【事件の表示】
　特許第２５４７３１７号「リンパ節障害関連ウイルス（LAV）のゲノムRNAのcDNAの全部又は一部であるDNAインサートを含むクローン化DNA配列」の特許請求の範囲第１−１６記載された発明に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２５４７３１７号の特許請求の範囲第１項ないし第９項に記載された発明についての特許を維持する。
【理　由】
 １．手続きの経緯
　本件特許は、昭和６０年９月１８日（パリ条約上の優先権主張８４年９月１９日英国）にされた出願であって、平成８年８月８日に、特許第２５４３１７号として登録され、その後、山抱　基純（以下異議申立人Iという。）と株式会社ミドリ十字（以下異議申立人IIという。）より、特許異議が申し立てられ、取消理由とそれに応答する訂正請求、訂正請求の取り下げを経へ、新たに取消理由が通知され、その応答期間内に、訂正請求がなされた。
　
２．訂正請求
２−１訂正の要旨
訂正事項（a）
特許請求の範囲第１，１５及び１６項の「LAVレトロウイルスゲノムの全部又はその一部に対応する」を特許請求の範囲の減縮を目的として、「LAVレトロウイルスゲノムRNAのcDNAの全部又はその一部である」とそれぞれ訂正する。
　これに伴い、特許請求の範囲の記載と発明の名称及び発明の詳細な説明の記載との整合を図るため、明瞭でない記載の釈明を目的として、明細書第１頁第１−２行目の発明の名称「リンパ節障害関連ウイルス（ＬＡＶ）のゲノムRNAとハイブリダイズしうるクローン化DNA配列」を「リンパ節障害関連ウイルス（LAV）のゲノムRNAのcDNAの全部又は一部であるDNAインサートを含むクローン化DNA配列」と訂正し、明細書第１頁第１３−４行目（特許掲載公報第２頁第４欄第２４−２５行目）の「ゲノムRNA及びDNAとハイブリダイズしうる」を「ゲノムRNAのcDNAの全部又はその一部であるDNAインサートを含有する」と訂正する。
　
訂正事項（ｂ）
特許請求の範囲第１，１５及び１６項の「LAVウイルスゲノムRNAと非緊縮条件下でハイブリダイゼーション」を「LAVウイルスゲノムRNAと緊縮条件下でハイブリダイゼーションする」に誤記を訂正する。
　
訂正事項（ｃ）
特許請求の範囲の減縮を目的として、「１０％硫酸デキストラン中３７℃であるドットブロットーハイブリダイゼーションアッセイにおいてはHTLV-I及びHTLV-IIレトロウイルスのRNAとクロスハイブリダイズしない」を「１０％硫酸デキストラン中３７℃であって、フィルターをHTLV-I配列から得た５３．１％GC含量を用いて３７℃（ｔｍ５０）で洗浄し、洗浄を５０℃と６５℃、１XSSC、０．１％SDS中で繰り返すドットハイブリダイゼーションアッセイにおいてはHTLV-I及びHTLV-IIレトロウイルスとクロスハイブリダイゼーションしないものであり、下図（ａ）のLAVゲノムの制限地図上に記載された制限酵素、BamHI（４６０）及びBamHI（６００）のいずれか２つによる切断フラグメントであって、下図（ｂ）のLAVゲノムの制限地図上に記載された制限酵素のいずれか２つによる切断フラグメントではない」と訂正し、
　特許請求の範囲第１項の「ことを特徴とするＤＮＡ。」、
　特許請求の範囲第１５項の「DNAからなるLAVのインビトロ検出用プローブ。」、及び
　特許請求の範囲第１６項の「DNAからなるLAVのインビトロ検出用プローブと接触せしめ、ハイブリダイズしたプローブを検出することを特徴とする方法。」
をそれぞれ
「ことを特徴とするDNA
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　」
「DNAからなるLAVのインビトロ検出用プローブ。（以下上記特許請求の範囲第１項に訂正された図面と同じ図面：省略）」、
　
「DNAからなるLAVのインビトロ検出用プローブと接触せしめ、ハイブリダイズしたプローブを検出することを特徴とする方法。（以下上記特許請求の範囲第１項に訂正された図面と同じ図面：省略）」
とそれぞれ訂正する。
　
訂正事項（ｄ）特許請求の範囲第３−７、１０及び１１項のそれぞれを、特許請求の範囲の減縮を目的として削除する。
　
訂正事項（ｅ）特許請求の範囲第８項中の「請求の範囲１−７のいずれかに記載の」を、訂正事項ｄに伴う明瞭でない記載の釈明を目的として、「請求の範囲１又は２に記載の」と訂正し、かつ特許請求の範囲第８項を特許請求の範囲第３項と訂正する。
　
訂正事項（ｆ）特許請求の範囲第９項を上記（ｄ）の訂正に伴う明瞭でない記載の釈明を目的として、特許請求の範囲第４項と訂正する。
　
訂正事項（ｇ）特許請求の範囲第１２項中の「KpnI（６１００）辺りからBamHI（８１５０）辺りまで」を、「KpnI（６１００）からPvuII（８５００）まで」に訂正する。
　
訂正事項（ｈ）特許請求の範囲第１３項中の「KpnＩ（３５００）辺りからＢglII（６５００）辺りまで」を、「KpnＩ（３５００）からPvuII（６５００）まで」に訂正する。
　
訂正事項（ｉ）特許請求の範囲第１４項中の「Pst(800)辺りからKpnI（3500）辺りまで」を、「PstI(800)」からPvuII（3800）まで」に訂正する。
　
訂正事項（ｊ）特許請求の範囲第１２−１４項の各々の中の「請求の範囲１１に記載の配列」を、訂正ｄに伴う明瞭でない記載の釈明を目的として、それぞれ削除し、かつ特許請求の範囲第１２−１４項をそれぞれ特許請求の範囲第５，６，及び７と訂正する。
　
訂正事項（ｋ）特許請求の範囲第１5，１６項については、それぞれ項番号を訂正し、特許請求の範囲第８，９項とする。
　
訂正事項（ｌ）特許掲載公報第３頁第５欄第２６−２７行の「第４−１１図は、第４図に制限地図を示したLAVゲノムの全配列を示す。」を誤記の訂正を目的として、「第４図−１１図は、第３図に制限酵素地図を示したLAVゲノムの全配列を示す」と訂正する。又、特許掲載公報第７頁第１３欄第２７行の「λJ19の完全な配列を第５−１２図に示す。」を誤記の訂正を目的として、「λJ19の完全な配列を第４−１１図に示す。」と訂正する。
　
２−２訂正の可否
２−２−１新規事項の有無、請求の目的の適否、特許請求の範囲の変更・拡張の有無
　
上記訂正の内、２−１の訂正事項（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｊ）及び（ｋ）は、特許請求の範囲の削除、又は特許請求の範囲の削除に伴う番号の付け替えにすぎないので、特許請求の範囲の減縮、又は不明瞭な記載の釈明であって、新規事項を含まず、特許請求の範囲を変更又は拡張するものではない。
　
　そこで、２−１の訂正事項（ａ）−（ｃ）、（ｇ）−（ｉ）、（ｌ）の訂正について検討する。
訂正事項（ａ）について
　「LAVレトロウイルスゲノムの全部又はその一部に対応する」を本件願書に添付された明細書に開示された「LAVレトロウイルスゲノムRNAのcDNAの全部又はその一部である」と特定する訂正をすることにより、特許請求の範囲を減縮するもので、新規事項は含まず、特許請求の範囲を変更拡張するものではない。
　また、上記訂正に伴い、特許請求の範囲と発明の名称及び発明の詳細な説明を整合させる訂正は、不明瞭な記載の釈明で、新規事項を含まず、特許請求の範囲を変更拡張するものではない。
　
訂正事項（ｂ）について
　これらの記載が誤記であることは、当業者には、直ちに看取できることであり、また訂正されたように解しないと本件クレームが意味をなさないことも明らかであるから、誤記を訂正するもであって、新規事項でもなく、特許請求の範囲を拡張変更するものでもない。
　
訂正事項（ｃ）について
　「フィルターをHTLV-I配列から得た５３．１％GC含量を用いて３７℃（ｔｍ５０）で洗浄し、洗浄を５０℃と６５℃、１XSSC、０．１％SDS中で繰り返す」という低緊縮な洗浄条件は、特許明細書に記載されている条件を加えるもので新規事項ではなく、特許請求の範囲を減縮するもので、特許請求の範囲を拡張変更するものではない。
　更に、「下図（ａ）のLAVゲノムの制限地図」は、本件願書に添付された第３図と同じものであり、上に記載された制限酵素、「BamHI（４６０）及びBamHI（６００）」は、本件願書に添付された図面２に記載された制限酵素位置で、いずれも、本件発明のλJ19に係るものであるから、新規事項ではなく、また、「下図（ｂ）のLAVゲノムの制限地図上に記載された制限酵素のいずれか２つによる切断フラグメント」は、本件取消理由通知において通知された先願に係る発明を除外するために挿入されたもので、特許請求の範囲を減縮するもので、新規事項ではないと審査・審判の実務上取り扱われているものである。
　そして、本訂正により追加された「制限酵素地図」による限定は、「クローン化DNA」を特定の断片に限定するもので、特許請求の範囲の減縮にするもので、特許請求の範囲を変更拡張するものではない。
　
訂正事項（ｇ）−（ｉ）について
訂正事項（ｇ）−（ｉ）は、出願当初の図面３に記載される特許請求の範囲第１項に付け加えられた図（ａ）のLAVゲノムの制限地図上に記載された制限酵素による切断フラグメントの内、それぞれ１つの切断フラグメントに特定するものであるから、特許請求の範囲を減縮するもので、新規事項は含まず、特許請求の範囲を変更拡張するものではない。
　
訂正事項（ｌ）について
第４図が配列を記載したものであり、第５図以降と連続したものであることは、第４図が第５図に連続する番号を付与された配列を記載していることから明らかであり、第３図が完全なLAVゲノム（クローンλJ19）の制限酵素地図であること、特許掲載公報第３頁右欄第２４−２５行目に記載されていることから、誤記であることは明らかで、新規事項を含まず、特許請求の範囲を変更拡張するものではない。
　
２−２−２ 独立特許要件の判断
　後述の、３−３，３−４に記載したとおり、訂正後の本件特許第１〜３発明は、独立して特許を受けることができるものである。
　
２−３　むすび
　上記の通りであるから、上記訂正請求は、特許法１２０条の４第２項及び第３項で準用する第１２６条第２項から第４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
　
３．特許異議申し立て
３−１　本件特許発明
　訂正後の本件特許の第１−３発明の要旨（以下、本件特許第１−３発明という。）は、訂正請求書の特許請求の範囲第１、８，及び９項に、それぞれ記載されたとおりのものであるところ、その第１項に係る発明の構成を符号を付して分節して記載すると次の通りである。
　
（a）ラムダＪＩ９（ＣＮＣＭ　Ｉ−３３８）に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムRNAのcDNAの全部又はその一部であるＤＮＡインサートを含有するクローン化ＤＮＡであって、
(b)該ＤＮＡインサートが、ＬＡＶウイルスのゲノムＲＮＡと非緊縮条件下でハイブリダイズするが、ハイブリダイゼーション及び洗浄が低緊縮条件下で行なわれ、ハイブリダイゼーションの低緊縮条件が２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン中３７℃で１晩であって、フィルターをHTLVー１配列から得た５３．１％GC含量を用いて３７℃（ｔｍ５０）で洗滌し、洗滌を５０℃と６５℃、１ｘＳＳＣ、０．１％SDS中で繰り返すドット−ハイブリダイゼーションアッセイにおいてはＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−ＩＩレトロウイルスのＲＮＡとクロス−ハイブリダイズしないものであり、
(c)下図（ａ）のLAVゲノムの制限地図上に記載された制限酵素、BamHI（４６０）及びBamHI（６００）のいずれか２つによる切断フラグメントであって、下図（ｂ）のLAVゲノムの制限地図上に記載された制限酵素のいずれか２つによる切断フラグメントではないことを特徴とするＤＮＡ。」
（図（ａ）及び図（ｂ）は省略した。２−１訂正事項（ｃ）参照。分節（ａ）−（ｃ）は当審で付した。）
　
３−２　異議申し立ての概要
特許異議申立人I及び/又はIIは、概略次のように主張している。
　
３−２−１　３６条
　特許異議申立人I及びIIは、本件特許明細書中の詳細な説明及び特許請求の範囲の記載は、特許法第３６条第３項及び４項にそれぞれ規定される要件を満たしていないので、本件特許は、特許法１１３条第４号に該当するから取り消されるべきであると主張している。
　
３−２−2　２９条の２
　異議申立人Iは、甲第１−２号証として、欧州特許出願公開公報第２７３５２９号及び米国特許出願第643306号を提出して、訂正前の本件特許第１−３発明は、本件出願前に出願され、本件出願の優先権主張日前の優先権を主張する欧州特許出願第２７３５２９号（１９８５年８月１９日出願：パリ優先権主張１９８４年８月２２日米国）に添付された明細書又は図面に記載された発明であるから、本件特許は特許法第２９条の２に違反して特許されたものであるから、特許法第１１３条第二号に該当するので、取り消されるべきであると主張している。更に、本理由に関連し、甲第３号証として、「Myers等編、「Human Retroviruses and AIDS 1989」Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos national Laboratory, new Mexico」を、甲第４号証として「Ratner,L等　Nature Vol.313, p.277-284(1985年１月）」を、甲第５号証として「Gallo等, Nature Vol.351, p.358（１９９１年５月）, 甲第６号証として「ATCC受託証の写し」を提出している。
　
　異議申立人IIは、甲第１−２号証として、特願昭第６０−５０３９３７号（特表昭第６１−５０１４３１号公報：１９８５年８月２２日出願：パリ優先権主張１９８４年８月２２日米国）及び米国特許出願第643306号を提出して、訂正前の本件特許第１−３発明は、本件出願前に出願され、本件出願の優先権主張日前の優先権を主張する特願昭６０−５０３９３７号に添付された明細書又は図面に記載された発明であるから、本件特許は特許法第２９条の２に違反して特許されたものであるから、特許法第１１３条第二号に該当するので、取り消されるべきであると主張している。
　
３−２−３　２９条２項
　特許異議申立人IIは、甲第３−４号証として、「Science  Vol.225, p.927-930」及び「Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol.８１，p.９９３−９９７」を提出して、訂正前の本件特許第１−３発明は、甲第３号証（以下刊行物１という）記載のものに甲第４号証（以下刊行物２という）記載のものを適用することにより当業者が容易になしえたものであるから、特許法第２９条第２項に違反して特許されたものであるから、特許法１１３条第二号に該当するので、取り消されるべきであると主張している。
　
　
３−３　特許異議申し立ての判断
３−３−１　３６条について
　訂正前の本件第１発明についての、異議申立人I及び／又は異議申立人IIの主張
　
（イ）訂正前の特許請求の範囲第１項中「ラムダJ19（CNCM Ｉ−３３８）に含まれるLAVレトロウイルスゲノムの全部又はその一部に対応するDNAインサートを含有するクローン化DNA」については、「ラムダJ19（CNCM Ｉ−３３８）に含まれる」ものが、LAVレトロウイルスゲノムの全部又はその一部か、DNAインサートか、クローン化DNAか不明。ラムダJ19以外のプラスミドに組み込むこともできるのか不明で、不明瞭である。更に、明細書の詳細な説明に記載されていない。したがって、本件特許請求の範囲は、「発明の詳細な説明に記載した発明の構成に欠くことができない事項のみ」が記載されたものではない。
　
（ロ）訂正前の特許請求の範囲第１項中の「該DNAインサートが、LAVウイルスのゲノムRNAと非緊縮条件下でハイブリダイズするが、ハイブリダイゼーション及び洗浄が低緊縮条件下で行なわれ、ハイブリダイゼーションの低緊縮条件が20％ホルムアミド、５×SSC、１×デンハート溶液、10％硫酸デキストラン中37℃であるドット−ハイブリダイゼーションアッセイにおいてはHTLV−Ｉ及びHTLV−IIレトロウイルスのRNAとクロス−ハイブリダイズしないことを特徴とするDNA」という記載について、まず「LAVウイルスのゲノムRNAと非緊縮条件下でハイブリダイズする」を裏付ける記載が本件明細書中にはない。また、LAVウイルスゲノムRNAとは、非緊縮条件下で（即ち、より低い緊縮度の条件下で）ハイブリダイゼーションするので、非特異的なハイブリダイゼーションを排除できないから、LAVウイルスのゲノムRNAとのハイブリダイゼーション条件を設定し得ないので当業者が容易に実施できない。
更に、「ハイブリダイゼーション及び洗浄が低緊縮条件下で行なわれ、ハイブリダイゼーションの低緊縮条件が20％ホルムアミド、５×SSC、１×デンハート溶液、10％硫酸デキストラン中37℃であるドット−ハイブリダイゼーションアッセイにおいてはHTLV−Ｉ及びHTLV−IIレトロウイルスのRNAとクロス−ハイブリダイズしない」との条件下でハイブリダイゼーションについても、HTLV-IIとのハイブリダイゼーションについての記載が明細書にはなく、HTLV−IについてもDNAとのハイブリダイゼーションであって、RNAとのハイブリダイゼーションについては明細書には一切記載されていない。したがって、発明の構成に欠くことのできない事項のみを記載するものではない。
　
（ハ）pLAV１３は寄託されていないので、pLAV１３は当業者が生産できず、訂正前の特許請求の範囲６項に係る発明が実施できない。更に、I-339の寄託は無効であるから、訂正前の特許請求の範囲１１におけるHindIII部位を含むものを実施できない。
　
（ニ）訂正前の特許請求の範囲第４−６項に記載の制限部位の内、３’末側のもっとも３’側のHindIII部位（9098-9103）付近にあるSacI部位（9054-9059）に対してすぐ５’側のBglII制限部位は、図面４−１１に記載がない。訂正前の特許請求の範囲第１０項に記載の６００位のBamHI、７６００位のBglII、及び９１５0位のBglIIが図面４−１１図になく、訂正前の特許請求の範囲１３及び１４項に記載の３５００位のKpnIが図面４−１１にない。
　
第２及び３発明についても、上記（イ）及び（ロ）が該当する旨、主張している。
　
（判断）
　
（イ）の点について：訂正請求により、クローン化cDNAが、上記構成要件（ｃ）で限定される図（ａ）のLAVゲノムの制限地図上に記載された制限酵素、BamHI（４６０）及びBamHI（６００）のいずれか２つによる切断フラグメントであって、下図（ｂ）のLAVゲノムの制限地図上に記載された制限酵素のいずれか２つによる切断フラグメントではないことを特徴とするＤＮＡインサートを含むものに限定されたので、いかなるcDNAであるかは明確である。
　
（ロ）の点について：まず、本件特許第１発明のクロ−ン化DNAは、上記（イ）においても述べたように、構成要件（ｃ）で特定される具体的に特定の制限酵素地図上の断片に限定されたDNAインサートを含有するもので、上記限定で既に「もの」として十分明確である。してみれば、構成要件（ｂ）による限定は、既に十分特定されている「もの」の特徴を列挙する程度にすぎないものと言うべきである。
　そして、「非緊縮条件下」は、「緊縮条件下」の誤りであるとして、訂正されたことは、上に述べた通りであり、緊縮条件下で目的のウイルスとハイブリダイズさせることは当業者が通常行うことであるから、「「LAVウイルスのゲノムRNAと非緊縮条件下でハイブリダイズする」を裏付ける記載が本件明細書中にはなく、LAVウイルスのゲノムRNAとのハイブリダイゼーション条件を設定し得ないので当業者が容易に実施できない。」という上記主張の不備は解消した。
　HTLV-IとのLAVウイルスのRNAとのハイブリダイゼーションについては本件明細書に記載がないが、LAVウイルスのDNAについては本件明細書に記載されている。そして、本件明細書においては、DNA-DNAハイブリダイゼーションについて、特許請求の範囲１で規定される条件のみならず、より穏やかな条件である「２０％ホルムアミド、8XSSC(tm.50)中でハイブリダイズさせ、２XSSC（tm.50）中３７℃で洗浄した場合でさえ、増感スクリーンを用いて−７０℃で２日露光した後でもハイブリダイゼーションは全く検出されなかった。」（本件特許公報第１４欄第４−８行目）と記載されていることから、HTLV-IのゲノムRNAとも本件請求の範囲１項記載のハイブリダイゼーション条件でクローン化DNAとハイブリダイズしないとはいえないということもできず、３６条４項に規定された要件に違背するとまでは言えない。
　また、HTLV-IIとのハイブリダイゼーションについての実施例としての具体的記載はないが、HTLV-IとHTLV-IIが非常に類似したもので、両者がハイブリダイズすることは、本件明細書に記載され出願時に既に広く知られており、しかも、HTLV-IIが同様の条件下ではハイブリダイズしないという根拠も提出されていないので、３６条第４項の要件を満たさないとすることはできない。
　
（ハ）の点について：I-339の寄託は無効であると主張するものの、異議申立人は寄託が無効であることを立証するための証拠方法を提出しておらず、しかも、特許請求の範囲１１は訂正請求により削除されたので、３６条第３項の要件に違反しているとは言えない。
　
（二）の点について：訂正請求により、訂正請求前の特許請求の範囲第４−６項，並びに第１０項については、特許請求の範囲より削除された。又、ＫｐｎＩ（３５００）は、図面３に記載されている。（なお、図面２のλ１９の制限地図及び図面3は、クローンλJ19を制限酵素で断片とし、それに基づき作成された図面であるところ、Kpn I（３５００）に係る制限部位が存在していたことに疑問はない。）したがってこの点の不備もない。
　
なお、本件特許第２発明及び第３発明についても、同様である。
　
上記のようであるから、本件明細書の記載が３６条３項又は４項に規定する要件を満たさないとはいえない。
　
　
３−３−２　２９条の２について
　
　特許異議申立人Iの提出した甲第１号証は、欧州特許出願公開公報であるところ、特許法第２９条の２でいう「当該特許出願日前の他の特許出願」とは、わが国に出願された出願のことを意味しているので、甲第１号証に基づく異議申立人Iの主張は、不適法な主張であるから、検討しない。（なお、上記甲第１号証の出願に対応する日本出願である異議申立人IIの提出した甲第１号証の出願については以下に検討する。）
　特許異議申立人IIが提出した甲第１号証である本件特許出願日より前に出願された特願昭６０−５０３９３７号（昭和６０年８月２２日出願（パリ優先権１９８４年８月２２日米国））の願書に最初に添付された明細書及び図面には、以下の事項が記載されている。（なお、以下の事項は、先願の優先権主張の基礎とする米国出願明細書又は図面にも記載されている）
　
（イ）「一般に、HTLV-IIIのクローニングには、濃縮したHTLV-IIIウイルスをH9細胞に感染後、組み込まれないウイルスDNAを分離すること、及びラムダファージライブラリーでこのDNAをクローニングしてウイルスｃＤNAでスクリーニングすることが含まれる。」（先願公表公報第３頁右上欄第６−１０行目）
（ロ）「細胞株H9/HTLV-IIIは、大量のHTLV-IIIウイルスを産生し、エイズ血清中のウイルス特異抗原及び抗体を検出するために使用する免疫的分析用の主要な産生細胞株として働く。H9/HTLV-III細胞（感染細胞）を培養し、細胞を集め、次いで新たに感染した細胞から低分子量DNAが得られる。ｃＤNAライブラリーをHTLV-IIIｃＤNAを使ってつくる。次いで、このｃＤNAを組み込まれていないウイルスDNA分析のためのプローブとして使用する。次に組み込まれていない直線DNA（プロウイルスDNA）を得るが、これは全HTLV-IIIゲノムを含み、即ち組換え能をもつ。次いでこのDNAを消化し、プラスミドラムダgtＷｅｓ・ラムダＢに入れラムダBH10クローンを形成させる。他のクローンはHTLV-IIIゲノム全体は含んでいないプロウイルスDNAを消化することによってつくる。」（先願公表公報第３頁右上欄第１０−２５行目）
（ハ）「H9/HTLV-IIIからの濃縮ウイルスを用い、新鮮な非感染H9細胞に５０ウイルス粒子・細胞の割合で感染させる。；培養物から４，１０，１５，２４及び４８時間後に細胞を集める。染色体外DNAをハート(Hirt)の方法によって抽出し、HTLV-IIIcDNAをプローブとして使って組み込まれていないウイルスDNAの量を分析する。このcDNAはオリゴ（dT）によってプライマーをつけ、蔗糖密度勾配で二度バンド形成させたウイルス粒子からのポリ（Ａ）含有RNAから転写した。組み込まれていない直線ウイルスは１０時間後に初めて検出され、・・・・・・ウイルスゲノムXbaIで切っていないが、SstIでは９kb、５．５kbび５kbの主要な３個のバンドが生じた。（図１）これらのバンドは二つの型のHTLV-IIIのHTLV-IIIの完全なゲノムを表し、両方共に。SstIによりLTRで切断され、一方はそのゲノムの中央に更にSstI部位をもつ。クローンBH10は９．０kbのウイルス挿入を含み、これは完全なHTLV-IIIゲノムに一致する大きさである。クローンＢＨ８及びＢＨ５はそれぞれ５．５kbと３．５kbの挿入を含み、ＢＨ５の２，３の制限酵素部位多型性を除き、これらは共にBH10と完全に重なる。したがって、BH10とＢＨ８及びＢＨ５はHTLV-IIIの２つの変株を表している。」（先願公表公報第３頁右下欄第８行−第４頁左上欄第１０行目）
（ニ）第２図は、組み込まれていないウイルスDNAからクローン化した関連性の高い二つのHTLV-III変株の制限エンドヌクレアーゼ地図を表す。三種の組換えクローン（λBH10，λＢＨ５，及びλＢＨ８）を分析し、その挿入（それぞれ９Ｋｂ、５．５Ｋｂ、及び３．５Ｋｂ）を示した酵素によって地図をつくった。これには太字とアステリスクで描かれた３箇所の酵素部位で異なっているHTLV-IIIの二種の変株が示されている。SstIはHTLV-IIIのLTRを切断するので、三種のクローンは一つのLTRを持つ二つの全長のゲノムを表している。（先願公表公報第２頁左下欄第６−１５行目）
　
他方、本件特許明細書には、以下の事項が記載されている。
　「さらに最近になって、、LAV様ウイルスがAIDS患者とプレーAIDS患者から別個に単離された。HTLV-III（ヒトT細胞白血病・リンパ腫ウイルスIII型。１２〜１５参照）及びARV（AIDS関連レトロウイルス）と呼ばれるこれらのウイルスはLAVに類似した特性を多く有しており、LAV原型(prototype)の別々の単離体である。言葉の便宜上これら全部「LAV」と指称する。（以下、記載事項１という。）
　
　
（対比：判断）
　
本件特許第１発明について
本件特許第１発明と先願当初明細書記載のものとを、比較検討する。
（A）　構成要件(a)について：
本件の構成要件（a）「（a）ラムダＪＩ９（ＣＮＣＭ　Ｉ−３３８）に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムRNAのcDNAの全部又はその一部であるＤＮＡインサートを含有するクローン化ＤＮＡ」を分析すると、構成要件（a）のクローンDNAは、「ラムダＪＩ９（ＣＮＣＭ　Ｉ−３３８）に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムRNAのcDNA」の「全部又は一部であるDNAインサートを含有するもの」である。
　
　そこで、ラムダＪＩ９（ＣＮＣＭ　Ｉ−３３８）に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムRNAのcDNAを含有するクローン化DNAと、先願明細書に記載されるクローンであるＢＨ１０，ＢＨ５，及びＢＨ８に含まれるDNAとを比較検討する。
　本件明細書の記載事項１にある定義によれば、HTLV-IIIはLAVウイルスと呼べるもので、クローンであるＢＨ１０，ＢＨ５，及びＢＨ８は、大凡上記摘示事項（ロ）の手順で作成されるものあるから、両者ともLAVウイルスをコードするDNAであるから、本件特許のラムダＪ１９に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムRNAのcDNAを含有するクローン化DNAと先願明細書に記載されるBH10、ＢＨ５及びＢＨ８に含有されるDNAとは、LAVウイルスDNAをコードする点で同一である。
　しかしながら、LAVウイルスをコードするDNAに種々の変異体があることは、異議申立人Iの提出した甲第３号証に、LAV-BRUとHTLV-IIIBの配列を並列して表示し、BRU、ＢＨ８，及びＢＨ１０の配列が異なるものとして示されていることからも明らかであるから、本件特許のラムダＪ１９に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムRNAのcDNAを含有するクローン化DNAと先願明細書に記載されるBH10、ＢＨ５及びＢＨ８とが同じものであるとまではただちには言えない。。
　なるほど、異議申立人Iの提出した甲第４号証には、ＢＨ１０の核酸配列が記載され、甲第５号証（Nature Vol351, p.358）には、「パスツール研究所の研究者及びNIHの研究者が後にAIDS患者由来のウイルスをクローン化したときに、両者は明らかにHIV-LAIを配列決定した。パスツール研究所においては、このウイルスはLAV−BRUと命名された、NIHにおいてはこのウイルスはHTLV-IIIBと命名された。」と記載されている。しかしながら、本件特許のλJ19とBRUとの関係、及び先願明細書中のHTLV-IIIとＢＨ１０，ＢＨ５，ＢＨ８との関係は説明されていない上、異議申立人I提出の上記甲第３号証によっても、BRUとＢＨ８及びBH10とは配列が異なっており、ラムダＪＩ９（ＣＮＣＭ　Ｉ−３３８）に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムRNAのcDNAのクローン化DNAと、先願明細書に記載されるクローンであるＢＨ１０，ＢＨ５，及びＢＨ８に含まれるDNAとが同一であるとまでは言えない。
　ところで、ラムダＪＩ９（ＣＮＣＭ　Ｉ−３３８）に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムRNAのcDNAを含有するクローン化DNAが、BH10，ＢＨ５，ＢＨ８に含まれるDNAとは全体として異なる配列であっても、部分において、重なることはあり得ることであるから、ラムダＪＩ９（ＣＮＣＭ　Ｉ−３３８）に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムRNAのcDNAの一部であるDNAが、BH10，ＢＨ５，ＢＨ８に含まれるDNAと一致する可能性は、排除できない。一方、本件特許第１発明は、構成要件（ａ）−（ｃ）を必須とするものであるので、次に、構成要件（ｃ）について検討する。
　
　構成要件（ｃ）について
本件特許第１発明は、クローン化DNAの内、特許請求の範囲第１項に記載された図面（ａ）に掲げられた具体的制限酵素断片に対するものであるが、先願明細書に開示された得られたcDNAは、結局、先願の図面２又は３に記載されたものであるが、これら図面に開示された具体的配列は、上記摘示事項（ハ）及び（ニ）から図面２に記載された制限酵素地図の断片が最大限であるところ、図２に記載された制限酵素地図は、本件特許請求の範囲第１項に掲げられた図面（ｂ）により、除外されたものであるから、結局、構成要件（ｃ）は、先願明細書に記載されたものと言うことはできない。
　
結局、本件特許第一発明は、特許請求の範囲第１項に掲げられた制限酵素地図（ａ）に記載される特定の制限酵素断片であるクローン化DNAであって、本件特許請求の範囲第一項に掲げられた（ｂ）という制限酵素地図により、先願明細書に開示された具体的DNAは、除外されているので、先願明細書に具体的に記載された配列制限酵素断片とは異なる制限酵素断片に係るものであるから、先願明細書に記載された発明とすることはできない。
　
本件特許第２及び３発明についても同様である。
　
　
３−３−３　２９条（２）項
　
刊行物１には、次の事項が記載されている。
　
（イ）「HTLV-III（HTLV-IIIB）に感染したHTcell Clone９(H9)の上清からウイルス粒子を、平衡ショ糖密度勾配遠心法で分離した。HTLV-IIIBは元々は、AIDS患者の短期リンパ球培養物の上清プールから得られた。ウイルス粒子は、又、他のAIDS患者（HTLV-IIIZ）の１次リンパ球培養物のウイルスにより新たに感染された正常末梢血リンパ球からも精製された。」（第２９８頁左カラム第１４行目−中カラム第２行目）
（ロ）「ウイルスは、SDSで破壊され、プロテインアーゼＫで分解、オリゴdTセルロースカラムで直接クロマログラフされた。得られたポリAの付いたＲＮＡは鋳型として３２ｐラベル化cDNA合成に使用された。得られたcDNAのサイズは、０．１から１０kbであった（データは示されない）。」（第２９８頁中カラム第３行目−１３行目）
（ハ）「ラベルされたcDNAを、感染されたH9細胞、非感染のH9細胞、及び他の非感染のヒト株化細胞から精製されたポリA含有RNAとハイブリダイズさせたとき、感染したH9だけが、ノーザンハイブリダイゼーションで明確なRNAバンドを示すことから、ホモローガスなRNAをもっていることが証明された。図１は、HTLV-IIIB及びHTLV-IIIＺ由来のcDNAは、同じパターンを示し、９．０，４．２，及び２．０kbのRNAを検出することを表している。」（第２９８頁中欄第１３行目−右欄第１行目）
（ニ）「これらのバンドはそのサイズにおいて、以前からHTLV-Iに感染した細胞で観察されているenvとpX配列の、ゲノムサイズ、メッセンジャーRNAサイズ、及びスプライスされたmRNAサイズに相当し、このことはこれらウイルスとの予想される関連性と軌を一にしている。」（第９２８頁右欄第１−８行目）
（ホ）「HTLV-IIIとHTLV-I及びHTLV-IIとのホモロジーを直接的に決定するために、特定の制限酵素で消化されたHTLV-I及びHTLV-IIのクローン化ゲノムにHTLV-IIIのcDNAをハイブリダイズさせた。HTLV-Iのプロトタイプ、HTLV-Iの変異株であるHTLV-Iｂ、及びHTLV-IIの完全なゲノムが、図の２の説明に示されるように２種類の制限酵素で消化され、３２ＰでラベルされたHTLV-IIIBcDNAにブロットハイブリダイズされた。gagとpolにわたる領域が最大のホモロジーを示す。」（第９２８頁右欄第１４行目−第９２９頁左欄第４行目）
（ヘ）「HTLV-IとHTLV-IIのenvとpx配列に相当する断片もpx配列だけを含む１．４kb　Pst I断片がハイブリダイズする（図２，レーン４））のと同様に、HTLV-IIIb　cDNAと弱くハイブリダイズ（図２、第一レーンの２．４ＫｂのPstI-PstI及び２．１ＫｂのSstI−PstI断片参照。）した。これらの配列の検出の容易さは、cDNAの調製物によって異なった。ウイルスゲノムの３’側があるか否か（representation）によるためである。」（９２９頁左欄第１６−２７行目）
（ト）「我々の研究では、HTLV-IIIとHTLV-IまたはHTLV-IIとの具体的な比較はできなかった。しかしながら、LTRを含む５’末端断片、及び３’末端断片での低いシグナルから、これらの要素には、最低限のホモロジーまたはホモロジーがないということを示唆している。」（９２９頁右欄第４−１１行目））
　
　
（対比判断）
　
本件特許第１発明と、刊行物１記載のものとを比較検討すると、両者は、
AIDSウイルスの原因ウイルスと考えられるウイルスのcDNAに係るものである点で、軌を一にするものである。
　
本件第１発明の構成要件の内、まず、構成要件（ａ）及び（ｃ）について刊行物１記載のものと比較検討する。
構成要件（ａ）について
　構成要件（a）は、「ラムダＪ１９（ＣＮＣＭ　Ｉ−３３８）に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムRNAのｃＤNAの全部又は一部であるDNAインサートを含有する」「クローンDNA」であるのに対し、
　刊行物１記載のものは、上記摘示事項（イ）〜（ロ）に摘示したように、「HTLV-III（HTLV-IIIB）に感染したHTcell Clone９(H9)の上清からウイルス粒子を分離し、ポリAの付いたＲＮＡは鋳型として３２ｐラベル化cDNAを合成したもの」であって、得られたcDNAのサイズは０．１から１０kbで、クローン化されたDNAではない点で相違する。
　
構成要件（ｃ）について：
　本件特許のDNAインサートが、特定の制限酵素で切断された断片であるのに対して、刊行物１においては、そもそも、ｃＤNAは０．１kbから１０．０kbまで広い幅がある混合物で、制限酵素による切断もなされていない。
　以上のように、本件第１発明と刊行物１記載のものとは、少なくとも、
（イ）本件第１発明のDNAインサートが構成要件（ｃ）で限定される特定の制限酵素断片である点、及び
（ロ）本件特許のDNAインサートがクローン化されているものである点において刊行物１記載のものとは相違するものである。
　
　
（相違点の検討）
　
（１）刊行物１記載のものと周知技術とを組み合わせることについて
　刊行物１記載の発明から、構成要件（ｃ）で特定される制限酵素断片（相違点（イ））を、当業者が容易に調製なし得たか、否かを検討する。
　刊行物１に記載されているものは、上記（ロ）に摘示したようにmRNAのcDNA混合物にすぎず、全長HTLV-IIIウイルスcDNAがとれていたことも確認されておらず、例えば、ポリAに対するポリＴプライマー部分より伸張した遠い側であるcDNAの３’側について、刊行物１には、上記刊行物１の摘示事項（ホ）−（ト）に示されるように、HTLV-I＜HTLV-IIとHTLV-IIIとのハイブリダイズは、３’側のコード領域や、LTR領域とハイブリダイズは弱く、逆転写酵素を用いては、長いmRNAのcDNAを直接作成することは困難であることを勘案すると、HTLV-IIIの全長配列が得られていたか不明であるというべきである。
　してみれば、このように全長配列が得られているかどうか不明な混合物cDNAから、全長配列cDNAを生成し取得することは容易であるとは言えず、更に、この全長配列を特定の制限酵素断片で、消化して断片を得ることも容易とは言えない。そして、本件発明の特定の制限酵素断片は、全長のウイルス配列に相当するクローンλJ19を取得した後に、制限酵素断片を得たもので、全長配列におけるそれぞれの断片の位置が確認できるものである。
　したがって、刊行物１記載の発明から、構成要件（ｃ）で特定される制限酵素断片を、当業者が容易に調製なし得たとすることはできない。
　
（２）刊行物１及び２を組み合わせることについて
　次に、刊行物１記載の発明及び刊行物２に記載のものから、本件特許の特定のDNAインサートを有するクローン化DNAすることが、当業者が容易になし得たものか否かについて検討する。
　刊行物２の記載事項を要約すると、HTLV-IIのプロウイルスを制限酵素の部分消化により染色体から切り出して断片化したものをクローニングしてライブラリーとし、HTLV-IのラベルしたpCRCF断片とハイブリダイズするものを選択し、更に当該クローンをプローブとして用いて再度複数のクローンをライブラリーから選択し、得られた複数のクローンの制限酵素地図を比較することで、共通部分（プロウイルス部分）及び、その両側の細胞側部分を決定し、全長プロウイルスゲノムを決めようとすること、しかしながら、LTRの正確な長さは決定できなかったことが記載されている。
　ここで、刊行物１記載のcDNA混合物を利用して、プロウイルス、あるいは、LAVウイルスゲノムRNAのcDNA全長を入手するために、刊行物２に示される手法により、刊行物１記載のcDNA配列をプローブとして用いて、全長のLAVウイルスを検索することの容易性を検討すると、本件の場合でも、１次プローブで２００万個のファージプラークをスクリーニングして７個のクローンが得られたにすぎないという確度の低く困難なものであることを考えると、当業者が容易になし得たものとは考えられない。
　そして、刊行物２記載の手法でスクリーニングした得られたプロウイルスのインサートを含有したクローンからは、LTRの外側の細胞のフランキング領域を含むものであって、LTR部分が十分に特定できないことは、上記要約に記載したとおりのものである。
　これに対して、本件方法では、ポリAプライマーを利用して、ウイルスRNAゲノムを逆転写して得たcDNAライブラリーからのpLAV１３には、LTRのU３及びＲが含まれ、しかも、pLAV１３というプローブのポリA部のごく上流にHindIII部位があることから、LTRのＲにHindIII部位があることを利用して、HindIIIの部分消化により、ウイルス遺伝子全長を含むクローンを得、pLAV１３を再度用いて、R-U５接合部分を見いだし、LTRを含むものを得ている。
　
　以上のことから、刊行物１記載のcDNAを用いて、刊行物２に記載のクローニング方法を用いて、全長ウイルスクローンを得ることは、当業者であっても容易になし得たものとは言えないものである。
　また、本件第１発明の制限酵素地図上の断片であるDNAインサートについてもについても、全長のウイルスcDNAが得られたならばこそ、その位置関係が明らかになって、得られたものであるから、やはり、刊行物1及び刊行物２記載のものから当業者が容易になし得たものとも言えない。
　
したがって、本件第１発明が、刊行物１−２記載のもの及び周知技術から容易になし得たものとはできない。
　
本件特許第２及び３発明についても同様である。
　
３−４むすび
　以上の通りであるから、特許異議申立人I及びIIの申し立てた理由及び証拠によっては、本件特許を取り消すことはできない。又、他に、本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　
　よって、結論の通り決定する。
【異議決定日】
平成１２年１２月２２日（２０００．１２．２２）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
訂正事項（ａ）
特許請求の範囲第１，１５及び１６項の「ＬＡＶ　レトロウイルスゲノムの全部又はその一部に対応する」を特許請求の範囲の減縮を目的として、「ＬＡＶ　レトロウイルスゲノムＲＮＡのｃＤＮＡの全部又はその一部である」とそれぞれ訂正する。
　これに伴い、特許請求の範囲の記載と発明の名称及び発明の詳細な説明の記載との整合を図るため、明瞭でない記載の釈明を目的として、明細書第１頁第１−２行目の発明の名称「リンパ節障害関連ウイルス（ＬＡＶ）のゲノムＲＮＡとハイブリダイズしうるクローン化ＤＮＡ配列」を「リンパ節障害関連ウイルス（ＬＡＶ）のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡの全部又は一部であるＤＮＡインサートを含むクローン化ＤＮＡ配列」と訂正し、明細書第１頁第１３−４行目（特許掲載公報第２頁第４欄第２４−２５行目）の「ゲノムＲＮＡ及びＤＮＡとハイブリダイズしうる」を「ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡの全部又はその一部であるＤＮＡインサートを含有する」と訂正する。
訂正事項（ｂ）
特許請求の範囲第１，１５及び１６項の「ＬＡＶウイルスゲノムＲＮＡと非緊縮条件下でハイブリダイゼーション」を「ＬＡＶウイルスゲノムＲＮＡと緊縮条件下でハイブリダイゼーションする」に誤記を訂正する。
訂正事項（ｃ）
特許請求の範囲の減縮を目的として、「１０％硫酸デキストラン中３７℃であるドットブロットーハイブリダイゼーションアッセイにおいてはＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩレトロウイルスのＲＮＡとクロスハイブリダイズしない」を「１０％硫酸デキストラン中３７℃であって、フィルターをＨＴＬＶ−Ｉ配列から得た５３．１％ＧＣ含量を用いて３７℃（ｔｍ５０）で洗浄し、洗浄を５０℃と６５℃、１　ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ　中で繰り返すドットハイブリダイゼーションアッセイにおいてはＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩレトロウイルスとクロスハイブリダイゼーションしないものであり、下図（ａ）のＬＡＶゲノムの制限地図上に記載された制限酵素、ＢａｍＨＩ（４６０）及びＢａｍＨＩ（６００）のいずれか２つによる切断フラグメントであって、下図（ｂ）のＬＡＶ　ゲノムの制限地図上に記載された制限酵素のいずれか２つによる切断フラグメントではない」と訂正し、
　特許請求の範囲第１項の「ことを特徴とするＤＮＡ。」、
　特許請求の範囲第１５項の「ＤＮＡからなるＬＡＶのインビトロ検出用プローブ。」、及び
　特許請求の範囲第１６項の「ＤＮＡからなるＬＡＶのインビトロ検出用プローブと接触せしめ、ハイブリダイズしたプローブを検出することを特徴とする方法。」
をそれぞれ
「ことを特徴とするＤＮＡ　　　　　」
「ＤＮＡからなるＬＡＶのインビトロ検出用プローブ。（以下上記特許請求の範囲第１項に訂正された図面と同じ図面：省略）」、
「ＤＮＡからなるＬＡＶのインビトロ検出用プローブと接触せしめ、ハイブリダイズしたプローブを検出することを特徴とする方法。（以下上記特許請求の範囲第１項に訂正された図面と同じ図面：省略）」
とそれぞれ訂正する。
訂正事項（ｄ）特許請求の範囲第３−７、１０及び１１項のそれぞれを、特許請求の範囲の減縮を目的として削除する。
訂正事項（ｅ）特許請求の範囲第８項中の「請求の範囲１−７のいずれかに記載の」を、訂正事項ｄに伴う明瞭でない記載の釈明を目的として、「請求の範囲１又は２に記載の」と訂正し、かつ特許請求の範囲第８項を特許請求の範囲第３項と訂正する。
訂正事項（ｆ）特許請求の範囲第９項を上記（ｄ）の訂正に伴う明瞭でない記載の釈明を目的として、特許請求の範囲第４項と訂正する。
訂正事項（ｇ）特許請求の範囲第１２項中の「ＫｐｎＩ（６１００）辺りからＢａｍＨＩ（８１５０）辺りまで」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「ＫｐｎＩ（６１００）からＰｖｕＩＩ（８５００）まで」に訂正する。
訂正事項（ｈ）特許請求の範囲第１３項中の「Ｋｐｎ　Ｉ（３５００）辺りからＢ　ｇｌＩＩ（６５００）辺りまで」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「ＫｐｎＩ（３５００）からＰｖｕＩＩ（６５００）まで」に訂正する。
訂正事項（ｉ）特許請求の範囲第１４項中の「Ｐｓｔ（８００）辺りからＫｐｎＩ（３５００）辺りまで」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「ＰｓｔＩ（８００）」からＰｖｕＩＩ（３８００）まで」に訂正する。
訂正事項（ｊ）特許請求の範囲第１２−１４項の各々の中の「請求の範囲１１に記載の配列」を、訂正ｄに伴う明瞭でない記載の釈明を目的として、それぞれ削除し、かつ特許請求の範囲第１２−１４項をそれぞれ特許請求の範囲第５，６，及び７と訂正する。
訂正事項（ｋ）特許請求の範囲第１５，１６項については、それぞれ項番号を訂正し、特許請求の範囲第８，９項とする。
訂正事項（ｌ）特許掲載公報第３頁第５欄第２６−２７行の「第４−１１図は、第４図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配列を示す。」を誤記の訂正を目的として、「第４図−１１図は、第３図に制限酵素地図を示したＬＡＶゲノムの全配列を示す」と訂正する。又、特許掲載公報第７頁第１３欄第２７行の「λ　Ｊ１９の完全な配列を第５−１２図に示す。」を誤記の訂正を目的として、「λ　Ｊ１９の完全な配列を第４−１１図に示す。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
リンパ節障害関連ウイルス（ＬＡＶ）のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡの全部又は一部であるＤＮＡインサートを含むクローン化ＤＮＡ配列
【発明の詳細な説明】
　本発明はリンパ節障害関連ウイルス（ＬＡＶ）のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡの全部又はその一部であるＤＮＡインサートを含有するクローン化ＤＮＡ配列、その製造方法ならびにその用途に係る。さらに特定的には、ＬＡＶウイルスまたは関連ウイルスまたはＤＮＡプロウイルスのいずれかを含有しているあらゆる媒質サンプル、特に生物学的試料中のこれらウイルスの検出に用いることができるＤＮＡ配列を含む安定なプローブに係る。
　リンパ節障害関連ウイルス（ＬＡＶ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の前徴または良性形態であることが多いリンパ節障害症候群に患った同性愛の患者のリンパ節から初めて単離されたヒトレトロウイルスである（１参照）。その後別のＬＡＶがＡＩＤＳ患者やプレーＡＩＤＳ患者から単離されている（２〜５参照）。入手できるデータは全て、このウイルスがＡＩＤＳの病因であることと一致している（１１参照）。
　このウイルスは活性化Ｔリンパ球で増殖し、丁細胞サブセットＯＫＴ４に対して向性をもっており（２〜６参照）、このサブセット中で細胞変性効果を誘発する。しかしこのウイルスは、ある種のエプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルスでトランスフォームしたＢ細胞株（ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）（７参照）中や樹立したＴリンパ芽球細胞株、ＣＥＭ中で増殖できるように順応させられている。
　さらに最近になって、ＬＡＶ様ウイルスがＡＩＤＳ患者とプレーＡＩＤＳ患者から別個に単離された。ＨＴＬＶ−ＩＩＩ（ヒトＴ細胞白血病／リンパ腫ウイルスＩＩＩ型。１２〜１５参照）およびＡＲＶ（ＡＩＤＳ関連レトロウイルス）とよばれるこれらのウイルスはＬＡＶに類似した特性を多く有しており、ＬＡＶ原型（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）の別々の単離体である。言葉の便宜上以後これらを全部「ＬＡＶ」と指称する。
　現在のところ利用できる検出法はウイルスタンパク質の識別を基にしている。このような方法は、１９８３年９月１５日付けの英国出願第８３　２４８００号の優先権を主張して１９８４年９月１４日に出願された名称を「リンパ節障害と後天性免疫不全症候群を診断するための抗原、手段および方法」とする欧州出願に開示されている。実際抗−ｐ２５抗体がＡＩＤＳ患者とプレーＡＩＤＳ患者の血清中に高率で発見され、これよりは低いがかなりの程度でＡＩＤＳの罹患の危険度が高い群でも見つかっている（８〜１０参照）。
　本発明は、ＬＡＶやその関連ウイルス（以後さらに概括的に「ＬＡＶウイルス（群）」と指称する）の検出に同様に有用であるばかりでなく、特にこれらウイルスのゲノムＤＮＡの特定の一部であってその発現産物が免疫的手法では必ずしも検出できないようなＤＮＡを検出する際にさらに多くの有用性を発揮する新規な手段を提供することを目的としている。
　以下図面を参照するが、図面中で、
−第１図はプラスミド組換え体に含有される好ましいＬＡＶインサート（挿入物）の制限地図を示し、
−第２図は完全なＬＡＶ断片の制限地図を示し、
−第３図は完全なＬＡＶゲノム（クローンλＪ１９）の制限地図であり、
−第４〜１１図は、第３図に制限地図を示したＬＡＶゲノムの全配列を示す。
　本発明のＤＮＡはＬＡＶのゲノムＲＮＡとハイブリダイズしうるＤＮＡ断片を含有するＤＮＡから成っている。特定的には、このＤＮＡは前記ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片またはこのｃＤＮＡもしくはｃＤＮＡ断片を含有する組換えＤＮＡから成る。
　好ましいクローン化ｃＤＮＡ断片は各々次の制限部位をそれぞれ（３′末端から５′末端へ）次の順序で含有する。
　１）　ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ（ＬＡＶ７５）
　２）　ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢａｌＩＩ，ＫｐｎＩ（ＬＡＶ８２）
　３）　ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｇｌＩＩ，ＫｐｎＩ，ＸｈｏＩ，ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＢｇｌＩＩ（ＬＡＶ１３）。
　ここで、ＬＡＶ７５，ＬＡＶ８２およびＬＡＶ１３という表示はそれぞれを最初にクローン化した組換えプラスミド（それぞれｐＬＡＶ７５，ｐＬＡＶ８２およびｐＬＡＶ１３と表示）の名称に対応している。言い換えると、ＬＡＶ７５，ＬＡＶ８２およびＬＡＶ１３はそれぞれ上記の組換えプラスミド中にインサートとして存在するということである。便宜上、ｃＤＮＡ断片が単離形態にあってもプラスミド形態にあっても、本明細書を通じてこの断片を表示するのにこのＬＡＶ７５，ＬＡＶ８２およびＬＡＶ１３という表示を使用する。したがって、上で最後に述べた組換え体の他のＤＮＡ部分はそれぞれｐＬＡＶ７５，ｐＬＡＶ８２およびｐＬＡＶ１３の対応する部分と同一かまたは異なる
　好ましいｃＤＮＡも（ＬＡＶ７５，ＬＡＶ８２およびＬＡＶ１３と同様に）、特にＬＡＶのレトロウイルス構造が今日までに知られたレトロウイルスのゲノム構造と概ね一致するものと仮定すれば、レトロウイルスのＤＮＡのコード領域の３′末端はもちろんＬＴＲ（長い末端反復配列、Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ）のＲ領域とＵ３領域に対応する領域を含有している。
　大きさが約２．５ｋｂｐのＬＡＶ１３は特に有利であることが判明した。このものはＬＡＶやＬＡＶ関連ウイルスに対して特異性が高く、またＬＡＶ７５やＬＡＶ８２よりも多くのＬＡＶレトロウイルスゲノムを認識する。特に、ＬＡＶ１３によってＬＴＲ内部のレトロウイルスゲノムのＲＵ５接合部の同定が可能となり、その後ＬＡＶゲノムのサイズの決定が可能になった。ＬＡＶゲノムサイズは平均すると約９．１〜９．２ｋｂである。
　ＬＡＶ１３は酵素ＥｃｏＲＩ，ＮｒｕＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，ＳｐｈＩ，ＳｔｕＩおよびＸｂａＩに対する制限部位をもたない。
　さらにＬＡＶ１３は、レトロウイルスゲノム内でエンベロープタンパク質をコードしている配列に相当するＤＮＡ配列部分だけは少なくとも含有しているようである。
　また本発明はＬＡＶレトロウイルスゲノム全体の一部分に相当すると思われるｃＤＮＡ中に含有される任意の断片にも係る。このＬＡＶレトロウイルスゲノム全体はその特徴として（５′末端から３′末端に向かって）後述の順序で一連の制限部位を含有している。
　好ましい全ＬＡＶゲノムの連続する部位の座標（制限地図）も後に、Ｒ領域に位置するＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位（これを座標１に選択した）に対する座標として示す。この座標は＋２００ｂｐ以内で評価されている。あるものは他のものよりも充分に確立されている。
　上記した本発明のＤＮＡはほぼ５５５０の座標の所にＨｉｎｄ　ＩＩＩを余分に含んでいることもある。
　さらに詳しくいうと本発明は概略の大きさが０．１ｋｂ（１０ｋｂ）で第３図に示した一連の制限部位を含むＤＮＡに係る。
　より一般的にいって本発明は、さらに詳細にいった場合後者（上記のＤＮＡ）のｃＤＮＡ変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）に係り、これら変異体は同じ一連の制限部位を後記の（５′末端から３′末端へ向かう）順序で有していてもよいが、制限部位のあるものが意図（自発）的かまたは意図的でなく誘発された突然変異に起因して欠失していてもまたは付加されていてもよい。
　さらに本発明は上述の制限地図でそれぞれ以下のように延びるＤＮＡ断片にほぼ対応する別の好ましいＤＮＡ断片にも係る。
−Ｋｐｎ　Ｉ（６１００）あたりからＢｇｌ　ＩＩ（９１５０）あたりまで。この断片は少なくとも１部がエンベロープのタンパク質をコードしている遺伝子に対応していると考えられる。特に約１１００００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎｓ）のタンパク質ｐ１１０はこの領域にコードされている。
−Ｋｐｎ　Ｉ（３５００）あたりからＢｇｌ　ＩＩ（６５００）あたりまで。この断片は少なくとも１部がｐｏｌ遺伝子（ウイルスポリメラーゼをコードしている。）に対応していると考えられる。
−Ｐｓｔ（８００）あたりからＫｐｎ　Ｉ（３５００）あたりまで。
　この断片は少なくとも１部がｇａｇ遺伝子（タンパク質ｐ２５，ｐ１８およびｐ１３を含めたコア抗原をコードしている）に対応していると考えられる。
　また本発明は、後に示されるようにＬＡＶのゲノムＲＮＡとハイブリダイズしうる他のＤＮＡ断片ならびにＬＡＶウイルス群の全ゲノムに相当する別のｃＤＮＡ変異体とハイブリダイズしうる他のＤＮＡ断片にも係り、さらにこれらＤＮＡやｃＤＮＡ断片を含有するＤＮＡ組換え体にも係る。
　さらに特定的には本発明は、上記の断片に対応しており、ほぼ同じ部位を互いにほとんど同じ距離だけ離して有するあらゆる断片に係り、これら断片は全て共通してＬＡＶレトロウイルスゲノムとハイブリダイズしうるという能力をもっている。もちろん、同様にＬＡＶレトロウイルスゲノムとハイブリダイズするという能力を実質的に変えない欠失や突然変異を有する断片は上でより特定的に述べたＤＮＡ断片の自明な均等物を形成するものと理解されたい。
　本発明の別の付加的な特徴は制限地図とヌクレオチド配列を含めて本発明の好ましいＤＮＡの付加的な特徴に関する開示を通して明らかとなろう。以下本発明の好ましいＤＮＡの製造条件とその特性を非限定的に例証する。
１．
ｃＤＮＡライブラリーの構築
　１．１　
ウイルス精製
　不死化した永久系ＬＡＶ産生Ｂ−リンパ球株（Ｌｉｎｅ）ＦＲ８（１９８４年５月９日付でパリ・パスツール研究所（ＩＮＳＴＩＴＵＴ　ＰＡＳＴＥＵＲ）の“Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ”に番号Ｉ−３０３で寄託。７参照）からビリオンを精製した。精製手順（プロトコル）は既報の通り（１参照）。主要なステップは、培養上清のボリエチレン−グリコール処理と、２０％シュクロース層（ｃｕｓｈｉｏｎ）を通すペレット化と、２０〜６０％シュクロース勾配によるバンド分け（ｂａｎｄｉｎｇ）と、ウイルス含有画分のペレット化であった。
　１．２　
第１ストランドｃＤＮＡ合成
　ウイルスに関連する洗滌で活性化された内因性反応は、ウイルスを精製しそのエンベロープを溶解した後このウイルスのリバーストランスクリプターゼ（逆転写酵素）を作用せしめる技術である。
　各反応毎にＦＲ８上清２５０〜３００ｍｌに相当する精製ウイルスを用いた。最終反応（液）量は１ｍｌであり、インキュベーションは３７℃で４５分間、タンパク質濃度は約２５０μ９／ｍｌであった。バッファーはＮａＣｌ　２５ｍＭ，ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．８）５０ｍＭ、ジチオスレイトール１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２　６ｍＭ、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ　各０．１ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００　０．０２％、オリゴｄＴプライマー５０μｇ／ｍｌであった。α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ　４００　Ｃｉ／ｍｍｏｌｅを０．６μＭまでかつコールド（放射化していない、ｃｏｌｄ）ｄＣＴＰを４μＭまで用いて１５分間ｃＤＮＡを標識した。その後、コールドｄＣＴＰを２５μＭまで加えて第１ストランドの最適な伸長を確実にした。
　ｄＣＴＰ追跡（付加、ｃｈａｓｅ）の３０分後ＥＤＴＡを２０ｍＭまで、ＳＤＳを０．５％まで加えて反応を停止させ、プロテイナーゼＫ　１００μｇ／ｍｌで１時間消化し、フェノール−クロロホルム抽出した。
　次にＧ−５０　Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｍａｃｉａ）上でｃＤＮＡを精製し、エタノール沈殿した。
１．３　
第２ストランド合成とクローニング
　精製しｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをＧＵＢＬＥＲとＨＯＦＦＭＡＮ（１７参照）に従ってＤＮＡポリメラーゼＩとＲＮａｓｅ　Ｈで処理した。ターミナルトランスフェラーゼを用いて２本鎖ｃＤＮＡの末端にｄＣを付加（ｄＣ−ｔａｉｌ）し、ｐＢＲ３２２の誘導体であるｐＢＲ３２７（３４参照）をｐｓｔ消化し、末端にｄＧを付加したものとアニールした。
　大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００　ｒｅｃＢＣ株をトランスフェクションしてｃＤＮＡライブラリーを得た。
２．　
ＬＡＶ−特異的クローンの検出
　２．１　ライブラリーのスクリーニング
　５００個の組換えクローンをニトロセルロースフィルター上で増殖させ、既報（１，２参照）のように内因性ウイルス関連反応で作成し、３２Ｐで標識したｃＤＮＡのもう１つのバッチを用いてその場（
ｉｎ　ｓｉｔｕ）
　これらのクローンを小規模に増幅しそれらのインサートのクロスハイブリダイゼーションを行なって主要な１群を得た。これらのクローンのうち組換え体とハイブリダイズする主要な１群を同定した。これらのｃＤＮＡクローンのうち３個、すなわち２．５ｋｂ、０．６ｋｂおよび０．８ｋｂのインサートをもつものをそれぞれｐＬＡＶ１３、７５および８２と命名して更に特性決定した（第１図）。
　３種のインサートは全て一端に共通の制限パターンをもっており、ブライミング部位が共通であることを示唆している。長さ５０ｂｐで共通のＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｐｓｔ　Ｉ断片の配列を決定した（第１図）。これら共通断片はクローニングｄＣテイル部の前にポリＡ鎖を含有することが示された。すなわちこれらのクローンはポリＡ−ＲＮＡの３′末端のコピーである。
　ＬＡＶ１３の特異性をいろいろなアッセイで示した。
　ｐＬＡＶ１３の特異性を、ニック翻訳したｐＬＡＶ１３をプローブとして用いた一連のフィルター八イブリゼーション実験で決定した。先ずこのプローブはドット（ｄｏｔ）およびノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ブロッティングによって精製したＬＡＶゲノムＲＮＡにハイブリダイズした（データは示さず）。またｐＬＡＶ１３は培養上清から濃縮されフィルターに直接固定されたウイルスのゲノムＲＮＡにもハイプリダイズする（ドットプロット法）。同様な方法でいろいろな起源、すなわち正常Ｔ細胞、ＦＲ８その他のＢ細胞のＬＡＶ産生株、ＣＥＭ細胞、および、（これら程強くはないが）ＡＩＤＳに罹った血友病患者から得た骨髄培養物由来のＬＡＶ（３参照）から得たＬＡＶ　ＲＮＡが検出された。非感染培養物は負であることが立証された。この迅速なドットブロット法は多少修正すれば血清その他の体液中のＬＡＶの検出に適用することができる。
　第二にこのプローブはＬＡＶに感染したＴリンパ球のサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ブロットとＬＡＶを産生するＣＥＭ細胞株（ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）とにおいてＤＮＡを検出した。同じハイブリダイゼーション条件下では、非感染リンパ球のＤＮＡでも正常肝から得たＤＮＡでもハイブリダイゼーションは検出されなかった（データは示さず）。
　後述するようにＬＡＶウイルス群の全レトロウイルスゲノムを同定するのにＬＡＶ１３を用いることができるという可能性から第３の特徴が導かれた。Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで開裂したｐＬＡＶ１３中の内部ウイルス断片と共に移動する特に特徴的な１．４５ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片が検出された。２．３ｋｂと６．７ｋｂにもバンドが検出された。このプローブの長さは２．５ｋｂしかなく、しかも接合断片は全く検出できなかったので、これら大き過ぎるバンドは、ＬＡＶゲノムのＨｉｎｄ　ＩＩＩ多型性から生じた内部断片に当たるのであろう。
　これらのデータを合わせると、ｐＬＡＶ１３ＤＮＡはヒトゲノムに対して外因性であり、ＬＡＶに感染した細胞から得たＲＮＡ形も組み込まれたＤＮＡ形も双方とも検出することが示される。すなわちｐＬＡＶ１３はＬＡＶに特異的である。従来知られているレトロウイルスのゲノム構造を考えれば、ｐＬＡＶ１３はオリゴ−ｄＴでプライムしたのでコード領域の３′末端と共にＬＴＲのＲ領域とＵ３領域も含有するはずである。
　
ＬＡＶゲノムＤＮＡのクローニング
　ＬＴＲのＲ領域内にＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位があることが判明したので、ＬＡＶに感染した細胞から得たプロウイルスＤＮＡをＨｉｎｄ　ＩＩＩで部分消化することによりＬＡＶゲノムをクローン化することにした。（ａ）部分消化すると完全なクローンを単離する機会が増大すること、および（ｂ）Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片はラムダ置換ベクター（ｌａｍｂｄａｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｖｅｃｔｏｒｓ）中で容易にクローン化されることが判明した。健常ドナーから得インビトロで
（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）
　ＬＡＶゲノムＤＮＡのクローニングはさらに詳細には次のようにして行なった。
　ｃＤＮＡを上述のようにＬＡＶに感染したＴ細胞から調製した後、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで部分的に消化し、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　Ｃｌ（ｐＨ８）。１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１Ｍ　ＮａＣｌ中５〜４０％のシュクロース勾配上で分画した（ＳＷ４１ローター、４０，０００ｒｐｍで１６時間）。単一画分（９±０．５ｋｂ）をキャリヤーとしての　Ｄｅｘｔｒａｎ　Ｔ４０　２０μｇ／ｍｌで沈殿させ、ＴＥバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ．Ｃｌ，ｐＨ８，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に取った。λ−Ｌ４７．１Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ腕は、先ずｃｏｓ部位を連結した後Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで消化し５〜４０％のシュクロース勾配を通して分画して調製した。λ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ腕のみを含有する画分をプールし、沈殿させ、ＴＥ−バッファーに取った。この腕とＤＮＡの連結は、３：１過剰モル濃度の腕と３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）とを用いてＤＮＡほぼ２００μｇ／ｍｌで行なった。溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）の
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
ｉｎ　ｓｉｔｕ
　このように、ニック翻訳したｐＬＡＶ　１３インサートをプローブとして用いた
ｉｎ　ｓｉｔｕ
　第２図の制限地図はプロットをｐＬＡＶ１３ＤＮＡに対してハイブリダイスすることで方向を決定した。
　ＬＡＶ１３ｃＤＮＡクローンの制限地図も第２図に示してある。λ−Ｊ１９の制限部位はＢがＢａｍＨＩ、ＢｇがＢｇｌ　ＩＩ、ＨがＨｉｎｄ　ＩＩＩ、ＫがＫｐｎ　Ｉ、ＰがＰｓｔＩ、ＲがＥｃｏ　ＲＩ、ＳがＳａｃ　Ｉ、ＳａがＳａｌ　Ｉ、ＸがＸｈｏ　Ｉである。目盛り（スケール）の下にはレトロウイルスの一般的な構造の概略図があり、これにはＬＴＲの要素の要素Ｕ３，ＲおよびＵ５が示されている。Ｒ／ＵＳ境界のみがはっきり決められており、他の境界は単に比ゆ的に図示しただけである。
　λ−Ｊ１９の５′の０．５２ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片中には他のＢａｍＨ　Ｉ部位があるかもしれない。これらの部位は小さ過ぎて検出できない断片を生じる。
　第２図はまた、λ−Ｊ１９とλ−Ｊ８１のＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片のうちｐＬＡＶ１３で検出されるものを（＋）として検出されないものを（−）として示している。
　さらに詳細にみると、λ−Ｊ１９には４つのＨｉｎｄ　ＩＩＩバンド、すなわち６．７ｋｂ、１．４５ｋｂ、０．６ｋｂおよび０．５２ｋｂのバンドがあり、これらの最初の２つがＨｉｎｄ　ＩＩＩで制限したＤＮＡのゲノムブロット中にあるバンドに対応する。最小の０．６ｋｂと０．５２ｋｂのバンドはゲノムブロット内にはみられなかったが、これらが独立に得られた分析クローンの全てに現われるという事実は、ＬＡＶのプロウイルスＤＮＡのランダムな組み込みを仮定すると、これらのバンドが内部断片に相当するもので接合断片（ｊｕｎｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）ではないということを示唆している。実際、０．５ｋｂバンドはｐＬＡＶ１３の小さい　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｐｓｔ　Ｉ断片を介してｐＬＡＶ１３ＤＮＡとハイブリダイズする（第２図）。すなわちλ−Ｊ１９の０．５ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片はＬＴＲ内部のＲ−Ｕ５接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を含有している。
　λ−Ｊ８１はλ−Ｊ１９の制限部位多型現象であると思われる。λ−Ｊ８１には４．３ｋｂ、２．３ｋｂ、１．４５ｋｂ、０．６ｋｂおよび０．５２ｋｂの５種のＨｉｎｄ　ＩＩＩ　バンドがある。この２．３ｋｂバンドはｐＬＡＶ１３プローブによるゲノムブロットで容易に検出されるが、４．３ｋｂ断片は検出されない。λ−Ｊ８１がＨｉｎｄ　ＩＩＩ　多型現象の１つであり組換えウイルスではないということは、ニック翻訳したλ−Ｊ１９ＤＮＡが緊縮ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下でλ−Ｊ８１の５つのＨｉｎｄ　ＩＩＩバンド全てとハイブリダイズするという事実によって示される。また、λ−Ｊ８１内のその他の制限部位はλ−Ｊ１９と同一である。
ＬＡＶ由来ｃＤＮＡの配列決定
　ファージ組換え体に対し特に重要な部位の配列決定を行なった。
　クローンλ−Ｊ１９の組換えファージＤＮＡ全体をＤＥＩＮＩＮＧＥＲ（１９８３）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２９，２１６のプロトコル（手順）に従って超音波処理した。このＤＮＡをクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）反応によって１６℃で１２時間修復した。ＤＮＡを０．８％アガロースゲル中に電気泳動させ、３００〜６００ｂｐのサイズ範囲のＤＮＡを切出し、電気溶出し、沈殿させた。ＤＮＡを（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ８，０．１ｍＥＤＴＡ　中に）再懸濁し、Ｔ４ＤＮＡ−およびＲＮＡ−リガーゼ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔら（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて、（制限酵素ＳｍａＩで切断した後アルカリ性ホスファターゼ処理をした）Ｍ１３ｍｐ８ＲＦ　ＤＮＡ中に連結した。ＴＧ１と名付けた
Ｅ
ｃｏｌｉ
　この
Ｅ
ｃｏｌｉ
　Ｈａｎａｈａｎ法（Ｈａｎａｈａｎ　Ｄ　（１９８３）、Ｊ．Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７）を用い、この菌株を連結混合物で形質転換した。軟アガロース中にＩＰＴＧとＸ−ｇａ１を有するトリプトン−アガロースプレート上にプレートアウトした。白色のプラークを摘出した後かまたは直接
ｉｎ　ｓｉｔｕ
Ｅ
ｃｏｌｉ
　正にハイブリダイズするＭ１３ファージプレートを５時間増殖させ、一本鎖ＤＮＡを抽出した。
　Ｓａｎｇｅｒらによって改良されたジデオキシ法および技法（Ｓａｎｇｅｒ　ら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
７４
．，１０，４
　λＪ１９の完全な配列を第４〜１１図に示す。
他のヒトレトロウイルスとの関係
　ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−ＨはＴ細胞サブセットであるＯＫＴ４に対する指向性をもった１対のＣ−タイプ形質転換型レトロウイルスを構成している（２０参照）。単離したＨＴＬＶ−Ｉは全配列が決定されており（２１参照）、ＨＴＬＶ−ＩＩの部分配列も決定・報告されている（２２〜２４参照）。どちらのゲノム（ＬＴＲ１個）も長さが約８．３ｋｂであり、ｐＸ領域を有しており、広い範囲で配列に相同性がある。これらのゲノムはかなり緊縮な条件（４０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ）下でお互いにハイブリダイズし、しかもｐＸ領域は６０％ホルムアミドでさえハイブリダイズする（２６参照）。したがって、保存されたｐＸ領域はこの類のウイルスの際立った特徴である。
　我々はクローン化したＬＡＶ　ＤＮＡとクローン化したＨＴＬＶ−ＩＩ　ＤＮＡ（ｐＭＯ、２７参照）とをプロット−ハイブリダイゼーションで比較し、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の低緊縮条件下ではクロス−ハイブリダイゼーションが全く起こらないことを見出した。たとえば、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで消化したλ−Ｊ１９、λ−Ｊ２７およびλ−Ｊ８１を電気泳動させ、ブロットし、３２Ｐ−ニック翻訳したｐＭＯ（ＨＴＬＶ−ＩＩ）ＤＮＡ（比活性は０．５×１０８ｃｐｍ／μｇより大）と、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ　ｓｕｌｐｈａｔｅ（硫酸デキストラン）中３７℃で一晩ハイブリダイズさせた。ＨＴＬＶ−１配列（２１）から得た５３．１％ＧＣ含量を用いて３７℃（ｔｍ．５０）
ｔ
　このように、ＬＡＶとＨＴＬＶウイルスの間の関係を示す分子的な証拠はない。また、ＨＴＬＶウイルスが８．３ｋｂであるのに対しＬＡＶゲノムはほぼ９ｋｂの長さである。ゲノムサイズが近いにもかかわらず、ＬＡＶとビスナ（ｖｉｓｎａ．２９参照）のクローン化したウイルスゲノムはクロスハイブリダイズすることはなく、非緊縮条件（ハイブリダイゼーション２０％ホルムアミド、８ＳＳＣ、３７℃；洗浄２ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃）でＬＡＶと多くのヒト内因性ウイルスゲノム（３０参照）とのハイブリダイゼーションが起こることもない。
　本発明はまた、さらに特定的には本発明によるＤＮＡ断片のいずれかから出発して作製することができるクローン化プローブにも係り、したがってこのような断片を含有する組換えＤＮＡ特に原核または真核細胞中で増幅でき前記の断片を担持しているあらゆるプラスミドにも係る。既に述べたように好ましいＤＮＡ断片はＬＡＶ１３である。
　クローン化したプロウイルスＤＮＡを放射性核種か蛍光試薬のいずれかで標識することにより分子ハイブリダイゼーションプローブとして用いるとＬＡＶビリオンＲＮＡを、血液、体液および（たとえば第ＶＩＩＩ因子濃縮物のような抗血友病因子の）血液製剤ならびにワクチンすなわちＢ型肝炎ワクチン中で直接検出しうる。ＬＡＶ産生細胞の培養上清中でウイルス全体が検出できることは既に示されている。その検出を達成する適切な方法は、前記の如き担体たとえばニトロセルロースフィルター等にウイルスを固定し、ビリオンを破砕し、標識（放射標識または「冷い（ｃｏｌｄ）」蛍光もしくは酵素標識）したプローブとハイブリダイズすることである。このような方法は既に、末梢血中のＢ型肝炎ウイルスの場合について（ＳＣＯＴＴＯ，Ｊ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９８３），
３
　本発明のプローブはまた、ＬＡＶ関連症状を示している患者の組織から得たゲノムＤＮＡの迅速なスクリーニングに使用してプロウイルスＤＮＡまたはＲＮＡが宿主組織およびその他の組織中に存在するかどうかを検べることもできる。
　このようなスクリーニングに使用できる方法は次のステップからなる。すなわち、組織からのＤＮＡの抽出、このＤＮＡの制限酵素開裂、断片の電気泳動および組織からのゲノムＤＮＡのサザンブロッテイング、その後の標識クローン化ＬＡＶプロウイルスＤＮＡとのハイブリダイゼーションである。
ｉｎ
ｓｉｔｕ
　また、ヒト、霊長目その他の哺乳類の種のリンパ液やリンパ組織およびその他の非リンパ組織を別の進化上関連したレトロウイルスが存在するかどうかを検討するためにスク−ニングすることもできる。上述の方法が使用できるがハイブリダイゼーションと洗浄は非緊縮条件下で行なわれるであろう。
　本発明のＤＮＡは診断目的用のＬＡＶウイルス抗原の発現を達成するためにと、もちろんＬＡＶに対するワクチンの製造にも使用できる。この点特に有利なのはコア（ｇａｇ領域）およびエンベロープタンパク質をコードしているＤＮＡ断片、特にＫｐｎ　Ｉ（６１００）からＢｇｌ　ＩＩ（９１５０）まで延びるＤＮＡ断片である。
　このために使用できる方法は多様である。
　ａ）ＤＮＡは様々な技法、たとえばリン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール、プロトプラスト−融合、等によって適当な選択マーカーをもった哺乳動物細胞中にトランスフェクトすることができる。
　ｂ）遺伝子に対応するＤＮＡ断片を
Ｅ
ｃｏｌｉ
　ｃ）プロウイルスＤＮＡを「ショットガンによって（断片化して）」原核生物発現ベクター中に導入して融合ポリペプチドを生成させることができる。抗原性のある融合タンパク質を産生する組換え体はこの組換え体ＬＡＶ抗原に対する抗体で単にスクリーニングするだけで同定できる。
　ｄ）本発明はまた、免疫原と抗原を産生すべくＬＡＶ抗原−遺伝子のＤＮＡ配列から推定され、化学的に合成できるオリゴペプチドにも係る。
　上記（ａ〜ｄ）は全て診断において許容されない系を用いて産生されるウイルス粒子をもたない、したがって生物学的危険がほとんどまたは全くない免疫原または抗原の入手源として使用できる。
　さらに本発明は上述の組換え体で形質転換され、前記ＤＮＡ断片を発現することができる宿主（原核または真核細胞）に係る。
　最後に本発明は、活性成分が発現された抗原、すなわち抗原全体、融合ポリペプチドまたはオリゴペプチドから成るようなワクチン組成物にも係る。
　本発明は最後に、ＬＡＶウイルス群がら抽出するかまたはｃＤＮＡから再度合成（逆転写）することができる精製ゲノムｍＲＮＡ、特に大きさがほぼ９．１〜９．２ｋｂで上記に定義したＤＮＡ断片のいずれかにハイブリダイズできる精製ｍＲＮＡ、あるいは前記精製ｍＲＮＡの一部に関する。また本発明は前記ＲＮＡの一部分にも係る。この精製ＲＮＡまたはその一部分のヌクレオチド構造は実際関連ｃＤＮＡのヌクレオチド配列から推定することができる。
　最後に、ラムダ−Ｊ１９とラムダ−Ｊ８１は１９８４年９月１１日付でそれぞれ番号Ｉ−３３８とＩ−３３９をもってＰａｓｔｅｕｒ（フランス）のＩＮＳＴＩＴＵＴ　ＰＡＳＴＥＵＲのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅｓ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ）に寄託されていることに言及しておく。
　終りに本発明は、そのＤＮＡ配列を決定してウイルスタンパク質（抗原）のアミノ酸配列の予知に使用することができるようなゲノムＤＮＡ、およびｃＤＮＡから誘導することができるＲＮＡプローブに関する。
　本明細書を通じてかっこで括った数で参照して来た参考文献の目録を次に挙げる。
　次の目録で参照されている刊行物は全て引用によってここに含まれるものとする。
（５７）【特許請求の範囲】
１．　ラムダＪ１９（ＣＮＣＭ　Ｉ−３３８）に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムＲＮＡのｃＤＮＡの全部又はその一部であるＤＮＡインサートを含有するクローン化ＤＮＡであって、該ＤＮＡインサートが、ＬＡＶウイルスのゲノムＲＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするが、ハイブリダイゼーション及び洗浄が低緊縮条件下で行なわれ、ハイブリダイゼーションの低緊縮条件が２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン中３７℃であって、フィルターをＨＴＬＶ−１配列から得た５３．１％ＧＣ含量を用いて３７℃（ｔｍ５０）で洗浄し、洗浄を５０℃と６５℃、１×ＳＳ
Ｃ
２．　ＬＡＶウイルスのゲノムＲＮＡとハイブリダイズする前記ＤＮＡインサートの組換え体である請求の範囲１に記載のＤＮＡ。
３．　ＬＴＲのＲ領域およびＵ３領域とＬＡＶレトロウイルスＤＮＡのコード領域の３′末端とに対応する領域を含有する請求の範囲１又は２に記載のＤＮＡ。
４．　大きさが約９．１−９．２ｋｂである請求の範囲１に記載のＤＮＡ。
５．　Ｋｐｎ　Ｉ（６１００）からＰｖｕＩＩ（８５００）まで延びる配列からなるＤＮＡインサートを含有する請求の範囲１に記載のＤＮＡ。
６．　Ｋｐｎ　Ｉ（３５００）からＰｖｕＩＩ（６５００）まで延びる配列からなるＤＮＡインサートを含有する請求の範囲１に記載のＤＮＡ。
７．　Ｐｓｔ　Ｉ（８００）からＰｖｕＩＩ（３８００）まで延びる配列からなるＤＮＡインサートを含有する請求の範囲１に記載のＤＮＡ。
８．　ラムダＪ１９（ＣＮＣＭ　Ｉ−３３８）に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムＲＮＡのｃＤＮＡの全部又はその一部であるＤＮＡインサートを含有するクローン化ＤＮＡであって、該ＤＮＡインサートが、（１）ＬＡＶウイルスのゲノムＲＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするが、ハイブリダイゼーション及び洗浄が低緊縮条件下で行なわれ、ハイブリダイゼーションの低緊縮条件が２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン中３７℃であって、フィルターをＨＴＬＶ−Ｉ配列から得た５３．１％ＧＣ含量を用いて３７℃（ｔｍ５０）で洗浄し、洗浄を５０℃と６５０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で繰り返すドットブロツト−ハイブリダイゼーションアツセイにおいてはＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩレトロウイルスのＲＮＡとクロス−ハイブリダイズしないものであり、かつ（２）下図（ａ）のＬＡＶゲノムの制限地図上に記載された制限酵素、Ｂａｍ　ＨＩ（４６０）及びＢａｍ　ＨＩ（６００）のいずれか２つによる切断フラグメントであって、下図（ｂ）のＬＡＶゲノムの制限地図上に記載された制限酵素のいずれか２つによる切断フラグメントではないことを特徴とするＤＮＡからなるＬＡＶのインビトロ検出用プローブ。
９．　ＬＡＶウイルス感染のインビトロ検出方法であって、ＬＡＶ感染の診断をすべき人から得、ハイブリダイゼーションに適した形態のＤＮＡを含有する生物学的サンプルを、ハイブリダイズ条件下で、ラムダＪ１９（ＣＮＣＭ　Ｉ−３３８）に含まれるＬＡＶレトロウイルスゲノムＲＮＡのｃＤＮＡの全部又はその一部であるＤＮＡインサートを含有するクローン化ＤＮＡであって、該ＤＮＡインサートが、ＬＡＶウイルスのゲノムＲＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするが、ハイブリダイゼーション及び洗浄が低緊縮条件下で行なわれ、ハイブリダイゼーションの低緊縮条件が２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン中３７℃であって、フィルターをＨＴＬＶ−１配列から得た５３．１％ＧＣ含量を用いて３７℃（ｔｍ５０）で洗浄し、洗浄を５０℃と６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で繰り返すドットブロットハイブリダイゼーションアッセイにおいてはＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩレトロウイルスのＲＮＡとクロス−ハイブリダイズしないものであり、下図（ａ）のＬＡＶゲノムの制限地図上に記載された制限酵素、Ｂａｍ　ＨＩ（４６０）及びＢａｍ　ＨＩ（６００）のいずれか２つによる切断フラグメントであって、下図（ｂ）のＬＡＶゲノムの制限地図上に記載された制限酵素のいずれか２つによる切断フラグメントではないことを特徴とするＤＮＡからなるＬＡＶのインビトロ検出用プローブと接触せしめ、ハイブリダイズしたプローブを検出することを特徴とする方法。