３９（ＩＢＳＡ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｑｕｅ ＳＡ）は、尿抽出物から得られるヒト閉経期性腺刺激ホルモン（ｈＭＧ）と呼ばれるヒト尿由来のＦＳＨを精製する方法を説明する。この方法は、ＤＥＡＥ型の弱塩基性陰イオン交換樹脂上でのイオン交換クロマトグラフィーを使用し、リガンドとしてアントラキノン誘導体を有する樹脂上におけるアフィニティークロマトグラフィーへと続く。この方法では、ＬＨを含まない６８７０ＩＵ（免疫測定）／ｍｇの比活性を有する尿由来のＦＳＨを生成すると言われている。タンパク質含量は、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質水溶液が２７７ｎｍで０.６２の光学濃度（１ｃｍの路程を有するクオーツキュベットにおいて）を有するとして決定した。
【０００９】
国際公開００／６３２４８（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｍａｓｓｏｎｅ ＳＡ）は、ヒトの尿から得た性腺刺激ホルモン（ＦＳＨを含む）を精製するための方法を説明する。この方法は下記の段階を含む：スルホプロピル型の強陽イオン樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフィー、強陰イオン樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。８４００ＩＵ／ｍｇの比活性を有し（Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ法：Ａｓｓａｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；１９５３，５３，６０４−６１６）、且つ１ＩＵ未満のＬＨ（ラット精嚢重量増加法：Ｖａｎ Ｈｅｌｌ Ｈ，Ｍａｔｔｈｉｊｓｅｎ Ｒ ＆ ＧＡ Ｏｖｅｒｂｅｅｋ１;Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１９６４，４７，４０９）の生物活性を７５ＩＵのＦＳＨあたりに有するＦＳＨ調製物が得られることが報告されている。タンパク質含量は、Ｌｏｗｒｙ法により測定した［Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５１，１９３，２６５］。
【００１０】
米国特許第５,９９０,２８８号（Ｍｕｓｉｃｋ他）は、ヒト下垂体又はヒトの閉経後の尿などの生体サンプルから得たＦＳＨを精製するための方法を説明する。この方法は、色素（ｄｙｅ）アフィニティークロマトグラフィーを用いる。この方法では、７６６０ＩＵ（免疫測定）／ｍｇの比活性及び１ＩＵ（免疫測定）／ｍｇ未満のＬＨを有するヒト下垂体ＦＳＨ、並びに６２９８ＩＵ（免疫測定）／ｍｇの比活性及び３ＩＵ（免疫測定）／ｍｇ未満のＬＨを有する尿由来ＦＳＨが得られると言われている。タンパク質含量は、２８０ｎｍでの吸収（１ｇ／ｌに対するＡ2801cmは１に等しいとする）により決定した。
【００１１】
Ｃｈｉｂａ他［Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＨ，ＦＳＨ ａｎｄ ＴＳＨ ｆｒｏｍ ｃａｎｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｇｌａｎｄ；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｊ．，１９９７，４４，２０５−２１８］は、コンカナバリン（Ｃｏｎ）Ａアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、及びＣｕ++を用いた固定化金属イオンクロマトグラフィーを用いた、イヌ下垂体性腺刺激ホルモン（ＦＳＨを含む）を精製するための技術を説明する。その結果得られるＦＳＨは、生物活性を測定するためのＦＳＨ用の放射受容体測定及びタンパク質含量を決定するためのＢｉｏＲａｄタンパク質測定キット（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ アメリカ合衆国  カリフォルニア州）を用いた場合、２.１７ＩＵ／ｇタンパク質の比活性を有することが報告されている。
【００１２】
国際公開８８／１０２７０（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｉ Ｒｉｃｅｒｃａ Ｃｅｓａｒｅ Ｓｅｒｏｎｏ ＳＰＡ）は、尿からヒトＦＳＨを精製するための方法を説明する。この方法は、ジビニルスルホンによりセファロース４Ｂに結合するＦＳＨ特異的固定化モノクローナル抗体を用いたイムノクロマトグラフィーを含み、逆相ＨＰＬＣへと続く。その結果得られるＦＳＨは、ＬＨ及び他の尿由来のタンパク質を含まず、凍結乾燥粉末（Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ法）は６２００ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。この調製物は、皮下投与に適した（非常に純度が高いため）最初のＦＳＨ調製物であった。
【００１３】
ＦＳＨを精製するための新規の方法が、依然として必要とされている。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
本発明の目的は、組み換えＦＳＨ又はＦＳＨ変異型を精製するための新規の方法を提供することである。
【００１５】
第一の側面において、本発明は組み換えヒトＦＳＨ又はＦＳＨ変異型を精製するための方法を提供し：
（１）イオン交換クロマトグラフィー；
（２）固定化金属イオンクロマトグラフィー；
（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
の段階を含んで成り、これらの段階は任意の順序で実施することができる。
【００１６】
略語
本発明の説明において、下記の略語を用いる：
ＦＳＨ：卵胞刺激ホルモン；
ｒＦＳＨ：組み換えＦＳＨ；
ｈＦＳＨ：ヒトＦＳＨ
ｒｈＦＳＨ：組み換えヒトＦＳＨ
ＢＶ：層（Ｂｅｄ）体積
ＤＥＡＥ：ジエチルアミノエチル
ＩＭＡＣ：固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー
ＯＤ：光学濃度
ＨＩＣ：疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＩＲＭＡ：免疫放射定量測定法
ＫＤ又はｋＤ：キロダルトン
ＨＣＰ：宿主細胞タンパク質、ＦＳＨの発現に用いられる宿主細胞から生じるタンパク質
ＩＰＣ：工程管理
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
Ｑ ＦＦ：ＱセファロースＦＦ上での陰イオン交換
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、組み換えヒトＦＳＨ又はＦＳＨ変異型を精製するための方法を提供し：
（１）イオン交換クロマトグラフィー；
（２）固定化金属イオンクロマトグラフィー；
（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、
の段階を含んで成り、これらの段階は任意の順序で実施することができる。
【００１８】
本発明の精製方法は、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（Ｓｅｒｏｎｏ）及びＭｅｔｒｏｄｉｎ−ＨＰ（Ｓｅｒｏｎｏ）などの既知のＦＳＨ産物に匹敵する純度の精製ＦＳＨを得ることを可能にする。本精製の出発物質は組み換えＦＳＨである。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様
本発明の精製方法は、イオン交換クロマトグラフィーの段階を含む。好ましい実施態様においては、下記のように、イオン交換クロマトグラフィーの段階は、強陰イオン交換樹脂、特に好ましくはＱセファロースＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの第四アンモニウム樹脂、又は類似の特性を有する樹脂を用いて実施される：
イオン交換体の型：強陰イオン
総容量（ｍｍｏｌ／ｍｌ）:０.１８〜０.２５
排除限界（球状タンパク質）：４×１０6
ビーズ形態：球状、直径４５〜１６５μｍ
ビーズ構造：架橋アガロース、６％
操作ｐＨ安定性：２〜１２
クリーニングｐＨ安定性：１〜１４
２５℃ １バール １５ｃｍ層高での線流速、ＸＫ５０／３０カラム：４００〜７００ｃｍ／時
【００２０】
イオン交換クロマトグラフィーの段階においては、好ましくは弱アルカリ性ｐＨ（例えば、７.２若しくは約７.２〜９.０若しくは約９.０、又は８.０若しくは約８.０〜９.０若しくは約９.０、最も好ましくは８.５若しくは約８.５）を有する緩衝液を用いて溶出を実施する。適切な緩衝液は、例えばホウ酸緩衝液、トリエタノールアミン／イミノ二酢酸を含む。８.５若しくは約８.５のｐＨのホウ酸緩衝液が最も好ましい。溶出緩衝液種の濃度は、好ましくは約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、より好ましくは約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、最も好ましくは約５０ｍＭの範囲内である。
【００２１】
イオン交換クロマトグラフィーの段階に先立って、粗ＦＳＨを濃縮するために、限外濾過の段階を実施することが望ましいだろう。限外濾過（又は透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））は、好ましくは約３〜１０ｋＤ、最も好ましくは約５ｋＤのカットオフを有する膜を用いて実施する。
【００２２】
本発明の方法は、固定化金属イオンクロマトグラフィーの段階も含む。好ましい実施態様においては、固定化金属イオンクロマトグラフィーの段階は、例えばイミノ二酢酸（ＩＤＡ）などの三座のキレート基を有する樹脂、並びにＣｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃａ2+、Ｍｇ2+及びＣｏ2+、好ましくはＣｕ++などの２価金属イオン（Ｍ2+）を用いて実施する。金属イオンキレート基は、例えばセファロースなどの適切な固形支持体に結合する。下記のように、特に好ましい樹脂は、キレーティングセファロースＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、又は類似の特性を有する他の樹脂である：
組成物：高度架橋６％アガロース
粒径：４５〜１６５μｍ
リガンド：スペーサ上のイミノ二酢酸基
カップリング化学：エポキシ
金属イオン容量：３０〜３７μｍｏｌ Ｃｕ2+／ｍｌ
ｐＨ安定性（操作）：３〜１３
ｐＨ安定性（短期間）：２〜１４
圧力／流量スペック：ベースマトリクス２００〜４００ｃｍ／時、１バール（１００ｋＰａ）、ＸＫ５０／６０カラム、層高２５ｃｍ
【００２３】
固定化金属イオンクロマトグラフィーの段階における溶出は、イミダゾール、リン酸塩又は酢酸塩、特に好ましくは酢酸アンモニウムなどの酢酸塩の緩衝液を用いて実施するべきである。溶離剤のｐＨは、好ましくは約７.５〜約１０、より好ましくは約８.０〜約９.５、特に好ましくは約９であるべきである。溶離剤中の緩衝種（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ｓｐｅｃｉｅｓ）の濃度は、好ましくは約０.１Ｍ〜約２Ｍ、より好ましくは約０.５Ｍ〜約１Ｍ、最も好ましくは約０.７５Ｍであるべきである。
【００２４】
この方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィーの段階も含む。好ましい実施態様においては、下記のように、疎水性相互作用クロマトグラフィーはフェニルセファロースＦＦ ＨＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの樹脂、又は類似の特性を有する樹脂を用いて実施する：
マトリクス：６％高度架橋球状アガロース
平均粒径：９０μｍ
疎水性リガンド：フェニル
リガンド密度：４０
ｐＨ安定性（短期間）：２〜１４
ｐＨ安定性（長期間及び動作範囲（ｗｏｒｋｉｎｇ ｒａｎｇｅ））：３〜１３
【００２５】
疎水性相互作用クロマトグラフィーの段階における溶出は、好ましくは弱アルカリ性ｐＨ（例えば、約７.２〜約９、より好ましくは約７.５〜約８.５、最も好ましくは約８.２５）を有する緩衝液を用いて実施する。特に好ましい溶離剤は、酢酸アンモニウム（５０ｍＭ）／硫酸アンモニウム（０.２５Ｍ）（好ましくは、ｐＨが約８.２５）である。
【００２６】
疎水性相互作用クロマトグラフィーの段階の後に、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）の段階を実施することも可能である。好ましくは、ＲＰＣは、ＳＯＵＲＣＥ３０ＲＰＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの樹脂を用いて実施する。好ましくは、溶出は、酢酸アンモニウム（好ましくは弱アルカリ性ｐＨ（例えばｐＨ約７〜８.５）、より好ましくは約７.５若しくは７.６）などの緩衝液を用いて実施する。好ましくは、緩衝液は、約５〜２５％（体積／体積）の、好ましくは約１０〜２０％の水混和性有機溶媒、好ましくはＣ1〜Ｃ3アルコール、最も好ましくは２−プロパノール（イソプロパノール）を含む。
【００２７】
イオン交換クロマトグラフィーの段階を最初に実施することが好ましいが、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属イオンクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の段階は任意の順序で実施することができる。下記に示す順序に従うことが好ましいが、残りの段階の固定化金属イオンクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、任意の順序で実施することができる：
（１）イオン交換クロマトグラフィー、（２）固定化金属イオンクロマトグラフィー、及び（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。
【００２８】
更に好ましい実施態様において、段階（２）及び段階（３）の間にイオン交換クロマトグラフィーの更なる段階を実施し（２ａ）、特に好ましくは、例えばジアミノエチル基を有する交換樹脂などの弱陰イオン交換樹脂、特にＤＥＡＥセファロースＦＦを用いて実施する。特に好ましい実施態様において、これらの段階は下記に示す順序で実施する：
（１）イオン交換クロマトグラフィー、（２）固定化金属イオンクロマトグラフィー、（２ａ）２段階目のイオン交換クロマトグラフィー、及び（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。
【００２９】
特に好ましい実施態様において、本発明の方法は下記のような特性を示す段階を含んで成る：
（１）イオン交換クロマトグラフィー（好ましくは、ＱセファロースＦＦなどの強陰イオン交換樹脂を用いて）；
（２）固定化金属イオンクロマトグラフィー（好ましくは、金属イオンとしてＣｕ++を用いたキレーティングセファロースＦＦを用いて）；
（２ａ）イオン交換クロマトグラフィー（好ましくは、ＤＥＡＥセファロースＦＦなどの弱陰イオン交換樹脂を用いて）；
（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（好ましくは、フェニルセファロースＦＦ ＨＳを用いて）。
【００３０】
好ましくは、２段階目のイオン交換クロマトグラフィー（２ａ）は、溶離剤として酢酸アンモニウム緩衝液（好ましくは、ｐＨが約８.５である）を用いて実施する。好ましくは、酢酸アンモニウム緩衝液は、約０.０５Ｍ〜約０.５Ｍ、より好ましくは約０.１１Ｍである。
【００３１】
更に好ましい実施態様においては、任意のクロマトグラフィーの段階の後に（特に好ましくは、逆相クロマトグラフィーの段階の後に）、ＦＳＨサンプルを限外濾過により濃縮する。限外濾過（又は透析濾過）は、好ましくは約３〜１０ｋＤ、最も好ましくは約５ｋＤのカットオフを有する膜を用いて実施する。
【００３２】
特に好ましい実施態様においては、下記の段階を下記に示す順序で実施する：
（０）限外濾過（好ましくは、約５ｋＤのカットオフを有する膜を用いて）、（１）イオン交換クロマトグラフィー（好ましくは、ＱセファロースＦＦを用いて）、（２）固定化金属イオンクロマトグラフィー（好ましくは、キレーティングセファロースＦＦ及びＣｕ++を用いて）、（２ａ）２段階目のイオン交換クロマトグラフィー（好ましくはＤＥＡＥセファロースＦＦ）、（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（好ましくは、フェニルセファロースＦＦ ＨＳを用いて）、（４）逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）（好ましくは、ＳＯＵＲＣＥ３０ＲＰＣを用いて）、及び（５）限外濾過（好ましくは、５ｋＤのカットオフを有する膜を用いて）。
【００３３】
精製ＦＳＨ調製物がウイルスのない状態であることを確実にするために、ＦＳＨサンプルをナノ濾過の段階にかけることが望ましいだろう。ナノ濾過は精製方法の任意の段階で行うことができるが、２段階目のイオン交換クロマトグラフィーの後、又は逆相クロマトグラフィーの後若しくは疎水性相互作用クロマトグラフィーの後に実施することが特に好ましい。ナノ濾過は２回以上実施することができ、例えば２回実施することができる。
【００３４】
特に好ましい実施態様においては、本発明の方法は下記の段階を含んで成る：
（０）限外濾過（好ましくは、約５ｋＤのカットオフを有する膜を用いて）、（１）イオン交換クロマトグラフィー（好ましくは、ＱセファロースＦＦを用いて）、（２）固定化金属イオンクロマトグラフィー（好ましくは、キレーティングセファロースＦＦ及びＣｕ++を用いて）、（２ａ）２段階目のイオン交換クロマトグラフィー（好ましくはＤＥＡＥセファロースＦＦ）、（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（好ましくは、フェニルセファロースＦＦ ＨＳを用いて）、（４）逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）（好ましくは、ＳＯＵＲＣＥ３０ＲＰＣを用いて）、及び（５）限外濾過（好ましくは、５ｋＤのカットオフを有する膜を用いて）、（６）ナノ濾過。
【００３５】
保管／凍結乾燥
上記の精製方法から得た精製ＦＳＨを含む液体組成物は、保管のためにそのまま凍結することができ、或いは精製後に溶媒を除去するために溶出液を凍結乾燥（「フリーズドライ」）にかけることができる。その結果得られた液体又は凍結乾燥産物を「ＦＳＨバルク（Ｂｕｌｋ）」と呼ぶ。
【００３６】
ＦＳＨ製剤
本発明の又は本発明の方法に従って精製されたＦＳＨ又はＦＳＨ変異型を、注入（筋肉内又は皮下のいずれかへの、好ましくは皮下への）のために製剤化すべきである。
【００３７】
ＦＳＨ製剤はフリーズドライすることができ、この場合ＦＳＨ製剤は注入の直前に注入用の水に溶解される。ＦＳＨ製剤は液状製剤であることもでき、この場合ＦＳＨ製剤は事前の溶解を伴わずに直接注入することができる。
【００３８】
ＦＳＨ製剤は、単回投与又は複数回投与であることができる。複数回投与の場合、ＦＳＨ製剤は好ましくは、例えばベンジルアルコール、メタクレゾール、チモール又はフェノール、好ましくはベンジルアルコール又はメタクレゾールなどの静菌剤を含むべきである。単回投与製剤も、静菌剤を含んで成ることができる。
【００３９】
本発明のＦＳＨは、例えばスクロース及びマンニトールなどの既知の賦形剤及び安定剤とともに製剤化することができる。それは、メチオニンなどの抗酸化物質も含んでなることができる。それは、ＴＷＥＥＮ（好ましくは、ＴＷＥＥＮ２０）、又はプルロニック（好ましくは、プルロニックＦ６８）などの界面活性剤を更に含んで成ることができる。
【００４０】
特に好ましい複数回投与製剤においては、本発明の方法により生成されたＦＳＨは、スクロース、リン酸緩衝液（ｐＨ７）、プルロニックＦ６８、メチオニン及びメタクレゾール又はベンジルアルコールとともに、注入用の水に溶解することにより製剤化される。
【００４１】
適応
本発明のＦＳＨは、ＦＳＨが適用される全ての処置における使用に適している。それは、介助生殖技術に対する排卵誘発、過排卵誘起における皮下投与、及び精子減少症の処置における皮下投与に特に適している。それは、ＬＨ及びｈＣＧなどの他の性腺刺激ホルモンと一緒に使用することができる。それは、クエン酸クロミフェン、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、レトロゾール、ファドロゾール及びＹＭ−５１１など）などのＦＳＨへの応答を増大させる化合物とともに使用することもできる。
【００４２】
配列：
配列番号１：ヒト糖タンパク質 α−サブユニット；
配列番号２：ｈＦＳＨ β−サブユニット
配列番号３：ｈＦＳＨ β−サブユニット 変異型１
配列番号４：ｈＦＳＨ β−サブユニット 変異型２
配列番号５：ｈＦＳＨ β−サブユニット 変異型３
【００４３】
本明細書中で使用される卵胞刺激ホルモン、又はＦＳＨは、完全長の成熟タンパク質として産生されるヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）を意味する。ＦＳＨは、ヒト糖タンパク質アルファ−サブユニット及びヒトＦＳＨベータ−サブユニットから構成される二量体である。ヒト糖タンパク質アルファサブユニットのタンパク質配列は配列番号１において与えられ、ヒトＦＳＨベータサブユニットのタンパク質配列は配列番号２において与えられる。
【００４４】
「組み換え体」という用語の使用は、組み換えＤＮＡ技術（例えば、国際公開８５／０１９５８を参照されたい）の使用により産生されるＦＳＨの調製物を意味する。組み換え技術を用いてＦＳＨを発現する方法の１つの例は、欧州特許第０２１１８９４号及び同第０４８７５１２号に説明されているように、ＦＳＨのアルファ及びベータサブユニットをコードするＤＮＡ配列（別々のプロモーターを有する各サブユニットを１つのベクター上で提供するのか、２つのベクター上で提供するのかに関わらず）を用いた真核細胞のトランスフェクションによるものである。ＦＳＨをコードするＤＮＡはｃＤＮＡであることができ、又はそれはイントロンを含むことができる。ＦＳＨを産生する組み換え技術の使用に関する別の例は、欧州特許第０５０５５００号（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＲＳ Ｈｏｌｄｉｎｇ ＮＶ）に説明されているように、作動接続（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）における異種調節セグメントを作用可能に連結するように、ＦＳＨのサブユニットの一方又は双方をコードする内因性配列に挿入するための相同的組み換えの使用によるものである。国際公開９９／５７２６３号（Ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）において開示されているものなどの方法も意図されており、ここではサブユニットの一方が非相同的に細胞に挿入され、他方のサブユニットが相同組み換えによる異種調節セグメントの挿入によるゲノム配列の活性化により発現される。本発明の方法は、これらの方法のいずれかを用いて発現されたＦＳＨを精製するのに用いることができる。
【００４５】
「組み換え細胞」という表現は、異種ＤＮＡを挿入することにより産生される細胞を指し、上記の任意の遺伝子操作方法を含む。
【００４６】
好ましくはＦＳＨは、ＦＳＨのヒト糖タンパク質アルファ−サブユニット及びベータ−サブユニットをコードするＤＮＡを含んで成る１つのベクター又は複数のベクターを用いて導入したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、組み換え技術により産生される。アルファ及びベータ−サブユニットをコードするＤＮＡは、同一の又は異なるベクター上に存在することができる。
【００４７】
「ＦＳＨ変異型」という表現は、アミノ酸配列、グリコシル化パターン又はサブユニット間の連結がヒトＦＳＨと異なるがＦＳＨ活性を示す分子を包含することが意図されている。例としては、持続性修飾組み換えＦＳＨであるＣＴＰ−ＦＳＨが挙げられ、これは野生型α−サブユニット及びｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドがＦＳＨのβ−サブユニットのＣ−末端に融合したハイブリッド型β−サブユニットから成る（ＬａＰｏｌｔ他;Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；１９９２，１３１，２５１４−２５２０；又はＫｌｅｉｎ他；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈＦＳＨ ａｇｏｎｉｓｔ；Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄ．２００３，１８，５０−５６に記載されている）。下記の配列（Ｎ−末端からＣ−末端まで）：
【化１】
2008500273.tif 000002
から成る、一本鎖分子である一本鎖ＣＴＰ−ＦＳＨも含まれる。ここで、βＦＳＨはＦＳＨのβ−サブユニットを意味し、βｈＣＧ ＣＴＰ（１１３−１４５）はｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドを意味し、そしてαＦＳＨはＦＳＨのα−サブユニットを意味する（Ｋｌｅｉｎ他［Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ；Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ＆ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ；２００２，７７，１２４８−１２５５］により説明されている）。ＦＳＨ変異型の他の例としては、α−及び／又はβ−サブユニットに組み込まれた付加的なグリコシル化部位を有するＦＳＨ分子（国際公開第０１／５８４９３号（Ｍａｘｙｇｅｎ）に開示されている）、及びサブユニット間Ｓ−Ｓ結合を有するＦＳＨ分子（国際公開第９８／５８９５７号に開示されている）が挙げられる。ＦＳＨ変異型の更なる例としては、国際公開第９１／１６９２２号及び国際公開第９２／２２５６８号に開示されているものなどの、ＦＳＨからの配列及びｈＣＧ又はＬＨからの配列を含んで成るキメラ分子が挙げられる。
【００４８】
本明細書中で言及されるＦＳＨ変異型は、配列番号：２の完全長成熟タンパク質よりも短いベータサブユニットのカルボキシ末端欠損も含む。ヒトベータサブユニットのカルボキシ末端欠損は、配列番号：３，４及び５において与えられる。ベータ鎖のカルボキシ末端変異型は既知のアルファサブユニットと二量体を形成し、ＦＳＨ変異型へテロ二量体を形成することが理解される。
【００４９】
好ましい実施態様においては、ＦＳＨがＣＨＯ細胞において組み換え技術により産生される。
【００５０】
好ましい実施態様においては、本発明の方法に従って産生される精製ＦＳＨは皮下投与に適しており、患者による自己投与を可能にする。
【００５１】
「粗組み換えＦＳＨ」という表現は、任意のクロマトグラフィーの段階を受ける前の、ＦＳＨを発現する組み換え細胞からの細胞培養上清を意味する。この表現は、（細胞から単離された）上清の未処理形態、及び濃縮されたそして／或いは濾過されたそして／或いは限外濾過された上清を包含する。
【００５２】
ＦＳＨ活性との関連での「生物活性」という用語は、Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ試験おける卵巣重量増加［Ａｓｓａｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；１９５３，５３，６０４−６１６］、又は女性患者における卵胞成長などの、ＦＳＨに関連する生物学的応答を誘導するＦＳＨ製剤の能力を意味する。女性患者における卵胞成長は超音波により評価することができ、例えば刺激８日目における約１６ｍｍの平均直径を有する卵胞の数に関する。生物活性は、ＦＳＨに対する一般に認められた基準に関して評価される。
【００５３】
ＦＳＨ調製物中のＬＨ含量は、例えばＤｅｌｆｉａ ｈＬＨ Ｓｐｅｃ（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ、フィンランド，トゥルク）などのＬＨ特異的免疫測定を用いて測定することができる。
【００５４】
ＦＳＨに関連した「比活性」という用語は、Ｓｔｅｅｌｍａｎ ＰｏｈｌｅｙバイオアッセイなどのＦＳＨ用の認識されている生物学的試験における、調製物のＩＵにおける生物活性（タンパク質の量により除される）を意味する。タンパク質の量は、Ｌｏｗｒｙ試験［Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ，Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，Ａ．Ｌ．Ｆａｒｒ ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ（１９５１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５；Ｈａｒｔｒｅｅ Ｅ．Ｅ．(１９７２)．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８：４２２；Ｊ．Ｒ．Ｄｕｌｌｅｙ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｇｒｉｅｖｅ(１９７５)Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：１３６］、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試験［Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．(１９７６)Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８］などの総タンパク質含量の測定により、又は２８０ｎｍでの吸収により決定される。好ましくは、本発明のＦＳＨは、約４０００ＩＵ／ｍｇ超、より好ましくは約６０００ＩＵ／ｍｇ超、更により好ましくは約７０００ＩＵ／ｍｇ超、更により好ましくは約８０００ＩＵ／ｍｇ超の特異的活性を有する。ここで、生物活性はＳｔｅｅｌｍａｎ Ｐｏｈｌｅｙバイオアッセイにより測定し、タンパク質含量は２８０ｎｍでのＯＤにより測定する。
【実施例】
【００５５】
精製
下記の実施例は、１５Ｌ及び７５Ｌのバイオリアクターにおいて産生された濃縮粗ｒ−ｈＦＳＨから出発する精製ｒ−ｈＦＳＨを提供する。
【００５６】
次のセクションで詳細を説明する精製方法のフローチャートは、図１において示される。その結果得られる精製ｒｈＦＳＨは、「ｒｈＦＳＨバルク」と呼ばれる。
【００５７】
全ての緩衝液に対するｐＨ及び導電値は、＋２５℃を参考にした；すなわち、導電値の決定は温度プローブを備えた機器を用いることにより実施し、得られた値は温度の差異に関して自動的に補正され、＋２５℃を参考にした。
【００５８】
導電率の測定に関しては、相関温度係数は常に２に設定された。
【００５９】
ステップ０：濃縮された粗ｒｈＦＳＨの透析濾過
装置
・Ｐｅｌｌｉｃｏｎ Ｍｉｎｉ型の限外濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ又は同等のもの）
・ＢＩＯＭＡＸ型の、ポリエーテルスルホンにおいてカットオフ５ＫＤでの限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ又は同等のもの）、０.１ｍ2
・Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ型の蠕動ポンプ又は同等のもの
【００６０】
材料
・濃縮された粗ｒ−ｈＦＳＨ
・出発量：ＦＳＨのためのＤＥＬＦＩＡ免疫測定により決定した、２００〜４００ｍｇのＦＳＨ（７５Ｌバイオリアクターから）
・水酸化ナトリウムペレット−（Ｍｅｒｃｋ）
・精製水（Ｍｏｄｕｌａｂ又は同等のもの）
・ホウ酸
・四ホウ酸ナトリウム十水和物
・水酸化ナトリウム（ペレット）
・ホウ酸緩衝液（５０ｍＭのホウ酸ナトリウム ｐＨ８.５±０.１）：３.０６ｇｒのホウ酸及び１０ｇｒの四ホウ酸ナトリウム二水和物を、撹拌しながら９００ｍＬの精製水に添加し、１Ｌとした。
【００６１】
限外濾過の手順
全ての操作は、冷蔵条件で実施した（３〜８℃）。
【００６２】
濃縮された粗ｒ−ｈＦＳＨ（１〜１.５Ｌ）を、下記の条件下で限外濾過した：
・緩衝液：５０ｍＭのホウ酸ナトリウム ｐＨ８.５±０.１、導電率 １.９±０.２ｍＳ／ｃｍ
・浸透流量：１５〜２５ｍＬ／分
・入り口圧力：１.５〜２.２バール
・膜間圧：１.５〜１.８バール
ここで：
膜間圧（ＴＭＰ）＝（入り口圧力＋出口圧力）／２
ｒｈＦＳＨ溶液を１Ｌの体積まで濃縮した。
・保持（ｒｅｔａｎｔａｔｅ）画分を１倍量の精製水を用いて希釈し、再び１Ｌまで濃縮した（洗浄）；
・洗浄段階をさらに２回繰り返した；
・透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）の導電率を調べ、１.５ｍＳ／ｃｍ未満である場合はそのサンプルを次に段階に進め、そうでない場合は洗浄段階を繰り返した。
透過液導電率＜１.５ｍＳ／ｃｍ
・保持画分の１倍量を、平衡緩衝液を用いて２倍量まで希釈し、初期の体積まで再び濃縮した。
・この操作をさらに２回繰り返した。
・透過液のｐＨ及び導電率を調べ、透過画分のｐＨ及び導電率がそれぞれ８.５±０.１及び１.９±０.２ｍＳ／ｃｍである場合はその透過液を次に段階に進め、そうでない場合は洗浄段階を繰り返した。
透過液ｐＨ＝８.５±０.１
透過液導電率：１.９±０.２ｍＳ／ｃｍ
・保持画分を回収し、そしてウルトラフィルター（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ）を３アリコートの平衡緩衝液で洗浄する。洗浄液を回収し、保持画分とともにプールして、最終的な回収体積がおよそ０.６〜１.２Ｌとなるようにした。
回収された体積：０.６〜１.２Ｌ
・この画分を：
＜＜ＳｔａｒｔＱ＞＞
とラベルした。
・５×０.５ｍＬのサンプルをＩＰＣのために−２０℃で保管した。
・この画分の体積を測定した（＋５±３℃で３日間以上保管することはできない）。
・下記のようにサンプルを分析した：２８０ｎｍでのＯＤ、ｐＨ、導電率及び免疫測定（ＤＥＬＦＩＡ）によるｒ−ｈＦＳＨ含量、及びＲＰ−ＨＰＬＣ。
【００６３】
ステップ１：ＱセファロースＦＦ上での陰イオン交換
装置
・クロマトグラフィーカラム ＸＫ ５０／２０
・Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ型の蠕動ポンプ又は同等のもの
・低温室（ｃｏｌｄ ｒｏｏｍ）
・２つのチャネルの記録形を備えたＵＶモニター（光路長２.５ｍｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又は同等のもの）
・ＵＶ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ又は同等のもの）
・ｐＨメーター（Ｍｅｔｒｏｈｍ又は同等のもの）
・導電率計（Ｍｅｔｒｏｈｍ又は同等のもの）
・はかり（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ又は同等のもの）
・Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ型の蠕動ポンプ又は同等のもの
【００６４】
材料
・限外濾過段階から得た、濃縮された粗ｒ−ｈＦＳＨ
・出発量：ＤＥＬＦＩＡによる、２００〜４００ｍｇのＦＳＨ
・水酸化ナトリウムペレット−（Ｍｅｒｃｋ）
・精製水（Ｍｏｄｕｌａｂ又は同等のもの）
・ホウ酸
・四ホウ酸ナトリウム十水和物
・水酸化ナトリウム（ペレット）
・塩化ナトリウム
・氷酢酸
【００６５】
緩衝液
平衡緩衝液：５０ｍＭのホウ酸ナトリウム ｐＨ８.５±０.１、導電率 １.９±０.２ｍＳ／ｃｍ
溶出緩衝液：５０ｍＭのホウ酸ナトリウム、０.１３ＭのＮａＣｌ ｐＨ８.５±０.１、導電率 １６±１.５ｍＳ／ｃｍ
剥離溶液：１.５ＭのＮａＣｌ
消毒（ｓａｎｉｔｉｚａｔｉｏｎ）溶液１：０.１Ｍの酢酸
消毒溶液２：０.５ＭのＮａＯＨ
保管溶液：０.０１ＭのＮａＯＨ
【００６６】
カラムパッキング
製造指示に従って、Ｑセファロースファストフロー樹脂でカラムを詰めた。詰められたカラムは下記の寸法（ｄｉｅｍｎｓｉｏｎ）を有した：
直径：５ｃｍ
層高：１１ｃｍ±１０％
層体積：１９０〜２４０ｍＬ
【００６７】
精製手順
全ての操作は：
・温度：３〜８℃
・線流速：２４０〜２８０ｃｍ／時
で実施した。
【００６８】
カラム消毒
少なくとも１ＢＶのＮａＯＨ ０.５Ｍを用いてカラムを洗い流し、次に３ＢＶの精製水を用いてすすいだ。
【００６９】
カラム平衡
６〜７又はそれを超えるＢＶの平衡緩衝液（５０ｍＭのホウ酸ナトリウム ｐＨ８.５±０.１、導電率 １.９±０.２ｍＳ／ｃｍ）を用いてカラムを洗い流した。
ｐＨ及び導電率を調べ、カラム流出物のパラメータが下記の目標値内になるまで洗浄を続けた：
ｐＨ８.５±０.１、導電率 １.９±０.２ｍＳ／ｃｍ
【００７０】
出発材料の調製
限外濾過の段階から得た濃縮され且つ透析濾過されたｒ−ｈＦＳＨを、材料のセクションで示した量に解かした。ｐＨ及び導電率を調べ、サンプルをＩＰＣのために保存した（５×０.５ｍＬ）。
【００７１】
充填
出発材料を平衡化したカラムに充填した。
【００７２】
洗浄
サンプル充填が完了した時、カラムを２〜３ＢＶの平衡緩衝液を用いて洗い流した。回収した体積を記録して、サンプルをＩＰＣのために保存し（５×０.５ｍＬ）、そしてこの画分を廃棄した。
【００７３】
溶出
５０ｍＭのホウ酸ナトリウム（０.１３ＭのＮａＣｌ ｐＨ８.５±０.１、導電率 １６±１.５ｍＳ／ｃｍ）を用いて溶出を開始した。開始から０.７〜１.０ＢＶ後にｒ−ｈＦＳＨが溶出し始めた。
４.５ＢＶの溶出画分が回収され、図２に表されたクロマトグラフィーのプロファイルでは２つのピークを示した。
回収した体積を記録し、ＩＰＣのためのサンプルを差し引いた（５×０.５ｍＬ）。
この画分は、４℃で３日間以上保管することはできなかった。
この画分は半精製されたｒ−ｈＦＳＨを含む。
【００７４】
ステップ（２）：キレーティングセファロースＦＦ上でのＩＭＡＣ
装置
・クロマトグラフィーカラム  Ｃ１０／４０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
・ｍｉｎｉｐｌｕｓ ２ Ｇｌｙｓｏｎ型の蠕動ポンプ又は同等のもの
・２つのチャネルの記録形を備えたＵＶモニター（光路長２.５ｍｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又は同等のもの）
・低温室
・ＵＶ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ又は同等のもの）
・ｐＨメーター（Ｍｅｔｒｏｈｍ又は同等のもの）
・導電率計（Ｍｅｔｒｏｈｍ又は同等のもの）
・はかり（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ又は同等のもの）
・Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ型の蠕動ポンプ又は同等のもの
【００７５】
材料
・ＱセファロースＦＦ後のｒ−ｈＦＳＨ
・水酸化ナトリウムペレット−（Ｍｅｒｃｋ）
・精製水（Ｍｏｄｕｌａｂ又は同等のもの）
・ホウ酸
・四ホウ酸ナトリウム十水和物
・水酸化ナトリウム（ペレット）
・塩化ナトリウム
・ＥＤＴＡ
・酢酸アンモニウム
・硫酸銅
・２５％アンモニア溶液
【００７６】
緩衝液
金属荷電溶液：０.２Ｍの硫酸銅
酸性化した水：１ｍＬの氷酢酸を撹拌しながら１Ｌの精製水に添加した。
平衡緩衝液：５０ｍＭのホウ酸ナトリウム ｐＨ８.２５±０.１、０.５ＭのＮａＣｌ
溶出：０.７５Ｍの酢酸アンモニウム ｐＨ９.０±０.１、導電率 ±０.５ｍＳ／ｃｍ
再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）溶液：０.５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ
消毒溶液：０.５ＭのＮａＯＨ
保管溶液：０.０１ＭのＮａＯＨ
【００７７】
カラムパッキング
製造指示に従って、キレーティングセファロースファストフロー樹脂でカラムを詰めた。詰められたカラムは下記の寸法を有した：
直径：１０ｍｍ
層高：２２±１０％
層体積：１６〜２０ｍＬ
【００７８】
精製手順
全ての操作は：
・温度：５±３℃
・線流速：２４０〜３００ｃｍ／時
で実施した。
【００７９】
カラム消毒
少なくとも１ＢＶのＮａＯＨ ０.５Ｍを用いてカラムを洗い流し、次に３ＢＶの精製水を用いてすすいだ。
【００８０】
カラム荷電
ｐＨが＜４.５（ｐＨ指示薬を用いて）になるまで、５〜６ＢＶの酸性化した水を用いてカラムを洗い流した。次に、吸収値（２８０ｎｍ）が基準に到達するまで、３ＢＶの０．２Ｍ 硫酸銅及び再び４〜５ＢＶの酸性化した水を用いてカラムを洗い流した。
【００８１】
カラム平衡
６又はそれを超えるＢＶの平衡緩衝液（５０ｍＭのホウ酸ナトリウム ｐＨ８.２５±０.１、０.５ＭのＮａＣｌ、導電率 ５０±５ｍＳ／ｃｍ）を用いてカラムを洗い流した。
ｐＨ及び導電率を調べ、カラム流出物のパラメータが目標値外である場合は洗浄を続けた：
ｐＨ８.２５±０.１、導電率 ５０±５ｍＳ／ｃｍ
【００８２】
出発材料の調製
ＱセファロースＦＦの段階から得たｒ−ｈＦＳＨについて、３５％のオルトリン酸を添加することによりｐＨを８.２５±０.１に調節し、ＮａＣｌを添加することにより導電率を５０±５ｍＳ／ｃｍに調節した。サンプルをＩＰＣ用に回収した（５×０.５ｍＬ）。
【００８３】
充填
出発材料を、上記のように平衡化したカラムに充填した。
【００８４】
洗浄
サンプル充填が完了した時、カラムを５〜１０ＢＶの平衡緩衝液（５０ｍＭのホウ酸ナトリウム ｐＨ８.２５±０.１、０.５ＭのＮａＣｌ、導電率 ５０±５ｍＳ／ｃｍ）を用いて洗い流した。
サンプルをＩＰＣ用に回収し（５×０.５ｍＬ）、そしてこの画分を廃棄した。
【００８５】
溶出
０.０７５Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ９.０±０.１、導電率 ７.２±０.５ｍＳ／ｃｍ）を用いて溶出を開始した。
開始から０.５ＢＶ後にｒ−ｈＦＳＨが主なピークとして溶出し始めた。
廃棄された最初の０.５ＢＶの後あたりで、オンラインのＯＤが急に増加する時に始まる主なピークの５〜７ＢＶを回収した。
ＩＰＣ用のサンプルを回収し（５×０.５ｍＬ）、この画分を２日以内の間３℃〜８℃で保管した。
ＩＭＡＣに対する溶出プロファイルを図３に示す。
この画分は半精製されたｒ−ｈＦＳＨを含んでいた。
【００８６】
ステップ（２ａ）：ＤＥＡＥセファロースＦＦ上での陰イオン交換
装置
・クロマトグラフィーカラム  ＶａｎｔａｇｅＬ２２／４０
・ｍｉｎｉｐｌｕｓ ２ Ｇｌｙｓｏｎ型の蠕動ポンプ又は同等のもの
・低温室
・２つのチャネルの記録形を備えたＵＶモニター（光路長２.５ｍｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又は同等のもの）
・ＵＶ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ又は同等のもの）
・ｐＨメーター（Ｍｅｔｒｏｈｍ又は同等のもの）
・導電率計（Ｍｅｔｒｏｈｍ又は同等のもの）
・はかり（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ又は同等のもの）
・Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ型の蠕動ポンプ又は同等のもの
【００８７】
材料
・ＩＭＡＣ後のｒ−ｈＦＳＨ
・水酸化ナトリウムペレット−（Ｍｅｒｃｋ）
・精製水（Ｍｏｄｕｌａｂ又は同等のもの）
・水酸化ナトリウム（ペレット）
・塩化ナトリウム
・酢酸アンモニウム
・２５％アンモニア溶液
【００８８】
緩衝液
平衡緩衝液：０.１１Ｍの酢酸アンモニウム ｐＨ８.５±０.１、導電率±０.５ｍＳ／ｃｍ
再生溶液：１.５ＭのＮａＣｌ
消毒溶液：０.５ＭのＮａＯＨ
保管溶液：０.０１ＭのＮａＯＨ
【００８９】
カラムパッキング
製造指示に従って、ＤＥＡＥセファロースファストフロー樹脂でカラムを詰めた。詰められたカラムは下記の寸法を有した：
直径：２２ｍｍ
層高：１６〜１７ｃｍ
層体積：６５〜７０ｍＬ
【００９０】
精製手順
全ての操作は：
・温度：５±３℃
・線流速：２４０〜３００ｃｍ／時
で実施した。
【００９１】
カラム消毒
少なくとも１ＢＶのＮａＯＨ ０.５Ｍを用いてカラムを洗い流し、次に３ＢＶの精製水を用いてすすいだ。
【００９２】
カラム平衡
６又はそれを超えるＢＶの平衡緩衝液（０.１１Ｍの酢酸アンモニウム ｐＨ８.５±０.１、導電率 １０.２±０.５ｍＳ／ｃｍ）を用いてカラムを洗い流した。
ｐＨ及び導電率を調べ、カラム流出物のパラメータが目標値外である場合は洗浄を続けた：
ｐＨ８.５±０.１、導電率１０.５±０.５ｍＳ／ｃｍ
【００９３】
出発材料の調製
ＩＭＡＣの段階から得たｒ−ｈＦＳＨについて、氷酢酸を添加することによりｐＨを８.５±０.１にし、精製水（導電率を目標値に調節するためには、少なくとも１倍量の水が必要である）を添加することにより導電率を１０.５±０.５ｍＳ／ｃｍに調節した。
サンプルをＩＰＣ用に回収した（５×０.５ｍＬ）。
【００９４】
充填
出発材料を、上記のように平衡化したカラムに充填した。
【００９５】
洗浄
サンプル充填が完了した時、カラムを３〜６ＢＶの平衡緩衝液（０.１１Ｍの酢酸アンモニウム ｐＨ８.５±０.１、導電率 １０.２±０.５ｍＳ／ｃｍ）を用いて洗い流した。
ＩＰＣ用のサンプルを回収し（５×０.５ｍＬ）、この画分を２日以内の間＋５±３℃で保管した。ＤＥＡＥセファロースＦＦクロマトグラフィーに対する溶出プロファイルを図４に示す。
【００９６】
ステップ（３）：フェニルセファロースＦＦ ＨＳ上での疎水性相互作用
装置
・クロマトグラフィーカラム  ＸＫ２６／３０
・ｍｉｎｉｐｌｕｓ ２ Ｇｌｙｓｏｎ型の蠕動ポンプ又は同等のもの
・２つのチャネルの記録形を備えたＵＶモニター（光路長２.５ｍｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又は同等のもの）
・低温室
・ＵＶ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ又は同等のもの）
・ｐＨメーター（Ｍｅｔｒｏｈｍ又は同等のもの）
・導電率計（Ｍｅｔｒｏｈｍ又は同等のもの）
・はかり（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ又は同等のもの）
・Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ型の蠕動ポンプ又は同等のもの
【００９７】
材料
・ＤＥＡＥ後のｒ−ｈＦＳＨ
・水酸化ナトリウムペレット−（Ｍｅｒｃｋ）
・精製水（Ｍｏｄｕｌａｂ又は同等のもの）
・水酸化ナトリウム（ペレット）
・塩化ナトリウム
・酢酸アンモニウム
・硫酸アンモニウム
・２５％アンモニア溶液
【００９８】
緩衝液
平衡緩衝液：５０ｍＭの酢酸アンモニウム、１Ｍ硫酸アンモニウム ｐＨ８.２５±０.１、導電率１４２±８ｍＳ／ｃｍ
洗浄緩衝液：５０ｍＭの酢酸アンモニウム、０.９Ｍ硫酸アンモニウム ｐＨ８.２５±０.１、導電率１３０±５ｍＳ／ｃｍ
溶出緩衝液：５０ｍＭの酢酸アンモニウム、０.２５Ｍ硫酸アンモニウム ｐＨ８.２５±０.１、導電率５０±３ｍＳ／ｃｍ
剥離溶液：精製水
消毒溶液：０.５ＭのＮａＯＨ
保管溶液：０.０１ＭのＮａＯＨ
【００９９】
カラムパッキング
製造指示に従って、フェニルセファロースファストフローＨＳ樹脂でカラムを詰めた。詰められたカラムは下記の寸法を有した：
直径：３４ｍｍ
層高：１４〜１５ｍｍ
層体積：１２５〜１３５ｍＬ
【０１００】
精製手順
全ての操作は：
・温度：５±３℃
・線流速：２４０〜３００ｃｍ／時
で実施した。
【０１０１】
カラム消毒
少なくとも１ＢＶのＮａＯＨ ０.５Ｍを用いてカラムを洗い流し、次に３〜５ＢＶの精製水を用いてすすいだ。
【０１０２】
カラム平衡
５〜６又はそれを超えるＢＶの平衡緩衝液（５０ｍＭの酢酸アンモニウム、１Ｍ硫酸アンモニウム ｐＨ８.２５±０.１、導電率１４０±８ｍＳ／ｃｍ）を用いてカラムを洗い流した。
ｐＨ及び導電率を調べ、カラム流出物のパラメータが目標値内になるまで洗浄を続けた：
ｐＨ８.２５±０.１、導電率１４０±８ｍＳ／ｃｍ
【０１０３】
出発材料の調製
ＤＥＡＥの段階から得たｒ−ｈＦＳＨに１Ｍの硫酸アンモニウムを添加し、そして２５％アンモニウム溶液を添加することによりｐＨを８.２５±０.１にした。
サンプルをＩＰＣ用に回収し（５×０.５ｍＬ）、この画分をフェニルカラムに充填した。
【０１０４】
充填
出発材料を、上記のように平衡化したカラムに充填した。
【０１０５】
充填後の洗浄
サンプル充填が完了した時、カラムを３〜６ＢＶの平衡緩衝液（５０ｍＭの酢酸アンモニウム、１Ｍの硫酸アンモニウム ｐＨ８.２５±０.１、導電率 １４０±５ｍＳ／ｃｍ）を用いて洗い流した。
ＩＰＣ用にサンプルを回収し（５×０.５ｍＬ）、この画分を廃棄した。
【０１０６】
洗浄
サンプル充填が完了した時、カラムを３〜６ＢＶの洗浄緩衝液（５０ｍＭの酢酸アンモニウム、０.９Ｍの硫酸アンモニウム ｐＨ８.２５±０.１、導電率 １３０±５ｍＳ／ｃｍ）を用いて洗い流した。
ＩＰＣ用にサンプルを回収し（５×０.５ｍＬ）、この画分を廃棄した。
【０１０７】
溶出
溶出緩衝液を用いて溶出を開始した。
開始から０.５〜０.８ＢＶの後に、主なピークとしてｒ−ｈＦＳＨが溶出し始めた。図５に表すクロマトグラフィーのプロファイルに従って、吸収値（２８０ｎｍ）が増大した時に始まる３〜４ＢＶの主なピークを回収した。
ＩＰＣ用にサンプルを回収し（５×０.５ｍＬ）、１日以内の間＋５±３℃で保管した。
【０１０８】
ステップ（４）：Ｓｏｕｒｃｅ３０ＲＰＣ上の逆相
装置
・クロマトグラフィーカラム：ＶａｎｔａｇｅＬ２２／４０
・２つのチャネルの記録形を備えたＵＶモニター（光路長２.５ｍｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又は同等のもの）
・蠕動ポンプ（Ｍｉｎｉｐｌｕｓ ２ Ｇｉｌｌｓｏｎ型の又は同等のもの）
・ＵＶ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ又は同等のもの）
・ｐＨメーター（Ｍｅｔｒｏｈｍ又は同等のもの）
・導電率計（Ｍｅｔｒｏｈｍ又は同等のもの）
・はかり（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ又は同等のもの）
【０１０９】
材料
・ＨＩＣ後のｒ−ｈＦＳＨ中間体
・Ｓｏｕｒｃｅ３０ＲＰＣ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
・酢酸アンモニウム−Ｍｅｒｃｋ
・氷酢酸−Ｍｅｒｃｋ
・水酸化ナトリウムペレット−Ｍｅｒｃｋ−
・５０％のＮａＯＨ溶液−Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ
・２５％のアンモニア溶液−Ｍｅｒｃｋ
・２−プロパノール−Ｍｅｒｃｋ
・水酸化ナトリウムペレット−Ｍｅｒｃｋ
【０１１０】
緩衝液
基礎（ｂａｓｅ）緩衝液：５０ｍＭの酢酸アンモニウム ｐＨ７.６±０.２、導電率６.５±０.５ｍＳ／ｃｍ
平衡緩衝液：５０ｍＭの酢酸アンモニウム ｐＨ７.６±０.２、１３％の２−プロパノール（ｖ／ｖ）を含む
溶出緩衝液：５０ｍＭの酢酸アンモニウム ｐＨ７.６±０.２、２０％の２−プロパノール（ｖ／ｖ）を含む
再生溶液：５０ｍＭの酢酸アンモニウム ｐＨ７.６±０.２、３５％の２−プロパノール（ｖ／ｖ）を含む
消毒溶液：０.５ＭのＮａＯＨ
保管溶液：０.０１ＭのＮａＯＨ
【０１１１】
カラムパッキング
製造指示に従って、Ｓｏｕｒｃｅ３０ＲＰＣ樹脂でカラムを詰めた。詰められたカラムは下記の寸法を有した：
直径：２２ｍｍ
層高：１３〜１４ｃｍ
層体積：４９.４〜５３.２ｍＬ
【０１１２】
精製手順
出発材料の調製
ＨＩＣ後の中間体を１３％（ｖ／ｖ）の２−プロパノール中でカラムに充填した。
全ての操作は：
温度：室温（＋２０±５℃）
線流速：３００〜４５０ｃｍ／時
で実施した。
【０１１３】
カラム消毒
少なくとも１ＢＶのＮａＯＨ ０.５Ｍを用いてカラムを洗い流し、６ＢＶの精製水を用いてすすいだ。
【０１１４】
カラム平衡
７〜１０又はそれを超えるＢＶの平衡緩衝液（５０ｍＭの酢酸アンモニウム ｐＨ７.６±０.２、１３％の２−プロパノール（ｖ／ｖ）を含む）を用いてカラムを洗い流した。
【０１１５】
充填
上記のように調製したＨＩＣ後の出発材料であるｒ−ｈＦＳＨを、カラムに充填した。
【０１１６】
充填後の洗浄
サンプル充填が完了した時、カラムを７〜１０ＢＶの平衡緩衝液を用いて洗い流した。
ＩＰＣ用にサンプルを回収し（５×０.５ｍＬ）、この画分を廃棄した。
【０１１７】
溶出
溶出緩衝液を用いて溶出を開始した。
開始から０.５〜０.８ＢＶの後に、主なピークとしてｒ−ｈＦＳＨが溶出し始めた。図６に表すクロマトグラフィーのプロファイルに従って、吸収値（２８０ｎｍ）が増大した時に始まる５〜７ＢＶの主なピークを回収した。回収が完了した後、ｒ−ｈＦＳＨと接触した２−プロパノールの割合を減少させるために、この溶液を精製水を用いて１：２に希釈した。
ＩＰＣ用にサンプルを回収し（５×０.５ｍＬ）、１日以内の間＋５±３℃で保管した。
この画分は精製されたｒ−ｈＦＳＨを含んでいた。
【０１１８】
カラム再生
溶出が完了した後、少なくとも３ＢＶの再生緩衝液を用いてカラムを洗い流した。
ＩＰＣ用にサンプルを回収し（５×０.５ｍＬ）、この画分を廃棄した。
【０１１９】
消毒
少なくとも１〜２ＢＶの水、そしてその後３ＢＶのＮａＯＨ ０.５Ｍを用いてカラムを洗い流し、１時間その流れを止め、次に６ＢＶの精製水を用いてカラムをすすいだ。
【０１２０】
保管
少なくとも３ＢＶの保管溶液、０.０１ＭのＮａＯＨを用いてカラムを洗い流し、次のサイクルまで保管した。
【０１２１】
ステップ（５）バルク限外濾過
装置
・１ Ｖｉｖａｆｌｏｗ ２００ ＰＥＳ，ＲＣ 又は Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ カットオフ ５ＫＤ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）
・蠕動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ型）
・ＵＶ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ型又は同等のもの）
・ｐＨメーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ型又は同等のもの）
・導電率計（Ｍｅｔｒｏｈｍ型又は同等のもの）
【０１２２】
材料
・ｒ−ｈＦＳＨ−ＨＩＣ溶出液
・水酸化ナトリウムペレット−Ｍｅｒｃｋ（ＮａＯＨ）。
・Ｍｏｄｕｌａｂによる精製水又は同等のもの
・窒素（操作圧力：３バール）−ＵＰＰグレード
【０１２３】
緩衝液
透析浸透溶液：ｒ−ｈＦＳＨの限外濾過を精製水を用いて実施した。
消毒溶液：０.５ＭのＮａＯＨ
保管溶液：０.０５ＭのＮａＯＨ
【０１２４】
手順
全ての操作は、冷温室（ｃｏｏｌ ｒｏｏｍ）（＋５±３℃）において実施した。
【０１２５】
限外濾過
ｒ−ｈＦＳＨ−ＨＩＣ溶出液をＶｉｖａｆｌｏｗシステムにおいて再循環させ、２０ｍＬ未満の体積にまで濃縮した。
保持画分を４倍量の精製水を用いて希釈し、２０ｍＬ未満まで濃縮した。
説明の通り、洗浄段階を繰り返した（５〜７回以上）。
透過液のｐＨ及び導電率はそれぞれ、７.１±０.２及び６.２±０.５ｍＳ／ｃｍであった。これらの値から外れている場合は、洗浄段階を繰り返した。
透過液ｐＨ＝７.１±０.２  −−  透過液導電率＝６.２±０.５ｍＳ／ｃｍ
ＯＤ（２８０ｎｍ）により約０.５〜０.７ｍｇ／ｍＬの終濃度のｒ−ｈＦＳＨを得るのに適した体積において、保持画分を回収した。
サンプルを分析用に回収した（１０×０.５ｍＬ）。サンプル及びバルクの双方を−２０℃で保管した。
【０１２６】
ステップ（６）ウイルスを除去するためのナノ濾過段階
材料及び装置
・ｒ−ｈＦＳＨ中間体溶液（ＤＥＡＥ後の又は限外濾過されたＲＰＣ後の）；
・Ｆｌｕｏｒｏｄｉｎｅ ＩＩ ＦＴＫＤＪＬ（Ｐａｌｌ）又はＶＶＬＰ ０.１μ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）型の、４７ｍｍサイズのプレフィルター；
・ＮＦＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又はＤＶ２０（Ｐａｌｌ）型の、４７ｍｍサイズのフィルター；
・精製水；
・ｐＨ試験紙；
・水酸化ナトリウム；
・窒素調節源（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｏｕｒｃｅ）；
・完全なステンレス鋼濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；
・シリコン及びｔｙｇｏｎチューブ。
【０１２７】
緩衝液
消毒溶液：０.５ＭのＮａＯＨ
【０１２８】
手順
全ての操作は、室温（＋２３±３℃）において実施した。
【０１２９】
ナノ濾過
このシステムを、ＤＥＡＥ後の又は濾過されたＲＰＣ後のｒＦＳＨ（０.１μフィルターで前濾過）で満たした。濾過の初めに、初期圧力が０.５バールとなるまで窒素を開け、システムをパージするためディスクホルダー上に位置する通気弁を開けた。
溶液の最初のドロップが現れたらすぐに、ディスクホルダーの通気弁を閉め、窒素圧を２.３〜２.８バールまで上昇させた。
窒素圧を２.３〜２.８バールに保ち、溶液を濾過した。
操作条件を下記に要約する：
【表１】
2008500273.tif 000003
【０１３０】
サンプルの生物活性
精製ｒｈＦＳＨの生物活性を、Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙ卵巣重量増加法を用いて測定した。２８０ｎｍでの吸収により決定（ε＝９.９５Ｍ-1ｃｍ-1とする）されるタンパク質含量により除した生物活性を用いて比活性を算出し、且つＬｏｗｒｙ法により決定されるタンパク質含量により除した生物活性を用いることによっても比活性を算出した。精製ｒｈＦＳＨバルクの比活性を表１に示す。
【表２】
2008500273.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】図１は、ｒｈＦＳＨの精製を示すフローチャートを示す。
【図２】図２は、２８０ｎｍでのＯＤにより検出したＱセファロースＦＦ上での粗ｒｈＦＳＨのクロマトグラフィーに対する溶出プロファイルを示す。
【図３】図３は、２８０ｎｍでのＯＤにより検出した部分的に精製したｒｈＦＳＨのＩＭＡＣクロマトグラフィーに対する溶出プロファイルを示す。
【図４】図４は、２８０ｎｍでのＯＤにより検出した部分的に精製したｒｈＦＳＨのＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーに対する溶出プロファイルを示す。
【図５】図５は、２８０ｎｍでのＯＤにより検出した部分的に精製したｒｈＦＳＨのフェニルセファロースクロマトグラフィーに対する溶出プロファイルを示す。
【図６】図６は、スクロース３０ＲＰＣカラムを用いたＲＰＣ段階に対する溶出プロファイルを示す。
【図１】
2008500273.tif 000005
【図２】
2008500273.tif 000006
【図３】
2008500273.tif 000007
【図４】
2008500273.tif 000008
【図５】
2008500273.tif 000009
【図６】
2008500273.tif 000010
【配列表】
2008500273000001.app
【国際調査報告】
2008500273.tif 000011
2008500273.tif 000012
2008500273.tif 000013
2008500273.tif 000014