(57)【要約】  本発明は、特定の治療処置に対する対象者の応答および／または副作用を評価または査定するための方法および組成物に関するものである。より具体的には、本発明は、対象者の応答および／または副作用を決定する方法、または治療用抗体で処置される対象者の処置プロトコルを、標的細胞を枯渇させずに標的を中和することが所望である状況に適合させる方法を提供する。本発明は対象者のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型の決定に基づくものである。好ましくは、治療用抗体は、Ｇ４サブクラスのＦｃ部分を含む抗体またはタンパク質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ部分を含む組成物での処置に対する対象者の応答を評価する方法であって、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基を決定することを含み、対象者が１５８位にフェニルアラニンを有することの決定は、該処置に対する応答の増加を示し、１５８位にバリンを有することの決定は、該処置に対する応答の減少を示し、ここで、該処置は組成物が関連または結合する細胞の枯渇を必要としない、方法。
【請求項２】
Ｆｃ部分を含む組成物での処置に対する対象者の応答を評価する方法であって、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基を決定することを含み、対象者が１５８位にフェニルアラニンを有することの決定は、該処置に対する応答の増加を示し、１５８位にバリンを有することの決定は、該処置に対する応答の減少を示し、ここで、該Ｆｃ部分はＧ４サブクラスのＦｃ部分である、方法。
【請求項３】
Ｆｃ部分を含む組成物での処置に関して対象者を選択するか、処置の対象者をモニターリングするか、あるいは処置の対象者の亜集団を同定するための方法であって、該方法は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基を決定することを含み、対象者が１５８位にフェニルアラニンを有することの決定は、該処置に対する応答の増加を示し、１５８位にバリンを有することの決定は、該処置に対する応答の減少を示し、ここで、該処置は組成物が関連または結合する細胞の枯渇を必要としない、方法。
【請求項４】
Ｆｃ部分を含む組成物での処置に対する副作用を評価する方法であって、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基を決定することを含み、対象者が１５８位にフェニルアラニンを有することの決定は、該処置に対する応答の増加を示し、１５８位にバリンを有することの決定は、該処置に対する応答の減少を示し、ここで、該処置は組成物が関連または結合する細胞の枯渇を必要としない、方法。
【請求項５】
組成物が抗体を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
組成物がＦｃ部分を含む融合タンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
Ｆｃ部分がＧ４サブクラスのＦｃ部分である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
処置が対象者の免疫応答を増強または減少させるためのものである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
処置が対象者の腫瘍を処置するために有効である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
組成物がＮＫ細胞表面受容体に特異的に結合する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
組成物がＴ細胞表面受容体に特異的に結合する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ＮＫ細胞表面受容体が抑制性および活性化細胞表面受容体からなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ＮＫ細胞表面受容体が抑制性細胞表面受容体である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＮＫ細胞表面受容体が活性化細胞表面受容体である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
活性化細胞表面受容体が、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
抑制性細胞表面受容体が、ＫＩＲおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａからなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子またはＲＮＡまたは、アミノ酸残基１５８をコードするヌクレオチドを含むそれらの部分をシークエンシングする工程を含む、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子またはＲＮＡまたは、アミノ酸残基１５８をコードするヌクレオチドを含むそれらの部分を増幅する工程を含む、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびネストＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅を実施する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が対立遺伝子特異的な制限酵素消化の工程を含む、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子またはＲＮＡまたは、アミノ酸残基１５８をコードするヌクレオチドを含むそれらの部分を、遺伝子型バリンまたはフェニルアラニンに特異的な核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる工程を含む、請求項１〜２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、
−生体サンプルからゲノムＤＮＡを取得すること；
−ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子または、アミノ酸残基１５８をコードするヌクレオチドを含むその部分を増幅すること；および
−ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子の１５８位のアミノ酸残基を決定すること；
を含む、請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、
−生体サンプルからゲノムＤＮＡを取得すること；
−ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子または、アミノ酸残基１５８をコードするヌクレオチドを含むその部分を増幅すること；
−対立遺伝子特異的な制限部位を導入すること；
−制限部位に特異的な酵素で核酸を消化すること；および
−消化産物を分析すること、すなわち、電気泳動による、消化産物の存在が、対立遺伝子の存在を示す；
を含む、請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、インビトロまたはエクスビボで細胞または生体サンプルまたは生体流体からトータル（またはメッセンジャー）ＲＮＡを抽出すること、場合によりｃＤＮＡ合成、特異的ＦＣＧＲＩＩＩａオリゴヌクレオチドプライマーを用いる（ＰＣＲ）増幅、およびＰＣＲ産物の分析；を含む、請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体ポリペプチドまたは、アミノ酸残基１５８を含むその部分をシークエンシングする工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
対象者がヒト対象者である、請求項１〜２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
対象者が腫瘍を有する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
対象者が炎症性障害を有する、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
対象者が、乾癬を含む炎症性皮膚疾患；炎症性腸疾患（例えばクローン病および潰瘍性大腸炎）；成人呼吸促迫症候群；皮膚炎；ＣＮＳ炎症性障害、例えば多発性硬化症；ブドウ膜炎性障害；アレルギー性症状、例えば湿疹および喘息および、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症反応が関与する他の症状；皮膚過敏性反応（毒ヅタおよび毒ガシを含む）；自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、多発性硬化症、レイノー症候群、自己免疫性甲状腺炎、シェーグレン症候群、若年発症糖尿病、および、典型的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症および血管炎に認められるサイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される遅延型過敏症に関連する免疫応答；悪性貧血；敗血症または外傷に続発する多臓器損傷症候群；自己免疫性溶血性貧血；重症筋無力症；抗原抗体複合体が媒介する疾患；および移植片対宿主または宿主対移植片疾患を含むすべての種類の移植拒絶；からなる群から選択される障害を有する、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
治療用抗体がリンパ球の膜抗原に結合する、請求項１〜２９のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の治療処置に対する対象者の応答および／または副作用を評価または査定するための方法および組成物に関するものである。より具体的には、本発明は、対象者の応答および／または副作用を決定する方法または治療用抗体で処置される対象者についての処置プロトコルを適合させる方法を提供する。本発明は、膜抗原を標的にするように設計されているが、標的細胞を枯渇（deplete）させる必要がない抗体で処置される患者に関して使用することができ、その治療に対する治療応答の増加または減少を示す対象者を同定するか、あるいは副作用、特にサイトカイン放出症候群等の望ましくない副作用、の危険性の増加または減少を示す対象者を同定するのに適している。
【０００２】
導入
ヒトにおける種々の治療ストラテジーは治療用抗体の使用に基づき、前記抗体はその抗体の結合対象である細胞に対して枯渇性である必要はない。前記ストラテジーのいくつかは、膜受容体と拮抗（antagonize）するか、あるいはそれに作動（agonize）する抗体を使用すること、および／または膜抗原を標的にすることを目標にする。その目的は細胞機能のモデュレーションである。前記ストラテジーには広範囲の治療様式が包含され、それには、非限定的に、免疫細胞機能（例えばＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）をモデュレーションするストラテジー、炎症症状および／または自己免疫性障害を処置するストラテジー、抗腫瘍ストラテジー（例えば、抗ｅｒｂＢ１およびｅｒｂＢ２抗体、例えばトラスツズマブ（trastuzumab）、パーツズマブ（pertuzumab）およびＡＢＸ−ＥＧＦ；抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ抗体、抗ＣＤ３３抗体Mylotarg（登録商標））、および心疾患または抗血栓症に関する処置（例えばReoPro（登録商標））が含まれる。ほとんどすべての前記適用では、抗体は、重要な膜受容体と拮抗することによって作用するか、あるいは細胞内シグナル伝達を誘発すると考えられる。典型的に前記抗体は、ＩｇＧ種、典型的にはＩｇＧ４のモノクローナル抗体であり、長いインビボ半減期を有するよう、完全長抗体であるのが最も好ましい。それらは、炎症性障害、例えば乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病の処置において開発されることが多いが、例えば、Ｆｃ媒介性ＡＤＣＣ機構が必要とされない場合には、癌において使用することもできる（例えば、Mylotarg、腫瘍細胞を標的にするＡＢＸ−ＥＧＦ、またはＮＫ細胞を活性化する抗ＮＫｐ３０抗体を参照されたい）。ＩｇＧ４の優先的使用により、細胞溶解が妨げられ、一方、ＦｃＲｎ受容体との相互作用のおかげで長いインビボ半減期が維持される。したがって、エフェクターの動員が必要でない場合には、この免疫グロブリンサブクラスが一般に使用される。このような治療用抗体の具体例はＣＤＰ５７１（HumicadeTMとも称される）であり、これは抗ＴＮＦα ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。他のＩｇＧ４抗体の例には、関節リウマチの処置に使用されるクレノリキシマブ（clenoliximab）または多発性硬化症の処置に使用されるｃｈ５Ｄ１２、アセリズマブ（aselizumab）（ＨｕＤｒｅｇ５５）、ＩｇＧ４型の抗セレクチンＬ抗体、セデリズマブ（cedelizumab）ＯＫＴｃｄｒ４ａ、ヒト化（抗ＣＤ４）およびロベリズマブ（rovelizumab）Ｈｕ２３Ｆ２Ｇ（ヒト化（抗ＣＤ１１ａ））が含まれる。標的細胞を枯渇させる活性を有することを必要とされない抗体のさらに他の例は、ＮＫ細胞表面受容体を標的にすることによってＮＫ細胞をモデュレーションする抗体であり、例えば抗ＮＫＧ２Ｄ、抗ＮＫｐ３０、抗ＮＫｐ４６または抗ＮＫｐ４４または抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体である。しかしながら、細胞溶解活性を誘発する能力を有さないＩｇＧ１抗体を取得することが可能であり、例えばMason Uら（J Rheumatol. 2002; 29(2): 220-9）は、ＩｇＧ１型の抗ＣＤ４抗体が、実質的に溶解を誘発しない場合にのみ効力を有する例を提供する。その文献では、特定のＩｇＧ１抗体は枯渇活性をなくすことが可能であることを実証しているが、前記示唆に関して、特に溶解活性はグリコシル化状態に依���する可能性があるので、ＩｇＧ１ベースの製品の開発における危険性を強調している。
【０００３】
抗体は、種々の種または起源または特異性由来の機能性ドメインを含む組換え抗体（キメラ、ヒト化、霊長類化、「完全」ヒト、または任意の様式で修飾されている抗体、その修飾には、非限定的に、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合を低下させる修飾が含まれる）でありうる。また、Ｆｃ部分を含む融合タンパク質が想定される。
【０００４】
前記非枯渇性抗体（non-depleting antibodies）はヒトの治療に対する新規かつ標的特異的なアプローチであるが、常に強い効力を示すわけではなく、望ましくない副作用を示すことが多い。したがって、その対象者の応答の性質を評価することによってその使用を改良することができる。例えば、ある抗体は効力に関して標的細胞の枯渇を必要としないにもかかわらず、ある患者では枯渇性であることが示唆されている（Isaacs JD, Wing MG, Greenwood JD, Hazleman BL, Hale G, Waldmann H.「ヒトの標的細胞を枯渇させる治療用ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体（A therapeutic human IgG4 monoclonal antibody that depletes target cells in humans.）」Clin Exp Immunol. 1996 Dec;106(3):427-33）。この標的を枯渇させる作用は枯渇性が望ましくない適用においてその製品の効力を低下させるであろう；したがって、その患者が、異なる製品を用いて、あるいは異なる療法にしたがって処置することができるとすれば、前記枯渇作用は重要な治療上の意義を有しうることが予測される。
【０００５】
別の例では、枯渇性抗体（depleting antibodies）は、重篤なサイトカイン放出症候群を含め、サイトカイン放出症候群を生じさせることが多いと知られている。標的枯渇性であることを必要とされないか、あるいは意図されない抗体で処置される対象の患者における前記影響を予測することは治療上有用であろう。同様に、枯渇性抗体での処置対象である患者における前記影響を予測することも同じく非常に重要であろう。その目的は、例えば、サイトカイン放出症候群を減少させるか、あるいは予防するのに有効な前投薬を患者に施すことによって治療方式を修正することである。サイトカイン放出症候群を誘発することが示唆される枯渇性抗体の例には、CAMPATH 1-Hモノクローナル抗体（Wingら, 1996, J Clin Invest 98, 2819-2826）および抗ＣＤ２０抗体Mabthera（リツキシマブ（rituximab））が含まれ、この場合、サイトカイン放出症候群のせいであると推定される症状には、発熱および悪寒、潮紅、血管性浮腫（angiodema）、吐き気、じんま疹／発疹、低血圧および気管支痙攣（bronchiospasm）が含まれる（Committee for Proprietary Med. Prod. Europ. Public Assessment Report, CPMP/259/98, The Europ. Agency for the Evaluation of Med. Prod. (1998)）。
【０００６】
抗体での処置に対する患者の応答および／または副作用の評価を可能にする方法が利用可能であれば、治療の治療効力が大きく向上する。その理由は、処置の損益比を良好に評価することができ、処置を調整することができ、最終的に新規治療用製品を開発することができるからである。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、Ｆｃ部分を含む治療用組成物、好ましくは治療用抗体に対する対象者の治療応答を査定（評価）するための新規方法および組成物を提案する。好ましくは、該治療用抗体は、標的細胞を枯渇させる能力を有さないか、あるいはその能力を有することを必要とされない抗体であり、より好ましくは、ＡＤＣＣ媒介性の標的細胞の枯渇を誘発する能力を有さないか、あるいは誘発しないか、あるいはその能力を有することを必要とされない抗体である。好ましい例では、前記抗体はＩｇＧ４抗体である。他の例では、前記抗体は、ＡＤＣＣ−またはＡＤＣＰ媒介性の標的細胞の枯渇を誘発する能力を有さないか、あるいは誘発しないか、あるいはその能力を有することを必要とされないＩｇＧ４以外の抗体である。前記抗体は、標的の枯渇を実質的に誘発しないか、あるいは好ましくは、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位にフェニルアラニンを有する個体において標的の枯渇を誘発しないＩｇＧ４以外の抗体であってもよい。好ましくは、前記非ＩｇＧ４抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合性を低下させる、Ｆｃ領域中の１以上の修飾を含む。
【０００８】
好ましくは、前記対象者の治療応答とは、膜抗原が抗体の標的であるが、特にＡＤＣＣ−またはＡＤＣＰ機構を介する、標的細胞の枯渇が必要とされない障害の処置における効力に関するものである。前記処置対象の障害の好ましい例には、非限定的に、感染性疾患、免疫不全、例えば炎症性障害および自己免疫性障害、移植、癌、および心血管障害が含まれる。また一般に障害には、免疫応答が増強または阻害されうる任意の障害が含まれるであろう。例えば、ＮＫ細胞（例えば抗ＮＣＲまたは抗ＫＩＲ）またはＴ細胞（例えば抗ＣＴＬＡ４）を活性化する能力を有するが、標的ＮＫまたはＴ細胞の溶解を必要とせず、さらには回避しようとする抗体は、癌または感染症の処置または予防に使用することができる。他の例では、膜抗原ｅｒｂＢ１ ｅｔ ｅｒｂＢ２（トラスツズマブ、パーツズマブ、セツキシマブ（cetuximab）、ＡＢＸ−ＥＧＦ）を標的にし、拮抗する抗体は、抗増殖性または抗抗原性（anti-antiogenic）活性を介して作用し、したがって標的細胞の溶解、特にＡＤＣＣ機構を介する溶解を必要としない。別の例では、ＶＥＧＦ受容体を阻害するが、標的細胞の溶解を誘発しない抗ＶＥＧＦＲ抗体を探求してよい。その目的は、任意の内皮に対する潜在的損傷を回避し、炎症を回避し、潜在的血栓症を回避することである。好ましくは、対象者の治療応答は生理的経路のモデュレーションに関するものであり、より好ましくは、抗炎症性作用、抗増殖性作用、免疫応答の阻害または増強に関するものである。
【０００９】
本発明は、治療用抗体に対する対象者の副作用を査定するための新規方法および組成物をさらに提案する。前記抗体はそれが結合する細胞に対して非枯渇性であるものとし、あるいはさらに特には、抗体で覆われた細胞のＡＤＣＣ−またはＡＤＣＰ−による溶解を回避するものとする。副作用は、サイトカイン放出または望ましくないＡＤＣＣ−またはＡＤＣＰ活性が誘発された結果生じうる。また本発明は、治療用抗体での処置に対して最良の応答プロファイルを有する患者を選択する方法を提案する。また本発明は、治療用抗体で患者を処置する方法であって、患者の応答を評価する先行工程を含む方法に関する。また本発明は、本発明を実施するのに適している組成物およびキットに関する。同様に、対象者の応答を査定またはモニターするか、あるいは抗体の作用様式を検証するために、本発明を臨床試験または実験的設定で使用してよい。３クラスのＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩ）およびそれらのサブクラスはヒトの８個の遺伝子によってエンコードされ、それらすべては染色体１の長腕上に位置している。これらの遺伝子のいくつかは機能的な対立遺伝子の多型を示し、したがって種々の受容体特性を有するアロタイプが生じる。これらの遺伝的因子の１つはＦＣＧＲ３Ａ中の遺伝子二型性であり、それは成熟タンパク質のアミノ酸１５８位にフェニルアラニン（Ｆ）またはバリン（Ｖ）を有するＦｃγＲＩＩＩａをエンコードする（Koeneら, Blood. 1997;90:1109-1114; Wu Jら, J Clin Invest. 1997; 100: 1059-1070）。ヒトＩｇＧ４は、ホモ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆまたはヘテロ接合性ＮＫ細胞と比較して、ホモ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖナチュラルキラー細胞（ＮＫ）により強く結合することが実証されている（Koeneら, 1997）。
【００１０】
本発明が提供するのは、対象者の遺伝子型と、Ｆｃ部分を含む組成物、特に抗体での処置に応答するその能力の相関を利用して、実質的に非枯渇性であることを意図される前記治療用組成物での処置に対する対象者の応答および副作用感受性を予測することができることである。より具体的には、本発明が提供するのは、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の遺伝子型を利用して、非枯渇性であることを意図される、Ｆｃ部分を含む組成物、特に抗体での処置に対する対象者の応答および副作用感受性を予測することができることである。本明細書中でさらに記載されるように、任意の適切な様式によって、例えば患者のＤＮＡ中に存在するヌクレオチド配列を決定するか、あるいは患者のＦｃγＲＩＩＩａ受容体中に存在するアミノ酸を決定することによって、患者の遺伝子型を決定することができることが理解される。後者は、例えば患者の受容体の表現型またはアロタイプを決定するための標準的アプローチにしたがう。
【００１１】
より具体的には、本発明が提供するのは、対象者のＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位にバリンが存在すれば、効力の点で該処置に対する応答の減少を示し、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位にフェニルアラニンが存在すれば、該処置に対する応答の増加を示すことである。さらに、本発明が提供するのは、対象者のＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位にバリンが存在すれば、該処置に対する副作用またはその副作用に対する感受性の増加を示し、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位にフェニルアラニンが存在すれば、該処置に対する副作用またはその副作用に対する感受性の減少を示すことである。
【００１２】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位に存在するアミノ酸残基のアイデンティティー（identity）は、ＦＣＧＲ３Ａ ｃＤＮＡの５５９位またはＦＣＧＲ３ＡゲノムＤＮＡの４９８５位のヌクレオチドの一塩基多型に対応する。ゆえに、対象者の遺伝子型の決定は、対象者のＤＮＡ中に存在するヌクレオチドを決定するか、あるいはＦｃγＲＩＩＩａ受容体中に存在するアミノ酸残基を決定することによって、容易に実行することができる。
【００１３】
副作用は、特にＮＫ細胞および／またはマクロファージによるＡＤＣＣ−またはＡＤＣＰ媒介性の、サイトカイン放出の誘発またはＦｃγｒＩＩＩａ保持細胞の活性化の結果でありうる。放出されるサイトカインの例は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−６である。サイトカイン放出の症状には、非限定的に、発熱および悪寒、潮紅、血管性浮腫、吐き気、じんま疹／発疹、低血圧および気管支痙攣が含まれることが多い。
【００１４】
したがって、本発明は、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型と、非枯渇性であることを意図される、Ｆｃ部分を含む組成物、特に抗体に対する臨床応答および分子的応答の関連に基づく方法を提供する。好ましくは、その組成物は、関連または結合対象の細胞の細胞溶解活性、特にＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを誘発することを意図されないものである。ゆえに本発明は、前記抗体に対する患者の応答をモニター、評価または選択するために使用することができるマーカーを提供する。ゆえに本発明は、治療用抗体での処置、より具体的には実質的に非枯渇性の抗体、特にＩｇＧ４抗体による治療処置を用いる患者の管理において遺伝薬理学的アプローチを導入する。一局面では、実質的に非枯渇性の抗体は、免疫細胞、より好ましくはＢ細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面に存在する受容体に結合する抗体である。別の好ましい局面では、実質的に非枯渇性の抗体は、腫瘍細胞（tumoral cell）または内皮細胞の表面に存在する受容体に結合する抗体である；受容体の例には、非限定的に、腫瘍細胞上のｅｒｂＢ１およびｅｒｂＢ２、および内皮細胞上の細胞性ＶＥＧＦ−Ｒが含まれる。他の例または受容体は当技術分野において既知であり、ならびに／あるいは、表１に記載され、本明細書中でさらに記載される。
【００１５】
本発明の方法は広範囲のＦｃ部分含有組成物、特に治療用抗体を用いて実施できることが理解される。一般に、前記抗体またはＦｃ部分含有組成物は非枯渇性であることを意図され、好ましくはその関連または結合する細胞に対して細胞溶解活性、特にＡＤＣＣまたはＡＤＣＰ活性を実質的に誘発しないか、あるいは誘発しないことが意図される。例えば、治療用抗体はＩｇＧ４サブタイプの抗体でありうる。好ましくは、該治療用抗体は標的細胞上の膜抗原に特異的に結合し、例えば、その標的細胞には、非限定的に、腫瘍細胞、内皮細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球または／およびＮＫ細胞が含まれる。好ましい例では、該治療用抗体はＮＫ細胞活性化受容体（NK cell activatory receptor）に結合して、それを活性化する。別の例では、該治療用抗体はＮＫ細胞活性化受容体に結合し、それに対するリガンド結合を妨害するか、あるいはその機能を阻害する。別の例では、該治療用抗体はＮＫ細胞抑制性受容体に結合し、それに対するリガンド結合を妨害するか、あるいはその機能を阻害し、それによりＮＫ細胞を活性化するか、あるいはその活性化を増強する。別の例では、該治療用抗体はＮＫ細胞抑制性受容体に結合して、それを活性化し、それによりＮＫ細胞の活性化を阻害する。別の局面では、該Ｆｃ部分を含む組成物、特に抗体は、膜炎症誘発性サイトカインまたはリンパ球受容体に特異的に結合する。
【００１６】
好ましい態様では、本発明にしたがって処置される対象者は腫瘍等の障害を有する。別の例では、対象者は、別の増殖性疾患、例えば過剰増殖（hyperproliferative）症状、例えば過形成、線維症（特に肺線維症、加えて他の種類の線維症、例えば腎線維症）、血管形成、乾癬、アテローム性動脈硬化症および血管中の平滑筋増殖、例えば狭窄または血管形成術後の再狭窄を有する。別の例では、対象者は炎症性または好ましくは自己免疫性障害を有し、その障害の例には、非限定的に、マクロファージおよび好中性顆粒球（多形核白血球、ＰＭＮ）および／またはＴ細胞を含む食細胞によって媒介される障害が含まれる。その例には、炎症性皮膚疾患、例えば乾癬；炎症性腸疾患（例えばクローン病および潰瘍性大腸炎）に関連する応答；成人呼吸促迫症候群；皮膚炎；ＣＮＳ炎症性障害、例えば多発性硬化症；ブドウ膜炎性（uveitic）障害；アレルギー性症状、例えば湿疹および喘息および、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症反応が関与する他の症状；皮膚過敏性反応（例えば毒ヅタおよび毒ガシ）；自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、多発性硬化症、レイノー症候群、自己免疫性甲状腺炎、シェーグレン症候群、若年発症糖尿病、および、典型的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症および血管炎に認められるサイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される遅延型過敏症に関連する免疫応答；悪性貧血；敗血症または外傷に続発する多臓器損傷症候群；自己免疫性溶血性貧血；重症筋無力症（myethemia gravis）；抗原抗体複合体が媒介する疾患；すべての種類の移植拒絶、例えば移植片対宿主または宿主対移植片疾患が含まれる。
【００１７】
治療用抗体に関する本発明の任意の態様は、Ｆｃ部分を含む抗体である限り、完全抗体またはフラグメントまたは修飾型抗体に関するものでありうることが理解される。本明細書中でさらに考察されるように、種々のエフェクターおよび薬物動態学的特性を有する５種類のヒト免疫グロブリンＦｃ領域：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥがある。ＩｇＧは血清中の最も豊富な免疫グロブリンである。またＩｇＧは、任意の免疫グロブリンのうちで最長の血清中の半減期（２３日）を有する。他の免疫グロブリンとは異なり、ＩｇＧは、ＦｃＲｎと称される特定のＦｃ受容体に結合した後に効率的に再循環される。ＦｃＲｎは構造的および遺伝学的にＦｃγＲと無関係である。４種のＩｇＧサブクラスＧ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４があり、各サブクラスは種々のエフェクター機能を有する。Ｇ１およびＧ３はＣ１ｑと結合し、古典経路によって補体を活性化することができるが、一方、Ｇ２およびＧ４はそれができない。Ｇ３はＧ１より効率的にＣ１ｑと結合することができるが、補体主導の（complement-directed）細胞溶解を媒介する点ではＧ１がより効果的である。ＩｇＧ中のＣ１ｑ結合部位はＣＨ２ドメインのカルボキシ末端領域に位置する。すべてのＩｇＧサブクラスはＦｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４）に対する結合能を有し、Ｇ１およびＧ３はＧ２およびＧ４より効果的である。ＩｇＧのＦｃ受容体結合領域は、ＣＨ２ドメインのヒンジおよびカルボキシ末端領域の両方に位置する残基によって形成される。ＩｇＡは単量体およびＪ鎖によってまとめられる二量体の両形態で存在しうる。ＩｇＡは血清中の２番目に豊富なＩｇであるが、その半減期は６日しかない。ＩｇＡは３種のエフェクター機能を有する。それは、それぞれ食作用および脱顆粒に関連するマクロファージおよび好酸球上のＩｇＡ特異的受容体に結合し、その結果、抗菌活性および特に、例えば寄生虫に対する、細胞障害性が生じる。また、それは副経路を介して補体を固定することができる。特に好ましい態様では、本発明は、Ｇ４サブクラスのＦｃ領域（本明細書中ではＩｇＧ４とも称され、重鎖上の完全な一式の定常領域を参照する場合にはγ４アイソタイプとも称される）にしたがって実行される。
【００１８】
本発明では、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＦｃ部分のアナログ、または免疫グロブリンのＦｃ部分のフラグメントを含む任意のタンパク質を使用することができる。特に好ましい態様では、前記タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合されている関心の対象の（例えばＩｇのＦｃ部分以外の）タンパク質を含む。関心の対象のタンパク質は、Ｆｃ部分に直接融合させてもよいし、ペプチドリンカーを介して融合させてもよい。Ｆｃ部分は、その一端または両端で関心の対象のタンパク質に融合させてよい。これらの異種融合タンパク質は、生物学的活性を有し、関心の対象のネイティブタンパク質と比較して半減期が増加することが知られている。一例は、Ｆｃ部分に融合されているＴＮＦ−アルファ受容体タンパク質であり、例えばエタネルセプト（etanercept）（ENBREL（登録商標）, Amgen, USA）である。別の例は、ヒトＬＦＡ−３の第一細胞外ドメインに融合されているＩｇＧ１サブタイプのＦｃ領域を含む融合タンパク質であるアルファセプト（alfacept）（Amevive）、または好ましくは修飾型Ｆｃ（ＩｇＧ１）−ＬＦＡ−３または他のＦｃ−ＬＦＡ−３融合タンパク質であり、それは実質的に非枯渇性であるか、あるいは低下した枯渇活性を有する。好ましくは、治療用抗体に関して考察されるように、該融合タンパク質は、好ましくは、非枯渇性であることが意図され、好ましくは、それが関連または結合する細胞の細胞溶解活性、特にＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを誘発しないことが意図される。融合タンパク質によって媒介される活性を参照する場合、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰは、交換可能に、融合タンパク質依存的細胞媒介性細胞障害（ＦＰＤＣＣ）および融合タンパク質依存的細胞媒介性食作用（ＦＰＤＣＰ）と称することもできる。好ましくは、Ｆｃ部分は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対して相対的に低い結合性を有するサブタイプのＦｃ部分であるか、あるいはＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する結合性を減少させるように修飾される。
【００１９】
本発明の追加の対象は、ＩｇＧ４サブタイプのＦｃ部分を含むタンパク質での処置に対する対象者の応答を査定する方法であって、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基を決定することを含み、１５８位にバリンが存在すれば該処置に対する応答が低いことを示し、１５８位にフェニルアラニンが存在すれば該処置に対する応答が良好であることを示す、方法である。
【００２０】
本発明の別の対象は、Ｆｃ部分含有組成物、好ましくは抗体での処置に関して患者を選択する方法であり、該組成物は非枯渇性であることを意図され、好ましくはそれが関連または結合する細胞の細胞溶解活性、特にＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを誘発しないことを意図され、該方法はＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基を決定すること、および１５８位にフェニルアラニンを有する患者を該処置に関して選択することを含む。また該方法は、ＦＣＧ３Ａ ｃＤＮＡのヌクレオチド位置５５９またはＦＣＧ３Ａ遺伝子のヌクレオチド位置４９８５に存在するヌクレオチドを決定することによって実行することができる。好ましくは、該治療用抗体はＩｇＧ４である。
【００２１】
本発明の他の対象は、Ｆｃ部分を含む組成物、好ましくは抗体での処置に対する対象者の副作用を査定する方法であり、該組成物は非枯渇性であることを意図され、好ましくはそれが関連または結合する細胞の細胞溶解活性、特にＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを誘発しないことを意図され、該方法はＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基を決定することを含み、１５８位にバリンが存在すれば該処置に対する副作用が強いことを示し、１５８位にフェニルアラニンが存在すれば該処置に対する副作用が弱いことを示す。また該方法は、ＦＣＧ３Ａ ｃＤＮＡのヌクレオチド位置５５９またはＦＣＧ３Ａ遺伝子のヌクレオチド位置４９８５に存在するヌクレオチドを決定することによって実行することができる。
【００２２】
本発明の方法は、疾患の処置方法において特に有益に使用することができる。好ましくは、該ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の遺伝子型は該治療の結果を示す。一例では、本発明の方法を使用して、対象者に投与される治療用組成物の量および投与計画を決定する。別の例では、本発明の方法を使用して、対象者に投与される治療用組成物が選択される。該組成物は、例えば、抗体結合細胞のＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを誘発する可能性が低いか、あるいは免疫細胞によるサイトカイン放出を誘発する可能性が低い治療用組成物である。
【００２３】
対象者がＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位にバリンを有することが決定された場合、その対象者は副作用に対する感受性の増加および／または処置に対する応答の減少（例えば処置の有効性が低い）を示すと考えられる。このような対象者は、該対象者において高い効力を提供する可能性が高い組成物を用いるか、あるいはその可能性が高い療法にしたがって、より有益に処置してよい。このような患者により適切であろう組成物の例は、同一の生物学的標的タンパク質に特異的に結合する別の抗体と比較して、低いＡＤＣＣまたはＡＤＣＰ活性、またはＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する低い結合性を有する抗体化合物である。一局面では、Koeneら, Blood（1997）の方法を使用するか、あるいはBIAcore系（Okasaki Aら. J Mol Biol 2004, 336: 1239-1249）を使用して、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する抗体の結合性を査定することができる。別法では、該ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位にバリンを有する対象者に、種々の用量または投与計画で、好ましくは１５８位にフェニルアラニンを有する対象者より低用量で、共同（conjoint）処置（例えばサイトカイン放出症候群を処置または予防するための前投薬）を用いて抗体を投与する。好ましくは、該投与計画、投薬または化合物の選択は、抗体結合細胞の溶解の減少および／またはサイトカイン放出の減少を生じさせることを意図される。ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に結合する能力が減少している抗体は既知であり、方法にしたがって調製することができる。特定の態様では、例えばＦｃ受容体との相互作用を低下させることが知られるＦｃ領域内の特定の残基を変更するか、あるいはＦｃ受容体に対する結合性を減少させうるＦｃ領域内（またはＩｇ内の他の位置）のアミノ酸の変更を実験によって同定する周知の方法を使用することによって、Ｆｃ受容体との相互作用を低下させるアミノ酸修飾を抗体に含有させる。枯渇が所望でない抗体中のＩｇＧ１サブタイプ由来のＦｃ領域の場合、Shieldsら（J. Biol. Chem. 276:6591-6604）；ＰＣＴ公開公報（国際公開公報）第ＷＯ２００４／１２６７５０号）に記載されるように修飾を実行することができる。前記文献の開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００２４】
また本発明は、対象者をモニターまたは処置するための方法であって、
対象者のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型を決定すること、ここで、その遺伝子型は、Ｆｃ部分含有組成物、特に抗体での処置に応答する可能性の増加または減少と相関するか、あるいは該抗体での処置の結果としての副作用を有する可能性の増加または減少と相関する；および
処置に対する副作用の発生または抗体での処置の効力に関して対象者をモニターすること：
を含む方法を提供する。
【００２５】
本発明は、対象者を処置するための方法であって、
対象者のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型を決定すること、ここで、その遺伝子型は、Ｆｃ部分含有組成物での処置に対する応答の増加または減少と相関するか、あるいは該抗体での処置の結果としての副作用を示す可能性の増加または減少と相関する；および
対象者の処置に適した治療を選択または決定する工程こと；を含む方法をさらに提供する。好ましくは、対象者の処置に適した治療を選択または決定する工程は、対象者に投与される組成物を選択することを含む。他の局面では、対象者の処置に適した治療を決定することまたは決定する工程は、対象者に投与される治療用組成物の用量、投与の頻度またはその組成物での処置の持続時間を選択することを含む。好ましくは、本方法は、（ｃ）工程（ｂ）で選択された治療、好ましくは組成物を対象者に処方する工程をさらに含む。好ましくは、対象者に投与される組成物は、ＦｃγＲＩＩＩａポリペプチド、好ましくは１５８位にバリンを含むＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドに対して減少した結合性を有する抗体組成物である。
【００２６】
別の局面では、対象者が、Ｆｃ部分含有組成物、特に抗体での処置に応じて発生する副作用（例えばサイトカイン放出症候群）に対する感受性の増加を示すことが決定されるか、あるいは対象者が、Ｆｃ部分含有組成物、特に抗体での処置に対する応答（効力）の減少を示すことが決定された場合、該副作用を減少させること、または処置の効力を向上させること、例えばＮＫおよび／またはマクロファージによって媒介されるＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを阻害することが意図される処置をその患者に処方することができる。
【００２７】
試験組成物の査定および臨床試験
また本発明の方法は、Ｆｃ部分含有組成物、特に抗体での処置に対する対象者の治療応答または前記処置によって誘発される副作用に対する感受性を査定する臨床試験において有益に使用することができる。このような方法は、例えば臨床試験の１、２またはそれ以上の治療群が処置に対する応答の増加または減少を示す対象者の数に関してつり合っているかどうかを決定するのに有用であることが予測される。また本発明の方法を使用して、臨床試験への算入に関して対象者を選択することができる。本発明の方法は、試験組成物の効力または副作用が査定される臨床試験において特に有用であることが予測される。
【００２８】
臨床試験において本発明の方法を使用することは、試験組成物が抗体媒介性の副作用、特にＮＫ細胞またはマクロファージ媒介性の副作用、例えばサイトカイン放出症候群を誘発する能力を有することが既知であるか、あるいは疑われる場合、または試験組成物が、そのＦｃ領域を介して、ＦｃγＲＩＩＩａポリペプチド、好ましくは１５８位にバリンを含むＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドに結合すると疑われる場合に特に適している。
【００２９】
例えば、本発明の方法は、対象者のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型を決定することを含むことができ、この場合、該遺伝子型にしたがって、該対象者は臨床試験での処置または分析に関する亜群、または臨床試験への算入に関する亜群に入れられる。
【００３０】
一局面では、本発明は、試験組成物の臨床試験を行うための方法であって、下記工程を含む方法を提供する。
（ａ）試験組成物を複数の個体に投与する工程；および
（ｂ）第一のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型を有する１または複数の個体および第二のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型を有する１または複数の個体を同定する工程、好ましくはこの場合
第一のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型は、副作用に対する感受性の増加またはＦｃ部分含有組成物、特に抗体での処置に対する応答の減少を示し、
第二のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型は、副作用に対する感受性の減少またはＦｃ部分含有組成物、特に抗体での処置に対する応答の減少を示す。本方法は、場合により、（ａ）第一のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型を有する個体（群）の試験組成物に対する応答を査定すること；および／または（ｂ）第二のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型を有する個体群の試験組成物に対する応答を査定すること；をさらに含んでよい。好ましくは、該第一および該第二のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型を有する両個体群において該試験組成物に対する応答を査定する。好ましくは、該第一および第二の亜集団の個体群において別々に該応答を査定する。該試験組成物に対する応答の査定は、好ましくは、試験組成物の治療効力を査定することを含む。
【００３１】
また本発明は、試験組成物の臨床試験を行うための方法であって、下記工程を含む方法に関する。
−第一のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型を有する第一の個体集団および第二のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型を有する第二の個体集団を同定する工程；
−第一および／または第二の個体集団の個体に試験組成物を投与する工程。一態様では、該第一の集団の個体に試験組成物を投与し、該第二の集団の個体には投与しない。一態様では、該第二の集団の個体に試験組成物を投与し、該第一の集団の個体には投与しない。別の態様では、該第一および該第二の両集団の個体に試験組成物を投与する。好ましくは、試験組成物はＦｃ部分含有組成物、特に抗体である。
【００３２】
本明細書中に記載の対象者をモニターまたは処置する方法および臨床試験を行う方法では、Ｆｃ部分含有組成物は、好ましくは、非枯渇性であることを意図され、好ましくはそれが関連または結合する細胞の細胞溶解活性、特にＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを誘発しないことを意図される。最も好ましくは、Ｆｃ部分含有組成物はサブクラスＧ４のＦｃ領域を含む。
【００３３】
詳細な説明
本明細書中で使用される下記の用語は、特に記載しない限り、それらに帰属する意味を有する。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「抗体」とは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにそのフラグメントおよび誘導体を表す。抗体は、重鎖の定常ドメインの種類に応じて、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てられる。これらのうちのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、等のサブクラスまたはアイソタイプにさらに分けられる。典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含む。各四量体は２個の同一のペアのポリペプチド鎖から構成され、各ペアは１個の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および1個の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）とは、それぞれ前記軽鎖および重鎖を表す。種々のクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の定常ドメインは、それぞれ「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」および「ミュー」と称される。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元の立体配置は周知である。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは本発明で使用するのに好ましいクラスの抗体であり、ＩｇＧが特に好ましく、その理由は、それらが生理的状況において最も一般的な抗体であるからであり、それらが実験室設定で最も容易に作成できるからであり、また、ＩｇＧはＦｃガンマ受容体によって特異的に認識されるからである。好ましくは本発明の抗体はモノクローナル抗体である。特に好ましいのは、ヒト化、キメラ、ヒト、またはそれ以外のヒトに適している抗体である。
【００３５】
「治療用抗体」とは、例えば本明細書中に記載の治療方法に関して、ヒトにおいて安全に使用することができる任意の抗体、抗体の誘導体、または抗体フラグメントを表す。ヒトに適している抗体には、すべての種類のヒト化、キメラ、または完全ヒト抗体、または、抗体の少なくとも部分がヒト由来であるか、あるいはネイティブの非ヒト抗体が使用される場合に誘発される免疫応答を回避するように他の様式で修飾されている任意の抗体が含まれる。
【００３６】
本発明の目的では、「ヒト化」抗体とは、１以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が動物の免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合されている抗体を表す。このようなヒト化抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように設計される。
【００３７】
「キメラ抗体」とは、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、別のまたは変更されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域またはキメラ抗体に新規特性を付与する完全に異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物、等に連結されるように、定常領域、またはその部分が変更、置換または交換されているか；あるいは（ｂ）別のまたは変更された抗原特異性を有する可変領域を伴うように、可変領域、またはその部分が変更、置換または交換されている抗体分子である。本発明の好ましい態様では、キメラ抗体であっても、免疫グロブリンのＦｃ領域、好ましくはヒトＦｃ領域を維持し、それにより標的細胞の表面のヒトＦｃ受容体との相互作用が許容される。
【００３８】
用語「特異的に結合する」とは、好ましくは競合結合アッセイにおいて、抗体が結合パートナーに結合できることを意味し、その結合パートナーは、例えば、ＮＫ受容体、例えばＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２ＤまたはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、膜抗原、例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１１／１８、ＩＣＡＭ、アルファ−４−インテグリンまたはＣＴＬＡ４であり、その結合性は、組換え型のタンパク質、それに含まれるエピトープ、または、単離されたＮＫまたは関連標的細胞の表面に存在するネイティブタンパク質を使用して査定される。特異的結合性を測定するための競合結合アッセイおよび他の方法は以下でさらに記載され、また、当技術分野において周知である。
【００３９】
本明細書中で使用される「ＡＤＣＣ」または「抗体依存的細胞媒介性細胞障害」とは、ＦｃｙＲ、特にＦｃγＲＩＩＩａを発現する非特異的細胞障害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性の反応を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用される「ＡＤＣＰ」または「抗体依存的細胞媒介性食作用」とは、ＦｃｙＲ、特にＦｃγＲＩＩＩａを発現する非特異的細胞障害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の食作用を引き起こす、細胞媒介性の反応を意味する。
【００４１】
本明細書中の「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を意味する。本明細書中で好ましいアミノ酸修飾は置換である。
【００４２】
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」とは、そのネイティブ状態で認められる通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を表す。純度および均質性は、典型的に、分析化学技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーを使用して決定される。調製物中に存在する最も多数の種であるタンパク質は実質的に精製されている。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「生体サンプル」には、非限定的に、生体液（例えば血清、リンパ、血液）、細胞サンプルまたは組織サンプル（例えば骨髄）が含まれる。
【００４４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書中で交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを表す。この用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーにあてはまる。
【００４５】
「標識」または「検出可能部分」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで通常使用される酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンおよび、例えばペプチド内に放射性標識を組み込むことによって、検出可能にすることができるか、あるいはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するのに使用されるタンパク質が含まれる。
【００４６】
用語「組換え」とは、例えば細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸またはタンパク質の導入、またはネイティブ核酸またはタンパク質の変更によって修飾されていること、またはその細胞がそのように修飾されている細胞由来であることを示す。ゆえに、例えば、組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）型の細胞内で認められない遺伝子を発現するか、あるいは、さもなければ異常発現されるか、発現が低下するか、あるいは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
【００４７】
一例では、Ｆｃ部分を含む組成物、好ましくは治療用抗体またはＦｃ融合タンパク質は、免疫系の重要なサイトカインまたは受容体−リガンド相互作用をブロックまたは中和する。該抗体の治療活性は、ＮＫ細胞の細胞溶解活性およびＡＤＣＣ誘発を必要としないか、あるいはそれらに基づかない。治療用抗体はポリクローナルであってよく、あるいは、好ましくは、モノクローナルである。ハイブリドーマまたは、所望の可変および定常ドメインを発現するように操作されている組換え細胞によってそれらを産生させてよい。ハイブリドーマにおいて抗体を産生させるための方法は、例えば米国特許第６，６７７，１３８号およびＰＣＴ公開公報（国際公開公報）第ＷＯ００／５８４９９号において既知であり、前記文献の開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。抗体は、抗原特異性および少ないヒンジ領域またはそれらの変種を保持する単鎖抗体または他の抗体誘導体であってよい。これらは、多機能性抗体、組換え抗体、ＳｃＦｖ、ヒト化抗体、またはその変種であってよい。治療用抗体は表面抗原、例えば、膜抗原または遊離抗原に特異的である。好ましい局面では、治療用抗体は、膜結合型サイトカイン、例えばＴＮＦα、または細胞表面分子、例えばＴリンパ球またはＢリンパ球細胞表面分子、またはＮＫ受容体に特異的であってよい。膜結合型分子の例には、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＦｃγＲＩＩＩａまたはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１１／１８、ＩＣＡＭ、アルファ−４−インテグリンまたはＴリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４およびＣＤ１５２抗原としても知られる）が含まれる。別の好ましい態様では、移植拒絶、例えば移植片対宿主または宿主対移植片疾患の処置において抗体を使用し、その抗体は、例えば非枯渇性ＩｇＧ１抗ＣＤ２５抗体（例えばバシリキシマブ（basiliximab）およびダクリズマブ（daclizumab））、ＩｇＧ４型の抗ＣＤ２５抗体、Ｔ細胞共刺激受容体を阻害する抗体、抗ＣＤ２８抗体であり、この場合、Ｔ細胞枯渇および／またはＡＰＣ媒介性増殖が回避対象である。治療用抗体は、好ましくは、ＩｇＧ４型、またはＩｇＧ１型の抗体であり、アミノ酸修飾を含むか、あるいはＦｃγＲＩＩＩａに対する結合性の低下を示すように作成される。
【００４８】
本発明にしたがって使用される、標的細胞に対して枯渇性である必要がない治療用抗体の典型例を表１に列挙する。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
本発明に関連する範囲内では、対象者または患者には、任意の哺乳類の対象者または患者、より好ましくはヒト対象者または患者が含まれる。
【００５１】
ＮＫ細胞を調節する抗体
好ましい態様では、標的細胞に対して枯渇性であることを意図されないか、あるいは必要とされない治療用抗体は、ＮＫ細胞上の膜結合型分子に結合することによってＮＫ細胞の機能を調節する抗体である。ＮＫ細胞の活性は複雑な機構によって調節され、その機構には、刺激および抑制性シグナルの両者が関与する。したがって、ＮＫ細胞の活性化または増殖を誘発することを含む有効なＮＫ細胞媒介性の治療は、これらの細胞を刺激すること、または抑制性シグナルを中和することの両者によって達成することができる。このようなアプローチは、例えばＮＫ細胞が標的細胞の溶解を媒介するが、治療用抗体が結合するＮＫ細胞受容体がＮＫ細胞の溶解に寄与しない場合の腫瘍または感染症の処置において有用である。他の治療はＮＫ細胞活性の減少を標的にするものである。これらの治療には、抑制性ＮＫ細胞受容体の活性化または活性化ＮＫ細胞受容体のブロックが関与する可能性があり、免疫不全、例えば自己免疫性障害の処置または移植において有用であろう。
【００５２】
本明細書中で使用される「ＮＫ」細胞とは、通常の免疫ではない免疫に関与するリンパ球の亜集団を表す。ＮＫ細胞は、特定の特徴および生物学的特性に基づいて同定することができる。その特徴および特性は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＣＤ５６および／またはＣＤ５７を含む特別な表面抗原の発現、細胞表面のアルファ／ベータまたはガンマ／デルタＴＣＲ複合体の非存在、特別な細胞溶解性酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現しない細胞に結合して、それらを死滅させる能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞または他の病的細胞を死滅させる能力、および免疫応答を刺激または阻害する、サイトカインと称されるタンパク質分子を放出する能力である。当技術分野において周知の方法を使用してＮＫ細胞を同定するのに、任意のこれらの特徴および活性を使用することができる。
【００５３】
本発明に関連する範囲内では、「活性」または「活性化」ＮＫ細胞とは、生物学的に活性なＮＫ細胞、より具体的には、標的細胞を溶解する能力を有するＮＫ細胞を示す。例えば、「活性」ＮＫ細胞は、ＮＫ活性化受容体−リガンドを発現し、「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現しない細胞（ＫＩＲ不適合細胞）を死滅させることができる。リダイレクトキリング（redirected killing）アッセイでの使用に適している標的細胞の例は、Ｐ８１５およびＫ５６２細胞であるが、任意の多数の細胞型を使用することができ、それらは当技術分野において周知である（例えばSivoriら (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitaleら (1998) J. Exp. Med. 187: 2065-2072; Pessinoら (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neriら (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8: 1131-1135を参照されたい）。また「活性」または「活性化」細胞は、当技術分野において既知のＮＫ活性に関連する任意の他の特性または活性、例えばサイトカイン（例えばＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファ産生、遊離細胞内カルシウムレベルの増加）によって同定することができる。
【００５４】
ＮＫ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ特異的抑制性受容体によって負に調節される（Karreら, 1986; Ohlenら, 1989; その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる）。これらの特定の受容体は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子またはＨＬＡの多型決定因子に結合し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の溶解を阻害する。ヒトでは、キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ）と称される受容体ファミリーがＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の群を認識する。
【００５５】
本発明では、用語「ＮＫ細胞の抑制性受容体をブロックする抗体」とは、ＮＫ細胞抑制性受容体、すなわちＮＫ細胞のＫＩＲまたはＮＫＧ２Ａ／Ｃに特異的であり、ＫＩＲまたはＮＫＧ２Ａ／Ｃの抑制性シグナルを中和する化合物、好ましくは抗体またはそのフラグメントを表す。好ましくは、前記化合物、好ましくは抗体またはそのフラグメントは、ＨＬＡとＮＫ細胞の抑制性受容体の間の相互作用をブロックすることができる。前記抗体はポリクローナルであってよく、あるいは、好ましくは、モノクローナルである。ハイブリドーマまたは、所望の可変および定常ドメインを発現するように操作されている組換え細胞によってそれらを産生させてよい。前記抗体は、抗原特異性および少ないヒンジ領域またはそれらの変種を保持する単鎖抗体または他の抗体誘導体、例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲおよびＳｃＦｖであってよい。これらは、多機能性抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、またはそれらの変種であってよい。
【００５６】
好ましくは、ＮＫ細胞の抑制性受容体をブロックする抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｃからなる群から選択される少なくとも１種の抑制性受容体の抑制性シグナルを中和する抗体またはそのフラグメントである。場合により、ＧＬ１８３（ＫＩＲ２ＤＬ２、Ｌ３、Immunotech, FranceおよびBeckton Dickinson, USAから入手可能）；ＥＢ６（ＫＩＲ２ＤＬ１、Immunotech, FranceおよびBeckton Dickinson, USAから入手可能）；ＡＺ１３８（ＫＩＲ３ＤＬ１、Morettaら, Univ. Genova, Italyから入手可能）；Ｑ６６（ＫＩＲ３ＤＬ２、Immunotech, Franceから入手可能）；Ｚ２７０（ＮＫＧ２Ａ、Immunotech, Franceから入手可能）；Ｐ２５（ＮＫＧ２Ａ／Ｃ、Morettaら, Univ. Genova, Italyから入手可能）；およびＤＸ９、Ｚ２７（ＫＩＲ３ＤＬ１、Immunotech, FranceおよびBeckton Dickinson, USAから入手可能）からなる群から抗体を選択することができる。
【００５７】
本明細書中で使用される用語「活性化ＮＫ受容体」とは、刺激された場合に、当技術分野において既知のＮＫ活性に関連する任意の特性または活性、例えばサイトカイン（例えばＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファ産生、細胞内遊離カルシウムレベルの増加、または例えば本明細書中の別の箇所で記載されるリダイレクトキリングアッセイにおいて細胞を標的にする能力）の測定可能な増加を生じさせるＮＫ細胞の表面の任意の分子を表す。このような受容体の例には、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６として知られる天然細胞障害性受容体（natural cytotoxicity receptor）（ＮＣＲ）が含まれる。別の特に好ましい例はＮＫＧ２Ｄ受容体であり、これはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにガンマ−デルタＴ細胞上にも存在する。以下、ＮＫ細胞が活性であるか否かを決定する方法をさらに詳細に記載する。
【００５８】
ＮＫ細胞が媒介する認識およびＨＬＡクラスＩ欠損標的細胞の死滅において重要な役割を果たすいくつかの別のＮＫ特異的受容体が同定されている。ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４と称されるこれらの受容体はＩｇスーパーファミリーのメンバーである。特異的ｍＡｂによって誘発されるそれらの架橋は強いＮＫ細胞活性化を生じさせ、その結果、細胞内Ｃａ＋＋レベルの増加、細胞障害性の誘発、およびリンホカイン放出が生じる。重要なことに、ｍＡｂ媒介性のＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、および／またはＮＫｐ４４の活性化により、多数の種類の標的細胞に対するＮＫ細胞障害性が活性化される。これらの知見は、天然細胞障害性におけるこれらの受容体の中心的役割に関する証拠を提供するものである。
【００５９】
ＮＫ細胞受容体に対する抗体は当技術分野において既知の任意の諸技術によって作成してよい。典型的には、ＮＫ細胞の表面に存在する活性化受容体を含む免疫原で、ヒトではない動物、好ましくはマウスを免疫化することによってそれらを作成する。活性化受容体は、ＮＫ細胞全体または細胞膜、受容体、例えばＮＫｐ３０（例えばＰＣＴ ＷＯ０１／３６６３０を参照されたい、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、ＮＫｐ４４（例えばVitaleら (1998) J. Exp. Med. 187:2065-2072を参照されたい、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、またはＮＫｐ４６（例えばSivoriら (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136; Pessinoら (1998) J. Exp. Med. 188:953-960を参照されたい；それらの開示内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる）の完全長配列、またはそれらのフラグメントまたは誘導体、典型的には免疫原性フラグメント、すなわち、任意の前記受容体または、刺激されるとＮＫ細胞の活性化を誘発する任意の他の受容体を発現する細胞の表面で露出しているエピトープを含むポリペプチドの部分を含むであろう。前記フラグメントは、典型的に、成熟ポリペプチド配列の少なくとも７個の連続アミノ酸、さらにより好ましくはその少なくとも１０個の連続アミノ酸を含有する。それらは本質的に受容体の細胞外ドメイン由来である。細胞障害性、細胞内遊離カルシウムレベルの増加、サイトカイン産生、または当技術分野において既知の任意の他の方法によって測定される細胞の活性化を刺激に応じて誘発するＮＫ細胞の表面に存在する任意の受容体を抗体の作成に使用できることが理解される。好ましい態様では、抗体の作成に使用される活性化ＮＫ細胞受容体はヒト受容体である。
【００６０】
一態様では、免疫原は、脂質膜中、典型的には細胞の表面に野生型ヒトＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６ポリペプチドを含む。特定の態様では、免疫原は無傷のＮＫ細胞、特に無傷のヒトＮＫ細胞を含み、場合によりそれは処理または溶解されている。好ましい本発明の単離抗体の例には、本発明の少なくとも１種の単離されたアミノ酸化合物を指向し、標的細胞の存在下に１：１の割合で置かれたＮＫ細胞によって誘発される天然細胞障害性についての、少なくとも約４倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約６倍の増加を誘発することができる、単離された抗体が含まれる。特定の態様では、前記抗体は、次のモノクローナル抗体：ＡＺ２０、Ａ７６、Ｚ２５、Ｚ２３１、またはＢＡＢ２８１のいずれかと本質的に同一のエピトープに結合する。本明細書中では、このような抗体は「ＡＺ２０様抗体」、「Ａ７６様抗体」、等と称される。用語、モノクローナル抗体ｘと「実質的に同一のエピトープまたは決定基と結合」とは、抗体がｘと「競合できる」ことを意味し、ここで、ｘはＡＺ２０、Ａ７６、等である。問題のモノクローナル抗体と実質的に同一のエピトープに結合する１以上の抗体の同定は、抗体の競合を査定することができる種々の免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか１つを使用して容易に決定することができる。すべての前記アッセイは当技術分野において通常のアッセイである（例えば、参照により本明細書に明確に組み入れられる、１９９７年８月２６日発行の米国特許第５，６６０，８２７号を参照されたい）。問題のモノクローナル抗体と同一または実質的に同一のエピトープに結合する抗体を同定するために、抗体が結合するエピトープを実際に決定することは、いかなる意味においても、必要とされないことが理解される。
【００６１】
他の局面では、抗体は、ＮＫ細胞上の天然細胞障害性受容体（ＮＣＲ）または阻害剤受容体以外の分子に結合してよい。例えば、抗体は任意の他のＮＫ表面分子、例えば活性化分子、共刺激受容体または接着分子に結合してよく、その例には、非限定的に、ＮＫｐ８０、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＮＫＲＰ−１Ａ（ＣＤ１６１）、ＢＹ５５（ＣＤ１６０）、ＰＥＮ５（ＣＤ１６２Ｒ）、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）およびＣＤ３１が含まれる。
【００６２】
個体を分類するための方法
本発明では、用語、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子とは、対象者のＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドをコードする任意の核酸分子を表す。この用語には、特に, ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ（プレｒＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、等）、等または、その配列の全体または部分を含む任意の合成核酸が含まれる。合成核酸には、ｃＤＮＡが含まれ、それはＲＮＡから調製され、また、ＦＣＧＲ３ＡゲノムＤＮＡの配列の少なくとも部分、例えば１以上のイントロンまたは１以上の変異を含有する部分を含有する。最も好ましくは、用語、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子とは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを表し、典型的にはゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを表す。ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子は好ましくはヒトＦＣＧＲ３Ａ遺伝子または核酸であり、すなわち、ヒトＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドの配列を有するＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドの全体または部分をコードする核酸の配列を含む。このような核酸は、単離するか、あるいは既知の技術にしたがって調製することができる。例えば、ハイブリダイゼーション技術によって遺伝子ライブラリーまたはバンクからそれらを単離してよい。遺伝学的または化学的にそれらを合成することもできる。ヒトＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の遺伝子構成は図１に示される通りである。ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列は図２に示される通りである。アミノ酸位置１５８は成熟タンパク質の残基１から番号付けされていて、シグナルペプチドを有するプレタンパク質の残基１７６に相当する。野生型ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の配列は図３に示される通りである（Genbankアクセッション番号AL590385または部分配列に関するNM_000569も参照されたい）。
【００６３】
本発明に関連する範囲内では、部分（a portion or part）とは、少なくとも３ヌクレオチド（例えばコドン）、好ましくは少なくとも９ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドを意味し、また、１０００ヌクレオチドほども多数のヌクレオチドを含有することができる。このような部分は、当技術分野において周知の任意の技術、例えば酵素による切断および／または化学的切断、化学合成またはそれらの組み合わせによって取得することができる。明瞭にする目的で、アミノ酸位置１５８をエンコードするＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の部分の配列：
【００６４】
【表２】
2008500832.tif 000003
を示す。
【００６５】
本開示内容の全体にわたって示されるように、本発明は、対象者のＦＣＧＲ３Ａ １５８遺伝子型をインビトロで決定することを含む方法を含む。ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型の決定に関する本発明の任意の態様では、その表現型を決定すること、すなわちＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドの１５８位に存在する（か、あるいはコードされる）アミノ酸残基のアイデンティティーを決定することによって、その遺伝子型を容易に決定することが可能であることが理解される。ゆえに、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型の決定は、ＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドの１５８位に存在する（か、あるいはコードされる）アミノ酸残基のアイデンティティーを決定することを含むか、あるいはからなるものでありうる。
【００６６】
好ましくは、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位にバリンがホモ接合性で存在すれば、効力の点で該処置に対する応答の減少を示し、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位にフェニルアラニンが（ヘテロ接合性またはホモ接合性で）存在すれば、該処置に対する応答の増加を示す。抗体での処置に由来する副作用に関して、好ましくはＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位がバリンに関してホモ接合性であれば、副作用に対する感受性の増加を示し、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位にフェニルアラニンが存在すれば、該処置に対して、副作用または副作用に対する感受性の減少を示す。ゆえに、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位の遺伝子型が治療応答または副作用に対して与える影響は概して通常より強く特徴付けられ、その影響は、対象者が１５８位のバリンに関するホモ接合体である場合、処置に対する応答の減少および／または副作用の増加である。しかし、１５８位のフェニルアラニンに関してホモ接合性またはヘテロ接合性である対象者は処置に対して類似の応答を有し、１５８位のバリンに関してホモ接合性である患者での観察結果と比較して、これらの両群の応答は増加する。また、１５８位のフェニルアラニンに関してホモ接合性またはヘテロ接合性である対象者は抗体での処置に由来する副作用に関して類似していて、１５８位のバリンに関してホモ接合性である患者での観察結果と比較して、これらの両群の副作用に対する感受性は減少する。
【００６７】
該対象者のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子または対応するポリペプチドの遺伝子型の決定は、コーディング核酸分子またはコードされるポリペプチドの分析を含む種々の技術によって達成してよい。分析は、シークエンシング（配列決定）、移動、電気泳動、免疫技術、増幅、特異的消化またはハイブリダイゼーション、等を含んでよい。
【００６８】
特定の態様では、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定は、ＦＣＧＲ３Ａ受容体遺伝子またはＲＮＡまたは、アミノ酸残基１５８をコードするヌクレオチドを含むそれらの部分をシークエンシングする工程を含む。
【００６９】
他の特定の態様では、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定は、ＦＣＧＲ３Ａ受容体遺伝子またはＲＮＡまたは、アミノ酸残基１５８をコードするヌクレオチドを含むそれらの部分を増幅する工程を含む。例えば慣用の方法およびプライマーを使用する、単純ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはネストＰＣＲ（nested PCR）等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅を実施してよい。ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定に関して、核酸プライマーの開示を含む、好ましい遺伝子型決定方法は、Dall'Ozzo S, Andres C, Bardos P, Watier H, and Thibault G, J Immunol Methods. 2003 Jun 1;277 (1-2):185-92に提供されている。非限定的に、前記文献中で開示される特定のヌクレオチド配列を含めて、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００７０】
この関連で、本発明で使用される増幅プライマーは、より好ましくは約５０個未満のヌクレオチドを含有し、さらにより好ましくは３０個未満のヌクレオチドを含有し、典型的には約２５または２０個未満のヌクレオチドを含有する。また、好ましいプライマーは、特異性を確保するために、通常、少なくとも５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも８ヌクレオチドを含有する。プライマーの配列はＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の配列に基づいて調製することができ、好ましくは、それと完全相補性であることを許容するようにできる。任意の既知の技術、例えば放射能、蛍光、酵素、化学的技術、等を使用してプローブを標識してよい。この標識化では、例えばリン光体（Phosphor）３２、ビオチン（１６−ｄＵＴＰ）、ジゴキシゲニン（digoxygenin）（１１−ｄＵＴＰ）を使用することができる。本発明は特定の検出または標識化技術によって拘束または限定されるものではないことが理解されよう。プライマーは、以下に開示されるように、増幅された核酸に対立遺伝子特異的な制限部位を導入するための制限部位をさらに含んでよい。
【００７１】
このような増幅プライマーの具体例は、例えば、配列番号１〜４である。
【００７２】
当業者は、増幅工程で使用するための他のプライマー、例えばＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の任意の断片および特に、フォワード配列およびリバース配列を含むプライマーペアを設計することができ、ここで、該ペアの該プライマーはＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の領域とハイブリダイズし、コドン１５８を含有するＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の少なくとも部分の増幅を可能にすることが理解されよう。好ましい態様では、各プライマーペアは、コドン１５８に相補的で、オーバーラップする少なくとも１プライマーを含み、１５８Ｖ（ｇｔｔ）および１５８Ｆ（ｔｔｔ）を識別することを可能にする。また、当業者は、通常の一般的知識および本明細書中に含まれるガイダンスに基づいて増幅条件を調節してよい。
【００７３】
ゆえに特定の態様では、本発明の方法は、細胞または生体サンプル中で、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＦＣＧＲ３Ａ ｍＲＮＡまたはｇＤＮＡの部分をＰＣＲ増幅すること、ここで、該部分はコドン１５８を含み、および例えば電気泳動、特に変性ゲル勾配電気泳動（ＤＧＧＥ）によってＰＣＲ産物を直接または間接的に分析することを含む。
【００７４】
他の特定の態様では、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定は対立遺伝子特異的な制限酵素消化の工程を含む。この工程は特定の対立遺伝子（例えば１５８Ｖ対立遺伝子）のコード配列を切断するが、他の対立遺伝子（例えば１５８Ｆ対立遺伝子、またはその逆）を切断しない制限酵素を使用して実行することができる。このような対立遺伝子特異的な制限酵素部位が配列中に天然には存在しない場合、その配列中に前記部位を含有する対立遺伝子特異的増幅プライマーを用いて核酸を増幅することによって、それらを配列に人工的に導入してよい。増幅後、例えば電気泳動によって、消化産物を分析することによって対立遺伝子の存在の判定を実行してよい。また、この技術により、選択された対立遺伝子に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である対象者を識別することが可能になる。
【００７５】
対立遺伝子特異的増幅プライマーの例には、例えば配列番号３が含まれる。配列番号３はＮｌａＩＩＩ部位（５’−ＣＡＴＧ−３’）の最初の３ヌクレオチドを導入する。Ｇの後ろで切断が生じる。このプライマーは、制限部位を創出するヌクレオチド３１（Ａ）を除き、ＦＣＧＲ３Ａとハイブリダイズしない１１塩基（これは増幅産物の電気泳動による分析を容易にする目的でプライマーを伸張するものである）、およびＦＣＧＲ３Ａとハイブリダイズする２１塩基を含む。
【００７６】
別の特定の態様では、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定は、ＦＣＧＲ３Ａ受容体遺伝子またはＲＮＡまたは、アミノ酸残基１５８をコードするヌクレオチドを含むそれらの部分を、遺伝子型バリンまたはフェニルアラニンに特異的な核酸プローブとハイブリダイズさせる工程およびハイブリッドの存在または非存在を判定する工程を含む。
【００７７】
上記方法を、単独で、または種々の組み合わせで使用できることが理解されよう。さらにまた、当業者に既知の他の技術を同様に使用して、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８遺伝子型を決定してよい。他の技術は、例えば増幅（例えばＰＣＲ）、特異的プライマー、特異的プローブ、移動、等を使用する任意の方法、典型的には定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＴＭＡ（転写媒介性増幅）、ＰＣＥ（酵素増幅免疫アッセイ）およびｂＤＮＡ（分岐ＤＮＡシグナル増幅）アッセイである。
【００７８】
本発明の好ましい態様では、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定は、
−生体サンプルからゲノムＤＮＡを取得すること；
−ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子または、アミノ酸残基１５８をコードするヌクレオチドを含むその部分を増幅すること；および
−ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子の１５８位のアミノ酸残基を決定すること：
を含む。
【００７９】
上記のような特異的プライマーを使用するＰＣＲ、例えばネストＰＣＲ等の任意の特定技術を用いて、増幅を達成することができる。最も好ましい態様では、１５８位のアミノ酸残基の決定は、対立遺伝子特異的な制限酵素消化によって実施される。その場合、本方法は、
−生体サンプルからゲノムＤＮＡを取得すること；
−ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子または、アミノ酸残基１５８をコードするヌクレオチドを含むその部分を増幅すること；
−対立遺伝子特異的な制限部位を導入すること；
−制限部位に特異的な酵素で核酸を消化すること；および
−消化産物を分析すること、すなわち、電気泳動によって、消化産物が存在すれば、対立遺伝子の存在を示す：
を含む。
【００８０】
他の特定の態様では、遺伝子型は、インビトロまたはエクスビボで細胞または生体サンプルまたは生体流体からトータル（またはメッセンジャー）ＲＮＡを抽出すること、場合によりｃＤＮＡ合成、ＦＣＧＲ３Ａ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いる（ＰＣＲ）増幅、およびＰＣＲ産物の分析：を含む方法によって決定される。
【００８１】
また、本発明の方法は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体ポリペプチドまたは、アミノ酸残基１５８を含むその部分を直接シークエンシングすることによって、あるいはＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドの各対立遺伝子に特異的な試薬を使用して、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基を決定することを含んでよい。これは当業者に既知の任意の適切な技術によって決定することができ、その技術には、免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡ、等）が含まれる。それは、ＦｃγＲＩＩＩａ１５８ポリペプチドに特異的な任意の親和性試薬、より好ましくは任意の抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を使用して実施することができる。特定の態様では、ＦｃγＲＩＩＩａ１５８ＶとＦｃγＲＩＩＩａ１５８Ｆと間を識別する抗ＦｃγＲＩＩＩａ１５８抗体（またはそのフラグメント）、より好ましくはモノクローナル抗体を用いて、ＦｃγＲＩＩＩａ１５８ポリペプチドが検出される。任意の適切な方式（放射能、蛍光、酵素、化学的方式、等）によって抗体（または親和性試薬）を標識してよい。あるいは、例えば、抗ＦｃγＲＩＩＩａ１５８抗体に結合する、標識されている二次試薬（例えば抗体）を使用して、ＦｃγＲＩＩＩａ１５８抗体免疫複合体の存在を明らかにしてよい（ならびに／あるいは定量してよい）。
【００８２】
上記方法は対象者の生体サンプル中のＦＣＧＲ３Ａ１５８の遺伝子型の決定に基づくものである。生体サンプルは、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子または対応するポリペプチドを含有する任意のサンプルであってよく、特に血液、骨髄、リンパ節または、ＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子またはポリペプチドを含有する流体、特に血液または尿であってよい。さらにまた、ＦＣＧＲ３Ａ １５８遺伝子は、細胞、組織または上記流体中に一般に存在するものであるため、本発明の方法では、その遺伝子またはポリペプチドを検出または分析で利用可能にするように処理されているサンプルを通常使用する。処理は、任意の慣用の固定化技術、細胞溶解（機械的または化学的または物理的）、または例えば免疫組織学または生物学で使用される任意の他の慣用の方法を含んでよい。
【００８３】
本方法は治療用抗体での処置に対する対象者の応答を決定するのに特に適している。この関連で、特定の態様では、対象者は障害を有し、治療用抗体での処置はその障害の改善を目的にする。この場合、抗体はそれが結合する細胞に対して枯渇性である必要がない。抗体の膜標的は上で考察される通りである。
【００８４】
以下の実施例では、本発明の別の局面および利点が開示される。本実施例は例示とみなされるべきであり、本出願の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【００８５】
実施例１
ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型の遺伝子型決定
材料および方法
ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ／Ｆ遺伝子型決定
すべてのサンプルの分析を同一の実験室で行い、標準的手順を使用してＤＮＡを抽出する。その手順には、相互汚染を回避するための予防策が含まれる。ＤＮＡは末梢血、骨髄またはリンパ節から単離することができる。ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型の遺伝子型決定は、Koeneら（Koeneら, Blood. 1997;90:1109-1114）によって記載されるように、ネストＰＣＲ、その後の対立遺伝子特異的な制限酵素消化を用いて実施する。簡単には、２種のＦＣＧＲ３Ａ特異的プライマー
【００８６】
【表３】
2008500832.tif 000004
（Eurobio, Les Ulis, France）を使用して、多型部位を含有する１．２kb断片を増幅する。
【００８７】
ＰＣＲアッセイは、１．２５μgのゲノムＤＮＡ、２００ngの各プライマー、２００μmol/Lの各ｄＮＴＰ（MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania）および１UのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega, Charbonniere, France）を製造元の推奨にしたがって用いて実施する。この第一のＰＣＲは、９５℃で１０分、次いで３５サイクル（各サイクルは９５℃で１分、５７℃で１．５分、７２℃で１．５分の３段階からなる）および完全伸張を達成するための７２℃で８分である。プライマー
【００８８】
【表４】
2008500832.tif 000005
（Eurobio）を使用する第二のＰＣＲでは、９４bp断片を増幅し、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ対立遺伝子においてのみ、ＮｌａＩＩＩ制限部位を創出する。
【００８９】
このネストＰＣＲは、１μLの増幅ＤＮＡ、１５０ngの各プライマー、２００μmol/Lの各ｄＮＴＰおよび１UのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施する。第一のサイクルは９５℃で５分であり、次いで３５サイクル（各サイクルは９５℃で１分、６４℃で１分、７２℃で１分の３段階からなる）を行い、そして７２℃で９．５分で伸張を完了する。次いで、１０UのＮｌａＩＩＩ（New England Biolabs, Hitchin, England）を用いて、３７℃で１２時間、増幅ＤＮＡ（１０μL）を消化し、８％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離する。臭化エチジウムで染色した後、紫外光でＤＮＡバンドを可視化する。ホモ接合性ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆ患者では、未消化の１つのバンド（９４bp）のみが見られる。ヘテロ接合性個体では３つのバンド（９４bp、６１bpおよび３３bp）が観察されるが、ホモ接合性ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ患者では、消化された２つのバンド（６１bpおよび３３bp）しか得られない。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１はヒトＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の遺伝子構成である。
【図２】図２はヒトＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆのアミノ酸配列（配列番号７）である。
【図３】図３はヒトＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆの核酸配列（配列番号８）である。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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