(57)【要約】  本発明は、サイクリンＤ３タンパク質をコードする核酸woシュートで選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある該核酸を植物に導入することにより、植物の収量を向上する方法に関する。また本発明は、シュートでサイクリンＤ３タンパク質をコードする核酸を選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある該核酸を含むトランスジェニック植物に関し、該植物は、対応する野生型植物と比べて収量が向上する。また本発明は、本発明の方法に有用な構築物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクリンＤ３をコードする核酸をシュートで選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある該核酸を、植物に導入することを含む、植物の収量を向上させる方法。
【請求項２】
収量の向上が、種子の収量の増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
収量の向上が、植物の地上面積の増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
種子の収量の増加が、（ｉ）種子のバイオマスの増加、（ｉｉ）（充実した）種子の数の増加、（ｉｉｉ）種子の大きさの増加、（ｉｖ）種子の体積の増加、（ｖ）収穫指数の増加、及び（ｖｉ）千粒重の増加、からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
サイクリンＤ３をコードする核酸が植物から得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体を植物に導入することを含み、核酸またはその機能的変異体が、
（ｉ）サイクリンＤ３をコードする核酸の一部、
（ｉｉ）サイクリンＤ３をコードする核酸の選択的スプライス変異体、
（ｉｉｉ）サイクリンＤ３をコードする核酸の対立遺伝子変異体、及び
（ｉｖ）サイクリンＤ３アミノ酸のホモログ、誘導体及び活性フラグメント、
から選択され、
（ｉ）〜（ｉｖ）の機能的変異体は、植物のＣＤＫと結合して活性化し得る、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
シュートで前記核酸を選択的に発現できるプロモーターが、β−エクスパンシンプロモーターと同等の発現プロフィールを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
対応する野生型植物と比べて収量が向上したトランスジェニック植物を作出する方法であって、
（ｉ）サイクリンＤ３をコードする核酸またはその変異体、好ましくは配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸又はその機能的変異体を、植物又は植物細胞に導入すること、ここで、前記核酸又はその機能的変異体は、サイクリンＤ３ポリペプチド又はその機能的変異体をコードし、前記ポリペプチドは、好ましくは配列番号２で表されるか又はその機能的変異体であり、前記核酸又はその機能的変異体は、シュート、特に栄養（地上）シュートの細胞増殖域で、前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターと機能的に結合されている、
（ｉｉ）植物細胞を、再生及び成熟した植物の成長を促進する条件下で培養すること、
を含む方法。
【請求項９】
収量の向上が、種子の収量の増加である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
収量の増加が、地上面積の増加を含み、及び種子の収量の増加が、（ｉ）種子のバイオマスの増加、（ｉｉ）（充実した）種子の数の増加、（ｉｉｉ）種子の大きさの増加、（ｉｖ）種子の体積の増加、（ｖ）収穫指数の増加、及び（ｉｖ）千粒重の増加、から選択される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
シュートで選択的に遺伝子を発現させることができるように、サイクリンＤ３ポリペプチド又はその機能的変異体をコードする遺伝子の遺伝子座において、遺伝子改変を植物に導入することを含む、植物の収量、特に種子の収量を向上させる方法。
【請求項１２】
遺伝子改変が、突然変異誘発、相同的組換え、ティリング及びＴ−ＤＮＡ活性化の１つ以上により行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって得られる植物。
【請求項１４】
（ｉ）サイクリンＤ３をコードする核酸又はその機能的変異体、好ましくは配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体、ここで、前記核酸は、サイクリンＤ３ポリペプチド又はその機能的変異体、好ましくは配列番号２で表されるサイクリンＤ３ポリペプチド又はその機能的変異体をコードする、
（ｉｉ）シュートで、特に栄養（地上）シュートの細胞増殖域で、（ｉ）の核酸を選択的に発現させることができるプロモーター、及び任意に、
（ｉｉｉ）転写終結配列、
を含む構築物。
【請求項１５】
プロモーターが、β−エクスパンシンプロモーターと同等の発現プロフィールを有する、請求項１４に記載の構築物。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の構築物で形質転換された植物。
【請求項１７】
サイクリンＤ３またはその機能的変異体をコードする核酸を、シュートで選択的に前記核酸を発現させることができるプロモーターの制御下に含むことを特徴とする、対応する野生型植物と比べて収量が向上したトランスジェニック植物。
【請求項１８】
サトウキビなどの単子葉植物、又はイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ミレット、ライムギ、オートムギまたはソルガムなどの穀類である、請求項１３、１６または１６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１９】
請求項１３、１６〜１８のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物の収穫可能な部分。
【請求項２０】
種子である、請求項１９に記載の収穫可能な部分。
【請求項２１】
収量の向上、特に種子の収量の増加におけるサイクリンＤ３をコードする単離された核酸の使用であって、該核酸は、シュートで該核酸を選択的に発現させることができるプロモーターと機能的に結合される、使用。
【請求項２２】
種子の収量が、（ｉ）種子のバイオマスの増加、（ｉｉ）（充実した）種子の数の増加、（ｉｉｉ）種子の大きさの増加、及び（ｉｖ）種子の体積の増加、（ｖ）収穫指数の増加、及び（ｖｉ）千粒重の増加、のいずれか１つ以上を含む、請求項２１の使用。
【請求項２３】
サイクリンＤ３をコードする核酸が、配列番号１で表される核酸またはその機能的変異体であり、またはサイクリンＤ３が、配列番号２で表されるアミノ酸またはその機能的変異体である、請求項２１または２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に分子生物学の分野に関し、対応する野生型植物の植物収量と比較して、植物収量を向上させる方法に関する。より具体的には、本発明は、サイクリンＤ３をコードする核酸を植物に導入することにより収量を増加させる方法に関し、前記核酸は、シュート(shoot)で選択的に発現されるプロモーターの制御下にある。また本発明は、シュートで選択的に発現されるプロモーターの制御下にある、単離されたサイクリンＤ３核酸を含む植物に関し、その植物は、対応する野生型植物と比較して増加した収量を有する。また本発明は、本発明による方法に使用する構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口は増加の一途を辿り、農業に利用できる耕作地の供給が次第に減少しているために、研究は農業の効率を上げる方向に向かっている。従来の農作物の手法及び園芸改良では、望ましい性質を有する植物を特定するために選抜育種技術を利用する。しかしながら、このような選抜育種技術はいくつか欠点があり、すなわちこれらの技術は、一般的に大きな労働力を必要とし、また、しばしば、親植物から伝えられる望ましい特性をいつももたらすとは限らない異種の遺伝的要素を含む植物が生じる。分子生物学の進歩により、人間は動物及び植物の生殖質を改変できるようになった。植物の遺伝子工学は、（一般的にはＤＮＡまたはＲＮＡの形の）遺伝物質の単離及び操作と、次の、遺伝物質の植物への導入を必要とする。このような技術は、経済的、作物学的、または園芸学的に様々に改良された特徴を有する農作物または植物を作出する力を持っている。具体的な経済的利益の形質は収量である。収量は、通常、農作物から得られる、測定可能な生産物の実利的な値と定義される。これは量及び／又は質の点から定義されうる。収量は幾つかの因子、例えば器官、植物構造（例えば枝の数）、採種などの数及び大きさなどに直接依存する。根の発達、栄養摂取及びストレス耐性も収量の決定における重要な因子である。農作物の収量は、上記因子の１つを最適化することにより増加することができ、植物の生来の成長メカニズムを改変することにより行うことができる。
【０００３】
植物の生来の成長機序は、「細胞周期」と総称して知られる、非常に秩序のある順番を有する事象にある。細胞周期の進行は、全ての多細胞性生物の成長と発達において基本的なことであり、細胞増殖に非常に重要である。細胞周期の主な構成要素は酵母、哺乳動物及び植物に高度に保存されている。細胞周期は、一般的に、Ｇ０−Ｇ１−Ｓ−Ｇ２−Ｍの連続した期に分けられる。ＤＮＡ複製又は合成は、一般的に、Ｓ期（「Ｓ」はＤＮＡ合成（ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）である）中に起こり、染色体の有糸分裂分離はＭ期（「Ｍ」は有糸分裂（Ｍｉｔｏｓｉｓ）である）中に起こり、ギャップ期、すなわちＧ１（ＤＮＡ複製前の細胞成長の期間）及びＧ２（ＤＮＡ複製後、分裂のために細胞が準備している期間）が間に存在する。細胞分裂は、細胞質分裂、すなわちＭ期の最終ステップ後に完了する。細胞周期を終え、静止した細胞は、Ｇ０期に入るといわれる。この期の細胞を刺激してＧ１期の細胞周期に再び入れることができる。Ｇ１、Ｇ２及びＧ０の「Ｇ」は「ギャップ（ｇａｐ）」を表す。細胞周期のプロセスが終了して、細胞分裂中に各娘細胞は親ゲノムの完全なコピーを受け取ることができる。
【０００４】
細胞分裂は、２つの主要な細胞周期事象、すなわちＤＮＡ合成の開始と有糸分裂の開始により制御される。これらの鍵となる各事象へのそれぞれの移行は、（ＤＮＡ複製及び分裂に関連する）特定のタンパク質複合体により表されるチェックポイントによって制御される。Ｇ１／Ｓ境界でのＤＮＡ合成に必要な遺伝子の発現は、哺乳動物細胞及び植物細胞の転写因子のＥ２Ｆファミリーによって調節される（Ｌａ  Ｔｈａｎｇｕｅ，  １９９４；  Ｍｕｌｌｅｒら，  ２００１；  Ｄｅ  Ｖｅｙｌｄｅｒら，  ２００２）。細胞周期への移行は、シグナルを１つにまとめて細胞周期遺伝子の転写を活性化できるＥ２Ｆ／Ｒｂ複合体により、調節／誘発される。細胞周期の異なる期の間の移行、及びそれによる細胞周期の進行は、一般的にサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と呼ばれる、異なるヘテロ二量体のセリン／スレオニンプロテインキナーゼの形成と活性化により駆動される。これらのキナーゼの活性の必要条件は、特定のサイクリンとの物理的結合であり、活性化のタイミングはサイクリンの発現に大きく依存している。サイクリンの結合は、その結合するＣＤＫのＮ末端ローブのコンフォメーション変化を誘発し、複合体の局在化と基質特異性に寄与する。単量体のＣＤＫは、サイクリンと結合すると活性化されて、その結果キナーゼ活性を有する。サイクリンタンパク質のレベルは、細胞周期中に変動し、そのためＣＤＫ活性化のタイミングを決定する際の重要な因子を表す。細胞周期中のサイクリンとＣＤＫを含むこれらの複合体の周期的な活性化は、細胞周期の移行（チェックポイント）の一時的な調節をメディエートする。
【０００５】
サイクリンは、有糸分裂サイクリン（高等真核生物ではＡ型及びＢ型サイクリン、出芽酵母ではＣＬＢと命名された）及びＧ１−特異的サイクリン（哺乳動物ではＤ型サイクリン、出芽酵母ではＣＬＮと命名された）に分類することができる。Ｈ型サイクリンはＣＡＫ（ＣＤＫ−活性化キナーゼ）の活性を調節する。植物で知られているサイクリンの４つの型の全てが、それらのヒトのカウンターパートとの類似性によってほとんど同定された。シロイヌナズナでは、１０個のＡ型、９個のＢ型、１０個のＤ型及び１個のＨ型サイクリンが記載されている（Ｖａｎｄｅｐｏｅｌｅら，２００２）。
【０００６】
１０個のＤ型サイクリンは、Ａ型及びＢ型サイクリンと対照的に、７つのサブクラス、即ちＤ１〜Ｄ７に細分され、互いに、高い配列類似性が欠如している。Ｄ３及びＤ４サブクラスのみが異なるメンバー、それぞれ３つと２つのメンバーを有する。Ｄ３型サイクリンの重複性は、１つのＤ３型サイクリンのノックアウトによる突然変異表現型を観察できない説明として、以前に提案された（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎら、２０００）。その２つのＤ３型サイクリンは、最近の分節重複を介して結合しており、これらは機能的に重複していることを示唆する。同様の仮説がＤ４型サイクリンに適用できると考えられ、これは、３つのうちの２つが重複したブロックに位置するからである。
【０００７】
Ａ型及びＢ型サイクリンと比べて、Ｄ型サイクリンに見られる非常に大きな多様性は、発生シグナル及び環境信号を細胞周期の中へ統合することにおけるＤ型サイクリンの仮想的役割を反映しているのかもしれない。例えば、Ｄ３型サイクリンは、サイトカイニン及びブラシノステロイドなどの植物ホルモンに対する応答を示すが、ＣＹＣＤ２及びＣＹＣＤ４はＧ１期の初めに活性化されて、糖利用性に対して反応する(概説についてはＳｔａｌｓ及びＩｎｚe，２００１を参照されたい)。
【０００８】
タバコのＣＹＣＤ２；１遺伝子の過剰発現は、形態学的変化もなく、細胞分裂を増進させ、全体的な植物成長速度を上げることが報告された（Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔら，２０００）。
【０００９】
ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下にあるシロイヌナズナのＣＹＣＤ３；１遺伝子の過剰発現は、子葉が大きく、最終的な植物の大きさが非常に小さく、発達の歪んだ植物にさせることが報告された。細胞レベルでは、細胞はＧ１期から押し進められて、分裂組織領域と、細胞分裂が通常無いか或いは制限される領域との両方で、異所性の細胞分裂が生じる。この細胞数の増加は、細胞の大きさの縮小とつながっている（Ｄｅｗｉｔｔｅら、２００３）。
【００１０】
植物の細胞周期にもっと的確に影響を与え、それにより植物の様々な成長の特徴をもっと的確に改変する能力は、農作物の増収、品種改良、観賞植物の生産、樹芸学（ａｂｏｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）、園芸学、林学、バイオリアクター（医薬、抗体またはワクチンなどの物質の生物工学的な生産、または有機性廃棄物の生物変換）に使用する藻類の生産及びこのような他の分野で、多くの適用があるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、植物におけるサイクリンＤ３の先行技術の発現に関する問題の幾つかを解決することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
サイクリンＤ３をコードする核酸を、シュート(shoot;苗条)で前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターの制御下で、植物に導入することにより、収量が向上した植物が得られることを見出した。従って、本発明では、サイクリンＤ３をコードする核酸をシュートで選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある該核酸を、植物に導入することを含む、植物の収量を向上させる方法を提供する。
【００１３】
本明細書で定義される用語「収量の増加」は、対応する野生型植物と各々比較して、以下のいずれか１つ以上についての増加を意味する。（ｉ）植物の１箇所以上の地上（収穫可能な）部分のバイオマスの増加（重量）、（ｉｉ）種子の収量の増加（種子のバイオマス（種子重量）の増加により生じてもよいし、植物体ごと又はそれぞれの種子を基準とした種子重量の増加でもよいし、種子重量の増加が、種子の長さ及び／又は種子の幅及び／又は種子の面積などの種子の寸法が変化したことによるものでもよい）、（ｉｉｉ）（充実した（ｆｉｌｌｅｄ））種子の数の増加、（ｖｉ）種子の大きさ（ｓｉｚｅ）の増加（種子の組成に影響があってもよい）、（ｖ）種子の体積（ｖｏｌｕｍｅ）の増加（種子の組成に影響があってもよい）、（ｖｉ）収穫指数の増加（全バイオマスに対する、種子などの収穫可能な部分の収量の比率として表される）、及び（ｖｉｉ）千粒重（ＴＫＷ）の増加（数えた充実した種子数及びその全重量から外挿される）。千粒重の増加は、種子の大きさの増大及び／又は種子の密度によるものでもよい。
【００１４】
例えばトウモロコシでは、収量の増加は、以下の１つ以上により表すことができる。ヘクタール又はエーカーあたりの植物数の増加、植物あたりの穂（ｅａｒ）の数の増加、列の数、列あたりの穀粒数、穀粒重量、千粒重、穂の長さ／直径などの増加。例えばイネでは、収量の増加は、以下の１つ以上の増加により表すことができる。ヘクタール又はエーカーあたりの植物の数、植物当たりの穂首（ｐａｎｉｃｌｅ）の数、穂首あたりの小穂の数、穂首あたりの花の数、種子の充填率の増加、千粒重の増加など。また、収量の増加は構造の改変により起こりうるし、または構造の改変の結果として起こりうる。
【００１５】
本発明の好ましい特徴によると、本発明の方法を行うことにより、対応する野生型植物と各々比べて、少なくとも以下の１つにより表される、収量が向上した植物が得られる。地上面積の増加、全種子数の増加、（充実した）種子の数の増加、種子重量の増加、及び収穫指数の増加。従って、本発明では、植物の収量、特に種子の収量を増加する方法が提供され、この方法は、サイクリンＤ３をコードする核酸をシュートで選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある該核酸を、植物に導入することを含む。
【００１６】
本発明の方法を行うことにより、（サイクリンＤ３遺伝子をシュートで選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある該核酸が導入された）植物が非ストレス条件下にあっても、または植物が対照植物と比べて様々なストレスにさらされていても、植物の収量が向上する。一般的に植物は、ストレスにさらされると、もっとゆっくりとした成長で応答する。強いストレス条件では、植物は完全に成長を停止することもある。一方、軽度のストレスは、本明細書において、植物がストレスにさらされても完全に成長を止めた植物が生じないストレスであると定義される。農作業（灌漑、施肥、農薬処理）の進歩により、栽培される作物は強いストレスにあまり遭遇しなくなる。その結果、しばしば、軽度のストレスにより誘発された成長の障害が、農業にとって望ましくない特性となる。軽度のストレスは、植物がさらされる可能性のある一般的なストレスである。これらのストレスは、植物がさらされる毎日の生物的及び／又は非生物的（環境）ストレスでありうる。一般的な非生物的または環境ストレスとして、不規則な高温又は低温／凍結温度により起こる温度ストレス、塩分ストレス、水分ストレス（渇水又は過剰水）が挙げられる。また、非生物的ストレスは、薬剤によっても起こる。生物的ストレスは、一般的に、細菌、ウイルス、真菌及び昆虫などの感染因子によって生じるストレスである。
【００１７】
更に有利なことに、本発明の方法はどんな植物でも行うことができる。本明細書において使用される用語「植物」は、植物全体、植物の原種及びその後代、及び植物部分を包含し、種子、シュート、茎、葉、根（塊茎を含む）、植物細胞、組織及び器官を含み、上記のそれぞれは目的の遺伝子を含むことが好ましい。また、用語「植物」は、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子を包含し、上記のそれぞれは目的の遺伝子を含むことが好ましい。
【００１８】
本発明の方法で特に有用な植物には、緑色植物（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）スーパーファミリーに属する全ての植物、具体的には以下の植物を含むリストから選択される、飼料または飼い葉用マメ科植物、観賞植物、食用作物、樹木または低木を含む、単子葉植物及び双子葉植物が挙げられる：アカシア（Ａｃａｃｉａ  ｓｐｐ．）、カエデ（Ａｃｅｒ  ｓｐｐ．）アクティニディア（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｓｐｐ．）、トチノキ（Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、アガチス・アウストラリス（Ａｇａｔｈｉｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、アルビジア・アマラ（Ａｌｂｉｚｉａ  ａｍａｒａ）、アルソフィラ・トリカラー（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ  ｔｒｉｃｏｌｏｒ）、メリケンカルカヤ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｓｐｐ．）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｓｐｐ．）、アレカ・カテチュ（Ａｒｅｃａ  ｃａｔｅｃｈｕ）、アステリア・フラグランス（Ａｓｔｅｌｉａ  ｆｒａｇｒａｎｓ）、アストラガルス・シサー（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｃｉｃｅｒ）、バイキアエア・プルリジュガ（Ｂａｉｋｉａｅａ  ｐｌｕｒｉｊｕｇａ）、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ  ｓｐｐ．）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）、ブルグイエラ・ジムノルヒザ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ  ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ）、ブルケア・アフリカーナ（Ｂｕｒｋｅａ  ａｆｒｉｃａｎａ）、ブテア・フロンドーサ（Ｂｕｔｅａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）、カダバ・ファリノーサ（Ｃａｄａｂａ  ｆａｒｉｎｏｓａ）、ネムノキ（Ｃａｌｌｉａｎｄｒａ  ｓｐｐ．）、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、カンナ・インディカ（Ｃａｎｎａ  ｉｎｄｉｃａ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）、桂皮（Ｃａｓｓｉａ  ｓｐｐ．）、セントロエマ・プベスケンス（Ｃｅｎｔｒｏｅｍａ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、ボケ（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ  ｓｐｐ．）、キンナモムム・カシア（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｓｓｉａ）、コフィア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）、コロフォスペルムム・モパネ（Ｃｏｌｏｐｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｍｏｐａｎｅ）、コロニリア・バリア（Ｃｏｒｏｎｉｌｌｉａ  ｖａｒｉａ）、コトネアスター・セロティナ（Ｃｏｔｏｎｅａｓｔｅｒ  ｓｅｒｏｔｉｎａ）、クルタエグス（Ｃｒｔａｅｇｕｓ  ｓｐｐ．）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓｐｐ．）、クプレッサス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、サイアセア・デアルバータ（Ｃｙａｔｈｅａ  ｄｅａｌｂａｔａ）、サイドニア・オブロンガ（Ｃｙｄｏｎｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）、クリプトメリア・ジャポニカ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、キンボポゴン（Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ  ｓｐｐ．）、シンシア・ディアルバータ（Ｃｙｎｔｈｅａ  ｄｅａｌｂａｔａ）、キドニア・オブロンガ（Ｃｙｄｏｎｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）、ダルベルジア・モネタリア（Ｄａｌｂｅｒｇｉａ  ｍｏｎｅｔａｒｉａ）、ダバリア・ディバリカータ（Ｄａｖａｌｌｉａ  ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）、デスモディウム（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ディクソニア・スクアローサ（Ｄｉｃｋｓｏｎｉａ  ｓｑｕａｒｏｓａ）、ディヘテロポゴン・アンプレクテンス（Ｄｉｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ  ａｍｐｌｅｃｔｅｎｓ）、ディオクレア（Ｄｉｏｃｌｅａ  ｓ���ｐ．）、ドリコス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｓｐｐ．）、ドリクニウム・レクタム（Ｄｏｒｙｃｎｉｕｍ  ｒｅｃｔｕｍ）、エチノクロア・ピラミダリス（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ  ｐｙｒａｍｉｄａｌｉｓ）、エラルティア（Ｅｈｒａｒｔｉａ  ｓｐｐ．）、エレウシン・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）、エラグレスティス（Ｅｒａｇｒｅｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、エリスリナ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  ｓｐｐ．）、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐ．）、ユークレア・シンペリー（Ｅｕｃｌｅａ  ｓｃｈｉｍｐｅｒｉ）、ユーラリア・ビローサ（Ｅｕｌａｌｉａ  ｖｉｌｌｏｓａ）、ファゴピルム（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｓｐｐ．）、フェイジョア・セロウィアナ（Ｆｅｉｊｏａ  ｓｅｌｌｏｗｉａｎａ）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｓｐｐ．）、フレミンジア（Ｆｌｅｍｉｎｇｉａ  ｓｐｐ．）、フレイシネチア・バンクシイ（Ｆｒｅｙｃｉｎｅｔｉａ  ｂａｎｋｓｉｉ）、ゲラニウム・ツンベルギイ（Ｇｅｒａｎｉｕｍ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、ギンゴ・ビロバ（Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、グリシン・ジャバニカ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｊａｖａｎｉｃａ）、グリリシディア（Ｇｌｉｒｉｃｉｄｉａ  ｓｐｐ．）、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、グレビレア（Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｓｐｐ．）、グイボウルティア・コレオスペルマ（Ｇｕｉｂｏｕｒｔｉａ  ｃｏｌｅｏｓｐｅｒｍａ）、ヘディサルム（Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ  ｓｐｐ．）、ヘマルチア・アルティッシマ（Ｈｅｍａｒｔｈｉａ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、ヘテロポゴン・コントルツス（Ｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒパーレニア・ルファ（Ｈｙｐａｒｒｈｅｎｉａ  ｒｕｆａ）、ヒペリクム・エレクツム（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｅｒｅｃｔｕｍ）、ヒペルセリア・ディソルタ（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｌｉａ  ｄｉｓｓｏｌｕｔａ）、インディゴ・インカルナータ（Ｉｎｄｉｇｏ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）、アイリス（Ｉｒｉｓ  ｓｐｐ．）、レプタルレナ・ピロリフォリア（Ｌｅｐｔａｒｒｈｅｎａ  ｐｙｒｏｌｉｆｏｌｉａ）、レスペディザ（Ｌｅｓｐｅｄｉｚａ  ｓｐｐ．）、レチュカ（Ｌｅｔｔｕｃａ  ｓｐｐ．）、レウカエナ・レウコセファラ（Ｌｅｕｃａｅｎａ  ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）、ロウデチア・シンプレクス（Ｌｏｕｄｅｔｉａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、ロトヌス・バイネシイ（Ｌｏｔｏｎｕｓ  ｂａｉｎｅｓｉｉ）、ハス（Ｌｏｔｕｓ  ｓｐｐ．）、マクロチローマ・アキシラレ（Ｍａｃｒｏｔｙｌｏｍａ  ａｘｉｌｌａｒｅ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｓｐｐ．）、マニホット・エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、メタセコイア・グリプトストロボイデス（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ  ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ）、ムサ・サピエンツム（Ｍｕｓａ  ｓａｐｉｅｎｔｕｍ）、ニコチアヌム（Ｎｉｃｏｔｉａｎｕｍ  ｓｐｐ．）、オノブリョチス（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ  ｓｐｐ．）、オルニトプス（Ｏｒｎｉｔｈｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓｐｐ．）、ペルトフォルム・アフリカヌム（Ｐｅｌｔｏｐｈｏｒｕｍ  ａｆｒｉｃ��ｎｕｍ）、ペニセツム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｓｐｐ．）、ペルセア・グラテッシマ（Ｐｅｒｓｅａ  ｇｒａｔｉｓｓｉｍａ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｓｐｐ．）、ファセオルス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｓｐｐ．）、フェニックス・カナリエンシス（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、フォルミウム・クッキアヌム（Ｐｈｏｒｍｉｕｍ  ｃｏｏｋｉａｎｕｍ）、フォチニア（Ｐｈｏｔｉｎｉａ  ｓｐｐ．）、ピセア・グラウカ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）、ピヌス（Ｐｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）ピスム・サティブム（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、ポドカルプス・トタラ（Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ  ｔｏｔａｒａ）ポゴナルスリア・フレッキイ（Ｐｏｇｏｎａｒｔｈｒｉａ  ｆｌｅｃｋｉｉ）、ポゴナルスリア・セクアルローサ（Ｐｏｇｏｎａｒｔｈｒｉａ  ｓｑｕａｒｒｏｓａ）、ハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、プロソピス・シネラリア（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ  ｃｉｎｅｒａｒｉａ）、シュードツガ・メンジエシイ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）、プテロロビウム・ステラツム（Ｐｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ  ｓｔｅｌｌａｔｕｍ）、パイラス・コミュニス（Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、クエルクス（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ラフィオレプシス・アンベルラタ（Ｒｈａｐｈｉｏｌｅｐｓｉｓ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ）、ロパロスチリス・サピダ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｔｙｌｉｓ  ｓａｐｉｄａ）、ルス・ナタレンシス（Ｒｈｕｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、リベス・グロッスラリア（Ｒｉｂｅｓ  ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａ）、スグリ（Ｒｉｂｅｓ  ｓｐｐ．）、ロビニア・シュードアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、バラ（Ｒｏｓａ  ｓｐｐ．）、キイチゴ（Ｒｕｂｕｓ  ｓｐｐ．）、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｓｐｐ．）、スキザクリウム・サングイネウム（Ｓｃｈｙｚａｃｈｙｒｉｕｍ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｍ）、スシアドピティス・ヴァティシラタ（Ｓｃｉａｄｏｐｉｔｙｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）、セコイア・セムペルビレンス（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、セコイアデンドロン・ギガンテウム（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ  ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、ソルガム・バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｓｐｐ．）、スポロボルス・フィムブリアツス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ  ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ）、スチブルス・アロペクロイデス（Ｓｔｉｂｕｒｕｓ  ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ）、スチロサントス・フミリス（Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｏｓ  ｈｕｍｉｌｉｓ）、タデハギ（Ｔａｄｅｈａｇｉ  ｓｐｐ．）、タキソディウム・ディスチクム（Ｔａｘｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）、テメダ・トリアンドラ（Ｔｈｅｍｅｄａ  ｔｒｉａｎｄｒａ）、トリフォリウム（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）、ツガ・ヘテロフィラ（Ｔｓｕｇａ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、スノキ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ビシア（Ｖｉｃｉａ  ｓｐｐ．）ビティス・ビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ワトソニア・ピラミダタ（Ｗａｔｓｏｎｉａ  ｐｙｒａｍｉｄａｔａ）、ザンテデスキア・アエチオピカ（Ｚａｎｔｅｄｅｓｃｈｉａ  ａｅｔｈｉｏｐ��ｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、アマランス、チョウセンアザミ、アスパラガス、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードの葉（ｃｏｌｌａｒｄ  ｇｒｅｅｎｓ）、亜麻、ケール、レンティル、ナタネ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、スカッシュ、茶及び藻類など。本発明の特に好ましい実施形態では、植物は、ダイズ、ヒマワリ、キャノーラ、アルファルファ、ナタネ、綿、トマト、ジャガイモまたはタバコなどの農作物植物である。更に好ましくは、植物は、サトウキビなどの単子葉植物である。より好ましくは、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ミレット、ライムギ、オートムギまたはソルガムなどの穀物である。
【００１９】
サイクリンＤ３は種々の方法を用いて同定することができる。例えば、照会するタンパク質配列を、翻訳されたシロイヌナズナの核酸配列データベースに対して、（例えば、ギャップ開始ペナルティー及びギャップ伸張ペナルティーのブラストデフォルトパラメーターを使って）ブラストサーチできる。照会する配列がサイクリンＤ３である場合、ブラストからの最初のヒットはシロイヌナズナのサイクリンＤ３であろう。サイクリンＤ３を同定する別の方法は、例えばＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｓｕｉｔｅ（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）のＡｌｉｇｎＸ  ｐｒｏｇｒａｍを使って、照会する配列と公知のサイクリンＤ３タンパク質配列を整列比較することによる。そして複数のアラインメントは、ギャップ開始ペナルティー１０及びギャップ伸張ペナルティー０．０１で行われてもよい。また、幾つかの保存領域の位置を改善するために、アラインメントのわずかな手作業の編集が必要となることもある。照会する配列がサイクリンＤ３であれば、公知のサイクリンＤ３配列と整列比較する。
【００２０】
本明細書で定義される「サイクリンＤ３」配列は、サイクリン又はサイクリンＤの系統樹、例えば図１に示されるような系統樹の作成に使用される場合、サイクリンＤ３（他のＤ型サイクリン、例えばＤ１、Ｄ２、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６及びＤ７ではない）を含むグループに該当するアミノ酸配列をいう。本明細書においてサイクリンＤ３をコードする核酸についての言及は、上に定義されたサイクリンＤ３アミノ酸をコードする核酸に言及する。
【００２１】
当業者であれば、ＧＣＧ、ＥＢＩまたはＣＬＵＳＴＡＬパッケージなどの、前記の如き系統樹を作成するための公知技術及びソフトウエアを使って、デフォルト・パラメーターを用いて、問題のアミノ酸配列が上述の定義の範囲内にあるかどうかを容易に決定できるであろう。このような系統樹を構築するときに、サイクリンＤ３グループに群をなす配列は、「サイクリンＤ３」の定義の範囲内にあると考えられる。このような配列をコードする核酸は、本発明の方法を行うのに有用である。
【００２２】
一般的に、サイクリンＤ３は、植物のＣＤＫ及びＲｂと結合し、それらを活性化する能力を有する。更に、サイクリンＤ３は以下の１つ以上、好ましくは全てを含んでもよい。（ｉ）サイクリンボックス、（ｉｉ）最初の４０個程度のアミノ酸内にあるＬｘＣｘＥモチーフ（ほとんどのサイクリンＤが有する特徴である）、及び（ｉｉｉ）図２に示されるボックスによって同定される、１つ以上、好ましくは全ての保存領域（図２に示されるように、ボックス内の１個のミスマッチは許容される）。
【００２３】
サイクリンＤ３の上述の定義に該当するサイクリンＤ３をコードする核酸の例を、以下の表１に挙げる。表に示したサイクリンＤ３をコードする核酸は、本発明の方法を行うのに有用であり、換言すれば、これらの核酸のどれか１つを、シュートでその核酸を選択的に発現させることができるプロモーターの制御下に導入して発現させることにより、対応する野生型植物と比べて収量の向上した植物を得るのに有用である。サイクリンＤ３をコードする核酸は、好ましくは、配列番号１で表される核酸、又は以下に説明される配列番号１の機能的変異体である。
【表１】
2008500808.tif 000002
【００２４】
本発明では、シュートでサイクリンＤ３の核酸の発現を増強または増加させることが認められる。遺伝子又は遺伝子産物の発現を増強又は増加させる方法は、当該技術分野で十分に記載されており、例えばプロモーターにより作動される過剰発現、転写エンハンサー又は翻訳エンハンサーの使用が挙げられる。
【００２５】
サイクリンＤ３をコードする核酸は、シュートで前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターと機能的に結合される。このようなプロモーターの例は、β−エクパンシンプロモーターと同等の発現プロフィールを有するプロモーターである。本発明の適用可能性は、配列番号１で表されるサイクリンＤ３に限定されないこと、また本発明の適用可能性は、本発明の方法のβ−エクスパンシンプロモーターの使用に限定されないことを明確にしておく。
【００２６】
サイクリンＤ３をコードする核酸はどんな源に由来するものでもよい。サイクリンＤ３をコードする核酸／遺伝子は、酵母または菌類などの微生物源、または植物、藻類または動物（ヒトを含む）源から単離できる。この核酸は、人為的な操作を経て、組成物及び/又はゲノム環境におけるその天然形から改変されてもよい。核酸は、好ましくは相同な核酸であり、即ち導入する植物種と同じ植物種から得られた核酸でもよいし、異なる植物種から得られた核酸でもよい。核酸は双子葉植物種、好ましくはアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、より好ましくはシロイヌナズナから単離される。より好ましくは、シロイヌナズナから単離されたサイクリンＤ３をコードする核酸は、Ｄ３型サイクリン、例えばサイクリンＤ３；１、サイクリンＤ３；２またはサイクリンＤ３；３である。最も好ましくは、サイクリンＤ３は、シロイヌナズナ由来のサイクリンＤ３；３であり、特に、配列番号１で表される核酸配列及び配列番号２で表されるアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号１で表される配列は、シロイヌナズナ由来のサイクリンＤ３；３を示し、配列番号２は対応するアミノ酸配列である。有利なことに、本発明の適用可能性は、配列番号１で表されるシロイヌナズナ由来のサイクリンＤ３；３の使用に限定されない。また、本発明による方法は、サイクリンＤ３をコードする核酸の機能的変異体を用いて、またはコードされたポリペプチドの機能的変異体を用いて行うことができる。本発明の方法に特に有用なのは、配列番号１で表される核酸の機能的変異体、または配列番号２で表されるアミノ酸の機能的変異体である。
【００２８】
本明細書で定義される「機能的変異体」は、植物のＣＤＫと結合し、それを活性化する能力を保持したサイクリンＤ３である（例えばＨｅａｌｙら（２００１，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６（１０）：  ７０４１−７０４７）を参照されたい）。また機能的変異体は、ほとんどの場合、ＣＬＮ（酵母のＤ型サイクリンの用語）を欠損した酵母の突然変異体を相補する。例えばＳｗａｍｉｎａｔｈａｎら（２０００，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ  １２４：  １６５８−１６６７）、特に１６６３頁を参照されたい。機能的変異体は、サイクリン又はサイクリンＤの系統樹、例えば図１に示される系統樹の作成に使用される場合、サイクリンＤ３（他のＤ型サイクリン、例えばサイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６及びＤ７ではない）を含むグループに該当するアミノ酸配列であるという意味で、サイクリンＤ３である。本明細書でサイクリンＤ３をコードする核酸についての言及は、上に定義されたサイクリンＤ３アミノ酸をコードする核酸に言及する。さらに、機能的変異体は、以下の１つ以上、好ましくは全てを含んでもよい。（ｉ）サイクリンボックス、（ｉｉ）最初の４０個程度のアミノ酸内のＬｘＣｘＥモチーフ（ほとんどのサイクリンＤが有する特徴である）；及び（ｉｉｉ）図２に示されるボックスにより同定される、１つ以上、好ましくは全ての保存領域（図２に示されるように、ボックス内の１個のミスマッチは許容される）。更にまた、当業者であれば、特定のサイクリンＤ３が機能的な変異体であるかどうか（植物の収量を向上できるかどうかという意味）、以下の実施例のセクションで説明される配列を、機能について調べる変異体と単純に置換することにより、容易に決定することができる。
【００２９】
本発明による方法を行うのに有用な、適切な機能的変異体の核酸及びアミノ酸配列には、
（ｉ）サイクリンＤ３をコードする核酸の一部、好ましくは配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸の一部、
（ｉｉ）サイクリンＤ３をコードする核酸の選択的スプライス変異体、好ましくは配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸の選択的スプライス変異体、
（ｉｉｉ）サイクリンＤ３をコードする核酸の対立遺伝子変異体、好ましくは配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸の対立遺伝子変異体、及び
サイクリンＤ３アミノ酸配列のホモログ、誘導体及び活性フラグメント、好ましくは配列番号２の配列で表されるサイクリンＤ３、が含まれる。
【００３０】
完全長のサイクリンＤ３をコードするＤＮＡ配列の使用は、本発明による方法を行うための必要条件でないことは、当業者に明らかであろう。本発明の方法は、サイクリンＤ３をコードするＤＮＡ／核酸の機能的部分、特に配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸の機能的部分を使用して、有利に行うことができる。部分（一部）とは、元の（大きな）ＤＮＡ分子に由来し又は調製されたＤＮＡ断片(piece)をいう。例えば、部分は、当該技術分野で周知の技術を用いて、配列番号１の核酸配列に１つ以上の欠失を作ることにより調製できる。
【００３１】
従って、本発明によれば、配列番号１で表される核酸の機能的部分を植物に導入することを含む、植物の収量を向上する方法が提供され、機能的部分は、シュートでその機能的部分を選択的に発現できるプロモーターの制御下にある。
【００３２】
本発明の方法に有用な別の機能的変異体は、サイクリンＤ３をコードする核酸の選択的スプライス変異体、特に配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸の選択的スプライス変異体である。本明細書で使用される用語「選択的スプライス変異体」は、選択されたイントロン及び／又はエキソンが切除され、置換されまたは付加された核酸配列の変異体を包含する。このような変異体は、おそらくタンパク質の生物学的活性が影響を受けていない変異体であり、このような影響を受けないことは、タンパク質の機能的セグメントを選択的に保持することにより達成することができる。このようなスプライス変異体は天然に見出すことができ、また人為的に作れる。このようなスプライス変異体を作製する方法は当該技術分野において周知である。
【００３３】
従って、本発明はまた、サイクリンＤ３をコードする核酸の選択的スプライス変異体、特に配列番号１の配列で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸の選択的スプライス変異体を植物に導入することを含む、植物の収量を向上させる方法を提供し、選択的スプライス変異体は、シュートでスプライス変異体を選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある。
【００３４】
本発明の方法に有用な別の変異体は、サイクリンＤ３をコードする核酸の対立遺伝子変異体、特に配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸の対立遺伝子変異体である。対立遺伝子変異体は天然に存在し、これらの天然の対立遺伝子の使用は本発明の方法に包含される。対立遺伝子変異体は、小さい挿入／欠失多型（ＩＮＤＥＬ）だけでなく一塩基多型（ＳＮＰ）も包含する。ＩＮＤＥＬのサイズは通常１００ｂｐ以下である。ＳＮＰ及びＩＮＤＥＬは、ほとんどの生物の天然の多型性株において、最大組の配列変異体を形成する。
【００３５】
従って、本発明はまた、サイクリンＤ３をコードする核酸の対立遺伝子変異体、特に配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸の対立遺伝子変異体を植物に導入することを含む、植物の収量を向上する方法を提供し、対立遺伝子変異体は、シュートで前記対立遺伝子変異体を選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある。
【００３６】
更に有利なことに、本発明による方法は、サイクリンＤ３のホモログ、誘導体又は活性フラグメント、好ましくは、配列番号２で表されるサイクリンＤ３のホモログ、誘導体または活性フラグメントを使って行ってもよい。配列番号２で表されるアミノ酸のホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸は、当業者に周知の日常的な技術を使って容易に決定することができる。
【００３７】
タンパク質の「ホモログ」は、問題の未改変のタンパク質に対して、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有し、そのホモログが由来する未改変のタンパク質と同様の生物学的及び機能的活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を包含する。このようなホモログを作製するため、タンパク質のアミノ酸を、類似の性質（例えばα−らせん構造またはβ−シート構造を形成するかまたは壊す、類似の疎水性、親水性、抗原性、性向）を持つ他のアミノ酸と置換することができる。保存的置換の表は当該技術分野で周知である（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。
【００３８】
本発明による方法に有用なホモログは、機能的変異体の定義、即ち、植物のＣＤＫと結合して、それを活性化する能力があり、上で定義されたサイクリンＤ３であるという定義に該当する。更に、ホモログは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、好適な順で増加して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性を有する点で特徴的である（サイクリンＤ３は互いに低い同一性％を有しているが、それでも配列番号２に対する３０％の同一性は他のサイクリンＤ３を同定するのに十分であることを示す図３を参照されたい）。更に、ホモログは、以下の１つ以上、好ましくは全てを含んでもよい：（ｉ）サイクリンボックス、（ｉｉ）最初の４０個程度のアミノ酸にあるＬｘＣｘＥモチーフ（ほとんどのサイクリンＤが有する特徴である）、及び（ｉｉｉ）図２に示されるボックスにより同定される保存領域の１つ以上、好ましくは全て（図２に示されるように、ボックス内の１個のミスマッチは許容される）。
【００３９】
また、用語「ホモログ」には、２つの特別な相同性形態が包含され、それらの形態はオーソロガス配列及びパラロガス配列を含み、それらの配列は遺伝子の先祖の関係を説明するのに使用される進化概念を包含する。用語「パラロガス」は、パラロガス遺伝子に導く種のゲノム内にある遺伝子重複に関する。用語「オーソロガス」は、先祖の関係に起因する異なる生物の相同な遺伝子に関する。
【００４０】
例えば、単子葉植物種におけるオーソロガスは、いわゆる相互のブラストサーチを行うことにより容易に見つけることができる。これは、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで見ることができる、公開され入手可能なＮＣＢＩデータベースなどの配列データベースに対して、問題の配列（例えば配列番号１または配列番号２）をブラストすることを含む最初のブラストにより行うことができる。もしイネのオーソロガスを探すとすれば、問題の配列を、例えばＮＣＢＩで入手可能なイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）の日本晴の２８，４６９の完全長ｃＤＮＡクローンに対してブラストする。ＢＬＡＳＴｎはヌクレオチドから開始する場合、またはＴＢＬＡＳＴＸはタンパク質から開始する場合に使用でき、スタンダードデフォルト値（エクスペクテーション１０、アラインメント５０）を用いる。ブラスト結果をフィルターにかけてもよい。そして、フィルターにかけた結果またはフィルターにかけていない結果のいずれかの完全長配列を、問題の配列（配列番号１または２）に対してブラストに戻す（即ち、２回目のブラストを行う）。次に、１回目及び２回目のブラストの結果を比較する。大ファミリーの場合、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して、クラスター化の視覚化に役立つ近縁関係結合樹（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｔｒｅｅ）を作成する。
【００４１】
ホモログはタンパク質の「置換変異体」の形態でもよく、即ち、アミノ酸配列の少なくとも１つの残基が除去されて、その場所に異なる残基が挿入される。アミノ酸置換は典型的に１つの残基の置換であるが、ポリペプチド上にある機能的な束縛に応じて群集化していてもよい。挿入は通常、約１〜１０アミノ酸残基のオーダーであり、欠失は約１〜２０残基の範囲である。好ましくは、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換を含む。
【００４２】
またホモログは、タンパク質の「挿入変異体」の形態、即ち、１つ以上のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位に導入されていてもよい。挿入は、１個又は複数のアミノ酸の配列内挿入だけでなく、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合も含んでもよい。一般的に、アミノ酸配列内の挿入は、アミノ−またはカルボキシ−末端融合よりも小さい、即ち約１〜１０残基のオーダーである。アミノ−またはカルボキシ−末端融合タンパク質又はペプチドの例として、酵母ツーハイブリッドシステムに使用される転写活性化因子の結合ドメイン又は活性化ドメイン、ファージコートタンパク質、（ヒスチジン）６−タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグ、プロテインＡ、マルトース−結合タンパク質、ジヒドロ葉酸還元酵素、タグ−１００エピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧ（登録商標）−エピトープ、ｌａｃＺ、ＣＭＰ（カルモジュリン−結合タンパク質）、ＨＡエピトープ、プロテインＣエピトープ及びＶＳＶエピトープが挙げられる。
【００４３】
タンパク質の「欠失変異体」の形態のホモログは、タンパク質から１つ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。
【００４４】
タンパク質のアミノ酸変異体は、当該技術分野で周知のペプチド合成技術、例えば固相ペプチド合成などを使って、または組換えＤＮＡ操作により、容易に作製できる。タンパク質の置換、挿入または欠失変異体を作るためのＤＮＡ配列の操作の方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ＤＮＡの所定の部位に置換突然変異を作る技術は当業者に周知であり、Ｍ１３突然変異誘発、Ｔ７−Ｇｅｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（ＵＳＢ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）、クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、ＰＣＲ−仲介部位特異的突然変異誘発法または他の部位特異的突然変異プロトコルが挙げられる。
【００４５】
「誘導体」としては、天然型タンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列と比較して、天然及び非天然アミノ酸残基の置換、欠失または付加を含み得る、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素が挙げられる。タンパク質の「誘導体」は、天然型ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、天然の、変化された、グリコシル化された、アシル化された、又は非天然の、アミノ酸残基を含みうるペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を包含する。また、誘導体は、その誘導体が由来するアミノ酸配列と比較して１つ以上の非アミノ酸置換を含んでもよく、例えば、アミノ酸配列と共有結合的に又は非共有結合的に結合したレポーター分子又は他のリガンド、例えば結合してその検出を容易にするレポーター分子、及び天然タンパク質のアミノ酸配列と比較して非天然のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００４６】
サイクリンＤ３タンパク質の「活性フラグメント」は、タンパク質の少なくとも５つの連続したアミノ酸残基を包含し、残基は、天然のタンパク質と類似の生物活性及び/又は機能的活性を保持する。あらゆる場合において、「ホモログ、誘導体及び活性フラグメント」は、上に定義された「機能的変異体」の定義に該当する。
【００４７】
サイクリンＤ３のホモログの検索及び同定の方法は十分に当業者の領域内にある。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野で周知であり、そのような方法として、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、（ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩの）ＡＬＩＧＮ  Ｘ及びＴＦＡＳＴＡが挙げられる。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３−４５３，  １９７０）のアルゴリズムを使用し、マッチする数を最大にし、ギャップの数を最小にする２つの完全な配列のアラインメントを見つける。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは配列の同一性のパーセントを計算し、これらの２つの配列間の類似性の統計学的分析を行う。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウエアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公開され入手可能である。本発明の方法に使用するのに適切なホモログ、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも３０％の配列同一性を有するホモログは、完全長サイクリンＤ３タンパク質配列を取得し、データのプレアラインメントを必要しない、所定のデータセットで配列の各ペア間の類似性及び同一性を計算するＭａｔＧＡＴ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ）などの類似性／同一性の行列ジェネレーターを使って、同定することができる。プログラムは、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのグローバルアラインメントアルゴリズム（ギャップ開始ペナルティー１２及びギャップ伸張ペナルティー２を使用）を用いて、一連のペアのアラインメントを行う。そして、例えば行列をスコアするＢｌｏｓｕｍ  ６０を使って類似性及び同一性を計算し、それからその結果を距離行列にする。
【００４８】
従って、本発明はまた、サイクリンＤ３のホモログ、誘導体または活性フラグメント、例えば配列番号２で表されるサイクリンＤ３のホモログ、誘導体または活性フラグメントをコードする核酸を植物に導入することを含む、植物の収量を向上する方法を提供し、ホモログ、誘導体または活性フラグメントは、シュートで前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある。
【００４９】
また本発明は、本発明による方法に有用な前記ヌクレオチド配列の導入及び／又は発現を容易にする遺伝子構築物及びベクターを提供する。
【００５０】
従って、
（ｉ）サイクリンＤ３をコードする核酸又はその機能的変異体、好ましくは配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体（上に定義される）（ここで、核酸は、サイクリンＤ３ポリペプチド又はその機能的変異体、好ましくは配列番号２で表されるサイクリンＤ３ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする。）、
（ｉｉ）シュートで、好ましくは栄養（地上）シュートの細胞増殖域で、（ｉ）の核酸を選択的に発現させることができるプロモーター、及び任意に、
（ｉｉｉ）転写終結配列、
を含む遺伝子構築物が提供される。
【００５１】
本発明による方法に有用な構築物は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる。市販された、植物に形質転換するのに適切で、形質転換された細胞で目的の遺伝子を発現させるのに適切なベクターに、遺伝子構築物を挿入することができる。
【００５２】
植物は、目的の配列（すなわち、サイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体（上に定義される））、例えば配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体（上に定義される）を含むベクターで形質転換される。目的の配列は、シュートで目的の配列を選択的に発現できるプロモーターと機能的に結合される。用語「調節要素」、「制御配列」及び「プロモーター」は本明細書においてすべて交換可能に用いられ、連結された配列の発現を行うことが可能な調節核酸配列を指す広い意味で取られるべきである。前述した用語に包含されるのは、古典的な真核生物のゲノム遺伝子由来の転写調節配列（ＣＣＡＡＴボックス配列の有無にかかわらず、正確な転写開始に必要とされるＴＡＴＡボックスを含む）、及び発生的及び／又は外的刺激に対する応答において、或いは組織特異的な方法において遺伝子の発現を変化させる、追加の調節要素（即ち上流活性化配列、エンハンサー及びサイレンサー）である。また上記用語に含まれるのは、古典的な原核生物遺伝子の転写調節配列であり、この場合、−３５ボックス配列及び／又は−１０ボックス転写調節配列を含んでもよい。また、用語「調節要素」は、細胞、組織または器官で核酸分子を発現させ、発現を活性化または増強する合成融合分子または誘導体を包含する。本明細書で使用される用語「機能的に結合された」は、プロモーター配列及び目的の遺伝子の間の機能的な結合をいい、それによりプロモーター配列は目的の遺伝子の転写を開始することができる。
【００５３】
サイクリンＤ３をコードする核酸またはその変異体、例えば配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸またはその変異体は、シュートで前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターと機能的に結合される。好ましくは、シュートで前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターは、例えば図５に示す、β−エクスパンシンプロモーターと同等の発現プロフィールを有する。当業者であれば、日常的な技術を用いて、β−エクスパンシンプロモーターと同等の発現プロフィールを有するプロモーターを容易に同定できるであろう。より具体的には、シュートで前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターは、シュートの細胞増殖域で、特に栄養（地上）シュートで、発現を作動できるプロモーターである。最も好ましくは、シュートで前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターは、β−エクスパンシンプロモーター（配列番号３）である。
【００５４】
また任意に、１つ以上のターミネーター配列を、植物に導入された構築物に使用してもよい。用語「ターミネーター」は、一次転写産物の３’プロセシング及びポリアデニル化、並びに転写の終結を示唆する、転写単位の末端のＤＮＡ配列である制御配列を包含する。追加の調節要素は、翻訳エンハンサーだけでなく転写エンハンサーも含んでもよい。当業者であれば、本発明の実施で使用するのに適切でありうるターミネーター及びエンハンサー配列を認識しているであろう。このような配列は当業者に知られており、または容易に得ることができるであろう。
【００５５】
更に、本発明の遺伝子構築物は、特定の細胞タイプにおいて維持及び／又は複製に必要とされる複製配列の開始点を含んでもよい。１つの例は、遺伝子構築物がエピソームの遺伝子エレメント（例えばプラスミドまたはコスミド分子）として細菌細胞に維持されることが必要とされる場合である。複製の好ましい開始点は、ｆ１−ｏｒｉ及びｃｏｌＥ１であるが、これに限定されない。
【００５６】
遺伝子構築物は、任意に、選択マーカー遺伝子を含んでもよい。本明細書で使用される用語「選択マーカー遺伝子」として、目的の核酸構築物でトランスフェクトされた、或いは形質転換された細胞の同定及び／又は選択を容易にするように発現される、細胞の表現型を付与する遺伝子が挙げられる。適切なマーカーは、抗生物質抵抗性または除草剤抵抗性を付与するマーカー、新しい代謝特性を導入するマーカー、或いは可視選択できるようにするマーカーから選択することができる。選択マーカー遺伝子の例として、抗生物質に対する抵抗性を与える遺伝子（例えばネオマイシン及びカナマイシンをリン酸化するｎｐｔII、またはハイグロマイシンをリン酸化するｈｐｔ）、除草剤に対して耐性を与える遺伝子（たとえばＢａｓｔａに対する耐性を与えるｂａｒ、グリホセートに対する耐性を与えるａｒｏＡまたはｇｏｘ）、または代謝特性を与える遺伝子（例えば植物が単一炭素源としてマンノースを使用できるようにするｍａｎＡ）が挙げられる。可視マーカー遺伝子は、色（例えばβ−グルクロニダーゼ、ＧＵＳ）、発光（例えばルシフェラーゼ）または蛍光（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ及びその誘導体）の形成をもたらす。
【００５７】
また本発明は、本発明による方法で得ることができる植物を包含する。従って本発明は、本発明による方法で得ることができる植物を提供し、植物は、シュートで核酸を選択的に発現させることができるプロモーターと機能的に結合した、サイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体を含む。
【００５８】
また本発明は、収量が向上したトランスジェニック植物の作出方法を提供し、サイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体、好ましくは配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体（上で定義される）の植物への導入を含み、核酸は、シュートで前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターと機能的に結合される。
【００５９】
より具体的には、本発明は、対応する野生型植物と比較して収量が向上したトランスジェニック植物の作出方法を提供し、その方法は、
（ｉ）サイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体、好ましくは配列番号１で表されるサイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体を、植物または植物細胞に導入すること（ここで、前記核酸またはその機能的変異体は、サイクリンＤ３ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードし、前記ポリペプチドは好ましくは配列番号２で表されるか又はその変異体であり、前記核酸またはその機能的変異体は、シュートで、好ましくは栄養（地上）シュートの細胞増殖域で、前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある。）、
（ｉｉ）再生及び成熟した植物の成長を促進する条件下で植物細胞を培養すること、
を含む。
【００６０】
核酸または機能的変異体は、植物細胞または植物自体に直接導入してもよい（組織、器官または植物の他の部分への導入を含む）。本発明の好ましい特徴によれば、核酸は形質転換により植物に好ましく導入される。
【００６１】
用語「植物への導入」は、主に、問題の特定の核酸（サイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体）で植物を形質転換することをいうが、その用語はまた、問題の特定の核酸が植物に導入される他の方法、例えば育種方法もいう。育種方法は当業者に周知である。
【００６２】
本明細書で言及される用語「形質転換」は、宿主細胞への外来性のポリヌクレオチドの移入を包含し、移入に用いられる方法によらない。器官形成または胚形成のいずれによってもよく、次のクローン増殖が可能な植物組織は、本発明の遺伝子構築物で形質転換され、それから完全な植物体に再生できる。選択される具体的な組織は、形質転換されるその特定の種に用いることができ、かつ最も適しているクローン増殖システムに応じて変わるであろう。例えば標的となる組織として、葉片、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、現存の分裂組織（たとえば頂端分裂組織、腋芽分裂組織及び根分裂組織）及び誘発された分裂組織（たとえば子葉分裂組織及び胚軸分裂組織）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、宿主細胞に過渡的に又は安定して導入することができ、ゲノムに組み込まれずに、例えばプラスミドとして、維持され得る。あるいは、宿主ゲノムに組み込まれてもよい。得られた形質転換植物細胞は、次に、当業者に公知の方法で形質転換植物に再生するのに使用することができる。
【００６３】
植物種の形質転換は、今や完全に日常的な技術である。幾つかの形質転換の方法のいずれも、適切な始祖細胞に目的の遺伝子を導入するのに有利に使用できる。形質転換の方法として、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡの取り込みを増やす化学物質、植物への直接のＤＮＡ注入、パーティクルガンボンバードメント、ウイルスまたは花粉を使った形質転換、及びマイクロプロジェクションの使用が挙げられる。方法は、プロトプラストのカルシウム／ポリエチレングリコール方法（Ｋｒｅｎｓ，  Ｆ．Ａ．ら、１８８２，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，  ７２−７４；  Ｎｅｇｒｕｔｉｕ  Ｉ．ら、１９８７，６月、  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８，  ３６３−３７３）；プロトプラストのエレクトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ  Ｒ．Ｄ．ら、１９８５  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ  ３，  １０９９−１１０２）；植物材料へのマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  Ａ．ら、１９８６，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２０２，  １７９−１８５）；ＤＮＡまたはＲＮＡコートパーティクルボンバードメント（Ｋｌｅｉｎ  Ｔ．Ｍ．ら、  １９８７，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，  ７０）；（非組み込みの）ウイルスの感染などから選択することができる。サイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体を発現するトランスジェニックイネ植物は、好ましくは、例えば以下のいずれかに説明される、イネの形質転換の周知の方法のいずれかを用いたアグロバクテリウムを介した形質転換を経由して作出される：公開欧州特許出願  ＥＰ  １１９８９８５  Ａ１、Ａｌｄｅｍｉｔａ及びＨｏｄｇｅｓ  （Ｐｌａｎｔａ，  １９９，  ６１２−６１７，  １９９６）；  Ｃｈａｎら、（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２  （３）  ４９１−５０６，  １９９３）、Ｈｉｅｉら（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６  （２）  ２７１−２８２，  １９９４）（これらの開示は、あたかも完全に記載されていたかのように本明細書に参照により組み込まれる）。トウモロコシの形質転換の場合、好ましい方法は、Ｉｓｈｉｄａら（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９６  Ｊｕｎ；  １４（６）：  ７４５−５０）、またはＦｒａｍｅら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００２  Ｍａｙ；  １２９（１）：  １３−２２）のいずれかに記載されており、これらの開示は、あたかも完全に記載されていたかのように本明細書に参照により組み込まれる。
【００６４】
一般的に形質転換後は、植物細胞または細胞グループは、目的の遺伝子と同時に移入された、植物で発現可能な遺伝子によりコードされる１つ以上のマーカーの存在について選択され、続いて形質転換された材料は完全な植物体に再生される。
【００６５】
ＤＮＡの移入及び再生後、推定的に形質転換された植物を例えばサザン法を使って、目的の遺伝子の存在、コピー数及び／又はゲノム組織について評価することができる。それとは別に又は追加して、新たに導入されたＤＮＡの発現レベルをノザン及び／又はウエスタン分析を使ってモニターすることができ、これらの技術はともに当業者に周知である。
【００６６】
作出された形質転換植物は、様々な方法、例えばクローン増殖または古典的な育種方法で増殖することができる。例えば、第１世代（またはＴ１）のトランスジェニック植物を自家受粉させて、均一の第２世代（またはＴ２）形質転換体を作ることができ、更にＴ２植物を古典的な育種技術によって増やすことができる。
【００６７】
作出された形質転換生物は多様な形をとることができる。例えば形質転換生物は、形質転換細胞と非形質転換細胞のキメラ、クローン形質転換体（例えば発現カセットを含むように形質転換された全ての細胞）、形質転換組織と非形質転換組織の移植片（例えば植物において、非形質転換の枝と接ぎ木された台木）でもよい。
【００６８】
また、本発明による方法は、サイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体を植物に導入することなく、行うこともできる。これは、シュートで選択的に前記遺伝子が発現できるように、好ましくはサイクリンＤ３をコードする遺伝子の遺伝子座に、遺伝子改変を導入することにより達成することができる。本明細書で定義された遺伝子座はゲノム領域を意味するととられ、目的の遺伝子及びそのコード領域の１０ＫＢ上流または下流を含む。
【００６９】
遺伝子改変は、例えば以下の方法の１つ（あるいは複数）により導入することができる。Ｔ−ＤＮＡ活性化、ティリング（ＴＩＬＬＩＮＧ）、突然変異誘発法、相同的組換え、または上で述べた、植物（細胞）でのサイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体の導入と発現（前記核酸は、シュートで前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある）。
【００７０】
Ｔ−ＤＮＡアクチベーションタギング（Ｈａｙａｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）１３５０−１３５３）は、プロモーターが標的遺伝子の発現を指令するような配置で目的の遺伝子又は遺伝子のコード領域の１０ＫＢ上流または下流のゲノム領域に、プロモーターを通常含んでいるＴ−ＤＮＡ（翻訳エンハンサーまたはイントロンを含んでもよい）を挿入することを含む。一般的に、それ自体が持つ天然プロモーターによる標的遺伝子の調節が破壊されて、その遺伝子は新しく導入されたプロモーターの制御の支配下に入る。一般的に、プロモーターはＴ−ＤＮＡに組み込まれる。このＴ−ＤＮＡは、例えばアグロバクテリウム感染を介して植物ゲノムにランダムに挿入され、挿入されたＴ−ＤＮＡに近い遺伝子の過剰発現を誘導する。作出されたトランスジェニック植物は、導入されたプロモーターに近い遺伝子の過剰発現のために、優性の表現型を示す。収量の向上を達成するため、導入すべきプロモーターは、シュートで選択的に発現させることができるプロモーターであればよい。
【００７１】
また、遺伝子改変は、ティリング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）の技術を使って、サイクリンＤ３をコードする核酸／遺伝子の遺伝子座に導入することもできる。これは、サイクリンＤ３の生物活性を示すことができる、サイクリンＤ３をコードする核酸を突然変異させた変異体を、作製及び／又は同定して最終的に単離するのに有用な突然変異誘発技術である。また、ティリングはこのような突然変異体を有する植物の選択を可能にする。これらの突然変異体は、天然型の遺伝子により示されるサイクリンＤ３活性よりも高い活性を示すこともある。ティリングは、高密度の突然変異誘発とハイスループットスクリーニング法を組合わせる。一般的に、ティリングのステップは以下のとおりである。（ａ）ＥＭＳ突然変異誘発（Ｒｅｄｅｉ及びＫｏｎｃｚ，１９９２；Ｆｅｌｄｍａｎｎら、１９９４；Ｌｉｇｈｔｎｅｒ及びＣａｓｐａｒ，１９９８）、（ｂ）ＤＮＡ調製及び個体のプール、（ｃ）目的の領域のＰＣＲ増幅、（ｄ）へテロ二本鎖の形成を可能にする変性及びアニーリング、（ｅ）ＤＨＰＬＣ（プールのヘテロ二本鎖の存在はクロマトグラムで余分なピークとして検出される）、（ｆ）突然変異個体の同定、及び（ｇ）突然変異ＰＣＲ生成物の配列決定。ティリング法は当該技術分野で周知である（ＭｃＣａｌｌｕｍ  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００  Ａｐｒ；１８（４）：４５５−７，ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｅｍｐｌｅ  ２００４（ＴＩＬＬＩＮＧ−ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｈａｒｖｅｓｔ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２００４  Ｆｅｂ；５（２）：１４５−５０．））。
【００７２】
突然変異誘発法は、サイクリンＤ３をコードする核酸の変異体を作製するのに使用できる。突然変異体を作製する方法は、当該技術分野で周知である。
【００７３】
Ｔ−ＤＮＡ活性化、ティリング及び部位特異的突然変異法は新規の対立遺伝子及びサイクリンＤ３変異体を作製することができる技術の例である。
【００７４】
相同的組換えは、選択した核酸を、ゲノム内の、確定済みの選択された位置に導入することを可能にする。相同的組換えは、酵母又はニセツリガネゴケなどの下等生物について生物科学で日常的に使用される標準的な技術である。植物で相同的組換えを行う方法は、モデル植物について（Ｏｆｆｒｉｎｇａら、Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  １９９０  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９９０  Ｏｃｔ；  ９（１０）：３０７７−８４）だけでなく、作物、例えばイネについても（Ｔｅｒａｄａ  Ｒ，  Ｕｒａｗａ  Ｈ，  Ｉｎａｇａｋｉ  Ｙ，  Ｔｓｕｇａｎｅ  Ｋ，  Ｉｉｄａ  Ｓ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００２．  Ｉｉｄａ及びＴｅｒａｄａ：  Ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｓ，  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｔ−ＤＮＡ：  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ．    Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００４  Ａｐｒ；  １５（２）：１３２−８）説明されている。標的となる核酸（サイクリンＤ３をコードする核酸またはその変異体（上で定義される）でもよい）は、サイクリンＤ３をコードする遺伝子の遺伝子座を標的にする必要はなく、例えば高発現の領域に導入してもよい。標的となる核酸は、内在性遺伝子を置換するために使用される改良された対立遺伝子でもよいし、または内因性遺伝子に加えて導入してもよい。
【００７５】
本発明は、明確に、あらゆる植物細胞、または本明細書で説明されたいずれかの方法で作出されたあらゆる植物、全ての植物部分及びその栄養繁殖体にまで拡張する。本発明は更に、上述のいずれかの方法で作出された、最初に形質転換又はトランスフェクトされた細胞、組織、器官または全植物体の後代を包含するよう拡張するが、ただ必要なのは、後代が、本発明の方法により親で作られたものと同じ遺伝子型及び／又は表現型の特徴を示すことである。また、本発明は、シュートでサイクリンＤ３をコードする核酸を発現させることができるプロモーターと機能的に結合された、単離されたサイクリンＤ３をコードする核酸を含む宿主細胞も含む。本発明による好ましい宿主細胞は植物細胞である。また本発明は、収穫可能な部分、例えば種子、葉、果実、花、茎栽培物（ｓｔｅｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、根茎、塊茎、及び鱗茎に拡張するが、これらに限定されない。
【００７６】
また本発明は、サイクリンＤ３をコードする核酸の使用及びサイクリンＤ３ポリペプチドの使用を包含する。
【００７７】
もちろんこのような使用は、植物の収量の向上における、特に地上面積の増加、全種子数の増加、（充実した）種子の数の増加、種子重量の増加、収穫指数の増加などにおける、シュートでサイクリンＤ３をコードする核酸を選択的に発現させることができるプロモーターと機能的に結合した、該核酸の使用に関する。サイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体は、上に定義したとおりである。好ましくは、配列番号１で表される核酸、または上に定義された機能的変異体である。
【００７８】
また、サイクリンＤ３をコードする核酸及びサイクリンＤ３ポリペプチドは、育種計画に使用することも考えられる。サイクリンＤ３は、配列番号１で表される核酸またはその機能的変異体（上に定義される）でもよく、またはサイクリンＤ３は、配列番号２で表されるアミノ酸またはその機能的変異体（上に定義される）でもよい。例えば、サイクリンＤ３をコードする核酸またはその機能的変異体は、好ましくは１つ以上の関連するファミリーメンバーと一緒に染色体（またはその一部）上に存在してもよい。このような育種計画の例では、植物でサイクリンＤ３タンパク質と遺伝子的に結合できるＤＮＡマーカーを同定し、遺伝子は、サイクリンＤ３タンパク質自体をコードする遺伝子、またはサイクリンＤ３タンパク質をコードする遺伝子の発現に及び/又はサイクリンＤ３タンパク質自体の活性に、直接または間接的に影響を与えることができる遺伝子でもよい。そしてそのＤＮＡマーカーを、育種計画において、対応する野生型植物と比較して収量が向上した植物を選択するのに使用できる。
【００７９】
また、サイクリンＤ３の対立遺伝子変異体は、従来の育種計画、例えばマーカーを補助に用いる育種にも使用できる。このような育種計画は、時々、植物を突然変異誘発処理して、植物に対立遺伝子変異を導入することを必要とする。１つの適切な変異誘発方法はＥＭＳ突然変異誘発法である。そして、例えばＰＣＲにより対立遺伝子変異体の同定を行う。この後、問題の配列の優れた対立遺伝子変異体を選択するための選択工程が続き、その対立遺伝子変異体は対応する野生型植物と比べて植物に向上した収量をもたらす。一般的に、選択は、問題の配列の異なる対立遺伝子変異体、例えば配列番号１の異なる対立遺伝子変異体を含む植物で収量をモニタリングすることによって行われる。収量のモニタリングは、温室または農場で行うことができる。更に、任意の工程として、優れた対立遺伝子変異体が同定された植物と別の植物との異種交配が挙げられる。これは、例えば目的の表現型特性の組み合わせを作製するのに使用できよう。
【００８０】
また、サイクリンＤ３をコードする核酸及びサイクリンＤ３ポリペプチドは成長調節剤として使用することが考えられる。サイクリンＤ３は配列番号１で表される核酸またはその機能的変異体（上で定義される）でもよく、またはサイクリンＤ３は配列番号２で表されるアミノ酸またはその機能的変異体（上で定義される）でもよい。これらのサイクリンＤ３は植物の収量の向上に有用であるので、サイクリンＤ３は有用な成長調節剤、例えば除草剤または成長促進剤などになるだろう。従って、本発明は、成長調節剤として使用するため、サイクリンＤ３を適切な担体、希釈剤または賦形剤と一緒に含む組成物を提供する。
【００８１】
本発明による方法は、上で説明したように、収量が向上した植物をもたらす。これらの有利な特徴は、他の経済的に有利な特性、例えば更に収量を増強する特性、様々なストレスに対する耐性、様々な構成的な特徴を改変する特性、及び／又は生化学的及び/又は生理学的特徴が組合わされてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
図面の説明：
本発明を添付の図を参照して説明する（後述の図面の簡単な説明を参照のこと）。
【実施例】
【００８３】
本発明を以下の実施例を参照して説明するが、説明のみを目的とする。
【００８４】
ＤＮＡ操作：特に明記しない限り、組換えＤＮＡ技術はＳａｍｂｒｏｏｋ（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＣＳＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４），Ｖｏｌｕｍｅｓ  １及び２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載される標準的なプロトコルに従って行う。標準的な材料と植物分子研究の方法は、Ｒ．Ｄ．Ｄ．  ＣｒｏｙのＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｓｅ（１９９３）、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ（ＵＫ）及びＢｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＵＫ）出版に説明されている。
【００８５】
実施例１：遺伝子クローニング
シロイヌナズナのサイクリンＤ３；３（内部参照ＣＤＳ００１８）を、シロイヌナズナシードリングｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，英国）をテンプレートとして用いてＰＣＲで増幅した。苗（ｓｅｅｄｌｉｎｇ）から抽出したＲＮＡを逆転写後、ｃＤＮＡをｐＣＭＶ  Ｓｐｏｒｔ  ６．０にクローニングした。バンクの平均挿入サイズは１．５ｋｂであり、クローンの最初の数は１．５９×１０７ｃｆｕであった。最初の力価は９．６×１０５ｃｆｕ／ｍｌと測定され、最初の増幅後は６×１０１１ｃｆｕ／ｍｌと測定された。プラスミド抽出後、テンプレート２００ｎｇを５０μｌのＰＣＲミックスに使用した。プライマーは、ｐｒｍ０３６０（センス、開始コドンは太字、ＡｔｔＢ１部位はイタリックで示す。）
【化１】
2008500808.tif 000003
【００８６】
及びｐｒｍ０３６１（リバース、相補的、停止コドンは太字、ＡｔｔＢ２部位はイタリックで示す。）
【化２】
2008500808.tif 000004
【００８７】
であり、これらはＧａｔｅｗａｙ組換えのＡｔｔＢ部位を含み、ＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲはＨｉｆｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使って標準的な条件で行った。１０８６ｂｐのＰＣＲフラグメントを増幅して、また標準的な方法を用いて精製した。次に、Ｇａｔｅｗａｙ用語による「エントリークローン」ｐ０４４３を作製するため、ＰＣＲフラグメントをｉｎ  ｖｉｖｏでｐＤＯＮＲ２０１プラスミドを用いて組換える間に、Ｇａｔｅｗａｙの手順の最初のステップのＢＰ反応を行なった。プラスミドｐＤＯＮＲ２０１はＧａｔｅｗａｙ（登録商標）技術の一部として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
【００８８】
実施例２：ベクターの構築
続いて、エントリークローンｐ０４３３を、ｐ３１６９（イネ形質転換に使用されるディスティネーションベクター）とのＬＲ反応に使用した。このベクターは、Ｔ−ＤＮＡボーダー内に機能的エレメントとして、植物選択マーカーと、植物スクリーナブルマーカーと、及びエントリークローンにすでにクローニングされた目的の配列を有するＬＲ  ｉｎ  ｖｉｖｏ組換え用のＧａｔｅｗａｙカセットとを含む。栄養（地上）シュートの増殖域での発現のためのβ−エクスパンシンプロモーターをＧａｔｅｗａｙカセットの上流に配置する。
【００８９】
ＬＲ組換えステップ後、得られた発現ベクター（図４参照）をアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４に形質転換し、続いてイネ植物に形質転換した。形質転換されたイネ植物は成長することができ、次に実施例３に説明するパラメーターについて試験した。
【００９０】
実施例３：評価及び結果
約１５〜２０の独立したＴ０イネ形質転換体を作出した。初代の形質転換体を成長させてＴ１種子を収穫するため、組織培養チャンバーから温室に移した。Ｔ１後代が３：１で導入遺伝子の存在／不存在に分離した、５つの事象が保持された。これらの各事象について、導入遺伝子（ヘテロ−及びホモ−接合体）を含む約１０本のＴ１苗、及び導入遺伝子を欠く（無接合体（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｔｅ））約１０本のＴ１苗を、可視マーカーの発現をモニタリングすることにより選択した。更に、最も良好なＴ１の事象について、Ｔ１世代と同じ方法でＴ２世代で評価したが、１事象あたりもっと多くの個体を用いた。
【００９１】
統計学的分析：ｔ−テスト及びＦ−テスト
２つのファクターＡＮＯＶＡ（変異体の分析）を、植物の表現型の特性を全体的に評価するため、統計学的モデルとして使用した。Ｆ−テストを、本発明の遺伝子で形質転換した全ての事象の全ての植物を測定する全てのパラメーターについて行った。Ｆ−テストは、全ての形質転換事象にわたって遺伝子の効果をチェックするため、及びグローバルな遺伝子効果としても知られる遺伝子の全体的な効果を証明するために行った。真のグローバルな遺伝子効果についての有意性の閾値は、Ｆ−テストについて５％確率レベルにセットした。有意なＦ−テスト値は遺伝子の効果を示し、表現型の違いを起こしている遺伝子の存在または位置のみだけではないことを意味する。
【００９２】
３．１  栄養繁殖測定：
選択したＴ１植物（導入遺伝子を有する約１０本、及び導入遺伝子を有しない約１０本）を温室に移した。各植物に固有のバーコードラベルを貼り、表現型のデータを対応する植物と明確にリンクさせた。選択したＴ１植物を、直径１０ｃｍのポットに入った土で以下の環境設定で育てた。明期＝１１．５時間、日光の強さ＝３０，０００ｌｕｘ以上、日中の温度＝２８℃以上、夜間の温度＝２２℃、相対湿度＝６０−７０℃。トランスジェニック植物及び対応する無接合体をランダムな位置で隣接させて育てた。播種期から成熟期まで、各植物を、何度かデジタル画像キャビネットに通過させて画像化した。各タイムポイントで、デジタル画像（２０４８ｘ１５３６ピクセル、１６００万色）を少なくとも６つの異なる角度から各植物を撮影した。以下に説明するパラメーターを、画像分析ソフトウエアを使って、自動化された方法で全ての植物の全てのデジタル画像から得た。
【００９３】
３．１．１  地上の植物面積
植物の地上面積を、バックグラウンドと区別される地上の植物部分からピクセルの全数を数えることにより決定した。この値を、同じ時点で異なる角度から撮った写真を平均化し、検量により平方ｍｍで表した物理的表面値に変換した。実験は、この方法で測定した地上の植物面積は地上の植物部分のバイオマスと相関することを示す。Ｔ１及びＴ２の評価の結果を以下の表１に示す。トランスジェニック植物及び対応する無接合体（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｔｅ）間の差のパーセンテージを示す。ＦテストのＰ値は、Ｔ１及びＴ２の評価の両方において有意であり、地上面積の導入遺伝子の存在の全体的な影響を示した。
【表２】
2008500808.tif 000005
【００９４】
３．２  種子関連パラメーターの測定
成熟した最初の穂（ｐａｎｉｃｌｅ）を収穫し、袋に詰め、バーコードを貼付し、それから３７℃のオーブンで３日間乾燥した。次に、穂を脱穀し、全ての種子を集めて数えた。充実した殻を、送風機を使って空の殻と分けた。空の殻を捨て、残った画分を再び数えた。充実した殻を化学天秤で重量測定した。この手順により、以下に説明する種子関連パラメーターのセットが得られた。
【００９５】
３．２．１  種子の全数
植物当たりの全種子数を、植物から収穫した殻の数を数えて計測した。Ｔ１及びＴ２の評価の結果を以下の表２に示す。トランスジェニック植物及び対応する無接合体間の差のパーセンテージを示す。ＦテストのＰ値は、Ｔ１及びＴ２の評価の両方において有意であり、導入遺伝子の存在が生産された種子の全数に有意な影響を与えることを示した。
【表３】
2008500808.tif 000006
【００９６】
３．２．２  充実した種子の数
充実した種子の数を、分離ステップ後に残った充実した殻の数を数えて測定した。Ｔ１及びＴ２の評価の結果を以下の表４に示す。トランスジェニック植物及び対応する無接合体間の差のパーセンテージを示す。ＦテストのＰ値は、Ｔ１及びＴ２の評価の両方において有意であり、導入遺伝子の存在が生産された充実した種子の数を有意に増加させることを示した。
【表４】
2008500808.tif 000007
【００９７】
３．２．３  全種子重量
種子の全収量を、植物から収穫した充実した殻の全てを重量測定することにより計測した。Ｔ１及びＴ２の評価の結果を、以下の表５に示す。トランスジェニック植物及び対応する無接合体間の差のパーセンテージを示す。ＦテストのＰ値は、Ｔ１及びＴ２の評価の両方において有意であり、導入遺伝子の存在は種子重量を有意に増加させることを示した。
【表５】
2008500808.tif 000008
【００９８】
３．２．４  植物の収穫指数
本発明における収穫指数は、全種子収量と地上面積（ｍｍ２）間の比率として定義され、ファクター１０６を乗じる。Ｔ１及びＴ２の評価の結果を以下の表６に示す。トランスジェニック植物及び対応する無接合体の差のパーセンテージを示す。ＦテストのＰ値は、Ｔ１及びＴ２の評価の両方において有意であり、導入遺伝子の存在は収穫指数を有意に増加させることを示した。
【表６】
2008500808.tif 000009
【００９９】
実施例４：比較データ  ｐオレオシン：：サイクリンＤ３；３
上記構築物を含む植物を作製し、ｐβ−エクスパンシン：：サイクリンＤ３；３について上記に説明した同じ手順を使って評価した。Ｔ１の評価の結果を以下の表７〜９に示す。トランスジェニック植物及び対応する無接合体間の差のパーセンテージを各テーブルに示す。ＦテストのＰ値も示す。
【表７】
2008500808.tif 000010
【０１００】
ＦテストのＰ値は有意であり、このプロモーターにより作動される導入遺伝子の発現が地上面積を有意に減少させることを示した。
【表８】
2008500808.tif 000011
【０１０１】
この結果は、トランスジェニック植物の種子の全重量が、対応する無接合体の全種子重量よりも軽かったことを示す。
【表９】
2008500808.tif 000012
【０１０２】
この結果は、トランスジェニック植物の充実した種子の数が、対応する無接合体の充実した種子の数よりも少なかったことを示す。
【０１０３】
実施例５：β−エクスパンシンプロモーターにより作動されるＧＵＳ発現
β−エクスパンシンプロモーターを、「ＢＰ組換え反応」を用いるＧａｔｅｗａｙＴＭシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のｐＤＯＮＲ２０１エントリープラスミドにクローニングした。クローニングされた挿入物の同一性及び塩基対組成を、配列決定により確認し、更に、得られたプラスミドを、制限酵素で消化して試験を行った。
【０１０４】
次に、レポーター遺伝子の前にプロモーターをクローニングするため、各エントリークローンを、ディスティネーションベクターを用いる「ＬＲ組換え反応」（ＧａｔｅｗａｙＴＭ）に使用した。このディスティネーションベクターを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子とプロモーターが、ＧＵＳ遺伝子の前のＧａｔｅｗａｙ組換えカセットの置換を介して機能的に結合するように設計した。得られたレポーターベクターは、ＧＵＳと機能的に結合したプロモーターを含み、次に、アグロバクテリウム株ＬＢＡ４０４４に形質転換し、それから標準的な形質転換技術を用いてイネ植物に形質転換した。
【０１０５】
形質転換イネ植物を形質転換細胞から作製した。植物の成長は、通常の条件下で行った。
【０１０６】
試験を行う植物又は植物の部分を、９０％の氷冷アセトンで覆い、４℃で３０分間インキュベートした。トリスバッファー［１Ｌの再蒸留水に、１５．７６ｇのＴｒｉｚｍａ  ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｔ３２５３）＋２.９２２ｇのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整］で５分間、３回洗浄した後、材料を、トリス/フェリシアネート（ｆｅｒｒｉｃｙａｎａｔｅ）／Ｘ−Ｇｌｕｃ液[９．８ｍｌのトリスバッファー＋０．２ｍｌのフェリシアネート原液(１０ｍｌのトリスバッファーに０．３３ｇのフェリシアン化カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｉｃｙａｎａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３６６７））＋０．２ｍｌのＸ−Ｇｌｕｃ原液（５００μｌのＤＭＳＯに２６．１ｍｇのＸ−Ｇｌｕｃ（Ｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＭＬ  １１３Ａ）］で覆った。減圧浸潤を１５〜３０分適用した。植物または植物の部分を、青色の発色が現れるまで、３７℃で１６時間までインキュベートした。サンプルをトリスバッファーで５分間、３回洗浄した。葉緑素を、連続して５０％、７０％及び９０％のエタノールで（各３０分間）抽出した。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ＣｌuｓｔａｌＷ及びデフォルト値を使い、平均距離系統樹のコンピュータ計算を行って作製されたマルチプルアラインメントを示す。サイクリンＤ３クラスターを示す。
【図２−１】公知のサイクリンＤ３タンパク質配列のアラインメントを示す。配列を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｓｕｉｔｅ  （ＩｎｆｏｒＭａｘ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）のＡｌｉｇｎＸプログラムを用いて整列比較した。マルチプルアラインメントをギャップ開始ペナルティー１０及びギャップ伸張ペナルティー０．０１で行った。また、軽微な手動による編集を、幾つかの保存領域をよりよい位置にする必要がある場合に行った。示したラインは、サイクリンＤ３が他のサイクリンと分かれることを示す。サイクリンＤ３に特異的な多くのモチーフをボックスで囲ってある。
【図２−２】公知のサイクリンＤ３タンパク質配列のアラインメントを示す。配列を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｓｕｉｔｅ  （ＩｎｆｏｒＭａｘ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）のＡｌｉｇｎＸプログラムを用いて整列比較した。マルチプルアラインメントをギャップ開始ペナルティー１０及びギャップ伸張ペナルティー０．０１で行った。また、軽微な手動による編集を、幾つかの保存領域をよりよい位置にする必要がある場合に行った。示したラインは、サイクリンＤ３が他のサイクリンと分かれることを示す。サイクリンＤ３に特異的な多くのモチーフをボックスで囲ってある。
【図２−３】公知のサイクリンＤ３タンパク質配列のアラインメントを示す。配列を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｓｕｉｔｅ  （ＩｎｆｏｒＭａｘ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）のＡｌｉｇｎＸプログラムを用いて整列比較した。マルチプルアラインメントをギャップ開始ペナルティー１０及びギャップ伸張ペナルティー０．０１で行った。また、軽微な手動による編集を、幾つかの保存領域をよりよい位置にする必要がある場合に行った。示したラインは、サイクリンＤ３が他のサイクリンと分かれることを示す。サイクリンＤ３に特異的な多くのモチーフをボックスで囲ってある。
【図２−４】公知のサイクリンＤ３タンパク質配列のアラインメントを示す。配列を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｓｕｉｔｅ  （ＩｎｆｏｒＭａｘ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）のＡｌｉｇｎＸプログラムを用いて整列比較した。マルチプルアラインメントをギャップ開始ペナルティー１０及びギャップ伸張ペナルティー０．０１で行った。また、軽微な手動による編集を、幾つかの保存領域をよりよい位置にする必要がある場合に行った。示したラインは、サイクリンＤ３が他のサイクリンと分かれることを示す。サイクリンＤ３に特異的な多くのモチーフをボックスで囲ってある。
【図２−５】公知のサイクリンＤ３タンパク質配列のアラインメントを示す。配列を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｓｕｉｔｅ  （ＩｎｆｏｒＭａｘ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）のＡｌｉｇｎＸプログラムを用いて整列比較した。マルチプルアラインメントをギャップ開始ペナルティー１０及びギャップ伸張ペナルティー０．０１で行った。また、軽微な手動による編集を、幾つかの保存領域をよりよい位置にする必要がある場合に行った。示したラインは、サイクリンＤ３が他のサイクリンと分かれることを示す。サイクリンＤ３に特異的な多くのモチーフをボックスで囲ってある。
【図３】データのプレアラインメントを必要とすることなく所定のデータセットで配列の各ペア間の類似性及び同一性を計算する、ＭａｔＧＡＴ  （Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ）を使って作製された、類似性／同一性の行列を示す。このプログラムは、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒのグローバルアラインメントアルゴリズム（ギャップ開始ペナルティー１２、及びギャップ開始ペナルティー２）を使って一連のペアのアラインメントを行う。そして、例えば行列をスコアするＢｌｏｓｕｍ  ６０を用いて、類似性及び同一性を計算し、次にその結果を距離行列にする。配列類似性を分割線の下半分に示し、配列同一性を分割線の上半分に示す。配列番号２の配列を、行列において番号５として示す。配列番号２の配列と少なくとも３０％の配列同一性を有する配列はサイクリンＤ３を包含する。
【図４】β−エクスパンシンプロモーターの制御下にある、シロイヌナズナサイクリンＤ３；３遺伝子の、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）の発現用バイナリーベクターを示す。
【図５】β−エクスパンシンプロモーターにより作動されるＧＵＳ発現の写真を示す。「Ｃ植物」の写真は、約５ｃｍの大きさになったときのＧＵＳ染色されたイネ植物である。「Ｂ植物」の写真は、約１０ｃｍの大きさになったときのＧＵＳ染色されたイネ植物である。また、同程度の発現プロフィールを持つプロモーターは、本発明の方法に有用でありうる。
【図６−１】本発明による方法を行うのに有用な配列の例の詳細を示す。
【図６−２】本発明による方法を行うのに有用な配列の例の詳細を示す。
【図１】
2008500808.tif 000013
【図２−１】
2008500808.tif 000014
【図２−２】
2008500808.tif 000015
【図２−３】
2008500808.tif 000016
【図２−４】
2008500808.tif 000017
【図２−５】
2008500808.tif 000018
【図３】
2008500808.tif 000019
【図４】
2008500808.tif 000020
【図５】
2008500808.tif 000021
【図６−１】
2008500808.tif 000022
【図６−２】
2008500808.tif 000023
【配列表】
2008500808000001.xml
【国際調査報告】
2008500808.tif 000027
2008500808.tif 000028
2008500808.tif 000029