(57)【要約】本発明はポリケチドおよび他の天然物の製造に関し、また、化合物のライブラリと個々の新規な物質に関する。一つの態様において、本発明は１７−デスメチルラパマイシン（17-desmethylrapamycin）およびその相同物、遺伝子組換技術を含むそれらの製造方法、および本発明物質の単離および用法を与える。他の態様において、本発明は１７−デスメチルラパマイシンおよびその相同物を、免疫抑制の誘発または維持、神経再生の刺激、または癌、Ｂ細胞性悪性腫瘍、真菌感染、移植片対宿主病、自己免疫疾患、炎症血管疾患、繊維化疾患の治療に用い、さらには創傷治癒標準に用いることを提案する。【選択図】図１
2008509895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１７−デスメチルラパマイシンおよびその相同物。
【請求項２】
化１で表される化合物。
【化１】
2008509895.tif 000027
【請求項３】
化１においてＲ４が基Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＦから選ばれる構造フラグメントを表し、Ｒ7がＨ，ＯＨまたはＯＭｅを表し、Ｒ8がＨ，ＯＨ，ＯＭｅ，ＣｌまたはＦを表す、請求項２の化合物。
【請求項４】
Ｒ４が化３（Ｒ7はＨまたはＯＨを表し、Ｒ8はＨ，ＯＨまたはＯＭｅを表す）に示す基Ａ（ｉ），Ｃ（ｉ），Ｅ（ｉ）およびＦ（ｉ）から選ばれる構造フラグメントを表す、請求項３の化合物。
【化３】
2008509895.tif 000028
【請求項５】
Ｒ５がＯＨを表すときＲ６はＨであり、Ｒ６がＯＨを表すときＲ５はＨである、請求項１〜４のいずれかの化合物。
【請求項６】
ｘが直接結合またはＣＨ２を表す、請求項１〜５のいずれかの化合物。
【請求項７】
ｘがＣＨ２を表す、請求項１〜６のいずれかの化合物。
【請求項８】
Ｒ2がＯＨを表す、請求項１〜７のいずれかの化合物。
【請求項９】
Ｒ１が（Ｈ，Ｈ）を表し、Ｒ２がＯＨを表し、Ｒ３がＨを表し、Ｒ４が化３の構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７およびＲ８が共にＯＨを表し、ｘがＣＨ２を表す、請求項１〜８のいずれかの化合物。
【請求項１０】
Ｒ１が（Ｈ，Ｈ）を表し、Ｒ２がＯＨを表し、Ｒ３がＨを表し、Ｒ４が化３の構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＨを表し、ｘがＣＨ２を表す、請求項２の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１が（Ｈ，Ｈ）または＝Ｏを表し、Ｒ２がＯＨまたはＯＭｅを表し、Ｒ３がＨまたはＯＭｅを表し、Ｒ４が化３の構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＨ，ＯＨまたはＯＭｅを表し、ｘがＣＨ２を表す、請求項２の化合物。
【請求項１２】
Ｒ１が＝Ｏを表し、Ｒ２がＯＨまたはＯＭｅを表し、Ｒ３がＨ，ＯＨまたはＯＭｅを表し、Ｒ４が化３の構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＦまたはＣｌを表し、ｘがＣＨ２を表す、請求項２の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１が＝Ｏを表し、Ｒ２がＯＨを表し、Ｒ３がＯＭｅを表し、Ｒ４が化３の構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＨを表し、ｘがＣＨ２を表す、請求項２の化合物。
【請求項１４】
Ｒ１が＝Ｏを表し、Ｒ２がＯＨを表し、Ｒ３がＯＨを表し、Ｒ４が化３の構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＨを表し、ｘがＣＨ２を表す、請求項２の化合物。
【請求項１５】
Ｒ１が＝Ｏを表し、Ｒ２がＯＨを表し、Ｒ３がＯＭｅを表し、Ｒ４が化３の構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＯＭｅを表し、ｘがＣＨ２を表す、請求項２の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の医療用化合物。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物を、免疫抑制の誘導または維持、神経再生の刺激、または癌、Ｂ−細胞悪性腫瘍、真菌感染症、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性疾患および血管疾患の治療のための調合に用いる用途。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能なキャリアからなる医薬品。
【請求項１９】
請求項１または２記載の１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物の産生方法であって、
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインをマロニル−ＣｏＡ−特異的ＡＴドメインで置換するステップと、
（ｂ）遺伝子操作されたラパマイシンＰＫＳを適当な宿主細胞において発現させるステップと、
（ｃ）前記宿主細胞を１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物が産生される条件下で培養し、任意に外因性前駆物質を供給するステップと、
（ｄ）任意に前記産生された化合物を単離するステップと、
を含む方法。
【請求項２０】
モジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインがマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインで置換された、遺伝子操作されたラパマイシンポリケチド合成酵素をエンコードする生合成クラスターを含む組換え菌株を産生する方法。
【請求項２１】
モジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、ラパマイシン、モネンシン、ＦＫ５０６、エリスロマイシン、ＦＫ５２０、アンフォテリシン、アンゴラマイシン、チロシン、「ｈｙｇ」、ＦＫ５２３、メリダマイシン、アンタスコマイシン、ＦＫ５２５およびツクバマイシンのクラスター群の一つから選択されるマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインで置換される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインがラパマイシン、モネンシンおよびＦＫ５０６のクラスター群の一つから選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記ＡＴドメインは、ラパマイシンモジュール２由来ＡＴドメイン、モネンシンモジュール３由来ＡＴドメイン、モネンシンモジュール６由来ＡＴドメイン、モネンシンモジュール８由来ＡＴドメイン、ＦＫ５０６モジュール３由来ＡＴドメインおよびＦＫ５０６モジュール７由来ＡＴドメインからなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインがラパマイシンモジュール２に由来する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９〜２４のいずれかに記載の方法であって、
（ａ）導入すべきＡＴを、適当な隣接制限部位を有する単一のＤＮＡフラグメントで単離するステップと、
（ｂ）適切な制限部位を用いて、目的ＡＴの隣接配列と相同であるＤＮＡ配列の領域を増幅させて単離するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）に記述した３つのＤＮＡフラグメントを共にリゲート（結紮）してＬＨＳ相同体、次いでドナーＡＴドメイン、次いでＲＨＳ相同体のインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）配列を得るステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの完全な配列を宿主株内への導入のためのベクター内に導入して最終プラスミドを得るステップであって、前記プラスミドが、
ｉ）接合のためのｏｒｉＴと、
ｉｉ）一つ以上の耐性マーカーと、
ｉｉｉ）成分が３７℃培養で選ばれるようにするための温度感受性複製原点と、
ｉｖ）Ｅ．ｃｏｌｉの複製原点と、
を含むステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で記述した最終プラスミドを用い、接合により宿主株を形質変換させるステップと、
（ｆ）関連抗生剤に対する耐性により形質変換体を選択するステップと、
（ｇ）抗生剤選択と共に３７℃で培養させることにより、一次成分を産生させるステップと、
（ｈ）抗生剤選択の不存在下で同様に３７℃で培養することにより、二次組換え体を選別するステップと、
（ｉ）所望の菌株を、その目的産生物を産生する能力によって同定するステップと、
（ｊ）任意に標準的方法により菌株の遺伝的特徴を確認するステップと、
を含む方法。
【請求項２６】
１７−デスメチルラパマイシン相同物の産生方法であって、
（ａ）請求項２０記載の方法に従い、ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインで置換された組換え菌株を産生させるステップと、
（ｂ）ポリケチド産生に適当な条件下で、前記組換え菌株に非天然スターター酸を供給するステップと、
を含む方法。
【請求項２７】
１７−デスメチルラパマイシン相同物の産生方法であって、
（ａ）請求項２０記載の方法に従い、ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインで置換された組換え菌株を産生させるステップと、
（ｂ）ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱから選択される一つ以上のラパマイシン補助遺伝子を付加的に欠失または不活性化させるステップと、
（ｃ）得られた菌株を、必要に応じて、任意に外因性前駆物質の存在下で培養して、１７−デスメチルラパマイシン相同物を産生するステップと、
を含む方法。
【請求項２８】
１７−デスメチルラパマイシン相同物の産生方法であって、
（ａ）請求項２０記載の方法に従い、ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインで置換された組換え菌株を産生させるステップと、
（ｂ）ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱから選択される一つ以上のラパマイシン補助遺伝子を付加的に欠失または不活性化させるステップと、
（ｃ）補助遺伝子の全部または部分集合をｉｎ−ｔｒａｎｓで再導入し、前記欠失を補完または部分的に補完するステップと、
（ｄ）得られた菌株を、必要に応じて、任意に外因性前駆物質の存在下で培養して、１７−デスメチルラパマイシン相同物を産生するステップと、
を含む方法。
【請求項２９】
１７−デスメチルラパマイシン相同物の産生方法であって、
（ａ）請求項２０記載の方法に従い、ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインで置換された組換え菌株を産生させるステップと、
（ｂ）ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱから選択される一つ以上のラパマイシン補助遺伝子を付加的に欠失または不活性化させるステップと、
（ｃ）任意に補助遺伝子の全部または部分集合をｉｎ−ｔｒａｎｓで再導入し、前記欠失を補完または部分的に補完するステップと、
（ｄ）ポリケチド産生に適当な条件下で、前記組換え菌株に非天然スターター酸を供給するステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリケチドおよびその他の天然生成物の製造、および化合物と個別の新規化合物のライブラリに関する。したがって、一態様において、本発明は、１７−デスメチルラパマイシン（17-desmethylrapamycin）およびその相同物、遺伝子組み換え技術を含むそれらの製造方法、および本発明化合物の単離および用途を提供する。別の態様において、本発明は、免疫抑制の誘導または維持、神経再生の刺激、または癌、Ｂ−細胞悪性腫瘍、真菌感染症、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性疾患、血管疾患および線維症の治療、および創傷治癒の調節における前記新規なラパマイシン相同物の用途を提供する。特定の一実施形態において、本発明は、１７−デスメチルラパマイシンおよびその相同物を産生する遺伝子操作された菌株を生成するため、ラパマイシンの産生を支配する生合成遺伝子を操作する方法を提供する。本発明はまた、このような菌株に非天然の酸出発物質を供給することで、１７−デスメチルラパマイシン相同物のライブラリを生成する方法、およびこのように製造された化合物のライブラリに関し、また、クローン化した遺伝子または遺伝子カセットが発現され、また他の相同物を生成する誘導菌株の生成、およびこれらの製造方法、および前記方法に採用される手段（例えば、核酸、ベクター、遺伝子カセットおよび遺伝子組み換え菌株）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラパマイシン（シロリムス）（図１）は、ピペコリン酸ラクトン（Ｐａｉｖａら、１９９１年）に連結された１，２，３−トリカルボニル部分を有する、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅＳ．ヒグロスコピカス）ＮＲＲＬ５４９１により産生される親油性マクロライド（Ｓｅｈｇａｌら、１９７５；Ｖｅｚｉｎａら、１９７５；米国特許第３，９２９，９９２号；米国特許第３，９９３，７４９号）。その他関連したマクロライド（図２）には、ＦＫ５０６（タクロリムス）（ＳｃｈｒｅｉｂｅｒおよびＣｒａｂｔｒｅｅ、１９９２年）、ＦＫ５２０（アスコマイシンまたはイムノマイシン）（Ｗｕら、２０００年）、ＦＫ５２５（Ｈａｔａｎａｋａ  Ｈら、１９８９年）、ＦＫ５２３（Ｈａｔａｎａｋａ，Ｈら、１９８８年）、アンタスコマイシン類（Ｆｅｈｒ，Ｔ．ら、１９９６年）およびメリダマイシン（Ｓａｌｉｔｕｒｏら、１９９５年）が挙げられる。本発明の目的のもとでは、ラパマイシンは、Ｆｉｎｄｌａｙら（１９８０年）または化情報索（第１１版インデックス蓄積本、１９８２〜１９８６年、ｐ６０７１９ＣＳ）の番号付け慣例よりは、ＭｃＡｌｐｉｎｅら（１９９１年）の番号付け慣例により記述される。
【０００３】
ラパマイシンのポリケチド骨格は、シキミ酸から誘導されたシクロヘキサンカルボン酸出発物質単位で、計７つのプロピオン酸単位および７つの酢酸単位を、頭−尾縮合して合成される（Ｐａｉｖａら、１９９１年）。Ｌ−リシンから誘導されたアミノ酸であるピペコリン酸は、前記ポリケチド骨格の最後の酢酸にアミド連結を通じて縮合され（Ｐａｉｖａら、１９９３年）、次いでラクトン化して大員環を形成する。前記生合成遺伝子クラスターを含む１０７ｋｂゲノム領域の配列分析が行われた（Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、１９９５年）。読み取り枠の分析結果は、モジュラーポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）をコードする３つの巨大遺伝子を示した（Ａｐａｒｉｃｉｏら、１９９６；Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、１９９５年）。前記ＰＫＳ遺伝子間には、非リボソームペプチド合成酵素の活性化ドメインと配列類似性を有するタンパク質をコードするｒａｐＰ遺伝子が埋め込まれており、これは、同じように作用するものと考えられる（Ｋｏｎｌｇら、１９９７年）。前記ＰＫＳ遺伝子をコードする領域の両側面には、ラパマイシンの生合成に必要なものとに推定される酵素をコードする２４個の付加的な読み取り枠が位置している（Ｍｏｌｎａｒら、１９９６年）。ここには、下記のポリケチド後組み換え酵素が含まれるが、ＲａｐＪおよびＲａｐＮと命名された２つのシトクロムＰ−４５０モノオキシゲナーゼ、関連フェレドキシンであるＲａｐＯ、および３つのＳＡＭ−依存性Ｏ−メチルトランスフェラーゼであるＲａｐＩ、ＲａｐＭおよびＲａｐＱである。他の隣接した遺伝子は、ラパマイシンの調節および移出にあたって役目をするものと推定される（Ｍｏｌｎａｒら、１９９６年）。前記クラスターは、また遺伝子ｒａｐＬを含有するが、その生成物であるＲａｐＬは、Ｌ−リシンのシクロデアミン化を通じるラパマイシンの前駆物質であるＬ−ピペコリン酸の形成を触媒するものと提示される（Ｋｈａｗら、１９９８；Ｐａｉｖａら、１９９３年）。
【０００４】
ラパマイシンのポリケチド核心は、タイプＩポリケチド合成酵素（ｒａｐ  ＰＫＳ）を含む極めて巨大な多機能タンパク質により組み立てされる。このポリペプチド複合体は、１個の負荷モジュールおよび１４個の拡張モジュールを含み、それぞれのモジュールは、成長するポリケチド鎖への特定のアシル−ＣｏＡ前駆物質の付加と、β−ケトカルボニル基の還元度との全部の責任を負う。それぞれのモジュールは、前記ポリペプチドの特異的ドメインにより移行されるいくつかの生化学反応を行う。全ての拡張モジュールは、前駆物質からアシル基を選択した後、アシル担体タンパク質（ａｃｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＣＰ）ドメインに提供するアシル転移酵素（ＡＴ）ドメイン、および脱カルボキシル化縮合により、既存のポリケチド鎖を新たなアシル−ＡＣＰに付加するβ−ケト合成酵素（ｋｅｔｏｓｙｎｔｈａｓｅ；ＫＳ）ドメインを含む。一部の拡張モジュールには、付加的ドメインが存在するが、β−ケト基をヒドロキシルに還元させるβ−ケト還元酵素（ＫＲ）ドメイン、ヒドロキシルに作用し二重結合を生成する脱水酵素（ＤＨ）ドメイン、および二重結合を還元させ飽和炭素を生成するエノイル還元酵素（ＥＲ）ドメインである。モジュール３および６では、そこに存在するβ−ケト加工ドメインは、そのドメインの作用が最終の構造において反映されないので、不活性であるものと予想される。最終の拡張モジュール（拡張モジュール１４）は、β−ケト−加工ドメインを含まないものと見える。ラパマイシン生合成の開始は、シキミ酸経路に由来し（Ｌｏｗｄｅｎ，Ｐ．Ａ．Ｓら、２００１年）、ＦＫ５０６およびＦＫ５２０（図２）のようなその他のＦＫＢＰ−結合分子に共通の４，５−ジヒドロキシシクロヘキサ−１−エンカルボン酸の導入を通じて起きる。ポリケチドの生合成後には、ｒａｐＰによりコードされたＮＲＰＳモジュールがピペコリン酸（Ｌ−リシンから誘導されたもの）を導入し、これは、ポリケチド骨格の最終の酢酸にアミド連結を通じて縮合される（Ｐａｉｖａら、１９９３年）。以降は、ラクトン化が起こり大員環が形成される。
【０００５】
３つのラパマイシンＰＫＳ遺伝子のそれぞれ、すなわちＮＲＰＳをコードする遺伝子および前記側面に位置する後期の遺伝子配列に対するヌクレオチド配列、およびそれに該当するポリペプチドが、Ａｐａｒｉｃｌｏら、１９９６年およびＳｃｈｗｅｃｋｅら、１９９５年において同定され、ＮＣＢＩに受託番号Ｘ８６７８０で受託され、最近、この配列に対する訂正がＷＯ０４／００７７０９号に公開された。
【０００６】
最初のラパマイシン生合成クラスターの酵素フリー生成物は、前駆−ラパマイシンと命名された（ＷＯ０４／００７７０９、Ｇｒｅｇｏｒｙら、２００４年）。完全に加工されたラパマイシンの製造には、ラパマイシン後期遺伝子であるＲａｐＪ、ＲａｐＮ、ＲａｐＯ、ＲａｐＭ、ＲａｐＱおよびＲａｐＩによりコードされる酵素によるポリケチド／ＮＲＰＳ核心の付加的加工が要求される。
【０００７】
ラパマイシンは、前記化合物で示される広範囲な活性スペクトルにより、顕著な薬理学的価値があり；これは、前記薬物の新規な相同物を生成しなければならない必要性を強調させる。ラパマイシンは、適当な抗真菌活性を示し、主にカンジダ種に対して示すが、糸状菌に対しても示す（Ｂａｋｅｒら、１９７８年；Ｓｅｈｇａｌら、１９７５年；Ｖｅｚｉｎａら、１９７５年；米国特許第３，９２９，９９２号；米国特許３，９９３，７４９号）。ラパマイシンは、多様な細胞種類において信号伝達経路を標的化することにより、例えば、細胞周期のＧ１段階からＳｋｅｓｒＰに進行させる信号伝逹経路を阻害することにより、細胞増殖を阻害する（Ｋｕｏら、１９９２年）。Ｔ細胞ではラパマイシンがＩＬ−２受容体からの信号伝逹を阻害し、それに続くＴ細胞の自己増殖を阻害し、免疫抑制をもたらす。ラパマイシンの前記阻害作用は、Ｔ細胞にのみ限定されるものではなく、ラパマイシンは、多様な類型の哺乳類細胞増殖を阻害する（Ｂｒｕｎｎら、１９９６年）。従って、ラパマイシンは、臓器同種移植片拒絶反応の防止および自己免疫疾患の治療において既に確認されておりまたは予想される治療用途を有する強力な免疫抑制剤である（Ｋａｈａｎら、１９９１年）。４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン（ＳＤＺ  ＲＡＤ，Ｃｅｒｔｉｃａｎ，ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）は、免疫抑制薬理学的作用を示すラパマイシンの半合成相同物である（Ｓｅｄｒａｎｉ，Ｒ．ら、１９９８年；Ｋｉｒｃｈｎｅｒら、２０００年；米国特許第５，６６５，７７２）。前記薬物は、２００３年、ヨーロッパにおいて承認されており、すぐに米国でも承認されるものと期待される。ラパマイシンエステルＣＣＩ−７７９（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ社）は、試験管内で細胞成長を阻害し、生体内で腫瘍成長を抑制する（Ｙｕら、２００１年）。ＣＣＩ−７７９は、現在、フェーズＩＩＩ−臨床試験段階にある。慢性斑状乾癬の治療でのラパマイシンの価値（ＫｉｒｂｙおよびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ、２００１年）、ＰＣ１２細胞での神経突起派生の刺激と同じ效果の潜在的用途（Ｌｙｏｎｓら、１９９４年）、機械的損傷後の血管および平滑筋細胞による、サイトカインに対する増殖反応の遮断（Ｇｒｅｇｏｒｙら、１９９３年）、および同種移植片線維症の予防でのラパマイシンの役割（ＷａｌｌｅｒおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ、２００１年）が、集中研究分野である（ＫａｈａｎおよびＣａｍａｒｄｏ、２００１年）。最近、ラパマイシンが長期免疫抑制療法を受けている臓器同種移植患者において、他の免疫抑制処方法を受ける患者に比べて癌発生率の低いことと関連があり、このような減少した癌発生率は、血管形成阻害によるものであると報告された（Ｇｕｂａら、２００２年）。イムノフィリンリガンドの神経栄養活性は、それらの免疫抑制活性に非依存的で（Ｓｔｅｉｎｅｒら、１９９７年）、国際特許出願ＷＯ０１／０３６９２号に要約されているように、神経成長刺激は、成熟したステロイド受容体複合体の崩壊により促進するものと報告された。高脂血症および血小板減少症のような副作用を含めて、潜在的な催奇形効果があるものと報告された（Ｈｅｎｔｇｅｓら、２００１年；ＫａｈａｎおよびＣａ���ａｒｄｏ、２００１年）。
【０００８】
ラパマイシンは、高等真核生物においてリボソームタンパク質Ｓ６を、リン酸化させるセリン／スレオニンキナーゼであるｐ７０Ｓ６ｋキナーゼの阻害を通じて細胞内で情報伝達増幅経路に影響を与える（Ｆｅｒｒａｒｉら、１９９３年；Ｋｕｏら、１９９２年）。前記Ｓ６タンパク質は、リボソームの４０Ｓサブユニットに位置し、ｔＲＮＡとｍＲＡＮ結合と関連した重要な機能的部位であるものと推定される。ｐ７０Ｓ６ｋによるＳ６リン酸化反応を通じたｍＲＡＮ翻訳に対して調節機能があるものと主張された（Ｋａｗａｓｏｍｅら、１９９８年）。ラパマイシンは、サイクリン依存性キナーゼの活性、ｃＡＭＰ−反応要素調節者（ＣＲＥＭ）のリン酸化および伸長因子結合タンパク質４Ｅ−ＢＰ１（ＰＨＡＳ１）のリン酸化を含めた他の増殖関連イベントに対するその效果を通じてタンパク質合成を阻害する（Ｈｕｎｇら、１９９６年）。前記薬物は、翻訳開始因子ｅＩＦ−４Ｅに結合する４Ｅ−ＢＰ１の脱リン酸化種の蓄積を誘導し、ｃａｐ−依存性ｍＲＮＡの翻訳開始を抑制する（Ｈａｒａら、１９９７年；Ｒａｕｇｈｔら、２００１年）。
【０００９】
今まで特性化されたラパマイシンの薬理学的作用は、ＦＫＢＰまたはイムノフィリンと呼ばれるシトソル受容体との相互作用により媒介されるものと推定される。イムノフィリン（この用語は、免疫抑制剤と結合するタンパク質を意味するものと用いられる）は、シスおよびトランスペプチド性プロリン結合の異性化を触媒し、広範囲な生物体で発見される、高度に保存された酵素族に属する（ＲｏｓｅｎおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、１９９２年）。イムノフィリン族に属する２つの大型酵素群は、ＦＫＢＰおよびサイクロフィリンにより代表される（ＳｃｈｒｅｉｂｅｒおよびＣｒａｂｔｒｅｅ、１９９２年）。真核生物Ｔ−細胞の主要細胞内ラパマイシン受容体は、ＦＫＢＰ１２（ＤｉＬｅｌｌａおよびＣｒａｉｇ、１９９１年）であり、それによる複合体は、標的タンパク質と特異的に相互作用し、細胞の情報伝達増幅経路を阻害する。ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体の結晶構造の分析として、「結合ドメイン」と呼ばれるラパマイシン−結合薬理作用団が確認された（ＶａｎＤｕｙｎｅら、１９９３年）（図１参照）。前記「結合ドメイン」は、イムノフィリンとの相互作用のために必要であり、エステル結合、ピペコリン酸−誘導環、ジカルボニルおよびヘミケタール環を含むＣ−１〜Ｃ４領域からなる。前記相互作用は、多数の疎水性接触、およびシクロヘキサン環上のヒドロキシル基への結合を含む一部の水素結合により特徴付けられる。ピペコリニル環（Ｃ２〜Ｎ７）は、タンパク質中に最も深く侵透するが、ここでは、疎水性結合空洞に存在する、高度に保存された芳香族アミノ酸残基により取り囲まれるようになる。Ｃ１およびＣ８カルボニル基は、全て水素結合に関連し、Ｃ９カルボニル基は、ＦＫＢＰ１２中に３つの完璧に保全された芳香族アミノ酸残基（１つのチロシンおよび２つのフェニルアラニン酸残基）により形成されたポケット内に伸びている。標的タンパク質と相互作用するイムノフィリン−リガンド複合体のドメインは、ＦＫＢＰから遠ざかるように飛び出している。
【００１０】
大部分のイムノフィリンは、免疫抑制活性に直接関連のあるように見えず、ＦＡＰ４８およびＦＡＰ１のような、ＦＫＢＰ−関連タンパク質（ＦＡＰ）と呼ばれるＦＫＢＰの天然リガンドの候補が報告されてはいるが、これらの天然リガンドについては比較的知られていない。複合体形成中のＦＰＡとＦＫＢＰの特異的相互作用は、投与量に依存的な方式で、ラパマイシンにより防止された（Ｃｈａｍｂｒａｕｄら、１９９６；Ｋｕｎｚら、２０００年）。イムノフィリンは、タンパク質折り畳み、タンパク質の組立ておよび輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、熱ショックタンパク質を含む分子複合体の共同調節、ステロイド受容体、イオンチャンネル、細胞間相互作用および遺伝子の転写および翻訳のような広範囲な細胞活性において機能するものと見える（Ｇａｌａｔ  ２０００年；ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＳｔｅｉｎｅｒ  １９９８年）。全てのイムノフィリンは、ペプチド性プロリンのシス−トランス異性化のタンパク質折り畳み特性を保有し、いくつかのイムノフィリンは、細胞内重要タンパク質合成部位である小胞体内に位置することにより発見される。ＦＫＢＰ１２（米国特許第５，１０９，１１２号）以外にも、他のイムノフィリンとしては、ＦＫＢＰ１２．６（米国特許第５，４５７，１８２号）、ＦＫＢＰ１３（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら、１９９３年；米国特許第５，４９８，５９７号）、ＦＫＢＰ２５（ＨｕｎｇおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、１９９２年；Ｊｉｎら、１９９２年）、ＦＫＢＰ１４．６（米国特許第５，３５４，８４５号）、ＦＫＢＰ５２（米国特許第５，７６３，５９０号）、ＦＫＢＰ６０（Ｙｅｍら、１９９２年）およびＦＫＢＰ６５（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、２０００年）が挙げられる。
【００１１】
ラパマイシン−ＦＫＢＰ１２複合体の標的は、酵母では、ＴＯＲ（ラパマイシンの標的）と確認され（Ａｌａｒｃｏｎら、１９９９年）、それに該当する哺乳動物タンパク質は、ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ−ラパマイシン関連タンパク質）またはｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的）と知られている（Ｂｒｏｗｎら、１９９４年）。これらのタンパク質は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼのホスホトランスフェラーゼドメインと相当な類似性を示し、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）での点突然変異がｍＴＯＲキナーゼ活性を無くすという観察結果は、キナーゼドメインの機能でのＦＲＢの連関性に対する証拠を提供する（Ｖｉｌｅｌｌａ−Ｂａｃｈら、１９９９年）。ＦＲＢドメインを含むｍＴＯＲの切断型とＦＫＢＰ１２−ラパマイシンの結晶構造（Ｃｈｅｎら、１９９５年）が得られ、これにより、ラパマイシンの「エフェクター」ドメインが正義された（Ｃｈｏｉら、１９９６年；Ｌｉａｎｇら、１９９９年）。前記結晶構造の分析結果は、タンパク質間接触は、ラパマイシンと各タンパク質との相互作用に比べて比較的制限されることを示す。ラパマイシンとＦＲＢとの間には、水素結合が確認されなかった。相互作用は、ラパマイシンのトリエン領域とＦＲＢの主に芳香族である残基との間の一連の疎水性接触にのみ集中された（Ｌｉａｎｇら、１９９９年）。ラパマイシンの最も深く埋もれた原子は、Ｃ２３に付着したメチルである（図１参照）。ラパマイシンのＣ２３〜Ｃ３４領域およびシクロヘキシル輪がＦＲＢと疎水性接触をなす。ラパマイシンでは、二元複合体と三元複合体との間に少ない立体構造変化があることが明白であった（Ｌｉａｎｇら、１９９９年）。
【００１２】
Ｃ１６メトキシ基で組み換えられたラパマイシン相同物の生物学的效果と、これらのＦＫＢＰ１２に結合する能力との間の差が調査されており、ＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲとの間の界面空間でのＣ１６置換体の位置が提示された（Ｌｕｅｎｇｏら、１９９５年）。ＦＫＢＰ１２と非免疫抑制性２８−Ｏ−メチルラパマイシンの結晶構造分析結果は、ｍＴＯＲ結合の崩壊をもたらすこともある、シクロヘキシル環の配向での相当な差を示した（Ｋａｌｌｅｎら、１９９６年）。
【００１３】
ｍＴＯＲ信号伝逹とニューロンでの局所的タンパク質合成との間の連結、翻訳制御に関連したタンパク質のリン酸状態に対するその效果、転写および翻訳段階での翻訳機構成分の豊富、アミノ酸透過酵素活性の制御および代謝経路に関与した多くの酵素の転写の調整について記述された（Ｒａｕｇｈｔら、２００１年）。ラパマイシン感受性のシグナル伝逹経路も、胎児脳の発達、学習および記憶形成に重要な役目をするものと見える（Ｔａｎｇら、２００２年）。酵母のＴＯＲタンパク質に関する研究でも、栄養感受性のシグナル伝逹経路を調節するのに役目をするものと示された（Ｈａｒｄｗｉｃｋら、１９９９年）。同様に、ｍＴＯＲは、タンパク質キナーゼＢ（ａｋｔ）の作用に対する直接的な標的であり、インスリンのシグナル伝達において、主要な役目をするものと確認された（Ｓｈｅｐｈｅｒｄら、１９９８年；Ｎａｖｅら、１９９９年）。哺乳類ＴＯＲはまた、アクチン細胞骨格の分極化、および翻訳開始の調節に関連している（Ａｌａｒｃｏｎら、１９９９年）。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、例えば、ｍＴＯＲは、細胞周期進行、癒着、細胞生存および血管形成のような腫瘍の病原性のいくつかの側面で機能がある（ＲｏｙｍａｎｓおよびＳｌｅｇｅｒｓ、２００１年）。
【００１４】
また、異なる細胞種類に存在する復讐のＦＫＢＰは、潜在的に変化した結合および／または作用基ドメインを有する新規なＦＫＢＰ−リガンド相同物の単離での活用性を示す。例えば、ステロイド受容体複合体の一部を形成する異性化酵素（ｒｏｔａｍａｓｅ）であるＦＫＢＰ５２の阻害が、ラパマイシン相同物（およびその他のＦＫＢＰ１２−結合化合物）の神経細胞再生および神経突起伸長を緩和させる作用機序であるものと確認された（ＷＯ０１／０３６９２号）。
【００１５】
ラパマイシンおよびラパマイシン相同物の薬物動態学的研究では、溶液中にさらに安定し、代謝作用攻撃にさらに耐性があり、および／または、向上した生体利用可能性のある、新規なラパマイシン化合物の開発に対する必要性が立証された。化学的に利用可能な位置を用いたラパマイシンの組み換えについて広範囲に提起された（下記参照）。しかしながら、このような接近法は、化学的組み換えに利用可能ないくつかの部位にのみ制限され、分子上の他の反応性部位の存在下で、特定の位置に選択的な組み換えをなすのに対する困難性により、その活用性がまた限定される。
【００１６】
分子の化学的に利用可能な部位を用いて合成された一群のラパマイシン相同物が報告された。下記化合物に対する記述には、図１に記述されたラパマイシン分子の付番方式を適用させた。相同化または置換のための分子上の化学的に利用可能な部位には、Ｃ４０およびＣ２８ヒドロキシル基（例えば、米国特許第５，６６５，７７２号、米国特許第５，３６２，７１８号）、Ｃ３９およびＣ１６メトキシ基（例えば、ＷＯ９６／４１８０７号、米国特許第５，７２８，７１０号）、Ｃ３２、Ｃ２６およびＣ９ケト基（例えば、米国特許第５，３７８，８３６号、米国特許第５，１３８，０５１号、米国特許第５，６６５，７７２号）が含まれる。トリエンを標的にしたＣ１７、Ｃ１９および／またはＣ２１での水添は、抗真菌活性は維持するが、免疫抑制特性の相対的損失をもたらした（例えば、米国特許第５，３９１，７３０号、米国特許第５，０２３，２６２号）。分子の安全性に対する相当な改善（例えば、Ｃ３２、Ｃ４０および／またはＣ２８でのオキシムの形成、米国特許第５，５６３，１４５号、米国特許第５，４４６，０４８号）、代謝作用攻撃に対する耐性（例えば、米国特許第５，９１２，２５３号）、生体利用可能性（例えば、米国特許第５，２２１，６７０号、米国特許第５，９５５，４５７号、ＷＯ９８／０４２７９号）および前駆薬物の製造（例えば、米国特許第６，０１５，８１５号、米国特許第５，４３２，１８３号）が、相同化を通じて達成された。しかしながら、化学的組み換えには相当量のラパマイシン鋳型が必要であり、塩基と酸に脆弱な化合物であるので、作業することが困難である。化学的相同化は、基に対して選択的であり得るのに対して、部位に対しては頻繁に選択的ではないことがある。従って、化学的組み換えには、頻繁に複数の保護および脱保護段階が必要であり、多様な収率で混合生成物を生成することができる。
【００１７】
新規なラパマイシン相同物を生成するための生物学的アプローチは、Ｓ．ヒグロスコピカスからラパマイシンの生合成遺伝子クラスターの配列が入手可能であったにもかかわらず（Ａｐａｒｉｃｉｏら、１９９６年；Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、１９９５年）、産生する微生物を用いる作業の際に直面する困難により、初期はあまり産生的ではなかった（Ｌｏｍｏｖｓｋａｙａら、１９９７年；Ｋｉｅｓｅｒら、２０００年）。本発明者らの最近の特許出願書には、ＰＫＳ後組み換え遺伝子の操作により、ラパマイシン生合成経路の変更を通じて、以前接近可能であったものよりも広い範囲のラパマイシン相同物が得られたことが記述されている（ＷＯ０４／００７７０９号）。また、ラパマイシン構造中に混入されるラパマイシンＰＫＳの天然反応誘発剤酸の代替物を供給することにより、また他の相同物も得られる（ＷＯ０４／００７７０９号）。このような方法は、ラパマイシン分子周囲の化学的空間にさらに多く近付させるのに対して、この技術は、タイプＩポリケチド合成酵素遺伝子によりコードされるラパマイシン分子の核心骨格を組み換えることはできない。
【００１８】
生体内変化およびファージに基づいた遺伝子組換えのような他の生物学的方法を用いて、ラパマイシン相同物を単離する方法も開示されている。突然変異株およびラパマイシン産生菌株の全てから付随的代謝産物を単離し、少量のラパマイシン相同物多数を得た。これらの菌株は、頻繁に収率が低く、ラパマイシン相同物の混合物を産生する。Ｓ．ヒグロスコピカスＮＣＩＭＢ  ４０３１９の培養液上澄液から２７−Ｏ−デスメチルラパマイシンおよび２７−デスメトキシラパマイシンを単離したことが報告された（Ｂｏｘら、１９９５年）。２７−Ｏ−デスメチルラパマイシンの抗真菌活性は、ラパマイシンの活性よりは低かったが、ＦＫＢＰ１２ＰＰＩ酵素（ＰＰＩａｓｅ）活性の阻害は増加されたものと示された。ネズミの脾臓Ｔ−細胞の、ＣｏｎＡで刺激された増殖の阻害、およびネズミの脾臓Ｂ細胞の、ＬＰＳで刺激された増殖の阻害は、ラパマイシンに比べて減少された（Ｂｏｘら、１９９５年）。同様に、ラパマイシン相同物であるプロリルラパマイシン、２７−Ｏ−デスメチルラパマイシンおよび２７−デスメトキシラパマイシン（図１に記載したようなラパマイシン分子の付番方式）の抗真菌活性は、ラパマイシンの活性よりも低かった（Ｗｏｎｇら、１９９８年）。ラパマイシン相同物（１６−Ｏ−デスメチルラパマイシン、２７−Ｏ−デスメチルラパマイシン、３９−Ｏ−デスメチルラパマイシン、１６，２７−Ｏ−ビスデスメチルラパマイシン、プロリルラパマイシン、２６−Ｏ−デスメチルプロリルラパマイシン、９−デオキソラパマイシン、２７−デスメトキシラパマイシン、２７−デスメトキシ−３９−Ｏ−デスメチルラパマイシン、９−デオキソ−２７−デスメトキシラパマイシン、２８−デヒドロラパマイシン、９−デオキソ−２７−デスメトキシ−３９−Ｏ−デスメチルラパマイシン）、また、アクチノプラネス種Ｎ９０２−１０９から、シトクロムＰ４５０阻害剤および／または前駆物質を培養液に供給し付加した後、または単離したラパマイシンの生体内変化後に単離した（Ｎｉｓｈｉｄａら、１９９５年）。しかしながら、このような阻害剤の使用は、特定酵素機能の標的化のみを可能とし、部位選択的ではなく、頻繁に生成物の混合物を結果とする。単一の選択された相同物の適切な産生は、この方法では可能ではない。単一の目的とする生成物の代わりにラパマイシン相同物の混合物が産生される結果は、また、収率に影響を及ぼす。前記化合物の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）阻害活性を評価したが、Ｃ２７または／およびＣ１６でのメチル基の損失後には、前記活性に対して效果が少ないものと検出された。９−デオキソラパマイシンにおいて活性のより顕著な減少が観察され；またＣ２７のメトキシ基、Ｃ２８のヒドロキシル基の損失、およびピペコリン酸−誘導基をプロリル基で置換することは、全て効能の減少をもたらした（Ｎｉｓｈｉｄａら、１９９５年）。同様に、ラパマイシンの生体内変化および１６，３９−Ｏ−ビスデスメチルラパマイシンの単離が報告された（ＷＯ９４／０９０１０号）。シクロヘキシル環に組み換えられた化合物、例えば、３９−Ｏ−デスメチルラパマイシン、およびＳＤＺＲＡＤおよびＣＣＩ−７７９のようなＣ４０組み換えされた化合物を���いた細胞増殖分析における一部の阻害活性の維持は、分子のこの領域が免疫抑制および坑癌特性の全てを有する新規なラパマイシン相同物の生成のための標的であることを確認させる。
【００１９】
シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、シクロヘクサ−１−エンカルボン酸、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘクサ−３−エンカルボン酸、３−ヒドロキシシクロヘキス−４−エンカルボン酸、およびシクロヘプト−１−エンカルボン酸をラパマイシン−産生ワイルドタイプＳ．ヒグロスコピカスの培養液に供給した後、新規なラパマイシン相同物が得られることが報告され、これにより、ラパマイシンポリケチド合成酵素の負荷モジュールに弾力性があることが立証された（Ｐ．Ａ．Ｓ．Ｌｏｗｄｅｎ、博士学位論文、ケンブリッジ大学、１９９７；Ｌｏｗｄｅｎら、２００４年）。これらの新規ラパマイシン相同物は、天然出発物質である４，５−ジヒドロキシシクロヘキス−１−エンカルボン酸と競争的に産生され、収率が減少され混合生成物が得られた。
【００２０】
ラパマイシンを産生するＳ．ヒグロスコピカスＮＲＲＬ５４９１の培養液に（±）ニペコチン酸を供給し、Ｌ−ピペコリン酸の産生を阻害し、硫黄含有ピペコリン酸相同物（Ｓ）−１，４−ティアザン−３−カルボン酸または（Ｓ）−１，４−チアザン−４−カルボン酸を共同供給することにより、ラパマイシンの２つの新規硫黄含有ラパマイシン相同物を単離した（Ｇｒａｚｉａｎｉら、２００３年）。
【００２１】
多様なラパマイシン相同物を産生する２つの組換えＳ．ヒグロスコピカス菌株を、ファージ技術により媒介する生物学的方法を用いて単離したことが報告された（Ｌｏｍｏｖｓｋａｙａら、１９９７年）。添加されたプロリン相同物の存在下、Ｓ．ヒグロスコピカスｒａｐＬ欠失変異が新規なラパマイシン相同物であるプロリルラパマイシン、４−ヒドロキシプロリルラパマイシンおよび４−ヒドロキシプロリル−２６−デスメトキシラパマイシンを合成した（Ｋｈａｗら、１９９８年）。同様に、新規なラパマイシンである３−ヒドロキシ−プロリル−ラパマイシン、３−ヒドロキシ−プロリル−２６−デスメトキシ−ラパマイシン、およびトランス−３−アザ−ビシクロ［３，１，０］ヘキサン−２−カルボン酸ラパマイシンがＷＯ９８／５４３０８号に開示されたような突然変異株の供給された培養液から同定された。プロリルラパマイシンおよび４−ヒドロキシプロリル−２６−デスメトキシ−ラパマイシンの活性が増殖分析で評価されており、後者化合物の阻害活性は、ラパマイシンの活性に比べて顕著に低かった（Ｋｈａｗら、１９９８年）。Ｓ．ヒグロスコピカスＡＴＣＣ２９２５３においてファージに基づいた方法論を用い、５つの隣接したた遺伝子であるｒａｐＱＯＮＭＬ（Ｃ１６、Ｃ２７でのポリケチド後組み換えおよびＬ−ピペコルリンサンの産生を担当）の欠損およびこれらをネオマイシン耐性マーカーで置換した場合、ピペコリン酸を供給したとき、１６−Ｏ−デスメチル−２７−デスメトキシラパマイシンが産生された（Ｃｈｕｎｇら、２００１年）。このような欠失突然変異の補完は立証されていない。また、ＲａｐＭまたはＲａｐＱのいずれの部位−特異性も、前記研究では確認されていない：したがって、Ｃ１６−ＯＨまたはＣ２７−ＯＨにおけるメチル化を必要とするラパマイシン相同物の合理的設計は、Ｃｈｕｎｇらにより可能でなかった（２００１年）。前記ファージに基づいた方法論には、詳細に後述するように、いくつかの短所があるが、遺伝子配列の開示から９年という長期間にわたって、単に３種類の組換えＳ．ヒグロスコピカス菌株の産生のみが報告されたことが挙げられる。遺伝子組み換えされた菌株を得る方法が、複雑であり、かつ、日数が長くかかり、本発明者による以前の出願書（ＷＯ０４／００７７０９号）に開示された方法論に比べて活用性がより顕著に限定される。
【００２２】
生物学的方法を用いて遺伝子を変化させてラパマイシンを操作する通常のアプローチは、宿主株の染色体において個別的遺伝子を突然変異または欠損させること、および／または同定または異種の遺伝子の余分のコピーとして個別遺伝子を個別にまたは遺伝子カセットとして挿入することを含む（ＷＯ０１／７９５２０号、ＷＯ０３／０４８３７５号）。しかしながら、上記したような生物学的方法を用いた新規なラパマイシン相同物の単離は、ラパマイシンを産生する生物体であるＳ．ヒグロスコピカスを形質変換させることによる困難により制限された。プラスミドＤＮＡを用いた形質変換または接合伝達に頻繁に用いられる方法は、ラパマイシン産生菌株としては成功的ではなかったものと報告された（Ｌｏｍｏｖｓｋｙａら、１９９７年；Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、１９９５年；Ｋｉｅｓｅｒら、２０００年）。ＷＯ０４／００７７０９号の開示以前の技術的水準では、Ｌｏｍｏｖｓｋｙａら（１９９７年）の方法論を用いたが、これは、労動集約的であり、ファージに基づいた方法として、Ｓ．ヒグロスコピカスに伝達されるクローンされたＤＮＡフラグメント（断片）のサイズにより厳格に制限される（Ｋｉｅｓｅｒら、２０００年）。この技術は、最大で約６．４ｋｂｐのクローンされたＤＮＡの伝達に制限される。従って、この技術を用いて欠損突然変異を相補する場合、当業者は、前記サイズ限界内に遺伝子物質を挿入させるように制限され、例えば、相補は目的とするプロモータ、相同性領域（必要に応じて）および耐性マーカー以外にも、２つの典型的な機能性遺伝子（普通、それぞれ約１ｋｂｐのサイズ）に制限される。ＷＯ０４／００７７０９号では、ラパマイシン生合成遺伝子クラスターを含む、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカスの亜種であるヒグロスコピカスＮＲＲＬ５４９１のような菌株の效率的形質変換のための組換え技術方法に対する記載が初めて開示された。以前は、ラパマイシン生合成遺伝子クラスターに対する遺伝子情報が１９９５年から利用可能ではあったが（Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、１９９５年）、この分野では、今まで制限された進行のみが行われた（Ｋｈａｗら、１９９８年；Ｃｈｕｎｇら、２００１年；ＷＯ０１／３４８１６号）。ＷＯ０４／００７７０９号は、ラパマイシン生合成経路を操作し、欠失突然変異の相補により、一定数のラパマイシン相同物を産生する方法として、ＰＫＳ後加工の量が特定に変わり、場合に応じて、外因性反応誘発剤酸を、少なくともｒａｐＫが欠失または不活性化した菌株に供給する方法について記述する。
【００２３】
以前の作業では、ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子が、原則的には新規なポリケチドを提供する目的で操作され得ることを立証した。このような変更には、下記が含まれる。
【００２４】
＊欠損（削除）：Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａのエリスロマイシン産生（ｅｒｙ）ＰＫＳのモジュール５でのＫＲドメインのＤＮＡコーディング部分の骨格内損失は、エリスロマイシン相同物、すなわち、５，６−ジデオキシ−３−α−ミカロシル−５−オキソエリスロノリドＢおよび５，６−ジデオキシ−５−オキソエリスロノリドＢの形成をもたらすものと示された（Ｄｏｎａｄｉｏら、１９９１年）。
【００２５】
＊個別ドメインの不活性化：ｅｒｙＰＫＳのモジュール４番のＥＲドメイン内活性部位残基の変更として、該当ＰＫＳをコードするＤＮＡの遺伝子操作およびそのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａへの導入による変更は、６，７−無水エリスロマイシンＣの産生をもたらした（Ｄｏｎａｄｉｏら、１９９３年）。
【００２６】
＊負荷モジュール交換：ＷＯ９８／０１５４６号は、ｅｒｙＰＫＳの負荷モジュールをアベルメクチン（ａｖｅ）ＰＫＳの負荷モジュールで置換し、相違した反応誘発剤単位を混入させるハイブリッドタイプＩＰＫＳ遺伝子を生成し、新規なエリスロマイシン相同物を製造することについて開示する。ハイブリッドｔｙｌａｃｔｏｎｅ負荷／ｐｌａｔｅｎｏｌｉｄｅポリケチド合成酵素が生成されたが（Ｋｕｈｓｔｏｓｓら、１９９６年）、これは、メチルマロニル−ＣｏＡのためのｔｙｌａｃｔｏｎｅ負荷モジュールのｐｌａｔｅｎｏｌｉｄｅ分子に対する特異性を成功的に伝達するものである。ＫＳＱの機能の説明（Ｂｉｓａｎｇら、１９９９年）およびＫＳＱ−含有負荷モジュールの操作についてＷＯ００／００６１８号に開始された。スピノシン生合成経路での負荷モジュール交換は、ＷＯ０３／０７０９０８号にも記述された。
【００２７】
＊ＡＴ交換：Ｏｌｉｙｎｙｋら（１９９６年）およびＷＯ９８／０１５４６号には、エリスロマイシンモジュール１のＡＴがラパマイシンモジュール２のＡＴドメインにより置換され、それにより、拡張子単位に対するモジュール１の特異性が変更されたＡＴドメイン交換について記述する。例えば、エリスロマイシンポリケチド合成酵素（ＷＯ９８／０１５４６号、Ｒｕａｎら、１９９７年；Ｓｔａｓｓｉら、１９９８年）において、そして、スピノシンポリケチド合成酵素（ＷＯ０３／０７０９０８号）における追加的ＡＴドメイン交換も記述された。
【００２８】
＊還元性ループ交換：例えば、各縮合反応中に形成されたβ−ケト基の還元性加工量の変更がＷＯ９８／０１５４６号、ＷＯ００／０１８２７号およびＫａｏら（１９９７年）に記述された。
【００２９】
＊ドメイン交換接近法の組合がＭｃＤａｎｉｅｌら（１９９９年）により例示された。
【００３０】
＊部位特異的突然変異誘発：ＷＯ０２／１４４８２号、Ｒｅｅｖｅｓら（２００１年）、Ｒｅｉｄら（２００３年）およびＤｅｌＶｅｃｃｈｉｏら（２００３年）は、特定された残基の選択された突然変異によるＡＴドメインの気質特異性に影響を及ぼすことが可能であることを立証した。
【００３１】
＊環縮小反応：例えば、不完全なモジューラポリケチド合成酵素を用い（Ｋａｏら、１９９４年）、または、エリスロマイシン鎖終了チオエステラーゼドメインをエリスロマイシンＰＫＳのモジュール１、２、３、５または６の下流に移動させると（Ｃｏｒｔｅｓら、１９９５年；Ｋａｏら、１９９５年；Ｋａｏら、１９９６年；Ｂｏｈｍら、１９９８年）、予想される切断したエリスロマイシン分子が産生されるようになる。
【００３２】
＊環拡張：ラパマイシンモジュールをエリスロマイシンＰＫＳの１番目のＯＲＦ内に、エリスロマイシンＰＫＳモジュール１と２間に挿入させると、予想される１６員の大員環か産生されるようになる（Ｒｏｗｅら、２００１年）。
【００３３】
ＰＫＳクラスターの組み換えは、上述したものに限定されるものではない。
【００３４】
しかしながら、ＰＫＳ遺伝子の全ての操作が予測される新たな相同物を産生できるものではないということが明らかになった。Ｄｏｎａｄｉｏら（１９９３年）が、エリスロマイシンＰＫＳのエノイル還元酵素（ＥＲ）ドメインを不活性化させたとき、得られた無水−相同物は完全に加工されなかったが、その理由は、前記相同物がこれ以上マイカロス−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの気質ではなかったからである。同様に、ポリケチド反応誘発剤単位を変化させると、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉにおいて、ラパマイシン相同物の完全な鎖延長および加工が防止された（Ｈｕｎｚｉｋｅｒら、１９９８年）。
【００３５】
ラパマイシン相同物が、生合成クラスター内のポリケチド合成酵素遺伝子を操作することにより製造され得れば、極めて好ましいことである。なぜならば、前記相同物が興味深い生物学的活性を有するものと予想されるからである。
【００３６】
ラパマイシン生合成クラスターの配列は、１９９５年に初めて公開された（Ｓｃｈｗｅｃｋｅら；Ａｐａｒｉｃｉｏら、１９９６年）。上述したＰＫＳの遺伝子操作に関する先行技術が多いにもかかわらず、未だ、ラパマイシンクラスターの核心ポリケチド合成酵素の成功的なポリケチド遺伝子操作が報告されたことがない。ラパマイシン産生者であるＳ．ヒグロスコピカスは操作しにくい生物体である（Ｌｏｍｏｖｓｋａｙａら、１９９７年）。
【００３７】
１７−デスメチルラパマイシンを産生するように変更された宿主細胞が、米国特許第６，６７０，１６８号で請求されたが、この特許は、そのような菌株がモジュール１０のＡＴドメインの置換により構築され得るという仮説以外に、どのようにしてこの化合物が製造され得たかについての説明や実施例を記述しない。前記位置での置換が理論的には１７−デスメチルラパマイシンを生成することができるという事実は、当業者にとっては明白なものであったが、上記において強調した困難性の見地から、どのようにしてそのような置換が行われたかについては明らかではなく、前記效果に対する教示は米国特許第６，６７０，１６８号に提供されていない。Ｓ．ヒグロスコピカスの作業に対する公知された困難性の見地から、そして、どのようにしてそのような組換え宿主株が生成され得たかに対する何らの詳細な説明無しには、上記は、そのような菌株の可能性のある開示であるというよりは、却って著者らが達成しようとするものに対する記載であることが明らかである。また、米国特許第６，６７０，１６８号は、当業者に、どんなに１７−デスメチルラパマイシンが製造されまたは単離され得たかについては、何らの教示を提供していない。ラパマイシン相同物の生合成に関する当時の技術的水準は、ＰＫＳ後組み換え酵素をコードする遺伝子が操作されるＷＯ０４／００７７０９号、およびラパマイシンへの混入のために外因性反応誘発剤酸を供給することを記述する関連出願書に限定される。ラパマイシンのＰＫＳを遺伝子操作するにあたって、進展が不足な一般的理由は、産生者生物体であるＳ．ヒグロスコピカスＮＲＲＬ５４９１の形質変換による技術的困難性のためである。
【発明の開示】
【００３８】
本発明は、１７−デスメチルラパマイシンおよびその相同物の生成に関する。１７−デスメチルラパマイシン相同物の入手には、ラパマイシンＰＫＳの遺伝子操作が必要である。現在の技術的水準では、前記したような菌株を産生するのに必要な遺伝子操作が達成できるのかについては、明らかではない。本発明における初期目標は、Ｓ．ヒグロスコピカスＭＧ２−１０の遺伝子操作である。Ｓ．ヒグロスコピカスＭＧ２−１０は、ＷＯ０４／００７７０９号およびＧｒｅｇｏｒｙら（２００４年）に開示されたように、外因性酸である３，４−ジヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸を供給すると、プレ・ラパマイシンを産生する。前記生物体の遺伝子操作は、外因性酸である３，４−ジヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸が供給されるとき、１７−デスメチルプレ・ラパマイシンを産生する遺伝子操作された菌株を生成するために行われた。現在の技術的水準は、そのような菌株が後期遺伝子カセットによる相補のための基礎菌株として（ＷＯ０４／００７７０９号）、および／または外因性酸を供給し（ＷＯ０４／００７７０９号）、また他のラパマイシン相同物を生成させるための基礎菌株として、将来の実験においてどんなに用いられ得るかについて教示するが、そのような菌株がどんなにＰＫＳ遺伝子操作によるＳ．ヒグロスコピカスで生成され得るかについては教示しない。本発明は、驚いたことに、Ｏｌｉｙｎｙｋら、１９９６年に記述されたものと類似した、ラパマイシンＰＫＳに対するＰＫＳ遺伝子操作方法論の成功的な応用について記述する。これは、これらの組換えＤＮＡ技術が、以前は、Ｓ．ヒグロスコピカスに成功的に適用されたことがないので、予想しなかった結果である。１７−デスメチルプレ・ラパマイシン相同物の産生のための菌株の生成は、後期遺伝子カセットによる相補のために有用な基礎菌株（ＷＯ０４／００７７０９号）、および／または外因性酸を供給するのに有用な基礎菌株（ＷＯ０４／００７７０９号）である。これらのラパマイシン相同物は、それぞれ半合成によりさらに組み換えられ得る。これは、ラパマイシン相同物のライブラリを生成するのに用いられ得る、真正な組合せ方法を初めて立証するものであり、前記方法は、ＰＫＳ遺伝子操作の水準、補助遺伝子の水準、反応誘発剤酸の混入、アミノ酸の混入、および半合成に利用可能な分子上の利用可能な化学的官能性のいずれか一つ以上において変更され得る。
【００３９】
発明の要約
一態様において、本発明は、１７−デスメチルラパマイシンおよびその相同物を提供し、特に本発明は下記化１で表される１７−デスメチルラパマイシン相同物およびその薬学的に許容可能な相同物を提供する。
【００４０】
【化１】
2008509895.tif 000003
【００４１】
別の態様において、本発明は、本発明の方法を用いて生成される１７−デスメチルラパマイシン相同物のライブラリを提供する。
【００４２】
新規なラパマイシン相同物は、免疫抑制剤、抗真菌剤、抗癌剤、抗炎症剤、神経生成剤、または移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶反応、自己免疫疾患、血管疾患および線維症の治療のための薬剤、または、創傷治癒の調節において用いられる薬剤として有用な化合物を産生するにあたって、直接的に有用であり、追加的半合成または生物変換のためのテンプレートとしても有用である。
【００４３】
さらに別の態様において、本発明は、医薬品での１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物の用途を提供する。さらに別の態様において、本発明は、免疫抑制の誘導または維持、神経再生の刺激、または癌、Ｂ−細胞悪性腫瘍、真菌感染症、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性疾患、血管疾患または線維症の治療のための薬剤の製造、または創傷治癒の調節での１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物の用途を提供する。
【００４４】
一実施形態では、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物が、免疫抑制の誘導または維持、神経再生の刺激、または癌、Ｂ−細胞悪性腫瘍、真菌感染症、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性疾患、血管疾患または線維症の治療のための併用療法、または創傷治癒の調節において用いられる。
【００４５】
本発明はまた、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物、またはその薬学的に許容可能な担体と共に薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を提供する。
【００４６】
また別の態様において、本発明は、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物の産生方法であって、
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインをマロニル−ＣｏＡ−特異的ＡＴドメインで置換するステップと、
（ｂ）遺伝子操作されたラパマイシンＰＫＳを適当な宿主細胞において発現させるステップと、
（ｃ）前記宿主細胞を１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物が産生される条件下で培養し、任意に外因性前駆物質を供給するステップと、
（ｄ）任意に前記産生された化合物を単離するステップと、
を含む方法を提供する。
【００４７】
好ましい実施形態では、前記マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインは、ラパマイシン、モネンシン、スピノシン、ＦＫ５０６、エリスロマイシン、ＦＫ５２０、アンフォテリシン、アンゴラマイシン、チロシン、「ｈｙｇ」、ＦＫ５２３、メリダマイシン、アンタスコマイシン、ＦＫ５２５およびツクバマイシンのクラスターの一つから選択される。より好ましい実施形態では、前記マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインは、ラパマイシン、モネンシンおよびＦＫ５０６のクラスターの一つから選択される。さらに好ましい実施形態では、前記ＡＴドメインは、ラパマイシンモジュール２、モネンシンモジュール３、モネンシンモジュール６、モネンシンモジュール８、ＦＫ５０６モジュール３およびＦＫ５０６モジュール７からなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、前記マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインは、ラパマイシンのモジュール２に由来する。
【００４８】
当業者であれは、このような形質変換が、任意のタイプＩＰＫＳまたは混合ＮＲＰＳ／ＰＫＳ由来の多数のマロニル−ＣｏＡ選択的アシルトランスフェラーゼドメイン中の任意のもので試みられ得ることを理解するだろう。当業者はまた、モジュール１０ＡＴによるマロニル−ＣｏＡの混入が、例えばＷＯ０２／１４４８２号に記述された方法を用いて、本来のｒａｐＡＴ１０を突然変異させてその特異性を変化させ、またはモジュール１０の全体をマロニル−ＣｏＡに対して選択的なＡＴドメインを含むモジュールで置換することにより行われ、前記モジュールには、天然モジュールおよび組合せモジュールが含まれることを理解するだろう。
【００４９】
さらなる態様において、本発明は、モジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインで置換されたとき、遺伝子操作されたラパマイシンポリケチド合成酵素をコードする生合成クラスターを含む組換え菌株を生成する方法を提供する。好ましい一実施形態では、前記マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインは、下記のＰＫＳクラスター：ラパマイシン、モネンシン、ＦＫ５０６、エリスロマイシン、ＦＫ５２０、アンフォテリシン、アンゴラマイシン、チロシン、「ｈｙｇ」、ＦＫ５２３、メリダマイシン、アンタスコマイシン、ＦＫ５２５およびツクバマイシンの一つから選択される。より好ましい実施形態では、前記マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインは、下記のクラスター：ラパマイシン、モネンシンおよびＦＫ５０６の一つから選択される。さらに好ましい実施形態では、前記ＡＴドメインは、ラパマイシンモジュール２、モネンシンモジュール３、モネンシンモジュール６、モジュール８、ＦＫ５０６モジュール３およびＦＫ５０６モジュール７からなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、前記マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインは、ラパマイシンのモジュール２に由来する。
【００５０】
ラパマイシンポリケチド合成酵素経路の遺伝子操作として、ここでは、Ｓ．ヒグロスコピカスＭＧ２−１０（この生成については、ＷＯ０４／００７７０９号およびＧｒｅｇｏｒｙら（２００４年）に開示されている）において例示しているが、当業者は、このような方法が、ワイルドタイプＳ．ヒグロスコピカスＮＲＲＬ５４９１およびその他の関連菌株にも同等に適用され得ることを理解するだろう。好ましくは、遺伝子操作された菌株は、Ｓ．ヒグロスコピカスＭＧ２−１０およびＳ．ヒグロスコピカスＮＲＲＬ５４９１からなる群から選択される。
【００５１】
本発明の上述した態様において、１７−デスメチルラパマイシンおよびその相同物の製造方法、および遺伝子操作されたラパマイシンポリケチド合成酵素をコードする生合成クラスターを含む組換え菌株を生成する方法を提供する実施形態は、
（ａ）単一のＤＮＡフラグメントとして導入すべきＡＴを適当な隣接制限部位で単離するステップと、
（ｂ）適切な制限部位を用いて、目的ＡＴの隣接配列と相同であるＤＮＡ配列の領域を増幅させて単離するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）に記述した３つのＤＮＡフラグメントを共にリゲート（結紮）してＬＨＳ相同体、次いでドナーＡＴドメイン、次いでＲＨＳ相同体のインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）配列を得るステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの完全な配列を宿主株内への導入のためのベクター内に導入して最終プラスミドを得るステップであって、前記プラスミドが、
ｉ）接合のためのｏｒｉＴと、
ｉｉ）一つ以上の耐性マーカーと、
ｉｉｉ）成分が３７℃培養で選ばれるようにするための温度感受性複製原点と、
ｉｖ）Ｅ．ｃｏｌｉの複製原点と、
を含むステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で記述した最終プラスミドを用い、接合により宿主株を形質変換させるステップと、
（ｆ）関連抗生剤に対する耐性により形質変換体を選択するステップと、
（ｇ）抗生剤選択と共に３７℃で培養させることにより、一次成分を産生させるステップと、
（ｈ）抗生剤選択の不存在下で同様に３７℃で培養することにより、二次組換え体を選別するステップと、
（ｉ）所望の菌株を、その目的産生物を産生する能力によって同定するステップと、
（ｊ）任意に標準的方法により菌株の遺伝的特徴を確認するステップと、
を含む。
【００５２】
別の態様において、本発明は、１７−デスメチルラパマイシン相同物の製造方法であって、
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインで置換された組換え菌株を生成させるステップと、
（ｂ）ポリケチド生成に適当な条件下で、前記組換え菌株に非天然スターター（反応誘発）酸を供給するステップと、
（ｃ）任意に、上記のように製造された化合物を単離するステップと、
を含む方法を提供する。
【００５３】
従って、本発明は、非天然反応誘発剤酸が混入された１７−デスメチルラパマイシン相同物を生成させる方法を提供する。好ましい実施形態では、前記組換え菌株は、ｒａｐＫが欠失または不活性化したものである。別の好ましい実施形態では、前記組換え菌株はｒａｐＫが欠失または不活性化し、この菌株に供給される非天然反応誘発剤酸は、シクロヘキサンカルボン酸、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される。
【００５４】
一実施形態では、前記菌株は、１７−デスメチルラパマイシンを産生する組換えＳ．ヒグロスコピカス宿主細胞ではない。別の実施形態では、前記菌株は、外因性前駆物質を提供せずに１７−デスメチルラパマイシンを産生する組換えＳ．ヒグロスコピカス宿主細胞ではない。
【００５５】
また別の態様において、本発明は、１７−デスメチルラパマイシン相同物を産生する方法であって、
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインで置換された組換え菌株（上記に詳述したものと同様である。）を生成させるステップと、
（ｂ）ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱから選択される一つ以上のラパマイシン補助遺伝子を付加的に欠失または不活性化させるステップと、
（ｃ）上記のように得た菌株を、必要に応じて、任意に外因性前駆物質の存在下で培養し、１７−デスメチルラパマイシン相同物を産生するステップと、
（ｄ）任意に、上記のように製造された化合物を単離するステップと、
を含む方法を提供する。
【００５６】
代替的な好ましい実施形態では、欠失した補助遺伝子は、ｒａｐＩ、ｒａｐＪおよびｒａｐＱである。代替的な好ましい実施形態では、欠失した補助遺伝子は、ｒａｐＪ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱである。
【００５７】
また別の態様において、本発明は、１７−デスメチルラパマイシン相同物を生成させる方法であって、
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインで置換された組換え菌株（上記に詳述したものと同様である。）を生成させるステップと、
（ｂ）ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱから選択される一つ以上のラパマイシン補助遺伝子を付加的に欠失または不活性化させるステップと、
（ｃ）補助遺伝子の全部または部分集合をｉｎ−ｔｒａｎｓで再導入し、前記欠失を補完しまたは部分的に補完するステップと、
（ｄ）上記のように得られた菌株を、必要に応じて、任意に外因性前駆物質の存在下で培養し、１７−デスメチルラパマイシン相同物を産生するステップと、
（ｅ）任意に、上記のように製造された化合物を単離するステップと、
を含む方法を提供する。
【００５８】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）において、全てのラパマイシン補助遺伝子が欠失または不活性化する。別の好ましい実施形態では、組換え菌株は、ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱまたはその相同物からなる群から選択される一つ以上の補助遺伝子で遺伝子補完されている。特定の一実施形態では、菌株は全ての補助遺伝子で補完されている。また別の好ましい実施形態では、組換え菌株は、補助遺伝子ｒａｐＫ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬまたはその相同物で遺伝子補完されている。代替的な好ましい実施形態では、組換え菌株は、ラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＫ、ｒａｐＩ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬまたはその相同物で遺伝子補完されている。
【００５９】
本発明のまた別の態様では、前記組み換えが組み合わされ、従って本発明は、１７−デスメチルラパマイシン相同物を製造する方法であって、
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインで置換された組換え菌株を生成させるステップと、
（ｂ）ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱから選択される一つ以上のラパマイシン補助遺伝子を付加的に欠失または不活性化させるステップと、
（ｃ）任意に、補助遺伝子の全部または部分集合をｉｎ−ｔｒａｎｓで再導入させ、前記欠失を補完しまたは部分的に補完するステップと、
（ｄ）ポリケチドの産生に適当な条件下で、前記組換え菌株に非天然スターター酸を供給するステップと、
（ｅ）任意に、上記のように製造された化合物を単離するステップと、
を含む方法を提供する。
【００６０】
好ましい一実施形態では、欠失または不活性化した補助遺伝子はｒａｐＫを含む。
【００６１】
好ましい一実施形態では、ステップ（ｂ）において、全てのラパマイシン補助遺伝子が欠失または不活性化する。特定の一態様において、本発明は、全てのラパマイシン補助遺伝子が欠失または不活性化した組換え菌株を、ラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱまたはその相同物で遺伝子補完し、非天然反応誘発剤酸を用いて、１７−デスメチルラパマイシン相同物を生成させる代替的方法を提供するが、この方法は、ｒａｐＫを除いた全ての補助遺伝子を含有し、外因性反応誘発剤酸が供給される菌株を生成させる。好ましい一実施形態では、前記加工した外因性反応誘発剤酸は、シクロヘキサンカルボン酸である。代替的な好ましい実施形態では、前記非天然反応誘発剤酸は、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸である。代替的な好ましい実施形態では、前記非天然反応誘発剤酸は、シクロヘプタンカルボン酸である。代替的な好ましい実施形態では、前記非天然反応誘発剤酸は、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される。
【００６２】
また他の実施形態では、本発明は、補助遺伝子活性および非天然反応誘発剤酸を用いて、１７−デスメチルラパマイシン相同物を生成させる方法を提供する。好ましい一実施形態では、欠失した補助遺伝子は、ｒａｐＫ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱであり、前記菌株に供給される非天然反応誘発剤酸は、シクロヘキサンカルボン酸である。代替的な好ましい実施形態では、前記ｒａｐＫ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱが欠失した前記菌株に供給される非天然反応誘発剤酸は、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸である。代替的な好ましい実施形態では、ｒａｐＫ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱが欠失した前記菌株に供給される非天然反応誘発剤酸は、シクロヘプタンカルボン酸である。好ましい一実施形態では、欠失した補助遺伝子は、ｒａｐＫ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱであり、前記菌株に供給される非天然反応誘発剤酸は、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される。
【００６３】
また別の好ましい実施形態では、欠失した補助遺伝子は、ｒａｐＫ、ｒａｐＩおよびｒａｐＱであり、前記菌株に供給される非天然反応誘発剤酸は、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、欠失した補助遺伝子は、ｒａｐＫ、ｒａｐＩおよびｒａｐＱであり、前記菌株に供給される非天然反応誘発剤酸は、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸である。さらに好ましい実施形態では、欠失した補助遺伝子は、ｒａｐＫ、ｒａｐＩおよびｒａｐＱであり、前記菌株に供給される非天然反応誘発剤酸は、シクロヘキサンカルボン酸である。
【００６４】
代替的な好ましい実施形態では、欠失した補助遺伝子は、ｒａｐＫおよびｒａｐＭであり、前記菌株に供給される非天然反応誘発剤酸は、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、供給される非天然反応誘発剤酸は、シクロヘキサンカルボン酸である。
【００６５】
また別の代替的な好ましい実施形態では、欠失した補助遺伝子は、ｒａｐＫ、ｒａｐＩおよびｒａｐＭであり、前記菌株に供給される非天然反応誘発剤酸は、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、供給される非天然反応誘発剤酸は、シクロヘキサンカルボン酸である。
【００６６】
代替的な好ましい実施形態では、欠失した補助遺伝子が、ｒａｐＫ、ｒａｐＩ、ｒａｐＪおよびｒａｐＱであり、前記菌株に供給される非天然反応誘発剤酸は、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、供給される非天然反応誘発剤酸は、シクロヘキサンカルボン酸である。
【００６７】
代替的な好ましい実施形態では、欠失した補助遺伝子は、ｒａｐＫ、ｒａｐＪ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱであり、前記菌株に供給される非天然反応誘発剤酸は、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、供給される非天然反応誘発剤酸は、シクロヘキサンカルボン酸である。
【００６８】
また他の実施形態において、本発明は、全てのラパマイシン補助遺伝子が欠失または不活性化した組換え菌株を、ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱまたはその相同物から選択される一つ以上の補助遺伝子で遺伝子補完させ、平行して、天然または非天然反応誘発剤酸を供給することにより、１７−デスメチルラパマイシン相同物を生成させる方法を提供する。好ましい実施形態では、前記組換え菌株は、ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬで遺伝子補完され、シクロヘキサンカルボン酸、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される反応誘発剤酸が供給される。好ましい実施形態では、前記組換え菌株は、ｒａｐＪ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬで遺伝子補完され、シクロヘキサンカルボン酸、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される反応誘発剤酸が供給される。
【００６９】
代替的な好ましい実施形態では、前記組換え菌株は、ｒａｐＪ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬで遺伝子補完され、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される反応誘発剤酸が供給される。より好ましい実施形態では、供給される反応誘発剤酸は、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸である。
【００７０】
代替的な好ましい実施形態では、前記組換え菌株は、ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯ、ｒａｐＱおよびｒａｐＬで遺伝子補完され、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される反応誘発剤酸が供給される。より好ましい実施形態では、供給される反応誘発剤酸は、シクロヘキサンカルボン酸である。
【００７１】
代替的な好ましい実施形態では、前記組換え菌株は、ｒａｐＪ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯ、ｒａｐＱおよびｒａｐＬで遺伝子補完され、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される反応誘発剤酸が供給される。より好ましい実施形態では、供給される反応誘発剤酸は、シクロヘキサンカルボン酸である。
【００７２】
代替的な好ましい実施形態では、前記組換え菌株は、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬで遺伝子補完され、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される反応誘発剤酸が供給される。より好ましい実施形態では、供給される反応誘発剤酸は、シクロヘキサンカルボン酸である。
【００７３】
代替的な好ましい実施形態では、前記組換え菌株は、ｒａｐＩ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬで遺伝子補完され、３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸からなる群から選択される反応誘発剤酸が供給される。より好ましい実施形態では、供給される反応誘発剤酸は、シクロヘキサンカルボン酸である。
【００７４】
また別の態様において、本発明は、１７−デスメチルラパマイシン相同物のライブラリを生成させる方法であって、
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインで置換された組換え菌株を生成させるステップと、
（ｂ）任意に、ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱから選択される一つ以上のラパマイシン補助遺伝子を欠失または不活性化させるステップと、
（ｃ）任意に、ラパマイシン補助遺伝子の全部または部分集合をｉｎ−ｔｒａｎｓで再導入し、前記欠失を補完しまたは部分的に補完するステップと、
（ｄ）一連の非天然反応誘発剤酸を前記組換え菌株の産生培養液に供給し、多数の１７−デスメチルラパマイシン相同物を生成させるステップと、
（ｅ）ポリケチドが産生されるように、適当な条件下で、天然または新規なアミノ酸を前記組換え菌株の産生培養液に供給するステップと、
（ｆ）任意に、上記のように製造された化合物を単離するステップと、
（ｇ）任意に、単離したラパマイシン相同物に対して半合成を行うステップと、
を含む方法を提供する。
【００７５】
本発明の前記およびその他の実施形態を、下記の詳細な説明、実施例および請求の範囲においてさらに詳述する。
【００７６】
定義
冠詞“ａ”または“ａｎ”はここでは一または一以上（すなわち少なくとも一）の文法上の対象物を指すために用いられる。一例として、“ａｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ”は一つの相同物またはより多くの相同物を意味する。
【００７７】
ここで用いる「相同物」の語は、別の化合物と構造的に近似しているが化合物として若干の相違（たとえば１個の原子が他に置換されている場合や、特定の官能基の存在または不存在）を有する化合物を参照する。
【００７８】
ここで用いる「１７−デスメチルラパマイシンおよびその相同物」の語は、化１に示される化合物を含むことを意図しており、該化合物を下記において「本発明（の）化合物」と呼ぶ。
【００７９】
【化１】
2008509895.tif 000004
【００８０】
ここで用いる「薬学的に許容可能な誘導体」の語は、薬学的に許容可能な塩（たとえば酸添加塩）を含む。それは溶媒化合物solvate（水和物など）を指すことをも含む。
【００８１】
ここで用いる「ハロ」はフルオロ、クロロ、ブロモおよびイオドを含む。
【００８２】
ここで用いる「チオール」はＳＨ基を含む。
【００８３】
そうでないように特定しない限り、ここに述べるＣ１−４アルキル基は、十分な数（たとえば最低３個）のＣ原子が存在する場合には直鎖型であって良い。このようなＣ１−４アルキル基は、そのうえ、一または複数のハロ（フルオロなど）原子で置換されていても良い。
【００８４】
Ｒ４が表すヘテロ環基（heterocyclic group）は完全飽和または部分飽和しているものであって良く、また、その特性として完全または部分的に芳香性であって良い。このような基はまた単環でも、または可能であれば二環系であっても良い。記述することができるヘテロ環基Ｒ４の基は、ジオキサニル（dioxanyl）、ジオキソリル（dioxolyl）、フラニル（furanyl）、 ヘキサヒドロピリミジニル（hexahydropyrimidinyl）、ヒダントイニル（hydantoinyl）、イミダゾリル（imidazolyl）、イソキサゾリジニル（isoxazolidinyl）、イソキサゾリル（isoxazolyl）、マレイミド（maleimido,）、モルフォリニル（morpholinyl）、オキサジアゾリル（oxadiazolyl）、１，２または１，３−オキサジアニリル（1 ,2- or 1 ,3-oxazinanyl）、オキサゾリル（oxazolyl）、ピペラジニル（piperazinyl）、ピペリジニル（piperidinyl）、ピラニル（pyranyl）、ピラジニル（pyrazinyl）、ピラゾリル（pyrazolyl）、ピリジニル（pyridinyl）、ピリドニル（pyridonyl）、ピリミジニル（pyrimidinyl）、ピロリジノニル（pyrrolidinonyl）、ピロリジニル（pyrrolidinyl）、ピロリニル（pyrrolinyl）、ピロリル（pyrrolyl）、スルフォラニル（sulfolanyl）、３−スルフォレニル（3-sulfolenyl）、テトラヒドロフラニル（tetrahydrofuranyl）、テトラヒドロピラニル（tetrahydropyranyl）、３，４，５，６−テトラヒドロピリジニル（3,4,5,6-tetrahydropyridinyl）、１，２，３，４−テトラヒドロピリミジニル（1,2,3,4-tetrahydropyrimidinyl）、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジニル（3,4,5,6-tetrahydropyrimidinyl）、テトラゾニル（tetrazolyl）、チアジアゾリル（thiadiazolyl）、チアゾリジニル（thiazolidinyl）、チアゾリル（thiazolyl）、チエニル（thienyl）、 トリアゾリル（triazolyl）およびそのようなもの（たとえばジオキサニル、ジオキソリル、ヘキサヒドロピリミジニル、ヒダントイニル、イソキサゾリジニル、マレイミド、モルフォリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピロリニル、スルフォラニル、３−スルフォレニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、３，４，５，６−テトラヒドロピリジニル、１，２，３，４−テトラヒドロピリミジニル、３，４，５，６−テトラヒドロピリミジニル、チアゾリジニルおよびそのようなものの飽和または部分不飽和単環基、特に、Ｎ，ＳまたはとりわけＯから選ばれる一つのヘテロ原子を含む飽和単環基、たとえばピペリジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニルその他）である。しかしながら、本発明の化合物に関連する一つの特定の実施形態において、Ｒ４はＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，ＥおよびＦの群から選ばれる構造的フラグメントを表す（すなわち、それはヘテロ環基を表さない）。
【００８５】
ここで用いる「形質転換遺伝子」の語は、ポリケチドのポスト・ポリケチド合成形質転換に必要な遺伝子を含み、限定されないがたとえばシトクローム（cytochrome）Ｐ−４５０モノオキシゲナーゼ（monooxygenases）、フェレドキシン（ferredoxins）およびSAM-dependent Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（methyltransferases）を含む。ラパマイシンシステムにおいて、これら形質転換遺伝子はｒａｐＮ、ｒａｐＯ、ｒａｐＭ、ｒａｐＩ、ｒａｐＱおよびｒａｐＪを含む。当業者は、これら遺伝子の相同物が関連する生合成遺伝子クラスターに存在し、これらの相同性遺伝子の使用も本発明方法において考慮されるべきことを理解するであろう。
【００８６】
ここで用いる「前駆的供給遺伝子（precursor supply gene（s））」の語は、天然または非天然の前駆物質を供給するために必要とされる遺伝子、天然または非天然に組み込まれた前駆物質を合成するために必要とされる遺伝子、および天然または非天然に組み込まれた前駆物質の組み込みのために必要とされる遺伝子を含む。非限定的例示として、ラパマイシンシステムにおけるこれら遺伝子にはｒａｐＬ，ｒａｐＫ，ｒａｐＰおよびｒａｐＡが含まれる。当業者は、これら遺伝子の相同物が関連する生合成遺伝子クラスターに存在し、これらの相同性遺伝子の使用も本発明方法において考慮されるべきことを理解するであろう。
【００８７】
ここで用いる「補助遺伝子（auxiliary gene（s））」の語は、形質転換遺伝子、前駆的供給遺伝子または形質転換遺伝子と前駆的供給遺伝子の両方を含む。
【００８８】
ここで用いる「前駆物質（precursor）」の語は、天然スターター酸（たとえば４，５−ジヒドロキシシクロヘクス−１−エネカルボキシル酸（4,5-dihydroxycyclohex-1-enecarboxylic acid））、非天然スターター酸、天然導入アミノ酸（たとえばピペコリン酸、プロリン）、非天然導入アミノ酸、マロニル−ＣｏＡおよびメチルマロニル−ＣｏＡを含む。
【００８９】
ここで用いる「非天然スターター酸」の語は、ポリケチド合成においてスターター酸として導入することができるあらゆる化合物であって、ＰＫＳにより通常選択されるスターター酸ではない。
【００９０】
疑義を避けるために述べておくが、「前駆物質」および「非天然スターター酸」の語は、オリゴケチド（たとえばジケチドおよびトリケチド）のＮ−アシルシステアミンチオエステル（N-acylcysteamine thioesters of oligoketides）、および、カルボキシル酸のＮ−アシルシステアミンチオエステルまたはエステルを含む。これらは最終製品に含まれていても良い。
【００９１】
ここで用いる「天然モジュール」の語は、ＫＳからＡＣＰまでの一連の連続ドメインを指し、それはＫＳ−ＡＴ−ＡＣＰ（この順番通り）を含み、任意追加的に、ベータケトレダクターゼ（β-ketoreductase、ＫＲ）ドメイン、ＫＲドメインおよびデヒドラターゼ（dehydratase、ＤＨ）ドメイン、ＫＲドメイン、ＤＨドメインおよびエノイルレダクターゼ（enoyl-reductase、ＥＲ）ドメインから選ばれる一またはそれ以上を含む。
【００９２】
ここで用いる「組合せモジュール（combinatorial module）」の語は、天然モジュールにおける一つの位置から続くモジュールにおける対応する位置へと延長する一連の連続ドメインを指す。それは、たとえば、モジュールＡのＡＴドメインの起点からモジュールＢのＡＴドメインの起点まで、または、モジュールＢのＫＳドメインの中間からモジュールＣのＫＳドメインの中間まで延長する。これらの組合せモジュールは「二重」またはより大きくても良く、たとえば２またはそれ以上の天然モジュールと同数のドメインを含むものであっても良い。
【００９３】
ここで用いる「プレラパマイシン（pre-rapamycin）」の語は、ラパマイシンポリケチド合成（ｒａｐＡ，ｒａｐＢおよびｒａｐＣを含む）の活性によって製造される最初の酵素フリー製品および形質転換遺伝子の作用前のｒａｐＰを指し、特に下記化２の構造を有する化合物を指す。
【００９４】
【化２】
2008509895.tif 000005
【００９５】
ここで用いる「自己免疫疾患（autoimmune disorder（s）」の語は、限定的ではないが、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythrematosis、ＳＬＥ）、関節リウマチ（rheumatoid arthritis）、重症筋無力症（myasthenia gravis）および多発性硬化症（multiple sclerosis）を含む。
【００９６】
ここで用いる「炎症疾患」の語は、限定的ではないが、乾癬（psoriasis）、皮膚炎（dermatitis）、湿疹（eczema）、脂漏症（seborrhoea）、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease、限定的ではないが潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis）およびクローン病（Crohn's disease）を含む）、肺炎（pulmonary inflammation、限定的ではないが喘息（asthma）、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease）、気腫（emphysema）、急性呼吸窮迫症候群（acute respiratory distress syndrome）および気管支炎（bronchitis）を含む）、およびブドウ膜炎（eye uveitis）を含む。
【００９７】
ここで用いる「癌（ガン」の語は、皮膚やより一般的には胸腺、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃または腸などの体器官に見られるエピセリウム（epithelium）から発生する悪性腫瘍を意味する。ガンは隣接組織に侵入して、離れた器官、たとえば骨や肝臓、肺または脳などに広がっていく（転移）傾向がある。ここで用いる「癌」の語は、非限定的な例示として、メラノーマ（melanoma、黒色腫）、リンフォーマ（lymphoma）、白血病（leukaemia）、繊維肉腫（fibrosarcoma）、横紋筋肉腫（rhabdomyosarcoma）および悪性肥満細胞腫（mastocytoma）を含み、さらに、非限定的な例示として、結腸大腸ガン、前立腺ガン、小細胞肺ガンおよび非小細胞肺ガン、乳ガン、すい臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、胃ガン、グリオバストーマ（gliobastoma）、肝ガン、卵巣ガンなどの細胞癌の種類を含む。
【００９８】
ここで用いる「Ｂ細胞腫瘍（B-cell malignancies）」の語は、慢性リンパ性白血病（chronic lymphocytic leukaemia＝CLL）、多発性骨髄腫（multiple myeloma）、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin's lymphoma＝NHL）などの疾患群を含む。これは、血液または造血器官の新生物疾患である。これは骨髄および免疫システムの機能不全を生じさせ、ホスト（宿主）を感染や出血しやすいものにする。
【００９９】
ここで用いる「血管疾患（vascular disease）」の語は、非限定的な例示として、レステノシス（restenosis）および血管閉塞（vascular occlusion）などの血管性の障害（hyperproliferative vascular disorders）、アテローム性動脈硬化症（graft vascular atherosclerosis）、心血管疾患（cardiovascular disease）、脳血管障害および末梢性血管疾患（cerebral vascular disease and peripheral vascular disease）（たとえば冠状動脈疾患（coronary artery disease）、動脈硬化症（arteriosclerosis）、アテローム性動脈硬化症（atherosclerosis）、非アテローム性動脈硬化症（nonatheromatous arteriosclerosis）または血管壁損傷（vascular wall damage）など）を含む。
【０１００】
ここで用いる「神経再生（neuronal regeneration）」の語は神経細胞成長刺激を意味し、神経突起伸長および神経細胞の機能的回復を含む。神経再生がその治療に顕著に有効であろうとされる疾患および疾病は、非限定的な例示として、アルツハイマー病（Alzheimer's disease）、パーキンソン病（Parkinson's disease病）、ハンチントン舞踏病（Huntingdon's chorea）、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）、三叉神経痛（trigeminal neuralgia）、舌咽神経痛（glossopharyngeal neuralgia）、ベル麻痺（Bell's palsy）、筋ジストロフィー（muscular dystrophy）、脳卒中（stroke）、進行性筋萎縮症（progressive muscular atrophy）、進行性球脊髄性筋萎縮症（progressive bulbar inherited muscular atrophy）、変形性頸椎症（cervical spondylosis）、ギラン・バレー症候群（Gullain-Barre syndrome）、痴呆（dementia）、末梢性神経障害（peripheral neuropathies）および末梢神経損傷（peripheral nerve damage）を含む。これらは身体的損傷（脊髄損傷またはトラウマ、座骨神経や顔面神経の外傷や損傷など）によって生ずるか、あるいは病状（糖尿病など）によって生ずるかを問わない。
【０１０１】
ここで用いる「繊維症（fibrotic diseases）」の語は、細胞外基質（extracellular matrix）の過剰産生に関連する疾患を意味し、非限定的な例示として、サルコイドーシス（sarcoidosis）、ケロイド、糸球体腎炎（glomerulonephritis）、末期腎臓疾患、肝繊維化症（非限定的な例示として、肝硬変（cirrhosis）、アルコール性肝障害（alcohol liver disease）および脂肪肝（steato-heptatitis）を含む）、慢性腎障害（chronic graft nephropathy）、血管疾患（vasculopathy）、心臓繊維化症（cardiac fibrosis）、肺線維症（pulmonary fibrosis）（非限定的な例示として、突発性肺線維症（idiopathic pulmonary fibrosis）および突発性線維性肺胞炎（cryptogenic fibrosing alveolitis）を含む）、黄班変性症（macular degeneration）、新生児およびvitreal網膜症、および、化学療法または放射線誘発線維症を含む。
【０１０２】
ここで用いる「創傷治癒（wound healing）」の語は、外皮およびその他の軟部組織への損傷に対する回復処置を意味し、限定的ではないが、術後創傷治癒、火傷や肥大性またはケロイドの傷痕治療、および術後癒着の予防を含む。
【０１０３】
発明の記述
一態様において、本発明は、１７−デスメチルラパマイシンおよびその相同物を提供し、特に本発明は化１で表される１７−デスメチルラパマイシン相同物およびその薬学的に許容可能な相同物を提供する。
【０１０４】
【化１】
2008509895.tif 000006
【０１０５】
一態様において、Ｒ４は既に定義したように基Ａ，Ｂ，Ｃ，ＥおよびＦから選ばれる構造フラグメント（たとえば基Ａ，Ｃ，ＥおよびＦから選ばれる構造フラグメント）であり、ここでＲ７およびＲ８は既に定義したものであり、たとえばＲ７はＨ，ＯＨまたはＯＭｅを表し、Ｒ８はＨ，ＯＨ，ＯＭｅ，ＣｌまたはＦ（たとえばＨ，ＯＨ，ＯＭｅまたはＦ）を表す。
【０１０６】
ほかの態様において、Ｒ４は基Ａ（ｉ），Ｃ（ｉ），Ｅ（ｉ）およびＦ（ｉ）から選ばれる構造フラグメントである（化３）。ここでＲ７およびＲ８は既に定義したものであり、たとえばＲ７はＨまたはＯＨを表し、Ｒ８はＨ，ＯＨまたはＯＭｅを表す。
【０１０７】
【化３】
2008509895.tif 000007
【０１０８】
別の好適な態様において、Ｒ４は上に定義した構造フラグメントＣ（ｉ）を表し、２）。ここでＲ８はＨであり、Ｒ７はＨ，ＯＭｅまたは特にＯＨである。
【０１０９】
好適な態様において、Ｒ５がＯＨを表すときＲ６はＨであり、Ｒ６がＯＨを表すときＲ５はＨであり、ｘは直接結合、とりわけＣＨ２を表す。
【０１１０】
代替的な態様において、Ｒ２はＯＨを表す。
【０１１１】
代替的な態様において、Ｒ４は４一に酸素を持つ６員環（たとえばテトラヒドロピラン−４−イル（tetrahydropyran-4-yl））である。
【０１１２】
本発明の化合物の好適な実施形態は、Ｒ１が（Ｈ，Ｈ）または＝Ｏを表し、Ｒ２がＯＨまたはＯＭｅを表し、Ｒ３がＯＨまたはＯＭｅを表し、Ｒ４が前記構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＨ，ＯＨまたはＯＭｅを表し、ｘがＣＨ２を表すものである。
【０１１３】
さらに高度に好適な態様において、Ｒ１が（Ｈ，Ｈ）を表し、Ｒ２がＯＨを表し、Ｒ３がＨを表し、Ｒ４が前記構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＨを表すものであり、ｘがＣＨ２を表す。
【０１１４】
好適な態様において、Ｒ１が（Ｈ，Ｈ）を表し、Ｒ２がＯＨを表し、Ｒ３がＨを表し、Ｒ４が前記構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７およびＲ８が共にＯＨを表すものであり、ｘがＣＨ２を表す。
【０１１５】
より高度に好適な態様において、Ｒ１が（Ｈ，Ｈ）を表し、Ｒ２がＯＨを表し、Ｒ３がＨを表し、Ｒ４が前記構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＦを表すものであり、ｘがＣＨ２を表す。
【０１１６】
より高度に好適な態様において、Ｒ１がＯを表し、Ｒ２がＯＨまたはＯＭｅを表し、Ｒ３がＨ，ＯＨまたはＯＭｅを表し、Ｒ４が前記構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＦまたはＣｌを表すものであり、ｘがＣＨ２を表す。
【０１１７】
より高度に好適な態様において、Ｒ１がＯを表し、Ｒ２がＯＨを表し、Ｒ３がＯＭｅを表し、Ｒ４が前記構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＨを表すものであり、ｘがＣＨ２を表す。
【０１１８】
より高度に好適な態様において、Ｒ１がＯを表し、Ｒ２がＯＨを表し、Ｒ３がＯＨを表し、Ｒ４が前記構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＨを表すものであり、ｘがＣＨ２を表す。
【０１１９】
より高度に好適な態様において、Ｒ１がＯを表し、Ｒ２がＯＨを表し、Ｒ３がＯＭｅを表し、Ｒ４が前記構造フラグメントＣ（ｉ）であってそのＲ７がＯＨ、Ｒ８がＯＭｅを表すものであり、ｘがＣＨ２を表す。
【０１２０】
一つの態様において、この化合物は１７−デスメチルラパマイシンではない。
【０１２１】
Ｒ４基が置換シクロヘキサン環を表す本発明化合物の上述の実施例の全てに関連して、記述することができる他の実施例は、シクロヘキサン環上の置換の相対的立体配置が、シクロヘキサン環がいす形立体配座に置かれたときに、各置換（Ｒ４基が付いたポリケチド環を含む）が同時に赤道位置をとるような物質を含む。すなわち、たとえば、記述することができる本発明の化合物は、部分構造フラグメントＣ，Ｄ，Ｆ，Ｃ（ｉ）およびＦ（ｉ）のシクロヘキサン環の２−，４−および／または６−位置に付いた基がシクロヘキサン基の１−位置に付いているポリケチド環に対してトランス配置となっているような物質を含む。記述することができる本発明の他の化合物は、部分構造フラグメントＣ，Ｄ，Ｆ，Ｃ（ｉ）およびＦ（ｉ）のシクロヘキサン環の３−および／または５−位置に付いた基がシクロヘキサン基の１−位置に付いているポリケチド環に対してシス配置となっているような物質を含む。記述することができる本発明のさらに他の化合物は、Ｒ４基が部分構造フラグメントＣ（ｉ）を表すときに、シクロヘキサン環の１−位置に付いているポリケチド環に対して、Ｒ７基（もし存在すれば、特にＯＨまたはＯＭｅ基）がトランス立体配置を持ち、Ｒ８基（もし存在すれば、特にＯＨまたはＯＭｅ基）がシス立体配置を持つような物質を含む。同様に、Ｒ４基がシクロヘキサ−３−エン環（すなわちＡまたはＡ（ｉ）の部分構造フラグメント）を表すとき、記述することができる本発明のさらに他の化合物は、シクロヘキサン環の１−位置に付いているポリケチド環に対して、２−および／または６−位置の置換基がトランス立体配置を持ち、３−位置の置換基がシス立体配置を持つような物質を含む。
【０１２２】
当業者であれば、１７−デスメチルラパマイシンおよびその相同物の産生のためにここに記述されている方法が関連する相同物のライブラリの産生にも適用可能であることが理解するであろう。したがって、さらに別の態様において、本発明は、本発明方法を用いて産生される１７−デスメチルラパマイシンのライブラリを与える。特に、本発明は、スターターとして配合される酸、配合されるアミノ酸、ポストＰＫＳ処理の度合いおよび半合成デリバティゼーション（semi-synthetic derivatisation）のうちの一または複数において異なる１７−デスメチルラパマイシン相同物のライブラリを与える。
【０１２３】
新規なラパマイシン相同物は、免疫抑制剤、抗菌剤、抗ガン剤、抗炎症剤、神経再生剤、または移植拒絶、移植片対宿主病、自己免疫不全、血管疾患、繊維化疾患などの治療薬、あるいは創傷治癒のレギュレーションに用いる薬剤として有用な化合物を製造するために直接、またはそのための更なる半合成またはバイオコンバージョンのためのテンプレートとして有用である。ラパマイシンおよびその相同物の半合成デリバティゼーションのための方法は当業界において良く知られており、米国特許第５６６５７７２号、米国特許第５３６２７１６号、国際公開ＷＯ９６／４１８０７、米国特許第５７２８７１０号、米国特許第５３７８８３６号、米国特許第５１３８０５１号、米国特許第５６６５７７２号、米国特許第５３９１７３０号、米国特許第５０２３２６２号、米国特許第５５６３１４５号、米国特許第５４４６０４８号、米国特許第５９１２２５３号、米国特許第５２２１６７０号、米国特許第５９５５４５７号、国際公開ＷＯ９８／０４２７９、米国特許第６０１５８１５号および米国特許第５４３２１８３号に記述されている改良法も含む（限定的ではない）。
【０１２４】
更なる態様において、本発明は１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物を医療用医薬品に用いることを与える。更なる態様において、本発明は１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物を、免疫抑制の誘導または維持、神経再生の刺激、または癌、Ｂ−細胞悪性腫瘍、真菌感染症、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性疾患、血管疾患および線維症の治療、および創傷治癒の調節のために用いる薬剤を調製するために用いることを与える。
【０１２５】
ラパマイシン相同物はまた、限定はされないがたとえば肺リンパ脈管筋腫症や結節性硬化症を含む他の症状の治療に有効であることが知られている。本発明の化合物を含む用途と方法はこれらの他の症状にも拡大される。
【０１２６】
当業者であれば、ルーチン的な経験によって、これらの化合物の真菌成長抑制能力を決定することができるであろう（たとえば、Ｂａｋｅｒ,Ｈ．Et al., 1978, ＮＣＣＬＳ Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing for easts; Approval standard M27-A, 17（9）. 1997）。加えて、当業者はそのルーチン的経験によってこれらの化合物の腫瘍細胞成長抑制能力を決定することができるであろう（Ｄｕｄｋｉｎ, Ｌ. et al. 2001； Ｙｕ et al. 2001を参照）。更なる態様において、本発明の化合物は免疫抑制を誘発するために有用である。この領域における化合物効能を決定するためのアッセイは当業者に良く知られており、非限定的な例として、免疫抑制活性：Warner, LM., et al., 1992, Kahan et al. （1991） & Kahan & Camardo, 2001）、アログラフト（Allografts）：Fishbein, T.M., et al., 2002, Kirchner et al. 2000、アウトイミューン／インフラマトリー／喘息（Autoimmune／Inflammatory／Asthma）：Carlson, RP. et al., 1993, Powell, N. et al., 2001、糖尿病（Diabetes）：Rabinovitch, A. et al., 2002、乾癬（Psoriasis）：Reitamo, S. et al., 2001、関節リウマチ（Rheumatoid arthritis）：Foey, A., et al., 2002、線維症（Fibrosis）：Zhu, J. et al., 1999, Jain, S., et al., 2001, Gregory et al. 1993が挙げられる。
【０１２７】
本発明の化合物の免疫抑制能力は、この目的のために用いられる標準的な試験方法で実証することができる。更なる態様において、本発明の化合物は抗線維化、神経再生および抗血管形成のメカニズムに対して有用であり、当業者はそのルーチン的経験によってこれら化合物の血管新生阻止能力を決定することができるであろう（たとえばGuba, M. et al., 2002）。当業者はまたそのルーチン的経験によってこれら化合物の血管過増殖症（vascular hyperproliferative desease）治療に対する有用性を決定することができるであろう（たとえばMorice, M.C. et al., 2002）。加えて、当業者はそのルーチン的経験によってこれら化合物の神経再生能力を決定することができるであろう。
【０１２８】
本発明はまた、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物からなる薬剤化合物、または、薬剤として許容され得るキャリアと共に薬剤として許容され得るその塩を提供する。
【０１２９】
本発明の上記化合粒またはその処方はいかなる従来法によっても投与可能であり、非限定的な例として、医療機器（たとえばステント）を介して、吸入または注射（皮下注射または筋内注射）によって、非経口、経口、局所（口内、舌下、経皮）にて投与することができる。治療は単一の投与または期間内の複数投与として行うことができる。
【０１３０】
本発明の化合物は単独で投与することも可能であるが、一または複数の許容できるキャリアと共に薬剤処方として提供されることが好ましい。キャリアは「許容できる」ものでなければならず、その意味は本発明の化合物と親和性があり且つそのレシピエントに対して有害でないことである。キャリアについての好適な例は詳しく後述する。
【０１３１】
本発明の化合物は単独で、または他の治療薬と組み合わせて投与可能である。二種（またはそれ以上）の薬剤を組み合わせて投与することは、使用する各薬剤の投与量を大幅に低下させ、したがって副作用を軽減させる。
【０１３２】
一実施形態において、免疫抑制の誘発または維持や、移植拒絶、移植片対宿主病、自己免疫疾患、炎症疾患等の治療のために、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物を他の薬剤と共に投与する。非限定的ではあるが好適な薬剤として、アザチオプリン、コルチステロイド、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸モフェチル（Mycophenolate Mofetil）、ＯＫＴ−３およびＡＴＧなどの免疫制御剤が含まれる。
【０１３３】
別の実施形態において、癌またはＢ細胞悪性腫瘍の治療のために、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物を他の薬剤と共に投与する。非限定的ではあるがその好適な薬剤として、メソトレキセート、ロイコボリン、アドリアマイシン、プレニゾン、ブレオマイシン、シクロフォスファミド、５−フルオロウラシル、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドクソルビシン、タモキシフェン、トレミフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、ゴセレリン、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ハーセプチン（商標名）など）、カペシタビン、塩酸ラロキシフェン、ＥＧＦＲ抑制剤（Iressa、Tarceva、Erbitux（いずれも商標名）など）、ＶＥＧＦ抑制剤（Avastin（商標名）など）、プロテアソーム抑制剤（Velcade（商標名）など）、Ｇｌｉｖｅｃ（商標名）またはｈｓｐ９０抑制剤（17-AAGなど）が含まれる。さらに、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物は、限定されないが放射線治療や外科手術を含む他の療法と組み合わせて投与することができる。
【０１３４】
一例として、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物は、血管症の治療のための他の治療薬と共に投与される。非限定的ではあるがその好適な薬剤として、ＡＣＥ抑制剤、アンジオテンシンＩＩレセプター拮抗剤、フィブリック酸相同物、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ抑制剤、ベータアドレナリン作用遮断剤、カルシウムチャンネル遮断剤、抗酸化剤、抗凝固剤および血小板抑制剤（たとえばPlavix（商標名）など）が含まれる。
【０１３５】
一例として、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物は、神経再生を刺激するための他の治療薬と共に投与される。非限定的ではあるがその好適な薬剤として、神経成長因子、グリア細胞由来の成長因子、脳性成長因子、毛様神経因子、ニューロトロフィン３のような神経栄養因子が含まれる。
【０１３６】
一例として、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物は、真菌感染治療のための他の治療薬と共に投与される。非限定的ではあるがその好適な薬剤として、アンフォテリシンＢ、フルシトシン、エキノカンジン（たとえばカスポファンギン、アニデュラファンギン、ミカファンギンなど）、グリセオフルビン、イミダゾール系またはトリアゾール系の抗感染剤（たとえばクロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オキシコナゾール、テルコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、ボリコナゾールなど）が含まれる。
【０１３７】
当業者には明らかなことであるが、他の薬剤と共に投与する場合、同一の治療レジームの一部として、２またはそれ以上の治療薬を患者に搬送するあらゆる手段を含む。２またはそれ以上の薬剤は単一のフォーミュレーションにおいて同時に投与することができるが、これは本質的なことではない。これら薬剤は異なるフォーミュレーションで異なる時に投与することもできる。
【０１３８】
フォーミュレーションは便宜的には単位剤形の中に存在し得る。また、調剤分野において公知であるいかなる方法によって調製することができる。このような方法は、有効成分（本発明の化合物）を、一または複数の副成分からなるキャリアと結合させるステップを含む。一般にこのフォーミュレーションは、有効成分を液体キャリアまたは微細に分割された固体キャリアまたはその両方と均一且つ緊密に結合させ、さらに必要であれば製品を形づくることによって調製される。
【０１３９】
本発明の化合物は、通常の場合、有効成分からなる薬剤フォーミュレーションの形で、経口または任意の非経口ルートで投与されるが、場合によっては、無害な有機または無機、酸または塩基、さらには塩として薬学的に許容され得る投薬形態を取ることができる。投薬ルートや治療すべき疾患および患者によって様々な投薬形態で化合物を投与することができる。
【０１４０】
たとえば、本発明の化合物は、薬効を即座に、または遅延させ、あるいは制御することを考慮して、錠剤、カプセル、胚珠（ovules）、エリキシル剤、液剤または懸濁液剤の形で経口投与、口内投与または舌下投与することができる。化合物は、香料剤や着色剤を含むことができる。本発明の化合物はまた筋内注射で投与可能である。
【０１４１】
経口投与に適した本発明化合物の液剤または懸濁液剤は、さらに、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミドなどの賦形剤、ポリソルベート８０などの分散剤、表面活性剤、ポリエチレングリコール、Ｐｈｏｓａｌ  ５０  ＰＧ（フォスフォチジルコリン、醤油脂肪酸、エタノール、モノ／ジグリセリド、プロピレングリコールおよびアスコルビルパルミテートからなる）を含むことができる。
【０１４２】
錠剤は、微結晶セルロース、ラクトース（ラクトース水和物やラクトース無水物など）、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムおよびグリシンなどの賦形剤、デンプン（好ましくは小麦、ポテトまたはタピオカスターチ）、グリコールデンプンナトリウム、クロスカメロースナトリウムおよびある種のケイ酸錯体などの崩壊剤、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、マクロゴール８０００、サクロース、ゼラチンおよびアカシアなどの増粒結合剤を含むことができる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ドコサン酸グリセリルおよびタルクなどの潤滑剤を含むことができる。
【０１４３】
類似タイプの固形化合物はゼラチンカプセルにおけるフィルターとしても使用可能である。この見地における好適な賦形剤は、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量ポリエチレングリコールなどである。液体懸濁物および／またはエリキシル剤のために、本発明化合物は様々な甘味剤ないし香料剤、着色剤ないし顔料、乳化剤および／または懸濁剤、水やエタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよびこれらの混合と組み合わせて用いることができる。
【０１４４】
錠剤は任意の一または複数の副成分と共に圧縮または成型によって調製することができる。圧縮法による錠剤は、粉体ないし粒体のような自由流動形態にある有効成分を適当な機械の中で圧縮することによって調製することができる。該有効成分は、結合剤（ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、潤滑剤、不活性希釈液、防腐剤、崩壊剤（グリコールデンプンナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、表面活性剤または分散剤と任意に混合することができる。成型法による錠剤は、不活性希釈液で湿潤された粉状の化合物を適当な機械の中で成型することによって調製することができる。錠剤は任意にコーティングまたはスコアリングが施され、たとえばヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な配合で用いて所望のリリースプロフィールを与えることにより、その中の有効成分のリリースを遅らせ、あるいは制御するようにフォーミュレーションすることができる。
【０１４５】
経口投与に適した本発明によるフォーミュレーションは、各々が所定量の有効成分を含有するカプセル剤、カシェ剤、錠剤などの別々のユニットとして、粉状物または粒状物として、水性液または非水性液中の溶液または懸濁液として、あるいは水中油型液体エマルジョンまたは油中水型液体エマルジョンとして、提供することができる。有効成分はボーラス（急速静注）投与、練り薬またはペーストとして提供することもできる。
【０１４６】
口内局所投与のために好適なフォーミュレーションは、香り付けされた通常はサクロースまたはアカシアまたはトラガントなどの基質内の活性成分からなるロゼンジ（lozenges）、ゼラチン、グリセリン、サクロース、アカシアなどの不活性基質内の活性成分からなる香剤、適当な液体キャリア内の活性成分からなるマウスウォッシュを含む。
【０１４７】
上述の成分に加えて、本発明のフォーミュレーションは、問題となるフォーミュレーションのタイプを考慮して、当業界に公知である他の薬剤を含むことができることを理解しなければならない。たとえば、経口投与に適したものは香料剤を含むことができる。
【０１４８】
局所投与に適合した医薬品化合物は、軟膏、クリーム、ローション、パウダー、溶液、ペースト、ジェル、含浸包帯、スプレー、エアロゾル、オイル、経皮デバイス、ダスティングパウダーなどとして設計することができる。これらの化合物は活性剤を含む従来法で調製することができる。これらは親和性のある従来公知のキャリアおよび添加剤、たとえば保存剤（防腐剤）、ドラッグペネトレーションをアシストする溶媒、クリームまたは軟膏内のエモリエント、ローションのためのエタノールまたはオレイルアルコールを含むことができる。このようなキャリアは化合物の約１％〜約９８％で存在することができる。より一般的にはこれらは化合物の約８０％を上限として存在する。例示的に述べるに過ぎないが、クリームまたは軟膏は、十分な量の親水性材料と化合物の約５〜１０重量％を含む水を混合して所望のコンシステンシー（consistency）を有するクリームまたは軟膏を製造することができる。
【０１４９】
経皮投与に適合した医薬品化合物は、レシピエントの表皮と長時間密接し続けるように意図された不連続パッチ（discrete patches）として提供することができる。たとえば、活性剤をパッチからイオントフォレーシス（iontophoresis）によってデリバーすることができる。
【０１５０】
外部組織たとえば口や皮膚へのアプリケーションのために、化合物は好ましくは局所用の軟膏またはクリームとして適用される。軟膏として設計される場合は、活性剤をパラフィン系または水溶性の軟膏ベースと共に使用し得る。
【０１５１】
あるいは、水中油クリームベースまたは油中水ベースと共に活性剤をクリーム中に設計しても良い。
【０１５２】
静脈投与のために、流体ユニットの単位投薬量フォームは、活性剤と、非限定的例示として水やアルコール、ポリオール、グリセリン、植物性油など、特に水が好ましいが、これらの無菌ベヒクルを用いて調製される。活性成分は、使用されるベヒクルと濃度に応じて、ベヒクルに懸濁または溶解され得る。溶液を調製する場合、活性成分は注射のために水に溶解し、適当なバイアル（vial）またはアンプルに注入する前にフィルタ殺菌し、シールされる。
【０１５３】
好ましくは、局所麻酔薬、防腐剤、緩衝剤などの添加剤がベヒクルに溶解される。安定性を高めるために、バイアルに注入する前に化合物を凍結して真空下で水を除去することができる。凍結乾燥したパウダーは次いでバイアル内でシールされ、使用前に注射用の水バイアルが供給されて液体を再構成する。
【０１５４】
静脈投与される懸濁液は、活性成分が溶解される代わりにベヒクル内に懸濁され、また、ろ過を伴わずに殺菌されることを除いて、溶液の場合とほぼ同様に調製される。活性成分は無菌ベヒクルに懸濁される前にエチレン酸化物に晒されることによって殺菌される。好ましくは、活性成分の均一な分散を促進させるために、界面活性剤または湿潤剤が化合物に含まれる。
【０１５５】
本発明の化合物は、また、当業界において公知の医療機器を用いて投与することができる。たとえば、一実施例によれば、本発明の薬剤化合物は無針（needleless）皮下注射器を用いて投与することができる。このような注射器は、米国特許第５３９９１６３号、米国特許第５３８３８５１号、米国特許第５３１２３３５号、米国特許第５０６４４１３号、米国特許第４９４１８８０号、米国特許第４７９０８２４号または米国特許第４５９６５５６号に開示されている。本発明に有用な公知のインプラントおよびモジュールの例を挙げれば、制御された速度で投薬するためのインプラント可能なマイクロインフュージョンポンプ（micro-infusion pump）を開示する米国特許第４４８７６０３号、外皮を通して投薬する医療器具を開示する米国特許第４４８６１９４号、厳密な注入速度で薬剤をデリバーするための薬剤インフュージョンポンプを開示する米国特許第４４４７２３３号、連続薬剤デリバリーのための可変速度インプラント可能インフュージョン装置を開示する米国特許第４４４７２２４号、マルチチャンバーのコンパートメントを有する浸透性薬剤デリバリーシステムを開示する米国特許第４４３９１９６号、および、浸透性薬剤デリバリーシステムを開示する米国特許第４４７５１９６号である。一つの特定の実施例として、本発明の化合物は、ＷＯ０１／８７２６３に記述されるものや関連する刊行物あるいはPerin（Perin、EC、2005）によって記述されるものに対応するような薬剤溶出ステント（drug-eluting stent）を用いて投与することができる。その他多くのインプラント、デリバリーシステムおよびモジュールが当業者に知られている。
【０１５６】
本発明の態様の他の実施例において、本発明化合物はプロドラッグ（prodrugs）の形で患者に提供することができる。これは特に抗ガン剤の場合に適用されるが、他の目的にも使用し得る。
【０１５７】
この適用に用いた「プロドラッグ」の語は、親薬剤（parent drug）に比べて小さな細胞毒性を持ち、酵素によってより活性的なフォームに活性化または変成され得るような薬剤活性物質の先駆物質または相同物に関連する（Wilman D.E.V.1986およびStella V.J.et al.1985を参照）。
【０１５８】
本発明化合物の１回投薬量は特定の化合物、関係する病気、サブジェクト、病気の性質および深刻度、サブジェクトの物質的な条件、および選択された投薬経路によって変わる。適切な１回投薬量は当業者であれば容易に決定することができる。
【０１５９】
コンポジションは本発明の化合物を０．１重量％以上、好ましくは１０〜６０重量％、あるいはそれ以上を含有する。これらは投薬方法に依存する。
【０１６０】
当業者には認識し得るように、本発明化合物の１回投薬量の適量と投薬間隔は、治療状況の性質および拡がり、投与の形態、経路および箇所、治療される患者の年齢および状況などによって決定され、最終的には医者が適切な投薬量を決定する。この投薬量は適切である限りしばしば繰り返され得る。副作用が発症した場合は、通常の臨床プラクティスに基づいて投薬の量および／または頻度を変更または減少させる。
【０１６１】
他の態様によれば、本発明は１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物の製造方法を与える。この方法は、
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメイン（methylmalonyl-CoA specific AT domain）をマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメイン（malonyl-CoA specific AT domain）に置換し、
（ｂ）遺伝子組み換えによるラパマイシンＰＫＳを適当なホスト細胞に発現させ、
（ｃ）必要に応じて外因性先駆細胞を供給しながら、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物が産生されるような条件でホスト細胞を培養し、
（ｄ）得られた産生物を必要に応じて単離する、ことからなる。
【０１６２】
特定の一実施形態において、産生される化合物は１７−デスメチルラパマイシンではない。
【０１６３】
この置換は、ラパマイシンＰＫＳモジュールによるマロニルＣｏＡの合体とメチル分枝のＣ１７欠失を結果として与え、このことはラパマイシンまたはプリラパマイシンと対比的である。一つの好適な実施形態において、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインは下記のポリケチド生合成遺伝子クラスターのうちの一つから選ばれる、すなわち、ラパマイシン、モネンシン（monensin）、ＦＫ５０６、エリスロマイシン（erythromycin）、ＦＫ５２０、アンフォテリシン（amphotericin）、アンゴラマイシン（angolamycin）、チロシン（tylosin）、ヒデルギン舌下錠（'hyg'）、ＦＫ５２３、メリダマイシン（meridamycin）、アンタスコミシン（antascomicin）、ＦＫ５２５、およびツクバマイシン（tsukubamycin）。さらに好適な実施形態においては、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、ラパマイシン、モネンシン、またはFK506のクラスターのうちの一つから選ばれる。さらに高度に好適な実施形態においては、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、ラパマイシンモジュール２由来のＡＴドメイン、モネンシンモジュール３由来のＡＴドメイン、モネンシンモジュール６由来のＡＴドメイン、モネンシンモジュール８由来のＡＴドメイン、ＦＫ５０６モジュール３由来のＡＴドメイン、およびＦＫ５０６モジュール７由来のＡＴドメインからなる群から選択される。最高に高度に好適な実施形態において、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインはラパマイシンのモジュール２由来のＡＴドメインである。
【０１６４】
デポジットされている配列にはＷＯ０４／００７７０９でも報告されているように、数多くのエラーがあることが確認されていることは注目すべきことである。本著者は、デポジットされている配列には更なるエラーが含まれている可能性を指摘する。そのうちの幾つかはこのクラスター遺伝子組み換え技術に用いられる領域におけるものである。配列表の配列は、公表されている配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチド（oligonucleotides）の配列と、配列されたポリヌクレオチド（polynucleotide）鎖反応（PCR）によって増幅されたＤＮＡフラグメントを表している。これらは、したがって、デポジットされている配列とは同じではないかも知れない。当業者は、配列されていないクローン化ＤＮＡフラグメントが機能的プロテインを形成するために生物学的に正しい配列を持ち、デポジットされている配列におけるエラーはこれに対して何らの効果も与えないと理解するであろう。ほかに認識されている（NCBI受入番号X86780）のは、ＰＫＳ遺伝子の予測翻訳（組み替え）製品であり、ドメインとモジュールの境界である（Aparicio et al. 1996）。Schwecke et al.（1995）に定義されているようにドメインおよび境界の定義における流動性は境界が存在する場所の例として考慮すべきであることを、当業者は理解するであろう。
【０１６５】
当業者は、ポリケチド合成物（および混合ＰＫＳ−ＮＲＰＳ）のタイプの中にドナーＡＴドメインとして用いられ得る多くのマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインが存在し、この組み替えを任意のタイプのＩＰＫＳまたは混合ＮＲＰＳ／ＰＫＳに由来する多数のマロニルＣｏＡ選択性アシルトランスフェラーゼ（acyl transferase）ドメインを用いて行うことができることを理解できるであろう。当業者はまた、モジュール１０ＡＴによるマロニルＣｏＡの組み込みを、たとえばＷＯ０２／１４４８２に記載された方法を用いてｒａｐＡＴ１０をその特異体に突然変異させることによって、あるいはモジュール１０をマロニルＣｏＡのために選択可能なＡＴドメイン含有モジュール、自然モジュールまたは組合せモジュールを含むもの、と置換することによって、実行可能であることを理解できるであろう。
【０１６６】
ラパマイシンＰＫＳへのマロニルＣｏＡ特異的ＡＴの導入は、ドナードメインをフランキング（flanking）してこれをインフレームで且つラパマイシンモジュール１０のアシルトランスフェラーゼと同位置でクローニングする限定領域の導入によって行われる。当業者は、限定酵素領域とジャンクション位置領域を使用することによってこれを実現し得ることを理解できるであろう。好適な実施形態によれば、ラパマイシンＡＴ２のマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、限定酵素領域MscIおよびAvrIIによって固められたＤＮＡフラグメント上に導入される。MscI領域は、下記保存アミノ酸配列ＰＧＱをエンコードするＤＮＡ配列と重なるＡＴドメインの最初に導入される。AvrII領域は、下記保存アミノ酸配列ＶＬＧをエンコードするＤＮＡ配列と重なるＡＴドメインの末端に導入される。当業者は、MscI領域をメチル化してET12567のような大腸菌株を通してｄｃｍＤＮＡを生じさせるこのクローニング戦略が、制限酵素MscIとの反応の前に要求されることを理解できるであろう。代替的な実施形態は他の制限領域、たとえば非限定的例示としてSpeIよびAvrII、MscIおよびBglII、SpeIおよびBglIIを含む。他の好適な代替例の組合せ制限領域はSpeIおよびAvrIIである。
【０１６７】
【表１】
2008509895.tif 000008
【０１６８】
一つの好適な実施形態において、Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ２−１０のラパマイシンポリケチド合成酵素が遺伝子組み換えによってマロニルＣｏＡ特異的ＡＴをモジュール１０に有するものとされる。高度に好適な実施形態において、下記実施例１に記述するように、マロニルＣｏＡ−ＡＴはラパマイシンＡＴ２である。
【０１６９】
当業者は、ＰＫＳ遺伝子クラスターの組み換えを行うためにＤＮＡを細胞に導入する方法には数多くのものがあることを理解できるであろう。実施例１において、我々は、温度感応型の起源プラズマを使った接合法を説明する。当業者は、他の方法、たとえば非限定的な例としてＷＯ０３／０３３６９９に記述されるような自己複製型ベクターを用いない相同組み換えを用いても良いことを理解できるであろう。したがって、遺伝子組み換えラパマイシンＰＫＳを産生するための組み換え法はここに記述されたものに限定されない。
【０１７０】
しかしながらに記述された方法は、遺伝子組み換えＰＫＳクラスターを産生するための好適な方法である。今日まで、ｒａｐＡ、ｒａｐＢまたはｒａｐＣの遺伝子組み換えを上記以外の方法でなし得た成功例は報告されていない。
【０１７１】
さらに別の態様において、本発明は、既述したように、モジュール１０のメチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインがマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインに置換されたラパマイシンポリケチド合成酵素をエンコードする組み換え生合成クラスターを含有する遺伝子改変種を産生させるための方法を提供する。一つの好適な実施形態において、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインは下記のポリケチド生合成遺伝子クラスターのうちの一つから選ばれる、すなわち、ラパマイシン、モネンシン、ＦＫ５０６、エリスロマイシン、ＦＫ５１０、アンフォテリシン、アンゴラマイシン、チロシン、ヒデルギン舌下錠、ＦＫ５２３、メリダマイシン、アンタスコミシン、ＦＫ５２５、およびツクバマイシン。さらに好適な実施形態においては、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、ラパマイシン、モネンシン、またはＦＫ５０６のクラスターのうちの一つから選ばれる。さらに高度に好適な実施形態においては、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインが、ラパマイシンモジュール２、モネンシンモジュール３、モネンシンモジュール６、モネンシンモジュール８、ＦＫ５０６モジュール３、およびＦＫ５０６モジュール７からなる群から選択される。最高に高度に好適な実施形態において、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインはラパマイシンのモジュール２に由来する。
【０１７２】
ラパマイシンポリケチド合成酵素経路の組み換えがＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ２−１０（その製造がＷＯ０４／００７７０９およびGregory et al. （2004）に開示されている）に例証されているが、当業者は、これらの方法が、野生型のＳ．ヒグロスコピカスＮＲＲＬ５４９１および他の関連した種（下記）に対しても等しく適用可能であることを理解するであろう。好ましくは、組み換え種はＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ２−１０およびＳ．ヒグロスコピカスＮＲＲＬ５４９１からなる群から選ばれる。
【０１７３】
この点について、Ｓ．ヒグロスコピカスＮＲＲＬ５４９１に関連する種は、Actinoplanes sp.N902-109（FERM BP-3832など）、Streptomyces sp.AA6554、Streptomyce hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475（ATCC 14891など）、Streptomyce hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678（ATCC 55087など）、Streptomyce hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674、Streptomyce hygroscopicus var. ascomyceticus（ATCC 55276など）、Streptomyces tsukubaensis No.9993（FERM BP-927など）、Streptomyce hygroscopicus subsp. yakushimaensis、Streptomyces sp.（DSM 4137など）、Streptomyces sp.（DSM 7348など） Micromonospora n.sp. A92-306401（DSM 8429など）、Streptomyces sp. MA 6858（ATCC 55098など）を含む。一実施形態においては、菌は、１７−デスメチルラパマイシンを生産する組み換えＳ．ヒグロスコピカスホスト細胞ではない。他の実施形態における菌は、外因的先駆物質の供給の不存在下で１７−デスメチルラパマイシンを生産する組み換えＳ．ヒグロスコピカス宿主細胞ではない。さらに別の実施形態では、菌は、５つの隣接遺伝子（contiguous genes）、ｒａｐＱＯＮＭＬの削除を含む組み換えＳ．ヒグロスコピカス宿主細胞ではない。
【０１７４】
任意的に、この方法はＷＯ０４／００７７０９に開示される方法と組み合わせて、１７−デスメチルラパマイシンの相同物を製造することができる。この相同物は、ポストＰＫＳ酵素による処理の程度または非天然スターター酸の添加において、天然ラパマイシン構造と異なる。
【０１７５】
本発明の既述した態様による一実施形態は、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物の製造方法および組み換えラパマイシンポリケチド合成酵素をエンコードする生合成クラスターを含む組み換え種の産生方法に関し、以下の追加的ステップからなる。
（ａ）導入すべきＡＴを適当な隣接制限領域を用いて単一のＤＮＡフラグメントに単離し、
（ｂ）同一の適当な制限領域を用いて目的ＡＴのフランキング配列と相同であるＤＮＡ配列領域を増幅・単離し、
（ｃ）上記（ａ）および（ｂ）に述べた３つのＤＮＡフラグメントを一緒にリゲートして、ＬＨＳホモロジーからドナーＡＴさらにＲＨＳホモロジーへと続くインフレーム配列を与え、
（ｄ）宿主菌株への導入のために上記（ｃ）からの完全配列を導入して下記からなる最終プラスミドを与え、
i）接合のためのｏｒｉＴ、
ii）一または複数の抵抗性マーカー、
iii）３７℃での培養によって選択され得るような成分である温度感応型の複製起点、
iv）大腸菌複製起点、
（ｅ）上記（ｄ）で述べた最終プラスミドを用いた接合によりホスト菌を変異させ、
（ｆ）この変異体を抗生物質耐性によって選択し、
（ｇ）選択抗生物質により３７℃で培養して主成分を産生し、
（ｈ）選択抗生物質の不存在下で同じく３７℃で培養して二次的な遺伝子組換体をスクリーニングし、
（ｉ）目的製品を製造する能力によって所望の菌を同定し、
（ｊ）必要に応じて標準的な方法で該菌の遺伝的性質を確認する。
【０１７６】
当業者は、ステップ（ｂ）で参照した適当な制限領域が、一緒にリゲートされたときに３つの配列がインフレームにあるようなものでなければならないことを理解するであろう。それらはＡＴのために用いられる２つの領域と同じである必要は必ずしもない。ホモロジーの左側領域のＲＨＳ上の制限領域は、該ＡＴのＬＨＳ上の領域と同一であるか、あるいはインフレーム配列を与えるほどに親和的でなければならない。ホモロジーの右側領域のＬＨＳ上の制限領域はその後のクローニングステップを実行するために適切であればいかなる領域でも良い。同様に、ホモロジーの右側領域のＬＨＳ上の領域は、該ＡＴのＲＨＳ上の領域と同一であるか、あるいはインフレーム配列を与えるほどに親和的でなければならず、この場合、ホモロジーの右側領域のＲＨＳ上の制限領域はその後のクローニングステップを実行するために適切であればいかなる領域でも良い。
【０１７７】
他の態様において、本発明は、次のステップからなる１７−デスメチルラパマイシン相同物の製造方法を与える。
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインがマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインに置換された組み換え菌を産生し、
（ｂ）ポリケチド製造に好適な環境下での上記組み換え菌の培養に非天然スターター酸を供給し、
（ｃ）任意的に、製造された化合物を単離する。
【０１７８】
したがって、本発明は、非天然スターター酸が添加された１７−デスメチルラパマイシン相同物の製造方法を提供する。特に、本発明は、環状またはヘテロ環のスターター酸の１７−デスメチルラパマイシン相同物への配合を提供する。この方法は、組み換えによるラパマイシン生合成遺伝子クラスター、１７−デスメチルラパマイシンのコアの責任遺伝子であるもの、を含む菌に上記択一的なスターター酸を供給するステップを含む。一実施形態において、組み換え菌は削除または不活性化された先駆供給遺伝子（precursor supply gene）を有していた。好適な実施形態によれば、この削除または不活性化された先駆供給遺伝子はｒａｐＫである。他の好適な実施形態によれば、組み換え菌は削除または不活性化されたｒａｐＫを有すると共に、この菌に供給される非天然スターター酸が、シクロヘキサンカルボキシル酸、３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれる。一実施形態において、菌は、１７−デスメチルラパマイシンを製造する組み換えＳ．ヒグロスコピカスホスト細胞ではない。他の実施形態における菌は、外因的先駆物質の供給の不存在下で１７−デスメチルラパマイシンを生産する組み換えＳ．ヒグロスコピカスホスト細胞ではない。
【０１７９】
本発明のこの態様は、非天然先駆体（たとえば環状またはヘテロ環のスターター酸）の添加を通じて多様なベース製品を効率的に製造する方法を提供する。後述するように方法は更なる態様の実施形態にもなり得る。
【０１８０】
したがって、一つの態様において、本発明は、環状またはヘテロ環のスターター酸を有する１７−デスメチルラパマイシン相同物の産生方法を与える。この方法は、
（ａ）組み換え技術によるラパマイシンＰＫＳ遺伝子を含む前記組み換え菌を組み替えて少なくとも一つの先駆供給遺伝子を追加的に削除または不活性化し、
（ｂ）環状またはヘテロ環の非天然スターター酸を前記組み換え菌に与えることからなる。
【０１８１】
好適な一実施形態において、組み換え菌はＷＯ０４／００７７０９およびここに記述された方法を用いて産生される。好適な一実施形態において、削除または不活性化された先駆供給遺伝子はｒａｐＫである。
【０１８２】
一実施形態において、供給される外因性の酸（exogenous acids）は、限定的ではないが、原子数５〜７の範囲で変動する環サイズを有するシクロアルキルカルボキシル酸（cycloalkyl carboxylic acids）またはその単純エステルである。好ましい実施形態において、カルボキシル酸はＷＯ０４／００７７０９に記述されるものである。
【０１８３】
他の好適な実施形態において、非天然スターター酸は本明細書の実施例２で記述されたものである。より好適な実施形態において、この菌に供給される非天然スターター酸は、シクロヘキサンカルボキシル酸、３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれる。
【０１８４】
一実施形態において、供給可能なヘテロ環スターター酸は、限定的ではないが、５〜７の原理数の範囲で変動する環サイズを有するヘテロ環カルボキシル酸またはその単純エステルを含む。この環は一または複数のヘテロ原子を含んでいても良い。環が複数のヘテロ原子を含む場合、それらのヘテロ原子は同一のものでも異なるものでも良い。ヘテロ原子はＯ，ＳおよびＮからなる群から選ぶことができる。環がＮを含む場合、それは遊離基（ＮＨ）として、またはアシル化アミン（Ｎ−ａｃｙｌ）として、またはアルキル化アミン（Ｎ−ａｌｋｙｌ）として、またはアルキル化窒素酸化物（Ｎ−ａｌｋｙｌ，Ｎ−Ｏ）として存在し得る。環がＳを含む場合、それは環状チオエーテル、スルホキシドまたはスルホンとして存在し得る。上述のヘテロ環カルボキシル酸のすべてにおいて、環の残部が置換されていないものでも良いし、あるいは一または複数の置換基、限定的ではないがたとえばＣ１−４アルキル、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌなどの置換基を含むものであっても良い。好ましくは、一例として、ヘテロ環カルボキシル酸は４位置に酸素原子を持つ６員環構造を有する。他の好適な実施形態では、ヘテロ環カルボキシル酸はテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−カルボキシル酸（tetrahydro-2H-pyran-4-carboxylic acid）である。
【０１８５】
他の態様によれば、本発明は下記ステップからなる１７−デスメチルラパマイシン相同物の産生方法を提供する。
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインがマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインに置換された組み換え菌を産生し（詳しくは上述）、
（ｂ）加えてｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱから選ばれる一または複数のラパマイシン補助遺伝子を削除または不活性化し、
（ｃ）得られた菌を、必要ならば外因性先駆物質の存在下で培養して、１７−デスメチルラパマイシン相同物を製造し、
（ｄ）得られた化合物を必要に応じて単離する。
【０１８６】
好適な実施形態において、削除または不活性化される補助遺伝子はｒａｐＩ、ｒａｐＪおよびｒａｐＱである。他の好適な実施形態において、削除される補助遺伝子はｒａｐＪ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱである。
【０１８７】
本発明の他の態様において、変異したラパマイシンＰＫＳは、一または複数のラパマイシン補助遺伝子が削除または不活性化されたホスト細胞の中で発現する。他の実施形態において、変異したラパマイシンＰＫＳは、全ての補助遺伝子が削除または不活性化されたホスト細胞、限定的ではないがたとえばＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ２−１０（ＷＯ０４／００７７０９, Gregory et al. 2004）のホスト細胞の中で発現する。当業者であれば、ＷＯ０４／００７７０９に存在する開示に基づいて、ｒａｐＫが削除または不活性化されたならば、１７−デスメチルラパマイシンまたはその相同物の製造のために外因性の酸を供給する必要があることを理解できるであろう。
【０１８８】
他の態様において、本発明は下記ステップからなる１７−デスメチルラパマイシン相同物の産生方法を提供する。
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインがマロニルＣｏＡ特異的特定ＡＴドメインに置換された組み換え菌を産生し（詳しくは上述）、
（ｂ）加えてｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱから選ばれる一または複数のラパマイシン補助遺伝子を削除または不活性化し、
（ｃ）補助遺伝子のすべてまたはサブセットを輸送中に（ｉｎ−ｔｒａｎｓ）再導入して削除を完全にまたは部分的にコンプリメントし、
（ｄ）得られた菌を、必要ならば外因性先駆物質の存在下で培養して、１７−デスメチルラパマイシン相同物を製造し、
（ｅ）得られた化合物を必要に応じて単離する。
【０１８９】
好適な実施形態において、ステップ（ｂ）ですべてのラパマイシン補助遺伝子を削除または不活性化する。別の好適な実施形態においては、組み換え菌を、ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱまたはそれらの相同物からなる群から選ばれる一または複数の補助遺伝子と遺伝子的にコンプリメントする。特定の実施形態において、菌をすべての補助遺伝子とコンプリメントする。別の好適な実施形態においては、組み換え菌をラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＫ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬまたはそれらの相同物と遺伝子的にコンプリメントする。他の好適な実施形態においては、組み換え菌をラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＫ、ｒａｐＩ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬまたはそれらの相同物と遺伝子的にコンプリメントする。
【０１９０】
したがって、本発明の特定の態様において、ＡＴスワップがＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ２−１０（ＷＯ０４／００７７０９およびGregory et al. 2004に開示されている）において行われる。そこではすべての補助遺伝子が削除され、得られた菌はラパマイシン製品を製造するために外因的な酸と化学的にコンプリメントする必要がある。たとえば、シクロヘキサンカルボキシル酸の供給は１７−デスメチル−３９−デスヒドロキシプレラパマイシンの製造をもたらし、スターター酸３，４−ジヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸の供給は１７−デスメチルプレ−ラパマイシンの製造をもたらす。好適な実施形態において、Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ２−１０においてＡＴスワップを実施することによって産生した菌はＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９であり、これは、実施例１に記述するように、ラパマイシンのモジュール２のアシルトランスフェラーゼをモジュール１０に導入してネイティブのＡＴ１０を置換することによって産生される。
【０１９１】
当業者であれば、Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９においてｒａｐＬのコピーは存在せず、記述した化学的コンプリメントはピペコリン酸または代替的なアミノ酸の添加を参照しないことを理解できるであろう。錯体産生媒体（complex production media）にリジンを補充することは、菌にピペコリン酸を与える（その方法は特定されないが、製造されたプレラパマイシン相同物を観測することによって実現される）。この菌（Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９）を培養すると、１７−デスメチルプロリルラパマイシン（17-desmethylprolylrapamycin）相同物の同時生産が低レベルで観察され、ｒａｐＬに不足する他の菌についても同様の観察がなされる。外因性の天然且つ新規なアミノ酸をピペコリン酸と直接競合させるようにして製造媒体に供給することにより、野生型ラパマイシン分子に添加することができる。当業者は、同様に、天然または非天然のアミノ酸をｒａｐＬ削除菌、限定的ではないがたとえばＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９に添加して、更なる新規ラパマイシン相同物を与えることができることを理解するであろう。
【０１９２】
任意的に、一または複数の削除された補助遺伝子を適切なプロモーターの下で前記ホスト細胞に導入することができる。好適な実施形態において、一または複数の削除された遺伝子をストレプトマイセスファージｐｈｉＢＴＩの染色体ファージ付着部位（chromosomal phage attachment site）に導入することができる（グレゴリーなど、2003）。当業者は、輸送中のコンプリメンテーションがこのファージアタッチメントサイトに限定されず、アタッチメントサイトの使用にすら限定されないことを理解するであろう。したがって、削除された補助遺伝子のコンプリメンテーションは、限定的ではないが、一または複数の補助遺伝子を適切なプロモーターの下で他のファージアタッチメントサイト、たとえばｐＳＥＴの相同物を使用してストレプトマイセスファージｐｈｉＣ３１のための付着部位などに導入することによっても実行可能である（Bierman ef al.1992）。このようなインテグレーションは他の利用可能なインテグレーション機能、非限定的な例として、ｐＳＡＭ２インテグラーゼ（たとえばｐＰＭ９２７ （Smovkina et al.1990））、Ｒ４インテグラーゼ（たとえばｐＡＴ９８（Matsuura et al.1996））、ＶＷＢインテグラーゼ（たとえばｐＫＴ０２（Van Mellaert et al.1998））、Ｌ５インテグラーゼ（たとえばLee et al.1991）などを用いて同様に実行することができる。当業者には認識できるであろうことであるが、適当なプロモーターと共に配達ベクター（delivery vector）に受け渡されて遺伝子をＳ．ヒグロスコピカスに導入するために用いられる他のシステムを産生するインテグレーション機能を含むと期待される放線菌（Actinomycete）ファージが多数存在する。とりわけ、多くの他のＳ．ヒグロスコピカスファージが同定されており、それらからもインテグレーション機能が得られ且つ同様にして利用され得るであろう。より多くのファージの特性が知られているので、同様にして使用し得るインテグラーゼが他にもあるであろうことが期待できる。場合によっては、これは、インテグラーゼに高効率のインテグレーションを可能にさせるために、特定ａｔｔＢ部位の添加による宿主菌の変更を必要とするかも知れない。適切なプロモーターの下での補助遺伝子の導入は、また、非限定的な例として、染色体内の中立位置に相同組み換えすることや、染色体内の非中立位置に相同組み換えする（たとえば選択した遺伝子を分裂させる）ことなどによっても実行可能である。自己複製型ベクターもまた使用可能であり、その非限定的な例として、ｐＳＧ５インテグラーゼ（たとえばｐＫＣ１１３９ Bierman et al.1992）、ｐｌＪ１０１（たとえば、plJ487、Kieser ef al.2000）、およびＳＣＰ２＊（たとえばｐｌＪ６９８、Kieser et al.2000）由来のストレプトマイセス複製起点を含む各種ベクターを挙げることができる。上記システムの一以上を用いて組み換え菌を遺伝子組み換えして１７−デスメチルラパマイシン相同物を産生することができる。当業者は、各補助遺伝子を適切に不活性化ないし削除することにより、すべての補助遺伝子の削除および輸送中コンプリメンテーションとして、同一の製品を製造する生合成経路を産生し得ることが理解できるであろう。このような遺伝子を必要に応じて遊離酸を供給しながら前記ホスト細胞内で発現させることは、天然ま��は非天然のスターター酸を組み込み、および／またはポストポリケチド処理について変更されたレベルを有する１７−デスメチルラパマイシン相同物の製造をもたらす。他の実施形態において、組み換えられたラパマイシンＰＫＳを、天然ではラパマイシン補助遺伝子（またはその相同体）を持たない異種ホスト細胞で前記補助遺伝子の選択と共に発現させることができる。好適な実施形態において、少なくともｒａｐＫが削除され、あるいはそうでなければＲａｐＫが宿主菌株に不存在であり、各種の外来性カルボキシル酸を前記ホスト菌に供給して、非天然スターター酸が組み込まれた１７−デスメチルラパマイシン相同物を製造することができる。
【０１９３】
本発明の別の態様において、上述の改変が組み合わされ、したがって本発明は下記ステップからなる１７−デスメチルラパマイシン相同物の製造方法を提供する。
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインがマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインに置換された組み換え菌を産生し、
（ｂ）加えてｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱから選ばれる一または複数のラパマイシン補助遺伝子を削除または不活性化し、
（ｃ）任意的に、補助遺伝子のすべてまたはサブセットを輸送中に再導入して削除を完全にまたは部分的にコンプリメントし、
（ｄ）ポリケチドの製造に適した条件下で前記組み換え菌に非天然スターター酸を供給し、
（ｅ）得られた化合物を必要に応じて単離する。
【０１９４】
好適な実施形態において、削除または不活性化された補助遺伝子はｒａｐＫを含む。
【０１９５】
好適な実施形態によれば、上記ステップ（ｂ）において、すべてのラパマイシン遺伝子が削除または不活性化される。一つの特定の態様において、本発明は非天然スターター酸が組み込まれた１７−デスメチルラパマイシン相同物を産生するための他の方法を提供する。この方法は、すべてのラパマイシン補助遺伝子が削除または不活性化された組み換え菌を、ラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱまたはそれらの相同物で遺伝子的にコンプリメントし、ｒａｐＫを除くすべての補助遺伝子を含む菌を産生させ、外来性のスターター酸で培養するものである。好適な実施形態において、外来性のスターター酸は３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸（3-methylcyclohexanecarboxylic acid）である。他の好適な実施形態において、非天然スターター酸はシクロヘプタンカルボキシル酸（cycloheptanecarboxylic acid）である。さらに別の好適な実施形態において、非天然スターター酸は、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれる。
【０１９６】
さらに別の態様において、本発明は、補助遺伝子活性と非天然スターター酸の組合せを用いて組み換え菌を発酵させることにより１７−デスメチルラパマイシン相同物を産生する方法を提供する。好適な実施形態において、削除された補助遺伝子はｒａｐＫ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱであり、この菌に供給される非天然スターター酸はシクロヘキサンカルボキシル酸である。別の好適な実施形態において、ｒａｐＫ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱが削除されたこの菌に供給される非天然スターター酸はメチルシクロヘキサンカルボキシル酸である。さらに別の好適な実施形態において、ｒａｐＫ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱが削除されたこの菌に供給される非天然スターター酸はシクロヘプタンカルボキシル酸である。好適な実施形態において、削除された補助遺伝子はｒａｐＫ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱであり、この菌に供給される非天然スターター酸は３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれる。
【０１９７】
さらに別の好適な実施形態において、削除された補助遺伝子はｒａｐＫ、ｒａｐＩおよびｒａｐＱであり、この菌に供給される非天然スターター酸は３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれる。さらに高度に好適な実施形態において、削除された補助遺伝子はｒａｐＫ、ｒａｐＩおよびｒａｐＱであり、この菌に供給される非天然スターター酸は３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸である。さらに高度に好適化された実施形態において、削除された補助遺伝子はｒａｐＫ、ｒａｐＩおよびｒａｐＱであり、この菌に供給される非天然スターター酸はシクロヘキサンカルボキシル酸である。
【０１９８】
他の好適な実施形態において、削除された補助遺伝子はｒａｐＫおよびｒａｐＭであり、この菌に供給される非天然スターター酸は３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれる。さらに高度に好適な実施形態において、非天然スターター酸はシクロヘキサンカルボキシル酸である。
【０１９９】
さらに別の好適な実施形態において、削除された補助遺伝子はｒａｐＫ、ｒａｐＩおよびｒａｐＭであり、この菌に供給される非天然スターター酸は３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれる。さらに高度に好適な実施形態において、供給される非天然スターター酸はシクロヘキサンカルボキシル酸である。
【０２００】
さらに別の好適な実施形態において、削除された補助遺伝子はｒａｐＫ、ｒａｐＩ、ｒａｐＪおよびｒａｐＱであり、この菌に供給される非天然スターター酸は３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれる。さらに高度に好適な実施形態において、供給される非天然スターター酸はシクロヘキサンカルボキシル酸である。
【０２０１】
さらに別の好適な実施形態において、削除された補助遺伝子はｒａｐＫ、ｒａｐＪ、ｒａｐＭおよびｒａｐＱであり、この菌に供給される非天然スターター酸は３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれる。さらに高度に好適な実施形態において、供給される非天然スターター酸はシクロヘキサンカルボキシル酸である。
【０２０２】
さらに別の態様において、本発明は、すべてのラパマイシン補助遺伝子が削除または不活性化された組み換え菌を、天然または非天然のスターター酸の供給と組み合わせて、ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱまたはそれらの相同物の一または複数で遺伝子的にコンプリメントすることにより１７−デスメチルラパマイシン相同物を産生させる方法を提供する。好適な実施形態において、ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬで前記組み換え菌を遺伝子的にコンプリメントし、シクロヘキサンカルボキシル酸、３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれる非天然スターター酸で培養する。好適な実施形態において、ｒａｐＪ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬで前記組み換え菌を遺伝子的にコンプリメントし、シクロヘキサンカルボキシル酸、３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれる非天然スターター酸で培養する。
【０２０３】
他の好適な実施例において、前記組み換え菌をｒａｐＪ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬで遺伝子的にコンプリメントし、シクロヘキサンカルボキシル酸、３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれるスターター酸で培養する。より高度に好適な実施形態において、供給されるスターター酸は３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸である。
【０２０４】
他の好適な実施形態において、前記組み換え菌をｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯ、ｒａｐＱおよびｒａｐＬで遺伝子的にコンプリメントし、シクロヘキサンカルボキシル酸、３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれるスターター酸で培養する。より高度に好適な実施形態において、供給されるスターター酸はシクロヘキサンカルボキシル酸である。
【０２０５】
他の好適な実施形態において、前記組み換え菌をｒａｐＪ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯ、ｒａｐＱおよびｒａｐＬで遺伝子的にコンプリメントし、シクロヘキサンカルボキシル酸、３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれるスターター酸で培養する。より高度に好適な実施形態において、供給されるスターター酸はシクロヘキサンカルボキシル酸である。
【０２０６】
他の好適な実施形態において、前記組み換え菌をｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬで遺伝子的にコンプリメントし、シクロヘキサンカルボキシル酸、３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれるスターター酸で培養する。より高度に好適な実施形態において、供給されるスターター酸はシクロヘキサンカルボキシル酸である。
【０２０７】
他の好適な実施形態において、前記組み換え菌をｒａｐＩ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬで遺伝子的にコンプリメントし、シクロヘキサンカルボキシル酸、３−メチルシクロヘキサンカルボキシル酸、シクロヘプタンカルボキシル酸、３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、４−フルオロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸、３−クロロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸および４−クロロ−３−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸からなる群より選ばれるスターター酸で培養する。より高度に好適な実施形態において、供給されるスターター酸はシクロヘキサンカルボキシル酸である。
【０２０８】
さらに別の態様において、本発明は下記ステップからなる１７−デスメチルラパマイシン相同物ライブラリの産生方法を提供する。
（ａ）ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０のメチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインがマロニルＣｏＡ特異的ＡＴドメインに置換された組み換え菌を産生し、
（ｂ）任意的に、ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＫ、ｒａｐＬ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＱから選ばれる一または複数の補助遺伝子を削除または不活性化し、
（ｃ）任意的に、ラパマイシン補助遺伝子のすべてまたはサブセットを輸送中に再導入して削除を完全にまたは部分的にコンプリメントし、
（ｄ）前記組み換え菌に非天然スターター酸配列を供給して、複数の１７−デスメチルラパマイシン相同物を産生させ、
（ｅ）ポリケチド製造に適した条件下で天然または新規のアミノ酸を供給し、
（ｆ）任意的に、得られた化合物を単離し、
（ｇ）任意的に、単離したラパマイシン相同物上で半合成を行う。
【０２０９】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳述するが、いかなる意味においてもこれら実施例は本発明の範囲を限定するものではないことを理解しなければならない。
【０２１０】
（材料）
すべての分子生物学的酵素および試薬は市販品から入手した。
【０２１１】
（微生物菌および培養条件）
Sambrook et al.（1989）に記述されるようにしてEscherichia C0// DHIOB（GibcoBRL）を２×ＴＹ培地で培養し、Paget et al.（1999）に記述されるようにして大腸菌ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）（1999） をカナマイシン（kanamaisin）２５ｍｇ／Ｌを用いて２×ＴＹ培地で培養した。ベクターｐＵＣ１８はニューイングランドバイオ研究所（New England Biolabs）から得た。ベクターｐＫＣ１１３９は、Practical Streptomyces Genetics、Kieser et al.（2000）に記述されている。大腸菌の形質転換体を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンまたは５０ｍｇ／Ｌのアプラマイシンと共に選択した。
【０２１２】
Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ２−１０（ＷＯ０４／００７７０９；Gregory et al.2004）およびその相同物を寒天培地１（下記）で２８℃に維持し、（Khaw et al.1998）に記述されているように、ＴＳＢＧＭ（１．０％ブドウ糖および１００ｍＭ  ＭＥＳを加えたトリプシン大豆培養液、ｐＨ６．０）内で培養した。必要に応じてアプラマイシン５０ｍｇ／Ｌを補充した。
【０２１３】
液体培養菌をエリエンマイヤー（Erienmeyer）フラスコまたはファルコンチューブ内で２８℃にて、３００ｒｐｍでシェークしながら培養した。
【０２１４】
（培養方法）
すべての菌の芽胞株を培地１で培養した後に調製した。それは、２０％ｗ／ｖグリセリンと１０％ｗ／ｖラクトースを含む蒸留水に保存して−８０℃で保管した。凍結株０．１ｍＬを２５０ｍＬフラスコ中の５０ｍＬ培地２（下記）に接種することによって植物培養菌（vegetative cultures）を調製した。培養菌を３６〜４８時間、２８℃、３００ｒｐｍでインキュベートした。
【０２１５】
（培養処理）
植物培養菌を５０ｍＬチューブ内の７ｍＬの培地３に０．５ｍＬを接種した。７日間にわたり２６℃、３００ｒｐｍで培養した。選択されたカルボキシル酸（非天然スターターまたは天然スターター）の供給／添加を接種２４時間後に行い、ほかに述べられていない限り１ｍＭで供給した。
【０２１６】
【表２】
2008509895.tif 000009
【０２１７】
【表３】
2008509895.tif 000010
【０２１８】
【表４】
2008509895.tif 000011
【０２１９】
【表５】
2008509895.tif 000012
【０２２０】
【表６】
2008509895.tif 000013
【０２２１】
抗ガン作用のためのin vitroバイオアッセイ
化合物が単分子膜増殖アッセイ（monolayer proliferation assay）中の１２個のヒト腫瘍細胞ラインのパネルにおいて発揮する抗ガン作用について、FreiburgのExperimental Oncology, Oncotest GmbH社の研究機関であるOncotest Testing Facilityで生体外評価を行った。選択された１２個の細胞ラインの特性を次の表に要約して示す。
【０２２２】
【表７】
2008509895.tif 000014
【０２２３】
Roth et al.1999に記述されるように、ヒト腫瘍異種移植片からオンコテスト（Oncotest）細胞ラインが確立された。ドナー異種移植片の起源はFiebig et al.1992に記述された。他の細胞ラインが、ＮＣｌ（H460, SF-268, OVCAR-3, DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-468）から得られ、またはドイツ国BraunschweigのＤＳＭＺから購入することができる（ＬＮＣＡＰ）。
【０２２４】
ほかに特記しない限り、すべての細胞サインは、ＲＰＭＩ１６４０培地と、１０％fetal calf serumと０．１ｍｇ／ｍＬゲンタミシン（ＰＡＡ、ドイツ国コルベ）を含む“ready-mix”培地にて、加湿雰囲気（９５％空気、５％二酸化炭素）中で３７℃で培養した。
【０２２５】
（単分子膜アッセイ）
変性死細胞染色用蛍光色素ＰＩアッセイ（modified propidium iodide assay）を用いて、１２個のヒト腫瘍細胞ラインの成長に対する試験化合物の影響を評価した（Dengler et al.1995）。
【０２２６】
要約すれば、トリプシン処理（trypsinization）によって指数関数的位相培養（exponential phase cultures）から細胞を取り出し、細胞ラインに応じた細胞密度（５〜１０，０００の範囲で変動する細胞数／ウエル）にて９６ウエル底面平滑マイクロタイタープレート（microtitre plates）に採取してカウントした。２４時間後に回収して指数関数的な増殖を再開させた後、培養培地０．０１ｍＬ（プレート当たり６個のcontrol well）または３９−デスメトキシラパマイシン（39-desmethoxyrapamycin）含有培養培地をウェルに添加した。各濃度を３つ培養した。３９−デスメトキシラパマイシンを２つの濃度（０．００１ｍＭおよび０．０１ｍＭ）で適用した。４日間の連続的インキュベーションの後、３９−デスメトキシラパマイシンを用いまたは用いずに細胞培養培地を０．２ｍＬの水性死細胞染色用蛍光色素ＰＩ溶液（７ｍｇ／Ｌ）で置換した。生存細胞の割合を測定するため、プレート凍結によって細胞を透過させた。プレートを解凍した後、Cytofluor4000マイクロプレートリーダー（励起５３０ｎｍ、放出６２０ｎｍ）を用いて蛍光発光を測定して、生存可能な細胞の総数との直接関係を得た。
【０２２７】
増殖抑制が（被処理数／コントロール）×１００（％Ｔ／Ｃ）として表され、細胞ラインの選択のために提供した。活性化合物について、生存細胞に対する化合物濃度をプロットすることによって検査した細胞ラインパネル全体に対するＩＣ５０およびＩＣ７０の平均値を算出し、これも提供した。
【０２２８】
実施例１  遺伝子組み換えによる菌Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９の単離
ｉ）プラスミドｐＡＬＫ８３の産生
プライマーＭＧ３０８ 5’-GTCCTAGGTGATGTCCCGGCAACACG-3’（配列ＩＤ番号：１３）およびMG309 5’-CACCTGCAGGCCCAACTCGGCCAGCTCGCT-3’（配列ＩＤ番号：１４）を用い、テンプレートとしてＳ．ヒグロスコピカスＮＲＲＬ５４９１から調製したコスミドＤＮＡ（cos26、Schwecke et al.1995参照）を使って、ラパマイシンモジュール１０アシルトランスフェラーゼ（ｒａｐＡＴ１０）の上流でホモロジーの領域を増幅した（Schwecke et al.1995に記述されるようにラパマイシンクラスターのｎｔ１１６９３からｎｔ１３２８９まで）。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて１５９６ｂｐのＰＣＲプロダクト（配列ＩＤ番号：１５）をリン酸化し、脱リン酸化ＳｍａｌダイジェストｐＵＣ１８にリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、プラスミドｐＭＧ２５５−４を単離した。プライマーＭＧ３１０ 5’-CCTGGCCAGGAAAGACGAACACGATCCT-3'（配列ＩＤ番号：１６）およびＭＧ３１１ 5’-CGAAGCTTGAGCCGCTGGCGATCGTGGGA-3（配列ＩＤ番号：１７）を用い、テンプレートとしてＳ．ヒグロスコピカスＮＲＲＬ５４９１から調製したコスミドＤＮＡ（cos26、Schwecke et al.1995参照）を使って、ラパマイシンモジュール１０ＡＴ下流でホモロジーの領域を増幅した（Schwecke et al.1995に記述されるようにラパマイシンクラスターのｎｔ１４１９１からｎｔ１５７４２まで）。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて１５５１ｂｐのＰＣＲプロダクト（配列ＩＤ番号：１８）をリン酸化し、脱リン酸化ＳｍａｌダイジェストｐＵＣ１８リゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、プラスミドｐＭＧ２５６−１を単離した。各プラスミドのインサートのインテグリティを配列分析によって検証した。
【０２２９】
プラスミドｐＣＪＲ２６（Rowe et al.1988）およびｐＭＧ２５６−１を各々、単離された大腸菌ＥＴ１２５６７および非メチル化（dam, dcm, hsdn）プラスミドＤＮＡに形質転換した。プラスミドｐＭＧ２５５−４をAvrII/HindIIIでダイジェストし、およそ４．３ｋｂｐのフラグメントを単離した。脱メチル化したｐＣＪＲ２６をMscI/AvrIIでダイジェストしておよそ１ｋｂｐのフラグメントを単離し、脱メチル化したｐＭＧ２５６−１をHindIIIで、部分的にMscIでダイジェストしておよそ１．５ｋｂｐのフラグメントを単離した。これら３つのＤＮＡフラグメントをリゲートしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した。得られたプラスミドｐＭＧ２９１−１４を単離した。このプラスミドをHindIII/XbaIでダイジェストしておよそ４ｋｂｐのフラグメントを単離し、HindIII/XbaIでダイジェストしたｐＫＣ１１３９にリゲートし、このＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂを形質転換した。得られたプラスミドｐＡＬＫ８３は、ＤＮＡ領域に隣接するモジュール２のラパマイシンアシルトランスフェラーゼドメインを含み、モジュール１０への相同組み換えを許容して、二重の組み換えによるＡＴスワップを達成する。
【０２３０】
ii）組み換え菌Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９の単離
プラスミドｐＵＺ８００２をハーバーリングする（harbouring）大腸菌ＥＴ１２５６７をｐＡＬＫ８３で形質転換して、コンジュゲーション（接合）のためのＥ.ｃｏｌｉドナー菌を産生した。これを用いてＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ２−１０（ＷＯ０４／００７７０９、Gregory et al.2004）をコンジュゲーションによって形質転換した。アプラマイシン耐性コロニーが単離され、これを培地１に５０ｍｇ／Ｌのアプラマイシンと２５ｍｇ／Ｌのナリジキシン酸を加えたものにパッチした。その後、このパッチを用いて、ＴＳＢＧＭを含むフラスコに５０ｍｇ／Ｌのアプラマイシンを接種した。この培養菌を２８℃で２日間、次いで３７℃で２日間インキュベートした。この培養菌を５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを含む培地１のプレートにストリークし、３７℃で７日間インキュベートした。５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを含む培地１のプレートに一つのコロニーを再パッチし、さらに７日間３７℃で培養した。これらのパッチを用いてＴＳＢＧＭのフラスコに抗生物質を用いずに接種し、３７℃で３日間培養した。この培養菌を培地１のプレートにストリークし、単一のコロニーを用いてアプラマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）と共にまたは単独で培地１のプレートにパッチして感受性を確認した。これは、プラスミド骨格の損失を含む二回目の組み換えイベントを表している。１４個のアプラマイシン感受性パッチを用いて１４×７ｍＬの培地２（ｒａｐＶ７）を接種し、これらの培養菌を２８℃で３日間増殖させた。次いでこれらを用いて（０．５ｍＬを７ｍＬに）培地３（ＭＤ６）に接種して５日間２６℃で培養した。この際、２４時間後の最終濃度が１ｍＭとなるようにシクロヘキサンカルボキシル酸を添加した。これら培養菌をＬＣＭＳによりラパマイシン相同物の製造のために評価した。９個の別個の培養菌は、１７−デスメチル−３９−デスヒドロキシプレ−ラパマイシンのために好適な分子量を有する新規化合物を産生することが分かった。これら培養菌の一つを製造レベル頑健性に基づいて選択して、新規化合物の単離のために大規模で培養した。この新規化合物をＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９と名付けた。
【０２３１】
iii）Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９由来の新規ラパマイシン相同物の分析
下記分析データに基づき、観測された新規ラパマイシン相同物は所望の１７−デスメチル−３９−デスヒドロキシプレ−ラパマイシンであると提案された。新規ラパマイシン相同物は３９−デスヒドロキシプレ−ラパマイシン（保持時間６．３５〜６．９５分）より極性が大きい（保持時間５．９〜６．２分）ものであり、これはメチル基が欠失しているためであると考えられる。
【０２３２】
ＭＧ７−９抽出物のＬＣＭＳおよびＬＣＭＳｎ分析の結果、新規ラパマイシン相同物のｍ／ｚ比は３９−デスヒドロキシプレ−ラパマイシンと比べて１４質量単位低く、これはメチル基の欠失に合致している。観測されたイオンは、[Ｍ−Ｈ]８１０．８、[Ｍ＋Ｎａ]＋ ８３４．８、[Ｍ＋Ｋ]＋ ８５０．８であった。ナトリウム付加物のフラグメンテーションは、以前に識別されたフラグメンテーション経路（図４）（J.A.Reather、理学博士、ケンブリッジ大学の研究報告、2000年）に従い、１７−デスメチル−３９−デスメトキシプレ−ラパマイシンのために予期されたイオンを与えた。このマススペクトロメトリーフラグメンテーションデータは、メチル損失がフラグメントＣ１６−Ｃ２７（天然体では３個のメチル基を有する）で生じている新規ラパマイシン相同物の領域を狭めている。これらのメチルはＣ１７（トリエン）、Ｃ２３（トリエンから炭素１個欠失）およびＣ２５（トリエンから炭素３個欠失）に付いている。ラパマイシンのＵＶトリエン特性が観測されたが、中心ピークのＵＶ最高値が変わっていた（３９−デスヒドロキシプレ−ラパマイシンのλ＝２７８ｎｍに対して２７０ｎｍ）。このことは、トリエン上の機能に変化をもたらしていることを強く示している。なぜならば、そのような波長変化はＣ１６（ＯＨ／ＯＣＨ３）における機能変化では観測されない。観測された変化は、メチル基損失に対して予測されるところと一致する。
【０２３３】
蓄積されたプロダクトを、また、ＬＣ高解像度フーリエ変換イオン・サイクロトロンレゾナンス・マススペクトロメトリー分析（ＬＣ−ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）によって分析した。親イオン（観測：834.51342（図５Ａ、Ｃ47Ｈ73ＮＯ10Ｎａ、計算: 834.51319、偏差０．２８ｐｐｍ）および重要な娘イオン（フラグメンテーション経路について添付図４を参照）のナトリウム付加物について正確なマスデータが得られた。
【０２３４】
【表８】
2008509895.tif 000015
【０２３５】
このマススペクトロメトリーフラグメンテーションデータは１７−デスメチル−３９−デスメトキシプレ−ラパマイシンと完全に一致している。
【０２３６】
iv）単離のための新規ラパマイシン相同物の発酵
すべての菌の芽胞株を、蒸留水中の２０％グリセリンおよび１０％ｗ／ｖ乳糖に保存し−８０℃で格納した培地１で培養して調製した。凍結株０．１ｍＬを２５０ｍＬフラスコ中の５０ｍＬ培地４に接種することにより、主な植物培養菌（vegetative cultures）を調製した。２５０ｒｐｍでシェーキングしながら培養菌を２８℃で４８時間インキュベートした。培養菌を次いで、２０００ｍＬフラスコ内の４００ｍＬ培地４に植え継ぎ培養して二次植物培養菌を得た。この培養菌を２５０ｒｐｍでシェーキングしながら２８℃で２４時間インキュベートした。
【０２３７】
植物培養菌を７．５％ｖ／ｖにて、２０Ｌファーメンタ（fermentor）内で１５Ｌの培地５（前述）に接種した。０．５ｖｖｍ＞３０％溶解酸素、最小チップ速度１．１８ｍｓ−１、最大チップ速度２．７５ｍｓ−１にて２６℃、６日間の培養を行った。接種の２４時間後および４８時間後にシクロヘキサンカルボキシル酸を注入して最終濃度２ｍＭ／Ｌを与えた。４８時間後に水２００ｍＬに９．５ｇのＬ−リジンを添加した。
【０２３８】
v）抽出および精製
発酵汁（１２Ｌ）を同量のメタノールと共に２時間撹拌した後、遠心分離（１０分間、３５００ｒｐｍ）して細胞をペレット状にした。上澄液をDiaion（登録商標）ＨＰ２０樹脂（４３ｇ／Ｌ）と共に１．５時間撹拌した後にろ過した。アセトン（合計量７．５Ｌ）で樹脂をバッチ洗浄してラパマイシン相同物を剥ぎ取り、溶剤を減圧下で除去した。得られた水性抽出物（８００ｍＬ）を水で１Ｌに希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１Ｌ）で抽出した。溶剤を減圧下で除去して粘質の褐色抽出物（10.9g）を得た。この抽出物をアセトン（ｃａ２０ｍＬ）に溶解し、シリカでコーティングし、シリカコラム（３×６．５ｃｍ径）に適用し、徐々に比率を変えたアセトン／ヘキサン（２０％〜４０％）で希釈した。ラパマイシン相同物含有フラクションをプールし、溶剤を減圧下で除去した。残余物（８４０ｍｇ）を１０：１０：１クロロホルム／ヘプタン／エタノールで希釈して、さらにSephadexＬＨ２０でクロマトグラフィにかけた。半精製されたラパマイシン相同物（１５１ｍｇ）をアセトニトリル（２．７ ｍＬ）に溶かし、遠心処理し（１０分間、１３２００ｒｐｍ）、GilsonＨＰＬＣを使用した逆位相（Ｃ１８）分取用（preparative）ＨＰＬＣによって精製した。この際、Phenomenex  ２１．２×２５０ｍｍ  Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８  ＢＤＳコラムを２１ｍＬ／ｍｉｎの６０％アセトニトリル／水で希釈した。最も純粋なフラクション（ＨＰＬＣ分析により同定）を結合し、溶媒を減圧下で除去して、１７−デスメチル−３９−デスメトキシプレ−ラパマイシン（１０ｍｇ）を得た。
【０２３９】
vi）特性
一連のＮＭＲ実験を行った（１Ｈ、１３Ｃ、ＡＰＴ、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹ）。これらのデータの完全且つ徹底的なレビューは、１７−デスメチル−３９−デスメトキシプレ−ラパマイシンの両方のロトマー（rotomers）のプロトンおよび炭素の大多数の帰属を可能にした。オレフィンメチル共鳴が不存在であることは、１ＨのＮＭＲスペクトルからすぐに明らかになった。Ｈ１６とオレフィンメチン（３９−デスヒドロキシプレ−ラパマイシンのスペクトルには存在しない）との相関性がCOSYスペクトルに見られ、この化合物はＣ１７にメチル基を持っていないことが確認された。この化合物の各公知ロトマーのＣ１７含有部について重要なＮＭＲ相関性が図７に示されている（これら２つの相違が図示されていないアミド構造部に存在する）。
【０２４０】
【表９】
2008509895.tif 000016
【０２４１】
ＮＭＲデータは１Ｈ−ＮＭＲについては５００ＭＨｚで、１３Ｃ−ＮＭＲについては１２５で、ＣＤＣｌ３中で得た。
【０２４２】
実施例２−Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９へのスターター酸のアレイ供給
【０２４３】
【表１０】
2008509895.tif 000017
【０２４４】
方法Ａ：（１Ｒ＊,３Ｒ＊,４Ｒ＊）−３，４−ジヒドロキシクロヘキサンカルボキシル酸の合成
【０２４５】
【化４】
2008509895.tif 000018
【０２４６】
（１Ｒ＊,３Ｒ＊,４Ｒ＊）−３，４−ジヒドロキシクロヘキサンカルボキシル酸は市販のラセミ化合物（racemic）の３−シクロヘキサンカルボキシル酸から容易に入手することができた。この酸をメタ−クロロ過安息香酸（meta-chloroperbenzoic acid）を用いた処理によってエポキシ化し、基質（トリエチルアミン）を加えることによって（１Ｒ＊,３Ｒ＊,４Ｒ＊）−４−ヒドロキシクロヘキサン−１，３−カルボラクトンにｉｎ  ｓｉｔｕ変換して、比較例としてのステレオケミストリ（stereochemistries）を作り出した。このラクトンを次いで水酸化カリウム水溶液の作用で水溶化（hydrolyzed）し、最終プロダクトをイオン交換樹脂で精製した（Corey, E.J.およびHuang, H. 1989）。
【０２４７】
方法Ｂ：エチル（１Ｒ＊,５Ｒ＊）５−ヒドロキシシクロヘキス-3-エン−カルボキシル酸の合成
【０２４８】
【化５】
2008509895.tif 000019
【０２４９】
シクロヘクス-3-エン-カルボキシル酸から（１Ｒ＊,３Ｒ＊,４Ｒ＊）−４−イオドヒドロキシクロヘキサン−１，３−カルボラクトンを産生させることによって、表題の化合物をラセミ化合物の形で調製し、これを次いで基質ＤＢＵ（1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene）で処理してＨＩを除去した。得られた（１Ｒ＊，５Ｓ＊）−シクロヘキサ−３−エン−１，５−カルボラクトンを次いでエタノールに溶解した水酸化カリウムで処理して、表題の化合物を産生した（Marshall, J.A.およびShiping, X. 1995）。
【０２５０】
方法Ｃ：エチル（１Ｒ＊，４Ｒ＊）−３−フルオロ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボキシル酸の合成
【０２５１】
【化６】
2008509895.tif 000020
【０２５２】
方法Ａで産生した（１Ｒ＊,３Ｒ＊,４Ｒ＊）−４−ヒドロキシクロヘキサン−１，３−カルボラクトンを（１Ｒ＊,３Ｒ＊,４Ｒ＊）−４−（１−テトラヒドロピラニル）オキシシクロヘキサン-1,3-カルボラクトンとして保護し、これをエタノール溶解水酸化カリウムで処理して（１Ｒ＊,３Ｒ＊,４Ｒ＊）−３−ヒドロキシ−４−（１−テトラヒドロピラニル）オキシシクロヘキサン−カルボキシル酸を産生した。活性化−置換方法（Yin et al. 2004）によってフルオリンを３位置に導入し、酸性ＤＯＷＥＸ樹脂で４−（１−テトラヒドロピラニル）基を除去した。
【０２５３】
ｉ）アレイ供給実験
Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を胞子形成が生ずるまで、培地１で２８℃、１４日間増殖させた。０．５ｃｍ径の寒天、ミセリア（mycelia）および胞子をプレートから取り出し、発泡栓（foam bung）を備えた５０ｍＬファルコンチューブ内の７ｍＬ培地２（ｒａｐＶ７）に移し、３００ｒｐｍでシェーキングしながら２８℃で４８時間培養した。この培養種０．５ｍＬをさらに発泡栓を備えた５０ｍＬファルコンチューブ内の７ｍＬ培地３（ＭＤ６）に移して、３００ｒｐｍでシェーキングしながら２６℃で２４時間培養した。メタノール０．０５ｍＬに溶解させたスターター酸を各々適当な培養に供給して最終濃度を2nMに調整した（スターター酸リストの表７を参照）。培養菌を２６℃にてさらに４日間培養した。次いで培養菌１ｍＬをフラスコから取り出し、２ｍＬエッペンドルフ（eppendorf）内のアセトニトリル１ｍＬに添加し、室温で１時間撹拌し、１３，０００ｒｐｍの遠心分離機に１５分間かけて遠心分離した。表層０．２ｍＬを除去してＨＰＬＣチューブに入れ、ＵＶおよびＬＣＭＳ検出を用いてＨＰＬＣで分析した。
【０２５４】
【表１１】
2008509895.tif 000021
【０２５５】
【化７】
2008509895.tif 000022
【０２５６】
実施例３−複合ベクターｐＬＬ１５０の構造
プラスミドｐＳＧｓｅｔ１（ＷＯ０４／００７７０９）をSpelおよびBstEllを用いてダイジェストし、2.481ｋｂｐのフラグメントを単離して、同様にSpeIおよびBstEIIでダイジェストしたベクターｐＲＴ８０１（Gregory et al. 2003）でリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、コロニーを制限酵素ダイジェスト（restriction enzyme digestion）によってスクリーニングし、最終プラスミドｐＬＬ１５０を単離した。図８参照。
【０２５７】
実施例４−Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を補助遺伝子カセットで相補することによる１７−デスメチルラパマイシンの単離
ｉ）ラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＫ, ｒａｐＩ, ｒａｐＪ, ｒａｐＮ, ｒａｐＯ, ｒａｐＭ, ｒａｐＱおよびｒａｐＬ（ｒａｐＫＩＪＮ／ＯＭＱＬ）を含有する相補的プラスミドｐＬＬ１５８の産生
SpeIおよびHindIIIを用いてプラスミドｐＳＧｓｅｔｒａｐｒａｐＫＩＪＮ／ＯＭＱＬ（ＷＯ０４／００７７０９）をダイジェストし、８．５１６ｋｂｐのフラグメント（ｒａｐｒａｐＫＩＪＮ／ＯＭＱＬを含有）を単離して同様にSpeIおよびHindIIIでダイジェストした複合ベクターｐＬＬ１５０でリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、最終プラスミドｐＬＬ１５８を制限酵素ダイジェストにより同定し確認した。
【０２５８】
ii）菌Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９（ｐＬＬ１５８）の単離
プラスミドｐＵＺ８００２をハーバリングする大腸菌ＥＴ１２５６７をｐＬＬ１５８で形質転換して、コンジュゲーションのためのＥ.ｃｏｌｉドナー菌を産生した。これを用いてコンジュゲーションによりＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を形質転換した。アプラマイシン抵抗性コロニーを培地１（５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌナリジクス酸）上で単離し、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌナリジクス酸と共に培地１にパッチした。これらのパッチを２８℃で培養した後、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えたＩＳＰ３培地上に二次パッチして２８℃で１４〜２１日間培養した。各パッチからのプラグを用いて、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えた７ｍＬの培地２（ＲａｐＶ７）を含有する個々のファルコンチューブを接種した。これらの培養菌を２８℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。次いで、これらを用いて培地３（ＭＤ６）に接種（０．５ｍＬを７ｍＬに）し、２６℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。等量のアセトニトリルの添加により、これらの培養菌から二次メタボライトが抽出された。細胞のデブリ（cell debris）を遠心分離除去した。サンプルをＬＣＭＳで１７−デスメチルラパマイシン製造のために評定した。
【０２５９】
iii）１７−デスメチルラパマイシンの分析
観測された新規ラパマイシン相同物はＬＣＭＳデータに基づいて１７−デスメチルラパマイシンであると提案された。これらのデータは、この新規ラパマイシン相同物がラパマイシンより１４質量単位小さいことを示し、メチル基が存在しないことに合致するものであった。観測されたイオンは[Ｍ−Ｈ]８９８．７、[Ｍ＋Ｎａ]＋９２２．７、[Ｍ＋Ｋ]＋９３８．６。ラパマイシンのＵＶトリエン特性が観測されたが、その中心ピークのＵＶ最高値が変わっていた（ラパマイシンのλ＝２７８ｎｍに対して２７０ｎｍ）。
【０２６０】
iv）単離のための１７−デスメチルラパマイシンの発酵
すべての菌の芽胞株を、蒸留水中の２０％グリセリンおよび１０％ｗ／ｖ乳糖に保存し−８０℃で格納した培地１で培養して調製した。凍結株０．１ｍＬを２５０ｍＬフラスコ中の５０ｍＬ培地４に接種することにより、主な植物培養菌を調製した。２５０ｒｐｍでシェーキングしながら培養菌を２８℃で４８時間インキュベートした。培養菌を次いで、２０００ｍＬフラスコ内の４００ｍＬ培地４に植え継ぎ培養して二次植物培養菌を得た。この培養菌を２５０ｒｐｍでシェーキングしながら２８℃で２４時間インキュベートした。
【０２６１】
植物培養菌を７．５％ｖ／ｖにて、２０Lファーメンタ内で１５Lの培地５（前述）に接種した。０．５ｖｖｍ?３０％溶解酸素、最小チップ速度１．１８ｍｓ−１、最大チップ速度２．７５ｍｓ−１にて２６℃、６日間の培養を行った。４８時間後に水２００ｍＬに９．５ｇのＬ−リジンを添加した。
【０２６２】
v）抽出および精製
発酵汁（１２Ｌ）を同量のメタノールと共に２時間撹拌した後、遠心分離（１０分間、３５００ｒｐｍ）して細胞をペレット状にした。上澄液をDiaion（登録商標）ＨＰ２０樹脂（４３ｇ／Ｌ）と共に１．５時間撹拌した後にろ過した。アセトン（合計量７．５Ｌ）で樹脂をバッチ洗浄してラパマイシン相同物を剥ぎ取り、溶剤を減圧下で除去した。得られた水性抽出物（〜８００ｍＬ）を水で１Ｌ  に希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１Ｌ）で抽出した。溶剤を減圧下で除去して粘質の褐色抽出物を得た。
【０２６３】
この抽出物をアセトン（ｃａ２０ｍＬ）に溶解し、シリカでコーティングし、シリカコラム（３×６．５ｃｍ径）に適用し、徐々に比率を変えたアセトン／ヘキサン（２０％〜４０％）で希釈した。ラパマイシン相同物含有フラクションをプールし、溶剤を減圧下で除去した。残余物を１０：１０：１クロロホルム／ヘプタン／エタノールで希釈して、さらにSephadexＬＨ２０でクロマトグラフィにかけた。半精製されたラパマイシン相同物をアセトニトリル（２．７ｍＬ）に溶かし、遠心処理し（１０分間、１３２００ｒｐｍ）、Gilson ＨＰＬＣを使用した逆位相（Ｃ１８）分取用ＨＰＬＣによって精製した。この際、Phenomenex ２１．２×２５０ｍｍ  Ｌｕｎａ ５μｍ  Ｃ１８  ＢＤＳコラムを２１ｍＬ／ｍｉｎの６０％アセトニトリル／水で希釈した。最も純粋なフラクション（ＨＰＬＣ分析により同定）を結合し、溶媒を減圧下で除去して、１７−デスメチルラパマイシン（１３３ｍｇ）を得た。
【０２６４】
vi）特性
単離した製品をＬＣＭＳｎ分析にかけたところ、ナトリウム付加物のフラグメンテーションが、以前に識別されたフラグメンテーション経路（J.A.Reather、理学博士、ケンブリッジ大学の研究報告、2000年）に基づいて１７−デスメチルラパマイシンのために予期されたイオンを与えた。このマススペクトロメトリーフラグメンテーションデータは、メチル損失がフラグメントＣ１６−Ｃ２７で生じている新規ラパマイシン相同物の領域を狭めている。ＮＭＲ実験を１Ｈ、１３Ｃ、ＡＰＴ、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹで行った。これらのデータの完全且つ徹底的なレビューは、１７−デスメチルラパマイシンの帰属を与えた。オレフィン的メチル共鳴の欠失が特に注目すべき点であり、下記表１２に記述される重要な相関性が観測された。
【０２６５】
【表１２】
2008509895.tif 000023
【０２６６】
実施例５−Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を補助遺伝子カセットで相補することによる９−デオキソ−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−Ｏ−デスメチルラパマイシン（9-deoxo-17-desmethyl-27-O-desmethyl-39-O-desmethyl rapamycin）の単離
【０２６７】
ｉ）ラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＫ, ｒａｐＮ, ｒａｐＯ, ｒａｐＭおよびｒａｐＬ（ｒａｐＫＮ／ＯＭＬ）を含有する相補的プラスミドｐＬＬ１７４の産生
SpeIおよびHindIIIを用いてプラスミドｐＳＧｓｅｔｒａｐＫＮ／ＯＭＬ（ＷＯ０４／００７７０９）をダイジェストし、５．７９５ｋｂｐフラグメント（ｒａｐＫＮ／ＯＭＬ含有）を単離して同様にSpeIおよびHindIIIでダイジェストした複合ベクターｐＬＬ１５０でリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、最終プラスミドｐＬＬ１７４を制限酵素ダイジェストにより同定し確認した。
【０２６８】
ii）菌Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９（ｐＬＬ１７４）の単離
プラスミドｐＵＺ８００２をハーバリングする大腸菌ＥＴ１２５６７をｐＬＬ１７４で形質転換して、コンジュゲーションのためのＥ．ｃｏｌｉドナー菌を産生した。これを用いてコンジュゲーションによりＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を形質転換した。アプラマイシン抵抗性コロニーを５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌナリジクス酸を加えた培地１上で単離し、パッチした。これらのパッチを２８℃で培養した後、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えたＩＳＰ３培地上に二次パッチして２８℃で１４〜２１日間培養した。各パッチからのプラグを用いて、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えた７ｍＬの培地２（ＲａｐＶ７）を含有する個々のファルコンチューブを接種した。これらの培養菌を２８℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。次いで、これらを用いて培地３（ＭＤ６）に接種（０．５ｍＬを７ｍＬに）し、２６℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。
【０２６９】
等量のアセトニトリルの添加により、これらの培養菌から二次メタボライトが抽出された。細胞のデブリを遠心分離除去した。サンプルをＬＣＭＳで９−デオキソ−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−Ｏ−デスメチルラパマイシン製造のために評定した。
【０２７０】
iii）９−デオキソ−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−Ｏ−デスメチルラパマイシンの分析
観測された新規ラパマイシン相同物はＬＣＭＳデータに基づいて９−デオキソ−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−Ｏ−デスメチルラパマイシンであると提案された。これらのデータは、この新規ラパマイシン相同物が１７−デスメチルラパマイシンより４２質量単位小さいことを示し、メチル基３個が存在しないことに合致するものであった。観測されたイオンは[Ｍ−Ｈ]８５６．８、[Ｍ＋Ｎａ]＋８８０．７、[Ｍ＋Ｋ]＋８９６．６。
【０２７１】
実施例６−Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を補助遺伝子カセットで相補することによる９−デオキソ−１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチルラパマイシン（9-deoxo-16-O-desmethyl-17-desmethyl-27-O-desmethyl rapamycin）の単離
【０２７２】
ｉ）ラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＫ, ｒａｐＩ, ｒａｐＮ, ｒａｐＯおよびｒａｐＬ（ｒａｐＫＩＮ／ＯＬ）を含有する相補的プラスミドｐＬＬ１７３の産生
SpeIおよびHindIIIを用いてプラスミドｐＳＧｓｅｔｒａｐＫＩＮ／ＯＬ（ＷＯ０４／００７７０９）をダイジェストし、５．６２４ｋｂｐフラグメント（ｒａｐＫＩＮ／ＯＬ含有）を単離して同様にSpeIおよびHindIIIでダイジェストした複合ベクターｐＬＬ１５０でリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、最終プラスミドｐＬＬ１７３を制限酵素ダイジェストにより同定し確認した。
【０２７３】
ii）菌Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９（ｐＬＬ１７３）の単離
プラスミドｐＵＺ８００２をハーバリングする大腸菌ＥＴ１２５６７をｐＬＬ１７３で形質転換して、コンジュゲーションのためのＥ．ｃｏｌｉドナー菌を産生した。これを用いてコンジュゲーションによりＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を形質転換した。アプラマイシン抵抗性コロニーを５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌナリジクス酸を加えた培地１上で単離し、パッチした。これらのパッチを２８℃で培養した後、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えたＩＳＰ３培地上に二次パッチして２８℃で１４〜２１日間培養した。各パッチからのプラグを用いて、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えた７ｍＬの培地２（ＲａｐＶ７）を含有する個々のファルコンチューブを接種した。これらの培養菌を２８℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。次いで、これらを用いて培地３（ＭＤ６）に接種（０．５ｍＬを７ｍＬに）し、２６℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。
【０２７４】
等量のアセトニトリルの添加により、これらの培養菌から二次メタボライトが抽出された。細胞のデブリを遠心分離除去した。サンプルをＬＣＭＳで９−デオキソ−１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチルラパマイシン製造のために評定した。
【０２７５】
iii）９−デオキソ−１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチルラパマイシンの分析
観測された新規ラパマイシン相同物はＬＣＭＳデータに基づいて９−デオキソ−１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチルラパマイシンであると提案された。これらのデータは、この新規ラパマイシン相同物が１７−デスメチルラパマイシンより４２質量単位小さいことを示し、メチル基３個が存在しないことに合致するものであった。観測されたイオンは[Ｍ−Ｈ]８５６．８、[Ｍ＋Ｎａ]＋８８０．７、[Ｍ＋Ｋ]＋８９６．６。
【０２７６】
実施例７−Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を補助遺伝子カセットで相補し且つ産生培地にスターター酸を補充することによる１７−デスメチル−３９−デスメトキシ−ラパマイシン（17-desmethyl-39-desmethoxy rapamycin）の単離
【０２７７】
ｉ）ラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＩ, ｒａｐＪ, ｒａｐＮ, ｒａｐＯ, ｒａｐＭ, ｒａｐＱおよびｒａｐＬ（ｒａｐＩＪＮ／ＯＭＱＬ）を含有する相補的プラスミドｐＬＬ１７８の産生
SpeIおよびHindIIIを用いてプラスミドｐMG２６２（ＷＯ０４／００７７０９）（遺伝子ｒａｐＩ, ｒａｐＪ, ｒａｐＮ, ｒａｐＯ, ｒａｐＭ, ｒａｐＱおよびｒａｐＬを発現）をダイジェストし、７．２５９ｋｂｐのフラグメント（ｒａｐＩＪＮ／ＯＭＱＬ含有）を単離して同様にSpeIおよびHindIIIでダイジェストした複合ベクターｐＬＬ１５０でリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、最終プラスミドｐＬＬ１７８を制限酵素ダイジェストにより同定し確認した。
【０２７８】
ii）菌Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９（ｐＬＬ１７８）の単離
プラスミドｐＵＺ８００２をハーバリングする大腸菌ＥＴ１２５６７をｐＬＬ１７８で形質転換して、コンジュゲーションのためのＥ．ｃｏｌｉドナー菌を産生した。これを用いてコンジュゲーションによりＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を形質転換した。アプラマイシン抵抗性コロニーを５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌナリジクス酸を加えた培地１上で単離し、パッチした。これらのパッチを２８℃で培養した後、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えたＩＳＰ３培地上に二次パッチして２８℃で１４〜２１日間培養した。各パッチからのプラグを用いて、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えた７ｍＬの培地２（ＲａｐＶ７）を含有する個々のファルコンチューブを接種した。これらの培養菌を２８℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。次いで、これらを用いて培地３（ＭＤ６）に接種（０．５ｍＬを７ｍＬに）し、２６℃、300ｒｐｍで２日間インキュベートした。培地３で２４時間培養した後、培養菌にシクロヘキサンカルボキシル酸を添加して最終濃度を１ｍＭとした。
【０２７９】
等量のアセトニトリルの添加により、これらの培養菌から二次メタボライトが抽出された。細胞のデブリを遠心分離除去した。サンプルをＬＣＭＳで１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン製造のために評定した。
【０２８０】
iii）１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン７−Ｏ−デスメチルラパマイシンの分析
観測された新規ラパマイシン相同物はＬＣＭＳデータに基づいて１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンであると提案された。これらのデータは、この新規ラパマイシン相同物が１７−デスメチルラパマイシンより３０質量単位小さいことを示し、メチル基１個が存在しないことに合致するものであった。観測されたイオンは[Ｍ−Ｈ]８６８．３、[Ｍ＋Ｎａ]＋８９２．３、[Ｍ＋Ｋ]＋９０８．３。ラパマイシンのＵＶトリエン特性が観測されたが、その中心ピークのＵＶ最高値が変わっていた（ラパマイシンのλ＝２７８ｎｍに対して２７０ｎｍ）。
【０２８１】
iv）単離のための１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンの発酵
すべての菌の芽胞株を、蒸留水中の２０％グリセリンおよび１０％ｗ／ｖ乳糖に保存し−８０℃で格納した培地１で培養して調製した。凍結株０．１ｍＬを２５０ｍＬフラスコ中の５０ｍＬ培地４に接種することにより、主な植物培養菌を調製した。２５０ｒｐｍでシェーキングしながら培養菌を２８℃で４８時間インキュベートした。培養菌を次いで、２０００ｍＬフラスコ内の４００ｍＬ培地４に植え継ぎ培養して二次植物培養菌を得た。この培養菌を２５０ｒｐｍでシェーキングしながら２８℃で２４時間インキュベートした。
【０２８２】
植物培養菌を７．５％ｖ／ｖにて、２０Ｌファーメンタ内で１５Ｌの培地５（前述）に接種した。０．５ｖｖｍ?３０％溶解酸素、最小チップ速度１．１８ｍｓ−１、最大チップ速度２．７５ｍｓ−１にて２６℃、６日間の培養を行った。４８時間後に水２００ｍＬに９．５ｇのＬ−リジンを添加した。
【０２８３】
v）抽出および精製
発酵汁（１２Ｌ）を同量のメタノールと共に２時間撹拌した後、遠心分離（１０分間、３５００ｒｐｍ）して細胞をペレット状にした。上澄液をDiaion（登録商標）ＨＰ２０樹脂（43ｇ／L）と共に１．５時間撹拌した後にろ過した。アセトン（合計量７．５Ｌ）で樹脂をバッチ洗浄してラパマイシン相同物を剥ぎ取り、溶剤を減圧下で除去した。得られた水性抽出物（〜８００ｍＬ）を水で１Ｌに希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１Ｌ）で抽出した。溶剤を減圧下で除去して粘質の褐色抽出物を得た。
【０２８４】
この抽出物をアセトン（ｃａ２０ｍＬ）に溶解し、シリカでコーティングし、シリカコラム（３×６．５ｃｍ径）に適用し、徐々に比率を変えたアセトン／ヘキサン（２０％〜４０％）で希釈した。ラパマイシン相同物含有フラクションをプールし、溶剤を減圧下で除去した。残余物を１０：１０：１クロロホルム／ヘプタン／エタノールで希釈して、さらにSephadexＬＨ２０でクロマトグラフィにかけた。半精製されたラパマイシン相同物をアセトニトリル（２．７ ｍＬ）に溶かし、遠心処理し（１０分間、１３２００ｒｐｍ）、Gilson ＨＰＬＣを使用した逆位相（Ｃ１８）分取用ＨＰＬＣによって精製した。この際、Phenomenex  ２１．２×２５０ｍｍ  Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８  ＢＤＳコラムを２１ｍＬ／ｍｉｎの６０％アセトニトリル／水で希釈した。最も純粋なフラクション（ＨＰＬＣ分析により同定）を結合し、溶媒を減圧下で除去して、１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン（３０ｍｇ）を得た。
【０２８５】
vi）特性
単離した製品をＬＣＭＳｎ分析にかけたところ、ナトリウム付加物のフラグメンテーションが、以前に識別されたフラグメンテーション経路（J.A.Reather、理学博士、ケンブリッジ大学の研究報告、2000年）に基づいて１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンのために予期されたイオンを与えた。このマススペクトロメトリーフラグメンテーションデータは、メチル損失がフラグメントＣ１６−Ｃ２７で生じ、メトキシ基損失がフラグメントＣ２８−Ｃ４４で生じている新規ラパマイシン相同物の領域を狭めている。ＮＭＲ実験を１Ｈ、１３Ｃ、ＡＰＴ、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹで行った。これらのデータの完全且つ徹底的なレビューは、１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンの帰属を与えた。オレフィン的メチル共鳴の不存在が特に注目すべき点であり、プロトンＮＭＲ帰属が下記表１３に記述されている。
【０２８６】
【表１３】
2008509895.tif 000024
【０２８７】
実施例８−Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を補助遺伝子カセットで相補し且つ産生培地にスターター酸を補充することによる１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン（16-O-desmethyl-17-desmethyl-39-desmethyl rapamycin）の単離
【０２８８】
ｉ）ラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＩ, ｒａｐＪ, ｒａｐＮ／Ｏ, ｒａｐＱおよびｒａｐＬ（ｒａｐＩＪＮ／ＯＱＬ）を含有する相補的プラスミドｐＬＬ184の産生
SpeIおよびHindIIIを用いてプラスミドｐMG２６０（ＷＯ０４／００７７０９）（遺伝子ｒａｐＩ, ｒａｐＪ, ｒａｐＮ, ｒａｐＯ, ｒａｐＱおよびｒａｐＬを発現）をダイジェストし、6.3ｋｂｐフラグメント（ｒａｐＩＪＮ／ＯＱＬ含有）を単離して同様にSpeIおよびHindIIIでダイジェストした複合ベクターｐＬＬ１５０でリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、最終プラスミドｐＬＬ１８４を制限酵素ダイジェストにより同定し確認した。
【０２８９】
ii）菌Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９（ｐＬＬ１８４）の単離
プラスミドｐＵＺ８００２をハーバリングする大腸菌ＥＴ１２５６７をｐＬＬ１８４で形質転換して、コンジュゲーションのためのＥ．ｃｏｌｉドナー菌を産生した。これを用いてコンジュゲーションによりＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を形質転換した。アプラマイシン抵抗性コロニーを５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌナリジクス酸を加えた培地１上で単離し、パッチした。これらのパッチを２８℃で培養した後、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えたＩＳＰ３培地上に二次パッチして２８℃で１４〜２１日間培養した。各パッチからのプラグを用いて、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えた７ｍＬの培地２（ＲａｐＶ７）を含有する個々のファルコンチューブを接種した。これらの培養菌を２８℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。次いで、これらを用いて培地３（ＭＤ６）に接種（０．５ｍＬを７ｍＬに）し、２６℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。培地３で２４時間培養した後、培養菌にシクロヘキサンカルボキシル酸を添加して最終濃度を１ｍＭとした。
【０２９０】
等量のアセトニトリルの添加により、これらの培養菌から二次メタボライトが抽出された。細胞のデブリを遠心分離除去した。サンプルをＬＣＭＳで１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン製造のために評定した。
【０２９１】
iii）１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンの分析
観測された新規ラパマイシン相同物はＬＣＭＳデータに基づいて１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンであると提案された。これらのデータは、この新規ラパマイシン相同物が１７−デスメチルラパマイシンより４４質量単位小さいことを示し、メトキシ基１個とメチル基１個が存在しないことに合致するものであった。観測されたイオンは[Ｍ−Ｈ]８５４．２、[Ｍ＋Ｎａ]＋８７８．３、[Ｍ＋Ｋ]＋８９４．３。
【０２９２】
実施例９−Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を補助遺伝子カセットで相補し且つ産生培地にスターター酸を補充することによる１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン（16-O-desmethyl-17-desmethyl-39-desmethyl rapamycin）の単離
【０２９３】
ｉ）ラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＪ, ｒａｐＮ／Ｏ, ｒａｐＱおよびｒａｐＬ（ｒａｐＪＮ／ＯＱＬ）を含有する相補的プラスミドｐＬＳＳ２４９の産生
EcoRIおよびBglIIを用いてプラスミドｐＳＧｓｅｔｒａｐＫＩＪＮ／ＯＱＬ（ＷＯ０４／００７７０９）をダイジェストし、３．７７４ｋｂｐフラグメントを単離して同様にダイジェストしたｐＳＧｓｅｔｒａｐＪ（ＷＯ０４／００７７０９）でリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、プラスミドｐＬＳＳ２３８を制限酵素ダイジェストにより同定した。プラスミドｐＬＳＳ２３８をさらにSpeIおよびHindIIIでダイジェストし、７．３１１ｋｂｐフラグメント（ｒａｐＪＮ／ＯＱＬ含有）を単離して同様にSpeIおよびHindIIIでダイジェストした複合ベクターでリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、最終プラスミドｐＬＳＳ２４９を制限酵素ダイジェストにより同定し確認した。
【０２９４】
ii）菌Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９（ｐＬＳＳ２４９）の単離
プラスミドｐＵＺ８００２をハーバリングする大腸菌ＥＴ１２５６７をｐＬＳＳ２４９で形質転換して、コンジュゲーションのためのＥ．ｃｏｌｉドナー菌を産生した。これを用いてコンジュゲーションによりＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を形質転換した。アプラマイシン抵抗性コロニーを５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌナリジクス酸を加えた培地１上で単離し、パッチした。これらのパッチを２８℃で培養した後、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えたＩＳＰ３培地上に二次パッチして２８℃で１４〜２１日間培養した。各パッチからのプラグを用いて、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えた７ｍＬの培地２（ＲａｐＶ７）を含有する個々のファルコンチューブを接種した。これらの培養菌を２８℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。次いで、これらを用いて培地３（ＭＤ６）に接種（０．５ｍＬを７ｍＬに）し、２６℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。培地３で２４時間培養した後、培養菌にシクロヘキサンカルボキシル酸を添加して最終濃度を１ｍＭとした。
【０２９５】
等量のアセトニトリルの添加により、これらの培養菌から二次メタボライトが抽出された。細胞のデブリを遠心分離除去した。サンプルをＬＣＭＳで１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン製造のために評定した。
【０２９６】
iii）１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンの分析
この新規ラパマイシン相同物のＬＣＭＳは、それが実施例８に記述したラパマイシン相同物と同じ質量と保持時間を持つものであることを示した。
【０２９７】
実施例１０−Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を補助遺伝子カセットで相補し且つ産生培地にスターター酸を補充することによる９−デオキソ−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン（9-deoxo-17-desmethyl-27-O-desmethyl-39-desmethoxy rapamycin）の単離
【０２９８】
ｉ）ラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＭ, ｒａｐＮ, ｒａｐＯおよびｒａｐＬ（ｒａｐＭＮ／ＯＬ）を含有する相補的プラスミドｐＬＬ１９１の産生
プラスミドｐＭＧ２３７の単離：プラスミドｐＳＧｓｅｔｒａｐＫＪＭＮ／Ｏは、遺伝子ｒａｐＫ, ｒａｐＪ, ｒａｐＭ, ｒａｐＮおよびｒａｐＯがactIプロモーターの下に配置されたｐＳＥＴ１５２由来プラスミドである。このプロモーターはそれ自身が、これもまた該プラスミドに存在するactII-ORF4によって制御される。これは、この作業に用いられる他のカセット含有プラスミドに対する相同的状況である。BglII/XbaIを用いてプラスミドｐＳＧｓｅｔｒａｐＫＪＭＮ／Ｏをダイジェストし、単離したｐＳＧＬｉｔｒａｐＬhisのベクターフラグメントを１ｋｂのXbaI／BglIIフラグメントでリゲートした。プラスミドｐMG２３７（ｒａｐＫ, ｒａｐＪ, ｒａｐＭ, ｒａｐＮ, ｒａｐＯおよびｒａｐＬを発現）が単離された。
【０２９９】
制限酵素SpeIおよびHindIIIを用いてプラスミドｐMG２３７（遺伝子ｒａｐＫ, ｒａｐＪ, ｒａｐＭ, ｒａｐＮ, ｒａｐＯおよびｒａｐＬを発現）をダイジェストし、６．８４１ｋｂｐフラグメントを単離して同様にSpeIおよびHindIIIでダイジェストした複合ベクターｐＬＬ１５０でリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、制限酵素ダイジェストにより、最終プラスミドｐＬＬ１７１を同定した。このプラスミドｐＬＬ１７１をAsiSIおよびNheIでダイジェストして、５．２９３ｋｂｐ（ｒａｐＭＮ／ＯＬ含有）を単離して同様にAsiSIおよびNheIでダイジェストしたｐＳＧｓｅｔｒａｐＭ（ＷＯ０４／００７７０９）でリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、制限酵素ダイジェストによりプラスミドｐＬＬ１８０を同定した。プラスミドｐＬＬ１８０は遺伝子ｒａｐＭ, ｒａｐＮ／ＯおよびｒａｐＬを発現している。これらをSpeIおよびHindIIIでのダイジェストにより複合ベクターｐＬＬ１５０に移した。４．７８５ｋｂｐのSpeI／HindIIIフラグメントがｐＬＬ１８０から単離され、これを同様にダイジェストしたｐＬＬ１５０でリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、制限酵素ダイジェストにより最終プラスミドｐＬＬ１９１を同定し確認した。
【０３００】
ii）菌Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９（ｐＬＬ１９１）の単離
プラスミドｐＵＺ８００２をハーバリングする大腸菌ＥＴ１２５６７をｐＬＬ１９１で形質転換して、コンジュゲーションのためのＥ．ｃｏｌｉドナー菌を産生した。これを用いてコンジュゲーションによりＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を形質転換した。アプラマイシン抵抗性コロニーを５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌナリジクス酸を加えた培地１上で単離し、パッチした。これらのパッチを２８℃で培養した後、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えたＩＳＰ３培地上に二次パッチして２８℃で１４〜２１日間培養した。各パッチからのプラグを用いて、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えた７ｍＬの培地２（ＲａｐＶ７）を含有する個々のファルコンチューブを接種した。これらの培養菌を２８℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。次いで、これらを用いて培地３（ＭＤ６）に接種（０．５ｍＬを７ｍＬに）し、２６℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。培地３で２４時間培養した後、培養菌にシクロヘキサンカルボキシル酸を添加して最終濃度を１ｍＭとした。
【０３０１】
等量のアセトニトリルの添加により、これらの培養菌から二次メタボライトが抽出された。細胞のデブリを遠心分離除去した。サンプルをＬＣＭＳで９−デオキソ−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン製造のために評定した。
【０３０２】
iii）９−デオキソ−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンの分析
観測された新規ラパマイシン相同物はＬＣＭＳデータに基づいて９−デオキソ−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンであると提案された。これらのデータは、この新規ラパマイシン相同物が１７−デスメチル−３９−デスヒドロキシプレ−ラパマイシンより３０質量単位大きいことを示し、メチル基１個とヒドロキシ基１個が追加されていることに合致するものであった。観測されたイオンは[Ｍ−Ｈ]８４０．６、[Ｍ＋Ｎａ]＋８６４．６、[Ｍ＋Ｋ]＋８８０．６。
【０３０３】
実施例１１−Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を補助遺伝子カセットで相補し且つ産生培地にスターター酸を補充することによる９−デオキソ−１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン（9-deoxo-16-O-desmethyl-17-desmethyl-27-O-desmethyl-39-desmethoxy rapamycin）の単離
【０３０４】
ｉ）ラパマイシン補助遺伝子ｒａｐＩ, ｒａｐＮ／ＯおよびｒａｐＬ（ｒａｐＩＮ／ＯＬ）を含有する相補的プラスミドｐＬＬ１９０の産生
制限酵素BglIIを用いてプラスミドｐＳＧｓｅｔＫＩＮ／ＯＬをダイジェストし、３．２７２ｋｂｐフラグメント（ｒａｐＩＮ／ＯＬ含有）を単離して、BglIIでダイジェストしアルカリフォスファターゼで処理したプラスミドｐＳＧｓｅｔｒａｐＩ（ＷＯ０４／００７７０９）でリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、制限酵素ダイジェストによりプラスミドｐＬＬ１７７を同定した。このプラスミドｐＬＬ１７７をさらにSpeIおよびHindIIIでダイジェストして５．６２４ｋｂｐフラグメント（ｒａｐＩＮ／ＯＬ含有）を単離して同様にSpeIおよびHindIIIでダイジェストした複合ベクターｐＬＬ１５０でリゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した後、制限酵素ダイジェストにより最終プラスミドｐＬＬ１９０を同定し確認した。
【０３０５】
ii）菌Ｓ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９（ｐＬＬ１９０）の単離
プラスミドｐＵＺ８００２をハーバリングする大腸菌ＥＴ１２５６７をｐＬＬ１９０で形質転換して、コンジュゲーションのためのＥ．ｃｏｌｉドナー菌を産生した。これを用いてコンジュゲーションによりＳ．ヒグロスコピカス ＭＧ７−９を形質転換した。アプラマイシン抵抗性コロニーを５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌナリジクス酸を加えた培地１上で単離し、パッチした。これらのパッチを２８℃で培養した後、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えたＩＳＰ３培地上に二次パッチして２８℃で１４〜２１日間培養した。各パッチからのプラグを用いて、５０ｍｇ／Ｌアプラマイシンを加えた７ｍＬの培地２（ＲａｐＶ７）を含有する個々のファルコンチューブを接種した。これらの培養菌を２８℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。次いで、これらを用いて培地３（ＭＤ６）に接種（０．５ｍＬを７ｍＬに）し、２６℃、３００ｒｐｍで２日間インキュベートした。培地３で２４時間培養した後、培養菌にシクロヘキサンカルボキシル酸を添加して最終濃度を１ｍＭとした。
【０３０６】
等量のアセトニトリルの添加により、これらの培養菌から二次メタボライトが抽出された。細胞のデブリを遠心分離除去した。サンプルをＬＣＭＳで９−デオキソ−１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン製造のために評定した。
【０３０７】
iii）９−デオキソ−１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンの分析
観測された新規ラパマイシン相同物はＬＣＭＳデータに基づいて９−デオキソ−１６−Ｏ−デスメチル−１７−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンであると提案された。これらのデータは、この新規ラパマイシン相同物が１７−デスメチル−３９−デスヒドロキシプレ−ラパマイシンより１６質量単位大きいことを示し、ヒドロキシ基１個が追加されていることに合致するものであった。観測されたイオンは[Ｍ−Ｈ]８２６．７、[Ｍ＋Ｎａ]＋８５０．６、[Ｍ＋Ｋ]＋８６６．６。
【０３０８】
実施例１２―抗ガン活性のためのin vitroバイオアッセイ
１７−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンのモノレイヤー増殖アッセイ内の１２個のヒト腫瘍細胞ラインでの抗ガン活性を、上述のようにしてプロピジウムアイオダイドアッセイを用いてin vitro評価した。
【０３０９】
結果は表１４に示されている。各結果は反復実験の平均値を表している。表１５は試験化合物と試験した細胞ラインに関連するラパマイシンのＩＣ５０とＩＣ７０を示す。
【０３１０】
【表１４】
2008509895.tif 000025
【０３１１】
【表１５】
2008509895.tif 000026
【０３１２】
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【０３１３】
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<130> BIOY/P30824WO
<150> GB 0417852.1
<151> 2004-08-11
<160> 18
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 
<223> Artificially generated restriction site
<400> 1
Phe Pro Gly Gln Gly
1 5
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial
<220> 
<223> Artificially generated restriction site
<400> 2
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<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 
<223> Artificially generated restriction site
<400> 3
Phe Pro Gly Gln Gly
1 5
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial
<220> 
<223> Artificially generated restriction site
<400> 4
ttcccgggtc agggg 15
<210> 5
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<212> PRT
<213> Artificial
<220> 
<223> Artificially generated restriction site
<400> 5
Phe Pro Gly Gln Gly
1 5
<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial
<220> 
<223> Artificially generated restriction site
<400> 6
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<212> PRT
<213> Artificial
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<400> 7
Ala Val Leu Gly Asp
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<212> DNA
<213> Artificial
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<400> 8
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<212> PRT
<213> Artificial
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Ala Val Leu Gly Asp
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<220> 
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<220> 
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<400> 13
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<212> DNA
<213> Artificial
<220> 
<223> Primer
<400> 14
cacctgcagg cccaactcgg ccagctcgct 30
<210> 15
<211> 1596
<212> DNA
<213> Artificial
<220> 
<223> Left region of homology PCT product from AT10, amplified from S. hygroscopicus using SEQ ID Nos 1 and 2, which contain additional restriction sites
<400> 15
cacctgcagg cccaactcgg ccagctcgct gatcagcgcc tcgtccgggg cgctgcggga 60
cagcaacagc agatgacgca caccgcgttc ggccaccagg tgccgggcgg cgatccccgc 120
cagcacaccc gaaccaccgg tgatcagaac cgtgccatcc ggatcccaga cgccttcagg 180
ctcaggctca gcgacgcccg tacgagtcag tcgcggtgcc tcgtaccggc cgtcgatgac 240
ccgcagccgc ggctcatcga gcccgacggt ggcggccagt tggtccgggg tgagggtgtc 300
gtcgtcactt tccaccagga cgaaccggcc cgggtgctcc gactgagccg aacgcatcaa 360
ccccgacacc gcggctgcgg ccaaaccagt tccggtccgc acaaccagcg tactgtcagt 420
gaaacgctcc cccgccagcc acacctgcac cgcctgcaga acctcagcgg tcagccgacg 480
agtctgtgcc agcgggtcac cgctgtcggg gagtgcggtg aacacaacga catcgggcat 540
cggcacctcg ccgtccgcga ggtcttcaaa cttgcccacc gtcacgccga cctgctggga 600
gaccgggatc tccgtccacg tcagggcgaa cagatcatcg acagcagaac cgagcgcatc 660
ggctgccacc ggacgggtca ccagcgagcc gatggtggcc accggccgac cgatgtcatc 720
agcgacccgc acaccccagc catccgcgac ccgtgtcatc gcgacccgca gcgtggccga 780
gccagtgaca tggacctgga cgtggttcca ggagaacggc aaccgcacgg tgtcgcggtc 840
ggcatcgggt gtgttcagga tcccggcgtg cagggcggca tccaacaccg cagggtggac 900
ggcgaatcgt gccgcgtcct gggtctgctc ctcagccaga gcaacctcgg cgaagacggt 960
gtcaccatca cgccacgcgg cctgcaaacc ctggaaggca ggtccgtact cgtaacccgc 1020
cctggtcagc tggtcgtaga agcctgccac gtccaccggc ttggcctgcg caggtggcca 1080
cgcggtgagg tccgacgttg gcacagtcgt gtcggacacg ctgacggtgg cggaaacgtg 1140
ccggacccag gcatcggcgc tgtccgcccg ggagaagacc gtcaccgcgc ggtgtccgga 1200
ctcgtcggcc tcgccgacgg atacggacag ttgcacaccg ccggtctgcg gcagcagaag 1260
cggggcttcg acgatcagct cgtcaacgac gtcgcagccc acctcatcag ccgcgcggac 1320
aaccagctcc acaaacccgg taccgggcag caggacactg ccccggaccg cgtgatcagc 1380
cagccacgcg tgggtggcca gtgatacccg cccggtcagc atcacaccat ccgaacccgg 1440
catcgccagc accgcaccca gcaacggatg gcccaccgca tccagacccg cccccgacac 1500
atcggcagac cggccggcct cagcccaata ccgctggtgc tggaacgcgt acgtcggaag 1560
atccagcacc cgtgttgccg ggacatcacc taggac 1596
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 16
cctggccagg aaagacgaac acgatcct 28
<210> 17
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 17
cgaagcttga gccgctggcg atcgtggga 29
<210> 18
<211> 1550
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Right region of homology PCR Product from AT10, amplified from S.hygroscopicus using SEQ ID Nos 1 and 2, which contain additional restriction sites.
<400> 18
cctgccagga aagacgaaca cgatcctggg gtcggacacc gcggtgccgg tgacggtctc 60
atctccaagg agtacggcgc ggtgctcgaa caccgaccgt gtcaccgcca gcgtcgatgc 120
cacagcccgt atatccactc cgggcgacgc cgccaggtag gcgcggagcc ggtcttcgtg 180
ttcggtcagg gcgggctggg tcttggccga tatcaccagc ggcaccagtt ccgaaaccag 240
tacgggtgta gagccagccg tgtcgcccac agactgtgcc ggtgcactct caaggatgac 300
gtgggcgtta gtgccactga tcccgaacga cgacacacct gcccgacggg gtcggccggt 360
ctccggccac ggctggttct ccgccaccag ctcgaccgca cccgccgacc agtccacatg 420
ccgcgacggc tcatccacat gcaacgtgcg cggcaccatg ctgtgctgca gggccatcac 480
catcttgatg acacccgaca cacctgcggc agcctgggta tggccgacgt tcgacttcag 540
cgatcccagc agcagcggct ccccgcggcc ctggccgtaa gtagcgatca ccgcctgggc 600
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gaagtacgac acccggcccg acaacacact cgccgcacca gcagttgtcc cgaagccgcc 1140
gaggtcggca ccgatgccgt agccaccggg gtaagcacct atgaagacgc cggtgtcgct 1200
gccgcgtacg gaaccgggct cgatcccggc ccgctcgaac gcctcccagg acacctcaag 1260
catcaaccgc tgctgcggat ccatcgccaa cgcctcacgc ggactgatcc cgaagaacga 1320
ggcgtcgaaa ccggccgcgg catccaggaa gccgccctgc acgctgtagg acttcccggg 1380
cgcgtccggg tccggatcgt acaggttctc gacgtcccag ccgcggtcgg ttgggaagcc 1440
ggaaatcgcg tccgtaccgg actcgaccaa gcgccacaga tcctccggcg acgagactcc 1500
accgggtagg cggcaggcca ttcccacgat cgccagcggc tcaagcttcg 1550
【図面の簡単な説明】
【０３１４】
【図１】ラパマイシンの構造図。Ａは結合ドメイン、Ｂは効果ドメイン。
【図２】ラパマイシンの構造図（Ａ）、ＦＫ５０６の構造図（Ｂ）、ＦＫ５２０の構造図（Ｃ）およびメリダマイシンの構造図（Ｄ）。
【図３】ＭＧ２−１０の遺伝子エンジニアリングによるＭＧ７−９の産生。
【図４】マススペクトロメトリーによる３９−デスメトキシ−１７−デスメチルプレ−ラパマイシンのフラグメンテーション。
【図５】３９−デスメトキシ−１７−デスメチルプレ−ラパマイシンのＬＣ−ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ分析。
【図６】３９−デスメトキシ−１７−デスメチルプレ−ラパマイシンのＬＣ−ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ分析。
【図７】１７−デスメチル−３９−デスヒドロキシプレ−ラパマイシンの顕著なＮＭＲ相関。
【図８】プラスミドｐＬＬ１５０の図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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