(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの第一脂質成分、少なくとも１つの第一ヘルパー脂質、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で脂質組成物から除去できる遮蔽化合物を含む、脂質組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの第一脂質成分、
少なくとも１つの第一ヘルパー脂質、および
ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で脂質組成物から除去できる遮蔽化合物
を含む、脂質組成物。
【請求項２】
前記遮蔽化合物が、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）、およびポリプロポレンを含む群より選択される、請求項１に記載の脂質組成物。
【請求項３】
前記遮蔽化合物が、ＰＥＧ２０００またはＰＥＧ５０００である、請求項２に記載の脂質組成物。
【請求項４】
前記組成物が、さらなる構成および／または第二ヘルパー脂質を含む、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項５】
前記脂質組成物が、核酸を含み、それにより該核酸が、好ましくは前記さらなる構成である、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項６】
前記核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）を含む群より選択される、請求項５に記載の脂質組成物。
【請求項７】
前記遮蔽化合物が、ＰＥＧとセラミドとのコンジュゲートである、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項８】
前記セラミドが、少なくとも１つの６〜１０の炭素原子、好ましくは８の炭素原子の短い炭素鎖置換基を含む、請求項７に記載の脂質組成物。
【請求項９】
前記セラミドが、第一ヘルパー脂質である、請求項７〜８のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項１０】
前記セラミドが、第二ヘルパー脂質である、請求項７〜８のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項１１】
前記遮蔽化合物が、前記核酸へ結合される、請求項５〜６のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項１２】
前記遮蔽化合物が、リンカー部分によって前記核酸に結合され、好ましくはリンカー部分によって前記核酸に共有結合される、請求項１１に記載の脂質組成物。
【請求項１３】
前記リンカー部分が、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ペプチド、Ｓ−Ｓリンカー、およびｐＨ感受性リンカーを含む群より選択される、請求項１２に記載の脂質組成物。
【請求項１４】
前記核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｉＮＡを含む群より選択され、前記リンカーが、センス鎖の３’末端に結合される、請求項１１〜１３のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項１５】
前記遮蔽化合物が、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分を含む、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項１６】
前記リンカーまたは部分が、陰イオン性リンカーまたは陰イオン性部分である、請求項１５に記載の脂質組成物。
【請求項１７】
前記陰イオン性リンカーまたは陰イオン性部分が、酸性環境においてほとんど陰イオン性または中性ではなく、それにより好ましくは該酸性条件がエンドソームである、請求項１６に記載の脂質組成物。
【請求項１８】
前記ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分が、オリゴ（グルタミン酸）、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢酸を含む群より選択される、請求項１５〜１７のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項１９】
前記第一脂質成分が、式（Ｉ）
【化１】
2008525514.tif 000009
（式中、Ｒ１およびＲ２は、アルキルを含む群より各々独立して選択され、
ｎは、１〜４の任意の整数であり、
Ｒ３は、リジル、オルニチル、２，４−ジアミノブチリル、ヒスチジル、および式（ＩＩ）
【化２】
2008525514.tif 000010
（式中、ｍは、１〜３の任意の整数であり、場合によりＮＨ３＋を欠き、そしてＹは、薬学的に許容される陰イオンである。）に記載のアシル部分を含む群より選択されるアシルである。）
に記載の化合物である、請求項１〜１８のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２０】
Ｒ１およびＲ２が、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、およびオレイルを含む群より各々独立して選択される、請求項１９に記載の脂質組成物。
【請求項２１】
Ｒ１が、ラウリルであり、Ｒ２が、ミリスチルであるか、または
Ｒ１が、パルミチルであり、Ｒ２が、オレイルである、請求項１９および２０のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２２】
ｍが、１または２である、請求項１９〜２１のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２３】
前記化合物が、好ましくは陰イオンＹ−と会合した陽イオン性脂質である、請求項１９〜２２のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２４】
Ｙ−が、ハロゲニド、アセテート、およびトリフルオロアセテートを含む群より選択される、請求項１９〜２３のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２５】
前記化合物が、
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド
【化３】
2008525514.tif 000011
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド
【化４】
2008525514.tif 000012
ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド
【化５】
2008525514.tif 000013
を含む群より選択される、請求項１９〜２４のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、担体を含む、請求項１〜２５のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２６のうちのいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に活性のある化合物と、好ましくは薬学的に許容され得る担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項２８】
前記薬学的に活性のある化合物および／または前記さらなる構成体が、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸を含む群より選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記タンパク質が、抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびＬＮＡを含む群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記核酸が、機能的核酸であり、それにより、好ましくは前記機能的核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピゲルマーを含む群より選択される、請求項２８または３０のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
好ましくは、前記第一および／または前記第二ヘルパー脂質が、セラミドとは異なるという条件のもとで、前記第一ヘルパー脂質および／または第二ヘルパー脂質が、リン脂質およびステロイドを含む群より選択される、請求項１〜３１のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第一および／または第二ヘルパー脂質またはヘルパー脂質成分が、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンおよび１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンを含む群より選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ヘルパー脂質成分の含有量が、前記組成物の全体的な脂質含有量の約２０〜約８０モル％である、請求項３２〜３３のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ヘルパー脂質成分の含有量が、約３５〜約６５モル％である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記脂質が、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドであり、前記ヘルパー脂質が、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンである、請求項３３〜３５のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記脂質が、前記組成物の全体的な脂質含有量の５０モル％であり、前記ヘルパー脂質が、５０モル％である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物が、さらに第二ヘルパー脂質を含む、請求項４〜３７のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記第一および／または前記第二ヘルパー脂質が、ＰＥＧ部分、ＨＥＧ部分、ポリヒドロキシエチルスターチ（ｐｏｌｙＨＥＳ）部分及びポリプロピレン部分を含む群より選択される群を含み、該部分が、好ましくは約５００〜１００００Ｄａの、より好ましくは約２０００〜５０００Ｄａの分子量を与える、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
ＰＥＧ部分を含む前記ヘルパー脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンおよび１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンを含む群より選択される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ヘルパー脂質の前記ＰＥＧ部分が、２，０００〜５，０００Ｄａの分子量を、好ましくは２，０００Ｄａの分子量を有する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物が、脂質成分としてβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドを、第一ヘルパー脂質として１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンを、および第二ヘルパー脂質として１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン−ＰＥＧ２０００を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記第二ヘルパー脂質の含有量が、約０．０５〜４．９モル％、好ましくは約１〜２モル％である、請求項３８〜４２のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記組成物が、約１〜１０モル％の、より好ましくは１〜７．５モル％の、および最も好ましくは１〜５モル％のＰＥＧおよび前記セラミドのコンジュゲートを含有する、請求項７〜１０および請求項１５〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記セラミドが、Ｃ８ｍであり、ＰＥＧが、ＰＥＧ２０００であり、ＰＥＧと前記セラミドとのコンジュゲートの含有量が、約１〜７．５モル％である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記セラミドが、Ｃ８ｍであり、ＰＥＧが、ＰＥＧ５０００であり、ＰＥＧと前記セラミドとのコンジュゲートの含有量が、約１〜５モル％である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
前記第一脂質成分の含有量が、約４２．５〜５０モル％であり、前記第一脂質の含有量が、約４２．５〜５０モル％であり、それにより、前記第一脂質成分、前記第一ヘルパー脂質、ならびにＰＥＧとセラミドとのコンジュゲートの含有量の合計が、１００モル％である、請求項４３〜４５のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記機能的核酸が、二本鎖リボ核酸であり、前記組成物がさらに、核酸を、好ましくは、より好ましくは二本鎖リボ核酸である機能的核酸を、最も好ましくは、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、およびリボザイムを含む群より選択される核酸であり、それにより好ましくは、陽イオン性脂質に対するＲＮＡｉのモル比が、約０〜０．０７５であり、好ましくは約０．０２〜０．０５であり、さらにより好ましくは０．０３７である、請求項１〜４７のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記第一脂質成分および／または前記ヘルパー脂質の少なくとも一つおよび／または前記遮蔽化合物が、水性媒体中の分散物として存在する、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記第一脂質成分および／または前記ヘルパー脂質の少なくとも一つおよび／または前記遮蔽化合物が、水混和性溶媒中の溶液として存在し、それにより好ましくは、前記溶媒が、エタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールを含む群より選択される、請求項１〜４８のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
薬物の製造のための、請求項１〜５０のうちのいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項５２】
転移剤としての、請求項１〜５０のうちのいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項５３】
前記転移剤が、薬学的に活性のある成分および／またはさらなる構成体を細胞、好ましくは哺乳類細胞、およびより好ましくはヒト細胞に転移させる、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
下記工程：
−  細胞または膜を提供すること、
−  請求項１〜５０のうちのいずれか一項に記載の組成物を提供し、それにより前記組成物が前記薬学的に活性のある化合物および／または前記さらなる構成体を含むこと、および
前記細胞または前記膜を、請求項１〜５０のうちのいずれか一項に記載の組成物と接触させること
を含む、薬学的に活性のある化合物および／またはさらなる構成体を前記細胞内にか、または前記膜、好ましくは細胞膜を横切って転移させるための方法。
【請求項５５】
前記方法が、さらなる工程として、前記薬学的に活性のある化合物および／または前記さらなる構成体を前記細胞中でおよび／または前記膜を越えて検出することを含む、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陽イオン性脂質、それを含有する組成物およびその使用、および化合物を細胞へと転移させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学も分子医学も、生物活性のある化合物の細胞への導入に重度に依存する。このような生物活性のある化合物は典型的に、とりわけ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにペプチドおよびタンパク質を各々含む。克服すべき遮蔽は典型的には、負に荷電した外側表面を有する脂質二重層である。当技術分野において、多くの技術が、細胞膜を貫通し、したがって生物活性のある化合物を導入するために開発されてきた。しかしながら、研究室での使用のために考えられたいくつかの方法は、医療分野で使用できず、特に薬物送達に適していない。例えば、当技術分野で公知の電気穿孔法および衝撃法は、仮にあったとしても、生物活性のある化合物の局所的な送達ができるのみであろう。該脂質二重層は別として、細胞膜は、トランスポーターシステムも含む。したがって、細胞膜を横切って生物活性のある化合物を転移させるために、トランスポーターシステムのこの種を使用する尽力試みが始まっている。しかしながら、このようなトランスポーターシステムの特異性または交差反応性により、それらの使用は、一般に適用可能な方法ではない。
【０００３】
生物活性のある化合物を細胞へ転移させるための、当技術分野で記載のより一般的に適用可能なアプローチは、ウィルスベクターの使用である。しかしながら、ウィルスベクターは、遺伝子をいくつかの細胞タイプへと効率よく転移させるためにのみ使用され得るが、それらは、化学合成された分子を細胞へ導入するためには使用され得ない。
【０００４】
代替的なアプローチは、いわゆるリポソームの使用であった（Bangham, J. MoI. Biol. 13, 238- 252）。リポソームは、水中での両親媒性脂質の会合に基づいて生じる小胞である。リポソームは典型的に、リン脂質の同心に配置される二重層を含む。層の数に依存して、リポソームは、小さな単層小胞、多層小胞、および大きな多層小胞として分類され得る。リポソームが、親水性化合物を水性中間層へ組み込むことができる一方、疎水性化合物が脂質層へ組み込まれるため、リポソームは、有効な送達剤であると立証してきた。脂質製剤の組成およびその調製方法の両者が、結果として生じる脂質凝集体の構造および大きさに及ぼす影響を有し、したがってリポソームに及ぼす影響を有することは、当技術分野において周知である。リポソームは、陽イオン性脂質を組み込むことも公知である。
【０００５】
陽イオン性脂質は、リポソームの成分であることは別として、それ自体が生体高分子の細胞送達に使用され得ることから、相当の注目を引いた。陽イオン性脂質を使用して、いずれかの陰イオン性化合物は、静電気的な相互作用による定量的な方法で実質的に封入され得る。さらに、陽イオン性脂質は負に荷電した細胞膜を相互作用し、細胞膜輸送を開始すると考えられている。通常、血清のない場合に、各製剤が、すべてではないがいくつかの細胞タイプにプラスミドを典型的に送達できるため、各製剤の用途が制限されると、陽イオン性脂質を含有するリポソーム製剤の用途または生物活性のある化合物と一緒の陽イオン性脂質それ自体の用途は、発見的なアプローチを必要とする。
【０００６】
脂質および脂質によって輸送される生物活性のある化合物の電荷および／または質量比は、該生物活性のある化合物の異なるタイプの送達において決定的な因子であることがわかってきた。例えば、大きさで５，０００〜１０，０００塩基を含むプラスミド送達に適した脂質製剤は、一般に、約１０〜約５０塩基を典型的に含む合成リボザイムまたはアンチセンス分子などのオリゴヌクレオチドの送達に効果的ではない。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムについての最適な送達条件は、同一の細胞タイプにおいてさえ異なることが最近示されてきた。
【０００７】
米国特許第６，３９５，７１３号は、親油基、リンカー、および頭部基から典型的になる陽イオン性脂質ベースの組成物、および生物活性のある化合物を細胞へ転移させるためのこのような組成物の使用を開示する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の根元的な問題は、生物活性のある化合物を細胞に、好ましくは動物細胞に導入するための手段を提供することであった。本発明の根元的なさらなる問題は、核酸、特にｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、およびＲＮＡｉまたはアプタマーなどの小さな核酸、およびスピゲルマーについての送達剤を提供することである。
【０００９】
本発明の根元的ななおもさらなる問題は、ｉｎ  ｖｉｖｏでより長い循環時間を提供する一方で、良好なトランスフェクション特徴および送達特徴を有する送達剤を提供することである。
【００１０】
これらの問題は、上述の独立した請求項の対象事項によって解決される。好ましい態様は、上述の請求項から選ぶことができる。
【００１１】
本発明の根元的な問題は、第一の局面において、
少なくとも１つの第一脂質成分、
少なくとも１つの第一ヘルパー脂質、および
ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で脂質組成物から除去できる遮蔽化合物
を含む前記脂質組成物によっても解決される。
【００１２】
第一の局面の態様において、遮蔽化合物は、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）、およびポリプロポレンを含む群より選択される。
【００１３】
第一の局面の好ましい態様において、遮蔽化合物は、ＰＥＧ２０００またはＰＥＧ５０００である。
【００１４】
第一の局面の態様において、組成物は、さらなる構成体および／または第二ヘルパー脂質を含む。
【００１５】
第一の局面の態様において、脂質組成物は、核酸を含み、それによりこのような核酸は好ましくは、さらなる構成体である。
【００１６】
第一の局面の好ましい態様において、核酸は、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピゲルマーを含む群より選択される。
【００１７】
第一の局面の態様において、遮蔽化合物は、ＰＥＧとセラミドのコンジュゲートである。第一の局面の好ましい態様において、セラミドは、６〜１０個の炭素原子からなる、好ましくは８個の炭素原子からなる少なくとも一つの短い炭素鎖置換基を含む。
【００１８】
第一の局面の態様において、セラミドは、第一ヘルパー脂質である。
【００１９】
第一の局面の代替的な態様において、セラミドは、第二ヘルパー脂質である。
【００２０】
第一の局面の態様において、遮蔽化合物は、核酸に結合される。
【００２１】
第一の局面の好ましい態様において、遮蔽化合物は、リンカー部分によって核酸に好ましくは共通結合されるリンカー部分によって核酸に結合される。
【００２２】
第一の局面のより好ましい態様において、リンカー部分は、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ペプチド、Ｓ−Ｓリンカー、およびｐＨ感受性リンカーを含む群より選択される。
【００２３】
第一の局面の好ましい態様において、核酸は、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｉＮＡを含む群より選択され、リンカーは、センス鎖の３’末端に結合される。
【００２４】
第一の局面の好ましい態様において、遮蔽化合物は、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分を含む。
【００２５】
第一の局面の好ましい態様において、リンカーまたは部分は、陰イオン性リンカーまたは陰イオン性部分である。
【００２６】
第一の局面のより好ましい態様において、陰イオン性リンカーまたは陰イオン性部分は、酸性環境においてほとんど陰イオン性または中性ではなく、それにより好ましくは該酸性条件がエンドソームである。
【００２７】
第一局面の態様において、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分は、オリゴ(グルタミン酸)、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミンペンタ酢酸を含む群より選択される。
【００２８】
第一の局面のある態様において、第一脂質成分は、式（I）
【化６】
2008525514.tif 000002
（式中、Ｒ１およびＲ２は、アルキルを含む群より各々独立して選択され、
ｎは、１〜４の任意の整数であり、
Ｒ３は、リジル、オルニチル、２，４−ジアミノブチリル、ヒスチジル、および式（ＩＩ）
【化７】
2008525514.tif 000003
（式中、ｍは、１〜３の任意の整数であり、場合により、ＮＨ３＋を欠き、Ｙ−は、薬学的に許容され得る陰イオンである。）に記載のアシル部分を含む群より選択されるアシルである。
に記載の化合物である。
【００２９】
第一の局面の好ましい態様において、Ｒ１およびＲ２は、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、およびオレイルを含む群より各々独立して選択される。
【００３０】
第一の局面のより好ましい態様において、Ｒ１はラウリルであり、Ｒ２はミリスチルであるか、または
Ｒ１はパルミチルであり、Ｒ２はオレイルである。
第一の局面のより好ましい態様において、第一局面のｍは、１または２である。
【００３１】
第一の局面のより好ましい態様において、化合物は、好ましくは陰イオンＹ−と会合した陽イオン性脂質である。
【００３２】
第一の局面のより好ましい態様において、Ｙ−は、ハロゲニド、アセテート、およびトリフルオロアセテートを含む群より選択される。
【００３３】
第一の局面のより好ましい態様において、化合物は、
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド
【化８】
2008525514.tif 000004
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド
【化９】
2008525514.tif 000005
ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド
【化１０】
2008525514.tif 000006
を含む群より選択される。
【００３４】
第一の局面のより好ましい態様において、組成物は、担体を含む。
本発明の根元的な問題は、第二の局面において、第一の局面に従った組成物と、薬学的に活性のある化合物と、好ましくは薬学的に許容され得る担体とを含む薬学的組成物によっても解決される。
【００３５】
第二の局面の態様において、薬学的に活性のある化合物および／またはさらなる構成体は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸を含む群より選択される。
【００３６】
第二の局面の好ましい態様において、タンパク質は、抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００３７】
代替的な好ましい態様において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびＬＮＡを含む群より選択される。
【００３８】
第二の局面の好ましい態様において、核酸は、機能的核酸であり、それにより好ましくは機能的核酸は、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピゲルマーを含む群より選択される。
【００３９】
第一および第二の局面の態様において、好ましくは第一および／または第二ヘルパー脂質がセラミドとは異なるという条件のもとで、第一ヘルパー脂質および／または第二ヘルパー脂質は、リン脂質およびステロイドを含む群より選択される。
【００４０】
第一および第二の局面の好ましい態様において、第一および／または第二ヘルパー脂質またはヘルパー脂質成分は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンおよび１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンを含む群より選択される。
【００４１】
第一および第二の局面のより好ましい態様において、ヘルパー脂質成分の含有量は、組成物の全体的な脂質含有量の約２０〜約８０モル％である。
【００４２】
第一および第二の局面のさらにより好ましい態様において、ヘルパー脂質成分の含有量は、約３５〜約６５モル％である。
【００４３】
第一および第二の局面の態様において、脂質は、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドであり、ヘルパー脂質は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンである
【００４４】
第一および第二の局面の好ましい態様において、脂質は、組成物の全体的な脂質含有量の５０モル％であり、ヘルパー脂質は、５０モル％である。
【００４５】
第一および第二の局面の態様において、組成物は、第二ヘルパー脂質をさらに含む。
【００４６】
第一および第二の局面の態様において、第一および／または第二ヘルパー脂質は、ＰＥＧ部分、ＨＥＧ部分、ポリヒドロキシエチルスターチ（ｐｏｌｙＨＥＳ）部分及びポリプロピレンを含む群より選択される記を含み、該部分は好ましくは約５００〜１００００Ｄａの、より好ましくは約２０００〜５０００Ｄａの分子量を示す。
【００４７】
第一および第二の局面の好ましい態様において、ＰＥＧ部分を含むヘルパー脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンおよび１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンを含む群より選択される。
【００４８】
第一および第二の局面のより好ましい態様において、ヘルパー脂質のＰＥＧ部分は、２，０００〜５，０００Ｄａの分子量、好ましくは２，０００Ｄａの分子量を有する。
【００４９】
第一および第二の局面のさらにより好ましい態様において、組成物は、脂質成分としてβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドを、第一ヘルパー脂質として１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンを、および第二ヘルパー脂質として１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン−ＰＥＧ２０００を含む。
【００５０】
第一および第二の局面の態様において、第二ヘルパー脂質の含有量は、約０．０５〜４．９モル％であり、好ましくは約１〜２モル％である。
【００５１】
第一および第二の局面の態様において、組成物は、ＰＥＧとセラミドとの共役体の約１〜１０モル％、より好ましくは１〜７．５モル％、最も好ましくは１〜５モル％を含有する。
【００５２】
第一および第二の局面の好ましい態様において、セラミドは、Ｃ８ｍであり、ＰＥＧは、ＰＥＧ２０００であり、ＰＥＧとセラミドとの共役体の含有量は、約１〜７．５モル％である。
【００５３】
第一および第二の局面の代替的な好ましい態様において、セラミドは、Ｃ８ｍであり、ＰＥＧは、ＰＥＧ５０００であり、ＰＥＧとセラミドとの共役体の含有量は、約１〜５モル％である。
【００５４】
第一および第二の局面の態様において、第一脂肪成分の含量は、約４２．５〜５０モル％であり、第一ヘルパー脂質の含量が約４２．５〜５０モル％であり、第一ヘルパー脂質の、およびＰＥＧとセラミドとの共役体の第一脂質成分の含有量の合計は、１００モル％である。
【００５５】
第一および第二の局面の態様において、機能的核酸は、二本鎖リボ核酸であり、組成物はさらに、核酸を含み、好ましくは、より好ましくは二本鎖リボ核酸であり、最も好ましくはＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、およびリボザイムを含む群より選択される核酸である機能的核酸を含み、それにより好ましくは、陽イオン性脂質に対するＲＮＡｉのモル比が、約０〜０．０７５、好ましくは約０．０２〜０．０５、さらにより好ましくは０．０３７である。
【００５６】
第一および第二の局面の態様において、第一脂質成分および／またはヘルパー脂質のうちの少なくとも１つおよび／または遮蔽化合物は、水性媒体中の分散物として存在する。
【００５７】
第一および第二の局面の代替的な態様において、第一脂質成分および／または、ヘルパー脂質のうちの少なくとも１つおよび／または遮蔽化合物は、水混和性溶媒中の溶液として存在し、好ましくは、前記溶媒は、エチノール及びｔｅｒｔ−ブタノールを含む群より選択される。
【００５８】
本発明の根元的な問題は、第三の局面において、薬物の製造のための第一または第二の局面に従った組成物の使用によっても解決される。
【００５９】
本発明の根元的な問題は、第四の局面において、転移剤としての第一または第二の局面に従った組成物の使用によっても解決される。
【００６０】
第四の局面の態様において、転移剤は、薬学的に活性のある成分および／またはさらなる構成体を細胞に、好ましくは哺乳類細胞に、より好ましくはヒト細胞に転移させる。
【００６１】
本発明の根元的な問題は、第五の局面において、薬学的に活性のある化合物および／またはさらなる構成体を細胞内にか、または膜、好ましくは細胞膜を横切って転移させるための下記工程：
【００６２】
細胞または膜を提供すること、
第一または第二の局面に従った組成物、薬学的に活性のある化合物および／またはさらなる構成体を提供すること、および
細胞または膜を、第一または第二の局面に従った組成物と接触させること
を含む方法によっても解決される。
【００６３】
第五の局面の態様において、方法は、さらなる工程、すなわち、
薬学的に活性のある化合物および／またはさらなる構成体を細胞中でおよび／または膜を越えて検出すること
を含む。
【００６４】
本発明は、核酸、特にＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｉＮＡなどの小さな核酸のｉｎ  ｖｉｖｏ適用における非常に効果的な送達が、少なくとも１つの第一脂質成分、少なくとも１つの第一ヘルパー脂質、および遮蔽化合物を含む脂質組成物を使用することによって達成され得ることを驚くべきことに見出した。遮蔽化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでより長い循環時間を提供し、したがって、脂質組成物を含有する核酸のより良好な体内分布を可能にする。このメカニズムによって、静脈内投与が実施されるときに、注入部位を取り囲む組織、通常は、脈管構造の内皮裏打ちによって脂質組成物は、すぐには吸収されないことから、脂質組成物の投与の部位からかなり離れているヒトまたは動物の体内の部位を標的にすることが可能である。本明細書において使用される遮蔽化合物は好ましくは、脂質組成物と、血清化合物または他の体液の化合物または細胞膜、好ましくは、脂質組成物が好ましく投与される脈管構造の内皮裏打ちの細胞膜との即時相互作用を回避する化合物である。遮蔽という用語は、免疫系の要素が、生きている生命体における循環時間を重ねて増大させる脂質組成物と即時相互作用しないことも意味する。その範囲において、遮蔽化合物は、抗オプシナイゼーション（ａｎｔｉ−ｏｐｓｉｎｉｚｉｎｇ）化合物として作用する。いずれのメカニズムまたは理論によって結合されると願うことなく、遮蔽化合物は、その環境との相互作用について利用可能な脂質組成物の表面積を低下させるカバーまたはコーティングを形成するように見え、さもなければそのような相互作用には早すぎるが寄り後の工程で認められるべき、別の脂質と融合する脂質組成物またはヒトや動物のそれぞれの身体の因子によって結合しているという結果になる。すなわち、脂質組成物の長期間投与の後に、このような相互作用は通常、送達を提供するために少なくとも特定の程度まで好ましい。遮蔽化合物の観察された効率の基礎となる別のメカニズムは、脂質組成物の、特に核酸、好ましくは本明細書で定義される機能的核酸、より好ましくはｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、およびＲＮＡｉを含有する脂質組成物の全体的な荷電の遮蔽である。また、脂質組成物の相互作用は影響されているように見え、それにより効果は、脂質成分の遮蔽よりもむしろ電荷の遮蔽から生じる。本開示に関して、組成物が１つの脂質と同じくらいわずかに含み得ることは認められる。
【００６５】
遮蔽化合物は、好ましくは、生物学的に不活性な化合物である。より好ましくは、遮蔽化合物は、それ自体、その表面上または分子上のいずれかの電荷を有さない。特に好ましい遮蔽化合物はしたがって、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルグルコースベースのポリマー、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）、およびポリプロピレンであり、それにより該化合物のいずれかは好ましくは、約５００〜１００００Ｄａの、より好ましくは約２０００〜５０００Ｄａの分子量を有する。
【００６６】
遮蔽化合物が、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で脂質組成物から除去され得ることは、本発明の重要な特長である。このような除去は、動物およびヒトの身体などの環境へ脂質組成物またはその一部の他の成分を曝露し、脂質組成物中に含有される核酸などの化合物の放出および送達をそれぞれ最終的に可能にする。ｉｎ  ｖｉｖｏ条件という用語は好ましくは、動物またはヒトの身体に存在する条件、好ましくは血液、間質液、および細胞内液などのいずれかの体液中に存在する条件、および／またはエンドソームおよび／またはリソソームに存在する条件を意味する。遮蔽化合物のデザインにより、除去は、以下に、より詳細に記載されるとおりに、さまざまな方法で影響を受け得る。
【００６７】
遮蔽剤の損失から生じるさらなる効果は、特に遮蔽剤がＰＥＧである場合、ペグ化とも呼ばれるＰＥＧを脂質製剤に提供するという事実に依存し、しばしば、このような脂質製剤によって細胞質へ送達されるべき核酸分子の機能性送達を結果的に低下させる。脂質製剤でのＰＥＧのかさ高い存在は、脂質剤形によって典型的に形成されるリポソームのエンドソーム取り込みを低下させるかまたは、脂質組成物に含まれるか結合した核酸の必要なエンドソームのエスケープを妨害する。
【００６８】
ある態様において、遮蔽化合物は、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）、およびポリプロピレンを含む群より選択され、セラミドに結合され、好ましくは共有結合される。セラミドは、脂質化合物と相互作用し、存在する場合、ヘルパー脂質と相互作用する。その範囲において、セラミドは、第一ヘルパー脂質かまたは第二ヘルパー脂質のいずれかであり得る。ＰＥＧへ共役したセラミドが、第一ヘルパー脂質とは異なることが好ましい。セラミドは、第一脂質成分および第一ヘルパー脂質によって好ましく形成される脂質組成物の脂質画分へ包埋され、特定の比率で比較的短い炭化水素鎖により放出されるであろう。したがって、セラミドが、脂質組成物から放出されるとき、遮蔽剤も放出される。それゆえ、本態様において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件は、脂質形成のデスインテグレーションを可能にし、したがって、脂質組成物のｉｎ  ｖｉｖｏでのより長い寿命または循環時間を提供する。
【００６９】
さらなる態様において、遮蔽剤は、脂質組成物中に含有されるかまたは脂質組成物と会合した核酸へ結合される。好ましくは、遮蔽剤は、核酸へ、最も好ましくはリンカーを通じて共有結合される。より好ましい態様において、リンカーは、生理学的条件下で、すなわち、動物またはヒトの生物体において普通の条件下で堅く結合するようデザインされる。好ましい態様において、核酸の特定の百分率のみが、リンカーを通じてこのようなポリマーとともに実際に提供される。いずれの理論による結合も願うことなく、脂質組成物の核酸分子形成部分の特定の数のみが、該脂質組成物へ遮蔽効果を提供するために、このようなかさ高い部分を有しなければならないことが十分であるように見える。好ましくは、核酸分子の部分は、約０〜２０％、より好ましくは３〜１０％、およびさらにより好ましくは６〜１０％の範囲である。（本明細書で遮蔽化合物としても呼ばれる）遮蔽剤を有する核酸の好ましい含有量は、約０〜３％、３〜６％、６〜１０％、および１０〜２０％であり、それにより、本段落においておよび本出願を通じて使用される％は、指示がない場合は、モル％である。
【００７０】
このようなリンカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件に存在するかまたはｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で存在するＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性によって開裂されるであろう１〜２０個のヌクレオチドをより好ましくは含むｓｓＲＮＡリンカーであり得る。さらなる態様において、リンカーは、存在するかインビボ条件下でＤＮＡエンドヌクレアーゼによって開裂されるｓｓＤＮＡリンカーによって形成される。さらなる態様において、リンカーは、二本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＤＮＡによって形成され得る。核酸からなるリンカーの安定性は、典型的には次のとおりである。すなわち、ｓｓＲＮＡ＜ｄｓＲＮＡ＜ｓｓＤＮＡ＜＜ｄｓＤＮＡである。このような安定性のバラエティによって、したがって改変された核酸および、このようなリンカーを各々含む脂質組成物の残存時間の特定のデザインが可能になる。
【００７１】
さらなる態様において、リンカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件中にまたはｉｎ  ｖｉｖｏ条件下に存在するプロテアーゼによって開裂されるオリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質によって形成され得る。なおもさらなる態様は、酸化還元条件に対して感受性のあるＳ−Ｓ連結を含むリンカーを提供する。
【００７２】
さらになおもさらなる態様において、リンカーは、ｐＨ感受性リンカーである。ｐＨ感受性リンカーの概念は、原則として、リポプレックスまたはリポソームのいずれかであり得る脂質組成物の内部移行に際し、内部移行の前の脂質組成物の保護になるときに明らかに有利である、いずれかの遮蔽剤が、化合物のさらなる使用の制限を与えることができ、よって、細胞内に転換され得るという見解に存する。本明細書で使用されるように、遮蔽剤は、好ましい態様において陰イオン性部分であるかまたはそれを含むエンドソームなどの酸性環境において、このような陰イオン性部分の電荷が変化する。このため、ｐＨ感受性リンカーと、静電気に基づいて脂質製剤中に含有されるようイオン性脂質との相互作用も変化し、通常、低下し、脂質製剤を含む陽イオン性脂質からのｐＨ感受性リンカーの漸増的なまたは漸減的な放出に至る。結果として、リポソームは、遮蔽剤が全くなくなり、したがって、細胞内の影響を発揮し得る。リンカーのこの種は、それ自体当技術分野で公知のリンカーおよびこの種の新たな、すなわちこの種の特徴を有するリンカーの両者を含む。好ましくは、このようなリンカーは、上述のようにリンカーが反応できる荷電特徴を有するいずれかのリンカーである。このようなｐＨ感受性リンカーの代表例は、それに限定されるものではないが、オリゴ（グルタミン酸）、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢酸を含む。このようなリンカーの遮蔽剤への連結、および一般的に遮蔽剤の部分と呼ばれる遮蔽剤へのこのようなリンカーの組み込みの両者は、当業者に公知である。
【００７３】
図１に示されるような、本明細書で本発明に記載の化合物とも呼ばれる、本発明に記載の脂質組成物中の第一脂質成分として使用される化合物は、Ｒ１−Ｎ−Ｒ２部分によって形成される親油基、Ｃ（Ｏ）−ＣＨ−（ＮＨ３)(ＣＨ２）ｎ−ＮＨ部分によって形成されるリンカー基及びＲ３部分によって形成される頭部基を含む。本発明者は、驚くべきことに、リンカー基で正の電荷を呈する種類の化合物が、細胞膜にわたって、好ましくは細胞へ、より好ましくは動物細胞へ生物活性のある化合物を転移させるのに特に適することを見出した。また、本発明者は、生物活性のある化合物が核酸、より好ましくはｓｉＲＮＡおよびｓｉＮＡである場合、本発明に記載の化合物によって仲介される転移が特に効果的であろうことを驚くべきことに見出した。
【００７４】
本明細書で好ましく使用されるように、アルキルという用語は、８〜２０個の炭素原子を、好ましくは１２〜１８個の炭素原子を含有する飽和脂肪族ラジカル、または８〜３０個の炭素原子を含有し、一不飽和または多価不飽和脂肪族炭化水素ラジカルを含有し、少なくとも一つの二重結合および三重結合をそれぞれ有する飽和脂肪族ラジカルを指す。したがって、好ましい態様において、アルキルという用語は、アルケニルおよびアルキニルも含む。アルキルは、分岐鎖および非分岐鎖の両者、すなわち非直鎖または直鎖アルキル基を指す。好ましい直鎖アルキル基は、８〜３０個の炭素原子を含有する。より好ましい直鎖アルキル基は、１２〜１８個の炭素原子を含有する。好ましい分岐鎖アルキル基は、８〜３０個の炭素原子を含有し、それにより８〜３０個の原子の数は、このような分岐鎖アルキル基の主鎖を形成する炭素原子の数を指す。分岐鎖アルキル基の主鎖は、主鎖から分岐した少なくとも一つのアルキル基を含有し、アルキル基は、本明細書のように定義されており、より好ましくは、アルキル基は、短鎖アルキル基を含み、より好ましくは１〜６個の、さらにより好ましくは１〜３個の、最も好ましくは１個のＣ原子を含む。より好ましいのは、主鎖に１２〜１８個の炭素原子を含有する分岐鎖アルキル基であり、分岐鎖アルキル基は、前述のとおり定義される。特に好ましいアルキル基は、フィタニル基である。
【００７５】
代替的な態様において、アルキルは、上述に定義されるような不飽和の分岐鎖または非分岐鎖アルキル基である。より好ましくはこのような不飽和親油性炭化水素ラジカルは、１、２、または３または４個の二重結合を含有し、それにより一つの二重結合を有するラジカルは、特に好ましい。最も好ましいのは、Ｃ１８：１デルタ９であるオレイル、すなわち、１８個のＣ原子を有する親油性炭化水素ラジカルであり、Ｃ原子番号９をＣ原子番号１０へ連結する単結合よりもむしろ位置９で、シス構成された二重結合が、示される。
【００７６】
本明細書で使用されるように、ｎは、１〜４のいずれかの整数であり、ｎが、１、２、３、および４であり得ることを意味する。本明細書で使用されるように、ｍは、１〜３のいずれかの整数であり、ｍが、１、２、および３であり得ることを意味する。
【００７７】
本発明に記載の化合物が好ましくは陽イオン性脂質であることは理解されるべきである。より好ましくは、本明細書に記載の化合物中に存在するＮＨ基またはＮＨ２基のうちのいずれかが、プロトン化した形態で存在する。典型的には、本発明に記載の化合物のいずれかの正の電荷が、陰イオンの存在によって補償される。このような陰イオンは、一価または多価陰イオンであり得る。好ましい陰イオンは、ハロゲン化物、アセテート、およびトリフルオロアセテートである。本明細書において使用されるハロゲン化物は、好ましくは、フッ化物、塩化物、ヨウ化物、および臭化物である。最も好ましくは、塩化物である。細胞へ転移されるべき陽イオン性脂質と生物活性のある化合物との会合に際し、ハロゲン化陰イオンは、１つまたはいくつもの負の電荷を好ましくは呈する生物活性のある化合物によって置換されるが、生物活性のある化合物の全体的な電荷が必ずしも負ではないことは認められなければならない。
【００７８】
式（I）に記載のいずれかの化合物が、少なくとも２つの不斉炭素原子を含むことは、認められるべきである。このような化合物のいずれかのあり得る鏡像異性体が本明細書で開示され、すなわち特にＲ−Ｒ、Ｓ−Ｓ、Ｒ−Ｓ、およびＳ−Ｒ鏡像異性体であることは、本発明内である。
【００７９】
本発明書に記載の化合物は、組成物を形成し得るかまたは組成物の一部であり得、それによりこのような組成物は、担体を含む。本明細書で脂質組成物とも呼ばれるこのような組成物において、本発明に記載の化合物は、脂質成分とも呼ばれる。このような担体は、好ましくは液状担体である。好ましい液状担体は、水性担体および非水性担体である。好ましい液状担体は、水、水性緩衝液系、より好ましくは、生理学的緩衝液強度および生理学的塩濃度を有する緩衝液系である。好ましい非水性担体は、溶媒であり、好ましくはエタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールなどの有機溶媒である。いずれの理論によって結合されることを願わずに、いずれかの水混和性有機溶媒は、原則として使用され得る。組成物、より特別には脂質組成物は、したがって、リポソームとして存在し得るかまたはリポソームを形成し得ることは認められるべきである。
【００８０】
本発明に記載の組成物は、本明細書でヘルパー脂質成分とも呼ばれる１つ以上のヘルパー脂質を含み得る。ヘルパー脂質成分は好ましくは、リン脂質およびステロイドを含む群より選択される。リン脂質は好ましくは、リン酸のジエステルおよびモノエステルである。リン脂質の好ましいメンバーは、ホスホグリセリド及びスフィンゴ脂質である。ここで用いるステロイドは、天然物または部分的に水素化したシクロペンタ［ａ］フェナントレンに基づいた合成化合物である。好ましくは、ステロイドは、２１〜３０個のＣ原子を含有する。特に好ましいステロイドは、コレステロールである。
【００８１】
特に好ましいヘルパー脂質は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
【００８２】
本発明に記載の特に好ましい組成物は、ＤＰｈｙＰＥと組み合わせた、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド［＃６］、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド［＃１１］、またはε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド［＃１５］のうちのいずれかを含み、それによりＤＰｈｙＰＥの含有量は、約９０〜２０モル％、好ましくは８０モル％、６５モル％、５０モル％、および３５モル％であり、それによりモル％という用語は、組成物の全体的な脂質含有量の百分率を指し、すなわち、本発明に記載の陽イオン性脂質と、それに制限されるものではないがいずれかのヘルパー脂質を包含するいずれかのさらなる脂質とを包含する組成物の脂質含有量の百分率を指す。
【００８３】
本発明に記載の組成物が好ましくは、本発明に記載の化合物および／または本明細書に開示されるヘルパー脂質の一つまたはいくつかを含み、それにより本発明に記載の化合物のいずれか、すなわち、陽イオン性脂質および／またはヘルパー脂質成分が、水性媒体中の分散物として存在することは、本発明内である。または、本発明に記載の化合物、すなわち、陽イオン性脂質および／またはヘルパー脂質成分は、水混和性溶媒中の溶液として存在する。水性媒体として、好ましくは本明細書に開示される水性担体のうちのいずれかが使用される。好ましい水混和性溶媒は、任意の比で水と均質な相を形成するいずれかの溶媒である。好ましい溶媒は、エタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールである。組成物、より特別には脂質組成物がしたがって、リポソームとして存在し得るか、リポソームを形成し得ることは、認められるべきである。
【００８４】
本発明のさまざまな態様における本発明に記載の組成物がしたがって薬学的組成物として使用され、薬学的組成物としても使用され得ることは、認められるべきである。後者の場合、薬学的組成物は、薬学活性のある化合物と、場合により薬学的に許容され得る担体とを含む。このような薬学的に許容され得る担体は、好ましくは、本発明による組成物に関してここに規定されるとおりの担体の基から選択される。当業者は、本明細書で開示されるような組成物は、原則として、その成分およびそのいずれかの組み合わせが薬学的に許容され得るよう提供される薬学的組成物としても使用され得ることを理解する。薬学的組成物は、薬学的に活性のある化合物を含む。このような薬学的に活性のある化合物は、好ましくはいずれかの生物活性のある化合物であり、より好ましくは本明細書に開示されるいずれかの生物活性のある化合物である、本発明に記載の組成物のさらなる構成体と同一であり得る。さらなる構成体、薬学的に活性のある化合物、および／または生物活性のある化合物は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸を含む群より好ましく選択される。
【００８５】
好ましくは、いずれかのこのような生物活性のある化合物は、負に荷電した分子である。負に荷電した分子という用語は、本発明に記載の陽イオン性脂質の性に荷電した基とイオン対であり得る少なくとも一つの負に荷電した基を有する分子を包含することを意味するが、本発明者は、いずれかの理論によって結合されることを願わない。原則として、リンカー部分での正の荷電は、脂質それ自体か、または陽イオン性脂質と負に荷電した分子との間に形成されるいずれかの複合体、すなわち生物活性のある化合物のいずれかの全体的な構造にいくらかの効果を及ぼすことができる。それは別として、米国特許第６，３９５，７１３号に開示される陽イオン性脂質と比較して、本発明に記載の脂質へ導入されるさらなる正の電荷は、Xu Y, Szoka FC Jr.; Biochemistry; 1996 May 07, 35 (18): 5616-23によって教示されるこの脂質の毒性の増大の一因となるべきである。当業者が先行技術のこの書類から期待したであろうこととは対照的に、本発明に記載の化合物は、本明細書に開示されるさまざまな目的に特に適しており、特にいかなる毒性もない。
【００８６】
本明細書で特に使用されるペプチドは、好ましくはペプチド結合を通じて互いに共有結合される少なくとも２つのアミノ酸からなるいずれかのポリマーである。より好ましくは、ペプチドは、２〜１０個のアミノ酸からなる。ペプチドの特に好ましい態様は、約１０〜約１００個のアミノ酸をさらにより好ましく含むオリゴペプチドである。本明細書で好ましく使用されるタンパク質は、互いに共有結合される複数のアミノ酸からなるポリマーである。好ましくは、このようなタンパク質は、少なくとも約１００個のアミノ酸またはアミノ酸残基を含む。
【００８７】
本発明に記載の陽イオン性脂質および組成物と関連して使用され得る好ましいタンパク質は、いずれかの抗体、好ましくはいずれかのモノクローナル抗体である。
【００８８】
特に好ましい生物活性化合物、薬学的に活性のある化合物およびすなわち本発明に記載の組成物と関連して使用されるようなさらなる構成体は、核酸である。このような核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはそれらのいずれかの混合物であり得る。より好ましくは、核酸は、機能的核酸である。本明細書で好ましく使用される機能的核酸は、ペプチドおよびたんぱく質についてそれぞれコード化する核酸ではない核酸である。好ましい機能的核酸は、当技術分野ですべて公知であるｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピゲルマーである。
【００８９】
ｓｉＲＮＡは、例えば国際特許出願ＰＣＴ／欧州特許第０３／０８６６６号に記載の小さな干渉性のＲＮＡである。これらの分子は典型的に、互いに塩基対形成する、すなわちワトソンクリック塩基対形成によって典型的に仲介される、互いに対して実質的に相補的な１５〜２５個の、好ましくは１８〜２３個のヌクレオチド対を含むｄｓＲＮＡ構造からなる。このｄｓＲＮＡ分子のうちの一本鎖は、標的核酸、好ましくはｍＲＮＡに実質的に相補的であるのに対し、該ｄｓＲＮＡ分子の第二鎖は、該標的核酸のストレッチに実質的に同一である。ｓｉＲＮＡ分子は、しかしながら互いに対して塩基対形成する必要が必ずしもない多くのさらなるオリゴヌクレオチドによってそれぞれ、各側および各ストレッチ上に隣接され得る。
【００９０】
ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡと本質的に同一のデザインを有するが、しかしながら、分子は、ｓｉＲＮＡと比較して有意に長い。ＲＮＡｉ分子は典型的に、５０個以上のヌクレオチドおよび塩基対をそれぞれ含む。
【００９１】
ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉと同一の作用モードに基づいて活性のある機能的核酸のさらなるクラスは、例えば国際特許出願ＰＣＴ／欧州特許第０３／０７４６５４号に記載される。より具体的には、ｓｉＮＡは、ｓｉＲＮＡに対応し、それによりｓｉＮＡ分子は、いずれのリボヌクレオチドも含まない。
【００９２】
本明細書で好ましく使用されるアンチセンス核酸は、標的ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡとの塩基相補性に基づきハイブリダイズする。ホスホジエステル結合ＤＮＡは、しかしながら、フォスフォチオエート結合ＤＮＡを除き、細胞内ヌクレアーゼによって迅速に分解される。したがって、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド複合体としてのみ効果的である。アンチセンス核酸の好ましい長さは、１６〜２３個ヌクレオチドの範囲である。アンチセンスオリゴヌクレオチドのこの種についての例は、とりわけ、米国特許第５，８４９，９０２号および米国特許第５，９８９，９１２号に記載される。
【００９３】
機能的核酸のさらなる群は、基本的に２つの部分を含むＲＮＡから好ましくなる触媒的に活性のある核酸であるリボザイムである。第一部分は、触媒活性を示すのに対し、第二部分は、標的核酸との特異的な相互作用をもたらす。典型的にはハイブリダイゼーションおよび、二つのハイブリダイゼーションしているストランドに基づいた実質的に相補的なストレッチのワトソン−クリック塩基対形成による、核酸とリボザイムの該部分との相互作用に基づき、それが分子内でまたは分子間でのいずれかで、リボザイムの触媒活性がフォスフォジエステラーゼ活性である場合、標的核酸を開裂させることを意味する、触媒的に活性のある部分が活性化し得る。リボザイム、その使用、およびそのデザイン原理は、当業者に公知であり、例えばDoherty and Doudna (Annu. Ref. Biophys. Biomolstruct. 2000; 30: 457- 75)に記載される。
【００９４】
機能的核酸のなおさらなる群は、アプタマーである。アプタマーは、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤ−核酸であり、標的分子と特異的に相互作用する。アプタマーの製造または選択は、例えば欧州特許第０５３３８３８号に記載される。ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、およびリボザイムとは対照的に、アプタマーは、いずれの標的ｍＲＮＡも分解しないが、タンパク質などの標的化合物の二次および三次構造と特異的に相互作用する。標的との相互作用に際し、標的は典型的に、その生物活性における変化を示す。アプタマーの長さは典型的に、少なくとも１５個から多くとも８０個のヌクレオチドの範囲であり、好ましくは約２０〜約５０個のヌクレオチドの範囲である。
【００９５】
機能的核酸の別の群は、例えば国際特許出願の国際公開公報第９８／０８８５６号に記載のスピゲルマーである。スピゲルマーは、アプタマーと同様の分子である。しかしながら、スピゲルマーは、アプタマーとは対照的に、Ｄ−ヌクレオチドよりもむしろ完全にまたはほとんどがＬ−ヌクレオチドからなる。さもなくば、特にスピゲルマーのあり得る長さに関して、アプタマーに関して要約されたとおりスピゲルマーに同様に適用される。
【００９６】
前述のように、本発明者は、本発明に記載の化合物およびこのような化合物を含む個々の組成物が、ＲＮＡｉ、より特別にはｓｉＲＮＡおよびｓｉＮＡを細胞へ転移する上で特に効果的であり得ることを驚くべきことに発見した。いずれの理論によって結合されることを願わないが、ヘルパー脂質が、ＰＥＧのないヘルパー脂質または特にＰＥＧ含有ヘルパー脂質のいずれかであり得る、本発明に記載の脂質組成物中に含有されるヘルパー脂質の特定のモル百分率により、驚くべき効果が具現化され、より具体的にはヘルパー脂質のこの種のいずれかの含有量が、本明細書に指定される濃度範囲内で含有される場合そうであることは留意されるべきである。それと関連して、本発明に記載の組成物が、ＰＥＧ部分を含むヘルパー脂質を含有する場合、このようなＰＥＧにより由来するヘルパー脂質含有組成物を使用するいずれかの送達またはトランスフェクションが、核酸、特にＲＮＡｉ分子、最も特別にはｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、およびリボザイムを送達する上で特に効果的であることは、特に注目すべきである。
【００９７】
これについての理由は、ＰＥＧ含有ヘルパー脂質の約４％超を含有するリポソームが活性がないのに対し、４％未満（好ましくは３％未満であるが０％超）を有するリポソームが機能的送達を仲介することを、本発明者が驚くべきことに見出したことである。基本的に、本発明者は、本発明に記載の脂質組成物中のＰＥＧの特定の量が、効果的なトランスフェクションおよび送達のためにそれぞれ提供するのに適していることを発見した。
【００９８】
さらなる局面において、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）またはリポソームとして好ましく存在する本発明に記載の脂質組成物が好ましくは、全体的な陽イオン電荷を示し、したがって、少なくとも１つの正の電荷の超過を示すことを、本発明者は驚くべきことに見出した。より好ましくは、脂質組成物は、約１：１．３〜１：５の負：正の電荷比を呈する。それゆえ、本発明はしたがって、さらなる局面において、約１：１．３〜１：５の負：正の電荷比を有する、少なくとも１つの陽イオン性脂質および核酸、好ましくはＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｉＮＡ、または本明細書に定義される機能的核酸のその他を含むいずれかの脂質組成物に関する。陽イオン性脂質は好ましくは、本明細書に記載のいずれかの陽イオン性脂質である。好ましい態様において、脂質組成物は、本明細書に記載のいずれかのヘルパー脂質またはヘルパー脂質組成物を含む。
【００９９】
本発明者は、特にｓｉＲＮＡと陽イオン性脂質とのモル濃度比が、特に、核酸含有脂質製剤の全体的な陽イオン性電荷に関して上述のようであった点において、本発明に記載の脂質組成物の成功した適用に決定的であり得ることも見出した。いずれの理論によって結合されることを願うことなく、特に本明細書に開示されるようイオン性脂質の１モルが、１分子あたり３つの正の電荷の最大値について提供し得るのに対し、本明細書に開示される核酸およびより特別にはｓｉＲＮＡ分子が、１分子あたり４０個の負の荷電の最大値について提供し得るように見える。本発明に記載の脂質製剤を含有するｓｉＲＮＡの全体的な正の電荷に到達するため、モル濃度比は、０〜０．０７５の最大値の範囲であり得る。好ましいモル濃度比の範囲は、約０．０２〜０．０５であり、さらにより好ましくは、約０．０３７のモル濃度比範囲である。
【０１００】
組成物およびより具体的には薬学的組成物が、薬学的に活性のある化合物およびさらなる構成体とそれぞれ同様に、本発明に記載の組成物中に含有され得る上述の生物活性のある化合物の１つ以上を含み得ることは、本発明内である。これらの化合物のうちのいずれかが原理上、薬学的に活性のある化合物として使用され得ることは当業者によって認められるであろう。このような薬学的に活性のある化合物は、疾病の病理機序（ｐａｔｈｏｍｅｃｈａｎｉｓｍ）に関与する標的分子に対して典型的に向けられる。本発明のいずれかの局面と関連して使用されるさまざまな生物活性のある化合物およびしたがって薬学的に活性のある化合物に根元的な一般的なデザイン原理および作用モードにより、事実上いずれかの標的に向けることができる。したがって、本発明に記載の化合物およびそれを含有する個々の組成物は、生物活性のある化合物のこの種を使用して配向され得、防止され得、および／または治療され得るいずれかの疾病または罹患した状態の治療または防止のために使用され得る。これらの生物活性のある化合物とは別に、その他の生物活性のある化合物も、本発明のいずれかの態様に従った組成物の一部であり得ることは認められるべきである。好ましくはこのような他の生物活性のある化合物が、本発明に記載の化合物と、より好ましくは、陽イオン性脂質として存在する本発明に記載の化合物と相互作用しているかまたは複合体形成される条件下で、好ましくはこのような他の生物活性のある化合物が、少なくとも一つの負の電荷を含む。
【０１０１】
本明細書で使用されるように、生物活性のある化合物は、好ましくは生物活性のあるいずれかの化合物であり、好ましくは生物学的システムに及ぼすいずれかの生物学的、化学的、および／または物理的効果を呈する。このような生物学的システムは好ましくは、いずれかの生化学反応、いずれかの細胞、好ましくはいずれかの動物細胞、より好ましくはいずれかの脊椎動物細胞、および最も好ましくはいずれかの哺乳類細胞であり、それに制限されるものではないが、いずれかのヒト細胞、いずれかの組織、いずれかの器官、およびいずれかの生物体を包含する。いずれかのこのような生物体は好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、家禽、サル、およびヒトを含む群より選択される。
【０１０２】
本発明に記載の組成物のうちのいずれか、より特別には本発明に記載のいずれかの薬学的組成物が、いずれかのさらなる薬学的に活性のある化合物を含み得ることも、本発明内である。
【０１０３】
本発明に記載の組成物、特に薬学的組成物は、投与のさまざまな形態について使用され得、それにより局所投与および全身性投与が特に好ましい。さらにより好ましいのは、筋肉内投与、経皮投与、皮下投与、静脈内投与、および肺投与を含む群より選択される投与の経路である。本明細書で好ましく使用されるように、局所投与は、個々の組成物が、細胞、組織、および器官に対する閉鎖的な空間関係においてそれぞれ投与され、そこへ組成物および生物活性のある化合物がそれぞれ投与されるべきである。本明細書に示されるように、全身性投与は、局所投与とは異なり、より好ましくは血液および分泌液などそれぞれの体液への投与であり、そこへ組成物および生物活性のある化合物がそれぞれ送達されるべきである投与を意味する。
【０１０４】
本明細書で使用されるように、生物活性のある化合物が、本発明に記載の化合物および組成物によって転移されるべき細胞膜を横切る細胞は、好ましくは真核細胞、より好ましくは脊椎細胞、およびさらにより好ましくは哺乳類細胞である。最も好ましくは、細胞はヒト細胞である。
【０１０５】
本発明の化合物および組成物を使用して製造され得るいずれかの薬物は、患者の処置及び予防のそれぞれを目的とする。好ましい患者は、脊椎動物であり、より好ましくは哺乳動物であり、さらにより好ましくは、マウス、ラット、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、家禽、サル、およびヒトを含む群より選択される。さらなる局面において、本発明に記載の化合物および組成物は、転移剤、より好ましくはトランスフェクション剤として使用され得る。
【０１０６】
本明細書で好ましく使用されるように、転移剤は、化合物、より好ましくは膜、より好ましくは細胞膜を横切る薬学的に活性のある化合物などの生物活性のある化合物を転移させるのに適しており、より好ましくはこのような化合物を本明細書で前述のような細胞へと転移させるのに適しているいずれかの薬剤である。さらにより好ましくは、このような転移は、いずれかのエンドソーム／リポソームからの放出も含む。
【０１０７】
なおもさらなる局面において、本発明は、細胞を生物活性のある化合物へ転移させるための方法、より特別にはトランスフェクションさせるための方法に関する。第一工程において、それにより工程のシーケンスは、必ずしも限定されず、特に以下に概略される工程のシーケンスには限定されず、細胞および膜および細胞がそれぞれ提供される。第二工程において、本発明に記載の化合物は、薬学的に活性のある化合物などの生物活性のある化合物と同様に提供される。この反応は、細胞および膜とそれぞれ接触され得、本発明に記載の化合物および組成物の生物物理的特徴によって、生物活性のある化合物は、膜の片側からもう片側へ転移されるであろうし、または膜が細胞を形成する場合、細胞の外側から細胞内へと転移されるであろう。細胞および膜とそれぞれ接触する前に、生物活性のある化合物および本発明に記載の化合物、すなわち陽イオン性脂質が接触し、その際、好ましくは複合体が形成され、このような複合体が細胞および膜とそれぞれ接触することは、本発明内である。
【０１０８】
本発明のさらなる局面において、生物活性のある化合物および薬学的に活性のある化合物をそれぞれ転移させるための方法は、細胞および膜をそれぞれ提供する工程、本発明に記載の組成物を提供する工程、ならびに組成物と細胞および膜との両者をそれぞれ接触させる工程を含む。組成物が細胞と膜が接触する前にまたはその間に、形成され得ることは、本発明内である。
【０１０９】
本明細書で開示される生物活性のある化合物を転移させるためのいずれかの方法の態様において、方法は、さらなる工程、好ましくは生物活性のある化合物が転移されたかどうかを検出する工程を含み得る。このような検出反応は、本発明に記載される転移される生物活性のある化合物の種類に強く依存し、当業者にとって自明であろう。このような方法が、本明細書に記載のいずれかの細胞、組織、器官、および生物体に関して実施されることは、本発明内である。
【０１１０】
さらなる態様において、遮蔽剤が、本明細書に記載されるように、本発明に記載の脂質組成物の脂質成分へ、好ましくは陽イオン性脂質へ結合することは、認められるべきである。
【０１１１】
本発明は、本発明のさらなる特長、態様、および利点が挙げられ得る以下の図および実施例に対する参照によりさらに説明される。
【０１１２】
実施例１：先行技術によるＮ−オレイル−パルミチルアミンの合成
Ｎ−オレイル−パルミチルアミンは、本発明に記載の化合物についての重要な出発材料である。原理上、Ｎ−オレイル−パルミチルアミンは、米国特許第６，３９５，７１３号に記載されるとおり合成され得る。個々の反応スキームは、図２に示されている。しかしながら、出発材料は、例えばＦｌｕｋａによって提供されるような技術等級のオレイルアミンである。ガスクロマトグラフィーによるこの出発材料の分析は、７０％以上の純度を示すのに対し、前記材料の３０％は、異なる鎖の長さを有するアミンからなる。これについての理由は、材料自体が植物原料から得られることであり得る。オレイルアミンおよび１−ブロモヘキサデカン（パルミチルブロミド）の両者を組み合わせることで、両出発材料を１００〜１２０℃で３０分間反応させた後に、Ｎ−オレイル−パルミチルアミンを生じる。収量は、約８３％である。
【０１１３】
実施例２：本発明によるＮ−パルミチル−オレイルアミンの合成
新たな合成が、本発明に記載の化合物と関連して、本発明者により明らかにされた（図３）。この新たな反応スキームは、不純物の高い量が、この出発材料に基づいて調製される転移剤の品質に影響しているという本発明者の発見に基づいている。したがって、ガスクロマトグラフィーによって示される９９％以上の純度を有し、オレイン酸をエチルクロロギ酸塩、ＴＥＡ、およびＣＨ２Ｃｌ２と接触させるこのようなオレイン酸を使用し、したがって、得られた混合したカルボキシ−炭酸無水物を、示されるように９９％以上の純度を再度有するヘキサデシルアミン（パルミチルアミン）と反応させることで、反応が開始し、（ＴＨＦ中の）ＬｉＡｌＨ４が結果として、無色の結晶個体として存在する８５％のＮ−パルミチル−オレイルアミン［＃２］を生じる。
【０１１４】
より詳細な反応条件は、いかに概略される。
【０１１５】
Ｎ−パルミチル−オレイルアミド［＃１］の合成
２．６２ｍＬ（２７．５ｍｍｏｌ）のクロロギ酸エチルエステルをアルゴン不活性ガス下でシュレンクにしたがって２５０ｍＬ窒素フラスコ中の３０ｍＬ無水ジクロロメタン中に溶解し、０℃へ冷却する。４０ｍＬ無水ジクロロメタン中の７．９３ｍＬ（２５ｍｍｏｌ）オレイン酸および４．１６ｍＬ（３０ｍｍｏｌ）トリエチルアミンの溶液を撹拌下で２０分以内に滴下して添加する。氷槽上で３０分間撹拌した後、５０ｍＬＣＨＣｌ３中の６．６４ｇ（２７．５ｍｍｏｌ）パルミチルアミンの溶液を迅速に滴下して添加し、混合物を室温で２時間撹拌させる。その後、溶液を各４０ｍＬの水で３回洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去する。残渣を１００ｍＬアセトンから再結晶化する。無色の固体の８９％の収率に相当する１１．２５ｇ（２２．３ｍｍｏｌ）を得る。
【０１１６】
Ｎ−パルミチル−オレイルアミン［＃２］の合成
エーテル中の２０ｍＬの１Ｍ  ＬｉＡｌＨ４をアルゴン不活性ガスの下で、滴下漏斗および還流濃縮器を有する２５０ｍＬ三つ首フラスコ中に提供した後、８０ｍＬのＴＨＦ中の７．５９ｇ（１５ｍｍｏｌ）のパルミチルオレオイルアミドの溶液を２０分以内で滴下して添加する。混合物を２．５時間還流した後、エーテル中の別の５ｍｌの１Ｍ  ＬｉＡｌＨ４を添加し、さらに２．５時間還流する。氷槽冷却の下で６Ｍ  ＮａＣｌを使用して、過剰の水素化物を分解し、沈殿物をろ過する。沈殿物を熱ＭｔＢＥ各４０ｍＬで２回抽出し、組み合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去する。残渣を１００ｍＬのＭｔＢＥから−２０℃で結晶化する。無色の結晶固体の８５％の収率に相当する６．２３ｇ（１２．７ｍｍｏｌ）を得る。
【０１１７】
実施例３：Ｂｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−プラミチル−Ｎ−オレイル−アミド［＃３］の合成
１０ｍＬの無水ジクロロメタン中の５２１ｍｇ（１．０６ｍｍｏｌ）のＮ−オレイル−パルミチルアミンを、５０ｍＬ丸底フラスコ中に溶解し、２８９ｍｇ（１．１７ｍｍｏｌ）のＥＥＤＱを添加する。その後、５００ｍｇ（１．１７ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを撹拌下で添加し、混合物を室温で２０時間撹拌する。溶液を８０ｍＬジクロロメタンとともに分離漏斗へ転移し、各２０ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣｌで３回、２０ｍＬ飽和ＮａＨＣＯ３溶液で１回洗浄する。Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた後、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去する（図４）。さらに精製されない黄色の粘性のある油を得る。１：１のヘキサン／酢酸エチルを使用する薄層クロマトグラフィーにおいて、０．７０のＲｆを観察した。
【０１１８】
実施例４：Ｂｏｃ−Ｄａｐ−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド［４番］の合成
１ｇのＢｏｃＤａｐ（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド未加工生成物を５０ｍＬ丸底フラスコ中の８ｍＬ無水ジクロロメタン中に溶解した。３ｍＬジエチルアミンを添加し、室温で撹拌した（図４）。反応の薄層クロマトグラフィー調節は、４．５時間後に出発生成物の反応が完了することを示した。揮発性成分をロータリーエバポレーターにより除去し、４０ｇシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ）を使用し、ヘキサン／酢酸エチル５：１を使用して、残渣をクロマトグラフィー精製する。酢酸エチル、酢酸エチル／メタノール４：１、およびジクロロメタン／メタノール４：１からなる工程勾配を使用して、生成物を溶出した。５７６ｍｇ（０．８５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｄａｐ−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドを黄色の粘性のある油として得た。
【０１１９】
実施例５：テトラ−Ｂｏｃ−［β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド］［＃５］の合成
５７６ｍｇ（０．８５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｄａｐ−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドを、１００ｍＬ丸底フラスコ中の１０ｍＬ無水ジクロロメタン中に溶解し、２１０ｍｇ（０．８５ｍｍｏｌ）ＥＥＤＱおよび４０３ｍｇ（０．８５ｍｍｏｌ）Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＯＨを撹拌下で添加した（図５）。混合物をアルゴン雰囲気下で室温で２０時間撹拌した。その後、ジクロロメタンをロータリーエバポレーターにより除去し、１００ｍＬ  ＭｔＢＥ中の残渣を、分液漏斗に転移した。有機相を０．１ＮＨＣｌ、１Ｎ  ＮａＯＨを用いて徹底的に洗浄し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、乾燥Ｎ２ＳＯ４及び溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。次に、この生産物をヘキサン／酢酸エチルを溶出剤として使用するフラッシュクロマトグラフィー（Combiflash Retrieve; Isco Inc.）により精製した。無色の粘性のある油の７２％の収率に相当する６９４ｍｇ（０．６１ｍｍｏｌ）を得た。
【０１２０】
実施例６：β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドの合成［＃６］
６９４ｍｇ（０．６１ｍｍｏｌ）の十分に乾燥したテトラ−Ｂｏｃ−［β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド］を、シュレンクに従った２５ｍＬ窒素フラスコ中のアルゴン大気下で提供し、ジオキサン中の８ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌを添加した（図５）。混合物をアルゴン不活性ガス下で、室温で２４時間撹拌し、それにより約６〜８時間後、生成物を無定形物としておよび一部ワックス様の固体として、溶液から沈殿した。反応（６５：２５：４のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨを使用する薄層調節）の完了後、いずれの揮発性成分も高圧下で除去した。４８９ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドを三塩酸塩として得た。
【０１２１】
実施例７：Ｎ−ラウリル−ミリスチルアミン［＃７］の合成
１８．５４ｇ（１００ｍｍｏｌ）のドデシルアミン（ラウリルアミン）、６．３６ｇ（６０ｍｍｏｌ）のＮａ２ＣＯ３、および５０ｍｇのヨウ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＩ）を、還流濃縮器および滴下漏斗を有する５００ｍＬの三つ首フラスコ中の１００ｍＬ無水ＤＭＦ中に懸濁した。１００ｍＬの無水ジオキサン中の１６．４ｍＬ（６０ｍｍｏｌ）の１−ブロモテトラデカンの溶液を１００℃で１１０分にわたって滴下して添加し、混合物をさらに３．５時間、１００℃で撹拌した（図６）。溶液をできるだけ熱い温度でろ過した。４℃で一晩沈殿した結晶固体を除去し、冷メタノール少量で洗浄した。その後、固体を２００ｍＬメタノールから再結晶化した。無色の葉様結晶９ｇを得、それを１００ｍＬＭｔＢＥから再結晶化する。−１８℃で沈殿した結晶を、冷却したフリットから吸引し、冷ＭｔＢＥで洗浄した。３５％の収率に相当する無色の結晶固体７．９４ｇ（２１ｍｍｏｌ）を得た。
【０１２２】
実施例８：Ｂｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド［＃８］の合成
７１５ｍｇ（１．６８ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを５０ｍＬ丸底フラスコ中の１５ｍＬ無水ジクロロメタン中に溶解し、４２０ｍｇ（１．７ｍｍｏｌ）のＥＥＤＱを添加した。混合物を室温で４５分間撹拌した後、２５ｍＬ無水ジクロロメタン中の６４１ｍｇ（１．６８ｍｍｏｌ）Ｎ−ラウリル−ミリスチルアミンの溶液を６０分以内でゆっくり滴下して添加した（図６）。２０時間の反応時間の後、溶媒をロータリーエバポレーターにより除去し、残渣を１００ｍＬのＭｔＢＥとともに分離漏斗へ転移した。溶液を０．１Ｎ  ＨＣｌおよび飽和ＮａＨＣＯ３溶液で完全に洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒をロータリーエバポレーターにより除去した。ヘキサン／酢酸エチルを溶出剤として使用するフラッシュクロマトグラフィー（Combiflash Retrieve; Isco Inc.）により精製した未加工の生成物１．０２ｇを得た。６０７ｍｇの純粋な生成物を無色の非常に粘性のある油として得た。１：１のヘキサン／酢酸エチルを使用する薄層クロマトグラフィーは、０．５８のＲｆを示した。
【０１２３】
実施例９：Ｂｏｃ−Ｄａｐ−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド［＃９］の合成
６０７ｍｇのＢｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミドを、５０ｍＬ丸底フラスコ中の８ｍＬ無水ジクロロメタン中に溶解した（図６）。３ｍＬのジエチルアミンを添加し、反応物を室温で４．５時間撹拌した。ロータリーエバポレーターを使用して揮発性構成体を除去し、４０ｇシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ）を５：１のヘキサン／酢酸エチルとともに使用するクロマトグラフィーにより、残渣を精製した。酢酸エチル、ジクロロメタン、３：１のジクロロメタン／メタノールからなる工程勾配により、生成物を溶出した。３７２ｍｇ（０．６５５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｄａｐ−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミドを黄色の粘性のある油として得た。
【０１２４】
実施例１０：テトラ−Ｂｏｃ−［β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド］［＃１０］の合成
３７２ｍｇ（０．６５５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｄａｐ−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミドを、５０ｍＬ丸底フラスコ中の８ｍＬ無水ジクロロメタン中に溶解し、１６２ｍｇ（０．６５５ｍｍｏｌ）ＥＥＤＱおよび３１１ｍｇ（０．６５５ｍｍｏｌ）Ｂｏｃ−Ａｒｇ−（Ｂｏｃ）２−ＯＨを撹拌下で添加した（図７）。混合物を室温で２０時間撹拌した。次に、ジクロロメタンをロータリーエバポレーターによって除去し、残渣を分液漏斗内の８０ｍｌ  ＭｔＢＥに移した。有機相を０．１Ｎ  ＨＣｌ、１Ｎ  ＮａＯＨ、および飽和ＮａＨＣＯ３溶液で完全に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒をロータリーエバポレーターにより除去した。その後、ヘキサン／酢酸エチルの工程勾配を使用するフラッシュクロマトグラフィー（Combiflash Retrieve; Isco Inc.）により、未加工の生成物を精製した。７６％の収率に相当する無色の粘性のある油５００ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を得た。
【０１２５】
実施例１１：β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミドトリヒドロクロリド［＃１１］の合成
５１１ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）の十分に乾燥したテトラ−Ｂｏｃ−［β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド］をアルゴン下でシュレンクに従った２５ｍＬアルゴンフラスコ中に提供し、ジオキサン中の１０ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌを添加した（図７）。混合物をアルゴン不活性ガスの下で室温で２４時間撹拌し、それにより生成物が、部分的に無定形の、部分的にワックス様の固体として溶液から６〜８時間後に沈殿した。反応（６５：２５：４のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨを使用する薄層クロマトグラフィー調節）の完了に際し、すべての揮発性成分を高真空の下で除去した。三塩酸塩の形態にある３２３ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミドを得た。
【０１２６】
実施例１２：Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド［＃１２］の合成
９３７ｍｇ（２ｍｍｏｌ）Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを５０ｍＬ丸底フラスコ中の１０ｍＬ無水ジクロロメタン中に溶解し、４９５ｍｇ（２ｍｍｏｌ）ＥＥＤＱを添加した（図８）。混合物を室温で６０分間撹拌した後、３０ｍL無水ジクロロメタン中の７６４ｍｇ（２ｍｍｏｌ）Ｎ−ラウリル−ミリスチルアミンの溶液を１２０分以内に滴下様式でゆっくり添加した。２０時間の反応時間の後、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去し、残渣を１００ｍＬＭｔＢＥとともに分離漏斗へ転移させた。溶液を０．１Ｎ  ＨＣｌおよび飽和ＮａＨＣＯ３で完全に洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去した。未加工の生成物１．７５７ｇを得、４：１のヘキサン／酢酸エチルを溶出剤として使用するフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製した。１．３７７ｇの純粋な生成物を無色の非常に粘性のある油として得る。１：１のヘキサン／酢酸エチルを使用する薄層クロマトグラフィーは、０．５７のＲｆを示した。
【０１２７】
実施例１３：Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド［＃１３］の合成
１．３７７ｇのＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドを５０ｍＬ丸底フラスコ中の１６ｍＬ無水ジクロロメタン中に溶解した。６ｍＬのジエチルアミンを添加し、混合物を室温で5時間撹拌した（図８）。ロータリーエバポレーターを使用して、揮発性成分を除去し、４０ｇシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ）を５：１のヘキサン／酢酸エチルとともに使用するクロマトグラフィーにより残渣を精製した。酢酸エチル、ジクロロメタン、および３：１のジクロロメタン／メタノールからなる工程勾配を使用して生成物を溶出した。５５６ｍｇ（０．９１１ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｌｙｓ−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミドを黄色の粘性のある油として、混合した画分１１９ｍｇを得た。
【０１２８】
実施例１４：テトラ−Ｂｏｃ−［ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド］［＃１４］の合成
５５６ｍｇ（０．９１１ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｌｙｓ−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドを４０ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解し、２２６ｍｇ（０．９１１ｍｍｏｌ）ＥＥＤＱおよび４３３ｍｇ（０．９１１ｍｍｏｌ）Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＯＨを撹拌下で添加した（図９）。混合物を室温で２０時間撹拌した。その後、ロータリーエバポレーターを使用してジクロロメタンを除去した。残渣を８０ｍＬ  ＭｔＢＥとともに分離漏斗へ転移させた。有機相を０．１Ｎ  ＨＣｌおよび飽和ＮａＨＣＯ３溶液で完全に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去した。その後、ヘキサン／酢酸エチルの工程勾配を使用するフラッシュクロマトグラフィー（Combiflash Retrieve; Isco Inc.）により、未加工の生成物を精製した。無色の粘性のある油を、７５％に相当する７３０ｍｇ（０．６８４ｍｍｏｌ）の収量で得た。
【０１２９】
実施例１５：ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミドトリヒドロクロリド［＃１５］の合成
７３０ｍｇ（０．６８４ｍｍｏｌ）の十分に乾燥したテトラ−Ｂｏｃ−［ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミド］をアルゴン下でシュレンクに従った２５ｍＬアルゴンフラスコ中に提供し、ジオキサン中の１０ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌを添加した（図９）。この混合物をアルゴン不活性ガスの下で室温で２４時間撹拌し、生成物が、約８時間後に、部分的にワックス様固体のアモルファスとして溶液から沈殿した。６５：２５：４のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨを使用する薄層クロマトグラフィーによってコントロールされた反応の完了時に、すべての揮発性成分を高真空下で除去した。４９１ｍｇ（０．６３３ｍｍｏｌ）のε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチルアミドを三塩酸塩として得た。
【０１３０】
実施例１６：トリ−Ｂｏｃ−γ−カルバミジノ−α，γ−ジアミノブタン酸［＃１６］の合成
１．３１ｇ（６ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｄａｂ−ＯＨを１００ｍＬ丸底フラスコ中の１５ｍＬアセトニトリル中に提供し、１２ｍｍｏｌのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加した（図１０）。その後、Ｂｏｃ−Ｄａｂ−ＯＨの一部が溶解するまで水を滴下して添加した後、１．９６ｇ（５ｍｍｏｌ）の１，３−ジ−Ｂｏｃ−２−（トリフルオロメチルスルホニル）グアニジンを添加した。混合物を室温で１２時間撹拌し、その上、ロータリーエバポレーターを使用してアセトニトリルを除去した。水性残渣を５ｍＬ水で希釈し、５０ｍＬジクロロメタンを添加した。撹拌下で２Ｎ  ＨＣｌを添加することによって、反応物をｐＨ２まで酸性化した後、有機相を分離する。水性相を５０ｍＬジクロロメタンで抽出した後、組み合わせた有機相を、希ＨＣｌおよび飽和ＮａＣｌ溶液のいくらかで洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去した。２：１のヘキサン／酢酸エチルを使用するシリカゲル６０上でのクロマトグラフィーを使用して残渣を精製した。無色の無定形固体の５０％の収率に相当する１．１３８ｇ（２．４７ｍｍｏｌ）を得た。
【０１３１】
実施例１７：ベータ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｍ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド［＃＃６］の合成
１５ｍＬ無水ＣＨ２Ｃｌ２中の１．２２５ｇ（６ｍｍｏｌ）ＢＯＣ−Ｄａｐ−ＯＨを、アルゴン大気下で滴下漏斗を含む２５０ｍＬシュレンクフラスコ中に懸濁し、１．７２ｍＬトリメチルアミンを添加する。３０ｍＬ無水ＣＨ２Ｃｌ２中の１．５２ｍＬ（１２ｍｍｏｌ）ＴＭＳＣＩの溶液を室温で激しい撹拌の下で１５〜２０分以内に滴下して添加する。その間、９４１ｍｇ（５．８ｍｍｏｌ）のカルボニルジイミダゾールをアルゴン大気下で１００ｍＬシュレンクフラスコ中の８ｍＬ無水ＣＨ２Ｃｌ２中に溶解する。２５ｍＬ無水ＣＨ２Ｃｌ２中の２．６６ｇ（５．６ｍｍｏｌ）Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＯＨの溶液を１５〜２０分以内で室温で撹拌下で滴下して添加する。両反応溶液を室温で４時間撹拌する。その後、８３２μＬ（６ｍｍｏｌ）トリエチルアミンを第一の溶液に加え、第二の溶液をアルゴン雰囲気化室温で滴下漏斗によって１５〜２０分以内に滴下しながら加えた。１５〜２０分後、３０ｍL水を添加し、４５分間激しく撹拌し、溶液を２のｐＨへ調整した。有機相を分離し、水性相をＣＨ２Ｃｌ２で何回も抽出する。組み合わせた有機相をＮａＣｌおよび硫酸ナトリウムの飽和溶液で乾燥させ、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去する。ジクロロメタンを溶出剤として使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーを使用して、ガラス様残渣を精製する。無色の無定形固体２．７４ｇ（４．１５ｍｍｏｌ、７４％）を得る［化合物１７］。
【０１３２】
この固体を実施例１０のうちの一つと本質的に類似の条件下でオレイルパルミチルアミン［＃２］と反応させ、それにより温度を３５〜４０℃へ設定する（収率７２％）。企図される最終生成物である三塩酸β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド［＃６］を、実施例１１に記載のＢｏｃ保護基を開裂させる際に得る。したがって得られる生成物はさらに、ＭｅＯＨ／水を溶出剤として使用するＲＰ−１８シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製され得る。
【０１３３】
実施例１８：陽イオン性リポソームおよびｓｉＲＮＡからなる複合体（脂質複合体）の製造
陽イオン性リポソームおよびｓｉＲＮＡからなる脂質複合体を、脂質フィルム／ケーク、エタノール注入手法、逆相蒸発、および界面活性剤透析手法［Liposomes as Tools in Basic Research and Industry; Jean R. Philippot and Francis Schuber; CRC Press January 1995 und Liposome Technology: Preparation of Liposomes:001 Gregory Gregoriadis CRC Press I Lie. April 1984参照］などの、当技術分野において公知の標準的な技術を使用して製造した。
【０１３４】
脂質複合体として本明細書でも参照される、したがって得られるリポソームは、脂質として三塩酸ベータ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド、およびさらに１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンまたは１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンのいずれかを含み、それにより、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンの使用が好ましい。このようなリポソームおよび脂質複合体のそれぞれの脂質画分は、５０モル％三塩酸ベータ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド、および５０モル％１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンまたは５０モル％１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンのいずれかであった。
【０１３５】
５０モル％三塩酸β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドおよび５０モル％１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンの組み合わせも、ａｔｕＦｅｃｔとして本明細書に参照される。
【０１３６】
原理上、本明細書で開示されるその他の脂質および脂質組成物が、上述の技術およびさらなる処理工程を使用して製造され得ることは理解されるべきである。
【０１３７】
リポソームおよび脂質複合体はそれぞれ、それらを大きさ、多価分散可能性（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ）、および層デザインに関してトリミングするよう、さらなる処理工程へ供される。これらの特徴は、超音波処理、多孔性膜を通じてなどの押し出し成形、および均質化、好ましくは高圧均質化によって調整され得る。
【０１３８】
したがって形成されるリポソームを、Ｂｅｃｋｍａｎ−ＣｏｕｌｔｅｒＮ５ミクロン下粒子分析装置を備えた光子相関分光法により特徴づけ、押し出し成形または高圧均質化のいずれかによって大きさを整えられるこのようなリポソームの結果を、図１２Ａおよび１２Ｂにそれぞれ示す。
【０１３９】
図１２Ａから、リポソームの大きさ分布が異なる大きさ押し出し成形、この場合、１，０００ｎｍおよび４００ｎｍをそれぞれ有する異なる膜を使用して改変され得ることが挙げられ得る。両者の場合、押し出し成形工程を２１回繰り返した。しかしながら、大きさ押し出し成形が、約５０〜５０００ｎｍであり得、押し出し成形工程を１０〜５０回繰り返し得ることは、本発明内である。
【０１４０】
図１２Ｂから挙げられ得るように、高圧均質化も、リポソームの大きさ分布を改変する適切な手段であり、それによりこのような高圧均質化を適用するに際し、リポソームの大きさは、リポソームが供される均質化周期の数に依存する。典型的な圧力範囲は、１００〜２５００バールであり、それによりこの場合適用される圧力は、１，５００バールであった。
【０１４１】
実施例１９：脂質組成物およびＰＥＧ含有量
第一脂質成分としてのβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイルアミドトリグリセリド（陽イオン性脂質）を含む脂質組成物の移動及び送達の効果へのＰＥＧのインパクトをテストするために、第一ヘルパー脂質としての１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）、ＰＥＧ２０００（Ｃ８ｍＰＥＧ２０００）およびＰＥＧ５０００（Ｃ８ｍＰＥ５０００）へそれぞれ共役されるセラミドであり、次の製剤を本発明に開示される方法に従って生成した。
【０１４２】
Ａ１〜Ａ５製剤：
【０１４３】
【表１】
2008525514.tif 000007
【０１４４】
Ｂ１〜Ｂ５製剤：
【０１４５】
【表２】
2008525514.tif 000008
【０１４６】
上述の製剤のいずれも、脂質濃度は、１．４４５ｍｇ／ｍＬであった。ＳｉＲＮＡ濃度は、３００ｍＭスクロース中に、１５μＭであった。形成されたストック複合体の希釈は細胞培養液中の２０、１０、５ｎＭの濃度を与えた。
【０１４７】
該製剤に含有されるＲＮＡｉ分子を、ＰＴＥＮに対して配向し、配列は、次のとおりであった。次の配列、すなわちｕａａｇｕｕｃｕａｇｃｕｇｕｇｇｕｇｇ−Ｐを有する第一ストランド、配列ｃｃａｃｃａｃａｇｃｕａｇａａｃｕｕａ−Ｐを有する第二ストランドであり、それにより改変パターンは、太字で印刷されているヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであるようになっており、ストランドのうちのいずれかにおいて、３’末端は、上述の配列におけるＰによって示されるリン酸塩で開始する。
【０１４８】
４０，０００細胞／穴を各々含有する６穴プレートに含有されるＨｅＬａ細胞へ脂質製剤を投与した。ＰＴＥＮの発現について細胞を分析し、結果を図１３にウェスタンブロットとして示す。ｐ１１０ａ発現を負荷コントロールとして使用し、抗体によって検出した。図１３Ａおよび１３Ｂに示されるウェスタンブロットのうちのいずれかから、ＰＥＧ化合物の含有量、すなわち遮蔽化合物が５および７．５モル％まで増大し得るのに対し、濃度が、使用されるＰＥＧ５０００と比較してＰＥＧ２０００の場合、より高いかまたはこの範囲のより高い末端にあり得ることが挙げられ得る。
【０１４９】
このことは、ＰＥＧが脂質組成物から除去できないそれらのＰＥＧ含有組成物と比較した明確な利点である。セラミドＰＥＧ共役体よりもむしろ１〜５モル％の範囲にある１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン−ポリエチレン−グリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）を含む同様の組成物の脂質製剤によって、効率よいノックダウンのために提供するよう１〜２モル％の導入のみが可能となる。
【０１５０】
明細書、請求項、および／または図において開示される本発明の特長は、個別でもそれらのいずれかの組み合わせにおいても、そのさまざまな形態において本発明を具現化するための材料であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
より特別には、
【図１】図１は、本発明に記載の陽イオン性脂質の基本的なデザインを示す。
【図２】図２は、本発明に記載の化合物の合成についての考えられ得る出発材料であるＮ−オレイル−パルミチルアミンの合成を示す。
【図３】図３は、本発明に記載の重要な出発材料であるＮ−オレイル−パルミチルアミンの合成を示す。
【図４】図４〜９は、三塩酸β−アルギニル−２，３−アミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド、三塩酸β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド、および三塩酸ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドの合成を示す。
【図５】図４〜９は、三塩酸β−アルギニル−２，３−アミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド、三塩酸β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド、および三塩酸ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドの合成を示す。
【図６】図４〜９は、三塩酸β−アルギニル−２，３−アミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド、三塩酸β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド、および三塩酸ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドの合成を示す。
【図７】図４〜９は、三塩酸β−アルギニル−２，３−アミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド、三塩酸β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド、および三塩酸ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドの合成を示す。
【図８】図４〜９は、三塩酸β−アルギニル−２，３−アミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド、三塩酸β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド、および三塩酸ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドの合成を示す。
【図９】図４〜９は、三塩酸β−アルギニル−２，３−アミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド、三塩酸β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド、および三塩酸ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドの合成を示す。
【図１０】図１０は、本発明に記載の陽イオン性脂質の合成についての代替成分である、代替陽イオン性頭部基の合成を示す。
【図１１−１】図１１は、三塩酸ベータ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドの合成についての代替的な合成経路を示す。
【図１１−２】図１１は、三塩酸ベータ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドの合成についての代替的な合成経路を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、本発明に記載の脂質製剤の大きさ分布、ならびに押し出し形成および高圧均質化の影響をそれぞれ示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、本発明に記載の脂質製剤の大きさ分布、ならびに押し出し形成および高圧均質化の影響をそれぞれ示す。
【図１３Ａ】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＰＥＧにより置換された脂質の異なる濃度のウェスタンブロット分析の結果および影響を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＰＥＧにより置換された脂質の異なる濃度のウェスタンブロット分析の結果および影響を示す。
【図１】
2008525514.tif 000014
【図２】
2008525514.tif 000015
【図３】
2008525514.tif 000016
【図４】
2008525514.tif 000017
【図５】
2008525514.tif 000018
【図６】
2008525514.tif 000019
【図７】
2008525514.tif 000020
【図８】
2008525514.tif 000021
【図９】
2008525514.tif 000022
【図１０】
2008525514.tif 000023
【図１１−１】
2008525514.tif 000024
【図１１−２】
2008525514.tif 000025
【図１２Ａ】
2008525514.tif 000026
【図１２Ｂ】
2008525514.tif 000027
【図１３Ａ】
2008525514.tif 000028
【図１３Ｂ】
2008525514.tif 000029
【配列表】
2008525514000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月2日(2007.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの第一脂質成分、
少なくとも１つの第一ヘルパー脂質、および
ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で脂質組成物から除去できる遮蔽化合物
を含む、脂質組成物。
【請求項２】
前記遮蔽化合物が、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）、およびポリプロポレンを含む群より選択される、請求項１に記載の脂質組成物。
【請求項３】
前記遮蔽化合物が、ＰＥＧ２０００またはＰＥＧ５０００である、請求項２に記載の脂質組成物。
【請求項４】
前記組成物が、さらなる構成および／または第二ヘルパー脂質を含む、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項５】
前記脂質組成物が、核酸を含み、それにより該核酸が、好ましくは前記さらなる構成である、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項６】
前記核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）を含む群より選択される、請求項５に記載の脂質組成物。
【請求項７】
前記遮蔽化合物が、ＰＥＧとセラミドとのコンジュゲートである、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項８】
前記セラミドが、少なくとも１つの６〜１０の炭素原子、好ましくは８の炭素原子の短い炭素鎖置換基を含む、請求項７に記載の脂質組成物。
【請求項９】
前記セラミドが、第一ヘルパー脂質である、請求項７〜８のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項１０】
前記セラミドが、第二ヘルパー脂質である、請求項７〜８のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項１１】
前記遮蔽化合物が、前記核酸へ結合される、請求項５〜６のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項１２】
前記遮蔽化合物が、リンカー部分によって前記核酸に結合され、好ましくはリンカー部分によって前記核酸に共有結合される、請求項１１に記載の脂質組成物。
【請求項１３】
前記リンカー部分が、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ペプチド、Ｓ−Ｓリンカー、およびｐＨ感受性リンカーを含む群より選択される、請求項１２に記載の脂質組成物。
【請求項１４】
前記核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｉＮＡを含む群より選択され、前記リンカーが、センス鎖の３’末端に結合される、請求項１１〜１３のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項１５】
前記遮蔽化合物が、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分を含む、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項１６】
前記リンカーまたは部分が、陰イオン性リンカーまたは陰イオン性部分である、請求項１５に記載の脂質組成物。
【請求項１７】
前記陰イオン性リンカーまたは陰イオン性部分が、酸性環境においてほとんど陰イオン性または中性ではなく、それにより好ましくは該酸性条件がエンドソームである、請求項１６に記載の脂質組成物。
【請求項１８】
前記ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分が、オリゴ（グルタミン酸）、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢酸を含む群より選択される、請求項１５〜１７のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項１９】
前記第一脂質成分が、式（Ｉ）
【化１】
2008525514.tif 000030
（式中、Ｒ１およびＲ２は、アルキルを含む群より各々独立して選択され、
ｎは、１〜４の任意の整数であり、
Ｒ３は、リジル、オルニチル、２，４−ジアミノブチリル、ヒスチジル、および式（ＩＩ）
【化２】
2008525514.tif 000031
（式中、ｍは、１〜３の任意の整数であり、場合によりＮＨ３＋を欠き、そしてＹは、薬学的に許容される陰イオンである。）に記載のアシル部分を含む群より選択されるアシルである。）
に記載の化合物である、請求項１〜１８のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２０】
Ｒ１およびＲ２が、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、およびオレイルを含む群より各々独立して選択される、請求項１９に記載の脂質組成物。
【請求項２１】
Ｒ１が、ラウリルであり、Ｒ２が、ミリスチルであるか、または
Ｒ１が、パルミチルであり、Ｒ２が、オレイルである、請求項１９および２０のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２２】
ｍが、１または２である、請求項１９〜２１のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２３】
前記化合物が、好ましくは陰イオンＹ−と会合した陽イオン性脂質である、請求項１９〜２２のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２４】
Ｙ−が、ハロゲニド、アセテート、およびトリフルオロアセテートを含む群より選択される、請求項１９〜２３のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２５】
前記化合物が、
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリド
【化３】
2008525514.tif 000032
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド
【化４】
2008525514.tif 000033
ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミドトリヒドロクロリド
【化５】
2008525514.tif 000034
を含む群より選択される、請求項１９〜２４のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、担体を含む、請求項１〜２５のうちのいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２６のうちのいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に活性のある化合物と、好ましくは薬学的に許容され得る担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項２８】
前記薬学的に活性のある化合物および／または前記さらなる構成体が、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸を含む群より選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記タンパク質が、抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびＬＮＡを含む群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記核酸が、機能的核酸であり、それにより、好ましくは前記機能的核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピゲルマーを含む群より選択される、請求項２８または３０のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
好ましくは、前記第一および／または前記第二ヘルパー脂質が、セラミドとは異なるという条件のもとで、前記第一ヘルパー脂質および／または第二ヘルパー脂質が、リン脂質およびステロイドを含む群より選択される、請求項１〜３１のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第一および／または第二ヘルパー脂質またはヘルパー脂質成分が、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンおよび１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンを含む群より選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ヘルパー脂質成分の含有量が、前記組成物の全体的な脂質含有量の約２０〜約８０モル％である、請求項３２〜３３のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ヘルパー脂質成分の含有量が、約３５〜約６５モル％である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記脂質が、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドであり、前記ヘルパー脂質が、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンである、請求項３３〜３５のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記脂質が、前記組成物の全体的な脂質含有量の５０モル％であり、前記ヘルパー脂質が、５０モル％である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物が、さらに第二ヘルパー脂質を含む、請求項４〜３７のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記第一および／または前記第二ヘルパー脂質が、ＰＥＧ部分、ＨＥＧ部分、ポリヒドロキシエチルスターチ（ｐｏｌｙＨＥＳ）部分及びポリプロピレン部分を含む群より選択される群を含み、該部分が、好ましくは約５００〜１００００Ｄａの、より好ましくは約２０００〜５０００Ｄａの分子量を与える、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
ＰＥＧ部分を含む前記ヘルパー脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンおよび１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンを含む群より選択される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ヘルパー脂質の前記ＰＥＧ部分が、２，０００〜５，０００Ｄａの分子量を、好ましくは２，０００Ｄａの分子量を有する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物が、脂質成分としてβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリヒドロクロリドを、第一ヘルパー脂質として１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミンを、および第二ヘルパー脂質として１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン−ＰＥＧ２０００を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記第二ヘルパー脂質の含有量が、約０．０５〜４．９モル％、好ましくは約１〜２モル％である、請求項３８〜４２のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記組成物が、約１〜１０モル％の、より好ましくは１〜７．５モル％の、および最も好ましくは１〜５モル％のＰＥＧおよび前記セラミドのコンジュゲートを含有する、請求項７〜１０および請求項１５〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記セラミドが、Ｃ８ｍであり、ＰＥＧが、ＰＥＧ２０００であり、ＰＥＧと前記セラミドとのコンジュゲートの含有量が、約１〜７．５モル％である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記セラミドが、Ｃ８ｍであり、ＰＥＧが、ＰＥＧ５０００であり、ＰＥＧと前記セラミドとのコンジュゲートの含有量が、約１〜５モル％である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
前記第一脂質成分の含有量が、約４２．５〜５０モル％であり、前記第一脂質の含有量が、約４２．５〜５０モル％であり、それにより、前記第一脂質成分、前記第一ヘルパー脂質、ならびにＰＥＧとセラミドとのコンジュゲートの含有量の合計が、１００モル％である、請求項４３〜４５のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記機能的核酸が、二本鎖リボ核酸であり、前記組成物がさらに、核酸を、好ましくは、より好ましくは二本鎖リボ核酸である機能的核酸を、最も好ましくは、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、およびリボザイムを含む群より選択される核酸であり、それにより好ましくは、陽イオン性脂質に対するＲＮＡｉのモル比が、約０〜０．０７５であり、好ましくは約０．０２〜０．０５であり、さらにより好ましくは０．０３７である、請求項１〜４７のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記第一脂質成分および／または前記ヘルパー脂質の少なくとも一つおよび／または前記遮蔽化合物が、水性媒体中の分散物として存在する、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記第一脂質成分および／または前記ヘルパー脂質の少なくとも一つおよび／または前記遮蔽化合物が、水混和性溶媒中の溶液として存在し、それにより好ましくは、前記溶媒が、エタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールを含む群より選択される、請求項１〜４８のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
薬物の製造のための、請求項１〜５０のうちのいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項５２】
転移剤としての、請求項１〜５０のうちのいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項５３】
前記転移剤が、薬学的に活性のある成分および／またはさらなる構成体を細胞、好ましくは哺乳類細胞、およびより好ましくはヒト細胞に転移させる、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
下記工程：
−  細胞または膜を提供すること、
−  請求項１〜５０のうちのいずれか一項に記載の組成物を提供し、それにより前記組成物が前記薬学的に活性のある化合物および／または前記さらなる構成体を含むこと、および
前記細胞または前記膜を、請求項１〜５０のうちのいずれか一項に記載の組成物と接触させること
を含む、薬学的に活性のある化合物および／またはさらなる構成体を前記細胞内にか、または前記膜、好ましくは細胞膜を横切って転移させるための方法。
【請求項５５】
前記方法が、さらなる工程として、前記薬学的に活性のある化合物および／または前記さらなる構成体を前記細胞中でおよび／または前記膜を越えて検出することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
請求項１〜５０のいずれか一項に記載の脂質組成物及びｓｉＲＮＡを含むリポプレックス。
【国際調査報告】
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